(57)【要約】  本発明は、水性媒体と、水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物を製造するための方法に関し、当該方法は：（ｉ）第１の疎水性媒体と、第１の疎水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物を提供することを含み；（ｉｉ）第１の体積の第１のヒドロゲルの周りにヒドロゲル化合物を含むある体積の水性組成物を配置することを含み；（ｉｉｉ）ヒドロゲル化合物を含む水性組成物にゲルを形成させ、そのことによってヒドロゲル物体を形成させることを含み、該ヒドロゲル物体は、第１の体積の第１のヒドロゲルと第２の体積の第２のヒドロゲルとを含み、該第２の体積の第２のヒドロゲルは、第１の体積の第１のヒドロゲルの周りに配置され；かつ、（ｉｖ）ヒドロゲル物体を第１の疎水性媒体から水性媒体へと移し、そのことによって水性媒体と水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物を製造することを含む。  本発明はさらに、ヒドロゲル物体を提供し、該ヒドロゲル物体は、第１の体積の第１のヒドロゲルと第２の体積の第２のヒドロゲルとを含み、該第２の体積の第２のヒドロゲルは、第１の体積の第１のヒドロゲルの周りに配置される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性媒体と、該水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物を製造するための方法であって、当該方法は：
（ｉ）第１の疎水性媒体と、該第１の疎水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物を提供することを含んでおり；
（ｉｉ）前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲルの周りにヒドロゲル化合物を含むある体積の水性組成物を配置することを含んでおり；
（ｉｉｉ）前記ヒドロゲル化合物を含む前記水性組成物にゲルを形成させ、そのことによってヒドロゲル物体を形成させることを含んでおり、該ヒドロゲル物体は、前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲルと第２の体積の第２のヒドロゲルとを含んでおり、前記の第２の体積の前記の第２のヒドロゲルは、前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲルの周りに配置されており；かつ、
（ｉｖ）前記ヒドロゲル物体を前記の第１の疎水性媒体から水性媒体へと移し、そのことによって前記水性媒体と前記水性媒体中に配置された前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲルとを含む前記組成物を製造することを含んでいる、
前記方法。
【請求項２】
前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲルが、その中に配置された１つ以上の積載物を含んでいる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記の１つ以上の積載物が、１つ以上の生体細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲルが、培養培地をさらに含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲルが、前記の第１のヒドロゲルの複数の小滴を含む小滴集合を含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。 
【請求項６】
前記小滴集合が、３次元構造体中に配置された前記の第１のヒドロゲルの複数の小滴を含んでおり、かつ、前記３次元構造体中の各小滴が、前記３次元構造体中の少なくとも１つのその他の小滴に接触している、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記小滴集合が、前記の第１のヒドロゲルの５０個以上の小滴を含んでいる、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記小滴集合が：
前記の第１のヒドロゲルの第１の複数の小滴を含んでおり、該小滴はそれぞれ、前記の第１のヒドロゲル中に配置された１つ以上の第１のタイプの生体細胞を含んでおり；かつ、
前記の第１のヒドロゲルの第２の複数の小滴を含んでおり、該小滴はそれぞれ、前記の第１のヒドロゲル中に配置された１つ以上の第２のタイプの生体細胞を含んでいる、
請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記小滴集合が、体積が０．００１〜１００ｎＬである１つ以上の小滴を含んでいる、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記の第１のヒドロゲルが多糖を含んでおり、好ましくは、前記の第１のヒドロゲルがアガロースを含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記の第１の疎水性媒体が、炭化水素化合物および／またはシリコーン油を含んでおり、好ましくは、前記炭化水素化合物がＣ８〜Ｃ１６アルカンであり、より好ましくは、前記炭化水素化合物がウンデカンである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記の第１の疎水性媒体が、炭化水素とシリコーン油とを、（炭化水素）：（シリコーン油）の体積比５０：５０〜８０：２０で、好ましくは、体積比６０：４０〜７０：３０で含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記の第１の疎水性媒体が、１つ以上の両親媒性化合物を、０．１ｍＭより低いか、またはそれに等しい総濃度で、好ましくは、０．０５ｍＭより低いか、またはそれに等しい総濃度で含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ヒドロゲル物体が、前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲルの表面上に配置された前記の第２のヒドロゲルの層を含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲルの周りにヒドロゲル化合物を含むある体積の水性組成物を配置することが：
前記の第１の疎水性媒体中に前記水性組成物の小滴を生成することと；
前記水性組成物の前記小滴を前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲルと接触させることとを含んでいる、
先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記水性組成物がヒドロゲル化合物を含んでおり、該ヒドロゲル化合物は多糖であり、好ましくは、該ヒドロゲル化合物はアガロースである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記水性組成物が、前記ヒドロゲル化合物を１．０〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記水性組成物および前記体積の第１のヒドロゲルの総体積が、１００ｎＬより多いか、またはそれに等しく、好ましくは、前記総体積が１０００ｎＬより多いか、またはそれに等しい、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヒドロゲル化合物を含む前記水性組成物にゲルを形成させることが、前記ヒドロゲル化合物を含む前記体積の前記水性組成物を１０．０℃より低いか、またはそれに等しい温度まで冷却することを含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒドロゲル物体を前記の第１の疎水性媒体から水性媒体へと移すことが、前記ヒドロゲル物体を第２の疎水性媒体から水性媒体へと移動させることを含んでいる、請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲルを含む前記の第２の体積の前記の第２のヒドロゲルを前記の第１の疎水性媒体から水性媒体へと移すことが：
前記ヒドロゲル物体を第１の相を通して第２の相へと渡すことを含んでおり、前記の第１の相は第２の疎水性媒体であり、かつ、前記の第２の相は水性媒体であり、かつ、前記の第２の相は前記の第１の相と接触している、
請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記の第１の相が、前記の第２の相より低密度であり、かつ、前記の第２の相の上に配置されており、かつ、前記ヒドロゲル物体を前記の第１の相を通して前記の第２の相へと渡すことが、前記ヒドロゲル物体を重力の影響の下、前記の第１の相を通って前記の第２の相へと落下させることを含んでいる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
当該方法がさらに、ステップ（ｉ）の前に
（ａ）両親媒性分子含有疎水性媒体を含む組成物を提供するステップを含んでおり、該両親媒性分子含有疎水性媒体は、その中に配置された前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲルを有しており；かつ、
（ｂ）前記両親媒性分子含有疎水性媒体に前記の第１の疎水性媒体を添加するステップと、必要に応じて、前記両親媒性分子含有疎水性媒体の少なくとも一部を前記の第１の疎水性媒体と置換するステップとを含んでいる、
先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記両親媒性分子含有疎水性媒体中に配置された前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲルが、前記の第１のヒドロゲルの１つ以上の小滴を含んでおり、前記の第１のヒドロゲルの前記の１つ以上の小滴はそれぞれ、両親媒性分子の外層を含んでいる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲルがさらに、その中に配置された１つ以上の生体細胞を含んでおり、かつ、当該方法がさらに、前記の１つ以上の生体細胞を培養するステップを含んでいる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
水性媒体と、該水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物であって、当該組成物は、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法から取得可能である、前記組成物。
【請求項２７】
第１の体積の第１のヒドロゲルを製造するための方法であって、当該方法は：
（ｉ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法によって、水性媒体と、該水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物を製造することを含んでおり；かつ、
（ｉｉ）前記の第１の体積の第１のヒドロゲルを単離することを含んでいる、
前記方法。
【請求項２８】
第１の体積の第１のヒドロゲルであって、当該該第１の体積の第１のヒドロゲルは、請求項２７に記載の方法によって取得可能である、前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲル。
【請求項２９】
組織様材料を製造するための方法であって、当該方法は、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法を実行するステップを含んでいる、前記方法。
【請求項３０】
組織様材料であって、当該組織様材料は、請求項２９に記載の方法によって取得可能である、前記組織様材料。
【請求項３１】
ヒドロゲル物体であって、当該ヒドロゲル物体は、第１の体積の第１のヒドロゲルと第２の体積の第２のヒドロゲルとを含んでおり、前記の第２の体積の前記の第２のヒドロゲルは、前記の第１の体積の前記の第１のヒドロゲルの周りに配置されており、
ここで、前記の第１の体積の第１のヒドロゲルが、前記の第１のヒドロゲルの複数の小滴を含む小滴集合を含んでおり、かつ、
前記の第１のヒドロゲルの各小滴が、その中に配置された１つ以上の積載物を含んでいる、
前記ヒドロゲル物体。
【請求項３２】
前記の１つ以上の積載物が、１つ以上の生体細胞である、請求項３１に記載のヒドロゲル物体。
【請求項３３】
前記の第１の体積の第１のヒドロゲルと前記の第２の体積の前記の第２のヒドロゲルとが、請求項４〜１０および１４のいずれか一項に記載のものである、請求項３１または請求項３２に記載のヒドロゲル物体。
【請求項３４】
水性媒体と、該水性媒体中に配置された請求項３１〜３３のいずれか一項に記載のヒドロゲル物体とを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、水性媒体と、水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物を製造するための方法に関する。本発明はまた、ヒドロゲル物体（ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｏｂｊｅｃｔ）に関し、該ヒドロゲル物体は、第１の体積の第１のヒドロゲルと、第２の体積の第２のヒドロゲルとを含んでおり、該第２の体積の第２のヒドロゲルは、第１の体積の第１のヒドロゲルの周りに配置されている。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
実験室で作製した（ｌａｂ−ｍａｄｅ）３Ｄ小滴（ｄｒｏｐｌｅｔ；液滴）プリンターを用いて、油中脂質溶液（ｌｉｐｉｄ−ｉｎ−ｏｉｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）中に、数千個のピコリットル（ｐＬ）体積の小滴を含有するパターニングされた小滴ネットワークが形成され得ることが先行して示されている（Ｖｉｌｌａｒ，  Ｇ．，  Ｇｒａｈａｍ，  Ａ．  Ｄ．  ＆  Ｂａｙｌｅｙ，  Ｈ．  Ａ  ｔｉｓｓｕｅ−ｌｉｋｅ  ｐｒｉｎｔｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０，  ４８〜５２  （２０１３）および国際公開第２０１４／０８７１７５号パンフレット）。先の小滴構造体はバルク油（ｂｕｌｋ  ｏｉｌ）溶液内で主に製造されたので、それらは脱水の影響を受けやすく、このことは元々のパターンの癒合および喪失を引き起こし得る。水和チャンバー（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒ）の使用が、かかる問題を低減させ得る。なぜなら、露点において構造体を維持し得るからである。しかしながら、これら方法は、結局は実験に限定され、かつ、用途を制限するかも知れない。追加的には、バルク油内に留められる構造体はまた、バルク相（ｂｕｌｋ  ｐｈａｓｅ）とのやりとりが制限される。このことは、マルチソーム（Ｖｉｌｌａｒ，  Ｇ．，  Ｈｅｒｏｎ，  Ａ．  Ｊ．  ＆  Ｂａｙｌｅｙ，  Ｈ．  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｒｏｐｌｅｔ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｔｈａｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．  Ｎａｔ．  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６，  ８０３〜８  （２０１１））、すなわち、バルク水性相（ｂｕｌｋ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ）に懸濁された油滴状で作成される小滴ネットワーク（ｐＨの変化に反応することが示され、かつ、分子をバルク相と交換し得た）のような構造体の製造を通して部分的に迂回されている。しかしながら、製造方法に起因して、マルチソームは、現在では入れ子のスフェロイド（ｎｅｓｔｅｄ  ｓｐｈｅｒｏｉｄ）に制限される、限定された幾何学的形状を有する。したがって、経時的に複雑な構造を保持するため、および、構造体に入る分子の交換のため、ヒドロゲル小滴ネットワークを相間移動させる必要性がある。
【０００３】
本発明者らは、具体的には、３Ｄパターニングされた細胞を搭載した（ｃｅｌｌ−ｌａｄｅｎ）小滴ネットワークのような大量のヒドロゲルを相間移動させることを目的とした。ヒドロゲルは機械的強度を提供するように選択されたが、それはまた、細胞化した足場（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｓｅｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）としても作用し得、微細組織内に配置された細胞の培養を可能にした。生物学的に関連する構造体への微細組織の発展は、異なる細胞タイプの空間的配置に高度に依存する。特に、創発的な（ｅｍｅｒｇｅｎｔ）生物学的特性を有する組織サンプルを合成するために、高解像度プリント方法論を足場補助（ｓｃａｆｆｏｌｄ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）相間移動と組み合わせることが所望される。
【０００４】
現存する方法は、ジャイアントユニラメラベシクル（ｇｉａｎｔ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）（ＧＵＶ）（Ｐａｕｔｏｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  １００，  １０７１８〜１０７２１  （２００３）；  Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２２，  ９８２４〜８  （２００６）；  Ｗａｌｄｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  １１，  ８４８〜６５  （２０１０）；  Ａｂｋａｒｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  ７，  ４６１０  （２０１１）；  Ｙａｎａｇｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １３３，  １１７７４〜９  （２０１１）；  Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  ９，  ９５３９  （２０１３））および多区画化ベシクル（ｍｕｌｔｉ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｓｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅ）に与えるための単一の小滴または小滴クラスター（〜１〜１０）の相間移動について説明する。このことは、水性溶液の上に油中脂質溶液がある２相カラムの境界面を介して構造体を渡すことによって示された（Ｅｌａｎｉ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ４，  ３３３２  （２０１３））。ＧＵＶ形成法は、相間移動を補助するための遠心力を付与するためにスピニングカラムを用いた。多区画化ベシクル法は、小滴の沈降を促すために、内部の小滴の密度をバルク相に対して増大させることに依存する、重力媒介アプローチを用いた。先行する努力にも関わらず、しかしながら、脂質が安定化された小滴のより大きなネットワークを相間移動させることは困難なままである。なぜなら、あらゆる製造される構造体が、油水境界面（ｏｉｌ−ａｑｕｅｏｕｓ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）の界面張力に打ち勝つ必要があるだけでなく、外側の脂質で完全に被覆される必要があるからである（内側の小滴−小滴２重層と外側の小滴−バルク水性２重層とを有する水性小滴ネットワークを形成するために）。
【０００５】
小滴ネットワークの相間移動についての文献の例は２つのみである（Ｅｌａｎｉ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ４，  ３３３２  （２０１３）およびＥｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ５，  １〜５  （２０１４））。それらの場合では、著者らは、２相カラムの境界面を介して高密度のスクロース系の小滴を相間移動させた。その研究の限界は次の通りである：相間移動した種が短命であること（概して最大１時間）；スクロースの小滴のみが示されたこと（細胞にとって理想的な環境ではない）；小滴が大体積のものであったこと（φ＞５００μｍ、すなわち＞６５ｎＬ）;ネットワークが単純であったこと（２〜８個の小滴から構成される）；および、相間移動が時間のうちの４３％または８０％しか起きなかったこと（溶液による）。
【０００６】
したがって、パターン忠実性の喪失を伴うことなく、高解像度である大量のヒドロゲル（カーゴを搭載して（ｃａｒｇｏ−ｌａｄｅｎ）いてもよい）の相間移動を可能にする方法を開発することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【０００７】
先行技術の方法に伴う上記の問題に鑑み、本発明者らは、バルク疎水性相（ｂｕｌｋ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｐｈａｓｅ）からバルク水性相へとある体積のヒドロゲル（例えば、例えば図２〜図５に示されるように、ビーズまたは生体細胞のようなカーゴを搭載したパターニングされた小滴ネットワーク）を相間移動させるための技術を開発した。このことは、パターン忠実性への破壊を最小限にする、多重ステップのゲル化に基づく方法論を用いることによって達成される。
【０００８】
本発明は、ヒドロゲル化合物の溶液（例えば、アガロース系溶液）中にビーズまたは細胞を懸濁させることと、これをパターニングされた小滴ネットワーク（続いて、ゲル化され、２次的な安定化ゲルに包まれ、その後、２相カラムを用いて相間移動した）として３Ｄプリントすることとによって開発された。本質的には、小滴ネットワークはゲル足場へと変換され、その後、油水境界面を通って沈んだ。本発明の方法は、相間移動前後を撮像することによって示されるように、固体ゲルの中に包み込むことによって、パターニングされたカーゴを所定の位置に保持する（例えば、図２）。本方法はまた、バルク水性相への細胞色素および細胞栄養素のそれぞれの取り込みによる足場内の細胞染色ならびに細胞の増殖によって示され得るが、存在するあらゆる内側の脂質を破壊する。移動したゲル化集合は、成形された足場（細胞に基づく実験用）を用いて可能であるものより大きな内部構造体を含有する。
【０００９】
細胞を搭載した足場は、本発明の方法によって浸透圧的に均衡した培養培地へと移動してもよく、その後、何日もの間、細胞が培養されてもよい。かかる移動したネットワーク内の生体細胞は、足場内で生存でき、増殖し、かつ、それらの分化能力を保持することが示された。本発明の方法のさらなる利点が、以下に提示される。
【００１０】
本発明の方法は、高度に再現可能であり、かつ、高い成功率を有する。特に、ヒドロゲル物体は、油水境界面上に静止するのではなく最も頻繁に相間移動するであろう。このことは、下方の水溶液よりも高密度であるヒドロゲル系ゲルに起因し、したがって、それは重力によって沈む。ｍｍスケールの足場（典型的には１×１×０．４ｍｍ３）の相間移動は何回も（ｎ＞１００）繰り返され、かつ、さらなる力を伴わずカラム内に配置される時は足場のうちの〜９０％が移動し、一方で、足場のうちの〜１０％が手による軽い機械的摂動（すなわち、チャンバースライドがゆっくりとした円運動で回転する）を必要とすることが、経験的に注目された。対照的に、Ｅｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ４，  ３３３２  （２０１３）は、４３％（ベシクルが組み込まれた時、８０％まで上がった）というより低い相間移動成功率を有する。不成功に終わった試みでは、相間移動中、小滴ネットワークは破裂してバルク水性相へと入った。
【００１１】
本発明の方法では、該体積のヒドロゲル（例えば、足場）は固体ゲルであり、かつ、該体積のヒドロゲルが溶解する、または、バルク相と癒合する危険性がない。足場は、劣化を伴うことなく、室温および細胞培養条件で用いられ得る。このことは、多数の実験で示されてきた。なぜなら、本発明者らが１週間にわたって、足場内で細胞を普通に培養したからである。Ｅｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ４，  ３３３２  （２０１３）は、平均寿命が６０分である相構造体を示している。
【００１２】
先行技術の方法と異なり、構造体が脂質２重層中に被覆される必要がなく、かつ、２相カラムが、油水境界面において連続する脂質単層が形成されるようにインキュベートされる必要がない。このことは、ヒドロゲル物体が約６０秒以内に移動する傾向があることを意味する。その他のＧＵＶおよび多区画化ベシクル法はすべて、典型的には、０．５〜４時間の間、脂質単層をインキュベートする必要がある。
【００１３】
本発明の方法は、高次の小滴ネットワークである大量のヒドロゲルと適合する。例えば、数１００個の小滴（〜１ｎＬの体積のもの）を含有する高次の小滴ネットワークが、成功裡にヒドロゲル足場へと変換され、かつ、相間移動した。本方法はまた、大きな単一の小滴（２００ｎＬの体積のもの）とも適合する。対照的に、Ｅｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ４，  ３３３２  （２０１３）において相間移動した最も複雑な小滴ネットワークは、７個の小滴のネットワークであった。
【００１４】
本発明の方法を用いれば、高いパターン忠実性を維持することが可能である。ある体積のヒドロゲル中に配置されたカーゴ（例えば、小滴集合（ｄｒｏｐｌｅｔ  ａｓｓｅｍｂｌｙ；液滴集合体）におけるビーズまたは細胞）のパターンは、ゲル化ステップおよび最終相間移動ステップの間ずっと保存される。本発明者らは、２型細胞の隣に１型細胞がある２重層から構成される足場を相間移動させることによって、このことを示した（例えば、図４に示されるように）。
【００１５】
細胞色素および細胞栄養素のような小分子が、相間移動した大量のヒドロゲルに浸透することが示された。細胞を搭載した足場が、カルセイン−ＡＭとヨウ化プロピジウムとを用いる生／死染色プロトコールによって相間移動後に成功裡に染色された（５μＭの絶対色素濃度において）。また、細胞が、バルク培養培地（ｂｕｌｋ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）中でサンプルをインキュベートすることによって、７日間にわたって培養され、かつ、増殖を示したが、足場における栄養素が不十分であり、かつ、廃棄物の蓄積があったので、足場は透過性であったに違いない。
【００１６】
本発明の方法で用いられるアガロースのようなヒドロゲルは無細胞毒性であり、かつ、移動したヒドロゲル物体内の細胞は＞８０％という相間移動後の高生存率を示した（小滴ネットワークの製造前は元々９０〜１００％生存可能であった細胞を用いた）。
【００１７】
移動したヒドロゲル物体は、典型的には、ＨＥＫ−２９３細胞を搭載した足場の培養実験によって示されるように、分化する能力のような通常の生物活性を抑制しない。細胞を搭載した足場が、最適化された培養および足場取扱い条件を用いて、１週間にわたって培養され、かつ、細胞数の増加と経時的にゲル足場内で増殖する特有の３Ｄ細胞クラスター形態の形成とが観察された。免疫細胞化学染色がまた、２．６±１．８％の有糸分裂活性を示す７日齢のＨＥＫ−２９３Ｔ足場を用いて実行された（図５ｄに示されるように）。
【００１８】
本発明はしたがって、水性媒体と、水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物を製造するための方法を提供し、当該方法は：
（ｉ）第１の疎水性媒体と、第１の疎水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物を提供することを含んでおり；
（ｉｉ）第１の体積の第１のヒドロゲルの周りにヒドロゲル化合物を含むある体積の水性組成物を配置することを含んでおり；
（ｉｉｉ）ヒドロゲル化合物を含む水性組成物にゲルを形成させ、そのことによってヒドロゲル物体を形成させることを含んでおり、該ヒドロゲル物体は、第１の体積の第１のヒドロゲルと第２の体積の第２のヒドロゲルとを含んでおり、該第２の体積の第２のヒドロゲルは、第１の体積の第１のヒドロゲルの周りに配置されており；かつ、
（ｉｖ）第１の疎水性媒体から水性媒体へとヒドロゲル物体を移動させ、そのことによって、水性媒体と、水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物を製造することを含んでいる。
【００１９】
本発明はさらに、ヒドロゲル物体を提供し、該ヒドロゲル物体は、第１の体積の第１のヒドロゲルと第２の体積の第２のヒドロゲルとを含んでおり、該第２の体積の第２のヒドロゲルは、第１の体積の第１のヒドロゲルの周りに配置されており、
ここで、第１の体積の第１のヒドロゲルは、第１のヒドロゲルの複数の小滴を含む小滴集合を含んでおり、かつ、
第１のヒドロゲルの各小滴は、その中に配置された１つ以上の積載物（ｃａｒｇｏ  ｉｔｅｍ）を含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明の方法の概略図を示している。Ａは、ゲル化した小滴集合（すなわち、第１の体積の第１のヒドロゲル）を製造するための、プリントされたネットワークのゲル化を示している。Ｂは、ゲル化した小滴集合（すなわち、第１の体積の第１のヒドロゲル）の周りに外側のゲル（すなわち、第２の体積の第２のヒドロゲル）の設定された被覆を形成するための、ヒドロゲル化合物を含む水性組成物でのゲル化した小滴集合のゲル被覆および後に続くゲル化を示している。これがヒドロゲル物体である。Ｃは、水性媒体中のヒドロゲル物体の相間移動を示している。
【図２】図２は、細胞を搭載したある体積の第１のヒドロゲルのゲル包装および相間移動の段階の顕微鏡写真を示している。
【図３】図３は、生体細胞を搭載した、相間移動した、プリントされたヒドロゲル足場の顕微鏡写真および蛍光画像を示している。
【図４】図４は、相間移動前後の、ラメラ構造にてパターニングされた、生体細胞を搭載した、プリントされたヒドロゲル足場の顕微鏡写真および蛍光画像を示している。
【図５】図５は、７日間にわたる培養における、相間移動した、プリントされたヒドロゲル足場における生体細胞発生の顕微鏡写真および蛍光画像を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、水性媒体と、水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物を製造するための方法を提供し、当該方法は：
（ｉ）第１の疎水性媒体と、第１の疎水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物を提供することを含んでおり；
（ｉｉ）第１の体積の第１のヒドロゲルの周りにヒドロゲル化合物を含むある体積の水性組成物を配置することを含んでおり；
（ｉｉｉ）ヒドロゲル化合物を含む水性組成物にゲルを形成させ、そのことによってヒドロゲル物体を形成させることを含んでおり、該ヒドロゲル物体は、第１の体積の第１のヒドロゲルと第２の体積の第２のヒドロゲルとを含んでおり、該第２の体積の第２のヒドロゲルは、第１の体積の第１のヒドロゲルの周りに配置されており；かつ、
（ｉｖ）第１の疎水性媒体から水性媒体へとヒドロゲル物体を移動させ、そのことによって、水性媒体と、水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物を製造することを含んでいる。
【００２２】
本発明の細胞を含有するプリントされた小滴ネットワーク（別名、細胞足場）のゲル封入および相間移動の概略図が、図１に示されている。（ａ）プリントされたネットワークはまず、冷却（４℃、２０分）によってプリント油内でゲル化される。プリント油の脂質はその後、繰り返されるシリコーン油洗浄によって希釈して除かれ、外側の脂質被覆のないネットワークを残す。（ｂ）プリントされたネットワークのゲル封入。ゲルネットワークの表面は、ピペットを用いて移されたアガロースの小滴で湿っている。アガロース包含構造体はその後、冷却（４℃、２０分）によって油内でゲル化される。（ｃ）相間移動。ゲル化し封入され、かつゲル化したネットワークは、培養培地の上に油がある２相カラムの上方の相へと動かされ、かつ、境界面を介して沈む。油が容器から除去され、該容器はその後、追加の培養培地で満たされ、かつ、細胞インキュベーターにて貯蔵される。
【００２３】
ヒドロゲル化合物は、ヒドロゲル化合物の水溶液がゲル化してヒドロゲルを形成することが可能であるようになっている化合物である。典型的には、ヒドロゲル化合物を含む水性媒体は、水性媒体の温度が特定の温度（その水性媒体中のヒドロゲル化合物のゲル化温度であるであろう）より下まで下げられる時、ゲル化してヒドロゲルを形成するであろう。ヒドロゲル化合物を含む水性組成物は、典型的にはそれ自体ゲルではなく、むしろ自由流動性の液体である。水性組成物がヒドロゲルであるのは、ヒドロゲル化合物を含むかかる水性組成物がゲル化してすぐだけである。ゲルは、「流体によってその全体積の至る所で膨張する、非流動性でコロイド状のネットワークまたはポリマーネットワーク」と定義されてもよい。ヒドロゲルは、「膨潤剤（すなわち、流体）が水であるゲル」と定義されてもよい。
【００２４】
第１の体積の第１のヒドロゲルは、典型的には、その中に配置された１つ以上の積載物を含む。本発明の方法は、相間移動中、ある体積の第１のヒドロゲル中に配置されたカーゴ物体のパターン忠実性の保存を可能にする。
【００２５】
積載物は、ヒドロゲル中に懸濁されていてもよい、任意の適切な物品、粒子または物体である。例えば、積載物は、プラスチックビーズ、ナノ粒子、ミクロ粒子または生体細胞から選択されてもよい。典型的には、１つ以上の積載物は、１つ以上の生体細胞である。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、用語「生体細胞」は周知であり、かつ、膜で囲まれた細胞質を含む細胞（典型的には、核またはリボソームのような小器官を含む）を意味する。生体細胞は、原核性であっても真核性であってもよい。生体細胞は、典型的には真核性である。生体細胞は、自然起源のものであってもよく、遺伝学的に（あるいはその他の方法で）改変されていてもよい。しばしば、生体細胞は、哺乳類組織由来の哺乳類細胞である。例えば、生体細胞は、ヒトまたはチンパンジーの組織のような霊長目の動物の組織由来であってもよい。
【００２７】
いくつかの実施形態では、１つ以上の生体細胞は、２つ以上の異なるタイプの生体細胞から選択される。
【００２８】
生体細胞のタイプは、特定の種から採った生体細胞の細胞タイプを意味する。例えば、哺乳類生体細胞タイプの典型的な例としては、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞、骨芽細胞、軟骨細胞および間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が挙げられる。細胞は、分化細胞であってもよく、複能性であっても全能性であってもよい幹細胞であってもよい。
【００２９】
１つ以上の生体細胞は、典型的には哺乳類細胞である。例えば、１つ以上の生体細胞は、ヒト細胞のような霊長類細胞であってもよい。
【００３０】
典型的には、存在すれば、１つ以上の生体細胞は、第１の体積の第１のヒドロゲルの１ｍＬあたり１０４〜１０８個の細胞の濃度で第１の体積の第１のヒドロゲル中に配置される。例えば、第１の体積の第１のヒドロゲル中に配置される生体細胞の濃度は、１ｍＬあたり１０５〜１０７個の細胞であってもよく、１ｍＬあたり１０６〜１０８個の細胞であってもよい。好ましくは、第１の体積の第１のヒドロゲル中の生体細胞の濃度は、１ｍＬあたり１０５個の細胞より高いか、またはそれに等しい。
【００３１】
第１の体積の第１のヒドロゲルは、典型的には、ある体積の水性組成物（インクまたはバイオインクともいわれ得る）をゲル化することによって取得される。該体積のインクまたはバイオインクは、疎水性媒体中にインクまたはバイオインクの小滴を生成することによって製造されてもよい。ゲル化前、インクまたはバイオインクは、典型的には、ヒドロゲル化合物（ゲル化してヒドロゲルを形成する成分）の水溶液と、その中に配置された１つ以上の積載物（存在すれば）を含む。インクまたはバイオインクは、典型的には、特に積載物が生体細胞であれば、培養培地をさらに含む。ゲル化は通常、ヒドロゲルを形成するためにヒドロゲル化合物の相の変化をもたらすのみであるので、すべての成分は典型的にはヒドロゲル中に留まる。
【００３２】
第１の体積の第１のヒドロゲルはさらに、典型的には培養培地を含む。培養培地は、生体細胞を培養するのに適した任意の水性媒体であり、かつ、培養培地は当業者に周知である。培養培地は、典型的には、１つ以上のアミノ酸（例えば、グルタミンまたはそのソース）、１つ以上の塩（例えば、塩化ナトリウムまたはピルビン酸ナトリウム）、グルコースおよび１つ以上のビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｂ、ＣまたはＤ）の水溶液である。培養培地はさらに、１つ以上の抗生物質を含んでいてもよい。抗生物質の例としては、ペニシリンおよびストレプトマイシンが挙げられる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、該体積の第１のヒドロゲルは：（ａ）（ゲル化した）ヒドロゲル化合物を０．５〜３０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で含み；（ｂ）培養培地を６０．０〜９０．０重量％の濃度で含み、かつ、（ｃ）必要に応じて、１つ以上の積載物を含む。
【００３４】
第１の体積の第１のヒドロゲルは、任意の形態であってもよい。第１の体積の第１のヒドロゲルは、任意の形状（例えば、実質的に球状または立方体状）であってもよい単一の連続する体積の第１のヒドロゲルであってもよい。第１の体積の第１のヒドロゲルは、複数の副体積の第１のヒドロゲル（それらの間に境界面を有していてもよい）を含んでいてもよい。典型的には、第１の体積の第１のヒドロゲルは、第１のヒドロゲルの複数の小滴を有する小滴集合を含む。第１の体積の第１のヒドロゲルは、様々なサイズを有していてもよい。例えば、第１の体積の第１のヒドロゲルの最大外形寸法は、１．０ｍｍ〜１０ｃｍであってもよく、１．０ｍｍより小さいか、またはそれに等しくてもよい。物体が最大外形寸法ｘを有していれば、その時、物体は辺の長さがｘである立方体内に収まり得る。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、用語「小滴」は、典型的には、任意の境界を有する（ｂｏｕｎｄ）体積の材料（例えば、液体またはゲルであってもよい）を意味する。小滴の体積は、典型的には１．０ｍＬより少なく、例えば０．１ｍＬより少ない。例えば、５００ｎＬより少ない体積を有する境界を有する体積のある体積のヒドロゲルは、小滴である。最初に生成される時、小滴は、その特徴通り（ｉｎ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ）実質的に球状であってもよい。しかしながら、一旦小滴集合中でその他の小滴と接触すると、小滴は様々な形状を採り得る。典型的には、小滴は、０．５より大きいか、またはそれに等しい（例えば、０．６より大きいか、またはそれに等しい）真球度（例えば、小滴と同一の体積の球の表面積の、小滴の実際の表面積に対する割合）を有する。したがって、小滴の最大外形寸法（例えば、長さ）は、典型的には、小滴の最小外形寸法（例えば、幅）の２．０倍より小さいか、またはそれに等しい。用語「媒体の小滴」は、典型的には、用語「媒体の体積」と同義である。
【００３６】
小滴集合は、典型的には３次元アレイにて配置される、小滴の集合体である。典型的には、小滴集合中、各小滴は、集合中の少なくとも１つのその他の小滴と接触している。「小滴集合」はまた、「［小滴中に含まれる材料の］体積の集合」と呼ばれてもよい。本発明の方法によって製造される小滴集合は、任意のサイズのものであってもよい。例えば、小滴集合の最大外形寸法は、０．０１ｍｍ〜１００．０ｍｍであってもよい。小滴集合の最大外形寸法が１０．０ｍｍより小さいか、またはそれに等しくてもよい（例えば、５．０ｍｍより小さいか、またはそれに等しくてもよい）場合がある。小滴集合はまた、「足場」と呼ばれてもよい。
【００３７】
第１の体積の第１のヒドロゲルを形成してもよい小滴集合は、典型的には、３次元構造体中に配置される第１のヒドロゲルの複数の小滴を含み、かつ、ここで、３次元構造体中の各小滴は、３次元構造体中の少なくとも１つのその他の小滴に接触する。
【００３８】
小滴集合は、典型的には、第１のヒドロゲルの５０個以上の小滴を含む。例えば、小滴集合は、第１のヒドロゲルの１００個以上の小滴を含んでいてもよく、第１のヒドロゲルの５００個以上の小滴を含んでいてもよい。小滴集合は、典型的には、０．００１〜１０００ｎＬ（例えば０．００１〜１００ｎＬ）の体積を有する１つ以上の小滴を含む。１つ以上の小滴の体積は、０．１ｎＬ〜５００ｎＬであってもよく、１．０ｎＬ〜３００ｎＬであってもよい。
【００３９】
典型的には、小滴集合中に２つ以上の細胞タイプが存在すれば、小滴のうちの１つ以上はそれぞれ、第１の体積の第１のヒドロゲル中に配置された２つ以上の生体細胞を含み、かつ、２つ以上の生体細胞は、２つ以上の異なるタイプの生体細胞から選択される。したがって、個別の小滴は、２つ以上のタイプの細胞を含んでいてもよい。代替的には、異なる小滴は異なる細胞タイプを含んでいてもよく、異なる細胞タイプを含有する構造的特徴が小滴集合に組み込まれることを可能にする。したがって、小滴集合が、第１の複数の小滴（小滴のそれぞれが第１の体積の第１のヒドロゲル中に配置された１つ以上の第１のタイプの生体細胞を含む）と、第２の複数の小滴（小滴のそれぞれが第１の体積の第１のヒドロゲル中に配置された１つ以上の第２のタイプの生体細胞を含む）とを含んでいてもよい場合がある。
【００４０】
第１のヒドロゲルは、典型的には、重合体状であるヒドロゲル化合物を含む。例えば、第１のヒドロゲルは、多糖、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、多数の疎水基を含むポリマーまたはそれらの誘導体である、ゲル化したヒドロゲル化合物を含んでいてもよい。第１のヒドロゲルは、典型的には多糖を含む。多糖ヒドロゲル化合物の例としては、アガロース、メチルセルロースおよびヒアルロナンが挙げられる。好ましくは、第１のヒドロゲルはアガロースを含む。第１のヒドロゲルは、典型的には、２０℃より低いゲル化温度を有する。ゲル化温度は、濃度が１０ｍｇ／ｍＬであるヒドロゲル化合物の水溶液について測定されたものであってもよい。
【００４１】
第１の体積の第１のヒドロゲル中のヒドロゲル化合物の濃度は、典型的には、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜５００．０ｍｇ／ｍＬである。例えば、第１の体積の第１のヒドロゲル中のヒドロゲル化合物の濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであってもよく、０．５ｍｇ／ｍＬ〜３０．０ｍｇ／ｍＬであってもよい。ヒドロゲル化合物の濃度は、例えば、１０〜１３ｍｇ／ｍＬであってもよい。
【００４２】
疎水性媒体は、典型的には、疎水性の液体（例えば、水と実質的に混和しない液体）である（例えば、疎水性媒体のうちの２重量％より少ない体積が水と混合する）。第１の疎水性媒体は、任意の疎水性媒体であってもよい。例えば、第１の疎水性媒体は、有機化合物を含んでいてもよい。典型的には、第１の疎水性媒体は、炭化水素化合物を含む。しばしば、第１の疎水性媒体は、炭化水素化合物および／またはシリコーン油を含む。
【００４３】
炭化水素化合物は、炭素および水素原子のみを含む化合物である。水素化合物の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０アルカン（例えば、６〜１８個の炭素原子を有する直鎖アルカン）およびＣ５〜Ｃ１０シクロアルカン（例えば、シクロペンタンまたはシクロヘキサン）が挙げられる。好ましくは、炭化水素化合物は、Ｃ８〜Ｃ１６アルカン（例えば、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカンまたはドデカン）である。好ましくは、炭化水素化合物はウンデカンである。
【００４４】
シリコーン油は、１つ以上のシロキサン基を含む高分子化合物を含む油である。例えば、シリコーン油は、典型的には、有機側鎖を有する重合シロキサンである。例えば、シリコーン油は、ポリジメチルシロキサン、ポリエチルメチルシロキサンまたはポリジエチルシロキサンを含んでいてもよい。
【００４５】
第１の疎水性媒体は、例えば、（炭化水素）：（シリコーン油）の体積比が５０：５０〜８０：２０である炭化水素とシリコーン油との混合物を含んでいてもよい。好ましくは、該体積比は、６０：４０〜７０：３０である。第１の疎水性媒体は、体積比が６０：４０〜７０：３０であるウンデカンとシリコーン油との混合物であってもよい。
【００４６】
第１の疎水性媒体の体積は、典型的には、０．０１ｍＬ〜１００．０ｍＬ（例えば、か〜）である
【００４７】
典型的には、第１の疎水性媒体は、非常に低濃度の両親媒性化合物を含み、好ましくは、両親媒性化合物を実質的に含まない。第１の疎水性媒体中の両親媒性化合物が低レベルまたはゼロレベルであることは、第１の体積の第１のヒドロゲル中のあらゆる両親媒性化合物が除去されることを意味する。典型的には、第１の疎水性媒体は、１つ以上の両親媒性化合物を０．１ｍＭより低いか、またはそれに等しい総濃度で（好ましくは、０．０５ｍＭより低いか、またはそれに等しい総濃度で）含む。例えば、第１の疎水性媒体は、１つ以上の両親媒性化合物を０．０２ｍＭより低いか、またはそれに等しい総濃度で含んでいてもよい。
【００４８】
両親媒性化合物は、親水基および新油基（例えば、疎水基）を両方とも含む化合物である。両親媒性分子は、典型的には、２重層とミセルとを形成することが可能である。両親媒性分子は、当業者に周知である。両親媒性化合物の例としては、トリグリセリド、脂肪酸およびリン脂質のような脂質が挙げられる。典型的には、１つ以上の両親媒性化合物は、リン脂質から選択される。リン脂質は、リン酸基で置換されたグリセロール分子と１つ以上の脂肪酸基とを含む化合物である。１つ以上の両親媒性化合物は、ホスホコリン脂質であってもよい。
【００４９】
本発明の方法では、ある体積の水性組成物が、第１の体積の第１のヒドロゲルの周りに配置される。「周りに配置する」は、典型的には「上に配置する」と同義である。なぜなら、疎水性媒体内のある体積の液体が、別の親水性の物体（すなわち、第１の体積の第１のヒドロゲル）を自発的に被覆するであろうからである。該体積の水性組成物は、第１の体積の第１のヒドロゲルを被覆し、かつ、一旦水性組成物がゲル化すると、これは、第１の体積の第１のヒドロゲル内の構造と任意のパターン忠実性との維持を補助する第１の体積の第１のヒドロゲルの周りの保護層として作用する第２の体積の第２のヒドロゲルを提供する。
【００５０】
ヒドロゲル物体は、典型的には、第１の体積の第１のヒドロゲルの表面上に配置された第２のヒドロゲルの層を含む。第２のヒドロゲルの層は、典型的には、第１の体積の第１のヒドロゲルの表面積の８０％より大きいか、またはそれに等しい範囲を覆う。第２のヒドロゲルは、例えば、第１の体積の第１のヒドロゲルの全表面を被覆してもよい。第２のヒドロゲルの層の厚さは、０．０１ｍｍより厚いか、またはそれに等しくてもよい（例えば、０．１ｍｍより厚いか、またはそれに等しい）。典型的には、第２のヒドロゲルの層の厚さは、１．０〜２００μｍ（例えば、４５〜８５μｍ）である。
【００５１】
第１の体積の第１のヒドロゲルの周りに第２の体積の第２のヒドロゲルを形成することは、典型的には、まず、第１の体積の第１のヒドロゲルの周りにヒドロゲル化合物（その後ゲル化して第２の体積の第２のヒドロゲルを形成し得る）を含むある体積の水性組成物を形成することを含む。第１の体積の第１のヒドロゲルの周りにヒドロゲル化合物を含む該体積の水性組成物は、第１の体積の第１のヒドロゲルを自発的に湿らせる水性組成物の小滴によって形成され得る。疎水性媒体中の両親媒性化合物が低濃度であることが、湿潤を促進する。
【００５２】
典型的には、第１の体積の第１のヒドロゲルの周りにヒドロゲル化合物を含むある体積の水性組成物を配置することは：第１の疎水性媒体中に水性組成物の小滴を生成することと；水性組成物の小滴を第１の体積の第１のヒドロゲルと接触させることとを含む。一旦水性組成物の小滴が第１の体積の第１のヒドロゲルに接触すると、それは、典型的には、第１の体積の第１のヒドロゲルを自発的に湿らせ、かつ被覆するであろう。水性組成物の小滴は、第１の体積の第１のヒドロゲルとの接触と同時に生成されてもよい。
【００５３】
水性組成物中のヒドロゲル化合物は、典型的には、高分子化合物（例えば、多糖、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、多数の疎水基を含むポリマーまたはそれらの誘導体）である。ヒドロゲル化合物は、典型的には多糖（例えば、アガロース、メチルセルロースおよびヒアルロナン）である。好ましくは、ヒドロゲル化合物はアガロースである。ヒドロゲル化合物を含む水性組成物は、典型的には、２０℃より低いゲル化温度を有する。
【００５４】
水性組成物中のヒドロゲル化合物の濃度は、典型的には、０．０１ｍｇ／ｍＬ〜５００．０ｍｇ／ｍＬである。例えば、水性組成物中のヒドロゲル化合物の濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１００．０ｍｇ／ｍＬであってもよく、０．５ｍｇ／ｍＬ〜３０．０ｍｇ／ｍＬであってもよい。例えば、水性組成物は、ヒドロゲル化合物を１．０〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでいてもよい。好ましくは、水性組成物は、アガロースを８．０ｍｇ／ｍＬ〜２０．０ｍｇ／ｍＬの濃度で含む。
【００５５】
水性組成物は、水を含む任意の液体媒体であってもよい。典型的には、水性組成物は、８０重量％より多いか、もしくはそれに等しい水、または、９０重量％より多いか、もしくはそれに等しい水を含む組成物である。ヒドロゲル化合物を含む水性組成物は、典型的には、水に溶解したヒドロゲル化合物を含む。
【００５６】
水性組成物と該体積の第１のヒドロゲルとの総体積は、典型的には、１００ｎＬより多いか、またはそれに等しい。好ましくは、総体積は、１０００ｎＬより多いか、またはそれに等しい。
【００５７】
第２のヒドロゲルは、第１のヒドロゲルと同一であっても異なっていてもよい。典型的には、第１および第２のヒドロゲルは両方とも、アガロースを含む。
【００５８】
ヒドロゲル化合物を含む水性組成物にゲルを形成させることは、典型的には、水性組成物を冷却すること、または、水性組成物をゲル化を引き起こす化合物もしくは電磁照射（例えば、ＵＶ光）に曝露することを含む。ヒドロゲル化合物を含む水性組成物にゲルを形成させることは、典型的には、ヒドロゲル化合物を有する該体積の水性組成物を２０．０℃より低いか、またはそれに等しい（例えば、１０．０℃より低いか、またはそれに等しい）温度まで冷却することを含む。
【００５９】
一旦水性組成物がゲル化して第２の体積の第２のヒドロゲルを形成すると、ヒドロゲル物体と第１の疎水性媒体の少なくとも一部とは、典型的には、レセプタクルへと動かされ、該レセプタクルの中で、第１の疎水性媒体から水性媒体へのヒドロゲル物体の相間移動が起こり得る。ヒドロゲル物体と第１の疎水性媒体の少なくとも一部とをレセプタクルへと移動させることは、例えば、ピペットを用いてヒドロゲル物体を移動させることを含んでいてもよい。第１の体積の第１のヒドロゲルは、典型的には、水性媒体へと移される前に、第２の疎水性媒体へと動かされる。レセプタクルは、典型的には、下記で説明するように、２つの相（第１の相と第２の相）を含むカラムである。
【００６０】
ヒドロゲル物体を第１の疎水性媒体から水性媒体へと移すことは、典型的には、ヒドロゲル物体を第２の疎水性媒体から水性媒体へと移動させることを含む。ヒドロゲル物体を移動させることは、ヒドロゲル物体に力を加えてそれが移動することを引き起こすこと、また、ヒドロゲル物体をそれ自体の力で移動させることのいずれかを含む。
【００６１】
第２の疎水性媒体は、典型的には、本発明の方法中の相間移動ステップにおける疎水性相である。したがって、ヒドロゲル物体は、上記のように、第１の疎水性媒体中に形成される。ヒドロゲル物体は、その後、必要に応じて第１の疎水性媒体の少なくとも一部とともに、例えばピペットを用いて、第２の疎水性媒体（典型的には、相間移動カラム中の相である）へと動かされる。ヒドロゲル物体が水性媒体へと移されるのは、その後、この第２の疎水性媒体からである。
【００６２】
第２の疎水性媒体は、第１の疎水性媒体と同一であっても異なっていてもよい。典型的には、第２の疎水性媒体は、炭化水素化合物および／または鉱油を含む。水素化合物の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０アルカン（例えば、１０〜１８個の炭素原子を有する直鎖アルカン）およびＣ５〜Ｃ１０シクロアルカン（例えば、シクロペンタンまたはシクロヘキサン）が挙げられる。好ましくは、炭化水素化合物は、Ｃ１０〜Ｃ１８アルカン（例えば、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカンおよびヘプタデカン）である。好ましくは、炭化水素化合物はヘキサデカンである。用語「鉱油」は、当業者に周知である。典型的には、鉱油は、１つ以上のアルカンと１つ以上のシクロアルカンとを含む。鉱油は、例えば、８〜１６個の炭素原子を有する１つ以上の直鎖アルカンを含んでいてもよい。鉱油の密度は、典型的には、２５℃において０．７〜０．９ｇ／ｃｍ３である。好ましくは、第２の疎水性媒体は、ヘキサデカンと鉱油とを含む。第２の疎水性媒体は、典型的には、ヘキサデカンと鉱油とを、（ヘキサデカン）：（鉱油）の体積比１：１〜５：１で含む。
【００６３】
第１の体積の第１のヒドロゲルを含む第２の体積の第２のヒドロゲルを第１の疎水性媒体から水性媒体へと移すことは、ヒドロゲル物体を第１の相（第２の疎水性媒体である）を介して第２の相（水性媒体である）へと渡すことを含み、かつ、第２の相は、第１の相と接触している。第１の相と第２の相とは、典型的には、相間移動カラム中にある。したがって、第１の相は、システムの温度では第２の相より低密度である。第１の相は、第２の相より上に配置される。
【００６４】
第１の相は、典型的には、第２の相より低い密度を有し、かつ、第２の相の上に配置され、かつ、ヒドロゲル物体を第１の相を介して第２の相へと渡すことは、ヒドロゲル物体を重力の影響で第１の相を介して第２の相へと落下させることを含む。ヒドロゲル物体が相境界を介して落下することを引き起こすために、第１および第２の相を撹拌する必要があるかも知れない場合がある。
【００６５】
水性媒体は、典型的には、第１の体積の第１のヒドロゲル中に配置された任意の生体細胞を培養するのに適した水性媒体である。水性媒体は、典型的には、培養培地を含む。第１の体積の第１のヒドロゲルは、したがって、その中に配置された１つ以上の生体細胞をさらに含んでいてもよく、かつ、本方法は、１つ以上の生体細胞を培養するステップをさらに含んでいてもよい。
【００６６】
第１の疎水性媒体中の第１の体積の第１のヒドロゲルの形成は、しばしば、両親媒性分子含有疎水性媒体中での第１のヒドロゲルの前駆体の小滴の生成と、後に続く両親媒性分子含有疎水性媒体と第１の疎水性媒体（典型的には、両親媒性分子を含まない）との置換とを含む。両親媒性分子が第１の体積の第１のヒドロゲルの形成を補助してもよい一方で、それらは、典型的には、その後は必要とされない。
【００６７】
したがって、いくつかの実施形態では、本方法はさらに、ステップ（ｉ）の前に：（ａ）両親媒性分子含有疎水性媒体を含む組成物を提供するステップを含み、該両親媒性分子含有疎水性媒体は、その中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルを有し；（ｂ）両親媒性分子含有疎水性媒体に第１の疎水性媒体を添加するステップを含み、必要に応じて、両親媒性分子含有疎水性媒体の少なくとも一部を第１の疎水性媒体と置換するステップを含む。両親媒性分子含有疎水性媒体の少なくとも一部を第１の疎水性媒体と置換することは、第１のヒドロゲルを囲む疎水性媒体中の両親媒性分子の濃度を下げることと、両親媒性分子を拡散させることとによって、第１の体積の第１のヒドロゲルから両親媒性分子を除去し得る。両親媒性分子含有疎水性媒体の少なくとも一部を第１の疎水性媒体と置換することは、繰り返し（例えば、２または３回）なされてもよい。両親媒性分子含有疎水性媒体の少なくとも一部を第１の疎水性媒体と置換することは、典型的には、第１の体積の第１のヒドロゲルを囲む疎水性媒体中の両親媒性分子の濃度が０．１ｍＭより低いか、もしくはそれに等しくなるか、または、０．０２ｍＭより低いか、もしくはそれに等しくなるまで繰り返される。
【００６８】
典型的には、ステップ（ｉ）の前のステップでは、両親媒性分子含有疎水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルは、第１のヒドロゲルの１つ以上の小滴を含み、第１のヒドロゲルの１つ以上の小滴はそれぞれ、両親媒性分子の外層を含む。
【００６９】
本発明はまた、水性媒体と、水性媒体中に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物を提供し、当該組成物は、本明細書に記載の方法から取得可能である。
【００７０】
本発明はまた、第１の体積の第１のヒドロゲルを製造するための方法を提供し、当該方法は：（ｉ）本明細書に記載の方法によって、水性媒体と、水性媒体に配置された第１の体積の第１のヒドロゲルとを含む組成物を製造することと；（ｉｉ）第１の体積の第１のヒドロゲルを単離することとを含む。第１の体積の第１のヒドロゲルを単離することは、例えば、水性媒体を除去することを含んでいてもよい。第１の体積の第１のヒドロゲルは、その後単離されるが、典型的には未だヒドロゲル物体内に配置されている。第２の体積の第２のヒドロゲルは、典型的には、栄養素およびその他の分子が、第１の体積の第１のヒドロゲルからヒドロゲル物体の外面へと第２の体積の第２のヒドロゲルを介して進むことを可能にする。
【００７１】
本発明はまた、第１の体積の第１のヒドロゲルを提供し、当該第１の体積の第１のヒドロゲルは、本明細書に記載の方法によって取得可能である。
【００７２】
本発明はまた、組織様材料を製造するための方法を提供し、当該方法は、本明細書に記載の方法を実行するステップを含む。本方法は、典型的には、ヒドロゲル物体を培養することのような追加のステップをさらに含む。本発明はまた、組織様材料を提供し、当該組織様材料は、本明細書に記載の方法によって取得可能である。
【００７３】
本発明は、ヒドロゲル物体を提供し、当該ヒドロゲル物体は、第１の体積の第１のヒドロゲルと第２の体積の第２のヒドロゲルとを含み、該第２の体積の第２のヒドロゲルは、第１の体積の第１のヒドロゲルの周りに配置され、ここで、第１の体積の第１のヒドロゲルは、第１のヒドロゲルの複数の小滴を含む小滴集合を含み、かつ、第１のヒドロゲルの各小滴は、その中に配置された１つ以上の積載物を含む。ヒドロゲル物体はさらに、本明細書に記載のものであってもよい。第１の体積の第１のヒドロゲルと第２の体積の第２のヒドロゲルとは、本明細書に記載のものであってもよい。
【００７４】
好ましくは、１つ以上の積載物は、１つ以上の生体細胞である。
【００７５】
本発明はまた、水性媒体と、水性媒体中に配置された本明細書に記載のヒドロゲル物体とを含む組成物を提供する。
【００７６】
本発明は、以下の実施例において、さらに説明されるであろう。
【実施例】
【００７７】
概要
細胞を搭載した小滴集合（足場）が、高細胞密度かつ高解像度である小滴ネットワークとして細胞を搭載したバイオインク（続いて、ゲル化し、ゲル封入され、その後バルク培養培地へと相間移動した）を３Ｄパターニングすることによって製造された。含まれるステップは：（ｉ）足場溶液を作成すること；（ｉｉ）足場溶液中で採取された細胞をバイオインクとして再懸濁させること；（ｉｉｉ）小滴ネットワークへのバイオインクの３Ｄ小滴プリント；（ｉｖ）細胞足場のゲル化および相間移動である。細胞足場は、その後、１週間以上の間、培養され得、生物活性を示す高密度の微細組織を形成する。
【００７８】
該ステップは以下で簡潔に説明され、かつ、さらなる詳細が実験の詳細のセクションにて見られ得る。
【００７９】
足場溶液：
足場溶液は、必要とされる場合、追加的な細胞特異的添加物を有するバルク細胞培養培地（ｂｕｌｋ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｕｍ）中のヒドロゲルから作成される。用いられたヒドロゲルは、ゲル化温度が極低温であるアガロースであった。なぜなら、これから構成されるバイオインクが、室温でゾル（またはプレゲル液体）としてプリントされ、その後、冷蔵庫内で４℃でゲル化し得るからである。用いられた添加物は、ＦＭＯＣ−ジペプチド（ＦＭＯＣ−ＩＧおよびＦＭＯＣ−ＦＦ、ここで、Ｉはイソロイシンであり、Ｇはグリシンであり、かつ、Ｆはフェニルアラニンである）であり、ネットワーク安定化剤として作用し（すなわち、癒合を防止した）、かつ、ネットワーク内の小滴と小滴との接着を増大させた。細胞外マトリックスタンパク質（ＥＣＭ）もまた、バイオインクを補うのに用いられ、かつ、これらはＩ型コラーゲン、フィブロネクチンまたはラミニンのいずれかであった。なぜなら、これらが細胞のための接着部位を提供するからである。これらＥＣＭが足場内の細胞増殖を促すことが経験的に注目された。実験の大部分において、用いられたＥＣＭ添加物はＩ型コラーゲンであった。
【００８０】
採取された細胞のバイオインクとしての再懸濁：
標準的な２Ｄ培養法によって増殖した細胞が、培養フラスコから採取され、かつ、遠心分離されてペレットを得た。この細胞ペレットは、その後、典型的な細胞密度である１５×１０６個の細胞／ｍＬで足場溶液中に再懸濁された。細胞はこの高密度で再懸濁された。なぜなら、細胞が、プリントされた構造体中に互いに複数の接点を形成し、かつ、その他の観察されたより低い細胞密度の足場よりも良好に増殖し得ることを見出したからである。用いられた哺乳類細胞株は、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＨＥＫ−２９３／ＹＦＰ、ＨＥＫ−２９３／ＣＦＰ、ヒツジ間葉系幹細胞（ｏＭＳＣ）、ｏＭＳＣ由来骨芽細胞およびマウス軟骨細胞を含んでいた。
【００８１】
小滴ネットワークの３Ｄバイオプリント：
細胞を搭載した小滴ネットワークとしてバイオインクをプリントするために、３Ｄ小滴プリンターが用いられた。プリントは、まず、バイオインクを搭載したプリントノズルを油中脂質溶液の浴槽へと降下させること、および、小滴を再現可能に形成するプリントパラメーターを見出すことによってなされた。これら条件は、その後、空間的に配置された小滴の連続する積層（デジタル方式の「プリントマップ」に基づく）によって、３Ｄ小滴ネットワークのプリントを自動化するのに用いられ得た。用いられた最適化されたプリント油は、１．２ｍＭのＤＰｈＰＣを含有する、ウンデカン：シリコーン油の体積比が６５：３５である混合物であった。この油は、理想のプリント（最適化された沈降速度）を可能にするために設計され、かつ、ＤＰｈＰＣは、それが安定的な２重層を形成するので用いられる。バイオインクプリントされたネットワークについて、構造体がいかなる小滴と小滴との癒合もほとんど示さず、かつ、ぎっしり詰まった構造体を形成したことが観察された。
【００８２】
ネットワークのゲル化およびゲル被覆（相間移動の準備）：
プリントされたネットワークは、２０〜２５分間、４℃まで冷却することによってゲル化された。ゲル化したカーゴを搭載したネットワークは、パターン忠実性における喪失を示さなかった。構造体は、少量のアガロースヒドロゲル（０．２〜０．４ｎＬ）中に被覆された。まず、プリント油がシリコーン油と交換され、その後、アガロース溶液の小滴がプリントされた構造体と癒合した。油交換は、プリントされたネットワークから脂質を除去し、小滴境界面の２重層の形成ではなく癒合が起きることを可能にするのに用いられた。被覆された構造体は、その後、ゲル化された（２０〜２５分間、４℃）。包装ステップは、それが相間移動中、ゲル小滴を一緒に保持し、かつ、形状の歪みを防止するので重要である。
【００８３】
細胞足場の相間移動：
構造体は、油と培養培地との境界面（この場合、細胞培養培地より上に、体積比が３：１であるヘキサデカンと鉱油との混合物がある２相カラム）を通過することによって相間移動した。細胞足場が、上方の油相へとマイクロピペットを用いて移され、かつ、重力によって境界面を通過した。相間移動後、油は除去され、かつ、細胞足場は細胞インキュベーターに貯蔵され、かつ、１週間にわたって培養された。
【００８４】
油混合物は、先行して発行された相間移動実験に基づいて、異なる油と脂質との組み合わせを経験的に試験することによって見出された。この油の組み合わせは、ネットワークが最小限の油の混入を伴って境界面を介して緩やかに沈むことを可能にすることが見出された。
【００８５】
実験の詳細：
足場溶液：
このセクションは、相間移動可能な足場を製造するのに用いられた足場溶液（バイオインクとも呼ばれる）について検討する。まず、バイオインクの取り扱いおよび組成が説明され、その後、足場添加物の作成方法が説明される。
【００８６】
溶液の調製の概観
足場溶液１〜３（ＳＳ１〜３）（表１参照）はすべて、同一の方式で製造された：すなわち、足場のバルク相が液体またはプレゲル溶液としてまず調製され、その後、足場添加物が添加され、最終的に、細胞が所望の密度で再懸濁された。
【００８７】
細菌感染を最小限にするために、足場溶液を滅菌するのに種々のステップが採用された。しかしながら、各バイオインク製造は、可能である場合、無菌技術およびバイオインク処理を用い、かつ、層流安全キャビネットにおいて実行された。結果として生じた細胞を搭載したバイオインクは、使用前、ＣＯ２インキュベーター［Ｍｉｄｉ  ４０、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社］において５％のＣＯ２で３７℃で貯蔵された。バイオインクは概して製造から３０分以内にプリントされたが、使用前、最大４時間貯蔵された。
【００８８】
アガロース系溶液（ＳＳ１〜ＳＳ３）
アガロース系足場溶液はすべて、足場添加物を有するか、または有しない、ゲル化点が極低であるアガロースから構成された。これら溶液は液体として調製され、かつ、ＥＣＭタンパク質または細胞が添加されるまで（その時点で溶液は３７℃で保たれた）、アガロースゲルの融解温度より上（すなわち、〜５０℃）で保たれた。細胞の添加前、溶液はそれぞれ、動力が半分に設定されたＬＥＤドライバー［ＬＥＤＤ１Ｂ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ社］によって制御されたＵＶ  ＬＥＤ［Ｅｃｌｉｐｓｅ−Ｍ３６５Ｌ２−Ｃ５、ニコン社］の下で３６５ｎｍの波長において１５分間、ＵＶ照射された。アガロース系足場溶液はすべて、作成日に用いられ、かつ、将来の使用のためには貯蔵されなかった。
【００８９】
ＳＳ１およびＳＳ２：ＦＭＯＣ−ＸＸを有するアガロース
ＦＭＯＣ−ジペプチドが添加されたアガロース溶液が、それぞれ体積比が８：１である１３〜１５ｍｇ／ｍＬのアガロースと１０ｍＭのＦＭＯＣ−ＸＸとの混合物として調製された。元々のアガロース溶液（ＳＳ１）は希釈されておらず、一方で、希釈されたアガロース溶液（ＳＳ２）はまた、１０体積％のＰＢＳを含有していた。足場溶液１については細胞の添加前、足場溶液２についてはＰＢＳの添加前にＵＶ処理が適用された。
【００９０】
足場溶液１の最終組成は、８８．９％の基礎培地および１１．１％の超純水中、１１．６〜１３．３ｍｇ／ｍＬのアガロースおよび１．１ｍＭのＦＭＯＣ−ＸＸであった。
【００９１】
一方、足場溶液２の最終組成は、８０％の基礎培地、１０％の超純水および１０％のＰＢＳ中、１０．４〜１２．０ｍｇ／ｍＬのアガロースおよび１．０ｍＭのＦＭＯＣ−ＸＸであった。
【００９２】
ＳＳ３：ＦＭＯＣ−ＸＸとＥＣＭ添加物とを有するアガロース
追加のバイオインクは、足場溶液２を種々の濃度のＥＣＭタンパク質（コラーゲン、フィブロネクチンまたはラミニンのいずれか）で補うことを伴った。調製は、ＦＭＯＣ−ＸＸ溶液を有するＵＶ滅菌されたアガロースに対して、ＰＢＳ中のＥＣＭタンパク質が所望の濃度で最初に添加され、それに続いてＰＢＳのみが添加されて１０体積％のＰＢＳ画分を与えること以外は、足場溶液２と同一であった。足場溶液はこの段階で、２８００超音波洗浄器［Ｂｒａｎｓｏｎ社］において超音波処理された（５分、４０ｋＨｚ）。ＥＣＭタンパク質は、コラーゲンについて３．５〜３００μｇ／ｍＬであり、かつ、フィブロネクチンおよびラミニンについて０．５〜２０μｇ／ｍＬである濃度範囲の間で補われた。１５μｇ／ｍＬのコラーゲンの添加が、微細組織の増殖のための標準として選択された。
【００９３】
したがって、標準的な足場溶液３の最終組成は、８０％の基礎培地、１０％の超純水および１０％のＰＢＳ中、１０．４〜１２．０ｍｇ／ｍＬのアガロース、１．０ｍＭのＦＭＯＣ−ＸＸおよび１５μｇ／ｍＬのコラーゲンであった。
【００９４】
足場添加物の調製
１０ｍＭのＦＭＯＣ−ＩＧおよび１０ｍＭのＦＭＯＣ  ＦＦ溶液
ＦＭＯＣ−イソロイシン−グリシン（ＦＭＯＣ−ＩＧ）およびＦＭＯＣ−フェニルアラニン−フェニルアラニン（ＦＭＯＣ−ＦＦ）の１０ｍＭ溶液が、−２０℃で貯蔵されていた粉末アリコートから調製され、かつ、室温まで昇温させられた。ＦＭＯＣ−ＩＧ（１６ｍｇ）とＦＭＯＣ−ＦＦ（１２ｍｇ）とは、１ＭのＮａＯＨ（１０〜２０μＬ）を有する超純水（１．５ｍＬ）に別々に溶解し、一晩中撹拌された。部分的に可溶化したＦＭＯＣ溶液は、Ｂｒａｎｓｏｎ社の２８００超音波洗浄器において超音波処理され（２０分、３７℃、４０ｋＨｚ）、ｐＨが０．１ｍＭのＮａＯＨを用いて８．５０（ＦＭＯＣ−ＩＧ）および１０．５０（ＦＭＯＣ−ＦＦ）のいずれかに調整され、その後、超純水を用いて３ｍＬの総体積へと希釈された。ＦＭＯＣ−ＩＧとＦＭＯＣ−ＦＦとは、１週間以内に用いられ、必要であれば使用前にｐＨが調整された。
【００９５】
１０ｍＭのＦＭＯＣ−ＸＸ溶液
ＦＭＯＣ−ＸＸ溶液は、ＦＭＯＣ−ＩＧおよびＦＭＯＣ−ＦＦの等しいモル比の溶液であった。１０ｍＭのＦＭＯＣ−ＸＸ溶液については、１０ｍＭのＦＭＯＣ−ＦＦと１０ｍＭのＦＭＯＣ−ＩＧとが体積比１：１の溶液として混合され、その後、超音波処理された（４０ｋＨｚ）。ＦＭＯＣ−ＸＸは、使用日に新たに作成された。
【００９６】
アガロース溶液
ゲル化点が極低であるアガロース［Ａ５０３０］が、１３〜１５ｍｇ／ｍＬのアガロース溶液を作成するのに用いられた。典型的には、アガロース粉末と基礎培地とが水槽（６５℃）中で温められた。温められたアガロース粉末（典型的には、〜１２ｍｇ）は、温められた基礎培地（典型的には、〜０．８ｍＬ）に溶解した。溶媒化を促進するために、溶液はボルテックス混合され、かつ、必要に応じて、マイクロピペット吸引によって機械的に摂動され、または超音波処理された（４０ｋＨｚ）。アガロース溶液は、一旦作成されると水槽（６５℃）に放置された。基礎培地は、ＨＥＫ−２９３派生細胞株用のＯｐｔｉ−ＭＥＭ登録商標またはｏＭＳＣ、骨芽細胞および軟骨細胞用のＤＭＥＭ−ＩＴＳのいずれかであった。
【００９７】
ＥＣＭタンパク質添加物
ＥＣＭタンパク質が、ストック濃度から活性ゲル形態（すなわち、使用溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ））へと希釈することによって調製された。ＥＣＭタンパク質のストック溶液は、５．０ｍｇ／ｍＬのウシコラーゲンＩ、１．０ｍｇ／ｍＬの天然マウスラミニンおよび１．０ｍｇ／ｍＬのヒトフィブロネクチンであり、４℃（コラーゲン）または−２０℃（ラミニンおよびフィブロネクチン）のいずれかにおいてアリコートとして貯蔵された。コラーゲンＩゲル使用溶液（３．０ｍｇ／ｍＬ）が、氷冷試薬を順番に混合することによって調製された：コラーゲンＩストック（５０μＬ）、１０×濃縮ＰＢＳ（８．３μＬ）、１ＮのＮａＯＨ（１．３μＬ）および超純水（２３．８μＬ）。ラミニンおよびフィブロネクチン使用溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）が、ＰＢＳ中で各ストック溶液を希釈することによって作成された（典型的には、１０μＬのタンパク質ストックを９０μＬのＰＢＳで）。ＥＣＭタンパク質使用溶液はすべて、層流生物学的安全キャビネットにおいて、バイオインクへのそれらの添加の直前に調製された。
【００９８】
表１：アガロース系バイオインクの組成。
【００９９】
【表１】
2019506888.tif 000002
【０１００】
採取された細胞のバイオインクとしての再懸濁：
細胞は、次のように採取され、かつ、足場溶液へと混合された。ＨＥＫ−２９３Ｔ（すなわち、非接着細胞）については、コンフルエントなＴ２５フラスコ培養物がＯｐｔｉ−ＭＥＭ登録商標（５ｍＬ）中に再懸濁され、これのアリコート（典型的には、１〜２ｍＬ）が、５７０２遠心分離機［Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社］中で遠心分離され（３〜５分、３００〜５００×Ｇ）、かつ、結果として生じたペレットが、所望の細胞密度で足場溶液中に再懸濁された。典型的な再懸濁については、１００〜２００μＬの足場溶液が細胞と混合され、１５×１０６個の細胞／ｍＬの溶液を与えた。一方、ＨＥＫ−２９３／ＹＦＰのような接着細胞株については、細胞溶液のアリコートが取得される前に、培養物がまずトリプシン処理され、その後、遠心分離後にＯｐｔｉ−ＭＥＭ登録商標（３１９８５−０６２）中に再懸濁された。ＭＳＣ、骨芽細胞または軟骨細胞バイオインクが調製された時、細胞はＯｐｔｉ−ＭＥＭ登録商標の代わりにＤＭＥＭ−ＩＴＳ培地中に再懸濁された。
【０１０１】
細胞懸濁アリコートから所望の密度で細胞を再懸濁させるために、アリコートの細胞密度がまず測定され、かつ、再懸濁体積が方程式３を用いて計算された。この方程式は、溶液の総細胞数（ｎｃｅｌｌｓ）＝細胞密度（ρｃｅｌｌｓ、単位は細胞／ｍＬ）×体積（Ｖｃｅｌｌｓ、単位はｍＬ）  式１から生じる。再懸濁については、細胞の総数は変化せず、したがって、細胞数の式は、元々の体積の溶液と最終（ｆｉｎａｌ）の体積の溶液を方程式２として同等化するのに用いられ得、方程式２は方程式３として再構成され得る。
【０１０２】
【数１】
2019506888.tif 000003
【０１０３】
【数２】
2019506888.tif 000004
【０１０４】
【数３】
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【０１０５】
細胞のアリコートの密度を測定する標準的な方法は、１００μＬの細胞アリコートと１００μＬのトリパンブルー溶液（死細胞のみ、濃い青色で染色された）とを混合して計数溶液を製造することであった。この溶液（２×１０μＬ）が、使い捨ての血球計算器チップに添加され、該使い捨ての血球計算器チップはチップのいずれの側面上にもある自動細胞計数器［ＩＩ  ＦＬ、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ社］によって読み取られ、値のセットを２つ与えた。自動細胞計数器は、生細胞密度、死細胞密度および総細胞密度を与える。２つの生細胞密度計数の平均が、初期（ｉｎｉｔｉａｌ）細胞密度についての値として用いられ、続いて、方程式３を用いて再懸濁／最終体積を計算するために用いられた。
【０１０６】
小滴ネットワークの３Ｄバイオプリント：
小滴プリンターの概観
小滴を生成するための装置（例えば、小滴ネットワークの３Ｄプリンター）の例の説明は、Ｖｉｌｌａｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０，  ４８〜５２  （２０１３）に見られ得る。要すれば、小滴生成器（「ピエゾ」と呼ばれる場合がある）は、突出した先細りのキャピラリーと共に、水性チャンバーの背面を密封する圧電ディスクを含んでいた。ピエゾは、先端部が油中脂質溶液のようなバルク疎水性媒体（ｂｕｌｋ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｍｅｄｉｕｍ）中に沈められる時、方形波電圧パルスの印加の際にノズルから小滴を吐出し得る。プリントステージ（例えば、油容器）を３次元で移動させるのに、電子マイクロマニピュレーターが用いられた。これは、デジタル方式の「プリントマップ」を解釈し、かつ、小滴吐出を自動化する、実験室で設計されたプリントソフトウェアとの組み合わせで、空間的に配置された小滴の連続する積層による３Ｄ小滴ネットワークの構築を可能にした。
【０１０７】
プリンターの準備
プリント前、ピエゾの水性チャンバーと、プリント油容器と、その他のプリント物品とが、超純水およびエタノールで十分に洗浄され、その後、Ｎ２（ｇ）の下で乾かされた。使用の日、キャピラリーは、超純水、エタノールおよびイソプロパノールで洗浄され、その後、Ｎ２（ｇ）の下で乾かされた。洗浄されたキャピラリーは、続いてプラズマ洗浄装置［Ｆｅｍｔｏ  ｖｅｒｓｉｏｎ  Ａ、Ｄｉｅｎｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ社］中に真空密封され、かつ、酸素プラズマで処理された（８分、５〜１０ＳＣＣＭ）。器具が洗浄されると、ピエゾが超純水で充填され、かつ、キャピラリーが挿入された。
【０１０８】
バイオインクを新たに充填するごとの合間に、キャピラリーがビルコン（Ｖｉｒｋｏｎ）、その後で８ＭのＮａＯＨ中に浸すことによって洗浄され、かつ、水性チャンバーに喪失水量が補充された。アガロース系バイオインクについては、キャピラリーがまた、６５℃で純水中に浸すことによって洗浄された。
【０１０９】
プリントされた細胞を搭載した小滴ネットワーク
細胞を搭載した足場が、細胞を含有するアガロース系足場溶液（すなわち、バイオインク）を用いて、１．２ｍＭのＤＰｈＰＣを含有する、体積比が６５：３５である（ウンデカン）：（シリコーン油）の混合物にプリントされた。標準的なプリントプロトコールが、以下に続く。
【０１１０】
バイオインクがボルテックス混合され、かつ、アリコート（１０μＬ）が、ヘキサデカン（８μＬ）と一緒にプリンターの充填用ウェルアレイに配置された。ヘキサデカン（〜１μＬ）がまずプリンターノズルに吸引充填され、バイオインク（１〜６μＬ）がその後に続いた。アガロース系バイオインクについては、ガラスキャピラリーの外側先端部が続いて純水中に浸されたレンズ用紙で拭かれた。
【０１１１】
一旦キャピラリーがプリント油（通常、２００μＬ）中に沈められると、ピエゾは、理想的には均一サイズのシングレット小滴の再現可能な吐出用の条件が見出されるまで、種々の電圧パルスで継続的に始動した。典型的な調整パルスパラメーターは、４０〜６３Ｖの電圧で５０〜３５０μｓパルス−幅であった。
【０１１２】
調整パルスは、細胞を搭載した小滴ネットワークを自動的にプリントするのに用いられ得る。典型的には、このプリントパルスの電圧は、一貫した小滴製造を保つために、複数のネットワークのプリントセッションの間ずっと、徐々に増大した。概して、複数のネットワークは、同一のプリントチャンバー内に連続してプリントされ、最後のネットワークは移動前に５分間放置された。バイオインクのプリント順およびプリントパラメーターについての情報が、異なるネットワークタイプについて以下で見られる。
【０１１３】
単一細胞タイプの足場
単一細胞タイプの細胞足場が、７×９または７×８の水平マップ寸法（ｘ×ｙ画素）を有する２〜４層の小滴立方体として主にプリントされた。相間移動する足場（すなわち、小滴集合）については、４層が通常の厚さであった。かかる足場は、図２および図３に示されている。
【０１１４】
ラメラ足場（２細胞タイプ）
すべての接合足場について、コラーゲンを有している、または有していない細胞を搭載したバイオインクが、まず１型細胞をプリントし、その後、ノズル洗浄およびバイオインク充填の後で２型細胞をプリントするために、単一の小滴生成器を用いてプリントされた（ａｓ  ｐｒｉｎｔｅｄ）。各接合点は、基部がより幅の広い小滴立方体（１型細胞）から構成され、その上には、中心に整列したより幅の狭い小滴立方体（２型細胞）があった。ラメラ足場は、図４に示されている。
【０１１５】
すべての例において、接合ネットワークが次のようにプリントされ、下方の小滴シートが３〜４層についてのフルマップ（すなわち、小滴が各画素において吐出されたマップ）としてプリントされ、その後、時々、構造体の縁部が上にある２つのさらなる層についての中空マップ（すなわち、小滴がマップの境界においてのみ吐出されたマップ）をプリントすることによって平らにされた。上方の層が同様にプリントされた：３〜４層についてのフルマップ、その後、時々、２層についての中空マップ。特定のマップサイズおよび各接合点についてプリントされた層の数が、表２に要約されている。
【０１１６】
表２：細胞接合点製造についてのプリントの詳細。各接合点のプリントは、上方および下方の層についてのバイオインクの細胞密度とマップ寸法（水平画素ｘ×ｙ×垂直画素ｚ）とを用いて列挙されている。非蛍光細胞は、ｒｅｄ  ＣＭＰＴＸ（ＲＣ）またはｄｅｅｐ  ｒｅｄ（ＤＲ）ｃｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ商標色素で染色された。軟骨細胞と骨芽細胞との接合点は、２つの別々の機会にプリントされた（それらがプリントされた順番で列挙されている）。
【０１１７】
【表２】
2019506888.tif 000006
【０１１８】
プリントされた足場のゲル化およびゲル封入：
プリントされた足場のゲル化およびゲル封入のステップは、図１に概略的に見られ得る。これらステップは、可能な場合、無菌処理された油の下で足場を用いて無菌で実行された。
【０１１９】
足場のゲル化
標準的なバイオインクプリント油に境界のあるＳＳ１、ＳＳ２またはＳＳ３のいずれかを含むプリントされた足場は、プリント後、静置された（５分）。足場はその後、冷蔵庫においてゲル化された（４℃、２０〜２５分）。ゲル化したネットワークは、直ちに用いられたか、水和チャンバーに貯蔵されたかのいずれかであった。
【０１２０】
足場のゲル被覆
ゲル化したネットワークを囲む油は、〜１５０μＬまで減らされた。シリコーン油ＡＲ２０（２００μＬ）が、キュベットの隅に穏やかに添加され、その後、混合油（２００μＬ）が、斜め向かいの隅から除去された。このシリコーン油添加および混合油除去ステップは、あと３回繰り返された。１３〜１５ｍｇ／ｍＬのゲル化温度が極低温であるアガロース（０．２〜０．４μＬ）が、各ネットワーク上に一度、マイクロピペットで移された。ゲルの滴が足場の表面を湿らせなかったら、その時は、銀線［φ０．１ｍｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社］が、足場の上へと小滴を操作して湿潤を引き起こすのに用いられた。被覆された足場はその後、ゲル化され（４℃、２０〜２５分）、その後、直ちに相間移動したか、水和チャンバーに貯蔵されたかのいずれかであった。
【０１２１】
ゲル封入された足場の相間移動：
ゲル封入された足場の相間移動のステップは、図１に概略的に見られ得る。これらステップは、可能な場合、無菌処理された油の下で足場を用いて無菌で実行された。 
【０１２２】
被覆された足場の相間移動
標準的な細胞足場培養培地（〜３００μＬ）の上に体積比が３：１であるヘキサデカンと鉱油との混合物（〜１８０μＬ）がある２相カラムが、顕微鏡チャンバースライド［１５４５３４Ｋ、Ｌａｂ−Ｔｅｋ商標］において作成され、その後、細胞インキュベーター（１５〜６０分、３７℃、５％のＣＯ２（ｇ））中に配置された。被覆された足場は、マイクロピペットによって、インキュベートされたカラムの上方の相へと、典型的にはカラムごとに１つの足場で移された。被覆された足場が自発的に相間移動しなかったら、チャンバースライドが、円運動にて手によって機械的に摂動された。足場がすべて相間移動すると、上方の油相が除去され、かつ、追加の標準的な細胞足場培養培地（３００μＬ）が添加された。チャンバーはその後、使用まで細胞インキュベーターに貯蔵された（３７℃、５％のＣＯ２（ｇ））。
【０１２３】
第１の体積のヒドロゲル（すなわち、細胞を搭載した足場）の、第２の体積のヒドロゲルでの被覆および後に続く相間移動中の顕微鏡写真が、図２に示されている。（ａ〜ｄ）ゲル化および相間移動プロセスの異なるポイントにおける独立のプリントされたｏＭＳＣネットワークの明視野共焦点顕微鏡写真。これらネットワークは、５×１０６個の細胞ｍＬ−１を含有するバイオインクでプリントされた。（ａ）内部のアガロースのゲル化の直後に撮像された油下のゲル化ネットワーク。（ｂ）脂質の希釈および油交換後のネットワーク。小滴と小滴との接合点は、もはや目に見えない。（ｃ）油下で外側のＵＬＧＴアガロース中被覆されたネットワーク（この場合、必要以上の外側のゲル）がネットワークを被覆し、構造体が球状になることを引き起こした。（ｄ）培養培地への移動後のゲル封入されたプリントされたネットワーク（生／死細胞色素を含有していた）。油は水性培養培地へと移されなかった。スケールバー＝２５０μｍ。
【０１２４】
ＨＥＫ−２９３ＴまたはｏＭＳＣ細胞のいずれかを搭載した足場を含む大量のヒドロゲルが、本発明の方法によって相間移動した。同種の細胞を含有する相間移動したプリントされた足場が、図３に示されている。Ａ，Ｂ，Ｃは、相間移動した同種の細胞足場の逆さまの（ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ）３Ｄ投影であり、カルセイン−ＡＭおよびヨウ化プロピジウムを用いる生−死プロトコールによって染色され、生細胞については緑色の染色をもたらし、かつ、死細胞については赤色の染色をもたらす。Ｄ，Ｅ，Ｆは、Ａ，Ｂ，Ｃにそれぞれ示される足場の合成の伝送および蛍光画像である。足場Ａ／ＤおよびＢ／Ｅは１５×１０６個の細胞／ｍＬにおいてプリントされたＨＥＫ−２９３Ｔであり、一方、足場Ｃ／Ｆは１５×１０６個の細胞／ｍＬにおいてプリントされたｏＭＳＣであった。足場はすべて１５μｇ／ｍＬのＩ型コラーゲンを含有していた。
【０１２５】
図４は、培養培地への相間移動後のラメラ細胞足場を示している。ここで、ラメラ細胞足場は、異なるように蛍光的にタグ付けされたＨＥＫ細胞の２つの隣接する層としてプリントすることによって、パターニングされた。結果は、足場の高解像度の細胞のパターニングされた特徴（〜２００μｍの厚さのこれら層のような）が、相間移動手順中に保存されていたことを示している。図４では、（ａ〜ｂ）は、（ａ）４５μｍおよび（ｂ）１８５μｍの高さにおいてゲル化（４℃、２０分）直後に撮像された２つの別個の細胞層から構成されるプリントされた足場の明視野および蛍光の合成顕微鏡写真を示している。ＨＥＫ−２９３／ＹＦＰ細胞（黄色）がＤＲ染色されたＨＥＫ−２９３／ＣＦＰ細胞（青色）の下でパターニングされた。（ｃ）ラメラネットワークの図であり、ここで、下方の小滴はＨＥＫ−２９３／ＹＦＰを含有するであろうし、一方で上方の小滴はＤＲ染色されたＨＥＫ−２９３／ＣＦＰを含有するであろう。（ｄ〜ｅ）（ｄ）４０μｍおよび（ｅ）１８０μｍの高さで撮像された、培養培地中のラメラネットワークの合成顕微鏡写真であり、別個の細胞層を示している。（ｆ〜ｇ）（ｆ）プリント直後の油；および（ｇ）相間移動直後の細胞培養培地中のラメラ細胞足場の３Ｄ再構成の横からの画像であり、ラメラ細胞パターンがその間ずっと保存されていたことを示している。
【０１２６】
図５は、７日間にわたる培養中に相間移動した足場内の細胞の発生を示している。細胞は、生−死染色プロトコールを用いて染色され、細胞が、７日間にわたる培養で高生存率を有し、かつ、細胞の質量を増大させたことを明らかにした。７日目の細胞の免疫細胞化学は、構造体全体における健康な細胞核と割合の低い有糸分裂活性細胞（細胞が増殖したことを示す）を明らかにした。（ａ〜ｃ）（ａ）０日目、（ｂ）３日目および（ｃ）７日目の培養物中のプリントされたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞足場の３Ｄ再構成の画像。構造体は、生細胞（カルセイン−ＡＭ）および死細胞（ヨウ化プロピジウム）について染色された。ゲル封入された足場中のプリントされた細胞は、高度に生存可能であり、かつ、培養の間中、細胞密度の増大を示した。（ｄ）細胞核（ＤＡＰＩ）および有糸分裂マーカーであるリン酸化ヒストン−Ｈ３（ＰＨ３、免疫細胞化学、白色）についての染色後の（ｃ）における足場の３Ｄ再構成の画像。足場は、低い割合の有糸分裂活性細胞を示し、足場内の細胞増殖を確認した。
【０１２７】
細胞足場の維持
相間移動した足場内の細胞は、顕微鏡チャンバースライド［１５４５３４Ｋ、Ｌａｂ−Ｔｅｋ商標］容器を用いて、１４日間まで培養培地（ウェルあたり〜６００μＬ）中で増殖した。足場は、培地交換と実験との間は、３７℃、５％のＣＯ２（ｇ）に設定されたＭｉｄｉ４０細胞インキュベーター［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ］中で貯蔵された。２〜３日毎に、足場培地は単一のウェルについて交換され、これは次の通りであった：〜２００〜３００μＬ容器培地が、空気と培地との境界面付近で注意深く除去され、その後、３００μＬの新たな培地がウェルの隅にゆっくりと添加され、この容器−培地除去、新たな培地の添加のステップは、あと１〜２回繰り返された。
【０１２８】
ＨＥＫ−２９３Ｔおよび蛍光ＨＥＫ−２９３足場の大部分は、完全に補充された標準的な細胞足場培養培地中で培養された。しかしながら、初期のＨＥＫ−２９３Ｔ足場は、抗生物質、ＨＥＰＥＳおよびＭＥＭ非必須アミノ酸なしで培養された（より早期の細胞足場培養培地中で）。
【０１２９】
ｏＭＳＣ足場は、標準的な生存率評価のためにはＭＳＣ培養培地中で培養され、かつ、分化実験のためには、ＭＳＣ分化培地またはＭＳＣ対照培地が用いられた。
【０１３０】
生／死アッセイ
細胞ネットワークの生／死染色が、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）と併せてカルセイン−ＡＭ（ＣＡＭ）色素（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ社）を用いることによって実行された。０．０５ｍＭのＣＡＭおよび０．０５ｍＭのＰＩの色素溶液が、プリント前の細胞を搭載したバイオインクに添加されたか、または、各成分についての最終濃度が〜５μＭであるプリントされたネットワークの培養培地に添加された。ネットワークは、蛍光共焦点顕微鏡法（Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５）によって撮像された。
【０１３１】
２つの細胞集団を含有するネットワーク
ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ商標色素（Ｌｉｆｅ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｒｅｄ  ＣＭＰＴＸ（ＲＣ）およびＤｅｅｐ  Ｒｅｄ（ＤＲ）が、細胞を蛍光的に染色するのに用いられた。プリント前、細胞は、５μＭのＲＣまたは１μＭのＤＲのいずれかを含有する無血清培養培地に懸濁された。染色された細胞は：ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＣＦＰ発現ＨＥＫ−２９３、初代軟骨細胞およびｏＭＳＣ由来骨芽細胞であった。プリントされたネットワークは、蛍光共焦点顕微鏡法（Ｌｅｉｃａ  ＳＰ５）および広視野光顕微鏡法（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＩ  ８）によって撮像された。
【０１３２】
プリントされたネットワークの免疫細胞化学
免疫細胞化学が、パラホルムアルデヒド中で固定された細胞ネットワークに対して実行された（補助的方法）。一次抗体は：０．２５体積％のウサギ抗リン酸化ヒストンＨ３（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）または０．６７体積％のウサギ抗ＳＯＸ−９（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）であった。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８または６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に結合したロバ二次抗体が、それぞれＳＯＸ−９およびリン酸化ヒストンＨ３抗体とともに用いられた。免疫染色されたネットワークは、蛍光共焦点顕微鏡法（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７１０）によって撮像された。
【０１３３】
細胞培養培地の形成：
相間移動した足場内の２Ｄの細胞コロニーまたは細胞を増殖させるのに用いられた細胞培養培地の形成。
【０１３４】
細胞培養培地の混合物
各細胞タイプに、それに特異的な細胞培養培地組成がある。培養培地はすべて、以下の添加物を有するか、または有しない必須培地から構成された：１０体積％のＦＢＳ、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ商標（グルタミンのソースである）、０．１ｍＭのＭＥＭ非必須アミノ酸、１０〜２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（緩衝剤）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（抗生物質）および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（抗生物質）。これら成分の割合は、表４に見られ得る。
【０１３５】
基礎培地は、異なる細胞株の間で異なり、ＤＭＥＭまたはＭＥＭのいずれかであった。具体的には３つの異なるＤＭＥＭ培養培地が、ほとんどの細胞株の培養の間中、用いられたが、これらはここで、それらのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社の製品コードとともに説明される：ＤＭＥＭ  Ｄ６５４６は、高グルコース培地であり、かつ、すべてのＨＥＫ−２９３細胞株派生物について用いられた；ＤＭＥＭ  Ｄ５５６４は、低グルコース培地であり、かつ、ＭＳＣの培養において用いられた；一方、ＤＭＥＭ  Ｄ５６７１は、ピルビン酸ナトリウムを有さない高グルコース培地であり、かつ、ＭＳＣの分化実験のためのＤＭＥＭ−ＩＴＳベース培地を作成するのに用いられた。各ＤＭＥＭは、（言及がなければ）重炭酸ナトリウム、塩酸ピリドキシンおよび１０ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを有する高（４５００ｍｇ／Ｌ）グルコースまたは低（１０００ｍｇ／ｍＬ）グルコースのいずれかを含有していた。ＭＳＣの骨形成分化および骨芽細胞の培養については、ＭＥＭ  Ｍ４５２６が用いられたが、これは重炭酸ナトリウムと、標準的なＭＥＭと比較して増大した濃度のアミノ酸とを含有していた。各細胞株の培養培地の基礎培地もまた、表４に記載されている。
【０１３６】
追加の栄養素または特別な抗生物質もまた、ＨＥＫ−２９３Ｔの標準的な２Ｄ培養以外のすべての細胞株について用いられた。これらは、各細胞タイプについて以下で説明される。
【０１３７】
表４：種々の細胞株を増殖させるのに用いられる標準的な培養培地についての組成。１００×濃縮ストックは、２００ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ商標）と、１０ｍＭのＭＥＭ−ＮＥＡＡと、１０，０００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを有する１０，０００Ｕ／ｍＬのペニシリン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ）である。
【０１３８】
【表４】
2019506888.tif 000007
【０１３９】
蛍光ＨＥＫ−２９３培養培地
蛍光タンパク質発現ＨＥＫ−２９３細胞の培養については、１０μｇ／ｍＬのブラストサイジンもまた、添加された。ストックブラストサイジン溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）は、ブラストサイジン粉末（５０ｍｇ）をフィルター滅菌された超純水（５ｍＬ）中に溶解することによって調製され、かつ、１０μＬのアリコートとして−２０℃で貯蔵された。ストック溶液は、培養フラスコあたり１μＬ／ｍＬで添加された。
【０１４０】
ヒツジＭＳＣおよび軟骨細胞培養培地
ｏＭＳＣ培地はすべて、追加の添加物を伴った；ＭＳＣ培養については、培地はまた、使用の直前に１０μｇ／ｍＬのＦＧＦストックから添加された５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦを含有していた。軟骨培養培地は、ＭＳＣ培養培地とまったく同一であった。ストックの１０μｇ／ｍＬのＦＧＦ溶液は、ＦＧＦ（５０μｇ）をフィルター滅菌された５ｍＭのＴｒｉｓ・ＨＣｌ溶液（５ｍＬ、ｐＨ７．６）中に溶解することによって作成され、アリコートで−２０℃で貯蔵された。
【０１４１】
ヒツジＭＳＣ分化培地
ＭＳＣ分化実験については、細胞は、ＭＳＣ分化培地またはＭＳＣ対照培地中で培養されるが、これら培地の基礎培地は、ＤＭＥＭ−ＩＴＳと呼ばれ、かつ、ＦＢＳで補充されていないが、ＩＴＳ（１０．０μｇ／ｍＬのウシインスリン、５．５μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリンおよび６．７ｎｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウムで）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ商標、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンならびに１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ  Ｄ５６７１から構成される。０〜７日目用のＭＳＣ分化培地もまた、すべて新たに補充された、１００ｎＭのデキサメタゾン、８０μＭのアスコルビン酸−２−リン酸および１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３を含有していた。７日目の後、ＭＳＣ分化培地は、追加的に、これもまた新たに添加された１０ｎｇ／ｍＬのインスリンを含んでいた。一方で、ＭＳＣ対照培地は０〜７日目用のＭＳＣ分化培地と同一であるが、ＴＧＦ−β３は有さない。ＭＳＣ培養についての追加的な栄養添加物の概要は、表５に見られ得る。
【０１４２】
追加の栄養素、デキサメタゾン、アスコルビン酸、ＴＧＦβ３およびインスリンは、すべて粉末試薬から調製され、ストック溶液をもたらしたが、該ストック溶液は、ボルテックス混合され、その後、フィルター滅菌され、かつ、アリコートとして−２０℃で貯蔵された。１００μＭのデキサメタゾンストックは、デキサメタゾン（３．９２５ｍｇ）をエタノール（１ｍＬ）中に溶解することによって調製され、その後、ＩＴＳ−ＤＭＥＭ（１ｍＬ）中で０．０１体積％の溶液へとさらに希釈された。アスコルビン酸については、８０ｍＭのストックが、Ｌ−アスコルビン酸−２リン酸セスキマグネシウム塩水和物を超純水（３ｍＬ）中に溶解することによって作成された。１０μｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３ストックは、ＴＧＦ−β３を１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するフィルター滅菌された４ｍＭの塩酸中に溶解することによって作成された。最後に、１０ｍｇ／ｍＬのストックインスリンは、インスリン（２０ｍｇ）を超純水で希釈した酢酸（２ｍＬ、ｐＨ２．０）中に溶解することによって調製された。
【０１４３】
表５：ＭＳＣ培地に添加された追加の栄養添加物の割合。添加された栄養素は、次のストック溶液、すなわち、１００×濃縮ＩＴＳ（１．００ｍｇ／ｍＬのウシインスリン、０．５５ｍｇ／ｍＬのヒトトランスフェリンおよび０．６７μｇ／ｍＬの亜セレン酸ナトリウムで）、１００×濃縮ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ）、１０μｇ／ｍＬのＦＧＦ、１００μＭのデキサメタゾン、８０ｍＭのアスコルビン酸−２−リン酸、１０μｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３および１０ｍｇ／ｍＬのインスリンからのものである。
【０１４４】
【表５】
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【０１４５】
骨芽細胞培養培地
ＭＳＣ骨形成については、骨芽細胞培養培地はまた、５０μＬ／ｍＬのＳｔｅｍＸＶｉｖｏ商標骨原性添加物を含有しており、それは使用の日に供給されたように添加された。骨原性添加物は、−２０℃においてアリコートとして貯蔵されていた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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