(57)【要約】本発明は、再灌流傷害の予防および／または治療に使用するためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストに関する。これらＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、ＣＤ３１ｓｈｅｄと呼ばれているＣＤ３１の切断型を有する細胞においてＣＤ３１シグナリングを修復できるペプチドまたはそのペプチド模倣薬である。本発明に係るＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、特に、虚血を治療するために使用される再灌流により引き起こされる臓器損傷から保護する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
再灌流傷害の予防および／または治療に使用するためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト。
【請求項２】
前記ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストが、
ａ）（ｉ）配列番号１の配列のアミノ酸５７９〜６０１位により定義されている配列の３〜１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチドと、
（ｉｉ）非ヒト哺乳類ＣＤ３１における配列番号１の配列のアミノ酸５７９〜６０１位に対応する配列の３〜１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチドと、
（ｉｉｉ）ペプチド（ｉ）の配列と少なくとも７０％同一である配列からなる３〜１５アミノ酸のペプチドと、
（ｉｖ）ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）のレトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）配列からなるペプチドと、
（ｖ）少なくとも１つもしくは少なくとも１つのさらなる化学的修飾を含むペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、もしくは（ｉｖ）と
からなる群で選択されるペプチド、または
ｂ）ペプチドａ）のペプチド模倣薬
である、請求項１に記載の使用のためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト。
【請求項３】
前記ペプチド（ｖ）が、少なくとも１つのＤ−エナンチオマー型のアミノ酸を含む、請求項２に記載の使用のためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト。
【請求項４】
前記ペプチドが水溶性である、請求項２または３に記載の使用のためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト。
【請求項５】
前記ペプチドが、ペプチダーゼに抵抗性である、請求項２〜４のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト。
【請求項６】
前記ペプチドが、配列番号２の配列のペプチド、配列番号３の配列のペプチド、配列番号４の配列のペプチド、配列番号５の配列のペプチド、Ｄ−エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号６の配列のペプチド、配列番号７の配列のペプチド、およびＤ−エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号８の配列のペプチドからなる群で選択される、請求項２〜５のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト。
【請求項７】
前記ペプチドが、配列番号５の配列のペプチド、またはＤ−エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号６の配列のペプチドである、請求項６に記載の使用のためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト。
【請求項８】
再灌流が、虚血を治療するために使用される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト。
【請求項９】
虚血が、心筋梗塞、虚血性大腸炎、腸間膜虚血、脳卒中、下肢の虚血、急性血液量減少からもたらされる内臓の虚血、炎症性疾患からもたらされる虚血、動脈枝の一部を除く体外循環血液固有の虚血、内臓および／または大動脈の手術に固有の虚血、冷阻血、臓器移植を目的とする移植片の加温再灌流に固有の虚血、ならびにそれらの組み合わせからなる群で選択される、請求項８に記載の使用のためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト。
【請求項１０】
前記ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストを、再灌流の前および／または間に投与する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト。
【請求項１１】
前記ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストを静脈内投与する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト。
【請求項１２】
前記ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストを再灌流の間持続的に投与する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト。
【請求項１３】
前記ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの第１のボーラス投与を単回投与で投与し、次いで前記ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの第２のボーラス投与を持続的に投与する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト。
【請求項１４】
前記ＣＤ３１アゴニストを、最大４８時間投与する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再灌流傷害の予防および／または治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
虚血は、組織への血液供給が重度に制限されているかまたは停止している病態であり、細胞の代謝に必要な酸素およびグルコースの欠乏を引き起こす。虚血は、たとえば、重大な動脈狭窄の存在、アテローム硬化性プラークにおける閉塞性血栓の形成、または血管のクランピングによるものであり得る。また、動脈血栓症は、動脈および静脈の両方を含む、閉塞の下流での血管中の血液うっ滞を特徴とする。虚血は、心筋梗塞、脳卒中、腸間膜虚血、または下肢の虚血などの命に関わる重大な病態の根底にあるプロセスである。きわめて好気性の組織、たとえば心臓、脳、および腸では、組織への不可逆的な虚血性の損傷が、非常に容易に起こり得る。
【０００３】
虚血の間、ミトコンドリアは、もはやクエン酸回路を介してＡＴＰを産生することが徐々にできなくなる。これらは、解糖系を嫌気性に切り替え、それによって乳酸塩の産生および細胞内媒体の酸性化がもたらされ、主な組織の代謝不全を引き起こす。心筋では、これらの現象により、力学的収縮が阻害され、急性の心筋の機能不全を引き起こす。腸間膜虚血では、これらは、多くの場合、腸上皮の病変および筋肉保護の喪失と関連しており、血液中のバクテリアルトランスロケーションが引き起こされる。
【０００４】
長期間の虚血は、低灌流組織または非灌流組織に対応する領域の壊死をもたらし、臓器の機能を不可逆的に損なう場合がある。
【０００５】
虚血により引き起こされる組織損傷を止めることのできる唯一の対抗策は、再灌流である。再灌流は、機械的（たとえば血管形成術またはバイパス手術）、薬理学的（線溶剤を用いた灌流）、または自然（内因性線維素溶解）であり得る。しかしながら、虚血組織の再灌流はその生存に重要ではあるが、虚血組織における血液供給の再灌流は、再灌流傷害と呼ばれるさらなる損傷を引き起こす。虚血臓器での再灌流により引き起こされるさらなる損傷は、細胞が酸素の非存在下に細胞自身を適合させるように代謝を変化させた環境に急激に酸素が供給されたことに疑いなく関与している。
【０００６】
接着分子の阻害剤（たとえばＲｈｕＭａｂ  ＣＤ１８抗体、Ｈｕ２３Ｆ２Ｇ抗体、および糖タンパク質ｒＰＳＬＧ−Ｉｇ）が、候補薬物として提案されている。残念なことに、血管再建と併用した、当該分子の使用に基づく臨床試験のすべてが、心筋梗塞の大きさを制限することに失敗した。
【０００７】
ＣＤ３１は、６つのＩｇ様細胞外ドメイン、短い膜貫通セグメント、および細胞質テールを含む１３０ｋＤａの一本鎖の糖タンパク質である。細胞質テールは、免疫受容体チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ：ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄｉｎ  ｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ）として作用する、２つの重要なチロシンベースのモチーフ（Ｙ６６３およびＹ６８６周辺）を含む。
【０００８】
細胞内ＣＤ３１のＩＴＩＭは、ＣＤ３１が、内因性キナーゼ活性を有さないため、休止状態ではリン酸化されない。ＣＤ３１分子は、相互作用する細胞間のＩｇ−様ドメイン１〜２のトランス型同種親和性の連携を介して互いに結合する。このトランス同種親和性結合は、膜平面でＣＤ３１分子のクラスタリングを誘発するために必要であり、次に、シス同種親和性の膜近傍配列を必要とする。次に、ＩＴＩＭが他のクラスター関連膜受容体（たとえばＴ細胞受容体など）によって近くに運ばれるチロシンキナーゼの活性に曝露され得るため、ＣＤ３１細胞内ＩＴＩＭのリン酸化が起こり得る。細胞内ＩＴＩＭのリン酸化は、細胞内ＳＨ２含有ホスファターゼの動員および活性化を引き起こす。最も近くの膜受容体に関連するシグナリングアダプターに応じて、ＳＨ２含有ホスファターゼの活性化は、シグナリングカスケードの活性化（たとえばＧＡＢ／ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、接着の駆動、内皮細胞の生存および増殖、ｆｏｘｐ３の発現およびリンパ球の調節性表現型への分化、能動的細胞―細胞脱離の駆動）、またはそれらの阻害（たとえばＪＡＫ／ＳＴＡＴ、白血球および血小板の活性化の予防）を引き起こし得る。よって、ＣＤ３１の機能は、細胞の種類に応じて変動する。
【０００９】
国際特許公開公報第２０１０／０００７４１号は、活性化Ｔリンパ球／メモリーＴリンパ球でのＣＤ３１の想定される喪失が、実際には不完全であり、５番目および６番目の細胞外Ｉｇ様ドメイン間のＣＤ３１の脱落からもたらされることを開示している。次に、ＣＤ３１の脱落した細胞外ドメイン（「可溶性ＣＤ３１」とも呼ばれている）は、循環へ放出され、これは、循環中でＣＤ３１の可溶性のスプライスバリアントと共に存在している。脱落後に膜に固定されたままになっている残りの小さなＣＤ３１エクトドメインは、「ＣＤ３１ｓｈｅｄ」と呼ばれている。この文書はまた、強力なホモオリゴマー形成を介してＣＤ３１ｓｈｅｄを架橋することによりＣＤ３１の生理的な免疫調節性機能を救出することができる、ＣＤ３１のエクトドメインの膜近傍アミノ酸に対応するペプチドをも開示している。このようなペプチドは、血栓性障害または自己免疫性障害の治療に有用である。血栓性障害に関して、これらペプチドは、実際に、たとえばプラーク成長の加速、動脈解離、および動脈瘤の形成を予防することにより、アテローム血栓症およびアテローム性動脈硬化に直接作用している。
【００１０】
国際特許公開公報第２０１３／１９００１４号は、血栓性障害または炎症性障害の治療への有用性を保持し、薬物開発により適した物理化学的な特性を提示している、細胞外ＣＤ３１の膜近傍近位部分内の８アミノ酸の特異的ペプチドを開示している。ペプチドＰ８ＲＩは、たとえばヒト血小板の凝集およびトロンビンの産生を低減させることにより、血栓性閉塞を予防する。
【００１１】
治療されていないアテローム性血栓症またはアテローム性動脈硬化症などの血栓性障害は、虚血を引き起こす場合があり、よって、虚血に先行し得る。狭義の意味では、虚血は、実際には、血栓性障害ではなく、臓器への血液流の妨害を表しており、血栓性障害の原因ではない。
【００１２】
よって、再灌流傷害の予防および／または治療のため、特には再灌流により引き起こされる臓器損傷を少なくとも低減するための解決法を提供することが、未だ必要とされている。
【００１３】
本発明の説明
驚くべきことに、本発明者らは、細胞表面に存在するＣＤ３１の切断型（本明細書中ＣＤ３１ｓｈｅｄと呼ばれている）に結合することにより、ＣＤ３１シグナリングを引き起こすことができるＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストが、再灌流傷害などの、好中球の爆発的な活性化を含む急性の病理学的状況に有用であることを見出した。前記ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、好ましくは、Ｄ−エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号６の配列のペプチドＰ８ＲＩなどの合成ペプチドである。
【００１４】
実際には、ＣＤ３１は、顆粒球の表面で高度に発現している。さらに、本発明者らは、顆粒球および内皮細胞において、ＣＤ３１が、細胞の活性化により切断されることを見出した。ＣＤ３１の切断は、その同種親和性のＣＤ３１−ＣＤ３１の恒常的機能を無効にする。
【００１５】
顆粒球は再灌流傷害により行われる炎症性組織損傷に関与する主な細胞であるため、これにより、再灌流傷害の予防および／または治療におけるＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの治療効果を説明することが可能である。それでもなお、再灌流に関与している細胞事象の複雑さを考慮すると、顆粒球により媒介される炎症性プロセスを主に標的とする（関連する代謝プロセスを標的としない）ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストのみを投与することの治療効果は、非常に驚くべきものである。
【００１６】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、好適には、標的となる血液要素（本質的に、急性再灌流の状況下の好中球および血小板）を枯渇させず、または決定的に抑制せず、創傷治癒におけるその生理的機能を保存できると考えられている。
【００１７】
実際に、本発明者らは、再灌流の前に、虚血を罹患した動物へＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストのみを投与することにより、壊死性損傷の程度を有意に減少させることができることを示した。実際に、（ＣＤ３１ノックアウトマウスにおける）ＣＤ３１の喪失は、心筋梗塞のマウスモデル（左前の冠動脈結紮）において、再灌流により引き起こされる組織の壊死および死亡率を増大させる（たとえば図１を参照）。対照的に、虚血−再灌流期間の間にペプチドＰ８ＲＩを投与すると、治療されていない対照マウスと比較することにより、壊死領域の大きさを強力に減少させることができる。
【００１８】
その上、腸間膜動脈の一過性閉塞モデルでは、ペプチドＰ８ＲＩの投与は、腸の壊死を予防するだけでなく、遊離ＤＮＡのレベルの進行性増加の停止、血中の空腹時（ｉｎｔｒａ−ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ）ヘモグロビンの濃度およびＬＰＳの分泌の減少、ならびに腸の絨毛表面の粘液の組織学的保存により示されるように、バクテリアルトランスロケーションをも予防する。
【００１９】
よって、本発明は、再灌流傷害の予防および／または治療に使用するためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストであって、細胞表面に存在するＣＤ３１ｓｈｅｄに結合し、前記結合が、少なくとも１つのＣＤ３１ｓｈｅｄＩＴＩＭチロシンのリン酸化をもたらす、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストに関する。
【００２０】
本発明に係るＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの使用は、特に、
壊死の進行を停止もしくは遅延させて、たとえば（たとえば心臓、脳、腸、腎臓、および／もしくは肢における）加温再灌流の間、壊死領域、特に虚血性の組織もしくは臓器の大きさを減少させることができ、
再灌流後の臓器生存の機会を増大させることができ、
再灌流した組織の血管病変（複数可）および／もしくは組織内の出血を停止もしくは制限（たとえば、脳における虚血性脳卒中の出血性変質を停止もしくは限定；上皮、特に腸の出血性の壊死を停止もしくは制限）でき、ならびに／または
（特に、再灌流の間、腸間膜虚血に加えて腸上皮において）バクテリアルトランスロケーションを制限でき、ならびに／または
組織もしくは臓器の移植の場合に、冷阻血時間を増大および／もしくは移植片の回復を改善することができる。
【００２１】
特に本発明は、上記に定義されている再灌流傷害の予防および／または治療に使用するためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストであって、再灌流が、心筋梗塞、虚血性大腸炎、腸間膜虚血、脳卒中、下肢の虚血、急性血液量減少からもたらされる内臓の虚血、炎症性疾患からもたらされる虚血、医療処置に固有の虚血（動脈枝の一部を除く体外循環血液に固有の虚血、内臓および／または大動脈の手術に固有の虚血、冷阻血、および／または臓器移植を目的とする移植片の加温再灌流に固有の虚血）、ならびにそれらの組み合わせなどの虚血を治療するために使用される、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストに関する。
【００２２】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、好ましくは、
再灌流の前および／もしくは最中、好ましくは可能な場合には、虚血―再灌流期間の前および／もしくは最中に、
持続注入下を含む、静脈内に、
特に虚血を回復させることができない場合には、再灌流の間、持続的に、ならびに／または
短期間の間、たとえば最大４８時間、より好ましくは最大２４時間、
使用または投与される。
【００２３】
また本発明は、上記に定義されているように使用するためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストであって、前記ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの第１の投与が、好ましくは虚血の前（たとえば虚血が、大動脈および／または内臓の手術などの医療処置、冷阻血、および／または臓器移植を目的とする移植片の温性再灌流に固有である場合）に、単回投与として使用され、前記ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの第２の投与が、特に虚血−再灌流の期間の間継続的に使用される、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストに関する。
【００２４】
上記に定義されているように使用するためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、好ましくは、
ａ）
（ｉ）配列番号１の配列のアミノ酸５７９〜６０１位により定義されている配列の３〜１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチド、
（ｉｉ）非ヒト哺乳類のＣＤ３１における配列番号１の配列のアミノ酸５７９〜６０１位に対応する配列の３〜１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチド、
（ｉｉｉ）ペプチド（ｉ）の配列と少なくとも７０％同一である配列からなる３〜１５アミノ酸のペプチド、
（ｉｖ）ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）のレトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）配列からなるペプチド、および
（ｖ）少なくとも１つもしくは少なくとも１つのさらなる化学的修飾を含むペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、もしくは（ｉｖ）
からなる群から選択されるペプチド、または
ｂ）前記ペプチドａ）のペプチド模倣薬
である。
【００２５】
好ましくは、前記ペプチドは、水溶性であり、かつ／またはペプチダーゼに抵抗性である。
【００２６】
一実施形態では、上記に定義されているように使用するためのペプチドは、その安定性および／または生物学的利用率を改善するために少なくとも１つの化学的修飾を含む。
【００２７】
好ましい実施形態では、前記ペプチドは、少なくとも１つの人工的なアミノ酸を含み、前記人工的なアミノ酸は、好ましくは、Ｄ−エナンチオマーのアミノ酸、βメチルアミノ酸、α置換型αアミノ酸、およびアミノ酸類似体からなる群から選択される。
【００２８】
さらなる好ましい実施形態では、前記ペプチド（ｖ）は、少なくとも１つのＤ−エナンチオマー型のアミノ酸を含む。
【００２９】
上記に定義されているように使用するためのペプチドの例として、配列番号２の配列のペプチド、配列番号３の配列のペプチド（ＰｅｐＲｅｇ  ＣＤ３１とも呼ばれている）、配列番号４の配列のペプチド、配列番号５の配列のペプチド（Ｐ８Ｆとも呼ばれている）、Ｄ−エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号６の配列のペプチド（Ｐ８ＲＩとも呼ばれている）、配列番号７の配列のペプチド、およびＤ−エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号８の配列のペプチドがある。
【００３０】
上記に定義されているように使用するための好ましいペプチドは、配列番号５の配列のペプチド、またはＤ−エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号６の配列のペプチドである。
【００３１】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト
「ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト」は、本明細書中では、細胞表面に存在するＣＤ３１ｓｈｅｄに結合する化合物であって、上記結合が、少なくとも１つのＣＤ３１ｓｈｅｄＩＴＩＭチロシンのリン酸化をもたらす、化合物を意味する。
【００３２】
ＩＴＩＭ（免疫受容抑制性チロシンモチーフ：Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｍｏｔｉｆ）は、コンセンサス配列Ｔ／Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｓ−ｘ−Ｙ−ｘ−ｘ−Ｌ／Ｖ／Ｉ（式中ｘは任意のアミノ酸を表す）からなる。
【００３３】
ＣＤ３１（およびＣＤ３１ｓｈｅｄ）は、概して、２つのＩＴＩＭを含む。
【００３４】
たとえば、２つのヒトＣＤ３１  ＩＴＩＭは、配列ＶＱＹＴＥＶの６６３  ＩＴＩＭ、および配列ＴＶＹＳＥＶの６８６  ＩＴＩＭである。
【００３５】
配列番号１の配列では、６６３  ＩＴＩＭのチロシンは６９０位にあり、６８６ＩＴＩＭのチロシンは７１３位にある。
【００３６】
たとえば、２つのマウスＣＤ３１  ＩＴＩＭは、配列ＶＥＹＴＥＶの６６３  ＩＴＩＭおよび配列ＴＶＹＳＥＩの６８６  ＩＴＩＭである。
【００３７】
細胞表面に存在するＣＤ３１ｓｈｅｄへのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの結合は、好ましくは、ＣＤ３１ｓｈｅｄの６８６  ＩＴＩＭの少なくともチロシンをリン酸化する。
【００３８】
細胞表面に存在するＣＤ３１ｓｈｅｄへの化合物の結合は、当業者に周知のいずれかの方法により、評価され得る。
【００３９】
たとえば、この結合は、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、またはｂｅｔａ−ｉｍａｇｅｒにより測定され得る。
【００４０】
好ましい実施形態では、細胞表面に存在するＣＤ３１ｓｈｅｄへの化合物の結合は、以下のように評価される：試験される化合物、または陰性対照としての無関係の類似体を、蛍光プローブ（たとえばフルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｅ））に結合させる。この化合物を、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含む生理食塩水バッファー（ＨＢＳＳ、培養培地）中１０６個の細胞／ｍｌの密度のＣＤ３１＋細胞（たとえば、ＪｕｒｋａｔＴ細胞などの細胞株、または末梢血Ｔ細胞などの初代培養細胞に由来）と共に連続希釈（たとえば１、１０、１００μｍｏｌ）でインキュベートする。細胞活性化因子（たとえば細胞がＴリンパ球の場合、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ｅ抗体＋２０μｇ／ｍｌの二次的なＦ（ａｂ’）２フラグメントなどのＴＣＲ架橋）の存在下で、同等の条件をインキュベートする。この反応を、５または２０分後に停止させた後、冷却バッファーでの洗浄ステップを繰り返す。細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、再度洗浄する。個々の細胞における試験される化合物の結合は、フローサイトメーターを使用して相対的な蛍光シグナルにより検出する。対照と比較して特定の化合物に関するシグナルが大きいこと、および休止細胞と比較して細胞の活性化因子を含む状態のシグナルが大きいことは、ＣＤ３１ｓｈｅｄへの適切な結合を表す。
【００４１】
少なくとも１つのＣＤ３１ｓｈｅｄＩＴＩＭ  チロシンのリン酸化は、直接、またはたとえば、アゴニストによりリン酸化される、細胞内ＳＨ−２チロシンホスファターゼのリン酸化を測定することにより間接的に評価され得る。
【００４２】
少なくとも１つのＣＤ３１ｓｈｅｄＩＴＩＭ  チロシンおよび／または細胞内ＳＨ−２チロシンホスファターゼのリン酸化は、当業者に周知のいずれかの方法により、評価され得る。
【００４３】
たとえば、少なくとも１つのＣＤ３１ｓｈｅｄのＩＴＩＭ  チロシンのリン酸化は、以下のように評価され得る：試験される化合物を、蛍光プローブ（たとえばフルオレセイン）に結合させる。この化合物を、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含む生理食塩水バッファー（ＨＢＳＳ、培養培地）中１０６個の細胞／ｍｌの密度のＣＤ３１＋細胞（たとえば、ＪｕｒｋａｔＴ細胞などの細胞株、または末梢血Ｔ細胞などの初代培養細胞に由来）と共に連続希釈（たとえば１、１０、１００μｍｏｌ）でインキュベートする。細胞活性化因子（たとえば細胞がＴリンパ球の場合、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ｅ抗体＋２０μｇ／ｍｌの二次的なＦ（ａｂ’）２フラグメントなどのＴＣＲ架橋）の存在下で、同等の条件をインキュベートする。この反応を、５または２０分後に停止させた後、冷却バッファー（ｃｏｕｌｄ  ｂｕｆｆｅｒ）での洗浄ステップを繰り返す。細胞を、パラホルムアルデヒドで固定し、メタノール含有バッファー（たとえばＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＰｅｒｍＢｕｆｆｅｒ  ＩＩＩ）で透過処理し、再度洗浄する。ＣＤ３１ｓｈｅｄのＩＴＩＭ  チロシン  ＣＤ３１（たとえばｐＹ６８６）または細胞内ＳＨ−２チロシンホスファターゼ（ｐＳＨＰ２  Ｙ５４２）の細胞内染色を、透過処理バッファーで希釈した適切な蛍光抗体を使用して、４℃の暗室において３０分間行う。次に、細胞を繰り返し洗浄し、相対的な蛍光シグナルを、フローサイトメーターで得る。
【００４４】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、好ましくは、少なくとも１つのＣＤ３１ｓｈｅｄ  ＩＴＩＭ  チロシンおよび／または細胞内ＳＨ−２チロシンホスファターゼのリン酸化の用量依存的な増加を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでもたらす。
【００４５】
少なくとも１つのＣＤ３１ｓｈｅｄ  ＩＴＩＭ  チロシンのリン酸化はまた、好中球、血小板、および／または内皮細胞の活性化の阻害を測定することにより、間接的に評価され得る。
【００４６】
好中球、血小板、および／または内皮細胞の活性化の阻害は、たとえばＣＤ３１アゴニストが、同等条件の刺激として同じ時間に添加される、当業者に周知のいずれかの方法により評価されてもよい。
【００４７】
たとえば、好中球の活性化は、表面インテグリンの発現の増大により、評価することができる。Ｐｅｒｃｏｌｌ（登録商標）で精製した末梢血の好中球を、組み換え型のヒトＩＬ−８またはＴＮＦαでプライミングし、次にｆＭＬＰで完全に活性化させる。３０分後に、細胞を、細胞活性化時に劇的に増加するβ２インテグリンＣＤ１１ｂなどの細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体で染色し、フローサイトメトリーの適切な蛍光チャネルにより解析する。
【００４８】
血小板の活性化は、ＣＤ６２Ｐ（Ｐ−セレクチン）の放出により評価することができる。たとえば、末梢静脈血由来の血小板を多く含む血漿を、ＣＤ３２Ａ（Ｆｃ受容体を活性化）に対するモノクローナル抗体で刺激する。この反応を、ＥＤＴＡを添加することにより３０分後に停止する。次に、試験管を遠心分離し、その上清を、可溶性ＣＤ６２Ｐの測定に使用する（市販のＥＬＩＳＡまたはビーズベースの試験）。
【００４９】
内皮細胞の活性化は、ＶＣＡＭ−１の発現により評価することができる。たとえば、ヒト初代培養内皮細胞（臍静脈または冠動脈由来であり、両者ともＰｒｏｍｏｃｅｌｌで市販されている）、継代２〜３を、無菌性カバーガラス（ｃｏｖｅｒｌｉｐ）上で培養し、ＴＮＦαで一晩刺激する。翌日、カバーガラスを固定し、ＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６）に対するモノクローナル抗体および適切な蛍光標識二次抗体で染色した後、核の対比染色を行い、および蛍光顕微鏡によるＶＣＡＭ−１陽性細胞の解析を行う。
【００５０】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、好ましくは、好中球、血小板、および／または内皮細胞の活性化の用量依存的な阻害をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。
【００５１】
好ましい実施形態では、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、ペプチドまたはそのペプチド模倣薬である。
【００５２】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストとして使用されるペプチド
本発明の一実施形態では、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストはペプチドである。
【００５３】
本ペプチドは、好ましくは、国際特許公開公報第２０１０／０００７４１号または同２０１３／１９００１４号で開示されているペプチドである。
【００５４】
好ましくは、ＣＤ３１ペプチドは合成ペプチドである。
【００５５】
「合成ペプチド」では、ペプチドが生きている生物、たとえばヒトの体内に存在しないことが意図されている。
【００５６】
合成ペプチドは、組成物またはキットの一部であってもよい。
【００５７】
合成ペプチドは、好ましくは精製されている。
【００５８】
本ペプチドは、
（ｉ）配列番号１の配列のアミノ酸５７９〜６０１位により定義されている配列の３〜１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチド、
（ｉｉ）非ヒト哺乳類ＣＤ３１における配列番号１の配列のアミノ酸５７９〜６０１位に対応する配列の３〜１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチド、
（ｉｉｉ）ペプチド（ｉ）の配列と少なくとも７０％同一である配列からなる３〜１５アミノ酸のペプチド、
（ｉｖ）ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）のレトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）配列からなるペプチド、および
（ｖ）少なくとも１つまたは少なくとも１つのさらなる化学的修飾、好ましくは少なくとも１つのＤ−エナンチオマー型のアミノ酸を含むペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）
からなる群から選択され得る。
【００５９】
「フラグメント」は、本明細書中では、連続したアミノ酸の配列を表す。たとえばフラグメントは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸のフラグメントであってもよい。
【００６０】
配列番号１の配列のアミノ酸５７９〜６０１位により定義されている配列は、配列番号１２の配列である。
【００６１】
よって、本ペプチドは、配列番号１２の配列の３〜１５アミノ酸のフラグメントからなってもよい。
【００６２】
また本ペプチドは、非ヒト哺乳類ＣＤ３１における配列番号１２の配列に対応する配列の３〜１５アミノ酸のフラグメントからなってもよい。
【００６３】
非ヒト哺乳類のＣＤ３１の非限定的な例として、配列番号９の配列のマウスＣＤ３１、配列番号１０の配列のウシＣＤ３１、および配列番号１１の配列のブタＣＤ３１がある。
【００６４】
当業者は、配列番号１の配列のアミノ酸５７９〜６０１位に対応する配列、すなわち非ヒト哺乳類ＣＤ３１タンパク質における配列番号１２に対応する配列を、たとえば配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１の配列のうちの１つを用いて、配列番号１の配列と前記非ヒト哺乳類ＣＤ３１タンパク質との間で配列アライメントを行うことにより、容易に同定することができる。
【００６５】
たとえば公開されているコンピュータソフトウェア、たとえばＢｉｏＰｅｒｌ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＣＳ−ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＬＡＬＩＧＮ、Ｊａｌｉｇｎｅｒ、ｍａｔｃｈｅｒ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア、およびアライメントアルゴリズム、たとえばＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する、配列のアライメントおよび配列の同一性の決定に関する方法は、当該分野で周知である。
【００６６】
本発明に係るＣＤ３１ペプチドの配列は、好ましくはヒトＣＤ３１またはマウスＣＤ３１の配列に由来する。
【００６７】
本ペプチドはまた、ペプチド（ｉ）、すなわち配列番号１の配列のアミノ酸５７９〜６０１位により定義されている配列の３〜１５アミノ酸のフラグメントの配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、または少なくとも９０％同一である配列からなる３〜１５アミノ酸のペプチドであってもよい。
【００６８】
４〜６アミノ酸の所定の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列は、前記所定の配列と最大１つのアミノ酸が異なる。
【００６９】
７〜９アミノ酸の所定の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列は、前記所定の配列と最大２つのアミノ酸が異なる。
【００７０】
１０〜１３アミノ酸の所定の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列は、前記所定の配列と最大３つのアミノ酸が異なる。
【００７１】
１４または１５アミノ酸の所定の配列と少なくとも７０％同一のペプチド配列は、前記所定の配列と最大４つのアミノ酸が異なる。
【００７２】
「参照配列と少なくともｘ％同一である配列」は、対象ペプチドのアミノ酸配列が、参照配列と同一であるか、または参照配列の各１００個のアミノ酸あたり最大１００−ｘ個のアミノ酸変化によって参照配列と異なることが意図されている。言い換えると、参照アミノ酸配列と少なくともｘ％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列のアミノ酸残基の最大１００−ｘ％を、挿入、欠失、または別のアミノ酸に置換してもよい。
【００７３】
２つ以上の配列の同一性を比較するための方法は、当該分野で周知である。たとえば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン９．１で利用可能なプログラム、たとえばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを使用して、２つのポリペプチド配列間の％同一性を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの「ローカルホモロジー（ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」アルゴリズムを使用し、２つの配列間で最良に類似性のある単一の領域を発見する。配列間の同一性を決定するための他のプログラムもまた、当該分野で周知であり、たとえばＮｅｅｄｌｅプログラムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  （１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３に記載されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムに基づいており、たとえば、ポリペプチド配列の比較に関して以下のパラメータを用いる：比較行列：ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップオープンペナルティ：１０、およびギャップ伸長ペナルティ：０．５、エンドギャップペナルティ：ｆａｌｓｅ、エンドギャップオープンペナルティ＝１０、エンドギャップ伸長ペナルティ＝０．５；ならびにポリヌクレオチド配列の比較に関して以下のパラメータを用いる：比較行列：ＤＮＡＦＵＬＬ；ギャップオープンペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．５、エンドギャップペナルティ：ｆａｌｓｅ、エンドギャップオープンペナルティ＝１０、エンドギャップ伸長ペナルティ＝０．５。
【００７４】
参照配列と「少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である」アミノ酸配列からなるペプチドは、参照配列と比較して、欠失、挿入、および／または置換などの変異を含み得る。
【００７５】
置換の場合、置換は、好ましくは、以下の表１に表されている保存的置換に対応する。好ましい実施形態では、参照配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であるアミノ酸からなるペプチドは、保存的置換のみにより参照配列と異なる。
【表１】
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【００７６】
別の好ましい実施形態では、参照配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であるアミノ酸配列からなるペプチドは、参照配列の天然に存在するアレルのバリアントに対応する。
【００７７】
さらなる別の好ましい実施形態では、参照配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であるアミノ酸配列からなるペプチドは、参照配列と比較して、別の非ヒト哺乳類種に由来するホモログ配列に対応する。
【００７８】
好ましい実施形態では、参照配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であるアミノ酸配列からなるペプチドは、保存的置換により参照配列と異なり、および／または参照配列と比較して別の非哺乳類種に由来するホモログ配列に対応する。
【００７９】
「ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）のレトロ−インベルソ配列からなるペプチド」との表現は、本明細書中で、そのアミノ酸が、ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）の配列とそれぞれ比較すると逆の順番にあり、天然に存在するＬ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸からなるという点で、ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）と異なるペプチドを意味する。
【００８０】
アミノ酸のＤ−エナンチオマー（Ｄ−アミノ酸とも呼ばれている）は、対応するＬ−エナンチオマー（Ｌ−アミノ酸とも呼ばれている）と同一の文字ではあるが小文字により表されている。よって、たとえばアルギニンのＬ−エナンチオマーは「Ｒ」と表されるが、Ｄ−エナンチオマーは、「ｒ」と表されている。
【００８１】
好ましくは、本ペプチドは、有機溶媒はまたは非有機溶媒に可溶性である。
【００８２】
好ましい実施形態では、本ペプチドは水溶性である。より具体的には、本ペプチドは、好ましくは、水および／またはＮａＣｌ（９ｇ／Ｌ）、ＰＢＳ、トリス、もしくはトリス−リン酸などの水性バッファーに可溶性である。水および水性バッファーに可溶であることは、薬理学的観点から特に好適である。このような可溶性のため、本ペプチドは、たとえば少なくともまたは最大、１マイクロモル濃度、１０マイクロモル濃度、５０マイクロモル濃度、１００マイクロモル濃度、５００マイクロモル濃度、１ｍＭ、５０ｍＭ、または１００ｍＭに等しい濃度で、水溶液に溶解し得る。
【００８３】
水に容易に溶解できる本発明のペプチドは、少なくとも１つの荷電アミノ酸（好ましくはアルギニン（Ｒ）および／またはリジン（Ｋ））の存在により得ることができる（前記荷電アミノ酸は、２つの疎水性残基の間に含まれていない）。
【００８４】
よって、好ましい実施形態では、本発明に係るペプチドは、少なくとも１つの荷電アミノ酸、好ましくはアルギニンおよび／またはリジンを含み、前記荷電アミノ酸は、２つの疎水性残基の間に含まれていない。
【００８５】
より好ましい実施形態では、前記荷電アミノ酸は、配列のＮ末端またはＣ末端のいずれかに位置している。
【００８６】
たとえば、本発明に係る好ましいペプチドの配列は、モチーフＲＶ（たとえばＶＲＶの代わりに）で始まる。
【００８７】
好ましい実施形態では、本ペプチドは、ペプチダーゼ、特に真核生物のペプチダーゼに抵抗性である。
【００８８】
「ペプチダーゼに抵抗性である」は、本明細書中では、哺乳類の血清と共に３７℃でインキュベーションした後、または生きている実験動物に注射した後に、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）および質量分析（ＭＳ）により決定した場合に、ペプチドが未消化なままであることを意味する。ペプチドの血清中での安定性を評価することを目的とする臨床試験は、十分に規格化されている（たとえばＪｅｎｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ａｓｐｍｏ，  ２００８，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４９４，  １７７−１８６を参照されたい）。非常にペプチターゼ抵抗性であるペプチドは、タンパク質分解酵素の存在下で、元の質量の最大７０％が未消化のままであり、および／または２４０分より長い半減期を示すペプチドである（たとえば、Ｋｕｍａｒａｓｉｎｇｈｅ  ａｎｄ  Ｈｒｕｂｙ，  ２０１５，  Ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ｂ．Ｍ．  Ｄｕｎｎ，  ｅｄ．  （Ｈｏｂｏｋｅｎ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：  Ｗｉｌｅｙ），  ｐｐ．  ２４７−２６を参照）。
【００８９】
本ペプチドは、好ましくは、可溶性ペプチダーゼまたは細胞表面に存在するペプチダーゼなどの、血中に存在するペプチダーゼに抵抗性である。
【００９０】
また本ペプチドは、好ましくはその安定性および／生物学的利用率を改善するために、少なくとも１つまたは少なくとも１つのさらなる化学的修飾を含んでもよい。
【００９１】
このような化学的修飾は、一般的に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける酵素的分解に対するペプチドの保護を増大させ、および／または膜障壁を通る能力を増大させることにより、その半減期が増加する、および／またはその生物活性を維持もしくは改善するペプチドを得ることを目的とする。
【００９２】
本ペプチドは、少なくとも１つの人工的なアミノ酸を含んでもよく、上記人工的なアミノ酸は、好ましくは、Ｄ−エナンチオマーのアミノ酸、βメチルアミノ酸、α置換型αアミノ酸、およびアミノ酸類似体からなる群から選択される。
【００９３】
「βメチルアミノ酸」は、本明細書中、側鎖にアミノメチル基を含むアミノ酸アラニンの誘導体を意味する。この非タンパク質原性アミノ酸は、極性塩基として分類される。
【００９４】
「α置換型αアミノ酸」は、本明細書中、Ｌアミノ酸のα炭素上の基（ＮＨ２）が、別の非タンパク質性の基、たとえばメチル基、アリール基、またはアシル基に変化していることを意味する。
【００９５】
「アミノ酸類似体」は、本明細中、天然のアミノ酸の他のいずれかの人工的な類似体を意味する。
【００９６】
よって、本ペプチドは、少なくとも１つのＤ−エナンチオマー型のアミノ酸を含む。たとえば、上記に定義されているペプチドのアミノ酸のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個が、Ｄ−エナンチオマー型であってもよい。
【００９７】
一実施形態では、本ペプチドは、Ｄ−アミノ酸からなる。
【００９８】
また本ペプチドは、逆位の配列、すなわちアミノ酸鎖の逆位を（Ｃ末端からＮ末端までに）含んでもよい。本ペプチドのアミノ酸配列全体が逆位であってもよく、またはアミノ酸配列の一部が逆位であってもよい。たとえば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸の連続した配列が逆位であってもよい。本明細書中「逆位の」アミノ酸の意味は、配列における連続したアミノ酸の配列の逆位を表す。
【００９９】
他の化学的修飾として、限定するものではないが、
ペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端への修飾、たとえばＮ末端のアシル化（好ましくはアセチル化）もしくは脱アミノ化、もしくはＣ末端カルボキシル基のアミド基もしくはアルコール基への修飾、
２つのアミノ酸間でのアミド結合での修飾：２つのアミノ酸を結合するアミド結合の窒素原子もしくはα炭素でのアシル化（好ましくはアセチル化）、もしくはアルキル化（好ましくはメチル化）、
２つのアミノ酸を結合するアミド結合のα炭素での修飾、たとえば、２つのアミノ酸を結合するアミド結合のα炭素でのアシル化（好ましくはアセチル化）もしくはアルキル化（好ましくはメチル化）、
１つもしくは複数の天然に存在するアミノ酸（Ｌ−エナンチオマー）が、アミノ酸鎖の逆位（Ｃ末端からＮ末端まで）と共に、対応するＤ−エナンチオマーに置換されている、レトロインベルソ、
１つもしくは複数のα炭素が窒素原子に置換されている、アザペプチド、ならびに／または
１つもしくは複数のアミノ酸のアミノ基が、α炭素よりもβ炭素に結合する、βペプチド
が、挙げられる。
【０１００】
本ペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然のプロセス、または当該分野で周知の化学修飾の技術のいずれかにより修飾されたアミノ酸を含む。このような修飾は、基本的なテキストおよびより詳細な研究論文、ならびに多くの研究文献で良好に説明されている。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含むポリペプチドの任意の場所で起こり得、所定のポリペプチドのいくつかの部位で同じ程度にまたは様々な程度で、同種の修飾が存在し得ると認識されている。また、所定のポリペプチドは、多くの種類の修飾を含んでもよい。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐していてもよく、これらは、分岐を伴わないまたは分岐を伴う環状であってもよい。環状ポリペプチド、分岐型ポリペプチド、および環状の分岐型ポリペプチドは、天然の翻訳後プロセスからもたらされてもよく、または合成方法により作製されてもよい。修飾として、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボース化、アライド化（ａｒａｉｄａｔｉｏｎ）、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合性架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化（ｍｅｆｈｙｌａｔｉｏｎ）、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｉａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化（ａｒｇｉｎｙｌａｔｉｏｎ）などのトランスファーＲＮＡ介在型のタンパク質へのアミノ酸の付加、およびユビキチン化が、挙げられる。
【０１０１】
本発明の好ましい実施形態では、本ペプチドは、
（ｉ）配列番号１の配列のアミノ酸５７９〜６０１位により定義されている配列の３〜１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチドであって、前記フラグメントが、配列番号１のアミノ酸５７９〜５８１位、アミノ酸５８９〜５９１位、アミノ酸５９９〜６０１位、および／またはアミノ酸５９３〜５９５位を含む、ペプチド、
（ｉｉ）非ヒト哺乳類ＣＤ３１における配列番号１の配列のアミノ酸５７９〜６０１位に対応する配列の３〜１５アミノ酸のフラグメント、たとえば、配列番号９の配列のアミノ酸５６８〜５９０位により定義されている配列の３〜１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチドであって、前記フラグメントが、好ましくは、配列番号９のアミノ酸５６８〜５７０位、アミノ酸５７８〜５８０位、アミノ酸５８８〜５９０位、および／またはアミノ酸５８２〜５８４位を含む、ペプチド、
（ｉｉｉ）ペプチド（ｉ）の配列と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも７５％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％同一、さらにより好ましくは少なくとも９０％同一である配列からなる３〜１５アミノ酸のペプチド、
（ｉｖ）ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）のレトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）配列からなるペプチド、および
（ｖ）少なくとも１つまたは少なくとも１つのさらなる化学的修飾を含むペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）
からなる群で選択される。
【０１０２】
このようなペプチドは、ＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号１３、配列番号９のアミノ酸５７６〜５９０位）、ＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号１４、配列番号９のアミノ酸５７７〜５９０位）、ＴＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号１５、配列番号９のアミノ酸５７８〜５９０位）、ＬＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号１６、配列番号９のアミノ酸５７９〜５９０位）、ＡＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号１７、配列番号９のアミノ酸５８０〜５９０位）、ＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号３、配列番号９のアミノ酸５８１〜５９０位）、ＲＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号１８、配列番号９のアミノ酸５８２〜５９０位）、ＶＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号１９、配列番号９のアミノ酸５８３〜５９０位）、ＦＬＡＰＷＫＫ（配列番号２０、配列番号９のアミノ酸５８４〜５９０位）、ＬＡＰＷＫＫ（配列番号２、配列番号９のアミノ酸５８５〜５９０位）、ＡＰＷＫＫ（配列番号２１、配列番号９のアミノ酸５８６〜５９０位）、ＰＷＫＫ（配列番号２２、配列番号９のアミノ酸５８７〜５９０位）、ＷＫＫ（配列番号９のアミノ酸５８８〜５９０位）、ＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号２３、配列番号１のアミノ酸５８７〜６０１位）、ＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号２４、配列番号１のアミノ酸５８８〜６０１位）、ＩＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号２５、配列番号１のアミノ酸５８９〜６０１位）、ＬＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号２６、配列番号１のアミノ酸５９０〜６０１位）、ＴＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号２７、配列番号１のアミノ酸５９１〜６０１位）、ＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号４、配列番号１のアミノ酸５９２〜６０１位）、ＲＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号２８、配列番号１のアミノ酸５９３〜６０１位）、ＶＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号２９、配列番号１のアミノ酸５９４〜６０１位）、ＩＬＡＰＷＫＫ（配列番号３０、配列番号１のアミノ酸５９５〜６０１位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲ（配列番号３１、配列番号９のアミノ酸５６８〜５８２位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶ（配列番号３２、配列番号９のアミノ酸５６８〜５８１位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬＡ（配列番号３３、配列番号９のアミノ酸５６８〜５８０位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴＬ（配列番号３４、配列番号９のアミノ酸５６８〜５７９位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳＴ（配列番号３５、配列番号９のアミノ酸５６８〜５７８位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳＳ（配列番号３６、配列番号９のアミノ酸５６８〜５７７位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲＳ（配列番号３７、配列番号９のアミノ酸５６８〜５７６位）、ＳＳＭＲＴＳＰＲ（配列番号３８、配列番号９のアミノ酸５６８〜５７５位）、ＳＳＭＲＴＳＰ（配列番号３９、配列番号９のアミノ酸５６８〜５７４位）、ＳＳＭＲＴＳ（配列番号４０、配列番号９のアミノ酸５６８〜５７３位）、ＳＳＭＲＴ（配列番号４１、配列番号９のアミノ酸５６８〜５７２位）、ＳＳＭＲ（配列番号４２、配列番号９のアミノ酸５６８〜５７１位）、ＳＳＭ（配列番号９のアミノ酸５６８〜５７０位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲ（配列番号４３、配列番号１のアミノ酸５７９〜５９３位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶ（配列番号４４、配列番号１のアミノ酸５７９〜５９２位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬＴ（配列番号４５、配列番号１のアミノ酸５７９〜５９１位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩＬ（配列番号４６、配列番号１のアミノ酸５７９〜５９０位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫＩ（配列番号４７、配列番号１のアミノ酸５７９〜５８９位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳＫ（配列番号４８、配列番号１のアミノ酸５７９〜５８８位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲＳ（配列番号４９、配列番号１のアミノ酸５７９〜５８７位）、ＮＨＡＳＳＶＰＲ（配列番号５０、配列番号１のアミノ酸５７９〜５８６位）、ＮＨＡＳＳＶＰ（配列番号５１、配列番号１のアミノ酸５７９〜５８５位）、ＮＨＡＳＳＶ（配列番号５２、配列番号１のアミノ酸５７９〜５８４位）、ＮＨＡＳＳ（配列番号５３、配列番号１のアミノ酸５７９〜５８３位）、ＮＨＡＳ（配列番号５４、配列番号１のアミノ酸５７９〜５８２位）、ＮＨＡ（配列番号１のアミノ酸５７９〜５８１位）、ＴＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬＡ（配列番号５５、配列番号９のアミノ酸５７２〜５８６位）、ＳＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦＬ（配列番号５６、配列番号９のアミノ酸５７３〜５８５位）、ＰＲＳＳＴＬＡＶＲＶＦ（配列番号５７、配列番号９のアミノ酸５７４〜５８４位）、ＲＳＳＴＬＡＶＲＶ（配列番号５８、配列番号９のアミノ酸５７５〜５８３位）、ＳＳＴＬＡＶＲ（配列番号５９、配列番号９のアミノ酸５７６〜５８２位）、ＳＴＬＡＶ（配列番号６０、配列番号９のアミノ酸５７７〜５８１位）、ＴＬＡ（配列番号９のアミノ酸５７８〜５８０位）、ＳＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬＡ（配列番号６１、配列番号１のアミノ酸５８３〜５９７位）、ＶＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩＬ（配列番号６２、配列番号１のアミノ酸５８４〜５９６位）、ＰＲＳＫＩＬＴＶＲＶＩ（配列番号６３、配列番号１のアミノ酸５８５〜５９５位）、ＲＳＫＩＬＴＶＲＶ（配列番号６４、配列番号１のアミノ酸５８６〜５９４位）、ＳＫＩＬＴＶＲ（配列番号６５、配列番号１のアミノ酸５８７〜５９３位）、ＫＩＬＴＶ（配列番号６６、配列番号１のアミノ酸５８８〜５６２位）、ＩＬＴ（配列番号１のアミノ酸５８９〜５９１位）、ＲＶＦ（配列番号９のアミノ酸５８２〜５８４位）、ＲＶＦＬ（配列番号６７、配列番号９のアミノ酸５８２〜５８５位）、ＲＶＦＬＡ（配列番号６８、配列番号９のアミノ酸５８２〜５８６位）、ＲＶＦＬＡＰ（配列番号６９、配列番号９のアミノ酸５８２〜５８７位）、ＲＶＦＬＡＰＷ（配列番号７０、配列番号９のアミノ酸５８２〜５８８位）、ＲＶＦＬＡＰＷＫ（配列番号５、配列番号９のアミノ酸５８２〜５８９位）、ＲＶＩ（配列番号１のアミノ酸５９３〜５９５位）、ＲＶＩＬ（配列番号７１、配列番号１のアミノ酸５９３〜５９６位）、ＲＶＩＬＡ（配列番号７２、配列番号１のアミノ酸５９３〜５９７位）、ＲＶＩＬＡＰ（配列番号７３、配列番号１のアミノ酸５９３〜５９８位）、ＲＶＩＬＡＰＷ（配列番号７４、配列番号１のアミノ酸５９３〜５９９位）、ＲＶＩＬＡＰＷＫ（配列番号７、配列番号１のアミノ酸５９３〜６００位）からなる群から選択される配列を有する。
【０１０３】
本発明のより好ましい実施形態では、本ペプチドは、
（ｉ）配列番号１の配列のアミノ酸５７９〜６０１位により定義されている配列の３〜１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチドであって、前記フラグメントが、配列番号１のアミノ酸５７９〜５８２位、アミノ酸５８８〜５９２位、アミノ酸５９８〜６０１位、および／またはアミノ酸５９３〜５９５位を含む、ペプチド、
（ｉｉ）非ヒト哺乳類ＣＤ３１における配列番号１の配列のアミノ酸５７９〜６０１位に対応する配列の３〜１５アミノ酸のフラグメント、たとえば、配列番号９の配列のアミノ酸５６８〜５９０位により定義されている配列の３〜１５アミノ酸のフラグメントからなるペプチドであって、前記フラグメントが、好ましくは、配列番号９のアミノ酸５６８〜５７１位、アミノ酸５７８〜５８０位、アミノ酸５８７〜５９０位、および／またはアミノ酸５８２〜５８４位を含む、ペプチド、
（ｉｉｉ）ペプチド（ｉ）の配列と少なくとも７０％同一、好ましくは少なくとも７５％同一、好ましくは少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％同一、さらにより好ましくは少なくとも９０％同一である配列からなる３〜１５アミノ酸のペプチド、
（ｉｖ）ペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）のレトロ−インベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）配列からなるペプチド、ならびに
（ｖ）少なくとも１つまたは少なくとも１つのさらなる化学的修飾を含むペプチド（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または（ｉｖ）
からなる群で選択されている。
【０１０４】
好ましい実施形態では、本ペプチドは、逆位および／または少なくとも１つの非天然のアミノ酸、たとえば少なくとも１つのＤ−アミノ酸を含む８アミノ酸のフラグメントである。実際に、このようなペプチドは、元のペプチドの活性を保持しているか、またはさらには活性の改善を示している。治療上の使用が意図されるペプチドに非天然のアミノ酸を組み込むことは、ペプチドの安定性を増大させるために、特にｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を増大させるために有用である。
【０１０５】
本発明の別の好ましい実施形態では、本ペプチドは、配列番号２の配列のペプチド、配列番号３の配列のペプチド、配列番号４の配列のペプチド、配列番号５の配列のペプチド、Ｄ−エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号６の配列のペプチド、配列番号７の配列のペプチド、およびＤ−エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号８の配列のペプチドからなる群で選択される。
【０１０６】
より好ましいペプチドは、配列番号５の配列のペプチド、またはＤ−エナンチオマーのアミノ酸からなる配列番号６の配列のペプチドである。
【０１０７】
本ペプチドは、たとえば固相合成もしくは液相合成といった化学的合成、または遺伝子操作などの当該分野で周知のいずれかの手段により、調製されてもよい。たとえば固相合成の場合、合成されるペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸を、有機溶媒に不溶性である担体に結合させて、そのアミノ基と側鎖官能基が適切な保護基で保護されているアミノ酸をＣ末端からＮ末端までの順で１つずつ縮合させる反応と、樹脂またはペプチドのアミノ基の保護基に結合したアミノ酸を放出する反応とを交互に繰り返すことによって、このようにしてペプチド鎖が伸長する。望ましいペプチドを合成した後、脱保護反応に供し、固相支持体から切断する、このようなペプチド切断反応は、Ｂｏｃ法ではフッ化水素またはトリフルオロメタンスルホン酸、およびＦ−ｍｏｃ反応ではＴＦＡを用いて行ってもよい。
【０１０８】
固相合成方法は、大きくは、使用される保護基の種類に応じて、ｔＢｏｃ方法およびＦｍｏｃ方法により分類される。通常、使用される保護基として、アミノ基では、ｔＢｏｅ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｃｌ−Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル）、Ｂｒ−Ｚ（２−ブロモベンジルオキシ（ｂｒｏｍｏｂｅｎｚｙｌｏｙｙ）カルボニル）、Ｂｚｌ（ベンジル）、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメトキシ（ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｃｔｈｏｘｙ）カルボニル）、Ｍｂｈ（４，４’−ジメトキシジベンズヒドリル）、Ｍｔｒ（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル）、Ｔｒｔ（トリチル）、Ｔｏｓ（トシル）、Ｚ（ベンジルオキシカルボニル）およびＣｌｚ−Ｂｚｌ（２，６−ジクロロベンジル）；グアニジノ基ではＮＯ２（ニトロ）およびＰｍｃ（２，２、５，７、８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）；ならびにヒドロキシル基ではｔＢｕ（ｔ−ブチル））が、挙げられる。
【０１０９】
あるいは、ＣＤ３１ペプチドは、組み換え技術を使用して合成されてもよい。
【０１１０】
本ペプチドを産生する方法は、任意に、前記ペプチドを精製するステップ、前記ペプチドを化学的に修飾するステップ、および／または前記ペプチドを医薬組成物に製剤化するステップを含んでもよい。
【０１１１】
ペプチド模倣薬
一実施形態では、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、「ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストとして使用されるペプチド」の節において上記に定義されているペプチド模倣薬、すなわち前記ペプチドを模倣する化合物である。
【０１１２】
「ペプチド模倣薬」は、所定のペプチドを模倣することにより、上記化合物に前記ペプチドと同等または類似の生物学的活性を与える、非ペプチド性の構造要素からなる化合物である。
【０１１３】
ペプチド模倣薬は、好ましくは、有機溶媒または非有機溶媒に可溶である。
【０１１４】
本発明に係るペプチドとして、ペプチド模倣薬は、好ましくは水溶性である。
【０１１５】
所定のペプチドのペプチド模倣薬を設計および合成するための方法は、当業者に周知であり、たとえば、ＲｉｐｋａおよびＲｉｃｈ（Ｃｕｒｒ．    Ｏｐｉｎ．    Ｃｈｅｍ．    Ｂｉｏｌ．    １９９８；  ２（４）：４４１−５２）ならびにＰａｔｃｈおよびＢａｒｒｏｎ（Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ２００２；  ６（６）：８７２−７）に記載の方法が挙げられる。
【０１１６】
上記に定義されているペプチド模倣薬は、非天然のアミノ酸（複数可）を使用することによるペプチドの構造的な修飾からなる群において選択される少なくとも１つの化学的修飾により得てもよい。
【０１１７】
医薬組成物
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、医薬組成物に製剤化することができる。よって、本発明は、少なくとも１つのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストと、好ましくは薬学的に許容可能なビヒクルとを含む医薬組成物を企図している。
【０１１８】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、上記、特に「ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト」、「ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストとして使用されるペプチド、」、および「ペプチド模倣薬」の節に定義されている通りである。
【０１１９】
少なくとも１つのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストを含む医薬組成物は、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストが、意図される目的、特に再灌流傷害の予防および／または治療を達成するために有効な量で含まれている、すべての組成物を含む。
【０１２０】
「薬学的に許容可能」との表現は、好ましくは活性成分の生物活性の有効性に干渉せず、および／または好ましくは投与される宿主に毒性ではない、いずれかの担体を含むことを意味する。
【０１２１】
薬学的に許容可能なビヒクルは、当業者に公知であるいずれかの方法により調製することができる。
【０１２２】
適切な薬学的に許容可能なビヒクルは、活性化合物を薬学的に使用できる調製物へと処理することを容易にする、賦形剤および補助剤を含んでもよい。適切な薬学的に許容可能なビヒクルは、たとえば、この分野において標準的な参照テキストである、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＵＳＡ，  １９８５）に記載されている。薬学的に許容可能なビヒクルは、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの投与形式、溶解度、および安定性に従って、規定通りに選択することができる。たとえば、静脈内投与用の製剤は、同様に、バッファー、希釈剤、および他の適切な添加剤を含み得る無菌性の水溶液を含んでもよい。薬物送達のためのバイオマテリアルおよび他のポリマーの使用、ならびに特定の投与形式を検証するための異なる技術およびモデルが、文献に開示されている。
【０１２３】
投与される用量は、治療される対象、望ましい効果、および選択される投与経路により決定される。投与される用量は、レシピエントの年齢、性別、健康状態、および体重、もし存在する場合は現在の治療、ならびに治療頻度、および望ましい効果の性質により決定されると理解される。各治療に必要とされる総用量を、複数回投与または単回投与で投与してもよい。
【０１２４】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、好ましくは液体（たとえば溶剤、懸濁剤）として製剤化されている。
【０１２５】
好ましい実施形態では、医薬組成物は、正確な投与を容易にするため単位剤形で存在している。用語「単位剤形」は、ヒト対象および他の哺乳類に関する単位用量として適切な物理的に個別の単位を表し、各単位は、適切な薬学的賦形剤と協同して望ましい治療効果をもたらすように計算された、あらかじめ決定された量の活性物質を含んでいる。典型的な単位剤形として、あらかじめ充填、あらかじめ測定された、液体組成物のアンプルおよびシリンジが挙げられる。このような組成物では、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、通常、微量の成分であり（たとえば約０．１〜約５０重量％、または好ましくは約１〜約４０重量％）、残りは、望ましい投与形態の形成に役立つ様々なビヒクルまたは担体、および加工助剤である。
【０１２６】
薬学的に許容可能なビヒクルに加えて、本医薬組成物はまた、微量の添加剤（複数可）、たとえば安定剤（複数可）、賦形剤（複数可）、バッファー（複数可）および／または保存剤（複数可）をも含むことができる。
【０１２７】
さらに本発明は、上記に定義されているＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストを含む医薬組成物と、投与様式に関する説明書とを含むキットを提供する。これら説明書は、たとえば、医学的適応、投与経路、用量、および／または治療される患者群を示してもよい。
【０１２８】
虚血
好ましい実施形態では、再灌流は、虚血を治療するために使用されている。
虚血は、組織への血液供給のうっ滞、制限、または停止である。
虚血は、好ましくは、心筋梗塞、虚血性大腸炎、腸間膜虚血、脳卒中、下肢の虚血、急性血液量減少からもたらされる内臓の虚血、炎症性疾患からもたらされる虚血、動脈枝の一部を除く体外循環血液固有の虚血、内臓および／または大動脈の手術に固有の虚血、冷阻血、臓器移植を目的とする移植片の加温再灌流に固有の虚血、ならびにそれらの組み合わせからなる群で選択される。
【０１２９】
心筋梗塞は、心筋における血流が不十分である場合に起こる。心筋梗塞は、無症候性であり得るか、または狭心症として知られている胸部の疼痛を引き起こし得る。
【０１３０】
大腸および小腸は両方とも虚血の影響を受ける可能性がある。
【０１３１】
大腸の虚血は、虚血性大腸炎と呼ばれている。
【０１３２】
腸間膜虚血は、小腸の虚血に対応する。
【０１３３】
脳卒中は、急性または慢性であり得る脳の虚血である。急性の虚血性脳卒中は、迅速に治療される場合は可逆的であり得る神経性の緊急事態である。脳の慢性的な虚血は、ある型の認知症をもたらし得る。
【０１３４】
下肢の虚血は、少なくとも１つの肢における血流の不足である。
【０１３５】
急性血液量減少からもたらされる内臓の虚血は、血液内容物の減少（たとえば出血後）、および／または血圧の低下（たとえば敗血症性ショック、サイトカイン性ショック、もしくは心原性ショックの間に起こる際の血管床の急激な拡張による）の場合の、他の組織（脳、心臓）への血液の再分布による内臓への灌流の不足である。
【０１３６】
人工的な虚血は、医療処置に固有の虚血である。
【０１３７】
内臓および／または大動脈の手術に固有の虚血は、外科医が実施する血液循環の停止、たとえば臓器の上流の血管の一時的なクランピングからもたらされる虚血である。
【０１３８】
移植片の虚血は、移植される組織または臓器がドナーから摘出された後に起こる。移植される組織または臓器は、虚血からもたらされる代謝性損傷を低減するため、一般的に、たとえば４℃で洗浄および冷却される。冷却した組織または臓器の虚血は、冷阻血と呼ばれている。
【０１３９】
冷阻血は、外植され、よってドナーの循環から切り離されている臓器で起こる虚血性損傷を表す。
【０１４０】
加温再灌流は、レシピエントにおける移植臓器の移植片に固有の循環の再確立（再灌流）を表す。
【０１４１】
本明細書中の「冷阻血時間」との表現は、血液供給が低減または中断された後の組織または臓器の冷却と、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて血液供給を回復させることにより加温された時間との間の時間を意味する。
【０１４２】
炎症性疾患からもたらされる虚血は、たとえば、腸の虚血であり、これはたとえばクローン病および／または潰瘍性大腸炎で起こり得る。
【０１４３】
本発明の一実施形態では、再灌流は、生物学的流体（血漿を含む）における可溶性の切断型ＣＤ３１の増加、よってＣＤ３１−Ｔリンパ球表現型の増加に関連している。
【０１４４】
本明細書中使用されているように、用語「ＣＤ３１−Ｔリンパ球表現型」は、用語「ＣＤ３１ｓｈｅｄリンパ球表現型」と互換可能に使用されている。これら用語は、たとえばＳｔｏｃｋｉｎｇｅｒら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １９９２，  ７５（１）：５３−８）、Ｄｅｍｅｕｒｅら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １９９６，  ８８（１）：１１０−５）、Ｃａｌｉｇｉｕｒｉら（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ，  ２００５，  ２５（８）：１６５９−６４）またはＣａｌｉｇｉｕｒｉら（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ，  ２００６，  ２６（３）：６１８−２３）に記載されているものなどの、ＣＤ３１を検出するための従来技術の方法を使用した場合に、その循環中のＴ細胞上のＣＤ３１を明確に失っている個体の表現型を表す。このような方法では、ＣＤ３１を検出するために使用される抗体は、１番目〜５番目の細胞外Ｉｇ様ドメインのいずれか１つに位置するエピトープに結合する（米国特許第８９５１７４３号参照）。
【０１４５】
好ましくは、ＣＤ３１−Ｔリンパ球表現型を有する個体では特に、循環中のＴリンパ球の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％がＣＤ３１ｓｈｅｄリンパ球である。このパーセンテージを計算するために、Ｔ細胞由来の切断型ＣＤ３１の血漿中濃度またはＣＤ３１−Ｔリンパ球の出現頻度のいずれかを、ＣＤ３１＋Ｔリンパ球と比較して測定してもよい。
【０１４６】
治療される対象
再灌流傷害の予防および／または治療に関して治療される必要のある対象は、個体または非ヒト哺乳類であり得る。
【０１４７】
用語「個体」または「患者」は、互換可能に使用されており、ヒトを表す。
【０１４８】
前記ヒトは、任意の年齢のヒト、たとえば乳児、小児、青年、成年、高齢者であり得る。
【０１４９】
非ヒト哺乳類は、好ましくは、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ウサギ、または霊長類である。
【０１５０】
対象は、好ましくは再灌流により治療されている虚血または再灌流により治療されていない虚血を罹患している。
【０１５１】
再灌流傷害の予防および／または治療
「再灌流傷害の治療」との表現は、本明細書中、特に虚血の後、特に臓器の損傷をすでに受けているまたは臓器損傷を受けていない再灌流下にある対象において、再灌流により引き起こされる臓器の損傷を除去もしくは低減、および／または再灌流により引き起こされる臓器の損傷の進行を停止もしくは遅延することを意味する。
【０１５２】
望ましい治療効果は、
特に加温再灌流の間の虚血性の組織もしくは臓器（たとえば心臓、脳、腸、腎臓、および／もしくは肢）における壊死の進行の停止もしくは遅延、たとえば壊死領域（複数可）の大きさの減少、
再灌流後の臓器生存の機会の増大、
たとえば再灌流の間の、腸間膜虚血に加え、絨毛の長さおよび幅、分裂指数、および／もしくは組織内出血の観点からの、腸上皮の病変（複数可）の停止もしくは低減、
たとえば再灌流の間の、腸間膜虚血に加え、血液、脾臓、肝臓、および／もしくは腸間膜の神経節におけるバクテリアルトランスロケーションの停止もしくは低減、ならびに／または
組織もしくは臓器移植の場合の、冷阻血時間の増加および／もしくは移植片の回復の改善
を、含む。
【０１５３】
「再灌流傷害の予防」との表現は、本明細書中で、再灌流に供される可能性のある対象の臓器損傷を少なくとも部分的に予防することを意味する。
【０１５４】
望ましい予防効果は、
壊死を、少なくとも部分的に予防すること、
再灌流後の臓器生存の機会の増大、
長期間の虚血後に再灌流を行うための肯定的な利点／リスク比を得るための時間枠／時間の遅延を増加させること、
臓器の機能を少なくとも部分的に予防すること（たとえば、損傷した腸上皮に関連する粘液の低減、心筋の収縮機能の低下、大脳または肢の再灌流後の運動性の低下の予防）、
たとえば再灌流の間、腸間膜虚血に加え、特に血液、脾臓、肝臓、および／もしくは腸間膜リンパ節におけるバクテリアルトランスロケーションを少なくとも部分的に予防すること、ならびに／または
組織もしくは臓器移植の場合の、冷阻血時間の増加および／もしくは移植片の加温回復の改善
を含む。
【０１５５】
「壊死」は、本明細書中、組織の１つまたはいくつかの細胞の死を意味する。
【０１５６】
再灌流、特に虚血を治療するための再灌流は、機械的血行再建および／または薬理学的な再灌流により得ることができる。
【０１５７】
機械的血行再建は、たとえば、血管形成術、および／または血栓吸引（ｔｈｒｏｍｂｏａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）、および／またはステント留置、および／または動脈内膜剥離術、および／またはバイパス手術を含み得る。
【０１５８】
薬理学的な再灌流は、少なくとも１つの線溶剤、および／または抗血小板薬／抗凝固薬（複数可）、および／または血管拡張薬（複数可）の投与を含み得る。
【０１５９】
線溶（血栓溶解）剤は、フィブリンに結合したプラスミノゲンのアクチベータであり、これらの作用は、酵素前駆体プラスミノゲンを、フィブリンを分解する活性酵素のプラスミンに変換することである。臨床での使用に利用可能な線溶剤の非限定的な例として、生理的な組織型プラスミノゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）、および一本鎖型（（ｓｃｕ−ＰＡ、プロウロキナーゼ）、または二本鎖型（（ｔｃｕ−ＰＡ、ウロキナーゼ）のウロキナーゼ型プラスミノゲンアクチベータ（ｕ−ＰＡ）、ならびに細菌性アクチベータプラスミノゲンストレプトキナーゼ、またはプラスミノゲンを含むそのアニソイル化（Ａｎｉｓｏｙｌａｔｅｄ）複合体（ＡＰＳＡＣ）がある。
【０１６０】
再灌流傷害の予防および／または治療に使用するためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト
本発明は特に、再灌流傷害の予防および／または治療に使用するためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストに関する。
【０１６１】
再灌流傷害の予防および／または治療は、特には、上記に定義されている通りである。
【０１６２】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、上記、特に「ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト」、「ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストとして使用されるペプチド」、および「ペプチド模倣薬」の節で定義されている。
【０１６３】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、医薬組成物の形態で提供されてもよい。前記医薬組成物は、特に、「医薬組成物」の節で上記に定義されている。
【０１６４】
よって、本発明は、その必要がある対象の再灌流傷害の予防および／または治療に使用するための上記に定義されているＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストまたは医薬組成物に関する。
【０１６５】
その必要がある対象は、「治療される対象」の節で上記に定義されている。
【０１６６】
前記その必要がある対象は、好ましくは虚血を罹患している。
【０１６７】
虚血は、「虚血」の節で上記に定義されている。
【０１６８】
よって、本発明は特に、上記で定義されているように使用するためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストまたは医薬組成物であって、再灌流が、虚血を治療するために使用されている、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストまたは医薬組成物に関する。
【０１６９】
特に本発明は、上記に定義されているように使用するためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストまたは医薬組成物であって、上記ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストが、
特に加温再灌流の間の虚血性の組織もしくは臓器（たとえば心臓、脳、腸、腎臓、および／もしくは肢）における壊死の進行を停止もしくは遅延させ、たとえば壊死領域（複数可）の大きさを減少させ、
再灌流後の臓器生存の機会を増大させ、
たとえば再灌流の間、腸間膜虚血に加え、絨毛の長さおよび幅、分裂指数、および／もしくは組織内出血の観点からの、腸上皮の病変（複数可）を停止もしくは阻害し、
たとえば再灌流の間、腸間膜虚血に加え、血液、肝臓、脾臓、および／もしくは腸間膜の神経節におけるバクテリアルトランスロケーションを停止もしくは低減し、ならびに／または
組織もしくは臓器移植の場合の冷阻血時間を増加し、および／もしくは移植片の加温回復を改善する、
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストまたは医薬組成物に関する。
【０１７０】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストまたは医薬組成物は、好ましくは、再灌流の前、および／または再灌流の間、好ましくは、可能である場合は虚血−再灌流期間全体の間に、使用または投与される。
【０１７１】
内臓および／または大動脈の待期的手術により引き起こされる虚血の場合、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストまたは医薬組成物は、好ましくは、再灌流の前および再灌流の間、たとえば虚血―再灌流期間の間、より好ましくは虚血の前および虚血―再灌流期間の間の両方で、使用または投与される。
【０１７２】
血液循環が血管中で停止すると、虚血が始まる。たとえば人工的な虚血の場合、血液循環は、血管がクランプされる際に停止する。
【０１７３】
血液循環が回復すると、再灌流が始まる。再灌流により引き起こされる損傷は、一般的に、４８時間以内、好ましくは２４時間以内に起こる。
【０１７４】
たとえば、「虚血より前」または「再灌流より前」の表現といった、「〜より前」との用語は、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストが、最大１時間前、好ましくは最大３０分前、より好ましくは最大２０分前、より好ましくは最大１０分前、たとえば１０分前、５分前、２分前、または直前に使用または投与されることを意味する。
【０１７５】
予定外の虚血の場合、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストはまたは医薬組成物は、可能な限り早く、たとえば、再灌流より前および／または再灌流の最中、好ましくは再灌流より前かつ再灌流の間に、使用または投与される。
【０１７６】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストまたは医薬組成物は、好ましくは静脈内で使用または投与される。静脈内投与により、再灌流の位置、特に虚血領域でＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの有効量を迅速に得ること、および／またはＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの有効量を維持することが可能となる。
【０１７７】
好ましい実施形態では、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストまたは医薬組成物は、再灌流の間、好ましくは、単回投与としてのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの第１のボーラス投与の後に、持続的に使用または投与される。
【０１７８】
たとえば、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの第１のボーラス投与は、単回投与として使用または投与され、次いで上記ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの第２のボーラス投与が、持続的に使用または投与される。本発明の一実施形態では、前記第１および第２のボーラス投与は、同じ量のＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストを含み得る。
【０１７９】
単回投与または持続的な投与としての投与に関するボーラス投与は、対象（ｋｇ）あたり２．５〜３０ｍｇのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト、好ましくは対象（ｋｇ）あたり２．５〜２０ｍｇのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト、より好ましくは対象（ｋｇ）あたり２．５〜１０ｍｇのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストを含み得る。
【０１８０】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストまたは医薬組成物は、好ましくは、短期間、たとえば最大４８時間、より好ましくは最大２４時間の間、使用または投与される。
【０１８１】
移植の場合、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストまたは医薬組成物は、好ましくは、外植された臓器（次に即時加温再灌流を受ける）を移植する前に、治療される対象、すなわちレシーバーに使用または投与される。本発明の好適な実施形態では、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストはまた、移植される組織または臓器の摘出の前、たとえば組織もしくは臓器の摘出の５〜１０分前、ならびに／または摘出された臓器もしくは組織を移植期間および／もしくは洗浄期間の間に持続的に灌流する５〜１０分前に、ドナーにも使用または投与される。
【０１８２】
再灌流傷害を予防および／または治療するための方法
また本発明は、その必要がある対象の再灌流傷害を予防および／または治療するための方法であって、前記対象にＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの有効量を投与するステップを含む、方法を目的とする。
【０１８３】
再灌流傷害の予防および／または治療は、特には上記に定義されている通りである。
【０１８４】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、上記、特に「ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト」、「ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストとして使用されるペプチド」、および「ペプチド模倣薬」の節で定義されている。
【０１８５】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストは、医薬組成物の形態で提供されてもよい。前記医薬組成物は、特に上記の「医薬組成物」の節で定義されている通りである。
【０１８６】
その必要がある対象は、上記の「治療される対象」の節で定義されている通りである。
【０１８７】
上記その必要のある対象は、好ましくは虚血を罹患している。
【０１８８】
虚血は、上記の「虚血」の節で定義されている通りである。
【０１８９】
よって本発明は、特に、上記に定義されている再灌流傷害を予防および／または治療するための方法であって、再灌流が虚血を治療するために使用されている、方法に関する。
【０１９０】
「有効量」または「治療上有効量」は、本明細書中では、再灌流傷害を予防および／または治療できる、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの濃度を達成するために十分な量を意味する。このような有効量は、当業者により、規定通りに決定することができる。実際に投与される化合物の量は、概して、治療される疾患、選択される投与経路、投与される実際の化合物、個々の患者の年齢、性別、体重、および応答、患者の症状の重症度などを含む関連する状況に照らして、医師によって決定される。また、特にペプチドの場合では、用量は、投与されるＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの安定性に依存し得ることは、当業者によって認識されるであろう。
【０１９１】
有効量は、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストと共投与され得る薬物またはプロドラッグにより変動し得る。
【０１９２】
治療上有効量は、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの何等かの毒性または有害な効果を、治療上有益な効果が上回る量を包含する。また治療上有効量は、利益、たとえば臨床上の利益を提供するために十分な量も包含する。
【０１９３】
ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの用量、投与形式、および効果は、特には、上記の「再灌流傷害の予防および／または治療に使用するためのＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニスト」の節で定義されている通りである。
【０１９４】
本発明は、以下の実施例および図面を考慮してさらに例示されている。
【０１９５】
学術雑誌の記事または抄録、公開済みまたは未公開の特許出願、発行済みの特許、または他のいずれかの参照文献を含む、本明細書中引用されているすべての参照文献は、引用された参照文献で提示されている全てのデータ、表、図面、およびテキストを含み、その全体が本明細書中参照として援用されている。
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】冠動脈の結紮による４５分間の虚血、次いで２４時間の再灌流後の生存のパーセンテージは、ＣＤ３１の非存在下では有意に低下した。ＷＴ：野生型マウス（９０％の生存；ｎ＝１７、２匹死亡）；ＣＤ３１  ＫＯ：ＣＤ３１ノックアウトマウス（４５％の生存、Ｎ＝９、４匹死亡）。ＣＨＩＴＥＳＴ＜０．００１。
【図２】冠動脈の結紮による４５分間の虚血、次いで２４時間の再灌流に供したアポリポタンパク質Ｅノックアウトマウス（雌性、１８週齢）における心筋梗塞のリスク領域およびサイズに及ぼすＰ８ＲＩ（再灌流の２分前に１０ｍｇ／Ｋｇ  Ｐ８ＲＩの皮下注射）の効果。この図面は、ＡＡＲ（左心室、ＬＶのパーセンテージ）、およびＭＩ（ＡＡＲおよびＬＶのパーセンテージとして両方を表現）の平均値を示している。Ｐ８ＲＩ：Ｐ８ＲＩを投与したマウス（ｎ＝５）；対照：Ｐ８ＲＩを含まないビヒクル（ＰＢＳ）の類似の容量を投与したマウス（ｎ＝５）。ｔ検定。
【図３】経時的な（時間）虚血―再灌流モデルに供したラットの血漿中の遊離ＤＮＡ（ｎｇ／ｍｌ）の定量化。血漿中の遊離ＤＮＡのレベルは、対照のラットでは時間と共に増加したが（上の線）、ペプチドＰ８ＲＩで処置したラットでは低いままであり（中央の線）、偽手術したラットと類似であった（下の線）。ＭＡＮＯＶＡ、反復測定、グループ効果：Ｆ＝０．３０１０８８３，ｐ＜０．０００１。
【図４】経時的な虚血―再灌流モデル（ｎｇ／ｋｇ／時間）に供したラットの尿における尿中遊離ＤＮＡ（ｎｇ／ｍｌ）の定量化。血漿中遊離ＤＮＡの尿中排泄率は、対照と比較して（Ｃ、灰色の箱）、ペプチドＰ８ＲＩで処置したラット（白抜きの箱）で減少した。ｔ検定  ｐ＝０．０２９３。
【図５】経時的な虚血―再灌流モデルに供したラットの腸内腔内の遊離ヘモグロビンの定量化（比率、総タンパク質含有量により正規化）。遊離ヘモグロビンの相対量は、対照（Ｃ、左のカラム）と比較して、ペプチドＰ８ＲＩで処置したラット（右のカラム）で減少した。ｔ検定  ｐ＝０．０２９３。
【図６】虚血―再灌流モデルに供したラットの腸粘膜における遊離ミエロペルオキシダーゼ  ＭＰＯの定量化（直接法ＥＬＩＳＡ、任意単位−光学密度として表したデータ）。ＭＰＯの相対量は、対照（Ｃ、灰色の箱）と比較して、ペプチドＰ８ＲＩで処置したラット（白抜きの箱）で減少した。マン・ホイットニーのＵ検定  ｐ＜０．００１。
【図７】虚血―再灌流モデルに供したラットにおける血漿中の可溶性Ｐ−セレクチンの定量化。Ｐ−セレクチン（ｐｇ／ｍｌ）は、対照（Ｃ、灰色の箱）と比較して、ペプチドＰ８ＲＩで処置したラット（白抜きの箱）で減少した。マン・ホイットニーのＵ検定、ｐ＝０．０１７３
【図８】経時的に解析される虚血―再灌流モデルに供したラットの血漿中ＭＭＰ９の定量化。ＭＭＰ９の累積濃度（異なる時点の曲線下面積）は、対照（Ｃ、灰色の箱）と比較して、ペプチドＰ８ＲＩで処置したラット（白抜きの箱）で減少した。マン・ホイットニーのＵ検定、ｐ＝０．００８２。
【図９】大脳虚血モデルにおける大脳組織内の免疫グロブリンの定量化。各グループのマウス（Ｐ８ＲＩ：虚血の誘導から９０分後にＰ８ＲＩで処置したマウス；生理食塩水：虚血の誘導から９０分後に生理食塩水溶液で処置したマウス；偽：偽手術したマウス）に関して、右／左のＩｇ比、すなわち［（虚血―再灌流傷害に供した）右半球の総Ｉｇ）］／［左半球（反対側、非虚血）の総Ｉｇ］が示されている。
【０１９７】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ヒトＣＤ３１の配列に対応する。
配列番号２は、ヒトまたはマウスＣＤ３１に由来する６アミノ酸ペプチドの配列ＬＡＰＷＫＫに対応する。
配列番号３は、ＰｅｐＲｅｇ  ＣＤ３１とも呼ばれている、マウスＣＤ３１に由来する１０アミノ酸ペプチドの配列ＶＲＶＦＬＡＰＷＫＫに対応する。
配列番号４は、ヒトＣＤ３１に由来する１０アミノ酸ペプチドの配列ＶＲＶＩＬＡＰＷＫＫに対応する。
配列番号５は、Ｐ８Ｆとも呼ばれている、マウスＣＤ３１に由来する、８アミノ酸ペプチドの配列ＲＶＦＬＡＰＷＫに対応する。
配列番号６は、配列番号５の逆位の配列を有し、Ｄ−アミノ酸からなる、Ｐ８ＲＩとも呼ばれている、８アミノ酸ペプチドの配列ｋｗｐａｌｆｖｒに対応する。
配列番号７は、ヒトＣＤ３１に由来する８アミノ酸ペプチドの配列ＲＶＩＬＡＰＷＫに対応する。
配列番号８は、配列番号７の逆位の配列を有し、Ｄ−アミノ酸からなる、８アミノ酸ペプチドの配列ｋｗｐａｌｉｖｒに対応する。
配列番号９は、マウスＣＤ３１の配列に対応する。
配列番号１０は、ウシＣＤ３１の配列に対応する。
配列番号１１は、ブタＣＤ３１の配列に対応する。
配列番号１２は、配列番号１のアミノ酸５７９〜６０１位に対応する。
【０１９８】
実施例
実施例１：心筋の虚血―再灌流のモデルにおけるＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの保護効果
材料および方法
冠動脈アテローム性硬化症の状況下で虚血−再灌流傷害を（患者で起こっている通りに）再現するために、概して１６週齢までに冠動脈アテローム性硬化症を発症する、１８週齢の雌性アポリポタンパク質Ｅノックアウトマウス（Ｎ＝１２／群）を使用した（Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．  １９９９  Ａｕｇ；１４５（２）：３０１−８）。Ｍｉｃｈａｅｌら（Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １９９５  Ｄｅｃ；２６９（６  Ｐｔ  ２）：Ｈ２１４７−５４）により記載される方法に従って、マウスの左主冠動脈を外科的に結紮した。４３分間の虚血の後、マウスに、Ｐ８ＲＩ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（ＰＢＳ）のいずれかを皮下注射により投与し、２分後に虚血領域を、結紮した冠動脈を再度開口することにより再灌流させた。翌日、マウスに再び麻酔をかけ、再度開胸し、冠動脈の結紮を再度行い、次に冠動脈枝を、左頸動脈の逆行性カニューレ挿入を介して冠動脈枝に押し入れたＰＢＳ２ｍｌですすぎ、非虚血領域を、同じカニューレでエバンスブルー５０μｌ（ＰＢＳ中３％）を注入することにより染色した。次に心臓を、迅速に胸部から摘出し、（拡張期で心臓を停止させるために）飽和ＫＣｌ溶液に浸漬し、ＰＢＳですすいだ。心房および右心室を切除し、左心室を、厚さ１ｍｍの切片４〜５片に切断した。虚血領域内の生存している心筋を、１％のトリフェニルテトラゾリウムクロリドを含む３７℃の温かいリン酸バッファーで、心臓切片を５分間インキュベートすることにより、赤色に染色した。各切片を写真に撮り、次に、リスク領域（ＡＡＲ、エバンスブルーにより陰性染色）および壊死領域（ＭＩ、ＴＴＣ溶液により赤色に陰性染色）を、コンピュータベースの画像解析により測定した。
【０１９９】
結果
左心室（ＬＶ）の表面および壊死性領域の％として表されるＡＡＲ（ＭＩ、ＡＡＲおよびＬＶのパーセンテージとして表されている）を、各切片について計算した。図２に示されているデータは、平均値±ＳＥＭとして表されている。ＡＡＲは、Ｐ８ＲＩ群および対照群で類似であり、よって、冠動脈上の外科的な結紮が、２つの群で同じ方法で行われたことが確認された。再灌流の２分前のＰ８ＲＩの投与は、リスク領域（ＡＡＲ）または左心室（ＬＶ）のパーセンテージとして、心筋梗塞（ＭＩ）の大きさを減少することに有意に有効であった。
【０２００】
実施例２：大脳の虚血―再灌流のモデルにおけるＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの保護効果
材料および方法
雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（８週齢、チャールズリバー（フランス））に、１．５％のイソフルラン（フォーレン、アボット（ドイツ）を含む空気―酸素の混合物を用いて、自発呼吸下で麻酔をかけた。
【０２０１】
シリコンコーティングした８−０のモノフィラメントを右総頸動脈に導入し、それを、先端が中大脳動脈（ＭＣＡ）の近位軸部を閉塞するまで内頸動脈に沿って進めることにより、限局的な大脳の虚血を誘導した。局所的な大脳の血流を、右ＭＣＡの領域の上の無処置の頭蓋に固定した可撓性の光ファイバープローブを用いるＬＤＦ（Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  ｆｌｏｗｍｅｔｒｙ）（ＰＦ５０１０，  Ｐｅｒｉｍｅｄ、スウェーデン）によりモニタリングした。直腸温を、温度計に接続した加熱パッドを介して３７℃に維持した。処置（Ｐ８ＲＩ（１０ｍｇ／ｋｇ体重）または生理食塩水（１００μｌ）の皮下ボーラス）を、虚血の誘導から９０分後に投与した。虚血の誘導から２時間後に、フィラメントを引き抜き、再灌流させた。
【０２０２】
虚血の誘導から２４時間後に、マウスにイソフルランで深く麻酔をかけ、無色の流体が１００ｍｍＨｇで右心房から得られるまで、心臓の中を生理食塩水で灌流させた。血液を含まない脳（すべての血液が、大脳内の血管から洗いだされた）を迅速に摘出し、右半球および左半球に分け、重量を測定し、液体窒素で急速冷凍し、−８０℃で保存した。
【０２０３】
脳の試料を、ＲＩＰＡバッファー（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトン、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）＋Ｒｏｃｈｅ製の抗プロテアーゼカクテル）中で、５μｌ／ｍｇ組織でホモジナイズし、１６０００ｇで２０分間遠心分離し、上清をアリコートにし、解析まで−８０℃で保存した。
【０２０４】
血液脳関門の透過率に及ぼすＰ８ＲＩの効果を評価するために、虚血―再灌流から誘導された局所炎症の主な結果の一つである、大脳組織内のイムノグロブリンの量を測定した。
【０２０５】
総イムノグロブリンを、市販のビーズベースのイムノアッセイ（ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｐａｎｅｌ，  Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  ｃａｔ  Ｎ°  ＥＰＸ０７０−２０８１５−９０１、製造社の指示にしたがう）を使用することにより測定した。マウスのイムノグロブリンのアイソタイプＩｇＧ１，ＫおよびＬならびにＩｇＧ２ａ，Ｋは、すべての試料で容易に検出可能であった。３つのアイソタイプのプールしたＩｇを、解析に使用した。
【０２０６】
結果
この結果を、以下の表２および図９に示す。データは、右／左のＩｇ比：［（虚血―再灌流傷害に供した）右半球の総Ｉｇ）］／［左半球（反対側、非虚血）の総Ｉｇ］として表されている。
【表２】
2019512520.tif 000003
【０２０７】
図９に示されているように、右／左のＩｇ比は、偽手術したマウスではおよそ１であり、虚血―再灌流の脳損傷に供したマウスでは一貫して増加した。特筆すべきことに、再灌流の３０分前のＰ８ＲＩ投与が、右／左のＩｇ比を有意に減少でき、これは血液脳関門の透過率の減少を反映している。
【０２０８】
実施例３：腸間膜虚血―再灌流のモデルにおけるＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストの保護効果
材料および方法
ラットに、腹腔内注射によりウレタンで麻酔をかけた。すべての実験期間の間、静脈のサンプリング、治療投与、および溶質の灌流（ＮａＣｌ（０．９％）、１０μｌ／Ｈ／ｇ体重（ｂ．ｗ．）のためカテーテルを右頸静脈に導入した。カテーテルを、動脈の血圧のモニタリングのため左内頸動脈に導入し、もう１つを、尿の収集のため膀胱に導入した。次に、正中開腹を行い、上腸間膜動脈の近位部を、左腎静脈の上部で切断した。腸間膜動脈の大動脈口を制御する。ペプチドの静脈内投与を、腸間膜動脈のクランプの５分前で血液のサンプリング（Ｔ０）後に開始する。次に、腸間膜動脈を３０分間クランプして（全体的な閉塞）、腸間膜虚血をもたらす。血液のサンプリングを、腸間膜虚血期間の終了時に行う（Ｔ０．５）。次に、腸間膜動脈のクランプを開放し、再灌流を４時間まで経過観察する。新たな血液のサンプリングを、各時間（Ｔ１．５、２．５、３．５、４．５）で行う。最後の血液のサンプリング後の実験期間の終了時に、動物を屠殺する。各時間で、尿を回収し、利尿を測定する。屠殺時に、虚血性の腸をサンプリングする。１つのフラグメントを、ヘモグロビン含有量を測定するために押し出す。他のフラグメントを、組織学のためパラホルムアルデヒドで固定する。
【０２０９】
虚血―再灌流傷害を特徴づけ、ＣＤ３１ｓｈｅｄアゴニストペプチドの有益な効果を評価するために、いくつかの中間の生物学的な基準：好中球起源由来の血漿中および尿中の遊離ＤＮＡ（Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ蛍光インターカラント、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、好中球の活性化および死亡の減少（ｔｒａｄｕｃｉｎｇ）、腸管内腔のヘモグロビン含有量（酸形成反応、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍキット）、上皮損傷の減少、好中球の局所蓄積および活性化を反映している腸粘膜中のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）含有量、血漿中の可溶性ｐ―セレクチン、ならびに全身性の好中球の活性化を反映しているＭＭＰ９含有量を、使用する。この理由としては、ｐ−セレクチンは、活性化好中球（および血小板）の表面からの切断により放出され、ＭＭＰ９は、好中球のアズール顆粒に含まれており、好中球の脱顆粒時に早期に放出されるためである。最後に、ムチンフィルムの保護の程度を、腸壁の組織学により評価した（アルシアンブルー染色）。
【０２１０】
結果
これらの実験条件では、Ｐ８ＲＩの灌流が、対照と比較してラットの血漿において血漿中および尿中の遊離ＤＮＡの進行性の増加を有意に低減する（図３および図４）。またＰ８ＲＩの灌流は、腸管内腔におけるヘモグロビン含有量を有意に減少させることができ（それぞれ１２９．４±４７．３９対３１７．１±９３．２７μｇ／ｍｇプロット、ｐ＜０．００１、図５参照）、直接法ＥＬＩＳＡによるＭＰＯの量により検出されるように、腸の粘膜における好中球の蓄積および活性化を有意に減少させることができ（図６）、循環中の可溶性Ｐ―セレクチンおよびＭＭＰ９の放出を有意に減少させることができ（図７および８）、ならびに上皮絨毛の摩耗、上皮剥離を保護することができ、かつ、粘液のフィルム強度を部分的に保存することができる。実際に、Ｐ８ＲＩの投与は、対照のラットにおける破壊と比較してムチンフィルムの大部分を保存した（データ不図示）。
【図１】
2019512520.tif 000004
【図２】
2019512520.tif 000005
【図３】
2019512520.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
2019512520.tif 000009
【図７】
2019512520.tif 000010
【図８】
2019512520.tif 000011
【図９】
2019512520.tif 000012
【配列表】
2019512520000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年11月19日(2018.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019512520000001.app
【国際調査報告】
2019512520.tif 000013
2019512520.tif 000014
2019512520.tif 000015