(57)【要約】本発明は、凍結保存された細胞（例えば、肝細胞）を寄せ集めた又は混合された集団の新規な調製方法に関する。特に、本発明は、単一の個体から提供された細胞（例えば、肝細胞）を急速に解凍し、これを混合して異種集団を作製し、次いで凍結保存することを含む。本発明はまた、即時使用の前に生存率を高めるための複数の凍結保存された細胞の調製に関する。このプロセスにより、化学的及び物理的ストレスへの曝露が必然的に減少し、結果として生存細胞の数が増加する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の供給源からの肝細胞を凍結保存するための方法であって、
Ａ）複数の供給源からの肝細胞を解凍するステップ；
Ｂ）複数の供給源からの肝細胞を保存溶液に寄せ集めるステップ；
Ｃ）寄せ集めた肝細胞を遠心分離して、ペレット化するステップ；
Ｄ）保存溶液を除去するステップ；
Ｅ）ペレット化された生存及び非生存肝細胞を凍結保存剤と混合するステップ；
Ｆ）寄せ集めた肝細胞をバイアルに分配するステップ；及び
Ｇ）バイアル中の肝細胞を凍結保存するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記肝細胞が、ヒト肝細胞、ブタ肝細胞、サル肝細胞、イヌ肝細胞、ネコ肝細胞、ウシ肝細胞、ウマ肝細胞、ヒツジ肝細胞及びげっ歯類肝細胞を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数の供給源が、無作為のグループ、又は性別、人種、年齢、代謝状態若しくは健康状態に基づき予め選択されたグループで構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記保存溶液が、ウィスコンシン大学溶液、ハイパーサーモゾル−ベース、又はハイパーサーモゾル−ＦＲＳで構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記保存溶液が、ウシ胎児血清でさらに構成されている、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
寄せ集めた細胞の分配が、細胞１０００万個／ｍｌを超える密度で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
遠心分離のステップが、密度勾配を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
遠心分離のステップが、生存細胞及び非生存細胞の両方をペレット化するために行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
寄せ集めた凍結保存された細胞を融解し、密度勾配分画のプロセスを適用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
密度勾配遠心分離のステップが、５０〜２００ＲＣＦの間で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記密度勾配分画が、ポリビニルピロリドンでコーティングしたコロイド状シリカ粒子による密度遠心分離を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記肝細胞が、懸濁状態で使用されるか、又はプレーティングされているかのいずれかである、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
ペレット化された肝細胞を凍結保存剤と混合するステップが、上下にピペッティングするステップ、ボルテックスするステップ、バイアルを前後に振るステップ、又はバイアルをタッピングするステップのうちの１つ又は複数のステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0003]本発明は、一般的に、複数のドナーからの肝細胞を寄せ集め、凍結保存することに関する。
【背景技術】
【０００２】
[0004]肝細胞は、肝臓の中の細胞のおよそ８０％を構成し、多くの薬理学的化合物、毒素又は生体異物の活性化及び最終的な解毒の両方にとって重要である。新薬の需要及び入手可能性の需要の増加、並びに市販承認の前のより厳格な規制や安全性に関する試験のために、単離された初代肝細胞は、実験室での薬物代謝、有効性及び毒性を研究する上で貴重な資源となっている。
【０００３】
[0005]近年、初代ドナー肝細胞の単離及び凍結保存において顕著な進歩がなされ、急速に解凍され、直ちに実験に使用することが可能であるようになっている。しかし、性別、年齢、民族性、健康状態、遺伝的背景、及び他の要因の変動が試験結果を歪めるために、１つのヒト肝臓（個々のドナー）から単離された肝細胞における肝臓代謝を研究しても、集団全体における肝機能を正確には反映していない。肝臓代謝のより正確な測定は、個々のドナー細胞の混合物又は「プール」を用いて、肝細胞の不均一集団を作製することである。
【０００４】
[0006]肝細胞を寄せ集めることについてはいくつかの方法が提案されている。これらのプロトコールは、生存細胞の総数を減少させる物理的及び化学的ストレスの両方に細胞を晒す長い手順をしばしば用いる。例えば、米国特許第７，６０４，９２９号の方法は、第２又は最終的な凍結保存段階の前に密度勾配遠心分離工程を利用する。これは細胞に化学的及び機械的ストレスを与え、細胞を損失する結果になるか（図１Ａ〜Ｂ）又は凍結保存中に死ぬように細胞を弱める。国際公開第２０１４／０４５２０２号Ａ２に開示されている別の方法は、寄せ集めるプロセスを通して肝細胞を凍結保存溶液中に維持する。凍結保存溶液は、細胞死を引き起こすことを知られるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの毒性試薬を含む。
【０００５】
[0007]提案されたシステム及び方法は、プロセスを通じて細胞の損失を減少させる技術を採用し、したがって、生存細胞の総数を増加させることを目的とする。
【発明の概要】
【０００６】
[0008]本出願は、肝細胞を寄せ集めるプロセスから生じる生存細胞の数を増加させることを目的とする。複数の供給源からの肝細胞を凍結保存するための１つの方法は：
Ａ）複数の供給源からの肝細胞を解凍するステップ；
Ｂ）複数の供給源からの肝細胞を保存溶液に寄せ集めるステップ；
Ｃ）寄せ集めた肝細胞を遠心分離して、生存肝細胞及び非生存肝細胞の両方をペレット化するステップ；
Ｄ）保存溶液を除去するステップ；
Ｅ）ペレット化された生存及び非生存肝細胞を凍結保存剤と混合するステップ；
Ｆ）寄せ集めた肝細胞をバイアルに分配するステップ；及び
Ｇ）バイアル中の肝細胞を凍結保存するステップ
を含む。
【０００７】
[0009]上記の方法は、ヒト肝細胞、ブタ肝細胞、サル肝細胞、イヌ肝細胞、ネコ肝細胞、ウシ肝細胞、ウマ肝細胞、ヒツジ肝細胞及びげっ歯類肝細胞を含む群から選択されるものを含む様々な種類の肝細胞を利用することができる。
【０００８】
[0010]性別、人種、年齢、代謝状態又は健康状態に基づいて、個々の供給源を寄せ集めることができる。場合によっては、その時に存在するサンプルセットに基づいてプールを無作為化させることができる。
【０００９】
[0011]使用することができる保存溶液の種類としては、ウィスコンシン大学溶液、ハイポサーモゾル−ベース（ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ−Ｂａｓｅ）、又はハイポサーモゾル−ＦＲＳ（ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ−ＦＲＳ）に加えて、凍結保存剤の毒性を低下させる及び／又は肝細胞に必須な栄養素を提供する他の同様な保存溶液が挙げられる。例えば、保存溶液は、ウシ胎児血清を含むことができる。
【００１０】
[0012]遠心分離のステップは、細胞にかかる物理的及び化学的ストレスを減少させるために、密度勾配を含まない。この遠心分離工程は、生存肝細胞及び非生存肝細胞の両方をペレット化する。
【００１１】
[0013]ペレットは、凍結する前に凍結保存剤と組み合わせることができる。凍結保存剤とペレット化された細胞を組み合わせる場合には、上下にピペッティングするステップ、ボルテックスするステップ、バイアルを前後に振るステップ、バイアルをタッピングするステップ又は同様のプロセスが、凍結保存溶液中の細胞を再懸濁するために使用することができる。
【００１２】
[0014]アリコート又は他の方法を介してペレット化された肝細胞をバイアルに分配する場合には、寄せ集めた細胞は、細胞８００〜１５００万個／ｍｌの範囲の密度で分配することができる。一実施形態では、細胞１３３３万個／ｍｌが使用される。
【００１３】
[0015]寄せ集めた肝細胞を最終的に解凍した後、ユーザーは、実験を実行する直前に生存細胞と非生存細胞とを分離するために密度勾配分画を行ってもよい。ある場合には、密度勾配遠心分離のステップは、５０〜２００ＲＣＦで実行される。密度勾配分画は、ポリビニルピロリドンでコーティングしたコロイド状シリカ粒子（パーコール；Ｐｅｒｃｏｌｌ）による密度勾配遠心分離を含んでいてもよい。
【００１４】
[0016]これらのプロセスで使用される肝細胞は、プレーティングされているか、又は懸濁状態で使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】パーコール勾配の有無における連続遠心分離後の生存ラット肝細胞の収量を示す図である。
【図２】事前に凍結保存された個々のドナーからの肝細胞からの肝細胞を寄せ集めて凍結保存する方法の概略を示す図である。
【図３】図２の最後の凍結保存ステップから生存細胞を非生存細胞から分離する方法の概略を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[0020]事前に凍結保存された個々のドナーから得られた肝細胞からの凍結保存された細胞（例えば、肝細胞）のプールを調製するための改良されたシステム及び方法の記載が本明細書に記載される。このシステム及び方法は、寄せ集めるプロセス中の肝細胞への物理的及び化学的ストレスを減少させる一方で、エンドユーザーによって行われる解凍後の遠心分離のステップ中の寄せ集めた生存細胞の回収物を増加させる。一般に、このシステム及び方法は、個々のドナー肝細胞のバイアルを解凍し、それらを保存溶液に寄せ集めることを含む。その後、寄せ集めた細胞を短時間、遠心分離して、生存細胞と非生存細胞の両方をペレット化し、次いで複数のバイアル中に高密度で凍結保存する。その後、エンドユーザーは、実験的使用の直前に生存細胞を非生存細胞から分離するために密度勾配遠心分離を行ってもよい。提案された方法の利点のいくつかは、寄せ集めた肝細胞を実験する前に生存細胞の数を減少させる機械的、化学的及び他の環境的な因子への曝露を減少させることである。
【００１７】
[0021]一実施形態において、事前に単離され凍結保存された個々のドナーからの肝細胞は、液体窒素気相中に最低−１５０℃で保存される。寄せ集められる個々のドナーバイアルは、無作為に、又は特定の代謝活性（例えば、ＥＣＯＤ、シトクロムＰ４５０、一般的なフェーズＩ又はフェーズＩＩ）、年齢、人種、性別、民族性、又は他の表現型決定要因に基づいて選択することができる。解凍されたバイアルの数は、混合集団に含まれる個体の数及び生成されるプールのサイズに依存する。例えば、各々の肝細胞のプールに使用される個々のバイアルの数は、２〜５０人からであり得る。各々のプールは、３００から１０００個のバイアルの範囲であり得る。例えば、３００個のバイアルを有する１０個のドナープールは、各々のドナーからおよそ３０個のバイアルが必要になると予想される。
【００１８】
[0022]個々のドナー肝細胞は、３７℃に維持された水浴中におよそ２分間又は氷の軸がほとんど見えなくなるまでバイアルを浸漬することによって解凍され、その後、４℃で、保存溶液を含む容器に内容物を速やかにデカントする。保存溶液は、凍結保存剤中に見出されるＤＭＳＯ（及び／又は肝細胞に毒性のある他の試薬）を希釈するために使用される。いくつかの例では、保存溶液はまた、寄せ集めるプロセス中の生存能力を向上させるために肝細胞に必須の栄養素を提供する。保存溶液の容量は、生成されるべきプールの大きさに依存するが、例えば、１ｍＬの凍結保存された細胞に対して１：１の比の保存溶液から構成することができる。保存溶液は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）含有又は非含有の、ウィスコンシン大学溶液（１０ｍＭラクトビオン酸カリウム、２５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３０ｍＭラフィノース、５ｍＭアデノシン、３ｍＭグルタチオン、１ｍＭアロプリノール、及び５０ｇ／Ｌ  ヒドロキシエチルデンプン（Ｈｙｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｓｔａｒｃｈ））、ハイポサーモゾル−ベース（ＨＴＳ−Ｂａｓｅ）、ハイポサーモゾル−ＦＲＳ（ＨＴＳ−ＦＲＳ）、又は他のそのような培地から構成することができる。複数のバイアルの肝細胞を解凍し、同じ容器で混合し、複数のドナー細胞の「寄せ集めた」集団を作製する間に、肝細胞を４℃で保存溶液中に維持する。解凍されたバイアルの数に依存して、解凍された肝細胞は保存溶液中に２〜１０時間置くことができる。
【００１９】
[0023]複数のバイアルの肝細胞を解凍して寄せ集めた後、細胞を５０〜２００相対遠心力（ＲＣＦ）の範囲で８〜１０分間遠心分離して、生存細胞と非生存細胞の両方をペレット化する。保存溶液は、例えば吸入によってペレット細胞から除去される。プロセス中のこの時点で密度勾配を含まない遠心分離のステップを使用することにより、第２の凍結保存の前の肝細胞における物理的及び化学的ストレスが低減される。図１Ａ〜Ｂは、密度勾配（例えば、パーコール）遠心分離が肝細胞に及ぼす影響を、密度勾配を含まない遠心分離と比較して示す。各々の続いて起こるスピンごとに、密度勾配（パーコール）を用いると、パーコール無しで遠心分離した肝細胞と比較して、生存細胞の総数が減少した。これらの結果は、密度勾配溶液を用いた遠心分離が生存細胞の総数を減少させることを示している。
【００２０】
[0024]細胞をペレット化して、保存溶液を除去した後、それらを直ちに、例えば１０％のＤＭＳＯを含むクライオストール（ＣｒｙｏＳｔｏｒ）（登録商標）ＣＳ１０で構成されていてもよい凍結保護剤溶液に再懸濁させる。その後、寄せ集めた非生存及び生存肝細胞を、バイアル当たり１〜１．５ｍＬのアリコートで細胞１０００〜１５００万個／ｍＬで分配する。細胞計数は、このプロセスの任意のステップに沿って、例えば、トリパンブルー、アクリジンオレンジ、又はヨウ化プロピジウムを用いないか、又は用いて、行うことができることに留意されたい。
【００２１】
[0025]混合又は再懸濁プロセスは、凍結保存剤をペレット化された肝細胞に添加することで構成されていてもよい。混合したペレット及び凍結保存剤をピペットで上下させたり、ボルテックスしたり、バイアル中に前後に振ったり、バイアル中でタッピングしたり、又は他の同様のプロセスで、ペレットを分解し、凍結保存剤全体に肝細胞を分散させることができる。
【００２２】
[0026]寄せ集めた肝細胞を含むバイアルは、速度制御された冷凍機を用いて凍結され、出荷の前、少なくとも３日以上１０年以下の間、最低−１５０℃で液体窒素中に維持される。バイアルは、ドライアイス又は気相の液体窒素（例えばデュワー）でエンドユーザーに出荷され、液体窒素中に最低−１５０℃で保存される。使用直前に、エンドユーザーは３７℃に維持された水浴中にバイアルをおよそ２分間浸漬するか、又は氷の軸がほとんど見えなくなるまで寄せ集めた肝細胞を解凍することができる。
【００２３】
[0027]寄せ集めた非生存及び生存肝細胞を、ポリビニルピロリドン（パーコール）勾配でコーティングした２０〜３０％のコロイドシリカに適用し、５０〜２００ＲＣＦで８〜１０分間遠心分離して、生存細胞を非生存細胞から分離する。したがって、生存細胞の最大数は、凍結保存又は他の凍結−融解サイクルにさらに晒されることなく、使用直前に単離される。このプロセスにより、５００万個から８００万個＋までの生存細胞が回収され、実験に即座に使用できる。実験としては、生存率；代謝活性；トランスポーター活性；並びに異物摂取、代謝、有効性、及び毒性のアッセイが挙げられるが、これに限定されない。
【実施例】
【００２４】
個々の凍結保存されたドナー肝細胞からの寄せ集めた肝細胞の調製手順を図２に示し、以下の操作を記載する：
１−Ａ  １０名のドナーからの凍結保存肝細胞のバイアルを、３７℃の水浴中で氷の軸がほとんど見えなくなるまでおよそ２分間解凍する。いくつかのプールは、ドナーあたり５００〜９００個の間のバイアル、又はこの例では、５０〜９０個のバイアルで構成することができることに留意されたい。
【００２５】
１−Ｂ  解凍した肝細胞懸濁液（１ｍＬ）を、５００ｍＬのハイポサーモゾル−ＦＲＳ保存溶液を含む１Ｌビーカーの中にピペットで入れ、４℃に維持し、肝細胞プールを生成する。
【００２６】
１−Ｃ  寄せ集めた肝細胞を１００Ｇで１０分間、保存溶液（ＦＲＳ）から遠心分離して生存細胞と非生存細胞の両方をペレット化する。
【００２７】
１−Ｄ  保存溶液を吸引により除去し、細胞を凍結保護剤クライオストール（登録商標）ＣＳ１０培地中で穏やかに再懸濁する（例えば、前後に振る）。細胞を、トリパンブルー排除を用いて細胞密度を測定し、必要に応じて追加の凍結保護溶液を添加して、およそ細胞１３．３×１０６個／ｍＬを達成する。
【００２８】
１−Ｅ  １．５ミリリットル又はおよそ２０００万個の細胞を個々のバイアルに等分する。
【００２９】
１−Ｆ  寄せ集めた肝細胞のバイアルは、速度制御された冷凍庫で凍結保存され、液体窒素気相中に最低−１５０℃で保存される。
【００３０】
エンドユーザーによって行われる寄せ集めた肝細胞からの生存細胞の分離の手順は、図２に示されており、以下の操作に記載される：
２−Ａ  寄せ集めた肝細胞のバイアルを、３７℃の水浴中で氷の軸がほとんど見えなくなるまでおよそ２分間解凍する。
【００３１】
２−Ｂ  肝細胞懸濁液を、２０〜３０％のパーコール密度勾配に注意深く適用する。
【００３２】
２−Ｃ  試料を２００ＲＣＦで１０分間遠心分離して生存細胞と非生存細胞を分離する。
【００３３】
２−Ｄ  最低５００万個の生存細胞が回収され、実験のために直ちに使用される。
【００３４】
[0028]生存細胞の収量は、希釈率、及び寄せ集めるプロセス中の曝露時間によって変化し得ることに留意されたい。例えば、より大きなバッチでは、１：１の解凍された凍結保存剤に対する保存溶液の比が、費用がかかりすぎるか、又は困難であることもある（寄せ集める容器の容積）。さらに、多数のバイアルを解凍するのにより多くの時間を要する。したがって、細胞は、高濃度の凍結保存毒素に長期間晒される。凍結保存剤がより希釈され、寄せ集める時間が短縮され、一般に生存肝細胞のより高い収率をもたらす、より小さいバッチで行うことが容易であることもある。例えば、ステップ２−Ｄは、より大きなバッチに対して５００万個の生存細胞をもたらすが、より小さいバッチ内では８００万個まで及びそれを超える生存細胞をもたらし得る。より小さいバッチでは、４：１の解凍された凍結保存剤に対する保存溶液の比であってもよい。
【００３５】
[0029]本明細書のプロセスは、懸濁又はプレーティングされた状態で使用される肝細胞に適用することができる。
【００３６】
[0030]実施例は肝細胞を記載しているが、本方法及びプロセスは他の細胞型に適用することができる。
【００３７】
[0031]本明細書に例示され記載されたこれらの実施形態及び特徴は例示的なものであって、本出願の最後に列挙された特許請求の範囲を限定することを意図しておらず、特許請求の範囲そのものでもない。複数の組合せ及び均等な構成部分、範囲及びステップは、本出願の範囲内であると見なされる。
【００３８】
［著作権に関する記載］
[0001]この特許出願書類の開示の一部は、図面を含む著作権保護の対象となる資料を含む。著作権者は、特許商標庁のファイル又は記録に載ったときのように特許文書又は特許開示のいずれかでのファクシミリによる複製に対して異論はないが、それ以外の場合にはすべての著作権を留保する。
【００３９】
［相互参照及び関連出願］
[0002]本出願は、以下の各々の同時係属中の出願：２０１５年２月２７日に出願された米国特許出願第６２／１２１，６１９号の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書中に取り込まれる。
【図１Ａ】
2019506162.tif 000002
【図１Ｂ】
2019506162.tif 000003
【図２】
2019506162.tif 000004
【図３】
2019506162.tif 000005
【国際調査報告】
2019506162.tif 000006
2019506162.tif 000007
2019506162.tif 000008