(57)【要約】  マイクロ流体配置を製造するための方法および装置が開示される。１つの配置では、第１の液体の連続するボディーが、基板と直接接触して提供される。第２の液体が第１の液体と直接接触して提供され、かつ、第１の液体を覆う。第１の液体は、第２の液体および基板とだけ直接接触する。第２の液体は、第１の液体を通過させられ、かつ、基板の選択された領域において基板と接触させられて、第１の液体の連続するボディーを、第２の液体によって互いに分離された第１の液体の複数のサブボディーへと分割する。第１の液体は、第２の液体と不混和性である。表面張力が、第２の液体によって互いから分離された第１の液体の複数のサブボディーを安定的に保持する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体配置を製造するための方法であって、当該方法は：
基板と直接接触した第１の液体の連続するボディーを提供することを有し；
前記の第１の液体と直接接触し、かつ、前記の第１の液体を覆う第２の液体を提供して、前記の第１の液体が、前記の第２の液体および前記基板とだけ直接接触するようにすることを有し；かつ、
前記の第２の液体に前記の第１の液体を通過させ、かつ、前記基板の選択された領域において前記基板と接触させて、前記の第１の液体の前記の連続するボディーを、前記の第２の液体によって互いから分離された前記の第１の液体の複数のサブボディーへと分割することを有し；
前記の第１の液体は、前記の第２の液体と不混和性であり；かつ、
表面張力が、前記の第２の液体によって互いから分離された前記の第１の液体の前記の複数のサブボディーを安定的に保持する、
前記方法。
【請求項２】
前記の第２の液体に前記の第１の液体を通過させることが、分離部材の遠位先端部を、前記基板の前記の選択された領域の上で前記の第１の液体を通して移動させることによって実行され；
前記分離部材の前記遠位先端部の少なくとも一部が、前記の第１の液体との接触に関してよりも前記の第２の液体との接触に関して低い表面エネルギー密度を有する、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分離部材を前記基板の上で移動させて前記の第１の液体の前記の連続するボディーの形状を定めながら、前記分離部材の前記遠位先端部を通して前記の第１の液体を排出することによって、前記の第２の液体に前記の第１の液体を通過させる前に、前記の第１の液体の前記の連続するボディーが提供される、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記分離部材の前記遠位先端部を用いて前記の第２の液体に前記の第１の液体を通過させる間、前記の第２の液体の一部が前記分離部材の前記遠位先端部の中へと吸い込まれ、かつ、前記分離部材の前記遠位先端部において保持される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記の第１の液体の前記の連続するボディーが、前記分離部材とは分離した注入部材の遠位先端部を通して、前記注入部材を前記基板の上で移動させて前記の第１の液体の前記の連続するボディーの形状を定めながら、前記の第１の液体を排出することによって提供される、
請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記の第１の液体の前記の連続するボディーが、前記の第２の液体が前記第１の液体と接触する前に前記基板上に形成される、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項７】
前記の第１の液体の前記の連続するボディーが、主に表面張力によって横方向に拘束される、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項８】
前記の第１の液体の前記の連続するボディーが、前記基板の実質的に平面である部分および前記の第２の液体とだけ直接接触する、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項９】
前記の第２の液体に前記の第１の液体を通過させることが、下記のステップを順番に有し、該下記のステップは：
前記の第１の液体の前記の連続するボディーを、等しい体積の２つのサブボディーへと対称的に分割するステップ；および、
先の分割ステップによって形成された各サブボディーを、等しい体積の２つのさらなるサブボディーへと対称的に繰り返し分割するステップである、
いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項１０】
各サブボディーと前記基板との間の接触領域が、サブボディーの足跡の輪郭を有するサブボディーの足跡を有し；かつ、
前記のサブボディーの足跡の輪郭のうちの少なくも部分集合が、少なくとも１つの直線部分を有する、
いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項１１】
各サブボディーと前記基板との間の接触領域が、サブボディーの足跡の輪郭を有するサブボディーの足跡を有し；かつ、
前記のサブボディーの足跡の輪郭のうちの少なくも部分集合が、互いに関してぴったりとついている、
いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項１２】
前記の第２の液体が前記の第１の液体より高密度である、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項１３】
前記の第１の液体、第２の液体および基板が、空気中の前記基板上の前記の第１の液体の小滴の平衡接触角および空気中の前記基板上の前記の第２の液体の小滴の平衡接触角が、両方とも９０度より小さくなるように選択される、いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項１４】
前記の第１の液体の複数の前記の連続するボディーが、部材を前記基板の上で移動させて前記の第１の液体の前記の連続するボディーのそれぞれの形状を定めながら、前記部材の遠位先端部から前記の第１の液体を排出することによって、同一の基板上の異なる位置において形成され；
前記の連続するボディーはそれぞれ、最初は前記の第２の液体によって覆われ、かつ、表面張力によって所定の位置に保持されており；かつ、 
前記の第１の液体の前記の連続するボディーはそれぞれ、次に、前記の第２の液体に前記の第１の液体を通過させ、かつ、前記基板の選択された領域において前記基板と接触させることによって、前記の第２の液体によって互いから分離された複数のサブボディーへと分割される、
いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項１５】
前記の第１の液体の前記の連続するボディーの中に、研究されるべき材料が提供され；かつ、
サブボディーへの前記分割が複数の隔離されたサンプルを生成し、該複数の隔離されたサンプルはそれぞれ、前記の研究されるべき材料の一部を含有している、
いずれかの先行する請求項に記載の方法。
【請求項１６】
前記の研究されるべき材料が生物学的材料を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物学的材料が接着性生細胞を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記接着性生細胞のうちの少なくとも一部が、前記の第１の液体の前記の連続するボディーが前記サブボディーへと分割される前に、前記基板に接着することが可能とされる、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記接着性細胞のうちの少なくとも一部が前記基板に接着した後で、前記の第１の液体の前記の連続するボディーに被験物質が添加され；かつ、
前記サブボディーへの前記分割が、前記被験物質が前記の第１の液体の前記の連続するボディーに添加された後で実行される、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験物質が薬剤を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記の第２の液体が、前記サブボディーへの前記分割の後で増殖培地と置換される、請求項１５〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記生物学的材料が生細胞を、各サブボディーの平均占有率が１つの生細胞より小さくなるような濃度で有する、請求項１５〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
いずれかの先行する請求項に記載の方法を用いて製造されるマイクロ流体配置。
【請求項２４】
マイクロ流体配置を製造するための装置であって、当該装置は：
注入システムを有し、該注入システムは、注入部材を基板の上で移動させて第１の液体の連続するボディーの形状を定めながら、前記注入部材の遠位先端部を通して前記の第１の液体を排出することによって、前記基板と直接接触した前記の第１の液体の前記の連続するボディーを提供するように構成されており；
遠位先端部を有する分離部材を有する分離システムを有し、該分離システムは、用時には、前記基板の選択された領域の上で前記の第１の液体を通して前記分離部材の前記遠位先端部を移動させることによって、第２の液体であって、前記の第１の液体と不混和性であり、かつ、前記の第１の液体と直接接触して提供され、かつ、前記の第１の液体を覆い、前記の第１の液体が前記の第２の液体および前記基板とだけ直接接触するようにする前記の第２の液体に、前記の第１の液体を通過させて、かつ、前記基板の前記の選択された領域において前記基板と接触させ、そのことによって、前記の第１の液体の前記の連続するボディーを、前記の第２の液体によって互いから分離された前記の第１の液体の複数のサブボディーへと分割するように構成されており；かつ、
コントローラーを有し、該コントローラーは、前記の第１の液体の前記の連続するボディーの形成中の、前記基板の上での前記注入部材の移動を制御し、かつ、前記の第１の液体の前記の連続するボディーの前記第１の液体の前記の複数のサブボディーへの分割中の、前記基板の上での前記分離部材の移動を制御するように構成されている
前記装置。
【請求項２５】
前記分離部材の前記遠位先端部の少なくとも一部が、前記の第１の液体との接触に関してよりも前記の第２の液体との接触に関して低い表面エネルギー密度を有する、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記基板と、前記の第１の液体の前記の連続するボディーと、前記の第１の液体と直接接触し、かつ、前記の第１の液体を覆う前記の第２の液体とをさらに有する、請求項２４または２５に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第１の液体のボディー（ｂｏｄｙ；塊）を、第２の液体によって互いから分離されかつ表面張力によって安定的に保持された（ｈｅｌｄ）、液体の複数のサブボディー（ｓｕｂ−ｂｏｄｉｅｓ；より小さい塊）へと分割することによってマイクロ流体配置（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を作成することに関する。サブボディーは、生細胞またはその他の生物学的材料のような研究されるべき材料を含有する隔離されたサンプルを提供するのに用いられ得る。
【背景技術】
【０００２】
生物学的材料に関連する研究には、マイクロウェルプレートが広範に用いられる。ウェルの小型化は、多数のウェルが同一のプレートに提供されることを可能にする。例えば、１０００個以上のウェルを有するプレートであって、各ウェルが数１０ナノリットルの領域においてある体積を有する前記プレートが知られている。しかしながら、ウェルを互いから分離する堅固な壁部を提供する内在的な必要性に起因して、さらなる小型化は困難である。これら壁部の厚さは、ウェルのために利用可能である表面積を減少させる。１５３６個のウェルを有する典型的なプレートについては、例えば、壁部は現在の設計について利用可能である表面の約６０％を占めることが予期される。より高密度については、壁部によって利用不能となる表面積の割合はさらに増大するであろう。
【０００３】
マイクロウェルプレートの小型化へのさらなる障壁が、物理的な壁部によって定められた小さいウェルに液体を添加することの困難性である。ウェルに信頼性高く添加されるべき液体については（すなわち、液体の下に空気を捕捉することを回避する方法では）、先端部が、先端部または先端部に付着したあらゆる液体がウェルの壁部に触れることなくウェルの底へと正確に前進する必要がある。液体がウェルの底に到達する前に壁部との接触がなされれば、壁部とともにメニスカスが形成され、かつ、液体の下の空気を捕捉するであろうと考えられる。このことは、液体がウェルの底に到達し得ないことを意味するかも知れない。
【０００４】
マイクロウェルプレートはまた、ウェルのサイズおよびプレートあたりのウェルの数が固定されているので柔軟性を欠く。さらに、生物学的および化学的適合性が、効率良い方式でウェルに対応する構造体を形成し得る材料を用いることの必要性によって制限され得る。例えば、高密度のプレートについては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）のような材料を用いる必要があるかも知れないが、未処置のＰＤＭＳは、それが毒素を示し、かつ、有機溶剤と反応するので、生物学的および化学的適合性が低い。
【０００５】
欧州特許公開第１５２７８８８号公報には、代替的なアプローチを開示されており、そこでは、生物学的材料の培養および分析のための増殖培地の密集した小滴のアレイを形成するのに、インクジェットプリンティングが用いられる。このアプローチは、伝統的なマイクロウェルプレートよりも柔軟性を提供するが、プリンティングを実行するための精巧な機器を必要とする。さらに、小滴が形成された後で小滴にさらなる材料を添加するのに時間がかかるし、かつ、結果として生じる静滴が互いにぴったりつく（ｔｅｓｓｅｌｌａｔｅ）ことがないので、それにより濡れていない有意な足跡（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ；フットプリント・占める面積）が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の課題のうちの１つ以上に少なくとも部分的に対処するマイクロ流体配置を作成する代替的な手段を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の態様によれば、マイクロ流体配置を製造する方法が提供され、当該方法は：基板と直接接触した第１の液体の連続する（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）ボディーを提供することを有し；第１の液体と直接接触し、かつ、第１の液体を覆う第２の液体を提供することを有し、第１の液体が、第２の液体および基板とだけ直接接触するようになっており；かつ、第２の液体に第１の液体を通過させ、かつ、基板の選択された領域において基板と直接接触させて、第１の液体の連続するボディーを、第２の液体によって互いから分離された第１の液体の複数のサブボディーへと分割することを有し：第１の液体は、第２の液体と不混和性であり（ｉｍｍｉｓｃｉｂｌｅ）；かつ、表面張力が、第２の液体によって互いから分離された第１の液体の複数のサブボディーを安定的に保持する。
【０００８】
当該方法は、液体のサブボディーが、サブボディーの幾何学的形状（ｇｅｏｍｅｔｒｙ；ジオメトリー）を定めるためにいかなる機械的または化学的構造体も事前に提供されることを伴わず、基板上で柔軟に形成されることを可能にする。サブボディーの形状およびサイズは、第２の液体が接触させられる基板の選択された領域の形状およびサイズによって定められる。下記で説明されるように、選択された領域の選択範囲は、比較的制限されない。例えば１００ミクロンまたはいっそう小さいオーダーの極めて小さいサブボディーを作成することが可能であり、かかるサブボディーは、標準的なマイクロプレート製造技術を用いて合理的な費用で作成することが困難または不可能なものである。サブボディーはまた、物理的な壁部を有するマイクロウェルプレートを用いて可能であるよりも、互いにいっそう密接して位置決めされ得る。本開示の実施形態の液体壁は、典型的には、７０〜１２０ミクロンの厚さを有し、このことは、マイクロ流体配置の表面積の９０％以上を、操作されるべき液体を含有するのに利用可能にする。さらに、サブボディーのいずれかにさらなる液体を添加することを妨害する堅固な壁部は存在しない。
【０００９】
インクジェットプリンティングなどによって配置される小滴のアレイと比較すると、当該方法は、精巧なプリンティング機器の必要性を回避し、かつ、いっそう高い空間充填効率を達成し得る（なぜなら、サブボディーの形状が円形である必要がないからである）。研究されるべき材料（例えば、細胞）および被験物質（例えば、薬剤）は、それらを第１の液体の連続するボディーに、それがサブボディーへと分割される前に添加することによって、同時に多数のサブボディーに添加され得る。濃度勾配が第１の液体の小片において課され得、かつ、小片はサブボディーへと分割され素早く、かつ容易に異なる濃度の成分を含有する多数のサンプルが作成され得る。本発明者らはさらに、サブボディーが形成された後でそれらの中に流体を配置することが、円形の足跡を有さないサブボディー（実質的に正方形または長方形のサブボディー）について、いっそう効率良く（結合がいっそう素早く起きる）達成され得ることを見出した。理論に拘束されることを希望することなく、この効果は、非円形のサブボディーの低減された対称性によって、および／または、それらがいっそう平らであり得るという事実によって影響を受けるかも知れないと考えられる。非円形のサブボディーは、本開示の方法を用いて容易に形成され得る。
【００１０】
ある実施形態では、第２の液体に第１の液体を通過させることは、基板の選択された領域の上で第１の液体を通して分離部材（ｓｅｐａｒａｔｏｒ  ｍｅｍｂｅｒ）の遠位先端部を移動させることによって実行され；かつ、分離部材の遠位先端部の少なくとも一部が、第１の液体との接触に関するよりも第２の液体との接触に関して低い表面エネルギー密度を有する。
【００１１】
分離部材の表面特性は、第２の液体が第１の液体を通して素早く、かつ効率良く引きず
られることを可能にし、分割工程が信頼性高く、かつ高速で実行されることを可能にする。第１の液体を通して分離要素（ｓｅｐａｒａｔｏｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を移動させる単純なアプローチは、比較的安価なハードウェアを用いて実装され得る。
【００１２】
ある実施形態では、第１の液体の連続するボディーは、主に表面張力によって横方向に（ｌａｔｅｒａｌｌｙ）拘束される。
【００１３】
この手段で連続するボディーを形成することは、第１の液体がレセプタクルの全表面にわたって広がる必要がないことを意味するので望ましい。このことは、形状がレセプタクルの形状とは独立して制御され得、いっそう最適な空間充填を可能にすることを意味する。連続するボディーは、例えば正方形または長方形に配置され得、このことは、レセプタクル自体が正方形または長方形でない時でさえ、正方形または長方形のサブボディーのアレイが第１の液体の浪費を最小限にしながら形成されることを可能にする。さらに、連続するボディーとレセプタクルの横壁との間の隙間は、壁部と、連続するボディーの形成または連続するボディーのサブボディーへの分割に用いられる任意の要素との間の妨害のリスクを低減させ得る。このようにして、多数の別個の連続するボディー（例えば、正方形または長方形）が形成され得る。本発明者らはさらに、第１の液体がレセプタクルの横壁によってではなく主に表面張力によって横方向に拘束されている時に、第１の液体の深さが、上にあるいっそう高密度の第２の液体によって層の厚さが壊されることを伴わず、いっそう高くなり得ることを見出した。
【００１４】
ある実施形態では、第２の液体に第１の液体を通過させることは、下記のステップを順番に有する：第１の液体の連続するボディーを、等しい体積の２つのサブボディーへと対称的に分割するステップ；および、先行する分割ステップによって形成された各サブボディーを、等しい体積の２つのさらなるサブボディーへと対称的に繰り返し分割するステップ。
【００１５】
このアプローチは、等しい体積の多数のサブボディーが正確に、かつ信頼性高く形成されることを可能にする。
【００１６】
ある実施形態では、各サブボディーと基板との間の接触領域が、サブボディーの足跡の輪郭を有するサブボディーの足跡を有し；かつ、サブボディーの足跡の輪郭のうちの少なくとも部分集合が、互いに対してぴったりとついている。
【００１７】
小滴のインクジェットプリンティングに基づく先行技術の方法とは対照的に、本開示の実施形態は、互いにぴったりとついたサブボディーが効率良い方式で生産されることを可能にし、そのことによって高い空間充填を達成する。
【００１８】
ある実施形態では、第２の液体は、第１の液体より高密度である。
【００１９】
当該方法は、驚くべきことに、基板との接触から離れるように第１の液体を持ち上げることが予期されるかも知れない浮力にも関わらず、第１の液体より高密度の第２の液体を用いて有効である。いっそう高密度の第２の液体の使用を可能にすることは、有利なことに、第２の液体について用いられ得る組成の範囲を広げる。さらに、第１の液体が基板全体に横方向に広がることを伴うことなく、各サブボディーにおいて安定的に保持され得る第１の液体の最大深さが増大する。
【００２０】
ある実施形態では、第１の液体の連続するボディーにおいて、研究されるべき材料が提供され、かつ、サブボディーへの分割が複数の隔離されたサンプルを生成し、該複数の隔離されたサンプルはそれぞれ、研究されるべき材料の一部を含有している。ある実施形態
では、研究されるべき材料は接着性生細胞を有し、かつ、細胞の少なくとも一部が、第１の液体の連続するボディーがサブボディーへと分割される前に基板に接着することが可能とされる。接着性生細胞の少なくとも一部が基板に接着した後で、第１の液体の連続するボディーに被験物質（例えば、薬剤）が添加される。サブボディーへの分割は、被験物質が第１の液体の連続するボディーに添加された後で実行される。
【００２１】
したがって、接着した生細胞が、それらが基板に接着することが可能とされた後で一緒に処置され、かつ、その後で複数の隔離されたサンプルへと分割されることを可能にする技法が提供される。このことは、先行技術のアプローチを用いては不可能であり、かつ、特に多数の隔離されたサンプルの作成と細胞への最小限の妨害が所望される場合に、相当な時間を節約し、かつ、システムの複雑さを省く。それはまた、各サンプルにおける細胞が非常に似た条件に曝露されたことを確実にし、このことは、被験物質（例えば、薬剤）が個別のウェルまたは小滴に手動で添加される時には確実にすることが困難であり、その場合、異なるサンプルの処置とインクジェットプリンティングまたはｄｒｏｐ−ｓｅｑ法に起因する物理的環境との間で有意な遅延を課するかも知れない。細胞は、それらをインクジェットスタイルのプリンティングシステムのプリンティングノズルを通過させることによって課されるストレスなしで、表面上に配置され得る。細胞が、それらが切断される前に接着することを可能にすることは、細胞が、それらが接着する前に小型の体積へともたらされる代替的なアプローチ（例えば、小滴プリンティングを介する）よりも、薬剤スクリーニングについてのいっそう古典的なウェルプレート出発条件を良好に表す。本発明者らはさらに、細胞生存率が、細胞が細胞の接着前に同一の体積の小滴において添加されたか、または存在した時と比べて、本開示の実施形態にしたがって形成されたサブボディーにおいていっそう高いことを見出した。
【００２２】
代替的な態様によれば、マイクロ流体配置を製造するための装置が提供され、当該装置は：注入システムを有し、該注入システムは、基板の上で注入部材（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ
ｍｅｍｂｅｒ）を移動させて第１の液体の連続するボディーの形状を定めながら、注入部材の遠位先端部を通して第１の液体を排出することによって、基板と直接接触した第１の液体の連続するボディーを提供するように構成されており；遠位先端部を有する分離部材を有する分離システムを有し、該分離システムは、用時には、基板の選択された領域の上で第１の液体を通して分離部材の遠位先端部を移動させることによって、第２の液体（該第２の液体は、第１の液体と不混和性であり、第１の液体と直接接触して提供され、かつ、第１の液体を覆い、第１の液体が第２の液体および基板とだけ直接接触するようにする）に、第１の液体を通過させて、かつ、基板の選択された領域において基板と接触させ、そのことによって、第１の液体の連続するボディーを、第２の液体によって互いから分離された第１の液体の複数のサブボディーへと分割するように構成されており；コントローラーを有し、該コントローラーは、第１の液体の連続するボディーの形成中、基板の上での注入部材の移動を制御し、かつ、第１の液体の連続するボディーの第１の液体の複数のサブボディーへの分割中、基板の上での分離部材の移動を制御するように構成されている。
【００２３】
したがって、本開示による方法を実行することが可能である装置が提供される。
【００２４】
ある実施形態では、注入部材と分離部材とは、別個の部材として提供され、これら部材の外面についての最適な特性が提供されることを可能にする。ある実施形態では、分離部材の遠位先端部の少なくとも一部が、第１の液体との接触に関するよりも第２の液体との接触に関して低い表面エネルギー密度を有する。好ましくは、注入部材の遠位先端部の少なくとも一部が、第２の液体との接触に関するよりも第１の液体との接触に関して低い表面エネルギー密度を有する。分離部材の表面特性は、第２の液体が効率良く分離部材の移動に追従することを可能にし、そのことによって、第１の液体を効率良く変位させる。注
入部材の表面特性は、第２の液体が既に存在する一方で第１の液体の連続するボディーが形成される時でさえ、第１の液体の連続するボディーが効率良く形成されることを可能にする（例えば、第２の液体を通して遠位先端部を挿入して第１の液体の連続するボディーを形成することによって）。注入部材の表面特性はまた、注入部材が基板上の第１の液体の形状を、それが形成された後で修正するのに用いられることを可能にする（例えば、基板を横切るように遠位先端部を引きずることによって基板上の新たな領域へと第１の液体を広げることによって）。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
添付の図面（対応する参照記号は、対応する部品を示している）を参照して、本発明の実施形態が、例としてのみ、ここで説明されるであろう：
【００２６】
【図１】図１は、基板上にある第１の液体の連続するボディーの概略的な側面図であり、第２の液体が第１の液体と直接接触しており、かつ、第１の液体を覆っている。
【図２】図２は、分離部材を用いた第１の液体の連続するボディーの分割中の図１の配置の概略的な側面図である。
【図３】図３は、図２の配置の概略的な平面図である。
【図４】図４は、サブボディーをさらに分割する、後に続くステップを示す概略的な側面図である。
【図５】図５は、図３および図４に描かれている方法を用いて形成されたサブボディーを示す概略的な側面図である。
【図６】図６は、等しい体積のサブボディーをもたらす分割スキームを描いている。
【図７】図７は、異なる体積のサブボディーを制御可能に提供するための分割スキームを描いている。
【図８】図８は、第１の液体の連続するボディーの分割を描いており、連続するボディーは逆さまに保持されている。
【図９】図９は、第１の液体の連続するボディーの分割を描いており、この場合、連続するボディーはレセプタクルの横壁へと延びている。
【図１０】図１０は、第１の液体の連続するボディーが第１のステップにおいて平行な細長い小片へと分割され、各小片がそれに続いて複数のサブボディーへと分割される、分割スキームを描いている。
【図１１】図１１は、第１の液体の連続するボディーが、少なくとも１つのリザーバーに接続された流路（ｃｏｎｄｕｉｔ）を有する少なくとも１つのサブボディーを形成するように分割される、分割スキームを描いている。
【図１２】図１２および図１３は、第１の液体の連続するボディーを形成し、かつ、別のステップにおいて第１の液体の連続するボディーをサブボディーへと分割するための分離部材の使用を描いている。
【図１３】図１２および図１３は、第１の液体の連続するボディーを形成し、かつ、別のステップにおいて第１の液体の連続するボディーをサブボディーへと分割するための分離部材の使用を描いている。
【図１４】図１４および図１５は、第１の液体の連続するボディーを形成するための注入部材、および、第１の液体の連続するボディーをサブボディーへと分割するための、注入部材から分離した分離部材の使用を描いている。
【図１５】図１４および図１５は、第１の液体の連続するボディーを形成するための注入部材、および、第１の液体の連続するボディーをサブボディーへと分割するための、注入部材から分離した分離部材の使用を描いている。
【図１６】図１６は、第１の液体の複数の連続するボディーを作成し、その後で連続するボディーをそれぞれ分割してサブボディーを作成することによって、互いに対して異なる組成を有する第１の液体のサブボディーの多数のセットを作成するためのスキームを描いている。
【図１７】図１７は、生物学的材料を試験するためのマイクロ流体配置を製造する方法のフレームワークを記載したフローチャートである。
【図１８】図１８は、接着性生細胞および被験物質を含有するサンプルを試験するためのマイクロ流体配置を製造する方法のフレームワークを記載したフローチャートである。
【図１９】図１９は、群になった細胞集団を増殖させるためのマイクロ流体配置を製造する方法のフレームワークを記載したフローチャートである。
【図２０】図２０は、流体配置を製造するための装置を描いている。
【００２７】
図は例示的な目的でのみ提供されており、かつ、構成要素が明確に視覚化されることを可能にするために縮尺通りに描かれていない。具体的には、第１および第２の流体の深さに対する基板を提供するレセプタクルの幅は、実際には、図面中に描かれているものよりいっそう大きいであろう。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
マイクロ流体配置を便宜に、かつ柔軟に製造するための方法が提供される。
【００２９】
図１に概略的に描かれているように、第１の液体１の連続するボディーが提供される。第１の液体１は、基板４と直接接触している。ある実施形態では、第１の液体１は水溶液を有するが、その他の組成が可能である。第２の液体２が、第１の液体１と直接接触して提供される。第２の液体２は、第１の液体と不混和性である。ある実施形態では、第１の液体１の連続するボディーは、第２の液体２が第１の液体１と接触する前に、基板４の上に形成される。その他の実施形態では、第１の液体１の連続するボディーは、第２の液体２が提供された後で形成される（例えば、第１の液体２を通して第１の液体１を注入することによって）。マイクロ流体配置が生物学的材料のサンプルを試験するのに用いられる実施形態では、第１の液体１の連続するボディーは、通常、第２の液体２が提供される前に形成されるであろう。第２の液体２は、第１の液体１を覆う。第１の液体は、したがって、完全に取り囲まれ、かつ、第２の液体２および基板４の組み合わせとだけ直接接触している。当該方法におけるこの時点で、第１の液体１は、第２の液体２および基板４以外のいかなるものとも接触していない。典型的には、基板４は、少なくとも第１の液体１の連続するボディーと接触する領域（典型的には、第１の液体１の連続するボディーの下にある）では、パターン化されていないであろう（機械的にも化学的にも）。ある実施形態では、第１の液体１の連続するボディーは、基板４の実質的に平面である部分および第２の液体２とだけ直接接触している。
【００３０】
図２〜図５に描かれているように、後に続くステップでは、第２の液体２は、第１の液体１を通過し、かつ、基板４の選択された領域５において基板４と接触することが強いられる。第２の液体２は、したがって、第１の液体１を変位させ、第１の液体１の代わりに、選択された領域５において基板４に接触する。第２の液体２を基板４の選択された領域５において基板４と接触させることの効果は、第１の液体１の連続するボディーを、第２の液体によって互いから分離された複数のサブボディーへと分割することである。表面張力が、第２の液体２によって互いから分離された第１の液体１の複数のサブボディーを安定的に保持する。
【００３１】
当該方法は、第１の液体１のサブボディーが、サブボディーの幾何学的形状を定めるためにいかなる機械的または化学的構造体も事前に作成されることを伴わず、基板４の上で柔軟に形成されることを可能にする。
【００３２】
第１の液体１、第２の液体２および基板４の具体的な組成は、特に限定されない。しかしながら、第１の液体１および第２の液体２は、基板４を当該方法が効率良く機能する程十分に濡らし得ることが望ましい。ある実施形態では、第１の液体１、第２の液体２およ
び基板４は、空気中における基板４の上の第１の液体１の小滴の平衡（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）接触角および空気中における基板４の上の第２の液体２の小滴の平衡接触角が、両方とも９０度より小さくなるように選択される。ある実施形態では、第１の液体１は水溶液を有する。この場合、基板４は、親水性であるとして説明され得る。ある実施形態では、第２の液体２は、ＦＣ４０（下記でさらに詳細に説明される）のようなフッ化炭素を有する。この場合、基板４は、親フルオロ性であるとして説明され得る。第１の液体１が水溶液であり、かつ、第２の液体２がフッ化炭素である場合、基板４は、したがって、親水性および親フルオロ性の両方であるものとして説明され得る。
【００３３】
ある実施形態では、第２の液体２に第１の液体１を通過させることは、基板４の選択された領域５の上で第１の液体１を通して分離部材６の遠位先端部を移動させることによって実行される。遠位先端部は第１の液体１を変位させ、かつ、第２の液体２が、先程は第１の液体１によって占められていた体積へと移動することを可能にする。第２の液体２は、そのことによって第１の液体１を通過することを強いられる。ある実施形態では、この工程は、分離部材６の遠位先端部の少なくとも一部を、第１の液体１との接触に関するよりも第２の液体２との接触に関して低い表面エネルギー密度を有するように構成することによって促進される。この手段では、第２の液体にとって、移動している遠位先端部の後ろの領域へと流れて、そのことによって効率良く第１の液体を変位させることがエネルギー的にいっそう好ましい。好ましくは、基板４はまた、第２の液体２にとって、基板４を濡らし、そのことによって基板４の選択された領域５において基板４と接触したままであり、かつ、分離したサブボディーにおいて第１の液体１を安定的に保持することがエネルギー的に好ましいように構成されている。
【００３４】
図２〜図５は、このタイプの実施形態を示している。図２および図３は、第１の液体１と接触している（典型的には、第１の液体１の下にある）基板４の平面と平行である水平方向への、第１の液体１を通した分離部材６の遠位先端部の移動を描いている。図２では、移動は頁の中へと向かう。図３では、移動は下方向である。ある実施形態では、遠位先端部は、遠位先端部が第１の液体１を通して動かされている間、基板４との接触を維持する。遠位先端部は、したがって、紙の上の鉛筆のように、基板４の表面に沿って引きずられ、または引っ張られてもよい。本発明者らは、このアプローチが第１の液体１の異なるサブボディーの間のきれいな分割を達成することを見出した。その他の実施形態では、遠位先端部と基板４との間の小間隔が、分割工程中の第１の液体を通した遠位先端部の移動の少なくとも一部の間、維持され得る。かかる実施形態では、遠位先端部において第１の液体以外の液体（例えば、第２の液体２）の小球体が保持され、第１の液体１が基板４の選択された領域５から離れるように信頼性高く変位することを確実にし得る。完了した時、図２および図３の工程は、図１の第１の液体１の連続するボディーが２つのサブボディーへと分割されることをもたらすであろう。該工程は繰り返され、かつ／または、多数の分離部材を用いて平行して実行されて、所望の数およびサイズの個別のサブボディー７（図５に概略的に示されている）を作成し得る。図４は、図２および図３のステップにおいて作成されたサブボディーのうちの１つの、さらなる２つのサブボディーへの分割を概略的に示している。図５は、図２および図３のステップにおいて形成されたその他のサブボディーについて図４のステップを繰り返すことの結果を描いている。該工程を直交方向に繰り返すことによって、１６個の正方形のサブボディー７が提供され得ることが明らかである。実際、数１００個または数１０００個のサブボディー７が、この方式で提供され得る。本発明者らは、例えば、該アプローチが日常的に用いられて、１００ミクロンより小さいピッチを有するサブボディーの正方形アレイを取得し得ることを示した。これは、標準的なマイクロウェルプレート製造技術を用いて可能となるよりも相当小さい。
【００３５】
ある実施形態では、形成されるサブボディー７の相対体積を制御するように、分割工程のシーケンスが選択される。ある実施形態では、図２〜図６に描かれているように、第２
の液体２に第１の液体１を通過させることは、下記のステップを順番に有する：第１の液体１の連続するボディーを、等しい体積の２つのサブボディーへと対称的に分割するステップ；および、先行する分割ステップによって形成された各サブボディーを、等しい体積の２つのさらなるサブボディーへと対称的に繰り返し分割するステップ。対称的な分割は、分割されるボディーまたはサブボディーの鏡面対称中心線に沿った分割を有していてもよい。図６は、例示的なシーケンスを描いている。ローマ数字は、基板４の選択された領域５の上での第１の液体１を通した分離部材６の遠位先端部の直線軌道のシーケンスの順番を描いている（この場合、直線）。軌道（ｉ）〜軌道（ｉｖ）は、まず、第１の液体１の正方形である初期の連続するボディーを隔離する。後に続く軌道（ｖ）〜軌道（ｘ）は、その後次第に、連続するボディーおよびそれから形成されるサブボディーを、１６個のサブボディーのアレイが提供されるまで、等しい体積へと対称的に分割する。各段階における対称的な分割は、各サブボディーが同一の体積を有することを確実にする（したがって、Ａ１＝Ｂ１＝．．．＝Ｃ４＝Ｄ４）。任意の数のアレイが作成されてもよい。
【００３６】
図７は、次第に増大する体積のサブボディーを制御可能に提供するための代替的な分割スキームを描いている。この場合、先の場合と同様、第１の液体１の正方形である初期の連続するボディーを隔離するために、軌道（ｉ）〜軌道（ｉｖ）が提供される。後に続く軌道（ｖ）〜軌道（ｘ）は、その後、左下の隅から右上の隅まで徐々にスキャンし、それぞれの場合において、連続するボディーまたはそれから形成されるサブボディーを非対称的に切断する（最後の２回の切断を除いて）。この工程の結果は、第１の液体が右上の方向に徐々に押され、右上の方向にサブボディーの相対体積の漸進的増加（すなわち、それらの深さの漸進的増加）をもたらすというものである。このことは、切断線に沿った第１の液体１の湾曲した縁部（均一でない深さ）の形成に起因する、切断線から離れるような第１の液体の正味の移動に起因して起こる。したがって、各切断について、切断によって形成された２つのサブボディーのうちの大きい方への液体の正味の移動が存在するであろう。
【００３７】
ある実施形態では、各サブボディー７と基板４との間の接触領域が、サブボディーの足跡の輪郭を有するサブボディーの足跡を有する。サブボディーの足跡の輪郭のうちの少なくとも部分集合が、それぞれ少なくとも１つの直線部分を有する。このことは、例えば、図２〜図７を参照して上記したもののような直線的な切断を用いてサブボディーを形成することによって達成され得る。この方式で形成されたサブボディー７のアレイは、したがって、基板の表面上への小滴の配置を伴う代替的な技術（小さい滴は湾曲した輪郭を有する）とは本質的に異なる。したがって、いっそう高レベルの空間充填が可能とされる。ある実施形態では、サブボディーの足跡の輪郭のうちの少なくとも部分集合が、互いに対してぴったりとついている。例えば、サブボディーの足跡は、正方形、長方形または平行四辺形を有していてもよい。これら四辺を持つ形状はすべて、図２〜図７を参照して上記したもののような直線的な切断を実行することによって効率良く形成され得る。
【００３８】
ある実施形態では、第２の液体２は、第１の液体１より高密度である。本発明者らは、第１の液体１より上にある第２の液体２によって第１の液体１に対して課される浮力にも関わらず、第１の液体１が、驚くべきことに、第１の液体１と基板４との間の表面張力効果に起因して基板４と安定的に接触したままであることを見出した。いっそう高密度である第２の液体２の使用を可能にすることは、それが第２の液体２について可能である組成の範囲を広げるため有利である。例えば、第１の液体１が水溶液である場合、ＦＣ４０のようなフッ化炭素が用いられ得、該フッ化炭素は十分に高い浸透性を提供し、第２の液体２の層を通したサブボディー７における細胞と周囲大気との間の生命の維持に必要なガスの交換を可能にする。ＦＣ４０は、小滴ベースのマイクロ流体学において広範に用いられる、密度が１．８５５５ｇ／ｍｌである、透明であり完全にフッ化している液体である。第１の液体１より高密度の第２の液体２を用いることはまた、それが、第１の液体が基板
４全体に横方向に広がることを伴わず、各サブボディー７において安定的に保持され得る第１の液体１の最大深さを増大させるので有利である。これはなぜなら、第１の液体１の重量が、サブボディー７を下向き（したがって外向き）に押し進める傾向にあり、かつ、この効果が浮力によって打ち消されるからである。
【００３９】
上記した実施形態では、マイクロ流体配置は、基板４の上面に形成されている。その他の実施形態では、図８に描かれているように、マイクロ流体配置は、基板４の下面に形成され得る。第１の液体１の連続するボディーの分割は、したがって、図２の配置に対して逆さまになった基板４を用いて実行され得る。この場合、表面張力が、第１の液体１を基板４との接触状態で保持し得る。基板と第１の液体１は、その後、第２の液体２を含有する浴槽４２に浸漬され得、一方で、第１の液体１の連続するボディーは、分離部材６を用いてサブボディーへと分割される。図２〜図５を参照して上記した後に続くステップは、図８の配置から始まって実行され得る。このアプローチは、マイクロ流体配置が例えば３Ｄ細胞培養スフェロイドの形成に用いられる場合に便宜であるかも知れない。
【００４０】
ある実施形態では、第１の液体１の連続するボディーは、主に表面張力によって横方向に拘束されている。例えば、第１の液体１の連続するボディーは、横壁までずっと延びるのではなく、基板４の上にある選択された領域５においてのみ提供されてもよい（例えば、基板４が、図１に描かれているように、横壁を有するレセプタクルの底面である場合）。連続するボディーは、したがって、横壁によって横方向に拘束されていない。この配置は、第２の液体２が第１の液体１より高密度である場合に、特に望ましい。なぜなら、それが、第２の液体２から第１の液体１に対してかけられる下向きの力に起因する第１の液体１の連続するボディーの厚さの均一性への妨害に対する大きい抵抗を提供するからである。本発明者らは、第１の液体１が主に表面張力によって横方向に拘束されている時には、そうでない時よりも第１の液体１の深さが結果的に高くなり得ることを見出した。第１の液体１の増大した深さを提供することは、それが、基板上のサブボディーの所定の空間密度について、いっそう大きいサブボディーの体積を可能にするので望ましい。例えば、サブボディーが細胞を培養するのに用いられる時、細胞は、したがって、いっそう多い量の必要とされる材料を備えており、さらなる対応がとられることが必要となる前に、細胞がいっそう長く、かつ／または、いっそう均一な条件下で生き残ることを可能にしてもよい。
【００４１】
その他の実施形態では、図９に概略的に描かれているように、第１の液体の連続するボディーは、基板４を提供するレセプタクルの横壁へと延びることが可能とされてもよい。この手段においては、レセプタクルの底を充填する第１の液体１の比較的深い層を提供し、その後で第１の液体１を除去して（例えば、ピペットで移して）、第１の液体１の薄いフィルムを残すことによって、第１の液体１の薄いフィルムが便宜に形成されてもよい。図９の配置は、第１の液体１の連続するボディーが横壁へと延びていることを除いて、図２のものに対応する。図２〜図５を参照して上記した後に続くステップは、図９の配置から始まって実行され得る。
【００４２】
ある実施形態では、第１の液体１の連続するボディーは、第１の液体１の連続するボディーをサブボディーへと分割する初期のステップにおいて、複数の細長い小片４０へと分割される。ある実施形態では、細長い小片４０は互いに平行である。図１０には、かかる配置の例が描かれている。該配置は、例えば、一連の平行な水平方向の軌道に沿って分離部材６を移動させて、第２の液体２と接触すべき選択された領域５を定めることによって形成され得る。後に続くステップでは、１つ以上の細長い小片４０の１つ以上の局所化された領域（例えば、外側端）に物質が添加される。該物質は、それぞれの細長い小片４０に沿って移動し（例えば、拡散および／または移流によって）、そのことによって、細長い小片４０に沿う濃度勾配を作り出す。後に続くステップでは、細長い小片は、複数のサ
ブボディーへと分割され、そのことによって、サブボディーであってその中に異なる濃度の選択された物質を有する前記サブボディーのセットを素早く、かつ容易に作成する。図１０の具体的な例では、細長い小片４０の複数のサブボディーへの分割は、図１０において実線の矢印で印の付けられた軌道に沿って分離部材６を移動させることによって実行される。
【００４３】
ある実施形態では、第１の液体１の連続するボディーをサブボディーへと分割することによって、いっそう複雑な形状が形成され得る。１つの例では、図１１に描かれているように、第１の液体１の連続するボディーは、少なくとも１つのサブボディーが少なくとも１つのリザーバー３２，３４に接続された少なくとも１つの流路３６を有して形成されるように分割される。流路３６とリザーバー３２，３４とは、用時に、液体がリザーバー３２，３４へと、またはリザーバー３２，３４から流路３６を通って駆動され得るように構成されていてもよい。流路３６は、典型的には、基板４に対して直角に見た時には細長い形態を有しているであろう。リザーバー３２，３４は、典型的には、円形であるか、流路３６の幅より大きい横寸法を少なくとも有しているであろう。示されている具体的な例では、シンクリザーバー３４に２つのソースリザーバー３２および３４を接続する、Ｔ形の流路３６が提供されている。用時には、ソースリザーバー３２からシンクリザーバー３４へと、例えば、ラプラス圧力、静液圧および／またはリザーバー３２への材料のポンピングによって、流れが生じる。
【００４４】
本開示の実施形態では、第１の液体１の連続するボディーは、基板４の上で遠位先端部を移動させて第１の液体の連続するボディーの形状を定めながら、遠位先端部から第１の液体１を排出することによって、基板４の上に第１の液体１を配置することによって形成される。このアプローチは、例えば、主に表面張力によって（壁によってではなく）横方向に拘束された第１の液体１の連続するボディーを形成する時に用いられてもよい。図１２〜図１５は、２つの考え得る実装を描いている。
【００４５】
図１２および図１３に描かれているように、１つの実施形態では、第１の液体１の連続するボディーは、基板の上で分離部材６を移動させて第１の液体１の連続するボディーの形状を定めながら、分離部材６の遠位先端部を通して第１の液体１を排出することによって提供される。したがって、後で連続するボディーをサブボディーへと分割するのに用いられる同一の部材（分離部材６）がまた、最初に連続するボディーを形成するのに用いられる。図１２には、この目的のために構成された分離部材６が描かれている。分離部材６は、内部ルーメンを有する。第１の液体１は、リザーバー（図示せず）から分離部材６の内部ルーメンを通して分離部材６の遠位先端部から外に出て基板４の上へとポンピングされ得る。遠位先端部は基板４の上で動かされて、第１の液体１が基板４の上で最終的に位置決めされる場所を定める。図１２は、頁の平面における左から右へのかかる移動を概略的に描いている。表面張力が、第１の液体１が基板４全体に横方向に広がることを制限する。第１の液体１の連続するボディーは、したがって、多種多様の形状およびサイズで形成され得る。図１３は、図１２に描かれている工程を用いて形成された連続するボディーを分割するための分離部材６の後に続く使用を描いている。示されている具体的な例では、分割は、第１の液体１を通して頁の平面の中へと分離部材を移動させることによって実行されている（図２にあるように）。この２重の使用の場合、分離部材６が第１の液体１の連続するボディーを第１の液体１のサブボディーへと分割するのに用いられている間、第１の液体１のいずれかが分離部材６の遠位先端部の近くに存在することを回避することが好ましい。第１の液体１のいずれかが遠位先端部の近くに存在すれば、分割工程は妥協され得、そのことによって、信頼性を減少させる。ある実施形態では、図１３に描かれているように、このリスクは、連続するボディーをサブボディーへと分割するのに分離部材６を用いる前に、第２の液体２の一部を分離部材６の遠位先端部の中へと吸い込むことによって低減または回避される。第２の液体２は、先行する処理ステップから分離部材６の
内部ルーメンに残っているかも知れない第１の液体１のいずれかを上方向に変位させる。第２の液体２は、分離部材６の遠位先端部を用いて第２の液体２に第１の液体１を通過させる間、分離部材６の遠位先端部に保持されていてもよい。
【００４６】
図１４〜図１５に描かれているように、代替的な実施形態では、第１の液体１の連続するボディーは、注入部材１８（分離部材６から分離している）を基板４の上で移動させて第１の液体１の連続するボディーの形状を定める一方で、注入部材１８の遠位先端部を通して第１の液体１を排出することによって提供される。したがって、まず連続するボディーを形成し、後に連続するボディーをサブボディーへと分割するのに、異なる部材（注入部材１８および分離部材６）が用いられる。この場合、注入部材１８の遠位先端部は、必ずしも、表面であって、それについての表面エネルギー密度が第１の液体との接触に関してよりも第２の液体との接触に関して低い前記表面を提供する必要がない。実際、いくつかの実施形態では、注入部材１８は、注入部材１８の遠位先端部の少なくとも一部が、第２の液体との接触に関してよりも第１の液体との接触に関して低い表面エネルギー密度を有するように構成されている。このことは、注入部材１８が、注入部材１８によるいかなる第１の液体の注入もさらに伴わず、先行して形成された第１の液体１の連続するボディーまたはサブボディーの形状を修正するのに用いられることを可能にするので便宜である。注入部材１８は、第１の液体１と接触させられ、その後で基板の上を引きずられて（例えば、基板４より上の短い距離が保持されながら）、サブボディーの連続するボディーを所定の方向に延ばし得る。注入部材１８は、例えば、先行して互いから分離された２つのサブボディーを一緒に接続するのに用いられてもよい。注入部材１８は、流路の部分を一緒に接続して、用時に流路を通して液体の流れを生じさせるように構成されたマイクロ流体配置の機能を修正するのに用いられてもよい。注入部材１８は、第２の液体２の層を通して第１の液体１を注入することによって連続するボディーを形成するのに用いられ得る。このことは、第１の液体１が注入部材１８の遠位先端部を十分な程度まで濡らさなければ達成することが困難または不可能である。ある実施形態では、注入部材１８は、材料であってそれについての表面エネルギー密度が第１の液体との接触に関するよりも第２の液体との接触に関して低い前記材料のスリーブで取り囲まれている。スリーブは、遠位先端部であってそれについての表面エネルギー密度が第２の液体との接触に関するよりも第１の液体との接触に関して低い前記遠位先端部において小さい領域を残してもよい。この配置は、有利なことに、第１の液体１の小滴が、注入部材１８の上方へと戻るように流れるのではなく、遠位先端部において制御された手段で生じることを促進する。ある実施形態では、第１の液体１は水溶液を有し、第２の液体２はフッ化炭素（例えば、ＦＣ４０）を有し、分離部材６はＰＴＦＥを有し、かつ、注入部材１８はステンレス鋼を有する。ステンレス鋼は良好な剛性を提供し、第１の液体１の正確な注入を可能にする。
【００４７】
図１４〜図１５の具体的な例では、注入部材１８と分離部材６とは、同一の処理ヘッド２０（図２０を参照）の上に取り付けられており、かつ、基板４の上で同時に動かされ得る。処理ヘッド２０は、注入部材１８と分離部材６とが選択的に前進および後退し得るように構成されている。したがって、図１４に描かれているように、注入部材１８の遠位先端部からの第１の液体１の排出による初期の連続するボディーの形成中、注入部材１８は前進し得、かつ、分離部材６は後退する。このことが終了し、かつ、連続するボディーをサブボディーへと分割することが所望される時は、注入部材１８は後退し得、かつ、分離部材６は前進する。分離部材６の遠位先端部は、その後、図１５（図１３および図２にあるように、分離部材６の遠位先端部の移動が頁の中に向かっている）に描かれているように、第１の液体１を通して動かされて、第１の液体１の連続するボディーをサブボディーへと分割し得る。
【００４８】
ある実施形態では、図１６に概略的に描かれているように、当該方法は、部材（例えば、上記の注入部材１８または分離部材６）の遠位先端部から第１の液体１を排出し、かつ
、部材を基板４の上で移動させて第１の液体１の連続するボディーのそれぞれの形状を定めることによって、同一の基板４の上の異なる位置において形成された第１の液体の複数の連続するボディーに適用される。第１の液体１の連続するボディーはそれぞれ、表面張力によって所定の位置に保持されている。このアプローチは、第１の液体１の多数の初期の連続するボディーが互いに対して異なる組成を有して形成されることを可能にする。異なる連続するボディーは、第１の液体１が部材から排出されるので、第１の液体１における意図的な相違に起因して異なる組成を有していてもよく、かつ、異なる物質が異なる連続するボディーに、連続するボディーが分割されてサブボディーを作成する前に添加されてもよい。この手段では、サブボディーの多数のセットが作成され得、各セットのサブボディーは同一の初期条件に曝露されるが、異なるセットのサブボディーは異なる初期条件に曝露される。例えば、生細胞のような生物学的材料が第１の液体１の初期の連続するボディーのそれぞれにおいて提供される場合、異なる薬剤が初期の連続するボディーの２つ以上に、それらがサブボディーへと分割される前に添加され得る。図１６の具体的な例では、第１の液体１の４つの連続するボディーが提供されている（実線によって描かれた大きい正方形）。４つの連続するボディーはそれぞれ、破線に沿って分割されて、サブボディーの別個のセット８Ａ〜８Ｄを４つの正方形アレイにて形成する。ある実施形態では、サブボディーの４つのセット８Ａ〜８Ｄは、生細胞を含有する同一組成の４つの連続するボディーを形成することによって提供される。その後、任意選択的には生細胞が基板４に接着することを可能にされた後で、同一組成の４つの連続するボディーのそれぞれに異なる薬剤が添加される。４つの連続するボディーは、分割されてサブボディーの４つのセット８Ａ〜８Ｄを形成し、かつ、細胞に対する異なる薬剤の効果を評価するために後で観察される。
【００４９】
ある実施形態では、製造されたマイクロ流体配置は、対象材料を研究するのに用いられる複数の隔離されたサンプルを有する。当該方法のフレームワークは、図１７に概略的に描かれている。ステップＳ１では、第１の液体１の連続するボディーは、研究されるべき材料を含有するように形成および構成される。研究されるべき材料は、第１の液体１の連続するボディー中に、連続するボディーを分割してサブボディーを提供する前に提供される。連続するボディーが、遠位先端部を基板４の上で移動させながら遠位先端部から第１の液体１を排出することによって形成される場合、研究されるべき材料は、第１の液体１が遠位先端部から排出されている間に第１の液体１の中に提供されてもよく、その後で添加されてもよい。ステップＳ２では、第２の液体が添加される。ステップＳ３では、連続するボディーが複数のサブボディーへと分割される。連続するボディーをサブボディーへと分割する工程は、複数の隔離されたサンプルを生成し、該複数の隔離されたサンプルはそれぞれ、研究されるべき材料が各サンプルに個別に添加されること（特に、多数のサブボディーが作成される場合および／またはサブボディーが非常に小さい場合、非常に時間がかかる）を必要とすることなく、研究されるべき材料の一部を含有する。 
【００５０】
ある実施形態では、研究されるべき材料は生物学的材料を有する。ある実施形態では、生物学的材料は接着性生細胞を有する。本開示の実施形態の方法は、接着性生細胞が基板４に接着することが可能にされる前に一緒に処置され、後で複数の隔離されたサンプルへと分割されることを可能にするので、この文脈で特に有利である。このことは、先行技術のアプローチを用いては不可能であり、かつ、特に多数の隔離されたサンプルの作成が所望される場合に、相当な時間を節約し、かつ、システムの複雑さを省く。
【００５１】
図１８は、接着性生細胞を取り扱うのに適用可能である方法のフレームワークを描いている。ステップＳ１１では、第１の液体１の連続するボディーは、接着性生細胞を含有するように形成および構成される。連続するボディーが、遠位先端部を基板４の上で移動させながら遠位先端部から第１の液体１を排出することによって形成される場合、接着性生細胞は、第１の液体１が遠位先端部から排出されている間に第１の液体１の中に提供され
てもよく、その後で添加されてもよい。ステップＳ１２では、接着性生細胞の少なくとも一部（任意選択的には、接着性生細胞の大部分）が、基板４に接着することが可能とされる（このことは、例えば、細胞を適切なインキュベーション条件に一晩中置いておくことによって達成されてもよい）。細胞が所望の程度で基板４に接着した時、第１の液体１（この場合、適切な増殖培地を有していてもよい）は、必要に応じて捨てられて、ステップＳ１３へと進む前に第１の液体１の薄いフィルムを残してもよい。ステップＳ１３では、接着性生細胞を含有する第１の液体１の連続するボディー（上記のように捨てられた後の薄いフィルムであってもよい）に被験物質（例えば、薬剤）が添加される。この段階で過剰な被験物質が捨てられて、第１の液体１の薄いフィルム（接着性細胞、増殖培地の残りおよび被験物質を含有する）を残してもよい。ステップＳ１４では、第２の液体２が添加される。ステップＳ１５では、第１の液体１の連続するボディーが複数のサブボディーへと分割される。連続するボディーをサブボディーへと分割する工程は、複数の隔離されたサンプルを生成し、該複数の隔離されたサンプルはそれぞれ、接着性生細胞と、細胞が接着した後で添加された被験物質とを、被験物質が各サンプルに個別に添加されることを必要とすることなく含有する。
【００５２】
図１９は、生細胞を含有する隔離されたサンプルを形成するのに適用可能であるさらなる方法のフレームワークを描いている。ステップＳ２１では、生細胞（任意選択的には、接着性生細胞）を含有するように、第１の液体１の連続するボディーが形成および構成される。ステップＳ２１は、上記のＳ１１と同一であってもよい。ステップＳ２１はまた、上記のステップＳ１２およびステップＳ１３のいずれか、または両方に対応するステップを有していてもよく、接着性生細胞が基板４に接着することが可能とされてもよく、かつ／または、接着性生細胞に被験物質（例えば、薬剤）が加えられてもよいようになっている。ステップＳ２２では、第２の液体２が添加される。ステップＳ２３では、連続するボディーが複数のサブボディーへと分割される。ステップＳ２４では、第２の液体２が除去される（例えば捨てること、または、注射することによって）。第１の液体１もまた、この段階で除去されてもよい。その後、基板４を覆うように増殖培地が添加される。本発明者らは、第１の液体１のサブボディーが第２の液体２の下に最初に形成される時にそれらを分離する分割線が、第１の液体１と第２の液体２とが除去され、かつ、増殖培地によって置換された時でさえ細胞の移動に対するバリアとして作用し続けることを見出した。理論に拘束されることを希望することなく、基板４の表面が修正され、かつ／または、第１の液体１および／もしくは第２の液体２の残渣が後に残されてこの効果を引き起こすと考えられる。結果は、便宜に、細胞集団が互いから隔離された領域において培養されることを可能にし、そのことによって、細胞の個別の集団の多数の研究が平行して効率良く実施されることを可能にする。例えば、サブボディーが最初は単一の細胞しか含有していなかった場合、結果として生じる細胞集団はすべて、同一の単一の細胞に由来する。
【００５３】
ある実施形態では、上記の方法は、単一の細胞の研究を実行するように適合する。このことは、例えば、第１の液体１の初期の連続するボディー中の生細胞の濃度を、連続するボディーを分割することによって作成された各サブボディーの平均占有率が１つの生細胞より小さくなる程十分に低くなるように提供することによって行われ得る。この手段では、サブボディーが、１つであり唯一の細胞を含有して作成されるであろう。このアプローチは、別個のウェルへの、ウェルが作成された後での細胞の個別の配置を必要とする代替的なアプローチ（例えば、マイクロウェルプレートにおける）より相当素早い。
【００５４】
図２０は、マイクロ流体配置を製造するための装置３０を描いている。示されている具体的な例では、装置３０は、図１４および図１５を参照して上記した方法を実行するように構成されているが、開示されたその他の実施形態のいずれかによる方法を実行するように修正され得る。例えば、装置３０は、第１の液体１の初期の連続するボディー１を形成することと、連続するボディーをサブボディーへと分割することとの両方に、単一の分離
部材６を用いるように修正され得る。代替的または追加的には、第１の液体１の初期の連続するボディーは、その他の装置要素を用いて、または、レセプタクルの下部を第１の液体で単純に充填することによって（すなわち、第１の液体がレセプタクルの横壁までずっと広がるようになっている）形成され得る。
【００５５】
図２０の装置３０は、注入システムを有する。注入システムは、注入部材１８を基板４の上で移動させて第１の液体１の連続するボディーの形状を定めながら、注入部材１８の遠位先端部を通して第１の液体１を排出することによって、基板４と直接接触した第１の液体１の連続するボディーを提供する。注入システムは、注入部材１８とポンピングシステム１２とを有する。用時、ポンピングシステム１２は、第１の液体１を含有するリザーバーと、第１の液体１をリザーバーから注入部材１８の内部ルーメンへと運ぶための流路と、内部ルーメンを通して注入部材１８の遠位先端部から外に出るように第１の液体をポンピングするための機構とを有する。実施形態では、注入システムはさらに、第１の液体１を制御可能に抽出するように構成されていてもよい（例えば、過剰な第１の液体を、注入部材１８を通して戻るように液体を吸い込むことにより制御可能に除去することによって）。
【００５６】
ある実施形態では、装置３０は、注入部材１８が基板４の上で動かされて第１の液体１の連続するボディーを形成する一方で、注入部材１８の遠位先端部と基板４との間の小さいが有限である間隔を維持するように構成されている。このことは、マイクロ流体配置が細胞ベースの研究（基板４の上で引きずられるべき注入部材１８が基板４と接触していれば引き起こされるかも知れない表面のひっかき、または、その他の修正によって影響を受ける）に用いられる場合に特に重要である。任意のかかる修正は、光アクセスおよび／または細胞適合性に悪影響を与え得る。ある実施形態では、このことは、取付部において注入部材１８をスライド可能に取り付けて、基板４との接触からの力が、注入部材１８が取付部内でスライドすることを引き起こすようにすることによって達成される。注入部材１８と基板４との間の接触は、取付部に対する注入部材１８のスライドを検出することによって検出される。接触が検出された時、注入部材１８は、注入部材１８が基板４の上で動かされて第１の液体１の連続するボディーを形成する（この運動中、基板４と接触することはない）前に、少しだけ（例えば、２０〜１５０ミクロン）引き戻される。遠位先端部と基板４との間の間隔を制御するためのこのアプローチは、３Ｄプリンターにおいて用いられる容量性／誘導性の方法または光ベースの感知技術のような代替物と比べて、費用効果のあるやり方で実装され得る。このアプローチはまた、導電面が提供されることを必要としない。
【００５７】
図２０の装置３０はさらに、分離システムを有する。分離システムは、遠位先端部を有する分離部材６を有する。分離システムは、用時には、基板４の選択された領域の上で第１の液体１を通して分離部材６の遠位先端部を移動させることによって、第２の液体２であって、第１の液体１と不混和性であり、かつ、第１の液体１と直接接触して提供され、かつ、第１の液体１を覆い、第１の液体１が第２の液体２および基板４とだけ直接接触するようにする前記の第２の液体２に、第１の液体１を通過させて、かつ、基板４の選択された領域５において基板４と接触させ、そのことによって、第１の液体１の連続するボディーを、第２の液体２によって互いから分離された第１の液体１の複数のサブボディーへと分割するように構成されている。第２の液体２は、第１の液体１の連続するボディーが形成される前後のいずれかに（通常は後）、上記のように提供されてもよい。ある実施形態では、装置３０は、第２の液体を適用または除去するためのアプリケーションシステムを有する（例えば、第２の液体を保持するためのリザーバーと、基板４より上に位置決め可能な出力／吸込ノズルと、出力／吸込ノズルを通してリザーバーへと基板から／リザーバーから基板へと第２の液体を制御可能にポンピングまたは吸い込むポンピング／吸込機構とを有する）。その他の実施形態では、第２の液体２は手動で加えられる。
【００５８】
図２０の装置３０はさらに、コントローラー１０を有する。コントローラー１０は、第１の液体１の連続するボディーの形成中の、基板４の上での注入部材１８の移動を制御する。コントローラー１０はさらに、第１の液体１の連続するボディーの第１の液体１の複数のサブボディーへの分割中の、基板４の上での分離部材６の移動を制御する。ある実施形態では、装置３０は、注入部材１８と分離部材６とを支持する処理ヘッド２０を有する。処理ヘッド２０は、注入部材１８と分離部材６とが選択的に前進および後退し得るように構成されている。ある実施形態では、前進および後退はコントローラー１０によって制御され、適切な作動機構が処理ヘッド２０の上に取り付けられている。処理ヘッド２０が必要とされるだけ移動することを可能にするために、ガントリーシステム１４が提供される。示されている具体的な例では、頁内の左右の移動が示されているが、移動はまた、頁の中に入る移動および頁の外に出る移動ならびに基板４に向かう移動および基板４から離れるような移動も有し得ることが把握されるであろう（処理ヘッド２０自体によって提供される注入部材１８および分離部材６の移動が、注入部材１８および／または分離部材６の必要とされる上下の変位を提供するのに十分でなければ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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