(57)【要約】  本開示は、ＨＩＶ感染症の予防、処置および／または機能的治癒のための組成物および方法に関する。本開示の一態様は、ＣＤ４に対するモノクローナル抗体、その組成物、ならびにＨＩＶ感染症の予防、処置および機能的治癒のためにこのような組成物を使用する方法に関する。
2019534891.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ４分子に対する抗体であって、該抗体は前記ＣＤ４分子の細胞外領域に特異的に結合し、前記抗体がＣＤ４＋細胞の表面上の前記ＣＤ４分子に結合すると、前記抗体は、
ａ）前記ＣＤ４＋細胞へのＨＩＶ侵入を競合的に阻害する；
ｂ）ＨＩＶに感染した静止期ＣＤ４＋細胞中の潜伏ＨＩＶ蓄積を活性化する；
ｄ）細胞ＨＩＶ  ＤＮＡのレベルを低下させる；および
ｅ）ウイルス量リバウンドなしにＨＩＶ感染症の持続的ウイルス学的寛解をもたらす；
上記抗体。
【請求項２】
前記抗体はＨＩＶの無細胞および細胞間伝達を競合的に阻害する請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
対象に投与すると、前記抗体は制御性Ｔ細胞の割合を減少させる請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
対象に投与すると、前記抗体はＣＤ８＋細胞の量を増加させる請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
対象に投与すると、前記抗体はＨＩＶ  ｇａｇモチーフペプチド刺激に応答してＣＤ８＋増殖細胞を増加させる請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
対象に投与すると、前記抗体はＨＩＶ感染ＣＤ４＋細胞を標的化する機能的ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ細胞を増強する請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体はＣＤ４＋細胞におけるＴＮＦ−α産生を増強する請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
架橋の有無にかかわらず、前記抗体は静止期ＣＤ４＋細胞を活性化する請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
ウイルス量リバウンドなしに、前記抗体はＨＩＶ陽性患者におけるＨＩＶウイルス量を血液１ｍＬ当たり５０コピー未満に減少させる請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体は前記ＣＤ４分子のドメイン１付近の領域に結合する請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体はＣＤ４のドメイン１のＣＤＲ２領域付近の領域に結合する請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体は、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２および配列番号３のＣＤＲ３を有する重鎖可変領域アミノ酸配列；及び
配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２および配列番号６のＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列；を有する請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体がヒト化モノクローナル抗体である請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；を有するヒト化モノクローナル抗体である請求項１に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有するヒト化モノクローナル抗体である請求項１に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有するヒト化モノクローナル抗体である請求項１に記載の抗体。
【請求項１８】
配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有するヒト化モノクローナル抗体である請求項１に記載の抗体。
【請求項１９】
ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上の膜結合ＣＤ４に対する絶対結合親和性（Ｋｄ）が約３．１×１０−１１Ｍ〜約８．１×１０−１１Ｍである請求項１に記載の抗体。
【請求項２０】
ＣＤ４分子に結合した請求項１に記載の抗体。
【請求項２１】
請求項１に記載の抗体を有する組成物。
【請求項２２】
請求項１に記載の抗体；及び医薬上許容可能な担体；を有する医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１に記載の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２０ｍＭグリシンおよび０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０の溶液を有する医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１に記載の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２０ｍＭグリシン、０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０および１０ｍＭヒスチジンの溶液を有する医薬組成物。
【請求項２５】
約１．０ｍｇ／ｍＬ〜約２００．０ｍｇ／ｍＬの請求項１に記載の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２０ｍＭグリシンおよび０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０の溶液を有する医薬組成物。
【請求項２６】
約１．０ｍｇ／ｍＬ〜約２００．０ｍｇ／ｍＬの請求項１に記載の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２０ｍＭグリシン、０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０および１０ｍＭヒスチジンの溶液を有する医薬組成物。
【請求項２７】
約１０．０ｍｇ／ｍＬの請求項１に記載の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２０ｍＭグリシンおよび０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０の溶液を有する医薬組成物。
【請求項２８】
約１０．０ｍｇ／ｍＬの請求項１に記載の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２０ｍＭグリシン、０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０および１０ｍＭヒスチジンの溶液を有する医薬組成物。
【請求項２９】
請求項１２に記載の抗体；及び医薬上許容可能な担体；を有する医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１６に記載の抗体；及び医薬上許容可能な担体；を有する医薬組成物。
【請求項３１】
薬理学上有効量の請求項１に記載の抗体を前記対象に投与することを有する、ＨＩＶに曝露される対象を処置する方法。
【請求項３２】
前記抗体をＨＩＶへの曝露前に前記対象に投与する請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体をＨＩＶへの曝露後に前記対象に投与する請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗体をＨＩＶへの曝露後４８時間以内に投与する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体を少なくとも約５ｍｇ／体重ｋｇの投与量で前記対象に投与する請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体を複数回前記対象に投与する請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体を毎週、隔週または毎月間隔で前記対象に投与する請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
抗ウイルス薬を前記対象に投与する工程をさらに有する請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗ウイルス薬が高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＨＡＡＲＴが、プロテアーゼ阻害剤または非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤と組み合わせて、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤を有する請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体をＨＡＡＲＴと同時に投与する請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体およびＨＡＡＲＴをサイクルの経過にわたって前記対象に投与し、前記サイクルが
ｉ）第１の期間にわたって前記抗体を前記対象に投与し、引き続いて第２の期間にわたって処置休日；および
ｉｉ）（ｉ）の前記第１の期間および前記第２の期間の間、ＨＡＡＲＴを前記対象に連続的に投与すること；
を有する請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体およびＨＡＡＲＴをサイクルの経過にわたって前記対象に投与し、前記サイクルが
ｉ）毎週、隔週または毎月間隔で、４ヶ月の期間にわたって前記抗体を前記対象に投与し、引き続いて２ヶ月の処置休日；および
ｉｉ）（ｉ）の６ヶ月の期間の間、ＨＡＡＲＴを前記対象に連続的に投与すること；
を有する請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象が２サイクルにわたって処置される請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象が２サイクルにわたって処置される請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体をＨＡＡＲＴと同時ではない時に投与する請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗体およびＨＡＡＲＴをサイクルの経過にわたって前記対象に投与し、前記サイクルが
ｉ）第１の期間にわたって前記抗体を前記対象に投与し、引き続いて第２の期間にわたって処置休日；および
ｉｉ）ＨＡＡＲＴを前記対象に前記第２の期間の間投与し、前記第１の期間の間投与しないこと；
を有する請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体を前記第１の期間の間、一定の間隔で投与する請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体を前記第１の期間の間、毎週、隔週または毎月間隔で投与する請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
ＨＩＶ感染症を有する対象を処置する方法であって、
ａ）薬理学上有効量の請求項１に記載の抗体；及び
ｂ）高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）；
を有する処置レジメンを前記対象に投与することを有する上記方法。
【請求項５１】
前記抗体を少なくとも約５ｍｇ／体重ｋｇの投与量で前記対象に投与する請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体およびＨＡＡＲＴをサイクルの経過にわたって前記対象に投与し、前記サイクルが
ｉ）第１の期間にわたって前記抗体を前記対象に投与し、引き続いて第２の期間にわたって処置休日；および
ｉｉ）（ｉ）の前記第１の期間および前記第２の期間の間、ＨＡＡＲＴを前記対象に連続的に投与すること；
を有する請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体およびＨＡＡＲＴをサイクルの経過にわたって前記対象に投与し、前記サイクルが
ｉ）毎週、隔週または毎月間隔で、４ヶ月の期間にわたって前記抗体を前記対象に投与し、引き続いて２ヶ月の処置休日；および
ｉｉ）（ｉ）の６ヶ月の期間の間、ＨＡＡＲＴを前記対象に連続的に投与すること；
を有する請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象が２サイクル以上にわたって処置される請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が２サイクル以上にわたって処置される請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体およびＨＡＡＲＴをサイクルの経過にわたって前記対象に投与し、前記サイクルが
ｉ）毎週、隔週または毎月間隔で、４ヶ月の期間にわたって前記抗体を前記対象に投与し、引き続いて２ヶ月の処置休日；および
ｉｉ）（ｉ）の６ヶ月の期間の間、ＨＡＡＲＴを前記対象に連続的に投与すること；
を有する請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
（ａ）の前記抗体を（ｂ）のＨＡＡＲＴと同時ではない時に投与する請求項５０記載の方法。
【請求項５８】
（ａ）の抗体および（ｂ）のＨＡＡＲＴをサイクルの経過にわたって前記対象に投与し、前記サイクルが
ｉ）第１の期間にわたって前記抗体を前記対象に投与し、引き続いて第２の期間にわたって処置休日；および
ｉｉ）ＨＡＡＲＴを前記対象に前記第２の期間の間投与し、前記第１の期間の間投与しないこと；
を有する請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体を前記第１の期間の間、一定の間隔で投与する請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体を前記第１の期間の間、毎週、隔週または毎月間隔で投与する請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
請求項１に記載の抗体を前記細胞に曝露することを有する、ＣＤ４＋細胞へのＨＩＶ侵入を阻害する方法。
【請求項６２】
請求項１に記載の抗体を前記細胞に曝露することを有する、ＣＤ４＋細胞へのｇｐ１２０の結合を阻害する方法。
【請求項６３】
請求項１に記載の抗体を前記細胞に曝露することを有する、静止期ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する方法。
【請求項６４】
請求項１に記載の抗体を前記細胞に曝露することを有する、静止期Ｔ細胞中のＨＩＶの潜伏蓄積を活性化する方法。
【請求項６５】
ＨＩＶに感染した細胞の試料中の潜伏ＨＩＶ蓄積を減少させる方法であって、
ａ）請求項１に記載の抗体を細胞の前記試料に曝露すること；及び
ｂ）ＨＡＡＲＴを細胞の前記試料に曝露すること；
を有する、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、出願日が2016年8月13日である米国仮特許出願第62/374752号（全体が参照により本明細書に組み込まれる）の利益を主張するＰＣＴ国際出願である。
【０００２】
本発明は、ＨＡＡＲＴの代替としての、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）安定化患者における、ＨＩＶ感染症の処置および持続的ウイルス学的寛解のためのＣＤ４に対する抗体に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＩＶ／ＡＩＤＳの世界的流行は、現代史において最も重要な世界的な健康問題である。併用抗レトロウイルス療法（ｃＡＲＴ）は、最適に使用すると、ＨＩＶ複製を有効に制御し、ＡＩＤＳの発症を予防し、寿命を延ばし、伝染のリスクを減らすことができる。この驚くべき成功にもかかわらず、現在の抗レトロウイルス療法は、治癒的でなく、感染患者が無期限に処置を続けなければならないため、限界がある。ＨＩＶと共に生きる３５００万人超の世界人口に生涯にわたる療法を提供することの課題を考慮すると、ＨＩＶ感染症のための処置法を開発することに強い関心がある。近年の総説論文「世界的科学戦略：ＨＩＶ治療に向けて２０１６年（Global Scientific Strategy: Towards an HIV Cure 2016）」は、この分野における重大な知識のギャップ及び研究上の疑問について記載しており、この分野の技術水準の背景として言及されている（Deeks, S.G., et al., 2016）。この総説論文に開示される情報は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
あらゆるウイルス感染症の処置における理想的な結果は、処置される患者内の全ての複製能のあるビリオンの完全な根絶、即ち治癒である。このような殺菌的治癒は、達成するのが困難であるか、及び／又はＨＩＶなどのある種のウイルス感染症については証明するのが困難であり得る。より実用的であるが臨床的に成功している、複雑なウイルス感染症のための処置成績は、持続的な長期のウイルス学的寛解の達成であろう。寛解は真のＨＩＶ処置法を開発するのに必要な先駆者であるように思われ、この分野でますます利用され、ＡＲＴの非存在下で、まだ定義されていない期間（おそらく数年）の長期の検出不能なウイルス血症の目標を示す。
【０００５】
現在の技術水準に鑑みて、ＨＡＡＲＴの代替としてのＨＩＶの持続的で長期間のウイルス学的寛解を達成することができる製品および処置方法が必要とされている。
【０００６】
参考文献：
1.Deek, S.G., Lewin, S.R., Ross, A.L. et al. “International AIDS Society global scientific strategy: towards an HIV cure 2016.” Nature Medicine.2016. 22:839-850.
2.  Hunt, P.W., LAnday, A.L., Sinclair, E., et al. A low T regulartory Cell Response May Contribute to Both Viral Control and Generalized Immune Activation in HIV Controllers. PLoS One. 2011. 6: e15924.
3.  Yuan R, Qi J, Zhang Z, et al. Anti-CD4: An Alternative Way to Inhibit HIV Infection. J HIV Retrovirus. 2016, 2:1.
4.  Celada F, Cambiaggi C, Maccari J, Burastero S, Gregory T, Patzer E, Porter J, McDanal C, Matthews T. Antibody raised against soluble CD4-rgp120 complex recognizes the CD4 moiety and blocks membrane fusion without inhibiting CD4-gp120 binding. J Exp Med. 1990 Oct 1;172(4):1143-1150
5.  Moore JP, Sattentau QJ, Klasse PJ, Burkly LC. A monoclonal antibody to CD4 domain 2 blocks soluble CD4-induced conformational changes in the envelope glycoproteins of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and HIV-1 infection of CD4+ cells. Journal of Virology. 1992;66(8):4784-4793.
6.  Wang, C.Y. “Antibodies against a host cell antigen complex for pre and post exposure protection from infection by HIV.” US Patent No. 5,912,176, 1999.
7.  Wang, C.Y., Sawyer, L.S.W., Murthy, K.K., et al. “Postexposure immunoprophylaxis of primary isolates by an antibody to HIV receptor complex.” Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999, 96, 10367-10372.
8.  Lynn, S. and Wang, C.Y. “Designed deimmunized monoclonal antibodies for protection against HIV exposure and treatment of HIV infection.” US Patent No. 7,501,494 (Issued March 10, 2009).
9.  Chiba, Y., “Leu3A Binding Peptides.” US Patent 5,171,838 (1992).
10.  Jameson, B.D., Rao, P.E., Kong, L.L. et al. Location and chemical synthesis of a binding site for HIV-1 on the CD4 protein. Science. 1988, 240, 1335-1339.
11.  Kuritzkes, D.R., Jacobson, J.L., Powderly, W.G., et al. “Antiretroviral activity of the anti-CD4 monoclonal antibody TNX-355 in patients infected with HIV type I.” J. Infect. Dis. 2004. 189:286-291.
12.  Yan-Mei Jiao et al. CD4+CD25+CD127 regulatory cells play multiple roles in maintaining HIV-1 p24 production in patients on long-term treatment: HIV-1 p24-producing cells and suppression of anti-HIV immunity. International Journal of Infectious Diseases. 2015; 37:42-49.
13.  Konig R, Shen X, Germain RN: Involvement of both major histocomputibility complex class11 alpha and beta chains in CD4 function indicates a role for ordered oligomerization in T cell activation. J Exp Med 1995;182:779-787.
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、ＨＡＡＲＴの代替としてのＨＡＡＲＴ安定化患者におけるＨＩＶ感染症の処置および持続的ウイルス学的寛解のための抗体、組成物および方法に関する。本開示の一面は、ＣＤ４に対する抗体、その組成物、ならびにその後のｃＡＲＴを含む他の処置の非存在下でのＨＡＡＲＴ安定化患者におけるＨＩＶ感染症の処置および持続的ウイルス学的寛解のためにこのような組成物を調製および使用する方法に関する。
【０００８】
ある態様において、抗体は、ＣＤ４上の細胞外部位に特異的に結合する。具体的な態様において、抗体は、ドメイン１のＣＤＲ２領域またはその近くの部位でＣＤ４に特異的に結合する。開示される抗体は、無細胞系と細胞間系の両方においてＣＤ４への結合を通して競合的ＨＩＶ侵入阻害を発揮する。開示される抗体はまた、架橋の有無にかかわらず、静止期ＣＤ４陽性Ｔ細胞を再活性化する能力を有し、これによりＴＮＦ−α産生の増加をもたらすことができる。このような抗体には、Ｂ４、Ｍ２及びｄＢ４Ｃ７を含むモノクローナル抗体（Ｍａｂ）（例えば、Wang, C.Y. 1999; Lynn. S. and Wang, C.Y. 2009）；Ｌｅｕ３ａ（Than, S. et al., 1997）、ＳＴ４（Briant, L,1999）；及び抗ＨＩＶ  ＲＣ、ＣＤ４のドメイン１のＣＤＲ２領域を含むポリクローナル抗体（Wang, C.Y., WO2016/043788）を挙げることができるがこれらに限定されない。
【０００９】
ある態様において、抗体は、ＣＤ４に対するものであり、ＣＤ４に特異的に結合し、機能的には、（１）無細胞伝達様式と細胞間伝達様式の両方で、ＨＩＶ侵入を阻止し、（２）ＨＩＶに感染した静止期ＣＤ４  Ｔ細胞を再活性化する能力を有する。具体的な態様におて、抗体は、ＴＮＦ産生、ＨＩＶ  ｐ２４放出またはＬｃｋキナーゼリン酸化によるＴ細胞活性化の増加に現れるように、架橋の有無にかかわらず、インビトロでＨＩＶに感染した静止期ＣＤ４  Ｔ細胞を再活性化する。ある態様において、開示される抗体でＨＩＶ患者を処置すると、（１）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の減少；（２）血中ＣＤ８＋細胞数の増加；（３）１つまたは複数のＨＩＶ特異的抗原によるインビトロ刺激によるＨＩＶ特異的ＣＤ８＋細胞の増殖；および／または（４）血球中のＨＩＶ  ＤＮＡレベルの低下がもたらされる。
【００１０】
本開示はまた、上記の機能的特性を有する抗ＣＤ４抗体（例えば、モノクローナルヒト、ヒト化、キメラ等）を有する医薬組成物、ならびにＨＩＶ感染症の処置および持続的ウイルス学的寛解のための該医薬組成物の使用方法に関する。具体的な態様は、その後のｃＡＲＴの非存在下でのＨＡＡＲＴ安定化患者におけるＨＩＶ感染症の処置及び持続的ウイルス学的寛解のために医薬組成物を調製及び／又は使用する方法に関する。
【００１１】
ある態様において、開示される抗体を有する、開示される医薬組成物を調製し、患者に投与して、ウイルス量をウイルス量リバウンドなしに検出不能なレベルまで低下させる。ある態様において、医薬組成物を調製し、毎週、隔週またはさらに長いスケジュールで約１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で患者に投与する。いくつかの態様において、医薬組成物を、単独療法として、またはＨＡＡＲＴなどの別の療法と組み合わせて投与する。いくつかの態様において、処置患者における血清抗体レベルが約１０μｇ／ｍＬ以上であれば、ウイルス量が、ウイルス量リバウンドなしに、検出不能なレベルまで低下する。ある態様において、医薬組成物を、単独療法として、毎週、または隔週、またはさらに長いスケジュールで約１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で与え、それにより血清抗体レベルが１０μｇ／ｍＬより高い限り、ウイルス量リバウンドなしに、処置対象においてウイルス量が検出不能なレベルまで低下する。
【００１２】
ＣＤ４に対する抗体を有する、開示される医薬組成物は、（１）単独で投与する場合、単独療法；（２）他の処置方法（例えば、ｃＡＲＴ）の補助として投与する場合、併用療法；または（３）断続的に与えられる他の処置方法（例えば、ｃＡＲＴ）を用いる薬物補充処置サイクルにおける単独療法；として、ＨＩＶ処置に用いることができる。
【００１３】
開示される抗体および処置方法によって達成される細胞的および免疫学的特徴は、エリートコントローラーまたは長期非進行者（ＬＴＮＰ）の特徴に似ている。すなわち、開示される抗体および処置方法は、その後のｃＡＲＴの非存在下でのＨＩＶ感染症の持続的ウイルス学的寛解を達成することができ、ＨＩＶ感染症の処置における革命である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１Ａは、競合的ＨＩＶ侵入阻害機構を示すグラフである。グラフは、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０および阻害剤（例えば、抗体薬物）が共通の標的表面分子の同じ部分（すなわち、ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２）上での結合について競合する、競合的ＨＩＶ侵入阻害モデルにおいて得られた理論的結果を示す。このモデルでは、阻害剤の濃度が一定の閾値に達すると、ＨＩＶ結合／侵入の１００％阻害を達成することができる。  図１Ｂは、ｍＡｂ  Ｂ４を用いて１０年間にわたって収集された８５０種超のＥｎｖシュードタイプＨＩＶウイルスの群からのＨＩＶ−１進入阻害を示す図である。ＭＡｂ  Ｂ４は、８５０種全てのＥｎｖシュードタイプウイルスにおいてほぼ１００％の最大阻害％（ＭＰＩ）でＨＩＶ侵入阻害の幅と効力の両方を提供し、ＩＣ５０は、１つは０．０１〜１μｇ／ｍＬ、もう１つは１０μｇ／ｍＬの２つの濃度付近に集中している。
【図２】図２Ａは、非競合的ＨＩＶ侵入阻害機構を示すグラフである。グラフは、ＨＩＶおよび阻害剤が同じ標的分子上の異なる部位（例えば、ＴＭＢ−３５５の場合はＣＤ４のドメイン２）に結合する、非競合的ＨＩＶ侵入阻害モデルにおいて得られた理論的結果を示す。この非競合的阻害モデルでは、ＨＩＶ結合／侵入を阻害剤によって減少させることができるが、阻害剤の濃度にかかわらず完全な阻害は達成されない。抗体薬物に対するＨＩＶの耐性は、薬物濃度にかかわらず、阻害％における「プラトー」として反映される。  図２Ｂは、ＴＭＢ−３５５を用いた１１のクレードを網羅する１１８種の多様なＨＩＶ−１  Ｅｎｖシュードウイルス株の群からのＨＩＶ−１進入阻害結果（Pace, G., et al., 2011）を示す図である。各ウイルスについて、黒色線は、最大１０μｇ／ｍＬの濃度のＴＭＢ−３５５で処理した場合の最大阻害％（ＭＰＩ）を示し（左Ｙ軸）；灰色線は対応するＩＣ５０を示す（右Ｙ軸）。ＴＭＢ−３５５は、ウイｓス株の９２％を５０％以上の阻害で中和し、ウイルス株の３１％を９５％以上の阻害で中和しただけであった。
【図３】以下の刺激によって誘導された静止期ＰＢＭＣにおけるウイルス再活性化（ＨＩＶ−１  ｐ２４  ｇａｇ産生によって測定される）を示す棒グラフである：図の凡例に示すように、非刺激（１レーン）、ＰＨＡ（２レーン）、不活性化ＨＩＶ（ｉＨＩＶ）溶解物（３レーン）、ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域に向けられたモノクローナル抗体（４レーン）、ＣＤ４ドメインのＣＤＲ３領域に向けられたモノクローナル抗体（５レーン）、ＣＤ４ドメイン１／２に向けられたモノクローナル抗体（６レーン）、可溶性ＣＤ４の存在下のｉＨＩＶ（７レーン）、可溶性ＣＤ４の存在下のＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域に向けられたモノクローナル抗体（８レーン）、可溶性ＣＤ４の存在下のＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ３領域に向けられたモノクローナル抗体（９レーン）、および可溶性ＣＤ４の存在下のＣＤ４ドメイン１／２に向けられたモノクローナル抗体（１０レーン）（Briant L., et al., 1999から改作）。
【図４】抗体Ｂ４が、抗体Ｌｅｕ３ａによって結合されたＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域を覆うコンフォメーションエピトープを認識することを示す図である。ＣＤ４陽性細胞に対する競合的結合阻害が、モノクローナル抗体Ｂ４およびＬｅｕ３ａ（ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域に対する）によって見られた。２匹の対象（Ｘ２８２およびＸ３０１）からのチンパンジーＰＢＭＣ細胞を試験に使用した。モノクローナル抗体Ｂ４をＦＩＴＣによって標識した。抗体Ｌｅｕ３ａをＰＥによって標識した。ＰＢＭＣ細胞のサイトフルオログラフ（cytofluorograph）分析は、左から２番目のパネル（パネル２）に示すようにＬｅｕ３ａ−ＰＥによる陽性結合、左から３番目のパネル（パネル３）に示すように抗体Ｂ４−ＦＩＴＣによる陽性結合、およびＰＢＭＣを最初にＬｅｕ３ａ−ＰＥによって染色し、引き続いて抗体Ｂ４−ＦＩＴＣで染色した場合、左から４番目のパネルに示すように二重染色集団（パネル４）を示した；一方、抗体Ｂ４−ＦＩＴＣによる事前の結合は、左から５番目のパネルに示すようにＬｅｕ３ａ−ＰＥによる逐次結合を阻止し、Ｂ４−ＦＩＴＣ結合のみを残した（パネル５）。この逐次結合阻害試験は、Ｌｅｕ３ａ−ＰＥに対する抗体Ｂ４−ＦＩＴＣによる一方向阻害を示し、抗体Ｂ４が、ドメイン１内のＡＡ４７−６４由来のペプチドのより短い範囲でＬｅｕ３によって認識されるＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２の領域付近のＣＤ４陽性細胞とのより大きい表面接触領域を認識することを示した。
【図５】ＥＬＩＳＡにより測定した、抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体によるｒｓＣＤ４に対するビオチン化Ｂ４結合の競合的阻害を示すグラフである。
【図６】ＰＢＭＣ上の表面ＣＤ４に対するｍＡｂ  ｄＢ４および抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体の抗体力価測定を示すグラフである。抗体力価測定を、ＣＤ４結合％対抗体濃度（μｇ／ｍＬ）として測定した。
【図７】図７Ａ〜図７Ｇは、処置未経験ＨＩＶ陽性およびＨＩＶ陰性対象における増殖ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞による、サイトカインＩＬ２およびＩＦＮ−γの超抗原ＳＥＢ誘導産生のｍＡｂ  ｄＢ４および抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体阻害の分析である。ＨＩＶ陰性対象についての、超抗原誘導増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ２産生のＭＡｂ  ｄＢ４および抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体阻害を示す図である（図７Ａ）。ＨＩＶ陽性対象についての、超抗原誘導増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ２産生のＭＡｂ  ｄＢ４および抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体阻害を示す図である（図７Ｂ）。ＨＩＶ陰性対象および年齢一致ＨＩＶ陽性対象についての、超抗原誘導増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＬ２産生のＭＡｂ  ｄＢ４および抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体阻害を示す図である（図７Ｃ）。
【図８】ＨＩＶ陰性対象についての、超抗原誘導増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生のＭＡｂ  ｄＢ４および抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体阻害を示す図である（図７Ｄ）。ＨＩＶ陽性対象についての、超抗原誘導増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生のＭＡｂ  ｄＢ４および抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体阻害を示す図である（図７Ｅ）。ＨＩＶ陰性対象についての、超抗原誘導増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生のＭＡｂ  ｄＢ４および抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体阻害を示す図である（図７Ｆ）。ＨＩＶ陽性対象についての、超抗原誘導増殖ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生のＭＡｂ  ｄＢ４および抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体阻害を示す図である（図７Ｇ）。
【図９】図８Ａ〜図８Ｄは、第ＩＩａ相臨床試験の経過にわたる、ウイルス量減少によって測定される、ＵＢ−４２１処置の臨床的有効性（上部パネル）、およびμｇ／ｍＬ血清濃度によって測定される、ＵＢ−４２１の薬物動態（下部パネル）を示すグラフである。以下の代表的な患者についての関連データが提供される：毎週１０ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１の投与を受けている患者１−１−０１（図８Ａ）。
【図１０】毎週１０ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１の投与を受けている患者１−１−０２（図８Ｂ）。
【図１１】隔週２５ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１の投与を受けている患者１−２−０３（図８Ｃ）。
【図１２】隔週２５ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１投与を受けている患者１−２−０６（図８Ｄ）。細胞の完全な被覆を示すＰＢＭＣ  ＣＤ４＋細胞上のＵＢ−４２１結合の期間は灰色で陰影を付けている。
【図１３】図９Ａは、有効ベースラインと共に、１０ｍｇ／ｋｇの試験薬物ＵＢ−４２１（上）または２５ｍｇ／ｋｇの試験薬物ＵＢ−４２１（下）のいずれかの全投与を受けたパープロトコル（per-protocol）（ＰＰ）集団における比較的安定なＣＤ４  Ｔ細胞数（平均およびＳＴＤ）を示すグラフである。  図９Ｂは、ＰＢＭＣを、ＵＢ４２１を受けている患者から得て、超抗原ＳＥＢ（上部パネル）またはＣＭＶ  ｐｐ６５（下部パネル）を含む抗原によって刺激した場合の、処置の前（Ｗ１）、最後（Ｗ８）および監視期間後（Ｗ１６）の患者のＣＤ３＋、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋細胞の増殖率を示す図である。
【図１４】図１０Ａおよび図１０Ｂは、他者によって行われた（Jacobson, J.L., et al., 2009; Toma, J., et al., 2011; 及びPace, C.S., et al., 2013）、ＴＭＢ−３５５（イバリズマブ、以前はＴＮＸ−３５５）についての同様の試験で観察されたウイルス量減少に対する、ＵＢ−４２１を用いた第ＩＩａ相臨床試験で観察されたウイルス量減少の理論的比較を示すグラフである。図１０Ａは、１０ｍｇ／ｋｇおよび２５ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１で処置した対象で観察されたウイルス量変化を要約するグラフであり、図１０Ｂは、同じ投与量レベルのＴＭＢ−３５５で処置した対象で観察されたウイルス量変化を要約するグラフである。
【図１５】図１１は、ＰＢＭＣを、ＵＢ４２１を受けている患者から得て、コンセンサスＢ配列を有するＨＩＶ  Ｇａｇモチーフペプチドによって刺激した場合の、ＵＢ４２１処置の前（Ｗ１）、最後（Ｗ８）および後（Ｗ１６）の特許のＣＤ３＋、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋およびＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の増殖率を示す図である。主にＣＤ３＋／ＣＤ８＋（ｐ＜０．０１）Ｔ細胞集団に起因するＣＤ３＋（ｐ＜０．０１）Ｔ細胞における増殖率の統計学的に著しい増加がある。
【図１６】図１２は、ＨＩＶ−１感染成人における抗レトロウイルス療法の代替としてＵＢ−４２１単独療法を使用した処置様式についてのコホート１とコホート２の両方からのプロトコル設計を示す概略図である。
【図１７】図１３は、処置の開始時（Ｖ１）または終了時（Ｖ１２）における１０ｍｇ／ｋｇの試験薬物ＵＢ−４２１（コホート１）または２５ｍｇ／ｋｇの試験薬物ＵＢ−４２１（コホート２）のいずれかの全投与を受けた患者における比較的安定なＣＤ４  Ｔ細胞数（平均およびＳＴＤ）を示すグラフである。コホート１（Ｐ＝０．３３１）とコホート２（Ｐ＝０．９０５）の両方について、処置前後に統計学的に著しい差はない。
【図１８】図１４は、処置の開始時（Ｖ１）または終了時（Ｖ１２）における１０ｍｇ／ｋｇの試験薬物ＵＢ−４２１（コホート１）または２５ｍｇ／ｋｇの試験薬物ＵＢ−４２１（コホート２）のいずれかの全投与を受けた患者におけるＣＤ８  Ｔ細胞数（平均およびＳＴＤ）を示すグラフである。コホート１（Ｐ＜０．００１）とコホート２（Ｐ＝０．００４）の両方について、処置前後に統計学的に著しい差がある。
【図１９】図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＨＩＶ−１感染成人において抗レトロウイルス療法の代替としてＵＢ−４２１単独療法を使用する第ＩＩａ相臨床試験の過程での、平均ウイルス量減少（ＨＩＶ  ＲＮＡコピー／ｍＬ）によって測定されるＵＢ−４２１処置の臨床的有効性、およびＵＢ−４２１−ａｌｅｘａ４８８結合細胞の平均百分率によって測定されるＵＢ−４２１の薬物動態を示すグラフである。コホート１については図１５Ａ、コホート２については図１５Ｂである。
【図２０】図１６Ａおよび図１６Ｂは、ＨＩＶ−１感染成人において抗レトロウイルス療法の代替としてＵＢ−４２１単独療法を使用する第ＩＩ相臨床試験の過程での、個々の患者のウイルス量減少（ＨＩＶ  ＲＮＡコピー／ｍＬ）によって測定されるＵＢ−４２１処置の臨床的有効性を示すグラフである。コホート１については図１６Ａ、コホート２については図１６Ｂである。ウイルスリバウンドは、２回の連続した来院における、４００  ＲＮＡコピー／ｍＬ超のウイルス量によって定義される（破線）。
【図２１】図１７Ａおよび図１７Ｂは、試験を通して、１０ｍｇ／ｋｇの試験薬物ＵＢ−４２１（コホート１、図１７Ａ）または、２５ｍｇ／ｋｇの試験薬物ＵＢ−４２１（コホート２、図１７Ｂ）の全投与を受けた患者における各時点（来院日）についてのＴｒｅｇ細胞％（平均およびＳＴＤ）を表す、全ＣＤ４＋細胞のうちのＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞％を示すグラフである。
【図２２】図１８は、処置期間の開始時（Ｖ１）もしくは終了時（Ｖ８）、またはＶ８〜Ｖ１２の患者が元のＨＡＡＲＴ処置に戻った監視期間の最後に測定された、１０ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇの試験薬物ＵＢ−４２１の全投与を受けた個々の患者についてのＰＢＭＣ  ＨＩＶ  プロウイルスＤＮＡ含量を示す図である。各線は個々の患者から得られた結果を表す。
【図２３】図１９は、抗レトロウイルス療法の代替として抗ＨＩＶ  ｇｐ１２０広域中和抗体ＶＲＣ０１単独療法を使用するＨＡＡＲＴ安定化患者における血漿ウイルス血症のレベル（実線の三角形、ＨＩＶ  ＲＮＡコピー／ｍＬ）およびＶＲＣ０１抗体血漿濃度（実線の円形、μｇ／ｍｌ）についての９人の患者のグラフである。高ＮＲＣ０１抗体血漿濃度血清の存在にもかかわらず、ＨＩＶ抑制が達成されなかったので、このＮＩＨ試験を予定より早く終了した。ｘ軸の上の逆三角形は、ＵＢ−４２１注入時点を表す。
【図２４】図２０は、４〜１６週間の期間にわたって（１）市販のＨＩＶ薬（ＨＡＡＲＴ）またはモノクローナル抗体（２）ＶＲＣ０１、（３）ＨＩＶ補助受容体ＣＣＲ５を標的とするＰｒｏ１４０または（４）ＵＢ４２１のいずれかを使用した単独療法についてのＨＩＶウイルス抑制の維持における有効性の比較を示す図である。
【図２５】図２１は、処置時にＵＢ４２１様抗体によって媒介される細胞機構には、（１）Ｔｒｅｇ細胞％の減少によるＨＩＶ抗原特異的Ｔ細胞活性の回復、（２）抗体結合時の感染細胞における潜伏ＨＩＶの活性化、および（３）新たなＨＩＶ感染症を阻止するための細胞間および無細胞感染の予防が含まれ；これらの全てが（４）ＨＩＶ−１感染症の持続的ウイルス学的寛解をもたらすウイルス蓄積の減少または排除をもたらすことを示す図である。
【図２６】図２２Ａ〜図２２Ｄは、ジャーカットＴ細胞におけるチロシン３９４（Ｙ３９４）およびチロシン５０５（Ｙ５０５）上のＬｃｋリン酸化のウエスタンブロット分析である。図２２Ａは、陽性コントロールとしての抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体による刺激後のＬｃｋ  Ｙ３９４リン酸化（上）およびＹ５０５リン酸化（中）、ならびに総Ｌｃｋタンパク質レベル（下）のウエスタンブロット像を示す図である。図２２Ｂは、図２２Ａに示す各時点の総Ｌｃｋで正規化したＬｃｋ  Ｙ３９４およびＹ５０５リン酸化レベルを示すグラフである。
【図２７】図２２Ｃは、架橋を伴うまたは伴わないＵＢ−４２１刺激によるＬｃｋ  Ｙ３９４リン酸化（上）、Ｙ５０５リン酸化（中）、および総Ｌｃｋタンパク質レベル（下）のウエスタンブロット像を示す図である。図２２Ｄは、図２２Ｃに示す各時点の総Ｌｃｋで正規化されたＬｃｋ  Ｙ３９４およびＹ５０５リン酸化レベルを示すグラフである（破線は架橋条件下で得られたデータを表し、実線は架橋なしの条件下で得られたデータを表す）。
【図２８】図２３Ａおよび２３Ｂは、正常献血者３由来の初代ＣＤ４＋Ｔ細胞における抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３）刺激によるＬｃｋリン酸化のウエスタンブロット分析である。図２３Ａは、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体刺激によるＬｃｋ  Ｙ３９４リン酸化（上）、Ｙ５０５リン酸化（中央）、および総Ｌｃｋタンパク質レベル（下）のウエスタンブロット像を示す図である。図２３Ｂは、図２３Ａの各時点の総Ｌｃｋで正規化されたＬｃｋ  Ｙ３９４およびＹ５０５リン酸化レベルを示すグラフである。
【図２９】図２４Ａ〜２４Ｄは、正常献血者１、２、４、５、６および７由来の初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＵＢ−４２１刺激によるＬｃｋリン酸化のウエスタンブロット分析である。図２４Ａは、健康なドナー１および２における架橋を伴うまたは伴わないＵＢ−４２１刺激によるＬｃｋ  Ｙ３９４リン酸化（上）、Ｙ５０５リン酸化（中）、および総Ｌｃｋタンパク質レベル（下）のウエスタンブロット像を示す図である。
【図３０】図２４Ｂは、健康なドナー４、５、６および７における架橋を伴わないＵＢ−４２１刺激によるＬｃｋ  Ｙ３９４リン酸化（上）、Ｙ５０５リン酸化（中）、および総Ｌｃｋタンパク質レベル（下）のウエスタンブロット像を示す図である。
【図３１】図２４Ｃは、図２４Ａおよび図２４Ｂの各時点の総Ｌｃｋで正規化されたＬｃｋ  Ｙ３９４およびＹ５０５リン酸化レベルを示すグラフである（破線は架橋条件下で得られたデータを表し、実線は架橋なしの条件下で得られたデータを表す）。
【図３２】図２４Ｄは、図２４Ａおよび図２４Ｂの各時点の総Ｌｃｋで正規化されたＬｃｋ  Ｙ３９４およびＹ５０５リン酸化レベルを示すグラフである（破線は架橋条件下で得られたデータを表し、実線は架橋なしの条件下で得られたデータを表す）。
【図３３】図２５Ａおよび２５Ｂは、正常献血者８および９由来の初代ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＬｃｋリン酸化のフローサイトメトリー分析である。図２５Ａは、陽性コントロールとしての抗ＣＤ３刺激（破線）によるまたは陰性コントロールとしての処置なし（実線）のいずれかでのＰＥ−抗−Ｌｃｋ  ｐＹ３９４（左）およびＡｌｅｘａ６４７−抗−ＬｃｋｐＹ５０５（右）のＭＦＩを示す図である。
【図３４】図２５Ｂは、架橋条件下（破線）または架橋を伴わない条件下（実線）での、ＵＢ−４２１で刺激された正常献血者８および９由来の初代ＣＤ４＋Ｔ細胞のＰＥ−抗−Ｌｃｋ  ｐＹ３９４（左）およびＡｌｅｘａ６４７−抗−ＬｃｋｐＹ５０５（右）のＭＦＩを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本開示は、ＨＡＡＲＴ安定化患者におけるＨＩＶ感染症の処置および持続的ウイルス学的寛解のための抗体、組成物および方法に関する。本開示の一面は、ＣＤ４に対する抗体、その組成物、ならびにその後のｃＡＲＴを含む他の処置の非存在下でのＨＡＡＲＴ安定化患者におけるＨＩＶ感染症の処置および持続的ウイルス学的寛解のためにこのような組成物を調製および使用する方法に関する。
【００１６】
本明細書で用いられる節の見出しは、組織化目的のためだけであり、記載されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。本願で引用される全ての参考文献または参考文献の一部は、あらゆる目的のために全体が本明細書に参照により明示的に組み込まれる。
【００１７】
ＣＤ４
ヒトＣＤ４（分化抗原群４）は、Ｔヘルパー細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞などの免疫細胞の表面に見られる４５８アミノ酸の糖タンパク質（UniProtKB/Swiss-Prot: P01730.1）である（ウェブサイト：en.wikipedia.org/wiki/CD4）。ＣＤ４のアミノ酸配列を、配列表に配列番号２２として示す。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、ヒト免疫系の必須部分である白血球である。これらはしばしばＣＤ４細胞、Ｔヘルパー細胞またはＴ４細胞と呼ばれる。これらは感染粒子を破壊するＣＤ８キラー細胞を含む他のタイプの免疫細胞にシグナルを送るのでヘルパー細胞である。ＣＤ４細胞が、例えば未処置のＨＩＶ感染症または移植前の免疫抑制の後に枯渇すると、身体は、そうでなければ戦うことができたであろう広範囲の感染症に対して脆弱なままになる。
【００１８】
ＣＤ４は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が抗原提示細胞と連通するのを助ける補助受容体である。ＣＤ４は、細胞外ドメインを用いて抗原提示細胞の表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子と直接相互作用する。細胞外ドメインは、２つのβシートで７本の鎖を有する免疫グロブリン様のβサンドイッチを採用する。その細胞内ドメインを使用して、ＣＤ４はチロシンキナーゼＬｃｋを動員することによってＴＣＲによって生成されたシグナルを増幅し、これは活性化Ｔ細胞のシグナル伝達カスケードの多くの分子成分を活性化するために不可欠である。それによって種々のタイプのヘルパーＴ細胞が産生される。
【００１９】
ＣＤ４の主な構造的特徴は、配列表に示され、以下にさらに詳述する。
【００２０】
ＣＤ４は免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、細胞の細胞外表面に露出している４つの免疫グロブリンドメイン（Ｄ１〜Ｄ４）を有する。ＣＤ４ドメインＤ１およびＤ３は免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）ドメインに似ている；一方、Ｄ２およびＤ４は免疫グロブリン定常（ＩｇＣ）ドメインに似ている。
【００２１】
ＣＤ４ドメイン１（Ｄ１）
Ｄ１コアドメイン（約アミノ酸（ａａ）２６〜１２５）は、ジスルフィド結合架橋によって連結されているβ鎖によって形成された２つのβシートからなる。Ｄ１のアミノ酸配列は、免疫グロブリン鎖と類似の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）で免疫グロブリンと相同性を共有する。ＣＤＲ１−、ＣＤＲ２−およびＣＤＲ３−様領域は、ＣＤ４のＤ１ドメインに位置している。
【００２２】
ＣＤ４のＤ１ドメインは、抗原提示細胞の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子と直接相互作用し、ｌｃｋを動員してヘルパーＴ細胞の活性化を促進し、よって適応免疫応答を調節する。ＣＤ４分子の細胞外領域のドメイン１とドメイン２の両方が、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子のための結合部位に寄与することが分かった；しかしながら、ドメイン１のみがＨＩＶ結合およびシンシチウム形成に関与することが分かった。特に、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０のための結合部位は、Ｄ１のＣＤＲ２様ループに局在することが分かった。
【００２３】
ＣＤ４のＤ１ドメインを認識するいくつかの抗ＣＤ４抗体が製造されている。例えば、ＨＩＶ  ＲＣ、Ｂ４、Ｍ２およびｄＢ４Ｃ７（例えば、Wang, C.Y. 1999; Lynn. S. and Wang, C.Y. 2009; 及び Wang, C.Y., WO2016/043788）；Ｌｅｕ３ａ（Chiba, Y. 1992）；ＯＫＴ４Ａ（Jameson, B.D., et al., 1988）；ＳＴ４および１３Ｂ８．２（Briant, L,1999）；６Ｈ１０（例えば、Moore, et al., 1992）；１５Ａ７、２Ｄ５、および２Ｆ２（例えば、Yuan R, et al., 2016）；ならびにＤ１とＤ２との間の領域を認識するＦ９１−５５およびＢＬ４（Briant, L, et al., 1999; Celada F, et al., 1990; 及びMoore, et al., 1992）がある。
【００２４】
ＣＤ４ドメイン２（Ｄ２）
ＣＤ４のＤ２ドメイン（約ａａ１２６〜２０３）は、その疎水性界面を介してＤ１と結合する。Ｄ２はクラスＩＩ  ＭＨＣ分子のための結合部位に寄与する。ＣＤ４のＤ２ドメインを認識するいくつかの抗ＣＤ４抗体が製造されている。例えば、イバリズマブ（ＴＭＢ−３５５；以前はＴＮＸ−３５５またはＨｕ５Ａ８として知られていた；例えばKuritzkes, D.R., et al., 2004）；Ｍ−Ｔ４４１（Konig R, et al., 1995）がある。
【００２５】
ＣＤ４ドメイン３（Ｄ３）
ＣＤ４のＤ３ドメインは、約ａａ２０４〜３１７に位置している。Ｄ２がＤ１と相互作用するのと同様に、Ｄ３はその疎水性界面を介してＤ４に結合する。抗体ＯＫＴ４はＤ３を認識する（例えば、Yuan R, et al., 2016; Moore, et al., 1992）。
【００２６】
ＣＤ４ドメイン４（Ｄ４）
Ｄ４ドメイン（約ａａ３１８〜３７４）は、膜貫通ドメインの前のＣＤ４分子上の最後の細胞外ドメインである。Ｄ２に構造的に似ているＤ４は、ＣＤ４分子の二量体化を介してＴ細胞およびＣＤ４機能を活性化すると広く信じられている。抗体ＯＫＴ４およびＬ１２０はＤ４を認識する（例えば、Yuan R, et al., 2016; Moore, et al., 1992）。
【００２７】
ＣＤ４−膜貫通領域および細胞質領域
膜貫通領域（約ａａ３９７〜４１８）は疎水性である一方で、細胞内／細胞質領域（約４１９〜４５８）は、シグナル伝達を媒介するためにリン酸化されている３個のセリン残基（Ｓ４３３、Ｓ４４０およびＳ４５６）を有する。これらのセリン残基は、Ｐ５６ｌｃｋチロシンリン酸化のレベルを上昇させ、シグナル伝達を調節することができる、Ｓｒｃチロシンキナーゼ（ＴＫ）ファミリーメンバーＰ５６ｌｃｋと直接結合する。
【００２８】
ＣＤ４−ＨＩＶ感染症における役割
ＨＩＶ−１は、ＣＤ４を使用して宿主Ｔ細胞への侵入を得て、ｇｐ１２０として知られるそのウイルスエンベロープタンパク質を通してこれを達成する。ｇｐ１２０は、成熟ＨＩＶ−１膜エンベロープ糖タンパク質前駆体ｇｐ１６０の２つのドメインのうちの１つであり、もう１つはｇｐ４１である。ｇｐ１２０のＣＤ４への結合は、ＨＩＶ−１付着の最初のステップを構成し、ＣＤ４−ｇｐ１２０相互作用はｇｐ１２０のコンフォメーションの変化を引き起こし、宿主細胞上で発現されるケモカイン受容体ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４に結合するのを可能にする。この二次結合は、ＨＩＶ−１のｇｐ４１（融合ペプチド）分子を宿主細胞膜に挿入することを可能にし、最終的にはウイルスと宿主との膜融合を媒介する。ＨＩＶ感染症は、ＣＤ４を発現するＴ細胞の数の漸進的な減少をもたらす。
【００２９】
したがって、ＣＤ４は、ＨＩＶ−１感染症の開始において重要な役割を果たす。ｇｐ１２０の結合および非結合結晶構造をＣＤ４と比較すると、「架橋シート」、即ち２つのβヘアピンによって形成された４本鎖βシートが、ＣＤ４結合中のｇｐ１２０コアの２つの密接に関連する「内側」および「外側」ドメインの相対配向を固定することを示す。ＣＤ４  Ｄ１ドメインは、これらの内側および外側ドメインならびに架橋シートと相互作用し、ｇｐ１２０内側ドメインの再配列をもたらす。なお、ｇｐ１２０  Ｖ３可変ループとのさらなる相互作用により、架橋シートは補助受容体結合部位を露出させる（例えば、Yuan R, et al., 2016）。
【００３０】
抗体
本開示の一面は、ＣＤ４に対する抗体、その組成物、ならびにＨＩＶ感染症の処置および持続的ウイルス学的寛解のためにこのような組成物を使用する方法に関する。
【００３１】
本開示の抗体は、インタクトな（intact）ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、霊長類化抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、合成抗体および組換え抗体を含む、インタクトな抗体分子を広く包含する。本開示はまた、所望の活性または機能を有するインタクトな抗体の一部（例えば、抗体の免疫学的断片）を含む。
【００３２】
本開示の抗体はＣＤ４に対するものである。いくつかの態様において、抗体は、ＣＤ４の細胞外領域に特異的に結合する。ある態様において、抗体は、ＣＤ４の免疫グロブリンドメイン（Ｄ１〜Ｄ４）の少なくとも１つを特異的に認識し、これに結合する。ある態様において、抗体は、ＣＤ４の免疫グロブリンドメインのうちの１つのみ（すなわち、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３またはＤ４）に結合する。具体的な態様において、抗体は、ＣＤ４のＤ１ドメインに結合する。いくつかの態様において、抗体は、Ｄ１ドメインの相補性決定領域（ＣＤＲ１、２、または３）またはその近くでＣＤ４に結合する。具体的な態様において、抗体は、Ｄ１ドメインのＣＤＲ２領域またはその近くでＣＤ４に結合する。
【００３３】
本開示の抗体は、任意の標準的な方法によって産生することができる。いくつかの態様において、開示される抗体は、動物（例えば、マウス、イヌ、モルモット、ブタ、ヤギ、ウマ等）を組換えＣＤ４タンパク質、ＣＤ４タンパク質の断片、ＣＤ４の免疫学的部分を含有する融合タンパク質および／またはＣＤ４の類似体もしくは相同体で免疫することによって産生される。他の態様において、抗体を、動物を表面上でＣＤ４を発現する細胞で免疫することによって産生することができる。さらに他の態様において、抗体を化学合成することができる。
【００３４】
ある態様において、抗体は、動物をＣＤ４タンパク質、ＣＤ４タンパク質の断片、ＣＤ４の免疫学的部分を含有する融合タンパク質および／またはＣＤ４の類似体もしくは相同体で免疫することによって産生される。いくつかの態様において、抗体は、動物を完全長ＣＤ４タンパク質を含有するペプチドで免疫することによって産生される。他の態様において、抗体は、動物をＣＤ４タンパク質の一部を含有するペプチドで免疫することによって産生される。例えば、ペプチドは、細胞外領域（例えば、Ｄ１〜Ｄ４）、免疫グロブリンドメイン（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３および／またはＤ４）、Ｄ１ドメイン内の相補性決定領域（ＣＤＲ１、２または３）を表すＣＤ４タンパク質の一部を含むことができる。抗体は、動物をＣＤ４の少なくとも一部またはＣＤ４のアミノ酸配列を有するペプチドの組み合わせを有する単一ペプチドで免疫することによって産生することができる。いくつかの態様において、ペプチド免疫原は、ＨＩＶがＣＤ４のこの部分に結合するので、ＨＩＶ受容体複合体（「ＨＩＶ  ＲＣ」）としても知られるＣＤ４のａａ３９〜６６を含む。具体的な態様において、ＨＩＶ  ＲＣペプチドは、ジスルフィド結合を介して環状にされる。いくつかの態様において、ポリクローナル抗体は、動物を環状ＨＩＶ  ＲＣペプチドで免疫することによって産生される。本明細書で用いられる「抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体」という用語は、ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域のａａ３９〜６６を含む環状ペプチドに対する免疫血清を指す。
【００３５】
他の態様において、抗体は、動物をＣＤ４陽性細胞で免疫することによって産生される。細胞株は、ジャーカット細胞、ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞、Ｕ８７ＭＧ細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨＯＳ細胞、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−１１９（商標））、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ）（登録商標）ＴＩＢ−１６１（商標））、ＭＪ（Ｇ１１）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−８２９４（商標））などのＣＤ４を発現する任意の細胞株とすることができる。ある態様において、抗体は、ＢＡＬＢ／ｃマウスをインタクトな未感染ＣＤ４＋ヒトＨＰＢ−ＡＬＬ細胞、Ｔ−急性リンパ芽球性白血病細胞株または精製末梢血単核Ｔ細胞（ＰＢＬ  Ｔ細胞）で免疫することによって産生することができる。このような抗体は、全て全体が参照により組み込まれる、Wangによる米国特許第５９１２１７６号及び第６０９０３８８号および国際公開第２０１６／０４３７８８号、ならびに１９９９年のWang et al.による雑誌論文にさらに詳細に論じられている。
【００３６】
ある態様において、本開示の抗体は、化学物質でタグ付けまたは標識化される。例えば、抗体を、ビオチン、スペーサーアーム、プローブ（例えば、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＴＲＩＴＣ、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒｓ、Ａｌｅｘａ、ＧＦＰ、Ｒ−フィコエリトリン、量子ドット等）、酵素コンジュゲートおよびこれらの組み合わせで標識化することができる。具体的な態様において、抗体は、ビオチンまたは蛍光プローブで標識化される。
【００３７】
具体的な態様において、抗体を脱免疫化（deimmunization）として知られている方法を通じて修飾することができる。本明細書で用いられる「脱免疫化」という用語は、一般に、動物内で免疫応答を誘因することなく動物に投与することができるように抗体の一部を修飾する方法を指す。具体的には、脱免疫化は、抗体を投与されている特定の動物において免疫原性となるであろう抗体のアミノ酸配列の一部（例えば、Ｔ細胞エピトープ）の位置を突き止めて、除去する方法を含む。この方法は、免疫学的および分子生物学的技術を組み合わせて使用することによって達成することができる。この方法は以前に記載されている（例えば、Jones,T.D. et al., 2009）。抗体の脱免疫化の場合、Ｔ細胞エピトープを除去するための突然変異を、一般に、抗体の結合親和性を著しく低下させることなく導入することができる。
【００３８】
本明細書で用いられる「ヒト化」という用語は、ヒトに投与した場合の抗体の免疫原性を除去するように、そのタンパク質配列が修飾（脱免疫化）された非ヒト種によってもともと産生された抗体を指す。ある態様において、開示される抗体は、定常領域をヒト定常領域で置き換えることによって、および／または哺乳動物細胞でのこれらの抗体をコードする遺伝子の発現によって、ヒトでの使用のために脱免疫化される。
【００３９】
本明細書で用いられる「ｍＡｂ  Ｂ４」または「Ｂ４」または「マウスＢ４」という用語は、ＣＤ４を認識することが示されており、ＨＩＶ侵入を阻害することができるマウスモノクローナル抗体を指す。この抗体の構造的および機能的特徴は、以下の実施例においてさらに詳細に論じられる。
【００４０】
本明細書で用いられる「ｍＡｂ  ｄＢ４」または「ｄＢ４」という用語は、ｍＡｂ  Ｂ４に由来するヒト脱免疫抗体を指す。一態様において、ｍＡｂ  Ｂ４は、、米国特許第７５０１４９４号および第７８７２１１０号（全体が参照により組み込まれる）に記載される方法によって、ヒトでの使用のために脱免疫化される。特定の態様において、ヒト脱免疫化ｍＡｂ  ｄＢ４が、ｍＡｂ  Ｂ４のマウス抗体の定常領域（ＣＨおよびＣκ）を除去し、ヒトＩｇＧ１の定常領域で置き換えることによって産生される。ＭＡｂ  ｄＢ４は、任意の適切な細胞クローンによって産生されるｄＢ４を包含する。具体的な態様において、ｍＡｂ  ｄＢ４がクローン７によって産生される。
【００４１】
本明細書で用いられる「ｍＡｂ  ｄＢ４Ｃ７」または「ｄＢ４Ｃ７」という用語は、全体が参照により組み込まれる、Wangによる米国特許第７５０１４９４号および同第７８７２１１０号ならびにＷＯ２０１６／０４３７８８号に以前記載された組換え遺伝子Ｂ４ＤＩＶＨｖ１／ＶＫ１ＣＨＯ＃７を含有するクローン７によって発現されるｍＡｂ  ｄＢ４を指す。Ｃ７クローンは大量のｍＡｂ  ｄＢ４抗体を産生することが示されている。さらに、ｍＡｂ  ｄＢ４Ｃ７の２９８位のＡｓｎ（Ｎ）残基は、Ｎ−グリコシル化部位を除去するようにＨｉｓ（Ｈ）で置換されており、したがって抗体Ｂ４の存在下で、ＩｇＧ媒介補体依存性細胞傷害（ＣｄＣ）を排除してＣＤ４陽性Ｔ細胞の枯渇を防ぐ。
【００４２】
本明細書で用いられる「ＵＢ−４２１」という用語は、ヒト対象に投与するのに適した形態で用いられるｍＡｂ  ｄＢ４Ｃ７を指す。
【００４３】
抗体は、グリコシル化、メチル化および／またはリン酸化のための部位を含む翻訳後修飾を含むことができる。ある態様において、抗体は、糖結合残基を有する。具体的な態様において、抗体は、グリコシル化部位として働くアスパラギン（Ａｓｎ）残基を含有する。ある態様において、Ａｓｎ残基は、重鎖上にあり、具体的な態様において、Ａｓｎは、Ｆｖ領域内および／またはＣＤＲ内にある。
【００４４】
本開示の抗体は、その興味深く独特の機能的特徴によっても説明することができる。
【００４５】
例えば、開示される抗体は、ＣＤ４のドメイン１へのその結合を通して強力な競合的ＨＩＶ侵入阻害を発揮する。特に、開示される抗体は、試験された全てのＥｎｖシュードタイプウイルスにおいてほぼ１００％の最大阻害％（ＭＰＩ）を有し、ＩＣ５０は２つの濃度付近に集中し、１つは０．０１〜１μｇ／ｍＬであり、もう１つは１０μｇ／ｍＬである。開示される抗体の結合活性は、ＨＩＶ  ｇｐ１２０エンベロープタンパク質によって示されるＣＤ４結合親和性よりも約２ｌｏｇ高い（すなわち、１００倍密接な結合）。さらに、開示される抗体の平均Ｋｄは５．６×１０−１１Ｍ（範囲：３．１〜８．１×１０−１１Ｍ）であると推定され、Ｂｍａｘは細胞１個当たり１．２×１０６Ａｂであると推定された（範囲：０．９３〜１．４×１０６）。
【００４６】
開示される抗体についての競合的阻害特性は、無細胞系と細胞間系の両方において示されている。開示される抗体は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質ｇｐ１２０  ＭＮについての親和性よりも少なくとも５０倍高い親和性でＣＤ４受容体に結合する。また、開示される抗体は、Ｌｅｕ３ａなどの他の市販の抗体と比較して、大きな親和性および特異性によりＣＤ４に結合する。
【００４７】
開示される抗体はまた、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の抗原誘導Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生（ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）を阻害することができ、これはパイロトーシスの病原性サイクルに関与している。ＣＤ４に対するこのような高親和性モノクローナル抗体は超抗原ＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ、ＳＥＢ）などの抗原誘導ＣＤ４陽性Ｔ細胞活性化およびサイトカイン（例えば、ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）産生を阻害する。不稔ＨＩＶ感染を有する静止ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるサイトカイン産生をもたらすこのような抗原誘導活性化は、これらの静止ＣＤ４＋Ｔ細胞および近くの正常静止期ＣＤ４陽性細胞のパイロトーシスをもたらし、ＣＤ４＋Ｔ細胞、よってＡＩＤＳの大量枯渇が生じる。
【００４８】
開示される抗体はまた、静止期ＣＤ４陽性Ｔ細胞を再活性化する能力を有する。この特性は、静止期Ｔ細胞中のＨＩＶの潜伏蓄積を再活性化してこれらの細胞を抗レトロウイルス薬による処置に感受性にするのに特に有用である。ＣＤ４に対するこのような高親和性抗体は、ＨＩＶの放出について静止期ＨＩＶ感染細胞を活性化することができる。ＨＩＶ感染静止期ＣＤ４＋Ｔ細胞の再活性化は、ＨＩＶ感染患者において本発明の抗体とＨＡＡＲＴを合わせた併用処置を可能にし、機能的治癒をもたらす。
【００４９】
開示される抗体のさらなる構造的および機能的特徴は、以下の実施例で提供する。
【００５０】
製剤
本開示はまた、ＨＩＶ感染症の予防、処置および／または機能的治癒に使用することができる医薬製剤に関する。ある態様において、製剤は、ＣＤ４に対する抗体を含む。具体的な態様において、本開示は、ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域内またはその近くの部位に向けられたＣＤ４に対する高親和性モノクローナル抗体を有する医薬組成物に関する。このような抗体の結合活性（ＥＣ５０）は、ＨＩＶ  ｇｐ１２０エンベロープタンパク質によって示されるＣＤ４結合親和性（ｇｐ１２０についてのＥＣ５０＝９７ｎＭ）よりも約２ｌｏｇ高い（すなわち、１００倍密接な結合）。
【００５１】
開示される抗体タンパク質の医薬製剤は、抗体タンパク質を任意の医薬上許容可能な担体と混合することによって調製することができる。医薬上許容可能な担体には、溶媒、分散媒、等張剤などが含まれる。担体は、液体、半固体、例えば、ペーストまたは固体担体とすることができる。担体の例として、水、生理食塩水もしくは他の緩衝液（例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液）、油、アルコール、タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン）、炭水化物（例えば単糖類、二糖類、およびグルコース、スクロース、トレハロース、マンノース、マンニトール、ソルビトールまたはデキストリンを含む他の炭水化物）、ゲル、脂質、リポソーム、樹脂、多孔質マトリックス、結合剤、充填剤、コーティング、安定剤、保存剤、抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）；塩形成対イオン（例えばナトリウム）；非イオン性界面活性剤（例えばツイーン（TWEEN）（商標）、プルロニックス（PLURONICS）（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００５２】
製剤は２種以上の活性化合物を含有し得る。例えば、製剤は、１種もしくは複数のＨＩＶ感染症を予防および処置するための抗体および／または１種もしくは複数の追加の有益な化合物を含むことができる。有効成分は、例えば、混和物、溶液、懸濁液、乳化、カプセル化、吸収などの任意の簡便で実用的な方法で担体と組み合わせることができ、錠剤、カプセル剤、粉末（凍結乾燥粉末を含む）、シロップ、注射、摂取、注入に適した懸濁液などの製剤にすることができる。徐放性製剤も調製することができる。
【００５３】
ある態様において、医薬製剤は、ヒトでの使用のためのｍＡｂ  ｄＢ４Ｃ７を含む。ｍＡｂ  ｄＢ４Ｃ７を含有する医薬製剤は、ｐＨ６．０〜７．０のクエン酸塩、リン酸塩、Ｔｒｉｓ、ＢＩＳ−Ｔｒｉｓ等を含む適切な緩衝液中で調製することができ、糖（５０ｍＭ〜５００ｍＭのスクロース、トレハロース、マンニトールまたはこれらの混合物）、界面活性剤（例えば、０．０２５％〜０．５％のＴｗｅｅｎ  ２０またはＴｗｅｅｎ  ８０）および／または他の試薬などの賦形剤も含むことができるが、それらに限定されない。具体的な態様において、製剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ６．５中２０ｍＭグリシン中ｍＡｂ  ｄＢ４Ｃ７、および０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ（ポリソルベート２０）を含む。別の具体的な態様において、１０ｍＭヒスチジンを含む皮下注射を含む一定の用途における使用のために、ｍＡｂ  ｄＢ４の高濃度製剤も調製した。
【００５４】
製剤は、種々の量の抗体を含むように調製することができる。一般に、対象に投与するための製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬを含む。ある態様において、製剤は、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ；約１．０ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ；約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ；または約１０ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬの抗体を含むことができる。具体的な態様において、製剤は、約１．０ｍｇ／ｍＬ、約５．０ｍｇ／ｍＬ、約１０．０ｍｇ／ｍＬまたは約２５．０ｍｇ／ｍＬの抗体を含む。
【００５５】
具体的な態様において、本発明は、ＨＩＶ感染症の患者における免疫療法として、競合ＨＩＶ侵入阻害ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示す、上記の結合特性を有するヒト、ヒト化またはキメラモノクローナル抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００５６】
別の態様において、本発明は、１０μｇ／ｍＬより高い血清抗体レベルで、処置対象においてウイルス量を検出不能なレベルまで低下させることができる単独療法として働く、上記の結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００５７】
別の態様において、本発明は、１２週間の処置期間中、１０μｇ／ｍＬより高い血清抗体レベルおよび維持された安定なＣＤ４  Ｔ細胞数で、処置対象においてウイルス量を検出不能なレベルまで低下させることができる単独療法として働く、上記の結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００５８】
ある態様において、本発明は、単独療法として、毎週または隔週のスケジュールで、約１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で与えられると、このような処置が１２週間の処置期間中、処置対象においてウイルス量を検出不能なレベルまで低下させることができるという上記の結合特性を有する、モノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００５９】
さらに別の好ましい態様において、本発明は、毎週または隔週のスケジュールで、約１０ｍｇ／ｋｇ以上で処置未経験ＨＩＶ患者に与えられると、患者の機能的治癒をもたらす、ＨＡＡＲＴを伴う補助療法における重要な成分として上記の結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００６０】
さらに別の好ましい態様において、本発明は、毎週または隔週のスケジュールで、約１０ｍｇ／ｋｇ以上で、ＨＡＡＲＴの下でウイルス量が安定化した患者に与えられると、患者の機能的治癒をもたらす、ＨＡＡＲＴを伴う補助療法における重要な成分として上記の結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００６１】
抗ウイルス薬
本開示はまた、ＨＩＶ感染症の処置、予防および機能的治癒のための方法において使用することができる抗ウイルス薬を含む。
【００６２】
抗ウイルス薬は、哺乳動物におけるＨＩＶの形成および／または複製を阻害するのに有効な任意の薬剤（化合物または生物学的薬剤）を含む。抗ウイルス薬の例として、侵入／融合阻害剤（例えば、マラビロク、エンフビルチド）；ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）およびヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤（ＮｔＲＴＩ）（例えば、ジドブジン、アバカビル、ジダノシン、ラミブジン、エムトリシタビン、スタブジンおよびテノホビル）；非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）（例えば、ネビラピン、エファビレンツ、エトラビリンおよびリルピビリン）；インテグラーゼ核鎖転移阻害剤またはＩＮＳＴＩとしても知られるインテグラーゼ阻害剤（例えば、ラルテグラビル、ドルテグラビル、エルビテグラビル）；プロテアーゼ阻害剤（例えば、サキナビル、メシル酸サキナビル、ホスアンプレナビル、チプラナビル、ロピナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、リトナビル、ダルナビル、アタザナビル、ベビリマット、ビベコン）；ウイルス成熟阻害剤；ＨＩＶ遺伝子の発現を標的とする薬剤；ＨＩＶ複製に関与する重要な宿主細胞遺伝子および遺伝子産物を標的とする薬剤；ならびに他の抗ＨＩＶ薬；ｉＲＮＡ剤；アンチセンスＲＮＡ；ｉＲＮＡ剤またはアンチセンスＲＮＡを発現するベクター；ＰＮＡおよび抗ウイルス抗体；ならびにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
抗ウイルス薬は、単独でまたは組み合わせて使用することができる。抗ウイルス薬の併用は、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）、併用抗レトロウイルス療法（ｃＡＲＴ）または高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）として知られている。抗レトロウイルス（ＡＲＶ）薬は、薬物が阻害するレトロウイルスのライフサイクルの段階によって広く分類される。典型的な組み合わせは、「骨格」としての２つのＮＲＴＩと「ベース」としての１つのＮＮＲＴＩ、ＰＩまたはＩＮＳＴＩを含む。ある態様において、コンビビル、トリジビル、カレトラ、エプジコム、トルバダ、アトリプラ、コムプレラ、スタリビルド、トリーメクなどの抗ウイルス薬の組み合わせが使用される。
【００６４】
ＨＩＶ感染症の処置および持続的ウイルス学的寛解の方法
本開示はまた、ＨＩＶ感染症の処置、予防および機能的治癒のための方法に関する。ある態様において、製剤は、ＣＤ４に対する抗体を含む。
【００６５】
さらなる面において、場合により医薬上許容可能な担体中に提供される、本明細書に開示される抗体を、対象におけるＨＩＶ感染症の処置、予防および／または機能的治癒、ならびにＨＩＶ伝染の予防に使用することができる。
【００６６】
ＨＩＶ感染症の「処置」という用語は、発症を遅延させるか、進行を減速させるか、ウイルス量を減少させるか、及び／又はＨＩＶ感染症によって引き起こされる症状を改善するための、ＨＩＶ感染症の有効な阻害を指す。処置には、ＨＩＶへの曝露前と曝露後の両方が含まれる。
【００６７】
ＨＩＶ感染症の「予防」という用語は、ＨＩＶ感染症の発症が遅延されるか、及び／又はＨＩＶ感染症の発生もしくは可能性が低減もしくは排除されることを意味する。ＨＩＶ伝染の「予防」という用語は、ＨＩＶのある個体から別の個体へ（例えば、妊娠、分娩または出産、または母乳栄養中にＨＩＶ陽性女性から子供へ）の伝染の発生または可能性が低減または排除されることを意味する。
【００６８】
「対象」という用語は、ヒト、アカゲザル、ヒヒおよびチンパンジーの対象を含む、任意の霊長類の対象を指す。
【００６９】
ＨＩＶ感染症を処置および／または予防するために、治療量の本明細書に開示される抗体を、必要としている対象に投与する。
【００７０】
「治療上有効量」という用語は、ＨＩＶ感染症を処置および／または予防するために、ＨＩＶ感染症の阻害をもたらすのに必要な投与量を意味する。抗体の投与量は、疾患状態ならびに対象の体重および状態、療法に対する対象の反応、製剤の種類および投与経路などの他の臨床因子に依存する。処置上有効で、有害ではない正確な投与量は、当業者によって決定することができる。
【００７１】
一般に、成人に投与するための抗体の適切な用量は、約３〜５０ｍｇ／（対象のｋｇ体重）の範囲であり、使用される典型的な初期範囲は、約５〜２５ｍｇ／（対象のｋｇ体重）重の範囲である。適切な投与量はまた、約５．０ｍｇ／（患者のｋｇ体重）、約１０．０ｍｇ／（患者のｋｇ体重）または約２５．０ｍｇ／（患者のｋｇ体重）を含む。
【００７２】
本発明のヒトモノクローナル抗体を含む治療用組成物は、例えば単位用量の注射などによって、慣用的に静脈内投与される。単位用量は、一般に、対象の単位投与量として適した物理的離散単位をさらに指す本発明の治療用組成物を指し、各単位は、必要な希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと共に所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含有する。
【００７３】
組成物は、投与製剤に適合する方法で、処置上有効な量で投与される。投与すべき量は、処置される対象、有効成分を利用する対象の系の能力、および望まれる処置効果の程度に依存する。投与に必要とされる有効成分の正確な量は、専門家の判断に依存し、各個人に特有のものである。しかしながら、全身施用のための適切な投与量範囲が本明細書に開示され、これは投与経路に依存する。投与に適したレジメンもまた可変的であるが、最初の投与、引き続いてその後の注射または他の投与による１時間または数時間間隔での反復投与が典型的である。あるいは、インビボ療法について指定される範囲内の血中濃度を維持するのに十分な持続点滴静注が考えられる。
【００７４】
対象におけるＨＩＶ感染症の処置、予防および／または機能的治癒のための方法は、有効量の抗体を含有する製剤を対象に投与するステップを含む。ある態様において、製剤は、単回投与で対象に提供される。他の態様において、製剤は、複数回投与で対象に提供される。製剤が複数回投与で提供される場合、製剤は１日１回、１週間に１回、隔週（隔週）または１ヶ月に１回投与され得る。具体的な態様において、処置スケジュールが１週間に１回である場合、製剤は、約５．０ｍｇ／（対象のｋｇ体重）の投与量で対象に投与される。別の態様において、処置スケジュールが隔週である場合、製剤は、約２５．０ｍｇ／（対象のｋｇ体重）の投与量で対象に投与される。
【００７５】
ある態様において、モノクローナル抗体を含む製剤は、高い安全率を示し、対象に１週間単位で５ｍｇ／ｋｇまたは２５ｍｇ／ｋｇで合計８週間繰り返し投与した場合に十分に耐容性を示した。具体的な態様において、モノクローナル抗体を、５ｍｇ／ｋｇでＨＩＶ感染の数時間以内に対象に投与して、ＨＩＶ感染症の殺菌的治癒を提供することができる。他の態様において、モノクローナル抗体を、５ｍｇ／ｋｇでＨＩＶ感染後数日以内に対象に投与して、ＨＩＶ感染症の機能的治癒を提供することができる。
【００７６】
ある態様において、本発明は、ウイルス量を減少させるための免疫療法として、静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）または皮下（ＳＣ）経路を介してＨＩＶ患者に投与することができる、上記の結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ、抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。具体的な態様において、本発明は、ＨＩＶ感染症の患者における免疫療法として、競合ＨＩＶ侵入阻害ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示す、上記の結合特性を有するヒト、ヒト化またはキメラモノクローナル抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００７７】
他のある態様において、本発明は、毎週または隔週スケジュールで、約１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で、ウイルス量を減少させるための免疫療法として、ＩＶ、ＩＭまたはＳＣ経路を介してＨＩＶ患者に投与することができる、上記の結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ、抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００７８】
別の態様において、本発明は、１０μｇ／ｍＬより高い血清抗体レベルで、処置対象におけるウイルス量を検出不能なレベルまで低下させることができる単独療法として働く、上記の結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００７９】
別の態様において、本発明は、１２週間の処置期間中、１０μｇ／ｍＬより高い血清抗体レベルおよび維持された安定なＣＤ４  Ｔ細胞数で、処置対象においてウイルス量を検出不能なレベルまで低下させることができる単独療法として働く、上記の結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００８０】
別の態様において、本発明は、単独療法として、毎週または隔週のスケジュールで、約１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で与えられると、このような処置が１２週間の処置期間中、処置対象においてウイルス量を検出不能なレベルまで低下させることができる、上記の結合特性を有する、モノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００８１】
別の態様において、本発明は、単独療法として、毎週または隔週のスケジュールで、約１０ｍｇ／ｋｇ以上の用量で与えられると、血清抗体レベルが１０μｇ／ｍＬより高い限り、このような処置が、ウイルス量リバウンドなしで、処置対象においてウイルス量を検出不能なレベルまで低下させることができる、上記の結合特性を有する、モノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００８２】
別の態様において、本発明は、毎週または隔週のスケジュールで、約１０ｍｇ／ｋｇ以上で処置未経験ＨＩＶ患者に与えられると、患者の機能的治癒をもたらす、ＨＡＡＲＴを伴う補助療法における重要な成分として上記の結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００８３】
別の態様において、本発明は、毎週または隔週のスケジュールで、約１０ｍｇ／ｋｇ以上で、ＨＡＡＲＴの下でウイルス量が安定化した患者に与えられると、患者の機能的治癒をもたらす、ＨＡＡＲＴを伴う補助療法における重要な成分として上記の結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００８４】
別の態様において、本発明は、機能的治癒をもたらす、１〜４またはそれ以上のサイクルにわたる、各処置サイクルがＨＡＡＲＴ下で安定した検出不能のウイルス量を経験している患者のための処置休日としての２〜４ヶ月間の抗ＣＤ４抗体処置から始まり、引き続いてＨＡＡＲＴ処置が続くＨＡＡＲＴ補充療法における重要な成分として、ＩＶ、ＩＭまたはＳＣ経路のいずれかで投与することができる上記の結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００８５】
別の態様において、本発明は、機能的治癒をもたらす、１〜４またはそれ以上のサイクルにわたる、各処置サイクルが処置未経験ＨＩＶ患者のための２〜４ヶ月間の抗ＣＤ４抗体処置から始まり、引き続いて２〜４ヶ月のＨＡＡＲＴ処置が続くＨＡＡＲＴ補充療法における重要な成分として、ＩＶ、ＩＭまたはＳＣ経路のいずれかで投与することができる上記の結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００８６】
別の態様において、本発明は、機能的治癒をもたらす、１〜４またはそれ以上のサイクルにわたる、各処置サイクルが、ＨＡＡＲＴ下で安定した検出不能のウイルス量を経験している患者のための処置休日としての２〜４ヶ月間の抗ＣＤ４抗体処置から始まり、引き続いて毎週または隔週スケジュールで約５ｍｇ／ｋｇ以上の用量のＨＡＡＲＴ処置が続くＨＡＡＲＴ補充療法における重要な成分として、ＩＶ、ＩＭまたはＳＣ経路のいずれかで投与することができる上記の結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００８７】
別の態様において、本発明は、機能的治癒をもたらす、１〜４またはそれ以上のサイクルにわたる、各処置サイクルが、処置未経験ＨＩＶ患者のための２〜４ヶ月間の抗ＣＤ４抗体処置から始まり、引き続いて毎週または隔週スケジュールで約５ｍｇ／ｋｇ以上の用量の２〜４ヶ月のＨＡＡＲＴ処置が続くＨＡＡＲＴ補充療法における重要な成分として、ＩＶ、ＩＭまたはＳＣ経路のいずれかで投与することができる上記の結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００８８】
別の態様において、本発明は、毎週または隔週のスケジュールで、約１０ｍｇ／ｋｇ以上で処置未経験ＨＩＶ患者に与えられると、患者の機能的治癒をもたらす、ＨＡＡＲＴを伴う補助療法における重要な成分として上記の結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００８９】
別の態様において、本発明は、毎週または隔週のスケジュールで、約１０ｍｇ／ｋｇ以上で、ＨＡＡＲＴの下でウイルス量が安定化した患者に与えられると、患者の機能的治癒をもたらす、ＨＡＡＲＴを伴う補助療法における重要な成分として上記の結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００９０】
別の態様において、本発明は、毎週または隔週のスケジュールで、約１０ｍｇ／ｋｇ以上で、ＨＡＡＲＴの補助療法で、ＨＡＡＲＴ処置に失敗した患者にＩＶ、ＩＭまたはＳＣ経路のいずれかで投与して、さらなるウイルス減少をもたらすことができる、上記の結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００９１】
別の態様において、本発明は、患者の機能的治癒をもたらす、強力なＨＡＡＲＴ処置様式の補助療法として処置未経験ＨＩＶ患者に対して、１〜４またはそれ以上のサイクルにわたる、１サイクル当たり２〜４ヶ月の処置期間から始まり、１〜２ヶ月の処置休日が続く断続的様式の、ＨＡＡＲＴを伴う補助療法における重要な成分として、ＩＶ、ＩＭまたはＳＣ経路のいずれかで投与することができる上記の結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００９２】
別の態様において、本発明は、患者の機能的治癒をもたらす、強力なＨＡＡＲＴ処置様式の補助療法として処置未経験ＨＩＶ患者に対して、１〜４またはそれ以上のサイクルにわたる、毎週または隔週スケジュールで、約５ｍｇ／ｋｇ以上の用量での、１サイクル当たり２〜４ヶ月の処置期間から始まり、１〜２ヶ月の処置休日が続く断続的様式の、ＨＡＡＲＴを伴う補助療法における重要な成分として、ＩＶ、ＩＭまたはＳＣ経路のいずれかで投与することができる上記の結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００９３】
別の態様において、本発明は、患者の機能的治癒をもたらす、強力なＨＡＡＲＴ処置様式の補助療法として、ＨＡＡＲＴ下で安定した検出不能なウイルス量を経験している患者に対して、１〜４またはそれ以上のサイクルにわたる、毎週または隔週スケジュールで、約５ｍｇ／ｋｇ以上の用量での、１サイクル当たり２〜４ヶ月の処置期間から始まり、１〜２ヶ月の処置休日が続く断続的様式の、ＨＡＡＲＴを伴う補助療法における重要な成分として、ＩＶ、ＩＭまたはＳＣ経路のいずれかで投与することができる上記の結合特性を有するモノクローナルヒト化抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００９４】
別の態様において、本発明は、ウイルス量を減少させるための免疫療法として、ＩＶ、ＩＭまたはＳＣ経路を介してＨＩＶ患者に投与することができる、上記の結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ、抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００９５】
別の態様において、本発明は、毎週または隔週スケジュールで、約５ｍｇ／ｋｇ以上の用量で、ウイルス量を減少させるための免疫療法として、ＩＶ、ＩＭまたはＳＣ経路を介してＨＩＶ患者に投与することができる、上記の結合特性を有するモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ、抗ＣＤ４抗体を有する医薬組成物に関する。
【００９６】
具体的な態様
（１）ＣＤ４分子に対する抗体であって、該抗体は、ＣＤ４分子の細胞外領域に特異的に結合し、該抗体がＣＤ４＋細胞の表面上のＣＤ４分子に結合すると、該抗体は、
ａ）ＣＤ４＋細胞へのＨＩＶ侵入を競合的に阻害する；
ｂ）ＨＩＶに感染した静止期ＣＤ４＋細胞中の潜伏ＨＩＶ蓄積を活性化する；
ｄ）細胞ＨＩＶ  ＤＮＡのレベルを低下させる；および
ｅ）ウイルス量リバウンドなしにＨＩＶ感染症の持続的ウイルス学的寛解をもたらす；
上記抗体。
（２）抗体は、ＨＩＶの無細胞および細胞間伝達を競合的に阻害する、（１）の抗体。
（３）対象に投与すると、抗体は、制御性Ｔ細胞の割合を減少させる、（１）の抗体。
（４）対象に投与すると、抗体は、ＣＤ８＋細胞の量を増加させる、（１）の抗体。
【００９７】
（５）対象に投与すると、抗体は、ＨＩＶ  ｇａｇモチーフペプチド刺激に応答してＣＤ８＋増殖細胞を増加させる、（１）の抗体。
（６）対象に投与すると、抗体は、ＨＩＶ感染ＣＤ４＋細胞を標的化する機能的ＨＩＶ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ細胞を増強する、（１）の抗体。
（７）抗体は、ＣＤ４＋細胞におけるＴＮＦ−α産生を増強する、（１）の抗体。
（８）抗体は、架橋の有無にかかわらず、静止期ＣＤ４＋細胞を活性化する、（１）の抗体。
（９）抗体は、ウイルス量リバウンドなしに、ＨＩＶ陽性患者におけるＨＩＶウイルス量を血液１ｍＬ当たり５０コピー未満に減少させる、（１）の抗体。
（１０）抗体は、ＣＤ４分子のドメイン１付近の領域に結合する、（１）の抗体。
（１１）抗体は、ＣＤ４のドメイン１のＣＤＲ２領域付近の領域に結合する、（１）の抗体。
【００９８】
（１２）抗体は、配列番号１のＣＤＲ１、配列番号２のＣＤＲ２および配列番号３のＣＤＲ３を有する重鎖可変領域アミノ酸配列；及び
配列番号４のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２および配列番号６のＣＤＲ３を有する軽鎖可変領域アミノ酸配列；を有する、（１）の抗体。
（１３）抗体がモノクローナル抗体である、（１）の抗体。
（１４）抗体がヒト化モノクローナル抗体である、（１）の抗体。
（１５）
配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と；
配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と
を含むヒト化モノクローナル抗体である、（１）の抗体。
（１６）抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有するヒト化モノクローナル抗体である、（１）の抗体。
（１７）抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有するヒト化モノクローナル抗体である、（１）の抗体。
（１８）抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖；及び配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖；を有するヒト化モノクローナル抗体である、（１）の抗体。
（１９）ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞上の膜結合ＣＤ４に対する絶対結合親和性（Ｋｄ）が約３．１×１０−１１Ｍ〜約８．１×１０−１１Ｍである、（１）の抗体。
（２０）ＣＤ４分子に結合した（１）の抗体。
【００９９】
（２１）（１）の抗体を有する組成物。
（２２）（１）の抗体及び医薬上許容可能な担体を有する医薬組成物。
（２３）（１）の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２０ｍＭグリシンおよび０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０の溶液を有する医薬組成物。
（２４）（１）の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２０ｍＭグリシン、０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０および１０ｍＭヒスチジンの溶液を有する医薬組成物。
（２５）（１）の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２０ｍＭグリシンおよび０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０の約１．０ｍｇ／ｍＬ〜約２００．０ｍｇ／ｍＬの溶液を有する医薬組成物。
（２６）（１）の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２０ｍＭグリシン、０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０および１０ｍＭヒスチジンの約１．０ｍｇ／ｍＬ〜約２００．０ｍｇ／ｍＬの溶液を有する医薬組成物。
（２７）（１）の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２０ｍＭグリシンおよび０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０の約１０．０ｍｇ／ｍＬの溶液を有する医薬組成物。
（２８）（１）の抗体の、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２０ｍＭグリシン、０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０および１０ｍＭヒスチジンの約１０．０ｍｇ／ｍＬの溶液を有する医薬組成物。
（２９）（１２）の抗体及び医薬上許容可能な担体を有する医薬組成物。
（３０）（１６）の抗体及び医薬上許容可能な担体を有する医薬組成物。
【０１００】
（３１）薬理学上有効量の（１）の抗体を対象に投与することを有する、ＨＩＶに曝露される対象を処置する方法。
（３２）抗体をＨＩＶへの曝露前に対象に投与する、（３１）の方法。
（３３）抗体をＨＩＶへの曝露後に対象に投与する、（３１）の方法。
（３４）抗体をＨＩＶへの曝露後４８時間以内に投与する、（３１）の方法。
（３５）少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で抗体を対象に投与する、（３１）の方法。
（３６）抗体を複数回対象に投与する、（３５）の方法。
（３７）抗体を毎週、隔週または毎月間隔で対象に投与する、（３６）の方法。
（３８）抗ウイルス薬を対象に投与するステップをさらに含む、（３６）の方法。
（３９）抗ウイルス薬が高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）である、（３８）の方法。
（４０）ＨＡＡＲＴが、プロテアーゼ阻害剤または非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤と組み合わせて、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤を有する、（３９）の方法。
（４１）抗体をＨＡＡＲＴと同時に投与する、（３９）記載の方法。
【０１０１】
（４２）抗体およびＨＡＡＲＴをサイクルの経過にわたって対象に投与し、サイクルが
ｉ）第１の期間にわたって抗体を対象に投与し、引き続いて第２の期間にわたって処置休日；および
ｉｉ）（ｉ）の第１の期間および第２の期間の間、ＨＡＡＲＴを対象に連続的に投与すること；を有する、（３９）の方法。
（４３）抗体およびＨＡＡＲＴをサイクルの経過にわたって対象に投与し、サイクルが
ｉ）毎週、隔週または毎月間隔で、４ヶ月の期間にわたって抗体を対象に投与し、引き続いて２ヶ月の処置休日；および
ｉｉ）（ｉ）の６ヶ月の期間の間、ＨＡＡＲＴを対象に連続的に投与すること；を有する、（３９）の方法。
（４４）対象が２サイクルにわたって処置される、（４２）の方法。
（４５）対象が２サイクルにわたって処置される、（４３）の方法。
（４６）抗体をＨＡＡＲＴと同時ではない時に投与する、（３９）記載の方法。
（４７）抗体およびＨＡＡＲＴをサイクルの経過にわたって対象に投与し、サイクルが
ｉ）第１の期間にわたって抗体を対象に投与し、引き続いて第２の期間にわたって処置休日；および
ｉｉ）ＨＡＡＲＴを対象に第２の期間の間投与し、第１の期間の間投与しないこと
を含む、（３９）の方法。
（４８）抗体を第１の期間の間、一定の間隔で投与する、（４７）の方法。
（４９）抗体を第１の期間の間、毎週、隔週または毎月間隔で投与する、（４７）の方法。
【０１０２】
（５０）  ａ）薬理学上有効量の（１）の抗体；及び
ｂ）高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）；を有する処置レジメンを対象に投与することを有する、ＨＩＶ感染症を有する対象を処置する方法。
（５１）少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で抗体を対象に投与する、（５０）の方法。
（５２）抗体およびＨＡＡＲＴをサイクルの経過にわたって対象に投与し、サイクルが
ｉ）第１の期間にわたって抗体を対象に投与し、引き続いて第２の期間にわたって処置休日；および
ｉｉ）（ｉ）の第１の期間および第２の期間の間、ＨＡＡＲＴを対象に連続的に投与すること；を有する、（５０）の方法。
（５３）抗体およびＨＡＡＲＴをサイクルの経過にわたって対象に投与し、サイクルが
ｉ）毎週、隔週または毎月間隔で、４ヶ月の期間にわたって抗体を対象に投与し、引き続いて２ヶ月の処置休日；および
ｉｉ）（ｉ）の６ヶ月の期間の間、ＨＡＡＲＴを対象に連続的に投与すること；を有する、（５０）の方法。
（５４）対象が２サイクル以上にわたって処置される、（５２）の方法。
（５５）対象が２サイクル以上にわたって処置される、（５３）の方法。
（５６）抗体およびＨＡＡＲＴをサイクルの経過にわたって対象に投与し、サイクルが
ｉ）毎週、隔週または毎月間隔で、４ヶ月の期間にわたって抗体を対象に投与し、引き続いて２ヶ月の処置休日；および
ｉｉ）（ｉ）の６ヶ月の期間の間、ＨＡＡＲＴを対象に連続的に投与すること；を有する、（５３）の方法。
（５７）（ｂ）のＨＡＡＲＴと同時ではない時に（ａ）の抗体を投与する、（５０）記載の方法。
【０１０３】
（５８）（ａ）の抗体および（ｂ）のＨＡＡＲＴをサイクルの経過にわたって対象に投与し、サイクルが
ｉ）第１の期間にわたって抗体を対象に投与し、引き続いて第２の期間にわたって処置休日；および
ｉｉ）ＨＡＡＲＴを対象に第２の期間の間投与し、第１の期間の間投与しないこと；を有する、（５０）の方法。
（５９）抗体を第１の期間の間、一定の間隔で投与する、（５８）の方法。
（６０）抗体を第１の期間の間、毎週、隔週または毎月間隔で投与する、（５８）の方法。
（６１）  （１）の抗体を細胞に曝露することを有する、ＣＤ４＋細胞へのＨＩＶ侵入を阻害する方法。
（６２）  （１）の抗体を細胞に曝露することを有する、ＣＤ４＋細胞へのｇｐ１２０の結合を阻害する方法。
（６３）  （１）の抗体を細胞に曝露することを有する、静止期ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化する方法。
（６４）  （１）の抗体を細胞に曝露することを有する、静止期Ｔ細胞中のＨＩＶの潜伏蓄積を活性化する方法。
（６５）ＨＩＶに感染した細胞の試料中の潜伏ＨＩＶ蓄積を減少させる方法であって、
ａ）（１）の抗体を細胞の試料に曝露すること；及び
ｂ）ＨＡＡＲＴを細胞の試料に曝露すること；を有する上記方法。
【０１０４】
特記しない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうではないと示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、文脈が明らかにそうではないと示さない限り、単語「または」は「および」を含むことを意図している。したがって、「ＡまたはＢを含む」は、Ａ、またはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。ポリペプチドについて与えられる全てのアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は近似値であり、説明のために提供されることがさらに理解されるべきである。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を開示される方法の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、全体が参照により組み込まれる。矛盾がある場合は、用語の説明を含む本明細書が優先するものとする。さらに、材料、方法および実施例は例示的なものに過ぎず、限定することを意図するものではない。
図面および関連する実施例の以下の例示的な説明は、本明細書において、特に実施例において頻繁に使用される一定の用語の理解を容易にするために提供される。説明は便宜上提供されており、本発明を限定するものではない。
【０１０５】
実施例１
ＭＡＢ  Ｂ４の免疫学的および機能的特性
モノクローナル抗体Ｂ４（ｍＡｂ  Ｂ４）またはＭ２（ｍＡｂ  Ｍ２）は、Ｔ細胞表面上の複雑なＨＩＶ受容体部位（ＣＤ４）を認識するモノクローナル抗体である。ＭＡｂ  Ｂ４またはＭ２は、ＣＤ４とＨＩＶ補助受容体の相互作用に影響を与え、干渉することができる。ＭＡｂ  Ｂ４またはＭ２は、一次ＨＩＶ−１分離株を優先的に中和した（両抗体は、米国特許第５９１２１７６号及び第第６０９０３８８号にさらに詳述されている）。
以下の情報は、全て全体が参照により組み込まれる、２つの米国特許（Wangによる第５９１２１７６号および第６０９０３８８号）およびWang et al.による１９９９年の雑誌論文から抜粋されたデータを含むマウスｍＡｂ  Ｂ４の発見および予備的特徴付け研究を要約する。
【０１０６】
１．ＨＰＢ  ＡＬＬ細胞または精製ＰＢＬ  Ｔ細胞による免疫化由来のマウスモノクローナル抗体
ＭＡｂ  Ｂ４は、ＢＡＬＢ／ｃマウスをインタクトな未感染ＣＤ４＋ヒトＨＰＢ−ＡＬＬ細胞、Ｔ−急性リンパ芽球性白血病細胞系で免疫することによって得た。
ＭＡｂ  Ｍ２は、ＢＡＬＢ／ｃマウスをＰＢＬから単離したインタクトな未感染ＣＤ４＋細胞で免疫することによって得た。
細胞表面上のＣＤ４に対する特異性を有し、ＨＩＶ−１の一次分離株に対して広い中和活性を有する、ｍＡｂ  Ｂ４またはＭ２によって表される新規なクラスの抗ＣＤ４抗体を得た。後の議論および実施例で、重要な特性の開示に焦点を合わせることを目的として、Ｍａｂ  Ｂ４のみをさらに示し、議論する。
【０１０７】
２．ｍＡｂ  Ｂ４認識部位の特徴付け
ＭＡｂ  Ｂ４は、組換え可溶性ＣＤ４（ｒｓＣＤ４）と比較して細胞表面上の膜結合ＣＤ４を優先的に認識することが分かった。
ＨＩＶの曝露前に膜結合型ＣＤ４に結合するＭＡｂ  Ｂ４は、その後のｇｐ１２０および全ウイルスのＣＤ４への付着を阻止することが示されている。しかしながら、抗体への曝露前にｇｐ１２０に結合していた膜結合ＣＤ４は、依然としてｍＡｂ  Ｂ４に結合することができる。したがって、ｍＡｂ  Ｂ４は、膜結合ＣＤ４へのｇｐ１２０の結合に影響を及ぼし得るが、ｇｐ１２０は、ＣＤ４へのｍＡｂ  Ｂ４の結合に影響を及ぼさない。
【０１０８】
３．ｍＡｂ  Ｂ４のインビトロ中和活性
マウスｍＡｂ  Ｂ４は、一般的な定義によれば、中和抗体ではない。代わりに、ｍＡｂ  Ｂ４はウイルスに付着することよりもむしろ宿主細胞受容体を被覆することによってウイルス侵入を阻害する。ＨＩＶ感染症に対するＭＡｂ  Ｂ４の効果は、当分野で使用されているウイルス中和アッセイによって容易に観察することができる（例えば、ＭＴ−２マイクロプラーク（Microplaque）中和アッセイ（Sawyer et al., 1994））。マウスｍＡｂ  Ｂ４の中和活性は、本発明者らの共同研究者であるDr.Carl Hanson（カリフォルニア保健局）によって評価され、またDr.Dr.John Mascola（Henry Jackson Foundation, WRAIR）、Dr. David Montefiori（デューク大学）およびDr.Malcolm Martin（ＮＩＡＩＤ）の実験室でも独立に評価された。１９９５年〜２０１０年に広く特徴付けられている以下のＨＩＶ中和機能は、ｍＡｂ  Ｂ４に関連している：
１．ＰＢＭＣ増殖一次分離株は、Ｔ細胞株適合分離株ＨＩＶ−１ＩＩＩＢおよびＨＩＶ−１ＭＮよりもｍＡｂ  Ｂ４による中和に対して感受性である。
２．ｍＡｂ  Ｂ４は、補助受容体使用ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４（二重）およびＣＣＲ５の一次分離株による感染を中和する。
３．ｍＡｂ  Ｂ４は、ＣＸＣＲ４補助受容体使用のＴ細胞株適合ＨＩＶ−１分離体に対して低い活性を有する。
４．ｍＡｂ  Ｂ４は、ＨＩＶ−１サブタイプＡ〜Ｇを表す多様な範囲のシンシチウム誘導（ＳＩ）および非シンシチウム誘導（ＮＳＩ）一次分離株を、９０％のエンドポイントおよび最大３ｌｏｇの感染力まで中和する。
５．ｍＡｂ  Ｂ４は、二重補助受容体ＨＩＶ−１エンベロープを有するＨＩＶ−２、ＳＩＶおよびＳＨＩＶを中和する。
６．扁桃組織培養システムでは、ｍＡｂ  Ｂ４がＨＩＶ−１一次分離株ＶＬ１３５（ＨＩＶ−１ＶＬ１３５）の感染力を２ｌｏｇ減少させる。わずか１２．５μｇ／ｍＬのｍＡｂ  Ｂ４が、多くの抗ウイルス抗体が抗体依存性増強を示す条件である活性ヒト補体の存在下、１００  ＴＩＤ５０（５０％扁桃感染用量）超の単球分離株ＪＲ−ＣＳＦを完全に中和する。
７．ｍＡｂ  Ｂ４は、感染後４８時間までに添加するとＨＩＶ−１ＶＬ１３５に対して中和活性を発揮し、７２時間後までに添加すると著しい抗ウイルス効果を示す。
ａ．細胞またはウイルスとプレインキュベートしたかどうかにかかわらず、これは等しく有効である。
ｂ．これは侵入後の機構によるよりもむしろ、新たな細胞への広がりから感染巣を阻止することによって作用する。
ｃ．これらのアッセイでは、ｍＡｂ  Ｂ４が細胞傷害性に寄与しなかった。
【０１０９】
実施例２
ＨＩＶ−１の中和および耐性アッセイ
１９９８年〜２０１１年に、種々のクレードの複数のＨＩＶ分離株について、Dr.Carl HansonおよびMonogram Biosciences,Inc.の実験室で以下のウイルス中和および耐性アッセイを行った。アッセイの詳細な説明を以下に記載する。
【０１１０】
１．ＨＩＶ−１中和アッセイ。
試験の各々に示すように血液または抗体試料を採取した。血清または抗体試料を、ＭＴ−２マイクロプラークアッセイまたはマイトジェン（ＰＨＡ）刺激ＰＢＭＣアッセイのいずれかを使用して、ＨＩＶ−１分離株のマルチクレード群で評価した。
【０１１１】
１．１．ＭＴ−２マイクロプラークアッセイ
ＭＴ−２マイクロプラークアッセイは、ＨＩＶのシンシチウム誘導分離株に限定した。アッセイを９６ウェルプレート中で行い、マイクロプラーク上のシンシチウムの蛍光染色により、１ウェル当たり最大２５個の小さなプラークを数えることができた。このアッセイでは、感染ＭＴ−２細胞が、遠心分離中にゲル化する溶融アガロースを通して遠心分離することによって単層に形成された。このアッセイは高感度であることが分かっており、ダイナミックレンジが何桁にも及ぶ。このアッセイはまた、多数の標本を処理するために比類なく効率的であることも分かった。多数の複製ウェルによって可能になったコンピュータ化統計分析の使用が、他のフォーマットを使用して達成することが困難であった一定程度の品質管理および標準化を提供することが分かった。
【０１１２】
１．２  ＰＢＭＣアッセイ
ＰＢＭＣアッセイは、ＰＢＭＣ中のｐ２４抗原の発現を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で感染細胞を増殖させた後に抗原捕捉ＥＬＩＳＡによって定量化する標準的な抗原減少アッセイである。このアッセイの利点は、全てのＨＩＶ株および分離株への適用性である。
【０１１３】
１．３  ウイルスストック。
中和、エキソビボおよびインビボ試験のためのＨＩＶ−１ストックを、表３、表５および表６ならびに図１ａ、図１ｂ、図３、図２２および図２３に列挙する。亜型Ａ〜ＧおよびＨの一次ＨＩＶ−１ウイルスは：（ａ）カリフォルニア州保健局のウイルスおよびリケッチア病研究所、ＶＲＤＬのサンフランシスコ男性健康調査に参加した男性同性愛者から分離した；（ｂ）世界保健機関のＨＩＶ隔離および特性評価ネットワークから入手した、（ｃ）米国軍事ＨＩＶ研究プログラムから提供された、および（ｄ）国立アレルギー感染症研究所AIDS Research and Reference Reagent Programからの贈り物としてのものであった。チンパンジー末梢血単核球（ＰＢＭＣ）で継代された患者分離株であるＤＨ−１２も、国立アレルギー感染症研究所AIDS Research and Reference Reagent Programによって供給された。
【０１１４】
１．４．Ｂ４またはｄＢ４中和活性
Ｂ４またはｄＢ４中和活性を、抗体を含有しないコントロールと比較した場合の、ウイルスの示される割合の減少（５０〜９５％）を提供する抗体濃度として定義した。５０％および９０％エンドポイントについての抗体濃度を、抗体希釈間の補間によって導き出した。
【０１１５】
２．ＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅ  ＨＩＶエントリーアッセイ
薬剤耐性を決定するためのＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅ  ＨＩＶエントリーアッセイを、Monogram Biosciences、Inc.（South San Francisco、カリフォルニア）で行った。
ベクタープールから生成した組換えウイルスを用いて、様々な濃度の薬物または抗体（例えば、Ｂ４またはｄＢ４）の存在下で細胞を感染させた。試験ベクターのウイルス複製を５０％（ＩＣ５０）又は９０％（ＩＣ９０）阻害するのに必要な薬物の量を決定した。
【０１１６】
２．１  ＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅ  ＨＩＶアッセイで用いられる組換えウイルスの生成
ＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅ  ＨＩＶアッセイで用いられる組換えウイルスを、ＨＩＶ感染の長期的試験でスクリーニングし、ＨＩＶ血清陽性として同定した患者から収集した試料から生成した。偶発的ＨＩＶ感染を有する個体については、臨床および血漿試料を、ＨＩＶウイルス量およびＣＤ４細胞数を含む実験室評価のために収集した。最初は血清陰性であったが、約１年の追跡調査後に血清陽性となった個体については、ウエスタンブロット法による２つの酵素免疫測定法によってＨＩＶ感染を確認した。
【０１１７】
セロコンバージョン時にサブタイプＡ、ＢＦ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＥＡ、Ｆ、ＧまたはＪを有する参加者からの試料（多重ハイブリダイゼーションアッセイを用いた以前のＨＩＶサブタイピングに基づく）を、表３に示すように、組換えウイルスの構築のために収集した。ＨＩＶ  ｅｎｖ、ｐｏｌ領域を試験試料から増幅し、増幅したＤＮＡを試験ベクターにクローニングした。ＧｅｎｅＳｅｑ  ＨＩＶでは、ベクタープールを配列決定してＨＩＶ遺伝子型を決定した。ＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅ  ＨＩＶアッセイでは、ベクタープールから生成された組換えウイルスを使用して、様々な濃度の薬物の存在下で細胞を感染させた。
【０１１８】
実施例３
全クレードのＨＩＶ分離株に対するＭＯＮＯＧＲＡＭ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ  ＰＨＥＮＯＳＥＮＳＥアッセイによるＭＡＢ  Ｂ４の中和活性
ｍＡｂ  Ｂ４がＢクレードの全てのＨＩＶウイルスを中和することは十分に証明されている。ある試験では、クレードＡ（ｎ＝８）、ＢＦ（ｎ＝１）、Ｃ（ｎ＝１８）、Ｄ（ｎ＝１８）、Ｅ（ｎ＝４）、ＥＡ（ｎ＝１０）、Ｆ（ｎ＝８）、Ｇ（ｎ＝４）、Ｊ（Ｎ＝２）からの合計７３種の代表的な非ＢクレードＨＩＶ分離株と３種のコントロールウイルス９２ＨＴ５９４、ＪＲＣＳＦ、ＪＲＦＬを組換えウイルスにし、ｍＡｂ  Ｂ４に対する感受性についてＰｈｅｎｏＳｅｎｓｅ  ＨＩＶアッセイで試験した（表３）。組換えウイルスの全部が、平均ＩＣ５０＝０．０１８μｇ／ｍＬおよびＩＣ９０＝０．０６２μｇ／ｍＬのこれまでにない低ＩＣ５０およびＩＣ９０濃度で、ｍＡｂ  Ｂ４に対して非常に感受性が高いことが分かった。これらのＨＩＶ分離株の多くが多剤耐性患者に由来することを見出すことは注目に値し、ｍＡｂ  Ｂ４またはそのヒト対応物が既にＨＩＶ薬剤耐性である患者を処置するのに非常に効率的であることを明らかに示している。
【０１１９】
実施例４
モノクローナル抗体Ｂ４は競合的ＨＩＶ侵入阻害を仲介する：処置時のＨＩＶ耐性変異体の予防を予測する予期せぬ特徴
競合的阻害試験により、ＣＤ４上の同じ受容体結合部位についてＨＩＶエンベロープタンパク質と競合し、それによって細胞へのＨＩＶの侵入を阻害する阻害剤（例えば、侵入阻害剤抗体）の能力および有効性を評価することができる。理論研究では、ｍＡｂ  Ｂ４はＣＤ４の結合についてＨＩＶエンベロープタンパク質（ｇｐ１２０）と競合する。図１Ａは、この試験の予測結果を示しており、各線は異なるウイルス分離株を表す。具体的には、この理論研究から予想される結果は、異なるウイルス分離株はｍＡｂ  Ｂ４に対して異なる感受性（ＩＣ５０）を有するが、ｍＡｂ  Ｂ４が十分な濃度で存在する限り、全てのウイルス分離株の侵入が１００％阻害されることを実証している。
【０１２０】
比較して、非競合的阻害試験は、ＨＩＶエンベロープタンパク質がＣＤ４に結合し、それによって細胞へのＨＩＶの侵入を阻害する能力を阻害または低下させる阻害剤（例えば、ＣＤ４の異なる部分に結合する補助受容体アンタゴニストまたは抗体）の能力および有効性を評価することができる。理論研究では、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｇｐ１２０）がＣＤ４に結合するのを阻害する非競合的阻害剤（例えば、ＴＭＢ−３５５）の能力を分析する。図２Ａは、この試験の予測結果を示しており、各線は異なるウイルス分離株を表す。具体的には、この理論研究から予想される結果は、異なるウイルス分離株はＴＭＢ−３５５に対して異なる感受性（ＩＣ５０）を有し、ウイルス分離株の少なくともある部分が、存在するＴＭＢ−３５５の量にかかわらず細胞に侵入することを実証している。この理論研究に基づいて、ＨＩＶ耐性は、ＩＣ５０にかかわらず、最大阻害％において「プラトー」として観察されることが予想されるであろう。
【０１２１】
ＴＭＢ−３５５（以前はＴＮＸ−３５５、イバリズマブとも呼ばれる）は、アカゲザルおよびヒトＣＤ４の細胞外ドメイン２に結合してＣＤ４＋細胞へのＨＩＶの結合後侵入を防ぐように設計されたヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である（例えばBurkly, LC, et al., 1992；およびKurizkes, DR, et al., 2004）。ＣＤ４上のＴＭＢ−３５５抗体結合部位は、ＨＩＶ−１エンベロープｇｐ１２０の結合に必要な部位とは異なり、主要組織適合遺伝子複合体タンパク質との相互作用に必要な部位とは異なる。したがって、ＴＭＢ−３５５は非競合的ＨＩＶ侵入阻害を媒介する。
【０１２２】
ＴＭＢ−３５５は、いくつかのＨＩＶ−１ウイルスに対して強力な中和活性を有することを示すが、広い群のＨＩＶ株を評価するとその阻害活性は矛盾する。図２Ｂは、１１８種のＥｎｖシュードタイプＨＩＶウイルスの群に対して、ＩＣ５０が０．０１μｇ／ｍＬから１０μｇ／ｍＬ（右Ｙ軸）に増加するのに合わせて、ＴＭＢ−３５５のＭＰＩが１００％〜１５％に及ぶ（左Ｙ軸）（各バーは１つのウイルス分離株を表す）（Ｓｏｎｇ，Ｒ．ら、２０１３）ことを示している。分析した全てのクレードのうち、クレードＡおよびＥウイルスは、クレードＡおよびＥウイルス以外よりもＴＭＢ−３５５に対して著しく感受性であった。さらに、ウイルス量減少のためにＴＭＢ−３５５処置を受けている患者からｇｐ１２０のＶ５領域で同定された突然変異を有するウイルス耐性変異体が見出された（Toma,J., et al., 2011；Pace,C.S., et al., 2013）。ＴＭＢ−３５５（イバリズマブ）によって実証された非競合的阻害効果は、ウイルス複製が１００％未満の阻害を有する分離株について起こるので、抗体処置期間中に耐性ＨＩＶ変異体が発生する可能性が高いことを示唆している。
【０１２３】
対照的に、８５０種超のＥｎｖシュードタイプＨＩＶウイルスの群から１０年間にわたって収集されたデータは、ｍＡｂ  Ｂ４がＨＩＶ侵入阻害において予想外の幅および効力を提供することを示している（図１Ｂ）。このデータ収集から、ｍＡｂ  Ｂ４がほぼ１００％のＭＰＩを有し、ＩＣ５０は、一方が０．０１〜１μｇ／ｍＬ、他方が約１０μｇ／ｍＬの２つの濃度付近に集中していることが分かる。ｍＡｂ  Ｂ４についてのＨＩＶ侵入阻害プロファイルは、ＩＣ５０にかかわらず約１００％の各ＨＩＶウイルスについてのＭＰＩを有する競合的阻害機構の典型的な特徴を有する。ｍＡｂ  Ｂ４の著しく強い競合的ＨＩＶ侵入阻害特徴に照らして、ウイルス耐性変異体はｍＡｂ  Ｂ４処置期間中に発生する可能性が低い。ｍＡｂ  Ｂ４によって発揮されるこのような厳しい競合的阻害は、これまでに試験された他のいかなるＨＩＶ阻害剤でも観察されたことがない。
【０１２４】
この実施例からのＭＰＩおよびＩＣ５０データは、実施例３で論じられる多剤耐性患者由来のＨＩＶ分離株の多くがｍＡｂ  Ｂ４に対して非常に感受性であることを示すデータと合わせて、ｍＡｂ  Ｂ４またはそのヒト対応物がＨＡＡＲＴ処置に失敗している薬剤耐性ＨＩＶ患者の処置に非常に効率的であることを示唆した。ｍＡｂ  Ｂ４によって媒介される中和様式は、ｍＡｂ  Ｂ４または類似のＦｖ領域を有するそのヒト対応物類似体による処置を受けているＨＩＶ患者における薬剤耐性ウイルス変異体の発生を妨げる独特のＨＩＶ薬を提供する。競合的ＨＩＶ結合阻害は、本発明に記載されるように、抗ＣＤ４抗体がＨＩＶ患者の処置において臨床的有効性を発揮することを可能にする独特の特性である。
【０１２５】
実施例５
抗体Ｂ４はＨＩＶの無細胞感染と細胞間伝達の両方を有効に阻害する
ＨＩＶ粒子は古典的には、ウイルスが血流および局所環境に拡散して細胞に感染する無細胞伝達によって全身に広がる。ウイルスはまた、密接な細胞間接触を必要とする機構によって感染細胞から非感染細胞に直接移動する能力も有する。感染細胞が未感染細胞と安定した接触点を形成し、ＨＩＶ粒子を未感染細胞に直接伝達すると、このような拡散が起こる。細胞間拡散は、無細胞拡散と比較して、効率的で、速く、血流中での拡散を必要としない。
【０１２６】
Sigal,A., et al., 2011は、共培養アッセイにおいて、無細胞ウイルスに起因する感染は抗レトロウイルス薬テノホビルの存在下で強く減少するのに対し、細胞間拡散を含む感染は薬物に対する感受性が著しく低いことを報告した。感度の低下は、薬物の存在下で複数回の感染が終結するのを防ぐのに十分であった。著者らは、確率論的感染モデルを用いて臨床薬物濃度の存在下で細胞間拡散からの複製を調べたところ、複製が実質的な突然変異の蓄積なしに断続的であることを見出した。細胞間拡散がインビボで同じ特性を有する場合、これは免疫系に有害な結果を及ぼし、危険因子を有する個体における処置の失敗につながり、潜在的にウイルス持続性に寄与し、したがってＨＩＶ感染症の治癒への障壁となり得る。
したがって、処置におけるその潜在的な効果を評価するために、ｍＡｂ  Ｂ４およびｍＡｂ  ｄＢ４関連抗体がＨＩＶの細胞間伝達を阻害する能力および効力を評価することが重要である。
【０１２７】
１．ＨＩＶの細胞間伝達の抗体媒介阻害を測定するためのアッセイ
１．１  材料および方法
１．１．１  細胞およびウイルス
ＨＩＶ−１ゲノムに遺伝子操作されたレポーター遺伝子ルシフェラーゼを有するＪｕｒｋａｔ−ｉｎＧＬｕｃクローン（NIH AIDS Research and Reagents Program）を、表面ＣＤ４の発現が低いためにドナー細胞として選択して、標的初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた共培養実験でドナー間感染を最小化した。レポーター遺伝子ルシフェラーゼは、感染細胞中で発現することができ、ウイルス感染のためのマーカーとして使用できる。感染細胞中のこれらのウイルス発現レポーターを測定して、ＨＩＶ−１感染を定量化することができる。初代ＣＤ４＋Ｔ細胞を標的細胞として使用した。クレードＤのウイルスＵＧ２６６およびＵＧ０４６を試験に使用した。
【０１２８】
１．１．２  ウイルスの細胞間伝達アッセイ    このアッセイでは、ドナーを、指示されるＨＩＶ−１株と混合する前に、系列希釈の抗体Ｂ４とプレインキュベートし、数日後、細胞の約１０〜７５％がＧａｇ＋となったら使用した。次いで、ドナーおよびＣＤ４陽性ＰＢＭＣ標的細胞を、９６ウェルプレート中、２００μｌ中１．５×１０６細胞／ｍｌの最終濃度で１：２の比で混合した。４８時間後、細胞を細胞内Ｇａｇについて染色し、フローサイトメトリーによって分析した。培養上清中に蓄積したＧＬｕｃを、BioLux Gaussiaルシフェラーゼアッセイキット（New England Biolabs）およびBerthold Technologiesルミノメーターを使用して検出した。
【０１２９】
１．１．３  ＩＣ５０およびＩＣ９０の計算    データをシグモイド用量−反応曲線（可変勾配）に当てはめることによって用量−反応阻害曲線を描いた。阻害％を、（未処理標的細胞の％シグナル−抗体処理細胞の％シグナル）／（未処理標的細胞の％シグナル）×１００として定義した。ＩＣ５０およびＩＣ９０をそれに応じて計算した。
【０１３０】
２．結果および考察
表４は、抗体Ｂ４が、厳格な９０％侵入阻害基準によって測定した場合に、ＨＩＶ（クレードＣのウイルス株ＵＧ２６６およびＵＧ０４６）の細胞間および無細胞伝達を同等に阻害することができたことを示している。具体的には、融合阻害力価が細胞間伝達アッセイにおいてＵＧ２６６およびＵＧ０４６ウイルス株について１：１４０および１：２４５であることが分かり、これはそれぞれ無細胞伝達中和アッセイにおける１：１３６および１：２３４の中和力価に匹敵した。５０％侵入阻害基準によって測定した場合、対応する無細胞伝達と比較して、２つの株についてのより高い融合阻害力価が細胞間伝達について観察された。
【０１３１】
これらの結果は、抗体Ｂ４が、ＨＩＶ  Ｅｎｖタンパク質を標的とする他の中和モノクローナル抗体およびこれまでに測定された他のＡＲＴ薬物と比較した場合、ＨＩＶの細胞間伝達と無細胞伝達の両方を阻害する能力においてまれな性質を有することを実証している。これらの結果は、ｍＡｂ  Ｂ４およびｍＡｂ  ｄＢ４関連抗体が個体におけるＨＩＶウイルスの無細胞および細胞間拡散を防ぐのに比類なく適していることを示唆している。
【０１３２】
実施例６
抗体ＵＢ−４２１（ＤＢ４Ｃ７またはＤＢ４）はＨＩＶ感染個体におけるウイルス複製増強のための静止期ＰＢＭＣＳの再活性化を媒介する
１．背景
ＨＩＶ−１は静止期末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に感染するが、その後の細胞活性化まで不活性のままである。静止ＰＢＭＣにかくまわれた潜伏ＨＩＶ−１を模倣する静止期Ｔ細胞の非生産的感染を可能にする細胞培養条件およびプロトコルを使用するインビトロモデルを使用して、熱不活性化ＨＩＶ−１（ｉＨＩＶ−１）またはｇｐｌ２０−抗ｇｐｌ２０免疫複合体のこれらの静止期ＰＢＭＣに対する刺激効果を調べた（Briant,L. et al., 1996）。
【０１３３】
熱不活性化ＨＩＶ−１（ｉＨＩＶ−１）またはｇｐｌ２０−抗ｇｐｌ２０免疫複合体のエンベロープ糖タンパク質とのＣＤ４会合が、架橋を通して、ＮＦ−ｋＢ（すなわち、核移行）ならびに同様に細胞外ドメイン１（Ｄ１）およびＣＤ４の細胞質内ドメインおよびいくつかのキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｒａｆ−１、ＭＥＫおよびＥＲＫ）を含むＡＰ−１の活性化を制御するシグナル伝達経路を刺激して細胞周期進行を誘導し、活性化マーカーＣＤ２５の細胞表面発現を促進し、プロウイルス組込みを刺激し、細胞にウイルスを産生させるのに十分であった。
【０１３４】
Than et al.による別の科学的発見（Than et al., 1997）は、抗ＣＤ４モノクローナル抗体によるｇｐ１２０結合部位でのＣＤ４分子の架橋が、ＨＩＶ感染患者の潜伏感染ＰＢＭＣを誘導してウイルス複製を促進することをさらに確認した。この研究で使用された抗ＣＤ４ｍＡｂは、ＣＤ４のＤ１のＣＤＲ２ループに結合するＬｅｕ３ａであった。具体的には、Ｌｅｕ３ａは、ＣＤ４のドメイン１内のａａ４７〜６４を有するペプチドによって表される線状エピトープを対象とする（Chiba,Y.1992）。
【０１３５】
さらに、静止期ＰＢＭＣにおけるウイルス再活性化は、ＣＤ４のドメイン１（Ｄ１）のＣＤＲ２−ループに対するモノクローナル抗体によって特異的に誘導され、Ｄ１のＣＤＲ３または近くのＤ１／Ｄ２接合領域などの他のエピトープに対する抗体によっては誘導されないことが分かった（Briant,L. et al., 1999）（図３、４レーンと５および６レーンを比較）。このようなウイルス再活性化は、可溶性ＣＤ４（ｓＣＤ４）によるＣＤＲ２ループリガンドの事前吸収によって防ぐことができる（図３、４レーンと８レーンを比較）。
【０１３６】
したがって、ドメイン１領域の周りのＣＤ４との高い結合親和性を有する抗体ｄＢ４Ｃ７（ＵＢ−４２１）が、ＨＩＶ感染個体におけるウイルス複製増強のための静止期ＰＢＭＣの再活性化を媒介し得るかどうかを評価することが重要であった。
【０１３７】
２．ＣＤ４のＤ１付近のＢ４／ｄＢ４コンフォメーション結合部位の精密化
２．１  ｍＡｂ  Ｂ４によるが、逆順ではない、チンパンジーＣＤ４陽性ＰＢＭＣへのＬｅｕ３ａ結合の競合的逐次結合阻害
２匹の対象（Ｘ２８２およびＸ３０１）から単離したチンパンジーＰＢＭＣ細胞、ならびにｍＡｂ  Ｂ４（ＦＩＴＣによって標識）およびＬｅｕ３ａ（ＰＥによって標識）をこの試験に使用した。ＰＢＭＣをそれぞれの抗体で順次染色し、サイトフルオログラフィーによって分析した。この実験から得られたデータを表５および図４に報告し、以下で考察する。
【０１３８】
単一標識コントロール試料では、Ｌｅｕ３ａで染色した細胞は、Ｌｅｕ３ａ−ＰＥ結合について陽性と試験されただけであった（図４、パネル２）；ｍＡｂ  Ｂ４で染色した細胞は、Ｂ４−ＦＩＴＣ結合について陽性と試験されただけであった（図４、パネル３）。具体的には、非感染チンパンジー試料（Ｘ２８２およびＸ３０１）中のＣＤ４＋細胞（Ｌｅｕ３ａによって検出される）は、ｍＡｂ  Ｂ４によって検出されたもの（２６．１％および４５．５％）と同様に、それぞれ２５．５％および４４．０％であった（表５）。
【０１３９】
Ｌｅｕ３ａの事前結合、引き続いてｍＡｂ  Ｂ４への曝露は、Ｌｅｕ３ａまたはＢ４単独で染色した単一標識コントロール細胞（すなわち、それぞれＸ２８２およびＸ３０１について２４．５％および４６．７％）と同様の二重染色（Ｌｅｕ３ａ＋／Ｂ４＋）ＰＢＭＣ細胞数をもたらした（図４、パネル４）（表５）。
【０１４０】
対照的に、ｍＡｂ  Ｂ４の事前結合、引き続いてＬｅｕ３ａへの曝露は、単一または二重染色手順のいずれにおいても、Ｌｅｕ３ａ陽性染色を伴わずにｍＡｂ  Ｂ４染色ＰＢＭＣのみをもたらした（図４、パネル５；表５）。
【０１４１】
まとめると、これらの結果は、Ｌｅｕ３ａ−ＰＥに対する抗体Ｂ４−ＦＩＴＣによる一方向阻害を実証している。すなわち、Ｂ４結合は事前のＬｅｕ３ａ結合によって阻止されない；しかしながら、Ｌｅｕ３ａ結合は事前のＢ４結合によって阻止される。これらのデータは、ｍＡｂ  Ｂ４が抗体Ｌｅｕ３ａによって認識されるＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域を被覆するコンフォメーションエピトープを認識し、ｍＡｂ  Ｂ４が抗体Ｌｅｕ３ａと比較して高い親和性でＣＤ４のこの領域に結合するという結論を支持する。
【０１４２】
２．２  ＨＩＶ  ＲＣペプチド（ａａ３９〜６６）に対する免疫血清によるｒｓＣＤ４へのＢ４結合のＥＬＩＳＡによる競合的阻害
完全長組換え可溶性ＣＤ４（ｒｓＣＤ４）に対するｍＡｂ  Ｂ４の結合親和性を、ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域に対する免疫血清を用いた競合的阻害試験を通して評価した。
【０１４３】
２．２．１  抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体。    モルモットを、ＣＤ４のａａ３９〜６６を含む環状ペプチドで免疫することによって、ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域に対するポリクローナル抗体を調製した。この環状ペプチドは、この試験ではＨＩＶ受容体複合体ペプチド（ＨＩＶ  ＲＣペプチド）と呼ばれ、Wang et al., 2002にペプチドｐ２２４０ｃとして以前記載されている。
【０１４４】
具体的には、０週目に完全フロイントアジュバント、ならびに３週および６週に不完全フロイント中投与１回当たり０．５ｍｌ中１００μｇで４〜６週齢Ｄｕｎｃａｎ  Ｈａｒｔｌｅｙモルモットを筋肉内免疫し、引き続いてその後不完全フロイント中の毎月ブースト後の指定される時点で、ＨＩＶ  ＲＣペプチドに対するモルモット血清を得た。
【０１４５】
得られたポリクローナル抗体を「抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体」と呼ぶ。
【０１４６】
２．２．２  抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体によるｒｓＣＤ４へのＢ４結合の競合的阻害。    １ウェルあたり０．１ｍＬで０．０８μｇ／ｍＬの完全長ｒｓＣＤ４でコーティングした９６ウェルマイクロタイタープレートを用いて、競合阻害実験を行った。ビオチン化Ｂ４抗体による結合、引き続いてトレーサーとしての結合アビジンＨＲＰとの結合の前に、ウェルを１：３０希釈のＨＩＶ  ＲＣペプチド（ＣＤ４のａａ３９〜６６）に対する免疫原による免疫化の０、３、６、９、１２、１４、１６および１９週間後に採取したモルモット血清とインキュベートした。同じ期間を通して収集した免疫されていないモルモットからの陰性コントロール血清（ＲＣアイソタイプ）も同様に試験した。
【０１４７】
図５は、ｒｓＣＤ４へのビオチン化Ｂ４の結合が最初の免疫の６週間後に得られた抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体によって著しく阻害され、最初の免疫の９週間後までにほぼ完全な阻害に達したことを示している。
【０１４８】
この競合的結合阻害試験はさらに、ｍＡｂ  Ｂ４の結合部位がＣＤ４のドメイン１のＣＤＲ２ループ付近であるが、このペプチドへのｍＡｂ  Ｂ４による直接結合が膜結合ＣＤ４のコンフォメーション輪郭に対するｍＡｂ  Ｂ４の優先的結合のために著しくないことを実証した。
【０１４９】
２．３  ｍＡｂ  ｄＢ４の架橋時のＨＩＶ感染個体におけるウイルス産生増強のための静止期ＣＤ４陽性Ｔ細胞の再活性化
細胞をｍＡｂ  ｄＢ４で処理し、ＴＮＦ−α産生、ウイルス量および細胞増殖を監視することによって、ｍＡｂ  ｄＢ４が静止期ＣＤ４＋細胞を活性化する能力を評価した。
【０１５０】
この試験では、２００μＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch）と共に３７℃で１時間インキュベートすることによって、８ウェル培養プレートをヒトＩｇＧでコーティングした。この試験でさらに使用するまで、コーティングプレートを４℃の冷蔵庫に保存した。
【０１５１】
ＨＩＶ患者のＰＢＭＣを標準的な慣例に従って１．５時間解凍した。以下に示すように、ＰＢＭＣをｍＡｂ  ｄＢ４（実験）、ＰＭＡ＋ＰＨＡ（陽性コントロール）、または培地のみ（陰性コントロール）のいずれかで処理することによって、静止期ＣＤ４＋細胞の活性化を評価した。
【０１５２】
２．３．１  ＭＡｂ  ｄＢ４処理。    細胞を３μｇ／１０６個細胞／ｍＬの濃度のｍＡｂ  ｄＢ４で４℃で１時間処理して細胞上のＣＤ４の架橋を開始させた。次いで、ｍＡｂ  ｄＢ４で処理した細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ培地および１０％ＦＢＳと共に７日間、コーティング４８ウェル培養プレート上で培養した。非コーティングウェルも陰性コントロールとして使用した。培養上清のアリコートを、後の評価のために０日目、２日目および７日目に凍結した。ｍＡｂ  ｄＢ４試料についての０日目の時点は、４℃で３０分の処理後に細胞から上清を除去することによって得た。
【０１５３】
２．３．２  ＰＭＡ＋ＰＨＡ処理。    細胞を、静止期ＣＤ４＋細胞を再活性化するための陽性コントロールとして、ＲＰＭＩ培地および１０％ＦＢＳを用いて７日間、コーティングした４８ウェル培養プレート上で、０．１μＭフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）および１５μｇ／ｍＬ酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ）（ＰＭＡ＋ＰＨＡ）で処理した。非コーティングウェルも陰性コントロールとして使用した。培養上清のアリコートを、後の評価のために０日目、２日目および７日目に凍結した。ＰＭＡ＋ＰＨＡ試料についての０日目の時点は、４℃で３０分の処理後に細胞から上清を除去することによって得た。
【０１５４】
２．３．３  培地のみ。    陰性コントロールとして、細胞をＲＰＭＩ培地および１０％ＦＢＳ（培地のみ）を用いて７日間コーティングした４８ウェル培養プレート上でインキュベートした。非コーティングウェルも追加の陰性コントロールとして使用した。培養上清のアリコートを、後の評価のために０日目、２日目および７日目に凍結した。培地のみ試料についての０日目の時点は、４℃で培地中３０分のインキュベーション後に細胞から上清を除去することによって得た。
【０１５５】
２．３．４  ＣＤ４＋再活性化の分析。    ＴＮＦ−α産生、ウイルス量および細胞増殖を評価することによって、ＣＤ４＋細胞の再活性化を決定した。この試験からの結果を表６に要約する。
【０１５６】
全ての試料からのアリコートを、（１）定量的ＥＬＩＳＡによってＴＮＦ−αの濃度について；（２）ＲＴ  ＰＣＲによってＨＩＶウイルス量について；（３）細胞数について；（４）標準的な方法を用いてトリパンブルーによって生存率について、分析した。
【０１５７】
具体的には、データは、培地のみの陰性コントロール（検出不能）およびＰＭＡ＋ＰＨＡで刺激した細胞（ｍＡｂ  ｄＢ４で被覆した細胞より約３〜５倍高い）と比較した場合、ＨＩＶ患者のｍＡｂ  ｄＢ４被覆ＰＢＭＣ細胞の架橋が中程度のＴＮＦ−α産生を誘因したことを示している。
【０１５８】
また、ｍＡｂ  ｄＢ４試料は培地のみの陰性コントロールと同様の速度で増殖した；一方、ＰＭＡ＋ＰＨＡ刺激細胞は、ｍＡｂ  ｄＢ４と架橋した細胞と比較してはるかに高い程度で増殖した（細胞数は、７日目にｍＡｂ  ｄＢ４培養物よりもＰＭＡ＋ＰＨＡ培養物で５倍高かった）。
【０１５９】
しかしながら、ＨＩＶウイルス量は、培地コントロールおよびＰＭＡ＋ＰＨＡ刺激細胞と比較して、ｍＡｂ  ｄＢ４と架橋した細胞で著しく増強された。具体的には、ｍＡｂｄＢ４と架橋した細胞は、それぞれ２日目および７日目に培地のみの陰性対象と比較した場合、ウイルス量の１５１％および２２０％の増加を示した；一方、ＰＭＡ＋ＰＨＡ培養物は、細胞増殖の５倍の増加にもかかわらず、最適以下のウイルス量産生を示した（それぞれ２日目および７日目に５５％および７８％）。
【０１６０】
３．結論
１．マウスｍＡｂ  Ｂ４は、抗体Ｌｅｕ３ａによって認識される部位（ＣＤＲ２領域のａａ４７〜６４）に近いＣＤ４上のコンフォメーション部位を認識することが分かった。ＭＡｂ  ｄＢ４は、実施例７で報告される比較試験に基づいて、ｍＡｂ  Ｂ４についてここで記載されるものと同じ認識特性を有する。
【０１６１】
２．完全長ｒｓＣＤ４へのマウスｍＡｂ  Ｂ４の結合は、ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域のａａ３９〜６６を含有する環状ペプチド（ＨＩＶ  ＲＣペプチド）に対するポリクローナル抗体によって阻害された。これらの結果は、ｍＡｂ  Ｂ４が、ＣＤ４のＤ１のＣＤＲ２ループに対応するＣＤ４のａａ３９〜６６を認識することを示唆している。ＭＡｂ  ｄＢ４は、実施例７で報告される比較試験に基づいて、ｍＡｂ  Ｂ４についてここで記載されるものと同じ認識特性を有すると予想される。
【０１６２】
３．ｍＡｂ  ｄＢ４とのＣＤ４架橋は、ＨＩＶ感染ＰＢＭＣ  ＣＤ４＋Ｔ細胞においてウイルス産生を活性化することがわかった。具体的には、ｍＡｂ  ｄＢ４は、表６に示すように、細胞増殖の誘導なしにＴＮＦ−α産生の誘導及びＨＩＶ産生の増強をもたらす。
【０１６３】
４．この実施例で得られた結果に基づいて、ｍＡｂ  ｄＢ４（ＵＢ−４２１を含む）は、ＨＩＶ感染個体におけるウイルス産生増強のために静止期ＰＢＭＣの再活性化を媒介することができる。
【０１６４】
実施例７
ＭＡＢ  ＤＢ４Ｃ７および抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞による抗原誘導性Ｔ細胞増殖およびサイトカイン（ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）産生を阻害し、それによって、パイロトーシスのＨＩＶ病原性サイクルを破壊する。
１．背景
近年の報告では、ＨＩＶが許容活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に感染すると、カスパーゼ−３依存性アポトーシスを介して静かに細胞死が起こることが示されている（Doitsh,G. et al., 2014）。逆に、Ｒ５またはＸ４向性ＨＩＶがリンパ系組織からの非許容静止ＣＤ４＋Ｔ細胞に不稔感染すると、これらの細胞はプログラム細胞死の激しい炎症形態であるカスパーゼ−１依存性パイロトーシスによって死滅する。インターフェロン誘導因子１６（ＩＦＩ１６）は、カスパーゼ−１の活性化を開始する不完全なＨＩＶ逆転写産物を認識する宿主ＤＮＡセンサーとして同定されている（Monroe,K.M. et al., 2013）。扁桃腺、リンパ節および脾臓を含むほとんどのヒトリンパ系組織では、細胞の活性化され許容されるサブセットは全ＣＤ４  Ｔ細胞の５％以下に相当する一方、非許容静止細胞はＨＩＶが遭遇する標的の９５％以上に相当する。したがって、カスパーゼ３媒介アポトーシスではなく、カスパーゼ１媒介パイロトーシスが、これらのリンパ系組織のＨＩＶ感染後のＣＤ４  Ｔ細胞死の駆動を主に担っているように思われる。これらの所見は、Ｒ５−向性ＨＩＶに感染したコントロールからの新鮮なリンパ節の分析によってさらに支持され、ここではカスパーゼ−１およびＩＬ−１βが静止期ＣＤ４  Ｔ細胞が豊富である傍皮質帯で検出される一方、カスパーゼ−３活性が生産的に感染した細胞が見られる解剖学的に異なる胚中心で検出される。
【０１６５】
パイロトーシスは、細胞内複製ニッチを除去し、炎症誘発性サイトカインおよび内因性危険シグナルの放出を介して宿主の防御反応を強化することによって、種々の細菌感染症の迅速な除去を促進する可能性がある。しかしながら、ＨＩＶ感染症のような病原性慢性炎症においては、パイロトーシスは防御反応ではなく、一次感染の排除につながらない。実際、パイロトーシスは、死にかけているＣＤ４  Ｔ細胞が、感染したリンパ系組織にさらに細胞を引き寄せてより多くの炎症を引き起こす炎症性シグナルを放出する悪質な病原性サイクルを作り出すように思われる。これらの事象は、疾患の進行および組織の損傷をあおる慢性的な炎症状態を確立する。慢性炎症はまた、潜伏ＨＩＶ蓄積の維持を促進し、メモリーＣＤ４  Ｔ細胞の恒常的増殖を促進する可能性がある。
【０１６６】
ＣＤ４  Ｔ細胞の枯渇および慢性炎症の発生は、疾患の進行を推進するＨＩＶ発病における特徴的な過程であり、パイロトーシスはこれら２つの疾患促進過程の間の予想外の関連をもたらす。
【０１６７】
上記の情報は、ＨＩＶ感染の間にリンパ系組織で起こるパイロトーシスが、ＣＤ４＋細胞の抗原刺激によって誘因されるＣＤ４＋細胞増殖および／または炎症性サイトカイン産生を抑制する機構によって軽減または低減され得ることを示唆している。
【０１６８】
２．実験
ｍＡｂ  ｄＢ４が、ＨＩＶ感染個体における慢性炎症の発生を抑制することによって、パイロトーシスによって引き起こされる病原性サイクルを破壊することができるかどうかを決定するための試験を行った。抗原刺激によって誘因されるサイトカイン産生の阻害は、既に不稔ＨＩＶ感染症を有する静止期Ｔ細胞の多くによるパイロトーシスの負担を軽減するのを助け、よってサイトカイン産生によるＣＤ４陽性Ｔ細胞枯渇におけるＨＩＶ病理を破壊するだろう。
【０１６９】
ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を使用するインビトロモデルを使用して、正常個体とＨＩＶ感染個体の両方において、ｍＡｂ  ｄＢ４Ｃ７（ＵＢ−４２１）がＰＢＭＣ  Ｔ細胞増殖を阻害する能力を評価した。ＳＥＢは、特定のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）を保有する全てのＴ細胞を刺激する能力を有し、大量のサイトカイン産生を誘導する超抗原である。
【０１７０】
Huyen Cao博士およびMohamed Elrefaei博士との共同研究を通して、正常ヒトドナー（ｎ＝３）およびＨＩＶ感染ドナー（ｎ＝６、ＡＲＴ未経験、ＣＤ４＋数＞２００、ウイルス量＞１００００）の機能的分析を行い、ｍＡｂ  ｄＢ４Ｃ７（ＵＢ−４２１）またはＣＤ４のＤ１のＣＤＲ２領域に対する抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体（実施例９に記載）が、細胞増殖およびサイトカイン（ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）産生を阻害することができるかどうかを評価した。
【０１７１】
２．１  試験対象および試料。
ＨＩＶ陽性ＡＲＴ処置未経験ボランティア（ｎ＝６）をＲＥＡＣＨコホート（San Francisco）から採用した。３人の年齢一致、ＨＩＶ血清陰性コントロールボランティアも試験に含めた。ＰＢＭＣを分離し、アッセイ時間まで液体窒素中で凍結保存した。
【０１７２】
２．２  飽和濃度のｍＡｂ  ｄＢ４Ｃ７または精製抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体を使用した。
ＣＤ４＋Ｔリンパ球を、それぞれ、最初にｍＡｂ  ｄＢ４Ｃ７  ＩｇＧまたは抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体ＩｇＧ、引き続いてＡｌｅｘａ−ヤギ抗ＨｕＩｇＧまたはＡｌｅｘａ−ヤギ抗モルモットＩｇＧで染色しを用いて間接免疫蛍光試験で染色した。得られた染色細胞を、検出された陽性細胞％についてフローサイトメトリーによって分析した。ｍＡｂ  ｄＢ４Ｃ７と抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体の両方を、２倍希釈で５０μｇ／ｍＬ〜０．００２５μｇ／ｍＬの間で力価測定した。ｍＡｂ  ｄＢ４および抗ＨＩＶ  ＲＣ抗体についての抗体力価測定を、ＣＤ４結合％対抗体濃度（μｇ／ｍＬ）として決定した。これらの力価測定を、ＨＩＶ感染個体および正常個体に対して行われたＴ細胞機能的アッセイに使用する前に評価した。
【０１７３】
図６は、機能的試験に使用されたそれぞれの試薬の飽和濃度が、ｍＡｂ  ｄＢ４（ｄＢ４Ｃ７）では１μｇ／ｍＬ、抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体では２５μｇ／ｍＬであることが分かったことを示している。
【０１７４】
２．３  ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖。
細胞分裂時のＣＦＤＡ−ＳＥ（カルボキシ−フルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステル）染色の喪失を伴うＣＦＳＥ（カルボキシ−フルオレセインスクシンイミジルエステル）蛍光アッセイによって細胞増殖を分析した。ＣＦＳＥを３Ｈ−チミジン（増殖）アッセイの代用として使用した。
【０１７５】
ＰＢＭＣを飽和濃度のｍＡｂ  ｄＢ４Ｃ７または精製抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体と共にインキュベートして、細胞表面上のＣＤ４受容体を被覆した。細胞を、それぞれ陰性コントロールおよび陽性コントロールとしての２５μｇ／ｍＬの抗ＨＩＶ  ＲＣアイソタイプおよびＰＨＡ（１０μｇ／ｍｌ；Sigma-Aldrich）と共にもインキュベートした。
【０１７６】
ＰＢＭＣをＰＢＳ中ＣＦＤＡ−ＳＥ（Molecular Probes, Eugene, OR）で標識し、次いで、１００％ＦＣＳ（Sigma-Aldrich, St.Louis, MO）でクエンチした。次いで、細胞を、ＰＢＳで洗浄した後、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０（Sigma-Aldrich）に再懸濁した。
【０１７７】
次いで、細胞をＳＥＢ  Ａｇ（１μｇ／ｍＬ）の存在下、５％ＣＯ２中、３７℃で５日間培養し、表面マーカーの発現について分析した。
【０１７８】
ＣＤ３＋（Ａｍｃｙａｎ）ゲートＣＤ４＋（ＰＥ、Ｄ２）、ＣＤ８＋（ＰｅｒｃｐＣＹ５．５）細胞集団を分析するためにフローサイトメトリーを行い、これらをそれぞれ増殖細胞の％としての％ＣＦＳＥ陽性細胞についてさらに測定した。１試料あたり４万（４００００）個のリンパ球をＬＳＲ  ＩＩ（BD Biosciences, Mountain View, CA）を用いて取得し、分析をＦＬＯＷＪＯソフトウェア（TreeStar, San Carlos, CA）によって行った。結果を分裂しているＣＤ４（またはＣＤ８）Ｔ細胞の％として測定した。全ての試験参加者がＰＨＡ刺激後に著しい増殖を実証した。ＳＥＢ  Ａｇ刺激なし（陰性コントロール）のＣＤ４  Ｔ細胞の増殖は０．５％未満であった。
【０１７９】
２．４  サイトカイン（ＩＬ  ２およびＩＦＮ−γ産生）の測定のための細胞内染色アッセイ。
ＰＢＭＣ（０．５×１０６個細胞）をＳＥＢ  Ａｇ（１μｇ／ｍＬ）と共に５％ＣＯ２中３７℃で２時間インキュベートした。細胞を０．１％ＦＣＳを含有するＰＢＳ（洗浄緩衝液）で洗浄し、細胞を溶解溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に室温で１０分間再懸濁することによって固定した。細胞を洗浄緩衝液で１回洗浄し、次いで、０．５ｍＬの透過処理溶液２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に再懸濁することによって透過処理し、室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄緩衝液で洗浄し、抗ＩＬ−２  ＡＰＣ、抗ＩＦＮ−γ（ＰＥ  ＣＹ７）、および抗ＣＤ３（Ａｍｃｙａｎ）、抗ＣＤ４（ＰＥ、Ｄ２）または抗ＣＤ８（Ｐｅｒｃｐ  ＣＹ５．５）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。１試料あたり４万（４００００）個のリンパ球をＬＳＲ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて取得し、分析をＦＬＯＷＪＯソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）によって行った。Ａｇ刺激なしのサイトカイン産生ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞の割合は０．０５％未満であった（陰性コントロール）。結果を、ＩＦＮ  −γまたはＩＬ２を発現するＣＤ４＋（またはＣＤ８＋）Ｔ細胞の％として表した。
【０１８０】
２．５  統計分析。
統計分析および比較を対応のあるｔ検定を用いて行った。
【０１８１】
３．結果
このＳＥＢ  Ａｇ誘導Ｔ細胞増殖試験から得られた結果は、ＨＩＶ  ＡＲＴ処置未経験患者と年齢一致正常個体の両方において、ｍＡｂ  ｄＢ４Ｃ７（１μｇ／ｍＬ）と抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体（２５μｇ／ｍＬ）の両方が、飽和条件下、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を減少させたが、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を減少させないことを明らかにした（データは示さず）。
【０１８２】
ｍＡｂ  ｄＢ４（１μｇ／ｍＬ）と精製抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体（２５μｇ／ｍＬ）の両方が、それぞれの飽和ＰＢＭＣ表面ＣＤ４結合濃度で、ＨＩＶ陰性（図７ａ）およびＨＩＶ陽性（図７ｂ）個体において、超抗原ＳＥＢ誘導増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ２産生を抑制した。このような抑制は、同じＨＩＶ陽性および陰性個体のＣＤ８＋Ｔ細胞では見られなかった（図７ｃ）。
【０１８３】
ｍＡｂ  ｄＢ４（１μｇ／ｍＬ）と精製抗ＨＩＶ  ＲＣ抗体（２５μｇ／ｍＬ）の両方が、それぞれの飽和濃度で、ＨＩＶ陰性（図７ｄ）およびＨＩＶ陽性（図７ｅ）個体において、超抗原ＳＥＢ誘導増殖ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生も抑制した。このような抑制は、同じＨＩＶ陰性（図７ｆ）および陽性（図７ｇ）個体のＣＤ８＋Ｔ細胞では見られなかった。
【０１８４】
４．結論
共にＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域を標的とする抗体ｍＡｂ  ｄＢ４Ｃ７（ＵＢ−４２１）および抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞による超抗原ＳＥＢ誘導Ｔ細胞増殖およびサイトカイン（ＩＬ２およびＩＦＮ  −γ）産生を抑制するが、ＣＤ８陽性Ｔ細胞によるＴ細胞増殖およびサイトカイン（ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）産生を抑制しないことが分かった。ｄＢ４Ｃ７および抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体がＣＤ４＋Ｔ細胞増殖および関連するサイトカイン（ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）産生を抑制できるという所見は、抗体が、パイロトーシスのＨＩＶ病原性サイクルを破壊する可能性を有し、他のＣＤ４陽性細胞関連サイトカイン産生に対して同様の抑制効果を発揮できることを示唆している。
【０１８５】
この実施例および前述の実施例で観察されるＣＤ４陽性Ｔ細胞増殖および関連するサイトカイン（ＩＬ２およびＩＦＮ−γ）産生に対する抑制効果は、本明細書に記載されるＣＤＲ２領域標的化抗体が、（１）静止期ＨＩＶ感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞を再活性化して、潜伏状態からのＨＩＶの放出を誘因する（実施例９で論じられる）；（２）静止期ＣＤ４＋Ｔ細胞の再活性化によって放出された新しいウイルスからの未感染ＣＤ４陽性Ｔ細胞へのＨＩＶ侵入の競合的阻害および予防（実施例４および６）；および（３）（超）抗原刺激によるＣＤ４陽性Ｔ細胞によるＴ細胞増殖およびサイトカイン産生の阻害（この実施例）を含むＣＤ４細胞に対する同時の相反する効果を発揮できるという点で非常に重要である。
【０１８６】
ＨＩＶ結合および免疫応答の開始のちょうどその部位（すなわち、ＣＤ４ドメイン１のＣＤＲ２領域）を標的とするｍＡｂ  ｄＢ４および抗ＨＩＶ  ＲＣポリクローナル抗体の独特の生物学的特徴は、ＨＩＶ感染症の機能的治癒に必要な特性、すなわち（１）侵入阻害を通してＨＩＶ感染を阻止する；（２）静止期Ｔ細胞におけるウイルス産生を再活性化する；および（３）サイトカイン産生を直接変化させる能力を提供する。
【０１８７】
実施例８
無症候性ＨＩＶ−１感染成人におけるＵＢ−４２１の安全性および有効性を検討するための第ＩＩＡ相、オープン、複数回投与、用量依存性試験
１．試験目的：
１．無症候性ＨＩＶ−１感染対象における、ＵＢ−４２１の２回投与レジメンの複数回投与の安全性および耐容性を評価すること。
２．これらの対象におけるＵＢ−４２１の２回投与レジメンの複数回投与の抗ウイルス活性の証拠を得ること。
３．最適なＵＢ−４２１投与および投与レジメンを決定するために抗ウイルス活性および安全性プロファイルを評価すること。
（臨床試験識別子：ＮＣＴ０１６６８０４３）。
【０１８８】
２．試験設計
これはＵＢ−４２１の反復静脈内投与によるオープン試験であった。ＨＩＶ−１について血清陽性で無症候性の対象を適格性についてスクリーニングした。２９人（２９）の登録対象は、８週間の処置期間にわたって、毎週１０ｍｇ／ｋｇ（コホート１）または隔週２５ｍｇ／ｋｇ（コホート２）の２つの用量レベルのうちの１つで、試験薬物（ＵＢ−４２１）の複数回の静脈内注入を受けた。対象を、場所によりおよび登録順序に基づいて順番に２つの試験コホートのうちの１つに割り当てた。対象を、８週間の処置期間後にさらに８週間の期間追跡した。試験は１６週目に終了した。
【０１８９】
３．選択基準
対象は第ＩＩａ相試験に適格となるために以下の基準を満たすことが必要であった：
１．無症候性、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）未経験、ＨＩＶ−１血清陽性
２．ＣＤ４＋Ｔ細胞数＞３５０細胞／ｍｍ３
３．ＨＩＶ−１ウイルス量＞５０００コピー／ｍＬ
４．即時療法を必要とする活動性感染症（ＨＩＶ−１を除く）がない
５．免疫調節薬または全身化学療法を使用していない
６．高活性抗レトロウイルス処置（ＨＡＡＲＴ）の必要がない
【０１９０】
この試験の完了後、対象は、外来診療所で日常的な監視スケジュール（抗レトロウイルス薬なし）に従うか、またはＨＩＶ／ＡＩＤＳの診断および処置のための現行のガイドラインに従って主任研究員によって必要とみなされた場合に標準処置抗レトロウイルス療法（例えば、ＨＡＡＲＴ）を受けた。ＵＢ−４２１の第Ｉ相試験に登録し、第ＩＩａ相試験の参加基準を満たした個人は、この試験に参加することが許可された。
【０１９１】
４．被験薬
ＵＢ−４２１（ｄＢ４Ｃ７  ｍＡｂ）を１０ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＬバイアル中１００ｍｇ）の濃度で供給した。
各登録対象は、以下の投与量レベルのうちの１つでＵＢ−４２１の複数回の静脈内注入を受けた：８週間にわたって毎週１０ｍｇ／ｋｇ（コホート１）または隔週２５ｍｇ／ｋｇ（コホート２）。ＵＢ−４２１の適切な量は、指定された用量および対象の体重に基づいていた。各個々の投与量を、コホート内の各個々の対象に同等の注入量の薬物を注入するように滅菌生理食塩水を用いて調整した。注入総量は、１０ｍｇ／ｋｇについては約１００ｍＬ、２５ｍｇ／ｋｇについては２００ｍＬであった。各投与の注入時間は約１〜２時間であった。
【０１９２】
５．評価基準：
５．１  主な安全性および有効性のエンドポイント
ＵＢ−４２１の以下の安全性および耐容性パラメータを１６週目（試験終了）まで評価した。
１．身体検査（ＰＥ）
２．バイタルサイン
３．臨床化学および血液学的検査
４．有害事象（ＡＥ）／重篤有害事象（ＳＡＥ）の発生率
試験期間中（Ｖ２〜Ｖ１２）、各試験コホートについて、ＵＢ−４２１の以下の有効性パラメータを評価した：
１．個々の最大ウイルス量減少
２．平均最大ウイルス量減少
【０１９３】
５．２  第２のウイルス学的エンドポイント
試験期間中（Ｖ２〜Ｖ１２）、以下のウイルス学的反応を評価した：
１．各試験コホート内および間のサブグループによる個々の最大ウイルス量減少および平均最大ウイルス量減少。
２．ウイルス量＜５０コピー／ｍＬを有する対象の割合；
３．ウイルス量＜２００コピー／ｍＬを有する対象の割合；
４．ウイルス量減少＞０．５ｌｏｇ１０コピー／ｍＬを有する対象の割合；
５．ウイルス量減少＞１ｌｏｇ１０コピー／ｍＬを有する対象の割合；
６．それぞれコホート１およびコホート２について、最後に完了した試験薬物投与の最大７日および１４日後のウイルスリバウンド（最下点からのウイルス量の０．５ｌｏｇ１０超の増加）を有する対象の割合；
７．抗ＵＢ−４２１抗体の血清濃度（ＵＢ−４２１の免疫原性）；
８．ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞数の変化；
９．ＵＢ−４２１の薬物動態パラメータ（Ｃｍａｘ、ＡＵＣ（０→∞）およびＡＵＣ（０→ｌａｓｔ））。
【０１９４】
６．分析集団：
処置意図（ＩＴＴ）集団：試験薬物の少なくとも１回の投与を受けた２９人の対象。コホート１およびコホート２のＩＴＴ集団はそれぞれ１４人の対象および１５人の対象であった。
パープロトコル（ＰＰ）集団：有効なベースラインおよび少なくとも１つの有効な処置後有効性測定（ＨＩＶ−１ウイルス量試験）を有し、主要なプロトコル違反を欠く、試験薬物の全ての投与を受けた１８人の対象。コホート１およびコホート２のＰＰ集団はそれぞれ７人の対象および１１人の対象であった。
安全性および免疫原性集団：処置意図集団に含まれる２９人の対象。
薬物動態集団：安全性および免疫原性集団内のサブセット集団に基づいていた。
ベースラインデータおよび安全性のエンドポイントは、安全性および免疫原性集団で分析し、有効性分析はＩＴＴとＰＰの集団の両方で行った。薬物動態分析を薬物動態集団で行った。
【０１９５】
７．試験期間
スクリーニング期間：＜４週間
処置期間：８週間
追跡調査期間：処置期間終了後８週間
来院０は初期スクリーニングを表し、試験中の各来院は１週間の期間を表す。追跡調査期間は通常、１週間間隔で行った。
【０１９６】
８．結果の要約：
８．１  試験集団。
合計３３人の無症候性ＨＩＶ感染成人を、台湾の２つの研究施設でスクリーニングした。これらのうち、２９人の対象がスクリーニング基準に合格し、試験に選ばれた。２９人の適格対象は全員男性であった。
【０１９７】
８．２  安全性および耐容性の結果：
２９人の対象全員が試験中に少なくとも１回のＡＥ、合計で１２８回のＡＥを経験した。そのうち、１１４回（全２９人の対象において８９．０６％）が処置下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）であり、１４回（５人の対象において１０．９４％）が処置前ＡＥであった。２９人の対象に重篤有害事象（ＳＡＥ）は観察されなかった。全ての処置前ＡＥはＵＢ−４２１とは無関係であり、これらの事象のいずれもＳＡＥと見なされなかった。報告されたＴＥＡＥの大部分（７８．９５％）は軽度であり、１７．５４％は中等度であり、３．５１％（１人対象）は重度であった。
【０１９８】
最も頻繁に観察された（１０％超）ＴＥＡＥは皮膚発疹および蕁麻疹であった。有害事象以外に、血液学（２２人の対象で１５４例）および生化学（６人の対象で３２例）実験室試験結果の異常が２２人の対象で観察された。しかしながら、変化のほとんどは軽微であり、臨床上著しくなかった。身体検査結果およびバイタルサインは、試験期間中、ほとんど正常または臨床上著しくなかった。
ＵＢ−４２１は、臨床試験プロトコルによって指定されているように、７３．８４％の８週間の処置期間の全体的処置耐容性を有し、試験期間中十分に耐容性を示した
【０１９９】
８．３  薬力学
８．３．１  ＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞数。   ８週間の処置期間および８週間の追跡調査期間の後、平均ＣＤ４＋Ｔ細胞数はベースラインから５５．１０±１１７．９７細胞／ｍｍ３だけわずかに減少したが、平均ＣＤ８＋Ｔ細胞数はベースラインから１９３．３１±４５９．３４細胞／ｍｍ３だけ増加した。コホート１における対象の代表的なＣＤ４＋Ｔ細胞数および平均ＣＤ４  Ｔ細胞数を図９ａの上部パネルに示す。コホート２における対象の代表的なＣＤ４＋Ｔ細胞数および平均ＣＤ４  Ｔ細胞数を図９ａの下のパネルに示す。
【０２００】
８．３．２  ＵＢ−４２１によるＣＤ４受容体の被覆。   ＣＤ４受容体被覆の程度を、蛍光コンジュゲートＵＢ−４２１を用いたフローサイトメトリーによって検出した。４人の代表的な対象、コホート１の２人の患者およびコホート２の２人の患者から得られた結果をそれぞれ図８ａ〜図８ｂおよび図８ｃ〜図８ｄに示す。アッセイの感度は０．１５μｇ／ｍＬである。毎週１０ｍｇ／ｋｇまたは隔週２５ｍｇ／ｋｇで繰り返し投与した場合のＵＢ−４２１の臨床的有効性は、１０μｇ／ｍＬ超の存在下で検出不能なレベルまでウイルスが減少することを明らかにした。単独療法として使用した場合のＵＢ−４２１血清レベル。ＰＢＭＣ  ＣＤ４＋細胞が完全に被覆されている限り（すなわち、％ｄＢ４Ｃ７−Ａｌｅｘａ結合が０に近づく）、ウイルスリバウンドはない。
【０２０１】
ＵＢ−４２１によるＰＢＭＣ上のＣＤ４受容体の完全な被覆は、両方の投与量レベルでのＵＢ−４２１の２〜３回の投与後に達成された。さらに、ＵＢ−４２１によるＣＤ４＋Ｔ細胞の完全な被覆は、処置期間全体を通して維持された（図８ａ〜図８ｄ）。対象のほとんどにおいて、蛍光ｄＢ４Ｃ７  ｍＡｂ（ｄＢ４Ｃ７−Ａｌｅｘａ）の結合によって決定されるように、ＣＤ４受容体へのＵＢ−４２１の結合は減少し、最後のＵＢ−４２１注入の３週間以内にベースライン値に戻った。
【０２０２】
試験中に対象の血清中に存在するＵＢ−４２１の濃度を評価して、完全なＣＤ４被覆およびＨＩＶ−１ウイルス抑制を達成するのに十分なＵＢ−４２１の血清濃度を決定した。得られたデータに基づいて、ＵＢ−４２１の血清濃度が１０μｇ／ｍＬより上に維持されている限り、ＵＢ−４２１によるＣＤ４＋Ｔ細胞の一定の完全な被覆およびＨＩＶ−１ウイルス抑制が達成された（図８ａ〜図８ｄ）。
【０２０３】
８．４  薬物動態：
コホート１で観察された平均ＡＵＣは、１７３００±１００００μｇ×時／ｍＬ（来院１〜２）から２３９００±１０７００μｇ×時／ｍＬ（来院８〜９）に増加し、その後、来院１１〜１２でベースラインに戻った。コホート１で観察された平均ＡＵＣ（０→ｌａｓｔ）は１７１０００±７０３００μｇ×時／ｍＬであった。
コホート２で観察された平均ＡＵＣは、５６５００±１９５００μｇ×時／ｍＬ（来院１〜３）から６１１００±２０７００μｇ×時／ｍＬ（来院７〜９）に増加し、その後、来院１１〜１２でベースラインに戻った。コホート２で観察された平均ＡＵＣ（０→ｌａｓｔ）は、２３９０００±７３９００μｇ×時間／ｍＬであった。
これらのデータは、ＡＵＣ（０→ｌａｓｔ）によって評価される平均血清薬物濃度が、毎週１０ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１注入（コホート１、１７１０００±７０３００μｇｘ時／ｍＬ）を受けた対象と比較して、隔週２５ｍｇ／ｋｇのＵＢ−４２１注入（コホート２、２３９０００±７３９００μｇ×時／ｍＬ）を投与された対象間で高いことを実証している。
【０２０４】
８．５  有効性の結果：
２９人（２９）のＨＩＶ−１感染対象がこの試験に採用され、ＵＢ−４２１の少なくとも１回の投与を受けた（ＩＴＴ集団）。採用された２９人（２９）の対象のうち、合計１８人（１８）の対象が８週間の処置期間を完了し、試験薬物の全ての投与を受けた（ＰＰ集団）。試験中の登録された無症候性ＨＩＶ−１感染対象の個々のおよび平均最大ウイルス量減少を評価することによって、ＵＢ−４２１の複数回投与の有効性を評価し、コホート１および２のＩＴＴおよびＰＰ集団についての結果を表７に要約する。
【０２０５】
平均最大ウイルス量減少は、ＩＴＴまたはＰＰ集団のいずれにおいても２つの投与量レベル間で著しく異ならないことが分かった。具体的には、ウイルス量は、ＩＴＴ集団において、コホート１では２．２７±０．６０ｌｏｇ１０コピー／ｍＬ、コホート２では２．４５±０．４６ｌｏｇ１０コピー／ｍＬ減少した。ＰＰ集団において、ウイルス量は、コホート１では２．７３±０．３４ｌｏｇ１０コピー／ｍＬ、コホート２では２．４７±０．４５ｌｏｇ１０コピー／ｍＬ減少した。
【０２０６】
処置期間中、０．５ｌｏｇ１０コピー／ｍＬ以上のウイルス量の減少が全（ｎ＝２９、１００．００％）試験対象で観察され；１ｌｏｇ１０コピー／ｍＬ以上のウイルス量の減少も全（ｎ＝２９、１００．００％）試験対象で観察された。
【０２０７】
処置期間中に得られたデータをさらに評価したところ、以下のことが明らかになった：
コホート１では、ＩＴＴの対象の８／１４（５７．１４％）およびＰＰの対象の５／７（７１．４３％）が、２００コピー／ｍＬ以下のウイルス量を有していた；さらに、ＩＴＴの対象の３／１４（２１．４３％）およびＰＰの対象の３／７（４２．８６％）が５０コピー／ｍＬ未満のウイルス量を有していた。
【０２０８】
コホート２では、ＩＴＴの対象の１０／１５（６６．６７％）およびＰＰの対象の７／１１（６３．６４％）が、２００コピー／ｍＬ以下のウイルス量を有しており；ＩＴＴの対象の３／１５（２０．００％）およびＰＰの対象の２／１１（１８．１８％）が５０コピー／ｍＬ未満のウイルス量を有していた。
【０２０９】
コホート１および２の対象からの代表的なウイルス量減少データを表７および図９ａに示す。各コホート内、コホート間、または各コホート内の亜集団間でウイルス量が減少した対象の割合に統計学的に著しい差はなかった。さらに、８週間の処置期間中に、ウイルス量が、それぞれコホート１および２の対象の４２．９％および１８．２％において、現在のアッセイ検出限界（２０コピー／ｍＬ）未満まで減少した。全ての対象で、ウイルス量の減少が持続し、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＵＢ−４２１によって完全に被覆されていた。追跡調査期間の最後までに、ウイルス量は両コホートにおいてベースラインレベルに戻った。さらに、処置期間中、対象のいずれにおいてもウイルスリバウンドは観察されなかった。両コホートにおいて、患者から、処置期間を通して定量可能な抗ＵＢ４２１抗体は検出されなかった。
【０２１０】
８．６  ＵＢ−４２１とＴＭＢ−３５５の比較：
ＵＢ−４２１について本試験で得られた結果を、他者（Jacobson, J.L. et al., 2009; Toma, J. et al., 2011;およびPace,C.S. et al., 2013）によって行われたＴＭＢ−３５５（イバリズマブ、以前はＴＮＸ−３５５）についての同様の試験で得られた結果に対して評価した。図１０ａは、ＣＤ４＋細胞が完全に被覆されているＵＢ−４２１の存在下での、ウイルス量リバウンドなしでの最大３Ｌｏｇ１０超の優れたウイルス量減少を示している。対照的に、ＴＭＢ−３５５による処置を受けている患者は、ＣＤ４＋細胞の完全な被覆の存在下でさえ、処置からわずか１週間後にウイルスリバウンドに遭遇し、耐性ウイルス変異体の発生を示している（図１０ｂ）。
【０２１１】
これら２つの処置レジメンの比較は、図に示すように、ＵＢ−４２１によるＨＩＶ感染対象の処置がＴＭＢ−３５５処置よりも明確な利点を有することを実証している。具体的には、ＵＢ−４２１は、処置期間を通して、および追跡調査期間に至るまでの１週間または２週間でさえも、ＨＩＶウイルス量の継続的な減少を提供し、最大ウイルス量減少は３ｌｏｇ１０超である。対照的に、ＴＭＢ−３５５は、最初の投与での一時的ウイルス量減少および約１ｌｏｇ１０の最大ウイルス量減少を提供するにすぎない。
【０２１２】
また、ＴＭＢ−３５５を用いた以前の試験は、血清ＴＭＢ−３５５の存在およびＣＤ４陽性Ｔ細胞の完全な被覆にもかかわらず、処置の１週間後にＨＩＶウイルスリバウンドが起こることを見出した（Jacobson, J.L. et al., 2009）。この結果は、ＴＭＢ−３５５（イバリズマブ）によって媒介される非競合的侵入阻害機構が抗体処置期間中に耐性ＨＩＶ変異体の発生の高い可能性を与えるという上記実施例４における初期の予測と一致する。実際、ウイルス量減少のためのＴＭＢ−３５５処置を受けている患者から、ｇｐ１２０のＶ５領域で同定された突然変異を有するウイルス耐性変異体が発見された（Toma, J. et al., 2011；Pace,C.S. et al., 2013）。
【０２１３】
これらの細胞を超抗原ＳＥＢ、ＣＭＶペプチドｐｐ６５、またはコンセンサスＢ配列を有するＨＩＶ  ｇａｇペプチド（ＨＩＶ  Ｇａｇモチーフペプチド）を含む種々の抗原によって刺激すると、ＣＤ３＋、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋対ＣＤ３＋／ＣＤ８＋細胞集団の増殖応答に関して、いくつかの非常に興味深い所見がある。
【０２１４】
図９ｂに示すように、超抗原ＳＥＢ（上部パネル）またはＣＭＶｐｐ６５ペプチド（下部パネル）について処置経過の前（Ｗ１）、最後（Ｗ８）または２ヶ月後（Ｗ１６）のいずれにおいても、ＣＤ３またはＣＤ３／ＣＤ４＋細胞によって、両集団による刺激性応答に関して観察される差はなかった。
【０２１５】
処置経過の前（Ｗ１）、最後（Ｗ８）または２ヶ月後（Ｗ１６）のいずれかに、ＨＩＶ  Ｇａｇモチーフペプチドを使用してＵＢ４２１を受けている患者のＰＢＭＣを刺激すると、非常に興味深い所見が得られた（図１１）。著しい増殖性ＣＤ３＋増殖応答が見られ、これはさらなる分析ではＷ１とＷ８の間のＣＤ３／ＣＤ８＋集団（Ｐ＜０．０１）によるものであった。ＵＢ４２１を受けた後のＨＩＶ  Ｇａｇモチーフペプチドによる刺激によるＨＩＶ患者におけるＣＤ３／ＣＤ８＋集団のこの著しい増加は、これらの患者におけるＨＩＶ特異的ＣＴＬ応答の改善を示す重要な臨床的意味を与え、非進行者の患者により似たこれらの患者におけるＨＩＶ感染Ｔ細胞のより優れた監視を可能にし得る。
【０２１６】
９．結論
無症候性ＨＩＶ−１感染対象におけるＵＢ−４２１による８週間の処置は十分に耐容性を示すことが分かった。さらに、それぞれコホート１（上部パネル）と２（下部パネル）の両方からの平均ＣＤ４  Ｔ細胞数（図９ａ）は、監視した２ヶ月間を通して安定したままであった。
【０２１７】
より重要なことには、ＵＢ−４２１による処置は全ての対象において著しいウイルス量減少をもたらした（処置対象の１００％が１ｌｏｇ１０コピー／ｍＬ以上の最大減少で反応した）。毎週１０ｍｇ／ｋｇ（コホート１）と隔週２５ｍｇ／ｋｇ（コホート２）の注入の両方のレジメンが、ウイルス量減少において同様の有効性を示した。ＩＴＴ集団における平均最大ウイルス減少は、コホート１では２．２７±０．６０ｌｏｇ１０コピー／ｍＬ、コホート２では２．４５±０．４６ｌｏｇ１０コピー／ｍＬに達した。ＵＢ−４２１で観察されたウイルス減少有効性は、これまでに試験された他のどの低分子抗ＨＩＶ薬よりも優れている。
【０２１８】
この慎重に実施されたＵＢ−４２１の複数回投与第ＩＩａ相試験の臨床試験結果は、処置期間中のウイルスリバウンドのない単独療法として、高い耐容性、安全性、および前例のないウイルス量減少有効性を実証した。本試験で得られた結果は予想外であり、ＣＤ４のドメイン１に結合する抗ＣＤ４モノクローナル抗体が主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩが媒介する免疫機能に干渉するために免疫抑制的であり、このような療法がＨＩＶ疾患の処置に不適切であるだろうという当分野における長期の疑い（Jacobson, J.L. et al., 2009）と矛盾する。これらの結果はさらに、直交性のＨＡＡＲＴおよび／または他のＨＩＶ蓄積活性化剤（ＨＤＡＣｉなど）と組み合わせてＵＢ−４２１を使用するＨＩＶ療法のさらなる様式が、ＨＩＶ感染症の機能的治癒を達成できることを示唆している。
【０２１９】
実施例９
ＨＩＶ−１感染成人における抗ウイルス療法の代替としてのＵＢ−４２１単独療法を使用した処置様式
図１２は、抗レトロウイルス薬の代替としてＵＢ−４２１単独療法を使用したＨＡＡＲＴ安定化患者の処置様式を示す。詳細な目的およびプロトコルを以下に記載する。
【０２２０】
１．適用患者集団
安定な高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）によるウイルス抑制を有するＨＩＶ−１について血清陽性である対象が、このような処置に適格である。
適格な患者は、最初の４ヶ月間、ＩＶ、ＩＭまたはＳＣ経路のいずれかを介して投与されるＵＢ−４２１を受け、引き続いて別のサイクルのＨＡＡＲＴ処置を受ける。「ＨＡＡＲＴ−ＵＢ−４２１」交互処置サイクルは、ＵＢ−４２１とＨＡＡＲＴ療法の両方を中止してウイルスリバウンドが観察されなくなるまで数回繰り返すことができ、それによってＨＩＶ感染症に対する機能的治癒をもたらす。
【０２２１】
より具体的には、図１２に示すように、これらの対象は、それぞれ８週間および１６週間の処置期間にわたって、毎週１０ｍｇ／ｋｇまたは隔週２５ｍｇ／ｋｇの２つの用量レベルのうちの１つで、試験薬物（ＵＢ−４２１）の複数回の静脈内注入を受けた。ＨＡＡＲＴレジメンを最初のＵＢ−４２１注入の前日に中止した。ＵＢ−４２１投与の前に、対象は、急性輸液反応を防ぐために、主任研究員によって判断されるステロイド薬および抗ヒスタミン薬を含む予防的投薬（前投薬）を受けた。最後に予定されたＵＢ−４２１投与を完了した後、全ての対象は同じ日に元のまたは他の適切なウイルス感受性抗レトロウイルス療法を再開した。ＨＡＡＲＴレジメンの使用は主任研究員によって判断された。全ての患者からのウイルス量ならびにＣＤ４およびＣＤ８細胞数を処置期間中および処置期間終了後２ヶ月の間監視した。
【０２２２】
２．選択基準
以下の基準の全てを満たす場合、対象をこの処置様式に含めた：
１．ＨＩＶ−１血清陽性；
２．年齢２０歳以上；
３．少なくとも２年間、少なくとも２つのヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）＋非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、インテグラーゼ阻害剤、またはプロテアーゼ阻害剤として定義されるＨＡＡＲＴ処置を受けた；処置が進行中であり、試験に入る前の１年以内に薬物の変更がない。
４．スクリーニング来院前１年以内にＣＤ４＋Ｔ細胞数≧５００個細胞／ｍｍ３またはＣＤ４割合≧２８％の２回の測定値を有する；
５．スクリーニング来院前４週間以内またはスクリーニング来院時にＣＤ４＋Ｔ細胞数≧５００個細胞／ｍｍ３が得られた；
６．１年あたり少なくとも２回ウイルス量測定して、ＨＩＶ−１血漿ＲＮＡが、スクリーニング来院前少なくとも１年間は検出不能のままである；ウイルス量はまた、スクリーニング来院前４週間以内またはスクリーニング来院時に検出不能である；スクリーニング来院の４週間前に検出可能なＨＩＶ血漿ＲＮＡエピソードが１回あっても、参加は除外されない。
【０２２３】
３．除外基準
以下の理由のいずれかのために、対象を処置様式から除外した。
１．即時療法を必要とする活動性感染症（ＨＩＶを除く）；
２．米国疾病管理予防センター（ＣＤＣ）のＨＩＶ感染分類システムに従って、カテゴリーＢおよびカテゴリーＣにより以前に診断されるか又は活動性のＡＩＤＳ定義病；
３．体重８０ｋｇ超；
４．確認されたＣＤ４＋Ｔ細胞数＜２５０細胞／ｍｍ３、またはスクリーニング前１２週間以内のＣＤ４＋Ｔ細胞割合≦１４％。
５．ＵＢ−４２１の第Ｉ相もしくは第ＩＩａ相試験、または抗ＵＢ−４２１抗体の存在の病歴のいずれかに以前に登録された；
６．試験薬物ＵＢ−４２１の初回投与前の１２週間以内でモノクローナル抗体に以前に曝露している；
７．研究者の意見で、対象がこの試験に参加することを妨げるであろうとスクリーニング、病歴および／または身体検査から決定された、精神医学的および行動的問題を含む、（ＨＩＶ−１感染症以外の）重大な疾患または臨床的に重要な所見；
８．試験薬物の初回投与前８週間以内の予防接種；
９．試験薬物の初回投与前１２週間以内の免疫調節療法（インターフェロンを含む）、全身化学療法；
１０．平均余命１２ヶ月未満；
１１．処置薬物の初回投与前１２週間以内の違法静注薬物；
１２．ウイルス学的応答の欠如、および以前の非ホジキンリンパ腫またはカポジ肉腫のための、ＨＡＡＲＴレジメンの２回以上の変更
１３．は研究者の意見で、対象が投与および来院スケジュールおよびプロトコル評価を順守する能力を妨げるであろう現在のアルコールまたは違法薬物の使用。
【０２２４】
４．製剤
製剤ＵＢ−４２１（ｄＢ４Ｃ７ｍＡｂ）を１０ｍｇ／ｍＬ（１０ｍＬバイアル中１００ｍｇ）の濃度で供給した。対象は、静脈内注入によって、８回の毎週１０ｍｇ／ｋｇ用量のＵＢ−４２１または８回の隔週２５ｍｇ／ｋｇ用量のＵＢ−４２１のいずれかを受けた。
ＵＢ−４２１の適切な量は、指定された用量および対象の体重に基づいていた。各個々の投与量を、コホート内の各個々の対象に同等の注入量の薬物を注入するように滅菌生理食塩水を用いて調整した。注入総量は、１０ｍｇ／ｋｇについては約１００ｍＬ、２５ｍｇ／ｋｇについては２００ｍＬであった。各投与の注入時間は約１〜２時間であった。
【０２２５】
５．結果
５．１  試験集団。
合計２９人のＨＡＡＲＴ安定化ＨＩＶ患者を台湾の２つの研究施設でスクリーニングした。これらのうち、２９人の対象がスクリーニング基準に合格し、試験に選ばれた。２９人の適格対象は全員男性であった。
【０２２６】
５．２  安全性および耐容性の結果：
２９人の対象全員が試験中に少なくとも１回のＡＥを経験した。全ての処置前ＡＥはＵＢ−４２１とは無関係であり、これらの事象のいずれもＳＡＥと見なされなかった。報告されたＴＥＡＥのほとんどは軽度であった。最も頻繁に観察されたＴＥＡＥは皮膚発疹および蕁麻疹であった。身体検査結果およびバイタルサインは、試験期間中、ほとんど正常または臨床上著しくなかった。
ＵＢ−４２１は、臨床試験プロトコルによって指定されているように、８週間または１６週間の処置期間の全体的処置耐容性を有し、試験期間中十分に耐容性を示した
【０２２７】
５．３  薬力学
５．３．１  ＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞数。   図１３に示すように著しい差がなく（コホート１についてはＰ＝０．３３１、コホート２についてはＰ＝０．９０５）、８週間（コホート１）および１６週間（コホート２）の処置期間および８週間の追跡調査期間（Ｖ１２）の後でも、平均ＣＤ４＋Ｔ細胞数は、ベースライン（Ｖ１）から、処置および監視期間（Ｖ１２）の後とほぼ同じままであった一方で、図１４に示すように、コホート１（Ｐ＜０．００１）とコホート２（Ｐ  ＜０．００４）の両方について、平均ＣＤ８＋Ｔ細胞数は、ベースライン（Ｖ１）から、処置および監視期間（Ｖ１２）後に著しく増加した。ＵＢ４２１処置後にＨＡＡＲＴ安定化患者において観察されるＣＤ８＋細胞のこの著しい増加はまた、実施例７、図９ａ下部パネル、ＵＢ４２１処置を受けている患者の重要な特徴に示されるようにＵＢ４２１を受けている処置未経験患者においても観察される。
【０２２８】
５．３．２  ＵＢ−４２１によるＣＤ４受容体の被覆。   ＣＤ４受容体被覆の程度を、蛍光コンジュゲートＵＢ−４２１を用いたフローサイトメトリーによって検出した。コホート１およびコホート２の患者について得られた結果を、それぞれ図１５Ａおよび図１５Ｂに示す。ＣＤ４受容体の完全な被覆は、それぞれコホート１およびコホート２について６３日および１１２日間見られる。患者が全（１００％）患者において元のＨＡＡＲＴ処置プロトコルに戻った場合、毎週１０ｍｇ／ｋｇまたは隔週２５ｍｇ／ｋｇで繰り返し投与した場合のＵＢ−４２１の臨床的有効性は、処置期間および完全なＣＤ４受容体被覆期間および処置後期間（コホート１については６３日目〜１１２日目、コホート２については１１２日目〜１６８日目）を通して、検出不能なレベルのウイルス量の完全抑制を明らかにした。処置期間の間、ＰＢＭＣ  ＣＤ４＋細胞が完全に被覆されている限り（すなわち、％ｄＢ４Ｃ７−Ａｌｅｘａ結合が０に近づく）、ウイルスリバウンドはない。
【０２２９】
ＵＢ−４２１によるＰＢＭＣ上のＣＤ４受容体の完全な被覆は、両方の投与量レベルでのＵＢ−４２１のただ１回の投与後に達成された。さらに、ＵＢ−４２１によるＣＤ４＋Ｔ細胞の完全な被覆は、処置期間全体を通して維持された（図１５）。対象のほとんどにおいて、蛍光ｄＢ４Ｃ７  ｍＡｂ（ｄＢ４Ｃ７−Ａｌｅｘａ）の結合によって決定されるように、ＣＤ４受容体へのＵＢ−４２１の結合は減少し、最後のＵＢ−４２１注入の３週間以内にベースライン値に戻った。
【０２３０】
試験中に対象の血清中に存在するＵＢ−４２１の濃度を評価して、完全なＣＤ４被覆およびＨＩＶ−１ウイルス抑制を達成するのに十分なＵＢ−４２１の血清濃度を決定した。得られたデータに基づいて、ＵＢ−４２１の血清濃度が１０μｇ／ｍＬより上に維持されている限り、ＵＢ−４２１によるＣＤ４＋Ｔ細胞の一定の完全な被覆およびＨＩＶ−１ウイルス抑制が達成された。
【０２３１】
５．３．３  制御性Ｔ細胞の定量化。    以前はサプレッサーＴ細胞として知られていた制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫系を調節し、自己抗原に対する耐容性を維持し、自己免疫疾患を予防するＴ細胞の亜集団である。Ｔｒｅｇは免疫抑制性であり、一般にエフェクターＴ細胞の誘導および増殖を抑制または下方制御する。ＴｒｅｇはバイオマーカーＣＤ４、ＦＯＸＰ３およびＣＤ２５を発現し、ナイーブＣＤ４細胞と同じ系統に由来すると考えられている（ウェブサイト：en.wikipedia.org/wiki/Regulatory_T_cell）。そのため、本発明者らは、ＵＢ４２１の免疫調節能力を評価するためのバイオマーカーとして（ＣＤ３／ＣＤ４陽性細胞のうちの）％Ｔｒｅｇを含めた。制御性Ｔ細胞の定量化のための手順を以下に記載する。
【０２３２】
ＥＤＴＡバキュテナーに収集した血液を溶解緩衝液を用いて室温で１０分間溶血させ、次いで、染色緩衝液で１回洗浄した。細胞を、抗ＣＤ４（Ｄ２）−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ２５−ＡＰＣおよび抗ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰを含む表面マーカー染色用の種々の抗体で氷上で３０分間染色した。次いで、細胞を２回洗浄し、製造業者の指示に従ってＡｎｔｉ−ＦｏｘＰ３−ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。次いで、細胞を２回洗浄し、固定緩衝液で固定した。試料をＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーターで取得した。データ分析はＦｌｏｗＪｏソフトウェアＶ１０．０．８．（６）を用いて行った。
【０２３３】
図１７に示すように、処置期間（Ｖ２〜Ｖ８）中のＶ１後のＴｒｅｇ細胞における減少レベル（％）は、平均でＶ１のおよそ半分である（それぞれコホート１およびコホート２において４４．４〜５９．６％および５２．４〜６５．３％）。処置期間後、Ｔｒｅｇ細胞％のレベルは、Ｖ１１でベースラインを超えて跳ね上がり（コホート１で１２０．５％、コホート２で１２０．１％）、平均してＶ１２でベースラインに戻った（コホート１で１１０．５％、コホート２で１１０．２％）。
【０２３４】
１．３．４  ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡの定量化。    ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡは、処置患者のＨＩＶ感染ウイルス蓄積含量を監視するための別のバイオマーカーを提供し得る。そのため、本発明者らは、ＨＡＡＲＴ処置後に安定化状態に達したＵＢ４２１を受けている患者についてこのような監視を行うために、下記のようにＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡの定量化のためのアッセイを確立した。
【０２３５】
５．３．５  細胞単離およびＤＮＡ抽出。    末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、患者の血液試料の標準的なＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心によって単離した。細胞ＤＮＡをＺＲ−Ｄｕｅｔ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｐｌｕｓキット（Zymo Research）を用いて精製ＰＢＭＣから抽出し、使用するまで−８０℃で保存した。各試料のＰＢＭＣの数をＤＮＡ抽出前に計数した。
【０２３６】
５．３．６  ＨＩＶ−１プロウイルスＤＮＡの定量化。    Ｓｅｍｉ−ＮｅｓｔｅｄリアルタイムＰＣＲのプライマーおよびプローブ配列ならびにＰＣＲ手順を以下に示すように修正した。手短に言えば、精製ＤＮＡおよび標準プラスミドを、ＨＩＶ−１  ｇａｇモチーフを有する保存領域を増幅する２ラウンドのＰＣＲに直接かけた。抽出したＤＮＡを最初に、SimpliAmp Thermal Cycler（Applied Biosystems）上で１０サイクルにわたって、２５μｌの反応物中でAmpliTaq Gold（Applied BioSystem）により０．２μＭの各プライマー、ＧＡＧ１およびＳＫ４３１を用いて増幅した。その後、ＴａｑＭａｎ検出化学を用いたリアルタイムＰＣＲ装置での第２の定量化ＰＣＲ増幅において、第１のＰＣＲの産物を鋳型として使用した。２μｌの第１のＰＣＲ産物を第２のＰＣＲに使用して、２０μｌの反応物中でTaqMan Fast Advanced Master Mix（Applied BioSystem）により０．２μＭの各プライマー、ＧＡＧ１およびＧＡＧ２を用いて増幅し、第２のＰＣＲ産物を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ５リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ）上で０．２μＭの二重標識蛍光プローブ、ＧＡＧ３によって検出した。ＨＩＶ−１  ｇａｇキャプシド領域を含有するプラスミドを用いて、５  ｘ  １０６〜４  ｘ  １０１コピーの標準曲線を作成した。
【０２３７】
細胞数をアルブミン遺伝子の定量ＰＣＲによって決定した。抽出したＤＮＡを、２０μｌの反応物中でTaqMan Fast Advanced Master Mix（Applied BioSystem）により０．２μＭの各プライマー、Ａｌｂ−ＦおよびＡｌｂ−Ｒを用いて増幅し、第２のＰＣＲ産物を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ５リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ）上で０．２μＭの二重標識蛍光プローブ、Ａｌｂ−Ｐによって検出した。アルブミンを含有するプラスミドを用いて、２．５×１０６〜４×１０３コピーの標準曲線を作成した。
【０２３８】
全ての試料を二連で実行した。結果を、ｑＰＣＲによって定量された細胞数で正規化することによって、１００万個のＰＢＭＣ当たりのＨＩＶプロウイルスＤＮＡのコピーとして示した。プライマーおよびプローブの配列は以下の通りである：
ＳＫ４３１  5’-TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT-3’（配列番号１５）、
ＧＡＧ１  5’-TCAGCCCAGAAGTAATACCCATGT-3’（配列番号１６）、
ＧＡＧ２  5’-CACTGTGTTTAGCATGGTGTTT-3’（配列番号１７）、
ＧＡＧ３  5’-FAM-ATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAGA-IBHQ-3’（配列番号１８）、
Ａｌｂ−Ｆ  5’-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3’（配列番号１９）、
Ａｌｂ−Ｒ  5’-ACTCATGGGAGCTGCTGGTTC-3’（配列番号２０）、
Ａｌｂ−Ｐ  5’-FAM-GGAGAGATTTGTGTGGGCATG ACAGG-IBHQ-3’（配列番号２１）
【０２３９】
５．３．７  ＵＢ‐４２１による細胞ＨＩＶ。    ＤＮＡの根絶ＵＢ−４２１  ＨＡＡＲＴ補充療法試験で、ＤＮＡ抽出およびＨＩＶプロウイルスＤＮＡ定量のためにＰＢＭＣを収集した。細胞ＨＩＶプロウイルスＤＮＡ含量を、Ｖ１（ＵＢ−４２１処置前）、Ｖ８（ＵＢ−４２１処置の最後）およびＶ１２（追跡調査の最後）で測定した。分析した７人の対象において、ＨＩＶプロウイルスＤＮＡ含量は、ＵＢ−４２１処置後に著しく減少し、その後、患者が、元のＨＡＡＲＴ処置に戻った後、最後のＵＢ−４２１投与（Ｖ１２）後９週間まで、同様のレベルで維持されることが分かった（図１８）。この結果は、ＵＢ−４２１処置がＨＡＡＲＴ処置および安定化患者において組込細胞ＨＩＶプロウイルスＤＮＡと非組込細胞ＨＩＶプロウイルスＤＮＡの両方をさらに減少させることができることを示し、ＵＢ４２１処置の結果としてのＨＩＶウイルス蓄積細胞の減少の可能性を示している。これは、強力なＨＩＶ侵入阻害剤としてのその重要な役割を超えたＵＢ４２１に関連する別の重要な特徴を表している。
【０２４０】
５．４  有効性の結果：
ウイルスリバウンドを、血清または血漿１ｍＬ当たり４００ＨＩＶ−１  ＲＮＡコピー超のウイルス量の３回以上の連続検出として定義した。個々の患者について図１６に示すように、ＨＡＡＲＴ処置中にＨＡＡＲＴ安定化患者についてほぼ同じ頻度で時折検出された数回の突然の変化を除いて、４００ＲＮＡコピー／ｍＬ（点線）未満の完全なウイルス抑制が処置期間全体にわたっておよび処置期間を越え維持された。これは、ＨＡＡＲＴの代替としてのＵＢ４２１処置における１００％の有効性を示す。
【０２４１】
全（９人中９人）患者（１００％）が１１〜８６日の処置期間中にこのような抑制を維持できなかった（図１９）広範囲中和抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体ＶＲＣ０１（ＮＩＨワクチン研究センターＶＲＣ０１）を用いてＮＩＨが行った同様のＨＡＡＲＴ補充試験と比較すると、ＵＢ４２１による最大１６週間（コホート２）の処置で１００％ウイルス抑制を維持する能力は前例がない。これは、ウイルス抑制の％を終了パラメータとして使用する場合、図２０に示すように、ＨＩＶ−１薬の中で今までに試験された全ての単独療法処置と比較して、さらにより印象的である。
【０２４２】
図２０に示すように、市場に出回っているＨＩＶ薬の歴史的データは、患者の５０％だけが最大４週間ウイルス抑制状態を維持していたことを示している。ＶＲＣ０１様抗ｇｐ１２０広域中和抗体は、このような単独療法を受けている患者の７０％が処置までの最大４週間ウイルス抑制を維持し、患者の約１０％が最大８週間まで処置するとウイルス抑制を維持したというＨＩＶ−１薬の著しい改善を示す。ＣＣＲ５進入阻害剤としてのＰｒｏ１４０は、進入受容体としてＣＣＲ５を使用していない患者のＨＩＶ−１のために約３０％の患者を試験参加について除外する不都合にもかかわらず、患者が４週間で９８％のウイルス抑制、８週間で８２％の抑制および１２週間で７５％の抑制を維持したという上述の２つを超えるさらなる改善を提供する。単剤療法としてのＵＢ４２１が、この代替試験で、試験したプロトコルに従って最大１６週間の処置で１００％抑制を維持したことを実証したことが、最も印象的である。この前例のない臨床結果は、ＣＤ４細胞が完全に被覆されている限り、ウイルス侵入阻害の技術水準の有効性（１００％）；処置中の％Ｔｒｅｇ細胞の減少および処置中のＣＤ４細胞とＣＤ８細胞両方の患者における回復（例えば、ＨＩＶ  ｇａｇ応答性ＣＤ８  Ｔ細胞増殖の増加）によって例示される印象的な免疫調節効果；−およびウイルス蓄積細胞の減少を示すＵＢ４２１処置によるＨＩＶ  ＤＮＡ含量の減少を示した。
【０２４３】
図２１は、ＵＢ４２１様抗ＣＤ４処置を受けた際にＨＩＶ−１患者に好影響を与える因子を要約している。例えば、図２１は、ＵＢ−４２１様抗体による処置が、（１）処置時および処置中のＴｒｅｇ細胞の％を減少させ、処置後のＣＤ８＋細胞数を増加させ、処置後のＨＩＶ  ｇａｇモチーフペプチド刺激に応答したＣＤ８＋増殖細胞を増加させる（これらの全てが、ＨＩＶ感染ＣＤ４細胞でのＣＴＬ標的化を媒介する機能的ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の増強を示す）ことによって、実施例８および９に実証されるようにＨＩＶ抗原特異的Ｔ細胞活性を回復する；（２）特にＨＩＶリザーバーＴ細胞が濃縮され、このような細胞が密に詰まっている組織濾胞ＣＤ４細胞において、ＴＮＦ  −α産生増強によって示されるように、Ｔ細胞活性化を増強する；および（３）強力な侵入阻害を提供することによって細胞間および無細胞感染を防ぎ、それによってＣＤ４陽性細胞の新たな感染を防ぐことを示している。これら３つの機構を支持して、ＵＢ−４２１様抗体による処置は：（４）測定された血球中のＨＩＶ  ＤＮＡ含量の減少によって証明される、ＨＩＶ  Ｔ細胞蓄積の減少をもたらす。図２１に示すこれらの４つの機構は、ＨＩＶ感染症の最終的な持続的ウイルス学的寛解、または機能的治癒をもたらすであろう。
【０２４４】
実施例１０
ＴＣＲシグナル伝達キナーゼＬＣＫのリン酸化および活性化により検出されるＵＢ４２１によるＣＤ４＋細胞の直接活性化
Ｌｃｋキナーゼリン酸化を介したＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化に対する、ＴＣＲ近位シグナル伝達分子であり、ＣＤ４細胞内ドメインに直接結合することが知られているＵＢ−４２１の効果を調べた。Ｌｃｋリン酸化の程度を、陽性コントロールとしてのＵＢ−４２１および他の公知のＴ細胞刺激剤（例えば、ＯＫＴ３、抗ＣＤ３）によって刺激した際のウエスタンブロットおよびフローサイトメトリー分析によって評価した。
【０２４５】
Ｔ細胞のシグナル伝達は、適切なＴ細胞の活性化および阻害を確実にするために厳密に調節されている。タンパク質リン酸化は、抗原認識時にＴ細胞受容体シグナル伝達（ＴＣＲシグナル伝達）を伝達および増強するための主な方法である。Ｔ細胞において特異的に発現される１つのキナーゼ、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）は、初期のＴＣＲシグナル伝達および調節において重要である。Ｌｃｋは、補助受容体ＣＤ４またはＣＤ８との会合を介してＴＣＲシグナル伝達複合体に動員され、これがＣＤ３−ゼータ（ζ）鎖およびゼータ鎖関連プロテインキナーゼ７０（Ｚａｐ７０）の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）をリン酸化し、今度はこれがＴＣＲシグナル伝達カスケード中の他のタンパク質をリン酸化してＴ細胞活性化をもたらす。
【０２４６】
ＬｃｋはＳｒｃチロシンキナーゼファミリーに属し、リンパ系細胞、主にＮＫ細胞およびＴ細胞においてもっぱら発現される。Ｓｒｃキナーゼファミリーの活性は２つのチロシンリン酸化部位によって制御されることが知られており、一方はキナーゼ活性を増強し（ＬｃｋではＹ３９４）、他方は阻害する（ＬｃｋではＹ５０５）。Ｌｃｋの触媒活性は、Ｙ５０５およびＹ３９４のリン酸化状態を制御するキナーゼおよびホスファターゼによって調節される。ＣＤ４＋Ｔ細胞では、Ｌｃｋは４つの異なる活性状態、（１）未リン酸化、（３）Ｙ３９４リン酸化、（３）Ｙ５０５リン酸化、および（４）刺激なしの二重リン酸化状態で存在する。Ｙ３９４は自己リン酸化部位であり、タンパク質の活性化に関連している。カルボキシル末端近くに位置するＹ５０５は、Ｃｓｋによってリン酸化され、ＣＤ４５によって脱リン酸化される。Ｌｃｋの三次構造はＹ５０５リン酸化の間に折り畳まれ、部位Ｙ３９４のリン酸化を妨げる。ＣＤ４５がＹ５０５を脱リン酸化すると、チロシンＹ３９４がキナーゼ活性のためにＬｃｋ上で自己リン酸化される。
【０２４７】
Ｔ細胞が活性化されると、活性型Ｌｃｋが免疫学的シナプスに即座に動員され、下流の分子をリン酸化する。ＴＣＲが抗原に結合し、活性化され、ＣＤ３ζ鎖およびＺＡＰ−７０を含む下流分子をリン酸化した後、Ｌｃｋは、（ａ）ホスファターゼＰＴＰＮ２２を介しあＹ３９４の脱リン酸化および（ｂ）キナーゼ、Ｃｓｋを介したＹ５０５の再リン酸化によって、迅速に失活する。刺激後の異なる時点でのＹ３９４の脱リン酸化は、ＴＣＲシグナル伝達カスケードを通したＴ細胞の活性化を示している。
【０２４８】
ＵＢ−４２１はＣＤ４ドメイン１上のＣＤＲ２領域の近くのコンフォメーションエピトープに結合して、ＨＩＶ−１の結合および細胞内への侵入を阻止する。ＣＤ４への結合後のＴＣＲシグナル伝達カスケードおよび免疫調節に対するＵＢ−４２１の効果は、ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリー分析によるＬｃｋのＹ３９４およびＹ５０５のリン酸化の定量化を通して研究されている。
【０２４９】
１  材料および方法
１．１  初代ＣＤ４＋Ｔ細胞の調製
健常ドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、最初にFicoll-Hypaque（GE Healthcare）密度勾配遠心法によって単離した。次いで、精製したＰＢＭＣからＣＤ４  Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec）によって、ＣＤ４＋Ｔ細胞をネガティブ選択した。
【０２５０】
１．２  ホスホ−Ｌｃｋの免疫ブロット分析
２００万個（２×１０６）のジャーカットＴ細胞または初代ヒトＴ細胞をＲＰＭＩで２回洗浄した。５μｇ／ｍｌのｍＡｂ  ＵＢ−４２１または抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を含む予め加温したＲＰＭＩ１ｍｌ中で全ての細胞を刺激し、次いで、「架橋」試料については１０μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（Jackson ImmunoResearch）で架橋し、指示された時間間隔で３７℃でインキュベートした。１ｍｌの冷ＰＢＳを添加し、遠心分離して上清を除去することによって、刺激を停止した。細胞ペレットを直ちに凍結し、溶解するまで−８０℃で保存した。
【０２５１】
凍結細胞ペレットを、１０μｇ／ｍｌのアプロチニン、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１ｍＭのＰＭＳＦ、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのピロリン酸ナトリウムおよび１０ｍＭのフッ化ナトリウムを含む、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ７．４）および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００溶解緩衝液（１％（ｖ／ｖ））４０μＬに溶解した。溶解物を４℃、１４０００ｒｐｍで７分間遠心分離して破片を除去した。細胞抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。膜を抗ホスホＬｃｋ（Ｙ３９４）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ホスホＬｃｋ（Ｙ５０５）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）または抗Ｌｃｋ（Ａｂｃａｍ）でプローブし、引き続いて適切なセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体（Jackson ImmunoResearch）を添加した。Ｃｌａｒｉｔｙ（商標）化学発光試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）およびＢｉｏＳｐｅｃｔｒｕｍ  ５００イメージングシステム（ＵＶＰ）によってシグナルを検出した。免疫ブロット用の全ての一次抗体を１：１０００〜１：５０００希釈で使用した。Ｌｃｋ  Ｙ３９４およびＹ５０５リン酸化レベル（バンドの密度）を、VisionWorkLS 8.2 Imaging Systemソフトウェアを使用することによって決定し、各時点での総Ｌｃｋの密度で正規化した。
【０２５２】
１．３  ホスホ−Ｌｃｋのフローサイトメトリー
刺激の前に、単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を無血清ＡＩＭ−５培地中で一晩インキュベートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞を氷上に置き、５μｇ／ｍＬのビオチン化抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）またはＵＢ−４２１を細胞に添加した後、氷上でさらに１０分間インキュベートした。次いで、細胞を３７℃で指示された時間架橋の有無にかかわらず刺激した。３７℃で指示された時間刺激する前に、精製ストレプトアビジン（BioLegend）をビオチン化抗体に添加することによって架橋を達成した。次いで、細胞をPhosflow Fix Buffer（BD Biosciences）によって３７℃で１０分間直ちに固定し、次いで、Phosflow Perm/Wash Buffer（BD Biosciences）で透過処理した。細胞を、氷上でＰＥ抗Ｓｒｃ（ｐＹ４１８）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７抗Ｌｃｋ（ｐＹ５０５）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。全ての試料をＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅフローサイトメーター（BD Biosciences）で収集した。データ分析はＦｌｏｗＪｏソフトウェアＶ１０．０．８（Tree Star Inc., Ashland, OR）で行った。
【０２５３】
２  結果
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、約８０ｍＬの正常な健康なドナーの血液から得た。血液試料は限られており、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数はドナー間で異なっていた。よって、全ての試験条件を同じドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞で行うことができるわけではなかった。いくつかの場合、Ｌｃｋリン酸化に対するＵＢ−４２１の効果を、非架橋条件下でしか評価することができなかった。陽性コントロールは架橋条件下で試験した抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）であり、陰性コントロールは未処理（培地のみ）試料であった。
【０２５４】
２．１  Ｌｃｋのチロシンリン酸化は、ジャーカットＴ細胞上のＵＢ−４２１結合によって誘導される。
ジャーカットＴ細胞をＵＢ−４２１で刺激して、Ｌｃｋリン酸化および下流ＴＣＲシグナル伝達事象を誘導するその能力を評価した。Ｔ細胞の公知の刺激剤である抗ＣＤ３抗体による刺激を陽性コントロールとして使用した。フローサイトメトリーを用いた以前の実験は、ジャーカットＴ細胞の１００％が細胞表面上でＣＤ４受容体を発現することを実証した。
【０２５５】
予想通り、ホスホ−Ｙ３９４Ｌｃｋレベルは、架橋条件下、抗ＣＤ３刺激ジャーカットＴ細胞において増強され、最初の時点である５分でピークに達した（図２２Ａおよび図２２Ｂ）。
ＵＢ−４２１で刺激された細胞では、Ｌｃｋはジャーカット細胞において架橋条件下と非架橋条件下の両方でリン酸化され、ＬｃｋチロシンＹ３９４のリン酸化レベルは増強され、１５分でピークに達した（図２２Ｃおよび図２２Ｄ）。
【０２５６】
２．２  Ｌｃｋのチロシンリン酸化は、初代ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＵＢ−４２１結合によって誘導される。
ＣＤ４へのＵＢ−４２１の結合およびＴＣＲシグナル伝達の効果を初代ＣＤ４＋Ｔ細胞で試験した。
ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、ネガティブ選択により純度約９０〜９５％まで精製した。陽性コントロールとして、細胞を抗ＣＤ３抗体で刺激したところ、Ｌｃｋ  Ｙ３９４のリン酸化レベルは予想通り維持された（図２３Ａおよび図２３Ｂ）。
【０２５７】
驚くべきことに、Ｌｃｋ  Ｙ３９４とＹ５０５の両方のチロシンリン酸化が、架橋条件下と非架橋条件下の両方でＵＢ−４２１で刺激された細胞において増強された（図２４Ａおよび図２４Ｂ）。架橋なしのＵＢ−４２１で刺激した細胞におけるＬｃｋ  Ｙ３９４のリン酸化の程度は、同じドナー（ドナー１およびドナー２）の架橋条件下でＵＢ−４２１で刺激した細胞よりもわずかに低かった（図２４Ａ）。リン酸化Ｙ３９４−Ｌｃｋは、ＵＢ−４２１の架橋の有無にかかわらず、ドナー１については５分、ドナー２については３０分でピークに達した（図２４Ａ）。
【０２５８】
架橋なしのＵＢ−４２１の刺激能力をさらに評価するために、追加のドナー（ドナー４〜７）の初代ＣＤ４＋Ｔ細胞をウエスタンブロット分析によって試験した。活性化（Ｙ３９４のリン酸化）および阻害（Ｙ５０５のリン酸化）が、試験したほとんどのドナーで観察された（図２４ａ〜図２４Ｄ）。リン酸化の程度、ピークまでの時間および持続時間は、個々のドナー間で著しく異なるように思われる（図２４Ｃおよび図２４Ｄ）。架橋なしのＵＢ−４２１で処理したＣＤ４＋Ｔ細胞については、Ｙ３９４のピークリン酸化レベルがドナー間で１〜４倍に及び、ピークまでの時間が刺激後５〜３０分に及んだ（図２４Ｃおよび図２４Ｄ）。
【０２５９】
ＵＢ−４２１によって誘導されたＬｃｋリン酸化を、フローサイトメトリーを介した細胞内染色によってさらに評価して、Ｌｃｋ  Ｙ３９４およびＹ５０５のリン酸化を単一細胞ベースで測定した。陽性コントロールとして、細胞を架橋条件下、抗ＣＤ３抗体で刺激した。陽性コントロール試料では、Ｌｃｋリン酸化および脱リン酸化が急速に起こり、ＴＣＲシグナル伝達の強度を制御した（図２５Ａ、点線）。陰性コントロール試料（処理なし）では、Ｙ３９４とＹ５０５の両方のリン酸化レベルは経時的に変化しないままであった（図２５Ａ、実線）。
【０２６０】
２人の異なるドナー（ドナー８および９）の初代ＣＤ４＋Ｔ細胞をＵＢ−４２１で処理した。架橋条件下で、ＵＢ−４２１は、抗ＣＤ３で刺激した陽性コントロール細胞と同様に、Ｙ３９４とＹ５０５の両方のリン酸化を誘導することが分かった（図２５Ｂ、点線）。非架橋条件下では、ＵＢ−４２１はより低いＬｃｋリン酸化を誘導した（図２５Ｂ、実線）。ある場合には、活性化が速すぎるために、減少傾向のみが観察された。結果は、Ｙ３９４のピークリン酸化レベルがＹ５０５より早く発生することを実証した。図２５Ｂは、Ｙ３９４のピークリン酸化レベルが、Ｙ５０５リン酸化の１０分と比較して、３分付近で発生した。結果はまた、ＵＢ−４２１の架橋によって誘導されたＬｃｋのリン酸化が、抗ＣＤ３刺激よりも遅いが、抗ＣＤ３と比較して同様のレベルのリン酸化でプラトーに達したことを示している。
【０２６１】
３  考察
ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲシグナル伝達は、不必要で、制御されていない免疫応答を回避するために厳密に調節されている。ＴＣＲシグナル伝達の重要なキナーゼとして、Ｌｃｋ活性は時間的と空間的の両方で調節されている。この試験では、抗ＣＤ４抗体であるＵＢ−４２１が、ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化し、Ｙ３９４（活性化型）およびＹ５０５（阻害型）でＬｃｋのリン酸化を誘導することができることが実証されている。Ｌｃｋは、ＬｃｋのＹ３９４リン酸化を分析することによって、ＵＢ−４２１の架橋なしで、ドナーのＣＤ４＋Ｔ細胞のほとんどにおいて活性化されている；しかしながら、リン酸化の程度は、架橋を有するＵＢ−４２１処理の程度と比較して低い。フローサイトメトリー分析により、架橋ＵＢ−４２１では、活性化チロシンが最初にリン酸化され、３分でプラトーに達し、引き続いて阻害型チロシンＹ５０５リン酸化が起こり、約１０分でプラトーに達することが分かった。これは、Ｌｃｋ活性が最初にＹ３９４のリン酸化によって増強され、その後すぐにＹ５０５の阻害性リン酸化によって制御されることを示している。
【０２６２】
ＵＢ−４２１は、慢性のＨＩＶ感染症を処置するためにいくつかの臨床試験で評価されており、単独療法としてＨＩＶウイルス抑制に対する大きな有効性を示している。ＣＤ４に結合することにより、ＵＢ−４２１は、架橋下または架橋条件なしで、ＴＣＲシグナル伝達カスケードキナーゼ、Ｌｃｋのの活性化も誘導することができた。Ｌｃｋ  Ｙ３９４およびＹ５０５のリン酸化のレベル、ピークまでの時間および持続時間に対するＵＢ−４２１処理の効果は、ドナー間で異なる。本結果は、ＵＢ−４２１が免疫応答を調節する可能性を有し得ることを示唆している。ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を増強することによって、ＵＢ−４２１はまた、ＨＩＶ侵入の競合的阻害に加えて、固有の免疫応答を介してＨＩＶ感染症を制御し得る。ＵＢ−４２１によって誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞ＴＣＲシグナル伝達および免疫応答のこのおよびさらなる試験は、ＨＩＶ感染症の制御におけるＵＢ−４２１のさらなる機構の理解にさらに光を当てるかもしれない。
【０２６３】
４  結論
・本試験の結果は、ＣＤ４へのＵＢ−４２１の結合が、健常ドナーから単離された初代ＣＤ４＋Ｔ細胞において、活性化チロシンＹ３９４と阻害性チロシンＹ５０５の両方でＬｃｋのリン酸化を誘導または増強することを実証している。
・Ｌｃｋのリン酸化は、架橋条件下または非架橋条件下で、ＵＢ−４２１によって活性化される。
・ＵＢ−４２１による処理時のＬｃｋリン酸化の程度、ピークまでの時間および持続時間は個々のドナー間で異なる。
・ＵＢ−４２１は強力なＨＩＶ侵入阻害剤に加えて免疫調節剤としても作用することができる。
【０２６４】
【表１】
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【０２６５】
【表２】
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【０２６６】
【表３】
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【０２６７】
【表４】
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【０２６８】
【表５】
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【０２６９】
【表６】
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【０２７０】
【表７】
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【０２７１】
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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