(57)【要約】  本発明は、一般に、新規のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子と、マスキング部分として作用するイデオタイプ特異的ポリペプチドとに関する。本発明はまた、このようなプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子及びイデオタイプ特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、このようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞とにも関する。本発明はさらに、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子及びイデオタイプ特異的ポリペプチドを生成するための方法と、これらのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子及びイデオタイプ特異的ポリペプチドを、疾患の治療において使用する方法とにも関する。【選択図】図１Ａ
2019514850.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＣＤ３への特異的結合が可能な第１の抗原結合部分と；
（ｂ）標的細胞抗原への特異的結合が可能な第２の抗原結合部分と；
（ｃ）プロテアーゼ切断型リンカーを介して、Ｔ細胞二重特異性結合性分子と共有結合しているマスキング部分であって、第１又は第２の抗原結合部分のイデオタイプへの特異的結合が可能であり、これにより、第１又は第２の抗原結合部分を可逆的に隠蔽するマスキング部分と
を含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項２】
マスキング部分が、第１の抗原結合部分と共有結合しており、第１の抗原結合部分を可逆的に隠蔽する、請求項１に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項３】
マスキング部分が、第１の抗原結合部分の重鎖可変領域と共有結合している、請求項１又は２に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項４】
マスキング部分が、抗イデオタイプｓｃＦｖである、請求項１から３のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項５】
第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域を交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である、請求項１から４のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項６】
第１の抗原結合部分が、従来型のＦａｂ分子である、請求項１から５のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項７】
ＣＤ３への特異的結合が可能な、１つを超えない抗原結合部分を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項８】
標的細胞抗原への特異的結合が可能なＦａｂ分子である、第３の抗原結合部分を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項９】
第３の抗原結合部分が、第２の抗原結合部分と同一である、請求項８に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項１０】
第２の抗原結合部分が、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、及びメソテリンからなる群から選択される標的細胞抗原への特異的結合が可能である、請求項１から９のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項１１】
第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している、請求項１から１０のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項１２】
第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、請求項１から１１のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項１３】
第１の抗原結合部分が、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している、請求項１から１２のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項１４】
安定的な会合が可能な、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを加えて含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項１５】
Ｆｃドメインが、ＩｇＧ、具体的には、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃドメインである、請求項１４に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項１６】
Ｆｃドメインが、天然ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較した、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を呈示する、請求項１４又は１５に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項１７】
マスキング部分が、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号２６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号２７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号２８）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
（ｄ）ＲＡＳＥＮＩＤＳＹＬＡ（配列番号２９）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号３０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号３１）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項１８】
プロテアーゼ切断型リンカーが、少なくとも１つのプロテアーゼ認識配列を含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項１９】
プロテアーゼ切断型リンカーが、プロテアーゼ認識配列ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号３６）を含む、請求項１８に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項２０】
第１の抗原結合部分が、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、
ａ）ＴＹＡＭＮ（配列番号４４）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
ｂ）ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４５）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
ｃ）ＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号４６）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
ｄ）ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号１７）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号１８）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号１９）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項２１】
第１の抗原結合部分が、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項２２】
第２の抗原結合部分が、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、
ａ）ＮＡＷＭＳ（配列番号１４）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
ｂ）ＲＩＫＳＫＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ（配列番号１５）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
ｃ）ＰＷＥＷＳＷＹＤＹ（配列番号１６）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
ｄ）ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号１７）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号１８）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号１９）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項２３】
第２の抗原結合部分が、メソテリンへの特異的結合が可能であり、
ａ）ＧＹＴＭＮ（配列番号１０７）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
ｂ）ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号１０８）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
ｃ）ＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号１０９）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
ｄ）ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１１０）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
ｅ）ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１１１）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
ｆ）ＱＱＷＳＫＨＰＬＴ（配列番号１１２）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項２４】
分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠蔽するための、イデオタイプ特異的ポリペプチド。
【請求項２５】
抗イデオタイプｓｃＦｖである、請求項２４に記載のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
【請求項２６】
リンカーを介して分子と共有結合している、請求項２４又は２５に記載のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
【請求項２７】
リンカーが、ペプチドリンカーである、請求項２６に記載のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
【請求項２８】
リンカーが、プロテアーゼ切断型リンカーである、請求項２６又は２７に記載のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
【請求項２９】
ペプチドリンカーが、少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む、請求項２６から２８のいずれか一項に記載のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
【請求項３０】
プロテアーゼ切断型リンカーが、プロテアーゼ認識配列ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号３６）を含む、請求項２９に記載のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
【請求項３１】
分子が、Ｔ細胞活性化二重特異性分子である、請求項２９又は３０に記載のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
【請求項３２】
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号２６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号２７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号２８）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
（ｄ）ＲＡＳＥＮＩＤＳＹＬＡ（配列番号２９）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号３０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号３１）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む、請求項２４から３１のいずれか一項に記載のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
【請求項３３】
請求項１から２３のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、又は請求項２４から３２のいずれか一項に記載のイデオタイプ特異的ポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
【請求項３４】
医薬としての使用のための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、請求項２４から３２のいずれか一項に記載のイデオタイプ特異的ポリペプチド、又は請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
医薬が、がんを治療するか、若しくはその進行を遅延させるか、免疫関連疾患を治療するか、若しくはその進行を遅延させるか、又は個体における免疫応答若しくは免疫機能を増強若しくは刺激するためのものである、請求項３４に記載の使用のためのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
【請求項３６】
医薬を製造するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、又は請求項２４から３２のいずれか一項に記載のイデオタイプ特異的ポリペプチドの使用。
【請求項３７】
疾患が、がんである、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
個体における疾患を治療する方法であって、前記個体へと、請求項１から２３のいずれか一項に記載のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を含む、治療的有効量の組成物を投与することを含む方法。
【請求項３９】
がんを治療するか、若しくはその進行を遅延させるか、免疫関連疾患を治療するか、若しくはその進行を遅延させるか、又は個体における免疫応答若しくは免疫機能を増強若しくは刺激するための、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、分子の抗原への結合を可逆的にマスキングする抗イデオタイプ結合部分を含む、新規のプロテアーゼ活性化型抗原結合性分子に関する。具体的には、本発明は、プロテアーゼにより切断されるまでＣＤ３結合部分をマスキングする抗イデオタイプ結合部分を有するＴ細胞結合分子に関する。これは、腫瘍などの標的組織、例えば、腫瘍浸潤Ｔ細胞に近接するまで、ＣＤ３結合部分をアクセス不可能とするか、又は「マスキング」することを可能とする。加えて、本発明は、このようなプロテアーゼ活性化Ｔ細胞結合分子及びイデオタイプ特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにこのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明のプロテアーゼ活性化Ｔ細胞結合分子を生成するための方法、及びこれを、例えば、疾患の治療において使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な臨床状況では、個別の標的細胞、又は特異的標的細胞型の選択的破壊が所望されることが多い。例えば、健常細胞及び健常組織をインタクトのままとし、損傷せずに、腫瘍細胞を、特異的に破壊することは、がん治療の第１の目標である。
【０００３】
これを達成する魅力的な様式は、免疫応答を、腫瘍に対して誘導して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞又は細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞に、腫瘍細胞を攻撃及び破壊させることである。この点で、１つの「アーム」により、標的細胞上の表面抗原に結合し、第２の「アーム」により、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化させる不変の成分に結合するようにデザインされた二重特異性抗体が、近年、関心を集めている。このような抗体の、その両方の標的への同時的な結合は、標的細胞とＴ細胞との間の、一過性の相互作用を強い、任意の細胞傷害性Ｔ細胞の活性化と、その後の標的細胞の溶解とを引き起こす。よって、免疫応答は、標的細胞へと再指向し、ＣＴＬの、通常のＭＨＣ制限型活性化に関与性である、標的細胞によるペプチド抗原の提示、又はＴ細胞の特異性に依存しない。
【０００４】
この文脈では、ＣＴＬが、標的細胞と近接した、すなわち、免疫学的シナプスが模倣された場合に限り活性化することが極めて重要である。特に、効果的な標的細胞の溶解を誘発するために、リンパ球のあらかじめの条件付け又は共刺激を要請しない、Ｔ細胞活性化二重特異性分子が所望される。いくつかの二重特異性抗体フォーマットを開発し、Ｔ細胞媒介型免疫療法へのそれらの適性について探索した。これらは、ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）分子（Nagorsen及びBaeuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)）、ダイアボディ（Holligerら, Prot Eng 9, 299-305 (1996)）及びタンデムダイアボディなど、その誘導体（Kipriyanovら, J Mol Biol 293, 41-66 (1999)）、ＤＡＲＴ（二重親和性再標的化）分子、（Mooreら, Blood 117, 4542-51 (2011)）、並びにトリオマブ（Seimetzら, Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)）を含む。
【発明の概要】
【０００５】
治療に適する二重特異性分子を作出する課題は、有効性、毒性、適用可能性、及び生産可能性と関連する、いくつかの技術的難題であって、対処しなければならない難題をもたらす。二重特異性分子が、標的細胞、例えば、がん細胞上の抗原であって、非標的組織内でもまた発現する抗原を標的化する場合、毒性が生じうる。したがって、標的細胞の存在下では、完全なＴ細胞の活性化をもたらすが、正常細胞又は正常組織の存在下では、Ｔ細胞の活性化をもたらさない、効果的なＴ細胞活性化二重特異性分子が必要とされている。
【０００６】
本発明は、一般に、標的細胞の存在下で選択的に活性化する、Ｔ細胞活性化二重特異性分子に関する。
【０００７】
一態様では、本発明は、
（ａ）ＣＤ３への特異的結合が可能な第１の抗原結合部分と；
（ｂ）標的細胞抗原への特異的結合が可能な第２の抗原結合部分と；
（ｃ）プロテアーゼ切断型リンカーを介して、Ｔ細胞二重特異性結合性分子と共有結合しているマスキング部分であって、第１又は第２の抗原結合部分のイデオタイプへの特異的結合が可能であり、これにより、第１又は第２の抗原結合部分を、可逆的に隠蔽するマスキング部分と
を含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子に関する。
【０００８】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のマスキング部分は、第１の抗原結合部分と共有結合している。一実施態様では、マスキング部分は、第１の抗原結合部分の重鎖可変領域と共有結合している。一実施態様では、マスキング部分は、第１の抗原結合部分の軽鎖可変領域と共有結合している。一実施態様では、マスキング部分は、抗イデオタイプｓｃＦｖである。
【０００９】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第２の抗原結合部分を可逆的に隠蔽する、第２のマスキング部分を含む。
【００１０】
一実施態様では、プロテアーゼ切断型リンカーを切断することが可能なプロテアーゼを、標的細胞に発現させる。一実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域を交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である。一実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域を交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である。一実施態様では、第１の抗原結合部分は、従来型のＦａｂ分子である。一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３への特異的結合が可能な、１つを超えない抗原結合部分を含む。一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原への特異的結合が可能なＦａｂ分子である、第３の抗原結合部分を含む。特定の一実施態様では、第３の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分と同一である。特定の一実施態様では、第３の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分と同一ではない。一実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１又はＨＥＲ１への特異的結合が可能である。一実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ１、又はメソテリンへの特異的結合が可能である。一実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、又はメソテリンへの特異的結合が可能である。
【００１１】
一実施態様では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している。特定の一実施態様では、第２の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へと融合させる。特定の一実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。特定の一実施態様では、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖は、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している。
【００１２】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、加えて、安定的な会合が可能な、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、具体的には、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃドメインである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、天然ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較した、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を呈示する。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減する、一又は複数のアミノ酸置換を含む。特定の一実施態様では、一又は複数のアミノ酸置換は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９（カバット番号付け）の群から選択される、一又は複数の位置におけるものである。特定の一実施態様では、Ｆｃドメインの各サブユニットは、活性化Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減する、３つのアミノ酸置換であって、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇであるアミノ酸置換を含む。特定の一実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施態様では、エフェクター機能は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。一実施態様では、標的細胞は、ヒト細胞である。
【００１３】
一実施態様では、マスキング部分は、
（ａ）ＤＹＳＩＨ（配列番号２０）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＡＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２１）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＰＹＤＹＤＶＬＤＹ（配列番号２２）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む。
【００１４】
一実施態様では、マスキング部分は、
（ａ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＮＹＳＹＩＨ（配列番号２３）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号２４）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＱＨＳＲＥＦＰＷＴ（配列番号２５）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む。
【００１５】
一実施態様では、マスキング部分は、
（ａ）ＤＹＳＩＨ（配列番号２０）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＡＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２１）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＤＶＬＤＹ（配列番号２２）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＮＹＳＹＩＨ（配列番号２３）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号２４）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＳＲＥＦＰＷＴ（配列番号２５）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む。
【００１６】
一実施態様では、マスキング部分は、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号２６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号２７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号２８）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む。
【００１７】
一実施態様では、マスキング部分は、
（ａ）ＲＡＳＥＮＩＤＳＹＬＡ（配列番号２９）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号３０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号３１）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む。
【００１８】
一実施態様では、マスキング部分は、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号２６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号２７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号２８）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
（ｄ）ＲＡＳＥＮＩＤＳＹＬＡ（配列番号２９）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号３０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号３１）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む。
【００１９】
一実施態様では、プロテアーゼ切断型リンカーは、少なくとも１つのプロテアーゼ認識配列を含む。一実施態様では、プロテアーゼ切断型リンカーは、プロテアーゼ認識配列を含む。一実施態様では、プロテアーゼ認識配列は、
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号３６）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号３７）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号３８）；及び
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号３９）
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号４０）
［配列中、Ｘは、任意のアミノ酸である］からなる群から選択される。
【００２０】
一実施態様では、プロテアーゼ切断型リンカーは、プロテアーゼ認識配列を含む。一実施態様では、プロテアーゼ認識配列は、
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号３６）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号３７）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号３８）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号３９）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号４０）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号９７）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号９８）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号９９）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１００）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１０１）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１０２）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１０３）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１０４）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１０５）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１０６）
［配列中、Ｘは、任意のアミノ酸である］からなる群から選択される。
【００２１】
一実施態様では、プロテアーゼ切断型リンカーを切断することが可能なプロテアーゼは、メタロプロテイナーゼ、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）１−２８、並びにディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）２、７−１２、１５、１７−２３、２８−３０、及び３３、セリンプロテアーゼ、例えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びマトリプターゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、並びにカテプシンプロテアーゼからなる群から選択される。具体的な一実施態様では、プロテアーゼは、ＭＭＰ９又はＭＭＰ２である。さらなる具体的な実施態様では、プロテアーゼは、マトリプターゼである。一実施態様では、プロテアーゼ切断型リンカーは、プロテアーゼ認識配列ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号３６）を含む。
【００２２】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【００２３】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲとを含む。
【００２４】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００２５】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００２６】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【００２７】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号１５１、配列番号１５２、及び配列番号１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１５４、配列番号１５５、及び配列番号１５６からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【００２８】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【００２９】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号１５１、配列番号１５２、及び配列番号１５３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１５４、配列番号１５５、及び配列番号１５６の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【００３０】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号４７のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００３１】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号１５７のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５８のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００３２】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００３３】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号１５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００３４】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、メソテリンへの特異的結合が可能であり、配列番号１０７、配列番号１０８、及び配列番号１０９からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１１０、配列番号１１１、及び配列番号１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【００３５】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、メソテリンへの特異的結合が可能であり、配列番号１０７、配列番号１０８、及び配列番号１０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１１０、配列番号１１１、及び配列番号１１２の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【００３６】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号１１３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１４のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００３７】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００３８】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＨＥＲ１への特異的結合が可能であり、出典明示によりその全体において本明細書に援用される、国際公開第２００６／０８２５１５号において開示されている抗体のうちのいずれか１つの、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００３９】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＨＥＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【００４０】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＨＥＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【００４１】
本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号３２のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子についての一実施態様では、第２の抗原結合部分は、配列番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３３のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
【００４２】
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、ＨＥＲ２への特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分は、配列番号１６０のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６１のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、第３の抗原結合部分は、配列番号１５９のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６１のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【００４３】
特定の一実施態様では、本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む。
【００４４】
特定の一実施態様では、本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む。
【００４５】
特定の一実施態様では、本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、
（ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの重鎖と；
（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの軽鎖と
を含む。
【００４６】
特定の一実施態様では、本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、
（ａ）配列番号７２のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む。
【００４７】
特定の一実施態様では、本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、
（ａ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む。
【００４８】
特定の一実施態様では、本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、
（ａ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を含む、第１の軽鎖と；
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む、第２の軽鎖と
を含む。
【００４９】
特定の一実施態様では、本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、
（ａ）配列番号７７のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号８２のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号７８のアミノ酸配列を含む、第１の軽鎖と；
（ｄ）配列番号８１のアミノ酸配列を含む、第２の軽鎖と
を含む。
【００５０】
特定の一実施態様では、本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、
（ａ）配列番号７６のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号７７のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号７８のアミノ酸配列を含む、第１の軽鎖と；
（ｄ）配列番号７９のアミノ酸配列を含む、第２の軽鎖と
を含む。
【００５１】
特定の一実施態様では、本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、
（ａ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号８１のアミノ酸配列を含む、第１の軽鎖と；
（ｄ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含む、第２の軽鎖と
を含む。
【００５２】
特定の一実施態様では、本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、
（ａ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号８１のアミノ酸配列を含む、第１の軽鎖と；
（ｄ）配列番号１３８のアミノ酸配列を含む、第２の軽鎖と
を含む。
【００５３】
一態様では、本発明は、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠蔽するための、イデオタイプ特異的ポリペプチドに関する。一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、抗イデオタイプｓｃＦｖである。一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、リンカーを介して分子と共有結合している。一実施態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一実施態様では、リンカーは、プロテアーゼ切断型リンカーである。一実施態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む。一実施態様では、プロテアーゼは、メタロプロテイナーゼ、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）１−２８、並びにディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）２、７−１２、１５、１７−２３、２８−３０、及び３３、セリンプロテアーゼ、例えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びマトリプターゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、並びにカテプシンプロテアーゼからなる群から選択される。具体的な一実施態様では、プロテアーゼは、ＭＭＰ９又はＭＭＰ２である。さらなる具体的な実施態様では、プロテアーゼは、マトリプターゼである。一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、１つを超えるリンカーを介して分子と共有結合している。一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、２つのリンカーを介して分子と共有結合している。
【００５４】
一実施態様では、抗ＣＤ３抗原結合部位を含む分子は、Ｔ細胞活性化二重特異性分子である。特定の一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、
（ａ）ＤＹＳＩＨ（配列番号２０）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＡＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２１）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＰＹＤＹＤＶＬＤＹ（配列番号２２）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む。
【００５５】
特定の一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、
（ａ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＮＹＳＹＩＨ（配列番号２３）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号２４）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＱＨＳＲＥＦＰＷＴ（配列番号２５）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む。
【００５６】
特定の一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、
（ａ）ＤＹＳＩＨ（配列番号２０）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＡＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２１）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＤＶＬＤＹ（配列番号２２）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列；
を含む重鎖可変領域と；
（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＮＹＳＹＩＨ（配列番号２３）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号２４）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＳＲＥＦＰＷＴ（配列番号２５）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む。
【００５７】
特定の一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号２６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号２７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号２８）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む。
【００５８】
特定の一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、
（ａ）ＲＡＳＥＮＩＤＳＹＬＡ（配列番号２９）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号３０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号３１）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む。
【００５９】
特定の一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号２６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号２７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号２８）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
（ｄ）ＲＡＳＥＮＩＤＳＹＬＡ（配列番号２９）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号３０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号３１）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む。
【００６０】
本発明の別の態様に従い、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドが提供される。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドも包摂する。本発明はまた、本発明の単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び本発明の単離ポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。一部の実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、特に、哺乳類細胞である。
【００６１】
別の態様では、本発明のプロテアーゼ活性化Ｔ細胞分子を生成する方法であって、ａ）本発明の宿主細胞を、プロテアーゼ活性化Ｔ細胞分子の発現に適する条件下で培養する工程と、ｂ）プロテアーゼ活性化Ｔ細胞分子を回収する工程とを含む方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法により生成されるプロテアーゼ活性化Ｔ細胞分子も包摂する。
【００６２】
別の態様では、本発明のイデオタイプ特異的ポリペプチドを生成する方法であって、ａ）本発明の宿主細胞を、プロテアーゼ活性化Ｔ細胞分子の発現に適する条件下で培養する工程と、ｂ）イデオタイプ特異的ポリペプチドを回収する工程とを含む方法が提供される。本発明はまた、本発明の方法により生成されるイデオタイプ特異的ポリペプチドも包摂する。
【００６３】
本発明はまた、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物も提供する。
【００６４】
本発明にはまた、本発明のプロテアーゼ活性化Ｔ細胞分子と、薬学的組成物とを使用する方法も包摂される。一態様では、本発明は、医薬としての使用のための、プロテアーゼ活性化Ｔ細胞分子、又は本発明の薬学的組成物を提供する。一態様では、それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための、本発明に従うプロテアーゼ活性化Ｔ細胞分子、又は薬学的組成物が提供される。具体的な実施態様では、疾患は、がんである。
【００６５】
また、それを必要とする個体における疾患の治療のための医薬を製造するための、本発明のプロテアーゼ活性化Ｔ細胞分子の使用のほか、個体における疾患を治療する方法であって、前記個体へと、薬学的に許容される形態の、本発明に従うプロテアーゼ活性化Ｔ細胞分子を含む、治療的有効量の組成物を投与することを含む方法も提供される。具体的な実施態様では、疾患は、がんである。上記の実施態様のうちのいずれかでは、個体は、好ましくは、哺乳類、特に、ヒトである。
【００６６】
本発明はまた、標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法であって、Ｔ細胞、特に、細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で、標的細胞を、本発明のプロテアーゼ活性化Ｔ細胞分子と接触させることを含む方法も提供する。
【００６７】
別の態様では、本発明はまた、本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子と、薬学的に許容される担体とを含む組成物も提供する。
【００６８】
別の態様では、本発明はまた、本明細書で記載されるイデオタイプ特異的ポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む組成物も提供する。
【００６９】
別の態様では、本発明はまた、本明細書で記載される、医薬としての使用のための、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、又はイデオタイプ特異的ポリペプチド、又は本明細書で記載される組成物も提供する。一実施態様では、医薬は、がんを治療するか、若しくはその進行を遅延させ、免疫関連疾患を治療するか、若しくはその進行を遅延させ、かつ／又は個体における免疫応答若しくは免疫機能を増強若しくは刺激するためのものである。
【００７０】
別の態様では、本発明はまた、本明細書で記載される、それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、又はイデオタイプ特異的ポリペプチドも提供する。一実施態様では、疾患は、増殖性疾患、特に、がんである。
【００７１】
別の態様では、本発明はまた、個体における疾患を治療する方法であって、前記個体へと、本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、又は組成物を含む、治療的有効量の組成物を投与することを含む方法も提供する。
【００７２】
別の態様では、本発明はまた、標的細胞の溶解を誘導するための方法であって、Ｔ細胞の存在下で、標的細胞を、本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、又は組成物と接触させることを含む方法も提供する。一実施態様では、標的細胞の溶解を誘導するための方法は、インビトロ法である。一実施態様では、標的細胞は、がん細胞である。一実施態様では、標的細胞は、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を活性化させることが可能なプロテアーゼを発現させる。
【００７３】
別の態様では、本発明はまた、抗ＣＤ３抗原結合分子のイデオタイプに特異的な、抗イデオタイプＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、抗ＣＤ３抗原結合分子に特異的に結合すると、抗ＣＤ３抗原結合分子の、ＣＤ３への結合をブロックする、抗イデオタイプＣＤ３抗体又はその断片も提供する。
【００７４】
一実施態様では、抗イデオタイプＣＤ３抗体又はその抗原結合断片は、プロテアーゼ認識部位を含むペプチドリンカーを介して、抗ＣＤ３抗原結合分子と可逆的に会合する。一実施態様では、ＣＤ３は、マウスＣＤ３、サルＣＤ３、又はヒトＣＤ３である。
【００７５】
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞活性化二重特異性分子の、インビボにおける毒性を軽減する方法であって、本明細書で記載されるイデオタイプ特異的ポリペプチドを、プロテアーゼ切断型リンカーにより、Ｔ細胞活性化二重特異性分子と結合させて、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を形成することを含み、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の、インビボにおける毒性が、Ｔ細胞活性化二重特異性分子の毒性と比較して軽減されている方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１Ａ】マスキング部分を伴う、異なるＣＤ３結合剤についての概略を描示する図である。７８５９：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４−ＭＫ０６２マトリプターゼ部位−ＣＤ３−Ｆｃを示す図である。
【図１Ｂ】マスキング部分を伴う、異なるＣＤ３結合剤についての概略を描示する図である。７８６０：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＫ０６２マトリプターゼ部位−ＣＤ３−Ｆｃを示す図である。
【図１Ｃ】マスキング部分を伴う、異なるＣＤ３結合剤についての概略を描示する図である。７８５７：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４−非切断型リンカー−ＣＤ３−Ｆｃを示す図である。
【図１Ｄ】マスキング部分を伴う、異なるＣＤ３結合剤についての概略を描示する図である。７８５８：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型リンカー−ＣＤ３−Ｆｃを示す図である。
【図１Ｅ】マスキング部分を伴う、異なるＣＤ３結合剤についての概略を描示する図である。７８６１：一価のＣＤ３Ｆｃを示す図である。
【図２】抗イデオタイプマスキング部分の、ＣＤ３結合剤（ＣＨ２５２７）に対する親和性をまとめる表である。
【図３Ａ−３Ｂ】図１Ａ及び１Ｂで描示した分子についての、キャピラリー電気泳動−ＳＤＳ解析を示す図である。非還元条件下（図３Ａ）及び還元条件下（図３Ｂ）における、図１Ａで描示した分子についての、キャピラリー電気泳動−ＳＤＳ解析を示す図である。非処理分子（Ｉ）と、処理分子（ＩＩＩ）との比較は、３７℃で４８時間にわたる、ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４による処理の後における、抗ＩＤ  ｓｃＦｖの完全な切断を示す。１例の試料（ＩＩ）は、非処理であったが、３７℃で４８時間にわたりインキュベートされた。
【図３Ｃ−３Ｄ】図１Ａ及び１Ｂで描示した分子についての、キャピラリー電気泳動−ＳＤＳ解析を示す図である。非還元条件下（図３Ｃ）及び還元条件下（図３Ｄ）における、図１Ｂで描示した分子についての、キャピラリー電気泳動−ＳＤＳ解析を示す図である。非処理分子（Ｉ）と、処理分子（ＩＩＩ）との比較は、３７℃で４８時間にわたる、ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４による処理の後における、抗ＩＤ  ｓｃＦｖの完全な切断を示す。１例の試料（ＩＩ）は、非処理であったが、３７℃で４８時間にわたりインキュベートされた。
【図４Ａ】抗イデオタイプによる、ＣＤ３への結合のマスキングの効果を示す図である。抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４のマスキング効果を示す、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターアッセイの結果を描示する図（図４Ａ）である。抗ヒトＦｃ抗体（アッセイプレート上にコーティングした）を介して、一価のＣＤ３  ＩｇＧを架橋してから、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ（ＮＦＡＴプロモーターを伴う、急性リンパ性白血病のレポーター細胞株であって、ヒトＣＤ３εを発現させるレポーター細胞株）を添加した。Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＮＦＡＴプロモーターを伴う、ヒト急性リンパ性白血病のレポーター細胞株であって、ヒトＣＤ３εを発現させるレポーター細胞株である。ＣＤ３結合剤が、ＣＤ３εに結合し、ルシフェラーゼを発現させる場合、これを、Ｏｎｅ−Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加の後の発光により測定することができる。
【図４Ｂ】抗イデオタイプによる、ＣＤ３への結合のマスキングの効果を示す図である。抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３のマスキング効果を示す、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーターアッセイの結果を描示する図（図４Ｂ）である。抗ヒトＦｃ抗体（アッセイプレート上にコーティングした）を介して、一価のＣＤ３  ＩｇＧを架橋してから、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ（ＮＦＡＴプロモーターを伴う、急性リンパ性白血病のレポーター細胞株であって、ヒトＣＤ３εを発現させるレポーター細胞株）を添加した。Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＮＦＡＴプロモーターを伴う、ヒト急性リンパ性白血病のレポーター細胞株であって、ヒトＣＤ３εを発現させるレポーター細胞株である。ＣＤ３結合剤が、ＣＤ３εに結合し、ルシフェラーゼを発現させる場合、これを、Ｏｎｅ−Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加の後の発光により測定することができる。
【図４Ｃ】抗イデオタイプによる、ＣＤ３への結合のマスキングの効果を示す図である。マスキング一価ＣＤ３結合剤及び非マスキング一価ＣＤ３結合剤の、ＣＤ３εへの結合についてのＥＣ５０値の比較を示す図である。
【図５Ａ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。７３４４：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４−ＭＫ０６２マトリプターゼ部位−ＣＤ３−１６Ｄ５−Ｆｃを示す図である。
【図５Ｂ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。７６７６：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４−非切断型リンカー−ＣＤ３−１６Ｄ５−Ｆｃを示す図である。
【図５Ｃ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。７４９６：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＫ０６２マトリプターゼ部位−ＣＤ３−１６Ｄ５−Ｆｃを示す図である。
【図５Ｄ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。７６１１：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型リンカー−ＣＤ３−１６Ｄ５−Ｆｃを示す図である。
【図５Ｅ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。６２９８：ＧＡ９１６−Ｄ−１６Ｄ５−０２  ｓｆ  Ｗ（１）：共通軽鎖を伴う、ＦｏｌＲ１  １６Ｄ５古典的２＋１  ＴＣＢを示す図である。
【図５Ｆ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。６１００：ＧＡ９１６−Ｄ−１６Ｄ５−０２  ｓｆ  Ｗ（３ａ）：共通軽鎖を伴う、ＦｏｌＲ１  １６Ｄ５逆２＋１  ＴＣＢを示す図である。
【図５Ｇ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。６１８２：ＤＰ４７ＧＳ  ＴＣＢ  ｓｆ  ＣＨＯ  Ｗ（９ａ）：ＤＰ４７逆２＋１  ＴＣＢを示す図である。
【図５Ｈ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。７４９４：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  Ｆａｂ  ４．１５．６４−ＭＫ０６２マトリプターゼ部位−ＣＤ３−１６Ｄ５−Ｆｃを示す図である。
【図６】サイズ排除クロマトグラフィーにより、トランスフェクションのために使用される第１のプラスミド比（１（ホール）：１（ノブ）：３（ＣＬＣ））を示す図である。
【図７】サイズ排除クロマトグラフィーにより、トランスフェクションのために使用される第２のプラスミド比（１（ホール）：２（ノブ）：３（ＣＬＣ））を示す図である。
【図８】図５Ａで描示されるＴＣＢ分子（ＩＤ：７３４４）（最終精製調製物）についてのＣＥ−ＳＤＳ解析：レーンＡ＝非還元、レーンＢ＝還元、レーンＣ＝タンパク質標準物質を示す図である。
【図９】図５Ｂで描示されるＴＣＢ分子（ＩＤ：７６７６）（最終精製調製物）についてのＣＥ−ＳＤＳ解析：レーンＡ＝非還元、レーンＢ＝還元、レーンＣ＝タンパク質標準物質を示す図である。
【図１０】図５Ｃで描示されるＴＣＢ分子（ＩＤ：７４９６）（最終精製調製物）についてのＣＥ−ＳＤＳ解析：レーンＡ＝非還元、レーンＢ＝還元、レーンＣ＝タンパク質標準物質を示す図である。
【図１１】図５Ｄで描示されるＴＣＢ分子（ＩＤ：７６１１）（最終精製調製物）についてのＣＥ−ＳＤＳ解析：レーンＡ＝非還元、レーンＢ＝還元、レーンＣ＝タンパク質標準物質を示す図である。
【図１２Ａ】図５Ａ及び５Ｃで描示される分子についてのキャピラリー電気泳動−ＳＤＳ解析を示す図である。非還元条件下における、図５Ａで描示した分子（ＩＤ：７３４４）である、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４−ＭＫ０６２−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃについての、キャピラリー電気泳動を示す図（図１２Ａ）である。非処理分子（Ｉ）と、処理分子（ＩＩＩ）との比較は、３７℃で４８時間にわたる、ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４による処理の後における、抗ＩＤ  ｓｃＦｖの完全な切断を示す。１例の試料（ＩＩ）は、非処理であったが、３７℃で４８時間にわたりインキュベートされた。あらかじめ染色されたタンパク質マーカー（ＩＶ）であるＭａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、適正な分子量を推定するために使用した。
【図１２Ｂ】図５Ａ及び５Ｃで描示される分子についてのキャピラリー電気泳動−ＳＤＳ解析を示す図である。還元条件下における、図５Ａで描示した分子（ＩＤ：７３４４）である、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４−ＭＫ０６２−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃについての、キャピラリー電気泳動を示す図（図１２Ｂ）である。非処理分子（Ｉ）と、処理分子（ＩＩＩ）との比較は、３７℃で４８時間にわたる、ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４による処理の後における、抗ＩＤ  ｓｃＦｖの完全な切断を示す。１例の試料（ＩＩ）は、非処理であったが、３７℃で４８時間にわたりインキュベートされた。あらかじめ染色されたタンパク質マーカー（ＩＶ）であるＭａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、適正な分子量を推定するために使用した。
【図１２Ｃ】図５Ａ及び５Ｃで描示される分子についてのキャピラリー電気泳動−ＳＤＳ解析を示す図である。非還元条件下における、図５Ｃで描示した分子（ＩＤ：７４９６）である、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＫ０６２−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃについての、キャピラリー電気泳動を示す図（図１２Ｃ）である。非処理分子（Ｉ）と、処理分子（ＩＩＩ）との比較は、３７℃で４８時間にわたる、ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４による処理の後における、抗ＩＤ  ｓｃＦｖの完全な切断を示す。１例の試料（ＩＩ）は、非処理であったが、インキュベートされた。あらかじめ染色されたタンパク質マーカー（ＩＶ）であるＭａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、適正な分子量を推定するために使用した。
【図１２Ｄ】図５Ａ及び５Ｃで描示される分子についてのキャピラリー電気泳動−ＳＤＳ解析を示す図である。還元条件下における、図５Ｃで描示した分子（ＩＤ：７４９６）である、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＫ０６２−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃについての、キャピラリー電気泳動を示す図（図１２Ｄ）である。非処理分子（Ｉ）と、処理分子（ＩＩＩ）との比較は、３７℃で４８時間にわたる、ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４による処理の後における、抗ＩＤ  ｓｃＦｖの完全な切断を示す。１例の試料（ＩＩ）は、非処理であったが、インキュベートされた。あらかじめ染色されたタンパク質マーカー（ＩＶ）であるＭａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、適正な分子量を推定するために使用した。
【図１３】Ｑｉｆｉｋｉｔ（Ｄａｋｏ）によりなされる、ＦｏｌＲ１の発現レベルの定量化を示す図である。ＦｏｌＲ１に対する抗体：ＬＳ−Ｃ１２５６２０−１００（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ）；２０μｇ／ｍｌで使用される；マウスＩｇＧ１アイソタイプ：型番５５４１２１（ＢＤ）。
【図１４Ａ】プロテアーゼ活性化型ＣＢによるＴ細胞の活性化を示す図である。４８時間にわたるインキュベーションの後において、濃度を１０ｎＭとするプロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子（異なる抗イデオタイプＣＤ３マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、精製ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４で前処理された分子である）及びヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝７：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）により誘導される、Ｓｋｏｖ３細胞の殺滅を示す図である。ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）による前処理は、３７℃で、２４時間にわたり行った。
【図１４Ｂ】プロテアーゼ活性化ＴＣＢによるＴ細胞の活性化を示す図である。ヒトＰＢＭＣによるＴ細胞の活性化であって、インキュベーション（Ｅ：Ｔ＝７：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）の４８時間後のＳｋｏｖ３細胞上における、１０ｎＭのプロテアーゼ活性化ＴＣＢ（異なる抗イデオタイプＣＤ３マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）の結合により誘導される活性化を示す図である。Ｔ細胞の活性化マーカーである、ＣＤ２５（左パネル）及びＣＤ６９（右パネル）。表示の通りの、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【図１５Ａ】プロテアーゼ活性化ＴＣＢによるＴ細胞の活性化を示す図である。４８時間にわたるインキュベーションの後において、濃度を１００ｎＭとするプロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子（異なる抗イデオタイプＣＤ３マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）及びヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝７：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）により誘導される、Ｍｋｎ−４５細胞の殺滅を示す図である。ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）による前処理は、３７℃で、２４時間にわたり行った。
【図１５Ｂ】プロテアーゼ活性化ＴＣＢによるＴ細胞の活性化を示す図である。ヒトＰＢＭＣによるＴ細胞の活性化であって、インキュベーション（Ｅ：Ｔ＝７：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）の４８時間後のＭｋｎ−４５細胞上における、１００ｎＭのプロテアーゼ活性化ＴＣＢ（異なる抗イデオタイプＣＤ３マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）の結合により誘導される活性化を示す図である。Ｔ細胞の活性化マーカーである、ＣＤ２５（左パネル）及びＣＤ６９（右パネル）。表示の通りの、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【図１６】４８時間にわたるインキュベーションの後において、濃度を１０ｎＭとするプロテアーゼ活性化型ＴＣＢ分子（異なる抗イデオタイプＣＤ３マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）及びヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）により誘導される、ＨＴ２９細胞の殺滅を示す図である。ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）による前処理は、３７℃で、２４時間にわたり行った。バーは、左から右へと、７３４４：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４−ＭＫ０６２−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃ；７３４４：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４−ＭＫ０６２−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃ＿処理あり；７６７６：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４−非切断型−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃ；７４９６：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＫ０６２−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃ；７４９６：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＫ０６２−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃ＿処理あり；７６１１：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型リンカー−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃ；６２９８：ＧＡ９１６−Ｄ−１６Ｄ５−０２  ｓｆ  Ｗ（１）；６１８２：ＤＰ４７ＧＳ  ＴＣＢ  ｓｆ  ＣＨＯ  Ｗ（９ａ）である。
【図１７】４８時間にわたるインキュベーションの後において、濃度を１０ｎＭとするプロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子（異なる抗イデオタイプＣＤ３マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）及びヒトＰＢＭＣ（図１４Ａで使用したＰＢＭＣとは異なるドナーに由来する）（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）により誘導される、Ｓｋｏｖ３細胞の殺滅を示す図である。ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）による前処理は、３７℃で、２４時間にわたり行った。バーは、左から右へと、７３４４：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４−ＭＫ０６２−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃ；７３４４：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４−ＭＫ０６２−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃ＿処理あり；７６７６：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４−非切断型−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃ；７４９６：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＫ０６２−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃ；７４９６：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＫ０６２−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃ＿処理あり；７６１１：抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型リンカー−ＣＤ３−１６Ｄ６−Ｆｃ；６２９８：ＧＡ９１６−Ｄ−１６Ｄ５−０２  ｓｆ  Ｗ（１）；６１８２：ＤＰ４７ＧＳ  ＴＣＢ  ｓｆ  ＣＨＯ  Ｗ（９ａ）である。
【図１８Ａ】プロテアーゼ活性化ＴＣＢによるＴ細胞の活性化を示す図である。４８時間にわたるインキュベーションの後において、プロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子（抗イデオタイプＣＤ３  ４．１５．６４マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）及びヒトＰＢＭＣ（バフィーコートから単離された）（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）により誘導される、ＨｅＬａ細胞の、用量依存的殺滅を示す図である。ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）による前処理は、３７℃で、２４時間にわたり行った。
【図１８Ｂ】プロテアーゼ活性化ＴＣＢによるＴ細胞の活性化を示す図である。ヒトＰＢＭＣによるＴ細胞の活性化であって、インキュベーション（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）の４８時間後のＨｅＬａ細胞上における、プロテアーゼ活性化ＴＣＢ（抗イデオタイプＣＤ３  ４．１５．６４マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）の結合により誘導される、用量依存的活性化を示す図である。Ｔ細胞の活性化マーカーである、ＣＤ２５（左パネル）及びＣＤ６９（右パネル）。表示の通りの、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【図１９Ａ】プロテアーゼ活性化型ＴＣＢによるＴ細胞の活性化を示す図である。４８時間にわたるインキュベーションの後において、プロテアーゼ活性化型ＴＣＢ分子（抗イデオタイプＣＤ３  ４．３２．６３マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）及びヒトＰＢＭＣ（バフィーコートから単離された）（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）により誘導される、ＨｅＬａ細胞の、用量依存的殺滅を示す図である。ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）による前処理は、３７℃で、２４時間にわたり行った。
【図１９Ｂ】プロテアーゼ活性化型ＴＣＢによるＴ細胞の活性化を示す図である。ヒトＰＢＭＣによるＴ細胞の活性化であって、インキュベーション（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）の４８時間後のＨｅＬａ細胞上における、プロテアーゼ活性化型ＴＣＢ（抗イデオタイプＣＤ３  ４．３２．６３マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）の結合により誘導される、用量依存的活性化を示す図である。Ｔ細胞の活性化マーカーである、ＣＤ２５（左パネル）及びＣＤ６９（右パネル）。表示の通りの、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【図２０Ａ】プロテアーゼ活性化型ＴＣＢによるＴ細胞の活性化を示す図である。４８時間にわたるインキュベーションの後において、プロテアーゼ活性化型ＴＣＢ分子（抗イデオタイプＣＤ３  ４．１５．６４マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）及びヒトＰＢＭＣ（バフィーコートから単離された）（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）により誘導される、Ｓｋｏｖ３細胞の、用量依存的殺滅を示す図である。ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）による前処理は、３７℃で、２４時間にわたり行った。
【図２０Ｂ】プロテアーゼ活性化型ＴＣＢによるＴ細胞の活性化を示す図である。ヒトＰＢＭＣによるＴ細胞の活性化であって、インキュベーション（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）の４８時間後のＳｋｏｖ３細胞上における、プロテアーゼ活性化型ＴＣＢ（抗イデオタイプＣＤ３  ４．１５．６４マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）の結合により誘導される、用量依存的活性化を示す図である。Ｔ細胞の活性化マーカーである、ＣＤ２５（左パネル）及びＣＤ６９（右パネル）。表示の通りの、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【図２１Ａ】プロテアーゼ活性化型ＴＣＢによるＴ細胞の活性化を示す図である。４８時間にわたるインキュベーションの後において、プロテアーゼ活性化型ＴＣＢ分子（抗イデオタイプＣＤ３  ４．３２．６３マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）及びヒトＰＢＭＣ（バフィーコートから単離された）（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）により誘導される、Ｓｋｏｖ３細胞の、用量依存的殺滅を示す図である。ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）による前処理は、３７℃で、２４時間にわたり行った。
【図２１Ｂ】プロテアーゼ活性化型ＴＣＢによるＴ細胞の活性化を示す図である。ヒトＰＢＭＣによるＴ細胞の活性化であって、インキュベーション（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）の４８時間後のＳｋｏｖ３細胞上における、プロテアーゼ活性化型ＴＣＢ（抗イデオタイプＣＤ３  ４．３２．６３マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）の結合により誘導される、用量依存的活性化を示す図である。Ｔ細胞の活性化マーカーである、ＣＤ２５（左パネル）及びＣＤ６９（右パネル）。表示の通りの、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【図２２Ａ】プロテアーゼ活性化ＴＣＢによるＴ細胞の活性化を示す図である。インキュベーション（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）の４８時間後のＨＴ２９細胞上における、プロテアーゼ活性化ＴＣＢ（抗イデオタイプＣＤ３  ４．１５．６４マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）の結合により誘導した、ヒトＰＢＭＣ（上記で記載した実験におけるドナーとは異なるドナー）による、Ｔ細胞の用量依存的活性化を示す。Ｔ細胞の活性化マーカーである、ＣＤ２５（左パネル）及びＣＤ６９（右パネル）。表示の通りの、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【図２２Ｂ】プロテアーゼ活性化ＴＣＢによるＴ細胞の活性化を示す図である。インキュベーション（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）の４８時間後のＨＴ２９細胞上における、プロテアーゼ活性化ＴＣＢ（抗イデオタイプＣＤ３  ４．３２．６３マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）の結合により誘導した、ヒトＰＢＭＣ（図１６におけるドナーとは異なるドナー）による、Ｔ細胞の用量依存的活性化を示す。Ｔ細胞の活性化マーカーである、ＣＤ２５（左パネル）及びＣＤ６９（右パネル）。表示の通りの、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【図２３】ヒトＰＢＭＣ（上記で記載した実験におけるドナーとは異なるドナー）による、Ｔ細胞の用量依存的活性化を、インキュベーション（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）の４８時間後のＨＲＣＥｐｉＣ細胞上における、プロテアーゼ活性化ＴＣＢ（抗イデオタイプＣＤ３  ４．１５．６４マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）の結合により誘導したことを示す図である。Ｔ細胞の活性化マーカーである、ＣＤ２５（左パネル）及びＣＤ６９（右パネル）。表示の通りの、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及びＣＤ８＋  Ｔ細胞。
【図２４】４８時間にわたるインキュベーションの後において、濃度を５０ｎＭとするプロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子（異なる抗イデオタイプＣＤ３マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）及びヒトＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）により誘導される、Ｏｖｃａｒ３細胞の殺滅を示す図である。ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）による前処理は、１０分間にわたり３７℃で行った（完全には切断されていない）。
【図２５】４８時間にわたるインキュベーションの後において、１０ｎＭのプロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子（抗イデオタイプＣＤ３  ４．１５．６４マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）及びヒトＰＢＭＣ（バフィーコートから単離された）（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、３例の異なるヒトＰＢＭＣドナーである）により誘導される、Ｓｋｏｖ３細胞の殺滅を示す図である。ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）による前処理は、３７℃で、２４時間にわたり行った。
【図２６】４８時間にわたるインキュベーションの後において、１０ｎＭのプロテアーゼ活性化型ＴＣＢ分子（抗イデオタイプＣＤ３  ４．３２．６３マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）及びヒトＰＢＭＣ（バフィーコートから単離された）（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、３例の異なるヒトＰＢＭＣドナーである）により誘導される、Ｓｋｏｖ３細胞の殺滅を示す図である。ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）による前処理は、３７℃で、２４時間にわたり行った。
【図２７】４８時間にわたるインキュベーションの後において、１００ｐＭのプロテアーゼ活性化型ＴＣＢ分子（抗イデオタイプＣＤ３  ４．３２．６３マスク、切断型リンカー及び非切断型リンカーを伴うＴＣＢであり、処理分子である）及びヒトＰＢＭＣ（バフィーコートから単離された）（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、３例の異なるヒトＰＢＭＣドナーである）により誘導される、ＨｅＬａ細胞の殺滅を示す図である。ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）による前処理は、３７℃で、２４時間にわたり行った。
【図２８】抗ＩＤ  ＧＡ２０１  ｓｃＦｖ−マトリックスメタロプロテアーゼ部位−ＧＡ２０１  Ｆｃ（ＧＡ２０１−抗ＧＡ２０１−ｓｃＦｖ）についての概略を描示する図である。
【図２９】抗ＨＥＲ１抗体である、ＧＡ２０１についての概略を描示する図である。
【図３０Ａ−３０Ｂ】非還元条件下（図３０Ａ）及び還元条件下（図３０Ｂ）における、図２８で描示した分子についての、キャピラリー電気泳動−ＳＤＳ解析を示す図である。図２８で描示した分子は、プロテインＡクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーにより、均質となるまで精製し、キャピラリー電気泳動−ＳＤＳ解析にかけた。
【図３１】ＧＡ２０１−抗ＧＡ２０１−ｓｃＦｖ及びＧＡ２０１の、Ｈ３２２Ｍ細胞上で発現するＨＥＲ１への結合についてのＦＡＣＳ解析であって、抗イデオタイプＧＡ２０１  ｓｃＦｖのマスキング効果を確認するＦＡＣＳ解析を示す図である。ＧＡ２０１−抗ＧＡ２０１−ｓｃＦｖを、マトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰ−２と共に、一晩にわたりインキュベートし、Ｈ３２２Ｍ細胞への結合を、切断されていないＧＡ２０１−抗ＧＡ２０１−ｓｃＦｖ、ＧＡ２０１及びアイソタイプＩｇＧ１コントロール抗体と比較した。Ｈ３２２Ｍ細胞上のＨＥＲ１への結合は、Ｆ（ａｂ’）２−ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ二次抗体ＦＩＴＣコンジュゲートにより検出し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩを使用するＦＡＣＳにより解析した。解析のために、中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を使用した。
【図３２】ＭＭＰ２切断の前及び後における、マスキングＧＡ２０１及び非マスキングＧＡ２０１の、ＨＥＲ１への結合についての表面プラズモン共鳴解析を示す図である。
【図３３Ａ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８３６４：Ｎ末端において、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＭＰ９−ＭＫ０６２マトリプターゼ部位を、ＣＤ３へと融合させた、古典的フォーマットの１６Ｄ５  ＴＣＢ。
【図３３Ｂ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８３６３：Ｎ末端において、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−カテプシンＳ／Ｂ部位を、ＣＤ３へと融合させた、古典的フォーマットの１６Ｄ５  ＴＣＢ。
【図３３Ｃ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８３６５：Ｎ末端において、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＫ０６２マトリプターゼ部位を、共通軽鎖へと融合させた、逆フォーマットの１６Ｄ５  ＴＣＢ。
【図３３Ｄ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８３６６：Ｎ末端において、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型リンカーを、共通軽鎖へと融合させた、逆フォーマットの１６Ｄ５  ＴＣＢ。
【図３３Ｅ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８６７２：Ｎ末端において、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＭＰ９−ＭＫ０６２マトリプターゼ部位を、ＣＤ３×Ｆａｂへと融合させた、古典的フォーマットの抗メソテリンＲＧ７７８７荷電残基ＴＣＢ。
【図３３Ｆ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８６７３：Ｎ末端において、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型リンカーを、ＣＤ３×Ｆａｂへと融合させた、古典的フォーマットの抗メソテリンＲＧ７７８７荷電残基ＴＣＢ。
【図３３Ｇ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８６７４：Ｎ末端において、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＭＰ９−ＭＫ０６２マトリプターゼ部位を、ＣＤ３×Ｆａｂへと融合させた、逆フォーマットの抗メソテリンＲＧ７７８７荷電残基ＴＣＢ。
【図３３Ｈ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８６７５：Ｎ末端において、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型リンカーを、ＣＤ３×Ｆａｂへと融合させた、逆フォーマットの抗メソテリンＲＧ７７８７荷電残基ＴＣＢ。
【図３３Ｉ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８５０５：逆フォーマットの、ＣＤ３×Ｆａｂ抗メソテリンＲＧ７７８７荷電残基ＴＣＢ。
【図３３Ｊ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８６７６：古典的フォーマットの、ＣＤ３×Ｆａｂ抗メソテリンＲＧ７７８７荷電残基ＴＣＢ。
【図３４】ＴＣＢ  ８３６５及びＴＣＢ  ８３６６（最終精製調製物）についてのＣＥ−ＳＤＳ解析：レーンＡ＝タンパク質標準物質、レーンＢ＝４℃で保存されたタンパク質、レーンＣ＝ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により前処理されたタンパク質、レーンＤ＝３７℃で、７２時間にわたりインキュベートされたタンパク質、及びレーンＥ＝分子３を描示する図である。
【図３５Ａ】図３３Ａ（ＩＤ：８３６４）で描示したＴＣＢについてのＣＥ−ＳＤＳ解析を描示する図である。ＴＣＢ  ８３６４（最終精製調製物）についてのＣＥ−ＳＤＳ解析：レーンＡ＝タンパク質標準物質、レーンＢ＝４℃で保存されたタンパク質、レーンＣ＝ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により前処理されたタンパク質、レーンＤ＝３７℃で、７２時間にわたりインキュベートされたタンパク質、及びレーンＥ＝非切断型リンカーコンストラクト。
【図３５Ｂ】図３３Ｂ（ＩＤ：８３６３）で描示したＴＣＢについてのＣＥ−ＳＤＳ解析を描示する図である。ＴＣＢ  ８３６３（最終精製調製物）についてのＣＥ−ＳＤＳ解析：レーンＡ＝タンパク質標準物質、レーンＢ＝４℃で保存されたタンパク質、レーンＣ＝ｒｈカテプシンＢ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により前処理されたタンパク質、レーンＤ＝ｒｈカテプシンＳ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により前処理されたタンパク質、レーンＥ＝３７℃で、７２時間にわたりインキュベートされたタンパク質、及びレーンＦ＝非切断型リンカーコンストラクト。
【図３６Ａ】ＨｅＬａ細胞及びＳｋｏｖ−３細胞を標的細胞として使用する、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ活性化アッセイを描示する図である。各点は、３重の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーにより表示する。Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＮＦＡＴプロモーターを伴う、ヒト急性リンパ性白血病のレポーター細胞株であって、ヒトＣＤ３εを発現させるレポーター細胞株である。ＴＣＢのＣＤ３結合剤が、腫瘍標的に結合し、ＣＤ３（架橋が必要である）が、ＣＤ３εに結合する場合、ルシフェラーゼの発現を、Ｏｎｅ−Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加の後の発光により測定することができる。  ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（黒の下向き三角）と、Ｎ末端において抗ＩＤ  ＣＤ３  ４．３２．６３  ｓｃＦｖ及びＭＭＰ９−マトリプターゼＭＫ０６２部位を融合させた、前処理プロテアーゼ活性化ＴＣＢ（８３６４；グレーの塗りつぶし四角）とを比較した。分子を、ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、３７℃で、約２０時間にわたり処理した。マスキングＴＣＢ（ＧＳ非切断型リンカーを含有する；グレーの上向き三角）、及び非標的化ＴＣＢコントロール（白抜きの下向き三角）も同様に示す。点線は、ＴＣＢを伴わない標的細胞及びエフェクター細胞による発光を示す。  ＨｅＬａ細胞を標的細胞として使用する、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ活性化アッセイを示す図である。
【図３６Ｂ】ＨｅＬａ細胞及びＳｋｏｖ−３細胞を標的細胞として使用する、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ活性化アッセイを描示する図である。各点は、３重の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーにより表示する。Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＮＦＡＴプロモーターを伴う、ヒト急性リンパ性白血病のレポーター細胞株であって、ヒトＣＤ３εを発現させるレポーター細胞株である。ＴＣＢのＣＤ３結合剤が、腫瘍標的に結合し、ＣＤ３（架橋が必要である）が、ＣＤ３εに結合する場合、ルシフェラーゼの発現を、Ｏｎｅ−Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加の後の発光により測定することができる。  ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（黒の下向き三角）と、Ｎ末端において抗ＩＤ  ＣＤ３  ４．３２．６３  ｓｃＦｖ及びＭＭＰ９−マトリプターゼＭＫ０６２部位を融合させた、前処理プロテアーゼ活性化ＴＣＢ（８３６４；グレーの塗りつぶし四角）とを比較した。分子を、ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、３７℃で、約２０時間にわたり処理した。マスキングＴＣＢ（ＧＳ非切断型リンカーを含有する；グレーの上向き三角）、及び非標的化ＴＣＢコントロール（白抜きの下向き三角）も同様に示す。点線は、ＴＣＢを伴わない標的細胞及びエフェクター細胞による発光を示す。  Ｓｋｏｖ−３細胞を標的細胞として使用する、Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ活性化アッセイを示す図である。
【図３７Ａ】ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ及びヒトＰＢＭＣ（エフェクター：標的＝１０：１）に媒介される、腫瘍細胞への細胞傷害性を描示する図である。各点は、３重の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーにより表示する。ＨｅＬａ標的細胞への細胞傷害性。ＭＫ０６２マトリプターゼリンカーにより連結された、抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖをどちらも含有する、２つの異なるフォーマットのプロテアーゼ活性化ＴＣＢの比較。
【図３７Ｂ】ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ及びヒトＰＢＭＣ（エフェクター：標的＝１０：１）に媒介される、腫瘍細胞への細胞傷害性を描示する図である。各点は、３重の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーにより表示する。Ｓｋｏｖ−３標的細胞への細胞傷害性。ＭＫ０６２マトリプターゼリンカーにより連結された、抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖをどちらも含有する、２つの異なるフォーマットのプロテアーゼ活性化ＴＣＢの比較。
【図３７Ｃ】ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ及びヒトＰＢＭＣ（エフェクター：標的＝１０：１）に媒介される、腫瘍細胞への細胞傷害性を描示する図である。各点は、３重の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーにより表示する。ＨｅＬａ標的細胞への細胞傷害性。抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖと、プロテアーゼ部位が異なるＧＳリンカーとを含有する、古典的プロテアーゼ活性化ＴＣＢの比較。ＭＭＰ９−マトリプターゼＭＫ０６２リンカーを含有するプロテアーゼ活性化ＴＣＢ（８３６４；グレーの四角）、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（ライトグレーの下向き三角）、マトリプターゼＭＫ０６２部位のみ（ライトグレーの菱形）／カテプシン部位（グレーの丸）、又は非切断型リンカー（黒の下向き三角）を含有するプロテアーゼ活性化ＴＣＢ。
【図３７Ｄ】ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ及びヒトＰＢＭＣ（エフェクター：標的＝１０：１）に媒介される、腫瘍細胞への細胞傷害性を描示する図である。各点は、３重の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーにより表示する。Ｓｋｏｖ−３標的細胞への細胞傷害性。抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖと、プロテアーゼ部位が異なるＧＳリンカーとを含有する、古典的プロテアーゼ活性化ＴＣＢの比較。ＭＭＰ９−マトリプターゼＭＫ０６２リンカーを含有するプロテアーゼ活性化ＴＣＢ（８３６４；グレーの四角）、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（ライトグレーの下向き三角）、マトリプターゼＭＫ０６２部位のみ（ライトグレーの菱形）／カテプシン部位（グレーの丸）、又は非切断型リンカー（黒の下向き三角）を含有するプロテアーゼ活性化ＴＣＢ。
【図３８Ａ】２００ｎＭの異なるＴＣＢ、及び３例の異なるヒトＰＢＭＣドナーとの、初代ヒト腎皮質上皮細胞のコインキュベーションの後における、ＣＤ８陽性細胞のＣＤ６９の定量化を描示する図である。Ｔ細胞を、４８時間にわたるインキュベーションの後に染色した（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）。ＣＤ８＋Ｔ細胞について、Ｔ細胞の活性化マーカーであるＣＤ６９の中央値蛍光強度を示す。各点は、３例の異なるヒトＰＢＭＣドナーについての、３重の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーに表示する。統計学的解析には、対応のないｔ検定を使用した。
【図３８Ｂ】２００ｎＭの異なるＴＣＢ、及び３例の異なるヒトＰＢＭＣドナーとの、ヒト気管支上皮細胞のコインキュベーションの後における、ＣＤ８陽性細胞のＣＤ６９の定量化を描示する図である。Ｔ細胞を、４８時間にわたるインキュベーションの後に染色した（Ｅ：Ｔ＝１０：１；エフェクターは、ヒトＰＢＭＣである）。ＣＤ８＋Ｔ細胞について、Ｔ細胞の活性化マーカーであるＣＤ６９の中央値蛍光強度を示す。各点は、３例の異なるヒトＰＢＭＣドナーについての、３重の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーに表示する。統計学的解析には、対応のないｔ検定を使用した。
【図３９Ａ】ＭＳＬＮ  ＴＣＢ及びヒトＰＢＭＣ（エフェクター：標的＝１０：１）に媒介される、腫瘍細胞への細胞傷害性を描示する図である。最大の標的細胞の溶解（＝１００％）は、ＬＤＨ読み出しの２０時間前における、標的細胞の、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴うインキュベーションにより達成した。最小の溶解（＝０％）とは、エフェクター細胞を伴うが、ＴＣＢを伴わずにコインキュベートされた標的細胞を指す。各点は、３重の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーにより表示する。ＮＣＩ  Ｈ５９６標的細胞への細胞傷害性。ＭＭＰ９−ＭＫ０６２マトリプターゼリンカーにより連結された、抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖを含有する、プロテアーゼ活性化ＭＳＬＮ  ＴＣＢ。プロテアーゼ活性化ＴＣＢ（８６７２；ライトグレーの丸）、ＭＳＬＮ  ＴＣＢ（ダークグレーの下向き三角）、及び非切断型リンカーを含有するプロテアーゼ活性化ＴＣＢ（８６７３；グレーの上向き三角）を比較する。
【図３９Ｂ】ＭＳＬＮ  ＴＣＢ及びヒトＰＢＭＣ（エフェクター：標的＝１０：１）に媒介される、腫瘍細胞への細胞傷害性を描示する図である。最大の標的細胞の溶解（＝１００％）は、ＬＤＨ読み出しの２０時間前における、標的細胞の、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴うインキュベーションにより達成した。最小の溶解（＝０％）とは、エフェクター細胞を伴うが、ＴＣＢを伴わずにコインキュベートされた標的細胞を指す。各点は、３重の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーにより表示する。ＡｓＰＣ−１標的細胞への細胞傷害性。ＭＭＰ９−ＭＫ０６２マトリプターゼリンカーにより連結された、抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖを含有する、プロテアーゼ活性化ＭＳＬＮ  ＴＣＢ。プロテアーゼ活性化ＴＣＢ（８６７２；ライトグレーの丸）、ＭＳＬＮ  ＴＣＢ（ダークグレーの下向き三角）、及び非切断型リンカーを含有するプロテアーゼ活性化ＴＣＢ（８６７３；グレーの上向き三角）を比較する。
【図４０】原発腫瘍試料及びプロテアーゼ活性化ＦｏｌＲ１  ＴＣＢを伴う、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ活性化アッセイを描示する図である。Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター細胞は、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（６２９８）及びＭＭＰ９−マトリプターゼ切断部位（８３６４）を含有するプロテアーゼ活性化ＦｏｌＲ１  ＴＣＢとのコインキュベーションの後で活性化する。プロテアーゼ活性化ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（８３６３、８４０８）及びコントロールのＴＣＢ（８４０９、７２３５）は、ルシフェラーゼの発現を誘導しない。点線は、腫瘍と共にコインキュベートされたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ細胞についての、ベースラインの発光を指し示す。
【図４１Ａ】ヒト血清中のインキュベーション後における、プロテアーゼ活性化ＴＣＢについてのキャピラリー電気泳動を示す図である。分子を、加湿インキュベーター（５％のＣＯ２）内、３７℃のヒトＩｇＧ枯渇血清中、０又は１４日間にわたりインキュベートした。全ての分子を、アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡ）により精製し、次いで、キャピラリー電気泳動により解析した。血清、０日目及び１４日目における血清中のＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（６２９８）についてのＣＥ−ＳＤＳ解析。
【図４１Ｂ】ヒト血清中のインキュベーション後における、プロテアーゼ活性化ＴＣＢについてのキャピラリー電気泳動を示す図である。分子を、加湿インキュベーター（５％のＣＯ２）内、３７℃のヒトＩｇＧ枯渇血清中、０又は１４日間にわたりインキュベートした。全ての分子を、アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡ）により精製し、次いで、キャピラリー電気泳動により解析した。血清、０日目及び１４日目における血清中のＭＭＰ９−マトリプターゼリンカーを伴うプロテアーゼ活性化ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（８３６４）についてのＣＥ−ＳＤＳ解析。
【図４１Ｃ】ヒト血清中のインキュベーション後における、プロテアーゼ活性化ＴＣＢについてのキャピラリー電気泳動を示す図である。分子を、加湿インキュベーター（５％のＣＯ２）内、３７℃のヒトＩｇＧ枯渇血清中、０又は１４日間にわたりインキュベートした。全ての分子を、アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡ）により精製し、次いで、キャピラリー電気泳動により解析した。血清、０日目及び１４日目における血清中のマトリプターゼリンカーを伴うプロテアーゼ活性化ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（８４０８）、並びに血清中であらかじめ切断された分子についてのＣＥ−ＳＤＳ解析。
【図４２Ａ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８９５５：Ｎ末端において、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＫ０６２−ＭＭＰ９リンカーを、ＶＨへと融合させた、古典的フォーマットのハーセプターグＴＣＢ。
【図４２Ｂ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８９５７：Ｎ末端において、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型リンカーを、ＶＨへと融合させた、古典的フォーマットのハーセプターグＴＣＢ。
【図４２Ｃ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８９５９：古典的フォーマットのハーセプターグＴＣＢ。
【図４２Ｄ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８９９７：Ｎ末端において、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＫ０６２−ＭＭＰ９リンカーを、ＶＨへと融合させた、古典的フォーマットのＦｏｌＲ１  ３６Ｆ２  ＴＣＢ。
【図４２Ｅ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８９９８：Ｎ末端において、抗ＩＤ  ＣＨ２５２７  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型リンカーを、ＶＨへと融合させた、古典的フォーマットのＦｏｌＲ１  ３６Ｆ２  ＴＣＢ。
【図４２Ｆ】マスキング部分を伴う、異なるＴ細胞二重特異性分子についての概略を描示する図である。８９９６：古典的フォーマットのＦｏｌＲ１  ３６Ｆ２  ＴＣＢ。
【図４３】ヒトＰＢＭＣ及び１００ｎＭ又は１０ｎＭのＴＣＢに媒介される、ヒト気管支上皮細胞への細胞傷害性を描示する図である。最大の標的細胞の溶解（＝１００％）は、ＬＤＨ読み出しの２０時間前における、標的細胞の、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴うインキュベーションにより達成した。最小の溶解（＝０％）とは、エフェクター細胞を伴うが、ＴＣＢを伴わずにコインキュベートされた標的細胞を指す。各点は、３重の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーにより表示する。
【図４４】１００ｎＭのＦｏｌＲ１  ＴＣＢ及びヒトＰＢＭＣに媒介される、ＦｏｌＲ１陰性標的細胞（Ｍｋｎ−４５）への細胞傷害性を描示する図である。最大の標的細胞の溶解（＝１００％）は、ＬＤＨ読み出しの２０時間前における、標的細胞の、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴うインキュベーションにより達成した。最小の溶解（＝０％）とは、エフェクター細胞を伴うが、ＴＣＢを伴わずにコインキュベートされた標的細胞を指す。各点は、３重の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーにより表示する。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
定義
以下で別途規定がない限り、本明細書において、用語は、当該技術分野で一般に使用される通りに使用する。
【００７８】
本明細書で使用される「抗原結合分子」という用語は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン及び誘導体、例えば、これらの断片である。
【００７９】
「二重特異性」という用語は、抗原結合分子が、少なくとも２つの異なる抗原決定基に特異的に結合することが可能であることを意味する。典型的に、二重特異性抗原結合分子は、それらの各々が、異なる抗原決定基に対して特異的である、２つの抗原結合部位を含む。ある特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、２つの抗原決定基、特に、２つの異なる細胞上で発現する、２つの抗原決定基に同時に結合することが可能である。
【００８０】
本明細書で使用される「〜価」という用語は、抗原結合分子内の、一定数の抗原結合部位の存在を表す。それ自体、「抗原への一価の結合」という用語は、抗原結合分子内の抗原に特異的な、１つの（かつ１つを超えない）抗原結合部位の存在を表す。
【００８１】
「抗原結合部位」とは、抗原との相互作用をもたらす、部位、すなわち、抗原結合分子の一又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来するアミノ酸残基を含む。天然の免疫グロブリン分子は、典型的に、２つの抗原結合部位を有し、Ｆａｂ分子は典型的に、単一の抗原結合部位を有する。
【００８２】
本明細書で使用される「抗原結合部分」という用語は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一実施態様では、抗原結合部分は、それを結合させた実体（例えば、第２の抗原結合部分）を、標的部位、例えば、抗原決定基を保有する、特異的種類の腫瘍細胞又は腫瘍間質へと方向付けることが可能である。別の実施態様では、抗原結合部分は、その標的抗原、例えば、Ｔ細胞受容体複合抗原を介して、シグナル伝達を活性化させることが可能である。抗原結合部分は、本明細書でさらに規定される通り、抗体及びその断片を含む。特定の抗原結合部分は、抗体の重鎖可変領域及び抗体の軽鎖可変領域を含む、抗体の抗原結合ドメインを含む。ある特定の実施態様では、抗原結合部分は、本明細書でさらに規定され、当該技術分野で公知の抗体定常領域を含みうる。有用な重鎖定常領域は、５つのアイソタイプ：α、δ、ε、γ、又はμのうちのいずれかを含む。有用な軽鎖定常領域は、２つのアイソタイプ：κ及びλのうちのいずれかを含む。
【００８３】
本明細書で使用される「抗原決定基」という用語は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、ポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続する連なり、又は非連続アミノ酸の異なる領域から構成されるコンフォメーショナルな立体構成）であって、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成する部位を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上、ウイルス感染細胞の表面上、他の罹患細胞の表面上、免疫細胞の表面上に、血清中及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に遊離して見出すことができる。本明細書で抗原と称するタンパク質（例えば、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＣＤ３、メソテリン）は、別途指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む、任意の脊椎動物供給源に由来する、タンパク質の任意の天然形態でありうる。特定の実施態様では、抗原は、ヒトタンパク質である。本明細書で特異的タンパク質に言及する場合、用語は、プロセシングされていない「完全長」タンパク質のほか、細胞内のプロセシングから生じる、タンパク質の任意の形態を包摂する。用語はまた、タンパク質の、天然に存在する変異体、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子変異体も包摂する。抗原として有用な例示的ヒトタンパク質は、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ１、及びＣＤ３、特に、ＣＤ３のエプシロンサブユニット（ヒト配列についての、ＵｎｉＰｒｏｔ番号：Ｐ０７７６６（ｖｅｒｓｉｏｎ  １３０）、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ番号：ＮＰ＿０００７２４．１、配列番号５４；又はカニクイザル［Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ］配列についての、ＵｎｉＰｒｏｔ番号：Ｑ９５ＬＩ５（ｖｅｒｓｉｏｎ  ４９）、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＢＡＢ７１８４９．１を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。ある特定の実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、異なる種に由来するＣＤ３間又は標的抗原間で保存されている、ＣＤ３又は標的細胞抗原のエピトープに結合する。ある特定の実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３及びＦｏｌＲ１には結合するが、ＦｏｌＲ２又はＦｏｌＲ３には結合しない。ある特定の実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３及びＨＥＲ１に結合する。ある特定の実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３及びメソテリンに結合する。ある特定の実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３及びＨＥＲ２に結合する。「特異的結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用から弁別されうることを意味する。抗原結合部分が、特異的抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又は当業者が精通している他の技法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法（ＢＩＡｃｏｒｅ計器上で解析される）（Liljebladら, Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び従来の結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）を介して測定することができる。一実施態様では、抗原結合部分が、非類縁タンパク質に結合する程度は、例えば、ＳＰＲにより測定される通り、抗原結合部分の、抗原への結合の約１０％未満である。ある特定の実施態様では、抗原に結合する抗原結合部分、又は抗原結合部分を含む抗原結合分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ又はこれ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【００８４】
「親和性」とは、分子（例えば、受容体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば、リガンド）との非共有結合的相互作用の総計の強度を指す。別途指示がない限り、本明細書で使用される「結合親和性」とは、結合対のメンバーの間（例えば、抗原結合部分と抗原との間、又は受容体とそのリガンドとの間）の１：１の相互作用を反映する、固有の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離速度定数及び会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である、解離定数（ＫＤ）により表される。したがって、同等な親和性は、速度定数の比が、同じ比を維持する限り、異なる速度定数を含みうる。親和性は、当該技術分野で公知の、十分に確立された方法であって、本明細書で記載される方法を含む方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００８５】
「結合の低減」、例えば、Ｆｃ受容体への結合の低減とは、例えば、ＳＰＲにより測定される、それぞれの相互作用についての親和性の低下を指す。明確さのために述べると、用語はまた、親和性の、ゼロ（又は解析法の検出限界を下回る値）への低減、すなわち、相互作用の完全な消失も含む。逆に、「結合の増大」とは、それぞれの相互作用についての結合親和性の増大を指す。
【００８６】
本明細書で使用される「Ｔ細胞の活性化」とは、Ｔリンパ球、特に、細胞傷害性Ｔリンパ球の、一又は複数の細胞性応答であって、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現から選択される応答を指す。本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、Ｔ細胞の活性化を誘導することが可能である。当該技術分野では、Ｔ細胞の活性化を測定するのに適するアッセイが公知であり、本明細書でも記載される。
【００８７】
本明細書で使用される「標的細胞抗原」とは、標的細胞、例えば、がん細胞又は腫瘍間質の細胞など、腫瘍内の細胞の表面上に提示される抗原決定基を指す。
【００８８】
抗原結合部分に関して、本明細書で使用される「第１」及び「第２」などの用語は、１つを超える、各種の部分が存在する場合の、識別の便宜のために使用される。別途明示的な指定のない限り、これらの用語の使用は、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の、具体的な順序又は方向を付与することを意図するものではない。
【００８９】
「Ｆａｂ分子」とは、免疫グロブリンの、重鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメイン（「Ｆａｂ重鎖」）、並びに軽鎖のＶＬドメイン及びＣＬドメイン（「Ｆａｂ軽鎖」）からなるタンパク質を指す。
【００９０】
「融合させた」とは、直接、又は１若しくは複数のペプチドリンカーを介して、成分（例えば、Ｆａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）を、ペプチド結合により連結することを意味する。
【００９１】
本明細書で使用される「単鎖」という用語は、ペプチド結合により直鎖状に連結された、アミノ酸モノマーを含む分子を指す。ある特定の実施態様では、抗原結合部分のうちの１つは、単鎖Ｆａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ軽鎖と、Ｆａｂ重鎖とを、単一のペプチド鎖を形成するように、ペプチドリンカーにより接続したＦａｂ分子である。特定のこのような実施態様では、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端を、単鎖Ｆａｂ分子内のＦａｂ重鎖のＮ末端へと接続する。
【００９２】
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」ともまた称する）とは、Ｆａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖の可変領域又は定常領域を交換したＦａｂ分子を意味する、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域と、重鎖定常領域とから構成されたペプチド鎖、及び重鎖可変領域と軽鎖定常領域とから構成されたペプチド鎖を含む。明確さのために述べると、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域を交換した、クロスオーバーＦａｂ分子では、本明細書では、重鎖定常領域を含むペプチド鎖を、クロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と称する。逆に、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域を交換した、クロスオーバーＦａｂ分子では、本明細書では、重鎖可変領域を含むペプチド鎖を、クロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と称する。
【００９３】
これに対し、「従来型の」Ｆａｂ分子とは、その天然のフォーマットにおけるＦａｂ分子、すなわち、重鎖可変領域及び重鎖定常領域から構成される重鎖（ＶＨ−ＣＨ１）と、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域から構成される軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）とを含むＦａｂ分子を意味する。
【００９４】
「免疫グロブリン分子」という用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンとは、ジスルフィド結合させた、２つの軽鎖と、２つの重鎖とから構成される、約１５０，０００ドルトンの、ヘテロテトラマーの糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端へと、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインともまた呼ばれる可変領域（ＶＨ）に続き、重鎖定常領域ともまた呼ばれる、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端へと、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインともまた呼ばれる可変領域（ＶＬ）に続き、軽鎖定常領域ともまた呼ばれる、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類のうちの１つへと割り当てることができ、これらの一部は、亜型、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）、及びα２（ＩｇＡ２）へとさらに分けることができる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる、２種類のうちの１つへと割り当てることができる。免疫グロブリンは、免疫グロブリンのヒンジ領域を介して連結された、２つのＦａｂ分子及びＦｃドメインから本質的になる。
【００９５】
本明細書では、「抗体」という用語を、最も広い意味で使用し、それらが、所望の抗原結合活性を呈示する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び抗体断片を含むがこれらに限定されない、多様な抗体構造を包摂する。
【００９６】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体以外の分子であって、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の部分を含む分子を指す。抗体断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び単一ドメイン抗体を含むがこれらに限定されない。ある特定の抗体断片の総説については、Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び同第５５８７４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、インビボにおける半減期を延長した、Ｆａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照されたい。ダイアボディとは、二価又は二重特異性でありうる、２つの抗原結合部位を伴う抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。Ｈｕｄｓｏｎら，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）においてはまた、トリアボディ及びテトラボディも記載されている。単一ドメイン抗体とは、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。ある特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照されたい）である。抗体断片は、インタクトな抗体の、タンパク質分解性消化のほか、本明細書で記載される、組換え宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はファージ）による生成を含むがこれらに限定されない、多様な技法により作製することができる。
【００９７】
「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原の一部又は全部に特異的に結合し、これらと相補的な領野を含む、抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の抗体の可変ドメイン（抗体の可変領域とまた呼ばれる）によりもたらされうる。特に、抗原結合ドメインは、抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００９８】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の重鎖又は軽鎖のドメインであって、抗体の、抗原への結合に関与するドメインを指す。天然の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は一般に、各ドメインが、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む、類似の構造を有する。例えば、Ｋｉｎｄｔら，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐ９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分でありうる。
【００９９】
本明細書で使用される「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変性であり、かつ／又は構造的に規定されたループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体の可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然の４本鎖抗体は、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）内の３つ、及びＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）内の３つである、６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般に、超可変ループ及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来するアミノ酸残基を含み、後者は、配列の可変性が最大であり、かつ／又は抗原認識に関与する。ＶＨ内のＣＤＲ１を例外として、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）はまた、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも称し、本明細書では、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及して、これらの用語を互換的に使用する。この特定の領域については、定義が、互いに対して比較した場合に、アミノ酸残基の重複又はサブセットを含む、Ｋａｂａｔら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８３）；及びＣｈｏｔｈｉａら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−９１７（１９８７）により記載されている。しかしながら、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及する、一方の定義の適用も、本明細書で規定及び使用される用語の範囲内にあることを意図する。上記で引用した参考文献の各々により規定されるＣＤＲを包摂する、適切なアミノ酸残基を、比較として、下記の表１に明示する。特定のＣＤＲを包摂する、正確な残基数は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて変動するであろう。当業者は、抗体の可変領域のアミノ酸配列を踏まえ、どの残基が、特定のＣＤＲを構成するのかを、常套的に決定しうる。
2019514850.tif 000003
【０１００】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体へと適用可能な可変領域配列のための番号づけシステムも規定した。当業者は、配列自体以外の実験データに依拠せずに、この「カバット番号付け」システムを、任意の可変領域配列へと明白に当てはめることができる。本明細書で使用される「カバット番号付け」とは、Ｋａｂａｔら，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）により明示される番号づけシステムを指す。特に断りのない限り、抗体の可変領域内の具体的なアミノ酸残基の位置についての番号付けへの言及は、カバット番号付けシステムに従う。
【０１０１】
配列表のポリペプチド配列は、カバット番号付けシステムに従い番号付けされない。しかし、配列表の配列の番号付けを、カバット番号付けへと転換することは十分に、当業者の技術の範囲内にある。
【０１０２】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は一般に、ＶＨ（又はＶＬ）内に、以下の順序：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４で現れる。
【０１０３】
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」とは、その重鎖により保有される定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体には、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの一部は、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２へとさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ぶ。
【０１０４】
本明細書では、「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語を、定常領域の少なくとも一部を含有する、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するように使用する。用語は、天然Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域の配列を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界部は、若干変動しうるであろうが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通例、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端へと拡がると規定される。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在する場合もあり、存在しない場合もある。本明細書では、特に断りのない限り、Ｆｃ領域内又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１において記載されている、ＥＵインデックスともまた呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。本明細書で使用される、Ｆｃドメインの「サブユニット」とは、ダイマーのＦｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定的な自己会合が可能な、免疫グロブリン重鎖のＣ末端の定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧのＦｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ  ＣＨ２定常ドメイン及びＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメインを含む。
【０１０５】
「Ｆｃドメインの、第１のサブユニットと、第２のサブユニットとの会合を促進する修飾」とは、Ｆｃドメインサブユニットを含むポリペプチドの、同一なポリペプチドとの会合であって、ホモダイマーを形成する会合を低減するか、又は防止する、ペプチド骨格の操作、又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。本明細書で使用される、会合を促進する修飾は、特に、会合することが所望される、２つのＦｃドメインサブユニット（すなわち、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニット）の各々へと施される個別の修飾であって、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するように、互いに相補的な修飾を含む。例えば、会合を促進する修飾は、それらの会合を、立体的又は静電的に、それぞれ、好適とするように、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変更しうる。したがって、サブユニット（例えば、抗原結合部分）の各々へと融合させる、さらなる成分が同じではないという意味において、非同一でありうる、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で、（ヘテロ）二量体化が生じる。一部の実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸突然変異、具体的には、アミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの、２つのサブユニットの各々における、個別のアミノ酸突然変異、具体的には、アミノ酸置換を含む。
【０１０６】
「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域へと帰せられうる生物学的活性であって、抗体のアイソタイプと共に変動する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞の食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による、免疫複合体に媒介される抗原の取込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、及びＢ細胞活性化を含む。
【０１０７】
本明細書で使用される「〜を操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）、操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、〜を操作すること（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」という用語は、天然に存在するポリペプチド若しくは組換えポリペプチド又はこれらの断片のペプチド骨格又は翻訳後修飾の任意の操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）を含むと考えられる。操作すること（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）は、個別のアミノ酸のアミノ酸配列、グリコシル化パターン、又は側鎖基の修飾のほか、これらの手法の組合せを含む。
【０１０８】
本明細書で使用される「アミノ酸突然変異」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び修飾を包摂することを意図する。最終的なコンストラクトに到達するように、最終的なコンストラクトが、所望の特性、例えば、Ｆｃ受容体への結合の低減、又は別のペプチドとの会合の増大を保有するという条件で、置換、欠失、挿入、及び修飾の任意の組合せを施すことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入は、アミノ酸の、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の、欠失及び挿入を含む。特定のアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特性を変更する目的では、非保存的アミノ酸置換、すなわち、１つのアミノ酸を、異なる構造的特性及び／又は化学的特性を有する、別のアミノ酸で置きかえることが、特に、好ましい。アミノ酸置換は、天然に存在しないアミノ酸、又は２０の標準的なアミノ酸の、天然に存在するアミノ酸誘導体（例えば、４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリジン）による置きかえを含む。アミノ酸突然変異は、当該技術分野で周知の遺伝子法又は化学法を使用して作出することができる。遺伝子法は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。化学修飾など、遺伝子操作以外の方法により、アミノ酸の側鎖基を変更する方法もまた、有用でありうることが想定される。本明細書では、同じアミノ酸突然変異を指し示すのに、多様な表記を使用する場合がある。例えば、Ｆｃドメインの３２９位におけるプロリンから、グリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ、又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと表示することができる。
【０１０９】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、アミド結合（ペプチド結合としてもまた公知である）により直鎖状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２つ又はこれを超えるアミノ酸の任意の鎖を指し、具体的な長さの産物を指すわけではない。したがって、２つ又はこれを超えるアミノ酸の鎖を指すのに使用される、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、又は他の任意の用語が、「ポリペプチド」の定義内に含まれ、「ポリペプチド」という用語を、これらの用語のうちのいずれかの代わりに使用することもでき、これらと互換的に使用することもできる。「ポリペプチド」という用語はまた、限定せずに述べると、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ／ｂｌｏｃｋｉｎｇ）基による誘導、タンパク質分解性切断、又は天然に存在しないアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチド発現後修飾の産物を指すことも意図する。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来する場合もあり、組換え技術により生成される場合もあるが、必ずしも、表示の核酸配列から翻訳されるわけではない。ポリペプチドは、化学合成を含む、任意の方式で作出することができる。本発明のポリペプチドは、約３若しくはこれを超える、５若しくはこれを超える、１０若しくはこれを超える、２０若しくはこれを超える、２５若しくはこれを超える、５０若しくはこれを超える、７５若しくはこれを超える、１００若しくはこれを超える、２００若しくはこれを超える、５００若しくはこれを超える、１，０００若しくはこれを超える、又は２，０００若しくはこれを超えるアミノ酸のサイズでありうる。ポリペプチドは、規定された三次元構造を有しうるが、必ずしも、このような構造を有するわけではない。規定された三次元構造を伴うポリペプチドを、フォールディングポリペプチドと称し、規定された三次元構造を有さず、多数の異なるコンフォメーションを取りうるポリペプチドを、アンフォールディングポリペプチドと称する。
【０１１０】
「単離」ポリペプチド又はその変異体若しくは誘導体とは、その天然の環境にないポリペプチドであることを意図する。特定レベルの精製が要請されるわけではない。例えば、単離ポリペプチドは、その天然（ｎａｔｉｖｅ又はｎａｔｕｒａｌ）環境から取り出すことができる。宿主細胞内で発現させる、組換え生成によるポリペプチド及びタンパク質は、本発明の目的では、任意の適切な技法により、分離、分画、又は部分的若しくは実質的に精製された、天然又は組換えのポリペプチドと同様に、単離されていると考えられる。
【０１１１】
参照ポリペプチド配列に照らした「アミノ酸配列の同一性パーセント（％）」は、配列をアライメントし、必要な場合は、ギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを達成するが、保存的置換は、配列同一性の部分として考慮せずにおいた後における、参照ポリペプチド配列内の、アミノ酸残基と同一な、候補配列内のアミノ酸残基の百分率と規定される。アミノ酸配列の同一性パーセントを決定することを目的とするアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴソフトウェア、ＢＬＡＳＴ−２ソフトウェア、ＡＬＩＧＮソフトウェア、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなど、市販のコンピュータソフトウェアを使用して、当該技術分野の範囲内にある多様な方式で達成することができる。当業者は、配列をアライメントするのに適切なパラメータであって、比較される配列の完全長にわたり、最適のアライメントを達成するのに必要とされる、任意のアルゴリズムを含むパラメータを決定することができる。しかし、本明細書の目的では、配列比較コンピュータプログラムであるＡＬＩＧＮ−２を使用して、アミノ酸配列の同一性％値を生成する。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により作製され、ソースコードが、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｏｆｆｉｃｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、２０５５９に、ユーザーマニュアルと共に出願され、ここで、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ第ＴＸＵ５１００８７号として登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから市販品を入手することもでき、ソースコードからコンパイルすることもできる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ディジタル式ＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含む、ＵＮＩＸオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルすべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定され、変動させない。ＡＬＩＧＮ−２を、アミノ酸配列比較のために援用する状況下では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、これとの、又はこれに照らした、アミノ酸配列の同一性％（これを、代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂに対する、これとの、又はこれに照らした、ある特定のアミノ酸配列の同一性％を有するか又は含む、所与のアミノ酸配列Ａとも称しうる）は、以下：
１００×割合Ｘ／Ｙ
［式中、Ｘは、配列アライメントプログラムであるＡＬＩＧＮ−２により、このプログラムによる、ＡとＢとのアライメントにおいて、同一なマッチとしてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂ内のアミノ酸残基の総数である］の通りに計算される。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列の同一性％と等しくないことが察知されるであろう。別途具体的に指定のない限り、本明細書で使用される、全てのアミノ酸配列の同一性％値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で記載した通りに得られる。
【０１１２】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単離核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来型のホスホジエステル結合を含む場合もあり、非従来型の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）内で見出される結合などのアミド結合）を含む場合もある。「核酸分子」という用語は、ポリヌクレオチド内に存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡ断片又はＲＮＡ断片を指す。
【０１１３】
「単離」核酸分子又は「単離」ポリヌクレオチドは、その天然の環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡ、又はＲＮＡであることを意図する。例えば、ベクター内に含有される、ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的では、単離されていると考えられる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例は、異種宿主細胞内で維持される組換えポリヌクレオチド、又は溶液中で（部分的に又は実質的に）精製されるポリヌクレオチドを含む。単離ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含有する細胞内に含有されるポリヌクレオチド分子を含むが、ポリヌクレオチド分子は、染色体外にも存在し、又はその天然の染色体内の位置と異なる染色体内の位置にも存在する。単離ＲＮＡ分子は、インビボ又はインビトロにおける、本発明のＲＮＡ転写物のほか、プラス鎖形態及びマイナス鎖形態、並びに二本鎖形態を含む。本発明に従う単離ポリヌクレオチド又は核酸は、合成により生成された、このような分子をさらに含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターなど制御エレメントであるか、又はこれらを含みうる。
【０１１４】
本発明の参照ヌクレオチド配列と、少なくとも、例えば、９５％「同一」なヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列１００ヌクレオチド当たり、最大で５つの点突然変異を含みうることを除き、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、参照配列と同一であることが意図される。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と、少なくとも、９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、参照配列内のヌクレオチドのうち、最大で５％を欠失させることもでき、別のヌクレオチドで置換することもでき、参照配列内の全ヌクレオチドのうちの最大で５％という、多数のヌクレオチドを、参照配列へと挿入することもできる。これらの参照配列の変更は、参照ヌクレオチド配列の５’末端位又は３’末端位に施すこともでき、これらの末端位の間のいずれかの位置に施すこともでき、参照配列内の残基間に個別に散在させることもでき、参照配列内の、一又は複数の連続基により散在させることもできる。実際上の問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるのかどうかは、ポリペプチドについて上記で論じたプログラム（例えば、ＡＬＩＧＮ−２）など、公知のコンピュータプログラムを使用して、従来の方式で決定することができる。
【０１１５】
「発現カセット」という用語は、組換え又は合成により作出されるポリヌクレオチドであって、標的細胞内の特定の核酸の転写を可能とする、一連の、指定された核酸エレメントを伴うポリヌクレオチドを指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片へと組み込むことができる。典型的に、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、他の配列の中でも、転写される核酸配列と、プロモーターとを含む。ある特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【０１１６】
「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内で作動可能に結合する特定の遺伝子を導入し、その発現を方向付けるのに使用されるＤＮＡ分子を指す。用語は、自己複製核酸構造としてのベクターのほか、それが導入される宿主細胞のゲノムへと組み込まれるベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定的なｍＲＮＡの転写を可能とする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、細胞の転写機構及び／又は翻訳機構により、遺伝子によりコードされるリボ核酸分子又はタンパク質を生成する。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【０１１７】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は、互換的に使用され、外因性核酸が導入される細胞であって、このような細胞の子孫を含む細胞を指す。宿主細胞は、初代形質転換細胞と、継代数に関わりなく、これに由来する子孫とを含む、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含む。子孫は、核酸含有量が親細胞と完全に同一ではなく、突然変異を含有しうる。本明細書には、元の形質転換細胞についてスクリーニング又は選択された、同じ機能又は生物活性を有する、突然変異体の子孫も含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を作出するのに使用しうる、任意の種類の細胞系である。宿主細胞は、ごく少数を挙げれば、培養細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞などの哺乳類培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含むが、また、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物組織若しくは動物組織の中に含まれる細胞も含む。
【０１１８】
「活性化Ｆｃ受容体」とは、抗体のＦｃドメインの係合の後で、エフェクター機能を果たすように、受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達イベントを誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）を含む。
【０１１９】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）とは、抗体でコートされた標的細胞の、免疫エフェクター細胞による溶解をもたらす免疫機構である。標的細胞とは、一般に、Ｆｃ領域に対してＮ末端であるタンパク質の部分を介して、抗体又はＦｃ領域を含むその誘導体が、特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される「ＡＤＣＣの低減」という用語は、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の所与の濃度で、所与の時間内に、上記で規定されたＡＤＣＣ機構により溶解する標的細胞の数の低減、及び／又は所与の時間内に、ＡＤＣＣ機構により、所与の数の標的細胞の溶解を達成するのに要請される、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の濃度の増大と規定される。ＡＤＣＣの低減は、同じ標準的な作製法、精製法、製剤化法、及び保管法（当業者に公知である）を使用して、同じ種類の宿主細胞により産生され、操作されていない、同じ抗体に媒介されるＡＤＣＣと比べた低減である。例えば、そのＦｃドメイン内に、ＡＤＣＣを低減するアミノ酸置換を含む抗体に媒介される、ＡＤＣＣの低減は、Ｆｃドメイン内のこのアミノ酸置換を伴わない同じ抗体に媒介されるＡＤＣＣと比べた低減である。当該技術分野では、ＡＤＣＣを測定するのに適するアッセイが周知である（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００６／０８２５１５、又はＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１を参照されたい）。
【０１２０】
薬剤の「有効量」とは、それが投与される細胞内又は組織内の生理的変化を結果としてもたらすのに必要な量を指す。
【０１２１】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、必要な投与量で、必要な時間にわたり、所望の治療的結果又は予防的結果を達成するのに有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、例えば、疾患の有害作用を消失させるか、減殺するか、遅延させるか、最小化するか、又は予防する。
【０１２２】
「個体」又は「対象」とは、哺乳類である。哺乳類は、馴致動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含むがこれらに限定されない。特に、個体又は対象は、ヒトである。
【０１２３】
「薬学的組成物」という用語は、その中に含有される有効成分の生物活性が有効となることを可能とするが、製剤が投与される対象に対して、許容不可能な程度に毒性となる、さらなる成分は含有しないような形態にある調製物を指す。
【０１２４】
「薬学的に許容される担体」とは、薬学的組成物中の、有効成分以外の成分であって、対象に対して非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体は、バッファー、賦形剤、安定剤、又は防腐剤を含むがこれらに限定されない。
【０１２５】
本明細書で使用される「治療」（及び、「〜を治療する」又は「〜を治療すること」など、その文法的変化形）とは、個体において治療される疾患の、自然の経過を変更しようとする企図における臨床的介入を指し、予防のために実施することもでき、臨床病理の経過中に実施することもできる。所望の治療効果は、疾患の発生又は再発の予防、症候の緩和、疾患の、任意の直接的又は間接的な病理学的帰結の減殺、転移の予防、疾患進行の速度の低下、病態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含むがこれらに限定されない。一部の実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を使用して、疾患の発生を遅延させるか、又は疾患の進行を緩徐化させる。
【０１２６】
「添付文書」という用語は、通例、治療用製品の市販のパッケージ内に含まれる指示書であって、適応症、使用、投与量、投与、併用療法、このような治療用製品の使用に関する禁忌及び／又は警告についての情報を含有する指示書を指すように使用される。
【０１２７】
本明細書で使用される「イデオタイプ特異的ポリペプチド」とは、抗原結合部分、例えば、ＣＤ３に特異的な抗原結合部分のイデオタイプを認識するポリペプチドを指す。イデオタイプ特異的ポリペプチドは、抗原結合部分の可変領域に特異的に結合し、これにより、抗原結合部分の、そのコグネイト抗原への特異的結合を低減又は防止することが可能である。抗原結合部分を含む分子と会合すると、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、分子のマスキング部分として機能しうる。具体的には、本明細書では、抗ＣＤ３結合分子のイデオタイプに特異的な、抗イデオタイプ抗体又は抗イデオタイプ結合性抗体断片が開示される。
【０１２８】
本明細書で使用される「プロテアーゼ」又は「タンパク質分解酵素」とは、認識部位において、リンカーを切断し、標的細胞が発現させる、任意のタンパク質分解酵素を指す。このようなプロテアーゼは、標的細胞により分泌される場合もあり、標的細胞との会合、例えば、標的細胞表面上の会合を維持する場合もあろう。プロテアーゼの例は、メタロプロテイナーゼ、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ１−２８、並びにディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）２、７−１２、１５、１７−２３、２８−３０、及び３３、セリンプロテアーゼ、例えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びマトリプターゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、並びにカテプシンファミリーのメンバーを含むがこれらに限定されない。
【０１２９】
Ｔ細胞活性化二重特異性分子に関して本明細書で使用される「プロテアーゼ活性化型」とは、ＣＤ３に結合する、Ｔ細胞活性化二重特異性分子の能力を低減するか、又は失効化させるマスキング部分のために、Ｔ細胞を活性化させる能力を低減するか又は失効化させた、Ｔ細胞活性化二重特異性分子を指す。タンパク質分解性切断、例えば、マスキング部分を、Ｔ細胞活性化二重特異性分子へと接続するリンカーの、タンパク質分解性切断により、マスキング部分が解離すると、ＣＤ３への結合が回復し、これにより、Ｔ細胞活性化二重特異性分子は活性化する。
【０１３０】
本明細書で使用される「可逆的隠蔽」とは、抗原結合部分又は分子が、その抗原、例えば、ＣＤ３に結合することを防止するように、マスキング部分又はイデオタイプ特異的ポリペプチドが、抗原結合部分又は分子に結合することを指す。この隠蔽は、イデオタイプ特異的ポリペプチドが、例えば、プロテアーゼ切断により、抗原結合部分又は分子から放出され、これにより、抗原結合部分又は分子を、その抗原に結合するように解放しうるという点で可逆的である。
詳細な説明
【０１３１】
一態様では、本発明は、
（ａ）ＣＤ３への特異的結合が可能な第１の抗原結合部分と；
（ｂ）標的細胞抗原への特異的結合が可能な第２の抗原結合部分と；
（ｃ）プロテアーゼ切断型リンカーを介して、Ｔ細胞二重特異性結合性分子と共有結合しているマスキング部分であって、第１又は第２の抗原結合部分のイデオタイプへの特異的結合が可能であり、これにより、第１又は第２の抗原結合部分を、可逆的に隠蔽するマスキング部分と
を含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子に関する。
【０１３２】
ＣＤ３への特異的結合が可能な、第１の抗原結合部分は、イデオタイプを含む。一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のマスキング部分は、第１の抗原結合部分と共有結合している。一実施態様では、マスキング部分は、第１の抗原結合部分の重鎖可変領域と共有結合している。一実施態様では、マスキング部分は、第１の抗原結合部分の軽鎖可変領域と共有結合している。この共有結合は、第１の抗原結合部位のイデオタイプへの、マスキング部分の、好ましくは非共有結合である、特異的結合とは別個である。第１の抗原結合部分のイデオタイプは、その可変領域を含む。一実施態様では、マスキング部分は、第１の抗原結合部分がＣＤ３に結合するときに、ＣＤ３と接触するアミノ酸残基に結合する。好ましい実施態様では、マスキング部分は、第１の抗原結合部分のコグネイト抗原又はその断片ではない、すなわち、マスキング部分は、ＣＤ３又はその断片ではない。一実施態様では、マスキング部分は、抗イデオタイプ抗体又はその断片である。一実施態様では、マスキング部分は、抗イデオタイプｓｃＦｖである。抗イデオタイプｓｃＦｖであるマスキング部分と、このようなマスキング部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化分子との例示的実施態様については、実施例において、詳細に記載する。
【０１３３】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第２の抗原結合部分を可逆的に隠蔽する、第２のマスキング部分を含む。
【０１３４】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）標的細胞抗原への特異的結合が可能なＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含む。
【０１３５】
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１３６】
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１３７】
具体的な実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１３８】
別の具体的な実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号４７のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１３９】
具体的な実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号１５１、配列番号１５２、及び配列番号１５３からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１５４、配列番号１５５、及び配列番号１５６の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１４０】
別の具体的な実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号１５７のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５８のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１４１】
別の具体的な実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＨＥＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１４２】
別の具体的な実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＨＥＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号３２のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
【０１４３】
別の具体的な実施態様では、第２の抗原結合部分は、ＨＥＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号１１５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１６のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１４４】
具体的な実施態様では、第２の抗原結合部分は、メソテリンへの特異的結合が可能であり、配列番号１０７、配列番号１０８、及び配列番号１０９からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１１０、配列番号１１１、及び配列番号１１２の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１４５】
別の具体的な実施態様では、第２の抗原結合部分は、メソテリンへの特異的結合が可能であり、配列番号１１３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１４のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１４６】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１４７】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４７のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１４８】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号１５１、配列番号１５２、及び配列番号１５３からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１５４、配列番号１５５、及び配列番号１５６の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１４９】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号１５７のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５８のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１５０】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）ＨＥＲ１への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１５１】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）ＨＥＲ１への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号１１５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１６のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１５２】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域を交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である。
【０１５３】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）メソテリンへの特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号１０７、配列番号１０８、及び配列番号１０９からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１１０、配列番号１１１、及び配列番号１１２の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１５４】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）メソテリンへの特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号１１３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１４のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１５５】
一実施態様では、第２の抗原結合部分は、従来型のＦａｂ分子である。
【０１５６】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域を交換した、クロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合部分は、従来型のＦａｂ分子である。さらなる特定の実施態様では、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している。
【０１５７】
特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、安定的な会合が可能な、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインをさらに含む。
【０１５８】
さらなる特定の実施態様では、ＣＤ３への特異的結合が可能な、１つを超えない抗原結合部分が、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子内に存在する（すなわち、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３への一価の結合をもたらす）。
【０１５９】
プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のフォーマット
プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の成分は、様々な構成で、互いに融合させることができる。例示的構成を、図１Ａ−１Ｅ及び５Ａ−５Ｈに描示する。さらなる例示的構成を、図３３Ａ−３３Ｋに描示する。
【０１６０】
特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、安定的な会合が可能な、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。一部の実施態様では、第２の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニット又は第２のサブユニットのＮ末端へと融合させる。
【０１６１】
このような一実施態様では、第１の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へと融合させる。このような具体的な実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は本質的に、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分と、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に、一又は複数のペプチドリンカーとからなり、この場合、第１の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へと融合させ、第２の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニット又は第２のサブユニットのＮ末端へと融合させる。加えて、任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を、互いに融合させることもできる。
【０１６２】
別のこのような実施態様では、第１の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニット又は第２のサブユニットのＮ末端へと融合させる。このような具体的な実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は本質的に、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分と、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に、一又は複数のペプチドリンカーとからなり、この場合、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分の各々を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端へと融合させる。
【０１６３】
他の実施態様では、第１の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニット又は第２のサブユニットのＮ末端へと融合させる。
【０１６４】
特定のこのような実施態様では、第２の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へと融合させる。このような具体的な実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は本質的に、第１の抗原結合部分と、第２の抗原結合部分と、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に、一又は複数のペプチドリンカーとからなり、この場合、第２の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へと融合させ、第１の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニット又は第２のサブユニットのＮ末端へと融合させる。加えて、任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を、互いに融合させることもできる。
【０１６５】
抗原結合部分を、Ｆｃドメイン又は互いに直接融合させることもでき、一又は複数のアミノ酸、典型的に、約２−２０アミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合させることもできる。当該技術分野では、ペプチドリンカーについて公知であり、本明細書でも記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、又はＧ４（ＳＧ４）ｎのペプチドリンカーを含む。「ｎ」とは、一般に、１から１０の間、典型的に、２から４の間の数である。第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を、互いに融合させるのに特に適するペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖と、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖とを接続するのに適する、例示的なペプチドリンカーは、ＥＰＫＳＣ（Ｄ）−（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１０５及び１０６）である。加えて、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含みうる。特に、抗原結合部分を、ＦｃドメインのサブユニットのＮ末端へと融合させる場合は、さらなるペプチドリンカーを伴うか又は伴わない、免疫グロブリンヒンジ領域又はその部分を介して、融合させることができる。
【０１６６】
標的細胞抗原への特異的結合が可能な、単一の抗原結合部分を伴う、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、高親和性の抗原結合部分の結合の後に、標的細胞抗原の内部移行が予測される場合に、特に有用である。このような場合、標的細胞抗原に特異的な、１つを超える抗原結合部分の存在が、標的細胞抗原の内部移行を増強することが可能であり、これにより、そのアベイラビリティーを低減しうる。
【０１６７】
しかし、多くの他の場合、例えば、標的部位への標的化を最適化するか、又は標的細胞抗原の架橋を可能とするように、標的細胞抗原に特異的な、２つ又はこれを超える抗原結合部分を含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子（図５Ａ−５Ｈに示した例を参照されたい）を有することが有利であろう。
【０１６８】
したがって、ある特定の実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原への特異的結合が可能なＦａｂ分子である、第３の抗原結合部分をさらに含む。一実施態様では、第３の抗原結合部分は、従来型のＦａｂ分子である。一実施態様では、第３の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分と同じ標的細胞抗原への特異的結合が可能である。特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、標的細胞抗原への特異的結合が可能である。特定の実施態様では、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、同一である（すなわち、同じアミノ酸配列を含む）。
【０１６９】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１７０】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含み；第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１７１】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含み；第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１７２】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、配列番号４７のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１７３】
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、ＨＥＲ１への特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１７４】
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含み；第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、ＨＥＲ１への特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１７５】
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含み；第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、ＨＥＲ１への特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１７６】
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、ＨＥＲ１への特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、配列番号１１５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１６のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１７７】
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、ＨＥＲ２への特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分は、配列番号１４２、配列番号１４３、及び配列番号１４４からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１４８、配列番号１４９、及び配列番号１５０の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含み、第３の抗原結合部分は、配列番号１４５、配列番号１４６、及び配列番号１４７からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１４８、配列番号１４９、及び配列番号１５０の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１７８】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含み；第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、ＨＥＲ２への特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分は、配列番号１４２、配列番号１４３、及び配列番号１４４からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１４８、配列番号１４９、及び配列番号１５０の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含み、第３の抗原結合部分は、配列番号１４５、配列番号１４６、及び配列番号１４７からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１４８、配列番号１４９、及び配列番号１５０の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１７９】
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、ＨＥＲ２への特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分は、配列番号１６０のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６１のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、第３の抗原結合部分は、配列番号１５９のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６１のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１８０】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、メソテリンへの特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、配列番号１０７、配列番号１０８、及び配列番号１０９からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１１０、配列番号１１１、及び配列番号１１２の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１８１】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含み；第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、メソテリンへの特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、配列番号１０７、配列番号１０８、及び配列番号１０９からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１１０、配列番号１１１、及び配列番号１１２の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１８２】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、メソテリンへの特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、配列番号１１３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１４のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０１８３】
一実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、ＨＥＲ１への特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１からなる群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１８４】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９からなる群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含み；第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、ＨＥＲ１への特異的結合が可能であり、この場合、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分は、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１からなる群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０１８５】
一実施態様では、第３の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニット又は第２のサブユニットのＮ末端へと融合させる。より具体的な実施態様では、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分の各々を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端へと融合させ、第１の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へと融合させる。加えて、任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を、互いに融合させることもできる。
【０１８６】
第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分を、直接、又はペプチドリンカーを介して、Ｆｃドメインへと融合させることができる。特定の実施態様では、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分の各々を、免疫グロブリンヒンジ領域を介して、Ｆｃドメインへと融合させる。具体的な実施態様では、免疫グロブリンヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域である。一実施態様では、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分並びにＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の一部である。特定の実施態様では、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンである。なおより特定の実施態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンである。別の実施態様では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリンである。さらなる特定の実施態様では、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。他の実施態様では、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は本質的に、標的細胞抗原への特異的結合が可能な免疫グロブリン分子と、ＣＤ３への特異的結合が可能な抗原結合部分とからなり、この場合、抗原結合部分は、任意選択的に、ペプチドリンカーを介して、免疫グロブリン重鎖のうちの１つのＮ末端へと融合させたＦａｂ分子、特に、クロスオーバーＦａｂ分子である。
【０１８７】
特定の実施態様では、第１の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分の各々を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインのサブユニットのうちの１つのＮ末端へと融合させ、第２の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へと融合させる。このような具体的な実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は本質的に、第１の抗原結合部分、第２の抗原結合部分、及び第３の抗原結合部分と、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に、一又は複数のペプチドリンカーとからなり、この場合、第２の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へと融合させ、第１の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端へと融合させ、第３の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端へと融合させる。加えて、任意選択的に、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を、互いに融合させることもできる。
【０１８８】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域と、Ｆａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域とを交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）各々が、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１８９】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域と、Ｆａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域とを交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）各々が、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４７のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１９０】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域と、Ｆａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域とを交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）各々が、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号１５１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１５３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１５４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５６の軽鎖ＣＤＲ３を含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１９１】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域と、Ｆａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域とを交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）各々が、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号１５７のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５８のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１９２】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域と、Ｆａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域とを交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）各々が、ＨＥＲ１への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号５６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１の軽鎖ＣＤＲ３を含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１９３】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域と、Ｆａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域とを交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）各々が、ＨＥＲ１への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号１１５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１６のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１９４】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域と、Ｆａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域とを交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）各々が、ＨＥＲ２への特異的結合が可能なＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分であって、第２の抗原結合部分が、配列番号１４２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１４４の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５０の軽鎖ＣＤＲ３を含み、第３の抗原結合部分が、配列番号１４５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４６の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１４８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５０の軽鎖ＣＤＲ３を含む第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１９５】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域と、Ｆａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域とを交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）各々が、ＨＥＲ２への特異的結合が可能なＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分であって、第２の抗原結合部分が、配列番号１６０のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６１のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、第３の抗原結合部分が、配列番号１５９のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１６１のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１９６】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４４の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域と、Ｆａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域とを交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）各々が、メソテリンへの特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号１０７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１１２の軽鎖ＣＤＲ３を含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１９７】
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）ＣＤ３への特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含むＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分であって、Ｆａｂ軽鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域と、Ｆａｂ重鎖の可変領域又は定常領域、特に定常領域とを交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である、第１の抗原結合部分と；
（ｉｉ）各々が、メソテリンへの特異的結合が可能なＦａｂ分子であり、配列番号１１３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１４のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むＦａｂ分子である、第２の抗原結合部分及び第３の抗原結合部分と
を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。
【０１９８】
上記の１０の実施態様のうちのいずれかに従う、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子はさらに、（ｉｉｉ）安定的な会合が可能な、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインも含むことが可能であり、第２の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へと融合させ、第１の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端へと融合させ、第３の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端へと融合させる。
【０１９９】
本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の一部では、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を、任意選択的にリンカーペプチドを介して互いに融合させる。第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分の構成に応じて、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を、そのＣ末端において、第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端へと融合させることもでき、第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖を、そのＣ末端において、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖のＮ末端へと融合させることもできる。第１及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖の融合は、マッチしないＦａｂ重鎖とＦａｂ軽鎖との誤対合をさらに低減し、また、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の一部の発現に必要とされるプラスミドの数も低減する。
【０２００】
ある特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１の抗原結合部分は、重鎖可変領域を、軽鎖可変領域で置きかえたクロスオーバーＦａｂ重鎖を含む）、これが、カルボキシ末端のペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））と、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端のペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とを含む。一部の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＬ（１））と、第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））とをさらに含む。ある特定の実施態様では、ポリペプチドを、例えば、ジスルフィド結合により、共有結合的に連結する。
【０２０１】
代替的な実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１の抗原結合部分は、重鎖定常領域を、軽鎖定常領域で置きかえたクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、これが、カルボキシ末端のペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＬ（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））と、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端のペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））とを含む。一部の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１））と、第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））とをさらに含む。ある特定の実施態様では、ポリペプチドを、例えば、ジスルフィド結合により、共有結合的に連結する。
【０２０２】
一部の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１の抗原結合部分は、重鎖可変領域を、軽鎖可変領域で置きかえたクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、これが、カルボキシ末端のペプチド結合を、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖と共有し、これが、カルボキシ末端のペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１の抗原結合部分は、重鎖定常領域を、軽鎖定常領域で置きかえたクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、これが、カルボキシ末端のペプチド結合を、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖と共有し、これが、カルボキシ末端のペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＬ（１）−ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。さらに他の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、これが、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（すなわち、第１の抗原結合部分は、重鎖可変領域を、軽鎖可変領域で置きかえたクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、これが、カルボキシ末端のペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＬ（１）−ＣＨ１（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。他の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、これが、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（すなわち、第１の抗原結合部分は、重鎖定常領域を、軽鎖定常領域で置きかえたクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み）、これが、カルボキシ末端のペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）−ＣＨ１（２）−ＶＨ（１）−ＣＬ（１）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））を含む。
【０２０３】
これらの実施態様のうちのあるものでは、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチドであって、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＬ（１））と、第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））とをさらに含む。これらの実施態様のうちの他のものでは、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域と共有するクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１））と、第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２））とをさらに含む。これらの実施態様のうちのさらに他のものでは、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域と共有し、これが、カルボキシ末端のペプチド結合を、第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有するポリペプチド（ＶＬ（１）−ＣＨ１（１）−ＶＬ（２）−ＣＬ（２））、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し、これが、カルボキシ末端のペプチド結合を、第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）−ＣＬ（１）−ＶＬ（２）−ＣＬ（２））、第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、これが、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２）−ＶＬ（１）−ＣＨ１（１））、又は第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、これが、カルボキシ末端のペプチド結合を、第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）−ＣＬ（２）−ＶＨ（１）−ＣＬ（１））をさらに含む。
【０２０４】
これらの実施態様に従うプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子はさらに、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットのポリペプチド（ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３の抗原結合部分のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端のペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）−ＣＨ１（３）−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４））、及び第３の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）−ＣＬ（３））も含みうる。ある特定の実施態様では、ポリペプチドを、例えば、ジスルフィド結合により、共有結合的に連結する。
【０２０５】
上記の実施態様のうちのいずれかに従い、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の成分（例えば、抗原結合部分、Ｆｃドメイン）を、直接融合させることもでき、多様なリンカー、特に、一又は複数のアミノ酸、典型的に、本明細書で記載されているか、又は当該技術分野で公知の、約２−２０アミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合させることもできる。適切な非免疫原性ペプチドリンカーは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、又はＧ４（ＳＧ４）ｎ［式中、ｎは、一般に、１から１０の間、典型的に、２から４の間の数である］のペプチドリンカーを含む。
【０２０６】
Ｆｃドメイン
プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含むポリペプチド鎖の対からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、その各サブユニットが、ＣＨ２  ＩｇＧ重鎖定常ドメイン及びＣＨ３  ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含むダイマーである。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いとの安定的な会合が可能である。一実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、１つを超えないＦｃドメインを含む。
【０２０７】
本発明に従う一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインは、ＩｇＧのＦｃドメインである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１のＦｃドメインである。別の実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４のＦｃドメインである。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８位（カバット番号付け）におけるアミノ酸置換、特に、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む、ＩｇＧ４のＦｃドメインである。このアミノ酸置換は、ＩｇＧ４抗体の、インビボにおけるＦａｂアームの交換を低減する（Stubenrauchら, Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)を参照されたい）。さらなる特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。
【０２０８】
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明に従うプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、Ｆｃドメインの、２つのサブユニットのうちの一方又は他方へと融合させた、異なる抗原結合部分を含み、したがって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、典型的に、２つの同一でないポリペプチド鎖内に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現、及びその後の二量体化は、２つのポリペプチドの、いくつかの可能な組合せをもたらす。したがって、組換え生成における、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の収量及び純度を改善するためには、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメイン内に、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利であろう。
【０２０９】
したがって、特定の実施態様では、本発明に従うプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの、第１のサブユニットと、第２のサブユニットとの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧのＦｃドメインの、２つのサブユニットの間の、最も広範なタンパク質間相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内の部位である。したがって、一実施態様では、前記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。
【０２１０】
具体的な実施態様では、前記修飾は、いわゆる、Ｆｃドメインの、２つのサブユニットのうちの１つにおける「ノブ」修飾と、Ｆｃドメインの、２つのサブユニットのうちの他の１つにおける「ホール」修飾とを含む、「ノブ・イントゥー・ホール」修飾である。
【０２１１】
ノブ・イントゥー・ホール技術については、例えば、米国特許第５７３１１６８号；米国特許第７６９５９３６号；Ｒｉｄｇｗａｙら，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９，６１７−６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８，  ７−１５  （２００１）において記載されている。一般に、方法は、ヘテロダイマー形成を促進し、ホモダイマー形成を妨げるよう、突出部を、空隙内に配置しうるように、第１のポリペプチドの接触面に、突出部（「ノブ」）を導入し、第２のポリペプチドの接触面に、対応する空隙（「ホール」）を導入することを伴う。第１のポリペプチドの接触面に由来する、小型のアミノ酸側鎖を、大型の側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置きかえることにより、突出部を構築する。大型のアミノ酸側鎖を、小型のアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）で置きかえることにより、突出部と同一又は同様のサイズの代補的空隙を、第２のポリペプチドの接触面内に創出する。
【０２１２】
したがって、特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内で、アミノ酸残基を、側鎖容積のより大きなアミノ酸残基で置きかえ、これにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突出部であって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空隙内に配置可能な突出部を作出し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内で、アミノ酸残基を、側鎖容積のより小さなアミノ酸残基で置きかえ、これにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空隙であって、その中に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突出部が配置可能な空隙を作出する。
【０２１３】
突出部及び空隙は、ポリペプチドをコードする核酸を変更することにより、例えば、部位特異的突然変異誘発、又はペプチド合成により施すことができる。
【０２１４】
具体的な実施態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内で、３６６位におけるスレオニン残基を、トリプトファン残基で置きかえ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内で、４０７位におけるチロシン残基を、バリン残基で置きかえる（Ｙ４０７Ｖ）。一実施態様では、加えて、Ｆｃドメインの第２のサブユニット内で、３６６位におけるスレオニン残基を、セリン残基で置きかえ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位におけるロイシン残基を、アラニン残基で置きかえる（Ｌ３６８Ａ）。
【０２１５】
なおさらなる実施態様では、加えて、Ｆｃドメインの第１のサブユニット内で、３５４位におけるセリン残基を、システイン残基で置きかえ（Ｓ３５４Ｃ）、加えて、Ｆｃドメインの第２のサブユニット内で、３４９位におけるチロシン残基を、システイン残基で置きかえる（Ｙ３４９Ｃ）。これらの２つのシステイン残基の導入は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの間のジスルフィド架橋の形成を結果としてもたらし、さらに、ダイマーを安定化させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。
【０２１６】
特定の実施態様では、ＣＤ３への結合が可能な抗原結合部分を、（任意選択的に、標的細胞抗原への結合が可能な抗原結合部分を介して）Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）へと融合させる。理論に束縛されることを望まずに述べると、ＣＤ３への結合が可能な抗原結合部分の、Ｆｃドメインの、ノブを含有するサブユニットへの融合は、ＣＤ３への結合が可能な、２つの抗原結合部分を含む抗原結合分子の作出（ノブを含有する、２つのポリペプチドの立体的衝突）を（さらに）最小化するであろう。
【０２１７】
代替的な実施態様では、Ｆｃドメインの、第１のサブユニットと、第２のサブユニットとの会合を促進する修飾は、静電ステアリング効果を媒介する修飾であって、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２００９／０８９００４において記載されている修飾を含む。一般に、この方法は、ホモダイマー形成は、静電的に不適となるが、ヘテロ二量体化は、静電的に好適となるように、２つのＦｃドメインサブユニットの接触面における、一又は複数のアミノ酸残基の、荷電アミノ酸残基による置きかえを伴う。
【０２１８】
Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低減するＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子へと、標的組織内の良好な蓄積、及び好適な組織−血液分布比に寄与する、長い血清半減期を含む、好適な薬物動態特性を付与する。しかし、Ｆｃドメインは、同時に、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の、好ましい抗原保有細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現させる細胞への、所望されない標的化ももたらしうる。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の共活性化は、抗原結合分子の、Ｔ細胞活性化特性、及び長い半減期と組み合わされると、全身投与されると、サイトカイン受容体の過剰な活性化と、重度の副作用とを結果としてもたらす、サイトカインの放出ももたらしうる。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体を保有する）免疫細胞の活性化はなお、例えば、ＮＫ細胞による、Ｔ細胞の潜在的な破壊のために、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の有効性さえ低減しうる。
【０２１９】
したがって、特定の実施態様では、本発明に従うプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較した、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を呈示する。このような一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子）は、天然ＩｇＧ１のＦｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１のＦｃドメインを含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子）と比較した、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満であり、最も好ましくは５％未満の、Ｆｃ受容体への結合親和性、及び／又は天然ＩｇＧ１のＦｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１のＦｃドメインを含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子）と比較した、５０％未満、好ましくは２０％未満、より好ましくは１０％未満であり、最も好ましくは５％未満のエフェクター機能を呈示する。一実施態様では、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子）は、実質的に、Ｆｃ受容体に結合せず、かつ／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一実施態様では、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びサイトカイン分泌の群から選択される一又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、天然ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較して、実質的に同様の、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性を呈示する。ＦｃＲｎへの、実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子）が、天然ＩｇＧ１のＦｃドメイン（又は天然ＩｇＧ１のＦｃドメインを含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子）の、ＦｃＲｎに対する結合親和性の、約７０％を超える、特に、約８０％を超える、より特定すると、約９０％を超える結合親和性を呈示する場合に達成される。
【０２２０】
ある特定の実施態様では、操作されていないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性を低減し、かつ／又はエフェクター機能を低減するように、Ｆｃドメインを操作する。特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの、Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減する、一又は複数のアミノ酸突然変異を含む。典型的に、一又は複数の、同じアミノ酸突然変異は、Ｆｃドメインの、２つのサブユニットの各々に存在する。一実施態様では、アミノ酸突然変異は、Ｆｃドメインの、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を低減する。一実施態様では、アミノ酸突然変異は、Ｆｃドメインの、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１、又は少なくとも１０分の１に低減する。Ｆｃドメインの、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を低減する、１つを超えるアミノ酸突然変異が存在する実施態様では、これらのアミノ酸突然変異の組合せは、Ｆｃドメインの、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を、少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１、又は少なくとも５０分の１にも低減しうる。一実施態様では、操作Ｆｃドメインを含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、操作されていないＦｃドメインを含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子と比較して、２０％未満、特に、１０％未満、より特定すると、５％未満の、Ｆｃ受容体への結合親和性を呈示する。特定の実施態様では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。一部の実施態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一部の実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な実施態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ、又はＦｃγＲＩＩａ、最も具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体の各々への結合を低減する。一部の実施態様では、補体成分への結合親和性、具体的には、Ｃ１ｑへの結合親和性もまた低減する。一実施態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減しない。ＦｃＲｎへの、実質的に同様の結合、すなわち、Ｆｃドメインの、前記受容体に対する結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子）が、操作されていないＦｃドメインの形態（又は前記操作されていないＦｃドメインの形態を含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子）の、ＦｃＲｎに対する結合親和性の、約７０％を超える結合親和性を呈示する場合に達成される。本発明のＦｃドメイン、又は前記Ｆｃドメインを含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、このような親和性の、約８０％を超え、なお約９０％を超える結合親和性を呈示しうる。ある特定の実施態様では、操作されていないＦｃドメインと比較して、エフェクター機能を低減するように、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインを操作する。エフェクター機能の低減は、以下：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞の食作用（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体に媒介される抗原の取込みの低減、ＮＫ細胞への結合の低減、マクロファージへの結合の低減、単球への結合の低減、多形核細胞への結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的なシグナル伝達の低減、標的に結合した抗体の架橋の低減、樹状細胞の成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの一又は複数を含みうるがこれらに限定されない。一実施態様では、エフェクター機能の低減は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減、及びサイトカイン分泌の低減の群から選択される一又は複数である。特定の実施態様では、エフェクター機能の低減は、ＡＤＣＣの低減である。一実施態様では、ＡＤＣＣの低減は、操作されていないＦｃドメイン（又は操作されていないＦｃドメインを含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
【０２２１】
一実施態様では、Ｆｃドメインの、Ｆｃ受容体に対する結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減するアミノ酸突然変異は、アミノ酸置換である。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１、及びＰ３２９の群から選択される位置におけるアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９の群から選択される位置におけるアミノ酸置換を含む。一部の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む。このような一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１のＦｃドメイン、特に、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位におけるアミノ酸置換を含む。より具体的な実施態様では、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特に、Ｐ３２９Ｇである。一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位におけるアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、及びＰ３３１から選択される位置におけるアミノ酸置換をさらに含む。より具体的な実施態様では、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ、又はＰ３３１Ｓである。特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９、Ｌ２３４、及びＬ２３５位におけるアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸突然変異である、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」）を含む。このような一実施態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１のＦｃドメイン、特に、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインである。アミノ酸置換の組合せである「Ｐ３２９Ｇ  ＬＡＬＡ」とは、出典明示によりその全体において本明細書に援用される、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１において記載されている通り、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの、Ｆｃγ受容体（並びに補体）への結合を、ほぼ完全に消失させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号はまた、このような突然変異体Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体の結合又はエフェクター機能など、その特性を決定するための方法についても記載する。
【０２２２】
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較した、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減と、エフェクター機能の低減とを呈示する。よって、一部の実施態様では、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のＦｃドメインは、ＩｇＧ４のＦｃドメイン、特に、ヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである。一実施態様では、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、Ｓ２２８位におけるアミノ酸置換、具体的には、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む。Ｆｃ受容体への、その結合親和性、及び／又はそのエフェクター機能をさらに低減するために、一実施態様では、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、Ｌ２３５位におけるアミノ酸置換、具体的には、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む。別の実施態様では、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、Ｐ３２９位におけるアミノ酸置換、具体的には、アミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む。特定の実施態様では、ＩｇＧ４のＦｃドメインは、Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９位におけるアミノ酸置換、具体的には、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む。このようなＩｇＧ４のＦｃドメイン突然変異体、及びそれらのＦｃγ受容体結合特性については、出典明示によりその全体において本明細書に援用される、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１において記載されている。
【０２２３】
特定の実施態様では、天然ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較した、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を呈示するＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａと、任意選択的に、Ｐ３２９Ｇとを含むヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅと、任意選択的に、Ｐ３２９Ｇとを含むヒトＩｇＧ４のＦｃドメインである。
【０２２４】
ある特定の実施態様では、ＦｃドメインのＮ−グリコシル化を、消失させている。このような一実施態様では、Ｆｃドメインは、Ｎ２９７位におけるアミノ酸突然変異、特に、アスパラギンをアラニンで置きかえる（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸で置きかえる（Ｎ２９７Ｄ）アミノ酸置換を含む。
【０２２５】
本明細書上記及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１３０８３１に記載されているＦｃドメインに加えて、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減したＦｃドメインはまた、Ｆｃドメイン残基である、２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの一又は複数を置換したＦｃドメイン（米国特許第６７３７０５６号）も含む。このようなＦｃ突然変異体は、２つ又はこれを超えるアミノ酸位置である、２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７位において置換したＦｃ突然変異体であって、残基である、２６５及び２９７を、アラニンへと置換した、いわゆる、「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含むＦｃ突然変異体（米国特許第７３３２５８１号）を含む。
【０２２６】
突然変異体Ｆｃドメインは、当該技術分野で周知の遺伝子法又は化学法を使用する、アミノ酸の欠失、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝子法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。適正なヌクレオチド変化は、例えば、シーケンシングにより検証することができる。
【０２２７】
Ｆｃ受容体への結合は、ＢＩＡｃｏｒｅ計器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な計測、及び組換え発現などにより得られうるＦｃ受容体を使用して、例えば、ＥＬＩＳＡ、又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができる。本明細書では、適切なこのような結合アッセイについて記載する。代替的に、Ｆｃドメイン、又は細胞活性化二重特異性抗原結合分子であって、Ｆｃドメインを含む二重特異性抗原結合分子の、Ｆｃ受容体に対する結合親和性は、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現させるヒトＮＫ細胞など、特定のＦｃ受容体を発現させることが公知の細胞株を使用して査定することができる。
【０２２８】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のエフェクター機能は、当該技術分野で公知の方法により測定することができる。本明細書では、ＡＤＣＣを測定するのに適するアッセイについて記載する。目的の分子のＡＤＣＣ活性について評価するインビトロアッセイの他の例については、米国特許第５５００３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３，７０５９−７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８２，１４９９−１５０２（１９８５）；米国特許第５８２１３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６６，１３５１−１３６１（１９８７）において記載されている。代替的に、非放射性アッセイ法も、援用することができる（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照されたい）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的に、又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５，６５２−６５６（１９９８）において開示されている動物モデルなどの動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。
【０２２９】
一部の実施態様では、Ｆｃドメインの、補体成分への結合、具体的には、Ｃ１ｑへの結合を低減する。したがって、エフェクター機能を低減するように、Ｆｃドメインを操作する、一部の実施態様では、前記エフェクター機能の低減は、ＣＤＣの低減を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子が、Ｃ１ｑに結合することが可能であり、したがって、ＣＤＣ活性を有するのかどうかを決定することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号における、Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体の活性化について評価するために、ＣＤＣアッセイを実施することができる（例えば、Gazzano-Santoroら, J Immunol Methods 202, 163 (1996); Craggら, Blood 101, 1045-1052 (2003); 並びにCragg及びGlennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照されたい）。
【０２３０】
抗原結合部分
本発明の抗原結合分子は、二重特異性である、すなわち、２つの異なる抗原決定基への特異的結合が可能な、少なくとも２つの抗原結合部分を含む。本発明に従い、抗原結合部分は、Ｆａｂ分子（すなわち、各々が可変領域及び定常領域を含む、重鎖及び軽鎖から構成される抗原結合ドメイン）である。一実施態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒトＦａｂ分子である。別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト化Ｆａｂ分子である。さらに別の実施態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖定常領域及びヒト軽鎖定常領域を含む。
【０２３１】
抗原結合部分のうちの少なくとも１つは、クロスオーバーＦａｂ分子である。このような修飾は、異なるＦａｂ分子に由来する重鎖及び軽鎖の誤対合を防止し、これにより、組換え生成における、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の収量及び純度を改善する。本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子に有用な、特定のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖の定常領域と、Ｆａｂ重鎖の定常領域とを交換する。本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子に有用な、別のクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖の可変領域と、Ｆａｂ重鎖の可変領域とを交換する。
【０２３２】
本発明に従う特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原、特に、腫瘍細胞抗原、及びＣＤ３への同時的な結合が可能である。一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原及びＣＤ３への同時的な結合により、Ｔ細胞と、標的細胞とを架橋することが可能である。なおより特定の実施態様では、このような同時的な結合は、標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解を結果としてもたらす。一実施態様では、このような同時的な結合は、Ｔ細胞の活性化を結果としてもたらす。他の実施態様では、このような同時的な結合は、Ｔリンパ球、特に、細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答であって、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現の群から選択される細胞応答を結果としてもたらす。一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の、ＣＤ３への、標的細胞抗原への同時的な結合を伴わない結合は、Ｔ細胞の活性化を結果としてもたらさない。
【０２３３】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を、標的細胞へと再指向させることが可能である。特定の実施態様では、前記再指向は、標的細胞による、ＭＨＣ媒介性のペプチド抗原の提示及び／又はＴ細胞の特異性に依存しない。
【０２３４】
特に、本発明の実施態様のうちのいずれかに従うＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。一部の実施態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞、特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０２３５】
ＣＤ３結合部分
本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３への結合が可能な、少なくとも１つの抗原結合部分（本明細書ではまた、「ＣＤ３抗原結合部分」又は「第１の抗原結合部分」とも称する）を含む。特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３への特異的結合が可能な、１つを超えない抗原結合部分を含む。一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＣＤ３への一価の結合をもたらす。ＣＤ３抗原結合分子は、クロスオーバーＦａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖の可変領域又は定常領域を交換したＦａｂ分子である。プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子内に、標的細胞抗原への特異的結合が可能な、１つを超える抗原結合部分が含まれる実施態様では、ＣＤ３への特異的結合が可能な抗原結合部分は、好ましくは、クロスオーバーＦａｂ分子であり、標的細胞抗原への特異的結合が可能な抗原結合部分は、従来型のＦａｂ分子である。
【０２３６】
特定の実施態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３又はカニクイザルＣＤ３、最も特定すると、ヒトＣＤ３である。特定の実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、ヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３に対して交差反応性である（すなわち、これらに特異的に結合する）。一部の実施態様では、第１の抗原結合部分は、ＣＤ３のエプシロンサブユニットへの特異的結合が可能である。
【０２３７】
ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０２３８】
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号１１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２３９】
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号４４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号４６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２４０】
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な重鎖可変領域配列と、配列番号５５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な軽鎖可変領域配列とを含む。
【０２４１】
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２４２】
一実施態様では、ＣＤ３抗原結合部分は、配列番号４３の重鎖可変領域配列と、配列番号５５の軽鎖可変領域配列とを含む。
【０２４３】
標的細胞抗原結合部分
本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原への結合が可能な、少なくとも１つの抗原結合部分（本明細書ではまた、「標的細胞抗原結合部分」又は「第２の」抗原結合部分若しくは「第３の」抗原結合部分とも称する）を含む。ある特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原への結合が可能な、２つの抗原結合部分を含む。特定のこのような実施態様では、これらの抗原結合部分の各々は、同じ抗原決定基に特異的に結合する。なおより特定の実施態様では、これらの抗原結合部分の全ては、同一である。一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原への特異的結合が可能な免疫グロブリン分子を含む。一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、標的細胞抗原への結合が可能な、２つを超えない抗原結合部分を含む。
【０２４４】
好ましい実施態様では、標的細胞抗原結合部分は、特異的抗原決定基に結合し、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を、標的部位、例えば、抗原決定基を保有する、特異的種類の腫瘍細胞へと方向付けることが可能なＦａｂ分子、特に、従来型のＦａｂ分子である。
【０２４５】
ある特定の実施態様では、標的細胞抗原結合部分は、細胞表面抗原に特異的に結合する。特定の実施態様では、標的細胞抗原結合部分は、標的細胞の表面上の葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）に特異的に結合する。別のこのような具体的な実施態様では、標的細胞抗原結合部分は、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、具体的には、ヒトＥＧＦＲ、例えば、ＨＥＲ１に特異的に結合する。別のこのような具体的な実施態様では、標的細胞抗原結合部分は、ＨＥＲ２に特異的に結合する。別のこのような具体的な実施態様では、標的細胞抗原結合部分は、メソテリン、具体的には、ヒトメソテリンに特異的に結合する。
【０２４６】
ある特定の実施態様では、標的細胞抗原結合部分を、腫瘍細胞上又はウイルス感染細胞上に提示される抗原など、病理学的状態と関連する抗原へと方向付ける。適切な抗原は、例えば、細胞表面受容体であるがこれらに限定されない細胞表面抗原である。特定の実施態様では、抗原は、ヒト抗原である。具体的な実施態様では、標的細胞抗原は、葉酸受容体１（ＦｏｌＲ１）及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、具体的には、ヒトＥＧＦＲ、例えば、ＨＥＲ１から選択される。さらなる具体的な実施態様では、標的細胞抗原は、ＨＥＲ２である。さらなる具体的な実施態様では、標的細胞抗原は、メソテリンである。
【０２４７】
一部の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＨＥＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む。一実施態様では、ＨＥＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号５６、配列番号５７、及び配列番号５８からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０２４８】
一実施態様では、ＨＥＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号５６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号５７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号６０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２４９】
一実施態様では、ＨＥＲ１に特異的な抗原結合部分は、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００６／０８２５１５において開示されている、抗ＨＥＲ１抗体の重鎖ＣＤＲ配列及び軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【０２５０】
一実施態様では、ＨＥＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号３２と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号３３と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号３４と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列のうちの少なくとも１つを含む。一実施態様では、ＨＥＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号３２のポリペプチド配列、配列番号３３のポリペプチド配列、及び配列番号３４のポリペプチド配列を含む。
【０２５１】
一実施態様では、ＨＥＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖをさらに含む。一実施態様では、抗イデオタイプｓｃＦｖは、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２５２】
一実施態様では、ＨＥＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖをさらに含む。一実施態様では、抗イデオタイプｓｃＦｖは、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２５３】
一実施態様では、ＨＥＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号４１又は４２と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖをさらに含む。一実施態様では、抗イデオタイプｓｃＦｖは、配列番号４１又は４２のポリペプチド配列を含む。
【０２５４】
一実施態様では、ＨＥＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号４８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む抗イデオタイプＨＥＲ１  ｓｃＦｖをさらに含む。一実施態様では、抗イデオタイプｓｃＦｖは、配列番号４８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２５５】
一実施態様では、ＨＥＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号３５と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含むリンカーをさらに含む。
【０２５６】
一実施態様では、ＨＥＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、又は１０６と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含むプロテアーゼ認識部位を有するリンカーをさらに含む。一実施態様では、プロテアーゼ認識部位は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、又は１０６のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、プロテアーゼ認識部位は、配列番号３６のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、プロテアーゼ認識部位は、配列番号９７のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、ＨＥＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７、８、９、１０、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、又は９６と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含むリンカーをさらに含む。一実施態様では、リンカーは、配列番号７、８、９、１０、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、又は９６のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、リンカーは、配列番号７のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、リンカーは、配列番号８６のポリペプチド配列を含む。
【０２５７】
一部の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＨＥＲ２に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む。一実施態様では、ＨＥＲ２に特異的な抗原結合部分は、配列番号１４２、配列番号１４３、及び配列番号１４４からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１４８、配列番号１４９、及び配列番号１５０の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。さらなる一実施態様では、ＨＥＲ２に特異的な抗原結合部分は、配列番号１４５、配列番号１４６、及び配列番号１４７からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１４８、配列番号１４９、及び配列番号１５０の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０２５８】
一実施態様では、ＨＥＲ２に特異的な抗原結合部分は、配列番号１４２の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４３の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１４４の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５０の軽鎖ＣＤＲ３を含む。さらなる実施態様では、ＨＥＲ２に特異的な抗原結合部分は、配列番号１４５の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４６の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１４７の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１４８の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１４９の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５０の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２５９】
一実施態様では、ＨＥＲ２に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖをさらに含む。一実施態様では、抗イデオタイプｓｃＦｖは、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２６０】
一実施態様では、ＨＥＲ２に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖをさらに含む。一実施態様では、抗イデオタイプｓｃＦｖは、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２６１】
一実施態様では、ＨＥＲ２に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号４１又は４２と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖをさらに含む。一実施態様では、抗イデオタイプｓｃＦｖは、配列番号４１又は４２のポリペプチド配列を含む。
【０２６２】
一実施態様では、ＨＥＲ２に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号４８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む抗イデオタイプＨＥＲ２  ｓｃＦｖをさらに含む。一実施態様では、抗イデオタイプｓｃＦｖは、配列番号４８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２６３】
一実施態様では、ＨＥＲ２に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号３５と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含むリンカーをさらに含む。
【０２６４】
一実施態様では、ＨＥＲ２に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、又は１０６と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含むプロテアーゼ認識部位を有するリンカーをさらに含む。一実施態様では、プロテアーゼ認識部位は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、又は１０６のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、プロテアーゼ認識部位は、配列番号３６のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、プロテアーゼ認識部位は、配列番号９７のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、ＨＥＲ２に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７、８、９、１０、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、又は９６と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含むリンカーをさらに含む。一実施態様では、リンカーは、配列番号７、８、９、１０、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、又は９６のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、リンカーは、配列番号７のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、リンカーは、配列番号８６のポリペプチド配列を含む。
【０２６５】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号１３２と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号１３６と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号８１と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号１３３と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。
【０２６６】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号１３２のポリペプチド配列、配列番号１３６のポリペプチド配列、配列番号８１のポリペプチド配列、及び配列番号１３３のポリペプチド配列を含む。
【０２６７】
特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ＦｏｌＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む。一実施態様では、ＦｏｌＲ１は、ヒトＦｏｌＲ１である。一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ヒトＦｏｌＲ１に特異的であり、ヒトＦｏｌＲ２又はヒトＦｏｌＲ３に結合しない、少なくとも１つの抗原結合部分を含む。一実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０２６８】
一実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号１４の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１７の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１８の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２６９】
さらなる実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号４７と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な重鎖可変領域配列、及び配列番号５５と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するこれらの変異体を含む。
【０２７０】
一実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２７１】
一実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号１５１、配列番号１５２、及び配列番号１５３からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１５４、配列番号１５５、及び配列番号１５６の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０２７２】
一実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号１５１の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１５２の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１５３の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１５４の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１５５の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５６の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２７３】
さらなる実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号１５７と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な重鎖可変領域配列、及び配列番号１５８と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するこれらの変異体を含む。
【０２７４】
一実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な抗原結合部分は、配列番号１５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２７５】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号２と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号１と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。
【０２７６】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号２のポリペプチド配列、及び配列番号１のポリペプチド配列を含む。
【０２７７】
一実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖをさらに含む。一実施態様では、抗イデオタイプｓｃＦｖは、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２７８】
一実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖをさらに含む。一実施態様では、抗イデオタイプｓｃＦｖは、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２７９】
一実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号４１又は４２と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖをさらに含む。一実施態様では、抗イデオタイプｓｃＦｖは、配列番号４１又は４２のポリペプチド配列を含む。
【０２８０】
一実施態様では、ＦｏｌＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、又は１０６と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含むプロテアーゼ認識部位を有するリンカーをさらに含む。一実施態様では、プロテアーゼ認識部位は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、又は１０６のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、プロテアーゼ認識部位は、配列番号３６のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、プロテアーゼ認識部位は、配列番号９７のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、ＦｏｒＲ１に特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７、８、９、１０、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、又は９６と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含むリンカーをさらに含む。一実施態様では、リンカーは、配列番号７、８、９、１０、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、又は９６のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、リンカーは、配列番号７のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、リンカーは、配列番号８６のポリペプチド配列を含む。
【０２８１】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号１と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号３と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号７２と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。
【０２８２】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号１と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号３と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号７２と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。
【０２８３】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号１と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号３と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号８５と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。
【０２８４】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号１と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号３と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号７３と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号７４と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。
【０２８５】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号１のポリペプチド配列、配列番号３のポリペプチド配列、及び配列番号７２のポリペプチド配列を含む。
【０２８６】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号１のポリペプチド配列、配列番号３のポリペプチド配列、及び配列番号８５のポリペプチド配列を含む。
【０２８７】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号１のポリペプチド配列、配列番号３のポリペプチド配列、配列番号７３のポリペプチド配列、及び配列番号７４のポリペプチド配列を含む。
【０２８８】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号１３７と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号１３９と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号８１と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号１３８と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。
【０２８９】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号１３７のポリペプチド配列、配列番号１３９のポリペプチド配列、配列番号８１のポリペプチド配列、及び配列番号１３８のポリペプチド配列を含む。
【０２９０】
特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、メソテリンに特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む。一実施態様では、メソテリンは、ヒトメソテリンである。一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、ヒトメソテリンに特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む。一実施態様では、メソテリンに特異的な抗原結合部分は、配列番号１０７、配列番号１０８、及び配列番号１０９からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１１０、配列番号１１１、及び配列番号１１２の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【０２９１】
一実施態様では、メソテリンに特異的な抗原結合部分は、配列番号１０７の重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０８の重鎖ＣＤＲ２、配列番号１０９の重鎖ＣＤＲ３、配列番号１１０の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１１の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１１２の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２９２】
さらなる実施態様では、メソテリンに特異的な抗原結合部分は、配列番号１１３と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な重鎖可変領域配列、及び配列番号１１４と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一な軽鎖可変領域配列、又は機能性を保持するこれらの変異体を含む。
【０２９３】
一実施態様では、メソテリンに特異的な抗原結合部分は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０２９４】
一実施態様では、メソテリンに特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖをさらに含む。一実施態様では、抗イデオタイプｓｃＦｖは、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２９５】
一実施態様では、メソテリンに特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖをさらに含む。一実施態様では、抗イデオタイプｓｃＦｖは、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０２９６】
一実施態様では、メソテリンに特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号４１又は４２と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖをさらに含む。一実施態様では、抗イデオタイプｓｃＦｖは、配列番号４１又は４２のポリペプチド配列を含む。
【０２９７】
一実施態様では、メソテリンに特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、又は１０６と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含むプロテアーゼ認識部位を有するリンカーをさらに含む。一実施態様では、プロテアーゼ認識部位は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、又は１０６のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、プロテアーゼ認識部位は、配列番号３６のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、プロテアーゼ認識部位は、配列番号９７のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、メソテリンに特異的な、少なくとも１つの抗原結合部分を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７、８、９、１０、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、又は９６と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含むリンカーをさらに含む。一実施態様では、リンカーは、配列番号７、８、９、１０、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、又は９６のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、リンカーは、配列番号７のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、リンカーは、配列番号８６のポリペプチド配列を含む。
【０２９８】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７７と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号７８と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号８１と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号８２と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。
【０２９９】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７６と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号７７と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号７８と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号７９と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。
【０３００】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７７のポリペプチド配列、配列番号７８のポリペプチド配列、配列番号８１のポリペプチド配列、及び配列番号８２のポリペプチド配列を含む。
【０３０１】
一実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７６のポリペプチド配列、配列番号７７のポリペプチド配列、配列番号７８のポリペプチド配列、及び配列番号７９のポリペプチド配列を含む。
【０３０２】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７６と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号７７と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号７８と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号８１と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。
【０３０３】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７７と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号７８と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、配列番号８１と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列、及び配列番号８４と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。
【０３０４】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７６のポリペプチド配列、配列番号７７のポリペプチド配列、配列番号７８のポリペプチド配列、及び配列番号８１のポリペプチド配列を含む。
【０３０５】
一実施態様では、Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、配列番号７７のポリペプチド配列、配列番号７８のポリペプチド配列、配列番号８１のポリペプチド配列、及び配列番号８４のポリペプチド配列を含む。
【０３０６】
マスキング部分
本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、少なくとも１つのマスキング部分を含む。他者らは、結合部分により認識される抗原の断片で結合部分をキャッピングすることにより、抗体の結合をマスキングしようと試みてきた（例えば、国際公開第２０１３１２８１９４号）。この手法は、いくつかの限界を有する。例えば、抗原の使用は、結合部分の親和性の低減において、それほどの柔軟性を可能としない。これは、親和性が、抗原マスクにより信頼できる形でマスキングするのに十分な程度に大きくなければならないためである。また、解離された抗原は、インビボにおいて、そのコグネイト受容体に潜在的に結合し、これらと相互作用し、このような受容体を発現させる細胞へと、所望されないシグナルを引き起こす場合もあろう。これに対し、本明細書で記載される手法は、抗イデオタイプ抗体又はその断片を、マスクとして使用する。有効なマスキング部分をデザインするための、２つの相反する検討事項は、１．マスキングの有効性、及び２．マスキングの可逆性である。親和性が小さ過ぎれば、マスキングは、無効となろう。しかし、親和性が大き過ぎれば、マスキング工程は、たやすく可逆的とはなりえないだろう。高親和性の抗イデオタイプマスクがよりよく作用するのか、低親和性の抗イデオタイプマスクがよりよく作用するのかは、予測できなかった。本明細書で記載される通り、高親和性マスキング部分の方が、抗原結合部位のマスキングにおいて、全般的により高性能であり、同時に、分子を活性化させるために有効に除去することができた。一実施態様では、抗イデオタイプマスクは、１−８ｎＭのＫＤを有する。一実施態様では、抗イデオタイプマスクは、３７℃で、２ｎＭのＫＤを有する。具体的な一実施態様では、マスキング部分は、ＣＤ３、例えば、ヒトＣＤ３への特異的結合が可能な、第１の抗原結合部分のイデオタイプを認識する。具体的な一実施態様では、マスキング部分は、標的細胞抗原への結合が可能な、第２の抗原結合部分のイデオタイプを認識する。
【０３０７】
一実施態様では、マスキング部分は、ＣＤ３結合部分をマスキングし、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。一実施態様では、マスキング部分は、配列番号２０の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２２の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０３０８】
一実施態様では、マスキング部分は、ＣＤ３結合部分をマスキングし、配列番号４１と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。一実施態様では、マスキング部分は、ＣＤ３結合部分をマスキングし、配列番号４１のポリペプチド配列を含む。
【０３０９】
好ましい一実施態様では、マスキング部分は、ＣＤ３結合部分をマスキングし、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。一実施態様では、マスキング部分は、配列番号２６の重鎖ＣＤＲ１、配列番号２７の重鎖ＣＤＲ２、配列番号２８の重鎖ＣＤＲ３、配列番号２９の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３０の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３１の軽鎖ＣＤＲ３を含む。一実施態様では、マスキング部分は、ＣＤ３結合部分をマスキングし、配列番号４２と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリペプチド配列を含む。好ましい一実施態様では、マスキング部分は、ＣＤ３結合部分をマスキングし、配列番号４２のポリペプチド配列を含む。
【０３１０】
一実施態様では、マスキング部分は、ＨＥＲ１結合部分をマスキングし、配列番号４８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ３のうちの少なくとも１つを含む。一実施態様では、抗イデオタイプｓｃＦｖは、配列番号４８の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４９の重鎖ＣＤＲ２、配列番号５０の重鎖ＣＤＲ３、配列番号５１の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号５２の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号５３の軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【０３１１】
一態様では、本発明は、分子の抗原結合部位の、抗原への結合を可逆的に隠蔽するための、イデオタイプ特異的ポリペプチドに関する。一実施態様では、本発明は、分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠蔽するための、イデオタイプ特異的ポリペプチドに関する。抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠蔽するための、このようなイデオタイプ特異的ポリペプチドは、抗ＣＤ３抗原結合部位のイデオタイプへの特異的結合が可能であり、これにより、抗ＣＤ３抗原結合部位の、ＣＤ３への結合を低減するか、又は失効させることが可能でなければならない。一実施態様では、本発明は、分子の抗ＨＥＲ１抗原結合部位を可逆的に隠蔽するための、イデオタイプ特異的ポリペプチドに関する。一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、抗イデオタイプｓｃＦｖである。一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、リンカーを介して分子と共有結合している。一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、１つを超えるリンカーを介して分子と共有結合している。一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、２つのリンカーを介して分子と共有結合している。一実施態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。一実施態様では、リンカーは、プロテアーゼ切断型リンカーである。一実施態様では、リンカーは、配列番号７、８、９、又は１０の配列を含む。一実施態様では、リンカーは、配列番号７、８、９、１０、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、又は９６の配列を含む。一実施態様では、リンカーは、配列番号７のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、リンカーは、配列番号８６のポリペプチド配列を含む。一実施態様では、ペプチドリンカーは、少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む。一実施態様では、プロテアーゼ認識部位は、配列番号３６、３７、３８、３９、４０、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、又は１０６のポリペプチド配列を含む。好ましい一実施態様では、プロテアーゼ認識部位は、プロテアーゼ認識配列ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号３６）を含む。さらなる実施態様では、リンカーは、１つを超えるプロテアーゼ認識部位を含む。好ましい一実施態様では、プロテアーゼ認識部位は、プロテアーゼ認識配列ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号９７）を含む。一実施態様では、プロテアーゼは、メタロプロテイナーゼ、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）１−２８、並びにディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ）２、７−１２、１５、１７−２３、２８−３０、及び３３、セリンプロテアーゼ、例えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子及びマトリプターゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、並びにカテプシンプロテアーゼからなる群から選択される。具体的な一実施態様では、プロテアーゼは、ＭＭＰ９又はＭＭＰ２である。さらなる具体的な実施態様では、プロテアーゼは、マトリプターゼである。
【０３１２】
一実施態様では、抗ＣＤ３抗原結合部位を含む分子は、Ｔ細胞活性化二重特異性分子である。特定の一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、ＤＹＳＩＨ（配列番号２０）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＡＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２１）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及びＰＹＤＹＤＶＬＤＹ（配列番号２２）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む。特定の一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＮＹＳＹＩＨ（配列番号２３）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号２４）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及びＱＨＳＲＥＦＰＷＴ（配列番号２５）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む。特定の一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、ＤＹＳＩＨ（配列番号２０）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＡＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２１）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；ＰＹＤＹＤＶＬＤＹ（配列番号２２）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域と；ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＮＹＳＹＩＨ（配列番号２３）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号２４）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及びＱＨＳＲＥＦＰＷＴ（配列番号２５）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。特定の一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、ＳＹＧＶＳ（配列番号２６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号２７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及びＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号２８）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む。特定の一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、ＲＡＳＥＮＩＤＳＹＬＡ（配列番号２９）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号３０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及びＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号３１）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む。特定の一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、ＳＹＧＶＳ（配列番号２６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号２７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号２８）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域と；ＲＡＳＥＮＩＤＳＹＬＡ（配列番号２９）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号３０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及びＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号３１）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列である、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１；配列番号４９のアミノ酸配列であるＣＤＲ  Ｈ２；及び配列番号５０のアミノ酸配列であるＣＤＲ  Ｈ３のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む。一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号５１のアミノ酸配列である、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１；配列番号５２のアミノ酸配列であるＣＤＲ  Ｌ２；及び配列番号５３のアミノ酸配列であるＣＤＲ  Ｌ３のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む。一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、配列番号４８のアミノ酸配列である、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１；配列番号４９のアミノ酸配列であるＣＤＲ  Ｈ２；及び配列番号５０のアミノ酸配列であるＣＤＲ  Ｈ３を含む重鎖可変領域と、配列番号５１のアミノ酸配列である、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１；配列番号５２のアミノ酸配列であるＣＤＲ  Ｌ２；及び配列番号５３のアミノ酸配列であるＣＤＲ  Ｌ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
【０３１３】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本明細書で記載される、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドも提供する。一部の実施態様では、前記断片は、抗原結合断片である。
【０３１４】
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６２−７１又はそれらの機能的断片若しくは変異体を含む配列番号に明示された配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドはさらに、それらの機能的断片又は変異体を含む配列番号１１７−１３１に明示された配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリヌクレオチドも含む。本発明のポリヌクレオチドはさらに、それらの機能的断片又は変異体を含む配列番号１６２−１７０に明示された配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なポリヌクレオチドも含む。
【０３１５】
本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子をコードするポリヌクレオチドは、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現させることもでき、共発現する複数の（例えば、２つ又はこれを超える）ポリヌクレオチドとして発現させることもできる。共発現するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、機能的なプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を形成するように、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合しうる。例えば、抗原結合部分の軽鎖部分は、抗原結合部分の重鎖部分と、Ｆｃドメインサブユニットと、任意選択的に、別の抗原結合部分（の一部）を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の部分に由来する、別個のポリヌクレオチドによりコードされうる。共発現させると、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合して、抗原結合部分を形成するであろう。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットのうちの一方と、任意選択的に、一又は複数の抗原結合部分（の一部）を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の部分は、２つのＦｃドメインサブユニットのうちの他方と、任意選択的に、抗原結合部分（の一部）を含む、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の部分に由来する、別個のポリヌクレオチドによりコードされうるであろう。共発現させると、Ｆｃドメインサブユニットは、会合して、Ｆｃドメインを形成するであろう。
【０３１６】
一部の実施態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書で記載される、本発明に従うプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の全体をコードする。他の実施態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書で記載される、本発明に従うプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子に含まれるポリペプチドをコードする。
【０３１７】
別の実施態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。別の実施態様では、本発明は、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４７、又は５５に示すポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。別の実施態様では、本発明は、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４７、５５、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５に示すポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。別の実施態様では、本発明は、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４７、５５、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、又は１４１に示すポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。別の実施態様では、本発明はさらに、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、又は７１に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な配列を含むポリヌクレオチドも対象とする。別の実施態様では、本発明はさらに、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、又は１３１に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な配列を含むポリヌクレオチドも対象とする。別の実施態様では、本発明はさらに、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、又は１７０に示されるヌクレオチド配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な配列を含むポリヌクレオチドも対象とする。別の実施態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、又は７１に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。別の実施態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、又は１３１に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。別の実施態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、又は１７０に示される核酸配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。別の実施態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号４３、４７、又は５５のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。本発明は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、保存的アミノ酸置換を伴う、配列番号４３、４７、又は５５の可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包摂する。
【０３１８】
別の実施態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号４３、４７、５５、１１３、１１４、１１５、又は１１６のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。本発明は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、保存的アミノ酸置換を伴う、配列番号４３、４７、５５、１１３、１１４、１１５、又は１１６の可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包摂する。
【０３１９】
別の実施態様では、本発明は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号４３、４７、５５、１１３、１１４、１１５、１１６、１５７、１５８、１５９、１６０、又は１６１のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一な可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを対象とする。本発明は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、保存的アミノ酸置換を伴う、配列番号４３、４７、５５、１１３、１１４、１１５、１１６、１５７、１５８、１５９、１６０、又は１６１の可変領域配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包摂する。
【０３２０】
ある特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある。
【０３２１】
本発明はまた、本明細書で記載されるイデオタイプ特異的ポリペプチド又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドも提供する。一部の実施態様では、前記断片は、イデオタイプ結合、すなわち、抗イデオタイプ特異的抗体又はその断片である。一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、抗イデオタイプｓｃＦｖである。
【０３２２】
本発明はまた、本発明のイデオタイプ特異的ポリペプチド又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、４８、４９、５０、５１、５２、及び５３のうちの一又は複数のポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドも包摂する。本発明はまた、本発明のイデオタイプ特異的ポリペプチド又はその断片をコードする単離ポリヌクレオチドであって、保存的アミノ酸置換を伴う、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、４８、４９、５０、５１、５２、及び５３のうちの一又は複数のポリペプチド配列をコードする配列を含むポリヌクレオチドも包摂する。
【０３２３】
本発明のイデオタイプ特異的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、イデオタイプ特異的ポリペプチドの全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現させることもでき、共発現する複数の（例えば、２つ又はこれを超える）ポリヌクレオチドとして発現させることもできる。共発現するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、機能的なイデオタイプ特異的ポリペプチド、例えば、マスキング部分を形成するように、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合しうる。例えば、一実施態様では、イデオタイプ特異的ポリペプチドは、抗イデオタイプｓｃＦｖ（単鎖可変断片）であり、この場合、抗イデオタイプｓｃＦｖの軽鎖可変部分は、抗イデオタイプｓｃＦｖの重鎖可変部分を含む抗イデオタイプｓｃＦｖの部分に由来する別個のポリヌクレオチドによりコードされうる。共発現すると、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合して、抗イデオタイプｓｃＦｖを形成するであろう。一部の実施態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書で記載される、本発明に従うイデオタイプ特異的ポリペプチドをコードする。
【０３２４】
ある特定の実施態様では、ポリヌクレオチド又は核酸は、ＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。本発明のＲＮＡは、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある。
【０３２５】
組換え法
本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、例えば、固体相ペプチド合成（例えば、メリフィールド固体相合成）又は組換え生成により得ることができる。組換え生成のためには、例えば、上記で記載したように、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子（断片）をコードする、一又は複数のポリヌクレオチドを、宿主細胞内の、さらなるクローニング及び／又は発現のために、一又は複数のベクターへと単離及び挿入する。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を使用して、たやすく単離及びシーケンシングすることができる。一実施態様では、本発明のポリヌクレオチドのうちの一又は複数を含むベクター、好ましくは、発現ベクターを提供する。当業者に周知の方法を使用して、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子（断片）のコード配列を、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ法、合成法、及びインビボにおける組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌら，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）において記載されている技法を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部の場合もあり、核酸断片の場合もある。発現ベクターは、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子（断片）（すなわち、コード化領域）をコードするポリヌクレオチドを、プロモーター及び／又は他の転写制御エレメント若しくは翻訳制御エレメントと作動可能に関連させてクローニングした発現カセットを含む。本明細書で使用される「コード化領域」とは、アミノ酸へと翻訳されるコドンからなる、核酸の部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）は、アミノ酸へと翻訳されないものの、存在する場合、コード化領域の一部であると考えられうるが、任意のフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’側非翻訳領域及び３’側非翻訳領域などは、コード化領域の一部ではない。２つ又はこれを超えるコード化領域は、単一のポリヌクレオチドコンストラクト内、例えば、単一のベクター上、又は個別のポリヌクレオチドコンストラクト内、例えば、個別の（異なる）ベクター上に存在しうる。さらに、任意のベクターは、単一のコード化領域を含有する場合もあり、２つ又はこれを超えるコード化領域を含む場合もあり、例えば、本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後に、又は翻訳と同時に、最終的なタンパク質へと分離される、一又は複数のポリペプチドをコードしうる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子（断片）、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドへと融合���せているか、又は融合させていない、異種コード化領域もコードしうる。異種コード化領域は、限定せずに述べると、分泌性シグナルペプチド又は異種機能ドメインなど、特化されたエレメント又はモチーフを含む。作動可能な関連とは、遺伝子産物の発現を、調節配列の影響下又は制御下に置くような形で、遺伝子産物のコード化領域、例えば、ポリペプチドを、一又は複数の調節配列と関連させる場合の関連である。プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を結果としてもたらし、２つのＤＮＡ断片の間の連関の性質が、発現調節配列が遺伝子産物の発現を方向付ける能力に干渉しないか、又はＤＮＡ鋳型の被転写能に干渉しない、２つのＤＮＡ断片（ポリペプチドコード化領域及びこれと関連するプロモーターなど）は、「作動可能に関連」している。したがって、プロモーターが、この核酸の転写をもたらすことが可能な場合、プロモーター領域は、ポリペプチドをコードする核酸と、作動可能に関連しているであろう。プロモーターは、所定の細胞内に限り、ＤＮＡの実質的な転写を方向付ける、細胞特異的プロモーターでありうる。プロモーターのほか、他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルも、細胞特異的転写を方向付けるように、ポリヌクレオチドと作動可能に関連させることができる。本明細書では、適切なプロモーター及び他の転写制御領域が開示される。当業者には、様々な転写制御領域が公知である。これらは、限定せずに述べると、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域であって、サイトメガロウイルス（例えば、イントロンＡと併せた前早期プロモーター）、シミアンウイルス４０（例えば、早期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルスなど）に由来するプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメントなどであるがこれらに限定されない転写制御領域を含む。他の転写制御領域は、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、及びウサギａ−グロビンなど、脊椎動物遺伝子に由来する転写制御領域のほか、真核細胞内の遺伝子発現を制御することが可能な他の配列を含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及び組織特異的エンハンサーのほか、誘導的プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、様々な翻訳制御エレメントは、当業者に公知である。これらは、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン及び翻訳終結コドン、並びにウイルス系に由来するエレメント（特に、ＣＩＴＥ配列ともまた称する、内部リボソーム侵入部位又はＩＲＥＳ）を含むがこれらに限定されない。発現カセットはまた、複製開始点及び／又はレトロウイルス長末端反復（ＬＴＲ）若しくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆末端反復（ＩＴＲ）などの染色体組込みエレメントなど、他の特徴も含みうる。
【０３２６】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸のコード化領域は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの分泌を方向付ける、分泌性ペプチド又はシグナルペプチドをコードする、さらなるコード化領域と関連しうる。例えば、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の分泌が所望である場合、シグナル配列をコードするＤＮＡを、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片をコードする核酸の上流に配置することができる。シグナル仮説に従うと、哺乳類細胞により分泌されるタンパク質は、増殖するタンパク質鎖の、粗面小胞体を越える移出が開始されると、成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞により分泌されるポリペプチドが一般に、ポリペプチドの分泌形態又は「成熟」形態を産生するように、翻訳されたポリペプチドから切断される、ポリペプチドのＮ末端へと融合させたシグナルペプチドを有することを承知している。ある特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリンの重鎖若しくは軽鎖のシグナルペプチド、又はこれと作動可能に関連させたポリペプチドの分泌を方向付ける能力を保持する配列の機能的な誘導体を使用する。代替的に、異種哺乳類のシグナルペプチド、又はその機能的な誘導体も使用することができる。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換することができる。
【０３２７】
後の精製（例えば、ヒスチジンタグ）を容易とするのに使用される場合もあり、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子への標識付けの一助とするのに使用される場合もある、短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子（断片）をコードするポリヌクレオチド内に組み入れることもでき、この末端に組み入れることもできる。
【０３２８】
さらなる実施態様では、本発明の、一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。ある特定の実施態様では、本発明の、一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターのそれぞれとの関連で、本明細書で記載される特徴のうちのいずれかを、単独で、又は組合せで組み込みうる。このような一実施態様では、宿主細胞は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えば、これらで形質転換されているか、又はこれらをトランスフェクトされている）。本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその断片を作出するように操作されうる、任意の種類の細胞系を指す。当該技術分野では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を複製し、その発現を支援するのに適する宿主細胞が周知である。このような細胞に、適切な場合、特定の発現ベクターをトランスフェクト又は形質導入することができ、臨床適用に十分な数量のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を得るように、大量のベクター含有細胞を、大スケールの発酵槽内の播種のために増殖させることができる。適切な宿主細胞は、大腸菌などの原核微生物、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞など、多様な真核細胞を含む。例えば、ポリペプチドは、グリコシル化を必要としない場合は特に、細菌内で生成することができる。発現の後、ポリペプチドを、可溶型画分内の細菌細胞ペーストから単離することができ、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母などの真核微生物も、ポリペプチドコードベクターに適する、クローニング宿主又は発現宿主であって、それらのグリコシル化経路が「ヒト化」されている結果として、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを伴うポリペプチドの生成をもたらす真菌株及び酵母株を含む宿主である。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２２，１４０９−１４１４（２００４）；及びＬｉら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４，２１０−２１５（２００６）を参照されたい。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適する宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞を含む。昆虫細胞と併せて使用することが可能であり、特に、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのための、多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物もまた、宿主として活用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、同第６０４０４９８号、同第６４２０５４８号、同第７１２５９７８号、及び同第６４１７４２９号（トランスジェニック植物において抗体を生成するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術について記載する）を参照されたい。脊椎動物細胞もまた、宿主として使用することができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合させた哺乳類細胞株は、有用でありうる。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０で形質転換された、サル腎臓Ｃ��１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児性腎臓株（例えば、Grahamら, J Gen Virol 36, 59 (1977)において記載されている２９３、又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)において記載されているＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えば、Matherら, Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)において記載されている）、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Urlaubら, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)）；並びにＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３、及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質の生成に適する、ある特定の哺乳類宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ及びＷｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞は、ごく少数を挙げれば、培養細胞、例えば、哺乳類培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞、及び植物細胞を含むが、また、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物組織若しくは動物組織の中に含まれる細胞も含む。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、好ましくは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２０細胞）などの哺乳類細胞である。
【０３２９】
当該技術分野では、これらの系内で、外来遺伝子を発現させる、標準的な技術が公知である。発現産物が、重鎖及び軽鎖のいずれも有する抗体となるよう、抗体鎖の他方もまた発現させるように、抗体など、抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現させる細胞を操作することができる。
【０３３０】
一実施態様では、本発明に従うプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を生成する方法であって、本明細書で提示されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の発現に適する条件下で培養することと、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から回収することとを含む方法が提供される。
【０３３１】
プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の成分を、互いに遺伝子融合させる。プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、その成分を、互いに直接的に融合させることもでき、リンカー配列を介して間接的に融合させることもできるようにデザインすることができる。リンカーの組成物及び長さは、当該技術分野で周知の方法に従い決定することができ、有効性について調べることができる。異なるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の成分の間のリンカー配列の例は、本明細書で提示される配列内に見出される。所望の場合、さらなる配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を、切断部位を組み込んで融合体の個別の成分を分離するために含めることができる。
【０３３２】
ある特定の実施態様では、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の、一又は複数の抗原結合部分は、抗原決定基への結合が可能な、少なくとも１つの抗体可変領域を含む。可変領域は、天然に存在するか又は天然に存在しない、抗体及びその断片の一部を形成する場合もあり、これに由来する場合もある。当該技術分野では、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法が周知である（例えば、Harlow及びLane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい）。天然に存在しない抗体は、固体相ペプチド合成を使用して構築することができ、組換えにより生成すること（例えば、米国特許第４１８６５６７号で記載されている）もでき、例えば、可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより得ることもできる（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照されたい）。
【０３３３】
任意の動物種の抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン、又は可変領域を、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子内で使用することができる。本発明で有用な、非限定的な抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン、又は可変領域は、マウス、霊長類、又はヒト由来のものでありうる。プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子が、ヒトにおける使用を目的とする場合、抗体の定常領域がヒトに由来する、抗体のキメラ形態も使用することができる。当該技術分野で周知の方法に従い、抗体のヒト化形態又は完全ヒト形態もまた調製することができる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒによる、米国特許第５５６５３３２号を参照されたい）。ヒト化は、（ａ）極めて重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保持するのに重要なフレームワーク残基）の保持を伴うか又は伴わずに、非ヒト（例えば、ドナー抗体）ＣＤＲを、ヒト（例えば、レシピエント抗体）フレームワーク及びヒト定常領域へとグラフトする方法、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原間相互作用に極めて重要な残基）のみを、ヒトフレームワーク及びヒト定常領域へとグラフトする方法、又は（ｃ）非ヒト可変ドメインの全体を移植するが、表面残基の置きかえにより、それらをヒト様区画で「クローキングする」方法を含むがこれらに限定されない、多様な方法により達成することができる。ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ及びＦｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  １３，１６１９−１６３３（２００８）において総説されており、例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３−３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６，１００２９−１００３３（１９８９）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１，６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＯｉ，Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４，６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎ  ３１（３），１６９−２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６，２５−３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングについて記載する）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８，４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェイシング」について記載する）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６，４３−６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」について記載する）；並びにＯｓｂｏｕｒｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６，６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａら，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３，２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングのための「誘導選択」法について記載する）においてさらに記載されている。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当該技術分野で公知の多様な技法を使用して生成することができる。ヒト抗体については、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ及びｖａｎ  ｄｅ  Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５，３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０，４５０−４５９（２００８）において一般的に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法により作製されるヒトモノクローナル抗体の一部を形成することが可能であり、これに由来しうる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照されたい））。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、免疫原を、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体、又はヒト可変領域を伴うインタクトな抗体を生成するように改変されたトランスジェニック動物へと投与することにより調製することもできる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照されたい）。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択された、Ｆｖクローン可変領域配列を単離することにより作出することもできる（例えば、Hoogenboomら, in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brienら編, Human Press, Totowa, NJ, 2001);及びMcCaffertyら, Nature 348, 552-554; Clacksonら, Nature 352, 624-628 (1991)を参照されたい）。ファージは典型的に、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片として提示する。
【０３３４】
ある特定の実施態様では、本発明で有用な抗原結合部分を、例えば、出典明示によりその全体が本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号において開示されている方法に従い、結合親和性を増強するように操作する。本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子が、特異的抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、又は当業者が精通している他の技法、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｔ１００システム上で解析する）（Liljebladら, Glyco J 17, 323-329 (2000)）、及び従来の結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）を介して測定することができる。競合アッセイを使用して、特定の抗原への結合について、参照抗体と競合する、抗体、抗体断片、抗原結合ドメイン、又は可変ドメイン、例えば、ＣＤ３への結合について、Ｖ９抗体と競合する抗体を同定することができる。ある特定の実施態様では、このような競合抗体は、参照抗体が結合する同じエピトープ（例えば、直鎖状エピトープ又はコンフォメーションエピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための、詳細な例示的方法については、Ｍｏｒｒｉｓ（１９９６）“Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６６（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）に提示されている。例示的な競合アッセイでは、固定化抗原（例えば、ＣＤ３）を、抗原に結合する、第１の標識化抗体（例えば、米国特許第６０５４２９７号に記載されているＶ９抗体）と、抗原への結合について、第１の抗体と競合するその能力について調べられる、第２の非標識化抗体とを含む溶液中でインキュベートする。第２の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在しうる。コントロールとして、固定化抗原を、第１の標識化抗体は含むが、第２の非標識化抗体は含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の、抗原への結合を許容する条件下におけるインキュベーション後、過剰な非結合抗体を除去し、固定化抗原と会合した標識の量を測定する。被験試料中の、固定化抗原と会合する標識の量が、コントロール試料と比べて実質的に低減された場合は、第２の抗体が、抗原への結合について、第１の抗体と競合していることを指し示す。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｃｈ．１４（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。
【０３３５】
本明細書で記載される通りに調製された、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど、当該技術分野で公知の技法により精製することができる。特定のタンパク質を精製するのに使用される実際の条件は、部分的に、正味の電荷、疎水性、親水性などの因子に依存し、当業者には明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子が結合する、抗体、リガンド、受容体、又は抗原を使用することができる。例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の精製のために、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスを使用することができる。逐次的な、プロテインＡ又はプロテインＧによるアフィニティークロマトグラフィー、及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、実施例で本質的に記載される、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を単離することができる。プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の純度は、周知の様々な解析法であって、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む方法のうちのいずれかにより決定することができる。例えば、実施例で記載される通りに発現させた重鎖融合タンパク質は、インタクトであり、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより裏付けられる通り、適正にアセンブルされることが示された（例えば、図８−１２を参照されたい）。３つのバンドを、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の、軽鎖、重鎖、及び重鎖／軽鎖の融合タンパク質の予測分子量に対応する、約Ｍｒ  ２５，０００、Ｍｒ  ５０，０００、及びＭｒ  ７５，０００で分解した。
【０３３６】
アッセイ
本明細書で提示されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、当該技術分野で公知の多様なアッセイにより、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性を、同定することもでき、それらについてスクリーニングすることもでき、それらの特徴を明らかにすることもできる。
【０３３７】
親和性アッセイ
プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の、Ｆｃ受容体又は標的抗原に対する親和性は、実施例で明示される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ計器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な計測、及び組換え発現により得られうるような受容体又は標的タンパク質を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対する、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の結合は、例えば、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、特定の受容体又は標的抗原を発現させる細胞株を使用して査定することができる。結合親和性を測定するための、具体的な例示的（ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｖｅ及びｅｘｅｍｐｌａｒｙ）実施態様については、以下及び下記の実施例で記載する。
【０３３８】
一実施態様に従い、ＫＤを、２５℃で、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する、表面プラズモン共鳴により測定する。
【０３３９】
Ｆｃ部分とＦｃ受容体との間の相互作用を解析するには、Ｈｉｓタグ付けした組換えＦｃ受容体を、ＣＭ５チップ上に固定化した抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）により捕捉し、二重特異性コンストラクトを、被分析物として使用する。略述すると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、供給業者の指示書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性化させる。５μｌ／分の流速の注射の前に、抗ペンタＨｉｓ抗体を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０で、４０μｇ／ｍｌへと希釈して、約６５００反応単位（ＲＵ）のカップリングタンパク質を達成する。リガンドの注射後、１Ｍのエタノールアミンを注射して、反応しなかった基をブロックする。その後、Ｆｃ受容体を、４又は１０ｎＭで、６０秒間にわたり捕捉する。反応速度の測定のために、二重特異性コンストラクトの、４倍の段階希釈液（５００ｎＭから４０００ｎＭの間の範囲）を、ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）中、２５℃、３０μｌ／分の流速で、１２０秒間にわたり注射する。
【０３４０】
標的抗原に対する親和性を決定するために、二重特異性コンストラクトを、抗ペンタＨｉｓ抗体について記載されている、活性化ＣＭ５センサーチップ表面上に固定化されている、抗ヒトＦａｂ特異的抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により捕捉する。カップリングタンパク質の最終量は、約１２０００ＲＵである。二重特異性コンストラクトを、３００ｎＭで、９０秒間にわたり捕捉する。標的抗原は、濃度範囲を２５０から１０００ｎＭとする、３０μｌ／分の流速で、１８０秒間にわたり、フローセルを流過させる。解離は、１８０秒間にわたりモニタリングする。
【０３４１】
参照フローセル上で得られる応答を控除することにより、バルク屈折率の差異を補正する。定常状態応答を使用して、非線形曲線の、ラングミュア結合についての等温曲線への当てはめにより、解離定数であるＫＤを導出した。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）は、会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時的に当てはめることにより、単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．１．１）を使用して計算する。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算する。例えば、Ｃｈｅｎら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３，８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。
【０３４２】
活性アッセイ
本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の生物活性は、実施例で記載される多様なアッセイにより測定することができる。生物学的活性は、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞内のシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞内の活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞など、標的細胞の溶解の誘導、並びに腫瘍の縮小及び／又は生存の改善の誘導を含みうる。
【０３４３】
組成物、製剤、及び投与経路
さらなる態様では、本発明は、例えば、下記の治療法のうちのいずれかにおける使用のための、本明細書で提示されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のうちのいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提示されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のうちのいずれかと、薬学的に許容される担体を含む。別の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書で提示されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のうちのいずれかと、例えば、下記で記載される、少なくとも１つのさらなる治療剤とを含む。
【０３４４】
さらに、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を、インビボにおける投与に適する形態で生成する方法であって、（ａ）本発明に従うプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を得ることと、（ｂ）プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を、少なくとも１つの薬学的に許容される担体と共に製剤化し、これにより、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の調製物を、インビボにおける投与のために製剤化することとを含む方法が提供される。
【０３４５】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中に溶解又は分散させた、治療的有効量の、一又は複数のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を含む。「薬学的な、又は薬理的に許容可能な」という語句は、援用される投与量及び濃度で、レシピエントに対して、一般に非毒性である、すなわち、適切な場合、例えば、ヒトなどの動物へと投与された場合、有害反応、アレルギー反応、又は他の望ましくない反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。少なくとも１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子と、任意選択的に、さらなる有効成分とを含有する薬学的組成物の調製は、出典明示により本明細書で援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０で例示される通り、本開示に照らして、当業者に公知であろう。さらに、動物（例えば、ヒト）への投与については、調製物は、ＦＤＡ下の生物学的基準についての当局又は他の諸国の対応する規制機関により要請される、無菌状態、発熱性、全般的な安全性、及び純度についての基準を満たすべきであることが理解されるであろう。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」とは、任意かつ全ての溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、当業者に公知である同様の材料及びそれらの組合せ（例えば、出典明示により本明細書で援用される、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照されたい）を含む。任意の従来の担体が、有効成分に対して不適合である場合を除き、治療的組成物中又は薬学的組成物中のその使用が想定される。
【０３４６】
組成物は、それが、固体形態で投与されるのか、液体形態で投与されるのか、エアゾール形態で投与されるのか、及び、それが、注射のような投与経路のために、滅菌を必要とするのかどうかに応じて、異なる種類の担体を含みうる。本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子（及び任意のさらなる治療剤）は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、脾臓内、腎臓内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、経粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、経口、局所（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ、ｌｏｃａｌｌｙ）、吸入（例えば、エアゾール吸入）、注射、点滴、連続注入、標的細胞を直接浸漬する局所灌流により、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームにより、脂質組成物（例えば、リポソーム）により、若しくは他の方法、又は当業者に公知である前出（例えば、出典明示により本明細書で援用される、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照されたい）の任意の組合せにより投与することができる。非経口投与、特に、静脈内注射は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子などのポリペプチド分子を投与するために、最も一般に使用される。
【０３４７】
非経口組成物は、注射、例えば、皮下注射、皮内注射、病巣内注射、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、髄腔内注射、又は腹腔内注射による投与のためにデザインされた組成物を含む。注射のために、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を、水溶液中、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液、又は生理的生理食塩水によるバッファーなど、生理学的に適合するバッファー中で製剤化することができる。溶液は、懸濁剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの調合剤を含有しうる。代替的に、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、使用の前における、適切なビヒクル、例えば、滅菌発熱物質非含有水による再構成のための粉末形態でもありうる。滅菌注射用溶液は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を、要請に応じて、下記で列挙される、他の多様な成分を伴う適切な溶媒中に、要求量で組み込むことにより調製する。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を介する濾過により、たやすく達することができる。一般に、分散体は、多様な滅菌有効成分を、基本分散媒及び／又は他の成分を含有する滅菌ビヒクルへと組み込むことにより調製する。滅菌注射用溶液、懸濁液、又はエマルジョンを調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、有効成分に加えた、既に滅菌濾過されたその液体媒体に由来する、任意のさらなる所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥法又は凍結乾燥法である。液体媒体は、必要な場合、適切な形で緩衝すべきであり、液体希釈剤は、十分な生理食塩水又はグルコースを伴う注射の前に、まず、等張性とすべきである。組成物は、製造及び保管の条件下で、安定でなければならず、細菌及び真菌など、微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。エンドトキシン汚染は、例えば、タンパク質１ｍｇ当たり０．５ｎｇ未満の安全なレベルで、最小限に保つべきことが察知されるであろう。適切な、薬学的に許容される担体は、リン酸塩、リン酸エステル、リン酸塩又はリン酸エステル、クエン酸塩、クエン酸エステル、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド；ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチルアルコール、又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むがこれらに限定されない。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなど、懸濁液の粘性を増大させる化合物を含有しうる。任意選択的に、懸濁液はまた、高濃度の溶液の調製を可能とする化合物の溶解度を増大させる、適切な安定剤又は薬剤も含有しうる。加えて、活性の化合物の懸濁液は、適切な油性注射用懸濁液としても調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルは、ゴマ油などの脂肪油、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、又はリポソームを含む。
【０３４８】
有効成分は、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）内、又はマクロエマルジョン中の、例えば、コアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル内にそれぞれ取り込むことができる。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）において開示されている。徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適切な例は、ポリペプチドを含有する、固体の疎水性ポリマーによる半透性マトリックスであって、成形品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態にあるマトリックスを含む。特定の実施態様では、注射用組成物の持続吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組合せなど、吸収を遅延させる薬剤の、組成物中の使用によりもたらすことができる。
【０３４９】
前出で記載した組成物に加えて、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子はまた、持効性製剤としても製剤化することができる。このような長時間作用型製剤は、植込みにより（例えば、皮下又は筋肉内）投与することもでき、筋肉内注射により投与することもできる。したがって、例えば、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、適切なポリマー材料若しくは疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとしての）又はイオン交換樹脂と共に製剤化することもでき、難溶型誘導体として、例えば、難溶型塩として製剤化することもできる。
【０３５０】
本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を含む薬学的組成物は、従来の混合工程、溶解工程、乳化工程、封入工程、取込み工程、又は凍結乾燥工程により製造することができる。薬学的組成物を、タンパク質の、薬学的に使用しうる調製物への加工を容易とする、一又は複数の生理的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、又は補助剤を使用して、従来の方式で製剤化することができる。適正な製剤は、選び出される投与経路に依存する。
【０３５１】
プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を、遊離酸形態又は遊離塩基形態、中性形態又は塩形態の組成物へと製剤化することができる。薬学的に許容される塩とは、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらは、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基により形成される酸付加塩、又は例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、若しくはマンデル酸などの有機酸により形成される酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基と共に形成される塩はまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、若しくは水酸化鉄などの無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、若しくはプロカインなどの有機塩基にも由来しうる。薬学的塩は、水性溶媒中、及び対応する遊離塩基形態以外のプロトン性溶媒中で、可溶性が大きくなる傾向がある。
【０３５２】
治療法及び組成物
本明細書で提示されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子のいずれも、治療法において使用することができる。本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、例えば、がんの治療における免疫療法剤として使用することができる。
【０３５３】
治療法における使用のために、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、医学行動規範と一致した様式で、製剤化し、用量設定し、投与する。この文脈における検討のための因子は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与法、投与スケジュール、及び医療施術者に公知の他の因子を含む。
【０３５４】
一態様では、医薬としての使用のための、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子が提供される。さらなる態様では、疾患の治療における使用のための、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子が提供される。ある特定の実施態様では、治療法における使用のための、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子が提供される。一実施態様では、本発明は、それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための、本明細書で記載される、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。ある特定の実施態様では、本発明は、疾患を有する個体を治療する方法であって、個体へと、治療的有効量のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を投与することを含む方法における使用のための、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。ある特定の実施態様では、治療される疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患は、がんである。ある特定の実施態様では、方法は、個体へと、治療的有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合の抗がん剤を投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、本発明は、本明細書で記載される、標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解の誘導における使用のための、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。ある特定の実施態様では、本発明は、個体における標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解を誘導する方法であって、個体へと、有効量のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を投与して、標的細胞の溶解を誘導することを含む方法における使用のための、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を提供する。上記の実施態様のうちのいずれかに従う「個体」とは、哺乳類、好ましくはヒトである。
【０３５５】
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、それを必要とする個体における疾患の治療のためのものである。さらなる実施態様では、医薬は、疾患を治療する方法であって、疾患を有する個体へと、治療的有効量の医薬を投与することを含む方法における使用のためのものである。ある特定の実施態様では、治療される疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患は、がんである。一実施態様では、方法は、個体へと、治療的有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合の抗がん剤を投与することをさらに含む。さらなる実施態様では、医薬は、標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解の誘導のためのものである。なおさらなる実施態様では、医薬は、個体における標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解を誘導する方法であって、個体へと、有効量の医薬を投与して、標的細胞の溶解を誘導することを含む方法における使用のためのものである。上記の実施態様のうちのいずれかに従う「個体」とは、哺乳類、好ましくはヒトでありうる。
【０３５６】
さらなる態様では、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、このような疾患を有する個体へと、治療的有効量の、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を投与することを含む。一実施態様では、薬学的に許容される形態にある、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を含む組成物を、前記個体へと投与する。ある特定の実施態様では、治療される疾患は、増殖性疾患である。特定の実施態様では、疾患は、がんである。ある特定の実施態様では、方法は、個体へと、治療的有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤、例えば、治療される疾患ががんである場合の抗がん剤を投与することをさらに含む。上記の実施態様のうちのいずれかに従う「個体」とは、哺乳類、好ましくはヒトでありうる。
【０３５７】
さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、Ｔ細胞、特に、細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で、標的細胞を、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子と接触させることを含む。さらなる態様では、個体における標的細胞、特に、腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法が提供される。このような一実施態様では、方法は、個体へと、有効量のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を投与して、標的細胞の溶解を誘導することを含む。一実施態様では、「個体」とは、ヒトである。
【０３５８】
ある特定の実施態様では、治療される疾患は、増殖性疾患、特に、がんである。がんの非限定的な例は、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん、及び腎臓がんを含む。本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を使用して治療されうる、他の細胞増殖障害は、腹部、骨、乳、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍を含むがこれらに限定されない。また、前がん性状態又は前がん性病変及びがん転移も含まれる。ある特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳がん、頭頸部がんからなる群から選択される。当業者は、多くの場合、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、治癒をもたらすことはできず、部分的な利益のみをもたらしうることをたやすく認識する。一部の実施態様では、一部の利益を有する生理的変化もまた、治療的に有益であると考える。したがって、一部の実施態様では、生理的変化をもたらす、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。治療を必要とする対象、患者、又は個体は、典型的に、哺乳類、より具体的には、ヒトである。
【０３５９】
一部の実施態様では、有効量の本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を、細胞へと投与する。他の実施態様では、治療的有効量の本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を、疾患の治療のために、個体へと投与する。
【０３６０】
疾患を予防又は治療するために、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の適切な投与量（単独で、又は１若しくは複数の他のさらなる治療剤と組み合わせて使用する場合の）は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子の種類、疾患の重症度及び経過、Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子を、予防目的で投与するのか、治療目的で投与するのか、既往の治療的介入又は併用される治療的介入、患者の病歴及びプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子への応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。いずれにせよ、投与担当の施術者が、組成物中の有効成分の濃度と、個々の対象に適切な用量とを決定することになる。本明細書では、単回又は多様な時点にわたる複数回の投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない、多様な投与スケジュールが想定される。
【０３６１】
プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、患者へと、単回、又は一連の治療にわたって、適切な形で投与する。疾患の種類及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ−１０ｍｇ／ｋｇ）のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子が、例えば、一又は複数にわたる個別の投与によるのであれ、連続的注入によるのであれ、患者への初回の候補投与量でありうる。典型的な毎日１回の投与量は、上記で言及した因子に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はこれを超える範囲でありうる。数日間又はこれを超える期間にわたる反復投与には、状態に応じて、治療は一般に、所望される病徴の抑制が生じるまで持続する。Ｔ細胞二重特異性抗原結合分子の、１つの例示的な投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的な例では、用量はまた、投与１回体重１ｋｇ当たり約１マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約５マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約１０マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約５０マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約１００マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約２００マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約３５０マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約５００マイクログラム、体重１ｋｇ当たり約１ミリグラム、体重１ｋｇ当たり約５ミリグラム、体重１ｋｇ当たり約１０ミリグラム、体重１ｋｇ当たり約５０ミリグラム、体重１ｋｇ当たり約１００ミリグラム、体重１ｋｇ当たり約２００ミリグラム、体重１ｋｇ当たり約３５０ミリグラム、体重１ｋｇ当たり約５００ミリグラムから、体重１ｋｇ当たり約１０００ｍｇ、又はこれを超える用量、及びこの中の導出可能な任意の範囲も含みうる。本明細書で列挙される数から導出可能な範囲の非限定的な例では、上記で記載した数に基づき、体重１ｋｇ当たり約５ｍｇから体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約５マイクログラムから体重１ｋｇ当たり約５００ミリグラムなどの範囲を投与することができる。したがって、一又は複数にわたる、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇの用量（又はこれらの任意の組合せ）を、患者へと投与することができる。このような用量は、間欠的に、例えば、毎週又は３週間ごとに（例えば、患者が、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の投与約２から約２０回、又は、例えば、約６回を施されように）投与することができる。初回の高負荷用量に続き、一又は複数にわたる低用量を投与することができる。しかし、他の投与量レジメンも有用でありうる。この治療の進行は、従来の技法及びアッセイにより容易にモニタリングされる。
【０３６２】
本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は一般に、意図される目的を達成するのに有効な量で使用する。疾患状態を治療又は予防する使用のために、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子又はその薬学的組成物を、治療的有効量で投与又は適用する。治療的有効量の決定は、とりわけ、本明細書で提示される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【０３６３】
全身投与のために、治療的有効用量を、まず、細胞培養アッセイなどのインビトロアッセイから推定することができる。次いで、用量を、動物モデルにおいて製剤化して、細胞培養物中で決定されたＩＣ５０を含む、循環濃度範囲を達成することができる。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量を、より正確に決定することができる。
【０３６４】
初回投与量はまた、当該技術分野で周知の技法を使用して、インビボデータ、例えば、動物モデルから推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づき、ヒトへの投与を、たやすく最適化しうるであろう。
【０３６５】
治療効果を維持するのに十分な、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の血漿レベルを個別にもたらすように、投与量及び投与間隔を調整することができる。注射による投与のための、通例の患者投与量は、約０．１から５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的に、約０．５から１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療的有効血漿レベルは、各日複数回の投与を実施することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えば、ＨＰＬＣにより測定することができる。
【０３６６】
局所投与又は選択的取込みの場合、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の有効局所濃度は、血漿濃度と関連する。当業者は、不要な実験を伴わずに、治療的有効局所投与量を、最適化することが可能であろう。
【０３６７】
治療的有効用量の、本明細書で記載されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は一般に、実質的な毒性を引き起こさずに、治療的利益をもたらすであろう。プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の毒性及び治療的有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物研究を使用して、ＬＤ５０（集団のうちの５０％に対して致死性である用量）及びＥＤ５０（集団のうちの５０％において、治療的に有効な用量）を決定することができる。毒性と治療的効果との用量比は、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表しうる治療指数である。大きな治療指数を呈示するプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子が好ましい。一実施態様では、本発明に従うプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、大きな治療指数を呈示する。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用に適する投与量の範囲を製剤化するのに使用することができる。投与量は、毒性をほとんど又は全く伴わずに、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、様々な因子、例えば、援用される剤形、活用される投与経路、対象の状態などに応じて、この範囲内で変動しうる。正確な製剤化、投与経路、及び投与量は、患者の状態を念頭に、個々の医師により選ばれうる（例えば、出典明示によりその全体において本明細書に援用される、Finglら, 1975,The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1を参照されたい）。
【０３６８】
本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子に治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全などのために、投与を、いかにして、いつ、終了させるのか、中断するのか、又は調整するのかについて承知しているであろう。逆に、主治医はまた、臨床応答が不十分（毒性を除き）であった場合、治療を高レベルへと調整することについても承知しているであろう。目的の障害を管理するときに投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などと共に変動するであろう。状態の重症度は、例えば、標準的な予後査定法により、部分的に査定することができる。さらに、投与及びおそらくは投与頻度もまた、個々の患者の年齢、体重、及び応答に従い変動するであろう。
【０３６９】
他の薬剤及び治療
本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、治療において、一又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は、少なくとも１つのさらなる治療剤と共に共投与することができる。「治療剤」という用語は、このような治療を必要とする個体における症候又は疾患を治療するのに投与される、任意の薬剤を包摂する。このようなさらなる治療剤は、治療される特定の適応に適する、任意の有効成分、好ましくは、互いに有害な影響を及ぼし合わない、相補的活性を伴う有効成分を含みうる。ある特定の実施態様では、さらなる治療剤は、免疫調節剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害剤、細胞アポトーシスの活性化因子、又は細胞の、アポトーシス誘導因子への感受性を増大させる薬剤である。特定の実施態様では、さらなる治療剤は、抗がん剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン療法、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化因子、又は抗血管新生剤である。
【０３７０】
このような他の薬剤は、意図される目的に有効な量の組合せで存在することが適する。このような他の薬剤の有効量は、使用されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の量、障害又は治療の種類、及び上記で論じた他の因子に依存する。プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子は一般に、本明細書で記載される同じ投与量及び投与経路で、若しくは本明細書で記載される投与量の約１から９９％で、又は任意の投与量で、適切であることが経験的／臨床的に決定されている任意の経路により使用する。
【０３７１】
上記で言及した、このような併用療法は、混合投与（この場合、２つ又はこれを超える治療剤を、同じ組成物中又は個別の組成物中に組み入れる）と、その場合、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の投与を、さらなる治療剤及び／又はアジュバントの投与の前に、これと同時に、かつ／又はこの後で行いうる個別投与とを包摂する。本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子はまた、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。
【０３７２】
製造品
本発明の別の態様では、上記で記載した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、容器上のラベル又は容器に添付された添付文書とを含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどを含む。容器は、ガラス又はプラスチックなど、様々な材料から形成することができる。容器は、単独の、又は状態を治療、予防、及び／又は診断するために有効な別の組成物と混合された組成物を保持し、滅菌のアクセスポートを有しうる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグの場合もあり、皮下注射針により穿刺可能な止栓を有するバイアルの場合もある）。組成物中の、少なくとも１つの活性薬剤は、本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子である。標識又は添付文書は、組成物を、えり抜きの状態を治療するために使用することを指し示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を含む組成物をその中に含有した第１の容器と；（ｂ）細胞傷害性治療剤又はそれ以外の治療剤をさらに含む組成物をその中に含有した第２の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品はさらに、組成物を使用して、特定の状態を治療しうることを指し示す添付文書も含みうる。代替的に、又は加えて、製造品はさらに、静菌性の注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストローズ溶液など、薬学的に許容可能なバッファーを含む、第２の（又は第３の）容器も含みうる。製造品はさらに、商業的視点及び使用者的視点から所望される他の材料であって、他のバッファー、希釈剤、フィルター、注射針、及びシリンジを含む材料も含みうる。
【０３７３】
例示的実施態様
１．  （ａ）ＣＤ３への特異的結合が可能な第１の抗原結合部分と；
（ｂ）標的細胞抗原への特異的結合が可能な第２の抗原結合部分と；
（ｃ）プロテアーゼ切断型リンカーを介して、Ｔ細胞二重特異性結合性分子と共有結合しているマスキング部分であって、第１又は第２の抗原結合部分のイデオタイプへの特異的結合が可能であり、これにより、第１又は第２の抗原結合部分を、可逆的に隠蔽するマスキング部分と
を含むプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２．  マスキング部分が、第１の抗原結合部分と共有結合しており、第１の抗原結合部分を可逆的に隠蔽する、実施態様１のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３．  マスキング部分が、第１の抗原結合部分の重鎖可変領域と共有結合している、実施態様１又は２のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４．  マスキング部分が、第１の抗原結合部分の軽鎖可変領域と共有結合している、実施態様１又は２のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５．  マスキング部分が、抗イデオタイプｓｃＦｖである、実施態様１から４のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６．  プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子が、第２の抗原結合部分を可逆的に隠蔽する、第２のマスキング部分を含む、実施態様２から５のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７．  プロテアーゼを、標的細胞に発現させる、実施態様１から６のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
８．  第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域又は定常領域を交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である、実施態様１から７のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
９．  第２の抗原結合部分が、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域を交換した、クロスオーバーＦａｂ分子である、実施態様１から８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１０．  第１の抗原結合部分が、従来型のＦａｂ分子である、実施態様１から９のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１１．  ＣＤ３への特異的結合が可能な、１つを超えない抗原結合部分を含む、実施態様１から１０のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１２．  標的細胞抗原への特異的結合が可能なＦａｂ分子である、第３の抗原結合部分を含む、実施態様１から１１のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１３．  第３の抗原結合部分が、第２の抗原結合部分と同一である、実施態様１２のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１４．  第２の抗原結合部分が、ＦｏｌＲ１又はＨＥＲ１への特異的結合が可能である、実施態様１から１３のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１５．  第２の抗原結合部分が、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ１、及びメソテリンからなる群から選択される標的細胞抗原への特異的結合が可能である、実施態様１から１３のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１６．  第２の抗原結合部分が、ＦｏｌＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、及びメソテリンからなる群から選択される標的細胞抗原への特異的結合が可能である、実施態様１から１３のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１７．  第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分が、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している、実施態様１から１６のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１８．  第２の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第１の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へと融合させた、実施態様１から１７のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１９．  第１の抗原結合部分を、Ｆａｂ重鎖のＣ末端において、第２の抗原結合部分のＦａｂ重鎖のＮ末端へと融合させた、実施態様１から１７のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２０．  第１の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合部分のＦａｂ軽鎖が、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している、実施態様１から１９のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２１．  安定的な会合が可能な、第１のサブユニット及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを加えて含む、実施態様１から２０のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２２．  Ｆｃドメインが、ＩｇＧ、具体的には、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃドメインである、実施態様２１のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２３．  Ｆｃドメインが、ヒトＦｃドメインである、実施態様２１又は２２のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２４．  Ｆｃドメインが、天然ＩｇＧ１のＦｃドメインと比較した、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を呈示する、実施態様２１から２３のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２５．  Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減する、一又は複数のアミノ酸置換を含む、実施態様２４のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２６．  前記一又は複数のアミノ酸置換が、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＰ３２９（カバット番号付け）の群から選択される、一又は複数の位置におけるものである、実施態様２５のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２７．  Ｆｃドメインの各サブユニットが、活性化Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低減する、３つのアミノ酸置換であって、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇであるアミノ酸置換を含む、実施態様２６のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２８．  Ｆｃ受容体が、Ｆｃγ受容体である、実施態様２４から２７のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
２９．  エフェクター機能が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である、実施態様２４から２８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３０．  マスキング部分が、
（ａ）ＤＹＳＩＨ（配列番号２０）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＡＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２１）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＰＹＤＹＤＶＬＤＹ（配列番号２２）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む、実施態様１から２９のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３１．  マスキング部分が、
（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＮＹＳＹＩＨ（配列番号２３）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号２４）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＳＲＥＦＰＷＴ（配列番号２５）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む、実施態様１から３０のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３２．  マスキング部分が、
（ａ）ＤＹＳＩＨ（配列番号２０）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＡＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２１）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＤＶＬＤＹ（配列番号２２）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＮＹＳＹＩＨ（配列番号２３）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号２４）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＳＲＥＦＰＷＴ（配列番号２５）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む、実施態様１から３１のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３３．  マスキング部分が、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号２６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号２７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号２８）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む、実施態様１から２９のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３４．  マスキング部分が、
（ｄ）ＲＡＳＥＮＩＤＳＹＬＡ（配列番号２９）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号３０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号３１）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む、実施態様１から２９及び３３のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３５．  マスキング部分が、
（ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号２６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号２７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号２８）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
（ｄ）ＲＡＳＥＮＩＤＳＹＬＡ（配列番号２９）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号３０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号３１）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む、実施態様１から２９及び３３から３４のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３６．  マスキング部分が、
（ａ）ＤＹＹＩＮ（配列番号４８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＶＩＮＰＤＳＧＧＴＤＹＮＱＮＦＫＧ（配列番号４９）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＲＤＳＹＧＦＤＹ（配列番号５０）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む、実施態様１から３５のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３７．  マスキング部分が、
（ａ）ＫＡＳＬＳＶＴＮＤＶＡ（配列番号５１）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＹＡＳＮＲＮＡ（配列番号５２）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＱＱＤＹＴＳＰＰＴ（配列番号５３）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む、実施態様１から３６のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３８．  マスキング部分が、
ａ）ＤＹＹＩＮ（配列番号４８）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
ｂ）ＶＩＮＰＤＳＧＧＴＤＹＮＱＮＦＫＧ（配列番号４９）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
ｃ）ＲＤＳＹＧＦＤＹ（配列番号５０）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
ｄ）ＫＡＳＬＳＶＴＮＤＶＡ（配列番号５１）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
ｅ）ＹＡＳＮＲＮＡ（配列番号５２）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
ｆ）ＱＱＤＹＴＳＰＰＴ（配列番号５３）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む、実施態様１から３７のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
３９．  プロテアーゼ切断型リンカーが、少なくとも１つのプロテアーゼ認識配列を含む、実施態様１から３８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４０．  プロテアーゼ切断型リンカーが、プロテアーゼ認識配列を含む、実施態様３９のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４１．  プロテアーゼ認識配列が、
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号３６）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号３７）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号３８）；及び
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号３９）
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号４０）
［配列中、Ｘは、任意のアミノ酸である］
からなる群から選択される、実施態様４０のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４２．  プロテアーゼ認識配列が、
（ａ）ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号３６）；
（ｂ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＧＲＳＲＧＳＦＰ（配列番号３７）；
（ｃ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＸＸＸＸＸＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号３８）；
（ｄ）ＲＱＡＲＶＶＮＧＶＰＬＳＬＹＳＧ（配列番号３９）；
（ｅ）ＰＬＧＬＷＳＱ（配列番号４０）；
（ｆ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号９７）；
（ｇ）ＦＶＧＧＴＧ（配列番号９８）；
（ｈ）ＫＫＡＡＰＶＮＧ（配列番号９９）；
（ｉ）ＰＭＡＫＫＶＮＧ（配列番号１００）；
（ｊ）ＱＡＲＡＫＶＮＧ（配列番号１０１）；
（ｋ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰ（配列番号１０２）；
（ｌ）ＱＡＲＡＫ（配列番号１０３）；
（ｍ）ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＰＭＡＫＫ（配列番号１０４）；
（ｎ）ＫＫＡＡＰ（配列番号１０５）；及び
（ｏ）ＰＭＡＫＫ（配列番号１０６）
［配列中、Ｘは、任意のアミノ酸である］
からなる群から選択される、実施態様４０のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４３．  プロテアーゼ切断型リンカーが、プロテアーゼ認識配列ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号３６）を含む、実施態様３９又は４０のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４４．  プロテアーゼ切断型リンカーが、プロテアーゼ認識配列ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号９７）を含む、実施態様３９又は４０のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４５．  プロテアーゼ切断型リンカーが、プロテアーゼ認識配列ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号３６）、又はプロテアーゼ認識配列ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号９７）を含む、実施態様３９又は４０のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４６．  プロテアーゼが、メタロプロテイナーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、及びカテプシンプロテアーゼからなる群から選択される、実施態様１から４５のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４７．  メタロプロテイナーゼが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、好ましくは、ＭＭＰ９又はＭＭＰ２である、実施態様４６のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４８．  セリンプロテアーゼが、マトリプターゼである、実施態様４６のプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
４９．  第１の抗原結合部分が、配列番号４４、配列番号４５、及び配列番号４６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む、実施態様１から４８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５０．  第１の抗原結合部分が、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、
ａ）ＴＹＡＭＮ（配列番号４４）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
ｂ）ＲＩＲＳＫＹＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号４５）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
ｃ）ＨＧＮＦＧＮＳＹＶＳＷＦＡＹ（配列番号４６）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
ｄ）ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号１７）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号１８）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号１９）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む、実施態様１から４９のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５１．  第１の抗原結合部分が、配列番号４３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１から５０のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５２．  第１の抗原結合部分が、ＣＤ３への特異的結合が可能であり、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１から５０のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５３．  第２の抗原結合部分が、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号１９の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む、実施態様１から５２のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５４．  第２の抗原結合部分が、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、
ａ）ＮＡＷＭＳ（配列番号１４）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
ｂ）ＲＩＫＳＫＴＤＧＧＴＴＤＹＡＡＰＶＫＧ（配列番号１５）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
ｃ）ＰＷＥＷＳＷＹＤＹ（配列番号１６）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
ｄ）ＧＳＳＴＧＡＶＴＴＳＮＹＡＮ（配列番号１７）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
ｅ）ＧＴＮＫＲＡＰ（配列番号１８）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
ｆ）ＡＬＷＹＳＮＬＷＶ（配列番号１９）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む、実施態様１から５３のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５５．  第２の抗原結合部分が、配列番号４７のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１から５４のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５６．  第２の抗原結合部分が、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号４７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１から５４のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５７．  第２の抗原結合部分が、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号１５１、配列番号１５２、及び配列番号１５３からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１５４、配列番号１５５、及び配列番号１５６の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む、実施態様１から５２のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５８．  第２の抗原結合部分が、ＦｏｌＲ１への特異的結合が可能であり、
ａ）ＳＹＹＭＨ（配列番号１５１）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
ｂ）ＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１５２）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
ｃ）ＳＦＦＴＧＦＨＬＤＹ（配列番号１５３）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
ｄ）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号１５４）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
ｅ）ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号１５５）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
ｆ）ＱＱＹＴＮＥＨＹＹＴ（配列番号１５６）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む、実施態様１から５２又は５７のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
５９．  第２の抗原結合部分が、配列番号１５７のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５８のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１から５２、５７又は５８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６０．  第２の抗原結合部分が、ＦｏｒＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号１５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１から５２又は５７から５９のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６１．  第２の抗原結合部分が、メソテリンへの特異的結合が可能であり、配列番号１０７、配列番号１０８、及び配列番号１０９からなる群から選択される、少なくとも１つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号１１０、配列番号１１１、及び配列番号１１２の群から選択される、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲとを含む、実施態様１から５２のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６２．  第２の抗原結合部分が、メソテリンへの特異的結合が可能であり、
ａ）ＧＹＴＭＮ（配列番号１０７）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
ｂ）ＬＩＴＰＹＮＧＡＳＳＹＮＱＫＦＲＧ（配列番号１０８）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；
ｃ）ＧＧＹＤＧＲＧＦＤＹ（配列番号１０９）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
ｄ）ＳＡＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号１１０）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
ｅ）ＤＴＳＫＬＡＳ（配列番号１１１）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
ｆ）ＱＱＷＳＫＨＰＬＴ（配列番号１１２）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む、実施態様１から５２又は６１のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６３．  第２の抗原結合部分が、配列番号１１３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１４のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１から５２、６１、又は６２のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６４．  第２の抗原結合部分が、メソテリンへの特異的結合が可能であり、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１から５２又は６１から６３のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６５．  第２の抗原結合部分が、配列番号３２のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号３３のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、実施態様１から５２のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６６．  第２の抗原結合部分が、ＨＥＲ１への特異的結合が可能であり、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様１から５２又は６５のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６７．  （ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、実施態様１から４８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６８．  （ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、実施態様１から４８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
６９．  ａ）配列番号３２のアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの重鎖と；
ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む、少なくとも１つの軽鎖と
を含む、実施態様１から４８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７０．  （ａ）配列番号７２のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、実施態様１から４８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７１．  （ａ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖と
を含む、実施態様１から４８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７２．  （ａ）配列番号７３のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を含む、第１の軽鎖と；
（ｄ）配列番号７４のアミノ酸配列を含む、第２の軽鎖と
を含む、実施態様１から４８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７３．  （ａ）配列番号７７のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号８２のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号７８のアミノ酸配列を含む、第１の軽鎖と；
（ｄ）配列番号８１のアミノ酸配列を含む、第２の軽鎖と
を含む、実施態様１から４８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７４．  （ａ）配列番号７６のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号７７のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号７８のアミノ酸配列を含む、第１の軽鎖と；
（ｄ）配列番号７９のアミノ酸配列を含む、第２の軽鎖と
を含む、実施態様１から４８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７５．  （ａ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号８１のアミノ酸配列を含む、第１の軽鎖と；
（ｄ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含む、第２の軽鎖と
を含む、実施態様１から４８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７６．  （ａ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、第１の重鎖と；
（ｂ）配列番号１３９のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖と；
（ｃ）配列番号８１のアミノ酸配列を含む、第１の軽鎖と；
（ｄ）配列番号１３８のアミノ酸配列を含む、第２の軽鎖と
を含む、実施態様１から４８のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
７７．  分子の抗ＣＤ３抗原結合部位を可逆的に隠蔽するための、イデオタイプ特異的ポリペプチド。
７８．  抗イデオタイプｓｃＦｖである、実施態様７７のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
７９．  リンカーを介して分子と共有結合している、実施態様７７又は７８のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
８０．  リンカーが、ペプチドリンカーである、実施態様７９のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
８１．  リンカーが、プロテアーゼ切断型リンカーである、実施態様７９又は８０のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
８２．  ペプチドリンカーが、少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む、実施態様７９から８１のいずれか１つのイデオタイプ特異的ポリペプチド。
８３．  プロテアーゼが、メタロプロテイナーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、及びカテプシンプロテアーゼからなる群から選択される、実施態様８２のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
８４．  メタロプロテイナーゼが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、好ましくは、ＭＭＰ９又はＭＭＰ２である、実施態様８３のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
８５．  セリンプロテアーゼが、マトリプターゼである、実施態様８３のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
８６．  プロテアーゼ切断型リンカーが、プロテアーゼ認識配列ＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号３６）、又はプロテアーゼ認識配列ＶＨＭＰＬＧＦＬＧＰＲＱＡＲＶＶＮＧ（配列番号９７）を含む、実施態様８２のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
８７．  分子が、Ｔ細胞活性化二重特異性分子である、実施態様の７７から８６のいずれか１つのイデオタイプ特異的ポリペプチド。
８８．  （ａ）ＤＹＳＩＨ（配列番号２０）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＡＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２１）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＰＹＤＹＤＶＬＤＹ（配列番号２２）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む、実施態様７７から８７のいずれか１つのイデオタイプ特異的ポリペプチド。
８９．  （ｄ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＮＹＳＹＩＨ（配列番号２３）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号２４）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＳＲＥＦＰＷＴ（配列番号２５）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む、実施態様７７から８８のいずれか１つのイデオタイプ特異的ポリペプチド。
９０．  （ａ）ＤＹＳＩＨ（配列番号２０）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＷＩＮＴＥＴＧＥＰＡＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号２１）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＰＹＤＹＤＶＬＤＹ（配列番号２２）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
（ｄ）ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＮＹＳＹＩＨ（配列番号２３）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＹＶＳＹＬＥＳ（配列番号２４）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＳＲＥＦＰＷＴ（配列番号２５）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む、実施態様７７から８７のいずれか１つのイデオタイプ特異的ポリペプチド。
９１．  （ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号２６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号２７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；及び
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号２８）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む重鎖可変領域を含む、実施態様７７から８７のいずれか１つのイデオタイプ特異的ポリペプチド。
９２．  （ｄ）ＲＡＳＥＮＩＤＳＹＬＡ（配列番号２９）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号３０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号３１）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
のうちの少なくとも１つを含む軽鎖可変領域を含む、実施態様７７から８７及び９１のいずれか１つのイデオタイプ特異的ポリペプチド。
９３．  （ａ）ＳＹＧＶＳ（配列番号２６）の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｈ）１アミノ酸配列；
（ｂ）ＩＩＷＧＤＧＳＴＮＹＨＳＡＬＩＳ（配列番号２７）のＣＤＲ  Ｈ２アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＩＴＴＶＶＤＤＹＹＡＭＤＹ（配列番号２８）のＣＤＲ  Ｈ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域と；
（ｄ）ＲＡＳＥＮＩＤＳＹＬＡ（配列番号２９）の軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ  Ｌ）１アミノ酸配列；
（ｅ）ＡＡＴＦＬＡＤ（配列番号３０）のＣＤＲ  Ｌ２アミノ酸配列；及び
（ｆ）ＱＨＹＹＳＴＰＹＴ（配列番号３１）のＣＤＲ  Ｌ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む、実施態様７７から８７のいずれか１つのイデオタイプ特異的ポリペプチド。
９４．  抗ＣＤ３抗原結合部位が、配列番号４３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号５５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、実施態様７７から９３のイデオタイプ特異的ポリペプチド。
９５．  実施態様１から７６のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性抗原結合分子、又は実施態様７７から９４のいずれか１つのイデオタイプ特異的ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
９６．  実施態様９５のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
９７．  ベクター、特に、実施態様９５のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
９８．  実施態様９５のポリヌクレオチド、又は実施態様９７のベクターを含む宿主細胞。
９９．  プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を生成する方法であって、ａ）実施態様９８の宿主細胞を、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の発現に適する条件下で培養する工程と、ｂ）プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を回収する工程とを含む方法。
１００．  実施態様９９の方法により生成されるプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１０１．  イデオタイプ特異的ポリペプチドを生成する方法であって、ａ）実施態様９８の宿主細胞を、イデオタイプ特異的ポリペプチドの発現に適する条件下で培養する工程と、ｂ）イデオタイプ特異的ポリペプチドを回収する工程とを含む方法。
１０２．  実施態様１０１の方法により生成されるイデオタイプ特異的ポリペプチド。
１０３．  実施態様１から７６のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
１０４．  実施態様７７から９４のいずれか１つのイデオタイプ特異的ポリペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物。
１０５．  医薬としての使用のための、実施態様１から７６のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、実施態様７７から９４のいずれか１つのイデオタイプ特異的ポリペプチド、又は実施態様１０３の組成物。
１０６．  医薬が、がんを治療するか、若しくはその進行を遅延させるか、免疫関連疾患を治療するか、若しくはその進行を遅延させるか、又は個体における免疫応答若しくは免疫機能を増強若しくは刺激するためのものである、実施態様１０５に従う使用のためのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子。
１０７．  それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための、実施態様１から７６のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、又は実施態様７７から９４のいずれか１つのイデオタイプ特異的ポリペプチド。
１０８．  疾患が、がんである、実施態様１０７に記載の、それを必要とする個体における疾患の治療における使用のための、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、又はイデオタイプ特異的ポリペプチド。
１０９．  医薬を製造するための、実施態様１から７６のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、又は実施態様７７から９４のいずれか１つのイデオタイプ特異的ポリペプチドの使用。
１１０．  疾患が、がんである、実施態様１０９に記載の使用。
１１１．  個体における疾患を治療する方法であって、前記個体へと、実施態様１から７６のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、又は実施態様１０３の組成物を含む、治療的有効量の組成物を投与することを含む方法。
１１２．  標的細胞の溶解を誘導するための方法であって、Ｔ細胞の存在下で、標的細胞を、実施態様１から７６のいずれか１つのプロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子、又は実施態様１０３の組成物と接触させることを含む方法。
１１３．  標的細胞が、がん細胞である、実施態様１１２の方法。
１１４．  標的細胞が、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を活性化させることが可能なプロテアーゼを発現させる、実施態様１１２又は１１３の方法。
１１５．  抗ＣＤ３抗原結合分子のイデオタイプに特異的な、抗イデオタイプＣＤ３抗体又はその抗原結合断片であって、抗ＣＤ３抗原結合分子に特異的に結合すると、抗ＣＤ３抗原結合分子の、ＣＤ３への結合をブロックする、抗イデオタイプＣＤ３抗体又はその断片。
１１６．  プロテアーゼ認識部位を含むペプチドリンカーを介して、抗ＣＤ３抗原結合分子と可逆的に会合する、実施態様１１５の抗イデオタイプＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
１１７．  ＣＤ３が、マウスＣＤ３、サルＣＤ３、又はヒトＣＤ３である、実施態様１１５又は１１６の抗イデオタイプＣＤ３抗体又はその抗原結合断片。
１１８．  Ｔ細胞活性化二重特異性分子の、インビボにおける毒性を軽減する方法であって、実施態様７７から９４のいずれか１つのイデオタイプ特異的ポリペプチドを、プロテアーゼ切断型リンカーにより、Ｔ細胞活性化二重特異性分子と結合させて、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子を形成することを含み、プロテアーゼ活性化型Ｔ細胞活性化二重特異性分子の、インビボにおける毒性を、Ｔ細胞活性化二重特異性分子の毒性と比較して軽減する方法。
１１９．  本明細書で記載した前出の通りの本発明。
【実施例】
【０３７４】
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上記で提示した一般的な記載を踏まえ、他の多様な実施態様も実施しうることが理解される。
【０３７５】
実施例１
抗イデオタイプｓｃＦｖを伴う、一価の抗ＣＤ３  ＩｇＧ分子の合成
本明細書では、Ｎ末端において連結された抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖによりマスキングされるＣＤ３結合剤について記載する。これらのコンストラクトは、腫瘍特異的プロテアーゼにより認識されるプロテアーゼ認識部位を含む。プロテアーゼ発現腫瘍細胞の存在下で、マスキング部分を接続するリンカーが切断され、これにより、ＣＤ３結合剤によるＣＤ３への結合が回復する。多様な抗イデオタイプｓｃＦｖを伴う、いくつかの一価の抗ＣＤ３  ＩｇＧ分子を生成したが、図１Ａ−１Ｅに、それらのそれぞれのＩＤ番号と共に、概略的に描示する。以下の分子：
識別番号７８５９：Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４及びプロテアーゼ切断型リンカーを融合させた、一価のＣＤ３  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．１５．６４−ＭＫ０６２マトリプターゼ部位−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＣＤ３  Ｆａｂへの融合−不活性Ｆｃ）；
識別番号７８６０：Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及びプロテアーゼ切断型リンカーを融合させた、一価のＣＤ３  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＫ０６２マトリプターゼ部位−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＣＤ３  Ｆａｂへの融合−不活性Ｆｃ）；
識別番号７８５７：Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４及びプロテアーゼ切断型リンカーを融合させた、一価のＣＤ３  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．１５．６４−非切断型リンカー−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＣＤ３  Ｆａｂへの融合−不活性Ｆｃ）；
識別番号７８５８：Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及びプロテアーゼ切断型リンカーを融合させた、一価のＣＤ３  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型リンカー−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＣＤ３  Ｆａｂへの融合−不活性Ｆｃ）；
識別番号７８６１：Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４／４．３２．６３及びプロテアーゼリンカーを融合させた、一価のＣＤ３  ＩｇＧ（ＣＤ３  Ｆａｂ−不活性Ｆｃ）
を調製した。
【０３７６】
抗イデオタイプ（ＩＤ）結合剤の配列は、ハイブリドーマ細胞のＲＮＡから、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄ）により得た。ハイブリドーマ細胞は、ＣＨ２５２７（ＶＬ＿７−４６（１３）／ＶＨ＿３−２３（１２））Ｆａｂ断片を伴うマウスの免疫化により得た。クローニングに必要な制限部位を含む単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）配列の合成は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに依頼した。６つの異なる抗イデオタイプＣＨ２５２７結合剤を、それらの親和性について比較し（図２；Ｂｉａｃｏｒｅ−Ａｎａｌｙｔｉｃｓ（ＡＧ  Ｍ．Ｓｃｈｒａｅｍｌ）による、２５℃／３７℃（Ａｎａｌｙｔ：ＭＡＫ＜ＣＥＡ／ＣＤ３＞ｒＨ）における結果）、それらのうちの２つを、ＣＤ３  Ｆａｂ−Ｆｃの重鎖におけるＮ末端融合体としてクローニングした。
【０３７７】
抗ＩＤ単鎖Ｆｖ  ＤＮＡ配列を、それぞれのレシピエントの哺乳類発現ベクターへとあらかじめ挿入されたＣＤ３  ＶＨ鎖とインフレームで、サブクローニングした。タンパク質の発現は、ＭＰＳＶプロモーターにより駆動され、合成ｐｏｌｙＡシグナル配列は、ＣＤＳの３’末端に存在する。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含有する。
【０３７８】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、哺乳類発現ベクターと共にコトランスフェクトすることにより、分子を生成した。細胞に、対応する発現ベクターを、１：１：２の比（「Ｆｃホール（ＣＨ２−ＣＨ３）」：「共通軽鎖（ＣＬＣ）」：「ベクター重鎖ノブ（ｓｃＦｖ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」）でトランスフェクトした。
【０３７９】
トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミン及び２５０ｍｇ／ｌのＧ４１８を含有する、無血清ＥｘＣｅｌｌ培地中で培養した。６００ｍｌのチューブスピンフラスコ（最大の作業容積を４００ｍＬとする）内の生成のために、８億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、Ｇ４１８を伴わないトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、８億個の細胞を、２１０×ｇで、５分間にわたり遠心分離し、上清を、６ｍＭのＬ−グルタミンを含有する、あらかじめ温めておいた４０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地で置きかえた。発現ベクターを、６ｍＭのＬ−グルタミンを含有する、４０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地と共に、総量４００μｇのＤＮＡへと混合した。ＰＥＩ溶液（２．７μｇ／ｍｌ）１０８０μｌを添加した後で、混合物を、１５秒間にわたり、ボルテックスし、その後、室温で１０分間にわたりインキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、６００ｍｌのチューブスピンフラスコへと移し、５％のＣＯ２雰囲気を伴うインキュベーター内、３７℃で、３時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、３２０ｍｌのＥｘＣｅｌｌ＋６ｍＭのＬ−グルタミン＋５ｇ／ＬのＰｅｐｓｏｙ＋１．０ｍＭのＶＰＡ＋３ｇ／ｌのグルコース培地を添加し、細胞を、２４時間にわたり培養してから、７％のＦｅｅｄ  ７でフィードした。６−７日間にわたる培養の後、上清を、２１０×ｇ（Ｓｉｇｍａ  ８Ｋ遠心分離機）で、２０−３０分間にわたる遠心分離による精製のために回収した。溶液を滅菌濾過（０．２２μｍのフィルター）し、最終濃度を０．０１％ｗ／ｖとするアジ化ナトリウムを添加した。精製まで、溶液を４℃に保った。分泌タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用するアフィニティークロマトグラフィーに続く、１から２回にわたるサイズ除外クロマトグラフィー工程により、細胞培養物上清から精製した。
【０３８０】
アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、２５ｍｌの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０  ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦカラム（ＣＶ＝５ｍＬ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０  ｐＨ７．５の少なくとも１０カラム容積で洗浄することにより、結合しなかったタンパク質を除去し、標的タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０  ｐＨ２．５の２０カラム容積（０％−１００％の勾配）中に溶出させた。タンパク質溶液は、２ＭのトリスｐＨ  １０．５の１／１０を添加することにより中和した。標的タンパク質は、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０で平衡化されたＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードする前に、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ３０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌｔｄ．）で、最大で４ｍｌの容積へと濃縮した。
【０３８１】
サイズ排除クロマトグラフィーの後における解析法のために、単一画分中の分子の純度及び分子量は、還元剤の非存在下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー（ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（商標）、Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）による染色により解析した。製造元の指示書に従い、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル系（４−１２％のビス−トリス；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ又は３−８％のトリス酢酸塩；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【０３８２】
精製タンパク質試料のタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定し、アミノ酸配列に基づき計算されるモル減衰係数で除することにより決定した。
【０３８３】
最終的な精製工程の後における、分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下におけるＣＥ−ＳＤＳ解析により解析した。製造元の指示書に従い、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。分子の凝集物含有量は、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中、２５℃で、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ解析用サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して解析した。全ての分子の最終品質は、良好であり、モノマー含有量は、≧９２％であった。
2019514850.tif 000004
【０３８４】
実施例２
プロテアーゼ活性化ＩｇＧの切断及び安定性
プロテアーゼ活性化ＩｇＧ分子についてのキャピラリー電気泳動：非処理試料と、処理試料との比較は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ解析におけるサイズのシフトにより指し示される（図３）通り、抗ＩＤ  ｓｃＦｖが、ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）による処理の後で、完全に切断されることを示した。３７℃で４８時間にわたりインキュベートされた試料についての解析は、製剤バッファー中の分子の安定性を確認した（図３Ａ−３Ｄ）。
【０３８５】
実施例３
ＣＤ３  ＩｇＧに対する、抗イデオタイプｓｃＦｖのマスキング効果
Ｎ末端における、抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖの融合により、ＣＤ３結合剤をマスキングする効能を、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーターアッセイにより示した。Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞（ＮＦＡＴプロモーターにより調節されたルシフェラーゼの発現を伴う、ヒト急性リンパ性白血病のレポーター細胞株；ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ  Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ−ＲＥ−ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ：型番ＣＳ１７６５０１）は、ＣＤ３εの結合により、ＮＦＡＴプロモーターが活性化すると、活性のホタルルシフェラーゼを発現させる。ルシフェラーゼ基質を添加したときの発光シグナルの強度は、ＣＤ３の活性化及びシグナル伝達の強度に比例する。完全に非マスキングの一価ＣＤ３分子を、ポジティブコントロールとして用いた。処理は、ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、３７℃で４８時間にわたり行った。並行して、壁面が白色の９６ウェル透明底（平底）プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）を、ウェル１つ当たり０．０２５ｕｌのＰＢＳ中に、８ｕｇ／ｍｌの抗ヒトＦｃ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄｓ）により、４℃で４８時間にわたりコーティングした。ピペッティングにより、ＰＢＳを除去してから、一価のＩｇＧを、２００ｎＭ−２．５６ｐＭである、表示の濃度範囲で添加した。プレートを、４℃で約３０分間にわたりインキュベートした。その後、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞を採取し、生存率は、ＶｉＣｅｌｌを使用して評価した。細胞を、ハイグロマイシンを伴わないＪｕｒｋａｔ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２ｇ／ｌのグルコース、２ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３、１０％のＦＣＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウム）中に再懸濁させ、ウェル１つ当たり１００μｌ（ウェル１つ当たりの細胞２５，０００個）を、一価の架橋ＣＤ３  ＩｇＧへと添加した。細胞を、加湿インキュベーター内、３７℃で３時間にわたりインキュベートした。プレートを、約１０分間にわたり、インキュベーターから取り出して、室温へと適応させてから、発光の読取りを行った。ウェル１つ当たり１００μｌのＯＮＥ−Ｇｌｏ溶液（ウェル１つ当たり、１：１のＯＮＥ−Ｇｌｏ及びアッセイ培地容積）を、ウェルへと添加し、暗所内、室温で１０分間にわたりインキュベートした。発光を、ＷＡＬＬＡＣ  Ｖｉｃｔｏｒ３  ＥＬＩＳＡリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２０３０）と、検出時間としての、ウェル１つ当たり１秒間とを使用して検出した。７８５７（非切断型リンカーを伴う４．１５．６４マスク）及び７８５９（非処理）は、非マスキング（７８６１）及び前処理分子（処理ありの７８５９）と比較して、著明に低減されたＣＤ３εの結合を示す（図４Ａ）。７７６０を、Ｎ末端の連結が、ＣＤ３の結合自体をブロックするわけではないことを示すコントロールとして組み入れた。７８５８（非切断型リンカーを伴う４．３２．６３マスク）及び７８６０（非処理）は、非マスキング（７８６１）及び前処理分子（処理ありの７８６０）と比較して、著明に低減されたＣＤ３εの結合を示す（図４Ｂ）。４．３２．６３マスクが、４．１５．６４より、はるかに効果的であることは、抗イデオタイプＣＤ３結合剤の親和性と符合する。ＥＣ５０値（図４Ｃ）の点では、４．３２．６３は、ＣＤ３結合剤の結合を、非マスキングのＣＤ３結合剤である７８６１の５４分の１にマスキングした。４．１５．６４マスクについては、ＣＤ３結合剤の結合のマスキングは、７８６１の１６分の１にとどまる。腫瘍標的及び標的結合剤に応じて、最良のマスクを査定することができる。
【０３８６】
実施例４
抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを伴う抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）分子の調製物
多様な抗イデオタイプｓｃＦｖを伴う、いくつかのＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）分子を生成したが、図５Ａ−５Ｈに、それらのそれぞれのＩＤ番号と共に、概略的に描示する。以下の分子：
ＩＤ７３４４：Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４及びプロテアーゼリンカーを融合させた、古典的フォーマットのＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．１５．６４−ＭＫ０６２マトリプターゼ部位−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＦｏｌＲ１  ＶＨへの融合−不活性Ｆｃ）（図５Ａ；配列番号１、２、及び３）；
ＩＤ７４９６：Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及びプロテアーゼリンカーを融合させた、古典的フォーマットのＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＫ０６２マトリプターゼ部位−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＦｏｌＲ１  ＶＨへの融合−不活性Ｆｃ）（図５Ｃ；配列番号１、３、及び４）；
ＩＤ７６７６：Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４及びプロテアーゼリンカーを融合させた、古典的フォーマットのＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．１５．６４−非切断型ＧＳリンカー−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＦｏｌＲ１  ＶＨへの融合−不活性Ｆｃ）（図５Ｂ；配列番号１、３、及び６）；
ＩＤ７６１１：Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及びプロテアーゼリンカーを融合させた、古典的フォーマットのＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型ＧＳリンカー−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＦｏｌＲ１  ＶＨへの融合−不活性Ｆｃ）（図５Ｄ；配列番号１、３、及び５）
を調製した。
【０３８７】
抗イデオタイプ（ＩＤ）結合剤の配列は、ハイブリドーマ細胞のＲＮＡから、ＲＡＣＥ−ＰＣＲ（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄ）により得た。ハイブリドーマ細胞は、マウスの免疫化により得た。クローニングに必要な制限部位を含む単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）配列の合成は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに依頼した。６つの異なる抗イデオタイプＣＨ２５２７結合剤を、それらの親和性について比較し（図２；Ｂｉａｃｏｒｅ−Ａｎａｌｙｔｉｃｓ（ＡＧ  Ｍ．Ｓｃｈｒａｅｍｌ）による、２５℃／３７℃（Ａｎａｌｙｔ：ＭＡＫ＜ＣＥＡ／ＣＤ３＞ｒＨ）における結果）、それらのうちの４つを、ＣＤ３−ＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ＴＣＢのＨＣにおけるＮ末端融合体としてクローニングした。
【０３８８】
抗ＩＤ単鎖Ｆｖ  ＤＮＡ配列を、それぞれのレシピエントの哺乳類発現ベクターへとあらかじめ挿入されたＣＤ３  ＶＨ鎖とインフレームで、サブクローニングした。タンパク質の発現は、ＭＰＳＶプロモーターにより駆動され、合成ｐｏｌｙＡシグナル配列は、コード配列（ＣＤＳ）の３’末端に存在する。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含有する。
【０３８９】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、哺乳類発現ベクターと共にコトランスフェクトすることにより、分子を生成した。細胞に、対応する発現ベクターを、１：３：２の比（「ベクター重鎖ホール（ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」：「共通軽鎖（ＣＬＣ）」：「ベクター重鎖ノブ（ｓｃＦｖ−ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３）」）でトランスフェクトした。
【０３９０】
トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミン及び２５０ｍｇ／ｌのＧ４１８を含有する、無血清ＥｘＣｅｌｌ培地中で培養した。６００ｍｌのチューブスピンフラスコ（最大の作業容積を４００ｍＬとする）内の生成のために、８億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、Ｇ４１８を伴わないトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、８億個の細胞を、２１０×ｇで、５分間にわたり遠心分離し、上清を、６ｍＭのＬ−グルタミンを含有する、４０ｍｌのあらかじめ温めておいたＣＤ  ＣＨＯ培地で置きかえた。発現ベクターを、６ｍＭのＬ−グルタミンを含有する、４０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地と共に、総量４００μｇのＤＮＡへと混合した。ＰＥＩ溶液（２．７μｇ／ｍｌ）１０８０μｌを添加した後で、混合物を、１５秒間にわたり、ボルテックスし、その後、室温で１０分間にわたりインキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、６００ｍｌのチューブスピンフラスコへと移し、５％のＣＯ２雰囲気を伴うインキュベーター内、３７℃で、３時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、３２０ｍｌのＥｘＣｅｌｌ＋６ｍＭのＬ−グルタミン＋５ｇ／ＬのＰｅｐｓｏｙ＋１．０ｍＭのＶＰＡ＋３ｇ／ｌのグルコース培地を添加し、細胞を、２４時間にわたり培養してから、７％のＦｅｅｄ  ７でフィードした。６−７日間にわたる培養の後、上清を、２１０×ｇ（Ｓｉｇｍａ  ８Ｋ遠心分離機）で、２０−３０分間にわたる遠心分離による精製のために回収した。溶液を滅菌濾過（０．２２μｍのフィルター）し、最終濃度を０．０１％ｗ／ｖとするアジ化ナトリウムを添加した。精製まで、溶液を４℃に保った。分泌タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用するアフィニティークロマトグラフィーに続く、１から２回にわたるサイズ除外クロマトグラフィー工程により、細胞培養物上清から精製した。
【０３９１】
アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、２５ｍｌの２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０  ｐＨ７．５で平衡化したＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦカラム（ＣＶ＝５ｍＬ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０  ｐＨ７．５の少なくとも１０カラム容積で洗浄することにより、結合しなかったタンパク質を除去し、標的タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０  ｐＨ２．５の２０カラム容積（０％−１００％の勾配）中に溶出させた。タンパク質溶液は、２ＭのトリスｐＨ  １０．５の１／１０を添加することにより中和した。標的タンパク質は、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０で平衡化されたＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードする前に、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ３０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌｔｄ．）で、４ｍｌの最大容積へと濃縮した。
【０３９２】
サイズ排除クロマトグラフィーの後における解析法のために、単一画分中の分子の純度及び分子量は、還元剤の非存在下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー（ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（商標）、Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）による染色により解析した。製造元の指示書に従い、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル系（４−１２％のビス−トリス；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ又は３−８％のトリス酢酸塩；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【０３９３】
精製タンパク質試料のタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定し、アミノ酸配列に基づき計算されるモル減衰係数で除することにより決定した。
【０３９４】
最終的な精製工程の後における、分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下におけるＣＥ−ＳＤＳ解析により解析した。製造元の指示書に従い、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。
【０３９５】
分子の凝集物含有量は、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニンモノハイドロクロライド、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中、２５℃で、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ解析用サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して解析した。全ての分子の最終品質は、良好であり、モノマー含有量は、≧９２％であった。
2019514850.tif 000005
【０３９６】
実施例５
プロテアーゼ活性化ＴＣＢの一過性発現
ノブ鎖は、ホール鎖及び軽鎖と比較して、低レベルで発現することが疑われるので、トランスフェクションのために使用される、異なるプラスミド比を、サイズ除外クロマトグラフィーにより比較した。図６及び７に示す通り、１（ホール）：１（ノブ）：３（ＣＬＣ）（図６）ではなく、１（ホール）：２（ノブ）：３（ＣＬＣ）（図７）のプラスミド比を使用したところ、適正な分子（左ピーク）の収量が増大し、ホール−ホールホモダイマー（右ピーク）の量が減少した。
【０３９７】
実施例６
プロテアーゼ活性化ＴＣＢの切断及び安定性
プロテアーゼ活性化ＴＣＢを、キャピラリー電気泳動により解析した。非処理試料と、処理試料との比較は、抗イデオタイプｓｃＦｃ部分が、ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４による処理の後で、完全に切断されることを示した。３７℃で４８時間にわたりインキュベートされた試料についての解析は、製剤バッファー中の分子の安定性を確認した（図１２Ａ−１２Ｄ）。
【０３９８】
実施例７
異なるレベルのＦｏｌＲ１を発現させる標的細胞株を使用する細胞殺滅
異なるレベルのＦｏｌＲ１を発現させる標的細胞株を使用して、プロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子により誘導される、Ｔ細胞媒介性の細胞の殺滅を評価した（図１３）。ヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用し、細胞の殺滅を、プロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子を伴う４８時間にわたるインキュベーションの後に検出した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、採取したばかりの血液、又は健常ヒトドナーから得られたバフィーコートから単離した。新鮮な血液には、５０ｍｌのＬｅｕｃｏｓｅｐチューブ（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏＯｎｅ）を、調製のために使用した。リンパ球調製物（バフィーコート）を濃縮するために、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７密度調製法を使用した。血液／バフィーコートを、滅菌ＰＢＳで、１：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配にわたり層状化させた（Ｓｉｇｍａ、型番Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、中断なし、室温）の後、ＰＢＭＣを含有する界面相の上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを、未使用のファルコンチューブに移し、その後、５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、赤血球を溶解させるために、ＰＢＭＣペレットを、２ｍｌのＡＣＫバッファー中に再懸濁させた。３７℃で約２−３分間にわたるインキュベーションの後、チューブに、滅菌ＰＢＳを、５０ｍｌまで満たし、３５０×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。この洗浄工程を、さらなる使用まで、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーター内、２％のＦＣＳと、１×ＧｌｕｔａＭａｘとを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中にＰＢＭＣを再懸濁させる前に、１回繰り返した。略述すると、接着性の標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにより採取し、カウントし、生存率について点検し、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中、１ｍｌ当たりの細胞０．４×１０６個で再懸濁させた。標的細胞は、丸底９６ウェルプレートを使用して、ウェル１つ当たりの細胞２００００個の密度で播種した。殺滅アッセイのために、分子を、表示の濃度、３重で添加した。ＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ＴＣＢを、ポジティブコントロールとして組み入れ、標的化されていないＴＣＢ分子（ＣＤ３に結合するが、標的細胞抗原には結合しない）を、ネガティブコントロールとして組み入れた。ＰＢＭＣを、最終Ｅ：Ｔ比を、１０：１として、標的細胞へと添加した。標的細胞の殺滅は、３７℃、５％ＣＯ２、４８時間にわたるインキュベーションの後、アポトーシス／壊死細胞による、細胞上清へのＬＤＨ放出の定量化（ＬＤＨ検出キット；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；型番１１６４４７９３００１）により評価した。最大の標的細胞の溶解（＝１００％）は、ＬＤＨ読み出しの１時間前における、標的細胞の、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴うインキュベーションにより達成した。最小の溶解（＝０％）とは、エフェクター細胞を伴うが、ＴＣＢを伴わずにコインキュベートされた標的細胞を指す。
【０３９９】
結果（図１４Ａ、１５Ａ、１６、１７、１８Ａ、１９Ａ、及び２０Ａ）は、Ｎ末端において、非切断型リンカーにより、抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖ部分を連結されたプロテアーゼ活性化ＴＣＢ（７６７６及び７６１１；それぞれ、図５Ｂ及び５Ｄ）が、Ｓｋｏｖ３細胞上及びＨＴ２９細胞上の細胞溶解を著明に低減することが可能であったことを示す。７６１１（図５Ｄ）が、ＨｅＬａ細胞上の殺滅の低減をもたらしたのに対し、７６７６における抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．１５．６４（図５Ｂ）は、細胞溶解の低減にそれほど効果的ではなかった。これは、抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖのＮ部分の親和性と符合する。高親和性のｓｃＦｖ部分は、より効果的にマスキングする。
【０４００】
処理ＴＣＢの力価と、非処理ＴＣＢの力価とが同等であることは、Ｈｅｌａ細胞及びＳｋｏｖ３細胞によるマトリプターゼの発現を示唆する。マトリプターゼの発現は、ＨＴ２９細胞内で、より低度であると考えられる。ＦｏｌＲ１陰性細胞株である、Ｍｋｎ−４５の処理は、本明細書で使用される全ての分子による、弱い殺滅を示すに過ぎない（図１５Ａ）。
【０４０１】
実施例８
腫瘍細胞株の、ヒトＰＢＭＣとのコインキュベーションの後におけるＴ細胞の活性化
プロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子により媒介されるＴ細胞の活性化を、Ｈｅｌａ細胞上、Ｓｋｏｖ３細胞上、及びＨＴ２９細胞上で評価した。ヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用し、Ｔ細胞の活性化を、標的細胞及び抗体を伴う４８時間にわたるインキュベーションの後に検出した。標的細胞は、丸底９６ウェルプレートを使用して、ウェル１つ当たりの細胞２００００個の密度で播種した。分子を、表示の濃度、３重で添加した。ＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ＴＣＢを、ポジティブコントロールとして組み入れ、標的化されていないＴＣＢ分子（ＣＤ３に結合するが、標的細胞抗原には結合しない）を、ネガティブコントロールとして組み入れた。ＰＢＭＣを、最終Ｅ：Ｔ比を、１０：１として、標的細胞へと添加した。Ｔ細胞の活性化は、３７℃、５％ＣＯ２、４８時間にわたるインキュベーションの後、ＣＤ４陽性Ｔ細胞上及びＣＤ８陽性Ｔ細胞上の、ＣＤ２５及びＣＤ６９の定量化により評価した。Ｔ細胞の活性化の結果は、標的細胞の殺滅について評価する前出の実施例で観察した結果と符合する（実施例７）。
【０４０２】
実施例９
プロテアーゼ活性化ＴＣＢと、低レベルの抗原を発現させる標的細胞株とにより媒介されるＴ細胞の活性化
プロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子により媒介されるＴ細胞の活性化を、ごく低レベルのＦｏｌＲ１を発現させるＨＴ２９細胞上で評価した（図１３）。バフィーコートから単離されたヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用した。リンパ球調製物（バフィーコート）を濃縮するために、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７密度調製法を使用した。バフィーコートを、滅菌ＰＢＳで、１：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配にわたり層状化させた（Ｓｉｇｍａ、型番Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、中断なし、室温）の後、ＰＢＭＣを含有する界面相の上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを、未使用のファルコンチューブに移し、その後、５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、赤血球を溶解させるために、ＰＢＭＣペレットを、２ｍｌのＡＣＫバッファー中に再懸濁させた。３７℃で約２−３分間にわたるインキュベーションの後、チューブに、滅菌ＰＢＳを、５０ｍｌまで満たし、３５０×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。この洗浄工程を、さらなる使用まで、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーター内、２％のＦＣＳと、１×ＧｌｕｔａＭａｘとを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中にＰＢＭＣを再懸濁させる前に、１回繰り返した。略述すると、接着性の標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにより採取し、カウントし、生存率について評価し、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中、１ｍｌ当たりの細胞０．４×１０６個で再懸濁させた。標的細胞は、丸底９６ウェルプレートを使用して、ウェル１つ当たりの細胞２００００個の密度で播種した。分子を、表示の濃度、３重で添加した。ＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ＴＣＢを、ポジティブコントロールとして組み入れ、標的化されていないＴＣＢ分子（ＣＤ３に結合するが、標的細胞抗原には結合しない）を、ネガティブコントロールとして組み入れた。ＰＢＭＣを、最終Ｅ：Ｔ比を、１０：１として、標的細胞へと添加した。Ｔ細胞の活性化は、３７℃、５％ＣＯ２、４８時間にわたるインキュベーションの後、ＣＤ４陽性Ｔ細胞上及びＣＤ８陽性Ｔ細胞上の、ＣＤ２５及びＣＤ６９の定量化により評価した。処理されたプロテアーゼ活性化ＴＣＢの力価は、１６Ｄ５  ＴＣＢ（６２９８）と同等である。１６Ｄ５  ＴＣＢ（逆フォーマット）は、古典的フォーマットより高力価を示す。非切断型リンカーを伴うか、又はマトリプターゼによる前処理を伴わないマスキングされたＴＣＢは、この細胞株上のＴ細胞の活性化を誘導しない。ＦｏｌＲ１の発現レベルが低度又は中程度の細胞株では、いずれの抗イデオタイプｓｃＦｖも、ＣＤ３  Ｆａｂをマスキングするのに十分である（図２２Ａ及び２２Ｂ）。
【０４０３】
実施例１０
初代細胞株ＨＲＣＥｐｉＣを伴うプロテアーゼ活性化ＴＣＢにより媒介されるＴ細胞の活性化
プロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子により媒介されるＴ細胞の活性化を、極めて少量のＦｏｌＲ１のみを発現させる、初代ヒト腎皮質上皮細胞（ＳｃｉｅｎｃｅＣｅｌｌ）細胞上で評価した（図１３）。バフィーコートから単離されたヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用した。リンパ球調製物（バフィーコート）を濃縮するために、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７密度調製法を使用した。バフィーコートを、滅菌ＰＢＳで、１：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配にわたり層状化させた（Ｓｉｇｍａ、型番Ｈ８８８９）。遠心分離（室温で、４５０×ｇ、３０分間、中断なし）の後、ＰＢＭＣを含有する界面相の上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを、未使用のファルコンチューブに移し、その後、５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、赤血球を溶解させるために、ＰＢＭＣペレットを、２ｍｌのＡＣＫバッファー中に再懸濁させた。３７℃で約２−３分間にわたるインキュベーションの後、チューブに、滅菌ＰＢＳを、５０ｍｌまで満たし、３５０×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。この洗浄工程を、さらなる使用まで、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーター内、２％のＦＣＳと、１×ＧｌｕｔａＭａｘとを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中にＰＢＭＣを再懸濁させる前に、１回繰り返した。略述すると、接着性の標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにより採取し、カウントし、生存率について点検し、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中、１ｍｌ当たりの細胞０．４×１０６個で再懸濁させた。標的細胞は、丸底９６ウェルプレートを使用して、ウェル１つ当たりの細胞２００００個の密度で播種した。プロテアーゼ活性化型ＴＣＢ分子を、表示の濃度、３重で添加した。ＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ＴＣＢを、ポジティブコントロールとして組み入れ、標的化されていないＴＣＢ分子（ＣＤ３に結合するが、標的細胞抗原には結合しない）を、ネガティブコントロールとして組み入れた。ＰＢＭＣを、最終Ｅ：Ｔ比を、１０：１として、標的細胞へと添加した。Ｔ細胞の活性化は、３７℃、５％ＣＯ２、４８時間にわたるインキュベーションの後、ＣＤ４陽性Ｔ細胞上及びＣＤ８陽性Ｔ細胞上の、ＣＤ２５及びＣＤ６９の定量化により評価した。マスキングされた１６Ｄ５  ＴＣＢは、ＴＣＢ濃度が最高の１０．０００ｐＭで、低レベルのＦｏｌＲ１の発現にもかかわらず、初代ヒト腎皮質上皮細胞と共にインキュベーションしても、Ｔ細胞の活性化を誘導しないことから、抗イデオタイプマスキング部分の有効性が裏付けられる。１６Ｄ５  ＴＣＢ（逆フォーマット及び古典的フォーマット）については、Ｔ細胞の活性化を、ほとんど観察することができない（図２３）。
【０４０４】
実施例１１
１６Ｄ５  ＴＣＢのＣＤ３結合剤をマスキングする抗ＩＤ  ＣＤ３  Ｆａｂ。Ｏｖｃａｒ３細胞上の殺滅。
プロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子により媒介される、Ｔ細胞媒介性の標的細胞の殺滅は、ＯＶＣＡＲ３細胞上で評価した（図２４）。ヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用し、細胞の殺滅を、分子を伴う４８時間にわたるインキュベーションの後に検出した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常ドナーの採取したばかりの血液から単離した。５０ｍｌのＬｅｕｃｏｓｅｐチューブ（ＧｒｅｉｎｅｒＢｉｏＯｎｅ）を、調製のために使用した。血液を、滅菌ＰＢＳで、１：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配にわたり層状化させた（Ｓｉｇｍａ、型番Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、中断なし、室温）の後、ＰＢＭＣを含有する界面相の上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを、未使用のファルコンチューブに移し、その後、５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、赤血球を溶解させるために、ＰＢＭＣペレットを、２ｍｌのＡＣＫバッファー中に再懸濁させた。３７℃で約２−３分間にわたるインキュベーションの後、チューブに、滅菌ＰＢＳを、５０ｍｌまで満たし、３５０×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。この洗浄工程を、さらなる使用まで、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーター内、２％のＦＣＳと、１×ＧｌｕｔａＭａｘとを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中にＰＢＭＣを再懸濁させる前に、１回繰り返した。略述すると、接着性の標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにより採取し、カウントし、生存率について点検し、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中、１ｍｌ当たりの細胞０．４×１０６個で再懸濁させた。標的細胞は、丸底９６ウェルプレートを使用して、ウェル１つ当たりの細胞２００００個の密度で播種した。殺滅アッセイのために、分子を、表示の濃度、３重で添加した。ＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ＴＣＢを、ポジティブコントロールとして組み入れ、標的化されていないＴＣＢ分子（ＣＤ３に結合するが、標的細胞抗原には結合しない）を、ネガティブコントロールとして組み入れた。ＰＢＭＣを、最終Ｅ：Ｔ比を、１０：１として、標的細胞へと添加した。標的細胞の殺滅は、３７℃、５％ＣＯ２、４８時間にわたるインキュベーションの後、アポトーシス／壊死細胞による、細胞上清へのＬＤＨ放出の定量化（ＬＤＨ検出キット；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；型番１１６４４７９３００１）により評価した。最大の標的細胞の溶解（＝１００％）は、ＬＤＨ読み出しの１時間前における、標的細胞及びＰＢＭＣの、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴うインキュベーションにより達成した。最小の溶解（＝０％）とは、エフェクター細胞を伴うが、ＴＣＢを伴わずにコインキュベートされた標的細胞を指す。結果（図２４）は、Ｎ末端において、非切断型リンカーにより、抗イデオタイプＣＤ３  ４．１５．６４交差Ｆａｂを連結されたプロテアーゼ活性化ＴＣＢが、ＣＤ３結合剤を、それほどマスキングしないことを示す。さらに、非処理分子もまた、これらの細胞の殺滅を誘導するため、Ｏｖｃａｒ３細胞は、マトリプターゼを発現させると考えられる。
【０４０５】
実施例１２
３例の異なるヒトＰＢＭＣドナーによる、Ｓｋｏｖ３細胞上及びＨｅＬａ細胞上の殺滅
プロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子により媒介される、Ｔ細胞による殺滅は、異なるレベルのＦｏｌＲ１を発現させる、２つの異なる細胞株上で評価した（図２５−２７）。ヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用し、細胞の殺滅を、分子を伴う４８時間にわたるインキュベーションの後に検出した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常ヒトドナーから得られたバフィーコートから単離した。リンパ球調製物（バフィーコート）を濃縮するために、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７密度調製法を使用した。血液／バフィーコートを、滅菌ＰＢＳで、１：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配にわたり層状化させた（Ｓｉｇｍａ、型番Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、中断なし、室温）の後、ＰＢＭＣを含有する界面相の上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを、未使用のファルコンチューブに移し、その後、５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、赤血球を溶解させるために、ＰＢＭＣペレットを、２ｍｌのＡＣＫバッファー中に再懸濁させた。３７℃で約２−３分間にわたるインキュベーションの後、チューブに、滅菌ＰＢＳを、５０ｍｌまで満たし、３５０×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。この洗浄工程を、１０％のＦＣＳと、１×ＧｌｕｔａＭａｘとを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中にＰＢＭＣを再懸濁させる前に、１回繰り返した。ＰＢＭＣを、１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ、及び１０％のＤＭＳＯを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁させた。ＰＢＭＣを、Ｃｏｏｌ  Ｃｅｌｌボックス内、−８０℃で、一晩にわたり凍結させてから、液体窒素へと移した。アッセイ開始の２４時間前、ＰＢＭＣを融解させ、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーター内、１０％のＦＣＳと、１×ＧｌｕｔａＭａｘとを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で保った。アッセイ開始の前日、接着性の標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにより採取し、カウントし、生存率について点検し、適切な培地中、１ｍｌ当たりの細胞０．４×１０６個で再懸濁させた。標的細胞は、平底９６ウェルプレートを使用して、ウェル１つ当たりの細胞２００００個の密度で播種した。アッセイの開始日に、ＰＢＭＣをカウントし、生存率について点検した。ＰＢＭＣを、３５０ｇで５分間にわたり遠心分離し、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中に再懸濁させた。標的細胞の培地を除去し、希釈された抗体を、表示の濃度、３重で添加する前に、ＰＢＭＣを、標的細胞へと添加した。ＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ＴＣＢを、ポジティブコントロールとして組み入れ、標的化されていないＴＣＢ分子（ＣＤ３に結合するが、標的細胞抗原には結合しない）を、ネガティブコントロールとして組み入れた。ＰＢＭＣを、Ｅ：Ｔ比を、１０：１として、標的細胞へと添加した。標的細胞の殺滅は、３７℃、５％ＣＯ２、４８時間にわたるインキュベーションの後、アポトーシス／壊死細胞による、細胞上清へのＬＤＨ放出の定量化（ＬＤＨ検出キット；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；型番１１６４４７９３００１）により評価した。最大の標的細胞の溶解（＝１００％）は、ＬＤＨ読み出しの２時間前におけ���、標的細胞の、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴うインキュベーションにより達成した。最小の溶解（＝０％）とは、エフェクター細胞を伴うが、ＴＣＢを伴わずにコインキュベートされた標的細胞を指す。
【０４０６】
結果（図２５−２７）は、Ｎ末端において、非切断型リンカーにより、ｓｃＦｖ  ４．３２．６３を連結されたＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（図５Ｄ）が、１００ｐＭの濃度における、ＨｅＬａ細胞上、及び１０ｎＭの濃度における、Ｓｋｏｖ３細胞上の殺滅の低減を誘導したことを示す。Ｎ末端において、非切断型リンカーにより、ｓｃＦｖ  ４．１５．６４を連結されたＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（図５Ｂ）は、１０ｎＭの濃度における、Ｓｋｏｖ３細胞上の殺滅の低減にそれほど効果的ではなかった。親和性の大きな抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３を意味する、より強力なマスキングは、ＣＤ３結合剤のマスキングにおいて、弱い抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．１５．６４より効果的である。処理ＴＣＢの力価と、非処理ＴＣＢの力価とが同等であることは、Ｈｅｌａ細胞及びＳｋｏｖ３細胞による、プロテアーゼ、例えば、マトリプターゼの発現を示唆する。
【０４０７】
実施例１３
抗イデオタイプＧＡ２０１  ｓｃＦｖでマスキングされた、ＨＥＲ１結合抗体であるＧＡ２０１の調製
本実施例では、以下の分子：
１：Ｎ末端において、抗イデオタイプＧＡ２０１  ｓｃＦｖ及びグリシンセリンリンカー内のマトリックスメタロプロテアーゼ部位（配列番号３２及び３４）を融合させたＧＡ２０１  ＩｇＧ１抗体と；
２：ＨＥＲ１結合ＩｇＧ１抗体であるＧＡ２０１（配列番号３２及び３３）と
を調製した。
【０４０８】
その概略的例示を、図２８及び２９に示す。ＧＡ２０１抗イデオタイプ（ＩＤ）結合剤の配列は、可変軽鎖及び可変重鎖のそれぞれの末端への縮重プライマーの結合を使用して、ハイブリドーマ細胞のＲＮＡからのＲＴ−ＰＣＲ（逆転写）により得た。ハイブリドーマ細胞は、マウスの免疫化により得た。フランキングの単一の制限エンドヌクレアーゼ部位を伴う、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ＤＮＡ配列の合成は、Ｇｅｎｅａｒｔに依頼され、ＧＡ２０１軽鎖におけるＮ末端の融合体としてクローニングされた。
【０４０９】
重鎖ｓｃＦｖ及び軽鎖ｓｃＦｖの全ての融合タンパク質をコードする発現プラスミドの構築には、Ｒｏｃｈｅ発現ベクターを使用した。ベクターは、以下のエレメント：
・選択マーカーとしての、ハイグロマイシン耐性遺伝子；
・エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の複製開始点である、ｏｒｉＰ；
・ベクターであるｐＵＣ１８に由来する複製開始点であって、大腸菌内のこのプラスミドの複製を可能とする複製開始点；
・大腸菌内でアンピシリン耐性を付与する、ベータ−ラクタマーゼ遺伝子；
・ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）に由来する前早期エンハンサー及び前早期プロモーター；
・ヒト免疫グロブリン１ポリアデニル化（「ポリＡ」）シグナル配列；及び
・固有のＢａｍＨＩ制限部位及びＸｂａＩ制限部位
から構成される。
【０４１０】
製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の指示書に従い、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、懸濁液中で増殖するヒト胎児性腎臓２９３−Ｆ細胞を、哺乳類発現ベクターと共にコトランスフェクトすることにより、分子を生成した。略述すると、懸濁液である、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３−Ｆ細胞を、３７℃／８％ＣＯ２、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ培地中で培養し、細胞を、トランスフェクション日に、新鮮な培地中、１ｍｌ当たりの生細胞１−２×１０６個の密度で播種した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）中で、２５０ｍｌの最終的なトランスフェクション容積に対して、３２５μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と、２５０μｇの重鎖（「ＧＡ２０１重鎖」）及び軽鎖（「抗ＧＡ２０１  ＶＨ−ＶＬ  ｓｃＦｖ−ＭＭＰ切断型リンカーＧ４Ｓ−ＧＡ２０１軽鎖」又は「ＧＡ２０１軽鎖」）のプラスミドＤＮＡとを、１：１のモル比で使用して、ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）複合体を調製した。トランスフェクションの７日後に、抗体を含有する細胞培養物上清を、１４０００ｇで、３０分間にわたる遠心分離により採取し、滅菌フィルター（０．２２μｍ）を通して濾過した。上清は、精製まで、−２０℃で保存した。
【０４１１】
分泌タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用するアフィニティークロマトグラフィーに続いて、サイズ排除クロマトグラフィーにより、細胞培養物上清から精製した。略述すると、滅菌濾過した細胞培養物上清を、ＰＢＳバッファー（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、及び２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化させたＨｉＴｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ  ＨＰ（５ｍｌ）カラムへと適用した。結合しなかったタンパク質は、平衡化バッファーで洗い落とした。抗体及び抗体変異体を、０．１Ｍのクエン酸バッファー、ｐＨ２．８で溶出させ、タンパク質含有画分を、０．１ｍｌの１Ｍのトリス、ｐＨ８．５で中和させた。次いで、溶出させたタンパク質画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ遠心分離フィルターデバイス（ＭＷＣＯ：３０Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、３ｍｌの容積へと濃縮し、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で平衡化させた、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ＨｉＬｏａｄ  １２０ｍｌ  １６／６０ゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）上にロードした。精製ＧＡ２０１−抗ＧＡ２０１−ｓｃＦｖ又は高分子量凝集物を５％未満とするＧＡ２０１を含有する画分をプールし、１．０ｍｇ／ｍｌのアリコートとして、−８０℃で保存した。
【０４１２】
サイズ排除クロマトグラフィーの後におけるタンパク質解析法のために、単一画分中の分子の純度及び分子量は、還元剤の非存在下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー（ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（商標）、Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）による染色により解析した。製造元の指示書に従い、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル系（４−１２％のビス−トリス；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ又は３−８％のトリス酢酸塩；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【０４１３】
精製タンパク質試料のタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定し、アミノ酸配列に基づき計算されるモル減衰係数で除することにより決定した。最終的な精製工程の後における、分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下におけるＣＥ−ＳＤＳ解析により解析した。製造元の指示書に従い、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。
【０４１４】
分子の凝集物含有量は、２００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．０のランニングバッファー中、２５℃で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００解析用サイズ除外カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する高速ＳＥＣにより解析した。２５μｇのタンパク質を、カラム上に、０．５ｍｌ／分の流速で注入し、５０分間にわたり、アイソクラティック溶出させた。
【０４１５】
全ての分子の最終純度は、高速ＳＥＣにより検出される通り、≧９５％のモノマー含有量であった。抗イデオタイプｓｃＦｖマスキングＧＡ２０１の分子量は、ＣＥ−ＳＤＳ解析により、非還元条件下で、２１６．３ｋＤａとして決定し（図１Ａ）、還元条件下で、それぞれ、ＧＡ２０１重鎖については、５８．３ｋＤａと決定し、ｓｃＦｖ連結ＧＡ２０１軽鎖については、６０．３ｋＤａと決定した（図３０Ｂ）。アミノ酸配列に基づく分子量を、重鎖については、４９．２ｋＤａと計算し、ｓｃＦｖ融合ＧＡ２０１軽鎖については、５１．９ｋＤａと計算したが、これらは、ＨＥＫ２９３細胞内の両方の鎖のグリコシル化を指し示す。
2019514850.tif 000006
【０４１６】
実施例１４
ＧＡ２０１  ＩｇＧに対する、抗イデオタイプｓｃＦｖのマスキング効果
抗イデオタイプＧＡ２０１  ｓｃＦｖの、Ｎ末端における融合により、ＧＡ２０１の、ＨＥＲ１への結合をマスキングする効能を、ＨＥＲ１を発現させるＨ３２２Ｍ細胞についてのＦＡＣＳ解析と、ＨＥＲ１コーティングチップ表面上の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析とにより示した。ＧＡ２０１−抗ＧＡ２０１−ｓｃＦｖのタンパク質分解性切断のために、組換え活性ヒトＭＭＰ２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用した。ＭＭＰ切断部位を含有するグリシンセリンリンカーにより、ＧＡ２０１へと融合させた、１ｍｇのＧＡ２０１抗イデオタイプｓｃＦｖを、３７℃で一晩にわたり、ＰＢＳ中に１．２μｇのＭＭＰ２と共にインキュベートした。
【０４１７】
切断されたＧＡ２０１−抗ＧＡ２０１−ｓｃＦｖ及び切断されていないＧＡ２０１−抗ＧＡ２０１−ｓｃＦｖの、ＨＥＲ１への結合についてのＦＡＣＳ解析のために、非小細胞肺がん細胞株であるＨ３２２Ｍを使用した。細胞を、１ｍｌ当たり１×１０６個へと調整し、９６ウェル丸底プレートへと分配した。分子を添加し、氷上で３０分間にわたりインキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋２％のＦＣＳ＋０．１％のアジ化ナトリウム）で、１回洗浄し、Ｆ（ａｂ’）２−ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ二次抗体ＦＩＴＣコンジュゲート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に再懸濁させた。氷上におけるさらなる２０分後、細胞を、２回にわたり洗浄し、ＦＡＣＳバッファー中に再懸濁させ、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩにより解析した。細胞１００００個について測定し、蛍光シグナルの中央値を、解析のために使用した。ＧＡ２０１−抗ＧＡ２０１−ｓｃＦｖの、ＭＭＰ−２による切断の前には、Ｈ３２２Ｍ細胞上のＨＥＲ１への結合は測定不能であったことから、ＧＡ２０１結合ドメインの、抗イデオタイプｓｃＦｖによる完全なマスキングが指し示される（図３１）。切断されなかったＧＡ２０１−抗ＧＡ２０１−ｓｃＦｖの結合は、非特異的アイソタイプＩｇＧコントロール抗体と同等であった（図３１）。これに対し、抗イデオタイプｓｃＦｖの、ＭＭＰによる切断は、ＧＡ２０１の活性化をもたらし、Ｈ３２２Ｍ細胞上のＨＥＲ１への結合は、非マスキング親抗体ＧＡ２０１と同様のレベルへと回復した（図３１）。
【０４１８】
ＭＭＰによる切断の後における、マスキングされたＧＡ２０１の結合についてのＦＡＣＳ結合データを確認するため、本発明者らはまた、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００測定器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する第２の解析法として、ＳＰＲ実験も実施した。標準的なアミンカップリング化学反応を使用して、ＨＥＲ１を、ＣＭ５バイオセンサーチップの表面上に固定化した。ＨＥＲ１細胞外ドメインを、酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中に、１μｇ／ｍｌで注入した。参照のコントロールフローセルも、同じ方式で処理したが、ビヒクルバッファーのみを伴った。一晩にわたる、ＭＭＰによる切断の前及び後における、ＧＡ２０１−抗ＧＡ２０１−ｓｃＦｖと、ＧＡ２０１とを、１×ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）中で希釈し、３．１２５及び５０ｎＭの間の漸増濃度、３０μｌ／分の流速で注入した。会合期は、３分間であり、解離時間は、１０分間であった。ＨＥＲ１の結合は、５μｌ／分の流速で、３０秒間にわたる、０．８５％のリン酸の注入により再生させた。反応速度定数及び平衡解離定数は、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア内の１：１ラングミュア結合モデルを使用することにより計算した。ＧＡ２０１親非マスキング抗体には、ＨＥＲ１の結合についての、１ｎＭのＫＤ値を決定した（図３２）。ＧＡ２０１−抗ＧＡ２０１−ｓｃＦｖの、ＭＭＰ−２を伴う、一晩にわたるインキュベーションの後、会合及び解離についての、非マスキングコントロール抗体と同様のｋａ速度定数及びｋｄ速度定数により、２ｎＭのＫＤ値が測定されたことから、プロテアーゼ切断による、ＨＥＲ１への結合の完全な回復が指し示される（図３２）。切断されていないＧＡ２０１−抗ＧＡ２０１−ｓｃＦｖは、ＳＰＲ解析において、ＨＥＲ１への結合を全く示さなかった（図３２）。まとめると、本発明者らは、抗イデオタイプｓｃＦｖの、ＩｇＧ１抗体ＧＡ２０１のＮ末端への融合による、ＨＥＲ１への結合の完全な喪失を、２つの独立の解析法により裏付けた。さらに、ＨＥＲ１への結合は、ｓｃＦｖの除去により、グリシンセリンリンカー内のＭＭＰ切断部位における、プロテアーゼによる切断を介して、完全に回復した。
【０４１９】
実施例１５
抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを伴う、抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３及び抗メソテリン／抗ＣＤ３Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）分子の調製物
多様な抗イデオタイプｓｃＦｖを伴う、いくつかのＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）分子を生成したが、図３３Ａ−３３Ｊに、それらのそれぞれのＩＤ番号と共に、概略的に描示する。以下の分子：
ＩＤ  ８３６４：「Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及びＭＭＰ９−ＭＫ０６２プロテアーゼリンカーを融合させた、古典的フォーマットのＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＭＰ９−ＭＫ０６２マトリプターゼ部位−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＦｏｌＲ１  ＶＨへの融合−不活性Ｆｃ）」（図３３Ａ；配列番号１、３、及び７２）；
ＩＤ  ８３６３：「Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及びカテプシンＳ／Ｂプロテアーゼリンカーを融合させた、古典的フォーマットのＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−カテプシンＳ／Ｂ部位−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＦｏｌＲ１  ＶＨへの融合−不活性Ｆｃ）」（図３３Ｂ；配列番号１、３、及び８５）；
ＩＤ  ８３６５：「Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及びＭＫ０６２マトリプターゼリンカーを融合させた、逆フォーマットのＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＫ０６２マトリプターゼリンカー−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＣＤ３  ＶＬへの融合−不活性Ｆｃ）」（図３３Ｃ；配列番号１、３、７３、及び７４）；
ＩＤ  ８３６６：「Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及び非切断型ＧＳリンカーを融合させた、逆フォーマットのＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型ＧＳリンカー−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＣＤ３  ＶＬへの融合−不活性Ｆｃ）」（図３３Ｄ）；
ＩＤ  ８６７２：「Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及びＭＭＰ９−ＭＫ０６２マトリプターゼを融合させた、古典的フォーマット、ＭＳＬＮ荷電変異体、ＣＤ３交差型の抗メソテリン  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＭＰ９−ＭＫ０６２マトリプターゼ−ＣＤ３−Ｎ末端における抗メソテリンＶＨへの融合−不活性Ｆｃ）」（図３３Ｅ；配列番号７７、７８、８１、８２）；
ＩＤ  ８６７３：「Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及び非切断型ＧＳリンカーを融合させた、古典的フォーマット、ＭＳＬＮ荷電変異体、ＣＤ３交差型の抗メソテリン  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型ＧＳリンカー−ＣＤ３−Ｎ末端における抗メソテリンＶＨへの融合−不活性Ｆｃ）」（図３３Ｆ）；
ＩＤ  ８６７４：「Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及びＭＭＰ９−ＭＫ０６２マトリプターゼを融合させた、逆フォーマット、ＭＳＬＮ荷電変異体、ＣＤ３交差型の抗メソテリン  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＭＰ９−ＭＫ０６２マトリプターゼ−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＣＤ３  ＶＨへの融合−不活性Ｆｃ）」（図３３Ｇ；配列番号７６、７７、７８、７９）；
ＩＤ  ８６７５：「Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及び非切断型ＧＳリンカーを融合させた、逆フォーマット、ＭＳＬＮ荷電変異体、ＣＤ３交差型の抗メソテリン  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型ＧＳリンカー−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＣＤ３  ＶＨへの融合−不活性Ｆｃ）」（図３３Ｈ）；
ＩＤ  ８５０５：「逆フォーマット、ＭＳＬＮ荷電変異体、ＣＤ３交差型の抗メソテリン  ２＋１  ＩｇＧ（Ｎ末端において、ＣＤ３  ＶＬ−不活性Ｆｃへと融合させた抗メソテリンＨＣ）」（図３３Ｉ）；
ＩＤ  ８６７６：「古典的フォーマット、ＭＳＬＮ荷電変異体、ＣＤ３交差型の抗メソテリン  ２＋１  ＩｇＧ（ＣＤ３−Ｎ末端における抗メソテリンＶＨへの融合−不活性Ｆｃを伴う抗メソテリンＩｇＧ）」（図３３Ｊ）
を調製した。
【０４２０】
可変ドメインを、それぞれのレシピエントの哺乳類発現ベクターへとあらかじめ挿入されたドメインとインフレームで、サブクローニングした。タンパク質の発現は、ＭＰＳＶプロモーターにより駆動され、合成ｐｏｌｙＡシグナル配列は、ＣＤＳの３’末端に存在する。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含有する。
【０４２１】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、懸濁液中で増殖するＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞を、哺乳類発現ベクターと共にコトランスフェクトすることにより、分子（８５０５を除く；この分子は、懸濁液中で増殖するＣＨＯ細胞を、哺乳類発現ベクターと共にコトランスフェクトすることにより生成した。一過性のトランスフェクションは、Ｅｖｉｔｒｉａ  ＡＧ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において行った）を生成した。トランスフェクションのために、ＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、６ｍＭのＬ−グルタミン及び２５０ｍｇ／ｌのＧ４１８を含有する、無血清ＥｘＣｅｌｌ培地中で培養した。６００ｍｌのチューブスピンフラスコ（最大の作業容積を４００ｍｌとする）内の生成のために、８億個のＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、Ｇ４１８を伴わないトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、８億個の細胞を、２１０×ｇで、５分間にわたり遠心分離し、上清を、６ｍＭのＬ−グルタミンを含有する、４０ｍｌのあらかじめ温めておいたＣＤ  ＣＨＯ培地で置きかえた。発現ベクターを、６ｍＭのＬ−グルタミンを含有する、４０ｍｌのＣＤ  ＣＨＯ培地と共に、総量４００μｇのＤＮＡへと混合した。ＰＥＩ溶液（２．７μｇ／ｍｌ）１０８０μｌを添加した後で、混合物を、１５秒間にわたり、ボルテックスし、その後、室温で１０分間にわたりインキュベートした。その後、細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、６００ｍｌのチューブスピンフラスコへと移し、５％のＣＯ２雰囲気を伴うインキュベーター内、３７℃で、３時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、３２０ｍｌのＥｘＣｅｌｌ＋６ｍＭのＬ−グルタミン＋５ｇ／ＬのＰｅｐｓｏｙ＋１．０ｍＭのＶＰＡ＋３ｇ／ｌのグルコース培地を添加し、細胞を、２４時間にわたり培養してから、７％のＦｅｅｄ  ７でフィードした。６−７日間にわたる培養の後、上清を、２１０×ｇ（Ｓｉｇｍａ  ８Ｋ遠心分離機）で、２０−３０分間にわたる遠心分離による精製のために回収した。溶液を滅菌濾過（０．２２μｍのフィルター）し、最終濃度を０．０１％ｗ／ｖとするアジ化ナトリウムを添加した。精製まで、溶液を４℃に保った。分泌タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用するアフィニティークロマトグラフィーに続く、１から２回にわたるサイズ除外クロマトグラフィー工程により、細胞培養物上清から精製した。
【０４２２】
アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ（ＣＶ＝５ｍＬ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５の少なくとも１０カラム容積で洗浄することにより、結合しなかったタンパク質を除去し、標的タンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３．０、２０カラム容積（０％−１００％の勾配）中に溶出させた。タンパク質溶液は、０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４  ｐＨ８．０の１／１０を添加することにより中和した。標的タンパク質は、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ  ｐＨ６．０で平衡化されたＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードする前に、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ３０Ｋ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｌｔｄ．）で、最大で４ｍｌの容積へと濃縮した。
【０４２３】
精製タンパク質試料のタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定し、アミノ酸配列に基づき計算されるモル減衰係数で除することにより決定した。
【０４２４】
最終的な精製工程の後における、分子の純度及び分子量は、還元剤の存在下及び非存在下におけるＣＥ−ＳＤＳ解析により解析した。製造元の指示書に従い、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。
【０４２５】
分子の凝集物含有量は、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニンモノハイドロクロライド、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、ｐＨ６．７のランニングバッファー中、２５℃で、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷ  ＸＬ解析用サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を使用して解析した。全ての分子の最終品質は、良好であり、モノマー含有量は、≧９５％であった。
2019514850.tif 000007
【０４２６】
実施例１６
品質管理及び安定性−異なるＴＣＢ分子についての、キャピラリー電気泳動によるＳＤＳ解析
最終的な精製工程の後における、分子の純度及び分子量を、還元剤の存在下及び非存在下におけるＣＥ−ＳＤＳ解析により解析した。製造元の指示書に従い、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。非処理分子（４℃で保存した）、処理分子（適切な組換えプロテアーゼ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、３７℃で２４時間にわたり処理された）、及び３７℃で７２時間にわたりインキュベートされた分子についての比較を行った（図３４、３５Ａ、及び３５Ｂ）。
【０４２７】
非処理分子と、処理分子との比較は、ＭＫ０６２マトリプターゼリンカーを含有する逆フォーマットについて、ｒｈマトリプターゼ／ＳＴ１４による処理の後における、抗ＩＤ  ｓｃＦｖの完全な切断に対して、ＭＭＰ９−ＭＫ０６２マトリプターゼリンカーの不完全な切断を示す。ｒｈカテプシンＢによる処理及びｒｈカテプシンＳによる処理も同様に、不完全である。酵素の精製についての条件は、最適となっていない。
【０４２８】
３７℃で７２時間にわたりインキュベートされた分子が、純粋な分子と同じ高度で泳動することから、インビトロアッセイの持続時間にわたり、分子が３７℃で安定であることが示唆される。適正な分子量を推定するために、あらかじめ染色されたタンパク質マーカーである、Ｍａｒｋ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
【０４２９】
実施例１７
プロテアーゼ活性化ＦｏｌＲ１  ＴＣＢの異なるリンカー及びフォーマットの比較
Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ活性化アッセイ：プロテアーゼ活性化ＴＣＢの異なるフォーマット及びリンカーを比較するためのＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ活性化アッセイである。Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＮＦＡＴプロモーターを伴う、ヒト急性リンパ性白血病のレポーター細胞株であって、ヒトＣＤ３εを発現させるレポーター細胞株である。ＴＣＢが、腫瘍標的に結合し、ＣＤ３結合剤が、ＣＤ３εに結合する（架橋形成）場合に、ルシフェラーゼの発現を、Ｏｎｅ−Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加の後の発光により測定することができる。２０，０００個の標的細胞を、壁面が白色の９６ウェル透明底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ）内、ハイグロマイシンを伴わない、ウェル１つ当たり５０ｕｌのＪｕｒｋａｔ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２ｇ／ｌのグルコース、２ｇ／ｌのＮａＨＣＯ３、１０％のＦＣＳ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１×ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウム）中に播種した。プレートを、３７℃で約２０時間にわたりインキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞を採取し、生存率は、ＶｉＣｅｌｌを使用して評価した。細胞を、ハイグロマイシンを伴わないＪｕｒｋａｔ培地中で再懸濁させ、ウェル１つ当たり５０μｌ（ウェル１つ当たりの細胞５０，０００個）を添加した。Ｅ：Ｔ比は、２．５：１（播種した細胞数に基づく）であった。抗体を、ハイグロマイシンを伴わないＪｕｒｋａｔ培地中で希釈し、ウェル１つ当たり５０ｕｌを添加した。細胞を、加湿インキュベーター内、３７℃で６時間にわたりインキュベートしてから、それらを、約１０分間にわたり、インキュベーターから取り出して、室温へと適応させてから、発光の読取りを行った。ウェル１つ当たり５０μｌのＯＮＥ−Ｇｌｏ溶液を、ウェルへと添加し、暗所内、室温で１０分間にわたりインキュベートした。発光を、ＷＡＬＬＡＣ  Ｖｉｃｔｏｒ３  ＥＬＩＳＡリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２０３０）と、検出時間としての、ウェル１つ当たり１秒間とを使用して検出した。前処理プロテアーゼ活性化ＴＣＢ（８３６４；グレーの塗りつぶし四角）と、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（黒の下向き三角）との比較は、切断後に力価が完全に回復することを示した。この濃度範囲では、マスキングＴＣＢ（ＧＳ非切断型リンカーを含有する；グレーの上向き三角）及び非標的化ＴＣＢコントロール（白抜きの下向き三角）でインキュベートされた、いずれの細胞株についても、発光は検出不能であった。点線は、ＴＣＢを伴わない標的細胞及びエフェクター細胞による発光を示す（図３６Ａ及び３６Ｂ）。
【０４３０】
実施例１８
異なるフォーマットのプロテアーゼ活性化ＴＣＢにより媒介される腫瘍細胞への細胞傷害性
プロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子により媒介される、Ｔ細胞による殺滅を、異なるレベルのＦｏｌＲ１を発現させる細胞株上で評価した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常ヒトドナーから得られたバフィーコートから単離した。バフィーコートを、滅菌ＰＢＳで、１：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配にわたり層状化させた（Ｓｉｇｍａ、型番Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、中断なし、室温）の後、ＰＢＭＣを含有する界面相を、未使用のファルコンチューブに移し、その後、これを、５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、赤血球を溶解させるために、ＰＢＭＣペレットを、２ｍｌのＡＣＫバッファー中に再懸濁させた。３７℃で約２−３分間にわたるインキュベーションの後、チューブに、滅菌ＰＢＳを、５０ｍｌまで満たし、３５０×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。この洗浄工程を、１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ、及び１０％のＤＭＳＯを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、ＰＢＭＣを再懸濁させる前に、１回繰り返した。ＰＢＭＣを、ＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（ＢｉｏＣｉｓｉｏｎ）内、−８０℃で、ゆっくりと凍結させ、次いで、液体窒素へと移した。アッセイ開始の１日前、接着性の標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにより採取し、カウントし、生存率について点検し、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中に再懸濁させた。標的細胞は、平底９６ウェルプレートを使用して、ウェル１つ当たりの細胞２００００個の密度で播種し、加湿インキュベーター内、３７℃で約２０時間にわたりインキュベートした。アッセイ開始の約２０時間前、ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中で融解させた。ＰＢＭＣを、３５０ｇで、７分間にわたり遠心分離した。ペレットを、新鮮な培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中に再懸濁させ、加湿インキュベーター内、３７℃、最長で２４時間にわたりインキュベートした。アッセイの開始日に、ＰＢＭＣを採取し、３５０ｇで、７分間にわたり遠心分離した。ペレットを、アッセイ培地中に再懸濁させ、ウェル１つ当たり１００ｕｌ中に、２０万個のＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔを１０：１とする；播種した標的細胞の数に基づく）を、標的細胞へと添加した。分子を、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中で希釈し、ウェル１つ当たり５０ｕｌを、表示の濃度、３重で添加してから、プレートを、加湿インキュベーター内、３７℃で約４８時間にわたりインキュベートした。標的細胞の殺滅は、３７℃、５％ＣＯ２で、４８時間にわたるインキュベーションの後、アポトーシス／壊死細胞による、細胞上清へのＬＤＨ放出の定量化（ＬＤＨ検出キット；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；型番１１６４４７９３００１）により評価した。最大の標的細胞の溶解（＝１００％）は、ＬＤＨ読み出しの２０時間前における、標的細胞の、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴うインキュベーションにより達成した。最小の溶解（＝０％）とは、エフェクター細胞���伴うが、ＴＣＢを伴わずにコインキュベートされた標的細胞を指す。
【０４３１】
結果（図３７Ａ及び３７Ｂ）は、いずれもがＭＫ０６２マトリプターゼリンカーで連結された、抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３を含有する、２つの異なるフォーマットのプロテアーゼ活性化ＴＣＢの比較を示す。プロテアーゼ活性化ＴＣＢの逆フォーマット（８３６５；グレーの丸）は、殺滅（ＨｅＬａ標的細胞及びＳｋｏｖ−３標的細胞）において、プロテアーゼ活性化ＴＣＢの古典的フォーマット（８４０８；ダークグレーの上向き三角）より力価が大きいと考えられる。しかし、非切断型リンカーを含有する逆分子（８３６６；ライトグレーの四角）は、マスキングにおいて、古典的分子（８４０９；ダークグレーの下向き三角）ほど効果的ではない。
【０４３２】
図３７Ｃ：ＨｅＬａ標的細胞への細胞傷害性：抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３と、プロテアーゼ部位が異なるＧＳリンカーとを含有する古典的なプロテアーゼ活性化ＴＣＢの比較である。ＭＭＰ９−マトリプターゼＭＫ０６２リンカーを含有するプロテアーゼ活性化ＴＣＢ（８３６４；グレーの四角）が、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（ライトグレーの下向き三角）の力価に達するのに対し、マトリプターゼＭＫ０６２のみを含有するプロテアーゼ活性化ＴＣＢ（ライトグレーの菱形）は、ＨｅＬａ細胞の殺滅における力価が小さい。カテプシン部位を含有する分子（グレーの丸）又は非切断型リンカーを含有する分子（黒の下向き三角）は、同等である。
【０４３３】
図３７Ｄ：Ｓｋｏｖ−３標的細胞への細胞傷害性：抗イデオタイプＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３と、プロテアーゼ部位が異なるＧＳリンカーとを含有する古典的なプロテアーゼ活性化ＴＣＢの比較である。ＭＭＰ９−マトリプターゼＭＫ０６２リンカーを含有するプロテアーゼ活性化ＴＣＢ（８３６４；グレーの四角）がほぼ、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（ライトグレーの下向き三角）の力価に達するのに対し、マトリプターゼＭＫ０６２のみを含有するプロテアーゼ活性化ＴＣＢ（ライトグレーの菱形）は、Ｓｋｏｖ−３細胞の殺滅における力価がより小さい。カテプシン部位を含有する分子（グレーの丸）は、マトリプターゼＭＫ０６２部位のみを含有する分子より力価が小さく、非切断型リンカーを含有する分子（黒の下向き三角）は、Ｓｋｏｖ−３細胞について、表示の濃度範囲内において１０％を下回る殺滅を誘導するにとどまる。
【０４３４】
実施例１９
ヒト腎皮質上皮細胞又はヒト気管支上皮細胞の、ＴＣＢ及びヒトＰＢＭＣとのコインキュベーション後における、Ｔ細胞の活性化
プロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子により媒介されるＴ細胞の活性化を、ごく少量のＦｏｌＲ１を発現させる、ＨＲＣＥｐｉ（ヒト腎皮質上皮細胞）及びＨＢＥｐｉＣ（ヒト気管支上皮細胞）について評価した。ヒトＰＢＭＣを、エフェクター細胞として使用し、Ｔ細胞の活性化マーカーを、分子及び細胞を伴う４８時間にわたるインキュベーションの後に染色した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常ヒトドナーから得られたバフィーコートから単離した。バフィーコートを、滅菌ＰＢＳで、１：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配にわたり層状化させた（Ｓｉｇｍａ、型番Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、中断なし、室温）の後、ＰＢＭＣを含有する界面相を、未使用のファルコンチューブに移し、その後、５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、赤血球を溶解させるために、ＰＢＭＣペレットを、２ｍｌのＡＣＫバッファー中に再懸濁させた。３７℃で約２分間にわたるインキュベーションの後、チューブに、滅菌ＰＢＳを、５０ｍｌまで満たし、３５０×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。この洗浄工程を、１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ、及び１０％のＤＭＳＯを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、ＰＢＭＣを再懸濁させる前に、１回繰り返した。ＰＢＭＣを、ＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ（ＢｉｏＣｉｓｉｏｎ）内、−８０℃で、ゆっくりと凍結させ、次いで、液体窒素へと移した。アッセイを開始する１日前に、接着性の標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにより採取し、カウントし、生存率について点検し、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中で再懸濁させた。標的細胞は、平底９６ウェルプレートを使用して、ウェル１つ当たりの細胞２００００個の密度で播種し、加湿インキュベーター内、３７℃で約２０時間にわたりインキュベートした。アッセイ開始の約２０時間前、ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中で融解させた。ＰＢＭＣを、３５０ｇで、７分間にわたり遠心分離した。ペレットを、新鮮な培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中に再懸濁させ、加湿インキュベーター内、３７℃、最長で２４時間にわたりインキュベートした。アッセイの開始日に、ＰＢＭＣを採取し、３５０ｇで、７分間にわたり遠心分離した。ペレットを、アッセイ培地中に再懸濁させ、ウェル１つ当たり１００ｕｌ中に、２０万個のＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔを１０：１とする；播種した標的細胞の数に基づく）を、標的細胞へと添加した。分子を、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中で希釈し、表示の濃度、３重で添加してから、プレートを、加湿インキュベーター内、３７℃で約４８時間にわたりインキュベートした。
【０４３５】
Ｔ細胞の活性化は、３７℃、５％ＣＯ２における４８時間にわたるインキュベーションの後に、ＣＤ４陽性Ｔ細胞／ＣＤ８陽性Ｔ細胞上の、ＣＤ２５及びＣＤ６９の定量化により評価した。ＦｏｌＲ１  １６Ｄ５  ＴＣＢ（６２９８）及び非標的化ＴＣＢ（ＣＤ３には結合するが、標的細胞抗原には結合しない；７２３５）を、コントロールとして組み入れる。各点は、３例の異なるヒトＰＢＭＣドナーについての、３重の平均値を表す。標準偏差は、誤差バーに表示する。統計学的解析には、対応のないｔ検定を使用した。結果は、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢについて、ＣＤ８陽性細胞のＣＤ６９の増大であって、プロテアーゼ活性化ＴＣＢについての中央値蛍光強度より著明に高度な増大を示す（図３８Ａ及び３８Ｂ）。
【０４３６】
実施例２０
異なるフォーマットのプロテアーゼ活性化メソテリン（ＭＳＬＮ）ＴＣＢにより媒介される、腫瘍細胞への細胞傷害性
プロテアーゼ活性化ＴＣＢ分子により媒介される、Ｔ細胞による殺滅を、異なるレベルのメソテリン（ＭＳＬＮ）を発現させる細胞株上で評価した。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常ヒトドナーから得られたバフィーコートから単離した。バフィーコートを、滅菌ＰＢＳで、１：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配にわたり層状化させた（Ｓｉｇｍａ、型番Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、中断なし、室温）の後、ＰＢＭＣを含有する界面相を、未使用のファルコンチューブに移し、その後、５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、赤血球を溶解させるために、ＰＢＭＣペレットを、２ｍｌのＡＣＫバッファー中に再懸濁させた。３７℃で約２分間にわたるインキュベーションの後、チューブに、滅菌ＰＢＳを、５０ｍｌまで満たし、３５０×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。この洗浄工程を、１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ、及び１０％のＤＭＳＯを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、ＰＢＭＣを再懸濁させる前に、１回繰り返した。ＰＢＭＣを、ＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ（ＢｉｏＣｉｓｉｏｎ）内、−８０℃で、ゆっくりと凍結させ、次いで、液体窒素へと移した。アッセイを開始する１日前に、接着性の標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにより採取し、カウントし、生存率について点検し、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中で再懸濁させた。標的細胞は、平底９６ウェルプレートを使用して、ウェル１つ当たりの細胞２００００個の密度で播種し、加湿インキュベーター内、３７℃で約２０時間にわたりインキュベートした。アッセイ開始の約２０時間前、ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中で融解させた。ＰＢＭＣを、３５０ｇで、７分間にわたり遠心分離した。ペレットを、新鮮な培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中に再懸濁させ、加湿インキュベーター内、３７℃、最長で２４時間にわたりインキュベートした。アッセイの開始日に、ＰＢＭＣを採取し、３５０ｇで、７分間にわたり遠心分離した。ペレットを、アッセイ培地中に再懸濁させ、ウェル１つ当たり１００ｕｌ中に、２０万個のＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔを１０：１とする；播種した標的細胞の数に基づく）を、標的細胞へと添加した。分子を、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中で希釈し、表示の濃度、３重で添加してから、プレートを、加湿インキュベーター内、３７℃で約４８時間にわたりインキュベートした。標的細胞の殺滅は、３７℃、５％ＣＯ２で、４８時間にわたるインキュベーションの後、アポトーシス／壊死細胞による、細胞上清へのＬＤＨ放出の定量化（ＬＤＨ検出キット；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；型番１１６４４７９３００１）により評価した。最大の標的細胞の溶解（＝１００％）は、ＬＤＨ読み出しの２０時間前における、標的細胞の、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴うインキュベーションにより達成した。最小の溶解（＝０％）とは、エフェクター細胞を伴うが、ＴＣＢを伴���ずにコインキュベートされた標的細胞を指す。
【０４３７】
結果（図３９Ａ及び３９Ｂ）は、プロテアーゼ活性化ＭＳＬＮ  ＴＣＢ（８６７２）により媒介される標的細胞の殺滅を、ＮＣＩ  Ｈ５９６細胞株及びＡｓＰＣ−１細胞株について示す。プロテアーゼ活性化ＴＣＢはほぼ、ＮＣＩ  Ｈ５９６及びＡｓＰＣ−１に対する、ＭＳＬＮ  ＴＣＢ（８６７６）の力価に達する。非切断型ＧＳリンカー（８６７３）を含有する分子は、いずれの細胞株に対しても、表示の濃度範囲内で、殺滅を誘導しない。
【０４３８】
実施例２１
原発腫瘍試料中の、標的の発現（ＦＯＬＲ１  ＴＣＢ）及びプロテアーゼ活性（プロテアーゼ活性化ＦＯＬＲ１  ＴＣＢ）をモニタリングする、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーターアッセイ
このアッセイの意図は、ヒト腫瘍試料中の、腫瘍標的抗原（ＦｏｌＲ１）の発現と、ＭＭＰ９、マトリプターゼ、又はカテプシンなど、腫瘍特異的プロテアーゼの活性とを示すことであった。
【０４３９】
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ＮＦＡＴプロモーターを伴う、ヒト急性リンパ性白血病のレポーター細胞株であって、ヒトＣＤ３εを発現させるレポーター細胞株である。Ｔ細胞二重特異性分子が、腫瘍標的及びＣＤ３εに結合する（架橋形成）場合に、ルシフェラーゼの発現を測定することができる。発光を、Ｏｎｅ−Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加の後で測定する。
【０４４０】
原発腫瘍試料は、Ｉｎｄｉｖｕｍｅｄ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙから受領した。試料は、輸送培地中、一晩にわたり発送された。手術の約２４時間後、試料を小片に切り分けた。１８ｕｌの低温マトリゲル（７３４−１１０１、Ｃｏｒｎｉｎｇ／ＶＷＲ）を添加することにより、壁面が白色の９６ウェル平底（透明底）プレートを調製した。プレートを、３７℃で、２分間にわたりインキュベートしてから、腫瘍小片を添加した（３重）。ウェル１つ当たり３３ｕｌの低温マトリゲルを添加し、プレートを、３７℃で、２分間にわたり、再度インキュベートした。ウェル１つ当たり５０ｕｌの抗体希釈液（ハイグロマイシンを伴わないが、２×ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＪｕｒｋａｔ培地中の）を添加し、プレートを、３７℃、５％のＣＯ２で約４８時間にわたりインキュベートした。
【０４４１】
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴレポーター細胞を採取し、生存率は、ＶｉＣｅｌｌを使用して評価した。細胞を、３５０×ｇで、７分間にわたり遠心分離してから、ハイグロマイシンを伴わないＪｕｒｋａｔ培地中で再懸濁させ、ウェル１つ当たり５０μｌ（ウェル１つ当たりの細胞５０．０００個）を添加した。プレートを、加湿インキュベーター内、３７℃で５時間にわたりインキュベートしてから、それを、発光の読取りのために取り出した。８０ｕｌの各ウェルを、壁面が白色の９６ウェルプレートへと移した。ウェル１つ当たり２７μｌのＯＮＥ−Ｇｌｏ溶液を、各ウェルへと添加し、暗所内、室温で１０分間にわたりインキュベートした。発光を、ＷＡＬＬＡＣ  Ｖｉｃｔｏｒ３  ＥＬＩＳＡリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２０３０）と、検出時間としての、ウェル１つ当たり１秒間とを使用して検出した。
【０４４２】
Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴレポーター細胞は、ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（６２９８）及びＭＭＰ９−マトリプターゼ切断部位を含有するプロテアーゼ活性化ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（８３６４）とのコインキュベーションの後で活性化する。プロテアーゼ活性化ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ（８３６３、８４０８）及びコントロールのＴＣＢ（８４０９、７２３５）は、ルシフェラーゼの発現を誘導しない。点線は、腫瘍と共にコインキュベートされたＪｕｒｋａｔ  ＮＦＡＴ細胞についての、ベースラインの発光を指し示す（図４０）。
【０４４３】
実施例２２
プロテアーゼ活性化ＴＣＢの、血清中の安定性
ヒト血清中のインキュベーション後における、プロテアーゼ活性化ＴＣＢについてのキャピラリー電気泳動。分子を、加湿インキュベーター（５％のＣＯ２）内、３７℃のヒトＩｇＧ枯渇血清中、０又は１４日間にわたりインキュベートした。全ての分子を、アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡ）により精製し、次いで、キャピラリー電気泳動により解析した。
【０４４４】
各分子１００ｕｇずつを、バッファー（０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０を伴うヒスチジンバッファー（Ｂｉｃｈｓｅｌ））又はヒト血清（ＩｇＧ枯渇させた、ＳＰ１８３９、ＴＬ−１５２１６、１６ＦＳＰ６３８１４）に添加した。分子の濃度は、２ｍｇ／ｍｌより高濃度であり、最終濃度は、０．５ｍｇ／ｍｌであった。１つの分子（８４０８）のための前処理は、ｒｈマトリプターゼ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、加湿インキュベーター内、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間にわたり行った（そうでなければ、血清のｐＨを変化させうるであろう）。０日目のための試料は、液体窒素中で直接凍結させ、解析まで、−８０℃で保存した。１４日目のための試料は、これらもまた、瞬時凍結させるまで、加湿インキュベーター内、３７℃、５％ＣＯ２で１４日間にわたりインキュベートした。
【０４４５】
ＨＰＬＣアフィニティークロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２００ｓｅｒｉｅｓ；カラム：Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃ−１３０Ｂ；パッケージング材料：Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＰＯＲＯＳ  ２０Ａ  ６０μｌ；バッファー：１０ｍＭのトリス、５０ｍＭのグリシン、５００ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ  ８．０及びｐＨ  ２．０；注射容積：流量１ｍｌ／分で１００μｌ；コレクション：ピークベース；中和：０．５Ｍのリン酸Ｎａ  ｐＨ８．０  １０％容積）を介して、ＣＥ−ＳＤＳ解析の前に、全ての試料を精製した。プロテアーゼ活性化ＴＣＢは、ヒトＩｇＧ枯渇血清中で、最短で１４日間にわたり、安定的である（図４１Ａ−４１Ｃ）。
【０４４６】
実施例２３
抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを伴う、抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３及び抗ＦｏｌＲ１／抗ＣＤ３  Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）分子のデザイン
いくつかのＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）分子をデザインしたが、図４２Ａ−４２Ｆに、それらのそれぞれのＩＤ番号と共に、概略的に描示する。以下の分子：
ＩＤ  ８９５５：「Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及びＭＭＰ９−ＭＫ０６２マトリプターゼを融合させた、古典的フォーマット、ハーセプターグ荷電変異体、ＣＤ３交差型のハーセプターグ  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＭＰ９−ＭＫ０６２マトリプターゼ−ＣＤ３−Ｎ末端におけるハーセプターグ  ＶＨへの融合−不活性Ｆｃ）」（図４２Ａ；配列番号８１、１３２、１３３、及び１３６）；
ＩＤ  ８９５７：「Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及び非切断型ＧＳリンカーを融合させた、古典的フォーマット、ハーセプターグ荷電変異体、ＣＤ３交差型のハーセプターグ  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型ＧＳリンカー−ＣＤ３−Ｎ末端におけるハーセプターグ  ＶＨへの融合−不活性Ｆｃ）」（図４２Ｂ；配列番号８１、１３２、１３３、及び１３５）；
ＩＤ  ８９５９：「古典的フォーマット、ハーセプターグ荷電変異体、ＣＤ３交差型のハーセプターグ  ２＋１  ＩｇＧ（ＣＤ３−Ｎ末端におけるハーセプターグ  ＶＨへの融合−不活性Ｆｃを伴う、ハーセプターグＩｇＧ）」（図４２Ｃ；配列番号８１、１３２、１３３、及び１３４）；
ＩＤ  ８９９７：「Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及びＭＭＰ９−ＭＫ０６２マトリプターゼを融合させた、古典的フォーマット、ＦｏｌＲ１  ３６Ｆ２荷電変異体、ＣＤ３交差型のＦｏｌＲ１  ３６Ｆ２  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−ＭＭＰ９−ＭＫ０６２マトリプターゼ−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＦｏｌＲ１  ３６Ｆ２  ＶＨへの融合−不活性Ｆｃ）」（図４２Ｄ；配列番号８１、１３７、１３８、及び１３９）；
ＩＤ  ８９９８：「Ｎ末端において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ  ４．３２．６３及び非切断型ＧＳリンカーを融合させた、古典的フォーマット、ＦｏｌＲ１  ３６Ｆ２荷電変異体、ＣＤ３交差型のＦｏｌＲ１  ３６Ｆ２  ２＋１  ＩｇＧ（抗イデオタイプｓｃＦｖ  ４．３２．６３−非切断型ＧＳリンカー−ＣＤ３−Ｎ末端におけるＦｏｌＲ１  ３６Ｆ２  ＶＨへの融合−不活性Ｆｃ）」（図４２Ｅ；配列番号８１、１３７、１３８、及び１４０）；
ＩＤ  ８９９６：「古典的フォーマット、ＦｏｌＲ１  ３６Ｆ２荷電変異体、ＣＤ３交差型のＦｏｌＲ１  ３６Ｆ２  ２＋１  ＩｇＧ（ＣＤ３−Ｎ末端におけるＦｏｌＲ１  ３６Ｆ２  ＶＨへの融合−不活性Ｆｃを伴う、ＦｏｌＲ１  ３６Ｆ２  ＩｇＧ）」（図４２Ｆ；配列番号８１、１３７、１３８、及び１４１）
をデザインした。
【０４４７】
可変ドメインを、それぞれのレシピエントの哺乳類発現ベクターへとあらかじめ挿入されたドメインとインフレームで、サブクローニングした。タンパク質の発現は、ＭＰＳＶプロモーター又はＣＭＶ（ハーセプターグ用）プロモーターにより駆動され、合成ｐｏｌｙＡシグナル配列は、ＣＤＳの３’末端に存在する。加えて、各ベクターは、ＥＢＶ  ＯｒｉＰ配列を含有する。
【０４４８】
実施例２４
プロテアーゼ活性化ＦｏｌＲ１  ＴＣＢにより媒介される、初代細胞への細胞傷害性
プロテアーゼ活性化ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ分子により媒介される、Ｔ細胞による殺滅を、低レベルのＦｏｌＲ１を発現させる初代細胞株上で評価した（図４３）。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常ヒトドナーから得られたバフィーコートから単離した。バフィーコートを、滅菌ＰＢＳで、１：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配にわたり層状化させた（Ｓｉｇｍａ、型番Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、中断なし、室温）の後、ＰＢＭＣを含有する界面相を、未使用のファルコンチューブに移し、その後、これを、５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、赤血球を溶解させるために、ＰＢＭＣペレットを、２ｍｌのＡＣＫバッファー中に再懸濁させた。３７℃で約２−３分間にわたるインキュベーションの後、チューブに、滅菌ＰＢＳを、５０ｍｌまで満たし、３５０×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。この洗浄工程を、１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ、及び１０％のＤＭＳＯを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、ＰＢＭＣを再懸濁させる前に、１回繰り返した。ＰＢＭＣを、ＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ（ＢｉｏＣｉｓｉｏｎ）内、−８０℃で、ゆっくりと凍結させ、次いで、液体窒素へと移した。アッセイ開始の１日前、接着性の標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにより採取し、カウントし、生存率について点検し、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中に再懸濁させた。標的細胞は、平底９６ウェルプレートを使用して、ウェル１つ当たりの細胞２００００個の密度で播種し、加湿インキュベーター内、３７℃で約２０時間にわたりインキュベートした。アッセイ開始の約２０時間前、ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中で融解させた。ＰＢＭＣを、３５０ｇで、７分間にわたり遠心分離した。ペレットを、新鮮な培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中に再懸濁させ、加湿インキュベーター内、３７℃、最長で２４時間にわたりインキュベートした。アッセイの開始日に、ＰＢＭＣを採取し、３５０ｇで、７分間にわたり遠心分離した。ペレットを、アッセイ培地中に再懸濁させ、ウェル１つ当たり１００ｕｌ中に、２０万個のＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔを１０：１とする；播種した標的細胞の数に基づく）を、標的細胞へと添加した。分子を、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中で希釈し、ウェル１つ当たり５０ｕｌを、表示の濃度、３重で添加してから、プレートを、加湿インキュベーター内、３７℃で約４８時間、７２時間、又は９６時間にわたりインキュベートした。標的細胞の殺滅は、３７℃、５％ＣＯ２で、４８時間、７２時間、及び９６時間にわたるインキュベーションの後、アポトーシス／壊死細胞による、細胞上清へのＬＤＨ放出の定量化（ＬＤＨ検出キット；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；型番１１６４４７９３００１）により評価した。最大の標的細胞の溶解（＝１００％）は、ＬＤＨ読み出しの２０時間前における、標的細胞の、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴うイン��ュベーションにより達成した。最小の溶解（＝０％）とは、エフェクター細胞を伴うが、ＴＣＢを伴わずにコインキュベートされた標的細胞を指す。
【０４４９】
ヒトＰＢＭＣ及び１００ｎＭ又は１０ｎＭのＦｏｌＲ１  ＴＣＢにより媒介されるヒト気管支上皮細胞への傷害性は、プロテアーゼ活性化ＴＣＢと比較してより高度である。
【０４５０】
実施例２５
プロテアーゼ活性化ＦｏｌＲ１  ＴＣＢにより媒介されるＦｏｌＲ１陰性標的細胞への細胞傷害性
プロテアーゼ活性化ＦｏｌＲ１  ＴＣＢ分子により媒介される、Ｔ細胞による殺滅は、ＦｏｌＲ１陰性Ｍｋｎ−４５細胞株上で評価した（図４４）。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健常ヒトドナーから得られたバフィーコートから単離した。バフィーコートを、滅菌ＰＢＳで、１：１に希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配にわたり層状化させた（Ｓｉｇｍａ、型番Ｈ８８８９）。遠心分離（４５０×ｇ、３０分間、中断なし、室温）の後、ＰＢＭＣを含有する界面相を、未使用のファルコンチューブに移し、その後、これを、５０ｍｌのＰＢＳで満たした。混合物を遠心分離し（４００×ｇ、１０分間、室温）、上清を廃棄し、赤血球を溶解させるために、ＰＢＭＣペレットを、２ｍｌのＡＣＫバッファー中に再懸濁させた。３７℃で約２−３分間にわたるインキュベーションの後、チューブに、滅菌ＰＢＳを、５０ｍｌまで満たし、３５０×ｇで１０分間にわたり遠心分離した。この洗浄工程を、１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ、及び１０％のＤＭＳＯを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中に、ＰＢＭＣを再懸濁させる前に、１回繰り返した。ＰＢＭＣを、ＣｏｏｌＣｅｌｌ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ（ＢｉｏＣｉｓｉｏｎ）内、−８０℃で、ゆっくりと凍結させ、次いで、液体窒素へと移した。アッセイ開始の１日前、接着性の標的細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡにより採取し、カウントし、生存率について点検し、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中に再懸濁させた。標的細胞は、平底９６ウェルプレートを使用して、ウェル１つ当たりの細胞２００００個の密度で播種し、加湿インキュベーター内、３７℃で約２０時間にわたりインキュベートした。アッセイ開始の約２０時間前、ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中で融解させた。ＰＢＭＣを、３５０ｇで、７分間にわたり遠心分離した。ペレットを、新鮮な培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中に再懸濁させ、加湿インキュベーター内、３７℃、最長で２４時間にわたりインキュベートした。アッセイの開始日に、ＰＢＭＣを採取し、３５０ｇで、７分間にわたり遠心分離した。ペレットを、アッセイ培地中に再懸濁させ、ウェル１つ当たり１００ｕｌ中に、２０万個のＰＢＭＣ（Ｅ：Ｔを１０：１とする；播種した標的細胞の数に基づく）を、標的細胞へと添加した。分子を、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０、２％のＦＣＳ、１×ＧｌｕｔａＭａｘ）中で希釈し、ウェル１つ当たり５０ｕｌを、表示の濃度、３重で添加してから、プレートを、加湿インキュベーター内、３７℃で約４８時間及び７２時間にわたりインキュベートした。標的細胞の殺滅は、３７℃、５％ＣＯ２で、４８時間、７２時間、及び９６時間にわたるインキュベーションの後、アポトーシス／壊死細胞による、細胞上清へのＬＤＨ放出の定量化（ＬＤＨ検出キット；Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；型番１１６４４７９３００１）により評価した。最大の標的細胞の溶解（＝１００％）は、ＬＤＨ読み出しの２０時間前における、標的細胞の、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴うインキュベーションにより達��した。最小の溶解（＝０％）とは、エフェクター細胞を伴うが、ＴＣＢを伴わずにコインキュベートされた標的細胞を指す。プロテアーゼ活性化ＴＣＢは、１００ｎＭで、標的細胞の殺滅を誘導しなかった。
2019514850.tif 000008
2019514850.tif 000009
2019514850.tif 000010
2019514850.tif 000011
2019514850.tif 000012
2019514850.tif 000013
2019514850.tif 000014
2019514850.tif 000015
2019514850.tif 000016
2019514850.tif 000017
2019514850.tif 000018
2019514850.tif 000019
2019514850.tif 000020
2019514850.tif 000021
2019514850.tif 000022
2019514850.tif 000023
2019514850.tif 000024
2019514850.tif 000025
2019514850.tif 000026
2019514850.tif 000027
2019514850.tif 000028
2019514850.tif 000029
2019514850.tif 000030
2019514850.tif 000031
2019514850.tif 000032
2019514850.tif 000033
2019514850.tif 000034
2019514850.tif 000035
2019514850.tif 000036
2019514850.tif 000037
2019514850.tif 000038
2019514850.tif 000039
2019514850.tif 000040
2019514850.tif 000041
2019514850.tif 000042
2019514850.tif 000043
2019514850.tif 000044
2019514850.tif 000045
【０４５１】
前出の本発明を、理解の明確さを目的とする例（ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ及びｅｘａｍｐｌｅ）として、ある程度詳細に記載してきたが、記載及び例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。本明細書で引用される、全ての特許及び学術文献の開示は、出典明示によりそれらの全体において明示的に援用される。
【図１Ａ】
2019514850.tif 000046
【図１Ｂ】
2019514850.tif 000047
【図１Ｃ】
2019514850.tif 000048
【図１Ｄ】
2019514850.tif 000049
【図１Ｅ】
2019514850.tif 000050
【図２】
2019514850.tif 000051
【図３Ａ−３Ｂ】
2019514850.tif 000052
【図３Ｃ−３Ｄ】
2019514850.tif 000053
【図４Ａ】
2019514850.tif 000054
【図４Ｂ】
2019514850.tif 000055
【図４Ｃ】
2019514850.tif 000056
【図５Ａ】
2019514850.tif 000057
【図５Ｂ】
2019514850.tif 000058
【図５Ｃ】
2019514850.tif 000059
【図５Ｄ】
2019514850.tif 000060
【図５Ｅ】
2019514850.tif 000061
【図５Ｆ】
2019514850.tif 000062
【図５Ｇ】
2019514850.tif 000063
【図５Ｈ】
2019514850.tif 000064
【図６】
2019514850.tif 000065
【図７】
2019514850.tif 000066
【図８】
2019514850.tif 000067
【図９】
2019514850.tif 000068
【図１０】
2019514850.tif 000069
【図１１】
2019514850.tif 000070
【図１２Ａ】
2019514850.tif 000071
【図１２Ｂ】
2019514850.tif 000072
【図１２Ｃ】
2019514850.tif 000073
【図１２Ｄ】
2019514850.tif 000074
【図１３】
2019514850.tif 000075
【図１４Ａ】
2019514850.tif 000076
【図１４Ｂ】
2019514850.tif 000077
【図１５Ａ】
2019514850.tif 000078
【図１５Ｂ】
2019514850.tif 000079
【図１６】
2019514850.tif 000080
【図１７】
2019514850.tif 000081
【図１８Ａ】
2019514850.tif 000082
【図１８Ｂ】
2019514850.tif 000083
【図１９Ａ】
2019514850.tif 000084
【図１９Ｂ】
2019514850.tif 000085
【図２０Ａ】
2019514850.tif 000086
【図２０Ｂ】
2019514850.tif 000087
【図２１Ａ】
2019514850.tif 000088
【図２１Ｂ】
2019514850.tif 000089
【図２２Ａ】
2019514850.tif 000090
【図２２Ｂ】
2019514850.tif 000091
【図２３】
2019514850.tif 000092
【図２４】
2019514850.tif 000093
【図２５】
2019514850.tif 000094
【図２６】
2019514850.tif 000095
【図２７】
2019514850.tif 000096
【図２８】
2019514850.tif 000097
【図２９】
2019514850.tif 000098
【図３０Ａ−３０Ｂ】
2019514850.tif 000099
【図３１】
2019514850.tif 000100
【図３２】
2019514850.tif 000101
【図３３Ａ】
2019514850.tif 000102
【図３３Ｂ】
2019514850.tif 000103
【図３３Ｃ】
2019514850.tif 000104
【図３３Ｄ】
2019514850.tif 000105
【図３３Ｅ】
2019514850.tif 000106
【図３３Ｆ】
2019514850.tif 000107
【図３３Ｇ】
2019514850.tif 000108
【図３３Ｈ】
2019514850.tif 000109
【図３３Ｉ】
2019514850.tif 000110
【図３３Ｊ】
2019514850.tif 000111
【図３４】
2019514850.tif 000112
【図３５Ａ】
2019514850.tif 000113
【図３５Ｂ】
2019514850.tif 000114
【図３６Ａ】
2019514850.tif 000115
【図３６Ｂ】
2019514850.tif 000116
【図３７Ａ】
2019514850.tif 000117
【図３７Ｂ】
2019514850.tif 000118
【図３７Ｃ】
2019514850.tif 000119
【図３７Ｄ】
2019514850.tif 000120
【図３８Ａ】
2019514850.tif 000121
【図３８Ｂ】
2019514850.tif 000122
【図３９Ａ】
2019514850.tif 000123
【図３９Ｂ】
2019514850.tif 000124
【図４０】
2019514850.tif 000125
【図４１Ａ】
2019514850.tif 000126
【図４１Ｂ】
2019514850.tif 000127
【図４１Ｃ】
2019514850.tif 000128
【図４２Ａ】
2019514850.tif 000129
【図４２Ｂ】
2019514850.tif 000130
【図４２Ｃ】
2019514850.tif 000131
【図４２Ｄ】
2019514850.tif 000132
【図４２Ｅ】
2019514850.tif 000133
【図４２Ｆ】
2019514850.tif 000134
【図４３】
2019514850.tif 000135
【図４４】
2019514850.tif 000136
【配列表】
2019514850000001.app
【国際調査報告】
2019514850.tif 000137
2019514850.tif 000138
2019514850.tif 000139
2019514850.tif 000140
2019514850.tif 000141
2019514850.tif 000142
2019514850.tif 000143
2019514850.tif 000144