(57)【要約】  本発明は黄色ブドウ球菌に活性のある抗微生物剤の分野に関する。特に本発明は、ＬｙｓＫエンドリシンのＣＨＡＰドメインと、リソスタフィンのＭ２３エンドペプチダーゼドメインと、ＡＬＥ−１の細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）と、ならびに、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチドおよびデフェンシンからなる群から選択されるさらなるペプチドと、を含むことを特徴とするポリペプチドに関する。さらに、本発明はそのようなポリペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含むベクター、および対応する宿主細胞、組成物、および装置に関連する。最後に、本発明は、本発明によるポリペプチドの、特に医薬分野での利用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ＬｙｓＫエンドリシンのＣＨＡＰドメイン、または前記ＬｙｓＫエンドリシンのＣＨＡＰドメインと、少なくとも８０％の配列同一性を示す、前記ＬｙｓＫエンドリシンのＣＨＡＰドメインのバリアントと、
ｉｉ）リソスタフィンのＭ２３エンドペプチダーゼドメイン、または前記リソスタフィンのＭ２３エンドペプチダーゼドメインと、少なくとも８０％の配列同一性を示す、前記リソスタフィンのＭ２３エンドペプチダーゼドメインのバリアントと、
ｉｉｉ）ＡＬＥ−１の細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）、または前記ＡＬＥ−１の細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）と、少なくとも９０％の配列同一性を示す、ＡＬＥ−１の細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）のバリアントと、
ｉｖ）抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチド、およびデフェンシンからなる群から選択されるさらなるペプチドと、
を含むポリペプチド。
【請求項２】
ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列、または配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す、配列番号１で示されるアミノ酸配列のバリアント、
ｉｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列、または配列番号３で示されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％の配列同一性を示す、配列番号３で示されるアミノ酸配列のバリアント、および／または、
ｉｉｉ）配列番号５で示されるアミノ酸配列、または配列番号５で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性を示す、配列番号５で示されるアミノ酸配列のバリアント、
が前記ポリペプチドに含まれることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドに、配列番号１、配列番号３、および／または、配列番号５で示されるアミノ酸配列が含まれ、
好ましくは、前記ポリペプチドに、配列番号３、および／または配列番号５で示されるアミノ酸配列が含まれ、
より好ましくは、前記ポリペプチドに配列番号５で示されるアミノ酸配列が含まれる、
ことを特徴とする請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列、または配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す、配列番号２で示されるアミノ酸配列のバリアント、
ｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列、または配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す、配列番号４で示されるアミノ酸配列のバリアント、および／または、
ｉｉｉ）配列番号６で示されるアミノ酸配列、または配列番号６で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９０％の配列同一性を示す、配列番号６で示されるアミノ酸配列のバリアント、
が前記ポリペプチドに含まれることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号２のバリアント配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と比較して、Ｋ１６Ｅ、Ｋ２７Ｎ、Ｈ５０Ｑ、Ｔ８５Ａ、Ｇ１５４Ｃ、Ｇ１５４Ｓからなる群から選択される一以上の変異を示し、好ましくは前記バリアント配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも変異Ｋ１６ＥおよびＨ５０Ｑを示し、より好ましくは、前記バリアント配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも変異Ｋ１６Ｅ、Ｋ２７Ｎ、Ｈ５０Ｑ、Ｔ８５Ａ、およびＧ１５４Ｓを示すことを特徴とする、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドに、配列番号２、配列番号４および配列番号６からなる群から選択される一以上の配列が含まれ、好ましくは、前記ポリペプチドに、配列番号４、および／または、配列番号６で示されるアミノ酸配列が含まれ、さらにより好ましくは、前記ポリペプチドに、配列番号６で示されるアミノ酸配列が含まれる、ことを特徴とする請求項１〜５何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドに配列番号２、配列番号４および配列番号６で示されるアミノ酸配列が含まれ、好ましくは、前記ポリペプチドに、配列番号８または配列番号９で示されるアミノ酸配列が含まれ、好ましくは、前記ポリペプチドに配列番号９で示されるアミノ酸配列が含まれる、ことを特徴とする請求項１〜６の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
各エレメントまたはそのバリアントの順序が、Ｎ末端からＣ末端にかけて：
ａ）ＣＨＡＰドメイン／Ｍ２３エンドペプチダーゼ／ＡＬＥ−１のＣＢＤ／ペプチド、または、
ｂ）ペプチド／ＣＨＡＰドメイン／Ｍ２３エンドペプチダーゼ／ＡＬＥ−１のＣＢＤ、
であることを特徴とする請求項１〜７の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドにタグ、好ましくはＨｉｓ６タグが含まれることを特徴とする請求項１〜８の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記さらなるペプチドが、
ｉ）配列番号４０〜９４からなる群から選択される抗微生物ペプチド、
ｉｉ）配列番号９８、配列番号９９および配列番号１００からなる群から選択される両親媒性ペプチド、
ｉｉｉ）配列番号１１〜３９からなる群から選択されるカチオン性ペプチド、
ｉｖ）配列番号９５に記載のスシペプチド、または、
ｉｉｉ）配列番号９６および配列番号９７からなる群から選択される疎水性ペプチド、
であることを特徴とする請求項１〜９の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記さらなるペプチドが、配列番号３８および配列番号９４からなる群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドに、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９および配列番号１１１からなる群から選択される配列と、これら４つの配列のうち何れかと少なくとも９０％の同一性を有するバリアント配列と、が含まれることを特徴とする請求項１〜１１の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドの長さが５００アミノ酸長を超えないことを特徴とする請求項１〜１２の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが黄色ブドウ球菌の細胞壁を分解できることを特徴とする請求項１〜１３の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号１のバリアント配列を含むポリペプチドであって、
前記バリアント配列が、配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、また
前記バリアント配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列と比較して、変異Ｈ８Ｎおよび／またはＴ４３Ａを示すことを特徴とするポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号２のバリアント配列を含むポリペプチドであって、
前記バリアント配列が、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、また
前記バリアント配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と比較して、変異Ｋ１６Ｅ、Ｋ２７Ｎ、Ｈ５０Ｑ、Ｔ８５Ａ、Ｇ１５４Ｃ、Ｇ１５４Ｓからなる群から選択される一以上の変異を示すことを特徴とするポリペプチド。
【請求項１７】
前記バリアント配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも変異Ｋ１６ＥおよびＨ５０Ｑを示すことを特徴とする請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記バリアント配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも変異Ｋ１６Ｅ、Ｋ２７Ｎ、Ｈ５０Ｑ、Ｔ８５Ａ、およびＧ１５４Ｓを示すことを特徴とする請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドに、ペプチドグリカンヒドロラーゼの少なくとも１つの触媒ドメインの配列がさらに含まれ、および／または、前記ポリペプチドが抗菌活性、特に黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を示していることを特徴とする請求項１６〜１８の何れか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記バリアント配列が、配列番号１０９または配列番号１１１で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の配列同一性を示し、
好ましくは配列番号１０９または配列番号１１１で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示すことを特徴とする請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドに配列番号１０８または配列番号１１０で示される配列が含まれていることを特徴とする請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１〜２１の何れか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２４】
請求項１〜２１の何れか一項に記載のポリペプチド、
請求項２２に記載の核酸、または
請求項２３に記載のベクター、
を含む宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１〜２１の何れか一項に記載のポリペプチド、
請求項２２に記載の核酸、
請求項２３に記載のベクター、および／または、
請求項２４に記載の宿主細胞を含み、
またキャリア、希釈剤、または賦形剤をさらに含むことを特徴とする組成物。
【請求項２６】
前記キャリア、希釈剤、または賦形剤が薬学的に許容可能であることを特徴とする請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が水溶液（好ましくは緩衝溶液または生理溶液）、粉末状、坐薬、エマルション、懸濁液、ゲル、ローション、クリーム、軟膏、塗り薬、注射剤、シロップ、スプレー、吸入剤、被覆組成物、好ましくはインプラント被覆組成物、ステント被覆組成物、もしくはカテーテル被覆組成物、または、生体材料、好ましくは骨セメントであることを特徴とする請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１〜２１の何れか一項に記載のポリペプチド、
請求項２２に記載の核酸、
請求項２３に記載のベクター、
請求項２４に記載の宿主細胞、および／または、
請求項２５〜２７の何れか一項に記載の組成物、
を含むことを特徴とするデバイス。
【請求項２９】
前記デバイスが医療デバイスであって、特に前記デバイスがインプラント、ステント、カテーテル、絆創膏、圧定布、または包帯であることを特徴とする請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３０】
人体もしくは動物体を手術もしくは治療により手当する方法で、または人体もしくは動物体に施される診断方法で使用されることを特徴とする、請求項１〜２１の何れか一項に記載のポリペプチド、請求項２２に記載の核酸、請求項２３に記載のベクター、請求項２４に記載の宿主細胞、および／または、請求項２５〜２７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
対象物の細菌感染症の治療または防止、特に黄色ブドウ球菌による細菌感染症の治療または防止に使用されることを特徴とする、請求項３０に記載の使用用途に用いられるポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、または組成物。
【請求項３２】
対象物の創傷の治療、特に医原性などの急性創傷、または慢性創傷の治療に使用されるか、または皮膚炎もしくは耳炎の治療に使用されることを特徴とする、請求項３０に記載の使用用途に用いられるポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、または組成物。
【請求項３３】
無生物の表面、組成物、および／または、物体を、特に院内環境または診療所で、消毒するための、請求項１〜２１の何れか一項に記載のポリペプチド、請求項２２に記載の核酸、請求項２３に記載のベクター、請求項２４に記載の宿主細胞、および／または、請求項２５〜２７の何れか一項に記載の組成物、の使用。
【請求項３４】
無生物の表面、組成物、および／または、物体の、細菌による汚染、特に黄色ブドウ球菌による汚染を防止するための、請求項１〜２１の何れか一項に記載のポリペプチド、請求項２２に記載の核酸、請求項２３に記載のベクター、請求項２４に記載の宿主細胞、および／または、請求項２５〜２７の何れか一項に記載の組成物、の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は黄色ブドウ球菌に活性のある抗微生物剤の分野に関する。特に、本発明は、ＬｙｓＫエンドリシンのＣＨＡＰドメインと、リソスタフィンのＭ２３エンドペプチダーゼドメインと、ＡＬＥ−１の細胞壁結合ドメインと、抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチド、またはデフェンシンから選択されるさらなるペプチドと、を含むことを特徴とするポリペプチドに関する。さらに、本発明は、そのようなポリペプチドをコードする核酸、そのような核酸を含むベクター、ならびに対応する宿主細胞、組成物、および装置に関連する。最後に、本発明は、本発明によるポリペプチドの、特に医薬分野での利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌性病原体は人間の健康に深刻な脅威を与える。殺菌活性または静菌活性を有する様々な種類の薬剤（抗生物質、など）が当技術分野で知られているが、これらに対する微生物耐性、特に抗生物質に対する微生物耐性は確実に高まっている。健康上の懸念を表す病原体の１つに黄色ブドウ球菌がある。黄色ブドウ球菌は、菌血症、感染性心内膜炎に加えて、骨関節感染症の最もありふれた原因の１つである。さらに黄色ブドウ球菌は、皮膚・軟部組織感染症に加えて、食中毒を引き起こす可能性がある。黄色ブドウ球菌は、抗生物質に対する耐性を急速に発現し、これは多剤耐性（multi-drug resistant; MDR）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant staphylococcusaureus;MRSA）、およびバンコマイシン（バンコマイシン中間株）に対する低感受性として説明される。耐性化が高まるにつれ従来の抗生物質の有用性が低くなるため、特に院内環境（病院内の環境）における黄色ブドウ球菌の細菌数をコントロールする新規抗微生物剤に一定の需要がある。黄色ブドウ球菌に高い活性のある薬剤にリソスタフィンがある。リソスタフィンは黄色ブドウ球菌の細胞壁ペプチドグリカンを分解することのできるペプチドグリカンヒドロラーゼである。これはスタフィロコッカス・シミュランス次亜種スタフィロリチカス（staphylolyticus）により産生される。リソスタフィンは、Ｎ末端触媒Ｍ２３エンドペプチダーゼドメインと、Ｃ末端細胞壁結合ドメイン（cell wall binding domain; CBD）の、２つのドメインを示す。しかし、黄色ブドウ球菌はまた、リソスタフィンに対して急速に耐性を発現する。近年、ベッカー（Becker）ら（Sci Rep. 2016 Apr 28;6:25063;本明細書に参照として組み込まれる）は、リソスタフィンとＬｙｓＫエンドリシンの抗菌作用が組み合わされた、融合タンパク質の作製について報告している。得られた融合タンパク質は、耐性株の発現率を大きく低下させた。
【０００３】
しかし、黄色ブドウ球菌に対し活性のある新規な抗菌剤になおも一定の需要が存在する。好ましくは、上記の薬剤は耐性株発現の発現率を低下させながら、同時に最小発育阻止濃度（MIC; minimum inhibitory concentration）に反映される高い抗菌作用を示す。本発明により解決される課題はしたがって、耐性株発現の発現率を低下させつつも、同時に高い抗菌作用を示す、黄色ブドウ球菌に対する新規抗菌剤を提供することにある。
【発明の概要】
【０００４】
本目的は、下記の特許請求の範囲に規定される主題により解決される。
【０００５】
本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語は、特に、特定の配列においてペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基からなるポリマーを指す。ポリペプチドのアミノ酸残基は、例えば、炭水化物およびリン酸などの種々の基の共有結合性付加によって修飾されてもよい。ヘムまたは脂質など、他の物質がより緩やかにポリペプチドと会合してもよく、本明細書において使用される「ポリペプチド」という用語にまた含まれる複合ポリペプチドを生じさせる。本明細書に用いられる当該用語にはタンパク質も含まれる。したがって、「ポリペプチド」の用語は、例えば２以上のアミノ酸ポリマー鎖からなる錯体も含まれている。「ポリペプチド」との用語には、当技術分野で通常用いられる任意選択的な修飾、例えば、ビオチン化、アセチル化、ＰＥＧ化、または、アミノ基、ＳＨ基、またはカルボキシル基（保護基など）、等の化学変化を示す、ポリペプチドに係る実施形態も含まれている。以下の詳細な説明から明らかになるように、本発明に係るポリペプチドは、非天然由来のポリペプチドである。本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、特定の長さを有するアミノ酸ポリマー鎖に限定されないが、通常は、ポリペプチドは、約２５０以上のアミノ酸からなる長さを示す。必ずではないが、通常は、本発明の典型的なポリペプチドは、アミノ酸の長さが約７５０を超えず、好ましくはアミノ酸の長さが約４５０を超えない。
【０００６】
本明細書で用いられる「バリアント配列」との用語は、それぞれの参照配列と比較して、一以上の付加、欠失、挿入、および／または、置換、およびこれらの組み合わせを示すアミノ酸配列のことを指す。これには、例えば、欠失／挿入、挿入／欠失、欠失／付加、付加／欠失、挿入／付加、付加／挿入、等の組み合わせが含まれる。当業者であれば、参照配列のそれぞれ同じ位置に存在するアミノ酸残基とは異なる、バリアント配列の特定の位置におけるアミノ酸残基の存在は、同じ位置における欠失とそれに続く挿入からなる組み合わせなどではなく、本明細書で定められた置換であることを理解するであろう。むしろ、付加、欠失、および置換からなる一以上の組み合わせについて言及される場合には、配列中の異なる位置における変化の組み合わせを意図しており、例えば、Ｎ末端部での付加および配列内での欠失について意図している。このようにして得られた配列は各参照配列、例えばある所定の配列番号と、一定レベルの配列同一性を示し、これは好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。好ましいバリアント配列は親分子のフラグメントであって、例えば親分子の活性を保持し、つまり一般的なレベルでそれぞれの親分子と同じ活性を示している所定の配列番号である。しかし、上記の活性は、それぞれの親分子と同じとするか、親分子より高くするか、または低くすることができる。また親配列内での保存的アミノ酸置換から生じるバリアント配列もまた好ましく、例えば、所定の配列番号に対し、一般的なレベルで親分子の活性を保持しているバリアント配列などである。
【０００７】
本明細書において、「〜％の配列同一性」とは以下の通りに理解される。つまり、比較される２つの配列を並べて、配列同士に最大の相関関係が得られるようにする。これには一方または両方の配列に「ギャップ」を挿入することで、アライメントの大きさを高めることが含まれる場合がある。配列同一性％はその後、比較される配列の各々の全長にわたって決定（グローバルアラインメントと呼ばれる）してもよく、これは同じ又は類似する長さの配列に対して特に好適であり、あるいは短い所定の長さにわたって決定（ローカルアラインメントと呼ばれる）することができて、これは長さが異なる配列に対してより好適である。この意味で、クエリーアミノ酸配列に対して例えば少なくとも９５％の「配列同一性」を有するアミノ酸配列は、クエリーアミノ酸配列に含まれる１００個のアミノ酸に対して、対象となるアミノ酸配列に最大で５回のアミノ酸改変が含まれていることを除いて、対象となるアミノ酸配列の配列がクエリー配列と同一であることを意図している。言い換えると、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を持つアミノ酸配列を得るためには、対象となる配列に最大で５％（１００のうち５）のアミノ酸残基を挿入するか、他のアミノ酸で置換するか、または欠失させることができる。２以上の配列の同一性および相同性を比較する方法は、当技術分野で周知の通りである。２つの配列の同一性の割合は、数学的アルゴリズムなどを利用することで判断可能である。限定されわけではないが、利用可能な好ましい数学的アルゴリズムの例としては、カーリン（Kerlin）らのアルゴリズム（（1993),PNASUSA,90:5873-5877）がある。このようなアルゴリズムはＢＬＡＳＴファミリーのプログラム、例えばＢＬＡＳＴまたはＮＢＬＡＳＴのプログラムに組み込まれており（Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 or Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402を参照のこと）、ＮＣＢＬのホームページ（ワールド・ワイド・ウェブサイト「ncbi.nlm.nih.gov」）からアクセス可能であって、またＦＡＳＴＡ（（Pearson (1990), Methods Enzymol. 83, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448.）にも組み込まれている。他の配列に対してある程度の同一性を有する配列は、これらのプログラムを用いて同定することができる。さらに、ウィスコンシン配列分析パッケージ（Wisconsin Sequence Analysis Package）のバージョン９．１で利用可能なプログラム（Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Res., 387-395）、例えばＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰのプログラムを利用することで２つのポリペプチド配列の同一性％を判断することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは（SmithおよびWaterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197）の「局所ホモロジー」アルゴリズムを利用し、２つの配列の中で最も類似する単一領域を見出す。本明細書において、参照配列と特定の長さの配列同一性を共有するアミノ酸配列について言及される場合、配列における上記の違いは、好ましくは保存的アミノ酸置換から生じるものである。好ましくは、そのような配列は、例えば、たとえより遅い速度であたっとしても、参照配列の活性を保持している。さらに本明細書において一定割合の配列同一性を「少なくとも」共有する配列について言及されている場合には、１００％���配列同一性は、好ましくは含まれない。
【０００８】
本明細書で用いられる「さらなるペプチド」との用語は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列内にあるアミノ酸配列のことを指す。上記配列は、カチオン性ペプチド、カチオン性ポリペプチド、両親媒性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチド、および／または、抗微生物ペプチドからなる配列とすることができる。当該用語は、Ｈｉｓ５−タグ、Ｈｉｓ６−タグ、Ｈｉｓ７−タグ、Ｈｉｓ８−タグ、Ｈｉｓ９−タグ、Ｈｉｓ１０−タグ、Ｈｉｓ１１−タグ、Ｈｉｓ１２−タグ、Ｈｉｓ１６−タグ、およびＨｉｓ２０−タグなどのＨｉｓ−タグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ａｖｉ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、Ｇｓｔ−タグ、ＪＳ−タグ、システイン−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、もしくは当技術分野において公知である他のタグ、チオレドキシン、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のような慣習的なタグを指さない。好ましくは、前記さらなるペプチドの配列は、少なくとも約３から最大で約５０までのアミノ酸残基の長さ、好ましくは最大で約３９までのアミノ酸残基の長さを有する。さらなるペプチド配列そのものがつぎの酵素：エンドペプチダーゼ、キチナーゼ、Ｔ４様ムラミニダーゼ、λ様ムラミニダーゼ、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニン−アミダーゼ（アミダーゼ）、ムラモイル−Ｌ−アラニン−アミダーゼ、ムラミダーゼ、溶解性トランスグリコシラーゼ（Ｃ）、溶解性トランスグリコシラーゼ（Ｍ）、Ｎ−アセチル−ムラミダーゼ（リゾチーム）、Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ、または、トランスグリコシラーゼ、の活性のうち、いずれかを提供することはない。通常は、さらなるペプチド配列は酵素活性を一切提供しない。
【０００９】
本明細書で使用される「カチオン性ペプチド」という用語は、正に荷電したアミノ酸残基を有するペプチドを指す。好ましくは、カチオン性ペプチドは、９．０またはそれより大きいｐＫａ値を有する。通常は、カチオン性ペプチドのアミノ酸残基のうちの少なくとも４個が、正に荷電することができ、例えば、リシンまたはアルギニンであり得る。「正に荷電した」とは、ほぼ生理学的条件で正味の正電荷を有するアミノ酸残基の側鎖を指す。本明細書において使用される「カチオン性ペプチド」という用語はまた、ポリカチオン性ペプチドも指すが、例えば、２０％未満、好ましくは１０％未満の正に荷電したアミノ酸残基を含むカチオン性ペプチドもまた含む。
【００１０】
本明細書において使用される「ポリカチオン性ペプチド」という用語は、大部分が正に荷電したアミノ酸残基、とりわけリシンおよび／またはアルギニン残基で構成されているペプチドを指す。アミノ酸残基の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％が、正に荷電したアミノ酸残基、とりわけリシンおよび／またはアルギニン残基である場合に、ペプチドは、大部分が正に荷電したアミノ酸残基で構成されている。正に荷電したアミノ酸残基ではないアミノ酸残基は、中性の電荷のアミノ酸残基、および／または負に荷電したアミノ酸残基、および／または疎水性アミノ酸残基であり得る。好ましくは、正に荷電したアミノ酸残基ではないアミノ酸残基は、中性の電荷のアミノ酸残基、とりわけセリンおよび／またはグリシンである。
【００１１】
本明細書において使用される「抗微生物ペプチド」（ＡＭＰ）という用語は、例えば、細菌、ウイルス、真菌、酵母、マイコプラズマ、および原生動物に対して殺微生物活性および／または静微生物（ｍｉｃｒｏｂｉｓｔａｔｉｃ）活性を有する、あらゆる天然由来のペプチドを指す。したがって、本明細書において使用される「抗微生物ペプチド」という用語は、とりわけ、抗細菌、抗真菌、抗糸状菌、抗寄生生物、抗原生動物、抗ウイルス、抗感染性、抗伝染性、および／または殺菌、殺藻、殺アメーバ、殺微生物、殺細菌、殺真菌、殺寄生生物、殺原生動物、殺原虫特性を有する任意のペプチドを指す。抗細菌ペプチドが、好ましい。抗微生物ペプチドは、ＲＮアーゼＡスーパーファミリーのメンバー、デフェンシン、カテリシジン、グラニュライシン、ヒスタチン、ソリアシン（ｐｓｏｒｉａｓｉｎ）、ダームシジン、またはヘプシジンであり得る。抗微生物ペプチドは、昆虫、魚、植物、クモ形類動物、脊椎動物、または哺乳動物に天然に存在し得る。好ましくは、抗微生物ペプチドは、昆虫、魚、植物、クモ形類動物、脊椎動物、または哺乳動物に天然に存在し得る。好ましくは、抗微生物ペプチドは、ラディッシュ、カイコガ、コモリグモ、カエル、好ましくはアフリカツメガエル（Xenopus laevis）、アカガエル属のカエル、より好ましくはウシガエル（Rana catesbeiana）、ヒキガエル、好ましくはアジアヒキガエル（Ｂｕｆｏ  ｇａｒｇａｒｉｚａｎｓ）、ハエ、好ましくはショウジョウバエ属（Drosophila）、より好ましくはキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、ネッタイシマカ（Aedes aegypti）、ミツバチ、マルハナバチ（bumblebee）、好ましくはマルハナバチ（Bombus pascuorum）、ニクバエ、好ましくはセンチニクバエ（Sarcophaga peregrine）、サソリ、カブトガニ、ナマズ（catfish）、好ましくはマナマズ（Parasilurus asotus）、雌牛、豚（pig）、ヒツジ、ブタ（porcine）、ウシ、サル、およびヒトに天然に存在し得る。本明細書では、「抗微生物ペプチド」（ＡＭＰ）は、とりわけ、カチオン性ペプチド、ポリカチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、スシペプチド、デフェンシン、および疎水性ペプチドではないが、それにもかかわらず抗微生物活性を示すペプチドであり得る。
【００１２】
本明細書において使用される「スシペプチド」という用語は、短いコンセンサスリピートを有する補体制御タンパク質（ＣＣＰ）を指す。スシペプチドのスシモジュールは、多くの異なるタンパク質においてタンパク質−タンパク質相互作用ドメインとして機能する。スシドメインを含有するペプチドは、抗微生物活性を有することが示されている。好ましくは、スシペプチドは、天然に存在するペプチドである。
【００１３】
本明細書において使用される「デフェンシン」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒト内に存在するペプチドを指し、デフェンシンは、感染性細菌および／または感染性ウイルスおよび／または真菌などの、外来性物質の破壊システムとしての自然宿主防御系において役割を果たす。デフェンシンは、抗体でない殺微生物、および／または、殺腫瘍性のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドである。「デフェンシン」の例は、「哺乳動物デフェンシン」、α−デフェンシン、β−デフェンシン、インドリシジン、およびマガイニンである。本明細書において使用される「デフェンシン」という用語は、動物細胞から単離された形態、または合成的に産生された形態の両方を指し、かつまた、それらの親タンパク質の細胞傷害活性を実質的に保持するが、その配列が１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入または欠失によって変更されている変異体も指す。
【００１４】
本明細書において使用される「両親媒性ペプチド」という用語は、親水性官能基および疎水性官能基の両方を有するペプチドを指す。好ましくは、本明細書において使用される「両親媒性ペプチド」という用語は、親水性基および疎水性基の規定された配置を有するペプチドを指し、例えば、両親媒性ペプチドは、例えばαヘリックス状であってもよく、主にヘリックスの一方の側に沿って非極性側鎖を有し、残りの表面に沿って極性残基を有する。
【００１５】
本明細書において使用される「疎水性基」という用語は、好ましくは、実質的に水に不溶性であるが、油相において可溶性であり、油相における溶解性が水または水相におけるものよりも高い、アミノ酸側鎖などの、化学基を指す。水中において、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基は、互いに相互作用して非水性環境を形成する。疎水性側鎖を有するアミノ酸残基の例は、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、システイン、アラニン、チロシン、およびプロリン残基である。
【００１６】
本明細書において使用される「疎水性ペプチド」という用語は、好ましくは疎水性基を有するアミノ酸残基で大部分が構成されている疎水性ペプチドを指す。そのようなペプチドは、好ましくは、大部分が疎水性アミノ酸残基で構成されており、すなわち、アミノ酸残基の少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも約１００％が、疎水性アミノ酸残基である。疎水性ではないアミノ酸残基は、好ましくは中性であり、好ましくは親水性ではない。
【００１７】
本明細書で「タグ」という用語は、当技術分野において典型的に、ａ）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の発現を改善する、ｂ）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の精製を容易にする、ｃ）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の固定化を容易にする、および／またはｄ）アミノ酸配列もしくはポリペプチド全体の検出を容易にするために、別のアミノ酸配列に融合されるかまたはそれに含まれる、アミノ酸配列を指す。タグの例は、Ｈｉｓ５−タグ、Ｈｉｓ６−タグ、Ｈｉｓ７−タグ、Ｈｉｓ８−タグ、Ｈｉｓ９−タグ、Ｈｉｓ１０−タグ、Ｈｉｓ１１−タグ、Ｈｉｓ１２−タグ、Ｈｉｓ１６−タグ、およびＨｉｓ２０−タグなどのＨｉｓタグ、Ｓｔｒｅｐ−タグ、Ａｖｉ−タグ、Ｍｙｃ−タグ、ＧＳＴ−タグ、ＪＳ−タグ、システイン−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、ＨＡ−タグ、チオレドキシン、またはマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ＹＦＰなどである。当業者は、様々な技術的応用に適する莫大な数のタグを知っているであろう。タグは、例えば、そのようなタグ付加されたポリペプチドを、例えば、様々なＥＬＩＳＡアッセイ形式における抗体結合または他の技術的応用に適するようにさせることができる。
【００１８】
本明細書において使用される「含む」という用語は、「からなる」（すなわち、追加的な他のものの存在を排除する）の意味に限定されると解釈されることはない。むしろ、「含む」とは、任意で追加的なものが存在し得ることを暗示する。「含む」という用語は、その範囲内に入る特に構想される態様として、「からなる」（すなわち、追加的な他のものの存在を排除する）および「含むがそれからならない」（すなわち、追加的な他のものの存在を必要とする）を包含し、前者がより好ましい。
【００１９】
本発明の発明者らは驚くことに、高い抗菌作用を示すと同時に、耐性株発現の発現率を低下させる新規ポリペプチド剤を見出した。何れの態様においても、本発明のポリペプチドは、ベッカー（Becker）ら（Sci Rep. 2016 Apr 28;6:25063）のＬ−Ｋ構造に係る最良の融合タンパク質に対して改善点を示している。
【００２０】
したがって、本発明は、第１の態様において、
ｉ）ＬｙｓＫエンドリシンのＣＨＡＰドメイン（またはＬｙｓＫエンドリシンのＣＨＡＰドメインと少なくとも８０％の配列同一性を示すそのバリアント配列）と、
ｉｉ）リソスタフィンのＭ２３エンドペプチダーゼドメイン（またはリソスタフィンのＭ２３エンドペプチダーゼドメインと少なくとも８０％の配列同一性を示すそのバリアント配列）と、
ｉｉｉ）ＡＬＥ−１の細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）（またはＡＬＥ−１の細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）と少なくとも９０％の配列同一性を示すそのバリアント配列）と、
ｉｖ）抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチド、およびデフェンシンからなる群から選択されるさらなるペプチドと、
を含むポリペプチドに関する。
【００２１】
本発明のポリペプチドには少なくとも４つの配列エレメントが含まれる。第１のエレメントはＬｙｓＫエンドリシン（配列番号１を参照のこと）のＣＨＡＰドメイン（cysteine-histidine dependent amido-hydrolase/peptidase domain）またはそのバリアント配列である。本発明のポリペプチドにはＬｙｓＫのＣＨＡＰドメインの他に、対応するより長いＬｙｓＫの配列エレメントおよび各バリアント配列を含むことができる。例えば、当該ポリペプチドには配列番号２で示される配列を含むことが可能で、これにＬｙｓＫエンドリシン（ＣＨＡＰドメインを含む）のＮ末端部が反映されているが、Ｎ末端メチオニンはない。第２のエレメントはリソスタフィンのＭ２３エンドペプチダーゼドメイン（配列番号３を参照のこと）またはそのバリアント配列である。このドメインはバクテリオシンリソスタフィンの触媒ドメインである。本発明のポリペプチドは、リソスタフィンのＭ２３エンドペプチダーゼドメインの他に、配列番号４で示される配列のような、より長い配列エレメント（および各バリアント配列）を含んでもよく、これはリソスタフィンのＮ末端部分を反映している（ａａ４−１５２；Ｍ２３エンドペプチダーゼドメインを含む）。第３の配列エレメントは、ＡＬＥ−１エンドリシン（配列番号５を参照のこと）の細胞壁結合ドメイン（cell wall binding domain, CBD)またはそのバリアント配列である。これは非触媒ドメインである。本発明のポリペプチドには、ＡＬＥ−１エンドリシンのＣＢＤの他に、ＡＬＥ−１エンドリシンのより長い配列エレメント（および各バリアント配列）、例えば配列番号６で示される配列が含まれていてもよく、これにはＡＬＥ−１エンドリシン（aa 234-327; CBDドメインを含む）のＣ末端部分が反映されている。２つの触媒ドメイン（ＣＨＡＰ，Ｍ２３）および（ＡＬＥ−１）のＣＢＤドメインは、原理的には任意の順序で存在可能である。しかし、好ましくは異なるエレメント（天然由来かバリアント配列かとは関係なく）をつぎの通り：ＣＨＡＰドメイン／Ｍ２３エンドペプチダーゼ／ＡＬＥ−１のＣＢＤ（Ｎ末端からＣ末端にかけて）：に配列させることができる。介在配列エレメントなど、他の配列エレメントが存在しても構わない。好ましくは、介在配列は各々の場合に、１０アミノ酸長を超えない、より好ましくは５アミノ酸長を超えない、短いリンカー配列である。最も好ましくは、これらは長さが１または２アミノ酸長しかない。リンカー配列は好ましくはフレキシブルな配列であって、一以上のグリシン残基を含む。このようなリンカーの例としては、グリシン・セリンリンカーまたは配列ＧＧＧＧＳ（配列番号７）がある。好ましくは、本発明のポリペプチドの第４エレメントである、さらなるペプチドは、当該２つの触媒ドメイン（ＣＨＡＰ、Ｍ２３）と、（ＡＬＥ−１）のＣＢＤドメインとにより形成されるユニットのＮ末端またはＣ末端に位置しているが、Ｃ末端位置がより好ましい。当該２つの触媒ドメイン（ＣＨＡＰ、Ｍ２３）と、ＣＢＤドメインとによりユニットが形成される場合（すなわち、当該ユニットのＣ末端またはＣ末端に当該ペプチドがある）、前記ユニットの長さは、好ましくは５００アミノ酸長より小さく、好ましくは４５０アミノ酸長よりも小さい。本発明の第��の態様に係るポリペプチドは、少なくとも、配列番号３（Ｍ２３）および／または配列番号５（ＡＬＥ−１）で示されるアミノ酸配列が含まれる場合が好ましい。最も好ましくは、本発明によるポリペプチドは、いずれにせよ配列番号５で示されるアミノ酸配列を含む。これら最後の２つのエレメント（Ｍ２３、ＡＬＥ−１）の好ましい配置は、配列番号８に反映されている。
【００２２】
ＣＨＡＰドメインに関し、本発明は数多くの潜在的なバリアント配列を提供し、つまり配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列を厳密的に使用する必要は全くない。潜在的な変異（配列番号２に対して識別）としては例えば、Ｋ１７Ｅ、Ｋ２８Ｎ、Ｈ５１Ｑ、Ｔ８６Ａ、Ｇ１５４ＳまたはＧ１５４Ｃ、Ｅ１７２Ｇ、Ｔ１７３Ｎ、またはＡ１７４Ｒが挙げられる。最も好ましくは配列番号２のバリアント配列であって、これには変異Ｋ１７Ｅおよび変異Ｈ５１Ｑが含まれる。最も好ましくは、前記バリアント配列には、変異Ｋ１７Ｅ、Ｋ２８Ｎ、Ｈ５１Ｑ、Ｔ８６ＡおよびＧ１５４Ｓが含まれている。これら変異は、本発明に係るポリペプチドの抗菌活性を改善し、また熱安定性を高めることが示されている。配列番号２に係る天然由来の配列が採用された場合、本発明の最初の３つのエレメントに係る好ましい配置が、配列番号９（Ｎ末端メチオニンなし）および配列番号１０に反映されている。本発明で使用されるものとして考えられるものとしてはまた、これらのバリアント配列があり、例えば、配列番号８、配列番号９または配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有するバリアント配列である。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、最初の３つのエレメント（ＣＨＡＰドメイン／Ｍ２３エンドペプチダーゼ／ＡＬＥ−１のＣＢＤ）の他に、第４のエレメント、つまり抗微生物ペプチド、両親媒性ペプチド、カチオン性ペプチド、疎水性ペプチド、スシペプチド、およびデフェンシンからなる群から選択されるペプチドが含まれる。好ましくは、さらなるペプチド配列は、ＬｙｓＫエンドリシンのＣＨＡＰドメイン、リソスタフィンのＭ２３エンドペプチダーゼドメインおよびＡＬＥ−１の細胞壁結合ドメイン（cell wall binding domain, CBD）に対して異種であって、つまり、このさらなるペプチド配列は、ＬｙｓＫエンドリシン配列、リソスタフィン配列、および／または、ＡＬＥ−１エンドリシン配列には生じない。好ましくは、本発明のポリペプチドの第４のエレメントは、２つの触媒ドメイン（ＣＨＡＰ，Ｍ２３）および（ＡＬＥ−１）のＣＢＤドメインにより形成されたユニットのＮ末端またはＣ末端に配置されるが、Ｃ末端位置がより好ましい。好適な配列はしたがって、ａ）ＣＨＡＰドメイン／Ｍ２３エンドペプチダーゼ／ＡＬＥ−１のＣＢＤ／ペプチド、およびｂ）ペプチド／ＣＨＡＰドメイン／Ｍ２３エンドペプチダーゼ／ＡＬＥ−１のＣＢＤ、である。当該ペプチドは、直接またはリンカー配列などの介在配列を介して、酵素ユニット（ＣＨＡＰドメイン／Ｍ２３エンドペプチダーゼ／ＡＬＥ−１のＣＢＤ）にリンクさせることができる。
【００２４】
さらなるペプチドとして使用することのできるカチオン性／ポリカチオン性のアミノ酸配列の例は下記の表に記載されている。
【００２５】
【表１】
2019535258.tif 000002
【００２６】
本発明を実施可能な抗菌性のアミノ酸配列の例は下記の表に記載されている。
【表２−１】
2019535258.tif 000003
【表２−２】
2019535258.tif 000004
前記さらなる配列は、Ding JL, Li P, Ho B Cell Mol Life Sci. 2008 Apr;65(7-8):1202-19. 「The Sushi peptides: structural characterization and mode of action against Gram-negative bacteria」に記載されているスシペプチドとすることができる。特に好ましいのは、配列番号９５に示されるスシ１ペプチドである。他の好ましいスシペプチドは、スシペプチドＳ１およびスシペプチドＳ３、ならびにその多数体（multiple）である；（Tan et al., FASEB J. 2000 Sep;14(12):1801-13）。
【００２７】
好ましい疎水性ペプチドは、配列番号９６で示されるアミノ酸配列を有するワルマフ（Ｗａｌｍａｇｈ）１、およびアミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（配列番号９７）を有する疎水性ペプチドである。
【００２８】
好ましい両親媒性ペプチドは、配列番号９８で示されるＴ４リゾチームのα４ヘリックス、および配列番号９９で示されるアミノ酸配列を有するＷＬＢＵ２−バリアント、および配列番号１００で示されるワルマフ２である。
【００２９】
より好ましくは、前記さらなるペプチドの配列は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９および配列番号９４からなる群から選択される。最も好ましくは、前記さらなるペプチドの配列は、配列番号３８および配列番号９４からなる群から選択される。
【００３０】
特に、本発明のポリペプチドが宿主細胞により組換えで発現される場合、本発明のポリペプチドがＮ末端にメチオニン残基を含むのが好ましい。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、１つまたは複数のタグ配列を追加的に含み得る。このようなタグ配列は、例えば、本発明のポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、またはペプチド配列と酵素ユニット（ＣＨＡＰドメイン／Ｍ２３エンドペプチダーゼ／ＡＬＥ−１のＣＢＤ）の間に位置していてもよい。好ましい実施形態では、１つまたは複数のタグ配列は、酵素ユニット（ＣＨＡＰドメイン／Ｍ２３エンドペプチダーゼ／ＡＬＥ−１のＣＢＤのＣ末端側に位置している。１つまたは複数のタグ配列は、酵素ユニットに、例えば直接または短いリンカーを介して連結されていてもよい（上を参照）。タグについての多数の例が、当技術分野において公知であり、そのうちのいくつかは、既に上述されている。本発明の文脈において、特に好ましいタグ配列は、Ｈｉｓ−タグ、好ましくは配列番号１０１記載のＨｉｓタグである。酵素ユニット（ＣＨＡＰドメイン／Ｍ２３エンドペプチダーゼ／ＡＬＥ−１のＣＢＤ）とタグを含む好ましい配列は、配列番号１０２および配列番号１０３である（いずれもＮ末端に任意選択的にメチオニンを有する）。ペプチド配列は、好ましくは（例えば配列番号１０２または配列番号１０３の）Ｃ末端に配置され、直接そこにリンクされているか、またはリンカー配列を介してリンクされている。
【００３２】
本発明に係るポリペプチドの、特に好ましい例は、配列番号１０４（Ｎ末端メチオニンが含まれる配列番号１０５）または配列番号１０６（Ｎ末端メチオニンが含まれる配列番号１０７）の配列を含むポリペプチドである。他の例としては、配列番号１０８（Ｎ末端メチオニンが含まれる配列番号１０９）および配列番号１１０（Ｎ末端メチオニンが含まれる配列番号１１１）がある。本発明ではまた、これら８つの配列のうち何れかのバリアント配列、特にこれら８つの配列の何れか１つと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示すバリアント配列、を含むポリペプチドを利用することも考えられる。好ましくは、前記ポリペプチドは各参照配列とくらべてより熱安定性があり、および／または、高い活性を示す。好ましくは、前記バリアント配列は、配列番号３８または配列番号９４で示される配列、および／または、配列番号５または配列番号６で示される配列をさらに含む。変異部位は特に、本発明が適切な変異だと同定した部位である。バリアント配列にＮ末端メチオニンが欠失していても構わない。
【００３３】
さらなる態様において、本発明はＬｙｓＫの改善されたＣＨＡＰドメインを含むポリペプチドに関する。本発明者らは抗菌活性および／または熱安定性を改善する変異を同定した。タンパク質ドメインは、他のドメインとは独立してフォールディングすることができるため、このドメインを他のエンドリシンなどの他のドメインとシャッフリングしたときに、これらの性質が保持され、これを利用することができる。
【００３４】
したがって、本発明は本発明の第２の態様において、さらなるペプチドに関し、前記ポリペプチドには配列番号１のバリアント配列が含まれ、前記バリアント配列は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し、また、配列番号１のアミノ酸配列と比較して、変異Ｈ８Ｎ、および／または、変異Ｔ４３Ａを示す。前記ポリペプチドは、これら２つの変異のうち少なくとも一方の変異を示す必要があるため、前記ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と、１００％の配列同一性を有さない。好ましくは、本発明の第２の態様に係るポリペプチドは、少なくともＨ８Ｎ変異を示し、また最も好ましくは、両方の変異を示す。
【００３５】
第３の態様において、本発明は、配列番号２のバリアント配列を含むさらなるポリペプチドに関し、前記バリアント配列は、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも８０％の配列同一性を有し、また前記バリアント配列は、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、Ｋ１６Ｅ、Ｋ２７Ｎ、Ｈ５０Ｑ、Ｔ８５Ａ、Ｇ１５４Ｃ、Ｇ１５４Ｓからなる群から選択される一以上の変異を示す。好ましくは、本発明の第３の態様に係るポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、少なくとも変異Ｋ１６Ｅおよび変異Ｈ５０Ｑを示すバリアント配列を含んでいる。さらにより好ましくは、本発明の第３の態様に係るポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と比較して、少なくとも変異Ｋ１６Ｅ、Ｋ２７Ｎ、Ｈ５０Ｑ、Ｔ８５Ａ、およびＧ１５４Ｓを示すバリアント配列を含んでいる。
【００３６】
本発明の第２または第３の態様に係るポリペプチドには、さらなる配列エレメント、特に、（例えば黄色ブドウ球菌などのブドウ球菌に対して）抗菌活性のある融合タンパク質を提供するドメインなどの、さらなるドメインを含むことができる。例えば、本発明の第２または第３の態様に係るポリペプチドは、ペプチドグリカン加水分解酵素の触媒領域を少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、または３つ以上）含むことができる。本発明の第２または第３の態様に係るポリペプチドに１を超える追加ドメインが含まれる場合には、そのドメインは異なるソース、即ち互いに異種であるソースに由来するものとすることができる。
【００３７】
本発明の第２または第３の態様に係るポリペプチドの例としては、前記バリアント配列が、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、または配列番号１１１で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の配列同一性を示すポリペプチド、好ましくは、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、または配列番号１１１で示されるアミノ酸配列と、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を示すことができる。
【００３８】
本発明のあらゆる態様によるポリペプチドの長さは、原則として限定されていないが、好ましくは、長さは過度に長くはない。好ましくは、本発明によるポリペプチドは、約６００アミノ酸長を超えない、好ましくは約５００アミノ酸長を超えない全体の長さを有する。
【００３９】
本発明に係るポリペプチドは、好ましくは黄色ブドウ球菌細菌のペプチドグリカンを分解する機能により特徴づけられる。酵素が活性的な場合にはペプチドグリカン層の分解により混濁が下がり、これは光学的に測定することができる（例えば、Briers et al., J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533, (2007)を参照のこと）。
【００４０】
本発明はまた本発明の一以上のポリペプチドをコードする核酸にも関する。本発明の核酸は核酸として考えられるすべての形態をとり得る。特に、本発明による核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらのハイブリッドであり得る。これらは一本鎖でも二本鎖でも構わない。
これらは小さな転写物のサイズ、またはバクテリオファージゲノムなど全ゲノムのサイズを有していても構わない。本明細書において、本発明の一以上のポリペプチドをコードする核酸は、センス鎖を反映している核酸とすることができる。同様にして、アンチセンス鎖もまた包含されている。核酸には、本発明のポリペプチドの発現のために異種プロモーターが包含されていてもよい。
【００４１】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明に係る核酸を含むベクターに関する。このようなベクターは、例えば本発明のポリペプチドを発現させる発現ベクターとすることができる。この発現は構造的発現または誘導的な発現とすることができる。本ベクターはまた、クローニングの目的のために本発明のポリペプチドの核酸配列を含むクローニングベクターであり得る。
【００４２】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸、および／または、本発明に係るベクター、を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、特に細菌細胞および酵母細胞からなる群から選択することができる。特に好ましい宿主細胞は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細胞である。
【００４３】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、および／または、本発明に係る宿主細胞、またさらには適切な希釈剤、賦形剤またはキャリアを含む組成物に関する。好ましい組成物には、本発明に係るポリペプチドが含まれる。好ましくは、本発明に係る組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体を含む。このような組成物は薬学的組成物とすることができる。さらには、本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、および／または、本発明に係る宿主細胞、を含む本発明に係る組成物は、水溶液（好ましくは緩衝溶液または生理溶液）、粉末状、坐薬、エマルション、懸濁液、ゲル、ローション、クリーム、軟膏、塗り薬、注射剤、シロップ、スプレー、吸入剤または他の医学的に適正なガレヌス組成物もしくはガレヌス製剤、被覆組成物、好ましくはインプラント被覆組成物、ステント被覆組成物もしくはカテーテル被覆組成物、生体材料、好ましくは骨セメントとすることができる。
【００４４】
さらなる態様において、本発明はデバイス、特に医療デバイスに関し、当該医療デバイスには、本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物が含まれる。このようなデバイス（またはその一部）に、例えば本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物を被覆または含浸させることができる。特に好ましいのは、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係る組成物で、被覆または含浸させることである。このようなデバイスは例えばインプラント、ステントまたはカテーテルである。これらのデバイスは、心臓手術または整形外科手術などに用途を見出すことができる。本発明の他の好適なデバイスとしては、例えば、本発明に係るポリペプチド（または本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物）を含む絆創膏、圧定布、または包帯とすることができる。これらは、例えば創傷ケアに用途を見出すことができる。
【００４５】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明に係るポリペプチド、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、人体もしくは動物体を手術もしくは治療により手当する方法で用いられる本発明に係る組成物、または人体もしくは動物体に施される診断方法に用いられる本発明に係る組成物に関する。
【００４６】
人間もしくは動物に対して実行される診断方法には、対象物からサンプルを取り出し、細菌培養物を確立し、培養物に本発明に係るポリペプチドなどを添加することにより、細菌増殖が抑えられるか否かを分析することが含まれる。この場合、黄色ブドウ球菌が存在する可能性が高い。
【００４７】
本発明に係る核酸または本発明に係るベクターがこの文脈で使用される場合には、好ましくは前記核酸またはベクターは、細胞から、本発明のポリペプチドの分泌を提供する。本発明の宿主細胞が使用される場合には、各宿主細胞が本発明のポリペプチドを分泌することが好ましい。
【００４８】
本発明はまた、感染症の治療もしくは防止に係る方法で用いられ、特に黄色ブドウ球菌に関連する感染症の治療方法または防止方法に使用される、本発明に係るポリペプチド（また同様にして本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物）に関する。この意味で、本発明はまた、皮膚炎（アトピー性皮膚炎など）または耳炎の治療、改善、または防止に係る方法に使用される、本発明に係るポリペプチド（また同様にして、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物））に関する。これらの病態、例えば二次感染症には、黄色ブドウ球菌が関わっていることが多い、
【００４９】
本発明はまた、対象物の傷の治療、特に、医原性などの急性創傷、または慢性創傷の治療に係る方法に用いられる、本発明に係るポリペプチド（また同様にして本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物）に関する。対象物は動物または人間等とすることができる。
【００５０】
本発明はまた、対象物にいる黄色ブドウ球菌を原因とする感染症の治療または防止に係る方法に関し、前記方法には対象物を、本発明に係るポリペプチド（または同様に、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物）に接触させることが含まれている。特に、本発明はまた、対象物にいる黄色ブドウ球菌を原因とする感染症の治療または防止に係る方法に関し、前記方法には対象物を、本発明に係るポリペプチドに接触させることが含まれる。
【００５１】
さらなる態様において、本発明は、本発明に係るポリペプチド（または本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物）の、特に院内環境または診療所で、無生物の表面、組成物、および／または、物体を消毒するための、使用に関する。
【００５２】
さらなる実施態様において、本発明は無生物の表面、組成物および／または物体が、細菌で汚染されること、特に黄色ブドウ球菌で汚染されることを防止するための、本発明に係るポリペプチド（または本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物）の使用に関する。
【００５３】
さらなる態様において、本発明は、特に院内環境または診療所で、無生物の表面、組成物、および／または、物体を消毒する方法に関し、前記方法には無生物の表面、組成物、および／または、物体を、本発明に係るポリペプチド（または本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物）に接触させることが含まれる。
【００５４】
さらなる実施態様において、本発明は無生物の表面、組成物および／または物体が細菌で汚染されること、特に黄色ブドウ球菌で汚染されることを防止する方法に関し、本方法には無生物の表面、組成物および／または物体を、本発明に係るポリペプチド（または本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る宿主細胞、および／または、本発明に係る組成物）と接触させることが含まれる。
【実施例】
【００５５】
以下において、本発明の実施形態および態様を説明する具体的な実施例が提示される。しかしながら、本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本発明の様々な変更は、本明細書に記載されたものに加えて、前述の説明および以下の実施例から当業者に明白であろう。このような変更はすべて添付の特許請求の範囲内に含まれる。
【実施例１】
【００５６】
黄色ブドウ球菌に対する本発明の２つの融合タンパク質の抗菌活性
ベッカー（Becker）ら（Sci Rep. 2016 Apr 28;6:25063）は、耐性黄色ブドウ球菌株の発現率が抑えられた融合タンパク質Ｌ−Ｋの形成について報告している。黄色ブドウ球菌に対して他の改良融合タンパク質を提供するために、本発明者らは２つの融合タンパク質を作製し、いずれもＬｙｓＫエンドリシンのＣＨＡＰドメインと、リソスタフィンのＭ２３エンドペプチダーゼドメインと、ＡＬＥ−１の細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）とを含んでいた。加えて、融合プロテインの一方にはカテプシンＧ（７７−８３）ペプチド（配列番号９４）が含まれ、他方にはカチオン性ペプチドＫＮＫ（配列番号３８）が含まれていた。得られた融合タンパク質（配列番号１０５および配列番号１０７）の抗菌活性および耐性発現を分析した。この目的のために、ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）アッセイ（以下を参照）を、数培養サイクルにわたって行った。
【００５７】
ＭＩＣアッセイ
黄色ブドウ球菌Ｓｐ１０をルリア−ベルターニ培地で培養し、ミューラー・ヒントン培地に１：１０で希釈した。約０．６の光学濃度ＯＤ６００において、同培地で細菌を１：１０に希釈した後、１：５００で希釈した。タンパク質緩衝剤（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）およびタンパク質またはゲンタマイシンを、様々な濃度のタンパク質／ゲンタマイシンおよび２０μｌの先端容積（end volume）を用いて、９６ウェルプレートに分注した。使用されたタンパク質は、配列番号１０５および配列番号１０７に記載の融合タンパク質であった。１８０μｌの細菌細胞または培地（ミューラー・ヒントン）コントロールを９６ウェルプレートに与え、混合した。当該プレートを３７℃で１８〜２２時間培養し、ウェルのＯＤ６００値を測定して細菌増殖を測定した。培地コントロールと同じＯＤ６００を示すタンパク質／ゲンタマイシンの最小濃度を持つウェルをＭＩＣとした。次のサイクルでは、Ｓｕｂ−ＭＩＣウェルからの細菌溶液を使用した。Ｓｕｂ−ＭＩＣウェルとは、ＭＩＣ濃度の次に低い濃度で試験されたウェルのことであって、つまり、培地コントロールよりも高いＯＤ６００を有する最も高いタンパク質／ゲンタマイシンの濃度である。耐性アッセイのさらなるサイクルのため、前サイクルのこのｓｕｂ−ＭＩＣウェルからの細菌を、次の一晩培養のために採取した。結果を以下の表３ａおよび表３ｂに示した。
【００５８】
【表３ａ】
2019535258.tif 000005
【００５９】
以下の表３ｂは、初期ＭＩＣ（サイクル１）に対する倍率変化としたときの表３ａの結果を表している。
【００６０】
【表３ｂ】
2019535258.tif 000006
【００６１】
上記の表３ｂから明らかなように、本発明の融合タンパク質は何れも、ゲンタマイシンと比較して、経時的に耐性株が発現しにくい。さらに、本発明に係る何れの融合タンパク質も、公知技術の融合タンパク質Ｌ−Ｋ（Becker et al., Sci Rep. 2016 Apr 28;6:25063を参照のこと）で報告された結果と比較して、より多くのサイクルの後で、驚くほどに耐性株の発現率が低く（本発明の両方の融合タンパク質が、１２サイクル後Sにおいて１．５倍の倍率変化であるのに対して、ベッカー（Becker）らのＬ−Ｋ融合タンパク質は、１０サイクル後に２倍の倍率変化であり（ベッカー（Becker）ら, 図１Ｂを参照のこと））、また同時により高い抗菌活性を示していた（本発明の融合タンパク質の初期ＭＩＣが４μｇ／ｍｌであるのに対して、ベッカー（Becker）らのＫ−Ｌ融合タンパク質は７．８μｇ／ｍであった）。
【実施例２】
【００６２】
本発明に係るポリペプチドのバリアント
本発明の発明者らはまた、上記ポリペプチドのバリアントを開発した。この目的のため、配列番号１０５で示される配列に変異を導入した。
【００６３】
【表４】
2019535258.tif 000007
【００６４】
下記の表５は、配列番号１０５の融合タンパク質に対する、これら変異体の活性に関する結果を表している。本明細書において、ＤＳＭ３４６株とは黄色ブドウ球菌株ＤＳＭ３４６（ライプニッツ研究所ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH）、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）のことを指す。Ｓ６４とＳ６９は、Ｒｏｂ  Ｌａｖｉｇｎｅ教授（Katholieke Universiteit Leuven、ベルギー）から得られた黄色ブドウ球菌株Ｓ６４およびＳ６９である。
【００６５】
【表５】
2019535258.tif 000008
【００６６】
全ての変異体が黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性を保持していた。上記変異のいくつかをまた、配列番号１０７で示される配列に対して検証した。さらに、上記変異の一部を組み合わせた。さらに、Ｇ１５４Ｃの代わりに変異Ｇ１５４Ｓを使用した。下記の表６は配列番号１０７で示される融合タンパク質に対して検証した変異を表している。
【００６７】
【表６】
2019535258.tif 000009
【００６８】
下記の表７は、配列番号１０７の融合タンパク質に対するこれら変異体の活性に関する結果を表している。
【００６９】
【表７】
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【００７０】
全ての変異体が黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性を保持していた。さらに、前記変異体のうち２つの変異体に関して、未改変の融合タンパク質と比較したときの、熱安定性を評価した。黄色ブドウ球菌株ＤＳＭ３４６を用いて熱安定性アッセイを行った。当該タンパク質を０，３ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈し、次いで様々な温度で２０分間培養した（以下の表８を参照のこと）。この培養時間後に標準ＭＩＣアッセイを行った。タンパク質がまだ（高い）活性を示していた後の温度が高ければ高いほど、タンパク質の熱安定性が良好である。
【００７１】
【表８】
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【００７２】
クローン１１および１５はしたがって、未改変の融合タンパク質と比較して、より高い熱安定性を示していた。
【配列表】
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【国際調査報告】
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