(57)【要約】  混合物又は細胞系に、カプシエイトシンターゼを提供することと、８−メチル−６−ノネノイル−コエンザイムＡ、６Ｅ−８−メチルノネン酸、又は８−メチルノナン酸を、混合物又は細胞系に供給することと、混合物又は細胞系に、バニリルアルコールを供給することと、混合物又は細胞系から、カプシノイドを収集することと、を含む、カプシノイドを調製する方法が、ここに提供される。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カプシノイドを生成する方法であって、
（ａ）カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）を、細胞系内で発現させる工程、
（ｂ）８−メチル−６−ノネノイル−ＣｏＡと、バニリルアルコールとを、前記細胞系に添加する工程、そして
（ｃ）前記カプシノイドを生成するに十分な時間、前記細胞系を培養する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
ジヒドロカプシエイトを生成する方法であって、
（ａ）カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）と、アシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）とを、細胞系内で発現させる工程、
（ｂ）８−メチルノナン酸と、バニリルアルコールとを、前記細胞系に添加する工程、そして
（ｃ）前記ジヒドロカプシエイトを生成するに十分な時間、前記細胞系を培養する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３】
カプシエイトを生成する方法であって、
（ａ）カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）と、アシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）とを、細胞系で発現させる工程、
（ｂ）６Ｅ−８−メチルノネン酸と、バニリルアルコールとを、前記細胞系に添加する工程、そして
（ｃ）前記カプシエイトを生成するに十分な時間、前記細胞系を培養する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項４】
カプシノイドを生成する方法であって、
（ａ）カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）と、アシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）とを、細胞系に発現する工程、
（ｂ）中間鎖脂肪酸と、バニリルアルコールとを、前記細胞系に添加する工程、
（ｃ）前記カプシノイドを生成するに十分な時間、前記細胞系を培養する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項５】
前記ＣＳアミノ酸配列が、トウガラシ属の植物に由来する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記トウガラシ属の植物が、ブートジョロキア植物である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＳが、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＳが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＣＳアミノ酸配列が、トウガラシ属の植物に由来する、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記トウガラシ属の植物が、ブートジョロキア植物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＣＳが、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＣＳが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞系が、イースト、非カプシノイド生成植物、藻及びバクテリアとを含む群より選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞系が、バクテリアである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞系が、大腸菌である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生成されたカプシノイド、カプシエイト又はジヒドロカプシエイトを収集することを、更に含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記生成されたカプシノイド、カプシエイト又はジヒドロカプシエイトを、７０％を超える純度に精製することを、更に含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記精製する工程が、酸塩基抽出を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記精製する工程が、減圧蒸留を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
精製する工程が、半生成ＨＰＬＣを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
カプシノイドを生成する方法であって、
（ａ）カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）を、反応混合物で提供する工程、
（ｂ）８−メチル−６−ノネノイル−コエンザイムＡと、バニリルアルコールとを、前記反応混合物に添加する工程、そして
（ｃ）前記カプシノイドを生成する十分な時間、前記反応混合物を培養する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２２】
ジヒドロカプシエイトを生成する方法であって、
（ａ）カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）と、アシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）とを、反応混合物で提供する工程、
（ｂ）８−メチルノナン酸と、バニリルアルコールとを、前記反応混合物に添加する工程、そして
（ｃ）前記ジヒドロカプシエイトを生成する十分な時間、前記反応混合物を培養する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２３】
カプシエイトを生成する方法であって、
（ａ）カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）と、アシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）とを、反応混合物で提供する工程、
（ｂ）６Ｅ−８−メチルノネン酸と、バニリルアルコールとを、前記反応混合物に添加する工程、そして
（ｃ）前記カプシエイトを生成する十分な時間、前記反応混合物を培養する工程、
を含むことを特徴とする、カプシエイトを生成する方法。
【請求項２４】
カプシノイドを生成する方法であって、
（ａ）カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）と、アシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）とを、反応混合物で提供する工程、
（ｂ）中間鎖脂肪酸と、バニリルアルコールとを、前記反応混合物に添加する工程、そして
（ｃ）生成の結果、前記カプシノイドを生成するに十分な時間、前記反応混合物を培養する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２５】
前記ＣＳアミノ酸配列が、前記トウガラシ属の植物に由来することを特徴とする、請求項２１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記トウガラシ属の植物が、ブートジョロキア植物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＳが、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＣＳが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＡＣＳアミノ酸配列が、前記トウガラシ属の植物に由来する、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記トウガラシ属の植物が、ブートジョロキア植物であることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＡＣＳが、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＡＣＳが、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＣＳ及び／又はＡＣＳが、イースト、非カプシノイド生成植物、藻及びバクテリアを含む群より選択される細胞系で生成される、請求項２１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞系が、バクテリアであることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞系が、大腸菌である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記生成されたカプシノイド、カプシエイト又はジヒドロカプシエイトを、反応混合物からを収集することを更に含む、請求項２１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記生成されたカプシノイド、カプシエイト又はジヒドロカプシエイトを、７０％を超える純度に精製することを更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記精製する工程が、酸塩基抽出を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記精製する工程が、減圧蒸留を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記精製する工程が、半生成ＨＰＬＣを含む、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１月７日に出願の米国仮出願番号第６２／２７６，０５９号に優先権を主張し、その開示は、参照事項としてここに包含される。
【０００２】
本発明は、カプシエイト、ジヒドロカプシエイト、ノルジヒドロカプシエイトを生合成的に含むカプシノイドを、主に細胞系内に調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
カプシノイドは、カプシエイト、ジヒドロカプシエイト及びノルジヒドロカプシエイトを含んでおり、チリペッパー（トウガラシ(Capsicum annuum L)）中に自然に存在する分子である。カプシエイトは、主として、赤トウガラシの辛味の無い栽培種、すなわちＣＨ１９甘に見出されており、カプサイシンレセプタの活性化を含むカプサイシンに匹敵する効果を提供することが知られている。カプシノイドは、カプサイシンを含まない独自の種類のチリペッパー、すなわちＣＨ１９甘では、最初に分離されていた（ヤザワら、１９８９）。
【０００４】
カプシノイドは、カプサイシノイド状物質であり、これは、上記のように、コショウ（トウガラシ）の辛味の無い栽培種の果物として最初に報告され、ＣＨ１９甘と命名されている（ヤザワら、１９８９）。その後、カプシエイト(capsiate)（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンジル（Ｅ）−８−メチル−６−ノネノエート）、ジヒドロカプシエイト（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンジル８−メチルノナノエート）、及び、ノルジヒドロカプシエイト（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンジル７−メチルオクタノエート）が、ＣＨ１９甘における３つの重要なカプシノイドとして確認された（コバタら、１９９８；コバタら、１９９９）。カプシノイドでは、カプサイシノイドの芳香族部分、バニリルアミンが、バニリルアルコールに交換される一方、そのアシル残基は、類似のカプサイシノイドのそれらと同一である。
【０００５】
以前、カプサイシノイドは、エネルギー代謝を推進し、身体−脂肪の蓄積を抑制し、肥満及び糖尿病に対して食事療法を提供する可能性を有していることが、報告されている。しかしながら、カプサイシンは辛味性及び神経毒性が強く、そのヒトへの投与を主として禁止している（マスダら、２００３）。対照的に、カプシエイトは、痛み及びエネルギー代謝に対するその効果無しに、並びに、カプサイシンの重量減少模倣体無しに、多量に取得することが可能である（マスダら、２００３、スニッカーら、２００９）。今日、カプシエイト及びＣＨ１９甘トウガラシエキスは、代謝を押し上げる栄養補助食品として広く使われている。
【０００６】
カプシノイドが、トウガラシで刺激を起因する物質である、カプサイシンと構造的に類似である一方で、カプシノイドは、辛味が非常に少ない。カプシノイドは、推測の「辛味閾値」を有していること、すなわちカプサイシンのそれの約１／１０００であることが知られている。カプサイシンとカプシノイドファミリーのメンバーと間の構造的差異を、図１に示す。カプシノイドは、カプサイシンのアミド結合と比較して、自身の構造中にエステル結合を有している。
【０００７】
カプサイシンは、熱を検出するために用いられる舌上において、知覚受容器を活性化させると考えられている（サーラーシら、１９９９）。また、これらのレセプタ、一過性受容器電位バニロイド１型（ＴＲＰＶ１）が、胃内及び他の器官内に存在する（ナジら、２００４）。ＴＲＰＶ１レセプタの活性化が、交感神経系（ＳＮＳ）を始動させることが理解される（イワイら、２００３）。カプサイシンは、ＳＮＳを活性化させることを介して、ヒト及び動物中における脂肪の燃焼の増加を実現することもある。
【０００８】
カプサイシンのように、カプシノイドは、一過性受容器電位バニロイド１（ＴＲＰＶ１）レセプタのような知覚受容器を活性化する（イイダら、２００３）。カプサイシン及びカプシノイドは、ＳＮＳの活性化を介して、ヒト及び動物内で燃焼する脂肪の増加を実現してもよい。しかしながら、カプサイシンとは異なり、カプシノイドは口内で熱感を開始しないのであり、なぜなら、カプシノイドは、カプサイシンとの比較における構造的差異が原因で、口腔内でＴＲＰＶ１レセプタを物理的に到達させることができないからだとの可能性がある。それにもかかわらず、カプシノイドは、胃内でＴＲＰＶ１レセプタを活性化させることが可能であり、これは、カプサイシン及びカプシノイドの代謝効果にとって重要であることが示された（オーヌキら、２００１）。
【０００９】
これらの代謝効果は、カプサイシン及びカプシノイドの両方における、制癌、抗炎症薬、及び鎮痛作用、ならびに体重管理を含んだ多くの健康上有益な性質に貢献すると考えられている（マチョら、２００３；サンチョら、２００２；ヒーら、２００９；カワバタら、２００６；ハンドラーら、２００８）。エネルギー代謝（スニッカーら２００９；イノウエら、２００７）と、体温（オーヌキら、２００１；ハチヤら、２００７）上昇との両方が、ヒトに生じた後に、カプシノイドの投与又はＣＨ１９甘の抽出へと続くことを、研究が示している。更に、身体脂肪の蓄積が抑制された後、カプシノイド摂取へと続いている（オーヌキら、２００１）。
【００１０】
しかしながら、甘トウガラシ中のカプシノイドの含有物は、極めて少量である。例えば、非常に高価なＣＨ１９甘トウガラシ１０，０００ポンドに由来することができるカプシノイドは、わずか１ポンドであり、これがカプシエイトのための市価を誘導する結果、甘トウガラシから抽出されるカプシエイトの価格が、極めて高価になってしまう（例えば、４０％〜９８％の純度のカプシエイトが、６００〜２５，０００米ドル；ｗｗｗ．ａｌｉｂａｂａ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔ−ｄｅｔａｉｌ／Ｈｉｇｈ−ｑｕａｌｉｔｙ−Ｃａｐｓｉａｔｅ−４０−ｔｏ−９８＿３４４８３２６４５．ｈｔｍｌ？ｓｐｍ＝ａ２７００．７７２４８３８．３５．１．Ｊ７７Ｙｈｔを参照）。従って、かなりの量のカプシノイドを生成するさらに効果的な方法が、望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本開示は、例えばここに記載される混合物又は細胞系を用いて、カプシノイドを調製する方法を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ある態様では、カプシノイドを生成する方法を提供し、この方法は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）を細胞系内に発現することと、８−メチル−６−ノネノイル−コエンザイムＡとバニリルアルコールとを細胞系に添加することと、カプシノイドを生成するに十分な時間、細胞系を培養することと、を備えている。他の態様では、ジヒドロカプシエイトを生成する方法を提供し、この方法は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）とアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）とを細胞系内に発現することと、８−メチルノナン酸とバニリルアルコールとを細胞系に添加することと、ジヒドロカプシエイトを生成するに十分な時間、細胞系を培養することと、を備えている。さらに他の態様では、カプシエイトを生成する方法を提供し、この方法は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）とアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）とを細胞系内に発現することと、６Ｅ−８−メチルノネン酸とバニリルアルコールとを細胞系に添加することと、カプシエイトを生成するに十分な時間、細胞系を培養することと、を備えている。別の態様では、カプシノイドを生成する方法を提供し、この方法は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）とアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）とを細胞系内に発現することと、中間鎖脂肪酸とバニリルアルコールとを細胞系に添加することと、カプシノイドを生成するに十分な時間、細胞系を培養することと、を備えている。
【００１３】
上記方法のいずれか１つの実施形態では、ＣＳアミノ酸配列は、トウガラシ属の植物より得られる。ある実施形態では、トウガラシ属の植物は、ブートジョロキア(ghost chili)植物である。ある実施形態では、ＣＳは、配列番号１に少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を備えている。ある実施形態では、ＣＳは、配列番号１のアミノ酸配列を備えている。
【００１４】
上記方法のいずれか１つの実施形態では、ＡＣＳアミノ酸配列は、トウガラシ属の植物より得られる。ある実施形態では、トウガラシ属の植物は、ブートジョロキア植物である。ある実施形態では、ＡＣＳは、配列番号２に少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を備えている。ある実施形態では、ＡＣＳは、配列番号２のアミノ酸配列を備えている。
【００１５】
上記方法のいずれか１つの実施形態では、細胞系は、イーストと、非カプシノイド生成植物と、藻と、バクテリアとを含む群より選択される。ある実施形態では、細胞系は、バクテリアである。ある実施形態では、細胞系は、大腸菌である。
【００１６】
上記方法のいずれか１つの実施形態では、この方法は、生成されたカプシノイド、カプシエイト又はジヒドロカプシエイトを収集することをさらに備えている。ある実施形態では、この方法はさらに、生成されたカプシノイド、カプシエイト又はジヒドロカプシエイトを、７０％を超える純度に精製することを、備えている。ある実施形態では、精製するステップは、酸塩基抽出を備えている。ある実施形態では、精製するステップは、減圧蒸留を備えている。ある実施形態では、精製するステップは、半生成ＨＰＬＣを備えている。
【００１７】
さらに他の態様では、カプシノイドを生成する方法を提供し、この方法は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）を反応混合物に提供することと、８−メチル−６−ノネノイル−コエンザイムＡと、バニリルアルコールとを、反応混合物に添加することと、カプシノイドを生成するに十分な時間、反応混合物を培養することと、を備えている。ある態様では、ジヒドロカプシエイトを生成する方法を提供し、この方法は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）とアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）とを反応混合物に提供することと、８−メチルノナン酸とバニリルアルコールとを反応混合物に添加することと、ジヒドロカプシエイトを生成するに十分な時間、反応混合物を培養することと、を備えている。別の態様では、カプシエイトを生成する方法を提供し、この方法は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）とアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）とを反応混合物に提供することと、６Ｅ−８−メチルノネン酸とバニリルアルコールとを反応混合物に添加することと、カプシエイトを生成するに十分な時間、反応混合物を培養することと、を備えている。さらに別の態様では、カプシノイドを生成する方法を提供し、この方法は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）とアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）とを反応混合物に提供することと、中間鎖脂肪酸とバニリルアルコールとを反応混合物に添加することと、生成の結果カプシノイドを生成するに十分な時間、反応混合物を培養することと、を備えている。
【００１８】
上記方法のいずれか１つの実施形態では、ＣＳアミノ酸配列は、トウガラシ属の植物より得られる。ある実施形態では、トウガラシ属の植物は、ブートジョロキア植物である。ある実施形態では、ＣＳは、少なくとも９０％配列番号１に一致するアミノ酸配列を備えている。ある実施形態では、ＣＳは、配列番号１のアミノ酸配列を備えている。
【００１９】
上記方法のいずれか１つの実施形態では、ＡＣＳアミノ酸配列は、トウガラシ属の植物より得られる。ある実施形態では、トウガラシ属の植物は、ブートジョロキア植物である。ある実施形態では、ＡＣＳは、少なくとも９０％配列番号２に一致するアミノ酸配列を備えている。ある実施形態では、ＡＣＳは、配列番号２のアミノ酸配列を備えている。
【００２０】
上記方法のいずれか１つの実施形態では、ＣＳやＡＣＳは、イーストと、非カプシノイド生成植物と、藻と、バクテリアとを含む群より選択される細胞系内に生成される。ある実施形態では、細胞系は、バクテリアである。ある実施形態では、細胞系は、大腸菌である。
【００２１】
上記方法のいずれか１つの実施形態では、この方法は、生成されたカプシノイド、カプシエイト、又はジヒドロカプシエイトを、反応混合物から収集することをさらに備えている。ある実施形態では、この方法は、生成されたカプシノイド、カプシエイト、又はジヒドロカプシエイトを、７０％を超える純度に精製することをさらに備えている。ある実施形態では、精製するステップは、酸塩基抽出を備えている。ある実施形態では、精製するステップは、減圧蒸留を備えている。ある実施形態では、精製するステップは、半生成ＨＰＬＣを備えている。
【００２２】
また、本開示は、以下の追加的な実施形態を提供する。ある実施形態では、カプシノイドを調製する生物変換方法を提供し、この方法は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）を混合物中に提供することと、８−メチルノネノイル−コエンザイムＡを混合物中に供給することと、バニリルアルコールを混合物に供給することと、カプシノイドを収集することと、を備えている。ある実施形態では、カプシエイトを調製する生物変換方法を提供し、この方法は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）を混合物中に提供することと、アシルトランスフェラーゼを混合物中に提供することと、６Ｅ−８−メチルノネン酸を供給することと、バニリルアルコールを混合物に供給することと、カプシエイトを収集することと、を備えている。ある実施形態では、ジヒドロカプシエイトを調製する生物変換方法を提供し、この方法は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）を混合物中に提供することと、アシルトランスフェラーゼを混合物中に提供することと、８−メチルノナン酸を供給することと、バニリルアルコールを混合物に供給することと、カプシエイトを収集することと、を備えている。ある実施形態では、カプシノイドを調製する生物変換方法を提供し、この方法は、ＣＳ遺伝子を細胞系内に発現することと、ＡＣＳ１遺伝子を細胞系内に発現することと、中間鎖脂肪酸を細胞系に供給することと、バニリルアルコールを細胞系に供給することと、カプシノイドを収集することと、を備えている。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】カプシエイト、ジヒドロカプシエイト、及びノルジヒドロカプシエイトのための分子構造を表す図である。
【図２】カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）−触媒カプシエイト生合成を表す図である。
【図３】６Ｅ−８−メチルノネン酸（６Ｅ）から推定カプシエイト（ＣＱ）を、８−メチルノナン酸（８Ｍ）からジヒドロカプシエイト（ＤＨＣＱ）、それぞれ製作するＨＰＬＣ性質を表す図である。ＶＡ（バニリルアルコール）、６Ｅ及び８Ｍの濃度は、５００ｍｇ／Ｌである。図３に示すように、６Ｅと８Ｍとから、それぞれ異なる製品が形成された。
【図４】ＶＡ＋６Ｅ（ＶＥ）からのＣＱと、ＶＡ＋８Ｍ（ＶＭ）からのＤＨＣＱ製作とを、それぞれ表す図である。実験は、三回実行された。
【図５】培養物中におけるＣＱとＤＨＣＱとの同一性を確かめるため、ＧＣ／ＭＳ分析を実行したことを示す図である。
【図６】誘導サンプルから取得されるＣＱ及びＤＨＣＱスペクトルに対するＧＣ／ＭＳライブラリーにおける、ＤＨＣＰ（ジヒドロカプサイシン）範囲の比較を表す図であり、なぜなら、ＣＱ及びＤＨＣＱスペクトルがＧＣ／ＭＳライブラリーになく、最も近いものはＤＨＣＰ（ジヒドロカプサイシン）のそれだからである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
別段に画定しない限り、ここに用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本開示の属する当業者に共通して理解されるような同一意味を有する。ここに記載されると同様な又は等しい、いずれかの方法及び物質を、本開示の実施又は実験に用いてもよいが、好ましい物質および方法は、下記で記載される。
【００２５】
対象技術の変形ポリペチドシーケンスに関しての「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、参照ポリペチドのアミノ酸残基と同一である候補シーケンスでのアミノ酸残基のパーセンテージのことをいい、これは、必要に応じて、最大のパーセント配列同一性を実現するため、シーケンスを合わせてギャップを導入した後であって、配列同一性の一部としていずれの保存的置換を考慮しない場合のことである。
【００２６】
パーセントアミノ酸配列同一性を決定するための調整は、たとえば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の、一般公開されているコンピュータソフトウェアを用いて、当該技術分野にある様々な方法で実現することが可能である。当業者は、調整を評価するために、比較すべきシーケンスのノーカットに対して、最大限の調整を実現するために必要ないずれかのアルゴリズムを含む適切なパラメータを決定することが可能である。例えば、シーケンス比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２を用いて、％アミノ酸配列同一性を決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２シーケンス比較プログラムを、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードしてもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は、いくつかの検索パラメータを用いており、ここで、それらの検索パラメータの全ては、デフォルト値まで設定され、これはたとえば、イエスを明らかにすること、ストランド＝全て、期待される発現１０、最小限の複雑度長＝１５／５、マルチパスｅ値＝０．０１、マルチパスのための定数＝２５、最終ギャップアランメントのための減少＝２５、及び、重み行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含んでいる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２がアミノ酸配列比較のために用いられる状況において、所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又は、アミノ酸配列Ｂに対しての、所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列の同一性（所与のアミノ酸配列Ｂへの、アミノ酸配列Ｂとの、又は、アミノ酸配列Ｂに対しての、所定％のアミノ酸配列の同一性を有する又は含む、所与のアミノ酸配列Ａとして、代替的に表現されることができる）を、以下の通りに計算する：分率Ｘ／Ｙの１００倍であり、ここで、Ｘは、Ａ及びＢのそのプログラムのアランメントにおいて、シーケンスアランメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２による完全な一致として記録されるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合は、Ａ対Ｂの％アミノ酸配列同一性は、Ｂ対Ａの％アミノ酸配列同一性と等しくないだろうことが理解されよう。
【００２７】
この意味で、アミノ酸配列「類似性」を決定するための技術は、当該技術分野では周知である。一般に、「類似性」は、２以上のアミノ酸が、同一であるか、又は、電荷や疎水性等の類似化学性及び／又は類似物性を有しているかの、適切な状態における、２以上のポリペチドの正確なアミノ酸対アミノ酸比較のことをいう。このように定義される「パーセント類似性」を、その後、比較中のポリペチドシーケンスの間で、決定してもよい。また、核酸及びアミノ酸配列同一性を決定する技術は、当該技術分野で周知であり、その遺伝子のためのｍＲＮＡのヌクレオチドシーケンスを（通常ｃＤＮＡ中間体を介して）決定することと、そこでコードされるアミノ酸配列を決定することと、これを第２のアミノ酸配列と比較することと、を含んでいる。一般に、「同一性」は、２つのポリヌクレオチド又はポリペチドシーケンスそれぞれの、正確な、ヌクレオチド対ヌクレオチド対応、又はアミノ酸対アミノ酸対応のことをいう。２以上のポリヌクレオチドシーケンスは、２以上のアミノ酸配列と同様に、これらの「パーセント同一性」を決定することにより、比較することが可能である。ウィスコンシンシーケンス分析パッケージ、バージョン８、（遺伝学コンピュータグループ、マディソン、ウィスコンシン州から入手可能）で入手可能なプログラム、例えば、ＧＡＰプログラムは、２つのポリヌクレオチド間の同一性と、２つのポリペチドシーケンスの間の同一性及び類似性との両方を、それぞれ、計算することができる。同一性又はシーケンスの類似性を計算する他のプログラムは、当業者により知られている。
【００２８】
特に明記しない限り、２つのポリペチド又はポリヌクレオチドシーケンスのパーセント同一性は、同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドの、これら２つのシーケンスの短い方の全長にわたったパーセンテージのことをいう。
【００２９】
「変換」は、当該技術分野の通常の技術者に理解されるように、その通常の及び慣習的な意味に従って用いられ、また、ポリヌクレオチドのターゲット細胞への移動することを指すために、非限定的に用いられる。移動されたポリヌクレオチドを、ターゲット細胞のゲノム又は染色体ＤＮＡに取り込む結果、遺伝的に安定な遺伝となることが可能であり、又は、宿主染色体の非依存性を複製することが可能となる。変換核酸フラグメントを含む宿主生物を、「形質転換」、又は「組換え型」、又は「変換」生物という。
【００３０】
宿主細胞に関連してここに用いられる際の、語「変換」、「形質転換」及び「組換え体」は、当該技術分野の通常の技術者に理解されるように、通常的かつ慣習的な意味に従って用いられ、また、非限定的に用いられて、異種の核酸分子がその内部に導入される植物又は微生物細胞等の、宿主生物の細胞のことを指す。核酸分子は、宿主細胞のゲノムに、安定的に組み込まれることが可能であり、又は、核酸分子は、染色体外の分子として存在することが可能である。
【００３１】
ポリヌクレオチドに関連してここに用いられる際の、語「組換え体」、「異種」、及び「外来」は、当該技術分野の通常の技術者に理解されるように、通常的かつ慣習的な意味に従って用いられ、また、非限定的に用いられて、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡシーケンス又は遺伝子）を指し、そのポリヌクレオチドは、特定の宿主細胞とは異質の起源から始まり、又は、同一起源の場合はその原形から改質される。従って、宿主細胞内に異種遺伝子は、遺伝子を含んでおり、この遺伝子は、特定の宿主細胞へ内因性を示すものの、例えば部位特異的突然変異又は他の組み換え技術の使用、を通して改質したものである。また、これらの語は、自然発生的ＤＮＡシーケンスの非自然発生的な複数のコピーを含んでいる。従って、これらの語は、細胞に異質の又は異種である、又は、細胞に対応するものの成分が通常見出されない宿主細胞内の位置又は形態である、ＤＮＡ部分、のことをいう。
【００３２】
同様に、ポリペチド又はアミノ酸配列に関連してここに用いられる際の、語「組換え体」、「異種」、及び「外来」は、ポリペチド又はアミノ酸配列を意味し、このポリペチド又はアミノ酸配列は、特定の宿主細胞とは異質の起源から始まり、又は、同一起源の場合はその原形から改質される。従って、組換えＤＮＡ部分を宿主細胞内で発現させて、組み換え型ポリペチドを生成することが可能である。
【００３３】
ここで用いられる例では、用語「細胞系」は、異所性タンパク質の発現を提供するいずれかの細胞のことをいう。これは、バクテリア、イースト、植物細胞及び動物細胞を含んでいる。これは、原核生物細胞及び真核生物細胞を含んでいる。また、これは、リボソーム等の、細胞成分を利用するタンパク質のインビトロ発現を含んでいる。
【００３４】
用語「細胞系を成長させる」は、ここに用いられる場合において、細胞の増加及び分離ができるようにさせる媒質を提供することを含んでいる。また、細胞又は細胞成分が組み換え型タンパク質を変形及び調製することが、可能になるように、リソースを提供することを含んでいる。
【００３５】
用語「タンパク質発現」ここで用いられる例では、遺伝子形質発現の一部としての、タンパク質生成のことをいう。これは、ＤＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写された後のステージから成っている。ｍＲＮＡを、その後ポリペプチド鎖に変換し、このポリペプチド鎖は最終的にタンパク質に迎え入れることになる。ＤＮＡは、トランスフェクション、すなわち細胞に核酸を故意に導入するプロセス、を介して細胞内に存在する。この語は、真核細胞内の非ウィルス法にしばしば用いられる。また、これは他の方法及び細胞型を指してもよいが、他の語が好ましい。「変換」は、バクテリア、植物細胞を含む非動物真核細胞の内部における、非ウィルスＤＮＡ転写を記載するために、より頻繁に用いられる。トランスダクションは、ウィルス媒介ＤＮＡ転写を記載するために、しばしば用いられる。変換、トランスダクション、及び、ウィルス感染は、本出願のためのトランスフェクションの定義により含まれる。更に、タンパク質発現は、インビトロ翻訳を含み、ここで、タンパク質は、細胞の外にある細胞器官を利用して発現される。
【００３６】
用語「生物変換」、別名「生体内変化」は、ここに用いられる場合において、より高価であり得る、又は、非生物学的に可能でない、化学反応を実施するための、しばしば微生物（例えばバクテリア及びイースト）である生存生物の使用を指している。これらの生物体は、物質を化学修飾型に変換する。
【００３７】
用語「反応物混合物」及び「混合物」は、ここに用いられるように、２以上の物質の物理配合を指し、これは、当該技術分野で知られている多くの変形により、溶液、懸濁液、又は、膠質の形態で混合されてもよい。反応混合物は、組み換え型タンパク質（例えば、ここに記載されるように、ＡＣＳ及びＣＳ）、及び、１つ以上のインビトロ反応物系の成分の混合物を備えていてもよく、このインビトロ反応物系の成分は、例えば基質（例えば、ここに記載されるように、バニリルアルコール（ＶＡ）、６Ｅ−８−メチルノネン酸（６Ｅ）、及び／又は、８−メチルノナン酸（８Ｍ））、バッファ（例えば、リン酸カリウムバッファ）、及び、塩（例えば、ＭｇＣｌ2）である。例えば、出願人は、トウガラシＡＣＳｌの活性を計測するために、ＨＰＬＣに基づく方法を用いた（チェンら、２０１１）。このシステムでは、反応混合物（４００μΕ）は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ０．１Ｍ、ｐＨ７．５、ＤＴＴ２ｍＭ、ＡＴＰ５ｍＭ、ＭｇＣｌ2１０ｍＭ、コエンザイムＡ０．５ｍＭ、トリトン０．１％、及び、カルボン酸２００μΜを含んでいた。精製酵素の２０μｍを添加して、反応を開始し、２０ミクロモルの酢酸の添加により、３０分後に停止した。アクレーム（商標）１２０ＣＩ  ８  逆相カラム（サーモサイエンティフィック社；３μ、１２０Ａ、１５０×３ｍｍ）を用いて、ダイオネクス−アルティメット（商標）３０００ＬＣシステム（サーモサイエンティフィック社）により、ＨＰＬＣを実行した。移動層が、溶媒Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸）及び溶媒Ｂ（アセトニトリル）から成っていた。勾配溶出手順が、以下の通りであった。０〜５分でＢが５％、５〜９分で直線濃度勾配、Ｂが５〜８０％、９〜１１分でＢが８０％、１１〜１２分でＢが５％。流量が、０．６ｍｌ／分であった。ダイオードアレイ検出体が、２００〜４００ｎｍの範囲で、データを収集した。基質及び製品の検出及び定量化のために、ピーク面積を、２５７ｎｍで評価した。
【００３８】
英単語「ａ」又は「ａｎ」を、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」（含む）とともに用いる場合は、「ｏｎｅ」（１つの）を意味してもよいが、「ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ」（１つ以上）、「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ」（少なくとも一つ）、及び，「ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ」（１つ又は１つ以上）の意味にも一致する。
【００３９】
上記のように、ＣＨ１９甘トウガラシ抽出中に存在するカプシエイト及びカプシノイドのような、カプシノイドは、多くの目的のため広く用いられているが、現在は、生成するには信じられないほど高価である。カプシエイトは、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ、またカプサイシンシンターゼと称される）によりトウガラシ内で自然に合成されると考えられており、アシルトランスフェラーゼは、８−メチル−６−ノネノイル部分を、８−メチル−６−ノネノイル−コエンザイムＡからバニリルアルコールへと移動させてエステル接合体を生成し（図２）、遺伝的に、その生合成は、トウガラシ内でＰｕｎ１座により制御される（ハンら、２０１３）。
【００４０】
ここに記載されるように、ゴーストトウガラシＡＣＳ１等のアシルＣｏＡシンテターゼ（ＡＣＳ）及びゴーストトウガラシＡＴ３／ＰＵＮ１等のカプシエイト／カプサイシンシンターゼ（ＣＳ）を利用する発現系を用いて、たとえばバニリルアルコール（ＶＡ）、及び、６Ｅ−８−メチルノネン酸（６Ｅ）か８−メチルノナン酸（８Ｍ）かのいずれか、の適切な出発原料を供給したときに、カプシノイドを生成することが可能であることが、見出された。
【００４１】
細胞系
ある態様では、本開示は、細菌内又は菌類細胞内等の、細胞系内での、カプシノイドの生成を目的とする。ある実施形態では、細胞系は、ゴーストトウガラシＡＣＳ１及びＡＴ３／ＰＵＮ１遺伝子を過剰発現させる大腸菌培養物である。カプサイシノイドの生成のためのゴーストトウガラシＡＣＳ１及びＡＴ３／ＰＵＮ１の使用が、以前に記載されていた（ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２０１５１０９１６８号として発表される、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１１７２９号を参照のこと。その全体が、参照事項としてここに包含される）。カプサイシノイドは、上記のように、カプシノイドから構造的及び機能的に識別可能である。図３に示すように、異なるカプシノイド製品は、バニリルアルコール（ＶＡ）と共に６Ｅ−８−メチルノネン酸（６Ｅ）の導入、又は、ＶＡと共に８Ｍの導入、から生成された。さらなる定量データは、このＡＣＳ１−ＰＵＮ１システムが、基質として８Ｍを推奨することを示した（図３）。
【００４２】
ある実施形態では、カプシノイドを生成する方法を提供し、この方法は、細胞系内でカプシエイトシンターゼ（ＣＳ）を発現させることと、８−メチル−６−ノネノイル−コエンザイムＡ及びバニリルアルコールを、細胞系に（一緒に、又は独立して）添加することと、カプシノイドを生成するに十分な時間、細胞系を培養することと、を備えている。ある実施形態では、ジヒドロカプシエイトを生成する方法を提供し、この方法は、細胞系内でカプシエイトシンターゼ（ＣＳ）及びアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）を発現させることと、８−メチルノナン酸及びバニリルアルコールを、細胞系に（一緒に、又は独立して）添加することと、ジヒドロカプシエイトを生成するに十分な時間、細胞系を培養することと、を備えている。ある実施形態では、カプシエイトを生成する方法を提供し、この方法は、細胞系内でカプシエイトシンターゼ（ＣＳ）及びアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）を発現させることと、６Ｅ−８−メチルノネン酸及びバニリルアルコールを、細胞系に（一緒に、又は独立して）添加することと、カプシエイトを生成するに十分な時間、細胞系を培養することとを備えている。ある実施形態では、カプシノイドを生成する方法を提供し、この方法は、細胞系内でカプシエイトシンターゼ（ＣＳ）及びアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）を発現させることと、中鎖脂肪酸及びバニリルアルコールを細胞系に（一緒に、又は独立して）添加することと、カプシノイドを生成するに十分な時間、細胞系を培養することとを備えている。
【００４３】
典型的な細胞系は、イースト細胞（ピキアパストリス又は出芽酵母）、植物又は植物細胞（例えば、非カプシノイド生成植物又はシロイヌナズナ、イネ又はトウモロコシ等の植物細胞）、藻細胞、及び細菌性細胞（例えば、大腸菌）を含んでいる。
【００４４】
対象とするカプシノイドを生成するに十分な時間は、生成中のカプシノイド、用いられる細胞系のタイプ、及び、細胞系が維持される疾患に従って変化する。バクテリア中にカプシノイドを生成する典型的な条件を、実施例で提供する。類似した条件を、多数の分子を生合成的に生成することができること（ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２０１４０８６８４２号を参照のこと）を示す出芽酵母等の、イーストに適応してもよい。ここに記載される条件を、多数の分子を生合成的に生成することができること（ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２０１０１２４３２４号を参照のこと）を示す植物細胞の用途に、適応してもよい。
【００４５】
本開示の他の実施形態は、カプシノイドを調製する生物変換方法であり、細胞系内でＣＳ遺伝子を発現させることと、細胞系内でＡＣＳ１遺伝子を発現させることと、細胞系に中間鎖脂肪酸を供給することと、細胞系にバニリルアルコールを供給することと、カプシノイドを収集することと、を備えている。
【００４６】
ここに提供したいずれかの細胞系のある実施形態では、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）を用いてもよい。ある実施形態では、ＣＳ核酸及び／又はアミノ酸配列は、トウガラシ属の植物（例えば、ブートジョロキア植物又はＣＨ１９甘植物）に由来する。ある実施形態では、ＣＳは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は、１００％が、配列番号１との同一性を有するアミノ酸配列を備えている。ある実施形態では、ＣＳは、配列番号１のアミノ酸配列から成っている。ある実施形態では、ＣＳは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は、１００％が、配列番号３との同一性を有する核酸一次構造によりコードされている。
【００４７】
ゴーストチリＰｕｎ１／ＡＴ３の典型的なアミノ酸配列
【表１】
2019500877.tif 000003
【００４８】
ここに提供したいずれかの細胞系のある実施形態では、アシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）を用いてもよい。ある実施形態では、ＡＣＳ核酸及び／又はアミノ酸配列は、トウガラシ属の植物（例えば、ブートジョロキア植物又はＣＨ１９甘植物）に由来する。ある実施形態では、ＡＣＳは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は、１００％の、配列番号２との同一性を有するアミノ酸配列を備えている。ある実施形態では、ＡＣＳは、配列番号２のアミノ酸配列から成っている。ある実施形態では、ＡＣＳは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は、１００％の配列番号４との同一性を有する核酸一次構造によりコードされる。
【００４９】
ブートジョロキアＡＣＳの典型的なアミノ酸配列
【表２】
2019500877.tif 000004
【００５０】
反応混合物
また、本開示は、適切な出発原料（例えば、ＶＡ及び６Ｅ、又は、ＶＡ、及び、８Ｍ）が添加される、ゴーストトウガラシＡＣＳ１等のＡＣＳ、及び／又は、ゴーストトウガラシＡＴ３／ＰＵＮ１等のＣＳ、を備えた、反応混合物（例えば、インビトロ反応混合物）を用いた、カプシノイドの生成を、一部分において、目的としている。
【００５１】
ある実施形態では、カプシノイドを生成する方法を提供し、この方法は、反応混合物にカプシエイトシンターゼ（ＣＳ）を提供することと、８−メチル−６−ノネノイル−コエンザイムＡ及びバニリルアルコールを、反応混合物に（一緒に、又は、独立して）添加することと、カプシノイドを生成するに十分な時間、反応混合物を培養することと、を備えている。ある実施形態では、ジヒドロカプシエイトを生成する方法を提供し、この方法は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）及びアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）を反応混合物に提供することと、８−メチルノナン酸及びバニリルアルコールを反応混合物に（一緒に、又は、独立して）添加することと、ジヒドロカプシエイトを生成するに十分な時間、反応混合物を培養することと、を備えている。ある実施形態では、カプシエイトを生成する方法を提供し、この方法は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）及びアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）を反応混合物に提供することと、６Ｅ−８−メチルノネン酸及びバニリルアルコールを反応混合物に（一緒に、又は、独立して）添加することと、カプシエイトを生成するに十分な時間、反応混合物を培養することと、を備えている。ある実施形態では、カプシノイドを生成する方法を提供し、この方法は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）及びアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）を反応混合物に提供することと、中鎖脂肪酸及びバニリルアルコールを反応混合物に（一緒に、又は、独立して）添加することと、生成の結果カプシノイドを生成するに十分な時間、反応混合物を培養することと、を備えている。得られた反応混合物が、かつて培養した望ましいカプシノイドを生成することができる限り、反応混合物の成分を、いずれかの状態で、一緒に又は独立して、添加してもよいことを、理解すべきである。
【００５２】
反応混合物に用いる酵素を、例えば、酵素を生成することが可能な大腸菌又は他の適切な宿主細胞に対して、好ましくは組み換えにより、又は、合成的に、いずれかの起源から生成することが可能である。反応混合物は、望ましいカプシノイドの生成に適切であり得る出発原料（例えば、ＶＡ及び６Ｅ、又はＶＡ及び８Ｍ）及び塩等の他の成分と、酵素とを含む緩衝液であってもよい。反応混合物は、細胞可溶化物（例えば、大腸菌又はイースト細胞可溶化物）を含んでいてもよく、又は、細胞可溶化物上に調製されてもよく、この細胞可溶化物は、出発原料等の付加成分（例えば、ＶＡ及び６Ｅ、又は、ＶＡ及び８Ｍ）が添加されていてもよい。
【００５３】
ここに提供されるいずれかの反応混合物のある実施形態では、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）を、用いてもよい。ある実施形態では、ＣＳ核酸及び／又はアミノ酸配列は、トウガラシ属の植物（例えば、ブートジョロキア植物又はＣＨ１９甘植物）に由来する。ある実施形態では、ＣＳは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は、１００％の、配列番号１との同一性を有する、アミノ酸配列を備えている。ある実施形態では、ＣＳは、配列番号１のアミノ酸配列から成っている。
【００５４】
ここに提供されるいずれかの反応混合物のある実施形態では、アシルトランスフェラーゼ（ＡＣＳ）を、用いてもよい。ある実施形態では、ＡＣＳ核酸及び／又はアミノ酸配列は、トウガラシ属の植物（例えば、ブートジョロキア植物又はＣＨ１９甘植物）に由来する。ある実施形態では、ＡＣＳは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％を有すること、又は、１００％の、配列番号２との同一性を有する、アミノ酸配列を備えている。ある実施形態では、ＡＣＳは、配列番号２のアミノ酸配列から成っている。
【００５５】
関心のカプシノイドを生成するに十分な時間は、生成されているカプシノイド、用いられる反応混合物のタイプ、及び、反応混合物が培養される条件に従い、変化する。反応混合物を用いた生合成的生成分子に対する典型的な条件が、当該技術分野で知られている（ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２０１６／０５４５３４号を参照のこと。その全体が、参照事項としてここに包含される）。
【００５６】
本開示の実施形態は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）を混合物に提供することと、８−メチル−６−ノネノイル−コエンザイムＡを混合物に供給することと、バニリルアルコールを混合物に供給することと、カプシノイドを収集することと、を含むカプシノイドを調製する生物変換方法である。
【００５７】
本開示の他の実施形態は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）を混合物に提供することと、アシルトランスフェラーゼを混合物に提供することと、６Ｅ−８−メチルノネン酸を供給することと、バニリルアルコールを混合物に供給することと、カプシエイトを収集することと、を含む、カプシエイトを調製する生物変換方法である。本開示の他の実施形態は、カプシエイトシンターゼ（ＣＳ）を混合物に提供することと、アシルトランスフェラーゼを混合物に提供することと、８−メチルノナン酸を供給することと、バニリルアルコールを混合物に供給することと、カプシエイトを収集することと、を含む、ジヒドロカプシエイトを調製する生物変換方法である。
【００５８】
精製
ここに提供されるいずれかの方法のある実施形態では、この方法は、カプシノイド（例えば、カプシエイト又はジヒドロカプシエイト）を精製することをさらに備えてもよい。ある実施形態では、カプシノイドは、５０重量％〜１００重量％の純度に精製される。ある実施形態では、カプシノイドは、重量により、６０％を超える純度、７０％を超える純度、８０％を超える純度、９０％を超える純度、９５％を超える純度、９６％を超える純度、９７％を超える純度、９８％を超える純度又は、９９％を超える純度に精製される。関心のカプシノイドは、当該技術分野で知られている、又は、ここに記載される、いずれかの方法により精製されてもよい。典型的な方法は、酸塩基抽出、減圧蒸留及び半生成(semi-preparative)ＨＰＬＣを含んでいる（リＨ．Ｘ．ら、食品科学技術、５７：４４６（２０１４）、及び、アンドレード−エイロアＡ、固相抽出内での試行錯誤方法論の選択肢：煤中のＰＡＨ及びＰＡＨ−誘導体を分析するための、本来のオートメーション化した固相抽出手順、ＲＳＣアドバンス４：３３６３６〜４４ページ（２０１４））。
【００５９】
組成物
ここに記載される方法で生成されるカプシノイドのいずれが、組成物に含まれてもよい。ある実施形態では、組成物は、経口的に消耗できる製品（飲料、食品、栄養補助食品、機能性食品、医薬品組成物、歯科衛生用品、又は、化粧品等）であり、この製品は、人又は動物の口に接触され、口に取得されその後口から吐き出される物質と、飲まれ食べられ飲み込まれ又は別段に摂取される物質と、ヒト又は動物の消費が、一般的に許される濃度範囲で用いられる際は、安全である物質と、を含んでいる。ここに用いられるように、「栄養補助食品」は、ビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、アミノ酸等の、食餌を補充するために、及び栄養分を提供するために意図された化合物を指し、これは、失ってもよいか、又は、十分な食餌量で消費されなくてもよい。当該技術分野で知られるいずれか適切な栄養補助食品を、用いてもよい。適切な栄養補助食品の例としては、例えば、栄養分、ビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、ハーブ、植物性薬品、アミノ酸、及び代謝物質とすることができる。
【００６０】
ここに用いられるように、「機能性食品」は、いずれかの食物、又は、食物の一部を含む化合物を指し、この食品は、抑止及び／又は疾患又は異常症の治療を含む医薬又は健康効果を提供してもよい（例えば、疲労、不眠症、老化の影響、記憶喪失、気分障害、心血管疾患及び血中コレステロール高水準、糖尿病、骨粗鬆症、炎症、自己免疫性疾患など）。当該技術分野で知られるいずれかの適切な機能性食品を、用いてもよい。ある実施形態では、機能性食品は、食物及び飲料への補助成分として、及び、腸内適用又は非経口適用のための医薬組成物として、用いることが可能であり、この医薬組成物は、カプセル又は錠剤等の固形剤、又は、溶液又は懸濁液等の液剤であってもよい。
【００６１】
ある実施形態では、栄養補助食品及び機能性食品は、保護親水コロイド、（ゴム、タンパク質、化工澱粉等）、バインダー、被膜剤、封入試薬／材料、壁／殻材料、マトリックスコンパウンド、コーティング、乳化剤、表面活性剤、溶解剤（油、脂肪、ワックス、レシチン等）、吸着剤、キャリヤー、充填剤、共通−コンパウンド、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶媒）、流動試薬、味覚マスキング試薬、増量剤、ゼリー状試薬、ゲル形成剤、抗酸化剤、及び抗菌を、さらに含むことが可能である。
【００６２】
当該技術分野で知られるいずれかの適切な医薬品組成物を、用いてもよい。特定の実施形態では、本開示の医薬品組成物は、カプシノイド、及び、１つ以上の薬理学的に許容しうる賦形剤を含むことが可能である。この組成物は、例えば、レミントンの薬学、マック出版社、イーストン、ペンシルバニア州、米国、に記載の、当該技術分野で適切に知られる手順に従って、製造することが可能である。
【実施例】
【００６３】
大腸菌内でのカプシノイドの生成
ブートジョロキアトウガラシからの、ＡＣＳ１及びＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子が、前述のとおり、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内で、同時−過剰発現した（ＰＣＴ出願公開公報ＷＯ２０１５／０６６６１５号参照、その内容は、ここに完全な状態で参照により組み込まれる）。プラスミドｐＣＤＦＤｕｅｔ−ＡＣＳ１を用いて、コンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。スペクチノマイシンの１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢプレート上で、形質転換細胞を選択した。ｐＣＤＦＤｕｅｔ−ＡＣＳｌを収容して得られたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を用いて、ｐＥＴｉｔｅ  Ｎ−Ｈｉｓ  ＳＵＭＯ−ゴーストＰｕｎ１ベクターでの第２の変換を行った。トランスフォーマントを、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ及びスペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌを含むＬＢプレート上で選択した。トランスフォーマント内でＡＣＳ１及びＰｕｎ１を共同過剰発現させるために用いたＡＣＳ１及びＡＴ３／Ｐｕｎ１コード配列を、下記に示す。
【００６４】
Ｐｕｎ１／ＡＴ３コード配列のシーケンス（ブートジョロキアトウガラシから）
【表３】
2019500877.tif 000005
【００６５】
ＡＣＳ１コード配列のシーケンス（ブートジョロキアトウガラシから）
【表４】
2019500877.tif 000006
【００６６】
次に、ＡＣＳ１及びＰＵＮ１の生成が、トランスフォーマントに誘導された。簡潔に、トランスフォーマントの一夜の培養物を、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ及びスペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌを含むＴＢ媒質（２％）に培養した。この一夜の培養物を、その後希薄化し、ＯＤ６００  ０．６に、３７℃で培養し、１６℃まで冷却した。その後、ＩＰＴＧ１ｍＭを添加して、ＡＣＳ１及びＰｕｎ１の発現を誘導した。１６℃での１時間の培養の後、以下の基質を培養物に添加した：（ａ）バニリルアルコール（ＶＡ）５００ｍｇ／Ｌ及び６Ｅ−８−メチルノネン酸（６Ｅ）５００ｍｇ／Ｌ、又は、（ｂ）ＶＡ５００ｍｇ／Ｌ及び８メチルノナン酸（８Ｍ）５００ｍｇ／Ｌ、のいずれか。バニリルアルコールの化学構造を、図２に提供する。６Ｅ及び８Ｍの化学構造を、下記に提供する。
【００６７】
【化１】
2019500877.tif 000007
８−メチルノナン酸
【化２】
2019500877.tif 000008
【００６８】
基質の供給後１６時間に、サンプルを取得し、それぞれ、推定カプシエイト（ＣＱ）及びジヒドロカプシエイト（ＤＨＣＱ）を酢酸エチルで抽出するとともに、推定ＣＱ及びＤＨＣＱ生成を、６Ｅ又は８Ｍの培養物からした（図３）。このＡＣＳ１−Ｐｕｎ１システムは、８Ｍが基質として好ましいことを、さらなる定量データが示した。誘導の１６時間後の、それぞれ、６Ｅ＋ＶＡ、又は、８Ｍ＋ＶＡによる、ＣＱ及びＤＨＣＱの生成を、３回の実験で確認した。
【００６９】
次に、誘導培養物におけるＣＱ及びＤＨＣＱの同一性を確かめるため、ＧＣ／ＭＳ分析を実行した。ＧＣ／ＭＳ−ＱＰ２０１０Ｓ検出器に接続する島津ＧＣ−２０１０システムにより、ＧＣ／ＭＳ分析を実行した。カラムＲｔｘ−５ＭＳ（厚さ０．２５μ；長さ３０ｍ；直径０．２５ｍｍ）を、分離に用いた。注入温度が２６５℃であり、注入モードが分割され、オーブン温度が１４０℃であった。温度傾度は以下の通りであった：０〜１分、１４０℃；１〜１１．２５分、１４０℃〜２６３℃、レート１２；１１．２５〜２１．２５分、２６３℃。誘導培養物からＣＱ及びＤＨＣＱのために取得されるＧＣ／ＭＳスペクトルを、図５に示す。その後、これらのスペクトルを、ＧＣ／ＭＳ機器におけるＭＳライブラリーからのＤＨＣＰ（ジヒドロカプサイシン）に対する標準スペクトルと、比較した。ＭＳライブラリーがＣＱ又はＤＨＣＱに対する標準を含んでいなかったため、ＤＨＣＰは、ＣＱ及びＤＨＣＱに最も近いものであった。ＤＨＣＱがＤＨＣＰより重い１つのダルトンであり、並びに、ＣＱがＤＨＣＰより軽い１つのダルトンであるため、サンプルにおけるＣＱとＤＨＣＱとの同一性は、ＧＣ／ＭＳの特徴によりしっかりと確立された（図６）。これらの結果は、ＶＡと、６Ｅ又は８Ｍのいずれかと、を出発原料として用いる生合成により、ＡＣＳ１及びＣＳ／ＡＴ３／Ｐｕｎ１遺伝子を、カプシノイドを生成するために用いることが可能であることを示している。
【００７０】
［参考文献］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019500877.tif 000019