(57)【要約】【課題】猫アレルゲンは、非常に多くの患者にとって共通の健康上の懸念であり、このアレルゲンは、本質的に社会に遍在する。【解決手段】  ネコ又はネコ細胞を遺伝子修飾するための組成物及び方法を記載する。これらの組成物及び方法は、ネコゲノムからＦｅｌ  ｄ１遺伝子の全て又は一部分をノックアウトするのに有用である。Ｆｅｌ  ｄ１遺伝子の全て又は一部分がノックアウトされているネコ細胞及び生物も記載する。これらの組成物及び方法は、Ｆｅｌ  ｄ１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介ゲノム編集のための試薬及び手順を含み得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分又は隣接領域と配列が同一なｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒＲＮＡと、を含むキメラガイドＲＮＡであって、前記一部分が、ＮＧＧからなるＰＡＭ配列の５’であり、式中、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧである、キメラガイドＲＮＡ。
【請求項２】
前記ｃｒＲＮＡが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の一部分、若しくは長さ１ｋｂの３’隣接領域と配列が同一であるか、又はＦｅｌ  ｄ１鎖２の一部分、若しくは長さ１ｋｂの５’隣接領域と配列が同一である、請求項１に記載のキメラガイドＲＮＡ。
【請求項３】
前記ｃｒＲＮＡが、配列番号１２２６又は配列番号１２２７に記載の配列の一部分と配列が同一である、請求項１に記載のキメラガイドＲＮＡ。
【請求項４】
前記ｃｒＲＮＡが、配列番号１２２６又は配列番号１２２７に記載の配列の一部分と実質的に相補的である、請求項１に記載のキメラガイドＲＮＡ。
【請求項５】
前記ｃｒＲＮＡの長さが、１８〜２２ヌクレオチド、例えば、２０ヌクレオチドである、請求項１に記載のキメラガイドＲＮＡ。
【請求項６】
前記ｃｒＲＮＡが、配列番号１〜１２２５に記載のＤＮＡ配列と配列が同一である、請求項１に記載のキメラガイドＲＮＡ。
【請求項７】
前記ｃｒＲＮＡが、配列番号１〜１２２５に記載のＤＮＡ配列と配列の点で少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である、請求項１に記載のキメラガイドＲＮＡ。
【請求項８】
前記ｃｒＲＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡから５’側に位置する、請求項１に記載のキメラガイドＲＮＡ。
【請求項９】
請求項１に記載のキメラガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子。
【請求項１０】
第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むキメラＤＮＡ分子であって、前記第１のポリヌクレオチドが、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分又は隣接領域と同一であり、前記一部分が、ＮＧＧ（式中、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ）からなるＰＡＭ配列の５’であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする、キメラＤＮＡ分子。
【請求項１１】
前記第１のポリヌクレオチドが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の一部分、若しくは長さ１ｋｂの３’隣接領域と同一であるか、又はＦｅｌ  ｄ１鎖２の一部分、若しくは長さ１ｋｂの５’隣接領域と同一である、請求項１０に記載のキメラＤＮＡ分子。
【請求項１２】
前記第１のポリヌクレオチドが、配列番号１２２６又は配列番号１２２７に記載の配列の一部分と同一である、請求項１０に記載のキメラＤＮＡ分子。
【請求項１３】
前記第１のポリヌクレオチドが、配列番号１２２６又は配列番号１２２７に記載の配列の一部分と実質的に相補的である、請求項１０に記載のキメラＤＮＡ分子。
【請求項１４】
前記第１のポリヌクレオチドの長さが、１８〜２２ヌクレオチド、例えば、２０ヌクレオチドである、請求項１０に記載のキメラＤＮＡ分子。
【請求項１５】
前記第１のポリヌクレオチドが、配列番号１〜１２２５に記載のＤＮＡ配列から選択される、請求項１０に記載のキメラＤＮＡ分子。
【請求項１６】
前記第１のポリヌクレオチドが、配列番号１〜１２２５に記載のＤＮＡ配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である、請求項１０に記載のキメラＤＮＡ分子。
【請求項１７】
前記第１のポリヌクレオチドが、前記第２のポリヌクレオチドから５’側に位置する、請求項１０に記載のキメラＤＮＡ分子。
【請求項１８】
前記第２のポリヌクレオチドが、配列番号１２２８〜１２３３に記載の配列又はその断片を含む、請求項１０に記載のキメラＤＮＡ分子。
【請求項１９】
プロモーターに動作可能に連結された請求項１０に記載のキメラＤＮＡ分子を含む発現構築物。
【請求項２０】
前記プロモーターが、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターである、請求項１９に記載の発現構築物。
【請求項２１】
前記Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターが、Ｕ６プロモーターである、請求項１９に記載の発現構築物。
【請求項２２】
請求項１９に記載の発現構築物を含む組換えベクター。
【請求項２３】
請求項１９に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
プロモーターに動作可能に連結されたＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドを含む第２の発現構築物をさらに含む、請求項２２に記載の組換えベクター。
【請求項２５】
前記第２の発現構築物の前記プロモーターが、構成的哺乳動物プロモーターである、請求項２２に記載の組換えベクター。
【請求項２６】
前記第２の発現構築物の前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項２２に記載の組換えベクター。
【請求項２７】
前記第２の発現構築物の前記プロモーターが、組織特異的プロモーターである、請求項２２に記載の組換えベクター。
【請求項２８】
前記組織特異的プロモーターが、皮膚特異的又は唾液腺特異的である、請求項２２に記載の組換えベクター。
【請求項２９】
請求項２２に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質又はその一部分の発現を欠く、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質をコードするゲノム配列の全て又は一部分を欠く、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質の低アレルゲン性バリアントを産生する、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
請求項２９に記載の宿主細胞に由来する細胞株。
【請求項３４】
ネコ細胞からＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の全て又は一部分を欠失させる方法であって、
第１及び第２のキメラガイドＲＮＡ並びにＣａｓ９タンパク質をネコ細胞に導入すること
を含み、
各々のキメラガイドＲＮＡが、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分と配列が同一になるように選択されるｃｒＲＮＡを含み、第２のポリヌクレオチドがｔｒａｃｒＲＮＡであり、
前記第１のキメラガイドＲＮＡ及び第２のキメラガイドＲＮＡが、前記Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列又は隣接領域において第１及び第２の二本鎖切断を生じさせるように前記Ｃａｓ９タンパク質に指示し、その結果、前記第１及び第２の二本鎖切断の修復時に、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列を含む介在部分が前記ネコ細胞のゲノムから除去される、方法。
【請求項３５】
前記第１のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の５’に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列と配列が同一であり、前記第２のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１の３’に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列と配列が同一である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の内部に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列と配列が同一であり、前記第２のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の内部に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列と配列が同一である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の５’側に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列と配列が同一であり、前記第２のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の内部に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列と配列が同一である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の内部に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列と配列が同一であり、前記第２のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の３’に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列と配列が同一である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列が、配列番号１〜１２２５に記載の配列から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１及び第２のキメラガイドＲＮＡ並びにＣａｓ９タンパク質が、リボ核タンパク質複合体として前記細胞に直接導入される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１及び第２のキメラガイドＲＮＡ並びにＣａｓ９タンパク質が、前記第１及び第２のキメラガイドＲＮＡ並びにＣａｓ９タンパク質を発現することができるポリヌクレオチドを含む１つ又は複数の発現カセットによって前記細胞に間接的に導入される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１及び第２のキメラガイドＲＮＡ並びにＣａｓ９タンパク質が、前記第１及び第２のキメラガイドＲＮＡ並びにＣａｓ９タンパク質を発現することができるポリヌクレオチドを含む１つ又は複数の組換えベクターによって前記細胞に間接的に導入される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の少なくとも一部分を欠き、その結果、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質発現が損なわれているか又は存在しない、改変細胞株。
【請求項４４】
前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質又はその一部分が、発現されるがヒトにおいて低アレルゲン性である、請求項４３に記載の改変細胞株。
【請求項４５】
Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質発現が損なわれているか又は存在しない猫を産生する方法であって、
請求項２３、２９〜３３、４３又は４４のいずれか一項に記載の細胞株又は宿主細胞のいずれかを培養すること、
単一の改変された細胞又は宿主細胞を除核卵子に入れてクローン胚を作出すること、
前記クローン胚をレシピエント雌猫に移植すること、及び
前記クローン胚を成熟させて猫にすること
を含む方法。
【請求項４６】
Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質発現が損なわれているか又は存在しない猫を産生する方法であって、
猫の卵母細胞を培養すること、
５’又は３’隣接領域のＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列を標的とするように設計されたものであるガイドＲＮＡのペアと、Ｃａｓ９タンパク質とを、前記猫の卵母細胞に導入すること、
前記卵母細胞に猫の精子を受精させて胚を作出すること、
前記胚をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養すること、
前記胚をレシピエント雌猫に移植すること、及び 
前記胚を成熟させて猫にすること
を含む方法。
【請求項４７】
Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分を欠き、その結果、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質の発現が損なわれているか又は存在しない、猫。
【請求項４８】
前記Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質又はその一部分が、発現されるがヒトにおいて低アレルゲン性である、請求項４７に記載の猫。
【請求項４９】
猫を処置する方法であって、
少なくとも第１及び第２のキメラガイドＲＮＡ並びにＣａｓ９タンパク質をコードする組換えベクターを、Ｆｅｌ  ｄ１発現について野生型である猫に投与すること
を含み、
各々のキメラガイドＲＮＡ（sgRNA）が、ｓｇＲＮＡ標的配列として選択されるＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分と配列が同一になるように選択されるｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒＲＮＡとを含み、
前記第１のキメラガイドＲＮＡ及び第２のキメラガイドＲＮＡが、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分又は隣接領域において第１及び第２の二本鎖切断を生じさせるように前記Ｃａｓ９タンパク質に指示し、その結果、前記第１及び第２の二本鎖切断の修復時に、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列を含む介在部分が前記ゲノムから除去される、方法。
【請求項５０】
前記ｓｇＲＮＡ標的配列が、配列番号１〜１２２５に記載の配列から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記組換えベクターが、ウイルスベクターである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ウイルスベクターが、ＦＩＶベースのベクターである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記組換えベクターが、Ｃａｓ９発現を駆動する組織特異的プロモーターを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記組換えベクターが、Ｃａｓ９発現を駆動する誘導性プロモーターを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記組換えベクターが、全身投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記組換えベクターが、唾液腺組織に投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
前記組換えベクターが、皮膚組織に投与される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質発現が、皮膚、唾液腺、肛門周囲腺又は涙腺において損なわれているか又は存在しない、請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
細胞からＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の全て又は一部分を欠失させる方法であって、
キメラガイドＲＮＡ（sgRNA）の第１及び第２のペア並びにＣａｓ９ニッカーゼをネコ細胞に導入すること
を含み、
各々のキメラガイドＲＮＡが、ｓｇＲＮＡ標的配列として選択されるＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分と配列が同一になるように選択されるｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒＲＮＡとを含み、
前記キメラガイドＲＮＡの第１のペアが、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の第１の部分又は隣接領域において一本鎖切断の第１のペアを生じさせるように前記Ｃａｓ９ニッカーゼに指示し、前記キメラガイドＲＮＡの第２のペアが、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の第２の部分又は隣接領域において一本鎖切断の第２のペアを生じさせるように前記Ｃａｓ９ニッカーゼに指示し、その結果、前記一本鎖切断の第１及び第２のペアの修復時に、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列を含む介在部分が前記ネコ細胞のゲノムから除去される、方法。
【請求項６１】
前記ｓｇＲＮＡ標的配列が、配列番号１〜１２２５に記載の配列から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記キメラガイドＲＮＡの第１のペアが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の５’に位置するゲノム配列を標的とするために選択され、前記キメラガイドＲＮＡの第２のペアが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の３’に位置するゲノム配列を標的とするために選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記キメラガイドＲＮＡの第１のペアが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の内部に位置するゲノム配列を標的とするために選択され、前記キメラガイドＲＮＡの第２のペアが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の内部に位置するゲノム配列を標的とするために選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記キメラガイドＲＮＡの第１のペアが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の５’側に位置するゲノム配列を標的とするために選択され、前記キメラガイドＲＮＡの第２のペアが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の内部に位置するゲノム配列を標的とする、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記キメラガイドＲＮＡの第１のペアが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の内部に位置するゲノム配列を標的とするために選択され、前記キメラガイドＲＮＡの第２のペアが、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の３’側に位置するゲノム配列を標的とするために選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記キメラガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ニッカーゼが、リボ核タンパク質複合体として前記細胞に直接導入される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
前記キメラガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ニッカーゼが、前記第１及び第２のキメラガイドＲＮＡ並びにＣａｓ９タンパク質を発現することができるポリヌクレオチドを含む１つ又は複数の発現カセットによって前記細胞に間接的に導入される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
前記キメラガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ニッカーゼが、前記第１及び第２のキメラガイドＲＮＡ並びにＣａｓ９タンパク質を発現することができるポリヌクレオチドを含む１つ又は複数の組換えベクターによって前記細胞に間接的に導入される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質の発現が排除される又は変化するようにＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の全て又は一部分が欠失している猫。
【請求項７０】
Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質を産生しないか、又はヒトにおいて低アレルゲン性である、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質又は断片を産生する、請求項６９に記載の猫。
【請求項７１】
前記Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の全て又は一部分が、体細胞から欠失している、請求項６９に記載の猫。
【請求項７２】
前記Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の全て又は一部分が、生殖系列細胞から欠失している、請求項６９に記載の猫。
【請求項７３】
前記Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の全て又は一部分が、体細胞と生殖系細胞の両方から欠失している、請求項６９に記載の猫。
【請求項７４】
前記Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の全て又は一部分を含むゲノム配列の少なくとも０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又は４９ｋｂが欠失している、請求項６９に記載の猫。
【請求項７５】
請求項６９に記載の雄及び雌猫のＦ１子孫。
【請求項７６】
ネコ細胞内のＦｅｌ  ｄ１遺伝子をノックアウトする方法であって、
キメラガイドＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質をネコ細胞に導入すること
を含み、
前記キメラガイドＲＮＡが、Ｆｅｌ  ｄ１標的ゲノム配列と配列が同一になるように選択されるｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒＲＮＡとを含み、
前記キメラガイドＲＮＡが、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分において二本鎖切断を生じさせるように前記Ｃａｓ９タンパク質に指示し、その結果、非相同末端結合による前記二本鎖切断の修復時に、Ｆｅｌ  ｄ１遺伝子の読み枠がシフトされることによってＦｅｌ  ｄ１遺伝子が非機能性にし、その結果、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が発現されない、方法。
【請求項７７】
ネコ細胞に外来ＤＮＡ配列をノックインする方法であって、ネコ細胞に、
キメラガイドＲＮＡ（sgRNA）及びＣａｓ９タンパク質と、
ドナー鋳型ＤＮＡと
を導入すること
を含み、前記ドナー鋳型ＤＮＡが、
第１の相同領域、
外来ＤＮＡ配列、
第２の相同領域、
を５’から３’にコードするポリヌクレオチドを含み、
前記第１の相同領域が、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の第１の部分と実質的に相補的であり、
前記第２の相同領域が、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の第２の部分と実質的に相補的であり、
前記キメラガイドＲＮＡが、ｓｇＲＮＡ標的配列として選択されるＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の第３の部分と配列が同一になるように選択されるｃｒＲＮＡと、ｔｒａｃｒＲＮＡとを含み、
前記キメラガイドＲＮＡが、前記Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の第３の部分の一部分において二本鎖切断を生じさせるように前記Ｃａｓ９タンパク質に指示し、その結果、相同組換え修復（HDR）による修復の結果として、前記ドナー鋳型ＤＮＡが前記ゲノムに導入されることによって前記外来配列が前記Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列に導入されることになる、方法。
【請求項７８】
前記外来配列の前記Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列への導入が、前記Ｆｅｌ  ｄ１遺伝子を非機能性にし、その結果、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が発現されない、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記外来ＤＮＡ配列が、タグである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記外来ＤＮＡ配列が、レポーターである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記ｓｇＲＮＡ標的配列が、配列番号１〜１２２５に記載の配列から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記キメラガイドＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質が、リボ核タンパク質複合体として前記細胞に直接導入される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
前記キメラガイドＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質が、前記第１及び第２のキメラガイドＲＮＡ並びにＣａｓ９タンパク質を発現することができるポリヌクレオチドを含む１つ又は複数の発現カセットによって前記細胞に間接的に導入される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
前記キメラガイドＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質が、前記第１及び第２のキメラガイドＲＮＡ並びにＣａｓ９タンパク質を発現することができるポリヌクレオチドを含む１つ又は複数の組換えベクターによって前記細胞に間接的に導入される、請求項７７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
[0001]  本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表を含み、この配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１７年３月２日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＷＲ−ＩＢ−１０１−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは１９２，６０３バイトである。
【０００２】
関連出願の相互参照
[0002]  本出願は、２０１６年３月４日に出願した米国特許仮出願第６２／３０３，６８６号の開示に依拠し、その出願日の優先権と利益を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
[0003]  本発明は、一般に、ネコ又はネコ細胞を遺伝子修飾するための組成物及び方法に関する。より詳細には、本発明は、ネコゲノムからＦｅｌ  ｄ１遺伝子の全て又は一部分をノックアウトするための組成物及び方法、並びにＦｅｌ  ｄ１遺伝子の全て又は一部分がノックアウトされているネコ細胞及び生物に関する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]  現代社会において、アレルギー及び喘息は、増加の一途をたどっている。一般的なアレルゲンは、イエダニから食物に至る様々な異なる源に由来する。家庭のペットは、もう１つの典型的なアレルゲン源であり、その一部（例えば、猫及び犬）は、ペットがいなくても家でよく見つかる。しかし、家庭のペットは、人々の日常生活において重要な役割を果たし、あらゆる年齢及び生い立ちの様々な個体にとって友人となり、癒やしとなるので、彼らの多くは、自分達のペットに対してアレルギーがあるもののペットを手放すことに耐えられないであろう。特に、猫アレルゲンは、非常に多くの患者にとって共通の健康上の懸念であり、このアレルゲンは、本質的に社会に遍在する。猫アレルゲンの粒子は、容易に浮遊し、何時間もそのままであり、そしてまたアレルゲンは、布地などの表面に付着し、猫を飼っている家庭から外界に伝播される結果となる。アレルゲンのそのような高い伝播率のため、オフィス、店舗又は学校において、その環境に猫が存在したことがあるかどうかにかかわらず、有意なレベルの猫アレルゲンを見いだすことができる。
【０００５】
[0005]  猫に対するアレルギーは、成人の１０〜１５％に、さらには６〜１９歳の間の児童の７人中１人に影響を与える。猫アレルギーに罹患している患者の症状は、鼻結膜炎から重症喘息まで様々であり得る。複数の猫アレルゲンが同定されているが、患者の９５％までが猫からの主要アレルゲンであるＦｅｌ  ｄ１に特異的なＩｇＥ抗体を有する。Ｆｅｌ  ｄ１は、アレルギーの個体の全ＩｇＥ抗体の６０〜９０％により認識される。
【０００６】
[0006]  Ｆｅｌ  ｄ１は、セクレトグロビンファミリーのタンパク質であり、分子量が３５ｋＤである四量体として存在する。この四量体タンパク質は、２つのヘテロ二量体で構成されており、これらの二量体の各々は、各々異なる遺伝子によりコードされた、３つのジスルフィド結合で連結された２本の逆平行鎖からなる。Ｇｒｏｎｌｕｎｄら、Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｂｏｎｄｓ  ａｎｄ  Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｃａｔ  Ａｌｌｅｒｇｅｎ  Ｆｅｌ  ｄ１  Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｌｌｅｒｇｅｎ  ｂｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７８巻、４１号、４０１４４〜４０１４１頁（２００３年１０月１０日）を参照されたい。鎖１（そのタンパク質産物は７０アミノ酸（８Ｋｄ）である）及び鎖２（９２アミノ酸（１０ｋＤ））をコードする遺伝子は、ネコゲノムにおいて狭領域で出発して外側に広がって対称的に配列されており、ＤＮＡの逆ストランドによりコードされている（Gronlundら、The Major Cat Allergen, Fel d 1, in Diagnosis and Therapy、Int Arch Allergy Immunol （2010）、151:265-274、及びMorgensternら、Amino acid sequence of Fel dI, the major allergen of the domestic cat: Protein sequence analysis and cDNA cloning、Proc Natl Acad Sci USA、88（21）:9690-9694（1991）を参照されたい）。２つの遺伝子は、１０，０００塩基対未満のゲノム全長の中に位置する。
【０００７】
[0007]  配列及び構造相同性の分析は、Ｆｅｌ  ｄ１が、アンドロゲン結合タンパク質（特に、マウス及びヤクのもの）及び他のウテログロビンアレルゲン（例えば、コウモリ及びウサギにより産生されるもの）と最も密接な関係があることを示唆している。Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質は、Ｃａ２＋イオンに結合し、またその構造に基づいて、ステロイドリガンドに結合する可能性がある２つの内部空洞も含有する。加えて、Ｆｅｌ  ｄ１は、上皮を保護する役割を果たす又は抗炎症特性を有する可能性があるという仮説が立てられている。しかし、長年にわたるＦｅｌ  ｄ１研究にもかかわらず、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質の生物学的機能は、依然として不明である。
【０００８】
[0008]  猫において、Ｆｅｌ  ｄ１は、皮膚の皮脂腺によってはもちろん、唾液腺、肛門周囲腺及び涙腺によっても産生される。Ｆｅｌ  ｄ１は、毛繕いによって唾液から、及び皮膚から毛皮へと運ばれる。仔猫が成猫より少ないＦｅｌ  ｄ１を産生することは公知であり、雌は、雄と比較してより低レベルのＦｅｌ  ｄ  １を産生する。また、去勢された猫のほうが去勢手術を受けていない猫より有意に少ないＦｅｌ  ｄ  １を産生する。鱗屑及び猫の毛の上の乾燥したＦｅｌ  ｄ１粒子が浮遊すると、それらの粒子は、何時間も浮遊し続けることができる。ヒトは、これらの粒子の吸入又は猫との直接接触のどちらかによってＦｅｌ  ｄ１と接触する。Ｆｅｌ  ｄ１に対する免疫系の応答は、ＩｇＥ抗体により媒介される。Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質が免疫細胞上の受容体と結合すると、結果として、サイトカイン及びヒスタミンをはじめとするアレルギー症状を刺激する炎症誘発剤が放出されることになる。また、Ｆｅｌ  ｄ１は、ゼラチン及びフィブロネクチン分解活性を有し、他のウテログロビン同様、ホスホリパーゼＡ２の活性に対する阻害剤であるということも証明されているが、これらのさらなる特性は、免疫応答に直接関連づけられていない。
【０００９】
[0009]  猫アレルギー患者の環境に存在するＦｅｌ  ｄ１の量を減ずる試みとして、猫の寝室への立ち入りの制限、頻繁な掃除機がけ又は蒸気清浄、及びさらには定期的に猫を洗うことが挙げられている。加えて、高性能微粒子除去（HEPA：High-Efficiency Particulate Air）フィルターは、環境に存在する浮遊アレルゲンの量を減少させることが証明されている。それでもやはり、これらの方法は、Ｆｅｌ  ｄ１を完全に排除することができず、重度アレルギー患者の症状は、残存する微量のアレルゲンに起因して、猫がその環境にいた後、多くの場合、長時間にわたって持続し得る。
【００１０】
[00010]  猫に対してアレルギーがある一部の個体は、特定の検査を受けてより低レベルのＦｅｌ  ｄ１を産生すると証明された動物を探すことを選択するが、選抜育種は、動物のアレルゲンを非常に多く低減させることができるだけであり、恐らく重度アレルギー患者には十分なものではない。さらに、低アレルゲンレベルのために選抜育種された動物は、生産に多大な時間及びコストがかかる。加えて、動物の血統の大規模な近親交配は、稀な遺伝子変異の同時発生の増加をもたらすことがあり、そしてその結果として重篤な遺伝性疾患をもたらすことがある。そのため、選抜育種の実施は、短期的には実際に役立つ可能性があるが、低アレルゲン性動物を生じさせるための長期解決策として支持できない。
【００１１】
[00011]  この分野での関連する努力としては、米国特許出願公開第２００３／０１７７５１２号及び同第２０１１／００２３１５６号に記載のものが挙げられ、前記特許文献の各々は、それらの全体が参照により組み込まれる。それでもなお、これらの課題に対処する改善された方法及び組成物が当技術分野では依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
[00012]  本発明は、家で飼う猫（イエネコ（Felis catus））などの猫の細胞内の１つ又は複数のＦｅｌ  ｄ１遺伝子の選択的欠失のための組成物及び方法を提供する。１つ又は複数のＦｅｌ  ｄ１遺伝子は、鎖１、鎖２、又は鎖１と鎖２の両方を含み得る。
【００１３】
[00013]  実施形態では、本発明は、猫細胞中のＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列を標的とする組成物及び方法を提供する。この実施形態の一態様では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムにおいてＦｅｌ  ｄ１をゲノム編集の標的とするために使用することができる複数のポリヌクレオチド配列を提供する。これらのポリヌクレオチドは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムにおいて猫細胞のゲノムからのＦｅｌ  ｄ１又はその一部分の、標的化された欠失に有用性がある可能性がある任意のｓｇＲＮＡを含み得る。
【００１４】
[00014]  本発明の実施形態は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含むキメラガイドＲＮＡ（sgRNA）を提供する。第１のポリヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡである。第２のポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡである。標的ＤＮＡ領域内に位置するＤＮＡの１本のストランドの一部分と結合することができるようなｃｒＲＮＡ（第１のポリヌクレオチド）が選択される。そのストランドの相補ストランドは、本明細書ではｓｇＲＮＡ標的配列と呼ばれ、配列の点でｃｒＲＮＡと同一である。ｓｇＲＮＡ標的配列は、ｓｇＲＮＡを標的ＤＮＡ部位に指向させるｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分であるので、本明細書ではｃｒＲＮＡ標的配列と呼ばれることもある。本明細書で使用される「配列の点で同一」は、ｃｒＲＮＡが、ｃｒＲＮＡがチミン（T）の代わりにウラシル（U）を含有するが、ｓｇＲＮＡ標的配列と同じ配列を有することを意味する。ｓｇＲＮＡ標的配列は、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分又は隣接領域であり、一部分は、ＮＧＧからなるＰＡＭ配列の５’であり、式中、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧである。
【００１５】
[00015]  実施形態では、ｓｇＲＮＡの第１のポリヌクレオチド（crRNA）は、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の一部分、若しくは長さ１ｋｂの３’隣接領域と配列が同一であるか、又はＦｅｌ  ｄ１鎖２の一部分、若しくは長さ１ｋｂの５’隣接領域と配列が同一である。
【００１６】
[00016]  実施形態では、ｓｇＲＮＡの第１のポリヌクレオチド（crRNA）は、配列番号１２２６若しくは配列番号１２２７に記載の配列の一部分と配列が同一であるか、又は配列番号１２２６若しくは配列番号１２２７に記載の配列の一部分と実質的に相補的である。
【００１７】
[00017]  実施形態では、ｓｇＲＮＡの第１のポリヌクレオチド（crRNA）の長さは、１８〜２２ヌクレオチド、例えば、１８、１９、２０、２１又は２２ヌクレオチドである。
【００１８】
[00018]  実施形態では、ｓｇＲＮＡの第１のポリヌクレオチド（crRNA）は、配列番号１〜１２２５に記載のＤＮＡ配列（例示的sgRNA標的配列）と配列が同一である。
【００１９】
[00019]  実施形態では、ｓｇＲＮＡの第１のポリヌクレオチドは、配列番号１〜１２２５に記載のＤＮＡ配列と配列の点で少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるｃｒＲＮＡである。
【００２０】
[00020]  実施形態では、ｓｇＲＮＡの第１のポリヌクレオチド（crRNA）は、ｓｇＲＮＡの第２のポリヌクレオチド（tracrRNA）の５’に位置する。
【００２１】
[00021]  本発明の実施形態は、本明細書に記載の任意のキメラガイドＲＮＡをコードするキメラＤＮＡ分子を含む。
【００２２】
[00022]  実施形態では、キメラＤＮＡ分子は、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含む。キメラＤＮＡ分子の第１のポリヌクレオチドは、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分又は隣接領域と同一であり、一部分は、ＮＧＧ（式中、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧ）からなるＰＡＭ配列の５’である。第２のポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする。
【００２３】
[00023]  実施形態では、キメラＤＮＡ分子の第１のポリヌクレオチドは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の一部分、若しくは長さ１ｋｂの３’隣接領域と同一であるか、又はＦｅｌ  ｄ１鎖２の一部分、若しくは長さ１ｋｂの５’隣接領域と同一である。
【００２４】
[00024]  実施形態では、キメラＤＮＡ分子の第１のポリヌクレオチドは、配列番号１２２６若しくは配列番号１２２７に記載の配列の一部分と同一であるか、又は配列番号１２２６若しくは配列番号１２２７に記載の配列の一部分と実質的に相補的である。
【００２５】
[00025]  実施形態では、キメラＤＮＡ分子の第１のポリヌクレオチドは、配列番号１〜１２２５に記載のＤＮＡ配列と同一である。
【００２６】
[00026]  実施形態では、キメラＤＮＡ分子の第１のポリヌクレオチドは、配列番号１〜１２２５に記載のＤＮＡ配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。
【００２７】
[00027]  実施形態では、キメラＤＮＡ分子の第２のポリヌクレオチドは、配列番号１２２８〜１２３３に記載の配列又はその断片を含み、ｓｇＲＮＡの第２のポリヌクレオチド（tracrRNA）は、配列番号１２２８〜１２３３に記載のＤＮＡ配列又はその断片と配列が同一になるように選択される。
【００２８】
[00028]  本発明の実施形態は、プロモーターに動作可能に連結された、本明細書に記載の任意のキメラＤＮＡ分子を含む、発現構築物を含む。プロモーターは、Ｕ６プロモーターなどのＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターであり得る。
【００２９】
[00029]  本発明の実施形態は、本明細書に記載の任意の発現構築物を含む、組換えベクターを含む。
【００３０】
[00030]  加えて、本発明の組換えベクターは、プロモーターに動作可能に連結されたＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドを含む、第２の発現構築物を含み得る。第２の発現構築物のプロモーターは、構成的哺乳動物プロモーター、誘導性プロモーター、又は組織特異的プロモーターであり得る。
【００３１】
[00031]  本発明の実施形態は、本明細書に記載の任意の組換えベクターを含む、宿主細胞を含む。実施形態では、宿主細胞は、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質若しくはその一部分の発現を欠き、及び／又はＦｅｌ  ｄ１タンパク質をコードするゲノム配列の全て若しくは一部分を欠く。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質の低アレルゲン性バリアントを産生する。
【００３２】
[00032]  本発明の実施形態は、本明細書に記載の任意の宿主細胞に由来する細胞株を含む。本発明の一部の態様では、細胞株は、不死化される。
【００３３】
[00033]  本発明の実施形態は、ネコ細胞からＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の全て又は一部分を欠失させる方法を含む。この方法は、第１及び第２のキメラガイドＲＮＡ並びにＣａｓ９タンパク質をネコ細胞に導入することを含む。各々のキメラガイドＲＮＡは、第１のポリヌクレオチドが、ｓｇＲＮＡ標的配列として選択されるＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分と配列が同一になるように選択されるユニークなｃｒＲＮＡであり、第２のポリヌクレオチドがｔｒａｃｒＲＮＡであるような、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含む。第１のキメラガイドＲＮＡ及び第２のキメラガイドＲＮＡは、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分又は隣接領域において第１及び第２の二本鎖切断を生じさせるようにＣａｓ９タンパク質に指示し、その結果、第１及び第２の二本鎖切断の修復時に、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列を含む介在部分がネコ細胞のゲノムから除去される。
【００３４】
[00034]  実施形態では、第１のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の５’に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分と配列が同一であり、第２のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１の３’に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列と配列が同一である。
【００３５】
[00035]  実施形態では、第１のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の一部分の内部に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分と配列が同一であり、第２のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の内部に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列と配列が同一である。
【００３６】
[00036]  実施形態では、第１のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の５’に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分と配列が同一であり、第２のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の内部に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分と配列が同一である。
【００３７】
[00037]  実施形態では、第１のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の内部に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分と配列が同一であり、第２のキメラガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の３’に位置するＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分と配列が同一である。
【００３８】
[00038]  一部の実施形態では、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分は、配列番号１〜１２２５に記載のＤＮＡ配列から選択される。
【００３９】
[00039]  さらなる実施形態は、細胞からＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の全て又は一部分を欠失させる方法を含む。この方法は、キメラガイドＲＮＡ（sgRNA）の第１及び第２のペア並びにＣａｓ９ニッカーゼをネコ細胞に導入することを含む。各々のキメラガイドＲＮＡは、第１のポリヌクレオチドが、ｓｇＲＮＡ標的配列として選択されるＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分と配列が同一のユニークなｃｒＲＮＡであり、第２のポリヌクレオチドがｔｒａｃｒＲＮＡであるような、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含む。キメラガイドＲＮＡの第１のペアは、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の第１の部分又は隣接領域において一本鎖切断の第１のペアを生じさせるようにＣａｓ９ニッカーゼに指示し、キメラガイドＲＮＡの第２のペアは、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の第２の部分又は隣接領域において一本鎖切断の第２のペアを生じさせるようにＣａｓ９ニッカーゼに指示し、その結果、一本鎖切断の第１及び第２のペアの修復時に、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列を含む介在部分がネコ細胞のゲノムから除去される。
【００４０】
[00040]  実施形態では、キメラガイドＲＮＡの第１のペアは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の５’に位置するゲノム配列と塩基対合することができるように選択され、キメラガイドＲＮＡの第２のペアは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の３’に位置するゲノム配列と塩基対合することができるように選択される。
【００４１】
[00041]  実施形態では、キメラガイドＲＮＡの第１のペアは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の内部に位置するゲノム配列と塩基対合することができるように選択され、キメラガイドＲＮＡの第２のペアは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の内部に位置するゲノム配列と塩基対合することができるように選択される。
【００４２】
[00042]  実施形態では、キメラガイドＲＮＡの第１のペアは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の５’に位置するゲノム配列と塩基対合することができるように選択され、キメラガイドＲＮＡの第２のペアは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の内部に位置するゲノム配列と塩基対合することができるように選択される。
【００４３】
[00043]  実施形態では、キメラガイドＲＮＡの第１のペアは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖２ゲノム配列の内部に位置するゲノム配列と塩基対合することができるように選択され、キメラガイドＲＮＡの第２のペアは、Ｆｅｌ  ｄ１鎖１ゲノム配列の３’に位置するゲノム配列と塩基対合することができるように選択される。
【００４４】
[00044]  実施形態では、ｓｇＲＮＡ標的配列として選択されるＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分は、配列番号１〜１２２５に記載のＤＮＡ配列から選択される。実施形態では、ｓｇＲＮＡ標的配列は、キメラガイドＲＮＡが塩基対合することができるように選択されるＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分の相補物である。
【００４５】
[00045]  本発明に記載の方法の実施形態では、キメラガイドＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質は、リボ核タンパク質複合体として細胞に直接的に導入される。
【００４６】
[00046]  本発明に記載の方法の実施形態では、キメラガイドＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質は、１つ又は複数の発現カセットによって細胞に間接的に導入される。
【００４７】
[00047]  実施形態では、第１及び第２のキメラガイドＲＮＡ並びにＣａｓ９タンパク質は、１つ又は複数のベクターによって細胞に間接的に導入される。
【００４８】
[00048]  実施形態は、Ｆｅｌ  ｄ１発現について野生型である猫に組換えベクターを投与することなどの、猫を処置する方法を含む。組換えベクターは、少なくとも第１及び第２のキメラガイドＲＮＡ並びにＣａｓ９タンパク質をコードする。各々のキメラガイドＲＮＡ（sgRNA）は、第１のポリヌクレオチドが、ｓｇＲＮＡ標的配列として選択されるＦｅｌ  ｄ  １ゲノム配列の一部分によってコードされるように選択されるユニークなｃｒＲＮＡであり、第２のポリヌクレオチドがｔｒａｃｒＲＮＡであるような、第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含む。第１のキメラガイドＲＮＡ及び第２のキメラガイドＲＮＡは、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分又は隣接領域において第１及び第２の二本鎖切断を生じさせるようにＣａｓ９タンパク質に指示し、その結果、第１及び第２の二本鎖切断の修復時に、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列を含む介在部分がゲノムから除去される。
【００４９】
[00049]  実施形態では、組換えベクターは、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターである。さらに、実施形態では、組換えベクターは、Ｃａｓ９発現を駆動する、組織特異的又は誘導性プロモーターを含む。
【００５０】
[00050]  さらに、組換えベクターを全身投与することができ、又は唾液腺若しくは皮膚組織などの特定の組織に投与することができる。
【００５１】
[00051]  さらに、本発明の方法の実施形態では、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質発現は、皮膚、唾液腺、肛門周囲腺又は涙腺において損なわれているか又は存在しない。
【００５２】
[00052]  本発明のさらなる実施形態は、Ｆｅｌ  ｄ１発現が損なわれているか又は存在しない猫を産生する方法を含む。
【００５３】
[00053]  一実施形態では、この方法は、本明細書に記載の細胞株又は宿主細胞のいずれかを培養すること、単一の改変された細胞又は宿主細胞を除核卵子に入れてクローン胚を作出すること、クローン胚をレシピエント雌猫に移植すること、及びクローン胚を成熟させて猫にすることを含む。
【００５４】
[00054]  別の実施形態では、この方法は、猫の卵母細胞を培養すること、５’又は３’隣接領域のＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列によってコードされるように設計されたものであるガイドＲＮＡのペアと、Ｃａｓ９タンパク質とを、猫の卵母細胞に導入すること、卵母細胞に猫の精子を受精させて胚を作出すること、胚をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養すること、胚をレシピエント雌猫に移植すること、及び胚を成熟させて猫にすることを含む。
【００５５】
[00055]  さらなる実施形態は、本明細書に記載の任意の方法に従って産生されるトランスジェニック又はノックアウト猫を含む。
【００５６】
[00056]  本発明の実施形態は、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の一部分を欠き、その結果、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質の発現が損なわれているか又は存在しない、猫を含む。実施形態では、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質又はその一部分は、発現されるがヒトにおいて低アレルゲン性である。
【００５７】
[00057]  一部の実施形態では、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の全て又は一部分が体細胞から欠失している。一部の実施形態では、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の全て又は一部分が生殖系列細胞から欠失している。一部の実施形態では、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の全て又は一部分が体細胞と生殖系列細胞の両方から欠失している。一部の実施形態では、５’及び／又は３’隣接領域を含む、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の少なくとも０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８又は４９ｋｂが、欠失している。
【００５８】
[00058]  本発明の別の実施形態は、本明細書に記載の雄及び雌猫の実施形態のＦ１子孫を含む。
【００５９】
[00059]  添付の図面は、本発明の実施形態のある特定の態様を例証するものであり、本発明を制限するために使用すべきものではない。本明細書と共に、これらの図面は、本発明のある特定の原理の説明に役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】[00060]イエネコＦｅｌ  ｄゲノム領域、鎖１及び鎖２のゲノムマップを示す図である。
【図２Ａ】[00061]イエネコＦｅｌ  ｄ１鎖１のゲノムマップを示す図である。
【図２Ｂ】[00062]イエネコＦｅｌ  ｄ１鎖２のゲノムマップを示す図である。
【図３】[00063]例示的ｓｇＲＮＡ標的領域を示す、イエネコＦｅｌ  ｄゲノム領域、鎖１及び鎖２のゲノムマップを示す図である。
【図４Ａ】[00064]本発明の実施形態によるＣａｓ９と共に使用するためのｓｇＲＮＡを設計する戦略の概要の図である。
【図４Ｂ】[00065]本発明の実施形態によるＣａｓ９ニッカーゼと共に使用するためのｓｇＲＮＡを設計する戦略の概要の図である。
【図５Ａ】[00066]本発明の実施形態によるガイドＲＮＡ発現カセットの模式図である。
【図５Ｂ】[00067]本発明の実施形態によるＣａｓ９発現カセットの模式図である。
【図６Ａ】[00068]本発明の実施形態によるｔｒａｃｒＲＮＡをコードするポリペプチドの上流へのｃｒＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドの挿入のためのクローニング部位を含むベクターの模式図である。
【図６Ｂ】[00069]本発明の実施形態による内部にｃｒＲＮＡがクローニングされた図６Ａのベクターの模式図である。
【図７】[00070]本発明の実施形態によるＣａｓ９発現カセットを含むベクターの模式図である。
【図８Ａ】[00071]本発明の実施形態による２つのガイドＲＮＡ発現カセットを含むベクターの模式図である。
【図８Ｂ】[00072]本発明の実施形態による８つまでのガイドＲＮＡ発現カセットを含むベクターの模式図である。
【図９Ａ】[00073]本発明の実施形態によるガイドＲＮＡ発現カセットとＣａｓ９発現カセットとを含むベクターの模式図である。
【図９Ｂ】[00074]本発明の実施形態による２つのガイドＲＮＡ発現カセットとＣａｓ９発現カセットとを含むベクターの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
[00075]  次に、本発明の様々な例示的実施形態に詳細に言及する。例示的実施形態についての以下の論述が本発明に対する限定を目的とするものでないことを理解されたい。むしろ、以下の論述は、読者が本発明のある特定の態様及び特徴をより詳細に理解できるようにするために与えるものである。
【００６２】
[00076]  本発明は、猫の細胞における、究極的には生きている猫における１つ又は複数のＦｅｌ  ｄ１遺伝子をコードするゲノムＤＮＡの選択的欠失のための組成物及び方法を提供する。これらの組成物及び方法は、家猫がこの重要なアレルゲンをもはや産生しない結果となる、Ｆｅｌ  ｄ１の産生を選択的に排除するための正確なゲノム改変に有用である。
【００６３】
[00077]  本発明の方法論の実施形態は、当技術分野において公知である、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介遺伝子編集に基づくものを含む（Congら、Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems、Science 2013年2月15日: 339（6121）、819-823 「Congら、2013」; Ranら、Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system、Nat Protoc. 2013年11月、8（11）: 2281-2308（「Ranら、2013」）; Doudna JA及びCharpentier E、The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9、Science、2014、346:6213、1258096-1-9; 及びJinekら、A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity、Science 337、816（2012）（「Jinek、2012」）を参照されたい）。簡単に言うと、ＣＲＩＳＰＲは、細菌由来タンパク質（Cas9）及び合成ガイドＲＮＡを利用して、ゲノム内の特定の位置に二本鎖切断を導入する、ＲＮＡ誘導型ゲノム編集システムである。そのマッチするゲノム配列とのハイブリダイゼーションによる切断を指示する特別設計のガイドＲＮＡ（gRNA、又はsgRNA）と共にＣａｓ９タンパク質を細胞にトランスフェクトすることにより、ゲノムＤＮＡの部位特異的開裂を細胞に導入することができる。細胞のＤＮＡ修復システムによる二本鎖切断の修復時に、エラーが導入されて特定の遺伝子のノックアウトが生じ得る。加えて、改変Ｃａｓ９タンパク質９（cas9「ニッカーゼ」）は、二本鎖切断ではなく一本鎖切断を導入することを除いて、同様に機能する。
【００６４】
[00078]  骨格ベクター、ＳｐＣａｓ９ゲノム改変システムのための他の試薬、及びプロトコールの詳細は、上記で参照したＣｏｎｇ及びＲａｎの公表文献、並びにブロード研究所（Broad Institute）のＤｒ．Ｆｅｎｇ  Ｚｈａｎｇのウェブサイト（http://www.genome-engineering.org/crispr/）において見つけることができる。システムの特徴、例えば、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９のアミノ酸配列（例えば、公開受託番号Ｑ９９ＺＷ２（NCBI）を参照されたい）及びｔｒａｃｒＲＮＡの配列（Jinek、2012を参照されたい）は、公的に入手可能である。化膿性連鎖球菌ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする例示的ＤＮＡ配列又はその断片は、配列番号１２２８〜１２３３に記載されている。ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９発現並びに関連アッセイのための試薬、クローニングベクター及びキットは、商業的供給業者、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＢｉｏＲａｄ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＯｒｉＧｅｎｅ、及びＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である。加えて、ＣＲＩＳＰＲプラスミド（Zhang labからのものを含む）は、非営利プラスミドリポジトリであるＡｄｄｇｅｎｅ（Cambridge、MA）に寄託されており、そこから入手可能であり、多数のプロトコール及び資料がＡｄｄｇｅｎｅウェブサイト（http://www.addgene.org/crispr/）で入手可能である。
【００６５】
[00079]  加えて、ＣＲＩＳＰＲ媒介遺伝子編集に関するバックグラウンド情報は、米国特許第８，６９７，３５９号、同第８，７９５，９６５号、同第８，８６５，４０６号、同第８，８７１，４４５号、同第８，８８９，３５６号、同第８，８８９，４１８号、同第８，９０６，６１６号、同第８，９３２，８１４号、同第８，９４５，８３９号、同第８，９９３，２３３号、同第８，９９９，６４１号、並びに米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号、同第２０１４／０１７０７５３号、同第２０１４／０１７９００６号、同第２０１４／０１７９７７０号、同第２０１４／０１８６８４３号、同第２０１４／０１８６９１９号、同第２０１４／０１８６９５８号、同第２０１４／０１８９８９６号、同第２０１４／０２２７７８７号、同第２０１４／０２３４９７２号、同第２０１４／０２４２６６４号、同第２０１４／０２４２６９９号、同第２０１４／０２４２７００号、同第２０１４／０２４８７０２号、同第２０１４／０２５６０４６号、同第２０１４／０２７３２３１号、同第２０１４／０２７３２３２号、同第２０１４／０２７３２３４号、同第２０１４／０２８７９３８号、同第２０１４／０３１０８３０号、同第２０１４／０３３５６２０号、同第２０１４／０３５７５３０号、同第２０１５／００２０２２３号、同第２０１５／００３１１３４号、同第２０１５／００７９６８１号、同第２０１５／０１８４１３９号、同第２０１５／０２０３８７２号、同第２０１５／０２３２８８２号、同第２０１５／０２３２８８３号、同第２０１５／０２４７１５０号、同第２０１５／０２９１９６５号、同第２０１５／０２９１９６６号、同第２０１５／０３５６２３９号において見つけることができ、これらの特許及び公開出願の開示は、それらの全体が本明細書で参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
[00080]  用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」は、同義で使用される。これらの用語は、任意の長さの重合体形態のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのどちらか、又はその類似体である。ポリヌクレオチドは、いかなる三次元構造を有してもよく、公知の又は未知の、いかなる機能を果たすものでもよい。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：結合分析から１つ又は複数の遺伝子座が定義される遺伝子又は遺伝子断片のコード又は非コード領域、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（mRNA）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（siRNA）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（shRNA）、マイクロＲＮＡ（miRNA）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、１つ又は複数の修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含むことがある。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの構築前に付与されることがあり、又は構築後に付与されることがある。ヌクレオチドの配列に非ヌクレオチド成分が割り込んでいることがある。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどにより、重合後にさらに修飾されることもある。
【００６７】
[00081]  本発明の態様では、用語「ガイドＲＮＡ」、「単鎖ガイドＲＮＡ」、「合成ガイドＲＮＡ」、「ｓｇＲＮＡ」及び「キメラガイドＲＮＡ」は同義で使用され、「ガイド配列」と「ｔｒａｃｒ配列」とを含むキメラポリヌクレオチド配列を指す。
【００６８】
[00082]  用語「ガイド配列」は、用語「ガイド」又は「ＣＲＩＳＰＲ標的化ＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」と同義で使用され得る。一般に、ガイド配列は、特定の位置で対応するＤＮＡ分子とハイブリダイズするように選択される、且つ、ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合をＤＮＡ分子内のその標的位置に指向させることができる、ガイドＲＮＡ内のポリヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ガイド配列と、それが結合することになる対応する配列との相補性度は、好適なアライメントアルゴリズムを使用して最適に並べられた場合、約５０％以上、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％であるか、又はそれより高い。一部の実施形態では、ガイド配列の長さは、約５ヌクレオチド以上、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、７５ヌクレオチドであるか、又はそれより長い。一部の実施形態では、ガイド配列の長さは、約７５ヌクレオチド未満、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２ヌクレオチド、又はそれ未満である。一部の実施形態では、ガイド配列の長さは、約５〜４０、１０〜３０、１５〜２５、１６〜２４、１７〜２３、１８〜２２、又は１９〜２１、又は２０ヌクレオチドである。好ましくは、ガイド配列の長さは、１８〜２２ヌクレオチドである。ＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を標的ＤＮＡ位置に指向させるガイド配列の能力を、いずれの好適なアッセイによって評定してもよい。
【００６９】
[00083]  用語「ｔｒａｃｒＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒ配列」は、ｃｒＲＮＡとＣａｓ９エンドヌクレアーゼ間の足場として作用する、ガイドＲＮＡの一部分を指す。ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする例示的ポリヌクレオチドは、配列番号１２２８〜１２３３に記載されている。したがって、好適なｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号１２２８〜１２３３におけるポリヌクレオチド又はその断片と配列が同一であるポリヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ、又はｔｒａｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの長さは、数約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００ヌクレオチドである。
【００７０】
[00084]  用語「ＣＲＩＳＰＲ」は、プラスミド又はウイルス起源の短いスペーサー配列が間の空間を占めている、選ばれた細菌及び古細菌のゲノム内の一連の短いダイレクトリピートである、クラスター化して規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）を指す。
【００７１】
[00085]  用語「ＣＲＩＳＰＲ複合体」及び「ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ」は、生物が侵入する遺伝物質に応答してそれを排除できるようにする、ＲＮＡ及びヌクレアーゼにより媒介される選ばれた細菌及び古細菌内の特異的な適応免疫システムを指す。
【００７２】
[00086]  用語「Ｃａｓ９」又は「Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ」（別名COG3513、Csx12、Cas5、又はCsn1）は、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃＲＮＡデュプレックスをＤＮＡの部位特異的二本鎖開裂に使用する、２つのヌクレアーゼドメインを有するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。本発明の態様では、これらの用語は、野生型Ｃａｓ９タンパク質を指すこともあり、又はＲＮＡにより誘導されるＤＮＡの二本鎖若しくは一本鎖開裂を媒介する、変異体、ホモログ、オルソログを含む、任意のバリアントを指すこともある。
【００７３】
[00087]  用語「Ｃａｓ９ニッカーゼ」は、そのヌクレアーゼドメインのうちの１つが非機能性であり、その結果、その活性がＤＮＡの一本鎖開裂に限定される、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを指す。
【００７４】
[00088]  用語「標的配列」は、ガイドＲＮＡの標的である特定のＤＮＡ領域（例えば、ゲノムDNA配列）を指す。この領域内のＤＮＡストランドは、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分とハイブリダイズする。ｓｇＲＮＡ標的配列は、この標的ＤＮＡ領域内に位置するポリヌクレオチド配列である。実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ標的配列の相補物であるポリヌクレオチド配列とハイブリダイズ（他に結合又は塩基対合と言われる）するように選択される。
【００７５】
[00089]  本明細書で使用される用語「野生型」は、当業者によって理解されている当技術分野の用語であり、変異体又はバリアント形態と区別される、自然に存在する典型的な形態の生物、株、遺伝子又は特性を意味する。
【００７６】
[00090]  本明細書で使用される用語「バリアント」は、自然に存在するものから外れるパターンを有する質を呈することを意味すると解釈されたい。「バリアント」ＤＮＡ分子は、ネイティブ配列の小さな変化、すなわち、ネイティブ配列の１つ又は複数のヌクレオチドが欠失、付加及び／又は置換される変化を含むＤＮＡ分子である。バリアントＤＮＡ分子は、例えば、標準的なＤＮＡ変異誘発技術により、又はバリアントＤＮＡ分子若しくはその一部分を化学的に合成することにより産生することができる。そのようなバリアントは、好ましくは、ポリヌクレオチドのタンパク質コード領域の読み枠を変化させず、所望の生物学的活性が変化も、低減も、増加もしていないタンパク質をコードすることができる。「バリアント」ペプチド又はタンパク質は、置換、欠失及び／又は挿入を含む、アミノ酸配列の変化を含むものである。
【００７７】
[00091]  用語「非天然起源の」又は「改変された」又は「遺伝子改変された」は、同義で使用され、人手の関与を示す。核酸分子又はポリペプチドに言及するときのこれらの用語は、核酸分子又はポリペプチドに、それらが自然界で天然に会合しており、自然界に見られるような、少なくとも１つの他の成分が、少なくとも実質的にないことを意味する。
【００７８】
[00092]  「相補性」は、核酸が伝統的ワトソン・クリック塩基対合又は他の非伝統型のどちらかにより別の核酸配列と水素結合を形成する能力を指す。相補性パーセントは、核酸分子中の、第２の核酸配列と水素結合(例えば、ワトソン・クリック塩基対合)を形成することができる残基の、百分率を示す(例えば、１０のうち５、６、７、８、９、１０は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％相補的となる)。「完全に相補的」は、核酸配列の連続する残基全てが、第２の核酸配列中の同数の連続する残基と水素結合することになることを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０ヌクレオチド、若しくはそれを超えるヌクレオチド数の領域にわたって少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％である相補性度を指すか、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
【００７９】
[00093]  ハイブリダイゼーションについて本明細書で使用される「ストリンジェントな条件」は、標的配列との相補性を有する核酸が主にその標的配列とハイブリダイズし、非標的配列と実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、一般に、配列依存性であり、多数の因子によって変わる。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列と特異的にハイブリダイズする温度は高い。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Tijssen（1993）、Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I、第2章「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay」、Elsevier、N.Y.に詳細に記載されている。
【００８０】
[00094]  「ハイブリダイゼーション」は、１つ又は複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化している複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合により起こることもあり、フーグスティーン結合により起こることもあり、又は任意の他の配列特異的様式で起こることもある。複合体は、二重鎖構造を形成する２本のストランドを含むこともあり、多鎖複合体を形成する３本若しくはそれより多くのストランドを含むこともあり、自己ハイブリダイズする単一のストランドを含むこともあり、又はこれらの任意の組合せを含むこともある。ハイブリダイゼーション反応は、より大規模なプロセスの一工程、例えば、ＰＣＲの開始、又は酵素によるポリヌクレオチドの切断を構成することもある。所与の配列とハイブリダイズすることができる配列は、所与の配列の「相補物」と呼ばれる。
【００８１】
[00095]  本明細書で使用される「発現」は、ポリヌクレオチドが鋳型ＤＮＡから（例えば、mRNA又は他のRNA転写物に）転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが、その後、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と呼ばれることがある。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含むことがある。
【００８２】
[00096]  本明細書で使用される「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エクソン及びイントロンを含む）はもちろん、遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域も、そのような制御配列がコード配列及び／又は転写された配列に隣接しているか否かを問わず、指す。したがって、遺伝子は、必ずしもこれらに限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列、例えばリボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界領域、複製起点、マトリックス結合部位、及び遺伝子座制御領域を含む。ある特定の態様によれば、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質合成の破壊をもたらすＦｅｌ  ｄ１遺伝子の任意の部分を本発明の組成物及び方法により標的とすることができる。本明細書での了解事項として、「Ｆｅｌ  ｄ１遺伝子」は、「Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列」と同義で使用することができる。
【００８３】
[00097]  用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書では同義で使用される。ポリマーは、直鎖状若しくは分岐していてもよく、修飾されたアミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸が割り込んでいてもよい。これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質修飾、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作、例えば標識成分とのコンジュゲーション、も包含する。本明細書で使用される用語「アミノ酸」は、グリシン及びＤ又はＬ両方の光学異性体、並びにアミノ酸類似体及びペプチド模倣物を含む、天然及び／又は非天然又は合成アミノ酸を含む。
【００８４】
[00098]  本明細書で使用される「同一性」は、基準ヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較したヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、配列は、最高次数のマッチが得られるように並べられる。「同一性」それ自体は、当技術分野で認識されている意味を有し、公開された技術を使用して計算することができる。（例えば、Computational Molecular Biology、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York（1988）；Biocomputing: Informatics And Genome Projects、Smith, D. W.編、Academic Press、New York（1993）；Computer Analysis of Sequence Data、Part I、Griffin, A. M.及びGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey（1994）；von Heinje, G.、Sequence Analysis In Molecular Biology、Academic Press（1987）；並びにSequence Analysis Primer、Gribskov, M.及びDevereux, J.編、M Stockton Press、New York（1991）を参照されたい）。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列間の同一性を測定する方法は幾つかあり、また用語「同一性」は、当業者に周知である（Carillo, H.及びLipton, D.、Siam J Applied Math 48:1073（1988））。２つの配列間の同一性又は類似性を判定するために一般に用いられる方法としては、Guide to Huge Computers、Martin J. Bishop編、Academic Press、San Diego（1994）並びにCarillo, H.及びLipton, D.、Siam Applied Math 48:1073（1988）において開示されているものが挙げられるが、これらに限定されない。コンピュータプログラムに同一性及び類似性を計算する方法及びアルゴリズムが含まれていることもある。２つの配列間の同一性及び類似性を判定するためのコンピュータプログラム方法の例としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J.ら、Nucleic Acids Research 12（i）:387（1984））、ＢＬＡＳＴＰ、ＥｘＰＡＳｙ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul, S. F.ら、J Molec Biol 215:403（1990））及びＦＡＳＴＤＢが挙げられるが、これらに限定されない。同一性及び類似性を判定するための方法の例は、参照により組み込まれる、Michaels, G.及びGarian, R.、Current Protocols in Protein Science、1巻、John Wiley & Sons, Inc.（2000)）において論じられている。本発明の一実施形態では、２つ以上のポリペプチド間の同一性を判定するために使用されるアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＰである。
【００８５】
[00099]  本明細書で使用されるとき、配列は、基準配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である場合、「実質的に同一」である。
【００８６】
[000100]  「動作可能に連結される／されている／された」。第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的関係に置かれているとき、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と「動作可能に連結されている」。例えば、プロモーターは、コード配列の転写又は発現に影響を与える場合、コード配列に動作可能に連結されている。一般に、動作可能に連結されているＤＮＡ配列は、連続しており、また２つのタンパク質コード領域を接合させる必要がある場合には読み枠内にある。
【００８７】
[000101]  組換えベクターなどの外来ポリヌクレオチドが導入された細胞、組織、器官又は生物は、「形質転換された」、「トランスフェクトされた」又は「トランスジェニック」と見なされる。「トランスジェニック」又は「形質転換された」細胞又は生物は、その細胞又はその生物の子孫も含む。
【００８８】
[000102]  本明細書で使用される「ノックアウト」は、遺伝子産物が排除されている細胞若しくは生物、又はそのような排除をもたらす任意の手順を指す。本発明のある特定の態様では、「ノックアウト」は、本明細書に記載の組成物及び方法の結果として生じる挿入、欠失、置換、フレームシフト変異などの結果として生じ得る。本明細書で使用される「ノックアウト」は、ＤＮＡ（例えば、ゲノムDNA）の一部分が除去されている遺伝子改変細胞又は生物も指すことがある。遺伝子に言及するときの用語「ノックアウト」は、その遺伝子と会合しているＤＮＡの全て又は一部分の除去を意味することを意図したものである。ある特定の態様では、本発明の組成物及び方法は、Ｆｅｌ  ｄ１遺伝子の全て又は一部分をノックアウトさせるのに有用である。
【００８９】
[000103]  本明細書で使用される「低アレルゲン性の」は、アレルギー反応の可能性を低減させる又は最小にするように設計されていることを意味する。本発明のある特定の態様では、低アレルゲン性の猫は、猫アレルゲンＦｅｌ  ｄ１の「ノックアウト」の結果として生じ得る。しかし、本発明は、組成物及び方法が、ＩｇＥ反応性を低減させる結果となるＦｅｌ  ｄ１二次元又は三次元構造の任意の変化を含む様々なメカニズムによって、Ｆｅｌ  ｄ１低アレルゲン性を生じさせることができることを企図している。
【００９０】
[000104]  本発明の組成物は、１つ又は複数のガイドＲＮＡ、及びガイドＲＮＡをコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含み、ガイドＲＮＡは、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の部位特異的開裂又はＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列の５’若しくは３’である任意の隣接部分の部位特異的開裂を指示することができる。猫ゲノム内の適切な標的配列を同定することにより、ガイドＲＮＡ、又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を、同定することができる。候補ガイドＲＮＡ標的配列を公開ゲノムデータから同定してもよく、又はネコ組織若しくは細胞試料からゲノムＤＮＡを単離し、そのゲノムＤＮＡをシークエンシングすることによって同定してもよい。実施形態では、配列番号１〜１２２５は、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列又は任意の隣接する５’若しくは３’隣接領域の部位特異的二本鎖開裂部位であり得る、猫ゲノム内の１２２５の候補標的配列を表す。候補標的配列を、コンピュータプロセッサにより実行される１つ若しくは複数のアルゴリズムによってｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで同定してもよく、又は手作業で同定してもよい。
【００９１】
[000105]  本発明の方法は、実施形態では、ハイスループットスクリーニングを含み得る、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術によるＦｅｌ  ｄ１のゲノム編集を開始させる効力についてのガイドＲＮＡのスクリーニングを含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効力を有するガイドＲＮＡを同定したら、活性ガイドＲＮＡを宿主細胞に導入することができ、その改変宿主細胞を、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質の発現を欠く猫のクローニングの基礎として使用することができる。
【００９２】
[000106]  本発明の方法は、核移植によるクローニングの際にドナー細胞として改変宿主細胞を使用するクローニングを含む。例えば、ネコ皮膚細胞又は成熟線維芽細胞を培養し、ガイドＲＮＡとＣａｓ９とをコードするベクターを当該細胞にトランスフェクトすることができる。Ｆｅｌ  ｄ１のノックアウトを確認したら、単一のドナー細胞を除核卵子に入れる。クローン胚を培養し、次いでサロゲート雌猫（surrogate queen）に外科的に移植する。加えて、本発明は、直接配偶子遺伝子修飾、又は胚性幹細胞の操作などによる、Ｆｅｌ  ｄ１ノックアウト細胞又は動物のさらなる作出方法を企図している。或いは、ガイドＲＮＡとＣａｓ９とをコードするウイルスベクターを野生型の猫に投与して、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列をｉｎ  ｖｉｖｏで切除することができる。ベクターを全身投与することができ、又は特定のＦｅｌ  ｄ１ゲノム発現組織に投与することができる。
【００９３】
[000107]  本発明の実施形態には、本発明の方法の結果としてＦｅｌ  ｄ１（又はその一部分）がノックアウトされているトランスジェニック猫も含まれる。これらの猫は、Ｆｅｌ  ｄ１又はその一部分の発現を低減させており、Ｆｅｌ  ｄ１が低アレルゲン性又は非アレルゲン性であり得る。これらの猫は、体細胞において及び生殖系列においてＦｅｌ  ｄ１がノックアウトされており、したがってこの特性を子孫に伝えることができる。
【００９４】
[000108]  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集の代替案として、本発明は、相同組換えによるノックアウト、Ｃｒｅ−ｌｏｘシステムによるノックアウト、又はＲＮＡ干渉によるノックダウンを含む、当技術分野において公知の他のゲノム編集、ノックダウン又はサイレンシングの方法の使用を企図している。例えば、相同組換えは、破壊構築物の設計、胚性幹細胞内のＦｅｌ  ｄ１遺伝子の欠失、改変幹細胞の胚への注入、胚の移植、仔猫（ヘテロ接合性Ｆｅｌ  ｄ１Δ）のスクリーニング、及びホモ接合体を得るためのヘテロ接合体の育種を含む。Ｃｒｅ−ｌｏｘシステムによる遺伝子改変は、エクソン又は完全Ｆｅｌ  ｄ１遺伝子の周囲にｌｏｘ部位を挿入するための相同組換え、次いで、Ｃｒｅリコンビナーゼのトランスフェクション及び発現を含む（Metzger, D.及びFeil, R. Engineering the mouse genome by site-specific recombination. Curr. Opin. Biotechnol. 10、470-476を参照されたい）。ＲＮＡ干渉は、翻訳を防止するための、又は特定のｍＲＮＡの分解を誘導するための、ネイティブの細胞機構を標的とするｓｉＲＮＡの導入を含む。これらの技術は、当技術分野において公知であり、総説されている（Lodish、Molecular Cell Biology、W.H.  Freeman and Company、New Yorkを参照されたい）。加えて、本発明の実施形態は、誘導性ノックアウト、組織特異的ノックアウト、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用するゲノム編集（例えば、米国特許出願公開第２０１１／００２３１５６号を参照されたい）、及びエピジェネティックサイレンシングなどのＣａｓ９バリエーション（DNAメチルトランスフェラーゼに融合したdCas9）を企図している。
【実施例】
【００９５】
[000109]  実施例：細胞株の培養
[000110]  イエネコ細胞株は、アメリカ合衆国細胞培養系統保存機関（American Type Culture Collection）（ATCC；Manassas、Virginia）から得ることができ、ＡＴＣＣウェブサイトで入手可能なＡＴＣＣ（登録商標）Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｇｕｉｄｅを含む、当技術分野において公知のプロトコールに従って培養することができる。入手可能であり得る細胞株の例としては、ＣＲＦＫ（ATCC（登録商標）CCL-94（商標）、Ｆｃｗｆ−４［Ｆｃｗｆ］（ATCC（登録商標）CRL-2787（商標））、ＦＣ７７．Ｔ（ATCC（登録商標）CRL-6105_FL（商標））、ＰＧ−４（Ｓ＋Ｌ−）（ATCC（登録商標）CRL-2032（商標））、ＭＹＡ−１（ATCC（登録商標）CRL-2417（商標））、Ｆ１Ｂ［Ｆ１Ｂ（Ｎ）］（ATCC（登録商標）CRL-6168（商標））、Ｇ３５５−５（ATCC（登録商標）CRL-2033（商標））、Ｆｃ２Ｌｕ（ATCC（登録商標）CCL-217（商標））、ＦＣ１１４Ｅ．Ｔｒ（ATCC（登録商標）CRL-6167（商標））、ＦＣ４７（ATCC（登録商標）CRL-6094（商標））、ＦｅＴ−Ｊ（ATCC（登録商標）CRL-11967（商標））、Ｆ２５（ATCC（登録商標）CRL-6566（商標））、Ｆｃ３Ｔｇ（ATCC（登録商標）CCL-176（商標））、ＦｅＬＶ−３２８１（ATCC（登録商標）CRL-9116（商標））、ＦＣ８３．Ｒｅｓ（ATCC（登録商標）CRL-6567（商標））、ＡＫ−Ｄ（ATCC（登録商標）CCL-150（商標））、ＦＣ２．Ｋ（ATCC（登録商標）CRL-6126（商標））、ＦＬ７４−ＵＣＤ−１（ATCC（登録商標）CRL-8012（商標））、ＦｅＴ−１Ｃ（ATCC（登録商標）CRL-11968（商標））が挙げられる。
【００９６】
[000111]  実施例：初代細胞培養
[000112]  初代細胞株は、猫組織の組織試料又は生検から樹立することができる。例としては、穿刺吸引、コア針生検、吸引生検及び画像誘導生検を含む、骨髄生検、内視鏡生検、皮膚穿刺生検及び針生検手順が挙げられる。これらは、組織試料の一部分を直ちに培養することになるか、又は後の培養のためにＤＭＳＯ若しくはグリセロールなどの凍結保護物質を使用して凍結保存することになることを除いて、病理検査に生検を用いるときに使用される標準的プロトコールに従って行うことになる。したがって、生検手順をここで詳細に述べる必要はない。
【００９７】
[000113]  生検試料の一部分からの細胞を、公知の様々な組織培養及び初代細胞培養のための方法によって培養することができる。例えば、初代細胞培養のために、組織試料を先ず切開して、脂肪及び壊死細胞を除去することができる。次いで、組織試料を酵素的に又は機械的に脱凝集させることができる。次いで、分散細胞をインキュベートし、培地を交換し、遊離した残屑及び接着していない細胞を除去することができる。初代細胞は、足場依存性の接着細胞であるため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで適切に増殖させるための表面を必要とする。一実施形態では、細胞を二次元（2D）培養で培養する。典型的には、プラスチックをコーティングしていない容器、例えば、フラスコ又はペトリ皿を使用し、適切な増殖因子及びサイトカインを補充した基本培地で構成された完全細胞培養培地に細胞を浸す。初代培養物の樹立中、宿主組織から導入される夾雑を阻害するために増殖培地に抗生物質を含めることは有用であり得る。初代細胞を培養するための様々なプロトコールが公知であり、アメリカ合衆国細胞培養系統保存機関ウェブサイトで入手可能なＡＴＣＣ（登録商標）Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｇｕｉｄｅをはじめとする様々な資料が入手可能である。
【００９８】
[000114]  実施例：ゲノムＤＮＡの抽出
[000115]  ゲノムＤＮＡを当技術分野において公知の様々なプロトコールに従って組織培養細胞から単離することができる。例えば、そのような手順の一例では、単層で培養したイエネコ細胞をトリプシン処理し、計数する。細胞を、５分間、５００ｘｇで４度での遠心分離により細胞をペレット化し、氷冷ＰＢＳで洗浄し、再ペレット化する。細胞を１容積の消化緩衝液に再懸濁させる（消化緩衝液１ｍｌ／細胞１０８個）。試料を回転させながら５０℃で１２〜１８時間インキュベートし、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、１０分間、１７００ｘｇで遠心分離する。水性層を新たなチューブに移し、１／２容積の７．５Ｍ酢酸アンモニウム及び２容積の１００％エタノールを添加してもよい。２分間、１７００ｘｇでスピンさせることによりＤＮＡをペレット化し、７０％エタノールで洗浄し、その後、エタノールをデカントし、放置して空気乾燥させる。ＤＮＡをＴＥ緩衝液に１ｍｇ／ｍｌで再懸濁させる。必要に応じて、試料を室温〜６５℃で穏やか振盪して再懸濁を助長する（哺乳動物細胞約１ｇによってＤＮＡ  ２ｍｇが得られる）。１０％ＳＤＳを０．１％の最終濃度になるように添加し、ＲＮアーゼＡを１μｇ／ｍＬの最終濃度になるように添加する。試料を１時間、３７℃でインキュベートする。その後、試料をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させる。
【００９９】
[000116]  消化緩衝液： 
１００ｍＭ  ＮａＣｌ
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ［ｐＨ８．０］
２５ｍＭ  ＥＤＴＡ［ｐＨ８．０］
０．５％ＳＤＳ
０．１ｍｇ／ｍＬ  プロテイナーゼＫ
【０１００】
[000117]  実施例：シークエンシング
[000118]  直接生検試料、凍結保存生検試料又は培養細胞試料から単離したゲノムＤＮＡをシークエンシング分析に付すことができる。サンガー（又はジデオキシ）法、マクサム・ギルバート、プライマーウォーキング及びショットガンシークエンシングをはじめとする、様々なシークエンシング手法が公知である。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シークエンシング、Ｒｏｃｈｅ  ４５４シークエンシング、Ｉｏｎ  ｔｏｒｒｅｎｔ：Ｐｒｏｔｏｎ／ＰＧＭシークエンシング、及びＳＯＬｉＤシークエンシングをはじめとする多数の異なるシークエンシング法を含む、次世代シークエンシング法（別名ハイスループットシークエンシング）が好ましい。そのような次世代技術は、文献において総説されている（Grada及びWeinbrecht、Next-Generation Sequencing: Methodology and Application Journal of Investigative Dermatology（2013）133、e11；並びにBahassi及びStambrook、Next-generation sequencing technologies: breaking the sound barrier of human genetics、Mutagenesis、2014年9月; 29（5）:303-10を参照されたい）。次世代シークエンス法は、全ゲノム、全エクソーム、及び部分ゲノム又はエクソームシークエンシング法を包含し得る。全エクソームシークエンシングは、ゲノムのわずか１％強を表す、ゲノムのタンパク質コード領域をカバーする。
【０１０１】
[000119]  実施例：ガイド配列の設計
[000120]  実施形態では、本発明のガイド配列を、１つ又は複数のＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列を標的とするために選択する。ガイド配列は、ゲノムＤＮＡのどちらかのストランド上の鎖１若しくは鎖２ゲノム配列を標的とすることもあり、又は鎖１若しくは鎖２の５’若しくは３’である任意の領域を標的とすることもある。好ましい実施形態では、ガイドＲＮＡの少なくとも１つのペアを、ペア間のゲノムＤＮＡの一部分を切除するために選択する。
【０１０２】
[000121]  加えて、本発明の実施形態は、Ｆｅｌ  ｄ１配列の隣接領域を標的とするための、及び／又はＦｅｌ  ｄ１配列の内部領域を標的とするための、又は両方のための、ガイドＲＮＡ配列の選択を企図している。したがって、ガイドＲＮＡを、１つ若しくは複数のエクソンを標的とするために選択してもよく、又はＦｅｌ  ｄ１ゲノムＤＮＡを完全に切除するために選択してもよい。例えば、一実施形態では、鎖１、鎖２又は両方の１つ又は複数のエクソンをコードするゲノムＤＮＡを標的とする。別の実施形態では、鎖１のエクソン１を標的とする。別の実施形態では、鎖１のエクソン２を標的とする。別の実施形態では、鎖１のエクソン３を標的とする。別の実施形態では、鎖２のエクソン１を標的とする。別の実施形態では、鎖２のエクソン２を標的とする。別の実施形態では、鎖２のエクソン３を標的とする。別の実施形態では、鎖１、鎖２、又は鎖１と鎖２の両方の、複数のエクソンを標的とする。別の実施形態では、鎖１又は鎖２の５’又は３’に隣接している領域を標的とする。別の実施形態では、Ｆｅｌ  ｄ１遺伝子の２つの隣接領域（例えば、一方は鎖２の上流、もう一方は鎖１の下流）を標的とする。本発明の実施形態では、長さが０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、又は１０ｋｂ以上である、５’又は３’隣接領域を標的とする。別の実施形態では、Ｆｅｌ  ｄ１遺伝子の２つの内部領域（例えば、１つは鎖２の内部、１つは鎖１の内部）を標的とする。ガイドＲＮＡを、１つ若しくは複数のエクソンを標的とするために選択してもよく、又はＦｅｌ  ｄ１ゲノムＤＮＡを完全に切除するために選択してもよい。別の実施形態では、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列のプロモーターなどの制御エレメントを標的とし、不活性化するように、ガイドＲＮＡを選択する。
【０１０３】
[000122]  本発明の実施形態は、予測される「オンターゲット」活性に基づくガイド配列の選択をさらに企図している。１つ又は複数の標的配列と結合し、「オフターゲット」活性の可能性が最小であるような、ガイド配列を選択する。したがって、標的配列とマッチし、ゲノムの他の領域との相同性が最小であるように、ガイド配列を設計すべきである。
【０１０４】
[000123]  本発明のさらなる実施形態は、標的となるゲノム領域内のプロモーター隣接モチーフ（PAM）配列の同定によるガイド配列の選択を企図している。ＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲ複合体により認識される短い配列であり、Ｃａｓ９の種に依存して様々であり得る。一実施形態では、ＰＡＭ配列は、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９に特異的であり、配列ＮＧＧ（式中、Ｎは任意のヌクレオチドである）からなる。標的配列は、ＰＡＭ配列の上流（又は５’）にあるように選択される。
【０１０５】
[000124]  例えば、ガイド配列を設計する方法の一実施形態では、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列内又はゲノム配列の５’又は３’隣接領域内のＰＡＭ（ＮＧＧ）配列を同定する。次いで、ＰＡＭ配列の上流（又は５’）のヌクレオチドの特定数を計数して、実際のガイドＲＮＡ配列の５’始点を決定する。一実施形態では、標的配列の始点は、ＰＡＭ配列の２０ヌクレオチド上流である。標的配列における効力を増大させることができるさらなる考慮事項としては、（配列の５’末端から）１位のＧ及び１７位のＡ又はＴが挙げられる。加えて、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の保存領域を標的とすることが好ましい。最後に、標的配列と相補的であるＲＮＡ配列を選択することにより、実際のガイド配列を決定する。
【０１０６】
[000125]  一実施形態では、ガイド配列を文献で又はＧｅｎＢａｎｋで入手可能なＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列（例えば、イエネコ分離株Cinnamon breed Abyssinian染色体E2、全ゲノムショットガン配列、公開受託番号ＣＭ００１３９２；また、Pontius, J.U.、Initial sequence and comparative analysis of the cat genome、Genome Res. 17（11）、1675-1689（2007）も参照されたい）から設計する。別の実施形態では、ガイド配列を１つ又は複数のネコ細胞株からのシークエンシングデータから設計する。ネコ細胞株は、市販のもの又はネコ組織試料から樹立されたものを含む、初代細胞培養物であってもよい。
【０１０７】
[000126]  例えば、図１は、鎖１及び鎖２コード領域を含むイエネコゲノムの４９．４キロベース領域のマップを示す。図２Ａ及び図２Ｂは、鎖１及び鎖２コード領域のクローズアップマップを示す。図１、図２Ａ及び図２Ｂのマップは、エクソンなどの、様々な特徴を示す。
【０１０８】
[000127]  図３は、ガイドＲＮＡ（又はより詳細には、sgRNAのcrRNA部分）の特異的標的領域を伴う図１のマップを示す。この場合、８つのｃｒＲＮＡ標的部位が表示されている（「A」は、DNAの1本のストランドの標的部位を表し、「B」は、相補ストランド上の対応する標的部位を表す）。下の表は、（crRNA）標的部位の相対位置を示す。
【０１０９】
【表１】
2019507610.tif 000003
加えて、次の表は、ガイドＲＮＡのペアを設計するための及び特にＦｅｌ  ｄ１ゲノム領域の標的部分を選択するための例示的戦略を示す。
【０１１０】
【表２】
2019507610.tif 000004
【０１１１】
[000128]  Ｆｅｌ  ｄ１遺伝子の可能な限り大きい部分を標的とする戦略が好ましい。例えば、Ｆｅｌ  ｄ１遺伝子の一部分の除去であって、その結果として、アレルギーを引き起こす可能性のあるあらゆる部分を排除することになる除去は、非常に望ましい。１つの特定の戦略は、Ｆｅｌ  ｄ１領域の外側に向かってｃｒＲＮＡ標的配列を選択することを含む可能性があり、これは、全領域を欠失させるのか、又は領域の開始部分を欠失させるのかを問わない。したがって、好ましい実施形態は、全Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム領域の５’及び３’である標的部位を含むが、アレルギー反応を低減する又は排除する結果となるゲノム領域のあらゆる部分の除去も可能である。代替戦略として、鎖１も鎖２も発現されないように、鎖１及び鎖２の開始部分を標的とすることができる。
【０１１２】
[000129]  したがって、特定の部位を標的とする上記戦略に従って、例えば、次の表に従って、ｃｒＲＮＡのペアを選択することができる。
【０１１３】
【表３】
2019507610.tif 000005
【０１１４】
[000130]  加えて、図４Ａは、Ｆｅｌ  ｄ１発現を破壊するためのガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分を選択するための例示的戦略を示す。
【０１１５】
[000131]  或いは、Ｃａｓ９「ニッカーゼ」を使用する場合、次の表に示すものなどの合計４つのｃｒＲＮＡを選択することになる（これは、一本鎖切断の２つのペアを必要とすることになるからである）。そのような戦略を図４Ｂにも示す。
【０１１６】
【表４】
2019507610.tif 000006
【０１１７】
[000132]  しかし、図３に示されているｃｒＲＮＡ標的部位は、単なる例示である。少なくとも約０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８及び４９ｋｂの長さを含む、概ね約０．０１ｋｂ〜５０ｋｂの長さであるＦｅｌ  ｄ１ゲノム配列又は関連領域を切除するための標的部位を選択することができる。
【０１１８】
[000133]  表５は、上で論じた部位の例示的標的ＤＮＡ配列、及び対応するｃｒＲＮＡ配列を示す。
【０１１９】
【表５】
2019507610.tif 000007
【０１２０】
[000134]  実施形態では、挿入、欠失、フレームシフト変異などを含む、Ｆｅｌ  ｄ１の発現を破壊する、低減させる又は排除する結果となる任意の適切な変異を誘導するために、ｃｒＲＮＡ標的を選択する。
【０１２１】
[000135]  一部の実施形態では、Ｆｅｌ  ｄ１遺伝子を非機能性にする破壊を導入するために、単一ｃｒＲＮＡ標的部位を選択する。例えば、Ｃａｓ９により導入される単一標的部位における二本鎖切断を非相同末端結合（NHEJ）により修復し、その結果として、読み枠をシフトさせることによりＦｅｌ  ｄ１遺伝子を有効にノックアウトするフレームシフト変異を導入することができる少数の塩基対の挿入及び欠失が生じ得る。別の例では、末端が目的の領域（すなわち、Fel d 1ゲノム配列）と同一である１片のＤＮＡ（「ドナー」）を、ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼと共に導入する。相同組換え修復（HDR）による修復の結果として、ドナーＤＮＡはゲノムに導入され、その結果として、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列に外来配列が導入されることとなり、これにより外来ＤＮＡが有効に「ノックイン」される。全領域を非機能性にするように、又は外来ＤＮＡ配列を発現させるように、外来ＤＮＡ配列を挿入することができる。外来ＤＮＡ配列としては、例えば、エピトープタグ（例えば、c-myc）又はレポーター（例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP））及び／又は非機能性Ｆｅｌ  ｄ１遺伝子を挙げることができる。そのような手順は総説されている（Wangら、One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering、153（4）: 910-918, 2013；Yangら、One-Step Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering、154（6）:1370-1379, 2013を参照されたい）。
【０１２２】
[000136]  実施例：ガイドＲＮＡ標的配列のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ同定
[000137]  特定のゲノム配列からガイドＲＮＡ標的配列を同定するプログラムを使用して、候補ガイドＲＮＡ標的配列のリストを同定した。プログラムは、ブロード研究所ウェブサイト（http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design）で入手可能である。どちらかの側に１ｋｂの追加配列があるＦｅｌ  ｄ１鎖１及び鎖２のゲノム配列を別々にプログラムに送信した。鎖１についての標的配列の全長は４５１６塩基対であり（全配列を配列番号１２２６に記載する）、鎖２についての全長は、４４１６塩基対であった（全配列を配列番号１２２７に記載する）。さらなるパラメータを下の表に提供する（定義は下で見いだすことができる）：
【０１２３】
【表６】
2019507610.tif 000008
[000138]  定数＝この標的に選ぶための候補ｓｇＲＮＡ配列の所望の数。
[000139]  標的分類群＝標的遺伝子の分類群。
[000140]  ＰＡＭポリシー＝今はＮＧＧのみに限定される。
[000141]  標的ウィンドウポリシー＝優先的に標的とする標的領域の一部分（標的モードにより定義される）（これをパーセント範囲として与え、例えば、5-65は、標的領域の5番目のパーセンタイル〜65番目のパーセンタイルの間の領域を標的とすることを意味する）。
[000142]  初期間隔要件＝可能な場合、ある特定の距離（ここでは全標的領域の長さに対する百分率で測定する）の離隔があるｓｇＲＮＡ配列を選ぶ。これを「初期」と呼ぶのは、標的についての全ての候補ｓｇＲＮＡを調査した後、定数を満たさなかった場合、その後の「ラウンド」選択の際にこの要件が緩和されるからである。
[000143]  オフターゲットマッチルールセットバージョン（「CFDスコア」）＝オフターゲットマッチを計算する方法、又は「ＣＦＤ」（切断頻度決定（Cutting Frequency Determination））スコア；今は、１つしかオフターゲットルールセットがない（「１」））。
[000144]  オフターゲット層ポリシー＝オフターゲットマッチを「層」にカテゴリー分けするために使用した方法：今はそのようなポリシーが１つしかなく（「１」）、それを次のように分類する：層Ｉ：タンパク質コード領域；層ＩＩ：コード遺伝子（イントロン又はエクソン）の転写配列内の任意の位置；層ＩＩＩ：非コード遺伝子の転写配列内の任意の位置；層ＩＶ：いずれの遺伝子にも含有されない（すなわち、転写されない）位置。
[000145]  オフターゲットマッチビンポリシー＝ＣＦＤスコアに従ってオフターゲットマッチを「マッチビン」にカテゴリー分けするために使用した閾値。数値の低い方から順にピリオドにより区切られた３つの閾値によって記録される４つのビンがある。閾値は、１００分の１単位である。例えば、「５．２０．１００」は、次の４つのビンを表す：ビンＩ：ＣＦＤ＝１．０、ビンＩＩ：１．０＞ＣＦＤ≧０．２、ビンＩＩＩ：０．２＞ＣＦＤ≧０．０５、ビンＩＶ：０．０５＞ＣＦＤ。
【０１２４】
[000146]  配列番号１〜１２２５は、上記の手順から得られる例示的標的配列を表示するものである。一般に、ＮＧＧ（式中、Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴ）のＰＡＭ配列を使用して、標的配列が見いだされる対応する鎖（鎖１又は鎖２）及びストランド（センス又はアンチセンス）から、配列を得た。標的配列合計１４２８（鎖１について７９５、及び鎖２について６３３）を同定したが、この初期セットには複製があったため、１４２８のうちの１２２５がユニーク配列であり、それらを配列番号１〜１２２５として記載する。１２２５のユニーク配列に関して、次の表は、配列番号、Ｆｅｌ  ｄ１鎖、ストランド、及び配列の同定に使用したＰＡＭ配列に伴う対応を表す。
【０１２５】
【表７】
2019507610.tif 000009
【０１２６】
[000147]  標的配列は標的ＤＮＡ領域内に位置するため、本明細書ではｓｇＲＮＡ標的配列と呼ぶ。対応するｃｒＲＮＡは、標的配列と配列が同一である。例えば、配列番号１〜１２２５で提供するｓｇＲＮＡ標的配列に対応する適切なｃｒＲＮＡとしては、ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＵＡＡＡＧＵＧＡＣＣ（配列番号１２４２）（配列番号１の標的配列によってコードされるcrRNA）；ＡＡＡＡＡＵＧＡＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡＵＡ（配列番号１２４３）（配列番号２の標的配列によってコードされるcrRNA）などを挙げることができる。
【０１２７】
[000148]  加えて、オフターゲット及びオンターゲット効果を予測するアルゴリズムに従ってガイドＲＮＡ標的配列をランク付けすることが可能である。例えば、アルゴリズムは、基準ゲノムが入手可能である場合、オンターゲット活性を最大にし、オフターゲット活性を最小にするように試みながら、与えられた標的についての候補ｓｇＲＮＡ配列をランク付けすること及び選ぶことができる。例えば、ブロード研究所ツールは、「ルールセット２」（Microsoft ResearchのAzimuth projectと協力して開発されたもの）を使用してｓｇＲＮＡオンターゲット活性をモデル化し、ＣＦＤ（切断頻度決定）スコアを使用してオフターゲット部位を評価する。
【０１２８】
[000149]  ガイドＲＮＡ標的配列を同定するためのさらなるツールとしては、ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／（Hsuら、DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases、Nature Biotechnology 31、827-832（2013）を参照されたい）及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅ−ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／（Heigwer, F.、Kerr, G.及びBoutros, M.、E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat. Methods 11、122-123（2014）を参照されたい）で見つけられるものが挙げられる。
【０１２９】
[000150]  実施例：オリゴヌクレオチド合成
[000151]  ガイドＲＮＡ標的配列を同定したら、ガイドＲＮＡとＣａｓ９とをコードするＤＮＡオリゴヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、オリゴヌクレオチド配列は、配列番号１〜１２２５に記載のｓｇＲＮＡ標的配列のいずれかと同一であり得る。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１２２５に記載のｓｇＲＮＡ標的配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一である。本発明の特異的態様では、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分をコードするオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１２２５に記載の２０ｍｅｒと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一である、２０ｍｅｒなどの１８ｍｅｒ〜２２ｍｅｒになる。ポリヌクレオチドの化学合成は、例えば市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置で行うことができる。加えて、オリゴヌクレオチド配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分をコードし得る。そのようなｔｒａｃｒＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドの例を配列番号１２２８〜１２３３に記載する。さらに、二重又は単一エンドヌクレアーゼ活性を有する任意のＣａｓ９タンパク質又はバリアントをコードするようにオリゴヌクレオチドを合成することができる。
【０１３０】
[000152]  実施例：ベクターへのクローニング
[000153]  クローニングについての一般的なプロトコールとしては、Sambrook、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、New Yorkにおいて見つけられるものが挙げられる。例えば、Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡのペアをコードするオリゴヌクレオチドを単一のベクターに、又は２つの別々のベクター（Ｃａｓ９をコードするベクターとガイドＲＮＡのペアをコードするベクター）に、クローニングすることができる。そのようなガイドＲＮＡ及びＣａｓ９のクローニングについてのプロトールは記載されている（Ranら、2013を参照されたい）。
【０１３１】
[000154]  ベクターは、哺乳動物細胞において転写物を発現させることができるプロモーターと、１つ又は複数のクローニング部位と、トランスフェクトされた細胞の選択のための選択マーカー（例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン（Hydromycin）、ゼオシン/Bleo）と、任意選択により、タグ、例えば、エピトープタグ（例えば、FLAG、HA、Myc、6xHis）、タンパク質精製タグ（GST）又は局在定位タグ（GFP）とを含有する、プラスミド又は他の組換えベクターであってもよい。或いは、ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。そのようなウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターは、細胞はもちろん生存動物対象においても広範な遺伝子送達用途に使用されている。使用することができるウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタイン・バー、アデノウイルス、ジェミニウイルス、及びカリモウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクターのさらなる例としては、ＨＩＶ又はＦＩＶに基づくものなどの、レンチウイルスベクターが挙げられる。非ウイルスベクターとしては、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体、及びバイオポリマーが挙げられる。非ウイルスベクターシステムの一例は、総説されているＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステムである（Aronovich, E.L.、The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy、Hum Mol Genet. 2011年4月 15; 20（R1）: R14-R20を参照されたい）。核酸に加えて、ベクターは、１つ若しくは複数の制御領域、及び／又は核酸移入結果（移入先の組織、発現期間など）の選択、測定及びモニタリングに有用な選択マーカーも含むことができる。
【０１３２】
[000155]  市販の哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ（商標）（Sigma Aldrich）、ｐ３ｘＦＬＡＧ−Ｍｙｃ−ＣＭＶ（商標）（Sigma Aldrich）、ｐＢＩ−ＣＭＶ（Clontech）、ｐｃＤＮＡ（商標）３．１（Life Technologies）、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ（Agilent Technologies）、ｐＩＲＥＳ（Clontech）などが挙げられる。
【０１３３】
[000156]  本発明の態様では、本発明の方法に使用することができるベクターは、次のもののいずれかを用いることがある：
１）ガイドＲＮＡ発現のためのＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター（例えば、U6プロモーター）。
２）Ｃａｓ９の発現のための構成的哺乳動物細胞プロモーター。
３）Ｃａｓ９を核に指向させるための核局在化シグナル（ＮＬＳ）。
４）緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ。
５）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（gRNA足場）。
６）制限酵素消化によってｔｒａｃｒＲＮＡ配列（G（N）20 gRNA）の上流にガイド配列（crRNA）オリゴヌクレオチドをクローニングするための部位。
７）１つ又は複数の選択マーカー。
【０１３４】
[000157]  図５Ａ及び図５Ｂは、独立した使用のための、又はベクターに組み込むための、２つの基本発現カセットの例を示す。図５Ａは、（５’から３’に）プロモーター、及びｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとｔｒａｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含むキメラＤＮＡポリヌクレオチドを含む、発現カセットを示す。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは一緒に、Ｃａｓ９タンパク質をゲノム内の特定の部位に指向させるガイドＲＮＡを構成している。図５Ａに示されているプロモーターは、Ｕ６プロモーターなどのｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターであり得る。
【０１３５】
[000158]  図５Ｂは、Ｃａｓ９をコードするポリヌクレオチドの５’に位置するプロモーターを含む発現カセットを示す。Ｃａｓ９をコードする配列に２つの核局在化シグナル（NLS）が隣接している。加えて、Ｃａｓ９をコードする配列のコドンを目的の種（すなわち、イエネコ細胞）における発現のために最適化することができる。発現カセットの３’末端には、ポリアデニル化部位をコードするポリヌクレオチド配列がある。しかし、レンチベクターにおける使用などの他の実施形態では、核局在化シグナルを必要としないこともある。分子生物学の当業者は、特定の応用の要件に従って発現カセットをカスタマイズすることができる。プロモーターは、哺乳動物プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターなどであり得る。
【０１３６】
[000159]  当技術分野におい公知の動物及び哺乳動物プロモーターの例としては、ＳＶ４０初期（SV40e）プロモーター領域、ラウス肉腫ウイルス（RSV）の３’長い末端反復（LTR）を含有するプロモーター、アデノウイルス（Ad）のＥ１Ａ又は主要後期プロモーター（MLP）遺伝子のプロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）初期プロモーター、単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼ（TK）プロモーター、バキュロウイルスＩＥ１プロモーター、伸長因子１アルファ（EF1）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター、ユビキチン（Ubc）プロモーター、アルブミンプロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｌプロモーター及び転写調節領域の制御配列、遍在性プロモーター（HPRT、ビメンチン、ベータ-アクチン、チューブリンなど）、中間径フィラメント（デスミン、神経フィラメント、ケラチン、GFAPなど）のプロモーター、（MDR、CFTR又は第VIII因子型などの）治療用遺伝子のプロモーター、発病又は疾患関連プロモーター；並びに組織特異性を呈するプロモーターであって、トランスジェニック動物で、例えば、膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子調節領域、膵ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子調節領域、リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域、精巣、乳房、リンパ系及び肥満細胞において活性なマウス乳癌ウイルス調節領域、肝臓において活性なアルブミン遺伝子、Ａｐｏ  ＡＩ及びＡｐｏ  ＡＩＩ調節領域、肝臓において活性なアルファフェトプロテイン遺伝子調節領域、肝臓において活性なアルファ１−アンチトリプシン遺伝子調節領域、骨髄系細胞において活性なベータグロビン遺伝子調節領域、脳内のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質調節領域、骨格筋において活性なミオシン軽鎖２遺伝子調節領域、及び視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域において用いられてきたプロモーター；ピルビン酸キナーゼプロモーター、ビリンプロモータ−、脂肪酸結合腸タンパク質のプロモーター、平滑筋細胞ベータアクチンのプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。加えて、これらの発現配列を、エンハンサー又は制御配列などの付加により修飾することができる。
【０１３７】
[000160]  発現カセットに使用することができる他の型のプロモーターとしては、限定ではないが、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、光制御プロモーター、発達段階特異的プロモーター（developmental-specific promoters）などを挙げることができる。
【０１３８】
[000161]  本発明に従って有用であり得る組織特異的プロモーターの例として、唾液腺特異的プロモーター、例えば、耳下腺分泌タンパク質（PSP）プロモーター、プロリンリッチタンパク質（PRP）プロモーター、及び唾液アミラーゼプロモーターがカナダ特許第ＣＡ２３６９６７２Ｃに記載されている。表皮発現のためのケラチンプロモーターなどの皮膚特異的プロモーターも記載されている（Blessingら、Genes. Devel.、7、204-15（1993）；Blessingら、J. Cell. Biol.、135, 227-39（1993）；及びByrneら、Mol., Cell. Biol.、13, 3176-90（1993）を参照されたい）。他の皮膚特異的プロモーターとしては、Ｅ−カドヘリン、エラスチン又はアルファ−１コラーゲンプロモーターが挙げられる。当技術分野において公知のこれらの及び他の組織特異的プロモーターは、Ｆｅｌ  ｄ１発現の組織特異的欠失に有用であり得る。
【０１３９】
[000162]  誘導性プロモーターは、プロモーターを活性化するために存在するリガンドのレベルに依存する遺伝子発現のレベルを活性化する。誘導性プロモーターの例は当技術分野において公知であり、テトラサイクリンにより活性化されるもの（TET-ON）、ラパマイシン若しくはその誘導体により活性化されるもの、或いは様々なステロイドリガンド（例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド若しくはエクジソン）又はそれらの類似体若しくは模倣物により活性化されるものを含む。市販されている誘導性プロモーターシステムとしては、Ｔｅｔリプレッサーへのテトラサイクリンの結合及び目的の遺伝子の発現を調節するプロモーターの抑制解除に基づく哺乳動物発現系であるＴ−ＲＥｘ（商標）システム（ThermoFisher Scientific、Waltham、MA）、並びにＴｅｔ−Ｏｎ  ３Ｇテトラサイクリン誘導性遺伝子発現システム（Clontech Laboratories, Inc.、Mountain View、CA）が挙げられる。
【０１４０】
[000163]  図６Ａは、ガイドＲＮＡの発現のためのカスタムｃｒＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドのクローニングに有用な組換えベクターを示す。このベクターは、（５’から３’に）プロモーター、クローニング部位、及びガイドＲＮＡのｔｒａｃｒ／足場部分をコードするポリヌクレオチドを含む。例えば、配列番号１〜１２２５に記載の１２２５のポリヌクレオチドのいずれかを２０ｍｅｒとして合成し、クローニング部位内の制限酵素部位とマッチする塩基を隣接させ、ベクターにクローニングすることができる。図６Ｂは、配列番号１〜１２２５に記載の配列のうちの１つから選択した配列を有するオリゴヌクレオチドをベクターにクローニングして発現カセットを完成させた、図６Ａのベクターを示す。
【０１４１】
[000164]  図７は、図５Ｂの発現カセットを有するベクターを示す。
[000165]  加えて、多重遺伝子標的化のために複数の発現カセットを含有するベクターが可能である。例えば、図８Ａは、２つのガイドＲＮＡを発現することができるベクターを示し、その一方で、図８Ｂは、８つまでのガイドＲＮＡを発現することができるベクターを示す。加えて、ガイドＲＮＡとＣａｓ９とをコードする発現カセットを別々のベクター又は同じベクターに備えさせることができる。例えば、図９Ａは、単一のガイドＲＮＡとＣａｓ９とを発現することができるベクターを示し、その一方で、図９Ｂは、ガイドＲＮＡのペアとＣａｓ９とを発現することができるベクターを示す。
【０１４２】
[000166]  加えて、多数の公的に入手可能なベクターを、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９発現の１つ又は２つのベクターシステムに使用することができる。市販のＣａｓ９ベクターの例としては、ｐＳｐＣａｓ９  ＢＢ−２Ａ−ＧＦＰ（PX458）、ｐＬｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲ  ｖ２、ｐＬｅｎｔｉＧｕｉｄｅ−Ｐｕｒｏ、ｐＧＳ−ｇＲＮＡ  ｐＧＳ−ｇＲＮＡ−Ｎｅｏ、ｐＡＡＶ  ＳｐＣａｓ９アクセプター（PX552）（GenScript、Piscataway、NJ）が挙げられる。Ａｄｄｇｅｎｅなどの非営利プラスミドリポジトリは、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９を発現することができるベクターのもう１つの源である。
【０１４３】
[000167]  実施例：ガイドＲＮＡ配列の試験
[000168]  ガイドＲＮＡ配列を、常例的方法によって細胞培養での試験の前に活性について試験してもよい。例えば、一部の実施形態では、目的のガイドＲＮＡ配列を、先ず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により合成する。次に、個々のガイドＲＮＡ配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験してそれらの効力を判定する。例えば、一実施形態では、標的配列を合成し、ＰＣＲにより増幅して鋳型を作出することができる。好ましい実施形態では、本発明の方法の実行の際に使用されることになる特定の猫細胞株のゲノムＤＮＡ標的配列をＰＣＲにより直接増幅して、鋳型を作出する。これにより、確実に、結果は目的の細胞株において起こることの典型となる。次いで、鋳型を目的のガイドＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼと併用することがある。その場合、アガロースゲル電気泳動を使用して、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが鋳型を切断する効率を測定することができる。そのような試験は、市販のキット（In Vitro Transcription and Screening Kits for sgRNA、Clontech Laboratories Inc、Mountain View、CA）から入手可能である。
【０１４４】
[000169]  或いは又は加えて、ガイドＲＮＡ配列を細胞培養で試験する。ガイドＲＮＡを、発現カセットを含有するＰＣＲアンプリコンとして又はガイドＲＮＡ発現プラスミドとして、細胞に送達することができる。ＰＣＲ及びプラスミドに基づく送達方法に加えて、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡをそれぞれｍＲＮＡ及びＲＮＡとして細胞に導入することができる。或いは、従来のリポフェクション試薬を使用して、培養細胞にＣａｓ９タンパク質及び合成ガイドＲＮＡオリゴヌクレオチドをトランスフェクトすることができる。これは、一般に、１）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡオリゴを二重にし、Ｃａｓ９タンパク質と混合することによる、リボヌクレアーゼタンパク質複合体（RNP）の構築、２）トランスフェクション試薬による培養細胞中のＲＮＰ複合体のリバーストランスフェクションを含む。
[000170]  例えば、一実施形態では、ガイド配列のペアをコードする２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを市販のＣａｓ９ベクター（オールインワンベクター）内に合成し、ネコ細胞株へのトランスフェクション用に調製してもよい。或いは、ガイド配列のペア及びＣａｓ９を別々のベクター（２ベクターシステム）にクローニングしてもよい。以下は、細胞培養でガイドＲＮＡ配列を試験するための例示的プロトコールである。
【０１４５】
[000171]  １０％の最終濃度になるようにウシ胎仔血清を補充したイーグル最小必須培地においてネコ宿主細胞を培養する。培養物を３７℃でインキュベートし、細胞濃度が細胞６〜７×１０４個／ｃｍ２の間になったら継代培養する。その後、細胞をトランスフェクションの前日に細胞培養プレートに細胞４〜６×１０４個／ｃｍ２で播種する。
【０１４６】
[000172]  標準的な方法を使用して、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９をネコ宿主細胞に導入する。ガイドＲＮＡとＣａｓ９とをコードするＤＮＡを含有するベクターを、当技術分野において公知の方法、例えば、トランスフェクション、電気泳動、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、又はＤＮＡベクター輸送体により、所望の宿主細胞に導入することができる。トランスフェクションの２〜３日後、細胞プールをサンガーシークエンシング、ＮＧＳ（次世代シークエンシング）及び／又はサーベイヤーアッセイにより直接分析することができる。標的領域のサンガーシークエンシングは、小さい挿入又は欠失（インデル）変異が導入された場合、二本鎖切断（DSB）の近接領域において重複ピークを検出することができる。サーベイヤーアッセイ（又はT7E1アッセイ）は、標的化された遺伝子座におけるインデル変異を検出するためにミスマッチ特異的ＤＮＡエンドヌクレアーゼの酵素を使用する。ミスマッチヘテロ二重鎖の二本鎖ＤＮＡを標的とし、消化することにより、このアッセイは、分析領域上のミスマッチ部位の数に依存して、２つ以上のより小さい断片を生じさせる。
【０１４７】
[000173]  トランスフェクトされた細胞がＣａｓ９発現プラスミド上に存在する場合、抗生物質耐性又はＧＦＰレポーターを使用してそれらの細胞を検出することができる。トランスフェクトされた細胞（選択を伴う又は伴わない）を、クローニングのために９６ウェルプレートに細胞１個／ウェルの密度でプレーティングすることができる。１０ｃｍプレート上の希釈された宿主細胞株を使用してこの手順を行ってコロニーを形成することもでき、将来の使用のためにこれらのコロニーを採取し、２４ウェルプレートに移すことができる。
【０１４８】
[000174]  クローンの発現後、各クローン中の細胞をサンガーシークエンシングにより分析して、標的領域に変異を有するクローンを同定することができる。シークエンシングトレースファイルは、二本鎖切断が小さいインデルの導入により修復された領域に重複ピークを示すことになる。
【０１４９】
[000175]  或いは、特異的抗体が入手可能である場合にはウェスタンブロットにより、又はＥＬＩＳＡ若しくは他のイムノアッセイによって、ノックアウト細胞株を確認することができる。
【０１５０】
[000176]  加えて、ガイドＲＮＡの効力を評定するハイスループットスクリーニングアッセイを開発することができる。簡単に言うと、ネコ細胞を９６ウェル又は３８４ウェルプレートで培養することができる。次いで、ｓｇＲＮＡベクターのライブラリーを使用して細胞にトランスフェクトすることができる（１ウェル当たりsgRNA配列２つ）。トランスフェクション後、内部Ｆｅｌ  ｄ１配列の増幅に基づくＰＣＲ用に細胞を調製して各ベクター設計の効力を確認することができ、この場合、ノックアウト成功は増幅の欠如をもたらし、また逆も同様である。或いは、又は加えて、Ｆｅｌ  ｄ１を発現する細胞株をアッセイに使用することができ、放射免疫アッセイ（RIA）又はＥＬＩＳＡなどの免疫学に基づくアッセイを使用してＦｅｌ  ｄ１タンパク質について細胞培地をアッセイすることができる。
【０１５１】
[000177]  トランスジェニック猫の作出
[000178]  Ｆｅｌ  ｄ１のＣａｓ９媒介ノックアウトについてのガイドＲＮＡの効力を確認したら、そのようなガイドＲＮＡをＣａｓ９と共に使用してトランスジェニック猫を作出することができる。遺伝子標的化及び動物クローニングのための一般手順を利用することができる（Denning C、及びPriddle, H、New frontiers in gene targeting and cloning: success, application and challenges in domestic animals and human embryonic stem cells、Reproduction（2003）126、1-11；並びにWang, B、及びZhou, J、Specific genetic modifications of domestic animals by gene targeting and animal cloning、Reproductive Biology and Endocrinology（2003）、1:103を参照されたい）。以下の実施例は、Ｆｅｌ  ｄ１ノックアウト猫を作出するための３つの異なる方法論を説明するものである。
【０１５２】
[000179]  実施例：核移植による遺伝子改変Ｆｅｌ  ｄ１ノックアウト猫のクローニング
[000180]  以下の実施例は、Ｓｈｉｎら、Ａ  ｃａｔ  ｃｌｏｎｅｄ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：Ｔｈｉｓ  ｋｉｔｔｅｎ’ｓ  ｃｏａｔ−ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｉｓ  ｎｏｔ  ａ  ｃａｒｂｏｎ  ｃｏｐｙ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｇｅｎｏｍｅ  ｄｏｎｏｒ’ｓ、Ｎａｔｕｒｅ、４１５巻（２００２）、８５９及びＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから適応させたものである。
【０１５３】
[000181]  卵母細胞回収及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの卵母細胞成熟
[000182]  地方獣医診療所での常例的な卵巣子宮摘出術から、６月齢より高齢の雌猫からの生殖器官を収集する。卵巣を生殖器官から除去し、ＴＬ−Ｈｅｐｅｓですすぎ、次いで、手術用メスの刃で刻んで未成熟卵子を放出させる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成熟のために、次いで、０．３６ｍＭ  ピルビン酸塩と、２．０ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、２．２８ｍＭ  乳酸カルシウムと、１．１３ｍＭ  システインと、１０，０００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ、１０，０００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（P/S）、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、１ＩＵ／ｍｌのｈＣＧ、０．５ＩＵ／ｍｌのｅＣＧ及び３ｍｇ／ｍｌの脂肪酸不含ＢＳＡ（IVM培地）を含有する溶液１％とを補充したアール塩を含有するＴＣＭ  １９９において、２４〜３０時間、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、及び９０％Ｎ２ガス並びに加湿空気雰囲気下、３８℃で、猫の卵子を培養する。
【０１５４】
[000183]  除核
[000184]  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成熟後、０．１％ヒアルロニダーゼを補充したＨｅｐｅｓ緩衝ＴＣＭ  １９９中での３分間の穏やかなピペッティングにより、卵丘細胞を卵子から除去する。卵丘細胞の除去後、３ｍｇ／ｍｌの脂肪酸不含ＢＳＡと、１５．０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢと５μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２とを補充したＨｅｐｅｓ緩衝ＴＣＭ  １９９が入っているペトリ皿に卵母細胞を配置し、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡で見ながら、Ｎａｒｓｈｉｇｅマイクロマニピュレーターに搭載されている斜角加工された硝子ピペットを使用して除核する。除核をＵＶ線下での観察により確認する。
【０１５５】
[000185]  細胞培養及びドナー細胞の調製
[000186]  ドナー猫から皮膚細胞又は成熟線維芽細胞を単離し、１０％ＦＢＳを補充した適切な哺乳動物細胞培養培地において２〜５日間、３７℃で、５％ＣＯ２及び空気の雰囲気で培養する。次いで、Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡのペア（鎖２の５’隣接領域を標的とするように設計されたガイドＲＮＡ、及び鎖１の３’隣接領域を標的とするように設計されたガイドＲＮＡ）とをコードする発現カセットを含むベクターを細胞にトランスフェクトする。ｓｇＲＮＡ標的配列は、例えば、配列番号１〜１２２５に記載のものから選択する。細胞の一部分でシークエンシングアッセイ又はＦｅｌ  ｄ１発現についてのアッセイを行って、Ｆｅｌ  ｄ１又はその一部分のノックアウトを確認する。細胞を複数回継代させて、収集し、凍結させ、液体窒素中で保管する。核移植の３〜５日前に、細胞株を解凍し、４ウェル皿（Nunc、Denmark）において１０％ＦＣＳ＋１％Ｐ／Ｓを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２中、３７℃で、５％ＣＯ２及び空気の雰囲気で維持する。
【０１５６】
[000187]  核移植、電気融合及び卵母細胞活性化
[000188]  核移植のために、改変Ｆｅｌ  ｄ１ノックアウトドナー細胞をインキュベーターから取り出し、１％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を使用してトリプシン処理し、０．３％ＢＳＡを含有するＣａ２＋、Ｍｇ２＋不含のＤ−ＰＢＳが入っているペトリ皿の中に配置する。次いで、マイクロマニピュレーションを使用して単一核ドナー細胞を除核卵子の囲卵腔内に配置する。
【０１５７】
[000189]  電気融合のために、０．１ｍＭ  Ｍｇ２＋を含有する０．３Ｍ  マンニトール溶液中で卵子／細胞カプレットを平衡させ、次いで、同じ培地が入っている電気融合チャンバに移す。ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ２００（BTX、San Diego、CA）により送られる２回の３．０ｋＶ／ｃｍ、２５マイクロ秒ＤＣパルスの印加により、細胞融合を誘導する。次いで、カプレットを融合チャンバから取り出し、洗浄し、０．３％ＢＳＡ及び５．０μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを補充したＴＣＭ  １９９中、３８℃で、５％ＣＯ２及び空気の雰囲気でインキュベートする。電気融合の２時間後、融合したカプレットをインキュベーターから取り出し、０．１ｍＭ  Ｃａ２＋と０．１ｍＭ  Ｍｇ２＋とを含有する０．３ｍＭ  マンニトール中で平衡させ、次いで、同じ培地が入っている融合チャンバ内に配置し、５秒間隔での２回の１．０ｋＶ／ｃｍ、５０マイクロ秒パルスの印加により電気パルス処理する。次いで、融合チャンバから卵子を取り出し、洗浄し、０．３％ＢＳＡと１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドと５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢとを補充したＴＣＭ  １９９中で６〜７時間、加湿空気中の５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２ガス混合物の中で、３８℃で、インキュベートする。次いで、０．３６ｍＭ  ピルビン酸塩と１．０ｍＭ  Ｌ−グルタミンと、２．２８ｍＭ  乳酸カルシウムと、１％非必須アミノ酸（NEAA）と、３ｍｇ／ｍｌの脂肪酸不含ＢＳＡ（IVC 1培地）とを補充した変性タイロード液中で１〜３日間、クローン胚を培養する。
【０１５８】
[000190]  レシピエント雌の同期化及び胚移植
[000191]  クローン胚をレシピエント雌猫の卵管に外科的に移植する。上で説明したのと同じホルモン注射レジメンを使用して、レシピエント雌猫の発情同期化を果たす。胚移植後、経腹壁超音波検査を用いて、妊娠についてモニターする。
【０１５９】
[000192]  クローン仔猫を６月齢まで育てる。唾液試料をＥＬＩＳＡアッセイに従ってＦｅｌ  ｄ１の産生について試験する。加えて、仔猫を麻酔し、唾液腺の生検試料を採取する。唾液腺外植片を、器官培養皿内の濾紙上の１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で増殖させる。外植片を、上記のゲノムＤＮＡ抽出、並びにＰＣＲ及び配列分析に付す。唾液試料のＥＬＩＳＡ試験は、対照と比較して検出可能なＦｅｌ  ｄ１がないことを示し、ＰＣＲ及びシークエンシング分析は、鎖１及び鎖２  Ｆｅｌ  ｄ１ゲノムＤＮＡの完全な破壊を確認する。
【０１６０】
[000193]  Ｆｅｌ  ｄ１アレルゲンについてのＥＬＩＳＡ試験に関して、アレルゲンレベルを唾液１マイクロリットル当たりのアレルゲンのミリグラムで報告する。典型的な猫は、唾液中に約４〜１６ｍｃｇ／ｍＬの唾液Ｆｅｌ  ｄ１アレルゲンを有するが、３４ｍｃｇ／ｍＬほどもの高い唾液Ｆｅｌ  ｄ１アレルゲンを有する猫もいる。この極めて低いアレルゲンレベルは、唾液中のアレルゲン０．０８〜１．０ｍｃｇ／ｍＬ、１．０〜１．７５ｍｃｇ／ｍＬのような非常に低いレベル、１．７５〜２．５ｍｃｇ／ｍＬのような低いレベル、２．５〜３．５ｍｃｇ／ｍＬのような中等度に低いレベル、及び３．５〜１６ｍｃｇ／ｍＬの範囲の正常レベルを特徴とするであろう。或いは、又はＥＬＩＳＡ試験に加えて、ウェスタンブロット分析を使用して、唾液又は外植片試料中のＦｅｌ  ｄ１産生の欠如を確認することができる。
【０１６１】
[000194]  実施例：直接配偶子遺伝子修飾による遺伝子改変Ｆｅｌ  ｄ１ノックアウト猫のクローニング
[000195]  以下の実施例は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗｏｎｇｓｒｉｋｅａｏら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ｃａｔ、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．；８（１０）：８５３−８５９（２０１１）から適応させたものである。当業者は、Ｗｏｎｇｓｒｉｋｅａｏの原稿及びＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓに提供されている特定の詳細をこの実施例に補足することができる。
【０１６２】
[000196]  卵巣摘出又は去勢後に廃棄される生殖腺を顕微解剖することにより、動物手順の追加なく雄と雌両方の家猫からの配偶子を得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させたグレードＩ及びＩＩの家猫卵母細胞に濃縮レンチウイルスベクター１００ピコリットルの囲卵腔マイクロインジェクション（PVSMI）に付す。レンチウイルスベクターは、２つのガイドＲＮＡ（鎖２の５’隣接領域を標的とするように設計されたガイドＲＮＡと、鎖１の３’隣接領域を標的とするように設計されたガイドＲＮＡ）及びＣａｓ９のための発現カセットを含む。注入する時間をネコ精子の体外受精（IVF）の１０〜１２時間前又は１０〜１２時間後とする。次いで、卵割した、ＩＶＦ後の卵母細胞から、移植用の胚を培養して選択し、レンチウイルスベクター形質導入の４８〜７２時間後、外科的に露出させた卵管に移植する。移植は、１４／１０時間の昼／夜環境により準備してホルモン同期化した雌猫において行う。レンチウイルスベクター形質導入を基準にして−４日にＰＭＳＧを及び−１日にＨＣＧを雌猫に注射し、精管切除され、無精子が検証された雄猫と、ＨＣＧ注射日から胚移植前日まで自由に交配させて、排卵及び黄体形成を誘導する。自然に排卵しない場合には、手術時に針で卵胞に穴を開ける。移植胚を子宮内で発達させる。仔猫からの皮膚及び唾液腺試料をＦｅｌ  ｄ１タンパク質発現及びゲノム欠失について評定する。結果は、Ｆｅｌ  ｄ１のノックアウト、及びこのアレルゲンの産生の完全欠如を示す。
【０１６３】
[000197]  実施例：胚性幹細胞操作による遺伝子改変Ｆｅｌ  ｄ１ノックアウト猫のクローニング
[000198]  猫の胚性幹細胞を培養し、Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡのペア（鎖２の内部領域を標的とするように設計されたガイドＲＮＡと、鎖１の３’隣接領域を標的とするように設計されたガイドＲＮＡ）をコードする発現カセットを含むベクターをそれらの細胞にトランスフェクトする。培養試料に関してシークエンシング分析を行って、Ｆｅｌ  ｄ１ゲノム配列の全て又は一部分のノックアウトを確認することができる。次いで、胚性幹細胞を胚盤胞に凝集又は注射により移入することができる。次いで、操作した胚を偽妊娠雌レシピエント猫に移植し、成熟させる。結果として生じる子孫は、Ｆｅｌ  ｄ１ノックアウトのためのヘテロ接合体である。次いで、ヘテロ接合体を異種交配させて、Ｆｅｌ  ｄ１ノックアウトのためのホモ接合体を産生する。
【０１６４】
[000199]  胚性幹細胞誘導、培養、操作及び移植のための詳細な手順は当技術分野において公知であり、参照により組み込まれる米国特許出願公開第２００３／０１７７５１２号に記載されている。当業者は、’５１２号特許出願公報に提供されている特定の詳細をこの実施例に補足することができる。
【０１６５】
[000200]  実施例：成体野生型猫の唾液腺の処置
[000201]  ＦＩＶベースのベクターを、Ｃａｓ９と配列番号１〜１２２５に記載のガイドＲＮＡ標的配列のうちの２つを標的とするために選択したガイドＲＮＡのペアとをコードする発現カセットを含むように遺伝子改変する。Ｆｅｌ  ｄ１配列の標的隣接領域（例えば、１つは鎖２の上流、１つは鎖１の下流）を標的とするためのガイドＲＮＡを選択する。全身作用の可能性を最小にするために、発現カセットを唾液腺特異的プロモーター（唾液アミラーゼプロモーター）により駆動する。移入ベクター、パッケージングベクター及びエンベロープベクターの２９３Ｔ細胞へのトランスフェクションにより、ウイルス粒子を産生する。トランスフェクションの４８及び７２時間後に上清を収集する。プールした上清から、超遠心分離機で回転させてウイルス粒子を１００倍濃縮し、ＰＢＳに再懸濁させる。希釈したウイルス上清を用いて感染させた２９３Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析により、ＦＩＶベースのベクターのウイルス力価を決定する。
【０１６６】
[000202]  １２月齢雄家猫に、デクスメデトミジン（０．０２５〜０．０３７５ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ）＋ブトルファノール（０．４〜０．６ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ）＋ケタミン（５〜７．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＭ）の組合せを投与する。延長ポリエチレンチューブを使用して猫の唾液腺に導管経由でカニューレを挿入する。カニューレを挿入した唾液腺にＦＩＶベースのベクターを繰り返し接種する。その後、カニューレを取り外し、猫をこの手順から回復させる。
【０１６７】
[000203]  手順後１週間、２週間及び１カ月の時点で、ウェスタンブロット分析に従ってＦｅｌ  ｄ１の産生について唾液試料を試験する。加えて、猫を再び麻酔し、唾液腺の生検試料を採取する。唾液腺外植片を、器官培養皿内の濾紙上の１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で増殖させる。外植片を、上記のゲノムＤＮＡ抽出、並びにＰＣＲ及びシークエンシング分析に付す。唾液試料のウェスタンブロット分析は、対照と比較してＦｅｌ  ｄ１免疫反応性がないことを示し、ＰＣＲシークエンシング分析又はサーベイヤーアッセイは、鎖１及び鎖２  Ｆｅｌ  ｄ１ゲノムＤＮＡの完全切除を確認する。
【０１６８】
[000204]  実施例：成体野生型猫の皮膚の処置
[000205]  ＦＩＶベースのベクターを、Ｃａｓ９と、Ｆｅｌ  ｄ１配列の内部領域（例えば、１つは鎖１の内部、及び１つは鎖２の内部）を標的とするために選択したガイドＲＮＡのペアとをコードする発現カセットを含むように遺伝子改変する。ガイドＲＮＡ、特に、ｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分は、配列番号１〜１２２５で提供するｓｇＲＮＡ標的配列に基づいて選択することができる。全身作用の可能性を最小にするために、発現カセットを皮膚特異的プロモーター（ケラチンプロモーター）により駆動する。ＦＩＶベースのベクターのウイルス粒子は、前の実施例で説明したように産生する。次いで、３４ゲージ針を使用して３歳の雌の家猫にＦＩＶベースのベクターを皮内注射する。或いは、猫の毛を剃って皮膚を露出させ、前の実施例のＦＩＶベースのベクターを、アルコール（例えば、メタノール）、アルキルメチルスルホキシド（例えば、DMSO）、ピロリドン（例えば、２−ピロリドン）、界面活性剤、尿素、モノラウリン酸グリセロール、モノラウリン酸ポリエチレングリコール、モノラウリン酸グリセロール、リドカイン塩酸塩（docainehydrochloride）、ヒドロコルチゾン、メントール又はサリチル酸メチルなどの透過促進剤を含む製剤で、局所適用する。任意選択により、樹立された方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６９７，６６９号に記載の方法に従って、皮膚に可逆的電気泳動を施してベクターの取り込みを増進させる。
【０１６９】
[000206]  手順後１週間、２週間及び１カ月の時点で、皮膚試料の生検を行い、皮膚試料を前の実施例で説明したようにＦｅｌ  ｄ１発現の分析又はゲノム欠失に付す。結果は、対照と比較してＦｅｌ  ｄ１免疫反応性がないことを示し、標的配列におけるＦｅｌ  ｄ１ゲノムＤＮＡの完全切除を確認する。
【０１７０】
[000207]  実施例：若年野生型猫の全身処置
[000208]  ２２ゲージ針を使用して６月齢の猫の橈側皮静脈にカテーテルを留置する。ＦＩＶベースのベクターを、Ｃａｓ９と配列番号１〜１２２５に記載のガイドＲＮＡ標的配列のうちの２つを標的とするために選択したガイドＲＮＡのペアとをコードする発現カセットを含むように遺伝子改変する。ガイドＲＮＡを、Ｆｅｌ  ｄ１配列の標的隣接領域（例えば、１つは鎖２の上流、１つは鎖１の下流）を標的とするために選択する。ＦＩＶベースのベクターのウイルス粒子を、前に説明したように産生する。Ｃａｓ９のための発現カセットを、任意選択により、発現をそれぞれ皮膚及び唾液腺に限定するケラチン及びアミラーゼのプロモーターによって駆動する。ＦＩＶベースのベクターを連続５日間、１日１回、静脈内投与する。手順後１カ月、３カ月及び６カ月の時点で、皮膚及び唾液腺の試料の生検を行い、それらの試料を前の実施例で説明したようにＦｅｌ  ｄ１発現の分析又はゲノム欠失に付す。結果は、対照と比較してＦｅｌ  ｄ１免疫反応性がないことを示し、鎖１及び鎖２  Ｆｅｌ  ｄ１ゲノムＤＮＡの完全切除を確認する。
【０１７１】
[000209]  実施例：緑色蛍光タンパク質のノックインによるＦｅｌ  ｄ１の不活性化
[000210]  それぞれの側部に緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターが隣接している２つの相同アームを有するプラスミドドナー（４００ｎｇ）を、Ｃａｓ９とガイドＲＮＡとをコードするベクターと共に、猫接合体に導入する。相同アームの各々は、約８００ｂｐである。Ｆｅｌ  ｄ１プロモーター並びに鎖１及び鎖２開始コドンの代わりにＧＦＰレポーターを挿入するように、ｓｇＲＮＡ及びプラスミドドナーを設計する。プラスミドドナーは、ＤＮＡにおける二本鎖切断を塞ぐためのＨＤＲプロセスにおいて鋳型として使用することになる。このようにして、相同アーム間のＧＦＰのコード配列は、切断が修復されるときにプロモーター領域及び開始コドンに取って代わることになる。ＧＦＰ配列のみを発現させるために、終止コドンをプラスミドドナー内のＧＦＰレポーター遺伝子配列の後に含める。接合体へのベクターの注入後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化胚盤胞を培養物に外植して、胚性幹細胞を誘導する。ＰＣＲ遺伝子型判定及びシークエンシングを使用して、正しく標的化された挿入物を担持する胚性幹細胞株を同定する。適切な励起及び発光フィルター設定を使用してマイクロプレート蛍光リーダーによってＧＦＰ発現を確認する。その後、正しく挿入された猫接合体を胚に発達させ、それらの胚をレシピエント雌猫に移植し、満期まで発達させる。生きて生まれてきた仔猫が、ＧＦＰを発現すること、及びまた前の実施例で説明したようにＦｅｌ  ｄ１発現を欠くことを確認する。
【０１７２】
[000211]  実施例：Ｆｅｌ  ｄ１低アレルゲン性の確認
[000212]  確認されたヒトＦｅｌ  ｄ１アレルギー罹患者群に対してアレルギー検査を行って、Ｆｅｌ  ｄ１低アレルゲン性表現型を産生する際のＦｅｌ  ｄ１ノックアウト手順の成功を確認することができる。例えば、猫の毛又は唾液をＦｅｌ  ｄ１ノックアウト猫から採取し、毛又は唾液の抽出物を調製し、皮膚検査手順（皮膚プリック、皮内、又は皮膚パッチ検査）の際に接種物として使用する。結果を、ＧｒｅｅｒのＳｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ  Ｃａｔ  Ｈａｉｒ（GREER（登録商標）、Lenoir、NC）などの皮膚検査診断で指示される、標準化猫毛抽出物と比較することができる。アレルギー反応（例えば、腫脹、発赤、じんま疹、くしゃみ、呼吸困難、喘息、皮膚のかゆみ、鼻水、鼻詰まり、咳嗽、及び／又は眼刺激）がないことで、特定のＦｅｌ  ｄ１ノックアウトが低アレルゲン性表現型をもたらすことを確認することができる。
【０１７３】
[000213]  或いは、又は加えて、確認されたヒトＦｅｌ  ｄ１アレルギー罹患者から血清試料を採取し、当技術分野において公知のＩｇＥ反応性及びアレルゲン活性を測定するｉｎ  ｖｉｔｒｏイムノアッセイを、前述の接種物を検査試料として使用して行ってもよい。例えば、Ｆｅｌ  ｄ１タンパク質のＩｇＥ抗体への結合を阻害するそのような検査試料の能力を、放射性アレルゲン吸着試験（RAST）阻害アッセイによって検査することができる。また、好塩基球除去技術（stripped basophil technique）を使用するヒスタミン放出アッセイにおいてそのような検査試料の活性を評定し、Ｆｅｌ  ｄ１のものと比較することができる（Chapmanら、The European Union CREATE Project: A model for international standardization of allergy diagnostics and vaccines、J Allergy Clin Immunol、122（5）:882-889（2008）を参照されたい）。
【０１７４】
[000214]  様々な特徴を有する特定の実施形態に関して本発明を説明してきた。上で提供した開示にかんがみて、本発明の範囲又は趣旨を逸脱することなく本発明の実施に様々な変更及び変化を加えることができることは、当業者には明らかであろう。例えば、本開示は、実施形態において、イエネコ（家で飼う猫）におけるゲノム修飾を論じているが、本発明は、チーター属（Acinonyx）、カラカル属（Caracal）、アジアゴールデンキャット属（Calopuma）、ネコ属（Felis）、オセロット属（Leopardus）、サーバル属（Leplailurus）、オオヤマネコ属（Lynx）、マヌルネコ属（Olocolobus）、マーブルキャット属（Pardofelis）、ベンガルヤマネコ属（Prionailurus）及びアフリカゴールデンキャット属（Profelis）のＦｅｌ  ｄ１を含む、任意の野生又は飼い慣らされたネコからのＦｅｌ  ｄ１の除去のための組成物及び方法を企図している。加えて、本開示で提供する方法に変更を加えて、他の猫アレルゲンを標的とし、除去することができることは、当業者には認識できるはずである。開示する特徴を、所与の応用又は設計の要件及び明細に基づいて、単独で使用してもよく、任意の組合せで使用してもよく、又は省いてもよいことは、当業者には認識できるであろう。実施形態が、ある特定の特徴を「含むこと」に言及している場合、実施形態が、代替的に、特徴のいずれか１つ又は複数「からなる」又は「から本質的になる」こともあることを理解されたい。本発明の他の実施形態は、本明細書及び本発明の実施を考察することで当業者に明らかになる。
【０１７５】
[000215]  値の範囲が本明細書中で与えられている場合、その範囲の上限と下限の間の各値も具体的に開示されていることに、特に留意される。これらのより小さい範囲の上限及び下限もまた、独立して、その範囲に含まれることもあり、除外されることもある。単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。本質的に例示的なものと見なされる本明細書及び実施例、並びに本発明の本質から逸脱しないその変形形態は、本発明の範囲に入ることが意図されている。さらに、本開示に引用した参考文献の全ては、それらの全体が参照により各々個々に本明細書に組み込まれており、それら自体は、本発明の実施可能な開示を補足する効率的方法を提供すること、並びに当技術分野における通常の技術レベルを詳述する背景を提供することを意図したものである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
2019507610.tif 000021
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019507610.tif 000026
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