(57)【要約】  本発明はFMDVワクチン又は組成物を包含する。本発明は、FMDV抗原、エピトープ又は免疫原をコード及び発現する組換えベクターを包含し、前記を用いて、FMDVから動物、特にヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類を防御することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
口蹄疫ウイルス（FMDV）抗原を発現する組換えウイルスベクターを含む組成物又はワクチン。
【請求項２】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスである、請求項１に記載の組成物又はワクチン。
【請求項３】
前記抗原が構造性FMDVタンパク質及び非構造性FMDVタンパク質を含む、請求項１又は２に記載の組成物又はワクチン。
【請求項４】
前記FMDV抗原が配列番号:2、4、6又は8に示される配列を有するポリペプチドを含む、請求項３に記載の組成物又はワクチン。
【請求項５】
前記FMDV抗原が配列番号:1、3、5又は7に示される配列を有するポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１−４のいずれか１項に記載の組成物又はワクチン。
【請求項６】
医薬的又は獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はベヒクルをさらに含む、請求項１−５のいずれか１項に記載の組成物又はワクチン。
【請求項７】
改善された熱安定性及び温度変動処理能力を有する、請求項１−６のいずれか１項に記載の組成物又はワクチン。
【請求項８】
前記医薬的又は獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はベヒクルが、ポリアクリル酸、LF2エマルジョン、LR6エマルジョン、TS6エマルジョン、LR4エマルジョン、カルボマー、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、サポニン、CpG、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、CARBIGENTM及びENABL(商標)から成る群から選択される、請求項１−７のいずれか１項に記載の組成物又はワクチン。
【請求項９】
FMDV感染感受性動物をワクチン免疫するか、又は前記動物でFMDVに対する免疫応答を引き出す方法であって、請求項１−８のいずれか１項に記載の組成物を少なくとも1回投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１０】
プライム-ブースト投与レジメンを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プライム-ブーストレジメンが、請求項１に記載の組成物のプライム投与、及びFMDV抗原をin vivoで発現するためのポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを含む組成物、又はFMDV抗原を含む組成物、又はFMDV抗原を含む不活化ウイルス組成物のブースト投与を含み、FMDVから前記動物を防御し、及び/又は感染動物における疾患の進行を予防する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プライム-ブーストレジメンが、FMDV抗原をin vivoで発現するためのポリヌクレオチドを含む組換えウイルスベクターを含む組成物、又はFMDV抗原を含む組成物、又はFMDV抗原を含む不活化ウイルス組成物のプライム投与、及び請求項１に記載の組成物のブースト投与を含み、FMDVから前記動物を防御し、及び/又は感染動物における疾患の進行を予防する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
母獣由来抗体陽性（MDA陽性）動物をFMDV感染に対して防御する、請求項９−１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（本出願は政府の援助により達成された。当該政府は本発明において一定の権利を有する。）
（関連出願の相互引用）本出願は米国仮特許出願（2016年1月29日出願）の優先権を主張する。
（技術分野）
本発明は、動物の口蹄疫ウイルス（FMDV）感染と闘う組成物に関する。本開示は、FMDV抗原を含む医薬組成物、FMDVに対抗しワクチン免疫する方法、並びにそのような方法及び組成物に関して使用されるキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
口蹄疫（FMD）は、農場飼育動物を冒すもっとも病毒性及び伝染性が強い疾患の1つである。この疾患は世界中の多くの国々、特にアフリカ、アジア及び南アメリカで地域的に流行する。加えて、大流行が周期的に発生しうる。ある国でこの疾患が発生すると、感染群の生産性低下、体重及び乳生産の低下、並びにこれらの国々に課される禁輸措置に起因する非常に深刻な経済的結果をもたらしうる。この疾患に対抗する手段は、輸入制限の厳格な適用、衛生管理及び検疫、病獣の屠殺、並びにワクチンを用いるワクチン免疫プログラムから成り、ワクチン免疫プログラムは、国レベル又は地域レベルで予防的手段として又は大流行発生時に定期的に実施される。
FMDは、その短い潜伏期間、強い伝染性、口内及び脚先端の潰瘍形成、及び時に若齢獣の死亡を特徴とする。FMDは、多数の動物種、特に畜牛、ブタ、ヒツジ及びヤギを冒す。この疾患の原因因子は、ピコルナウイルス科のアフトウイルス属に属するリボ核酸（RNA）ウイルスである（Cooper et al., 1978, Intervirology 10, 165-180）。現在、以下の少なくとも7つの型の口蹄疫ウイルス（FMDV）が知られている：ヨーロッパ型（A、O及びC）、アフリカ型（SAT1、SAT2及びSAT3）、及びアジア型（アジア1）。多数の亜型もまた区別されている（Kleid et al., 1981, Science 214, 1125-1129）。
【０００３】
FMDVは、直径が約25nmの裸の正二十面体ウイルスであり、約8500ヌクレオチドから成る一本鎖RNA分子（プラスの極性を有する）を含む。このRNA分子はただ1つのオープンリーディングフレーム（ORF）を含み、前記ORFは、特にキャプシド前駆体（タンパク質P1又はP88としても知られている）を含む単一ポリプロテインをコードする。タンパク質P1はそのアミノ末端でミリスチル化される。成熟過程で、タンパク質P1は、プロテアーゼ3CによってVP0、VP1及びVP3（又はぞれぞれ1AB、1D及び1C）として知られる3つのタンパク質に切断される（Belsham G.J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261）。ビリオン中では、タンパク質VP0は、続いて2つのタンパク質（VP4及びVP2（又はそれぞれ1A及び1B））に切断される。タンパク質VP0からVP4及びVP2への変換メカニズム並びに成熟ビリオン形成メカニズムは不明である。タンパク質VP1、VP2及びVP3は約26,000Daの分子量を有するが、タンパク質VP4は約8,000Daで小さい。
【０００４】
キャプシドタンパク質の単純な結合が、プロトマー或いは5S分子（前記はFMDVキャプシドの初期構成成分である）を形成する。続いて、このプロトマーはペンタマーへと複合化し、12S分子を形成する。ビリオンは、12の12Sペンタマーの集合によるゲノムRNA分子の被包化から生じ、したがって146S粒子を構成する。ウイルスキャプシドはまた、その内部にRNA分子が存在しなくても形成されうる（以下では“空キャプシド”）。空キャプシドはまた70S粒子と称される。空キャプシドの形成はウイルス複製時に自然に生じるか、又は化学的処理によって人工的に生じうる。
【０００５】
天然の空キャプシドでいくつかの研究が実施された。Rowlandsらは、A10口蹄疫は主として4つのタンパク質（VP1、VP2、VP3及びVP4）を含むことを示した（Rowlands et al., J.Gen.Virol., 1975, 26, 227-238）。比較すると、天然の空キャプシド（組換えでは得られないがA10口蹄疫ウイルスの培養から精製される）は、本質的に非切断タンパク質VP0を含み、A-Pando口蹄疫ウイルスに関して同一の結果がRweyemamuによって記載されている（Rweyemamu et al., Archives of Virology, 1979, 59, 69-79）。Tris-EDTAの存在下での透析後及び遠心分離後に得られる人工空キャプシドは、VP4タンパク質を含まない。これらの人工空キャプシドはRowlandsらにしたがえばわずかに免疫原性で、天然の空キャプシドはホルムアルデヒドで処理しそれらを安定化させた後でのみ免疫原性であるが、それにもかかわらず、モルモットで天然の空キャプシドによって誘発される抗体応答は、著者が認めているように一貫していない。さらにまた、Rowlandsら及びRweyemamuらは、天然の空キャプシドを安定化させる必要性に同意していない。Rweyemamuらの場合、ホルムアルデヒドによる処理のないことは天然の空キャプシドの抗原性レベルについて先入観をもつことにはならない。免疫原性はモルモットの中和抗体誘発によって試験されただけである。
【０００６】
組換えバキュロウイルスの手段による、キャプシドタンパク質の前駆体P1をコードする遺伝子の昆虫細胞での発現が、プロテアーゼ3C結合P1をコードする遺伝子の大腸菌（E. coli）での発現と比較されている（Grubman et al., Vaccine, 1993, 11, 825-829；Lewis et al., J.Virol., 1991, 65, 6572-6580）。大腸菌でのP1及び3Cの共同発現は空キャプシド70Sの集合化をもたらす。これら2つの構築物の発現生成物はモルモット及びブタで中和抗体の産生を生じる。P1/バキュロウイルス構築物により得られる力価は低い。これら同じ発現生成物はブタで部分的な防御を誘発する。しかしながら、当該疾患に対して防御を示したいくらかのブタはチャレンジウイルスの複製に対しては防御を示さない。しかしながら、大腸菌発現系は当該タンパク質をミリスチル化せず、プロテアーゼ3Cはこの細胞に対して有毒である。Lewisらは、ウイルスの組立て及び動物で最大の防御を得るために必要とされるキャプシドの構造に関する基本的な疑問の答えは未だ得られていないと結論した。さらにまた、Grubmanらは、ワクチンの処方化の前に空キャプシドを安定化することは必要であろうと述べ、この点に関して彼らはウイルス培養から抽出によって得られた空キャプシドで見られた問題について同意を示している（上記参照）。
【０００７】
P1タンパク質のいくらか又は全部を含む融合タンパク質もまた、ウイルスベクター（すなわちヘルペスウイルス又はワクシニアウイルス）の使用により得られた。特に、CA-A-2,047,585は融合タンパク質の生成に用いられるウシヘルペスウイルスを記載している。前記融合タンパク質は、このウシヘルペスウイルスの糖タンパク質gpIIIと融合した口蹄疫ウイルスのペプチド配列（P1のアミノ酸200から213と結合したP1のアミノ酸141から158）を含む。アデノウイルスベクターはFMDV空ウイルスキャプシドの発現のために用いられた（US 8,323,663）。ウイルスベクターはまた安定化されたFMDV空キャプシドの発現のために用いられた（US 7,531,182、USSN14/863,181）。最近、植物細胞及び昆虫細胞がFMDV抗原生成の供給源として精査されている（US 2011/0236416, USSN14/863,181）。
母獣由来抗体（MDA）は、仔ウシ（2歳齢以下の畜牛）のFMDVに対するワクチン免疫への応答を抑制する能力を有することが報告されている（Graves, 1963, Journal of Immunology 91:251-256；Brun et al., 1977, Developments in Biological Standardisation, 25:117-122）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
FMDVポリペプチド並びにそのフラグメント及び変種を発現する組換えウイルスベクターを含む組成物又はワクチンが提供される。当該FMDV抗原並びにそのフラグメント及び変種は免疫原性及び防御性特性を保持する。組換えウイルスベクターはFMDV抗原を発現するアデノウイルスベクターであってもよい。
組換えウイルスベクターはワクチン及び/又は医薬組成物に処方することができる。そのようなワクチン又は組成物を用いて動物をワクチン免疫し、同種及び異種FMDV株に対して防御を提供することができる。医薬的又は獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はベヒクルとともに処方されたワクチン又は組成物は、熱安定性改善及び温度変動処理能力を提供する。
通常動物及び母獣由来抗体陽性（MDA陽性）動物でFMDV感染に対する防御を強化する方法が提供される。少なくとも1つの抗原性ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種及び使用のための指示を含むキットもまた提供される。
【０００９】
以下の詳細な説明（例示として提供されるが、記載した具体的な実施態様にのみ本開示を限定する意図はない）は、本添付図面と一緒にしてもっともよく理解できよう。前記添付図面は下記の通りである：
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】DNA配列及びタンパク質配列を要約した表を示す。
【図２】FMDV A24株の遺伝子及びキメラA24-A12構築物で用いられるA24(p1-2AB’)遺伝子を示す。
【図３】FMDV A12株の遺伝子及びキメラA24-A12構築物で用いられるA12(3B’/3C)遺伝子を示す。
【図４】組換えアデノウイルスベクター性（recombinant adenovirus vectored）A24-A12 FMDVワクチンのPCRによる遺伝子構造同一性アッセイを示す。
【図５】組換えアデノウイルスベクター性A24-A12 FMDVワクチンのウェスタンブロットを示す。
【図６】組換えアデノウイルスベクター性FMDV O1Mワクチンで用いられるFMDV O1M株の遺伝子を示す。
【図７】組換えアデノウイルスベクター性FMDV Irnワクチンで用いられるFMDV Irn株の遺伝子を示す。
【図８】組換えアデノウイルスベクター性FMDVアジアワクチンで用いられるFMDVアジア株の遺伝子を示す。
【図９】種々の用量のO血清型FMDVワクチンによるパーセント防御を示す。
【図１０】種々の用量のO血清型FNDVワクチンの血清学を示す。
【図１１】組換えアデノウイルスベクター性FMDV＋アジュバントの25℃におけるウイルス死滅活性を示す。
【図１２】組換えアデノウイルスベクター性FMDV＋アジュバントの4℃におけるウイルス死滅活性を示す。
【図１３】FMDV VN力価の幾何平均を示す。
【図１４】SAV力価の幾何平均を示す。
【図１５】FMDV VN力価の幾何平均を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
詳細な説明
動物で免疫原性応答を引き出す、FMDV抗原を発現する組換えウイルスベクターを含む組成物又はワクチンが提供される。当該組換えウイルスベクターは、FMDV抗原を発現するアデノウイルスベクターでもよい。当該抗原を発現する組換えウイルスベクターをワクチン又は医薬組成物に処方して、動物で防御応答を引き出し又は刺激するために用いることができる。ある実施態様では、当該ポリペプチド抗原は、FMDV構造タンパク質P1（VP4-VP2-Vｐ3-VP1）、非構造タンパク質P2（2A、2B及び2C）又は非構造タンパク質P3（3A、3B、3C及び3D）又は前記の活性フラグメント若しくは変種である。
本開示の抗原性ポリペプチドは、完全長ポリペプチド又はその活性なフラグメント若しくは変種でもよいことは承知されている。“活性なフラグメント”又は“活性な変種”とは、当該フラグメント又は変種が当該ポリペプチドの抗原性の性質を保持することを意図する。したがって、本開示は、動物で免疫原性応答を引き出すFMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原を包含する。FMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原は、動物（例えばヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類）で応答を引き出し、誘発し又は刺激する、任意のFMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原（例えばタンパク質、ペプチド又はそのフラグメント若しくは変種（ただしこれらに限定されない））でありうる。
キャプシドタンパク質の単純な結合が、プロトマー或いは5S分子（前記はFMDVキャプシドの初期構成成分である）を形成する。続いて、このプロトマーはペンタマーへと複合化し、12S分子を形成する。ビリオンは、12の12Sペンタマーの集合によるゲノムRNA分子の被包化から生じ、したがって146S粒子を構成する。ウイルスキャプシドはまた、その内部にRNA分子が存在しなくても形成されうる（以下では“空キャプシド”）。空キャプシドはまた70S粒子と称される。空キャプシドの形成はウイルス複製時に自然に生じるか、又は化学的処理によって人工的に生じうる。
【００１２】
本開示はウシ類、ヤギ類又はブタ類のワクチン若しくは組成物に関し、前記は、有効量の組換えFMDV抗原又はFMDV抗原を発現する組換えウイルスベクター及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はベヒクルを含むことができる。
いくつかの実施態様では、ワクチンはさらに、アジュバント、例えば米国特許7,371,395に記載された水中油（O/W）エマルジョンを含む。
さらに他の実施態様では、アジュバントは、TS6、TS7、TS8及びTS9エマルジョン、LR3、LR4及びLR6エマルジョン、LF2エマルジョン、CARBIGENTMアジュバント、ENABL(商標)アジュバント、ポリアクリル酸、水酸化アルミニウム若しくはリン酸アルミニウム、サポニン、CpG、油中水エマルジョン、及び水中油エマルジョン、又は前記の組合せを含む。
いくつかの実施態様では、動物の応答は防御免疫応答である。
【００１３】
“動物”とは哺乳動物、鳥類などを意図する。動物又は宿主には哺乳動物及びヒトが含まれる。動物は以下から成る群から選択できる：ウマ類（例えばウマ）、イヌ類（例えばイヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル）、ネコ類（例えばライオン、トラ、家ネコ、野生ネコ、他の大型のネコ、及び他のネコ類（チーター及びオオヤマネコを含む））、ヒツジ類（例えばヒツジ）、ウシ類（例えば畜牛、乳牛）、ブタ類（例えばブタ）、ヤギ類（例えばヤギ）、トリ類（例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミュ及びヒクイドリ）、霊長類（例えば原猿、メガネザル、サル、テナガザル、類人猿）、及び魚類。“動物”という用語はまた、全ての発育段階（胚性期及び胎児期を含む）の個々の動物を含む。
特段の説明がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本開示が属する分野の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。単数用語“a”、“an”及び“the”は、文脈が明瞭にそうではないことを示していないかぎり複数の対応語を含む。同様に、“or”という語は、文脈が明らかにそうではないことを示していないかぎり“and”を含むことが意図される。
【００１４】
本開示の抗原性ポリペプチドはFMDVに対して防御する能力を有する。すなわち、それらは動物で免疫応答を刺激する能力を有する。“抗原”又は“免疫原”とは、特異的な免疫応答を宿主動物で誘発する物質を意味する。抗原は、全生物（死滅、弱毒化又は生）；生物のサブユニット又は部分；免疫原性特性を有する挿入物を含む組換えベクター；宿主動物に提示されたとき免疫応答を誘発する能力を有するDNAの断片又はフラグメント；ポリペプチド、エピトープ、ハプテン、又は前記の任意の組合せを含むことができる。また別には、免疫原又は抗原は毒素又は抗毒素を含むことができる。
【００１５】
本明細書で用いられる“免疫原性タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド”という用語は、いったん宿主に投与されたら、当該タンパク質に対して液性及び/又は細胞性タイプの免疫応答を惹起することができるという意味で免疫学的に活性であるポリペプチドを含む。複数の実施態様で、タンパク質フラグメントは、完全なタンパク質と実質的に同じ免疫学的活性を有する。したがって、本開示のタンパク質フラグメントは、少なくとも1つのエピトープ又は抗原性決定基を含むか、又は本質的に前記から成るか、又は前記から成る。本明細書で用いられる、“免疫原性”タンパク質又はポリペプチドには、当該タンパク質の完全長配列、そのアナローグ、又はその免疫原性フラグメントが含まれる。“免疫原性フラグメント”とは、1つ以上のエピトープを含み、したがって上記に記載の免疫学的応答を引き出す、タンパク質のフラグメントを意味する。そのようなフラグメントは、多数のエピトープマッピング技術を用いて識別することができる。例えば、線状エピトープは、例えば固体支持体上で多数のペプチド（当該タンパク質分子の複数の部分に対応するペプチド）を同時合成し、当該ペプチドが当該支持体にまだ付着している間に当該ペプチドを抗体と反応させることによって決定できる。そのような技術は当業界で公知であり、例えば以下に記載されている：U.S.Pat.No.4,708,871；Geysen et al., 1984；Geysen et al., 1986。同様に、立体的エピトープは、アミノ酸の空間配座を例えばX-線結晶学及び二次元核磁気共鳴で決定することによって容易に識別される。特にT. paraのタンパク質に応用できる複数の方法がPCT/US2004/022605に記載されている。
【００１６】
論議のように、本開示は抗原性ポリペプチドの活性なフラグメント及び変種を包含する。したがって、“免疫原性タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド”という用語はさらに当該配列への欠失、付加及び置換を意図するが、ただし当該ポリペプチドが機能して本明細書で定義される免疫学的応答を生じる場合に限られる。“保存的変型”は、あるアミノ酸残基の別の生物学的に類似する残基による入替え、又はコードされるアミノ酸残基が変化しないか或いは別の生物学的に類似する残基である核酸配列中のヌクレオチドの入替えを指す。これに関しては、いくつかの置換は概ね本質的に保存的、すなわち1つのアミノ酸ファミリー内で生じる置換であろう。例えば、アミノ酸は概して4つのファミリーに分割される：（1）酸性--アスパラギン酸及びグルタミン酸；（2）塩基性--リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性--アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（4）非荷電極性--グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン及びチロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンはときに芳香族アミノ酸として分類される。保存的変型の例には以下が含まれる：1つの疎水性残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン）による別の疎水性残基の置換、又は1つの極性残基による別の極性残基の置換、例えば、アルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、又はグルタミンによるアスパラギンの置換など；又はあるアミノ酸の構造的に関係を有するアミノ酸による同様な保存的入替え（前記は生物学的活性に大きな影響を及ぼさない）。タンパク質の免疫原性に実質的に影響を及ぼさない小さなアミノ酸置換を有するが、参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するタンパク質は、したがって参照ポリペプチドの定義内である。これらの改変によって生成される全てのポリペプチドがここに含まれる。“保存的変型”という用語はまた未置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することを含むが、ただし当該置換ポリペプチドに対して生じた抗体がまた未置換ポリペプチドと免疫的に反応することを条件とする。
【００１７】
“エピトープ”という用語は、特異的B細胞及び/又はT細胞が応答する抗原又はハプテン上の部位を指す。当該用語はまた、“抗原性決定基”又は“抗原性決定部位”と互換的に用いられる。同じエピトープを認識する抗体は、1つの抗体が別の抗体と標的抗原との結合を阻止する能力を示す簡単な免疫アッセイによって識別することができる。
組成物又はワクチンに対する“免疫学的応答”は、当該宿主における問題の組成物又はワクチンに対する細胞性及び/又は抗体媒介性免疫応答の発生である。通例、“免疫学的応答”には以下の作用の1つ以上が含まれる（ただしこれらに限定されない）：問題の組成物又はワクチンに含まれる1つ又は複数の抗原を特異的に指向する抗体、B細胞、ヘルパーT細胞、及び/又は細胞傷害性T細胞の産生。好ましくは、宿主は治療的又は防御的な免疫学的応答のどちらかを示し、したがって新たな感染に対する耐性が強化され、及び/又は当該疾患の臨床的重篤度が軽減されるであろう。そのような防御は、感染宿主によって通常示される症状の軽減又は欠如、より迅速な回復期間、及び/又は感染宿主におけるウイルス力価の低下によって提示されるであろう。
【００１８】
合成抗原もまた本定義内に含まれ、例えばポリエピトープ、フランキングエピトープ、及び他の組換え体又は合成により誘導された抗原である。本開示の目的のための免疫原性フラグメントは通例、当該分子の少なくとも約3アミノ酸、少なくとも約5アミノ酸、少なくとも約10−15アミノ酸、又は約15−25アミノ酸又はそれより多いアミノ酸を含むであろう。フラグメントの長さに決定的な上限はなく、前記は、完全長に近いタンパク質配列又はタンパク質の少なくとも1つのエピトープを含む融合タンパク質すら含むことができよう。
したがって、エピトープを発現するポリヌクレオチドの最小限構造は、それが、FMDVポリペプチドのエピトープ又は抗原性決定基をコードするヌクレオチドを含むか又は本質的に前記から成るか又は前記から成るということである。FMDVポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、当該ポリペプチドをコードする配列の最小限15ヌクレオチド、約30−45ヌクレオチド、約45−75、又は少なくとも57、87又は150の連続的な又は切れ目のないヌクレオチドを含むか、又は本質的に前記から成るか、又は前記から成ることができる。
【００１９】
“核酸”又は“ポリヌクレオチド”という用語は、直鎖状若しくは分枝状、一本鎖若しくは二本鎖、又は前記のハイブリッドであるRNA又はDNAを指す。前記用語はまたRNA/DNAハイブリッドを包含する。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、改変ヌクレオチド（例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナローグ）、ウラシル、他の糖及び連結基（例えばフルオロリボース及びチオレート）、及びヌクレオチド分枝を含むことができる。ヌクレオチドの配列はさらに、重合の後で、例えば共役によって標識成分で改変することができる。この定義に含まれる他のタイプの改変は、キャップ、1つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナローグによる置換、及びポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド又は固体支持体に結合させるための手段の導入である。ポリヌクレオチドは化学合成によって入手するか、又は微生物から誘導することができる。
【００２０】
“遺伝子”という用語は広範囲に用いられ、生物学的機能を伴うポリヌクレオチドの任意のセグメントを指す。したがって、遺伝子は、ゲノム配列のようにイントロン及びエクソンを、cDNAのようにまさにコード配列のみを及び/又はそれらの発現に必要な調節配列を含む。例えば、遺伝子はまた、mRNA若しくは機能的RNAを発現するか、又は特定のタンパク質をコードする核酸フラグメントを指し、前記は調節配列を含む。
本開示はさらに、FMDV抗原、エピトープ又は免疫原をコードするポリヌクレオチドの相補鎖を含む。相補鎖はポリマーで任意の長さであることができ、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び任意の組合せのアナローグを含むことができる。
【００２１】
“タンパク質”、“ペプチド”、“ポリペプチド”及び“ポリペプチドフラグメント”という用語は本明細書で互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。当該ポリマーは直鎖状でも分枝状でもよく、改変アミノ酸又はアミノ酸アナローグを含むことができ、さらにアミノ酸以外の化学的部分によって中断されていてもよい。当該用語はまた天然に又は介入により改変されたアミノ酸ポリマーを包含する。そのような改変は、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは改変、例えば標識成分若しくは生物活性成分との結合である。
【００２２】
“単離された”生物学的成分（例えば核酸又はタンパク質又は細胞内小器官）は、当該成分が天然に存在する当該生物の細胞内の他の生物学的成分（例えば他の染色体上の及び染色体外のDNA、RNA、タンパク質並びに細胞内小器官）から実質的に分離又は精製されてある成分を指す。“単離された”核酸及びタンパク質には標準的な精製方法によって精製された核酸及びタンパク質が含まれる。当該用語はまた化学合成と同様に組換え技術によって調製された核酸及びタンパク質を包含する。
本明細書で用いられる“精製された”という用語は絶対的な純度を必要とせず、むしろ相対的用語として意図される。したがって、例えば、精製されたポリペプチド調製物は、当該ポリペプチドがその天然の環境中の当該ポリペプチドよりも濃縮されている調製物である。いくつかの実施態様では、当該ポリペプチドは細胞成分から分離されている。“実質的に精製された”とは、当該ポリペプチドが、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、若しくは少なくとも98%の、又は前記を越える細胞性成分又は物質が取り除かれたいくつかの実施態様にあることを意図する。同様に、当該ポリペプチドを部分的に精製することも可能である。“部分的に精製された”とは、細胞性成分又は物質の60%未満が除去されることを意図する。同じことがポリヌクレオチドにも適用される。本明細書に開示されるポリペプチドは当業界で公知の任意の手段によって精製することができる。
【００２３】
上記で指摘したように、抗原性ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種は、ウイルスベクターによってin vivoで生成されるFMDV抗原性ポリペプチドである。開示のポリヌクレオチド及びそれらによってコードされるポリペプチドのフラグメント及び変種もまた本開示に包含される。“フラグメント”とは、ポリヌクレオチドの部分又は前記によってコードされる抗原性アミノ酸配列の部分を意図する。ポリヌクレオチドのフラグメントは、自然のままのタンパク質の生物学的活性を保持し、したがって本明細書のいずれかに記載の免疫原性活性を有するタンパク質フラグメントをコードすることができる。当該ポリペプチド配列のフラグメントは、動物で防御性免疫応答を誘発する能力を保持する。
“変種”は実質的に類似の配列を意味することが意図される。ポリヌクレオチドについては、変種は、自然のままのポリヌクレオチド内の1つ以上の部位における1つ以上のヌクレオチドの欠失及び/又は付加、及び/又は自然のままのポリヌクレオチドの1つ以上の部位における1つ以上のヌクレオチドの置換を含む。本明細書で用いられるように、“自然のままの”ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、それぞれ天然に存在するヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を含む。本開示の個々のポリヌクレオチドの変種（例えば参照ポリヌクレオチド）はまた、変種ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間のパーセント配列同一性の比較によって評価することができる。“変種”タンパク質は、自然のままのタンパク質の1つ以上の部位における1つ以上のアミノ酸の欠失又は付加、及び/又は自然のままのタンパク質の1つ以上の部位における1つ以上のアミノ酸の置換によって誘導されたタンパク質を意味することが意図される。本開示に包含される変種タンパク質は生物学的に活性である。すなわち、それらは免疫応答を引き出す能力を有する。
ある特徴では、本開示はヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類のFMDV単離株に由来するFMDVポリペプチドを提供する。別の特徴では、本開示は、配列番号:2、4、6又は8に示される配列を有するポリペプチド、及び前記の変種又はフラグメントを提供する。
【００２４】
さらにまた、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類のFMDVポリペプチドのホモローグも本開示の範囲内であることが意図される。本明細書で用いられるように、“ホモローグ”という用語にはオルソローグ、アナローグ及びパラローグが含まれる。“アナローグ”という用語は、同じ又は類似の機能を有するが、無関係の生物で別個に進化した2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。“オルソローグ”という用語は、異なる種に由来するが、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。通常は、オルソローグは同じ又は類似の機能を有するポリペプチドをコードする。“パラローグ”という用語は、ゲノム内の重複により関係する2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。通常パラローグは異なる機能を有するが、これらの機能は関係を有することがある。野生型FMDVポリペプチドのアナローグ、オルソローグ及びパラローグは、翻訳後修飾によって、アミノ酸配列相違によって、又はその両方によって野生型FMDVポリペプチドと相違することができる。特に、本開示のホモローグは概ね、野生型FMDVポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の全部若しくは部分と少なくとも80−85%、85−90%、90−95%、又は95%、96%、97%、98%、99%配列同一性を示し、さらに類似の機能を示すであろう。変種には対立遺伝子変種が含まれる。“対立遺伝子変種”という用語は多型を含むポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。多型はタンパク質のアミノ酸配列に変化を生じ、天然の集団（例えばウイルス種又は系統）に存在する。そのような天然の対立遺伝子変型は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに典型的には1−5%の多様性を生じ得る。対立遺伝子変種は、問題の核酸配列の配列決定によって多数の異なる種で識別することができ、ハイブリダイゼーションプローブを用いそれらの種で同じ遺伝子の遺伝子座を識別することによって容易に遂行できる。天然の対立遺伝子変型の結果であり、かつ問題の遺伝子の機能的活性を変更しない、任意の及び全てのそのような核酸変型及びその結果のアミノ酸多型又は変型は、本発明の範囲内であることが意図される。
【００２５】
本明細書で用いられるように、“誘導体”又は“変種”は、1つ以上の保存的アミノ酸変型又は他の小さな改変を有ポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸を指し、したがって（1）当該対応するポリペプチドは野生型ポリペプチドと比較したとき実質的に等価の機能を有するか、又は（2）当該ポリペプチドに対して生じた抗体は野生型ポリペプチドと免疫的に反応性を有する。これらの変種又は誘導体には、FMDVポリペプチドの一次アミノ酸配列の小さな改変を有するポリペプチドが含まれ、前記は、対応する未改変のポリペプチドと比較したとき実質的に等価の活性を有するペプチドをもたらしうる。そのような改変は、位置指定変異誘導のように意図的であっても又は偶発的であってもよい。“変種”という用語はさらに当該配列に対する欠失、付加及び置換を意図するが、ただし当該ポリペプチドが機能して本明細書に定義する免疫学的応答を生じる場合に限られる。
“保存的変型”という用語は、あるアミノ酸残基の別の生物学的に類似の残基による入替え又は核酸配列中のヌクレオチドの入替えを指し、後者ではその結果、コードされるアミノ酸残基は変化しないか又は別の生物学的に類似する残基である。これに関しては、特に好ましい置換は概ね上記に記載したように本質的に保存的であるだろう。
【００２６】
本開示のポリヌクレオチドには、遺伝暗号（例えば特定の宿主のための最適化コドン使用）の結果として縮重配列が含まれる。本明細書で用いられるように、“最適化”は、遺伝子操作されてある与えられた種でその発現が高められたポリヌクレオチドを指す。FMDVポリペプチドをコードする最適化ポリヌクレオチドを提供するために、FMDVタンパク質のDNA配列は、1）個々の種で高度に発現される遺伝子が好むコドンを含むように、2）前記種のヌクレオチド塩基組成で実質的に見いだされるA+T又はG+C含量を含むように、3）前記の種の開始配列を形成するように、4）RNAの脱安定化、不適切なポリアデニル化、分解及び停止を引き起こす配列、又は二次構造ヘアピン若しくはRNAスプライス部位を形成する配列を除去するように改変できる。前記種におけるFMVDタンパク質の発現増加は、真核細胞及び原核細胞又は個々の種におけるコドン使用頻度の分布を利用することによって達成できる。“好ましいコドン使用頻度”という用語は、ある与えられたアミノ酸を指定するために特定の宿主細胞によって示されるヌクレオチドコドンの使用における優先性を指す。20の天然のアミノ酸が存在し、その大半は2つ以上のコドンによって指定される。したがって、全ての縮重ヌクレオチド配列が本開示に含まれるが、ただしそのヌクレオチド配列によってコードされるFMDVポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化しない場合に限られる。
【００２７】
2つのアミノ酸配列間の配列同一性は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）ペアワイズblast及びblosum62マトリックスで標準的パラメーターを用いて決定することができる。例えば、NCBI（"National Center for Biotechnology Information", Bethesda, Md., USA）サーバーで利用できるBLAST又はBLASTXアルゴリズムを参照されたい。
配列に関して“同一性”は、2つの配列の短い方の配列中のヌクレオチド又はアミノ酸の数で割った、同一ヌクレオチド又はアミノ酸を有する位置の数を指し、この場合、2つの配列のアラインメントは、WilburとLipmanのアルゴリズム（1983, Proc Natl Acad Sci, 80:pp726-730）にしたがって決定できる。2つのアミノ酸配列の配列同一性若しくは配列類似性、又は2つのヌクレオチド配列の配列同一性は、Vector NTIソフトウェアパッケージ（Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA）を用いて決定することができる。RNA配列がDNA配列と類似する又はある配列同一性若しくは相同性の程度を有するというとき、DNA配列中のチミジン（T）はRNA配列中のウラシル（U）と等価と考えられる。したがって、RNA配列は本開示の範囲内であり、DNA配列中のチミジン（T）をRNA配列中のウラシル（U）と等価と考えることによってDNA配列から誘導することができる。
ハイブリダイゼーション反応は種々の“ストリンジェンシー”条件下で実施できる。例えば以下の文献を参照されたい：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition（Sambrook et al., 2014）。
【００２８】
本開示はさらに、ベクター分子又は発現ベクターに含まれ、プロモーター成分及び場合によってエンハンサーに作動できるように連結されたFMDVポリヌクレオチドを包含する。
“ベクター”は、標的細胞にin vitro又はin vivoでデリバリーされる異種ポリヌクレオチドを含む、組換えDNA若しくはRNAプラスミド又はウイルスを指す。当該異種ポリヌクレオチドは予防又は治療の目的のために対象の配列を含むことができ、場合によって発現カセットの形態であってもよい。本明細書で用いられるように、ベクターは最終標的細胞又は対象生物で複製する能力を有する必要はない。前記用語はクローニングベクター及びウイルスベクターを含む。
“組換え体”という用語は、天然には存在しないか、又は天然では見出されない配置で別のポリヌクレオチドに連結されている、半合成又は合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
“異種”は、ある実在物が比較されている当該実在物の残りの部分と遺伝学的に別個の実在物に由来することを意味する。例えば、あるポリヌクレオチドを異なる供給源に由来するプラスミド又はベクター中に遺伝子操作によって配置することができ、前記ポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである。自然のままのコード配列から取り出され、当該自然のままの配列以外のコード配列に作動できるように連結されたプロモーターは異種プロモーターである。
本開示は、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類及びブタ類のワクチン又は医薬若しくは免疫学的組成物に関し、前記は、有効量の組換えFMDV抗原及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、アジュバント、賦形剤又はベヒクルを含むことができる。
本明細書に記載の内容は、部分的には、バキュロウイルス/昆虫細胞発現系で調製されたFMDV抗原に関連する組成物及び方法を対象とし、前記抗原は、同種及び異種FMDV株のチャレンジに対して高度に免疫原性であり動物を防御する。
【００２９】
組成物
本開示はFMDVワクチン又は組成物に関し、前記は有効量の組換えFMDV抗原及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はベヒクルを含むことができる。ある実施態様では、FMDVワクチン又は組成物はFMDV抗原を発現する組換えウイルスベクターを含む。
本開示のある実施態様は、FMDV抗原を発現するウイルスベクターを含むワクチン又は組成物に関する。当該FMDV抗原は、下記領域のcDNAの発現によって得られる：P1（VP4-VP2-VP3-VP1）、2A/2B’/3B’及び3C、又はP1（VP4-VP2-VP3-VP1）、2A/2B/2C及び3A/3B/3C/3D。構造領域P1及び非構造領域P2又はP3は、同じFMDV血清型又は異なる血清型（キメラ抗原）に由来しうる。
本開示は、動物（例えばヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類）で免疫原性応答を引き出すFMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原を包含する。FMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原は、動物（例えばヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類）で応答を引き出し、誘発し又は刺激する任意のFMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原（例えばタンパク質、ペプチド又はそのフラグメントであるが、ただし前記に限定されない）でありうる。
【００３０】
FMDV免疫学的組成物又はワクチンが組換え免疫学的組成物又はワクチンである実施態様では、当該組成物又はワクチンは、組換えベクター及び医薬的又は獣医的に許容できる賦形剤、担体、アジュバント又はベヒクルを含み、当該組換えベクターはバキュロウイルス発現ベクターであり、前記ベクターは、FMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。当該FMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原は、VP1、VP2、VP3、VP4、2A、2B、2C、3A、3B、3C若しくは3D又は前記の組合せでもよい。
ある実施態様では、P1（VP4-VP2-VP3-VP1）-2A/部分的2B/部分的3B及び3Cポリペプチドがウイルスベクターで発現され、発現は1つ以上のプロモーター配列によって調節されうる。別の実施態様では、FMDV抗原は以下を含むキメラ抗原でもよい：P1（VP4-VP2-VP3-VP1）-2A-部分的2B（FMDV A24血清型由来）及び部分的3B（FMDV A12血清型由来）及び3C抗原（FMDV A24血清型由来）。さらに別の実施態様では、FMDV抗原はP1（VP4-VP2-VP3-VP1）-2A-2B-部分的2C-部分的3A-3B-3Cでもよい。
別の実施態様では、FMDV抗原は以下に由来することができる：FMDV O1 Manisa、O1 BFS又はCampos、A24 Cruzeiro、A12、Asia 1 Shamir、A Iran’96、Asia/IRN/05、A22 Iraq、SAT2 Saudi Arabia。
【００３１】
本開示はFMDVワクチンに関し、前記は、有効量の組換えFMDV抗原、又はFMDV抗原を発現する組換えウイルスベクター及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はベヒクルを含むことができる。
別の実施態様では、医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はベヒクルは、油中水エマルジョンでもよい。さらに別の実施態様では、医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はベヒクルは、水中油エマルジョンでもよい。
本開示はさらに、ベクター分子又は発現ベクターに含まれ、プロモーターエレメントに及び場合によってエンハンサーに作動できるように連結されたFMDVポリヌクレオチドを包含する。
【００３２】
ある特徴では、本開示は、配列番号:2、4、6又は8に示される配列を有するFMDVポリペプチド（特にヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類のポリペプチド）及び前記の変種又はフラグメントを提供する。
別の特徴では、本開示は、本開示の抗原性ポリペプチド、特に配列番号:2、4、6又は8に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチドを提供する。
さらに別の特徴では、本開示は、上記で識別したFMDVポリペプチド（配列番号:2、4、6又は8）のフラグメント及び変種を提供し、前記は分子生物学的技術を用いて当業者によって容易に調製され得る。
【００３３】
変種及び相同なポリペプチドは、配列番号:2、4、6又は8に示されるアミノ酸配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一性のアミノ酸配列を有する。
FMDVポリペプチドの免疫原性フラグメントは、配列番号:2、4、6又は8に示される配列を有するFMDVポリペプチドの連続する少なくとも8、10、15、又は20アミノ酸、少なくとも21アミノ酸、少なくとも23アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、又は少なくとも30アミノ酸、又は前記の変種を含む。別の実施態様では、FMDVポリペプチドのフラグメントは、完全長FMDVポリペプチドで見いだされる固有の抗原性エピトープを含む。
【００３４】
別の特徴では、本開示は、FMDVポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号:2、4、6又は8に示される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらに別の特徴では、本開示は、配列番号:2、4、6又は8に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリペプチド、又は保存的変種、対立遺伝子変種、ホモローグ、又はこれらポリペプチドの1つの少なくとも8若しくは少なくとも10の連続するアミノ酸を含む免疫原性フラグメント、又はこれらポリペプチドの組合せをコードするポリヌクレオチドを提供する。
別の特徴では、本開示は、配列番号:1、3、5又は7に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド又はその変種を提供する。さらに別の特徴では、本開示は、配列番号:1、3、5又は7に示される配列を有するポリヌクレオチドの1つと少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%配列同一性を有するポリヌクレオチド又はその変種を提供する。
本開示のポリヌクレオチドは、追加的配列、例えば同じ転写ユニット内の追加的コード配列、制御エレメント、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、5’UTR、3’UTR、転写終了因子、ポリアデニル化部位、同じ又は異なるプロ―モーター下の追加的転写ユニット、クローニング、発現、相同組換え及び宿主細胞の形質転換を可能にする配列、並びに本開示の実施を提供するために所望できる任意の構築物を含むことができる。
【００３５】
FMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原の発現のためのエレメントが有利には本発明のベクターに存在する。最低限の態様では、前記エレメントは、開始コドン（ATG）、終止コドン及びプロモーター、及び場合によってはまたポリアデニル化配列（ある種のベクター、例えばプラスミドベクター及びある種のウイルスベクター（例えばポックスウイルス以外のウイルスベクター）のために必要）を含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成る。ポリヌクレオチドがポリプロテインフラグメント（例えばFMDVペプチド）を有利にはベクター内でコードするとき、ATGは当該リーディングフレームの5’に配置され、終止コドンは3’に配置される。発現制御のための他のエレメントも存在することがあり、前記エレメントは、例えばエンハンサー配列、安定化配列（例えばイントロン）、及び当該タンパク質の分泌を可能にするシグナル配列である。
【００３６】
本開示はまた、ベクター（例えば発現ベクター）を含む調製物、例えば治療組成物に関する。前記調製物は、1つ以上のベクター（例えば発現ベクター、例えばin vivo発現ベクター）を含むことができ、前記ベクターは、1つ以上のFMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原を含みさらにそれらを発現する。ある実施態様では、ベクターは、1つのFMDV抗原、エピトープ又は免疫原をコードする（さらに有利にはそれらを発現する）ポリヌクレオチドを含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成る1つのポリヌクレオチドを、医薬的に又は獣医的に許容できる担体、賦形剤又はベヒクル中に含みさらにそれらを発現する。したがって、本開示のある実施態様にしたがえば、調製物中の他の1つのベクター又は複数のベクターは、FMDVポリペプチド、抗原、エピトープ若しくは免疫原又は前記のフラグメントの1つ以上の他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むか、又は本質的に前記から成るか、又は前記から成り、さらに適切な状況下で当該ベクターはそれらを発現する。
【００３７】
別の実施態様にしたがえば、調製物中の当該1つのベクター又は複数のベクターは、FMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原の1つ以上のタンパク質又はそのフラグメント（1つ又は複数）をコードするポリヌクレオチド（1つ又は複数）を含むか、又は本質的に前記から成るか、又は前記から成り、当該1つのベクター又は複数のベクターは当該ポリヌクレオチド（1つ又は複数）を発現する。別の実施態様では、当該調製物は、FMDVポリペプチド、抗原、融合タンパク質又は前記のエピトープをコードし発現する（有利にはin vivoで発現する）ポリヌクレオチドを含む1つ、2つ又は3つ以上のベクターを含む。本開示はまたベクターの混合物に向けられ、前記混合物は、異なるFMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原（例えば異なる動物種（例えばヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類であるがただしこれらに限定されない）に由来するFMDVポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原）をコードし発現するポリヌクレオチドを含む。
【００３８】
本開示のさらに別の実施態様にしたがえば、発現ベクターは、プラスミドベクター又はDNAプラスミドベクター、特にin vivo発現ベクターである。具体的で非限定的な例では、ポリヌクレオチド配列挿入用ベクターとして、pVR1020又は1012プラスミド（VICAL Inc.；Luke et al., 1997；Hartikka et al., 1996, Hum Gene Ther, 7(10): 1205-17；例えば米国特許5,846,946号及び6,451,769号参照）を利用できる。pVR1020プラスミドはpVR1012に由来し、ヒトtPAシグナル配列を含む。ある実施態様では、ヒトtPAシグナルは、Genbankアクセッション番号HUMTPA14のアミノ酸M(1)からアミノ酸S(23)を含む。別の具体的で非限定的な例では、ポリヌクレオチド配列挿入用ベクターとして利用されるプラスミドは、Genbankアクセッション番号U28070のアミノ酸M(24)からアミノ酸A(48)のウマIGF1のシグナルペプチド配列を含むことができる。前記の実施のために参考となるか又は利用できるDNAプラスミドに関するさらに別の情報は、例えば米国特許6,852,705号、6,818,628号、6,586,412号、6,576,243号、6,558,674号、6,464,984号、6,451,770、号6,376,473号及び6,221,362号で見いだされる。
【００３９】
プラスミドという用語は、本開示のポリヌクレオチド及び所望される宿主又は標的の1つの細胞又は複数の細胞での前記ポリヌクレオチドのin vivo発現に必要なエレメントを含む任意のDNA転写ユニットをカバーし、これに関しては、スーパーコイル若しくは非スーパーコイル状プラスミド、環状プラスミドとともに直鎖状型が本発明の範囲内であることが特記される。
プラスミドは、FMDV抗原、エピトープ又は免疫原をコードするポリヌクレオチ（場合によって異種ペプチド配列と融合される）に加えて、変種、アナローグ又はフラグメントを含むか、又は前記を収納するか、又は本質的に前記から成り、それらはプロモーターに作動できるように連結されるか、プロモーターの制御下にあるか、又はプロモーターに依存する。概して、真核細胞で機能する強力なプロモーターを利用することが有利である。強力なプロモーターは、ヒト又はネズミ起原（又は場合によって別の起原（例えばラット又はモルモット））の最初期サイトメガロウイルスプロモーター（CMV-IE）、スーパープロモーターでもよいが、ただし前記に限定されない（Ni, M.et al., Plant J.7, 661-676, 1995）。CMV-IEプロモーターは実際のプロモーター部分を含むことができ、前記はエンハンサー部分と結合しても結合してなくてもよい。EP-A-260148、EP-A-323597、米国特許5,168,062号、5,385,839号及び4,968,615号とともにPCT出願WO87/03905を参照されたい。複数の実施態様で、CMV-IEプロモーターはヒトCMV-IE（Boshart et al., 1985, Cell 41(2): 521-30）又はネズミCMV-IEである。
より大まかに言えば、プロモーターはウイルス起源、植物起原又は細胞性起原である。本発明の実施で利用できるCMV-IE以外の強力なウイルスプロモーターは、SV40ウイルスの初期/後期プロモーター又はラウス肉腫ウイルスのLTRプロモーターである。本開示の実施で有用でありうる強力な細胞性プロモーターは、骨格遺伝子のプロモーター、例えばデスミンプロモーター（Kwissa et al., 2000, Vaccine 18(22): 2337-44）又はアクチンプロモータ（Miyazaki et al., 1989, Gene 79(2): 269-77）である。
【００４０】
プラスミドは他の発現制御エレメントを含むことができる。安定化配列、例えばイントロン配列（例えばトウモロコシアルコールデヒドロゲナーゼイントロン（Callis et al.Genes & Dev.1(10):1183-1200, Dec.1987）、hCMV-IEの第一イントロン（PCT出願WO1989/01036）、ウサギβ-グロビン遺伝子のイントロンII（van Ooyen et al., 1979, Science, 206(4416): 337-44））を取り込むことは特に有利である。別の実施態様では、プラスミドは3’UTRを含むことができる。3’UTRは、アグロバクテリウム（agrobacterium）ノパリンシンターゼ(Nos)3’UTRでもよい（ただし前記に限定されない）（Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence.Depicker, A.et al.J.Mol.Appl.Genet., 1982；Bevan, NAR, 1984, 12(22): 8711-8721）。
プラスミド及びポックスウイルス以外のウイルスベクターのためのポリアデニル化シグナル（ポリA）に関しては、ウシ成長ホルモン（bGH）遺伝子のポリ(A)シグナル（US5,122,458参照）又はウサギβ-グロビン遺伝子のポリ(A)シグナル又はSV40ウイルスのポリ(A)シグナルの使用がより有用でありうる。
“宿主細胞”は、外因性ポリヌクレオチド（例えば組換えプラスミド又はベクター）の投与によって遺伝的に変化を受けたか又は遺伝的に変化を受ける能力を有する原核細胞又は真核細胞を指す。遺伝的に変化した細胞というとき、当該用語は、当初の変化した細胞及びその子孫の両方を指す。
ある実施態様では、組換えFMDV抗原は昆虫細胞で発現される。
【００４１】
使用方法
ある実施態様では、本明細書に開示する内容はヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類をワクチン免疫する方法に向けられ、前記方法は、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類に有効量のワクチンを投与する工程を含み、前記ワクチンは、FMDV抗原を発現する組換えウイルスベクター及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はベヒクルを含むことができる。
本開示のある実施態様では、前記方法は、本開示のエマルジョンとともに処方されたワクチン組成物のただ1回の投与を含む。例えば、ある実施態様では、当該免疫学的又はワクチン組成物はFMDV抗原を発現する組換えウイルスベクターを含む。
本開示の別の実施態様では、当該方法は2つの異種ワクチン組成物のただ1回の投与を含む。当該異種ワクチン又は組成物は、異なるタイプのワクチン、例えばFMDV VLPワクチン又はFMDVウイルスベクターワクチンでもよい。当該異種ワクチンはまた、異なるFMDV血清タイプ（例えばA24、A12、O1 Manisa、Asia又はIraq株）のキャプシドを発現する同じタイプのワクチンであってもよい。
ある実施態様では、本明細書に開示する内容はヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類をワクチン免疫する方法に向けられ、前記方法は、FMDV抗原をin vivoで発現する組換えウイルスベクターを含むワクチンをヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類に投与する工程を含む。
ある実施態様では、本明細書に開示する内容は免疫応答を引出す方法に向けられ、前記方法は、FMDV抗原をin vivoで発現する組換えウイルスベクターを含むワクチンをヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類に投与する工程を含む。
同種及び異種FMDV株の両方をチャレンジに用いて、ワクチンの有効性を試験する。投与は皮下又は筋肉内に実施できる。投与は注射針を用いないで実施できる（例えばピグジェット（Pigjet）又はバイオジェット（Biojet））。
【００４２】
本開示のある実施態様では、プライム-ブーストレジメンを利用できる。前記は、少なくとも1回の一次投与及び少なくとも1回のブースター投与を含み、少なくとも1つの共通のポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原が用いられる。一次投与で用いられる免疫学的組成物又はワクチンは、ブーストとして用いられるものと本質的に異なる。しかしながら、同じ組成物を一次投与及びブースト投与として使用できることを特記しておく。この投与プロトコルは“プライム-ブースト”と呼ばれる。
【００４３】
本開示のプライム-ブーストは組換えウイルスベクターを含むことができ、前記は、抗原性ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種をコードするFMDVコード配列又はそのフラグメントの発現に用いられる。具体的には、当該ウイルスベクターは、抗原性ポリペプチドをコードするFMDV遺伝子又はそのフラグメントを発現することができる。本明細書で意図されるウイルスベクターには、ポックスウイルス［例えば、ワクシニアウイルス又は弱毒ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス又は弱毒アビポックスウイルス（例えばカナリアポックス、鶏痘、ダブポックス（dovepox）、ハトポックス（pigeonpox）、ウズラポックス、ALVAC、TROVAC（米国特許5,505,941号及び5,494,8070号参照））、アライグマポックスウイルス、ブタポックスウイルスなど］、アデノウイルス（例えばヒトアデノウイルス、イヌアデノウイルス）、ヘルペスウイルス（例えばイヌヘルペスウイルス、シチメンチョウヘルペスウイルス、マレック病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、ネコヘルペスウイルス、喉頭気管炎ウイルス（ILTV）、ウシヘルペスウイルス、ブタヘルペスウイルス）、バキュロウイルス、レトロウイルスなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。別の実施態様では、アビポックス発現ベクターはカナリアポックスベクター（例えばALVAC）でもよい。さらに別の実施態様では、アビポックス発現ベクターは鶏痘ベクター（例えばTROVAC）でもよい。発現されるべき本開示のFMDV抗原は、特定のポックスウイルスプロモーター、例えばとりわけエントモポックスウイルスAmsacta moorei 42Kプロモーター（Barcena, et al.2000, J Gen Virol 81(4):1073-85）、ワクシニアプロモーター7.5 kDa（Cochran et al., 1985, J Virol 54(1): 30-7）、ワクシニアプロモーターI3L（Riviere et al., 1992, J Virol 66(6):3424-34）、ワクシニアプロモーターHA（Shida, 1986, Virology 150(2): 451-62）、牛痘プロモーターATI（Funahashi et al., 1988, J Gen Virol 69 (1):35-47）、ワクシニアプロモーターH6（Taylor et al., 1988, Vaccine 6(6):504-8；Guo et al., 1989, J Virol 63(10):4189-98；Perkus et al., 1989, J Virol 63(9):3829-36）の制御下へ挿入される。
【００４４】
別の実施態様では、アビポックス発現ベクターはカナリアポックスベクター（例えばALVAC）でもよい。FMDV抗原、エピトープ又は免疫原はFMDV P1-3Cでもよい。FMDVウイルスベクターは、カナリアポックスベクター（例えばvCP2186、vCP2181又はvCP2176）、又は鶏痘ウイルス（例えばvFP2215（米国特許7,527,960号参照））でもよい。さらに別の実施態様では、FMDV抗原、エピトープ又は免疫原はアオウキクサで生成できる（米国特許公開2011/0236416）。
【００４５】
本開示のプライム-ブーストプロトコルの別の特徴では、本開示のFMDV抗原を含む組成物が投与され、その後で、昆虫細胞でバキュロウイルスによって発現されたFMDV VLPを含むサブユニットワクチンを含むワクチン又は組成物（USSN14/863,181参照）、又はFMDV抗原を含む不活化ウイルスワクチン又は組成物、又はFMDV抗原を含むか又は前記を発現するDNAプラスミドワクチン又は組成物の投与が続く。同様に、プライム-ブーストプロトコルは、昆虫細胞でバキュロウイルスによって発現されたFMDV VLPを含むサブユニットワクチンを含むワクチン又は組成物、又はFMDV抗原を含む不活化ウイルスワクチン又は組成物、又はFMDV抗原を含むか又は前記を発現するDNAプラスミドワクチン又は組成物の投与、及びその後に続く本開示のFMDV抗原を含む組成物の投与を含むことができる。一次及び二次投与の両方が本開示のFMDV抗原を含む組成物を含むことができることをさらに特記しておく。
【００４６】
プライム-ブーストプロトコルは、少なくとも1回のプライム投与及び少なくとも1回のブースト投与を含み、少なくとも1つの共通のポリペプチド及び/又はその変種若しくはフラグメントが用いられる。プライム投与で用いられるワクチンはその後のブースターワクチンとして用いられるものと本質的に相違してもよい。プライム投与は1回以上の投与を含むことができる。
哺乳動物である標的種のための組成物の用量体積（例えばヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類のための組成物の用量体積）は、ウイルスベクター（例えば非ポックスウイルスウイルスベクター系組成物）を基準にして、概ね約0.1から約5.0mL、約0.1から約3.0mL、及び約0.5mLから約2.5mLである。
ワクチンの有効性は、最後の免疫から約2から4週間後に、動物（例えばヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類）をFMDVの病毒株（例えばFMDV O1 Manisa、O1 BFS又はCampos、A24 Cruzeiro、A12、Asia 1 Shamir、A Iran’96、Asia/IRN/05、A22 Iraq、SAT2 Saudi Arabia株）でチャレンジすることによって試験できる。
【００４７】
さらに他の株には以下のFMDVが含まれうる：A10-61、A5、A12、A24/Cruzeiro、C3/Indaial、O1、C1-Santa Pau、C1-C5、A22/550/Azerbaijan/65、SAT1-SAT3、A、A/TNC/71/94、A/IND/2/68、A/IND/3/77、A/IND/5/68、A/IND/7/82、A/IND/16/82、A/IND/17/77、A/IND/17/82、A/IND/19/76、A/IND/20/82、A/IND/22/82、A/IND/25/81、A/IND/26/82、A/IND/54/79、A/IND/57/79、A/IND/73/79、A/IND/85/79、A/IND/86/79、A/APA/25/84、A/APN/41/84、A/APS/44/05、A/APS/50/05、A/APS/55/05、A/APS/66/05、A/APS/68/05、A/BIM/46/95、A/GUM/33/84、A/ORS/66/84、A/ORS/75/88、A/TNAn/60/947/Asia/1、A/IRN/05、Asia/IRN/05、O/HK/2001、O/UKG/3952/2001、O/UKG/4141/2001、Asia 1/HNK/CHA/05（GenBankアクセッション番号EF149010（参照により本明細書に含まれる））、Asia I/XJ（Li, ZhiYong et al.Chin Sci Bull, 2007）、HK/70（Chin Sci Bull, 2006, 51(17): 2072―2078）、O/UKG/7039/2001、O/UKG/9161/2001、O/UKG/7299/2001、O/UKG/4014/2001、O/UKG/4998/2001、O/UKG/9443/2001、O/UKG/5470/2001、O/UKG/5681/2001、O/ES/2001、HKN/2002、O5India、O/BKF/2/92、K/37/84/A、KEN/1/76/A、GAM/51/98/A、A10/Holland、O/KEN/1/91、O/IND49/97、O/IND65/98、O/IND64/98、O/IND48/98、O/IND47/98、O/IND82/97、O/IND81/99、O/IND81/98、O/IND79/97、O/IND78/97、O/IND75/97、O/IND74/97、O/IND70/97、O/IND66/98、O/IND63/97、O/IND61/97、O/IND57/98、O/IND56/98、O/IND55/98、O/IND54/98、O/IND469/98、O/IND465/97、O/IND464/97、O/IND424/97、O/IND423/97、O/IND420/97、O/IND414/97、O/IND411/97、O/IND410/97、O/IND409/97、O/IND407/97、O/IND399/97、O/IND39/97、O/IND391/97、O/IND38/97、O/IND384/97、O/IND380/97、O/IND37/97、O/IND352/97、O/IND33/97、O/IND31/97、O/IND296/97、O/IND23/99、O/IND463/97、O/IND461/97、O/IND427/98、O/IND28/97、O/IND287/99、O/IND285/99、O/IND282/99、O/IND281/97、O/IND27/97、O/IND278/97、O/IND256/99、O/IND249/99、O/IND210/99、O/IND208/99、O/IND207/99、O/IND205/99、O/IND185/99、O/IND175/99、O/IND170/97、O/IND164/99、O/IND160/99、O/IND153/99、O/IND148/99、O/IND146/99、O/SKR/2000、A22/India/17/77。
【００４８】
これらのFMDV株の更なる詳細は欧州バイオインフォマティクス情報（EMBL-EBI）のウェブページで見出すことができ、関連するヌクレオチド配列の全てが参照により本明細書に含まれる。本発明者らは、全てのFMDV株が（本明細書に列挙したもの及びまだ同定されていないものもともに）、本開示にしたがって発現されて、例えば有効なワクチン組成物を生じうるであろうと考える。同種株及び異種株の両方をチャレンジに用いてワクチンの有効性を試験することができる。動物は、皮内、皮下、噴霧、鼻内、眼内、気管内チャレンジするか、及び/又は経口的にチャレンジすることができる。
プライム-ブースト投与は、有利には1から6週間離して、例えば約3週間離して実施することができる。ある実施態様にしたがえば、半年ブースター又は1年ブースターもまた想定され、有利にはウイルスベクター系ワクチンが用いられる。動物は、最初の投与時に有利には少なくとも6から8週齢又は約6カ月齢である。
プライム-ブーストプロトコルで用いられる本開示の組換え抗原ポリペプチドを含む組成物は、医薬的若しくは獣医的に許容できるベヒクル、希釈剤、アジュバント又は賦形剤中に含まれる。本開示のプロトコルは、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類のFMDVから動物を防御し、及び/又は感染動物で疾患の進行を予防する。
【００４９】
本明細書の開示は例として提供され本開示はそれらに限定されないことは、当業者には理解されよう。本明細書の開示及び当業界の知識から、当業者は、一切の煩瑣な実験を行うことなく各注射プロトコルで用いられるべき投与回数、投与経路及び用量を決定できる。
本開示は、本開示にしたがって作製された治療組成物の有効量を少なくとも1回動物に投与することを意図する。動物は雄、雌、妊娠雌及び新生仔でよい。この投与は、多様な経路（筋肉内（IM）、皮内（ID）若しくは皮下注射、又は鼻内若しくは経口投与を含む）を介することができる。本開示の治療組成物はまた、無針装置（例えばピグジェット、デルモジェット（Dermojet）、バイオジェクター（Biojector）、アビジェット（Avijet）（Merial, GA, USA）、ベトジェット（Vetjet）又はビタジェット（Vitajet）装置（Bioject, Oregon, USA））によって投与できる。プラスミド組成物投与の別のアプローチはエレクトロポレーションの使用である（例えば以下を参照されたい：Tollefsen et al., 2002；Tollefsen et al., 2003；Babiuk et al., 2002；PCT出願WO99/01158）。
【００５０】
ある実施態様では、本開示は、FMDV抗原又はエピトープをデリバリーし標的細胞で発現するために治療的に有効な量の処方物の投与を提供する。治療的に有効な量の決定は、当業者にとって日常的な実験である。ある実施態様では、処方物は、FMDV抗原又はエピトープを発現するポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、ベヒクル又は賦形剤を含む。別の実施態様では、医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、ベヒクル又は賦形剤は、宿主動物へのトランスフェクション又はポリヌクレオチドの他の移転手段を促進するか、及び/又はベクター又はタンパク質の宿主での保存を改善する。
ある実施態様では、本明細書に開示する内容は、感染動物とワクチン接種動物とを弁別（DIVA）するための検出方法を提供する。
本開示のワクチン又は組成物の使用が動物のFMDV感染の検出を可能にすることが本明細書で開示される。感染動物とワクチン接種動物とを弁別（DIVA）することによって、本開示のワクチン又は組成物の使用は動物の感染の検出を可能にすることが本明細書で開示される。FMDV非構造タンパク質を用いて動物でFMDV感染を診断する方法（例えばFMDV 3ABC又は3D-特異的ELISA）が本明細書で開示される。
【００５１】
製品
ある実施態様では、本明細書に開示する内容は免疫応答を引き出し又は誘発する方法を実施するためのキットに向けられ、前記キットは、組換えFMDV免疫学的組成物若しくはワクチン、又は不活化FMDV免疫学的組成物若しくはワクチン、組換えFMDVウイルス組成物若しくはワクチンのいずれか1つ、及び当該方法を実施するための指示を含むことができる。
本開示の別の実施態様は、FMDVに対する免疫学的又は防御的応答を動物で誘発する方法を実施するためのキットであり、前記は、本開示のFMDV抗原を含む組成物又はワクチン及び組換えFMDVウイルス免疫学的組成物又はワクチン、及び動物で免疫応答を引き出すために有効な量でデリバリーする方法を実施するための指示を含む。
本開示の別の実施態様は、FMDVに対する免疫学的又は防御的応答を動物で誘発する方法を実施するためのキットであり、前記キットは、本開示のFMDV抗原を含む組成物又はワクチン及び不活化FMDV免疫学的組成物又はワクチン、及び動物で免疫応答を引き出すために有効な量でデリバリーする方法を実施するための指示を含む。
本開示のさらに別の特徴は、上記に記載した本開示のプライム-ブーストワクチン免疫のためのキットに関する。前記キットは以下の少なくとも2つのバイアルを含むことができる：第一のバイアルは本開示のプライムワクチン免疫のためのワクチン又は組成物を含み、第二のバイアルは本開示のブーストワクチン免疫のためのワクチン又は組成物を含む。前記キットは、追加のプライムワクチン免疫又は追加のブーストワクチン免疫のために追加の第一又は第二のバイアルを含むことができる。
【００５２】
ある実施態様では、FMDV抗原又はそのフラグメント若しくは変種、及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はベヒクルを含む組成物が開示される。別の実施態様では、FMDV抗原を発現する組換えウイルスベクター及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はベヒクルを含む組成物が開示される。別の実施態様では、上記に記載の組成物が開示され、その場合、FMDV抗原又はそのフラグメント若しくは変種は、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類のFMDV抗原の少なくとも15アミノ酸を含む免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様では、上記の組成物が開示され、その場合、FMDV抗原又はそのフラグメント若しくは変種は部分的に精製されている。ある実施態様では、上記の組成物が開示され、その場合、FMDV抗原又はそのフラグメント若しくは変種は実質的に精製されている。
【００５３】
ある実施態様では、上記の組成物が開示され、その場合、FMDV抗原又はそのフラグメント若しくは変種はヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類のFMDVポリペプチドである。ある実施態様では、上記の組成物が開示され、その場合、FMDVポリペプチドは、P1ポリペプチド、VP0ポリペプチド、VP1ポリペプチド、VP3ポリペプチド、VP2ポリペプチド、VP4ポリペプチド、2Aポリペプチド、2Bポリペプチド、2Cポリペプチド、3Aポリペプチド、3Bポリペプチド、3Cポリペプチド、又は3Dポリペプチドである。ある実施態様では、上記の組成物が開示され、その場合、FMDV抗原又はそのフラグメント若しくは変種は、配列番号:2、4、6又は8に示される配列と少なくとも80%配列同一性を有する。ある実施態様では、上記の組成物が開示され、その場合、FMDV抗原は、配列番号:1、3、5又は7に示される配列と少なくとも70%配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施態様では、上記の組成物が開示され、その場合、医薬的又は獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はベヒクルは、油中水エマルジョン又は水中油エマルジョンである。別の実施態様では、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類のFMDVに感受性を有する動物をワクチン免疫する方法が開示され、前記方法は、当該動物に上記の組成物を投与する工程を含む。ある実施態様では、ヒツジ類、ウシ類、ヤギ類又はブタ類のFMDVに感受性を有する動物をワクチン免疫する方法が開示され、前記方法は、プライム-ブーストレジメンを含む。ある実施態様では、昆虫細胞で発現され実質的に精製された抗原性ポリペプチドが開示され、その場合、当該ポリペプチドは、配列番号:2、4、6又は8に示される配列を有するポリペプチドと少なくとも80%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。任意の実施態様で、当該動物は好ましくはヒツジ類、ウシ類、ブタ類又はヤギ類である。ある実施態様では、動物でFMDV感染を診断する方法が開示される。さらに別の実施態様では、少なくとも2つのバイアルを含むプライム-ブーストワクチン免疫キットが開示され、その場合、第一のバイアルは、FMDV抗原又はそのフラグメント若しくは変種を含む組成物を含み、第二のバイアルは、FMDV抗原を含むか又は発現する組換えウイルスベクターを含む。
【００５４】
医薬的に若しくは獣医的に許容できる担体又はベヒクル又はアジュバント又は賦形剤は当業者には周知である。例えば、医薬的若しくは獣医的に許容できる担体又はベヒクル又は賦形剤は、0.9% NaCl（例えば食塩水）溶液又はリン酸緩衝液でもよい。本開示の方法に使用できる他の医薬的若しくは獣医的に許容できる担体又はベヒクル又は賦形剤には、ポリ-(L-グルタメート)又はポリビニルピロリドンが含まれるが、ただしこれらに限定されない。医薬的若しくは獣医的に許容できる担体又はベヒクル又はアジュバント又は賦形剤は、ベクター（又は本発明のベクターからin vitroで発現されるタンパク質）の投与を促進する任意の化合物又は化合物の組合せでよく、有利には、当該担体、ベヒクル又は賦形剤はトランスフェクションを促進するか、及び/又はベクター（又はタンパク質）の保存を改善することができる。用量及び用量体積は本明細書において一般的な記述で考察され、さらに、当業者は、当業界の知識と併せて本開示を熟読することによって煩瑣な実験を実施することなくそれらを決定することができる。
第四級アンモニウム塩を含む陽イオン性脂質（プラスミドにとって有益ではあるが絶対的にというわけではない）は、有利には以下の式を有するものである：
【００５５】
【化１】
2019507184.tif 000002
【００５６】
式中、R1は12から18の炭素原子を有する飽和又は不飽和直鎖脂肪族ラジカルであり、R2は2つ又は3つの炭素原子を含む別の脂肪族ラジカルであり、Xはアミン又はヒドロキシル基（例えばDMRIE）である。別の実施態様では、陽イオン性脂質は中性脂質（例えばDOPE）と結合できる。
これらの陽イオン性脂質の中では、特にDMRIE（N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-bis(テトラデシロキシ)-1-プロパンアンモニウム（WO96/34109））が好ましく、前記は有利には中性脂質（有利にはDOPE（ジオレオイル-ホスファチジル-エタノールアミン（Behr, 1994））と結合してDMRIE-DOPEを形成する。
【００５７】
有利には、アジュバントとプラスミドの混合物は即席で形成され、有利には調製物の投与と同時に又は調製物の投与の少し前（例えば投与の少し前又は投与前）に形成される。プラスミド-アジュバント混合物は、有利には、混合物が複合体を形成するために十分な時間を投与前に生じるように、例えば、投与前約10から約60分間（例えば投与前約30分間）形成される。
DOPEが存在するとき、DMRIE：DOPEのモル比は約95：約5から約5：約95、又は約1：約1、例えば1：1である。
DMRIE又はDMRIE-DOPEアジュバント：プラスミド重量比は、約50：約1から約1：約10、例えば約10：約1から約1：約5、及び約1：約1から約1：約2、例えば1：1からから1：2である。
【００５８】
別の実施態様では、医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤、アジュバント又はベヒクルは油中水エマルジョンでもよい。適切な油中水エマルジョンの例には、油を基剤とする油中水ワクチンエマルジョンが含まれる。前記は安定かつ4℃で液体であり、以下を含有する：6から50 v/v%の抗原含有水相（好ましくは12から25 v/v%）、50から94 v/v%の油相であって全体に又は部分的に非代謝性油（例えば鉱物油、例えばパラフィン油）及び/又は代謝性油（例えば植物油又は脂肪酸又はアルコールエステル）を含むもの、0.2から20 p/v%の界面活性剤（好ましくは3から8 p/v%）、後者は全体に又は部分的に存在するか、或いはポリグリセロールエステル（前記ポリグリセロールエステルは好ましくはポリグリセロール(ポリ)リシノール酸エステル）又はポリオキシエチレンリシン油又は他の水素添加ポリオキシエチレンリシン油の混合物として存在する。油中水エマルジョンで用いることができる界面活性剤の例には以下が含まれる：エトキシル化ソルビタンエステル（例えばポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエート（TWEEN80(商標)）、アプリケム社（AppliChem, Inc., Cheshire, CT）から入手できる）及びソルビタンエステル（例えばソルビタンモノオレエート（SPAN80(商標)）、シグマアルドリッチ社(Sigma Aldrich, St.Louis, MO)から入手できる）。加えて、油中水エマルジョンに関しては米国特許6,919,084号もまた参照されたい（例えば、前記の実施例8は参照により本明細書に含まれる）。いくつかの実施態様では、抗原含有水相は、1つ以上の緩衝剤を含む食塩水溶液を含む。適切な緩衝溶液の例にはリン酸緩衝食塩水が含まれる。ある有益な実施態様では、油中水エマルジョンは水/油/水（W/O/W）の三重エマルジョンでもよい（米国特許6,358,500号）。他の適切なエマルジョンの例は米国特許7,371,395号に記載されている。
【００５９】
本開示の免疫学的組成物及びワクチンは、1つ以上のアジュバントを含むか又は本質的に前記から成ることができる。本開示の実施で使用される適切なアジュバントは、（1）アクリル酸又はメタクリル酸ポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体ポリマー、（2）免疫刺激性配列（ISS）、例えば1つ以上の非メチル化CpGユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman et al., 1996, PNAS USA, 93(7):2879-83；WO98/16247）、（3）水中油エマルジョン、例えばSPTエマルジョン（“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” M.Powell, M.Newman, Plenum Press刊（1995）の147ページに記載）及びエマルジョンMF59（同書の183ページに記載）、（4）四級アンモニウム塩を含む陽イオン脂質（例えばDDA）、（5）サイトカイン、（6）水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム、（7）サポニン、又は（8）本出願に引用され及び参照により含まれるいずれかの資料で考察されている他のアジュバント、又は（9）前記の任意の組合せ又は混合物である。
【００６０】
水中油エマルジョン（3）（特にウイルスベクターのために適切である）は、以下を基剤とすることができる：軽質流動パラフィン油（欧州局方型）、イソプレノイド油（例えばスクアラン、スクアレン）、アルケンのオリゴマー化から得られる油（例えばイソブテン又はデセン）、直鎖アルキル基を有する酸又はアルコールのエステル（例えば植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコール、ジ(カプリレート/カプレート)、グリセロールトリ(カプリレート/カプレート)、及びジオレイン酸プロピレングリコール）、又は分枝脂肪アルコール又は酸のエステル（特にイソステアリン酸エステル）。
油を乳化剤と組み合わせて用いてエマルジョンを形成する。乳化剤は非イオン性界面活性剤でもよい。前記は例えば以下である：エステルであって、一方ではソルビタン、マンニド（例えば無水オレイン酸マンニトール）、グリセロール、ポリグリセロール又はプロピレングリコールのエステル、及び他方ではオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸又はヒドロキシステアリン酸のエステル（前記エステルは場合によってエトキシル化される）、又はポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック（例えばプルロニック（Pluronic）、例えばL121。
【００６１】
タイプ（1）のアジュバントポリマーの中では、架橋アクリル酸又はメタクリル酸（特に糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルによって架橋されたもの）のポリマーが好ましい。これらの化合物はカルボマーの名称で知られる（Pharmeuropa, vol.8, no.2, June 1996）。当業者はまた米国特許2,909,462号を参照できる。前記特許は、ポリヒドロキシル化合物によって架橋されたそのようなアクリル酸ポリマーを提供する。前記ヒドロキシル化合物は、少なくとも3つのヒドロキシル基（好ましくはそのような基は8つを超えない）を有し、少なくとも3つのヒドロキシル基の水素原子は、少なくとも2つの炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルによって入れ替えられる。好ましいラジカルは、2から4の炭素原子を含むもの、例えばビニル、アリル、及び他のエチレン性不飽和基である。不飽和ラジカルはまた、他の置換基（例えばメチル）を含むことができる。CARBOPOL(商標)（BF Goodrich, Ohio, USA）の名で販売される製品が特に適切である。それらはアリルサッカロース又はアリルペンタエリトリトールによって架橋される。それらの中ではとりわけ、CARBOPOL(商標) 974P、934P及び971Pが挙げられる。
無水マレイン酸-アルケニル誘導体コポリマーに関しては、EMATM（Monsanto）が好ましい。前記は、直鎖又は架橋されたエチレン-無水マレイン酸のコポリマーであり、それらは例えばジビニルエーテルによって架橋される。
構造に関しては、アクリル酸又はメタクリル酸ポリマー及びEMA(商標)は、好ましくは以下の式を有する基本ユニットによって形成される：
【００６２】
【化２】
2019507184.tif 000003
【００６３】
式中、
R1及びR2は同じでも異なっていてもよく、H又はCH3であり、
x＝0又は1で、好ましくはx＝1であり、
y＝1又は2で、x＋y＝2である。
EMA(商標)の場合はx＝0及びy＝2であり、カルボマーの場合はx＝y＝1である。
これらのポリマーは水又は生理学的食塩溶液に可溶性で（20g/L NaCl）、pHは、例えばナトリウム化合物（NaOH）によって7.3から7.4に調整されて、アジュバント溶液が提供され、前記アジュバント溶液に発現ベクターを取り込むことができる。最終的な免疫学的組成物又はワクチン組成物におけるポリマーの濃度は、約0.01から約1.5% w/v、約0.05から約1% w/v、及び約0.1から約0.4% w/vの範囲でよい。
【００６４】
1つ又は複数のサイトカイン（5）はワクチン組成物中でタンパク質形であるか、又は1つ若しくは複数の免疫原又はそのエピトープとともに宿主で共同発現させることができる。好ましくは、1つ又は複数のサイトカインは、1つ若しくは複数の免疫原又はそのエピトープを発現するベクターと同じベクターによって又は別々のベクターによって共同発現される。
本開示は、例えば複数の活性成分を、有利には一緒にかつアジュバント、担体、サイトカイン、及び/又は希釈剤とともに混合することによるそのような組合せ組成物の調製を包含する。
【００６５】
本開示に用いることができるサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンα（IFNα）、インターフェロンβ（IFNβ）、インターフェロンγ（IFNγ）、インターロイキン-1α（IL-1α）、インターロイキン-1β（IL-1β）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-5（IL-5）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-8（IL-8）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン-10（IL-10）、インターロイキン-11（IL-11）、インターロイキン-12（IL-12）、腫瘍壊死因子α（TNFα）、腫瘍壊死因子β（TNFβ）、ポリイノシン酸及びポリシチジル酸、シチジン-リン酸-グアノシンオリゴデオキシヌクレオチド（CpG ODN）、及び形質転換増殖因子β（TGFβ）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。サイトカインは、本開示の免疫学的又はワクチン組成物とともに共同投与されるか、及び/又は連続的に投与されうることは理解される。したがって、例えば、本開示のワクチンはまた、in vivoで適切なサイトカイン（例えばワクチンを接種される又は免疫学的応答が誘引される宿主に適合するサイトカイン（例えばウシ類に投与される調製物にはウシ類サイトカイン））を発現する外因性核酸分子を含むことができる。
【００６６】
具体的な実施態様では、アジュバントには以下が含まれうる：TS6、TS7、TS8及びTS9エマルジョン（米国特許7,371,395号）；LR3及びLR4（US7,691,368）；TSAP（米国特許出願公開20110129494）；TRIGENTM（Newport Labs）；合成dsRNA（例えばポリ-IC、ポリ-ICLC（HILTONOL(商標)））；CARBIGENTMアジュバント（MVP Laboratories, Inc.）；ENABL(商標)アジュバント（VaxLiant）；及びMONTANIDETMアジュバント（W/O、W/O/W、O/W、IMS及びゲル）（SEPPIC）。最終的な免疫学的組成物又はワクチン組成物におけるアジュバント濃度は5%から80% v/vの範囲であることができる。
バキュロウイルス/昆虫細胞発現ポリペプチドを土台とする免疫学的組成物及び/又はワクチンの場合、1用量は、約1μgから約2000μg、約50μgから約1000μg、約100μgから約500μgのFMDV抗原、エピトープ又は免疫原を含むことができる。当該用量は、約102から約1020、約103から約1018、約104から約1016、約105から約1012のVLP（ウイルス様粒子）を含むことができる。FMDV抗原を発現するウイルスベクターを土台とする免疫学的組成物及び/又はワクチンの場合、1用量は、約103ウイルス粒子から約1015ウイルス粒子、約103ウイルス粒子から約1014ウイルス粒子、約103ウイルス粒子から約1013ウイルス粒子、約103ウイルス粒子から約1012ウイルス粒子を含むことができる。ウイルス粒子は以下を含む（ただしこれらに限定されない）任意のウイルス力価測定方法を基準にして計算できる：FFA（フォーカス形成アッセイ）若しくはFFU（フォーカス形成単位）、TCID50（50%組織培養感染用量）、PFU（プラーク形成単位）、及びFAID50（50%蛍光抗体感染用量）。用量体積は約0.1から約10mL、約0.2から約5mLであることができる。
以下の非限定的な例によって、これから本開示をさらに説明するであろう。
【実施例】
【００６７】
DNA挿入物、プラスミド及び組換えウイルスベクターの構築は、J.Sambrookらが記載した標準的な分子生物学技術を用いて実施された（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2014）。
【００６８】
実施例1：組換えヒトアデノウイルス5ベクター性FMDV抗原の構築
実施例1.2：組換えヒトアデノウイルス5ベクター性FMDVキメラA24-A12抗原の構築
そのゲノム（GV11骨格、米国特許8,323,663号参照）のE1、E3及びE4領域に欠失を有するヒトアデノウイルスC、血清型5（Ad5）ベクター（アデノウイルスベクター）を用いて、キメラFMDVタンパク質を発現する組換えFMDVワクチンを構築した。当該キメラFMDVタンパク質は、FMDV血清型A24の構造性キャプシド遺伝子（A24 P1）及び非構造性遺伝子A24（2A-部分的2B）、FMDV血清型A12の非構造性部分的3B遺伝子及びプロテアーゼ遺伝子（部分的3B-3C）を含んでいる（配列番号:2）。
FMDV A24(P1-2A-部分的2B)-A12(部分的3B-3C)をコードするキメラポリヌクレオチドをシャトルプラスミドに導入した（図2及び3参照）。直鎖化GV11プラスミド（カナマイシン耐性遺伝子を保有する）及びキメラFMDVポリヌクレオチドを含む直鎖化シャトルプラスミドによるBJDE3大腸菌細胞の共同形質転換後に、カナマイシン耐性大腸菌クローンを選別した。組換えプラスミドを保有するクローンはRFLPによって確認された。単一クローンを選別し、プラスミドを直鎖化してM2A細胞にトランスフェクトした。M2A細胞トランスフェクションから得られる溶解物を連続継代して、組換えアデノウイルスベクター性キメラFMDVワクチンの抗力価ストックを作製した。
【００６９】
ドナー遺伝子挿入部位はAd5 E1発現カセットのCMVプロモーターとSV40ポリAとの間に存在する。当該発現カセットはE1領域のBBAに挿入される。A24-A12発現カセット（E1領域欠失接合部に位置する）は、ウイルスゲノムのRNA転写では右から左に読取りが進む。当該挿入カセットのフランキングヌクレオチド配列には既知の調節シグナルは存在しない。CMVエンハンサー/プロモーターは転写開始を制御する。この配列内に、ウイルス性エンハンサーCAATボックス、TATAボックス、転写開始部位、及び5'スプライス部位配列が存在する。
CMV配列の後にスプライスドナー配列を含む人工非翻訳領域（UTR）が続く。発現されるべき遺伝子のオープンリーディングフレームが3'スプライス部位配列に続き、サルウイルス40（SV40）初期ポリアデニル化シグナルは当該オープンリーディングフレームの3’に配置され転写を終了させる。
RBA遺伝子構造同一性（GSI）アッセイのためにプライマー対を設計した。GSIアッセイはPCRを用いて骨格の生物学的因子及び発現カセットを識別する。GSIブロット（図4参照）は正確な骨格及びA24-A12 FMDV発現カセットを示した。A24-A12発現カセットの配列分析もまた、シャトルプラスミドと組換えアデノウイルスベクター性キメラA24-A12 FMDVワクチンから抽出されたDNAとの間のヌクレオチド配列同一性を立証した。
組換えアデノウイルスベクター性キメラA24-A12 FMDVワクチンは、293細胞でA24タンパク質をin vitroで発現することがウェスタンブロットアッセイによって確認され、約28KDaの位置に泳動する反応性タンパク質が得られた（図5参照）。ウェスタンブロットアッセイで検出に用いられた抗体はモノクローナル抗体である。組換えアデノウイルスベクター性キメラA24-A12 FMDVワクチンから発現されるA24タンパク質の分子量は、陽性コントロールのシャトルプラスミドを293細胞へトランスフェクトした後に観察されるタンパク質の分子量と区別できなかった（図5参照）。
【００７０】
実施例1.2：組換えヒトアデノウイルス5ベクター性FMDV O1M抗原の構築
そのゲノム（GV11骨格、米国特許8,323,663号参照）のE1、E3及びE4領域に欠失を有するヒトアデノウイルスC、血清型5（Ad5）ベクター（アデノウイルスベクター）を用いて、FMDVタンパク質を発現する組換えFMDVワクチンを構築した。当該FMDVタンパク質は、FMDV O1/Man/87株に由来する構造性キャプシドP1（VP4-VP2-VP3-VP1）並びに非構造性タンパク質2ABC及び3ABC（完全長プロテアーゼ3Cを含む）を含んでいる（配列番号:4）。
FMDV O1M Pl（VP4-VP2-VP3-VP1-2ABC’3A’BC）をコードする合成ポリヌクレオチド（配列番号:3）をシャトルプラスミドに導入した（図6参照）。組換えアデノウイルスベクター性O1M FMDVワクチンを実施例1.2に記載の手順にしたがって構築した。
O1M87 FMDV発現カセット（E1領域欠失接合部に位置する）は、ウイルスゲノムのRNA転写では右から左に読取りが進む。当該挿入カセットのフランキングヌクレオチド配列には既知の調節シグナルは存在しない。CMVエンハンサー/プロモーターは転写開始を制御する。この配列内に、ウイルス性エンハンサーCAATボックス、TATAボックス、転写開始部位、及び5'スプライス部位配列が存在する。
CMV配列の後にスプライスドナー配列を含む人工非翻訳領域（UTR）が続く。発現されるべき遺伝子のオープンリーディングフレームが3'スプライス部位配列に続き、サルウイルス40（SV40）初期ポリアデニル化シグナルは当該オープンリーディングフレームの3’に配置され転写を終了させる。
GSIブロットは正確な骨格及びO1M87 FMDV発現カセットを示した。O1M87 FMDV発現カセットの配列分析もまた、シャトルプラスミドと組換えアデノウイルスベクター性O1M87 FMDVワクチンから抽出されたDNAとの間のヌクレオチド配列同一性を立証した。組換えアデノウイルスベクター性O1M87 FMDVワクチンは、293細胞でO1M87タンパク質をin vitroで発現することがウェスタンブロットアッセイによって確認された。
【００７１】
実施例1.3：組換えヒトアデノウイルス5ベクター性FMDV Irn抗原の構築
そのゲノム（GV11骨格、米国特許8,323,663号参照）のE1、E3及びE4領域に欠失を有するヒトアデノウイルスC、血清型5（Ad5）ベクター（アデノウイルスベクター）を用いて、FMDVタンパク質を発現する組換えFMDVワクチンを構築した。合成FMDVキャプシドコード配列P1並びにFMDV血清型A/Irn/05の非構造性遺伝子2A、2B、部分的2C（2C’）、部分的3A（3A’）、3B及び3Cのプロテアーゼコード配列をシャトルプラスミドに導入した（図7参照）。組換えアデノウイルスベクター性Irn FMDVワクチンは実施例1.2に記載の手順にしたがって構築した。
Irn FMDV発現カセット（E1領域欠失接合部に位置する）は、ウイルスゲノムのRNA転写では右から左に読取りが進む。当該挿入カセットのフランキングヌクレオチド配列には既知の調節シグナルは存在しない。CMVエンハンサー/プロモーターは転写開始を制御する。この配列内に、ウイルス性エンハンサーCAATボックス、TATAボックス、転写開始部位、及び5'スプライス部位配列が存在する。
CMV配列の後にスプライスドナー配列を含む人工非翻訳領域（UTR）が続く。発現されるべき遺伝子のオープンリーディングフレームが3'スプライス部位配列に続き、サルウイルス40（SV40）初期ポリアデニル化シグナルは当該オープンリーディングフレームの3’に配置され転写を終了させる。
組換えアデノウイルスベクター性Irn FMDVワクチンは、PCR系遺伝子構造同一性（GSI）アッセイを用いて識別され、ウェスタンブロット技術によるタンパク質の発現で立証された。
【００７２】
実施例1.4：組換えヒトアデノウイルス5ベクター性FMDV Asia抗原の構築
そのゲノム（GV11骨格、米国特許8,323,663号参照）のE1、E3及びE4領域に欠失を有するヒトアデノウイルスC、血清型5（Ad5）ベクター（アデノウイルスベクター）を用いて、FMDVタンパク質を発現する組換えFMDVワクチンを構築した。合成FMDVキャプシドコード配列P1並びにFMDV Asia/Leb/89の非構造性遺伝子2A、2B、部分的2C（2C’）、部分的3A（3A’）、3B及び3Cのプロテアーゼコード配列をシャトルプラスミドに導入した（図8参照）。組換えアデノウイルスベクター性Asia FMDVワクチンは実施例1.2に記載の手順にしたがって構築した。
Asia FMDV発現カセット（E1領域欠失接合部に位置する）は、ウイルスゲノムのRNA転写では右から左に読取りが進む。当該挿入カセットのフランキングヌクレオチド配列には既知の調節シグナルは存在しない。CMVエンハンサー/プロモーターは転写開始を制御する。この配列内に、ウイルス性エンハンサーCAATボックス、TATAボックス、転写開始部位、及び5'スプライス部位配列が存在する。
CMV配列の後にスプライスドナー配列を含む人工非翻訳領域（UTR）が続く。発現されるべき遺伝子のオープンリーディングフレームが3'スプライス部位配列に続き、サルウイルス40（SV40）初期ポリアデニル化シグナルは当該オープンリーディングフレームの3’に配置され転写を終了させる。
組換えアデノウイルスベクター性Asia FMDVワクチンは、293細胞でAsiaタンパク質をin vitroで発現することがウェスタンブロットアッセイによって確認され、約38KDaの位置に泳動する反応性タンパク質が得られた。ウェスタンブロットアッセイで検出に用いられた抗体はFMD VP2ポリクローナル抗体である。発現されたAsiaSS.2Bタンパク質の分子量は、陽性コントロールプラスミドを293細胞へトランスフェクトした後に観察されるタンパク質の分子量と区別できなかった。
【００７３】
実施例2：畜牛及びブタでのチャレンジ実験
畜牛及びブタをA24-A12 FMDVワクチン又はO1M87 FMDVワクチンで0日目に1回IMによりワクチン免疫し、14日目に多くの血清型（例えばA24、A12、O1、Asia、Irn及びIraq株）でチャレンジした。
図9は、3通りの異なる用量のFMDVチャレンジに対するO1 FMDVワクチンの動物及びコントロールにおける防御を示す。この用量滴定実験では、組換えアデノベクター性O1M FMDVワクチンは、ワクチン接種後14日（14dpv）の直接的IDL同種チャレンジ後にFMD普遍化病変（足病巣）に対して防御を付与する能力について評価された。健康な6カ月齢の雌のホルスタイン畜牛を4つの処置グループの1つにランダムに分けた。コントロールナイーブ畜牛（T01；n＝4）をただ1回2mL用量の最終処方緩衝液（FFB）を用いて筋肉内により免疫した。T02−T04（n＝7/グループ）の畜牛には、ENABLTMC1アジュバント中で処方したマスターウイルス継代2（MSV+2）から調製した活性成分の用量を下げながらワクチン免疫を実施した（抗アデノウイルスヘキソンフォーカス形成単位（FFU）又はフォーカス形成アッセイ（FFA）；log10）。T02−T04にはそれぞれ、総用量2.38ｘ105、5.94ｘ104FFU、又は1.49ｘ104FFUが投与された。ワクチン接種後2週間（チャレンジ日）で、T02及びT03ワクチン接種動物の100%がFMDV O1 Manisa血清ウイルス中和（SVN）力価を有し、それに対して、最低ワクチン用量処置グループ（T04）では43%であった。FMDV O1 Manisaの1ｘ104ウシ50%感染用量単位（BID50）による舌皮内チャレンジ後、T01コントロールナイーブ畜牛の100%が普遍化病変（足病巣）を示した。対照的に、ワクチン接種グループの普遍化病変に対する防御レベルは、86%（T04）から100%（T02及びT03）の範囲であった。4匹のコントロール畜牛（T01）の全てが、チャレンジ後1−3日（1−3dpc）に収集した血漿でFMDV陽性であったが、21匹のワクチン接種動物ではいずれも1−5dpcにはウイルス血症を示さなかった。T01では、2−5dpcに収集した鼻サンプルの88%がウイルス陽性であり、それに対して2−5dpc検査サンプルの25%（T03）、27%（T02）及び36%（T04）が陽性であった。図10は、3通り用量のO1 FMDVワクチン及びコントロールにおける血清学を示す。
これらの結果は、ENABL C1アジュバント中で処方された組換えアデノベクターO1M FMDVワクチンの活性成分は高度に免疫原性で畜牛のIDL同種FMDVチャレンジに対して有効であり、最小限の概算防御用量に関するデータを提供することを示している。
A24-A12及びO1M87ワクチンの両方が試験され、仔ウシ及びマウスで安全であった。
【００７４】
実施例3：アジュバントの血清学的免疫原性及び対応するウイルス死滅/安定性実験
アジュバント添加ワクチンは最低防御用量（MPD）を減少させ、より有効なワクチンをもたらすことができる。MPD減少はアジュバント費用及び供給保証によって比較考量できる。しかしながら、いくつかのアジュバントはワクチンの有効性を低下させうる。アジュバントは望ましくない応答へ免疫系を向かわせることがあり、又はアジュバントは免疫物質に対して有害なことがある（例えば安定性の欠如）。
本試験の目的は、アジュバントの血清学的有効性を評価することであった。血清学的有効性試験を畜牛で実施し、並行してウイルス死滅/安定性試験を実施して、5つのアジュバントのいずれかがアデノウイルスFMDVワクチンに対して有害な作用を有するか否かを決定した。各用量は、それぞれのアジュバントを含む2mL用量中に200μLの最終AI（活性成分）/用量から成っている。アジュバントは、ポリアクリル酸、LF2エマルジョン、LR6エマルジョン、CARBIGENTM及びENABL(商標)C1である（下記表11参照）。
【００７５】
表1.1：アデノウイルスFMDVワクチンの調製
2019507184.tif 000004
TS6*：US 7,608,279及びUS 7,371,395に記載のTS6アジュバント/エマルジョン
LR4**:US7,691,368に記載のLR4アジュバント/エマルジョン
CARBIGENTM：カルボマー系（Carbopol 934P）アジュバント懸濁物（MVPラボラトリーズ社（MVP Laboratories, Inc）の製品）
ENABL(商標)C1：VaxLiantから市場で購入した畜牛用アジュバント製品
【００７６】
表1.2：TS6エマルジョン（US7,608,279及びUS7,371,395に記載のプレマルジョン）
2019507184.tif 000005
【００７７】
Table 1.3：LR4エマルジョン（US7,691,368に記載のプレマルジョン
2019507184.tif 000006
【００７８】
ワクチンを4℃で保存し、時間の経過にしたがって試験した。標準的フォーカス形成アッセイによる力価測定アッセイにしたがって各ワクチン中のウイルスの力価を測定した（その場合、検出ウイルスの量は細胞単層で特異的抗アデノウイルス抗体によって判読された）。それぞれの力価を比較した。最初の3カ月のデータが下記の表2並びに図11（25℃）及び図12（4℃）に示される。4℃では、処方化ワクチンに存在する大半の抗原又はウイルスは3カ月にわたって安定である。25℃では、ポリアクリル酸、LF2及びCarbigen Mで処方された抗原又はウイルスは7週間の間比較的安定である。これら3つの処方物の安定性は25℃では3カ月時点でわずかな低下を示した。しかしながら、組換えウイルスがアジュバントの保護効果を立証するアジュバントと組合されるとき、前記安定性の低下は小さい。アジュバントLR6で処方された抗原又はウイルスは、4℃及び25℃の両方における検出未満ベルから明瞭なようにいくらかのアジュバントアッセイ干渉を受けた。しかしながら、LR6アジュバント添加処方物は3カ月で固有のウイルス力価を生じ、25℃で安定である。
【００７９】
表2：5つのアジュバントの最大3カ月間のウイルス死滅及び安定性試験
2019507184.tif 000007
検出未満*：アジュバントアッセイ干渉
【００８０】
対応する血清学試験を畜牛で実施した。各グループは実験グループ当たり10匹の動物を含み（コントロールでは5匹）、それらに0日目に1用量（2mL）を投与し、続いて21日目にブーストを実施した。実験を通して血液サンプルをいくつかの時点で採取し、血清サンプルを分析した。ウイルス中和力価による血清学的試験を実施した。初期データは、最初のワクチン接種後14日目にいくつかのグループで血清学的応答を示した。総合すれば、これらのデータは、ある種のアジュバント中で処方されたアデノウイルスベクター性FMDワクチンは、熱安定性の改善及び温度変動処理能力のための条件を提供できることを示している。これらの初期データをまとめるとき、免疫学的応答は維持されるか又は潜在的に改善される。
【００８１】
実施例4：複数の組換えヒトアデノウイルスベクター性FMDV O1抗原による畜牛の2用量ワクチン免疫の血清学的免疫原性
本実験の目的は、種々のアジュバントを用いて又は用いないで処方したアデノベクター性FMDV O1 Manisaを投与した後の畜牛の血清学的抗体応答を評価することである。
普通に飼育した55匹の仔ウシ（約5カ月齢）をそれぞれ、下記の表4に示すように6通りの処置グループの1つにランダムに分けた。
【００８２】
表4：
2019507184.tif 000008
【００８３】
グループ6（監視用動物）以外の全ての仔ウシを、アジュバントを含む（グループ1−4）又はアジュバントを含まない（グループ5）アデノウイルスベクター性O1/Manisa構築物で、21日間隔で2回試験ワクチンの2mLでワクチン免疫した。全ての注射は筋肉内経路（IM）により右及び左側の肩で交互に実施した。上記の表4は各グループの処置の要旨を含んでいる。
各ワクチン接種後に少なくとも1時間、仔ウシを断続的に急性全身性の有害事象の臨床的徴候について観察した。全ての畜牛から血液サンプルを、-1日目（ワクチン接種前）、7、15、21（ワクチン接種前）、28、及び35日目に収集した。全ての畜牛の血清サンプルをFMDV抗体について血清ウイルス中和（SNV）により検査した。加えて、アデノウイルスに対する抗体応答（SAV）を、-1日目及び35日目に収集したサンプルで全てのグループの全ての動物で決定した。SVN及びSAVの結果をLog10で示し、0.6Log10以下の値は血清抗体について陰性とみなした。
ワクチン接種後の安全性評価は、各ワクチン接種後の少なくとも3日間の直腸温度、目視観察及び注射部位の触診を含んでいた。注射部位の局所性有害事象を有する乳牛は異常の寛解まで断続的に観察した。本実験は最後の血液収集後35日目で終了した。
【００８４】
FMDV抗体を用いるFMDV血清学的応答の血清ウイルス中和（SVN）Log10による結果は下記に記載される。
全てのグループの全ての動物が実験の開始前にFMDV抗体について陰性であった。全ての監視用動物は実験を通してFNDV抗体について陰性であった。ワクチン接種後の血清転換は0.9を超えるLog10力価の増加と定義した。14日目までに（最初のワクチン接種から2週間）、ENABL(商標)C1（グループ1）の仔ウシで5/10（50%）が血清転換した。残りのワクチン接種グループ(2−5)では、20−40%の仔ウシが血清転換した。加えて、グループの平均抗体力価はグループ1（ENABL(商標)C1）でわずかに高く、グループ2（LF）及び3（ポリアクリル酸）がその後に続いた（図13）。
35日目までに（2回目のワクチン接種から2週間）、全てのワクチン接種動物（グループ1、ENABL(商標)C1；グループ2、LF；グループ5、アジュバント無し）が血清転換し、
グループ3（ポリアクリル酸）及びグループ4（Carbigen M）のそれぞれ90%及び80%が後に続いた。LFアジュバントとともにワクチン接種された動物、続いてアジュバント無しでワクチン接種された動物（グループ5）、及びENABL(商標)C1（グループ1）アジュバントでワクチン接種された動物が、2用量ワクチン免疫レジメンの後でより高い抗体応答を示した（図13参照）。
【００８５】
アデノウイルス抗体を用いた血清ウイルス中和（SNV）Log10によるFMDV血清学的応答の結果は下記に記載される。
全ての監視用動物及びワクチン接種動物は、-1日目のSN抗体力価でアデノウイルス陰性であった（Log10は0.6以下）。35日目までに、ワクチン接種仔ウシの全て（グループ5の1匹（ID 134）を除く）が血清転換し、アジュバントを含むワクチンでワクチン接種された動物のグループ（グループ1−4）で全体的により高い幾何平均を示した（図14参照）。
これらの結果は、いくつかのグループにおける最初のワクチン接種後14日目の血清学的応答を示した。2回目のワクチン接種から2週間後に、より高い抗体応答が、LFアジュバントでワクチン接種された仔ウシで観察され、アジュバント無しでワクチン接種された動物及びENABL C1アジュバントでワクチン接種された動物が続いた。
これらの結果は、アジュバントの有無にかかわらず、単回ワクチン接種後の抗体応答は小さいことを示唆している。しかしながら、2回ワクチン接種（プライム-ブースト）レジメンを用いるとき、抗体応答は全体的に高くなる。ワクチン構築物を筋肉内に2回（3週間離して）投与したとき、全身的有害事象は観察されなかった。
【００８６】
実施例5：ワクチン免疫後のブタにおけるFMDVワクチンの血清学的評価
本実験の目的は一価ワクチン処方物の投与後の仔ブタで抗体応答を評価することである。一価ワクチン処方物は、アデノ5ベクター性FMDV O1 Manisa及び/又はFMDVバキュロウイルス発現O1 Manisa組換えウイルス様粒子（VLP）を含んでいる。
20匹の普通に飼育した仔ブタ（約5週齢）を2通りの処置グループ（各々10匹の仔ブタを含む）にランダムに分けた。グループの組成は下記の表5に示されている。
【００８７】
表5：
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【００８８】
グループ1の仔ブタに2mLのワクチンを接種した。全ての注射は筋肉内経路（IM）により右及び左側の肩で交互に実施した。各ワクチン接種前に全体的な健康状態について仔ブタを観察した。全ての仔ブタから血液サンプルを0日目（ワクチン接種前）、7、14、21（ワクチン接種前）、28及び35日目に収集した。全仔ブタの35日目の血清サンプルをFMDV抗体について血清ウイルス中和（SVN）によって検査した。グループ１の仔ブタのサンプルは全収集日についてSVNアッセイに付された（なぜならば、それらは35日目に続いて全体的に高い抗体応答を有していたからである）。結果をLog10で示し、0.75Log10以下の値を血清抗体陰性とみなした。ワクチン接種後安全性評価は、各ワクチン接種後の3日間の直腸温度、目視観察及び注射部位の触診を含んでいた。
FMDV抗体を用いる血清ウイルス中和（SVN）Log10によるFMD血清学的応答の結果を下記に記載する。全ての監視用動物は本実験の前及び終了時にFMDV抗体陰性であった。
28日目までに（2回目のワクチン接種後1週間）、グループ1の全仔ブタが血清転換した（力価は1.20Log10以上）（図15参照）。ワクチン接種に起因する全身性及び/又は局所性有害作用は観察されなかった。これらの結果は、最初のワクチン接種後にワクチン接種グループが小さな抗体応答しか持たなかったとしても、2回目の（プライム-ブースト）ワクチン接種後の抗体応答は実験終了時までに高くなったことを明瞭に示した。
【００８９】
実施例6：投与経路
本実験の目的は、畜牛又はブタで2用量ワクチン接種の血清学的応答を評価することであり、このとき2回の組換えアデノウイルスベクター性FMDVワクチン、1回の組換えアデノウイルスベクター性FMDVワクチン及び1回のバキュロウイルス発現組換えFMDVウイルス様粒子（VLP）ワクチン、又は2回のFMDV VLPワクチンが用いられ、さらに種々の投与経路（経皮、皮下、又は皮内経路）が用いられる。本実験はまた、複数ワクチンが投与されるときの干渉問題に注目するために設計される。
アジュバントは、ポリアクリル酸、LF2エマルジョン、LR6エマルジョン、CARBIGENTM、及びENABL(商標)C1である。処置グループは下記の表6に提示される。
【００９０】
表6：
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【００９１】
各ワクチン接種後に少なくとも1時間、仔ウシを断続的に急性全身性の有害事象の臨床的徴候について観察した。全ての畜牛から血液サンプルを、-1日目（ワクチン接種前）、7、15、21（ワクチン接種前）、28、及び35日目に収集した。全ての畜牛の血清サンプルをFMDV抗体について血清ウイルス中和（SNV）により検査した。加えて、アデノウイルスに対する抗体応答（SAV）を、-1日目及び35日目に収集したサンプルで全てのグループの全ての動物で決定した。
ワクチン接種後安全性評価は、各ワクチン接種後の少なくとも3日間の直腸温度、目視観察及び注射部位の触診を含んでいた。注射部位の局所性有害事象を有する乳牛は異常の寛解まで断続的に観察される。
プライム-ブーストは全グループに影響を与えるが、プライム-ブースト効果はアデノウイルスワクチンのプライムを受けた後にバキュロウイルスFMD構築物のブーストを受けた動物で大きいことを結果は示している。さらにまた、投与経路は血清学的応答及び防御に影響するとともに免疫持続期間にも影響を及ぼす。特定の投与経路及び/又は投与経路（TD、IM及びSQ）の組み合わせは、免疫応答を激化させ、防御をさらに高め、干渉を克服し、さらに母獣由来抗体陽性（MDA陽性）動物を防御するように思われる。
【００９２】
実施例7：ブタ類での有効性
ブタをプライム-ブーストレジメンで21日離して2回FMD（いくつかの血清型）に対してワクチン免疫し、14dpvに多くのFMDV血清型（例えばA24、A12、O1、Asia、Irn及びIraq株）でチャレンジする。プライム-ブーストレジメンでは、異種プライム-ブーストプロトコル（アデノプライムに続いてバキュロブースト）とともに同種プライム-ブースト（アデノ-アデノ、バキュロ-バキュロ）が考察される。
用量滴定試験では、組換えアデノベクター性FMDVワクチンが、ワクチン接種後14日（14dpv）の同種及び異種チャレンジ後のFMD普遍化病変（足病巣）に対する防御付与能力について評価される。本実験では実施例2に記載の手順を用い、プライム-ブースト投与レジメンにおける免疫防御用量を決定する。
結果は、プライム-ブーストプロトコルで用いられた組換えアデノベクターFMDVワクチンは、ブタの同種及び異種FMDVチャレンジで高度に免疫原性で有効であること、干渉を克服し母獣由来抗体陽性（MDA陽性）動物を防御することを明瞭に示している。
【００９３】
実施例8：ウシ類での有効性
畜牛に最初に組換えアデノウイルスベクター性FMDVワクチンを接種し、21日離して通常の殺滅FMDワクチン又はバキュロウイルス発現FMDV VLPワクチンでブーストし、さらに第二のワクチン接種後14日で多くのFMDV血清型（例えばA24、A12、O1、Asia、Irn及びIraq株）でチャレンジする。
用量滴定試験では、組換えアデノベクター性FMDVワクチンが、ワクチン接種後14日（14dpv）の直接的な同種及び異種チャレンジ後のFMD普遍化病変（足病巣）に対する防御付与能力について評価される。本実験では実施例2に記載の手順を用い、プライム-ブースト投与レジメンにおける免疫防御用量を決定する。
これらの結果は、プライム-ブースト投与レジメンは、畜牛で同種及び異種FMDVチャレンジに対して高度に免疫原性で有効であること、FMDV感染に対する防御を動物に提供し、干渉を克服し、かつ母獣由来抗体陽性（MDA陽性）動物を防御することを明瞭に示している。
*  *  *  *  *  *  *  *
【００９４】
これまで本開示の実施態様を詳細に述べてきたが、上記の例によって明確にされる本開示は上記の記載に示す具体的な細目に限定されないことは理解されるべきである。なぜならば、多くの明白なその変型は本開示の趣旨を逸脱することなく可能だからである。
本明細書で引用又は言及された全ての資料（“本明細書引用資料”）、及び本明細書引用資料で引用又は言及された全ての資料は、本明細書に又は本明細書に参照により含まれる任意の資料に記載された任意の製造業者の指示、説明書、製品仕様書及び任意の製品についてのプロダクトシートとともに参照により本明細書に含まれ、かつ本発明の実施で利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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