(57)【要約】本明細書では、内分泌療法に対する感受性の指数（ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数）と称される、エストロゲン受容体（ＥＲ）関連遺伝子およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）関連遺伝子の指数に基づいて、ホルモン（内分泌）療法に対する腫瘍の感受性を決定する方法が提供され、かつ、変異を含むＥＲ遺伝子（ＥＳＲ１）ＲＮＡ転写物の、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の値に対する割合がさらに考慮される場合がある。さらに、内分泌療法に対して感受性であることがＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数によって決定された乳がん患者を処置する方法が提供される。
2019514930.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において乳がんを処置する方法であって、
（ａ）患者試料中の一組のエストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）関連遺伝子の発現レベルを決定するステップと、
（ｂ）前記ＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の発現に基づいて、内分泌療法に対する感受性の指数（ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数）を計算するステップと、
（ｃ）内分泌療法に対して感受性であることが前記（ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数）に基づいて識別された前記患者に有効量の内分泌療法を施行するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を計算するステップが、前記一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の前記発現を、一組の参照遺伝子に対して正規化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
計算するステップが、前記一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の平均発現と、前記一組の参照遺伝子の平均発現との間の差としてさらに定義される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
最適化定数の加算をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記最適化定数が２の値を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
０超のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数が、患者を内分泌療法に対して感受性であると識別する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
０．５超のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数が、患者を内分泌療法に対して感受性であると識別する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
１超のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数が、患者を内分泌療法に対して感受性であると識別する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子が、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＴＣ２、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、およびＫＣＮＥ４からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１０種を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子が、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＴＣ２、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、およびＫＣＮＥ４からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７種を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子が、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＴＣ２、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、およびＫＣＮＥ４からなる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記一組の参照遺伝子が、ＬＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２、およびＴＲＩＭ２からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも５種を含む、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記一組の参照遺伝子が、ＬＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２、およびＴＲＩＭ２からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも６、７、８、または９種を含む、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記一組の参照遺伝子が、ＬＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２、およびＴＲＩＭ２からなる、請求項２から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記乳がんが転移性乳がんである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記乳がんが、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶの乳がんである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記乳がんがホルモン受容体陽性である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ホルモン受容体がＥＲおよび／またはＰＲである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記乳がんがＨＥＲ２陰性である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記内分泌療法が、エストロゲン受容体の阻害もしくは分解、エストロゲンのがん細胞への制限、またはエストロゲンの卵巣放出の抑制を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記内分泌療法が、選択的エストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭ）、アロマターゼ阻害薬、または選択的エストロゲン受容体分解因子（ＳＥＲＤ）を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記内分泌療法が、タモキシフェン、トレミフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、またはフルベストラントを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者試料が、血液、唾液、尿、または組織生検である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記患者試料が血液である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記組織生検がホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）としてさらに定義される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記組織生検が腫瘍生検としてさらに定義される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍生検が瞬間冷凍またはＲＮＡ安定化剤によって保存される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ａ）が、前記患者試料からＲＮＡを単離することを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
単離することが、前記試料を溶解緩衝液で消化することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記発現レベルを決定するステップが、逆転写定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、マイクロアレイ解析、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ（登録商標）ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイ、ピコドロップレットターゲティングおよび逆転写、またはＲＮＡシーケンシングを行うことを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記患者が過去に抗がん療法を施行されたことがある、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗がん療法が、化学療法、内分泌療法、および／または生物学的療法である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記患者が前記化学療法および／または内分泌療法に対して感受性を呈した、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記化学療法がタキサン−アントラサイクリン化学療法である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗がん療法が少なくとも５年間にわたり施行された、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｂ）が、ＥＳＲ１遺伝子の変異を含む転写物の割合を検出するステップをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記割合が、野生型ＥＳＲ１の発現と比べた変異ＥＳＲ１の発現として計算される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＥＳＲ１遺伝子の前記変異が、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ５３４Ｅ、Ｐ５３５Ｈ、Ｌ５３６Ｑ、Ｌ５３６Ｒ、Ｙ５３７Ｃ、Ｙ５３７Ｓ、Ｙ５３７Ｎ、またはＤ５３８Ｇである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも第２の抗がん療法を施行するステップをさらに含む。請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗がん療法が、化学療法、免疫療法、手術、照射療法、または生物学的療法である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗がん療法が第２の内分泌療法である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗がん療法が細胞周期阻害薬である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
細胞阻害薬がパルボシクリブである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗がん療法がｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ経路阻害薬である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ経路阻害薬がエベロリムスである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第２の抗がん療法が前記内分泌療法の有効性を上昇させる、請求項３９から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記内分泌療法および／または少なくとも第２の抗がん療法が、経口的に、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、経皮的に、皮下に、局所的に、局部的に、または直接注射もしくは灌流によって施行される、請求項３９から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記内分泌療法および／または少なくとも第２の抗がん療法が同時に施行される、請求項３９から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記内分泌療法が、前記少なくとも第２の抗がん療法の前に施行される、請求項３９から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記患者がヒトである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
乳がんを患う対象の腫瘍内分泌感受性を決定する方法であって、
（ａ）試料中の一組のエストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）関連遺伝子の発現レベルを決定するステップと、
（ｂ）前記ＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の発現に基づいて、内分泌療法に対する感受性の指数（ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数）を計算するステップと
を含む、方法。
【請求項５２】
前記ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を計算するステップが、前記一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の前記発現を、一組の参照遺伝子に対して正規化することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
計算するステップが、前記一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の平均発現と、前記一組の参照遺伝子の平均発現との間の差としてさらに定義される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
最適化定数の加算をさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記最適化定数が２の値を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
０超のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数が、対象を内分泌療法に対して感受性であると識別する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
０．５超のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数が、対象を内分泌療法に対して感受性であると識別する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
１超のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数が、対象を内分泌療法に対して感受性であると識別する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子が、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＴＣ２、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、およびＫＣＮＥ４からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１０種を含む、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子が、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＴＣ２、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、およびＫＣＮＥ４からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７種を含む、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子が、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＴＣ２、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、およびＫＣＮＥ４からなる、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記一組の参照遺伝子が、ＬＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２、およびＴＲＩＭ２からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも５種を含む、請求項５２から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記一組の参照遺伝子が、ＬＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２、およびＴＲＩＭ２からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも６、７、８、または９種を含む、請求項５２から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記一組の参照遺伝子が、ＬＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２、およびＴＲＩＭ２からなる、請求項５２から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記乳がんが転移性乳がんである、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記乳がんが、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶの乳がんである、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記乳がんがホルモン受容体陽性である、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ホルモン受容体がＥＲおよび／またはＰＲである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記乳がんが、ＨＥＲ２の本質的に正常な発現を有する、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記内分泌療法がタモキシフェン療法またはアロマターゼ阻害薬療法である、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記タモキシフェン療法が、タモキシフェン、トレミフェン、またはフルベストラントを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記アロマターゼ阻害薬療法が、レトロゾール、アナストロゾール、またはエキセメスタンを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記試料が、血液、唾液、尿、または組織生検である、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記試料が血液である、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記組織生検がホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）としてさらに定義される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記組織生検が腫瘍生検としてさらに定義される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記腫瘍生検が瞬間冷凍またはＲＮＡ安定化剤によって保存される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
ステップ（ａ）が、前記患者試料からＲＮＡを単離することを含む、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記発現レベルを決定するステップが、逆転写定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、マイクロアレイ解析、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ（登録商標）アッセイ、またはＲＮＡシーケンシングを行うことを含む、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記対象が過去に抗がん療法を施行されたことがある、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記抗がん療法が、化学療法および／または内分泌療法である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記対象が前記化学療法および／または内分泌療法に対して感受性を呈した、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記化学療法がタキサン−および／またはアントラサイクリン化学療法である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記抗がん療法が少なくとも５年間にわたり施行された、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
ステップ（ｂ）が、ＥＳＲ１遺伝子の変異を含む転写物の割合を検出するステップをさらに含む、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記割合が、野生型ＥＳＲ１の発現と比べた変異ＥＳＲ１の発現として計算される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＥＳＲ１遺伝子の前記変異が、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ５３４Ｅ、Ｐ５３５Ｈ、Ｌ５３６Ｑ、Ｌ５３６Ｒ、Ｙ５３７Ｃ、Ｙ５３７Ｓ、Ｙ５３７Ｎ、またはＤ５３８Ｇである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記対象がヒトである、請求項５１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
対象において乳がんを処置する方法であって、有効量の内分泌療法を前記対象に施行するステップを含み、前記対象が内分泌療法に対して感受性であることがＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数に基づいて決定されている、方法。
【請求項９０】
前記ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数が、前記対象に由来する試料中の一組のエストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）関連遺伝子の発現レベルを決定すること、ならびに前記ＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の発現に基づいて前記ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を計算することによって決定される、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記対象が、請求項５１から８８のいずれか一項に記載の方法に従い、内分泌療法に対して感受性であることが前記ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数に基づいて決定されている、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
内分泌療法に対して感受性であることがＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数に基づいて識別された対象において乳がんを処置するための有効量の内分泌療法を含む組成物。
【請求項９３】
前記ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数が、前記対象に由来する試料中の一組のエストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）関連遺伝子の発現レベルを決定すること、ならびに前記ＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の発現に基づいて前記ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を計算することによって決定される、請求項９２に記載の組成物。
【請求項９４】
前記対象が、請求項５１から８８のいずれか一項に記載の方法に従い、内分泌療法に対して感受性であることが前記ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数に基づいて決定されている、請求項９２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年４月２９日に出願された米国仮出願番号第６２／３２９，７７４号の優先権の利益を主張しており、その全体の内容は、本明細書によって参考として援用される。
【０００２】
発明の背景
本発明は、米国立衛生研究所により授与された助成金第ＨＨＳＮ２６１２００８００００１Ｅ号の下で政府支援を受けてなされた。政府は本発明にある特定の権利を有する。
【０００３】
１．  発明の分野
本発明は概して、分子生物学および医学の分野に関する。より特定すると、本発明は、転写プロファイリングに基づいてがんを処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．  関連技術の説明
内分泌療法（ホルモン療法としても公知）は、転移性のホルモン受容体陽性およびＨＥＲ２陰性（ＨＲ＋／ＨＥＲ２−）の乳がんの緩和処置のための基礎である（Giordanoら、２０１４年；Cardosoら、２０１４年）。しかしながら、緩和療法の効力は、患者および処置の種類に応じて不定である。さらに、ホルモン受容体発現の変化（例えば、転移性乳がんの約２０％におけるプロゲステロン受容体（ＰＲ、遺伝子名ＰＧＲ）の損失または転移性乳がんの約１０％におけるエストロゲン受容体（ＥＲ、遺伝子名ＥＳＲ１）の損失（Lowerら、２００５年；Hoefnagelら、２０１０年；Amirら、２０１２年；Thompsonら、２０１０年）、ＥＳＲ１における機能的に活性な遺伝子の変異の獲得（Toyら、２０１３年；Robinsonら、２０１３年）、およびエストロゲンへの依存性を減少させる転写プロファイルの変化を通じて、進行疾患におけるがん細胞のエストロゲンへの依存からがん細胞を切り離す、分子的な進行事象があることについて、一貫した証拠がある。
現在の指針は再発性ＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳がん患者のための一次処置として内分泌療法を推奨しているが、二次的内分泌抵抗性が発生したかもしれない懸念が存在する場合は、後続処置の選択がますます困難になり得る（Giordanoら、２０１４年；Cardosoら、２０１４年）。さらなる内分泌ベースの療法に対する感受性を推定するためには、アジュバント設定における患者の以前の内分泌感受性の履歴、過去の再発事象の数、内臓転移の発生、および施行された過去の内分泌（ホルモン）処置の数などの臨床的変数が使用され得る。いくつかのゲノム多重遺伝子アッセイは、標準的なマーカーの免疫組織化学的評価の使用を超えて、早期ホルモン受容体陽性（ＨＲ＋）乳がんにおける処置の決断を個別化するに当たってのその価値を証明しているが（van't  Veerら、２００２年；Paikら、２００４年；Filipitsら、２０１１年）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ（ＡＪＣＣステージ）による現在の基準によって定義されたステージＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶを含む進行乳がんの設定で使用するための、処置応答を予測するための高い解析妥当性を有するカスタマイズされたアッセイが必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Giordano,  S.  H.ら、J.  Clin.  Oncol.  32,  1−23,  2014.
【非特許文献２】Cardoso,  F.ら、Ann.  Oncol.  25,  1871−1888,  2014.
【非特許文献３】Lower,  E.  E.ら、Breast  Cancer  Res.  Treat.  90,  65−70,  2005.
【非特許文献４】Hoefnagel,  L.  D.ら、Breast  Cancer  Res.  12,  R75,  2010.
【非特許文献５】Amir,  E.ら、J.  Clin.  Oncol.  30,  587−592,  2012.
【非特許文献６】Thompson,  A.  M.ら、Breast  Cancer  Res.  12,  R92,  2010.
【非特許文献７】Toy,  W.ら、Nat.  Genet.  45,  1439−45,  2013.
【非特許文献８】Robinsonら、Nature  Genetics,  45:1446-151,  2013.
【非特許文献９】Veer,  L.  J.  Vanら、415,  2002.
【非特許文献１０】Paik,  S.ら、N.  Engl.  J.  Med.  351,  2817−2826,  2004.
【非特許文献１１】Filipits,  M.ら、Clin.  Cancer  Res.  17,  6012−6020,  2011.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本開示の諸実施形態は、ホルモン療法（内分泌療法としても公知）単独または他の抗がん療法との組合せに対して感受性のある乳房腫瘍の検出および処置のための方法を提供する。第１の実施形態では、患者において乳がんを処置する方法であって、（ａ）患者試料中における、エストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）の両方の発現に関連する一組の遺伝子の発現レベルを決定するステップと；（ｂ）ＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の発現の指数に基づいて、内分泌療法に対する感受性の指数（ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数）を計算するステップと；（ｃ）内分泌療法に対する患者のがんの予測される感受性（ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数）に基づいて有効量の内分泌療法を患者に施行するステップとを含む、方法が提供される。
【０００７】
別の実施形態では、本開示は、対象において乳がんを処置する方法であって、有効量の内分泌療法を前記対象に施行するステップを含み、対象が内分泌療法に対して感受性であることがＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数に基づいて決定されている、方法を提供する。一部の態様では、対象は、対象に由来する試料中の一組のエストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）関連遺伝子の発現レベルを決定すること、ならびにＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の発現に基づいてＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を計算することによって、内分泌療法に対して感受性であることがＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数に基づいて決定されている。
【０００８】
さらなる実施形態は、内分泌療法に対して感受性であることがＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数に基づいて識別された対象において乳がんを処置するための有効量の内分泌療法を含む組成物を提供する。一部の態様では、対象は、対象に由来する試料中の一組のエストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）関連遺伝子の発現レベルを決定すること、ならびにＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の発現に基づいてＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を計算することによって、内分泌療法に対して感受性であることがＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数に基づいて決定されている。
【０００９】
上記の実施形態の一部の態様では、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を計算するステップは、一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の発現を、一組の参照遺伝子に対して正規化することを含む。ある特定の態様では、計算するステップは、一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の平均発現と、一組の参照遺伝子の平均発現との間の差としてさらに定義される。一部の態様では、本方法は、最適化定数の加算をさらに含む。特定の態様では、最適化定数は２の値を有する。一部の態様では、０超のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、患者を内分泌療法に対して感受性であると識別する。ある特定の態様では、０．５超のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、患者を内分泌療法に対して感受性であると識別する。一部の態様では、１超のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、患者を内分泌療法に対して感受性であると識別する。
【００１０】
ある特定の態様では、一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子は、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＴＣ２、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、およびＫＣＮＥ４からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１０種を含む。一部の態様では、一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子は、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＴＣ２、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、およびＫＣＮＥ４からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７種を含む。一部の態様では、一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子は、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＴＣ２、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、およびＫＣＮＥ４からなる。
【００１１】
一部の態様では、一組の参照遺伝子は、ＬＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２、およびＴＲＩＭ２からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも５種を含む。ある特定の態様では、一組の参照遺伝子は、ＬＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２、およびＴＲＩＭ２からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも６、７、８、または９種を含む。一部の態様では、一組の参照遺伝子は、ＬＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２、およびＴＲＩＭ２からなる。
【００１２】
ある特定の態様では、乳がんは、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶの乳がんである。ある特定の態様では、乳がんはホルモン受容体陽性である。一部の態様では、ホルモン受容体はＥＲおよび／またはＰＲである。一部の態様では、乳がんは、例えば、非がんレベルと比較して、ＨＥＲ２の本質的に正常な発現を有する（すなわち、ＨＥＲ２陰性である）。
【００１３】
一部の態様では、内分泌療法は、選択的エストロゲン受容体調節（ＳＥＲＭ）、アロマターゼ阻害（ＡＩ）、または選択的エストロゲン受容体分解（ＳＥＲＤ）クラスの処置を含む。一部の態様では、ＳＥＲＭ療法は、タモキシフェンまたはトレミフェンを含む。ある特定の態様では、アロマターゼ阻害薬療法は、レトロゾール、アナストロゾール、またはエキセメスタンを含む。一部の態様では、ＳＥＲＤ療法は、フルベストラントを含む。ある特定の態様では、順次または併行して施行される処置などの第２の処置が、内分泌療法の有効性を上昇させるために施行され得る。ある特定の態様では、第２の処置は、第１の内分泌療法の有効性を上昇させる、エストロゲンの卵巣放出の抑制などのさらなる内分泌療法を含む。一部の態様では、第２の処置は、内分泌療法の有効性を上昇させる生物学的療法を含む。
【００１４】
ある特定の態様では、患者試料は、血液、唾液、尿、細胞診試料、組織生検、または外科的に摘出した組織である。一部の態様では、患者試料は血液である。ある特定の態様では、組織生検は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）としてさらに定義される。一部の態様では、組織生検は腫瘍生検としてさらに定義される。ある特定の態様では、細胞診試料または腫瘍生検は、瞬間冷凍またはＲＮＡ安定化剤によって保存される。
【００１５】
一部の態様では、ステップ（ａ）は、患者試料からＲＮＡを単離することを含む。ある特定の態様では、試料を溶解緩衝液で消化してもよく、かつ／または、ＲＮＡをピコドロップレット濃縮によって濃縮してもよい。ある特定の態様では、発現レベルを決定するステップは、逆転写定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、マイクロアレイ解析、またはＲＮＡシーケンシングを行うことを含む。一部の態様では、発現レベルを決定するステップは、鋳型への直接的なハイブリダイゼーション、例えばＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ（登録商標）ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイもしくはＱｕａｎｔｉｇｅｎｅアッセイ、ピコドロップレットターゲティングおよび逆転写、またはＲＮＡｓｅプロテクションアッセイを含む。
【００１６】
一部の態様では、患者は過去に抗がん療法を施行されたことがある。ある特定の態様では、抗がん療法は、化学療法および／または内分泌療法である。一部の態様では、患者は前記化学療法および／または内分泌療法に対して感受性を呈した。ある特定の態様では、化学療法はタキサン−アントラサイクリン化学療法である。一部の態様では、抗がん療法は少なくとも５年間にわたり施行された。
【００１７】
ある特定の態様では、ステップ（ｂ）は、ＥＳＲ１遺伝子からの変異を含む転写物の割合を検出することをさらに含む。一部の態様では、この割合は、野生型ＥＳＲ１の発現と比べた変異ＥＳＲ１の発現として計算される。ある特定の態様では、ＥＳＲ１遺伝子の変異は、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ５３４Ｅ、Ｐ５３５Ｈ、Ｌ５３６Ｑ、Ｌ５３６Ｒ、Ｙ５３７Ｃ、Ｙ５３７Ｓ、Ｙ５３７Ｎ、またはＤ５３８Ｇである。一部の態様では、試料中の変異ＥＳＲ１転写物の割合は、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の測定の結果と比べて解釈される。
【００１８】
一部の態様では、本方法は、少なくとも第２の抗がん療法を施行するステップをさらに含む。ある特定の態様では、抗がん療法は、化学療法、免疫療法、手術、照射療法、または生物学的療法である。一部の態様では、抗がん療法は第２の内分泌療法である。ある特定の態様では、内分泌療法および／または少なくとも第２の抗がん療法は、経口的に、静脈内に、腹腔内に、気管内に、腫瘍内に、筋肉内に、内視鏡的に、病巣内に、経皮的に、皮下に、経皮的に、局部的に、または直接注射もしくは灌流によって施行される。一部の態様では、内分泌療法および／または少なくとも第２の抗がん療法は同時に施行される。ある特定の態様では、内分泌療法は、少なくとも第２の抗がん療法の前に施行される。一部の態様では、患者はヒトである。
【００１９】
さらなる実施形態では、乳がんを患う対象の腫瘍の感受性を決定するための方法であって、（ａ）試料中の一組のエストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）関連遺伝子の発現レベルを決定するステップと、（ｂ）ＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の発現に基づいて、内分泌療法に対する感受性の指数（ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数）を計算するステップとを含む、方法が提供される。
【００２０】
一部の態様では、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を計算するステップは、一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の発現を、一組の参照遺伝子に対して正規化することを含む。ある特定の態様では、計算するステップは、一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の平均発現と、一組の参照遺伝子の平均発現との間の差としてさらに定義される。一部の態様では、本方法は、最適化定数の加算をさらに含む。特定の態様では、最適化定数は２の値を有する。一部の態様では、０超のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、患者を内分泌療法に対して感受性であると識別する。ある特定の態様では、０．５超のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、患者を内分泌療法に対して感受性であると識別する。一部の態様では、１超のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、患者を内分泌療法に対して感受性であると識別する。
【００２１】
ある特定の態様では、一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子は、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＴＣ２、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、およびＫＣＮＥ４からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１０種を含む。一部の態様では、一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子は、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＴＣ２、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、およびＫＣＮＥ４からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７種を含む。一部の態様では、一組のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子は、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＴＣ２、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、およびＫＣＮＥ４からなる。
【００２２】
一部の態様では、一組の参照遺伝子は、ＬＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２、およびＴＲＩＭ２からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも５種を含む。ある特定の態様では、一組の参照遺伝子は、ＬＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２、およびＴＲＩＭ２からなる群から選択される遺伝子のうちの少なくとも６、７、８、または９種を含む。一部の態様では、一組の参照遺伝子は、ＬＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２、およびＴＲＩＭ２からなる。
【００２３】
ある特定の態様では、乳がんは、転移性乳がんである。一部の態様では、乳がんは、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶの乳がんである。ある特定の態様では、乳がんはホルモン受容体陽性である。一部の態様では、ホルモン受容体はＥＲおよび／またはＰＲである。一部の態様では、乳がんは、ＨＥＲ２の本質的に正常な発現を有する。
【００２４】
一部の態様では、内分泌療法は、選択的エストロゲン受容体調節（ＳＥＲＭ）、アロマターゼ阻害（ＡＩ）、または選択的エストロゲン受容体分解（ＳＥＲＤ）クラスの処置を含む。一部の態様では、ＳＥＲＭ療法は、タモキシフェンまたはトレミフェンを含む。ある特定の態様では、アロマターゼ阻害薬療法は、レトロゾール、アナストロゾール、またはエキセメスタンを含む。一部の態様では、ＳＥＲＤ療法は、フルベストラントを含む。  
【００２５】
ある特定の態様では、試料は、血液、唾液、尿、細胞診試料、組織生検、または外科的に摘出した組織である。一部の態様では、試料は血液である。ある特定の態様では、組織生検は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）としてさらに定義される。一部の態様では、組織生検は腫瘍生検としてさらに定義される。ある特定の態様では、細胞診試料または腫瘍生検は、瞬間冷凍またはＲＮＡ安定化剤によって保存される。一部の態様では、細胞診試料は、ガラススライド上または溶液中のいずれかで保存された細胞として、アルコールをベースにした固定剤中に保存される。
【００２６】
一部の態様では、ステップ（ａ）は、試料からＲＮＡを単離することを含む。ある特定の態様では、発現レベルを決定するステップは、逆転写定量的リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、マイクロアレイ解析、またはＲＮＡシーケンシングを行うことを含む。一部の態様では、発現レベルを決定するステップは、鋳型への直接的なハイブリダイゼーション、例えばＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ（登録商標）アッセイもしくはＱｕａｎｔｉｇｅｎｅアッセイ、またはＲＮＡｓｅプロテクションアッセイを含む。
【００２７】
一部の態様では、対象は過去に抗がん療法を施行されたことがある。ある特定の態様では、抗がん療法は、化学療法および／または内分泌療法である。一部の態様では、対象は前記化学療法および／または内分泌療法に対して感受性を呈した。ある特定の態様では、化学療法はタキサン−および／またはアントラサイクリン化学療法である。一部の態様では、抗がん療法は少なくとも５年間にわたり施行された。
【００２８】
ある特定の態様では、ステップ（ｂ）は、ＥＳＲ１遺伝子における変異を含む転写物の割合を検出することをさらに含む。一部の態様では、この割合は、野生型ＥＳＲ１の発現と比べた変異ＥＳＲ１の発現として計算される。ある特定の態様では、ＥＳＲ１遺伝子の変異は、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ５３４Ｅ、Ｐ５３５Ｈ、Ｌ５３６Ｑ、Ｌ５３６Ｒ、Ｙ５３７Ｃ、Ｙ５３７Ｓ、Ｙ５３７Ｎ、またはＤ５３８Ｇである。
【００２９】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な記述から明らかとなる。しかしながら、詳細な記述および具体的な例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、当業者には本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および改変がこの詳細な記述から明らかとなるため、単に例示として提示されていることを理解されたい。
【００３０】
続く図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに明示するために含まれている。本発明は、これらの図面のうちの１つまたは複数を本明細書において提示される特定の実施形態の詳細な記述と組み合わせて参照することによって、より深く理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｄ：原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験：（Ａ）アッセイ手順の反復試験区(replicates)。（Ｂ）各腫瘍から得た３つの生検間での腫瘍内不均一性。（Ｃ）各腫瘍からの組織および掻爬細胞診試料の一致した標本間での試料型間比較。（Ｄ）ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームＵ１３３ＡおよびＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０のプラットフォーム間の比較。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｄ：原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験：（Ａ）アッセイ手順の反復試験区(replicates)。（Ｂ）各腫瘍から得た３つの生検間での腫瘍内不均一性。（Ｃ）各腫瘍からの組織および掻爬細胞診試料の一致した標本間での試料型間比較。（Ｄ）ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームＵ１３３ＡおよびＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０のプラットフォーム間の比較。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｄ：原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験：（Ａ）アッセイ手順の反復試験区(replicates)。（Ｂ）各腫瘍から得た３つの生検間での腫瘍内不均一性。（Ｃ）各腫瘍からの組織および掻爬細胞診試料の一致した標本間での試料型間比較。（Ｄ）ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームＵ１３３ＡおよびＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０のプラットフォーム間の比較。
【図１Ｄ】図１Ａ〜Ｄ：原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験：（Ａ）アッセイ手順の反復試験区(replicates)。（Ｂ）各腫瘍から得た３つの生検間での腫瘍内不均一性。（Ｃ）各腫瘍からの組織および掻爬細胞診試料の一致した標本間での試料型間比較。（Ｄ）ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームＵ１３３ＡおよびＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０のプラットフォーム間の比較。
【００３２】
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｆ：原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験：（Ａ）正常な肝臓試料のＲＮＡの連続的スパイクイン。（Ｂ）乳房試料の汚染。（Ｃ）保存前の試料の長時間にわたるｅｘ  ｖｉｖｏ冷虚血時間の持続期間。（Ｄ）プラットフォーム間の比較。（Ｅ）研究室間の比較。（Ｆ）アッセイ内の妥当性検証。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｆ：原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験：（Ａ）正常な肝臓試料のＲＮＡの連続的スパイクイン。（Ｂ）乳房試料の汚染。（Ｃ）保存前の試料の長時間にわたるｅｘ  ｖｉｖｏ冷虚血時間の持続期間。（Ｄ）プラットフォーム間の比較。（Ｅ）研究室間の比較。（Ｆ）アッセイ内の妥当性検証。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｆ：原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験：（Ａ）正常な肝臓試料のＲＮＡの連続的スパイクイン。（Ｂ）乳房試料の汚染。（Ｃ）保存前の試料の長時間にわたるｅｘ  ｖｉｖｏ冷虚血時間の持続期間。（Ｄ）プラットフォーム間の比較。（Ｅ）研究室間の比較。（Ｆ）アッセイ内の妥当性検証。
【図２Ｄ】図２Ａ〜Ｆ：原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験：（Ａ）正常な肝臓試料のＲＮＡの連続的スパイクイン。（Ｂ）乳房試料の汚染。（Ｃ）保存前の試料の長時間にわたるｅｘ  ｖｉｖｏ冷虚血時間の持続期間。（Ｄ）プラットフォーム間の比較。（Ｅ）研究室間の比較。（Ｆ）アッセイ内の妥当性検証。
【図２Ｅ】図２Ａ〜Ｆ：原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験：（Ａ）正常な肝臓試料のＲＮＡの連続的スパイクイン。（Ｂ）乳房試料の汚染。（Ｃ）保存前の試料の長時間にわたるｅｘ  ｖｉｖｏ冷虚血時間の持続期間。（Ｄ）プラットフォーム間の比較。（Ｅ）研究室間の比較。（Ｆ）アッセイ内の妥当性検証。
【図２Ｆ】図２Ａ〜Ｆ：原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験：（Ａ）正常な肝臓試料のＲＮＡの連続的スパイクイン。（Ｂ）乳房試料の汚染。（Ｃ）保存前の試料の長時間にわたるｅｘ  ｖｉｖｏ冷虚血時間の持続期間。（Ｄ）プラットフォーム間の比較。（Ｅ）研究室間の比較。（Ｆ）アッセイ内の妥当性検証。
【００３３】
【図３Ａ】図３Ａ〜Ｄ：ホルモン療法による処置後の再発性転移性（ステージＩＶ）乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数による生存期間のカプラン・マイヤープロット：（Ａ）腫瘍生検後の次の処置がホルモン療法であった７９名の患者における無増悪生存期間（ＰＦＳ）、ＰＦＳ中央値に７か月の差。（Ｂ）腫瘍生検後の次の処置がホルモン療法であった７９名の同患者における全生存期間（ＯＳ）、ＯＳ中央値に３１か月の差。（Ｃ）ホルモン療法に対する以前の応答の臨床歴がある４６名の患者のサブセットにおける無増悪生存期間（ＰＦＳ）、ＰＦＳ中央値に１１か月の差。（Ｄ）ホルモン療法に対する以前の応答の臨床歴がある４６名の患者の同サブセットにおける全生存期間（ＯＳ）、ＯＳ中央値に３０か月の差。
【図３Ｂ】図３Ａ〜Ｄ：ホルモン療法による処置後の再発性転移性（ステージＩＶ）乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数による生存期間のカプラン・マイヤープロット：（Ａ）腫瘍生検後の次の処置がホルモン療法であった７９名の患者における無増悪生存期間（ＰＦＳ）、ＰＦＳ中央値に７か月の差。（Ｂ）腫瘍生検後の次の処置がホルモン療法であった７９名の同患者における全生存期間（ＯＳ）、ＯＳ中央値に３１か月の差。（Ｃ）ホルモン療法に対する以前の応答の臨床歴がある４６名の患者のサブセットにおける無増悪生存期間（ＰＦＳ）、ＰＦＳ中央値に１１か月の差。（Ｄ）ホルモン療法に対する以前の応答の臨床歴がある４６名の患者の同サブセットにおける全生存期間（ＯＳ）、ＯＳ中央値に３０か月の差。
【図３Ｃ】図３Ａ〜Ｄ：ホルモン療法による処置後の再発性転移性（ステージＩＶ）乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数による生存期間のカプラン・マイヤープロット：（Ａ）腫瘍生検後の次の処置がホルモン療法であった７９名の患者における無増悪生存期間（ＰＦＳ）、ＰＦＳ中央値に７か月の差。（Ｂ）腫瘍生検後の次の処置がホルモン療法であった７９名の同患者における全生存期間（ＯＳ）、ＯＳ中央値に３１か月の差。（Ｃ）ホルモン療法に対する以前の応答の臨床歴がある４６名の患者のサブセットにおける無増悪生存期間（ＰＦＳ）、ＰＦＳ中央値に１１か月の差。（Ｄ）ホルモン療法に対する以前の応答の臨床歴がある４６名の患者の同サブセットにおける全生存期間（ＯＳ）、ＯＳ中央値に３０か月の差。
【図３Ｄ】図３Ａ〜Ｄ：ホルモン療法による処置後の再発性転移性（ステージＩＶ）乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数による生存期間のカプラン・マイヤープロット：（Ａ）腫瘍生検後の次の処置がホルモン療法であった７９名の患者における無増悪生存期間（ＰＦＳ）、ＰＦＳ中央値に７か月の差。（Ｂ）腫瘍生検後の次の処置がホルモン療法であった７９名の同患者における全生存期間（ＯＳ）、ＯＳ中央値に３１か月の差。（Ｃ）ホルモン療法に対する以前の応答の臨床歴がある４６名の患者のサブセットにおける無増悪生存期間（ＰＦＳ）、ＰＦＳ中央値に１１か月の差。（Ｄ）ホルモン療法に対する以前の応答の臨床歴がある４６名の患者の同サブセットにおける全生存期間（ＯＳ）、ＯＳ中央値に３０か月の差。
【００３４】
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｄ：アッセイ型および試料型間で比較したときの原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅハイブリダイゼーションアッセイ）：（Ａ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイによる新鮮冷凍腫瘍試料からの測定値を、符合するホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料を使用したＱｕａｎｔｉｇｅｎｅのカスタムアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘビーズベースのハイブリダイゼーション）からの測定値と比較したもの。灰色の破線は線形回帰直線を示す。（Ｂ）それぞれが異なる日に各試験バッチを行う２名の異なる技師を含み、かつ各バッチが異なるロットの試薬を含む３バッチをそれぞれが含む、スライド上のＦＦＰＥ組織切片の繰り返し試験の比較。（Ｃ）異なる腫瘍を使用し、（Ａ）に示される線形回帰解析からの等式を適用することによってＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ法によるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定を補正した、（Ａ）に示される研究結果の妥当性検証研究。（Ｄ）異なる腫瘍を使用し、（Ａ）に示される線形回帰解析からの等式を適用することによってＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ法によるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定を補正した、（Ｂ）に示される研究結果の妥当性検証研究。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｄ：アッセイ型および試料型間で比較したときの原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅハイブリダイゼーションアッセイ）：（Ａ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイによる新鮮冷凍腫瘍試料からの測定値を、符合するホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料を使用したＱｕａｎｔｉｇｅｎｅのカスタムアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘビーズベースのハイブリダイゼーション）からの測定値と比較したもの。灰色の破線は線形回帰直線を示す。（Ｂ）それぞれが異なる日に各試験バッチを行う２名の異なる技師を含み、かつ各バッチが異なるロットの試薬を含む３バッチをそれぞれが含む、スライド上のＦＦＰＥ組織切片の繰り返し試験の比較。（Ｃ）異なる腫瘍を使用し、（Ａ）に示される線形回帰解析からの等式を適用することによってＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ法によるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定を補正した、（Ａ）に示される研究結果の妥当性検証研究。（Ｄ）異なる腫瘍を使用し、（Ａ）に示される線形回帰解析からの等式を適用することによってＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ法によるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定を補正した、（Ｂ）に示される研究結果の妥当性検証研究。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｄ：アッセイ型および試料型間で比較したときの原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅハイブリダイゼーションアッセイ）：（Ａ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイによる新鮮冷凍腫瘍試料からの測定値を、符合するホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料を使用したＱｕａｎｔｉｇｅｎｅのカスタムアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘビーズベースのハイブリダイゼーション）からの測定値と比較したもの。灰色の破線は線形回帰直線を示す。（Ｂ）それぞれが異なる日に各試験バッチを行う２名の異なる技師を含み、かつ各バッチが異なるロットの試薬を含む３バッチをそれぞれが含む、スライド上のＦＦＰＥ組織切片の繰り返し試験の比較。（Ｃ）異なる腫瘍を使用し、（Ａ）に示される線形回帰解析からの等式を適用することによってＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ法によるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定を補正した、（Ａ）に示される研究結果の妥当性検証研究。（Ｄ）異なる腫瘍を使用し、（Ａ）に示される線形回帰解析からの等式を適用することによってＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ法によるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定を補正した、（Ｂ）に示される研究結果の妥当性検証研究。
【図４Ｄ】図４Ａ〜Ｄ：アッセイ型および試料型間で比較したときの原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅハイブリダイゼーションアッセイ）：（Ａ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイによる新鮮冷凍腫瘍試料からの測定値を、符合するホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料を使用したＱｕａｎｔｉｇｅｎｅのカスタムアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘビーズベースのハイブリダイゼーション）からの測定値と比較したもの。灰色の破線は線形回帰直線を示す。（Ｂ）それぞれが異なる日に各試験バッチを行う２名の異なる技師を含み、かつ各バッチが異なるロットの試薬を含む３バッチをそれぞれが含む、スライド上のＦＦＰＥ組織切片の繰り返し試験の比較。（Ｃ）異なる腫瘍を使用し、（Ａ）に示される線形回帰解析からの等式を適用することによってＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ法によるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定を補正した、（Ａ）に示される研究結果の妥当性検証研究。（Ｄ）異なる腫瘍を使用し、（Ａ）に示される線形回帰解析からの等式を適用することによってＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ法によるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定を補正した、（Ｂ）に示される研究結果の妥当性検証研究。
【００３５】
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｂ：アッセイ型および試料型間で比較したときの原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒハイブリダイゼーションアッセイへの変換）：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイでプロファイリングした新鮮冷凍（ＦＦ）ＲＮＡからのＳＥＴＥＲ／ＰＲの、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｎ−ｃｏｕｎｔｅｒハイブリダイゼーションプラットフォームへの変換。（Ａ）Ｕ１３３ＡによるＦＦ試料のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を、ＦＦＰＥ試料を使用したＮａｎｏｓｔｒｉｎｇプラットフォームに対して較正するための、原発性乳がんの較正コホート；（Ｂ）ＦＦＰＥ試料を用いたＮａｎｏｓｔｒｉｎｇプラットフォームを使用し、較正されたＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を試験するための、原発性乳がんの妥当性検証コホート。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｂ：アッセイ型および試料型間で比較したときの原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒハイブリダイゼーションアッセイへの変換）：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイでプロファイリングした新鮮冷凍（ＦＦ）ＲＮＡからのＳＥＴＥＲ／ＰＲの、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｎ−ｃｏｕｎｔｅｒハイブリダイゼーションプラットフォームへの変換。（Ａ）Ｕ１３３ＡによるＦＦ試料のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を、ＦＦＰＥ試料を使用したＮａｎｏｓｔｒｉｎｇプラットフォームに対して較正するための、原発性乳がんの較正コホート；（Ｂ）ＦＦＰＥ試料を用いたＮａｎｏｓｔｒｉｎｇプラットフォームを使用し、較正されたＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を試験するための、原発性乳がんの妥当性検証コホート。
【００３６】
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｄ：アッセイ型および試料型間で比較したときの原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験（Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋマイクロアレイへの変換）：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイでプロファイリングした新鮮冷凍（ＦＦ）ＲＮＡからのＳＥＴＥＲ／ＰＲの、Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  Ｖ２マイクロアレイプラットフォームへの変換。（Ａ、Ｃ）線形回帰を使用して、Ｕ１３３ＡによるＦＦ試料のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を、ＦＦ試料（Ａ）またはＦＦＰＥ試料（Ｃ）を使用したＡｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  Ｖ２アレイに対して較正するための、原発性乳がんの較正コホート。（Ｂ、Ｄ）ＦＦ試料（Ｂ）またはＦＦＰＥ試料（Ｄ）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  Ｖ２アレイを使用し、較正されたＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を試験するための、原発性乳がんの妥当性検証コホート。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｄ：アッセイ型および試料型間で比較したときの原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験（Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋマイクロアレイへの変換）：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイでプロファイリングした新鮮冷凍（ＦＦ）ＲＮＡからのＳＥＴＥＲ／ＰＲの、Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  Ｖ２マイクロアレイプラットフォームへの変換。（Ａ、Ｃ）線形回帰を使用して、Ｕ１３３ＡによるＦＦ試料のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を、ＦＦ試料（Ａ）またはＦＦＰＥ試料（Ｃ）を使用したＡｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  Ｖ２アレイに対して較正するための、原発性乳がんの較正コホート。（Ｂ、Ｄ）ＦＦ試料（Ｂ）またはＦＦＰＥ試料（Ｄ）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  Ｖ２アレイを使用し、較正されたＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を試験するための、原発性乳がんの妥当性検証コホート。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｄ：アッセイ型および試料型間で比較したときの原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験（Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋマイクロアレイへの変換）：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイでプロファイリングした新鮮冷凍（ＦＦ）ＲＮＡからのＳＥＴＥＲ／ＰＲの、Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  Ｖ２マイクロアレイプラットフォームへの変換。（Ａ、Ｃ）線形回帰を使用して、Ｕ１３３ＡによるＦＦ試料のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を、ＦＦ試料（Ａ）またはＦＦＰＥ試料（Ｃ）を使用したＡｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  Ｖ２アレイに対して較正するための、原発性乳がんの較正コホート。（Ｂ、Ｄ）ＦＦ試料（Ｂ）またはＦＦＰＥ試料（Ｄ）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  Ｖ２アレイを使用し、較正されたＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を試験するための、原発性乳がんの妥当性検証コホート。
【図６Ｄ】図６Ａ〜Ｄ：アッセイ型および試料型間で比較したときの原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験（Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋマイクロアレイへの変換）：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイでプロファイリングした新鮮冷凍（ＦＦ）ＲＮＡからのＳＥＴＥＲ／ＰＲの、Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  Ｖ２マイクロアレイプラットフォームへの変換。（Ａ、Ｃ）線形回帰を使用して、Ｕ１３３ＡによるＦＦ試料のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を、ＦＦ試料（Ａ）またはＦＦＰＥ試料（Ｃ）を使用したＡｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  Ｖ２アレイに対して較正するための、原発性乳がんの較正コホート。（Ｂ、Ｄ）ＦＦ試料（Ｂ）またはＦＦＰＥ試料（Ｄ）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋ  Ｖ２アレイを使用し、較正されたＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を試験するための、原発性乳がんの妥当性検証コホート。
【００３７】
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｄ：アッセイ型および試料型間で比較したときの原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験（ＲａｉｎＤａｎｃｅピコドロップレットターゲティングＲＮＡシーケンシングアッセイへの変換）：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイでプロファイリングした新鮮冷凍（ＦＦ）ＲＮＡからのＳＥＴＥＲ／ＰＲの、ＲａｉｎＤａｎｃｅピコドロップレットベースのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ＲＮＡ−Ｓｅｑアッセイ（ＲＤ）を使用したカスタム標的化ＲＮＡシーケンシング法への変換。（Ａ、Ｃ）線形回帰を使用して、Ｕ１３３ＡによるＦＦ試料のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を、ＦＦ試料（Ａ）またはＦＦＰＥ試料（Ｃ）を使用したＲＤアッセイに対して較正するための、原発性乳がんの較正コホート。（Ｂ、Ｄ）ＦＦ試料（Ｂ）またはＦＦＰＥ試料（Ｄ）を用いたＲＤアッセイを使用し、較正されたＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を試験するための、原発性乳がんの妥当性検証コホート。
【図７Ｂ】図７Ａ〜Ｄ：アッセイ型および試料型間で比較したときの原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験（ＲａｉｎＤａｎｃｅピコドロップレットターゲティングＲＮＡシーケンシングアッセイへの変換）：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイでプロファイリングした新鮮冷凍（ＦＦ）ＲＮＡからのＳＥＴＥＲ／ＰＲの、ＲａｉｎＤａｎｃｅピコドロップレットベースのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ＲＮＡ−Ｓｅｑアッセイ（ＲＤ）を使用したカスタム標的化ＲＮＡシーケンシング法への変換。（Ａ、Ｃ）線形回帰を使用して、Ｕ１３３ＡによるＦＦ試料のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を、ＦＦ試料（Ａ）またはＦＦＰＥ試料（Ｃ）を使用したＲＤアッセイに対して較正するための、原発性乳がんの較正コホート。（Ｂ、Ｄ）ＦＦ試料（Ｂ）またはＦＦＰＥ試料（Ｄ）を用いたＲＤアッセイを使用し、較正されたＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を試験するための、原発性乳がんの妥当性検証コホート。
【図７Ｃ】図７Ａ〜Ｄ：アッセイ型および試料型間で比較したときの原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験（ＲａｉｎＤａｎｃｅピコドロップレットターゲティングＲＮＡシーケンシングアッセイへの変換）：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイでプロファイリングした新鮮冷凍（ＦＦ）ＲＮＡからのＳＥＴＥＲ／ＰＲの、ＲａｉｎＤａｎｃｅピコドロップレットベースのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ＲＮＡ−Ｓｅｑアッセイ（ＲＤ）を使用したカスタム標的化ＲＮＡシーケンシング法への変換。（Ａ、Ｃ）線形回帰を使用して、Ｕ１３３ＡによるＦＦ試料のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を、ＦＦ試料（Ａ）またはＦＦＰＥ試料（Ｃ）を使用したＲＤアッセイに対して較正するための、原発性乳がんの較正コホート。（Ｂ、Ｄ）ＦＦ試料（Ｂ）またはＦＦＰＥ試料（Ｄ）を用いたＲＤアッセイを使用し、較正されたＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を試験するための、原発性乳がんの妥当性検証コホート。
【図７Ｄ】図７Ａ〜Ｄ：アッセイ型および試料型間で比較したときの原発性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の再現性に関する試験（ＲａｉｎＤａｎｃｅピコドロップレットターゲティングＲＮＡシーケンシングアッセイへの変換）：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイでプロファイリングした新鮮冷凍（ＦＦ）ＲＮＡからのＳＥＴＥＲ／ＰＲの、ＲａｉｎＤａｎｃｅピコドロップレットベースのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ＲＮＡ−Ｓｅｑアッセイ（ＲＤ）を使用したカスタム標的化ＲＮＡシーケンシング法への変換。（Ａ、Ｃ）線形回帰を使用して、Ｕ１３３ＡによるＦＦ試料のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を、ＦＦ試料（Ａ）またはＦＦＰＥ試料（Ｃ）を使用したＲＤアッセイに対して較正するための、原発性乳がんの較正コホート。（Ｂ、Ｄ）ＦＦ試料（Ｂ）またはＦＦＰＥ試料（Ｄ）を用いたＲＤアッセイを使用し、較正されたＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を試験するための、原発性乳がんの妥当性検証コホート。
【００３８】
【図８】図８：ステージＩＶ（転移性）乳がんにおけるＥＳＲ１変異の頻度と対比したＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数：任意の進行事象の時点で将来を見越して８２名のＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳がん患者から転移部位の標的化針生検を得た。精製したＲＮＡを、ＲａｉｎＤａｎｃｅ（ＲＤ）プラットフォームを使用したＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数遺伝子の標的化ＲＮＡシーケンシングに供した。転移の１７％（１４／８２）においてＥＳＲ１  ＬＢＤ変異が識別された（変異転写物１％〜９８％の範囲）。高頻度の変異（転写物の１０％超）は、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ値がより高い（中央値を超える）転移にしか観察されなかった。
【００３９】
【図９Ａ】図９Ａ〜Ｆ：ホルモン療法による処置後の再発性転移性（ステージＩＶ）乳がんにおけるＥＳＲ１遺伝子の変異ステータスによるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（ＲＤ標的化ＲＮＡシーケンシングアッセイ）による生存期間のカプラン・マイヤープロット：内分泌療法を次に受けた患者（ｎ＝５８）において、ＥＳＲ１変異頻度単独では、無増悪生存期間（Ａ）または全生存期間（Ｂ）の差を予測しなかった。ＲａｉｎＤａｎｃｅ（ＲＤ）アッセイを使用すると、より高いＳＥＴＥＲ／ＰＲ単独で、より長い無増悪生存期間（Ｃ）および全生存期間（Ｄ）が予測された。この予測は、ＬＢＤ変異を有しない患者においてより顕著であった（ＥおよびＦ）。
【図９Ｂ】図９Ａ〜Ｆ：ホルモン療法による処置後の再発性転移性（ステージＩＶ）乳がんにおけるＥＳＲ１遺伝子の変異ステータスによるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（ＲＤ標的化ＲＮＡシーケンシングアッセイ）による生存期間のカプラン・マイヤープロット：内分泌療法を次に受けた患者（ｎ＝５８）において、ＥＳＲ１変異頻度単独では、無増悪生存期間（Ａ）または全生存期間（Ｂ）の差を予測しなかった。ＲａｉｎＤａｎｃｅ（ＲＤ）アッセイを使用すると、より高いＳＥＴＥＲ／ＰＲ単独で、より長い無増悪生存期間（Ｃ）および全生存期間（Ｄ）が予測された。この予測は、ＬＢＤ変異を有しない患者においてより顕著であった（ＥおよびＦ）。
【図９Ｃ】図９Ａ〜Ｆ：ホルモン療法による処置後の再発性転移性（ステージＩＶ）乳がんにおけるＥＳＲ１遺伝子の変異ステータスによるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（ＲＤ標的化ＲＮＡシーケンシングアッセイ）による生存期間のカプラン・マイヤープロット：内分泌療法を次に受けた患者（ｎ＝５８）において、ＥＳＲ１変異頻度単独では、無増悪生存期間（Ａ）または全生存期間（Ｂ）の差を予測しなかった。ＲａｉｎＤａｎｃｅ（ＲＤ）アッセイを使用すると、より高いＳＥＴＥＲ／ＰＲ単独で、より長い無増悪生存期間（Ｃ）および全生存期間（Ｄ）が予測された。この予測は、ＬＢＤ変異を有しない患者においてより顕著であった（ＥおよびＦ）。
【図９Ｄ】図９Ａ〜Ｆ：ホルモン療法による処置後の再発性転移性（ステージＩＶ）乳がんにおけるＥＳＲ１遺伝子の変異ステータスによるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（ＲＤ標的化ＲＮＡシーケンシングアッセイ）による生存期間のカプラン・マイヤープロット：内分泌療法を次に受けた患者（ｎ＝５８）において、ＥＳＲ１変異頻度単独では、無増悪生存期間（Ａ）または全生存期間（Ｂ）の差を予測しなかった。ＲａｉｎＤａｎｃｅ（ＲＤ）アッセイを使用すると、より高いＳＥＴＥＲ／ＰＲ単独で、より長い無増悪生存期間（Ｃ）および全生存期間（Ｄ）が予測された。この予測は、ＬＢＤ変異を有しない患者においてより顕著であった（ＥおよびＦ）。
【図９Ｅ】図９Ａ〜Ｆ：ホルモン療法による処置後の再発性転移性（ステージＩＶ）乳がんにおけるＥＳＲ１遺伝子の変異ステータスによるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（ＲＤ標的化ＲＮＡシーケンシングアッセイ）による生存期間のカプラン・マイヤープロット：内分泌療法を次に受けた患者（ｎ＝５８）において、ＥＳＲ１変異頻度単独では、無増悪生存期間（Ａ）または全生存期間（Ｂ）の差を予測しなかった。ＲａｉｎＤａｎｃｅ（ＲＤ）アッセイを使用すると、より高いＳＥＴＥＲ／ＰＲ単独で、より長い無増悪生存期間（Ｃ）および全生存期間（Ｄ）が予測された。この予測は、ＬＢＤ変異を有しない患者においてより顕著であった（ＥおよびＦ）。
【図９Ｆ】図９Ａ〜Ｆ：ホルモン療法による処置後の再発性転移性（ステージＩＶ）乳がんにおけるＥＳＲ１遺伝子の変異ステータスによるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（ＲＤ標的化ＲＮＡシーケンシングアッセイ）による生存期間のカプラン・マイヤープロット：内分泌療法を次に受けた患者（ｎ＝５８）において、ＥＳＲ１変異頻度単独では、無増悪生存期間（Ａ）または全生存期間（Ｂ）の差を予測しなかった。ＲａｉｎＤａｎｃｅ（ＲＤ）アッセイを使用すると、より高いＳＥＴＥＲ／ＰＲ単独で、より長い無増悪生存期間（Ｃ）および全生存期間（Ｄ）が予測された。この予測は、ＬＢＤ変異を有しない患者においてより顕著であった（ＥおよびＦ）。
【００４０】
【図１０】図１０：ステージＩＩ〜ＩＩＩ（原発性）乳がんにおけるＥＳＲ１変異の頻度と対比したＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数：初期診断時に将来を見越して９５名の患者から原発性ＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳がんの標的化生検を得た。精製したＲＮＡを、ＲａｉｎＤａｎｃｅ（ＲＤ）プラットフォームを使用したＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数遺伝子の標的化ＲＮＡシーケンシングに供した。ＥＳＲ１の稀なＬＢＤ変異は、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数値がより高いがん：原発性がん試料の１５％（１４／９５）において観察された（変異転写物１％〜３％の範囲）。
【００４１】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜Ｂ：手術およびネオアジュバント化学療法（ＮＡＣ）による処置後、ならびにホルモン療法による処置前のステージＩＩおよびＩＩＩ乳がんにおける、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数による生存期間：初期診断時に臨床ステージＩＩ〜ＩＩＩのＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳がんを有した患者のＮＡＣ完了後のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数と残存がん負荷（ＲＣＢ）との間の関係。（Ａ）表３に示される多変数モデルの係数を使用して連続的ＲＣＢと比較した連続的ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（ｙ軸）の予後モデル。（Ｂ）中等度の残存疾患または広範な残存疾患のＲＣＢクラスによる患者に関し、高いＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（実線）と低いＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（破線）とを対比して区別するように予め定義した１．８５のカットポイントを使用したＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数のクラスが示されている。ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数クラスは、ＲＣＢ−ＩＩの患者およびＲＣＢ−ＩＩＩの患者に関する予後判定能を有した。ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の高いＲＣＢ−ＩＩ（実線）で優れた予後判定が観察された。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜Ｂ：手術およびネオアジュバント化学療法（ＮＡＣ）による処置後、ならびにホルモン療法による処置前のステージＩＩおよびＩＩＩ乳がんにおける、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数による生存期間：初期診断時に臨床ステージＩＩ〜ＩＩＩのＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳がんを有した患者のＮＡＣ完了後のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数と残存がん負荷（ＲＣＢ）との間の関係。（Ａ）表３に示される多変数モデルの係数を使用して連続的ＲＣＢと比較した連続的ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（ｙ軸）の予後モデル。（Ｂ）中等度の残存疾患または広範な残存疾患のＲＣＢクラスによる患者に関し、高いＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（実線）と低いＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（破線）とを対比して区別するように予め定義した１．８５のカットポイントを使用したＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数のクラスが示されている。ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数クラスは、ＲＣＢ−ＩＩの患者およびＲＣＢ−ＩＩＩの患者に関する予後判定能を有した。ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の高いＲＣＢ−ＩＩ（実線）で優れた予後判定が観察された。
【００４２】
【図１２】図１２：手術による処置後、ならびに化学療法およびホルモン療法による処置前のステージＩＩおよびＩＩＩ乳がんにおける、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数による生存期間：高いＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（低リスク）について示されているリンパ節陽性ＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳がん（すなわちステージＩＩまたはＩＩＩ）患者の遠隔無再発生存期間を、低いＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（高リスク）と比較したカプラン・マイヤープロット。この結果は、盲検化かつ独立した外部の妥当性検証研究によるものであった。
【００４３】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜Ｅ：解析前データセットおよび解析データセット。（Ａ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３ＡおよびＰｌｕｓ２．０マイクロアレイを比較したアッセイ間の再現性。（Ｂ）細胞診（掻爬）および組織試料を比較した試料型間の再現性。（Ｃ）アッセイ内反復試験区および腫瘍内不均一性：同じ摘出検体の３つの異なる肉眼的腫瘍部Ａ、Ｂ、およびＣから組織試料を採り、腫瘍内不均一性を評価した。ケースのサブセットにおいて、５つの異なるレベルで研究室手順を繰り返した。（Ｄ）冷虚血遅延および試料型の影響：外科的除去後の時間遅延を増大させながら、同じ腫瘍の手術検体の組織試料を固定剤中に保管したか、またはスナップ冷凍した。（Ｅ）肝臓および正常組織の汚染：腫瘍試料を正常な乳房組織または肝臓組織と様々な比で混合して、汚染の影響を評価した。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜Ｅ：解析前データセットおよび解析データセット。（Ａ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３ＡおよびＰｌｕｓ２．０マイクロアレイを比較したアッセイ間の再現性。（Ｂ）細胞診（掻爬）および組織試料を比較した試料型間の再現性。（Ｃ）アッセイ内反復試験区および腫瘍内不均一性：同じ摘出検体の３つの異なる肉眼的腫瘍部Ａ、Ｂ、およびＣから組織試料を採り、腫瘍内不均一性を評価した。ケースのサブセットにおいて、５つの異なるレベルで研究室手順を繰り返した。（Ｄ）冷虚血遅延および試料型の影響：外科的除去後の時間遅延を増大させながら、同じ腫瘍の手術検体の組織試料を固定剤中に保管したか、またはスナップ冷凍した。（Ｅ）肝臓および正常組織の汚染：腫瘍試料を正常な乳房組織または肝臓組織と様々な比で混合して、汚染の影響を評価した。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜Ｅ：解析前データセットおよび解析データセット。（Ａ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３ＡおよびＰｌｕｓ２．０マイクロアレイを比較したアッセイ間の再現性。（Ｂ）細胞診（掻爬）および組織試料を比較した試料型間の再現性。（Ｃ）アッセイ内反復試験区および腫瘍内不均一性：同じ摘出検体の３つの異なる肉眼的腫瘍部Ａ、Ｂ、およびＣから組織試料を採り、腫瘍内不均一性を評価した。ケースのサブセットにおいて、５つの異なるレベルで研究室手順を繰り返した。（Ｄ）冷虚血遅延および試料型の影響：外科的除去後の時間遅延を増大させながら、同じ腫瘍の手術検体の組織試料を固定剤中に保管したか、またはスナップ冷凍した。（Ｅ）肝臓および正常組織の汚染：腫瘍試料を正常な乳房組織または肝臓組織と様々な比で混合して、汚染の影響を評価した。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜Ｅ：解析前データセットおよび解析データセット。（Ａ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３ＡおよびＰｌｕｓ２．０マイクロアレイを比較したアッセイ間の再現性。（Ｂ）細胞診（掻爬）および組織試料を比較した試料型間の再現性。（Ｃ）アッセイ内反復試験区および腫瘍内不均一性：同じ摘出検体の３つの異なる肉眼的腫瘍部Ａ、Ｂ、およびＣから組織試料を採り、腫瘍内不均一性を評価した。ケースのサブセットにおいて、５つの異なるレベルで研究室手順を繰り返した。（Ｄ）冷虚血遅延および試料型の影響：外科的除去後の時間遅延を増大させながら、同じ腫瘍の手術検体の組織試料を固定剤中に保管したか、またはスナップ冷凍した。（Ｅ）肝臓および正常組織の汚染：腫瘍試料を正常な乳房組織または肝臓組織と様々な比で混合して、汚染の影響を評価した。
【図１３Ｅ】図１３Ａ〜Ｅ：解析前データセットおよび解析データセット。（Ａ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３ＡおよびＰｌｕｓ２．０マイクロアレイを比較したアッセイ間の再現性。（Ｂ）細胞診（掻爬）および組織試料を比較した試料型間の再現性。（Ｃ）アッセイ内反復試験区および腫瘍内不均一性：同じ摘出検体の３つの異なる肉眼的腫瘍部Ａ、Ｂ、およびＣから組織試料を採り、腫瘍内不均一性を評価した。ケースのサブセットにおいて、５つの異なるレベルで研究室手順を繰り返した。（Ｄ）冷虚血遅延および試料型の影響：外科的除去後の時間遅延を増大させながら、同じ腫瘍の手術検体の組織試料を固定剤中に保管したか、またはスナップ冷凍した。（Ｅ）肝臓および正常組織の汚染：腫瘍試料を正常な乳房組織または肝臓組織と様々な比で混合して、汚染の影響を評価した。
【００４４】
【図１４Ａ】図１４Ａ〜Ｂ：（Ａ）データセット間の様々な重複レベルを例示する概略図。研究ＡおよびＢは、同じケース、組織試料、およびアレイデータを共有する。研究ＩＩＩは研究ＩおよびＩＩと同じケースを共有するが、個別の試料を採り、個別に処理およびプロファイリングした。（Ｂ）異なる解析データセットおよび解析前データセットの、発見データセットの試料および／またはケースとの重複。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜Ｂ：（Ａ）データセット間の様々な重複レベルを例示する概略図。研究ＡおよびＢは、同じケース、組織試料、およびアレイデータを共有する。研究ＩＩＩは研究ＩおよびＩＩと同じケースを共有するが、個別の試料を採り、個別に処理およびプロファイリングした。（Ｂ）異なる解析データセットおよび解析前データセットの、発見データセットの試料および／またはケースとの重複。
【００４５】
【図１５】図１５：一連の技術的および生物学的なフィルタリングステップによる、ＥＳＲ１およびＰＧＲ遺伝子の発現レベルとの最も強く信頼性のある相関性を示した発現レベルを有する遺伝子の選択。
【００４６】
【図１６Ａ】図１６Ａ〜Ｂ：ホルモン受容体陽性発見コホート中のＥＳＲ１およびＰＧＲ関連遺伝子（Ａ）ならびに発見コホートのホルモン受容体陽性ＨＥＲ２陰性サブセット中の参照遺伝子（Ｂ）の分布。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜Ｂ：ホルモン受容体陽性発見コホート中のＥＳＲ１およびＰＧＲ関連遺伝子（Ａ）ならびに発見コホートのホルモン受容体陽性ＨＥＲ２陰性サブセット中の参照遺伝子（Ｂ）の分布。
【００４７】
【図１７Ａ】図１７Ａ〜Ｂ：（Ａ）発見データセット中の標的および参照遺伝子の分布。変動の差を例示するために、標的遺伝子の和が参照遺伝子の和に対してプロットされている。（Ｂ）１７５のさらなるホルモン受容体陰性ケースを使用し、スコアを直線的にスケーリングして、ホルモン受容体陰性腫瘍に負の値を割り当てた。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜Ｂ：（Ａ）発見データセット中の標的および参照遺伝子の分布。変動の差を例示するために、標的遺伝子の和が参照遺伝子の和に対してプロットされている。（Ｂ）１７５のさらなるホルモン受容体陰性ケースを使用し、スコアを直線的にスケーリングして、ホルモン受容体陰性腫瘍に負の値を割り当てた。
【００４８】
【図１８】図１８：ＦＦＰＥおよびＱｕａｎｔｉｇｅｎｅプラットフォームを用い、かつ異なる作業者で異なるロットの試薬を使用した、経時的なＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定の再現性。５つの異なる試料のＦＦＰＥ切片を２０週間にわたり週１回アッセイした。２名の異なる作業者（青色および緑色のデータ点により示される）がアッセイを行った。
【００４９】
【図１９】図１９：ＦＦＰＥおよびＱｕａｎｔｉｇｅｎｅプラットフォームを用いたＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定の品質管理閾値の決定。５つの原発性乳がんから、ＦＦＰＥ組織から得られたＲＮＡの限界希釈物（１２５ｎｇ〜１．９５ｎｇ）をアッセイした。これらの測定値を、Ｕ１３３Ａマイクロアレイでプロファイリングした新鮮／冷凍ＲＮＡを使用して測定したＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数値と比較した。Ｕ１３３Ａ測定値からのＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定値の絶対的な逸脱が、参照遺伝子値の中央値に対して示されており、品質査定の合格または不合格としては参照遺伝子値の中央値に対し、＞４．０のカットオフが最適であると決定された。
【００５０】
【図２０Ａ】図２０Ａ〜Ｂ：転移性乳がん患者における（Ａ）診断時のステージによるＳＥＴＥＲ／ＰＲ、および（Ｂ）生検した再発事象数によるＳＥＴＥＲ／ＰＲ。
【図２０Ｂ】図２０Ａ〜Ｂ：転移性乳がん患者における（Ａ）診断時のステージによるＳＥＴＥＲ／ＰＲ、および（Ｂ）生検した再発事象数によるＳＥＴＥＲ／ＰＲ。
【００５１】
【図２１Ａ】図２１Ａ〜Ｃ：ＳＥＴＥＲ／ＰＲならびに臨床的および病理学的な腫瘍特徴。（Ａ）プロトコール生検のための転移性乳がんの部位、（Ｂ）免疫組織化学的検査によるＰＧＲステータス、および（Ｃ）内分泌処置に対する以前の感受性。
【図２１Ｂ】図２１Ａ〜Ｃ：ＳＥＴＥＲ／ＰＲならびに臨床的および病理学的な腫瘍特徴。（Ａ）プロトコール生検のための転移性乳がんの部位、（Ｂ）免疫組織化学的検査によるＰＧＲステータス、および（Ｃ）内分泌処置に対する以前の感受性。
【図２１Ｃ】図２１Ａ〜Ｃ：ＳＥＴＥＲ／ＰＲならびに臨床的および病理学的な腫瘍特徴。（Ａ）プロトコール生検のための転移性乳がんの部位、（Ｂ）免疫組織化学的検査によるＰＧＲステータス、および（Ｃ）内分泌処置に対する以前の感受性。
【００５２】
【図２２−１】図２２：本発明者らの標的化ＲＮＡシーケンシングＲＤ法を使用して測定した、同じ患者から得た末梢血試料の血漿エキソソームおよび肝転移物のＦＦＰＥ腫瘍生検中に由来するＲＮＡのＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数において使用した転写物の発現レベル。
【図２２−２】図２２：本発明者らの標的化ＲＮＡシーケンシングＲＤ法を使用して測定した、同じ患者から得た末梢血試料の血漿エキソソームおよび肝転移物のＦＦＰＥ腫瘍生検中に由来するＲＮＡのＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数において使用した転写物の発現レベル。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
例示の実施形態の説明
乳がん療法の過程は、症候性疾患負荷またはより急速な進行性疾患のために化学療法への切り替えが好ましい場合を除き（Giordanoら、２０１４年；Cardosoら、２０１４年；Beslijaら、２００７年）、一続きの利用可能な内分泌処置に従うことに通常は依拠する（Barriosら、２０１２年；Dodwellら、２００６年）。しかしながら、処置選択肢の選択がさらなる内分泌処置、化学療法処置、および他の分子標的アプローチを含むよう拡大し続けているため、この処置方策では、繊細な臨床判断がますます要求される。したがって、本開示は、本明細書ではＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数と称される、内分泌療法に対する腫瘍の感受性の指数を提供することにより、現在の技術に関連する課題を克服する。
【００５４】
ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、表５に開示されるような、エストロゲン受容体（ＥＲ）遺伝子（ＥＳＲ１）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）遺伝子（ＰＧＲ）の両方に関連する遺伝子の組合せの発現レベルを使用して計算される。一部の実施形態では、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、内分泌療法単独または他の療法との組合せに対する、乳がん、特に転移性乳がんの感受性を予測するために使用される。したがって、さらなる実施形態は、内分泌療法に対して感受性であることがＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を使用して識別された乳がんを、内分泌療法を患者に施行することによって処置する方法を含む。
【００５５】
ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、臨床情報、処置情報、および生存情報のアノテーションを行ったホルモン受容体陽性乳がん転移物の針生検試料の前向きコホート（ＲＮＡ保存料中で保管してからＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａ遺伝子発現アレイを使用してプロファイリングした）を使用し、妥当性を検証した。本明細書において提供される技術的にロバストなカスタマイズされたアッセイを開発するために、さらなる実験を行って、腫瘍内不均一性、技術的反復、様々なマイクロアレイプラットフォーム、および様々な種類の腫瘍生検の影響下における遺伝子発現測定の再現性を推定した。
【００５６】
Ｉ．  定義
本明細書で使用される場合、規定の構成成分に関する「本質的に含まない」とは、本明細書では、規定の構成成分のうちのいずれも、組成物中に意図的に製剤化されていないこと、および／または単に汚染物としてもしくは微量で存在することを意味するように使用される。したがって、組成物の任意の意図されない汚染に起因する規定の構成成分の総量は、０．０５％を優に下回り、好ましくは０．０１％を下回る。標準的な解析法を用いて規定の構成成分の量が全く検出され得ない組成物が最も好ましい。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は１つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉と併せて使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」という言葉は、１つまたは１つよりも多くを意味し得る。
【００５８】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すことが明示的に示されている場合または代替物が相互排他的である場合を除いて「および／または」を意味するように使用されるが、本開示は、代替物のみと「および／または」とを指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２またはそれよりも多くを意味し得る。
【００５９】
本願全体を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために用いられるデバイスや方法に特有の誤差の変動、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００６０】
「処置」および「処置すること」とは、疾患または健康に関連する状態の治療利益を得る目的で、対象に治療剤を投与もしくは適用すること、または対象に手順もしくはモダリティを行うことを指す。例えば、処置は、ホルモン療法の施行を含み得る。
【００６１】
「対象」および「患者」は、ヒトまたは非ヒトのいずれか、例えば霊長類、哺乳動物、および脊椎動物を指す。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００６２】
本願全体を通して使用される「治療利益」または「治療上有効な」という用語は、この状態の医療処置に関する対象の健康状態を促進または増進するもの全てを指す。これは、疾患の徴候または症状の頻度または重症度の低減を含むが、これに限定されない。例えば、がんの処置は、例えば、腫瘍のサイズの低減、腫瘍の浸潤性の低減、がんの増殖速度の低減、または転移の防止を伴い得る。がんの処置は、がんを患う対象の生存期間の延長を指す場合もある。
【００６３】
「予後判定」とは、患者がどのように進行するか、そして回復の見込みがあるかどうかの予測を指す。「がん予後判定」とは、概して、がんの考えられる過程または転帰の予見または予測を指す。本明細書で使用される場合、がん予後判定は、次の、がんに罹りやすいかもしくはがんと診断された患者の生存の持続期間、無再発生存の持続期間、がんに罹りやすいかもしくはがんと診断された患者の無増悪生存の持続期間、がんに罹りやすいかもしくはがんと診断された患者群における奏効率、がんに罹りやすいかもしくはがんと診断された患者もしくは患者群における応答の持続期間、ならびに／または、がんに罹りやすいかもしくはがんと診断された患者における転移および／もしくはがんの進行の尤度のうちの、いずれか１つまたは複数の予見または予測を含む。予後判定は、従来のがん療法などのがん処置後の好ましい生存期間の予測も含む。
【００６４】
「抗がん」剤は、例えば、がん細胞の殺傷を促進すること、がん細胞のアポトーシスを誘導すること、がん細胞の増殖速度を低減すること、転移の発生率もしくは数を低減すること、腫瘍サイズを低減すること、腫瘍増殖を阻害すること、腫瘍もしくはがん細胞への血液供給を低減すること、がん細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進すること、がんの進行を防止もしくは阻害すること、またはがんを患う対象の寿命を延ばすことにより、対象においてがん細胞／腫瘍に負の影響を与えることができる。
【００６５】
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、鋳型依存性プロセスにおいて新生核酸の合成のプライミングを行うことができるあらゆる核酸を包含するよう意図される。典型的にプライマーは１０個から２０個および／または３０個の塩基対の長さのオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を用いてもよい。プライマーは二本鎖および／または一本鎖の形態で用意され得るが、一本鎖形態が好ましい。
【００６６】
本明細書において「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および所望の生物学的活性を呈する限りは抗体断片を明確にカバーする。
【００６７】
「薬学的または薬理学的に許容される」という句は、適切な場合はヒトなどの動物に投与されたときに有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。本開示を踏まえた当業者には、抗体またはさらなる活性成分を含む医薬組成物の調製が認知されよう。さらに、動物（例えばヒト）への投与の場合、調製物がＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓにより要求される無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の基準を満たすべきであることは理解されよう。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、当業者には認知されるであろうが、ありとあらゆる水性溶媒（例えば水、アルコール／水溶液、食塩水溶液、非経口ビヒクル、例えば塩化ナトリウム、リンゲルデキストロースなど）、非水性溶媒（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチル）、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存料（例えば抗菌または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、色素、流体および栄養素補給剤、かかる同様の材料およびそれらの組合せを含む。医薬組成物中の種々の構成成分のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメータに従って調整される。
【００６９】
「単位用量」または「投与量」という用語は、対象において使用するのに好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち適切なルートおよび処置レジメンとの関連で上記の所望の応答をもたらすように計算された所定分量の治療用組成物を含む。処置の数および単位用量の両方に従って投与される分量は、所望される効果に依存する。患者または対象に投与される本実施形態の組成物の実際の投与量は、対象の体重、年齢、健康、および性別、処置される疾患の種類、疾患侵入の範囲、過去のまたは併行する治療介入、患者の特発性、投与ルート、ならびに特定の治療用物質の力価、安定性、および毒性など、物理的および生理学的な要因によって決定され得る。例えば、ある用量は、投与１回当たり約１μｇ／ｋｇ／体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重（このような範囲は介在する用量を含む）またはそれよりも多く、およびその中で導き出せる任意の範囲を含むこともできる。本明細書に列記される数から導き出せる範囲の非限定的な例において、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５μｇ／ｋｇ／体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ／体重などの範囲を投与することができる。いかなる場合も、組成物中の活性成分の濃度および個々の対象に適切な用量は、投与を担当する施術者が決定する。
【００７０】
「免疫チェックポイント」という用語は、免疫反応の平衡を保つためにその構成成分に阻害シグナルを供給する免疫系におけるタンパク質などの分子を指す。公知の免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１ならびにそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２、加えてＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３、ＫＩＲを含む。ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３、およびＫＩＲが関与する経路は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１依存性経路と同様の免疫チェックポイント経路を構成することが当技術分野では認識されている（例えば、Pardoll、２０１２年；Mellmanら、２０１１年を参照されたい）。
【００７１】
「免疫チェックポイント阻害薬」とは、免疫チェックポイントタンパク質の機能を阻害するあらゆる化合物を指す。阻害は、機能の低減および完全な遮断を含む。特に、免疫チェックポイントタンパク質は、ヒト免疫チェックポイントタンパク質である。したがって、免疫チェックポイントタンパク質阻害薬は特に、ヒト免疫チェックポイントタンパク質の阻害薬である。
【００７２】
「ホルモン」および「内分泌」療法または処置という用語は本明細書では交換可能に使用され、特異的なホルモン（例えばエストロゲン）を産生する身体の能力を遮断するか、またはホルモン作用に干渉する薬剤を指す。
【００７３】
本明細書で使用される「発現レベルを決定すること」という用語は、遺伝子（単数または複数）の量、例えばｍＲＮＡの量を、定量的に、半定量的に、または定性的に確認または測定するために、プローブ、プライマー、もしくは抗体などの遺伝子特異的試薬および／または方法を、試料、例えば対象の試料および／または対照試料に適用することを意味する。例えば、遺伝子のレベルは、例えば、バイオマーカー検出剤、例えば抗体、例えば標識抗体がバイオマーカーに特異的に結合し、例えばポリペプチドバイオマーカーの量の相対的または絶対的な確認を可能にする、例えば免疫組織化学的検査、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降などを含むイムノアッセイや、例えばマイクロアレイ解析、定量的ＲＴ−ＰＣＲなどのＲＴ−ＰＣＲ、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）、ノーザンブロット、デジタル分子バーコード技術、例えばＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ：ｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）解析、およびＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲアッセイを含む、例えばプローブベースおよび増幅ベースの方法を含む、プローブまたはプライマーもしくはプライマーセットを使用して核酸バイオマーカーの量を確認する、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲプロトコールを含むいくつかの方法によって決定することができる。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料または細胞におけるｍＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの、ｍＲＮＡ検出および数量化の他の方法を適用してもよい。この技術は現在、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）ＶｉｅｗＲＮＡ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって提供されており、これは、増幅系に特異的に結合してハイブリダイゼーションシグナルを増幅するプローブセットを各ｍＲＮＡに使用する；これらの増幅されたシグナルは、標準的な蛍光顕微鏡または撮像系を使用して可視化することができる。例えばこの系は、例えば同じ組織切片中に存在する正常および腫瘍細胞を試料が有する場合、不均一試料中の転写物レベルを検出および測定することができる。言及したように、組織試料中の遺伝子発現レベルを測定するために、および例えばＦＦＰＥ試料中のｍＲＮＡレベルを測定するために、ＴａｑＭａｎプローブベースの遺伝子発現解析（ＰＣＲベース）を使用することもできる。手短に述べると、ＴａｑＭａｎプローブベースのアッセイは、ｍＲＮＡ標的と特異的にハイブリダイズするプローブを利用する。このプローブは、各末端に結合したクエンチャー色素およびレポーター色素（蛍光分子）を含み、ｍＲＮＡ標的との特異的なハイブリダイゼーションが起こったときにのみ蛍光が発せられる。増幅ステップ中、ポリメラーゼ酵素のエキソヌクレアーゼ活性がクエンチャーおよびレポーター色素をプローブから脱離させ、蛍光発光が生じ得る。検出系によってこの蛍光発光が記録され、シグナルが測定される；これらのシグナル強度を使用して、試料中の所与の転写物の存在量（遺伝子発現）を計算する。
【００７４】
本明細書で使用される「試料」という用語は、患者から得られたあらゆる生物学的検体を含む。試料としては、限定されないが、全血、血漿、血清、赤血球、白血球（例えば末梢血単核細胞）、乳管洗浄液、乳頭吸引液、リンパ（例えばリンパ節の播種性腫瘍細胞）、骨髄穿刺液、唾液、尿、便（すなわち糞便）、痰、気管支肺胞洗浄液、涙、細針吸引液（例えば、腫瘍などの標的を対象とした、または乳輪周囲などの正常細胞のランダムサンプリングである、細針吸引により採取したもの）、任意の他の体液、組織試料（例えば腫瘍組織）、例えば腫瘍の生検（例えば針生検）またはリンパ節の生検（例えばセンチネルリンパ節生検）、およびそれらの細胞抽出物が挙げられる。一部の実施形態では、試料は、全血またはその分画構成成分、例えば血漿、血清、または細胞ペレットである。一部の実施形態では、試料は、例えば乳房の固形腫瘍由来のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍組織試料である。
【００７５】
「生検」とは、診断または予後判定の評価のために組織試料を取り出すプロセス、および組織検体そのものを指す。本発明の方法および組成物には、当技術分野で公知の任意の生検技術を適用することができる。適用される生検技術は一般に、数ある要因の中でも特に、評価される組織型ならびに腫瘍のサイズおよび種類（すなわち、固形または懸濁液（すなわち血液または腹水））に依存する。代表的な生検技術としては、摘除生検、切開生検、針生検（例えば、コア針生検、細針吸引生検など）、外科的生検、および骨髄生検が挙げられる。生検技術は例えば、Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine、Kasperら編、第１６版、２００５年、第７０章、および第Ｖ部全体において論じられている。当業者であれば、所与の組織試料中のがん性および／または前がん性細胞を識別するために生検技術が行われ得ることを察知するであろう。
【００７６】
ＩＩ．  ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数
本開示の諸実施形態は、本明細書ではＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数と称される、内分泌療法に対する腫瘍の感受性の指数を提供する。ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、表５に開示されるような、ＳＬＣ３９Ａ６、ＳＴＣ２、ＣＡ１２、ＥＳＲ１、ＰＤＺＫ１、ＮＰＹ１Ｒ、ＣＤ２、ＭＡＰＴ、ＱＤＰＲ、ＡＺＧＰ１、ＡＢＡＴ、ＡＤＣＹ１、ＣＤ３Ｄ、ＮＡＴ１、ＭＲＰＳ３０、ＤＮＡＪＣ１２、ＳＣＵＢＥ２、およびＫＣＮＥ４を含む、エストロゲン受容体（ＥＲ）およびプロゲステロン受容体（ＰＲ）の両方に関連する遺伝子の組合せの発現レベルを使用して計算される。一部の態様では、表５中の遺伝子のうちの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８種が、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を決定するために使用される。ＥＲおよびＰＲ関連遺伝子は、表５に開示されるような、ＬＤＨＡ、ＡＴＰ５Ｊ２、ＶＤＡＣ２、ＤＡＲＳ、ＵＣＰ２、ＵＢＥ２Ｚ、ＡＫ２、ＷＩＰＦ２、ＡＰＰＢＰ２、およびＴＲＩＭ２を含む、参照遺伝子に対して正規化され得る。一部の態様では、ＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の発現を正規化するために、表５に開示される参照遺伝子のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、または１０種が使用される。
【００７７】
一部の態様では、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、
【数１】
2019514930.tif 000003
（式中、Ｔｉは、１８種の標的遺伝子のうちｉ番目の発現であり、Ｒｊは、１０種の参照遺伝子のうちｊ番目の発現である）のように計算される。０のスコア値における免疫組織化学的検査によるホルモン受容体陽性および陰性ケースへの分離を最適化するために、定数が加算される。
【００７８】
Ａ．  ＲＮＡの単離
本開示の諸態様は、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を決定するのに使用するための患者試料からのＲＮＡの単離に関する。患者試料は、血液、唾液、尿、または組織生検であり得る。組織生検は、瞬間冷凍された（例えば液体窒素で）、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された、かつ／またはＲＮＡ安定化剤（例えばＲＮＡｌａｔｅｒ）によって保存された腫瘍生検であり得る。一部の態様では、単離は必要ではなく、アッセイは、組織試料のホモジネート中からＲＮＡを直接利用する。ある特定の態様では、ＦＦＰＥ腫瘍試料のホモジネートは酵素消化される。
【００７９】
ＲＮＡは、当業者に周知の技術を使用して単離され得る。諸方法は、特定のＲＮＡ集団を単離するためのプロセスを実施する前に細胞をカオトロピック（例えばグアニジニウムイソチオシアネート）および／または洗剤（例えばＮ−ラウロイルサルコシン）で溶解するステップを一般に伴う。クロマトグラフィーは、核酸をタンパク質または他の核酸から分離または単離するために使用されることが多いプロセスである。このような方法は、ゲルマトリックスを用いた電気泳動、フィルターカラム、コーティングされた磁性ビーズ、アルコール沈殿、および／または他のクロマトグラフィーを伴い得る。
【００８０】
Ｂ．  発現の査定
ある特定の態様では、本開示の方法は、乳がんを患う対象に由来する試料中のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子ならびに１つまたは複数の参照遺伝子の発現を測定するステップに関する。発現情報は、研究室、技師、デバイス、または臨床医によりがん試料を試験することによって得ることができる。ある特定の実施形態では、表５のものを含む１つまたは複数の遺伝子の差次的発現が測定され得る。
【００８１】
遺伝子の発現レベルは、当技術分野で公知の任意の好適な手段を使用して検出することができる。例えば、遺伝子発現の検出は、核酸増幅法（例えばＲＴ−ＰＣＲ、ドロップレットベースのＲＴ増幅、ＲＮＡ配列ライブラリのエクソン捕捉、次世代ＲＮＡシーケンシング）、アレイ解析（例えばマイクロアレイ解析）、またはハイブリダイゼーション法（例えばリボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ビーズベースのアッセイ、またはＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ（登録商標））を使用し、核酸分子（例えばＲＮＡ）を検出することによって達成することができる。遺伝子発現の検出は、イムノアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡアッセイ、またはタンパク質アレイ）を含む、遺伝子によりコードされるタンパク質を検出するアッセイを使用して達成することもできる。
【００８２】
次に、各がん試料における発現のパターンまたはシグネチャを使用することで、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を使用したがん生存期間または再発の予測などの、がん予後判定または分類を行うことができる。ＥＲおよびＰＲ関連遺伝子のうちの１つまたは複数の発現は、がん患者、とりわけ乳がん患者のための予後の予測もしくは報告または処置選択肢の処方を行うために査定され得る。
【００８３】
１つまたは複数のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の発現は、当技術分野で周知である多様な技術によって測定することができる。ある遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のレベルの数量化は、その遺伝子の発現を測定するために使用され得る。代替的に、ＥＲおよびＰＲ関連遺伝子のタンパク質産物のレベルの数量化を、遺伝子の発現を測定するために行ってもよい。以下に論じられる方法に関するさらなる情報は、Ausubelら、（２００３年）Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  &amp;  Sons、New  York、NY、またはSambrookら（１９８９年）Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Press、Cold  Spring  Harbor、NYに見出すことができる。目的のｍＲＮＡまたはタンパク質の検出を最適化するためにはどのパラメータを操作すればよいかは、当業者には認知されよう。
【００８４】
複数のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の差次的発現を数量化するためには、核酸マイクロアレイが使用され得る。マイクロアレイ解析は、市販の機器を製造元のプロトコールに従って使用して、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）技術（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）またはｌｎｃｙｔｅ（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）のＭｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用することによって行うことができる。典型的には、一本鎖核酸（例えばｃＤＮＡまたはオリゴヌクレオチド）をマイクロチップ基板上に播くか、または並べる。並べた配列を次に、目的の細胞に由来する特異的核酸プローブとハイブリダイズさせる。目的の細胞から抽出されたＲＮＡの逆転写による蛍光標識デオキシヌクレオチドの組み込みによって、蛍光標識ｃＤＮＡプローブが生成され得る。代替的に、ＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により増幅し、ビオチンなどのマーカーで標識してもよい。標識したプローブを次に、高度にストリンジェントな条件下でマイクロチップ上に固定化された核酸とハイブリダイズさせる。非特異的に結合したプローブを除去するためにストリンジェントな洗浄を行った後、共焦点レーザー顕微鏡法またはＣＣＤカメラなどの別の検出法によってチップを走査する。一般には、ハイブリダイゼーションファイル中の蛍光強度の生データをロバストな統計的正規化アルゴリズムで前処理して、発現値を生成する。
【００８５】
複数のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の差次的発現を測定するためには、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用することもできる。ｑＲＴ−ＰＣＲでは一般に、ＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに逆転写し、これを次にＰＣＲ反応によって増幅する。ＰＣＲ産物の量をサイクル毎にリアルタイムで追跡することで、ｍＲＮＡの初期濃度の決定が可能になる。ＰＣＲ産物の量を測定するために、二本鎖ＤＮＡに結合するＳＹＢＲグリーンなどの蛍光色素の存在下で反応を行ってもよい。反応は、増幅されるＤＮＡに特異的な蛍光レポータープローブを用いて行うこともできる。
【００８６】
例えば、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡ）を製造元の説明に従って使用して、抽出されたＲＮＡを逆転写することができる。一部の実施形態では、遺伝子発現レベルは、溶液中のｍＲＮＡを測定する遺伝子発現解析技術を使用して決定され得る。遺伝子発現を検出する方法は例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第ＵＳ２０１４０３５７６６０号および同第ＵＳ２０１３０２５９８５８号に記述されている。そのような遺伝子発現解析技術の例としては、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（商標）、ＲＴ−ＰＣＲ、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ（登録商標）、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）、ｇＮＰＡ（登録商標）、ＨＴＧ（登録商標）、マイクロアレイ、およびシーケンシングが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇの方法は、個々の標的分子に結合することができる、標識「ナノレポーター」と称される標識レポーター分子を使用する。ナノレポーターの標識コードを通じて、標的分子へのナノレポーターの結合によって標的分子が識別される。Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇの方法は、米国特許第７，４７３，７６７号に記述されている（Geissら、２００８年も参照されたい）。諸方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５３５，８８９号に記述されているようなＲａｉｎＤａｎｃｅドロップレット増幅法を含み得る。シーケンシングは、次世代シーケンシングのためのタグ付きライブラリを生成した後のＩｌｌｕｍｉｎａ標的化シーケンシングなどの、エクソン捕捉を含み得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第ＷＯ２０１３１３１９６２号に記述されている）。
【００８７】
蛍光レポータープローブの非限定的な一例は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）である。蛍光レポータープローブは、ＰＣＲ伸長サイクル中にクエンチャーが除去されると蛍光を発する。マルチプレックスｑＲＴ−ＰＣＲは、それぞれが異なるフルオロフォアを含む複数の遺伝子特異的レポータープローブを使用することによって行われ得る。蛍光値は各サイクル中に記録され、増幅反応中のその点までに増幅した産物の量を表す。誤差を最小限に抑え、任意の試料間の変動を低減するために、ｑＲＴ−ＰＣＲは典型的には参照標準を使用して行われる。理想的な参照標準は、様々な組織間で一定のレベルにおいて発現し、実験処置による影響を受けない。この系は、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、およびコンピュータを含み得る。この系は、サーモサイクラーで９６ウェルフォーマットにて試料を増幅する。増幅中、９６ウェル全てで光学繊維ケーブルを介してレーザー誘導蛍光シグナルをリアルタイムで収集し、ＣＣＤで検出する。この系は、計器を運転し、データを解析するためのソフトウェアを含む。
【００８８】
誤差および試料間の変動の影響を最小限に抑えるために、内部標準を使用してＲＴ−ＰＣＲを行ってもよい。理想的な内部標準は、様々な組織間で一定のレベルにおいて発現し、実験処置による影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正規化するために一般的に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨ、β−アクチン、および１８ＳリボソームＲＮＡのｍＲＮＡである。
【００８９】
ＲＴ−ＰＣＲのバリエーションは、二重標識蛍光発生プローブ（例えばＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ）によりＰＣＲ産物の蓄積を測定するリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲである。リアルタイムＰＣＲは、各標的配列に対して内部競合物を正規化のために使用する定量的競合ＰＣＲと、試料中に含まれる正規化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する定量的競合ＰＣＲとの両方と適合性がある（Heidら、１９９６年を参照されたい）。定量的ＰＣＲは米国特許第５，５３８，８４８号にも記述されている。関連するプローブおよび定量的増幅手順は、米国特許第５，７１６，７８４号および米国特許第５，７２３，５９１号に記述されている。マイクロタイタープレートにて定量的ＰＣＲを実行するための計器は、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手可能である。
【００９０】
ＲＮＡ源として固定されたパラフィン包埋組織を使用して遺伝子発現レベルを定量化するための代表的なプロトコールのステップは、ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長、および増幅を含め、公開されている種々の雑誌論文に記載されている（Godfreyら、２０００年；Spechtら、２００１年を参照されたい）。簡潔に述べると、代表的なプロセスは、パラフィン包埋された新生物組織試料または隣接した非がん性組織の約１０μｍ厚の切片を切り取ることから始まる。次にＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを取り出す。代替的には、新生物試料または他の組織試料からＲＮＡを直接単離する。ＲＮＡ濃度の解析後、ＲＮＡ修復および／または増幅ステップを必要であれば含んでもよく、遺伝子特異的プライマーを使用してＲＮＡを逆転写し、続いて、タグ付きＲＮＡシーケンシングライブラリの調製、およびペアエンドシーケンシングを行う。別の例では、ＲＮＡは逆転写せず、特異的な鋳型と直接ハイブリダイズさせ、次にオリゴヌクレオチドおよび／または化学もしくは蛍光色で標識して、レーザーにより検出および計数する。
【００９１】
複数のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の差次的発現を測定するためには、免疫組織化学染色を使用することもできる。この方法では、組織切片の細胞内のタンパク質の局在化が、特異的な抗体とのタンパク質の相互作用によって可能になる。このためには、組織をホルムアルデヒドまたは別の好適な固定剤で固定し、ワックスまたはプラスチックに包埋し、ミクロトームを使用して薄い切片（約０．１ｍｍ〜数ｍｍ厚）に切り分けてもよい。代替的には、クライオスタットを使用して組織を冷凍し、薄い切片に切り分けてもよい。組織の切片を固体表面に並べて付着させてもよい（すなわち、組織マイクロアレイ）。組織の切片を目的の抗原に対する一次抗体と共にインキュベートし、続いて洗浄することで未結合の抗体を除去する。一次抗体を検出系と共役させてもよいし、または検出系と共役した二次抗体を用いて一次抗体を検出してもよい。検出系は、フルオロフォアであってもよいし、または、基質を比色産物、蛍光産物、もしくは化学発光産物に転換することができる、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素であってもよい。染色された組織切片は一般に顕微鏡下で走査される。がんを患う対象に由来する組織試料は不均一であり得るため、すなわち、一部の細胞は正常であり得、他の細胞はがん性であり得るため、組織内の陽性染色細胞の百分率を決定することができる。この測定は、染色の強度の数量化と併せて、バイオマーカーの発現値を生成するために使用され得る。
【００９２】
複数のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の差次的発現を測定するためには、酵素結合免疫吸着アッセイ、すなわちＥＬＩＳＡを使用してもよい。ＥＬＩＳＡアッセイには多くのバリエーションがある。全てが、固体表面、一般にはマイクロタイタープレート上に抗原または抗体を固定化することに基づく。元になるＥＬＩＳＡ法は、目的のバイオマーカータンパク質を含む試料を調製するステップと、マイクロタイタープレートのウェルを試料でコーティングするステップと、特異的な抗原を認識する一次抗体と共に各ウェルをインキュベートするステップと、未結合の抗体を洗い落とすステップと、次に抗体−抗原複合体を検出するステップとを含む。抗体−抗体複合体は、直接的に検出することができる。このためには、検出可能な産物を産生する酵素などの検出系と一次抗体をコンジュゲートする。抗体−抗体複合体は、間接的に検出してもよい。このためには、上述の検出系とコンジュゲートした二次抗体によって一次抗体を検出する。次にマイクロタイタープレートを走査し、当技術分野で公知の手段を使用して強度の生データを発現値に変換することができる。
【００９３】
複数のＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の差次的発現を測定するためには、抗体マイクロアレイを使用することもできる。このためには、マイクロアレイまたはバイオチップの表面に複数の抗体を並べ、共有結合させる。一般に、目的のバイオマーカータンパク質を含むタンパク質抽出物を蛍光色素で標識する。
【００９４】
標識されたＥＲおよびＰＲ関連遺伝子タンパク質は、抗体マイクロアレイと共にインキュベートされ得る。洗浄して未結合のタンパク質を除去した後、マイクロアレイを走査する。蛍光強度の生データは、当技術分野で公知の手段を使用して発現値に転換することができる。
【００９５】
複数のバイオマーカーの差次的発現を測定するためには、Ｌｕｍｉｎｅｘマルチプレキシングマイクロスフェアを使用することもできる。これらの微視的なポリスチレンビーズは、各ビーズが固有のスペクトルシグネチャ（これは最大で１００種存在する）を有するように、蛍光色素で内部が色分けされている。同じシグネチャを有するビーズは、目的の標的に結合する特異的なオリゴヌクレオチドまたは特異的な抗体（すなわち、それぞれバイオマーカーｍＲＮＡまたはタンパク質）でタグ付けされる。標的も同様に蛍光レポーターでタグ付けされる。よって、一方はビーズ由来、他方は標的のレポーター分子由来の、２つの色供給源が存在する。これらのビーズは次に、標的を含む試料と共にインキュベートされ、これは１つのウェル中で最大１００個まで検出され得る。ビーズの小さなサイズ／表面積および標的に対するビーズの三次元曝露により、結合反応中のほぼ溶液相の動態が可能になる。捕捉された標的は、各ビーズを識別する内部色素、およびまたアッセイ中に捕捉されたあらゆるレポーター色素をレーザーが励起する、フローサイトメトリに基づく先端技術の流体工学によって検出される。獲得ファイルのデータは、当技術分野で公知の手段を使用して発現値に転換することができる。
【００９６】
複数のバイオマーカーの差次的発現を測定するためには、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用することもできる。この方法は、組織切片の細胞における目的のｍＲＮＡの局在化を可能にする。この方法では、組織を冷凍するか、または固定および包埋し、次に薄い切片に切り分けてもよく、これらの切片を固体表面に並べて付着させる。組織切片は、目的のｍＲＮＡとハイブリダイズさせる標識アンチセンスプローブと共にインキュベートされる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄ステップは一般に、高度にストリンジェントな条件下で行われる。別のタンパク質または抗体により検出され得るフルオロフォアまたは小さなタグ（例えばビオチンまたはジゴキシゲニン）でプローブを標識することにより、標識されたハイブリッドが顕微鏡下で検出および可視化され得るようにしてもよい。各アンチセンスプローブが区別可能な標識を有することを条件として、複数のｍＲＮＡを同時に検出することができる。ハイブリダイズされた組織アレイは一般に顕微鏡下で走査される。がんを患う対象の組織試料は不均一であり得るため、すなわち、一部の細胞は正常であり得、他の細胞はがん性であり得るため、組織内の陽性染色細胞の百分率を決定することができる。この測定は、染色の強度の数量化と併せて、各バイオマーカーの発現値を生成するために使用され得る。
【００９７】
Ｃ．  ＥＳＲ１変異
エストロゲン受容体遺伝子ＥＳＲ１の活性化変異は、乳がん療法において獲得された内分泌抵抗性の肝要な機構である。したがって、本発明の一部の態様は、変異ＥＳＲ１の発現に関する変数を含めることにより、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数をさらに精緻化する。変異型のＥＳＲ１を発現する転写物の存在は、活性化変異が濃縮されている領域であることが公知であるＥＳＲ１転写物のリガンド結合ドメイン配列の特異的な部分を増幅する特異的なプライマーによって検出される。変異型のＥＳＲ１を発現する転写物の割合は、試料中で確実に発現され変異を生じにくいＥＳＲ１転写物の領域を検出する異なるプライマーを使用して測定されたＥＳＲ１の発現と比べた変異ＥＳＲ１の発現として計算される。一例において、変異ステータスは、ＳＥＴ指数ステータスとロジスティックに統合される（あり／なしが高／低と組み合わされる）。別の例では、転写物の変異ステータス、変異しているＥＳＲ１転写物の割合、およびＳＥＴ指数値が多変数指数スコアに統合され、スコアの係数は、内分泌療法後の予後判定の多変数Ｃｏｘ回帰モデルに基づく。
【００９８】
ＥＳＲ１の変異は当技術分野で公知である。例えば、ｐ．Ｌｅｕ５３６Ｇｌｎ、ｐ．Ｔｙｒ５３７Ｓｅｒ、ｐ．Ｔｙｒ５３７Ｃｙｓ、ｐ．Ｔｙｒ５３７Ａｓｎ、およびｐ．Ａｓｐ５３８Ｇｌｙをコードする識別された５つのＥＳＲ１変異は、構成的活性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗エストロゲン療法に対する持続的な応答性をもたらすことが示された（Robinsonら、２０１３年）。他のＥＳＲ１変異は、Ｓ４６３Ｐ、Ｖ５３４Ｅ、Ｐ５３５Ｈ、Ｌ５３６Ｑ、Ｌ５３６Ｒ、Ｙ５３７Ｃ、Ｙ５３７Ｓ、Ｙ５３７Ｎ、およびＤ５３８Ｇを含む。
【００９９】
ＩＩＩ．  処置方法
本明細書では、内分泌療法に対する感受性であることがＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を使用して決定された個体において乳がんを処置するまたはその進行を遅延させるための方法であって、有効量のホルモン療法を個体に施行するステップを含む方法が提供される。乳がんは、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶの乳がんであり得、特定の態様では、ステージＩＶ乳がんは転移性であり、以前の処置の後に再発したものである。ある特定の態様では、乳がんは、ホルモン受容体陽性（すなわち、エストロゲンホルモンの受容体に対して陽性（ＥＲ陽性がん）および／もしくはプロゲステロンホルモンに対して陽性（ＰＲ陽性がん））であり、かつ／またはＨＥＲ２陰性である。
【０１００】
乳がんのための例示的なホルモン療法は、エストロゲンおよびエストロゲン受容体複合体の活性を阻害する、タモキシフェン、トレミフェン、およびフルベストラントなどのＳＥＲＭ、ＡＩ、およびＳＥＲＤクラスの薬物を含む。他のホルモン療法としては、レトロゾール、アナストロゾール、およびエキセメスタンなどのアロマターゼ阻害薬を含む、エストロゲンレベルを低下させる処置が挙げられる。卵巣を外科的に除去することにより、永久的な卵巣切除が行われる場合がある。この作業は卵巣摘出術と呼ばれる。より多くの場合、卵巣切除は、ゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標））またはリュープロリド（Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標））などの黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）類似体と呼ばれる薬物を用いて行われる。これらの薬物は、エストロゲンを作るために身体が卵巣に送るシグナルを停止させる。これらは、閉経前の女性におけるホルモン療法として、単独で使用することもでき、または他のホルモン薬（タモキシフェン、アロマターゼ阻害薬、フルベストラント）と共に使用することもできる。ホルモン療法の有効性は、異なる生物学的経路を相乗的に阻害するためのさらなる療法、例えばパルボシクリブ（Ｃｄｋ４／６阻害薬）、エベロリムス（ｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ阻害薬）、免疫療法、または他の療法の追加によって増強することもできる。
【０１０１】
一部の実施形態では、個体は、１つまたは複数の抗がん療法に対して抵抗性がある（抵抗性があることが示されている）がんを有する。一部の実施形態では、抗がん療法に対する抵抗性は、がんの再発または難治性がんを含む。再発は、処置後の元の部位または新たな部位におけるがんの再出現を指す場合がある。一部の実施形態では、抗がん療法に対する抵抗性は、抗がん療法による処置中のがんの進行を含む。一部の実施形態では、がんは初期段階であるか、または後期段階である。
【０１０２】
一部の態様では、患者は、過去にホルモン療法および／またはさらなる抗がん療法を施行されたことがある。例えば、患者は、化学療法と組み合わせたホルモン療法を、例えば５年間にわたって施行されたことがあり得る。一部の態様では、患者は、ホルモン療法に対して過去に感受性を示したことがある。
【０１０３】
一部の態様では、ホルモン療法は、少なくとも１つのさらなる抗がん療法と組み合わせて施行される。ホルモン療法は、さらなる抗がん剤よりも前に、その間に、その後に、または種々の組合せで施行されてもよい。施行は、併行から、数分間、数日間、数週間に及ぶ間隔をあけてもよい。ホルモン療法が抗がん剤とは別々に患者に提供される実施形態では、２つの化合物が依然として有利に組み合わさった効果を患者に及ぼすことができるように、各送達時点の間でかなりの期間が過ぎていないことを確実にするのが一般的である。そのような事例では、ホルモン療法および抗がん療法が、互いの約１２〜２４時間または７２時間以内に、より特定すると互いの約６〜１２時間以内に患者に提供され得ることが想定される。一部の状況では、それぞれの施行間で数日（２、３、４、５、６、または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）が経過する場合、処置の期間を著しく延長することが望ましい場合がある。
【０１０４】
ホルモン療法、および任意選択で抗がん剤は、同じ投与ルートまたは異なる投与ルートによって投与されてもよい。一部の実施形態では、ホルモン療法および／または抗がん剤は、静脈内に、筋肉内に、皮下に、局所的に、経口的に、経皮的に、腹腔内に、眼窩内に、植え込みにより、吸入により、くも膜下腔内に、脳室内に、または鼻腔内に投与される。有効量のホルモン療法および／または抗がん剤は、疾患の防止または処置のために投与されてもよい。ホルモン療法および抗がん剤の適切な投与量は、処置される疾患の種類、疾患の重症度および過程、個体の臨床状態、個体の臨床歴および処置への応答、ならびに担当医の裁量に基づいて決定され得る。
【０１０５】
腫瘍内注射、または腫瘍脈管構造への注射は、別個の接触可能な固形腫瘍に対して具体的に想定される。局所的、領域性、または全身的な投与も適切であり得る。４ｃｍ超の腫瘍に関しては、投与される容量は約４〜１０ｍｌ（特に１０ｍｌ）となり、４ｃｍ未満の腫瘍に関しては、約１〜３ｍｌの容量（特に３ｍｌ）が使用される。単一用量として送達される複数の注射は、約０．１〜約０．５ｍｌ容量を含む。
【０１０６】
Ａ．  医薬組成物
本明細書では、ホルモン療法と、任意選択で、抗がん剤と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物および製剤も提供される。
【０１０７】
本明細書に記述される医薬組成物および製剤は、所望の純度を有する活性成分（例えば抗体またはポリペプチド）を、１つまたは複数の任意選択の薬学的に許容される担体と混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製することができる（Remington's  Pharmaceutical  Sciences、第２２版、２０１２年）。薬学的に許容される担体は、用いられる投与量および濃度においてレシピエントに対して概して無毒であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコール、またはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、間質薬物分散剤、例えば可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）をさらに含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号および同第２００６／０１０４９６８号に記述されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つまたは複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと組み合わせられる。
【０１０８】
Ｂ．  抗がん療法
ある特定の実施形態では、本実施形態の組成物および方法は、少なくともさらなる抗がん剤と順次または組合せでホルモン療法を伴う。さらなる療法は、放射線療法、手術（例えば乳腺腫瘍摘出術および乳房切除術）、化学療法、分子標的阻害薬、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、または前述のものの組合せであり得る。さらなる療法は、アジュバント、ネオアジュバント、または緩和療法の形態であってもよい。
【０１０９】
一部の実施形態では、さらなる療法は、小分子酵素阻害薬または抗転移剤の投与である。一部の実施形態では、さらなる療法は、副作用制限剤（例えば、処置の副作用の発生および／または重症度を減らすことを目的とした薬剤、例えば制吐剤など）の投与である。一部の実施形態では、さらなる療法は、放射線療法である。一部の実施形態では、さらなる療法は、手術である。一部の実施形態では、さらなる療法は、放射線療法および手術の組合せである。一部の実施形態では、さらなる療法は、ガンマ線照射である。一部の実施形態では、さらなる療法は、受容体もしくは受容体キナーゼシグナル伝達分子、サイクリン依存性キナーゼ、または細胞周期を統御するｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ経路を標的とする療法、ＨＳＰ９０阻害薬、チューブリン阻害薬、アポトーシス阻害薬、および／あるいは化学防御剤である。さらなる療法は、当技術分野で公知の化学療法剤のうちの１つまたは複数であってもよい。
【０１１０】
種々の組合せを用いることができる。以下の例では、ホルモン療法は「Ａ」であり、抗がん療法は「Ｂ」である。
A/B/A      B/A/B      B/B/A      A/A/B      A/B/B      B/A/A      A/B/B/B      B/A/B/B
B/B/B/A      B/B/A/B      A/A/B/B      A/B/A/B      A/B/B/A      B/B/A/A
B/A/B/A      B/A/A/B      A/A/A/B      B/A/A/A      A/B/A/A      A/A/B/A
【０１１１】
本実施形態のいずれかの化合物または療法の患者への投与は、薬剤に毒性がある場合はそれを考慮しつつ、かかる化合物の投与に関する一般的なプロトコールに従う。したがって、一部の実施形態では、併用療法に起因し得る毒性をモニタリングするステップがある。
【０１１２】
１．  化学療法
多種多様な化学療法剤を本実施形態に従って使用することができる。「化学療法」という用語は、がんを処置するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」とは、がんの処置において投与される化合物または組成物を含意するように使用される。これらの薬剤または薬物は、細胞内におけるそれらの活性様態、例えば、それらが細胞周期に影響を及ぼすかどうか、およびどの段階で細胞周期に影響を及ぼすかによって分類される。代替的には、薬剤は、ＤＮＡを直接的に架橋する能力、ＤＮＡにインターカレートする能力、または核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体異常および有糸分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けられる場合がある。
【０１１３】
化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド（cyclosphosphamide）；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホラミド（triethiylenethiophosphoramide）、およびトリメチロロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルメラミン（methylamelamines）；アセトゲニン（とりわけブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼルシンおよびビセレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、およびウラシルマスタード；ニトロソウレア（nitrosureas）、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ranimnustine）；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、とりわけカリチアマイシンガンマ１ＩおよびカリチアマイシンオメガＩ１）；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン（authrarnycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン（chromomycinis）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、およびゾルビシン；代謝拮抗薬、例えばメトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキサート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタ���ビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、およびフロクスウリジン；アンドロゲン、例えばカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン；抗副腎剤、例えばミトタンおよびトリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エフロルニチン（elformithine）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（lonidainine）；マイタンシノイド、例えばマイタンシンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール（mopidanmol）；ニトラクリン（nitraerine）；ペントスタチン；フェナメト（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけＴ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えばパクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位複合体、例えばシスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えばＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（difluorometlhylornithine）（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えばレチノイン酸；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリカマイシン（plicomycin）、ゲムシタビン（gemcitabien）、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ（tansferase）阻害薬、トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【０１１４】
２．  照射療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く使用されてきた他の因子としては、γ線、Ｘ線として一般的に公知であるもの、および／または腫瘍細胞への放射性同位元素の指向性送達が挙げられる。マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号および同第４，８７０，２８７号）、およびＵＶ照射など、他の形態のＤＮＡ損傷因子も想定される。これらの因子の全てが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に対する幅広い損傷に影響を及ぼす可能性が高い。Ｘ線の投与量範囲は、長期間（３〜４週間）にわたる５０〜２００レントゲンの一日用量から、２０００〜６０００レントゲンの単回用量まで様々である。放射性同位元素の投与量範囲は多岐にわたり、同位元素の半減期、発せられる放射線の強度および種類、ならびに新生細胞による取り込みに依存する。
【０１１５】
３．  免疫療法
当業者は、さらなる免疫療法が、諸実施形態の方法と組み合わせて、または併せて使用され得ることを理解するであろう。がん処置との関連において、免疫療法薬は一般に、がん細胞を標的とし破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用に依拠する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））がその一例である。免疫エフェクターは例えば、腫瘍細胞表面の何らかのマーカーに対して特異的な抗体であり得る。抗体は、単独で療法のエフェクターとして機能する場合もあれば、細胞殺傷に実際に影響するように他の細胞を動員する場合もある。抗体は、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）とコンジュゲートし、標的化剤として機能することもできる。代替的には、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。
【０１１６】
抗体−薬物コンジュゲートは、がん治療薬の開発のための画期的なアプローチとして出現した。がんは、世界中で主な死亡原因のうちの１つである。抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞殺傷薬と共有結合したモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。このアプローチは、ＭＡｂのその抗原標的に対する高い特異性を高力価の細胞傷害性薬物と組み合わせ、濃縮レベルの抗原を有する腫瘍細胞にペイロード（薬物）を送達する「武装」ＭＡｂをもたらす（Carterら、２００８年；Teicher、２０１４年；Lealら、２０１４年）。薬物の標的化送達はまた、正常組織におけるその曝露を最小限に抑えるため、毒性を減少させ、治療指数を向上させる。ＦＤＡにより、２０１１年にＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）、２０１３年にＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシンまたはＴ−ＤＭ１）の２種のＡＤＣ薬が認可されたことで、このアプローチの妥当性が示された。現在３０種を超えるＡＤＣ薬候補が、がん処置に関する臨床治験の様々な段階にある（Lealら、２０１４年）。抗体工学およびリンカー−ペイロードの最適化がますます成熟するにつれて、新たなＡＤＣの創出および開発は、このアプローチに好適な新たな標的の特定および妥当性検証（Teicher、２００９年）ならびに標的化ＭＡｂの生成にますます依存している。ＡＤＣ標的の２つの基準は、腫瘍細胞における上方制御された／高いレベルの発現、およびロバストな内部移行である。
【０１１７】
免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的化に適した、すなわち他の細胞の大半に存在しない、何らかのマーカーを有していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、それらのうちのいずれも、本実施形態との関連における標的化に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、癌胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂＢ、およびｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替的な態様は、抗がん作用を免疫刺激作用と組み合わせることである。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮなどのサイトカイン、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８などのケモカイン、およびＦＬＴ３リガンドなどの増殖因子を含む、免疫刺激分子も存在する。
【０１１８】
現在調査中または使用されている免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号および同第５，７３９，１６９号；HuiおよびHashimoto、１９９８年；Christodoulidesら、１９９８年）；サイトカイン療法、例えばインターフェロンα、β、およびγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ならびにＴＮＦ（Bukowskiら、１９９８年；Davidsonら、１９９８年；Hellstrandら、１９９８年）；遺伝子療法、例えばＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびｐ５３（Qinら、１９９８年；Austin-WardおよびVillaseca、１９９８年；米国特許第５，８３０，８８０号および同第５，８４６，９４５号）；ならびにモノクローナル抗体、例えば抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、および抗ｐ１８５（Hollander、２０１２年；Hanibuchiら、１９９８年；米国特許第５，８２４，３１１号）である。本明細書に記述される抗体療法と共に１つまたは複数の抗がん療法が用いられ得ることが想定される。
【０１１９】
一部の実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害薬であり得る。免疫チェックポイントは、免疫系においてシグナルを大きくする分子（例えば共刺激分子）またはシグナルを小さくする分子のいずれかである。免疫チェックポイント遮断により標的化され得る阻害性チェックポイント分子としては、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６としても公知）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエータ（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２としても公知）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ−１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、ならびにＴ細胞活性化のＶ−ドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）が挙げられる。特に、免疫チェックポイント阻害薬は、ＰＤ−１軸および／またはＣＴＬＡ−４を標的とする。
【０１２０】
免疫チェックポイント阻害薬は、小分子などの薬物、組換え型のリガンドもしくは受容体であってもよく、または特に、ヒト抗体などの抗体である（例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１５０１６７１８号；Pardoll、２０１２年；これらはいずれも参照により本明細書に組み込まれる）。免疫チェックポイントタンパク質の公知の阻害薬またはその類似体を使用することができ、特に、キメラ化型、ヒト化型、またはヒト型の抗体を使用することができる。当業者は認知するであろうが、本開示で言及されるある特定の抗体に対して、代替的かつ／または均等な名称が使用される場合がある。そのような代替的かつ／または均等な名称は、本発明との関連において交換可能である。例えば、ランブロリズマブは、代替的かつ均等な名称であるＭＫ−３４７５およびペンブロリズマブとしても知られることが公知である。
【０１２１】
一部の実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１がそのリガンド結合パートナーに結合することを阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤ−１リガンド結合パートナーはＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２である。別の実施形態では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１がその結合パートナーに結合することを阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤＬ１結合パートナーはＰＤ−１および／またはＢ７−１である。別の実施形態では、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２がその結合パートナーに結合することを阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤＬ２結合パートナーはＰＤ−１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合性断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、全て参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７３５，５５３号、同第８，３５４，５０９号、および同第８，００８，４４９号に記述されている。本明細書において提供される方法において使用される他のＰＤ−１軸アンタゴニストは、全て参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１４０２９４８９８号、同第２０１４０２２０２１号、および同第２０１１０００８３６９号に記述されているように、当技術分野で公知である。
【０１２２】
一部の実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体（例えばヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）である。一部の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびＣＴ−０１１からなる群から選択される。一部の実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば免疫グロブリン配列のＦｃ領域）と融合したＰＤＬ１またはＰＤＬ２の細胞外部分またはＰＤ−１結合性部分を含むイムノアドヘシン）である。一部の実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストはＡＭＰ−２２４である。ニボルマブは、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＢＭＳ−９３６５５８、およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても公知であり、ＷＯ２００６／１２１１６８に記述されている抗ＰＤ−１抗体である。ペンブロリズマブは、ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ  ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、およびＳＣＨ−９００４７５としても公知であり、ＷＯ２００９／１１４３３５に記述されている抗ＰＤ−１抗体である。ＣＴ−０１１は、ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ−１としても公知であり、ＷＯ２００９／１０１６１１に記述されている抗ＰＤ−１抗体である。ＡＭＰ−２２４は、Ｂ７−ＤＣＩｇとしても公知であり、ＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２に記述されているＰＤＬ２−Ｆｃ融合可溶性受容体である。
【０１２３】
本明細書において提供される方法で標的化することができる別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても公知の細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）である。ヒトＣＴＬＡ−４の完全なｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ−４はＴ細胞の表面に見出され、抗原提示細胞の表面でＣＤ８０またはＣＤ８６に結合すると「オフ」スイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面で発現し、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝達する免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４はＴ細胞共刺激タンパク質のＣＤ２８と類似しており、両分子が抗原提示細胞においてそれぞれＢ７−１およびＢ７−２とも呼ばれるＣＤ８０およびＣＤ８６に結合する。ＣＴＬＡ４は阻害シグナルをＴ細胞に伝達するが、ＣＤ２８は刺激シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４は制御性Ｔ細胞においても見出され、その機能のために重要であり得る。Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８を介したＴ細胞活性化は、Ｂ７分子の阻害性受容体であるＣＴＬＡ−４の発現増大につながる。
【０１２４】
一部の実施形態では、免疫チェックポイント阻害薬は、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えばヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）、その抗原結合性断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。
【０１２５】
本方法で使用するのに好適な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体（またはそれに由来するＶＨおよび／またはＶＬドメイン）は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。代替的には、当技術分野で認識されている抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用してもよい。例えば、ＵＳ８，１１９，１２９、ＷＯ０１／１４４２４、ＷＯ９８／４２７５２；ＷＯ００／３７５０４（ＣＰ６７５，２０６、トレメリムマブとしても公知；旧称チシリムマブ）、米国特許第６，２０７，１５６号；Hurwitzら、１９９８年；Camachoら、２００４年；Mokyrら、１９９８年に開示されている抗ＣＴＬＡ−４抗体を、本明細書において開示される方法で使用することができる。前述の公開文献のそれぞれの教示は、参照により本明細書に組み込まれる。当技術分野で認識されているこれらの抗体のうちのいずれかとＣＴＬＡ−４への結合について競合する抗体を使用することもできる。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ−４抗体は、全て参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願第ＷＯ２００１０１４４２４号、同第ＷＯ２００００３７５０４号、および米国特許第８，０１７，１１４号に記述されている。
【０１２６】
例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、およびＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても公知）またはその抗原結合性断片およびバリアントである（例えば、ＷＯ０１／１４４２４を参照されたい）。他の実施形態では、抗体は、イピリムマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたはＶＲを含む。したがって一実施形態では、抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインと、イピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインとを含む。別の実施形態では、抗体は、上述の抗体と同じＣＴＬＡ−４のエピトープとの結合に関して競合し、かつ／またはそれに結合する。別の実施形態では、抗体は、上述の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％、または９９％の可変領域同一性）を有する。
【０１２７】
ＣＴＬＡ−４を調節する他の分子としては、全て参照により本明細書に組み込まれる米国特許第ＵＳ５８４４９０５号、同第ＵＳ５８８５７９６号、ならびに国際特許出願第ＷＯ１９９５００１９９４号および同第ＷＯ１９９８０４２７５２号に記述されているようなＣＴＬＡ−４リガンドおよび受容体、ならびに参照により本明細書に組み込まれる米国特許第ＵＳ８３２９８６７号に記述されているようなイムノアドヘシン（immunoadhesion）が挙げられる。
【０１２８】
４．  手術
がんを患う人々のおよそ６０％は、防止、診断、進行度診断、治癒、および緩和目的の手術を含む何らかの種類の手術を受ける。治癒目的の手術は、がん性組織の全てまたは一部が物理的に除去され、摘除され、かつ／または破壊される摘出を含み、他の療法、例えば本実施形態の処置、化学療法、照射療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および／または代替的な療法と併せて使用されてもよい。腫瘍摘出とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍摘出に加えて、手術による処置としては、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡制御手術（モース術）が挙げられる。
【０１２９】
がん性細胞、組織、または腫瘍の一部または全てが摘除されると、体内に空洞が形成される場合がある。処置は、さらなる抗がん療法の灌流、直接注射、または患部への局所適用によって達成され得る。そのような処置は、例えば、１、２、３、４、５、６、もしくは７日毎、または１、２、３、４、および５週間毎、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２か月毎に繰り返されてもよい。これらの処置はまた、様々な投与量のものであってもよい。
【０１３０】
５．  他の薬剤
処置の治療効力を向上させるために、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて他の薬剤が使用され得ることが想定される。最近妥当性が示され認可された臨床例は、細胞周期を阻害する生物学的療法（例えばパルボシクリブ）またはｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ経路を阻害する生物学的療法（例えばエベロリムス）とホルモン療法の併行施行を含む。したがって、さらなる例が想定され得る。これらのさらなる薬剤は、細胞表面受容体およびＧＡＰジャンクションの上方制御に影響する薬剤、細胞分裂阻害剤および分化剤、細胞接着の阻害薬、アポトーシス誘導因子に対する過剰増殖性細胞の感受性を増大させる薬剤、または他の生物学的薬剤を含む。ＧＡＰジャンクションの数を増加させることによる細胞間シグナル伝達の増大は、近隣の過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖作用を増大させる。他の実施形態では、処置の抗過剰増殖性効力を向上させるために、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて細胞分裂阻害剤または分化剤が使用され得る。細胞接着の阻害薬は、本実施形態の効力を向上させることが想定される。細胞接着阻害薬の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害薬およびロバスタチンである。処置効力を向上させるために、本実施形態のある特定の態様と組み合わせて、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増大させる他の薬剤、例えば抗体ｃ２２５が使用され得ることがさらに想定される。
【０１３１】
ＩＶ．  製造品またはキット
本発明のさらなる実施形態は、ＥＲおよびＰＲ関連遺伝子の発現および転写出力の測定、解析、および報告のためのキットを含む。キットは、マイクロアレイ、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、または他のゲノムプラットフォーム試薬および材料、ならびに記述される方法の少なくとも一部分を行うためのハードウェアおよび／またはソフトウェアを含み得るが、これらに限定されない。例えば、既存のマイクロアレイのためのカスタムマイクロアレイまたは解析法が想定される。したがって、同様に本明細書において提供されるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を決定するためにカスタマイズされたアッセイを含む製造品またはキットが提供される。製造品またはキットは、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を決定するため、そして次に個体において乳がんを処置するまたはその進行を遅延させるために、カスタマイズされたアッセイを使用するための説明を含む添付文書をさらに含み得る。本明細書に記述されるＥＲおよびＰＲ関連遺伝子のうちのいずれかのためのプローブが製造品またはキットに含まれていてもよい。好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、バッグ、およびシリンジが挙げられる。容器は、ガラス、プラスチック（例えばポリ塩化ビニルまたはポリオレフィン）、または金属合金（例えばステンレス鋼またはハステロイ）などの多様な材料から形成されていてよい。一部の実施形態では、容器が製剤を保持し、容器に付されたまたは関連付けられたラベルが使用上の指示を示してもよい。製造品またはキットは、他の緩衝液、希釈液、フィルター、針、シリンジ、および使用説明を含む添付文書を含め、商業および使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。１つまたは複数の薬剤に好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、バッグ、およびシリンジが挙げられる。
【実施例】
【０１３２】
Ｖ．  実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下に続く実施例において開示される技術が、本発明の実施に当たって良好に機能することが本発明者により発見された技術を代表し、したがって本発明の実施のために好ましい様態を構成すると考えられ得ることは、当業者には察知されるべきである。しかしながら当業者は、本開示を踏まえ、開示されている特定の実施形態に多くの変更を加えても、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを察知すべきである。
【０１３３】
（実施例１）
進行乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の評価
解析前条件および解析条件の研究における性能：図１は、指数の開発に使用した異なる技術的データセットにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲの性能を示す。ＳＥＴＥＲ／ＰＲは、技術的反復試験区（ＩＣＣ＝０．９９０）、腫瘍内反復試験区（ＩＣＣ＝０．９５３）、および様々な組織試料間（細胞診対組織、ρＰ＝０．９５２）で優れた再現性を有した。Ｐｌｕｓ２．０アレイから得られたスコア値は、Ｕ１３３Ａマイクロアレイと比較するとより高い値に対するわずかなバイアスを有した。
【０１３４】
解析前条件および解析条件の独立研究における性能：図２は、特徴選択プロセスで過去に使用されなかった解析前および解析の妥当性検証研究におけるＳＥＴＥＲ／ＰＲの性能を示す。クロスプラットフォームの再現性は、Ｕ１３３ＡおよびＰｌｕｓ２．０マイクロアレイ両方でプロファイリングした３２ケースの独立データセットにおいて、補正されたスコアではρＰ＝０．９９４、そして研究室間の再現性ではρＰ＝０．９９５の妥当性が示された。相互作用モデルにおいて調整後のスコア値に有意なバイアスはなかった。Ｕ１３３Ａマイクロアレイでのアッセイの技術的再現性は、３６個のデータペアの独立データセットにおいて妥当性が示された（ρＰ＝０．９９３）。ＳＥＴＥＲ／ＰＲは、負のスコア値は、肝臓または正常な乳房組織においてＥＳＲ／ＰＧＲに関連した転写レベルのベースラインへとより急速に回帰するが、肝臓または正常な乳房組織の汚染の妥当な範囲にわたってかなり安定であった。汚染０％〜９０％の範囲にわたり、リスク分類は一貫性が高かった（それぞれκ＝０．８６５および０．８４２）。ＳＥＴＥＲ／ＰＲ測定に対する時間遅延および試料保存法または長時間の冷虚血遅延の統計的に有意な影響はなかった。
【０１３５】
転移性乳がんにおける内分泌感受性の予後予測：ホルモン受容体陽性ＨＥＲ２陰性転移性乳がんを患う１４０名の患者の特徴を表１にまとめる。ＳＥＴＥＲ／ＰＲは、ＰＲ免疫組織化学的ステータス（ｐ＜０．０００１）および内分泌感受性の以前の臨床歴（ｐ＝０．０４７１）と正の関連を示し、以前の進行事象数（ｐ＝０．００９）と負の関連を示した。観察されたＳＥＴＥＲ／ＰＲの範囲は、様々な転移部位からの試料において比較可能であった。
【０１３６】
【表１】
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【０１３７】
連続的ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、内分泌ベースの療法を受けている患者では無増悪生存期間の予測能を有したが（ハザード率０．６０９（０．４７５〜０．７８２）、ｐ＝０．０００１、表２）、化学療法を受けている患者では無増悪生存期間の予測能を有しなかった（ハザード率０．６５１（０．４０３〜１．０５１）、ｐ＝０．０７９２）。再発（以前の全身療法後）の時点で生検が得られ、次の処置が内分泌療法を含んだ患者の生存期間に対して、さらなる解析を行った（表２）。患者が以前の内分泌療法に対する感受性の臨床的証拠を過去に示したことがある場合、連続的ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、転移のＰＲステータス、以前の再発事象数、および任意の内臓転移の有無（表２）を含む多変量モデルにおいて、ホルモン療法でのＰＦＳの独立した予後判定能を有した。
【０１３８】
【表２】
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【０１３９】
緩和的内分泌療法の開始後ＰＦＳ６か月の時点で処置に感受性のあるケースと感受性のないケースとの分類を最適化する閾値を、ＳＥＴＥＲ／ＰＲを二分するように選択した。このように（０．６５の閾値で）二分すると、ＳＥＴＥＲ／ＰＲは、単変量および多変量解析の両方において、ホルモン療法でのＰＦＳの独立した予後判定能を有した（表２）。特に、セラノスティックな効果は、内分泌療法に対する感受性の臨床的証拠を過去に示したことがある患者サブセットにおいてより顕著であった。図３は、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数のこの最適化された閾値を同じコホートの患者に使用したカプラン・マイヤープロットを示す。
【０１４０】
ホルマリン固定パラフィン包埋組織に基づくカスタマイズされたアッセイへの移行：ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織に基づくカスタマイズされたアッセイへのスコアの移行可能性を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｐｌｅｘプラットフォームを使用して評価した（図４）。標的化アッセイを使用し、３６個の乳がん試料のプロファイリングをＵ１３３Ａマイクロアレイにて二連で行った。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅプラットフォームでの測定は、同じパラフィンブロックの２つの異なる単一セクションおよび２つの異なるロットの試薬を使用して、二連で繰り返した。２名の異なる個体が異なる日に実験を行った。これらの条件下で、ＦＦＰＥベースのアッセイの技術的再現性は優れていた（それぞれρＰ＝０．９９４および０．９９７）。次に、３６個の試料のアレイおよびＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ測定の２反復試験区の平均を使用して線形モデルの当てはめを行い、スコア値に対する技術移行の影響を評価した。次に、技術移行に関する推定値の妥当性検証を、両方のプラットフォームでプロファイリングした一組３１個の独立標本において行った。アッセイ間の再現性はρＰ＝０．９８０およびリスク層別でκ＝０．９４３と優れていた。ＦＦＰＥ試料のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定を、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒ（図５）、Ａｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋバージョン２遺伝子発現マイクロアレイ（図６）、およびＲａｉｎＤａｎｃｅ（ドロップレットターゲティングおよび増幅）とＩｌｌｕｍｉｎａ（シーケンシング）プラットフォームとを組み合わせて使用したピコドロップレットベースの標的化ＲＮＡシーケンシング（図７）を含む他の技術的プラットフォームに変換したとき、同様の結果が観察された。これは、遺伝子発現測定のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数が、異なる試料型および技術的プラットフォームでの使用のためにロバストに変換されることを明示する。ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数はＥＳＲ１およびＰＧＲに関連した転写を測定する概念に基づいており、その計算は、過剰適合を起こしやすい方法である転帰データのモデリングを回避する。これは、１８種の情報遺伝子および１０種の参照遺伝子に基づく再現性のある遺伝子発現アッセイであり、パイロット結果は、これをどのように変換すれば日常的な臨床使用において固定腫瘍試料に使用することができるかを明示している。さらに、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、重要な解析前条件（組織および細胞診試料、ｅｘ  ｖｉｖｏ虚血、組織試料の保存または固定、ならびに腫瘍内空間的不均一性）、および解析条件（アッセイ手順の全てのレベルにおける技術的再現性、アッセイのための様々な技術的プラットフォーム）に対してロバストであった。
【０１４１】
ＳＥＴＥＲ／ＰＲは、特に転移性乳がんのために開発された初めての多重遺伝子アッセイである。より高いＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、アジュバントまたは緩和設定における無増悪期間の延長により、内分泌療法により処置された転移性乳がん患者、特にホルモン療法に対する臨床的感受性を過去に示したことがある患者の、より長い無増悪生存期間および全生存期間と関連付けられた（表２、図３）。したがって、ＳＥＴＥＲ／ＰＲが緩和的内分泌処置の設定における診断ツールとしてさらに開発される有望な候補である可能性がある。
【０１４２】
さらに、標的化次世代シーケンシングアプローチは、エストロゲン受容体アルファ遺伝子（ＥＳＲ１）の既知の変異の遺伝子座において、この遺伝子の転写物の発現した配列の割合を検出および測定するための、さらなる標的化プローブを含み得ることが明示された。ＥＳＲ１は、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数における転写物のうちの１つであり、ＥＲのリガンド非依存的活性化に起因して、ステージＩＶ転移性乳がんにおいて変異する場合がある。これは、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の標的化ＲＮＡシーケンシングアッセイから観察することができ、このアッセイでは変異ＥＳＲ１転写物の割合を測定することができ、これはより高いＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数値と関連付けられる（図８）。ＥＳＲ１のＤＮＡにおける変異は、転移性乳がん患者の内分泌療法に対する抵抗性の可能性のある原因であり、過去の内分泌処置に起因して獲得され得ることが、他者により報告されている。したがって、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数が高い一部の転移性がんは野生型ＥＳＲ１を有する（そしてホルモン療法に良好に応答することが期待され得る）のに対して、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数が高いが高頻度で変異するＥＳＲ１転写物を有する他のものは、ホルモン療法に対する抵抗性を示する可能性がある（図８）。予備段階の結果は、関連するＥＳＲ１変異の既知の遺伝子座における転写された配列の測定および解析を、正常なＥＳＲ１の活性化から生じるはずである転写の測定（ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数により測定される）と組み合わせると、予測能の高い診断アルゴリズムがもたらされることを明示している（図９）。この加算により、ＥＳＲ１遺伝子が既知の遺伝子座において変異したかどうか、および変異を含む転写物の割合がアッセイに含まれる。
【０１４３】
（実施例２）
ステージＩＩ〜ＩＩＩ疾患におけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の臨床的妥当性検証
実施例１に記述したＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、転移性乳がんのために内分泌療法を受ける患者の無増悪生存期間および全生存期間の向上を予測するための予後診断試験としてのその使用に関し、ステージＩＶ（すなわち転移性）である乳がんの日常的なホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片の試験に基づいている。
【０１４４】
次に、ＲＮＡハイブリダイゼーション法、例えばＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｐｌｅｘ法（図４）、およびＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ法（図５）、他の種類のマイクロアレイプラットフォーム、例えばＡｇｉｌｅｎｔ  ４４Ｋバージョン２アレイ（図６）、およびソースＲＮＡの標的化逆転写を伴う標的化ＲＮＡシーケンシング法（例えばＲａｉｎＤａｎｃｅドロップレット増幅法）（図７）、またはタグ付きライブラリ次世代シーケンシングの調製後のエクソン捕捉法（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ標的化シーケンシング）を含む、様々なカスタマイズされたゲノム技術を使用して、指数の実用可能性を試験した。ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、組織試料または血液試料（血液試料中に十分なＲＮＡが存在する場合）において測定され得ることも見出された。
【０１４５】
さらに、標的化次世代シーケンシングアプローチは、エストロゲン受容体アルファ遺伝子（ＥＳＲ１）の既知の変異の遺伝子座において、この遺伝子の転写物の発現した配列の割合を検出および測定するための、さらなる標的化プローブを含み得ることが明示された。ＥＳＲ１は、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数における転写物のうちの１つであり、ステージＩＶ転移性乳がんにおいて変異する場合があるが、元の原発性乳がんでは稀である。ＥＳＲ１のＤＮＡにおける変異は、過去の内分泌処置に起因して獲得され得ることが、他者により報告されている。しかしながら、本データは、関連するＥＳＲ１変異が、ＤＮＡシーケンシング法から典型的に得られるものよりもシーケンシングリードの深度が大幅に高い標的化ＲＮＡシーケンシングアプローチのためのＲＤアッセイを使用し、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数によって測定した場合、過去に処置されていない原発性ＥＲ＋乳がんの１５％において低い割合（１〜３％）のＥＳＲ１転写物が既知の遺伝子座で変異していたことを明示したということを示す（図１０）。転移性がんにおける観察と同様に、稀な変異ＥＳＲ１転写物を含んだ原発がんのサブセットは、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の値が高いがんのサブセットであった（図１０）。このように、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数値と変異ＥＳＲ１転写物の割合との間の相互関係が、再発性転移性がん試料（図８）および無処置の原発がん（図１０）の両方で観察された。
【０１４６】
ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、ＨＲ＋／ＨＥＲ２−のステージＩＩ〜ＩＩＩ乳がん患者で、術前処置としての順次的なタキサンベースおよびアントラサイクリンベースの化学療法レジメン、すなわちネオアジュバント化学療法（ＮＡＣ）、続いて局所的な腫瘍処置のための手術を受け、残存がん負荷（ＲＣＢ）予後判定スコアを使用して腫瘍応答を評価し、次にアジュバント処置として任意の標準的なアジュバントホルモン療法を受けた患者の無再発生存転帰を独立して予測することも示された。この集団では、診断時における元の疾患負荷、すなわち臨床ステージ（ｃ−ステージ）；化学療法の完了後に残存するがんの負荷（ＲＣＢ指数）；および後のアジュバントホルモン療法に対する感受性を予測するＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数という、それぞれ独立して予後判定能を有した３つの変数があった（表３）。これは、追跡期間中央値（ｆ−ｕｐ）がそれぞれ８年間および５年間であった２つの異なる患者コホートにおいて観察された（表３）。
【０１４７】
【表３】
2019514930.tif 000006
【０１４８】
図１１は、初期診断時に臨床ステージＩＩ〜ＩＩＩのＨＲ＋／ＨＥＲ２−乳がんを有した患者におけるＮＡＣ完了後のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数と残存がん負荷（ＲＣＢ）との間の関係を示す。この実施例では、ＮＡＣ後に中等度の残存がん（ＲＣＢ−ＩＩ）および高いＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（実線）を有し、後のアジュバントホルモン療法からの予後判定が優れていた多くの患者が特に識別された（図１１Ｂ）。しかし他の患者は、図１１Ｂに示されるように、ＮＡＣ後の広範な残存疾患（ＲＣＢ−ＩＩＩ）と低いＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数（破線）との組合せから予後不良であった。
【０１４９】
ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、アジュバント処置として内分泌療法を受ける患者の優れた無疾患生存期間、無再発生存期間、および全生存期間を予測する予後診断試験として、ステージＩＩ〜ＩＩＩ乳がん患者にも拡大されることが示された。盲検化臨床的妥当性検証研究の結果を図１２に示す。これは、標準的な化学療法（ＦＥＣ×３／Ｄ×３）を受けた後に標準的なアジュバントホルモン療法を少なくとも５年間にわたり処方された患者の原発性腫瘍試料の盲検化妥当性検証解析であった。ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、冷凍された腫瘍試料由来のＲＮＡを使用して、Ｕ１３３Ａ遺伝子発現マイクロアレイから計算した。
【０１５０】
図１２のこの結果は、タキサン−アントラサイクリン化学療法レジメンで一様に処置された外部コホートの盲検化した独立の解析からのものであるが、高いＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を有する患者における１０年遠隔無再発生存率のより精確な推定を得るためには、より大きな標本サイズが使用される。１０年は、ＨＲ＋／ＨＥＲ２−患者集団の生存期間解析に適切なエンドポイントである。９０％超の１０年ＤＲＦＳは、診断時の結節性転移にもかかわらず傑出した生存確率を有する患者を識別するため、臨床的に有用かつ実現可能（ａｃｔｉｏｎａｂｌｅ）な結果であろう。これは将来の研究において、ホルモン療法単独または分子標的療法と合わせたホルモン療法など、化学療法を回避する代替的な処置選択肢の比較のための適切な集団および生存期間のベンチマークとなる可能性がある。反対に、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数が低い患者の懸念となる予後リスク自体が、ステージＩＩ〜ＩＩＩの疾患を患う患者に利用可能となっている多くのアジュバント（例えばパルボシクリブまたはエベロリムス）の臨床治験への参加を奨励するのに臨床的に有用となる可能性がある。
【０１５１】
（実施例３）
材料および方法
患者および試料
発見データセット（Ｎ＝３８９）：第１のパートは、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ）において新たに浸潤性乳がんと診断された患者から得た４３７のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイプロファイルの公開データセットのサブセット（Symmansら、２０１０年）であった。エストロゲン受容体１（ＥＳＲ１）、プロゲステロン受容体（ＰＧＲ）、およびＨＥＲ２−ステータスに関する情報が入手可能な２４２のホルモン受容体陽性ケースを使用した。このデータセットのうち、１８１のさらなるホルモン受容体陰性ケースをスコアのスケーリングのために使用した。第２のパートは、新たに診断された乳がんまたは組織試料の浸潤性乳がん手術後のＦＮＡを得るためのリサーチプロトコールに参加したＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎの患者のうち、ホルモン受容体陽性乳がん患者の１４７の新たな試料からなった。これらの患者は試料収集前に全身処置を受けなかった。試料はＲＮＡｌａｔｅｒに保管した。表４は、発見コホートにおける患者の受容体ステータス、ステージ、および組織試料の種類を示す。
【０１５２】
【表４】
2019514930.tif 000007
【０１５３】
ステージＩＶ乳がんの臨床コホート（Ｎ＝１４０）：臨床的アノテーション付きデータセットは、２００４年から２０１３年の間にＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎにおいて転移性乳がんの細針吸引物（ＦＮＡ）を得るためのリサーチプロトコールに参加した患者からなった。患者は患者および医師の選択に従って処置された。リサーチデータベース中、３２９ケースが遡及的解析のために利用可能であった。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイで２３４のプロファイリングを行った。２１２のマイクロアレイが品質管理に合格した。３２個のＨＥＲ２陽性腫瘍および２６個のホルモン受容体陰性腫瘍は除外した。さらに１４ケースを他の理由（生検後の追跡データなし、乳がん以外の診断）で除外し、結果として１４０ケースをこの研究に使用した。追跡期間中央値は、無増悪生存期間で５．１か月、全生存期間で１８．６か月であった（表２）。
【０１５４】
ＥＲおよびＰＲ陽性は、腫瘍細胞の１０％以上が核染色されることと定義した。ＨＥＲ２陽性は、３＋の免疫組織化学スコアおよび／または蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより決定して２．２超のＨＥＲ２／ＣＥＰ１７比として定義した。原稿はＲＥＭＡＲＫの指針（McShaneら、２００６年）に従って書かれた。
【０１５５】
分子アッセイ
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａマイクロアレイ：過去に記述されているように、ＲＮＡを抽出し、処理し、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノムＵ１３３Ａマイクロアレイ（Ｕ１３３Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）とハイブリダイズさせた。手短に述べると、ＭＡＳ５．０アルゴリズムを使用して生の強度ファイルを処理し、プローブセットレベルの強度を生成し、６００のアレイ強度中央値に対して正規化し、ｌｏｇ２変換し、各試料中の１，３２２種の乳がん参照遺伝子の発現を使用してスケーリングした（Symmansら、２０１０年；Hatzisら、２０１１年）。
【０１５６】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｐｌｅｘプラットフォーム：ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｐｌｅｘアッセイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎａｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、ツリー状のシグナル増幅を使用した特異的なＲＮＡ配列を捕捉する蛍光ビーズに基づくハイブリダイゼーションベースのマルチプレックスプラットフォームである。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅのＦＦＰＥ組織ホモジネート用試料処理キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎａｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を製造元の説明に従って用い、単一の１０μｍ  ＦＦＰＥスライドを１つ使用してＦＦＰＥ組織ホモジネートを調製した。カスタマイズされたＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  Ｐｌｅｘ試薬系を、カスタム選択した予め設計済の遺伝子特異的アッセイと共に使用して、１０種の参照遺伝子および１８種の標的遺伝子を捕捉した。バックグラウンド値を減算することにより生の値のバックグラウンド補正を行い、ｌｏｇ２変換した。
【０１５７】
アッセイ間の再現性（Ｕ１３３Ａ対Ｐｌｕｓ２）：このデータセットは、３つの異なるセンターから得た８８個のホルモン受容体陽性乳がん試料からなるマイクロアレイ品質管理研究（ＭＡＱＣ、別所に記述する）のサブセットである。組織試料は、以前に全身処置を全く受けていない患者の手術検体から採った。次に試料を細かく切り、混合し、２等分にし、ＭＤＡＣＣにおいてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３ＡおよびＰｌｕｓ２．０マイクロアレイの両方で処理するためにＲＮＡｌａｔｅｒに保管した。両プラットフォームで利用可能な２２，２７７個のプローブセットのうちのそれぞれについて、プローブセットワイズのピアソン相関係数を計算した。このデータセットからの情報は、ＳＥＴＥＲ／ＰＲの開発に使用した。
【０１５８】
試料型間の再現性（細胞診対組織）：このデータセットは、クロスプラットフォームデータセットから８７ケース、１つのさらなるホルモン受容体陽性ケース、および２８のホルモン受容体陰性ケースを含んだ。上述のように手術後に採られた組織試料に加えて、同時に、腫瘍の切断表面をメスで掻爬することにより掻爬（＝細胞診）試料を採った。試料をＵ１３３Ａマイクロアレイで処理するためにＲＮＡｌａｔｅｒに保管した。ピアソン相関係数を各プローブセットで計算して、様々な組織型を使用した再現性を評価した。このデータセットからの情報は、ＳＥＴＥＲ／ＰＲの開発に使用した。
【０１５９】
アッセイ内再現性および腫瘍内不均一性：これらの試料は、試料型間データセットの４９個の手術検体のサブセットおよび２つのさらなるケースを使用して収集した。同じ腫瘍の異なる肉眼的腫瘍部から３つの組織試料を採った。１つの試料（Ａ）は技術的再現性研究のために使用した。この試料を細かく切り、混合し、８０％を使用して、５つの異なるレベルの研究室プロトコール：ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、ｃＲＮＡ合成、および同じチップの再走査を繰り返した。試料ミックスの残りの２０％を使用して全てのステップを繰り返し、合計６つの技術的反復試験区をもたらした。さらなる腫瘍試料（Ｂ）および（Ｃ）は、空間的再現性研究のために元の試料（Ａ）と併せて使用するためにプロファイリングした。２つの入れ子になったデータセットの２０×６および５１×３のデータ点を使用し、各データセットにおけるアレイ上の各プローブセットに関するクラス内相関係数（ＩＣＣ）を計算して、それぞれ技術的および空間的な再現性の測定値を得た。ＩＣＣは、異なる腫瘍試料間の差に起因し得る、データの全変動のうちの割合として解釈することができる。例えば、０．９５のＩＣＣは、全変動の９５％が腫瘍間の差によって、そして５％が腫瘍内の差によって説明され得ることを意味する。このデータセットからの情報は、ＳＥＴＥＲ／ＰＲの再現性の妥当性検証に使用した。
【０１６０】
組織の取扱いの影響に関するデータセット：これは、ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎにおいて術中病理査定時に収集された、過去に処置されていない乳がん患者の１１個の腫瘍の公開データセットであった。研究の設計および統計解析の詳細は、過去に記述されている（Giordanoら、２０１４年）。手短に述べると、組織試料を刻み、混合し、８等分に分割した。１分割量を直ちにＲＮＡｌａｔｅｒに入れた。残りの分割量は、２０、４０、６０、１２０、もしくは１８０分間室温に保った後ＲＮＡｌａｔｅｒに入れたか、または即座（０分すなわちベースライン）および室温で４０分間後にドライアイス上でスナップ冷凍した。ランダム群内切片を用いた線形混合効果モデル（ＬＭＥ）を使用し、ｒパッケージｌｍｅ４（Cardosoら、２０１４年）を使用して、試料保存法（ＲＮＡｌａｔｅｒ対新鮮冷凍）および時間遅延（０対４０分）の影響を推定した。試料安定化遅延（冷虚血時間）の影響は、同様のモデルを使用し、一定の傾き（冷虚血時間の影響のため）およびランダム切片（腫瘍間の生物学的変動のため）を用いて査定した。尤度比検定を使用して目的のタームを含まない縮小モデルと完全なモデルを比較することにより、係数の統計的有意性を評価した。このデータセットからの情報は、ＳＥＴＥＲ／ＰＲの再現性の妥当性検証に使用した。
【０１６１】
肝臓および正常組織の汚染：１１個の乳がん試料を、肝臓０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、９０％、および１００％の様々な比で、１１個の個別の肝臓試料とプールしたデータセット。正常組織汚染データセットでは、同じ比を使用して、１１個の乳がん試料を１１個の個別の正常乳房組織試料とプールした。このデータセットからの情報は、ＳＥＴＥＲ／ＰＲの再現性の妥当性検証に使用した。
【０１６２】
アッセイ間の再現性の妥当性検証；研究室間の再現性：２つの異なるマイクロアレイプラットフォーム（Ｕ１３３ＡおよびＰｌｕｓ２）および２つの異なる研究室（ＭＤＡＣＣおよびＪＢＩ）でプロファイリングした１６ケースの公開データセットを使用して、クロスプラットフォームの再現性の妥当性を検証し、異なる研究室での処理の影響を評価した。このデータセットからの情報は、ＳＥＴＥＲ／ＰＲの再現性の妥当性検証に使用した。
【０１６３】
３６ケースのデータセットを使用して、カスタマイズされたアッセイの実用可能性を評価した。全ての試料をＵ１３３ＡマイクロアレイおよびＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ  Ｐｌｅｘプラットフォームにて二連でプロファイリングした。線形モデルの当てはめを行い、プラットフォームの影響を評価し、新たなプラットフォームのための転換係数を求めた。このデータセットは、両プラットフォームにおいてＳＥＴＥＲ／ＰＲのアッセイ内再現性の妥当性を検証するためにも使用した。結果の妥当性検証のため、別の３６個の腫瘍のセットを両プラットフォームでプロファイリングした。
【０１６４】
データセットの関係：図１３は、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を計算するためにアルゴリズムで測定するのに最も信頼性のある遺伝子を識別するために使用した解析前条件および解析条件の様々な比較のための研究設計を例示し、これらの研究の対応する結果は図１および２に提示されている。図１４は、異なるデータセットのケースおよび／または試料の部分的重複を示す。発見コホートのパートＩＩにおける１４７名の患者のうち、８８名の患者はクロスプラットフォームデータセットにも含まれた。これらのうち７７には重複標本があった。すなわち、発見で使用した１４７のＵ１３３Ａアレイのうちの７７については、さらなる符合するＰＬＵＳ２．０アレイデータが利用可能であった。残りの１１ケースでは、同じ患者の腫瘍を使用したが、個別の試料を採り、Ｕ１３３ＡおよびＰＬＵＳ２．０アレイで別々にプロファイリングした。空間的再現性研究における５１名中３９名の患者は、発見データセットにも含まれた。１３ケースにおいて、異なる腫瘍部から得られた３つの試料のうちの１つは発見のためにも使用し、２６ケースでは、３つの個別の腫瘍試料およびＵ１３３Ａマイクロアレイプロファイルを使用した。空間的再現性研究における５１名中５０名の患者は組織間データセットにも含まれたが、異なる腫瘍試料およびマイクロアレイプロファイルを使用した。
【０１６５】
ＥＳＲ１およびＰＧＲ関連遺伝子の選択：特徴選択プロセスの目的は、ＥＳＲ１およびＰＧＲ両方の発現に関連するが高い再現性もある少数のプローブセットを識別することであった。異なる技術的データセットから得た情報のみならず訓練データセットも使用し、一連の非特異的および特異的なフィルタリングステップを適用した（図１５）。７つの連続したステップは次のとおりであった：
１．再現性の高いプローブセットを選択するため、ＥＳＲ１およびＰＧＲ関連遺伝子の選択のための非特異的フィルタリングは主に再現性に基づいた：技術的および空間的両方の再現性について少なくとも０．６のクラス内相関係数を有するプローブセットのみを保持した。
２．次に、参照プローブセットを除去した（プローブセットＩＤ中の「ＡＦＦＸ」）。
３．低発現（少なくとも５つが発現するのは試料の４０％未満）かつ／または発見データセットにおける低い可変性（０．５より小さい四分位数間範囲および／または１より小さい５分位〜９５分位範囲）を有するプローブセットを除去した。
４．増殖のためのサロゲートとしてのオーロラキナーゼＡ発現に関連するプローブセットを除去した（発見データセット、スピアマン→＞０．５）。
５．残りの６８２６個のプローブセットのうち、ＥＳＲ１およびＰＧＲの両方について少なくとも０．３のスピアマン相関係数絶対値を有するプローブセットのみを選択し、結果として１５８個のプローブセット（発見データセット）を得た。
６．候補数をさらに低減するため、異なるマイクロアレイプラットフォーム間で良好な再現性（クロスプラットフォーム相関性＞０．９）および高い可変性（発見データセット；四分位数間範囲＞１．５）を有するもののみを残した。このステップにより、１８種の遺伝子を表す２４個のプローブセットが残った。
７．上述した全ての発現および品質の測定基準を含む投票スキームを使用して、各プローブセットにつき１つの代表的な遺伝子を選択した。
【０１６６】
参照遺伝子の選択：参照遺伝子の選択では、発見コホートの３３１のＨＥＲ２陰性ケースのみを使用した。参照遺伝子の選択では、２２，２８３個の利用可能なプローブセットに以下のフィルタリングステップを適用した：
１．技術的再現性のＩＣＣ＞０．９、空間的再現性のＩＣＣ＞０．８。
２．ＥＲ、ＰＲ、またはＨＥＲ２との強い相関性なし（絶対値→＜０．４）。
３．良好な組織間（→＞０．８）およびクロスプラットフォームの再現性（→＞０．８）。
４．０．２未満の分散、および値の９５％が１．７５の範囲内。プローブセットの分散は典型的にプローブセット強度の関数であるため、より低い発現範囲をカバーするためには、分散基準も緩めた（８〜９の遺伝子発現範囲中央値に対して０．７５未満の分散、および７〜８の範囲をカバーするためには１．５未満の分散）。全てのフィルタリング基準に合格したプローブセットから、１０種の代表的な遺伝子を選択した。
【０１６７】
ＳＥＴＥＲ／ＰＲの定義：図１６は、選択された標的遺伝子および参照遺伝子の分布を示し、表５はアノテーションを列記する。図１７Ａでは、参照遺伝子の大幅に狭い分布を例示するために、標的遺伝子の平均が参照遺伝子の平均に対してプロットされている。発見データセットの３８９ケースおよび１７５のさらなるホルモン受容体陰性ケースを使用し、スコアを直線的にスケーリングして、０のＳＥＴＥＲ／ＰＲ値におけるホルモン受容体陽性対ホルモン受容体陰性ケースの弁別を最適化した（図１７Ｂ）。
【０１６８】
【表５】
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【０１６９】
ＳＥＴＥＲ／ＰＲの再現性：表６に示されるクロスプラットフォームの再現性は、第１のデータセットを使用したクロスプラットフォームの再現性に関する線形モデルの結果を列記する。次に、Ｕ１３３Ａ≒１＊Ｐｌｕｓ２−０．２を使用したシグネチャの転換後に第２のデータセットを用いて推定値の妥当性を検証した。
【０１７０】
【表６】
2019514930.tif 000009
【０１７１】
ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定の技師間、試薬バッチ間、および経時的一貫性：図１８は、５つの異なる乳がん試料におけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の２０回連続の週１回試験の結果を示す。各ケースにおいて、未染色ＦＦＰＥ組織切片の直接溶解（事前のＲＮＡ精製なし）およびＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ法を使用した遺伝子発現の測定から始まる、研究室の標準作業プロトコール（ＳＯＰ）に従った。研究過程中、２名の検査技師（異なる色で示す）が交替で週１回の測定を行い、各技師が３つの異なるバッチのＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ試薬を利用した。ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数は、それぞれ未染色のＦＦＰＥ組織切片のレベルから開始する２０回連続の測定で一貫して再現性があった。
【０１７２】
ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定の品質管理：図１９は、４．０超（ｌｏｇ２スケール）の参照遺伝子値の中央値が、許容されるＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数結果の品質査定に適切なカットポイントとなることを示す。これは、ＦＦＰＥ試料およびＱｕａｎｔｉｇｅｎｅプラットフォームを用いてＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定を報告するための最小閾値を決定するための限界希釈研究から決定された。５つの原発性乳がんから、ＦＦＰＥ組織から得られたＲＮＡの限界希釈物（１２５ｎｇ〜１．９５ｎｇ）をアッセイした。これらの測定値を、Ｕ１３３Ａマイクロアレイでプロファイリングした新鮮／冷凍ＲＮＡを使用して測定したＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数値と比較した。参照遺伝子の発現中央値が≦４．０（ｌｏｇ２スケール）であったとき、Ｕ１３３ＡからのＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数測定値の絶対的な逸脱は明らかであった。参照遺伝子の発現中央値が＞４．０であったときにＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数値の逸脱はなかった。
【０１７３】
ＳＥＴＥＲ／ＰＲに対する冷虚血の影響：表７は、ＳＥＴＥＲ／ＰＲに対する試料保存法（ＲＮＡｌａｔｅｒ対新鮮冷凍）および時間遅延（０対４０分）の影響を推定するためのランダム群内切片を用いた線形混合効果モデルの結果を列記する。表８は、一定の傾き（冷虚血時間の影響のため）およびランダム切片（腫瘍間の生物学的変動のため）を用いた、試料安定化遅延（冷虚血時間）の影響に関するモデルの結果を列記する。尤度比検定を使用して目的のタームを含まない縮小モデルと完全なモデルを比較することにより、係数の統計的有意性を評価した。
【０１７４】
【表７】
2019514930.tif 000010
【０１７５】
【表８】
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【０１７６】
ＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数のステージ関連変化：図２０は、転移性乳がん患者の診断時のステージおよび生検した再発事象数によるＳＥＴＥＲ／ＰＲの減少を示す。転移性乳がんのＳＥＴＥＲ／ＰＲ（表９）は、内分泌ベースの療法で処置された７９名の転移性乳がん患者のサブセットの臨床的および病理学的な特徴のまとめを提示し、表１０は、プロトコール処置を列記する。図２１においてＳＥＴＥＲ／ＰＲは、臨床的および病理学的な特徴に従ってプロットされている。
【０１７７】
血液試料中のＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数の測定：図２２は、転移性乳がんのＲＮＡ（肝転移のＦＦＰＥ生検由来）および患者の末梢血のＲＮＡ（血漿エキソソーム由来）の符合標本における、ＲＤ標的化ＲＮＡシーケンシング法を使用したＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数遺伝子の発現測定値の比較を示し、血液試料からＳＥＴＥＲ／ＰＲ指数を測定する実用可能性を明示する。
【０１７８】
【表９】
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【０１７９】
【表１０】
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【０１８０】
統計法
Ｕ１３３Ａマイクロアレイからの標的および参照プローブセットの識別および選択：目的は、発見コホートの３８９ケースにおけるスピアマンの順位相関係数に基づいて、ＥＳＲ１およびＰＧＲの発現に関連する高い再現性がある少数のプローブセット（プローブセット２０５２２５＿ａｔおよび２０８３０５＿ａｔ）を識別することであった。発見データセットおよび解析データセットを使用し、一連の非特異的および特異的なフィルタリングステップを適用して、良好な腫瘍内および技術的な再現性、異なるマイクロアレイプラットフォーム間および異なる種類の組織試料間で良好な再現性、ならびに好ましい発現測定基準（最小発現レベルおよび可変性による）を有するプローブセットを選択した。
【０１８１】
アレイ上の各候補プローブセットのクロスプラットフォームおよび組織間の再現性の評価のためにピアソンの相関性を使用した。クラス内相関係数（ＩＣＣ）を使用して、アッセイ内および腫瘍内の再現性を評価した。増殖と強い関連があったプローブセットは除去した。最終的なリストは、１８種のＥＳＲおよびＰＧＲ関連遺伝子を表す１８個のプローブセットを含んだ。参照遺伝子の選択では、訓練データセットの３３１のホルモン受容体陽性ＨＥＲ２陰性ケースを使用して、可変性がほとんどなく試料間の再現性が高いプローブセットを選択した。最終的なリストは１０個のプローブセットを含んだ。
【０１８２】
ＳＥＴＥＲ／ＰＲは、
【数２】
2019514930.tif 000014
（式中、Ｔｉは、１８種の標的遺伝子のうちｉ番目の発現であり、Ｒｊは、１０種の参照遺伝子のうちｊ番目の発現である）のように定義される。０のスコア値における免疫組織化学的検査によるホルモン受容体陽性および陰性ケースへの分離を最適化するために、定数を加算した。
【０１８３】
ＳＥＴＥＲ／ＰＲの解析および解析前性能：発見プロセスで使用した技術的データセット中の集約されたＳＥＴＥＲ／ＰＲの性能を調べるため、本発明者らは、個々の候補の評価に関するものと同じ方法を使用した。加えて、線形モデルの当てはめを行い、異なるマイクロアレイプラットフォームの影響を評価した。ピアソン相関性を使用して、アッセイ内、アッセイ間、および研究室間の再現性を評価した。ランダム群内切片を用いた線形混合効果モデル（ＬＭＥ）を使用し、ｒパッケージｌｍｅ４を使用して、試料保存法（ＲＮＡｌａｔｅｒ対新鮮冷凍）および時間遅延（０対４０分）の影響を推定した。試料安定化遅延（冷虚血時間）の影響は、同様のモデルを使用し、一定の傾き（冷虚血時間の影響のため）およびランダム切片（腫瘍間の生物学的変動のため）を用いて査定した。尤度比検定を使用して目的のタームを含まない縮小モデルと完全なモデルを比較することにより、係数の統計的有意性を評価した。正常な乳房組織および肝臓組織の汚染の影響を調べるため、ＳＥＴＥＲ／ＰＲ値を汚染の百分率に対してプロットした。複数の評価者に関するＦｌｅｉｓｓのκ統計量を使用して、リスククラスの割り当ての再現性を評価した。
【０１８４】
転移性乳がんにおけるＳＥＴＥＲ／ＰＲ：生存期間の解析では、Ｒパッケージの生存期間を使用した。無増悪生存期間は、プロトコール処置の開始から疾患進行または全死因死亡までの時間であった。全生存期間のエンドポイントは、全死因死亡であった。以前の内分泌感受性は、転移性疾患の内分泌療法中に少なくとも６か月の無増悪生存期間または原発性乳がんのアジュバント内分泌療法中に５年の無増悪生存期間の履歴として定義した。連続的ＳＥＴＥＲ／ＰＲと内分泌感受性との間の関係にはロジスティック回帰を、生存転帰との関係にはＣｏｘ回帰を使用してモデリングを行った。二分されたスコアを使用して生存転帰を評価するために、カプラン・マイヤー法および対数順位検定を使用した。全ての統計解析および算出は、Ｒ  ｖ．３．１．２（Ｒ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ、２０１５年）およびＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ（Huberら、２０１５年）で行った。
【０１８５】
本明細書において開示および特許請求される方法の全ては、本開示を踏まえれば過度の実験を行うことなく実施および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態の観点から記述したが、これらの方法に、および本明細書に記述される方法のステップまたはステップの順序において、本発明の概念、趣旨、および範囲から逸脱することなく変更を適用してもよいことは当業者には明らかであろう。より明確に述べると、化学的かつ生理学的に関連しているある特定の薬剤を本明細書に記述される薬剤の代わりに用いながらも同じまたは同様の結果を達成することができることが明らかであろう。当業者にとって明らかな全てのこのような同様の置換および改変は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨、範囲、および概念に含まれるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載のものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する限りにおいて、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図４Ａ】
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【図６Ａ】
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【図７Ａ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１２】
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【図１４Ａ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１７Ａ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【国際調査報告】
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2019514930.tif 000076
2019514930.tif 000077
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