(57)【要約】  本発明は、個体が前癌または癌を有するか否かを判定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、前記個体の尿試料中におけるメチル化マーカセットの１つ以上のメチル化マーカの有無を判定することと、前記個体が尿試料中における前記１つ以上のメチル化マーカの有無の検出に基づいて、個体が前癌または癌を有するか否かを判定することとを含み、前記１つ以上のメチル化マーカの存在は個体が前癌または癌を有することを示す方法を提供する。本発明は、尿試料中のメチル化マーカセットの１つ以上のメチル化マーカの有無に基づいて、前癌または癌を分類する方法をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体が前癌または癌を有するか否かを判定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、
前記個体の尿試料中におけるメチル化マーカセットの１つ以上のメチル化マーカの有無を判定することと、
前記尿試料中における前記１つ以上のメチル化マーカの有無の検出に基づいて、前記個体が前癌または癌を有するか否かを判定することとを含み、
前記１つ以上のメチル化マーカの存在は、前記個体が前癌または癌を有することを示し、前記メチル化マーカの不在は、前記個体が前癌または癌を有さないことを示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
癌を有する個体の前癌または癌の種類を判定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、
前記個体の尿試料中におけるメチル化マーカセットの１つ以上のメチル化マーカの有無を判定することと、
前記尿試料中における前記１つ以上のメチル化マーカの有無の検出に基づいて、前癌または癌の種類を判定することとを含み、
前記１つ以上のメチル化マーカの有無は、前記個体の１つ以上の種類の前癌または癌の指標であることを特徴とする方法。
【請求項３】
前記メチル化マーカセットは、表９に特定されたメチル化マーカからなる群から選択された少なくとも１つのメチル化マーカを含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
表９の、ＲＡＳＳＦ１Ａ，ＺＮＦ１５４，ＴＭＥＦＦ２，ＧＤＦ１５，ＣＤＫＮ２Ａ，ＳＨＯＸ２，ＳＯＸ１７，ＧＡＴＡ２，３ＯＳＴ２；ＧＹＧＢ；ＦＡＭ１９Ａ４；ＰＨＡＣＴＲ３およびＡＰＣのプロモータ領域における少なくとも１つのメチル化マーカの存在の検出は、前記個体が肺癌、好ましくは非小細胞肺癌を有することを示し、
表９の遺伝子、ＧＤＦ１５；ＴＭＥＦＦ２，ＶＩＭ，ＴＷＩＳＴ１，ＮＩＤ２，ＺＮＦ１５４およびＲＡＳＳＦ１Ａのうちの少なくとも１つにおけるプロモータ領域での少なくとも１つのメチル化マーカの存在の検出は、前記個体が、尿路上皮細胞癌、たとえば膀胱癌を有することを示し、
表９の少なくとも１つのメチル化マーカＧＳＴＰ１の存在の検出は、前記個体が前立腺癌を有することを示し、
表９の遺伝子、ＦＡＭ１９Ａ４，ＰＨＡＣＴＲ３，ＰＲＤＭ１４，ＣＡＤＭ１，ＭＡＬおよびｍｉＲ１２４−２のうちの少なくとも１つのプロモータ領域での少なくとも１つのメチル化マーカの存在の検出は、前記個体が子宮頸癌を有することを示し、
表９の遺伝子、ＣＹＧＢ，ＳＦＲＰ２ＡおよびＭＧＭＴのうちの少なくとも１つにおけるプロモータ領域での少なくとも１つのメチル化マーカの存在の検出は、前記個体が大腸癌を有することを示すことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
メチル化マーカの有無の検出は、前記尿試料中における核酸の増幅を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つのメチル化マーカは、表９に特定された遺伝子のプロモータ領域におけるＣｐＧ島であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記前癌は、日光角化症、バレット食道、委縮性胃炎、先天的角化異常症、鉄欠乏性嚥下困難症、扁平苔癬、口腔粘膜下線維症、日光弾力線維症、子宮頸部異形成、白斑症、大腸腺腫症および紅板症からなる群から選択され、ならびに／または
前記癌は、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌、子宮頸癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、たとえば乳管内上皮内癌、頭頸部癌、尿路上皮細胞癌、たとえば膀胱癌、血液系腫瘍、たとえば、限定されないが骨髄腫、白血病、リンパ腫および脊髄異形成症候群、消化管（ＧＩ管）および消化付属器の癌、たとえば限定されないが食道、胃、胆道系、膵臓、小腸、大腸、胆嚢癌、肝癌、直腸癌、肛門癌および直腸からなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前癌または癌の種類を判定することは、前記個体の前記尿試料中における、表９の少なくとも１つのメチル化マーカの不在を検出することを含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記尿試料は、無細胞尿試料であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
メチル化マーカセットにおける１つ以上のメチル化マーカの検出のための手段を含むキットであって、
前記セットは、表９に特定された前記メチル化マーカからなる群から選択された、少なくとも１つのメチル化マーカを含み、
前記セットは、尿から核酸を抽出するための核酸抽出緩衝液をさらに含むことを特徴とするキット。
【請求項１１】
メチル化マーカセットから１つ以上のメチル化マーカの核酸を増幅するための、少なくとも２つの核酸増幅プライマーを含むことを特徴とする核酸増幅装置。
【請求項１２】
前記メチル化マーカセットは、表９に特定された前記メチル化マーカからなる群から選択された少なくとも１つのメチル化マーカを含むことを特徴とする請求項１１に記載の核酸増幅装置。
【請求項１３】
表９の前記メチル化マーカセットの前記メチル化マーカを含む、核酸を増幅するための核酸増幅プライマーを含むことを特徴とする請求項１１または１２に記載の核酸増幅装置。
【請求項１４】
癌を有する個体における前癌または癌の種類を、当該個体の無細胞尿試料から判定するための、請求項１０に記載のキット、または請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の装置の使用。
【請求項１５】
個体の前癌または癌を、当該個体の無細胞尿試料から検出するための、請求項１０に記載のキット、または請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の装置の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿試料を分析する分野に関する。特に、本発明は、各個体の尿中の、特にメチル化核酸における癌性核酸の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、ほとんどの場合、顕微鏡下で細胞または組織試料を探す専門家によって診断される。ある場合、細胞のタンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡに実施される試験は、癌が存在する場合、医者に伝えるのに役立つ。これらの試験は、最も良い治療の選択肢を選択する際に重要である。
【０００３】
そのような試験は、典型的には、個人が症状を訴えるときに実施される。そのような場合、もし癌であれば、癌が、簡単な手術が治療とはならない程度まで既に進行したか、または転移のおそれが高いことは、化学療法および／または放射線療法による侵襲性治療を必要とし、一般的に予後不良をもたらす。
【０００４】
一方、症状が癌を原因としないとき、患者は、生体組織検査の結果を待つ相当な時間にわたって不安なままである。
【０００５】
したがって、個体が癌を有するか否かを判定するための、もし癌であればどのような種類の癌であるのかを判定するための、簡便、迅速かつ非侵襲性の方法が必要である。
【０００６】
本発明は、尿試料中において、癌および前癌を検出し、分類するための、手段および方法を提供する。手段および方法は、尿中の核酸、特にＤＮＡを検出し、検出された核酸のメチル化状態を分析することによって、癌または前癌を検出し分類する。
【０００７】
ある種類の癌および前癌は、ある遺伝子のメチル化に関連することが当該技術分野で知られている。ＤＮＡのメチル化は、自然作用であり、典型的には、細胞が体内の特定の種類の細胞に分化するときに生じる。ＤＮＡメチル化は、ＤＮＡにメチル基を付加する作用である。メチル化は、あるＤＮＡの挙動および機能を変えることが示された。遺伝子プロモータに位置するとき、ＤＮＡメチル化は、典型的には遺伝子転写を抑制するように働く。ＤＮＡメチル化は、通常の発生に必須であり、多くの重要な作用、たとえば、ゲノムインプリンティング、Ｘ染色体不活性化、反復配列の抑制および加齢に関連する。疾患において、ＤＮＡメチル化は、癌に関連付けられた。
【０００８】
真核生物において、メチル化は、ＤＮＡの４つの核酸の１つに限定される。シトシンＤＮＡメチル化の生じる確率は、種の間で異なる。ＤＮＡメチル化は、典型的にはＣｐＧジヌクレオチドにおいて生じる。メチル化の他の形態は、主に胚性幹細胞または神経発生において検出された。
【０００９】
哺乳類において、全ＣｐＧの６０％〜９０％はメチル化される。メチル化されたＣ残基は、時間が過ぎるにつれ自発的に脱アミノ化され、Ｔ残基を形成し、このことは、ヒトゲノムにおけるＣｐＧジヌクレオチドの比較的低い発現の理由であると考えられる。
【００１０】
脱メチル化されたＣｐＧは、多くの場合、ＣｐＧ島と称されるクラスタに集まり、ＣｐＧ島は多くの遺伝子の５’調節領域内に存在する。癌および前癌において、遺伝子プロモータＣｐＧ島は、異常に高メチル化され、細胞分裂に続いて娘細胞によって受け継がれる転写サイレンシングをもたらす。ＤＮＡメチル化の変化は、癌発生の重要な要素として認識されている。低メチル化は、一般的に、より早期に生じ、染色体不安定性、およびインプリンティングの消失に関連し、一方、高メチル化は、プロモータに関連する。
【００１１】
糸球体濾過障壁は、低分子量（＜５５００Ｄａ）の物質と、小さい有効分子半径（たとえば、水、尿素およびグルコース）とを生じ、血漿中と同じ濃度で濾液に現れる。より大きな巨大分子は、微量の血漿アルブミン（６９ｋＤａ）のみが糸球体濾液に普通に存在するように、経路から次第に取り除かれる。他の要因、たとえば半径および荷電も、濾過における物質の様子に影響を与える。測定は、糸球体濾過がアニオンの通過を制限するが、カチオンの通過を促進することを示唆する。この結論は、より長く、および／またはさらに負に荷電した糖鎖（デキストラン）がより低い有効性で通過するとの観察を部分的に根拠とした。
【００１２】
尿細管の機能は、糸球体で濾過された大部分の水分および溶質を回収することである。水分が回収されなければ、腎臓は、３０分足らずの間に全血漿を排出するであろう。尿細管において、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、濾過された栄養素（たとえば、グルコースおよびアミノ酸）、２価イオン（たとえば、Ｃａ２＋、ＨＰＯ４２−、およびＳＯ４２−）、ならびに水は、再吸収される。最後に、近位尿細管は、ＮＨ４＋および様々な内在性および外来性溶質を管腔に分泌し、老廃物の濃縮物を作製し、最終的な尿を構成する（Boulpaepら，Medical Physiology, 2012, Philadelphia: Saunders）。
【００１３】
様々な尿成分のうち、いくらかのＤＮＡも存在することが見出された。尿中のＤＮＡの大部分は、細胞中に見出される。尿に特異的なＤＮＡ単離キットの製造業者（Zymoresearch社）によれば、回収可能なＤＮＡの総量は、尿中において約５〜２５μｇ／Ｌである。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、個々の検出物が前癌または癌を有するか否かを判定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、
前記個体の尿試料中におけるメチル化マーカセットの１つ以上のメチル化マーカの有無を判定することと、
尿試料中における前記１つ以上のメチル化マーカの存在の検出に基づいて、個体が前癌または癌を有するか否かを判定することとを含み、
前記１つ以上のメチル化マーカの有無は、個体が前癌または癌を有することを示し、メチル化マーカの不在は、個体が前癌または癌を有さないことを示す方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、癌を有する個体における、前癌または癌の種類を判定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、
前記個体の尿試料中における、メチル化マーカセットの１つ以上のメチル化マーカの有無を判定することと、
前記尿試料中における１つ以上のメチル化マーカの有無の検出に基づいて、前癌または癌の種類を判定することとを含み、
前記１つ以上のメチル化マーカの有無は、前記個体の前癌または癌の１つ以上の種類の指標である方法を提供する。
【００１６】
本発明は、メチル化マーカセットにおける１つ以上のメチル化マーカの検出のための手段を含むキットであって、当該セットは表９に特定されたメチル化マーカからなる群から選択された少なくとも１つのメチル化マーカを含み、当該セットは尿から核酸を抽出するための核酸抽出緩衝液をさらに含むキットをさらに提供する。
【００１７】
また、メチル化マーカセットからの１つ以上のメチル化マーカの核酸を増幅するための少なくとも２つの核酸増幅プライマーを含む核酸増幅装置を提供する。
【００１８】
本発明は、個体の尿試料から、癌を有する個体の前癌または癌の種類を判定するための、本発明に係るキット、または本発明に係る装置の使用をさらに提供する。
【００１９】
本発明は、個体の尿試料から個体における前癌または癌を検出するための、本発明に係るキット、または本発明に係る装置の使用をさらに提供する。
【００２０】
本発明は、個体が前癌または癌を個体中に有するか否かを判定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を提供する。本発明は、前癌または癌を有する個体における、前癌または癌の種類を判定するｉｎ  ｖｉｔｒｏ法をさらに提供する。本方法は、前記個体の尿試料中においてメチル化マーカセットの１つ以上のメチル化マーカの有無を判定することを含む。前癌および癌の種類は、個体の尿中における１つ以上の特定のメチル化マーカの有無の検出から判定することができる。あるメチル化マーカの存在および／または不在は、個体が有する可能性が高い前癌または癌の種類の指標である。１つ以上のメチル化マーカの有無は、個体が前癌または癌を有することを示し、メチル化マーカの不在は、個体が前癌または癌を有しないことを示す。
【００２１】
様々な前癌および癌は、本発明を用いて検出することができる。一方、いくつかのメチル化マーカは、前癌または癌の有無に関わらず常に検出され、いくつかのメチル化マーカは、個体が前癌または癌を有するときのみ、尿中に検出される。いくつかの癌メチル化マーカは、様々な種類の前癌または癌を検出するので、個体が前癌または癌自体を有するか否かを判定するために、および（他のメチル化マーカと組み合わされたとき）癌を分類するために適している。
【００２２】
前癌状態または前悪性状態は、潜在的前癌状態または潜在的前悪性状態と称されることもあり、癌のリスクの増加に関連した、細胞の異常な形態の状態である。未処置のままであれば、これらの状態は、癌をもたらすであろう。そのような状態は、通常、形成異常または良性新生物である。「前癌」との用語は、急速に進行する浸潤段階に発展しない非侵襲性癌である、上皮内癌を表すために使用される。全ての上皮内癌が侵襲性疾患に進行するわけではない。
【００２３】
前癌（前悪性とも称される）病変は、顕微鏡試験下で異常に見え、明らかに正常な対応物よりも癌が生じやすい形態学的に異常な組織である。前癌の例は、日光角化症、バレット食道、委縮性胃炎、先天的角化異常症、鉄欠乏性嚥下困難症、扁平苔癬、口腔粘膜下線維症、日光弾力線維症、子宮頸部異形成、白斑症、大腸腺腫症および紅板症である。好ましい実施形態において、前癌は、大腸腺腫症である。検出および／または分類可能な癌は、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌、子宮頸癌、前立腺癌、卵巣癌、乳癌、たとえば乳管内上皮内癌、頭頸部癌、尿路上皮細胞癌、たとえば膀胱癌、血液系腫瘍、たとえば、限定されないが骨髄腫、白血病、リンパ腫および脊髄異形成症候群、消化管（ＧＩ管）および消化付属器の癌、たとえば限定されないが食道、胃、胆道系、膵臓、小腸、大腸、胆嚢癌、肝癌、直腸癌、肛門癌および直腸を含み、好ましくはからなる。好ましい実施形態において、検出される癌は、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌、乳癌、頭頸部癌、血液系腫瘍、たとえば、限定されないが骨髄腫、白血病、リンパ腫および脊髄異形成症候群、消化管または消化付属器の癌、たとえば、限定されないが食道、胃、胆道系、膵臓、小腸、大腸、直腸、胆嚢、肝臓および肛門の癌を含む。本発明における癌は、原発癌および転移癌を示す。
【００２４】
前癌または癌は、腎臓を通過し、尿に達した核酸の、前癌または癌であることが好ましい。注意深く集められた尿試料においてさえ、尿路上皮性細胞腫瘍、たとえば、膀胱癌またはその前癌性前駆段階は、核酸を、腎臓を通過する必要なく、尿に直接落とすことができる。前癌病変または癌は、前癌状態が癌に進行した個体の尿に関連付けられた少なくともいくつかのメチル化マーカを検出することによって検出することができる。好ましい実施形態において、癌は、尿路上皮性細胞腫瘍、子宮頸癌、もしくは前立腺癌、またはその前癌段階ではない。好ましい実施形態において、癌は、膀胱癌またはその前癌段階ではない。
【００２５】
前癌または癌の分類は、癌の創生組織を判定することを含む。たとえば、肺に転移した膀胱癌は、典型的には膀胱癌として分類される。分類は、癌が転移したか否かを判定することを含んでもよく、このことは任意である。また、分類は、個体が、数種類の前癌または癌のうち１つ以上を有するという判定をすることもできる。
【００２６】
個体は、好ましくは哺乳類であり、好ましくはヒトである。
【００２７】
尿は、成分の濃度が、食事と消費される脂質の量とに応じて変化する溶液である。尿の様々な周知の成分のうちには、核酸も存在する。尿中のＤＮＡの大部分は、細胞に付随して見出される。商業的供給源は、尿から回収可能なＤＮＡの量が１回平均約５〜１００μｇ／Ｌであると述べている。本発明において、試料は、無細胞尿試料である。ＤＮＡは、ＰＣＲによって増幅するために十分に大きい断片（平均１５０ｂｐ）とともに重合状態で腎臓障壁を超えることができる。尿中の無細胞ＤＮＡは、平均約２〜１００μｇ／Ｌである。全ての尿試料が分析のために十分なＤＮＡを含むわけではない。そのような試料は、典型的にはコントロールを実施することによって特定される。好ましいコントロールは、標準的ＤＮＡ、たとえばアクチンの存在を判定するＰＣＲである。ＤＮＡが不十分である場合、多くの場合、さらなる個体試料を集めれば十分である。また、ＤＮＡは、大量の尿から濃縮することができる。たとえば凍結乾燥によって尿を濃縮することも可能である。
【００２８】
男性遺伝子断片は、輸血後の女性、または男性を妊娠している女性の尿中に示された。また、げっ歯類において、注入されたヒトＤＮＡ配列は、尿中で増幅することもできた。他の調査では、１ｍＬの試料あたり４７〜６５ｐｇ／μＬ（４７〜６５μｇ／μＬに相当する）の（無細胞）ＤＮＡを集めることができた。さらに、変異に関連した結腸直腸腫瘍は、尿に由来する遊離ＤＮＡ中に示された（Suら 2008; Ann N Y Acad Sci. 2008 Aug; 1137: 197-206）。尿の長期保存は、ＤＮＡの質に影響を与え得る。したがって、典型的には、新鮮な尿試料が本発明において使用され、典型的には、試料は採取された日のうちに使用されるが、尿試料の適切な処置によれば、より長い時間待つことも可能である（たとえばHilhorstら 2013; BMC Nephrol, 2013. 14: p. 238を参照）。他のＤＮＡ保存手段および方法は、たとえばZymoresearch社によって市販されており（urine conditioning buffer）、何日もＤＮＡを室温で維持する。
【００２９】
ＣｐＧジヌクレオチドにおいて異常にメチル化されたシトシンは、癌において広く見られる現象である（Jones, PA および Laird, PW, 「Cancer epigenetics comes of age,」 Nat. Genet. 21: 163-167 (1999)）。ＣｐＧ島の高メチル化の結果、プロモータにおけるクロマチン構造が変化し、転写装置との通常の相互作用を妨げる（Baylin, SBら 「Alterations in DNA methylation: A fundamental aspect of neoplasia,」 Advances in cancer research (eds. G.F. Nande Woude および G. Klein), vol. 72: 141-196 (1998), Academic Press, San Diego, CA）。これが増殖抑制に関連する遺伝子に生じると、得られる転写サイレンシングは腫瘍増殖を促進するであろう。また、プロモータＣｐＧ島の高メチル化は、古典的腫瘍抑制遺伝子、ならびに細胞周期調節およびＤＮＡミスマッチ修復について重要な遺伝子の転写不活性化についての通常の機序であることが示された。シトシンのメチル化は、したがって、遺伝子発現の制御において重要な役割を果たしており、メチル化パターンまたは状態の変化は、疾患をもたらす可能性が高い。細胞の、通常状態、前癌状態および癌状態の間におけるＣｐＧジヌクレオチドにおけるメチル化の相違は、本明細書においてメチル化マーカと称される。尿中のそのようなメチル化マーカの検出は、個体が前癌または癌を有する指標にすることができる。ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化が増加した染色体ＤＮＡも、高メチル化ＤＮＡと称されてもよい。一般的に高メチル化は、細胞の癌または前癌状態に関連付けられる。メチル化マーカは、様々な方法で検出することができる。検出は、変質した細胞または組織と通常の細胞または組織との間のＣｐＧ部位内の異なるメチル化レベルを判定することができるメチル化アッセイを用いて実施可能である。この目的のために有用なメチル化特異的アッセイは、ハイスループットまたはマイクロアレイを用いる、たとえば、メチル化特異的ＰＣＲ、バイサルファイトゲノムシークエンス法、メチル化特異的プライマー伸長法、および当該分野で公知の他の方法を含む。メチル化マーカの検出のために適切な方法は、Shanmuganathanら (2013) Journal of Molecular Diagnostics Vol 15: pp 17-26に記載されている。この参考文献とその中で言及された論文は、メチル化マーカの検出のための方法を記述する限り、参照によって本明細書に組み込まれる。次世代バイサルファイトアンプリコンシークエンシングに適した方法は、Margolinら (2016) Vol 18: pp 283-298に記載されており、参照によって本明細書に組み込まれる。ＷＯ２００９１０４９６７に開示された好適な装置も、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３０】
本発明のメチル化マーカは、典型的には、前癌または癌を有さない個体の尿中には検出されない。本発明のメチル化マーカは、個体が前癌または癌を有するときにのみ検出される。様々な前癌または癌は、尿中の様々なメチル化マーカに関連付けられてもよい。そのような相違は、前癌または癌の分類のために本発明において利用される。いくつかの種類の癌または前癌は、前癌または癌の個体の尿中における同じメチル化マーカの存在に関連付けられてもよい。そのようなマーカの検出は、検出されたマーカが関連付けられた１つ以上の前癌または癌が個体に存在する指標である。そのようなメチル化マーカは、時には共通マーカとも称される。共通マーカは、個体が癌または前癌自体を有するか否かを検出するために特に適している。
【００３１】
個体の尿中における１つのメチル化マーカの検出は、個体中の癌または前癌の存在の指標である。尿中の１つ以上のメチル化マーカの試験は、典型的には、個体が前癌または癌を有するか否かのより正確な判定を可能にする。尿中における１つ以上のメチル化マーカの試験は、典型的には、個体が有する前癌または癌のより正確な分類を可能にする。多くの異なる種類の癌または前癌に共通するマーカは、典型的には、個体が癌を有するか否かを判定するための本発明の方法において使用される。多くの前癌または癌によって共有されないマーカと、好ましくは腫瘍特異的であるマーカとは、典型的には、個体の前癌または癌を分類するために使用される。
【００３２】
本発明の方法は、同時に、尿が試験された個体が癌または前癌を有することを検出し、癌または前癌を分類してもよい。
【００３３】
本明細書において、「ポリヌクレオチドプライマー／プローブ」との用語は、１つ以上の種類の化学結合、通常、水素結合形成による相補的塩基対形成によって、標的核酸の相補配列に結合することができる核酸を表す。本明細書において、プローブは、天然塩基（すなわち、Ａ，Ｇ，Ｃ，もしくはＴ）、または修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）、または糖部分を含んでもよく、加えて、プライマー／プローブの塩基は、ハイブリッド形成を妨げない限り、リン酸ジエステル結合の他の結合によって結合されてもよい。したがって、たとえば、プライマー／プローブは、構成塩基がリン酸ジエステル結合ではなくペプチド結合によって結合されるペプチド核酸であってもよい。プローブは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プライマー／プローブとの完全な相補性を欠いている標的配列に結合してもよいことは、当業者に理解されるであろう。プライマー／プローブは、好ましくは、同位体、発色団、発光団、色素原によって直接標識されるか、またはストレプトアビジン複合体に後に結合するビオチンなどによって間接的に標識される。プライマー／プローブの有無についてのアッセイによって、当業者は、配列または部分配列の有無を検出することができる。
【００３４】
本明細書に使用されるように、「メチル化」との用語は、遺伝子制御領域のＣｐＧジヌクレオチド内のヌクレオチド塩基シトシンのＣ５−位置におけるメチル基の共有結合を表す。「高メチル化」との用語は、試験試料と同じ種類の、通常の個体または細胞の試料のＤＮＡ配列内における対応するＣｐＧジヌクレオチドにおいて見出される５−ｍＣｙｔの量に比べて、試験試料のＤＮＡ配列内における１または複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける５−メチル−シトシン（「５−ｍＣｙｔ」）の存在の増加に対応するメチル化状態を表す。「メチル化状態（methylation state）」または「メチル化状態（methylation status）」または「メチル化レベル」または「メチル化度」との用語は、ＤＮＡ配列内の１または複数のＣｐＧジヌクレオチドにおける５−ｍＣｙｔの有無を表す。本明細書において使用されるように、「メチル化状態」または「メチル化状態」または「メチル化レベル」または「メチル化度」との用語は、入れ替えて使用される。
【００３５】
本明細書において使用されるように、「ＣｐＧ島」との用語は、ＣｐＧジヌクレオチドに富んだ短いＤＮＡ配列であり、２００ｂｐ長よりも長く、０．５よりも多いＧＣ含有量を有し、０．６よりも多い、ＧＣ含有量に基づく期待量とを有する。Gardiner-Garden およびFrommerの「CpG islands in vertebrate genomes,」 J MolBiol 196(2): 261-282 (1987)」を参照のこと。ＣｐＧ島は、全てのハウスキーピング遺伝子および多くの組織特異的遺伝子の５’末端、ならびにいくつかの組織特異的遺伝子の３’末端に関連付けられた。少数の遺伝子は、ＣｐＧ枯渇したＤＮＡの数千塩基対で離れた５’および３’ＣｐＧ島の両方を含む。５’ＣｐＧ島は、５’隣接ＤＮＡ、エキソン、およびイントロンを介して延びるが、大部分の３’ＣｐＧ島は、エキソンに関連して現れる。ＣｐＧ島は、いくらかの明らかな例外を除いて、一般的に異なる種における等価遺伝子の転写ユニットに対して同じ位置に見出される。ＣｐＧ島は、哺乳類ゲノムの１％〜２％を構成すると推定されており、全てのハウスキーピング遺伝子のプロモータにおいて見出され、４０％の組織特異的発現を示す遺伝子においてあまり保存されていない位置に見出される。ＣｐＧ島におけるＣｐＧジヌクレオチドの頑強さは、発現状態に関わりなく、ＣｐＧ島のメチル化の一般的な欠如に主に起因すると考えられる。「ＣｐＧ部位」との用語は、ＣｐＧ島内のＣｐＧジヌクレオチドを表す。ＣｐＧ島は、典型的には、しかし常にではなく、約０．２〜約１ｋｂの長さである。
【００３６】
本明細書に使用されるように、「検出すること」は、尿試料中におけるメチル化マーカを含む標的核酸分子の有無の特定を表す。本明細書に使用されるように、「検出すること」は、（標的にハイブリダイズすることが可能な）プローブ核酸分子を直接または間接に標識することによって生じるシグナルが測定または観察される処理の間に標的核酸分子の存在を検出することも表わす。したがって、プローブ核酸の検出は、存在の直接の指標、したがって、標的核酸、たとえばマーカ遺伝子をコードする配列の検出である。たとえば、検出可能な標識が蛍光標識であれば、標的核酸は、好適な波長によって励起されたときプローブ核酸における蛍光標識によって発せられた光を観察もしくは測定することによって「検出される」か、または検出可能な標識が蛍光／消光の組み合わせであれば、標的核酸は、プローブ核酸に存在する蛍光／消光の組み合わせの結合もしくは解離によって発せられた光を観察もしくは測定することによって「検出される」。プローブ核酸の検出は、標的核酸の検出を示す。検出可能な標識が放射性標識であれば、標的核酸は、放射性標識されたプローブを用いるハイブリダイゼーション後、たとえばオートラジオグラフィによって「検出」される。蛍光、放射性、および他の化学標識を「検出するための」方法および技術は、Ausubelら（1995, Short Protocols in Molecular Biology, 3r Ed. John Wiley and Sons, Inc.）に見出すことができる。また、核酸は、「間接的に検出」されてもよく、ある成分、たとえば酵素活性が標的にハイブリダイズするプローブ核酸に付加され、適した基質もしくは特定抗原、もしくは抗体もしくは他の特定の指示剤の添加によって検出可能である他のマーカの存在下において検出を可能にしてもよい。また、標的核酸分子は、患者の臨床試料から作製された核酸試料を、標的核酸配列の一部にハイブリダイズするように特別に設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することによって検出することができる。定量的増幅法、たとえば、限定されないがＴａｑＭａｎも、本発明に係る標的核酸を「検出」するために使用されてもよい。核酸分子は、（たとえば定量的ＰＣＲによって）測定された核酸のレベル、または検出可能な標識によってもたらされる検出可能なシグナルのレベルが、少しでもバックグラウンドレベルを超えている場合、本明細書において使用されるように「検出」される。
【００３７】
本明細書において使用されるように、「検出」は、個体の前癌または癌状態の指標である標的核酸分子の特定のＣｐＧ部位におけるメチル化状態もしくは状況、およびまたは前癌もしくは癌の種類を検出することをさらに表す。標的核酸分子の特異的ＣｐＧ部位におけるメチル化状態（state or status）は、診断、疾患観察、および治療アプローチについて有益な情報を提供することができる。当該分野において公知の様々な方法が特異的ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を判定するために使用されてもよい。そのような方法は、限定されないが、メチル化されたＣｐＧ島の増幅、Toyotaら「Identification of differentially methylated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification,」 Cancer Res., 59: 2307-2312 (1999)，ＷＯ００／２６４０１Ａ１； differential methylation hybridization，Huangら「Methylation profiling of CpG islands in human breast cancer cells,」 Hum. Mol. Genet, 8: 459-470 (1999); methylation-specific PCR (MSP)，Hermanら「Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands,」PNAS USA 93: 9821-9826 (1992)，米国特許第５，７８６，１４６号； methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SnuPE)，米国特許６，２５１，５９４号； combined bisulfite restriction analysis (COBRA)，XiongおよびLaird，「COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay,」Nucleic Acids Research, 25(12): 2532-2534 (1997 を参照のこと； ならびにメチル化特異的プライマー伸長（ＭＳＰＥ）などを含む。
【００３８】
メチル化マーカは、マーカＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されたときに検出される（存在する）。メチル化マーカは、マーカを含むマーカＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないとき、検出されない（存在しない）。
【００３９】
本発明の方法は、尿中におけるメチル化マーカセットの１つ以上のメチル化マーカの有無を判定することを含む。メチル化マーカは、マーカＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されたとき検出される（存在する）。メチル化マーカは、マーカを含むマーカＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないとき検出されない（存在しない）。好ましい実施形態において、メチル化マーカセットのうち２以上のメチル化マーカの有無が判定される。好ましい実施形態において、メチル化マーカセットのうち３つ以上、好ましくは４つ以上のメチル化マーカの有無が検出される。メチル化マーカセットは、好ましくは、表９において特定されたメチル化マーカからなる群から選択された少なくとも１つのメチル化マーカを含む。メチル化マーカセットは、好ましくは表９のメチル化マーカセットを含み、さらに好ましくは表９のメチル化マーカセットからなる。１つのメチル化マーカの存在が癌または前癌の１つ以上の種類に関連付けられる場合、１つ以上のメチル化マーカの有無を判定することが有益である。そのような場合、より多くのメチル化マーカが好ましい。そのような場合、好ましくは、癌を識別するために必要に応じて多くのメチル化マーカが判定される。
【００４０】
表９の遺伝子、ＲＡＳＳＦ１Ａ，ＺＮＦ１５４，ＴＭＥＦＦ２，ＧＤＦ１５，ＣＤＫＮ２Ａ，ＳＨＯＸ２，ＳＯＸ１７，ＧＡＴＡ２，３ＯＳＴ２，ＣＹＧＢ，ＦＡＭ１９Ａ４，ＰＨＡＣＴＲ３およびＡＰＣのうちの少なくとも１つのプロモータ領域での少なくとも１つのメチル化マーカの存在の検出は、個体が、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌を有することを示す。好ましい実施形態において、表９の遺伝子、ＲＡＳＳＦ１Ａ，ＺＮＦ１５４，ＴＭＥＦＦ２，ＣＤＫＮ２Ａ，ＳＨＯＸ２，ＳＯＸ１７，ＧＡＴＡ２，３ＯＳＴ２，ＣＹＧＢ，ＦＡＭ１９Ａ４，ＰＨＡＣＴＲ３およびＡＰＣのうちの少なくとも２つにおけるプロモータ領域で少なくとも１つのメチル化マーカが検出されたことは、個体が、肺癌、好ましくは非小胞肺癌を有することを示す。好ましい実施形態において、表９の遺伝子、ＲＡＳＳＦ１Ａ，ＺＮＦ１５４，ＴＭＥＦＦ２，ＣＤＫＮ２Ａ，ＳＨＯＸ２，ＳＯＸ１７，ＧＡＴＡ２，３ＯＳＴ２，ＣＹＧＢ，ＦＡＭ１９Ａ４，ＰＨＡＣＴＲ３およびＡＰＣのうちの少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つにおけるプロモータ領域でメチル化マーカが検出されたことは、個体が、肺癌、好ましくは非小細胞肺癌を有することを示す。個体が肺癌を有するか否かを判定する場合、ＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化マーカの有無が判定されることが好ましい。好ましい実施形態において、ＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子と、ＧＡＴＡ２，３ＯＳＴ２，ＧＤＦ１５，ＴＭＥＦＦ２遺伝子の少なくとも１つとのプロモータ領域におけるメチル化マーカが判定される。好ましい実施形態において、ＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子と、ＧＡＴＡ２，３ＯＳＴ２，ＧＤＦ１５，ＴＭＥＦＦ２の、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、およびより好ましくは４つとのプロモータ領域におけるメチル化マーカの有無が判定される。個体が肺癌を有するか否かを判定する他の実施形態において、ＣＹＧＢ，ＦＡＭ１９Ａ４またはＰＨＡＣＴＲ３遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化マーカの有無が判定されることが好ましい。個体が肺癌を有するか否かを判定する他の実施形態において、ＣＹＧＢ遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化マーカの有無が判定されることが好ましい。個体が肺癌を有するか否かを判定する他の実施形態において、ＣＹＧＢ遺伝子と、ＦＡＭ１９Ａ４またはＰＨＡＣＴＲ３遺伝子の少なくとも１つとのプロモータ領域におけるメチル化マーカの有無が判定されることが好ましい。好ましい実施形態において、ＣＹＧＢ遺伝子と、ＧＡＴＡ２，３ＯＳＴ２，ＧＤＦ１５，ＴＭＥＦＦ２遺伝子の少なくとも１つとのプロモータ領域におけるメチル化マーカが判定される。好ましい実施形態において、ＣＹＧＢ遺伝子と、ＧＡＴＡ２，３ＯＳＴ２，ＧＤＦ１５，ＴＭＥＦＦ２，ＦＡＭ１９Ａ４またはＰＨＡＣＴＲ３の少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは４つとのプロモータ領域におけるメチル化マーカの有無が判定される。メチル化マーカのパネルの拡張は、方法の精度を向上させる。
【００４１】
表９の遺伝子、ＧＤＦ１５，ＴＭＥＦＦ２，ＶＩＭ，ＴＷＩＳＴ１，ＮＩＤ２，ＺＮＦ１５４およびＲＡＳＳＦ１Ａのうちの少なくとも１つにおけるプロモータ領域での少なくとも１つのメチル化マーカの存在の検出は、個体が尿路上皮細胞腫瘍、たとえば膀胱癌を有することを示す。好ましい実施形態において、個体が尿路上皮細胞腫瘍、たとえば膀胱癌を有することを示すために、表９の遺伝子、ＧＤＦ１５，ＴＭＥＦＦ２，ＶＩＭ，ＴＷＩＳＴ１，ＮＩＤ２，ＺＮＦ１５４およびＲＡＳＳＦ１Ａのうちの少なくとも２つにおけるプロモータ領域で少なくとも１つのメチル化マーカが検出される。好ましい実施形態において、個体が尿路上皮細胞腫瘍、たとえば膀胱癌を有することを示すために、表９の遺伝子、ＧＤＦ１５，ＴＭＥＦＦ２，ＶＩＭ，ＴＷＩＳＴ１，ＮＩＤ２，ＺＮＦ１５４およびＲＡＳＳＦ１Ａのうちの、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つにおけるプロモータ領域でメチル化マーカが検出される。個体が尿路上皮細胞腫瘍、たとえば膵臓癌を有するか否かを判定する場合、ＧＤＦ１５遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化マーカの有無が判定されることが好ましい。好ましい実施形態において、ＧＤＦ１５遺伝子と、ＴＭＥＦＦ２，ＶＩＭおよびＲＡＳＳＦ１Ａ遺伝子の、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは３つとのプロモータ領域におけるメチル化マーカが判定される。
【００４２】
表９の遺伝子、ＣＹＧＢ，ＳＦＲＰ２ＡおよびＭＧＭＴのうちの少なくとも１つにおけるプロモータ領域での少なくとも１つのメチル化マーカの存在の検出は、個体が大腸癌を有することを示す。好ましい実施形態において、個体が大腸癌を有することを示すために、表９の遺伝子、ＣＹＧＢ，ＳＦＲＰ２ＡおよびＭＧＭＴのうちの少なくとも２つにおけるプロモータ領域で少なくとも１つのメチル化マーカが検出される。好ましい実施形態において、個体が大腸癌を有することを示すために、表９の遺伝子、ＣＹＧＢ，ＳＦＲＰ２ＡおよびＭＧＭＴのうちの少なくとも３つにおけるプロモータ領域でメチル化マーカが検出される。個体が大腸癌を有するか否かを判定する場合、ＣＹＧＢ遺伝子のプロモータ領域におけるメチル化マーカの有無が判定されることが好ましい。好ましい実施形態において、個体が大腸癌を有することを示すために、表９の遺伝子、ＣＹＧＢおよびＭＧＭＴのうちの少なくとも２つにおけるプロモータ領域でメチル化マーカが検出される。
【００４３】
メチル化マーカのパネルの拡張は、本方法の精度を向上させる。
【００４４】
表９の遺伝子、ＦＡＭ１９Ａ４，ＰＨＡＣＴＲ３，ＰＲＤＭ１４，ＣＡＤ  Ｍ１，ＭＡＬおよびｍｉＲ１２４−２のうちの少なくとも１つにおけるプロモータ領域での少なくとも１つのメチル化マーカの存在の検出は、個体が子宮頸癌を有することを示す。好ましい実施形態において、個体が子宮頸癌を有することを示すために、表９の遺伝子、ＦＡＭ１９Ａ４，ＰＨＡＣＴＲ３，ＰＲＤＭ１４，ＣＡＤ  Ｍ１，ＭＡＬおよびｍｉＲ１２４−２のうちの少なくとも２つにおけるプロモータ領域で少なくとも１つのメチル化マーカが検出される。好ましい実施形態において、個体が子宮頸癌を有することを示すために、表９の遺伝子、ＦＡＭ１９Ａ４，ＰＨＡＣＴＲ３，ＰＲＤＭ１４，ＣＡＤ  Ｍ１，ＭＡＬおよびｍｉＲ１２４−２遺伝子のうちの、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、好ましくは少なくとも５つ、より好ましくは少なくとも６つにおけるプロモータ領域でメチル化マーカが検出される。個体が子宮頸癌を有するか否かを判定する場合、ＦＡＭ１９Ａ４遺伝子，ＰＲＤＭ１４遺伝子、または好ましくはそれらの組み合わせのプロモータ領域におけるメチル化マーカの有無が判定されることが好ましい。ＦＡＭ１９Ａ４遺伝子、ＰＲＤＭ１４遺伝子、または好ましくはそれらの組み合わせのプロモータ領域におけるメチル化マーカの有無が、ＭＡＬ，ｍｉＲ１２４−２，ＰＨＡＣＴＲ３およびＣＡＤＭ１遺伝子の、１つ、２つ、３つ、または好ましくは４つのプロモータにおけるメチル化マーカの有無とともに判定されることが好ましい。メチル化マーカのパネルの拡大は、本方法の精度を向上させる。
【００４５】
表９の遺伝子ＧＳＴＰ１のプロモータ領域における少なくとも１つのメチル化マーカの存在の検出は、個体が前立腺癌を有することを示す。
【００４６】
いくつかのマーカは、１つ以上の腫瘍において検出される。そのような場合、マーカは、個体が癌または前癌を有することを示すために特に適している。（前）癌の種類は、他の診断手段によって、および／またはより多くのメチル化マーカを試験に含ませることによって判定することができる。
【００４７】
本発明の方法は、個体が（前）癌を有することを示してもよい。そのような場合において、本発明は、多くの場合、癌の原発部位（初期腫瘍部位）の組織が何であるのかを示すこともできる。個体が大腸癌を有することを示すことは、癌が大腸に位置しなければならないことを意味するのではない。腫瘍は、転移し、異なる位置に存在してもよい。
【００４８】
本発明の方法は、個体が癌を有することを示してもよい。しかしながら、本発明の方法は、より多くの場合、試験された個体が癌または前癌を有する相当な可能性を有することを示す。個体が、癌を診断するさらなる試験を受けることが望ましい。一態様において、本発明の方法は、前癌または癌を有する通常の可能性よりも高い可能性を有する個体を選別する方法である。
【００４９】
個体における前癌または癌の有無の検出は、好ましくは、表９の遺伝子、ＦＡＭ１９Ａ４，ＲＡＳＳＦ１ＡまたはＺＮＦ１５４のプロモータ領域でメチル化マーカの有無を判定することによって判定される。好ましい実施形態において、個体における、癌または前癌の有無の検出は、表９の遺伝子、ＦＡＭ１９Ａ４，ＲＡＳＳＦ１Ａのプロモータ領域におけるメチル化マーカ、および表９のＺＮＦ１５４のプロモータ領域におけるメチル化マーカ、ならびに好ましくはそれらの組み合わせの有無を判定することによって判定される。表９の遺伝子ＦＡＭ１９Ａ４またはＲＡＳＳＦ１Ａ、および／または表９の遺伝子ＺＮＦ１５４のプロモータ領域におけるメチル化マーカが存在しないことは、尿が集められた個体が、前癌もしくは癌を有しないか、またはもはや前癌もしくは癌を有さないことを示す。
【００５０】
本発明に開示されたようなメチル化マーカの有無の検出は、好ましくは尿試料中における核酸の増幅を含む。好ましくは、少なくとも１つのメチル化マーカの存在の検出は、個体の尿試料中における核酸の、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも３０個、好ましくは少なくとも５０個、好ましくは少なくとも１００個、およびより好ましくは１５０個の連続したヌクレオチドを増幅することを含む。好ましくは、少なくとも１つのメチル化マーカは、表９に特定された遺伝子のプロモータ領域におけるＣｐＧ島である。
【００５１】
メチル化マーカは、好ましくは、表９に列挙された遺伝子のプロモータ領域におけるＣｐＧ島における１つ以上のＣｐＧ’のメチル化を含む。表９のメチル化マーカは、したがって、表９に列挙された遺伝子のプロモータ領域のＣｐＧ島における１つ以上のＣｐＧ’のメチル化である。このメチル化を検出するための、メチル化特異的ＰＣＲ（好ましくは定量的ＰＣＲ）のためのプライマーを設計する１つの方法は、DavidovicらおよびSnellenbergら［１，２］に述べられている。
【００５２】
前癌または癌の種類を判定することは、好ましくは、個体の尿試料中における表９の少なくとも１つのメチル化マーカの存在を検出することを含む。表９のメチル化マーカの存在は、個体が癌または前癌を有することを示す。次に、特定のメチル化マーカの存在は、典型的には、分類においてある前癌または癌を含む。他のある種類のメチル化マーカの不在は、前癌または癌の種類のリストからある種類を除くことができる。よって、存在または不在の両者が、前癌または癌のある種類の指標であってもよい。個体が癌または前癌を有さないことを判定することは、好ましくは、表９に記載された２つ以上の遺伝子のプロモータにおけるメチル化マーカの不在を判定することを含む。好ましくは、表９に記載された、少なくとも、３つ，４つ，５つ，６つ，７つまたはより多くの遺伝子のプロモータにおいて。
【００５３】
本発明は、癌または前癌の発生について個体の集団検診をするための方法であって、
個体の前記集団から尿試料を回収することと、前記尿試料の、メチル化マーカセットの１つ以上のメチル化マーカの有無を判定することと、
尿試料中の前記１つ以上のメチル化マーカの有無の検出に基づいて、癌または前癌を有する個体が存在するか否かを判定することとを含み、
１つ以上のメチル化マーカの存在は、個体の集団が前癌または癌を有することを示し、
メチル化マーカの不在は、集団が前癌または癌を有さないことを示す方法をさらに提供する。１つ以上のメチル化マーカは、好ましくは、本発明のメチル化マーカ、たとえば表９に記載されたメチル化マーカである。
【００５４】
個体が癌または前癌を有するか否かを判定するための尿試料の集団検診または試験は、好ましくは、癌またな前癌状態がどのようなものであるのか知られていない個体（集団）の尿試料または複数の尿試料（集団検診の場合）に実施される。
【００５５】
本発明の試料は、尿試料である。好ましい実施形態において、試料は、無細胞の尿試料である。無細胞の試料は、尿の濾過によって、または上清の遠心分離および回収によって集められてもよい。集められた尿試料から無傷の細胞を本質的に取り除く他の方法は、当該分野において公知であり、本発明においても有用である。典型的には、常に必要であるわけではないが、より大きな細胞の破片も、本発明の方法を実施する前に尿から除去される。本発明において規定されたような細胞は、核を含む細胞である。赤血球は、尿中に存在してもよく、好ましくは除去される。無細胞試料は、好ましくは、３０００ｘｇにおいて遠心分離後、上清を回収することによって集められる。
【００５６】
本発明は、核酸増幅装置であって、メチル化マーカセットが、好ましくは、表９に特定されたメチル化マーカからなる群から選択されたメチル化マーカを検出するための少なくとも１つの手段を含む核酸増幅装置をさらに提供する。好ましい実施形態において、装置は、表１のメチル化マーカセットに由来するメチル化マーカを含む核酸を増幅するための核酸増幅プライマーを含む。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】癌患者の尿（赤色）および健常コントロールの尿（緑色）における２つのメチル化マーカのｑＰＣＲ結果の例である。ボックスプロットは、対数スケールにおけるハウスキーピング遺伝子Ｂアクチンに関連するＭＧＭＴおよびＦＡＭ１９Ａ４のメチル化レベルを表す。ＭＧＭＴは、癌患者の間の識別力がないマーカの一例であり、健常コントロールが検出された。ＦＡＭ１９Ａ４は、良好な識別力を有するマーカの一例である。
【図２】メチル化特異的ｑＰＣＲの結果の一例である。複数の遺伝子と、生成物溶融曲線との増幅プロットの両方を示した（上部グラフ）。様々な増幅産物について様々な溶融温度が明確に見られる（下部グラフ）。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
［実施例］
材料および方法
全ての尿試料は、完全な同意のもとでボランティアによって提供された。尿は、非侵襲的に得られる「廃棄物」であるので、医療倫理概観委員会（medical and ethical overview board）の承認は必要とはされなかった。それにも関わらず、全ての被験者は、彼らの尿の使用の許諾を求められた。
【００５９】
我々は、膀胱癌様症状の２０人の患者、確認された子宮頸癌の２０人の患者の尿を集めた。第１実験において、我々は、２０人の肺癌患者と１０人の健常者との尿試料を試験した。第２実験において、我々は、肺癌患者の別々の１４個の尿試料と、１９個のコントロールとを試験した。我々は、大腸癌を有する１１人の患者と、２２人のコントロールとの尿試料も試験した。子宮頸癌患者について、子宮頸部標本に基づく通常のメチル化試験を我々の結果と比較した。
【００６０】
我々は、膀胱癌について、ＲＡＳＳＦ１Ａ，ＶＩＭ，ＧＤＦ１５およびＴＭＥＦＦ２遺伝子、肺癌について、ＡＰＣ，ＧＡＴＡ２，３ＯＳＴ２，ＲＡＳＳＦ１Ａ，ＧＤＦ１５，ＴＭＥＦＦ２  ＶＩＭ，ＧＹＧＢ，ＦＡＭ１９Ａ４およびＰＨＡＣＴＲ３遺伝子、子宮頸癌について、ＦＡＭ１９Ａ４，ＰＨＡＣＴＲ３，ＰＲＤＭ１４，ＣＡＤ  Ｍ１，ＭＡＬおよびｍｉＲ１２４−２遺伝子、ならびに大腸癌について、ＣＹＧＢ，ＳＦＲＰ２ａおよびＭＧＭＴ遺伝子のプロモータ領域のメチル化を調べた。
【表１】
2019516397.tif 000002
【００６１】
ＤＮＡは、プロトコールに従ってZymo research社の「Quick-DNAUrine」キットを用いて尿試料（用途に応じて抽出ごとに５〜４０ｍＬの尿）から抽出された。ＤＮＡは、続いてバイサルファイト（プロトコールに従ってZymo research社「EZ DNA Methylation」キット）を用いて処理された。得られたバイサルフェイト処理されたＤＮＡは、iQ SYBR Green supermixを用いるＢＩＯＲＡＤリアルタイムＣＦＸ３８４、またはＡＢＩ−７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystems社）において、メチル化特異的ｑＰＣＲ（ＭＳＰ）に使用された。結果は、機械特異的ソフトウェアを用いて分析された（データ例の図２を参照のこと）。
【００６２】
結果
血液に対して、尿は、初期濾過および有用な化合物の連続的な活性再吸収によって、体の「廃棄物」の濃縮物を既に含んでいる。さらに、尿は、血液よりも大量に利用可能であり、４０ｍＬの尿まで着手可能である。１０μＬのＨ２Ｏにその尿からＤＮＡを抽出することによって、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）の前に、腎臓によって行われる濃縮に加えて、４０００ｘの濃縮工程が達成される。
【００６３】
全てのｑＰＣＲ試料は、メチル化独立マーカとして本明細書において使用されるβアクチン遺伝子の存在について同時に試験された。これは、ｑＰＣＲのために十分なＤＮＡが尿試料中に存在するか否かを評価するために使用された。いくつかの試料は、（十分な）ＤＮＡを含まなかった。
【００６４】
膀胱癌試料のｑＰＣＲ結果は、２０個のうち１２個の試料中に十分なＤＮＡがあることを示し、これらの１２個の試料のうち１１個は、我々のメチル化マーカの１つ以上に陽性であった。
【表２】
2019516397.tif 000003
【００６５】
子宮頸癌患者の尿は、自然尿およびカテーテル尿を用いて標本（swab）のメチル化パターンと比較するために使用された。同様のメチル化パターンは、尿および標本試料中に観察された。カテーテル尿（腫瘍細胞または腫瘍細胞の破片に接触しない）は、以下の表３に示されるように我々のマーカ遺伝子の明確なメチル化を示した。５人の健常な女性コントロール被験者は、尿中の全ての６つのマーカに全て陰性であった。
【表３−Ａ】
2019516397.tif 000004
【表３−Ｂ】
2019516397.tif 000005
【００６６】
子宮頸癌患者のカテーテル尿におけるメチル化ＤＮＡ配列の存在は、腫瘍と尿との直接接触なしに尿に到達するメチル化マーカの性能を示す。なぜなら、カテーテル尿は、外陰部を通過せず、子宮頸部、膣および外陰部での混入を排除するからである。腫瘍由来のメチル化ＤＮＡ配列が直接の接触なしに尿に達することを確かめるために、非泌尿器癌である肺癌が調べられ、ｅｘ  ｖｉｖｏ混入の可能性を排除された。２セットの患者試料は、２つの異なるメチル化マーカパネルを用いて分析された。
【００６７】
βアクチン制御遺伝子に陽性シグナルを有する患者のみが表４に列挙された。第１試料セットにおいて、我々は、２７個の試料のうち１９個において十分なＤＮＡ（βアクチンメチル化独立コントロール）が見出された。試料は、ＲＡＳＳＦ１Ａ，ＧＡＴＡ２，３ＯＳＴ２，ＡＰＣ，ＧＤＦ１５，ＴＭＥＦＦ２およびＶＩＭについて試験された。これらの１９個の試料のうち１１個は、以下の名称の遺伝子のプロモータ領域の高メチル化を示した。
【表４】
2019516397.tif 000006
【００６８】
この試料セットの１０人の健常コントロールのうち８人は、陽性のβアクチンシグナルを有した。これらの８個の試料のうち２個は、１または２個のマーカについてメチル化陽性を示し（表５）、このことは、この試験に閾値が必要であることを示す。
【表５】
2019516397.tif 000007
【００６９】
第２試料セットにおいて、１４人の患者の試料は、陽性のｂアクチンシグナルを有した。これらの１４個の試料のうち、１１個は、ＣＹＧＢ，ＦＡＭ１９Ａ４およびＰＨＡＣＴＲ３と名付けられた３つの遺伝子のプロモータ領域の、特定の閾値を超えた高メチル化を示した（表６）。陽性ｂアクチンシグナルを有する１９個の健常コントロール試料のうち、これらの３つのマーカが上述の閾値と同じ閾値を超えて検出された試料はなかった。第４のメチル化マーカが調べられ、ＰＲＤＭ４は、１４人の患者の試料のうち１２人において特定されたが、１９個のコントロール試料のうち８個においても特定された（表７）。このことは、腫瘍において以前に特定された全ての高メチル化ＤＮＡ配列が、尿試料における強い診断力を有するわけではないことを示している。
【表６】
2019516397.tif 000008
【表７】
2019516397.tif 000009
【００７０】
尿に接触していない腫瘍からの少なくともいくつかの高メチル化ＤＮＡ配列が、尿に達し、患者の尿試料中に検出することができることをさらに確かめるために、我々は、非泌尿器癌である大腸癌の患者からの尿試料の別のセットを試験した。
【００７１】
１１個の尿試料は、陽性ｂアクチンシグナルを有した。これらの試料は、３つのメチル化マーカ、ＣＹＧＢ，ＳＦＲＰ２およびＭＧＭＴについて試験された。これらのマーカの全ては、癌患者の尿中で検出可能であった。これらの３つのマーカのうちＣＹＧＢのみが、健常コントロールに比較して患者の尿中により頻繁に検出された（表７を参照のこと）。ＭＧＭＴの識別力がないことは、図１に示される。このことは、腫瘍中に特定される全てのメチル化ＤＮＡ配列が、尿試料中の癌選択的マーカとして使用可能であるわけではないこと強調する。
【表８】
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【００７２】
図１は、癌患者の尿中（赤色）と、健常コントロールの尿中（緑色）との２つのメチル化マーカのｑＰＣＲ結果の一例を示す。ハウスキーピング遺伝子Ｂアクチンに関して、それぞれＭＧＭＴおよびＦＡＭ１９Ａ４のメチル化レベルを対数スケールで表す箱ひげ図が示される。ＭＧＭＴは、癌患者と健常コントロールとの間の識別力が検出されなかったマーカの例である。ＦＡＭ１９Ａは、良好な識別力を有するマーカの例である。
【００７３】
結論
結果は、尿が腫瘍（細胞）に直接接触しなくても、尿は、検出のために十分なそのメチル化状態を保持する、十分な腫瘍ＤＮＡを含むことを示す。さらに、検出されたメチル化ＤＮＡ断片は、腫瘍検出および予測の指標である遺伝子特異的配列に結合することができる。したがって、我々は、尿中の無細胞メチル化ＤＮＡ断片の検出が、癌の検出および分類に実行可能な方法であると結論付ける。
【表９−Ａ】
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【表９−Ｂ】
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【００７４】
引用文献
1.  Snellenberg, S., et al., Development of a multiplex methylation-specific PCR as candidate triage test for women with an HPV-positive cervical scrape. BMC Cancer, 2012. 12: p. 551.
2.  Davidovic, R.S., et al., Methylation-specific PCR: four steps in primer design. Central European Journal of Biology, 2014. 9(12): p. 1127-1139.
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【誤訳訂正書】
【提出日】平成30年12月3日(2018.12.3)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】図面
【訂正対象項目名】全図
【訂正方法】追加
【訂正の内容】
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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