(57)【要約】ヒト器官細胞（例えば、肝細胞）が、日常的に使用されている非ヒト血漿細胞培養培地の代わりにヒト血漿培地（例えば、７０％〜１００％のヒト血漿）で培養される方法が開示される。この培養方法は、細胞がヒト血漿に浸かっている体内環境とよく似た環境にヒト器官細胞がいられるようにする。さらに、ヒト器官細胞とヒト血漿培地を細胞培養容器中に含む細胞培養システムが開示される。細胞培養システムの使用は、直接的に人の体内に変換できる、薬物の薬理、薬物動態、および薬物の毒物学的な効果を含む試験化合物の性質、Ｂ型肝炎感染症もしくはＣ型肝炎感染症を含む肝臓病の進行などの器官の病気の進行、あるいは遺伝子発現、タンパク質合成もしくはホルモン応答などの細胞生物学プロセスを評価するための培養されたヒト器官細胞の適用を含む。【選択図】図１
2019516391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）非ヒト血漿培地でヒト器官細胞を培養すること、
ｂ）前記非ヒト血漿培地をヒト血漿培地に置き換えること、および、
ｃ）前記ヒト器官細胞をヒト血漿培地で培養すること
を含み、
少なくとも１〜１５日もしくはそれ以上に一回、前記ヒト血漿培地が新たなヒト血漿培地に更新される
ヒト器官細胞を培養する方法。
【請求項２】
前記ヒト器官細胞が非ヒト血漿培地で少なくとも２０分培養される
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒト器官細胞が少なくとも１５日間、ヒト血漿培地で培養される
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト器官細胞が約１５日までヒト血漿培地で培養される
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト器官細胞は新たに単離されるか、予め低温保存されるか、または、継続的に培養された細胞株から取得される
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト血漿培地は７０〜１００％のヒト血漿を含む
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒト血漿培地は１００％の血漿からなる
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒト器官細胞は、肝細胞、腎細胞、肺上皮細胞、腸細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、ニューロン、リンパ球、赤血球、ケラチノサイト、含脂肪細胞、副腎細胞、甲状腺細胞、胸腺細胞、結合組織細胞、精巣細胞、卵巣細胞、もしくはこれらの組み合わせから選択される
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ａ）非ヒト血漿培地でヒト肝細胞を培養すること、
ｂ）前記非ヒト血漿培地をヒト血漿培地に置き換えること、および、
ｃ）前記ヒト器官細胞をヒト血漿培地で培養すること
を含み、
少なくとも１〜１５日もしくはそれ以上に一回、前記ヒト血漿培地が新たなヒト血漿培地に更新される
ヒト肝細胞を培養する方法。
【請求項１０】
前記ヒト肝細胞が非ヒト血漿培地で少なくとも２０分培養される
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヒト肝細胞が少なくとも１５日間、ヒト血漿培地で培養される
請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヒト肝細胞が約１５日までヒト血漿培地で培養される
請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒト肝細胞は新たに単離されるか、予め低温保存されるか、または、継続的に培養された細胞株から取得される
請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒト血漿培地は７０〜１００％のヒト血漿を含む
請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒト血漿培地は１００％の血漿からなる
請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
ａ）ヒト肝細胞をヒトの肝臓から単離すること、
ｂ）非ヒト血漿培地で前記ヒト肝細胞を培養すること、
ｃ）前記非ヒト血漿培地をヒト血漿培地に置き換えること、および、
ｄ）ヒト器官細胞をヒト血漿培地で培養すること
を含み、
少なくとも１〜１５日もしくはそれ以上に一回、前記ヒト血漿培地が新たなヒト血漿培地に更新される
ヒト肝細胞を培養する方法。
【請求項１７】
前記ヒト肝細胞が非ヒト血漿培地で少なくとも２０分培養される
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒト肝細胞が少なくとも１５日間、ヒト血漿培地で培養される
請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヒト肝細胞が約１５日までヒト血漿培地で培養される
請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒト血漿培地は７０〜１００％のヒト血漿を含む
請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒト血漿培地は１００％のヒト血漿からなる
請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
１つ以上の分析ウェルを含む細胞培養容器
を含み、
前記分析ウェルはヒト血漿培地およびヒト器官細胞を含む
試験化合物の性質、肝臓病の進行、および／または細胞生物学プロセスを評価するための細胞培養システム。
【請求項２３】
試験化合物をさらに含む
請求項２２に記載の細胞培養システム。
【請求項２４】
前記試験化合物は、薬物、薬物候補、工業化学物質、環境汚染物質、殺虫剤（pesticide）、殺虫剤（insecticide）、生物学上の化学物質もしくは化学物質である
請求項２２に記載の細胞培養システム。
【請求項２５】
前記試験化合物の性質は、薬物代謝、薬物−薬物相互作用、および、前記試験化合物の薬理を含む
請求項２２に記載の細胞培養システム。
【請求項２６】
肝臓病は、Ａ型肝炎感染症、Ｂ型肝炎感染症、もしくはＣ型肝炎感染症を含む
請求項２２に記載の細胞培養システム。
【請求項２７】
細胞生物学プロセスは、遺伝子発現、タンパク質合成もしくはホルモン応答を含む
請求項２２に記載の細胞培養システム。
【請求項２８】
前記ヒト細胞は、初代細胞もしくは細胞株である
請求項２２に記載の細胞培養システム。
【請求項２９】
前記ヒト器官細胞は、予め低温保存される
請求項２２に記載の細胞培養システム。
【請求項３０】
前記ヒト器官細胞は、肝細胞、腎細胞、肺上皮細胞、腸細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、ニューロン、リンパ球、赤血球、ケラチノサイト、含脂肪細胞、副腎細胞、甲状腺細胞、胸腺細胞、結合組織細胞、精巣細胞、卵巣細胞、もしくはこれらの組み合わせから選択される
請求項２２に記載の細胞培養システム。
【請求項３１】
前記細胞培養容器は、シングルウェルプレートである
請求項２２に記載の細胞培養システム。
【請求項３２】
前記細胞培養容器は、マルチウェルプレートである
請求項２２に記載の細胞培養システム。
【請求項３３】
前記ヒト血漿は、ヒト提供者から取得された血液から調整される
請求項２２に記載の細胞培養システム。
【請求項３４】
前記ヒト血漿は、複数の提供者からプールされる
請求項２２に記載の細胞培養システム。
【請求項３５】
前記ヒト血漿培地は７０〜１００％のヒト血漿を含む
請求項２２に記載の細胞培養システム。
【請求項３６】
前記ヒト血漿培地は１００％の血漿からなる
請求項２２に記載の細胞培養システム。
【請求項３７】
１つ以上の分析ウェルを含む細胞培養容器
を含み、
前記分析ウェルはヒト血漿培地およびヒト肝細胞を含む
試験化合物の性質、肝臓病の進行、および／または細胞生物学プロセスを評価するための細胞培養システム。
【請求項３８】
試験化合物もしくはウイルスをさらに含む
請求項３７に記載の細胞培養システム。
【請求項３９】
前記試験化合物は、薬物、薬物候補、工業化学物質、環境汚染物質、殺虫剤（pesticide）、殺虫剤（insecticide）、生物学上の化学物質もしくは化学物質である
請求項３７に記載の細胞培養システム。
【請求項４０】
前記試験化合物の性質は、薬物代謝、薬物−薬物相互作用、および、前記試験化合物の薬理を含む
請求項３７に記載の細胞培養システム。
【請求項４１】
肝臓病は、Ａ型肝炎感染症、Ｂ型肝炎感染症、もしくはＣ型肝炎感染症を含む
請求項３７に記載の細胞培養システム。
【請求項４２】
細胞生物学プロセスは、遺伝子発現、タンパク質合成もしくはホルモン応答を含む
請求項３７に記載の細胞培養システム。
【請求項４３】
前記ヒト肝細胞は、初代細胞もしくは細胞株である
請求項３７に記載の細胞培養システム。
【請求項４４】
前記ヒト肝細胞は、予め低温保存される
請求項３７に記載の細胞培養システム。
【請求項４５】
前記細胞培養容器は、シングルウェルプレートである
請求項３７に記載の細胞培養システム。
【請求項４６】
前記細胞培養容器は、マルチウェルプレートである
請求項３７に記載の細胞培養システム。
【請求項４７】
前記ヒト血漿は、ヒト提供者から取得された血液から調製される
請求項３７に記載の細胞培養システム。
【請求項４８】
前記ヒト血漿は、複数の提供者からプールされる
請求項３７に記載の細胞培養システム。
【請求項４９】
前記ヒト血漿培地は９０〜１００％のヒト血漿を含む
請求項３７に記載の細胞培養システム。
【請求項５０】
前記ヒト血漿培地は１００％の血漿からなる
請求項３７に記載の細胞培養システム。
【請求項５１】
ａ）請求項２２〜５０の細胞培養システムを提供すること、
ｂ）前記試験化合物を前記分析ウェルに導入すること、
ｃ）前記試験化合物を０．５時間から１０日の間３３〜４０℃でインキュベートすること、および、
ｄ）前記試験化合物の性質を判定するために、ヒト細胞もしくは細胞培地のエンドポイント分析を行うこと
を含む試験化合物の性質を評価するための方法
【請求項５２】
前記エンドポイント分析は、細胞の生存能力、細胞機能、遺伝子発現、タンパク質発現、代謝物生成もしくは代謝物プロファイルの測定を含む
請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記エンドポイント分析は、試験化合物の消失および代謝物の出現の測定、同時投与された第２の試験化合物の代謝に対する第１の試験化合物の影響の測定、または、ヒト器官細胞への薬理学的効果の計測を含む
請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記システムは３７℃で５％のＣＯ２の存在下で培養される
請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記試験化合物の性質は、薬物代謝、薬物−薬物相互作用、および、前記試験化合物の薬理を含む
請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記試験化合物は、薬物、薬物候補、工業化学物質、環境汚染物質、殺虫剤（pesticide）、殺虫剤（insecticide）、生物学上の化学物質もしくは化学物質である
請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
ａ）請求項２２〜５０の細胞培養システムを提供すること、
ｂ）前記ヒト肝細胞を前記ヒト血漿培地で培養すること、および
ｃ）病気の進行に関連する前記ヒト肝細胞の細胞生物学、化学および／または分子生物学を評価するために、前記ヒト肝細胞もしくは細胞培地のエンドポイント分析を行うこと
を含む肝臓病の進行を評価するための方法。
【請求項５８】
前記肝臓病は、Ａ型肝炎感染症、Ｂ型肝炎感染症、もしくはＣ型肝炎感染症を含む
請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
肝炎ウイルスを前記分析ウェルに導入することを
さらに含む請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
試験化合物を前記分析ウェルに導入することを
さらに含む請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記試験化合物は、薬物、薬物候補、工業化学物質、環境汚染物質、殺虫剤（pesticide）、殺虫剤（insecticide）、生物学上の化学物質もしくは化学物質である
請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記システムは３７℃で５％のＣＯ２の存在下でインキュベートされる
請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
ａ）請求項２２〜５０の細胞培養システムを提供すること、
ｂ）前記ヒト器官細胞を前記ヒト血漿培地で培養すること、および、
ｃ）研究される細胞生物学プロセスに関連する前記ヒト器官細胞の細胞生物学、化学および分子生物学を評価するために、前記ヒト器官細胞もしくは細胞培地のエンドポイント分析を行うこと
を含む細胞生物学プロセスを評価するための方法。
【請求項６４】
試験化合物を前記分析ウェルに導入することを
さらに含む請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記試験化合物は、薬物、薬物候補、工業化学物質、環境汚染物質、殺虫剤（pesticide）、殺虫剤（insecticide）、生物学上の化学物質もしくは化学物質である
請求項６４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連する出願のクロスリファレンス＞
本出願は、２０１６年５月２４日に出願された米国仮特許出願番号６２／３４０，７０２号（参照することによって全体が本出願に含まれる）の利益を主張する。
【０００２】
開示された発明は、概して細胞培養方法、細胞培養システム、および、培養された細胞を薬物薬理活性、薬物代謝、薬物−薬物相互作用および薬物毒性の評価に使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明は、器官の細胞（例えば、肝細胞）をヒト血漿で細胞培養する方法、および、培養された細胞を薬物薬理活性、薬物代謝、薬物−薬物相互作用および薬物毒性の評価に使用する方法に関する。
【０００４】
体外細胞培養実験システムは生物医学研究のために日常的に使用されている。細胞培養と哺乳類の体内の有機体の間の主な相違は、人工的なレベルの栄養物を含み、しばしば、例えばウシ胎仔血清のような動物製品が補充された培地で細胞培養が行われることである。
【０００５】
これまで、ヒトの細胞用の細胞培地は、生存能力と増殖を維持するために化学的に設計されてきた。肝臓の細胞株、遺伝的に形質転換を起こした肝細胞、腫瘍源から取得した肝細胞のクローン性増殖をサポートするために、化学的に定義された細胞培地の改善が行われてきた。これらの複雑な培養環境は、例えば、ニコチンアミド、アミノ酸、トランスフェリン、ホルモン、デキサメタゾン、微量金属、炭水化物、バッファ試薬およびアルブミンなどの肝細胞の増殖促進物質（これらの一部もしくは全ては細胞を培養するために外因性でありうる）を含むことができる。主な課題は、体内の細胞で見られるような機能を保つために、初代細胞（正常な組織から得られた細胞）を培養することである。
【０００６】
体外での細胞培養とは対照的に、動物もしくはヒトの体内では、内生の血漿および血液細胞から構成される循環する血液によって、個々の器官の細胞は栄養を与えられる。この環境の違いにより、細胞培養システムを用いて得られた観察を直接体内の事象に外挿することが困難になる。
【０００７】
重要な細胞培養システムは、薬物代謝、薬物−薬物相互作用および薬理作用などの薬物性質の体内での評価のための「代表的存在（gold standard）」と一般に考えられている初代培養ヒト肝細胞である。人工的培地で維持されるヒト肝細胞の性質は体内の肝臓とは異なると知られているので、主な課題は、体外で培養された肝細胞で観察された事象の体内での事象への変換である。追加的な悪化因子（compounding factor）は、研究対象の薬物の血漿タンパク質への結合である。
【０００８】
本明細書に開示する本発明は、ヒト肝細胞などのヒト器官細胞を培養するためにヒト血漿を用いることで、人工的および／または外因性の構成物を含む従来の細胞培地のこれらの欠点に対処する。
【発明の概要】
【０００９】
ヒト器官細胞培養方法、ヒト血漿培地およびヒト器官細胞を含む細胞培養システム、ならびに、試験化合物の性質、肝臓病の進行、もしくは細胞生物学プロセスを評価するためにそのシステムを使用するための方法が提供される。実施形態では、非ヒト血漿培地でヒト器官細胞を培養するステップ、非ヒト血漿培地をヒト血漿培地に置き換えるステップ、および、ヒト器官細胞をヒト血漿培地で培養するステップを含み、少なくとも１〜１５日もしくはそれ以上に一回、ヒト血漿培地が新たなヒト血漿培地に更新される、ヒト器官細胞を培養する方法が提供される。実施形態では、ヒト血漿培地は、栄養物を補充し老廃物を除去するために、２〜３日ごとに取り替えられる。
【００１０】
ヒト器官細胞は、これらのヒト器官細胞が非ヒト血漿培地で培養できる期間の長さに比べると、ヒト血漿培地でより長い期間にわたって培養されることができ、改善を提供する。実施例１を参照。実施形態では、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも４５日、少なくとも６０日、または、少なくとも９０日の間、ヒト器官細胞はヒト血漿培地で培養される。これは、細胞が１４日目に弱り始め、２９日目にほとんど全て死滅する非ヒト血漿培地でヒト器官細胞（例えば、ヒト肝細胞）を培養することに対する改善である。図１を参照。本明細書に開示される細胞培養方法は、１５日以上などの２週間以上の期間にわたる分析評価に使用可能な細胞培養システムを提供する。実施形態では、１５日まで、２０日まで、２５日まで、３０日まで、４５日まで、６０日まで、または、９０日までの間、ヒト器官細胞はヒト血漿培地で培養され、ヒト器官細胞は培養期間の間生存可能なままである。ヒト肝細胞は、ヒトの体内の肝臓での代謝を理解するために変換される長期間にわたる体外代謝研究に特に有用である。
【００１１】
実施形態では、ヒト器官細胞は新たに単離されるか、予め低温保存されるか、または、継続的に培養された細胞株から取得される。予め低温保存される場合、方法は、まず、細胞を通常の培養条件で解凍すること、および、その後の一時期、非ヒト血漿培地で培養することを含む。この期間は典型的には少なくとも２０分であるが、数時間から１日またはそれ以上であり得る。
【００１２】
実施形態では、ヒト血漿培地は、１００％の血漿からなる。ある実施形態では、ヒト血漿培地は、７０％〜１００％のヒト血漿、もしくは約８０％〜１００％のヒト血漿、もしくは約９０％〜約１００％のヒト血漿、もしくは約９５％〜約１００％のヒト血漿を含む。実施形態では、ヒト血漿培地は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％のヒト血漿を含む。
【００１３】
実施形態では、ヒト器官細胞は、肝細胞、腎細胞、肺上皮細胞、腸細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、ニューロン、リンパ球、赤血球、ケラチノサイト、含脂肪細胞、副腎細胞、甲状腺細胞、胸腺細胞、結合組織細胞、精巣細胞、卵巣細胞、もしくはこれらの組み合わせから選択される。ある実施形態では、ヒト器官細胞はヒト肝細胞である。
【００１４】
実施形態では、非ヒト血漿培地でヒト肝細胞を培養するステップ、非ヒト血漿培地をヒト血漿培地に置き換えるステップ、および、ヒト器官細胞をヒト血漿培地で培養するステップを含み、少なくとも１〜１５日もしくはそれ以上に一回、ヒト血漿培地が新たなヒト血漿培地に更新される、ヒト肝細胞を培養する方法が提供される。
【００１５】
実施形態では、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも４５日、少なくとも６０日、または、少なくとも９０日の間、ヒト肝細胞はヒト血漿培地で培養される。実施形態では、１５日まで、２０日まで、２５日まで、３０日まで、４５日まで、６０日まで、または、９０日までの間、ヒト肝細胞はヒト血漿培地で培養され、ヒト器官細胞は培養期間の間生存可能なままである。
【００１６】
実施形態では、ヒト肝細胞は、１００％の血漿からなるヒト血漿培地で培養される。ある実施形態では、ヒト肝細胞は、７０％〜１００％のヒト血漿、もしくは約８０％〜１００％のヒト血漿、もしくは約９０％〜約１００％のヒト血漿、もしくは約９５％〜約１００％のヒト血漿を含むヒト血漿培地で培養される。実施形態では、ヒト肝細胞は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％のヒト血漿を含むヒト血漿培地で培養される。
【００１７】
実施形態では、ヒト肝細胞は（提供者から）新たに単離されるか、予め低温保存されるか、または、継続的に培養された細胞株から取得される。予め低温保存される場合、方法は、まず、ヒト肝細胞を通常の培養条件で解凍すること、および、その後一時期、非ヒト血漿細胞培地で培養することを含む。この期間は典型的には少なくとも２０分であるが、数時間から１日またはそれ以上であり得る。
【００１８】
新たに単離されたヒト肝細胞のために、提供者からの肝臓の一部がコラゲナーゼを用いて分解され、ヒト血漿培地で様々な適用のために精製および培養されることができる個々の肝細胞に肝実質を解離させる。新たに単離されたヒト肝細胞は便利ではないが日常的に使用されている。
【００１９】
実施形態では、ヒト肝細胞をヒトの肝臓から単離するステップ、非ヒト血漿培地でヒト肝細胞を培養するステップ、非ヒト血漿培地をヒト血漿培地に置き換えるステップ、および、ヒト器官細胞をヒト血漿培地で培養するステップを含み、少なくとも１〜１５日もしくはそれ以上に一回、ヒト血漿培地が新たなヒト血漿培地に更新される、ヒト肝細胞を培養する方法が提供される。
【００２０】
実施形態では、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも４５日、少なくとも６０日、または、少なくとも９０日の間、ヒトの肝臓から単離されたヒト肝細胞はヒト血漿培地で培養される。実施形態では、１５日まで、２０日まで、２５日まで、３０日まで、４５日まで、６０日まで、または、９０日までの間、ヒトの肝臓から単離されたヒト肝細胞はヒト血漿培地で培養され、ヒト肝細胞は培養期間の間生存可能なままである。
【００２１】
実施形態では、ヒト肝細胞は、１００％の血漿からなるヒト血漿培地で培養される。ある実施形態では、ヒト肝細胞は、７０％〜１００％のヒト血漿、もしくは約８０％〜１００％のヒト血漿、もしくは約９０％〜約１００％のヒト血漿、もしくは約９５％〜約１００％のヒト血漿を含むヒト血漿培地で培養される。実施形態では、ヒト肝細胞は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％のヒト血漿を含むヒト血漿培地で培養される。
【００２２】
実施形態では、試験化合物の性質、肝臓病の進行、もしくは細胞生物学プロセスを評価するための細胞培養システムであって、１つ以上の分析ウェル（assay well)を含む細胞培養容器を含み、分析ウェルはヒト血漿培地およびヒト器官細胞を含む細胞培養システムを提供する。実施形態では、細胞培養システムは、肝炎ウイルスなどのウイルスをさらに含む。実施形態では、細胞培養システムは、さらに試験化合物を含む。試験化合物は、薬物、薬物候補、工業化学物質、環境汚染物質、殺虫剤（pesticide）、殺虫剤（insecticide）、生物学上の化学物質（biological chemical）、および化学物質から選択され得る。
【００２３】
実施形態では、試験化合物の性質は、薬物代謝、薬物−薬物相互作用、および、試験化合物の薬理を含む。実施形態では、肝臓病は、Ａ型肝炎感染症、Ｂ型肝炎感染症、もしくはＣ型肝炎感染症を含む。実施形態では、細胞生物学プロセスは、遺伝子発現、タンパク質合成もしくはホルモン応答を含む。
【００２４】
実施形態では、細胞培養システムは、（提供者から）新たに単離されるか、予め低温保存されるか、または、継続的に培養された細胞株から取得されたヒト器官細胞を含む。実施形態では、細胞培養システムは１００％の血漿からなるヒト血漿培地を含む。ある実施形態では、細胞培養システムは、７０％〜１００％のヒト血漿、もしくは約８０％〜１００％のヒト血漿、もしくは約９０％〜約１００％のヒト血漿、もしくは約９５％〜約１００％のヒト血漿を含むヒト血漿培地を含む。実施形態では、細胞培養システムは、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％のヒト血漿を含むヒト血漿培地を含む。実施形態では、ヒト血漿は、ヒト提供者から取得した血液から調製される。ある実施形態では、ヒト血漿は、複数の提供者からプールされる。
【００２５】
実施形態では、細胞培養システムは、肝細胞、腎細胞、肺上皮細胞、腸細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、ニューロン、リンパ球、赤血球、ケラチノサイト、含脂肪細胞、副腎細胞、甲状腺細胞、胸腺細胞、結合組織細胞、精巣細胞、卵巣細胞、もしくはこれらの組み合わせから選択されたヒト器官細胞を含む。ある実施形態では、細胞培養システムはヒト肝細胞を含む。
【００２６】
実施形態では、細胞培養システムは、シングルウェルプレートである細胞培養容器を含む。他の実施形態では、細胞培養システムは、マルチウェルプレートである細胞培養容器を含む。
【００２７】
実施形態では、試験化合物の性質、肝臓病の進行、もしくは細胞生物学プロセスを評価するための細胞培養システムであって、１つ以上の分析ウェルを含む細胞培養容器を含み、分析ウェルはヒト血漿培地およびヒト肝細胞を含む細胞培養システムを提供する。実施形態では、細胞培養システムは、ヒト肝細胞を含み、肝炎ウイルスなどのウイルスをさらに含む。実施形態では、細胞培養システムは、ヒト肝細胞を含み、試験化合物をさらに含む。試験化合物は、薬物、薬物候補、工業化学物質、環境汚染物質、殺虫剤（pesticide）、殺虫剤（insecticide）、生物学上の化学物質、および化学物質から選択され得る。
【００２８】
実施形態では、試験化合物の性質は、薬物代謝、薬物−薬物相互作用、および、試験化合物の薬理を含む。実施形態では、肝臓病は、Ａ型肝炎感染症、Ｂ型肝炎感染症、もしくはＣ型肝炎感染症を含む。実施形態では、細胞生物学プロセスは、遺伝子発現、タンパク質合成もしくはホルモン応答を含む。
【００２９】
実施形態では、細胞培養システムは、肝臓から新たに単離されたヒト肝細胞、予め低温保存されたヒト肝細胞、または、継続的に培養された細胞株から取得されたヒト肝細胞を含む。実施形態では、細胞培養システムは、ヒト肝細胞、ならびに、１００％の血漿からなるヒト血漿培地を含む。ある実施形態では、細胞培養システムは、ヒト肝細胞、ならびに、７０％〜１００％のヒト血漿、もしくは約８０％〜１００％のヒト血漿、もしくは約９０％〜約１００％のヒト血漿、もしくは約９５％〜約１００％のヒト血漿を含むヒト血漿培地を含む。実施形態では、細胞培養システムは、ヒト肝細胞、ならびに、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％のヒト血漿を含むヒト血漿培地を含む。
【００３０】
実施形態では、試験化合物の性質、肝臓病の進行、および／または細胞生物学プロセスを評価するための方法であって、本細胞培養システムの分析ウェルに試験化合物を導入するステップ、試験化合物を０．５時間から１０日の間３３〜４０℃でインキュベートするステップ、および、試験化合物の性質、病気の進行または細胞生物学プロセスを判定するためにヒト細胞もしくは細胞培地のエンドポイント分析を行うステップを含む方法を提供する。実施形態では、システムは、３７℃で５％のＣＯ２の存在下でインキュベートされる。
【００３１】
実施形態では、試験化合物は、薬物、薬物候補、工業化学物質、環境汚染物質、殺虫剤（pesticide）、殺虫剤（insecticide）、生物学上の化学物質、もしくは化学物質である。実施形態では、試験化合物の性質は、薬物代謝、薬物−薬物相互作用、および、試験化合物の薬理を含む。
【００３２】
他の実施形態では、試験化合物が細胞培養システムに添加されない方法が本明細書で提供される。実施形態では、方法は、細胞培養システムにウイルスを添加するが試験化合物を添加しないことを含む。ある実施形態では、方法は、細胞培養システムにウイルスを添加することであって、試験化合物の細胞培養システムへの添加がその後で行われることを含む。実施形態では、エンドポイント分析は、細胞の生存能力、細胞機能、遺伝子発現、タンパク質発現、代謝物生成もしくは代謝物プロファイルの測定を含む。ある実施形態では、エンドポイント分析は試験化合物の消失および代謝物の出現の測定、同時投与された第２の試験化合物の代謝に対する第１の試験化合物の影響の測定、または、ヒト器官細胞への薬理学的効果の計測を含む。
【００３３】
肝臓病の進行を評価するための方法では、病気の進行に関係のあるヒト肝細胞の細胞生物学、化学および／または分子生物学を評価するために、ヒト肝細胞もしくは細胞培地のエンドポイント分析が行われる。実施形態では、肝臓病は、Ａ型肝炎感染症、Ｂ型肝炎感染症、もしくはＣ型肝炎感染症を含む。実施形態では、肝臓病を評価するための方法は、ヒト肝細胞およびウイルスの添加を含む細胞培養システムの使用を含む。実施形態では、ウイルスは、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、もしくはＣ型肝炎ウイルスである。ある実施形態では、肝臓病の進行を評価するための方法は、細胞培養システムへのウイルスの添加の後で試験化合物を添加することをさらに含む。
【００３４】
細胞生物学プロセスを評価するための方法では、例えば、試験化合物もしくは病気の進行に応答して、研究されている細胞生化学プロセスに関連したヒト肝細胞の細胞生物学、化学および／または分子生物学を評価するために、ヒト肝細胞もしくは細胞培地のエンドポイント分析が行われる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ウィリアムＥ培地で（William E medium）ならびにヒト血漿培地で７日、１４日、および２４日培養された提供者からのヒト肝細胞の細胞形態を提供する。ウィリアムＥ培地で培養されたヒト肝細胞は１４日で弱り始め２４日目まで弱り続ける。ヒト血漿培地でヒト肝細胞は、２４日目まで優れた上皮細胞形態を損なわないまま培養された。
【図２】ヒト血漿培地ならびにウィリアムＥ培地で２９日培養されたヒト肝細胞の形態を提供する。ウィリアムＥ培地で培養されたヒト肝細胞はほとんど全て死滅しているが、ヒト肝細胞は優れた細胞形態を示す。
【図３】ヒト血漿培地およびタンパク質フィー肝細胞培地（protein fee hepatocyte media、ＨＩＭ）で７日、１４日、２４日、および２９日培養されたヒト肝細胞の細胞形態を提供する。
【図４】ヒト血漿培地またはＨＩＭで培養されたヒト肝細胞からのＣＹＰ１Ａ２（オメプラゾールによる）、ＣＹＰ２Ｂ６（フェノバルビタールによる）、および、ＣＹＰ２Ａ４（リファムピンによる）の（ｍＲＮＡによって測定された）ＣＹＰ酵素誘導で増大する折り畳み構造の表を提供する。
【図５】体外でアフラトキシンＢ１（肝毒性のための代謝活性を要求する）存在下のヒト血漿培地で培養されたヒト肝細胞からの急性および亜慢性の肝毒性の評価を提供する。図５は、アフラトキシンＢ１はヒト血漿培地で培養されたヒト肝細胞に対して細胞毒性であることを示す。
【図６】ヒト血漿培地またはＨＩＭで培養された１人の提供者からのヒト肝細胞中での、ｍＲＮＡによって測定されたＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現のリファムピン誘導の用量依存性を提供する。
【図７】ヒト血漿培地またはＨＩＭで培養された１人の提供者からのヒト肝細胞中での、ｍＲＮＡによって測定されたＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現のリファムピン誘導の用量依存性を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
ヒト器官細胞をヒト血漿培地で培養するための方法、組成物、およびキットが本明細書で提供される。細胞培養システムは、細胞培養容器中のヒト器官細胞およびヒト血漿、ならびに、試験化合物の性質、器官の病気の進行および／または細胞生物学プロセスを評価するための培養されたヒト器官細胞の使用を含む。実施形態では、方法は、７０％〜１００％のヒト血漿を含むヒト血漿培地でヒト器官細胞を培養するための方法を含む。ある実施形態では、方法は、非ヒト血漿培地でヒト器官細胞を培養するステップ、非ヒト血漿培地をヒト血漿培地に置き換えるステップ、および、ヒト器官細胞をヒト血漿培地で培養するステップを含み、少なくとも１〜１５日もしくはそれ以上に一回、ヒト血漿培地が新たなヒト血漿培地に更新される。実施形態では、ヒト血漿培地は、栄養物の補充および老廃物の除去を可能にするために、例えば、２〜３日ごとに新たなヒト血漿培地に取り替えられる。ある実施形態では、ヒト器官細胞は、ヒト肝細胞である。他のある実施形態では、ヒト器官細胞は、１００％のヒト血漿培地で培養されたヒト肝細胞である。
【００３７】
本明細書の方法は、例えば、１〜約３０日もしくはより長く（例えば９０日まで）などの延長された期間の間、ヒト器官細胞をヒト血漿培地で培養することにより実行される。培養の長さは、試験化合物の性質、器官の病気の進行および／または細胞生物学プロセスを評価するための方法でのそれらの使用に依存するであろう。ここで、当業者は、特定の分析のために必要な細胞培養期間を理解できる。実施形態では、ヒト血漿培地のヒト器官細胞は、少なくとも１５日間培養される。他の実施形態では、ヒト血漿培地のヒト器官細胞は、約１５日間まで培養される。実施形態では、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも４５日、少なくとも６０日、または、少なくとも９０日の間、ヒト器官細胞はヒト血漿培地で培養される。実施形態では、１５日まで、２０日まで、２５日まで、３０日まで、４５日まで、６０日まで、または、９０日までの間、ヒト器官細胞はヒト血漿培地で培養され、ヒト器官細胞は培養期間の間生存可能なままである。
【００３８】
実施形態では、ヒト血漿培地は、１００％の血漿からなる。ある実施形態では、ヒト血漿培地は、約７０％〜１００％のヒト血漿、もしくは約８０％〜１００％のヒト血漿、もしくは約９０％〜約１００％のヒト血漿、もしくは約９５％〜約１００％のヒト血漿を含む。実施形態では、ヒト血漿培地は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％のヒト血漿を含む。
【００３９】
本明細書のヒト器官細胞をヒト血漿培地で培養する方法は、同じ細胞が非ヒト血漿培地で培養された場合に比べて、優れた細胞形態で数日および数週間長く生存するヒト器官細胞を提供する。実施例１および図１〜図３を参照。ヒト肝細胞がウィリアムＥ培地のような非ヒト細胞培地で培養された場合、細胞は１４日目で弱り始め、１か月以内の２９日目でほとんど死滅する。対照的に、２、３日に１回ヒト血漿培地が交換されているヒト血漿培地で培養されたヒト肝細胞は、１か月の細胞培養後も、優れた細胞形態を有して生存可能である。この細胞培養方法は、試験化合物の性質、器官の病気の進行および／または細胞生物学プロセスを評価するための改善された細胞培養システムを提供する。
【００４０】
実施形態では、１つ以上の分析ウェルを含む細胞培養容器を含む、試験化合物の性質、器官の病気（肝臓病など）の進行および／または細胞生物学プロセスを評価するための細胞培養システムを、組成物は含む。ここで、分析ウェルはヒト血漿培地およびヒト器官細胞を含む。ある実施形態では、細胞培養システムは、ある範囲の試験化合物の代謝効果もしくは応答をテストするために高スループットスクリーニングのために使用される。この例では、細胞培養システムは、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレートまたはこれらの任意の組み合わせなどのマルチウェルプレートである細胞培養容器を含む。他の実施形態では、外的な代謝システムは１つの分析ウェルを含む細胞培養容器を含む。
【００４１】
ある実施形態では、本明細書の細胞培養システムの使用が、細胞培養システムへの試験化合物もしくは試験物質の添加によって行われる。試験化合物は分析ウェルに導入され、インキュベートされ、その後、試験化合物によって影響を受ける細胞生物学プロセスを含む試験化合物の性質を判定するために、ヒト器官細胞もしくは細胞培地のエンドポイント分析が行われる。実施形態では、試験化合物の性質は、試験化合物の薬物代謝、薬物−薬物相互作用、および薬理を含む。他の実施形態では、試験化合物は分析ウェルに導入されない。この例では、ヒト器官細胞はヒト血漿培地で培養され、細胞生物学プロセスまたは評価される器官の病気の進行に関連する細胞生物学、化学および分子生物学を評価するために、ヒト器官細胞もしくは細胞培地のエンドポイント分析が行われる。実施形態では、器官の病気は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎感染症、もしくはＣ型肝炎感染症などの肝臓病である。実施形態では、細胞生物学プロセスは、遺伝子発現、タンパク質合成、もしくはホルモン応答を含む。
【００４２】
ある実施形態では、本明細書の細胞培養システムの使用は、病気の進行の評価用の細胞培養システムへのウイルスの添加によって行われる。実施形態では、ヒト肝細胞およびヒト血漿培地を含む細胞培養システムに肝炎ウイルスが添加される。実施形態では、その後、ヒト肝細胞、ヒト血漿培地、および肝炎ウイルスを含む細胞培養システムに、試験化合物が添加される。実施形態では、細胞生物学プロセスまたは評価される肝臓病の進行に関連する細胞生物学、化学および分子生物学を評価するために、ヒト肝細胞もしくは細胞培地のエンドポイント分析が行われる。
【００４３】
本発明で使用される試験化合物は、薬物、薬物候補、生物製剤、食物成分、薬草もしくは植物の成分、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むが、これらに限定されない。実施形態では、試験化合物は、薬物、薬物候補、工業化学物質、環境汚染物質、殺虫剤（pesticide）、殺虫剤（insecticide）、生物学上の化学物質、ワクチン製剤、細胞毒性化学物質、変異原、発がん性物質、ホルモン、抑制化合物、化学療法薬もしくは化学療法化学物質である。試験化合物は、天然物もしくは合成物であり得、かつ、有機物もしくは無機物であり得る。当業者は、適切な溶媒もしくはバッファの中の細胞培養システム中に存在するヒト血漿培地に試験化合物が添加されることができることを理解するであろう。
【００４４】
実施形態では、試験化合物は、薬物、薬物候補、工業化学物質、環境汚染物質、殺虫剤（pesticide）、殺虫剤（insecticide）、生物学上の化学物質、もしくは化学物質である。
【００４５】
実施形態では、ヒト器官細胞は、肝細胞、腎細胞、肺上皮細胞、腸細胞、心筋細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、ニューロン、リンパ球、赤血球、ケラチノサイト、含脂肪細胞、副腎細胞、甲状腺細胞、胸腺細胞、結合組織細胞、精巣細胞、卵巣細胞、もしくはこれらの組み合わせから選択される。ある実施形態では、ヒト器官細胞は、ヒト血漿培地で培養されたヒト肝細胞である。「ヒト器官細胞」についての言及は、肝細胞や腸細胞などの上記の個々の器官細胞の任意のものを、それらが関連する文章に詳細に開示されているかのように意味することが理解される。
【００４６】
実施形態では、ヒト血漿培地で培養されるヒト器官細胞は、新たに単離されるか、予め低温保存されるか、または、継続的に培養された細胞株から取得される。従って実施形態では、ヒト器官細胞を非ヒト血漿培地で培養する前に、器官細胞は、まず解凍されることができ、そして、非ヒト血漿培地などの培地で培養されることができる。ある実施形態では、器官細胞が細胞培養容器の表面に付着するのに十分な期間にわたって、器官細胞は培地で培養されることができる。実施形態では、ヒト器官細胞は、提供者から予め低温保存されたヒト肝細胞（１人の提供者からの個々のロットとして、または、複数の提供者からプールされて低温保存され得る）である。
【００４７】
実施形態では、ヒト器官細胞は、低温保存されたか、または、新たに調製された初代細胞もしくは細胞株である。ある実施形態では、ヒト器官細胞は、肝臓（肝細胞）、腸（腸細胞）、および腎臓（腎細胞）など、体内で薬物代謝に貢献する器官からのものである。実施形態では、ヒト器官細胞は、肝臓での代謝のための肝細胞、腸での代謝のための腸細胞、もしくは腎臓での代謝のための腎近位尿細管細胞（renal proximal tube cell）である。ある実施形態では、異なる器官の細胞は、試験化合物の代謝における個々の器官の役割を個々に定義するために用いられる。換言すると、腸細胞は、口から摂取された試験化合物の腸での代謝のモデルを作るために使用されることができ、肺上皮細胞は吸入した試験化合物の代謝のモデルを作るために使用され、腎近位尿細管細胞は腎臓に排泄された試験化合物の腎臓の代謝のモデルを作るために使用されることができる。他の実施形態では、異なる器官の細胞は、試験化合物の全体の代謝を理解するために組み合わせて用いられる。ある実施形態では、試験化合物は、本細胞培養システム中で使用されるヒト器官細胞の種類を決定する。実施形態では、経口が試験化合物の主な投与ルートである場合、腸細胞がヒト器官細胞として選択され得る。代替的に、試験化合物が腎臓で排泄される場合、腎近位尿細管細胞がヒト器官細胞として選択され得る。従って、細胞培養システムは、細胞培養容器、ヒト血漿培地、ならびに、ヒト肝細胞、腸細胞もしくは腎近位尿細管細胞を含む。
【００４８】
ある実施形態では、ヒト器官細胞はヒト肝細胞である。Li, A. P. (2007) Human hepatocytes: isolation, cryopreservation and applications in drug development. Chemico-biological interactions, 168(1), 16-29を参照。通常の方法によりヒトの肝臓から得られた新たに調製されたヒト器官細胞または低温保存された細胞（例えば、肝細胞）は、ヒト器官細胞として使用されることができる。Hewitt, Nicola J., et al. "Primary hepatocytes: current understanding of the regulation of metabolic enzymes and transporter proteins, and pharmaceutical practice for the use of hepatocytes in metabolism, enzyme induction, transporter, clearance, and hepatotoxicity studies." Drug metabolism reviews 39.1 (2007): 159-234を参照。肝細胞は、懸濁液もしくは適切な増殖培地（例えば、非ヒト血漿培地）を含む適切な培養プレート上に固定された形式で使用されることができる。
【００４９】
当業者は、適切な非ヒト血漿細胞培養増殖培地の選択方法を理解できる。肝細胞用には、細胞培養増殖培地は、ウィリアムＥ培地およびダルベッコ改変イーグル最小必須培地（Dulbecco's Modified Eagle's Minimal Medium）を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
実施形態では、ヒト器官細胞は肝細胞（肝臓の実質細胞）である。肝臓の代謝は代謝依存の生体異物毒性（metabolism-dependent xenobiotic toxicity）の主要な決定因子として知られている。Ｐ４５０および非Ｐ４５０フェーズ１酸化酵素経路が比較的不活性な親化合物から反応性の高い（毒性／発がん性／変異原性）代謝物への生活性を主に実行する。フェーズ２接合経路は、毒性の親化合物もしくは代謝物のより毒性の低い化合物への生体内変化を主に実行する。フェーズ１経路およびフェーズ２経路のいずれも、肝細胞に存在する（極めて重要な肝細胞タイプは肝臓での代謝を実行する）。実施形態では、腸細胞は経口で摂取された毒物の腸での代謝のモデルを作るために使用されることができる。他の実施形態では、腎近位尿細管細胞は腎臓での代謝のモデルを作るために使用されることができる。ある他の実施形態では、腸細胞は、腸での代謝のモデルを作るために使用されることができる。
【００５１】
ある実施形態では、ヒト器官細胞は組み換え細胞であり、例えば、それらは薬物代謝酵素を含むように設計されている。ある実施形態では、ヒト器官細胞は、シトクロムＰ４５０のアイソフォームを含むように設計される。以下を参照。Doehmer, J., Battula, N., Wolfel, C., Kudla, C., Keita, Y. and Staib, A.H., 1992.Biotransformation of caffeine and theophylline in mammalian cell lines genetically engineered for expression of single cytochrome P450 isoforms, Biochemical pharmacology, 43(2), pp.225-235、Donato, M. T., Jimenez, N., Castell, J. V., & Gomez-Lechon, M. J. (2004). Fluorescence-based assays for screening nine cytochrome P450 (P450) activities in intact cells expressing individual human P450 enzymes. Drug Metabolism and Disposition, 32(7), 699-706。
【００５２】
実施形態では、試験化合物の代謝を判定するための本細胞培養システムおよび方法を用いて、ＨｅｐＧ２などの安定した細胞株がヒト血漿培地で培養される。ＨｅｐＧ２は、良く分化した肝細胞がんのコーカサス人の１５歳の男性の肝臓から派生した永久的な細胞株である。体外での高度な形態学的分化と機能分化によって、ＨｅｐＧ２は体外でヒト肝細胞中の細胞内輸送ならびに胆細管および洞様毛細血管膜（sinusoidal membrane）タンパク質および脂質のダイナミクスを研究するための適切なモデルとなることができる。Ihrke et al., WIF-B cells: an in vitro model for studies of hepatocyte polarity. Journal of Cell Biology 123 (6), 1761-1775, 1993を参照。ある実施形態では、試験化合物の代謝を判定するための本細胞培養システムおよび方法を用いて、ＨｅｐａＲＧなどの安定した細胞株がヒト血漿培地で培養される。以下を参照。Guillouzo, A., Corlu, A., Aninat, C., Glaise, D., Morel, F. and Guguen-Guillouzo, C., 2007、The human hepatoma HepaRG cells: a highly-differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics. Chemico-biological interactions, 168(1), pp.66-73。
【００５３】
実施形態では、存在しているヒト器官細胞は、自然界に存在しない「組み換え型」（「外因性」ともいわれる）核酸シーケンスを含むように遺伝子学的に変異もしくは修飾され得、あるいは、遺伝機能を追加または削除するためのアンチセンス技術によって修飾され得る。遺伝子学的に修飾された細胞の生成方法は、当技術分野で知られている。例えば、“Current Protocols in Molecular Biology,” Ausubel et al., eds, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 2000を参照。
【００５４】
従って、実施形態では、ヒト器官細胞をヒト血漿培地で培養する方法は、初代細胞、幹細胞、前駆細胞、通常の細胞株、遺伝子学的に修飾された細胞株、遺伝子学的に改変された細胞株、不死化細胞株、および形質転換された細胞株などを含む任意の器官細胞タイプへの使用に適している。本発明は、単一の細胞タイプもしくは細胞株、または異なる細胞タイプの組み合わせへの使用に適している。細胞は、任意の組織タイプ（例えば、心臓、胃、腎臓、腸、肺、肝臓、脂肪、骨、軟骨、骨格筋、平滑筋、心筋、骨髄、筋肉、脳、膵臓）ならびに細胞タイプ（例えば、上皮、内皮、間葉、含脂肪細胞、造血）であることができる。
【００５５】
実施形態では、組成物は、試験化合物の性質、肝臓病の進行、もしくは細胞生物学プロセスを評価するための細胞培養システムであって、１つ以上の分析ウェルを含む細胞培養容器を含み、分析ウェルはヒト血漿培地およびヒト器官細胞を含む細胞培養システムを含む。実施形態では、細胞培養システムが使用され、試験化合物が分析ウェルに導入され、試験化合物は０．５時間から１０日の間３３〜４０℃でインキュベートされ、その後、試験化合物の性質を評価するためにヒト細胞もしくは細胞培地のエンドポイント分析が行われる。ヒト血漿培地で培養されたヒト器官細胞は、直接的に人の体内に変換されることができる結果を伴った、薬物薬理活性、薬物代謝、薬物−薬物相互作用および薬物毒性の評価に使用されることができる。
【００５６】
実施形態では、生物学的および薬理学的な化学物質に対して異なる反応をし得る、様々な遺伝子的に異なる個人から細胞が培養される。遺伝子的な差は、試験化合物の代謝に間接的および直接的に影響を与えることができる。実施形態では、ヒト器官細胞は、複数の個人もしくは提供者から細胞がプールされたものである。ある実施形態では、ヒト器官細胞は、個体数の異種性を反映している。
【００５７】
実施形態では、ヒト器官細胞（例えば、肝細胞を含む肝臓の細胞、尿細管細胞を含む腎臓の細胞、長期間にわたって有機物質を保持することができる含脂肪細胞を含む脂肪細胞）は、薬学的に活性な化合物の解毒および代謝に関わっている。実施形態では、これらの細胞は、細胞培養システム中で肺の細胞などの呼吸および酸素化プロセスに関わる細胞と混合され得る。
【００５８】
実施形態では、予め低温保存されたか、提供者の器官から新たに単離されたか、または、継続的に培養された細胞株から取得されたヒト器官細胞は、ヒト血漿培地と置き換えられる非ヒト血漿培地で、少なくとも２０分の間、また、数時間もしくは一日以上まで培養される。ヒト血漿培地は、約７０％〜１００％のヒト血漿を含む。ある実施形態では、ヒト血漿培地は、１００％の血漿からなる。ある実施形態では、ヒト血漿培地は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％のヒト血漿を含み、この比率は細胞培地で日常的に用いられる。ある実施形態では、ヒト器官細胞は、約７５％〜１００％のヒト血漿、約８０％〜１００％のヒト血漿、約８５％〜１００％のヒト血漿、約９０％〜１００％のヒト血漿、および約９５％〜１００％のヒト血漿を含むヒト血漿培地で培養される。ヒト血漿は、複数の提供者からプールされるか、個々の提供者からプールされる。実施形態では、ヒト血漿は少なくとも５人の提供者からプールされる。実施形態では、ヒト血漿はヒトの血液から取得される。実施例１を参照。実施例１で、ヒト肝細胞は１００％のヒト血漿培地で２〜３日ごとに培地を取り換えて２９日培養され、２９日目でも優れた細胞形態を示した。対照的に、ウィリアムＥ培地のような非ヒト細胞培地で培養されたヒト肝細胞は１４日目で弱り始め、２９日目でほとんど死滅した。
【００５９】
実施形態では、少なくとも１５日、少なくとも２０日、少なくとも２９日、少なくとも３０日、少なくとも４５日、少なくとも６０日、または、少なくとも９０日の間、ヒト器官細胞はヒト血漿培地で培養されることができる。ある実施形態では、ヒト血漿培地中のヒト器官細胞は、少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも５日、少なくとも１０日、もしくは、少なくとも１５日の間培養されることができる。ある実施形態では、ヒト血漿培地中のヒト器官細胞は、５日まで、１０日まで、１５日まで、約３０日まで、４５日まで、６０日まで、もしくは９０日までの間培養されることができる。
【００６０】
ある実施形態では、ヒト肝細胞はヒト血漿培地で培養される。ここで、ステップは、非ヒト血漿培地でヒト肝細胞を培養するステップ、非ヒト血漿培地をヒト血漿培地に置き換えるステップ、および、ヒト器官細胞をヒト血漿培地で培養するステップを含み、少なくとも１〜１５日もしくはそれ以上に一回、ヒト血漿培地が新たなヒト血漿培地に更新される。実施形態では、ヒト肝細胞は低温保存され、解凍され、その後、非ヒト血漿培地で培養される。他の実施形態では、ヒト肝細胞はヒト血漿培地で培養され、ステップは、ヒトの肝臓からヒト肝細胞を単離するステップ、非ヒト血漿培地でヒト肝細胞を培養するステップ、非ヒト血漿培地をヒト血漿培地に置き換えるステップ、および、ヒト器官細胞をヒト血漿培地で培養するステップを含み、少なくとも１〜１５日もしくはそれ以上に一回、ヒト血漿培地が新たなヒト血漿培地に更新される。実施形態では、少なくとも１週間、２週間、３週間もしくは少なくとも約１か月（例えば、４週間もしくは約２９〜３１日）、ヒト肝細胞はヒト血漿培地で培養される。実施形態では、細胞培養条件は可能な限り生理的条件を再現する。本明細書で使用されるように、「生理的条件」という語句は、細胞培養条件は体内の特定の細胞のための自然の組織の条件をできるだけ模倣するように非常に詳細に監視されることを意味するように定義される。
【００６１】
実施形態では、試験化合物の性質、器官の病気の進行および／または細胞生物学プロセスを評価するための、ヒト器官細胞およびヒト血漿培地を細胞培養容器に含む細胞培養システムの使用を提供する。
【００６２】
実施形態では、試験化合物は、入力変数を考慮し、本明細書では、細胞培養システムの試験化合物と同じ意味で使用される。試験化合物は、薬物動態ベースの培養システム（例えば、現在の外因的代謝システム）に添加し、その後、出力された対象の変数の変化（例えば、Ｏ２の消費、ＣＯ２の生成、細胞の生存性、対象のタンパク質の発現（タンパク質発現）、細胞機能、対象の遺伝子の発現（遺伝子発現）、代謝物生成もしくは代謝物プロファイル）について対象細胞（もしくは培地）を評価することによって生物学的活性がスクリーニングされる。試験化合物は、典型的には、溶液中もしくはヒト血漿培地の培養中の細胞に容易に溶解する形式で加えられる。試験化合物は、流水システムを用いるか、もしくは代替的にボーラスを他の静的溶液に追加することにより添加されることができる。流水システムでは、２つの流体が使用され、一方は生理的に中性な溶液で、他方は同じ溶液に試験化合物を追加したものである。第１の溶液が細胞を通過し、その後第２の溶液が通過する。１種類の溶液法では、試験化合物のボーラスが細胞を取り囲む対象の培地に添加される。ボーラスの追加に伴ってもしくは流水法の２つの溶液の間で、培地の全体の組成が著しく変化すべきではない。
【００６３】
実施形態では、試験化合物は薬理学的な活性薬物もしくは薬物候補ならびに遺伝子的な活性分子を含む。対象の試験対象物は、化学療法薬、抗炎症剤、ホルモンもしくはホルモン拮抗薬、イオンチャネル修飾因子、および、神経刺激性の化学物質を含む。本発明に適した例示的な薬学的化学物質は、"The Pharmacological Basis of Therapeutics," Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996)の第９版の以下の章に記載されている。「Drugs Acting at Synaptic and Neuroeffector Junctional Sites」、「Drugs Acting on the Central Nervous System」、「Autacoids: Drug Therapy of Inflammation」、「Water, Salts and Ions」、「Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism」、「Cardiovascular Drugs」、「Drugs Affecting Gastrointestinal Function」、「Drugs Affecting Uterine Motility」、「Chemotherapy of Parasitic Infections」、「Chemotherapy of Microbial Diseases」、「Chemotherapy of Neoplastic Diseases」、「Drugs Used for Immunosuppression」、「Drugs Acting on Blood-Forming Organs」、「Hormones and Hormone Antagonists」、「Vitamins, Dermatology」、および「Toxicology」。さらに、毒素ならびに生物学的および化学的兵器剤も含まれる。例えば、Somani, S. M. (Ed.), "Chemical Warfare Agents," Academic Press, New York, 1992)を参照。
【００６４】
実施形態では、試験化合物は本明細書に記載した全ての種類の分子を含み、および、さらにもしくは別に未知の試料を含むことができる。多くの試料は溶液中に化合物を含むであろうが、適切な溶媒に溶解されることのできる固体試料も分析され得る。対象の試験化合物を含む試料は、分析用に調製された化合物のライブラリだけでなく、地下水、海水もしくは採鉱廃棄物などの環境試料、農作物もしくは組織試料から調製した溶解液などの生物学的試料、薬剤を生成する間の経時変化などの工業的試料などを含む。試験化合物を含む対象の試料は、植物もしくは真菌細胞から、薬物候補などの潜在的な薬学的価値を評価される。
【００６５】
試験化合物は、合成化合物もしくは天然化合物のライブラリを含む多種多様な源から取得される。例えば、多種多様の有機化合物、ならびに、ランダム化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む生分子のランダムおよび有向の合成のための多くの方法が利用可能である。代替的に、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物、もしくは動物抽出物の形式の天然化合物のライブラリが利用可能であるか容易に調製することができる。さらに、天然もしくは合成的に生成されたライブラリおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手法で容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリを生成するために使用され得る。既知の薬物は、構造類似体を生成するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの、直接もしくはランダムな化学修飾を受けることができる。
【００６６】
実施形態では、病気の進行または細胞生化学プロセスを含む試験化合物の性質を判定するために、試験化合物を伴った細胞培養システムの培養の後でエンドポイント分析が行われる。実施形態では、エンドポイント分析は、細胞培養システムの出力変数（例えば、試験化合物の性質）を特定する。実施形態では、出力変数は、細胞の定量可能な要素、特に細胞培養システムで正確に測定されることができる要素である。出力変数は、例えば、生存能力、呼吸、代謝、細胞表面決定、レセプター、タンパク質、あるいは、それらの構造的もしくは翻訳後の修飾物、脂質、炭水化物、有機分子もしくは無機分子、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、もしくはこれらの細胞構成物から誘導される部分などを含む任意の細胞構成物もしくは細胞生成物であり得る。実施形態では、出力変数は、直接的もしくは間接的な試験化合物もしくはその代謝物の結果である。ほとんどの出力変数は定量的な情報であるが、いくつかの例では、半定量的もしくは定性的な結果が得られる。情報は、１つの決定された値、または、平均値、中央値、もしくは分散を含み得る。情報の特徴的な範囲は、個々の出力について得られるであろう。変動性が予測され、一連の試験出力の範囲が通常の統計法を用いて確立されることができる。
【００６７】
選択された代謝マーカーの存在を定量化するために様々な方法が使用され得る。液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、質量分析（ＭＳ）およびそれらの組み合わせ（ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ）が代謝物の定量化のために日常的に使用される。存在する分子の量の非ＬＣ／ＭＳ測定のために、簡便な方法は、分子を検出可能な部分（蛍光性、発光性、放射性、酵素的に活性であり得る部分）でラベルすることである。蛍光性および発光性の部分は、任意の生分子、構造もしくは細胞タイプを実質的にラベルするために容易に利用できる。免疫蛍光部分は、特定のタンパク質だけでなく特定の形態、分割生成物（cleavage products）もしくはリン酸化などのサイト修飾を結合することも対象としている。個々のペプチドおよびタンパク質は、例えば、緑の蛍光タンパク質キメラを細胞内で発現させることなどによって自然発光するように設計されてもよい（概説として、Jones et al. (1999) Trends Biotechnol. 17(12):477-81を参照）。
【００６８】
免疫組織化学、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着法（enzyme linked immunosorbance assay、ＥＬＩＳＡ）および関連する非酵素技術などのイムノアッセイ技術によって、出力変数が測定され得る。これらの技術は特定の抗体を、１つの分子ターゲットに結合するためのそれらの高度な特異性のために、特に有用なレポーター分子として用いる。細胞ベースのＥＬＩＳＡもしくは関連する非酵素もしくは蛍光ベースの方法は、細胞表面パラメータを測定することができる。このような分析からの情報は、個々の蛍光抗体特定細胞表面の分子もしくはサイトカイン、または、蛍光強度の平均値、蛍光強度の中央値、蛍光強度の分散、もしくはこれらの間の関連に関連した平均蛍光であり得る。毒性分析のために、出力は酵素放出、細胞ＡＴＰ含有量、反応性酸素種構成、減らされたグルタチオンの減少、タンパク質合成、タンパク質含有量、ＤＮＡ含有量、色素排除、色素内包、および細胞分離などの細胞生存性の測定を含むことができる。薬物動態分析のために、特定の病気のターゲットに関連した分析が使用できる。
【００６９】
実施形態では、スクリーニング分析の結果は、参照化合物、濃度曲線、対照（代謝的に適格性のある細胞を伴う場合及び伴わない場合）などから得られた結果と比較され得る。結果の比較は、適切な推論プロトコル、ＡＩシステム、統計比較、アルゴリズム等を用いて行われる。
【００７０】
参照出力データのデータベースが適合される。これらのデータベースは、１つもしくは複数の環境的条件またはパラメータが除去されるかあるいは特に変更された環境的条件の下で扱われた細胞の分析からの参照だけでなく、既知の化学物質もしくは化学物質の組み合わせから得られた結果も含むことができる。データマトリクスが生成されることができる。ここで、データマトリクスの個々のポイントは、出力変数からの情報に対応する。個々の出力のデータは、再現された判定（例えば、同じタイプの複数の個々の細胞）からもたらされる。
【００７１】
情報は、平均（mean）、平均値（average）、中央値もしくは分散あるいは他の統計的または数学的に導かれる測定に関連した値である。出力情報は、対応する参照情報と直接比較することによりさらに精緻化される。同じ条件下で個々の出力から得られた絶対値は、生存している生物学的システムに由来した変動性を示し、かつ、個体間の固有の変動性だけでなく個々の細胞の変動性も反映する。
【００７２】
＜実施例＞
以下の実施例は、本明細書に記載された実施形態をどのように使用するかの完全な開示および記述を当業者が理解できるようにするために提供され、本開示の範囲を限定する意図で記載されたものではなく、以下の実施例が全ての実験もしくは実行された実験のみを表すことを意図したものでもない。使用された数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを担保できるように努力されているが、いくらかの実験誤差や偏差は考慮されるべきである。他に特に示さない限り、部分は体積比であり、温度はセ氏温度である。以下の実施例で説明しようとする基本的な態様を変更することなく、記載された方法の変更が行われ得ることは理解されるべきである。
【００７３】
実施例１：ヒト肝細胞の全（１００％）ヒト血漿中での培養
【００７４】
ヒトの体内では、全ての細胞は血漿で栄養を補給されている。従って、ヒト血漿はヒトの細胞を培養するための最も適切な培地である。
【００７５】
予め低温保存された１００％融合性の固定可能な（confluent plateable）ヒト肝細胞（ＨＨ１０５３／５７／６２、３人の提供者）は、１００％ヒト血漿（最小限に修正された５人の提供者からプールされたヒト血漿）およびウィリアムＥ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で培養された。ウィリアムＥ培地は、ラットの成体の肝上皮細胞の長期間細胞培養ための削減された血清添加培地であるが、ヒト肝細胞の培養にも使用可能である。肝細胞は、９６ウェルプレート中で月曜日、水曜日、および、金曜日ごとに培地を交換して全体で２９日間にわたって培養された。
【００７６】
培養された肝細胞の細胞形態は７日目、１４日目、２４日目、および２９日目に評価され、ウィリアムＥ培地で培養されたヒト肝細胞は１４日目で弱り始め、２９日目での実験の終わりまで弱っていった。対照的に、１００％ヒト血漿培地で培養されたヒト肝細胞は、２４日を通して、完全で正常な上皮細胞形態を保った。図１を参照。ウィリアムＥ培地で培養されたヒト肝細胞は２９日目でほとんどすべて死滅したが、１００％ヒト血漿で培養されたヒト肝細胞は、正常な上皮細胞形態を伴って生存可能なままであった。図２を参照。
【００７７】
ヒト肝細胞は、延長された期間（４週間を超えて）ヒト血漿培地で培養できる。対照的に、最も一般的に肝細胞の培養に使用される培地であるウィリアムＥ培地で培養されたヒト肝細胞は、およそ２週間もしくは１４日目で弱り始めた。
【００７８】
実施例２：シトクロムＰ４５０誘導
【００７９】
ヒト提供者からの肝細胞（予め低温保存されている）は、１００％ヒト血漿（最小限に修正された５人の提供者からプールされたヒト血漿培地、ＨＰＺ−Ａ）およびタンパク質を含まない肝細胞培地（ＨＩＭ）の両方で、全体で２９日の継続期間にわたって固定された（plate）。肝細胞は９６ウェルのコラーゲンコートされた組織培養皿中に、万能低温保存固定培地（Universal Cryopreservation Plating Medium、ＵＣＰＭ）を用いて固定された。取り付けから４時間後、培地はＨＰＺ−Ａおよび０．２５ｍｇ／ｍＬのマトリゲルを含むＨＩＭに変更された。培地はその後、次の日と２９日の培養期間の２〜３日ごとに、マトリゲルを含まないＨＰＺ−Ａに変更された。
【００８０】
図３は、ヒト血漿培地で培養されたヒト肝細胞をＨＩＭの場合と比較したときの７日目、１４日目、２４日目、および２９日目の細胞形態を示す。ヒト血漿培地で培養されたヒト肝細胞は、２９日目でも通常の上皮細胞形態を伴って生存可能なままであった。従って、１００％ヒト血漿培地（ＨＰＺ−Ａ）は、ヒト肝細胞を少なくとも２９日間かそれより長い延長された期間の間培養するためにうまく使用することができる。
【００８１】
ＣＹＰ誘導比較では、４ロットのヒト肝細胞（ＨＨ１００７、ＨＨ１０２６、ＨＨ１０５１、およびＨＨ１０５３）が使用された。シトクロムＰ４５０タンパク質は、薬物代謝に関わる多くの反応を触媒するモノオキシゲナーゼである。肝細胞は、９６ウェルのプレート中に、先に開示したようにＨＩＭとヒト血漿培地の両方に固定され、固定の５日後に原型的な誘導因子の処理を開始した。処理期間は３日であった。ＣＹＰ１Ａ２（オメプラゾール）、ＣＹＰ２Ｂ６（フェノバルビタールによる）、および、ＣＹＰ３Ａ４（リファムピンによる）の誘導を測定するために、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現が使用された。
【００８２】
図４は、ＨＩＭおよびヒト血漿培地の両方で培養されたヒト肝細胞の４つのロットの各々でのｍＲＮＡによる測定されたＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、および、ＣＹＰ３Ａ４の各々の誘導を示す。ヒト血漿培地で培養されたヒト肝細胞は、ＣＹＰ１Ａ２誘導、ＣＹＰ２Ｂ６誘導、および、ＣＹＰ３Ａ４誘導に応答し、完全なＰ４５０誘導経路を保持していることを示した。
【００８３】
長期的な細胞毒性のために、ロットＨＨ１０６２が先に開示したようにヒト血漿培地で培養され、７種類の濃度のアフラトキシンＢ１（濃度の範囲は１μＭから９０μＭ）で２日目と１０日目に処理された。生存能力は細胞ＡＴＰ含有量（ＡＴＰＬｉｔｅ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に基づいて定量化された。結果は、以下の式を用いて相対的な生存能力として表された。
【００８４】
相対的な生存能力（％）＝ＡＴＰ（処理）／ＡＴＰ（溶媒対照）×１００
【００８５】
図５は、体外のヒト血漿中での急性および亜慢性の肝毒性評価を示す。アフラトキシンＢ１（肝毒性のための代謝活性を要求する）は、ヒト血漿培地で培養されたヒト肝細胞にとって細胞毒性であることが分かった。１０日の処理期間後のアフラトキシンのＵＣ５０値は２日の処理期間の後に観測されたものの１９倍低い。この結果は、ヒト血漿中で培養されたヒト肝細胞は、前駆毒性物質（protoxicant）を活性化することができ、慢性的な肝毒性の評価に使用できることを示した。
【００８６】
実施例３：シトクロムＰ４５０  ３Ａ４誘導
【００８７】
ＣＹＰ３Ａ４は、シトクロムＰ４５０スーパーファミリーの酵素のメンバーである。
【００８８】
２人の提供者からの（予め低温保存された）肝細胞は、実施例２に記載したように固定され、培養された。ＣＹＰ３Ａ４誘導の比較のために、ヒト肝細胞のロット（ＨＨ１０５１およびＨＨ１０５３）が使用された。ＨＩＭ中で培養されたヒト肝細胞に、固定してから２日目に３日間の処理期間でリファムピン（濃度の範囲は１μＭから２０μＭ）を添加し、ヒト血漿培地で培養されたヒト肝細胞に、固定してから５日目に３日間の処理期間でリファムピン（濃度の範囲は１０μＭから２００μＭ）を添加した。リファムピンによるＣＹＰ３Ａ４の誘導を測定するために、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現が使用された。
【００８９】
図６および図７は、リファムピンによるＣＹＰ３Ａ４遺伝子発現の誘導の容量依存性を示す。評価された濃度では、ヒト血漿培地で培養された肝細胞中の最大の誘導された折り畳みは、ＨＩＭ中で培養された肝細胞によって観測されたものよりも低かった。
【００９０】
実施例４：肝臓病のメカニズムと治療の評価
【００９１】
ヒト血漿で培養されたヒト肝細胞の潜在的な適用は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎および／またはＣ型肝炎の評価用である。ヒト血漿肝細胞培養は、（例えば、肝炎患者から）精製されたウイルスもしくはウイルス含有血漿のいずれかに感染されることができる。ウイルス複製および得られた肝細胞の変化は、ウイルス感染および肝臓のダメージのメカニズムの理解を助けることができる。ウイルス感染した肝細胞は、肝炎のための薬の開発のための抗肝炎薬候補のスクリーニングにも使用されることができる。
【００９２】
当業者は多くの変形および他の実施形態を、現在開示した発明の範囲と精神の範囲内で考案できる。実際、当業者は、開示された発明の基本的な態様を変化することなく、記載された物質、方法、図面、実験実施例および実施形態を変化させることができる。開示された任意の実施形態は、他の開示された実施形態と組み合わせて使用され得る。
【００９３】
開示された実施形態、実施例、および実験例は、開示の範囲を限定することを意図しておらず、以下の実験が全てのもしくは実行された実験のみを表すことを意図したものでもない。使用された数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを担保できるように努力されているが、いくらかの実験誤差や偏差は考慮されるべきである。実験例で説明しようとする基本的な態様を変更することなく、記載された方法の変更が行われ得ることは理解されるべきである。
【図１】
2019516391.tif 000003
【図２】
2019516391.tif 000004
【図３】
2019516391.tif 000005
【図４】
2019516391.tif 000006
【図５】
2019516391.tif 000007
【図６】
2019516391.tif 000008
【図７】
2019516391.tif 000009
【国際調査報告】
2019516391.tif 000010