(57)【要約】  本発明は、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に結合する特性を有し、前記ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する結合親和力は、野生型ＴＣＲがＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する結合親和力の少なくとも２倍であるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。本発明は、このようなタイプのＴＣＲと治療剤との融合分子をさらに提供する。このようなタイプのＴＣＲは、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体腫瘍細胞を標的化して提示させるために、単独で使用することができ、治療剤と併用することもできる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に結合する活性を有し、前記Ｔ細胞受容体は、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ領域の基準配列は、以下の通りであり、
ＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ
ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥ
ＣＤＲ３α：ＡＴＤＡＮＧＫＩＩ、また少なくとも１つの下記の突然変異を含み、
2019535328.tif 000027
および／または、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ領域の基準配列は、以下の通りであり、
ＣＤＲ１β：ＳＧＨＤＹ
ＣＤＲ２β：ＦＮＮＮＶＰ
ＣＤＲ３β：ＡＳＳＬＧＳＮＥＱＹ、また少なくとも１つの下記の突然変異を含む、前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）。
2019535328.tif 000028
【請求項２】
ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に結合する活性を有し、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲは、配列番号：１に示されるα鎖可変ドメインにおいて突然変異され、前記突然変異のアミノ酸残基のサイトは、２７Ｔ、２８Ｓ、２９Ｉ、３０Ｎ、５１Ｓ、５２Ｎ、５３Ｅ、５４Ｒ、９０Ａ、９１Ｔ、９３Ａ、９４Ｎ、９５Ｇ、９６Ｋ、９７Ｉ及び９８Ｉ中の１つまたは複数を含み、アミノ酸残基の番号は、配列番号：１に示される番号を使用し、および／または前記ＴＣＲは、配列番号：２に示されるβ鎖可変ドメインにおいて突然変異され、前記突然変異のアミノ酸残基のサイトは、５１Ｎ、５２Ｎ、５３Ｖ、５４Ｐ、９５Ｓ、９６Ｌ及び９８Ｓ中の１つまたは複数を含み、アミノ酸残基の番号は、配列番号：２に示される番号を使用し、
好ましくは、突然変異後の前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、２７Ｇ、２８Ｗ、２９Ａまたは２９Ｖ、３０Ｑ、５１Ｔ、５２Ｇ、５３Ｑ、５４Ｑまたは５４Ａ、９０Ｍ、９１Ｙ、９３Ｅまたは９３Ｑ、９４Ｆまたは９４Ｙまたは９４Ｗ、９５Ａまたは９５Ｑ、９６Ｗまたは９６Ｒまたは９６Ｔまたは９６Ｓまたは９６Ｍまたは９６Ｌ、９７Ｗまたは９７Ｖまたは９７Ｙまたは９７Ｐ、及び９８Ｅまたは９８Ｎまたは９８Ｄまたは９８Ｑまたは９８Ｋまたは９８Ｖまたは９８Ｇまたは９８Ｍまたは９８Ｓから選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基の番号は、配列番号：１に示される番号を使用し、および／または突然変異後の前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、５１Ｈ、５２Ｇ、５３Ａ、５４Ｖ、９５Ｑまたは９５Ｍ、９６Ｒまたは９６Ｋまたは９６Ｍ、及び９８Ａまたは９８Ｇまたは９８Ｐから選択される１つまたは複数のアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基の番号は、配列番号：２に示される番号を使用することを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３】
前記ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体の親和力は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍であることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項４】
前記ＴＣＲのα鎖可変ドメインは、配列番号：１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲのβ鎖可変ドメインは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項５】
前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、包含ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β及びＣＤＲ３βを含み、前記ＣＤＲ１βは、ＳＧＨＤＹ配列を含むことを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項６】
前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β及びＣＤＲ３βを含み、
前記ＣＤＲ２βは、ＦＮ［２βＸ１］［２βＸ２］［２βＸ３］［２βＸ４］配列を含み、［２βＸ１］、［２βＸ２］、［２βＸ３］、及び［２βＸ４］は、それぞれ独立して任意の天然アミノ酸残基から選択されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項７】
前記［２βＸ１］は、ＮまたはＨであることを特徴とする
請求項６に記載のＴＣＲ。
【請求項８】
前記［２βＸ２］は、ＮまたはＧであることを特徴とする
請求項６に記載のＴＣＲ。
【請求項９】
前記［２βＸ３］は、ＶまたはＡであることを特徴とする
請求項６に記載のＴＣＲ。
【請求項１０】
前記［２βＸ４］は、ＰまたはＶであることを特徴とする
請求項６に記載のＴＣＲ。
【請求項１１】
前記ＣＤＲ２βは、ＦＮＨＧＡＶ及びＦＮＮＮＶＰから選択される配列を含むことを特徴とする
請求項６に記載のＴＣＲ。
【請求項１２】
前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β及びＣＤＲ３βを含み、
前記ＣＤＲ３βは、ＡＳ［３βＸ１］［３βＸ２］Ｇ［３βＸ３］ＮＥＱＹ配列を含み、［３βＸ１］、［３βＸ２］、［３βＸ３］は、独立して任意の天然アミノ酸残基から選択されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１３】
前記［３βＸ１］は、Ｓ、ＱまたはＭであることを特徴とする
請求項１２に記載のＴＣＲ。
【請求項１４】
前記［３βＸ２］は、Ｌ、Ｒ、Ｋ、またはＭであることを特徴とする
請求項１２に記載のＴＣＲ。
【請求項１５】
前記［３βＸ３］は、Ｓ、Ａ、ＧまたはＰであることを特徴とする
請求項１２に記載のＴＣＲ。
【請求項１６】
前記ＣＤＲ３は、ＡＳＱＲＧＳＮＥＱＹ、ＡＳＱＫＧＡＮＥＱＹ、ＡＳＱＬＧＳＮＥＱＹ、ＡＳＱＬＧＡＮＥＱＹ、ＡＳＱＬＧＧＮＥＱＹ、ＡＳＱＬＧＰＮＥＱＹ、ＡＳＱＲＧＡＮＥＱＹ、ＡＳＱＭＧＳＮＥＱＹ、ＡＳＱＭＧＡＮＥＱＹ及びＡＳＭＬＧＳＮＥＱＹから選択される配列を含むことを特徴とする
請求項１２に記載のＴＣＲ。
【請求項１７】
前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α及びＣＤＲ３αを含み、前記ＣＤＲ１αは、［１αＸ１］［１αＸ２］［１αＸ３］［１αＸ４］Ｎ配列を含み、［１αＸ１］、［１αＸ２］、［１αＸ３］、［１αＸ４］、［１αＸ５］は、独立して任意の天然アミノ酸残基から選択されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項１８】
前記［１αＸ１］は、ＴまたはＧであることを特徴とする
請求項１７に記載のＴＣＲ。
【請求項１９】
前記［１αＸ２］は、ＳまたはＷであることを特徴とする
請求項１７に記載のＴＣＲ。
【請求項２０】
前記［１αＸ３］は、ＩまたはＡまたはＶであることを特徴とする
請求項１７に記載のＴＣＲ。
【請求項２１】
前記［１αＸ４］は、ＮまたはＱであることを特徴とする
請求項１７に記載のＴＣＲ。
【請求項２２】
前記ＣＤＲ１αは、ＧＳＩＱＮ、ＧＷＡＱＮ、ＧＷＶＱＮ及びＴＳＩＮＮから選択される配列を含むことを特徴とする
請求項１７に記載のＴＣＲ。
【請求項２３】
前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α及びＣＤＲ３αを含み、前記ＣＤＲ２αは、ＩＲ［２αＸ１］［２αＸ２］［２αＸ３］［２αＸ４］Ｅ配列を含み、［２αＸ１］、［２αＸ２］、［２αＸ３］、［２αＸ４］は、独立して任意の天然アミノ酸残基から選択されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項２４】
前記［２αＸ１］は、ＳまたはＴであることを特徴とする
請求項２３に記載のＴＣＲ。
【請求項２５】
前記［２αＸ２］は、ＮまたはＧであることを特徴とする
請求項２３に記載のＴＣＲ。
【請求項２６】
前記［２αＸ３］は、ＥまたはＱであることを特徴とする
請求項２３に記載のＴＣＲ。
【請求項２７】
前記［２αＸ４］は、Ｒ、ＡまたはＱであることを特徴とする
請求項２３に記載のＴＣＲ。
【請求項２８】
前記ＣＤＲ２αは、ＩＲＴＧＥＱＥ、ＩＲＴＧＱＡＥ及びＩＲＳＮＥＲＥから選択される配列を含むことを特徴とする
請求項２３に記載のＴＣＲ。
【請求項２９】
前記ＴＣＲは、下記のグループから選択されるＣＤＲを有することを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
2019535328.tif 000029
2019535328.tif 000030
2019535328.tif 000031
2019535328.tif 000032
【請求項３０】
前記ＴＣＲは、可溶であることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３１】
前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３２】
前記ＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のＴＣＲα鎖、及び（ｉｉ）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のＴＣＲβ鎖を含み、（ｉ）及び（ｉｉ）の両方は、ＴＣＲ鎖の可変ドメイン及び少なくとも一部の定常ドメインを含むことを特徴とする
請求項３１に記載のＴＣＲ。
【請求項３３】
前記ＴＣＲのα鎖定常領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合が含まれることを特徴とする
請求項３２に記載のＴＣＲ。
【請求項３４】
前記ＴＣＲαとβ鎖の定常領域の間に人工鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＰｒｏ８９及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、及び
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０から選択される１つまたは複数のグループのサイトを置換したことを特徴とする
請求項３３に記載のＴＣＲ。
【請求項３５】
前記ＴＣＲのα鎖可変ドメインアミノ酸配列は、配列番号：５８−８６から選択され、および／または前記ＴＣＲのβ鎖可変ドメインアミノ酸配列は、配列番号：８７−１０２から選択されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３６】
前記ＴＣＲは、下記のグループから選択されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
2019535328.tif 000033
2019535328.tif 000034
2019535328.tif 000035
【請求項３７】
前記ＴＣＲは、単鎖ＴＣＲであることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３８】
前記ＴＣＲは、α鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインからなる単鎖ＴＣＲであり、前記α鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインは、柔軟なオリゴペプチド配列（ｌｉｎｋｅｒ）によって連結されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３９】
前記ＴＣＲα鎖可変ドメインおよび／またはβ鎖可変ドメインの疎水性コアは、変異していることを特徴とする
請求項３８に記載のＴＣＲ。
【請求項４０】
前記ＴＣＲのα鎖可変ドメインアミノ酸配列は、配列番号：９−３７から選択され、および／または前記ＴＣＲのβ鎖可変ドメインアミノ酸配列は、配列番号：３８−５３から選択されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項４１】
前記ＴＣＲは、下記のグループから選択されることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
2019535328.tif 000036
2019535328.tif 000037
2019535328.tif 000038
【請求項４２】
前記ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のＣ−またはＮ−末端にコンジュゲートが結合されることを特徴とする
請求項１〜４１のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項４３】
前記ＴＣＲに結合されるコンジュゲートは、検出可能なマーカー、治療剤、ＰＫ修飾部分または任意のこれらの物質の組み合わせであることを特徴とする
請求項４２に記載のＴＣＲ。
【請求項４４】
前記ＴＣＲに結合される治療剤は、前記ＴＣＲのαまたはβ鎖のＣ−またはＮ−末端に連結される抗−ＣＤ３抗体であることを特徴とする
請求項４３に記載のＴＣＲ。
【請求項４５】
多価ＴＣＲ複合体であって、
少なくとも２つのＴＣＲ分子を含み、その中の少なくとも１つのＴＣＲ分子は、前記の請求項中のいずれか１項に記載のＴＣＲである、前記多価ＴＣＲ複合体。
【請求項４６】
核酸分子であって、
請求項１〜４４のいずれか１項に記載のＴＣＲをコードする核酸配列またはその相補的な配列を含む、前記核酸分子。
【請求項４７】
ベクターであって、
請求項４６に記載の核酸分子を含む、前記ベクター。
【請求項４８】
宿主細胞であって、
請求項４７に記載のベクターまたは染色体に外因性が統合された請求項４６に記載の核酸分子を含む、前記宿主細胞。
【請求項４９】
単離された細胞であって、
請求項１〜４４のいずれか１項に記載のＴＣＲを発現する、前記単離された細胞。
【請求項５０】
薬学的組成物であって、
薬学的に許容されるベクター及び請求項１〜４４のいずれか１項に記載のＴＣＲ、または請求項４５に記載のＴＣＲ複合体、または請求項４９に記載の細胞を含む、前記薬学的組成物。
【請求項５１】
疾患を治療する方法であって、
治療が必要な対象に、請求項１〜４４のいずれか１項に記載のＴＣＲ、または請求項４５に記載のＴＣＲ複合体、または請求項４９に記載の細胞、または請求項５０に記載の薬学的組成物を投与するステップを含む、前記疾患を治療する方法。
【請求項５２】
請求項１〜４４のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体、請求項４５に記載のＴＣＲ複合体または請求項４９に記載の細胞の使用であって、
腫瘍を治療するための医薬を製造するための、前記請求項１〜４４のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体、請求項４５に記載のＴＣＲ複合体または請求項４９に記載の細胞の使用。
【請求項５３】
請求項１〜４４のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体を製造する方法であって、
（ｉ）請求項４８に記載の宿主細胞を培養して、請求項１〜４４のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体を発現させるステップと、
（ｉｉ）前記Ｔ細胞受容体を単離または精製するステップと、を含む、前記請求項１〜４４のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術分野に関し、さらに具体的には、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質由来のポリペプチドを識別することができるＴ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に関する。本発明は、また、前記受容体の製造及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
特異的な方法で抗原を識別することができる分子は、２つのタイプのみが存在する。その１つは、免疫グロブリンまたは抗体であり、他の１つは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、これはα鎖／β鎖またはγ鎖／δ鎖によってヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）の形式で存在する細胞膜表面の糖タンパク質である。免疫系のＴＣＲ総スペクトルの組成は、胸腺でＶ（Ｄ）Ｊによって組換えされた後、陽性及び陰性の選択によって生成される。末梢環境において、ＴＣＲは、主要組織適合性複合体−ペプチド複合体（ｐＭＨＣ）に対するＴ細胞の特異的な識別を媒介し、従って免疫系の細胞免疫機能にとって非常に重要である。
【０００３】
ＴＣＲは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）上に提示される特異的な抗原ペプチドの唯一の受容体であり、このような外因性ペプチドまたは内因性ペプチドは、細胞で異常が現れる唯一の現象であることができる。免疫系において、抗原特異的なＴＣＲとｐＭＨＣ複合体の結合により、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間の直接的な物理的接触を誘発し、次いでＴ細胞及びＡＰＣの両方の他の細胞膜表面分子が相互作用して、一連の後続的な細胞シグナル伝達と他の生理的反応を起こし、異なる抗原特異的なＴ細胞がその標的細胞に免疫効果を発揮するようにする。
【０００４】
ＴＣＲに対応されるＭＨＣ  Ｉ型とＩＩ型の分子リガンドも免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質であるが、抗原の提示に特異的であり、異なる個体が異なるＭＨＣを有するため、一つのタンパク質抗原内の異なるオリゴペプチドがそれぞれのＡＰＣ細胞表面に提示されることができる。人間のＭＨＣは、通常ＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ複合体と称する。
【０００５】
オリゴペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣは、様々な腫瘍細胞によって発現されたＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ.，（１９９７）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９４  １９１４−１９１８）に由来する。腫瘍細胞のＩ型ＨＬＡ分子提示は、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣを含むＮＹ−ＥＳＯ−１由来のオリゴペプチドを含む。従って、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体は、腫瘍細胞の標識を標的化することができるＴＣＲを提供する。ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に結合することができるＴＣＲは、腫瘍の治療に対して高い適用の価値を持っている。例えば、当該腫瘍細胞標識を標的化することができるＴＣＲは、当該ＴＣＲを発現するＴ細胞を破壊することができるように、細胞毒性剤または免疫刺激剤を標的細胞に伝達し、またはＴ細胞に形質転換して、養子免疫治療と呼ばれる治療の過程で患者に投与されることができる。前者の目的について、理想的なＴＣＲは、比較的に高い親和力を持つことで、当該ＴＣＲが標的化された細胞上に長期間存在させることができる。後者の目的について、好ましくは、中等親和力のＴＣＲを使用する。従って、当業者は、異なる目的を満たすことができる腫瘍細胞標識を標的化するＴＣＲの開発に専念している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に比較的に高い親和力を有するＴＣＲを提供することである。
本発明の他の目的は、前記のタイプのＴＣＲの製造方法及び前記のタイプのＴＣＲの使用を提供することである。
本発明の第１の態様において、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に結合する活性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
他の一つの好ましい例において、前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に結合する活性を有し、前記Ｔ細胞受容体は、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ領域の基準配列は、以下の通りであり、
ＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ
ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥ
ＣＤＲ３α：ＡＴＤＡＮＧＫＩＩ、また少なくとも１つの下記の突然変異を含み、
2019535328.tif 000002
および／または，前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ領域の基準配列、以下の通りであり、
ＣＤＲ１β：ＳＧＨＤＹ
ＣＤＲ２β：ＦＮＮＮＶＰ
ＣＤＲ３β：ＡＳＳＬＧＳＮＥＱＹ、また少なくとも１つの下記の突然変異を含む。
【０００８】
2019535328.tif 000003
【０００９】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖ＣＤＲ領域の突然変異の数は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、または１２個であることができる。
【００１０】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲβ鎖ＣＤＲ領域の突然変異の数は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個であることができる。
【００１１】
他の一つの好ましい例において、本発明によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、及びＣＤＲ３αを含む。
【００１２】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ３αは、［３αＸ１］［３αＸ２］Ｄ［３αＸ３］［３αＸ４］［３αＸ５］［３αＸ６］［３αＸ７］［３αＸ８］配列を含み、ここで、［３αＸ１］、［３αＸ２］、［３αＸ３］、［３αＸ４］、［３αＸ５］、［３αＸ６］、［３αＸ７］、［３αＸ８］は、独立して任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【００１３】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ１］は、ＡまたはＭである。
【００１４】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ２］は、ＴまたはＹである。
【００１５】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ３］は、ＡまたはＥまたはＱである。
【００１６】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ４］は、ＮまたはＦまたはＹまたはＷである。
【００１７】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ５］は、ＧまたはＡまたはＱである。
【００１８】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ６］は、ＫまたはＷまたはＲまたはＴまたはＳまたはＭまたはＬである。
【００１９】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ７］は、ＩまたはＷまたはＶまたはＹまたはＰである。
【００２０】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ８］は、ＩまたはＮまたはＥまたはＤまたはＱまたはＶまたはＫまたはＧまたはＭまたはＳである。
【００２１】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ１］は、Ａであり、［３αＸ２］は、Ｔであり、［３αＸ３］は、Ａであり、［３αＸ４］は、ＮまたはＦまたはＷであり、［３αＸ５］は、Ａであり、［３αＸ６］は、ＷまたはＲであり、［３αＸ７］は、Ｗであり、また［３αＸ８］は、ＩまたはＮまたはＥまたはＤである。
【００２２】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ３αは、ＡＴＤＡＮＡＲＷＮ、ＡＴＤＡＮＡＲＷＥ、ＡＴＤＡＮＡＲＷＤ、ＡＴＤＡＦＡＷＷＩ、及びＡＴＤＡＷＡＲＷＩから選択される配列を含む。
【００２３】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ１αは、［１αＸ１］［１αＸ２］［１αＸ３］［１αＸ４］Ｎ配列を含み、ここで、［１αＸ１］、［１αＸ２］、［１αＸ３］、［１αＸ４］、［１αＸ５］は、独立して任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【００２４】
他の一つの好ましい例において、前記［１αＸ１］は、ＴまたはＧである。
【００２５】
他の一つの好ましい例において、前記［１αＸ２］は、ＳまたはＷである。
【００２６】
他の一つの好ましい例において、前記［１αＸ３］は、ＩまたはＡまたはＶである。
【００２７】
他の一つの好ましい例において、前記［１αＸ４］は、ＮまたはＱである。
【００２８】
他の一つの好ましい例において、前記［１αＸ１］は、Ｇであり、［１αＸ２］は、ＳまたはＷであり、［１αＸ３］は、ＩまたはＡまたはＶであり、また［１αＸ４］は、Ｑである。
【００２９】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ１αは、ＧＳＩＱＮ、ＧＷＡＱＮ、ＧＷＶＱＮ及びＴＳＩＮＮから選択される配列を含む。
【００３０】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ２αは、ＩＲ［２αＸ１］［２αＸ２］［２αＸ３］［２αＸ４］Ｅ配列を含み、ここで、［２αＸ１］、［２αＸ２］、［２αＸ３］、［２αＸ４］は、独立して任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【００３１】
他の一つの好ましい例において、前記［２αＸ１］は、ＳまたはＴである。
【００３２】
他の一つの好ましい例において、前記［２αＸ２］は、ＮまたはＧである。
【００３３】
他の一つの好ましい例において、前記［２αＸ３］は、ＥまたはＱである。
【００３４】
他の一つの好ましい例において、前記［２αＸ４］は、Ｒ、ＡまたはＱである。
【００３５】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ２αは、ＩＲＴＧＥＱＥ、ＩＲＴＧＱＡＥ及びＩＲＳＮＥＲＥから選択される配列を含む。
【００３６】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β及びＣＤＲ３βを含み、ここで、前記ＣＤＲ１βは、ＳＧＨＤＹ配列を含む。
【００３７】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ２βは、ＦＮ［２βＸ１］［２βＸ２］［２βＸ３］［２βＸ４］配列を含み、ここで、［２βＸ１］、［２βＸ２］、［２βＸ３］、及び［２βＸ４］は、それぞれ独立して任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【００３８】
他の一つの好ましい例において、前記［２βＸ１］は、ＮまたはＨである。
【００３９】
他の一つの好ましい例において、前記［２βＸ２］は、ＮまたはＧである。
【００４０】
他の一つの好ましい例において、前記［２βＸ３］は、ＶまたはＡである。
【００４１】
他の一つの好ましい例において、前記［２βＸ４］は、ＰまたはＶである。
【００４２】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ２βは、ＦＮＨＧＡＶ、及びＦＮＮＮＶＰから選択される配列を含む。
【００４３】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ３βは、ＡＳ［３βＸ１］［３βＸ２］Ｇ［３βＸ３］ＮＥＱＹ配列を含み、ここで、［３βＸ１］、［３βＸ２］、［３βＸ３］は、独立して任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【００４４】
他の一つの好ましい例において、前記［３βＸ１］は、Ｓ、ＱまたはＭである。
【００４５】
他の一つの好ましい例において、前記［３βＸ２］は、Ｌ、Ｒ、Ｋ、またはＭである。
【００４６】
他の一つの好ましい例において、前記［３βＸ３］は、Ｓ、Ａ、ＧまたはＰである。
【００４７】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ３βは、ＡＳＱＲＧＳＮＥＱＹ、ＡＳＱＫＧＡＮＥＱＹ、ＡＳＱＬＧＳＮＥＱＹ、ＡＳＱＬＧＡＮＥＱＹ、ＡＳＱＬＧＧＮＥＱＹ、ＡＳＱＬＧＰＮＥＱＹ、ＡＳＱＲＧＡＮＥＱＹ、ＡＳＱＭＧＳＮＥＱＹ、ＡＳＱＭＧＡＮＥＱＹ及びＡＳＭＬＧＳＮＥＱＹから選択される配列を含む。
【００４８】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲのＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ、ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥ、及びＣＤＲ３α：ＡＴＤＡＮＧＫＩＩのようなＣＤＲを同時に含まない。
【００４９】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲのＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β：ＳＧＨＤＹ、ＣＤＲ２β：ＦＮＮＮＶＰ、及びＣＤＲ３β：ＡＳＳＬＧＳＮＥＱＹのようなＣＤＲを同時に含まない。
【００５０】
他の一つの好ましい例において、前記突然変異は、α鎖および／またはβ鎖可変ドメインの１つまたは複数ＣＤＲ領域で起こる。
【００５１】
他の一つの好ましい例において、前記突然変異は、α鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３で起こり、および／または前記突然変異は、β鎖のＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３で起こる。
【００５２】
本発明の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体との親和力は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍であり、好ましくは、少なくとも５倍であり、さらに好ましくは、少なくとも１０倍である。
【００５３】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体との親和力は、野生型ＴＣＲの少なくとも５０倍であり、好ましくは、少なくとも１００倍であり、さらに好ましくは、少なくとも５００倍であり、最も好ましくは、少なくとも１０００倍である。
【００５４】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体との親和力は、野生型ＴＣＲの少なくとも１０４倍であり、好ましくは、少なくとも１０５倍であり、さらに好ましくは、少なくとも１０６倍であり、もっとも好ましくは、少なくとも１０７倍である。
【００５５】
具体的に、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する前記ＴＣＲの解離平衡定数ＫＤ≦２０μＭであり、
【００５６】
他の一つの好ましい例において、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する前記ＴＣＲの解離平衡定数は、５μＭ≦ＫＤ≦１０μＭであり、好ましくは、０.１μＭ≦ＫＤ≦１μＭであり、さらに好ましくは、１ｎＭ≦ＫＤ≦１００ｎＭであり、
【００５７】
他の一つの好ましい例において、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する前記ＴＣＲの解離平衡定数は、１００ｐＭ≦ＫＤ≦１０００ｐＭであり、好ましくは、１０ｐＭ≦ＫＤ≦１００ｐＭであり、さらに好ましくは、１ｐＭ≦ＫＤ≦１０ｐＭである。
【００５８】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲは、具体的に下記のグループから選択されるＣＤＲを有する。
【００５９】
2019535328.tif 000004
2019535328.tif 000005
2019535328.tif 000006
2019535328.tif 000007
【００６０】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲは、可溶である。
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲまたは単鎖ＴＣＲである。
【００６１】
他の一つの好ましい例において、本発明のＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、前記ＴＣＲのα鎖可変ドメインは、配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、さらに好ましくは、少なくとも９２％、最も好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であることができる）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲのβ鎖可変ドメインは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９４％、最も好ましくは、少なくとも９７％、（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であることができる）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６２】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のＴＣＲα鎖、及び（ii）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のＴＣＲβ鎖を含み、ここで、（ｉ）及び（ii）の両方は、ＴＣＲ鎖の可変ドメイン及び少なくとも一部の定常ドメインを含む。
【００６３】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合が含まれる。
【００６４】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合が形成されるシステイン残基は、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１的６１番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、または
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸から選択される１つまたは複数のグループのサイトを置換した。
【００６５】
他の一つの好ましい例において、α鎖可変領域とβ鎖定常領域との間には人工鎖間ジスルフィド結合が含まれたＴＣＲは、α鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメイン及び膜貫通ドメイン以外の全部または一部のβ鎖定常ドメインを含むが、α鎖定常ドメインを含まず、前記ＴＣＲのα鎖可変ドメインは、β鎖とヘテロ二量体を形成する。
【００６６】
他の一つの好ましい例において、α鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合が含まれたＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のＴＣＲα鎖、及び（ii）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のＴＣＲβ鎖を含み、ここで、（ｉ）及び（ii）の両方は、ＴＣＲ鎖の可変ドメイン及び少なくとも一部の定常ドメインを含む。
【００６７】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、（ｉ）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のＴＣＲα鎖、及び（ii）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のＴＣＲβ鎖を含み、ここで、（ｉ）及び（ii）の両方は、ＴＣＲ鎖の可変ドメイン及び少なくとも一部の定常ドメインを含み、α鎖定常領域とβ鎖定常領域との間には人工鎖間ジスルフィド結合が含まれる。
【００６８】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲαとβ鎖の定常領域の間に人工鎖間ジスルフィド結合が形成されるシステイン残基は、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、
ＲＡＣ＊０１エクソン１のＰｒｏ８９及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、及び
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０から選択される１つまたは複数のグループのサイトを置換した。
【００６９】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲは、単鎖ＴＣＲである。
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲは、α鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインからなる単鎖ＴＣＲであり、前記α鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインは、柔軟なオリゴペプチド配列（ｌｉｎｋｅｒ）によって連結される。
【００７０】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインおよび／またはβ鎖可変ドメインの疎水性コアは、突然変異される。
他の一つの好ましい例において、前記疎水性コアが突然変異されたＴＣＲは、α可変ドメインとβ可変ドメインからなる単鎖ＴＣＲであり、前記α可変ドメインとβ可変ドメインは、柔軟なオリゴペプチド配列（ｌｉｎｋｅｒ）によって連結される。
【００７１】
他の一つの好ましい例において、配列番号：１に示される番号を使用し、本発明のＴＣＲのα鎖可変ドメイン疎水性コアアミノ酸残基１９Ａ（即ち、ＩＭＧＴに列挙されたα鎖可変領域１９番目）、２１Ｍ（即ち、ＩＭＧＴに列挙されたα鎖可変領域２１番目）、７９Ｓ（即ち、ＩＭＧＴに列挙されたα鎖可変領域９４番目）の中１つまたは複数が突然変異され、および／または配列番号：２に示される番号を使用し、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメイン疎水性コアアミノ酸残基１３Ｔ（即ち、ＩＭＧＴに列挙されたβ鎖可変領域１３番目）、８２Ｓ（即ち、ＩＭＧＴに列挙されたβ鎖可変領域９４番目）の中１つまたは複数が突然変異される。
【００７２】
他の一つの好ましい実施例において、配列番号：１に示される番号を使用し、本発明α鎖可変ドメイン疎水性コアは、アミノ酸残基１９Ｖ、２１Ｉ及び７９Ｖ中の１つまたは複数を含み、および／または配列番号：２に示される番号を使用し、前記ＴＣＲβ可変ドメイン疎水性コアは、アミノ酸残基１３Ｖ及び８２Ｖ中の１つまたは複数を含む。さらに具体的に、前記ＴＣＲα可変ドメイン疎水性コアの突然変異形態は、Ａ１９Ｖ、Ｍ２１Ｉ及びＳ７９Ｖ中の１つまたは複数のグループを含み、前記ＴＣＲβ可変ドメイン疎水性コアの突然変異の形態は、Ｔ１３Ｖ及びＳ８２Ｖ中の１つまたは複数のグループを含む。
【００７３】
他の一つの好ましい例において、本発明前記ＴＣＲは、単鎖ＴＣＲであり、前記ＴＣＲのα鎖可変ドメインは、配列番号：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、さらに好ましくは、少なくとも９２％、最も好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であることができる）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲのβ鎖可変ドメインは、配列番号：４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９４％、最も好ましくは、少なくとも９７％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であることができる）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７４】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖可変ドメインアミノ酸配列は、配列番号：９−３７及び５８−８６から選択され、および／または前記ＴＣＲのβ鎖可変ドメインアミノ酸配列は、配列番号：３８−５３及び８７−１０２から選択される。
【００７５】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲは、下記のグループから選択される。
【００７６】
2019535328.tif 000008
2019535328.tif 000009
【００７７】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲは、下記のグループから選択される。
【００７８】
2019535328.tif 000010
2019535328.tif 000011
2019535328.tif 000012
【００７９】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のＣ−またはＮ−末端にコンジュゲートが結合される。
【００８０】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲに結合されるコンジュゲートは、検出可能なマーカー、治療剤、ＰＫ修飾部分または任意のこれらの物質の組み合わせである。
【００８１】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲに結合される治療剤は、前記ＴＣＲのαまたはβ鎖のＣ−またはＮ−末端に連結される抗−ＣＤ３抗体である。
【００８２】
本発明の一つの好ましい実施形態において、前記Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に結合する活性を有し、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲは、配列番号：１に示されるα鎖可変ドメインで突然変異され、前記突然変異のアミノ酸残基のサイトは、２７Ｔ、２８Ｓ、２９Ｉ、３０Ｎ、５１Ｓ、５２Ｎ、５３Ｅ、５４Ｒ、９０Ａ、９１Ｔ、９３Ａ、９４Ｎ、９５Ｇ、９６Ｋ、９７Ｉ及び９８Ｉ中の１つまたは複数を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、配列番号：５６または１に示される番号を使用し、および／または前記ＴＣＲは、配列番号：２に示されるβ鎖可変ドメインで突然変異され、前記突然変異のアミノ酸残基のサイトは、５１Ｎ、５２Ｎ、５３Ｖ、５４Ｐ、９５Ｓ、９６Ｌ及び９８Ｓ中の１つまたは複数を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、配列番号：５７または２に示される番号を使用し、
好ましくは、突然変異後の前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、２７Ｇ、２８Ｗ、２９Ａまたは２９Ｖ、３０Ｑ、５１Ｔ、５２Ｇ、５３Ｑ、５４Ｑまたは５４Ａ、９０Ｍ、９１Ｙ、９３Ｅまたは９３Ｑ、９４Ｆまたは９４Ｙまたは９４Ｗ、９５Ａまたは９５Ｑ、９６Ｗまたは９６Ｒまたは９６Ｔまたは９６Ｓまたは９６Ｍまたは９６Ｌ、９７Ｗまたは９７Ｖまたは９７Ｙまたは９７Ｐ、及び９８Ｅまたは９８Ｎまたは９８Ｄまたは９８Ｑまたは９８Ｋまたは９８Ｖまたは９８Ｇまたは９８Ｍまたは９８Ｓから選択される１つまたは複数アミノ酸残基を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、配列番号：１に示される番号を使用し、および／または突然変異後の前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、５１Ｈ、５２Ｇ、５３Ａ、５４Ｖ、９５Ｑまたは９５Ｍ、９６Ｒまたは９６Ｋまたは９６Ｍ、及び９８Ａまたは９８Ｇまたは９８Ｐから選択される１つまたは複数アミノ酸残基を含み、アミノ酸残基の番号は、配列番号：２に示される番号を使用する。
【００８３】
本発明の第２の態様において、少なくとも２つのＴＣＲ分子を含み、その中の少なくとも１つのＴＣＲ分子は、本発明の第１の態様によるＴＣＲである多価ＴＣＲ複合体を提供した。
【００８４】
本発明の第３の態様において、本発明の第１の態様によるＴＣＲ分子または本発明の第２の態様による多価ＴＣＲ複合体をコードする核酸配列またはその相補的な配列を含む核酸分子を提供した。
【００８５】
本発明の第４の態様において、本発明の第３の態様による核酸分子を含むを提供した。
【００８６】
本発明の第５の態様において、本発明の第４の態様によるベクターまたは染色体に外因性が統合された本発明の第３の態様による核酸分子を含む宿主細胞を提供した。
【００８７】
本発明の第６の態様において、本発明の第１の態様によるＴＣＲを発現する単離された細胞を提供した。
【００８８】
本発明の第７の態様において、薬学的に許容されるベクター及び本発明の第１の態様によるＴＣＲ、または本発明の第２の態様によるＴＣＲ複合体、または本発明の第６の態様による細胞を含む薬学的組成物を提供する。
【００８９】
本発明の第８の態様において、治療が必要な対象に、本発明の第１の態様によるＴＣＲ、または本発明の第２の態様によるＴＣＲ複合体、または本発明の第６の態様による細胞、または本発明の第７の態様による薬学的組成物を適量投与するステップを含む疾患を治療する方法を提供した。
【００９０】
本発明の第９の態様において、腫瘍を治療するための医薬を製造する本発明の第１の態様によるＴＣＲ、または本発明の第２の態様によるＴＣＲ複合体、または本発明の第６の態様による細胞の使用を提供する。
【００９１】
本発明の第１０の態様において、（ｉ）本発明の第５の態様による宿主細胞を培養して、本発明の第１の態様によるＴ細胞受容体を発現させるステップと、（ｉｉ）前記Ｔ細胞受容体を単離または精製するステップと、を含む本発明の第１の態様によるＴ細胞受容体を製造する方法を提供する。
【発明の効果】
【００９２】
本発明の範囲内で、本発明の前記各技術の特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に記述された各技術的特徴は、互いに組み合わされて、新たなまたは好ましい技術手段を構成することができることを理解すべきである。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返して説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１ａ−ｂ】それぞれＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に特異的に結合することができる野生型ＴＣＲαとβ鎖可変ドメインアミノ酸配列を示す。
【図２ａ−ｂ】それぞれ本発明で構築された一本鎖鋳型ＴＣＲのα可変ドメインアミノ酸配列とβ鎖可変ドメインアミノ酸配列である。
【図３ａ−ｂ】それぞれ本発明で構築された一本鎖鋳型ＴＣＲのα可変ドメインのＤＮＡ配列とβ鎖可変ドメインのＤＮＡ配列である。
【図４ａ−ｂ】それぞれ本発明で構築された一本鎖鋳型ＴＣＲの連結オリゴペプチド（ｌｉｎｋｅｒ）のアミノ酸配列とヌクレオチド配列である。
【図５（１）−（１０）】それぞれＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に高親和力を有する単鎖ＴＣＲのα鎖可変ドメインアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で表示される。
【図５（１１）−（２０）】それぞれＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に高親和力を有する単鎖ＴＣＲのα鎖可変ドメインアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で表示される。
【図５（２１）−（２９）】それぞれＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に高親和力を有する単鎖ＴＣＲのα鎖可変ドメインアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で表示される。
【図６（１）−（１０）】それぞれＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に高親和力を有する単鎖ＴＣＲのβ鎖可変ドメインアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で表示される。
【図６（１１）−（１６）】それぞれＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に高親和力を有する単鎖ＴＣＲのβ鎖可変ドメインアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で表示される。
【図７ａ−ｂ】それぞれ本発明で構築された一本鎖鋳型ＴＣＲのアミノ酸配列とＤＮＡ配列である。
【図８ａ−ｂ】それぞれ本発明における参照ＴＣＲαとβ鎖のアミノ酸配列を示す。
【図９（１）−（１０）】それぞれＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に高親和力を有するヘテロ二量体ＴＣＲのα鎖可変ドメインアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で表示される。
【図９（１１）−（２０）】それぞれＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に高親和力を有するヘテロ二量体ＴＣＲのα鎖可変ドメインアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で表示される。
【図９（２１）−（２９）】それぞれＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に高親和力を有するヘテロ二量体ＴＣＲのα鎖可変ドメインアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で表示される。
【図１０（１）−（１０）】それぞれＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に高親和力を有するヘテロ二量体ＴＣＲのβ鎖可変ドメインアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で表示される。
【図１０（１１）−（１６）】それぞれＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に高親和力を有するヘテロ二量体ＴＣＲのβ鎖可変ドメインアミノ酸配列を示し、突然変異の残基は、下線で表示される。
【図１１ａ−ｂ】それぞれＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に特異的に結合することができる野生型ＴＣＲαとβ鎖アミノ酸配列を示す。
【図１２】参照ＴＣＲ、即ち野生型ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体の結合曲線である。
【図１３】本発明の高親和力ＴＣＲが形質感染された効果細胞のＩＮＦ−γ活性実験結果図である。
【図１４】標的細胞に対する本発明の高親和力ＴＣＲが形質感染された効果細胞の殺傷実験結果図である。
【図１５ａ−ｂ】効果細胞に対する融合タンパク質の再指向実験結果図である。
【図１６】本発明の高親和力ＴＣＲが形質感染された効果細胞の体内効能結果図である。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
本発明は、広範囲なかつ深い研究を経て、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣオリゴペプチド（ＮＹ−ＥＳＯ−１たんぱく質由来）を識別する高親和性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を獲得し、前記ＳＬＬＭＷＩＴＱＣオリゴペプチドは、ペプチド−ＨＬＡ  Ａ２複合体の形態で提示される。前記高親和性ＴＣＲは、そのα鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ領域であり、
ＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ
ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥ
ＣＤＲ３α：ＡＴＤＡＮＧＫＩＩで突然変異され、および／またはそのβ鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ領域であり、
ＣＤＲ１β：ＳＧＨＤＹ
ＣＤＲ２β：ＦＮＮＮＶＰ
ＣＤＲ３β：ＡＳＳＬＧＳＮＥＱＹで突然変異され、また、前記ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する突然変異後の本発明ＴＣＲの親和力および／または結合半減期は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍である。
【００９５】
本発明を説明する前に、前記の具体的な方法と実験条件は変更されることができるため、本発明は、このような方法と条件に制限されないことを理解すべきである。また、本文に使用される用語は、具体的な実施形態を説明することを目的とし、その意図は限定的ではなく、本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲のみによって制限される。
【００９６】
他に定義されない限り、本文に使用されたすべての技術と科学用語はすべて当業者によって通常理解されているもののと同じ意味を持つ。
【００９７】
本発明の実施またはテストで、本発明によるものと似てたり、等価的な任意の方法と材料を使用することができるが、本文は、ここで好ましい方法と材料を挙げる。
【００９８】
用語
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）
国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）を使用してＴＣＲを記述することができる。天然αβヘテロ二量体ＴＣＲは、α鎖とβ鎖を有する。広義的には、各鎖は、可変領域、連結領域及び定常領域を含み、β鎖は、通常は、可変領域と連結領域との間に短い可変領域を含むが、当該可変領域は、一般的に連結領域の一部として考慮される。独特のＩＭＧＴのＴＲＡＪとＴＲＢＪでＴＣＲの連結領域を決定し、ＩＭＧＴのＴＲＡＣとＴＲＢＣでＴＣＲの定常領域を決定する。
【００９９】
各可変領域は、フレーム（ｆｒａｍｅ）配列にキメラされた（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、お及びＣＤＲ３の３つのＣＤＲ（相補決定領域）を含む。ＩＭＧＴ命名法において、ＴＲＡＶとＴＲＢＶの異なる番号は、それぞれ異なるＶαタイプとＶβの種類を指す。ＩＭＧＴシステムにおいて、α鎖定常ドメインは、ＴＲＡＣ＊０１の符号を有し、ここで、「ＴＲ」は、Ｔ細胞受容体遺伝子を表し、「Ａ」は、α鎖遺伝子を表し、Ｃは、定常領域を表し、「＊０１」は、対立遺伝子１を表す。β鎖定常ドメインは、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１の符号を有し、ここで、「ＴＲ」は、Ｔ細胞受容体遺伝子を表し、「Ｂ」は、β鎖遺伝子を表し、Ｃは、定常領域を表し、「＊０１」は、対立遺伝子１を表す。α鎖の定常領域は唯一に決定されるものであり、β鎖の形態で、２つの可能な定常領域遺伝子「Ｃ１」と「Ｃ２」が存在する。当業者は、開示されたＩＭＧＴデータベースによってＴＣＲαとβ鎖の定常領域遺伝子配列を得ることができる。
【０１００】
一般的に、ＴＣＲのαとβ鎖は、それぞれ２つの「ドメイン」、即ち、可変ドメインと定常ドメインを有するものとみなす。可変ドメインは、連結された可変領域と連結領域で構成される。従って、本願発明の明細書と請求の範囲において、「ＴＣＲα鎖可変ドメイン」とは、連結されたＴＲＡＶとＴＲＡＪ領域を指し、同様に、「ＴＣＲβ鎖可変ドメイン」とは、連結されたＴＲＢＶとＴＲＢＤ／ＴＲＢＪ領域を指す。ＴＣＲα鎖可変ドメインの３つのＣＤＲは、それぞれＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α及びＣＤＲ３αであり、ＴＣＲβ鎖可変ドメインの３つのＣＤＲは、それぞれＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β及びＣＤＲ３βである。本発明のＴＣＲ可変ドメインのフレーム配列は、マウスまたはヒト化であることができ、好ましくは、ヒト化である。ＴＣＲの定常ドメインは、細胞内の部分、膜貫通領域及び細胞外の部分を含む。可溶性のＴＣＲを得て、ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体との間の親和性を測定するために、本発明のＴＣＲは、好ましくは、膜貫通領域を含まない。さらに好ましくは、本発明のＴＣＲのアミノ酸配列とは、ＴＣＲの細胞外アミノ酸配列を指す。
【０１０１】
本発明による「野生型ＴＣＲ」のα鎖アミノ酸配列及びβ鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１０３及び配列番号：１０４であり、図１１ａ及び１１ｂに示された通りである。本発明による「参照ＴＣＲ」のα鎖アミノ酸配列及びβ鎖アミノ酸配列は、それぞれ配列番号：５６及び配列番号：５７であり、図８ａ及び８ｂに示された通りである。本発明において、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に結合することができる野生型ＴＣＲのα及びβ鎖可変ドメインアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１及び配列番号：２であり、図１ａ及び１ｂに示された通りである。本発明において、用語「本発明のポリペプチド」、「本発明のＴＣＲ」、「本発明のＴ細胞受容体」は、相互交換に使用することができる。
【０１０２】
本発明の一つの好ましい実施形態において、本発明によるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、及びＣＤＲ３αを含む。
【０１０３】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ３αは、［３αＸ１］［３αＸ２］Ｄ［３αＸ３］［３αＸ４］［３αＸ５］［３αＸ６］［３αＸ７］［３αＸ８］配列を含み、ここで、［３αＸ１］、［３αＸ２］、［３αＸ３］、［３αＸ４］、［３αＸ５］、［３αＸ６］、［３αＸ７］、［３αＸ８］は、独立して任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【０１０４】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ１］は、ＡまたはＭである。
【０１０５】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ２］は、ＴまたはＹである。
【０１０６】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ３］は、ＡまたはＥまたはＱである。
【０１０７】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ４］は、ＮまたはＦまたはＹまたはＷである。
【０１０８】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ５］は、ＧまたはＡまたはＱである。
【０１０９】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ６］は、ＫまたはＷまたはＲまたはＴまたはＳまたはＭまたはＬである。
【０１１０】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ７］は、ＩまたはＷまたはＶまたはＹまたはＰである。
【０１１１】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ８］は、ＩまたはＮまたはＥまたはＤまたはＱまたはＶまたはＫまたはＧまたはＭまたはＳである。
【０１１２】
他の一つの好ましい例において、前記［３αＸ１］は、Ａであり、［３αＸ２］は、Ｔ、［３αＸ３］は、Ａであり、［３αＸ４］は、ＮまたはＦまたはＷであり、［３αＸ５］は、Ａであり、［３αＸ６］は、ＷまたはＲであり、［３αＸ７］は、Ｗであり、また［３αＸ８］は、ＩまたはＮまたはＥまたはＤである。
【０１１３】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ３αは、ＡＴＤＡＮＡＲＷＮ、ＡＴＤＡＮＡＲＷＥ、ＡＴＤＡＮＡＲＷＤ、ＡＴＤＡＦＡＷＷＩ、及びＡＴＤＡＷＡＲＷＩから選択される配列を含む。
【０１１４】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ１αは、［１αＸ１］［１αＸ２］［１αＸ３］［１αＸ４］Ｎ配列を含み、ここで、［１αＸ１］、［１αＸ２］、［１αＸ３］、［１αＸ４］、［１αＸ５］は、独立して任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【０１１５】
他の一つの好ましい例において、前記［１αＸ１］は、ＴまたはＧである。
【０１１６】
他の一つの好ましい例において、前記［１αＸ２］は、ＳまたはＷである。
【０１１７】
他の一つの好ましい例において、前記［１αＸ３］は、ＩまたはＡまたはＶである。
【０１１８】
他の一つの好ましい例において、前記［１αＸ４］は、ＮまたはＱである。
【０１１９】
他の一つの好ましい例において、前記［１αＸ１］は、Ｇであり、［１αＸ２は、ＳまたはＷであり、［１αＸ３］は、ＩまたはＡまたはＶであり、また［１αＸ４］は、Ｑである。
【０１２０】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ１αは、ＧＳＩＱＮ、ＧＷＡＱＮ、ＧＷＶＱＮ及びＴＳＩＮＮから選択される配列を含む。
【０１２１】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ２αは、ＩＲ［２αＸ１］［２αＸ２］［２αＸ３］［２αＸ４］Ｅ配列を含み、ここで、［２αＸ１］、［２αＸ２］、［２αＸ３］、［２αＸ４］は、独立して任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【０１２２】
他の一つの好ましい例において、前記［２αＸ１］は、ＳまたはＴである。
【０１２３】
他の一つの好ましい例において、前記［２αＸ２］は、ＮまたはＧである。
【０１２４】
他の一つの好ましい例において、前記［２αＸ３］は、ＥまたはＱである。
【０１２５】
他の一つの好ましい例において、前記［２αＸ４］は、Ｒ、ＡまたはＱである。
【０１２６】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ２αは、ＩＲＴＧＥＱＥ、ＩＲＴＧＱＡＥ及びＩＲＳＮＥＲＥから選択される配列を含む。
【０１２７】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β及びＣＤＲ３βを含み、ここで、前記ＣＤＲ１βは、ＳＧＨＤＹ配列を含む。
【０１２８】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ２βは、ＦＮ［２βＸ１］［２βＸ２］［２βＸ３］［２βＸ４］配列を含み、ここで、［２βＸ１］、［２βＸ２］、［２βＸ３］、及び［２βＸ４］は、それぞれ独立して任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【０１２９】
他の一つの好ましい例において、前記［２βＸ１］は、ＮまたはＨである。
【０１３０】
他の一つの好ましい例において、前記［２βＸ２］は、ＮまたはＧである。
【０１３１】
他の一つの好ましい例において、前記［２βＸ３］は、ＶまたはＡである。
【０１３２】
他の一つの好ましい例において、前記［２βＸ４］は、ＰまたはＶである。
【０１３３】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ２βは、ＦＮＨＧＡＶ、及びＦＮＮＮＶＰから選択される配列を含む。
【０１３４】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ３βは、ＡＳ［３βＸ１］［３βＸ２］Ｇ［３βＸ３］ＮＥＱＹ配列を含み、ここで、［３βＸ１］、［３βＸ２］、［３βＸ３］は、独立して任意の天然アミノ酸残基から選択される。
【０１３５】
他の一つの好ましい例において、前記［３βＸ１］は、Ｓ、ＱまたはＭである。
【０１３６】
他の一つの好ましい例において、前記［３βＸ２］は、Ｌ、Ｒ、Ｋ、またはＭである。
【０１３７】
他の一つの好ましい例において、前記［３βＸ３］は、Ｓ、Ａ、ＧまたはＰである。
【０１３８】
他の一つの好ましい例において、前記ＣＤＲ３βは、ＡＳＱＲＧＳＮＥＱＹ、ＡＳＱＫＧＡＮＥＱＹ、ＡＳＱＬＧＳＮＥＱＹ、ＡＳＱＬＧＡＮＥＱＹ、ＡＳＱＬＧＧＮＥＱＹ、ＡＳＱＬＧＰＮＥＱＹ、ＡＳＱＲＧＡＮＥＱＹ、ＡＳＱＭＧＳＮＥＱＹ、ＡＳＱＭＧＡＮＥＱＹ及びＡＳＭＬＧＳＮＥＱＹから選択される配列を含む。
【０１３９】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲのＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ、ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥ、及びＣＤＲ３α：ＡＴＤＡＮＧＫＩＩのようなＣＤＲを同時に含まない。
【０１４０】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲのＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＣＤＲ１β：ＳＧＨＤＹ、ＣＤＲ２β：ＦＮＮＮＶＰ、及びＣＤＲ３β：ＡＳＳＬＧＳＮＥＱＹのようなＣＤＲを同時に含まない。
【０１４１】
天然鎖間ジスルフィド結合と人工鎖間ジスルフィド結合
天然ＴＣＲの膜近位領域ＣαとＣβ鎖の間にジスルフィド結合が存在し、本発明では「天然鎖間ジスルフィド結合」と称する。本発明において、人工的に導入されて、天然鎖間ジスルフィド結合の位置と異なる位置を有する鎖間の共有ジスルフィド結合を「人工鎖間ジスルフィド結合」と称する。
【０１４２】
説明の便利のために、本発明でＴＲＡＣ＊０１とＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１アミノ酸配列の位置番号をＮ端からＣ端の手順に沿って位置ナンバリングして、例えば、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１で、Ｎ段からＣ段の手順に基づいて６０番目のアミノ酸は、Ｐ（プロリン（Ｐｒｏｌｉｎｅ））であり、本発明において、これをＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＰｒｏ６０と記述することができ、これをＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸と記述することもでき、また、例えば、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１で、Ｎ段からＣ段の手順に基づいて６１番目のアミノ酸は、Ｑ（グルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ））であり、本発明において、これをＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｎ６１と記述することができで、これをＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸と記述することもでき、他のものもこれによって類推する。本発明において、可変領域ＴＲＡＶとＴＲＢＶのアミノ酸配列の位置番号は、ＩＭＧＴに列挙された位置に基づいてナンバリングされる。例えば、ＴＲＡＶのあるアミノ酸がＩＭＧＴに列挙された位置番号が４６であれば、本発明でこれをＴＲＡＶ４６番目のアミノ酸で記述し、他のものもこれによって類推する。本発明において、他のアミノ酸の配列の位置番号について特別な説明があれば、特殊な説明に従う。
【０１４３】
腫瘍
用語「腫瘍」とは、病理学的タイプまたは感染の段階に関係なく、すべてのタイプの腫瘍細胞生長または発がん過程を含む転移組織または悪性形質転換細胞、組織、または器官を指す。腫瘍の実施例は、非制限的に、固形腫瘍、軟組織腫瘍、および転移性病変を含む。固形腫瘍の実施例は、肉腫、扁平上皮癌及び癌のような異なる器官系統の悪性腫瘍を含む。例えば、感染した前立腺、肺、乳房、リンパ、腸胃（例えば、結腸）及び尿生殖路（例えば、腎臓、上皮細胞）、咽頭を含む。肺扁平上皮癌は、ほとんどの結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺部の非小細胞癌、小腸癌及び食道癌のような悪性腫瘍を含む。前記癌の転移性病変は、同様に、本発明の方法と組成物により治療及び予防することができる。
【０１４４】
発明の詳細な説明
周知のように、ＴＣＲのα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインは、それぞれ３つのＣＤＲを含み、抗体の相補決定領域と類似している。ＣＤＲ３は、抗原オリゴペプチドと相互作用し、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、ＨＬＡと相互作用する。従って、ＴＣＲ分子のＣＤＲが、それと抗原オリゴペプチド−ＨＬＡ複合体の相互作用を決定した。抗原オリゴペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣとＨＬＡ  Ａ２複合体（即ち、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体）を結合することができる野生型ＴＣＲのα鎖可変ドメインアミノ酸配列とβ鎖可変ドメインアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：１と配列番号：２であり、当該配列は、本発明者が初めて発見した。これは、下記のＣＤＲ領域を有する。
α鎖可変ドメインＣＤＲ  ＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ
ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥ
ＣＤＲ３α：ＡＴＤＡＮＧＫＩＩ
及びβ鎖可変ドメインＣＤＲ  ＣＤＲ１β：ＳＧＨＤＹ
ＣＤＲ２β：ＦＮＮＮＶＰ
ＣＤＲ３β：ＡＳＳＬＧＳＮＥＱＹ
【０１４５】
本発明は、前記ＣＤＲ領域の変異体スクリーニングを介して、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体との親和力が野生型ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体の親和力の少なくとも２倍の高親和力のＴＣＲを獲得した。
【０１４６】
本発明は、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に結合される活性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供した。
【０１４７】
前記Ｔ細胞受容体ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメイン及びＴＣＲβ鎖可変ドメインを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ領域の基準配列は、以下の通りであり、
ＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ
ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥ
ＣＤＲ３α：ＡＴＤＡＮＧＫＩＩ、また少なくとも１つの下記の突然変異を含み、
2019535328.tif 000013
および／または，前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、３つのＣＤＲ領域を含み、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの３つのＣＤＲ領域の基準配列は、以下の通りであり、
ＣＤＲ１β：ＳＧＨＤＹ
ＣＤＲ２β：ＦＮＮＮＶＰ
ＣＤＲ３β：ＡＳＳＬＧＳＮＥＱＹ、また少なくとも１つの下記の突然変異を含む。
【０１４８】
2019535328.tif 000014
【０１４９】
さらに詳細に、前記ＴＣＲα鎖ＣＤＲ領域の突然変異の数は、３個または４個または６個または８個または９個または１１個または１２個であり、および／または前記ＴＣＲβ鎖ＣＤＲ領域の突然変異の数は、１個または２個または３個または４個または５個または６個または７個である。
【０１５０】
さらに、本発明によるＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲであり、前記ＴＣＲのα鎖可変ドメインは、配列番号：１に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、さらに好ましくは、少なくとも９２％、最も好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であることができる）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲのβ鎖可変ドメインは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と有少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９４％、最も好ましくは、少なくとも９７％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であることができる）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５１】
さらに、本発明によるＴＣＲは、単鎖ＴＣＲであり、前記ＴＣＲのα鎖可変ドメインは、配列番号：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは、少なくとも９０％、さらに好ましくは、少なくとも９２％、最も好ましくは、少なくとも９４％（例えば、少なくとも８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であることができる）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含み、および／または前記ＴＣＲのβ鎖可変ドメインは、配列番号：４に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９２％、さらに好ましくは、少なくとも９４％、最も好ましくは、少なくとも９７％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性であることができる）の配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５２】
好ましくは、前記ＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のＴＣＲα鎖、及び（ii）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部のＴＣＲβ鎖を含み、ここで、（ｉ）及び（ii）の両方は、ＴＣＲ鎖の可変ドメイン及び少なくとも一部の定常ドメインを含む。
【０１５３】
本発明において、野生型ＴＣＲα鎖可変ドメイン配列番号：１の３つのＣＤＲ、即ちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ配列番号：１の第２７−３１番、第４９−５５番及び第９０−９８番に位置される。これによって、アミノ酸残基の番号は、配列番号：１に示される番号を使用し、２７Ｔは、ＣＤＲ１αの１番目のＴであり、２８Ｓは、ＣＤＲ１αの２番目のＳであり、２９Ｉは、ＣＤＲ１αの３番目のＩであり、３０Ｎは、ＣＤＲ１αの４番目のＮであり、５１Ｓは、ＣＤＲ２αの３番目のＳであり、５２Ｎは、ＣＤＲ２αの４番目のＮであり、５３Ｅは、ＣＤＲ２αの５番目のＥであり、５４Ｒは、ＣＤＲ２αの６番目のＲであり、９０Ａは、ＣＤＲ３αの１番目のＡであり、９１Ｔは、ＣＤＲ３αの２番目のＴであり、９３Ａは、ＣＤＲ３αの４番目のＡであり、９４Ｎは、ＣＤＲ３αの５番目のＮであり、９５Ｇは、ＣＤＲ３αの６番目のＧであり、９６Ｋは、ＣＤＲ３αの７番目のＫであり、９７Ｉは、ＣＤＲ３αの８番目のＩであり、９８Ｉは、ＣＤＲ３αの９番目のＩである。
【０１５４】
同様に、本発明における野生型ＴＣＲβ鎖可変ドメイン配列番号：２の３つのＣＤＲ、即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ配列番号：２の第２７−３１番、第４９−５４番及び第９３−１０２番に位置される。従って、アミノ酸残基の番号は、配列番号：２に示される番号を使用し、５１Ｎは、ＣＤＲ２βの３番目のＮであり、５２Ｎは、ＣＤＲ２βの４番目のＮであり、５３Ｖは、ＣＤＲ２βの５番目のＶであり、５４Ｐは、ＣＤＲ２βの６番目のＰであり、９５Ｓは、ＣＤＲ３βの３番目のＳであり、９６Ｌは、ＣＤＲ３βの４番目のＬであり、９８Ｓは、ＣＤＲ３βの６番目のＳである。
【０１５５】
本発明において、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に結合する特性を有し、α鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインを含むＴＣＲを提供し、前記ＴＣＲは、配列番号：１に示されるα鎖可変ドメインにおいて突然変異され、前記突然変異のアミノ酸残基のサイトは、２７Ｔ、２８Ｓ、２９Ｉ、３０Ｎ、５１Ｓ、５２Ｎ、５３Ｅ、５４Ｒ、９０Ａ、９１Ｔ、９３Ａ、９４Ｎ、９５Ｇ、９６Ｋ、９７Ｉ及び９８Ｉ中の１つまたは複数を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、配列番号：１に示される番号を使用し、および／または前記ＴＣＲは、配列番号：２に示されるβ鎖可変ドメインにおいて突然変異され、前記突然変異のアミノ酸残基のサイトは、５１Ｎ、５２Ｎ、５３Ｖ、５４Ｐ、９５Ｓ、９６Ｌ及び９８Ｓ中の１つまたは複数を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、配列番号：２に示される番号を使用し、
好ましくは、突然変異後の前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、２７Ｇ、２８Ｗ、２９Ａまたは２９Ｖ、３０Ｑ、５１Ｔ、５２Ｇ、５３Ｑ、５４Ｑまたは５４Ａ、９０Ｍ、９１Ｙ、９３Ｅまたは９３Ｑ、９４Ｆまたは９４Ｙまたは９４Ｗ、９５Ａまたは９５Ｑ、９６Ｗまたは９６Ｒまたは９６Ｔまたは９６Ｓまたは９６Ｍまたは９６Ｌ、９７Ｗまたは９７Ｖまたは９７Ｙまたは９７Ｐ、及び９８Ｅまたは９８Ｎまたは９８Ｄまたは９８Ｑまたは９８Ｋまたは９８Ｖまたは９８Ｇまたは９８Ｍまたは９８Ｓから選択される１つまたは複数アミノ酸残基を含み、ここで、アミノ酸残基の番号は、配列番号：１に示される番号を使用し、および／または突然変異後の前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、５１Ｈ、５２Ｇ、５３Ａ、５４Ｖ、９５Ｑまたは９５Ｍ、９６Ｒまたは９６Ｋまたは９６Ｍ、及び９８Ａまたは９８Ｇまたは９８Ｐから選択される１つまたは複数アミノ酸残基を含み、アミノ酸残基の番号は、配列番号：２に示される番号を使用することを特徴とする。
【０１５６】
さらに具体的に、α鎖可変ドメインによる突然変異の具体的な形態は、Ｔ２７Ｇ、Ｓ２８Ｗ、Ｉ２９Ａ／Ｖ、Ｎ３０Ｑ、Ｓ５１Ｔ、Ｎ５２Ｇ、Ｅ５３Ｑ、Ｒ５４Ｑ／Ａ、Ａ９０Ｍ、Ｔ９１Ｙ、Ａ９３Ｅ／Ｑ、Ｎ９４Ｆ／Ｙ／Ｗ、Ｇ９５Ａ／Ｑ、Ｋ９６Ｗ／Ｒ／Ｔ／Ｓ／Ｍ／Ｌ、Ｉ９７Ｗ／Ｖ／Ｙ／Ｐ及びＩ９８Ｎ／Ｅ／Ｄ／Ｑ／Ｋ／Ｖ／Ｇ／Ｍ／Ｓ中の１つまたは複数のグループを含み、β鎖可変ドメインによる突然変異の具体的な形態は、Ｎ５１Ｈ、Ｎ５２Ｇ、Ｖ５３Ａ、Ｐ５４Ｖ、Ｓ９５Ｑ／Ｍ、Ｌ９６Ｒ／Ｋ／Ｍ及びＳ９８Ａ／Ｇ／Ｐ中の１つまたは複数のグループを含む。
【０１５７】
当業者に公知された部位特異的突然変異方法によって、野生型ＴＣＲα鎖定常領域ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８をシステインに突然変異させ、β鎖定常領域ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７をシステインに突然変異させ、参照ＴＣＲを得て、そのアミノ酸配列は、それぞれ図８ａ及び８ｂに示される通りであり、突然変異後のシステイン残基を太文字で表示した。前記システイン置換は、さらに安定した可溶性ＴＣＲを形成するために、参照ＴＣＲのαとβ鎖の定常領域の間に人工鎖間ジスルフィド結合を形成することができ、従って、ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体との間の結合親和性および／または結合半減期をさらに便利に評価することができる。ＴＣＲ可変領域のＣＤＲ領域が、ｐＭＨＣ複合体との間の親和力を決定し、従って、前記ＴＣＲ定常領域のシステイン置換は、ＴＣＲの結合親和力および／または結合半減期に影響を及ぼさないことを理解すべきである。従って、本発明において、測定された参照ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体との間の結合親和力は、野生型ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体との間の結合親和力とみたされる。同様に、測定された本発明のＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体との間の結合親和力が、参照ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体との間の結合親和力の少なくとも１０倍であれば、本発明のＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体との間の結合親和力が、野生型ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体との間の結合親和力の少なくとも１０倍であることと同等である。
【０１５８】
任意の適切な方法で結合親和力（解離平衡定数ＫＤと反比例）と結合半減期（Ｔ１／２に表示される）を測定することができる。ＴＣＲの親和力を倍増するとＫＤが半分に減ることを理解すべきである。Ｔ１／２は、Ｉｎ２を解離速度（Ｋｏｆｆ）で割った値として計算される。従って、Ｔ１／２が倍増するとＫｏｆｆが半分に減る。好ましくは、同じ試験案を使用して、与えられたＴＣＲの結合親和力または結合半減期回数、例えば３回またはもっと測定して、結果の平均値をとった。好ましい実施形態において、本実施例における表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）の方法でこれらの測定を行った。当該方法で測定されたＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する参照ＴＣＲの解離平衡定数ＫＤは、４.３Ｅ−０５Ｍ、即ち４３μＭであり、本発明でＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する野生型ＴＣＲの解離平衡定数ＫＤも４３μＭであるとみなされる。ＴＣＲの親和力が倍増するとＫＤが半分に減るので、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する高親和力ＴＣＲの解離平衡定数ＫＤが４.３Ｅ−０６Ｍ、即ち４.３μＭと測定されると、当該ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する高親和力ＴＣＲの親和性がＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する野生型ＴＣＲの親和力の１０倍であることを説明する。当業者に公知されたＫＤ値の単位の間の換算関係は１Ｍ＝１０００μＭ、１μＭ＝１０００ｎＭ、１ｎＭ＝１０００ｐＭである。
【０１５９】
本発明の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体の親和力は、野生型ＴＣＲの少なくとも２倍であり、好ましくは、少なくとも５倍であり、さらに好ましくは、少なくとも１０倍である。
【０１６０】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体の親和力は、野生型ＴＣＲの少なくとも５０倍であり、好ましくは、少なくとも１００倍であり、さらに好ましくは、少なくとも５００倍であり、最も好ましくは、少なくとも１０００倍である。
【０１６１】
他の一つの好ましい例において、前記ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体の親和力は、野生型ＴＣＲの少なくとも１０４倍であり、好ましくは、少なくとも１０５倍であり、さらに好ましくは、少なくとも１０６倍であり、最も好ましくは、少なくとも１０７倍である。
【０１６２】
具体的に、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する前記ＴＣＲの解離平衡定数は、ＫＤ≦２０μＭであり、
他の一つの好ましい例において、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する前記ＴＣＲの解離平衡定数は、５μＭ≦ＫＤ≦１０μＭであり、好ましくは、０.１μＭ≦ＫＤ≦１μＭであり、さらに好ましくは、１ｎＭ≦ＫＤ≦１００ｎＭであり、
他の一つの好ましい例において、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対する前記ＴＣＲの解離平衡定数は、１００ｐＭ≦ＫＤ≦１０００ｐＭであり、好ましくは、１０ｐＭ≦ＫＤ≦１００ｐＭであり、さらに好ましくは、１ｐＭ≦ＫＤ≦１０ｐＭである。
【０１６３】
任意の適切な方法で突然変異させることができ、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるこのようなものは、制限酵素によるクローニングまたはライゲーション独立クローニング（ＬＩＣ）の方法を含むがこれらに限定されない。多くの標準的な分子生物学の教科書では、これらの方法を詳細に説明した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異と制限酵素によるクローニングに対するより多くの詳細については、ＣＳＨＬ出版社のＳａｍｂｒｏｏｋとＲｕｓｓｅｌｌ，（２００１）分子クローニング−実験室手帳（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第３版）を参照することができる。ＬＩＣ方法に対するより多くの情報は、（Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ，（１９９５）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ６（１）：３０−６）を参照することができる。
【０１６４】
本発明のＴＣＲを生成する方法は、このようなタイプのＴＣＲを示すファージ粒子の多様なライブラリ（ｌｉｂｒａｒｙ）からＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に対して高親和性を有するＴＣＲをスクリーニングであることができるが、これに限定されず、例えば、文献（Ｌｉ、ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ２３（３）：３４９−３５４）に記載の通りである。
【０１６５】
野生型ＴＣＲαとβ鎖可変ドメインアミノ酸を発現する遺伝子またはわずかに変形された野生型ＴＣＲのαとβ鎖可変ドメインアミノ酸を発現する遺伝子は、すべての鋳型ＴＣＲを製造するために使用することができることを理解すべきである。その後、当該鋳型ＴＣＲの可変ドメインをコードするＤＮＡに、本発明の高親和力ＴＣＲを生成するために必要な変更が導入される。
【０１６６】
本発明の高親和性ＴＣＲは、α鎖可変ドメインアミノ酸配列配列番号：５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６中の１つ、および／またはβ鎖可変ドメインアミノ酸配列配列番号：８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２中の１つを含む。従って、野生型ＴＣＲのα鎖可変ドメインアミノ酸配列（配列番号：１）を含むＴＣＲα鎖は、配列番号：８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２中の１つを含むＴＣＲβ鎖とヘテロ二量体ＴＣＲまたは単鎖ＴＣＲ分子を形成することができる。または、野生型ＴＣＲのβ可変ドメインアミノ酸配列（配列番号：２）を含むＴＣＲβ鎖は、配列番号：５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６中の１つを含むＴＣＲα鎖とヘテロ二量体ＴＣＲまたは単鎖ＴＣＲ分子を形成することができる。または、ＴＣＲα鎖可変ドメインアミノ酸配列配列番号：５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６中の１つを含むＴＣＲα鎖は、ＴＣＲβ鎖可変ドメインアミノ酸配列配列番号：８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２中の１つを含むＴＣＲβ鎖とヘテロ二量体ＴＣＲまたは単鎖ＴＣＲ分子を形成することができる。本発明において、ヘテロ二量体ＴＣＲ分子を形成するα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、好ましくは下記表１から選択される。
【０１６７】
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2019535328.tif 000016
2019535328.tif 000017
【０１６８】
本発明の目的に基づいて、本発明のＴＣＲは、少なくとも１つのＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβ鎖可変ドメインを有する部分である。通常、これらはＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインを同時に含む。これらは、αβヘテロ二量体または一本鎖形態または他の任意の安定的に存在することができる形態であることができる。養子免疫療法では、αβヘテロ二量体ＴＣＲの全長鎖（細胞と膜貫通ドメインを含む）が形質感染することができる。本発明のＴＣＲは、治療剤を抗原提示細胞に伝達するためのターゲット剤又は他の分子と組み合わせて二機能性ポリペプチドを効果細胞に指向させるために使用することができ、この時、好ましくは、ＴＣＲは利用可溶形態である。
【０１６９】
安定性について、先行技術でＴＣＲのαとβ鎖定常ドメインの間に人工鎖間ジスルフィド結合を導入すれば、可溶性の且つ安定的なＴＣＲ分子を得ることができることを開示し、例えば、特許文献ＰＣＴ／ＣＮ２０１５／０９３８０６に記述した通りである。従って、本発明のＴＣＲは、そのαとβ鎖定常ドメインの残基の間に人工鎖間ジスルフィド結合された導入するＴＣＲであることができる。システイン残基は、前記ＴＣＲのαとβ鎖定常ドメインの間に人工鎖間ジスルフィド結合を形成する。システイン残基は、天然ＴＣＲ内の適切なサイトの他のアミノ酸残基に置換して、人工鎖間ジスルフィド結合を形成する。例えば、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８を置換して、及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７を置換して、ジスルフィド結合を形成する。システイン残基を導入してジスルフィド結合を形成する他のサイトは、さらにＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＰｒｏ８９及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、またはＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０であることができる。即ち、システイン残基が前記αとβ鎖定常ドメイン中の任意のサイトに置換された。システイン残基を含まず、天然鎖間ジスルフィド結合を欠失する目的を達成するために、本発明のＴＣＲ定常ドメインの１つまたは複数のＣ末端から最大１５個、または最大１０個、または最大８個またはより少ないアミノ酸を切断することができ、天然鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を他の１つのアミノ酸に突然変異させて、前記目的を達成することもできる。
【０１７０】
上述したように、本発明のＴＣＲは、そのαとβ鎖定常ドメインの残基の間に導入された人工鎖間ジスルフィド結合を含むことができる。定常ドメインの間に上述したように導入された人工ジスルフィド結合を含んでも、含まなくても、本発明のＴＣＲは、ＴＲＡＣ定常ドメイン配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列をすべて含むことができることに注意すべきである。ＴＣＲのＴＲＡＣ定常ドメイン配列とＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列は、ＴＣＲ中に存在する天然鎖間ジスルフィド結合によって連結することができる。
【０１７１】
なお、安定性について、特許文献ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７７６８０で、ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合を導入して、ＴＣＲの安定性を著しく向上させることができることを開示した。従って、本発明の高親和力ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合がさらに含まれることができる。具体的に、前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工鎖間ジスルフィド結合が形成されたシステイン残基は、ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、またはＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸及びＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸を置換した。好ましくは、このようなＴＣＲは、（ｉ）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部ＴＣＲα鎖、及び（ii）その膜貫通ドメイン以外の全部または一部ＴＣＲβ鎖を含むことができ、ここで、（ｉ）及び（ii）の両方は、ＴＣＲ鎖の可変ドメイン及び少なくとも一部の定常ドメインを含み、α鎖とβ鎖は、ヘテロ二量体を形成する。さらに好ましくは、このようなＴＣＲは、α鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメイン及び膜貫通ドメイン以外の全部または一部β鎖定常ドメインを含むことができるが、α鎖定常ドメインを含まず、前記ＴＣＲのα鎖可変ドメインは、β鎖とヘテロ二量体を形成する。
【０１７２】
安定性について、一方、本発明のＴＣＲは、その疎水性コア領域で突然変異されたＴＣＲをさらに含み、好ましくは、これらの疎水性コア領域の突然変異は、本発明のＴＣＲの安定性を向上させることができる突然変異であり、例えば、公開番号ＷＯ２０１４／２０６３０４の特許文献に記載された通りである。このようなＴＣＲは、（αおよび／またはβ鎖）可変領域のアミノ酸１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、９４番、および／またはα鎖Ｊ遺伝子（ＴＲＡＪ）オリゴペプチドのアミノ酸位置後ろから３、５、７番、および／またはβ鎖Ｊ遺伝子（ＴＲＢＪ）オリゴペプチドのアミノ酸位置後ろから２、４、６番の可変ドメイン疎水性コアの位置で突然変異されることができ、ここで、アミノ酸配列の位置番号は、国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）に列挙された位置に基づいてナンバリングされる。当業者は、前記の国際免疫遺伝学情報システムを知っていて、当該データベースに基づいてＩＭＧＴ中の異なるＴＣＲのアミノ酸残基の位置番号を得ることができる。
【０１７３】
さらに具体的に、本発明中の疎水性コア領域が突然変異されたＴＣＲは、αとβ鎖の可変ドメインを柔軟なペプチド鎖で連結して構成された高安定性の単鎖ＴＣＲであることができる。ＴＣＲ可変領域のＣＤＲ領域は、オリゴペプチド−ＨＬＡ複合体との間の親和力を決定し、疎水性コアの突然変異は、ＴＣＲをさらに安定させることがでるが、オリゴペプチド−ＨＬＡ複合体との間の親和力に影響を与えない。本発明において、柔軟なペプチド鎖は、任意の適切なＴＣＲαとβ鎖可変ドメインを連結するペプチド鎖であることができることに注意すべきである。本発明の実施例１で構築された高親和性ＴＣＲの選別用鋳型鎖は、前記疎水性コア突然変異を含む高安定性の単鎖ＴＣＲである。安定性が比較的に高いＴＣＲを使用して、ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体との間の親和力を容易に評価することができる。
【０１７４】
当該一本鎖鋳型ＴＣＲのα鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインのＣＤＲ領域と野生型ＴＣＲのＣＤＲ領域は、完全に同じである。即ち、α鎖可変ドメインの３つのＣＤＲは、それぞれＣＤＲ１α：ＴＳＩＮＮ、ＣＤＲ２α：ＩＲＳＮＥＲＥ、ＣＤＲ３α：ＡＴＤＡＮＧＫＩＩであり、β鎖可変ドメインの３つのＣＤＲは、それぞれＣＤＲ１β：ＳＧＨＤＹ、ＣＤＲ２β：ＦＮＮＮＶＰ、ＣＤＲ３β：ＡＳＳＬＧＳＮＥＱＹである。当該一本鎖鋳型ＴＣＲのアミノ酸配列（配列番号：５４）及びヌクレオチド配列（配列番号：５５）は、それぞれ図７ａ及び図７ｂに示された通りである。これにより、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体に対して高親和性を有するα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインで構成された単鎖ＴＣＲをスクリーニングした。
【０１７５】
本発明において、一本鎖鋳型ＴＣＲα鎖可変ドメイン配列番号：３の３つのＣＤＲ、即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ配列番号：３の２７−３１番目、４９−５５番目及び９０−９８番目に位置される。これにより、アミノ酸残基の番号は、配列番号：３に示される番号を使用し、２７Ｔは、ＣＤＲ１αの１番目のＴであり、２８Ｓは、ＣＤＲ１αの２番目のＳであり、２９Ｉは、ＣＤＲ１αの３番目のＩであり、３０Ｎは、ＣＤＲ１αの４番目のＮであり、５１Ｓは、ＣＤＲ２αの３番目のＳであり、５２Ｎは、ＣＤＲ２αの４番目のＮであり、５３Ｅは、ＣＤＲ２αの５番目のＥであり、５４Ｒは、ＣＤＲ２αの６番目のＲであり、９０Ａは、ＣＤＲ３αの１番目のＡであり、９１Ｔは、ＣＤＲ３αの２番目のＴであり、９３Ａは、ＣＤＲ３αの４番目のＡであり、９４Ｎは、ＣＤＲ３αの５番目のＮであり、９５Ｇは、ＣＤＲ３αの６番目のＧであり、９６Ｋは、ＣＤＲ３αの７番目のＫであり、９７Ｉは、ＣＤＲ３αの８番目のＩであり、９８Ｉは、ＣＤＲ３αの９番目のＩである。
【０１７６】
同様に、本発明において、一本鎖鋳型ＴＣＲβ鎖可変ドメイン配列番号：４の３つのＣＤＲ、即ちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ配列番号：２の２７−３１番目、４９−５４番目及び９３−１０２番目に位置される。従って、アミノ酸残基の番号は、配列番号：２に示される番号を使用し、５１Ｎは、ＣＤＲ２βの３番目のＮであり、５２Ｎは、ＣＤＲ２βの４番目のＮであり、５３Ｖは、ＣＤＲ２βの５番目のＶであり、５４Ｐは、ＣＤＲ２βの６番目のＰであり、９５Ｓは、ＣＤＲ３βの３番目のＳであり、９６Ｌは、ＣＤＲ３βの４番目のＬであり、９８Ｓは、ＣＤＲ３βの６番目のＳである。
【０１７７】
本発明のＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に対して高親和性を有するαβヘテロ二量体の獲得は、スクリーニングされた高親和性単鎖ＴＣＲのαとβ鎖可変ドメインのＣＤＲ領域を野生型ＴＣＲα鎖可変ドメイン（配列番号：１）とβ鎖可変ドメイン（配列番号：２）の対応する位置に転移して得られたものである。
【０１７８】
本発明の一部の実施例において、配列番号：１に示される番号を使用し、本発明のＴＣＲのα鎖可変ドメイン疎水性コアアミノ酸残基１９Ａ（即ち、ＩＭＧＴに列挙されたα鎖可変領域１９番目）、２１Ｍ（即ち、ＩＭＧＴに列挙されたα鎖可変領域２１番目）、７９Ｓ（即ち、ＩＭＧＴに列挙されたα鎖可変領域９４番目）中の１つまたは複数が突然変異され、および／または配列番号：２に示される番号を使用し、前記ＴＣＲβ鎖可変ドメイン疎水性コアアミノ酸残基１３Ｔ（即ち、ＭＧＴに列挙されたβ鎖可変領域１３番目）、８２Ｓ（即ち、ＩＭＧＴに列挙されたβ鎖可変領域９４番目）中の１つまたは複数が突然変異される。
【０１７９】
さらに具体的に、本発明の一部の実施例において、配列番号：１に示される番号を使用し、本発明α鎖可変ドメイン疎水性コアは、アミノ酸残基１９Ｖ、２１Ｉ及び７９Ｖ中の１つまたは複数を含み、および／または配列番号：２に示される番号を使用し、前記ＴＣＲβ可変ドメイン疎水性コアは、アミノ酸残基１３Ｖ及び８２Ｖ中の１つまたは複数を含み。さらに具体的に、前記ＴＣＲα可変ドメイン疎水性コアの突然変異形態は、Ａ１９Ｖ、Ｍ２１Ｉ及びＳ７９Ｖ中の１つまたは複数のグループを含み、前記ＴＣＲβ可変ドメイン疎水性コアの突然変異形態は、Ｔ１３Ｖ及びＳ８２Ｖ中の１つまたは複数のグループを含む。
【０１８０】
本発明の高親和性ＴＣＲは、α鎖可変ドメインアミノ酸配列配列番号：９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６及び３７中の１つ、および／またはβ鎖可変ドメインアミノ酸配列配列番号：３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２及び５３中の１つをさらに含む。従って、前記鋳型鎖としての高安定性の単鎖ＴＣＲα鎖可変ドメイン（配列番号：３）は、アミノ酸配列が配列番号：３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２または５３のＴＣＲβ鎖可変ドメインと組み合わせて、前記単鎖ＴＣＲ分子を形成することができる。または、前記鋳型鎖としての高安定性の単鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメイン（配列番号：４）は、アミノ酸配列が配列番号：９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６または３７のＴＣＲα鎖可変ドメインと組み合わせて、前記単鎖ＴＣＲ分子を形成することができる。または、ＴＣＲα鎖可変ドメイン配列番号：９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６及び３７中の１つは、ＴＣＲβ鎖可変ドメイン配列番号：３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２及び５３中の１つの組み合わせて、前記単鎖ＴＣＲ分子を形成することができる。本発明において、高親和力単鎖ＴＣＲ分子のα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、好ましくは下記表２から選択される。
【０１８１】
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2019535328.tif 000019
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【０１８２】
本発明のＴＣＲは、多価複合体の形態で提供されることもできる。本発明の多価ＴＣＲ複合体は、ｐ５３の４合体ドメインを使用して形成された４合体、または複数の本発明のＴＣＲが、他のいずれかの分子と結合して形成された複合体のような２個、３個、４個またはさらに多い本発明のＴＣＲと結合されて形成されたポリマーを含む。本発明のＴＣＲ複合体は、提示特定抗原を体外または体内追跡したり、標的化するために使用することができ、これらのタイプの応用がある他の多価ＴＣＲ複合体の中間体を製造するために使用することもできる。
【０１８３】
本発明のＴＣＲは、単独で使用することができ、コンジュゲートと共有結合または他の方法で結合されることもでき、好ましくは、共有方式で結合される。前記コンジュゲートは、検出可能なマーカー（診断目的のためのものであり、ここで、前記ＴＣＲは、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体を提示する細胞の存在を検出するためのものである）、治療剤、ＰＫ（タンパク質キナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ））修飾部分または任意の以上これらの物質の組み合わせ結合または接合を含む。
【０１８４】
診断用の検出可能なマーカーは、蛍光または蛍光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）、またはＣＴ（コンピュータ断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成することができる酵素を含むが、これに限定されない。
【０１８５】
本発明のＴＣＲと結合したり、接合されたりする治療剤は、１.放射性核種（Ｋｏｐｐｅ等，２００５年，がん転移評論（Ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｒｅｖｉｅｗｓ）２４，５３９）、  ２.生物毒（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ等、１９８９，自然（Ｎａｔｕｒｅ）３３９，３９４；  Ｅｐｅｌ等、２００２年，癌免疫学および免疫療法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）５１，５６５），３.ＩＬ−２などのサイトカイン（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ）（Ｇｉｌｌｉｅｓ等，１９９２年，米国国立科学アカデミー（ＰＮＡＳ）８９，１４２８、Ｃａｒｄ等，２００４年，癌免疫学および免疫療法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）５３，３４５、Ｈａｌｉｎ等，２００３年，がん研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）６３，３２０２）、４.抗体Ｆｃ断片（Ｍｏｓｑｕｅｒａ等，２００５年，免疫学雑誌（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）１７４，４３８１）、５.抗体ｓｃＦｖ断片（Ｚｈｕ等，１９９５，癌国際ジャーナル（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）６２，３１９）、６.金ナノ粒子／ナノロッド（Ｌａｐｏｔｋｏ等，２００５年，がん通信（Ｃａｎｃｅｒ  ｌｅｔｔｅｒｓ）２３９，３６、Ｈｕａｎｇ等，２００６年，米国化学学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）１２８，２１１５）、７.ウイルス粒子（Ｐｅｎｇ等，２００４年，遺伝子治療（Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）１１，１２３４）、８.リポソーム（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）（Ｍａｍｏｔ等，２００５年，がん研究（Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）６５，１１６３１）、９.ナノ磁性粒子、１０.プロドラッグ（Ｐｒｏｄｒｕｇ）活性酵素（例えば、ＤＴ−ディアポーラ第（ＤＴＤ）またはビフェニル加水分解酵素類似蛋白質（ＢＰＨＬ））、１１.化学治療剤（例えば、シスプラチン（Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ））または任意の形式のナノ粒子を含むが、これらに限定されない。
【０１８６】
本発明にＴＣＲ結合される抗体またはその断片は、抗−ＣＤ３または抗−ＣＤ２８または抗−ＣＤ１６抗体のような抗−Ｔ細胞またはＮＫ−細胞決定抗体を含み、前記抗体またはその断片とＴＣＲの結合は、効果細胞に対して指向して標的細胞をより効果的に標的化することができる。一つの好ましい実施形態において、本発明のＴＣＲは、抗−ＣＤ３抗体または前記抗−ＣＤ３抗体の機能断片または変異体と結合される。具体的に、本発明のＴＣＲと抗ＣＤ３一本鎖抗体の融合分子は、配列番号：９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６から選択されるＴＣＲα鎖可変ドメインアミノ酸配列、及び配列番号：３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２から選択されるＴＣＲβ鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
【０１８７】
本発明は、また本発明のＴＣＲをコードする核酸分子に関する。本発明の核酸分子は、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であることができる。ＤＮＡは、コーディング鎖または非コーディング鎖であることができる。例えば、本発明のＴＣＲをコードする核酸配列は、可以与本発明の図面に示される核酸配列と同じであることができ、または変形された変異体であることができる。「変形された変異体」の意味を例を挙げて説明すれば、本文に使用されたように、「変形された変異体」は、本発明の配列番号：５４のタンパク質配列を備えたが、配列番号：５５の配列と他の核酸配列をコードすることを指す。
【０１８８】
通常、本発明の核酸分子全長配列またはその断片は、ＰＣＲ増幅法、組換え方法または人工合成の方法で得ることができるが、これに限定されない。現在、本発明のＴＣＲ（またはその断片、またはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列を化学合成的に完全に得ることができる。そして、当該ＤＮＡ配列は、本分野で公知の従来のＤＮＡ分子（または、例えばベクター）と細胞に導入することができる。
【０１８９】
本発明は、また、本発明の核酸分子を含むベクター、および本発明のベクターまたはコード配列から遺伝子工学によって生成された宿主細胞に関する。
【０１９０】
本発明は、本発明のＴＣＲを発現する単離細胞、特にＴ細胞をさらに含む。本発明の高親和力ＴＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡへのＴ細胞形質感染に適した様々な方法がある（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓ等.，（２００８）Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ.１８０：６１１６−６１３１）。本発明の高親和性ＴＣＲを発現するＴ細胞は、養子免疫治療に使用することができる。当業者は、養子免疫治療を実行するための多くの適切な方法を知っている（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等.，（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ８（４）：２９９−３０８）。
【０１９１】
本発明は、薬学的に許容されるベクター及び本発明のＴＣＲ、または本発明のＴＣＲ複合体、または本発明のＴＣＲを提示する細胞を含む薬学的組成物をさらに提供した。
【０１９２】
本発明は、治療が必要な対象に、本発明のＴＣＲ、または本発明のＴＣＲ複合体、または本発明のＴＣＲを提示する細胞、または本発明の薬学的組成物を適量投与するステップを含む疾患を治療する方法をさらに提供する。
【０１９３】
本文のアミノ酸の名称は、国際的に通用する単一の英語アルパベトルル使用して表示して、これに対応されるアミノ酸の名称は、３つの英語のアルファベットと略称し、それぞれＡｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｖａｌ（Ｖ）であることを理解しなければならなく、
本発明において、Ｐｒｏ６０または６０Ｐは、すべて６０番目のプロリンを示す。なお、本発明による変異体の具体的な形態の表現方法は、例えば、「Ｔ２７Ｇ」は、２７番目のＴがＧで置換されたことを表し、同様に、「Ｉ２９Ａ／Ｖ」は２９番目のＩがＡで置換され、またはＶに置換されたことを表す。他のものもそれに応じて類推する。
【０１９４】
本分野において、性能が似ていたり、類似のアミノ酸に置換する場合には、一般的にタンパク質の機能を変化させない。通常、Ｃ末端および／またはＮ末端に１つまたは複数のアミノ酸を添加しても、タンパク質の構造と機能を変化させない。従って、本発明のＴＣＲは、本発明のＴＣＲの最大５個、好ましくは３個、さらに好ましくは２個、最も好ましくは１個のアミノ酸（特にＣＤＲ領域のほかの場所されたアミノ酸）をさらに含み、性質が似ているか近いアミノ酸に置換されても、まだ機能的ＴＣＲを維持することができる。
【０１９５】
本発明は、本発明のＴＣＲに対して少し変形させたＴＣＲをさらに含む。変形（通常は、１次構造は変更されない）の形式は、アセチル化（Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）またはカルボキシ化（Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ）のような、本発明のＴＣＲの化学的誘導形式を含む。変形はグリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）をさらに含み、例えば、本発明のＴＣＲの合成と加工で、または追加の加工段階でグリコシル化して生成されたＴＣＲある。これらの変形は、ＴＣＲをグリコシル化させた酵素（例えば、哺乳動物のグリコシル化酵素または脱グリコシル化酵素）に露出させて完成することができる。変形形式でリン酸化アミノ酸残基（例えば、ホスホチロシン（Ｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）、フォースポーセリン（Ｐｈｏｓｐｈｏｓｅｒｉｎｅ）、ホスホスレオニン（Ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｒｅｏｎｉｎｅ））を有する配列をさらに含む。変形されてその抗タンパク質加水分解性能を向上させたり、溶解性を最適化させたＴＣＲをさらに含む。
【０１９６】
本発明のＴＣＲ、ＴＣＲ複合体または本発明のＴＣＲで形質感染Ｔ細胞は、薬学的に許容されるベクターと一緒に薬学的組成物に提供されることができる。通常、本発明のＴＣＲ、多価ＴＣＲ複合体または細胞は、無菌薬学的組成物の一部として提供され、前記組成物は、通常、薬学的に許容されるベクターを含む。当該薬学的組成物は、任意の適切な形式であることができる（患者に投与されるための方法によって決定される）。単位剤形で提供されることができ、一般的に密閉された容器に提供され、キット（Ｋｉｔ）の一部として提供されることができる。このタイプのキット（しかし、必須ではない）は、使用説明書が含まれる。複数の前記単位剤形を含むことができる。
【０１９７】
なお、本発明のＴＣＲは、単独で使用することができ、他の治療剤と組み合わせたり、組み合わせて併用することができる（例えば、同じ薬学的組成物に調製する）。
【０１９８】
薬学的組成物は、薬学的に許容されるベクターをさらに含むことができる。用語「薬学的に許容されるベクター」は、治療剤を投与するためのベクターを意味する。当該用語は、これらの自体には投与を受ける個体に有害な抗体を誘導せず、投与後過度の毒性のない薬剤のベクトルは、前記組成物を指す。これらのベクターは、当業者に公知されたものである。レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ.  Ｃｏ.，Ｎ.Ｊ.  １９９１））で、薬学的に許容される賦形剤に関する十分な議論を見つけることができる。これらのベクターは、塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン（Ｇｌｙｃｅｒｉｎ）、エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）、アジュバント、およびそれらの組み合わせを含む（ただし、これに限定されない）。
【０１９９】
治療性組成物で薬学的に許容されるベクターは、水、塩水、グリセリン及びエタノールのような液体を含むことができる。また、このようなベクターに湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質が存在することができる。
【０２００】
通常、治療性組成物は、液体溶液または懸濁液のような注射可能な製剤として製造することができ、注射前に溶液または懸濁液に調製するのに適した固体形態の液体ベクターで製造されることもできる。
【０２０１】
本発明の組成物で製造されると、これを従来の経路によって投与することができ、ここで眼内、筋肉内、静脈内、皮下、皮内または局所投与を含み（ただし、これらに限定されない）、好ましくは、皮下、筋肉内または静脈内を含む非経口投与である。予防または治療される対象は、動物、特に人であることができる。
【０２０２】
本発明の薬学的組成物が、実際の治療に使用される場合には、使用状況に応じて、様々な異なる剤形の薬学的組成物を使用することができる。好ましくは、注射剤、経口剤などが挙げられる。
【０２０３】
これらの薬学的組成物は、通常の方法によって混合、希釈または溶解して調製することができ、また、賦形剤、崩壊剤、接着剤、潤滑剤、シンナー、緩衝剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｔｉｅｓ）、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、安定剤、および助溶剤のような適切な薬学的添加剤をたまに追加し、当該調製過程は製剤は、通常の方法で行われることができる。
【０２０４】
本発明の薬学的組成物は、徐放剤の形式で投与することもできる。例えば、本発明のＴＣＲは、徐放性ポリマーがベクトルである錠剤またはマイクロカプセルに混入された後、手術を介して治療するための組織として移植することができる。徐放性ポリマーの例として、エチレン−酢酸ビニル（ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｖｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）ポリマー、ポリヒドロメタアクリレート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｍｅｔａａｃｒｙｌａｔｅ）、ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、乳酸ポリマー、乳酸−グリコール酸重合体などを例に挙げられ、好ましくは、乳酸−グリコール酸共重合体のような生分解性ポリマーを挙げられる。
【０２０５】
本発明の薬学的組成物が、実際の治療に使用される場合、活性成分である本発明のＴＣＲまたはＴＣＲ複合体または本発明のＴＣＲを提示する細胞は、治療される各患者の体重、年齢、性別、症状の程度に応じて決定されることができ、最終的に医師によって合理的な容量が決定される。
【０２０６】
本発明の主な利点は、下記の通りである。
（１）前記ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に対する本発明のＴＣＲの親和力および／または結合半減期は、少なくとも野生型ＴＣＲの２倍、好ましくは、少なくとも１０倍である。
（２）前記ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に対する本発明のＴＣＲの親和力および／または結合半減期は、少なくとも野生型ＴＣＲの１００倍であり、好ましくは、少なくとも１０００倍であり、さらに好ましくは、１０４〜１０７倍に達することができる。
（３）本発明の高親和力ＴＣＲを形質導入させる効果細胞は、標的細胞に対して非常に強い殺傷作用がある。
次の具体的な実施例では、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、単に本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲はこれに限定されないことを理解しなければならない。下記の実施例において、具体的な条件を示していない実験方法は、例えば、（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ等、分子クローン：実験室ハンドブック（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第３版）（２００１）ＣＳＨＬ出版社）に記載された条件、またはメーカーから提案する条件のような通常の条件に従う。他の説明がなければ、割合と部数は重量に基づいて計算される。
【０２０７】
材料及び方法
本発明の実施例に使用された実験材料について特別な説明がなければ、すべての市販で入手することができて、ここで、Ｅ.ｃｏｌｉ  ＤＨ５αはＴｉａｎｇｅｎから購入され、Ｅ.ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）はＴｉａｎｇｅｎから購入され、Ｅ.ｃｏｌｉ  Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）はＮｏｖａｇｅｎから購入され、プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）ｐＥＴ２８ａはＮｏｖａｇｅｎから購入される。
【０２０８】
実施例１.疎水性コア突然変異された安定的な単鎖ＴＣＲ鋳型鎖の生成
本発明は、部位特定突然変異の方法で、特許文献ＷＯ２０１４／２０６３０４による記載に基づいて、１つの柔軟なオリゴペプチド（ｌｉｎｋｅｒ）によってＴＣＲαとβ鎖可変ドメインを連結して構成された安定的な単鎖ＴＣＲ分子を構築し、そのアミノ酸とＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号：５４と配列番号：５５であり、図７ａ及び図７ｂに示された通りである。当該単鎖ＴＣＲ分子を鋳型で高親和性ＴＣＲ分子をスクリーニングした。当該鋳型鎖のα可変ドメイン（配列番号：３）とβ可変ドメイン（配列番号：４）のアミノ酸配列は、図２ａ及び図２ｂに図示された通りであり、これに対応されるＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号：５と６であり、図３ａ及び３ｂに示された通りであり、柔軟なオリゴペプチド（ｌｉｎｋｅｒ）のアミノ酸配列とＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号：７と８であり、図４ａ及び４ｂに示された通りである。
【０２０９】
鋳型鎖を持った目的遺伝子をＮｃｏＩとＮｏｔＩ二重酵素で切断し、ＮｃｏＩとＮｏｔＩ二重酵素によって切断されたｐＥＴ２８ａベクターに連結させる。連結産物をＥ.ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換させ、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を含有するＬＢプレートにコーティングし、３７℃の温度の下で一晩反転培養し、陽性クローンを取り、ＰＣＲでスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンス（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）し、配列が正確であるかどうかを確認した後、組換えプラスミドを発現するために抽出して、Ｅ.ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた。
【０２１０】
実施例２.実施例１で構築された安定的な単鎖ＴＣＲの発現、再生及び精製
実施例１で製造された組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ−鋳型鎖を含有するＢＬ２１（ＤＥ  ３）ギュンラクをカナマイシンを含有するＬＢ培地に完全に接種し、ＯＤ６００が０.６〜０.８になるまで３７℃の温度で培養し、ＩＰＴＧを入れて最終濃度を０.５ｍＭにして、３７℃の温度で継続して４時間培養した。５０００ｒｐＭで１５分間遠心分離して細胞沈殿物を得て、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ）で細胞沈殿物を分解させ、６０００ｒｐＭで１５分間遠心分離して封入体を回収し、再びＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ）で洗浄し、細胞破壊、水と膜成分を除去し、６０００ｒｐＭで１５分間遠心分離して封入体を収集した。封入体を緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８.０、８Ｍの尿素）に溶解させ、高速遠心分離して不溶性物質を除去し、上清液をＢＣＡ法で定量して分割入れて、−８０℃の温度下で保管した。
【０２１１】
５ｍｇの溶解された単鎖ＴＣＲボンイプチェタンパク質に、２.５ｍＬの緩衝液（６Ｍ  Ｇｕａ−ＨＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８.１、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を入れて、ＤＴＴを入れて最終濃度を１０ｍＭとし、３７℃の温度で３０分間処理した。注射器で１２５ｍＬの再生緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８.１、０.４ＭＬ−アルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）、５Ｍの尿素、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、６.５ｍＭβ−ｍｅｒｃａｐｔｈｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、１.８７ｍＭ  Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ）に前記処理された単鎖ＴＣＲを滴下し、４℃の温度下で１０分間攪拌した後、再生液を４  ｋＤａのセルロース膜透析バック（ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｂａｇ）に入れ、透析バッグを１Ｌの予冷された水に入れて、４℃の温度下で一晩ゆっくりと攪拌した。１７時間後、透析液を１Ｌの予冷された緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８.０）に変えて、４℃の温度で継続して８時間透析した後、透析液を同じ新鮮な緩衝液に変えて継続して一晩透析した。１７時間後、サンプルを０.４５μｍのろ過膜でろ過して、真空脱気した後、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８.０で製造された０−１ＭのＮａＣｌの線形勾配溶出液に蛋白質を精製し、収集された溶出成分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、単鎖ＴＣＲを含有する成分を濃縮させた後、再度ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、目的成分ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【０２１２】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析に使用される溶出成分をさらにゲルろ過法で純度を測定した。条件は、クロマトグラフィーカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏ  ＳＥＣ−３（３００Ａ、φ７.８×３００ｍｍ）であり、移動相は、１５０ｍＭのリン酸塩緩衝液であり、流速は０.５ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は２５℃であり、紫外線検出波長は２１４ｎｍである。
【０２１３】
実施例３.結合特性
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００リアルタイム分析システムとしてＴＣＲ分子とＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体の結合活性を測定した。抗ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）の抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）のカップリングバッファ（Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（１０ｍＭの酢酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）緩衝液、ｐＨ４.７７）を入れた後、抗体を事前にＥＤＣとＮＨＳによって活性化されたＣＭ５チップに流して、抗体をチップ表面に固定させ、最後にエタノールアミン（Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）の塩酸溶液で未反応活性表面を遮断して、カップリング処理を完了しており、カップリングレベルは、約１５０００ＲＵである。
【０２１４】
低濃度のストレプトアビジンを抗体にコーティングされたチップ表面に流すし、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体を検出チャンネルに流し、他の１つのチャネルを参照チャンネルとし、再び０.０５ｍＭのビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）を１０μＬ／ｍｉｎの流速で２分間チップを流して、ストレプトアビジンの残りの結合サイトをブロックした。単一の循環動力学解析方法を使用して親和力を測定し、ＴＣＲをＨＥＰＥＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.００５％Ｐ２０、ｐＨ７.４）で、いくつかの異なる濃度に希釈し、３０μＬ／ｍｉｎの流速で順次チップ表面を流れるようにして、サンプルの１回の注入当たりの結合時間は１２０秒であり、最後のサンプル注入終了後、これを６００秒間解離させる。各ラウンドごとに測定終了後ｐＨ１.７５の１０ｍＭのＧｌｙ−ＨＣｌでチップを再生させた。ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで動力学パラメータを計算した。
【０２１５】
前記ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体の製造過程は、下記の通りである、。
【０２１６】
ａ.精製
１００ｍｌの重鎖または軽鎖の発現を誘導するＥ.ｃｏｌｉ菌液を収集し、４℃の温度下で８０００ｇで１０分間遠心分離した後、１０ｍｌのＰＢＳで菌体を１回洗浄し、次に５ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｍｅｒｃｋ）で激しく振とうして菌体を再浮遊させ、室温下で２０分間スピン培養した後、４℃、６０００ｇの条件下で１５分間遠心分離させ、上清を捨て、封入体を収集した。
【０２１７】
前記封入体を５ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに再浮遊させ、室温下で５分間スピン培養し、３０ｍｌの１０倍に希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れて均一に混合し、４℃、６０００ｇの条件下で１５分間遠心分離し、上清を捨て、３０ｍｌの１０倍に希釈されたＢｕｇＢｕｓｔｅｒを入れて封入体を再浮遊し、均一に混合し、４℃、６０００ｇの条件下で１５分間遠心分離し、２回繰り返して、３０ｍｌの２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８.０を入れて封入体を再浮遊し、均一に混合し、４℃、６０００ｇの条件下で１５分間遠心分離し、最後に２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ８Ｍの尿素で封入体を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで封入体純度を測定し、ＢＣＡキットで濃度を測定した。
【０２１８】
ｂ.再生
合成されたオリゴペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（北京賽百盛遺伝子技術有限公司）を２０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯに溶解した。軽鎖と重鎖のボンイプチェを８Ｍの尿素、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８.０、１０ｍＭのＤＴＴで溶解させ、再生前に３Ｍの塩酸グアニジン（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡを入れてさらに変性させた。ＳＬＬＭＷＩＴＱＣペプチドを２５ｍｇ／Ｌ（最終濃度）で再生緩衝液（０.４Ｍ  Ｌ−アルギニン、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８.３、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.５ｍＭ酸化グルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、５ｍＭ還元グルタチオン、０.２ｍＭ  ｐＭＳＦ、４℃まで冷却）に入れた後、２０  ｍｇ／Ｌでの軽鎖と９０ｍｇ／Ｌでの重鎖（最終濃度であり、重鎖を３回に分けて入れ、８ｈ／回）を順次入れ、再生は４℃の温度で少なくとも３日間に完成し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで正常に再生されたかどうかを測定した。
【０２１９】
ｃ.再生後の精製
１０体積の２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８.０で透析して再生緩衝液を変えて、緩衝液を少なくとも２回変えて溶液のイオン強度を減らした。透析後、０.４５μｍのセルロースアセテート（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ａｃｅｔａｔｅ）膜タンパク質溶液を濾過した後、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）陰イオン交換カラム（５ｍｌバッドボリューム（Ｂｅｄ  Ｖｏｌｕｍｅ））に入れた。Ａｋｔａ精製器（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）で、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８.０で製造された０〜４００ｍＭのＮａＣｌの線形勾配でタンパク質を溶出し、ｐＭＨＣが約２５０ｍＭのＮａＣｌで溶出し、ピーク成分を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を測定した。
【０２２０】
ｄ.ビオチン化
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ超濾過チューブで精製されたｐＭＨＣ分子を濃縮するとともに、緩衝液を２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８.０に置換した後、ビオチン化試薬０.０５ＭのＢｉｃｉｎｅ  ｐＨ８.３、１０ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｇＯＡｃ、５０μＭのＤ−Ｂｉｏｔｉｎ、１００μｇ／ｍｌのＢｉｒＡ酵素（ＧＳＴ−ＢｉｒＡ）を入れて、室温下で混合液を一晩培養し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでビオチン化が完了したかどうかを検出した。
【０２２１】
ｅ.ビオチン化された複合体の精製
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ超濾過チューブでビオチン化標識されたｐＭＨＣ分子を１ｍｌに濃縮し、ゲル濾過クロマトグラフィーでビオチン化されたｐＭＨＣを精製し、Ａｋｔａ精製器（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）を使用して、濾過されたＰＢＳでＨｉＰｒｅｐＴＭ１６／６０  Ｓ２００  ＨＲカラム（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）を前平衡させ、１ｍｌの濃縮後のビオチン化ｐＭＨＣ分子を入れた後、ＰＢＳで１ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出した。ビオチン化されたｐＭＨＣ分子は、約５５ｍｌの単一ピーク溶出であった。タンパク質が含有された成分を併合して、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ超濾過チューブで濃縮し、ＢＣＡ法（Ｔｈｅｒｍｏ）でタンパク質濃度を測定し、プロテアーゼ（Ｐｒｏｔｅａｓｅ）阻害剤ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を入れてビオチン化されたｐＭＨＣ分子を分けて−８０℃の温度下で保管した。
実施例４.高親和性単鎖ＴＣＲの生成
ファージディスプレイ技術は、高親和力変異体についてスクリーニングするためのＴＣＲ高親和力変異体ライブラリーを生成する手段である。Ｌｉ等（（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ２３（３）：３４９−３５４）に記載されたＴＣＲファージディスプレイ及びスクリーニング方法を実施例１の単鎖ＴＣＲ鋳型に応用した。当該鋳型鎖のＣＤＲ領域を変異させて高親和性ＴＣＲのライブラリーを構築し、選択した。いくつかのラウンドに経て選択されたファージのライブラリーは、すべて対応する抗原に特異的に結合され、その中で、単一のクローンを選択して、配列解析を行った。
【０２２２】
実施例３のＢＩＡｃｏｒｅ方法を使用してＴＣＲ分子とＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体の相互作用を分析し、親和力、および／または結合半減期は、少なくとも野生型ＴＣＲの２倍の高親和性ＴＣＲをスクリーニングし、即ち、スクリーニングされた高親和性ＴＣＲがＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に結合される解離平衡定数ＫＤは、野生型ＴＣＲがＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に結合された解離平衡定数ＫＤの２分の１よりも小さいか同じで、結果は下記表３の通りである。前記の方法を利用して、参照ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体の相互作用のＫＤ値が４３μＭであることを測定し、その相互作用グラフは、図１２に示した通りであり、即ち、野生型ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体の相互作用のＫＤ値も４３μＭであり、即ち、４.３Ｅ−０５Ｍである。
【０２２３】
具体的に、配列番号：１に示される番号を使用して、これらの高親和力ＴＣＲ突然変異体のα鎖可変ドメインは、２７Ｔ、２８Ｓ、２９Ｉ、３０Ｎ、５１Ｓ、５２Ｎ、５３Ｅ、５４Ｒ、９０Ａ、９１Ｔ、９３Ａ、９４Ｎ、９５Ｇ、９６Ｋ、９７Ｉと９８Ｉの一つまたは複数のサイトのアミノ酸で突然変異され、および／または配列番号：４１に示される番号を使用して、これらの高親和性ＴＣＲ突然変異体のβ鎖可変ドメインは、５１Ｎ、５２Ｎ、５３Ｖ、５４Ｐ、９５Ｓ、９６Ｌと９８Ｓの一つまたは複数のサイトで突然変異される。
【０２２４】
さらに具体的に、配列番号：１に示される番号を使用して、これらの高親和力ＴＣＲのα鎖可変ドメインは、２７Ｇ、２８Ｗ、２９Ａまたは２９Ｖ、３０Ｑ、５１Ｔ、５２Ｇ、５３Ｑ、５４Ｑまたは５４Ａ、９０Ｍ、９１Ｙ、９３Ｅまたは９３Ｑ、９４Ｆまたは９４Ｙまたは９４Ｗ、９５Ａまたは９５Ｑ、９６Ｗまたは９６Ｒまたは９６Ｔまたは９６Ｓまたは９６Ｍまたは９６Ｌ、９７Ｗまたは９７Ｖまたは９７Ｙまたは９７Ｐ、及び９８Ｅまたは９８Ｎまたは９８Ｄまたは９８Ｑまたは９８Ｋまたは９８Ｖまたは９８Ｇまたは９８Ｍまたは９８Ｓから選択される１つまたは複数アミノ酸残基を含み、および／または配列番号：２に示される番号を使用にて、これらの高親和力ＴＣＲのβ鎖可変ドメインは、５１Ｈ、５２Ｇ、５３Ａ、５４Ｖ、９５Ｑまたは９５Ｍ、９６Ｒまたは９６Ｋまたは９６Ｍ、及び９８Ａまたは９８Ｇまたは９８Ｐから選択される１つまたは複数アミノ酸残基を含む。
【０２２５】
高親和性単鎖ＴＣＲのα鎖可変ドメイン（配列番号：９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６和３７）とβ鎖可変ドメイン（配列番号：３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２和５３）の具体的なアミノ酸配列は、図５（１）〜（２９）及び図６（１）〜（１６）に示した通りである。
【０２２６】
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2019535328.tif 000022
2019535328.tif 000023
【０２２７】
実施例５.高親和性αβヘテロ二量体ＴＣＲの生成
実施例４でスクリーニングされた高親和力の単鎖ＴＣＲのＣＤＲ領域の変異をαβヘテロ二量体ＴＣＲの可変ドメインの対応するサイトに導入し、ＢＩＡｃｏｒｅを介しＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体との親和力を測定した。前記ＣＤＲ領域と親和力突然変異の導入は、当業者に公知された部位の特定の変異体の方法を使用した。前記野生型ＴＣＲのα鎖とβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列はそれぞれ図１ａ（配列番号：１）と１ｂ（配列番号：２）に示す通りである。
【０２２８】
留意すべきことは、ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ  Ａ２複合体との間の結合親和性および／または結合半減期をさらに容易に評価するための、より安定的な可溶性ＴＣＲを得るために、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、αとβ鎖の不変領域にそれぞれ一つのシステイン残基を導入して、人工鎖間ジスルフィド結合を形成したＴＣＲであることができ、本実施例において、システイン残基が導入された後、ＴＣＲαとβ鎖のアミノ酸配列は、それぞれ図８ａ（配列番号：５６）及び８ｂ（配列番号：５７）に示された通りであり、導入されたシステイン残基は、太字のアルファベットで表示した。
【０２２９】
「分子クローン実験手帳」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第３版、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ）に記述された標準的な方法によって発現されるＴＣＲαとβ鎖の細胞外配列の遺伝子を合成した後、それぞれ発現ベクターｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）に挿入し、アップストリーム（Ｕｐｓｔｒｅａｍ）と下流（Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）のクローンサイトは、それぞれＮｃｏＩとＮｏｔＩである。ＣＤＲ領域の変異は、当業者に公知されたオーバーラップＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ  ＰＣＲ）によって導入される。挿入された断片は、シーケンシングにより正確かどうかが確認される。
【０２３０】
実施例６.αβヘテロ二量体ＴＣＲの発現、再生及び精製
ＴＣＲαとβ鎖の発現ベクターをそれぞれ化学的形質転換法により発現細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させ、細菌をＬＢ培養液に生長させ、ＯＤ６００＝０.６時の最終濃度が０.５ｍＭであるＩＰＴＧで誘導し、ＴＣＲのαおよびβ鎖で発現させた後、形成された封入体をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）で抽出し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶液に何度も繰り返して洗浄し、最終的に封入体を６Ｍの塩酸グアニジン、１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８.１）に溶解した。
【０２３１】
溶解されたＴＣＲαとβ鎖を１：１の質量比で５Ｍの尿素、０.４Ｍのアルギニン、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８.１）、３.７ｍＭのｃｙｓｔａｍｉｎｅ、６.６ｍＭのβ−ｍｅｒｃａｐｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（４℃）に速やかに溶解させ、最終濃度は６０ｍｇ／ｍＬである。混合した後、溶液を１０倍体積の脱イオン水で透析して（４℃）、１２時間後に脱イオン水を緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０）に変えて継続して４℃の温度下で１２時間透析した。透析終了した溶液を０.４５μＭのろ過膜でろ過した後、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ、５ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル溶出ピークに正常に再生されたαとβの二量体が含有されたことを確認した。ＴＣＲをゲルろ過クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ１６／６０、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にさらに精製した。精製されたＴＣＲ純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより９０％よりも大きいと測定され、濃度はＢＣＡ法で測定した。
【０２３２】
実施例７.ＢＩＡｃｏｒｅ分析結果
実施例３による方法を使用して高親和力ＣＤＲ領域のαβヘテロ二量体ＴＣＲとＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体の親和力を測定した。
【０２３３】
高親和性単鎖ＴＣＲαとβ鎖からスクリーニングされたＣＤＲ領域をそれぞれ野生型ＴＣＲα鎖可変ドメイン配列番号：１とβ鎖可変ドメイン配列番号：２の対応する位置に移動し、αβヘテロ二量体ＴＣＲを形成した。得られた新たなＴＣＲαとβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ、図９（１）〜図９（２９）及び図１０（１）〜図１０（１６）に示される通りである。ＴＣＲ分子のＣＤＲ領域が対応するｐＭＨＣ複合体との親和力を決定するため、当業者は、高親和力突然変異を導入したαβヘテロ二量体ＴＣＲはＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体の高親和力も有すると期待することができる。実施例５による方法で発現ベクターを構築し、実施例６による方法で前記と親和力突然変異を導入したαβヘテロ二量体ＴＣＲを発現させ、再生して精製した後、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００でＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体との親和力を測定し、表４に示す通りである。
【０２３４】
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【０２３５】
前記表４からわかるように、ＣＤＲ領域の突然変異が導入されたαβヘテロ二量体ＴＣＲは、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体の高親和力を維持した。前記ヘテロ二量体ＴＣＲの親和性は、野生型ＴＣＲがＳＬＬＭＷＩＴＱＣ−ＨＬＡ−Ａ２複合体に対する親和性の少なくとも２倍である。
【０２３６】
実施例８.抗−ＣＤ３抗体と高親和性単鎖ＴＣＲの融合体の発現、再生及び精製
本発明の高親和性単鎖ＴＣＲ分子と抗ＣＤ３抗体の一本鎖分子（ｓｃＦｖ）を融合して融合分子を構築した。オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲの方法を通じて、プライマーを設計して、抗−ＣＤ３抗体と高親和性単鎖ＴＣＲ分子の遺伝子を連結し、中間の連結オリゴペプチド（ｌｉｎｋｅｒ）は、ＧＧＧＧＳに設計され、融合分子の遺伝子断片が制限酵素サイトＮｃｏＩとＮｏｔＩを持つようにした。ＰＣＲ増幅産物をＮｃｏＩとＮｏｔＩ二重酵素で切断し、ＮｃｏＩとＮｏｔＩ二重酵素で切断されたｐＥＴ２８ａベクターによって連結される。連結産物をＥ.ｃｏｌｉ  ＤＨ５αコムピント（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞に形質転換させ、カナマイシンを含有したＬＢプレートにコーティングし、３７℃の温度の下で一晩反転培養し、陽性クローンをとり、ＰＣＲスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンスし、配列の正確かどうかを確認した後、組換えプラスミドを発現するために抽出して、Ｅ.ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）受容性細胞に形質転換させた。
【０２３７】
融合タンパク質の発現
目的遺伝子を含有した発現プラスミドを大腸菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させ、ＬＢプレート（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）をにコーティングして、３７℃の温度の下で、一晩培養した。次の日、クローンを選択して、１０ｍｌのＬＢ液体培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）を２〜３時間培養し、１：１００の体積比に基づいて、１ＬのＬＢ培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）に接種し、継続して０.５〜０.８のＯＤ６００まで培養した後、０.５ｍＭの最終濃度のＩＰＴＧで目的タンパク質の発現を誘導した。４時間誘導した後、６０００ｒｐＭで１０分間遠心分離して細胞を得た。ＰＢＳ緩衝液で菌体を１回洗浄し、菌体を分けて入れて、２００ｍｌの細菌培養物に該当する菌体をとり、５ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に細菌を解離し、６０００ｇで１５分間遠心分離して封入体を収集した。その後、洗剤で４回洗浄して細胞を破壊物と膜成分を除去した。その後、ＰＢＳのような緩衝液で封入体を洗浄して、洗剤と塩を除去した。最終的には、封入体を８Ｍの尿素を含有したＴｒｉｓ緩衝液で溶解させ、封入体の濃度を測定し、これを分けて入れ、−８０℃の温度下で冷凍保管した。
【０２３８】
融合タンパク質のリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）
−８０℃の超低温冷蔵庫で約１０ｍｇの封入体を取り出した後、解凍し、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を入れて最終濃度を１０ｍＭにし、３７℃の温度で３０分〜１時間の間インキュベーションし（Ｉｎｃｕｂａｔｅ）ジスルフィド結合が完全に解除されることを確保した。その後、封入体サンプル溶液をそれぞれ２００ｍｌの４℃の予冷リフォールディング緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８.１、４００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５Ｍ  尿素、６.５ｍＭβ−ｍｅｒｃａｐｔｈｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ、１.８７ｍＭ  Ｃｙｓｔａｍｉｎｅ）に滴下して、約４℃の温度下で３０分間ゆっくりと攪拌した。再生溶液を８倍体積の予冷されたＨ２Ｏで１６〜２０時間の間透析した。再び８倍体積の１０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８.０で２回透析し、４℃の温度で継続して約８時間の間透析し、透析後のサンプルをろ過した後、下記のように精製した。
【０２３９】
融合タンパク質の第１のステップの精製
透析されたリポーリング物質（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８.０に）をＰＯＲＯＳ  ＨＱ／２０陰イオン交換クロマトグラフィー前のロードカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＡＫＴＡ精製器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で０〜６００ｍＭのＮａＣｌで勾配溶出した。クマシブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）で染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥで各成分を分析した後、合併した。
【０２４０】
融合タンパク質の第２のステップの精製
第１のステップの精製合併されたサンプル溶液を濃縮して、このステップの精製に提供し、ＰＢＳ緩衝液で事前平衡させたＳｕｐｅｒｄｅｘ７５１０／３００ＧＬゲル濾過クロマトグラフィー前のロードカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して融合タンパク質を精製して、クマシーブリリアントブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥでのピークの成分を分析した後、合併した。
【０２４１】
実施例９.抗−ＣＤ３抗体と高親和性αβヘテロ二量体ＴＣＲの融合体の発現、再生及び精製
抗−ＣＤ３の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）とαβヘテロ二量体ＴＣＲを融合して、融合分子を製造した。抗−ＣＤ３のｓｃＦｖとＴＣＲのβ鎖を融合し、前記ＴＣＲβ鎖は、任意の前記高親和性αβヘテロ二量体ＴＣＲのβ鎖可変ドメインを含むことができ、融合分子のＴＣＲα鎖は、任意の前記高親和性αβヘテロ二量体ＴＣＲのα鎖可変ドメインを含むことができる。
【０２４２】
融合分子発現ベクターの構築
１.α鎖発現ベクターの構築
αβヘテロ二量体ＴＣＲのα鎖を持った目的遺伝子をＮｃｏＩとＮｏｔＩ二重酵素で切断し、ＮｃｏＩとＮｏｔＩ二重酵素で切断されたｐＥＴ２８ａベクターに連結した。連結産物をＥ.ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換させ、カナマイシンを含有したＬＢプレートにコーティングし、３７℃の温度下で一晩反転培養し、陽性クローンをとり、ＰＣＲスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンスで、配列の正確かどうかを確認した後、組換えプラスミドを発現するために抽出して、Ｅ.ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた。
【０２４３】
２.  抗−ＣＤ３（ｓｃＦｖ）−β鎖発現ベクターの構築
オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲの方法で、プライマーを設計して抗−ＣＤ３  ｓｃＦｖと高親和性ヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖遺伝子を連結し、中間の連結オリゴペプチド（ｌｉｎｋｅｒ）はＧＧＧＧＳであり、抗−ＣＤ３のｓｃＦｖと高親和性ヘテロ二量体ＴＣＲβ鎖の融合タンパク質の遺伝子断片が制限酵素サイトＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）とＮｏｔＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）を持つようにした。ＰＣＲ増幅産物をＮｃｏＩとＮｏｔＩ二重酵素で切断し、ＮｃｏＩとＮｏｔＩ二重酵素で切断されたｐＥＴ２８ａベクターに連結した。連結産物をＥ.ｃｏｌｉＤＨ５α受容性細胞に形質転換させ、カナマイシンを含有したＬＢプレートにコーティングし、３７℃の温度の下で一晩反転培養し、陽性クローンをとり、ＰＣＲスクリーニングし、陽性組換え体に対してシーケンスし、配列の正確かどうかを確認した後、組換えプラスミドを発現するために抽出して、Ｅ.ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）受容性細胞に形質転換させた。
【０２４４】
融合タンパク質の発現、再生及び精製
発現プラスミドをそれぞれＥ.ｃｏｌｉ  Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）受容性細胞に形質転換させ、ＬＢプレート（カナマイシン５０μｇ／  ｍＬ）にコーティングして、３７℃の温度下で一晩培養した。次の日、クローンを選択して、１０ｍｌのＬＢ液体培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）を２〜３時間培養し、１：１００の体積比に基づいて、１ＬのＬＢ培地（カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）に接種し、継続して０.５〜０.８のＯＤ６００まで培養した後、最終濃度が１ｍＭのＩＰＴＧを入れて目的タンパク質の発現を誘導した。４時間誘導した後、６０００  ｒｐＭで１０分間遠心分離して細胞を得た。ＰＢＳ緩衝液で菌体を１回洗浄し、菌体を分けて入れて、２００ｍｌの細菌培養物に該当する菌体をとり、５ｍｌのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に細菌を解離し、６０００ｇで１５分間遠心分離して封入体を収集した。その後、洗剤で４回洗浄して細胞を破壊物と膜成分を除去した。その後、ＰＢＳのような緩衝液で封入体を洗浄して洗剤と塩を除去した。最終的には、封入体を６Ｍの塩酸グアニジン、１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８.１を含有した緩衝液で溶解し、封入体の濃度を測定し、これを分けて入れ、−８０℃の温度下で冷凍保管した。
【０２４５】
溶解されたＴＣＲα鎖と抗−ＣＤ３（ｓｃＦｖ）−β鎖を２：５の質量比で５Ｍの尿素（ｕｒｅａ）、０.４ＭのＬ−アルギニン（Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ）、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８.１、３.７ｍＭのｃｙｓｔａｍｉｎｅ、６.６ｍＭのβ−ｍｅｒｃａｐｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（４℃）に迅速で混合し、α鎖と抗−ＣＤ３（ｓｃＦｖ）−β鎖の最終濃度は、それぞれ０.１ｍｇ／ｍＬ、０.２５ｍｇ／ｍＬである。
【０２４６】
混合後の溶液を１０倍体積の脱イオン水で透析して（４℃）、１２時間後に脱イオン水を緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０）に変えて継続して４℃の温度で１２時間透析した。透析終了液を０.４５μＭのろ過膜でろ過した後、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ、５ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル溶出ピークに正常に再生されたＴＣＲα鎖と抗−ＣＤ３（ｓｃＦｖ）−β鎖の二量体のＴＣＲが含有されたことを確認した。ＴＣＲ融合分子をサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓ−１００１６／６０、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でさらに精製して、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ５ｍｌ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で再精製した。精製されたＴＣＲ融合分子の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより９０％よりも大きいと測定され、濃度はＢＣＡ法で測定した。
【０２４７】
実施例１０.本発明の高親和力ＴＣＲが形質感染効果細胞の活性化機能の実験
本実施例では、本発明の高親和力ＴＣＲが形質感染された効果細胞が標的細胞に対して優れた特異的活性作用があることを検証した。
【０２４８】
ＥＬＩＳＰＯＴ実験を通して細胞での本発明の高親和力ＴＣＲの機能と特異性を測定した。ＥＬＩＳＰＯＴ実験を通して、細胞の機能を測定する方法は、当業者によく知られている。本実施例ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ実験は、健康なボランティアの血液から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞を使用してレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）によって形質感染ＴＣＲを効果細胞とし、それぞれのＴＣＲ１（α鎖可変ドメイン配列番号：６７、β鎖可変ドメイン配列番号：２）とＴＣＲ２（α鎖可変ドメイン配列番号：６８、β鎖可変ドメイン配列番号：２）でタグ付けして、対照群の効果細胞をＷＴ−ＴＣＲ（形質感染野生型ＴＣＲ）とＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）（形質感染ＧＦＰ）でタグ付けした。標的細胞株は、Ａ３７５、Ｍｅｌ６２４、Ｍｅｌ５２６とＮＣＩ−Ｈ１６５０細胞である。ここで、標的細胞株Ａ３７５とＭｅｌ６２４は、関連抗原を発現して、Ｍｅｌ５２６とＮＣＩ−Ｈ１６５０は、関連抗原を発現していないため、対照とした。
【０２４９】
まず、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを準備した。ＥＬＩＳＰＯＴプレートをエタノールに有効にしてコーティングして、４℃の温度の下で一晩経過した、実験１日目に、コーティング液を除去し、洗浄して遮断し、室温下で２時間培養し、ブロック液を除去し、する順番にテストされている各成分をＥＬＩＳＰＯＴプレート：培地に入れて効果細胞を１×１０５個の細胞／ｍｌに調節し、培地に入れてターゲット細胞株を２×１０５個の細胞／ｍｌに調節した。均一に混合した後、２×１０５個の細胞／ｍｌ（即ち、２００００個の細胞／ウェル）の１００μＬの標的細胞株、１×１０５個の細胞／ｍｌ（即ち、１００００個の細胞／ウェル）の１００μＬの効果細胞をとり、対応するウェルに入れて、２つのデュプルリケイトウェル（Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  Ｗｅｌｌ）を設定した。一晩インキュベーションした（３７℃、５％ＣＯ２）。実験２日目に、プレートを洗浄し、二次検出と発色を行い、プレートを乾燥し、再度免疫ドットプレートリーダー（ＥＬＩＳＰＯＴ  ＲＥＡＤＥＲ  ｓｙｓｔｅｍ；  ＡＩＤ２０会社）で膜に形成された点を計数した。実験結果は、図１３に示した通りであり、本発明の高親和力ＴＣＲを形質感染させた効果細胞は、標的細胞に対して優れた特異的活性作用がある。
【０２５０】
実施例１１.本発明の高親和力ＴＣＲを形質感染させた効果細胞の殺傷機能実験
本実施例は、非放射性細胞毒性実験を通じて、ＬＤＨの放出を測定することにより、本発明のＴＣＲを形質導入させた細胞の殺傷機能を検証した。当該試験は、５１Ｃｒ放出細胞毒性試験の比色代替試験で、細胞分解後放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を定量分析した。３０分間のカップリングされた酵素反応で培地に放出されたＬＤＨを検出し、酵素反応でＬＤＨはテトラゾリウム塩（ＩＮＴ）を赤色のホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）に転換させることができる。生成された赤色の産物の量と分解された細胞の数は正比例する。標準９６ウェルプレートリーダーで４９０ｎｍの可視光線データを収集することができる。
【０２５１】
ＬＤＨの放出実験で、細胞の機能を検出する方法は、当業者によく知られている。本実施例ＬＤＨ実験は、健康なボランティアの血液から単離されたＰＢＬ細胞に、レンチウイルスによって形質感染されたＴＣＲを効果細胞とした。標的細胞株は、Ａ３７５（３５２５）、ＭＥＬ６２４（１６０５）、ＮＣＩ−Ｈ１６５０（２）とＭＥＬ５２６（４）細胞である。ここで、Ａ３７５（３５２５）とＭＥＬ６２４（１６０５）は、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を発現した。ＮＣＩ−Ｈ１６５０（２）とＭＥＬ５２６（４）は、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を、基本的に発現せず、これを対照とした。
【０２５２】
まず、ＬＤＨプレートを準備した。実験１日目に、下記の順序に従ってテストされている各成分をプレート：培地に入れて効果細胞を２×１０６個の細胞／ｍｌに調節し、培地に入れてターゲット細胞株を５×１０５個の細胞／ｍｌに調節した。均一に混合した後、５×１０５個の細胞／ｍｌ（即ち、５００００個の細胞／ウェル）の１００μＬの標的細胞株、２×１０６個の細胞／ｍｌ（即ち、２０００００個の細胞／ウェル）の１００μＬの効果細胞をとり、対応するウェルに入れて、２つのデュプルリケイトウェルを設定した。同時に、効果細胞自発ウェル、標的細胞自発ウェル、標的細胞最大ウェル、体積校正対照ウェルと培地背景対照ウェルを設定した。一晩インキュベーションした（３７℃、５％ＣＯ２）。実験２日目に、発色を測定し、反応終了後、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｃｋ）で４９０ｎｍの下で吸光値を記録した。実験結果は、図１４に示した通りであり、本発明のＴＣＲが形質導入された細胞は、関連抗原を発現する標的細胞に対して非常に強い殺傷作用があるが、関連抗原を発現していない標的細胞に対して殺傷作用がない。
【０２５３】
実施例１２.本発明の高親和力ＴＣＲと抗−ＣＤ３抗体の融合タンパク質の機能の実験
本実施例は、本発明の高親和力ＴＣＲと抗−ＣＤ３抗体の融合タンパク質が効果細胞に対して方向転換することができ、優れた活性作用があることを検証した。
【０２５４】
ＥＬＩＳＰＯＴ実験を通して、細胞の機能を測定する方法は、当業者によく知られている。本実施例ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ実験に使用された効果細胞は、健康なボランティアの血液から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞であり、標的細胞株は、ＩＭ９と２９３Ｔであり、ここで、ＩＭ９は関連抗原を発現し、２９３Ｔは、関連抗原を発現していない。本発明の高親和力ＴＣＲをランダムに選択して、実施例８に基づいて融合タンパク質を製造し、具体的に、選択された高親和力ＴＣＲのαとβ鎖は、下記の通りである。α鎖配列番号：１４、β鎖配列番号：３８、α鎖配列番号：１７、β鎖配列番号：４０、α鎖配列番号：１３、β鎖配列番号：４１、α鎖配列番号：１１、β鎖配列番号：４０、α鎖配列番号：１５、β鎖配列番号：４２、α鎖配列番号：１６、β鎖配列番号：４１、α鎖配列番号：１１、β鎖配列番号：３８、α鎖配列番号：１１、β鎖配列番号：３９、α鎖配列番号：１０、β鎖配列番号：３８、α鎖配列番号：１２、β鎖配列番号：４１。
【０２５５】
まず、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを準備した。ＥＬＩＳＰＯＴプレートをエタノールに有効にしてコーティングして、４℃の温度下で一晩経過した。実験１日目に、コーティング液を除去し、洗浄して遮断し、室温下で２時間培養して、ブロック液を除去し、下記の順序に従ってテストされている各成分をＥＬＩＳＰＯＴプレート：培地に入れてＣＤ８＋Ｔ細胞を２×１０４個の細胞／ｍｌのに調節し、培地に入れてターゲット細胞株を２×１０５個の細胞／ｍｌに調節し、培地を入れて融合タンパク質を０.０４μＭの濃度に希釈して、順番に１０倍勾配で希釈し、合計６つの濃度の勾配である。均一に混合した後、５０μＬの融合タンパク質希釈剤、２×１０５個の細胞／ｍｌ（即ち、１００００個の細胞／ウェル）の５０μＬの標的細胞株、２×１０４個の細胞／ｍｌ（即ち、２０００個の効果細胞／ウェル）の１００μＬの効果細胞を取り、対応するウェルに入れて、２つのデュプルリケイトウェルを設定した。一晩インキュベーションした（３７℃、５％ＣＯ２）。実験２日目に、プレートを洗浄し、二次検出と発色を行い、プレートを乾燥し、再度免疫ドットプレートリーダー（ＥＬＩＳＰＯＴ  ＲＥＡＤＥＲ  ｓｙｓｔｅｍ、ＡＩＤ２０会社）で膜に形成された点を計数した。実験結果は、図１５ａと１５ｂに示されるように、本発明の高親和力ＴＣＲと抗−ＣＤ３抗体の融合タンパク質は、効果細胞を方向転換することができ、優れた活性作用がある。
【０２５６】
実施例１３.本発明の高親和力ＴＣＲ分子の体内効能
本発明の高親和力ＴＣＲで形質感染Ｔ細胞をヒト黒色腫異種移植片モデルのマウスに注射して、体内で腫瘍の抑制効果を測定した。
【０２５７】
実験にＮＳＧマウス（南京大学−南京生物医学研究所）（雌性、実験週齢６〜８週）を実験対象として使用し、実験時間１０日前培養した後収集し、浮遊されたＡ３７５腫瘍細胞（ＡＴＣＣ）浮遊液を３＊１０＾６個／匹（注射体積２００ｕｌ）の数でマウスの腹部の片側皮下に注射して、黒色腫異種移植マウスモデルを構築した。
【０２５８】
実験開始当日にスライドキャリパー（ｓｌｉｄｅ  ｃａｌｉｐｅｒｓ）で、各マウスの成形された腫瘍の長い直径（ａ）、短い直径（ｂ）をそれぞれ測定し、Ｖ＝ａ＊ｂ＾２／２の式に従って腫瘍体積を測定した後、グループ分けの設定は、ＰＢＳ群５匹、対照群（ＴＣＲを形質感染させていないＴ細胞）７匹、ＴＣＲ１（α鎖可変ドメイン配列番号：６７、β鎖可変ドメイン配列番号：２）が形質感染されたＴ細胞群１０匹とＴＣＲ２（α鎖可変ドメイン配列番号：６８、β鎖可変ドメイン配列番号：２）が形質感染されたＴ細胞群１０匹であり、腫瘍体積に基づいて、マウスをランダムに分ける。グループを分けた後、製造されたＴ細胞を１＊１０＾７個／匹にそれぞれ前記グループのマウスの尾静脈に注射し、ＰＢＳグループのマウスの尾静脈に、１００ｕｌのＰＢＳを注射した。
【０２５９】
ＴＣＲ−Ｔ細胞注入後、製造されたＩＬ−２溶液（５００００ＩＵ／１００ＵＬ）を再取り、各マウスの腹腔内に１００ｕｌ注射した後、４日の間に毎日のよう量のＩＬ−２溶液を連続的に注射した。実験開始から前記の方法に基づいて、３日間隔でマウスの腫瘍径を測定し、体積を計算し、マウスの腫瘍が大きすぎて行動に影響を与えたり、腫瘍がおさまるまで維持し、前記データを整理して、各グループのマウス腫瘍体積についてのデータの統計分析処理した。
【０２６０】
得られた実験結果は、図１６に示した通りであり、本発明の高親和性ＴＣＲを形質感染させたＴ細胞を注射したマウス群の腫瘍生長は著しく抑制されて縮小される傾向があるが、ＴＣＲを形質感染させていないＴ細胞群を注射した群とＰＢＳを注射したマウス群の腫瘍体積は、まだすぐに増加した。
【０２６１】
本発明に記載されているすべての文献は、本願発明では、それぞれの文献が単独で参照として引用されているかのように参照として引用される。このほか、本発明の前記の内容を閲読した後、当業者は、本発明について、様々な変更または修正を行うことができ、このような一等価形式も、本明細書に添付された特許請求の範囲によって限定された範囲に属することを理解しなければならない。
【図１ａ−ｂ】
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【図２ａ−ｂ】
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【図３ａ−ｂ】
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【図４ａ−ｂ】
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【図５（１）−（１０）】
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【図５（１１）−（２０）】
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【図５（２１）−（２９）】
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【図６（１）−（１０）】
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【図６（１１）−（１６）】
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【図７ａ−ｂ】
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【図８ａ−ｂ】
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【図９（１）−（１０）】
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【図９（１１）−（２０）】
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【図９（２１）−（２９）】
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【図１０（１）−（１０）】
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【図１０（１１）−（１６）】
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【図１１ａ−ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ−ｂ】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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