(57)【要約】  本願は、ギ酸脱水素酵素の活性が増加した、プトレシンを生産する微生物及びこれを用いてプトレシンを生産する方法に関する。【選択図】図２
2019506178.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ギ酸脱水素酵素（formate dehydrogenase、Fdh）の活性が変形前の活性に比べて増加した、プトレシンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項２】
前記Ｆｄｈがカンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）由来である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記Ｆｄｈが配列番号１０のアミノ酸配列で構成される、請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
さらに、オルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ODC）の活性が導入された、請求項１に記載の微生物。
【請求項５】
さらに、アセチルトランスフェラーゼの活性が内在的活性に比べて弱化された、請求項１に記載の微生物。
【請求項６】
さらに、プトレシン排出活性を示すタンパク質の活性が内在的活性に比べて増加した、請求項１に記載の微生物。
【請求項７】
前記微生物がコリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１に記載の微生物。
【請求項８】
（ａ）請求項１〜７のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養する段階；及び
（ｂ）前記段階で得られる微生物または培地からプトレシンを回収する段階を含む、プトレシン生産方法。
【請求項９】
前記培養する段階は、前記微生物をギ酸を含まない培地で培養する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物を培養する段階は、好気性条件下で培養する、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、プトレシンを生産する微生物及びそれを用いてプトレシンを生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プトレシンは、ポリアミドの原料物質の一つとして知られている。プトレシンは現在まで石油化合物を原料物質とする化学的な方法で生産され、遺伝子操作技術及び発酵技術を利用したプトレシン発酵生産技術が研究されている。
【０００３】
例えば、コリネバクテリウム属菌株の代謝経路を操作したプトレシンの生産が可能な菌株が既に公知となっている（大韓民国公開特許第2014-0115244号（特許文献１）、国際公開WO2014-148743号（特許文献２））。
【０００４】
一方、ギ酸脱水素酵素は、ギ酸の酸化を触媒させて第二の基質であるＮＡＤ＋を還元させ、結果物としてＮＡＤＨとＣＯ２を生成する酵素である。ＮＡＤＨは、菌株の代謝の全般にわたる重要な物質として知られている。ＮＡＤＨの増加を通じて菌株内の還元力を増加させることができ、目的物質の生産に有利であるからである。
【０００５】
ギ酸脱水素酵素を用いてＮＡＤＨを強化させ、嫌気条件でコハク酸及びバイオアルコールを生産する方法が公知となっている。コハク酸は、嫌気発酵条件で還元性ＴＣＡ（reverse TCA）経路を利用して生産が可能である。還元性ＴＣＡ経路においてＮＡＤＨの量はコハク酸の生産と直接の関連性を有しており、オキサロ酢酸（oxaloacetate）からコハク酸経路まで２モルのＮＡＤＨが消耗される。実際にグルコースからコハク酸を嫌気条件で生産するときにＦＤＨを強化させると、２０％以上の収率が増加することが報告されている（Appl Environ Microbiol., 2012年、78(9):3325-3337）。しかし、コハク酸とは異なり、プトレシン生合成経路では、ＮＡＤＨが直接的な基質として使用されず、ギ酸脱水素酵素とプトレシン生産との関連性については、報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】大韓民国公開特許第2014-0115244号公報
【特許文献２】国際公開WO2014-148743号公報
【特許文献３】国際公開WO2009/096689号公報
【特許文献４】大韓民国登録特許第0620092号公報
【特許文献５】国際公開WO2006/065095号公報
【特許文献６】大韓民国公開特許第2013-0082478号公報
【特許文献７】大韓民国公開特許第2014-0017243号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Microbiology(2012), 158, 2428-2439
【非特許文献２】J.Sambrook et al., Molecular Cloning、A Laboratory Manual、2nd Edition、Cold Spring Harbor Laboratory press、 Cold Spring Harbor、New York、1989
【非特許文献３】FM Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、Inc.、New York
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らはプトレシン生産菌株でプトレシンの生産を増加させるために鋭意努力した結果、ギ酸脱水素酵素を過発現させて菌株内のＮＡＤＨ及びＡＴＰ水準を増加させ、これを通じてプトレシン生産が増加することを確認することにより本願を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願の一つの目的は、ギ酸脱水素酵素（formate dehydrogenase、Fdh）の活性が増加した、プトレシンを生産するコリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
【００１０】
本願の他の目的は、前記微生物を用いてプトレシンを生産する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１１】
本願のプトレシン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物は、ギ酸脱水素酵素の活性が増加するように変形されてＮＡＤＨ及びＡＴＰ生成が増加され、これを通じてプトレシン生産を増加させることができ、プトレシンの大量生産に効果的に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】大腸菌宿主を用いてＣｂＦｄｈを過発現させた結果を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。１列は大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３を用いて１８℃の条件で２４時間発現させた細胞破砕液状のタンパク質の結果である。２列は大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３を用いて１８℃の条件で２４時間発現させた可溶性タンパク質の結果である。３列は大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３を用いて３０℃の条件で８時間発現させた細胞破砕液状のタンパク質の結果である。４列は大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３を用いて３０℃の条件で８時間発現させた可溶性タンパク質の結果である。５列は大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ＤＥ３を用いて１８℃の条件で２４時間発現させた細胞破砕液状のタンパク質の結果である。６列は大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ＤＥ３を用いて１８℃の条件で２４時間発現させた可溶性タンパク質の結果である。７列は大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ＤＥ３を用いて３０℃の条件で８時間発現させた細胞破砕液状のタンパク質の結果である。８列は大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ  ＤＥ３を用いて３０℃の条件で８時間発現させた可溶性タンパク質の結果である。
【図２】経時によるＮＡＤＨの生成量を表示したグラフである。緩衝液は、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を使用し、対照群は、可溶性タンパク質を除いた反応サンプルである。ＣｂＦｄｈは大腸菌ＢＬ２１  ＤＥ３を用いて３０℃でギ酸脱水素酵素を過発現させた可溶性タンパク質の１０％添加反応サンプルである。ＣｂＦｄｈの場合、経時につれてＣｂＦｄｈの反応物であるＮＡＤＨが持続的に増加することを確認できた。
【図３】経時によるギ酸の濃度を表示したグラフである。対照群は、コリネバクテリウム・グルタミクム菌株にｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７ベクターが挿入された菌株である。ＣｂＦｄｈはＣ．ｂｏｉｄｉｎｉｉ由来のギ酸脱水素酵素遺伝子の発現が可能なｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７＿ＣｂＦｄｈプラスミドが挿入された菌株である。培養液に０、２、及び１０ｇ／ｌのギ酸を入れて対照群とＣｂＦｄｈのギ酸濃度の変化を観察した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
前記目的を達成するための一つの様態として、本願はギ酸脱水素酵素（formate dehydrogenase、Fdh）の活性が増加した、プトレシンを生産するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００１４】
本願において、用語、「ギ酸脱水素酵素（formate dehydrogenase、以下「Fdh」と記載）」とは、ギ酸を基質とし、酸化反応を触媒させてＮＡＤ＋を還元させ、ＮＡＤＨ及びＣＯ２を生成する酵素を通称する。
【００１５】
前記ギ酸脱水素酵素は、微生物の種または菌株によって活性を示すタンパク質のアミノ酸配列に違いが存在する場合があるため、その由来や配列に限定されない。
【００１６】
具体的に、前記Ｆｄｈはセリポリオプシス・サブファーミスポーラ（Ceriporiopsis subvermispora）、メチロバクテリウム・エキストロクエンス（Methylobacterium extorquens）、メチロサイナス・トリコスポリウム（Methylosinus trichosporium）、キュープリアビダス・オキサラティカス（Cupriavidus oxalaticus）、カンジダ・メチリカ（Candida methylica）、メチロトローフ細菌（methylotrophic bacterium）、アンサイロバクター・アクアティカス（Ancylobacter aquaticus）、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）、マイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）などの由来であってもよく、最近公知となったコリネバクテリウム・グルタミクム（Microbiology(2012)、158、2428-2439（非特許文献１））由来であってもよい。具体的には、カンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）由来であってもよいが、これに制限されない。
【００１７】
また、本願において、Ｆｄｈは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むタンパク質、または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、さらに具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列であり、実質的に、ギ酸脱水素酵素としての活性を有するタンパク質であれば制限なく含むことができる。
【００１８】
前記配列と相同性を有する配列であり、実質的に配列番号１０のタンパク質と同一または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、やはり本願のカテゴリに含まれることは自明である。
【００１９】
本願のＦｄｈをコードするポリヌクレオチドは、前記Ｆｄｈタンパク質と類似した活性を有する限り、配列番号１０のアミノ酸配列または前記配列と７０％以上、具体的には８０％以上、さらに具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。例えば、配列番号９の塩基配列を含むことができる。
【００２０】
また、本願のＦｄｈをコードするポリヌクレオチドは、配列番号９の塩基配列又は前記塩基配列に由来したプローブ（probe）と厳しい条件（stringent conditions）で混成化されてもよく、正常に機能するＦｄｈをコードする変異形であってもよい。
【００２１】
前記において用語「相同性」とは、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで示すことができる。本明細書において、与えられたアミノ酸配列または塩基配列と同一または類似した活性を有するその相同性配列が「％相同性」と示される。例えば、スコア（score）、同一性（identity）及び類似度（similarity）などのパラメータ（parameter）を計算する標準ソフトウェア、具体的には、ＢＬＡＳＴ  ２．０を利用したり、定義された厳しい条件の下でサザン混成化実験によって配列を比較することにより確認することができ、定義される適合した混成化条件は、該当技術の範囲内であり、当業者によく知られている方法（例えば、J.Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989（非特許文献２）; FM Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York（非特許文献３））で決定されてもよい。前記において用語「厳しい条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。例えば、このような条件は、文献（例えば、J.Sambrook et al.,  同上）に具体的に記載されている。
【００２２】
本願において、用語、「活性の増加」とは、微生物が有する内在的活性または変形前の活性に比べて活性が向上したことを意味する。前記活性の増加は、外来のＦｄｈを導入することと、内在的Ｆｄｈの活性を強化することをいずれも含むことができる。具体的には、ギ酸脱水素酵素の活性が増加してプトレシン生産能の増加を意味する。
【００２３】
具体的には、本願において活性の増加は、
１）前記酵素を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数の増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
３）前記酵素の活性が強化するように染色体上のポリヌクレオチド配列の変形、
または
４）その組み合わせにより強化するように変形する方法などにより行うことができるが、これに制限されない。
【００２４】
前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに限定されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われたり、宿主細胞内の染色体内に挿入されることにより行われる。具体的には、本願の酵素を暗号化するポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製され、機能することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行われる。または前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより、前記宿主細胞の染色体内の前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加させる方法で行うことができる。
【００２５】
また、コピー数の増加の一様態として、酵素の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを導入することにより行うことができる。外来ポリヌクレオチド配列の導入は、前記酵素と同一／類似した活性を示す酵素を暗号化する外来ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入して行うことができる。前記外来ポリヌクレオチドは、前記酵素と同一／類似した活性を示す限り、その由来や配列に制限なく使用することができる。また、前記外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化し、宿主細胞内に導入することができる。前記導入は、公知となった形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることにより、酵素が生成され、その活性が増加する。
【００２６】
次に、２）ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形は、特にこれに限定されないが、前記発現調節配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、またはさらに強い活性を有する核酸配列で交換することにより行うことができる。前記発現調節の配列は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などを含むことができる。
【００２７】
具体的には、ポリヌクレオチド発現単位の上部には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよいが、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロモーター、ｌｙｓＣＰ１プロモーター、ＥＦ−Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡあるいはａｃｅＢプロモーターなどがある。より具体的には、コリネバクテリウム属由来のプロモーターであるｌｙｓＣＰ１プロモーター（WO2009/096689（特許文献３））、あるいはＣＪ７プロモーター（大韓民国登録特許第0620092号（特許文献４）及びWO2006/065095（特許文献５））と作動可能に連結されて前記酵素をコードするポリヌクレオチドの発現率を向上させることができるが、これに限定されない。
【００２８】
併せて、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに限定されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、またはさらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列で交換することにより行うことができる。
【００２９】
最後に、４）前記１）〜３）の組み合わせにより強化されるように変形する方法は、前記酵素を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数の増加、その発現が増加するように発現調節配列の変形、染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形及び前記酵素の活性を示す外来のポリヌクレオチドまたはそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの変形中の１以上の方法をともに適用して行うことができる。
【００３０】
本願で使用される用語「ベクター」とは、適合した宿主内で目的タンパク質を発現させることができるように、適合した調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始することができるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の終結を調節する配列を含むことができる。ベクターは、適合した宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノムそのものに統合することができる。
【００３１】
本願で使用されるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界において公知となった任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用することができ、プラスミドベクターとしてｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを使用することができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを使用することができる。
【００３２】
一例として、細胞内の染色体挿入用ベクターを通じて染色体内に目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを変異されたポリヌクレオチドに交換することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えにより行われてもよいが、これに限定されない。
【００３３】
本願において、用語「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現されるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現さえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらすべてを含むことができる。また、前記ポリヌクレオチドは、標的タンパク質をコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現することができるものであれば、どのような形態で導入されても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体的に発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入することができる。前記発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、及び翻訳終結シグナルを含むことができる。前記発現カセットは、自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよいが、これに限定されない。
【００３４】
また、前記において用語「作動可能に連結された」とは、本願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と、前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。
【００３５】
本願で使用される用語「プトレシンを生産する微生物」または「プトレシン生産能を有する微生物」とは、自然的にプトレシン生産能を有している微生物またはプトレシンの生産能がない母菌株にプトレシンの生産能が付与された微生物を意味する。
【００３６】
前記プトレシンを生産する微生物は、特にこれに限定されないが、例えば、グルタミン酸からオルニチンまでの生合成経路を強化するためにグルタミン酸をアセチルグルタミン酸（N-acetylglutamate）に転換するアセチルグルタミン酸シンターゼまたはアセチルオルニチンをオルニチンに転換するオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ArgJ）、アセチルグルタミン酸をアセチルグルタミルホスフェート（N-acetylglutamyl phosphate）に転換するアセチルグルタミン酸キナーゼ（ArgB）、アセチルグルタミルホスフェートをアセチルグルタミン酸セミアルデヒド（N-acetylglutamate semialdehyde）に転換するアセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ArgC）、アセチルグルタミン酸セミアルデヒドをアセチルオルニチン（N-acetylornithine）に転換するアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）の活性を、内在的活性に比べて増加させるように変形されてプトレシンの生合成原料として使用されるオルニチンの生産性が向上されたものであってもよい。
【００３７】
また、前記微生物は、オルニチンにおいてアルギニン合成に関与するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine carbamoyltransfrase、ArgF）、グルタミン酸エクスポーター（glutamate exporter）活性を示すタンパク質、及び／またはプトレシンをアセチル化させるアセチルトランスフェラーゼの活性を内在的活性が不活性化されるように変異され／されるか、オルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase，ODC）の活性を導入するように変形されたものであってもよい。
【００３８】
この時、前記オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ArgF）、グルタミン酸エクスポーター（glutamate exporter）活性を示すタンパク質、オルニチンデカルボキシラーゼ（ODC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ArgJ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ArgB）、アセチルガンマグルタミルホスフェートレダクターゼ（ArgC）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ArgD）は、特にそれに限定されないが、具体的には、それぞれ配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、及び１７で記載されるアミノ酸配列またはこれと７０％以上、具体的には８０％以上、さらに具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００３９】
また、プトレシンをアセチル化させるアセチルトランスフェラーゼは、特にこれに限定されないが、具体的には、配列番号：１８または１９で記載されるアミノ酸配列またはこれと７０％以上、具体的には８０％以上、さらに具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００４０】
また、プトレシン排出活性を示すタンパク質の活性が内在的活性に比べて増加したものであってもよいが、これに限定されるものではない。プトレシン排出活性を示すタンパク質は、特にこれに限定されないが、具体的には、配列番号：２０または２１で記載されるアミノ酸配列またはこれと７０％以上、具体的には８０％以上、さらに具体的には９０％以上、より一層具体的には９５％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００４１】
一方、本願の微生物は、プトレシン生産能を有する微生物であり、前記Ｆｄｈタンパク質が発現される原核微生物を含むことができ、その例としては、エシェリキア属（Escherichia sp.）、シゲラ属（Shigella sp.）、シトロバクター属（Citrobacter sp.）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）エルシニア属（Yersinia sp.）、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）、エルウィニア属（Erwinia sp.）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium sp.）、ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）、セレノモナス属（Selenomanas sp.）、ビブリオ属（Vibrio sp.）、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）、ストレプトマイセス属（Streptomyces sp.）、アルカノバクテリウム属（Arcanobacterium sp.）、アルカリゲネス属（Alcaligenes sp.）などに属する微生物であってもよい。具体的には、本願の微生物は、コリネバクテリウム属またはエシェリキア属に属する微生物であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミクム（Corynebacterium glutamicum）であってもよいが、これに限定されない。
【００４２】
もう一つの様態として、本願は、プトレシンを製造するための、前記コリネバクテリウム微生物の用途を提供する。前記微生物は、ギ酸脱水素酵素（formate dehydrogenase，Fdh）の活性が変形前の活性に比べて増加した微生物であり、前記用途はプトレシンを製造するためのものであってもよい。
【００４３】
もう一つの様態として、本願は、（ａ）ギ酸脱水素酵素（formate dehydrogenase，Fdh）の活性が増加されたプトレシンを生産するコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び（ｂ）前記段階で得られる微生物または培地からプトレシンを回収する段階を含むプトレシン生産方法を提供する。
【００４４】
ギ酸脱水素酵素及びプトレシン生産能が向上した微生物については、前記説明した通りである。
【００４５】
前記方法において、前記微生物を培養する段階は、特にこれに限定されないが、公知となった回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行うことができる。このとき、培養条件は、特にこれに限定されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を使用して適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的にはｐＨ６〜８、最も具体的にはｐＨ６．８）を調節することができ、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持することができる。培養温度は２０〜４５℃、具体的には２５〜４０℃を維持することができ、約１０〜１６０時間培養することができるが、これに限定されるものではない。前記培養により生産されたプトレシンは培地中に分泌されるか、細胞内に残留することができる。
【００４６】
併せて、使用される培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、澱粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、サンフラワー油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕粉及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウム）などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されない。リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に使用したり、または混合して使用することができるが、これに限定されない。また、培地にはその他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含むことができる。
【００４７】
本願の前記培養段階で生産されたプトレシンを回収する方法は、培養方法によって、当該分野において公知となった適合した方法を用いて培養液から目的とするアミノ酸を収集することができる。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが使用されることができ、当該分野において公知となった適合した方法を用いて培地または微生物から目的とするプトレシンを回収することができる。
【００４８】
以下、本願を実施例により、さらに詳しく説明する。しかし、これら実施例は、本願を例示的に説明するためのものであり、本願の範囲がこれら実施例により制限されるものではない。
【００４９】
実施例１：ＣｂＦｄｈの大腸菌発現及び反応性の評価
１）ＣｂＦｄｈ遺伝子の大腸菌発現
ＣｂＦｄｈ（Candida boidinii formate dehydrogenase）を大腸菌に過発現させるためにカンジダ・ボイジニ（Candida boidinii）ＫＣＴＣ１７７７６菌株を培養してゲノムＤＮＡを得た。配列番号１及び２のプライマーを用いてｐＥＴ２８ａベクターにギ酸脱水素酵素遺伝子（CbFdh）（配列番号９）を挿入した。
【００５０】
具体的には、ＰＣＲ条件は、変性（denaturation）９５℃で３０秒、アニーリング（annealing）５５℃で３０秒、伸長（extension）７２℃で１分を３０回繰り返して行った。このＰＣＲ結果物から１．０％のアガロースゲルで電気泳動した後、１．１ｋｂサイズのバンドを溶離して精製した。前記精製されたＰＣＲ産物とｐＥＴ２８ａベクター溶液のサンプルにＮｃｏＩとＸｈｏＩを入れて３７℃、４時間の反応で制限酵素処理し、１．５％のアガロースゲルを用いて電気泳動した後、ＣｂＦｄｈとベクターサイズの核酸断片を切り取った後、Ｇｅｌ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（GeneAll、ソウル）を用いて精製された核酸断片を得た。前記得られた各１ｍｇのＣｂＦｄｈ断片とｐＥＴ２８ａベクター断片をＴ４リガーゼ（ligase）を用いて連結させた後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α菌株に２５００Ｖでエレクトロポレーション（electrophoration）した。前記エレクトロポレーションの後、回収された菌株を５０μｇ／ｌのスペクチノマイシン（spectinomycin）を含むＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で１日間培養した後、スペクチノマイシンに耐性を示す菌株を選別した。回収された菌株を５０μｇ／ｌのカナマイシン（kanamycin）を含むＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で１日間培養した後、耐性を示す菌株を選別した。選別された菌株は、Ｔ７プロモーターとターミネーター（terminator）配列の配列番号３及び４のプライマーを用いて前記条件でＰＣＲした後、１．０％のアガロースゲル上で遺伝子のサイズが１．３ｋｂで観察されることを確認することによりＣｂＦｄｈの挿入を確認した。
【００５１】
前記ＣｂＦｄｈの挿入が確認された菌株を３ｍｌＬＢ溶液培地に５０ｍｇ／ｍｌの濃度のアンピシリンを入れて３７℃で１２時間培養した。培養された菌株を抗生剤を含む５０ｍｌのＬＢに入れて３７℃で培養し、光学光度（６００ｎｍの波長）が０．８になると、０．２ｍＭのＩＰＴＧを添加して多様な温度／時間の条件で発現を誘導した。培養された菌株を洗浄し、ソニケータ（sonicator）を用いて細胞を粉砕した。粉砕した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果を通じてＣｂＦｄｈ（４１ｋＤａ、配列番号１０）が過発現されたことを確認した（図１）。
【００５２】
２）発現されたＣｂＦｄｈ遺伝子の活性評価
ＣｂＦｄｈの活性を評価するために、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を反応緩衝液として使用した。前記緩衝液に１０ｍＭのＮＡＤ＋と０．１％のギ酸ナトリウム（sodium formate）を入れた溶液を対照群として使用した。一方、対照群に前記実施例１−１）で確認したＣｂＦｄｈ過発現細胞粉砕液を１０％の割合で入れてＣｂＦｄｈの活性を評価した。反応液は、９６ウェルプレートリーダーを使用して３３９ｎｍの波長で数値の変化を確認した。３４０ｎｍの波長の光は、ＮＡＤＨに選択的に吸収されることが知られている。
【００５３】
その結果、数分間ＮＡＤＨが持続的に生成されることが確認できた（図２）。本実施例を通じてＣｂＦｄｈが大腸菌で過発現され、発現されたタンパク質は、固有の活性を有すると評価された。
【００５４】
実施例２：ＣｂＦｄｈ発現コリネバクテリウム属微生物の製作
次に、プトレシンを生産するコリネバクテリウム属菌株にＣｂＦｄｈの機能を強化してプトレシン生産能の向上有無を確認しようとした。コリネバクテリウム属菌株でＣｂＦｄｈを発現させ、その活性を確認するためにＣｂＦｄｈの遺伝子開始コドンの前にＣＪ７プロモーター（KCCM10617、大韓民国登録特許第10-0620092号（特許文献４））を導入した。
【００５５】
まず、ＣＪ７プロモーター配列を含む遺伝子を得るためにコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び６のプライマー対を用いたＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、変性９５℃で３０秒、アニーリング５５℃で３０秒及び伸長７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返して行った。１．５％のアガロースゲルを用いて電気泳動した後、４００ｂｐ（base pair）のサイズを有するＰＣＲ核酸の結果物を確認した。得られたＰＣＲ結果物からＰＣＲ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（GeneAll、ソウル）を用いて精製されたＣＪ７プロモーター核酸断片を確保した。精製されたＣＪ７核酸断片とｐＳＣＥＣベクター溶液サンプルにＢａｍＨＩとＸｂａＩを入れて３７℃、４時間の反応で制限酵素処理した。その後、１．５％のアガロースゲルを用いて電気泳動した後、４００ｂｐのサイズを有するＣＪ７プロモーターとｐＳＣＥＣベクターのサイズの核酸断片を切り取り、Ｇｅｌ  ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（GeneAll、ソウル）を用いてＣＪ７プロモーター断片とｐＳＣＥＣベクターの核酸断片を得た。前記各１ｍｇのＣＪ７プロモーター断片とｐＳＣＥＣベクターをＴ４リガーゼを用いて連結した後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α菌株に２５００Ｖでエレクトロポレーション（electrophoration）した。エレクトロポレーションの後、回収された菌株を５０μｇ／ｌのスペクチノマイシン（spectinomycin）を含むＬＢ平板培地に塗抹して３７℃で１日間培養した後、スペクチノマイシンに耐性を示す菌株を１８種選別した。前記選別された１８個の菌株を、配列番号５及び６のプライマーを用いてコロニーＰＣＲの後、４００ｂｐのサイズを有するＰＣＲ結果物を確認することができた。コロニーＰＣＲの結果からＣＪ７プロモーターを有するｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７の製作を確認した。
【００５６】
前記実施例１で得られたＣｂＦｄｈ  ＰＣＲ結果物の獲得条件と同様に、配列番号７及び８のプライマーを用いてｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７に挿入することができるＣｂＦｄｈ  ＰＣＲ結果物を獲得した。制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩで処理されたｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７とＣｂＦｄｈ  ＰＣＲ結果物を連結してＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α菌株に挿入した。選別された菌株からｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７＿ＣｂＦｄｈを得てプトレシン生産菌株であるコリネバクテリウム属微生物ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ（大韓民国公開特許第2013-0082478号（特許文献６））とＫＣＣＭ１１４０１Ｐ（大韓民国公開特許第2014-0017243号（特許文献７））に２５００Ｖでエレクトロポレーション（electrophoration）した。
【００５７】
前記エレクトロポレーションして得た菌株を５０μｇ／ｌのスペクチノマイシン（spectinomycin）を含むＢＨＩＳ平板培地（Braine heart infusion  ３７ｇ／ｌ、ソルビトール９１ｇ／ｌ、寒天２％）に塗抹して培養することによりコロニーを形成させた。前記選別された菌株は、５０μｇ／ｌのスペクチノマイシン（spectinomycin）を含むＣＭ培地（ｇｌｕｃｏｓｅ  １０ｇ／ｌ、ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ  １０ｇ／ｌ、ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ／ｌ、ｂｅｅｆ  ｅｘｔｒａｃｔ  ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ２．５ｇ／ｌ、Ｕｒｅａ  ２ｇ／ｌ、ｐＨ６．８）で振とう培養して最終選別した。ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７＿ＣｂＦｄｈが挿入されたＫＣＣＭ１１２４０Ｐ菌株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７＿ＣｂＦｄｈ（ＣＣ０４−００８１）と命名し、ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７が挿入されたＫＣＣＭ１１２４０Ｐ菌株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７と命名した。同様に、ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７＿ＣｂＦｄｈが挿入されたＫＣＣＭ１１４０１Ｐ菌株をＫＣＣＭ１１４０１Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７＿ＣｂＦｄｈと命名し、ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７が挿入されたＫＣＣＭ１１４０１Ｐ菌株をＫＣＣＭ１１４０１Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７と命名した。
【００５８】
このうち、ＣＣ０４−００８１菌株を２０１６年１月８日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korea Culture center of Microorganisms、KCCM）に受託番号ＫＣＣＭ１１７９８Ｐとして寄託した。
【００５９】
実施例３：コリネバクテリウム属微生物におけるＣｂＦｄｈの活性評価
ＣｂＦｄｈが挿入されたコリネバクテリウム属菌株のギ酸脱炭酸酵素活性を確認するために、ギ酸（formic acid）を添加した培地でギ酸の濃度変化を分析した（図３）。ＣｂＦｄｈが強化された菌株と空ベクターが挿入された菌株の培養液に０ｇ／ｌ、２ｇ／ｌ、１０ｇ／ｌの濃度のギ酸を培養液に添加した。強化菌株と空ベクター挿入菌株はＫＣＣＭ１１２４０Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７＿ＣｂＦｄｈとＫＣＣＭ１１２４０Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７を使用した。
【００６０】
培養の結果、空ベクターが含まれた菌株の場合、２ｇ／ｌ及び１０ｇ／ｌのギ酸が添加されたとき、ギ酸が培養液にそのまま残っていることを確認することができた。一方、ＣｂＦｄｈが強化された菌株は、２ｇ／ｌのギ酸を２４時間以内にすべて分解することを確認することができた。そして、１０ｇ／ｌのギ酸が添加された場合には、３２時間以内に全部は分解しなかったが、持続的にギ酸が減少することが確認できた。反応３２時間目に対照群の菌株と比較して見ると、８０％程度のギ酸が転換されたことが確認できた。
【００６１】
ＣｂＦｄｈ強化菌株及び対照群の菌株培養を通じたギ酸の変化量分析を通じてＣｂＦｄｈ強化菌株はギ酸を分解することが確認できた。この結果を通じてコリネバクテリウム属菌株に導入されたＣｂＦｄｈが正常に発現し、機能を維持していることを確認した。
【００６２】
実施例４：ＣｂＦｄｈ強化プトレシン菌株の生産能の評価
ＣｂＦｄｈ強化プトレシン菌株の生産能を評価するために製作された４種のコリネバクテリウム・グルタミクム変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７＿ＣｂＦｄｈ、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７、ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７＿ＣｂＦｄｈ、ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７）をそれぞれ１ｍＭのアルギニン含有ＣＭ平板培地（ｇｌｕｃｏｓｅ  １％、ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ  １％、ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５％、ｂｅｅｆ  ｅｘｔｒａｃｔ  ０．５％、ＮａＣｌ  ０．２５％、ｕｒｅａ  ０．２％、５０％ＮａＯＨ  １００μｌ、５０μｇのスペクチノマイシン、ａｇａｒ  ２％、ｐＨ  ６．８、１ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。これから培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（Ｇｌｕｃｏｓｅ  ８％、大豆タンパク質０．２５％、トウモロコシ固形０．５０％、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ４％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％、ｕｒｅａ  ０．１５％、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩３ｍｇ、カルシウム−パントテン酸３ｍｇ、ニコチン酸アミド３ｍｇ、ＣａＣＯ３  ５％、５０μｇのスペクチノマイシン、１ｌ基準）に一白金耳程度で接種した後、これを３０℃で２００ｒｐｍで、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７＿ＣｂＦｄｈ及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７菌株の場合、９８時間、ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７＿ＣｂＦｄｈ及びＫＣＣＭ１１４０１Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７菌株の場合、１０４時間振とう培養した。
【００６３】
各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記表１に示した。
【００６４】
【表１】
2019506178.tif 000003
【００６５】
培養液に存在するプトレシン濃度はＨＰＬＣを用いて分析した。前記表１に示すように、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７菌株の場合、５ｇ／ｌのギ酸の有無によってプトレシン生成量がそれほど変化しなかった。一方、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７＿ＣｂＦｄｈが導入された菌株は、５ｇ／ｌのギ酸の有無に関係なく、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７菌株に比べて生産量が７％以上増加していることを確認した。ギ酸の有無に関係なく、Ｆｄｈ強化菌株のプトレシン生産量が増加していることを確認した。
【００６６】
また、ギ酸の添加なしに同一培地で評価されたＫＣＣＭ１１４０１Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７菌株の場合１１．４ｇ／ｌのプトレシンが生産され、５ｇ／ｌのギ酸が添加された培地で培養された菌株は、６％程度の収率が減少（１０．７ｇ／ｌ）することを確認した。一方、ＣｂＦｄｈが強化された菌株であるＫＣＣＭ１１４０１Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７＿ＣｂＦｄｈの場合、ギ酸の有無に関係なく、同量のプトレシンが生成（１２．０ｇ／ｌ）することを確認した。ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７＿ＣｂＦｄｈ菌株とＫＣＣＭ１１４０１Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７菌株から生産されたプトレシンを分析したとき、ＣｂＦｄｈが強化された菌株は、ＫＣＣＭ１１４０１Ｐ／ｐＳＣＥＣ＿ＣＪ７より５％以上プトレシンの生産量が増加していることを確認することができた。ギ酸の有無とは無関係にＣｂＦｄｈ強化菌株がプトレシン生産能を向上させたことを確認した。
【００６７】
前記の結果を総合すると、プトレシン生産菌株にギ酸脱水素酵素（ＣｂＦｄｈ）が導入された形質転換菌株は、プトレシンの生産量がさらに増加することを確認し、これは、ギ酸の添加有無とは無関係に示される効果である。そこで、本願を通じてプトレシンを効率的に大量生産できることが期待される。
【００６８】
以上の説明から、本願が属する技術分野の当業者であれば、本願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されることがあることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本願の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【００６９】
2019506178.tif 000004
【図１】
2019506178.tif 000005
【図２】
2019506178.tif 000006
【図３】
2019506178.tif 000007
【配列表】
2019506178000001.app
【国際調査報告】
2019506178.tif 000008
2019506178.tif 000009
2019506178.tif 000010
2019506178.tif 000011