(57)【要約】  本発明は、ＣＤＫ１２（サイクリン依存性キナーゼ１２）の阻害剤と、反復伸長転写物の生成によって引き起こされる対象の障害の治療または予防でのそれらの使用とに関する。
2019512554.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反復伸長転写物の生成によって引き起こされる対象の障害の治療または予防に使用するための阻害剤であって、前記阻害剤がＣＤＫ１２（サイクリン依存性キナーゼ１２）の阻害剤である、阻害剤。
【請求項２】
前記反復伸長転写物が核内に保持される前記転写物をもたらす、請求項１に記載の使用のための阻害剤。
【請求項３】
前記障害が、筋強直性ジストロフィー１型、筋強直性ジストロフィー２型、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および前頭側頭型認知症（Ｃ９ＯＲＦ７２）、ハンチントン病類縁疾患２型、ハンチントン病、脊髄小脳失調症１型、２型、３型、６型、７型、８型、１０型、３１型、１７型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症ならびに球脊髄性筋萎縮症を含む群から選択された任意の障害を含む、請求項１または２に記載の使用のための阻害剤。
【請求項４】
前記反復伸長転写物が、ＣＴＧ  ＤＮＡ反復、ＣＣＴＧ  ＤＮＡ反復、ＣＧＧ  ＤＮＡ反復、ＧＧＧＧＣＣ  ＤＮＡ反復、ＡＴＴＣＴ  ＤＮＡ反復、ＴＧＧＡＡ  ＤＮＡ反復またはＣＡＧ  ＤＮＡ反復由来のＲＮＡを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項５】
前記阻害剤がＣＤＫ１２に特異的である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項６】
前記阻害剤がＣＤＫ９の活性または利用能の阻害剤ではない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項７】
前記阻害剤がＣＤＫ１２発現の阻害剤を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項８】
前記阻害剤が、ＣＤＫ１２発現を阻害することができるオリゴヌクレオチドを含む、請求項７に記載の使用のための阻害剤。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドがＣＤＫ１２  ｍＲＮＡ転写物に実質的に相補的な配列を含む、請求項８に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１０】
前記阻害剤が、ＣＤＫ１２に結合することができ、および／またはその標的分子に対するＣＤＫ１２の結合を遮断することができる分子を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１１】
前記阻害剤が、サイクリンＫに対するＣＤＫ１２の結合を妨げることができる分子を含む、請求項１〜６または１０のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１２】
前記阻害剤が、ＣＤＫ１２がＲＮＡポリメラーゼＩＩのｃ末端ドメイン上でＳｅｒ２をリン酸化するのを妨げることができる分子を含む、請求項１〜６、１０または１１のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１３】
ＣＤＫ１２に対する前記阻害剤の前記結合が、ＣＤＫ１２活性部位が遮断されるように、前記活性部位にあるか、前記ＣＤＫ１２活性部位に隣接している、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１４】
ＣＤＫ１２に対する前記阻害剤の前記結合がアミノ酸位置７２７〜１０２０にある、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１５】
ＣＤＫ１２に対する前記阻害剤の前記結合がＮおよびＣ末端ローブの周りに伸び、結合したＡＴＰと接触するＣ末端ドメイン伸長部にある、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１６】
ＣＤＫ１２に対する前記阻害剤の前記結合が、Ｔｈｒ７３７、Ｌｙｓ７５６、Ｇｌｕ８１４、Ｍｅｔ８１６およびＡｓｐ８１９から選択されるＡＴＰ接触残基のうち任意の１つ以上にある、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１７】
前記阻害剤が、ＣＤＫ１２に結合することができる小分子、オリゴヌクレオチド、ペプチドまたはタンパク質を含む、請求項１〜６または１０〜１６のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１８】
前記阻害剤がピラゾロ［１，５ｂ］ピリダジンコア構造を含み、ＣＤＫ１２活性を阻害することができる、請求項１〜６または１０〜１７のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１９】
前記阻害剤が式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含み、
【化１】
2019512554.tif 000026
式中、
Ｒ１は、Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ−、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ハロアルキル、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＣ１−６アルキルであり、
Ｒ２は、Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ−、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ハロアルキル、ハロゲン、−ＣＮまたは−ＯＣ１−６アルキルであるか、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１個、２個または３個のヘテロ原子を有する５員または６員のシクロアリール、シクロアルキルまたは複素環、例えばベンゼン、モルホリニル、ピペリジン、ピペラジンであり、
Ｒ３は、Ｃ３−６シクロアルキル、例えばシクロプロピルであり、
【化２】
2019512554.tif 000027
または
【化３】
2019512554.tif 000028
式中、
Ｒ４は、Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ−、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ハロアルキル、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＣ１−６アルキルであり、
Ｒ５は、Ｈ；−ＯＨ；−Ｏ−；Ｃ１−６アルキル；Ｃ２−６アルケニル；Ｃ２−６アルキニル；Ｃ１−６ハロアルキル；ハロゲン；−ＣＮ；−ＯＣ１−６アルキル；Ｃ１−６アルキル−Ｎ−（Ｘ）（Ｙ）；Ｏ、ＳおよびＮから選択される１個、２個または３個のヘテロ原子を有する５員もしくは６員のシクロアリール、シクロアルキルもしくは複素環であって、前記シクロアリール、シクロアルキルもしくは複素環が、Ｃ１−３アルキル、例えばＮ−メチルピペラジニルに任意に置換されている５員もしくは６員のシクロアリール、シクロアルキルもしくは複素環；または−ＯＣ１−６アルキル−Ｎ（Ｘ）（Ｙ）であり、
式中、Ｘは、ＨまたはＣ１−６アルキルであり、Ｙは、ＨまたはＣ１−６アルキルであり、
式中、アルキル基は１個以上の−ＯＨ基に任意に置換され、
Ｒ６は、Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ−、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ハロアルキル、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＣ１−６アルキルである、請求項１〜６または１０〜１８のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項２０】
請求項１９に記載の使用のための阻害剤であって、
Ｒ１はＨであり、
Ｒ２はＨであり、
Ｒ３はＣ３−６シクロアルキル、例えばシクロプロピルであり、
【化４】
2019512554.tif 000029
または
【化５】
2019512554.tif 000030
式中、
Ｒ４は、Ｈ、−ＣＮ、−ＯＣ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルであり、
Ｒ５は、Ｈ；Ｃ１−６アルキル−Ｎ−（Ｘ）（Ｙ）；Ｏ、ＳおよびＮから選択される１個、２個または３個のヘテロ原子を有する５員または６員のシクロアリール、シクロアルキルまたは複素環であって、前記シクロアリール、シクロアルキルまたは複素環が、Ｃ１−３アルキル、例えばＮ−メチルピペラジニルに任意に置換されている５員または６員のシクロアリール、シクロアルキルまたは複素環、−ＯＣ１−６アルキル−Ｎ（Ｘ）（Ｙ）であり、
式中、Ｘは、ＨまたはＣ１−６アルキルであり、Ｙは、ＨまたはＣ１−６アルキルであり、
式中、アルキル基は１個以上の−ＯＨ基に任意に置換され、
Ｒ６は、Ｈまたは−ＯＣ１−６アルキルである、阻害剤。
【請求項２１】
請求項１９に記載の使用のための阻害剤であって、
Ｒ１はＨであり、
Ｒ２はＨであり、
Ｒ３はシクロプロピルであり、
【化６】
2019512554.tif 000031
または
【化７】
2019512554.tif 000032
式中、
Ｒ４は、Ｈ、−ＣＮ、−ＯＣＨ３、ＣＦ３であり、
Ｒ５は、Ｈ、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ−メチルピペラジニル、−ＯＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２であり、
Ｒ６は、Ｈまたは−ＯＣＨ３である、阻害剤。
【請求項２２】
請求項１９に記載の使用のための阻害剤であって、
Ｒ１はＨであり、
Ｒ２はＨであり、
Ｒ３はシクロプロピルであり、
【化８】
2019512554.tif 000033
または
【化９】
2019512554.tif 000034
式中、
Ｒ４はＨであり、Ｒ５は−ＣＨ２ＮＥｔ２または−ＯＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ６はＨであるか、
Ｒ４は−ＣＮ、−ＯＣＨ３であり、Ｒ５はＨであり、Ｒ６はＨであるか、
Ｒ４は−ＣＦ３であり、Ｒ５はＮ−メチルピペラジニルであり、Ｒ６はＨであるか、
Ｒ４は−ＯＣＨ３であり、Ｒ５はＨであり、Ｒ６は−ＯＣＨ３である、阻害剤。
【請求項２３】
式（Ｉ）の前記阻害剤が以下の式を備えている、請求項１９に記載の使用のための阻害剤。
【化１０】
2019512554.tif 000035
または
【化１１】
2019512554.tif 000036
または
【化１２】
2019512554.tif 000037
または
【化１３】
2019512554.tif 000038
または
【化１４】
2019512554.tif 000039
または
【化１５】
2019512554.tif 000040
または
【化１６】
2019512554.tif 000041
または
【化１７】
2019512554.tif 000042
【請求項２４】
前記阻害剤が式（Ｘ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、請求項１〜６または１０〜１６に記載の使用のための阻害剤。
【化１８】
2019512554.tif 000043
【請求項２５】
前記阻害剤が式（ＸＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、請求項１〜６または１０〜１６に記載の使用のための阻害剤。
【化１９】
2019512554.tif 000044
【請求項２６】
前記阻害剤が式（ＸＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、請求項１〜６または１０〜１６に記載の使用のための阻害剤。
【化２０】
2019512554.tif 000045
【請求項２７】
前記阻害剤が式（ＸＩＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、請求項１〜６または１０〜１６に記載の使用のための阻害剤。
【化２１】
2019512554.tif 000046
【請求項２８】
前記阻害剤が式（ＸＩＶ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む、請求項１〜６または１０〜１６に記載の使用のための阻害剤。
【化２２】
2019512554.tif 000047
【請求項２９】
前記阻害剤が少なくとも１つの他の治療剤と組み合わせて投与されるか、投与されるように構成される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項３０】
前記１つの他の治療剤が、オリゴヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡまたはその等価物を含むか、
前記少なくとも１つの他の治療剤が、小分子、薬物、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチドまたはワクチンを含んでもよい、請求項２９に記載の使用のための阻害剤。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの他の治療剤が、ナトリウムチャネル遮断薬、ＣＮＳ刺激薬、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、クレアチン補充、メカセルミンリンファベート（ＩＰＬＥＸ、組換えインスリン様成長因子１およびその結合タンパク質、ＢＰ−３の組合せ）、ペンタミジン、ビスアミジニウム阻害剤、ロモフンギンもしくはジロモフンギンまたはそれらの組合せを含む、請求項２９に記載の使用のための阻害剤。
【請求項３２】
前記使用が、前記ＤＭＰＫ遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドと組み合わされたものである、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項３３】
前記阻害剤が断続的に投与されるか、投与されるように構成される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の使用のための阻害剤。
【請求項３４】
対象の反復伸長転写物の生成によって引き起こされる障害の治療または予防のための医薬品の調製でのＣＤＫ１２阻害剤の使用。
【請求項３５】
対象の反復伸長転写物の生成によって引き起こされる障害を治療または予防する方法であって、ＣＤＫ１２の阻害剤を対象に投与することを含む方法。
【請求項３６】
前記方法が少なくとも１つの他の治療剤のその後の投与をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
反復伸長転写物の生成によって引き起こされる障害のための治療剤のスクリーニング方法であって、
・スクリーニングのための分子を提供することと、
・前記分子がＣＤＫ１２の活性を阻害するかどうかを検出することとを含み、
ＣＤＫ１２の阻害の検出により、潜在的候補治療剤として分子を選択する方法。
【請求項３８】
ＣＤＫ１２阻害剤および薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項３９】
少なくとも１つの他の治療剤をさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
場合により添付の図面を参照して、本明細書に実質的に記載された阻害剤、方法、使用または組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイクリン依存性キナーゼ１２（ＣＤＫ１２）の阻害剤、特にＲＮＡ反復伸長転写物の生成によって引き起こされる障害の治療に使用するためのＣＤＫ１２の阻害剤に関する。ＲＮＡ反復伸長転写物は、筋強直性ジストロフィーにみられるようなＣＴＧ  ＤＮＡ反復伸長由来のものであってよい。
【背景技術】
【０００２】
筋強直性ジストロフィーは、本明細書ではＤＭとも呼ばれ、成人の筋ジストロフィーの最もよくみられる形態である。ＤＭ１型（ＤＭ１）は、８，０００人中１人に発症し、ＤＭＰＫ（ジストロフィア・ミオトニカ・プロテインキナーゼ）遺伝子の３’非翻訳領域のＣＴＧ反復配列によって引き起こされる。このＣＴＧ反復配列は患者では大幅に伸長しており、野生型染色体上の５〜３７の反復数と比較して、当該染色体上に５０〜数千の反復を有することがある。伸長したＤＮＡ反復配列は転写され、ＲＮＡ反復伸長転写物は、正確にスプライシングされているにもかかわらず、核内に隔離されたままであり、独特なフォーカス（ｆｏｃｉ）を形成する。これらのフォーカスは、主要なスプライシング調節因子であるＭＢＮＬ１（マッスルブラインド様（ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ−ｌｉｋｅ）スプライシング調節因子１）などの細胞タンパク質と相互作用し、これが次に下流のスプライシング異常をもたらす。タンパク質の隔離に加えて、変異型ＲＮＡはスプライシングに関わるＣＥＬＦ１（ＣＵＧＢＰ、Ｅｌａｖ様ファミリーメンバー１）の活性化を引き起こす。新たな分子経路は、翻訳の阻害を含め、毒性ＲＮＡの影響を受けると考えられている。
【０００３】
ＤＭは遺伝性かつ進行性の常染色体優性多系統障害であり、症状はきわめて多様であり得る。典型的な特徴には、筋緊張、筋力低下、心不整脈、認知機能障害、糖尿病および白内障が挙げられる。現在、ＤＭの治療法はなく、臨床管理は、筋緊張を治療するメキシレチンおよび昼間の眠気に対処するモダフィニルなど、障害の特異的な症状を治療するために既に市販されている薬物を利用する断片的な手法に依存している。しかし、障害の複雑かつ多様な性質のために、個々の症状の治療は、病態を管理する効率的な方法ではない。
【０００４】
ＤＭ分子経路の重要な要素は特定されているが、これらの因子がどのように相互作用するかは依然として分かっていない。近年、分子経路の様々な点を標的として様々なレベルの成功を収めたことを含め、この病態に対する治療的処置に対してかなりの努力が払われている。最も明白な手法は、反復伸長転写物を直接標的として、有害な反復を無力化するか、転写物の分解およびその後の細胞からのクリアランスを促進することである。今日まで、これは、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかを用いて試みられてきた（Ｌａｎｇｌｏｉｓ，Ｍ．Ａ．ら（２００３）、分子療法：米国遺伝子治療学会誌、７：６７０〜６８０；Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｔ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ、４８８：１１１〜１１５；およびＭｕｌｄｅｒｓ，Ｓ．Ａ．ら（２００９）、米国科学アカデミー紀要、１０６：１３９１５〜１３９２０）。反復配列を直接標的とする他の方法は、ＲＮＡの溝に位置し、タンパク質の会合および結合を妨げることによってＭＢＮＬタンパク質の結合を物理的に妨げるモルホリノオリゴヌクレオチドまたは小分子などのブロッキング分子（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の導入を含む（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｔ．Ｍ．ら（２００９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３２５：３３６〜３３９）。ペンタミジン、ビスアミジニウム阻害剤、一連のペプチドリガンドならびに２つの天然産物、ロモフンギンおよびジロモフンギンを含む一連の化合物が、ＣＵＧ反復：ＭＢＮＬタンパク質相互作用を首尾よく破壊することが示されている。これらの化合物を用いたＤＭ１−モデル−ＣＵＧ−反復細胞の治療は、この複合体からのＭＢＮＬタンパク質の放出と一致して、核内フォーカスの消失およびＤＭ関連スプライシング事象の逆転をもたらした。これらの化合物は、ＲＮＡ：タンパク質相互作用の破壊が治療開発の選択肢となり得ることを示す。しかし、これらの化合物は、毒性が高く、経口アベイラビリティが不良であり、ペプチドリガンドの場合には血清中で不安定であるために、薬物開発のための好適な出発点ではない。今日まで、ＤＭの好適な治療は存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、前述の欠点のうち少なくとも１つに対処することを狙いとして、ＤＭ−１にみられるようなＣＴＧ反復伸長転写物などの反復伸長転写物の生成によって引き起こされる障害を治療するのに有用な、別の、好ましくは改善された治療法および化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、反復伸長転写物の生成によって引き起こされる対象の障害の治療または予防に使用するための阻害剤が提供され、ここで阻害剤は、ＣＤＫ１２（サイクリン依存性キナーゼ１２）の阻害剤である。
【０００７】
反復伸長転写物は、転写物の核内保持をもたらすことがある。一実施形態では、「核内に保持される（ｒｅｔａｉｎｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ）」という用語は、核を離れる検出可能な反復伸長転写物を指し得ない。別の実施形態では、この用語は、核を離れる転写物の遅延（すなわち、核内の一時的な保持）を指し得る。
【０００８】
障害は、ＲＮＡ反復伸長転写物、例えば、ＣＴＧ  ＤＮＡ反復伸長由来の転写物に関連する任意の障害を含み得、ここで変異転写物は核から輸送されない。障害は、筋強直性ジストロフィー１型（ＣＴＧｎ）、筋強直性ジストロフィー２型（ＣＣＴＧｎ）、脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＣＧＧｎ）ならびに筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および前頭側頭型認知症（Ｃ９ＯＲＦ７２）（ＧＧＧＧＣＣｎ）を含む群から選択された任意の障害であってよく、これらの各々は、反復ＤＮＡ伸長由来の転写物の核内保持を示すか、示し得る。障害は、核内保持を示し得る脊髄小脳失調症８型（ＣＴＧｎ）、脊髄小脳失調症１０型（ＡＴＴＣＴｎ）および脊髄小脳失調症３１型（ＴＧＧＡＡｎ）を含む群から選択された任意の障害であってよい。障害は、ハンチントン病類縁疾患２型（ＣＴＧｎ）およびハンチントン病、脊髄小脳失調症１型、２型、３型、６型、７型、１７型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症ならびに球脊髄性筋萎縮症（（ＣＡＧｎ）反復伸長に関連するが、疾患範囲の最長末端で反復伸長を伴う転写物の核内保持を示し得る）を含む群から選択された任意の障害であってよい。障害は、表１に提供される任意の１つ以上の障害を含んでもよい。
【０００９】
【表１】
2019512554.tif 000003
【００１０】
一実施形態では、反復伸長転写物は、ＣＴＧ反復由来のＲＮＡを含み得る（すなわち、ＲＮＡは、ＣＵＧ反復配列を含み得る）。別の実施形態では、反復伸長転写物は、ＣＣＴＧ反復由来のＲＮＡを含み得る（すなわち、ＲＮＡは、ＣＣＵＧ反復配列を含み得る）。別の実施形態では、反復伸長転写物は、ＣＧＧ反復由来のＲＮＡを含み得る。別の実施形態では、反復伸長転写物は、ＧＧＧＧＣＣ反復由来のＲＮＡを含み得る。別の実施形態では、反復伸長転写物は、ＡＴＴＣＴ反復由来のＲＮＡを含み得る（すなわち、ＲＮＡは、ＡＵＵＣＵ反復配列を含み得る）。別の実施形態では、反復伸長転写物は、ＣＡＧ反復由来のＲＮＡを含み得る。別の実施形態では、反復伸長転写物は、ＴＧＧＡＡ反復由来のＲＮＡを含み得る（すなわち、ＲＮＡは、ＵＧＧＡＡ反復配列を含み得る）。
【００１１】
ＣＤＫ１２は、転写伸長に関連するＣ末端反復ドメインキナーゼであり、転写の開始に関与するのではなく、伸長する転写物に関連することが示されている。本発明は、ＣＤＫ１２の阻害が、ＤＭ細胞からの核内フォーカスの除去をもたらすことを見出した。さらに有利には、ＣＤＫ１２は転写開始時に必要とされず、その阻害は全体的な転写停止をもたらさないことから、ＤＭ、およびＣＴＧ反復伸長由来の転写物などの反復伸長転写物の生成によって引き起こされる他の障害の長期間の治療の標的として適している。
【００１２】
本明細書中のＣＤＫ１２と関連して使用される用語「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」は、ＣＤＫ１２の活性の低下または完全な排除を意味すると理解される。ＣＤＫ１２の活性の低下は１００％であり得る。あるいは、ＣＤＫ１２の活性の低下は、少なくとも９０％であり得る。ＣＤＫ１２の活性の低下は、少なくとも８０％であり得る。ＣＤＫ１２の活性の低下は、少なくとも７０％であり得る。ＣＤＫ１２の活性の低下は、少なくとも６０％であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＤＫ１２の阻害は、スクリーニングされる分子の存在下での基質ペプチドのリン酸化中にＡＴＰのＣＤＫ１２消費の阻害を測定するアッセイによって測定されてもよい。
【００１３】
ＣＤＫ１２の阻害は、ＣＤＫ１２活性部位を直接的または間接的に遮断すること、ＣＤＫ１２の立体構造を変化させること、ＣＤＫ１２の相互作用を遮断すること、サイクリンＫの結合を妨げること、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣ末端ドメイン上でＳｅｒ２のリン酸化を妨げること、ＣＤＫ１２の存在を減少させること、または例えば凝集によってＣＤＫ１２を隔離することを含み得る。
【００１４】
ＣＤＫ１２の活性の阻害は、ＣＤＫ１２の存在の減少によるものであり得る（すなわち、ＣＤＫ１２自体の活性は阻害され得ないが、細胞および組織で利用可能な活性なＣＤＫ１２の量が減少され得る）。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤＫ１２の発現を減少させることによって、ＣＤＫ１２の阻害がもたらされてもよい。あるいは、ＣＤＫ１２が不活性型に変異されてもよい。あるいは、細胞または組織で利用可能な活性なＣＤＫ１２の量を減少させるために、ＣＤＫ１２が分解または隔離の標的とされてもよい。ＣＤＫ１２の量の減少は１００％であり得る。あるいは、ＣＤＫ１２の量の減少は、少なくとも９０％であり得る。ＣＤＫ１２の量の減少は、少なくとも８０％であり得る。ＣＤＫ１２の量の減少は、少なくとも７０％であり得る。ＣＤＫ１２の量の減少は、少なくとも６０％であり得る。サンプル中のＣＤＫ１２転写物のＲＴ−ＰＣＲ、またはウェスタンブロットによって、ＣＤＫ１２の存在の減少によるＣＤＫ１２の活性の阻害が測定されてもよい。当業者は、サンプル中の任意の特定のタンパク質またはその転写物の存在および量を決定するために使用され得るいくつかの方法があることを理解するであろう。
【００１５】
本明細書で使用される用語「阻害剤」は、ＣＤＫ１２の活性の阻害を引き起こすことができる分子などの薬剤を含むと理解される。追加的にまたは代替案として、本明細書で使用される用語「阻害剤」は、ＣＤＫ１２の利用能の阻害を引き起こすことができる分子などの薬剤を含むと理解される。
【００１６】
阻害剤は、ＣＤＫ１２に特異的であり得る。例えば、阻害剤は、他のサイクリン依存性キナーゼを阻害しないか、実質的に阻害しなくてもよい。あるいは、１つ以上の他のサイクリン依存性キナーゼの活性は、阻害剤によって阻害され得るが、ＣＤＫ１２の活性と同等であるか、それよりも低くてよい。あるいは、１つ以上の他のサイクリン依存性キナーゼの活性は、阻害剤によって阻害され得るが、ＣＤＫ１２の活性よりも顕著に低くてよい。一実施形態では、阻害剤は、ＣＤＫ９の活性または利用能の阻害剤ではない。阻害され得ないか、顕著に阻害され得ない他のＣＤＫは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ８、ＣＤＫ９、ＣＤＫ１０、ＣＤＫ１１およびＣＤＫ１３またはそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。阻害され得ないか、顕著に阻害され得ない他のＣＤＫは、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ５およびＣＤＫ９またはそれらの組合せを含む群から選択されてもよい。好ましくは、ＣＤＫ９は、本発明の阻害剤によって阻害されないか、顕著に阻害されない。
【００１７】
阻害剤は、ＣＤＫ１２の発現の阻害剤を含んでもよい。阻害剤は、ＣＤＫ１２の発現を阻害することができるｓｉＲＮＡなどのオリゴヌクレオチドを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、ＣＤＫ１２遺伝子の核酸、またはその調節エレメント、またはそのｍＲＮＡ転写物に結合することができる配列を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、ＣＤＫ１２遺伝子またはその調節エレメントに実質的に相補的な配列を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、ＣＤＫ１２  ｍＲＮＡ転写物に実質的に相補的な配列を含んでもよい。配列は、少なくとも５ヌクレオチドの領域にわたって実質的に相補的であり得る。配列は、少なくとも８ヌクレオチドの領域にわたって実質的に相補的であり得る。配列は、少なくとも１０、１３、１５または１８ヌクレオチドの領域にわたって実質的に相補的であり得る。オリゴヌクレオチドは、配列番号１に結合し、ｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンシングなど、その翻訳を減少させることができる配列を含んでもよい。
【００１８】
阻害剤は、ＣＤＫ１２に結合することができる分子を含んでもよい。阻害剤分子は、その標的分子に対するＣＤＫ１２の結合を遮断することができてもよい。阻害剤は、サイクリンＫに対するＣＤＫ１２の結合を妨げることができる分子を含んでもよい。阻害剤は、ＣＤＫ１２がＲＮＡポリメラーゼＩＩのｃ末端ドメイン上でＳｅｒ２をリン酸化するのを妨げることができる分子を含んでもよい。ＣＤＫ１２に対する阻害剤の結合は、活性部位が遮断されるように、ＣＤＫ１２活性部位にあるか、ＣＤＫ１２活性部位に隣接していてもよい。ＣＤＫ１２に対する阻害剤の結合は、アミノ酸位置７２７〜１０２０（以下の配列では下線を付してある）にあってよい。ＣＤＫ１２に対する阻害剤の結合は、ＮおよびＣ末端ローブの周りに伸び、結合したＡＴＰと接触するＣ末端ドメイン伸長部（Ｃ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）にあってよい（Ｃ末端ドメイン伸長部はＣＤＫ１２の残基１０１１〜１０３９を含む）。そのようなドメインはＣＤＫ１２に独特であり、ＣＤＫ９には存在しない。ＣＤＫ１２に対する阻害剤の結合は、Ｔｈｒ７３７、Ｌｙｓ７５６、Ｇｌｕ８１４、Ｍｅｔ８１６およびＡｓｐ８１９（以下の配列では太字）から選択されるＡＴＰ接触残基のうち任意の１つ以上にあってよい。
【００１９】
ＣＤＫ１２はサイクリンＫに結合し、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣ末端ドメイン上でＳｅｒ２をリン酸化する。有利には、阻害剤治療は、野生型と変異ＤＭＰＫ転写物との相対的比率の変化をもたらす（ＣＤＫ１２の阻害は、伸長された反復転写物の優先的消失をもたらす）。
【００２０】
阻害剤は、治療的に活性な薬剤を含んでもよい。阻害剤は小分子を含んでもよい。用語「小分子」は、１ｋＤａ未満の分子量を有する任意の化合物を意味する。阻害剤は、１ＫＤａ未満の分子量を有する有機化合物であってよい。分子量とは、分子中のあらゆる原子の原子量の合計であると理解される。
【００２１】
阻害剤は、オリゴヌクレオチドなどの核酸を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成核類似体、例えばＰＭＯ、ＬＮＡもしくはＰＮＡを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、ＣＤＫ１２のｓｉＲＮＡサイレンシングのために、ＣＧＡＡＡＵＡＡＵＧＡＵＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＵＵの配列またはその変異体を含んでもよい。
【００２２】
阻害剤は、ＣＤＫ１２に結合することができるペプチドまたはタンパク質を含んでもよい。阻害剤は、抗体または抗体フラグメントもしくは抗体模倣物（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｍｅｔｉｃ）を含んでもよい。
【００２３】
阻害剤は、細胞膜透過性であってよい。
【００２４】
阻害剤は、ピラゾロ［１，５ｂ］ピリダジンコア構造を含み、ＣＤＫ１２の活性を阻害することができてもよい。
【００２５】
一実施形態では、阻害剤は、式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含み、
【化１】
2019512554.tif 000004
式中、
Ｒ１は、Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ−、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ハロアルキル、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＣ１−６アルキルであり、
Ｒ２は、Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ−、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ハロアルキル、ハロゲン、−ＣＮまたは−ＯＣ１−６アルキルであるか、Ｏ、ＳおよびＮから選択される１個、２個または３個のヘテロ原子を有する５員または６員のシクロアリール、シクロアルキルまたは複素環、例えばベンゼン、モルホリニル、ピペリジン、ピペラジンであり、
Ｒ３は、Ｃ３−６シクロアルキル、例えばシクロプロピルであり、
【化２】
2019512554.tif 000005
または
【化３】
2019512554.tif 000006
式中、
Ｒ４は、Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ−、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ハロアルキル、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＣ１−６アルキルであり、
Ｒ５は、Ｈ；−ＯＨ；−Ｏ−；Ｃ１−６アルキル；Ｃ２−６アルケニル；Ｃ２−６アルキニル；Ｃ１−６ハロアルキル；ハロゲン；−ＣＮ；−ＯＣ１−６アルキル；Ｃ１−６アルキル−Ｎ−（Ｘ）（Ｙ）；Ｏ、ＳおよびＮから選択される１個、２個もしくは３個のヘテロ原子を有する５員もしくは６員のシクロアリール、シクロアルキルもしくは複素環であって、前記シクロアリール、シクロアルキルもしくは複素環が、Ｃ１−３アルキル、例えばＮ−メチルピペラジニルに任意に置換されている５員もしくは６員のシクロアリール、シクロアルキルもしくは複素環；または−ＯＣ１−６アルキル−Ｎ（Ｘ）（Ｙ）であり、
式中、Ｘは、ＨまたはＣ１−６アルキルであり、Ｙは、ＨまたはＣ１−６アルキルであり、
式中、アルキル基は１個以上の−ＯＨ基に任意に置換され、
Ｒ６は、Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ−、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ１−６ハロアルキル、ハロゲン、−ＣＮ、−ＯＣ１−６アルキルである。
【００２６】
好ましくは、
Ｒ１はＨであり、
Ｒ２はＨであり、
Ｒ３はＣ３−６シクロアルキル、例えばシクロプロピルであり、
【化４】
2019512554.tif 000007
または
【化５】
2019512554.tif 000008
式中、
Ｒ４は、Ｈ、−ＣＮ、−ＯＣ１−６アルキル、Ｃ１−６ハロアルキルであり、
Ｒ５は、Ｈ；Ｃ１−６アルキル−Ｎ−（Ｘ）（Ｙ）；Ｏ、ＳおよびＮから選択される１個、２個または３個のヘテロ原子を有する５員または６員のシクロアリール、シクロアルキルまたは複素環であって、前記シクロアリール、シクロアルキルまたは複素環が、Ｃ１−３アルキル、例えばＮ−メチルピペラジニルに任意に置換されている５員または６員のシクロアリール、シクロアルキルまたは複素環、−ＯＣ１−６アルキル−Ｎ（Ｘ）（Ｙ）であり、
式中、Ｘは、ＨまたはＣ１−６アルキルであり、Ｙは、ＨまたはＣ１−６アルキルであり、
式中、アルキル基は１個以上の−ＯＨ基に任意に置換され、
Ｒ６は、Ｈまたは−ＯＣ１−６アルキルである。
【００２７】
好ましくは、
Ｒ１はＨであり、
Ｒ２はＨであり、
Ｒ３はシクロプロピルであり、
【化６】
2019512554.tif 000009
または
【化７】
2019512554.tif 000010
式中、
Ｒ４は、Ｈ、−ＣＮ、−ＯＣＨ３、ＣＦ３であり、
Ｒ５は、Ｈ、−ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２、Ｎ−メチルピペラジニル、−ＯＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２であり、
Ｒ６は、Ｈまたは−ＯＣＨ３である。
【００２８】
一実施形態では、Ｒ１はＨであり、Ｒ２はＨであり、Ｒ３はシクロプロピルであり、
【化８】
2019512554.tif 000011
または
【化９】
2019512554.tif 000012
式中、
Ｒ４はＨであり、Ｒ５は−ＣＨ２ＮＥｔ２または−ＯＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２であり、Ｒ６はＨであるか、
Ｒ４は−ＣＮ、−ＯＣＨ３であり、Ｒ５はＨであり、Ｒ６はＨであるか、
Ｒ４は−ＣＦ３であり、Ｒ５はＮ−メチルピペラジニルであり、Ｒ６はＨであるか、
Ｒ４は−ＯＣＨ３であり、Ｒ５はＨであり、Ｒ６は−ＯＣＨ３である。
【００２９】
一実施形態では、式（Ｉ）の阻害剤は、以下の式を備えている。
【化１０】
2019512554.tif 000013
【００３０】
別の実施形態では、式（Ｉ）の阻害剤は、以下の式を備えている。
【化１１】
2019512554.tif 000014
【００３１】
別の実施形態では、式（Ｉ）の阻害剤は、以下の式を備えている。
【化１２】
2019512554.tif 000015
【００３２】
別の実施形態では、式（Ｉ）の阻害剤は、以下の式を備えている。
【化１３】
2019512554.tif 000016
【００３３】
一実施形態では、式（Ｉ）の阻害剤は、以下の式を備えている。
【化１４】
2019512554.tif 000017
【００３４】
一実施形態では、式（Ｉ）の阻害剤は、以下の式を備えている。
【化１５】
2019512554.tif 000018
【００３５】
一実施形態では、式（Ｉ）の阻害剤は、以下の式を備えている。
【化１６】
2019512554.tif 000019
【００３６】
一実施形態では、式（Ｉ）の阻害剤は、以下の式を備えている。
【化１７】
2019512554.tif 000020
【００３７】
阻害剤は、ジナシクリブまたはその誘導体を含んでもよい。例えば、一実施形態では、阻害剤は、式（Ｘ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む。
【化１８】
2019512554.tif 000021
【００３８】
一実施形態では、阻害剤は、式（ＸＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む。
【化１９】
2019512554.tif 000022
【００３９】
一実施形態では、阻害剤は、式（ＸＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む。
【化２０】
2019512554.tif 000023
【００４０】
一実施形態では、阻害剤は、式（ＸＩＩＩ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む。
【化２１】
2019512554.tif 000024
【００４１】
一実施形態では、阻害剤は、式（ＸＩＶ）の化合物またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を含む。
【化２２】
2019512554.tif 000025
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「Ｃ１−Ｃ３アルキル」は、１〜３個の炭素原子を含む直鎖または分枝鎖のアルキル基を指す。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「６員ヘテロシクリル」は、６員環を有し、少なくとも１個のヘテロ原子を環員として含む飽和単環式複素環式基を指し、前記少なくとも１個のヘテロ原子の各々は、窒素、酸素および硫黄からなる群から独立に選択されてもよい。ヘテロシクリルの１つの基は、環員として１個のヘテロ原子を有する。ヘテロシクリルの別の基は、環員として２個のヘテロ原子を有する。ヘテロシクリル基の例には、ピペラジニル、モルホリニル、ピペリジニル、オキサニル、チアニルまたはジオキサニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「ハロアルキル」は、１つ以上の水素がハロゲンに置換されている先に定義した意味を有するアルキル基を指す。ハロＣ１−３アルキル基とは、アルキル部分が１〜３個のＣ原子を有するハロアルキル基を指す。具体的には、モノハロアルキル基、ジハロアルキル基またはポリハロアルキル基が包含される。モノハロアルキル基は、一例として、その基内にヨード原子、ブロモ原子、クロロ原子またはフルオロ原子を有してもよい。ジハロまたはポリハロアルキル基は、同一のハロ原子または異なるハロ基の組合せのうち２個以上を有してもよい。ハロアルキル基の例には、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、クロロメチル、ジクロロメチル、トリクロロメチル、ペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル、ジフルオロクロロメチル、ジクロロフルオロメチル、ジフルオロエチル、ジフルオロプロピル、ジクロロエチルまたはジクロロプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
さらに、式Ｉ〜ＸＶＩの化合物は、不斉炭素原子（キラル原子）を含むことができ、したがって、ラセミおよび光学活性形態で存在することができる。したがって、光学異性体または鏡像異性体、ラセミ化合物、互変異性体およびジアステレオマーも、式Ｉ〜ＸＶＩの化合物に包含される。
【００４６】
一実施形態では、阻害剤は、少なくとも１つの他の治療剤と組み合わせて投与されるか、投与されるように構成される。１つの他の治療剤は、オリゴヌクレオチド、例えば、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡまたはその等価物を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、例えばＲＮＡ干渉経路を介して、分解のために、伸長された反復転写物を標的とすることができ得る。オリゴヌクレオチドは、（ＣＡＧ）７の配列を含んでもよい。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＡＧの配列を含んでもよい。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  Ｃの配列を含んでもよい。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＣＧＧＡＧＣＧＧＴＴＧＴＧＡＡＣＴＧＧＣの配列を含んでもよい。
【００４７】
オリゴヌクレオチドは、ＣＵＧｎ、ＣＣＵＧｎ、ＣＧＧｎ、ＧＧＧＧＣＣｎ、ＣＡＧｎまたはＡＵＵＣＵｎなどの反復配列を標的としてもよい。あるいは、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＣＵＧｎ、ＣＣＵＧｎ、ＣＧＧｎ、ＧＧＧＧＣＣｎ、ＣＡＧｎ、ＡＵＵＣＵｎなどの伸長された反復転写物を含む標的ＲＮＡのどこにでも結合してもよい。当業者であれば、Ｕ（ウリジン）残基が、ＤＮＡと比較してＲＮＡ中のＴ（チミン）残基を置換することを理解するであろう。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿００１０８１５６３、ＡＹ３２９６２２、ＡＦ３８９８８６、ＡＦ３８９８８７、ＡＨ０１０９８２、Ｌ１９４９３、ＪＮ６８１２７１、ＡＦ１２６７４９、ＮＭ＿０１３２３６、ＮＭ＿００１２７１６０４、ＮＭ＿００２１１１、ＮＭ＿０００３３２、ＮＭ＿００２９７３、ＮＭ＿００４９９３、ＮＭ＿００００６８、ＮＭ＿０００３３３、ＣＲ４５６７７６、Ｄ３１８４０またはＭ３４２３３からの転写物のいずれかからの転写物などの伸長された反復転写物を含む標的ＲＮＡのどこにでも結合してもよい。
【００４８】
オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド長であってよい。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１５ヌクレオチド長である。
【００４９】
有利には、ＤＭ−１など、反復伸長転写物の生成によって引き起こされる障害に対して有益な効果をもたらすために、阻害剤に対する連続的な曝露は不要であり得る。パルス療法で十分であり得る。阻害剤は、短時間の曝露後に罹患した細胞から核内フォーカスを除去し得、この短時間の曝露は長時間の効果をもたらし、阻害剤治療は、野生型と変異ＤＭＰＫ転写物との相対的比率の変化をもたらす（ＣＤＫ１２の阻害は、伸長された反復転写物の優先的消失をもたらす）。これは、反復伸長転写物からＣＤＫ１２を除去し、続いて核内フォーカスを解離させ、変異転写物を分解することによって生じ得る。核内フォーカスは、分解から反復伸長転写物を保護し、核内フォーカスが放出されると、反復伸長転写物は細胞内分解または標的分解に対して脆弱になり得る。したがって、ＣＤＫ１２阻害剤による短期間の治療を用いてフォーカスを分散させ、内因性プロセスによる分解または例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドによる分解に反復伸長転写物を曝露する「２ヒット」療法レジメンが提供されてもよい。
【００５０】
少なくとも１つの他の治療剤は、小分子、薬物、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、抗体、ヌクレオチドまたはワクチンを含んでもよい。少なくとも１つの他の治療剤は、メキシレチン、フェニトインまたはプロカインアミドなどのナトリウムチャネル遮断薬を含んでもよい。少なくとも１つの他の治療剤は、例えば過度の昼間の眠気を治療するためのモダフィニルなどのＣＮＳ刺激薬を含んでもよい。少なくとも１つの他の治療剤は、例えば、筋肉低下を改善するために提供されてもよいデヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、クレアチン補充またはメカセルミンリンファベート（ｍｅｃａｓｅｒｍｉｎ  ｒｉｎｆａｂａｔｅ）（ＩＰＬＥＸ、組換えインスリン様成長因子１およびその結合タンパク質、ＢＰ−３の組合せ）を含んでもよい。少なくとも１つの他の治療剤は、ペンタミジン、ビスアミジニウム阻害剤、ロモフンギンまたはジロモフンギンのうちいずれか１つ以上を含んでもよい。
【００５１】
一実施形態では、ＣＤＫ阻害剤は、ＤＭＰＫ遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドと組み合わせて使用されてもよい。ＤＭＰＫ遺伝子は、３’非翻訳領域の伸長反復中に存在し得るか、遺伝子内のどこの部位でも標的化され得る。
【００５２】
少なくとも１つの他の治療剤と組み合わせた使用は、併用用量製剤または個別用量製剤を含んでもよい。使用は、同時または順次であってよい。
【００５３】
阻害剤は、断続的に投与されるか、投与されるように構成されてもよい。例えば、阻害剤は、３日間の治療サイクル中に１回投与されるか、投与されるように構成されてもよい。あるいは、阻害剤は、２日間の治療サイクル中に１回投与されるか、投与されるように構成されてもよい。あるいは、阻害剤は、４日間の治療サイクル中に１回投与されるか、投与されるように構成されてもよい。あるいは、阻害剤は、少なくとも３日間の治療サイクル中に１回投与されるか、投与されるように構成されてもよい。あるいは、阻害剤は、少なくとも５日間の治療サイクル中に１回投与されるか、投与されるように構成されてもよい。阻害剤は、３日間の治療サイクルの１日目に投与されるか、投与されるように構成されてもよく、用量は投与直後の２時間以内に放出される。
【００５４】
阻害剤は、治療上有効な用量で提供および／または投与されてもよい。用量は、ＤＭ−１など、反復伸長転写物の生成によって引き起こされる障害の１つ以上の症状の緩和または予防を引き起こすのに十分であり得る。用量は、ＤＭ−１など、反復伸長転写物の生成によって引き起こされる障害のあらゆる症状の緩和または予防を引き起こすのに十分であり得る。用量は、ＣＤＫ１２の活性または存在を少なくとも５０％低下させるのに十分であり得る。用量は、反復伸長転写物の核内保持を少なくとも５０％減少させるのに十分であり得る。用量は、６分間歩行試験およびハンドグリップ試験によって判定される筋緊張および筋力を改善するのに十分であり得る。
【００５５】
一実施形態では、用量は、約２〜約１００ｍｇ／ｋｇを有してもよい。一実施形態では、用量は、約５〜約８０ｍｇ／ｋｇを有してもよい。一実施形態では、用量は、約２〜約６０ｍｇ／ｋｇを有してもよい。一実施形態では、用量は、約５〜約６０ｍｇ／ｋｇを有してもよい。一実施形態では、用量は、約５〜約３０ｍｇ／ｋｇを有してもよい。一実施形態では、用量は、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇを有してもよい。一実施形態では、用量は、約５〜約１０ｍｇ／ｋｇを有してもよい。用量は、２４時間以内に６０ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、２４時間以内に３０ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、２４時間以内に１０ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、２４時間以内に５ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、３日間の期間内に１００ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、３日間の期間内に６０ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、３日間の期間内に３０ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、３日間の期間内に１０ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、３日間の期間内に５ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、１週間の期間内に１００ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、１週間の期間内に６０ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、１週間の期間内に３０ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、１週間の期間内に２０ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、１週間の期間内に１０ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、２週間または４週間の期間内に１００ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、２週間または４週間の期間内に６０ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、２週間または４週間の期間内に３０ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。用量は、２週間または４週間の期間内に１０ｍｇ／ｋｇ以下を有してもよい。２４時間以内に４回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。２４時間以内に３回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。２４時間以内に２回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。２４時間以内に１回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。３日間の期間内に、４回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。３日間の期間内に、３回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。３日間の期間内に、２回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。３日間の期間内に、１回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。１週間の期間内に、４回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。１週間の期間内に、３回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。１週間の期間内に、２回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。１週間の期間内に、１回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。２週間または４週間の期間内に、２０回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。２週間または４週間の期間内に、１５回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。２週間または４週間の期間内に、１０回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。２週間または４週間の期間内に、８回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。２週間または４週間の期間内に、５回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。２週間または４週間の期間内に、４回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。２週間または４週間の期間内に、３回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。２週間または４週間の期間内に、２回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。２週間または４週間の期間内に、１回以下の用量が投与されるか、投与されるように構成されてもよい。
【００５６】
有利には、治療される対象に有益な効果をもたらすために阻害剤への連続的な曝露は不要であり得、パルス療法で十分であり得る。この投与方法は、阻害剤適用の比較的短い持続時間／比較的低い頻度を可能にすることから、副作用を低減するという利点を有し得る。
【００５７】
阻害剤は、例えば、静脈内、筋肉内または皮下注射によって、経口的または非経口的に投与されてもよい。一実施形態では、阻害剤は経口投与に適している。
【００５８】
対象は哺乳動物であってよい。一実施形態では、対象はヒトである。
【００５９】
本発明の別の態様によれば、対象の反復伸長転写物、例えば、ＣＴＧ反復伸長由来のＲＮＡ転写物の生成によって引き起こされる障害を治療または予防するための医薬品の調製に、ＣＤＫ１２阻害剤の使用が提供される。
【００６０】
本発明の別の態様によれば、対象の反復伸長転写物の生成によって引き起こされる障害を治療または予防するための方法であって、ＣＤＫ１２の阻害剤を対象に投与することを含む方法が提供される。ＲＮＡ反復伸長転写物は、ＣＴＧ反復伸長由来であり得る。
【００６１】
該方法は、少なくとも１つの他の治療剤のその後の投与をさらに含んでもよい。少なくとも１つの他の治療剤は、オリゴヌクレオチドを含んでもよい。少なくとも１つの他の治療剤は、ＤＭＰＫの核酸反復転写物の分解を増強するのに適切であってよい。
【００６２】
本発明の別の態様によれば、ＤＭでのＲＮＡ反復伸長転写物など、反復伸長転写物の生成によって引き起こされる障害のための治療剤のスクリーニング方法であって、
・スクリーニングのための分子を提供することと、
・分子がＣＤＫ１２の活性を阻害するかどうかを検出することとを含み、
ＣＤＫ１２の阻害の検出により、潜在的候補治療剤として分子を選択する方法が提供される。
【００６３】
分子がＣＤＫ１２の活性を阻害するかどうかを検出することは、スクリーニングされる分子の存在下での基質ペプチドのリン酸化中にＡＴＰのＣＤＫ１２消費の阻害を測定するアッセイの使用を含んでもよい。
【００６４】
ＣＤＫ１２の阻害は選択的阻害であってよい。スクリーニング方法は、分子がＣＤＫ９などの他のサイクリン依存性キナーゼを顕著に阻害しないかどうかを検出する工程をさらに含んでもよい。
【００６５】
本発明の別の態様によれば、ＣＤＫ１２阻害剤および薬学的に許容される担体を含む組成物が提供される。
【００６６】
組成物は、少なくとも１つの他の治療剤をさらに含んでもよい。少なくとも１つの他の治療剤は、細胞内分解または標的分解を介して反復伸長転写物の分解を増強することができ得る。少なくとも１つの他の治療剤は、本明細書に記載の任意の１つ以上の治療剤を含んでもよい。
【００６７】
本発明の別の態様によれば、本明細書に記載のＣＤＫ１２阻害剤が提供される。
【００６８】
当業者は、本発明の一実施形態または態様の任意の特徴が、適切な場合には、本発明の他の実施形態または態様に適用可能であり得ることを理解するであろう。
【００６９】
ここで、以下の図面を参照して、単なる例示として本発明の詳細な説明を行う。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】ＰＫＩＳ化合物コレクションのスクリーニングは、核内フォーカスを減少させる６つの阻害剤を同定した。（Ａ〜Ｆ）６つの阻害剤は、１１点希釈にわたって核内フォーカスを減少させる。グラフは、ＤＭＳＯ処理細胞と比較した核内フォーカスの比率を示す。６つの化合物はいずれも、共通のピラゾロ［１，５ｂ］ピリダジンコア構造を有する。
【図２】共通のキナーゼ標的を同定するためのＰＫＩＳ阻害プロファイルの分析。（Ａ）２つの化合物の部分最小二乗モデルのローディングプロット。核内フォーカスアッセイと相関するキナーゼ活性を標識し、サイクリン依存性キナーゼを＊で強調表示する。（Ｂ〜Ｇ）プロットは、６つの活性化合物を含め、核内フォーカスアッセイでの活性に従ってグループ化された０．１μＭ濃度の化合物におけるキナーゼ標的の阻害率を示す。キナーゼに対する阻害活性活性が２５％未満の化合物は、グラフに含めていない。
【図３】ＣＤＫファミリー阻害剤の集中スクリーニング。（Ａ）ＳＮＳ−０３２、（Ｂ）ＡＴ７５１９、（Ｃ）ＰＤ０３３２９９１、（Ｄ）Ｒ−ロスコビチン、（Ｅ）ジナシクリブ、（Ｆ）ＣＤＫ９阻害剤ＩＩについて、ＤＭＳＯ処理細胞と比較した核内フォーカスの比率をプロットする１２点希釈グラフ。
【図４】ケモプロテオミクス標的デコンボリューション。異なる濃度の遊離競合化合物またはビヒクル（ＤＭＳＯ）の存在下で、ＳＮＳ−０３２で誘導体化したビーズを用いて、Ｋ５６２細胞抽出物またはＡ２０４細胞抽出物からキナーゼを親和性捕捉することによってＩＣ５０値を生成した。各化合物に関するフォーカス阻害アッセイのｐＩＣ５０に対して、ｐＩＣ５０値をプロットする。ＣＤＫ５、ＣＤＫ７、ＣＤＫ９およびＣＤＫ１２について、キナーゼ結合親和性とフォーカスに対する阻害活性との良好な相関が観察される。ｒ：ピアソンの相関係数、ｐ：ｐ値（計算された確率）。
【図５】ＤＭにおけるＣＤＫ９およびＣＤＫ１２タンパク質発現。（Ａ）ＣＤＫ９および（Ｂ）ＣＤＫ１２に関する非ＤＭおよびＤＭ１患者の外側広筋生検サンプルのウェスタンブロット。両ブロットをα−チューブリンに対して正規化する。（Ｃ）α−チューブリンに対して正規化されたＣＤＫ９タンパク質の量を定量するためのヒストグラム。（Ｄ）α−チューブリンに対して正規化されたＣＤＫ１２タンパク質の量を定量するためのヒストグラム。（Ｅ）非ＤＭおよびＤＭ１線維芽細胞のＣＤＫ１２の免疫組織化学的検査。（Ｆ）ＣＤＫ１２核顆粒の数の定量。（Ｇ）免疫組織化学的検査およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＣＤＫ１２核顆粒との反復伸長フォーカスの共局在を示す（緑色／輝点のＣＤＫ１２、反復伸長ＲＮＡ（矢印））。（Ｈ）ｓｈＲＮＡによるＣＤＫ１２タンパク質のノックダウンは、ＣＤＫ１２タンパク質顆粒（緑色）を減少させ、続いてＣＵＧ反復伸長ＲＮＡフォーカス（赤色／矢印）を減少させる。
【図６】ＤＭの治療法としての阻害剤治療。（Ａ）ＤＭＰＫのフラグメントの増幅およびＢｐｍＩ消化後の核（Ｎ）および細胞質（Ｃ）ＲＮＡ画分からのＲＴ−ＰＣＲ産物を示す臭化エチジウム染色ゲル。ローディングコントロールとしてＧＡＰＤＨを使用する。（Ｂ）野生型ＤＭＰＫ転写物と比較した核変異ＤＭＰＫ転写物の相対的比率を示すヒストグラム。ジナシクリブ（１μＭ）で２４時間処理した後に、ＤＭ１線維芽細胞にみられる変異と野生型ＤＭＰＫ転写物との相対的比率を評価した。（Ｃ〜Ｆ）ヒストグラムは、核１個当たり０、＜２、＜５および５＋のフォーカスを有する集団中の細胞の比率を示す。（Ｃ）未処理のＤＭ１細胞。（Ｄ）ＳＮＳ−０３２で２時間処理したＤＭ１細胞。（Ｅ）ＳＮＳ−０３２で２時間処理し、増殖培地中で４８時間回復させたＤＭ１細胞。（Ｆ）ＳＮＳ−０３２で２時間処理し、増殖培地中で７２時間回復させたＤＭ１細胞。
【図７】ＤＭ１マウスモデルに対する阻害剤処置。（Ａ）ビヒクルおよびジナシクリブ化合物処置後のＨＳＡＬＲマウスの四頭筋、腓腹筋および傍脊柱筋の総合筋緊張度スコア（１処置群当たりｎ＝６）。（Ｂ）ジナシクリブおよびビヒクル処置ＨＳＡＬＲマウスの筋肉の種類ごとの筋緊張度。（Ｃ）ビヒクルおよびジナシクリブ処置マウスから得られた四頭筋および腓腹筋サンプル中のＡＴＰ２Ａ１スプライスアイソフォームを評価するための臭化エチジウム染色ゲル。（Ｄ）ビヒクルおよびジナシクリブ処置ＨＳＡＬＲマウスのエキソン２２排除と包含との相対的比率を示すヒストグラム。（Ｅ〜Ｆ）ラミニン染色は、ビヒクル対照動物と比較して、ジナシクリブ処置マウスの筋線維内の集中した核の減少を示す。
【図８】ＰＫＩＳコレクションのスクリーニングは、ＣＭＧＣキナーゼファミリーを同定する。候補細胞標的として部分最小二乗モデルから同定されたキナーゼのＰＫＩＳ阻害プロファイルを分析し、活性化合物と不活性化合物とを比較するためのプロット。阻害が２５％未満の化合物はグラフに含めていない。
【図９】１１種の化合物のキノビーズ（Ｋｉｎｏｂｅａｄ）プロファイリング。核内フォーカスアッセイで一連の活性を表す１１種の化合物のセットのキノビーズプロファイリング。２μＭの濃度でＫ５６２細胞抽出物に各化合物を添加し、続いてキノビーズとともにインキュベートし、ビーズ結合タンパク質を定量することによって、標的プロファイルを作成した。Ａ：値は、ＤＭＳＯ対照と比較した標的結合を示し、ここで１の値は１００％の結合を表すため標的阻害はなく、０の値は標的キナーゼの０％の結合および１００％の阻害を示す。Ｂ：試験した各化合物の構造を示す。
【図１０】固定化された阻害剤ＳＮＳ−０３２およびＡＴ７５１９のタンパク質結合プロファイルの比較。
【図１１】異なる化合物／標的の組合せに対する用量応答競合結合曲線の例。セファロースビーズにＳＮＳ−０３２を固定化することによって親和性マトリックスを生成し、ビヒクル（ＤＭＳＯ）または示されるような異なる濃度の阻害剤の存在下で、Ｋ５６２細胞抽出物またはＡ２０４細胞抽出物からの親和性捕捉を行った。用量応答競合曲線のＩＣ５０濃度および変曲点は、点線で示されている。
【図１２】ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡによるＣＤＫ１２タンパク質のノックダウン。（Ａ）スクランブルｓｈＲＮＡおよびＣＤＫ１２  ｓｈＲＮＡによるノックダウン後のＣＤＫ１２免疫組織化学的検査。（Ｂ）ＣＤＫ１２  ｓｈＲＮＡ細胞内の核内のＣＤＫ１２タンパク質顆粒の定量は、スクランブルｓｈＲＮＡと比較してＣＤＫ１２顆粒数の５６％の減少を示す。（Ｃ）スクランブルｓｈＲＮＡおよびＣＤＫ１２  ｓｈＲＮＡによるノックダウン後のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析。（Ｄ）ＣＤＫ１２  ｓｈＲＮＡ細胞内の核内のＣＵＧ反復ＲＮＡフォーカスの定量は、スクランブルｓｈＲＮＡと比較して６９％の減少を示す。（Ｅ）ヒストグラムは、スクランブルｓｈＲＮＡおよびＣＤＫ１２  ｓｈＲＮＡ処理細胞内に核１個当たり０、１〜２、３〜４および５＋のフォーカスを有する集団中の細胞の比率を示す。（Ｆ）スクランブルｓｉＲＮＡおよびＣＤＫ１２  ｓｉＲＮＡによるノックダウン後のＣＤＫ１２免疫組織化学的検査。（Ｇ）ＣＤＫ１２  ｓｉＲＮＡ細胞内の核内のＣＤＫ１２顆粒の定量は、スクランブルｓｉＲＮＡと比較してＣＤＫ１２顆粒数の４７％の減少を示す。（Ｈ）ＣＤＫ１２およびα−チューブリンのウェスタンブロット分析によるｓｉＲＮＡの検証。（Ｉ）ウェスタンブロット分析の強度スキャンのヒストグラムは、スクランブルコントロールと比較してＣＤＫ１２タンパク質の３４％の減少を示した。α−チューブリンに対して正規化されたデータ。（Ｊ）スクランブルｓｉＲＮＡおよびＣＤＫ１２  ｓｉＲＮＡによるノックダウン後のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析。（Ｋ）ＣＤＫ１２  ｓｉＲＮＡ細胞内の核内のＣＵＧ反復ＲＮＡフォーカスの定量は、スクランブルｓｉＲＮＡと比較して４６％の減少を示す。（Ｌ）ヒストグラムは、スクランブルｓｉＲＮＡおよびＣＤＫ１２  ｓｉＲＮＡ処理細胞内に核１個当たり０、１〜２、３〜４および５＋のフォーカスを有する集団中の細胞の比率を示す。
【図１３】以前に報告されたＣＤＫ阻害剤のＩＣ５０値。
【図１４】細胞抽出物に添加された異なるＣＤＫ阻害剤に関して、Ｋ５６２細胞抽出物に対するＳＮＳ−０３２親和性マトリックスによる親和性捕捉によって生成されたｐＩＣ５０値。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
緒言
筋強直性ジストロフィーは、ＤＭＰＫ遺伝子の３’非翻訳領域内のＣＴＧ反復伸長によって引き起こされ、独特な核内フォーカスの形成をもたらす。キナーゼの関与は、病状の病態生理に結びつけられているが、今日まで、薬物開発ための決定的なキナーゼ標的は同定されていない。本明細書では、ＣＤＫ１２がＤＭ細胞株およびＤＭ患者筋生検で上昇することが観察されている。反復伸長転写物は核スペックルの周辺に蓄積し、ＣＤＫ１２はこれらの核スペックルと共局在する。ＣＤＫ１２の阻害は、ＤＭ関連核内フォーカスの分散および反復伸長転写物の分解をもたらすことが見出されている。
【００７２】
結果および考察
ＰＫＩＳコレクションのスクリーニング
以前に報告されたアッセイを用いて、核内フォーカスを減少させる化合物についてＰＫＩＳコレクションをスクリーニングし、次いで、該化合物の既知の選択性プロファイルについて化合物を分析して、共通のキナーゼ標的を同定した（Ｋｅｔｌｅｙ，Ａ．ら（２０１４）、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、２３：１５５１〜１５６２）。２０１１Ｍ〜１９ｎＭの１１点希釈系列を用いて２４時間かけてＤＭ１線維芽細胞を化合物で処理した。処理後、核内フォーカスを視覚化するためにｃｙ３標識ＣＡＧ１０プローブを用いて蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行い、カスタマイズされたＭｅｔａＥｘｐｒｅｓｓソフトウェアを用いて、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓプレートリーダーで細胞を分析した（Ｋｅｔｌｅｙ，Ａら（２０１４）、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、２３：１５５１〜１５６２）。ＤＭＳＯ処理細胞と比較して濃度依存的に核内フォーカスを減少させた化合物を同定し、その後の試験のために優先順位をつけた。共通のピラゾロ［１，５ｂ］ピリダジンコアを有する６つの化合物が、ＤＭ細胞の２４時間処理後に核内フォーカスの数を減少させることが分かった（図１）。
【００７３】
標的デコンボリューション
６つの活性化合物の既知の選択性プロファイルを検討して、共通のキナーゼ標的を同定した。フォーカスアッセイから生成されたｐＩＣ５０値と、２２４のキナーゼ標的に対する化合物阻害プロファイルとを比較した（Ｄｒｅｗｒｙ，Ｄ．Ｈ．ら（２０１４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１４：３４０〜３４２）。部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを用いて、共通の標的がＣＭＧＣ（サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ（ＧＳＫ）およびＣＤＫ様キナーゼ）ファミリーのメンバーである可能性が高いことを示唆したデータをクラスター化した（図２Ａ）。事実、これらの化合物は当初、ＣＤＫファミリーメンバーを標的とするように設計され（Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｋ．Ｌ．ら（２００８）、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ、１８：５７５８〜５７６２）、核内フォーカスアッセイで活性な阻害剤はいずれも、ＣＤＫファミリーの多くのメンバーにわたって顕著な活性を示した。核内フォーカスアッセイでは、６つのヒット化合物のキナーゼ阻害プロファイルとそれらの活性とを比較し、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ５およびＣＤＫ６がフォーカス形成に関与しない可能性が示唆された（図２Ｂ〜図２Ｇ）。ＰＫＩＳコレクションが対象とする標的のうち、ＣＤＫ４は何らかの役割を果たしている可能性が高いように思われたが（図２Ｅ）、他のＣＤＫファミリーメンバーはＰＫＩＳアノテーションから漏れているため、考慮する必要があった。
【００７４】
既知のＣＤＫファミリー阻害剤分子の集中スクリーニング
次に、核内フォーカスアッセイでは、十分にアノテーションされた選択性プロファイルを有する追加の小分子ＣＤＫ阻害剤を試験した（図１３）。この阻害剤のサブセットは、核内フォーカスアッセイでは、特異的な活性、およびＣＤＫファミリーメンバーにわたる様々な範囲の効力を示した（図３）。ＣＤＫファミリーの関与を確認するために、無差別なキナーゼ阻害剤の組合せを用いて誘導体化したセファロースビーズに基づくキノビーズ法を用いて（Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ，Ｍら（２００７）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２５：１０３５〜１０４４；Ｗｅｒｎｅｒ，Ｔ．ら（２０１２）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、８４：７１８８〜７１９４；およびＫｒｕｓｅ，Ｕら（２０１１）、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２５：８９〜１００）、核内フォーカスアッセイで一連の活性を表す１０種の化合物をプロファイリングした。２μＭの濃度でＫ５６２赤白血病細胞抽出物に各化合物を添加し、続いて２種類のキノビーズとともにインキュベートし、ビーズ結合タンパク質を定量することによって、標的プロファイルを生成した。第１のタイプのビーズが、真核生物プロテインキナーゼファミリーのチロシンおよびセリン／スレオニンキナーゼのプロファイリングのために開発されたのに対して（Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ，Ｍ．ら（２００７）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２５：１０３５〜１０４４）、第２のタイプのビーズは、ＰＩ３Ｋ／脂質キナーゼファミリーから追加のキナーゼを捕捉する（Ｂｅｒｇａｍｉｎｉ，Ｇ．ら（２０１２）、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、８：５７６〜５８２）。プロファイリング結果は、ＰＫＩＳデータと一致して、このサブセット中の最も活性な化合物がＣＤＫファミリーのみにわたって共有活性を示したことを明確に示した（図９Ａ）。
【００７５】
候補標的キナーゼを絞り込むために、核内フォーカス活性阻害剤および核内フォーカス不活性阻害剤についてＩＣ５０値を比較した。小分子ＳＮＳ−０３２（ＢＭＳ３８７０３２としても知られている）およびＡＴ−７５１９は、核内フォーカスアッセイで高い活性を示し、ＣＤＫ２およびＣＤＫ９に対して最も高い効力を示す（図３ａおよび図３ｂならびに図１３）。しかし、ＣＤＫ２は、この標的に対する活性化合物および不活性化合物のＩＣ５０値の顕著な重複のために、核内フォーカス減少の原因とはなり得ない。同様に、ＣＤＫ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６およびＣＤＫ７はいずれも、類似の理由から考慮に入れることはできない（図１３）。
【００７６】
既知のＣＤＫ阻害剤化合物のこのサブセットの分析によって、ＰＫＩＳスクリーニングの結果が確認されるが、核内フォーカス減少の原因である標的が、あまりよく把握されていないＣＤＫファミリーメンバーである可能性が高まる。この可能性を検討するために、様々な効力を有する４つの追加のＣＤＫ阻害剤を試験して、候補標的としてのＣＤＫ９の潜在的関与を特定した（図３Ｅ〜図３Ｆおよび図１３）。興味深いことに、ジナシクリブおよびＳＮＳ−０３２は、ＣＤＫ９に対して同じＩＣ５０値を有するが、ジナシクリブは、核内フォーカスアッセイでは顕著に増加した活性を示す。さらに、特異的ではあるが効力の低いＣＤＫ９阻害剤であり、３５０ｎＭのＩＣ５０値を有するＣＤＫ９阻害剤ＩＩ（図３Ｆ）は、最高濃度で核内フォーカスを減少させたが、同等のＣＤＫ９  ＩＣ５０値（それぞれ４００ｎＭおよび５００ｎＭ）を有する２つの他の化合物、ＰＤ０３３２９９１およびＲ−ロスコビチンは、核内フォーカスアッセイでは試験した濃度で不活性である（図３Ｃおよび図３Ｄ）。これらのデータは、核内フォーカス減少の標的としての新たなＣＤＫファミリーメンバーを示唆している。
【００７７】
ケモプロテオミクス標的分解能
核内フォーカス減少の原因となる特異的なＣＤＫを特定するために、好適な第２級アミンを含む２つの活性化合物、ＳＮＳ−０３２およびＡＴ７５１９の固定化によって、ＣＤＫファミリー内の標的範囲を拡大することが求められた（図１０）。いずれかの化合物によって誘導体化されたビーズは、市販のキナーゼパネルには存在しないファミリーメンバーを含め、ＣＤＫファミリーの良好な範囲を示した。ＣＤＫファミリーにわたる阻害剤選択性をプロファイリングする詳細なケモプロテオミクス試験のために、Ｋ５６２細胞またはＡ２０４横紋筋肉腫細胞に対する活性化合物全種、および不活性化合物のうち１つ（ＰＤ０３３２９９１）について、用量応答競合結合プロファイルを作成した。Ｋ５６２、Ａ２０４およびＤＭ１細胞株が同じキナーゼを発現することを確認するために、全プロテオーム解析を行った。プロファイリングによって同定されたＣＤＫ／ＰＣＴＫタンパク質はいずれも、以下のような表現型フォーカスアッセイに使用された細胞でも同定された：
【００７８】
ＤＭ線維芽細胞の全プロテオーム解析によって同定されたＣＤＫファミリーメンバータンパク質（ＣＤＫファミリータンパク質のタンパク質受託番号）。
ＣＤＫ１：Ｐ０６４９３
ＣＤＫ２：ＣＡＡ４３８０７．１
ＣＤＫ４：ＣＡＧ４７０４３
ＣＤＫ５：ＣＡＧ３３３２２
ＣＤＫ６：Ｑ００５３４
ＣＤＫ７：Ｐ５０６１３
ＣＤＫ９：ＡＡＦ７２１８３
ＣＤＫ１０：ＡＡＨ２５３０１
ＣＤＫ１２：Ｑ９ＮＹＶ４．２
ＣＤＫ１３：Ｑ１４００４．２
ＰＣＴＫ１：Ｑ００５３６
ＰＣＴＫ２：Ｑ００５３７．２
【００７９】
得られたデータセットは、１２のＣＤＫファミリーキナーゼに対するＩＣ５０曲線を含む（図１１、図１４）。フォーカスに対する阻害活性とのキナーゼＩＣ５０値の化合物セットにわたる最良の相関が、ＣＤＫ１２、続いてＣＤＫ９に観察された（図４）。ＣＤＫ９およびＣＤＫ１２に対するＩＣ５０値は、フォーカスアッセイでのそれらの観察された活性と密接に一致するが、ＣＤＫ２およびＣＤＫ７に対するＩＣ５０値は、それらを標的として含めるには低すぎると思われる。図３Ｅに提示された以前の分析と一致して、ジナシクリブは、ＣＤＫファミリー、特にＣＤＫ１２に対する最も活性な阻害剤であり、ＣＤＫ１２が最も有力なキナーゼ標的であり得ることが示唆された。
【００８０】
ＤＭ発症におけるＣＤＫ１２
これまでのところ、実験は、反復伸長フォーカスとの関連性を有する可能性が最も高いキナーゼとして、ＣＤＫ１２を提示している。ＤＭ発症の潜在的関与を検討するために、ウェスタンブロットを使用して、ＤＭ１患者４例および健常被験者４例から得られた外側広筋生検サンプルに対して、ＣＤＫ９に加えてＣＤＫ１２の内在量を評価した。対照と比較してＣＤＫ９タンパク質の量に有意差は検出され得なかった（図５Ａおよび図５Ｃ）。しかし、健常被験者から得られたものと比較して、ＤＭ生検ではＣＤＫ１２の量が明らかに増加し、ＤＭサンプルでは４８％多いＣＤＫ１２タンパク質が検出された（ｐ＝０．００２５）（図５Ｂおよび図５Ｄ）。
【００８１】
ＤＭ病態生理での核内フォーカスとＣＤＫ１２との関係を理解するために、ＤＭおよび非ＤＭ線維芽細胞に対する免疫組織化学的検査によって、タンパク質の細胞内位置を確立した。以前に公開された非ＤＭ細胞のデータと一致して、ＣＤＫ１２は、ＤＭおよび非ＤＭ細胞の両方で、顆粒構造で核内に局在した（Ｋｏ，Ｔ．Ｋ．ら（２００１）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ、１１４：２５９１〜２６０３）（図５Ｅ）。４００個の細胞に対するこれらの構造の定量は、非ＤＭ細胞内の１２．０７（±２．２７）と比較して、ＤＭ細胞では顆粒の数が上昇し、平均数１８．７４（±３．８８）であったことを示した（ｐ＜０．０００１）（図５ｆ）。ＣＤＫ１２顆粒の大きさは、非ＤＭおよびＤＭ細胞で有意差を示さなかった。この数の増加は、ウェスタンブロットによって検出されたＣＤＫ１２タンパク質の全体的な量の増加と一致する。次に、ＣＤＫ１２の免疫組織化学的検査を行い、次いでｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行って、反復伸長ＲＮＡフォーカスを検出した。ＣＤＫ１２タンパク質との反復伸長フォーカスの共局在が見出された。カスタマイズされたＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェアを用いた定量では、１００％の反復伸長フォーカスがＣＤＫ１２タンパク質と共局在することが明らかにされた（図５ｇ）。ＤＭにおけるＣＤＫ１２タンパク質の増加の影響およびＣＤＫ１２タンパク質顆粒と反復伸長フォーカスとの関係を理解するために、ｓｈＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを用いて、ＤＭ細胞内のＣＤＫ１２顆粒の数を減少させた。次いで、反復伸長フォーカスに対する影響を評価した。ＣＤＫ１２に対して３つのｓｈＲＮＡを発現するレンチウイルス感染後、対照細胞と比較して、ＣＤＫ１２顆粒の数の５６％の減少および反復伸長フォーカスの６９％の減少が観察された（図５Ｈおよび図１２Ａ〜図１２Ｅ）。これは、ＣＤＫ１２のｓｉＲＮＡノックダウンおよびウェスタンブロット分析による定量によって確認され、ここでタンパク質の量の３４％の減少を確認した。これにより、ＣＤＫ１２タンパク質顆粒が４６％減少し、反復伸長ＲＮＡフォーカスが４７％減少し、ＣＤＫ１２の特異的阻害および核顆粒からのＣＤＫ１２タンパク質の溶解が、反復伸長フォーカスの分散をもたらすことが示された（図１２Ｆ〜図１２Ｌ）。
【００８２】
ＤＭの治療法としての阻害剤治療
ＣＤＫ１２と核内フォーカスとの間の関連が確立され、核内フォーカスが反復伸長転写物を含むことから、反復伸長転写物の量に対する阻害剤治療の効果を確立することが求められた。このために、Ｂｐｍｌ多型を利用して野生型と変異ＤＭＰＫ転写物とを区別するためにするＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いた（図６Ａ）（Ｈａｍｓｈｅｒｅ，Ｍ．Ｇ．ら（１９９７）、Ｐｒｏ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９４：７３９４〜７３９９）。ジナシクリブで処理した後、核および細胞質細胞抽出物の分析は、反復伸長転写物が核画分内に依然として保持されていることを示した。しかし、Ｇｅｎｅｓｃａｎ分析を用いた定量は、核内の野生型転写物と比較して反復伸長転写物の相対的比率が５９％減少していることを示した（図６Ｂ）。これらのデータは、ジナシクリブへの曝露が転写物を含む反復の優先的消失をもたらすことを示し、ひいては、ＣＤＫ１２を標的とすることが、ＤＭ治療開発のための実行可能な選択肢を提供することを示唆している。
【００８３】
反復転写物の消失は、阻害剤処理後の伸長された転写物の不完全な転写に起因し得るか、反復伸長転写物からのＣＤＫ１２の除去、それに続く核内フォーカスの解離および変異転写物の分解によるものであり得る。後者が正しい場合、核内フォーカスが反復伸長転写物を分解から保護し、核内フォーカスが放出されると、反復伸長転写物が細胞内分解または標的分解に対して脆弱になり得ることを示唆している可能性がある。したがって、ＣＤＫ１２阻害剤による短時間の治療を用いてフォーカスを分散させ、内因性プロセスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドによる分解に反復伸長転写物を曝露する２ヒット療法レジメンの可能性が提案されている（Ｍｕｌｄｅｒｓ，Ｓ．Ａ．ら（２００９）、米国科学アカデミー紀要、１０６：１３９１５〜１３９２０）。
【００８４】
ＣＤＫ１２は、ＤＭ細胞内の核内フォーカスに関連する転写調節キナーゼであるため、この標的の阻害が、核内フォーカスの形成および分散の動態に及ぼす効果を確立することが求められた。これを行うために、２時間から４８時間までの様々な長さの時間にわたり、２つの最も効力の強いフォーカス減少化合物、ジナシクリブおよびＳＮＳ−０３２にＤＭ１線維芽細胞を曝露した。両化合物はフォーカスを顕著に減少させたが、これはＳＮＳ−０３２の場合が最も迅速であり、処理のわずか２時間後に効果を発揮した。転写調節阻害剤に対する継続的曝露は、ＤＭに対する有望な治療選択肢ではあり得ず、したがって、核内フォーカスに対する短期治療の効果を検討した。ＳＮＳ−０３２にＤＭ１線維芽細胞を２時間曝露し、その後、細胞を完全に洗浄し、完全増殖培地で回復させた。核内フォーカスの定量は、未処理のＤＭ１細胞６８％が５つを超えるフォーカスを有し、５％のみが検出可能なフォーカスを有しないことを示した（図６Ｃ）。２時間かけてＳＮＳ−０３２を用いて細胞を処理し、回復時間を伴わない場合、細胞２８％が５つを超えるフォーカスを有し、細胞１０％がフォーカスを有しないという分布に変化する（図６Ｄ）。しかし、ＳＮＳ−０３２への曝露後４８時間および７２時間の回復後、核内フォーカスのない細胞の比率は、それぞれ１４％および３６％にさらに増加する（図６Ｅおよび図６Ｆ）。まとめると、このデータは、阻害剤を用いた短期（２時間）の処理、続く長期（７２時間）の回復が、核内フォーカスの数の顕著な減少および変異転写物の優先的減少をもたらし、したがって、パルス療法が、ＤＭ療法に対する効果的な手法になる可能性があることを示唆している。
【００８５】
この阻害剤ＨＳＡＬＲのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を確立するために、合計１２回の注射を含む２８日間の治療期間にわたり、腹腔内注射によってマウスを処置した。阻害剤処置後、筋電図解析によりマウスを分析して、筋緊張に対する機能的効果を評価し、試験した４種類の筋肉、四頭筋、腓腹筋、前脛骨筋および腰部傍脊柱筋にわたる筋緊張度スコアの有意な改善を実証した（ｐ＝０．００２１、ｎ＝６）（図７Ａ〜図７Ｂ）。分子分析では、ＡＴＰ２Ａ１のスプライスアイソフォームに対するエキソン２２の包含の改善（図７Ｃ〜図７Ｄ）と、阻害剤処置後の筋線維内の集中した核の存在の減少とが実証された（図７Ｅ〜図７Ｆ）。
【００８６】
材料および方法
細胞培養
ペニシリンおよびストレプトマイシンならびに１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で線維芽細胞を増殖させた。
【００８７】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションプロトコル
細胞を化合物に２４時間曝露した後、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行って、Ｃｙ３標識（ＣＡＧ）１０プローブを用いてフォーカスを同定した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ｉｍａｇｉｎｇシステムを用いてプレートを分析し、化合物処理１回当たり、ウェル当たり９個の領域を画像化して、ウェル当たり約１００個の細胞を得た。Ｈｏｅｃｈｓｔ染色によって核領域を同定し、背景を超えて８０グレースケール以上の隣接するピクセルをスコアすることによって、フォーカスの数、大きさおよび輝度を決定した。
【００８８】
細胞抽出物の調製
Ｋ５６２およびＡ２０４細胞をＡＴＣＣから入手し、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地で培養した。細胞を１，５×１０６細胞／ｍｌまで増殖させた。１５％ＦＣＳを含むＭｃＣｏｙ  ５Ａ培地でＡ２０４細胞を培養した。細胞を１００％コンフルエントまで増殖させた。細胞を採取し、氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。アリコートを液体窒素中で急速冷凍し、−８０℃で保存した。記載されているように細胞抽出物を調製した（Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ，Ｍ．ら（２０１１）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２９：２５５〜２６５）。
【００８９】
ケモプロテオミクス
以前に記載されたように親和性プロファイリングを行った（Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ，Ｍ．ら（２００７）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２５：１０３５〜１０４４およびＢａｎｔｓｃｈｅｆｆ，Ｍ．ら（２０１１）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２９：２５５〜２６５）。１ｍＭの濃度でＳＮＳ−０３２を用いてセファロースビーズを誘導体化してビーズマトリックスを生成したか、キノビーズＴＭをプロファイリングのためのマトリックスとして使用した。ビーズ（キノビーズＴＭの場合には３５μｌまたはＳＮＳ−０３２の場合には５μｌ）を洗浄し、化合物または緩衝液で予めインキュベートした１ｍｌ（５ｍｇ）のＫ５６２細胞抽出物を用いて４℃で１時間かけて溶解緩衝液中で平衡化した。ビーズを使い捨てカラム（ＭｏＢｉＴｅｃ）に移し、溶解緩衝液で十分に洗浄し、ＳＤＳサンプル緩衝液を用いて溶出した。タンパク質をアルキル化し、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分離し、コロイド状クマシーで染色し、アイソバリック質量タギング（ｉｓｏｂａｒｉｃ  ｍａｓｓ  ｔａｇｇｉｎｇ）およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより定量した。
【００９０】
ペプチドおよびタンパク質の同定および定量
ＴＭＴアイソバリック質量タグによるサンプル調製および標識は、基本的に記載されているように行った（Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ，Ｍ．ら（２０１１）、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２９：２５５〜２６５）。質量分光分析のために、サンプルを真空中で乾燥させ、０．１％ギ酸水溶液に再懸濁し、質量分析計に連結したナノＬＣシステムにサンプルのアリコートを注入した：Ｅｋｓｉｇｅｎｔ  １Ｄ＋をＬＴＱ−ＯｒｂｉｔｒａｐＸＬ質量分析計に連結、Ｗａｔｅｒｓ  ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙをＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｌｉｔｅ質量分析計に連結、またはＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＲＳＬＣ  ｎａｎｏをＱ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結。カスタマイズされた５０ｃｍ×７５μＭ（内径）の逆相カラム（Ｒｅｐｒｏｓｉｌ）上で４０℃でペプチドを分離させた。０．１％ギ酸中の３％アセトニトリル〜４０％アセトニトリルを用いて１２０〜２７０分間かけて勾配溶離を行った。ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬはＸｃａｌｉｂｕｒ  ２．０を用いて操作し、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＥｌｉｔｅおよびＱ  Ｅｘａｃｔｉｖｅの機器はＸｃａｌｉｂｕｒ  ２．２ソフトウェアを用いて操作した。ＬＴＱ−ＯｒｂｉｔｒａｐＸＬ／Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｌｉｔｅでは３０．０００の分解能（ｍ／ｚ＝４００で測定）、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅでは７０．０００の分解能（ｍ／ｚ＝２００）で完全なペプチドを検出した。ｍ／ｚ  ４４５．１２００２５で（Ｓｉ（ＣＨ３）２０）６Ｈ＋からのイオンシグナルを使用して、ＬＴＱ−ＯｒｂｉｔｒａｐＸＬによって内部較正を行った。１５．０００／１７．５００の分解能で、ＣＩＤ／ＨＣＤ（ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ）法の組合せまたはＨＣＤのみ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｌｉｔｅ／Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ）を用いて、１０個までのペプチド前駆体（ＬＴＱ−ＯｒｂｉｔｒａｐＸＬ／Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｌｉｔｅは６個の前駆体、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅは１０個）について、データ依存性タンデム質量スペクトルを生成した。ＣＩＤでは、最大５，０００個のイオン（ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ）がイオントラップ（最大イオン蓄積時間＝１５０ｍｓｅｃ）に蓄積され、ＨＣＤでは、最大５０．０００個のイオン（ＬＴＱ−ＯｒｂｉｔｒａｐＸＬ、最大イオン蓄積時間＝３５０ｍｓｅｃ）、最大３０．０００個のイオン（Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｌｉｔｅ、最大イオン蓄積時間＝１５０ｍｓｅｃ）および１ｅ６イオン（Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ、最大イオン蓄積時間＝６０ｍｓｅｃ）がＨＣＤセルに蓄積された。ペプチド前駆体では１０ｐ．ｐ．ｍ．の質量許容差（ｍａｓｓ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）およびフラグメントイオンでは０．６Ｄａ（ＣＩＤ）または２０ｍＤａ（ＨＣＤ）の許容差を使用するタンパク質同定に、Ｍａｓｃｏｔ  ２．３および２．４（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。システイン残基のカルバミドメチル化およびリジン残基のＴＭＴ修飾を固定修飾として設定し、メチオニン酸化と、タンパク質のＮ末端アセチル化と、ペプチドＮ末端のＴＭＴ修飾とを可変修飾として設定した。検索データベースは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｅｘデータベースのカスタムバージョンに、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅが提供するスクリプトを使用して作成されたこのデータベースのデコイバージョンとを組み合わせて構成した。タンパク質定量の基準：独特なペプチドに一致する最小２つの配列割り当てが必要であった（定量されたタンパク質のためのＦＤＲ＜＜０．１％）。Ｍａｓｃｏｔイオンスコア＞１０、前駆体イオンのシグナル対バックグラウンド比＞４、シグナル対干渉＞０．５（Ｓａｖｉｔｓｋｉ，Ｍ．Ｍ．ら（２０１０）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、２１：１６６８〜１６７９）。レポーターイオン強度とイオン蓄積時間とを乗算し、質量分析計に存在するレポーターイオンの数に比例する面積値を得た。ペプチドの折りたたみ変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）は、記載されるように同位体純度について補正し、シグナル対干渉測定により推定されるように、ほぼアイソバリックピークを共溶出させることによって引き起こされる干渉について調整した（Ｓａｖｉｔｓｋｉ．Ｍ．Ｍ．ら（２０１３）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２：３５８６〜３５９８）。合計ベースのブートストラップアルゴリズム（Ｓａｖｉｔｓｋｉ，Ｍ．Ｍ．（２０１１）、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、８３：８９５９〜８９６７）を用いてタンパク質の定量を達成した。
【００９１】
反復伸長転写物のアッセイ
化合物処理細胞および未処理細胞由来の１μｇの全ＲＮＡを用いて逆転写を行った。プライマーＮ１１、５’−ＣＡＣＴＧＴＣＧＧＡＣＡＴＴＣＧＧＧＡＡＧＧＴＧＣおよび１３３、５’ＧＣＴＴＧＣＡＣＧＴＧＴＧＧＣＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧを用いて合成したｃＤＮＡの１／２０を用いてＰＣＲを行った。Ｇｅｎｅｓｃａｎ分析では、プライマーＮ１１をＦＡＭで標識した。Ｔｍ５８℃で増幅を行った。続いてＰＣＲ産物を２分間かけて９５℃に加熱してから、４℃に冷却した。ＤＭＰＫ  ＰＣＲ産物のＢｐｍｌ制限消化分析のために、３７℃で２０μｌの総反応容量で、制限酵素Ｂｐｍｌ（ＮＥＢ）によって８μｌのＰＣＲ混合物を一晩消化させた。３％アガロースゲルを用いて９０Ｖで電気泳動により最終産物を分析し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて、またはＡＢ１３７７シーケンサーでのフラグメント分析、続いてＧｅｎｅｓｃａｎ定量によって、バンドの密度を定量した。
【００９２】
ウェスタンブロットおよび検出
製造者の指示に従って市販のＮｕＰａｇｅシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）を使用して、ウェスタンブロットを行った。この試験で使用された一次抗体は、ヒトＣＤＫ９（Ａｂｃａｍ、１：１０００希釈）、ヒトＣＤＫ１２（Ａｂｃａｍ、１：４００希釈）、ヒトα−チューブリンおよびヒトラミンＢ（ともにＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚから入手し、１：５００の希釈で使用）であった。抗マウスＩｇＧ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を二次抗体として使用した。ウェスタンブロットでのバンドの定量にＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用した。
【００９３】
共局在試験
カバーガラス上で２４時間細胞を増殖させた後、５０：５０の氷冷したアセトン：メタノールで固定し、透過処理した。５％のヒツジ血清を含む５％ＢＳＡ中で細胞をブロックした。抗ＣＤＫ１２抗体（Ａｂｃａｍ）を１：１０００希釈で４℃で一晩使用し、続いてＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ−４８８抗マウス二次抗体（１：５００）で染色した。細胞を４％ＰＦＡ中で５分間インキュベートし、続いてプレハイブリダイゼーション溶液（４０％ホルムアミド、１０％２０×ＳＳＣ、５０％ＤＥＰＣ水）中で１５分間インキュベートし、Ｃｙ３標識ＣＡＧｉｏプローブとともに３７℃で一晩インキュベートした。ＤＡＰＩを用いたＶｅｃｔｏｒｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉａを用いて、カバーガラスをスライド上に載せた。Ｚｅｉｓｓ  ７１０共焦点顕微鏡を用いて画像を取得し、ＬＳＭ画像ブラウザを用いて分析した。
【００９４】
ｓｉＲＮＡ合成
ＡＢＩ  ３９４  ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いてｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。カラム（ＳｙｎＢａｓｅ商標ＣＰＧ１０００Å、ＲＮＡ：０．２μｍｏｌ）、標準２’−ＯＴＢＤＭＳ  ＲＮＡ−ホスホラミダイトおよび合成機用試薬はＬｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．から購入し、ＭｅＮＨ２溶液（エタノール中３３重量％）はＦｌｕｋａから入手し、ＮＥｔ３・３ＨＦ、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）はＡｌｄｒｉｃｈから購入し、ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｎａｐ商標−１０カラムはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨから入手した。合成機で使用する前に、ＣａＨ２からジクロロメタンおよびアセトニトリルを新たに蒸留した。
【００９５】
標準的な０．２μＭスケールプロトコルを用いてｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成したが、各ヌクレオチド付加工程について１０分間のカップリング時間を用いた。ポリマーに結合したオリゴリボヌクレオチドを合成カラムから１．５ｍＬ微量遠心管に移し、ＭｅＮＨ２溶液（１ｍＬ）に懸濁した。混合物を１０分間かけて６５℃に加熱し、室温（水／氷浴）に冷却し、１分間遠心分離した（１００００ｇ）。ＣＰＧビーズから上清を分離し、ＲＮａｓｅフリー水（２×０．２５ｍＬ）でビーズを洗浄し、上清をすべて合わせ、乾燥させた（窒素気流下で２時間、次いで凍結乾燥させた）。オリゴリボヌクレオチドを無水ＮＥｔ３・３ＨＦ／ＮＥｔ３／ＮＭＰ溶液（１．５ｍＬのＮＭＰ、７５０μｌのＮＥｔ３および１．０ｍＬのＮＥｔ３・３ＨＦの溶液２５０μｌ）に再懸濁し、１．５時間かけて６５℃に加熱し、室温に冷却し、３Ｍ  ＮａＯＡｃ溶液（２５μＬ）で急冷した。この混合物にｎ−ＢｕＯＨ（１ｍＬ）を加え、十分に混合し、１〜２時間かけて−７０℃に冷却して（ドライアイス）、さらに沈殿させ、３０分間遠心分離した（４℃、１３０００ｇ）。上清を除去し、ペレットを７０％ＥｔＯＨ（２×５００μＬ）で洗浄し、次いで真空中で乾燥させた（３０分間）。ＲＮａｓｅフリー水（１ｍＬ）に乾燥沈殿物を溶解し、標準的なプロトコルに従って、Ｎａｐ商標−１０カラムを用いて脱塩した。得られた溶液を一晩凍結乾燥させ、オリゴリボヌクレオチドを白色の泡沫／粉末として残した。
【００９６】
ＣＤＫ１２  ｓｉＲＮＡノックダウン
スクランブル：５’ＡＣＧＵＧＡＣＡＣＧＵＵＣＧＧＡＧＡＡＵＵおよびＣＤＫ１２：５’ＣＧＡＡＡＵＡＡＵＧＡＵＧＵＵＧＧＣＡＣＣＡＧＵＵ  ｓｉＲＮＡ配列。１日目および４日目にＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステムを使用して、８００ｎＭのスクランブルｓｉＲＮＡまたはＣＤＫ１２  ｓｉＲＮＡを細胞にエレクトロポレーションした。免疫組織化学的検査、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションおよびウェスタンブロット分析のために、７日目に細胞を回収した。
【００９７】
ＣＤＫ１２  ｓｈＲＮＡノックダウン
９６ウェルフォーマットでの感染前日に、４０％コンフルエントで細胞を播種した。ＤＭＥＭ培地に希釈した５μｇ／ｍｌポリブレン中に、１０のＭＯＩでレンチウイルス力価（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  ｓｃ−４４３４３−Ｖ）を添加した。２５００ｒｐｍで３０分間の遠心分離により細胞をスピン接種（ｓｐｉｎ  ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ）した。２４時間のインキュベーション後、ウイルスを除去し、新鮮なＤＭＥＭ培地と交換した。４日目に感染を繰り返し、免疫組織化学的検査およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション解析のために７日目に細胞を回収した。
【００９８】
ＣＤＫ１２配列
１０  ２０  ３０  ４０  ５０
ＭＰＮＳＥＲＨＧＧＫ  ＫＤＧＳＧＧＡＳＧＴ  ＬＱＰＳＳＧＧＧＳＳ  ＮＳＲＥＲＨＲＬＶＳ  ＫＨＫＲＨＫＳＫＨＳ
６０  ７０  ８０  ９０  １００
ＫＤＭＧＬＶＴＰＥＡ  ＡＳＬＧＴＶＩＫＰＬ  ＶＥＹＤＤＩＳＳＤＳ  ＤＴＦＳＤＤＭＡＦＫ  ＬＤＲＲＥＮＤＥＲＲ
１１０  １２０  １３０  １４０  １５０
ＧＳＤＲＳＤＲＬＨＫ  ＨＲＨＨＱＨＲＲＳＲ  ＤＬＬＫＡＫＱＴＥＫ  ＥＫＳＱＥＶＳＳＫＳ  ＧＳＭＫＤＲＩＳＧＳ
１６０  １７０  １８０  １９０  ２００
ＳＫＲＳＮＥＥＴＤＤ  ＹＧＫＡＱＶＡＫＳＳ  ＳＫＥＳＲＳＳＫＬＨ  ＫＥＫＴＲＫＥＲＥＬ  ＫＳＧＨＫＤＲＳＫＳ
２１０  ２２０  ２３０  ２４０  ２５０
ＨＲＫＲＥＴＰＫＳＹ  ＫＴＶＤＳＰＫＲＲＳ  ＲＳＰＨＲＫＷＳＤＳ  ＳＫＱＤＤＳＰＳＧＡ  ＳＹＧＱＤＹＤＬＳＰ
２６０  ２７０  ２８０  ２９０  ３００
ＳＲＳＨＴＳＳＮＹＤ  ＳＹＫＫＳＰＧＳＴＳ  ＲＲＱＳＶＳＰＰＹＫ  ＥＰＳＡＹＱＳＳＴＲ  ＳＰＳＰＹＳＲＲＱＲ
３１０  ３２０  ３３０  ３４０  ３５０
ＳＶＳＰＹＳＲＲＲＳ  ＳＳＹＥＲＳＧＳＹＳ  ＧＲＳＰＳＰＹＧＲＲ  ＲＳＳＳＰＦＬＳＫＲ  ＳＬＳＲＳＰＬＰＳＲ
３６０  ３７０  ３８０  ３９０  ４００
ＫＳＭＫＳＲＳＲＳＰ  ＡＹＳＲＨＳＳＳＨＳ  ＫＫＫＲＳＳＳＲＳＲ  ＨＳＳＩＳＰＶＲＬＰ  ＬＮＳＳＬＧＡＥＬＳ
４１０  ４２０  ４３０  ４４０  ４５０
ＲＫＫＫＥＲＡＡＡＡ  ＡＡＡＫＭＤＧＫＥＳ  ＫＧＳＰＶＦＬＰＲＫ  ＥＮＳＳＶＥＡＫＤＳ  ＧＬＥＳＫＫＬＰＲＳ
４６０  ４７０  ４８０  ４９０  ５００
ＶＫＬＥＫＳＡＰＤＴ  ＥＬＶＮＶＴＨＬＮＴ  ＥＶＫＮＳＳＤＴＧＫ  ＶＫＬＤＥＮＳＥＫＨ  ＬＶＫＤＬＫＡＱＧＴ
５１０  ５２０  ５３０  ５４０  ５５０
ＲＤＳＫＰＩＡＬＫＥ  ＥＩＶＴＰＫＥＴＥＴ  ＳＥＫＥＴＰＰＰＬＰ  ＴＩＡＳＰＰＰＰＬＰ  ＴＴＴＰＰＰＱＴＰＰ
５６０  ５７０  ５８０  ５９０  ６００
ＬＰＰＬＰＰＩＰＡＬ  ＰＱＱＰＰＬＰＰＳＱ  ＰＡＦＳＱＶＰＡＳＳ  ＴＳＴＬＰＰＳＴＨＳ  ＫＴＳＡＶＳＳＱＡＮ
６１０  ６２０  ６３０  ６４０  ６５０
ＳＱＰＰＶＱＶＳＶＫ  ＴＱＶＳＶＴＡＡＩＰ  ＨＬＫＴＳＴＬＰＰＬ  ＰＬＰＰＬＬＰＧＤＤ  ＤＭＤＳＰＫＥＴＬＰ
６６０  ６７０  ６８０  ６９０  ７００
ＳＫＰＶＫＫＥＫＥＱ  ＲＴＲＨＬＬＴＤＬＰ  ＬＰＰＥＬＰＧＧＤＬ  ＳＰＰＤＳＰＥＰＫＡ  ＩＴＰＰＱＱＰＹＫＫ
７１０  ７２０  ７３０  ７４０  ７５０
ＲＰＫＩＣＣＰＲＹＧ  ＥＲＲＱＴＥＳＤＷＧ  ＫＲＣＶＤＫＦＤＩＩ  ＧＩＩＧＥＧＴＹＧＱ  ＶＹＫＡＫＤＫＤＴＧ
７６０  ７７０  ７８０  ７９０  ８００
ＥＬＶＡＬＫＫＶＲＬ  ＤＮＥＫＥＧＦＰＩＴ  ＡＩＲＥＩＫＩＬＲＱ  ＬＩＨＲＳＶＶＮＭＫ  ＥＩＶＴＤＫＱＤＡＬ
８１０  ８２０  ８３０  ８４０  ８５０
ＤＦＫＫＤＫＧＡＦＹ  ＬＶＦＥＹＭＤＨＤＬ  ＭＧＬＬＥＳＧＬＶＨ  ＦＳＥＤＨＩＫＳＦＭ  ＫＱＬＭＥＧＬＥＹＣ
８６０  ８７０  ８８０  ８９０  ９００
ＨＫＫＮＦＬＨＲＤＩ  ＫＣＳＮＩＬＬＮＮＳ  ＧＱＩＫＬＡＤＦＧＬ  ＡＲＬＹＮＳＥＥＳＲ  ＰＹＴＮＫＶＩＴＬＷ
９１０  ９２０  ９３０  ９４０  ９５０
ＹＲＰＰＥＬＬＬＧＥ  ＥＲＹＴＰＡＩＤＶＷ  ＳＣＧＣＩＬＧＥＬＦ  ＴＫＫＰＩＦＱＡＮＬ  ＥＬＡＱＬＥＬＩＳＲ
９６０  ９７０  ９８０  ９９０  １０００
ＬＣＧＳＰＣＰＡＶＷ  ＰＤＶＩＫＬＰＹＦＮ  ＴＭＫＰＫＫＱＹＲＲ  ＲＬＲＥＥＦＳＦＩＰ  ＳＡＡＬＤＬＬＤＨＭ
１０１０  １０２０  １０３０  １０４０  １０５０
ＬＴＬＤＰＳＫＲＣＴ  ＡＥＱＴＬＱＳＤＦＬ  ＫＤＶＥＬＳＫＭＡＰ  ＰＤＬＰＨＷＱＤＣＨ  ＥＬＷＳＫＫＲＲＲＱ
１０６０  １０７０  １０８０  １０９０  １１００
ＲＱＳＧＶＶＶＥＥＰ  ＰＰＳＫＴＳＲＫＥＴ  ＴＳＧＴＳＴＥＰＶＫ  ＮＳＳＰＡＰＰＱＰＡ  ＰＧＫＶＥＳＧＡＧＤ
１１１０  １１２０  １１３０  １１４０  １１５０
ＡＩＧＬＡＤＩＴＱＱ  ＬＮＱＳＥＬＡＶＬＬ  ＮＬＬＱＳＱＴＤＬＳ  ＩＰＱＭＡＱＬＬＮＩ  ＨＳＮＰＥＭＱＱＱＬ
１１６０  １１７０  １１８０  １１９０  １２００
ＥＡＬＮＱＳＩＳＡＬ  ＴＥＡＴＳＱＱＱＤＳ  ＥＴＭＡＰＥＥＳＬＫ  ＥＡＰＳＡＰＶＩＬＰ  ＳＡＥＱＴＴＬＥＡＳ
１２１０  １２２０  １２３０  １２４０  １２５０
ＳＴＰＡＤＭＱＮＩＬ  ＡＶＬＬＳＱＬＭＫＴ  ＱＥＰＡＧＳＬＥＥＮ  ＮＳＤＫＮＳＧＰＱＧ  ＰＲＲＴＰＴＭＰＱＥ
１２６０  １２７０  １２８０  １２９０  １３００
ＥＡＡＡＣＰＰＨＩＬ  ＰＰＥＫＲＰＰＥＰＰ  ＧＰＰＰＰＰＰＰＰＰ  ＬＶＥＧＤＬＳＳＡＰ  ＱＥＬＮＰＡＶＴＡＡ
１３１０  １３２０  １３３０  １３４０  １３５０
ＬＬＱＬＬＳＱＰＥＡ  ＥＰＰＧＨＬＰＨＥＨ  ＱＡＬＲＰＭＥＹＳＴ  ＲＰＲＰＮＲＴＹＧＮ  ＴＤＧＰＥＴＧＦＳＡ
１３６０  １３７０  １３８０  １３９０  １４００
ＩＤＴＤＥＲＮＳＧＰ  ＡＬＴＥＳＬＶＱＴＬ  ＶＫＮＲＴＦＳＧＳＬ  ＳＨＬＧＥＳＳＳＹＱ  ＧＴＧＳＶＱＦＰＧＤ
１４１０  １４２０  １４３０  １４４０  １４５０
ＱＤＬＲＦＡＲＶＰＬ  ＡＬＨＰＶＶＧＱＰＦ  ＬＫＡＥＧＳＳＮＳＶ  ＶＨＡＥＴＫＬＱＮＹ  ＧＥＬＧＰＧＴＴＧＡ
１４６０  １４７０  １４８０  １４９０
ＳＳＳＧＡＧＬＨＷＧ  ＧＰＴＱＳＳＡＹＧＫ  ＬＹＲＧＰＴＲＶＰＰ  ＲＧＧＲＧＲＧＶＰＹ
【００９９】
ＣＤＫ１２のキナーゼドメインは、アミノ酸位置７２７〜１０２０（下線部）に由来する。ＣＤＫ１２は、ＮおよびＣ末端ローブの周りに伸び、結合したＡＴＰ（下線および斜体）と接触する追加のＣ末端ドメイン伸長部を有する。これはＣＤＫ１２に独特であり、ＣＤＫ９には存在しない。
【０１００】
ＡＴＰとの接触残基は、Ｔｈｒ７３７、Ｌｙｓ７５６、Ｇｌｕ８１４、Ｍｅｔ８１６およびＡｓｐ８１９である（太字で強調されている）。
【０１０１】
ＣＤＫ１２転写物配列（配列番号１）
１  ｇｔｇｔｇａｃｔｇｇ  ｇｔｃｔｇｔｇｔｇａ  ｇｇｇａｇａｇａｇｔ  ｇｔｇｔｇｔｇｇｔｇ  ｔｇｇａｇｇｔｇａａ  ａｃｇｇａｇｇｃａａ
６１  ｇａａａｇｇｇｇｇｃ  ｔａｃｃｔｃａｇｇａ  ｇｃｇａｇｇｇａｃａ  ａａｇｇｇｇｇｃｇｔ  ｇａｇｇｃａｃｃｔａ  ｇｇｃｃｇｃｇｇｃａ
１２１  ｃｃｃｃｇｇｃｇａｃ  ａｇｇａａｇｃｃｇｔ  ｃｃｔｇａａｃｃｇｇ  ｇｃｔａｃｃｇｇｇｔ  ａｇｇｇｇａａｇｇｇ  ｃｃｃｇｃｇｔａｇｔ
１８１  ｃｃｔｃｇｃａｇｇｇ  ｃｃｃｃａｇａｇｃｔ  ｇｇａｇｔｃｇｇｃｔ  ｃｃａｃａｇｃｃｃｃ  ｇｇｇｃｃｇｔｃｇｇ  ｃｔｔｃｔｃａｃｔｔ
２４１  ｃｃｔｇｇａｃｃｔｃ  ｃｃｃｇｇｃｇｃｃｃ  ｇｇｇｃｃｔｇａｇｇ  ａｃｔｇｇｃｔｃｇｇ  ｃｇｇａｇｇｇａｇａ  ａｇａｇｇａａａｃａ
３０１  ｇａｃｔｔｇａｇｃａ  ｇｃｔｃｃｃｃｇｔｔ  ｇｔｃｔｃｇｃａａｃ  ｔｃｃａｃｔｇｃｃｇ  ａｇｇａａｃｔｃｔｃ  ａｔｔｔｃｔｔｃｃｃ
３６１  ｔｃｇｃｔｃｃｔｔｃ  ａｃｃｃｃｃｃａｃｃ  ｔｃａｔｇｔａｇａａ  ｇｇｇｔｇｃｔｇａｇ  ｇｃｇｔｃｇｇｇａｇ  ｇｇａｇｇａｇｇａｇ
４２１  ｃｃｔｇｇｇｃｔａｃ  ｃｇｔｃｃｃｔｇｃｃ  ｃｔｃｃｃｃａｃｃｃ  ｃｃｔｔｃｃｃｇｇｇ  ｇｃｇｃｔｔｔｇｇｔ  ｇｇｇｃｇｔｇｇａｇ
４８１  ｔｔｇｇｇｇｔｔｇｇ  ｇｇｇｇｇｔｇｇｇｔ  ｇｇｇｇｇｔｔｇｃｔ  ｔｔｔｔｇｇａｇｔｇ  ｃｔｇｇｇｇａａｃｔ  ｔｔｔｔｔｃｃｃｔｔ
５４１  ｃｔｔｃａｇｇｔｃａ  ｇｇｇｇａａａｇｇｇ  ａａｔｇｃｃｃａａｔ  ｔｃａｇａｇａｇａｃ  ａｔｇｇｇｇｇｃａａ  ｇａａｇｇａｃｇｇｇ
６０１  ａｇｔｇｇａｇｇａｇ  ｃｔｔｃｔｇｇａａｃ  ｔｔｔｇｃａｇｃｃｇ  ｔｃａｔｃｇｇｇａｇ  ｇｃｇｇｃａｇｃｔｃ  ｔａａｃａｇｃａｇａ
６６１  ｇａｇｃｇｔｃａｃｃ  ｇｃｔｔｇｇｔａｔｃ  ｇａａｇｃａｃａａｇ  ｃｇｇｃａｔａａｇｔ  ｃｃａａａｃａｃｔｃ  ｃａａａｇａｃａｔｇ
７２１  ｇｇｇｔｔｇｇｔｇａ  ｃｃｃｃｃｇａａｇｃ  ａｇｃａｔｃｃｃｔｇ  ｇｇｃａｃａｇｔｔａ  ｔｃａａａｃｃｔｔｔ  ｇｇｔｇｇａｇｔａｔ
７８１  ｇａｔｇａｔａｔｃａ  ｇｃｔｃｔｇａｔｔｃ  ｃｇａｃａｃｃｔｔｃ  ｔｃｃｇａｔｇａｃａ  ｔｇｇｃｃｔｔｃａａ  ａｃｔａｇａｃｃｇａ
８４１  ａｇｇｇａｇａａｃｇ  ａｃｇａａｃｇｔｃｇ  ｔｇｇａｔｃａｇａｔ  ｃｇｇａｇｃｇａｃｃ  ｇｃｃｔｇｃａｃａａ  ａｃａｔｃｇｔｃａｃ
９０１  ｃａｃｃａｇｃａｃａ  ｇｇｃｇｔｔｃｃｃｇ  ｇｇａｃｔｔａｃｔａ  ａａａｇｃｔａａａｃ  ａｇａｃｃｇａａａａ  ａｇａａａａａａｇｃ
９６１  ｃａａｇａａｇｔｃｔ  ｃｃａｇｃａａｇｔｃ  ｇｇｇａｔｃｇａｔｇ  ａａｇｇａｃｃｇｇａ  ｔａｔｃｇｇｇａａｇ  ｔｔｃａａａｇｃｇｔ
１０２１  ｔｃｇａａｔｇａｇｇ  ａｇａｃｔｇａｔｇａ  ｃｔａｔｇｇｇａａｇ  ｇｃｇｃａｇｇｔａｇ  ｃｃａａａａｇｃａｇ  ｃａｇｃａａｇｇａａ
１０８１  ｔｃｃａｇｇｔｃａｔ  ｃｃａａｇｃｔｃｃａ  ｃａａｇｇａｇａａｇ  ａｃｃａｇｇａａａｇ  ａａｃｇｇｇａｇｃｔ  ｇａａｇｔｃｔｇｇｇ
１１４１  ｃａｃａａａｇａｃｃ  ｇｇａｇｔａａａａｇ  ｔｃａｔｃｇａａａａ  ａｇｇｇａａａｃａｃ  ｃｃａａａａｇｔｔａ  ｃａａａａｃａｇｔｇ
１２０１  ｇａｃａｇｃｃｃａａ  ａａｃｇｇａｇａｔｃ  ｃａｇｇａｇｃｃｃｃ  ｃａｃａｇｇａａｇｔ  ｇｇｔｃｔｇａｃａｇ  ｃｔｃｃａａａｃａａ
１２６１  ｇａｔｇａｔａｇｃｃ  ｃｃｔｃｇｇｇａｇｃ  ｔｔｃｔｔａｔｇｇｃ  ｃａａｇａｔｔａｔｇ  ａｃｃｔｔａｇｔｃｃ  ｃｔｃａｃｇａｔｃｔ
１３２１  ｃａｔａｃｃｔｃｇａ  ｇｃａａｔｔａｔｇａ  ｃｔｃｃｔａｃａａｇ  ａａａａｇｔｃｃｔｇ  ｇａａｇｔａｃｃｔｃ  ｇａｇａａｇｇｃａｇ
１３８１  ｔｃｇｇｔｃａｇｔｃ  ｃｃｃｃｔｔａｃａａ  ｇｇａｇｃｃｔｔｃｇ  ｇｃｃｔａｃｃａｇｔ  ｃｃａｇｃａｃｃｃｇ  ｇｔｃａｃｃｇａｇｃ
１４４１  ｃｃｃｔａｃａｇｔａ  ｇｇｃｇａｃａｇａｇ  ａｔｃｔｇｔｃａｇｔ  ｃｃｃｔａｔａｇｃａ  ｇｇａｇａｃｇｇｔｃ  ｇｔｃｃａｇｃｔａｃ
１５０１  ｇａａａｇａａｇｔｇ  ｇｃｔｃｔｔａｃａｇ  ｃｇｇｇｃｇａｔｃｇ  ｃｃｃａｇｔｃｃｃｔ  ａｔｇｇｔｃｇａａｇ  ｇｃｇｇｔｃｃａｇｃ
１５６１  ａｇｃｃｃｔｔｔｃｃ  ｔｇａｇｃａａｇｃｇ  ｇｔｃｔｃｔｇａｇｔ  ｃｇｇａｇｔｃｃａｃ  ｔｃｃｃｃａｇｔａｇ  ｇａａａｔｃｃａｔｇ
１６２１  ａａｇｔｃｃａｇａａ  ｇｔａｇａａｇｔｃｃ  ｔｇｃａｔａｔｔｃａ  ａｇａｃａｔｔｃａｔ  ｃｔｔｃｔｃａｔａｇ  ｔａａａａａｇａａｇ
１６８１  ａｇａｔｃｃａｇｔｔ  ｃａｃｇｃａｇｔｃｇ  ｔｃａｔｔｃｃａｇｔ  ａｔｃｔｃａｃｃｔｇ  ｔｃａｇｇｃｔｔｃｃ  ａｃｔｔａａｔｔｃｃ
１７４１  ａｇｔｃｔｇｇｇａｇ  ｃｔｇａａｃｔｃａｇ  ｔａｇｇａａａａａｇ  ａａｇｇａａａｇａｇ  ｃａｇｃｔｇｃｔｇｃ  ｔｇｃｔｇｃａｇｃａ
１８０１  ａａｇａｔｇｇａｔｇ  ｇａａａｇｇａｇｔｃ  ｃａａｇｇｇｔｔｃａ  ｃｃｔｇｔａｔｔｔｔ  ｔｇｃｃｔａｇａａａ  ａｇａｇａａｃａｇｔ
１８６１  ｔｃａｇｔａｇａｇｇ  ｃｔａａｇｇａｔｔｃ  ａｇｇｔｔｔｇｇａｇ  ｔｃｔａａａａａｇｔ  ｔａｃｃｃａｇａａｇ  ｔｇｔａａａａｔｔｇ
１９２１  ｇａａａａａｔｃｔｇ  ｃｃｃｃａｇａｔａｃ  ｔｇａａｃｔｇｇｔｇ  ａａｔｇｔａａｃａｃ  ａｔｃｔａａａｃａｃ  ａｇａｇｇｔａａａａ
１９８１  ａａｔｔｃｔｔｃａｇ  ａｔａｃａｇｇｇａａ  ａｇｔａａａｇｔｔｇ  ｇａｔｇａｇａａｃｔ  ｃｃｇａｇａａｇｃａ  ｔｃｔｔｇｔｔａａａ
２０４１  ｇａｔｔｔｇａａａｇ  ｃａｃａｇｇｇａａｃ  ａａｇａｇａｃｔｃｔ  ａａａｃｃｃａｔａｇ  ｃａｃｔｇａａａｇａ  ｇｇａｇａｔｔｇｔｔ
２１０１  ａｃｔｃｃａａａｇｇ  ａｇａｃａｇａａａｃ  ａｔｃａｇａａａａｇ  ｇａｇａｃｃｃｃｔｃ  ｃａｃｃｔｃｔｔｃｃ  ｃａｃａａｔｔｇｃｔ
２１６１  ｔｃｔｃｃｃｃｃａｃ  ｃｃｃｃｔｃｔａｃｃ  ａａｃｔａｃｔａｃｃ  ｃｃｔｃｃａｃｃｔｃ  ａｇａｃａｃｃｃｃｃ  ｔｔｔｇｃｃａｃｃｔ
２２２１  ｔｔｇｃｃｔｃｃａａ  ｔａｃｃａｇｃｔｃｔ  ｔｃｃａｃａｇｃａａ  ｃｃａｃｃｔｃｔｇｃ  ｃｔｃｃｔｔｃｔｃａ  ｇｃｃａｇｃａｔｔｔ
２２８１  ａｇｔｃａｇｇｔｔｃ  ｃｔｇｃｔｔｃｃａｇ  ｔａｃｔｔｃａａｃｔ  ｔｔｇｃｃｃｃｃｔｔ  ｃｔａｃｔｃａｃｔｃ  ａａａｇａｃａｔｃｔ
２３４１  ｇｃｔｇｔｇｔｃｃｔ  ｃｔｃａｇｇｃａａａ  ｔｔｃｔｃａｇｃｃｃ  ｃｃｔｇｔａｃａｇｇ  ｔｔｔｃｔｇｔｇａａ  ｇａｃｔｃａａｇｔａ
２４０１  ｔｃｔｇｔａａｃａｇ  ｃｔｇｃｔａｔｔｃｃ  ａｃａｃｃｔｇａａａ  ａｃｔｔｃａａｃｇｔ  ｔｇｃｃｔｃｃｔｔｔ  ｇｃｃｃｃｔｃｃｃａ
２４６１  ｃｃｃｔｔａｔｔａｃ  ｃｔｇｇａｇａｔｇａ  ｔｇａｃａｔｇｇａｔ  ａｇｔｃｃａａａａｇ  ａａａｃｔｃｔｔｃｃ  ｔｔｃａａａａｃｃｔ
２５２１  ｇｔｇａａｇａａａｇ  ａｇａａｇｇａａｃａ  ｇａｇｇａｃａｃｇｔ  ｃａｃｔｔａｃｔｃａ  ｃａｇａｃｃｔｔｃｃ  ｔｃｔｃｃｃｔｃｃａ
２５８１  ｇａｇｃｔｃｃｃｔｇ  ｇｔｇｇａｇａｔｃｔ  ｇｔｃｔｃｃｃｃｃａ  ｇａｃｔｃｔｃｃａｇ  ａａｃｃａａａｇｇｃ  ａａｔｃａｃａｃｃａ
２６４１  ｃｃｔｃａｇｃａａｃ  ｃａｔａｔａａａａａ  ｇａｇａｃｃａａａａ  ａｔｔｔｇｔｔｇｔｃ  ｃｔｃｇｔｔａｔｇｇ  ａｇａａａｇａａｇａ
２７０１  ｃａａａｃａｇａａａ  ｇｃｇａｃｔｇｇｇｇ  ｇａａａｃｇｃｔｇｔ  ｇｔｇｇａｃａａｇｔ  ｔｔｇａｃａｔｔａｔ  ｔｇｇｇａｔｔａｔｔ
２７６１  ｇｇａｇａａｇｇａａ  ｃｃｔａｔｇｇｃｃａ  ａｇｔａｔａｔａａａ  ｇｃｃａａｇｇａｃａ  ａａｇａｃａｃａｇｇ  ａｇａａｃｔａｇｔｇ
２８２１  ｇｃｔｃｔｇａａｇａ  ａｇｇｔｇａｇａｃｔ  ａｇａｃａａｔｇａｇ  ａａａｇａｇｇｇｃｔ  ｔｃｃｃａａｔｃａｃ  ａｇｃｃａｔｔｃｇｔ
２８８１  ｇａａａｔｃａａａａ  ｔｃｃｔｔｃｇｔｃａ  ｇｔｔａａｔｃｃａｃ  ｃｇａａｇｔｇｔｔｇ  ｔｔａａｃａｔｇａａ  ｇｇａａａｔｔｇｔｃ
２９４１  ａｃａｇａｔａａａｃ  ａａｇａｔｇｃａｃｔ  ｇｇａｔｔｔｃａａｇ  ａａｇｇａｃａａａｇ  ｇｔｇｃｃｔｔｔｔａ  ｃｃｔｔｇｔａｔｔｔ
３００１  ｇａｇｔａｔａｔｇｇ  ａｃｃａｔｇａｃｔｔ  ａａｔｇｇｇａｃｔｇ  ｃｔａｇａａｔｃｔｇ  ｇｔｔｔｇｇｔｇｃａ  ｃｔｔｔｔｃｔｇａｇ
３０６１  ｇａｃｃａｔａｔｃａ  ａｇｔｃｇｔｔｃａｔ  ｇａａａｃａｇｃｔａ  ａｔｇｇａａｇｇａｔ  ｔｇｇａａｔａｃｔｇ  ｔｃａｃａａａａａｇ
３１２１  ａａｔｔｔｃｃｔｇｃ  ａｔｃｇｇｇａｔａｔ  ｔａａｇｔｇｔｔｃｔ  ａａｃａｔｔｔｔｇｃ  ｔｇａａｔａａｃａｇ  ｔｇｇｇｃａａａｔｃ
３１８１  ａａａｃｔａｇｃａｇ  ａｔｔｔｔｇｇａｃｔ  ｔｇｃｔｃｇｇｃｔｃ  ｔａｔａａｃｔｃｔｇ  ａａｇａｇａｇｔｃｇ  ｃｃｃｔｔａｃａｃａ
３２４１  ａａｃａａａｇｔｃａ  ｔｔａｃｔｔｔｇｔｇ  ｇｔａｃｃｇａｃｃｔ  ｃｃａｇａａｃｔａｃ  ｔｇｃｔａｇｇａｇａ  ｇｇａａｃｇｔｔａｃ
３３０１  ａｃａｃｃａｇｃｃａ  ｔａｇａｔｇｔｔｔｇ  ｇａｇｃｔｇｔｇｇａ  ｔｇｔａｔｔｃｔｔｇ  ｇｇｇａａｃｔａｔｔ  ｃａｃａａａｇａａｇ
３３６１  ｃｃｔａｔｔｔｔｔｃ  ａａｇｃｃａａｔｃｔ  ｇｇａａｃｔｇｇｃｔ  ｃａｇｃｔａｇａａｃ  ｔｇａｔｃａｇｃｃｇ  ａｃｔｔｔｇｔｇｇｔ
３４２１  ａｇｃｃｃｔｔｇｔｃ  ｃａｇｃｔｇｔｇｔｇ  ｇｃｃｔｇａｔｇｔｔ  ａｔｃａａａｃｔｇｃ  ｃｃｔａｃｔｔｃａａ  ｃａｃｃａｔｇａａａ
３４８１  ｃｃｇａａｇａａｇｃ  ａａｔａｔｃｇａａｇ  ｇｃｇｔｃｔａｃｇａ  ｇａａｇａａｔｔｃｔ  ｃｔｔｔｃａｔｔｃｃ  ｔｔｃｔｇｃａｇｃａ
３５４１  ｃｔｔｇａｔｔｔａｔ  ｔｇｇａｃｃａｃａｔ  ｇｃｔｇａｃａｃｔａ  ｇａｔｃｃｔａｇｔａ  ａｇｃｇｇｔｇｃａｃ  ａｇｃｔｇａａｃａｇ
３６０１  ａｃｃｃｔａｃａｇａ  ｇｃｇａｃｔｔｃｃｔ  ｔａａａｇａｔｇｔｃ  ｇａａｃｔｃａｇｃａ  ａａａｔｇｇｃｔｃｃ  ｔｃｃａｇａｃｃｔｃ
３６６１  ｃｃｃｃａｃｔｇｇｃ  ａｇｇａｔｔｇｃｃａ  ｔｇａｇｔｔｇｔｇｇ  ａｇｔａａｇａａａｃ  ｇｇｃｇａｃｇｔｃａ  ｇｃｇａｃａａａｇｔ
３７２１  ｇｇｔｇｔｔｇｔａｇ  ｔｃｇａａｇａｇｃｃ  ａｃｃｔｃｃａｔｃｃ  ａａａａｃｔｔｃｔｃ  ｇａａａａｇａａａｃ  ｔａｃｃｔｃａｇｇｇ
３７８１  ａｃａａｇｔａｃｔｇ  ａｇｃｃｔｇｔｇａａ  ｇａａｃａｇｃａｇｃ  ｃｃａｇｃａｃｃａｃ  ｃｔｃａｇｃｃｔｇｃ  ｔｃｃｔｇｇｃａａｇ
３８４１  ｇｔｇｇａｇｔｃｔｇ  ｇｇｇｃｔｇｇｇｇａ  ｔｇｃａａｔａｇｇｃ  ｃｔｔｇｃｔｇａｃａ  ｔｃａｃａｃａａｃａ  ｇｃｔｇａａｔｃａａ
３９０１  ａｇｔｇａａｔｔｇｇ  ｃａｇｔｇｔｔａｔｔ  ａａａｃｃｔｇｃｔｇ  ｃａｇａｇｃｃａａａ  ｃｃｇａｃｃｔｇａｇ  ｃａｔｃｃｃｔｃａａ
３９６１  ａｔｇｇｃａｃａｇｃ  ｔｇｃｔｔａａｃａｔ  ｃｃａｃｔｃｃａａｃ  ｃｃａｇａｇａｔｇｃ  ａｇｃａｇｃａｇｃｔ  ｇｇａａｇｃｃｃｔｇ
４０２１  ａａｃｃａａｔｃｃａ  ｔｃａｇｔｇｃｃｃｔ  ｇａｃｇｇａａｇｃｔ  ａｃｔｔｃｃｃａｇｃ  ａｇｃａｇｇａｃｔｃ  ａｇａｇａｃｃａｔｇ
４０８１  ｇｃｃｃｃａｇａｇｇ  ａｇｔｃｔｔｔｇａａ  ｇｇａａｇｃａｃｃｃ  ｔｃｔｇｃｃｃｃａｇ  ｔｇａｔｃｃｔｇｃｃ  ｔｔｃａｇｃａｇａａ
４１４１  ｃａｇａｃｇａｃｃｃ  ｔｔｇａａｇｃｔｔｃ  ａａｇｃａｃａｃｃａ  ｇｃｔｇａｃａｔｇｃ  ａｇａａｔａｔａｔｔ  ｇｇｃａｇｔｔｃｔｃ
４２０１  ｔｔｇａｇｔｃａｇｃ  ｔｇａｔｇａａａａｃ  ｃｃａａｇａｇｃｃａ  ｇｃａｇｇｃａｇｔｃ  ｔｇｇａｇｇａａａａ  ｃａａｃａｇｔｇａｃ
４２６１  ａａｇａａｃａｇｔｇ  ｇｇｃｃａｃａｇｇｇ  ｇｃｃｃｃｇａａｇａ  ａｃｔｃｃｃａｃａａ  ｔｇｃｃａｃａｇｇａ  ｇｇａｇｇｃａｇｃａ
４３２１  ｇｃａｔｇｔｃｃｔｃ  ｃｔｃａｃａｔｔｃｔ  ｔｃｃａｃｃａｇａｇ  ａａｇａｇｇｃｃｃｃ  ｃｔｇａｇｃｃｃｃｃ  ｃｇｇａｃｃｔｃｃａ
４３８１  ｃｃｇｃｃｇｃｃａｃ  ｃｔｃｃａｃｃｃｃｃ  ｔｃｔｇｇｔｔｇａａ  ｇｇｃｇａｔｃｔｔｔ  ｃｃａｇｃｇｃｃｃｃ  ｃｃａｇｇａｇｔｔｇ
４４４１  ａａｃｃｃａｇｃｃｇ  ｔｇａｃａｇｃｃｇｃ  ｃｔｔｇｃｔｇｃａａ  ｃｔｔｔｔａｔｃｃｃ  ａｇｃｃｔｇａａｇｃ  ａｇａｇｃｃｔｃｃｔ
４５０１  ｇｇｃｃａｃｃｔｇｃ  ｃａｃａｔｇａｇｃａ  ｃｃａｇｇｃｃｔｔｇ  ａｇａｃｃａａｔｇｇ  ａｇｔａｃｔｃｃａｃ  ｃｃｇａｃｃｃｃｇｔ
４５６１  ｃｃａａａｃａｇｇａ  ｃｔｔａｔｇｇａａａ  ｃａｃｔｇａｔｇｇｇ  ｃｃｔｇａａａｃａｇ  ｇｇｔｔｃａｇｔｇｃ  ｃａｔｔｇａｃａｃｔ
４６２１  ｇａｔｇａａｃｇａａ  ａｃｔｃｔｇｇｔｃｃ  ａｇｃｃｔｔｇａｃａ  ｇａａｔｃｃｔｔｇｇ  ｔｃｃａｇａｃｃｃｔ  ｇｇｔｇａａｇａａｃ
４６８１  ａｇｇａｃｃｔｔｃｔ  ｃａｇｇｃｔｃｔｃｔ  ｇａｇｃｃａｃｃｔｔ  ｇｇｇｇａｇｔｃｃａ  ｇｃａｇｔｔａｃｃａ  ｇｇｇｃａｃａｇｇｇ
４７４１  ｔｃａｇｔｇｃａｇｔ  ｔｔｃｃａｇｇｇｇａ  ｃｃａｇｇａｃｃｔｃ  ｃｇｔｔｔｔｇｃｃａ  ｇｇｇｔｃｃｃｃｔｔ  ａｇｃｇｔｔａｃａｃ
４８０１  ｃｃｇｇｔｇｇｔｃｇ  ｇｇｃａａｃｃａｔｔ  ｃｃｔｇａａｇｇｃｔ  ｇａｇｇｇａａｇｃａ  ｇｃａａｔｔｃｔｇｔ  ｇｇｔａｃａｔｇｃａ
４８６１  ｇａｇａｃｃａａａｔ  ｔｇｃａａａａｃｔａ  ｔｇｇｇｇａｇｃｔｇ  ｇｇｇｃｃａｇｇａａ  ｃｃａｃｔｇｇｇｇｃ  ｃａｇｃａｇｃｔｃａ
４９２１  ｇｇａｇｃａｇｇｃｃ  ｔｔｃａｃｔｇｇｇｇ  ｇｇｇｃｃｃａａｃｔ  ｃａｇｔｃｔｔｃｔｇ  ｃｔｔａｔｇｇａａａ  ａｃｔｃｔａｔｃｇｇ
４９８１  ｇｇｇｃｃｔａｃａａ  ｇａｇｔｃｃｃａｃｃ  ａａｇａｇｇｇｇｇａ  ａｇａｇｇｇａｇａｇ  ｇａｇｔｔｃｃｔｔａ  ｃｔａａｃｃｃａｇａ
５０４１  ｇａｃｔｔｃａｇｔｇ  ｔｃｃｔｇａａａｇａ  ｔｔｃｃｔｔｔｃｃｔ  ａｔｃｃａｔｃｃｔｔ  ｃｃａｔｃｃａｇｔｔ  ｃｔｃｔｇａａｔｃｔ
５１０１  ｔｔａａｔｇａａａｔ  ｃａｔｔｔｇｃｃａｇ  ａｇｃｇａｇｇｔａａ  ｔｃａｔｃｔｇｃａｔ  ｔｔｇｇｃｔａｃｔｇ  ｃａａａｇｃｔｇｔｃ
５１６１  ｃｇｔｔｇｔａｔｔｃ  ｃｔｔｇｃｔｃａｃｔ  ｔｇｃｔａｃｔａｇｃ  ａｇｇｃｇａｃｔｔａ  ｃｇａａａｔａａｔｇ  ａｔｇｔｔｇｇｃａｃ
５２２１  ｃａｇｔｔｃｃｃｃｃ  ｔｇｇａｔｇｇｇｃｔ  ａｔａｇｃｃａｇａａ  ｃａｔｔｔａｃｔｔｃ  ａａｃｔｃｔａｃｃｔ  ｔａｇｔａｇａｔａｃ
５２８１  ａａｇｔａｇａｇａａ  ｔａｔｇｇａｇａｇｇ  ａｔｃａｔｔａｃａｔ  ｔｇａａａａｇｔａａ  ａｔｇｔｔｔｔａｔｔ  ａｇｔｔｃａｔｔｇｃ
５３４１  ｃｔｇｃａｃｔｔａｃ  ｔｇａｔｃｇｇａａｇ  ａｇａｇａａａｇａａ  ｃａｇｔｔｔｃａｇｔ  ａｔｔｇａｇａｔｇｇ  ｃｔｃａｇｇａｇａｇ
５４０１  ｇｃｔｃｔｔｔｇａｔ  ｔｔｔｔａａａｇｔｔ  ｔｔｇｇｇｇｔｇｇｇ  ｇｇａｔｔｇｔｇｔｇ  ｔｇｇｔｔｔｃｔｔｔ  ｃｔｔｔｔｇａａｔｔ
５４６１  ｔｔａａｔｔｔａｇｇ  ｔｇｔｔｔｔｇｇｇｔ  ｔｔｔｔｔｔｃｃｔｔ  ｔａａａｇａｇａａｔ  ａｇｔｇｔｔｃａｃａ  ａａａｔｔｔｇａｇｃ
５５２１  ｔｇｃｔｃｔｔｔｇｇ  ｃｔｔｔｔｇｃｔａｔ  ａａｇｇｇａａａｃａ  ｇａｇｔｇｇｃｃｔｇ  ｇｃｔｇａｔｔｔｇａ  ａｔａａａｔｇｔｔｔ
５５８１  ｃｔｔｔｃｃｔｃｔｃ  ｃａｃｃａｔｃｔｃａ  ｃａｔｔｔｔｇｃｔｔ  ｔｔａａｇｔｇａａｃ  ａｃｔｔｔｔｔｃｃｃ  ｃａｔｔｇａｇｃａｔ
５６４１  ｃｔｔｇａａｃａｔａ  ｃｔｔｔｔｔｔｔｃｃ  ａａａｔａａａｔｔａ  ｃｔｃａｔｃｃｔｔａ  ａａｇｔｔｔａｃｔｃ  ｃａｃｔｔｔｇａｃａ
５７０１  ａａａｇａｔａｃｇｃ  ｃｃｔｔｃｔｃｃｃｔ  ｇｃａｃａｔａａａｇ  ｃａｇｇｔｔｇｔａｇ  ａａｃｇｔｇｇｃａｔ  ｔｃｔｔｇｇｇｃａａ
５７６１  ｇｔａｇｇｔａｇａｃ  ｔｔｔａｃｃｃａｇｔ  ｃｔｃｔｔｔｃｃｔｔ  ｔｔｔｔｇｃｔｇａｔ  ｇｔｇｔｇｃｔｃｔｃ  ｔｃｔｃｔｃｔｃｔｔ
５８２１  ｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃ  ｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃ  ｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃ  ｔｃｔｃｔｃｔｃｔｃ  ｔｇｔｃｔｃｇｃｔｔ  ｇｃｔｃｇｃｔｃｔｃ
５８８１  ｇｃｔｇｔｔｔｃｔｃ  ｔｃｔｃｔｔｔｇａｇ  ｇｃａｔｔｔｇｔｔｔ  ｇｇａａａａａａｔｃ  ｇｔｔｇａｇａｔｇｃ  ｃｃａａｇａａｃｃｔ
５９４１  ｇｇｇａｔａａｔｔｃ  ｔｔｔａｃｔｔｔｔｔ  ｔｔｇａａａｔａａａ  ｇｇａａａｇｇａａａ  ｔｔｃａｇａｃｔｃｔ  ｔａｃａｔｔｇｔｔｃ
６００１  ｔｃｔｇｔａａｃｔｃ  ｔｔｃａａｔｔｃｔａ  ａａａｔｇｔｔｔｔｇ  ｔｔｔｔｔｔａａａｃ  ｃａｔｇｔｔｃｔｇａ  ｔｇｇｇｇａａｇｔｔ
６０６１  ｇａｔｔｔｇｔａａｇ  ｔｇｔｇｇａｃａｇｃ  ｔｔｇｇａｃａｔｔｇ  ｃｔｇｃｔｇａｇｃｔ  ｇｔｇｇｔｔａｇａｇ  ａｔｇａｔｇｃｃｔｃ
６１２１  ｃａｔｔｃｃｔａｇａ  ｇｇｇｃｔａａｔａａ  ｃａｇｃａｔｔｔａｇ  ｃａｔａｔｔｇｔｔｔ  ａｃａｃａｔａｔａｔ  ｔｔｔｔａｔｇｔｃａ
６１８１  ａａａａａａａａａｃ  ａａａａａｃｃｔｔｔ  ｃａａａｃａｇａｇｃ  ａｔｔｇｔｇａｔａｔ  ｔｇｔｃａａａｇａｇ  ａａａａａｃａａａｔ
６２４１  ｃｃｔｇａａｇａｔａ  ｃａｔｇｇａａａｔｇ  ｔａａｃｃｔａｇｔｔ  ｔａｇｇｇｔｇｇｇｔ  ａｔｔｔｔｔｃｔｇａ  ａｇａｔａｃａｔｃａ
６３０１  ａｔａｃｃｔｇａｃｃ  ｔｔｔｔｔｔａａａａ  ａａａｔａａｔｔｔｔ  ａａａａｃａｇｃａｔ  ａｃｔｇｔｇａｇｇａ  ａｇａａｃａｇｔａｔ
６３６１  ｔｇａｃａｔａｃｃｃ  ａｃａｔｃｃｃａｇｃ  ａｔｇｔｇｔａｃｃｃ  ｔｇｃｃａｇｔｔｃｔ  ｔｔｔａｇｇｇａｔｔ  ｔｔｔｃｃｔｃｃａａ
６４２１  ａｇａｇａｔｔｔｇｇ  ａｔｔｔｇｇｔｔｔｔ  ｇｇｔａａａａｇｇｇ  ｇｔｔａａａｔｔｇｔ  ｇｃｔｔｃｃａｇｇｃ  ａａｇａａｃｔｔｔｇ
６４８１  ｃｃｔｔａｔｃａｔａ  ａａｃａｇｇａａａｔ  ｇａａａａａｇｇｇａ  ａｇｇｇｃｔｇｔｃａ  ｇｇａｔｇｇｇａｔａ  ａｔｔｔｇｇｇａｇｇ
６５４１  ｃｔｔｃｔｃａｔｔｃ  ｔｇｇｃｔｔｃｔａｔ  ｔｔｃｔａｔｇｔｇａ  ｇｔａｃｃａｇｃａｔ  ａｔａｇａｇｔｇｔｔ  ｔｔａａａａａｃａｇ
６６０１  ａｔａｃａｔｇｔｃａ  ｔａｔａａｔｔｔａｔ  ｃｔｇｃａｃａｇａｃ  ｔｔａｇａｃｃｔｔｃ  ａｇｇａａａｃａｔａ  ｇｇｔｔａａｇｃｃｃ
６６６１  ｃｃｔｔｔｔａｃａａ  ａｇａａａａａｇｔａ  ａａｃａｔａｃｔｔｃ  ａｇｃａｔｃｔｔｇｇ  ａｇｇｇｔａｇｔｔｔ  ｔｃａａａａｃｔｃａ
６７２１  ａｇｔｔｔｃａｔｇｔ  ｔｔｃａａｔｇｃｃａ  ａｇｔｔｃｔｔａｔｔ  ｔｔａａａａａａｔａ  ａａａｔｃｔａｃｔｔ  ａｔａａｇａｇａａａ
６７８１  ｇｇｔｇｃａｔｔａｃ  ｔｔａａａａａａａａ  ａａａａｃｔｔｔａａ  ａｇａａａｔｇａａａ  ｇａａｇａａｃｃｃｔ  ｃｔｔｃａｇａｔａｃ
６８４１  ｔｔａｃｔｔｇａａｇ  ａｃｔｇｔｔｔｔｃｃ  ｃｃｔｇｔｔａａｔｇ  ａｇａｔａｔａｇｃｔ  ａｇａｔａｔｃｇｇｔ  ｇｔｇｔｇｔａｔｔｔ
６９０１  ｃｔｔｔａｔｔａｔｔ  ｃｔｃｔｇｇｔｔｔｔ  ｔｇａｔｃｔｇｇｃｃ  ｔｔｇｃｃｔｃｃａｇ  ｇｇｃｃａａａｃａｃ  ｔｇａｔｔｔａｇａａ
６９６１  ａｇａｇａｇｃｃｔｔ  ｃｔａｇｃｔａｔｔｔ  ｔｇｇｃａｔｔｇａｔ  ｇｇｃｔｔｔｔｔａｔ  ａｃｃａｇｔｇｔｇｔ  ｃｃａｇｔｔａｇａｔ
７０２１  ｔｔａｃｔａｇｇｃｔ  ｔａｃｔｇａｃａｔｇ  ｃｔａｔｔｇｇｔａａ  ａｔｃｇｃａｔｔａａ  ａｇｔｔｃａｔｃｔｇ  ａａｃｃｔｔｃｔｇｔ
７０８１  ｃｔｇｔｔｇａｃｔｔ  ｃｔｔａｇｔｃｃｔｃ  ａｇａｃａｔｇｇｇｃ  ｃｔｔｔｇｔｇｔｔｔ  ｔａｇａａｔａｔｔｔ  ｇａａｔｔｔｇａｇｔ
７１４１  ｔａｔｔｇｇｇｃｃｃ  ｃａｃｔｃｃｃｔｇｔ  ｔｔｔｔｔａｔｔａａ  ａｇａａｃｇｔｇａｇ  ｃｃｔｇｇｇａｔａｃ  ｔｔｔｃａｇａａｇｔ
７２０１  ａｔｃｔｇｔｔｃａａ  ｔｇａａａａａａａｇ  ｔｔｇｇｔｔｔｃｃｃ  ａｔｃａａａｔａｔｇ  ａａｔａａａａｔｔｃ  ｔｃｔａｔａｔａｔｔ
７２６１  ｔｃａｔｔｇｔａｔｔ  ｔｔｇｇｔｔａｔｃａ  ｇｃａｇｔｃａｔｃａ  ａｔａａｔｇｔｔｔｔ  ｔｃｃｃｔｃｃｃｃｔ  ｃｔｃｃｃａｃｃｔｃ
７３２１  ｔｔａｔｔｔｔｔａａ  ｔｔａｔｇｃｃａａａ  ｔａｔｃｃｔａａａｔ  ａａｔａｔａｃｔｔａ  ａｇｃｃｔｃｃａｔｔ  ｃｃｃｔｃａｔｃｃｃ
７３８１  ｔａｃｔａｇｇｇａａ  ｇｇｇｇｇｔｇａｇｔ  ｇｔａｔｇｔｇｔｇａ  ｇｔｇｔａｔｇｔｇｔ  ａｔｇｔａｔｇａｔｃ  ｃｃａｔｃｔｃａｃｃ
７４４１  ｃｃｃａｃｃｃｃｃａ  ｔｔｔｔｇｇｇａｇｔ  ｃｔｔｔｔａａａａｔ  ｇａａａａｃａａａｇ  ｔｔｔｇｇｔａｇｔｔ  ｔｔｇａｃｔａｔｔｔ
７５０１  ｃｔａａａａｇｃａｇ  ａｇｇａｇａａａａａ  ａａａａｃｔｔａｔｔ  ｔａａａｔａｔｃｃｔ  ｇｇａａｔｃｔｇｔａ  ｔｇｇａｇｇａａｇａ
７５６１  ａａａｇｇｔａｔｔｔ  ｇｔｔａａｔｔｔｔｔ  ｃａｇｔｔａｃｇｔｔ  ａｔｃｔａｔａａａｃ  ａｔｇａｔｇｇａａｇ  ｔａａａｇｇｔｔｔｇ
７６２１  ｇｃａｇａａｔｔｔｃ  ａｃｃｔｔｇａｃｔａ  ｔｔｔｇａａａａｔｔ  ａｃａｇａｃｃｃａａ  ｔｔａａｔｔｃｃａｔ  ｔｃａａａａｇｔｇｇ
７６８１  ｔｔｔｔｃｇｔｔｔｔ  ｇｔｔｔｔａａｔｔａ  ｔｔｇｔａｃａａｔｇ  ａｇａｇａｔａｔｔｇ  ｔｃｔａｔｔａａａｔ  ａｃａｔｔａｔｔｔｔ
７７４１  ｇａａｃａｇａｔｇａ  ｇａａａｔｃｔｇａｔ  ｔｃｔｇｔｔｃａｔｇ  ａｇｔｇｇｇａｇｇｃ  ａａａａｃｔｇｇｔｔ  ｔｇａｃｃｇｔｇａｔ
７８０１  ｃａｔｔｔｔｔｇｔｇ  ｇｔｔｔｔｇａａａａ  ｃａａａｔａｔａｃｔ  ｔｇａｃｃｃａｇｔｔ  ｔｃｃｔｔａｇｔｔｔ  ｔｔｔｃｔｔｃａａｃ
７８６１  ｔｇｔｃｃａｔａｇｇ  ａａｃｇａｔａａｇｔ  ａｔｔｔｇａａａｇｃ  ａａｃａｔｃａａａｔ  ｃｔａｔａｃｇｔｔｔ  ａａａｇｃａｇｇｇｃ
７９２１  ａｇｔｔａｇｃａｃａ  ａａｔｔｔｇｃａａｇ  ｔａｇａａｃｔｔｃｔ  ａｔｔａｇｃｔｔａｔ  ｇｃｃａｔａｇａｃａ  ｔｃａｃｃｃａａｃｃ
７９８１  ａｃｔｔｇｔａｔｇｔ  ｇｔｇｔｇｔｇｔａｔ  ａｔａｔａａｔａｔｇ  ｃａｔａｔａｔａｇｔ  ｔａｃｃｇｔｇｃｔａ  ａａａｔｇｇｔｔａｃ
８０４１  ｃａｇｃａｇｇｔｔｔ  ｔｇａｇａｇａｇａａ  ｔｇｃｔｇｃａｔｃａ  ｇａａａａｇｔｇｔｃ  ａｇｔｔｇｃｃａｃｃ  ｔｃａｔｔｃｔｃｃｃ
８１０１  ｔｇａｔｔｔａｇｇｔ  ｔｃｃｔｇａｃａｃｔ  ｇａｔｔｃｃｔｔｔｃ  ｔｃｔｃｔｃｇｔｔｔ  ｔｔｇａｃｃｃｃｃａ  ｔｔｇｇｇｔｇｔａｔ
８１６１  ｃｔｔｇｔｃｔａｔｇ  ｔａｃａｇａｔａｔｔ  ｔｔｇｔａａｔａｔａ  ｔｔａａａｔｔｔｔｔ  ｔｔｃｔｔｔｃａｇｔ  ｔｔａｔａａａａａｔ
８２２１  ｇｇａａａｇｔｇｇａ  ｇａｔｔｇｇａａａａ  ｔｔａａａｔａｔｔｔ  ｃｃｔｇｔｔａｃｔａ  ｔａｃｃａｃｔｔｔｔ  ｇｃｔｃｃａｔｔｇｃ
８２８１  ａｔｔ
【図１−１】
2019512554.tif 000048
【図１−２】
2019512554.tif 000049
【図２Ａ】
2019512554.tif 000050
【図２−２】
2019512554.tif 000051
【図３−１】
2019512554.tif 000052
【図３−２】
2019512554.tif 000053
【図４】
2019512554.tif 000054
【図５】
2019512554.tif 000055
【図６】
2019512554.tif 000056
【図７】
2019512554.tif 000057
【図８】
2019512554.tif 000058
【図９Ａ】
2019512554.tif 000059
【図９Ｂ−１】
2019512554.tif 000060
【図９Ｂ−２】
2019512554.tif 000061
【図１０】
2019512554.tif 000062
【図１１】
2019512554.tif 000063
【図１２−１】
2019512554.tif 000064
【図１２−２】
2019512554.tif 000065
【図１２−３】
2019512554.tif 000066
【図１２−４】
2019512554.tif 000067
【図１３】
2019512554.tif 000068
【図１４】
2019512554.tif 000069
【配列表】
2019512554000001.app
【国際調査報告】
2019512554.tif 000070
2019512554.tif 000071
2019512554.tif 000072
2019512554.tif 000073
2019512554.tif 000074
2019512554.tif 000075