(57)【要約】被験体において腫瘍を処置するための方法が本明細書で開示され、上記方法は、腫瘍において変化した発現を有する１種もしくはこれより多くのｍｉＲＮＡ核酸、またはそのバリアント（例えば、ミミックまたはミメティック）を被験体に投与することを包含する。１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡ核酸を含む組成物もまた、本明細書で開示される。いくつかの例では、上記ｍｉＲＮＡ核酸は、例えば、改変ｍｉＲＮＡ、ならびに１もしくはこれより多くの改変ヌクレオチドならびに／または５’末端および／もしくは３’末端改変を含むｍｉＲＮＡ核酸である。特定の例では、上記改変ｍｉＲＮＡ核酸は、ｍｉＲ−３０ａ核酸である。１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡ核酸の変化した発現を有する腫瘍を有すると、被験体を診断するための方法が本明細書にさらに開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、有効量の、ｍｉＲ−３０核酸、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ核酸、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ核酸、ｍｉＲ−１４５−５ｐ核酸、ｍｉＲ−３３８−３ｐ核酸、ｍｉＲ−２０５−５ｐ核酸、ｍｉＲ−３７５核酸、ｍｉＲ−２９核酸、ｍｉＲ−２７核酸、ｍｉＲ−１０１核酸、これらのうちのいずれかのミミックおよび／もしくはミメティック、またはこれらのうちのいずれか２種もしくはこれより多くの組み合わせを含む単離されたマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）核酸を該被験体に投与し、それによってがんを有する該被験体を処置することを包含する、方法。
【請求項２】
前記ｍｉＲ−３０核酸は、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ核酸、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ核酸、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ核酸、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ核酸、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ核酸、またはこれらのミミックおよび／もしくはミメティックである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍｉＲ−３０核酸またはそのミミックおよび／もしくはミメティックは、配列番号４２および配列番号５６の二重鎖、配列番号４２および配列番号５７の二重鎖、または配列番号１〜１１、配列番号３７〜６１、および配列番号６６のうちの１つもしくはこれより多くを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｍｉＲ−３０核酸またはそのミミックおよび／もしくはミメティックは、配列番号７３〜９２、配列番号５０および配列番号６１の二重鎖、配列番号７３および配列番号６１の二重鎖、または配列番号７４および配列番号６１の二重鎖のうちの１つもしくはこれより多くを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ核酸またはそのミミックおよび／もしくはミメティックは、配列番号１２を含み、前記ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ核酸またはそのミミックおよび／もしくはミメティックは、配列番号１５を含み、前記ｍｉＲ−１４５−５ｐ核酸またはそのミミックおよび／もしくはミメティックは、配列番号１８を含み、前記ｍｉＲ−３３８−３ｐ核酸またはそのミミックおよび／もしくはミメティックは、配列番号２１を含み、前記ｍｉＲ−３７５核酸またはそのミミックおよび／もしくはミメティックは、配列番号１７を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ｍｉＲ−２６ａ−５ｐミミックまたはミメティックは、配列番号６４、配列番号６５、および配列番号１０５〜１１５のうちの１つまたはこれより多くを含み、前記ｍｉＲ−１４５−５ｐミミックまたはミメティックは、配列番号６６、配列番号６７、および配列番号１１６〜１２５のうちの１つまたはこれより多くを含み、前記ｍｉＲ−３７５ミミックまたはミメティックは、配列番号６２、配列番号６３、および配列番号９３〜１０４のうちの１つまたはこれより多くを含み、前記ｍｉＲ−１０１ミミックまたはミメティックは、配列番号１２６〜１３５のうちの１つまたはこれより多くを含み、前記ｍｉＲ−２９ミミックまたはミメティックは、配列番号１３６〜１４６のうちの１つまたはこれより多くを含み、または前記ｍｉＲ−２７ミミックまたはミメティックは、配列番号１４７〜１５８のうちの１つまたはこれより多くを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記方法は、有効量の、前記ｍｉＲ−３０核酸、前記ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ核酸、前記ｍｉＲ−１４５−５ｐ核酸、ならびに前記ｍｉＲ−３７５核酸またはこれらのミミックおよび／もしくはミメティックを投与することを包含する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ｍｉＲＮＡ核酸および／またはそのミミックもしくはミメティックは、表６〜１４に列挙される１つまたはこれより多くのｍＲＮＡの発現を減少させる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
１種またはこれより多くの前記単離されたｍｉＲＮＡ核酸は、リポソーム組成物において投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記リポソームは、該リポソームを前記がんに向かわせる１種またはこれより多くの分子をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的化分子は、抗トランスフェリンレセプター抗体またはそのフラグメントを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記がんは、扁平上皮癌を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記扁平上皮癌は、頭頚部の扁平上皮癌、肺の扁平上皮癌、または子宮頸部の扁平上皮癌を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記がんは、上皮起源のがんであり、子宮頸部の腺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳房腺癌、および膵臓癌の群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
１種またはこれより多くのさらなる治療を投与することをさらに包含する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１種またはこれより多くのさらなる治療は、外科手術、放射線療法、および化学療法を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１種のｍｉＲ−３０ミミックもしくはミメティック核酸、少なくとも１種のｍｉＲ−３７５ミミックもしくはミメティック核酸、少なくとも１種のｍｉＲ−２６ａ−５ｐミミックもしくはミメティック核酸、または少なくとも１種のｍｉＲ−１４５−５ｐミミックもしくはミメティック核酸を含む、組成物。
【請求項１８】
少なくとも１種のｍｉＲ−１０１ミミックもしくはミメティック核酸、少なくとも１種のｍｉＲ−２９ミミックもしくはミメティック核酸、または少なくとも１種のｍｉＲ−２７ミミックもしくはミメティック核酸を含む、組成物。
【請求項１９】
前記ミミックまたはミメティック核酸は、５’末端改変、および／または３’末端改変の、１種もしくはこれより多くの改変核酸を含む、請求項１７または１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ミミックまたはミメティック核酸は、２’−Ｏ−メチル改変、２’−メトキシエトキシ改変、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ改変、２’−アミノプロポキシ改変、および２’−フルオロ改変のヌクレオチドのうちの１種またはこれより多くを含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ミミックまたはミメティック核酸は、５’−アミノＣ３改変、５’−アミノＣ６改変、または５’−アミノＣ１２改変を含む、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ミミックまたはミメティック核酸は、配列番号３７〜６７、配列番号４２および配列番号５６の二重鎖、または配列番号４２および配列番号５７の二重鎖のうちのいずれか１つを含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ミミックまたはミメティック核酸は、配列番号７３〜１２５、配列番号５０および配列番号６１の二重鎖、配列番号７３および配列番号６１の二重鎖、または配列番号７４および配列番号６１の二重鎖のうちのいずれか１つを含む、請求項１７または１９〜２１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ミミックまたはミメティック核酸は、配列番号１２６〜１５８のいずれか１つを含む、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ミミックまたはミメティック核酸は、ナノ粒子またはリポソームの中に組み込まれる、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記リポソームは、前記ナノ粒子またはリポソームを腫瘍に向かわせる１種またはこれより多くの分子をさらに含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記標的化分子は、抗トランスフェリンレセプター抗体またはそのフラグメントを含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項２７〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
固形腫瘍を有する被験体を処置するための方法であって、該方法は、有効量の、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の組成物を該被験体に投与することを包含する、方法。
【請求項３０】
腫瘍を有する被験体を診断するための方法であって、該方法は、
該被験体から得られたサンプル中で少なくとも１種のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）核酸の発現を検出することであって、ここで該少なくとも１種のｍｉＲＮＡ核酸は、表１、表３、表４、表５、表１８、および表２０のうちのいずれか１つに列挙されるｍｉＲＮＡ核酸のうちの少なくとも１種を含む、こと；ならびに
該被験体から得られた該サンプル中での該ｍｉＲＮＡ核酸のうちの少なくとも１種の発現を、コントロールと比較すること、
を包含し、
ここで該コントロールと比較した該被験体から得られた該サンプル中の該ｍｉＲＮＡ核酸の変化した発現は、腫瘍を有する被験体を同定する、方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡ核酸は、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−２９、またはｍｉＲ−１０１核酸を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１種のｍｉＲＮＡ核酸は、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、およびｍｉＲ−３３８−３ｐの各々を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験体は、扁平上皮癌の腫瘍を有する、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記被験体に由来する前記サンプルは、該被験体に由来する腫瘍サンプルである、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｍｉＲＮＡの前記変化した発現が、前記コントロールと比較して減少した発現である場合に、表１、表３、表４、表５、表１８、表２０、表２１、および表２３のうちのいずれか１つに列挙されるｍｉＲＮＡ核酸のうちの少なくとも１種の有効量を前記被験体に投与することをさらに包含する、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１６年３月７日に出願された米国仮出願第６２／３０４，８４４号の利益を請求し、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本開示は、がんの処置および／または診断、特に、マイクロＲＮＡを利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）発現の脱制御は、がんの複雑な悪性表現型を媒介する異常に発現したｍＲＮＡの潜在的に重要な寄与駆動因子として明らかになった（Ｓｔａｈｌｈｕｔ  ａｎｄ  Ｓｌａｃｋ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ．  ５：１１１，  ２０１３）。どのｍｉＲが、悪性表現型を調整する多様な経路および遺伝子プログラム内の極めて重要なｍＲＮＡ標的を共制御するかは、それほど明らかではない。単一のｍｉＲが複数のｍＲＮＡを同時に標的とし得るので、ｍｉＲベースの治療剤は、がんにおいて単一のがん遺伝子または経路を標的とするより選択的な低分子または生物学的治療を使用して観察される固有のまたは獲得した抵抗性を緩和するのに役立ち得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｓｔａｈｌｈｕｔ  ａｎｄ  Ｓｌａｃｋ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ．  ５：１１１，  ２０１３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
要旨
がんにおいて増加または減少した発現を有するｍｉＲＮＡが本明細書で開示される。開示されるｍｉＲＮＡまたはそのミミックおよび／もしくはミメティックは、がん（例えば、悪性腫瘍）を有する被験体を処置および／または診断するための方法において利用され得る。
【０００６】
がんを有する被験体を処置するための方法が、本明細書で開示される。上記方法は、腫瘍において変化した発現を有する１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡ核酸（またはそのミミックもしくはミメティック）を被験体に投与することを包含する。いくつかの例では、上記方法は、がんを有する被験体に、有効量の、ｍｉＲ−３０核酸、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ核酸、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ核酸、ｍｉＲ−１４５−５ｐ核酸、ｍｉＲ−３３８−３ｐ核酸、ｍｉＲ−３７５核酸、ｍｉＲ−２９核酸、ｍｉＲ−２７核酸、ｍｉＲ−１０１核酸、これらのミミックもしくはミメティック、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ１４５−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−３７５のうちのいずれか１種に相補的なｍｉＲ、またはこれらのうちのいずれか２種もしくはこれより多くの組み合わせを投与することを包含する。特定の例では、上記被験体は、扁平上皮癌（例えば、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ））を有する。さらなる例では、上記方法は、有効量の、表１、表３、表４、表５、表１８、表２０、表２１、および表２３のうちのいずれか１つに列挙されるｍｉＲＮＡ核酸のうちの少なくとも１種、これらのミミックもしくはミメティック、相補的オリゴヌクレオチド、またはこれらのうちのいずれか２種もしくはこれより多くの組み合わせを上記被験体に投与することを包含する。いくつかの例では、上記ｍｉＲＮＡ核酸は、二重鎖ｍｉＲＮＡ核酸として投与される、および／またはベクターの中に含まれる。いくつかの例では、上記ｍｉＲＮＡ核酸および／またはそのミミックもしくはミメティックは、表６〜１４に列挙される１つまたはこれより多くのｍＲＮＡの発現を減少させる。
【０００７】
１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡ核酸（例えば、表１、表３、表４、表５、表１８、表２０、表２１、および表２３のうちのいずれか１つに列挙されるｍｉＲＮＡのうちの少なくとも１種）を含む組成物も、本明細書で開示される。いくつかの例では、ｍｉＲＮＡ核酸は、改変ｍｉＲＮＡ（例えば、１もしくはこれより多くの配列改変、改変ヌクレオチド、ならびに／または５’末端および／もしくは３’末端の改変を含むｍｉＲＮＡ核酸）である。特定の例では、上記改変ｍｉＲＮＡ核酸は、ｍｉＲ−３０ａ核酸（配列番号３７〜６１として本明細書で提供される改変ｍｉＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない）である。他の例では、上記改変ｍｉＲＮＡ核酸は、配列番号６２〜６７として本明細書で提供されるｍｉＲＮＡ核酸を含む。なおさらなる例では、上記改変ｍｉＲＮＡ核酸は、配列番号７３〜１５８として本明細書で提供されるｍｉＲＮＡ核酸を含む。いくつかの例では、上記ｍｉＲＮＡ核酸は、二重鎖ｍｉＲＮＡ核酸を含む、および／またはベクターの中に含まれる。
【０００８】
１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡ核酸の変化した発現を有する腫瘍を有すると、被験体を診断するための方法が、本明細書でさらに開示される。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記被験体に由来するサンプル中で、表１、表３、表４、表５、表１８、および表２０のうちのいずれか１つに列挙される１種もしくはこれより多くのｍｉＲＮＡの発現を検出すること、ならびに上記被験体に由来するサンプル中での発現を、コントロールと比較することを包含する。いくつかの例では、上記コントロールと比較したｍｉＲＮＡ発現の変化した量は、上記被験体が腫瘍を有することを示す。いくつかの例では、上記方法は、ｍｉＲ−３０核酸、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ核酸、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ核酸、ｍｉＲ−１４５−５ｐ核酸、ｍｉＲ−３３８−３ｐ核酸、またはｍｉＲ−３７５核酸のうちの１種またはこれより多くの発現を検出すること、および上記ｍｉＲＮＡのうちの１種またはこれより多くの発現が、上記コントロールと比較して減少する場合に、上記被験体が腫瘍（扁平上皮癌の腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない）を有することを決定することを包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡ核酸を上記被験体に投与することをさらに包含する（例えば、ｍｉＲ−３０核酸、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ核酸、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ核酸、ｍｉＲ−１４５−５ｐ核酸、ｍｉＲ−３３８−３ｐ核酸、ｍｉＲ−３７５核酸、またはこれらのミミックもしくはミメティックのうちの１種またはこれより多く）。
【０００９】
本開示の前述および他の特徴は、添付の図面を参照しながら進められる以下の詳細な説明からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＨＮＳＣＣにおけるｍｉＲ−３０発現および機能のスクリーニングおよび検証のための例示的方法を示す模式図である。
【００１１】
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａおよび図２Ｂは、粘膜コントロールと比較した場合に、ＴＣＧＡ（図２Ａ）およびＵＳＭＣ（図２Ｂ）両方のＨＮＳＣＣ腫瘍コホートにおいてＳＡＭｓｅｑによって差次的に発現されると同定された３３種のｍｉＲＮＡを示すグラフの対である。各々に関して、左：線形スケールで表される、腫瘍と粘膜との間の発現の中央値の倍数変化。右：ｌｏｇ１０  ＲＰＭとしての粘膜および腫瘍の発現分布の中央値の箱ひげ図。中央値は、中央部にある濃い黒線によって表され、バーは、２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルを表し、アウトライアーは、個々の点として示される。ＦＤＲ≦０．０５。
【００１２】
【図２Ｃ−Ｄ】図２Ｃおよび２Ｄは、ＴＣＧＡ（図２Ｃ）およびＵＭＳＣ（図２Ｄ）のＨＮＳＣＣコホートにおける９種のｍｉＲＮＡの低下した発現を示すグラフの対である。腫瘍と粘膜コントロールとの間の発現の中央値の倍数変化を、各グラフの左側に示す。粘膜および腫瘍の発現分布の中央値の箱ひげ図は、ｌｏｇ１０  ＲＰＭ（１００万個の塩基対あたりのリード数）として各グラフの右側に示される。中央値は、中央部にある濃い黒線によって表され、バーは、２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルを表し、アウトライアーは、個々の点として示される。ＦＤＲ≦０．０５。
【００１３】
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、ＮＳＣＣ増殖に際して減少した発現を有するｍｉＲＮＡの効果を示す一連のグラフである。マイクロＲＮＡは、ＨＮＳＣＣ細胞株ＵＭ−ＳＣＣ−１のインビトロでのゲノムワイドＲＮＡｉスクリーニングにおいて抗増殖活性を示した。散布図は、ＴＣＧＡ（図３Ａ）およびＵＭＳＣ（図３Ｂ）の発現データを使用して、増殖スコア（絶対偏差の中央値（ＭＡＤ））の統計的分布に対する差次的に発現されるマイクロＲＮＡ（ｙ軸において粘膜に対するｌｏｇ２  腫瘍）を示す。上記プロットの左下部分のボックスは、ＲＮＡｉスクリーニングにおける抗増殖活性（ｘ軸）とともに抑制されたマイクロＲＮＡ発現比（ｙ軸）を示す。ｍｉＲ−３０−５ｐファミリーメンバーは、赤色で印が付けられる。図３Ｃは、ｍｉＲＮＡミミックコントロールのパーセンテージとして示される、ＵＭ−ＳＣＣ−１におけるトランスフェクションの９６時間後のｍｉＲＮＡミミックの抗増殖性を示すグラフである。図３Ｄは、ＴＣＧＡコホートに由来する粘膜および腫瘍標本におけるｈｓａ−ｍｉＲ−３０−５ｐファミリーメンバーの発現を示す。バーは、ＳＥＭを示し、＊は、（ｑ＜０．２  ｓａｍｓｅｑツール）を示す。ｍｉＲ−３０ａ−５ｐおよびｍｉＲ−３０ｅ−５ｐは、粘膜標本において最高に発現されたファミリーメンバーであり、腫瘍標本において最大の低下を示す。
【図３Ｃ−Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、ＮＳＣＣ増殖に際して減少した発現を有するｍｉＲＮＡの効果を示す一連のグラフである。マイクロＲＮＡは、ＨＮＳＣＣ細胞株ＵＭ−ＳＣＣ−１のインビトロでのゲノムワイドＲＮＡｉスクリーニングにおいて抗増殖活性を示した。散布図は、ＴＣＧＡ（図３Ａ）およびＵＭＳＣ（図３Ｂ）の発現データを使用して、増殖スコア（絶対偏差の中央値（ＭＡＤ））の統計的分布に対する差次的に発現されるマイクロＲＮＡ（ｙ軸において粘膜に対するｌｏｇ２  腫瘍）を示す。上記プロットの左下部分のボックスは、ＲＮＡｉスクリーニングにおける抗増殖活性（ｘ軸）とともに抑制されたマイクロＲＮＡ発現比（ｙ軸）を示す。ｍｉＲ−３０−５ｐファミリーメンバーは、赤色で印が付けられる。図３Ｃは、ｍｉＲＮＡミミックコントロールのパーセンテージとして示される、ＵＭ−ＳＣＣ−１におけるトランスフェクションの９６時間後のｍｉＲＮＡミミックの抗増殖性を示すグラフである。図３Ｄは、ＴＣＧＡコホートに由来する粘膜および腫瘍標本におけるｈｓａ−ｍｉＲ−３０−５ｐファミリーメンバーの発現を示す。バーは、ＳＥＭを示し、＊は、（ｑ＜０．２  ｓａｍｓｅｑツール）を示す。ｍｉＲ−３０ａ−５ｐおよびｍｉＲ−３０ｅ−５ｐは、粘膜標本において最高に発現されたファミリーメンバーであり、腫瘍標本において最大の低下を示す。
【００１４】
【図４】図４は、ＨＮＳＣＣ  ＴＣＧＡデータセットからのｍＲＮＡ発現（ｌｏｇ１０  ＲＳＥＭ（期待値最大化によるＲＮＡ−Ｓｅｑ），  ｙ軸）に対するｍｉＲ−３０ａ−５ｐの発現（ｌｏｇ１０  ＲＰＭ，  ｘ軸）を示す一連のパネルであり、推定ｍｉＲ−３０結合部位を含むｍＲＮＡに関してフィルタリングされる。線形回帰散布図は、示されたｍＲＮＡに関して、ｐ値とともに示される。
【００１５】
【図５】図５は、ｍｉＲ陰性コントロール（ｎｅｇ  Ｃｏｎ）、ｍｉＲ−３０ａ、または抗ｍｉＲ−３０ａコントロールオリゴヌクレオチドで７２時間トランスフェクトしたＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞における選択されたｍｉＲ−３０標的遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ測定値を示す一対のグラフである。全てのデータは３回の独立した実験の平均を表し、エラーバーは、ＳＥＭを表す。＊スチューデントのＴ検定によるｐ値＜０．０５。
【００１６】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｅは、ＨＮＳＣＣ細胞株におけるｍｉＲ−３０ａ推定標的の検証を示す一連のパネルである。図６Ａは、Ｍｆｏｌｄ（ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄにおいてワールドワイドウェブ上で入手可能）によって推定される、ｍｉＲ−３０ａ（配列番号１）と標的ｍＲＮＡ  ＥＧＦＲ（配列番号６８）、ＩＧＦＩＲ（配列番号６９）、ＭＥＴ（配列番号７０）、およびＩＲＳ−１（配列番号７１）の３’  ＵＴＲとの塩基対合を示す。赤色の塩基は、シード配列の結合を示す。ｍＲＮＡにおける下線を付した塩基は、変異体３’  ＵＴＲコントロールレポーターにおいて欠失させた。図６Ｂは、ｍｉＲ３０ａまたは抗３０ａおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子の後ろにクローニングされた野生型３’  ＵＴＲ（左側）または変異体３’  ＵＴＲ（右側）を含むベクターでのＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞の共トランスフェクションの４８時間後に測定した相対的ルシフェラーゼ活性を示す。５×ｍｉＲ−３０結合部位を含む陽性コントロールベクター（Ｐｏｓ  Ｃｏｎ）および陰性ＧＡＰＤＨ  ３’  ＵＴＲコントロールもまた、示す。全てのデータは、３回の独立した実験の平均を表し、エラーバーは、ＳＥＭを表す。（＊）は、スチューデントのＴ検定によるｐ値＜０．０５を示す。図６Ｃおよび６Ｄは、ｍｉＲ−３０ａ、抗３０ａ、または陰性コントロールｍｉＲ（ＮＣ）オリゴヌクレオチドでのトランスフェクションの７２時間後のヒト口腔ケラチノサイト（ＨＯＫ）またはＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞からの全細胞溶解物を使用する、ｍｉＲ−３０標的の発現（図６Ｃ）および下流のシグナル伝達分子のリン酸化（図６Ｄ）を示すウェスタンブロットの画像である。図６Ｅは、三連の実験から分析したｍｉＲ−３０−５ｐ標的のタンパク質レベルを示すグラフである。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｅは、ＨＮＳＣＣ細胞株におけるｍｉＲ−３０ａ推定標的の検証を示す一連のパネルである。図６Ａは、Ｍｆｏｌｄ（ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄにおいてワールドワイドウェブ上で入手可能）によって推定される、ｍｉＲ−３０ａ（配列番号１）と標的ｍＲＮＡ  ＥＧＦＲ（配列番号６８）、ＩＧＦＩＲ（配列番号６９）、ＭＥＴ（配列番号７０）、およびＩＲＳ−１（配列番号７１）の３’  ＵＴＲとの塩基対合を示す。赤色の塩基は、シード配列の結合を示す。ｍＲＮＡにおける下線を付した塩基は、変異体３’  ＵＴＲコントロールレポーターにおいて欠失させた。図６Ｂは、ｍｉＲ３０ａまたは抗３０ａおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子の後ろにクローニングされた野生型３’  ＵＴＲ（左側）または変異体３’  ＵＴＲ（右側）を含むベクターでのＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞の共トランスフェクションの４８時間後に測定した相対的ルシフェラーゼ活性を示す。５×ｍｉＲ−３０結合部位を含む陽性コントロールベクター（Ｐｏｓ  Ｃｏｎ）および陰性ＧＡＰＤＨ  ３’  ＵＴＲコントロールもまた、示す。全てのデータは、３回の独立した実験の平均を表し、エラーバーは、ＳＥＭを表す。（＊）は、スチューデントのＴ検定によるｐ値＜０．０５を示す。図６Ｃおよび６Ｄは、ｍｉＲ−３０ａ、抗３０ａ、または陰性コントロールｍｉＲ（ＮＣ）オリゴヌクレオチドでのトランスフェクションの７２時間後のヒト口腔ケラチノサイト（ＨＯＫ）またはＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞からの全細胞溶解物を使用する、ｍｉＲ−３０標的の発現（図６Ｃ）および下流のシグナル伝達分子のリン酸化（図６Ｄ）を示すウェスタンブロットの画像である。図６Ｅは、三連の実験から分析したｍｉＲ−３０−５ｐ標的のタンパク質レベルを示すグラフである。
【図６Ｃ−Ｅ】図６Ａ〜６Ｅは、ＨＮＳＣＣ細胞株におけるｍｉＲ−３０ａ推定標的の検証を示す一連のパネルである。図６Ａは、Ｍｆｏｌｄ（ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄにおいてワールドワイドウェブ上で入手可能）によって推定される、ｍｉＲ−３０ａ（配列番号１）と標的ｍＲＮＡ  ＥＧＦＲ（配列番号６８）、ＩＧＦＩＲ（配列番号６９）、ＭＥＴ（配列番号７０）、およびＩＲＳ−１（配列番号７１）の３’  ＵＴＲとの塩基対合を示す。赤色の塩基は、シード配列の結合を示す。ｍＲＮＡにおける下線を付した塩基は、変異体３’  ＵＴＲコントロールレポーターにおいて欠失させた。図６Ｂは、ｍｉＲ３０ａまたは抗３０ａおよびＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子の後ろにクローニングされた野生型３’  ＵＴＲ（左側）または変異体３’  ＵＴＲ（右側）を含むベクターでのＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞の共トランスフェクションの４８時間後に測定した相対的ルシフェラーゼ活性を示す。５×ｍｉＲ−３０結合部位を含む陽性コントロールベクター（Ｐｏｓ  Ｃｏｎ）および陰性ＧＡＰＤＨ  ３’  ＵＴＲコントロールもまた、示す。全てのデータは、３回の独立した実験の平均を表し、エラーバーは、ＳＥＭを表す。（＊）は、スチューデントのＴ検定によるｐ値＜０．０５を示す。図６Ｃおよび６Ｄは、ｍｉＲ−３０ａ、抗３０ａ、または陰性コントロールｍｉＲ（ＮＣ）オリゴヌクレオチドでのトランスフェクションの７２時間後のヒト口腔ケラチノサイト（ＨＯＫ）またはＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞からの全細胞溶解物を使用する、ｍｉＲ−３０標的の発現（図６Ｃ）および下流のシグナル伝達分子のリン酸化（図６Ｄ）を示すウェスタンブロットの画像である。図６Ｅは、三連の実験から分析したｍｉＲ−３０−５ｐ標的のタンパク質レベルを示すグラフである。
【００１７】
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ〜７Ｉは、ＨＮＳＣＣ細胞成長、コロニー形成、シスプラチン感受性、および細胞生存性に対するｍｉＲ−３０ａミミックの効果を示す一連のパネルである。図７Ａは、初代ヒト口腔ケラチノサイト（ＨＯＫ）および１０種のＨＮＳＣＣ細胞株にわたるコントロール（ＮＣ）またはｍｉＲ−３０ａミミックでのトランスフェクション後５日目に、６回反復でのＸＴＴアッセイによって測定した増殖を示すグラフである。図７Ｂは、対数増殖期にある場合のＨＯＫ細胞および１０種のＨＮＳＣＣ細胞株におけるｑＲＴ−ＰＣＲによって測定したｍｉＲ−３０ａ発現の基底レベルを示すグラフである。相対的ｍｉＲ−３０ａ発現レベルを、上記細胞株の平均発現に対して正規化した。
【００１８】
【図７Ｃ−Ｄ】図７Ｃは、ｍｉＲ−３０ａまたは抗ｍｉＲ３０ａオリゴヌクレオチドでのトランスフェクションの４８時間後の、ＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞のコロニー形成アッセイを示すグラフである。コロニーを、３個のウェルにおいて計数し、３回の独立した実験において反復した。図７Ｄは、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐミミックで４８時間トランスフェクトし、２μＭ  シスプラチンで３時間処理し、次いで洗浄したＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞を示すグラフである。細胞密度を、シスプラチン処理の７２時間後にＸＴＴアッセイによって測定した。少なくとも３回の実験の平均±ＳＥＭ、＊は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【００１９】
【図７Ｅ−Ｇ】図７Ｅは、ｍｉＲ３０ａおよび抗ｍｉＲ−３０ａオリゴヌクレオチドでのトランスフェクションの４８時間後のＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞のコロニー形成のグラフである。コロニーを３個のウェルにおいて計数し、３回の独立した実験において反復した。図７Ｆは、ｍｉＲ−３０ａミミックで４８時間トランスフェクトし、２μＭ  シスプラチンで３時間処理し、次いで、洗浄したＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞の細胞密度を示すグラフである。細胞密度を、シスプラチン処理の７２時間後にＸＴＴアッセイによって測定した。全てのデータは、少なくとも３回の実験の平均を表し、エラーバーは、ＳＥＭを表す。図７Ｇは、コントロール（Ｎｅｇ  ｃｏｎ）、ｍｉＲ−３０ａ、または抗ｍｉＲ−３０ａ二重鎖でトランスフェクトしたＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞の細胞生存性を示すグラフである。＊スチューデントのＴ検定によるｐ値＜０．０５。
【００２０】
【図７Ｈ−Ｉ】図７Ｈは、コントロール、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、または抗３０ａトランスフェクションでのコロニー形成アッセイの代表的画像を示すデジタル画像である。図７Ｉは、コントロール、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、またはその抗ｍｉＲでのトランスフェクション、またはＩＣ５０用量でのシスプラチン処理との組み合わせたコントロール、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、またはその抗ｍｉＲでのトランスフェクションの後の０日目、１日目、３日目、および５日目における６回反復のＸＴＴアッセイによるＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞の増殖を示す一対のグラフである。
【００２１】
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａ〜８Ｄは、ＨＮＳＣＣ細胞の運動性および侵入性に対するｍｉＲ−３０ａの効果を示す一連のパネルである。ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞（左側）およびＵＭ−ＳＣＣ−６細胞（右側）を、創傷を作る前にｍｉＲ−３０ａまたは抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドで４８時間トランスフェクトした。コントロールにおいて創傷閉鎖まで細胞移動を追跡した。創傷治癒の代表的な光学顕微鏡画像（１００×）を示す（図８Ａ）。ＵＭ−ＳＣＣ−１、左側、時間０；  右側、時間２０時間。ＵＭ−ＳＣＣ−６、左側、時間０；  右側、時間６０時間。経時的な細胞移動を定量した（図８Ｂ）。図８Ｃは、ＵＭ−ＳＣＣ−１の侵入膜の代表的な光学顕微鏡画像である（１００×）。図８Ｄは、ＵＭ−ＳＣＣ−１（左側）およびＵＭ−ＳＣＣ−４６（右側）の侵入している細胞の相対的定量のグラフである。全てのデータは、少なくとも３回の実験の平均を表し、エラーバーは、ＳＥＭを表す。（＊）は、スチューデントのＴ検定によるｐ値＜０．０５を表す。
【図８Ｃ−Ｄ】図８Ａ〜８Ｄは、ＨＮＳＣＣ細胞の運動性および侵入性に対するｍｉＲ−３０ａの効果を示す一連のパネルである。ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞（左側）およびＵＭ−ＳＣＣ−６細胞（右側）を、創傷を作る前にｍｉＲ−３０ａまたは抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドで４８時間トランスフェクトした。コントロールにおいて創傷閉鎖まで細胞移動を追跡した。創傷治癒の代表的な光学顕微鏡画像（１００×）を示す（図８Ａ）。ＵＭ−ＳＣＣ−１、左側、時間０；  右側、時間２０時間。ＵＭ−ＳＣＣ−６、左側、時間０；  右側、時間６０時間。経時的な細胞移動を定量した（図８Ｂ）。図８Ｃは、ＵＭ−ＳＣＣ−１の侵入膜の代表的な光学顕微鏡画像である（１００×）。図８Ｄは、ＵＭ−ＳＣＣ−１（左側）およびＵＭ−ＳＣＣ−４６（右側）の侵入している細胞の相対的定量のグラフである。全てのデータは、少なくとも３回の実験の平均を表し、エラーバーは、ＳＥＭを表す。（＊）は、スチューデントのＴ検定によるｐ値＜０．０５を表す。
【００２２】
【図９Ａ−Ｂ】図９Ａ〜９Ｅは、インビボでのＨＮＳＣＣ異種移植片腫瘍に対するｍｉＲ−３０ａ−５ｐミミックの効果を示す一連のパネルである。図９Ａは、ＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞を筋肉内注射した無胸腺ｎｕ／ｎｕ雌性マウスの腫瘍および器官の一連の画像である。その腫瘍を、約３００ｍｍ３へと成長させ、次いで、そのマウスに、１００μｇ（約５ｍｇ／ｋｇ）の複合体化ＦＩＴＣ標識コントロールオリゴヌクレオチドまたはコントロールビヒクルを静脈内（ＩＶ）注射した。注射の２４時間後に、腫瘍および器官を採取するためにマウスを屠殺した。図９Ｂは、月曜日、水曜日、および金曜日（ＭＷＦ）に３週間にわたって、６０μｇ（約ｍｇ／ｋｇ）の、ナノ粒子の中にパッケージした複合体化ｍｉＲ−３０ａミミック（ｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬ）またはコントロールを９用量ＩＶ注射した、ＵＭ−ＳＣＣ−４６異種移植片腫瘍  約１５０ｍｍ３を有するマウスにおける腫瘍成長のグラフである。グラフは、各群の平均腫瘍容積を示し、エラーバーは、ＳＥＭを示す。２４日目の処置終了時の腫瘍サイズの代表的画像を、コントロールおよびｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬ処置マウス（上）および処置の間のマウス体重（下）について図９Ｃに示す。図９Ｄは、コントロールまたはｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬで処置したマウス間のカプラン−マイヤー生存分析を示す。図９Ｅは、ＭＷＦスケジュールで６０μｇ  ｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬまたはコントロールの４用量でＩＶ注射した、約１５０ｍｍ３へと成長させたＨＰＶ＋ＵＭ−ＳＣＣ−４７異種移植片腫瘍を有するマウスの平均腫瘍容積を示す。最後の処置の２４時間後に、マウスを屠殺し、腫瘍組織を分子分析のために集めた。エラーバーは、ＳＥＭを示し、（＊）は、スチューデントのＴ検定によるｐ値＜０．０５を示す。
【図９Ｃ−Ｅ】図９Ａ〜９Ｅは、インビボでのＨＮＳＣＣ異種移植片腫瘍に対するｍｉＲ−３０ａ−５ｐミミックの効果を示す一連のパネルである。図９Ａは、ＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞を筋肉内注射した無胸腺ｎｕ／ｎｕ雌性マウスの腫瘍および器官の一連の画像である。その腫瘍を、約３００ｍｍ３へと成長させ、次いで、そのマウスに、１００μｇ（約５ｍｇ／ｋｇ）の複合体化ＦＩＴＣ標識コントロールオリゴヌクレオチドまたはコントロールビヒクルを静脈内（ＩＶ）注射した。注射の２４時間後に、腫瘍および器官を採取するためにマウスを屠殺した。図９Ｂは、月曜日、水曜日、および金曜日（ＭＷＦ）に３週間にわたって、６０μｇ（約ｍｇ／ｋｇ）の、ナノ粒子の中にパッケージした複合体化ｍｉＲ−３０ａミミック（ｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬ）またはコントロールを９用量ＩＶ注射した、ＵＭ−ＳＣＣ−４６異種移植片腫瘍  約１５０ｍｍ３を有するマウスにおける腫瘍成長のグラフである。グラフは、各群の平均腫瘍容積を示し、エラーバーは、ＳＥＭを示す。２４日目の処置終了時の腫瘍サイズの代表的画像を、コントロールおよびｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬ処置マウス（上）および処置の間のマウス体重（下）について図９Ｃに示す。図９Ｄは、コントロールまたはｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬで処置したマウス間のカプラン−マイヤー生存分析を示す。図９Ｅは、ＭＷＦスケジュールで６０μｇ  ｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬまたはコントロールの４用量でＩＶ注射した、約１５０ｍｍ３へと成長させたＨＰＶ＋ＵＭ−ＳＣＣ−４７異種移植片腫瘍を有するマウスの平均腫瘍容積を示す。最後の処置の２４時間後に、マウスを屠殺し、腫瘍組織を分子分析のために集めた。エラーバーは、ＳＥＭを示し、（＊）は、スチューデントのＴ検定によるｐ値＜０．０５を示す。
【００２３】
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＵＭ−ＳＣＣ−４６異種移植片腫瘍を移植し、ＭＷＦスケジュールで６０μｇのコントロールｍｉＲ−ＳｃＬまたはｍｉＲ−３０ａ−ＳｃＬの４用量をｉ．ｖ．注射したマウスにおけるｍｉＲ−３０ａ−５ｐ標的ｍＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲを示すグラフである。データは、３匹の動物の平均を表し、エラーバーは、ＳＥＭを示し、（＊）は、スチューデントのＴ検定によるｐ値＜０．０５を表す。
【００２４】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、コントロールｍｉＲ−ｓｃＬまたはｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬ処置後の異種移植片腫瘍から採取した凍結切片におけるＥＧＦＲおよびＭＥＴの免疫蛍光染色を示す一連のデジタル画像である。スケールバー、２０μｍ。図１０Ｃは、ＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞（左側）およびＵＭ−ＳＣＣ−４７細胞（右側）における６個の独立した４０×視野から定量した平均蛍光強度を示す１対のグラフである。エラーバーは、±ＳＥＭを表し、（＊）は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｂは、コントロールｍｉＲ−ｓｃＬまたはｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬ処置後の異種移植片腫瘍から採取した凍結切片におけるＥＧＦＲおよびＭＥＴの免疫蛍光染色を示す一連のデジタル画像である。スケールバー、２０μｍ。図１０Ｃは、ＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞（左側）およびＵＭ−ＳＣＣ−４７細胞（右側）における６個の独立した４０×視野から定量した平均蛍光強度を示す１対のグラフである。エラーバーは、±ＳＥＭを表し、（＊）は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【００２５】
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓによって、ｍｉＲ３０標的化分子を、増殖および移動に関連して報告された相互作用および機能と関連付ける経路模式図である。赤色で示される分子は、ｍｉＲ−３０ａ発現に対して逆関係を有するｍｉＲ−３０ａ−５ｐ標的遺伝子である。青色で示される分子は、赤色の分子と関連付けられる結合またはシグナル伝達相互作用を示す分子である。
【００２６】
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、免疫組織化学によって、Ｋｉ−６７に関して染色したＵＭ−ＳＣＣ−４６異種移植片腫瘍の代表的デジタル画像および定量である。値は、６個の独立した２０×視野から定量した平均強度を表し、エラーバーは、±ＳＥＭを表し、（＊）は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。図１０Ｆは、ｍｉＲ−３０標的遺伝子であるＥＧＦＲまたはＭＥＴに関して免疫蛍光によって染色したＵＭ−ＳＣＣ−４７異種移植片腫瘍の代表的画像を示す。
【図１０Ｆ】図１０Ｅは、免疫組織化学によって、Ｋｉ−６７に関して染色したＵＭ−ＳＣＣ−４６異種移植片腫瘍の代表的デジタル画像および定量である。値は、６個の独立した２０×視野から定量した平均強度を表し、エラーバーは、±ＳＥＭを表し、（＊）は、スチューデントのｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。図１０Ｆは、ｍｉＲ−３０標的遺伝子であるＥＧＦＲまたはＭＥＴに関して免疫蛍光によって染色したＵＭ−ＳＣＣ−４７異種移植片腫瘍の代表的画像を示す。
【００２７】
【図１１Ａ−Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｆは、ｍｉＲ−３０ファミリーメンバーのコピー数多型（ＣＮＶ）、メチル化、および発現と、ＨＮＳＣＣの臨床上の特徴との関連を示す一連のパネルである。図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＭＩＲ３０Ａ／Ｃ２遺伝子（図１１Ａ）およびＭＩＲ３０Ｅ／Ｃ１遺伝子（図１１Ｂ）と重なり合う染色体位置上のホモ接合性およびヘテロ接合性の欠失の頻度を示すＩｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ，  Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）プロットである。青色は、コピー数の低下を表し、赤色は、コピー数の増加を表す。サンプルを、ＣＮＶの値に基づいて処理した。図１１Ｃおよび図１１Ｄは、カラムで示しかつｍｉＲ３０ＡプロモーターのＤＮＡメチル化（図１１Ｃ）またはｍｉＲ３０ＥのＣＮＶ（図１１Ｄ）によってソートしたＴＣＧＡ由来のＨＮＳＣＣサンプル（ｎ＝２６０）を示す。臨床上の特徴（着色したバー、上４列）および遺伝的特徴（ヒートマップ、下３列）を、応じて類別した。ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐのＣＮＶおよび発現（図１１Ｅ）とｍｉＲ−３０ａ−５ｐのメチル化および低発現（図１１Ｆ）との間には、有意な相関が観察された。ｍｉＲ−３０ａ−５ｐの低発現は、口腔に発生する腫瘍と有意に相関し、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐの低発現は、喉頭に発生するＨＰＶ陰性腫瘍と有意に相関した。
【図１１Ｃ−Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｆは、ｍｉＲ−３０ファミリーメンバーのコピー数多型（ＣＮＶ）、メチル化、および発現と、ＨＮＳＣＣの臨床上の特徴との関連を示す一連のパネルである。図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＭＩＲ３０Ａ／Ｃ２遺伝子（図１１Ａ）およびＭＩＲ３０Ｅ／Ｃ１遺伝子（図１１Ｂ）と重なり合う染色体位置上のホモ接合性およびヘテロ接合性の欠失の頻度を示すＩｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ，  Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）プロットである。青色は、コピー数の低下を表し、赤色は、コピー数の増加を表す。サンプルを、ＣＮＶの値に基づいて処理した。図１１Ｃおよび図１１Ｄは、カラムで示しかつｍｉＲ３０ＡプロモーターのＤＮＡメチル化（図１１Ｃ）またはｍｉＲ３０ＥのＣＮＶ（図１１Ｄ）によってソートしたＴＣＧＡ由来のＨＮＳＣＣサンプル（ｎ＝２６０）を示す。臨床上の特徴（着色したバー、上４列）および遺伝的特徴（ヒートマップ、下３列）を、応じて類別した。ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐのＣＮＶおよび発現（図１１Ｅ）とｍｉＲ−３０ａ−５ｐのメチル化および低発現（図１１Ｆ）との間には、有意な相関が観察された。ｍｉＲ−３０ａ−５ｐの低発現は、口腔に発生する腫瘍と有意に相関し、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐの低発現は、喉頭に発生するＨＰＶ陰性腫瘍と有意に相関した。
【図１１Ｅ−Ｆ】図１１Ａ〜１１Ｆは、ｍｉＲ−３０ファミリーメンバーのコピー数多型（ＣＮＶ）、メチル化、および発現と、ＨＮＳＣＣの臨床上の特徴との関連を示す一連のパネルである。図１１Ａおよび図１１Ｂは、ＭＩＲ３０Ａ／Ｃ２遺伝子（図１１Ａ）およびＭＩＲ３０Ｅ／Ｃ１遺伝子（図１１Ｂ）と重なり合う染色体位置上のホモ接合性およびヘテロ接合性の欠失の頻度を示すＩｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ，  Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）プロットである。青色は、コピー数の低下を表し、赤色は、コピー数の増加を表す。サンプルを、ＣＮＶの値に基づいて処理した。図１１Ｃおよび図１１Ｄは、カラムで示しかつｍｉＲ３０ＡプロモーターのＤＮＡメチル化（図１１Ｃ）またはｍｉＲ３０ＥのＣＮＶ（図１１Ｄ）によってソートしたＴＣＧＡ由来のＨＮＳＣＣサンプル（ｎ＝２６０）を示す。臨床上の特徴（着色したバー、上４列）および遺伝的特徴（ヒートマップ、下３列）を、応じて類別した。ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐのＣＮＶおよび発現（図１１Ｅ）とｍｉＲ−３０ａ−５ｐのメチル化および低発現（図１１Ｆ）との間には、有意な相関が観察された。ｍｉＲ−３０ａ−５ｐの低発現は、口腔に発生する腫瘍と有意に相関し、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐの低発現は、喉頭に発生するＨＰＶ陰性腫瘍と有意に相関した。
【００２８】
【図１１Ｇ−Ｈ】図１１Ｇおよび１１Ｈは、発現の中央値によって高いおよび低いに分離したｍｉＲ−３０ａ−５ｐ  （図１１Ｇ）およびｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ（図１１Ｈ）の生存分析を示すグラフの対である。カプラン−マイヤープロットおよびログランク検定のｐ値は、疾患特異的生存を比較する。
【００２９】
【図１２Ａ】図１２Ａおよび図１２Ｂは、低い全生存（図１２Ａ、左側）と相関したｍｉＲ−３０ｅの低い発現、低い全生存と相関したＭＩＲ３０Ｅ遺伝子座のＣＮＶ喪失（図１２Ａ、中央）を示す一連のカプラン−マイヤー生存プロットであり、そして中咽頭に発生する低レベルまたは高レベルのｍｉＲ−３０ｅ−５ｐを発現する腫瘍に関する生存分析は、生存の差異を明らかにし、それによって、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐの高発現から、より良好な予後が推定された（図１２Ａ、右側）。そしてｍｉＲ−２６ａ−５ｐ（図１２Ｂ、上側）およびｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ（図１２Ｂ、下側）の低発現は、低い全生存と相関した。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび図１２Ｂは、低い全生存（図１２Ａ、左側）と相関したｍｉＲ−３０ｅの低い発現、低い全生存と相関したＭＩＲ３０Ｅ遺伝子座のＣＮＶ喪失（図１２Ａ、中央）を示す一連のカプラン−マイヤー生存プロットであり、そして中咽頭に発生する低レベルまたは高レベルのｍｉＲ−３０ｅ−５ｐを発現する腫瘍に関する生存分析は、生存の差異を明らかにし、それによって、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐの高発現から、より良好な予後が推定された（図１２Ａ、右側）。そしてｍｉＲ−２６ａ−５ｐ（図１２Ｂ、上側）およびｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ（図１２Ｂ、下側）の低発現は、低い全生存と相関した。
【００３０】
【図１３】図１３は、ｍｉＲ−３０ａでトランスフェクトし、ＸＴＴアッセイによって測定した非ＨＮＳＣＣがん細胞株の細胞生存性を示すグラフである。データは、６回の反復の平均を表し、エラーバーは、ＳＥＭを示す。＊，  ｐ＜０．０５。
【００３１】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、ＵＭＳＣＣ−４６異種移植片モデルに対する改変ｍｉＲ−３０ａオリゴヌクレオチドの効果を示す一連のパネルである。図１４Ａは、コントロールマウス、放射線療法（ＲＴ）で処置したマウス、ｍｉＲ−３０ａ−ｓｃｌで処置したマウス、ならびにｍｉＲ−３０ａ−００６−ｓｃｌおよび放射線療法（Ｍ００６−ｓｃｌ＋ＲＴ）で処置したマウスにおける腫瘍成長を示す。図１４Ｂは、コントロール、放射線療法（ＲＴ）、Ｍ−ｍｉＲ−００６（Ｍ−００６）、Ｍ−００６＋放射線、およびシスプラチン処置したマウスにおけるカプラン−マイヤー生存プロットである。
【００３２】
【図１５】図１５は、示した細胞株の細胞密度に対するｍｉＲ組み合わせ処置の効果を示すグラフである。上記細胞を、ｍｉＲ−３０ａ−０１４（Ｇ１１＋Ｐ１２鎖（stand））、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２６ａ、およびｍｉＲ−３７５の組み合わせでトランスフェクトした。データは、６回の反復の平均を表し、エラーバーは、ＳＤを表す。
【００３３】
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ＵＭ−ＳＣＣ１０８細胞（図１６Ａ）、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞（図１６Ｂ）、ＵＭ−ＳＣＣ−４７細胞（図１６Ｃ）およびＵＭ−ＳＣＣ−１Ｇ細胞（図１６Ｄ）の細胞密度に対する個々のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの対の効果を示すグラフである。ＮＴ、トランスフェクトされない；  ＮＣ、陰性コントロール；  １４５、ｍｉＲ−１４５−５ｐ；  ３７５、ｍｉＲ−３７５；  ｍ１６、Ｍ−ｍｉＲ３０ａ−０１６；  ２６ａ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ；  ３０ａ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ＵＭ−ＳＣＣ１０８細胞（図１６Ａ）、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞（図１６Ｂ）、ＵＭ−ＳＣＣ−４７細胞（図１６Ｃ）およびＵＭ−ＳＣＣ−１Ｇ細胞（図１６Ｄ）の細胞密度に対する個々のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの対の効果を示すグラフである。ＮＴ、トランスフェクトされない；  ＮＣ、陰性コントロール；  １４５、ｍｉＲ−１４５−５ｐ；  ３７５、ｍｉＲ−３７５；  ｍ１６、Ｍ−ｍｉＲ３０ａ−０１６；  ２６ａ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ；  ３０ａ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ＵＭ−ＳＣＣ１０８細胞（図１６Ａ）、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞（図１６Ｂ）、ＵＭ−ＳＣＣ−４７細胞（図１６Ｃ）およびＵＭ−ＳＣＣ−１Ｇ細胞（図１６Ｄ）の細胞密度に対する個々のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの対の効果を示すグラフである。ＮＴ、トランスフェクトされない；  ＮＣ、陰性コントロール；  １４５、ｍｉＲ−１４５−５ｐ；  ３７５、ｍｉＲ−３７５；  ｍ１６、Ｍ−ｍｉＲ３０ａ−０１６；  ２６ａ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ；  ３０ａ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ＵＭ−ＳＣＣ１０８細胞（図１６Ａ）、ＵＭ−ＳＣＣ−２２Ｂ細胞（図１６Ｂ）、ＵＭ−ＳＣＣ−４７細胞（図１６Ｃ）およびＵＭ−ＳＣＣ−１Ｇ細胞（図１６Ｄ）の細胞密度に対する個々のｍｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの対の効果を示すグラフである。ＮＴ、トランスフェクトされない；  ＮＣ、陰性コントロール；  １４５、ｍｉＲ−１４５−５ｐ；  ３７５、ｍｉＲ−３７５；  ｍ１６、Ｍ−ｍｉＲ３０ａ−０１６；  ２６ａ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ；  ３０ａ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ。
【００３４】
【図１７】図１７Ａおよび図１７Ｂは、ｍｉＲ−２７−５ｐ二重鎖またはｍｉＲ−２６ｂ−１−５ｐ二重鎖でトランスフェクトしたＵＭ−ＳＣＣ−１細胞（図１７Ａ）またはＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞（図１７Ｂ）における細胞生存性を示すグラフである。データは、６回の反復の平均を表す。エラーバーは、ＳＥＭを示す。＊スチューデントのＴ検定によってｐ＜０．０５。
【００３５】
【図１８】図１８は、４８時間の過程にわたって血清中のｍｉＲ−３０ａおよび改変ミミック（Ｍ−００６、Ｍ−０１８、およびＭ−０１９）の安定性を示す一連のデジタル画像である。
【００３６】
【図１９】図１９は、ＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞の細胞密度に対するｍｉＲＮＡ対の効果を示すグラフである。ＮＴ、トランスフェクトされない；  ＮＣ、陰性コントロール；  ｍｉＲＮＡ対は、表１９および表２２に示されるとおりである。エラーバーは、ＳＤを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
配列表
本明細書で列挙されるかまたは添付の配列表中の任意の核酸配列およびアミノ酸配列は、特許法施行規則§１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基およびアミノ酸に関する標準文字略語を使用して示される。少なくともいくらかの場合には、各核酸配列の一方の鎖のみが示されるが、相補鎖は、示された鎖への任意の言及によって包含されると理解される。
【００３８】
配列番号１〜３６は、例示的な成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号３７〜５３は、改変ｍｉＲ−３０ａガイド鎖ヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号５４〜６１は、改変ｍｉＲ−３０ａパッセンジャー鎖ヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号６２および配列番号６３は、それぞれ、改変ｍｉＲ−３７５ガイド鎖およびパッセンジャー鎖である。
【００４２】
配列番号６４および配列番号６５は、それぞれ、改変ｍｉＲ−２６ａ−５ｐガイド鎖およびパッセンジャー鎖である。
【００４３】
配列番号６６および配列番号６７は、それぞれ、改変ｍｉＲ−１４５−５ｐガイド鎖およびパッセンジャー鎖である。
【００４４】
配列番号６８は、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）３’非翻訳領域（ＵＴＲ）ヌクレオチド配列である。
【００４５】
配列番号６９は、インスリン成長因子−１レセプター（ＩＧＦＲ１）３’  ＵＴＲヌクレオチド配列である。
【００４６】
配列番号７０は、ＭＥＴ  ３’  ＵＴＲヌクレオチド配列である。
【００４７】
配列番号７１は、インスリンレセプター基質１（ＩＲＳ−１）  ３’  ＵＴＲヌクレオチド配列である。
【００４８】
配列番号７２は、例示的なｍｉＲ−３０ａパッセンジャー鎖ヌクレオチド配列である。
【００４９】
配列番号７３〜９２は、さらなる例示的な改変ｍｉＲ−３０ａガイド鎖およびパッセンジャー鎖である。
【００５０】
配列番号９３〜１０４は、さらなる例示的な改変ｍｉＲ−３７５ガイド鎖およびパッセンジャー鎖である。
【００５１】
配列番号１０５〜１１５は、さらなる例示的な改変ｍｉＲ−２６ガイド鎖およびパッセンジャー鎖である。
【００５２】
配列番号１１６〜１２５は、さらなる例示的な改変ｍｉＲ−１４５−５ｐガイド鎖およびパッセンジャー鎖である。
【００５３】
配列番号１２６〜１３５は、さらなる例示的な改変ｍｉＲ−１０１ガイド鎖およびパッセンジャー鎖である。
【００５４】
配列番号１３６〜１４６は、さらなる例示的な改変ｍｉＲ−２９ガイド鎖およびパッセンジャー鎖である。
【００５５】
配列番号１４７〜１５８は、さらなる例示的な改変ｍｉＲ−２７ガイド鎖およびパッセンジャー鎖である。
【００５６】
詳細な説明
ゲノムワイド発現プロファイリング研究は、原発性腫瘍および細胞株においてｍＲＮＡおよびｍｉＲ発現の広い脱制御および不均一性（heterogeneity）を示した。これは、数百もの候補の中から、悪性表現型および治療抵抗性において決定的に重要なｍｉＲおよびｍＲＮＡを同定するにあたって複雑性および難題を強調する。しかし、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）からの頭頚部および全がん分析の近年の発表（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｎａｔｕｒｅ  ５１７：５７６−５８２，  ２０１５；  Ｈｏａｄｌｅｙら，  Ｃｅｌｌ  １５８：９２９−９４４，  ２０１４）まで、複数のプラットフォームからの包括的データは、最も顕著に変化したｍｉＲ、逆に発現されるｍＲＮＡ、およびそれらの発現を駆動するゲノム変化の寄与を比較し同定するために、このような大きなデータセットから利用可能ではなかった。
【００５７】
あるいは、ｍｉＲライブラリーを使用する機能的スクリーニングは、ＨＮＳＣＣにおける悪性表現型の異なる特徴に寄与するｍｉＲを同定した（Ｌｉｎｄｅｎｂｅｒｇｈ−ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｌａｓら，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９：５６４７−５６５７，  ２０１３）。しかし、優先順位の決定は困難であり、腫瘍の発現プロファイリングまたはインビトロスクリーニングによって同定された多くの候補ｍｉＲはしばしば、インビボで治療活性に翻訳されない。今までのところ、遺伝的および後生的な変化によって駆動される腫瘍抑制性ｍｉＲは、ゲノムおよび機能の統合分析を通じてほとんど同定されていない。多様なｍＲＮＡプログラムを制御することが示され、ＨＮＳＣＣの悪性表現型、臨床上の特徴、または治療抵抗性に関与したｍｉＲはさらに少なかった。
【００５８】
本明細書で開示されるのは、がん（例えば、１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡの発現が変化するがん）を処置または阻害するために利用され得る、および／または被験体においてがんの診断のために利用され得るｍｉＲである。がんにおいて潜在的に制御性の、生物学的な、および／または治療的に重要なｍｉＲを同定するために、本発明者らは、構造および機能的ゲノム分析を組み合わせた統合アプローチを使用した。本発明者らは、ＴＣＧＡからのｍｉＲの発現および逆に相関したｍＲＮＡの分析、ならびにＨＮＳＣＣ腫瘍の検証データセットと、インビトロでの抗増殖ｍｉＲに関する機能的スクリーニングとを比較した。２７９個のＨＮＳＣＣ腫瘍標本に由来するＴＣＧＡからのデータおよび７８１個のｍｉＲライブラリーの機能的スクリーニングの統合は、９種の過小発現されたおよび阻害性のｍｉＲを明らかにし、そのうちの４種は、ｍｉＲ−３０−５ｐファミリーのメンバーであった。特に、本発明者らは、減少したｍｉＲ−３０ａ発現が、成長因子レセプターのプログラムの過剰発現、シグナル伝達、ならびにＨＮＳＣＣの生物学および臨床上の特徴に関わる転移性ｍＲＮＡに逆に関連することを決定した。本明細書で開示されるように、腫瘍抑制におけるｍｉＲ−３０−５ｐの役割は、成長因子レセプターチロシンキナーゼ、シグナル伝達、および転移に集中するいくつかの古典的がん遺伝子の制御において確認された。最後に、本明細書で開示されるのは、ＨＮＳＣＣの異種移植片腫瘍モデルにおいて送達される場合に、腫瘍成長を遅らせ得る合成ｍｉＲ−３０ａ−５ｐミミック製剤である。
【００５９】
Ｉ．略語
ＣＮＶ          コピー数多型
ＨＮＳＣＣ          頭頚部扁平上皮癌
ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ          マイクロＲＮＡ
ＲＰＭ          １００万個の塩基対あたりのリード数
ＲＳＥＭ          期待値最大化法によるＲＮＡ−Ｓｅｑ
ＳＣＣ          扁平上皮癌
ＴＣＧＡ          がんゲノムアトラス（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ）
ＸＴＴ          ３’−［１−（フェニルアミノカルボニル）−３，４−テトラゾリウム]−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼンスルホン酸ナトリウム水和物
【００６０】
ＩＩ．用語
別段注記されなければ、技術用語は、従来からの使用法に従って使用される。分子生物学における一般的用語の定義は、以下において見出され得る：Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ，  出版：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００  （ＩＳＢＮ  ０１９８７９２７６Ｘ）；  Ｋｅｎｄｒｅｗら（編），  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  出版：Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  １９９４（ＩＳＢＮ  ０６３２０２１８２９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（編），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  出版：Ｗｉｌｅｙ，  Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９５  （ＩＳＢＮ  ０４７１１８６３４１）；ならびに他の類似の参考文献。
【００６１】
本明細書で使用される場合、単数形の用語「１つの、ある（ａ）」「１つの、ある（ａｎ）」、および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は、状況が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形への言及を含む。同様に、語句「もしくは、または、あるいは（ｏｒ）」は、状況が明らかにそうでないことを示さない限り、「および（ａｎｄ）」を含むように意図される。また、本明細書で使用される場合、用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」を意味する。よって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ａ  ｏｒ  Ｂ）」は、Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量値は、核酸またはポリペプチドに関して与えられる場合、近似値であり、そして説明のために提供されることは、さらに理解されるべきである。本明細書で記載されるものに類似または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料は、以下で記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体において参考として援用される。矛盾する場合、用語の説明を含め、本明細書が優先する。材料、方法および例は、例証に過ぎず、限定であることを意図しない。
【００６２】
本開示の種々の実施形態の検討を促すために、以下の具体的用語の説明が提供される：
【００６３】
変化した発現：    ｍｉＲ核酸の発現における変化とは、生物学的サンプルにおいて検出可能な、例えば、コントロールに対するｍｉＲ核酸のレベルにおける変化（ｃｈａｎｇｅ）または差異（例えば、増加または減少）に言及する。発現における「変化（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）は、発現における増加（アップレギュレーション）または発現における減少（ダウンレギュレーション）を含む。いくつかの例では、その差異は、コントロールまたは参照値（例えば、健康なコントロール被験体または健康なコントロール被験体の集団に由来するサンプルにおけるマイクロＲＮＡ発現の量）に対応する。
【００６４】
がん：    分化の喪失、増加した成長速度、周りの組織への侵入、および転移能力があることを伴う、特徴的な退形成を受けた悪性新生物（例えば、腫瘍）。転移性のがんは、その転移性のがんが由来する元の（原発の）がんの元の部位以外の身体中の１またはこれより多くの部位にあるがんである。いくつかの例では、がんは、同じ組織タイプの正常または健康な組織と比較して、新生物において１またはこれより多くのｍｉＲＮＡの発現が変化した（例えば、増加または減少した）状態である。例示的ながんとしては、扁平上皮癌（例えば、ＨＮＳＣＣ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００６５】
コントロール：    「コントロール」とは、試験サンプル（例えば、健康な被験体（または健康な被験体の集団）から得られるサンプル）との比較のために使用されるサンプルまたは標準に言及する。いくつかの実施形態において、コントロールは、健康な被験体（または健康な被験体の集団）または同じ被験体に由来しかつがんと同じ組織学的タイプの非悪性組織（本明細書で「正常」コントロールともいわれる）から得られるサンプルである。いくつかの実施形態において、コントロールは、ヒストリカルコントロールまたは標準値（例えば、ベースラインまたは正常値（例えば、健康な被験体におけるベースラインまたは正常値）を表す以前に試験されたコントロールサンプルまたはサンプル群）である。いくつかの例では、コントロールは、複数のサンプルから得られる平均値（または値の平均範囲）を表す標準値（例えば、正常被験体に由来する１種またはこれより多くのｍｉＲ核酸の発現の平均値または値の範囲）である。
【００６６】
有効量：  所望の応答（例えば、ある状態または疾患と関連する１またはこれより多くの徴候または症状を低減または阻害する）を生じるために十分である薬剤（例えば、１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡ）の量。いくつかの例では、「有効量」は、腫瘍の１またはこれより多くの徴候または症状を処置または阻害する量である。いくつかの例では、「有効量」は、その薬剤単独でまたは１種もしくはこれより多くのさらなる治療とともに、所望の応答（例えば、被験体における腫瘍サイズ、被験体における腫瘍の数、被験体における腫瘍転移のサイズもしくは数の減少、および／または被験体の生存（例えば、無病生存、無転移生存、または全生存）の増加）を誘導する治療上有効な量である。
【００６７】
単離された：    「単離された」生物学的構成要素（例えば、核酸分子、タンパク質、または細胞）は、他の生物学的構成要素（例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質および細胞などの、上記構成要素が天然に存在する、生物の細胞もしくは組織において、またはその生物自体において）から離して実質的に分離または精製されている。「単離され」ている核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製法によって精製されたものを含む。その用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸分子（マイクロＲＮＡを含む）およびタンパク質、ならびに化学合成された核酸分子およびタンパク質を包含する。
【００６８】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：    遺伝子発現を制御する１本鎖の小さな非コードＲＮＡ分子。ｍｉＲＮＡは一般に、約１６〜２７ヌクレオチドの長さである。ｍｉＲＮＡは、代表的には、標的ｍＲＮＡの切断を促進することによって、または細胞転写物の翻訳をブロックすることによって、遺伝子発現をモジュレートする（例えば、翻訳を増加または減少させる）。ｍｉＲＮＡは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして公知の一次転写物から前駆体（ｐｒｅ）−ｍｉＲＮＡといわれる短いステム−ループ構造へと、最終的には、機能的な成熟ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１種またはこれより多くのメッセンジャーＲＮＡ分子に対して部分的に相補的であり、それらの主な機能は、遺伝子発現をダウンレギュレートすることである。本明細書で利用される場合「ｍｉＲ核酸」または「ｍｉＲＮＡ核酸」とは、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ二重鎖、または成熟ｍｉＲＮＡのうちのいずれかに言及する。
【００６９】
ｍｉＲＮＡ配列は、公的に入手可能である。例えば、ｍｉＲＢａｓｅ（ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）は、註釈付きのｍｉＲＮＡ配列の検索可能なデータベースを含む。ｍｉＲＮＡ配列はまた、当業者に公知の他のデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）が挙げられる）を通じて入手可能である。当業者はまた、公的なデータベースおよびアルゴリズムを利用して、例えば、ＭｉｃｒｏＣｏｓｍ  Ｔａｒｇｅｔｓ（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎｒｉｇｈｔ−ｓｒｖ／ｍｉｃｒｏｃｏｓｍ／ｈｔｄｏｃｓ／ｔａｒｇｅｔｓ／）、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ）、およびＰｉｃＴａｒ（ｐｉｃｔａｒ．ｍｄｃ−ｂｅｒｌｉｎ．ｄｅ）において、特定のｍｉＲＮＡの標的を同定し得る。ある生物（例えば、マウス）に由来するｍｉＲＮＡ配列に基づいて、当業者は、その利用可能なデータベースを利用して、別の生物（例えば、ヒト）に由来する相当するｍｉＲＮＡを決定し得る。
【００７０】
ｍｉＲＮＡミミックまたはミメティック：    ｍｉＲＮＡミメティックは、天然または野生型のｍｉＲＮＡと同じ配列を有するが、改変された骨格、改変された塩基、および／または５’もしくは３’末端改変を有するｍｉＲＮＡを含む。いくつかの例では、ｍｉＲＮＡミメティックは、分解またはヌクレアーゼ活性に対して感受性が低い可能性がある。ｍｉＲＮＡミミックは、少なくとも１つの配列改変を有し、かつ天然または野生型のｍｉＲＮＡと７５％またはこれより高い配列同一性を有し、そしてまた、野生型または天然のｍｉＲＮＡと類似の親和性で同じｍＲＮＡ（複数可）に結合するｍｉＲＮＡである。開示されるｍｉＲＮＡはまた、ｍｉＲＮＡミメティックおよびｍｉＲＮＡミミックの両方、例えば、野生型ｍｉＲＮＡに対して少なくとも１個の配列改変（例えば、７５％またはこれより高い配列同一性）を有し、そしてまた、改変された骨格、塩基、および／または末端改変を有するｍｉＲＮＡであり得る。
【００７１】
サンプル（または生物学的サンプル）：    ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、タンパク質、またはこれらの組み合わせを含む、いくつかの例では、被験体から得られる標本。例としては、末梢血、尿、唾液、組織生検、細針吸引物、手術標本、および剖検材料が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、サンプルは、腫瘍サンプル（例えば、新鮮な、凍結の、または固定された腫瘍サンプル）を含む。
【００７２】
被験体：    ヒトおよび非ヒト哺乳動物（例えば、実験用のまたは獣医学的な被験体）を含むカテゴリーの、生きている多細胞の脊椎動物の生物。
【００７３】
ベクター：    そのベクターが宿主細胞の中で複製および／または組み込む能力を妨害することなく、外来核酸の挿入を可能にする核酸分子。ベクターは、宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列（例えば、複製起点）を含み得る。ベクターはまた、１種もしくはこれより多くの選択マーカー遺伝子および／または他の遺伝的エレメントを含み得る。発現ベクターは、挿入される核酸（複数可）の転写および翻訳を可能にするために必要な制御配列を含むベクターである。本明細書中のいくつかの実施形態において、そのベクターは、プラスミドベクターである。他の実施形態において、そのベクターは、ウイルスベクターである。
【００７４】
ＩＩＩ．ｍｉＲＮＡ
本明細書で開示されるのは、がん（扁平上皮腫瘍（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ）が挙げられるが、これらに限定されない）において差次的に制御されるｍｉＲＮＡである。これらのｍｉＲＮＡは、腫瘍を処置するための方法において利用され得、診断方法においても使用され得る。組成物および処置方法においても利用され得る改変ｍｉＲＮＡがまた、開示される。
【００７５】
ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現を制御する小さな非コードＲＮＡ分子である。成熟ｍｉＲＮＡは一般に、約１７〜２５ヌクレオチドの長さである。ｍｉＲＮＡは、代表的には、標的ｍＲＮＡの切断を促進するか、または細胞転写物の翻訳をブロックすることによって、遺伝子発現をモジュレートする（例えば、翻訳を増加または減少させる）。ｍｉＲＮＡは、「ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ」として公知の一次転写物から「前駆体（ｐｒｅ）−ｍｉＲＮＡ」といわれる短いステム−ループ構造へとプロセシングされる。そのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ二重鎖へと、そして最終的には、機能的な成熟１本鎖ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる。ｍｉＲＮＡ二重鎖をプロセシングする間に、一方の鎖（「パッセンジャー」鎖といわれる）は分解される一方で、他方の鎖（「ガイド」鎖）は、成熟ｍｉＲＮＡ分子である。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、１種またはこれより多くのメッセンジャーＲＮＡ分子に対して部分的に相補的であり、それらの主な機能は、遺伝子発現をダウンレギュレートすることである。本明細書で開示される場合、ｍｉＲＮＡ核酸は、前駆体ｍｉＲＮＡ、ならびにプロセシングされたおよび成熟ｍｉＲＮＡ核酸を含む。例えば、ｍｉＲＮＡ核酸は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ二重鎖、または成熟ｍｉＲＮＡ核酸であり得る。
【００７６】
ｍｉＲＮＡ配列は、公的に入手可能である。当業者は、ｍｉＲＮＡ前駆体、ならびにプロセシングされたまたは成熟ｍｉＲＮＡを、例えば、公的に利用可能なデータベースを利用して同定し得る。例えば、ｍｉＲＢａｓｅ（ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ）は、註釈付きのｍｉＲＮＡ配列の検索可能なデータベースを含む。ｍｉＲＮＡ配列はまた、当業者に公知の他のデータベース（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）が挙げられる）を通じて入手可能である。当業者はまた、公的なデータベースおよびアルゴリズムを利用して、例えば、ＭｉｃｒｏＣｏｓｍ  Ｔａｒｇｅｔｓ（ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎｒｉｇｈｔ−ｓｒｖ／ｍｉｃｒｏｃｏｓｍ／ｈｔｄｏｃｓ／ｔａｒｇｅｔｓ／）、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ（ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ）、およびＰｉｃＴａｒ（ｐｉｃｔａｒ．ｍｄｃ−ｂｅｒｌｉｎ．ｄｅ）において、特定のｍｉＲＮＡの標的を同定し得る。ある生物（例えば、マウス）に由来するｍｉＲＮＡ配列に基づいて、当業者は、その利用可能なデータベースを利用して、別の生物（例えば、ヒト）に由来する相当するｍｉＲＮＡを決定し得る。
【００７７】
いくつかの例では、マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの切断または不安定化を活性化することによって機能し、これは、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション、ＦＲＥＴ、ノーザンブロット、または配列決定によって検出され得る。マイクロＲＮＡはまた、標的ｍＲＮＡをタンパク質へと翻訳することを阻害することによっても機能し得、これは、ウェスタンブロット、免疫ブロッティング、蛍光偏光アッセイ、酵素活性アッセイ、ＦＲＥＴ、免疫蛍光、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、または質量分析によって検出され得る。標的化ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの発現における得られた変化は、多くのがん関連表現型（細胞成長、細胞死に対する抵抗、炎症促進性プロセス、増加した移動および侵入、血管新生、免疫破壊の回避、複製の不死性、低下したゲノム安定性、細胞エネルギー特性（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ）の脱制御、ならびに／または腫瘍成長および進行をもたらす後生的プロセスの脱制御が挙げられる）の抑制を生じ得る。
【００７８】
いくつかの例では、本明細書で開示される組成物および方法において有用なｍｉＲＮＡ核酸は、表１に列挙される成熟ｍｉＲＮＡを含む。他の例では、そのｍｉＲＮＡ核酸は、このような改変ｍｉＲＮＡが、非改変ｍｉＲＮＡの１またはこれより多くの機能を保持する限りにおいて、表１に列挙されるものと少なくとも７５％配列同一性を有するもの（例えば、ｍｉＲＮＡミミック）を含む。例えば、ｍｉＲＮＡ核酸は、表１に列挙されるｍｉＲＮＡのうちの１つの核酸配列と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％  ９９％、または１００％同一の核酸配列を含むか、またはこれらからなる。開示される組成物および方法において有用なさらなるｍｉＲＮＡ核酸は、このような改変ｍｉＲＮＡが非改変ｍｉＲＮＡの１またはこれより多くの機能を保持する限りにおいて、表１８、表２０、表２１、および表２３に示される改変ｍｉＲＮＡ（ガイド鎖および／またはパッセンジャー鎖を含む）、または表１８、表２０、表２１、および表２３に示されるものと少なくとも７５％の配列同一性（例えば、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有するｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡミメティックおよび／またはミミック）を含む。いくつかの例では、表１、表１８、表２０、表２１、または表２３に示されるものと少なくとも７５％配列同一性を有するｍｉＲＮＡは、少なくとも１個の（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはこれより多くの）天然に存在しないヌクレオチドを含む。
【表１−１】
2019512489.tif 000002
【表１−２】
2019512489.tif 000003
【００７９】
さらなる例では、ｍｉＲＮＡ核酸は、ｍｉＲＮＡ核酸が特定のｍｉＲＮＡの機能（例えば、ｍｉＲＮＡ標的配列へのハイブリダイゼーションまたはｍｉＲＮＡ二重鎖の形成）を保持する限りにおいて、本明細書で開示されるｍｉＲＮＡ核酸（例えば、配列番号１〜６７または配列番号７２または配列番号７３〜１５８）のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列より僅かに長いかまたは短いｍｉＲＮＡ核酸を含む。例えば、ｍｉＲＮＡ核酸は、本明細書に記載されるｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列の５’末端または３’末端での数個のヌクレオチドの欠失または付加（例えば、５’末端または３’末端からの１個、２個、３個、４個もしくはこれより多くのヌクレオチドの付加もしくは欠失、またはこれらの組み合わせ（例えば、一方の末端からの欠失および他方の末端への付加））を含み得る。特定の例では、本明細書で記載される改変ｍｉＲＮＡは、３’末端での１個またはこれより多くのヌクレオチドの付加（例えば、ｍｉＲＮＡパッセンジャー鎖の３’末端での１個またはこれより多くのヌクレオチド（例えば、１個、２個、３個、もしくはこれより多くのヌクレオチド）の付加）を含む。
【００８０】
また、ｍｉＲＮＡ配列に対するバリエーション（例えば、配列番号１〜６７または配列番号７２または配列番号７３〜１５８のうちのいずれかに示される配列のバリエーション）を含むｍｉＲＮＡは、このような改変ｍｉＲＮＡが非改変ｍｉＲＮＡの１またはこれより多くの機能を保持する限りにおいて、本開示によって提供される。いくつかの例では、改変は、ガイド鎖−パッセンジャー鎖二重鎖の増加した安定性を提供する。いくつかの例では、改変は、ｍｉＲＮＡにおいて１個またはこれより多くのヌクレオチド（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、またはこれより多くのヌクレオチド）の置換を含む。特定の例では、改変は、ｍｉＲ−３０パッセンジャー鎖（例えば、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ）の１位、６位、および２０位のうちの１個またはこれより多くの置換を含む。
【００８１】
ｍｉＲＮＡミメティック（例えば、１個もしくはこれより多くの改変されたヌクレオチドまたは核酸アナログを含むｍｉＲＮＡ核酸）がまた、提供される。いくつかの実施形態において、単離されたｍｉＲＮＡは、例えば、ヌクレアーゼ抵抗性を増大させる、半減期を増強する、および／または効力を改善するための、少なくとも１個の核酸塩基改変を含む。マイクロＲＮＡへの適用に適した核酸塩基改変は、当該分野で周知である（例えば、米国特許出願公開番号２０１０／０２９８４０７；同２００７／０２１３２９２；同２００６／０２８７２６０；同２００６／００３５２５４；同２００６／０００８８２２；および同２００５／０２８８２４４を参照のこと）。
【００８２】
いくつかの例では（例えば、標的核酸分子に対するヌクレアーゼ抵抗性および／または結合親和性を増加させるために）、本開示のｍｉＲＮＡは、２’−Ｏ−メチル、２’−フッ素、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−Ｏ−アミノプロピル、２’−アミノ糖改変および／またはホスホロチオエート結合を含む。ロックド核酸（locked  nucleic  acid）（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）（例えば、２’−４’−エチレン架橋核酸）およびある種の核酸塩基改変を含めることはまた、標的に対する結合親和性を増加させ得る。オリゴヌクレオチド骨格の中にピラノース糖を含めることはまた、エンドヌクレアーゼ的な（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）切断を減少させ得る。さらなる改変としては、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、アンロック核酸（unlocked  nucleic  acid）（ＵＮＡ）、α−Ｌ−ＬＮＡ、４’−Ｃ−ヒドロキシメチル−ＤＮＡ、２’−Ｎ−アダマンチルメチルカルボニル−２’−アミノ−ＬＮＡ、２’−Ｎ−ピレン−１−イルメチル−２’−アミノ−ＬＮＡ、Ｅ２’−アミノエチル、２’−グアニジノエチル、２’−シアノエチル、２’−アミノプロピル、オキセタン−ＬＮＡ、２’，４’−炭素環式−ＬＮＡ−ロックド核酸、２’，４’−炭素環式−ＥＮＡ−ロックド核酸、２’−デオキシ−２’−Ｎ，４’−Ｃ−エチレン−ＬＮＡ、アルトリトール核酸、ヘキシトール核酸、２’−アミノエトキシメチル、および２’−アミノプロポキシメチルが挙げられる。
【００８３】
さらなるｍｉＲＮＡミメティックとしては、改変された骨格または非天然のヌクレオシド間結合を有するｍｉＲＮＡが挙げられる。改変された骨格を有するオリゴマーは、骨格の中にリン原子を保持するものおよび骨格の中にリン原子を有しないものを含む。それらのヌクレオシド間骨格の中にリン原子を有しない改変されたオリゴヌクレオチドは、一般に、当該分野で核酸塩基オリゴマーといわれる。改変されたオリゴヌクレオチド骨格を有する核酸塩基オリゴマーは、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル−ホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート（ｔｈｉｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、チオノアルキルホスホネート（ｔｈｉｏｎｏａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、チオノアルキルホスホトリエステル（ｔｈｉｏｎｏａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒ）、およびボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が挙げられる）を含む。種々の塩、混合塩および遊離酸形態がまた、含まれる。
【００８４】
中にリン原子を含まない改変されたオリゴヌクレオチド骨格を有するｍｉＲＮＡは、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１種もしくはこれより多くの短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式のヌクレオシド間結合によって形成される骨格を有する。これらは、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素の部分が混合している他のものを有するものを含む。
【００８５】
他の例では、改変ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡミメティック）は、１個またはこれより多くの置換された糖部分を含む。このような改変としては、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエトキシ、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、２’−アミノプロポキシ、および２’−フルオロ改変が挙げられる。改変はまた、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸塩基オリゴマー上の他の位置、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’位においてなされ得る。核酸塩基オリゴマーはまた、糖ミメティック（例えば、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分）を有し得る。
【００８６】
さらなる例において、改変ｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡミメティック）は、５’末端または３’末端において改変を含む。このような改変としては、ｍｉＲＮＡの５’末端において一級アミノ基（例えば、炭素スペーサー、例えば、アミノ−Ｃ３、アミノ−Ｃ６、またはアミノ−Ｃ１２とともに）が挙げられる。さらなる末端改変としては、ＵＮＡ、メチルホスホネート、ホスフィトレート（ｐｈｏｓｐｈｉｔｈｏｒａｔｅ）、逆塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｂａｓｅ）、またはＮ−メチル−Ｇキャップが挙げられる。
【００８７】
他の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、２種またはこれより多くの改変（例えば、塩基置換、ヌクレオシド間結合での改変、改変された糖、または５’末端および／もしくは３’末端での改変から選択される２種またはこれより多くの改変）を含む。二重鎖ｍｉＲＮＡ分子に関しては、その改変（複数可）は、ガイド鎖、パッセンジャー鎖、または両方に存在し得る。
【００８８】
いくつかの例では、本明細書で開示される改変（例えば、ミミックまたはミメティック）ｍｉＲＮＡ核酸としては、５’末端アミノ改変（例えば、５’−アミノＣ６改変（例えば、５’−アミノＣ６改変パッセンジャー鎖）が挙げられる。他の例では、改変（例えば、ミミックまたはミメティック）ｍｉＲＮＡ核酸は、２’改変（例えば、２’−Ｏ−Ｍｅ）を有する１個またはこれより多くのヌクレオチド（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、またはこれより多くのヌクレオチド）を含む。その２’改変ヌクレオシドは、ｍｉＲＮＡに対して内部にあってもよいし（いずれの改変も、５’末端ヌクレオチド上にも３’末端ヌクレオチド上にもない）、５’末端および／または３’末端のヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの例では、ｍｉＲＮＡガイド鎖は、２’改変を有する１個またはこれより多くのヌクレオチド（例えば、３〜１０個、４〜９個、または５〜８個のヌクレオチド）を含む。具体例において、ガイド鎖は、１個またはこれより多くの内部ヌクレオチド上に２’改変を含み、いくつかの例では、５’または３’末端ヌクレオチド上に含まない。他の例では、ｍｉＲＮＡパッセンジャー鎖は、２’改変を有する１個またはこれより多くのヌクレオチド（例えば、３〜１０個、４〜８個、または５〜７個のヌクレオチド）を含む。具体例において、パッセンジャー鎖は、５’または３’末端ヌクレオチド上に２’改変を含むが、１個またはこれより多くの内部ヌクレオチドの２’改変をも含み得る。特定の非限定的例では、改変ｍｉＲＮＡは、以下の表１８、表２０、表２１、および表２３に示されるものを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、開示されるｍｉＲＮＡ核酸または改変（例えば、ミメティックまたはミミック）ｍｉＲＮＡ核酸は、検出可能な標識と会合される。いくつかの例では、ｍｉＲＮＡ核酸は、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、クマリン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料）、ハプテン（例えば、ジゴキシゲニンまたはＭｙｃ）、または放射活性標識に結合体化される。他の実施形態において、上記ｍｉＲＮＡ核酸は、ペプチドまたはタンパク質と例えば、標的化された送達を促進するために）会合される（例えば、ｔａｔ、ＭＡＣＶ  ＧＰ１、葉酸レセプター、またはペネトラチン）。当業者は、特定の状況に依存して、さらなる検出可能な標識またはペプチドを選択し得る。
【００９０】
ＩＶ．がんを処置または阻害するための方法および組成物
腫瘍において差次的に発現されるｍｉＲＮＡが本明細書で開示される。これらｍｉＲＮＡは、被験体においてがんを処置または阻害する方法において利用され得る。従って、本明細書で開示されるのは、有効量の１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡを被験体に投与することを包含する、該被験体においてがんを処置または阻害するための方法である。特定の例では、上記方法は、がんを有する被験体に、腫瘍においてダウンレギュレートされる１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡを、腫瘍（例えば、扁平上皮癌）を有する被験体に投与することを包含する。
【００９１】
いくつかの実施形態において、上記方法は、腫瘍を有する被験体に、有効量の少なくとも１種の単離されたｍｉＲ−３０核酸（例えば、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、またはｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ核酸）またはそのミミックもしくはミメティック、あるいは上記ｍｉＲ−３０核酸またはそのミミックもしくはミメティックをコードするベクターを投与することを包含する。ｍｉＲ−３０核酸の具体的な非限定的例としては、本明細書で開示される配列番号１〜１１および配列番号６６が挙げられる。さらなる例では、上記方法は、腫瘍を有する被験体に、有効量のバリアントまたは改変（例えば、ミミックまたはミメティック）ｍｉＲ−３０核酸を投与することを包含する。改変ｍｉＲ−３０核酸は、例えば、配列番号３７〜６１および配列番号７３〜９２から選択されるｍｉＲ−３０二重鎖（ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む）として投与され得る。特定の非限定的な例において、改変ｍｉＲ−３０核酸としては、配列番号４１および配列番号５５を含むｍｉＲ−３０二重鎖、配列番号４２および配列番号５６を含むｍｉＲ−３０二重鎖、配列番号４２および配列番号５７を含むｍｉＲ−３０二重鎖、配列番号５０および配列番号６１を含むｍｉＲ−３０二重鎖、配列番号７３および配列番号６１を含むｍｉＲ−３０二重鎖、または配列番号７４および配列番号６１を含むｍｉＲＮＡ二重鎖が挙げられる。改変ｍｉＲ−３０二重鎖のさらなる例としては、以下の表１９および表２２中のものが挙げられる。
【００９２】
さらなる実施形態において、上記方法は、腫瘍を有する被験体に、有効量の、単離されたｍｉＲ−３０（例えば、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、および／もしくはｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ）、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−２９、もしくはｍｉＲ−１０１核酸、これらのうちのいずれかのミミックもしくはミメティック、またはこれらのうちの２種もしくはこれより多くの組み合わせ（１種もしくはこれより多くの二重鎖ｍｉＲ核酸または上記ｍｉＲ核酸（複数可）をコードするベクターを含む）のうちの１またはこれより多くを投与することを包含する。改変ｍｉＲ核酸は、例えば、配列番号６２〜６７および配列番号９３〜１５８から選択される、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含むｍｉＲ二重鎖として投与され得る。
【００９３】
特定の例では、上記方法は、腫瘍を有する被験体に、有効量の、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２６ａ、およびｍｉＲ−３７５核酸の組み合わせを投与することを包含する。具体的な非限定的例において、上記方法は、上記被験体に、ｍｉＲ−３０ａ−０１４（配列番号４１および配列番号５５）、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２６ａ、およびｍｉＲ−３７５の組み合わせを投与することを包含する。さらなる例において、上記方法は、表１、表３、表４、表５、表１８、表２０、表２１、および表２３のうちのいずれか１つ（例えば、２〜１０、４〜２０、６〜３０、１０〜５０、またはこれより多く）からの少なくとも２種（例えば、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、またはこれより多くの）ｍｉＲＮＡを投与することを包含する。上記ｍｉＲＮＡは、１本鎖ｍｉＲ核酸、二重鎖ｍｉＲ核酸（例えば、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の二重鎖）、またはｍｉＲ核酸を含むベクターとして投与され得る。
【００９４】
他の例では、上記方法は、腫瘍を有する被験体に、有効量の、２種またはこれより多くのｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−３７５、およびｍｉＲ−２６ａ核酸を投与することを包含する。いくつかの例では、上記方法は、上記被験体に、ｍｉＲ−３０核酸（例えば、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ核酸または改変ｍｉＲ−３０ａ核酸（例えば、表１８、表１９、および表２１中のもの））およびｍｉＲ−１４５核酸を投与することを包含する。他の例では、上記方法は、上記被験体に、ｍｉＲ−１４５核酸およびｍｉＲ−３７５核酸を投与することを包含する。さらなる例において、上記方法は、上記被験体に、ｍｉＲ−３０核酸（例えば、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ核酸または改変ｍｉＲ−３０ａ核酸（例えば、表１８および表１９中のもの））およびｍｉＲ−３７５核酸を投与することを包含する。いくつかの例では、上記方法は、上記被験体に、ｍｉＲ−１４５核酸およびｍｉＲ−２６ａ核酸を投与することを包含する。さらなる例では、上記方法は、上記被験体に、ｍｉＲ−２６ａ核酸およびｍｉＲ−３７５核酸を投与することを包含する。他の例では、上記方法は、上記被験体に、ｍｉＲ−３０核酸（例えば、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ核酸または改変ｍｉＲ−３０ａ核酸（例えば、表１８および表１９中のもの））およびｍｉＲ−２６ａ核酸を投与することを包含する。
【００９５】
開示される方法は、被験体においてがんを処置または阻害するために使用され得る。例示的ながんとしては、以下が挙げられる：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌におけるがん（Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ＡＩＤＳ関連がん（例えば、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、中枢神経系原発リンパ腫）、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫様ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管がん、膀胱がん、骨がん（例えば、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、骨肉腫および悪性線維性組織球腫）、脳腫瘍（例えば、星状細胞腫、脳幹グリオーマ（Ｂｒａｉｎ  Ｓｔｅｍ，  Ｇｌｉｏｍａ）、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胎児性腫瘍、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫）、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、心（心臓）腫瘍、中枢神経系（例えば、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、胎児性腫瘍、胚細胞腫瘍、リンパ腫、原発性）、子宮頚がん、胆管癌、脊索腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸がん、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼のがん（例えば、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫）、卵管がん、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍（例えば、頭蓋外、性腺外、卵巣、精巣）、妊娠性絨毛性疾患、グリオーマ、ヘアリーセル白血病、頭頚部がん、心臓がん、肝細胞がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、膵島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓（例えば、腎細胞、ウィルムス腫瘍）、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、ヘアリーセル白血病、口唇口腔がん、肝臓がん、肺がん（例えば、非小細胞、小細胞）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連、バーキット、皮膚Ｔ細胞、ホジキン、非ホジキン、中枢神経系原発）、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部がん、ＮＵＴ遺伝子が関与する正中腺癌、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭がん、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔咽頭がん、卵巣がん（例えば、上皮、胚細胞腫瘍、低悪性度腫瘍）、膵がん、膵神経内分泌腫瘍（膵島細胞腫瘍）、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、中枢神経系（ＣＮＳ）原発リンパ腫、原発性腹膜がん、前立腺癌、直腸がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫（例えば、ユーイング肉腫、カポジ、骨肉腫、横紋筋肉腫、軟部組織肉腫、子宮肉腫、血管腫瘍）、セザリー症候群、皮膚がん（例えば、黒色腫、メルケル細胞癌、非黒色腫）、小腸がん、扁平上皮癌、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、皮膚、精巣がん��咽喉がん、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、原発不明癌、稀な小児期のがん（Ｕｎｕｓｕａｌ  Ｃａｎｃｅｒｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ）、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、血管腫瘍、外陰がん、またはウィルムス腫瘍。
【００９６】
いくつかの非限定的な実施形態において、上記方法は、扁平上皮癌（ＳＣＣ）（例えば、頭頚部扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、または子宮頸部扁平上皮癌）を処置または阻害することを包含する。ＳＣＣは、多くの異なる器官（皮膚、口唇、口腔、食道、膀胱、前立腺、肺、膣、および子宮頸部が挙げられる）において起こり得る癌タイプのがんである。それは、扁平上皮（扁平上皮細胞分化を示す上皮）の悪性腫瘍である。いくつかの例では、上記腫瘍は、ＨＮＳＣＣ（例えば、口腔扁平上皮癌（例えば、口唇、舌、硬口蓋、口腔底、または頬粘膜の腫瘍）、口腔咽頭扁平上皮癌（例えば、軟口蓋、舌の基部、または扁桃領域の腫瘍）、下咽頭扁平上皮癌（例えば、梨状窩、咽頭後壁、または輪状後部領域の腫瘍）、鼻咽頭扁平上皮癌（例えば、上顎洞の腫瘍）、または喉頭扁平上皮癌である。他の例では、上記腫瘍は、肺ＳＣＣまたは子宮頸部ＳＣＣである。さらなる例において、上記腫瘍は、甲状腺の扁平上皮癌、食道ＳＣＣ、皮膚の扁平上皮癌、乳房の扁平上皮癌、または膀胱の扁平上皮癌である。
【００９７】
さらなる非限定的な実施形態において、上記方法は、子宮頸部の腺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、乳房腺癌、または膵臓癌を処置または阻害することを包含する。
【００９８】
いくつかの実施形態において、被験体は、有効量の、本明細書で開示される１種もしくはこれより多くのｍｉＲＮＡまたは改変ｍｉＲＮＡを含む組成物を投与される。本明細書で開示されるｍｉＲＮＡのうちの１種もしくはこれより多く（例えば、２種、３種、４種、５種、またはもしくはこれより多くのｍｉＲＮＡ）を含む薬学的組成物は、選択される特定の投与様式に依存して、適切な固体または液体のキャリアとともに製剤化され得る。本開示において有用な薬学的に受容可能なキャリアおよび賦形剤は、従来どおりである。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  Ｅｄｉｔｏｒ，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  第２１版（２００５）を参照のこと。例えば、非経口製剤は、通常は、薬学的におよび薬理学的に受容可能な流体ビヒクル（例えば、水、生理食塩水、他の平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなど）である注射用流体を含む。固体組成物（例えば、粉剤・散剤（ｐｏｗｄｅｒ）、丸剤、錠剤、またはカプセル剤形態）に関しては、従来の非毒性固体キャリアとしては、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが挙げられ得る。生物学的に中性のキャリアに加えて、投与されるべき薬学的組成物は、少量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、ｐＨ緩衝化剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）を含み得る。含まれ得る賦形剤は、例えば、他のタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物）である。
【００９９】
当業者は、例えば、処置されている腫瘍のタイプ、疾患進行の程度、被験体の年齢、健康状態および性別、被験体のサイズ（例えば、体重および／または身長）、および投与経路などの因子を考慮して、被験体に投与されるべき有効量の開示されるｍｉＲ核酸（またはｍｉＲ核酸の組み合わせ）を容易に決定し得る。例えば、有効量は、処置されるべき被験体のおよその体重に基づき得る。このような有効量は、任意の適切な経路によって投与され得る。いくつかの例では、被験体に投与されるべき有効量のｍｉＲ核酸（またはｍｉＲ核酸の組み合わせ）は、体重の約５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約１００μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、または約４０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲に及ぶ。１つの非限定的な例において、投与される量は、約５ｍｇ／ｋｇのｍｉＲ核酸（またはｍｉＲ核酸の組み合わせ）である。
【０１００】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、例えば、特定の用量の個々の投与に適した単位投与形態で投与される。いくつかの例では、単位投与量は、約１ｍｇ〜約５ｇの１種またはこれより多くのｍｉＲ核酸分子（例えば、約５ｍｇ〜約５０ｍｇ、約１０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１００ｍｇ〜約２．５ｇ、約２５０ｍｇ〜約１ｇ、または約５００ｍｇ〜約５ｇ）を含む。いくつかの例では、単位投与量は、約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５ｇ、３ｇ、４ｇ、または５ｇの１種またはこれより多くのｍｉＲ核酸を含む。
【０１０１】
当業者はまた、被験体への開示されるｍｉＲ核酸（またはｍｉＲ核酸の組み合わせ）の投与のための適切な投与レジメンを容易に決定し得る。例えば、上記ｍｉＲ核酸（複数可）は、被験体へと１回（例えば、１回の注射または蓄積物（deposition）として）または反復用量で投与され得る。いくつかの例では、ｍｉＲ核酸（またはｍｉＲ核酸の組み合わせ）は、所望の治療転帰（例えば、腫瘍の１もしくはこれより多くの徴候または症状の低減）を達成するために、必要な場合に長期間にわたって毎日１回もしくは２回、１週間に２回、１週間に３回、毎週、２週間に１回、または毎月投与される。他の例では、上記ｍｉＲ核酸（複数可）は、連続様式で（例えば、ポンプ、埋没物、または連続放出性剤を使用して）投与される。
【０１０２】
治療剤は、当該分野で公知の任意の適切な手段を使用して、処置の必要性のある被験体に投与され得る。投与の方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：腺管内、皮内、筋肉内、腹腔内、非経口、静脈内、皮下、膣、直腸、鼻内、吸入、経口、または遺伝子銃によって。鼻内投与とは、片方または両方の鼻腔を介して鼻または鼻経路へと組成物を送達することをいい、噴霧機構または飛沫機構によるか、または核酸のエアロゾル化を介する送達を含み得る。吸入器による組成物の投与は、鼻または口腔を通って、噴霧機構または飛沫機構による送達を介するものであり得る。送達は、挿管法を介して呼吸系のうちのいずれかの領域へと直接であり得る。非経口投与は一般に、注射によって達成される。注射剤は、従来の形態において、液体溶液もしくは懸濁物、注射前の溶液もしくは液体中の懸濁物に適した固体形態、またはエマルジョンとしてのいずれかで調製され得る。注射用液剤および懸濁剤は、滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。投与は、全身または局所であり得る。特定の非限定的例において、投与は、静脈内である。他の例では、投与は、皮下、筋肉内、または腹腔内である。当業者は、治療剤（複数可）、処置されている状態、被験体の健康状態および処置歴、ならびに他の関連する臨床因子に依存して、適切な投与経路を選択し得る。
【０１０３】
治療剤は、任意の適切な様式において、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアとともに投与され得る。薬学的に受容可能なキャリアは、投与されている特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、一部決定される。よって、本開示の薬学的組成物の広く種々の適切な製剤が存在する。
【０１０４】
非経口投与のための調製物は、滅菌した水性または非水性の液剤、懸濁剤、およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物性油（例えば、オリーブ油）、および注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）である。水性キャリアとしては、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンもしくは懸濁液（塩類および緩衝媒体が挙げられる）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸添加リンゲル、または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体および栄養素補充物（ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）、電解質補充物（例えば、リンゲルデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。保存剤および他の添加剤もまた、存在し得る（例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような）。
【０１０５】
局所投与のための製剤としては、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液体および粉剤・散剤が挙げられ得る。従来の薬学的キャリア、水性基剤、粉末基剤または油性基剤、濃化剤などは、必要であり得るか、または望ましい場合がある。
【０１０６】
経口投与のための組成物としては、粉剤・散剤または粒剤、水または非水性媒体中の懸濁剤または液剤、カプセル剤、サシェ、錠剤が挙げられる。濃化剤、矯味矯臭剤、希釈剤、乳化剤、分散補助物質または結合剤は、望ましい場合がある。
【０１０７】
組成物のうちのいくつかは、潜在的に、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸）、および有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸）との反応によって、または無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム）、および有機塩基（例えば、モノアルキル、ジアルキル、トリアルキルおよびアリールアミンならびに置換エタノールアミン）との反応によって形成される薬学的に受容可能な酸付加塩または塩基付加塩として投与され得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、リポソームは、開示されるｍｉＲ核酸またはｍｉＲ核酸の組み合わせを被験体に送達するために使用される。リポソームはまた、遺伝子生成物の血中半減期を増加させ得る。本明細書で開示される組成物および方法における使用に適切なリポソームは、標準的な小胞形成脂質から形成され得、これは一般に、中性または負に荷電したリン脂質およびステロール（例えば、コレステロール）を含む。脂質の選択は一般に、いくつかの因子（例えば、所望のリポソームサイズおよび血流中のリポソームの半減期）を考慮することによってガイドされる。特定の例において、リポソームは、１種またはこれより多くの開示されるｍｉＲ核酸およびカチオン性脂質（例えば、ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＤＯＴＡＰ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ））で形成される。
【０１０９】
種々の方法が、リポソームを調製するために当該分野で公知である（例えば、Ｓｚｏｋａら，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｅｎｇ．  ９：４６７，  １９８０；ならびに米国特許第４，２３５，８７１号；同第４，５０１，７２８号；同第４，８３７，０２８号；および同第５，０１９，３６９号を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ｍｉＲ核酸を被験体に送達するために使用され得る。治療用ＲＮＡ分子を送達するために使用され得るカチオン性脂質およびポリマーは、記載されている（例えば、Ｚｈａｎｇら，  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  １２３（１）：１−１０，  ２００７；  Ｖｏｒｈｉｅｓら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８０：１１−２９，  ２００９；および米国特許出願公開番号２００９／０３０６１９４を参照のこと）。いくつかの例では、リポソームはさらに、腫瘍への複合体の標的化を増加させる分子（例えば、トランスフェリンレセプターに結合する分子（例えば、抗トランスフェリンレセプター抗体またはそのフラグメント））を含む。一例において、リポソームは、抗トランスフェリンレセプター一本鎖抗体フラグメントを含む（例えば、Ｐｉｒｏｌｌｏら，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １７：１１７−１２４，  ２００６；  Ｐｉｒｏｌｌｏら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６７：２９３８−２９４３，  ２００７を参照のこと）。さらなる標的化分子としては、葉酸レセプター、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＲＯＲ１、ＧＬＵＴ１、カドヘリン、ＣＤ４４、ＰＳＭＡ、およびＭＡＧＥが挙げられる。ポリペプチドキャリアはまた、ｍｉＲ核酸を被験体に投与するために使用され得る（例えば、Ｒａｈｂｅｋら，  Ｊ．  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  １０：８１−９３，  ２００８を参照のこと）。当業者は、さらなる標的化分子またはポリペプチドキャリアを同定し得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、上記方法は、開示されるｍｉＲＮＡ核酸またはそのミミックもしくはミメティック（例えば、配列番号１〜６７および配列番号７２、配列番号７３〜１５８、またはそのミミックおよび／もしくはミメティックのうちのいずれか）のうちの１種またはこれより多くをコードするベクターを投与することを包含する。開示される方法における使用のためのベクターは、非ウイルス（例えば、プラスミド）またはウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス）起源のものであり得る。適切なベクター（例えば、遺伝子治療ベクター）は、当該分野で周知である。
【０１１１】
いくつかの例では、上記ｍｉＲＮＡ核酸は、任意の適切なプロモーターを使用して組換え環状または線状ＤＮＡプラスミドから発現される。プラスミドからＲＮＡを発現するために適切なプロモーターとしては、例えば、Ｕ６またはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはメタロチオネインプロモーターが挙げられる。他の適切なプロモーターの選択は、当該分野の技術範囲内である。組換えプラスミドはまた、ｍｉＲ遺伝子生成物の発現のために誘導性または制御性のプロモーターを含み得る。
【０１１２】
１つの非限定的な実施形態において、ｍｉＲＮＡ核酸は、ＲＮＡ前駆体分子としてプラスミドから発現され、その前駆体分子は、標的細胞内で機能的または成熟ｍｉＲＮＡへとプロセシングされる。ｍｉＲＮＡを発現するために適したプラスミドの選択、核酸配列をプラスミドへと挿入して遺伝子生成物を発現するための方法、およびその組換えプラスミドを目的の細胞へと送達するための方法は、当該分野の技術範囲内である（例えば、Ｚｅｎｇら，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ９：１３２７−１３３３，  ２００２；  Ｔｕｓｃｈｌ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０：４４６−４４８，  ２００２；  Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｒｎｐら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５５３，  ２００２；  Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：４９７−５００，  ２００２；  Ｐａｄｄｉｓｏｎら，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １６：９４８−９５８，  ２００２；  Ｌｅｅら，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：５００−５０５，  ２００２；およびＰａｕｌら，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：５０５−５０８，  ２００２を参照のこと）。
【０１１３】
本開示はまた、被験体を、ｍｉＲＮＡ核酸のうちの１種またはこれより多くの組み合わせを用い、がんの処置において有用な１種またはこれより多くの他の薬剤と組み合わせて処置するための方法を包含する。例えば、本開示の化合物は、有効用量の、１種またはこれより多くの腫瘍治療（手術、化学療法剤、放射線、遺伝子治療、ホルモン療法、免疫療法、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド治療が挙げられるが、これらに限定されない）と組み合わせて投与され得る。熟練した臨床医は、処置されている腫瘍のタイプ、被験体の臨床歴、全体的な状態、および他の因子に基づいて、適切な治療の組み合わせを選択し得る。用語「組み合わせての投与」または「共投与」とは、活性薬剤または治療の同時および逐次的な投与の両方に言及する。
【０１１４】
化学療法剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、およびメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ホテムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシン）、白金化合物（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、およびＢＢＲ３４６４）、ブスルファン、ダカルバジン、メクロレタミン、プロカルバジン、テモゾロミド、チオテパ、およびウラムスチン；代謝拮抗物質（例えば、葉酸（例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド、およびラルチトレキセド）、プリン（例えば、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、メルカプトプリン、およびチオグアニン）、ピリミジン（例えば、カペシタビン）、シタラビン、フルオロウラシル、およびゲムシタビン）；植物アルカロイド（例えば、ポドフィルム（例えば、エトポシド、およびテニポシド）、タキサン（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセル）、ビンカ（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビン））；細胞傷害性／抗腫瘍抗生物質（例えば、アントラサイクリンファミリーメンバー（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびバルルビシン）、ブレオマイシン、ヒドロキシウレア、およびマイトマイシン）；トポイソメラーゼインティビター（例えば、トポテカンおよびイリノテカン）；モノクローナル抗体（例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、パニツムマブ、およびトラスツズマブ）；光増感剤（例えば、アミノレブリン酸、アミノレブリン酸メチル、ポルフィルマーナトリウム、およびベルテポルフィン）；ならびに他の薬剤（例えば、アリトレチノイン、アルトレタミン、アムサクリン、アナグレリド、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、ベキサロテン、ボルテゾミブ、セレコキシブ、デニロイキンジフチトクス、エルロチニブ、エストラムスチン、ゲフィチニブ、ヒドロキシカルバミド、イマチニブ、ペントスタチン、マソプロコール、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、およびトレチノイン）。
【０１１５】
特定の例において、被験体がＨＮＳＣＣを有する場合、化学療法剤としては、シスプラチン、カルボプラチン、セツキシマブ、ベバシズマブ、エルロチニブ、ブレオマイシン、パクリタキセル／カルボプラチンまたはこれらのうちの２種もしくはこれより多くの組み合わせが挙げられる。別の例において、被験体が肺ＳＣＣを有する場合、化学療法剤としては、単独で、またはエトポシド、ゲムシタビン、パクリタキセル、ビノレルビン、トポテカン、もしくはイリノテカンとの組み合わせにおいて、シスプラチンまたはカルボプラチンが挙げられる。当業者は、がんのタイプ、がんのステージ、がんの分子プロフィール、ならびに被験体の健康状態および処置歴のような因子に基づいて、適切なさらなる処置（例えば、化学療法）を選択し得る。
【０１１６】
Ｖ．腫瘍を診断するための方法
本明細書で開示されるのは、被験体における腫瘍を診断するための方法である。いくつかの例では、上記方法は、例えば、コントロールと比較して、被験体に由来するサンプル中の１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡの量の変化（例えば、増加または減少）を検出することによって、被験体における腫瘍を同定することを包含する。いくつかの例では、上記方法は、腫瘍を有すると診断された被験体に処置を投与することをさらに包含する。一例において、上記被験体は、１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡの減少した量（例えば、コントロールと比較した場合）を発現する腫瘍を有すると診断され、有効量の、低下した発現を有する上記１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡを含む組成物が上記被験体に投与される。
【０１１７】
本明細書で記載される方法において使用されるサンプル（例えば、組織または他の生物学的サンプル）は、当該分野で公知の任意の方法を使用して調製され得る。サンプルとしては、被験体から得られるか、排出されるか、または分泌される任意の固体もしくは流体サンプルが挙げられる。例えば、サンプルは、例えば、血液、血漿、血清、尿、胆汁、腹水、唾液、脳脊髄液、房水もしくは硝子体液、または任意の身体分泌物、漏出物、滲出物（例えば、膿瘍または感染もしくは炎症の任意の他の部位から得られる流体）から得られる生物学的流体、あるいは関節（例えば、正常な関節または疾患に罹患した関節）から得られる流体であり得る。サンプルはまた、任意の器官もしくは組織（生検または剖検の標本（例えば、腫瘍生検）を含む）から得られるサンプルであり得るか、または細胞（初代細胞もしくは培養細胞に拘わらず）または任意の細胞、組織もしくは器官によって馴化した培地を含み得る。特定の実施形態において、上記サンプルは、腫瘍サンプルまたは血液サンプルを含む。上記サンプルは、慣用的スクリーニングのために被験体から、または障害（例えば、腫瘍）を有すると疑われる被験体から得られ得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、上記方法は、ｍｉＲ−３０（例えば、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、またはｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ）、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−２９、またはｍｉＲ−１０１のうちの１種またはこれより多くの量を、被験体に由来するサンプル（例えば、その被験体に由来する腫瘍サンプル）中で検出することを包含する。他の実施形態において、上記方法は、表１、表３、表４、表５、表１８、および表２０（下記）に列挙される１つまたはこれより多くのｍｉＲＮＡの量を検出することを包含する。特定の例では、上記方法は、上記ｍｉＲの成熟形態、または上記ｍｉＲの前駆体形態（例えば、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）のいずれかの発現を検出することを包含する。代表的には、ｍｉＲ検出法は、配列特異的検出（例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはマイクロアレイ分析による）を包含する。ｍｉＲ特異的プライマーおよびプローブは、当該分野で公知の（例えば、ワールドワイドウェブでｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇにおいて入手可能な）前駆体および成熟ｍｉＲ核酸配列を使用して設計され得る。
【０１１９】
上記方法のうちのいくつかの実施形態において、１種またはこれより多くのｍｉＲ核酸の発現の変化（例えば、発現における統計的に有意な増加または減少）は、被験体に由来するサンプル中で、少なくとも２倍（例えば、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍（約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約３０倍、および約１００倍が挙げられる））である。いくつかの例では、検出される変化は、コントロール（例えば、参照値または健康なコントロール被験体）と比較した場合の発現における増加または減少である。いくつかの例では、その検出される増加または減少は、コントロールまたは標準と比較して、少なくとも２倍の増加または減少である。差次的な発現の決定のために、サンプルに対して比較するためのコントロールまたは標準は、健康な被験体（または健康な被験体の集団）から得られるサンプルまたはヒストリカルコントロールまたは標準値（例えば、以前に試験されたコントロールサンプルまたはベースラインもしくは正常値（例えば、健康な被験体におけるベースラインもしくは正常値）を表すサンプル群）を含む。いくつかの例では、コントロールは、複数のサンプルから得られた平均値（または平均的な値の範囲）（例えば、正常な被験体からの１種またはこれより多くのｍｉＲ核酸の発現の平均値または平均的な値の範囲）を表す標準値である。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、上記方法はさらに、腫瘍と診断された被験体にとって適切な治療を提供することを包含する。いくつかの例では、上記治療は、１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡ核酸の発現を阻害する薬剤（例えば、コントロールと比較して被験体に由来するサンプル中でアップレギュレートされると同定されるｍｉＲ核酸を阻害する薬剤）を投与することを包含する。他の例では、上記治療は、１種またはこれより多くのｍｉＲ核酸（例えば、コントロールと比較して被験体に由来するサンプル中でダウンレギュレートすると同定される１種またはこれより多くのｍｉＲ核酸）（例えば、ＩＶ節に記載されるとおり）を投与することを包含する、薬剤を投与することを包含する。
【０１２１】
以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を例証するために提供される。これらの実施例は、本開示を、記載される特定の特徴または実施形態に限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１２２】
実施例１
材料および方法
ＨＮＳＣＣ患者サンプル：    新鮮な凍結ＨＮＳＣＣ組織および粘膜サンプルを、ＩＲＢ承認プロトコルの一部としてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒから集めた。そのＨＮＳＣＣ患者の臨床的特徴づけを、表２にまとめる。その集めた組織を急速凍結し、ＯＣＴ凍結媒体（Ｆｉｓｈｅｒ）にマウントし、７マイクロメートル切片に切り出し、Ｈ＆Ｅ標準法によって染色した。その染色したスライドを、ＳＣＡＮＳＣＯＰＥ画像獲得デバイス（Ａｐｅｒｉｏ）を使用してスキャンし、ＩＭＡＧＥＳＣＯＰＥソフトウェア（Ａｐｅｒｉｏ）で調べて、腫瘍または粘膜扁平上皮の存在を担保した。その染色したスライドを使用して、組織ブロックを大きく切り出して（ｍａｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔ）、各サンプルにおいて所望の扁平上皮腫瘍または上皮細胞の最低７０％を達成した。
【表２】
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【０１２３】
ＨＮＳＣＣサンプルからのマイクロＲＮＡ単離、ライブラリー調製および配列決定：    大きなＲＮＡおよび小さなＲＮＡを、改訂された製造業者のプロトコルに従って、ｍｉｒＶａｎａＴＭ  ｍｉＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製した。１５〜２０ｍｇの凍結組織を、１ｍＬのＴＲＩＺＯＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中でＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ組織粉砕機（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してホモジナイズした。ホモジナイズした後、標準的なフェノール−クロロホルム法を使用して抽出を行った。その抽出した水相に、１０％  添加剤（ｖ／ｖ）を添加し、次いで、大きなＲＮＡおよび小さなＲＮＡを分画するための標準的な製造業者のプロトコルを行った。ＲＮＡ濃度を、ＮＡＮＯＤＲＯＰ分光計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定し、全ＲＮＡ完全性を、ＲＮＡ  ６０００  Ｎａｎｏキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００機器で検証した。小さなＲＮＡを富化したサンプル中にマイクロＲＮＡが十分存在していることを、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって検証した。
【０１２４】
小さなＲＮＡの配列決定ライブラリーを、ＳＯＬｉＤＴＭ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して製造業者のプロトコルによって構築した。簡潔には、１μｇの富化した小さなＲＮＡ（＜２００塩基）を、配列決定アダプターへとライゲーションするために使用した。ｃＤＮＡライブラリーを、逆転写し、次いで、変性尿素１０％  ＰＡＧＥ上での分離によってサイズ選択した。１８〜３８ヌクレオチドの挿入サイズに相当するバンドを切り出した。次いで、そのライブラリーを、インゲルＰＣＲ（ｉｎ−ｇｅｌ  ＰＣＲ）によって増幅およびバーコード付加（ｂａｒｃｏｄｅｄ）した。ライブラリーサイズを、ＤＮＡ  １０００キットを使用してＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で検証した。ｃＤＮＡライブラリー濃度を、ＳＯＬｉＤＴＭライブラリーＴＡＱＭＡＮ定量キットによるＲＴ−ＰＣＲによって決定した。８種のｃＤＮＡライブラリーの等量（equal  patrs）を、一緒にマルチプレックス化し、０．６ｐｍｏｌのマルチプレックス化したプールを、ＳＯＬｉＤＴＭ  ＥＺ  ＢｅａｄＴＭシステムとＥ２０試薬とを使用するエマルジョンＰＣＲのために使用した。乳化、増幅、およびビーズ富化を、製造業者のプロトコルに従って行った。各プールの富化したビーズを、ＳＯＬｉＤＴＭ  ｐｒｅ−ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｐｌｕｓ  ｋｉｔを使用して製造業者のプロトコルに従って３’標識した。４×１０８個のビーズを、６レーンフローチップの１レーンあたりに置き、次いで、そのフローチップの配列決定を、ＳＯＬｉＤＴＭ  ５５００システム次世代配列決定機とＳＯＬｉＤＴＭ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  ＳＰ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とで行った。
【０１２５】
マイクロＲＮＡマッピング、発現プロファイリング定量、および示差的存在量分析（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ａｂｕｎｄａｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）：    配列決定リードを、ＬｉｆｅＳｃｏｐｅＴＭ  ２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のｍｉＲＮＡモジュールを使用してヒト参照ゲノムＨｇ１９にマッピングした。下流のステップを主に、ｍｉＲＤｅｅｐ２ソフトウェアパッケージ（Ｆｒｉｅｄｌａｅｎｄｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６：４０７−４１５，  ２００８）を使用して行った。簡潔には、ｓａｍ形式でのマッピング結果を、ｍｉＲＤｅｅｐ２で使用されるａｒｆ形式に変換し、翻って、ｍｉＲＤｅｅｐ２．ｐｌスクリプトを使用して、デフォルト設定を使用して配列決定結果における公知のおよび新規のｍｉＲＮＡ全てを同定した。最後に、その同定したｍｉＲＮＡ全てを、これらに割り当てられたリード数に基づいて定量し、そのサンプルにおける１００万あたりの総カウントを使用して正規化した。
【０１２６】
リードカウントインプットマトリクスおよびＦＤＲ閾値０．０５でのＳＡＭｓｅｑ’ｓ（ｓａｍｒ  ｖ２．０，  Ｒ  ３．０．２）２クラスの対応のない分析（two-class  unpaired  analyses）を使用して、差次的に発現されるｍｉＲＮＡを同定した。各実行から、ファイルの対：遺伝子「アップ」、および「ダウン」を生成し、次いで、そのフィルタリングした結果を中央値ベースの倍数変化によってランク付けした。
【０１２７】
ｍｉＲＮＡ階層的クラスター分析：    マイクロＲＮＡ発現の階層的クラスター分析を、ノートブックからＰａｒｔｅｋ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ  ６．６を使用して行った。ＲＰＭ（１００万あたりのリード数）で正規化したマイクロＲＮＡ発現を、正常サンプルおよび腫瘍サンプルの両方にわたって分散によってランク付けし、上位５０％の最も多いバリアントマイクロＲＮＡを選択して、低い発現物を除去した。腫瘍標本と粘膜標本との間で差次的に発現されたマイクロＲＮＡを比較し、両側スチューデントのＴ検定の後にｐ値＜０．０５によってフィルタリングした。発現データを、平均発現に合わせて調整し、次いで、ピアソンの相違度アルゴリズム（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）と完全連結法とを使用して階層的クラスター化を行った。
【０１２８】
ＨＮＳＣＣ  ＴＣＧＡデータにおけるｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ対を同定する統合分析：    ２７９個の腫瘍標本に関するｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ存在量を、レベル３のデータ（ワールドワイドウェブでｔｃｇａ−ｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｏｃｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｈｎｓｃ＿２０１４において入手可能）から抽出した。５ｐ鎖および３ｐ鎖のｍｉＲＮＡリードカウントを、ｍｉＲＢａｓｅ註釈付きｍｉＲＮＡに整列させたＲＰＭに対して正規化した。ｍｉＲＮＡを、サンプル間にわたるＲＰＭ分散によってランク付けし、少なくとも５０  ＲＰＭの最小発現を伴う最も可変性の５０％を、統合分析のために使用した。遺伝子発現を、ＲＮＡ−ＳｅｑデータからＲＳＥＭ  ｖ１．１．１３２で計算し、最小の非ゼロＲＳＥＭ値（０．００３３）でゼロを置き換えた。遺伝子のうちの最も相違する５０％を、統合分析のために使用した。ｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ発現データの両方を、ｌｏｇ２変換した。
【０１２９】
マルチステップアプローチを、ｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ標的の関係性を同定するために適用した。線形回帰を使用して、入手可能な推定ツールとともに、ｍｉＲＮＡ標的データベースからｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ発現のペアワイズ負相関を同定した。グローバルｍｉＲＮＡ−ｍＲＮＡ相互作用の高い信頼性のデータセットを生成した。
【０１３０】
コピー数多型（ＣＮＶ）データ分析：    ２７９個の腫瘍標本のコピー数データを、レベル３データから抽出した。各遺伝子と関連するＣＮＶ数を、相当するゲノム位置におけるセグメント化ＧＩＳＴＩＣ５値として定義した。Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｉｅｗｅｒ  （ＩＧＶ）を使用して、コピー数データを可視化した。線形回帰を適用して、ｍｉＲＮＡ発現とＣＮＶとの間の相関関係を評価した。
【０１３１】
ＴＣＧＡ  ＤＮＡメチル化データ分析：    ＤＮＡメチル化データ分析のために、本発明者らは、ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ５１７：５７６−５８２，  ２０１５）からの２７９個の腫瘍標本に関するレベル３  ＤＮＡメチル化データを使用した。そのデータを、Ｉｌｌｕｍｉｎａヒトメチル化４５０ｋアレイからのβ値（β）として表した。ｍｉＲ−３０ファミリーからのｍｉＲＮＡのプロモーター領域におけるＣｐＧプローブは、ＰＲＯｍｉＲＮＡ（ワールドワイドウェブでｐｒｏｍｉｒｎａ．ｍｏｌｇｅｎ．ｍｐｇ．ｄｅにおいて入手可能；Ｍａｒｓｉｃｏら，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．  １４：Ｒ８４，  ２０１３）から転写開始部位（ＴＳＳ）の座標を使用して見出した。そのプロモーター領域を、ＴＳＳから±１５００ｂｐとして特定した。あらゆるＣｐＧプローブに関して、本発明者らは、非メチル化サンプル（β＜０．１）とメチル化サンプル（β＞０．３）との間のｍｉＲＮＡ存在量の差異を、ｔ検定を使用して概算した。ｔ検定からＢＨ較正Ｐ値（ＦＤＲ）を使用して、閾値として０．０５を使用して非メチル化群とメチル化群との間で有意に差次的に発現されるＣｐＧプローブを見出した。次いで、メチル化β値を、ｍｉＲあたりの有意なプローブにわたって平均し、その対応するｍｉＲ発現と、スピアマンの相関検定を使用して相関させた。
【０１３２】
生存分析：    Ｒ生存統計パッケージ、バージョン２．３７−２（ワールドワイドウェブでＣＲＡＮ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｐａｃｋａｇｅ＝ｓｕｒｖｉｖａｌにおいて入手可能）を使用して、全生存時間を分析し、カプラン−マイヤープロットを生成し、ログランク検定ｐ値を計算した。被験体を、低ｍｉＲＮＡ発現（＜中央値）および高ｍｉＲＮＡ発現（≧中央値）として、カットオフとしての各ｍｉＲＮＡの中央値発現を使用して二分した。全生存時間をＣＮＶによって比較するために、被験体を、彼らのＧＩＳＴＩＣコピー数値が−０．１未満である場合に、ＭＩＲ３０Ｅ／Ａ欠失を有すると分類し、そうでなければ、彼らが欠失を有しないと考えた。
【０１３３】
ｍｉＲ−３０遺伝子変化および発現と、ＴＣＧＡデータベースからのＨＮＳＣＣのステージ、部位、喫煙およびＨＰＶ状態との関連：    フィッシャーの正確度検定を使用して、ｍｉＲ−３０ａ発現／メチル化と臨床的特徴との間、またはｍｉＲ−３０ｅ発現／コピー数喪失と臨床的特徴との間の関連を評価した。統計分析を、Ｒバージョン３．２．２を使用して行った。有意性を、ｐ＜０．０５として定義した。腫瘍部位を、その腫瘍サンプルが以下の解剖学的細区画のうちのいずれに由来する場合に、口腔と分類した：頬粘膜、口腔底、硬口蓋、口唇、口腔、口腔舌、および歯槽突起；腫瘍部位を、その腫瘍サンプルが扁桃、舌の基部または中咽頭に由来する場合に中咽頭として分類した。
【０１３４】
ｍｉＲ−３０ａ発現と推定標的遺伝子との逆相関：    線形回帰分析を、以前に記載されるように（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ５１７：５７６−５８２，  ２０１５）行って、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐの発現とその推定標的遺伝子との間の逆の関連性を、ＨＮＳＣＣ  ＴＣＧＡデータベースを使用して評価した。線形回帰からのＰ値により、逆の関連性の統計的有意性を評価する。
【０１３５】
ＨＮＳＣＣ細胞株：    １０個のＨＮＳＣＣ細胞株のパネルを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ扁平上皮癌（ＵＭ−ＳＣＣ）シリーズから得た（Ｂｒｅｎｎｅｒら，  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  ３２：４１７−４２６，  ２０１０）。これらのＵＭ−ＳＣＣ細胞株の起源を、Ｂｒｅｎｎｅｒらに記載されるように、９個のマーカーでの遺伝子型決定によって確証した。株の保存された凍結ストックを、培養の３ヶ月以内に使用した。ＵＭ−ＳＣＣ細胞株を、１０％  ウシ胎仔血清、ペニシリンおよびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸、およびピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）を補充した最小必須培地中で培養した。口腔歯肉粘膜に由来するヒト初代口腔ケラチノサイト（ＨＯＫ）を、Ｌｏｎｚａから購入し、コントロール細胞株として使用した。その細胞を、５継代未満にわたって、栄養補助剤入り無血清口腔ケラチノサイト培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｌｌ）の中で培養した。
【０１３６】
インビトロマイクロＲＮＡミミック生存性スクリーニング：    細胞を、非必須アミノ酸およびピルビン酸ナトリウムを補充した１０％  熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ中で維持した。トランスフェクションを、３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５７０）中で行った。細胞生存性を、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯルミネッセント細胞生存性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。トランスフェクションのために、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＲＮＡｉＭａｘ試薬（０．１μＬ）を含む２０μＬの無血清培地を、ｍｉＲＮＡミミック（０．８ｐｍｏｌ）を含むウェルに添加した。脂質およびｍｉＲＮＡミミックを、ＭＥＭ、２０％  ＦＢＳ中の１５００個の細胞を添加する前に４５分間周囲温度で複合体化させて、ＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ中の２０ｎＭ  ｍｉＲＮＡミミックを含む最終トランスフェクション混合物を得た。
【０１３７】
スクリーニング作戦を、Ｓａｎｇｅｒ  ｍｉＲＢａｓｅ  １３．０に基づいてかつ約８００ミミックからなるｍｉＲＮＡミミックライブラリー（Ｑｉａｇｅｎ）に対して行った。生存性（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ，  Ｐｒｏｍｅｇａ）を，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０４  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダーでトランスフェクションの７２時間後にアッセイした。Ａｍｂｉｏｎ  ＳＩＬＥＮＣＥＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  陰性コントロール＃２を、正規化のために全てのスクリーニングプレートに組み込んだ（１６ウェル／プレート；各プレートでの陰性コントロール値の中央値を使用して、サンプルウェルを正規化した）。Ｑｉａｇｅｎ’ｓ  ＡｌｌＳｔａｒｓ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈコントロールを、陽性のトランスフェクションコントロールとして組み込んだ（１６ウェル／プレート）。全てのスクリーニングプレートは、０．６より大きいアッセイｚ’−ｆａｃｔｏｒを示した。陰性コントロールで正規化した生存性データを、絶対偏差の中央値（ＭＡＤ）を使用してロバストｚスコアへと変換した（Ｃｈｕｎｇら，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｃｒｅｅｎ  １３：１４９−１５８，  ２００８）．
【０１３８】
ｍＲＮＡ標的に対するＲＴ−ＰＣＲ検証：    ２×１０５  ＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞を、６ウェルプレートの各ウェルに入れた。１５ｎＭのｍｉｒＶａｎａ  マイクロＲＮＡミミックまたはインヒビター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、３．７５μＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して標準的な製造業者のプロトコルによって４８〜７２時間、逆トランスフェクトした。次いで、細胞を、通常媒体およびＰＢＳで洗浄し、０．５ｍＬ  ＴＲＩＺＯＬ試薬の中に集めた。全ＲＮＡを、ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して精製した。２μｇの全ＲＮＡを、ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して製造業者の指示に従って逆転写した。ｍＲＮＡ発現レベルを、リアルタイムＰＣＲによって、ＴＡＱＭＡＮ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して評価し、４０ｎｇのｃＤＮＡを各反応において使用した。反応を、ＡＢＩ  ７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲ機器で実行した。発現レベルを、内因性負荷コントロールとしての１８Ｓ  ＲＮＡに対して正規化した。
【０１３９】
ウェスタンブロッティング：    ＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞を、上記に記載されるようにトランスフェクトし、次いで、１００μＬのＳＤＳ溶解緩衝液（１％  ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）、およびＨａｌｔ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））へと溶解した。サンプルを、プローブソニケーターを使用して５秒間×４回（各々氷上で）超音波処理した。溶解物を、１４，０００×ｇにおいて１０分間、４℃で遠心分離することによって清澄にした。タンパク質濃度を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。２５μｇの全タンパク質を、４〜１２％勾配Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質を、０．４５μｍ  ＰＶＤＦ  ＩＭＭＯＢＩＬＯＮ−ＦＬ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に、ＸＣＥＬＬ転写システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して転写した。プローブするために使用した一次抗体を、以下に列挙する。適切なＩＲＤｙｅ蛍光標識二次抗体を、１：５０００の希釈率においてＯＤＹＳＳＥＹ（登録商標）  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｍａｇｅｒで、標準的な製造業者のプロトコル（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用して検出のために使用した。バンドを、Ｏｄｙｓｓｅｙ画像化ソフトウェアバージョン３．０．３０を使用して定量した。
【０１４０】
一次抗体：  ＥＧＦＲ  １：１０００希釈（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＃４４０５）、ＦＲＺＤ２  １：５００希釈（Ａｂｃａｍ，  ＃５２５６５）、ＩＲＳ１  １：１０００希釈（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＃３４０７）、ＩＴＧＡ６  １：１０００希釈（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＃３７５０）、ＩＧＦ１Ｒ  １：１０００希釈（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＃３０１８）、ＭＥＴ  １：１０００希釈（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＃８１９８）、Ｐａｎ−ＡＫＴ  １：１０００希釈（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＃２９２０）、ｐｉ−ＡＫＴ  Ｓｅｒ４７３  １：１０００希釈（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＃４０６０）、Ｓｒｃ  １：１０００希釈（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＃２１１０）、ｐｉ−Ｓｒｃ  Ｔｙｒ４１６  １：１０００希釈（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＃２１０１）、Ｓｔａｔ３  １：１０００希釈（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＃９１３９）、ｐｉ−Ｓｔａｔ３  Ｓｅｒ７２７  １：１０００希釈（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ＃９１３４）。
【０１４１】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ：    Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの後ろにクローニングした、ＥＧＦＲ、ＩＧＦ１Ｒ、ＭＥＴ、およびＩＲＳ１の野生型または変異体３’  ＵＴＲをコードするベクターを、Ｓｗｉｔｃｈｇｅａｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓから購入した。細胞を、白色底の９６ウェルプレートにおいて１×１０４／ウェルで播種した。翌日に、１００ｎｇのベクターおよび１５ｎＭのマイクロＲＮＡミミックを、０．２μＬのＤｈａｒｍａＦＥＣＴＴＭ  Ｄｕｏトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して共トランスフェクトした。細胞を、４８時間インキュベートした。細胞数の正規化のために、１００μＬのＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＦＬＵＯＲ細胞生存性アッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、細胞を３０分間、３７℃でインキュベートした。蛍光を、５０５ｎｍにおいて細胞生存性を評価するために読み取った。ルシフェラーゼ活性を、Ｒｅｎｉｌｌａ−Ｇｌｏ（登録商標）  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して製造業者の指示に従って検出した。相対的ルシフェラーゼ活性を、各ウェルの蛍光生存性読み取りに対して正規化した。全ての測定値は、各実験条件において６つの複製の平均を表す。
【０１４２】
ＸＴＴ増殖アッセイ：    細胞を、９６ウェルプレートにおいて２×１０３細胞／ウェルで播種し、１５ｎＭ  オリゴヌクレオチドで４８時間、上記に記載されるように０．１５μＬのＲＮＡｉＭＡＸとともに逆トランスフェクトした。トランスフェクションの後に、２００μＬのコントロールまたは２μＭ  シスプラチンを含む培地を、細胞上に３時間置いた。細胞を、温かい培地で洗浄し、次いで、新鮮な培地を添加した。細胞増殖を、示された日数で、３’−［１−（フェニルアミノカルボニル）−３，４−テトラゾリウム]−ビス（４−メトキシ−６−ニトロ）ベンゼンスルホン酸ナトリウム水和物（ＸＴＴ）  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて製造業者の指示に従ってアッセイした。ＸＴＴアッセイ試薬を、アッセイ前に４時間添加した。各時点で、吸光度を４５０ｎｍおよび６５５ｎｍで読み取り、Δ吸光度を計算した。全ての時点は、各実験条件における６回の反復の平均を表す。
【０１４３】
移動アッセイ：    細胞を、６ウェルプレートにおいて４×１０５細胞／ウェルで播種し、１５μＭ  オリゴヌクレオチドで４８時間、上記で記載されるように逆トランスフェクトした。トランスフェクションの後に、培地を交換し、ｐ１０００ピペットチップを用いて各ウェルの横方向および縦方向に、細胞がないスクラッチを作製した。各スクラッチにおいて４つの印を付けた位置を、１００×倍率で種々の時点で画像化した。そのスクラッチの領域を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して決定し（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：９７１−６７５，  ２０１２）、その空の領域への経時的な移動のパーセントを、計算した。
【０１４４】
ＭＡＴＲＩＧＥＬ侵入アッセイ：    細胞を、６ウェルプレートに播種し、１５ｎＭ  オリゴヌクレオチドで４８時間、上記のようにＲＮＡｉＭＡＸとともに逆トランスフェクトした。トランスフェクションの後に、細胞をトリプシン処理し、添加物なしのＤＭＥＭ中に懸濁した。ＢｉｏＣｏａｔＴＭ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒｓを、製造業者の指示（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に従って調製した。５×１０４細胞を、各チャンバの上側に置いた。チャンバの底側を、ＤＭＥＭ中の化学誘因物質として１００ｎｇ／ｍＬ  ｒＥＧＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含むウェルの中に置いた。チャンバを２４時間、３７℃においてインキュベートした。侵入していない細胞を、侵入膜の上側をこすり取ることによって除去し、侵入している細胞を、メタノール中の０．０５％  クリスタルバイオレット溶液で１分間染色した（Ｓｉｇｍａ）。侵入膜をスライドカラスにマウントし、侵入している細胞を１００×倍率でカウントした。
【０１４５】
コロニー形成アッセイ：    細胞を、６ウェルプレートに播種し、１５ｎＭ  オリゴヌクレオチドで４８時間、上記のようにＲＮＡｉＭＡＸとともに逆トランスフェクトした。トランスフェクションの後に、細胞をトリプシン処理し、種々の密度で６ウェルプレートに再プレートした。細胞を、１１日間インキュベートし、次いで、０．１％  クリスタルバイオレット／メタノール溶液で染色した。＞５０細胞を有するコロニーを３連のウェルにおいてカウントし、生存する細胞の割合を計算した。
【０１４６】
抗トランスフェリンレセプター１本鎖抗体フラグメントを有するｍｉＲ３０ａナノ粒子の開発：    ナノ粒子インビボ送達を試験する蛍光ｓｉＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成され、リポソームへのオリゴヌクレオチドの製剤化を、以前に記載されるように行った（Ｐｉｒｏｌｌｏら，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １７：１１７−１２４，  ２００６；  Ｐｉｒｏｌｌｏら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６７：２９３８−２９４３，  ２００７；  Ｙｕら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２：ｅ４８，  ２００４）。簡潔には、１：１モル比の、各１本鎖アンチセンスおよびコグネートセンスオリゴヌクレオチドをアニールした。カチオン性リポソーム（ジオレオイルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＤＯＴＡＰ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ａｌａｂａｓｔｅｒ，  ＡＬ）を、１：１モル比においてエタノール注射法によって調製した（Ｘｕら，  Ｎｏｌ．  Ｍｅｄ．  ７：７２３−７３４，  ２００１）。抗トランスフェリンレセプター１本鎖抗体フラグメント（ＴｆＲｓｃＦｖ）を、１：３０（ｗ／ｗ）という以前に確立した比においてリポソームと混合した（Ｙｕら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２：ｅ４８，  ２００４）。そのｍｉＲＮＡ分子をその後、１μｇ  ｓｉＲＮＡ  対  ７ｎｍｏｌ  リポソームの比の混合物へと添加し、続いて、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ３０００  ＨＳ  （Ｍａｌｖｅｒｎ，  Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，  ＵＫ）での動的光散乱によって最終のイムノリポソーム製剤のナノサイズ粒子分布のサイズ分けおよび確認を行った。ｍｉＲ−３０ａミミックオリゴヌクレオチドとガイド鎖配列５’−ＵＧＵＡＡＡＣＡＵＣＣＵＣＧＡＣＵＧＧＡＡＧＣＵ−３’（配列番号１）およびパッセンジャー鎖配列５’−ＡＧＣＵＵＣＣＡＧＵＣＧＧＡＵＧＵＵＵＡＣＡＣＧ−３’（配列番号７２）は、Ｔｒｉｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成された。アニーリング後に、上記ミミックを上記のように製剤化した。複合体化したｍｉＲ３０ａミミックを、ｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬと称する。
【０１４７】
インビボ腫瘍標的化および成長アッセイ：    全ての動物実験を、ＮＩＤＣＤの動物実験委員会が承認したプロトコルの下で行い、全米研究評議会の実験動物の管理と使用に関する指針（１９９６）に従った。６〜８週齢の無胸腺ｎｕ／ｎｕ雌性マウス（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒ，  ＮＣＩから得た）の右脚に、１００μＬの３０％  Ｔｙｐｅ  ３  ＢＭＥ  Ｃｕｌｔｒｅｘ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）／ＭＥＭ培地中の２×１０６  ＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍が一旦約１００ｍｍ３に達した後（注射のおよそ１週間後）、マウスを処置（各々ｎ＝４〜５マウス）；コントロールおよびｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬのために４群に無作為化した。３ｍｇ／ｋｇ  ｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬの９用量を、月曜日、水曜日、および金曜日（ＭＷＦ）に３週間にわたって、合計９用量、尾静脈注射によって投与した。腫瘍サイズを、外部キャリパーでＭＷＦに測定し、容積を式Ｖ＝１／２  Ｌ＊Ｗ２で計算した。腫瘍成長を、平均容積と平均の標準誤差として報告する。カプラン−マイヤー生存分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウェア（ｖ６．０５）で行った。生存統計をログランク（マンテル−コックス）検定を使用して行い、ハザード比を、ログランク検定を介して計算した。
【０１４８】
免疫蛍光：    新鮮な腫瘍を、ＯＣＴの中に包埋し、次いで、ドライアイス上で急速凍結した。腫瘍組織を、５μｍ切片へと切り出した。切片を、７分間、−２０℃において氷冷メタノール（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）中で固定した。次いで、サンプルを３回ＰＢＳで洗浄した。切片を、室温において１時間、ブロッキング溶液１（１×ＰＢＳ中に３％  ＢＳＡ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）とともに加湿チャンバ中でインキュベートし、続いて、ブロッキング溶液２（１×ＰＢＳ中に１０％  ＮＧＳ）とともに１時間インキュベートすることによって、ブロッキングした。次いで、切片を、希釈溶液（１×ＰＢＳ中に１％  ＢＳＡ＋０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で希釈した一次抗体とともに一晩４℃において加湿チャンバ中でインキュベートした。細胞を１×ＰＢＳで５回洗浄した後、そのスライドを、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）を有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤で暗所中マウントした。サンプルを、ＬＳＭ  ７８０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ，  Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，  ＮＹ）で分析した。共焦点データを、Ｚｅｎ  ２０１２  ＳＰ１（ブラックエディション）ソフトウェアを使用して分析し、色の強度の程度を、Ｚｅｎ  ２０１２（ブルーエディション）ソフトウェアを使用して確かめた。
【０１４９】
実施例２
ＨＮＳＣＣ組織におけるｍｉＲ−３０ファミリーメンバーの減少した発現
ＨＮＳＣＣ組織において差次的に発現されるｍｉＲＮＡ（ｍｉＲｓ）を調べるために、２７９のＨＮＳＣＣとＴＣＧＡ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  ２０１５）によって公開された１６の粘膜扁平上皮コントロール標本のｍｉＲ配列決定データを、分析した。腫瘍標本と粘膜標本との間の差次的発現分析を介して、１２９のｍｉＲ（７７の増加したｍｉＲおよび５３の減少したｍｉＲを含む（ＦＤＲ＜０．２；表３、図１；図２Ａおよび２Ｂ））を同定した。これらの観察を、口腔由来の１３のＨＮＳＣＣ標本およびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎからの９個のマッチした粘膜サンプルの独立したパネルのｍｉＲ配列決定および発現分析によって検証した（表４）。両方のデータセットにおいて有意に変化しかつ検証されたｍｉＲのペアワイズ比較は、ｍｉＲ−３０ファミリーのいくつかのメンバーおよび以前の研究において同定されたいくつかのｍｉＲの減少した発現を明らかにした（図２Ｃおよび図２Ｄ；表３および表４）。顕著なことには、ｍｉＲ−３０−５ｐファミリーメンバーは、両方のコホートにおいて標本のうちの＞７０％にわたって少なくとも２倍の発現の減少を示した。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【０１５０】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【０１５１】
実施例３
ｍｉＲ−３０ファミリーメンバーは、ＨＮＳＣＣ増殖を阻害する
【０１５２】
独立した機能的ゲノミクススクリーニングを、７８１のｍｉＲのライブラリーをヒトＨＮＳＣＣ株ＵＭ−ＳＣＣ−１へとトランスフェクトした後に行って、増殖を阻害した候補ｍｉＲを同定した（表５）。疾患生物学に対する関連性を有するｍｉＲに関するスクリーニングヒットを豊富にするために、高い抗増殖活性（ＭＡＤスコア＜−１）を示したｍｉＲを、ＴＣＧＡおよびＵＭＳＣ両方の検証データベースにおける配列プロファイリングによって低下した発現をも示したｍｉＲに対してフィルタリングした（図３Ａおよび３Ｂ）。腫瘍標本において減少した発現を有する９個のｍｉＲを同定した。これは、機能的ゲノムスクリーニングの間に再発現された場合に、有意な阻害活性を示した（図３Ｃ）。顕著なことには、ｍｉＲ−３０−５ｐファミリーのいくつかのメンバーは、ｍｉＲのこの高度に選択されたクラスの中で再び存在し、これは、ＨＮＳＣＣにおけるｍｉＲ−３０−５ｐファミリーメンバーの生物学的および機能的重要性を裏付ける。これらの中で、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐおよびｍｉＲ−３０ｅ−５ｐは、粘膜サンプルの中で最も高度に発現され、腫瘍標本にわたって減少していた（図３Ｄ）。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【０１５３】
実施例４
ｍｉＲＮＡの逆に発現された標的および成長促進シグナル伝達および転移性ｍＲＮＡの相関
【０１５４】
ＨＮＳＣＣにおいていくつかのｍｉＲＮＡによって制御される標的ｍＲＮＡのネットワークおよび根底にあるそれらの潜在的機能を同定するために、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−２０５−５ｐ、およびｍｉＲ−３７５の低下した発現を、各々、がんにおいて潜在的に生物学的に重要なｍＲＮＡとの逆相関に関して分析した。線形回帰分析を、各ｍｉＲＮＡと、ＴＣＧＡデータセットにおける２７９個のＨＮＳＣＣ腫瘍標本に対して行ったＲＮＡ−ｓｅｑから得たゲノムワイドｍＲＮＡ発現レベルとの間で行った。その結果を、表６〜１４に示す。
【０１５５】
例として、９１個のｍＲＮＡは、ＦＤＲ≦０．０５を使用してｍｉＲ−３０ａに対して逆に発現されるとして検出され、かつまたＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）マイクロＲＮＡ標的フィルタに基づいて３’  ＵＴＲにおけるｍｉＲ−３０ａ−５ｐの推定または検証された結合部位を含んでいた（表６）。ｍｉＲ−３０ａ−５ｐといくつかの代表的な標的遺伝子の有意な反相関を、図４に示す。ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ発現は、ＨＮＳＣＣにおいて過剰発現されることが以前に示されたいくつかのがん遺伝子（ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＩＴＧＡ６およびＳＥＲＰＩＮＥ１が挙げられる）に対する逆関係を示した（図４）（Ｖａｎ  Ｗａｅｓら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５５：５４３４−５４４４，  １９９５；  Ｖａｎ  Ｗａｅｓら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｐｈｙｓ．  ７７：４４７−４５４，  ２０１０；  Ｆｒｅｕｄｌｓｐｅｒｇｅｒら，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｔａｒｇｅｔｓ  １５：６３−７４，  ２０１１）。
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【０１５６】
【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【０１５７】
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【０１５８】
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【０１５９】
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【０１６０】
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【０１６１】
【表１２−１】
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【表１２−２】
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【０１６２】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【表１３−５】
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【表１３−６】
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【表１３−７】
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【表１３−８】
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【表１３−９】
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【表１３−１０】
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【表１３−１１】
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【表１３−１２】
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【表１３−１３】
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【表１３−１４】
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【表１３−１５】
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【表１３−１６】
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【表１３−１７】
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【表１３−１８】
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【表１３−１９】
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【０１６３】
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【表１４−５】
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【表１４−６】
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【表１４−７】
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【０１６４】
ＩＰＡによる逆に発現された標的遺伝子の機能的経路分析は、上位のがん疾患機能のうちの２つ（細胞増殖（２１個のｍＲＮＡ、ｐ＝８．９５×１０−１０）および転移（２３個のｍＲＮＡ、ｐ＝９．５４×１０−１２）を含む）を同定した（表１５）。これらのネットワークは、がん成長（ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＰＤＧＦＲＢ、ＩＲＳ１、ＳＯＣＳ１、ＣＣＮＡ１）、接着、移動および侵入（ＭＥＴ、ＩＴＧＡ６、ＮＴ５Ｅ、ＳＥＲＰＩＮＥ１）、ならびに分化（ＷＮＴ７Ｂ／５Ａ、ＦＺＤ２、ＣＥＬＳＲ３、ＣＴＨＲＣ１）に決定的に関わる分子の多様なレパートリーを有する。上記遺伝子のうちの大部分は、ｍｉＲ−３０の新規な標的であり、機能的特徴づけによっては以前に検証されていない。
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【０１６５】
逆に発現されたｍＲＮＡの制御を検証するために、ＨＮＳＣＣ株ＵＭ−ＳＣＣ−４６（これは、相対的に低下したｍｉＲ−３０ａ−５ｐを発現する）において潜在的に標的化されるｍＲＮＡに対する、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ（これは、ＵＭ−ＳＣＣ−４６においてｍｉＲ−３０ｅ−５ｐより高度に発現される（図７Ｃ））または抗ｍｉＲ３０ａの異所性発現の効果を調べた。ｍｉＲ−３０ａ−５ｐの発現後に、ｍＲＮＡ発現の低下が、ｑＲＴ−ＰＣＲによって１１の選択されたｍＲＮＡに関して観察された一方で、抗ｍｉＲ３０ａの発現は、これらの標的遺伝子発現を抑制しなかったか、または増加させた（図５）。バイオインフォマティクス分析および実験データの両方が、ＨＮＳＣＣの病理に関わるいくつかの標的遺伝子に対するｍｉＲ３０ａの抑制機能の仮説を裏付ける。
【０１６６】
実施例５
標的遺伝子発現のｍｉＲ−３０ａ−５ｐ直接的制御の機能的検証
ｍｉＲ−３０−５ｐファミリーメンバーによる選択された標的遺伝子の直接的制御をさらに検証するために、ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＩＧＦ１ＲおよびＩＲＳ−１の３’  ＵＴＲを含むルシフェラーゼ構築物（これは、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐに対する標的結合部位を含む）を利用した（図６Ａ）。ｍｉＲ−３０ａ−５ｐのシード配列に相補的な結合部位に欠失を有するベクターも、構築した（図６Ａ）。ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ（しかし抗ｍｉＲ３０ａではない）は、レポーター活性を抑制し、これは、ΔｍｉＲ−３０部位欠失によって排除された（図６Ｂ）。成長シグナル伝達（ＥＧＦＲ、ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＲＳ１）、接着（ＩＴＧＡ６）および分化（ＦＺＤ２）に関わるいくつかの分子の発現に対する効果をまた、ウェスタンブロットによって確認した（図６Ｃおよび６Ｅ）。これら成長因子レセプターは、いくつかの発がんシグナル伝達経路を刺激するので、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ−ＡＫＴ（Ｆｒｅｕｄｌｓｐｅｒｇｅｒら，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｔａｒｇｅｔｓ  １５：６３−７４，  ２０１１）、ＳＲＣ（Ｅｇｌｏｆｆら，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  ３５：２８６−２９７，  ２００８）、およびＳＴＡＴ３シグナル伝達（Ｍａｌｉ，  Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．  ５１：５６５−５６９，  ２０１５）へのシグナルリン酸化に対するｍｉＲ３０ａ−５ｐの機能的効果を調べた。ｍｉＲ−３０ａ−５ｐは、これらのシグナル伝達分子の下流のリン酸化を減少させた（図６Ｄ）。これらのデータは、ＨＮＳＣＣの悪性表現型において過剰発現され、これに関わる生物学的標的に対してｍｉＲ−３０ａ−５ｐの直接的な制御効果を示す。
【０１６７】
実施例６
ｍｉＲ−３０ａは、ＨＮＳＣＣ細胞による細胞増殖、運動性および侵入性を阻害する
複数のｍｉＲ−３０ａ標的は、細胞成長をモジュレートし得るので、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐの抗増殖効果を、１１種のＨＮＳＣＣ細胞株のパネルにおいて確認した。４種の細胞株（ＵＭ−ＳＣＣ−１１Ａ、１１Ｂ、４６、４７）は、コントロールと比較した場合、＜５０％の有意に減少した細胞密度を示し（図７Ａ）、このことは、これらの細胞株におけるｍｉＲ−３０ａ−５ｐの低い発現と一致した（図７Ｂ）。しかし、成長阻害はＨＯＫ細胞において観察されなかった。ＵＭ−ＳＣＣ−１およびＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞におけるｍｉＲ−３０ａ−５ｐおよびｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ発現の基底レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した（図７Ｃ）。増殖を、ＸＴＴアッセイによってＵＭ−ＳＣＣ−１またはＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞においても測定した。類似の増殖阻害が、ファミリーメンバー間で観察された（図７Ｄ）。
【０１６８】
ｍｉＲ−３０ａ−５ｐはまた、ＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞において＞５０％コロニー形成を抑制した（図７Ｅおよび図７Ｈ）。成長シグナル伝達は、治療抵抗性を媒介し得るので、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐがシスプラチン（ＨＮＳＣＣを処置するために使用される最も一般的な化学療法薬）の効果を増大させ得るかどうかを調べた。シスプラチンに対する感受性は、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐの異所性発現によって増強された（図７Ｆおよび図７Ｉ）。ｍｉＲ−３０ａの抗増殖効果におけるＥＧＦＲの重要性を試験するために、ＥＧＦＲコード配列を、ＵＭ−ＳＣＣ−４６においてその制御性３’ＵＴＲなしで過剰発現するＵＭ−ＳＣＣ−４６の安定な細胞株を作製した。この細胞株は、増殖に対するｍｉＲ−３０ａ−５ｐの効果において有意な低下を示した（図７Ｇ）。
【０１６９】
ＨＮＳＣＣにおけるｍｉＲ−３０−５ｐファミリー標的のうちのいくつかは、ＥＧＦＲ（Ｆｒｅｕｄｌｓｐｅｒｇｅｒら，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｔｈｅｒ．  Ｔａｒｇｅｔｓ  １５：６３−７４，  ２０１１）、ＭＥＴ（Ｄｏｎｇら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１：５９１１−５９１８，  ２００１）、ＩＴＧＡ６（Ｃａｒｅｙら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｕｐｐｌ．  １７Ｆ：２２３−２３２，  １９９３）、およびＳｅｒｐｉｎｅ１（Ｋａｒｂｉｅｎｅｒら，  ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．  ８：８５０−８６０，  ２０１１）を含め、細胞運動性および侵入性にも関わっていた。ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−５ｐの異所性発現は、２種のＨＮＳＣＣ細胞株の移動アッセイにおいて細胞運動性を有意に遅らせ（図８Ａおよび図８Ｂ）、ＭＡＴＲＩＧＥＬ被覆トランスウェル移動アッセイにおいてＥＧＦ刺激性侵入性を有意に低下させた（図８Ｃおよび図８Ｄ）。まとめると、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐの増加した発現は、ＨＮＳＣＣにおいて細胞増殖、コロニー形成、移動、および侵入性を有意に阻害し、ならびに化学療法感受性（chemosensitivity）を有意に増強した。
【０１７０】
実施例７
ｍｉＲ−３０ａミミックは、ヒトＨＮＳＣＣ異種移植片の腫瘍成長を抑制する
ｍｉＲ−３０ａ−５ｐミミックを、送達のために、腫瘍細胞上に過剰発現されたトランスフェリンレセプターを標的とする、１本鎖抗体フラグメント（ＴｆＲｓｃＦｖ）を有するカチオン性リポソームナノ送達システム（ｓｃＬ）へと製剤化した（Ｐｉｒｏｌｌｏら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６８：１２４７−１２５０，  ２００８；  Ｐｉｒｏｌｌｏら，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １７：１１７−１２４，  ２００６）。ＦＩＴＣ結合体化コントロールオリゴヌクレオチドを含むｓｃＬキャリアは、肺または肝臓と比較した場合に、ＨＮＳＣＣ異種移植片において優先的な取り込みを受けるか、または腎臓を介して排出される（図９Ａ）。改変ｍｉＲ−３０ａ−５ｐミミックと複合体化したナノリポソーム粒子（ｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬ）またはコントロールｍｉＲ（６０μｇまたは約３ｍｇ／ｋｇ）を、月曜日、水曜日、および金曜日（ＭＷＦ）に３週間にわたって静脈内（ＩＶ）に９用量で与え、ＵＭ−ＳＣＣ−４６異種移植片腫瘍を担持するマウスにおいて試験した。有意な腫瘍成長遅延および生存の長期化が、ｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬ処置で観察された（図９Ｂ〜Ｄ）。ｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬでの処置は、体重の有意な低下を引き起こさず、その処置が十分に許容されたことが示唆された（図９Ｃ）。インビボでの腫瘍成長に対する類似の阻害効果は、第２のＨＮＳＣＣ異種移植片モデル、ＵＭ−ＳＣＣ４７（これは、ＨＰＶ陽性である）において観察された（図９Ｅ）。
【０１７１】
６種のｍｉＲ−３０ａ−５ｐ標的遺伝子の定量的ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、実質的に減少した遺伝子発現が、ｍｉＲ−３０ａ−ｓｃＬナノ粒子の４用量による処置後に観察された（図１０Ａおよび図１０Ｆ）。免疫蛍光染色によるＥＧＦＲおよびＭＥＴの減少した発現はまた、インビボでの処置後の異種移植片腫瘍から採取した凍結切片において観察された（図１０Ｂおよび図１０Ｃ）。ｍｉＲ−３０ａ−５ｐのいくつかの標的遺伝子をインビトロおよびインビボ両方での確認により、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓによって推定されるとおりの増殖および移動に関して報告された相互作用および機能を結びつける経路ダイヤグラムが構築された（図１０Ｄ）。ｍｉＲ−３０ａ−５ｐファミリーの抗増殖効果を確認したところ、ｋｉ−６７染色の減少もまた観察された（図１０Ｅ）。
【０１７２】
実施例８
ＨＮＳＣＣの臨床上の特徴と関連するｍｉＲ−３０ファミリーメンバーの遺伝的変化
ｍｉＲ−３０ファミリーメンバーの発現の喪失がＨＮＳＣＣの病因において重要である場合、そこには、ゲノムレベルでの欠失または後生的なサイレンシングに対する選択圧があり得る。この疑問に対処するために、ＨＮＳＣＣ  ＴＣＧＡデータセットからのｍｉＲ−３０ファミリーメンバーのコピー数多型を分析した（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。ＭＩＲ３０ＡおよびＭＩＲ３０Ｃ２遺伝子は、染色体６上で一緒にクラスター化され、ＭＩＲ３０ＥおよびＭＩＲ３０Ｃ１遺伝子は、染色体１上で一緒にクラスター化され、ここでこれらの遺伝子座においてそれぞれ１９．７％および１４．７％が、少なくともヘテロ接合性喪失を示す。統合分析は、ｍｉＲ−３０ａ（ｐ＝０．１５、図１１Ａおよび図１１Ｃ）およびｍｉＲ−３０ｅ（ｐ＝０．０００６、図１１Ｂおよび図１１Ｄ）に関して、ヘテロ接合性コピー数喪失と発現の減少との傾向または有意な相関を裏付けた。本発明者らはさらに、観察されるｍｉＲ−３０ａ／ｅのより広く減少した発現が、推定プロモーターのメチル化と関連するかどうかを分析し、平均ＤＮＡメチル化を、ＭＩＲ３０Ａ／Ｃ２プロモーターおよびコード領域とともに比較した（表１６）。ＭＩＲ３０ＡプロモーターのＤＮＡメチル化の増加と、腫瘍標本のサブセットにおけるより低下した発現との間に、相関が観察された（ｐ＝０．０００５７、図１１Ｃおよび図１１Ｆ）。
【０１７３】
口腔腫瘍（ｎ＝８７）の高いパーセンテージは、低下したｍｉＲ−３０ａ−５ｐ発現を示し、スピアマンの相関検定によって、ＭＩＲ３０ＡプロモーターにおけるＣＰＺＧ部位のＭＩＲ３０Ａ過剰メチル化と有意に相関した（ｐ値  ６．１５Ｅ−０７、図１１Ｃおよび図１１Ｆ；表１７）。ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐの低下した発現は、ＨＰＶ陰性状態と相関した。さらに、喉頭部位において起こる腫瘍は、低下したｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ発現およびＭＩＲ３０Ｅコピー数欠失と有意に相関した（図１１Ｅおよび表１７）。
【表１６−１】
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【表１６−２】
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【０１７４】
【表１７】
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【０１７５】
ＨＰＶ＋および口腔咽頭がんの予後は、ＨＰＶ−および喉頭ＨＮＳＣＣよりよいので、ｍｉＲ−３０ａ／ｅ発現と予後における差異との関連を、調べた。ｍｉＲ−３０ｅのより低い発現は、より低い全生存と有意に相関し（図１２Ａ、左パネル）、ＨＰＶ−腫瘍との関連と一致した。低下した生存に向かう傾向はまた、ＭＩＲ３０Ｅ遺伝子座のコピー数喪失を示した患者のサブセットにおいて観察された。これは、腫瘍のサブセットにおいて減少したｍｉＲ３０ｅ発現へのゲノムコピー変化の寄与を裏付ける（図１２Ａ、中央パネル）。驚くべきことに、腫瘍亜部位に関する生存分析は、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐの低発現が、口腔咽頭癌（図１２Ａ、右パネル）（口腔咽頭癌は、大部分はＨＰＶ＋であり、これに関してより悪い予後および治療標的と関連するゲノム変化が十分に規定されていない）における最悪の予後と関連することを明らかにした。このデータセットは、低ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ発現と、不十分な疾患特異的生存（ｐ値  ０．０２４、図１１Ｇ）との間の強い相関およびｍｉＲ−３０ｅ−５ｐに関して類似の傾向（ｐ値  ０．１１３、図１１Ｈ）を示した。これらのデータは、低下したｍｉＲ−３０ａ／ｅ発現が、ＨＮＳＣＣにおける遺伝的変化または後生的な変化、ＨＮＳＣＣ腫瘍亜部位、ＨＰＶ状態、および臨床的に関連する予後と関連することを示唆する。さらに、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐおよびｍｉＲ−２６ｂ−５ｐの低い発現は、低い全生存と相関した（図１２Ｂ）。
【０１７６】
実施例９
がん細胞株におけるｍｉＲ−３０ａの抗増殖活性
がんのさらなるタイプの増殖に対するｍｉＲ−３０ａの効果を、ＭＥ１８０（子宮頸部扁平上皮癌）、ＨｅＬａ（子宮頚部腺癌）、ＨＣＴ１１６（結腸直腸癌）、ＤＵ−１４５（前立腺癌）、ＰＣ３（前立腺癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳房腺癌）、およびＰａｎｃ１（膵臓癌）細胞株に対して試験した。細胞を、９６ウェルプレートにおいて２×１０３  細胞／ウェルで播種し、１５ｎＭ  ｍｉＲ−３０ａ二重鎖で４８時間、０．１５μｌのＲＮＡｉＭＡＸとともに逆トランスフェクトした。トランスフェクションの後に、培地を交換し、細胞を５日間インキュベートした。インキュベーションの後に、細胞生存性を、ＸＴＴアッセイによって測定した。ｍｉＲ−３０ａは、全ての試験した細胞株において細胞生存性を減少させた（図１３）。
【０１７７】
実施例１０
改変ｍｉＲ−３０ａ  ｍｉＲＮＡ
いくつかの改変された前駆体ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａミミックおよび／またはミメティックの設計および合成を行った。例示的な改変ｍｉＲ−３０ａ核酸を、表１８に示す。
【０１７８】
パッセンジャー鎖の塩基１、６、および２０を変異させて、得られる二重鎖の安定性を増加させた。ＲＩＳＣによるガイド鎖に対する鎖選択を偏らせるために、２塩基のオーバーハングを、パッセンジャー鎖の３’末端に配置した。鎖選択をさらに偏らせるために、パッセンジャー鎖の５’末端における５’アミノＣ６改変もまた、試験した。オリゴヌクレオチドにおける個々の核酸の２’位の改変が相補鎖に対する親和性を改善し得、そしてヌクレアーゼに対する抵抗性をも付与し得ることは、公知である。しかし、これらの改変がマイクロＲＮＡ機能に対してどんな効果を有するかは、未知である。これを試験するために、パッセンジャー鎖の末端において３塩基の２’改変を含むオリゴヌクレオチド（パッセンジャー鎖７）を合成した。７位と１８位との間の連続する塩基もまた、別個のオリゴヌクレオチドにおいて改変した（ガイド鎖１〜５）。それらの鎖をハイブリダイズさせて、５ｐ鎖の成熟を偏らせ得るｍｉＲ−３０ａの６種の異なる二重鎖ミミックを作製した。
【０１７９】
活性に対する鎖の長さの効果もまた、試験した。ガイド鎖１１（これは、２塩基短いが、ガイド鎖５と同じ塩基の２’改変を有する）およびパッセンジャー鎖１２（これも、パッセンジャー鎖６より２塩基短いが、オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端において３塩基の２’改変をなお含む）を合成した。全ての鎖を組み合わせて、６種の新しいミミックを作製した（０１０〜０１５）。
【表１８】
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【０１８０】
細胞生存性を、改変ｍｉＲ−３０ａミミックでトランスフェクトしたＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞において評価した。ＵＭＳＣＣ−４６細胞を、９６ウェルプレートにおいて２×１０３細胞／ウェルで播種し、１５ｎＭ  二重鎖で４８時間、０．１５μＬのＲＮＡｉＭＡＸとともに逆トランスフェクトした。トランスフェクションの後に、培地を交換し、細胞を５日間インキュベートした。インキュベーションの後に、細胞生存性をＸＴＴアッセイによって測定した。データは、６回の反復の平均を表す。Ｍ−ｍｉＲ３０ａ−００６（Ｇ５＋Ｐ７）、Ｍ−ｍｉＲ３０ａ−０１４（Ｇ１１＋Ｐ１２）、およびＭ−ｍｉＲ−３０ａ−０１６（Ｇ１１＋Ｐ１４）は、細胞生存性に対して最大の効果を有した（表１９）。
【表１９】
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【０１８１】
Ｍ−ｍｉＲ３０ａ−００６オリゴヌクレオチドもまた、ＵＭＳＣＣ−４６異種移植片腫瘍のマウスモデルにおいて試験した。ＵＭＳＣＣ−４６異種移植片腫瘍約１００ｍｍ３を有するマウスに、６０μｇ（約３ｍｇ／ｋｇ）の複合体化ｍｉＲ−３０ａミミックまたはコントロールビヒクルの９用量を、ＭＷＦで３週間にわたってＩＶ注射した。マウスを、２４日目に１０×２Ｇｙの割合の放射線療法で毎日（合計２０Ｇｙ）処置した（図１４Ａ〜１４Ｂ）。
【０１８２】
実施例１１
細胞増殖に対する組み合わせｍｉＲＮＡ処置の効果
細胞生存性を、４種のｍｉＲＮＡ−  Ｍ−ｍｉＲ３０ａ−０１４、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、およびｍｉＲ−３７５の混合物で、７．５ｎＭまたは１５ｎＭの全二重鎖（それぞれ、各二重鎖が１．８７５ｎＭまたは３．７５ｎＭ）でトランスフェクトした９種のＨＮＳＣＣ腫瘍細胞株において評価した。他の実験では、７．５ｎＭまたは１５ｎＭの全二重鎖においてｍｉＲＮＡの対で細胞をトランスフェクトした。細胞を、９６ウェルプレートにおいて１．５〜２×１０３細胞／ウェルで播種し、混合物で４８時間、０．１５μＬのＲＮＡｉＭＡＸとともに逆トランスフェクトした。一晩のトランスフェクションの後に、培地を交換し、細胞を４〜５日間インキュベートした。インキュベーション後、細胞生存性を、実施例１に記載されるようにＸＴＴアッセイによって測定した。
【０１８３】
その４種のｍｉＲＮＡ混合物は、全細胞株において（図１５）、特に、１５ｎＭ濃度において細胞密度を減少させた。同様に、２種のｍｉＲＮＡ組み合わせもまた、細胞密度を減少させた（図１６Ａ〜１６Ｄ）。
【０１８４】
実施例１２
細胞生存性に対するさらなるｍｉＲＮＡの効果
細胞生存性を、ｍｉＲ２７−５ｐまたはｍｉＲ−２ｂ−１−５ｐ二重鎖でトランスフェクトしたＵＭ−ＳＣＣ−１細胞またはＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞において評価した。９６ウェルプレートにおいて、ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞を１．５×１０３細胞／ウェルで播種し、ＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞を２×１０３細胞／ウェルで播種し、７．５ｎＭまたは１５ｎＭの二重鎖で４８時間、０．１５μＬのＲＮＡｉＭＡＸとともに逆トランスフェクトした。トランスフェクションの後に、培地を交換し、細胞を５日間インキュベートした。細胞生存性をＸＴＴアッセイによって測定した。
【０１８５】
ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐおよびｍｉＲ−２９−ｂ−１−５ｐはともに、ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞およびＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞の両方において細胞密度を減少させた（図１７Ａおよび図１７Ｂ）。
【０１８６】
実施例１３
改変ｍｉＲＮＡ
いくつかのｍｉＲミミックおよび／またはミメティックの設計を行った。例示的なｍｉＲミミックおよび／またはミメティックを表２０に示す。
【表２０】
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【０１８７】
実施例１４
頭頚部扁平上皮癌の処置
この実施例は、被験体においてＨＮＳＣＣを処置または阻害するために使用され得る方法を記載する。しかし、当業者は、本明細書中の教示に基づいて、これらの具体的方法から外れた方法がまた、ＨＮＳＣＣを成功裡に処置するために使用され得ることを理解する。当業者はまた、これらの方法がまた、被験体において他のがんを処置または阻害するために使用され得ることを認識する。
【０１８８】
一例において、ＨＮＳＣＣ（または別のタイプの腫瘍）を有する被験体を選択する。いくつかの例では、上記被験体は、ＨＮＳＣＣ腫瘍を有する。他の例では、上記被験体は、１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−３０ａファミリーメンバー、ｍｉＲ−２６ファミリーメンバー、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、およびｍｉＲ−３７５のうちの１種またはこれより多く）の減少した発現を有すると決定されたＨＮＳＣＣ腫瘍を有する。他の例では、上記被験体は、１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡ（例えば、ＭＩＲ３０遺伝子、ＭＩＲ２６遺伝子、ＭＩＲ１４５遺伝子、ＭＩＲ３３８遺伝子、およびＭＩＲ３７５遺伝子のうちの１種またはこれより多く）をコードするＤＮＡにおいて欠失を有する腫瘍を有する。他の例では、上記被験体は、プロモーターの、または１種またはこれより多くのｍｉＲＮＡ（例えば、ＭＩＲ３０遺伝子、ＭＩＲ２６遺伝子、ＭＩＲ１４５遺伝子、ＭＩＲ３３８遺伝子、およびＭＩＲ３７５遺伝子のうちの１種またはこれより多く）をコードするＤＮＡにおいて増加したメチル化を有する腫瘍を有する。
【０１８９】
被験体選択の後に、有効量のｍｉＲＮＡ核酸（例えば、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐまたはそのミミックもしくはミメティック）またはｍｉＲＮＡ核酸の混合物（例えば、ｍｉＲ−３０ａ、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２６ａ、およびｍｉＲ−３７５またはこれらのうちの１種もしくはこれより多くのミミックまたはミメティックの混合物）を、上記被験体に投与する。上記被験体に投与される組成物の量は、処置されている被験体、腫瘍の重篤度（例えば、ＴＮＭステージ）、および組成物の投与様式に依存する。理想的には、有効量のｍｉＲＮＡ（複数可）は、被験体において実質的な細胞傷害性効果を引き起こすことなく被験体においてＨＮＳＣＣの１またはこれより多くの徴候および症状を減少させるために十分な量である。
【０１９０】
いくつかの例では、腫瘍の数および／もしくはサイズ、転移の数および／もしくはサイズの減少、疾患進行の低減（もしくは停止）、生存（例えば、無病生存、無増悪生存、および／もしくは無転移生存）の増加、またはこれらのうちの２種もしくはこれより多くの組み合わせは、その処置の有効性を示す。
【０１９１】
実施例１５
さらなるｍｉＲ−３０ミミックの設計および試験
さらなる改変ｍｉＲ−３０−５ｐガイド鎖およびパッセンジャー鎖を設計した。これを表２１に示す。
【表２１】
2019512489.tif 000080
【０１９２】
細胞生存性を、実施例１１に記載されるように、改変ｍｉＲ−３０ａミミックでトランスフェクトしたＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞において評価した。データは、６回の反復の平均を表す（表２２）。血清中の上記ミミックの安定性を試験した（図１８）。Ｍ−ｍｉＲ３０−０１８およびＭ−ｍｉＲ３０−０１９に組み込まれた化学的改変は、ヒト血清中で＞５０×の増加した安定性とともに、ヌクレアーゼに対する長期の抵抗性を付与した（図１８）。細胞生存性を、実施例１１に記載されるように、その示されたｍｉＲＮＡ二重鎖（７．５ｎＭまたは１５ｎＭの全二重鎖）でトランスフェクトしたＵＭ−ＳＣＣ−４６細胞において評価した（図１９）。Ｍ−ｍｉＲ３０−０１８およびＭ−ｍｉＲ３０−０１９は、生物学的なマイクロＲＮＡを超えて大いに改善されるＭ−００６に等しいがん細胞の増殖を阻害する効力をなお維持した（図１９および表２２）。
【表２２】
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【０１９３】
実施例１６
さらなるｍｉＲミミック
【０１９４】
さらなるｍｉＲミミックおよび／またはミメティックの設計を行った。例示的なｍｉＲミミックおよび／またはミメティックを表２３に示す。
【表２３−１】
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【表２３−２】
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【０１９５】
本開示の原理が適用され得る多くの考えられる実施形態に鑑みて、例証された実施形態が例に過ぎず、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではないことは、認識されるべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の請求項によって定義される。本発明者らは、従って、これらの請求項の範囲および趣旨の範囲内に入る全てを本発明者らの発明として特許請求する。
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
2019512489.tif 000085
【図２Ｃ−Ｄ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４】
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【図５】
2019512489.tif 000090
【図６Ａ】
2019512489.tif 000091
【図６Ｂ】
2019512489.tif 000092
【図６Ｃ−Ｅ】
2019512489.tif 000093
【図７Ａ−Ｂ】
2019512489.tif 000094
【図７Ｃ−Ｄ】
2019512489.tif 000095
【図７Ｅ−Ｇ】
2019512489.tif 000096
【図７Ｈ−Ｉ】
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【図８Ａ−Ｂ】
2019512489.tif 000098
【図８Ｃ−Ｄ】
2019512489.tif 000099
【図９Ａ−Ｂ】
2019512489.tif 000100
【図９Ｃ−Ｅ】
2019512489.tif 000101
【図１０Ａ】
2019512489.tif 000102
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
2019512489.tif 000106
【図１０Ｆ】
2019512489.tif 000107
【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１１Ｅ−Ｆ】
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【図１１Ｇ−Ｈ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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