(57)【要約】有毛細胞に分化する能力を娘細胞において維持しながら支持細胞の幹細胞/前駆細胞が増殖するように誘導することを含む、支持細胞の幹細胞/前駆細胞の自己複製を誘導するための組成物および方法；ならびに、GSK3α阻害剤およびその塩を、任意で、分化阻害剤、例えば、NotchアゴニストまたはHDAC阻害剤（例えば、バルプロ酸）と組み合わせて使用する、組成物および方法が提供される。2019507802.tif 000012
2019507802.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
蝸牛組織内の蝸牛細胞集団を増殖させる方法であって、該蝸牛組織を、GSK3α阻害剤またはその薬学的に許容される塩である幹細胞増殖因子と接触させる工程を含み、それによって該蝸牛組織において増殖した細胞集団が形成される、前記方法。
【請求項２】
前記GSK3α阻害剤が、幹細胞増殖アッセイにおいて幹細胞増殖アッセイ細胞集団内のLgr5+細胞の数を少なくとも約1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、5倍、10倍、または20倍増やすことができ、任意で表1より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記GSK3α阻害剤が、幹細胞分化アッセイにおいて、Lgr5+細胞を含む細胞集団から有毛細胞を形成させることができる、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記蝸牛組織が固有の形態を維持する、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記蝸牛組織が対象内にある、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記蝸牛組織を組成物と接触させる工程が、該組成物を前記対象に経鼓膜投与することによって成し遂げられる、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記蝸牛組織を組成物と接触させる工程が、前記対象の聴覚機能の改善をもたらす、請求項5記載の方法。
【請求項８】
組織細胞の発生を促進する方法であって、GSK3α阻害剤もしくはその薬学的に許容される塩を幹細胞集団に投与するか、またはGSK3α阻害剤もしくはその薬学的に許容される塩が幹細胞集団に投与されるようにする工程を含む、前記方法。
【請求項９】
前記組織細胞が蝸牛細胞である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記組織細胞が内耳有毛細胞である、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
特定の組織細胞の非存在または欠如に関連する疾患を有するかまたはその発症リスクのある対象を処置する方法であって、GSK3α阻害剤もしくはその薬学的に許容される塩を該対象に投与するか、またはGSK3α阻害剤もしくはその薬学的に許容される塩が該対象に投与されるようにする、前記方法。
【請求項１２】
前記組織細胞が蝸牛細胞である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記組織細胞が内耳有毛細胞である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
難聴を有するかまたはその発症リスクのある対象を処置する方法であって、GSK3α阻害剤またはその薬学的に許容される塩を該対象に投与する工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
前記化合物が、生体適合性マトリックスの中に分散している、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記生体適合性マトリックスが、生体適合性ゲルまたは生体適合性発泡体である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物が、前記対象の蝸牛組織に経鼓膜投与される、請求項11〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
分化阻害剤を投与する工程をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記分化阻害剤が、HDAC阻害剤およびNotchアゴニストまたはそれらの薬学的に許容される塩より選択される、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記HDAC阻害剤が、バルプロ酸またはその薬学的に許容される塩である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
前記GSK3α阻害剤が、少なくとも約0.5x、または0.6x、0.7x、0.8x、0.9x、1.0x、1.1x、1.2x、または1.3x、1.4x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、25x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、または100xのGSK3α/GSK3β選択比を有する、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記GSK3α阻害剤が、GSK3αとGSK3βの両方に対して効力を有し、該効力が、GSK3αとGSK3βの両方の阻害について約100nM未満であるか、またはGSK3αとGSK3βの両方の阻害について約50nM未満、20nM未満、10nM未満、5nM未満、2nM未満、もしくは約1nM未満である、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記GSK3α阻害剤が、少なくとも約10xもしくは15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x、60x、60x、80x、90x、または少なくとも約100xのGSK3α/CDK選択比を有する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
前記GSK3α阻害剤が、少なくとも約10xもしくは15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x、60x、60x、80x、90x、または少なくとも約100xのGSK3α/MAPK選択比を有する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記GSK3α阻害剤が、少なくとも約10xもしくは15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x、60x、60x、80x、90x、または少なくとも約100xのGSK3α/ERK選択比を有する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
前記GSK3α阻害剤が、少なくとも約10xもしくは15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x、60x、60x、80x、90x、または少なくとも約100xのGSK3α/MEK選択比を有する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記GSK3α阻害剤が、約1nM〜約1000nM; 約100nM〜約1000nM; 約10nM〜約100nM; または約1nM〜約10nMにわたる、GSK3αに対する効力を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記GSK3α阻害剤が、GSK3阻害剤XXIIもしくはAZD1080またはそれらの薬学的に許容される塩である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
薬学的に許容される担体と、GSK3α阻害剤またはその薬学的に許容される塩である幹細胞増殖因子とを含み、中耳および/または内耳への投与に適している、薬学的組成物。
【請求項３０】
前記GSK3α阻害剤が、生体適合性マトリックスの中に分散している、請求項29記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記生体適合性マトリックスが、生体適合性ゲルまたは生体適合性発泡体である、請求項30記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
正円窓膜への局所投与に適している、請求項29〜31のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
経鼓膜投与、任意で、蝸牛組織への経鼓膜投与に適している、請求項29〜31のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
前記GSK3α阻害剤が、GSK3阻害剤XXIIもしくはAZD1080またはそれらの薬学的に許容される塩である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
分化阻害剤をさらに含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
前記分化阻害剤が、HDAC阻害剤およびNotchアゴニストまたはそれらの薬学的に許容される塩より選択される、請求項35記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
前記HDAC阻害剤が、バルプロ酸またはその薬学的に許容される塩である、請求項36記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
前記GSK3α阻害剤が、少なくとも約0.5x、または0.6x、0.7x、0.8x、0.9x、1.0x、1.1x、1.2x、または1.3x、1.4x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、25x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、または100xのGSK3α/GSK3β選択比を有する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
前記GSK3α阻害剤が、GSK3αとGSK3βの両方に対する効力を有し、該効力が、GSK3αとGSK3βの両方の阻害について約100nM未満であるか、またはGSK3αとGSK3βの両方の阻害について約50nM未満、20nM未満、10nM未満、5nM未満、2nM未満、もしくは約1nM未満である、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
前記GSK3α阻害剤が、少なくとも約10xもしくは15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x、60x、60x、80x、90x、または少なくとも約100xのGSK3α/CDK選択比を有する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
前記GSK3α阻害剤が、少なくとも約10xもしくは15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x、60x、60x、80x、90x、または少なくとも約100xのGSK3α/MAPK選択比を有する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
前記GSK3α阻害剤が、少なくとも約10xもしくは15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x、60x、60x、80x、90x、または少なくとも約100xのGSK3α/ERK選択比を有する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
前記GSK3α阻害剤が、少なくとも約10xもしくは15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x、60x、60x、80x、90x、または少なくとも約100xのGSK3α/MEK選択比を有する、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
前記GSK3α阻害剤が、約1nM〜約1000nM; 約100nM〜約1000nM; 約10nM〜約100nM; または約1nM〜約10nMにわたる、GSK3αに対する効力を含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
ポロキサマーを含む、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
前記ポロキサマーが、ポロキサマー188およびポロキサマー407のうちの少なくとも1つまたはそれらの混合物を含む、請求項45記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
前記ポロキサマーの濃度が、前記組成物に対して約5wt％〜約25wt％である、請求項45または46記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
前記ポロキサマーの濃度が、前記組成物に対して約10wt％〜約23wt％である、請求項47記載の薬学的組成物。
【請求項４９】
前記ポロキサマーの濃度が、前記組成物に対して約15wt％〜約20wt％である、請求項48記載の薬学的組成物。
【請求項５０】
前記ポロキサマーの濃度が、前記組成物に対して約17wt％である、請求項49記載の薬学的組成物。
【請求項５１】
前記GSK3α阻害剤の濃度が、約0.01uM〜1000mM、約0.1uM〜1000mM、約1uM〜100mM、約10uM〜10mM、約1uM〜10uM、約10uM〜100uM、約100uM〜1000uM、約1mM〜10mM、もしくは約10mM〜100mMであるか；または前記GSK3α阻害剤の濃度比が、インビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.01〜1,000,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.1〜100,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1〜10,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜5000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約50〜2000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜1000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1000倍であるか；または前記GSK3α阻害剤の濃度が、約0.01nM〜1000uM、約0.1nM〜1000uM、約1nM〜100uM、約10nM〜10uM、約1nM〜10nM、約10nM〜100nM、約100nM〜1000nM、約1uM〜10uM、もしくは約10uM〜100uMであり、任意で、該有効活性がLgr5増殖アッセイにおいて測定される、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５２】
前記GSK3α阻害剤がGSK3阻害剤XXIIであり、GSK3阻害剤XXIIの濃度が、約0.1uM〜1000mM、約1uM〜100mM、10uM〜10mM、約100uM〜10mM、もしくは100uM〜1mM、もしくは約1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、もしくは10mMであるか；またはGSK3阻害剤XXIIの濃度比が、インビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.1〜1,000,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1〜100,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約10〜10,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜1000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1000倍であるか；またはGSK3阻害剤XXIIの濃度が、約0.1nM〜1000uM、約1nM〜100uM、約10nM〜10uM、約100nM〜1uM、もしくは約0.5uMであり、任意で、該インビトロ活性アッセイにおける活性がLgr5増殖アッセイにおいて測定される、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５３】
前記GSK3α阻害剤がAZD1080であり、AZD1080の濃度が、約0.1uM〜1000mM、約1uM〜1000mM、約10uM〜100mM、約100uM〜10mM、約1mM〜10mM、もしくは約1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、もしくは10mMであるか；またはAZD1080の濃度比が、インビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.1〜1,000,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1〜100,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約10〜10,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜1000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1000倍であるか；またはAZD1080の濃度が、約1nM〜1000uM、約10nM〜1000uM、約100nM〜100uM、約1uM〜10uM、もしくは約1uM、2uM、3uM、4uM、5uM、6uM、7uM、8uM、9uM、もしくは10uMであり、任意で、該有効活性がLgr5増殖アッセイにおいて測定される、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５４】
前記HDAC阻害剤の濃度が、約0.01uM〜100,000mM、約1uM〜10,000mM、約10uM〜10,000mM、約100uM〜1000mM、約1uM〜10uM、約10uM〜100uM、約100uM〜1000uM、約1000uM〜10mM、約10mM〜100mM、約100mM〜1000mM、もしくは約1000mM〜10,000mMであるか；または前記HDAC阻害剤の濃度比が、インビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.1〜1,000,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1〜100,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約10〜10,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜1000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1000倍であるか；または前記HDAC阻害剤の濃度が、約0.01nM〜100,000uM、約1nM〜10,000uM、約10nM〜10,000uM、約100nM〜1000uM、約1nM〜10nM、約10nM〜100nM、約100nM〜1000nM、約1uM〜10uM、約10uM〜100uM、約100uM〜1000uM、もしくは約1000uM〜10,000uMであり、任意で、該有効活性がLgr5増殖アッセイにおいて測定される、請求項36〜53のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５５】
前記HDAC阻害剤がバルプロ酸であり、バルプロ酸の濃度が、約10uM〜100,000mM、約1mM〜10,000mM、約10mM〜10,000mM、約100mM〜10,000mM、約200mM〜2000mM、約1000mM、もしくは約600mMであるか；またはバルプロ酸の濃度比が、インビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.1〜1,000,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1〜100,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約10〜10,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜1000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1000倍であるか；またはバルプロ酸の濃度が、約10nM〜100,000uM、1uM〜10,000uM、約10uM〜10,000uM、約100uM〜10,000uM、約200uM〜2000uM、もしくは約1000uMであり、任意で、該有効活性がLgr5増殖アッセイにおいて測定される、請求項36〜54のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５６】
前記GSK3α阻害剤が、幹細胞増殖アッセイにおいて幹細胞増殖アッセイ細胞集団内のLgr5+細胞の数を少なくとも約1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、5倍、10倍、または20倍増やすことができ、任意で表1より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５７】
前記GSK3α阻害剤が、幹細胞分化アッセイにおいて、Lgr5+細胞を含む細胞集団から有毛細胞を形成させることができる、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
蝸牛組織における蝸牛細胞集団の増殖において使用するための、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
難聴を有するかまたはその発症リスクのある対象の処置において使用するための、前記請求項のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、35U.S.C.119条(e)に基づいて、2016年3月2日に出願された米国特許出願第62/302,803号;および2016年3月3日に出願された米国特許出願62/303,099号に係る優先権を主張する。これらはそれぞれ、その全体が参照により組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本開示は、組織細胞に分化する能力を娘細胞において維持しながら支持細胞の幹細胞/前駆細胞が増殖するように誘導することを含む、支持細胞の幹細胞/前駆細胞の自己複製を誘導するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
幹細胞は体内において複数の細胞タイプを発生させる並外れた能力を示す。胚性幹細胞に加えて、組織特異的幹細胞が発生中に、ならびに成人ではホメオスタシスおよび損傷修復において重要な役割を果たす。幹細胞は増殖することで自己複製し、分化することで組織特異的細胞タイプを発生させる。様々な幹細胞の特徴は組織によって変わり、内因性の遺伝子状態およびエピジェネティック状態によって決定される。しかしながら、種々の幹細胞の自己複製と分化との間のバランスは全て厳密に制御されている。自己複製が制御されていなければ幹細胞が異常増殖し、おそらく腫瘍を形成する可能性がある。これに対して、分化が制御されていなければ幹細胞プールが枯渇し、その結果、組織ホメオスタシスを維持する能力が損なわれる可能性がある。従って、幹細胞はその環境を絶えず感知し、増殖、分化、またはアポトーシスによって適切に応答する。幹細胞の増殖と分化のタイミングと程度を制御することによって再生を推進することが望ましいだろう。だんだんと取り除かれる低分子を用いて増殖を制御することで、幹細胞の増殖と分化のタイミングと程度を制御することが可能になるだろう。注目すべきことに、異なる組織に由来する組織幹細胞は、かなり状況依存的であるが、自己複製および分化を調節するために限られた数のシグナル伝達経路を共有する。これらの経路の一部がWnt経路およびGSK3β経路である。
【０００４】
Lgr5は多様な組織にわたって発現しており、消化管上皮(Barker et al. 2007)、腎臓、毛包、および胃(Barker et al, 2010; Haegebarth & Clevers, 2009)などの様々な組織における成人幹細胞バイオマーカーとして特定されている。例えば、哺乳動物内耳有毛細胞がLgr5+細胞に由来することが2011年に初めて発表された(Chai et al, 2011, Shi et al. 2012)。Lgr5はWnt/β-カテニン経路の既知の成分であり、Wnt/β-カテニン経路は分化、増殖、および幹細胞特徴の誘導において主要な役割を果たすことが示されている(Barker et al. 2007)。
【０００５】
内耳の有毛細胞が恒久的に傷つけられると感音難聴が起こり、その結果、集団の大部分において意思疎通問題が起こる。有毛細胞は、音の刺激を変換する受容器細胞である。傷つけられた有毛細胞の再生は、現在は補装具以外の療法が無い状態の処置へ向かう道となるだろう。有毛細胞は哺乳動物の蝸牛では再生しないが、下等脊椎動物では、有毛細胞を取り囲んでいる支持細胞と呼ばれる上皮細胞から新しい有毛細胞が発生する。
【０００６】
以前の研究は、有毛細胞の形成につながる遺伝子の活性化または強制発現によって支持細胞から有毛細胞へ分化転換することに焦点を合わせており、特に、Atoh1発現を強化する機構に焦点を合わせている(Bermingham et al., 1999; Zheng and Gao, 2000; Izumikawa et al., 2005; Mizutari et al., 2013)。興味深いことに、Atoh1ベクターが形質導入された細胞は前庭表現型を獲得し(Kawamoto et al., 2003; Huang et al., 2009; Yang et al.,2012, 2013)、完全な発生を欠くことが示されている。述べられたように、遺伝子挿入によるAtoh1のアップレギュレーションは、本来の蝸牛においては見出されない形でふるまう非蝸牛細胞タイプを作り出すことが示されている。さらに、これらの方法は有毛細胞の数を増やすが、支持細胞の数を減らす。支持細胞は、専門化した役割を有することが知られているので(Ramirez-Camancho 2006, Dale and Jagger 2010)、これらの細胞が失われると、適切な蝸牛機能において問題が生じるかもしれない。
【０００７】
従って、長い間感じられてきた、損傷前に聴覚細胞を保護する必要性、損傷後に既存の細胞の機能を保存する/向上させる必要性、損傷後にニューロンおよび有毛細胞を含む構造を再生する必要性、ならびに損傷後に蝸牛支持細胞または有毛細胞を再生する必要性が依然としてある。以下に開示されるように、特定の態様では、本開示は、聴覚機能不全を予防および処置するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図1A〜1Bは、複数の条件でのLgr5-GFP内耳支持細胞の増殖を示す。図1Aは、増殖因子(GF)=[EGF、bFGF、IGF-1]、VPA(V)を、GSK3βを優先的に阻害する分子であるCHIR99021(C)、またはGSK3αを優先的に阻害する分子であるAZD1080と組み合わせて含有する培地中で10日間培養したLgr5-GFP内耳前駆細胞の明視野画像およびGFP蛍光画像を示す。図1Bは、GF=[EGF、bFGF、IGF-1]、VPA(V)を、GSK3βを優先的に阻害する分子であるCHIR99021(C)、またはGSK3αを優先的に阻害する分子であるAZD1080と組み合わせて含有する培地中で10日間培養したLgr5-GFP内耳前駆細胞の定量を示す。
【図２】図2A〜2Bは、複数の条件でのLgr5-GFP内耳支持細胞の増殖を示す。図2Bは、GF=[EGF、bFGF、IGF-1]、VPA(V)を、GSK3βを優先的に阻害する分子であるCHIR99021(C)、またはGSK3αとGSK3βを等しく阻害する分子であるGSK3阻害剤XXIIと組み合わせて含有する培地中で10日間培養したLgr5-GFP内耳前駆細胞の明視野画像およびGFP蛍光画像を示す。図2Bは、GF=[EGF、bFGF、IGF-1]、VPA(V)を、GSK3βを優先的に阻害する分子であるCHIR99021(C)、またはCHIR99021よりも高いGSK3α阻害優先度を有する分子であるGSK3阻害剤XXIIと組み合わせて含有する培地中で10日間培養したLgr5-GFP内耳前駆細胞の定量を示す。
【図３】図3は、エクスビボで処置したコルチ器官内にある有毛細胞数の増加を示す。GSK3阻害剤XXIIで処置したコルチ器官はLgr5-GFP発現の増加と、2列の内有毛細胞と、6列の外有毛細胞を示した。これは、蝸牛において通常見られる正常な1列の内有毛細胞と3列の外有毛細胞よりも増えている。
【図４】図4は、騒音で傷つけられたCBA/CaJマウスにおける聴覚回復を示す。バルプロ酸とCHIR99021(CV)で処置した動物は、試験した全ての周波数(n=32)にわたって有意な回復を示した。CHIR99021はGSKαと比較してGSK3βを優先的に阻害する。VPA(V)とGSK3阻害剤XXII(CHIR99021よりも高いGSK3α阻害優先度を有する分子(n=6))で処置した動物。
【発明の概要】
【０００９】
概要
一局面では、本開示は、細胞集団を有効量のGSK3α阻害剤またはその薬学的に許容される塩と接触させる工程を含む、幹細胞を増殖させるための方法を提供する。一部の態様では、前記方法は、細胞集団を分化阻害剤（例えば、HDAC阻害剤またはNotchアゴニスト）と接触させる工程をさらに含む。特定の態様では、分化阻害剤はバルプロ酸である。
【００１０】
従って、本開示の様々な局面の中でも、細胞集団におけるWnt経路を活性化させて、集団の自己複製能（すなわち、同等の増殖能および「細胞運命特定」能をもつ娘細胞を繰り返し生じさせる能力）および分化能（すなわち、分化が特定された娘細胞を生じさせる能力）を高める方法が言及され得る。一態様では、細胞集団は蝸牛支持細胞集団である。好ましくは、Wnt経路は、前記集団のメンバーにおいてc-myc遺伝子の上流で、かつ前記集団が遺伝子組換えされることなく、活性化される。代わりに、Wnt経路は、好ましくは、このような活性を一過的に誘導する低分子によって活性化される。さらに、支持細胞集団には、好ましくはLGR5+でありかつコルチ器官に内在する支持細胞が含まれる。
【００１１】
本開示のさらなる局面は、蝸牛細胞集団に含まれる支持細胞の幹細胞/前駆細胞の自己複製を誘導するための方法である。すなわち、支持細胞の幹細胞/前駆細胞は、有毛細胞に分化する能力を娘細胞において維持しながら増殖する（すなわち、分裂して娘細胞を形成する）ように誘導される。対照的に、支持細胞の幹細胞/前駆細胞が（多分化能を維持することなく）増殖するようにしか誘導されないのであれば、娘細胞には有毛細胞に分裂する能力が無いであろう。さらに、既存の幹細胞/前駆細胞集団が分化するようにしか強制されなかったら、幹細胞プールが枯渇する可能性がある。
【００１２】
増殖は、好ましくは、このような活性を一過的に誘導する低分子によって活性化される。さらに、特定の態様では、支持細胞集団には、好ましくはLGR5+でありかつコルチ器官に内在する支持細胞が含まれる。
【００１３】
様々な態様において、Wnt経路はGSK3α阻害剤を用いて活性化される。一部の態様では、Wnt経路は複数種のGSK3α阻害剤を用いて活性化される。一部の態様では、本明細書中の方法に従って用いられるGSK3α阻害剤には、本明細書において開示されるGSK3α阻害剤のうちの1種または複数種が含まれる。一態様では、1種または複数種のGSK3α阻害剤は、表1にあるGSK3α阻害剤のうちの1種または複数種である。
【００１４】
従って、特定の態様では、本開示は、「人工多能性幹細胞」を作り出すように幹細胞特性を誘導することに関与する経路および機構（例えば、Wnt経路）を、例えば、支持細胞をGSK3α阻害剤と接触させることで活性化することによって、支持細胞集団の自己複製を誘導する方法を提供する。好ましくは、前記経路は、低分子（例えば、表1にあるGSK3α阻害剤のいずれか1種または複数種）を用いて活性化される。例えば、組成物がインビトロで支持細胞集団に適用されたときには、この集団が幹細胞増殖アッセイにおいて高度に、かつ高純度で増殖するように誘導し、また、この集団が幹細胞分化アッセイにおいて高純度の組織細胞集団に分化するのも可能にする。このような1つの態様では、前記組成物は、何世代にもわたって分裂し、結果として生じた細胞の大きな割合を組織細胞に分化させる能力を維持することができる幹細胞を生成するように増殖させることで幹細胞特性を誘導および維持する。さらに、増殖している幹細胞は、Lgr5、Sox2、Opeml、Phex、lin28、Lgr6、サイクリンD1、Msx1、Myb、Kit、Gdnf3、Zic3、Dppa3、Dppa4、Dppa5、Nanog、Esrrb、Rex1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3l、Utf1、Tcl1、Oct4、Klf4、Pax6、Six2、Zic1、Zic2、Otx2、Bmi1、CDX2、STAT3、Smad1、Smad2、smad2/3、smad4、smad5、およびsmad7のうちの1つまたは複数を含んでもよい幹細胞マーカーを発現する。
【００１５】
特定の態様では、本開示は、親細胞集団を含む蝸牛組織において蝸牛細胞集団を増殖させる方法であって、蝸牛組織を幹細胞増殖因子と接触させる工程を含み、それによって蝸牛組織において増殖した細胞集団が形成され、
幹細胞増殖因子は、(i)幹細胞増殖アッセイにおいて増殖アッセイ期間にわたって増殖アッセイ初期細胞集団から増殖アッセイ最終細胞集団を形成させることができ、(ii)幹細胞分化アッセイにおいて分化アッセイ期間にわたって分化アッセイ初期細胞集団から分化アッセイ最終細胞集団を形成させることができ、
(a)増殖アッセイ初期細胞集団には、(i)増殖アッセイ初期数の総細胞、(ii)増殖アッセイ初期数のLgr5+細胞、(iii)増殖アッセイ初期数の有毛細胞、(iv)Lgr5+細胞の増殖アッセイ初期数と総細胞の増殖アッセイ初期数の比に等しい増殖アッセイ初期Lgr5+細胞比、および(v)有毛細胞の増殖アッセイ初期数と総細胞の増殖アッセイ初期数の比に等しい増殖アッセイ初期有毛細胞比があり;
(b)増殖アッセイ最終細胞集団には、(i)増殖アッセイ最終数の総細胞、(ii)増殖アッセイ最終数のLgr5+細胞、(iii)増殖アッセイ最終数の有毛細胞、(iv)Lgr5+細胞の増殖アッセイ最終数と総細胞の増殖アッセイ最終数の比に等しい増殖アッセイ最終Lgr5+細胞比、および(v)有毛細胞の増殖アッセイ最終数と総細胞の増殖アッセイ最終数の比に等しい増殖アッセイ最終有毛細胞比があり;
(c)分化アッセイ初期細胞集団には、(i)分化アッセイ初期数の総細胞、(ii)分化アッセイ初期数のLgr5+細胞、(iii)分化アッセイ初期数の有毛細胞、(iv)Lgr5+細胞の分化アッセイ初期数と総細胞の分化アッセイ初期数の比に等しい分化アッセイ初期Lgr5+細胞比、および(v)有毛細胞の分化アッセイ初期数と総細胞の分化アッセイ初期数の比に等しい分化アッセイ初期有毛細胞比があり;
(d)分化アッセイ最終細胞集団には、(i)分化アッセイ最終数の総細胞、(ii)分化アッセイ最終数のLgr5+細胞、(iii)分化アッセイ最終数の有毛細胞、(iv)Lgr5+細胞の分化アッセイ最終数と総細胞の分化アッセイ最終数の比に等しい分化アッセイ最終Lgr5+細胞比、および(v)有毛細胞の分化アッセイ最終数と総細胞の分化アッセイ最終数の比に等しい分化アッセイ最終有毛細胞比があり;
(e)Lgr5+細胞の増殖アッセイ最終数はLgr5+細胞の増殖アッセイ初期数よりも少なくとも10倍多く;
(f)有毛細胞の分化アッセイ最終数はゼロでない数である、方法を提供する。
【００１６】
特定のこのような態様において、幹細胞増殖因子は幹細胞性推進剤(Stemness Driver)（例えば、GSK3α阻害剤）を含む。特定の態様では、幹細胞増殖因子は分化阻害剤を含む。特定の態様では、幹細胞増殖因子は幹細胞性推進剤と分化阻害剤を含む。特定の態様では、幹細胞増殖因子はGSK3α阻害剤（例えば、表1に示したGSK3α阻害剤）であり、前記方法は、蝸牛組織内の蝸牛細胞を分化阻害剤と接触させる工程をさらに含む。一部の態様では、分化阻害剤はHDAC阻害剤またはNotchアゴニストである。一部の態様では、分化阻害剤はバルプロ酸である。
【００１７】
特定の態様では、本開示は、蝸牛細胞集団内の支持細胞の細胞密度を増加させるための方法であって、支持細胞において幹細胞特性を誘導する経路および機構を活性化する工程、(新たに形成された娘細胞において支持細胞の多能性特徴を維持しながら)活性化された支持細胞を増殖させる工程、ならびに、その後に、増殖した集団が有毛細胞に分化して、増殖した蝸牛細胞集団を形成するのを可能にする工程(さらには増殖した集団が有毛細胞に分化して、増殖した蝸牛細胞集団を形成するように誘導する工程)を含み、増殖した蝸牛細胞集団内の有毛細胞の細胞密度が、最初の（増殖していない）蝸牛細胞集団における有毛細胞の細胞密度より多い、方法を提供する。一部の態様では、支持細胞集団はインビトロ支持細胞集団である。一部の態様では、支持細胞集団はインビボ支持細胞集団である。さらに、増殖段階は、好ましくは、蝸牛構造の天然構造を実質的に維持するように制御される。このような態様において、増殖は、c-mycの誘導によるものではなく、また集団が遺伝子組換されることなく、このような活性を一過的に誘導する1種または複数種のGSK3α阻害剤（例えば、表1に示したGSK-α阻害剤のうちの1種または複数種）によって誘導される。一部の態様では、このような方法は細胞を分化阻害剤と接触させる工程をさらに含む。一部の態様では、分化阻害剤はHDAC阻害剤またはNotchアゴニストである。一部の態様では、分化阻害剤はバルプロ酸である。さらに、特定の態様では、支持細胞集団には、好ましくは、LGR5+であり、かつコルチ器官に内在する支持細胞が含まれる。
【００１８】
特定の態様では、本開示は、蝸牛細胞集団内のLgr5+支持細胞の細胞密度を増加させるための方法であって、Lgr5+支持細胞において幹細胞特性を誘導または維持する経路および機構を活性化する工程、(このような幹細胞特性を維持しながら)活性化されたLgr5+支持細胞を増殖させる工程、ならびに、その後に、増殖した集団が有毛細胞に分化して、増殖した蝸牛細胞集団を形成するのを可能にする(さらには、増殖した集団が有毛細胞に分化して、増殖した蝸牛細胞集団を形成するように誘導する)工程を含み、増殖した蝸牛細胞集団内の有毛細胞の細胞密度は、最初の（増殖していない）蝸牛細胞集団内の有毛細胞の細胞密度より大きい、方法を提供する。一部の態様では、Lgr5+支持細胞集団はインビトロLgr5+幹細胞集団である。一部の態様では、Lgr5+支持細胞集団はインビボ支持細胞集団である。さらに、特定の態様では、増殖段階は、好ましくは、蝸牛構造の天然構造を実質的に維持するように制御される。このような態様において、増殖は1種または複数種のGSK3α阻害剤（例えば、表1に示したGSK-α阻害剤のうちの1種または複数種）によって誘導される。一部の態様では、GSK3α阻害剤は、c-mycの誘導によるものではなく、また集団が遺伝子組換されることなく、このような活性を一過的に誘導する。一部の態様では、このような方法は細胞を分化阻害剤と接触させる工程をさらに含む。一部の態様では、分化阻害剤はHDAC阻害剤またはNotchアゴニストである。一部の態様では、分化阻害剤はバルプロ酸である。
【００１９】
特定の態様では、幹細胞の増殖を誘導し、幹細胞集団の望ましい増殖が成し遂げられるまで幹細胞の分化を阻害するために、幹細胞性推進剤（例えば、GSK-α阻害剤）および分化阻害剤（例えば、NotchアゴニストまたはHDAC阻害剤、例えば、バルプロ酸）を含有する組成物が蝸牛細胞集団に投与される。その後に、増殖した集団は有毛細胞に分化するようになされる(か、さらには、任意で、有毛細胞に分化するように誘導される)。さらに、増殖段階は、好ましくは、蝸牛構造の天然構造を実質的に維持するように制御される。一部の態様では、幹細胞性推進剤および分化阻害剤は低分子である。一部の態様では、幹細胞集団はインビボ幹細胞集団である。一部の態様では、幹細胞集団はインビトロ幹細胞集団である。一部の態様では、幹細胞集団はインビボLgr5+幹細胞集団である。一部の態様では、幹細胞集団はインビトロLgr5+幹細胞集団である。一部の態様では、幹細胞性推進剤はGSK-α阻害剤である。一部の態様では、分化阻害剤はHDAC阻害剤またはNotchアゴニストである。一部の態様では、分化阻害剤はバルプロ酸である。
【００２０】
特定の態様では、本開示は、蝸牛細胞の初期集団において有毛細胞の細胞密度を増加させるための方法であって、初期集団(インビボ集団でもインビトロ集団でもよい)が、有毛細胞、Lgr-支持細胞、およびLgr5+支持細胞を含む、方法を提供する。前記方法は、初期集団に幹細胞性推進剤および分化阻害剤を投与する工程を含む。一部の態様では、幹細胞性推進剤はGSK-α阻害剤である。一部の態様では、分化阻害剤はHDAC阻害剤またはNotchアゴニストである。一部の態様では、分化阻害剤はバルプロ酸である。
【００２１】
特定の態様では、前記方法は、幹細胞増殖アッセイにおいて、幹細胞マーカーLgr5+を発現する幹細胞を生成する。特定の態様では、幹細胞増殖アッセイにおいてLgr5+幹細胞と非Lgr5+幹細胞の混合集団が配置されれば、前記方法は、この集団においてLgr5+細胞の比を増加させる。
【００２２】
支持細胞集団が蝸牛構造の天然構造を破壊する程度まで増殖すると蝸牛機能が阻害される可能性がある。低分子シグナルを用いて既存の支持細胞の増殖を推進することで、特定の細胞タイプを標的化することができず、細胞の遺伝情報を恒久的に変えることができない遺伝子送達を用いるよりももっと制御された有毛細胞再生が可能になるかもしれない。有毛細胞が何列も並んでおり、その間に支持細胞がある、ほぼ正常な蝸牛構造が望ましく、有毛細胞は他の有毛細胞と接触していない。さらに、蝸牛において、この器官の解剖学的構造を破壊する大きな細胞凝集を作り出すように増殖を推進する遺伝子組換えの使用を回避することが望ましいだろう。
【００２３】
特定の態様では、本開示は、蝸牛支持細胞の選択的増殖を推進するのに用いられ得る幹細胞性推進剤を含む組成物を提供する。場合によっては、分化阻害剤が有効分化阻害濃度で存在しなければ、幹細胞性推進剤は支持細胞から有毛細胞への分化も誘導する可能性がある。増殖と分化を両方とも推進する可能性のある幹細胞性推進剤の例にはGSK3α阻害剤が含まれる。これらの態様のうちのいくつかでは、前記組成物は幹細胞性推進剤と分化阻害剤を含み、幹細胞性推進剤と分化阻害剤は異なる薬剤である。このような1つの態様では、幹細胞性推進剤はGSK3α阻害剤（例えば、本明細書において開示されるGSK3α阻害剤の1つ）であり、分化阻害剤はバルプロ酸である。
【００２４】
特定の態様では、本開示は、有毛細胞および支持細胞を含む蝸牛細胞の初期集団において有毛細胞の細胞密度を増加させるための方法を提供する。前記方法は、初期集団内の支持細胞の数を選択的に増殖して中間蝸牛細胞集団を形成させる工程を含み、中間蝸牛細胞集団内の支持細胞の数と有毛細胞の数の比は、初期蝸牛細胞集団内の支持細胞の数と有毛細胞の数の比より大きい。前記方法は、中間蝸牛細胞集団において有毛細胞を発生させて、増殖した蝸牛細胞集団を形成させる工程をさらに含み、増殖した蝸牛細胞集団内の有毛細胞の数と支持細胞の数の比は、中間蝸牛細胞集団内の有毛細胞の数と支持細胞の数の比より大きい。
【００２５】
特定の態様では、本開示は、蝸牛細胞初期集団においてLgr5+支持細胞の数を増加させるか、または蝸牛細胞初期集団においてLgr5+活性を増加させるための方法であって、初期集団が支持細胞および有毛細胞を含む、方法を提供する。例えば、このような1つの方法では、初期集団と比べてLgr5+支持細胞の数が増殖している中間集団が形成される。または、このような1つの方法では、初期集団と比べて支持細胞のLgr5+活性が増加している中間集団が形成される。または、通常、Lgr5+が無いか、Lgr5+レベルが非常に低い細胞タイプにおいてLgr5+発現を活性化することによって、初期細胞集団と比べてLgr5+細胞の数が増加している方法。さらなる例として、初期蝸牛細胞集団と比べてLgr5+支持細胞の数が増殖しており、Lgr5活性が増加している中間集団が形成される。その後に、増殖した蝸牛細胞集団を形成するように、中間蝸牛細胞集団内の有毛細胞が発生してもよい。この場合、増殖した蝸牛細胞集団内の有毛細胞と支持細胞の比は、中間蝸牛細胞集団内の有毛細胞の数と支持細胞の数の比より大きい。
【００２６】
一部の態様では、本開示の方法は、有効幹細胞性推進剤濃度と有効分化阻害濃度の分化阻害剤がある第1の増殖期間と、それに続く、有効幹細胞性推進剤濃度があるが、有効分化阻害濃度の分化阻害剤がない分化期間を含む。このような一部の態様では、幹細胞性推進剤および分化阻害剤を様々な速度で放出する製剤に入れられて、幹細胞性推進剤および分化阻害剤が蝸牛細胞に供給される。このような一部の態様では、幹細胞性推進剤はGSK3α阻害剤（例えば、表1に開示されるGSK3α阻害剤のうちの1種または複数種）である。このような一部の態様では、幹細胞性推進剤はGSK3α阻害剤（例えば、表1に開示されるGSK3α阻害剤のうちの1種または複数種）であり、分化阻害剤はHDAC阻害剤またはNotchアゴニストである。このような一部の態様では、幹細胞性推進剤はGSK3α阻害剤（例えば、表1に開示されるGSK3α阻害剤のうちの1種または複数種）であり、分化阻害剤はバルプロ酸である。
【００２７】
特定の態様では、本開示は、有毛細胞を発生させる方法および有毛細胞を発生させるための組成物を提供し、前記方法は、（例えば、インビトロ、エクスビボ、もしくはインビボ試料/対象の）幹細胞集団に、(i)GSK3α阻害剤（またはその誘導体もしくは薬学的に許容される塩）および(ii)バルプロ酸（またはその誘導体もしくは類似体もしくは薬学的に許容される塩）の両方を含む組成物を投与するか、あるいは当該幹細胞集団に当該組成物が投与されるようにする工程であって、それによって、幹細胞集団内の幹細胞が増殖し、その結果、増殖した幹細胞の集団が得られる、工程；ならびに増殖した幹細胞の集団をGSK3α阻害剤（またはその誘導体もしくは薬学的に許容される塩）、任意で、分化阻害剤（例えば、NotchアゴニストまたはHDAC阻害剤、例えば、バルプロ酸）に曝露する工程であって、それによって、増殖した幹細胞の集団から内耳有毛細胞の発生が促進される、工程を含む。
【００２８】
特定の態様では、本開示は、聴覚機能不全を予防および処置するための方法を提供する。例えば、特定の態様では、本開示は、対象において聴覚障害を予防および処置するための方法であって、有効量のGSK3α阻害剤（例えば、表1に開示されるGSK3α阻害剤のうちのいずれか1種または複数種）を前記対象に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００２９】
特定の態様では、本開示はまた、本明細書に記載の細胞のエクスビボ使用にも関する。例えば、本明細書に記載のアプローチは発見目的で使用することができる。例えば、本開示の特定の態様は、有毛細胞前駆細胞を増殖する、および/または有毛細胞の数を増加させる薬剤を特定するのに有用であり、また、支持細胞および/または有毛細胞を保護する（例えば、支持細胞および/または有毛細胞の生存を支持する）薬剤を特定するのにも有用であり、支持細胞または有毛細胞を含む分化した子孫に対して毒性があるか、または毒性がない薬剤を特定するのにも有用である。
【００３０】
特定の態様では、本開示は、対象における聴覚系の細胞の喪失もしくは死亡を阻害するための方法であって、本明細書に記載の有効量の組成物（例えば、GSK3α阻害剤、任意で、分化阻害剤（例えば、NotchアゴニストもしくはHDAC阻害剤、例えば、バルプロ酸）またはその誘導体またはその薬学的に許容される塩と、許容される担体または賦形剤を含む）を前記対象に投与し、それによって、対象における聴覚系の細胞の喪失もしくは死亡を阻害する工程か、または有毛細胞および/もしくはニューロンを含む構造を再生する工程を含む、方法を提供する。
【００３１】
特定の態様では、本開示は、対象における聴覚系の細胞の増殖を維持または促進するための方法であって、内因性の修復を増強または開始するのに有効な量で、本明細書に記載の薬剤(GSK3α阻害剤、任意で、分化阻害剤（例えば、NotchアゴニストもしくはHDAC阻害剤、例えば、バルプロ酸を含む）またはその誘導体もしくはその薬学的に許容される塩）を含む組成物を前記対象に投与し、それによって、対象における聴覚系の細胞の増殖を維持または促進する工程を含む、方法を提供する。
【００３２】
支持細胞と多数のLgr5+細胞を含む親細胞集団を含む蝸牛組織において蝸牛細胞集団を増殖させる方法であって、蝸牛組織を幹細胞増殖因子と接触させる工程を含み、それによって、蝸牛組織において増殖した細胞集団が形成され、幹細胞増殖因子が、(i)幹細胞増殖アッセイにおいて、幹細胞増殖アッセイ細胞集団内のLgr5+細胞の数を少なくとも10倍増やすことができ、(ii)幹細胞分化アッセイにおいて、Lgr5+細胞を含む細胞集団から有毛細胞を形成させることができる、方法も本明細書において説明される。
【００３３】
支持細胞を含む親細胞集団を含む蝸牛組織において蝸牛細胞集団を増殖させる方法であって、蝸牛組織を幹細胞増殖因子と接触させる工程を含み、それによって、蝸牛組織において増殖した細胞集団が形成される、方法も本明細書において説明される。幹細胞増殖因子は、(i)幹細胞増殖アッセイにおいて増殖アッセイ期間にわたって増殖アッセイ初期細胞集団から増殖アッセイ最終細胞集団を形成させることができ、(ii)幹細胞分化アッセイにおいて分化アッセイ期間にわたって分化アッセイ初期細胞集団から分化アッセイ最終細胞集団を形成させることができ、(a)増殖アッセイ初期細胞集団には、(i)増殖アッセイ初期数の総細胞、(ii)増殖アッセイ初期数のLgr5+細胞、(iii)増殖アッセイ初期数の有毛細胞、(iv)Lgr5+細胞の増殖アッセイ初期数と総細胞の増殖アッセイ初期数の比に等しい増殖アッセイ初期Lgr5+細胞比、および(v)有毛細胞の増殖アッセイ初期数と総細胞の増殖アッセイ初期数の比に等しい増殖アッセイ初期有毛細胞比があり;(b)増殖アッセイ最終細胞集団には、(i)増殖アッセイ最終数の総細胞、(ii)増殖アッセイ最終数のLgr5+細胞、(iii)増殖アッセイ最終数の有毛細胞、(iv)Lgr5+細胞の増殖アッセイ最終数と総細胞の増殖アッセイ最終数の比に等しい増殖アッセイ最終Lgr5+細胞比、および(v)有毛細胞の増殖アッセイ最終数と総細胞の増殖アッセイ最終数の比に等しい増殖アッセイ最終有毛細胞比があり;(c)分化アッセイ初期細胞集団には、(i)分化アッセイ初期数の総細胞、(ii)分化アッセイ初期数のLgr5+細胞、(iii)分化アッセイ初期数の有毛細胞、(iv)Lgr5+細胞の分化アッセイ初期数と総細胞の分化アッセイ初期数の比に等しい分化アッセイ初期Lgr5+細胞比、および(v)有毛細胞の分化アッセイ初期数と総細胞の分化アッセイ初期数の比に等しい分化アッセイ初期有毛細胞比があり;(d)分化アッセイ最終細胞集団には、(i)分化アッセイ最終数の総細胞、(ii)分化アッセイ最終数のLgr5+細胞、(iii)分化アッセイ最終数の有毛細胞、(iv)Lgr5+細胞の分化アッセイ最終数と総細胞の分化アッセイ最終数の比に等しい分化アッセイ最終Lgr5+細胞比、および(v)有毛細胞の分化アッセイ最終数と総細胞の分化アッセイ最終数の比に等しい分化アッセイ最終有毛細胞比があり;(e)Lgr5+細胞の増殖アッセイ最終数はLgr5+細胞の増殖アッセイ初期数よりも少なくとも10倍多く;(f)有毛細胞の分化アッセイ最終数はゼロでない数である。
【００３４】
Lgr5+細胞の増殖アッセイ最終数は、Lgr5+細胞の増殖アッセイ初期数より少なくとも50倍、または少なくとも100倍多くてもよい。蝸牛組織内の増殖した細胞集団は、親集団よりも多い数の有毛細胞を含んでもよい。増殖アッセイ最終Lgr5+細胞比は分化アッセイ初期Lgr5+細胞比より少なくとも2倍多くてもよい。分化アッセイ最終有毛細胞比は増殖アッセイ初期有毛細胞比より少なくとも2倍多くてもよい。増殖アッセイ最終有毛細胞比は増殖アッセイ初期有毛細胞比より少なくとも25％少なくてもよい。増殖アッセイ最終Lgr5+細胞比は増殖アッセイ初期Lgr5+細胞比より少なくとも10％多くてもよい。蝸牛組織の1つまたは複数の形態学的特徴を維持することができる。固有の形態を維持することができる。幹細胞増殖因子を生体適合性マトリックスの中に分散させることができ、生体適合性マトリックスは生体適合性ゲルでもよく生体適合性発泡体でもよい。蝸牛組織はインビボ蝸牛組織でもエクスビボ蝸牛組織でもよい。前記方法は、s期にあるLgr5+細胞の集団を生成することができる。少なくとも1種類の幹細胞増殖因子は幹細胞性推進剤と分化阻害剤の両方を含んでもよい。例えば、一部の態様では、幹細胞増殖因子は、GSK3α阻害剤である幹細胞性推進剤と、分化阻害剤を含む。一部の態様では、幹細胞増殖因子は、GSK3α阻害剤である幹細胞性推進剤と、HDAC阻害剤またはNotchアゴニストである分化阻害剤を含む。一部の態様では、幹細胞増殖因子は、GSK3α阻害剤である幹細胞性推進剤と、バルプロ酸である分化阻害剤を含む。初期段階では、少なくとも、有効増殖濃度の幹細胞性推進剤と、少なくとも、有効分化阻害濃度の分化阻害剤を蝸牛組織と接触させることができ、その後の段階では、少なくとも、有効増殖濃度の幹細胞性推進剤と、有効分化阻害濃度未満の分化阻害剤を接触させることができる。蝸牛組織は対象の中にあってもよく、蝸牛組織と前記組成物との接触は、組成物を対象に経鼓膜投与することによって成し遂げることができる。蝸牛組織を前記組成物と接触させることで、対象の聴覚機能を改善することができる。
【００３５】
難聴を有するかまたはその発症リスクのある対象を処置する方法も本明細書において説明される。前記方法は、GSK3α阻害剤を対象の蝸牛組織に経鼓膜投与する工程を含んでもよい。一部のこのような態様において、前記方法は、分化阻害剤を組織に投与する工程をさらに含む。このような1つの態様では、分化阻害剤はHDAC阻害剤またはNotchアゴニストである。このような1つの態様では、分化阻害剤はバルプロ酸である。
【００３６】
特定の態様は、薬学的に許容される担体と、GSK3α阻害剤またはその薬学的に許容される塩である幹細胞増殖因子を含む薬学的組成物に関する。一部の態様では、前記組成物は内耳および/または中耳への投与に適している。場合によっては、前記組成物は正円窓膜への局所投与に適している。一部の態様では、前記組成物は、鼓室内投与または経鼓膜投与、例えば、蝸牛組織への鼓室内投与または経鼓膜投与に適している。
【００３７】
一部の態様では、GSK3α阻害剤は生体適合性マトリックスの中に分散している。特定の態様では、生体適合性マトリックスは生体適合性ゲルまたは生体適合性発泡体である。
【００３８】
一部の組成物は分化阻害剤をさらに含む。特定の態様において、分化阻害剤は、HDAC阻害剤およびNotchアゴニスト、またはその薬学的に許容される塩より選択される。一部の態様では、HDAC阻害剤は、バルプロ酸、またはその誘導体もしくは類似体もしくは薬学的に許容される塩である。
【００３９】
一部の態様では、GSK3α阻害剤は、少なくとも約0.5x、または0.6x、0.7x、0.8x、0.9x、1.0x、1.1x、1.2x、または1.3x、1.4x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、25x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、または100xであるGSK3α/GSK3β選択比(selectivity ratio)を有する。一部の態様では、GSK3α阻害剤はGSK3αとGSK3βの両方に対して効力を有し、効力は、GSK3αとGSK3βの両方の阻害について約100nM未満であるか、あるいはGSK3αとGSK3βの両方の阻害について約50nM未満、約20nM未満、約10nM未満、約5nM未満、約2nM未満、または約1nM未満である。一部の態様では、GSK3α阻害剤は、少なくとも約10xもしくは15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x、60x、60x、80x、90x、または少なくとも約100xのGSK3α/CDK選択比を有する。一部の態様では、GSK3α阻害剤は、少なくとも約10xもしくは15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x、60x、60x、80x、90x、または少なくとも約100xであるGSK3α/MAPK選択比を有する。一部の態様では、GSK3α阻害剤は、少なくとも約10xもしくは15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x、60x、60x、80x、90x、または少なくとも約100xであるGSK3α/ERK選択比を有する。一部の態様では、GSK3α阻害剤は、少なくとも約10xもしくは15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x、50x、60x、60x、80x、90x、または少なくとも約100xであるGSK3α/MEK選択比を有する。一部の態様では、GSK3α阻害剤は、約1nM〜約1000nM; 約100nM〜約1000nM; 約10nM〜約100nM; または約1nM〜約10nMにわたる、GSK3αに対する効力を含む。
【００４０】
一部の態様では、薬学的組成物はポロキサマーを含む。特定の態様において、ポロキサマーは、ポロキサマー188およびポロキサマー407のうちの少なくとも1つまたはそれらの混合物を含む。一部の態様では、ポロキサマーの濃度は前記組成物に対して約5wt％〜約25wt％である。特定の態様において、ポロキサマーの濃度は前記組成物に対して約10wt％〜約23wt％である。一部の態様では、ポロキサマーの濃度は前記組成物に対して約15wt％〜約20wt％である。特定の態様において、ポロキサマーの濃度は前記組成物に対して約17wt％である。
【００４１】
一部の組成物において、GSK3α阻害剤の濃度が、約0.01uM〜1000mM、約0.1uM〜1000mM、約1uM〜100mM、約10uM〜10mM、約1uM〜10uM、約10uM〜100uM、約100uM〜1000uM、約1mM〜10mM、もしくは約10mM〜100mMであるか；またはGSK3α阻害剤の濃度比が、インビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.01〜1,000,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.1〜100,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1〜10,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜5000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約50〜2000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜1000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1000倍であるか；またはGSK3α阻害剤の濃度が、約0.01nM〜1000uM、約0.1nM〜1000uM、約1nM〜100uM、約10nM〜10uM、約1nM〜10nM、約10nM〜100nM、約100nM〜1000nM、約1uM〜10uM、もしくは約10uM〜100uMである。
【００４２】
一部の態様では、GSK3α阻害剤はGSK3阻害剤XXIIであり、GSK3阻害剤XXIIの濃度が、約0.1uM〜1000mM、約1uM〜100mM、10uM〜10mM、約100uM〜10mM、もしくは100uM〜1mM、または約1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、もしくは10mMであるか；あるいはGSK3阻害剤XXIIの濃度比が、インビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.1〜1,000,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1〜100,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約10〜10,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜1000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1000倍であるか；あるいはGSK3阻害剤XXIIの濃度が、約0.1nM〜1000uM、約1nM〜100uM、約10nM〜10uM、約100nM〜1uM、もしくは約0.5uMである。
【００４３】
特定の態様では、GSK3α阻害剤はAZD1080であり、AZD1080の濃度が、約0.1uM〜1000mM、約1uM〜1000mM、約10uM〜100mM、約100uM〜10mM、約1mM〜10mM、または約1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、もしくは10mMであるか；あるいはAZD1080の濃度比が、インビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.1〜1,000,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1〜100,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約10〜10,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜1000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1000倍であるか；あるいはAZD1080の濃度が、約1nM〜1000uM、約10nM〜1000uM、約100nM〜100uM、約1uM〜10uM、または約1uM、2uM、3uM、4uM、5uM、6uM、7uM、8uM、9uM、もしくは10uMである。
【００４４】
一部の態様では、HDAC阻害剤の濃度が、約0.01uM〜100,000mM、約1uM〜10,000mM、約10uM〜10,000mM、約100uM〜1000mM、約1uM〜10uM、約10uM〜100uM、約100uM〜1000uM、約1000uM〜10mM、約10mM〜100mM、約100mM〜1000mM、もしくは約1000mM〜10,000mMであるか；またはHDAC阻害剤の濃度比が、インビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.1〜1,000,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1〜100,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約10〜10,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜1000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1000倍であるか；またはHDAC阻害剤の濃度が、約0.01nM〜100,000uM、約1nM〜10,000uM、約10nM〜10,000uM、約100nM〜1000uM、約1nM〜10nM、約10nM〜100nM、約100nM〜1000nM、約1uM〜10uM、約10uM〜100uM、約100uM〜1000uM、もしくは約1000uM〜10,000uMである。
【００４５】
特定の態様では、HDAC阻害剤はバルプロ酸であり、バルプロ酸の濃度が、約10uM〜100,000mM、約1mM〜10,000mM、約10mM〜10,000mM、約100mM〜10,000mM、約200mM〜2000mM、約1000mM、もしくは約600mMであるか；またはバルプロ酸の濃度比が、インビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.1〜1,000,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1〜100,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約10〜10,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜1000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1000倍であるか；またはバルプロ酸の濃度が、約10nM〜100,000uM、1uM〜10,000uM、約10uM〜10,000uM、約100uM〜10,000uM、約200uM〜2000uM、もしくは約1000uMである。
【００４６】
特定の態様では、有効活性は、本明細書に記載のようにLgr5増殖アッセイにおいて測定される。
【００４７】
特定の組成物では、GSK3α阻害剤は、幹細胞増殖アッセイにおいて幹細胞増殖アッセイ細胞集団内のLgr5+細胞の数を少なくとも約1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、5倍、10倍、または20倍増やすことができ、任意で表1より選択される。一部の組成物では、GSK3α阻害剤は、幹細胞分化アッセイにおいて、Lgr5+細胞を含む細胞集団から有毛細胞を形成させることができる。
【００４８】
薬学的組成物は、蝸牛組織内の蝸牛細胞集団を増殖させるための前記組成物の使用を含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれか1つまたは複数において使用することができる。薬学的組成物はまた、難聴を有するかまたはその発症リスクのある対象を処置するために使用することもできる。
【００４９】
Myo7a+蝸牛細胞を発生させるための方法も含まれる。前記方法は、Lgr5+蝸牛細胞をGSK3α阻害剤と接触させ、それによって、Lgr5+細胞の増殖した集団を発生させ、それによって、Myo7a+蝸牛細胞を発生させるための工程を含んでもよい。
【００５０】
他の目的および特徴は一部は明らかであり、一部は下記で指摘される。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
詳細な説明
定義
本願において、「または」の使用は、特に定めのない限り「および/または」を含む。本願において使用する「含む(comprise)」という用語およびこの用語の語尾変化、例えば、「含む(comprising)」および「含む(comprises)」は、他の添加物、成分、整数、または工程を除外することが意図されない。「からなる」とは、「からなる」という句に続くものは何であっても含み、「からなる」という句に続くものに限定されることを意味する。従って、「からなる」という句は、列挙された要素が必要とされるか、または必須のものであり、他の要素が存在しない場合があることを示す。「から本質的になる」とは、この句の後に列挙された、あらゆる要素を含み、列挙された要素について本開示において指定された活性もしくは作用を妨害しないか、または列挙された要素について本開示において指定された活性もしくは作用に寄与しない他の要素に限定されることを意味する。従って、「から本質的になる」という句は、列挙された要素が必要とされるか、または必須のものであるが、他の要素が任意のものであり、列挙された要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼすか、または及ぼさないかに応じて存在してもよく、存在しなくてもよいことを示す。
【００５２】
本願において使用する「約」という用語は同義の語句として用いられる。「約」を伴って、または伴わずに、本願において用いられる、あらゆる数字が、関連する分野の当業者によって理解される、あらゆる通常の変動をカバーすることが意図される。特定の態様では、「約」という用語は、特に定めのない限り、または文脈から明らかにされていない限り(このような数字が、あり得る値の100％を超える場合を除いて)、(指定された参照値より大きいか、または指定された参照値より小さい)いずれの方向にしても、指定された参照値の25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、またはそれより少ない％の範囲内にある、ある範囲の値を指す。
【００５３】
「投与」とは、物質を対象に導入することを指す。一部の態様では、投与は、例えば、注射による、耳介投与、耳介内投与、蝸牛内投与、前庭内投与、または経鼓膜投与である。一部の態様では、投与は内耳への直接投与であり、例えば、正円窓、耳嚢、または前庭階を通じた注射である。一部の態様では、投与は、蝸牛移植片送達系を介した内耳への直接投与である。一部の態様では、前記物質は中耳に経鼓膜注射される。特定の態様において、「投与されるようにする（投与させる、投与をもたらす）」は、第1の成分がすでに投与された後の（例えば、異なる時間での、かつ/または異なる行為者による）第2の成分の投与を指す。
【００５４】
「抗体」とは、免疫原結合能力を有する、免疫グロブリンポリペプチドまたはその断片を指す。
【００５５】
本明細書で使用する「アゴニスト」とは、標的遺伝子の発現もしくは活性、タンパク質の発現もしくは活性、または経路の発現もしくは活性を増加させる薬剤である。従って、アゴニストは、標的遺伝子またはタンパク質に対して、この生理学的作用を直接的または間接的に引き起こす何らかのやり方で、そのコグネイト受容体に結合し、これを活性化することができる。アゴニストはまた、経路成分の活性を調整することによって、例えば、経路の負の制御因子の活性を阻害することによって経路の活性を増やすこともできる。従って、「Wntアゴニスト」はWnt経路活性を増やす薬剤と定義することができ、Wnt経路活性の増加は、細胞におけるTCF/LEFを介した転写の増加によって測定することができる。従って、「Wntアゴニスト」は、任意のおよび全てのWntファミリータンパク質、細胞内β-カテニン分解阻害剤、およびTCF/LEFアクチベーターを含む、Frizzled受容体ファミリーに結合し、これを活性化する真のWntアゴニストでもよい。
【００５６】
「アンタゴニスト」とは、受容体に結合し、その結果、他の分子による結合を減少させるか、または無くす薬剤を指す。
【００５７】
「アンチセンス」とは、長さに関係なく、核酸配列のコード鎖またはmRNAに相補的な核酸配列を指す。アンチセンスRNAを1個1個の細胞、組織、またはオルガノイドに導入することができる。アンチセンス核酸は、改変されたバックボーン、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または当技術分野において公知の他の改変されたバックボーンを含んでもよく、非天然のヌクレオシド間結合を含んでもよい。
【００５８】
本明細書において言及される「相補的核酸配列」とは、相補的ヌクレオチド塩基対で構成される別の核酸配列とハイブリダイズすることができる核酸配列である。「ハイブリダイズする」とは、適切なストリンジェンシー条件下で、相補的ヌクレオチド塩基の間で二本鎖分子を形成するように対形成する（例えば、DNAではアデニン(A)がチミン(T)と塩基対を形成し、同様に、グアニン(G)がシトシン(C)と塩基対を形成する）ことを意味する（例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照されたい）。
【００５９】
「耳介投与」とは、鼓膜を通過して対象の内耳に組成物を投与するためにカテーテルまたはウィック(wick)装置を使用する方法を指す。ウィックまたはカテーテルの挿入を容易にするために、鼓膜には、適切な大きさの注射器またはピペットを用いて穴が開けられてもよい。前記装置はまた、当業者に公知の他の任意の方法、例えば、前記装置の外科的移植を用いて挿入することもできる。特定の態様において、ウィックまたはカテーテル装置は独立型装置でもよい。独立型装置は、前記装置が対象の耳に挿入され、次いで、前記組成物が内耳に制御可能に放出されることを意味する。他の特定の態様では、ウィックまたはカテーテル装置は、さらなる組成物の投与を可能にするポンプまたは他の装置に取り付けられてもよく、つなげられてもよい。ポンプは投与単位を送達するように自動プログラムされてもよく、対象または医療従事者によって制御されてもよい。
【００６０】
本明細書で使用する「細胞凝集物」とは、直径が40ミクロン超の、特定の細胞タイプのクラスターを形成するように増殖した、および/または基底膜に対して垂直に3つを超える細胞層が存在する形態を生じた、コルチ器官にある細胞の集まりを意味するものとする。「細胞凝集物」はまた、1つまたは複数の細胞タイプが網状層、すなわち内リンパと外リンパとの間の境界を突破するように引き起こす細胞の集まりが、細胞分裂によって作り出されるプロセスも指す場合がある。
【００６１】
特定の細胞タイプに関連して本明細書で使用する「細胞密度」とは、代表的顕微鏡試料にある、面積あたりの細胞タイプの平均数である。細胞タイプには、Lgr5+細胞、有毛細胞、または支持細胞が含まれ得るが、これに限定されない。細胞密度は、蝸牛またはコルチ器官を含むがこれに限定されない特定の器官または組織内の、特定の細胞タイプを用いて評価され得る。例えば、コルチ器官におけるLgr5+細胞密度は、コルチ器官全体にわたって測定した場合のLgr5+細胞の細胞密度である。典型的には、支持細胞とLgr5+細胞は、コルチ器官の横断面を見ることによって数え上げられる。典型的には、有毛細胞は、コルチ器官の表面を見下ろすことによって数え上げられるが、場合によっては、代表的顕微鏡試料に記載のように横断面が用いられる場合がある。典型的には、Lgr5+細胞の細胞密度は、代表的顕微鏡試料に記載のようにコルチ器官のホールマウント調製物を分析し、上皮の表面に沿って、特定の距離にわたってLgr5細胞の数を計数することによって測定される。有毛細胞は、形態学的特徴、例えば、束または有毛細胞に特異的な染色（例えば、ミオシンVIIa、プレスチン(Prestin)、vGlut3、Pou4f3、エスピン、結合ファロイジン(conjugated-Phalloidin)、PMCA2、Ribeye、Atoh1など）によって特定されてもよい。Lgr5+細胞は特異的な染色または抗体（例えば、Lgr5-GFPトランスジェニックレポーター、抗Lgr5抗体など）によって特定されてもよい。
【００６２】
本明細書で使用する「蝸牛における濃度」とは、蝸牛液をサンプリングすることによって測定した場合の特定の薬剤の濃度である。特に定めのない限り、試料は、蝸牛における薬剤の平均濃度をほぼ表すように、かなり十分な蝸牛液部分を含まなければならない。例えば、試料は前庭階から採取されてもよく、1つ1つの試料が、指定された蝸牛部分における蝸牛液で構成されるように、一連の液体試料が連続して採取されてもよい。
【００６３】
「相補的核酸配列」とは、相補的ヌクレオチド塩基対で構成される別の核酸配列とハイブリダイズすることができる核酸配列を指す。
【００６４】
特定の細胞タイプに関連して本明細書で使用する「横断面細胞密度」とは、代表的顕微鏡試料にある組織を通る横断面の面積あたりの細胞タイプの平均数である。特定の面にある細胞数を求めるためにコルチ器官の横断面も使用することができる。典型的には、有毛細胞の横断面細胞密度は、コルチ器官のホールマウント調製物を分析し、代表的顕微鏡試料に記載のように上皮の一部に沿って選ばれた横断面において、特定の距離にわたって有毛細胞の数を計数することによって測定される。典型的には、Lgr5+細胞の横断面細胞密度は、代表的顕微鏡試料に記載のようにコルチ器官のホールマウント調製物を分析し、上皮の一部に沿って選ばれた横断面において、特定の距離にわたってLgr5+細胞の数を計数することによって測定される。有毛細胞は、形態学的特徴、例えば、束または有毛細胞に特異的な染色(適切な染料には、例えば、ミオシンVIIa、プレスチン、vGlut3、Pou4f3、結合ファロイジン、PMCA2、Atoh1が含まれる)によって特定されてもよい。Lgr5+細胞は、特異的な染色または抗体によって特定されてもよい(適切な染料および抗体には、Lgr5 mRNA、Lgr5-GFPトランスジェニックレポーター系、抗Lgr5抗体などの蛍光インサイチューハイブリダイゼーションが含まれる)。
【００６５】
「減少させる」とは、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも5％、例えば、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、または100％減少させることを指す。
【００６６】
「減少させる」はまた、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも1倍、例えば、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、またはそれより多く減少させることも意味する。
【００６７】
本明細書で使用する「分化阻害剤」とは、内耳幹細胞から内耳有毛細胞への分化を阻害する可能性のある薬剤である。一部の分化阻害剤は出生後幹細胞マーカーの発現を維持する。一部の分化阻害剤にはNotchアゴニストおよびHDAC阻害剤が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【００６８】
本明細書で使用する「分化期間」とは、有効分化阻害濃度が無く、有効幹細胞性推進剤濃度がある期間である。
【００６９】
「有効濃度」とは、幹細胞性推進剤については有効幹細胞性推進剤濃度でもよく、分化阻害剤ついては有効分化阻害濃度でもよい。
【００７０】
「有効分化阻害濃度」とは、幹細胞増殖アッセイの開始時と比較して、幹細胞増殖アッセイの終了時に細胞の全集団のうち有毛細胞である割合を50％を超えて増やさない、分化阻害剤の最小濃度である。有効分化阻害濃度を測定する際には、Atoh1-GFPマウスでないマウス系統の有毛細胞を定量するために、細胞に対する有毛細胞染色がフローサイトメトリーと共に用いられる場合がある。または、およびAtoh1-GFPマウス系統が用いられる場合がある。
【００７１】
本明細書で使用する「有効放出速度」(mass/time)は、有効濃度(mass/volume)*30uL/1時間である。
【００７２】
「有効幹細胞性推進剤濃度」とは、幹細胞性推進剤無しで行われるが、他の全ての成分が等濃度で存在する幹細胞増殖アッセイにおけるLgr5+細胞の数と比較して、幹細胞増殖アッセイにおけるLGR5+細胞数の少なくとも1.5倍増加を誘導する幹細胞性推進剤の最小濃度である。
【００７３】
「無くす」とは、検出不可能なレベルまで減少させることを意味する。
【００７４】
「生着する」または「生着」とは、幹細胞または前駆細胞が組織の既存の細胞と接触することによってインビボで関心対象の組織に組み込まれるプロセスを指す。「上皮前駆細胞」とは、上皮細胞となる細胞系列に限定される能力を有する多能性細胞を指す。
【００７５】
「上皮幹細胞」とは、上皮細胞となる細胞系列を含む複数の細胞系列に拘束される(committed)能力を有する多能性細胞を指す。
【００７６】
「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を指す。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％を含む。断片は、10個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、または100個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個、または1000個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含んでもよい。
【００７７】
本明細書において同義に用いられる「GSK3α」、「GSK3α」、および「GSK3A」はグリコーゲン合成酵素キナーゼ3αの頭字語である。
【００７８】
「GSK3α阻害剤」は、GSK3αの活性を阻害する化合物または組成物（例えば、本明細書において、例えば、表1において開示されるGSK3α阻害剤のいずれか1つ）である。
【００７９】
本明細書において同義に用いられる「GSK3β」、「GSK-3β」、および「GSK-3B」はグリコーゲン合成酵素キナーゼ3βの頭字語である。
【００８０】
「GSK3β阻害剤」は、GSK3βの活性を阻害する化合物または組成物である。
【００８１】
「GSK3α効力」とは、GSK3α阻害剤のIC50値を指す。IC50値は、当技術分野において公知の任意の適切な方法を用いて測定することができる。一態様では、活性アッセイは、約0.2uMの酵素（例えば、GSK3α）のみ、または約0.2uMの酵素（例えば、GSK3α）と10μMの公知のペプチド基質を含む。ペプチドへの時間依存的なリン酸取り込みを確かめるために、ペプチドをキナーゼ反応（10mM HEPES[pH7.0]、10mM MgCl2、200μM EDTA、100μM冷ATP、1μCi[γ-32P]ATP）に供する。
【００８２】
「GSK3β効力」とはGSK3β阻害剤のIC50値を指す。
【００８３】
「GSK3α選択的」とは、別の標的、例えば、GSK3β、CDK、MAPK、ERK、またはMEKに対する効力よりも、GSK3αに対する効力が高いGSK3α阻害剤を指す。
【００８４】
特定の化合物（例えば、GSK3α阻害剤）の「GSK3α/CDK選択比」は、CDKに対する化合物のIC50を、GSK3αに対する化合物のIC50で割った比である。
【００８５】
特定の化合物（例えば、GSK3α阻害剤）の「GSK3α/GSK3β選択比」は、GSK3βに対する化合物のIC50を、GSK3αに対する化合物のIC50で割った比である。
【００８６】
特定の化合物（例えば、GSK3α阻害剤）の「GSK3α/ERK選択比」は、ERKに対する化合物のIC50を、GSK3αに対する化合物のIC50で割った比である。
【００８７】
特定の化合物（例えば、GSK3α阻害剤）の「GSK3α/MAPK選択比」は、MAPKに対する化合物のIC50を、GSK3αに対する化合物のIC50で割った比である。
【００８８】
特定の化合物（例えば、GSK3α阻害剤）の「GSK3α/MEK選択比」は、MECに対する化合物のIC50を、GSK3αに対する化合物のIC50で割った比である。
【００８９】
「ハイブリダイズする」とは、適切なストリンジェンシー条件下で、相補的ポリヌクレオチド塩基の間で二本鎖分子を形成するように対形成する（例えば、DNAではアデニン(A)がチミン(T)と塩基対を形成し、同様に、グアニン(G)がシトシン(C)と塩基対を形成する）ことを指す（例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照されたい）。
【００９０】
「阻害剤」とは、標的遺伝子の発現もしくは活性または標的タンパク質の発現もしくは活性を減少させる薬剤を指す。「アンタゴニスト」は阻害剤でもよいが、さらに具体的には、受容体に結合し、その結果、他の分子による結合を減少させるか、または無くす薬剤である。
【００９１】
本明細書で使用する「阻害性核酸」とは、哺乳動物細胞に投与されたときに、標的遺伝子の発現を減少させる、二本鎖RNA、RNA干渉、miRNA、siRNA、shRNA、もしくはアンチセンスRNA、またはその一部、またはそのミメティックである。典型的には、核酸阻害剤は、少なくとも、標的核酸分子の一部もしくはそのオルソログ含むか、または少なくとも、標的核酸分子の相補鎖の一部を含む。典型的には、標的遺伝子の発現は10％低減するか、25％低減するか、50％低減するか、75％低減するか、さらには90〜100％低減する。
【００９２】
「インビトロLgr5活性」とは、インビトロ細胞集団におけるLgr5の発現または活性のレベルを指す。インビトロLgr5活性は、例えば、Lgr5-GFP発現マウス、例えば、B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/Jマウス(Lgr5-EGFP-IRES-creERT2またはLgr5-GFPマウス、Jackson Lab Stock No: 008875とも知られる)に由来する細胞では、細胞を単一細胞に解離し、ヨウ化プロピジウム(PI)で染色し、フローサイトメーターを用いて細胞のLgr5-GFP発現を分析することによって測定され得る。同じ培養手順および分析手順を経た、野生型(非Lgr5-GFP)マウスに由来する内耳上皮細胞を負の対照として使用することができる。典型的には、GFP陽性集団とGFP陰性集団の両方を含む2つの細胞集団が、一方の変数としてGFP/FITCを用いる二変数プロットに示される。Lgr5陽性細胞は、GFP陽性細胞集団をゲーティングすることによって特定される。Lgr5陽性細胞のパーセントは、GFP陰性集団と負の対照の両方に対してGFP陽性細胞集団をゲーティングすることによって測定される。Lgr5陽性細胞の数は細胞の総数にLgr5陽性細胞パーセントを掛けることによって計算される。非Lgr5-GFPマウスに由来する細胞の場合、Lgr5活性は、抗Lgr5抗体を用いて、またはLgr5遺伝子に対する定量PCRを用いて測定することができる。
【００９３】
本明細書で使用する「インビボLgr5活性」とは、対象におけるLgr5の発現または活性のレベルである。「インビボLgr5活性」は、例えば、動物の内耳を取り出し、Lgr5タンパク質またはLgr5 mRNAを測定することによって測定され得る。Lgr5タンパク質産生は、蝸牛試料を画像化することで確かめられたときに蛍光強度を測定する目的で抗Lgr5抗体を用いて測定することができる。この場合、蛍光強度はLgr5の存在の尺度として用いられる。抗Lgr5抗体と共にウエスタンブロットを使用することができる。この場合、処置された器官から細胞を採取してLgr5タンパク質の増加を確かめることができる。定量PCRまたはRNAインサイチューハイブリダイゼーションを用いて、Lgr5 mRNA産生の相対変化を測定することができる。この場合、内耳から細胞を採取してLgr5 mRNAの変化を確かめることができる。または、Lgr5発現は、Lgr5プロモーターによって動かされるGFPレポータートランスジェニック系を用いて測定することができる。この場合、GFP蛍光の存在または強度を、フローサイトメトリー、画像化を用いて直接検出することができるか、または抗GFP抗体を用いて間接的に検出することができる。
【００９４】
「増加させる」とは、例えば、標準品のレベルと比較して、少なくとも1倍、例えば、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、またはそれより多く増加させることも意味する。
【００９５】
「増加させる」とは、例えば、参照のレベルと比較して、少なくとも5％、例えば、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％、またはそれより多く増加させることを指す。
【００９６】
「耳介内投与」とは、組成物を直接注射することによって対象の中耳または内耳に組成物を投与することを指す。
【００９７】
「蝸牛内」投与とは、鼓膜を通過して、および正円窓膜を通過して蝸牛に組成物を直接注射することを指す。
【００９８】
「前庭内」投与とは、鼓膜を通過して、および正円窓膜を通過して前庭器官に組成物を直接注射することを指す。
【００９９】
「単離された」とは、天然状態で見出されるように通常、材料に付随する成分を様々な程度まで含まない材料を指す。「単離する」とは、最初の供給源または周囲にあるものからの、ある程度の分離を指す。
【０１００】
「Lgr5」は、Gタンパク質共役受容体49(GPR49)またはGタンパク質共役受容体67(GPR67)とも知られる、Leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor 5の頭字語である。「Lgr5」は、ヒトではLgr5遺伝子によってコードされるタンパク質である。
【０１０１】
「Lgr5活性」は、細胞集団におけるLgr5活性のレベルとして定義される。インビトロ細胞集団では、Lgr5活性はインビトロLgr5活性アッセイにおいて測定される場合がある。インビボ細胞集団では、Lgr5活性はインビボLgr5活性アッセイにおいて測定される場合がある。
【０１０２】
本明細書で使用する「Lgr5+細胞」または「Lgr5陽性細胞」とは、Lgr5を発現する細胞である。本明細書で使用する「Lgr5-細胞」とは、Lgr5+ではない細胞である。
【０１０３】
本明細書で使用する「系統追跡(Lineage Tracing)」とは、レポーターが誘導されたときに標的遺伝子を発現する、あらゆる細胞の運命追跡を可能にするマウス系統を使用することである。これは、有毛細胞または支持細胞の遺伝子(Sox2、Lgr5、ミオシンVIIa、Pou4f3など)を含んでもよい。例えば、系統追跡は、誘導されたときに、誘導時にLgr5を発現した細胞の運命を追跡することができる、レポーターマウスと交雑したLgr5-EGFP-IRES-creERT2マウスを使用してもよい。さらなる例として、Lgr5細胞を単離して単一細胞にし、幹細胞増殖アッセイにおいて培養してコロニーを作製し、次いで、その後に分化アッセイにおいて分化させ、有毛細胞および/または支持細胞のタンパク質を染色し、有毛細胞または支持細胞の染色とのレポーター共局在を確かめてLgr5細胞の運命を確かめることによって細胞運命を分析することができる。さらに、系統追跡は、蝸牛外植片において、処置後の無傷の器官内での支持細胞または有毛細胞の運命を追跡するために行うことができる。例えば、Lgr5細胞運命は、レポーターマウスと交雑したLgr5-EGFP-IRES-creERT2マウスから蝸牛を単離し、処置前または処置中にLgr5細胞のレポーターを誘導することによって確かめることができる。次いで、有毛細胞および/または支持細胞のタンパク質を染色し、有毛細胞または支持細胞の染色とのレポーター共局在を確かめてLgr5細胞の運命を確かめることによって器官の細胞運命を分析することができる。さらに、系統追跡は、インビボで、処置後の無傷の器官内での支持細胞または有毛細胞の運命を追跡するために行うことができる。例えば、Lgr5細胞運命は、レポーターマウスと交雑したLgr5-EGFP-IRES-creERT2マウスにおいてレポーターを誘導し、動物を処置し、次いで、蝸牛を単離することによって確かめることができる。次いで、有毛細胞および/または支持細胞のタンパク質を染色し、有毛細胞または支持細胞の染色とのレポーター共局在を確かめてLgr5細胞の運命を確かめることによって器官の細胞運命を分析することができる。系統追跡は、当技術分野において標準になっているような関心対象の別のレポーターを用いて行われてもよい。
【０１０４】
「哺乳動物」とは、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、サル、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ウマ、雌ウシ(cow)、またはブタを含むが、これに限定されない任意の哺乳動物を指す。
【０１０５】
本明細書で使用する「平均放出時間」とは、放出アッセイにおいて、薬剤の半分が担体からリン酸緩衝食塩水に放出される時間である。
【０１０６】
本明細書で使用する「固有の形態」とは、組織構造が主に健常組織における構造を反映していることを意味する。
【０１０７】
本明細書で使用する「非ヒト哺乳動物」とは、ヒトでない任意の哺乳動物を指す。
【０１０８】
本明細書において関連する文脈において使用する、細胞の「数」という用語は、0個の細胞でもよく、1個の細胞でもよく、それより多い細胞でもよい。
【０１０９】
本明細書で使用する「コルチ器官」とは、蝸牛にある聴覚器官の感覚細胞(内有毛細胞および外有毛細胞)を指す。
【０１１０】
「オルガノイド」または「上皮オルガノイド」とは、器官または器官の一部に似ており、その特定の器官に関連する細胞タイプを有する細胞クラスターまたは凝集物を指す。
【０１１１】
細胞の「集団」とは、1個より多いが、好ましくは少なくとも1X103個の細胞、少なくとも1X104個の細胞、少なくとも少なくとも1X105個の細胞、少なくとも1X106個の細胞、少なくとも1X107個の細胞、少なくとも1X108個の細胞、少なくとも1X109個の細胞、または少なくとも1X1010個の細胞である任意の数の細胞を指す。
【０１１２】
本明細書で使用する「前駆細胞」とは、幹細胞のように特定のタイプの細胞に分化する傾向を有するが、幹細胞よりもすでに特定の細胞になっており、「標的」細胞に分化するように推進されている細胞を指す。
【０１１３】
本明細書で使用する「増殖期間」とは、有効幹細胞性推進剤濃度と、分化阻害濃度の分化阻害剤がある期間である。
【０１１４】
特定の態様では、組成物中にある任意の化合物の「純度」が具体的に定義される場合がある。例えば、特定の組成物は、限定されることないが、例えば、化合物を分離、特定、および定量するために生化学および分析化学において頻繁に用いられるカラムクロマトグラフィーの周知の形態である高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって測定した場合に、純度が少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の化合物を、その間にある全ての小数値を含めて含んでもよい。
【０１１５】
「参照」とは、標準的な、または対照の（例えば、試験薬剤または試験薬剤の組み合わせで処置されていない）状態を意味する。
【０１１６】
本明細書で使用する「放出アッセイ」とは、薬剤が生体適合性マトリックスから透析膜を通って食塩水環境に放出される速度を求める試験である。例示的な放出アッセイは、1mlのリン酸緩衝食塩水に溶解した30マイクロリットルの組成物を、適切なカットオフをもつ食塩水透析バックに入れ、37℃で透析バックを10mLのリン酸緩衝食塩水に入れることによって行われてもよい。透析膜サイズは、評価されている薬剤が膜から出るのを可能にするために薬剤サイズに基づいて選択されてもよい。低分子放出の場合、3.5〜5kDaカットオフが用いられてもよい。前記薬剤は幹細胞性推進剤、分化阻害剤、または他の薬剤でもよい。組成物の放出速度は経時変化する場合があり、1時間刻みで測定される場合がある。
【０１１７】
本明細書で使用する「代表的顕微鏡試料」は、測定されている特徴のサイズまたは数の平均が、関連する視野が全て測定された場合の特徴のサイズまたは数の平均を表すと理にかなって言うことができる、細胞培養系、摘出された組織の一部、または摘出された組織全体の内部にある十分な数の視野を表す。例えば、コルチ器官上で、周波数の範囲で有毛細胞数を評価するために、ImageJソフトウェア(NIH)を用いて、蝸牛ホールマウントの全長と、個々の計数されるセグメントの長さを測定することができる。1200〜1400μmの4つの蝸牛セグメント(頂端、中間〜頂端、中間〜基底、および基底)のうちのいずれかの全体または一部にある、内側有毛細胞、外側有毛細胞、および支持細胞の総数を計数することができる。100μm視野サイズの少なくとも3つの視野が理にかなって代表的顕微鏡試料とみなされるだろう。代表的顕微鏡試料は、特定の距離あたりの細胞として測定することができる、視野内での測定を含んでもよい。代表的顕微鏡試料は、細胞間接触、蝸牛構造、および細胞成分（例えば、束、シナプス）などの形態を評価するのに使用することができる。
【０１１８】
「ロゼットパターニング(Rosette Patterning)」とは、<5％の有毛細胞が他の有毛細胞に隣接している、蝸牛における特徴的な細胞配置である。
【０１１９】
「試料」という用語は、得られた、提供された、および/または分析に供された体積または質量を指す。一部の態様では、試料は、組織試料、細胞試料、液体試料などであるかまたはそれらを含む。一部の態様では、試料は対象（例えば、ヒトもしくは動物対象）から採取される（または当該対象である）。一部の態様では、組織試料は、脳、毛（毛根を含む）、頬スワブ、血液、唾液、精液、筋肉であるかもしくはそれらを含むか、または任意の内臓に由来するか、またはこれらのうちのいずれか1つに関連する癌細胞、前癌細胞、もしくは腫瘍細胞に由来する。液体は、尿、血液、腹水、胸膜液、脊髄液などでもよいが、これに限定されない。体組織は、脳組織、皮膚組織、筋肉組織、子宮内膜組織、子宮組織、および子宮頸組織、またはこれらのいずれか1つに関連する癌細胞、前癌細胞、もしくは腫瘍細胞を含んでもよいが、これに限定されない。態様において、体組織は脳組織または脳の腫瘍もしくは癌である。当業者は、一部の態様では、「試料」が供給源（例えば、対象）から得られた点では「一次試料」であることを理解する。一部の態様では、「試料」とは、例えば、汚染する可能性がある、特定の成分を除去するために、および/または関心対象の特定の成分を分離もしくは精製するために一次試料が処理された結果である。
【０１２０】
特定の化合物の「選択比」とは、試験酵素に対する化合物の効力と比較した、対照酵素に対する化合物の効力の比である。例えば、特定の阻害剤の「GSK3α/GSK3β選択比」は、GSK3βに対する化合物のIC50を、GSK3αに対する化合物のIC50で割った比である。同様に、特定の阻害剤のGSK3α/MEK選択比は、MEKに対する化合物のIC50を、GSK3αに対する化合物のIC50で割った比である。
【０１２１】
「自己複製」とは、幹細胞が分裂して、母細胞と区別がつかない発生能力を持つ、1個(非対称分裂)または2個(対称分裂)の娘細胞を生じるプロセスを指す。自己複製は増殖と、未分化状態の維持を両方とも含む。
【０１２２】
「siRNA」とは二本鎖RNAを指す。最適には、siRNAは、長さが18、19、20、21、22、23、または24ヌクレオチドであり、3’末端に2塩基オーバーハングを有する。これらのdsRNAを個々の細胞または培養系に導入することができる。このようなsiRNAはmRNAレベルまたはプロモーター活性をダウンレギュレートするために用いられる。
【０１２３】
「幹細胞」とは、自己複製する能力、および複数の細胞系列へ分化する能力を有する多能性細胞を指す。
【０１２４】
本明細書で使用する「幹細胞分化アッセイ」とは、幹細胞の分化能力を確かめるためのアッセイである。例示的な幹細胞分化アッセイでは、3〜7日齢のAtoh1-GFPマウスから、コルチ器官感覚上皮を単離し、上皮を単一細胞に解離し、細胞を40umセルストレーナーに通すことによって初期細胞集団用の数の細胞を採取する。約5000個の細胞を40μlの培養支持体（例えば: マトリゲル(Corning, Growth Factor Reduced)）に閉じ込め、500μlの適切な培養培地と、増殖因子と、試験されている薬剤が入っている24ウェルプレートのウェルの中心に入れる。適切な培養培地および増殖因子は、培地サプリメント(1X N2、1X B27、2mM Glutamax、10mM HEPES、1mM N-アセチルシステイン、および100U/mlペニシリン/100μg/mlストレプトマイシン)と、増殖因子(50ng/ml EGF、50ng/ml bFGF、および50ng/ml IGF-1)を含むAdvanced DMEM/F12を含み、評価されている薬剤を各ウェルに添加する。細胞を37℃および5％CO2の標準的な細胞培養インキュベーターに入れて10日間培養し、培地を2日ごとに交換する。次いで、幹細胞増殖アッセイ薬剤を除去し、基本培養培地および分化を推進する分子と交換することによって、これらの細胞を培養する。適切な基本培養培地は、1X N2、1X B27、2mM Glutamax、10mM HEPES、1mM N-アセチルシステイン、および100U/mlペニシリン/100μg/mlストレプトマイシンを加えたAdvanced DMEM/F12であり、分化を推進する適切な分子は、10日間の3μM CHIR99021および5μM DAPTであり、培地を2日ごとに交換する。集団内にある有毛細胞の数は、GFPを対象にしたフローサイトメトリーを用いて測定される場合がある。さらに、有毛細胞分化のレベルは、適切な、かつ調節されていない参照遺伝子またはハウスキーピング遺伝子（例えば、Hprt）を用いて基準化された有毛細胞マーカー（例えば、Myo7a）発現レベルを測定するqPCRを用いて評価することができる。有毛細胞分化のレベルはまた、有毛細胞マーカー（例えば、ミオシン7a、vGlut3、エスピン、PMCAs、Ribeye、結合ファロイジン、Atoh1、Pou4f3など）を対象にした免疫染色でも評価することができる。有毛細胞分化のレベルはまた、ミオシン7a、vGlut3、エスピン、PMCAs、プレスチン、Ribeye、Atoh1、Pou4f3を対象にしたウエスタンブロットでも評価することができる。
【０１２５】
本明細書で使用する「幹細胞アッセイ」とは、細胞または細胞集団が幹細胞であるかどうか、または幹細胞もしくは幹細胞マーカーが豊富にあるかどうか確かめるための一連の判断基準について細胞または細胞集団を試験するアッセイである。幹細胞アッセイでは、細胞/細胞集団を、幹細胞マーカーの発現などの幹細胞特徴について試験し、さらに、任意で、自己複製能力および分化能力を含む幹細胞機能について試験する。
【０１２６】
本明細書で使用する「幹細胞増殖因子」とは、自己複製能力および分化能力を有する細胞の集団の増加を誘導する化合物(またはそのように示されているのであれば組成物)である。
【０１２７】
本明細書で使用する「幹細胞増殖アッセイ」とは、出発細胞集団から幹細胞の生成を薬剤が誘導する能力を確かめるためのアッセイである。例示的な幹細胞増殖アッセイでは、3〜7日齢のLgr5-GFPマウス、例えば、B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/Jマウス(Lgr5-EGFP-IRES-creERT2またはLgr5-GFPマウスとも知られる, Jackson Lab Stock No: 008875)から、コルチ器官感覚上皮を単離し、上皮を単一細胞に解離することによって初期細胞集団用の数の細胞を採取する。約5000個の細胞を40μlの培養支持体（例えば: マトリゲル(Corning, Growth Factor Reduced)）に閉じ込め、500μlの適切な培養培地と、増殖因子と、試験されている薬剤が入っている24ウェルプレートのウェルの中心に入れる。適切な培養培地および増殖因子は、培地サプリメント(1X N2、1X B27、2mM Glutamax、10mM HEPES、1mM N-アセチルシステイン、および100U/mlペニシリン/100μg/mlストレプトマイシン)と、増殖因子(50ng/ml EGF、50ng/ml bFGF、および50ng/ml IGF-1)を含むAdvanced DMEM/F12を含み、評価されている薬剤を各ウェルに添加する。細胞を37℃および5％CO2の標準的な細胞培養インキュベーターに入れて10日間培養し、培地を2日ごとに交換する。Lgr5+細胞の数は、インビトロLgr5活性アッセイにおいてLgr5+と特定された細胞の数を計数することによって定量する。Lgr5+細胞の割合は、細胞集団内のLgr5+と特定された細胞の数を、細胞集団に存在する細胞の総数で割ることによって定量する。集団のLgr5+活性の平均は、適切な、かつ調節されていない参照遺伝子またはハウスキーピング遺伝子（例えば、Hprt）を用いて基準化された、集団のLgr5 mRNA発現レベルの平均を測定することによって定量する。集団内の有毛細胞の数は、有毛細胞マーカー（例えば、ミオシンVIIa）によって、または有毛細胞遺伝子（例えば、Pou4f3-GFP、Atoh1-nGFP）の内因性レポーターを用いて染色し、フローサイトメトリーを用いて分析することによって測定することができる。有毛細胞である細胞の割合は、細胞集団内の有毛細胞と特定された細胞の数を、細胞集団に存在する細胞の総数で割ることによって定量する。Lgr5活性はqPCRによって測定することができる。
【０１２８】
本明細書で使用する「幹細胞マーカー」は、幹細胞において特異的に発現している遺伝子産物（例えば、タンパク質、RNAなど）と定義することができる。幹細胞マーカーの1つのタイプは、幹細胞同一性の維持を直接、かつ特異的に支持する遺伝子産物である。例にはLgr5およびSox2が含まれる。さらなる幹細胞マーカーは、文献に記載のアッセイを用いて特定することができる。幹細胞同一性の維持に、ある遺伝子が必要とされるかどうか確かめるためには、機能獲得研究および機能喪失研究を使用することができる。機能獲得研究では、特定の遺伝子産物(幹細胞マーカー)の過剰発現が幹細胞同一性を維持するのに役立つだろう。機能喪失研究では、幹細胞マーカーが取り除かれると幹細胞同一性が失われるか、または幹細胞分化が誘導されるだろう。別のタイプの幹細胞マーカーは、幹細胞にしか発現していないが、幹細胞の同一性を維持するための特定の機能を必ず有するとは限らない遺伝子である。このタイプのマーカーは、選別された幹細胞の遺伝子発現シグネチャーと非幹細胞の遺伝子発現シグネチャーをマイクロアレイおよびqPCRなどのアッセイによって比較することによって特定することができる。このタイプの幹細胞マーカーは文献において見出される（例えば、Liu Q. et al., Int J Biochem Cell Biol. 2015 Mar;60:99-111. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25582750）。潜在的な幹細胞マーカーには、Ccdc121、Gdf10、Opcm1、Phexなどが含まれる。特定の細胞または細胞集団におけるLgr5またはSox2などの幹細胞マーカーの発現は、qPCR、免疫組織化学、ウエスタンブロット、およびRNAハイブリダイゼーションなどのアッセイを用いて測定することができる。幹細胞マーカーの発現はまた、示された幹細胞マーカーの発現を示すことができるレポーター、例えば、Lgr5-GFPまたはSox2-GFPを発現するトランスジェニック細胞を用いて測定することもできる。次いで、フローサイトメトリー分析を用いてレポーター発現の活性を測定することができる。レポーター発現を直接視覚化するのに蛍光顕微鏡も使用することができる。さらに、幹細胞マーカーの発現は、全体的な遺伝子発現プロファイル分析のためのマイクロアレイ分析を用いて確かめられる場合がある。特定の細胞集団または精製された細胞集団の遺伝子発現プロファイルを幹細胞の遺伝子発現プロファイルと比較して、2つの細胞集団間の類似性を確かめることができる。幹細胞の機能は、コロニー形成アッセイまたはスフェア(sphere)形成アッセイ、自己複製アッセイ、および分化アッセイによって測定することができる。コロニー(またはスフェア)形成アッセイでは、幹細胞は適切な培養培地中で培養されたときには細胞培養表面（例えば、細胞培養皿）にコロニーを形成することができるか、もしくは細胞培養支持体（例えば、マトリゲル）に埋もれた状態でコロニーを形成することができるか、または懸濁液中で培養されたときにはスフェアを形成することができるはずである。コロニー/スフェア形成アッセイでは、シングル幹細胞を適切な培養培地に低細胞密度で播種し、特定の期間(7〜10日)にわたって増殖させる。次いで、形成したコロニーを計数し、オリジナル細胞の幹細胞性の指標である幹細胞マーカー発現についてスコア付けする。次いで、任意で、形成したコロニーを選び、継代し��、その自己複製能および分化能を試験する。自己複製アッセイでは、幹細胞は適切な培養培地中で培養されたときには、少なくとも1回（例えば、1回、2回、3回、4回、5回、10回、20回など）の細胞分裂にわたって幹細胞マーカー（例えば、Lgr5）を維持するはずである。幹細胞分化アッセイでは、幹細胞は適切な分化培地中で培養されたときには、qPCR、免疫染色、ウエスタンブロット、RNAハイブリダイゼーション、またはフローサイトメトリーによって測定される有毛細胞マーカー発現によって特定できる有毛細胞を生じることができるはずである。
【０１２９】
本明細書で使用する「幹細胞性推進剤」とは、自己複製能または有毛細胞に分化する能力を維持しながら、Lgr5+細胞の増殖を誘導するか、細胞においてLgr5をアップレギュレートするか、または細胞においてLgr5発現を維持する組成物である。一般的に、幹細胞性推進剤は出生後幹細胞の少なくとも1種類のバイオマーカーをアップレギュレートする。幹細胞性推進剤にはWntアゴニストおよびGSK3β阻害剤が含まれるが、これに限定されない。
【０１３０】
「対象」は、ヒトおよび哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌ、およびウマ）を含む。一部の態様では、対象は哺乳動物、特に、霊長類、特に、ヒトである。一部の態様では、対象は、家畜、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、雌ウシ、ブタなど;家禽類、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウなど;ならびに飼いならされた動物、特に、ペット、例えば、イヌおよびネコである。一部の態様において（例えば、特に研究の文脈において）、対象哺乳動物は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類、またはブタ、例えば、近交系ブタなどである。
【０１３１】
蝸牛上皮に関連して本明細書で使用する「支持細胞」は、有毛細胞でない、コルチ器官内にある上皮細胞を含む。これは、内柱細胞、外柱細胞、内支持細胞(phalangeal cell)、ダイテルス細胞(Deiter cell)、ヘンゼン細胞、ベッチャー細胞(Boettcher cell)、および/またはクラウディウス細胞を含む。
【０１３２】
「統計的に有意な」とは、結果が偶然に起こった可能性は低いことを意味する。統計的有意性は、当技術分野において公知の任意の方法によって求めることができる。有意性の一般的に用いられる尺度にはp値が含まれる。p値とは、帰無仮説が真の場合に、観察された事象が起こる頻度または確率である。得られたp値が有意水準より小さければ、帰無仮説は棄却される。簡単な場合では、有意水準は0.05以下のp値と定義される。
【０１３３】
「実質的に」または「本質的に」とは、ほぼ全て、またはほぼ完全に、例えば、ある何らかの量の95％以上を意味する。
【０１３４】
「相乗作用」または「相乗効果」とは、別々に生じた各効果の合計よりも大きな効果;相加効果よりも大きな効果である。
【０１３５】
本明細書で使用する「TGF-β阻害剤」とは、TGF-β活性を低減する組成物である。
【０１３６】
「組織」とは、例えば、蝸牛組織、例えば、コルチ器官を含む、特定の機能を一緒に果たす、同じ起源に由来する類似の細胞が集まったものである。
【０１３７】
「経鼓膜」投与は、鼓膜を通過して中耳に組成物を直接注射することを指す。
【０１３８】
細胞集団に関連して本明細書で使用する「処置する」とは、アウトカムを生じさせるために前記物質を集団に送達することを意味する。インビトロ集団の場合、前記物質は集団に直接送達されてもよい、(さらには間接的に送達されてもよい)。インビボ集団の場合、前記物質は宿主対象への投与によって送達されてもよい。
【０１３９】
「バルプロ酸」(VPA)は化学式C8H16O2と、以下の別名:2-プロピルペンタン酸を有する。この化学構造は以下の通りである。
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【０１４０】
一部の態様では、本明細書における「バルプロ酸」または「VPA」への言及は、「バルプロ酸、またはその薬学的に許容される塩」を意味する。
【０１４１】
本明細書で使用する「Wnt活性化」とはWntシグナル伝達経路の活性化である。
【０１４２】
「薬学的に許容される塩」とは酸付加塩と塩基付加塩の両方を含む。
【０１４３】
「薬学的に許容される酸付加塩」とは、生物学的に望ましくないか、または他の点で望ましくない遊離塩基の生物学的有効性および生物学的特性を保持しており、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などがあるが、これに限定されない無機酸、および酢酸、2,2-ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、4-アセトアミド安息香酸、ショウノウ酸、ショウノウ-10-スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン-1,2-二スルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、粘液酸、ゲンチシン酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルクロン酸、グルタミン酸、グルタル酸、2-オキソ-グルタル酸、グリセロリン酸、グリコール酸、馬尿酸、イソ酪酸、乳酸、ラクトビオン酸、ラウリン酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、ナフタレン-1,5-二スルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸、ニコチン酸、オレイン酸、オロチン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸(pamoic acid)、プロピオン酸、ピログルタミン酸、ピルビン酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、チオシアン酸、/トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、ウンデシレン酸などがあるが、これに限定されない有機酸を用いて形成された塩を指す。
【０１４４】
「薬学的に許容される塩基付加塩」とは、生物学的に望ましくないか、または他の点で望ましくない遊離酸の生物学的有効性および生物学的特性を保持している塩を指す。これらの塩は、遊離酸への無機塩基または有機塩基の添加から調製される。無機塩基から得られる塩には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、アルミニウム塩などが含まれるが、これに限定されない。例えば、無機塩には、アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩が含まれるが、これに限定されない。有機塩基に由来する塩には、一級アミン、二級アミン、および三級アミン、天然置換アミンを含む置換アミン、環式アミンの塩、および塩基性イオン交換樹脂、例えば、アンモニア、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、ジエタノールアミン、エタノールアミン、デアノール、2-ジメチルアミノエタノール、2-ジエチルアミノエタノール、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、ベネサミン(benethamine)、ベンザチン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、N-エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などが含まれるが、これに限定されない。特定の態様において用いられる例示的な有機塩基には、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、およびカフェインが含まれる。
【０１４５】
本開示の例示的な態様の説明は以下の通りである。
【０１４６】
本開示は、Wnt経路を活性化するための、および/またはGSK3α活性を阻害するための方法および組成物に関する。
【０１４７】
一部の局面において、本開示は、分化を阻害しながら幹細胞性を誘導する初期段階と、幹細胞を組織細胞に分化させる、その後の段階を含む、幹細胞を制御して増殖させるための方法であって、有効量のGSK3α阻害剤またはその薬学的に許容される塩を、任意で、分化阻害剤（例えば、NotchアゴニストまたはHDAC阻害剤、例えば、バルプロ酸）と組み合わせて細胞集団に投与する工程を含む、方法を提供する。一部の態様では、分化阻害剤はHDAC阻害剤またはNotchアゴニストである。一部の態様では、分化阻害剤はバルプロ酸またはその薬学的に許容される塩である。
【０１４８】
特定の局面において、本開示は、特定の組織細胞の非存在または欠如に関連する障害または疾患の発生および/または重篤度を予防する、低減する、または処置するための方法に関する。一局面では、本開示は、内耳障害、ならびに内耳組織、特に内耳有毛細胞、その前駆細胞、任意で、血管条、および関連する聴神経が関与する聴力障害の発生および/または重篤度を予防する、低減する、または処置するための方法に関する。有毛細胞数の低下および/または有毛細胞機能の低下が原因となっている可能性のある、恒久的な難聴につながる状態は特に関心が高い。シスプラチンおよびその類似体、アミノグリコシド系抗生物質、サリチル酸塩およびその類似体、またはループ利尿薬を含む聴覚毒性の治療薬物の望まれない副作用として生じた状態も関心が高い。特定の態様では、本開示は、内耳組織、特に内耳支持細胞および有毛細胞の成長、増殖、または再生を誘導する、促進する、または強化することに関する。
【０１４９】
特に、本明細書において示される方法は、急性および慢性の耳疾患および難聴、めまい、ならびに平衡問題を予防および/または処置するための薬学的製剤を調製するのに有用であり、特に、突発性難聴、音響性外傷、長期の騒音曝露による難聴、老人性難聴、内耳装具移植中の外傷（挿入外傷）、内耳部分の疾患によるめまい、メニエール病に関連する、および/またはメニエール病の症状としてのめまい、メニエール病に関連する、および/またはメニエール病の症状としての回転性めまい、耳鳴、ならびに抗生物質および細胞分裂停止薬物および他の薬物による難聴を予防および/または処置するための薬学的製剤を調製するのに有用である。
【０１５０】
蝸牛支持細胞集団がインビボであってもインビトロであっても前記化合物で処置されたときに、処置された支持細胞は、増殖能と分化能、もっと具体的には蝸牛有毛細胞に分化する能力を有する点で幹細胞に似た(stem-like)挙動を示す。好ましくは、前記組成物は、何世代もわたって分裂し、結果として生じた細胞の大きな割合を有毛細胞に分化させる能力を維持することができる娘幹細胞を支持細胞が生成するように誘導および維持する。特定の態様では、増殖中の幹細胞は、Lgr5、Sox2、Opeml、Phex、lin28、Lgr6、サイクリンD1、Msx1、Myb、Kit、Gdnf3、Zic3、Dppa3、Dppa4、Dppa5、Nanog、Esrrb、Rex1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3l、Utf1、Tcl1、Oct4、Klf4、Pax6、Six2、Zic1、Zic2、Otx2、Bmi1、CDX2、STAT3、Smad1、Smad2、smad2/3、smad4、smad5、および/またはsmad7を含んでもよい幹細胞マーカーを発現する。
【０１５１】
一部の態様では、本開示の方法は、有毛細胞がかなり形成される前に、既存の支持細胞集団の幹細胞性(すなわち、自己複製)を維持する、さらには一過的に増加させるのに用いられる場合がある。一部の態様では、既存の支持細胞集団は、内柱細胞、外柱細胞、内支持細胞、ダイテルス細胞、ヘンゼン細胞、ベッチャー細胞、および/またはクラウディウス細胞を含む。これらの細胞タイプの1つまたは複数の増殖を確認するために、代表的顕微鏡試料の端から端までの免疫染色による形態学的分析(細胞数を含む)と系統追跡が用いられる場合がある。一部の態様では、既存の支持細胞はLgr5+細胞を含む。細胞集団間のLgr5アップレギュレーションを確認するために、免疫染色による形態学的分析(細胞数を含む)とqPCRおよびRNAハイブリダイゼーションが用いられる場合がある。
【０１５２】
有利なことに、本開示の方法は、遺伝子操作を用いることなく、これらの目標を成し遂げる。多くの学術研究において用いられる生殖細胞系列操作は、難聴を処置するための治療上望ましいアプローチではない。概して、この療法は、好ましくは、低分子、ペプチド、抗体、または遺伝子療法が伴わない他の非核酸分子もしくは核酸送達ベクターの投与を伴う。特定の態様では、この療法は有機低分子の投与を伴う。好ましくは、聴覚の保護または回復は、中耳に注射され、蝸牛の中に拡散する(非遺伝子)治療剤を用いることによって成し遂げられる。
【０１５３】
蝸牛は、存在する全ての細胞タイプに大きく頼っており、これらの細胞の構成は蝸牛の機能にとって重要である。支持細胞は神経伝達物質循環および蝸牛メカニクスにおいて重要な役割を果たしている。従って、コルチ器官内のロゼットパターニングを維持することは機能にとって重要な可能性がある。基底膜の蝸牛メカニクスは有毛細胞変換を促進する。蝸牛メカニクスの感度が高いので、多量の細胞を回避することも望ましい。支持細胞の機能と正しいメカニクスは正常な聴覚に必要であるので、全体で、基底膜に沿った有毛細胞と支持細胞の正しい分布と関係を維持することは増殖後であっても聴覚に望ましい特徴である可能性が高い。
【０１５４】
本開示の一態様では、蝸牛細胞集団内の有毛細胞の細胞密度は、蝸牛上皮に特有のロゼットパターンを維持するか、さらには確立するやり方で大きくなる。
【０１５５】
本開示の一局面によれば、有毛細胞と支持細胞の両方を含む蝸牛細胞集団において有毛細胞の細胞密度を増加させることができる。蝸牛細胞集団はインビボ集団でもよく（すなわち、対象の蝸牛上皮に含まれてもよく）、蝸牛細胞集団はインビトロ(エクスビボ)集団でもよい。集団がインビトロ集団であれば、細胞密度の増加は、処置前および処置後に採取した集団の代表的顕微鏡試料を参照することによって確かめることができる。集団がインビボ集団であれば、細胞密度の増加は、聴覚の改善に相関する有毛細胞密度の増加が起こった対象の聴覚への影響を確かめることによって間接的に確かめることができる。
【０１５６】
一態様では、幹細胞増殖アッセイにおいて神経細胞の非存在下で配置された支持細胞はリボンシナプスを形成する。
【０１５７】
本来の蝸牛では、有毛細胞と支持細胞のパターニングは基底膜に平行する形で生じる。本開示の一態様では、蝸牛細胞集団における支持細胞の増殖は、基底膜が蝸牛上皮を特徴付ける形で増殖する。
【０１５８】
一態様では、初期蝸牛細胞集団内の支持細胞の数は、初期蝸牛細胞集団を本開示の組成物（例えば、有効濃度の幹細胞性推進剤、例えば、GSK3α阻害剤と有効濃度の分化阻害剤（例えば、NotchアゴニストまたはHDAC阻害剤、例えば、バルプロ酸）を含有する組成物）で処置して中間蝸牛細胞集団を形成することによって選択的に増幅され、中間蝸牛細胞集団内の支持細胞と有毛細胞の比は、初期蝸牛細胞集団内の支持細胞と有毛細胞の比より大きい。増殖した蝸牛細胞集団は、例えば、インビボ集団、インビトロ集団、さらにはインビトロ外植片でもよい。このような1つの態様では、中間蝸牛細胞集団内の支持細胞と有毛細胞の比は、初期蝸牛細胞集団内の支持細胞と有毛細胞の比より大きい。例えば、このような1つの態様では、中間蝸牛細胞集団内の支持細胞と有毛細胞の比は、初期蝸牛細胞集団内の支持細胞と有毛細胞の比より1.1倍大きい。さらなる例として、このような1つの態様において、中間蝸牛細胞集団内の支持細胞と有毛細胞の比は、初期蝸牛細胞集団内の支持細胞と有毛細胞の比より1.5倍大きい。さらなる例として、このような1つの態様において、中間蝸牛細胞集団内の支持細胞と有毛細胞の比は、初期蝸牛細胞集団内の支持細胞と有毛細胞の比より2倍大きい。さらなる例として、このような1つの態様において、中間蝸牛細胞集団内の支持細胞と有毛細胞の比は、初期蝸牛細胞集団内の支持細胞と有毛細胞の比より3倍大きい。前述の態様のそれぞれにおいて、本段落に記載のように本開示の組成物が蝸牛細胞集団を増殖させる能力は幹細胞増殖アッセイによって確かめられ得る。
【０１５９】
一態様では、蝸牛細胞集団を本開示の組成物（例えば、有効濃度の幹細胞性推進剤、例えば、GSK3α阻害剤と、有効濃度の分化阻害剤（例えば、NotchアゴニストまたはHDAC阻害剤、例えば、バルプロ酸）を含有する組成物）で処置することによって、中間蝸牛細胞集団を形成するように蝸牛細胞集団内の幹細胞の数は増幅され、中間蝸牛細胞集団内の幹細胞の細胞密度は、初期蝸牛細胞集団内の幹細胞の細胞密度より多い。処置された蝸牛細胞集団は、例えば、インビボ集団、インビトロ集団、さらにはインビトロ外植片でもよい。このような1つの態様では、処置された蝸牛細胞集団内の幹細胞の細胞密度は、初期蝸牛細胞集団内の幹細胞の細胞密度より少なくとも1.1倍多い。例えば、このような1つの態様では、処置された蝸牛細胞集団内の幹細胞の細胞密度は、初期蝸牛細胞集団内の幹細胞の細胞密度より少なくとも1.25倍多い。例えば、このような1つの態様では、処置された蝸牛細胞集団内の幹細胞の細胞密度は、初期蝸牛細胞集団内の幹細胞の細胞密度より少なくとも1.5倍多い。さらなる例として、このような1つの態様では、処置された蝸牛細胞集団内の幹細胞の細胞密度は、初期蝸牛細胞集団内の幹細胞の細胞密度より少なくとも2倍多い。さらなる例として、このような1つの態様では、処置された蝸牛細胞集団内の幹細胞の細胞密度は、初期蝸牛細胞集団内の幹細胞の細胞密度より少なくとも3倍多い。インビトロ蝸牛細胞集団はインビボ集団よりも有意に多く増殖する可能性がある。例えば、特定の態様では、増殖したインビトロ幹細胞集団内の幹細胞の細胞密度は、初期蝸牛細胞集団内の幹細胞の細胞密度より少なくとも4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、75倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、さらには3000倍多くてもよい。前述の態様のそれぞれにおいて、本段落に記載のように本開示の組成物が蝸牛細胞集団を増殖させる能力は幹細胞増殖アッセイによって確かめられ得る。
【０１６０】
本開示の一局面によれば、蝸牛支持細胞集団は、前記集団のLgr5活性を増加させるために、本開示の組成物（例えば、有効濃度の幹細胞性推進剤、例えば、GSK3α阻害剤と、有効濃度の分化阻害剤（例えば、NotchアゴニストまたはHDAC阻害剤、例えば、バルプロ酸）を含有する組成物）によって処置される。例えば、一態様では、GSK3α阻害剤には、蝸牛支持細胞のインビトロ集団のLgr5活性を少なくとも1.2倍増加させる、および維持する能力がある。さらなる例として、このような1つの態様では、GSK3α阻害剤には、蝸牛支持細胞のインビトロ集団のLgr5活性を1.5倍増加させる能力がある。さらなる例として、このような1つの態様では、GSK3α阻害剤には、蝸牛支持細胞のインビトロ集団のLgr5活性を2倍、3倍、5倍、10倍、100倍、500倍、1000倍、2000倍、さらには3000倍増加させる能力がある。Lgr5活性の増加はインビボ集団についても観察される可能性があるが、観察される増加は、ある程度少なめになるかもしれない。例えば、一態様では、GSK3α阻害剤には、蝸牛支持細胞のインビボ集団のLgr5活性を少なくとも5％増加させる能力がある。さらなる例として、このような1つの態様では、GSK3α阻害剤には、蝸牛支持細胞のインビボ集団のLgr5活性を少なくとも10％増加させる能力がある。さらなる例として、このような1つの態様では、GSK3α阻害剤には、蝸牛支持細胞のインビボ集団のLgr5活性を少なくとも20％増加させる能力がある。さらなる例として、このような1つの態様では、GSK3α阻害剤には、蝸牛支持細胞のインビボ集団のLgr5活性を少なくとも30％増加させる能力がある。前述の態様のそれぞれにおいて、このようなLgr5活性増加についてのGSK3α阻害剤の能力は、例えば、インビトロLgr5+活性アッセイにおいて証明されてもよく、インビボ集団では、例えば、器官を単離し、免疫染色、Lgr5（例えば、Lgr5、Sox2）の内因性蛍光タンパク質発現、およびLgr5を対象にしたqPCRを用いた形態学的分析を行うことによって測定されるようにインビボLgr5+活性アッセイにおいて証明されてもよい。
【０１６１】
集団のLgr5活性を増加させることに加えて、（インビボでもインビトロでも）Lgr5+支持細胞を含有する蝸牛細胞集団を本開示の組成物（例えば、有効濃度の幹細胞性推進剤、例えば、GSK3α阻害剤と、有効濃度の分化阻害剤（例えば、NotchアゴニストまたはHDAC阻害剤、例えば、バルプロ酸）を含有する組成物）で処置することによって、蝸牛細胞集団内のLgr5+支持細胞の数が増加する可能性がある。概して、いくつかの機構のうちの1つまたは複数を介して、初期細胞集団と比べて支持細胞の幹細胞/前駆細胞の細胞密度が増殖する可能性がある。例えば、このような1つの態様では、幹細胞の性質が増加した(すなわち、有毛細胞に分化する能力が高い)、新たに発生したLgr5+支持細胞が発生する可能性がある。さらなる例として、このような1つの態様では、細胞分裂によって娘Lgr5+細胞が発生しないが、既存のLgr5+支持細胞は有毛細胞に分化するように誘導される。さらなる例として、このような1つの態様では、細胞分裂によって娘細胞が発生しないが、Lgr5-支持細胞が高レベルのLgr5活性まで活性化され、次いで、活性化された支持細胞は有毛細胞に分化することができる。この機構に関係なく、一態様では、本開示の組成物（例えば、GSK3α阻害剤を含む組成物）には、蝸牛支持細胞のインビトロで単離された細胞集団においてLgr5+支持細胞の細胞密度を少なくとも5倍増加させる能力がある。さらなる例として、このような1つの態様では、前記組成物（例えば、GSK3α阻害剤を含む組成物）には、蝸牛支持細胞のインビトロ集団において、Lgr5+支持細胞の細胞密度を少なくとも10倍増加させる能力がある。さらなる例として、このような1つの態様では、前記組成物（例えば、GSK3α阻害剤を含む組成物）には、蝸牛支持細胞のインビトロ集団において、Lgr5+支持細胞の細胞密度を少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1000倍、さらには少なくとも2000倍増加させる能力がある。Lgr5+支持細胞の細胞密度の増加はまたインビボ集団についても観察される可能性があるが、観察される増加は、ある程度少なめになるかもしれない。例えば、一態様では、前記組成物（例えば、GSK3α阻害剤を含む組成物）には、蝸牛支持細胞のインビボ集団においてLgr5+支持細胞の細胞密度を少なくとも5％増加させる能力がある。さらなる例として、このような1つの態様では、前記組成物（例えば、GSK3α阻害剤を含む組成物）には、蝸牛支持細胞のインビボ集団においてLgr5+支持細胞の細胞密度を少なくとも10％増加させる能力がある。さらなる例として、このような1つの態様では、前記組成物（例えば、GSK3α阻害剤を含む組成物）には、蝸牛支持細胞のインビボ集団においてLgr5+支持細胞の細胞密度を少なくとも20％増加させる能力がある。さらなる例として、このような1つの態様では、前記組成物（例えば、GSK3α阻害剤を含む組成物）には、蝸牛支持細胞のインビボ集団においてLgr5+支持細胞の細胞密度を少なくとも30％増加させる能力がある。インビトロ集団におけるLgr5+支持細胞のこのような増加について、前記組成物（例えば、GSK3α阻害剤を含む組成物）の能力は、例えば、幹細胞増殖アッセイにおいて証明されてもよく、適切なインビボアッセイにおいて証明されてもよい。一態様では、本開示の組成物（例えば、GSK3α阻害剤を含む組成物）には、Lgr5が存在しないかまたはLgr5の検出レベルが低い細胞においてLgr5発現を誘導することによって、固有の形態を維持しながら蝸牛にあるLgr5+細胞の数を増加させる能力がある。一態様では、本開示の組成物（例えば、GSK3α阻害剤を含む組成物）には、Lgr5が存在しないかまたはLgr5の検出レベルが低い細胞においてLgr5発現を誘導することによって、固有の形態を維持しながら、かつ細胞凝集物を生じることなく、蝸牛にあるLgr5+細胞の数を増加させる能力がある。
【０１６２】
Lgr5+支持細胞の細胞密度を増加させることに加えて、一態様では、本開示の方法には、蝸牛細胞集団内のLgr5+細胞と有毛細胞の比を増加させる能力がある。一態様では、初期蝸牛細胞集団内のLgr5+支持細胞の数は、初期蝸牛細胞集団を本開示の組成物（例えば、有効濃度の幹細胞性推進剤、例えば、GSK3α阻害剤と有効濃度の分化阻害剤（例えば、NotchアゴニストまたはHDAC阻害剤、例えば、バルプロ酸）を含有する組成物）で処置して、増殖した細胞集団を形成することによって選択的に増幅され、増殖した蝸牛細胞集団内のLgr5+支持細胞の数は少なくとも有毛細胞の数に等しい。増殖した蝸牛細胞集団は、例えば、インビボ集団でもよく、インビトロ集団でもよく、さらにはインビトロ外植片でもよい。このような1つの態様では、増殖した蝸牛細胞集団内のLgr5+支持細胞と有毛細胞の比は少なくとも1:1である。例えば、このような1つの態様において、増殖した蝸牛細胞集団内のLgr5+支持細胞と有毛細胞の比は少なくとも1.5:1である。さらなる例として、このような1つの態様において、増殖した蝸牛細胞集団内のLgr5+支持細胞と有毛細胞の比は少なくとも2:1である。さらなる例として、このような1つの態様において、増殖した蝸牛細胞集団内のLgr5+支持細胞と有毛細胞の比は少なくとも3:1である。さらなる例として、このような1つの態様において、増殖した蝸牛細胞集団内のLgr5+支持細胞と有毛細胞の比は少なくとも4:1である。さらなる例として、このような1つの態様において、増殖した蝸牛細胞集団内のLgr5+支持細胞と有毛細胞の比は少なくとも5:1である。前述の態様のそれぞれにおいて、本開示の前記組成物（例えば、前記組成物はGSK3α阻害剤を含む）が本段落に記載のように蝸牛細胞集団を増殖させる能力は幹細胞増殖アッセイによって確かめられ得る。
【０１６３】
特定の態様では、前記方法は、感覚上皮上にある総細胞に対するLgr5+細胞の割合を少なくとも10％、20％、50％、100％、250％、500％、1000％、または5000％増加させる。
【０１６４】
特定の態様では、前記方法は、感覚上皮、例えば、コルチ器官上にある細胞の少なくとも10％、20％、30％、50％、70％、または85％になるまでLgr5+細胞を増加させる。
【０１６５】
一般的に、蝸牛における支持細胞の過剰増殖は回避されることが好ましい。一態様では、本開示の方法には、蝸牛の本来の表面を飛び出した新たな細胞の突起物、例えば、細胞凝集物を作り出さすことなく蝸牛細胞集団を増殖させる能力がある。一部の態様では、組成物（例えば、GSK3α阻害剤を含む組成物）を正円窓膜に配置して30日後に蝸牛組織は固有の形態をとる。一部の態様では、組成物（例えば、GSK3α阻害剤を含む組成物）を正円窓膜に配置して30日後に蝸牛組織は固有の形態をとり、細胞凝集物を欠いている。一部の態様では、前記組成物（例えば、前記組成物はGSK3α阻害剤を含む）を正円窓膜に配置して30日後に蝸牛組織は固有の形態をとり、コルチ器官にあるLgr5+細胞の少なくとも10％、20％、30％、50％、75％、90％、95％、98％、さらには少なくとも99％が細胞凝集物の一部でない。
【０１６６】
概して、支持細胞集団（具体的にはLgr5+支持細胞）を前記のように増殖させることに加えて、本開示の方法には、有毛細胞に分化する能力を娘細胞において維持する能力がある。インビボ集団では、この能力の維持は対象の聴覚の改善によって間接的に観察される可能性がある。インビトロ集団では、この能力の維持は、出発集団に対する有毛細胞数の増加によって直接的に観察される可能性があるか、あるいはLGR5活性、SOX2活性、または本明細書の他の箇所で特定される他の幹細胞マーカーの1つもしくは複数を測定することによって間接的に観察される可能性がある。
【０１６７】
一態様では、前記方法が概して蝸牛支持細胞集団（特にLgr5+支持細胞集団）の幹細胞性を増加させる能力は、Lgr5活性アッセイによって確かめられたときには、単離されたLgr5+細胞のインビトロ集団のLgr5活性の増加と相関付けられる可能性がある。以前に述べたように、このような1つの態様では、前記組成物（例えば、前記組成物はGSK3α阻害剤を含む）には、初期細胞集団内の細胞のLgr5活性と比べて、中間細胞集団内の幹細胞のLgr5活性を平均して5倍増加させる能力がある。さらなる例として、このような1つの態様では、前記方法には、初期細胞集団内の細胞のLgr5活性と比べて、中間細胞集団における幹細胞遺伝子のLgr5活性を10倍増加させる能力がある。さらなる例として、このような1つの態様では、前記方法には、初期細胞集団内の細胞のLgr5活性と比べて、中間細胞集団内の幹細胞のLgr5活性を100倍増加させる能力がある。さらなる例として、このような1つの態様では、前記方法には、初期細胞集団内の細胞のLgr5活性と比べて、中間細胞集団内の幹細胞のLgr5活性を1000倍増加させる能力がある。前述の態様のそれぞれにおいて、細胞集団内の幹細胞の活性増加は、インビトロでは、標的遺伝子を対象にした免疫染色もしくは内因性蛍光タンパク質発現と、画像化分析もしくはフローサイトメトリーによる相対強度の分析によって、または標的幹細胞遺伝子を対象にしたqPCRを用いて確かめられる可能性がある。任意で、結果として生じた幹細胞集団の同一性は、幹細胞マーカー発現アッセイ、コロニー形成アッセイ、自己複製アッセイを含む幹細胞アッセイ、および幹細胞アッセイにおいて規定されるような分化アッセイによってさらに確かめられる可能性がある。
【０１６８】
一部の態様では、成体哺乳動物に適用された前記方法は、S期にある成体哺乳動物Lgr5+細胞の集団を生成する。
【０１６９】
一態様では、GSK3α阻害剤がマウスの正円窓に適用された後に、コルチ器官にある細胞集団のインビボLgr5+活性は、前記組成物（例えば、前記組成物はGSK3α阻害剤を含む）に曝露されていない集団のベースラインと比べて1.3x、1.5x、20xまで増加する。一部の態様では、前記組成物（例えば、前記組成物はGSK3α阻害剤を含む）がマウスの正円窓に適用された後に、コルチ器官にある細胞の平均インビボLgr5+活性は、前記組成物（例えば、前記組成物はGSK3α阻害剤を含む）に曝露されていない集団のベースラインと比べて1.3x、1.5x、20xまで増加する。
【０１７０】
特定の態様では、前記方法は、Lgr5+細胞が数で支持細胞集団の少なくとも10％、7.5％、10％、100％までになるまでLgr5+細胞を増加させる。
【０１７１】
場合によっては、分化阻害剤が有効分化阻害濃度で存在しなければ、幹細胞性推進剤は支持細胞から有毛細胞への分化も誘導する可能性がある。増殖と分化を両方とも推進する可能性のある幹細胞性推進剤の例には、GSK3α阻害剤、例えば、表1に開示されるGSK3α阻害剤が含まれる。
【０１７２】
一部の態様では、幹細胞性推進剤はLgr5+幹細胞の増殖を推進するのに用いられる場合がある。場合によっては、分化阻害剤が有効分化阻害濃度で存在しなければ、幹細胞性推進剤はLgr5+細胞から有毛細胞への分化も誘導する可能性がある。増殖と分化を両方とも推進する可能性のある幹細胞性推進剤の例には、GSK3α阻害剤、例えば、表1に開示されるGSK3α阻害剤が含まれる。一部の態様では、分化阻害剤は幹細胞性推進剤でもある。一部の態様では、分化阻害剤はバルプロ酸であり、バルプロ酸は幹細胞性推進剤である場合がある。一部の態様では、分化阻害剤が幹細胞性推進剤でもあるなら、分化阻害剤の濃度は分化期間中は有効分化阻害濃度より少ない。
【０１７３】
特定の態様では、前記組成物（例えば、前記組成物はGSK3α阻害剤を含む）には、蝸牛にあるLgr5+細胞のパーセントを5％、10％、25％、50％、または80％増加させる能力がある。特定の態様では、本開示は、(i)GSK3α阻害剤と(ii)バルプロ酸の組み合わせを含む組成物を提供する。一部の態様では、上記の(i)と(ii)を含む、このような組み合わせ組成物の使用には、蝸牛にあるLgr5+細胞のパーセントを5％、10％、25％、50％、または80％増加させる能力がある。
【０１７４】
幹細胞性推進剤
本開示の範囲内にある例示的なGSK3α阻害剤を表1に示す。
【０１７５】
(表１)例示的なGSK3α阻害剤
2019507802.tif 000004
ACS Chem. Biol. 2016, 11, 1952-1963
PLoS One (2016), 11(4), e0153075
【０１７６】
一部の態様では、本開示のGSK3α阻害剤は、1nM未満の、GSK3αに対する効力を含む。一部の態様では、本開示のGSK3α阻害剤は、1〜10nMの、GSK3αに対する効力を含む。一部の態様では、本開示のGSK3α阻害剤は、10nM〜100nMの、GSK3αに対する効力を含む。一部の態様では、本開示のGSK3α阻害剤は、100nM〜1000nMの、GSK3αに対する効力を含む。
【０１７７】
一部の態様では、GSK3α阻害剤は、Witherington, J. et.al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2003), 13(18), 3055-3057; Witherington, J. et.al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2003), 13(18), 3059-3062;またはWitherington, J. et.al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2003), 13(9), 1577-1580に開示されるピラゾロピリジン化合物である。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７８】
一部の態様では、GSK3α阻害剤は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Witherington, J. et.al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2003), 13(9), 1581-1584に開示されるピラゾロピリダジン化合物である。
【０１７９】
GSK3αに対する効力およびGSK3βに対する効力は、以下の参考文献: Unoa, Y. et.al., Brain Research (2009), 1296, 148; Neumann, T. et.al., B. Journal of Medicinal Chemistry (2015), 58(22), 8907-8919にある実験手順に記載のように確かめることができる。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１８０】
一部の態様では、強力なGSK3α阻害剤に似た構造を有する化合物も強力なGSK-3-α阻害を示す。従って、一部の態様では、GSK3α阻害剤は、GSK-3-βXXII阻害剤CAS1195901-31-5:
2019507802.tif 000005
に似た結合モチーフを形成するピラゾールである。
【０１８１】
一部の態様では、GSK3α阻害剤は、以下の構造:
2019507802.tif 000006
を含む。
【０１８２】
一部の態様では、GSK3α阻害剤は、Unoa, Y., Iwashitaa et.al., Brain Research (2009) 1296, 148;またはTsukamoto, T.; WO2006085685に開示される化合物である。
【０１８３】
一部の態様では、GSK3α阻害剤は、Wyatt, P.G. et.al., J. Med. Chem. 2008, 51, 4986-4999;WO2005002552A2、WO2005012256A1、WO2007129062A1、WO2007129066A1、WO2008001101A2、WO2008001115A2;US20110002879A1;WO2005002576A2;WO2006070192;WO2006077414A1;WO2006077416;WO2006077419WO2006077424;WO2006077425A1;WO2006070198A1WO2006070195;WO2006077426A2;WO2006003440A1;WO2007129062;WO2006077428;WO2006070202;WO2008007113A2;WO2008007122A2;WO2008007123A2;またはWO2008009954に開示される化合物である。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１８４】
一部の態様では、GSK3α阻害剤は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Urich, R. et.al., Journal of Medicinal Chemistry (2014), 57(18), 7536-7549に開示される化合物である。
【０１８５】
一部の態様では、GSK3α阻害剤は、CN102060772 または Lu, Y. et.al., Chemical Pharmaceutical Bulletin (2014), 62(3), 238-246に開示される化合物である。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１８６】
一部の態様では、本開示のGSK3α阻害剤はGSK3αとGSK3βを両方とも阻害する。一部の態様では、GSK3α阻害剤には、GSK3αとGSK3βに対する効力があり、効力は、GSK3αとGSK3βの両方の阻害について約100nM未満であるか、あるいはGSK3αとGSK3βの両方の阻害について約50nM、20nM、10nM、5nM、2nMより少ないか、または1nM未満である。
【０１８７】
一部の態様では、GSK3α阻害剤はGSK3βよりもGSK3αに対する選択性が高い。一部の態様では、GSK3α阻害剤は、GSK3α/GSK3β選択比の全ての整数（例えば、61x、62x、63x）およびこの間の範囲（例えば、約1x〜約100x;約20x〜約90x;約40x〜約60x）を含めて、少なくとも約0.5x、または少なくとも約0.6x、0.7x、0.8x、0.9x、1.0x、1.1x、1.2x、または1.3x、1.4x、1.5x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x、20x、25x、30x、40x、50x、60x、70x、80x、90x、または100xであるGSK3α/GSK3β選択比を含む。
【０１８８】
一部の態様では、本開示のGSK3α阻害剤はGSK3αとGSK3βに対する効力を含み、GSK3αに対する効力とGSK3βに対する効力は約100％異なるか、または約50％;約25％;約20％;もしくは約5％異なる。一部の態様では、本開示のGSK3α阻害剤はGSK3αとGSK3βに対する効力を含み、GSK3αに対する効力とGSK3βに対する効力は検出できるほどの差はない。
【０１８９】
一部の態様では、GSK3α阻害剤は、(i)Lo Monte, F. et.al., Journal of Medicinal Chemistry (2012), 55(9), 4407-4424; Neumann, T. et.al., Journal of Medicinal Chemistry (2015), 58(22), 8907-8919に開示されるオキサジアゾール化合物;(ii)Georgievska, B. et.al., Journal of neurochemistry (2013), 125(3), 446-56に開示されるインドール化合物; (iii)Luo, G. et.al., Journal of Medicinal Chemistry (2016), 59(3), 1041-1051に開示されるイソニコチンアミド化合物;(iv)Remsing Rix, L.L. et.al., ACS Chemical Biology (2014), 9(2), 353-358またはBertrand, J. A. et.al., Journal of Molecular Biology (2003), 333(2), 393-407に開示されるマレイミド化合物;(v)Lum, C. et.al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2008), 18(12), 3578-358に開示されるジアミノピリミジンおよびアザプリン化合物;ならびに(vi)Kramer, T.; Schmidt, B.; Lo Monte, F. International Journal of Alzheimer’s Disease (2012), 381029, 32; Feng, L. et.al, Journal of the American Chemical Society (2011), 133(15), 5976-5986; Bregman, H. et.al., Journal of the American Chemical Society (2004), 126(42), 13594-13595; Atilla-Gokcumen, G. E.; Di Costanzo, L.; Meggers, E. JBIC, Journal of Biological Inorganic Chemistry (2011), 16(1), 45-50に開示される金属錯体より選択される、GSK3βよりもGSK3α選択性がある化合物である。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９０】
一部の態様では、本開示のGSK3α阻害剤は、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)を阻害する（例えば、CDKが放射性ATPを既知のペプチド基質に組み込む能力を阻害剤の存在下で試験する標準的な放射測定インビトロキナーゼアッセイを用いて、インビトロで、CDKの一団、例えば、CDK1、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9に対して）検出可能な効力を全く含まない。一部の態様では、本開示のGSK3α阻害剤はCDKよりもGSK3αに対する選択性が高い。一部の態様では、GSK3α阻害剤は、GSK3α/CDK選択比の全ての整数（例えば、81x、82x、83x）およびこの間の範囲（例えば、約10x〜約1000x;約200x〜約900x;約400x〜約600x）を含めて、少なくとも約10x、少なくとも約15x、少なくとも約20x、少なくとも約25x、少なくとも約30x、少なくとも約35x、少なくとも約40x、少なくとも約45x、少なくとも約50x、少なくとも約60x、少なくとも約60x、少なくとも約80x、少なくとも約90x、少なくとも約100x、少なくとも約200x、少なくとも約500x、少なくとも約1000x、または少なくとも約15,000xであるGSK3α/CDK選択比を含む。
【０１９１】
一部の態様では、本開示のGSK3α阻害剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)が放射性ATPを既知のペプチド基質に組み込む能力を阻害剤の存在下で試験する標準的な放射測定インビトロキナーゼアッセイを用いて、インビトロで、MAPKを阻害する検出可能な効力を全く含まない。一部の態様では、本開示のGSK3α阻害剤はMAPKよりもGSK3αに対する選択性が高い。一部の態様では、GSK3α阻害剤は、GSK3α/MAPK選択比の全ての整数（例えば、81x、82x、83x）およびこの間の範囲（例えば、約10x〜約1000x;約200x〜約900x;約400x〜約600x）を含めて、少なくとも約10x、少なくとも約15x、少なくとも約20x、少なくとも約25x、少なくとも約30x、少なくとも約35x、少なくとも約40x、少なくとも約45x、少なくとも約50x、少なくとも約60x、少なくとも約60x、少なくとも約80x、少なくとも約90x、少なくとも約100x、少なくとも約200x、少なくとも約500x、少なくとも約1000x、または少なくとも約15,000xであるGSK3α/MAPK選択比を含む。
【０１９２】
一部の態様では、本開示のGSK3α阻害剤は、細胞外シグナル制御キナーゼ(ERK)が放射性ATPを既知のペプチド基質に組み込む能力を阻害剤の存在下で試験する標準的な放射測定インビトロキナーゼアッセイを用いて、インビトロで、ERKを阻害する検出可能な効力を全く含まない。一部の態様では、本開示のGSK3α阻害剤はERKよりもGSK3αに対する選択性が高い。一部の態様では、GSK3α阻害剤は、GSK3α/ERK選択比の全ての整数（例えば、81x、82x、83x）およびこの間の範囲（例えば、約10x〜約1000x;約200x〜約900x;約400x〜約600x）を含めて、少なくとも約10x、少なくとも約15x、少なくとも約20x、少なくとも約25x、少なくとも約30x、少なくとも約35x、少なくとも約40x、少なくとも約45x、少なくとも約50x、少なくとも約60x、少なくとも約60x、少なくとも約80x、少なくとも約90x、少なくとも約100x、少なくとも約200x、少なくとも約500x、少なくとも約1000x、または少なくとも約15,000xであるGSK3α/ERK選択比を含む。
【０１９３】
一部の態様では、本開示のGSK3α阻害剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ(MEK)が放射性ATPを既知のペプチド基質に組み込む能力を阻害剤の存在下で試験する標準的な放射測定インビトロキナーゼアッセイを用いて、インビトロで、MEKを阻害する検出可能な効力を全く含まない。一部の態様では、本開示のGSK3α阻害剤はMEKよりもGSK3αに対する選択性が高い。一部の態様では、GSK3α阻害剤は、GSK3α/MEK選択比の全ての整数（例えば、81x、82x、83x）およびこの間の範囲（例えば、約10x〜約1000x;約200x〜約900x;約400x〜約600x）を含めて、少なくとも約10x、少なくとも約15x、少なくとも約20x、少なくとも約25x、少なくとも約30x、少なくとも約35x、少なくとも約40x、少なくとも約45x、少なくとも約50x、少なくとも約60x、少なくとも約60x、少なくとも約80x、少なくとも約90x、少なくとも約100x、少なくとも約200x、少なくとも約500x、少なくとも約1000x、または少なくとも約15,000xであるGSK3α/MEK選択比を含む。
【０１９４】
本明細書において開示される組成物および方法の様々な態様において使用するためのGSK3α阻害剤のクラスには、表1のA列に列挙したGSK3α阻害剤が含まれるが、これに限定されない。本明細書において開示される組成物および方法の様々な態様において使用するための具体的なGSK3α阻害剤には、表1のB列に列挙したGSK3α阻害剤が含まれるが、これに限定されない。
【０１９５】
薬剤の組み合わせ
特定の態様では、前記組成物は、表1、A列のクラスの中にある薬剤(またはその誘導体もしくは薬学的に許容される塩)と分化阻害剤を含む。特定の態様では、前記組成物は、表1、A列のクラスの中にある薬剤(またはその誘導体もしくは薬学的に許容される塩)とHDAC阻害剤(またはその誘導体もしくは薬学的に許容される塩)あるいはNotchアゴニスト(またはその誘導体もしくは薬学的に許容される塩)を含む。特定の態様では、前記組成物は、表1、A列のクラスの中にある薬剤(またはその誘導体もしくは薬学的に許容される塩)とバルプロ酸(またはその誘導体もしくは類似体もしくは薬学的に許容される塩)を含む。組み合わされた薬剤の送達プロファイル。
【０１９６】
本開示の範囲内にある例示的なHDAC阻害剤を表4に示した。
【０１９７】
(表４)HDAC阻害剤
2019507802.tif 000007
2019507802.tif 000008
2019507802.tif 000009
【０１９８】
本開示の範囲内にある例示的なNotchアゴニストを表3に示した。
【０１９９】
(表３)Notchアゴニスト
2019507802.tif 000010
【０２００】
一部の態様では、Lgr5+幹細胞の増殖を推進するために幹細胞性推進剤が用いられる場合がある。場合によっては、分化阻害剤が有効分化阻害濃度で存在しなければ、幹細胞性推進剤はLGR5+細胞から有毛細胞への分化も誘導する場合がある。増殖と分化を両方とも推進する可能性のある幹細胞性推進剤の一例にはGSK3α阻害剤が含まれる。一部の態様では、分化阻害剤はHDAC阻害剤(またはその誘導体もしくは薬学的に許容される塩)でもよく、Notchアゴニスト(またはその誘導体もしくは薬学的に許容される塩)でもよい。一部の態様では、分化阻害剤はバルプロ酸(またはその誘導体もしくは薬学的に許容される塩)である。特定の態様では、幹細胞集団はインビボ対象の幹細胞集団であり、前記方法は難聴および/または前庭機能不全の処置である（例えば、増殖した幹細胞の集団から内耳有毛細胞が発生すると難聴が部分的もしくは完全に回復する、および/または前庭機能が改善する）。特定の態様では、幹細胞集団はインビボ対象の幹細胞集団であり、前記方法は、（例えば、難聴および/または前庭機能不全に関連しない疾患および/または障害を処置するために）対象にとって既知の安全な最大薬物投与量（例えば、この方法に起因する内耳有毛細胞の発生の非存在下で送達される場合の既知の安全な最大薬物投与量）よりも高い濃度の薬物を（例えば、この薬物の用量制限聴器毒性が低減したか、または無くなったために）対象に送達する工程をさらに含む。
【０２０１】
特定の態様では、前記方法は、発生した内耳有毛細胞を用いてハイスループットスクリーニングを行う工程をさらに含む。特定の態様では、前記方法は、発生した内耳有毛細胞を用いて、内耳有毛細胞に対する毒性があるかどうか分子をスクリーニングする工程を含む。特定の態様では、前記方法は、発生した内耳有毛細胞を用いて、内耳有毛細胞の生存を改善する能力があるかどうか分子をスクリーニングする工程（例えば、前記分子に曝露された内耳有毛細胞の生存を改善する能力があるかどうか分子をスクリーニングする工程）を含む。
【０２０２】
一部の局面において、本開示は、増殖した幹細胞の集団を生成する方法であって、GSK3α阻害剤（例えば、表1に開示されるGSK3α阻害剤）を、任意で分化阻害剤と組み合わせて、幹細胞集団（例えば、インビトロ、エクスビボ、もしくはインビボ試料/対象の幹細胞集団）に投与するか、または該GSK3α阻害剤が、任意で分化阻害剤との組み合わせで、該幹細胞集団に投与されるようにする、工程を含む、方法に関する。一部の態様では、分化阻害剤はHDAC阻害剤またはNotchアゴニストである。一部の態様では、分化阻害剤はバルプロ酸である。
【０２０３】
特定の態様では、投与する工程は、耳に1回または複数回注射することによって（例えば、中耳および/または内耳に経鼓膜注射することによって）行われる。
【０２０４】
特定の態様では、投与する工程は、GSK3α阻害剤を持続的に投与する工程を含む。一部の態様では、投与する工程は分化阻害剤をGSK3α阻害剤と組み合わせて投与する工程をさらに含む。一部の態様では、GSK3α阻害剤と分化阻害剤は単一の組み合わせ組成物として投与される。一部の態様では、GSK3α阻害剤と分化阻害剤は別々の組成物として連続して投与される。
【０２０５】
特定の態様では、投与する工程は、GSK3α阻害剤を持続的に投与する工程を含み、投与する工程は、HDAC阻害剤またはNotchアゴニストをGSK3α阻害剤と組み合わせて投与する工程をさらに含む。一部の態様では、GSK3α阻害剤とHDAC阻害剤またはNotchアゴニストは単一の組み合わせ組成物として投与される。一部の態様では、GSK3α阻害剤とHDAC阻害剤またはNotchアゴニストは別々の組成物として連続して投与される。
【０２０６】
特定の態様では、投与する工程は、GSK3α阻害剤を持続的に投与する工程を含み、投与する工程は、バルプロ酸をGSK3α阻害剤と組み合わせて投与する工程をさらに含む。一部の態様では、GSK3α阻害剤とバルプロ酸は単一の組み合わせ組成物として投与される。一部の態様では、GSK3α阻害剤とバルプロ酸は別々の組成物として連続して投与される。
【０２０７】
特定の態様では、幹細胞は内耳の幹細胞および/または支持細胞である。
【０２０８】
特定の態様では、前記方法は、幹細胞の発生した増殖した集団を用いてハイスループットスクリーニングを行う工程をさらに含む。特定の態様では、前記方法は、発生した幹細胞を用いて、幹細胞および/またはその子孫に対する毒性があるかどうか分子をスクリーニングする工程をさらに含む。特定の態様では、前記方法は、発生した幹細胞を用いて、幹細胞および/またはその子孫の生存を改善する能力があるかどうか分子をスクリーニングする工程を含む。
【０２０９】
一部の局面において、本開示は、難聴および/もしくは前庭機能不全を有するかまたはその発症リスクのある対象を処置する方法であって、難聴および/もしくは前庭機能不全を経験したことがあるかまたはその発症リスクがある対象を特定する工程、GSK3α阻害剤を（任意で分化阻害剤と共に）投与するか、またはGSK3α阻害剤が（任意で分化阻害剤と共に）投与されるようにする、工程を含む、方法に関する。一部の態様では、分化阻害剤はHDAC阻害剤またはNotchアゴニストである。一部の態様では、分化阻害剤はバルプロ酸である。
【０２１０】
特定の態様では、幹細胞集団はLgr5+細胞を含む。特定の態様では、幹細胞集団は出生後細胞を含む。特定の態様では、幹細胞集団は上皮幹細胞を含む。特定の態様では、幹細胞は前駆細胞を含む。
【０２１１】
特定の態様では、投与する工程は、VPA（例えば、薬学的に許容される形（例えば、塩））を対象に投与する工程またはVPAが対象に投与されるようにする工程を含む。特定の態様では、投与する工程は、耳に1回または複数回注射することによって（例えば、中耳および/または内耳に経鼓膜注射することによって）行われる。
【０２１２】
一部の局面において、本開示は、内耳有毛細胞を発生させる方法であって、（例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ試料/対象の）初期幹細胞集団内の幹細胞を増殖させて、（例えば、増殖した集団が初期幹細胞集団よりも少なくとも1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、5倍、10倍、または20倍多くなるように）増殖した幹細胞の集団を得る工程;および増殖した幹細胞の集団から内耳有毛細胞の発生を促進する工程を含む、方法に関する。
【０２１３】
一部の局面において、本開示は、内耳有毛細胞を発生させる方法であって、GSK3α阻害剤（例えば、薬学的に許容される形（例えば、塩））を、対象の耳にある細胞集団に投与し、それによって、内耳有毛細胞の発生を促進する工程を含む、方法に関する。
【０２１４】
一部の局面において、本開示は、内耳有毛細胞を発生させる方法であって、（例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ試料/対象の）初期集団内の出生後LGR5+細胞を増殖させて、（例えば、増殖した集団が初期幹細胞集団よりも少なくとも1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、5倍、10倍、または20倍多くなるように）LGR5+細胞の増殖した集団を得る工程であって、このLGR5+細胞の増殖した集団から内耳有毛細胞が発生する、工程を含む、方法に関する。特定の態様では、幹細胞は前駆細胞を含む。
【０２１５】
一部の局面において、本開示は、疾患または障害を処置する方法であって、対象（インビボ）の初期集団内の出生後Lgr5+上皮細胞を増殖させて、（例えば、増殖した集団が初期出生後Lgr5+上皮細胞集団よりも少なくとも1.25倍、1.5倍、1.75倍、2倍、3倍、5倍、10倍、または20倍多くなるように）Lgr5+上皮細胞の増殖した集団を得る工程を含む、方法に関する。
【０２１６】
一部の態様では、Lgr5+細胞は有毛細胞に分化される。
【０２１７】
組成物および投与
特定の態様は、薬学的に許容される担体と、GSK3α阻害剤またはその薬学的に許容される塩である幹細胞増殖因子を含む、薬学的組成物、予防用組成物、または治療用組成物に関する。一部の態様では、上記のように、組成物は、内耳および/または中耳への投与、例えば、正円窓膜への局所投与または鼓室内投与もしくは経鼓膜投与、例えば、蝸牛組織への鼓室内投与もしくは経鼓膜投与に適している。
【０２１８】
「薬学的に許容される」という句は、適切な医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、過敏、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を引き起こすことなくヒトおよび動物の組織との接触における使用に適しており、妥当なベネフィット/リスク比に見合った化合物、材料、組成物、および/または剤形を指すために本明細書において用いられる。
【０２１９】
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤」は、ヒトまたは家畜での使用が受け入れられると米食品医薬品局により認可された任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動化剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、色素/着色剤、風味相乗剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、または乳化剤を含むが、それに限定されるわけではない。例示的な薬学的に許容される担体には、糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース;デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン;セルロースおよびその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、および酢酸セルロース;トラガカントゴム;麦芽;ゼラチン;タルク;カカオ脂、ろう、動物性脂肪および植物性脂肪、パラフィン、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、酸化亜鉛;油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油;グリコール、例えば、プロピレングリコール;ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール;エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル;寒天;緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム;アルギン酸;発熱物質を含まない水;等張食塩水;リンゲル液;エチルアルコール;リン酸緩衝液;ならびに薬学的製剤において用いられる他の任意の適合性物質が含まれるが、これに限定されない。
【０２２０】
特定の組成物は少なくとも1種類の生体適合性マトリックスを含む。本明細書で使用する「生体適合性マトリックス」という用語は、治療剤を放出するためにヒトへの投与が許容されているポリマー担体である。場合によっては、生体適合性マトリックスは生体適合性ゲルでも生体適合性発泡体でもよい。
【０２２１】
特定の組成物は少なくともポロキサマーを含む。ポロキサマーは、ポリ(オキシエチレン)-ポリ(オキシプロピレン)-ポリ(オキシエチレン)のトリブロックとして構築される、(すなわち、親水性ポリ(オキシエチレン)ブロックと疎水性ポリ(オキシプロピレン)ブロック)から形成されるトリブロックコポリマーである。ポロキサマーは、プロピレンオキシドブロック疎水性物質とエチレンオキシド親水性物質を有するブロック共重合体界面活性剤の一種である。ポロキサマーは市販されている（例えば、Pluronic（登録商標）ポリオールはBASF Corporationから入手可能である）。または、ポロキサマーは公知の技法によって合成することができる。
【０２２２】
例示的なポロキサマーには、ポロキサマー124、ポロキサマー188、ポロキサマー237、ポロキサマー338、およびポロキサマー407が含まれる。一部の態様では、ポロキサマーは、ポロキサマー124、ポロキサマー188、ポロキサマー237、ポロキサマー338、またはポロキサマー407のうち2つ以上の混合物を含む。一部の態様では、2つ以上のポロキサマーの混合物はポロキサマー407およびポロキサマー124を含む。特定の態様において、ポロキサマーは、ポロキサマー188およびポロキサマー407のうちの少なくとも1つ、またはそれらの混合物を含む。一部の態様では、ポロキサマーはポロキサマー407である。
【０２２３】
一部の態様では、ポロキサマーの濃度は、前記組成物に対して約5wt％〜約25wt％であるか、または前記組成物に対して約5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、11wt％、12wt％、13wt％、14wt％、15wt％、16wt％、17wt％、18wt％、19wt％、20wt％、21wt％、22wt％、23wt％、24wt％、もしくは25wt％である。特定の態様では、ポロキサマーの濃度は前記組成物に対して約10wt％〜約23wt％である。一部の態様では、ポロキサマーの濃度は前記組成物に対して約15wt％〜約20wt％である。特定の態様において、ポロキサマーの濃度は前記組成物に対して約17wt％である。
【０２２４】
一部の態様では、湿潤剤、乳化剤、および潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、離型剤、コーティング薬剤、甘味剤、着香剤および芳香剤、防腐剤および抗酸化物質も前記組成物に存在してよい。
【０２２５】
特定の組成物は少なくとも1種類の抗酸化物質を含む。薬学的に許容される抗酸化物質の例には、(1)水溶性抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど;(2)油溶性抗酸化物質、例えば、アスコルビン酸パルミテート、ブチルヒドロキシアニソール(BHA)、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロールなど;および(3)金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。
【０２２６】
特定の態様では、体温付近での前記組成物の粘度は、室温での前記組成物の粘度とはかなり異なる（例えば、室温での前記組成物の粘度よりも小さい、室温での前記組成物の粘度よりも大きい）。
【０２２７】
一部の態様では、前記組成物は緩衝液を含む。例えば、特定の場合では、緩衝液は生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水(PBS)である。
【０２２８】
一部の態様では、前記組成物は生理学的pHにあるか、生理学的pH付近にある。例えば、一部の態様では、前記組成物のpHは、全ての整数、小数値、およびこの間にある範囲、例えば、約6〜約6.5〜約7〜約7.5〜約8を含む、約6〜約8である。特定の態様では、前記組成物のpHは約7.4(±0.2)である。
【０２２９】
特定の態様では、GSK3α阻害剤は、有効な、または別のやり方で規定された濃度または濃度範囲で薬学的組成物に存在する。例えば、特定の態様では、GSK3α阻害剤は、全ての整数およびこの間にある範囲を含めて、約0.01uM〜1000mM、約0.1uM〜1000mM、約1uM〜100mM、約10uM〜10mM、約1uM〜10uM、約10uM〜100uM、約100uM〜1000uM、約1mM〜10mM、もしくは約10mM〜100mMの濃度で；またはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.01〜1,000,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.1〜100,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1〜10,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜5000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約50〜2000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜1000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1000倍の濃度比で；または約0.01nM〜1000uM、約0.1nM〜1000uM、約1nM〜100uM、約10nM〜10uM、約1nM〜10nM、約10nM〜100nM、約100nM〜1000nM、約1uM〜10uM、もしくは約10uM〜100uMの濃度で、組成物中に存在する。一部の態様では、有効活性は、本明細書に記載のようにLgr5増殖アッセイにおいて測定される。
【０２３０】
一部の態様では、GSK3α阻害剤はGSK3阻害剤XXIIであり、GSK3阻害剤XXIIは、全ての整数およびこの間にある範囲を含めて、約0.1uM〜1000mM、約1uM〜100mM、10uM〜10mM、約100uM〜10mM、もしくは100uM〜1mM、または約1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、もしくは10mMの濃度で；あるいはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.1〜1,000,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1〜100,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約10〜10,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜1000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1000倍の濃度比で；あるいは約0.1nM〜1000uM、約1nM〜100uM、約10nM〜10uM、約100nM〜1uM、もしくは約0.5uMの濃度で、組成物中に存在する。一部の態様では、有効活性は、本明細書に記載のようにLgr5増殖アッセイにおいて測定される。
【０２３１】
特定の態様では、GSK3α阻害剤はAZD1080であり、AZD1080の濃度が、全ての整数およびこの間にある範囲を含めて、約0.1uM〜1000mM、約1uM〜1000mM、約10uM〜100mM、約100uM〜10mM、約1mM〜10mM、または約1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、もしくは10mMであるか；またはAZD1080の濃度比が、インビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.1〜1,000,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1〜100,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約10〜10,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜1000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1000倍であるか；あるいはAZD1080の濃度が、約1nM〜1000uM、約10nM〜1000uM、約100nM〜100uM、約1uM〜10uM、または約1uM、2uM、3uM、4uM、5uM、6uM、7uM、8uM、9uM、もしくは10uMである。一部の態様では、有効活性は、本明細書に記載のようにLgr5増殖アッセイにおいて測定される。
【０２３２】
特定の態様では、HDAC阻害剤は、有効な、または別のやり方で規定された濃度または濃度範囲で薬学的組成物に存在する。例えば、特定の態様では、HDAC阻害剤は、全ての整数およびこの間にある範囲を含めて、約0.01uM〜100,000mM、約1uM〜10,000mM、約10uM〜10,000mM、約100uM〜1000mM、約1uM〜10uM、約10uM〜100uM、約100uM〜1000uM、約1000uM〜10mM、約10mM〜100mM、約100mM〜1000mM、もしくは約1000mM〜10,000mMの濃度で；またはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.1〜1,000,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1〜100,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約10〜10,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜1000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1000倍の濃度比で；または約0.01nM〜100,000uM、約1nM〜10,000uM、約10nM〜10,000uM、約100nM〜1000uM、約1nM〜10nM、約10nM〜100nM、約100nM〜1000nM、約1uM〜10uM、約10uM〜100uM、約100uM〜1000uM、もしくは約1000uM〜10,000uMの濃度で、組成物中に存在する。一部の態様では、有効活性は、本明細書に記載のようにLgr5増殖アッセイにおいて測定される。
【０２３３】
一部の態様では、HDAC阻害剤はバルプロ酸であり、バルプロ酸の濃度が、全ての整数およびこの間にある範囲を含めて、約10uM〜100,000mM、約1mM〜10,000mM、約10mM〜10,000mM、約100mM〜10,000mM、約200mM〜2000mM、約1000mM、もしくは約600mMであるか；またはバルプロ酸の濃度比が、インビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約0.1〜1,000,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1〜100,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約10〜10,000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約100〜1000倍、もしくはインビトロ活性アッセイにおけるその有効活性に対して約1000倍であるか；またはバルプロ酸の濃度が、約10nM〜100,000uM、1uM〜10,000uM、約10uM〜10,000uM、約100uM〜10,000uM、約200uM〜2000uM、もしくは約1000uMである。一部の態様では、有効活性は、本明細書に記載のようにLgr5増殖アッセイにおいて測定される。
【０２３４】
本明細書に記載の化合物または組成物は、望ましい送達経路、例えば、経鼓膜注射、経鼓膜ウィックおよびカテーテル、蝸牛移植片、ならびに注射デポーに適した任意のやり方で処方することができる。場合によっては、組成物または製剤は、その誘導体またはプロドラッグ、溶媒和化合物、立体異性体、ラセミ体、または互変異性体を含む1種または複数種の生理学的に許容される成分と、任意の生理学的に許容される担体、希釈剤、および/または賦形剤を含む。
【０２３５】
上記で述べたように、特定の組成物は、中耳または内耳への投与、例えば、正円窓膜への局所投与に適しており、特定の方法は、中耳または内耳への投与、例えば、正円窓膜への局所投与を使用する。正円窓膜は内耳空間に対する生物学的障壁であり、聴力障害を局所的に処置するための大きな障害である。投与される薬物は、内耳空間に到達するためには、この膜を乗り越えなければならない。薬物は手術（例えば、鼓膜を通過する注射）により正円窓膜に局所的に配置することができ、次いで、正円窓膜を通り抜けることができる。正円窓を通り抜けた物質は典型的には外リンパの中に分布し、従って、有毛細胞および支持細胞に到達する。
【０２３６】
薬学的組成物または製剤はまた、本明細書において言及された薬剤が正円窓膜を通過するのを助ける膜浸透促進剤も含有してよい。従って、液体、ゲル、または発泡体製剤が用いられてもよい。活性成分を経口的に適用すること、または送達アプローチの組み合わせを使用することも可能である。
【０２３７】
特定の組成物は、中耳または内耳への投与、例えば、鼓室内投与または経鼓膜投与による中耳または内耳への投与に適しており、特定の方法は、中耳または内耳への投与、例えば、鼓室内投与または経鼓膜投与による中耳または内耳への投与を使用する。薬物の耳への鼓室内(IT)送達は臨床目的と研究目的の両方で用いられることが多くなっている。いくつかのグループは、マイクロカテーテルおよびマイクロウィック(microwick)を用いて薬物を持続的に適用したが、大多数は、単回IT注射として、または(2週間までの期間にわたって8回の注射まで)繰り返しIT注射することで薬物を適用した。
【０２３８】
鼓室内に適用された薬物は、主として正円窓(RW)膜を通過することによって内耳液に入ると考えられている。計算から、耳に入る薬物の量と、耳の長さに沿った薬物の分布を両方とも制御する主な因子は、薬物が中耳空間に残存する期間であることが分かっている。水溶液を単回「ワンショット」適用するか、または数時間にわたって適用すると、蝸牛の長さに沿って、適用された物質の急な薬物勾配が生じ、その後に、薬物が耳全体に分布するようになるので、蝸牛の基底回転(basal turn)での濃度が急激に低下する。
【０２３９】
他の注射アプローチには、浸透圧ポンプによる注射アプローチ、または移植された生体材料との組み合わせによる注射アプローチ、より好ましくは、注射または注入による注射アプローチが含まれる。放出反応速度および薬物分布の制御に役立つことができる生体材料には、ヒドロゲル材料、分解性材料が含まれる。最も好ましく用いられる材料の1つの種類にはインサイチューでゲル化する材料が含まれる。可能性のある全ての材料および方法が、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、参考文献
2019507802.tif 000011
において述べられている。他の材料には、コラーゲン、またはフィブリン、ゼラチン、および脱細胞(decelluarized)組織を含む他の天然材料が含まれる。ゲルフォーム(Gelfoam)も適している場合がある。
【０２４０】
送達はまた、送達される組成物に添加される薬剤、例えば、膜浸透促進剤を含むが、これに限定されない他の手段を介して強化されてもよく、超音波、エレクトロポレーション、または高速噴流を介して装置を通り抜けてもよい。
【０２４１】
本明細書に記載の方法はまた、PCT出願番号WO2012103012A1に記載の細胞タイプを含む、当業者に公知の様々な方法を用いて生成され得る内耳細胞タイプにも使用することができる。
【０２４２】
ヒトおよび動物の処置について、投与される特定の薬剤の量は、処置されている障害および障害の重篤度;使用される特定の薬剤の活性;患者の年齢、体重、身体全体の健康、性別、および食事;使用される特定の薬剤の投与時間、投与経路、および排出速度;処置期間;使用される特定の薬剤と組み合わせて用いられる、または同時に用いられる薬物;処方している医師または獣医師の判断;ならびに医学分野および獣医学分野において公知の同様の要因を含む様々な要因によって決まる場合がある。
【０２４３】
本明細書に記載の薬剤は、処置を必要とする対象に治療有効量で投与されてもよい。本明細書に記載の組成物（例えば、1種または複数種のGSK3α阻害剤と、任意で、分化阻害剤（例えば、（例えば、NotchアゴニストまたはHDAC阻害剤、例えば、バルプロ酸）を含む組成物）の投与は、適切な任意の投与経路を介するもの、例えば、鼓室内投与によるものでよい。他の経路には、摂取、または非経口経路、例えば、静脈内経路、動脈内経路、腹腔内経路、くも膜下腔内経路、脳室内経路、尿道内経路、胸骨内経路、頭蓋内経路、筋肉内経路、鼻腔内経路、皮下経路、舌下経路、経皮経路、または吸入もしくはガス注入による経路、または外耳道および鼓膜の皮膚を通って吸収させるための耳滴下による局部経路が含まれる。このような投与は、単回または複数回の経口投与、規定された回数の点耳剤、あるいはボーラス注射、複数回の注射、または短期もしくは長期の注入としての投与でもよい。等量の、または異なる投与量の特定の製剤をある期間にわたって周期的に非経口送達するために植込み型装置（例えば、植込み型注入ポンプ）も用いられる場合がある。このような非経口投与の場合、化合物は、好ましくは、水または別の適切な溶媒もしくは溶媒混合物に溶解した滅菌溶液として処方される。溶液は、他の物質、例えば、溶液を血液と同じ浸透圧にする目的で塩、糖（特にグルコースまたはマンニトール）、緩衝剤、例えば、酢酸、クエン酸、および/またはリン酸ならびにそのナトリウム塩、ならびに防腐剤を含有してもよい。
【０２４４】
本明細書に記載の組成物は、前記組成物を内耳に送達するのに十分な多数の方法によって投与することができる。組成物の内耳への送達は、前記組成物が正円窓を通って内耳に拡散し得るように前記組成物を中耳に送達することを含む。組成物の内耳への送達はまた、正円窓膜を通り抜けて直接注射することによって組成物を内耳に送達することも含む。このような方法には、経鼓膜ウィックもしくはカテーテルによる耳介投与、または非経口投与、例えば、耳介内注射、経鼓膜注射、もしくは蝸牛内注射による非経口投与が含まれるが、これに限定されない。
【０２４５】
特定の態様では、本開示の化合物、組成物、および製剤は局所投与される。局所投与とは、全身に投与されないことを意味する。
【０２４６】
一態様では、耳介投与を用いて化合物または組成物を対象に投与するための注射器および針器具が用いられる。適切な大きさの針を用いて鼓膜に穴をあけ、穴があいた鼓膜を通って対象の中耳の中に、前記組成物を含むウィックまたはカテーテルを挿入する。この装置は、正円窓と接触するように、または正円窓のすぐ隣にあるように挿入されてもよい。耳介投与に用いられる例示的な装置には、経鼓膜ウィック、経鼓膜カテーテル、正円窓マイクロカテーテル(正円窓に薬を送達する小さなカテーテル)、およびSilverstein Microwicks(商標)(対象または医療従事者による調節を可能にする小さなチューブ。チューブから正円窓まで「ウィック」が通っている)が含まれるが、これに限定されない。
【０２４７】
一部の態様では、鼓膜を通って中耳および/または内耳に入る注射である経鼓膜注射を用いて化合物または組成物を対象に投与するための注射器および針器具が用いられる。この製剤は経鼓膜注射を介して正円窓膜に直接投与されてもよく、蝸牛内注射を介して蝸牛に直接投与されてもよく、前庭内注射を介して前庭器官に直接投与されてもよい。
【０２４８】
一部の態様では、送達装置は、化合物または組成物を中耳および/または内耳に投与するように設計された器具である。ほんの一例として、GYRUS Medical GmbHは、正円窓小窩(round window niche)の視覚化用および正円窓小窩への薬物送達用にマイクロオトスコープを提供している。Arenbergは、米国特許第5,421,818号;同第5,474,529号;および同第5,476,446号において内耳構造に液体を送達するための医学的処置装置について説明している。これらはそれぞれ、このような開示のために参照により本明細書に組み入れられる。このような開示のために参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第08/874,208号は、組成物を内耳に送達するために液体導入管を移植するための外科的方法について説明している。さらに、このような開示のために参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2007/0167918号は、経鼓膜で液体をサンプリングし、医用薬剤を適用するための耳吸引器(otic aspirator)と薬物ディスペンサーの組み合わせについて説明している。
【０２４９】
一部の態様では、本明細書において開示される化合物または組成物は、これを必要とする対象に1回投与される。一部の態様では、本明細書において開示される化合物または組成物は、これを必要とする対象に1回より多く投与される。一部の態様では、本明細書において開示される化合物または組成物の第1の投与の後に、本明細書において開示される化合物または組成物の第2の投与、第3の投与、第4の投与、または第5の投与が行われる。
【０２５０】
化合物または組成物を必要とする対象に化合物または組成物が投与される回数は、医療従事者の裁量、障害、障害の重篤度、および製剤に対する対象の応答によって決まる。一部の態様では、本明細書において開示される化合物または組成物は、これを必要とする軽度の急性状態にかかっている対象に1回投与される。一部の態様では、本明細書において開示される化合物または組成物は、これを必要とする中程度または重度の急性状態にかかっている対象に1回より多く投与される。対象の状態が改善しない場合、対象の疾患または状態の症状を寛解させるために、または別のやり方で管理もしくは制限するために、化合物または組成物は医師の裁量で長期にわたって、すなわち、対象の一生涯を含めて長い期間にわたって投与されることがある。
【０２５１】
対象の状態が改善する場合、化合物または組成物は医師の裁量で連続して投与されることがある。または、投与されている薬物の用量は一時的に減らされてもよく、特定の時間にわたって一時的に中断されてもよい(すなわち、「休薬期間」)。休薬期間の長さは、ほんの一例として、2日、3日、4日、5日、6日、7日、10日、12日、15日、20日、28日、35日、50日、70日、100日、120日、150日、180日、200日、250日、280日、300日、320日、350日、および365日を含めて2日〜1年まである。休薬期間中の用量の減量は、ほんの一例として、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、および100％を含めて10％〜100％でもよい。
【０２５２】
対象の聴覚および/または平衡が改善したら、必要であれば維持量を投与することができる。その後に、任意で、症状の関数として、投与量もしくは投与頻度またはその両方を、改善した疾患、障害、または状態が保たれる水準まで少なくする。特定の態様では、症状が再発したら、対象は長期的に断続的な処置を必要とする。
【実施例】
【０２５３】
アッセイ:マウス系統
Lgr5-EGFP-IRES-Cre-ERマウス(Barker et al.,2007)(http://jaxmice.jax.org/strain/008875.html)を用いて、蝸牛幹細胞増殖に対する低分子の効果を分析した。Atoh1-nGFPマウス(Lumpkin et al.,2003)(Dr. Jane Johnsonにより提供)を用いて、分化した有毛細胞を特定した。
【０２５４】
内耳からの幹細胞の単離：  全ての動物試験を、米国立衛生研究所のガイドラインに従って、承認された施設プロトコールの下で行った。新生仔マウス(生後1〜3日目)を用いた実験のために、蝸牛をHBSS中で解剖し、血管条および蝸牛軸からコルチ器官を分離した。次いで、蝸牛上皮を、その下にある間葉から分離するために、コルチ器官をCell Recovery Solution (Corning)で1時間処置した。次いで、上皮を収集し、TrypLE (Life Technologies)で37℃で15〜20分間処置した。機械的にすりつぶすことで入手した単一細胞を濾過し(40μm)、3D培養のためにマトリゲル (Corning)に懸濁した。
【０２５５】
Lgr5陽性細胞の増殖
Glutamax(GIBCO)、N2、B27(Invitrogen)、EGF(50 ng/mL; Chemicon)、bFGF(50 ng/mL; Chemicon)、IGF1(50ng/mL; Chemicon)、およびGSK3α阻害剤を加えた、DMEMとF12の1:1混合物中で細胞を培養した。培地を1日おきに交換した。
【０２５６】
Lgr5陽性前駆細胞の分化：  分化を推進する分子を添加して、または分化を推進する分子を添加することなく増殖因子を除去した後に、幹細胞コロニーを、Glutamax(GIBCO)、N2、B27(Invitrogen)を加えた、DMEMとF12の1:1混合物中で分化させた。分化にする効果を試験するために低分子を培養物に添加した。3μMのGSK3α阻害剤を用いて最適な分化条件を実現した。
【０２５７】
分析
複数の条件で培養して10日後(D10)にLgr5陽性細胞を定量した。TrypLE(Gibco)を用いて細胞コロニーを解離して単一細胞にした。次いで、細胞をヨウ化プロピジウム(PI)で染色し、Lgr5-GFP発現についてフローサイトメーターを用いて分析した。GFP陽性細胞の数およびGFP陽性細胞のパーセントを定量した。
【０２５８】
分化した有毛細胞の数を求めるために、分化処置をして0日目(D0)および10日目(D10)にAtoh1-nGFP陽性細胞を定量した。マトリゲルからコロニーを外すために、細胞コロニーをCell Recovery Solution中でインキュベートし、TrypLEを用いて解離して単一細胞にした。複数の培養条件についてGFP陽性細胞の総数およびパーセントをフローサイトメーターを用いて定量した。ANOVAを用いて複数の条件間で平均を比較し、両側スチューデントt検定を用いて、各条件と、収率が最も高い処置を比較した。
【０２５９】
実施例1
細胞培養：  ヘテロ接合性Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2(Lgr5-GFP)マウスをJackson Labsから入手し、細胞を単離するために新生仔P2-P5マウスを使用した。コルチ器官をLgr5-GFPマウスから単離し、さらに、Tryple(Life Technologies)を用いて解離して単一細胞にした。次いで、以前に述べられたように(Yin et al, 2014)、細胞を培養した。簡単に述べると、細胞をマトリゲルに閉じ込め、24ウェルプレートにあるウェルの中心にプレートした。マトリゲルを重合した後に、EGF(50ng/ml)(上皮細胞増殖因子)、bFGF(50ng/ml)(線維芽細胞増殖因子)、およびIGF1(50ng/ml)(インシュリン様増殖因子1)を含む増殖因子、バルプロ酸ナトリウム塩(1mM)、ならびにCHIR99021(3μM)、またはAZD1080(様々な濃度)、またはGSK3阻害剤XXII(様々な濃濃度)を含む低分子を含有する、培養培地(N2およびB27を含むAdvanced DMEM/F12)500μlを添加した。
【０２６０】
単一細胞を単離するために、蝸牛を耳嚢から単離し、蝸牛軸組織(聴神経)および血管条(イオン輸送上皮)を除去した。次いで、コルチ器官をTryple(Life Technologies)の中に37℃で15〜20分間、入れた。機械的にすりつぶすことで入手した単一細胞をセルストレーナー(40μm)で濾過した。次いで、単一細胞をマトリゲル中で混合し、3D培養系において培養した。3D培養の中にLgr5細胞を含有する各ウェルには、バックグラウンド増殖因子およびVPAの存在下で、CHIR99021、AZD1080、またはGSK阻害剤XXIIを前記のように添加した。
【０２６１】
Lgr5細胞の定量：  細胞培養培地を除去し、Trypleを添加した。37℃で15〜20分間インキュベートした後に、機械的すりつぶしを用いてコロニーを解離して単一細胞にした。PI染色およびLgr5-GFPを用いてLgr5-GFP生細胞の数を計数した。
【０２６２】
蝸牛外植片での研究の場合、Lgr5-GFPマウスから単離したコルチ器官をCHIR99021+VPAまたはGSK3阻害剤XXII+VPAで3日間処置した。コルチ器官をカバーガラス上にプレートし、薬物を含有する培地に浸した。増殖因子は存在しなかった。CHIR99021(3uM)、GSK3阻害剤XXII(.3uM)、VPA(1mM)。
【０２６３】
マウスでの研究の場合、ポロキサマー407ゲル(Sigma-Aldrich)の17〜19％(w/w)原液を、pH7.4の冷1xリン酸緩衝食塩水にゆっくりと添加することによって調製した。この溶液は、冷蔵時または室温では液体であるが、体温では固化する。投与の間、視覚化するために、ゲルをエバンスブルー色素(50ppm)で青色に着色した。
【０２６４】
次いで、87.6mg/mlのVPAと55.6mg/mlのCHIR99021または87.6mg/mlのVPAと50mg/mlのGSK3阻害剤XXIIを、5％DMSOを含む17〜19％ポロキサマー407に溶解して製剤を調製した。
【０２６５】
CBA/CaJマウスをノイズチャンバーに入れて、120dB SPLで2時間、8〜16kHzオクターブ帯域の騒音帯域に曝露することによって聴覚喪失させた。騒音曝露して24時間後に、聴性脳幹反応(ABR)を測定することでマウスの聴覚を評価した。ABR波Iの目視による検出に必要な最小音圧レベル(SPL)は、5kHz、10kHz、20kHz、28.3kHz、および40kHzで確かめられた。ABR測定後に、中耳空洞を満たすためにポロキサマーゲル薬物混合物の経鼓膜注射を送達した。30日後にABRを評価し、騒音曝露の24時間後から30日後にかけて聴覚閾値の改善が確かめられた。結果を図4に示した。
【０２６６】
結果
Lgr5細胞は、蝸牛上皮内にある支持細胞サブセットの中に存在する。Lgr5-GFPマウス系統を用いて、本発明者らは、蝸牛から単離したシングルLgr5+支持細胞をマトリゲルをベースとする3D培養系において増殖させるために、複数種のGSK3α阻害剤およびGSK3β阻害剤の活性化または阻害を試験した。内耳上皮細胞は、上皮細胞増殖因子(EGFまたはE)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGFまたはF)、およびインシュリン様増殖因子1(IGF-1またはI)を含む増殖因子の存在下でニューロスフェアとして培養できることが示されている(Li et al., 2003)。しかしながら、この条件ではLgr5-GFP細胞増殖は観察されない。EGF、bFGF、およびIGF-1を添加すると共に、CHIR99021(CHIRまたはC)とヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤であるバルプロ酸(VPAまたはV)の組み合わせを用いてグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)阻害剤を阻害すると、蝸牛Lgr5細胞におけるLgr5細胞増殖が向上することが示されている(McLean et al.)。ここでは、図に示したように、CHIR99021よりも強いGSKα阻害優先度を有する分子がLgr5-GFP細胞の増殖を促進することが見出され、EGF、bFGF、IGF-1、およびVPAがバックグラウンドにある、AZD1080とGSK阻害剤XXIIの培養物では大きなLgr5-GFP+細胞コロニーが観察された(図1Aおよび図2A)。フローサイトメトリー分析からも、CHIRとVPAの組み合わせが、バックグラウンド増殖因子の中でのAZD108とVPAまたはGSK阻害剤XXIIとVPAと同様にLgr5-GFP細胞数を増加させることが明らかになった(図1Bおよび図2B)。
【０２６７】
CHIR99021と比較してGSK3α阻害優先度が高い分子(GSK3阻害剤XXII)をVPA(V)と併用してエクスビボで処置したコルチ器官は、有毛細胞数が増加したという証拠を示した。
【０２６８】
騒音で傷つけられた内耳に、CHIR99021と比較してGSK3α阻害優先度が高い分子(GSK3阻害剤XXII)をVPA(V)と組み合わせて投与すると、聴覚が回復した、という証拠が示された。
【０２６９】
図1および図2に示したように、増殖因子(GF)、VPA(V)、およびGSK3阻害剤を含有するカクテルはインビトロでLgr5+内耳前駆細胞の増殖およびGFP発現を促進し、これらの増殖を可能にした。
【０２７０】
図3の結果から、CHIR99021よりもGSK3α阻害優先度が高い分子(GSK3阻害剤XXII)をVPA(V)と組み合わせてエクスビボで処置したコルチ器官では有毛細胞数が増加したことが分かる。
【０２７１】
図4の結果から、騒音で傷つけられたCBA/CaJマウスにおいて聴覚が回復したことが分かる。具体的には、GSK3α阻害優先度が高い分子であるGSK3XXII+VPAを用いた処置はCHIR99021+VPA(CV)よりも良好に聴覚を回復した。閾値の10dB改善は、特定の音についてラウドネス(loudness)を2倍にし、臨床上意味があるとみなされる。CV製剤は10dBの回復を実現した。これに対して、VPA/GSK3阻害剤XXII製剤はもっと大きな回復を実現した。
【０２７２】
前述の説明から、本明細書に記載の発明を様々な使用および条件に取り入れるために、本明細書に記載の発明に変更および修正が加えられ得ることは明らかである。本発明において使用するための方法および材料が本明細書において説明される。当技術分野において公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。前記の材料、方法、および実施例は例示に過ぎず、限定することが意図されない。このような態様も以下の特許請求の範囲の範囲内である。本明細書における変数の任意の定義における要素の一覧の説明は、任意の1つの要素として、または列挙された要素の組み合わせ(もしくはサブコンビネーション(subcombination))として、その変数を定義することを含む。本明細書における態様の説明は、その態様を任意の1つの態様として、または他の任意の態様もしくはその一部と組み合わせて含む。本明細書において言及された全ての特許、公開された出願、および参考文献の開示は、その全体が参照により組み入れられる。本発明は、特に、その例となる態様について示され、説明されたが、添付の特許請求の範囲が包含する本発明の範囲から逸脱することなく、本発明に形状および細部の様々な変化が加えられ得ることが当業者に理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月1日(2018.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019507802000001.app
【国際調査報告】
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2019507802.tif 000018