(57)【要約】  ｉｎ  ｖｉｔｒｏで昆虫細胞においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を生成するための組成物および方法を開示する。組換えバキュロウイルスベクターは、ＡＡＶ  Ｃａｐｓｉｄ遺伝子発現カセット（Ｃａｐ）、ＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子発現カセット（Ｒｅｐ）、およびＡＡＶ発現カセット中の開始コドンから最大で約４ｋｂに位置するバキュロウイルス相同領域（ｈｒ）を含む。Ｃａｐ、Ｒｅｐ、およびｈｒを含む組換えバキュロウイルスを有する昆虫細胞におけるバキュロウイルスとＡＡＶの生成レベルは、ＣａｐとＲｅｐを含むがｈｒを含まない対照と比較してより高い。さらに、Ｃａｐ、Ｒｅｐおよびｈｒを含む組換えバキュロウイルスで感染された昆虫細胞におけるバキュロウイルスおよびＡＡＶの生成レベルは細胞の連続継代にわたり比較的安定しているが、バキュロウイルスとＡＡＶの生成レベルは、ＣａｐとＲｅｐを含むが、ｈｒを含まない組換えバキュロウイルスを含む昆虫細胞の連続継代にわたり低下する。【選択図】図１０Ａ
2019514352.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセット、
ＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセット、および
ＡＡＶ発現カセットの開始コドンから最大で約４ｋｂに位置するバキュロウイルス相同領域（ｈｒ）
を含むバキュロウイルスベクター。
【請求項２】
５’から３’への順に、前記Ｃａｐ発現カセット、前記Ｒｅｐ発現カセット、および前記バキュロウイルス相同領域（ｈｒ）を含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
５’から３’への順に、前記Ｒｅｐ発現カセット、前記Ｃａｐ発現カセット、および前記バキュロウイルス相同領域（ｈｒ）を含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
５’から３’への順に、前記Ｃａｐ発現カセット、前記バキュロウイルス相同領域（ｈｒ）、および前記Ｒｅｐ発現カセットを含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
５’から３’への順に、前記Ｒｅｐ発現カセット、前記バキュロウイルス相同領域（ｈｒ）、および前記Ｃａｐ発現カセットを含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項６】
５’から３’への順に、前記バキュロウイルス相同領域（ｈｒ）、前記Ｃａｐ発現カセット、および前記Ｒｅｐ発現カセットを含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項７】
５’から３’への順に、前記バキュロウイルス相同領域（ｈｒ）、前記Ｒｅｐ発現カセット、および前記Ｃａｐ発現カセットを含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項８】
前記ｈｒ領域が前記Ｒｅｐ発現カセットと前記Ｃａｐ発現カセットとの間にあり、かつ前記Ｒｅｐ発現カセットおよび前記Ｃａｐ発現カセットが頭−頭（５’−５’）配向にある、請求項１に記載のベクター。
【請求項９】
前記バキュロウイルス相同領域がｈｒ２配列である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１０】
前記ベクターがＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を含まない、請求項１〜９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１１】
細胞を含む昆虫細胞株であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクターを含む、昆虫細胞株。
【請求項１２】
前記細胞が第２のベクターをさらに含み、前記第２のベクターがＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接される導入遺伝子を含む、請求項１１に記載の昆虫細胞株。
【請求項１３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでバキュロウイルスを増殖させる方法であって、
請求項１１または請求項１２に記載の昆虫細胞の培養物を用意すること、および
前記細胞をインキュベートすること
を含む、方法。
【請求項１４】
前記細胞をインキュベートすることが前記細胞を継代培養することを含み、および継代７でのＡＡＶ生成収率がＡＡＶ  Ｃａｐ発現カッセットとＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセットとを含むがバキュロウイルスｈｒを含まないバキュロウイルスベクターを含む対照昆虫細胞株と比較して少なくとも２倍大きい、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセットを含むバキュロウイルスの継代７での力価が総バキュロウイルス力価の２１．５％を上回る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＡＶを増殖させる方法であって、
昆虫細胞の培養物を用意すること、
前記昆虫細胞を請求項１〜１０のいずれか１項に記載のバキュロウイルスベクターで感染するまたはトランスフェクトすること、および
前記細胞をインキュベートすること
を含む、方法。
【請求項１７】
前記昆虫細胞からのＡＡＶの継代７での収率が前記ｈｒを有しないバキュロウイルスベクターを含む昆虫細胞からのＡＡＶの継代７での収率よりも少なくとも５０％大きい、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記バキュロウイルスｈｒを含む細胞からのＡＡＶの継代７での収率が前記ｈｒを有しないバキュロウイルスベクターを含む細胞からのＡＡＶの収率よりも少なくとも２０％大きい、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記バキュロウイルスベクターがＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を含まない、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＡＶを生成する方法であって、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクター、およびＡＡＶ  ＩＴＲに隣接される導入遺伝子を含むベクターを含む昆虫細胞培養物を増殖させることを含む、方法。
【請求項２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで昆虫細胞においてＡＡＶを生成するためのＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を有しないバキュロウイルスベクターであって、
ＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセット、
ＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセット、および
ＡＡＶ発現カセットの開始コドンから最大で約４ｋｂに位置するバキュロウイルス相同領域（ｈｒ）
を含む、バキュロウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
先行出願の参照
本出願は、２０１６年４月２１日出願の米国仮出願第６２／３２５，８１７号に対して利益および優先権を主張する。同出願第６２／３２５，８１７号はその全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照による組み込み
本開示の一部である配列表は、コンピュータ可読形式と、ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列を含む書面での配列表とを含む。コンピュータ可読形式で記録された配列表情報は、書面での配列表と同一である。配列表の主題は、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
序論
最初のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介遺伝子治療薬の承認を得て、ＡＡＶベクターを大規模に製造する技術への要望が高まっている（Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ，Ｓ．，  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０，１８３１−１８３２，２０１２）。現在、ＡＡＶを生成するためのいくつかの技術がある。従来の方法は、三重または二重のプラスミドによるＨＥＫ２９３細胞または他の哺乳動物細胞株のトランスフェクションを利用している。この方法はＡＡＶの収率が低く、それが接着細胞を必要とするためにスケールアップが難しい（Ｘｉａｏ，Ｘ．，  Ｌｉ，Ｊ．＆  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，２２２４−２２３２，１９９８）。ＡＡＶを生成するための別の方法は、哺乳動物細胞を感染させるために単純ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルス（ＨＳＶ）を利用する。この方法は、ＨＳＶ種を十分に生成する上での困難によって妨げられ、ＡＡＶ生産性も低い（Ｂｏｏｔｈ，Ｍ．Ｊ．，ら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １１，８２９−８３７，２００４）。
【０００４】
昆虫細胞においてＡＡＶベクターを生成するバキュロウイルスをベースにした方法は、他の系と比較して、ＡＡＶ生成収率を大幅に増加させた（Ｕｒａｂｅ，Ｍ．，ら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３，１９３５−１９４３，２００１；Ｃｈｅｎ，  Ｈ．，Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １６，  ９２４−９３０，  ２００８；Ｃｈｅｎ，  Ｈ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  １，  ｅ５７，２０１２；Ｃｈｅｎに付与された米国特許第８，９４５，９１８号）。しかし、組換えバキュロウイルスは多数の継代にわたって不安定になることがあり、ＡＡＶ生成の低下をもたらす。したがって、多数継代後でもＡＡＶベクターの生成を高収率で維持できるＡＡＶ生成系への満たされていない必要性が存在する。
【０００５】
バキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ（キンウワバ科）多核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）ゲノムは、ｈｒ１〜ｈｒ５と名付けられた５つの「相同領域」（ｈｒ）を含む（Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｍ．Ａ．，およびＦａｕｌｋｎｅｒ，Ｐ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４５，  ９６１−９７０，１９８３；Ｇｕａｒｉｎｏ，Ｌ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６０，  ２１４−２２３，１９８６）。これらの５つの領域は、エンハンサーとして機能できる（Ｇｕａｒｉｎｏ，  Ｌ．Ａ．，ら，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６０，  ２２４−２２９，１９８６）。ｈｒ１〜ｈｒ５の配列は報告されており（Ｇｕａｒｉｎｏ，Ｌ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６０，  ２１４−２２３，１９８６；Ｇｕａｒｉｎｏ，Ｌ．Ａ．，ら，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６０，  ２２４−２２９，１９８６）、本明細書に記載される。ｈｒは、約４００塩基対〜最高約１，０００塩基対の長さであり得る。ＡｃＭＮＰＶのｈｒ配列の例は、以下の通りである。
ｈｒ１：ＡＴＣＧＡＴＧＡＴＴ  ＧＡＣＣＣＣＡＡＣＡ  ＡＡＡＧＡＴＴＴＡＴ  ＡＡＴＴＡＡＴＣＡＴ  ＡＡＴＣＡＣＧＡＡＣ  ＡＡＣＡＡＣＡＡＧＴ  ＣＡＡＴＧＡＡＡＣＡ  ＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧ  ＴＴＧＴＣＧＡＴＡＡ  ＡＡＣＡＴＴＣＡＴＡ  ＡＡＴＧＡＣＡＣＡＧ  ＣＡＡＣＡＴＡＣＡＡ  ＴＴＣＴＴＧＣＡＴＡ  ＡＴＡＡＡＡＡＴＴＴ  ＡＡＡＴＧＡＣＡＴＣ  ＡＴＡＴＴＴＧＡＧＡ  ＡＴＡＡＣＡＡＡＴＧ  ＡＣＡＴＴＡＴＣＣＣ  ＴＣＧＡＴＴＧＴＧＴ  ＴＴＴＡＣＡＡＧＴＡ  ＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣ  ＣＧＴＡＡＡＧＣＧＡ  ＧＴＴＴＡＧＴＴＴＴ  ＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡ  ＴＧＡＣＡＴＣＡＴＴ  ＴＧＴＡＴＡＡＴＧＡ  ＣＡＴＣＡＴＣＣＣＣ  ＴＧＡＴＴＧＴＧＴＴ  ＴＴＡＣＡＡＧＴＡＧ  ＡＡＴＴＣＴＡＴＣＣ  ＧＴＡＡＡＧＣＧＡＧ  ＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧ  ＡＡＡＡＣＡＡＡＴＧ  ＡＧＴＣＡＴＡＣＣＴ  ＡＡＡＣＡＣＧＴＴＡ  ＡＴＡＡＴＣＴＴＣＴ  ＧＡＴＡＴＣＡＧＣＴ  ＴＡＴＧＡＣＴＣＡＡ  ＧＴＴＡＴＧＡＧＣＣ  ＧＴＧＴＧＣＡＡＡＡ  ＣＡＴＧＡＧＡＴＡＡ  ＧＴＴＴＡＴＧＡＣＡ  ＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧ  ＡＴＣＧＴＧＣＧＴＴ  ＡＣＡＡＧＴＡＧＡＡ  ＴＴＣＴＡＣＴＣＧＴ  ＡＡＡＧＣＣＡＧＴＴ  ＣＧＧＴＴＡＴＧＡＧ  ＣＣＧＴＧＴＧＣＡＡ  ＡＡＣＡＴＧＡＣＡＴ  ＣＡＧＣＴＴＡＴＧＡ  ＣＴＣＡＴＡＣＴＴＧ  ＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴ  ＡＣＧＣＧＴＡＧＡＡ  ＴＴＣＴＡＣＴＣＧＴ  ＡＡＡＧＣＧＡＧＴＴ  ＣＧＧＴＴＡＴＧＡＧ  ＣＣＧＴＧＴＧＣＡＡ  ＡＡＣＡＴＧＡＣＡＴ  ＣＡＧＣＴＴＡＴＧＡ  ＧＴＣＡＴＡＡＴＴＡ  ＡＴＣＧＴＧＣＧＴＴ  ＡＣＡＡＧＴＡＧＡＡ  ＴＴＣＴＡＣＴＣＧＴ  ＡＡＡＧＣＧＡＧＴＴ  ＧＡＡＧＧＡＴＣＡＴ  ＡＴＴＴＡＧＴＴＧＣ  ＧＴＴＴＡＴＧＡＧＡ  ＴＡＡＧＡＴＴＧＡＡ  ＡＡＧＣＧＴＧＴＡＡ  ＡＡＴＧＴＴＴＣＣＣ  ＧＣＧＣＴＴＧＧＣＡ  ＣＡＡＣＴＡＴＴＴＡ  ＣＡＡＴＧＣＧＧＣＣ  ＡＡＧＴＴＡＴＡＡＡ  ＡＧＡＴＴＣＴＡＡＴ  ＣＴＧＡＴＡＴＧＴＴ  ＴＴＡＡＡＡＣＡＣＣ  ＴＴＴＧＣＧＧＣＣＣ  ＧＡＧＴＴＧＴＴＴＧ  ＣＧＴＡＣＧＴＧＡＣ  ＴＡＧＣＧＡＡＧＡＡ  ＧＡＴＧＴＧＴＧＧＡ  ＣＣＧＣＡＧＡＡＣＡ  ＧＡＴＡＧＴＡＡＡＡ  ＣＡＡＡＡＣＣＣＴＡ  ＧＴＡＴＴＧＧＡＧＣ  ＡＡＴＡＡＴＣＧＡＴ（配列番号１）
ｈｒ２：ＴＧＡＧＣＡＡＡＡＣ  ＡＣＡＡＣＣＧＧＣＡ  ＡＡＴＴＣＴＣＧＧＣ  ＧＧＣＣＧＴＴＴＧＧ  ＧＡＡＴＧＣＧＧＡＡ  ＴＡＡＴＴＧＣＣＡＴ  ＡＴＧＴＡＡＡＴＧＡ  ＴＧＴＣＡＴＣＧＧＴ  ＴＣＴＡＡＣＴＣＧＣ  ＴＴＴＡＣＧＡＧＴＡ  ＧＡＡＴＴＣＴＡＣＧ  ＴＧＴＡＡＡＡＣＡＴ  ＡＡＴＣＡＡＧＡＧＡ  ＴＧＡＴＧＴＣＡＴＴ  ＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡ  ＡＡＣＴＧＡＡＣＴＣ  ＡＡＧＡＡＡＴＧＡＴ  ＧＴＣＡＴＴＴＧＴＴ  ＴＴＴＣＡＡＡＡＣＴ  ＧＡＡＣＴＧＧＣＴＴ  ＴＡＣＧＡＧＴＡＧＡ  ＡＴＴＣＴＡＣＴＴＧ  ＴＡＡＡＡＣＡＣＡＡ  ＴＣＧＡＧＡＧＡＴＧ  ＡＴＧＴＣＡＴＡＴＴ  ＴＴＧＣＡＣＡＣＧＧ  ＣＴＣＴＡＡＴＴＡＡ  ＡＣＴＣＧＣＴＴＴＡ  ＣＧＡＧＴＡＡＡＡＴ  ＴＣＴＡＣＴＴＧＴＡ  ＡＣＧＣＡＴＧＡＴＣ  ＡＡＧＧＧＡＴＧＡＴ  ＧＴＣＡＴＴＧＧＡＴ  ＧＡＧＴＣＡＴＴＴＧ  ＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡ  ＣＴＡＡＡＣＴＣＧＣ  ＴＴＴＡＣＧＡＧＴＡ  ＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴ  ＴＧＴＡＡＡＡＣＡＣ  ＡＡＴＣＡＡＧＧＧＡ  ＴＧＡＴＧＴＣＡＴＴ  ＡＴＡＣＡＡＡＴＧＡ  ＴＧＴＣＡＴＴＴＧＴ  ＴＴＴＴＣＡＡＡＡＣ  ＴＡＡＡＣＴＣＧＣＴ  ＴＴＡＣＧＧＧＴＡＧ  ＡＡＴＴＣＴＡＣＴＴ  ＧＴＡＡＡＡＣＡＧＣ  ＡＡＣＴＣＧＡＧＧＧ  ＡＴＧＡＴＧＴＣＡＴ  ＣＣＴＴＴＡＣＴＣＧ  ＡＴＧＡＴＴＡＴＡＡ  ＡＣＧＴＧＴＴＴＡＴ  ＧＴＡＴＧＡＣＴＣＡ  ＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣ  ＡＡＡＡＣＴＡＡＡＣ  ＴＣＧＣＴＴＴＡＣＧ  ＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣ  ＴＡＣＴＴＧＴＡＡＣ  ＧＣＡＣＧＡＴＣＡＡ  ＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴ  ＣＡＴＴＴＡＴＴＴＧ  ＴＧＣＡＡＡＧＣＴＣ  ＧＡＴＧＴＣＡＴＣＴ  ＴＴＴＧＣＡＣＡＣＧ  ＡＴＴＡＴＡＡＡＣＡ  ＣＡＡＴＣＣＡＡＡＴ  ＡＡＴＧＡＣＴＣＡＴ  ＴＴＧＴＴＴＴＣＡＡ  ＡＡＣＴＧＡＡＣＴＣ  ＧＣＴＴＴＡＣＧＡＧ  ＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡ  ＣＴＴＧＴＡＡＡＡＣ  ＡＣＡＡＴＣＡＡＧＧ  ＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡ  ＴＴＴＴＣＡＡＡＡＴ  ＧＡＴＧＴＣＡＴＴＴ  ＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡ  ＡＣＴＡＡＡＣＴＣＧ  ＣＴＴＴＡＣＧＡＧＴ  ＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣ  ＴＴＧＴＡＡＡＡＣＡ  ＣＡＡＴＣＡＡＧＧＧ  ＡＴＧＡＴＧＴＣＡＴ  ＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧ  ＡＴＣＡＴＴＴＧＴＴ  ＴＴＴＣＡＡＡＡＣＴ  ＡＡＡＣＴＣＧＣＴＴ  ＴＡＣＧＡＧＴＡＧＡ  ＡＴＴＣＴＡＣＧＴＧ  ＴＡＡＡＡＣＡＣＡＡ  ＴＣＡＡＧＧＧＡＴＧ  ＡＴＧＴＣＡＴＴＴＡ  ＣＴＡＡＡＴＡＡＡＡ  ＴＡＡＴＴＡＴＴＴＡ  ＡＡＴＡＡＡＡＣＴＧ  ＴＴＴＴＴＴＡＴＴＧ  ＴＣＡＡＡＴＡＣＡＣ  ＡＴＴＧＡＴＴＣＡＣ（配列番号２）
ｈｒ３：ＡＣＧＣＧＴＡＧＡＡ  ＴＴＣＴＡＣＴＴＧＴ  ＡＡＡＧＣＡＡＧＴＴ  ＡＡＡＡＴＡＡＧＣＣ  ＧＴＧＴＧＣＡＡＡＡ  ＡＴＧＡＣＡＴＣＡＧ  ＡＣＡＡＡＴＧＡＣＡ  ＴＣＡＴＣＴＡＣＣＴ  ＡＴＣＡＴＧＡＴＣＡ  ＴＧＴＴＡＡＴＡＡＴ  ＣＡＴＧＴＴＴＴＡＡ  ＡＡＴＧＡＣＡＴＣＡ  ＧＣＴＴＡＴＧＡＣＴ  ＡＡＴＡＡＴＴＧＡＴ  ＣＧＴＧＣＧＴＴＡＣ  ＡＡＧＴＡＧＡＡＴＴ  ＣＴＡＣＴＣＧＴＡＡ  ＡＧＣＧＡＧＴＴＴＡ  ＧＴＴＴＴＧＡＡＡＡ  ＣＡＡＡＴＧＡＧＴＣ  ＡＴＣＡＴＴＡＡＡＣ  ＡＴＧＴＴＡＡＴＡＡ  ＴＣＧＴＧＴＡＴＡＡ  ＡＧＧＡＴＧＡＣＡＴ  ＣＡＴＣＣＡＣＴＡＡ  ＴＣＧＴＧＣＧＴＴＡ  ＣＡＡＧＴＡＧＡＡＴ  ＴＣＴＡＣＴＣＧＴＡ  ＡＡＧＣＧＡＧＴＴＣ  ＧＧＴＴＴＴＧＡＡＡ  ＡＡＣＡＡＡＴＧＡＣ  ＡＴＣＡＴＴＴＣＴＴ  ＧＡＴＴＧＴＧＴＴＴ  ＴＡＣＡＣＧＴＡＧＡ  ＡＴＴＣＴＡＣＴＣＧ  ＴＡＡＡＧＴＡＴＧＴ  ＴＣＡＧＴＴＴＡＡＡ  ＡＡＡＣＡＡＡＴＧＡ  ＣＡＴＣＡＴＴＴＴＡ  ＣＡＧＡＴＧＡＣＡＴ  ＣＡＴＴＴＣＴＴＧＡ  ＴＴＡＴＧＴＴＴＴＡ  ＣＡＡＧＴＡＧＡＡＴ  ＴＣＴＡＣＴＣＧＴＡ  ＡＡＧＣＧＡＧＴＴＴ  ＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡ  ＡＡＣＡＡＡＴＧＡＣ  ＡＴＣＡＴＣＴＣＴＴ  ＧＡＴＴＡＴＧＴＴＴ  ＴＡＣＡＡＧＴＡＧＡ  ＡＴＴＣＴＡＣＴＣＧ  ＴＡＡＡＧＣＧＡＧＴ  ＴＴＡＧＴＴＴＴＧＡ  ＡＡＡＡＣＡＡＡＴＧ  ＡＣＡＴＣＡＴＣＴＣ  ＴＴＧＡＴＴＡＴＧＴ  ＴＴＴＡＣＡＡＧＴＡ  ＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴ  ＣＧＴＡＡＡＧＣＧＡ  ＧＴＴＴＡＧＴＴＴＴ  ＧＡＡＡＡＡＣＡＡＡ  ＴＧＡＣＡＴＣＡＴＣ  ＣＣＴＴＧＡＴＣＡＴ  ＧＣＧＴＴＡＣＡＡＧ  ＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡ  ＣＴＣＧＴＡＡＡＧＣ  ＧＡＧＴＴＧＡＡＴＴ  ＴＴＧＡＴＴＡＣＡＡ  ＴＡＴＴ（配列番号３）
ｈｒ４左：ＡＴＧＣＡＴＡＴＡＡ  ＴＴＧＴＧＴＡＣＡＡ  ＡＡＴＡＴＧＡＣＴＣ  ＡＴＴＡＡＴＣＧＡＴ  ＣＧＴＧＣＧＴＴＡＣ  ＡＡＧＴＡＧＡＡＴＴ  ＣＴＡＣＴＧＧＴＡＡ  ＡＧＣＡＡＧＴＴＣＧ  ＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣ  ＧＴＧＴＧＣＡＡＡＡ  ＣＡＴＧＡＣＡＴＣＡ  ＴＡＡＣＴＡＡＴＣＡ  ＴＧＴＴＴＡＴＡＡＴ  ＣＡＴＧＴＧＣＡＡＡ  ＡＴＡＴＧＡＣＡＴＣ  ＡＴＣＣＧＡＣＧＡＴ  ＴＧＴＧＴＴＴＴＡＣ  ＡＡＧＴＡＧＡＡＴＴ  ＣＴＡＣＴＣＧＴＡＡ  ＡＧＣＧＡＧＴＴＴＡ  ＡＡＡＡＴＴＴＴＧＴ  ＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧ  ＡＡＡＣＡＡＣＧＴＧ  ＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴ  ＴＡＣＡＡＴＡＴＴＴ  ＡＡＧＴＧＡＡＡＣＡ  ＴＴＡＴＧＡＣＴＴＣ  ＣＡＡＴＡＡＴＴＴＴ  ＧＴＧＧＡＴＧＴＧＧ  ＡＴＡＣＧＴＴＴＧＣ  ＡＡＧＡＣＡＡＴＴＧ  ＡＴＴＡＣＡＧＡＴＡ  ＡＡＴＧＴＡＧＴＧＣ  ＴＣＴＡＡＴＣＧＡＡ  ＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴ  ＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧ  ＣＡＡＡＣＡＴＴＴＴ  ＡＧＡＧＡＴＴＡＧＴ  ＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣ  ＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧ  ＴＡＴＴＴＴＧＡＧＧ  ＴＧＣＣＡＡＣＴＣＡ  ＡＡＡＡＡＡＣＴＡＴ  ＧＡＡＴＡＣＡＴＴＡ  ＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴ  ＴＴＴＡＣＧＡＡＣＡ  ＡＡＡＴＡＴＡＴＧＧ  ＡＣＧＡＴＴＣＧＡＴ  ＡＧＡＴＴＡＴＡＡＡ  ＧＡＴＴＴＴＡＡＣＡ  ＧＡＣＧＣＡＴＣＣＴ  ＡＴＴＧＡＴＡＧＴＴ  ＴＴＴＡＡＡＴＴＣＧ  ＣＴＴＴＡＡＡＣＡＡ  ＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣ  ＴＡＣＴＴＴＣＣＡＴ  ＣＧＴＡＣＴＡＡＡＧ  ＡＧＡＴＣＡＴＣＧＡ  ＧＧＴＧＧＣＣＡＴＴ  ＡＡＡＣＧＴＴＴＡＡ  ＡＣＡＡＡＡＴＴＡＡ  ＣＣＣＣＧＡＴＴＴＡ  ＡＡＧＡＧＴＴＣＴＣ  ＣＧＣＧＣＡＡＴＧＣ  ＴＴＣＡＧＣＡＴＴＡ  ＣＡＡＡＴＧＡＡＴＧ  ＴＴＴＧＧＡＡＡＡＴ  ＣＴＡＧＡ（配列番号４）
ｈｒ４右：ＡＡＣＴＧＧＣＴＴＴ  ＡＣＧＡＧＴＡＧＡＡ  ＴＴＣＴＡＣＴＴＧＴ  ＡＡＡＡＣＡＣＡＡＴ  ＣＡＡＧＡＡＡＴＧＡ  ＴＧＴＣＡＴＴＴＴＴ  ＧＴＡＣＧＴＧＡＴＴ  ＡＴＡＡＡＣＡＴＧＴ  ＴＴＡＡＡＣＡＴＧＧ  ＴＡＣＡＴＴＧＡＡＣ  ＴＴＡＡＴＴＴＴＴＧ  ＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡ  ＡＡＣＴＡＧＡＴＴＡ  ＡＴＧＴＡＴＧＡＣＴ  ＣＡＴＴＴＧＴＴＴＧ  ＴＧＣＡＡＧＴＴＧＡ  ＴＡＡＡＣＧＴＧＡＴ  ＴＡＡＴＡＴＡＴＧＡ  ＣＴＣＡＴＡＴＧＴＴ  ＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡ  ＴＧＧＴＧＴＣＡＴＣ  ＧＴＡＣＡＡＡＣＴＣ  ＧＣＴＴＴＡＣＧＡＧ  ＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡ  ＣＴＴＧＴＡＡＡＡＣ  ＡＣＡＡＴＣＧＡＧＧ  ＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡ  ＴＴＴＧＴＡＧＡＡＴ  ＧＡＴＧＴＣＡＴＴＴ  ＧＴＴＴＴＴＴＣＡＡ  ＡＡＣＣＧＡＡＣＴＣ  ＧＣＴＴＴＡＣＧＡＧ  ＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡ  ＣＴＴＧＴＡＡＡＡＣ  ＡＣＡＡＴＣＧＡＧＧ  ＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡ  ＴＴＴＧＴＡＧＡＡＴ  ＧＡＴＧＴＣＡＴＣＧ  ＴＡＣＡＡＡＣＴＣＧ  ＣＴＴＴＡＣＧＡＧＴ  ＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧ  ＴＡＡＡＡＣＡＣ（配列番号５）
ｈｒ５：ＴＴＧＡＡＡＡＴＴＴ  ＡＴＴＧＣＣＴＡＡＴ  ＡＴＴＡＴＴＴＴＴＧ  ＴＣＡＧＴＴＣＧＴＴ  ＧＴＣＡＴＴＴＡＴＴ  ＡＡＴＴＴＧＧＡＴＧ  ＡＴＧＴＣＣＡＴＴＴ  ＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡ  ＴＴＧＡＡＣＴＧＧＣ  ＴＴＴＡＣＧＡＧＴＡ  ＧＡＡＴＴＣＴＡＣＧ  ＣＧＴＡＡＡＡＣＡＣ  ＡＡＴＣＡＡＧＴＡＴ  ＧＡＧＴＣＡＴＡＡＧ  ＣＴＧＡＴＧＴＣＡＴ  ＧＴＴＴＴＧＣＡＣＡ  ＣＧＧＣＴＣＡＴＡＡ  ＣＣＧＡＡＣＴＧＧＣ  ＴＴＴＡＣＧＡＧＴＡ  ＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴ  ＴＧＴＡＡＣＧＣＡＣ  ＧＡＴＣＧＡＧＴＧＧ  ＡＴＧＡＴＧＧＴＣＡ  ＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣ  ＡＡＡＴＣＧＡＧＡＴ  ＧＡＴＧＴＣＡＴＧＴ  ＴＴＴＧＣＡＣＡＣＧ  ＧＧＣＴＣＡＴＡＡＡ  ＣＴＧＣＴＴＴＡＣＧ  ＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣ  ＴＡＣＧＴＧＴＡＡＣ  ＧＣＡＣＧＡＴＣＧＡ  ＴＴＧＡＴＧＡＧＴＣ  ＡＴＴＴＧＴＴＴＴＧ  ＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡ  ＴＣＡＴＡＣＡＡＴＡ  ＴＧＡＣＴＣＡＴＴＴ  ＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡ  ＡＣＣＧＡＡＣＴＴＧ  ＡＴＴＴＡＣＧＧＧＴ  ＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣ  ＴＣＧＴＡＡＡＧＣＡ  ＣＡＡＴＣＡＡＡＡＡ  ＧＡＴＧＡＴＧＴＣＡ  ＴＴＴＧＴＴＴＴＴＣ  ＡＡＡＡＣＴＧＡＡＣ  ＴＣＴＣＧＧＣＴＴＴ  ＡＣＧＡＧＴＡＧＡＡ  ＴＴＣＴＡＣＧＴＧＴ  ＡＡＡＡＣＡＣＡＡＴ  ＣＡＡＧＡＡＡＴＧＡ  ＴＧＴＣＡＴＴＴＧＴ  ＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡ  ＡＡＡＧＣＴＧＡＴＧ  ＴＣＡＴＧＴＴＴＴＧ  ＣＡＣＡＴＧＧＣＴＣ  ＡＴＡＡＣＴＡＡＡＣ  ＴＣＧＣＴＴＴＡＣＧ  ＧＧＴＡＧＡＡＴＴＣ  ＴＡＣＧＣＧＴＡＡＡ  ＡＣＡＴＧＡＴＴＧＡ  ＴＡＡＴＴＡＡＡＴＡ  ＡＴＴＣＡＴＴＴＧＣ  ＡＡＡＧＣＴＡＴＡＣ  ＧＴＴＡＡＡＴＣＡＡ  ＡＣＧＧＡＣＧＴＴＡ  ＴＧＧＡＡＴＴＧＴＡ  ＴＡＡＴＡＴＴＡＡＡ  ＴＡＴＧＣＡＡＴＴＧ  ＡＴＣＣＡＡＣＡＡＡ  ＴＡＡＡＡＴＴＡＴＡ  ＡＴＡＧＡＧＣＡＡＧ  ＴＣＧＡＣ（配列番号６）
【０００６】
ｈｒ１〜ｈｒ４の配列は、Ｇｕａｒｉｎｏ，Ｌ．Ａ．，ら，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６０，  ２２４−２２９，１９８６からであり、ｈｒ５は、Ｇｕａｒｉｎｏ，Ｌ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６０，  ２１４−２２３，１９８６からである。ｈｒ２の他の配列は、Ａｓｌａｎｉｄｉ，Ｇ．，ら，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０６，  ５０５９−５０６４，２００９，およびＡｙｒｅｓ，Ｍ．Ｄ．，ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０２，  ５８６−６０５，１９９４に報告されている。
【０００７】
加えて、昆虫ウイルスの相補領域中の配列多様性が報告されている。ＡｃＭＮＰＶ相補領域とのわずか６４％の同一性を有する配列は、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）核多角体ウイルス由来の相補領域（ｈｒ）配列として認識されている（Ｍａｊｉｍａ，Ｋ．，ら，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７，  ７５１３−７５２１，１９９３）。
【０００８】
バキュロウイルスｈｒは、ＡＡＶ２シス作用Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を介して作用してＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を有する昆虫細胞株でＡＡＶ生成を向上させることができると報告されている（Ａｓｌａｎｉｄｉ，Ｇ．，ら，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０６，  ５０５９−５０６４，２００９）。本研究は、一過性トランスフェクションアッセイにおいてＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子の発現を試験し、ｒｅｐの上流にｈｒ２とＲＢＥを有する構築物によるトランスフェクション後に転写が上昇したことを報告した。研究者らはフィードフォーワードループを提案し、このループにおいて、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子の両方の転写がトランス作用バキュロウイルス発現ベクターにコードされた最初期トランス因子１（ＩＥ−１）によって誘導される。彼らのモデルにおいて、生成物の１つ（Ｒｅｐタンパク質）がＲＢＥと相互作用して、救出／増幅を誘導し、より多くの転写を媒介する。
【０００９】
バキュロウイルスｈｒ配列は、連続カスケード昆虫細胞バイオリアクターにおいて組換えバキュロウイルスを安定させることも報告されている（Ｐｉｊｌｍａｎ，Ｇ．Ｐ．，ら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８７，  ７４３−７５３，２００４）。しかし、バキュロウイルス系においてＡＡＶウイルス生産性を向上させるｈｒ配列についての報告はなかった。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで昆虫細胞中のバキュロウイルスに基づく系においてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）生成を向上させる組成物および方法を開発した。組成物および方法は、ＡＡＶ  Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を含まないがバキュロウイルス相同領域（ｈｒ）を含むベクターを使用する。種々の構成において、ＡＡＶゲノムを含むバキュロウイルスゲノムを有する昆虫細胞株の安定性は、多数継代にわたって維持できる。
【００１１】
種々の構成において、本発明の教示のベクターを含む昆虫細胞でのＡＡＶ生成は、ｈｒを含まないベクターと比較して向上され得る。さらに、本発明の教示のベクターを含む昆虫細胞株は、継代を繰り返した後でも、ＡＡＶ生成の高力価を安定して維持できる。
【００１２】
種々の実施形態において、本発明の教示は、ベクターを含む。種々の構成において、ベクターは、例えば、これに限定されないがバクミドシャトルベクター（Ｌｕｃｋｏｗ，Ｖ．，ら，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６７，  ４５６６−４５７９，１９９３）などの、バキュロウイルスまたはプラスミドであり得る。種々の構成において、ベクターはＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセット、ＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセット、およびバキュロウイルス相同領域（ｈｒ）を含んでよい。種々の構成において、ｈｒはＡＡＶ発現カセットの開始コドンから最大で約４ｋｂに位置できる。種々の構成において、ｈｒが挿入され得る。種々の構成において、ｈｒは、ＡＡＶ発現カセットの開始コドンから最大で約０．５ｋｂ、約１ｋｂ、約１．５ｋｂ、約２ｋｂ、約２．５ｋｂ、約３ｋｂ、約３．５ｋｂ、約４ｋｂまたは約４．５ｋｂに位置できる。種々の構成において、挿入されるｈｒ領域は、Ｒｅｐ発現カセットの開始コドンから最大で約４ｋｂに位置できる。種々の構成において、挿入されるｈｒ領域は、Ｃａｐ発現カセットの開始コドンから最大で約４ｋｂに位置できる。種々の構成において、ベクターは、バキュロウイルスなどのウイルス、例えば、これに限定されないが、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ（キンウワバ科）多核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）からの配列を含んでよい。いくつかの構成において、ベクターは、ｈｒを含むように改変された、前述（Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １６，  ９２４−９３０，２００８；Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  １，  ｅ５７，２０１２；Ｃｈｅｎに付与された米国特許第８，９４５，９１８号）のベクターであり得る。
【００１３】
種々の構成において、ＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセットおよびＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセットは、前述（Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １６，  ９２４−９３０，２００８；Ｃｈｅｎ，Ｈ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  １，  ｅ５７，２０１２；Ｃｈｅｎに付与された米国特許第８，９４５，９１８号）のようであり得、ｈｒは、ＡｃＭＮＰＶなどのバキュロイウルス由来のｈｒ１、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４またはｈｒ５であり得る。いくつかの構成において、ｈｒはＡｃＭＮＰＶ  ｈｒ２であり得る。いくつかの構成において、ｈｒはＡｃＭＮＰＶと配列同一性を共有するｈｒであり得、例えば、これに限定されないが、ＡｃＭＮＰＶ由来のｈｒ、別の昆虫ウイルス由来のｈｒ、またはｈｒ２などのＡｃＭＮＰＶと少なくとも６４％の配列同一性、少なくとも６５％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも７５％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、少なくとも８５％の配列同一性、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性、もしくはそれを超える配列同一性を共有する人工ｈｒ配列であり得る。
【００１４】
種々の構成において、本発明の教示のベクターは、Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を除外でき、およびＡＡＶを、ｈｒを含むがＲＢＥを含まないベクターを用いて、昆虫細胞中で生成できる。
【００１５】
種々の構成において、本発明の教示のベクターは、５’から３’への順に、Ｃａｐ発現カセット、Ｒｅｐ発現カセット、およびバキュロウイルス相同領域を含んでよい。
【００１６】
種々の構成において、本発明の教示のベクターは、５’から３’への順に、Ｒｅｐ発現カセット、Ｃａｐ発現カセット、およびバキュロウイルス相同領域を含んでよい。
【００１７】
種々の構成において、本発明の教示のベクターは、５’から３’への順に、Ｃａｐ発現カセット、バキュロウイルス相同領域、およびＲｅｐ発現カセットを含んでよい。
【００１８】
種々の構成において、本発明の教示のベクターは、５’から３’への順に、Ｒｅｐ発現カセット、バキュロウイルス相同領域、およびＣａｐ発現カセットを含んでよい。
【００１９】
種々の構成において、本発明の教示のベクターは、５’から３’への順に、バキュロウイルス相同領域、Ｃａｐ発現カセット、およびＲｅｐ発現カセットを含んでよい。
【００２０】
種々の構成において、本発明の教示のベクターは、５’から３’への順に、バキュロウイルス相同領域、Ｒｅｐ発現カセット、およびＣａｐ発現カセットを含んでよい。
【００２１】
種々の構成において、ｈｒ領域は、Ｒｅｐ発現カセットとＣａｐ発現カセットとの間に位置できる。種々の構成において、Ｒｅｐ発現カセットとＣａｐ発現カセットは、頭−頭（５’−５’）配向、尾部−尾部（３’−３’）配向、または頭−尾部（５’−３’）配向にあり得る
【００２２】
種々の構成において、本発明の教示は、例えば、これに限定されないが、本明細書に記載のベクターを含むＳｆ９細胞、Ｔｎｉ前駆細胞、またはＥ４ａ細胞などの昆虫細胞株を含む。種々の構成において、本発明の教示は、これに限定されないがＳｆ９細胞などの昆虫細胞株を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、本発明の教示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでバキュロウイルスを増殖させる方法を含む。種々の構成において、これらの方法は、昆虫細胞の培養物を用意すること、昆虫細胞をＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセット、ＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセット、およびバキュロウイルス相同領域（ｈｒ）を含むベクターで感染することまたはトランスフェクトすること、およびこれらの細胞をインキュベートすることを含む。種々の構成において、ｈｒはＡＡＶ発現カセットから最大で約４ｋｂであり得る。種々の構成において、ｈｒはＲｅｐ発現カセットから最大で約４ｋｂであり得る。種々の構成において、ｈｒはＣａｐ発現カセットから最大で約４ｋｂであり得る。種々の態様において、結果として生じる細胞株は、繰り返して継代培養され得る。
【００２４】
いくつかの実施形態において、本発明の教示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＡＶを増殖させる方法を含む。これらの方法において、ＡＡＶ  Ｃａｐカセット、ＡＡＶ  Ｒｅｐカセットおよびｈｒを含むバキュロウイルスを用いて、例えば、これに限定されないが、Ｓｆ９細胞、Ｔｎｉ前駆細胞、またはＥ４ａ細胞などの、昆虫細胞を感染させる、またはトランスフェクトする（または同時感染させる、もしくは同時トランスフェクトする）ことができる。感染された（またはトランスフェクトされた）細胞は次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖され、それによってバキュロウイルスおよびＡＡＶを生成する細胞株を形成できる。そのような細胞株は、ＡＡＶ生成をほとんどまたは全く損なうことなく複数継代の間、例えば少なくとも３継代、少なくとも４継代、少なくとも５継代、少なくとも６継代、少なくとも７継代、少なくとも８継代、少なくとも９継代、または少なくとも１０継代の間、繰り返して継代培養できる。種々の構成において、本発明の教示のＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセット、ＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセットおよびｈｒを含むベクターを含む昆虫細胞株からのＡＡＶ生成は、例えば７継代後に、ＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセットおよびＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセットを含むがｈｒを含まないベクターを含む昆虫細胞株の７継代後のそれよりも、少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、もしくは少なくとも４倍多いことがあり得る。種々の構成において、本発明の教示のＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセット、ＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセットおよびｈｒを含むベクターを含む昆虫細胞株からのＡＡＶ生成は、例えば８継代後に、ＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセットおよびＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセットを含むがｈｒを含まないベクターを含む昆虫細胞株の８継代後のそれよりも、少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、もしくは少なくとも４倍多いことがあり得る。種々の構成において、本発明の教示のＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセット、ＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセットおよびｈｒを含むベクターを含む昆虫細胞株からのＡＡＶ生成は、例えば９継代後に、ＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセットおよびＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセットを含むがｈｒを含まないベクターを含む昆虫細胞株の９継代後のそれよりも、少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、もしくは少なくとも４倍多いことがあり得る。種々の構成において、本発明の教示のＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセット、ＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセットおよびｈｒを含むベクターを含む昆虫細胞株からのＡＡＶ生成は、例えば１０継代後に、ＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセットおよびＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセットを含むがｈｒを含まないベクターを含む昆虫細胞株の１０継代後のそれよりも、少なくとも２倍多い、少なくとも３倍多い、もしくは少なくとも４倍多いことがあり得る。
【００２５】
いくつかの実施形態において、本発明の教示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでバキュロウイルスを増殖させる方法を含む。これらの方法において、ＡＡＶ  ＣａｐカセットおよびＡＡＶ  Ｒｅｐカセットを含むバキュロウイルスベクターを用いて、例えば、これに限定されないが、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のＳｆ９細胞などのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの昆虫細胞、または例えば、これに限定されないが、キンワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）由来のＴｎｉ前駆細胞もしくはＥｓｔｉｍａ  ａｃｒｅａ由来のＥ４ａ細胞などの別の昆虫由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞を感染させる、またはトランスフェクトする（または同時感染させるもしくは同時トランスフェクトする）ことができる。種々の構成において、細胞はＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）間の、例えば、これに限定されないがＡＡＶ５のＩＴＲ間の導入遺伝子で同時感染されてよい。いくつかの構成において、導入遺伝子は、例えば、これに限定されないが、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子などの、レポーター遺伝子であり得る。感染された（またはトランスフェクトされた）細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖され、それによってバキュロウイルスを生成する細胞株を形成できる。そのような細胞株は、繰り返して継代培養できる。種々の構成において、Ｃａｐ遺伝子またはＲｅｐ遺伝子などのＡＡＶ遺伝子を含むバキュロウイルスの力価は、ベクターがｈｒを含む場合継代７で総バキュロウイルスの力価の少なくとも２０％であり得る。種々の構成において、Ｃａｐ遺伝子またはＲｅｐ遺伝子などのＡＡＶ遺伝子を含むバキュロウイルスの力価は、ベクターがｈｒを含む場合継代７で総バキュロウイルスの力価の少なくとも３０％であり得る。種々の構成において、Ｃａｐ遺伝子またはＲｅｐ遺伝子などのＡＡＶ遺伝子を含むバキュロウイルスの力価は、ベクターがｈｒを含む場合継代７で総バキュロウイルスの力価の少なくとも４０％であり得る。種々の構成において、Ｃａｐ遺伝子またはＲｅｐ遺伝子などのＡＡＶ遺伝子を含むバキュロウイルスの力価は、ベクターがｈｒを含む場合継代７で総バキュロウイルスの力価の少なくとも５０％であり得る。種々の構成において、Ｃａｐ遺伝子またはＲｅｐ遺伝子などのＡＡＶ遺伝子を含むバキュロウイルスの力価は、ベクターがｈｒを含む場合継代７で総バキュロウイルスの力価の少なくとも６０％であり得る。種々の構成において、Ｃａｐ遺伝子またはＲｅｐ遺伝子などのＡＡＶ遺伝子を含むバキュロウイルスの力価は、ベクターがｈｒを含む場合継代７で総バキュロウイルスの力価の少なくとも７０％であり得る。種々の構成において、Ｃａｐ遺伝子またはＲｅｐ遺伝子などのＡＡＶ遺伝子を含むバキュロウイルスの力価は、ベクターがｈｒを含む場合継代７で総バキュロウイルスの力価の少なくとも８０％であり得る。種々の構成において、Ｃａｐ遺伝子またはＲｅｐ遺伝子などのＡＡＶ遺伝子を含むバキュロウイルスの力価は、ベクターがｈｒを含む場合継代７で総バキュロウイルスの力価の少なくとも９０％であり得る。種々の構成において、Ｃａｐ遺伝子またはＲｅｐ遺伝子などのＡＡＶ遺伝子を含むバキュロウイルスの力価は、ベクターがｈｒを含む場合継代７で総バキュロウイルスの力価の少なくとも１００％であり得る。種々の構成において、Ｃａｐ遺伝子またはＲｅｐ遺伝子などのＡＡＶ遺伝子を含むバキュロウイルスの力価は、ベクターがｈｒを含む場合継代１０で総バキュロウイルスの力価の少なくとも２０％であり得る。種々の構成において、Ｃａｐ遺伝子またはＲｅｐ遺伝子などのＡＡＶ遺伝子を含むバキュロウイルスの力価は、ベクターがｈｒを含む場合継代１０で総バキュロウイルスの力価の少なくとも５％であり得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本発明の教示はｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＡＶを増殖させる方法を含む。これらの方法では、ｈｒを含む本発明の教示のベクターを含む昆虫細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖され繰り返して継代培養され得る。いくつかの構成において、ｈｒを含まない対照ベクターを有する昆虫細胞株由来の継代７（Ｐ７）でのＡＡＶの相対収率は、ｈｒを含むベクターを有する昆虫細胞由来のＡＡＶ収率の６０％未満であり得る。いくつかの構成において、ｈｒを含まない対照ベクターを有する昆虫細胞株由来の継代７（Ｐ７）でのＡＡＶの相対収率は、ｈｒを含むベクターを有する昆虫細胞由来のＡＡＶ収率の５０％未満であり得る。いくつかの構成において、ｈｒを含まない対照ベクターを有する昆虫細胞株由来の継代７（Ｐ７）でのＡＡＶの相対収率は、ｈｒを含むベクターを有する昆虫細胞由来のＡＡＶ収率の４０％未満であり得る。いくつかの構成において、ｈｒを含まない対照ベクターを有する昆虫細胞株由来の継代７（Ｐ７）でのＡＡＶの相対収率は、ｈｒを含むベクターを有する昆虫細胞由来のＡＡＶ収率の３０％未満であり得る。いくつかの構成において、ｈｒを含まない対照ベクターを有する昆虫細胞株由来の継代７（Ｐ７）でのＡＡＶの相対収率は、ｈｒを含むベクターを有する昆虫細胞由来のＡＡＶ収率の２０％未満であり得る。いくつかの構成において、ｈｒを含まない対照ベクターを有する昆虫細胞株由来の継代１０（Ｐ１０）でのＡＡＶの相対収率は、ｈｒを含むベクターを有する昆虫細胞由来のＡＡＶ収率の２０％未満であり得る。
【００２７】
本発明の教示は、これに限定されないが、以下の態様を含む。
１．バキュロウイルスベクターであって、
ＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセット、ＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセット、およびＡＡＶ発現カセットの開始コドンから最大で約４ｋｂに位置するバキュロウイルス相同領域（ｈｒ）を含む、バキュロウイルスベクター。
２．５’から３’への順に、Ｃａｐ発現カセット、Ｒｅｐ発現カセット、およびバキュロウイルス相同領域（ｈｒ）を含む、態様１に記載のベクター。
３．５’から３’への順に、Ｒｅｐ発現カセット、Ｃａｐ発現カセット、およびバキュロウイルス相同領域（ｈｒ）を含む、態様１に記載のベクター。
４．５’から３’への順に、Ｃａｐ発現カセット、バキュロウイルス相同領域（ｈｒ）、およびＲｅｐ発現カセットを含む、態様１に記載のベクター。
５．５’から３’への順に、Ｒｅｐ発現カセット、バキュロウイルス相同領域（ｈｒ）、およびＣａｐ発現カセットを含む、態様１に記載のベクター。
６．５’から３’  への順に、バキュロウイルス相同領域（ｈｒ）、Ｃａｐ発現カセット、およびＲｅｐ発現カセットを含む、態様１に記載のベクター。
７．５’から３’への順に、バキュロウイルス相同領域（ｈｒ）、Ｒｅｐ発現カセット、およびＣａｐ発現カセットを含む、態様１に記載のベクター。
８．ｈｒ領域がＲｅｐ発現カセットとＣａｐ発現カセットとの間にあり、かつＲｅｐ発現カセットとＣａｐ発現カセットとが頭−頭（５’−５’）配向にある、態様１に記載のベクター。
９．バキュロウイルス相同領域がｈｒ２配列である、態様１〜９のいずれか１態様に記載のベクター。
１０．ベクターがＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を含まない、態様１〜９のいずれか１態様に記載のベクター。
１１．細胞を含む昆虫細胞株であって、態様１〜１０のいずれか１態様に記載のベクターを含む、昆虫細胞株。
１２．細胞が第２のベクターをさらに含み、上記第２のベクターがＡＡＶ  ＩＴＲに隣接される導入遺伝子を含む、態様１１に記載の昆虫細胞株。
１３．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでバキュロウイルスを増殖させる方法であって、態様１１または態様１２に記載の昆虫細胞の培養物を用意すること、およびこの細胞をインキュベートすることを含む、方法。
１４．細胞をインキュベートすることが細胞を継代培養することを含み、および継代７でのＡＡＶ生成収率がＡＡＶ  Ｃａｐ発現カッセットと、ＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセットとを含むがバキュロウイルスｈｒを含まないバキュロウイルスベクターを含む対照昆虫細胞株と比較して少なくとも２倍大きい、態様１３に記載の方法。
１５．ＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセットを含むバキュロウイルスの継代７での力価が総バキュロウイルス力価（総バキュロウイルスについてはｇｐ６４のｑＰＣＲによって、ＡＡＶについてはＣａｐのｑＰＣＲによって測定される）の２１．５％を上回る、態様１３に記載の方法。
１６．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＡＶを増殖させる方法であって、昆虫細胞の培養物を用意すること、この昆虫細胞を態様１〜１０のいずれか１態様に記載のバキュロウイルスベクターで感染することまたはトランスフェクトすること、およびこの細胞をインキュベートすることを含む、方法。
１７．昆虫細胞由来のＡＡＶの継代７での収率がｈｒを含まないバキュロウイルスベクターを含む昆虫細胞由来のＡＡＶの継代７での収率よりも少なくとも５０％大きい、態様１６に記載の方法。
１８．バキュロウイルスｈｒを含む細胞由来のＡＡＶの継代７での収率がｈｒを含まないバキュロウイルスベクターを含む細胞由来のＡＡＶの収率よりも少なくとも２０％大きい、態様１６に記載の方法。
１９．バキュロウイルスベクターがＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を含まない、態様１６に記載の方法。
２０．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＡＶを生成する方法であって、態様１〜１０のいずれか１態様に記載のベクター、およびＡＡＶ  ＩＴＲに隣接される導入遺伝子を含むベクターを含む昆虫細胞培養物を増殖させることを含む、方法。
２１．ｉｎ  ｖｉｔｒｏで昆虫細胞においてＡＡＶを生成するためのＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）を含まないバキュロウイルスベクターであって、ＡＡＶ  Ｃａｐ発現カセット、ＡＡＶ  Ｒｅｐ発現カセット、およびＡＡＶ発現カセットの開始コドンから最大で約４ｋｂに位置するバキュロウイルス相同領域（ｈｒ）を含む、バキュロウイルスベクター。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ＡＡＶ８カプシド遺伝子とＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子との間にｈｒ２配列を含む、本発明の教示のバキュロウイルスシャトルプラスミドを例示する。
【図２】ＡＡＶ８Ｃａｐ遺伝子、およびＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子とゲンタマイシン耐性（ＧｍＲ）遺伝子との間のｈｒ２配列を含む、本発明の教示のバキュロウイルスシャトルプラスミドを例示する。
【図３】ＡＡＶ９Ｃａｐ遺伝子、およびＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子とゲンタマイシン耐性（ＧｍＲ）遺伝子との間のｈｒ２配列を含む、本発明の教示のバキュロウイルスシャトルプラスミドを例示する。
【図４】ＡＡＶ６Ｃａｐ遺伝子、およびＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子とゲンタマイシン耐性（ＧｍＲ）遺伝子との間のｈｒ２配列を含む、本発明の教示のバキュロウイルスシャトルプラスミドを例示する。
【図５】ＡＡＶ１Ｃａｐ遺伝子、およびＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子とゲンタマイシン耐性（ＧｍＲ）遺伝子との間のｈｒ２配列を含む、本発明の教示のバキュロウイルスシャトルプラスミドを例示する。
【図６】ＡＡＶ５Ｃａｐ遺伝子、およびＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子とゲンタマイシン耐性（ＧｍＲ）遺伝子との間のｈｒ２配列を含む、本発明の教示のバキュロウイルスシャトルプラスミドを例示する。
【図７】バキュロウイルスシャトルプラスミドＶ３７２−ｐＦＢ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−ＳＶ４０ｐＡ一完全ＩＴＲでの２つのＩＴＲに隣接されるＧＦＰ発現カセットを例示する。
【図８】ｈｒ２配列を有するまたは有しない組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）による比較のＡＡＶ生成収率を例示する。
【図９Ａ】継代３〜継代１０からのｈｒ２配列の有無による比較の組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）力価を例示する。
【図９Ｂ】継代３〜継代１０からのｈｒ２配列の有無による比較の組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）力価を例示する。
【図９Ｃ】継代３〜継代１０からのｈｒ２配列の有無による比較の組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）力価を例示する。
【図９Ｄ】継代３〜継代１０からのｈｒ２配列の有無による比較の組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）力価を例示する。
【図９Ｅ】継代３〜継代１０からのｈｒ２配列の有無による比較の組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）力価を例示する。
【図９Ｆ】継代３〜継代１０からのｈｒ２配列の有無による比較の組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）力価を例示する。
【図９Ｇ】継代３〜継代１０からのｈｒ２配列の有無による比較の組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）力価を例示する。
【図９Ｈ】継代３〜継代１０からのｈｒ２配列の有無による比較の組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）力価を例示する。
【図１０Ａ】ＡＡＶ株間の継代３〜継代１０からのまたは継代１０でのｈｒ２配列の有無による組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）間の比較のＡＡＶ生成収率を例示する。
【図１０Ｂ】ＡＡＶ株間の継代３〜継代１０からのまたは継代１０でのｈｒ２配列の有無による組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）間の比較のＡＡＶ生成収率を例示する。
【図１０Ｃ】ＡＡＶ株間の継代３〜継代１０からのまたは継代１０でのｈｒ２配列の有無による組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）間の比較のＡＡＶ生成収率を例示する。
【図１０Ｄ】ＡＡＶ株間の継代３〜継代１０からのまたは継代１０でのｈｒ２配列の有無による組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）間の比較のＡＡＶ生成収率を例示する。
【図１０Ｅ】ＡＡＶ株間の継代３〜継代１０からのまたは継代１０でのｈｒ２配列の有無による組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）間の比較のＡＡＶ生成収率を例示する。
【図１１Ａ】ｈｒ２配列を有するまたは有しない組換えバキュロウイルスで感染された細胞中のＡＡＶカプシドタンパク質のウエスタンブロット発現を例示する。
【図１１Ｂ】ｈｒ２配列を有するまたは有しない組換えバキュロウイルスで感染された細胞中のＡＡＶカプシドタンパク質のウエスタンブロット発現を例示する。
【図１２Ａ】ｈｒ２配列を有するまたは有しない組換えバキュロウイルスで感染された細胞中のＡＡＶｒｅｐタンパク質のウエスタンブロット発現を例示する。
【図１２Ｂ】ｈｒ２配列を有するまたは有しない組換えバキュロウイルスで感染された細胞中のＡＡＶｒｅｐタンパク質のウエスタンブロット発現を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書に記載の方法および組成物は、当業者に周知の検査技法を利用しており、これらの技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ２００１；  Ｓｐｅｃｔｏｒ，  Ｄ．  Ｌ．ら，Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９９８；Ｎａｇｙ，  Ａ．，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ２００３およびＨａｒｌｏｗ，  Ｅ．，  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９９９に見出すことができる。本明細書および添付のいずれかの特許請求項で用いる場合、文脈上別途指示しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数形も組み入れることを意図する。
【００３０】
以下の材料および方法は、本発明の教示の種々の態様でも用いられる。
【００３１】
昆虫細胞培養：
ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞、キンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）細胞およびＥｓｔｉｍａ  ａｃｒｅａ細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇストレージボトル中の１００単位／ｍＬのペニシリンと１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を補充したＥＳＦ９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で、２８℃で培養した。細胞密度が８×１０６細胞／ｍＬに達したならば、細胞を維持のために１：４に分けた。
【００３２】
プラスミド構築と組換えバキュロウイルスの生成：
ｈｒ２配列をバキュロウイルスゲノムからＰＣＲ増幅し、プラスミドＶ０５３−ｐＦＢＤ−ｉｎＲｅｐＯｐｔ−ｉｎＣａｐ８中にクローン化して、Ｖ０５９−ｐＦＢＤ−ｉｎＲｅｐＯｐｔ−ｈｒ２−ｉｎＣａｐ８を作製した。ｋｏｚａｋ配列を組み入れるために、プラスミドＶ０５９をＢｓｔＺ１７１とＡｇｅｌで切断してＢｓｔＺ１７１−Ａｇｅｌフラグメントを除去し、ＢｓｔＺ１７１−ＡｇｅｌフラグメントをＶ１５０−ｐＦＢ−ｉｎＣａｐ８−ｉｎＲｅｐ−ｋｏｚａｋからのＶＰ１開始コドンの上流のｋｏｚａｋ配列と置き換えて、ｈｒ２がＲｅｐ発現カセットとＣａｐ発現カセットとの間に位置するＶ２７７−ｐＦＢ−ｉｎＣａｐ８−ｈｒ２−ｉｎＲｅｐ−ｋｏｚａｋを作製した。ｈｒ２配列をＲｅｐ発現カセットのポリＡ配列の後の別の部位に挿入するために、ｈｒ２配列を、Ｖ２７７からのプライマー３２０５Ｆ（５’−ＧＣＴＴＴＡＣＧＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＧＴＧＴ−３’配列番号７）および３２０６Ｒ（５’−ＧＧＣＣＴＡＣＧＴＡＧＴＴＴＴＡＣＡＣＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＣＧＴ−３’配列番号８）でＰＣＲ増幅した。ｐｃプロモーター配列を、Ｖ１５０からのプライマー３０６５Ｆ（５’−ＡＴＴＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＡＧＧＧＣＣＧ−３’配列番号９）および３２０４Ｒ（５’−ＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＣＧＴＡＡＡＧＣＣＣＡＧＴＴＧＡＣＡＴＡＡＧＣＣＴＧＴＴＣＧ−３’配列番号１０）で増幅した。これらのｈｒ２およびｐｃプロモーターＰＣＲフラグメントを、プライマー３０６５Ｆおよび３２０６Ｒでの２回目のＰＣＲ反応によって結合した。結合したＰＣＲフラグメントを、ＢｓｒＧＩおよびＳｎａＢＩで消化し、Ｖ１５０、Ｖ２１２、Ｖ１９５、Ｖ１８８、およびＶ１４６のＢｓｒＧＩ部位およびＳｎａＢＩ部位にライゲートして、それぞれ、Ｖ２８８−ｐＦＢ−ｉｎＣａｐ８−ｉｎＲｅｐ−ｈｒ２、Ｖ２８９−ｐＦＢ−ｉｎＣａｐ９−ｉｎＲｅｐ−ｈｒ２、Ｖ２９０−ｐＦＢ−ｉｎＣａｐ６−ｉｎＲｅｐ−ｈｒ２、Ｖ２９１−ｐＦＢ−ｉｎＣａｐ１−ｉｎＲｅｐ−ｈｒ２、およびＶ２９５−ｐＦＢ−ｉｎＣａｐ５−ｉｎＲｅｐ−ｈｒ２を作製した。ｈｒ配列挿入を有するプラスミドの例を、図１〜６に図示する。
【００３３】
プラスミドｐＦＢ−ＣＭＶ−ＧＦＰを、ＧＦＰフラグメントをＰＣＲ増幅することにより構築し、次いでこれをＶ０３２−ｐＦＢ−ＣＭＶ−ＳＶ４０ｐＡの多重クローニング部位にクローン化した（図７）。
【００３４】
これらのプラスミドを用いて、メーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のプロトコルに従って、バクミドを生成した。手短に言うと、プラスミドを２ｎｇ／μＬの濃度に希釈し、２μＬのプラスミドＤＮＡを用いてＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞を形質転換した。２日間のインキュベーション後に、白色コロニーを選び、ミニプレップバクミドＤＮＡを調製した。ミニプレップバクミドＤＮＡを用いてＳｆ９細胞をトランスフェクトして、組換えバキュロウイルスを生成した。
【００３５】
組換えバキュロウイルスのプラーク精製と継代培養：
均質クローンを得るために、生成した組換えバキュロウイルスをプラーク精製した。手短に言うと、Ｓｆ９細胞を、２ｍＬのＥＳＦ９２１培地中で１．５ｅ＋６細胞／ウェルの細胞密度で６ウェルプレート上に播種し、２８℃で３０分間、インキュベートした。バキュロウイルスを、１ｍＬ容量で１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６、および１０−７にそれぞれ希釈した。インキュベーション終了時に、培地をウェルから除去し、２５０μＬの各希釈液を添加して、２８℃で１時間、Ｓｆ９細胞を感染した。インキュベーション終了時に、３ｍＬの１％のアガロースオーバーレイ（４２℃まで冷却）をウェルに添加した。アガロースが凝固すると、２ｍＬのＥＳＦ９２１培地を各ウェルに添加し、プレートを２８℃で５〜７日間インキュベートした。十分に形成されたプラークを選び、継代のために昆虫細胞を感染するのに用いた。
【００３６】
プラーク精製した組換えバキュロウイルスを継代培養するために、昆虫細胞を約１ｍｏｉのウイルスで２８℃で３日間感染し、上清を収集した。収集したウイルスを用いて、もう一度新鮮な昆虫細胞を感染し、これを継代１０まで続けた。
【００３７】
組換えバキュロウイルスとＡＡＶベクターのリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）定量：
組換えバキュロウイルスとＡＡＶの力価を決定するために、ｑＰＣＲ法を用いた。１プラーク形成単位（ｐｆｕ）がウイルスの約２０ゲノムコピーを含むことが、経験的に決定された。手短に言うと、収集したウイルスをｑＰＣＲ希釈緩衝液中で希釈し、９５℃に３０分間加熱してウイルス粒子を破壊した。処理したウイルス試料を次いで、既知の標準とともにＣＨＲＯＭＯ４（商標）システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中でアッセイした。Ｃｔ値をｐｆｕに変換し、これを用いて、バキュロウイルス継代培養とＡＡＶ生成を誘導した。
【００３８】
ＡＡＶベクター生成および定量：
組換えバキュロウイルスを用いて昆虫細胞を感染させ、ＡＡＶベクターを生成した。手短に言うと、ｈｒ２配列を有するまたは有しないＲｅｐ遺伝子およびＣａｐ遺伝子を含有する１０ｍｏｉの組換えバキュロウイルスを、ＡＡＶ  ＩＴＲに隣接されるＧＦＰマーカー遺伝子を含有する５ｍｏｉの組換えバキュロウイルスとともに２８℃で３日間同時感染させた。細胞ペレットを、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により収集した。細胞ペレットを、超音波処理によってＳｆ９溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のＳａｒｋｏｓｙｌ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１４０単位／ｍＬのベンゾナーゼ）中で溶解した。細胞破壊片を、８０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によって除去した。透明溶解液を、次のようにＡＡＶ生産性の定量のために用いた：溶解液を、ｑＰＣＲ希釈緩衝液で希釈し、混入しているＤＮＡを、デオキシリボヌクレアーゼＩ酵素と３７℃で１時間インキュベートすることによって破壊した。デオキシリボヌクレアーゼＩ酵素を、１００ｍＭのＥＤＴＡの存在下で、９５℃で３０分間、加熱することによって不活性化した。処理したＡＡＶ試料をさらに希釈し、Ｃｈｒｏｍｏ４  ｑＰＣＲ装置でアッセイした。Ｃｔ値を、ＡＡＶベクターゲノムコピーに変換した。
【００３９】
ウエスタンブロット解析：
ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスを用いて３日間Ｓｆ９細胞を感染し、細胞ペレットを、３，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により収集した。約２×１０６細胞を含む細胞ペレットを３００μＬのＰＢＳ緩衝液中に最初に再懸濁し、次いで１００μＬの４×ＬＤＳ試料緩衝液とともにボルテックスして、細胞を溶解した。溶解物を９５℃で５分間加熱し、次いで２０秒間、超音波処理して、ゲノムＤＮＡをせん断した。短時間の遠心分離の後、溶解物を次いで１０％ＳＤＳ−ゲル上にロードして、タンパク質を分離した。タンパク質を次いで、ゲルからニトロセルロース膜に移した。５％脱脂乳でのブロッキング後に、膜をｒｅｐタンパク質またはｃａｐタンパク質に対する特異的抗体を用いて探索した。第１の抗体に対し西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合された第２の抗体を用いて、カラー・マトリックス反応によりｒｅｐタンパク質またはｃａｐタンパク質を検出した。
【００４０】
実施例
本発明の教示は、いずれの特許請求の範囲または態様を限定することを意図しない実施例に記載の説明を含む。具体的に過去形で示されない限り、実施例は仮想例または実際例であり得る。以下の非限定例は、本発明の教示をさらに例示するために提供される。本開示の観点から、多くの変更が開示された特定の実施形態においてなされ、および本発明の教示の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をさらに得られることを当業者は理解する。
【００４１】
実施例１
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
【００４２】
このプラスミドにおいて（図１）、ｈｒ２配列は、ＡＡＶ８カプシド遺伝子カセットとＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子カセットとの間に位置する。ベクターは、頭−頭配向でＣａｐ遺伝子とＲｅｐ遺伝子を含む。このシャトルプラスミドを用いて組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を生成し、次にこれを用いて昆虫細胞中でＡＡＶ８を生成した。
【００４３】
実施例２
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
【００４４】
このプラスミドにおいて（図２）、ｈｒ２配列は、ＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子カセットとゲンタマイシン耐性（ＧｍＲ）との間に位置する。このベクターは、ＡＡＶ８カプシド遺伝子カセットも含む。Ｃａｐ遺伝子とＲｅｐ遺伝子は、頭−尾部配向にある。このプラスミドを用いて組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を生成し、次にこれを用いて昆虫細胞中でＡＡＶ８を生成した。
【００４５】
実施例３
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
【００４６】
このプラスミドにおいて（図３）、ｈｒ２配列は、ＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子カセットとゲンタマイシン耐性（ＧｍＲ）との間に位置する。このベクターは、ＡＡＶ９カプシド遺伝子カセットも含む。Ｃａｐ遺伝子とＲｅｐ遺伝子は、頭−尾部配向にある。このプラスミドを用いて組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を生成し、次にこれを用いて昆虫細胞中でＡＡＶ９を生成した。
【００４７】
実施例４
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
【００４８】
このプラスミドにおいて（図４）、ｈｒ２配列は、ＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子カセットとゲンタマイシン耐性（ＧｍＲ）との間に位置する。このベクターは、ＡＡＶ６カプシド遺伝子カセットも含む。Ｃａｐ遺伝子とＲｅｐ遺伝子は、頭−尾部配向にある。このプラスミドを用いて組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を生成し、次にこれを用いて昆虫細胞中でＡＡＶ６を生成した。
【００４９】
実施例５
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
【００５０】
このプラスミドにおいて（図５）、ｈｒ２配列は、ＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子カセットとゲンタマイシン耐性（ＧｍＲ）との間に位置する。このベクターは、ＡＡＶ１カプシド遺伝子カセットも含む。Ｃａｐ遺伝子とＲｅｐ遺伝子は、頭−尾部配向にある。このプラスミドを用いて組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を生成し、次にこれを用いて昆虫細胞中でＡＡＶ１を生成した。
【００５１】
実施例６
本実施例は本発明の教示のシャトルベクターを例示する。
【００５２】
このプラスミドにおいて（図６）、ｈｒ２配列は、ＡＡＶ２  ｒｅｐ遺伝子カセットとゲンタマイシン耐性（ＧｍＲ）との間に位置する。このベクターは、ＡＡＶ５カプシド遺伝子カセットも含む。Ｃａｐ遺伝子とＲｅｐ遺伝子は、頭−尾部配向にある。このプラスミドを用いて組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）を生成し、次にこれを用いて昆虫細胞中でＡＡＶ５を生成した。
【００５３】
実施例７
本実施例はｈｒ配列がＡＡＶ生成収率を高めることを例示する。
【００５４】
これらの実験において、ｈｒ２配列を、プラスミドＶ２７７（図１）中のＲｅｐ発現カセットとＣａｐ発現カセットとの間またはプラスミドＶ２８９（図３）およびＶ２９５（図６）中のＲｅｐ発現カセットのポリＡ配列の後のいずれかにクローン化し、組換えバキュロウイルスを調製した。これらの組換えバキュロウイルスを用いて、ＡＡＶ生成のためにＧＦＰ遺伝子を保有している組換えバキュロウイルスとともにＳｆ９細胞を同時感染した。結果を第８図に示す。データは、ｈｒ２配列が、ｈｒ２配列の位置およびＡＡＶ血清型とは関係なくＡＡＶの生産性を高めることを示している。ＡＡＶ生産性の増加は、ｈｒ２欠損対照と比較して、２倍〜４倍の範囲であった。
【００５５】
実施例８
本実施例は、ｈｒ配列がＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子を含有する組換えバキュロウイルスの安定性を高めることを例示する。
【００５６】
これらの実験において、ｈｒ２配列を有するまたは有しない組換えバキュロウイルスの安定性をさらに解析するために、組換えバキュロウイルスのプラーク精製および多数継代を使用した。ｇｐ６４遺伝子（本発明の教示のすべての組換えバキュロウイルスに存在する）に対応する、ｇｐ６４Ｆ（５’−ＣＣＣＴＣＴＧＴＧＴＡＣＴＴＧＧＣＴＣＴＡＡＣＧ−３’配列番号１１）とｇｐ６４Ｒ（５’−ＣＧＧＴＧＡＡＡＣＧＣＡＡＡＧＴＣＧＡＧＣＡＣＣＧ−３’配列番号１２）との一対のｑＰＣＲプライマーを用いて、総バキュロウイルス力価を決定した。Ｒｅｐ発現カセットとＣａｐ発現カセットを含むバキュロウイルスについて、Ｒｅｐ配列に対応する、Ｒｅｐ２Ｆ（５’−ＡＴＴＣＡＴＧＣＴＣＣＡＣＣＴＣＡＡＣＣ−３’配列番号１３）とＲｅｐ２Ｒ（５’−ＧＣＣＧＴＣＴＧＧＡＴＣＡＴＧＡＣＴＴＴ−３’配列番号１４）との一対のｑＰＣＲプライマーを用いて、これらのバキュロウイルスの力価を決定した。Ｃａｐ１−Ｒｅｐ（図５）、Ｃａｐ６−Ｒｅｐ（図４）、Ｃａｐ９−Ｒｅｐ（図３）およびＣａｐ８−Ｒｅｐ（図２）を保有している組換えバキュロウイルスを、これらの実験のために選択した。各継代について、総バキュロウイルスのプラーク形成単位（ｐｆｕ）をｇｐ６４プライマーで決定し、１００％とした。各継代の特定のバキュロウイルスを、総バキュロウイルスのパーセンテージとして、Ｒｅｐプライマーセットを使用して決定した。第ｈｒ２配列を有するまたは有しない組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）力価について、結果を図９Ａ〜Ｈに示す。図９Ａは、ｈｒ２配列なしでＡＡＶ１カプシド遺伝子とＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子を発現するｒＢＶ−ｉｎＣａｐ１−ｉｎＲｅｐ（Ｃａｐ１  Ｖ１８８）を有する細胞においてｇｐ６４とｒｅｐ２のｑＰＣＲプライマーを用いて決定したｒＢＶ力価を例示する。図９Ｂは、ｒＢＶ−ｉｎＣａｐ１−ｉｎＲｅｐ−ｈｒ２（ｈｒ２配列を有してＡＡＶ１カプシド遺伝子とＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子を発現するＣａｐ１  Ｖ２９１）を有する細胞においてｇｐ６４とｒｅｐ２のｑＰＣＲプライマーを用いて決定したｒＢＶ力価を例示する。図９Ｃは、ｈｒ２配列なしでＡＡＶ６カプシド遺伝子とＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子を発現するｒＢＶを有する細胞においてｇｐ６４とｒｅｐ２のｑＰＣＲプライマーを用いて決定したｒＢＶ力価を例示する。図９Ｄは、ｈｒ２配列を有してＡＡＶ６カプシド遺伝子とＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子を発現するｒＢＶ−ｉｎＣａｐ６−ｉｎＲｅｐ（Ｃａｐ６  Ｖ１９５）を有する細胞においてｇｐ６４とｒｅｐ２のｑＰＣＲプライマーを用いて決定したｒＢＶ力価を例示する。図９Ｅは、ｈｒ２配列なしでＡＡＶ９カプシド遺伝子とＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子を発現するｒＢＶ−ｉｎＣａｐ９−ｉｎＲｅｐ（Ｃａｐ９  Ｖ２１２）を有する細胞においてｇｐ６４とｒｅｐ２のｑＰＣＲプライマーを用いて決定したｒＢＶ力価を例示する。図９Ｆは、ｈｒ２配列を有してＡＡＶ９カプシド遺伝子とＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子を発現するｒＢＶ−ｉｎＣａｐ９−ｉｎＲｅｐ−ｈｒ２（Ｃａｐ９  Ｖ２８９）を有する細胞においてｇｐ６４とｒｅｐ２のｑＰＣＲプライマーを用いて決定したｒＢＶ力価を例示する。図９Ｇは、ｈｒ２配列なしでＡＡＶ８カプシ��遺伝子とＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子を発現するｒＢＶ−Ｃａｐ８−ｉｎＲｅｐ（Ｃａｐ８  Ｖ１５０）を有する細胞においてｇｐ６４とｒｅｐ２のｑＰＣＲプライマーを用いて決定したｒＢＶ力価を例示する。図９Ｈは、ｈｒ２配列を有してＡＡＶ８カプシド遺伝子とＡＡＶ２ｒｅｐ遺伝子を発現するｒＢＶ−ｉｎＣａｐ８−ｉｎＲｅｐ−ｈｒ２（Ｃａｐ８  Ｖ２８８）を有する細胞においてｇｐ６４とｒｅｐ２のｑＰＣＲプライマーを用いて決定したｒＢＶ力価を例示する。ｒＢＶを、Ｓｆ９細胞（図９Ａ〜Ｄ）、Ｔｎｉ前駆細胞（図９Ｅ〜Ｆ）およびＥ４ａ細胞（図９Ｇ〜Ｈ）において生成し、継代培養した。データは、バキュロウイルスがｈｒ２配列を含まなかった場合、特定のバキュロウイルス力価は継代数の増加とともに減少した（図９Ａ、図９Ｃ、図９Ｅおよび図９Ｇ）が、バキュロウイルスがｒｅｐ発現カセットの近くにｈｒ２配列を含んだ場合、特定のバキュロウイルス力価のより小さな減少があった（図９Ｂ、図９Ｄ、図９Ｆおよび図９Ｈ）ことを示す。これらの変化は、Ｓｆ９（図９Ａ〜９Ｄ）、Ｔｎｉ前駆細胞（図９Ｅ〜Ｆ）、またはＥ４ａ細胞（図９Ｇ〜Ｈ）が宿主細胞であったかどうかに関係なく、当てはまった。継代１０までに、ベクターがｈｒを含有しなかった場合、ＡＡＶ  Ｃａｐ１またはＡＡＶ  Ｃａｐ６を有するバキュロウイルスは総ｒＢＶ力価の１０％を下回った（図９Ａ、図９Ｃ、図９Ｅおよび図９Ｇ）が、ベクターがｈｒ２を含有した場合、ＡＡＶ  Ｃａｐ１またはＡＡＶ  Ｃａｐ６を有するバキュロウイルスは総ｒＢＶ力価の約２０％であった（図９Ｂ、図９Ｄ、図９Ｆ、図９Ｈ）。
【００５７】
実施例９
本実施例は、ｈｒ配列がＡＡＶｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子を含有する組換えバキュロウイルス（ｒＢＶ）のＡＡＶ生産性を高めることを例示する。
【００５８】
これらの実験において、継代３〜継代１０のｈｒ配列を有するまたは有しないｒＢＶを用いて、ＧＦＰを含有するｒＢＶとともに、Ｓｆ９、Ｔｎｉ前駆細胞およびＥ４ａの細胞株を同時感染してＡＡＶベクターを生成した。同時感染から３日後に、細胞ペレットを収集し、ＡＡＶ生成収率を決定した。図１０Ａ〜Ｄに示すように、Ｓｆ９細胞でのＡＡＶ１（図１０Ａ）、Ｓｆ９細胞でのＡＡＶ６（図１０Ｂ）、Ｔｎｉ前駆細胞でのＡＡＶ９（図１０Ｃ）およびＥ４ａ細胞でのＡＡＶ８（図１０Ｄ）の生成収率は、バキュロウイルスベクターがｈｒ２配列を含んだ場合、継代３〜１０にわたり維持された。対照的に、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ９およびＡＡＶ８の生成収率は、ｒＢＶ中にｈｒ２を含まない場合、継代３〜１０にわたり劇的に減少した。この観察をさらに確認するために、Ｓｆ９細胞を、ｈｒ２配列を含む（Ｖ２９０、Ｖ２８８およびＶ２８９）またはｈｒ２配列を含まない（Ｖ１９５、Ｖ１５０およびＶ２１２）継代１０のｒＢＶで同時感染して、ＡＡＶ６（Ｖ１９５およびＶ２９０）、ＡＡＶ８（Ｖ１５０およびＶ２８８）、およびＡＡＶ９（Ｖ２１２およびＶ２８９）ベクターを生成した。結果は、ｈｒ２を含有するｒＢＶで感染されたＳｆ９細胞からのＡＡＶ生成収率がｈｒ２配列を含まないｒＢＶで感染されたＳｆ９細胞よりも大幅に高い（図１０Ｅ）（ｈｒ＋ｒＢＶ  Ｖ２９０、Ｖ２８８およびＶ２８９を、ｈｒ−ｒＢＶ  Ｖ１９５、１５０およびＶ２１２と比較して）ことを示す。
【００５９】
実施例１０
本実施例は、ＡＡＶ  ｒｅｐとｃａｐの発現が多数継代を通してｒＢＶ安定性と直接相関することを例示する。
【００６０】
これらの実験において、ウエスタンブロットを行って、ｒｅｐタンパク質とｃａｐタンパク質の発現レベルを決定した。図１１Ａ〜Ｂは、それぞれ継代３〜継代１０のｈｒ２配列を含まない組換えバキュロウイルスｒＢＶ−ｉｎＣａｐ６−ｉｎＲｅｐ（Ｖ１９５）（図１１Ａ）およびｈｒ２配列を含むｒＢＶ−ｉｎＣａｐ６−ｉｎＲｅｐ−ｈｒ２（Ｖ２９０）（図１１Ｂ）でのＳｆ９細胞の感染後のＡＡＶ６カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３の発現を例示する。Ｍ、タンパク質サイズマーカー；レーン１〜８、継代３〜１０のｒＢＶで感染されたＳｆ９細胞から調製した細胞溶解物。
【００６１】
図１２Ａ〜Ｂは、ｈｒ２配列を含まない組換えバキュロウイルスｒＢＶ−ｉｎＣａｐ８−ｉｎＲｅｐ（Ｖ１５０）（図１２Ａ）およびｈｒ２配列を含むｒＢＶ−ｉｎＣａｐ８−ｉｎＲｅｐ−ｈｒ２（Ｖ２８８）（図１２Ｂ）でのＳｆ９細胞の感染後のＡＡＶ２ｒｅｐタンパク質ＲＥＰ７８とＲＥＰ５２の発現を例示する。Ｍ、タンパク質サイズマーカー；レーン１〜５、継代６〜１０のｒＢＶで感染されたＳｆ９細胞から調製した細胞溶解物。図１１および図１２の結果は、ｈｒ配列を含まないｒＢＶと比較して、ｈｒ配列を含むｒＢＶが、後の継代を含み、多数の継代にわたりｒｅｐタンパク質とｃａｐタンパク質を高いレベルで発現することを示す。
【００６２】
引用したすべての参考文献は、各々その全体を参照により取り込まれる。出願人は、いずれの参考文献の著者によって提示されるいずれの結論に異議を申し立てる権利を保有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【国際調査報告】
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