(57)【要約】【構成】本発明は、一つかそれ以上のスペーサー層および一つかそれ以上の細胞固定化層を有する構造化細胞増殖マトリックスまたは構成体に関する。さらに、本発明はこのマトリックスまたは構成体を有するバイオリアクターを提供するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞が取り付き、増殖する表面を有する一つかそれ以上の細胞固定化層、およびこれら細胞固定化層に隣接配置した、曲がりくねった経路を作り出す構造体を有する一つかそれ以上のスペーサー層を有し、前記細胞固定化層およびスペーサー層両者の表面にそって曲がりくねった経路を細胞および培地が流れ、これら細胞が前記固定化層に効率よく移動し、固定化層内に深く取り付くことを特徴とする細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項２】
前記スペーサー層がメッシュ構造体を有する請求項１に記載の細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項３】
前記スペーサー層のメッシュサイズが０．０５ｍｍ〜５ｍｍである請求項２に記載の細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項４】
前記細胞固定化層が細胞固定化部を定め、そして前記スペーサー層がスペーサー部を定める請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項５】
前記スペーサー部に対する前記固定化部の厚さ比が少なくとも０．１である請求項４に記載の細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項６】
前記スペーサー部の厚さが少なくとも０．１ｍｍ、好ましくは０．１〜５ｍｍである請求項４または５に記載の細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項７】
前記マトリックス構成体が、一つかそれ以上の細胞固定化層、およびこの細胞固定化層に隣接配置した一つかそれ以上のスペーサー層を有する構成体であり、この構成体をコア周囲に螺旋状に、あるいは同心円状に巻き付ける請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項８】
前記細胞固定化層を製織布または不織布から構成する請求項１〜７のいずれか１項に記載の細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項９】
一つかそれ以上のスペーサー部および一つかそれ以上の細胞固定化部を有し、前記スペーサー部が曲がりくねった経路を有する少なくとも一つのスペーサー層を有し、前記細胞固定化部が少なくとも一つの細胞固定化層を有し、前記スペーサー部に対する前記固定化部の厚さ比が少なくとも０．１であり、そして前記スペーサー部の厚さが少なくとも０．１ｍｍであることを特徴とする構造化細胞増殖マトリックス。
【請求項１０】
前記スペーサー層が、細胞および培地が前記スペーサー層および固定化層の表面にそって移動する曲がりくねった開放経路を作り出す請求項９に記載のマトリックス。
【請求項１１】
前記スペーサー層がメッシュ構造体を有する請求項９または１０に記載のマトリックス。
【請求項１２】
前記スペーサー層のメッシュサイズが０．０５ｍｍ〜５ｍｍである請求項１１に記載のマトリックス。
【請求項１３】
前記スペーサー層および／または前記細胞固定化層を生体適合性ポリマーで形成する請求項９〜１２のいずれか１項に記載のマトリックス。
【請求項１４】
前記細胞固定化層が親水性である請求項９〜１３のいずれか１項に記載のマトリックス。
【請求項１５】
前記スペーサー層が疎水性、あるいは親水性である請求項９〜１４のいずれか１項に記載のマトリックス。
【請求項１６】
少なくとも一つのスペーサー層が、少なくとも部分的に細胞固定化層によって覆われていない請求項９〜１５のいずれか１項に記載のマトリックス。
【請求項１７】
製織布または不織布から形成した一つかそれ以上の細胞固定化層、およびこの細胞固定化層に隣接配置する、メッシュ構造体から形成した一つかそれ以上のスペーサー層を有する構成体を有し、この構成体が軸線にそって螺旋状か、あるいは同心円状に巻き付いている細胞増殖マトリックス構成体であって、前記スペーサー層のメッシュサイズが０．０５ｍｍ〜５ｍｍ、前記スペーサー層および固定化層の厚さが０．０５ｍｍ〜３ｍｍであることを特徴とする細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の細胞増殖マトリックス構成体またはマトリックスの細胞増殖への使用。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載のマトリックスを有するバイオリアクター。
【請求項２０】
内側スペースを有し、前記マトリックスがこの内側スペースの少なくとも１０％以上１００％以下を占める請求項１９に記載のバイオリアクター。
【請求項２１】
前記バイオリアクターおよび／または前記マトリックスが使い捨て式である請求項１９または２０に記載のバイオリアクター。
【請求項２２】
細胞が取り付き、増殖する第１表面を有する少なくとも一つの細胞固定化層、およびこの細胞固定化層の前記表面に接触する少なくとも一つのスペーサーを有し、このスペーサーが形成する曲がりくねった経路を前記第１表面にそって細胞および培地が通過することを特徴とする細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項２３】
第１スペーサーまたは第２スペーサーがメッシュまたはベアリング構造体を有する請求項２２に記載の細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項２４】
前記の少なくとも一つのスペーサーを前記の少なくとも一つの細胞固定化層の上に、あるいは下に積層する請求項２３に記載の細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項２５】
前記スペーサーの一端に流入する培地が前記の少なくとも一つのスペーサーの表面に流れるように、前記の少なくとも一つの細胞固定化層にそって垂直方向に前記の少なくとも一つのスペーサーを設ける請求項２２に記載の細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項２６】
前記の少なくとも一つの細胞固定化層が第２表面を有するとともに、さらにこの第２表面に接触する第２スペーサーを有する請求項２２に記載の細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項２７】
前記の少なくとも一つの細胞固定化層の上に、あるいは下に前記第１スペーサーおよび第２スペーサーを積層する請求項２６に記載の細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項２８】
前記スペーサーの一端に流入する培地が前記の少なくとも一つのスペーサーの表面に流れるように、前記の少なくとも一つの細胞固定化層にそって垂直方向に第１スペーサーおよび第２スペーサーを設ける請求項２６に記載の細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項２９】
細胞が取り付き、増殖する表面を有する少なくとも一つの細胞固定化層、および少なくとも一つのスペーサーを有し、細胞および培地がこの表面にそって前記スペーサーの曲がりくねった経路を通過する細胞増殖マトリックス構成体であって、前記の少なくとも一つの固定化層および前記の少なくとも一つのスペーサーを半径方向に交互に配置するように、前記マトリックス構成体が螺旋構成を有することを特徴とする細胞増殖マトリックス構成体。
【請求項３０】
それぞれが細胞に取り付き、増殖する表面を有する少なくとも二つの細胞固定化層、および少なくとも一つのスペーサーを有し、細胞および培地がこの表面にそって前記スペーサーの曲がりくねった経路を通過する細胞増殖マトリックス構成体であって、前記の少なくとも二つの細胞固定化層および前記の少なくとも一つのスペーサーを積層配置することを特徴とする細胞増殖マトリックス構成体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は細胞増殖マトリックス、特に構造化高密度細胞増殖マトリックス（ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ，ｈｉｇｈ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｍａｔｒｉｘ）に関する。さらに、本発明はこのマトリックスを使用して細胞を増殖させること、およびこのマトリックスを有するバイオリアクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞、動物細胞、哺乳動物細胞および／または組織などの細胞を培養する技術は難しくかつ複雑である。というのは、これら細胞は繊細な上に、増殖時に栄養素および酸素を必要とし、これらも複雑であり、しかも維持が難しい。細胞を大量に培養する必要性が増していることを前提にすると、バイオリアクターおよび培養装置は研究上、および活性タンパク質および／または抗体および／または任意の細胞副生物を生成するための細胞生成の点から見て重要なツールになってきている。
【０００３】
従来のバイオリアクターは非構造化細胞増殖マトリックスを有し、細胞培地を循環させるための内部または外部循環機構を備えている。一般に、細胞増殖マトリックスは担体を有している。これら担体のビーズの形態は構造が規則的、あるいは不規則的であり、あるいは細胞増殖に適合するポリマーあるいはその他の物質からなる製織した、あるいは不織のマイクロファイバーで構成することができる。担体は各種の形態および寸法を取ることができる。
【０００４】
公知のバイオリアクターおよびその非構造化細胞増殖マトリックスにはいくつかの問題がある。充填時、移動時や再分配時に培地流れの影響を受けて経時的に増殖マトリックスの体積的な均一性の再現性が失われるため、細胞培養環境を再現できなくなり、またバイオリアクターの異なる部分の微小環境の相違が顕著になる。担体がバイオリアクター内部の所定領域に集まる恐れがあり、それによって細胞培養時の均一性がかなり劣化する。従って、培養された細胞の一部が培地および／または酸素供給源へのアクセスがきわめて限られるか、あるいはアクセスできなくなり、細胞代謝、生成物の質が変化するだけでなく、場合によっては細胞死を招き、細胞生成速度が低下する。さらに、相互に取り付く恐れのある担体の変わりやすいサイズおよび形状を考えると、非均一性のマトリックスは製造が難しく、また充填も困難である。従来の細胞増殖マトリックスの別な問題点は、細胞培地表面を正確に決定できないことにある。最後に、バイオリアクターへの担体の充填作業は手間がかかり、従ってコストが高い。
【０００５】
ＵＳ３，９４８，７３２には、螺旋巻きの管状室部を有する構成体が開示されている。この管状室部を介して培地および細胞が管状室内部および螺旋中心のまわりを移動し、管状室の内壁に取り付く。この構成体はスペーサー部材を有し、管状室部に差し込む離間突出支持部材をスペーサー部材に設ける。これら突出部材があるため、螺旋巻き構成体を軸線方向に横断して流れるガス流れが増加する。いかなる時でもスペーサー部材が管状室内の細胞または細胞培地に接触することはなく、ましてこのスペーサー部材が細胞の移動経路になることはない。
【０００６】
本発明の目的は、上記問題点の少なくとも一部を解消した細胞増殖マトリックスおよびこのマトリックスを有するバイオリアクターを提供することにある。この細胞増殖マトリックスは、培地および細胞が循環した状態で、小さな容積内で大きな細胞増殖面を確保できるため好ましい。システム内の圧力低下については、ある種の細胞生存性に対して逆効果になるため、避ける必要がある。手動操作を維持し、かつコストを最小限に抑制した状態で再現性および均一性を改善する必要がある。スペーサー層については、細胞および細胞培地が移動する曲がりくねった経路が必要であり、スペーサー層および細胞固定化層にそって平行な経路を容易に作り出すことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＵＳ３，９４８，７３２
【発明の概要】
【０００８】
本発明の第１態様は、請求項１、８、１４、２２、２９および３０に記載の細胞増殖マトリックス構成体ないしマトリックス構造体（ｍａｔｒｉｘ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）または構造化細胞増殖マトリックスに関する。
【０００９】
本発明の第２態様は、本発明実施態様の細胞増殖マトリックス構成体またはマトリックスを細胞増殖に適用することに関する。
【００１０】
本発明の第３態様は、本発明実施態様の細胞増殖マトリックス構成体またはマトリックスを有するバイオリアクターに関する。
【００１１】
従来と比較して、本発明の細胞増殖マトリックス構成体またはマトリックスはいくつかの作用効果を有する。構造化構成体を利用することによって、細胞増殖プロセス時の可変性を排除できるか、最小限に抑えることができる。公知細胞培養面および固定化層数のために、細胞培養表面を容易かつ正確に設定できる。バイオリアクター内に設ける細胞培養表面については、マトリックスおよび／またはバイオリアクターの設計を変更することなく容易に採用できる。
【００１２】
本発明マトリックスによってバイオリアクター内部に改良され組織化された細胞流れおよび細胞培地流れを作り出すことができる。
【００１３】
さらに、構造化された細胞増殖マトリックスの場合、バイオリアクター内部に効率よく充填できるため、内側スペースの利用を最適化でき、このバイオリアクター内部に細胞増殖表面を大きく取ることができる。これによって、細胞密度の高い培養表面を確保できる。さらに、マトリックスの構造化設計のために、当該マトリックスを有するバイオリアクターにおける生成を一定した状態で再現性高く実施できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ−Ｂ】本発明の２つの実施態様に従って構成したマトリックス構成体の一部を示す横断面図である。
【図２Ａ−Ｄ】本発明の実施態様に従って構成したマトリックス構成体を例示する非限定的な実施例を示す図である。
【図３Ａ−Ｂ】本発明の一実施態様に従って部分的にロール巻きしたマトリックス構成体、および充填率が高い構成の構成体の一実施態様を示す斜視図および上面図である。
【図３Ｃ】本発明の一実施態様に従って構成した、完全なロール巻き状態のマトリックスを示す上面図である。
【図４Ａ−Ｄ】本発明の一実施態様に従って構成したメッシュスペーサー層構造の実施例を示す図である。
【図５】本発明の一実施態様に従って構成したマトリックス構成体を設けたバイオリアクター室であって、上下間のスペーサー層および固定化層の表面にそって軸線方向に流体および細胞が流れるバイオリアクター室を示す図である。
【図６】本発明の一実施態様に従って構成したマトリックス構成体を設けた回転型バイオリアクターであって、使用時にはその軸線を中心にして回転する回転型バイオリアクターを示す側面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は細胞増殖マトリックス構成体、このマトリックス構成体の細胞増殖への適用、および当該マトリックス構成体を有するバイオリアクターに関する。
【００１６】
特に断らない限り、技術用語や科学用語を始めとする、発明の開示に使用する用語すべては、本発明が属する分野における当業者が通常に理解する意味で使用する。念のために、本発明をよりよく理解してもらうために、いくつかの用語について定義を下しておく。
【００１７】
本明細書に使用する以下の用語は以下の意味をもつ。
【００１８】
本明細書で使用する単数表現については、文脈上明示しない限り、単数および複数表現の両者を指すものとする。例えば、“区画”は一つかそれ以上の区画を意味する。
【００１９】
パラメーター、量、一過性の期間などの測定可能な値を指す用語に使用される“約”については、本発明を好適に実施できる限り、具体的に記載した値の±２０％以下、好ましくは±１０％以下、より好ましくは±５％以下、さらにより好ましくは±１％、さらにより好ましくは±０．１％以下は許容範囲である。なお、修飾語“約”を伴う値についても具体的に開示されたものであると理解されたい。
【００２０】
また、本明細書で使用する“有する”は“含む”、“含有する”などと同義であり、成分などの存在を具体的に示す包括的な、あるいは何の制約もない用語であり、付加的な、明示していない、公知かつ本明細書に記載する成分、特徴、要素、部材、工程などの存在を排除するものではない。
【００２１】
終点による数値範囲の記載には、この範囲に包括される、記載された終点を含むすべての数値および分数を含むものとする。
【００２２】
本明細書全体を通じて用語“構成体”、“マトリックス構成体”および“マトリックス”は交換可能である。
【００２３】
本発明の第１態様は、細胞が取り付き、増殖する表面をもち、細胞固定化部（ａ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｃｔｉｏｎ）を形成する一つかそれ以上の細胞固定化層を有する細胞増殖マトリックス構成体に関する。これら細胞固定化層に一つかそれ以上のスペーサー層を隣接配置する。このスペーサー層はスペーサー部（ａ  ｓｐａｃｅｒ  ｓｅｃｔｉｏｎ）を形成する構造を有し、このスペーサー部によって細胞および培地が開放しかつ曲がりくねった経路を通過する。スペーサー層の構造または特質については、スペーサー層が、細胞および培地がこのスペーサー層の表面および固定化層に対して平行に移動する曲がりくねった開放経路を構築するように選択される。このスペーサー部が形成する曲がりくねった経路またはチャネルによって乱流が発生するため、細胞および細胞培地の固定化層への浸入が加速する。
【００２４】
上記細胞固定化層が細胞固定化部を定め、そして上記スペーサー層がスペーサー部を定める。
【００２５】
本発明の別な代替的実施態様は、一つかそれ以上のスペーサー部および一つかそれ以上の細胞固定化層を有する構造化細胞増殖マトリックスに関する。各スペーサー部が少なくとも一つのスペーサー層を有し、そして各細胞固定化部が少なくとも一つの細胞固定化層を有し、スペーサー部に対する固定化部の厚さ比が少なくとも０．１であり、そしてスペーサー部の厚さが少なくとも０．１ｍｍである。一つの実施態様では、スペーサー部が、細胞がスペーサー層にそって移動する曲がりくねった経路またはチャネルを構成する構造を有する。
【００２６】
本発明の目的を達成するためには、曲がりくねった経路は、全体的な経路にそってこれから変化する方向性をもった成分を有する経路でなければならない。
【００２７】
マトリックス構成体については、静的なバイオリアクターの場合に、流体および細胞がスペーサー層および細胞固定化層の表面にそって軸線方向に流れるように、あるいは回転型バイオリアクターの場合に、両層の表面にそって接線方向に流れるように設計する。従って、スペーサー層の構造については、固定化層間に曲がりくねった開放経路を形成し、これによって乱流を発生するように選択される必要がある。この乱流によって、細胞および培地が固定化層中に押し込まれることになる。
【００２８】
なお、当業者ならば、既に公知なように、このような曲がりくねった経路スペーサーは複数の方法で形成できることを理解できるはずである。一つの実施態様では、スペーサー層はベアリング構造体で構成してもよく、あるいはビーズなどの球形物体、球形近似物体または卵形物体を相互の上部に三次元構造体として充填して構成すればよい（図１Ｂを参照）。ベアリング構造体については、場合に応じて表面支持体に固定した球または球体から形成した構造体と考えればよい。これらが曲がりくねった経路を形成し、この経路から流体が流入することができる。
【００２９】
別な実施態様では、スペーサー層はメッシュでもよく、あるいはメッシュ構造体から構成してもよい。本発明の目的を達成するために、メッシュ構造体またはメッシュはフィラメント、ワイヤまたは糸からなるネットワークパターンまたはウェブ状パターンからなる構造体でなければならない。このネットワークが三次元織りの孔、開口または穿孔を形成する。メッシュ構造体の実施例を図４Ａ〜図４Ｄに示す。なお、これらは本発明を限定するものではないことは理解されたい。
【００３０】
本発明の細胞増殖マトリックス構成体またはマトリックスは、高密度細胞増殖を可能にする基体になる。高密度細胞バイオリアクターの場合、最小容積で最大の細胞増殖表面を実現できるため好ましい。本発明の細胞増殖マトリックス構成体の設計については、これらの要件を実現できるように最適化する。固定化部にスペーサー部を隣接配置することによって、細胞および培地が確実に流れる。これらスペーサー部が乱流発生を促し、細胞取り付き部間に実質的に接線方向流れが発生するだけでなく、固定化層に流れるランダムな垂直流れが発生する。このため、固定化部の固定化層への細胞の取り付きが加速する。
【００３１】
さらに、細胞がバイオリアクター内部により均一に分布する。スペーサー部が、取り付きが生じるまで細胞移動のスペースを確保し、かつ固定化部がフィルターとして作用することを防止するからである。さらに、スペーサーが代謝物質（ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ）の移動用スペースを確保することによって毒性のある代謝物質の除去を促す。
【００３２】
さらに、スペーサー部によって培地の分布が良好になり、それによってまた、バイオリアクター内部の栄養素の分布が良好なものになる。バイオリアクター内部のすべての細胞に等分に培地が与えられる。マトリックスの構造化設計のため、バイオリアクター内部には選択的な培地経路が形成されることはない。これは、従来の非構造化マトリックスには認められない改良点である。従来技術では、バイオリアクター内に使用すると、選択的な培地経路を形成する。非構造化担体が培地流れの影響を受けて移動し、この結果、細胞分布が非均一化するからである。
【００３３】
圧力低下および容量損失を最小限に抑えるために、スペーサー部については、細胞および流体流れの曲がりくねった経路を有する構造体で構成する。一つの実施態様では、この構造体はメッシュである。スペーサー部にメッシュ構造体を使用することによって、物理的なバリヤーの厚さを絶対最小値に維持でき、一定の圧力を確保した状態で、隣接固定化部間に十分なスペースを確保できる。
【００３４】
一つの実施態様では、スペーサー層の構造体またはメッシュサイズは０．０５ｍｍ〜５ｍｍである。構造体またはメッシュサイズの選択は重要である。というのは、システム内に十分な圧力を確保し、かつ細胞密度を高く維持した状態と、固定化部間に十分なバリヤーを確保することによって細胞および培地が流れる状態との間のバランスに影響を与えるからである。メッシュまたはグリッドの開口は任意の形状であればよく、例えば円形開口、楕円形開口、正方形開口または矩形開口を使用することができる。一つの実施態様では、開口サイズは少なくとも０．０５ｍｍ、少なくとも０．０６ｍｍ、少なくとも０．０８ｍｍ、少なくとも０．１ｍｍ、少なくとも０．１５ｍｍ、少なくとも０．２ｍｍ、あるいは少なくとも０．２５ｍｍである。別な実施態様では、開口サイズは５ｍｍ以下、４．５ｍｍ以下、４ｍｍ以下、３．５ｍｍ以下、３ｍｍ以下であり、これら値の間にある任意な値でもよい。
【００３５】
なお、一つかそれ以上のスペーサー層から構成したスペーサー部の厚さもマトリックス構成体の機能に影響を与えることは理解されたい。一つの実施態様では、スペーサー部の厚さは少なくとも０．１ｍｍ、より好ましくは０．１ｍｍ〜５ｍｍ、一層好ましくは０．２ｍｍ〜１ｍｍである。一つの実施態様では、スペーサー部の厚さは０．２５ｍｍ〜０．６ｍｍ、例えば０．４ｍｍまたは０．５ｍｍである。
【００３６】
一つの実施態様では、スペーサー部の厚さはｍｍ単位で少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、少なくとも２．１、少なくとも２．２、少なくとも２．３、少なくとも２．４、少なくとも２．５、少なくとも２．６、少なくとも２．７、少なくとも２．８、少なくとも２．９、少なくとも３、少なくとも３．１、少なくとも３．２、少なくとも３．３、少なくとも３．４、少なくとも３．５、少なくとも３．６、少なくとも３．７、少なくとも３．８、少なくとも３．９、少なくとも４、少なくとも４．１、少なくとも４．２、少なくとも４．３、少なくとも４．４、少なくとも４．５、少なくとも４．６、少なくとも４．７、少なくとも４．８、少なくとも４．９、少なくとも５、少なくとも５．５、少なくとも６、少なくとも６．５、少なくとも７、少なくとも７．５、少なくとも８、少なくとも８．５、少なくとも９、少なくとも９．５、少なくとも１０、あるいはこれら数値間に含まれる任意の値である。
【００３７】
別な、あるいは代替的な実施態様では、スペーサー部の厚さはｍｍ単位で１０００以下、９５０以下、９００以下、８５０以下、８００以下、７５０以下、７００以下、６５０以下、６００以下、５５０以下、５００以下、４５０以下、４００以下、３５０以下、３００以下、２５０以下、２００以下、１９０以下、１８０以下、１７０以下、１６０以下、１５０以下、１４０以下、１３０以下、１２０以下、１１０以下、１００以下、９５以下、９０以下、８５以下、８０以下、７５以下、７０以下、６５以下、６０以下、５５以下、５０以下、４５以下、４０以下、３５以下、３０以下、２５以下、２０以下、１５以下、１２以下、あるいはこれら数値間に含まれる任意の値である。
【００３８】
細胞固定化部の厚さもシステムの機能にとって等しく重要である。細胞固定化部が厚過ぎると、細胞密集域が希薄になり過ぎ、一方あまりにも薄すぎると、利用できる細胞増殖表面に否定的な影響が現れ、同様に細胞増殖に否定的な影響が出る。固定化部の厚さについては、０．１ｍｍ〜１５ｍｍが好ましく、０．１ｍｍ〜１０ｍｍがより好ましく、一層好ましくは０．１ｍｍ〜５ｍｍまたは０．１ｍｍ〜１ｍｍである。
【００３９】
細胞増殖表面間の十分な細胞および培地流れと細胞増殖の対象である細胞表面を十分大きく取ることとの間でバランスを取る必要がある。本発明者の知見によると、理想としては、スペーサー部に対する細胞固定化部の厚さ比は少なくとも０．１、より好ましくは０．１〜５、さらにより好ましく０．１〜２（例えば１：１）でなければならない。このように設定すると、システムの要件を満足できる。
【００４０】
一つの実施態様では、スペーサー部に対する固定化部の厚さ比は少なくとも０．１、少なくとも０．２、少なくとも０．３、少なくとも０．４、少なくとも０．５、少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、少なくとも２．１、少なくとも２．２、少なくとも２．３、少なくとも２．４、少なくとも２．５、少なくとも２．６、少なくとも２．７、少なくとも２．８、少なくとも２．９、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、あるいはこれら数値間に含まれる任意の値である。
【００４１】
さらに別な、あるいは代替的な実施態様では、スペーサー部に対する固定化部の厚さ比は５０以下、４５以下、４０以下、３５以下、３０以下、２５以下、２０以下、１９以下、１８以下、１７以下、１６以下、１５以下、１４以下、１３以下、１２以下、１１以下、あるいはこれら数値間に含まれる任意の値である。
【００４２】
マトリックス構成体内においてそれぞれスペーサー部および固定化部を構成するスペーサー層および／または細胞固定化層については、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、プラズマ処理ポリエチレン、プラズマ処理ポリエステル、プラズマ処理ポリプロピレンまたはプラズマ処理ポリアミドからなる群から選択する生体適合性ポリマーから構成するのが好ましい。これら層は親水性でもよく、あるいは疎水性でもよい。細胞固定化層については、親水性を呈することが好ましい。
【００４３】
両層の厚さについては、０．０５ｍｍ〜３ｍｍが有利であり、より好ましくは０．１〜２ｍｍまたは０．１〜１ｍｍである。
【００４４】
細胞固定化層に適する材料としては製織布または不織布を挙げることができる。不織布を使用するのが好ましい。製織布とは反対に、不織布は製織や編成によって作るものではなく、また繊維を糸に変換する必要のない布である。不織布は広く定義すると、繊維またはフィラメントを機械的に、熱的にあるいは化学的に絡み合わせることによって（およびフィルムを多孔化することによって）結合したシートまたはウェブ構造体である。本発明に使用する不織布の特質については、その発生源を問うものではなく、天然繊維または合成繊維であればよい。ポリエステルやポリプロピレンなどのポリマーからなる不織布が好ましい。本発明に使用する細胞固定化層については、ポリエチレンテレフタレート不織布から選択すればよい。不織布については、細胞の取り付きおよび細胞流れを加速するためにプラズマ処理を行ってもよい。
【００４５】
スペーサー層については、上述したようにメッシュサイズの（生体適合性を備えた）ポリマーで構成することができる。一つの実施態様では、スペーサー層は合成織布または合成構造体である。別な実施態様では、スペーサー層はベアリング構造体である。このような構造体は、生体高分子（例えばアルギン酸塩など）から構成することができる。この目的に合うならば、他の材料も使用でき、例示するとシリカ、ポリスチレン、アガロース、スチレンジビニルベンゼン、ポリアクリロニトリルやラテックスである。
【００４６】
スペーサー層については、バイオバーデン（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を減らすためにガンマ線を照射してもよい。
【００４７】
マトリックス構成体については、バイオリアクターの用途および型に応じて多くの形態で設計できる。
【００４８】
本発明の一実施態様では、固定化部およびスペーサー部は交互に配置する。交互配置とは、各スペーサー部の後に細胞固定化部が続き、そしてこれにスペーサー部が続くことを意味する。各部を図示のように（後述を参照）、上下に交互配置してもよく、あるいはマトリックスおよび／またはマトリックスを設置するバイオリアクターの用途に従って水平に交互配置してもよい。
【００４９】
この実施態様では、細胞固定化層のうちの一層かそれ以上の層を一つかそれ以上のスペーサー層に重ねる（逆もある）。この積層配置を必要に応じて数回繰り返すと、いくつかの固定化部／スペーサー部からなる積層体を形成できる。理想的には、最終構成が１〜５００交互に積み重なった上記層構成を有するのがよい。積層された層をフレームまたはカセット内に設けるか、あるいは周囲をシール／接合すればよい。別な実施態様では、得られた積層体を軸またはコアの周囲に巻き付け、螺旋状にする。
【００５０】
固定化部およびスペーサー部の両者に使用する層数については、適合性、層の特性（寸法、大きさなど）および所望する結果に基づいて選択できる。具体的には、固定化部またはスペーサー部のいずれかにおける層数は１〜２０であればよく、より好ましくは１〜１０であり、さらにより好ましくは１〜５である。
【００５１】
上記のように、スペーサー部を設けるため、培地が流れるマトリックスの内部にスペースを確保できる。このため、マトリックスにおける培地の循環性が良くなり、すべての培養細胞に培地が行き渡る。この効果は、スペーサー部が一つのスペーサー層を有し、そして固定化部が２つの固定化層を有する実施態様においてより一層顕著になる。スペーサー部を介しマトリックス内部で流動する培地は、細胞固定化部に対して接線方向を向く。
【００５２】
スペーサー部のスペーサー層の剛性によりマトリックスの剛性が強くなる。本発明の実施態様のマトリックスはいずれも、当業者にとっては公知な方法によって圧縮できる。圧縮されたマトリックスは、圧縮されていないマトリックスよりも最大で２０％、好ましくは最大で１５％、より好ましくは最大で１０％サイズが小さくなる。
【００５３】
一つの実施態様では、少なくとも一つのスペーサー層またはスペーサー部の一面については、細胞固定化層または他の層または他の部によって少なくとも部分的にカバーされていない。このカバーされていない層部または層については、バイオリアクターの内壁に接触するように設けるよう、設計される。このように設計すると、バイオリアクター内部にプランジャー効果が発生しない。
【００５４】
本発明の代替的な実施態様では、マトリックス構成体は上記のように、固定化部を形成する一つかそれ以上の細胞固定化層、およびこの細胞固定化層に隣接して（あるいは上および／または下に）設けられ、スペーサー部を形成する一つかそれ以上のスペーサー層を有する構成をもつ。場合に応じて、この層構成を繰り返すと、一つかそれ以上の細胞固定化層および一つかそれ以上のスペーサー層が交互に積層された積層体を構成することができる。この結果、軸線またはコアに螺旋状に、あるいは同心状に巻かれたものを得ることができる。スペーサー部の厚さについては０．１ｍｍ〜５ｍｍ、より好ましくは０．２ｍｍ〜１ｍｍであればよく、一方固定化部の厚さについては０．１ｍｍ〜５ｍｍであればよい。スペーサー部の厚さに対する固定化部の厚さの比については、１：２〜２：１が好ましく、１：１がより好ましい。このための層数は使用する層の特性に基づいて変わり、従って上記のように任意に選択できるが、２つの固定化層を使用し、かつ一つのスペーサー層を使用した場合に満足のいく結果が得られることが判明した。スペーサー層および固定化層の厚さについては、０．０５ｍｍ〜３ｍｍであればよく、０．１ｍｍ〜２ｍｍまたは０．１ｍｍ〜１ｍｍがより好ましい。固定化層およびスペーサー層の材料については、限定するものではないが、固定化層は上記の他の実施態様で説明したように製織布または不織布から作られるのが好ましい。スペーサー層についても製織布または不織布であればよく、メッシュ構造を有してもよい。
【００５５】
バイオリアクター内に設けた場合、好ましくはバイオリアクターの壁部に面する側面であるマトリックス構成体の外側層が、スペーサー層になるため、増殖している細胞がバイオリアクターの壁部に接することがなくなる。このようなバイオリアクターは加熱することができ、この領域内の細胞増殖の収率および／または品質が両立できる。さらに別な実施態様では、マトリックス構成体の外周にいくつかのスペーサー層を設けることができ、隔離を確保できる。さらに別な実施態様では、スペーサー層とは異なる別な材料からなる隔離層を設ける。
【００５６】
本発明のマトリックス構成体は、従来構成体と比較して簡単で、反復使用が可能である。さらに、本発明は特定の寸法および／または細胞増殖面をもつマトリックスを容易に製造できるため拡大／縮小可能なマトリックスを提供できる。本発明の構成体／マトリックスは拡大／縮小可能であるが、これは培地流れの均一性および／または品質に影響を与えるものではない。
【００５７】
本発明の別な態様は、以上説明してきたいずれかの実施態様の構成体／マトリックスを細胞の増殖に適用することに関する。
【００５８】
本発明の別な態様は、以上説明してきたいずれかの実施態様の構成体またはマトリックスを有するバイオリアクターに関する。このバイオリアクターは二つ以上の構成体またはマトリックスを有してもよい。さらに別な実施態様では、構成体／マトリックスおよび／またはこのマトリックスを有するバイオリアクターの使用は一回限りである。この構成体／マトリックスは、バイオリアクター内に垂直に、あるいは水平に設けることができる。
【００５９】
構成体／マトリックスについては、バイオリアクターの内部スペースの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、あるいは少なくとも５０％を占めるのが好ましい。このマトリックスは、バイオリアクターの内部スペースの１００％以下、９０％以下、８０％以下、７０％以下、あるいは６０％以下を占める。
【００６０】
バイオリアクターとしては、灌流バイオリアクター、ウェーブバイオリアクター、円筒形バイオリアクター、回転バイオリアクター、バッグバイオリアクター、移動床バイオリアクター、充填床バイオリアクター、繊維状バイオリアクター、膜バイオリアクター、バッチバイオリアクター、あるいは連続バイオリアクターなどの当業者にとっては公知な任意型式のバイオリアクターを使用することができる。バイオリアクターは任意の形状を取り、ステンレス鋼、ガラスやプラスチックなどの適切な材料から構成できる。
【００６１】
なお、本発明は上記の実施態様に制限されるものではなく、請求項を再検討することなく本発明実施例に一部変更を加えることができる。
【図面の詳細な説明】
【００６２】
図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の２つの実施態様に従って構成したマトリックス構成体の一部を示す横断面図である。（固定化部１０を形成する）一つかそれ以上の細胞固定化層２の間に一つかそれ以上のスペーサー層３または３´を設けることによって、乱流（黒い矢印で示す）およびランダムな垂直流（白い矢印で示す）が発生する。このマトリックス構成体は、固定床内に使用した場合に、流れを十分に分配させる流路を形成する。このように設計すると、液体流れに均一性を確保できる結果、細胞がマトリックス構成体全体に等しく均一に行き渡らせることができる。曲がりくねった開放経路を作り出すスペーサーを設けることによって、細胞流および培地流が両層の表面に沿って流れる。乱流が細胞および培地を細胞固定化層により深く押し込むことになる。この設計を細胞生成に使用した場合、全体として、再現性および均一性を確保できる。
【００６３】
図１Ａは、スペーサー部１１がメッシュ生地製の一つかそれ以上のスペーサー層３を有する実施態様を示す図である。この目的に使用できる考えられるメッシュ生地の実施例を、各種形態の開口を示す図４Ａ〜図４Ｄに示す。
【００６４】
図１Ｂは、スペーサー部がビーズなどの球形物や球形近似物からなる別な実施態様を示す。
【００６５】
メッシュ構造体およびビーズは、いずれも上記のように曲がりくねった開放経路を作り出す構造体または層の実施例である。
【００６６】
図２Ａ〜図２Ｄは、それぞれ細胞固定化部１０およびスペーサー部１１を構成する固定化層ｖｓスペーサー層の層数の配置例を示す図である。
【００６７】
各部の厚さは、それに含まれる層の厚さの合計に対応する。一つの実施態様では、図２Ａおよび図２Ｂに示すように、スペーサー部１１は一つのスペーサー層を有し、そして細胞固定化部１０は２つの細胞固定化層を有する。この構成の場合、各固定化層の少なくとも一面がスペーサー層の一面に接触する。図２Ｃおよび図２Ｄに、スペーサー部１１が一つのスペーサー層を有し、そして固定化部が３つの固定化層を有する代替的な実施例を示す。
【００６８】
スペーサー部および細胞固定化部については、形状は任意でよく、寸法も異なっていてもよく、あるいは同じでもよい。マトリックスについては、異なる部分を交互配置し、三次元（３Ｄ）マトリックスを形成することができる。このマトリックスの幾何学的形状は任意でよく、例えば円筒形、三角形、矩形やその他の不規則な３Ｄ形状を取ることができる。３Ｄマトリックスを巻き付け、螺旋形にするなど３Ｄマトリックスをさらに形成することによって、このマトリックスを他の形状にしてもよい。
【００６９】
巻き付けたマトリックスのそれぞれ斜視図および上面図である図３Ａおよび図３Ｂに巻き付けたマトリックスの実施例を示す。図３Ａおよび図３Ｂに示すマトリックスまたは構成体は、螺旋構造を例示するために“緩く”巻き付けられた状態にある。なお、マトリックスの巻き付け度は、構成体の使用方法および／または使用者の目的に従って変更可能であることは理解されたい。構成体またはマトリックスについては、強く巻き付け、図３Ｃに示す螺旋構造などの構造にしてもよい。
【００７０】
図３Ｃに、メッシュ構造の一つかそれ以上のスペーサー層３に一つかそれ以上の細胞固定化層２を隣接配置し、場合に応じて層形成を数回繰り返し、積層体を構成した本発明の一実施態様を示す。メッシュ構造の実施例は、図４Ａ〜図４Ｄ（拡大図）に示す通りである。好ましくは、本発明のスペーサー層が有するメッシュ構造が、２つの固定化層の間に層化した場合に細胞および流体が流れる曲がりくねった経路を作り出す。あるいは、他のスペーサー構造を使用してこのような曲がりくねった経路を作り出してよい。図３Ｃに示す実施態様の場合、図示のように、軸線またはコアにそって螺旋状に、あるいは同心円状に巻き付けることによってすべての層を緊密に巻き付ける。コアの直径、層の長さおよび／または層数が最終的に構成体またはマトリックスのサイズを決定することになる。層の厚さについては、０．１ｍｍ〜５ｍｍが好ましい。図３Ｄに示す実施態様では、層の厚さは０．２５ｍｍ〜０．７ｍｍであり、細胞固定化層のうちの二層の間に一つのスペーサー層が挟まる。好ましくは、得られた螺旋構成の外層が一つかそれ以上のスペーサー層になる。あるいは、スペーサー層および細胞固定化層の両層とは異なる隔離層を外層とすることも可能である。スペーサー層については、メッシュサイズが０．０５ｍｍ〜５ｍｍのメッシュ製織布が好ましい。細胞固定化層については、不織布が好ましい。
【００７１】
図５および図６にそれぞれ本発明の実施態様に従って構成したマトリックス構成体を備えた静的バイオリアクターおよび回転バイオリアクターを示す。図５および図６の場合、バイオリアクター室内に図３Ｃに示すマトリックスを設ける。いずれの実施態様も、細胞および培地の流れはスペーサー層が作り出す経路にそって流れる。
【００７２】
図５に示す実施態様では、培地および細胞はスペーサー層および固定化層の表面にそって軸線方向にマトリックス構成体内を（上から下に、あるいは下から上に）流れる。
【００７３】
図６に回転バイオリアクターを示す。マトリックス構成体は培地に部分的に沈み込み、バイオリアクターおよびマトリックスが軸線にそって回転する。この実施態様では、培地および細胞の流れは、スペーサー層および固定化層の表面にそって接線方向に流れる（螺旋経路）。
【符号の説明】
【００７４】
２：固定化層、細胞固定化層
３、３´：スペーサー層
１０：固定化部、細胞固定化部
１１：スペーサー部
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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