(57)【要約】本開示の主題は、皮質ニューロンへのヒト幹細胞の分化を誘導するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、およびこのような方法によって発生した皮質ニューロンを提供する。本開示の主題はまた、神経変性ＣＮＳ障害を処置するための、このような皮質ニューロンの使用を提供する。この方法は、幹細胞集団を、有効濃度の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤などを含む阻害剤に曝露するステップを含み得る。
2019506901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を分化させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、複数の細胞が分化し、１種または複数の皮質ニューロン前駆体マーカーを発現するように、幹細胞集団を、有効濃度の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤への曝露の開始後、少なくとも６日目に、検出可能なレベルのＰＡＸ６を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤への曝露の開始後、６日目までに、検出可能なレベルのＰＡＸ６を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞集団を前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露した後、少なくとも２日目または３日目に、前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を前記幹細胞集団に曝露する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞集団を前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露した後、２日目または３日目までに、前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤を前記幹細胞集団に曝露する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の細胞が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤への曝露後、少なくとも１３日目に、ＴＵＪ１、ＴＢＲ１、ＴＬＥ４、ＤＣＸ、ＲＥＥＬＩＮ、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＦＯＸＰ２、ＲＧＳ４、ＣＵＸ２、ＢＬＢＰ、およびそれらの組合せからなる群から選択される検出可能なレベルのマーカーを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の細胞が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤への曝露後、１３日目までに、ＴＵＪ１、ＴＢＲ１、ＴＬＥ４、ＤＣＸ、ＲＥＥＬＩＮ、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＦＯＸＰ２、ＲＧＳ４、ＣＵＸ２、ＢＬＢＰ、およびそれらの組合せからなる群から選択される検出可能なレベルのマーカーを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
検出可能なレベルのＴＵＪ１を発現する前記複数の細胞の少なくとも５０％が、検出可能なレベルのＴＢＲ１、ＴＬＥ４、またはそれらの組合せも発現する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記幹細胞集団が、前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露された後、少なくとも１６日目に、分化した皮質ニューロンの電気生理学的活性を示す、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に少なくとも６日間曝露する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に６日間まで曝露する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に少なくとも７日間曝露する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および前記ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤を、前記幹細胞集団に７日間まで曝露する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＸＡＶ９３９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＰＤ０３２５９０１、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、ＳＵ５４０２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤が、γ−セクレターゼ阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記γ−セクレターゼ阻害剤が、ＤＡＰＴ、それらの誘導体、またはそれらの混合物を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２１】
前記幹細胞が、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびＦクラス多能性幹細胞からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞を皮質ニューロンに成熟させるのに好都合な条件に、前記複数の細胞を晒すステップをさらに含み、前記複数の細胞を、ＢＤＮＦ、ｃＡＭＰ、およびアスコルビン酸シグナル伝達を活性化する１種または複数の化合物に曝露するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
１種または複数の皮質ニューロンマーカーまたはそれらの前駆体を発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って幹細胞集団から誘導される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団。
【請求項２４】
請求項２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含む、組成物。
【請求項２５】
対象の神経変性障害を処置する方法であって、有効量の請求項２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項２６】
前記対象が、神経変性障害を有すると診断を受けたか、またはその危険性がある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記神経変性障害が、パーキンソン病である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
神経変性障害を処置するための医薬の製造における、請求項２３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団の使用。
【請求項２９】
幹細胞の分化を誘導するためのキットであって、
（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｃ）ウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｅ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｅ）ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、
（ｆ）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および
（ｇ）請求項１から２２のいずれか一項に記載の１種または複数の皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団への前記幹細胞の分化を誘導するための指示書
の１つまたは複数を含む、キット。
【請求項３０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団を含むキットであって、前記細胞集団が、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って分化する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年１月２７日に出願された米国仮出願番号第６２／２８７，８２１号、および２０１７年１月２３日に出願された米国仮出願番号第６２／４４９，４８８号に基づく優先権を主張しており、これら仮出願の各々の内容は、それらの全体が本明細書中に参考として援用され、そしてそれらの各々に基づく優先権が主張される。
【０００２】
補助金情報
本発明は、国立衛生研究所によって授与された補助金番号Ｒ０１ＮＳ０７２３８１およびＮＳ０８４３３４の下の政府支援でなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
１．緒言
本開示の主題は、ヒト幹細胞から誘導された皮質ニューロンおよびそれらの前駆体、ならびに神経障害の細胞ベースの処置におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．発明の背景
過去数年にわたって、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）を初期神経系統に変換するための方法が開発されてきた。特に効率的な戦略は、分化１１日目以内にヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）またはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からＰＡＸ６＋中枢神経系（ＣＮＳ）神経前駆体への分化を誘発するために、ＳＭＡＤシグナル伝達を阻害する小分子（例えば、二重ＳＭＡＤ阻害）を使用することである１。神経サブタイプの指定は、ＷＮＴシグナル伝達などのさらなる小分子標的化経路を使用して、さらに調節され得る。二重ＳＭＡＤ阻害条件下でＷＮＴシグナル伝達を活性化する化合物に時限的に曝露すると、ＳＯＸ１０＋神経堤系統が誘導される。それとは対照的に、ＷＮＴシグナル伝達の阻害は、ＦＯＸＧ１＋前脳前駆体の誘導を増強する２〜４。これらの操作は、定義された神経前駆体細胞集団を効率的に特定するが、機能的ニューロンへのさらなる分化は、数ヶ月まではかからないとしても数週間に及ぶ場合がある、長期にわたるプロセスになっている。ニューロンの運命獲得を加速するための試みでは、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の強力な阻害剤であるＳＵ５４０２５、およびノッチシグナル伝達をブロックするγ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴ６の、２種のさらなる小分子の使用が説明された。これらの２種の阻害剤（ＳＤ）を、二重ＳＭＡＤ阻害およびＷＮＴ活性化と組み合わせて適用すると、標準二重ＳＭＡＤ阻害条件下で神経前駆体細胞を誘導するのに必要な期間１と同じ期間である分化１１日目までに、７５％の有糸分裂後ニューロンが生じる７。しかし、急速に誘導されたニューロンにおけるＢＲＮ３ＡおよびＩＳＬ１の同時発現により、これらは、ＰＡＸ６由来のＣＮＳニューロンではなく、末梢性感覚と定義付けられた７。したがって、感覚運命指定中にニューロンの運命獲得を加速するための戦略が、ＣＮＳ運命に適応され得るかどうかは、まだ不明である。ＰＡＸ６由来の皮質ニューロンは、ヒト発生および神経変性ＣＮＳ障害の分野に関連する。したがって当技術分野では、皮質ニューロンを急速に誘導するための方法および組成物が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
３．発明の概要
本開示の主題は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化によって幹細胞から誘導された、皮質ニューロンおよびそれらの前駆体、例えばその近接前駆体に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼの阻害が、（ｉ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｉｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｉｉｉ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｉｖ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および（ｖ）ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させた幹細胞からの皮質ニューロンの分化を加速するという発見に少なくとも部分的に基づく。
【０００７】
ある特定の実施形態では、皮質ニューロン（およびその近接前駆体）へのヒト幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、ヒト幹細胞集団を、（ｉ）有効量の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｉｉ）有効量の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および（ｉｉｉ）有効量のウィングレス（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップを含み、細胞は、有効量の阻害剤と、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、または４日間まで、５日間まで、６日間まで、７日間まで、８日間まで、９日間までもしくは１０日間まで接触させる。
【０００８】
ある特定の実施形態では、この方法はさらに、細胞を、（ｉｖ）有効量のＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達（ＭＥＫとしても公知）の１種または複数の阻害剤、（ｖ）有効量のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および（ｖｉ）有効量のノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞は、（ｉｖ）、（ｖ）および／または（ｖｉ）と、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、または少なくとも４日間まで、５日間まで、６日間まで、７日間まで、８日間まで、９日間まで、１０日間まで、１１日間まで、１２日間まで、１３日間までもしくは１４日間まで接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞を有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも２日目（または少なくとも４８時間目）に、有効量の（ｉｖ）、（ｖ）および／または（ｖｉ）と最初に接触させる。
【０００９】
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞を有効量の（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）阻害剤と最初に接触させた後、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、または約６日目に、有効量の（ｉｖ）、（ｖ）および／または（ｖｉ）阻害剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞を有効量の（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）阻害剤と最初に接触させた後、約２４時間目、約４８時間目、約７２時間目、約９６時間目、約１２０時間目、または約１４４時間目に、有効量の（ｉｖ）、（ｖ）および／または（ｖｉ）阻害剤と最初に接触させる。
【００１０】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、有効量の阻害剤（ｉ）〜（ｉｉｉ）と、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間接触させ、有効量の阻害剤（ｉｖ）〜（ｖｉ）と、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間接触させ、次に、有効量のノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、有効量のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、有効量のＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および／または有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化因子と、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間さらに接触させる。
【００１１】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、阻害剤（ｉ）〜（ｉｉｉ）と、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間接触させ、有効量の阻害剤（ｉｖ）〜（ｖｉ）と、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間接触させ、次に、ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間さらに接触させる。
【００１２】
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞が検出可能なレベルのＰＡＸ６を発現するようになる期間にわたって、有効濃度の（ｉ）〜（ｖｉ）と接触させる。ある特定の実施形態では、前記期間は、細胞を有効濃度の阻害剤（ｉ）、すなわち、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、約６日間である。
【００１３】
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞が検出可能なレベルのＴＵＪ１を発現するようになる期間にわたって、有効濃度の（ｉ）〜（ｖｉ）と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞の少なくとも３０％が、検出可能なレベルのＴＵＪ１を発現するようになる期間にわたって、有効濃度の（ｉ）〜（ｖｉ）と接触させる。ある特定の実施形態では、前記期間は、細胞を有効濃度の阻害剤（ｉ）、すなわち、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、約１３日間である。ある特定の実施形態では、細胞はさらに、ＴＢＲ１および／またはＴＬＥ４を同時発現する。
【００１４】
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞が検出可能なレベルのＴＵＪ１、ならびにＴＢＲ１および／またはＴＬＥ４の一方または両方を発現するようになる期間にわたって、有効濃度の（ｉ）〜（ｖｉ）と接触させる。
【００１５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って接触させた細胞は、検出可能なレベルのＴＵＪ１を発現し、細胞の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれよりも多くは、検出可能なレベルのＴＢＲ１、ＴＬＥ４、またはそれらの組合せも発現する。
【００１６】
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞が検出可能なレベルの皮質ニューロンマーカーを発現するようになる期間にわたって、有効濃度の（ｉ）〜（ｖｉ）と接触させる。ある特定の実施形態では、皮質ニューロンマーカーは、ＴＢＲ１、ＴＬＥ４、ＤＣＸ、ＲＥＥＬＩＮ、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＦＯＸＰ２、ＲＧＳ４、ＣＵＸ２、ＢＬＢＰおよびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、細胞は、有効濃度の阻害剤（ｉ）、すなわち、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、１４日後、１５日後、２０日後、２５日後、３０日後、３３日後またはより後に、検出可能なレベルの皮質ニューロンマーカーを発現する。
【００１７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って調製された細胞は、有効濃度の（ｉ）、すなわち、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させた後、少なくとも１６日目に、分化した皮質ニューロンの電気生理学的活性を示す。
【００１８】
ある特定の実施形態では、皮質ニューロンおよびそれらの前駆体へのヒト幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、ヒト幹細胞集団を、有効濃度の（ｉ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｉｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｉｉｉ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｉｖ）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｖ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および（ｖｉ）ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞を（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）と接触させた後、少なくとも２日目または少なくとも３日目に、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、有効濃度の（ｉ）、すなわち、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも４日間〜２０日間の間、または少なくとも６日間〜１６日間の間、少なくとも約８日間〜１４日間の間、または少なくとも約１０日間〜１２日間の間、培養する。
【００１９】
ある特定の実施形態では、この方法は、（ａ）ヒト多能性幹細胞を、有効濃度の（ｉ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｉｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｉｉｉ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させるステップと、（ｂ）前記細胞を、有効濃度の（ｉ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｉｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｉｉｉ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と共に、少なくとも約６日間または７日間培養するステップと、（ｃ）前記細胞を、（ａ）の後少なくとも約２日目または３日目に、有効濃度の（ｉｖ）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｖ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および（ｖｉ）ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させるステップと、（ｄ）前記細胞を、少なくとも約１０日間もしくは１１日間、または前記細胞の少なくとも２０％がＴＵＪ１を発現するまで、有効濃度の（ｉｖ）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｖ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および（ｖｉ）ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と共に培養するステップとを含む。
【００２０】
ある特定の実施形態では、この方法は、前記分化細胞を皮質ニューロン集団に成熟させるのに好都合な条件に、前記分化細胞集団を晒すステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な前記条件は、適切な細胞培養培地中で前記分化細胞集団を培養するステップを含む。ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な前記条件は、前記分化細胞集団を、皮質ニューロンへの前記前駆体の成熟を増強する１種または複数の分子と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、成熟を増強する前記１種または複数の分子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ｃＡＭＰ、およびアスコルビン酸シグナル伝達の活性化因子からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、細胞は、有効濃度の（ｉ）、すなわち、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目もしくは１２日目に、または５日目まで、６日目まで、７日目まで、８日目まで、９日目まで、１０日目までもしくは１２日目まで、前記成熟因子と接触させる。
【００２１】
本開示はまた、本明細書に記載される方法に従って調製された、１種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団またはその前駆体細胞集団を提供する。ある特定の実施形態では、細胞集団の少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％）は、１種または複数の皮質ニューロンマーカーを発現し、細胞集団の約１５％未満（例えば、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満）は、幹細胞マーカー（例えば、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４および／またはＳＳＥＡ３）、グリア細胞マーカー（例えば、ＧＦＡＰ、ＡＱＰ４、および／またはＯＬＩＧ２）、網膜細胞マーカー（例えば、ＣＨＸ１０）、末梢性感覚ニューロン（例えば、ＢＲＮ３Ａ、および／またはＩＳＬ１）、神経堤前駆体（例えば、ＳＯＸ１０）、または頭蓋プラコード前駆体（例えば、ＳＩＸ１）からなる群から選択される１種または複数のマーカーを発現する。
【００２２】
ある特定の実施形態では、分化細胞集団は、ヒト幹細胞集団から誘導される。本開示の主題はさらに、このような分化細胞集団を含む組成物を提供する。
【００２３】
さらに、本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、以下：（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｃ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の阻害剤（ｄ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｅ）ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｆ）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および（ｇ）１種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団またはその前駆体細胞集団への幹細胞の分化を誘導するための指示書の１つまたは複数を含む。
【００２４】
本開示の主題はまた、１種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団またはその前駆体細胞集団を含むキットを提供し、細胞は、本明細書に記載される方法に従って調製される。
【００２５】
ある特定の実施形態では、前記ヒト幹細胞は、ヒト胚幹細胞、ヒト人工多能性幹細胞、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、およびＦクラス多能性幹細胞からなる群から選択される。
【００２６】
本開示の主題はさらに、対象の神経変性障害を処置する方法を提供する。ある特定の実施形態では、この方法は、本明細書に記載される有効量の分化細胞集団を、神経変性障害に罹患している対象に投与するステップを含む。
【００２７】
本開示の主題はさらに、対象の神経変性障害を処置するための、本明細書に記載される分化細胞集団を提供する。
【００２８】
本開示の主題はさらに、神経変性障害を処置するための医薬の製造における、本明細書に記載される分化細胞集団の使用を提供する。
【００２９】
ある特定の実施形態では、神経変性障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、または統合失調症である。
４．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１ＡＢＣ】図１Ａ〜１Ｉは、組合せ小分子ベースのプロトコールを使用する、ヒト多能性幹細胞からの皮質ニューロンの急速な誘導を示す図解、画像およびグラフを示す。図１Ａは、前脳運命に対する神経堤、および加速されたニューロンの運命に対する神経前駆体を発生させるための経路操作の概略図である。ＳＯＸ１０＋神経堤前駆体、ＰＡＸ６＋ＣＮＳ前駆体およびＢＲＮ３Ａ／ＩＳＬ１＋感覚ニューロンを誘導するためのプロトコールは報告されているが、本発明は、皮質ニューロンの急速な誘導のための戦略に焦点を当てる。図１Ｂは、同等のタンパク質マーカーを用いる同時標識を査定することによって、ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、ＳＯＸ１０：：ＧＦＰおよびＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ  ｈＥＳＣベースのレポーター株の検証を示す画像を示す。図１Ｃは、様々なプロトコールの下での、ＣＮＳ（ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、左）、ＮＣ（ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ、中央）およびプラコード（ＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、右）誘導の経時的定量分析のグラフを示す。（ＬＳＢ＝二重ＳＭＡＤ阻害；ＸＡＶ＝ＸＡＶ９３９、タンキラーゼ阻害剤（ＷＮＴ−ｉ）；ＣＨＩＲ＝ＣＨＩＲ９９０２１、ＧＳＫ３β−阻害（ＷＮＴ−活性化）。Ｓ＝ＳＵ５４０２、ＦＧＦＲ阻害剤；Ｄ＝ＤＡＰＴ、γ−セクレターゼ阻害剤（ノッチ−ｉ）。各状態および細胞株ごとに、Ｎ＝３の独立な細胞培養バッチ。図１Ｄは、ＮＣベースのｈＰＳＣ分化に対する、ＣＮＳベースのｈＰＳＣ分化中のＣＮＳ前駆体マーカーＰＡＸ６、神経堤前駆体マーカーＳＯＸ１０およびニューロンマーカーＴＵＪ１の免疫細胞化学画像を示す。図１Ｅは、ニューロンの運命獲得を加速するためにＳ／Ｄ曝露と組み合わせたＣＮＳおよびＮＣベースのｈＰＳＣ分化の免疫組織化学的検査画像を示す。図１Ｆは、図１Ｄおよび１Ｅから得たＴＵＪ１データの、細胞内フローによる分化１３日目の定量を示すグラフである。図１Ｄおよび１Ｅのデータは、条件および細胞株ごとに３回または５回の独立な実験から誘導される。黒色点は、独立な実験から得た値を表す。左から右に、Ｎ＝３、３、５、３。統計は、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定を使用して行った（両側）。ＸＡＶ対ＸＡＶ＋Ｓ／Ｄ：ｔ＝９．５１０  ｄＦ＝２．１６０、Ｐ＝０．００８４。ＣＨＩＲ＋Ｓ／Ｄ対ＸＡＶ＋Ｓ／Ｄ：ｔ＝１３．４０、ｄｆ＝４．７１８、Ｐ＜０．０００１。図１Ｇは、細胞内フローサイトメトリーによるＮＥＳＴＩＮ＋およびＴＵＪ１＋細胞の百分率の定量に基づく、ＰおよびＳ単一および組合せ用量応答分析（上）、ならびに培養下のｃｍ２当たりの総ニューロンの推定値（Ｐ１Ｓ５Ｄ条件およびＰ８Ｓ１０Ｄ条件下で０日目にプレーティングしたｈＰＳＣごとに、それぞれ約０．７および０．２ニューロンを１３日目に得た）のグラフを示す。Ｐ＝ＰＤ０３２５９０１、ＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤。Ｐ、Ｓ、Ｄの後の数字は、μＭによるそれぞれの濃度を表す。各カラムは、スクリーニングしたマーカーごとのＮ＝２の技術的繰返しを表す。図１Ｈは、１３日目までのＰ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄ培養物におけるＰＡＸ６／ＴＵＪ１の免疫細胞化学画像を示す。図１Ｉは、細胞内フローサイトメトリーによる１３日目のＴＵＪ１＋細胞の定量を示すグラフ��示す。黒色点は、独立な実験から得た値を表す。左から右に、Ｎ＝４、５、５、４。統計は、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定を使用して行った（両側）。ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｄ対ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）／Ｄ：ｔ＝４．０５７、ｄＦ＝６．０４５、Ｐ＝０．００６６。ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）対ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）／Ｄ：ｔ＝２０．６２、ｄＦ＝４．８８０、Ｐ＜０．０００１。ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）／Ｄ対ＸＡＶ＋Ｐ（８）／Ｓ（１０）／Ｄ：ｔ＝１３．２６、ｄＦ＝６．３９７、Ｐ＜０．０００１。スケールバー：１００μｍ（ｂ）、２００μｍ（ｄ、ｅ、ｈ）。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１ＤＥＦ】図１Ａ〜１Ｉは、組合せ小分子ベースのプロトコールを使用する、ヒト多能性幹細胞からの皮質ニューロンの急速な誘導を示す図解、画像およびグラフを示す。図１Ａは、前脳運命に対する神経堤、および加速されたニューロンの運命に対する神経前駆体を発生させるための経路操作の概略図である。ＳＯＸ１０＋神経堤前駆体、ＰＡＸ６＋ＣＮＳ前駆体およびＢＲＮ３Ａ／ＩＳＬ１＋感覚ニューロンを誘導するためのプロトコールは報告されているが、本発明は、皮質ニューロンの急速な誘導のための戦略に焦点を当てる。図１Ｂは、同等のタンパク質マーカーを用いる同時標識を査定することによって、ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、ＳＯＸ１０：：ＧＦＰおよびＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ  ｈＥＳＣベースのレポーター株の検証を示す画像を示す。図１Ｃは、様々なプロトコールの下での、ＣＮＳ（ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、左）、ＮＣ（ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ、中央）およびプラコード（ＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、右）誘導の経時的定量分析のグラフを示す。（ＬＳＢ＝二重ＳＭＡＤ阻害；ＸＡＶ＝ＸＡＶ９３９、タンキラーゼ阻害剤（ＷＮＴ−ｉ）；ＣＨＩＲ＝ＣＨＩＲ９９０２１、ＧＳＫ３β−阻害（ＷＮＴ−活性化）。Ｓ＝ＳＵ５４０２、ＦＧＦＲ阻害剤；Ｄ＝ＤＡＰＴ、γ−セクレターゼ阻害剤（ノッチ−ｉ）。各状態および細胞株ごとに、Ｎ＝３の独立な細胞培養バッチ。図１Ｄは、ＮＣベースのｈＰＳＣ分化に対する、ＣＮＳベースのｈＰＳＣ分化中のＣＮＳ前駆体マーカーＰＡＸ６、神経堤前駆体マーカーＳＯＸ１０およびニューロンマーカーＴＵＪ１の免疫細胞化学画像を示す。図１Ｅは、ニューロンの運命獲得を加速するためにＳ／Ｄ曝露と組み合わせたＣＮＳおよびＮＣベースのｈＰＳＣ分化の免疫組織化学的検査画像を示す。図１Ｆは、図１Ｄおよび１Ｅから得たＴＵＪ１データの、細胞内フローによる分化１３日目の定量を示すグラフである。図１Ｄおよび１Ｅのデータは、条件および細胞株ごとに３回または５回の独立な実験から誘導される。黒色点は、独立な実験から得た値を表す。左から右に、Ｎ＝３、３、５、３。統計は、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定を使用して行った（両側）。ＸＡＶ対ＸＡＶ＋Ｓ／Ｄ：ｔ＝９．５１０  ｄＦ＝２．１６０、Ｐ＝０．００８４。ＣＨＩＲ＋Ｓ／Ｄ対ＸＡＶ＋Ｓ／Ｄ：ｔ＝１３．４０、ｄｆ＝４．７１８、Ｐ＜０．０００１。図１Ｇは、細胞内フローサイトメトリーによるＮＥＳＴＩＮ＋およびＴＵＪ１＋細胞の百分率の定量に基づく、ＰおよびＳ単一および組合せ用量応答分析（上）、ならびに培養下のｃｍ２当たりの総ニューロンの推定値（Ｐ１Ｓ５Ｄ条件およびＰ８Ｓ１０Ｄ条件下で０日目にプレーティングしたｈＰＳＣごとに、それぞれ約０．７および０．２ニューロンを１３日目に得た）のグラフを示す。Ｐ＝ＰＤ０３２５９０１、ＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤。Ｐ、Ｓ、Ｄの後の数字は、μＭによるそれぞれの濃度を表す。各カラムは、スクリーニングしたマーカーごとのＮ＝２の技術的繰返しを表す。図１Ｈは、１３日目までのＰ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄ培養物におけるＰＡＸ６／ＴＵＪ１の免疫細胞化学画像を示す。図１Ｉは、細胞内フローサイトメトリーによる１３日目のＴＵＪ１＋細胞の定量を示すグラフ��示す。黒色点は、独立な実験から得た値を表す。左から右に、Ｎ＝４、５、５、４。統計は、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定を使用して行った（両側）。ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｄ対ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）／Ｄ：ｔ＝４．０５７、ｄＦ＝６．０４５、Ｐ＝０．００６６。ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）対ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）／Ｄ：ｔ＝２０．６２、ｄＦ＝４．８８０、Ｐ＜０．０００１。ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）／Ｄ対ＸＡＶ＋Ｐ（８）／Ｓ（１０）／Ｄ：ｔ＝１３．２６、ｄＦ＝６．３９７、Ｐ＜０．０００１。スケールバー：１００μｍ（ｂ）、２００μｍ（ｄ、ｅ、ｈ）。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１Ｇ】図１Ａ〜１Ｉは、組合せ小分子ベースのプロトコールを使用する、ヒト多能性幹細胞からの皮質ニューロンの急速な誘導を示す図解、画像およびグラフを示す。図１Ａは、前脳運命に対する神経堤、および加速されたニューロンの運命に対する神経前駆体を発生させるための経路操作の概略図である。ＳＯＸ１０＋神経堤前駆体、ＰＡＸ６＋ＣＮＳ前駆体およびＢＲＮ３Ａ／ＩＳＬ１＋感覚ニューロンを誘導するためのプロトコールは報告されているが、本発明は、皮質ニューロンの急速な誘導のための戦略に焦点を当てる。図１Ｂは、同等のタンパク質マーカーを用いる同時標識を査定することによって、ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、ＳＯＸ１０：：ＧＦＰおよびＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ  ｈＥＳＣベースのレポーター株の検証を示す画像を示す。図１Ｃは、様々なプロトコールの下での、ＣＮＳ（ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、左）、ＮＣ（ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ、中央）およびプラコード（ＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、右）誘導の経時的定量分析のグラフを示す。（ＬＳＢ＝二重ＳＭＡＤ阻害；ＸＡＶ＝ＸＡＶ９３９、タンキラーゼ阻害剤（ＷＮＴ−ｉ）；ＣＨＩＲ＝ＣＨＩＲ９９０２１、ＧＳＫ３β−阻害（ＷＮＴ−活性化）。Ｓ＝ＳＵ５４０２、ＦＧＦＲ阻害剤；Ｄ＝ＤＡＰＴ、γ−セクレターゼ阻害剤（ノッチ−ｉ）。各状態および細胞株ごとに、Ｎ＝３の独立な細胞培養バッチ。図１Ｄは、ＮＣベースのｈＰＳＣ分化に対する、ＣＮＳベースのｈＰＳＣ分化中のＣＮＳ前駆体マーカーＰＡＸ６、神経堤前駆体マーカーＳＯＸ１０およびニューロンマーカーＴＵＪ１の免疫細胞化学画像を示す。図１Ｅは、ニューロンの運命獲得を加速するためにＳ／Ｄ曝露と組み合わせたＣＮＳおよびＮＣベースのｈＰＳＣ分化の免疫組織化学的検査画像を示す。図１Ｆは、図１Ｄおよび１Ｅから得たＴＵＪ１データの、細胞内フローによる分化１３日目の定量を示すグラフである。図１Ｄおよび１Ｅのデータは、条件および細胞株ごとに３回または５回の独立な実験から誘導される。黒色点は、独立な実験から得た値を表す。左から右に、Ｎ＝３、３、５、３。統計は、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定を使用して行った（両側）。ＸＡＶ対ＸＡＶ＋Ｓ／Ｄ：ｔ＝９．５１０  ｄＦ＝２．１６０、Ｐ＝０．００８４。ＣＨＩＲ＋Ｓ／Ｄ対ＸＡＶ＋Ｓ／Ｄ：ｔ＝１３．４０、ｄｆ＝４．７１８、Ｐ＜０．０００１。図１Ｇは、細胞内フローサイトメトリーによるＮＥＳＴＩＮ＋およびＴＵＪ１＋細胞の百分率の定量に基づく、ＰおよびＳ単一および組合せ用量応答分析（上）、ならびに培養下のｃｍ２当たりの総ニューロンの推定値（Ｐ１Ｓ５Ｄ条件およびＰ８Ｓ１０Ｄ条件下で０日目にプレーティングしたｈＰＳＣごとに、それぞれ約０．７および０．２ニューロンを１３日目に得た）のグラフを示す。Ｐ＝ＰＤ０３２５９０１、ＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤。Ｐ、Ｓ、Ｄの後の数字は、μＭによるそれぞれの濃度を表す。各カラムは、スクリーニングしたマーカーごとのＮ＝２の技術的繰返しを表す。図１Ｈは、１３日目までのＰ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄ培養物におけるＰＡＸ６／ＴＵＪ１の免疫細胞化学画像を示す。図１Ｉは、細胞内フローサイトメトリーによる１３日目のＴＵＪ１＋細胞の定量を示すグラフを示��。黒色点は、独立な実験から得た値を表す。左から右に、Ｎ＝４、５、５、４。統計は、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定を使用して行った（両側）。ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｄ対ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）／Ｄ：ｔ＝４．０５７、ｄＦ＝６．０４５、Ｐ＝０．００６６。ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）対ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）／Ｄ：ｔ＝２０．６２、ｄＦ＝４．８８０、Ｐ＜０．０００１。ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）／Ｄ対ＸＡＶ＋Ｐ（８）／Ｓ（１０）／Ｄ：ｔ＝１３．２６、ｄＦ＝６．３９７、Ｐ＜０．０００１。スケールバー：１００μｍ（ｂ）、２００μｍ（ｄ、ｅ、ｈ）。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１ＨＩ】図１Ａ〜１Ｉは、組合せ小分子ベースのプロトコールを使用する、ヒト多能性幹細胞からの皮質ニューロンの急速な誘導を示す図解、画像およびグラフを示す。図１Ａは、前脳運命に対する神経堤、および加速されたニューロンの運命に対する神経前駆体を発生させるための経路操作の概略図である。ＳＯＸ１０＋神経堤前駆体、ＰＡＸ６＋ＣＮＳ前駆体およびＢＲＮ３Ａ／ＩＳＬ１＋感覚ニューロンを誘導するためのプロトコールは報告されているが、本発明は、皮質ニューロンの急速な誘導のための戦略に焦点を当てる。図１Ｂは、同等のタンパク質マーカーを用いる同時標識を査定することによって、ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、ＳＯＸ１０：：ＧＦＰおよびＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ  ｈＥＳＣベースのレポーター株の検証を示す画像を示す。図１Ｃは、様々なプロトコールの下での、ＣＮＳ（ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、左）、ＮＣ（ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ、中央）およびプラコード（ＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ、右）誘導の経時的定量分析のグラフを示す。（ＬＳＢ＝二重ＳＭＡＤ阻害；ＸＡＶ＝ＸＡＶ９３９、タンキラーゼ阻害剤（ＷＮＴ−ｉ）；ＣＨＩＲ＝ＣＨＩＲ９９０２１、ＧＳＫ３β−阻害（ＷＮＴ−活性化）。Ｓ＝ＳＵ５４０２、ＦＧＦＲ阻害剤；Ｄ＝ＤＡＰＴ、γ−セクレターゼ阻害剤（ノッチ−ｉ）。各状態および細胞株ごとに、Ｎ＝３の独立な細胞培養バッチ。図１Ｄは、ＮＣベースのｈＰＳＣ分化に対する、ＣＮＳベースのｈＰＳＣ分化中のＣＮＳ前駆体マーカーＰＡＸ６、神経堤前駆体マーカーＳＯＸ１０およびニューロンマーカーＴＵＪ１の免疫細胞化学画像を示す。図１Ｅは、ニューロンの運命獲得を加速するためにＳ／Ｄ曝露と組み合わせたＣＮＳおよびＮＣベースのｈＰＳＣ分化の免疫組織化学的検査画像を示す。図１Ｆは、図１Ｄおよび１Ｅから得たＴＵＪ１データの、細胞内フローによる分化１３日目の定量を示すグラフである。図１Ｄおよび１Ｅのデータは、条件および細胞株ごとに３回または５回の独立な実験から誘導される。黒色点は、独立な実験から得た値を表す。左から右に、Ｎ＝３、３、５、３。統計は、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定を使用して行った（両側）。ＸＡＶ対ＸＡＶ＋Ｓ／Ｄ：ｔ＝９．５１０  ｄＦ＝２．１６０、Ｐ＝０．００８４。ＣＨＩＲ＋Ｓ／Ｄ対ＸＡＶ＋Ｓ／Ｄ：ｔ＝１３．４０、ｄｆ＝４．７１８、Ｐ＜０．０００１。図１Ｇは、細胞内フローサイトメトリーによるＮＥＳＴＩＮ＋およびＴＵＪ１＋細胞の百分率の定量に基づく、ＰおよびＳ単一および組合せ用量応答分析（上）、ならびに培養下のｃｍ２当たりの総ニューロンの推定値（Ｐ１Ｓ５Ｄ条件およびＰ８Ｓ１０Ｄ条件下で０日目にプレーティングしたｈＰＳＣごとに、それぞれ約０．７および０．２ニューロンを１３日目に得た）のグラフを示す。Ｐ＝ＰＤ０３２５９０１、ＥＲＫ／ＭＥＫ阻害剤。Ｐ、Ｓ、Ｄの後の数字は、μＭによるそれぞれの濃度を表す。各カラムは、スクリーニングしたマーカーごとのＮ＝２の技術的繰返しを表す。図１Ｈは、１３日目までのＰ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄ培養物におけるＰＡＸ６／ＴＵＪ１の免疫細胞化学画像を示す。図１Ｉは、細胞内フローサイトメトリーによる１３日目のＴＵＪ１＋細胞の定量を示すグラフを��す。黒色点は、独立な実験から得た値を表す。左から右に、Ｎ＝４、５、５、４。統計は、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定を使用して行った（両側）。ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｄ対ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）／Ｄ：ｔ＝４．０５７、ｄＦ＝６．０４５、Ｐ＝０．００６６。ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）対ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）／Ｄ：ｔ＝２０．６２、ｄＦ＝４．８８０、Ｐ＜０．０００１。ＸＡＶ＋Ｐ（１）／Ｓ（５）／Ｄ対ＸＡＶ＋Ｐ（８）／Ｓ（１０）／Ｄ：ｔ＝１３．２６、ｄＦ＝６．３９７、Ｐ＜０．０００１。スケールバー：１００μｍ（ｂ）、２００μｍ（ｄ、ｅ、ｈ）。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【００３１】
【図２ＡＢ】図２Ａ〜２Ｄは、ｈＥＳＣ株およびｈｉＰＳＣ株における急速な皮質ニューロン誘導を示す図解、画像およびグラフを示す。図２Ａは、Ｐ／Ｓ／Ｄプロトコールのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化スキームを示す図解を示す。ｈＰＳＣを、分化の前日に、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２および１０μＭのＲＯＣＫ−阻害剤Ｙ−２７６３２で補充したｈＥＳＣ培地中、２００，０００個／ｃｍ２でプレーティングした。小分子を、二重ＳＭＡＤ阻害（ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２）およびＸＡＶ９３９処理（ＬＳＢＸ）の存在下で添加した。ＰＤ０３２５９０１、ＳＵ５４０２およびＤＡＰＴ（Ｐ／Ｓ／Ｄ）の適用の最適なタイミングを示す。図２Ｂおよび２Ｃは、ＴＢＲ１／ＴＵＪ１発現の免疫蛍光による、１３日目のｈｉＰＳＣ株に対する（ｂ）Ｐ１Ｓ５Ｄおよび（ｃ）Ｐ８Ｓ１０Ｄプロトコールの検証を示す画像を示す。図２Ｄは、細胞内フローサイトメトリーによる、試験した様々なｈｉＰＳＣ株に関する１３日目のニューロン誘導効率の定量を示すグラフを示す。株１．１、１．２、１．３については、Ｎ＝３の独立な細胞培養バッチ、ならびに株７．１、７．２および７．４については、Ｎ＝１。スケールバー：５０μｍ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図２ＣＤ】図２Ａ〜２Ｄは、ｈＥＳＣ株およびｈｉＰＳＣ株における急速な皮質ニューロン誘導を示す図解、画像およびグラフを示す。図２Ａは、Ｐ／Ｓ／Ｄプロトコールのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化スキームを示す図解を示す。ｈＰＳＣを、分化の前日に、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２および１０μＭのＲＯＣＫ−阻害剤Ｙ−２７６３２で補充したｈＥＳＣ培地中、２００，０００個／ｃｍ２でプレーティングした。小分子を、二重ＳＭＡＤ阻害（ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２）およびＸＡＶ９３９処理（ＬＳＢＸ）の存在下で添加した。ＰＤ０３２５９０１、ＳＵ５４０２およびＤＡＰＴ（Ｐ／Ｓ／Ｄ）の適用の最適なタイミングを示す。図２Ｂおよび２Ｃは、ＴＢＲ１／ＴＵＪ１発現の免疫蛍光による、１３日目のｈｉＰＳＣ株に対する（ｂ）Ｐ１Ｓ５Ｄおよび（ｃ）Ｐ８Ｓ１０Ｄプロトコールの検証を示す画像を示す。図２Ｄは、細胞内フローサイトメトリーによる、試験した様々なｈｉＰＳＣ株に関する１３日目のニューロン誘導効率の定量を示すグラフを示す。株１．１、１．２、１．３については、Ｎ＝３の独立な細胞培養バッチ、ならびに株７．１、７．２および７．４については、Ｎ＝１。スケールバー：５０μｍ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【００３２】
【図３ＡＢ】図３Ａ〜３Ｌは、分化１３日目までのｈＰＳＣ誘導ニューロンの時間的および表現型の特徴付けのグラフおよび画像を示す。図３Ａは、１３日目の各群間の平均差を比較するための、細胞内フローサイトメトリー（Ｎ＝４の独立な細胞培養バッチ）、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定（両側）による、ニューロン誘導効率の経時的分析を示すグラフを示す。ＬＳＢＸ対Ｐ１Ｓ５Ｄ：ｔ＝２０．７９  ｄＦ＝３．０４２、Ｐ＝０．０００２。３ｉ対Ｐ１Ｓ５Ｄ：ｔ＝０．８２７７  ｄＦ＝５．０１３、Ｐ＝０．４４５５、Ｎ．Ｓ．。Ｐ１Ｓ５Ｄ対Ｐ８Ｓ１０Ｄ：ｔ＝１２．７９  ｄＦ＝５．９９４、Ｐ＜０．０００１。図３Ｂは、分化５日目、８日目、１１日目、１３日目の経時的ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフを示す。ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）：ヒト多能性マーカー；ＰＡＸ６：背側皮質前駆細胞マーカー；ＦＯＸＧ１：前脳マーカー；ＤＣＸ：汎ニューロンマーカー；ＴＢＲ１：プレプレート、サブプレートおよび皮質ＶＩ層ニューロンマーカー；ＲＥＥＬＩＮ：皮質Ｉ層（Ｃａｊａｌ−Ｒｅｔｚｉｕｓ細胞）ニューロンマーカー。ＦＣ：倍率変化。Ｎ＝３の独立な細胞培養バッチ。図３Ｃは、免疫蛍光による１３日目のＴＢＲ１／ＴＵＪ１発現を示す画像を示す。図３Ｄおよび３Ｅは、（Ｄ）全細胞におけるＴＢＲ１＋細胞の百分率（ｔ＝３．１５１、ｄＦ＝７．８２０、Ｐ＝０．０１４０、両側）、または（Ｅ）ＴＵＪ１＋ニューロンにおけるＴＢＲ１＋細胞の百分率（ｔ＝１．０９４、ｄＦ＝９．９９７、Ｐ＝０．２９９４、両側、Ｎ．Ｓ．）の定量を示すグラフを示す。黒色点は、３つの独立な細胞培養バッチから得た６つの１５０μｍ×１５０μｍのエリアの、一様無作為選択の定量から得た値を表す。統計は、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定を使用して行った。図３Ｆは、１３日目を超える長期間培養プロトコールの図解を示す。８日目よりも前のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化は、図２Ａに記載されるものと同じである。長期間培養では、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞を、分化の８日目にＮＢ／Ｂ２７＋ＢＣＡ培地中で、その後阻害剤を添加せずにそれぞれ１５０，０００個／ｃｍ２および３００，０００個／ｃｍ２で継代した。細胞を、様々な時点で固定し、免疫細胞化学またはＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために処理した。図３Ｇは、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞の長期間維持によって、別個の皮質層運命を構成するニューロン：ＦＯＸＰ２（Ｖ層〜ＶＩ層）、ＴＬＥ４（ＶＩ層）、ＣＴＩＰ２（Ｖ層）、ＳＡＴＢ２（ＩＩ層〜ＩＩＩ層、Ｖ層）、ＲＧＳ４（ＩＩ層〜ＩＩＩ層、Ｖ層）、ＣＵＸ２（皮質前駆細胞およびＩＩ層〜ＩＶ層）が生成されたことを示す。図３Ｈは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化を使用する全細胞集団におけるＴＢＲ１＋、ＣＴＩＰ２＋およびＳＡＴＢ２＋細胞の定量を示すグラフを示す。Ｎ＝２つの独立な細胞培養バッチから２０倍の対物レンズを使用して捕えた、６つの無作為に選択された写真フレームの定量。図３Ｉは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化４０日目の、マーカー陽性細胞におけるＥｄＵ陽性の百分率の定量を示すグラフを示す。ＥｄＵを、４８時間培養物に、分化の様々な時点（ｘ軸上に示される通り）で添加し、培養物を４０日目に固定した。着色された点は���２つの独立な細胞培養バッチから得た個々の写真フレームの定量結果の値を表す。左から右に、Ｎ＝３、４、４；０、０、０；３、４、３；３、３、４；３、５、１；１、３、４。スケールバー：５０μｍ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。図３Ｊは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化４０日目のＴＢＲ１およびＣＴＩＰ２によるＥｄＵを用いる同時標識を示す代表的な画像を示す。図３Ｋは、Ｅ６培地中Ｐ／Ｓ／Ｄを使用する、加速ニューロン分化プロトコールの代替スキームを示す。図３Ｌは、ＰＡＸ６／ＴＵＪ１およびＴＢＲ１／ＴＵＪ１発現の免疫細胞化学による、１３日目のＥ６におけるＰ／Ｓ／Ｄプロトコールの検証を示す。スケールバー：５０μｍ、図３Ｌの左パネルおよび中央パネルの１００μｍは除く。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｎ．Ｓ．：有意差なし。
【図３ＣＤＥ】図３Ａ〜３Ｌは、分化１３日目までのｈＰＳＣ誘導ニューロンの時間的および表現型の特徴付けのグラフおよび画像を示す。図３Ａは、１３日目の各群間の平均差を比較するための、細胞内フローサイトメトリー（Ｎ＝４の独立な細胞培養バッチ）、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定（両側）による、ニューロン誘導効率の経時的分析を示すグラフを示す。ＬＳＢＸ対Ｐ１Ｓ５Ｄ：ｔ＝２０．７９  ｄＦ＝３．０４２、Ｐ＝０．０００２。３ｉ対Ｐ１Ｓ５Ｄ：ｔ＝０．８２７７  ｄＦ＝５．０１３、Ｐ＝０．４４５５、Ｎ．Ｓ．。Ｐ１Ｓ５Ｄ対Ｐ８Ｓ１０Ｄ：ｔ＝１２．７９  ｄＦ＝５．９９４、Ｐ＜０．０００１。図３Ｂは、分化５日目、８日目、１１日目、１３日目の経時的ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフを示す。ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）：ヒト多能性マーカー；ＰＡＸ６：背側皮質前駆細胞マーカー；ＦＯＸＧ１：前脳マーカー；ＤＣＸ：汎ニューロンマーカー；ＴＢＲ１：プレプレート、サブプレートおよび皮質ＶＩ層ニューロンマーカー；ＲＥＥＬＩＮ：皮質Ｉ層（Ｃａｊａｌ−Ｒｅｔｚｉｕｓ細胞）ニューロンマーカー。ＦＣ：倍率変化。Ｎ＝３の独立な細胞培養バッチ。図３Ｃは、免疫蛍光による１３日目のＴＢＲ１／ＴＵＪ１発現を示す画像を示す。図３Ｄおよび３Ｅは、（Ｄ）全細胞におけるＴＢＲ１＋細胞の百分率（ｔ＝３．１５１、ｄＦ＝７．８２０、Ｐ＝０．０１４０、両側）、または（Ｅ）ＴＵＪ１＋ニューロンにおけるＴＢＲ１＋細胞の百分率（ｔ＝１．０９４、ｄＦ＝９．９９７、Ｐ＝０．２９９４、両側、Ｎ．Ｓ．）の定量を示すグラフを示す。黒色点は、３つの独立な細胞培養バッチから得た６つの１５０μｍ×１５０μｍのエリアの、一様無作為選択の定量から得た値を表す。統計は、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定を使用して行った。図３Ｆは、１３日目を超える長期間培養プロトコールの図解を示す。８日目よりも前のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化は、図２Ａに記載されるものと同じである。長期間培養では、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞を、分化の８日目にＮＢ／Ｂ２７＋ＢＣＡ培地中で、その後阻害剤を添加せずにそれぞれ１５０，０００個／ｃｍ２および３００，０００個／ｃｍ２で継代した。細胞を、様々な時点で固定し、免疫細胞化学またはＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために処理した。図３Ｇは、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞の長期間維持によって、別個の皮質層運命を構成するニューロン：ＦＯＸＰ２（Ｖ層〜ＶＩ層）、ＴＬＥ４（ＶＩ層）、ＣＴＩＰ２（Ｖ層）、ＳＡＴＢ２（ＩＩ層〜ＩＩＩ層、Ｖ層）、ＲＧＳ４（ＩＩ層〜ＩＩＩ層、Ｖ層）、ＣＵＸ２（皮質前駆細胞およびＩＩ層〜ＩＶ層）が生成されたことを示す。図３Ｈは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化を使用する全細胞集団におけるＴＢＲ１＋、ＣＴＩＰ２＋およびＳＡＴＢ２＋細胞の定量を示すグラフを示す。Ｎ＝２つの独立な細胞培養バッチから２０倍の対物レンズを使用して捕えた、６つの無作為に選択された写真フレームの定量。図３Ｉは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化４０日目の、マーカー陽性細胞におけるＥｄＵ陽性の百分率の定量を示すグラフを示す。ＥｄＵを、４８時間培養物に、分化の様々な時点（ｘ軸上に示される通り）で添加し、培養物を４０日目に固定した。着色された点���、２つの独立な細胞培養バッチから得た個々の写真フレームの定量結果の値を表す。左から右に、Ｎ＝３、４、４；０、０、０；３、４、３；３、３、４；３、５、１；１、３、４。スケールバー：５０μｍ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。図３Ｊは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化４０日目のＴＢＲ１およびＣＴＩＰ２によるＥｄＵを用いる同時標識を示す代表的な画像を示す。図３Ｋは、Ｅ６培地中Ｐ／Ｓ／Ｄを使用する、加速ニューロン分化プロトコールの代替スキームを示す。図３Ｌは、ＰＡＸ６／ＴＵＪ１およびＴＢＲ１／ＴＵＪ１発現の免疫細胞化学による、１３日目のＥ６におけるＰ／Ｓ／Ｄプロトコールの検証を示す。スケールバー：５０μｍ、図３Ｌの左パネルおよび中央パネルの１００μｍは除く。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｎ．Ｓ．：有意差なし。
【図３Ｆ】図３Ａ〜３Ｌは、分化１３日目までのｈＰＳＣ誘導ニューロンの時間的および表現型の特徴付けのグラフおよび画像を示す。図３Ａは、１３日目の各群間の平均差を比較するための、細胞内フローサイトメトリー（Ｎ＝４の独立な細胞培養バッチ）、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定（両側）による、ニューロン誘導効率の経時的分析を示すグラフを示す。ＬＳＢＸ対Ｐ１Ｓ５Ｄ：ｔ＝２０．７９  ｄＦ＝３．０４２、Ｐ＝０．０００２。３ｉ対Ｐ１Ｓ５Ｄ：ｔ＝０．８２７７  ｄＦ＝５．０１３、Ｐ＝０．４４５５、Ｎ．Ｓ．。Ｐ１Ｓ５Ｄ対Ｐ８Ｓ１０Ｄ：ｔ＝１２．７９  ｄＦ＝５．９９４、Ｐ＜０．０００１。図３Ｂは、分化５日目、８日目、１１日目、１３日目の経時的ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフを示す。ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）：ヒト多能性マーカー；ＰＡＸ６：背側皮質前駆細胞マーカー；ＦＯＸＧ１：前脳マーカー；ＤＣＸ：汎ニューロンマーカー；ＴＢＲ１：プレプレート、サブプレートおよび皮質ＶＩ層ニューロンマーカー；ＲＥＥＬＩＮ：皮質Ｉ層（Ｃａｊａｌ−Ｒｅｔｚｉｕｓ細胞）ニューロンマーカー。ＦＣ：倍率変化。Ｎ＝３の独立な細胞培養バッチ。図３Ｃは、免疫蛍光による１３日目のＴＢＲ１／ＴＵＪ１発現を示す画像を示す。図３Ｄおよび３Ｅは、（Ｄ）全細胞におけるＴＢＲ１＋細胞の百分率（ｔ＝３．１５１、ｄＦ＝７．８２０、Ｐ＝０．０１４０、両側）、または（Ｅ）ＴＵＪ１＋ニューロンにおけるＴＢＲ１＋細胞の百分率（ｔ＝１．０９４、ｄＦ＝９．９９７、Ｐ＝０．２９９４、両側、Ｎ．Ｓ．）の定量を示すグラフを示す。黒色点は、３つの独立な細胞培養バッチから得た６つの１５０μｍ×１５０μｍのエリアの、一様無作為選択の定量から得た値を表す。統計は、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定を使用して行った。図３Ｆは、１３日目を超える長期間培養プロトコールの図解を示す。８日目よりも前のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化は、図２Ａに記載されるものと同じである。長期間培養では、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞を、分化の８日目にＮＢ／Ｂ２７＋ＢＣＡ培地中で、その後阻害剤を添加せずにそれぞれ１５０，０００個／ｃｍ２および３００，０００個／ｃｍ２で継代した。細胞を、様々な時点で固定し、免疫細胞化学またはＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために処理した。図３Ｇは、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞の長期間維持によって、別個の皮質層運命を構成するニューロン：ＦＯＸＰ２（Ｖ層〜ＶＩ層）、ＴＬＥ４（ＶＩ層）、ＣＴＩＰ２（Ｖ層）、ＳＡＴＢ２（ＩＩ層〜ＩＩＩ層、Ｖ層）、ＲＧＳ４（ＩＩ層〜ＩＩＩ層、Ｖ層）、ＣＵＸ２（皮質前駆細胞およびＩＩ層〜ＩＶ層）が生成されたことを示す。図３Ｈは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化を使用する全細胞集団におけるＴＢＲ１＋、ＣＴＩＰ２＋およびＳＡＴＢ２＋細胞の定量を示すグラフを示す。Ｎ＝２つの独立な細胞培養バッチから２０倍の対物レンズを使用して捕えた、６つの無作為に選択された写真フレームの定量。図３Ｉは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化４０日目の、マーカー陽性細胞におけるＥｄＵ陽性の百分率の定量を示すグラフを示す。ＥｄＵを、４８時間培養物に、分化の様々な時点（ｘ軸上に示される通り）で添加し、培養物を４０日目に固定した。着色された点は、���つの独立な細胞培養バッチから得た個々の写真フレームの定量結果の値を表す。左から右に、Ｎ＝３、４、４；０、０、０；３、４、３；３、３、４；３、５、１；１、３、４。スケールバー：５０μｍ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。図３Ｊは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化４０日目のＴＢＲ１およびＣＴＩＰ２によるＥｄＵを用いる同時標識を示す代表的な画像を示す。図３Ｋは、Ｅ６培地中Ｐ／Ｓ／Ｄを使用する、加速ニューロン分化プロトコールの代替スキームを示す。図３Ｌは、ＰＡＸ６／ＴＵＪ１およびＴＢＲ１／ＴＵＪ１発現の免疫細胞化学による、１３日目のＥ６におけるＰ／Ｓ／Ｄプロトコールの検証を示す。スケールバー：５０μｍ、図３Ｌの左パネルおよび中央パネルの１００μｍは除く。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｎ．Ｓ．：有意差なし。
【図３Ｇ】図３Ａ〜３Ｌは、分化１３日目までのｈＰＳＣ誘導ニューロンの時間的および表現型の特徴付けのグラフおよび画像を示す。図３Ａは、１３日目の各群間の平均差を比較するための、細胞内フローサイトメトリー（Ｎ＝４の独立な細胞培養バッチ）、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定（両側）による、ニューロン誘導効率の経時的分析を示すグラフを示す。ＬＳＢＸ対Ｐ１Ｓ５Ｄ：ｔ＝２０．７９  ｄＦ＝３．０４２、Ｐ＝０．０００２。３ｉ対Ｐ１Ｓ５Ｄ：ｔ＝０．８２７７  ｄＦ＝５．０１３、Ｐ＝０．４４５５、Ｎ．Ｓ．。Ｐ１Ｓ５Ｄ対Ｐ８Ｓ１０Ｄ：ｔ＝１２．７９  ｄＦ＝５．９９４、Ｐ＜０．０００１。図３Ｂは、分化５日目、８日目、１１日目、１３日目の経時的ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフを示す。ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）：ヒト多能性マーカー；ＰＡＸ６：背側皮質前駆細胞マーカー；ＦＯＸＧ１：前脳マーカー；ＤＣＸ：汎ニューロンマーカー；ＴＢＲ１：プレプレート、サブプレートおよび皮質ＶＩ層ニューロンマーカー；ＲＥＥＬＩＮ：皮質Ｉ層（Ｃａｊａｌ−Ｒｅｔｚｉｕｓ細胞）ニューロンマーカー。ＦＣ：倍率変化。Ｎ＝３の独立な細胞培養バッチ。図３Ｃは、免疫蛍光による１３日目のＴＢＲ１／ＴＵＪ１発現を示す画像を示す。図３Ｄおよび３Ｅは、（Ｄ）全細胞におけるＴＢＲ１＋細胞の百分率（ｔ＝３．１５１、ｄＦ＝７．８２０、Ｐ＝０．０１４０、両側）、または（Ｅ）ＴＵＪ１＋ニューロンにおけるＴＢＲ１＋細胞の百分率（ｔ＝１．０９４、ｄＦ＝９．９９７、Ｐ＝０．２９９４、両側、Ｎ．Ｓ．）の定量を示すグラフを示す。黒色点は、３つの独立な細胞培養バッチから得た６つの１５０μｍ×１５０μｍのエリアの、一様無作為選択の定量から得た値を表す。統計は、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定を使用して行った。図３Ｆは、１３日目を超える長期間培養プロトコールの図解を示す。８日目よりも前のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化は、図２Ａに記載されるものと同じである。長期間培養では、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞を、分化の８日目にＮＢ／Ｂ２７＋ＢＣＡ培地中で、その後阻害剤を添加せずにそれぞれ１５０，０００個／ｃｍ２および３００，０００個／ｃｍ２で継代した。細胞を、様々な時点で固定し、免疫細胞化学またはＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために処理した。図３Ｇは、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞の長期間維持によって、別個の皮質層運命を構成するニューロン：ＦＯＸＰ２（Ｖ層〜ＶＩ層）、ＴＬＥ４（ＶＩ層）、ＣＴＩＰ２（Ｖ層）、ＳＡＴＢ２（ＩＩ層〜ＩＩＩ層、Ｖ層）、ＲＧＳ４（ＩＩ層〜ＩＩＩ層、Ｖ層）、ＣＵＸ２（皮質前駆細胞およびＩＩ層〜ＩＶ層）が生成されたことを示す。図３Ｈは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化を使用する全細胞集団におけるＴＢＲ１＋、ＣＴＩＰ２＋およびＳＡＴＢ２＋細胞の定量を示すグラフを示す。Ｎ＝２つの独立な細胞培養バッチから２０倍の対物レンズを使用して捕えた、６つの無作為に選択された写真フレームの定量。図３Ｉは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化４０日目の、マーカー陽性細胞におけるＥｄＵ陽性の百分率の定量を示すグラフを示す。ＥｄＵを、４８時間培養物に、分化の様々な時点（ｘ軸上に示される通り）で添加し、培養物を４０日目に固定した。着色された点は、���つの独立な細胞培養バッチから得た個々の写真フレームの定量結果の値を表す。左から右に、Ｎ＝３、４、４；０、０、０；３、４、３；３、３、４；３、５、１；１、３、４。スケールバー：５０μｍ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。図３Ｊは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化４０日目のＴＢＲ１およびＣＴＩＰ２によるＥｄＵを用いる同時標識を示す代表的な画像を示す。図３Ｋは、Ｅ６培地中Ｐ／Ｓ／Ｄを使用する、加速ニューロン分化プロトコールの代替スキームを示す。図３Ｌは、ＰＡＸ６／ＴＵＪ１およびＴＢＲ１／ＴＵＪ１発現の免疫細胞化学による、１３日目のＥ６におけるＰ／Ｓ／Ｄプロトコールの検証を示す。スケールバー：５０μｍ、図３Ｌの左パネルおよび中央パネルの１００μｍは除く。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｎ．Ｓ．：有意差なし。
【図３ＨＩＪ】図３Ａ〜３Ｌは、分化１３日目までのｈＰＳＣ誘導ニューロンの時間的および表現型の特徴付けのグラフおよび画像を示す。図３Ａは、１３日目の各群間の平均差を比較するための、細胞内フローサイトメトリー（Ｎ＝４の独立な細胞培養バッチ）、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定（両側）による、ニューロン誘導効率の経時的分析を示すグラフを示す。ＬＳＢＸ対Ｐ１Ｓ５Ｄ：ｔ＝２０．７９  ｄＦ＝３．０４２、Ｐ＝０．０００２。３ｉ対Ｐ１Ｓ５Ｄ：ｔ＝０．８２７７  ｄＦ＝５．０１３、Ｐ＝０．４４５５、Ｎ．Ｓ．。Ｐ１Ｓ５Ｄ対Ｐ８Ｓ１０Ｄ：ｔ＝１２．７９  ｄＦ＝５．９９４、Ｐ＜０．０００１。図３Ｂは、分化５日目、８日目、１１日目、１３日目の経時的ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフを示す。ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）：ヒト多能性マーカー；ＰＡＸ６：背側皮質前駆細胞マーカー；ＦＯＸＧ１：前脳マーカー；ＤＣＸ：汎ニューロンマーカー；ＴＢＲ１：プレプレート、サブプレートおよび皮質ＶＩ層ニューロンマーカー；ＲＥＥＬＩＮ：皮質Ｉ層（Ｃａｊａｌ−Ｒｅｔｚｉｕｓ細胞）ニューロンマーカー。ＦＣ：倍率変化。Ｎ＝３の独立な細胞培養バッチ。図３Ｃは、免疫蛍光による１３日目のＴＢＲ１／ＴＵＪ１発現を示す画像を示す。図３Ｄおよび３Ｅは、（Ｄ）全細胞におけるＴＢＲ１＋細胞の百分率（ｔ＝３．１５１、ｄＦ＝７．８２０、Ｐ＝０．０１４０、両側）、または（Ｅ）ＴＵＪ１＋ニューロンにおけるＴＢＲ１＋細胞の百分率（ｔ＝１．０９４、ｄＦ＝９．９９７、Ｐ＝０．２９９４、両側、Ｎ．Ｓ．）の定量を示すグラフを示す。黒色点は、３つの独立な細胞培養バッチから得た６つの１５０μｍ×１５０μｍのエリアの、一様無作為選択の定量から得た値を表す。統計は、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定を使用して行った。図３Ｆは、１３日目を超える長期間培養プロトコールの図解を示す。８日目よりも前のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化は、図２Ａに記載されるものと同じである。長期間培養では、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞を、分化の８日目にＮＢ／Ｂ２７＋ＢＣＡ培地中で、その後阻害剤を添加せずにそれぞれ１５０，０００個／ｃｍ２および３００，０００個／ｃｍ２で継代した。細胞を、様々な時点で固定し、免疫細胞化学またはＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために処理した。図３Ｇは、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞の長期間維持によって、別個の皮質層運命を構成するニューロン：ＦＯＸＰ２（Ｖ層〜ＶＩ層）、ＴＬＥ４（ＶＩ層）、ＣＴＩＰ２（Ｖ層）、ＳＡＴＢ２（ＩＩ層〜ＩＩＩ層、Ｖ層）、ＲＧＳ４（ＩＩ層〜ＩＩＩ層、Ｖ層）、ＣＵＸ２（皮質前駆細胞およびＩＩ層〜ＩＶ層）が生成されたことを示す。図３Ｈは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化を使用する全細胞集団におけるＴＢＲ１＋、ＣＴＩＰ２＋およびＳＡＴＢ２＋細胞の定量を示すグラフを示す。Ｎ＝２つの独立な細胞培養バッチから２０倍の対物レンズを使用して捕えた、６つの無作為に選択された写真フレームの定量。図３Ｉは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化４０日目の、マーカー陽性細胞におけるＥｄＵ陽性の百分率の定量を示すグラフを示す。ＥｄＵを、４８時間培養物に、分化の様々な時点（ｘ軸上に示される通り）で添加し、培養物を４０日目に固定した。着色された点���、２つの独立な細胞培養バッチから得た個々の写真フレームの定量結果の値を表す。左から右に、Ｎ＝３、４、４；０、０、０；３、４、３；３、３、４；３、５、１；１、３、４。スケールバー：５０μｍ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。図３Ｊは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化４０日目のＴＢＲ１およびＣＴＩＰ２によるＥｄＵを用いる同時標識を示す代表的な画像を示す。図３Ｋは、Ｅ６培地中Ｐ／Ｓ／Ｄを使用する、加速ニューロン分化プロトコールの代替スキームを示す。図３Ｌは、ＰＡＸ６／ＴＵＪ１およびＴＢＲ１／ＴＵＪ１発現の免疫細胞化学による、１３日目のＥ６におけるＰ／Ｓ／Ｄプロトコールの検証を示す。スケールバー：５０μｍ、図３Ｌの左パネルおよび中央パネルの１００μｍは除く。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｎ．Ｓ．：有意差なし。
【図３ＫＬ】図３Ａ〜３Ｌは、分化１３日目までのｈＰＳＣ誘導ニューロンの時間的および表現型の特徴付けのグラフおよび画像を示す。図３Ａは、１３日目の各群間の平均差を比較するための、細胞内フローサイトメトリー（Ｎ＝４の独立な細胞培養バッチ）、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定（両側）による、ニューロン誘導効率の経時的分析を示すグラフを示す。ＬＳＢＸ対Ｐ１Ｓ５Ｄ：ｔ＝２０．７９  ｄＦ＝３．０４２、Ｐ＝０．０００２。３ｉ対Ｐ１Ｓ５Ｄ：ｔ＝０．８２７７  ｄＦ＝５．０１３、Ｐ＝０．４４５５、Ｎ．Ｓ．。Ｐ１Ｓ５Ｄ対Ｐ８Ｓ１０Ｄ：ｔ＝１２．７９  ｄＦ＝５．９９４、Ｐ＜０．０００１。図３Ｂは、分化５日目、８日目、１１日目、１３日目の経時的ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のグラフを示す。ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）：ヒト多能性マーカー；ＰＡＸ６：背側皮質前駆細胞マーカー；ＦＯＸＧ１：前脳マーカー；ＤＣＸ：汎ニューロンマーカー；ＴＢＲ１：プレプレート、サブプレートおよび皮質ＶＩ層ニューロンマーカー；ＲＥＥＬＩＮ：皮質Ｉ層（Ｃａｊａｌ−Ｒｅｔｚｉｕｓ細胞）ニューロンマーカー。ＦＣ：倍率変化。Ｎ＝３の独立な細胞培養バッチ。図３Ｃは、免疫蛍光による１３日目のＴＢＲ１／ＴＵＪ１発現を示す画像を示す。図３Ｄおよび３Ｅは、（Ｄ）全細胞におけるＴＢＲ１＋細胞の百分率（ｔ＝３．１５１、ｄＦ＝７．８２０、Ｐ＝０．０１４０、両側）、または（Ｅ）ＴＵＪ１＋ニューロンにおけるＴＢＲ１＋細胞の百分率（ｔ＝１．０９４、ｄＦ＝９．９９７、Ｐ＝０．２９９４、両側、Ｎ．Ｓ．）の定量を示すグラフを示す。黒色点は、３つの独立な細胞培養バッチから得た６つの１５０μｍ×１５０μｍのエリアの、一様無作為選択の定量から得た値を表す。統計は、ウェルチの補正を伴う独立ｔ検定を使用して行った。図３Ｆは、１３日目を超える長期間培養プロトコールの図解を示す。８日目よりも前のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化は、図２Ａに記載されるものと同じである。長期間培養では、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞を、分化の８日目にＮＢ／Ｂ２７＋ＢＣＡ培地中で、その後阻害剤を添加せずにそれぞれ１５０，０００個／ｃｍ２および３００，０００個／ｃｍ２で継代した。細胞を、様々な時点で固定し、免疫細胞化学またはＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために処理した。図３Ｇは、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞の長期間維持によって、別個の皮質層運命を構成するニューロン：ＦＯＸＰ２（Ｖ層〜ＶＩ層）、ＴＬＥ４（ＶＩ層）、ＣＴＩＰ２（Ｖ層）、ＳＡＴＢ２（ＩＩ層〜ＩＩＩ層、Ｖ層）、ＲＧＳ４（ＩＩ層〜ＩＩＩ層、Ｖ層）、ＣＵＸ２（皮質前駆細胞およびＩＩ層〜ＩＶ層）が生成されたことを示す。図３Ｈは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化を使用する全細胞集団におけるＴＢＲ１＋、ＣＴＩＰ２＋およびＳＡＴＢ２＋細胞の定量を示すグラフを示す。Ｎ＝２つの独立な細胞培養バッチから２０倍の対物レンズを使用して捕えた、６つの無作為に選択された写真フレームの定量。図３Ｉは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化４０日目の、マーカー陽性細胞におけるＥｄＵ陽性の百分率の定量を示すグラフを示す。ＥｄＵを、４８時間培養物に、分化の様々な時点（ｘ軸上に示される通り）で添加し、培養物を４０日目に固定した。着色された点は���２つの独立な細胞培養バッチから得た個々の写真フレームの定量結果の値を表す。左から右に、Ｎ＝３、４、４；０、０、０；３、４、３；３、３、４；３、５、１；１、３、４。スケールバー：５０μｍ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。図３Ｊは、Ｐ１Ｓ５Ｄ分化４０日目のＴＢＲ１およびＣＴＩＰ２によるＥｄＵを用いる同時標識を示す代表的な画像を示す。図３Ｋは、Ｅ６培地中Ｐ／Ｓ／Ｄを使用する、加速ニューロン分化プロトコールの代替スキームを示す。図３Ｌは、ＰＡＸ６／ＴＵＪ１およびＴＢＲ１／ＴＵＪ１発現の免疫細胞化学による、１３日目のＥ６におけるＰ／Ｓ／Ｄプロトコールの検証を示す。スケールバー：５０μｍ、図３Ｌの左パネルおよび中央パネルの１００μｍは除く。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｎ．Ｓ．：有意差なし。
【００３３】
【図４】図４は、様々な培養プロトコールに関するＴＵＪ１の細胞内フロー分析を示すグラフを示す。各グラフは、１３日目のＴＵＪ１＋ニューロン集団の細胞内フローサイトメトリーのゲーティングを示す（青色：ＴＵＪ１染色。赤色：アイソタイプ対照）。
【００３４】
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、ＦＯＸＧ１発現に対する、細胞シグナル伝達における様々な小分子ベースの操作の影響を示す画像およびグラフを示す。図５Ａは、１３日目のＦＯＸＧ１／ＴＵＪ１の同時発現に関する免疫細胞化学画像を示す。図５Ｂは、Ｐ１Ｓ５Ｄ条件下で、ただしそれぞれ小分子因子の１つを系統的に除去した後の、ｑＲＴ−ＰＣＲによるＦＯＸＧ１転写物発現レベルの定量を示すグラフを示す。Ｎ＝３の独立な細胞培養バッチ。スケールバー：１００μｍ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【００３５】
【図６ＡＢ】図６Ａ〜６Ｆは、誘導の加速によって、成熟した電気生理学的特性を有するｈＰＳＣ由来の皮質ニューロンがｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られることを示す図解およびグラフを示す。図６Ａは、ニューロン誘導およびニューロン維持のための６つの異なる処理条件の概略図を示す。８日目までのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化プロトコールは、図２Ａに記載されるものと同じである。次に、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞を、８日目にＮＢ／Ｂ２７＋ＢＣＡ中でそれぞれ１５０，０００個／ｃｍ２および３００，０００個／ｃｍ２で継代した。継代したＰ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞の両方を、阻害剤なし（＋なし）、ＤＡＰＴを伴うもの（＋Ｄ）、およびＰＤ０３１５９０１（１ｕＭ）、ＳＵ５４０２（５ｕＭ）、ＤＡＰＴ、ＣＨＩＲ９９０２１（３ｕＭ）を伴うもの（＋ＰＳＤＣ）の３つの条件で、合計６つの異なる細胞処理を行ってさらに維持した。図６Ｂは、６つの分化条件を代表する細胞から得た分化１６日目の代表的な活動電位発火トレースのグラフを示す。図６Ｃは、１６日目の自動発火電気生理学的特性の定量である（電流注入なし）。黒色点は、個々の細胞の値を表す。左から右に、Ｎ＝４つの独立な細胞培養バッチからの１５、１８、１１、１６、１７、１２。ＰＳＤＣ：Ｐ（１）Ｓ（５）Ｄ＋ＣＨＩＲ。図６Ｄは、電流注入なしおよび−１０ｐＡの電流注入を用いた、分化１６日目に指示された発火周波数を伴う細胞の百分率の定量を示す。−１０ｐＡ電流注入によって、惹起発火が誘発され、さらに高い割合の細胞が高い発火周波数に適応することができた。左から右に、Ｎ＝４つの独立な細胞培養バッチからの１５、１８、１１、１６、１７、１２。ＰＳＤＣ：Ｐ（１μＭ）Ｓ（５μＭ）Ｄ＋ＣＨＩＲ。図６Ｅは、ホールセルパッチクランプによる、３７日目のＰ１Ｓ５Ｄ＋なしのニューロンの電位依存性ナトリウムチャネル応答を示すグラフを示し、この応答は、ナトリウムチャネルを特異的にブロックするテトロドトキシン（ＴＴＸ）によってブロックすることができた。挿入図：ナトリウムチャネル電流を誘発するために使用したプロトコール。図６Ｆは、Ｐ１Ｓ５Ｄ＋なしの条件下で４０日目に記録された、機能的シナプス形成の兆候である自発的興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）を示すグラフを示す。ｓＥＰＳＣは、ＡＭＰＡ受容体を選択的にブロックするＮＢＱＸによってブロックすることができたが、このことは、興奮性シナプス電流であることを示している。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図６ＣＤ】図６Ａ〜６Ｆは、誘導の加速によって、成熟した電気生理学的特性を有するｈＰＳＣ由来の皮質ニューロンがｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られることを示す図解およびグラフを示す。図６Ａは、ニューロン誘導およびニューロン維持のための６つの異なる処理条件の概略図を示す。８日目までのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化プロトコールは、図２Ａに記載されるものと同じである。次に、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞を、８日目にＮＢ／Ｂ２７＋ＢＣＡ中でそれぞれ１５０，０００個／ｃｍ２および３００，０００個／ｃｍ２で継代した。継代したＰ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞の両方を、阻害剤なし（＋なし）、ＤＡＰＴを伴うもの（＋Ｄ）、およびＰＤ０３１５９０１（１ｕＭ）、ＳＵ５４０２（５ｕＭ）、ＤＡＰＴ、ＣＨＩＲ９９０２１（３ｕＭ）を伴うもの（＋ＰＳＤＣ）の３つの条件で、合計６つの異なる細胞処理を行ってさらに維持した。図６Ｂは、６つの分化条件を代表する細胞から得た分化１６日目の代表的な活動電位発火トレースのグラフを示す。図６Ｃは、１６日目の自動発火電気生理学的特性の定量である（電流注入なし）。黒色点は、個々の細胞の値を表す。左から右に、Ｎ＝４つの独立な細胞培養バッチからの１５、１８、１１、１６、１７、１２。ＰＳＤＣ：Ｐ（１）Ｓ（５）Ｄ＋ＣＨＩＲ。図６Ｄは、電流注入なしおよび−１０ｐＡの電流注入を用いた、分化１６日目に指示された発火周波数を伴う細胞の百分率の定量を示す。−１０ｐＡ電流注入によって、惹起発火が誘発され、さらに高い割合の細胞が高い発火周波数に適応することができた。左から右に、Ｎ＝４つの独立な細胞培養バッチからの１５、１８、１１、１６、１７、１２。ＰＳＤＣ：Ｐ（１μＭ）Ｓ（５μＭ）Ｄ＋ＣＨＩＲ。図６Ｅは、ホールセルパッチクランプによる、３７日目のＰ１Ｓ５Ｄ＋なしのニューロンの電位依存性ナトリウムチャネル応答を示すグラフを示し、この応答は、ナトリウムチャネルを特異的にブロックするテトロドトキシン（ＴＴＸ）によってブロックすることができた。挿入図：ナトリウムチャネル電流を誘発するために使用したプロトコール。図６Ｆは、Ｐ１Ｓ５Ｄ＋なしの条件下で４０日目に記録された、機能的シナプス形成の兆候である自発的興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）を示すグラフを示す。ｓＥＰＳＣは、ＡＭＰＡ受容体を選択的にブロックするＮＢＱＸによってブロックすることができたが、このことは、興奮性シナプス電流であることを示している。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【図６ＥＦ】図６Ａ〜６Ｆは、誘導の加速によって、成熟した電気生理学的特性を有するｈＰＳＣ由来の皮質ニューロンがｉｎ  ｖｉｔｒｏで得られることを示す図解およびグラフを示す。図６Ａは、ニューロン誘導およびニューロン維持のための６つの異なる処理条件の概略図を示す。８日目までのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化プロトコールは、図２Ａに記載されるものと同じである。次に、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞を、８日目にＮＢ／Ｂ２７＋ＢＣＡ中でそれぞれ１５０，０００個／ｃｍ２および３００，０００個／ｃｍ２で継代した。継代したＰ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞の両方を、阻害剤なし（＋なし）、ＤＡＰＴを伴うもの（＋Ｄ）、およびＰＤ０３１５９０１（１ｕＭ）、ＳＵ５４０２（５ｕＭ）、ＤＡＰＴ、ＣＨＩＲ９９０２１（３ｕＭ）を伴うもの（＋ＰＳＤＣ）の３つの条件で、合計６つの異なる細胞処理を行ってさらに維持した。図６Ｂは、６つの分化条件を代表する細胞から得た分化１６日目の代表的な活動電位発火トレースのグラフを示す。図６Ｃは、１６日目の自動発火電気生理学的特性の定量である（電流注入なし）。黒色点は、個々の細胞の値を表す。左から右に、Ｎ＝４つの独立な細胞培養バッチからの１５、１８、１１、１６、１７、１２。ＰＳＤＣ：Ｐ（１）Ｓ（５）Ｄ＋ＣＨＩＲ。図６Ｄは、電流注入なしおよび−１０ｐＡの電流注入を用いた、分化１６日目に指示された発火周波数を伴う細胞の百分率の定量を示す。−１０ｐＡ電流注入によって、惹起発火が誘発され、さらに高い割合の細胞が高い発火周波数に適応することができた。左から右に、Ｎ＝４つの独立な細胞培養バッチからの１５、１８、１１、１６、１７、１２。ＰＳＤＣ：Ｐ（１μＭ）Ｓ（５μＭ）Ｄ＋ＣＨＩＲ。図６Ｅは、ホールセルパッチクランプによる、３７日目のＰ１Ｓ５Ｄ＋なしのニューロンの電位依存性ナトリウムチャネル応答を示すグラフを示し、この応答は、ナトリウムチャネルを特異的にブロックするテトロドトキシン（ＴＴＸ）によってブロックすることができた。挿入図：ナトリウムチャネル電流を誘発するために使用したプロトコール。図６Ｆは、Ｐ１Ｓ５Ｄ＋なしの条件下で４０日目に記録された、機能的シナプス形成の兆候である自発的興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）を示すグラフを示す。ｓＥＰＳＣは、ＡＭＰＡ受容体を選択的にブロックするＮＢＱＸによってブロックすることができたが、このことは、興奮性シナプス電流であることを示している。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【００３６】
【図７ＡＢ】図７Ａ〜７Ｃは、小分子因子がない状態で維持されたＰ１Ｓ５Ｄ培養物に関する電気生理学的パラメーターをまとめた図解およびグラフを示す。図７Ａは、さらなる分化時に成熟レベルを増大するための、Ｐ１Ｓ５Ｄ＋なしの処理の概略図である。図７Ｂは、さらなる分化時に成熟レベルを増大するための、図７Ｂおよび７Ｃで分析されたＰ１Ｓ５Ｄ＋なしの処理を示す。また図７Ｂは、３７日目までのＰ１Ｓ５Ｄ＋なしの処理の分析を示すグラフを示す。図７Ｃは、３７日目までのＰ１Ｓ５Ｄ＋なしの条件の電気生理学的特性の経時的定量分析を示すグラフを示す。時間が経過するにつれて、静止膜電位が過分極し、入力抵抗が低下し、Ｎａ＋−チャネル電流が増大し、活動電位閾値が低下し、最大発火周波数が増加した。統計は、最初に、各群の平均に統計的有意差が存在するかについて決定するために、通常の一元ＡＮＯＶＡを使用して行った：Ｆ＝０．３２２２、Ｐ＝０．８０９３、Ｒ２＝０．０２４８（ＲＥＭ）；Ｆ＝７．５５４、Ｐ＝０．００２３、Ｒ２＝０．５８６２（半値幅）；Ｆ＝０．７６５４、Ｐ＝０．５２０９、Ｒ２＝０．０５６０（上昇Ｔａｕ）；Ｆ＝４．８８、Ｐ＝０．００６、Ｒ２＝０．２８９１（入力抵抗）；Ｆ＝７．３６４、Ｐ＝０．０００５、Ｒ２＝０．３６７６（周波数）。次に、ダネット多重比較検定を使用して、各群の平均値を１６日目と比較した。有意である比較対照だけを、グラフ上でマークした。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、小分子因子がない状態で維持されたＰ１Ｓ５Ｄ培養物に関する電気生理学的パラメーターをまとめた図解およびグラフを示す。図７Ａは、さらなる分化時に成熟レベルを増大するための、Ｐ１Ｓ５Ｄ＋なしの処理の概略図である。図７Ｂは、さらなる分化時に成熟レベルを増大するための、図７Ｂおよび７Ｃで分析されたＰ１Ｓ５Ｄ＋なしの処理を示す。また図７Ｂは、３７日目までのＰ１Ｓ５Ｄ＋なしの処理の分析を示すグラフを示す。図７Ｃは、３７日目までのＰ１Ｓ５Ｄ＋なしの条件の電気生理学的特性の経時的定量分析を示すグラフを示す。時間が経過するにつれて、静止膜電位が過分極し、入力抵抗が低下し、Ｎａ＋−チャネル電流が増大し、活動電位閾値が低下し、最大発火周波数が増加した。統計は、最初に、各群の平均に統計的有意差が存在するかについて決定するために、通常の一元ＡＮＯＶＡを使用して行った：Ｆ＝０．３２２２、Ｐ＝０．８０９３、Ｒ２＝０．０２４８（ＲＥＭ）；Ｆ＝７．５５４、Ｐ＝０．００２３、Ｒ２＝０．５８６２（半値幅）；Ｆ＝０．７６５４、Ｐ＝０．５２０９、Ｒ２＝０．０５６０（上昇Ｔａｕ）；Ｆ＝４．８８、Ｐ＝０．００６、Ｒ２＝０．２８９１（入力抵抗）；Ｆ＝７．３６４、Ｐ＝０．０００５、Ｒ２＝０．３６７６（周波数）。次に、ダネット多重比較検定を使用して、各群の平均値を１６日目と比較した。有意である比較対照だけを、グラフ上でマークした。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００３７】
【図８ＡＢ】図８Ａ〜８Ｇは、星状膠細胞または星状膠細胞条件培地を用いるｈＰＳＣ由来のニューロンの共培養に関する図解、画像およびグラフを示す。図８Ａは、星状膠細胞共培養または条件培地を用いるＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの長期間維持の概略図である。図８Ｂは、２５日目および３５日目の、星状膠細胞または条件培地と共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの明視野画像を示す。図８Ｃは、−３０ｐＡ〜＋１００ｐＡの体細胞電流注入によって惹起された、２５日目および３５日目の星状膠細胞または条件培地を用いて共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの活動電位発火の代表的なトレースを示すグラフを示す。図８Ｄは、受動的膜特性および活動電位特性の定量分析を示すグラフを示す。図８Ｅは、星状膠細胞共培養によるＰ８Ｓ１０Ｄ＋ＤニューロンのＭＡＰ２ａｂ染色の画像を示しており、これは、培養により樹状突起枝分かれの複雑度が経時的に増大することを示している。図８Ｆは、条件培地だけで培養したニューロンと比較した、星状膠細胞と共に共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの３６日目のショール分析を示すグラフを示す。スケールバー：５０μｍ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。図８Ｇは、星状膠細胞と共に共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの、９０日目の明視野画像を示す。Ｎ＝２５日目、３５日目の星状膠細胞を含む培養物、および２５日目、３５日目の条件培地中の培養物で記録された、１５、２３、７、５個の細胞。
【図８ＣＤ】図８Ａ〜８Ｇは、星状膠細胞または星状膠細胞条件培地を用いるｈＰＳＣ由来のニューロンの共培養に関する図解、画像およびグラフを示す。図８Ａは、星状膠細胞共培養または条件培地を用いるＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの長期間維持の概略図である。図８Ｂは、２５日目および３５日目の、星状膠細胞または条件培地と共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの明視野画像を示す。図８Ｃは、−３０ｐＡ〜＋１００ｐＡの体細胞電流注入によって惹起された、２５日目および３５日目の星状膠細胞または条件培地を用いて共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの活動電位発火の代表的なトレースを示すグラフを示す。図８Ｄは、受動的膜特性および活動電位特性の定量分析を示すグラフを示す。図８Ｅは、星状膠細胞共培養によるＰ８Ｓ１０Ｄ＋ＤニューロンのＭＡＰ２ａｂ染色の画像を示しており、これは、培養により樹状突起枝分かれの複雑度が経時的に増大することを示している。図８Ｆは、条件培地だけで培養したニューロンと比較した、星状膠細胞と共に共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの３６日目のショール分析を示すグラフを示す。スケールバー：５０μｍ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。図８Ｇは、星状膠細胞と共に共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの、９０日目の明視野画像を示す。Ｎ＝２５日目、３５日目の星状膠細胞を含む培養物、および２５日目、３５日目の条件培地中の培養物で記録された、１５、２３、７、５個の細胞。
【図８ＥＦ】図８Ａ〜８Ｇは、星状膠細胞または星状膠細胞条件培地を用いるｈＰＳＣ由来のニューロンの共培養に関する図解、画像およびグラフを示す。図８Ａは、星状膠細胞共培養または条件培地を用いるＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの長期間維持の概略図である。図８Ｂは、２５日目および３５日目の、星状膠細胞または条件培地と共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの明視野画像を示す。図８Ｃは、−３０ｐＡ〜＋１００ｐＡの体細胞電流注入によって惹起された、２５日目および３５日目の星状膠細胞または条件培地を用いて共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの活動電位発火の代表的なトレースを示すグラフを示す。図８Ｄは、受動的膜特性および活動電位特性の定量分析を示すグラフを示す。図８Ｅは、星状膠細胞共培養によるＰ８Ｓ１０Ｄ＋ＤニューロンのＭＡＰ２ａｂ染色の画像を示しており、これは、培養により樹状突起枝分かれの複雑度が経時的に増大することを示している。図８Ｆは、条件培地だけで培養したニューロンと比較した、星状膠細胞と共に共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの３６日目のショール分析を示すグラフを示す。スケールバー：５０μｍ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。図８Ｇは、星状膠細胞と共に共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの、９０日目の明視野画像を示す。Ｎ＝２５日目、３５日目の星状膠細胞を含む培養物、および２５日目、３５日目の条件培地中の培養物で記録された、１５、２３、７、５個の細胞。
【図８Ｇ】図８Ａ〜８Ｇは、星状膠細胞または星状膠細胞条件培地を用いるｈＰＳＣ由来のニューロンの共培養に関する図解、画像およびグラフを示す。図８Ａは、星状膠細胞共培養または条件培地を用いるＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの長期間維持の概略図である。図８Ｂは、２５日目および３５日目の、星状膠細胞または条件培地と共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの明視野画像を示す。図８Ｃは、−３０ｐＡ〜＋１００ｐＡの体細胞電流注入によって惹起された、２５日目および３５日目の星状膠細胞または条件培地を用いて共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの活動電位発火の代表的なトレースを示すグラフを示す。図８Ｄは、受動的膜特性および活動電位特性の定量分析を示すグラフを示す。図８Ｅは、星状膠細胞共培養によるＰ８Ｓ１０Ｄ＋ＤニューロンのＭＡＰ２ａｂ染色の画像を示しており、これは、培養により樹状突起枝分かれの複雑度が経時的に増大することを示している。図８Ｆは、条件培地だけで培養したニューロンと比較した、星状膠細胞と共に共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの３６日目のショール分析を示すグラフを示す。スケールバー：５０μｍ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。図８Ｇは、星状膠細胞と共に共培養したＰ８Ｓ１０Ｄ＋Ｄニューロンの、９０日目の明視野画像を示す。Ｎ＝２５日目、３５日目の星状膠細胞を含む培養物、および２５日目、３５日目の条件培地中の培養物で記録された、１５、２３、７、５個の細胞。
【００３８】
【図９】図９は、ＰＳＤで処理した細胞の新生仔マウスへの生着の概略図を示す。
【００３９】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｅは、ｉＤＩＳＣＯ１８ベースのホールマウント脳の画像化によって査定された、新生仔マウス脳にグラフトされたｈＰＳＣ由来のニューロンの、Ｐ１Ｓ５Ｄ誘導を使用する広範な軸索投射および統合を示す画像を示す。図１０Ａは、１．５ヶ月目のグラフトコアおよびその皮質投射の背側の図を示す。図１０Ｂは、グラフト後１〜６ヶ月のグラフト脳の、全脳免疫組織化学的検査およびライトシート顕微鏡による画像化を使用する分析を示す。１．５ヶ月目のグラフトコアおよびその皮質投射の背側の図。図１０Ｃは、グラフトコア形態および主な投射領域（前頭皮質および脳梁）を示す投射（厚さ１００μｍ）を示す。点線：正中線、矢印：脳梁の異常な長軸方向の投射。図１０Ｄは、１．５ヶ月目、３ヶ月目および６ヶ月目のグラフト投射形態を示す、脳の半分のｉＤＩＳＣＯベースの画像化を示す。上パネル：グラフトコアおよびそれらの主な皮質投射を示す脳の半分の図。中央パネル：囲んだ領域の線維形態、および経時的に増大したそれらの枝分かれの詳細を示す投射（厚さ１００μｍ）。下パネル：海馬における、ＧＦＰを用いて同時標識されたｈシナプトフィジンを示す投射（厚さ１００μｍ）。ｈＳｙｎシグナルは、１．５ヶ月目は存在せず、３ヶ月目は非常におぼろげであったが、６ヶ月目には非常に高かった。図１０Ｅは、ヒト特異的細胞質マーカー（ＳＣ１２１）またはＧＦＰ発現によって同定されたグラフト誘導ニューロンにおける、皮質同一性のマーカーに関する免疫組織化学的分析を示す。グラフト細胞の約６０％が、ＴＢＲ１を発現し、約５０％が、ＣＴＩＰ２を発現し（すべてのＣＴＩＰ２＋細胞の半分よりも多くが、ＴＢＲ１を同時発現した）、約３０％が、ＳＡＴＢ２を発現した。Ｎ＝１ヶ月目、１．５ヶ月目および３ヶ月目については分析した動物５匹、ならびに６ヶ月目については分析した動物２匹。スケールバー：５００μｍ（ｂ、ｃ、ｄ、上パネルおよび中央パネル）、５０μｍ（ｄ、下パネルおよびｅ）。
【図１０ＢＣ】図１０Ａ〜１０Ｅは、ｉＤＩＳＣＯ１８ベースのホールマウント脳の画像化によって査定された、新生仔マウス脳にグラフトされたｈＰＳＣ由来のニューロンの、Ｐ１Ｓ５Ｄ誘導を使用する広範な軸索投射および統合を示す画像を示す。図１０Ａは、１．５ヶ月目のグラフトコアおよびその皮質投射の背側の図を示す。図１０Ｂは、グラフト後１〜６ヶ月のグラフト脳の、全脳免疫組織化学的検査およびライトシート顕微鏡による画像化を使用する分析を示す。１．５ヶ月目のグラフトコアおよびその皮質投射の背側の図。図１０Ｃは、グラフトコア形態および主な投射領域（前頭皮質および脳梁）を示す投射（厚さ１００μｍ）を示す。点線：正中線、矢印：脳梁の異常な長軸方向の投射。図１０Ｄは、１．５ヶ月目、３ヶ月目および６ヶ月目のグラフト投射形態を示す、脳の半分のｉＤＩＳＣＯベースの画像化を示す。上パネル：グラフトコアおよびそれらの主な皮質投射を示す脳の半分の図。中央パネル：囲んだ領域の線維形態、および経時的に増大したそれらの枝分かれの詳細を示す投射（厚さ１００μｍ）。下パネル：海馬における、ＧＦＰを用いて同時標識されたｈシナプトフィジンを示す投射（厚さ１００μｍ）。ｈＳｙｎシグナルは、１．５ヶ月目は存在せず、３ヶ月目は非常におぼろげであったが、６ヶ月目には非常に高かった。図１０Ｅは、ヒト特異的細胞質マーカー（ＳＣ１２１）またはＧＦＰ発現によって同定されたグラフト誘導ニューロンにおける、皮質同一性のマーカーに関する免疫組織化学的分析を示す。グラフト細胞の約６０％が、ＴＢＲ１を発現し、約５０％が、ＣＴＩＰ２を発現し（すべてのＣＴＩＰ２＋細胞の半分よりも多くが、ＴＢＲ１を同時発現した）、約３０％が、ＳＡＴＢ２を発現した。Ｎ＝１ヶ月目、１．５ヶ月目および３ヶ月目については分析した動物５匹、ならびに６ヶ月目については分析した動物２匹。スケールバー：５００μｍ（ｂ、ｃ、ｄ、上パネルおよび中央パネル）、５０μｍ（ｄ、下パネルおよびｅ）。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｅは、ｉＤＩＳＣＯ１８ベースのホールマウント脳の画像化によって査定された、新生仔マウス脳にグラフトされたｈＰＳＣ由来のニューロンの、Ｐ１Ｓ５Ｄ誘導を使用する広範な軸索投射および統合を示す画像を示す。図１０Ａは、１．５ヶ月目のグラフトコアおよびその皮質投射の背側の図を示す。図１０Ｂは、グラフト後１〜６ヶ月のグラフト脳の、全脳免疫組織化学的検査およびライトシート顕微鏡による画像化を使用する分析を示す。１．５ヶ月目のグラフトコアおよびその皮質投射の背側の図。図１０Ｃは、グラフトコア形態および主な投射領域（前頭皮質および脳梁）を示す投射（厚さ１００μｍ）を示す。点線：正中線、矢印：脳梁の異常な長軸方向の投射。図１０Ｄは、１．５ヶ月目、３ヶ月目および６ヶ月目のグラフト投射形態を示す、脳の半分のｉＤＩＳＣＯベースの画像化を示す。上パネル：グラフトコアおよびそれらの主な皮質投射を示す脳の半分の図。中央パネル：囲んだ領域の線維形態、および経時的に増大したそれらの枝分かれの詳細を示す投射（厚さ１００μｍ）。下パネル：海馬における、ＧＦＰを用いて同時標識されたｈシナプトフィジンを示す投射（厚さ１００μｍ）。ｈＳｙｎシグナルは、１．５ヶ月目は存在せず、３ヶ月目は非常におぼろげであったが、６ヶ月目には非常に高かった。図１０Ｅは、ヒト特異的細胞質マーカー（ＳＣ１２１）またはＧＦＰ発現によって同定されたグラフト誘導ニューロンにおける、皮質同一性のマーカーに関する免疫組織化学的分析を示す。グラフト細胞の約６０％が、ＴＢＲ１を発現し、約５０％が、ＣＴＩＰ２を発現し（すべてのＣＴＩＰ２＋細胞の半分よりも多くが、ＴＢＲ１を同時発現した）、約３０％が、ＳＡＴＢ２を発現した。Ｎ＝１ヶ月目、１．５ヶ月目および３ヶ月目については分析した動物５匹、ならびに６ヶ月目については分析した動物２匹。スケールバー：５００μｍ（ｂ、ｃ、ｄ、上パネルおよび中央パネル）、５０μｍ（ｄ、下パネルおよびｅ）。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜１０Ｅは、ｉＤＩＳＣＯ１８ベースのホールマウント脳の画像化によって査定された、新生仔マウス脳にグラフトされたｈＰＳＣ由来のニューロンの、Ｐ１Ｓ５Ｄ誘導を使用する広範な軸索投射および統合を示す画像を示す。図１０Ａは、１．５ヶ月目のグラフトコアおよびその皮質投射の背側の図を示す。図１０Ｂは、グラフト後１〜６ヶ月のグラフト脳の、全脳免疫組織化学的検査およびライトシート顕微鏡による画像化を使用する分析を示す。１．５ヶ月目のグラフトコアおよびその皮質投射の背側の図。図１０Ｃは、グラフトコア形態および主な投射領域（前頭皮質および脳梁）を示す投射（厚さ１００μｍ）を示す。点線：正中線、矢印：脳梁の異常な長軸方向の投射。図１０Ｄは、１．５ヶ月目、３ヶ月目および６ヶ月目のグラフト投射形態を示す、脳の半分のｉＤＩＳＣＯベースの画像化を示す。上パネル：グラフトコアおよびそれらの主な皮質投射を示す脳の半分の図。中央パネル：囲んだ領域の線維形態、および経時的に増大したそれらの枝分かれの詳細を示す投射（厚さ１００μｍ）。下パネル：海馬における、ＧＦＰを用いて同時標識されたｈシナプトフィジンを示す投射（厚さ１００μｍ）。ｈＳｙｎシグナルは、１．５ヶ月目は存在せず、３ヶ月目は非常におぼろげであったが、６ヶ月目には非常に高かった。図１０Ｅは、ヒト特異的細胞質マーカー（ＳＣ１２１）またはＧＦＰ発現によって同定されたグラフト誘導ニューロンにおける、皮質同一性のマーカーに関する免疫組織化学的分析を示す。グラフト細胞の約６０％が、ＴＢＲ１を発現し、約５０％が、ＣＴＩＰ２を発現し（すべてのＣＴＩＰ２＋細胞の半分よりも多くが、ＴＢＲ１を同時発現した）、約３０％が、ＳＡＴＢ２を発現した。Ｎ＝１ヶ月目、１．５ヶ月目および３ヶ月目については分析した動物５匹、ならびに６ヶ月目については分析した動物２匹。スケールバー：５００μｍ（ｂ、ｃ、ｄ、上パネルおよび中央パネル）、５０μｍ（ｄ、下パネルおよびｅ）。
【００４０】
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂは、移植の１ヶ月後のＰ８Ｓ１０ＤおよびＬＳＢ＋ＸＡＶグラフトのｉＤＩＳＣＯベースの全脳免疫蛍光分析の画像を示す。図１１Ａは、ＧＦＰについて染色されたＰ８Ｓ１０Ｄがグラフトされた脳の半分の画像を示す（前頭皮質領域の全体図および詳細）。Ｐ８Ｓ１０Ｄグラフトは、新生仔マウス皮質への移植後、一貫性のない生存を示した。しかし、生存グラフトを有する動物は、皮質領域にわたって長い線維投射を示した。軸索がないＧＦＰ＋細胞は、グラフトの外側に豊富に検出された（囲んだ領域）。図１１Ｂは、ＧＦＰについて染色されたＬＳＢ＋Ｘがグラフトされた脳の半分の画像を示す。全体図（側面および背側）、およびグラフト周辺部の詳細（囲んだ領域）。ＬＳＢ＋Ｘグラフトは、宿主脳において大量の過成長を示して腫瘍様構造をもたらし、ニューロン分化および成熟の証拠は非常に限られていた。ごくわずかな短い線維路を、グラフト周辺部に見ることができる（囲んだ領域）。Ｎ＝分析したＰ８Ｓ１０Ｄ条件については動物２匹、およびＬＳＢ＋ＸＡＶ条件については動物４匹。スケールバー：５００μｍ。
【００４１】
【図１２ＡＢ】図１２Ａ〜１２Ｄは、移植の１．５ヶ月後のＰ１Ｓ５Ｄグラフトニューロンの投射経路および形態の画像を示す。図１２Ａは、成体マウス脳の目印が、組織自己蛍光によって明らかになり得ることを示す画像を示す。４８８ｎｍのレーザー励起の内在蛍光から、主な有髄化路を示すｉＤＩＳＣＯ処理後の成体マウス脳の中心で撮影された光学的切片の厚さ１００μｍの最大投射。図１２Ｂは、主経路に従っていないグラフトニューロンからの軸索の例を示す画像を示す。誕生時にグラフトされた、ＧＦＰについて染色された全ｉＤＩＳＣＯで処理した１．５ヶ月齢マウスの脳の、厚さ１００μｍの最大投射。線条体では、皮質におけるグラフトニューロンから下行するＧＦＰ＋軸索は、主に主下行路の外側に見られる。皮質では、ＧＦＰ＋軸索の大きい束が、異常な位置に観察された。図１２Ｃは、主経路に従うグラフトニューロンからの軸索の例を示す画像を示す。誕生時にグラフトされた、ＧＦＰについて染色されたｉＤＩＳＣＯで処理した１．５ヶ月齢マウスの脳。海馬では、ＣＡ３に存在するグラフトニューロン（矢印）は、海馬采路に沿って中隔に向かって送られる軸索である。皮質では、グラフトニューロンは脳梁軸索に従って半球を横断する。図１２Ｄは、グラフトされた脳に見られるいくつかの形態の画像を示し、大部分のニューロンは、グラフトコア内で緻密化され、したがってそれらの樹状形態は隠される。しかし、いくつかのＧＦＰ＋ニューロンは、グラフトコアの外側に見出され、多様な形態を示している。Ｎ＝３、スケールバーは、１ｍｍ（ａ）、５００μｍ（ｂ、ｃ）および２００μｍ（ｄ）である。
【図１２ＣＤ】図１２Ａ〜１２Ｄは、移植の１．５ヶ月後のＰ１Ｓ５Ｄグラフトニューロンの投射経路および形態の画像を示す。図１２Ａは、成体マウス脳の目印が、組織自己蛍光によって明らかになり得ることを示す画像を示す。４８８ｎｍのレーザー励起の内在蛍光から、主な有髄化路を示すｉＤＩＳＣＯ処理後の成体マウス脳の中心で撮影された光学的切片の厚さ１００μｍの最大投射。図１２Ｂは、主経路に従っていないグラフトニューロンからの軸索の例を示す画像を示す。誕生時にグラフトされた、ＧＦＰについて染色された全ｉＤＩＳＣＯで処理した１．５ヶ月齢マウスの脳の、厚さ１００μｍの最大投射。線条体では、皮質におけるグラフトニューロンから下行するＧＦＰ＋軸索は、主に主下行路の外側に見られる。皮質では、ＧＦＰ＋軸索の大きい束が、異常な位置に観察された。図１２Ｃは、主経路に従うグラフトニューロンからの軸索の例を示す画像を示す。誕生時にグラフトされた、ＧＦＰについて染色されたｉＤＩＳＣＯで処理した１．５ヶ月齢マウスの脳。海馬では、ＣＡ３に存在するグラフトニューロン（矢印）は、海馬采路に沿って中隔に向かって送られる軸索である。皮質では、グラフトニューロンは脳梁軸索に従って半球を横断する。図１２Ｄは、グラフトされた脳に見られるいくつかの形態の画像を示し、大部分のニューロンは、グラフトコア内で緻密化され、したがってそれらの樹状形態は隠される。しかし、いくつかのＧＦＰ＋ニューロンは、グラフトコアの外側に見出され、多様な形態を示している。Ｎ＝３、スケールバーは、１ｍｍ（ａ）、５００μｍ（ｂ、ｃ）および２００μｍ（ｄ）である。
【００４２】
【図１３ＡＢ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ｉｎ  ｖｉｖｏのＰ１Ｓ５Ｄグラフトニューロンの電気生理を示す画像および図を示す。図１３Ａおよび１３Ｂは、活動電位および発火パターン、ならびにそれぞれ異常な成熟特性を有する、Ｐ１０（図１３Ａ）およびＰ３０（図１３Ｂ）におけるＧＦＰ＋グラフト由来のｓＥＰＳＣの記録を示す。図１３Ｃの代表的な活動電位、ならびにＰ１５およびＰ４５において記録された図１３ＤのｓＥＰＳＣによって示される通り、図１３Ｃおよび１３Ｄは、グラフトのほとんどのＧＦＰ＋細胞が、より未成熟の発火パターンを示したことを示す。Ｎ＝分析したＰ１Ｓ５Ｄ条件については動物４匹、および分析したＰ８Ｓ１０状態については動物１匹。
【図１３ＣＤ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ｉｎ  ｖｉｖｏのＰ１Ｓ５Ｄグラフトニューロンの電気生理を示す画像および図を示す。図１３Ａおよび１３Ｂは、活動電位および発火パターン、ならびにそれぞれ異常な成熟特性を有する、Ｐ１０（図１３Ａ）およびＰ３０（図１３Ｂ）におけるＧＦＰ＋グラフト由来のｓＥＰＳＣの記録を示す。図１３Ｃの代表的な活動電位、ならびにＰ１５およびＰ４５において記録された図１３ＤのｓＥＰＳＣによって示される通り、図１３Ｃおよび１３Ｄは、グラフトのほとんどのＧＦＰ＋細胞が、より未成熟の発火パターンを示したことを示す。Ｎ＝分析したＰ１Ｓ５Ｄ条件については動物４匹、および分析したＰ８Ｓ１０状態については動物１匹。
【００４３】
【図１４】図１４は、急速な皮質ニューロン誘導パラダイムの概要である。ＬＳＢによる二重ＳＭＡＤ阻害は、栄養外胚葉、中内胚葉、および非神経性外胚葉細胞運命を阻害し、ＣＮＳ運命を促進する。ＸＡＶ９３９は、前側ＣＮＳ同一性を促進するが、ＳＵ５４０２／ＰＤ０３２５９０１は、多能性から神経外胚葉性運命に向かって出るのを加速する。高度に過渡的な前側神経外胚葉性前駆体状態は、ＤＡＰＴおよびＳＵ５４０２／ＰＤ０３２５９０１の存在下で、有糸分裂後皮質運命に向かって駆動される。未成熟皮質ニューロンは、分化１６日目までに機能的成熟度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで獲得することができ、新生仔マウス宿主脳にグラフトされた８日目のニューロンは、皮質内の広範な軸索投射および統合を示す。
【００４４】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｇは、Ｐ／Ｓ／Ｄ処理時の投与量依存的な増殖応答および生存率を示す。（ａ）Ｐ／Ｓ／Ｄ処理翌日（分化３日目）の全細胞における、ホスホ−ヒストン３（ｐＨ３）を発現する有糸分裂細胞の百分率。（ｂ）Ｐ／Ｓ／Ｄ処理翌日（分化３日目）の全細胞における、切断型カスパーゼ３（ＣＣ３）を発現するアポトーシス細胞の百分率。ａ、ｂの破線の囲みで強調されている条件は、Ｓ濃度が増大する順序によって並べられたＰ１投与群である。ａ、ｂでは、Ｎ＝２つの独立な細胞培養バッチのそれぞれから無作為に選択された４つの写真フレーム。統計的分析を、ダネット多重比較検定を使用して行って、各投与を分化３日目のＬＳＢ＋Ｘと比較した。ＬＳＢ＋Ｘとは有意に異なる比較対照だけを、グラフ上でマークした。（ｃ）Ｐの濃度が増大する順序、または（ｄ）Ｓの濃度が増大する順序に従う、ａのグループ分けされた結果の概要。（ｅ）Ｐの濃度が増大する順序、または（ｆ）Ｓの濃度が増大する順序に従う、ｂのグループ分けされた結果の概要。ｃ〜ｆでは、統計的分析を、ダネット多重比較検定を使用して行って、Ｐの各投与をＰなしの群と比較し（ｃ、ｅ）、Ｓの各投与をＳ投与なしの群と比較した（ｄ、ｆ）。（ｇ）ｃ〜ｆに示される様々な投与群の命名法。黒色点は、個々の写真フレームの定量から得られた値を表す。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【００４５】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｄは、分化１３日目の追加の運命マーカーの特徴付けを示す。（ａ）Ｐ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄの両方の誘導における、分化１３日目の有糸分裂後ニューロンにおけるＶＩ層マーカーＴＬＥ４の発現、および前駆細胞におけるＣＵＸ２の発現。（ｂ）異なる脳エリアおよび運命を表すＴＢＲ１以外のマーカーの１３日目のｍＲＮＡ発現の定量。Ｎ＝３つの独立な細胞培養バッチ。皮質前駆細胞マーカーＯＴＸ２、ＺＮＦ５２１、ＢＲＮ２およびＣＯＵＰＴＦ１、Ｖ層皮質ニューロンマーカーＣＴＩＰ２、ならびに小胞グルタミン酸輸送体ＶＧＬＵＴ１は、ＬＳＢ＋Ｘと比較してアップレギュレートされる。（ｃ）１３日目のＰ１Ｓ５Ｄ培養物およびＰ８Ｓ１０Ｄ培養物の両方におけるＢＲＮ３Ａ＋細胞およびＩＳＬ１＋細胞の発現。（ｄ）１３日目のＢＲＮ３Ａ＋細胞の定量。スケールバー：５０μｍ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【００４６】
【図１７】図１７は、１３日目を超える長期間培養の分子の特徴付けを示す。ＬＳＢ＋Ｘで処理した培養物と比較した、Ｐ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄで処理した培養物におけるｍＲＮＡ発現の定量（図３Ｆ）。ＲＧＳ４：皮質ＩＩ層〜ＩＩＩ層、Ｖ層マーカー。ＣＨＸ１０：レチナールマーカー。ＧＦＡＰ、ＡＱＰ４：星状膠細胞マーカー。ＯＬＩＧ２：オリゴデンドロサイト前駆体マーカー。ＬＳＢ＋Ｘ細胞の長期間培養では、小分子阻害剤を再添加せずに、細胞をＮ２培地中で維持した。Ｎ＝３つの独立な細胞培養バッチ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す。
【００４７】
【図１８ＡＢ】図１８Ａ〜１８Ｇは、Ｐ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄで処理した細胞の両方における、ＣＵＸ２−ＣｒｅＥＲＴ２条件的レポーターｈＰＳＣ株の発生、およびＣＵＸ２＋ニューロンの初期発生を示す。（ａ）ＣＵＸ２第１エクソンを標的化する相同性ドナーの設計。選択カセットを、遺伝子組換え後のＦｌｐリコンビナーゼの発現時に切除した。標的化を確認するためのプライマー配列の位置を示す。（ｂ）標的化対立遺伝子の概略図。遺伝子導入株は、ＣＵＸ２遺伝子座からＣｒｅＥＲＴ２を発現し、ＡＡＶＳ１セーフハーバー遺伝子座にあるＣＡＧプロモーター下でＦＬＥＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ条件的レポーターを発現する。４ＯＨＴの存在下でＣＵＸ２が発現すると、レポーター遺伝子座での組換えおよびｔｄＴｏｍａｔｏ発現が誘導される。（ｃ）標的化遺伝子組換えのＰＣＲによる確認。レーン１〜２によって、それぞれＣＵＸ２ゲノム遺伝子座の５’および３’ＣｒｅＥＲＴ２挿入が確認され、レーン３〜４によって、それぞれＡＡＶＳ１ゲノム遺伝子座の５’および３’ＣＡＧ−ＦＬＥＸ／ｔｄＴｏｍａｔｏ挿入が確認される。（ｄ）ＣＵＸ２遺伝子座のゲノムＤＮＡシークエンシングによって、１つの対立遺伝子および野生型非標的化対立遺伝子の標的化の成功が確認される。（ｅ）４ＯＨＴ誘導後の培養による７０日目のｔｄＴｏｍａｔｏ陽性有糸分裂後ニューロン（ｉ）。典型的な錐体形態および長い投射は、より高い拡大率で観察することができる（ｉｉ）。（ｆ）分化３３日目にＰ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄ培養で観察された、成熟形態を有するＣＵＸ２＋ニューロン。（ｇ）３３日目の錐体形態は、Ｐ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄニューロンの皮質投射ニューロン同一性を示唆している。ｅ（ｉ）のスケールバーは１００μｍを表し、他のスケールバーは５０μｍを表す。
【図１８ＣＤＥＦＧ】図１８Ａ〜１８Ｇは、Ｐ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄで処理した細胞の両方における、ＣＵＸ２−ＣｒｅＥＲＴ２条件的レポーターｈＰＳＣ株の発生、およびＣＵＸ２＋ニューロンの初期発生を示す。（ａ）ＣＵＸ２第１エクソンを標的化する相同性ドナーの設計。選択カセットを、遺伝子組換え後のＦｌｐリコンビナーゼの発現時に切除した。標的化を確認するためのプライマー配列の位置を示す。（ｂ）標的化対立遺伝子の概略図。遺伝子導入株は、ＣＵＸ２遺伝子座からＣｒｅＥＲＴ２を発現し、ＡＡＶＳ１セーフハーバー遺伝子座にあるＣＡＧプロモーター下でＦＬＥＸ−ｔｄＴｏｍａｔｏ条件的レポーターを発現する。４ＯＨＴの存在下でＣＵＸ２が発現すると、レポーター遺伝子座での組換えおよびｔｄＴｏｍａｔｏ発現が誘導される。（ｃ）標的化遺伝子組換えのＰＣＲによる確認。レーン１〜２によって、それぞれＣＵＸ２ゲノム遺伝子座の５’および３’ＣｒｅＥＲＴ２挿入が確認され、レーン３〜４によって、それぞれＡＡＶＳ１ゲノム遺伝子座の５’および３’ＣＡＧ−ＦＬＥＸ／ｔｄＴｏｍａｔｏ挿入が確認される。（ｄ）ＣＵＸ２遺伝子座のゲノムＤＮＡシークエンシングによって、１つの対立遺伝子および野生型非標的化対立遺伝子の標的化の成功が確認される。（ｅ）４ＯＨＴ誘導後の培養による７０日目のｔｄＴｏｍａｔｏ陽性有糸分裂後ニューロン（ｉ）。典型的な錐体形態および長い投射は、より高い拡大率で観察することができる（ｉｉ）。（ｆ）分化３３日目にＰ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄ培養で観察された、成熟形態を有するＣＵＸ２＋ニューロン。（ｇ）３３日目の錐体形態は、Ｐ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄニューロンの皮質投射ニューロン同一性を示唆している。ｅ（ｉ）のスケールバーは１００μｍを表し、他のスケールバーは５０μｍを表す。
【００４８】
【図１９−１】図１９は、Ｐ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄの分化１３日目の細胞を特徴付けるためのチェックリストを示す（ＴＢＲ１＋ニューロン以外）。
【図１９−２】図１９は、Ｐ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄの分化１３日目の細胞を特徴付けるためのチェックリストを示す（ＴＢＲ１＋ニューロン以外）。
【００４９】
【図２０】図２０は、ＣＵＸ２レポーター株遺伝子型解析のために使用したプライマーを示す。
【００５０】
【図２１】図２１は、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞およびＰ８Ｓ１０Ｄ細胞のための毎日の培養プロトコールの概要を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
５．詳細な説明
本開示の主題は、例えば、ヒト幹細胞を機能的皮質ニューロンにｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させることによって、ヒト幹細胞から誘導される皮質ニューロンを調製する方法、およびこのような方法によって生成された細胞に関する。ＣＮＳ神経変性障害を処置するためのこのような細胞の使用も提供される。
【００５２】
本開示を、制限することなく明らかにする目的で、詳細な説明を、以下の小区分に分ける。
５．１  定義
５．２  幹細胞を分化させる方法
５．３  分化細胞集団を含む組成物
５．４  ＣＮＳ神経変性障害を予防および／または処置する方法
５．５  キット
【００５３】
５．１  定義
本明細書において使用される用語は、一般に、それぞれの用語が使用される本発明の文脈および特定の文脈において、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有する。本発明の組成物および方法、ならびにそれらをどのように作成し使用するかについての説明により、実務者に追加の指針を提供するためのある特定の用語を、以下または本明細書の他所で論じる。
【００５４】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内であることを意味し、この範囲は、部分的に、値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定系の限界に応じて決まる。例えば、「約」は、当技術分野の実施に従って、標準偏差の３倍以内または３倍超を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、例えば１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物系またはプロセスに関して、この用語は、値のある指標以内、例えば５倍以内または２倍以内であることを意味し得る。
【００５５】
本明細書で使用される、「シグナル伝達タンパク質」に関する「シグナル伝達」という用語は、膜受容体タンパク質とのリガンドの結合または他の刺激によって活性化されるか、またはその他の方式で影響を受けるタンパク質を指す。シグナル伝達タンパク質の例として、ＳＭＡＤ、ベータ−カテニン（catnin）を含むウィングレス（Ｗｎｔ）複合体タンパク質、ＮＯＴＣＨ、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、アクチビン、ノーダルおよびグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３Ｐ）タンパク質、ＦＧＦおよびＭＡＰＫ／ＥＲＫ（ＭＥＫ）タンパク質が挙げられるが、それらに限定されない。多くの細胞表面受容体または内部受容体タンパク質については、リガンドと受容体の相互反応は、細胞の応答に直結しない。リガンドによって活性化された受容体は、最初に、細胞内の他のタンパク質と相互反応することができ、その後、細胞の挙動に対するリガンドの最終的な生理的効果が生じる。しばしば、相互反応する一連のいくつかの細胞タンパク質の挙動が、受容体の活性化または阻害後に変わる。受容体の活性化によって誘導された一連の細胞変化の全体は、シグナル伝達機構またはシグナル伝達経路と呼ばれる。
【００５６】
本明細書で使用される「シグナル」という用語は、細胞の構造および機能の変化を制御する、内部および外部の因子を指す。それらは、化学的または物理的性質であり得る。
【００５７】
本明細書で使用される「リガンド」という用語は、受容体に結合する分子およびタンパク質、例えば、形質転換成長因子−ベータ（ＴＦＧβ）、アクチビン、ノーダル、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）等を指す。
【００５８】
本明細書で使用される「阻害剤」は、分子または経路のシグナル伝達機能を妨害する（例えば、低減、低下、抑制、排除、またはブロックする）、化合物または分子（例えば、小分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、天然化合物、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、または抗体）を指す。阻害剤は、命名されたタンパク質（シグナル伝達分子、命名されたシグナル伝達分子に関与する任意の分子、命名された関連分子、例えばグリコーゲン合成酵素キナーゼ３β（ＧＳＫ３β））（例えば、それらに限定されるものではないが、本明細書に記載されるシグナル伝達分子を含む）の任意の活性を変化させる、任意の化合物または分子であり得る。一例として、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤は、例えば、ＳＭＡＤと直接接触し、ＳＭＡＤ  ｍＲＮＡと接触し、ＳＭＡＤのコンフォメーション変化を引き起こし、ＳＭＡＤタンパク質レベルを低下させ、またはシグナル伝達パートナーとのＳＭＡＤとの相互反応を妨害し、ＳＭＡＤ標的遺伝子の発現に影響を及ぼすことによって機能し得る。また阻害剤には、上流シグナル伝達分子（例えば、細胞外ドメイン内）を遮断することによってＳＭＡＤ生物活性を間接的に調節する分子が含まれる。ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤分子および効果の例として、骨形成タンパク質を封鎖し、ＡＬＫ受容体１、２、３および６の活性化を阻害し、したがって下流ＳＭＡＤ活性化を防止するノギンが挙げられる。同じく、コーディン、ケルベロス、フォリスタチンも同様に、ＳＭＡＤシグナル伝達の細胞外活性化因子を封鎖する。膜貫通タンパク質であるＢａｍｂｉも、細胞外ＴＧＦβシグナル伝達分子を封鎖する疑似受容体として作用する。アクチビン、ノーダル、ＴＧＦβ、およびＢＭＰをブロックする抗体は、ＳＭＡＤシグナル伝達等の細胞外活性化因子を中和するための使用を企図される。先の例は、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害に関するが、他のシグナル伝達分子を阻害するために、同様または類似の機構を使用することができる。阻害剤の例として、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害のためのＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ）およびＳＢ４３１５４２（ＳＢ）（ＬＳＢ）、Ｗｎｔ阻害のためのＸＡＶ９３９（Ｘ）、ＦＧＦシグナル伝達阻害のためのＳＵ５４０２（Ｓ）、ノッチシグナル伝達阻害のためのＤＡＰＴ（Ｄ）、およびＭＡＰＫ／ＥＲＫ（ＭＥＫ）シグナル伝達阻害のためのＰＤ０３２５９０１（Ｐ）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５９】
阻害剤は、命名された分子の阻害を引き起こす命名されたシグナル伝達分子から上流にある分子に結合し、影響を及ぼすことによって誘導される阻害に加えて、競合的阻害（別の公知の結合化合物の結合を排除または低減するような方式で、活性部位に結合する）およびアロステリック阻害（タンパク質の活性部位との化合物の結合を妨害するような方式で、タンパク質コンフォメーションを変化させる方式でタンパク質に結合する）に関して説明される。阻害剤は、実際にシグナル伝達標的と接触することによって、シグナル伝達標的またはシグナル伝達標的経路を阻害する「直接的阻害剤」であり得る。
【００６０】
本明細書で使用される「活性化因子」は、分子または経路のシグナル伝達機能、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化を増大し、誘導し、刺激し、活性化し、容易にし、または増強する化合物を指す。
【００６１】
本明細書で使用される「誘導体」という用語は、類似のコア構造を有する化合物を指す。
【００６２】
本明細書で使用される「細胞の集団」または「細胞集団」という用語は、少なくとも２個の細胞の群を指す。非限定的な例では、細胞集団は、少なくとも約１０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、少なくとも約８００個、少なくとも約９００個、少なくとも約１０００個の細胞、少なくとも約５，０００個の細胞または少なくとも約１０，０００個の細胞または少なくとも約１００，０００個の細胞または少なくとも約１，０００，０００個の細胞を含み得る。集団は、１種の細胞型を含む純粋な集団、例えば皮質ニューロン前駆体の集団、または未分化幹細胞の集団であり得る。あるいは、集団は、１種を超える細胞型、例えば混合細胞集団を含み得る。
【００６３】
本明細書で使用される「幹細胞」という用語は、培養で無期限に分裂し、指定された細胞を生じる能力を有する細胞を指す。ヒト幹細胞は、ヒト由来の幹細胞を指す。
【００６４】
本明細書で使用される「胚幹細胞」という用語は、培養による長期間にわたる分化なしに分裂することができ、３つの一次胚葉の細胞および組織に発達することが公知の、着床前段階の胚から誘導される一次（未分化）細胞を指す。ヒト胚幹細胞は、ヒト由来の胚幹細胞を指す。本明細書で使用される「ヒト胚幹細胞」または「ｈＥＳＣ」という用語は、培養による長期間にわたる分化なしに分裂することができ、３つの一次胚葉の細胞および組織に発達することが公知の、胚盤胞段階を含む初期段階のヒト胚から誘導されるタイプの多能性幹細胞を指す。
【００６５】
本明細書で使用される「胚幹細胞株」という用語は、数日間、数ヶ月間から数年間まで、分化なしに増殖を可能にするｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で培養された、胚幹細胞集団を指す。例えば、「胚幹細胞」は、培養による長期間にわたる分化なしに分裂することができ、３つの一次胚葉の細胞および組織に発達することが公知の、着床前段階の胚から誘導される一次（未分化）細胞を指すことができる。ヒト胚幹細胞は、ヒト由来の胚幹細胞を指す。本明細書で使用される「ヒト胚幹細胞」または「ｈＥＳＣ」という用語は、培養による長期間にわたる分化なしに分裂することができ、３つの一次胚葉の細胞および組織に発達することが公知の、胚盤胞段階を含む初期段階のヒト胚から誘導されるタイプの多能性幹細胞を指す。
【００６６】
本明細書で使用される「多能性（pluripotent）」という用語は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉を含む、生物の３種の発達上の胚葉に発達する能力を指す。
【００６７】
本明細書で使用される「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、ある特定の胚性遺伝子（例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＫＬＦ４導入遺伝子）が、体細胞、例えばＣＩ  ４、Ｃ７２等に導入されることによって形成された、胚幹細胞に類似したタイプの多能性幹細胞を指す（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、TakahashiおよびYamanaka、Cell  １２６巻、６６３〜６７６頁（２００６年）を参照されたい）。
【００６８】
本明細書で使用される「体細胞」という用語は、配偶子（卵または精子）以外の体内の任意の細胞を指し、時に「成体」細胞と呼ばれる。
【００６９】
本明細書で使用される「体細胞（成体）幹細胞」という用語は、自己再生（実験室中）および分化の両方について能力が制限されている、多くの臓器および分化した組織に見出される相対的に稀な未分化細胞を指す。このような細胞は、それらの分化能が異なっているが、通常は起源臓器の細胞型に限定される。
【００７０】
本明細書で使用される「ニューロン」という用語は、神経系の主要な機能単位である神経細胞を指す。ニューロンは、細胞体、ならびにその突起である軸索および１つまたは複数の樹状突起からなる。ニューロンは、シナプスで神経伝達物質を放出することによって、他のニューロンまたは細胞に情報を伝送する。
【００７１】
本明細書で使用される「増殖」という用語は、細胞数の増加を指す。
【００７２】
本明細書で使用される「未分化」という用語は、指定された細胞型にまだ発達していない細胞を指す。
【００７３】
本明細書で使用される「分化」という用語は、指定されていない胚性細胞が、心臓、肝臓または筋細胞などの指定された細胞の特質を獲得するプロセスを指す。分化は、通常は細胞表面に埋め込まれたタンパク質を伴うシグナル伝達経路を介して、細胞遺伝子と細胞外側の物理的および化学的条件との相互反応によって制御される。
【００７４】
本明細書で使用される「定方向性分化」という用語は、腸ニューロン前駆体などの特定の（例えば所望の）細胞型への分化を誘導するための、幹細胞の培養条件の操作を指す。
【００７５】
幹細胞に関して本明細書で使用される「定方向性分化」という用語は、多能性状態から、より成熟したまたは指定された細胞の運命（例えば、皮質ニューロン等）への幹細胞の移行を促進するための、小分子、成長因子タンパク質、および他の成長条件の使用を指す。
【００７６】
細胞に関して本明細書で使用される「分化を誘導する」という用語は、デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）から非デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）への変化を指す。したがって、「幹細胞の分化を誘導する」は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）を、幹細胞とは異なる特徴、例えば遺伝子型（例えば、遺伝子分析、例えばマイクロアレイによって決定される遺伝子発現の変化）および／または表現型（例えば、タンパク質、例えばＴＵＪＩ、ＤＣＸ、ＴＢＲ１、ＲＥＥＬＩＮ、およびＦＯＸＧ１の発現の変化）を有する子孫細胞に分裂するように誘導することを指す。
【００７７】
本明細書で使用される「細胞培養」という用語は、研究または医療処置のための人工培地におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の成長を指す。
【００７８】
本明細書で使用される「培養培地」という用語は、培養容器、例えばペトリプレート、マルチウェルプレート等の細胞を被覆し、細胞に栄養を与え、細胞を補助するための栄養分を含有する液体を指す。また培養培地は、細胞内の所望の変化をもたらすために添加される成長因子を含み得る。
【００７９】
本明細書で使用される、細胞を化合物（例えば、１種または複数の阻害剤、活性化因子、および／または誘導因子）と「接触させる」という用語は、細胞を化合物に曝露すること、例えば化合物を、細胞に触れさせる位置に置くことを指す。接触は、任意の適切な方法を使用して遂行され得る。例えば接触は、化合物を、細胞を入れた管に添加することによって遂行され得る。また接触は、化合物を、細胞を含む培養培地に添加することによって遂行され得る。化合物のそれぞれ（例えば、阻害剤、活性化因子、および本明細書に開示される迷走神経堤パターン形成を誘導する分子）は、細胞を含む培養培地に、溶液（例えば、濃縮溶液）として添加され得る。あるいはまたはさらには、化合物（例えば、阻害剤、活性化因子、および本明細書に開示される迷走神経堤パターン形成を誘導する分子）ならびに細胞は、配合された細胞培養培地中に存在し得る。
【００８０】
有効量とは、所望の効果をもたらす量である。
【００８１】
本明細書で使用される「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工環境、および人工環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境は、試験管および細胞培養物によって例示されるが、それらに限定されない。
【００８２】
本明細書で使用される「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、自然環境（例えば、動物または細胞）、および自然環境内で生じるプロセスまたは反応、例えば胚発達、細胞分化、神経管形成等を指す。
【００８３】
遺伝子またはタンパク質に関して本明細書で使用される「発現する」という用語は、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイなどのアッセイを使用して観察され得るｍＲＮＡまたはタンパク質を作製すること指す。
【００８４】
本明細書で使用される「マーカー」または「細胞マーカー」という用語は、特定の細胞または細胞型を特定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞のためのマーカーは、１種のマーカーに限定することができず、複数のマーカーは、マーカーの指定の群によって、ある細胞または細胞型を別の細胞または細胞型から同定することができるように、マーカーの「パターン」を指すことができる。
【００８５】
本明細書で使用される「から誘導された」または「から確立された」または「から分化した」という用語は、本明細書で開示される任意の細胞に関する場合、細胞系、組織中の親細胞（例えば、解離された胚、または体液）から、任意の操作、例えばそれらに限定されるものではないが、単細胞単離、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養、例えばタンパク質、化学物質、放射線、ウイルスによる感染を使用する処置および／または変異誘発、ＤＮＡ配列、例えばモルフォゲン等を用いるトランスフェクション、培養した親細胞に含有されている任意の細胞の選択（例えば連続培養による）を使用して得られた（例えば、単離された、精製された等）細胞を指す。誘導された細胞は、成長因子、サイトカイン、サイトカイン処置の選択された進行、接着性、接着性の欠如、分類手順等に対する応答に関して、混合集団から選択され得る。
【００８６】
本明細書の「個体」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば哺乳動物などの脊椎動物である。哺乳動物には、ヒト、霊長類、家畜動物、スポーツ用動物、げっ歯類およびペットが含まれるが、それらに限定されない。非ヒト動物対象の非限定的な例として、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットなどのげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、ならびに非ヒト霊長類、例えば類人猿およびサルが挙げられる。
【００８７】
本明細書で使用される「疾患」という用語は、細胞、組織または臓器の正常な機能を損なうまたは妨害する任意の状態または障害を指す。
【００８８】
本明細書で使用される「処置する」または「処置」という用語は、処置を受ける個体または細胞の疾患過程を変えるための臨床的な介入を指し、この処置は、予防のために、または臨床病理の過程中のいずれかに実施され得る。処置の治療効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的結果の縮小、転移の予防、疾患進行速度の低下、病状の回復または緩和、および寛解または予後の改善が含まれるが、それらに限定されない。疾患または障害の進行を予防することによって、処置は、影響を受けているもしくは診断を受けた対象、または障害を有することが疑われる対象の障害に起因する悪化を予防することができ、障害の危険性がある、または障害を有すると疑われる対象の障害または障害の症候の発症を予防することもできる。
【００８９】
５．２  幹細胞を分化させる方法
本開示の主題は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ヒト幹細胞の非限定的な例として、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞、始原胚細胞様の多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Ｆクラス多能性幹細胞、体細胞幹細胞、がん幹細胞、または系統特異的に分化することができる任意の他の細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、非ヒト幹細胞である。非ヒト幹細胞の非限定的な例として、非ヒト霊長類幹細胞、げっ歯類幹細胞、イヌ幹細胞、ネコ幹細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、胚幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞である。
【００９０】
本発明は、幹細胞を、皮質ニューロンまたはそれらの前駆体に分化させる方法を開示する。いかなる理論にも限定するものではないが、本発明は、幹細胞をＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼの阻害剤と接触させることによって、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触している幹細胞からの皮質ニューロンの分化を加速することを開示する。
【００９１】
ある特定の実施形態では、リガンドに関する「Ｗｎｔ」または「ウィングレス」は、Ｗｎｔ受容体、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体ファミリーの受容体と相互反応することができる分泌タンパク質（例えばヒトのＩｎｔｌ（インテグレーション１））の群を指す。
【００９２】
ある特定の実施形態では、シグナル伝達経路に関する「Ｗｎｔ」または「ウィングレス」という用語は、β−カテニンが媒介するまたは媒介しない、ＷｎｔファミリーリガンドおよびＷｎｔファミリー受容体、例えばＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体から構成されたシグナル経路を指す。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達経路は、β−カテニンによる媒介、例えばＷＮＴ４／β−カテニンを含む。
【００９３】
ある特定の実施形態では、本開示の分化方法は、幹細胞集団を、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させ、それによってＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達を阻害するステップを含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤は、ＴＧＦβ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ノーダル、およびアクチビンを含むリガンドを中和するか、または受容体および下流エフェクターをブロックすることによって、それらのシグナル経路をブロックする。ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例は、あらゆる目的でそれらの全体が参照によって組み込まれる、ＷＯ／２０１０／０９６４９６、ＷＯ／２０１１／１４９７６２、ＷＯ／２０１３／０６７３６２、ＷＯ／２０１４／１７６６０６、ＷＯ／２０１５／０７７６４８、Chambersら、Nature  Biotechnology  ２７巻、２７５〜２８０頁（２００９年）、およびChambersら、Nature  biotechnology  ３０巻、７１５〜７２０頁（２０１２年）に開示されている。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。「ＳＢ４３１５４２」は、ＣＡＳ番号３０１８３６−４１−９、分子式Ｃ２２Ｈ１８Ｎ４Ｏ３、および名称４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミドを有する分子を指す。例えば、以下の構造を参照されたい。
【化１】
2019506901.tif 000003
【００９４】
本開示の分化方法は、さらに、幹細胞をＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させ、それによってＳｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達を阻害するステップをさらに含む。ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例は、あらゆる目的でそれらの全体が参照によって組み込まれる、ＷＯ／２０１０／０９６４９６、ＷＯ／２０１１／１４９７６２、ＷＯ／２０１３／０６７３６２、ＷＯ／２０１４／１７６６０６、ＷＯ／２０１５／０７７６４８、Chambersら、Nature  Biotechnology  ２７巻、２７５〜２８０頁（２００９年）、およびChambersら、Nature  biotechnology  ３０巻、７１５〜７２０頁（２０１２年）に開示されている。ある特定の実施形態では、ＳＭＡＤシグナル伝達の１種または複数の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。「ＬＤＮ１９３１８９」は、化学式Ｃ２５Ｈ２２Ｎ６の小分子ＤＭ−３１８９、ＩＵＰＡＣ名４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリンを指す。ＬＤＮ１９３１８９は、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤として機能することができる。ＬＤＮ１９３１８９はまた、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、およびＡＬＫ６、タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の非常に強力な小分子阻害剤であり、Ｉ型ＴＧＦβ受容体のＡＬＫ１およびＡＬＫ３ファミリーのメンバーのシグナル伝達を阻害して、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびアクチビンサイトカインシグナルを含む複数の生物学的シグナルの伝送を阻害し、その後、Ｓｍａｄ１、Ｓｍａｄ５、およびＳｍａｄ８のＳＭＡＤリン酸化を阻害する（参照によって本明細書に組み込まれる、Yuら（２００８年）Nat  Med  １４巻：１３６３〜１３６９頁；Cunyら（２００８年）Bioorg.  Med.  Chem.  Lett.  １８巻：４３８８〜４３９２頁）。ある特定の実施形態では、ＬＤＮ１９３１８９は、以下の構造を有する。
【化２】
2019506901.tif 000004
【００９５】
本発明はさらに、幹細胞集団を皮質ニューロンまたはそれらの前駆体に分化させる方法であって、細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、例えば、それに限定されるものではないが、ＸＡＶ３９９、タンキラーゼ阻害剤（Huangら、Nature  ４６１巻、６１４〜６２０頁（２００９年））、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ（Ｄｋｋ）タンパク質、分泌Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ｓＦＲＰ）、ＩＷＲ（Chenら、Nature  Chemical  Biology  ５巻（２号）：１００〜１０７頁（２００９年）；Kulakら、Molecular  and  Cellular  Biology、４巻；３５号（１４）：２４２５〜３５頁（２０１５年））、２，４−ジアミノ−キナゾリン（Chenら、Bioorganic  &  medicinal  chemistry  letters、１巻；１９号（１７）：４９８０〜３頁（２００９年））、ＩＷＰ（Chenら、Nat  Chem  Biol.  ２００９年２月；５巻（２号）：１００〜７頁）、ＬＧＫ９７４、Ｃ５９（Proffittら、Cancer  Res.  ２０１３年１月１５日；７３巻（２号）：５０２〜７頁）、Ａｎｔ１．４Ｂｒ/Ａｎｔ１．４Ｃｌ（Morrellら、PLoS  One.  ２００８年８月１３日；３巻（８号）：ｅ２９３０頁）、ニクロサミド（Chenら、Biochemistry.  ２００９年１１月３日；４８巻（４３号）：１０２６７〜７４頁）、アピクラレンおよびバフィロマイシン（Cruciatら、Science.  ２０１０年１月２２日；３２７巻（５９６４号）：４５９〜６３頁）、Ｇ００７−ＬＫおよびＧ２４４−ＬＭ（Lauら、Cancer  Res.  ２０１３年５月１５日；７３巻（１０号）：３１３２〜４４頁）、ピルビニウム（Thorneら、Nat  Chem  Biol.  ２０１０年１１月；６巻（１１号）：８２９〜３６頁）、ＮＳＣ６６８０３６（Shanら、Biochemistry.  ２００５年１１月２９日；４４巻（４７号）：１５４９５〜５０３頁）、ケルセチン（Parkら、Biochem  Biophys  Res  Commun.  ２００５年３月４日；３２８巻（１号）：２２７〜３４頁）、ＩＣＧ−００１（Emamiら、Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A.  ２００４年８月２４日；１０１巻（３４号）：１２６８２〜７頁）、ＰＫＦ１１５−５８４（Lepourceletら、Cancer  Cell.  ２００４年１月；５巻（１号）：９１〜１０２頁）、ＢＣ２０５９（Fiskusら、Leukemia.  ２０１５年１月；２９巻（６号）：１２６７〜７８頁）、Ｓｈｉｚｏｋａｏｌ  Ｄ（Tangら、PLoS  One.  ２０１６年３月２４日；１１巻（３号）：ｅ０１５２０１２頁）、およびそれらの誘導体と接触させる方法を提供する。
【００９６】
ある特定の実施形態では、ＸＡＶ３９９は、化学式Ｃ１４Ｈ１１Ｆ３Ｎ２ＯＳを有する、３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オンである。ある特定の実施形態では、ＸＡＶ３９９は、以下の構造を有する。
【化３】
2019506901.tif 000005
【００９７】
ある特定の実施形態では、幹細胞集団は、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、有効量のＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および有効量のＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させ、細胞は、阻害剤と、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間またはそれよりも長期間接触させ、皮質ニューロンまたはそれらの前駆体の１種または複数のマーカーを発現する細胞集団を生成するのに有効な濃度の前記化合物と接触させる。
【００９８】
ある特定の実施形態では、細胞は、有効量の阻害剤と、約４日間まで、約５日間まで、約６日間まで、約７日間まで、約８日間まで、約９日間まで、約１０日間まで、約１１日間まで、約１２日間まで、約１３日間まで、約１４日間まで、約１５日間まで、約１６日間まで、約１７日間まで、約１８日間まで、約１９日間まで、約２０日間またはそれよりも長期間接触させ、皮質ニューロンまたはそれらの前駆体の１種または複数のマーカーを発現する細胞集団を生成するのに有効な濃度の前記化合物と接触させる。
【００９９】
ある特定の実施形態では、細胞は、有効量の阻害剤と、約４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間またはそれよりも長期間接触させ、皮質ニューロンまたはそれらの前駆体の１種または複数のマーカーを発現する細胞集団を生成するのに有効な濃度の前記化合物と接触させる。
【０１００】
ある特定の実施形態では、細胞をＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と接触させる日は、０日目に相当し、細胞を、阻害剤と、０日目〜６日目の間、または０日目〜７日目の間にわたって接触させる。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、細胞は、約１〜２０μＭの間、約２〜１８μＭの間、約４〜１６μＭの間、約６〜１４μＭの間、約８〜１２μＭの間、または約１０μＭの濃度の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、細胞は、約１〜１８μＭの間、約１〜１６μＭの間、約１〜１４μＭの間、約１〜１２μＭの間、約１〜１０μＭの間、約１〜８μＭの間、約１〜６μＭの間、約１〜４μＭの間、または約１〜２μＭの間の濃度の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、細胞は、約２〜２０μＭの間、約４〜２０μＭの間、約６〜２０μＭの間、約８〜２０μＭの間、約１０〜２０μＭの間、約１２〜２０μＭの間、約１４〜２０μＭの間、約１６〜２０μＭの間、または約１８〜２０μＭの間の濃度の形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、細胞は、約１０〜５００ｎＭの間、約２５〜４７５ｎＭの間、約５０〜４５０ｎＭの間、約１００〜４００ｎＭの間、約１５０〜３５０ｎＭの間、約２００〜３００ｎＭの間、または約２５０ｎＭ、または約１００ｎＭ、または約５０ｎＭの濃度のＢＭＰシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、細胞は、約１０〜４７５ｎＭの間、約１０〜４５０ｎＭの間、約１０〜４００ｎＭの間、約１０〜３５０ｎＭの間、約１０〜３００ｎＭの間、約１０〜２５０ｎＭの間、約１０〜２００ｎＭの間、約１０〜１５０ｎＭの間、約１０〜１００ｎＭの間、または約１０〜５０ｎＭの間の濃度のＢＭＰシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、細胞は、約２５〜５００ｎＭの間、約５０〜５００ｎＭの間、約１００〜５００ｎＭの間、約１５０〜５００ｎＭの間、約２００〜５００ｎＭの間、約２５０〜５００ｎＭの間、約３００〜５００ｎＭの間、約３５０〜５００ｎＭの間、約４００〜５００ｎＭの間、または約４５０〜５００ｎＭの間の濃度のＢＭＰシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、細胞は、約０．１〜１０μＭの間、約０．５〜８μＭの間、約１〜６μＭの間、約２〜５．５μＭの間、または約５μＭ、または約２μＭ、または約１μＭの濃度のＷｎｔシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、細胞は、約０．１〜８μＭの間、約０．１〜６μＭの間、約０．１〜４μＭの間、約０．１〜２μＭの間、約０．１〜１μＭの間、または約０．１〜０．５μＭの間の濃度のＷｎｔシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、細胞は、約０．５〜１０μＭの間、約１〜１０μＭの間、約２〜０μＭの間、約４〜１０μＭの間、約６〜１０μＭの間、または約８〜１０μＭの間の濃度のＷｎｔシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、有効量のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、例えば、ＳＵ５４０２（Sunら、Journal  of  medicinal  chemistry  ４２巻、５１２０〜５１３０頁（１９９９年）；Patersonら、Br.  J.  Haematol.  １２４巻、５９５頁（２００４年）；Tanakaら、Nature  ４３５巻：１７２頁（２００５年））、ＰＤ１７３０７４（Ｎ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）尿素；Bansalら、J.Neurosci.Res.、２００３年；７４巻：４８６頁）、ＦＩＩＮ１塩酸塩（Ｎ−（３−（（３−（２，６−ジクロロ−３，５−ジメトキシフェニル）−７−（４−（ジエチルアミノ）ブチルアミノ）−２−オキソ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｄ］ピリミジン−１（２Ｈ）−イル）メチル）フェニル）アクリルアミド；Zhou、Chem.Biol.、２０１０年；１７巻：２８５頁）、ＳＵ６６６８（５−［１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−２，４−ジメチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパン酸；Yamamotoら、Cancer  Res.  ２００８年１２月１日；６８巻（２３号）：９７５４〜６２頁）、ＰＤ１６６２８５二塩酸塩（６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］フェニル］アミノ］−８−メチルピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン二塩酸塩；Panekら、J  Pharmacol  Exp  Ther.  １９９７年１２月；２８３巻（３号）：１４３３〜４４頁）、ＰＤ１６１５７０（Ｎ−［６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）尿素；Hambyら、J  Med  Chem.  １９９７年７月１８日；４０巻（１５号）：２２９６〜３０３頁）、ＡＰ２４５３４（３−（２−イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジン−３−イルエチニル）−４−メチル−Ｎ−［４−［（４−メチル−１−ピペラジニル）メチル］−３−（トリフルオロメチル）フェニル］−ベンズアミド；Huangら、J.Med.Chem.、２０１０年；５３巻：４７０１頁）、またはそれらの誘導体とさらに接触させる。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、用語「ＳＵ５４０２」は、化学式Ｃ１７Ｈ１６Ｎ２Ｏ３および化学名：２−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパン酸を有する小分子を指す。ある特定の実施形態では、ＳＵ５４０２は、以下の構造を有する。
【化４】
2019506901.tif 000006
【０１１２】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、有効量のノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、例えば、ＤＡＰＴ（Doveyら、Journal  of  neurochemistry  ７６巻、１７３〜１８１頁（２００１年））、Ｂｅｇａｃｅｓｔａｔ（５−クロロ−Ｎ−［（１Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−１−（ヒドロキシメチル）−２−（トリフルオロメチル）プロピル］−２−チオフェンスルホンアミド；Mayerら、J.Med.Chem.  ５１巻：７３４８頁（２００８年））、ＤＢＺ（Ｎ−［（１Ｓ）−２−［［（７Ｓ）−６，７−ジヒドロ−５−メチル−６−オキソ−５Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン−７−イル］アミノ］−１−メチル−２−オキソエチル］−３，５−ジフルオロベンゼンアセトアミド；van  Esら、Nature  ４３５巻：９５９頁（２００５年））、ＢＭＳ２９９８９７（２−［（１Ｒ）−１−［［（４−クロロフェニル）スルホニル］（２，５−ジフルオロフェニル）アミノ］エチル−５−フルオロベンゼンブタン酸；Goldsteinら、J.Pharmacol.Exp.Ther.  ３２３巻：１０２頁（２００７年））、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｗ（３，５−ビス（４−ニトロフェノキシ）安息香酸；Okochiら、J.Biol.Chem.  ２８１巻：７８９０頁（２００６年））、Ｆｌｕｒｉｚａｎ（（Ｒ）−２−フルオロ−α−メチル［１，１’−ビフェニル］−４−酢酸；Eriksenら、J.Clin.Invest.  １１２巻：４４０頁（２００３年））、Ｌ−６８５，４５８（（５Ｓ）−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６−フェニル−（４Ｒ）−ヒドロキシ−（２Ｒ）−ベンジルヘキサノイル）−Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニンアミド；Shearmanら、Biochemistry  ３９巻：８６９８頁（２０００年））、ＪＬＫ６（７−アミノ−４−クロロ−３−メトキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン；Petitら、Nat.Cell.Biol.  ３巻：５０７頁（２００１年））、ＭＲＫ５６０（Ｎ−［ｃｉｓ−４−［（４−クロロフェニル）スルホニル］−４−（２，５−ジフルオロフェニル）シクロヘキシル］−１，１，１−トリフルオロメタンスルホンアミド；Bestら、J.Pharm.Exp.Ther.  ３１７巻：７８６頁（２００６年））、ＰＦ３０８４０１４臭化水素酸塩（（２Ｓ）−２−［［（２Ｓ）−６，８−ジフルオロ−１，２，３，４−テトラヒドロ−２−ナフタレニル］アミノ］−Ｎ−［１−［２−［（２，２−ジメチルプロピル）アミノ］−１，１−ジメチルエチル］−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］ペンタンアミド二臭化水素酸塩；Lanzら、J.Pharmacol.Exp.Ther.  ３３４巻：２６９頁（２０１０年））、またはそれらの誘導体とさらに接触させる。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、用語「ＤＡＰＴ」は、ノッチを阻害するγ−セクレターゼ阻害剤の一例を指し、この阻害剤は、ジペプチド性γ−セクレターゼに特異的な阻害剤と説明され、それ以外では、Ｎ−［（３，５−ジフルオロフェニル）アセチル］−Ｌ−アラニル−２−フェニル］グリシン−１，１−ジメチルエチルエステル；ＬＹ−３７４９７３、Ｎ−−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステル；Ｎ−−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシンｔ−ブチルエステルとして公知であり、化学式Ｃ２３Ｈ２６Ｆ２Ｎ２Ｏ４を有する。ＤＡＰＴ誘導体の一例は、光で活性化可能なＤＡＰＴ誘導体である、ＤＡＰ−ＢｐＢ（Ｎ−−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェナセチル）−Ｌ−アラニル］−（Ｓ）−フェニルグリシン−４−（４−（８−ビオチンアミド）オクチルアミノ）ベンゾイル）ベンジル）メチルアミド）である。ある特定の実施形態では、ＤＡＰＴは、以下の構造を有する。
【化５】
2019506901.tif 000007
【０１１４】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、有効量のＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼの１種または複数の阻害剤、例えば、ＰＤ１９８３０６（Ciruelaら、British  Journal  of  Pharmacology  １３８巻（５号）：７５１〜６頁（２００３年）；Pelletierら、Arthritis  &  Rheumatism、４８巻：１５８２〜１５９３頁（２００３年））、ＰＤ０３２５９０１（Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド；Barrettら、Bioorganic  &  medicinal  chemistry  letters  １８巻、６５０１〜６５０４頁（２００８年））、１０Ｚ−ヒメニアルジシン（（４Ｚ）−４−（２−アミノ−１，５−ジヒドロ−５−オキソ−４Ｈ−イミダゾール−４−イリデン）−２−ブロモ−４，５，６，７−テトラヒドロピロロ［２，３−ｃ］アゼピン−８（１Ｈ）−オン；Bretonら、J.Pharmacol.Exp.Ther.  ２８２巻：４５９頁（１９９７年））、ＰＤ１８４３５２（２−［（２−クロロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−Ｎ−シクロプロピルメトキシ）−３，４−ジフルオロベンズアミド；Allenら、Semin.Oncol.  ３０巻：１０５頁（２００３年））、ＰＤ１９８３０６（Ｎ−（シクロプロピルメトキシ）−３，４，５−トリフルオロ−２−［（４−ヨード−２−メチルフェニル）アミノ］−ベンズアミド；Pelletierら、Arthrit.Rheumat.  ４８巻：１５８２頁（２００３年））、ＰＤ３３４５８１（Ｎ−［５−［３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］フェニル］−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル］−４−モルホリンエタンアミン；Ohrenら、Nat.Struct.Mol.Biol.  １１巻：１１９２頁（２００４年））、ＰＤ９８０５９（２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン；Dudleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.  ９２巻：７６８６頁（１９９５年））、ＳＬ３２７（α−［アミノ［（４−アミノフェニル）チオ］メチレン］−２−（トリフルオロメチル）ベンゼンアセトニトリル；Wangら、J.Pharmacol.Exp.Ther.  ３０４巻：１７２頁（２００３年））、Ｕ１０２４（ビス［アミノ（メチルチオ）メチレン]ブタンジニトリル；Favataら、J.Biol.Chem.  ２７３巻：１８６２３頁（１９９８年））、Ｕ０１２６（１，４−ジアミノ−２，３−ジシアノ−１，４−ビス［２−アミノフェニルチオ］ブタジエン；Favataら、J.Biol.Chem.  ２７３巻：１８６２３頁（１９９８年））、アルクチゲニン（（３Ｒ，４Ｒ）−４−［（３，４−ジメトキシフェニル）メチル］ジヒドロ−３−［（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）メチル］−２（３Ｈ）−フラノン；Jangら、J.Neurosci.Res.  ６８巻：２３３頁（２００２年））、ＢＩＸ０２１８９（（３Ｚ）−３−［［［３−［（ジメチルアミノ）メチル］フェニル］アミノ］フェニルメチレン］−２，３−ジヒドロ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−オキソ−１Ｈ−インドール−６−カルボキサミド；Tatakeら、Biochem.Biophys.Res.Comm.  ３７７巻：１２０頁（２００８年））、またはそれらの誘導体と接触させる。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、用語「ＰＤ０３２５９０１」は、化学式Ｃ１６Ｈ１４Ｆ３ＩＮ２Ｏ４および化学名Ｎ−（２，３−ジヒドロキシ−プロポキシ）−３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−ベンズアミドを有する小分子を指す。ある特定の実施形態では、ＰＤ０３２５９０１は、以下の構造を有する。
【化６】
2019506901.tif 000008
【０１１６】
ある特定の実施形態では、有効量の阻害剤は、細胞と、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間またはそれよりも長期間接触させる。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、細胞は、有効量のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼの１種または複数の阻害剤と、４日間まで、５日間まで、６日間まで、７日間まで、８日間まで、９日間まで、１０日間まで、１１日間まで、１２日間まで、１３日間まで、１４日間まで、１５日間まで、１６日間まで、１７日間まで、１８日間まで、１９日間まで、２０日間までまたはそれよりも長期間まで接触させる。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、有効量のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼの１種または複数の阻害剤は、細胞を有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および／またはＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも約１日目、少なくとも約２日目、少なくとも約３日目、少なくとも約４日目または少なくとも約５日目に、ヒト幹細胞と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞を有効量の（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）阻害剤と最初に接触させた後、約２４時間目、約４８時間目、約７２時間目、約９６時間目、約１２０時間目、または約１４４時間目に、有効量の（ｉｖ）、（ｖ）および／または（ｖｉ）阻害剤と最初に接触させる。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、有効量のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼの１種または複数の阻害剤は、細胞を有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および／またはＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、約１日目まで、２日目まで、３日目まで、４日目までまたは５日目まで、ヒト幹細胞と接触させる。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、細胞は、有効量のＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼの１種または複数の阻害剤と、約４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間またはそれよりも長期間接触させ、皮質ニューロンまたはそれらの前駆体の１種または複数のマーカーを発現する細胞集団を生成するのに有効な濃度の前記化合物と接触させる。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、細胞は、約１〜２０μＭの間、約２〜１８μＭの間、約４〜１６μＭの間、約６〜１４μＭの間、約８〜１２μＭの間、または約１０μＭ、または約５μＭの濃度のノッチシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、細胞は、約２〜２０μＭの間、約４〜２０μＭの間、約６〜２０μＭの間、約８〜２０μＭの間、約１０〜２０μＭの間、約１２〜２０μＭの間、約１４〜２０μＭの間、約１６〜２０μＭの間、または約１８〜２０μＭの間の濃度のノッチシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、細胞は、約１〜１８μＭの間、約１〜１６μＭの間、約１〜１４μＭの間、約１〜１２μＭの間、約１〜１０μＭの間、約１〜８μＭの間、約１〜６μＭの間、約１〜４μＭの間、または約１〜２μＭの間の濃度のノッチシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、細胞は、約０．５〜２０μＭの間、約１〜１８μＭの間、約２〜１６μＭの間、約４〜１４μＭの間、約６〜１２μＭの間、約８〜１０μＭの間、または約２μＭ、または約５μＭ、または約１０μＭの濃度のＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、細胞は、約０．５〜１８μＭの間、約０．５〜１６μＭの間、約０．５〜１４μＭの間、約０．５〜１２μＭの間、約０．５〜１０μＭの間、約０．５〜８μＭの間、約０．５〜６μＭの間、約０．５〜４μＭの間、約０．５〜２μＭの間、約０．５〜１μＭの間の濃度のＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、細胞は、約１〜２０μＭの間、約２〜２０μＭの間、約４〜２０μＭの間、約６〜２０μＭの間、約８〜２０μＭの間、約１０〜２０μＭの間、約１２〜２０μＭの間、約１４〜２０μＭの間、約１６〜２０μＭの間、または約１８〜２０μＭの間の濃度のＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、細胞は、約０．０１〜２０μＭの間、約０．１〜１８μＭの間、約１〜１６μＭの間、約２〜１４μＭの間、約３〜１２μＭの間、約４〜１０μＭの間、約５〜約８μＭの間、または約０．４μＭ、または約１μＭ、または約８μＭの濃度のＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、細胞は、約０．０１〜１８μＭの間、約０．０１〜１６μＭの間、約０．０１〜１４μＭの間、約０．０１〜１２μＭの間、約０．０１〜１０μＭの間、約０．０１〜８μＭの間、約０．０１〜６μＭの間、約０．０１〜４μＭの間、約０．０１〜２μＭの間、約０．０１〜１μＭの間の濃度のＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、細胞は、約０．１〜２０μＭの間、約１〜２０μＭの間、約２〜２０μＭの間、約４〜２０μＭの間、約６〜２０μＭの間、約８〜２０μＭの間、約１０〜２０μＭの間、約１２〜２０μＭの間、約１４〜２０μＭの間、約１６〜２０μＭの間、または約１８〜２０μＭの間の濃度のＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の阻害剤と接触させる。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、本開示は、ヒト幹細胞を皮質ニューロンまたはそれらの前駆体に分化させる方法であって、細胞を、（ｉ）有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤（例えば、１０μＭ）、（ｉｉ）有効量のＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（例えば、２５０ｎＭ）、（ｉｉｉ）有効量のＷｎｔシグナル伝達の阻害剤（例えば、５μＭ）、（ｉｖ）有効量のノッチシグナル伝達の阻害剤（例えば、１０μＭ）、（ｖ）有効量のＦＧＦシグナル伝達の阻害剤（例えば、５μＭまたは１０μＭ）、および（ｖｉ）有効量のＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達の阻害剤（例えば、１μＭまたは８μＭ）と接触させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）は、細胞を有効量の（ｉ）と最初に接触させた後、少なくとも２日目に細胞と接触させる。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、本開示は、ヒト幹細胞を皮質ニューロンまたはそれらの前駆体に分化させる方法であって、細胞を、（ｉ）有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤（例えば、１０μＭ）、（ｉｉ）有効量のＢＭＰシグナル伝達の阻害剤（例えば、１００ｎＭ）、（ｉｉｉ）有効量のＷｎｔシグナル伝達の阻害剤（例えば、２μＭ）、（ｉｖ）有効量のノッチシグナル伝達の阻害剤（例えば、５μＭ）、（ｖ）有効量のＦＧＦシグナル伝達の阻害剤（例えば、２μＭ）、および（ｖｉ）有効量のＭＡＰＫ／ＥＲＫシグナル伝達の阻害剤（例えば、０．４μＭ）と接触させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、（ｉｖ）、（ｖ）および（ｖｉ）は、細胞を有効量の（ｉ）と最初に接触させた後、少なくとも３日目に細胞と接触させる。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、阻害剤（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の濃度は、細胞に少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間もしくは６日間、または１日間まで、２日間まで、３日間まで、４日間まで、５日間までもしくは６日間まで接触させた後、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％または７０％低減される。
【０１３３】
ある特定の実施形態では、この方法は、前記細胞を皮質ニューロン集団に成熟させるのに好都合な条件に、前記分化細胞集団を晒すステップをさらに含み、細胞を、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ｃＡＭＰ、およびアスコルビン酸シグナル伝達の有効濃度の１種または複数の活性化因子と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞を有効濃度の（ｉ）、すなわち、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも約５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間もしくは１２日間、または約５日間まで、６日間まで、７日間まで、８日間まで、９日間まで、１０日間まで、１１日間までもしくは１２日間まで、前記成熟化合物と接触させる。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、成熟させるのに好都合な条件は、適切な細胞培養培地中で細胞を培養することを含む。ある特定の実施形態では、適切な細胞培養培地は、ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地を含む。ある特定の実施形態では、適切な細胞培養培地は、Ｌ−グルタミン、およびＢ２７（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を補充したＮＢ培地である。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って接触させた細胞は、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも約４日目、５日目、６日目、７日目もしくは８日目もしくはより後に、または約４日目まで、５日目まで、６日目まで、７日目までもしくは８日目までもしくはより後までに、検出可能なレベルのＰＡＸ６（対合ボックス６）を発現する。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞が検出可能なレベルのＰＡＸ６を発現するようになる期間にわたって、有効濃度の（ｉ）〜（ｖｉ）と接触させる。ある特定の実施形態では、前記期間は、細胞を有効濃度の阻害剤（ｉ）、すなわち、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、約４日間、５日間、６日間、７日間または８日間である。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、ＰＡＸ６の発現は、細胞集団の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％またはそれよりも多い細胞において検出可能である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って接触させた細胞は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させた後、約６日目に、検出可能なレベルのＰＡＸ６を発現する。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って接触させた細胞は、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも約１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目もしくは１６日目もしくはより後に、または約１０日目まで、１１日目まで、１２日目まで、１３日目まで、１４日目まで、１５日目までもしくは１６日目までもしくはより後までに、検出可能なレベルのＴＵＪ１（クラスＩＩＩベータ−チューブリン）、ＦＯＸＧ１（フォークヘッドボックスＧ１）、および／またはＤＣＸ（ダブルコルチン）を発現する。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞が検出可能なレベルのＴＵＪ１、ＦＯＸＧ１、および／またはＤＣＸを発現するようになる期間にわたって、有効濃度の（ｉ）〜（ｖｉ）と接触させる。ある特定の実施形態では、前記期間は、細胞を有効濃度の阻害剤（ｉ）、すなわち、ＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させた後、約１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間または１６日間である。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って接触させた細胞は、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させた後、約１３日目に、検出可能なレベルのＴＵＪ１を発現する。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、ＴＵＪ１の発現は、細胞集団の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％またはそれよりも多い細胞において検出可能である。ある特定の実施形態では、細胞は、ＴＢＲ１（Ｔ−ｂｏｘ、ｂｒａｉｎ  １）および／またはＴＬＥ４（ｓｐｌｉｔ  ４のトランスデューシン様エンハンサー）をさらに同時発現する。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って接触させた細胞は、検出可能なレベルのＴＵＪ１を発現し、細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれよりも多くは、検出可能なレベルのＴＢＲ１、ＴＬＥ４、またはそれらの組合せも発現する。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、細胞は、細胞が検出可能なレベルのＴＵＪ１ならびにＴＢＲ１および／またはＴＬＥ４の一方または両方を発現するようになる期間にわたって、有効濃度の（ｉ）〜（ｖｉ）と接触させる。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、検出可能なレベルのＰＡＸ６、ＴＵＪ１、ＦＯＸＧ１、ＤＣＸ、ＴＢＲ１、ＴＬＥ４、またはそれらの任意の組合せを発現する前記細胞は、近接皮質ニューロン前駆体である。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って接触させた細胞は、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤と最初に接触させた後、少なくとも約４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、２０日目、２５日目、３０日目、３３日目に、もしくはより後に、または約４日目まで、５日目まで、６日目まで、７日目まで、８日目まで、９日目まで、１０日目まで、１１日目まで、１２日目まで、１３日目まで、１４日目まで、１５日目まで、２０日目まで、２５日目まで、３０日目まで、３３日目までに、もしくはより後までに、ＴＢＲ１（Ｔ−ｂｏｘ、ｂｒａｉｎ  １）、ＴＬＥ４（ｓｐｌｉｔ  ４のトランスデューシン様エンハンサー）、ＤＣＸ（ダブルコルチン）、ＲＥＬＮ（リーリン）、ＣＴＩＰ２（Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ｂ）、ＳＡＴＢ２（ＳＡＴＢホメオボックス２）、ＦＯＸＰ２（フォークヘッドボックスタンパク質Ｐ２）、ＲＧＳ４（Ｇタンパク質シグナル伝達４の調節物質）、ＣＵＸ２（ｃｕｔ様ホメオボックス２）、ＢＬＢＰ（脳脂質結合タンパク質）、およびそれらの組合せからなる群から選択される検出可能なレベルの皮質ニューロンマーカーを発現する。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、ＴＢＲ１、ＴＬＥ４、ＤＣＸ、ＲＥＥＬＩＮ、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＦＯＸＰ２、ＲＧＳ４、ＣＵＸ２、および／またはＢＬＢＰの発現は、細胞集団の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれよりも多い細胞において検出可能である。ある特定の実施形態では、細胞は、検出可能なレベルのＴＵＪ１も発現する。
【０１４７】
本開示の主題はまた、本明細書に記載される方法によって生成されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団、およびこのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞を含む組成物を提供する。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って調製された細胞は、有効量のＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の阻害剤と接触させた後、少なくとも約６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、２０日目もしくはより後に、または約６日目まで、７日目まで、８日目まで、９日目まで、１０日目まで、１１日目まで、１２日目まで、１３日目まで、１４日目まで、１５日目まで、１６日目まで、１７日目まで、１８日目まで、１９日目まで、２０日目までもしくはより後までに、成熟した分化した皮質ニューロンの電気生理学的特性を示す。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、有効量の阻害剤（ｉ）〜（ｉｉｉ）と、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間またはそれよりも長期間接触させ、有効量の阻害剤（ｉｖ）〜（ｖｉ）と、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間またはそれよりも長期間接触させ、次に、有効量のＷｎｔシグナル伝達の活性化因子、例えば、ＧＳＫ３β阻害剤、例えばＣＨＩＲ９９０２１（ＷＯ２０１１／１４９７６２；およびCalderら、J  Neurosci.  ２０１５年８月１９日；３５巻（３３号）：１１４６２〜８１頁）、有効量のＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼの阻害剤、有効量のノッチシグナル伝達の阻害剤、および／または有効量のＦＧＦシグナル伝達の阻害剤と、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間またはそれよりも長期間さらに接触させる。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、この方法は、（ａ）ヒト多能性幹細胞を、有効濃度の（ｉ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｉｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｉｉｉ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させるステップと、（ｂ）前記細胞を、有効濃度の（ｉ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｉｉ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｉｉｉ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と共に、少なくとも約６日間または７日間培養するステップと、（ｃ）前記細胞を、（ａ）の後少なくとも約２日目または３日目に、有効濃度の（ｉｖ）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｖ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および（ｖｉ）ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と最初に接触させるステップと、（ｄ）前記細胞を、少なくとも約１０日間もしくは１１日間、または前記細胞の少なくとも２０％がＴＵＪ１を発現するまで、有効濃度の（ｉｖ）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｖ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および（ｖｉ）ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と共に培養するステップとを含む。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、有効量の阻害剤（ｉ）〜（ｉｉｉ）と、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間またはそれよりも長期間接触させ、有効量の阻害剤（ｉｖ）〜（ｖｉ）と、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間またはそれよりも長期間接触させ、次に、有効量のノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤と、少なくとも約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間または１０日間またはそれよりも長期間さらに接触させる。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、前述の阻害剤、活性化因子および分子は、幹細胞を含む細胞培養培地に添加される。適切な細胞培養培地には、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ（登録商標）血清置換（「ＫＳＲ」）培地、Ｎ２培地、およびＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（登録商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（登録商標）（「Ｅ８／Ｅ６」）培地、およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（ＮＢ）培地（例えば、Ｎ２およびＢ−２７（登録商標）補充物を補充したＮＢ培地）が含まれるが、それらに限定されない。ＫＳＲ培地、Ｎ２培地、Ｅ８／Ｅ６培地およびＮＢ培地は、商業的に利用可能である。
【０１５３】
ＫＳＲ培地は、未分化ｈＥＳＣ細胞を培養で成長させ、維持するために最適化された、定義された無血清配合物である。ＫＳＲ培地の構成成分は、ＷＯ２０１１／１４９７６２に開示されている。ある特定の実施形態では、ＫＳＲ培地は、ノックアウトＤＭＥＭ、ノックアウト血清置換、Ｌ−グルタミン、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、ＭＥＭ、およびβ−メルカプトエタノールを含む。
【０１５４】
Ｅ８／Ｅ６培地は、ヒト多能性幹細胞の成長および拡大増殖を支持する、フィーダーを含まないおよび異種成分を含まない培地である。Ｅ８／Ｅ６培地は、体細胞再プログラムを支持することが証明されている。さらに、Ｅ８／Ｅ６培地は、ＰＳＣ培養の特注培地の配合のためのベースとして使用され得る。Ｅ８／Ｅ６培地の一例は、その全体が参照によって組み込まれる、Chenら、Nat  Methods.  ２０１１年５月；８巻（５号）：４２４〜９頁に記載されている。Ｅ８／Ｅ６培地の一例は、その全体が参照によって組み込まれる、ＷＯ１５／０７７６４８に開示されている。ある特定の実施形態では、Ｅ８／Ｅ６細胞培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、アスコルビン酸、セレニウム（selenum）、インスリン、ＮａＨＣＯ３、トランスフェリン、ＦＧＦ２およびＴＧＦβを含む。ある特定の実施形態では、Ｅ６培地は、ＦＧＦ２およびＴＧＦβを含まない。Ｅ８／Ｅ６培地は、活性なＢＭＰまたはＷｎｔ成分を含まないという点で、ＫＳＲ培地とは異なる。したがって、ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞集団を培養して、皮質ニューロン集団に分化させるためにＥ８／Ｅ６培地が使用される場合、ＢＭＰの１種または複数の阻害剤は、Ｅ８／Ｅ６培地に添加される必要はない。
【０１５５】
Ｎ２補充物は、未分化神経幹細胞および前駆細胞を培養で拡大増殖させるために使用される、化学的に定義された、動物質を含まない補充物である。Ｎ２補充物は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地と使用されることを意図される。Ｎ２培地の構成成分は、ＷＯ２０１１／１４９７６２に開示されている。ある特定の実施形態では、Ｎ２培地は、グルコース、重炭酸ナトリウム、プトレシン、プロゲステロン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、およびインスリンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含む。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、最初にＫＳＲ培地またはＥ６培地中で培養され、この培地は、幹細胞と、前述の阻害剤および活性化因子の少なくとも１つとの初期接触後、約１日目、約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約７日目、約８日目、約９日目、約１０日目、約１１日目または約１２日目から、増量したＮ２／Ｂ２７培地で徐々に置き換えられる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、最初にＫＳＲ培地中で培養され、この培地は、幹細胞と、前述の阻害剤および活性化因子の少なくとも１つとの初期接触後、約４日目（例えば、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触後、４日目）から、増量したＮ２／Ｂ２７培地で徐々に置き換えられる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、最初にＥ６培地中で培養され、この培地は、幹細胞と、前述の阻害剤および活性化因子の少なくとも１つとの初期接触後、約５日目（例えば、幹細胞とＴＧＦβ／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤との初期接触後、５日目）から、増量したＮ２／Ｂ２７培地で徐々に置き換えられる。
【０１５７】
分化した皮質ニューロンまたはそれらの前駆体は、例えば細胞培養培地中で分化した後、精製され得る。本明細書で使用される「精製された」、「精製する」、「精製」、「単離された」、「単離する」および「単離」という用語は、試料から、少なくとも１種の汚染物質の量を低減することを指す。例えば、所望の細胞型は、望ましくない細胞型の量の対応する低減によって、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、もしくは少なくとも９９．９％、またはそれよりも多く精製される。「精製する」という用語は、試料から、ある特定の細胞（例えば、望ましくない細胞）を除去することを指すことができる。非皮質ニューロン細胞またはそれらの前駆体の除去または選択によって、試料中の所望の細胞のパーセンテージが増大する。ある特定の実施形態では、細胞は、混合細胞集団を、少なくとも１種の皮質ニューロンマーカーを発現する細胞に分類することによって精製される。ある特定の実施形態では、細胞は、混合細胞集団を、少なくとも１種の腸皮質ニューロンマーカー、例えば、ＴＢＲ１、ＴＬＥ４、ＤＣＸ、ＲＥＥＬＩＮ、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＦＯＸＰ２、ＲＧＳ４、ＣＵＸ２、ＢＬＢＰ、またはそれらの組合せを発現する細胞に分類することによって精製される。
【０１５８】
５．３．分化細胞集団を含む組成物
本開示はまた、本明細書に記載される方法に従って調製された、１種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞集団またはその前駆体細胞集団を提供する。ある特定の実施形態では、細胞集団の少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％、または少なくとも９９．９％）は、１種または複数の皮質ニューロンマーカー、例えば、ＴＢＲ１、ＴＬＥ４、ＤＣＸ、ＲＥＥＬＩＮ、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＦＯＸＰ２、ＲＧＳ４、ＣＵＸ２、ＢＬＢＰ、またはそれらの組合せを発現する。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、細胞集団の約１５％未満（例えば、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満）は、幹細胞マーカー（例えば、ＯＣＴ４（オクタマー結合転写因子４）、ＮＡＮＯＧ（Ｎａｎｏｇホメオボックス）、ＳＯＸ２（ＳＲＹ−Ｂｏｘ  ２）、ＬＩＮ２８（Ｌｉｎ−２８ホモログＡ）、ＳＳＥＡ４（段階特異的胚抗原−４）および／またはＳＳＥＡ３（段階特異的胚抗原−３）、グリア細胞マーカー（例えば、ＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）、ＡＱＰ４（アクアポリン４）、および／またはＯＬＩＧ２（オリゴデンドロサイト系統転写因子２））、網膜細胞マーカー（例えば、ＣＨＸ１０（視覚系ホメオボックス２））、末梢性感覚ニューロン（例えば、ＢＲＮ３Ａ（脳特異的ホメオボックス／ＰＯＵドメインタンパク質３Ａ）、および／またはＩＳＬ１（ＩＳＬ  ＬＩＭホメオボックス１））、神経堤前駆体（例えば、ＳＯＸ１０（ＳＲＹ−Ｂｏｘ  １０））、または頭蓋プラコード前駆体（例えば、ＳＩＸ１（ＳＩＸホメオボックス１））からなる群から選択される１種または複数のマーカーを発現する。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、分化細胞集団は、ヒト幹細胞集団から誘導される。本開示の主題はさらに、このような分化細胞集団を含む組成物を提供する。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、組成物は、約１×１０４〜約１×１０１０個、約１×１０４〜約１×１０５個、約１×１０５〜約１×１０９個、約１×１０５〜約１×１０６個、約１×１０５〜約１×１０７個、約１×１０６〜約１×１０７個、約１×１０６〜約１×１０８個、約１×１０７〜約１×１０８個、約１×１０８〜約１×１０９個、約１×１０８〜約１×１０１０個、または約１×１０９〜約１×１０１０個の、本開示の幹細胞由来の細胞集団を含む。
【０１６２】
ある特定の非限定的な実施形態では、組成物は、生体適合性のある足場またはマトリックス、例えば、細胞が対象にインプラントまたはグラフトされると組織再生を容易にする、生体適合性のある三次元足場をさらに含む。ある特定の非限定的な実施形態では、生体適合性のある足場は、細胞外マトリックス材料、合成ポリマー、サイトカイン、コラーゲン、ポリペプチドもしくはタンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロースもしくはゼラチンを含む多糖類、および／またはヒドロゲルを含む。（例えば、それぞれの内容全体が参照によって組み込まれる、米国特許出願第２０１５／０１５９１３５号、同第２０１１／０２９６５４２号、同第２００９／０１２３４３３号、および同第２００８／０２６８０１９号を参照されたい）。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、添加剤、賦形剤またはそれらの組合せを含む医薬組成物である。組成物は、本明細書に記載されるＣＮＳ神経変性障害を予防および／または処置するために使用され得る。
【０１６４】
５．４  ＣＮＳ神経変性障害を予防および／または処置する方法
１種または複数の皮質ニューロンマーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞（「幹細胞由来の皮質ニューロン」とも呼ばれる）、またはそれらの前駆体は、神経変性障害を予防および／または処置するために使用され得る。本開示の主題は、神経変性障害を予防および／または処置する方法であって、有効量の本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体を、神経変性障害に罹患している対象に投与するステップを含む方法を提供する。神経変性障害の非限定的な例として、パーキンソン病、アルツハイマー病、および統合失調症が挙げられる。
【０１６５】
本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体は、神経変性障害を処置または予防するために、対象に全身的にまたは直接的に投与され得る。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体は、目的の臓器（例えば、中枢神経系（ＣＮＳ））に直接的に注射される。
【０１６６】
本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体は、任意の生理的に許容される媒体により投与され得る。本開示の幹細胞由来の細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供される。本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体、ならびにそれらを含む医薬組成物は、局所注射、同所（ＯＴ）注射、全身注射、静脈内注射、または非経口投与を介して投与され得る。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体は、神経変性障害に罹患している対象に、同所（ＯＴ）注射を介して投与される。
【０１６７】
本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体、ならびにそれらを含む医薬組成物は、好都合には、無菌液体調製物、例えば等張水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液、または粘性組成物として提供することができ、これらは、選択されたｐＨに緩衝され得る。液体調製物は、普通は、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物よりも容易に調製される。さらに、液体組成物は、特に注射によって投与するのに、いくらかより好都合である。他方では、粘性組成物は、特定の組織とより長期間接触させるのに適した粘度範囲内で製剤化され得る。液体または粘性組成物は、担体を含むことができ、この担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）および適切なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。注射可能な滅菌溶液剤は、本開示の主題の組成物、例えば本開示の幹細胞由来の前駆体を含む組成物を、所望に応じて様々な量のその他の成分と共に、必要量の適切な溶媒に組み込むことによって調製され得る。このような組成物は、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、ブドウ糖などの、適切な担体、賦形剤、または添加剤の混合物で存在し得る。また組成物は、凍結乾燥させることができる。組成物は、所望の投与経路および調製物に応じて、湿潤剤、分散化剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化添加物質または増粘添加物質、保存剤、香味剤、着色剤などの補助物質を含有し得る。過度の実験方法なしに適切な調製物を調製するために、参照によって本明細書に組み込まれる「REMINGTON'S  PHARMACEUTICAL  SCIENCE」、第１７版、１９８５年などの標準書を参考にすることができる。
【０１６８】
抗菌性保存剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝液を含めた、組成物の安定性および無菌性を増強する様々な添加物質を添加することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等によって確保され得る。注射可能な医薬形態の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム（alum  inurn）およびゼラチンを使用することによってもたらされ得る。しかし、本開示の主題によれば、使用される任意の媒体、賦形剤、または添加物質は、本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体と適合しなければならない。
【０１６９】
組成物の粘度は、所望に応じて薬学的に許容される増粘剤を使用して、選択されたレベルに維持され得る。メチルセルロースは、容易に、経済的に利用可能であり、取り扱いが容易であるため使用され得る。他の適切な増粘剤には、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー等が含まれる。増粘剤の濃度は、選択される薬剤に応じて決まり得る。重要な点は、選択された粘度を達成する量を使用することである。明らかに、適切な担体および他の添加物質の選択は、正確な投与経路、および特定の剤形、例えば液体剤形の性質（例えば、組成物を、溶液、懸濁液、ゲルまたは別の液体形態、例えば持続放出形態または液体充填形態のいずれに製剤化すべきか）に応じて決まる。
【０１７０】
当業者は、組成物の構成成分が、化学的に不活性であるように選択されるべきであり、本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体の生存率または有効性に影響を及ぼさないことを認識されよう。このことは、当業者にとって、化学的および薬学的原理の問題にならず、または問題は、標準書を参照することによってもしくは簡単な実験によって（過度の実験方法を伴わない）、本開示および本明細書に引用される文献から容易に回避され得る。
【０１７１】
本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体の治療上の使用に関する１つの考察は、最適な効果を達成するのに必要な細胞の量である。最適な効果には、神経変性障害に罹患している対象のＣＮＳ領域への生着、および／または対象のＣＮＳ機能の改善が含まれるが、それらに限定されない。
【０１７２】
「有効量」（または「治療有効量」）は、処置時に有益なまたは所望の臨床的な結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は、１回または複数の用量で対象に投与され得る。処置に関して、有効量とは、神経変性障害の進行を緩和し、回復させ、安定化し、逆行させ、もしくは緩徐するか、またはそうでなければ神経変性障害の病理学的結果を低減するのに十分な量である。有効量は、一般に、個々の場合に応じて医師によって決定され、当業者の知識の範囲内である。典型的に、有効量を達成するのに適した投与量を決定する場合には、複数の因子が考慮される。これらの因子には、対象の年齢、性別および体重、処置を受ける状態、状態の重症度、ならびに投与される細胞の形態および有効濃度が含まれる。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体の有効量は、神経変性障害に罹患している対象のＣＮＳ領域に生着するのに十分な量である。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来の皮質ニューロンおよびそれらの前駆体の有効量は、神経変性障害に罹患している対象のＣＮＳの機能を改善するのに十分な量であり、例えば、改善された機能は、正常なヒトのＣＮＳの機能の約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％または約１００％であり得る。
【０１７４】
投与される細胞の量は、処置を受ける対象ごとに変わる。ある特定の実施形態では、約１×１０４〜約１×１０１０個、約１×１０４〜約１×１０５個、約１×１０５〜約１×１０９個、約１×１０５〜約１×１０６個、約１×１０５〜約１×１０７個、約１×１０６〜約１×１０７個、約１×１０６〜約１×１０８個、約１×１０７〜約１×１０８個、約１×１０８〜約１×１０９個、約１×１０８〜約１×１０１０個、または約１×１０９〜約１×１０１０個の、本開示の幹細胞由来の細胞が投与される。
【０１７５】
５．５  キット
本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、以下：（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−ノーダルシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｃ）Ｗｎｔシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｄ）ＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｅ）ノッチシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、（ｆ）ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および（ｇ）本明細書に記載される方法に従って、１種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団またはその前駆体細胞集団への幹細胞の分化を誘導するための指示書の１つまたは複数を含む。
【０１７６】
本開示の主題はまた、１種または複数のニューロンマーカー、例えば、皮質ニューロンマーカーを発現する分化細胞集団またはその前駆体細胞集団を含むキットであって、細胞が、本明細書に記載される方法に従って調製されるキットを提供する。ある特定の実施形態では、細胞は、医薬組成物に含まれる。
【実施例】
【０１７７】
６．実施例
本開示の主題は、本開示の主題の例として、限定のためではなく提供される、以下の実施例を参照することにより、より良く理解される。
【０１７８】
（実施例１）
６．１  実施例１：幹細胞集団を６つのシグナル伝達経路阻害剤と接触させることによって、幹細胞由来の皮質ニューロンを調製する方法。
【０１７９】
要約
機能的ニューロンへのヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）の変換においては、かなりの進歩が得られている。しかし、ヒトニューロンの指定および機能的成熟のタイミングが長引くことは、依然として、疾患モデリングおよび再生医療におけるｈＰＳＣ由来の系統の日常的な適用を妨げる重要課題である。本発明者らは、組合せ小分子のスクリーニングを使用して、末梢性感覚ニューロンを急速に誘導するための条件を既に同定した。ここで本発明者らは、ＣＮＳ運命への到達を加速するアプローチを一般化するための試みにより、皮質ニューロンの急速な誘導について報告する。本発明者らは、グリア共培養の必要なしに、分化１３日目までに有糸分裂後皮質ニューロンを誘導し、分化１６日目までに機能的電気生理学的特性を誘導するための、６つの経路阻害剤の組合せの使用を実証する。生後マウスの皮質に分化８日目に移植したニューロンは、機能的であり、ｉＤＩＳＣＯベースの全脳画像化を使用して示される通り、長距離投射を確立する。皮質ニューロン運命への分化の加速は、ＣＮＳ障害における疾患モデリングおよび細胞治療のためのｈＰＳＣベースの戦略を容易にするはずである。
【０１８０】
結果
ニューロンの運命獲得を加速するための試みでは、本開示の主題は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）シグナル伝達の強力な阻害剤であるＳＵ５４０２、およびノッチシグナル伝達をブロックするγ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴの、２種のさらなる小分子の使用を提供する６。これらの２種の阻害剤（ＳＤ）を、二重ＳＭＡＤ阻害およびＷＮＴ活性化と組み合わせて適用すると、標準二重ＳＭＡＤ阻害条件下で神経前駆体細胞を誘導するのに必要な期間１と同じ期間である分化１１日目までに、７５％の有糸分裂後ニューロンが生じる７。しかし、急速に誘導されたニューロンにおけるＢＲＮ３ＡおよびＩＳＬ１の同時発現により、これらは、ＰＡＸ６由来のＣＮＳニューロンではなく、末梢性感覚と定義付けられた７。したがって、感覚運命指定中にニューロンの運命獲得を加速するための戦略がＣＮＳ運命に適応され得るかどうかは、まだ不明である。ＰＡＸ６由来の皮質ニューロンは、ヒト発生の研究のため、ならびにヒトの神経発生性および神経変性ＣＮＳ障害のモデリングのために、特に興味深い。ｈＰＳＣから皮質ニューロンを誘導するために信頼できるプロトコールが存在するが、それらの条件は、低層および上層の両方の皮質ニューロンを得るのに３０日〜９０日の間の分化が必要であり１５、３０、完全成熟を達成するには、さらにより長期間が必要である。ここで本発明者らは、疾患モデリングおよび再生医療への適用における、ｈＰＳＣ由来のニューロンの日常的な適用を容易にするためにヒト皮質ニューロン運命誘導を大幅に加速する小分子ベースの条件を同定することを目的とする。
【０１８１】
ＣＮＳニューロン分化を加速するプロトコールの開発
神経堤運命に対するＣＮＳの決定における、ＷＮＴシグナル伝達の非常に重要な役割を前提として３、８、開示される方法は、皮質ニューロン運命への急速な分化を誘発したＷＮＴシグナル伝達を活性化するのではなく、そのＷＮＴシグナル伝達を阻害する組合せ小分子のアプローチを開発した（図１Ａ）。開示される方法は、ＧＳＫ３β阻害剤であるＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ；ＷＮＴアゴニスト）を、タンキラーゼ阻害およびアキシン安定化によって作用するＷＮＴアンタゴニストであるＸＡＶ９３９と交換する９。すべての他の阻害剤（ＬＤＮ＋ＳＢ＝二重ＳＭＡＤ阻害（ＬＳＢ）、ＳＵ５４０２およびＤＡＰＴ）は、前脳ニューロン運命を急速に誘導することを目的とする初期の研究のために、変更せずにそのままにすることができる（ＬＳＢ＋Ｘ／Ｓ／Ｄプロトコール、図２Ａ）。急速なニューロン誘導中、ＣＮＳからＰＮＳ運命への切替えを予想外に誘発した本発明者らの経験を前提として７、開示される方法は、最初に３種の遺伝的ｈＥＳＣレポーター株を使用して、Ｘ／Ｓ／Ｄ条件下で初期外胚葉系統の選択に対する影響を査定した。ＣＮＳ系統をモニターするために、開示される方法は、新規なＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰレポーター株を確立し、神経堤運命については、開示される方法は、過去に公開されたＳＯＸ１０：：ＧＦＰレポーター株を使用し２、７、頭蓋プラコードの同一性については、開示される方法は、新規なＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ株を使用した。ＴＡＬＥＮベースの遺伝子標的化を使用して、ＰＡＸ６およびＳＩＸ１レポーター株の両方を発生させた。開示される方法は、免疫細胞化学を使用してＧＦＰを対応するタンパク質の発現と同等にすることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化後のレポーターの忠実性を確証した２、１０（図１Ｂ）。
【０１８２】
開示される方法はまた、図１Ｃに示される通り、Ｘ／Ｓ／Ｄ条件下で外胚葉の運命選択を査定した。過去の研究と一致して、ＬＳＢおよびＬＳＢ＋Ｘは共に、ＳＯＸ１０＋またはＳＩＸ１＋汚染物質が非常に少ない、ＰＡＸ６＋細胞のほぼ均一な集団（＞９５％）を生じた。それとは対照的に、ＬＳＢ＋ＣまたはＬＳＢ＋Ｃ／Ｓ／Ｄ（３ｉまたはＰＮＳ感覚ニューロンプロトコールとも呼ばれる７）は、少量のＰＡＸ６＋しか生じなかったが、神経堤誘導におけるＷＮＴシグナル伝達のための重要な役割と適合する多数のＳＯＸ１０＋神経堤前駆体を生じた７。重要なことに、本発明者らの急速なＣＮＳニューロンプロトコール候補であるＬＳＢ＋Ｘ／Ｓ／Ｄは、早くも分化６日目には、ほぼ純粋な（＞９８％）ＰＡＸ６＋細胞集団を生じた。これは、ＬＳＢおよびＬＳＢＸよりも著しく急速であり、ｈＰＳＣの既存の多能性においてＦＧＦ阻害が果たす役割と適合している。得られたデータは、図１Ｃに示される通り、ＣＮＳ同一性、ならびにＳＵ５４０２およびＤＡＰＴへの曝露後の神経誘導タイミングの加速を実証している。
【０１８３】
開示される方法はまた、ＬＳＢ＋Ｘ／Ｓ／Ｄが、感覚ニューロン運命指定中に３ｉプロトコール７（ＬＳＢ＋Ｃ／Ｓ／Ｄ）について報告されたものに匹敵する効率で、推定上のＣＮＳニューロンを誘導できるかどうかについて査定した。β−ＩＩＩチューブリン（ＴＵＪ１）について細胞内フローサイトメトリーを使用すると、汎ニューロンマーカーＬＳＢ＋ＣおよびＬＳＢ＋Ｘは、１３日目までにＴＵＪ１＋ニューロンがほとんどなかったが、３ｉ条件（ＬＳＢ＋Ｃ／Ｓ／Ｄ）では、４０％のＴＵＪ１＋細胞が得られた。それとは対照的に、新規なＬＳＢ＋Ｘ／Ｓ／Ｄ条件では、図１Ｄ〜１Ｆに示される通り、わずか１０％のＴＵＪ１＋ニューロンを生じた。これらのデータは、ＳＵ５４０２およびＤＡＰＴの存在下でＷＮＴシグナル伝達が阻害されると、ＣＮＳ系統ニューロンが生じるが、中程度の効果しかないことを示している。
【０１８４】
ニューロンの変換効率を向上させる試みでは、開示される方法は、ＬＳＢ＋Ｘにおいて候補小分子のスクリーニングを実施する。開示される方法は、神経前駆体細胞増殖、例えばＳＨＨ（シクロパミン、Ｃｕｒ−６１４１４、プルモルファミン）、ＰＩ３ＫおよびＰＤＧＦＲ（ＬＹ−２９４００２、イマチニブ）、ＭＹＣ／ブロモドメインタンパク質（ＪＱ１）、レチノイドシグナル伝達（オール−トランスレチノイン酸）、ＴＧＦβ活性化（ＩＤＥ−１）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害（ロバスタチン）およびニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害（Ｐ７Ｃ３）に関与する分子標的化シグナル伝達経路、ならびにＥＲＫシグナル伝達（ＰＤ０３２５９０１）を含むＦＧＦ受容体活性化の下流のシグナル伝達経路を選択することができる。マウスにおけるＥＲＫ１／２の阻害によって、皮質発生中の早期のニューロン分化が引き起こされ１２、ＥＲＫ阻害は、ｈＰＳＣにおける全体的なニューロン分化を増強するための戦略として、既に提案されている１３。ほとんどの条件は、ニューロンの運命獲得の著しい改善をもたらさなかった（データ示さず）。
【０１８５】
しかし、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼまたはＭＥＫ）の、経口で生体利用可能な強力な阻害剤であるＰＤ０３２５９０１は８、ＴＵＪ１＋の収率％を＞５０％まで強化することができ、これは、高濃度で使用した場合の３ｉ感覚ニューロンプロトコールに匹敵する値である（図１Ｇ、上パネル）。しかし、高い百分率のＴＵＪ１＋細胞は、全細胞数の低収率と相関しており、毒性を示唆した（図１Ｇ、下パネル）。ニューロン誘導効率と全体的な細胞毒性の平衡を保つ試みでは、より低いＰＤ濃度をＳＵ曝露と組み合わせると、全ニューロン収率が増大した。ＤＡＰＴを用いる追加の処理は、全体的なニューロン収率に負の影響を及ぼさなかったが、いくつかの条件を用いたニューロン誘導の効率はさらに増大して、分化１３日目には＞５０％のＴＵＪ１＋細胞を達成した。これらのデータによって、ＬＳＢ＋Ｘ＋Ｐ／Ｓ／Ｄは、皮質ニューロンの急速な誘導の有望な候補条件として定義付けられる。収率の低下が、急速な細胞周期からの脱出に起因するか、または直接的な毒性に起因するかを理解するために、本発明者らは、ホスホ−ヒストン３（ｐＨ３）および切断型カスパーゼ３（ＣＣ３）を、それぞれ細胞増殖および細胞死のマーカーとして測定した。ＰＤ０３２５９０１およびＳＵ５４０２の両方への曝露によって、早くもＰ／Ｓ処理の２４時間後に細胞増殖が低減されたが、細胞死は、高用量のＳＵ５４０２で初めて観察されており（図１５Ａ〜Ｆ）、このことは、前駆体細胞の増殖制限が、急速なニューロン分化応答において非常に重要な因子であることを暗示している。高百分率のニューロンをもたらし、毒性をごく低レベルに抑える２つの濃度には、ｉ）Ｐ（１μＭ）Ｓ（５μＭ）＝Ｐ１Ｓ５Ｄ条件、およびｉｉ）Ｐ（８μＭ）Ｓ（１０μＭ）＝Ｐ８Ｓ１０Ｄ条件が含まれる（図１Ｈおよび１Ｉ）。
【０１８６】
ＣＮＳおよび皮質ニューロン同一性の表現型分析
時間的フロー分析では、図３Ａおよび図４に示される通り、Ｐ８Ｓ１０Ｄ条件によってニューロンの運命獲得が劇的に加速され、３ｉ（Ｃ＋Ｓ／Ｄ）またはより穏やかなＣＮＳ（Ｐ１Ｓ５Ｄ）ニューロンプロトコールと比較して、１３日目に著しく高い百分率のニューロン（７０％のＴＵＪ１＋ニューロン）が生じたことが実証された。遺伝子発現分析では、ＬＳＢ＋Ｘ／Ｐ／Ｓ／Ｄ条件において、多能性マーカーＯＣＴ４のダウンレギュレーション、ならびに神経マーカーおよびニューロンマーカーＰＡＸ６、ＦＯＸＧ１およびＤＣＸ、ならびにＴＢＲ１（プレプレート、サブプレートおよびＶＩ層）およびＲＥＥＬＩＮを含む初期に生まれた皮質ニューロンのマーカーの誘導が確認された。それとは対照的に、感覚ニューロン（３ｉ）および加速なしのＣＮＳプロトコール（ＬＳＢ＋Ｘ）は、それぞれ皮質マーカーおよびニューロンマーカーの誘導の欠如を示した（図３Ｂ）。
【０１８７】
Ｐ８Ｓ１０Ｄ条件下で前脳マーカーＦＯＸＧ１の誘導が制限されることを前提として、ＦＯＸＧ１発現に対する各小分子の影響（図５Ａおよび５Ｂ）を試験した。それらのデータは、特に、神経誘導中のＰＤへの曝露によって、ＦＯＸＧ１誘導効率が低下したことを示した。しかし、Ｐ１Ｓ５Ｄ条件およびＰ８Ｓ１０Ｄ条件下の両方で、ＶＩ層皮質ニューロンマーカーＴＢＲ１＋の高効率の誘導が観察され、１３日目にすべてのＴＵＪ１＋細胞の５０％超において同時発現し（図３Ｃ〜３Ｅ）、これは、ＶＩ層マーカーＴＬＥ４の発現と類似していた（図１６Ａ）。ＴＢＲ１およびＴＬＥ４に対して陰性であった残部を同定するために、本発明者らは、１３日目の追加のマーカーのパネルをスクリーニングした（図１９、図１６Ｂ）。驚くべきことに、１５％〜２０％のニューロンがＢＲＮ３Ａを発現したが、ごくわずかなニューロンが、ＩＳＬ１を発現しており、これは、汚染性ＢＲＮ３Ａ＋ＣＮＳ系統の存在を示唆している（図１９、図１６Ｃ〜Ｄ）。ＢＲＮ３ＡおよびＧＳＸ２の両方の発現に基づくと（図１６Ｂ）、これらの非皮質ニューロンは、初期視床系統に相当し得る（www.gensat.org;http://developingmouse.brain-map.org）。ＴＵＪ１陰性画分の特徴付けによって、皮質前駆体細胞の同一性と一致して、ＴＢＲ２、ＢＬＢＰおよびＣＵＸ２に対して陽性の細胞の存在が示された（図１９、図１６Ａ〜Ｂ）。本発明者らはさらに、ＬＳＢ＋Ｘ／Ｐ／Ｓ／Ｄ条件において、他の前側ＣＮＳおよび皮質前駆細胞およびニューロンマーカーのアップレギュレーションを観察した（ＬＳＢ＋Ｘと比較）（図１６Ｂ）。しかし、本発明者らは、腹側前脳、皮質介在ニューロンまたは他のＧＡＢＡ作動性ニューロン運命の発現を検出しなかった（図１９、図１６Ｂ）。
【０１８８】
ＬＳＢ＋Ｘ／Ｐ／Ｓ／Ｄ条件が、複数の株にわたって強固であるかどうかを決定するために、本発明者らは、２人の健康な個体から誘導した６種の独立なｈｉＰＳＣ株を試験した。分化１３日目までに、すべての株がＴＢＲ１＋／ＴＵＪ１＋ニューロンについて富化され、ＷＡ０９  ｈＥＳＣ株から得られた形態と類似の形態を示した（図２Ｂおよび２Ｃ）。ニューロンの百分率の定量によって、ＷＡ０９について観察されたものと類似の効率が示されたが、複数の株の間でいくらかのばらつきがあった（図２Ｄ）。加速プロトコールをＧＭＰ適合培養条件に移すための試みでは、プロトコールを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（商標）培地（Ｅ６）ベースの誘導プラットフォームにさらに適応させた（図３Ｋ）。本発明者らは、分化１３日目までに、効率的なＰＡＸ６誘導、および高度に富化されたＴＢＲ１＋有糸分裂後ニューロン集団の発生の加速を観察した（図２Ｈ）。したがって、急速な誘導戦略は、ｈｉＰＳＣ株にわたって適用され、ＧＭＰ適合培養条件に適応させることができる。
【０１８９】
皮質投射ニューロンは、インサイドアウト方式で生成される１４。分化１３日目までのＴＢＲ１およびＲＥＥＬＩＮのアップレギュレーションは、最も早く生まれた皮質深部層ニューロンを発生させる潜在的な偏向を示唆した。しかし、ＦＧＦ−ＥＲＫおよびノッチ阻害がない状態でＰ１Ｓ５ＤまたはＰ８Ｓ１０Ｄ培養物をさらに維持することによって（１３〜５５日目）（図３Ｆ）、ＦＯＸＰ２（Ｖ〜ＶＩ層）、ＣＴＩＰ２（Ｖ層）、ＳＡＴＢ２（ＩＩ〜ＩＩＩ層、Ｖ層）、ＲＧＳ４（ＩＩ〜ＩＩＩ層、Ｖ層）（図３、図１７）などの、より広い範囲の皮質層を代表するマーカーを発現するニューロンを発生させることができ、タモキシフェン誘導性ＣＵＸ２レポーターｈＥＳＣ株を使用することによってモニターされた、上層ＣＵＸ２＋（ＩＩ〜ＩＶ層）ニューロンを発生させることができた（図１８Ａ〜Ｄ）。Ｐ１Ｓ５ＤまたはＰ８Ｓ１０Ｄで処理した細胞は、加速なしのプロトコールを使用した５５日目と比較して、早くも３３日目に成熟形態を有するＣＵＸ２＋有糸分裂後ニューロンを生成し始めた（図１８Ｅ〜Ｇ）。皮質神経発生は、著しく加速されるが、ＧＦＡＰ、ＡＱＰ４またはＯＬＩＧ２などのグリアマーカーのアップレギュレーションは観察されなかった。同様に、ＣＨＸ１０などのレチナール運命マーカーの誘導もなかった（図１７）。ＴＢＲ１＋、ＣＴＩＰ２＋およびＳＡＴＢ２＋ニューロンの定量によって（図３Ｈ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ由来のニューロンは、ｉｎ  ｖｉｖｏ皮質形成と一致するマーカー発現の時間的順序に従い得ることが示唆された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのニューロンサブタイプ誘導の特定のタイミングにさらに取り組むために、本発明者らは、誕生日決定実験を実施した（図３Ｆ）。層に特異的なマーカーを用いるＥｄＵ同時標識では、細胞誕生の連続波が示された（図３Ｉ〜Ｊ）。したがって、本発明者らのデータは、ＶＩ層の高効率な誘導を実証しており、修飾小分子タイミングレジメンを使用して上層ニューロンの誘導を加速する実現可能性を示している。
【０１９０】
多くの細胞は、３３日目までにＶＩ層マーカーＴＢＲ１、ＦＯＸＰ２およびＴＬＥ４を発現し、Ｖ層マーカーＣＴＩＰ２、ならびにＩＩ〜Ｖ層マーカーＳＡＴＢ２を、細胞の１０％超において発現し始めるが、これは、ｈＰＳＣからの皮質ニューロン誘導について現在公開されているプロトコールと比較して、最も早い発現である。図３Ｇに示される通り、誘導の３３日目までに、Ｐ１Ｓ５Ｄ培養によって、深層ＴＢＲ１＋およびＦＯＸＰ２＋のニューロン（Ｖ〜ＶＩ層）、ＣＴＩＰ２＋（Ｖ層）およびＳＡＴＢ２＋脳梁ニューロン（ＩＩ〜Ｖ層）が生じる。また、図３Ｇに示される通り、ＥＲＫおよびノッチ阻害がない状態でＰ１Ｓ５ＤまたはＰ８Ｓ１０Ｄ培養物をさらに維持することによって（誘導の５５日目まで）、ＣＴＩＰ２＋およびＳＡＴＢ２＋などの上層マーカーを発現するニューロンを効率的に生成することができた（それぞれ、およそ６０％および２０％のＴＵＪ１＋ニューロン）。
【０１９１】
培養を継続すると、図３Ｈに定量される通り、４５日目および５５日目に上層に属するより多くのニューロンが富化される。異なる層のニューロンについて誕生のタイミングに取り組むために、開示される方法は、ＥｄＵパルス標識を実施し（図３Ｉおよび３Ｊ）、それによって、初期に生まれた細胞集団がＶＩ層のＴＢＲ１＋ニューロンであることが実証されるが、これは皮質形成の固有の時間的機序と一致する。
【０１９２】
ニューロン機能の急速な誘導
開示される方法は、急速なＣＮＳニューロン誘導条件下でＴＢＲ１＋細胞の高効率な誘導を実証するが、修飾小分子タイミングレジメンを使用して上層マーカーを発現するニューロンを誘導する実現可能性を示すこともできる。開示される方法は、ニューロンマーカーの急速な誘導に、反復活動電位を自然発生的に発火させる能力などの、急速なｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能的成熟が並行するかどうかについて、さらに調査することができる。ｈＰＳＣ由来のニューロンの機能的成熟は、分化約５０〜１００日目に典型的に生じる活動電位の発火により、既に実証されている１５。開示される方法は、成熟を査定するために、ニューロンの運命に向かって誘導した細胞を、Ｐ１Ｓ５ＤまたはＰ８Ｓ１０Ｄ条件下で８日間培養し、その後、ｉ）任意の小分子阻害剤を含まない基本培地、ｉｉ）ＤＡＰＴだけを添加した培地、またはｉｉｉ）ＤＡＰＴをＳＵ５４０２、ＰＤおよびＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）（Ｐ／Ｓ／Ｄ／Ｃ）と共に添加した培地のいずれかで、さらに８日間培養することができる（図６Ａ）。ＧＳＫ３β阻害剤ＣＨＩＲは、Ｐ／Ｓ／Ｄで維持された培養物に対して強力な生存促進効果を発揮し、正準ＷＮＴシグナル伝達の活性化を誘発することによって、軸索伸張およびシナプス形成を含めたニューロン分化を促進することが既に示されているので１６、１７、この最終分化ステップに含めた。意外なことに、Ｐ／Ｓ／Ｄ／ＣＨＩＲ下で８日間維持されたＰ８Ｓ１０Ｄ細胞は（多能性状態から分化１６日目）、静止膜電位において、または−１０ｐＡの電流注入後に過分極が誘導されたら、一連の活動電位の発火によって特徴付けられる成熟した電気生理学的特性を自然発生的に示した（図６Ｂ）。すべての条件下で、記録されたニューロンの７０％〜８０％は、発火できることが記録され、約２０％〜３０％のニューロンは、Ｐ／Ｓ／Ｄ／Ｃを用いたＰ８Ｓ１０Ｄ細胞で、より成熟した発火パターンを示した（一連のおよそ１０回の活動電位発火ピーク）（図６Ｄ）。
【０１９３】
Ｐ１Ｓ５ＤニューロンおよびＰ８Ｓ１０Ｄニューロンの両方で査定されたニューロン成熟の追加のパラメーターには、静止膜電位、初期発火の活動電位半値幅および上昇率（Ｔａｕ）、入力抵抗、ならびに最大発火周波数が含まれる（図６Ｃおよび６Ｄ）。Ｐ／Ｓ／Ｄ／ＣＨＩＲ中で細胞を維持することによって、最も成熟したニューロン特性が得られたが、最も穏やかな条件（任意の小分子阻害剤を含まない基本培地中、Ｐ１Ｓ５Ｄで処理した細胞）でも、３７日目までに成熟した発火パターンのニューロンが生じ（図７Ａ〜７Ｃ）、この期間は、過去のほとんどのｈＰＳＣ由来の皮質ニューロン分化プロトコールにおける期間よりも著しく速い。
【０１９４】
強固な電位依存性ナトリウムチャネル応答も観察され、テトロドトキシン（ＴＴＸ）によってブロックされた（図６Ｅ）。さらに細胞は、自発的興奮性シナプス後電流（ｓＥＰＳＣ）を示したが、ｓＥＰＳＣは、特異的なＡＭＰＡ受容体アンタゴニストであるＮＢＱＸによって阻害され（図６Ｆ）、このことは、機能的興奮性シナプスが形成されたことを示している。機能的成熟データは、任意の星状膠細胞共培養がない状態で得られたが、マウス星状膠細胞（８日目）へのＰ８Ｓ１０Ｄ培養物の再プレーティング、または星状膠細胞の条件培地中の培養によって（図８Ａ〜８Ｃ）、全体的なニューロンの生存が改善され、入力抵抗が低下し、形態複雑性が増強されたニューロンが得られた（図８Ｄ〜８Ｆ）。さらに本発明者らは、星状膠細胞の添加によって、ニューロンの成熟がさらに加速され得るか、または維持が促進され得るかどうかについて試験した。実際、ＤＡＰＴの存在下で、マウス星状膠細胞でまたは星状膠細胞条件培地中でＰ８Ｓ１０Ｄ誘導ニューロンを培養することによって（図８Ａ〜Ｃ）、全体的なニューロンの生存が改善され、急速に誘導されたニューロンを、７０日から９０日を超えて長期間維持することができた（図８Ｇ）。星状膠細胞での培養によって、入力抵抗が低下し、形態複雑性が増強されたニューロンがさらに得られたが、このことは、ニューロンの成熟度の増大を示している（図８Ｅ〜Ｇ）。
【０１９５】
ｉＤＩＳＣＯベースの全脳分析を使用するｈＰＳＣ由来のニューロンのｉｎ  ｖｉｖｏ分析
ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータにより、本発明者らの組合せ小分子プロトコールが、皮質マーカーの発現および機能的電気生理学的特性を有するニューロンを急速に誘導できることが実証される。しかし、長期間生存、軸索投射能力および宿主回路網への統合をより完全に査定するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ移植研究を実施した。ＥＧＦＰを構成的に発現するｈＥＳＣから誘導された分化８日目の未成熟ニューロンを、Ｐ２  ＮＯＤ−ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒｇｃ−／−マウスの体性感覚皮質にグラフトした（図９）。
【０１９６】
グラフトした動物の脳を、グラフト１〜６ヶ月後に収集し、ｉＤＩＳＣＯ１８透明化およびホールマウント免疫組織化学的検査プロトコールに従って、全脳免疫蛍光画像化に晒した（図１０Ａ）。ほとんどの移植研究を、本発明者らの研究で試験した最終時点である移植後６ヶ月目まで強固なｉｎ  ｖｉｖｏ生存を示したＰ１Ｓ５Ｄパラダイムを使用して行った。Ｐ８Ｓ１０Ｄニューロンは、より可変的なｉｎ  ｖｉｖｏ生存を示し、移植１ヶ月後に動物のサブセットだけで生着および軸索投射の証拠があった（図１１Ａ）。ＬＳＢ＋Ｘ条件からの同等の８日目の細胞は、広範なグラフト過成長を示し、ニューロン分化またはグラフト統合の証拠は最小限であった（図１１Ｂ）。これらのデータは、初期神経上皮の「ロゼット段階」細胞が、腫瘍様の過成長をもたらすことを示唆する過去の結果を思い起こさせるものである２２。したがって、後期神経前駆体またはニューロンへの神経上皮細胞の分化は、神経過成長の危険性を低減するのに非常に重要である。
【０１９７】
グラフトの１ヶ月後および１．５ヶ月後の、Ｐ１Ｓ５Ｄニューロンをグラフトした脳の詳細な分析によって、グラフトコアおよびニューロン投射を可視化することができた（図１０Ｃ）。１ヶ月後、ＧＦＰ＋グラフト細胞は、すべての皮質層にわたって、広範な脱束化（defasciculated）投射を発生させた（図１０Ｂ）。いくつかの長い高密度束も、一貫して皮質層ＶＩに見られた。投射のほとんどは、前頭前野の運動皮質および前頭皮質で終端するが、多くの軸索は、脳梁を介して同側性海馬および対側性皮質にも辿っていた（図１０Ｃ）。非常に低密度のグラフト由来の線維が、線条体において観察されたが、これは、グラフトニューロンが、標的化外套下（subpallial）領域ではなく皮質領域にわたる投射を好んだことを示唆している。本発明者らは、自己蛍光を使用して宿主軸索経路を位置付けて（図１２Ａ）、グラフト由来の線維束の大部分が、内在性路に従ったことを観察した（図１２Ｃ）。しかし、いくつかの線維は、宿主下行路の外側に投射した（図１２Ｂ）。
【０１９８】
移植後１．５ヶ月までに、グラフト由来の軸索線維束の大部分は、ごく限られた終末分枝を伴って進行する経路探索に特徴的なパターンである成長円錐を思い起こさせる、直線軌道および拡大末端構造に従った（図１０Ｄ、左パネル）。それとは対照的に、移植後３ヶ月までおよび最も顕著には６ヶ月目に（図１０Ｄ、中央パネルおよび右パネル）、同等の標的エリアにおいて広範なヒト軸索終末分枝が存在した（図１０Ｄ、左パネルに対する中央パネル）。広範な分枝と同時に、ヒトシナプトフィジン陽性構造の高密度ネットワークが観察されたが、これは、宿主海馬などのいくつかの標的エリアのＧＦＰ＋線維と共存していた（図１０Ｄ、右下パネル）。グラフトニューロンは、単極、双極、多極および錐体の形状の様々な形態を示した（図１２Ｄ）。ｉＤＩＳＣＯベースの分析は、全般的な前脳マーカーＦＯＸＧ１、ならびに層特異的マーカー、例えばＲＥＥＬＩＮ、ＳＡＴＢ２およびＣＴＩＰ２の発現を含む、ヒト細胞におけるｉｎ  ｖｉｖｏ皮質マーカー発現を確認した従来の免疫組織化学的分析を用いて補完した（図１０Ｅ）。さらに、電気生理学によってｉｎ  ｖｉｖｏ機能の予備的な証拠が得られた（図１３）。グラフトニューロンにおけるＳＡＴＢ２＋の発現は、ｉＤＩＳＣＯベースの研究における交連軸索投射の存在と同等の交連ニューロン同一性と適合する（図１０Ｄ）。このデータは、分化８日目のＰ１Ｓ５Ｄ誘導神経細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存能および皮質内の広範な軸索投射能を有することを示した。Ｐ８Ｓ１０Ｄ誘導ニューロンは、グラフトサイズおよび生存率の全体的な低減を示したが、生存グラフトを有する動物は、１．５ヶ月目に、既に広範な線維伸張および分枝を示した。
【０１９９】
考察
開示される方法は、分化８日目のＰ１Ｓ５Ｄ誘導神経細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏ生存能および皮質内の広範な軸索投射能を有することを示すことができる。Ｐ８Ｓ１０Ｄニューロンは、グラフトサイズおよび生存率の全体的な低減を示したが、生存グラフトを有する動物は、１．５ヶ月目に、広範な線維伸張および分枝を示した。Ｐ８Ｓ１０Ｄグラフトが、Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞と比較して、より急速にｉｎ  ｖｉｖｏ成熟するかどうかを決定するには、将来的により詳細な研究が必要である。興味深いことに、任意の加速を伴わない二重ＳＭＡＤ阻害培養物（ＬＳＢ＋ＸＡＶ）からの８日目の同等のグラフトは、広範なグラフト過成長を示し、ニューロン分化の証拠は最小限であった（図１１Ｂ）。これらのデータは、初期神経上皮の「ロゼット段階」細胞が、神経上皮細胞の腫瘍様の過成長をもたらすことを示唆する本発明者らの過去の実験結果等と同等である１９。また、いくつかのニューロンは、固有の白質に従って軸索を伸ばし、いくつかのニューロンは、ランダム方向に軸索を伸ばすので、グラフト細胞は、軸索路探索の不均一性を示す（図１２）。したがって、後期神経前駆体またはニューロン系統へのさらなる分化は、神経過成長の危険性を低減するのに非常に重要である。
【０２００】
開示される方法は、ｈＰＳＣ由来のグラフト生存、軸索投射および宿主神経支配を位置付けるために、ｉＤＩＳＣＯを最初に適用する。ｉＤＩＳＣＯデータは、ＧＦＰのため、ならびにヒトシナプトフィジンなどのヒト特異的マーカーの発現のために、全脳免疫組織化学的検査および画像化を含む。しかしこの技術は、グラフト生物学の特定の態様をモニターするための、ほとんどの任意のヒト特異的マーカーを用いる使用に適しているはずである。将来的な研究では、選択的皮質エリアおよび層同一性を有するこのような細胞の定義されたｈＰＳＣ由来の皮質系統の位置付け領域に特異的な投射にｉＤＩＳＣＯを適用することは、特に興味深いものになるかもしれない２０。このアッセイは、関連系統であるが別個の投射パターンを有するニューロン、例えばＡ１０（腹側被蓋野）同一性に対してＡ９（黒質）の中脳ドーパミンニューロンを定義し、同所位２２に対して異所位２１に位置するニューロンの末端投射パターンを位置付けるためのツールとして働くこともできた。
【０２０１】
開示される方法は、分化１６日目までに成熟した電気生理学的特性を有し、生後マウス皮質においてｉｎ  ｖｉｖｏ生着能および長距離投射能を有する皮質ニューロンをもたらすことができる急速誘導プロトコールを提供する（図１４）。本発明の実施形態によれば、感覚ニューロン誘導７および新しい皮質ニューロン誘導の例に従って、他のニューロンサブタイプのために類似の加速戦略を開発することができる。このような急速な定方向性分化プロトコールは、疾患モデリング、薬物発見または細胞治療に関連する特異的ニューロンを得るのにかかる時間および費用を、著しく低減することができる。現在のＰ１Ｓ５ＤまたはＰ８Ｓ１０Ｄ条件下で誘導された皮質ニューロンは、皮質深層に偏向する。
【０２０２】
約２週間の分化で機能的ニューロンを発生させる時間枠は、ＮＧＮ２ベースの分化などのｈＰＳＣの転写因子ベースのニューロン誘導を使用する場合に達成される速度に匹敵する２３。しかし、小分子を介する定方向性分化は、特異的ニューロンを発生させるための柔軟性を拡大することができ、遺伝的修飾の必要をなくす。最後に、この研究は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＰＳＣからのヒト系統の多様性を再構築する能力の増大と共に、疾患モデリングおよび再生医療においてｉＰＳＣ由来のニューロンの全潜在能力を活用する道のりの、分化および成熟のタイミングを独立なパラメーターとして調節するための一歩となる。
【０２０３】
方法
ｈＥＳＣ株およびｈｉＰＳＣ株の発生
ｈＥＳＣ（ＷＡ−０９、継代３２〜６０回）を、ＷｉＣｅｌｌから得、継代６０回まで維持した。ｈＥＳＣ  ＳＯＸ１０：：ＧＦＰ細菌人工染色体レポーター株（ＷＡ−０９；継代４０〜７０回）を、既に報告されている通り発生させた７。構成的ＥＧＦＰ＋ｈＥＳＣ株（ＷＡ−０９；継代３５〜６０回）を、報告されている通り発生させた２４。ｈｉＰＳＣを誘導するために、線維芽細胞を、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｓｈｅｌｄｏｎ（ラトガース大学）によって寄贈により共有されているプロトコールに従って皮膚パンチ生検を消化することによって調製した。簡潔には、皮膚パンチを、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中コラゲナーゼ（１％）およびディスパーゼ（１単位／ｍｌ）の混合物で、組織培養インキュベーター中３７℃で１６〜１８時間消化させた。消化後、上皮層を廃棄し、部分的に消化された皮膚層を、乾燥組織培養皿の表面上で四等分し、撹乱されないように２〜５分間静置して、皿への接着を促した。皮膚層が剥離しないように、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを、ウェルに注意深く添加した。コンフルエント病巣がウェルの約２／３を覆うまで、培養物を３日おきに栄養補給した。コンフルエントに達したら、培養物をトリプシン処理によって継代し、再プログラミングの前に４〜５回継代するために拡張した。人工多能性幹細胞を、オリジナルのＣｙｔｏＴｕｎｅ  ｉＰＳ再プログラミングキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１３７８００２）を使用して、製造業者のプロトコールをいくつか修正して使用して生成した。１ｍＭのバルプロ酸（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含有するヒトＥＳ培地を２〜９日目に添加した。２〜３週間後、個々のｉＰＳクローンを採取し、ｉＰＳ株として繁殖させた。所与の個体からの３つのｉＰＳサブコロニーのそれぞれが、本当に非クローン性であったかを検証するために、３つの別個の形質導入から誘導された３つの異なるウェルからコロニーを選択した。各株を１０回の継代で繁殖させた後、品質管理アッセイを実施した。先に、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４およびＴｒａ−１−８１の発現を確認した。すべての多能性マーカーを発現したクローンは、ＭＳＫＣＣのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙによって、正常な核型を有することが検証された。１０回の継代後に存在しているＳｅｎｄａｉベクターの量を、ＴａｑＭａｎ  ｉＰＳＣ  Ｓｅｎｄａｉ検出キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１３６４０）を使用して定量し、０．０１％未満のＳｅｎｄａｉウイルスアンプリコン（Ｍｒ０４２６９８８０＿ｍｒ）を有するクローンだけを使用した。
【０２０４】
ＰＡＸ６：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰおよびＳＩＸ１：：Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ株の発生（継代４０〜６５回）
ＰＡＸ６−Ｐ２Ａ−Ｈ２Ｂ−ＧＦＰおよびＳＩＸ１−Ｐ２Ａ−Ｈ２Ｂ−ＧＦＰドナー構築物を、ｐＵＣ１９骨格へのＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニング（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を実施することによって発生させた。相同性アームを、ゲノムＤＮＡを使用することによって発生させ、Ｈ２Ｂ：ＧＦＰは、Ｇｅｏｆｆ  Ｗａｈｌ（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド番号１１６８０）から寄贈されたものであり、Ｐｇｋ−Ｐｕｒｏは、ＡＡＶＳ１  ｈＰｇｋ−ＰｕｒｏＲ−ｐＡドナープラスミド（Ｒｕｄｏｌｆ  Ｊａｅｎｉｓｃｈからの寄贈（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド番号２２０７２））から増幅させた。ＴＡＬＥヌクレアーゼは、Ａｄｄｇｅｎｅによって提供されたＴＡＬＥ−Ｔｏｏｌｂｏｘを使用して発生させた２５。Ｐａｘ６の終止コドンを標的化する配列は、ＴＧＴＣＣＴＧＴＡＴＴＧＴＡＣＣＡＣＴおよびＴＧＴＡＴＡＣＡＡＡＧＧＴＣＣＴＴＧＴであり、Ｓｉｘ１については、ＴＣＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＣＣＴＣＡおよびＴＴＧＧＧＧＴＣＣＴＡＡＧＴＧＧＧＧＡであった。簡潔には、ドナープラスミド２５μｇおよび各ＴＡＬＥＮ５μｇを、１０×１０６個のＨ９  ｈＥＳＣにヌクレオフェクション処理した（nucleofected）。ヌクレオフェクションの７２時間後に、ピューロマイシン選択を適用して、抵抗性クローンを単離した。クローンを増幅し、標的化を確認するゲノムＰＣＲを実施した。使用したすべての陽性クローンは、正常な核型を有していた。
【０２０５】
遺伝子導入ＣＵＸ２条件的レポーター株の発生
ＣＵＸ２：：ＣｒｅＥＲＴ２／ＡＡＶＳ１−ＣＡＧ：：ＦＬＥＸ／ｔｄＴｏｍａｔｏ株を、２つの逐次的なヌクレオフェクションおよび選択サイクルによって、ＲＵＥＳ２バックグラウンドで創出した。１回目は、ＣＵＸ２：：ＣｒｅＥＲＴ２／ＦＲＴ−Ｐｕｒｏ−ＦＲＴ−ＴＫ相同性ドナー２μｇを、ＣＵＸ２開始コドンを標的化するＴＡＬＥＮと一緒に、２×１０６個の初期継代ｈＥＳＣに電気穿孔した（図１８）。Ａｍａｘａヌクレオフェクター溶液Ｌ（Ｌｏｎｚａ）を使用して、ヌクレオフェクションを行った。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で培養物を処理することによって単細胞を得、それらの細胞を、３日間のヌクレオフェクション後にＲＯＣＫ−阻害剤Ｙ−２７６３２（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）で維持した。その後、ヌクレオフェクション処理した細胞を、最初の１０日間維持したピューロマイシン選択培地で２週間成長させた。無作為統合の陰性選択のために、ガンシクロビル（２μＭ）も添加した。２週間後、ＰＣＲ遺伝子型解析、シークエンシング、および核型分析によってさらに特徴付けるために、２２のクローンを選択した。あらゆる基準を満たした１つのクローンを拡張し、ＡＡＶＳ１  ＣＡＧ：：ＦＬＥＸ  ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＢＳＤ相同性ドナー２μｇ、ＡＡＶＳ１右および左ＴＡＬＥＮ（Ａｄｄｇｅｎｅ）それぞれ０．５μｇ、ならびにｐＣＡＧ−Ｆｌｐｅ（Ａｄｄｇｅｎｅ）２μｇを用いて２回目のヌクレオフェクションに晒した。Ｆｌｐリコンビナーゼを添加して、ＣＵＸ２遺伝子座の導入遺伝子からＦＲＴ−Ｐｕｒｏ−ＦＲＴカセットを切除した。次に、ヌクレオフェクション処理した細胞を、ブラストサイジン選択下で２週間成長させた。その後、ＰＣＲ遺伝子型解析のために１２のクローンを拡張し、ＦＲＴ−Ｐｕｒｏ−ＦＲＴカセットの切除について確認した。導入遺伝子を担持することが見出されたクローンの中から１つのクローンを核型分析し、さらなる実験のために選択した。遺伝子型解析のために使用したプライマーのリストは、図２０に提供されている。
【０２０６】
未分化細胞の培養およびニューロン誘導（分化０〜１３日目）
ｈＰＳＣ株を、ゼラチンでコーティングした組織培養プレート上に細胞１６，０００個／ｃｍ２で予めプレーティングしたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ；Ｇｌｏｂａｌｓｔｅｍ）と共に維持した。培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％（ｖ／ｖ）ノックアウト血清置換、１ｍＭのＬ−グルタミン、１００μＭのＭＥＭ非必須アミノ酸および０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有していた。無菌濾過後に１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した。細胞を毎日栄養補給し、６Ｕ／ｍｌのディスパーゼを使用して毎週継代した。神経分化のために、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて細胞を解離させ、マトリゲルでコーティングしたプレート上に１０μＭのＹ−２７６３２を補充して、細胞２００，０００個／ｃｍ２の密度で、報告されている通り１予めプレーティングし、コンフルエントの翌日に分化を開始させた。ノックアウトＤＭＥＭ８２０ｍｌ、ノックアウト血清置換１５０ｍｌ、１ｍＭのＬ−グルタミン、１００μＭのＭＥＭ非必須アミノ酸および０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含有するＫＳＲ培地を使用して、分化を開始させた。ＬＳＢ＋Ｘ／Ｐ／Ｓ／Ｄ誘導で使用した阻害剤には、ＬＤＮ１９３１８９（２５０ｎＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）、ＸＡＶ９３９（５μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）、ＰＤ０３２５９０１（Ｐ１Ｓ５Ｄ中１μＭ、Ｐ８Ｓ１０Ｄ中８μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）、ＳＵ５４０２（Ｐ１Ｓ５Ｄ中５μＭ、Ｐ８Ｓ１０Ｄ中１０μＭ；Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）、ＤＡＰＴ（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）が含まれていた。論文に記載されている他の誘導で使用されたさらなる阻害剤には、ＣＨＩＲ９９０２１（ＬＳＢＣ中６μＭ、ＬＳＢ＋Ｃ／Ｓ／Ｄ中３μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）が含まれる。Ｂ２７補充物を含むＮ２培地１（Ｎ２／Ｂ２７；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、８日目のＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、ジブチリルｃＡＭＰ（０．５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびアスコルビン酸（０．２ｍＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＢＣＡ）で補充した１００％ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７／Ｌ−Ｇｌｕ含有培地（ＮＢ／Ｂ２７；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に達するまで、４日目から１日おきに増分１／３で増大して添加した。Ｐ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄ分化スキームの概要（分化０〜１３日目）は、図２１に示される詳細な毎日の栄養補給の指示と共に、図２Ａに提示されており、０〜１３日目のＰ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄ誘導の段階的プロトコール、ならびに１３日目を超える長期間培養について以下に説明される通りである。本発明者らは、１３日目までのニューロン収率の一貫した結果をもたらした３つの異なるロットのＫＳＲを試験した。
【０２０７】
０〜１３日目のＰ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄ誘導の段階的プロトコール、ならびに１３日目を超える長期間培養
１．組織培養皿をマトリゲル（３５４２３４；ＢＤ）でコーティングする：ＤＭＥＭ／Ｆ１２で１：３０希釈し、組織培養皿に適用する。室温に２時間置く。
２．細胞を剥離する：細胞培養物をＰＢＳで１回洗浄し、ほとんどの細胞が剥離されるまで、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて３７℃で０．５〜１時間解離する。
３．細胞を洗浄した後、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）で補充したｈＥＳＣ培地に再懸濁し、ゼラチンでコーティングしたプレート上に３７℃で１時間プレーティングして、ＭＥＦを除去する。
４．細胞懸濁液を収集する。洗浄した後、細胞をＹ−２７６３２およびＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）で補充したＭＥＦ条件培地（完全にコンフルエントなＭＥＦ培養物から収集した条件ｈＥＳＣ培地）に、細胞２００，０００個／ｃｍ２でプレーティングする。
５．翌日に分化を開始させる（０日目）。ノックアウトＤＭＥＭ８２０ｍｌ、ノックアウト血清置換１５０ｍｌ、１ｍＭのＬ−グルタミン、１００μＭのＭＥＭ非必須アミノ酸および０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＫＳＲ培地を使用して、分化を開始させた。Ｐ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄ誘導で使用した阻害剤には、ＬＤＮ１９３１８９（２５０ｎＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）、ＸＡＶ９３９（５μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）、ＰＤ０３２５９０１（Ｐ１Ｓ５Ｄ中１μＭ、Ｐ８Ｓ１０Ｄ中８μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）、ＳＵ５４０２（Ｐ１Ｓ５Ｄ中５μＭ、Ｐ８Ｓ１０Ｄ中１０μＭ；Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）、ＤＡＰＴ（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）が含まれる。ＬＳＢ＋Ｘを０〜６日目に添加し、Ｐ／Ｓ／Ｄを２〜１３日目に添加した。
６．Ｂ２７補充物を含むＮ２培地１（Ｎ２／Ｂ２７；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、４日目から１日おきに増分１／３で増大して添加した：４日目および５日目については、１／３のＮ２／Ｂ２７、６日目および７日目については、２／３のＮ２／Ｂ２７。８日目から、培地を、Ｂ２７（ＮＢ／Ｂ２７）、ＢＤＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、ｃＡＭＰ（０．５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびアスコルビン酸（０．２ｍＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＢＣＡ）で補充したｎｅｕｒｏｂａｓａｌに切り替える。Ｐ１Ｓ５ＤおよびＰ８Ｓ１０Ｄ分化スキームの概要（０〜１３日目）は、図２Ａに提示されている。
７．深層および上層ニューロンの発生のための１３日目を超える長期間培養については、細胞を、ステップ１〜６に記載される通り予めプレーティングし、８日目まで分化させ、次にＰＯ／ラミニン／フィブロネクチンでコーティングした皿上で継代した。これらの皿を、ＰＢＳで希釈したポリオルニチン（ＰＯ；１５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって、３７℃で２４時間処理した。皿を、ＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳで希釈したマウスラミニンＩ（１μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）およびフィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、３７℃で１２時間さらに処理した。ラミニンおよびフィブロネクチンは、使用直前に除去した。
８．８日目の細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて３７℃で０．５〜１時間解離させた。細胞を洗浄した後、ＰＯ／ラミニン／フィブロネクチンでコーティングした皿上に、それぞれＮＢ／Ｂ２７＋ＢＣＡ中細胞１５０，０００個／ｃｍ２（Ｐ１Ｓ５Ｄ群）または細胞３００，０００個／ｃｍ２（Ｐ８Ｓ１０Ｄ群）でプレーティングした。
９．培地を３〜４日おきに変え、ニューロンのより良好な付着のために、１μｇ／ｍｌのラミニンを毎週添加した。
１０．次に細胞を、電気生理学的記録、免疫組織化学的検査、およびＲＮＡ抽出のために、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏ時点で査定した。
１１．毎日の栄養補給の指示の概要については、図２１を参照されたい。
【０２０８】
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（商標）培地（Ｅ６）での急速なニューロン分化
ｈＰＳＣ株（ＷＡ−０９）を、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地（補充物Ｅ８を含む）中、ビトロネクチン（ＶＴＮ−Ｎ；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でコーティングした培養プレート内で維持した。細胞を毎日栄養補給し、ＥＤＴＡ溶液を用いて５日おきに継代した。神経誘導のために細胞を解離し、ＫＳＲベースの誘導について記載されるものと同じやり方で、Ｅ８に予めプレーティングした。細胞がコンフルエントになった翌日に、分化を開始させた。Ｅ６でのＬＳＢ＋Ｘ誘導に使用した阻害剤には、１０日間の処置についてはＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ）およびＳＢ４３１５４２（１０μＭ）が含まれ、３日間の処置についてはＸＡＶ９３９（２μＭ）が含まれていた。最初の１０日間については、Ｅ６を使用し、１０日目からはＮ２／Ｂ２７に切り替えた。誘導を加速するために、細胞を、Ｅ６中前述の濃度のＬＳＢ＋Ｘで、０日目から３日間処理した。次に３日目から、ＬＤＮ１９３１８９（５０ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（５μＭ）、ＸＡＶ９３９（１μＭ）、ＰＤ０３２５９０１（０．４μＭ）、ＳＵ５４０２（２μＭ）およびＤＡＰＴ（５μＭ）をＥ６に添加した。Ｎ２／Ｂ２７培地を、増分１／３で５日目から１日おきにＥ６に添加した。Ｎ２／Ｂ２７の阻害剤には、ＫＳＲ／Ｎ２ベースの誘導のＰ１Ｓ５Ｄと同じ濃度のＬＳＢ＋Ｘ＋Ｐ／Ｓ／Ｄが含まれる。ＬＳＢ＋Ｘは、７日目に取り除かれるが、Ｐ／Ｓ／Ｄは残存する。９日目から、１００％ＮＢ／Ｂ２７＋ＢＣＡを使用した。ＮＢ／Ｂ２７で使用した阻害剤には、ＰＤ０３２５９０１（１μＭ）、ＳＵ５４０２（５μＭ）およびＤＡＰＴ（１０μＭ）が含まれる。Ｅ６での加速分化スキームの概要（分化０〜１３日目）は、図３Ｋに提示されている。
【０２０９】
深層および上層ニューロンの発生のための１３日目を超える長期間培養
深層および上層皮質ニューロンの発生のための長期間培養プロトコールは、図２１に提示される詳細な毎日の栄養補給の指示と共に、図３Ｆに模式的に示されている。ｈＰＳＣを、図２Ａに記載される通り、０日目からＰ１Ｓ５ＤまたはＰ８Ｓ１０Ｄによって誘導し、分化８日目に、Ａｃｃｕｔａｓｅ媒介性解離によって３７℃で０．５〜１時間継代した。細胞を、予めコーティングした培養皿上に、Ｐ１Ｓ５Ｄ群またはＰ８Ｓ１０Ｄ群についてそれぞれ細胞１５０，０００個／ｃｍ２または細胞３００，０００個／ｃｍ２で再びプレーティングした。皿を予めコーティングするために、ＰＢＳで希釈したポリオルニチン（ＰＯ；１５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に３７℃で２４時間曝露し、ＰＢＳで３回洗浄した後、培養皿を、ＰＢＳで希釈したマウスラミニンＩ（１μｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）およびフィブロネクチン（２μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、３７℃で１２時間さらに処理した。ラミニンおよびフィブロネクチンは、使用直前に除去した。継代および長期間培養の両方のために使用した培地は、前述の通りＮＢ／Ｂ２７＋ＢＣＡであった。培地を３〜４日おきに変え、ニューロンの付着を維持するために、１μｇ／ｍｌのラミニンを毎週添加した。次に細胞を、電気生理学的記録、免疫組織化学的検査、およびＲＮＡ抽出のために、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏ時点で査定した。図８に示される結果については、継代したＰ８Ｓ１０Ｄ細胞を、マウス星状膠細胞と共に、または星状膠細胞条件培地の存在下で共培養した。それらの研究のための星状膠細胞の単離および維持は、既に記載されている通りに行った３１。条件培地の収集のために、星状膠細胞にＮＢ／Ｂ２７＋ＢＣＡを補給し、条件培地を２〜３日おきに収集した。次に、条件培地を、０．２２μｍ膜孔真空フィルタ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を介して濾過して、細胞の汚染を取り除いた。
【０２１０】
細胞のＥｄＵ標識および定量
ＥｄＵを、それぞれ分化の様々な時点（８日目、１３日目、１８日目、２３日目、２８日目、３３日目）で開始して、４８時間窓で培養物に５μＭで添加し、細胞を、４０日目に４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。ＥｄＵを、製造業者の指定に従って、Ｃｌｉｃｋ−ｉＴ  ＥｄＵ画像化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて検出した。ＥｄＵ標識実験におけるＥｄＵ陽性および皮質層マーカー陽性ニューロンの定量、ならびに長期間培養におけるマーカー陽性ニューロンおよび全細胞の定量は、核定量のためのＩＴＣＮプラグインを含むＩｍａｇｅＪを、手動計数と組み合わせて使用して行った。２つの独立な細胞培養バッチからの６つの一様無作為に選択された画像フレームを、２０倍の対物レンズを使用して捕え、定量のために使用した。同時標識分析（ＥｄＵ、皮質層マーカー）について適切に解析できなかったクラスターを含有するエリアは、回避した。ｐＨ３および切断型カスパーゼ３陽性細胞の定量も、ＩＴＣＮプラグインを含むＩｍａｇｅＪを使用して行った。培養プレートごとに、４つの一様無作為に選択された画像フレームを、１０倍の対物レンズを使用して捕え、２つの独立な細胞培養バッチから定量するために使用した。すべての定量の結果を、Ｐｒｉｓｍ（バージョン６．０、ＧｒａｐｈＰａｄ）でプロットした。
【０２１１】
ＲＮＡ抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲ
細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で溶解し、−２０℃で保存した。全ＲＮＡを、フェノール／クロロホルムおよびイソプロパノール沈殿を使用して抽出し、ｄｄＨ２Ｏに溶解させた。ｃＤＮＡを、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｈ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して生成した。定量的ＲＴ−ＰＣＲを、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｒｅａｌｐｌｅｘ２（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して実施し、ＧＡＰＤＨを標準化のためのハウスキーピング遺伝子対照として使用した。デルタデルタＣｔおよび倍率変化を算出し、結果をＰｒｉｓｍ（バージョン６．０、ＧｒａｐｈＰａｄ）でプロットした。
【０２１２】
免疫細胞化学
細胞を、４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、透過処理し、ＰＢＳ中０．３％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを使用して１時間ブロックした。免疫細胞化学のために、細胞を、同じブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。この研究で使用した一次抗体のリストは、表１に提供されている。数回洗浄した後、細胞を、ブロッキング緩衝液で希釈した適切なＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ二次抗体（１：５００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）およびＤＡＰＩ（１：１０００；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）と共に室温で１時間インキュベートした。洗浄した後、細胞を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１顕微鏡によって、Ｈａｍａｍａｔｓｕ  ＯＲＣＡ  ＣＣＤカメラを使用して画像を撮影した。ｉｎ  ｖｉｖｏ研究の組織学的分析のために、固定した脳を、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ  ＶＴ１２００Ｓ）を使用して厚さ６０μｍスライスの薄片にし、その後、０．０２％ＮａＮ３を含むＰＢＳ中で１週間まで保存した。免疫細胞化学のために、スライスを透過処理し、ＰＢＳ中０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と１％ＢＳＡを使用して２時間ブロックし、同じブロッキング緩衝液で希釈した一次抗体と共に４℃で３〜５日間インキュベートした。二次抗体染色を、細胞に対して同様に実施した。前述と同じ設定のＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１顕微鏡、またはＺ−シリーズによる２μｍでの共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００）のいずれかによって、画像を獲得した。共焦点画像を、浸水レンズ（１０倍および４０倍）で撮影し、ＦｌｕｏＶｉｅｗ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）およびＰｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。
【表１−１】
2019506901.tif 000009
【表１−２】
2019506901.tif 000010
【表１−３】
2019506901.tif 000011
【０２１３】
ｉＤＩＳＣＯ全脳免疫蛍光および画像化
脳を、最新のオンラインプロトコール（ｈｔｔｐ：／／ｉｄｉｓｃｏ．ｉｎｆｏ、２０１５年１月バージョン）に記載されている修正を加えて、ｉＤＩＳＣＯプロトコールに記載されている通り処理した１８。使用した一次抗体は、ニワトリ抗ＧＦＰ（１：１０００；Ａｖｅｓ  ＧＦＰ−１０２０）、およびマウス抗ｈシナプトフィジン（１：１０００；Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）であった。使用した二次抗体は、ロバ抗ニワトリ−Ａｌｅｘａ６４７（１：１０００；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）およびロバ抗マウス−Ａｌｅｘａ５６８（１：１０００；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。透明化試料を、ｓＣＭＯＳカメラ（Ａｎｄｏｒ  Ｎｅｏ）を備えたライトシート顕微鏡（Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ＩＩ、ＬａＶｉｓｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃ）および作動距離６ｍｍの浸漬キャップを備えた２倍／０．５対物レンズで画像化した。
【０２１４】
フローサイトメトリー
細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅを用いて３７℃で３０分間〜１時間解離させた。洗浄した後、細胞を、ヨウ化プロピジウム（２μｇ／ｍｌ）を含む１倍のＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒプラットフォーム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって保存した。ＧＦＰ＋％を、ヨウ化プロピジウム陰性集団内で決定した。細胞内フローサイトメトリーのために、細胞を解離させ、洗浄し、４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。次に、固定した細胞を透過処理し、製造業者の指示書に従って、１倍のＢＤ  Ｐｅｒｍ／洗浄緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して染色した。使用したフローサイトメトリーのためのコンジュゲート一次抗体は、Ｎｅｓｔｉｎ−Ａｌｅｘａ６４７（１：５０；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、番号５６０３４１）およびＴＵＪ１−Ａｌｅｘａ４８８（１：５０；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、番号５６０３３８）であった。細胞を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを使用して分類した。結果を、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６）を使用して分析した。
【０２１５】
電気生理学
細胞を、分化８日目に再びプレーティングし、直径３５ｍｍのペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ）によりニューロン分化培地中で維持した。１６日目、２３日目、３０日目、３７日目および４０日目に、電気生理学的処理を、プレインキュベーションと共にＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中で３７℃において２時間実施した後、記録した。ＥＧＦＰ＋グラフト細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ記録のために、ＥＧＦＰ＋Ｈ９誘導細胞を移植したＮＯＤ−ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒｇｃ−／−マウスを、Ａｖｅｒｔｉｎで麻酔し、断頭した。脳を除去し、３５０μｍの冠状脳スライスを、Ｖｉｂｒａｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２を発泡させた、１２０ｍＭの塩化コリン、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．６ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、７ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５ｍＭのＣａＣｌ２、１．３ｍＭのアスコルビン酸および１５ｍＭのＤ−グルコースを含有する氷冷した塩化コリンベースの切断用溶液中で薄片を作った。スライスを、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２を発泡させた、１２６ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１．３ｍＭのＭｇＳＯ４、２．４ｍＭのＣａＣｌ２、２６ｍＭのＮａＨＣＯ３および１０ｍＭのＤ−グルコースを含有する人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）に移し、３２℃のインターフェイスチャンバ内に回収して少なくとも１時間置き、次に室温で保持した後、ＡＣＳＦを含有する３４℃の記録用チャンバに移した。
【０２１６】
落射蛍光照明、ＣＣＤカメラ、および２つの浸水レンズ（１０倍および６０倍）を備えた赤外ＤＩＣ顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１）を使用して視覚化し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで記録用電極をＥＧＦＰ＋グラフト細胞およびＨ９誘導ニューロンに向けた。ガラス製記録用電極（７〜９ＭΩの抵抗性）を、１２６ｍＭのグルコン酸カリウム、２ｍＭのＫＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍＭのＥＧＴＡ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、４ｍＭのＮａ２ＡＴＰ、０．４ｍＭのＮａ２ＧＴＰおよび０．５％ニューロビオチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ｐＨ７．２５および２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ）からなる細胞内溶液で充填した。記録データを、Ｍｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ｂ増幅器およびｐＣＬＡＭＰ１０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して収集した。発火事象を拾得し、発火の反応速度を、Ｃｌａｍｐｆｉｔ１０．２を使用して分析した。小過分極電流注入（−５ｐＡ）パルス点における細胞の入力抵抗を、定常に達した後、オームの法則によって膜電位変化から得た。自発性ＰＳＣを、ミニ分析プログラム（Ｓｙｎａｐｔｏｓｏｆｔ  Ｉｎｃ．）を使用して分析した。
【０２１７】
新生仔マウスへの移植
すべての手順は、ＮＩＨガイドラインに従って実施され、地方のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＢＣ）およびＥｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＥＳＣＲＯ）によって承認された。Ｐ１Ｓ５Ｄ細胞を、誘導８日目にＡｃｃｕｔａｓｅを用いて解離し、４０μｍの細胞ストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）で濾過した。細胞を１回洗浄し、氷冷したＰＢＳに密度１００，０００個の細胞／μｌで再懸濁し、次に３３ゲージの鋭い針を有する１０μｌシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）によって採取した。合計２μｌの細胞を、定位装置およびシリンジを駆動するための電気ポンプ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、Ｐ２新生仔ＮＯＤ−ＳＣＩＤ  ＩＬ２Ｒｇｃ−／−マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の体性感覚皮質に１μｌ／１分の速度で注射した。グラフトの１ヶ月後、１．５ヶ月後、３ヶ月後、および６ヶ月後に、完全麻酔下のマウスに、ヘパリン（２０単位／ｍｌ）を含有するＰＢＳを経心的に灌流した後、４％パラホルムアルデヒド２０ｍｌを灌流した。次に、マウス脳を抽出し、４％パラホルムアルデヒドによって一晩後固定した。
【０２１８】
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【０２１９】
本開示の主題およびその利点を詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書では様々な変更、置換および修正が行われ得ることを理解されたい。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載されるプロセス、機械、製造、ならびに物質の組成、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図されない。当業者は、本開示の主題、プロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法またはステップの開示から容易に理解される通り、本明細書に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たすか、または実質的に同じ結果を達成する、既存のまたは開発される今後のものは、本開示の主題に従って利用され得る。したがって、添付の特許請求の範囲は、それらの範囲内に、このようなプロセス、機械、製造、物質の組成、手段、方法またはステップの範囲内を含むことが意図される。
【０２２０】
特許文書、特許出願、刊行物、生成物の説明およびプロトコールが、本願を通して引用されているが、それらの開示は、あらゆる目的でそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１ＡＢＣ】
2019506901.tif 000012
【図１ＤＥＦ】
2019506901.tif 000013
【図１Ｇ】
2019506901.tif 000014
【図１ＨＩ】
2019506901.tif 000015
【図２ＡＢ】
2019506901.tif 000016
【図２ＣＤ】
2019506901.tif 000017
【図３ＡＢ】
2019506901.tif 000018
【図３ＣＤＥ】
2019506901.tif 000019
【図３Ｆ】
2019506901.tif 000020
【図３Ｇ】
2019506901.tif 000021
【図３ＨＩＪ】
2019506901.tif 000022
【図３ＫＬ】
2019506901.tif 000023
【図４】
2019506901.tif 000024
【図５】
2019506901.tif 000025
【図６ＡＢ】
2019506901.tif 000026
【図６ＣＤ】
2019506901.tif 000027
【図６ＥＦ】
2019506901.tif 000028
【図７ＡＢ】
2019506901.tif 000029
【図７Ｃ】
2019506901.tif 000030
【図８ＡＢ】
2019506901.tif 000031
【図８ＣＤ】
2019506901.tif 000032
【図８ＥＦ】
2019506901.tif 000033
【図８Ｇ】
2019506901.tif 000034
【図９】
2019506901.tif 000035
【図１０Ａ】
2019506901.tif 000036
【図１０ＢＣ】
2019506901.tif 000037
【図１０Ｄ】
2019506901.tif 000038
【図１０Ｅ】
2019506901.tif 000039
【図１１】
2019506901.tif 000040
【図１２ＡＢ】
2019506901.tif 000041
【図１２ＣＤ】
2019506901.tif 000042
【図１３ＡＢ】
2019506901.tif 000043
【図１３ＣＤ】
2019506901.tif 000044
【図１４】
2019506901.tif 000045
【図１５】
2019506901.tif 000046
【図１６】
2019506901.tif 000047
【図１７】
2019506901.tif 000048
【図１８ＡＢ】
2019506901.tif 000049
【図１８ＣＤＥＦＧ】
2019506901.tif 000050
【図１９−１】
2019506901.tif 000051
【図１９−２】
2019506901.tif 000052
【図２０】
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【図２１】
2019506901.tif 000054
【配列表】
2019506901000001.app
【国際調査報告】
2019506901.tif 000055
2019506901.tif 000056