(57)【要約】本発明は、側方流動デバイスを用いて、小さい被検体を含む被検体を迅速に検出する方法、デバイスおよび組成物を提供する。サンドイッチベースのイムノアッセイを用いることによって、全血、血清または血漿サンプル中のビタミンＤを検出および定量できるそのような側方流動デバイスが、本明細書中に記載される。１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を検出および計測するための代替のデバイス、方法およびキットが、大いに必要とされている。本発明は、このニーズに応え、さらなる利点を提供する。
2019507890.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を検出するための検査デバイスであって、
（ａ）
（ｉ）生物学的サンプルを吸収し、前記生物学的サンプルをコンジュゲートパッドに運搬するように構成された、サンプル適用パッド；
（ｉｉ）１種またはそれを超えるビタミンＤ分子に特異的に結合するビタミンＤ結合剤を含む前記コンジュゲートパッド；および
（ｉｉｉ）前記ビタミンＤ結合剤を前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子と複合体化することによって生成されるエピトープに特異的に結合する検出抗体が固定化された第１の領域を含む検出ゾーン
を含むハウジングを備える、検査デバイス。
【請求項２】
前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ４、２５−ヒドロキシビタミンＤ５および１，２５−ヒドロキシビタミンＤ３からなる群より選択される、請求項１に記載の検査デバイス。
【請求項３】
前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３からなる群より選択される、請求項２に記載の検査デバイス。
【請求項４】
前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３である、請求項２に記載の検査デバイス。
【請求項５】
前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子が、２５−ヒドロキシビタミンＤ２からなる、請求項２に記載の検査デバイス。
【請求項６】
前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子が、２５−ヒドロキシビタミンＤ３からなる、請求項２に記載の検査デバイス。
【請求項７】
前記検出ゾーンが、前記ビタミンＤ結合剤が前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子に結合されているか否かを問わず前記ビタミンＤ結合剤に結合することができる第３の抗体が固定化された第２の領域をさらに含む、請求項１に記載の検査デバイス。
【請求項８】
前記ビタミンＤ結合剤が、検出試薬にコンジュゲートされている、請求項１に記載の検査デバイス。
【請求項９】
前記検出試薬が、金粒子、ラテックス粒子、炭素ナノ粒子、セレンナノ粒子、銀ナノ粒子、量子ドット、蛍光化合物、色素、酵素およびリポソームからなる群より選択される、請求項８に記載の検査デバイス。
【請求項１０】
前記検出試薬が、前記金粒子である、請求項９に記載の検査デバイス。
【請求項１１】
前記検出試薬が、前記ラテックス粒子である、請求項９に記載の検査デバイス。
【請求項１２】
前記サンプル適用パッド、前記コンジュゲートパッドおよび前記検出ゾーンが、前記生物学的サンプルが通る流路に沿って上流から下流に並んでいる、請求項１に記載の検査デバイス。
【請求項１３】
前記生物学的サンプルの粒子性の部分を前記生物学的サンプルの水性の部分と分離するように構成された濾過構成要素を前記サンプル適用パッドと前記コンジュゲートパッドとの間にさらに備える、請求項１に記載の検査デバイス。
【請求項１４】
前記検出抗体が、軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖が、配列番号１〜５および１６〜２０からなる群より選択される配列を含み；前記重鎖が、配列番号６〜１５からなる群より選択される配列を含む、前述の請求項のいずれかに記載の検査デバイス。
【請求項１５】
前記検出抗体が、前記ビタミンＤ結合剤よりも前記エピトープに対して高い結合親和性を示す、前述の請求項のいずれかに記載の検査デバイス。
【請求項１６】
前記検出抗体が、ｓｃＦｖ、ＶＨ、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２結合単位を含む、前述の請求項のいずれかに記載の検査デバイス。
【請求項１７】
前記検出抗体が、軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖が、配列番号１〜５および１６〜２０からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を共有する配列を含み、前記重鎖が、配列番号６〜１５からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含む、前述の請求項のいずれかに記載の検査デバイス。
【請求項１８】
（ａ）前述の請求項のいずれか１項に記載の前記検査デバイスの前記サンプル適用パッドに生物学的サンプルを適用する工程；
（ｂ）前記サンプル適用パッドに追跡緩衝液を適用する工程；および
（ｃ）前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を検出する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
前記サンプル中の前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を定量する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記定量する工程が、前記血液サンプルを、十分レベル、不足レベルまたは欠乏レベルの前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を有すると分類する、サンプル１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記十分レベルが、少なくとも３０ｎｇ／ｍＬである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記不足レベルが、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬかつ３０ｎｇ／ｍＬ未満である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記欠乏レベルが、１０ｎｇ／ｍＬ未満である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記定量する工程が、前記検出膜のイメージを提供するイメージングデバイス、および前記検出膜の前記イメージに基づいて前記サンプル中の前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を定量するように構成されたプログラムされたコンピュータ上のソフトウェアを使用する工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記イメージングデバイスおよび前記プログラムされたコンピュータが、単一のデバイスである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記追跡緩衝液が、ビタミンＤ結合タンパク質から前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を解離する試薬を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
前記生物学的サンプルが、全血、血清、血漿、尿、唾液、眼内液、髄液および汗からなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
結合アッセイを行うように構成された検査デバイスを用いて、生物学的サンプル中の１つまたはそれを超えるビタミンＤレベルを検出するための方法であって、
（ａ）前記生物学的サンプルを前記検査デバイスに接触させる工程；
（ｂ）前記生物学的サンプルを、（１）ビタミンＤ結合剤と（２）１種またはそれを超えるビタミンＤ分子とによって形成された複合体を含む反応混合物を利用する前記結合アッセイに供する工程；
（ｃ）前記ビタミンＤ結合剤を前記１種またはそれを超えるビタミンＤ結合分子と複合体化することによって形成されるエピトープに結合する検出剤に前記複合体をさらに曝露する工程
を含み、前記結合アッセイは、前記生物学的サンプルにおいて、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析の検出感度に匹敵する検出感度を有する、方法。
【請求項２９】
前記検出剤が、軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖が、配列番号１〜５および１６〜２０からなる群より選択される配列を含み、前記重鎖が、配列番号６〜１５からなる群より選択される配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記検出剤が、前記ビタミンＤ結合剤よりも前記複合体に対して高い結合親和性を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記検出剤が、ｓｃＦｖ、ＶＨ、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２結合単位を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出剤が、軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖が、配列番号１〜５および１６〜２０からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を共有する配列を含み、前記重鎖が、配列番号６〜１５からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記生物学的サンプルが、全血、血清、血漿、尿、唾液、眼内液、髄液および汗からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
（ａ）請求項１〜１７のいずれか１項に記載の前記検査デバイス、および
（ｂ）前記キットを使用するための書面の指示書
を含む、キット。
【請求項３５】
滅菌剤；皮膚を穿刺するデバイス；ガーゼ；追跡緩衝液；およびマイクロピペットからなる群より選択される１つまたはそれを超える構成要素をさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記滅菌剤が、アルコールワイプである、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
前記皮膚を穿刺するデバイスが、ランセット、針およびシリンジからなる群より選択される、請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
前記追跡緩衝液が、血液サンプル中のビタミンＤ結合タンパク質から１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を解離するように構成された、請求項３４に記載のキット。
【請求項３９】
シグナル強度を前記サンプル中の前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子の量に関係づけるカラーチャートをさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１６年１月２２日に出願された米国仮出願番号第６２／２８６，２９７号（代理人書類番号４９８２１−７０１．１０１）の利益を主張しており、この仮出願は、その全体が参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ビタミンＤは、カルシウムの腸管吸収の増大およびそのホメオスタシスの制御に関与するステロイドホルモン群のことをいう。ビタミンＤの一般的な２つの形態は、ビタミンＤ２およびビタミンＤ３である。ビタミンＤ３は、紫外線への曝露を通じてヒトの皮膚において天然に産生されるのに対して、ビタミンＤ２は、主に食物および栄養補助食品から得られる。ビタミンＤ２およびビタミンＤ３は、生物学的に不活性である；活性化には、ビタミンＤ２およびビタミンＤ３が肝臓に運搬される必要があり、肝臓においてヒドロキシル化によって、本明細書中で２５−ヒドロキシビタミンＤ（「２５−（ＯＨ）Ｄ」）と称される活性型に代謝され得る。ビタミンＤ結合タンパク質ＤＢＰは、すべてのビタミンＤ代謝産物に対する主要な血清運搬タンパク質である。ＤＢＰは、全２５−ＯＨＤの９５〜９９％を運搬し、１〜５％だけが、アルブミンおよびリポタンパク質によって運ばれる。ビタミンＤ欠乏は、骨粗鬆症、骨減少症、くる病、がん、自己免疫疾患、循環器疾患および感染症をはじめとした多くの疾患に関連付けられており、高い死亡リスクにも関連している。
【０００３】
残念なことに、ビタミンＤ欠乏は、世界的な健康衛生上の重大な懸念であり、世界的に蔓延している。全世界の推定１０億人が、十分なビタミンＤレベルを有していない。さらに、米国人の６４％が十分なビタミンＤを有しておらず、最適以下のビタミンＤレベルを有していると推定されている。ビタミンＤ欠乏の主な原因は、ほとんどのヒトにとって主要なビタミンＤ源である適度な日光曝露を欠いていることである。
【０００４】
２５−（ＯＨ）Ｄの血液検査を用いることによって、被験体の循環ビタミンＤ濃度を測定することができる。２５−ＯＨ（Ｄ２）および２５−ＯＨ（Ｄ３）を含む２５−（ＯＨ）Ｄの血中濃度は、ビタミンＤの状態の最良の指標であると考えられている。過去１０年間で、患者集団における２５−（ＯＨ）Ｄレベルの解析の需要が世界的に高まりを見せている。
【０００５】
ビタミンＤは、高度に親油性の性質であり、ビタミンＤ結合タンパク質ＤＢＰに高親和性で結合するので、正確に計測するのが難しい被検体である。現在の計測は、主として、専門の研究室において時間のかかる方法（例えば、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）アッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合競合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および競合タンパク質結合アッセイ（ＣＰＢＡ））を用いて行われている。
【０００６】
ビタミンＤ代謝産物を検出および定量する方法を改善する必要性がある。簡易化された迅速かつ正確なアッセイによってビタミンＤ代謝産物を検出および定量する方法、組成物およびデバイスが、本明細書中に提供される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を検出および計測するための代替のデバイス、方法およびキットが、大いに必要とされている。本発明は、このニーズに応え、さらなる利点を提供する。１つの態様において、本発明は、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を検出するための検査デバイスであって、（ａ）（ｉ）生物学的サンプルを吸収し、生物学的サンプルをコンジュゲートパッドに運搬するように構成された、サンプル適用パッド；（ｉｉ）１種またはそれを超えるビタミンＤ分子に特異的に結合するビタミンＤ結合剤を含むコンジュゲートパッド；および（ｉｉｉ）ビタミンＤ結合剤を１種またはそれを超えるビタミンＤ分子と複合体化することによって生成されるエピトープに特異的に結合する検出抗体が固定化された第１の領域を含む検出ゾーンを含むハウジングを備える、検査デバイスを提供する。
【０００８】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、２５−ヒドロキシビタミンＤ４、２５−ヒドロキシビタミンＤ５および１，２５−ヒドロキシビタミンＤ３からなる群より選択される。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３からなる群より選択される。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２および２５−ヒドロキシビタミンＤ３である。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２からなる。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子は、２５−ヒドロキシビタミンＤ３からなる。
【０００９】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、検出ゾーンは、ビタミンＤ結合剤が１種またはそれを超えるビタミンＤ分子に結合されているか否かを問わずビタミンＤ結合剤に結合することができる第３の抗体が固定化された第２の領域をさらに含む。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、ビタミンＤ結合剤は、検出試薬にコンジュゲートされている。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、検出試薬は、金粒子、ラテックス粒子、炭素ナノ粒子、セレンナノ粒子、銀ナノ粒子、量子ドット、蛍光化合物、色素、酵素およびリポソームからなる群より選択される。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、検出試薬は、金粒子である。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、検出試薬は、ラテックス粒子である。
【００１０】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、サンプル適用パッド、コンジュゲートパッドおよび検出ゾーンは、生物学的サンプルが通る流路に沿って上流から下流に並んでいる。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、検査デバイスは、生物学的サンプルの粒子性の部分を生物学的サンプルの水性の部分と分離するように構成された濾過構成要素をサンプル適用パッドとコンジュゲートパッドとの間にさらに備える。
【００１１】
１つの態様において、本発明は、本明細書に開示の検査デバイスの任意の１つのサンプル適用パッドに生物学的サンプルを適用する工程；サンプル適用パッドに追跡緩衝液を適用する工程；および１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を検出する工程を含む、方法を提供する。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、方法は、サンプル中の１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を定量する工程をさらに含む。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、定量する工程は、血液サンプルを、十分レベル、不足レベルまたは欠乏レベルの１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を有すると分類する。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、十分レベルは、少なくとも３０ｎｇ／ｍＬである。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、不足レベルは、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬかつ３０ｎｇ／ｍＬ未満である。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、欠乏レベルは、１０ｎｇ／ｍＬ未満である。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、定量する工程は、検出膜のイメージを提供するイメージングデバイス、および検出膜のイメージに基づいてサンプル中の１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を定量するように構成されたプログラムされたコンピュータ上のソフトウェアを使用する工程をさらに含む。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、イメージングデバイスおよびプログラムされたコンピュータは、単一のデバイスである。
【００１２】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、追跡緩衝液は、ビタミンＤ結合タンパク質から１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を解離する試薬を含む。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、全血、血清、血漿、尿、唾液、眼内液、髄液および汗からなる群より選択される。  
【００１３】
いくつかの実施形態において、検出抗体は、軽鎖および重鎖を含み、軽鎖は、配列番号１〜５および１６〜２０からなる群より選択される配列を含み；重鎖は、配列番号５〜１５からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、検出抗体は、ビタミンＤ結合剤よりも免疫複合体に対して高い結合親和性を示す。いくつかの実施形態において、検出抗体は、ｓｃＦｖ、ＶＨ、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２結合単位を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、検出抗体は、軽鎖および重鎖を含み、軽鎖は、配列番号１〜５および１６〜２０からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を共有する配列を含み、重鎖は、配列番号６〜１５からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含む。
【００１５】
なお別の態様において、本発明は、結合アッセイを行うように構成された検査デバイスを用いて、生物学的サンプル中の１つまたはそれを超えるビタミンＤレベルを検出するための方法であって、（ａ）生物学的サンプルを検査デバイスに接触させる工程；（ｂ）生物学的サンプルを、（１）ビタミンＤ結合剤と（２）１種またはそれを超えるビタミンＤ分子とによって形成された複合体を含む反応混合物を利用する結合アッセイに供する工程；（ｃ）ビタミンＤ結合剤を１種またはそれを超えるビタミンＤ結合分子と複合体化することによって形成されるエピトープに結合する検出剤に複合体をさらに曝露する工程を含み、結合アッセイは、生物学的サンプルにおいて、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析の検出感度に匹敵する検出感度を有する、方法を提供する。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、全血、血清、血漿、尿、唾液、眼内液、髄液および汗からなる群より選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、検出剤は、軽鎖および重鎖を含み、軽鎖は、配列番号１〜５および１６〜２０からなる群より選択される配列を含み、重鎖は、配列番号６〜１５からなる群より選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、検出剤は、ビタミンＤ結合剤よりも複合体に対して高い結合親和性を示す。いくつかの実施形態において、検出剤が、ｓｃＦｖ、ＶＨ、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２結合単位を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、検出剤は、軽鎖および重鎖を含み、軽鎖は、配列番号１〜５および１６〜２０からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を共有する配列を含み、重鎖は、配列番号６〜１５からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、全血、血清、血漿、尿、唾液、眼内液、髄液および汗からなる群より選択される。
【００１９】
１つの態様において、本発明は、本明細書に開示される検査デバイスの任意の１つ、およびキットを使用するための書面の指示書を含む、キットを提供する。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、キットは、滅菌剤；皮膚を穿刺するデバイス；ガーゼ；追跡緩衝液；およびマイクロピペットからなる群より選択される１つまたはそれを超える構成要素をさらに含む。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、滅菌剤は、アルコールワイプである。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、皮膚を穿刺するデバイスは、ランセット、針およびシリンジからなる群より選択される。
【００２０】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、追跡緩衝液は、血液サンプル中のビタミンＤ結合タンパク質から１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を解離するように構成されている。本明細書で提供されるいくつかの実施形態において、キットは、シグナル強度をサンプル中の１種またはそれを超えるビタミンＤ分子の量に関係づけるカラーチャートをさらに含む。
参照による援用
【００２１】
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が明確かつ個別に参照により援用されると示されたかのように同程  度に参照により本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本発明の新規の特徴は、添付の請求項に詳細に示される。本発明の特徴および利点のより良い理解は、本発明の原理を利用した例証的な実施形態を示している以下の詳細な説明および添付の図面を参照することにより得られる。
【００２３】
【図１ＡＢ】図１Ａ〜Ｂは、ビタミンＤ代謝産物レベルを検出するための例示的な側方流動デバイスを提供している。図１Ａは、被験体におけるビタミンＤ代謝産物のレベルに関するバンド密度を示している。図１Ｂは、バンド密度を血液サンプル中のビタミン代謝産物の濃度の定量的範囲に関連づけるカラーチャートを示している。図１Ｃは、ビタミンＤを検出するための例示的な側方流動デバイスの概略図を提供している。
【図１Ｃ】図１Ａ〜Ｂは、ビタミンＤ代謝産物レベルを検出するための例示的な側方流動デバイスを提供している。図１Ａは、被験体におけるビタミンＤ代謝産物のレベルに関するバンド密度を示している。図１Ｂは、バンド密度を血液サンプル中のビタミン代謝産物の濃度の定量的範囲に関連づけるカラーチャートを示している。図１Ｃは、ビタミンＤを検出するための例示的な側方流動デバイスの概略図を提供している。
【００２４】
【図２】図２は、２５−（ＯＨ）Ｄ３：ＡＦ１０抗体の免疫複合体へのマウス抗体クローンの結合を試験した酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を図示している。
【００２５】
【図３】図３は、２５−（ＯＨ）Ｄ３：ＡＦ１０抗体の免疫複合体への合成抗体クローンの結合を試験したＥＬＩＳＡの結果を図示している。
【００２６】
【図４】図４は、血清中のビタミンＤレベルと、２５−（ＯＨ）Ｄ：ＡＦ１０抗体の免疫複合体に特異的に結合する抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡのシグナルとの線形関係を図示している。
【００２７】
【図５】図５は、例示的な側方流動デバイスを使用して被験体の血液中および血清中の２５−（ＯＨ）Ｄレベルを試験した結果を示しており、シグナル強度と１０ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌの範囲の２５−（ＯＨ）Ｄレベルとの線形相関を示している。
【００２８】
【図６】図６は、（ｉ）スマートフォンベースのリーダーによって計測される毛細管血のビタミンＤレベルを計測する例示的な側方流動デバイス、および（ｉｉ）ＥＬＩＳＡベースの血清検査およびまたは血液検査を用いて計測されたときのビタミンＤレベルの比較結果を図示している。
【００２９】
【図７】図７は、本明細書中に開示される検査デバイスの検出ゾーンのイメージを解析するために使用され得る例示的なコンピュータシステムを示している。
【００３０】
【図８】図８は、ポータブル側方流動アッセイリーダーを用いた例示的なビタミンＤ計測手順を示している。
【００３１】
【図９】図９は、側方流動アッセイおよび液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析アッセイから生成された試験結果の相関関係を示している。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
本明細書中に記載されるような本開示のシステムおよび方法は、別段示されない限り、当業者の技術の範囲内である、分子生物学（組換え手法を含む）、細胞生物学、生化学、マイクロアレイおよび配列決定技術の従来の手法および説明を使用し得る。そのような従来の手法としては、オリゴヌクレオチドのポリマーアレイ合成、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびライゲーション、オリゴヌクレオチドの配列決定、ならびに標識を用いたハイブリダイゼーションの検出が挙げられる。好適な手法の具体的な説明は、本明細書中の実施例を参照することにより、得ることができる。しかしながら、等価な従来の手順も当然のことながら使用できる。そのような従来の技術および説明は、Ｇｒｅｅｎら編、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ）（１９９９）；Ｗｅｉｎｅｒら編、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００７）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００３）；ＢｏｗｔｅｌｌおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ（２００３）；Ｍｏｕｎｔ，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（２００４）；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００６）などの標準的な研究所マニュアル；およびＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００２）（全てＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから）；Ｓｔｒｙｅｒ，  Ｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版）  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｎ．Ｙ．（１９９５）；Ｇａｉｔ，  “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ（１９８４）；ＮｅｌｓｏｎおよびＣｏｘ，  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）；およびＢｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５版、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００２）に見出すことができ、これらの全ては、その全体が全ての目的のために本明細書に参考として援用される。
【００３３】
本開示は、記載される特定のシステムおよび方法、組成物、標的および使用法に限定されず、したがって当然のことながら変化し得ることが理解されるべきである。本明細書中で使用される用語は、単に特定の態様を説明する目的であって、本開示の範囲を限定すると意図されておらず、本開示の範囲は、添付の請求項によってのみ限定されることも理解されるべきである。
【００３４】
用語「約」または「およそ」は、当業者が決定した特定の値についての許容され得る誤差範囲内を意味し、それは、その値がどのようにして計測または決定されたか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、当該分野における慣行に従って、１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、１０％まで、５％までまたは１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生体系または生物学的プロセスに関して、この用語は、ある値の１桁以内、好ましくは、５倍以内、より好ましくは、２倍以内を意味し得る。特定の値が本願および請求項に記載される場合、別段述べられない限り、その特定の値についての許容され得る誤差範囲内を意味する用語「約」が想定されるべきである。
【００３５】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用される。本明細書で使用される場合、それらは、任意の長さのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらのアナログ）の重合体型をいう。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、既知または未知の任意の機能を果たし得る。ポリヌクレオチドの非限定的な例は、遺伝子または遺伝子フラグメントのコード領域または非コード領域、遺伝子間ＤＮＡ、連鎖解析から導かれる遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、アダプターおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド（例えば、メチル化されたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログ）を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識成分とのコンジュゲーションなどによって、さらに修飾され得る。
【００３６】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいうために本明細書中で交換可能に使用される。そのポリマーは、直鎖状であっても分枝状であってもよく、これは修飾されたアミノ酸を含んでもよく、これは非アミノ酸によって中断されてもよい。これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または他の任意の操作（例えば、標識成分とのコンジュゲーション）。本明細書中で使用されるとき、用語「アミノ酸」には、天然および／もしくは非天然のアミノ酸または合成アミノ酸（グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体の両方、ならびにアミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含む）が含まれる。
【００３７】
「コントロール」は、実験において比較目的で使用される代替の被験体またはサンプルである。
【００３８】
用語「被験体」、「個体」および「患者」は、脊椎動物、好ましくは、哺乳動物、より好ましくは、ヒトのことをいうために本明細書中で交換可能に使用される。哺乳動物としては、ネズミ、サル、ヒト、農場動物、競技用動物およびペットが挙げられるが、これらに限定されない。インビボにおいて得られたまたはインビトロにおいて培養された生物学的実体の組織、細胞およびそれらの子孫も包含される。
【００３９】
用語「決定すること（ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ）」、「測定すること（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）」、「評価すること（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価すること（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイすること」、「検出すること」および「解析すること」は、任意の形態の測定をいうために本明細書中で交換可能に使用され得、これらの用語には、エレメントが存在するか否かを決定すること（例えば、検出）が含まれる。これらの用語には、定量的および／または定性的な決定の両方が含まれ得る。評価することは、相対的または絶対的であり得る。「〜の存在を検出すること」には、存在するものの量を決定すること、ならびに存在するか存在しないかを決定することが含まれ得る。
【００４０】
「抗体」は、特異的に結合する領域を表面上または空洞内に有する、免疫グロブリン、またはその誘導体もしくはフラグメントもしくは活性なフラグメントであり、それにより、別の分子の特定の空間的構成および極性構成と相補的であると定義される。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得、当該分野で周知の手法（例えば、宿主の免疫化および血清の収集またはハイブリッド細胞株技術）によって調製され得る。
検査デバイス
【００４１】
１つの態様において、本開示は、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を検出するための検査デバイスであって、（ａ）（ｉ）生物学的サンプルを吸収し、生物学的サンプルをコンジュゲートパッドに運搬するように構成された、サンプル適用ユニット；（ｉｉ）１種またはそれを超えるビタミンＤ分子に特異的に結合する第１の抗体を含むコンジュゲートパッド；および（ｉｉｉ）免疫複合体であって、（ａ）前記第１の抗体および（ｂ）前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を含む免疫複合体、あるいは前記第１の抗体および前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を複合体化させることによって生成されるエピトープに特異的に結合する第２の抗体が固定化された第１の領域を含む検出ゾーンを含むハウジングを備える、検査デバイスを提供する。
【００４２】
「１種またはそれを超えるビタミンＤ分子」は、カルシウム、鉄、マグネシウム、リン酸塩および亜鉛の腸管吸収の増大に関与する脂溶性のセコステロイド（ｓｅｃｏｓｔｅｒｉｏｄｓ）の群のメンバーをいう。この群の例示的なメンバーは、ビタミンＤ１、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、ビタミンＤ４およびそれらのヒドロキシル化されたバージョンである。例示的なヒドロキシル化されたビタミンＤ分子は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２（２５−ＯＨＤ２または２５−（ＯＨ）Ｄ２）および２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５−ＯＨＤ３または２５−（ＯＨ）Ｄ３）である。１種またはそれを超えるビタミンＤ分子は、１−α位にさらなるヒドロキシ基をビタミンＤ化合物（例えば、１，２５−ヒドロキシビタミンＤ３（１，２５−ＯＨＤ３または１，２５−（ＯＨ）Ｄ３））を含み得る。
【００４３】
検査デバイスは、側方流動検査デバイスであり得る。側方流動デバイスは、テストストリップが閉じ込められたハウジングを備え得る。テストストリップは、サンプル適用ユニット、コンジュゲートパッドおよび／または検出ユニットを備え得る。テストストリップは、１種またはそれを超える材料を含み得る。テストストリップが、１種より多い材料を備える場合、その１種またはそれを超える材料は、好ましくは、流体連通している。テストストリップの１つの材料は、テストストリップの別の材料上を覆い得る（例えば、ニトロセルロースの上を覆う濾紙）。あるいはまたはさらに、テストストリップは、１種またはそれを超える材料を含む領域に続いて、１種またはそれを超える異なる材料を含む領域を備え得る。この場合、これらの領域は、流体連通しており、互いに部分的に重なっていてもよいし、重なっていなくてもよい。テストストリップに適した材料としては、セルロース由来の材料（例えば、濾紙、クロマトグラフィー紙、ニトロセルロースおよび酢酸セルロース）ならびにガラス繊維、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリ塩化ビニル、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレート、セラミック材料でできている材料などが挙げられるが、これらに限定されない。テストストリップの材料は、それらの毛細管流動の特徴または適用されたサンプルの特徴を改変するために必要に応じて処理され得る。例えば、テストストリップのサンプル適用領域は、最適な試験条件を確保するために、適用された尿サンプルのｐＨまたは比重を補正する緩衝液で処理され得る。
【００４４】
テストストリップ材料は、単一の構造（例えば、ストリップに切断されるシート）であり得るか、あるいはいくつかのストリップ、または例えば薄層クロマトグラフィーに見られるような、支持体もしくは固体表面に結合された粒子性材料であり得、吸収パッドを一体部分としてまたは液体と接触してのいずれか有し得る。この材料は、レーンの形成を誘導するようにスポットすることができる、レーンを有するシートでもあり得、別個のアッセイを各レーンにおいて行うことができる。この材料は、長方形、円形、楕円形、三角形（ｔｒｉａｇｏｎａｌ）または他の形状を有し得るが、但し、毛細管移動による検査液の少なくとも１つの横断方向が存在する。楕円形または円形の片においてその中心で検査液と接触したときのように、他の横断方向も存在し得る。しかしながら、考慮すべき主要な事柄は、所定の部位への少なくとも１つの流動方向が存在するということである。以下の考察において、ストリップは、例証として説明されるのであって、限定として説明されるのではない。
【００４５】
テストストリップのための支持体は、支持体が望まれるかまたは必要である場合、一般に、水不溶性であり、非多孔性かつ剛性であることが多いが、弾性であってもよく、通常、疎水性で多孔性であり、通常、ストリップと同じ長さおよび幅であるが、それより大きくても小さくてもよい。支持体材料は、透明であり得、本発明の検査デバイスがアセンブルされたとき、透明の支持体材料がテストストリップ上に保護層を形成するように、透明の支持体材料は、ユーザーによって見られ得るテストストリップの側に存在し得、それはは、検査デバイスの前面における開口などによって外部環境に露出され得る。天然と合成の両方の多種多様の非可動性および非可動性の材料ならびにそれらの組み合わせが使用され得るが、但し、その支持体は、その材料の毛管現象を干渉しないか、またはアッセイの構成要素に非特異的に結合しないか、またはシグナル生成系を干渉しない。例証的なポリマーとしては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）、ガラス、セラミックス、金属などが挙げられる。弾性支持体は、ポリウレタン、ネオプレン、ラテックス、シリコーンゴムなどでできている場合がある。
【００４６】
検査デバイスは、サンプル適用ユニットに通じるサンプル適用開口部を備え得る。いくつかの場合において、「サンプル適用開口部」は、検査デバイスまたはテストストリップの一部をいうことがあり、その検査デバイスにおける開口は、テストストリップのサンプル適用ユニットへのアクセスを提供する。本発明の１つの実施形態において、サンプル適用開口部は、開放端のチャネルによって検査デバイスの近位端に作製されている。好ましくは、テストストリップは、サンプル適用開口部と接触したサンプルがテストストリップに適用されるように開放端のチャネルに係合している。代替の実施形態では、サンプル適用開口部は、テストストリップのサンプル適用ユニットが検査デバイスの外部と流体連通するように、検査デバイスの前面における開口によって形成されている。
【００４７】
「サンプル適用ユニット」は、サンプルが適用され得るテストストリップの一部であり得る。本発明のテストストリップのサンプル適用ゾーンは、好ましくは、本発明の検査デバイスのサンプル適用開口部に存在し、そのサンプル適用開口部と流体連通している。いくつかの場合において、サンプル適用ユニットは、生物学的流体の粒子性の部分を除去して水性成分だけを残すように構成された濾過構成要素を備える。例えば、血液細胞を濾別するための構成要素が、ＷＯ２００３０１４７２６およびＷＯ２００９０６９０１７（これらの全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている。
【００４８】
「コンジュゲートパッド」は、試薬が提供されているテストストリップの領域（試薬ゾーンと称され得る）をいう。コンジュゲートパッドは、テストストリップ上に含められた吸収性または非吸収性の材料の別個のセグメントであり得るか、または他のゾーン（例えば、被検体検出ゾーン）も含むテストストリップの吸収性または非吸収性の材料の領域であり得る。試薬ゾーンは、直接的または間接的な標識であり得る検出試薬を有し得る。好ましくは、検出試薬は、乾燥した状態では不動であるが湿った状態では可動性である形態で提供される。試薬は、特異的結合メンバー（例えば、抗体）、被検体または被検体アナログ、酵素、基質、指示薬、シグナル生成系の構成要素、テストストリップアッセイの機能に寄与する化学物質または化合物（例えば、緩衝剤、還元剤、キレート剤、界面活性剤など）であり得る。
【００４９】
いくつかの場合において、標識は、検出可能なシグナルを生成し得る、特異的結合メンバーに結合した任意の分子であり得る。本発明では、標識は、不活性であり得、検出ゾーンにおいて濃縮することによってシグナルを提供し得るか、または単独でシグナル生成系のメンバーに対する結合部位として働き得るか、または検出可能なシグナルを自発的に生成し得るか、またはシグナル生成系とともに、検出可能なシグナルを生成し得る。標識は、金粒子、ラテックス粒子、炭素ナノ粒子、セレンナノ粒子、銀ナノ粒子、量子ドット、蛍光化合物、織物染料、酵素およびリポソームからなる群より選択され得る。標識は、金粒子であり得る。標識は、ラテックス粒子であり得る。
【００５０】
「特異的結合メンバー」は、特異的に結合する領域を表面上または空洞内に有する２つの異なる分子のうちの１つであり、それにより、他方の分子の特定の空間的構成および極性構成と相補的であると定義される。特異的結合メンバーは、抗原−抗体などの免疫学的対のメンバーであり得るが、他の特異的結合対（例えば、リガンド−キャリアタンパク質、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、核酸二重鎖、ＩｇＧ−プロテインＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡなど）は、免疫学的対ではないが、この定義に含まれる。特異的結合メンバーは、結合剤であり得る。
【００５１】
結合剤は、１つまたはそれを超える分子に相補的に結合する分子であり得る。結合剤は、タンパク質、核酸、リガンド、レセプターなどであり得る。
【００５２】
結合剤である例示的なタンパク質としては、赤血球凝集素、小分子結合タンパク質、活性もしくは不活性な酵素、または断片化された抗体が挙げられ得る。赤血球凝集素は、抗体またはレクチンを含み得る。抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）の１つまたはそれを超えるクラスであり得る。例えば、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＷまたはそれらの改変されたバージョンであり得る。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体または二重特異性抗体であり得る。抗体は、様々なタイプの結合領域を含み得る。例えば、抗体は、ｓｃＦｖ、ＶＨ、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２結合領域を有し得る。抗体は、様々な修飾を含み得る。例えば、抗体は、１つまたはそれを超える検出試薬によって修飾され得る。抗体は、別の結合剤、オリゴヌクレオチドまたはタンパク質にコンジュゲートされ得る。
【００５３】
結合剤は、様々な組み合わせのタンパク質サブユニットを組み込んでいる融合タンパク質であり得る。そのタンパク質サブユニットの組み合わせは、天然に存在しないことがあるか、または天然に存在し得る。非限定的な例として、融合タンパク質は、抗体の態様（例えば、Ｆｃ領域）および１つまたはそれを超えるレセプタードメインを組み込み得る。融合タンパク質は、２つまたはそれを超えるサブユニットを含み得る。例えば、融合タンパク質は、二量体、三量体、四量体または五量体であり得る。
【００５４】
本発明の１つの態様において、１つまたはそれを超える結合剤は、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を検出するために使用され得る。ある実施形態において、ビタミンＤ結合剤は、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子に特異的に結合する。ビタミンＤ結合剤は、特異的結合メンバーであり得る。ビタミンＤ結合剤は、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子に結合することができる特異的結合メンバーであり得る。ビタミンＤ結合剤は、本明細書中で称される第１の抗体であり得る。
【００５５】
検出剤が使用され得、検出剤は、ビタミンＤ結合剤と１種またはそれを超えるビタミンＤ分子との複合体に結合し得る。検出剤は、ビタミンＤ結合剤または第１の抗体と複合体化された１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を検出するために使用され得る。検出剤は、ビタミンＤ結合剤とビタミンＤ分子との第１の複合体に特異的に結合する検出抗体であり得る。検出剤は、本明細書中で称される第２の抗体または検出抗体であり得る。
【００５６】
ビタミンＤ結合剤が１種またはそれを超えるビタミンＤ分子に結合しているか否かを問わずビタミンＤ結合剤に結合することができる第３の結合剤が使用され得る。
【００５７】
結合剤は、表１に列挙されるアミノ酸配列（配列番号１〜２０）のいずれかまたはそれらの組み合わせを含み得る。
【００５８】
いくつかの実施形態において、コンジュゲートパッドは、検出試薬を含み、その検出試薬は、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子に特異的に結合する第１の抗体である。ビタミンＤ抗体は、当該分野で公知である。例示的なビタミンＤ抗体であるＡＦ１０は、実施例１に記載されているように作製された。１種またはそれを超えるビタミンＤ分子に結合することができる他の抗体は、当該分野で公知であり、例えば、ＵＳ２０１３００５９８２５（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている抗体である。
【００５９】
「検出ゾーン」は、上に記載されたような色素が、位置のシフト、出現、色の変化または必要に応じて消失として観察され得るテストストリップの領域である。検出ゾーンの検出または観察は、検出可能な標識の選択に応じて任意の簡便な手段によって行われ得る。例えば、検出または観察は、視覚的に、蛍光的に、反射率によって、エックス線撮影で、または当業者に公知の他の任意の手段によって、行われ得る。
【００６０】
検出ゾーンは、（ａ）１種またはそれを超えるビタミンＤ分子に特異的に結合する第１の抗体（例えば、ＡＦ１０）および（ｂ）１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を含む免疫複合体に特異的に結合する検出剤または第２の抗体が固定化された第１の領域を含み得る。いくつかの場合において、検出剤または第２の抗体は、ビタミンＤ結合剤または第１の抗体と１種またはそれを超えるビタミンＤ分子との複合体が形成されたとき生成されるエピトープに結合する。例えば、第２の抗体は、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子と第１の抗体との間の接合部に結合し得る。いくつかの場合において、ビタミンＤ結合剤または第１の抗体と１種またはそれを超えるビタミンＤ分子との結合は、検出剤または第２の抗体によって認識されるエピトープをビタミンＤ結合剤上または第１の抗体上に形成させ得る。いくつかの場合において、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子が結合した際に形成されるエピトープは、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子の結合部位ではなく、第１の抗体の別の部位におけるエピトープである。いくつかの場合において、第２の抗体は、第１の抗体に結合したとき、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を認識し得る。検出ゾーンの第１の領域は、被検体の存在を示す検出可能なシグナルを提供し得る。検出ゾーンの第１の領域は、被検体（「特異的結合メンバー」）に特異的な固定化された結合試薬、および／または被検体と反応する酵素を含み得る。被検体の検出を可能にし得るかまたは増大し得る他の物質（例えば、基質、緩衝液、塩）も、検出ゾーンに提供され得る。シグナル生成系の１つまたはそれを超えるメンバーは、検出ゾーンに直接または間接的に結合され得る。検出ゾーンは、必要に応じて、その検査が適切に行われたという示唆を提供する１つまたはそれを超えるコントロールゾーンを含む第２の領域を含み得る。
【００６１】
いくつかの場合において、検出ゾーンは、第２の領域をさらに含み得る。この領域は、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子に結合されているか否かを問わず第１の抗体に結合する特異的結合メンバーが固定化されたコントロール領域であり得る。例えば、その特異的結合メンバーは、第１の抗体の定常領域に結合し得る第３の抗体であり得る。第３の抗体は、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子が結合されているか否かを問わず変化しない第１の抗体上のエピトープに結合し得る。いくつかの場合において、第２の領域は、コントロール領域であり得、そこに固定化された特異的結合メンバーは、プロテインＡであり得る。いくつかの場合において、コンジュゲートパッドは、第１の抗体とは異なる種に由来するさらなる抗体を含み、そのさらなる抗体は、第１の抗体、ビタミンＤまたはビタミンＤ結合タンパク質に結合しない。いくつかの場合において、第２の領域は、コントロール領域であり、第３の抗体は、さらなる抗体を認識するが、第１の抗体または第２の抗体を認識しない。例えば、第１の抗体および第２の抗体が、それぞれマウスおよびラットに由来する場合、さらなる抗体は、ニワトリに由来し得、第３の抗体は、ヤギ抗ニワトリ抗体、ラット抗ニワトリ抗体などであり得る。
【００６２】
第２の領域に出現するシグナルは、第１の抗体が検出され得ることおよびテストストリップが適切に機能していることを示唆するために使用され得る。第２の領域は、検出可能な標識が位置のシフト、出現、色の変化または必要に応じて消失として観察され得るテストストリップの領域であり得る。第２の領域の検出または観察は、色素の特定の選択に応じて、任意の簡便な手段によって行われ得、それらの手段としては、特に、例えば、視覚的に、蛍光的に、反射率によって、エックス線撮影で、側方流動リーダーによってなどであるがこれらに限定されない。
【００６３】
生物学的サンプルは、被検体の存在または量について試験される任意の材料である。好ましくは、生物学的サンプルは、流体サンプル、好ましくは、液体サンプルである。本発明の検査デバイスを用いて試験され得る液体サンプルの例としては、血液、血清、血漿、唾液、尿、眼内液、精液、汗および髄液を含む体液が挙げられる。生物学的サンプルは、血液または血漿であり得る。粘稠性液体、半固体または固体の検体を用いて、サンプルになり得る液体の溶液、溶出液、懸濁液または抽出物が生成され得る。例えば、咽頭または生殖器スワブが、液体溶液に懸濁されて、サンプルが生成され得る。
【００６４】
例示的な側方流動アッセイは、図１Ｃに提供されている。例示的な側方流動アッセイは、前記生物学的サンプルが通る流路に沿って上流から下流に並んでいる、サンプル適用パッド、コンジュゲートパッドおよび前記検出ゾーンを備える。サンプルが、サンプル適用パッドまたはサンプルパッドに適用され得る。サンプルの適用の後、追跡緩衝液が適用され得る。血液サンプルから、ビタミンＤ（例えば、２５−（ＯＨ）Ｄ）が、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子に特異的に結合する第１の抗体（Ｍａｂ−１）を含むコンジュゲートパッドに流動して、免疫複合体を生成し得る。第１の抗体は、コロイド金などの検出試薬にコンジュゲートされている場合がある。免疫複合体化した抗体および複合体化していない抗体が、検出ゾーンに流動し得る。検出ゾーンは、コントロールラインおよび検査ラインを含み得る。検査ラインは、Ｍａｂ−１と１つまたはそれを超える２５−（ＯＨ）Ｄ分子とが複合体化することによって生成されるエピトープに特異的に結合する第２の抗体（Ｍａｂ−２）を含み得る。免疫複合体化したＭａｂ−１および複合体化していないＭａｂ−１は、Ｍａｂ−１が１種またはそれを超えるビタミンＤ分子に結合されているか否かを問わずＭａｂ−１に結合することができる第３の抗体（抗ＩｇＧ抗体）を含むコントロールラインに側方流動し得る。複合体化していないＭａｂ−１抗体および／または免疫複合体化したＭａｂ−１抗体が、コントロールラインにおいて検出され得る。Ｍａｂ−２に結合した免疫複合体化したＭａｂ−１抗体は、検査ラインにおいて検出され得る。検査ラインにおける検出レベルは、ビタミンＤのレベルを示し得る。
方法
【００６５】
１つの態様において、本開示は、本明細書中に開示される検査デバイスを用いて１種またはそれを超えるビタミンＤ分子のレベルを検出することができる方法を提供する。方法は、本明細書に開示の検査デバイスのサンプル適用ユニットに生物学的サンプルを適用する工程；サンプル適用ユニットに追跡緩衝液を適用する工程；および１種またはそれを超えるビタミンＤ分子のレベルを検出する工程を含み得る。そのような検出は、検査デバイスの第２の領域に出現するシグナルを可視化することによって（例えば、特異的結合剤による検出ゾーンにおける標識された第１の抗体の濃縮によって）行われ得る。
【００６６】
いくつかの場合において、方法は、サンプル中の１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を定量する工程をさらに含む。定量は、検出ゾーンの第１の領域におけるシグナル強度と生物学的サンプル中に存在する被検体の量との関係性を判定することによって行われ得る。シグナル強度と生物学的サンプル中に存在する被検体の量との関係性は、既知量の１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を含む標準の適用によって、各バッチまたは各テストストリップに対して判定され得ることが認識されるだろう。
【００６７】
いくつかの場合において、定量は、生物学的サンプル中に十分レベル、不足レベルまたは欠乏レベルの１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を有すると被験体を分類することなどによる、半定量的であり得る。十分レベルのビタミンＤは、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも３５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｎｇ／ｍＬまたは少なくとも５０ｎｇ／ｍＬであり得る。不足レベルのビタミンＤは、少なくとも５ｎｇ／ｍＬかつ最大で４５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬかつ最大で４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬかつ最大で３５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬかつ最大で３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬかつ最大で２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬかつ最大で２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬかつ最大で１５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも５ｎｇ／ｍＬかつ最大で１０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬかつ最大で４５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬかつ最大で４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬかつ最大で３５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬかつ最大で３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬかつ最大で２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬかつ最大で２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｎｇ／ｍＬかつ最大で１５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｎｇ／ｍＬかつ最大で４５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｎｇ／ｍＬかつ最大で４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｎｇ／ｍＬかつ最大で３５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｎｇ／ｍＬかつ最大で３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｎｇ／ｍＬかつ最大で２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｎｇ／ｍＬかつ最大で２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬかつ最大で４５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬかつ最大で４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬかつ最大で３５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬかつ最大で３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬかつ最大で２５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬかつ最大で４５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬかつ最大で４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬかつ最大で３５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬかつ最大で３０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｎｇ／ｍＬかつ最大で４５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｎｇ／ｍＬかつ最大で４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも３０ｎｇ／ｍＬかつ最大で３５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも３５ｎｇ／ｍＬかつ最大で４５ｎｇ／ｍＬ、少なくとも３５ｎｇ／ｍＬかつ最大で４０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも４０ｎｇ／ｍＬかつ最大で４５ｎｇ／ｍＬであり得る。欠乏レベルのビタミンＤは、最大で１０ｎｇ／ｍＬ、最大で１５ｎｇ／ｍＬ、最大で２０ｎｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｎｇ／ｍＬ、最大で３０ｎｇ／ｍＬ、最大で３５ｎｇ／ｍＬ、最大で４０ｎｇ／ｍＬまたは最大で５０ｎｇ／ｍＬあり得る。例えば、被験体は、３０ｎｇ／ｍＬ超の１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を有し得、十分レベルの１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を有すると分類され得る。例えば、被験体は、１０〜３０ｎｇ／ｍＬの１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を有し得、不足レベルの１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を有すると分類され得る。例えば、被験体は、１０ｎｇ／ｍＬ未満の１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を有し得、欠乏レベルの１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を有すると分類され得る。
【００６８】
いくつかの場合において、定量する工程は、検出ゾーンのイメージを生成するイメージングデバイス、およびその検出ゾーンのイメージに基づいて生物学的サンプル中の１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を定量するように設定されたプログラムされたコンピュータ上のソフトウェアを使用する工程をさらに含んだ。そのイメージは、シグナル強度について解析され得る。いくつかの場合において、シグナル強度は、変数（例えば、光強度、光質およびイメージングデバイス間の変動）についてイメージを正規化するために、コントロール領域のシグナル強度と比較される。
【００６９】
図７は、本開示の方法を実行するようにプログラムされているかまたはその他の方法で設定されているコンピュータシステム７０１を示している。コンピュータシステム７０１は、本明細書中に提供される方法を実行するのに不可欠であり得、本明細書中に提供される方法は、コンピュータシステム７０１の非存在下において別の方法で実行するのは極めて困難であり得る。コンピュータシステム７０１は、本開示の方法（例えば、検出ゾーンのイメージに基づいて生物学的サンプル中の１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を定量する方法）の様々な態様を制御し得る。コンピュータシステム７０１は、ユーザーの電子デバイス、またはその電子デバイスに対して遠く離れて位置するコンピュータシステムであり得る。その電子デバイスは、携帯型電子デバイスであり得る。代替として、コンピュータシステム７０１は、コンピュータサーバーであり得る。
【００７０】
コンピュータシステム７０１は、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサーまたは並列処理のための複数のプロセッサーであり得る中央処理装置（ＣＰＵ、本明細書中では「プロセッサー」および「コンピュータプロセッサー」でもある）７０５を備える。コンピュータシステム７０１は、メモリーまたはメモリーロケーション７１０（例えば、ランダムアクセスメモリー、読み出し専用メモリー、フラッシュメモリー）、電子記憶装置７１５（例えば、ハードディスク）、１つまたはそれを超える他のシステムと通信するための通信用インターフェース７２０（例えば、ネットワークアダプター）、および周辺機器７２５（例えば、キャッシュ、他のメモリー、データストレージおよび／または電子ディスプレーアダプター）も備える。メモリー７１０、記憶装置７１５、インターフェース７２０および周辺機器７２５は、マザーボードなどのコミュニケーションバス（実線）を介してＣＰＵ７０５と通信している。記憶装置７１５は、データを格納するためのデータ記憶装置（またはデータリポジトリ）であり得る。コンピュータシステム７０１は、通信用インターフェース７２０を活用してコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）７３０に作動可能に連結され得る。ネットワーク７３０は、インターネット（Ｉｎｔｅｒｎｅｔ）、インターネット（ｉｎｔｅｒｎｅｔ）および／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信しているイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであり得る。ネットワーク７３０は、いくつかの場合において、テレコミュニケーションおよび／またはデータネットワークである。ネットワーク７３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にし得る１つまたはそれを超えるコンピュータサーバーを含み得る。ネットワーク７３０は、いくつかの場合において、コンピュータシステム７０１を活用して、コンピュータシステム７０１に連結されたデバイスがクライアントまたはサーバーとして振る舞うことを可能にし得るピアツーピアネットワークを実装し得る。
【００７１】
ＣＰＵ７０５は、プログラムまたはソフトウェアにおいて具体化され得る、一連の機械可読命令を実行し得る。それらの命令は、メモリー７１０などのメモリーロケーションに格納され得る。それらの命令は、ＣＰＵ７０５に向けられ得、続いて、本開示の方法を実行するようにＣＰＵ７０５をプログラムできるかまたはその他の方法で設定できる。ＣＰＵ７０５によって実行されるオペレーションの例としては、フェッチ、デコード、実行および書き戻しが挙げられ得る。
【００７２】
ＣＰＵ７０５は、集積回路などの回路の一部であり得る。システム７０１の１つまたはそれを超える他の構成要素は、その回路に含まれ得る。いくつかの場合において、その回路は、アプリケーション向け集積回路（ＡＳＩＣ）である。
【００７３】
記憶装置７１５は、ファイル（例えば、ドライバー、ライブラリーおよび保存されたプログラム）を格納し得る。記憶装置７１５は、ユーザーデータ、例えば、ユーザー選択およびユーザープログラムを格納し得る。コンピュータシステム７０１は、いくつかの場合において、コンピュータシステム７０１に対して外付けである（例えば、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステム７０１と通信しているリモートサーバー上に存在する）１つまたはそれを超えるさらなるデータ記憶装置を備え得る。
【００７４】
コンピュータシステム７０１は、ネットワーク７３０を介して１つまたはそれを超えるリモートコンピュータシステムと通信し得る。例えば、コンピュータシステム７０１は、ユーザー（例えば、患者、医療提供者またはサービス提供者）のリモートコンピュータシステムと通信し得る。リモートコンピュータシステムの例としては、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレートＰＣまたはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ  Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、Ａｎｄｒｏｉｄ対応デバイス、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））または携帯情報端末が挙げられる。ユーザーは、ネットワーク７３０を介してコンピュータシステム７０１にアクセスできる。
【００７５】
本明細書中に記載されるような方法は、コンピュータシステム７０１の電子記憶ロケーション（例えば、メモリー７１０または電子記憶装置７１５）に格納された、機械（例えば、コンピュータプロセッサー）が実行可能なコードを経て実行され得る。メモリー７１０は、データベースの一部であり得る。機械が実行可能なコードまたは機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供され得る。使用において、そのコードは、プロセッサー７０５によって実行され得る。いくつかの場合において、そのコードは、記憶装置７１５から検索され得、プロセッサー７０５によってすぐにアクセスできるようにメモリー７１０に格納され得る。いくつかの状況において、電子記憶装置７１５は除外され得、機械が実行可能な命令がメモリー７１０に格納される。
【００７６】
上記コードは、そのコードを実行するように適合されたプロセッサーを有する機械とともに使用するようにプリコンパイルおよび設定され得るか、または実行時にコンパイルされ得る。そのコードは、そのコードがプリコンパイルされた形式またはコンパイルされたままの形式で実行するのを可能にするように選択され得るプログラミング言語で供給され得る。
【００７７】
本明細書中に提供されるシステムおよび方法の態様（例えば、コンピュータシステム７０１）は、プログラミングにおいて具体化され得る。この技術の様々な態様は、代表的には、機械可読媒体の１タイプにおいて保持されるかまたは具体化される、機械（またはプロセッサー）が実行可能なコードおよび／または関連するデータの形態の「製品」または「製造品」として考えられ得る。機械が実行可能なコードは、メモリー（例えば、読み出し専用メモリー、ランダムアクセスメモリー、フラッシュメモリー）またはハードディスクなどの電子記憶装置に格納され得る。「ストレージ」タイプの媒体は、コンピュータの有形のメモリー、プロセッサーなど、またはソフトウェアプログラミングのために非一時的なストレージをいつでも提供し得るそれらの関連するモジュール（例えば、様々な半導体メモリー、テープドライブ、ディスクドライブなど）のいずれかまたはすべてを含み得る。そのソフトウェアの全部または一部は、時々、インターネットまたは他の様々なテレコミュニケーションネットワークを介して通信され得る。そのような通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサーから別のコンピュータまたはプロセッサーに、例えば、管理サーバーまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームに、ソフトウェアのローディングを可能にし得る。したがって、ソフトウェアエレメントを有し得る別のタイプの媒体としては、例えば、有線の光学的な陸線ネットワークを介しておよび様々なエアリンクを通じて、ローカルデバイス間の物理インターフェースを越えて使用される、光波、電波および電磁波が挙げられる。そのような波を運ぶ物理的エレメント（例えば、有線または無線リンク、光リンクなど）も、ソフトウェアを有する媒体として見なされ得る。本明細書中で使用されるとき、コンピュータ「可読媒体」または機械「可読媒体」などの用語は、非一時的な有形の「記憶」媒体に限定されない限り、実行のためにプロセッサーに命令を提供する際に関与する任意の媒体をいう。
【００７８】
したがって、機械可読媒体、例えば、コンピュータで実行可能なコードは、有形の記録媒体、搬送波媒体または物理的な伝送媒体を含むがこれらに限定されない多くの形態をとり得る。不揮発性記憶媒体としては、例えば、光学ディスクまたは磁気ディスク（例えば、任意のコンピュータ（複数可）などにおける任意の記憶デバイス）が挙げられ、例えば、図面に示されるデータベースなどを実行するために使用され得る。揮発性記憶媒体としては、ダイナミックメモリー（例えば、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリー）が挙げられる。有形の伝送媒体としては、同軸ケーブル；銅線および光ファイバー（コンピュータシステム内のバスを含むワイヤーを含む）が挙げられる。搬送波伝送媒体は、電気信号もしくは電磁信号または音波もしくは光波の形態（例えば、無線周波（ＲＦ）および赤外（ＩＲ）データ通信において生成されるもの）をとり得る。ゆえに、コンピュータ可読媒体の一般的な形態としては、例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他の任意の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤまたはＤＶＤ−ＲＯＭ、他の任意の光学媒体、パンチカード  紙テープ、穴のパターンを有する他の任意の物理的記録媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭおよびＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、他の任意のメモリーチップまたはカートリッジ、データもしくは命令を搬送する搬送波、そのような搬送波を搬送するケーブルもしくはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／もしくはデータを読むことができる他の任意の媒体が挙げられる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くが、実行するために、プロセッサーへの１つまたはそれより多い順序の１つまたはそれより多い命令を保持することに関わり得る。
【００７９】
コンピュータシステム７０１は、例えば遺伝情報（例えば、単一個体または個体群における、疾患を引き起こす対立遺伝子の同定）を提供するためのユーザーインターフェース（ＵＩ）７４０を備える電子ディスプレー７３５を備え得るかまたはそれと通信し得る。ＵＩの例としては、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）およびウェブベースのユーザーインターフェース（またはウェブインターフェース）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８０】
追跡緩衝液は、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を検出するために使用され得る。追跡緩衝液は、ビタミンＤ結合タンパク質および／またはアルブミンから１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を解離する試薬を含むように構成され得る。１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を解離する試薬の非限定的な例は、酸性溶液、アルカリ性溶液、８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（ｎａｐｔｈａｌｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、３−（アセトニルベンジル）−４−ヒドロキシクマリン、アルキルアミノフルオロ界面活性剤、ペルフルオロヘキサン酸、ペルフルオロオクタン酸、プロテイナーゼＫ、尿素および塩酸グアニジンである。例えば、追跡緩衝液は、ＷＯ２００４０６３７０４（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されているような、酸性溶液またはアルカリ性溶液であり得る。別では、追跡緩衝液は、米国特許第７，４８２，１６２号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されているような８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸および／または３−（アセトニルベンジル）−４−ヒドロキシクマリンを用いて、内在性の結合タンパク質からビタミンＤを競合的に置換することに依存し得る。
【００８１】
追跡緩衝液は、例えば、３．８〜４．８のｐＨを有し、５〜３０％ＤＭＳＯ、液体の有機アミド、および必要に応じて０．５〜５％の短鎖アルコールを含む試薬（例えば、ＷＯ２００７０３９１９４（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されているもの）であり得る。追跡緩衝液は、安定化剤、およびアルキルアミノフルオロ界面活性剤を含む、ＷＯ２００８０３９２６６（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されているような捕捉リガンドを含み得る。
キット
【００８２】
１つの態様において、本開示は、１種またはそれを超えるビタミンＤ分子のレベルを検出することができるキットを提供し、そのキットは、本明細書中に開示される検査デバイスおよびそのキットを使用するための書面の指示書を含む。いくつかの実施形態において、キットは、滅菌剤；皮膚を穿刺するデバイス；ガーゼ；追跡緩衝液；およびマイクロピペットからなる群より選択される１つまたはそれを超える構成要素をさらに含み得る。
【００８３】
滅菌剤は、例えば、ヒトの皮膚を消毒することができるアルコールワイプであり得る。
【００８４】
皮膚を穿刺するためのデバイスは、少量の血液を得るために被験体の皮膚を穿通することができる小さい鋭利な物体であり得る。皮膚を穿刺するためのデバイスは、ランセット、針およびシリンジからなる群より選択され得る。ランセットは、例えば、バネで動き得る。
【００８５】
追跡緩衝液は、先に記載されたような、ビタミンＤ結合タンパク質から１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を解離するための試薬を含み得る。
【００８６】
マイクロピペットは、既知体積の生物学的サンプルをデバイスに提供し得る。
【００８７】
キットは、シグナル強度をサンプル中の前記１種またはそれを超えるビタミンＤ分子の量に関係づけるカラーチャートをさらに含み得る。バッチごとにばらつきが生じる可能性があるので、カラーチャートは、既知量の１種またはそれを超えるビタミンＤ分子を含む標準を流し、生物学的サンプル中の種々の範囲の量の１種またはそれを超えるビタミンＤ分子に対応する色を判定することによって、検査デバイスの各バッチに対して経験的に生成され得る。
【実施例】
【００８８】
実施例１：２５−（ＯＨ）Ｄに対するモノクローナル抗体の作製
【００８９】
２５−（ＯＨ）Ｄに対するモノクローナル抗体を、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６，４９５）の変法によって調製した。３位においてキャリアタンパク質ＫＨＬにコンジュゲートされた２５−（ＯＨ）Ｄの皮下注射によってマウスを免疫した。フロイント完全アジュバントを抗原とともに注射した。フロイント不完全アジュバントを抗原の追加免疫のために使用した。２５−（ＯＨ）Ｄ３に対する免疫応答をＥＬＩＳＡによってモニターした。４〜５回の抗原の追加免疫の後、脾臓細胞を回収し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下においてミエローマ細胞と融合した。融合した細胞を９６ウェルプレートに播種し、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）選択培地の存在下において生育した。融合細胞からの上清を、ＥＬＩＳＡによって２５−（ＯＨ）Ｄ３および２５−（ＯＨ）Ｄ２への結合活性について試験した。２５−（ＯＨ）Ｄ３と２５−（ＯＨ）Ｄ２の両方に対する結合について高親和性を有するクローンＡＦ１０を、大規模な抗体産生および精製に向けて選択した。
【００９０】
実施例２：２５−（ＯＨ）Ｄと免疫されたマウス由来のｍＡｂとの免疫複合体に対するモノクローナル抗体の作製
【００９１】
２６位においてキャリアタンパク質キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートされた２５−（ＯＨ）Ｄの皮下注射によってマウスを免疫した。フロイント完全アジュバントを抗原とともに注射した。ＫＬＨコンジュゲートおよびフロイント不完全アジュバントを１回目および３回目の追加免疫に使用し、２５−（ＯＨ）Ｄ：抗体ＡＦ１０の免疫複合体を２回目および４回目の追加免疫に使用した。２５−（ＯＨ）Ｄ：抗体ＡＦ１０の免疫複合体に対する免疫応答をＥＬＩＳＡアッセイによってモニターした。４回の追加免疫の後、脾臓細胞を回収した。次いで、脾臓細胞からＲＮＡを単離し、可変遺伝子の増幅を行った。
【００９２】
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ｍＲＮＡ精製キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造者のプロトコルに従って使用することによって、ｍＲＮＡを単離した。続いて、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、第１鎖（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡを作製した。そのｃＤＮＡから、Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に従って記載されているように、マウスＶＨ、ＶＫおよびＶλに対するプライマーセットを使用するＰＣＲによって重鎖可変遺伝子および軽鎖可変遺伝子を別々に増幅した。（ＧＳ３）４リンカーの部分配列を３’ＶＨおよび５’ＶＬに付加するために、重鎖可変領域遺伝子および軽鎖可変領域遺伝子をＰＣＲによってさらに増幅した。一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のアセンブリのために、３回目のＰＣＲ反応において、２回目に増幅された等量のＶＨおよびＶＬ  ＤＮＡを混合した。最終的なｓｃＦｖ  ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製カラム（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて精製した。精製されたｓｃＦｖ  ＤＮＡおよびＰＣＡＮＴＡＢ５ベクターＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＮｏｔｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｌａｂ）で消化し、次いで、１％アガロースゲルによってサイズ選択した。ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて、切り出したバンドを精製した。消化されたｓｃＦｖ、ベクターＤＮＡおよびＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｌａｂ）を、１６℃における一晩のライゲーションのために混合した。２０μｇのライゲートしたＤＮＡを精製し、エレクトロポレーションによって大腸菌ＴＧ１のコンピテントセルに形質転換した。形質転換の後、ＴＧ１細胞をＳＯＣ培地に懸濁し、３７℃および２５０ｒｐｍの振盪で１時間インキュベートした。ＴＧ１細胞を、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび２％グルコースを含む２ＹＴ−寒天プレートにプレーティングした。３０℃で一晩インキュベーションした後、ＴＧ１形質転換体を、１５％グリセロール、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび２％グルコースを含む２ＹＴに回収し、そのライブラリーアリコートを貯蔵のために−８０℃で維持した。この手順によって、１．２×１０９コロニーというライブラリーサイズがもたらされた。
【００９３】
ファージディスプレイライブラリーを以下のとおり調製した。２００ｍＬの２ＹＴ培地（１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび２％グルコースを含む）に、開始時のＯＤが０．１のライブラリーＴＧ１細胞を接種した。３７℃、２５０ｒｐｍの振盪での３〜４時間のインキュベーションの後、ＫＯ７ヘルパーファージを１：１０比の細胞対ファージで添加し、培養物を振盪せずに３７℃で１時間インキュベートした。ＴＧ１細胞を遠心分離し、細胞ペレットを、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび３５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２Ｌの２ＹＴに再懸濁した後、３０℃、２５０ｒｐｍの振盪で一晩インキュベーションした。次いで、ＴＧ１細胞を４℃、６０００×ｇで３０分間遠心分離した。ライブラリーファージ粒子を培養上清からのＰＥＧ沈殿によって精製し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、ＯＤ２６８の計測によって滴定した。そのファージディスプレイ抗体ライブラリーを、２０％グリセロールを含むＰＢＳ中において−８０℃で貯蔵した。
【００９４】
免疫複合体特異的抗体を、以下の選択手順によって上記のマウスｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーから選択した。マイクロタイターウェルを１μｇのｍＡｂ  ＡＦ１０で４℃において一晩コーティングした。１×ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で２時間ブロッキングした後、１μｇの２５−（ＯＨ）Ｄ３を４℃での一晩のインキュベーションのために各ウェルに添加した。そのウェルをＰＢＳで３回洗浄し、１×ｃｈｅｍｉｂｌｏｃｋｅｒで１時間、室温においてブロッキングした。２５−（ＯＨ）Ｄ：抗体ＡＦ１０の免疫複合体に対する親和性選択を行う前に、４００μｌのファージライブラリー溶液（合計１，０１２個のファージ粒子）を、ビタミンＤを含まず抗体ＡＦ１０を含むウェルにおいて２時間、室温でプレインキュベートし、その後、未結合のファージを、室温での２時間のインキュベーションのために、２５−（ＯＨ）Ｄ：抗体ＡＦ１０の免疫複合体を含む４つのウェルに移した。未結合のファージを除去し、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１０回洗浄した。結合したファージを１００μｌの１００ｍＭ  ＨＣｌで１０分間溶出し、溶出したファージを回収し、１０％１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで中和した。次いで、溶出したファージを、３７℃での１時間のインキュベーションのために、１０ｍＬの新鮮ＴＧ１細胞（ＯＤ６００約０．８）に添加した。感染したＴＧ１細胞を、一晩生育するために、カルベニシリンおよびグルコースを含む２枚の２ＹＴプレートにプレーティングし、一晩経過した細胞を、上に記載されたような１回目のファージ調製のために回収した。記載されたばかりのこれらの２回目のファージに対して親和性選択手順を行った。合計３回の親和性選択を行った。
【００９５】
ｓｃＦｖ−ｐ３融合物の発現および結合活性の確認のために、３回目の親和性選択からの感染したＴＧ１コロニーを拾った。簡潔には、単離されたＴＧコロニーを、１００μｌの２ＹＴ／カルベニシリンおよびグルコースを含む９６ウェルプレートに拾い（５枚のプレートおよび合計４８０個のコロニー）、３０℃で一晩インキュベートした。２日目に、１ウェルあたり１０μｌの培養物を、１ウェルあたり５００μｌの、カルベニシリンおよび０．１％グルコースを含む２ＹＴ培地を含む、９６ウェル深プレートにおける対応するウェルに移した。その深ウェルプレートを、培養物が０．８〜１のＯＤ６００に達するまで、３７℃の振盪恒温器において２５０ｒｐｍで振盪してインキュベートした。次いで、６ｍＭ  ＩＰＴＧを含む１００μｌの２ＹＴを各ウェルに添加し、発現プレートを、２５０ｒｐｍで振盪して３０℃で一晩インキュベートした。次いで、２．５ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１６０μＬの溶解緩衝液を発現プレートの各ウェルに添加し、培養物を室温において１時間振盪した。培養上清を、１ウェルあたり１４０μｌの２×ＣｈｅｍｉＢｌｏｃｋｅｒと混合し、２５０ｒｐｍで振盪しつつ、さらに３０分間インキュベートした。培養上清を遠心分離し、下記のような結合アッセイのために調製した。
【００９６】
２５−（ＯＨ）Ｄ：抗体ＡＦ１０の免疫複合体に結合することができるクローンについてスクリーニングするために、各発現プレートに対して２枚の９６ウェルアッセイプレートを準備し、１枚のプレートは、ＡＦ１０抗体のみでコーティングし、他方は、２５−（ＯＨ）Ｄ：抗体ＡＦ１０の免疫複合体でコーティングした。これらのアッセイプレートを、室温において２時間、１×ＣｈｅｍｉＢｌｏｃｋｅｒでブロッキングした。発現プレートからの培養上清を、アッセイプレートの対応するウェルに移した。室温における１時間のインキュベーションおよびＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎによる３回の洗浄の後、１００μＬのマウス抗Ｍ１３  ｐ３抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｌａｂ）を、室温における１時間のインキュベーションのために各ウェルに添加した。サンプルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、１００μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧを、１時間のインキュベーションのために各ウェルに添加した。サンプルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、１００μＬの基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を各ウェルに添加した。１０〜３０分の発色の後にＯＤ６３０を計測した。２５−（ＯＨ）Ｄ：抗体ＡＦ１０の免疫複合体に結合したがＡＦ１０抗体のみには結合しなかったクローンを、確認のために選択した。陽性の培養上清を１：３の比で段階希釈し、上記の手順に従って再度アッセイした。図２は、２５−（ＯＨ）Ｄ３：抗体ＡＦ１０の免疫複合体に対する結合活性を有する６つのクローンを示している。重鎖可変領域（配列番号６〜１５）および軽鎖可変領域（配列番号１〜５および１６〜２０）のユニークな配列を表１に列挙する。
【００９７】
軽鎖は、配列番号１〜５および１６〜２０からなる群より選択される配列を含み得る。重鎖は、配列番号６〜１５からなる群より選択される配列を含み得る。いくつかの場合において、軽鎖は、配列番号１〜５および１６〜２０からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含み得る。いくつかの場合において、重鎖は、配列番号６〜１５からなる群より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列相同性を有する配列を含み得る。
【００９８】
抗体は、以下のアミノ酸配列：配列番号６の重鎖および配列番号１の軽鎖、配列番号６の重鎖および配列番号２の軽鎖、配列番号６の重鎖および配列番号３の軽鎖、配列番号６の重鎖および配列番号４の軽鎖、配列番号６の重鎖および配列番号５の軽鎖、配列番号６の重鎖および配列番号１６の軽鎖、配列番号６の重鎖および配列番号１７の軽鎖、配列番号６の重鎖および配列番号１８の軽鎖、配列番号６の重鎖および配列番号１９の軽鎖、配列番号６の重鎖および配列番号２０の軽鎖、のいずれかを有する軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含み得る。
【００９９】
抗体は、以下のアミノ酸配列：配列番号７の重鎖および配列番号１の軽鎖、配列番号７の重鎖および配列番号２の軽鎖、配列番号７の重鎖および配列番号３の軽鎖、配列番号７の重鎖および配列番号４の軽鎖、配列番号７の重鎖および配列番号５の軽鎖、配列番号７の重鎖および配列番号１６の軽鎖、配列番号７の重鎖および配列番号１７の軽鎖、配列番号７の重鎖および配列番号１８の軽鎖、配列番号７の重鎖および配列番号１９の軽鎖、配列番号７の重鎖および配列番号２０の軽鎖、のいずれかを有する軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含み得る。
【０１００】
抗体は、以下のアミノ酸配列：配列番号８の重鎖および配列番号１の軽鎖、配列番号８の重鎖および配列番号２の軽鎖、配列番号８の重鎖および配列番号３の軽鎖、配列番号８の重鎖および配列番号４の軽鎖、配列番号８の重鎖および配列番号５の軽鎖、配列番号８の重鎖および配列番号１６の軽鎖、配列番号８の重鎖および配列番号１７の軽鎖、配列番号８の重鎖および配列番号１８の軽鎖、配列番号８の重鎖および配列番号１９の軽鎖、配列番号８の重鎖および配列番号２０の軽鎖、のいずれかを有する軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含み得る。
【０１０１】
抗体は、以下のアミノ酸配列：配列番号９の重鎖および配列番号１の軽鎖、配列番号９の重鎖および配列番号２の軽鎖、配列番号９の重鎖および配列番号３の軽鎖、配列番号９の重鎖および配列番号４の軽鎖、配列番号９の重鎖および配列番号５の軽鎖、配列番号９の重鎖および配列番号１６の軽鎖、配列番号９の重鎖および配列番号１７の軽鎖、配列番号９の重鎖および配列番号１８の軽鎖、配列番号９の重鎖および配列番号１９の軽鎖、配列番号９の重鎖および配列番号２０の軽鎖、のいずれかを有する軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含み得る。
【０１０２】
抗体は、以下のアミノ酸配列：配列番号１０の重鎖および配列番号１の軽鎖、配列番号１０の重鎖および配列番号２の軽鎖、配列番号１０の重鎖および配列番号３の軽鎖、配列番号１０の重鎖および配列番号４の軽鎖、配列番号１０の重鎖および配列番号５の軽鎖、配列番号１０の重鎖および配列番号１６の軽鎖、配列番号１０の重鎖および配列番号１７の軽鎖、配列番号１０の重鎖および配列番号１８の軽鎖、配列番号１０の重鎖および配列番号１９の軽鎖、配列番号１０の重鎖および配列番号２０の軽鎖、のいずれかを有する軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含み得る。
【０１０３】
抗体は、以下のアミノ酸配列：配列番号１１の重鎖および配列番号１の軽鎖、配列番号１１の重鎖および配列番号２の軽鎖、配列番号１１の重鎖および配列番号３の軽鎖、配列番号１１の重鎖および配列番号４の軽鎖、配列番号１１の重鎖および配列番号５の軽鎖、配列番号１１の重鎖および配列番号１６の軽鎖、配列番号１１の重鎖および配列番号１７の軽鎖、配列番号１１の重鎖および配列番号１８の軽鎖、配列番号１１の重鎖および配列番号１９の軽鎖、配列番号１１の重鎖および配列番号２０の軽鎖、のいずれかを有する軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含み得る。
【０１０４】
抗体は、以下のアミノ酸配列：配列番号１２の重鎖および配列番号１の軽鎖、配列番号１２の重鎖および配列番号２の軽鎖、配列番号１２の重鎖および配列番号３の軽鎖、配列番号１２の重鎖および配列番号４の軽鎖、配列番号１２の重鎖および配列番号５の軽鎖、配列番号１２の重鎖および配列番号１６の軽鎖、配列番号１２の重鎖および配列番号１７の軽鎖、配列番号１２の重鎖および配列番号１８の軽鎖、配列番号１２の重鎖および配列番号１９の軽鎖、配列番号１２の重鎖および配列番号２０の軽鎖、のいずれかを有する軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含み得る。
【０１０５】
抗体は、以下のアミノ酸配列：配列番号１３の重鎖および配列番号１の軽鎖、配列番号１３の重鎖および配列番号２の軽鎖、配列番号１３の重鎖および配列番号３の軽鎖、配列番号１３の重鎖および配列番号４の軽鎖、配列番号１３の重鎖および配列番号５の軽鎖、配列番号１３の重鎖および配列番号１６の軽鎖、配列番号１３の重鎖および配列番号１７の軽鎖、配列番号１３の重鎖および配列番号１８の軽鎖、配列番号１３の重鎖および配列番号１９の軽鎖、配列番号１３の重鎖および配列番号２０の軽鎖、のいずれかを有する軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含み得る。
【０１０６】
抗体は、以下のアミノ酸配列：配列番号１４の重鎖および配列番号１の軽鎖、配列番号１４の重鎖および配列番号２の軽鎖、配列番号１４の重鎖および配列番号３の軽鎖、配列番号１４の重鎖および配列番号４の軽鎖、配列番号１４の重鎖および配列番号５の軽鎖、配列番号１４の重鎖および配列番号１６の軽鎖、配列番号１４の重鎖および配列番号１７の軽鎖、配列番号１４の重鎖および配列番号１８の軽鎖、配列番号１４の重鎖および配列番号１９の軽鎖、配列番号１４の重鎖および配列番号２０の軽鎖、のいずれかを有する軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含み得る。
【０１０７】
抗体は、以下のアミノ酸配列：配列番号１５の重鎖および配列番号１の軽鎖、配列番号１５の重鎖および配列番号２の軽鎖、配列番号１５の重鎖および配列番号３の軽鎖、配列番号１５の重鎖および配列番号４の軽鎖、配列番号１５の重鎖および配列番号５の軽鎖、配列番号１５の重鎖および配列番号１６の軽鎖、配列番号１５の重鎖および配列番号１７の軽鎖、配列番号１５の重鎖および配列番号１８の軽鎖、配列番号１５の重鎖および配列番号１９の軽鎖、配列番号１５の重鎖および配列番号２０の軽鎖、のいずれかを有する軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲを含み得る。
【表１−１】
2019507890.tif 000003
【表１−２】
2019507890.tif 000004
【０１０８】
実施例３：合成ライブラリーからの２５−（ＯＨ）Ｄ：ｍＡＢの免疫複合体に対するモノクローナル抗体の作製
【０１０９】
合成抗体ライブラリーを、天然のＶＨ／ＶＬ対形成頻度（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｐｐ．１−７，２０１２  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｐｒｏｔｅｉｎ／ｇｚｓ０４３に記載されている）に基づいてデザインし、頻繁に対形成されたヒトＶＨ１、ＶＨ３、ＶＫ１、ＶＫ３、Ｖλ１、Ｖλ２およびＶλ３のフレームワークを遺伝子合成のためのマスター遺伝子として選択した。選択されたマスター遺伝子を、重複するオリゴのＰＣＲアセンブリによって合成した。オリゴの長さは、６０〜８０塩基であり、すべてのＣＤＲに対するオリゴが、アミノ酸残基をランダム化するためにヌクレオチドＮＮＳおよび／またはＭＶＳを用いた縮重オリゴであった。１回目のＰＣＲアセンブリの後、５つの軽鎖マスター遺伝子を、ＰＣＲによって軽鎖定常領域とアセンブルした。得られた完全長軽鎖遺伝子を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩＩおよびＮｃｏＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｌａｂ）で消化し、１％アガロースゲルにおいてサイズ選択した。サイズ選択されたフラグメントをＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットで精製および抽出した。消化された軽鎖遺伝子、ｐＡＸＤ２０ベクターＤＮＡおよびＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｌａｂ）を混合し、ライゲーションを１６℃において一晩進めた。各軽鎖遺伝子構築物に対して、２０μｇのライゲートされたＤＮＡを精製し、エレクトロポレーションによって大腸菌ＴＯＰ１０のコンピテントセルに形質転換した。次いで、形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび２％グルコースを含む１００枚の２ＹＴ−寒天プレートにおいて生育した。３０℃での一晩のインキュベーションの後、ライブラリー形質転換体を回収し、１５％グリセロールを含む２ＹＴに懸濁した。そのストックの半分を、ライブラリーアリコートとして−８０℃で貯蔵し、残りをＱｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキットによって処理した。得られたライブラリーのサイズを表２に列挙する。重鎖クローニングの次の工程のために、ＡＦＫ１およびＡＦｋ３のＤＮＡを組み合わせ、ＡＦＬ１、ＡＦＬ２およびＡＦＬ３も組み合わせた。
【表２】
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【０１１０】
ＰＣＲによってアセンブルされたＶＨ１およびＶＨ３マスター遺伝子を、さらにＰＣＲによってＣＨ１定常領域とアセンブルし、得られたＦｄ遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩおよびＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂ）で消化し、１％アガロースゲルによってサイズ選択した。サイズ選択されたフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットで精製および抽出した。消化されたＦｄ遺伝子、軽鎖ライブラリーＤＮＡおよびＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｌａｂ）を混合し、ライゲーションを１６℃において一晩進めた。各Ｆｄ鎖遺伝子ライブラリーに対して、４０μｇのライゲートされたＤＮＡを精製し、エレクトロポレーションによって大腸菌ＴＧ１のコンピテントセルに形質転換した。次いで、形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび２％グルコースを含む４００枚の２ＹＴ−寒天プレートにおいて生育した。３０℃での一晩のインキュベーションの後、ライブラリー形質転換体を回収し、１５％グリセロールを含む２ＹＴに懸濁した。ライブラリーアリコートを調製し、−８０℃で貯蔵した。得られたライブラリーサイズを表３に列挙する。
【表３】
2019507890.tif 000006
【０１１１】
ファージディスプレイライブラリーを以下のとおり調製した。５００の２ＹＴ（１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび２％グルコースを含む）培養物に、開始時のＯＤが０．１のライブラリーＴＧ１細胞を接種した。３７℃、２５０ｒｐｍの振盪での３〜４時間のインキュベーションの後、ＫＯ７ヘルパーファージを１：１０比で添加した。次いで、培養物を振盪せずに３７℃で１時間インキュベートした。３０℃、２５０ｒｐｍの振盪で一晩インキュベーションのために、ＴＧ１細胞を遠心分離し、細胞ペレットを、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび３５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２Ｌの２ＹＴに再懸濁した。次いで、ＴＧ１細胞を４℃、６０００×ｇで３０分間遠心分離した。ライブラリーファージ粒子を培養上清からのＰＥＧ沈殿によって精製し、ＰＢＳに再懸濁し、ＯＤ２６８の計測によって滴定した。そのファージディスプレイ抗体ライブラリーを、２０％グリセロールを含むＰＢＳ中において−８０℃で貯蔵した。各ライブラリーを別々に調製し、別々に維持した。
【０１１２】
免疫複合体特異的抗体を選択する手順は、実施例２における説明と似ている。簡潔には、２種類のマイクロタイターウェルを準備し、１つは、ＡＦ１０抗体のみでコーティングし、２つ目は、２５−（ＯＨ）Ｄ３：ＡＦ１０の免疫複合体でコーティングした。親和性選択の前に、ＡＦ１０だけに結合するファージを枯渇させるために、個別のライブラリーを、ＡＦ１０のみのウェルにおいてプレインキュベートした。次いで、上清を、２５−（ＯＨ）Ｄ３：ＡＦ１０の免疫複合体でコーティングされたマイクロタイターウェルに移す。１回目の親和性選択では、合計８ウェルを使用し、各ライブラリーファージを２ウェルに添加した。２回目の親和性選択では、１回目からのファージを混合し、インキュベーションのために４ウェルを使用した。合計３回の親和性選択を行った。
【０１１３】
ｐ３融合物の発現および結合活性の確認のために、３回目の親和性選択からのコロニーを拾った。この手順は、実施例２に記載された手順に似ている。簡潔には、５枚の９６ウェルプレートおよび合計４８０個のコロニーを拾って、マスタープレートを作製した。２日目に、１ウェルあたり１０μｌの培養物を、９６ウェル深ウェル発現プレートにおける対応するウェルに移した。その深ウェルプレートを、培養物が０．８〜１のＯＤ６００ｎｍに達するまで、３７℃の振盪恒温器において２５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。６ｍＭ  ＩＰＴＧを含む１００μｌの２ＹＴを各ウェルに添加し、発現プレートを、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で一晩インキュベートした。２．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１６０μｌの溶解緩衝液を発現プレートの各ウェルに添加し、プレートを室温において１時間振盪しながらインキュベートした。培養上清を、１ウェルあたり１４０μｌの２×ＣｈｅｍｉＢｌｏｃｋｅｒと混合し、２５０ｒｐｍでさらに３０分間インキュベートした。培養上清を遠心分離し、下記のような結合アッセイのために調製した。
【０１１４】
ＥＬＩＳＡスクリーニング手順は、実施例２に記載された手順に似ていた。簡潔には、各発現プレートに対して、２枚の９６ウェルアッセイプレートを準備し、１枚のプレートは、ＡＦ１０抗体のみでコーティングし、２枚目は、２５−（ＯＨ）Ｄ３：ＡＦ１０の免疫複合体でコーティングした。発現プレートからの培養上清を、アッセイプレートの対応するウェルに移した。室温における１時間のインキュベーションの後、サンプルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。１００μｌのＨＲＰコンジュゲート抗Ｆａｂ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅａｅａｒｃｈ  Ｌａｂ，ＵＳＡ）を、室温における１時間のインキュベーションのために各ウェルに添加した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、１００μｌの基質ＴＭＢを、１０〜３０分の発色のために各ウェルに添加し、５０μｌの停止液を添加した。次いで、ＯＤ４５０を計測した。２５−（ＯＨ）Ｄ３：ＡＦ１０の免疫複合体に結合したがＡＦ１０抗体のみには結合しなかったクローンを、確認のために選択した。陽性の培養上清の１：３段階希釈物を、上記手順に従ってアッセイした。図３は、表１に列挙された可変領域配列を有する、２５−（ＯＨ）Ｄ３：ＡＦ１０の免疫複合体に対する５つのクローンの結合活性を示している。
【０１１５】
実施例４：組換え抗体の発現および精製
【０１１６】
組換えＦａｂを発現させるために、ＶＨおよびＶＬ遺伝子（ｇｅｎｓ）を大腸菌発現ベクターｐＥｘにクローニングした。各個別のクローンに対して、２０ｍｌの一晩培養物を、２％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む２ＹＴ中に調製し、３７℃の振盪恒温器においてインキュベートした。翌日、０．１％グルコースおよび１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む７００ｍＬの２ＹＴに、７ｍｌの一晩培養物を移すことによって、２ＬのＵｌｔｒａ  ｙｉｅｌｄフラスコ（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）において接種した。３５℃、２８０ｒｐｍの振盪で、ＯＤ６００が約０．８になるまでおよそ２〜３時間、培養物を生育した。次いで、３５０μｌの１Ｍ  ＩＰＴＧをその培養物に添加し、２２℃、２８０ｒｐｍの振盪で一晩誘導した。７５００×ｇでの２０分間の遠心分離によって細胞ペレットを回収し、室温における１時間のインキュベーションのために、１ｍｇ／ｍｌのリゾチームおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む溶解緩衝液に再懸濁した。可溶性Ｆａｂを含む上清を、４℃、１５，０００ｒｐｍの２５０００×ｇで２回遠心することによって回収した。次いで、その上清を、Ｆａｂ結合用の５ｍｌのプロテインＧカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードし、５０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。次いで、Ｆａｂタンパク質を０．３Ｍ酢酸，ｐＨ３緩衝液で溶出した。溶出した画分を回収し、０．５体積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．５緩衝液で中和した。Ｆａｂサンプルの緩衝液をＰＢＳに交換し、３〜５ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮した。このＦａｂサンプルを−８０℃で貯蔵した。
【０１１７】
ＩｇＧ発現のために、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを、それぞれサイトメガロウイルスプロモーターベースの哺乳動物発現ベクターＰＭＸ３０およびｐＭＸ３１にクローニングした。重鎖ベクターＤＮＡおよび軽鎖ベクターＤＮＡを１：３の比で混合し、無血清培地中の３０ｍｌのＨＥＫ２９３細胞懸濁液に一過性にトランスフェクトした。２０時間後、細胞をサンプリングし、生存率および生細胞数を測定し、力価を計測した（Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅ，ＦｏｒｔｅＢｉｏ）。それらの培養物を５日目に回収し、各々に対するさらなるサンプルを計測して、細胞密度、生存率および力価を測定した。ＩｇＧを含む条件培地を回収し、一過性のトランスフェクション生成物から遠心分離および濾過によって浄化した。上清をプロテインＡカラムに流し、低ｐＨ緩衝液（ｐＨ＝３）で溶出した。０．２μｍメンブランフィルターを用いる濾過を行った後、等分した。精製および濾過の後、ＯＤ２８０および消衰係数に基づいてタンパク質濃度を計算した。概して、この手順から１〜５ｍｇのＩｇＧが生成された。
【０１１８】
実施例５：血清中２５−（ＯＨ）Ｄの計測のためのサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ
【０１１９】
２５−（ＯＨ）Ｄ：ＡＦ１０の免疫複合体に対するモノクローナル抗体を用いて、サンドイッチベースのＥＬＩＳＡアッセイを調製した。遊離２５−（ＯＨ）Ｄ３をそのアッセイに使用した。簡潔には、１００μＬ／ウェルのＡＦ１０抗体（３μｇ／ｍｌのＰＢＳ溶液）を使用して、４℃で一晩、マイクロタイタープレートをコーティングした。
【０１２０】
そのアッセイプレートをＰＢＳで洗浄し、室温において２時間、１×ＣｈｅｍｉＢｌｏｃｋｅｒでブロッキングした。０．５〜５０ｎｇ／ｍｌの濃度における５μＬ／ウェルの２５−（ＯＨ）Ｄ３をそのプレートに添加し、その後、３μｇ／ｍｌの２００μＬの抗免疫複合体抗体を添加した。室温における１時間のインキュベーションの後、そのプレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、１００μｌのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅａｅａｒｃｈ  Ｌａｂ，ＵＳＡ）を、室温における３０分間のインキュベーションのために各ウェルに添加した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、１００μｌの基質ＴＭＢを、３０分の発色のために各ウェルに添加した。５０μＬの停止液を添加し、ＯＤ４５０を計測した。このデータは、用量依存的応答を示し、２５−（ＯＨ）Ｄ検出のためのサンドイッチＥＬＩＳＡの概念証明として働いた。臨床サンプルを検出するためのこのアッセイの有用性をさらに確かめるために、２５−（ＯＨ）Ｄ値（ＡＤＶＩＡ  Ｃｅｎｔａｕｒ  ＶｉｔａｍｉｎＤ  Ｔｏｔａｌ  ａｓｓａｙ，Ｓｉｅｍｅｎｓによって測定された）を有する患者血清サンプルを、上記サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて計測した。このアッセイは、２５−（ＯＨ）Ｄ：ＡＦ１０の免疫複合体に対する３μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を含む２００μＬのＣａｌＢｉｏｔｅｃｈ放出緩衝液（Ｃａｌｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を各ウェルに添加した後、５μｌの血清サンプルを添加したことを除いては、遊離２５−（ＯＨ）Ｄ３に対するように行われた。混合の後、プレートを室温において１．５時間インキュベートした。図４は、血清中２５−（ＯＨ）ＤのサンドイッチＥＬＩＳＡの成功した検出を示しており、ビタミンＤ濃度を計測する２つの方法の間の線形関係を示している。
【０１２１】
実施例６：２５−（ＯＨ）Ｄを計測するための側方流動アッセイ
【０１２２】
例示的な側方流動デバイスは、サンプル運搬のためのサンプル適用ユニット（例えば、ＡｈｌｓｔｒｏｍまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）、標識された抗体を含むコンジュゲートパッド、ならびに固定化された捕捉試薬および吸収パッド（例えば、ＡｈｌｓｔｒｏｍまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ製）を含む検出ゾーンを備える。
【０１２３】
乾燥したコンジュゲートパッドを以下のとおり調製した。クエン酸ナトリウムで塩化金を沸点において還元することによって、０．０４％コロイド溶液を調製した。２５μｇの抗２５−（ＯＨ）Ｄ抗体を１ｍｌの０．０４％コロイド溶液に添加し、室温において３０分間インキュベートした。次いで、そのコンジュゲートを１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。次いで、上清をデカントし、ペレットを１ｍＬの１５ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ７．４に懸濁した。類似の手順を行って、ポジティブコントロールのために使用されるコロイド金−抗ニワトリＩｇＧ抗体のコンジュゲートを調製した。抗２５−（ＯＨ）Ｄコンジュゲートおよび抗ニワトリＩｇＧコンジュゲートを、コンジュゲートパッド基剤と１：１０の比で混合した。１０ｍｌのコンジュゲートパッド基剤混合物を８ｃｍ×８ｃｍの繊維ガラスシート片に適用し、室温において４時間真空乾燥した。そのパッドを乾燥剤とともに乾燥室において貯蔵した。
【０１２４】
検出膜を調製するために、２５−（ＯＨ）Ｄ：ＡＦ１０の免疫複合体に対するモノクローナル抗体を、検査ライン溶液として０．２〜１．５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で１５ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４中に調製した。その検査ライン溶液を、０．６〜１．０μＬ／ｃｍの量でニトロセルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  １２５またはＧＥ  ＡＥ９９）上に分注した。同様に、抗ニワトリＩｇＧを含むコントロールライン溶液をニトロセルロース膜上のコントロールラインの位置に分注した。次いで、その膜を、３０％未満の湿度の環境において１時間風乾させ、次いで、乾燥剤とともに乾燥室において貯蔵した。
【０１２５】
検査デバイスを構築するために、検出膜、コンジュゲートパッドおよびサンプルウィッキング材料を並べ、アセンブルされたストリップをプラスチックのハウジング内に入れた。
【０１２６】
既知の２５−（ＯＨ）Ｄ濃度を含む血清または血液サンプルを使用することによって、そのデバイスを評価した。５μＬの血清または１０μＬの毛細管血をサンプルパッドに適用した後、３滴（１００μＬ）のサンプル追跡緩衝液を適用した。１５分後、検査ラインおよびコントロールラインを読み出した。図５に示されている結果は、血清中のビタミンＤ濃度が上昇するにつれて、サンプルにおける検査ライン上のシグナル密度が高まることを示している。この検査デバイスは、被験体が、十分なビタミンＤ、不足しているビタミンＤ、または欠乏したビタミンＤを有することを示す（図１Ａ）。さらに、この検査デバイスは、シグナル強度と、サンプル中の１０ｎｇ／ｍｌ〜８０ｎｇ／ｍｌの範囲の２５−（ＯＨ）Ｄレベルとの間に線形関係を示した。半定量的カラーチャート（図１Ｂ）を用いて計測されたビタミンＤレベルについて、さらなるサンプルを試験した。そのデータを、ＡＤＶＩＡ  Ｃｅｎｔａｕｒ  ＶｉｔＤアッセイによって測定されたビタミンＤレベルと比較した。表４に示されているように、側方流動検査デバイスの結果は、ＡＤＶＩＡ  Ｃｅｎｔａｕｒ  ＶｉｔＤアッセイの試験と一致した。これらの試験は、異なる製造ロットのデバイスで再現された。
【表４−１】
2019507890.tif 000007
【表４−２】
2019507890.tif 000008
【０１２７】
さらに、スマートフォンベースのリーダーを毛細管血サンプル中のビタミンＤレベルの定量的検出に使用した。１０μｌの毛細管血をサンプルパッドに適用した後、３滴（１００μｌ）のサンプル追跡緩衝液を適用した。１５分後、検査ラインを読み出した。対応する個体の血清サンプルを回収し、ＥＬＩＳＡ試験に供した。図６は、側方流動検査デバイスを用いた毛細管血検査とＥＬＩＳＡベースの血清試験との比較を示している。このデータは、０．９１という相関係数Ｒを有する正の線形相関を示している。
【０１２８】
実施例７：Ｃｕｂｅ−Ｒｅａｄｅｒを用いた２５−（ＯＨ）Ｄの計測のための側方流動アッセイ
【０１２９】
２５−ＯＨビタミンＤの完全に定量的な計測のために、Ｃｕｂｅ−Ｒｅａｄｅｒ（ｏｐＴｒｉｃｏｎ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ製）を使用した。Ｃｕｂｅ−Ｒｅａｄｅｒは、縁の長さがおよそ４１ｍｍで重さが４０ｇである立方体の形状を有するポータブル側方流動アッセイリーダーである。計測手順は、図８に示されている。
【０１３０】
液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）アッセイによって測定された２５−ＯＨビタミンＤ値を有する合計２０個のヒト血清サンプルを側方流動試験に適用した。計測手順は、実施例６に記載されている。表５に列挙される結果は、側方流動試験の２５−ＯＨビタミンＤ値が、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイ（２５−ＯＨビタミンＤの計測の「ゴールド」スタンダードな方法）から生成された真の値に非常に近いことを示している。
【表５−１】
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【表５−２】
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側方流動試験とＬＣ−ＭＳ／ＭＳアッセイとの間の２５−ＯＨビタミンＤ値の比較は、０．９８という相関係数を有する線形回帰Ｙ＝０．９８Ｘ＋１．４９をもたらす。この比較結果を図９に示す。
【０１３１】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書中に示され、記載されてきたが、そのような実施形態は単なる例として提供されていることが当業者に明らかである。数多くのバリエーション、変更および置換が、本発明から逸脱することなく当業者には想起される。本明細書中に記載される本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明の実施において使用され得ることが理解されるべきである。以下の請求項は、本発明の範囲を定義すること、ならびにこれらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物がこれらの請求項によって包含されることが意図されている。
【図１ＡＢ】
2019507890.tif 000011
【図１Ｃ】
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【図２】
2019507890.tif 000013
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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