(57)【要約】  本発明は、ヒトまたは別の動物由来の変異ウイルス、好ましくはインフルエンザウイルス、および変異ウイルスの調製方法を提供する。この方法は、ウイルスゲノム内の１つ以上の遺伝子の内在性終止コドンの上流にＵＡＧコドンを導入することを含む。本発明はさらに、弱毒化生ワクチンとしての、または複製可能であり制御可能で安全なウイルスモデルとしての変異ウイルスの用途にも関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスの少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸が、終止コドン上流の１つ以上のコドンに位置する位置において１つ以上のＵＡＧコドンを含むことを特徴とする、変異ウイルス。
【請求項２】
手足口病ウイルス、コクサッキーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ、Ｂ型肝炎ウイルスＨＢＶ、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ、デングウイルス、エボラウイルス、ジカウイルス、ＳＡＲＳ、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、森林脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、新規エンテロウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳病ウイルス、ブタ熱ウイルス、口蹄疫ウイルス、およびパルボウイルスからなる群から選択される、請求項１に記載の変異ウイルス。
【請求項３】
ウイルスがインフルエンザウイルスであり、インフルエンザウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、ＮＳまたはＭタンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸が、終止コドン上流の１つ以上のコドンに位置する１つ以上の位置において１つ以上のＵＡＧコドンを含む、請求項１に記載の変異ウイルス。
【請求項４】
ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、ＮＳまたはＭタンパク質からなる群から選択される少なくとも２つ、３つまたは４つのタンパク質をコードする核酸が、終止コドン上流の１つ以上のコドンに位置する１つ以上の位置において１つ以上のＵＡＧコドンを含む、請求項３に記載の変異インフルエンザウイルス。
【請求項５】
ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＮＰタンパク質からなる群から選択される少なくとも２つ、３つまたは４つのタンパク質をコードする核酸が、終止コドン上流の１つ以上のコドンに位置する１つ以上の位置において１つ以上のＵＡＧコドンを含む、請求項３に記載の変異インフルエンザウイルス。
【請求項６】
インフルエンザウイルスが、本明細書の表２ａ）、２ｂ）、２ｃ）、２ｄ）、２ｅ）、２ｆ）、２ｇ）、２ｈ）および２ｉ）に列挙される１つ以上の遺伝子座位内の１つ以上の位置においてＵＡＧコドンを含む、請求項３に記載の変異インフルエンザウイルス。
【請求項７】
インフルエンザウイルスが、ＰＡタンパク質のＲ２６６、ＰＢ１タンパク質のＲ５２、ＰＢ２タンパク質のＫ３３、および／またはＮＰタンパク質のＤ１０１をコードする核酸のコドンの位置においてＵＡＧコドンを含む、請求項３に記載の変異インフルエンザウイルス。
【請求項８】
ウイルス内のタンパク質が、ＵＡＧコドンに対応する位置において非天然アミノ酸を含み、好ましくは非天然アミノ酸が、式（Ｉ）
【化１】
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(I)
に示されるＬｙｓ−ジアジリン、式（ＩＩ）
【化２】
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(II)
に示されるＬｙｓ−アジド、またはジアジリンもしくはアジド構造を含む少なくとも１つの他の非天然アミノ酸から選択されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載の変異ウイルス。
【請求項９】
非天然アミノ酸がｎ位に位置するＬｙｓ−ジアジリンであり、非天然アミノ酸が次の様式：
【化３】
2019500051.tif 000029
でウイルスタンパク質に連結し、
式中、Ｒ1からＲ2への向きが、アミノ酸配列のＮ末端からＣ末端への向きであり、ｎ位がインフルエンザウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、ＮＳ、またはＭタンパク質のいずれか１つのアミノ酸配列の任意の位置であってよく、Ｒ1が１位からｎ−１位までのアミノ酸残基を表し、Ｒ2がｎ＋１位からＣ末端までのアミノ酸残基を表し、Ｒ3が、
【化４】
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であり、
好ましくは、ｎがタンパク質の開始コドンのｐ−１位下流からその天然の終止コドンのｑ位上流までの任意の位置であり、ｐおよびｑが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、または全長のアミノ酸配列の長さから１引いたものと等しい値までから独立して選択される、請求項８に記載の変異ウイルス。
【請求項１０】
非天然アミノ酸がｎ位に位置するＬｙｓ−ジアジドであり、非天然アミノ酸が次の様式：
【化５】
2019500051.tif 000031
でウイルスタンパク質に連結し、
式中、Ｒ1からＲ2への向きが、アミノ酸配列のＮ末端からＣ末端への向きであり、ｎ位がインフルエンザウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、ＮＳ、またはＭタンパク質のいずれか１つのアミノ酸配列の任意の位置であり得、Ｒ1が１位からｎ−１位までのアミノ酸残基を表し、Ｒ2がｎ＋１位からＣ末端までのアミノ酸残基を表し、Ｒ4が、
【化６】
2019500051.tif 000032
であり、
好ましくは、ｎがタンパク質の開始コドンのｐ−１位下流からその天然の終止コドンのｑ位上流までの任意の位置であり、ｐおよびｑが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、または全長のアミノ酸配列の長さから１引いたものと等しい値までから独立して選択される、請求項８に記載の変異ウイルス。
【請求項１１】
タンパク質内の複数の位置において非天然アミノ酸を含む、請求項８から１０のいずれか１項に記載の変異ウイルス。
【請求項１２】
ウイルスがインフルエンザウイルスであり、ＰＡのＲ２６６、ＰＢ１のＲ５２、ＰＢ２のＫ３３、およびＮＰのＤ１０１において非天然アミノ酸を含む、請求項１１に記載の変異ウイルス。
【請求項１３】
ウイルスのタンパク質をコードする配列の内在性ＵＡＧ終止コドンが、ＵＡＡ終止コドンを提供するように変異している、請求項１から１２のいずれか１項に記載のウイルス。
【請求項１４】
ウイルスがインフルエンザウイルスであり、
非変異ＰＢ２のアミノ酸配列が配列番号２に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異ＰＢ１のアミノ酸配列が配列番号３に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異ＰＡのアミノ酸配列が配列番号４に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異ＨＡのアミノ酸配列が配列番号５に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異ＮＰのアミノ酸配列が配列番号６に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異ＮＡのアミノ酸配列が配列番号７に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異Ｍのアミノ酸配列が配列番号８に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、または
非変異ＮＳのアミノ酸配列が配列番号９に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一である、
請求項３から１３のいずれか１項に記載の変異ウイルス。
【請求項１５】
変異ウイルスが、ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧであり、ＰＡタンパク質のＲ２６６、ＰＢ１タンパク質のＲ５２、ＰＢ２タンパク質のＫ３３、およびＮＰタンパク質のＤ１０１をコードするコドンの位置においてＵＡＧコドンを含む、請求項１４に記載の変異ウイルス。
【請求項１６】
ウイルスがヒトまたは他の動物起源のインフルエンザウイルス、好ましくは、インフルエンザＡ、ＢまたはＣウイルスである、請求項３に記載の変異ウイルス。
【請求項１７】
本明細書の表２ａ）〜２ｉ）および表４に列挙される１以上の変異を含む、請求項３に記載の変異ウイルス。
【請求項１８】
核酸分子が、天然終止コドンに加えて、人為的に導入されたＵＡＧをさらに含むことを特徴とする、請求項１から１７のいずれか１項に記載の変異ウイルスをコードする核酸分子またはそれによってコードされる変異タンパク質。
【請求項１９】
請求項１から１７のいずれか１項に記載の変異ウイルスを調製するための方法であって、
（１）好適なベクターに作動可能に連結した１つ以上の変異遺伝子を含む変異核酸を含む発現ベクター、および他の非変異遺伝子を含む核酸を含む１つ以上の発現ベクターを、ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現する動物細胞株にトランスフェクトするか、または変異核酸を含む発現ベクターをｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を発現するプラスミドと共に動物細胞株に共トランスフェクトするステップと、
（２）トランスフェクトした細胞をＬｙｓ−ジアジリンまたはＬｙｓ−アジドを含む培養培地中で培養するステップと、
（３）変異ウイルスを回収するステップと
を含む方法。
【請求項２０】
ステップ（１）におけるプラスミドが、２０１１年６月１４日にＣｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、受託番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：４９５１を有する大腸菌ｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳ内のプラスミドｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
動物細胞株が、哺乳類細胞株、鳥類細胞株、ハムスター細胞株などからなる群から選択され、好ましくは２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ａ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、またはｓｆ９細胞から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡＰｙｌ）を安定に発現する動物細胞株が、２０１５年１１月１７日にＣＧＭＣＣに寄託され、ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１１５９２の受託番号を有するＨＥＫ２９３−ＰＹＬである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
弱毒化ウイルスをスクリーニングする方法であって、
（１）遺伝子変異：ウイルスゲノム内の１つ以上の遺伝子の１つ以上の選択されたコドンを、遺伝子工学の方法によってＴＡＧコドンに変異させて１つ以上の変異遺伝子を得るステップと、
（２）発現ベクターの構築：ステップ（１）において得られた１つ以上の変異遺伝子を好適なベクターに作動可能に連結して、変異遺伝子の発現ベクターを得るステップと、
（３）ステップ（２）において得られた変異遺伝子の発現ベクター、および他の非変異遺伝子を含む遺伝子を含む１つ以上の発現ベクターを、ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現する動物細胞株にトランスフェクトするか、または変異遺伝子を含む発現ベクターをｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を発現するプラスミドと共に動物細胞株に共トランスフェクトするステップと、
（４）トランスフェクトされた細胞をＬｙｓ−ジアジリンまたはＬｙｓ−アジドを含む培養培地中で培養し、培地の上清を収集し、Ｌｙｓ−ジアジリンまたはＬｙｓ−アジドを含むプレートを用いて、非天然アミノ酸に対する上清中のウイルスの依存性を検出するステップと、
（５）非天然アミノ酸Ｌｙｓ−ジアジリンまたはＬｙｓ−アジドに対する依存性を維持する変異体を弱毒化ウイルスとして同定するステップと
を含む方法。
【請求項２４】
ステップ（５）の後に、（６）ステップ（５）における成功裏に部位特異的変異させた候補の変異部位を組み合わせ、ウイルスを再パッケージングしてＵＡＧコドンが複数の遺伝子断片に導入され、非天然アミノ酸がパッケージングされたウイルス内の複数の対応するタンパク質に導入されるようにし、非天然アミノ酸に対するパッケージングされた生成物の依存性を再び検出し、長期間の継代の後に非天然アミノ酸に対する依存性を保持する組み合わされた変異体を、最適な部位特異的変異の候補として決定するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（６）の後に、（７）ステップ（６）において得られた変異ウイルスの安全性を調べ、安全なウイルスを同定するステップをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ウイルスが、手足口病ウイルス、コクサッキーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ、Ｂ型肝炎ウイルスＨＢＶ、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ、デングウイルス、エボラウイルス、ジカウイルス、ＳＡＲＳ、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、森林脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、新規エンテロウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳病ウイルス、ブタ熱ウイルス、口蹄疫ウイルス、およびパルボウイルスからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
１つ以上の選択されたコドンが、コード配列のｎ位に独立して位置し、ｎがタンパク質の開始コドンのｐ−１位下流からその天然の終止コドンのｑ位上流までの任意の位置であり、ｐおよびｑが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、または全長のアミノ酸配列の長さから１引いたものと等しい値までから独立して選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
ステップ（３）におけるプラスミドが、２０１１年６月１４日にＣＧＭＣＣに寄託され、受託番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：４９５１を有する大腸菌ｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳ内のプラスミドｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
動物細胞株が、哺乳類細胞株、鳥類細胞株、ハムスター細胞株などからなる群から選択され、好ましくは２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ａ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、またはｓｆ９細胞から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡＰｙｌ）を安定に発現する動物細胞株が、２０１５年１１月１７日にＣＧＭＣＣに寄託され、ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１１５９２の受託番号を有するＨＥＫ２９３−ＰＹＬである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
変異、パッケージングおよびスクリーニングのステップが繰り返される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
インフルエンザウイルスがインフルエンザＡ、ＢまたはＣウイルスである、請求項２３から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１から１７のいずれか１項に記載の有効量の変異インフルエンザウイルスを含む組成物。
【請求項３５】
請求項１から１７のいずれか１項に記載の有効量の変異インフルエンザウイルスを含むワクチン。
【請求項３６】
請求項１から１７のいずれか１項に記載の有効量の変異インフルエンザウイルス、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３７】
インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染を予防または治療するための生弱毒化ワクチンまたは関連する医薬の製造における、請求項１から１７のいずれか１項に記載の変異インフルエンザウイルスの使用。
【請求項３８】
インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染の予防または治療における、請求項１から１７のいずれか１項に記載の変異インフルエンザウイルスの使用。
【請求項３９】
ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現することができ、２０１５年１１月１７日にＣＧＭＣＣに寄託され、ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１１５９２の受託番号を有するＨＥＫ２９３−ＰＹＬである、哺乳動物細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物製剤の分野、特に変異ウイルス、特にその１つ以上のタンパク質中に非天然のアミノ酸を含む変異ウイルス、例えばインフルエンザウイルスなどに関する。本発明はまた、変異ウイルスを作製する方法に関する。本発明はさらに、変異ウイルスの使用、例えば、生ウイルスワクチン、ウイルス病原性などの安全なモデルとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、インフルエンザウイルスによって引き起こされる急性疾患であり、呼吸器を通じて伝達され、鳥類、哺乳類およびヒトに季節的に感染することができる。インフルエンザウイルスはＡ型、Ｂ型、およびＣ型に分類することができ、その中でＡ型インフルエンザウイルス（インフルエンザＡウイルスとしても知られる）が、最も頻繁に大流行する。インフルエンザＡウイルスは、オルトミクソウイルス科に属し、それらのゲノムは８つの独立した一本鎖ＲＮＡ断片からなり、１０個のタンパク質：ヘマグルチニン（ＨＡ）；Ｍ１およびＭ２を含むマトリックスタンパク質（Ｍ）；ノイラミニダーゼ（ＮＡ）；ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）；ＮＳ１およびＮＥＰを含む非構造タンパク質（ＮＳ）；および３つのポリメラーゼＰＢ１、ＰＢ２、およびＰＡをコードする。これらのタンパク質は、インフルエンザウイルスの生物学的機能に重要な役割を果たす。インフルエンザＡウイルスは、主要表面抗原ＨＡおよびＮＡ間の抗原性の差異に従って異なるサブタイプに分類される。現在までに、ＨＡタンパク質の１８のサブタイプおよびＮＡタンパク質の１１のサブタイプが発見されている。インフルエンザＡウイルスの大規模なパンデミックは、非常に高い罹患率と死亡率を引き起こし得、ヒトの健康に重大な脅威をもたらす（W.H.O. 2003; Coleman 2007）。インフルエンザＡウイルスは、２０世紀において３つの主要なインフルエンザの大流行、すなわち、１９１８年におけるＨ１Ｎ１、１９５７年におけるＨ２Ｎ２、および１９６８年におけるＨ３Ｎ２を引き起こし、約５０００万人の死亡をもたらした（Kilbourne 2006; Taubenberger, Hultin et al. 2007）。２００９年におけるインフルエンザＡ大流行はまた、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルスによって引き起こされ（Dawood, Jain et al. 2009; Zimmer and Burke 2009）、急速に伝播して世界的な注目を集めた。統計によると、世界中で毎年平均、３００，０００〜５００，０００人の人々がインフルエンザによって死亡する（Fiore, Shay et al. 2007）。
【０００３】
インフルエンザが発見されてから、科学者はインフルエンザウイルスの予防と制御に取り組んできている。現在、ワクチン接種は、インフルエンザを予防し、インフルエンザの伝播を抑制する最も有益な手段である。インフルエンザウイルスワクチンは、１９３０年代後半からヒトにおいて使用され始めた。既存のインフルエンザウイルスワクチンは次のカテゴリーに分類される：不活化ウイルスワクチン、弱毒化ウイルスワクチン、ＤＮＡワクチン、サブユニットワクチン、組換えウイルスベクターワクチン、およびウイロイド粒子ワクチン。
【０００４】
現在使用される不活化インフルエンザワクチンは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびＢ型インフルエンザウイルスのワクチンを含む、三価ワクチンである。長年にわたる臨床応用により、不活化インフルエンザワクチンは良好な免疫効果および安全性のプロファイルを有し、接種後に身体を刺激して対応する抗体を産生することができるが、それらは、分泌免疫グロブリン（ｓＩｇＡｓ）の産生を刺激することができないという欠点を有する。さらに、インフルエンザウイルスのニワトリ胚における継代の間に抗原変異が起こる。さらに、多くのニワトリは、インビボで多くのウイルスを保有し、ワクチンはこれらのウイルスによって汚染されている可能性がある。新規のパンデミックの抗原変異体は、ニワトリ胚において効率的に複製することができ、大量のワクチンを作製できるようにするべきである。ワクチンの調製のために使用される野生型ウイルスは、卵において増殖し、それらの免疫原性は、ある程度変化または低下する。作製されたワクチン株が現在の流行ウイルス株と一致しない場合、それはその免疫保護効果を失う。近年、主要な開発は、主にＭＤＣＫ細胞およびＶｅｒｏ細胞である哺乳動物細胞が、インフルエンザウイルスの培養のためのニワトリ胚と置き換わるために使用されることであり、外因性因子による汚染がない、容易な大規模生産、安定した抗原などの利点を有する。哺乳動物細胞において培養されるインフルエンザワクチンは、より良好な免疫原性を有し、より少ない接種後の有害反応をもたらし、より安全である。研究段階において、優れた実験結果を達成している。しかしながら、解決することのできないいくつかの問題が未だ存在し、臨床応用はまだ見られていない。
【０００５】
生弱毒化ワクチンは、次の５つの型を主に含む：熱感受性ワクチン、再集合体ワクチン、低温適応生弱毒化インフルエンザワクチン、逆遺伝学技術によって作製されたワクチン、および複製欠損インフルエンザワクチン。当該技術分野において現在成功裏に開発されているものは、低温適応生弱毒化インフルエンザワクチンである。ワクチンは、低い病原性を有し、最適温度で増殖できるインフルエンザウイルス株である。ウイルスは、約２５℃でのみ複製できるが、３７℃では複製できず、したがって、それによって引き起こされる感染は上気道に限定され、明らかな臨床的なインフルエンザの症状は存在しない。弱毒化株および現在の流行ウイルス株を、遺伝子組換えに供し、弱毒化株と流行ウイルス株のＨＡおよびＮＡ遺伝子を有する組換えウイルスを得る。いくつかの研究が、低温適応株の生物学的特性が非常に安定であることを確認している。抗体産生の陽性率は、弱毒化インフルエンザワクチンおよび不活化ワクチンによる免疫後、５０％〜７０％であり、インフルエンザパンデミックを効果的に抑制することができる。低温適応生弱毒化ワクチンはロシアで使用されており、米国での使用が認可されようとしており、ワクチン接種経路および免疫効果の点で、不活化ワクチンと比較してある程度優位性を示し、例えばそれらは、鼻腔内スプレーまたは点滴によって免疫を実施できる。低温適応生弱毒化ワクチンは上気道において複製でき、粘膜ｓＩｇＡおよび全身性体液性、および細胞性免疫応答を誘導し、不活化ワクチンと比べてより広く、かつより長く続く保護をもたらす。しかしながら、低温適応生弱毒化ワクチンは他のインフルエンザウイルスと遺伝的に再集合して毒性の再集合体ウイルスを生成することができ、二価または三価の低温適応生弱毒化ワクチンにおいて干渉が起こる可能性がある。
【０００６】
理想的なワクチンは次の特性を有するべきである。１．強い免疫原性、２．低い毒性、３．遺伝的安定性、および４．流行している流行株と一致する抗原性を迅速に示す能力。不活性化ワクチンと比較した生ワクチンの利点および生ワクチンの安全性を考慮して、制御可能に複製し、遺伝的に安定で安全で効果的である新規生インフルエンザウイルスワクチンの生産のための哺乳動物細胞の使用は、ワクチンの安全性および有効性を改善し、インフルエンザワクチンの迅速な開発を促進するであろう。
【０００７】
遺伝コード拡張技術
数年の研究の後、原核生物リボソームの翻訳メカニズムが包括的に理解され、異なる機能状態を有する様々なリボソームの結晶およびその電子顕微鏡構造が解明され、ほとんどのアミノｔＲＮＡシンテターゼの構造も解明されている。これらの研究結果に基づいて、近年、遺伝コード拡張技術が開発され、それによってアンバー終止コドン（ＴＡＧ）が、複数の非天然アミノ酸をコードするために使用され、生物に部位特異的に挿入される。これまで、この技術は、いくつかの非天然アミノ酸を、生細胞の標的タンパク質において成功裏に部位特異的に発現させることを可能にし、これらのタンパク質に新規な物理的、化学的および生理学的特性を付与した。このアプローチを使用することによって、非天然アミノ酸（親和性標識および光異性化アミノ酸、カルボニルアミノ酸ならびにグリコシル化アミノ酸を含む）をタンパク質に導入できる（L. Wang et al, 2001, SCIENCE 292: 498-500; J. W. Chin et al, 2002, Journal of the American Chemical Society 124 : 9026-9027; J. W. Chin &P. G. Schultz, 2002, ChemBioChem 11: 1135-1137）。これらの研究は、例えば、カルボニル、アルキニル、およびアジド基などの特殊な化学基のような化学官能基をタンパク質に選択的かつ日常的に導入することが可能であることを示す。一般に、これらの基は、安定した共有結合を効率的かつ選択的に形成することができ、これは、タンパク質の部位特異的修飾およびタンパク質の特性の改善により貢献する。この技術は、タンパク質の部位特異的修飾だけでなく、生物（例えば、ウイルス、細菌など）の部位特異的標識、部位特異的修飾および複製制御などにも使用することができる。ＴＡＧ終止コドンが導入される生物の増殖およびタンパク質発現は、対応する外因性非天然アミノ酸を含むバイオ直交系に依存する。
【発明の概要】
【０００８】
部位特異的変異インフルエンザウイルスが、インフルエンザウイルスのゲノム中にアンバー終止コドン（ＴＡＧ）を導入すること、ならびにメタノコッカス属古細菌のｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を含むタンパク質翻訳系を用いることによる対応するタンパク質の対応する部位への非天然アミノ酸の部位特異的組み込みによって本発明者らによって得られている。このクラスのインフルエンザウイルスの複製およびタンパク質発現を含む一連の生物学的プロセスは、非天然アミノ酸を含むバイオ直交系に依存する。すなわち、このクラスのウイルスは、特別な非天然アミノ酸を含むバイオ直交系においてパッケージングされ、増殖され、調製され得る。非天然アミノ酸を含むバイオ直交系がなければ、ウイルスの生命活動（例えば、複製およびタンパク質発現など）を行うことができない。したがって、その調製が非天然アミノ酸に依存するインフルエンザウイルスは、非常に安全である。さらに、部位特異的変異インフルエンザウイルスをさらに修飾して部位特異的修飾インフルエンザウイルスを得ることができ、前記部位特異的修飾は、例えば、インフルエンザウイルスタンパク質の特定のアミノ酸への免疫強化物質の部位特異的導入を含み、これによって、改良された性能を有するインフルエンザウイルス、例えば増強された免疫原性を有する改変体を得ることができる。
【０００９】
本発明の最も重要な突破口は、インフルエンザウイルスが非天然アミノ酸を含むバイオ直交系においてのみ複製できるように、アンバー終止コドン（ＵＡＧ）がインフルエンザウイルスのゲノムに導入されることである。非天然アミノ酸を含むバイオ直交系に対するインフルエンザウイルスの依存性を利用することにより、インフルエンザウイルスをこの系において大規模に調製することができる。バイオ直交系は動物およびヒトには存在しないため、調製されたインフルエンザウイルスは動物およびヒトにおいて複製、増殖することができず、ウイルスの安全性が増し、インフルエンザウイルスは本物の生インフルエンザウイルスワクチンである。さらに、合成非天然アミノ酸は、異なる機能を有する官能基を有するように修飾することができるので、部位特異的修飾インフルエンザウイルスの均質性および免疫原性の維持を可能にする、結果として生じる特異的部位特異的修飾に対する保証を提供することができる。例えば、クリック反応は、前記非天然アミノ酸においてのみ起こり得るが、ウイルスタンパク質の他の部位では起こり得ない。
【００１０】
変異系の原理は、変異ｔＲＮＡPylおよびＰｙｌＲＳが次の関係を満たすことである：（１）ｔＲＮＡPylは、宿主細胞においてリシルｔＲＮＡ酵素を利用することができず、変異ＰｙｌＲＳによってのみアシル化され得る；（２）変異ＰｙｌＲＳはｔＲＮＡPylのみをアシル化することができるが、他のｔＲＮＡをアシル化することはできない。したがって、変異ｔＲＮＡPylと変異ＰｙｌＲＳとの間には直交関係が存在する。このような直交性酵素は、およびこの種の酵素のみで、非天然アミノ酸をそのような直交ｔＲＮＡにアシル化することができ、かつこのｔＲＮＡのみをアシル化することができ、他のｔＲＮＡをアシル化することはできない。得られた直交リシルｔＲＮＡシンターゼ／ｔＲＮＡ系は、２０個の典型的なアミノ酸以外の、Ｌｙｓ−ジアジリンまたはＬｙｓ−アジドなどまたは他の非天然アミノ酸をアンバーコドンＴＡＧに対応させ、インフルエンザウイルスの各々のタンパク質への非天然アミノ酸の導入を可能にする。バイオ直交系は動物およびヒトには存在しないため、調製されたインフルエンザウイルスは動物およびヒトにおいて複製、増殖することができず、ウイルスの安全性が増す。したがって、本発明の一態様は、天然アミノ酸が導入されたインフルエンザウイルスに関し、それはＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、ＮＳ、またはＭタンパク質の少なくとも１つの少なくとも１つの部位におけるアミノ酸が、非天然アミノ酸に変異されていることを特徴とし、好ましくは前記非天然アミノ酸が、式（Ｉ）
【化１】
2019500051.tif 000003
(I)
に示されるＬｙｓ−ジアジリン、式（ＩＩ）
【化２】
2019500051.tif 000004
(II)
に示されるＬｙｓ−アジド、または、ジアジリンもしくはアジド構造を含む別の非天然アミノ酸から選択される。
【００１１】
本発明の別の態様は、非天然アミノ酸が導入されたインフルエンザウイルスを調製するための方法に関し、それは、（１）インフルエンザウイルスの様々なタンパク質をコードする遺伝子であって、タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子が、その終止コドンの上流の１つ以上の部位においてＴＡＧ変異を含む遺伝子を含むプラスミドを構築するステップと、（２）ステップ（１）のプラスミドを、非天然アミノ酸（例えばＬｙｓ−ジアジリンおよびＬｙｓ−アジド）を特異的に認識するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼを発現する動物細胞にトランスフェクトするか、またはステップ（１）のプラスミド、および非天然アミノ酸（例えばＬｙｓ−ジアジリンおよびＬｙｓ−アジド）を特異的に認識するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼを発現するプラスミドを動物細胞に共トランスフェクトするステップと、（３）トランスフェクトした細胞を所望の非天然アミノ酸を含む培地中で培養して、ＴＡＧ終止コドンがゲノムに導入されて、非天然アミノ酸が対応するタンパク質に導入されるようにしたインフルエンザウイルスを得るステップとを含む。動物細胞は、例えば、２９３Ｔ細胞のような、哺乳動物細胞、鳥類細胞などであってよい。
【００１２】
一実施形態において、Ｌｙｓ−ジアジリンおよびＬｙｓ−アジドのような非天然アミノ酸を特異的に認識するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼを発現するプラスミドは、Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒに寄託されているｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳプラスミドであり、寄託日は２０１１年６月１４日である。プラスミドは、２０１２１０２１４４５１．６の特許番号を有する中国特許に開示された。受託番号Ｎｏ．ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：４９５１を有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）と称される細菌細胞は、プラスミドｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳを含み、プラスミドは、例えば、Ｌｙｓ−ジアジリンおよびＬｙｓ−アジドのような非天然アミノ酸を特異的に認識するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼを発現することができる。
【００１３】
別の実施形態において、ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＰｙｌ）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡＰｙｌ）を安定に発現する動物細胞株は、Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒに寄託されたＨＥＫ２９３−ＰＹＬであり、株はＮｏ．１  Ｂｅｉｃｈｅｎ  Ｗｅｓｔ  Ｒｏａｄ、Ｃｈａｏｙａｎｇ  Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｃｉｔｙ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに寄託され、寄託日は２０１５年１１月１７日であり、受託番号はＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１１５９２であり、その分類された名称はヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。本発明において使用される動物細胞株はまた、Ｌｙｓ−ジアジリンおよびＬｙｓ−アジドのような非天然アミノ酸を特異的に認識するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼを発現するプラスミドをトランスフェクトする手段によって調製することもできる。細胞にトランスフェクトする方法は、当該技術分野において周知である。
【００１４】
当業者は、複数の方法によって、インフルエンザウイルスの様々なタンパク質をコードする遺伝子にＴＡＧ変異を導入する好適な部位を決定することができる。例えば、インフルエンザウイルスの対応するタンパク質中のアミノ酸の保存性を分析してもよく、ＴＡＧを導入する部位を、バイオインフォマティクスの手段によって決定してもよい。
本発明の一つの具体的な実施形態において、アンバーコドンＴＡＧを有するインフルエンザウイルス遺伝子を、ベクター（例えば、ＰＨＨ２１プラスミド）へと挿入し、次いで、宿主細胞（例えば、２９３Ｔ細胞）に、ｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳプラスミドと共にそのベクターをトランスフェクトする。したがって、部位特異的変異インフルエンザウイルスは、Ｌｙｓ−ジアジリンおよびＬｙｓ−アジドのような非天然アミノ酸を培養培地中に添加することによって得ることができる。
【００１５】
本発明の一実施形態において、インフルエンザウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＮＰ遺伝子断片にＴＡＧをそれぞれ導入し、次いでインフルエンザウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＮＰタンパク質の対応する部位にＬｙｓ−アジドを部位特異的に修飾し、中空繊維カラムおよびゲルクロマトグラフィーまたはショ糖密度勾配遠心分離方法によって精製された変異インフルエンザウイルスを得る。インビトロおよびインビボで実施された実験から、変異インフルエンザウイルスは非常に高い安全性プロファイルおよび遺伝的安定性を有し、不活化ウイルスと比較してより良好な免疫効果を誘発することが予備的に証明されている。
【００１６】
本発明の一実施形態において、インフルエンザウイルスの生産効率を向上させ、将来の産業生産を促進するために、本発明者らは、ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡＰｙｌ）を安定に発現し得る安定な哺乳動物細胞株ＨＥＫ２９３−ＰＹＬを樹立した。安定な哺乳動物細胞株はまた、従来の方法の欠点を克服する。例えば、ニワトリ胚においてウイルスを増殖せる方法によって得られるウイルスは、ヒトにおいてアレルギーなどの有害反応を常に引き起こす。本発明においては、哺乳動物細胞で調製することができる変異インフルエンザウイルスが提供され、アンバー終止コドンＵＡＧおよび非天然アミノ酸がそれぞれ、そのゲノムおよび対応するタンパク質に導入される。ウイルスはまた、ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡＰｙｌ）を安定に発現する安定な哺乳動物細胞株（例えば、２９３Ｔ細胞）から調製することができる。調製された変異インフルエンザウイルスは、非常に良好な安全性プロファイルおよび高い免疫原性を有する。
【００１７】
ｔＲＮＡを安定に発現させる理想的な方法は未だ存在しない。変異インフルエンザウイルスのレスキュー効率を改善するために、複数の研究の結果、本発明者らは、二重レンチウイルス形質導入と安定なプラスミドトランスフェクションの組み合わせを含む３ラウンドスクリーニング方法、ならびに直交ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを安定に発現する特異的細胞株、すなわちｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡＰｙｌ）を安定に発現する安定な哺乳動物細胞株ＨＥＫ２９３−ＰＹＬを確立した（図１１Ａ）。本発明者らはまた、ピューロマイシン耐性およびハイグロマイシン耐性を有し、それぞれアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼおよび３９位にＴＡＧ変異を有するＧＦＰレポーター遺伝子を保有する２つのレンチウイルス過剰発現ベクターを構築し、安定な細胞株ｐｙｌＲＳ／ＧＦＰ39TAGは、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の２ラウンドのウイルス形質導入およびピューロマイシン／ハイグロマイシンスクリーニングによって得られる。その後、１２コピーのｔＲＮＡを有し、ゼオマイシン耐性を有するｂｊｍｕ−ｚｅｏ−１２ｔＲＮＡベクターを構築する。次いで、細胞株ｐｙｌＲＳ／ＧＦＰ39TAGにプラスミド線状化を経てベクターをトランスフェクトし、ＵＡＡの存在下でゼオマイシンスクリーニングに供し、ＧＦＰ陽性細胞を分離する（この細胞はＵＡＡの存在下で緑色であり、ＵＡＡを除去するとき無色になる）。これにより、直交ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを安定に発現する安定細胞株ＨＥＫ２９３−ＰＹＬを得る。
【００１８】
本発明の一実施形態において、本発明者らは、リバースジェネティクス技術を用いて、現在存在するインフルエンザウイルスモデルの任意の遺伝子を他の亜型または株の遺伝子で置き換えて、他の亜型または株のインフルエンザウイルスを調製することができる。この方法は、任意のサブタイプまたは株のインフルエンザウイルスに適用可能であり、調製されたウイルスは、非天然アミノ酸を含むバイオ直交系に対する厳密な依存性を有する。さらに、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、またはＢ型インフルエンザウイルスの表面抗原を含む多価インフルエンザウイルスのような多価インフルエンザウイルスも、リバースジェネティクス技術および遺伝子コドン技術を用いることによって調製することができる。より重要なことに、本発明の方法によって調製される病原性および多価の変異ウイルスは、非常に高い安全性プロファイルと有効性を有する。
【００１９】
本発明は以下を提供する。
１．ウイルスの少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸が、終止コドン上流の１つ以上のコドンに位置する位置において１つ以上のＵＡＧコドンを含むことを特徴とする、変異ウイルス。
１つ以上のＵＡＧコドンは、前記終止コドン上流の１つ以上のコドンを置換し得る。１つ以上のＵＡＧコドンは、前記終止コドン上流の１つ以上のコドンの前記位置に挿入され得る。１つ以上のＵＡＧコドンは、前記終止コドン上流の１つ以上のコドンを置換し得、１つ以上のＵＡＧコドンは、前記終止コドン上流の１つ以上のコドンの前記位置に挿入され得る。
２．手足口病ウイルス、コクサッキーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ、Ｂ型肝炎ウイルスＨＢＶ、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ、デングウイルス、エボラウイルス、ジカウイルス、ＳＡＲＳ、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、森林脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、新規エンテロウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳病ウイルス、ブタ熱ウイルス、口蹄疫ウイルス、およびパルボウイルスからなる群から選択される、項目１に記載の変異ウイルス。
３．ウイルスがインフルエンザウイルスであり、インフルエンザウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、ＮＳまたはＭタンパク質から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸が終止コドン上流の１つ以上のコドンに位置する１つ以上の位置において１つ以上のＵＡＧコドンを含む、項目１に記載の変異ウイルス。
４．ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、ＮＳまたはＭタンパク質からなる群から選択される少なくとも２つ、３つまたは４つのタンパク質をコードする核酸が終止コドン上流の１つ以上のコドンに位置する１つ以上の位置において１つ以上のＵＡＧコドンを含む、項目３に記載の変異インフルエンザウイルス。
５．ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、およびＮＰタンパク質からなる群から選択される少なくとも２つ、３つまたは４つのタンパク質をコードする核酸が終止コドン上流の１つ以上のコドンに位置する１つ以上の位置において１つ以上のＵＡＧコドンを含む、項目３に記載の変異インフルエンザウイルス。
６．インフルエンザウイルスが、本明細書の表２ａ）、２ｂ）、２ｃ）、２ｄ）、２ｅ）、２ｆ）、２ｇ）、２ｈ）および２ｉ）に列挙される１つ以上の遺伝子座位内の１つ以上の位置においてＵＡＧコドンを含む、項目３に記載の変異インフルエンザウイルス。
７．インフルエンザウイルスが、ＰＡタンパク質のＲ２６６、ＰＢ１タンパク質のＲ５２、ＰＢ２タンパク質のＫ３３、および／またはＮＰタンパク質のＤ１０１をコードする核酸のコドンの位置においてＵＡＧコドンを含む、項目３に記載の変異インフルエンザウイルス。
８．ウイルス内のタンパク質が、ＵＡＧコドンに対応する位置において非天然アミノ酸を含み、好ましくは非天然アミノ酸が、式（Ｉ）
【００２０】
【化３】
2019500051.tif 000005
(I)
に示されるＬｙｓ−ジアジリン、式（ＩＩ）
【化４】
2019500051.tif 000006
(II)
に示されるＬｙｓ−アジド、または、ジアジリンもしくはアジド構造を含む他の少なくとも１つの非天然アミノ酸から選択されることを特徴とする、項目１から７のいずれか１項目に記載の変異ウイルス。
９．非天然アミノ酸がｎ位に位置するＬｙｓ−ジアジリンであり、非天然アミノ酸が次の様式：
【００２１】
【化５】
2019500051.tif 000007
でウイルスタンパク質に連結し、
式中、Ｒ1からＲ2への向きが、アミノ酸配列のＮ末端からＣ末端への向きであり、ｎ位がインフルエンザウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、ＮＳ、またはＭタンパク質のいずれか１つのアミノ酸配列の任意の位置であり得、Ｒ1が１位からｎ−１位までのアミノ酸残基を表し、Ｒ2がｎ＋１位からＣ末端までのアミノ酸残基を表し、Ｒ3が、
【００２２】
【化６】
2019500051.tif 000008
であり、
好ましくは、ｎがタンパク質の開始コドンのｐ−１位下流からその天然の終止コドンのｑ位上流までの任意の位置であり、ｐおよびｑが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、または全長のアミノ酸配列の長さから１引いたものと等しい値までから独立して選択される、項目８に記載の変異ウイルス。
１０．非天然アミノ酸がｎ位に位置するＬｙｓ−ジアジドであり、非天然アミノ酸が次の様式：
【００２３】
【化７】
2019500051.tif 000009
でウイルスタンパク質に連結し、
式中、Ｒ1からＲ2への向きが、アミノ酸配列のＮ末端からＣ末端への向きであり、ｎ位がインフルエンザウイルスのＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰ、ＮＡ、ＨＡ、ＮＳ、またはＭタンパク質のいずれか１つのアミノ酸配列の任意の位置であり得、Ｒ1が１位からｎ−１位までのアミノ酸残基を表し、Ｒ2がｎ＋１位からＣ末端までのアミノ酸残基を表し、Ｒ4が、
【００２４】
【化８】
2019500051.tif 000010
であり、
好ましくは、ｎがタンパク質の開始コドンのｐ−１位下流からその天然の終止コドンのｑ位上流までの任意の位置であり、ｐおよびｑが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、または全長のアミノ酸配列の長さから１引いたものと等しい値までから独立して選択される、項目８に記載の変異ウイルス。
１１．タンパク質内の複数の位置において非天然アミノ酸を含む、項目８から１０のいずれか１項目に記載の変異ウイルス。
１２．ウイルスがインフルエンザウイルスであり、ＰＡのＲ２６６、ＰＢ１のＲ５２、ＰＢ２のＫ３３、およびＮＰのＤ１０１において非天然アミノ酸を含む、項目１１に記載の変異ウイルス。
１３．ウイルスのタンパク質をコードする配列の内在性ＵＡＧ終止コドンが、ＵＡＡ終止コドンを提供するように変異している、項目１から１２のいずれか１項目に記載のウイルス。
１４．ウイルスがインフルエンザウイルスであり、
非変異ＰＢ２のアミノ酸配列が配列番号２に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異ＰＢ１のアミノ酸配列が配列番号３に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異ＰＡのアミノ酸配列が配列番号４に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異ＨＡのアミノ酸配列が配列番号５に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異ＮＰのアミノ酸配列が配列番号６に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異ＮＡのアミノ酸配列が配列番号７に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、
非変異Ｍのアミノ酸配列が配列番号８に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一であるか、または
非変異ＮＳのアミノ酸配列が配列番号９に記述される核酸によってコードされるアミノ酸配列と同一である、
項目３から１３のいずれか１項目に記載の変異ウイルス。
１５．変異ウイルスが、ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧであり、ＰＡタンパク質のＲ２６６、ＰＢ１タンパク質のＲ５２、ＰＢ２タンパク質のＫ３３、およびＮＰタンパク質のＤ１０１をコードするコドンの位置においてＵＡＧコドンを含む、項目１４に記載の変異ウイルス。
１６．ウイルスがヒトまたは他の動物起源のインフルエンザウイルス、好ましくは、インフルエンザＡ、ＢまたはＣウイルスである、項目３に記載の変異ウイルス。
１７．本明細書の表２ａ）〜２ｉ）および表４に列挙される１以上の変異を含む、項目３に記載の変異ウイルス。
１８．核酸分子が、天然終止コドンに加えて、人為的に導入されたＵＡＧをさらに含むことを特徴とする、項目１から１７のいずれか１項目に記載の変異ウイルスをコードする核酸分子またはそれによってコードされる変異タンパク質。
【００２５】
１９．項目１から１７のいずれか１項目に記載の変異ウイルスを調製するための方法であって、
（１）好適なベクターに作動可能に連結した１つ以上の変異遺伝子を含む変異核酸を含む発現ベクター、および他の非変異遺伝子を含む核酸を含む１つ以上の発現ベクターを、ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現する動物細胞株にトランスフェクトするか、または変異核酸を含む発現ベクターをｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を発現するプラスミドと共に動物細胞株に共トランスフェクトするステップと、
（２）トランスフェクトした細胞をＬｙｓ−ジアジリンまたはＬｙｓ−アジドを含む培養培地中で培養するステップと、
（３）変異ウイルスを回収するステップと
を含む方法。
２０．ステップ（１）におけるプラスミドが、２０１１年６月１４日にＣｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅ（ＣＧＭＣＣ）に寄託され、受託番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：４９５１を有する大腸菌ｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳ内のプラスミドｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳである、項目１９に記載の方法。
２１．動物細胞株が、哺乳類細胞株、鳥類細胞株、ハムスター細胞株などからなる群から選択され、好ましくは２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ａ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、またはｓｆ９細胞から選択される、項目１９に記載の方法。
２２．ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現する動物細胞株が、２０１５年１１月１７日にＣＧＭＣＣに寄託され、ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１１５９２の受託番号を有するＨＥＫ２９３−ＰＹＬである、項目１９に記載の方法。
２３．弱毒化ウイルスをスクリーニングする方法であって、
（１）遺伝子変異：ウイルスゲノム内の１つ以上の遺伝子の１つ以上の選択されたコドンを、遺伝子工学の方法によってＴＡＧコドンに変異させて１つ以上の変異遺伝子を得るステップと、
（２）発現ベクターの構築：ステップ（１）において得られた１つ以上の変異遺伝子を好適なベクターに作動可能に連結して、変異遺伝子の発現ベクターを得るステップと、
（３）ステップ（２）において得られた変異遺伝子の発現ベクター、および他の非変異遺伝子を含む遺伝子を含む１つ以上の発現ベクターを、ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現する動物細胞株にトランスフェクトするか、または変異遺伝子を含む発現ベクターをｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を発現するプラスミドと共に動物細胞株に共トランスフェクトするステップと、
（４）トランスフェクトされた細胞をＬｙｓ−ジアジリンまたはＬｙｓ−アジドを含む培養培地中で培養し、培地の上清を収集し、Ｌｙｓ−ジアジリンまたはＬｙｓ−アジドを含むプレートを用いて、非天然アミノ酸に対する上清中のウイルスの依存性を検出するステップと、
（５）非天然アミノ酸Ｌｙｓ−ジアジリンまたはＬｙｓ−アジドに対する依存性を維持する変異体を弱毒化ウイルスとして同定するステップと
を含む方法。
２４．ステップ（５）の後に、（６）ステップ（５）における成功裏に部位特異的変異させた候補の変異部位を組み合わせ、ウイルスを再パッケージングしてＵＡＧコドンが複数の遺伝子断片に導入され、非天然アミノ酸がパッケージングされたウイルス内の複数の対応するタンパク質に導入されるようにし、非天然アミノ酸に対するパッケージングされた生成物の依存性を再び検出し、長期間の継代の後に非天然アミノ酸に対する依存性を保持する組み合わされた変異体を、最適な部位特異的変異の候補として決定するステップをさらに含む、項目２３に記載の方法。
２５．ステップ（６）の後に、（７）ステップ（６）において得られた変異ウイルスの安全性を調べ、安全なウイルスを同定するステップをさらに含む、項目２４に記載の方法。
２６．ウイルスが、手足口病ウイルス、コクサッキーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ、Ｂ型肝炎ウイルスＨＢＶ、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ、デングウイルス、エボラウイルス、ジカウイルス、ＳＡＲＳ、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、森林脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、新規エンテロウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳病ウイルス、ブタ熱ウイルス、口蹄疫ウイルス、およびパルボウイルスからなる群から選択される、項目２３に記載の方法。
【００２６】
２７．１つ以上の選択されたコドンが、コード配列のｎ位に独立して位置し、ｎがタンパク質の開始コドンのｐ−１位下流からその天然の終止コドンのｑ位上流までの任意の位置であり、ｐおよびｑが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、または全長のアミノ酸配列の長さから１引いたものと等しい値までから独立して選択される、項目２３に記載の方法。
２８．ウイルスがインフルエンザウイルスである、項目２３に記載の方法。
２９．ステップ（３）におけるプラスミドが、２０１１年６月１４日にＣＧＭＣＣに寄託され、受託番号ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：４９５１を有する大腸菌ｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳ内のプラスミドｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳである、項目２３に記載の方法。
３０．動物細胞株が、哺乳類細胞株、鳥類細胞株、ハムスター細胞株などからなる群から選択され、好ましくは２９３細胞、２９３Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ａ５４９細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、またはｓｆ９細胞から選択される、項目２３に記載の方法。
３１．ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現する動物細胞株が、２０１５年１１月１７日にＣＧＭＣＣに寄託され、ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１１５９２の受託番号を有するＨＥＫ２９３−ＰＹＬである、項目２３に記載の方法。
３２．変異、パッケージングおよびスクリーニングのステップが繰り返される、項目２３に記載の方法。
３３．インフルエンザウイルスがインフルエンザＡ、ＢまたはＣウイルスである、項目２３から３２のいずれか１項目に記載の方法。
３４．項目１から１７のいずれか１項目に記載の有効量の変異インフルエンザウイルスを含む組成物。
３５．項目１から１７のいずれか１項目に記載の有効量の変異インフルエンザウイルスを含むワクチン。
３６．項目１から１７のいずれか１項目に記載の有効量の変異インフルエンザウイルス、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物。
３７．インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染を予防または治療するための生弱毒化ワクチンまたは関連する医薬の製造における、項目１から１７のいずれか１項目に記載の変異インフルエンザウイルスの使用。
３８．インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染の予防または治療における、項目１から１７のいずれか１項目に記載の変異インフルエンザウイルスの使用。
３９．ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現することができ、２０１５年１１月１７日にＣＧＭＣＣに寄託され、ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：１１５９２の受託番号を有するＨＥＫ２９３−ＰＹＬである、動物細胞株。
【００２７】
上述の組成物、医薬組成物およびワクチンは、当該技術分野における従来技術を使用することによって、および本発明による部位特異的変異インフルエンザウイルスの調製を利用して、調製することができ、それらは、ヒトおよび動物におけるインフルエンザウイルスによって引き起こされる感染を含む、インフルエンザウイルスによって引き起こされる感染を予防または治療するために使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】バイオインフォマティクスツールＣｏｎｓｕｒｆを用いてインフルエンザウイルスの様々なタンパク質のアミノ酸配列の保存性を計算するワークフロー。
【図２Ａ】インフルエンザウイルスの様々なタンパク質の点変異の後のインフルエンザウイルスのレスキューの効果。変異部位は単に代表的であり、示されているものに限定しない。インフルエンザウイルスＮＰタンパク質の点変異の後のインフルエンザウイルスのレスキューの効果。
【図２Ｂ】インフルエンザウイルスＰＡタンパク質の点変異の後のインフルエンザウイルスのレスキューの効果。
【図２Ｃ】インフルエンザウイルスＰＢ２タンパク質の点変異の後のインフルエンザウイルスのレスキューの効果。
【図２Ｄ】インフルエンザウイルスＰＢ１タンパク質の点変異の後のインフルエンザウイルスのレスキューの効果。
【図２Ｅ】インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の点変異の後のインフルエンザウイルスのレスキューの効果。
【図２Ｆ】インフルエンザウイルスＮＡタンパク質の点変異の後のインフルエンザウイルスのレスキューの効果。
【図２Ｇ】インフルエンザウイルスＮＳタンパク質の点変異の後のインフルエンザウイルスのレスキューの効果。
【図２Ｈ】インフルエンザウイルスＭ１タンパク質の点変異の後のインフルエンザウイルスのレスキューの効果。
【図３】インフルエンザウイルスのＮＰ、ＰＡ、ＰＢ１、およびＰＢ２に点変異を同時に導入した後のインフルエンザウイルスのレスキューの効果。特に、インフルエンザウイルスのＮＰ−Ｓ３、ＮＰ−Ｓ１、ＰＢ１−Ｓ４、およびＰＢ２−Ｓ４の４つの部位を選択して組み合わせ、４つの部位に同時に変異導入し、生じるプラスミドをインフルエンザウイルスのレスキューに使用する。生じるインフルエンザウイルスをＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧと命名する。
【図４】調製したＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧの遺伝的安定性の試験は、調製した変異インフルエンザウイルスが複数の継代後も未だ安定であることを示す。実験中、ウイルスを４ヶ月まで続けて継代し、調製したウイルスはその非天然アミノ酸に対する依存性を維持する。
【図５】ｑＲＴ−ＰＣＲの結果は、本発明の方法を用いて産生したインフルエンザウイルスが、野生型インフルエンザウイルスに近い非常に高い収率を有することを示す。
【図６】野生型および変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧウイルスの抗原赤血球凝集反応力価を測定することにより、変異インフルエンザウイルスおよび野生型ウイルスが実質的に同一の抗原赤血球凝集反応力価を有することを立証し、さらに変異インフルエンザウイルスの収率が非常に高いことも立証した。
【図７】変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧウイルスの安全性および免疫原性を試験するために、ウイルスを経鼻的に接種し、血液を眼窩腔から採取する、動物実験プログラムを設計する。
【図８】動物における変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧウイルスの安全性プロファイル（群当たり１０匹のマウス）。（Ａ）野生型インフルエンザウイルスを接種するとき、全てのマウスは有意に減少した体重を有するが、変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧウイルスまたは不活化インフルエンザＷＳＮ陽性コントロールを接種するとき、全てのマウスは有意な体重減少を示さない。（Ｂ）野生型インフルエンザウイルスを接種するとき、全てのマウスは接種後１０日目で死亡するが、変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧウイルスまたは不活化インフルエンザウイルスＷＳＮ陽性コントロールを接種するとき、全てのマウスは観察期間中に生存する。これは、変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧが、動物における良好な安全性を有することを示す。
【図９Ａ】動物における変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧの有効性。図７に記述される実験プログラムに従って、各々の群からのマウスの肺組織を摘出し、肺組織中のウイルスの相対量をｑＲＴ−ＰＣＲによって検出する。図に示されるように、マウスを不活化ウイルスまたは変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧによって免疫するとき、マウスの肺組織におけるウイルス量が減少し、それは免疫用量依存的である。さらに、変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧの免疫効果は、不活化ウイルスのものよりも良好である。
【図９Ｂ】免疫前後のマウスの各々の群における抗ＨＡ抗体のレベルをＥＬＩＳＡアッセイによって試験する。結果は、免疫後１４日、および免疫後２１日でマウスにおける抗体のレベルは増加し、２１日目における抗体のレベルは、１４日目におけるものよりも高いことを示す。
【図９Ｃ】図７に記述される実験プログラムに従って、各々の群のマウスを個別に免疫し、次いで、１００ＬＤ50のＷＳＮを感染させる。マウスの体重もまた調べる。調製した変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇが、動物をウイルス感染から保護することにおいて良好に機能することを見出した。さらに、１倍用量における変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇのマウスに対する保護効果は、１０倍用量における不活化ＷＳＮのものに匹敵する。これは、調製した弱毒化インフルエンザワクチンが、不活化ワクチンよりも優れていることを完全に立証する。
【図９Ｄ】図７に記述される実験プログラムに従って、各々の群のマウスを個別に免疫し、次いで、１００ＬＤ50のＷＳＮを感染させる。マウスの死亡率を調べる。調製した変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇが、動物をウイルス感染から保護できることを見出した。さらに、１倍用量における変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇのマウスに対する保護効果は、１０倍用量における不活化ＷＳＮのものに匹敵する。これは、調製した弱毒化インフルエンザワクチンが、不活化ワクチンよりも優れていることを完全に立証する。
【図１０】ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現する安定な哺乳動物細胞株ＨＥＫ２９３−ＰＹＬを用いることによる変異インフルエンザウイルスのレスキューの効率を、正常哺乳動物細胞２９３Ｔを用いる変異インフルエンザウイルスのレスキューの効率と比較する。結果は、細胞株ＨＥＫ２９３−ＰＹＬを用いることによる変異インフルエンザウイルスのレスキューの効率が、正常２９３Ｔ細胞を用いるものよりも非常に高いことを示す。
【図１１Ａ】直交ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼのための安定な細胞株ＨＥＫ２９３−ＰＹＬをスクリーニングするための方法の確立である。
【図１１Ｂ】二重ウイルス過剰発現系の構築。
【図１１Ｃ】ｂｊｍｕ−１２ｔ−ｚｅｏベクターの構築。
【図１２】ＮＡタンパク質およびＮＰタンパク質に対する抗体のレベルを、インフルエンザウイルスワクチンをワクチン接種したマウスにおいて測定する。ＷＳＮ−ＲＰＮ−ｔａｇは、マウスにおけるＮＡに対する特異的抗体およびＮＰに対する特異的抗体の産生を誘導することができる。
【図１３】ＷＳＮ−ＲＰＮ−ｔａｇによる、マウスの肺におけるウイルス特異的抗体ＩｇＡの産生の誘導。ＷＳＮ−ＲＰＮ−ｔａｇは、不活化ＷＳＮと比較して高いレベルでＩｇＡの産生を誘導することができる。
【図１４】ＷＳＮ−ＲＰＮ−ｔａｇで免疫するマウスの肺におけるＮＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の量。不活化ＷＳＮはＮＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の量に最小の影響を有するが、一方で、ＷＳＮ−ＲＰＮ−ｔａｇで免疫するマウスの肺におけるＮＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の量は有意に増加する。
【図１５】本発明者らの調製するＵＡＧを含む変異インフルエンザウイルスが、野生型インフルエンザウイルスの複製および病原性を阻害することができることを示す。（Ａ）ゲノム内に４つのＵＡＧを含む変異ウイルスは、野生型ウイルスのプラーク形成を阻害する。野生型は野生型ウイルスを表し、ＣＡＩＶは低温適応弱毒化インフルエンザワクチンである。（Ｂ）ＵＡＧを含む変異ウイルスは、野生型ウイルスのプラーク形成を阻害し、ＵＡＧの数が増加するにつれ、阻害活性が増強する。（Ｃ）動物において、ＵＡＧを含む変異ウイルスは、野生型ウイルスの感染によって引き起こされる動物の死亡率を低減する。（Ｄ）動物において、ＵＡＧを含む変異ウイルスは、野生型ウイルスの感染によって引き起こされる動物における体重減少を低減する。（Ｅ）動物において、ＵＡＧを含む変異ウイルスは、野生型ウイルスの感染によって引き起こされる動物の肺組織のウイルス力価を低減する。★、Ｐ＜０．０５；★★、Ｐ＜０．０１；★★★、Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明者らは、本発明のより良い理解を助けるために、実施例を用いて具体的な実験を記載し、例示したが、実施例は説明のためのみに用いられ、本発明の保護の範囲を限定するものではない。本発明に相当する任意の変形または実施形態が本発明に含まれる。
【実施例】
【００３０】
（実施例１）
部位特異的変異を含むインフルエンザウイルスＷＳＮの遺伝子ベクターの構築
（１）補助プラスミドの作製
プラスミドｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳ（これ以降「補助プラスミド」と呼ぶ）を、受託番号Ｎｏ．ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ：４９５１を有する大腸菌（Ｃｈｉｎａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒに寄託され、株はＮｏ．１  ｏｆ  Ｂｅｉｃｈｅｎ  Ｗｅｓｔ  Ｒｏａｄ、Ｃｈａｏｙａｎｇ  Ｄｉｓｔｒｉｃｔ、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｃｉｔｙ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに寄託され、プラスミドは２０１１年６月１４日に寄託され、大腸菌と称される細菌細胞はプラスミドｐＡＣＹＣ−ｔＲＮＡ／ＰｙｌＲＳを含む）から取得し、プラスミドは、非天然アミノ酸Ｌｙｓ−ジアジリンおよびＬｙｓ−アジドを特異的に認識するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼを発現することができる。
【００３１】
（２）野生型インフルエンザウイルスＷＳＮをレスキューするためのプラスミドの作製
Ｐｕｂｍｅｄによって公開されたインフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ／１９３３の遺伝子配列に従って、インフルエンザウイルスの様々な遺伝子断片の遺伝子を全ゲノム合成によって取得した。インフルエンザウイルスの様々な遺伝子配列を、それぞれ、配列番号２〜９に示す。次いで、遺伝子配列を、ｐＨＨ２１、ｐＣＤＮＡ３（ｎｅｏ）またはｐｃＡＡＧＧＳ／ＭＣＳベクターに連結し、野生型インフルエンザウイルスＷＳＮをレスキューするためのプラスミドを取得した。取得したプラスミドの名称および構成を表１に示す。
【表１】
2019500051.tif 000011
【００３２】
（３）部位特異的変異導入のための部位の選択
インフルエンザウイルスの様々なタンパク質のアミノ酸の保存性を、バイオインフォマティクスツール「Ｃｏｎｓｕｒｆ」を用いて解析した。保存、比較的保存、比較的非保存、および非保存のアミノ酸の部位（ＮＰ−ＰＤＢ：２ＩＱＨ；ＰＡ−ＰＤＢ：４ＩＵＪ；ＰＢ１−ＰＤＢ：３Ａ１Ｇ、２ＺＮＬ；ＰＢ２−ＰＤＢ：４ＥＮＦ；ＮＡ−ＰＤＢ：３ＴＩ６；ＨＡ−ＰＤＢ：１ＲＶＴ；Ｍ−ＰＤＢ：４ＰＵＳ、２ＲＬＦ、３ＢＫＤ；ＮＳ−ＰＤＢ：３Ｌ４Ｑ）を、解析したインフルエンザウイルスタンパク質の結晶構造に従って、変異のために選択した。各々のタンパク質において選択した変異部位を、それぞれ表２ａ）〜表２ｉ）に示す。
【００３３】
【表２】
2019500051.tif 000012
【００３４】
【表３】
2019500051.tif 000013
【００３５】
【表４】
2019500051.tif 000014
【００３６】
【表５】
2019500051.tif 000015
【００３７】
【表６】
2019500051.tif 000016
【００３８】
【表７】
2019500051.tif 000017
【００３９】
【表８】
2019500051.tif 000018
【００４０】
【表９】
2019500051.tif 000019
【００４１】
【表１０】
2019500051.tif 000020
【００４２】
（４）部位特異的変異プライマーの設計および変異ベクターの構築
Ｂｅｎ１  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ２、Ｂｅｎ２  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ１、Ｂｅｎ３  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＡ、Ｂｅｎ４  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＨＡ、Ｂｅｎ５  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＰ、Ｂｅｎ６  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＡ、Ｂｅｎ７  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−Ｍ、またはＢｅｎ８  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＳを鋳型プラスミドとして用い、従来のプライマー設計ガイドラインに従ってプライマーを設計し、部位特異的変異導入キット（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔｓ（カタログ番号２１０５１８）を用いて、表２ａ）〜２ｉ）に列挙されるアミノ酸の部位に対応するコードヌクレオチドをアンバー終止コドンＴＡＧへと変異した。変異の成功をシークエンシング手段によって確認した。
いくつかのタンパク質の選択した部位における変異を、表３に示すプライマー配列を用いて実施した。
【００４３】
【表１１】
2019500051.tif 000021
変異部位の上流および下流のヌクレオチド配列および当該技術分野における従来の設計知識に従って設計する変異プライマーを用いて他の変異を導入することができる。
【００４４】
（５）ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現する安定な哺乳動物細胞株ＨＥＫ２９３−ＰＹＬの樹立
ピューロマイシン耐性およびハイグロマイシン耐性を有し、それぞれアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼおよび３９位におけるＴＡＧ変異を有するＧＦＰレポーター遺伝子を保有する、２つのレンチウイルス過剰発現ベクターを構築し、安定な細胞株ｐｙｌＲＳ／ＧＦＰ39TAGを、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の２ラウンドのウイルス形質導入およびピューロマイシン／ハイグロマイシンスクリーニングによって得た。その後、１２コピーのｔＲＮＡを有し、ゼオマイシン耐性を有するｂｊｍｕ−ｚｅｏ−１２ｔＲＮＡベクターを構築し、次いで、細胞株ｐｙｌＲＳ／ＧＦＰ39TAGにプラスミド線状化を経てベクターをトランスフェクトし、ＵＡＡの存在下でゼオマイシンスクリーニングに供し、ＧＦＰ陽性細胞を分離した（この細胞はＵＡＡの存在下で緑色であり、ＵＡＡを除去したとき無色になった）。これにより、直交ｔＲＮＡ  ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを安定に発現する安定細胞株ＨＥＫ２９３−ＰＹＬを得た（図１１Ａ）。
【００４５】
ａ．ベクターの構築
ｐｓｄ３１ベクターから出発し、最初にｓｖ４０−ｐｕｒｏR遺伝子を、それぞれＢａｍＨＩ／ｘｂａｌ制限酵素部位を通じてＩＲＥＳ−ｐｕｒｏRおよびＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏR遺伝子によって置き換え、異なる耐性を有する、２つのウイルスベクターｐｓｄ３１−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏRおよびｐｓｄ３１−ＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏRを生じた。ＩＲＥＳは、配列内リボソーム進入部位であり、ＩＲＥＳ配列は、多シストロン性遺伝子の発現に典型的に利用される。例えば、ＩＲＥＳ配列が目的の遺伝子の後に挿入され、その後に選択可能なマーカー遺伝子が続き、そのような転写ｍＲＮＡは、両方のタンパク質を同時に発現できるようになる。ＩＲＥＳ系を用いる目的の遺伝子を過剰発現は２つの利点がある：１．目的の遺伝子、およびマーカー遺伝子がプロモーターを共有し、偽陽性の発生を避ける、２．ＩＲＥＳ翻訳の効率が、開始部位における伝統的な翻訳よりも低いため、目的の遺伝子の発現レベルがマーカー遺伝子のものよりも高い。したがって、ＣＭＶ−ｐｙｌＲＳ配列およびＣＭＶ−ＧＦＰ39TAG配列が、ＢａｍＨＩ制限部位を通じてＩＲＥＳ部位の前にそれぞれ導入され、目的の２つのタンパク質を同時に過剰発現することができる二重ウイルス系ｐｓｄ３１−ＣＭＶ−ｐｙｌＲＳ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏR／ｐｓｄ３１−ＣＭＶ−ＧＦＰ39TAG−ＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏRを得た。
安定なプラスミドトランスフェクションの手段によってｔＲＮＡを過剰発現した。ｔＲＮＡの発現レベルを確かにするため、配列番号１に記述される配列を有するｂｊｍｕ−１２ｔ−ｚｅｏベクターを構築し、取得した（図１１Ｃ）。
【００４６】
ｂ．レンチウイルスのパッケージングおよび形質導入
ｐｓｄ３１−ＣＭＶ−ｐｙｌＲＳ−ＩＲＥＳ−ｐｕｒｏRウイルスをパッケージングし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質導入し、０．６μｇ／ｍｌの濃度でピューロマイシンスクリーニングを実施し、よって安定な細胞株「Ｎｏ．１」を得た。次いで、ｐｓｄ３１−ＣＭＶ−ＧＦＰ39TAG−ＩＲＥＳ−ｈｙｇｒｏRウイルスを添加し、２００μｇ／ｍｌの濃度でハイグロマイシンスクリーニングを実施し、よって安定な細胞株「Ｎｏ．２」を得た。
【００４７】
ｃ．安定なプラスミドトランスフェクション
３ラウンドのスクリーニングを、安定なプラスミドトランスフェクションの手段によって実施し、直交ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼを安定に発現する特殊な細胞株を最終的に取得したが、ステップは次のようであった：
Ａ．酵素消化によるｂｊｍｕ−１２ｔ−ｚｅｏベクターの線状化の後、ｐｙｌＲＳおよびＧＦＰ39TAGタンパク質を発現する安定な細胞株Ｎｏ．２にベクターをトランスフェクトした（１０ｃｍディッシュ、ディッシュ当たり１０μｇプラスミド、トランスフェクションは、抗生剤の非存在下で実施した）；
Ｂ．トランスフェクションの６時間後、液体を交換し、非天然アミノ酸を添加した；
Ｃ．トランスフェクションの４８時間後、緑色蛍光を観察し、液体を交換し、４００μｇ／ｍｌのゼオマイシンを添加した；
Ｄ．全てのブランク群が死滅するまで３日ごとに液体を交換し、トランスフェクション群においてクローンを形成した；
Ｅ．ＧＦＰ陽性クローンを単離して精製し、半分の用量のゼオマイシンを含む増幅培地へと供し、１２ｔ−ｚｅｏ安定化細胞株ＨＥＫ２９３−ＰＹＬを得た。
【００４８】
（６）部位特異的変異導入後のインフルエンザウイルスのレスキュー
Ｎｅｕｍａｎｎら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 9345-50）に開示されるインフルエンザウイルスをレスキューするための通常の方法に従ってインフルエンザウイルスをレスキューするのに使用される１２のプラスミドを安定な細胞株に共トランスフェクトし、１２のプラスミドのうちの対応するプラスミドのみが、部位特異的変異プラスミドと置き換えられた。６ウェルプレートの各々のウェルに対し、０．１μｇの各々のプラスミドを添加した。トランスフェクションの後、細胞の病的な状態を観察し、ウイルスをレスキューでき、かつ非天然アミノ酸に依存性である変異部位を、スクリーニングした。スクリーリングした部位を、タンパク質および変異部位によって命名した。例えば、Ｂｅｎ３  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＡプラスミドを変異導入した。変異を成功裏に実施した後、ステップ（５）で樹立した安定な細胞株に、インフルエンザウイルスをレスキューする他のプラスミドＢｅｎ１  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ２、Ｂｅｎ２  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＰＢ１、Ｂｅｎ４  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＨＡ、Ｂｅｎ５  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＰ、Ｂｅｎ６  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＡ、Ｂｅｎ７  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−Ｍ、Ｂｅｎ８  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＳ、Ｂｅｎ９  ｐｃＤＮＡ  ３（ｎｅｏ）−ＰＢ２；Ｂｅｎ１０  ｐｃＤＮＡ  ３（ｎｅｏ）−ＰＢ１；Ｂｅｎ１１  ｐｃＤＮＡ  ３（ｎｅｏ）−ＰＡ；およびＢｅｎ１３  ｐｃＡＧＧＳ／ＭＣＳ−ＮＰと共に変異プラスミドを共トランスフェクトし、それによって、インフルエンザウイルスのＰＡ遺伝子断片のＳ１部位にコドンＴＡＧを導入した変異インフルエンザウイルスをレスキューしたが、ここで部位はＰＡ−Ｓ１と称され、呼称は表２ａ）〜表２ｉ）に示す変異部位に対応する。
同一の手順に従い、他の部位にＴＡＧコドンを導入した変異インフルエンザウイルスを取得でき、変異部位に従って命名した。
【００４９】
【表１２】
2019500051.tif 000022
【００５０】
【表１３】
2019500051.tif 000023
【００５１】
【表１４】
2019500051.tif 000024
【００５２】
インフルエンザウイルスのレスキューに高効率であり、かつ遺伝的に安定であった部位ＰＡ−Ｓ１、ＰＢ１−Ｓ４、ＰＢ２−Ｓ４、およびＮＰ−Ｓ３を選択して組み合わせた。ステップ（５）で樹立した安定な細胞株に、インフルエンザウイルスをレスキューする他のプラスミドＢｅｎ４  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＨＡ；Ｂｅｎ６  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＡ；Ｂｅｎ７  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−Ｍ；Ｂｅｎ８  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＳ；Ｂｅｎ９  ｐｃＤＮＡ  ３（ｎｅｏ）−ＰＢ２；Ｂｅｎ１０  ｐｃＤＮＡ  （ｎｅｏ）−ＰＢ；Ｂｅｎ１１  ｐｃＤＮＡ  ３  （ｎｅｏ）−ＰＡ；Ｂｅｎ１３  ｐｃＡＧＧＳ／ＭＣＳ−ＮＰと共に４つのプラスミドを共トランスフェクトし、これによって、部位ＰＡ−Ｓ１、ＰＢ１−Ｓ４、ＰＢ２−Ｓ４、およびＢＰ−Ｓ３に同時にＴＡＧコドンを導入した変異インフルエンザウイルスをレスキューした。変異インフルエンザウイルスをＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇと名付けた。
【００５３】
（実施例２）
部位特異的変異インフルエンザウイルスの発現および精製
ＴＡＧコドンが導入されたインフルエンザウイルスをレスキューするための本発明におけるプラスミドコンストラクトは、ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現できる哺乳動物安定細胞株において転写され、発現することができる。これらのタンパク質翻訳系は、インフルエンザウイルスの対応するタンパク質に対して、非天然アミノ酸Ｌｙｓ−ジアジリンまたはＬｙｓ−ジアジリンに構造的に類似するアジド非天然アミノ酸であるＬｙｓ−アジドを組み込むのに使用でき、インフルエンザウイルスの対応するタンパク質の部位特異的変異導入をもたらす。
次に、２つの非天然アミノ酸Ｌｙｓ−ジアジリンまたはＬｙｓ−アジドの成功した組み込みおよび変異タンパク質の生産性能を試験した。
【００５４】
（１）非天然アミノ酸Ｌｙｓ−ジアジリンの合成および同定
非天然アミノ酸Ｌｙｓ−ジアジリン化学合成のための反応式を以下に示す：
【化９】
2019500051.tif 000025
上述の式に示すとおり、１５ｍＬの原材料１（５−ヒドロキシ−２−ペンタノン）および４０ｍＬの液体アンモニアを−４０℃５時間の撹拌条件下で反応に供し、次いで、−６０℃に冷却し、ＮＨ2ＯＳＯ3Ｈのメタノール溶液をゆっくりと滴下添加し、添加の終了後に室温まで加熱し、終夜反応させた。沈殿物をろ別し、トリエチルアミンを上清に添加し、氷浴条件下で反応液の色が暗くなり、気泡が発生しなくなるまでＩ2をゆっくりと上清に添加した。反応が完了した後、溶媒を蒸発によって除去し、残渣をエチルエーテルで抽出し、乾燥させた。エチルエーテルを蒸発によって除去し、残留液を減圧蒸留して２５．４ｇの無色粘性液体「生成物２」を得た。
【００５５】
上述の生成物２を、ピリジンに溶解し、０℃の撹拌条件下で１１ｇのＴｓＣｌを添加し、終夜反応するようにさせた。反応が完了した後、反応溶液を、濃塩酸および氷水の混合物に添加し、エチルエーテルで抽出した。エチルエーテル層を、１Ｎ塩酸と１ＮＮａＯＨでそれぞれ洗浄した。有機相を乾燥カラム上で分離し、１１．８ｇの無色粘性液体「生成物３」をもたらした。
【００５６】
上述の生成物３をＤＭＦに溶解し、ＮａＮ3を添加し、室温で終夜反応させるようにして反応を完了し、大量の水を添加し、エチルエーテルで抽出した。エチルエーテルを蒸発によって除去した。残りの生成物をＴＨＦ：水（９：１）の混合物に溶解し、トリフェニルホスフィンを添加し、室温で反応させるようにした。反応が完了した後、１Ｎ  ＨＣｌを添加し、均質に混合し、ＴＨＦをスピン乾燥によって除去した。未反応の原材料ＰＰｈ３およびＯ＝ＰＰｈ３を、ジクロロメタンで洗浄することにより除去した。１Ｎ  ＮａＯＨを、液相に添加してｐＨを１２に調整し、４．０ｇの「生成物４」を塩化メチレンによって抽出した。
【００５７】
５．２ｇの出発材料５（Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＭｅ）とカルボニルジイミダゾールの反応は５．９ｇの化合物６をもたらした。次いで、化合物６を上述の生成物４（４．０ｇ）とカップリングして化合物７をもたらした。Ｂｏｃおよびメチルエステルを、２ステップ脱保護の手段によって除去し、４．５ｇの目的の「生成物８」、Ｌｙｓ−ジアジリンを得た。分光法によって確認された結果は：1H NMR (400 MHz, D2O): δ 3.10 (1H, t, J = 6.3 Hz), 2.96 (4H, m), 1.25 (10H, m), 0.90 (3H, s); 13C NMR (100 MHz, D2O): 183.63, 160.66, 56.00, 39.80, 39.30, 34.49, 30.84, 29.20, 26.75, 23.92, 22.43, 18.80; HREIMS m/z 308.16937 [M+1]+ (C12H22N5NaO3の計算値, 308.16931)であり、調製したＬｙｓ−ジアジリンの構造が正しいことを実証した。
【００５８】
（２）非天然アミノ酸Ｌｙｓ−ジアジリンの組み込みによる変異インフルエンザウイルスのレスキュー
実施例１のステップ（６）における部位特異的変異導入の後のインフルエンザウイルスのレスキューにおいて取得したインフルエンザパッケージングプラスミドを、ステップ（５）の安定な細胞株に共トランスフェクトし；６時間後、１％のＦＢＳ、２μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ−トリプシン、１ｍＭの非天然アミノ酸Ｌｙｓ−ジアジリンを含む新しい培養培地を用いた；そして非天然アミノ酸Ｌｙｓ−ジアジリンを含まない培養培地をコントロールとして使用した。このレスキュー実験において、野生型インフルエンザウイルスＷＳＮを陽性コントロールとして使用し、ウイルスをレスキューするためのプラスミドを除いて、変異インフルエンザウイルスのレスキューにおけるものと同一の条件であった。トランスフェクションが完了した後、細胞の状態を毎日観察した。細胞にトランスフェクトするのに使用したインフルエンザウイルス変異体は、非天然アミノ酸を含む培地で培養したとき細胞が病変を示し、非天然アミノ酸を含まない培養培地で培養したとき病変をまったく示さなかった場合に、陽性変異体として同定した。対照的に、野生型インフルエンザウイルスで感染した細胞は、非天然アミノ酸の存在または非存在の培養培地中で培養したときに、病変を示した。
【００５９】
（３）Ｌｙｓ−ジアジリン変異インフルエンザウイルスの精製
１）変異インフルエンザウイルスをレスキューしたステップ（２）の細胞株が完全に病変を示したとき、細胞上清を収集し、５０００ｇで１０分間遠心し、上清を０．４５μｍ膜を通してろ過した。
２）インフルエンザウイルスを以下のようにスクロース密度勾配遠心分離によって精製した：ステップ１）のウイルス溶液を５０ｍｌの遠心チューブ（高速に耐えるようにされている）中で１０5ｇで２時間遠心し、沈殿物をもたらし、１ｍｌのＰＢＳでの再懸濁が後に続いた。
３）スクロースをＮＴＥバッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解し、２０％スクロース溶液を作製し、そして溶液を０．４５μｍ膜上でろ過した。
４）ステップ３）のスクロース溶液を５０ｍｌまたは１５ｍｌの遠心チューブに添加し、ステップ２）のＰＢ懸濁液をスクロース溶液上に滴下し、遠心を１１×１０4ｇで２時間実施した。
５）約１５ｍｌのＮＴＥバッファーを沈殿物に添加し、１１×１０4ｇで２時間さらに遠心した。
６）ステップ５）の沈殿物をＰＢＳで再懸濁した。
（４）変異インフルエンザウイルスにおけるＬｙｓ−アジドの組み込みおよび発現、ならびにインフルエンザウイルスの精製
非天然アミノ酸Ｌｙｓ−アジド化学合成のための反応式を以下に示す：
【化１０】
2019500051.tif 000026
上述の式に示すとおり、２．３ｍＬの原材料１（２−ブロモエタノール）を、９０ｍＬのアセトンおよび１５ｍＬの水の混合溶液に溶解し、３．１２ｇのＮａＮ3を添加した；混合物を、６０℃油浴中で２０時間加熱して還流し、室温へと冷却し、回転蒸発に供してアセトンを除去し、無水エーテルで抽出し（３０ｍＬ×８）、無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、回転蒸発に供して溶媒を除去し、２．６２ｇの無色の液体である生成物２をもたらした。
生成物２（５００ｍｇ、５．７４ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（１０ｍｌ）中のトリホスゲン（１．７０ｇ、５．７４ｍｍｏｌ）の溶液へと添加し、０℃で８時間、撹拌条件下で反応させ、蒸発に供して溶媒を除去した。残渣を真空下で１時間乾燥し、生成物３として無色油状液体をもたらした。
【００６０】
生成物３を１．５ｍｌのＴＨＦに溶解し、１Ｍ  ＮａＯＨ（２０ｍｌ）／ＴＨＦ（５ｍｌ）中のＢｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１．７ｇ、６．８８ｍｍｏｌ）溶液に添加し、０℃で１２時間撹拌条件下で反応するようにさせ、室温へと徐々に加温した。反応溶液を再び０℃に冷却し、反応溶液のｐＨを、０℃の１Ｍ塩酸溶液を用いて２〜３に調整した。反応溶液をＥｔＯＡｃで抽出し（３０ｍＬ×５）、有機層を２×１００ｍＬの飽和塩溶液で洗浄した。有機層を無水Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した後、ろ過し、回転蒸発に供して溶媒を除去し、生成物４として１．６５ｇの無色粘性液体をさらに精製することなくもたらした。
【００６１】
生成物４を１５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2に溶解し、１５ｍＬのＴＦＡを撹拌条件下でゆっくりと滴下添加し、次いで、室温で３０分間反応するようにさせ、蒸発に供して溶媒を除去した。残留液生成物を５ｍＬメタノールで溶解し、１００ｍＬのエーテルを添加して大量の白色固体沈殿物を形成するようにし、次いでろ過し、乾燥し、最終生成物５：1H NMR (D2O): δ = 1.22-1.45 (m, 4H), 1.67-1.73 (m, 2H), 2.99 (m, 2H), 3.38 (m, 2H), 3.70 (m, 1H), 4.09 (m, 2 H); 13C NMR (D2O): δ = 21.4, 28.4, 29.6, 39.5, 53.4, 56.2, 57.8, 116.0 (TFA), 153.1, 162.3 (TFA), 172.9. HRMS: m/z C9H17N5O4 [M]+の計算値: 259.1281; 実測値: 259.1283として１．３８ｇの白色固体をもたらし、生じたＬｙｓ−アジドの構造が正しいことを実証した。
Ｌｙｓ−ジアジリンをＬｙｓ−アジドと置き換えたこと以外は、他の条件は上述のステップ２〜３のものと同一であった。変異が成功であること、および対応する変異部位にＵＡＧを導入した変異インフルエンザウイルスを得たことを確認するために変異ウイルスの導入に際して細胞病変形成の発生を観察した。
【００６２】
変異インフルエンザウイルスの一部分のレスキューを図２に示す例として使用した。結果は、コドンＵＡＧをインフルエンザウイルスの８タンパク質をコードする遺伝子断片に導入でき、対応する変異インフルエンザウイルスをレスキューできたことを示した。ＰＡ−Ｓ１、ＰＢ１−Ｓ４、ＰＢ２−Ｓ４、およびＮＰ−Ｓ３の４つの部位が、インフルエンザウイルスのレスキューにおいて特に効率的であり、かつ遺伝的に安定であり、それらは理想的な変異部位であった。これらの４つの部位を組み合わせた、すなわち、ステップ（５）で樹立した安定な細胞株に、これらの４つのプラスミドおよびインフルエンザウイルスをレスキューする他のプラスミドＢｅｎ４  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＨＡ；Ｂｅｎ６  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＡ；Ｂｅｎ７  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−Ｍ；Ｂｅｎ８  ｐＰｏｌＩ−ＷＳＮ−ＮＳ；Ｂｅｎ９  ｐｃＤＮＡ  ３（ｎｅｏ）−ＰＢ２；Ｂｅｎ１０  ｐｃＤＮＡ  ３（ｎｅｏ）−ＰＢ１；Ｂｅｎ１１  ｐｃＤＮＡ３（ｎｅｏ）−ＰＡ；Ｂｅｎ１３  ｐｃＡＧＧＳ／ＭＣＳ−ＮＰを共トランスフェクトし、これによって、部位ＰＡ−Ｓ１、ＰＢ１−Ｓ４、ＰＢ２−Ｓ４、およびＮＰ−Ｓ３に同時にＵＡＧコドンを導入した変異インフルエンザウイルスをレスキューした。変異インフルエンザウイルスをＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇ（ＰＣＴ−４Ａ）と名付けた。変異インフルエンザウイルスＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇのレスキュー効率は高かった。変異インフルエンザウイルスは、高収率を有し、かつ高い遺伝的安定性を示し、本発明者らの調製する最終的な変異生成物であった。
５．  変異インフルエンザウイルスＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇのレスキュー効率に関する研究
本発明者らは、正常哺乳動物細胞株２９３Ｔによる変異インフルエンザウイルスＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇをレスキューする効率と、ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を安定に発現する安定な哺乳動物細胞株ＨＥＫ２９３−ＰＹＬのものと比較した。
【００６３】
実験を３つの群に分割した。第１の群において、安定な細胞株ＨＥＫ２９３−ＰＹＬを使用し、ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を発現する１．２μｇのプラスミドならびに変異インフルエンザウイルスをレスキューする１．２μｇのプラスミドを同時にトランスフェクトした；第２の群において、安定な細胞株を使用し、変異インフルエンザウイルスをレスキューする２．４μｇのプラスミドのみをトランスフェクトした；第３の群において、正常２９３Ｔ細胞を使用し、ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡPyl）およびピロリジル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ｔＲＮＡPyl）を発現する１．２μｇのプラスミドならびに変異インフルエンザウイルスをレスキューする１．２μｇのプラスミドを同時にトランスフェクトした。図１０に示す結果は、安定な細胞株ＨＥＫ２９３−ＰＹＬのインフルエンザウイルスをレスキューする効率は、正常２９３Ｔ細胞のものよりもはるかに高かったことを実証した（図１０においてＮＡＥＫの存在として示される）。
【００６４】
さらに、本発明者らはまた、調製した変異インフルエンザウイルスＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇの収率を調査した。同一の条件で調製した野生型および変異ウイルスのＭ遺伝子断片のｍＲＮＡレベルを測定することによって、変異インフルエンザウイルスの収率が野生型のものと実質的に同一であったことを実証した（図５）。さらに、野生型および変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧウイルスの抗原赤血球凝集反応力価を測定することにより、変異ウイルスおよび野生型ウイルスが実質的に同一の抗原赤血球凝集反応力価を有したことを立証し、さらに変異インフルエンザウイルスの収率が非常に高かったことも立証した。具体的な実験操作は、ｑＲＴ−ＰＣＲの実験ステップおよびウイルスの抗原赤血球凝集反応力価を測定するための方法を指すことができる。
【００６５】
（実施例３）
細胞レベルにおける変異インフルエンザウイルスＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇの安全性に関する研究
調製した変異インフルエンザウイルスＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇの長期的な連続的継代培養を実施することによって、本発明者らは、変異インフルエンザウイルスの変異部位におけるＵＡＧコドンの安定性を調査した。具体的な実験は次のとおりであった：新規に調製した変異インフルエンザウイルスＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇを１％ＦＢＳ、２μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ−トリプシンおよび１ｍＭの非天然アミノ酸ＮＡＥＫを含む新規の培地にＭＯＩ＝０．０１で接種し、コントロールとして感染した安定な細胞と非天然アミノ酸ＮＡＥＫを含まない培地を用いた。１ｍＭのＮＡＥＫ培地中の細胞が完全に病変を示したのち、上清を除去し、０．４５μｍ膜上でろ過し、１／１０００の比で新規培地に接種し、コントロールとして感染した安定な細胞と非天然アミノ酸ＮＡＥＫを含まない培地を用いた。そのような繰り返しによってウイルスの長期間の継代を実施した。
図４は、変異インフルエンザウイルスＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇが、長期間の継代の後、その非天然アミノ酸に対する依存性を維持したこと、すなわち、それが、非天然アミノ酸を含む培地においてのみ大規模で再生産して細胞に病変を起こすことができることを示した。これは、インフルエンザウイルス遺伝子に導入されたＵＡＧコドンがずっと安定に存在していたことを示し、選択した部位が遺伝的に安定であることを実証した。
【００６６】
（実施例４）
動物における変異インフルエンザウイルスＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇの安全性および効率に関する研究
実験プログラムは図７を指すことができ、具体的な実施は以下の通りであった：
１）８０匹のマウスを、各々の群に１０匹のマウスとして８群に分割した。
２）マウスを環境に適用させるため１日間飼育した。
３）次の日に、マウスを秤量し、各々の群より５匹のマウスを選択し、それらの血清を収集した（マウスを失血死から保護するため２０〜４０μｌの血液量を収集し、収集した血清を−８０℃の冷凍保存に供した）。
４）２日間の飼育の後（血液を収集した動物は正常状態に復帰した）、群およびウイルス溶液のチューブ番号に従って次の対応するウイルス溶液をマウスに接種した。
ウイルス接種の方法：麻酔したマウスに、点鼻法により５０μｌのウイルス溶液を鼻腔内接種した。半致死量ＬＤ50は、１００００ウイルス粒子／５０μｌであった。１倍致死量は、１０*ＬＤ50であり、１０5ウイルス粒子／５０μｌに相当した。１０倍致死量は、１００*ＬＤ50であり、１０6ウイルス粒子／５０μｌに相当した。
第１の群は、チューブ番号１中のウイルス溶液（組成物：ＰＢＳ）を接種した。
第２の群は、チューブ番号２中のウイルス溶液（組成物：ＷＳＮ野生型の１倍致死量）を接種した。
第３の群は、チューブ番号３中のウイルス溶液（組成物：ＷＳＮ−ＲＮＰ型の１倍致死量）を接種した。
第４の群は、チューブ番号４中のウイルス溶液（組成物：ＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇの５倍致死量）を接種した。
第５の群は、チューブ番号５中のウイルス溶液（組成物：ＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇの１０倍致死量）を接種した。
第６の群は、チューブ番号６中のウイルス溶液（組成物：不活化ＷＳＮの１倍致死量）を接種した。
第７の群は、チューブ番号７中のウイルス溶液（組成物：不活化ＷＳＮの５倍致死量）を接種した。
第７の群は、チューブ番号８中のウイルス溶液（組成物：不活化ＷＳＮの１０倍致死量）を接種した。
群間の交差感染を防いだ。
５）接種後の各々の日において、マウスを秤量し、その体重を記録し、マウスの死亡を記録した。
６）ウイルス溶液の接種後１４日目と２１日目において、マウスの血清を再び収集した（２０〜４０μｌの血液を収集し、収集した血清を−８０℃の冷凍保存に供した）。
７）ウイルス溶液の接種後２１日目において、各々のマウスに、１００*ＬＤ50の用量の５０μｌの新規のウイルス溶液で鼻腔内感染した。
【００６７】
次いで、マウスを２〜３週間さらに観察し、秤量し、記録した。マウスの死亡を記録した。さらに、ウイルス溶液の感染後３日目において、各々の群より３匹のマウスを得て、その肺組織を摘出し、粉砕し、ホモジナイズした；上清を収集した（−８０℃の冷凍保存に供することもできた）。残りのマウスをさらに観察した。
【００６８】
図８に示すように、野生型インフルエンザウイルスを接種したとき、全てのマウスは、体重を有意に減らし、接種後１０日目に死亡したが、一方で変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧウイルスまたは不活化インフルエンザＷＳＮ−陽性コントロールを接種したとき、全てのマウスは有意な体重減少をまったく示さず、観察期間の間生き延びた。これは、変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧが、動物における良好な安全性を有したことを実証した。
【００６９】
図９Ａに示すように、図７に記述される実験プログラムに従って、各々の群からのマウスの肺組織を摘出し、肺組織中のウイルスの相対量をｑＲＴ−ＰＣＲによって検出した。結果は、マウスを不活化ウイルスまたは変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧによって免疫するとき、マウスの肺組織におけるウイルス量が減少し、それは免疫用量依存的であったことを示した。さらに、変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ＴＡＧの免疫効果は、不活化ウイルスのものよりも良好であった。
図９Ｂに示すように、免疫前後のマウスの各々の群における抗ＨＡ抗体のレベルをＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。結果は、免疫後１４日、および免疫後２１日でマウスにおける抗体のレベルは増加し、２１日目における抗体のレベルは、１４日目におけるものよりも高かったことを示した。
【００７０】
図９Ｃに示すとおり、図７に記述される実験プログラムに従って、各々の群のマウスを個別に免疫し、次いで、１００×ＬＤ50のＷＳＮを感染させた。マウスの体重および死亡率を調査した。変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇ株が、動物をウイルス感染から良好に保護できたことを見出した。さらに、１倍用量における変異ＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇのマウスに対する保護効果は、１０倍用量における不活化ＷＳＮのものに匹敵した。これは、弱毒化インフルエンザワクチンが、免疫原性において不活化ワクチンよりも優れていたことを完全に立証した。
（実施例５）
インフルエンザウイルスワクチンによってワクチン接種されたマウスにおける抗−ＮＡタンパク質および抗−ＮＰタンパク質のレベルの測定
実施例４に記載されるウイルスを接種する方法に従って、マウスにＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇおよび不活化ＷＳＮを接種した。
【００７１】
マウスにおけるＮＡまたはＮＰタンパク質に対する抗体の量をＥＬＩＳＡ方法によって検出した。具体的に、ＮＡまたはＮＰタンパク質を、コーティング溶液で３０ｎｇ／１００μｌに希釈した。ＥＬＩＳＡ方法のための９６ウェルプレートを、上述の希釈溶液によって４℃で終夜コーティングし、ＥＬＩＳＡ洗浄溶液で洗浄し、３％ＢＳＡ洗浄溶液によって３７℃で１時間ブロッキングした。マウスからの血清を０．５％ＢＳＡ洗浄溶液で希釈し、対応するウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートし、上清を捨てた後に洗浄溶液によって５回洗浄し、ＨＲＰ−標識ヤギ抗マウスＩｇＧを添加し、３７℃で１時間インキュベートし、上清を捨てた後に洗浄溶液によって５回洗浄し、ＴＭＢによって５〜１０分間発色させた。反応をＥＬＩＳＡ停止バッファーによって停止した。ＯＤ値を４５０ｎｍにおいて測定した。
【００７２】
図１２に示す結果は、ＷＳＮ−ＲＰＮ−ｔａｇが、マウスにおいて、ＮＡに対する特異的抗体の産生を、不活化ワクチンのものよりも高い産生レベルにおいて誘導することができることを実証し、本発明者らの調製するワクチンがより良好な免疫原性を有したことを示す。より重要なことに、本発明者らの発明したＷＳＮ−ＲＰＮ−ｔａｇはまた、インフルエンザウイルスの内部タンパク質であるＮＰに対する抗体の産生をマウスにおいて誘導することができ、これはマウスに交差免疫保護をもたらすために有益であった。
（実施例６）
ＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇによるマウス肺におけるウイルスに対する特異的ＩｇＡの産生の誘導
具体的な実施は以下のとおりであった：
１）１５匹のマウスを、各々の群に５匹のマウスとして３群に分割した。
２）マウスを環境に適用させるため１日間飼育した。
３）次の日に、群およびウイルス溶液のチューブ番号に従って次の対応するウイルス溶液をマウスに接種した。
ウイルス接種の方法：麻酔したマウスに、点鼻法により５０μｌのウイルス溶液を鼻腔内接種した。実施例４と同様に、半致死量ＬＤ50は、１００００ウイルス粒子／５０μｌであり；１倍致死量は１０*ＬＤ50であり；１０倍致死量は１００*ＬＤ50であった。
第１の群は、チューブ番号１中のウイルス溶液（組成物：ＰＢＳ）を接種した。
第２の群は、チューブ番号２中のウイルス溶液（組成物：ＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇの１０倍致死量）を接種した。
第３の群は、チューブ番号３中のウイルス溶液（組成物：不活化ＷＳＮの１０倍致死量）を接種した。
群間の交差感染を防いだ。
４）ウイルス溶液の接種後２１日目に、各々の群のマウスより肺組織を摘出し、ＰＢＳで洗浄し、洗浄溶液を収集した。収集した洗浄溶液を−８０℃の冷凍保存に供した。
【００７３】
ＩｇＡ産生をＥＬＩＳＡ方法によって検出した。具体的に、精製したＷＳＮウイルスを、コーティング溶液で０．５μｇ／１００μｌに希釈した。ＥＬＩＳＡ方法のための９６ウェルプレートを、上述の希釈溶液によって４℃で終夜コーティングし、ＥＬＩＳＡ洗浄溶液で洗浄し、３％ＢＳＡ洗浄溶液によって３７℃で１時間ブロッキングした。マウスからの血清を０．５％ＢＳＡ洗浄溶液で希釈し、対応するウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートし、上清を捨てた後に洗浄溶液によって５回洗浄し、ＨＲＰ−標識ヤギ抗マウスＩｇＡを添加し、３７℃で１時間インキュベートし、上清を捨てた後に洗浄溶液によって５回洗浄し、ＴＭＢによって５〜１０分間発色させた。反応をＥＬＩＳＡ停止バッファーによって停止した。ＯＤ値を４５０ｎｍにおいて測定した。
図１３に示した結果は、ＷＳＮ−ＲＮＰ−ｔａｇが、不活化ＷＳＮと比べて高いレベルでＩｇＡの産生を誘導できたことを実証し、これはマウスに交差免疫保護をもたらすために有益であった。
【００７４】
（実施例７）
ＷＳＮ−ＲＰＮ−ｔａｇで免疫するマウスの肺におけるＮＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の量の変化
試験方法：マウスを免疫した３週間後、マウスの肺組織を摘出し、そこからＴリンパ球を単離した。Ｔリンパ球を抗マウスＣＤ８ａ−ＡＰＣ抗体およびインフルエンザＮＰ３６６−３７４−四量体−ＰＥで染色した。インフルエンザ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数（割合）をフローサイトメトリーで測定したが、このステップは、参考文献Budimir, N. et al., Heterosubtypic cross-protection induced by whole inactivated influenza virus vaccine in mice: influence of the route of vaccine administration. Influenza Other Respir Viruses 7, 1202-1209 (2013)に見出される。
【００７５】
図１４に示す結果は、不活化ＷＳＮはＮＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の量に最小の影響を有したが、一方で、ＷＳＮ−ＲＰＮ−ｔａｇで免疫するマウスの肺におけるＮＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の量は有意に増加したことを実証し、これは、マウスに交差免疫保護を提供するのに有益であった。
【００７６】
（実施例８）
本発明者らの調製するＵＡＧコドンを含むウイルスワクチンの野生型ウイルスに対する阻害効果の研究
ＵＡＧコドンを含むウイルスの、野生型ウイルスの複製に対する効果を、最初に細胞レベルで調査した。具体的な実施は以下のとおりであった：
１．  ６ウェルプレートにＭＤＣＫ細胞を、ウェル当たり５×１０5個の細胞で提供した。
２．  ２４時間後、細胞に野生型ウイルス（ＭＯＩ＝０．０１）を感染させるか、または野生型ウイルスおよび変異ウイルス（ＭＯＩ＝０．１または１）の混合物を共感染させた。
３．  ２４時間後、２００μｌの細胞上清を７２時間まで１２時間ごとに回収した。
４．  上清中の野生型ウイルスの力価を測定した。
【００７７】
図１５Ａおよび１５Ｂに示す結果は、変異ウイルスが野生型ウイルスの子孫ウイルスの力価を低減し、変異ウイルスの増加した力価または変異ウイルスのゲノム内のＵＡＧコドンの増加した数が、野生型ウイルスの複製に対する変異ウイルスの阻害効果の増強をもたらしたことを実証する。
【００７８】
次いで、ＵＡＧコドンを含むウイルスの、野生型ウイルスの複製に対する効果を、動物において調査した。具体的な実施は以下のとおりであった：
１．  各々の群に対して１５匹のＢａｌｂ／Ｃマウス。Ｂａｌｂ／Ｃマウスに野生型ウイルス（２×１０4ＰＦＵ）または野生型ウイルスおよび変異ウイルスの混合物（２×１０6ＰＦＵ）を経鼻的な接種手段によって感染させた；あるいは、マウスを最初に野生型ウイルス（２×１０4ＰＦＵ）で感染させ、２４時間後にマウスを変異ウイルス（２×１０6ＰＦＵ）で感染させた。
２．  ３日後、各々の群より５匹のマウスを無作為に選択し、犠牲にした。肺組織を摘出した。肺組織中の野生型ウイルスの力価を測定した。
３．  残りの１０匹のマウスの生存率および体重を２週間観察した。
【００７９】
図１５Ｃ、ＤおよびＥに示す結果は、次を実証した。野生型ウイルスのみを接種したとき、マウスの全ては体重を低減し、最終的に死亡した；野生型ウイルスおよび変異ウイルスの混合物を同時に接種したとき、マウスは体重における明らかな減少を示さず、９０％の最終生存率を示し、肺組織における明らかに減少したウイルスを示した；野生型ウイルスを接種し、２４時間後に変異ウイルスを接種したとき、マウスは減少した体重を有し、４０％の生存率を有した。これは、変異ウイルスがマウスにおける野生型ウイルスの複製を阻害でき、したがって、マウスに保護をもたらしたことを実証した。これらの結果はまた、治療効果を有するワクチンが、本発明によって提供される技術によって調製できることをも実証した。
【００８０】
上述の生弱毒化インフルエンザウイルスワクチンを調製するための方法は、好ましくは、手足口病ウイルス、コクサッキーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスＨＣＶ、Ｂ型肝炎ウイルスＨＢＶ、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ヒトパピローマウイルスＨＰＶ、単純ヘルペスウイルスＨＳＶ、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ、デングウイルス、エボラウイルス、ジカウイルス、ＳＡＲＳ、中東呼吸器症候群ウイルス、ロタウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、日本脳炎ウイルス、森林脳炎ウイルス、ハンタンウイルス、新規エンテロウイルス、風疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、青耳病ウイルス、ブタ熱ウイルス、口蹄疫ウイルス、およびパルボウイルスである、任意の他の種類のウイルスに対して適用することもできる。
上述されることは、本発明のいくつかの実施形態にのみ含まれる。当業者であれば、本発明の概念から逸脱することなく、多くの変形および改良を行うことができ、それらの全てが本発明の保護の範囲内である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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