(57)【要約】  レポーターモイエティ、基質モイエティ及び脱安定化モイエティを含むポリペプチドをコーディングする組み換えポリヌクレオチド、それを含む宿主細胞、及びそれを利用してプロテアーゼ・レベルを測定する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レポーターモイエティ、脱安定化モイエティ、及びＮ末端に、前記レポーターモイエティと、Ｃ末端に、前記脱安定化モイエティを作動的に連結する基質モイエティであって、前記基質モイエティは、プロテアーゼ活性の切断部位を含むものである基質モイエティを含むポリペプチドをコーディングする第１ポリヌクレオチドを含む組み換えポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記プロテアーゼは、神経毒素ポリペプチドであり、前記神経毒素ポリペプチドは、ボツリヌス毒素血清タイプＡ（ＢｏＮＴ／Ａ）、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／ＣＤ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／ＤＣ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／ＦＡ、ＢｏＮＴ／Ｇ、またはテタヌス神経毒素（ＴｅＮＴ）であるものである求項１に記載の組み換えポリヌクレオチド。
【請求項３】
第１ポリヌクレオチドの上流または下流に連結されたバイシストロン配列、及び前記バイシストロン配列の上流または下流に作動可能に連結された内部標準レポーターをコーディングするポリヌクレオチドをさらに含むものである請求項１に記載の組み換えポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記バイシストロン配列は、内部リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ）であるか、あるいはリボゾームがペプチド結合形成を抜かさせるものである請求項３に記載の組み換えポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載の組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項６】
前記宿主細胞は、神経毒素ポリペプチドを、細胞質中に転置させる細胞であるものである請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞は、ＮＴ２，ＳｉＭａまたはＮＧ１０８−１５細胞であるものである請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングする外来ポリヌクレオチドを含むものである請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項５に記載の宿主細胞をタンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドを含むと疑われる試料と接触させる段階と、
接触された産物中の前記レポーターから放出される信号を測定する段階と、を含む試料中の神経毒素ポリペプチドのプロテアーゼ活性を決定する方法。
【請求項１０】
前記組み換えポリヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチドの上流または下流に連結されたバイシストロン配列、及び前記バイシストロン配列の上流または下流に作動可能に連結された内部標準レポーターをコーディングするポリヌクレオチドをさらに含むことである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
接触させる段階前に、前記宿主細胞を培地中で培養し、神経細胞に分化させる段階をさらに含むことである請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞は、ＮＴ２，ＳｉＭａまたはＮＧ１０８−１５細胞であることである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項５に記載の宿主細胞に、プロテアーゼポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを導入させる段階と、前記ポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を培養し、培養物中の前記レポーターモイエティ、前記内部標準レポーターまたはその産物から放出される信号を測定する段階と、を含む宿主細胞がプロテアーゼを発現または阻害することができる能力を測定する方法。
【請求項１４】
前記培養は、試験物質の存在下で行われることである請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レポーターモイエティ、基質モイエティ及び脱安定化モイエティを含むポリペプチドをコーディングする組み換えポリヌクレオチド、それを含む宿主細胞、並びにそれを利用してプロテアーゼ・レベルを測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼは、タンパク質分解（proteolysis）を行う酵素である。該プロテアーゼは、ポリペプチド鎖内にアミノ酸を互いに連結するペプチド結合を加水分解によって分解する。該プロテアーゼには、神経毒素が含まれもする。Clostridium botulinum及びClostridium tetaniは、非常に強力な神経毒素、すなわち、ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ）とテタヌス毒素（ＴｅＮＴ）とを生産する。これらクロストリジウム神経毒素は、神経細胞（neuronal cell）に特異的に結合し、神経伝達物質（neurotransmitter）の放出を阻害する。該神経毒素のような一部プロテアーゼは、非常に強力な毒性を有しているだけではなく、極少量で存在するために、その活性を安全であって正確に測定することができる方法が要求されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
一様相は、レポーターモイエティ、脱安定化モイエティ、及び前記レポーターモイエティと前記脱安定化モイエティとを作動的に連結する基質モイエティであって、前記基質モイエティは、プロテアーゼ活性の切断部位（cleavage site）を含むものである基質モイエティを含むポリペプチドをコーディングする第１ポリヌクレオチドを含む組み換えポリヌクレオチドを提供する。
【０００４】
他の様相は、前記組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【０００５】
他の様相は、前記組み換えポリヌクレオチドによってコーディングされるポリペプチド、及びレポーターモイエティ、内部標準レポーターまたはその産物によって放出される信号を測定するための検出剤（detection agent）を含む、プロテアーゼポリペプチドのタンパク質分解活性（proteolytic activity）を決定するためのキットを提供する。
【０００６】
他の様相は、前記組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞、及びレポーターモイエティ、内部標準レポーターまたはその産物によって放出される信号を測定するための検出剤を含む、プロテアーゼポリペプチドのタンパク質分解活性を決定するためのキットを提供する。
【０００７】
他の様相は、前記組み換えポリヌクレオチドによってコーディングされるポリペプチドを、プロテアーゼポリペプチドを含むと疑われる試料と接触させる段階、及び接触された産物中の前記レポーターモイエティまたはその産物から放出される信号を測定する段階を含む、試料中のプロテアーゼポリペプチドのプロテアーゼ活性を決定する方法を提供する。
【０００８】
他の様相は、前記宿主細胞を、プロテアーゼポリペプチドを含むと疑われる試料と接触させる段階、及び接触された産物中の前記レポーターモイエティ、前記内部標準レポーターまたはその産物から放出される信号を測定する段階を含む、試料中のプロテアーゼポリペプチドのプロテアーゼ活性を決定する方法を提供する。
【０００９】
他の様相は、前記組み換えポリヌクレオチドによってコーディングされるポリペプチドを、プロテアーゼポリペプチドに接触させる段階、接触された産物中の前記レポーターモイエティまたはその産物から放出される信号を測定する段階、及び前記測定された信号から、前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上を決定する段階を含む、試料中のプロテアーゼポリペプチドの特性を決定する方法を提供する。
【００１０】
他の様相は、前記宿主細胞をプロテアーゼポリペプチドに接触させる段階、接触された産物中の前記レポーターモイエティ、前記内部標準レポーターまたはその産物から放出される信号を測定する段階、及び前記測定された信号から、前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上を決定する段階を含む、試料中のプロテアーゼポリペプチドの特性を決定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】一様相による組み換えポリヌクレオチドの構造を示した図面である。
【図２】一様相による組み換えポリヌクレオチドの構造、及びそれによって発現されたポリペプチドとプロテアーゼとの反応を示す図面である。
【図３】一様相による組み換えポリヌクレオチドが、細胞内でプロテアーゼと接触する場合を示す図面である。
【図４】一様相による内部標準レポーターをコーディングするヌクレオチド配列を有する組み換えポリヌクレオチドが、細胞内でプロテアーゼと接触する場合を示す図面である。
【図５】ｐＦＢベクター１に形質感染（transient transfection）されたＮＧ１０８−１５細胞を神経細胞に分化させた後、ボツリヌス毒素Ａで中毒化させた後、レポーターモイエティの活性を測定した結果を示す図面である。
【図６】ｐＦＢベクター２に形質感染されたＮＧ１０８−１５細胞を神経細胞に分化させた後、ボツリヌス毒素Ａで中毒化させた後、細胞を蛍光顕微鏡で確認した結果を示す図面である。
【図７】ｐＦＢベクター３に形質感染されたＮＧ１０８−１５細胞を神経細胞に分化させた後、ボツリヌス毒素Ａで中毒化させた後、細胞のレポーターモイエティの活性を測定した結果を示す図面である。
【図８】ｐＦＢベクター３に形質感染されたＳｉＭａ細胞を神経細胞に分化させた後、ボツリヌス毒素Ａで中毒化させた後、細胞のレポーターモイエティの活性を測定した結果を示す図面である。
【図９】ｐＦＢベクター３に形質感染されたＮＴ２細胞を神経細胞に分化させた後、ボツリヌス毒素Ａで中毒化させた後、細胞のレポーターモイエティの活性を測定した結果を示す図面である。
【図１０】ｐＦＢベクター６に形質感染されたＮＧ１０８−１５細胞を神経細胞に分化させた後、ボツリヌス毒素Ｂの軽鎖を発現するｐＣＤＮＡ４＿ＢＬＣベクターを一時的形質感染したＮＧ１０８−１５細胞から発現されたレポーターモイエティ、及び内部標準レポータータンパク質から出る信号を確認した結果を示す図面である。
【図１１】ｐＦＢベクター２に形質感染されたＮＴ２細胞を、安定化された単一クローン由来細胞株で確立して神経細胞に分化させた後、異なる濃度のＢｏＮＴ／Ａで中毒化させて発現されたレポーターモイエティタンパク質から出る信号を確認した結果を示す図面である。
【図１２】ｐＦＢベクター２に形質感染されたＮＴ２細胞を、安定化された単一クローン由来細胞株で確立して神経細胞に分化させた後、異なる濃度のＢｏＮＴ／Ａ含有完製品で中毒化させて発現されたレポーターモイエティ、及び内部標準レポータータンパク質から出る信号を確認した結果を示す図面である。
【図１３】ｐＦＢベクター２に形質感染されたＮＴ２細胞を、安定化された単一クローン由来細胞株で確立して神経細胞に分化させた後、異なる濃度のＢｏＮＴ／Ａ含有完製品で中毒化させて発現されたレポーターモイエティ、及び内部標準レポータータンパク質から出る信号を確認した結果を示す図面である。
【図１４】ｐＦＢベクター２に形質感染されたＮＴ２細胞を、安定化された単一クローン由来細胞株で確立して神経細胞に分化させた後、異なる濃度のＢｏＮＴ／Ａ含有完製品で中毒化させて発現されたレポーターモイエティ、及び内部標準レポータータンパク質から出る信号を確認した結果を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
第１様相は、レポーターモイエティ（reporter moiety）、脱安定化モイエティ（destabilization moiety）、及び前記レポーターモイエティと前記脱安定化モイエティとを作動的に連結する基質モイエティ（substrate moiety）であって、前記基質モイエティは、プロテアーゼ活性の切断部位（cleavage site）を含むものである基質モイエティを含むポリペプチドをコーディングする第１ポリヌクレオチドを含む組み換えポリヌクレオチドを提供する。
【００１３】
前記組み換えポリヌクレオチドにおいて、前記レポーターモイエティは、検出可能な信号を放出するか、あるいはそれによって触媒される反応で検出可能な信号を放出する物質（以下、「産物（product）」ともいう）を放出する物質でもある。前記レポーターモイエティは、蛍光タンパク質、β−lactamase、β−galactosidase、alkaline phosphatase、chloramphenicol acetyaltransferase、β−glucuronidase、peroxidase及びluciferaseからなる群から選択されるものでもある。前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、Citrine、ＣＦＰ、ＲＦＰ、Kaede、ＰＡ−ＧＦＰ、Emerald、Venus、ＤｓＲｅｄ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＺｓＧｒｅｅｎ、及びＺｓＹｅｌｌｏｗのタンパク質からなる群から選択されるものでもある。
【００１４】
前記組み換えポリヌクレオチドにおいて、前記脱安定化モイエティは、その不在時に比べ、細胞内において、前記第１ポリヌクレオチドの発現を低減させる特性を有するものでもある。前記発現は、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルでの発現でもある。前記脱安定化モイエティは、細胞内において、第１ポリヌクレオチドから発現されるｍＲＮＡまたはタンパク質の分解を促進するものでもある。前記脱安定化モイエティは、ＰＥＳＴ、ＣＬ１またはＰＥＳＴと、ＣＬ１との融合タンパク質でもある。
【００１５】
前記プロテアーゼは、バクテリア由来のものでもある。前記バクテリアは、クロストリジウム属のものでもある。前記プロテアーゼは、神経毒素（neurotoxin）ポリペプチドでもある。前記プロテアーゼは、エンドプロテアーゼでもある。前記神経毒素ポリペプチドは、ボツリヌス毒素血清タイプＡ（ＢｏＮＴ／Ａ：botulinum toxin serotype Ａ）、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／ＣＤ、ＢｏＮＴ／ＤＣ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／ＦＡ、ＢｏＮＴ／Ｇ、テタヌス神経毒素（ＴｅＮＴ）、またはそれらの変異体でもある。前記プロテアーゼは、前記基質モイエティ中の切断部位を切断するものでもある。前記切断部位は、前記プロテアーゼによって認識されて切断される部位でもある。各ボツリヌス毒素血清タイプのアミノ酸配列、及びそれをコーディングするポリヌクレオチドは、知られている。ボツリヌス毒素血清タイプのアミノ酸配列、及びそれをコーディングするポリヌクレオチドは、例えば、ＷＯ２００４−０３１３５５の配列番号１ないし１４に開示された配列を有するものでもある。
【００１６】
前記切断部位は、プロテアーゼによって特定切断部位で切断されるペプチド基質でもある。前記切断部位は、例えば、神経毒素の内生性プロテアーゼによって認識されて切断される切断部位でもある。該神経毒素の切断部位は、自然に発生するか、あるいは人為的に作られたものでもある。該神経毒素切断部位は、例えば、ＢｏＮＴ／Ａ，ＢｏＮＴ／Ｅプロテアーゼ、またはそれらの変異体によって認識されて切断されるタンパク質に由来したものでもある。前記タンパク質は、ＳＮＡＰ−２５、そのアイソフォーム、パラログまたはオーソログでもある。ＳＮＡＰ−２５は、ヒト，rat，mouse，bovine，danio，carassius，xenopus，torpedo，strongylocentrotus，loligo，lymnaeaまたはaplysia由来のものでもある。ＳＮＡＰ−２５は、ＳＮＡＰ−２５ＡまたはＳＮＡＰ−２５Ｂでもある。
【００１７】
また、神経毒素切断部位は、例えば、ＢｏＮＴ／Ｂ，ＢｏＮＴ／Ｄ，ＢｏＮＴ／Ｆ，ＢｏＮＴ／Ｇプロテアーゼ、またはそれらの変異体によって認識されて切断されるタンパク質に由来したものでもある。前記タンパク質は、ＶＡＭＰ、そのアイソフォーム、パラログまたはオーソログでもある。前記タンパク質は、ＶＡＭＰ、そのアイソフォーム、パラログまたはオーソログは、例えば、ヒトあるいはマウスのＶＡＭＰ−１，ＶＡＭＰ−２，ＶＡＭＰ−３／cellubravin、bovine ＶＡＭＰ−２、rat ＶＡＭＰ−２またはＶＡＭＰ−３、chicken ＶＡＭＰ−１，ＶＡＭＰ−２またはＶＡＭＰ−３、torpedo ＶＡＭＰ−１、strongylocentrotus ＶＡＭＰ、drosophila ｓｙｂＡ，ｓｙｎＢ，ｓｙｎＣ，ｓｙｎＤ、またはｓｙｎ、hirudo ＶＡＭＰ、xenopus ＶＡＭＰ−２またはＶＡＭＰ−３、danio ＶＡＭＰ−１またはＶＡＭＰ−２、loligo ＶＡＭＰ、lymnaea ＶＡＭＰ、aplysia ＶＡＭＰまたはcaenorhabditis ＳＮＢ１−likeでもある。
【００１８】
また、該神経毒素切断部位は、ＢｏＮＴ／Ｃプロテアーゼまたはその変異体によって認識されて切断されるタンパク質に由来したものでもある。前記タンパク質は、syntaxinまたはそのオーソログ、パラログ、相同体でもある。前記タンパク質は、例えば、ヒトあるいはマウスのsyntaxin １Ａ，syntaxin １Ｂ１，syntaxin ２−１，syntaxin ２−２，syntaxin ２−３，syntaxin ３Ａまたはsyntaxin １Ｂ２、bovineまたはrat syntaxin １Ａ，syntaxin １Ｂ１またはsyntaxin １Ｂ２、rat syntaxin ２またはrat syntaxin ３、mouse syntaxin １Ａ，syntaxin １Ｂ１，syntaxin １Ｂ２，syntaxin ２，syntaxin ３Ａ，syntaxin ３Ｂまたはsyntaxin ３Ｃ、chicken syntaxin １Ａまたはsyntaxin ２、xenopus syntaxin １Ａまたはsyntaxin １Ｂ、danio syntaxin １Ａ，syntaxin １Ｂまたはsyntaxin ３、torpedo syntaxin １Ａまたはsyntaxin １Ｂ、strongylocentrotus syntaxin １Ａまたはsyntaxin １Ｂ、drosophila syntaxin １Ａまたはsyntaxin １Ｂ、hirudo syntaxin １Ａまたはsyntaxin １Ｂ、loligo syntaxin １Ａまたはsyntaxin １Ｂ、lymnaea syntaxin １Ａまたはsyntaxin １Ｂ、またはそのオーソログ、パラログ、相同体でもある。
【００１９】
前記組み換えポリヌクレオチドは、細胞内において、第１ポリヌクレオチドを発現させる調節配列を含むものでもある。前記組み換えポリヌクレオチドは、発現可能な組み換えポリヌクレオチドでもある。前記調節配列は、プローモーター，インハンサー，ターミネーター配列、またはそれらの組み合わせでもある。前記細胞は、前記プロテアーゼと結合し、内在化（internalization）することができることでもある。
【００２０】
前記組み換えポリヌクレオチドにおいて、前記プロテアーゼは、神経毒素ポリペプチドであり、前記細胞は、前記神経毒素ポリペプチドとの結合、内在化、細胞内部での放出、またはそれらの組み合わせが起こるようになっているものでもある。前記細胞は、クロストリジウム属の神経毒素に中毒されるものでもある。前記神経毒素ポリペプチドは、ボツリヌス毒素血清タイプＡ（ＢｏＮＴ／Ａ）、ＢｏＮＴ／Ｂ、ＢｏＮＴ／Ｃ、ＢｏＮＴ／Ｄ、ＢｏＮＴ／ＣＤ、ＢｏＮＴ／ＤＣ、ＢｏＮＴ／Ｅ、ＢｏＮＴ／Ｆ、ＢｏＮＴ／ＦＡ、ＢｏＮＴ／Ｇ、テタヌス神経毒素（ＴｅＮＴ）、またはそれらの変異体でもある。前記細胞は、内分泌性細胞（endocrine cell）などでもある。前記細胞は、一次ニューロン（primary neuron）、neuroblastoma細胞、または万能幹細胞から分化されたニューロンでもある。
【００２１】
前記組み換えポリヌクレオチドは、ベクターでもある。前記ベクターは、発現ベクターでもある。前記ベクターは、ウイルスベクター、プラスミドベクターまたは線形核酸構造体（linear nucleic acid construct）でもある。
【００２２】
前記組み換えポリヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチドの上流または下流に連結されたバイシストロン配列（bicistronic sequence）をさらに含むものでもある。前記バイシストロン配列は、５’キャップ（cap）非依存的に翻訳（５’−cap independently translate）されるヌクレオチド配列でもある。前記バイシストロン配列は、ｍＲＮＡからポリペプチドを合成する翻訳の間、リボゾームが１つの５’キャップを有したｍＲＮＡから、２以上のポリペプチドを合成させるヌクレオチド配列でもある。前記バイシストロン配列は、内部リボゾーム進入部位（ＩＲＥＳ：internal ribosomal entry site）であるか、あるいはリボゾームがペプチド結合形成を抜かさせるヌクレオチド配列でもある。リボゾームがペプチド結合形成を抜かさせるバイシストロン配列は、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２ＡまたはＦ２Ａ（例：配列番号１３，２０，２２または２４）をコーディングするポリヌクレオチド配列（例：配列番号５，１９，２１または２３）でもある。
【００２３】
前記組み換えポリヌクレオチドは、また、前記バイシストロン配列の上流または下流に作動可能に連結された内部標準レポーターをコーディングするポリヌクレオチドをさらに含むものでもある。前記内部標準レポーターは、前記レポーターモイエティと異なるものでもある。前記内部標準レポーターは、検出可能な信号を放出するか、あるいはそれによって触媒される反応で検出可能な信号を放出する物質に転換する物質でもある。前記内部標準レポーターは、蛍光タンパク質、β−lactamase、β−galactosidase、alkaline phosphatase、chloramphenicol acetyaltransferase、β−glucuronidase、peroxidase及びluciferaseからなる群から選択されるものでもある。前記蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、Citrine、ＣＦＰ、ＲＦＰ、Kaede、ＰＡ−ＧＦＰ、Emerald、Venus、ＤｓＲｅｄ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＺｓＧｒｅｅｎ及びＺｓＹｅｌｌｏｗのタンパク質からなる群から選択されるものでもある。
【００２４】
図１は、一様相による組み換えポリヌクレオチドの構造を示した図面である。図１のＡ及びＢにおいて、Ｒ、Ｓ、及びＤは、それぞれレポーターモイエティ、基質モイエティ、及び脱安定化モイエティをコーディングするヌクレオチド配列を示す。図１のＢにおいて、Ｉ及びＢは、それぞれ内部標準レポーター（internal standard reporter）、及びバイシストロン配列をコーディングするヌクレオチド配列を示す。図１において、前記組み換えポリヌクレオチドは、左側から右側に、５’→３の順序で記載したものである。図１のＡに示されているように、前記組み換えポリヌクレオチドは、Ｒ−Ｓ−Ｄの構造を有することができる。しかし、該構造は、例示的なものであり、前記組み換えポリヌクレオチドは、さらなる−Ｓ−の構造がＲとＤとの間に連結され、２個以上、例えば、３または４以上の基質モイエティをコーディングするヌクレオチド配列を含むか、あるいは−Ｄ構造も、２個以上、例えば３または４以上の脱安定化モイエティを含んでもよい。図１のＡに示されているように、前記組み換えポリヌクレオチドは、Ｉ−Ｂ−Ｒ−Ｓ−Ｄの構造を有している。しかし、該構造は、例示的なものであり、前記組み換えポリヌクレオチドは、さらなる−Ｉ−Ｂ−の構造が５’位置に連結され、２個以上、例えば、３または４以上の内部標準レポーターをコーディングするヌクレオチド配列を含んでもよい。前記組み換えポリヌクレオチドは、Ｒ−Ｓ−Ｄ−Ｂ−Ｉの構造を有することができる。しかし、該構造は、例示的なものであり、前記組み換えポリヌクレオチドは、さらなる−Ｂ−Ｉ−の構造が３’位置に連結され、２個以上、例えば、３または４以上の内部標準レポーターをコーディングするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００２５】
図２は、一様相による組み換えポリヌクレオチドの構造、及びそれによって発現されたポリペプチドとプロテアーゼとの反応を示す図面である。図２において、一様相による組み換えポリヌクレオチドによって発現されたポリペプチドは、プロテアーゼの存在下、基質モイエティの切断部位が切断され、レポーターモイエティ断片と残りとに断片化される。
【００２６】
図３は、一様相による組み換えポリヌクレオチドが、細胞内でプロテアーゼと接触する場合を示す図面である。図３において、一様相による組み換えポリヌクレオチドによって発現されたポリペプチドは、プロテアーゼの存在下、基質モイエティの切断部位が切断され、レポーターモイエティ断片と残りとに断片化される。
【００２７】
図３に示されているように、細胞内にプロテアーゼが形質感染される場合（上端）、Ｒ−Ｓ−Ｄ構造を有するポリペプチドは、Ｓ部位で切断され、レポーターモイエティは、脱安定化モイエティ（Ｄ）から分離され、脱安定化モイエティ（Ｄ）が形質感染される場合に比べ、さらに安定化される。それにより、前記レポーターモイエティ、またはそれに由来する物質から測定される信号は、脱安定化モイエティ（Ｄ）が形質感染される場合に比べ、さらに強い。図３において、下端は、細胞内にプロテアーゼが存在しない場合、Ｒ−Ｓ−Ｄ構造を有するポリペプチドは、脱安定化モイエティ（Ｄ）をそのまま維持しており、脱安定化モイエティ（Ｄ）により、Ｒ−Ｓ−Ｄ構造を有するポリペプチドのレベルが低くなり、それにより、そこから測定される信号も、低くなるということをを示す。
【００２８】
図４は、一様相による内部標準レポーターをコーディングするヌクレオチド配列を有する組み換えポリヌクレオチドが、細胞内において、プロテアーゼと接触する場合を示す図面である。図４において、一様相による組み換えポリヌクレオチドによって発現されたポリペプチドは、プロテアーゼの存在下、基質モイエティの切断部位が切断され、レポーターモイエティ断片と残りとに断片化される。
【００２９】
図４に示されているように、細胞内においてプロテアーゼが形質感染される場合（Ａ）、Ｒ−Ｓ−Ｄ構造を有するポリペプチドは、Ｓ部位で切断され、レポーターモイエティは、脱安定化モイエティ（Ｄ）から分離され、脱安定化モイエティ（Ｄ）が形質感染される場合に比べ、さらに安定化される。それにより、前記レポーターモイエティ、またはそれに由来する物質から測定される信号は、脱安定化モイエティ（Ｄ）が形質感染される場合に比べ、さらに強い。図４において、下端（Ｂ）は、細胞内にプロテアーゼが存在しない場合、Ｒ−Ｓ−Ｄ構造を有するポリペプチドは、脱安定化モイエティ（Ｄ）をそのまま維持しており、脱安定化モイエティ（Ｄ）により、Ｒ−Ｓ−Ｄ構造を有するポリペプチドのレベルが低くなり、それにより、そこから測定される信号も、低くなるということを示す。図４において、前記組み換えポリヌクレオチドから発現される内部標準レポータータンパク質は、プロテアーゼの存在有無に係わりなく、細胞内で発現される。一方、前記Ｒ−Ｓ−Ｄポリペプチドは、前記バイシストロン配列により、５’キャップ非依存的に翻訳されて合成される。従って、前記内部標準レポーターから測定される信号は、宿主細胞において、前記組み換えポリヌクレオチドを発現させる条件の標準化にも使用される。
【００３０】
第２様相は、前記組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。前記宿主細胞は、前記プロテアーゼを、細胞内、例えば、細胞質内に転置させる（translocate）ものでもある。前記宿主細胞は、プロテアーゼ、例えば、神経毒素ポリペプチドを細胞内、例えば、細胞質中に転置させる細胞でもある。前記宿主細胞は、例えば、プロテアーゼと、受容体を介して結合し、その複合体を細胞内、例えば、細胞質中に転置させるものでもある。しかし、請求された発明が、特定の転置メカニズムに限定されると解釈されるものではない。前記宿主細胞は、プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを、細胞質内で発現することができる細胞でもある。前記宿主細胞は、プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを含むものでもある。該プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドは、染色体内に挿入されているか、あるいは染色体外で形質感染されるものでもある。該プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドは、一時的（transient）または永久的（permanently）に発現されるものでもある。該プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドは、それ自体、またはベクターのようなビークルに含まれた形態でもある。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞外部から導入されたものでもある。前記宿主細胞は、組み換え細胞でもある。前記宿主細胞は、内分泌性細胞でもある。前記細胞は、一次ニューロン、neuroblastoma細胞、及び万能幹細胞から分化されたニューロンからなる群から選択されたものでもある。
【００３１】
前記宿主細胞は、前記組み換えポリヌクレオチドを発現することができるものでもある。前記宿主細胞は、前記組み換えポリヌクレオチドから、レポーターモイエティ、脱安定化モイエティ、及び前記レポーターモイエティと前記脱安定化モイエティとを作動的に連結する基質モイエティであって、前記基質モイエティは、プロテアーゼ活性の切断部位を含むものである基質モイエティを含むポリペプチド、または前記ポリペプチドと前記内部標準レポータータンパク質とを発現するものでもある。
【００３２】
第３様相は、前記組み換えポリヌクレオチドによってコーディングされるポリペプチド、及びレポーターモイエティ、内部標準レポーターまたはその産物によって放出される信号を測定するための検出剤（detection agent）を含む、プロテアーゼ、例えば、神経毒素ポリペプチドのタンパク質分解活性（proteolytic activity）を決定するためのキットを提供する。前記キットにおいて、前記レポーターは、ルシフェラーゼ（luciferase）であり、前記キットは、ルシフェラーゼ基質をさらに含み、前記検出剤は、前記ルシフェラーゼ基質の酵素的転換を測定するためのもの、例えば、光検出器でもある。前記レポーターは、蛍光タンパク質であり、前記検出剤は、前記蛍光タンパク質から出る蛍光を測定するためのもの、例えば、前記蛍光タンパク質を、励起光を利用して励起させ、それによって放出される蛍光を測定するための装備でもある。前記内部標準レポーターは、前記レポーターモイエティとは異なるものでもある。前記レポーターは、前記レポーターモイエティとは異なるルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質でもある。
【００３３】
第４様相は、前記組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞、及びレポーターモイエティ、内部標準レポーターまたはその産物によって放出される信号を測定するための検出剤を含む、プロテアーゼ、例えば、神経毒素ポリペプチドのタンパク質分解活性を決定するためのキットを提供する。前記キットにおいて、前記レポーターは、ルシフェラーゼであり、前記キットは、ルシフェラーゼ基質をさらに含み、前記検出剤は、前記ルシフェラーゼ基質の酵素的転換を測定するためのものでもある。前記レポーターは、蛍光タンパク質であり、前記検出剤は、前記蛍光タンパク質から出る蛍光を測定するためもの、例えば、前記蛍光タンパク質を、励起光を利用して励起させ、それによって放出される蛍光を測定するための装備でもある。前記内部標準レポーターは、前記レポーターモイエティとは異なるものでもある。前記レポーターは、前記レポーターモイエティとは異なるルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質でもある。
【００３４】
第５様相は、前記組み換えポリヌクレオチドによってコーディングされるポリペプチドを、プロテアーゼポリペプチドを含むと疑われる試料と接触させる段階と、接触された産物中の前記レポーターモイエティまたはその産物から放出される信号を測定する段階と、を含む、試料中のプロテアーゼ活性を決定する方法を提供する。
第６様相は、前記組み換えポリヌクレオチドによってコーディングされるポリペプチドを、プロテアーゼポリペプチドに接触させる段階と、接触された産物中の前記レポーターモイエティまたはその産物から放出される信号を測定する段階と、前記測定された信号から、前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上を決定する段階と、を含む、試料中のプロテアーゼポリペプチドの特性を決定する方法を提供する。
【００３５】
第５様相及び第６様相の前記方法は、前記組み換えポリヌクレオチドによってコーディングされるポリペプチドを、プロテアーゼポリペプチドを含むと疑われる試料またはプロテアーゼと接触させる段階を含む。前記接触は、前記ポリペプチド中のプロテアーゼ活性の切断部位が分解させる条件下でも行われる。前記プロテアーゼは、神経毒素ポリペプチドでもある。
【００３６】
前記接触は、液体媒質中で行われるものでもある。前記液体媒質は、前記プロテアーゼのタンパク質分解活性を作動させる条件を有するものでもある。前記条件は、ｐＨ、温度、補助因子、塩濃度、またはそれらの組み合わせでもある。前記液体媒質は、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液でもある。
【００３７】
第５様相及び第６様相の前記方法は、また、接触された産物中の前記レポーターモイエティまたはその産物から放出される信号を測定する段階を含む。前記レポーターモイエティが、検出可能な信号を放出するポリペプチドである場合、前記段階は、前記信号を直接に測定するものでもある。例えば、前記レポーターモイエティが、ＧＦＰのような蛍光タンパク質である場合、その蛍光を測定するものでもある。該蛍光の測定は、前記接触された産物に励起光を照射し、前記接触された産物から出る放射光を測定するものでもある。励起光及び放射光の波長は、選択される蛍光タンパク質によって適切に選択することができる。前記レポーターモイエティが、それによって触媒される反応において検出可能な信号を放出する物質に転換するポリペプチドである場合、前記段階は、接触された産物中に、前記レポーターモイエティの触媒活性に必要な基質を添加し、該基質を、検出可能な信号を放出する物質に転換させる段階をさらに含んでもよい。次に、検出可能な信号を放出する物質から、前記信号を測定するものでもある。例えば、前記レポーターモイエティは、ルシフェラーゼであり、前記接触させる段階、または信号を測定する段階は、反応液内にルシフェラーゼ基質を添加する段階を含み、前記検出は、前記ルシフェラーゼ基質の酵素的転換を測定するためのものでもある。前記ルシフェラーゼ基質は、ルシフェリンでもある。
【００３８】
第５様相及び第６様相の前記方法において、前記測定された信号を対照群から測定された信号と比較する段階をさらに含むものでもある。前記対照群は、プロテアーゼ、例えば、神経毒素ポリペプチドがないか、あるいは知られた濃度のプロテアーゼ、例えば、神経毒素ポリペプチドを含む試料を使用したものを除いては、同一過程によって測定されたものでもある。前記方法は、前記比較する段階によって得られた信号と試料とにおいて、プロテアーゼ・レベルとの相関関係により、試料中のプロテアーゼ・レベルを決定する段階をさらに含むものでもある。
【００３９】
第６様相の前記方法は、前記測定された信号から、前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上を決定する段階を含む。前記信号の放出開始点、及び持続時間のうち１以上は、当業者により、前記測定された信号から容易に決定される。例えば、該当業者は、経時的プロテアーゼ活性を示す信号値、例えば、放出された信号から、放出開始時点及び持続時間を決定することができる。前記経時的プロテアーゼ活性を示す信号値は、経時的に放出された信号の測定値から、前記信号の放出開始時点及び持続時間を決定することができる。前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上は、プロテアーゼタイプのような特性によっても異なる。前記レポーターモイエティが、検出可能な信号を放出するポリペプチドである場合、プロテアーゼ活性によって切断部位が分解される場合、放出された信号が増大し始め、プロテアーゼ活性が消える場合、放出された信号が低減するものでもある。例えば、同一条件で測定された場合、プロテアーゼの特性により、前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上が異なりもする。また、前記プロテアーゼは、そのような相対的比較だけではなく、前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上の絶対値またはその範囲から、他のプロテアーゼとも区別される。従って、前記決定する段階は、知られたプロテアーゼに係わる前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上と比較すること、または知られたプロテアーゼの前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上の絶対値またはその範囲から、プロテアーゼ特性を決定することを含んでもよい。前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上により、そのプロテアーゼにより、治療される適応症（indication）が異なりもする。従って、前記方法は、決定されたプロテアーゼ特性に基づいて、プロテアーゼにより、個体で治療される適応症を決定することを含んでもよい。
【００４０】
第７様相は、前記宿主細胞を、プロテアーゼポリペプチドを含むと疑われる試料と接触させる段階と、接触された産物中の前記レポーターモイエティ、前記内部標準レポーターまたはその産物から放出される信号を測定する段階と、を含む、試料中のプロテアーゼ活性を決定する方法を提供する。
【００４１】
第８様相は、前記宿主細胞をプロテアーゼポリペプチドに接触させる段階と、接触された産物中の前記レポーターモイエティ、前記内部標準レポーターまたはその産物から放出される信号を測定する段階と、前記測定された信号から、前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上を決定する段階と、を含む、試料中のプロテアーゼポリペプチドの特性を決定する方法を提供する。
【００４２】
第７様相及び第８様相の前記方法は、前記宿主細胞を、プロテアーゼポリペプチドを含むと疑われる試料と接触させる段階を含む。前記接触は、プロテアーゼ活性の切断部位が分解させる条件下でも行われる。前記プロテアーゼは、神経毒素ポリペプチドでもある。前記接触は、液体媒質中で行われるものでもある。前記液体媒質は、前記プロテアーゼのタンパク質分解活性を作動させる条件を有するものでもある。前記条件は、ｐＨ、温度、補助因子、塩濃度、またはそれらの組み合わせでもある。前記液体媒質は、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）のような緩衝溶液、または宿主細胞が培養される培地でもある。
【００４３】
第７様相及び第８様相の前記方法において、前記宿主細胞は、前記プロテアーゼを、細胞内、例えば、細胞質内に転置させるものでもある。前記宿主細胞は、プロテアーゼ、例えば、神経毒素ポリペプチドを、細胞内、例えば、細胞質中に転置させる細胞でもある。前記宿主細胞は、例えば、プロテアーゼと、受容体を介して結合し、その複合体を細胞内例えば、細胞質中に転置させるものでもある。しかし、請求された発明が、特定の転置メカニズムに限定されると解釈されるものではない。前記宿主細胞は、プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを、細胞質内で発現することができる細胞でもある。前記宿主細胞は、プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを含むものでもある。該プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドは、染色体内に挿入されているか、あるいは染色体外に存在するものでもある。該プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドは、一時的または安定して（stably）発現されるものでもある。該プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドは、それ自体、またはベクターのようなビークルに含まれた形態でもある。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞外部から導入されたものでもある。前記宿主細胞は、組み換え細胞でもある。前記宿主細胞は、内分泌性細胞でもある。前記宿主細胞は、一次ニューロン、neuroblastoma細胞、及び万能幹細胞から分化されたニューロンからなる群から選択されたものでもある。前記宿主細胞は、前記組み換えポリヌクレオチドを発現することができるものでもある。前記宿主細胞は、前記組み換えポリヌクレオチドから、レポーターモイエティ、脱安定化モイエティ、及び前記レポーターモイエティと前記脱安定化モイエティとを作動的に連結する基質モイエティであって、前記基質モイエティは、プロテアーゼ活性の切断部位を含むものである基質モイエティを含むポリペプチド、または前記ポリペプチドと前記内部標準レポータータンパク質とを発現するものでもある。
【００４４】
第７様相及び第８様相の前記方法は、また、接触された産物中の前記レポーターモイエティ、内部標準レポーターまたはその産物から放出される信号を測定する段階を含む。前記レポーターモイエティまたは内部標準レポーターが、検出可能な信号を放出するポリペプチドである場合、前記段階は、前記信号を直接に測定するものでもある。例えば、前記レポーターモイエティが、ＧＦＰのような蛍光タンパク質である場合、その蛍光を測定するものでもある。該蛍光の測定は、前記接触された産物に励起光を照射し、前記接触された産物から出る放射光を測定するものでもある。該励起光及び該放射光の波長は、選択される蛍光タンパク質によって適切に選択することができる。前記レポーターモイエティまたは内部標準レポーターが、それによって触媒される反応において検出可能な信号を放出する物質に転換するポリペプチドである場合、前記段階は、接触された産物中に、前記レポーターモイエティの触媒活性に必要な基質を添加し、該基質を、検出可能な信号を放出する物質に転換させる段階をさらに含んでもよい。次に、検出可能な信号を放出する物質から、前記信号を測定するものでもある。例えば、前記レポーターモイエティまたは内部標準レポーターは、ルシフェラーゼであり、前記接触させる段階、または信号を測定する段階は、反応液内にルシフェラーゼ基質を添加する段階を含み、前記検出は、前記ルシフェラーゼ基質の酵素的転換を測定するためのものでもある。前記ルシフェラーゼ基質は、ルシフェリンでもある。例えば、前記レポーターモイエティは、ルシフェラーゼであり、前記接触させる段階、または信号を測定する段階は、反応液内にルシフェラーゼ基質を添加する段階を含み、前記検出は、前記ルシフェラーゼ基質の酵素的転換を測定するためのものでもある。前記ルシフェラーゼ基質は、ルシフェリンでもある。
【００４５】
第７様相及び第８様相の方法において、前記レポーターは、蛍光タンパク質であり、前記測定する段階は、前記蛍光タンパク質から出る蛍光を測定するものを含むものでもある。
【００４６】
第７様相及び第８様相の方法において、前記測定された信号を対照群から測定された信号と比較する段階をさらに含むものでもある。前記対照群は、神経毒素ポリペプチドがないか、あるいは知られた濃度の神経毒素ポリペプチドを含む試料を使用したものを除いては、同一過程によって測定されたものでもある。前記方法は、前記比較する段階によって得られた信号と試料とにおいて、神経毒素ポリペプチドのレベルとの相関関係により、試料中の神経毒素ポリペプチドのレベルを決定する段階をさらに含むものでもある。
【００４７】
第７様相及び第８様相の方法において、前記組み換えポリヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチドの上流または下流に連結されたバイシストロン配列、及び前記バイシストロン配列の上流または下流に作動可能に連結された内部標準レポーターをコーディングするポリヌクレオチドをさらに含むものでもある。その場合、前記方法は、内部標準レポーターから放出される信号を測定する段階をさらに含むものでもある。前記方法は、また、内部標準レポーターから放出される信号対比で、前記レポーターから放出される信号のレベルを決定する段階をさらに含むものでもある。
【００４８】
第８様相の前記方法は、前記測定された信号から、前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上を決定する段階を含む。前記信号の放出開始点、及び持続時間のうち１以上は、当業者により、前記測定された信号から容易に決定される。例えば、当業者は、経時的プロテアーゼ活性を示す信号値、例えば、放出された信号から、前記信号の放出開始時点及び持続時間を決定することができる。前記経時的プロテアーゼ活性を示す信号値は、経時的に放出された信号の測定値から、前記信号の放出開始時点及び持続時間を決定することができる。前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上は、プロテアーゼタイプのような特性によっても異なる。前記レポーターモイエティが、検出可能な信号を放出するポリペプチドである場合、該プロテアーゼ活性によって切断部位が分解される場合、放出された信号が増大し始め、プロテアーゼ活性が消える場合、放出された信号が低減するものでもある。例えば、同一条件で測定された場合、該プロテアーゼの特性により、前記信号の放出開始時点とその持続時間のうち１以上が異なりもする。また、前記プロテアーゼは、そのような相対的比較だけではなく、前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上の絶対値またはその範囲から、他のプロテアーゼとも区別される。従って、前記決定する段階は、知られたプロテアーゼに係わる前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上と比較すること、または知られたプロテアーゼの前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上の絶対値またはその範囲から、プロテアーゼ特性を決定することを含んでもよい。前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上により、そのプロテアーゼにより、治療される適応症が異なりもする。従って、前記方法は、決定されたプロテアーゼ特性に基づいて、該プロテアーゼにより、個体で治療される適応症を決定することを含んでもよい。
【００４９】
第８様相の前記方法は、細胞の損傷なしに、例えば、細胞粉砕（lysis）なしに、前記測定された信号から、前記信号の放出開始時点及び持続時間のうち１以上を決定する段階を含んでもよい。
【００５０】
第９様相は、前記宿主細胞にプロテアーゼポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチド導入させる段階と、前記ポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を培養し、培養物中の前記レポーターモイエティ、前記内部標準レポーターまたはその産物から放出される信号を測定する段階と、を含む、宿主細胞がプロテアーゼを発現または阻害することができる能力を測定する方法を提供する。
【００５１】
前記方法は、前記宿主細胞に、プロテアーゼポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチド導入させる段階を含む。宿主細胞及びプロテアーゼについては、前述の通りである。導入させる段階は、形質転換（transformation）、形質感染（transfection）または形質導入（transduction）のような任意のポリヌクレオチドを細胞に導入する方法にもよる。前記宿主細胞は、プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを、細胞質内で発現することができる細胞でもある。前記宿主細胞は、プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを含むものでもある。該プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドは、染色体内に挿入されているか、あるいは染色体外に存在するものでもある。該プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドは、一時的または安定して発現されるものでもある。該プロテアーゼ、例えば、タンパク質分解活性神経毒素ポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドは、それ自体、またはベクターのようなビークルに含まれた形態でもある。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞外部から導入されたものでもある。前記宿主細胞は、組み換え細胞でもある。前記宿主細胞は、内分泌細胞でもある。前記宿主細胞は、一次ニューロン、neuroblastoma細胞、及び万能幹細胞から分化されたニューロンからなる群から選択されたものでもある。
【００５２】
前記方法は、前記ポリヌクレオチドが導入された宿主細胞を培養し、培養物中の前記レポーターモイエティ、前記内部標準レポーターまたはその産物から放出される信号を測定する段階を含む。前記培養は、試験物質の存在下で行われる。前記試験物質は、タンパク質、多糖のような重合体であるか、あるいは小さい分子化合物（small molecule compound）でもある。前記試験物質は、プロテアーゼを阻害するか、あるいは促進すると見られる物質でもある。前記宿主細胞は、前記候補物質をコーディングするポリヌクレオチドが導入されたものでもある。従って、前記方法は、プロテアーゼ活性を調節する物質をスクリーニングする方法でもある。前記スクリーニングする方法において、試験物質を使用して得られた信号である実験群信号と、対照群実験から得られた信号である対照群信号とを比較する段階を含んでもよい。前記対照群は、プロテアーゼ活性を調節すると知られた物質を使用した陽性対照群、または前記候補物質を除いて同一に遂行して得られた陰性対照群でもある。前記方法は、前記比較する段階から得られた比較結果から、候補物質がプロテアーゼ活性を調節する物質であるか否かということを決定する段階を含んでもよい。例えば、前記実験群信号が、陰性対照群信号より大きい場合、前記物質は、プロテアーゼ活性を促進する活性を有すると決定することができる。また、前記実験群信号が、陰性対照群信号より小さい場合、前記物質は、プロテアーゼ活性を阻害する活性を有すると決定することができる。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明について、実施例を介して、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【００５４】
実施例１：レポーターモイエティ・基質モイエティ・脱安定化モイエティ（以下、「Ｒ−Ｓ−Ｄ」ともいう）ポリペプチドをコーディングする組み換えポリヌクレオチド、及びそれを含む細胞の作製
（１）レポーターモイエティ・基質モイエティ・脱安定化モイエティ（以下、「Ｒ−Ｓ−Ｄ」ともいう）ポリペプチドをコーディングする組み換えポリヌクレオチドの作製
前記組み換えポリヌクレオチドは、２つの構造を作製した。一つは、Ｒ−Ｓ−Ｄ構造を有するポリペプチドをコーディングするものであり、他の一つは、Ｉ−Ｂ−Ｒ−Ｓ−Ｄ構造を有するポリペプチドをコーディングするものである。ここで、Ｉ及びＢは、それぞれ内部標準レポーターをコーディングするヌクレオチド配列及びバイシストロン配列である。前記組み換えポリヌクレオチドは、プラスミドベクターの形態である。
【００５５】
前記内部標準レポーターまたはレポーターモイエティは、発光タンパク質あるいは蛍光タンパク質をコーディングしているヌクレオチド配列を使用した。具体的には、発光タンパク質をコーディングする配列は、ホタル・ルシフェラーゼタンパク質（ＦＬｕｃ：firefly luciferase）（例：配列番号９）をコーディングするヌクレオチド配列（例：配列番号１）と、ナノ・ルシフェラーゼタンパク質（ＮＬｕｃ：nano−luciferase）（配列番号１０）をコーディングするヌクレオチド配列（配列番号２）とを使用し、蛍光タンパク質をコーディングする配列は、強化された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ：enhanced green fluorescence protein）（配列番号１１）をコーディングしているヌクレオチド配列（配列番号３）またはｍチェリータンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）（配列番号１２）をコーディングしているヌクレオチド配列（配列番号４）を使用した。
【００５６】
前記バイシストロン配列は、豚テスコウイルス−１（teschovirus−１）に由来した自家切断ペプチドをコーディングするヌクレオチド配列（Ｐ２Ａ）（配列番号５）を使用した。
【００５７】
タンパク質分解酵素の基質モイエティは、ボツリヌス毒素タイプＡ型の場合、ヒトＳＮＡＰ２５のＣ末端部位であって、全体２０７個アミノ酸配列のうち１４５番から２０７番までのアミノ酸配列（配列番号１４）をコーディングするヌクレオチド配列（配列番号６）、またはボツリヌス毒素タイプＢ型の場合、ヒトＶＡＭＰ２（配列番号１８）をコーディングするヌクレオチド配列（配列番号１７）を使用した。
【００５８】
脱安定化モイエティは、ＰＥＳＴ配列（配列番号１６）をコーディングするヌクレオチド配列（配列番号８）、及びＣＬ１配列（配列番号１５）をコーディングするヌクレオチド配列（配列番号７）を使用した。
【００５９】
前記組み換えポリヌクレオチドの作製過程は、次の通りであった。
【００６０】
まず、ｐＧＬ４．３１ベクター（Promega）から、ホタル・ルシフェラーゼタンパク質（ＦＬｕｃ）（配列番号９）をコーディングするヌクレオチド（配列番号１）（以下、「ＦＬｕｃ配列」とする）を、ｐＮＬ１．１ベクター（Promega）から、ナノ・ルシフェラーゼタンパク質（ＮＬｕｃ）（配列番号１０）をコーディングするヌクレオチド配列（配列番号２）（以下、「ＮＬｕｃ配列」とする）を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（clontech）から、強化された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）（配列番号１１）をコーディングするヌクレオチド配列（配列番号３）（以下、「ｅＧＦＰ配列」とする）を、ｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｃ１ベクターから、ｍチェリータンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）（配列番号１２）をコーディングしているヌクレオチド配列（配列番号４）（以下、「ｍＣｈｅｒｒｙ配列」とする）を得た。ヒトＳＮＡＰ２５のＣ末端部位として、全体２０７個アミノ酸配列のうち１４５番から２０７番までのアミノ酸配列をコーディングするヌクレオチド配列（配列番号６）（以下、「ＳＮＡＰ２５配列」とする）と、ヒトＶＡＭＰ２をコーディングするヌクレオチド配列（以下、「ＶＡＭＰ２配列」とする）は、ヒト由来細胞株のｍＲＮＡにおいて、ＲＴ−ＰＣＲを介してヌクレオチド配列を合成した。ＣＬ１とＰＥＳＴとが融合されたＣＬ１−ＰＥＳＴポリペプチドをコーディングする配列（以下、「ＣＬ１−ＰＥＳＴ配列」とする）、及び豚テスコウイルス−１（teschovirus−１）に由来した自家切断ペプチドＰ２Ａをコーディングするヌクレオチド配列（以下、「Ｐ２Ａ配列」とする）は、遺伝子合成を介して得た。
【００６１】
次に、前記の配列の組み合わせで、Ｒ−Ｓ−ＤあるいはＩ−Ｂ−Ｒ−Ｓ−Ｄの組み換えられたポリヌクレオチドを、制限酵素を利用した遺伝子クローニング法を利用して作製し、ｐＣＤＮＡ４ベクター（invitrogen）またはｐＦＢベクター（Agilent）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ制限酵素部位に連結し、組み換えベクターを作製した。例として、ＮＬｕｃ配列・ＳＮＡＰ２５配列・ＣＬ１−ＰＥＳＴ配列で構成された組み換えポリヌクレオチドが、ｐＣＤＮＡ４ベクターのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ酵素部位に導入されたベクター（以下、「ｐＣＤＮＡ４ベクター１」ともいう）、またはｐＦＢベクターのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ酵素部位に導入されたｐＦＢベクター（以下、「ｐＦＢベクター１」ともいう）を作製した。また、前記ｍＣｈｅｒｒｙ配列、ＳＮＡＰ２５配列及びＣＬ１−ＰＥＳＴ配列で構成された組み換えポリヌクレオチドが、ｐＣＤＮＡ４ベクターのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ酵素部位に導入されたベクター（以下、「ｐＣＤＮＡ４ベクター２」ともいう）、またはｐＦＢベクターのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ酵素部位に導入されたｐＦＢベクター（以下、「ｐＦＢベクター２」ともいう）を作製した。また、前記ＦＬｕｃ配列、Ｐ２ａ配列、ＮＬｕｃ配列、ＳＮＡＰ２５配列及びＣＬ１−ＰＥＳＴ配列で構成された組み換えポリヌクレオチドが、ｐＣＤＮＡ４ベクターのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ酵素部位に導入されたベクター（以下、「ｐＣＤＮＡ４ベクター３」という）、またはｐＦＢベクターのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ酵素部位に導入されたｐＦＢベクター（以下、「ｐＦＢベクター３」ともいう）を作製した。また、前記ＦＬｕｃ配列、Ｐ２ａ配列、ＮＬｕｃ配列、ＶＡＭＰ２配列及びＣＬ１−ＰＥＳＴ配列で構成された組み換えポリヌクレオチドが、ｐＦＢベクターのＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ酵素部位に導入されたｐＦＢベクター（以下、「ｐＦＢベクター４」ともいう）を作製した。
【００６２】
ここで、ｐＣＤＮＡ４ベクターは、プラスミド由来のベクターであり、細胞で前記組み換えポリヌクレオチドを、一時的発現をなさせるために使用した。一方、ｐＦＢベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ：Moloney murine leukemia virus）由来のベクターであり、形質感染を介して操作された細胞株、すなわち、前記組み換えポリヌクレオチドが染色体内に導入された細胞株作製に使用された。
【００６３】
作製されたプラスミドベクター及びウイルスベクターは、シクォンシングを介して、作製物の構成を確認し、細胞培養用レベルで、プラスミドベクターＤＮＡを精製及び分離した。
【００６４】
（２）Ｒ−Ｓ−ＤポリペプチドまたはＩ−Ｂ−Ｒ−Ｓ−Ｄポリペプチドを発現する細胞の作製
前記（１）で作製されたベクターを、安定して一定に発現する細胞株を構築するために、ＭＭＬＶ由来ウイルスベクター、すなわち、ｐＦＢベクターを利用した形質導入法を遂行した。ＭＭＬＶ由来ウイルスベクターを利用した形質感染法は、当業界で広く遂行される方法であり、当該参照文献を参照した（Felts Ka et al., Mol Biotechnol. 2002 Sep; 22 (1): 25-32）。簡略に説明すれば、パッケージングのための細胞であるＨＥＫ−２９３Ｔ（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−３２１６）細胞を、１０％ ＦＢＳ（fetal bovine serum）が含まれたＤＭＥＭ培地１０ｍｌに、１Ｘ１０７の細胞個数を、５５ｃｍ２カルチャディッシュにシーディングし、２４時間、３７℃及び５％ ＣＯ２インキュベータで培養した後、（１）で作製された本発明の組み換えポリヌクレオチドｐＦＢベクター、すなわち、ｐＦＢベクター１，２，３または４、ｐＣＭＶ−ｇａｇｐｏｌ（Cell Biolabs，ｉｎｃ．）、及びｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（Cell Biolabs，ｉｎｃ．）を、３：２：１の比率で混合した。このとき、ｐＦＢベクターは、７．５μｇを使用した。このベクターの混合物は、形質感染を行うために、LipofectamineＴＭ ３０００（invitrogen）を利用し、形質導入方法は、製造者の指針によって遂行した。形質導入後の４８時間、細胞を同一条件で培養した。それにより、前記ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から、感染性あるパッケージングされたｐＦＢベクター１，２，３または４含有ウイルスを生産した。
【００６５】
次に、生産された前記感染性あるパッケージングされたｐＦＢベクター１，２，３または４含有ウイルスを目的細胞に形質感染させ、安定化されて一定に発現する細胞株を確立した。該目的細胞は、ＮＧ１０８−１５細胞（ＡＴＣＣ−ＨＢ−１２３１７）、ＳｉＭａ細胞（ＤＳＭＺ：ＡＣＣ−１６４）及びＮＴ２細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１９７３）を使用した。ＮＧ１０８−１５細胞は、鼠の神経芽細胞腫（neuroblastoma）とラットの神経膠腫との雑種細胞であり、神経細胞への分化を介して、ボツリヌス毒素Ａ型に対する感受性が確認された細胞株であり（Whitemarsh RC et al., Biochem Biophys Res Commun. 2012 Oct 19; 427 (2): 426-30）、ＳｉＭａ細胞は、ヒト由来神経芽細胞腫由来の細胞株であり、神経細胞への分化を介して、ボツリヌス毒素Ａ型に対する感受性が確認された細胞株であり（Fernandez-Salas E et al., PLoS One. 2012; 7 (11): e49516）、ＮＴ２細胞は、ヒトの睾丸に由来した胎生期癌（embryonal carcinoma）細胞株であり、多分化能を有しており、特定条件下で神経細胞に分化が進み、神経細胞に分化されたＮＴ２細胞は、ボツリヌス毒素Ａ型に対する感受性が確認された（Tegenge et al., Cell Mol Neurobiol. 2012 Aug; 32 (6): 1021-9）。
【００６６】
目的ポリペプチドの発現が安定化された細胞株作製の具体的過程は、次の通りである。
【００６７】
まず、該目的細胞は、感染一日前、１０％ ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭ培地０．５ｍｌを含む２４−ウェル（well）プレートの各ウェル当たり、約１ｘ１０５細胞にシーディングし、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータで１日培養した。また、前述のところで収集されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の培養上澄み液を、０．４５μｍシリンジフィルタを利用して濾過し、細胞と細胞残骸とが除去されたウイルス溶液を得た。そのように得られたウイルス溶液を、１ｍｌ／ウェル（２４ウェル）の濃度で培地が除去された、前記目的細胞が培養されたウェルに添加し、同一条件で６時間培養し、感染を起こさせた。感染時、目的細胞への感染効率を高めるために、polybreneを８ｍｇ／ｍｌレベルで添加した。６時間後、前記培地を、一般細胞培養用培地である１０％ ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭ培地に交換し、２日間同一条件で培養した。
【００６８】
次に、２４ウェルで感染された目的細胞は、２日間培養後、５５ｃｍ２カルチャディッシュに移送され、ｐＦＢベクターの選択的抗生剤であるゲネチシン（geneticin；Gibco）を、５００〜１，０００μｇ／ｍｌで添加し、５日間培養した。適切な抗生剤の用量は、目的細胞とgeneticinとの滴定試験（titration）に基づいて処理した。ＮＴ２細胞が目的細胞である場合、１０ｍｌの細胞培養用培地を含んだカルチャディッシュにおいて、５日間８００μｇ／ｍｌのゲネチシン存在下で培養した。
【００６９】
次に、単一細胞クローンを形成するために、目的細胞を２細胞／wellの濃度で、９６ウェルのウェルに移送した。５５ｃｍ２カルチャディッシュ培養で使用された同一培地１００μｌを含んだ９６ウェルプレートの各ウェルにおいて、同一条件下で４週間培養をしながら、単一細胞のクローンが形成されたコロニーを、細胞培養用顕微鏡を介して選別し、拡張培養を行った。
【００７０】
該段階で製造された組み換えポリヌクレオチドの構成により、前選別過程を遂行することができる。すなわち、内部標準レポータータンパク質が蛍光タンパク質である場合、蛍光顕微鏡を利用し、または内部標準レポータータンパク質が発光タンパク質である場合、発光分析を介して、前選別過程を遂行した。
【００７１】
また、内部標準レポータータンパク質が存在しない組み換えポリヌクレオチドの前選別過程のため、または内部標準レポータータンパク質が存在する各単一クローン細胞株の感度優秀性をまず選別するために、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（Sigma）を、１０μＭ培地の濃度で添加するか、あるいは前記組み換えポリヌクレオチドがＳＮＡＰ２５配列を含む場合に限定し、ボツリヌス毒素タイプＡ型の軽鎖ＤＮＡを、前記組み換えポリヌクレオチドが、ＶＡＭＰ２配列を含む場合、ボツリヌス毒素タイプＢ型の軽鎖ＤＮＡをLipofectamineＴＭ ３０００（invitrogen）を使用し、製造者の指針によって形質導入した。このとき、ＢｏＮＴ／ＡＬＣとＢｏＮＴ／ＢＬＣは、ｐＣＤＡ４のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に導入された。該方法は、９６ウェルにおいて、約３〜４週間培養しながら、単一クローンのコロニーが確認された細胞に限り、同個数の細胞を、９６ウェルプレート２枚に独立してシーディングし、１枚は、選別のための実験に使い、１枚は、維持培養用に利用した。
【００７２】
そのような選別過程を介して、単一クローン由来の細胞株は、それぞれ拡張培養を行って凍結保管した。該凍結保管法は、一般的な哺乳動物細胞の凍結保管法で遂行したが、簡略に説明すれば、５ｘ１０７ないし１ｘ１０７の細胞を、５％あるいは１０％のＤＭＳＯが含まれた培養培地１ｍｌに希釈し、凍結用バイアルに入れ、プログラム化された凍結容器を利用し、−８０℃まで温度を低くし、その後、液化窒素タンクのガス相で保管した。
【００７３】
その結果、ｐＦＢベクター１，２，３，４または６含有ウイルスを、安定化されて一定に発現する細胞株ＮＧ１０８−１５細胞、ＳｉＭａ細胞及びＮＴ２細胞を確立した。
【００７４】
（３）確立されたＮＧ１０８−１５細胞、ＳｉＭａ細胞及びＮＴ２細胞の神経細胞への分化及び毒素中毒法
ＮＧ１０８−１５細胞、ＳｉＭａ細胞及びＮＴ２細胞は、神経芽細胞腫細胞株または胚性癌（embryonal carcinoma cell）細胞株であり、それらは、神経細胞に分化される場合、ボツリヌス毒素の感受性があると知られている。従って、それら細胞を、次の過程によって神経細胞に分化させた。
【００７５】
ＮＧ１０８−１５細胞は、１０（ｖ／ｖ）％ ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地において、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータで維持培養した。神経細胞分化のために、matrigel（ＢＤ science）がコーティングされた細胞培養用９６ウェルプレートの各ウェルに、２ｘ１０４細胞／ウェルの濃度で細胞をシーディングし、約５日間、レチノイン酸（retinoic acid）５０μＭとパルモルファミン（purmophamine）２５μＭとが添加されたneurobasal培地（Gibco）で同一条件で培養した。前記neurobasal培地は、補充剤として、Ｂ２７（Gibco）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Gibco）及びnon−essential amino acid（Gibco）をそれぞれ１Ｘの量で含んでいる。
【００７６】
ＳｉＭａ細胞は、１０（ｖ／ｖ）％ ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ培地において、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータで維持培養した。神経細胞分化のために、matrigel（ＢＤscience）がコーティングされた細胞培養用９６ウェルプレートの各ウェルに、５ｘ１０４細胞／ウェルの濃度で細胞をシーディングし、約５日間、レチノイン酸５０μＭが添加された無血清ＭＥＭ培地（Welgene）で同一条件で培養した。前記ＭＥＭ培地は、補充剤としてＢ２７（Gibco）、Ｎ２（Gibco）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Gibco）、ＨＥＰＥＳ（Gibco）及びnon−essential amino acid（Gibco）をそれぞれ１Ｘの量で含んでいる。
【００７７】
ＮＴ２細胞（以下、「ＮＴｔｅｒａ２細胞」ともいう）は、１０（ｖ／ｖ）％ ＦＢＳが添加されたα−ＭＥＭ培地（Welgene）において、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータで維持培養した。神経細胞分化のために、ペトリディッシュ（petri dish）の各ウェルに、１ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度で細胞をシーディングし、１週間、レチノイン酸５０μＭが添加された分化用培地で、同一条件で２日あるいは３日ごとに培地を交換しながら培養した。分化用培地は、１０（ｖ／ｖ）％ ＦＢＳが添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Welgene）培地を使用した。
【００７８】
そのように培養された細胞は、球状体を形成し、１週間の培養後、球状体を収集し、同一面積の一般細胞培養プレートに球状体を移送し、付着細胞として、１週間、同一条件で、レチノイン酸５０μＭが添加された前記分化培地において、２〜３日ごとに培地を交換しながら培養した。その後、付着した細胞を、トリプシンを利用して脱群集化及び脱付着化させて細胞個数を数えた。
【００７９】
１ｘ１０７細胞を、１７５Ｔフラスコ（Ｎｕｎｃ）に移送し、有糸分裂阻害剤（mitotic inhibitor）が添加された前記分化用培地で、同一条件で、２〜３日ごとに培地を交換しながら１０日間培養した。有糸分裂阻害剤は、ＡｒａＣ １μＭ、ウリジン（uridine）１０μＭ及びフロクスウリジン（floxuridine）１０μＭであった。神経細胞に分化された細胞は、トリプシンを利用して脱付着化させながら、ここで得られた細胞は、凍結保管した。凍結保管用培地は、凍結用培地を利用し、凍結法は、前記細胞凍結方法を利用した。分化された神経細胞は、matrigelがコーティングされた細胞培養用９６ウェルプレートに、ウェル当たり１ｘ１０５細胞レベルにシーディングし、前記分化用培地において、約１０日以上培養しながら、培地は２〜３日間ごとに交換した。
【００８０】
（４）分化された神経細胞に対するボツリヌス毒素の中毒化
分化された神経細胞において、ボツリヌス毒素タイプＡ型の中毒化は、次のように行った。精製された毒素タンパク質の中毒化は、前記分化用培地に精製された毒素タンパク質を適切な濃度に希釈した後、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータにおいて維持培養中の前記神経細胞の培養液と交換した。その後、同一条件で２４時間培養し、毒素中毒化を誘導し、その後、培地を前記分化用培地に交換し、７２時間同一条件で培養した。
【００８１】
前記分化用培地を、商業的に販売されるボツリヌス毒素医薬品バイアル（Medidoxin；Neuronox）に添加し、凍結乾燥した毒素タンパク質と賦形剤とを懸濁した後、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータで維持培養中である細胞の培養液と交換した。完製品バイアルに対する毒素力価実験は、賦形剤の処理量を同一にするために、毒素プラシーボバイアルを利用した。毒素プラシーボバイアルは、完製品毒素バイアルにおいて、毒素タンパク質だけを除去した。
【００８２】
すなわち、毒素完済バイアルと毒素プラシーボバイアルとを同量に懸濁した後、各処理濃度により、中毒させる培地の総量を同一に処理した。
【００８３】
（５）レポーターモイエティまたは内部標準レポーターの定量分析
前記組み換えポリヌクレオチドから発現されたレポーターモイエティまたは内部標準レポータータンパク質の定量分析は、次のように行った。
【００８４】
本発明の前記組み換えポリヌクレオチドにおいて、発光タンパク質を、レポーターモイエティあるいは内部標準レポータータンパク質として利用した場合、発光分析法を介して、前記発光タンパク質を定量分析した。該レポーターモイエティがＮＬｕｃである場合、nano−luciferase assay kit（promega）によって分析した。
【００８５】
レポーターモイエティがＮＬｕｃであり、内部標準レポータータンパク質がＦＬｕｃである場合、one−ｇｌｏ dual nano−luciferase assay kit（promega社）を利用し、試験は、供給者のマニュアル通り行い、発光は、SpectraMax（MolecularDevice社）を使用して測定した。正規化（normalization）のために測定されたＮＬｕｃ値は、内部標準レポータータンパク質であるＦＬｕｃ値で割った値を結果値として利用した。
【００８６】
本発明の前記組み換えポリヌクレオチドにおいて、蛍光タンパク質を、レポーターモイエティあるいは内部標準レポータータンパク質として利用した場合、蛍光測定器を介して、蛍光値を定量分析した。レポーターモイエティがｍＣｈｅｒｒｙであり、内部標準レポータータンパク質がｅＧＦＰである場合、蛍光測定器であるSpectraMax（MolecularDevice社）を使用し、ｍＣｈｅｒｒｙの場合、６１０ｎｍ波長で励起して５０７ｎｍ波長で放出値を測定した。ｅＧＦＰの場合４８８ｎｍ波長で励起し、５０７ｎｍ波長で放出値を測定した。正規化のために測定されたｍＣｈｅｒｒｙの放出値は、内部標準レポータータンパク質であるｅＧＦＰの放出値で割った値を結果値として利用した。また、incucyte機器（Essen Bioscience社）を利用し、ＧＦＰとＲＦＰとの蛍光値を測定し、正規化を行い、結果値として利用することができる。ｅＧＦＰは、ＧＦＰ系であり、ｍＣｈｅｒｒｙは、ＲＦＰ系である。
【００８７】
（６）結果
図５は、ｐＦＢベクター１に形質感染されたＮＧ１０８−１５細胞を、神経細胞に分化させた後、ボツリヌス毒素Ａで中毒化させた後、レポーターモイエティの活性を測定した結果を示す。図５において、ｐＦＢベクター１に形質感染されたＮＧ１０８−１５細胞の作製、神経細胞への分化、ボツリヌス毒素Ａによる中毒化、及びレポーターモイエティの活性測定は、前記（３）、（４）及び（５）に記載された通りである。図５において、ナノ・ルシフェラーゼの活性測定は、中毒化のために、最終的に、７２時間培養された細胞を、前述のnano−luciferase kitを利用して発光度を測定した。図５に図示されているように、測定されたナノ・ルシフェラーゼの活性は、１０ｎＭボツリヌス毒素Ａで中毒化させたものが、そうではない場合に比べ、著しく増大した相対的発光単位（relative luminescence unit）を示した。
【００８８】
図６は、ｐＦＢベクター２に形質感染されたＮＧ１０８−１５細胞を神経細胞に分化させた後、ボツリヌス毒素Ａで中毒化させた後、細胞を蛍光顕微鏡で確認した結果を示す。図６において、ｐＦＢベクター２に形質感染されたＮＧ１０８−１５細胞の作製、神経細胞への分化、及びボツリヌス毒素Ａによる中毒化は、前記（３）及び（４）に記載された通りである。図６に示された結果は、Olympus ＦＳＸ−１００機器蛍光顕微鏡を使用し、中毒化のために、最終的に、７２時間培養された細胞を蛍光観察した。
【００８９】
図６において、対照群は、ボツリヌス毒素Ａ濃度が０ｎＭである対照群であり、ＢｏＮＴ／Ａ１ｎＭは、ボツリヌス毒素Ａ濃度が１ｎＭである実験群を示す。図６に示されているように、実験群において、赤色蛍光を帯びる細胞が顕著に増加した。
【００９０】
図５及び図６の結果は、ボツリヌス毒素Ａにより、ＳＮＡＰ２５の切断部位が切断されない場合、ＮＬｕｃ−ＳＮＰＡ２５基質モイエティ−ＣＬ１−ＰＥＳＴ構造のポリペプチドが容易に分解され、相対的発光単位が低い一方、ボツリヌス毒素Ａにより、ＳＮＡＰ２５の切断部位が切断される場合、ＮＬｕｃ−ＳＮＰＡ２５基質モイエティ−ＣＬ１−ＰＥＳＴ構造のポリペプチドが、分解から安定化され、相対的発光単位が高いということを示す。
【００９１】
図７は、ｐＦＢベクター３に形質感染されたＮＧ１０８−１５細胞を神経細胞に分化させた後、ボツリヌス毒素Ａによって中毒化させた後、該細胞を蛍光顕微鏡で確認した結果を示す。図７において、ｐＦＢベクター３に形質感染されたＮＧ１０８−１５細胞の作製、神経細胞への分化、ボツリヌス毒素Ａによる中毒化、及びレポーターモイエティの活性測定は、前記（３）、（４）及び（５）に記載された通りである。図７において、ホタル・ルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）及びナノ・ルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）の活性測定は、中毒化のために、最終的に、７２時間培養された細胞を、one−ｇｌｏ nano dual luciferase kitを利用して発光度を測定した。
【００９２】
図７に示されているように、測定されたホタル・ルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）に対するナノ・ルシフェラーゼの相対的活性は、１０ｎＭボツリヌス毒素Ａによって中毒化させたものが、そうではない場合に比べ、顕著に増大した相対的発光単位（relative luminescence unit）を示した。図７において、ＢｏＮＴ／Ａ０ｎＭは、ボツリヌス毒素Ａ濃度が０ｎＭである対照群であり、ＢｏＮＴ／Ａ１ｎＭは、ボツリヌス毒素Ａ濃度が１ｎＭである実験群を示す。図７に示されているように、測定されたナノ・ルシフェラーゼの活性は、１０ｎＭボツリヌス毒素Ａによって中毒化させたものが、そうではない場合に比べ、顕著に増大した相対的発光を示した。
【００９３】
図８は、ｐＦＢベクター３に形質感染されたＳｉＭａ細胞を神経細胞に分化させた後、ボツリヌス毒素Ａによって中毒化させた後、細胞を蛍光顕微鏡で確認した結果を示す。
【００９４】
図９は、ｐＦＢベクター３に形質感染されたＮＴ２細胞を神経細胞に分化させた後、ボツリヌス毒素Ａによって中毒化させた後、細胞を蛍光顕微鏡で確認した結果を示す。
【００９５】
図８及び図９は、細胞として、ＮＧ１０８−１５を使用した代わりに、ＳｉＭａ細胞及びＮＴ２細胞をそれぞれ使用したものを除いては、図７の過程と同一過程によって測定されたものである。図８及び図９に示されているように、測定されたナノ・ルシフェラーゼの活性は、１０ｎＭボツリヌス毒素Ａによって中毒化させたものが、そうではない場合に比べ、顕著に増大した相対的発光を示した。
【００９６】
図１０は、ｐＦＢベクター４を利用して形質感染を誘導し、安定してポリペプチドを発現するＮＧ１０８−１５細胞において、ＢｏＮＴ／Ｂの軽鎖を任意発現させた後（ｐＣＤＮＡ４−ＢＬＣ）、発現されたレポーターモイエティ、及び内部標準レポータータンパク質から出る信号を確認した結果を示す。ここで、ｐＣＤＮＡ４−ＢＬＣベクターは、LipofectamineＴＭ ３０００（invitrogen）を使用し、製造者の指針により、形質導入した。形質導入後の４８時間、細胞を同一条件で培養した。それにより、ｐＣＤＮＡ４−ＢＬＣベクターは、ＮＧ１０８−１５細胞において、一時的に発現される。図１０において、縦軸は、ＮＬｕｃ値をＦｌｕｃで正規化した値である。
【００９７】
図１０に示されているように、ホタル・ルシフェラーゼに対して測定されたナノ・ルシフェラーゼの活性は、１０μｇボツリヌス毒素Ｂの軽鎖をコーディングするｐＣＤＮＡ４−ＢＬＣのＤＮＡを導入させたものが、そうではない場合に比べ、顕著に増大した相対的発光を示した。
【００９８】
図１１は、ｐＦＢベクター３が形質導入された安定化された細胞株ＮＴ２細胞を、異なる濃度のＢｏＮＴ／Ａで中毒化させ、発現されたレポーターモイエティタンパク質から出る信号を確認した結果を示す。図１１において、ＢｏＮＴ／ＡＡＰＩは、ＢｏＮＴ／Ａとして、ＢｏＮＴ／Ａを含む製品の製造に使用される原料を示す。ＢｏＮＴ／ＡＡＰＩは、（株）メディトックスから供給された。ｐＦＢベクター３は、LipofectamineＴＭ ３０００（invitrogen）を使用し、製造者の指針によって形質導入した。形質導入後の４８時間、細胞を同一条件で培養した。それにより、ｐＦＢベクター３は、ＮＴ２細胞で一時的に発現される。図１１において、ＲＬＵは、相対的ルシフェラーゼ単位（relative luciferase unit）を示す。図１１に示されているように、ホタル・ルシフェラーゼに対して測定されたナノ・ルシフェラーゼの活性は、１ｐＭないし１０ｎＭの濃度において、ボツリヌス毒素Ａの濃度依存的に、相対的発光単位を示した。それは、ＲＬＵを測定することにより、試料中のボツリヌス毒素、例えば、タイプＡのレベルを測定することができるということを示す。
【００９９】
図１２ないし図１４は、ｐＦＢベクター３が形質導入された安定化されたＮＴ２細胞を、異なる濃度のＢｏＮＴ／Ａ含有完製品で中毒化させ、発現されたレポーターモイエティ、及び内部標準レポータータンパク質から出る信号を確認した結果を示す。図１２ないし図１４は、ＢｏＮＴ／Ａとして、ＢｏＮＴ／Ａを含む製品の製造に使用される原料を使用した代わりに、ＢｏＮＴ／Ａとして、ＢｏＮＴ／Ａを含む製品を使用したものを除いては、同一過程によって測定した。ＢｏＮＴ／ＡＡＰＩに比べ、前記製品は、賦形剤などの成分をさらに含む。図１２、図１３及び図１４は、それぞれＦＬｕｃ、ＮＬｕｃ及びＮＬｕｃ／ＦＬｕｃの値で示したものである。
【０１００】
図１４に示されているように、ホタル・ルシフェラーゼに対して測定されたナノ・ルシフェラーゼの活性は、１Ｕないし１０Ｕの濃度において、ボツリヌス毒素Ａの濃度依存的に相対的発光単位を示した。それは、ＲＬＵを測定することにより、試料中のボツリヌス毒素、例えば、タイプＡのレベルを測定することができるということを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
第１様相による組み換えポリヌクレオチドによれば、それを含んだ宿主細胞及び試料中の神経毒素ポリペプチドのプロテアーゼ活性を決定する方法にも使用される。
【０１０２】
第２様相による前記組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞によれば、試料中の神経毒素ポリペプチドのプロテアーゼ活性を決定する方法に効率的に使用される。
【０１０３】
第３様相及び第４様相による神経毒素ポリペプチドのタンパク質分解活性を決定するためのキットによれば、神経毒素ポリペプチドのタンパク質分解活性を決定するのにも使用される。
【０１０４】
第５様相及び第７様相による試料中の神経毒素ポリペプチドの特性を決定する方法によれば、神経毒素ポリペプチドの特性を効率的に決定することができる。
【０１０５】
第６様相及び第８様相による試料中の神経毒素ポリペプチドのプロテアーゼ活性を決定する方法によれば、試料中の神経毒素ポリペプチドのプロテアーゼ活性を効率的に決定することができる。
【０１０６】
第９様相による宿主細胞がプロテアーゼを発現または阻害することができる能力を測定する方法によれば、宿主細胞が、プロテアーゼを発現または阻害することができる能力を効率的に測定するか、あるいは試験物質が、プロテアーゼ活性を調節することができるか否かということを決定することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019516379.tif 000018
2019516379.tif 000019
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