(57)【要約】  本明細書では、がんの治療及び予防に関連する技術、特に限定するものではないが、前立腺癌の治療に関連する組成物及び方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体の前立腺癌の治療方法であって：
（ａ）前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）遺伝子由来のヌクレオチド配列を有する核酸を含むワクチンを被験体に投与し；及び
（ｂ）ヒトプログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）阻害剤を前記被験体に投与することを包み、前記ワクチンと前記ＰＤ−１阻害剤を同時に投与する、前記治療方法。
【請求項２】
前記同時投与が、前記ワクチンの投与後、前記ワクチンの投与から２４時間以内に前記ＰＤ−１阻害剤を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸が、転写調節エレメント及び／または免疫刺激配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＰＡＰ遺伝子由来の前記ヌクレオチド配列が、転写調節エレメントに作動可能に連結している、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＡＰ遺伝子がヒトＰＡＰ遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＡＰ遺伝子がげっ歯類ＰＡＰ遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記被験体がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸がｐＴＶＧ４−ＨＰである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＤ−１阻害剤がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＤ−１阻害剤が、ペンブロリズマブまたはニボルマブである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列、またはその一部もしくは置換変異体を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＤ−１阻害剤を１〜５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＤ−１阻害剤を静脈内投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ワクチンをおよそ１００μｇの量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ワクチンが、アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ワクチンが、ＧＭ−ＣＳＦをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ワクチンを皮内または経皮投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ワクチンを約２週間毎に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤を複数回投与し、前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤の初回の同時投与後に、最大９０日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に投与し、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
９１日〜３６５日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
９０日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
３６６日〜７３０日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
３６５日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
最大９０日の期間、前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤を１０〜２８日毎に同時に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
９１日〜３６５日の期間、前記ワクチンと前記ＰＤ−１阻害剤を１０〜２８日毎に同時に投与することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
９０日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤を１０〜２８日毎に投与する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
９０日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、患者が疾患の進行の客観的エビデンスを示すまで、前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤を１０〜２８日毎に投与する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
３６６日〜７３０日の期間、前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤を１０〜２８日毎に投与することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
３６５日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤を１０〜２８日毎に投与する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
９０日後にＰＳＡの減少または腫瘍体積の縮小を示す患者を選択し、患者が疾患の進行の客観的エビデンスを示すまで、前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤を１０〜２８日毎に投与する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、前記被験体において、前記ワクチン単独の投与に比べて向上した抗腫瘍応答をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、ＰＡＰ特異的Ｔ細胞の数を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法が、ＰＤ−１を発現する循環ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法が、前記被験体の血中の循環腫瘍細胞の量を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が、前記被験体におけるＰＡＰ特異的抗体の量を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、非ＰＡＰ前立腺関連抗原に対する免疫応答を誘発する、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記ワクチンを投与する１つ以上の工程及び／または前記被験体由来の試料中のＰＤ−１陽性Ｔ細胞の数を測定する１つ以上の工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
１）ＰＡＰ遺伝子由来のヌクレオチド配列を有する核酸を含むワクチンを含む第一の医薬組成物；及び
２）ＰＤ−１阻害剤を含む第二の医薬組成物を含むキット。
【請求項３９】
前記ＰＡＰ遺伝子が、ヒトまたはげっ歯類ＰＡＰ遺伝子である、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記第二の医薬組成物が、ペンブロリズマブを含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
前記第二の医薬組成物が、ニボルマブを含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４２】
前記第一及び第二の医薬組成物を単回用量として含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４３】
前記核酸ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤を複数回投与する投与計画に十分な用量を提供するのに十分な量の前記第一の医薬組成物及び前記第二の医薬組成物を含む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４４】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の配列によって提供されるポリペプチドまたはペプチドをコードする、請求項３８に記載のキット。
【請求項４５】
前記被験体の前立腺癌の治療方法であって：
（ａ）前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）遺伝子由来のヌクレオチド配列を有する核酸を含むワクチンを被験体に投与し；及び
（ｂ）ヒトプログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）阻害剤を前記被験体に投与することを含み、
前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤の初回投与後に、前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤を重複スケジュールで複数回投与する、前記治療方法。
【請求項４６】
前記初回投与時に、前記ワクチンを前記ＰＤ−１阻害剤より先に投与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記重複スケジュールの開始時に、前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤を、互いに４８時間以内に投与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤の初回投与後、最大９０日間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
９１日〜３６５日間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
９０日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
３６６日〜７３０日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
３６５日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
それを必要とする被験体における前立腺癌の治療のための前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）遺伝子由来のヌクレオチド配列を有する核酸を含むワクチン及びヒトプログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）阻害剤の使用であって、前記ワクチンと前記ＰＤ−１阻害剤を同時に投与する、前記使用。
【請求項５４】
前記同時投与が、前記ワクチンの投与後、前記ワクチンの投与から２４時間以内に前記ＰＤ−１阻害剤を投与することを含む、請求項５３に記載の使用。
【請求項５５】
前記核酸が、転写調節エレメント及び／または免疫刺激配列をさらに含む、請求項５３〜５４のいずれかに記載の使用。
【請求項５６】
ＰＡＰ遺伝子由来の前記ヌクレオチド配列が、転写調節エレメントに作動可能に連結している、請求項５３〜５５のいずれかに記載の使用。
【請求項５７】
前記ＰＡＰ遺伝子がヒトＰＡＰ遺伝子である、請求項５３〜５６のいずれかに記載の使用。
【請求項５８】
前記ＰＡＰ遺伝子がげっ歯類ＰＡＰ遺伝子である、請求項５３〜５７のいずれかに記載の使用。
【請求項５９】
前記被験体がヒトである、請求項５３〜５８のいずれかに記載の使用。
【請求項６０】
前記核酸がｐＴＶＧ４−ＨＰである、請求項５３〜５９のいずれかに記載の使用。
【請求項６１】
前記ＰＤ−１阻害剤がモノクローナル抗体である、請求項５３〜６０のいずれかに記載の使用。
【請求項６２】
前記ＰＤ−１阻害剤が、ペンブロリズマブまたはニボルマブである、請求項５３〜６１のいずれかに記載の使用。
【請求項６３】
前記ヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列、またはその一部もしくは置換変異体を含むポリペプチドをコードする、請求項５３〜６２のいずれかに記載の使用。
【請求項６４】
前記ＰＤ−１阻害剤を１〜５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する、請求項５３〜６３のいずれかに記載の使用。
【請求項６５】
前記ＰＤ−１阻害剤を静脈内投与する、請求項５３〜６４のいずれかに記載の使用。
【請求項６６】
前記ワクチンをおよそ１００μｇの量で投与する、請求項５３〜６５のいずれかに記載の使用。
【請求項６７】
前記ワクチンが、さらにアジュバントを含む、請求項５３〜６６のいずれかに記載の使用。
【請求項６８】
前記ワクチンが、ＧＭ−ＣＳＦをさらに含む、請求項５３〜６７のいずれかに記載の使用。
【請求項６９】
前記ワクチンを、皮内または経皮投与する、請求項５３〜６８のいずれかに記載の使用。
【請求項７０】
前記ワクチンを約２週間毎に投与する、請求項５３〜６９のいずれかに記載の使用。
【請求項７１】
前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤を複数回投与し、前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤の初回の同時投与後に、最大９０日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する、請求項５３〜６９のいずれかに記載の使用。
【請求項７２】
９１日〜３６５日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与することをさらに含む、請求項７１に記載の使用。
【請求項７３】
９０日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する、請求項７１〜７２のいずれかに記載の使用。
【請求項７４】
３６６日〜７３０日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与することをさらに含む、請求項７１〜７３のいずれかに記載の使用。
【請求項７５】
３６５日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する、請求項７１〜７４のいずれかに記載の使用。
【請求項７６】
最大９０日の期間、前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤を１０〜２８日毎に同時に投与する、請求項５３〜６９のいずれかに記載の使用。
【請求項７７】
９１日〜３６５日の期間、前記ワクチンと前記ＰＤ−１阻害剤を１０〜２８日毎に同時に投与することをさらに含む、請求項７６に記載の使用。
【請求項７８】
９０日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、前記ワクチンと前記ＰＤ−１阻害剤を１０〜２８日毎に投与する、請求項７６〜７７のいずれかに記載の使用。
【請求項７９】
９０日後にＰＳＡの減少または腫瘍体積の縮小を示す患者を選択し、患者が疾患の進行の客観的エビデンスを示すまで、前記ワクチンと前記ＰＤ−１阻害剤を１０〜２８日毎に投与する、請求項７６〜７８のいずれかに記載の使用。
【請求項８０】
３６６日〜７３０日の期間、前記ワクチンと前記ＰＤ−１阻害剤を１０〜２８日毎に投与することをさらに含む、請求項７６〜７９のいずれかに記載の使用。
【請求項８１】
３６５日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、前記ワクチンと前記ＰＤ−１阻害剤を１０〜２８日毎に投与する、請求項７６〜８０のいずれかに記載の使用。
【請求項８２】
９０日後にＰＳＡの減少または腫瘍体積の縮小を示す患者を選択し、患者が疾患の進行の客観的エビデンスを示すまで、前記ワクチンと前記ＰＤ−１阻害剤を１０〜２８日毎に投与する、請求項７６〜８１のいずれかに記載の使用。
【請求項８３】
前記方法が、前記被験体において、前記ワクチン単独の投与に比べて向上した抗腫瘍応答をもたらす、請求項５３〜８２のいずれかに記載の使用。
【請求項８４】
前記方法が、ＰＡＰ特異的Ｔ細胞の数を増加させる、請求項５３〜８３のいずれかに記載の使用。
【請求項８５】
前記方法が、ＰＤ−１を発現する循環ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増加させる、請求項５３〜８４のいずれかに記載の使用。
【請求項８６】
前記方法が、前記被験体の血中の循環腫瘍細胞の量を減少させる、請求項５３〜８５のいずれかに記載の使用。
【請求項８７】
前記方法が、前記被験体におけるＰＡＰ特異的抗体の量を増加させる、請求項５３〜８６のいずれかに記載の使用。
【請求項８８】
前記方法が、非ＰＡＰ前立腺関連抗原に対する免疫応答を誘発する、請求項５３〜８７のいずれかに記載の使用。
【請求項８９】
前記ワクチンを投与する１つ以上の工程及び／または前記被験体由来の試料中のＰＤ−１陽性Ｔ細胞の数を測定する１つ以上の工程を含む、請求項５３〜８８のいずれかに記載の使用。
【請求項９０】
それを必要とする被験体における前立腺癌の治療のための前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）遺伝子由来のヌクレオチド配列を有する核酸を含むワクチン及びヒトプログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）阻害剤の使用であって、前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤の初回投与後に、前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤を重複スケジュールで複数回投与する、前記使用。
【請求項９１】
初回投与時に、前記ワクチンを前記ＰＤ−１阻害剤より先に投与する、請求項９０に記載の使用。
【請求項９２】
前記重複スケジュールの開始時に、前記ワクチンと前記ＰＤ−１阻害剤を、互いに４８時間以内に投与する、請求項９０〜９１のいずれかに記載の使用。
【請求項９３】
前記ワクチン及び前記ＰＤ−１阻害剤の初回投与後、最大９０日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する、請求項９０〜９２のいずれかに記載の使用。
【請求項９４】
９１日〜３６５日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与することをさらに含む、請求項９０〜９３のいずれかに記載の使用。
【請求項９５】
９０日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する、請求項９０〜９４のいずれかに記載の使用。
【請求項９６】
３６６日〜７３０日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与することをさらに含む、請求項９０〜９５のいずれかに記載の使用。
【請求項９７】
３６５日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、前記ワクチンを１０〜２１日毎に、前記ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する、請求項９０〜９６のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願との相互参照］
本出願は、２０１６年２月１２日に出願された米国特許仮出願第６２／２９４，３４９号、及び２０１６年１０月５日に出願された米国特許仮出願６２／４０４，２５２号の利益を主張し、これらの各々はその全体を参照として本明細書に援用する。
【０００２】
［連邦支援研究または開発に関する声明］
本発明は、国防総省によって付与された助成金番号Ｗ８１ＸＷＨ−０８−１−０３４１、及びアメリカ国立衛生研究所によって付与された助成金番号ＣＡ１４２６０８の下で、政府支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本明細書では、がんの治療及び予防に関連する技術、特に、限定するものではないが、前立腺癌の治療に関連する組成物及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
前立腺癌は男性の中で最も一般的な腫瘍であり、米国における男性のがん関連の死亡の第二の原因である［１］。スクリーニングと早期発見の進歩にもかかわらず、２０１４年における米国人男性の３０，０００人以上が前立腺癌の結果として死亡すると推定されている［１］。手術や放射線による治療は、限局性と推定される疾患に対しては依然として有効であるが、これらの患者のおよそ３分の１は１０年後に進行性または転移性疾患に罹患する［２］。前立腺癌は、転移性になると治癒することはなく、一般的には、最初にアンドロゲン除去療法で治療を行い、アンドロゲン除去療法を基礎としながら、そこに他の治療法を追加していく［３］。残念なことに、通常２〜３年以内に、この疾患はアンドロゲン除去療法に対して不応性になり、去勢抵抗性前立腺癌はこの疾患の致命的な表現型である。過去数年間に、いくつかの治療法が、この患者集団における全生存期間を延長するそれらの能力に基づいて、ＦＤＡに承認された。具体的には、ドセタキセルは、２回の大きな無作為化試験においてミトキサントロンに比べて２〜３か月の全生存期間の中央値改善が示された後、２００４年に承認された［４，５］。カバジタキセルは、国際的な治験においてミトキサントロンに比べて同様の２〜３か月の全生存期間の中央値改善が示された後、ドセタキセルに抵抗性の疾患を有する患者に対して２０１０年に承認された［６］。また、２０１０年には、ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標）、Ｄｅｎｄｒｅｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が、前向き無作為化盲検第ＩＩＩ相プラセボ対照臨床試験の結果と、全生存期間における４か月の中央値改善を示した従前の第ＩＩＩ相臨床試験の基礎資料に基づいて、最小症候性の去勢抵抗性転移性前立腺癌の患者に対して承認された［７］。最後に、２０１１年及び２０１３年に、アンドロゲンの合成またはシグナル伝達を標的とする薬剤であるアビラテロン及びエンザルタミドが、２〜３か月の全生存期間の中央値改善を示した前向き無作為化盲検プラセボ対照試験の結果を受けて、ドセタキセル抵抗性去勢抵抗性転移性前立腺癌の条件下において承認された［８，９］。これらの最近の進歩により、進行性前立腺癌患者の状況は明らかに改善された；しかしながら、最近の進歩は、去勢抵抗性疾患の管理についての最適な手順及びアプローチに関して新たな課題を提示している。進行性前立腺癌に対して化学療法が強い効果をもたらすにもかかわらず、部分的には潜在的な副作用のために、化学療法が短い全生存期間しかもたらさないことから、多くの患者及び治療医師は、すべての患者に対してそれを使用することは正しくない可能性があると考えている［１０］。したがって、新規かつ改善された前立腺癌治療が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
［概要］
能動免疫療法としても知られるワクチンベースの戦略は、より優れた治療法を提供する。例えば、ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔの承認を導いた治験では、化学療法剤で通常認められるものに比べて、より軽度の有害事象を示した［７］。前立腺癌に対する多くのワクチンは臨床開発中であり、そのすべてが同様の安全特性を示し、そのうちのいくつかは抗腫瘍活性を示した［１１，１２，１３，１４］。Ｔ細胞チェックポイント遮断に関連する活性などの抗原非特異的免疫活性化療法の開発にも関心が寄せられている。例えば、ＰＤ／ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４の阻害剤は、単独で、または併用で、転移性メラノーマに対して顕著な有効性を示し［１５，１６，１７］、ＰＤ／ＰＤ−Ｌ遮断阻害剤は、いくつかの固形腫瘍タイプに対して単剤で活性を示した［１８，１９］。特に、ＰＤ−１は腫瘍を直接標的とするのではなくＴ細胞区画を標的とするため、ＰＤ−１の標的化は普遍的な治療であるべきである。しかしながら、ＰＤ−１遮断抗体を用いた別の第Ｉ相試験では、転移性前立腺癌患者（ｎ＝２５）において客観的応答は観察されなかった［１８，１９］。前立腺癌に比べて、腎細胞癌、メラノーマ、及び非小細胞肺癌を有する患者において、より高い応答頻度で観察される特定の腫瘍に対する応答の差は、例えば、応答患者及び非応答患者のＴ細胞における差に起因する可能性が高いことを示唆している。さらに、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を用いた早期臨床試験により、生検による標的腫瘍細胞上のＰＤ−１（ＰＤ−Ｌ１）のリガンドの少なくとも１つの発現が、治療に対する臨床応答と関連することが明らかになった［１８］。組織浸潤性Ｔ細胞がＩＦＮγの発現を介してＰＤ−Ｌ１の発現を誘導し得ることを考えれば、これは予想されることである。それにもかかわらず、前立腺癌などのＰＤ−Ｌ１を発現することが知られているいくつかの腫瘍［２０］は、単剤療法としてのＰＤ−１遮断による治療に対してほとんど応答を示さなかった［１８，１９］。
【０００６】
マウスモデルにおける腫瘍抗原を標的とするワクチンを試験する実験の間に、滑液肉腫Ｘブレイクポイント２（ＳＳＸ２）をコードするＤＮＡワクチンによる免疫化が、細胞溶解活性を有し、ＰＤ−１を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞の生成をもたらすことを示すデータが収集された。さらに、免疫化は、腫瘍における代償応答をもたらし、ＰＤ−Ｌ１の発現を高める。さらなる試験では、ＤＮＡワクチンに変化を導入することにより、細胞溶解活性を有するＣＤ８＋Ｔ細胞の数及び結合活性を高める試みを行ったが、このＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１上方制御が原因で、予期せぬ低い抗腫瘍免疫応答がもたらされた。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかを遮断する抗体を用いたこの経路の遮断は、このマウスモデルにおける腫瘍特異的標的抗原をコードするワクチンの抗腫瘍活性を回復させたが、単独療法としての抗ＰＤ−１治療単独では認められない効果として証明できるほどの効果を有していなかった。重要なことに、天然（非修飾）抗原をコードするワクチンとＰＤ−１を遮断する抗体とを併用した免疫化は、同様に、ワクチン接種単独に比べて抗腫瘍応答の改善を示した（例えば、Ｒｅｋｏｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）“ＰＤ−１  ｏｒ  ＰＤ−Ｌ１  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＳＳＸ２  Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ３：９４６−５５参照）。結果として、能動免疫療法とＰＤ−１チェックポイント阻害剤との併用投与は、治療法の効力のさらなる向上をもたらし、さらに、転移性がん患者における持続的な客観的抗腫瘍応答を有する可能性がある［２１］。
【０００７】
前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）は、前立腺癌を標的とするワクチンベースの治療戦略のモデル抗原である。ＰＡＰは、詳細に明らかにされたタンパク質であり、その発現は、正常及び悪性の前立腺組織に本質的に限定されている［２２］。これは、げっ歯類相同体が存在する少数の既知の前立腺特異的タンパク質の一つでもあり、したがってワクチン戦略を評価し毒性を評価するための動物モデルを提供する［２３］。ラットモデルにおいて、ＰＡＰを標的とするワクチン戦略は、ＰＡＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍細胞の破壊を媒介する推定集団、及び抗腫瘍応答をもたらし得ることを、別々の研究室のデータが示している［２４，２５，２６，２７］。ＰＡＰは、自家末梢血単核球にｅｘ  ｖｉｖｏでＰＡＰ−ＧＭ−ＣＳＦ融合タンパク質を負荷した自己抗原提示細胞ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔワクチンの標的抗原である。別の第Ｉ相臨床試験では、ＰＡＰのマウス相同体を負荷した樹状細胞を評価し、このアプローチの免疫原性を実証した［２８］。げっ歯類の研究では、実験により、特にプラスミドＤＮＡワクチンなどの遺伝子ワクチンを用いてＰＡＰを免疫学的に標的化できることが示された［２５，２６］。この同じＤＮＡワクチン（ｐＴＶＧ−ＨＰ）を用いて早期ＰＳＡ再発（臨床ステージＤ０）前立腺癌患者において実施した第Ｉ／ＩＩ相試験の結果が報告されている。１２週間にわたり治療した２２人の被験体において、有意な有害事象は観察されなかった。さらに、いくつかの患者がＰＡＰ特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のエビデンスを示し、いくつかの患者がＰＳＡ倍加時間の延長を経験したことは、免疫学的有効性を示すとともに抗腫瘍効果の可能性を示唆するものであった［２９］。免疫化後数か月にわたって複数回検出可能なＰＡＰに対する長期間のＩＦＮγ分泌免疫応答の存在がＰＳＡ倍加時間の増加と関連していたことは、それが効力の合理的なバイオマーカーとして機能する可能性を示唆するものであった［３０］。さらに、数か月後に繰り返し免疫して免疫応答を増強することができることが見出され、このことは、ＤＮＡワクチンが腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発する単純な手段を提供し得ることを示唆している［３１］。最後に、さらなる研究により、ｐＴＶＧ−ＨＰで以前に治療された患者は、マウスモデルでの知見と同様に、ＰＤ−１を発現する循環ＰＡＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＰＤ−Ｌ１発現が増加した循環ＥｐＣａｍ＋循環上皮細胞（ＣＥＣ）を有することが示された。
【０００８】
したがって、これらの知見は、ｐＴＶＧ−ＨＰワクチンが前立腺腫瘍に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を特異的に誘発し、さらにＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤による処置によってｐＴＶＧ−ＨＰワクチンの効力が増強され得ることを示している。
【０００９】
したがって、本明細書において提供する技術は、ＤＮＡワクチンを、ＰＤ−１経路阻害剤（例えば、ペンブロリズマブまたはニボルマブ）か、または患者の臨床応答、例えば、客観的疾患応答、血清ＰＳＡの低下、及び／または疾患の進行までの時間の延長をもたらすＰＤ−Ｌ１阻害剤と一緒に（例えば、同時に）、または順に用いて患者を治療するがん治療を提供する。いくつかの実施形態では、患者は、去勢抵抗性転移性前立腺癌を有する。
【００１０】
さらに、本技術は、前立腺癌の治療のための他の抗原に対するワクチンを含むことが企図されている。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンを、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（「ＣＴＬＡ−４」；ＣＤ１５２（表面抗原分類１５２）としても知られる）の阻害剤、例えばＣＴＬＡ−４阻害剤またはＣＴＬＡ−４経路阻害剤（例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体））と一緒に（例えば、同時に）、または順に用いて患者を治療するがん治療を提供する。いくつかの実施形態は、ＤＮＡワクチンを、ＣＴＬＡ−４阻害剤またはＣＴＬＡ−４経路阻害剤及びＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−１経路阻害剤の両方と一緒に（例えば、同時に）、または順に用いる治療を含む。いくつかの実施形態は、ＤＮＡワクチンを、ＣＴＬＡ−４阻害剤またはＣＴＬＡ−４経路阻害剤及びＰＤ−Ｌ１阻害剤またはＰＤ−Ｌ１経路阻害剤の両方と一緒に（例えば、同時に）または順に用いる治療を含む。
【００１１】
したがって、本明細書において、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）遺伝子由来のヌクレオチド配列を有する核酸を含むワクチンを被験体に投与し；ヒトプログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）阻害剤及び／またはヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）を被験体に投与することを含む、被験体の前立腺癌の治療方法の実施形態を提供する。いくつかの実施形態では、患者は、去勢抵抗性転移性前立腺癌を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、転写調節エレメントをさらに含み、例えば、いくつかの実施形態では、ＰＡＰ遺伝子由来のヌクレオチド配列は、転写調節エレメント（例えば、転写調節エレメントを含む核酸、例えば、転写調節エレメント（例えば、コアプロモーター、近位プロモーター、エンハンサー、遺伝子座制御領域、転写因子結合部位、活性化因子、活性化補助因子など））をコードするヌクレオチド配列を有する核酸に作動可能に連結する。
【００１２】
本技術は、ＰＡＰ遺伝子由来のヌクレオチド配列を有する核酸の供給源に関して制限されない。例えば、いくつかの実施形態では、核酸はヒトＰＡＰ遺伝子由来のヌクレオチド配列を有し、いくつかの実施形態では、核酸はげっ歯類ＰＡＰ遺伝子由来のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３の１つによって提供されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはその一部もしくはその置換変異体をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、ｐＴＶＧ４−ＨＰであるか、またはｐＴＶＧ−ＨＰを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３の１つによって提供されるアミノ酸配列に対し、少なくとも８０％同一の（例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または少なくとも９９％同一の）アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。
【００１３】
さらに、本技術は、がん（例えば、前立腺癌）を有するか、またはがん（例えば、前立腺癌）を有するリスクがある被験体の治療に関する。いくつかの実施形態では、被験体はヒトである。いくつかの実施形態では、被験体は、がんの治療を必要とするヒトであり、例えば、いくつかの実施形態では、被験体は、前立腺癌の治療を必要とするヒトである。
【００１４】
本技術は、投与するＰＤ−１阻害剤に関して制限されない。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）または抗体の抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、モノクローナル抗体であり、例えば、ペンブロリズマブまたはニボルマブである。
【００１５】
さらに、いくつかの実施形態は、ＰＤ−Ｌ１阻害剤を含む組成物、ＰＤ−Ｌ１阻害剤の使用（例えば、投与など）を含む方法などに関する。したがって、実施形態は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を遮断する抗体（例えば、モノクローナル抗体）、または抗体の抗原結合断片、及びそのようなＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を遮断する抗体及び／または抗体断片の使用に関する方法を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載する技術を通じてＰＤ−１阻害剤の代わりにＰＤ−Ｌ１阻害剤を利用できることが想定される（例えば、ＰＤ−１阻害剤の使用を含む技術は、いくつかの実施形態ではＰＤ−１阻害剤の代わりにＰＤ−Ｌ１を用いることが想定される）。例えば、Ｒｅｋｏｓｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ３：９４６−５５参照。前記文献は、ＰＤ−１の阻害剤またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）と併用する場合に、ＤＮＡワクチンの抗腫瘍活性が増加することを示している。
【００１６】
本技術は、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤の投与のためのいくつかの投与計画を提供する。いくつかの実施形態では、ワクチンとＰＤ−１阻害剤を同時に投与する（例えば、同じ日に；例えば、ＰＤ−１阻害剤を投与してから１〜５時間以内及び最大で２４時間以内にワクチンを投与する）。
【００１７】
他の実施形態では、ワクチンの最終投与を行った後にＰＤ−１阻害剤を投与し、例えば、ＰＤ−１阻害剤の初回投与をいったん行うと、ＰＤ−１阻害剤の投与計画中にはワクチンを投与しない。例えば、いくつかの実施形態では、最終用量の核酸ワクチンを被験体に投与してから、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１時間超、または１２時間超の後に、ＰＤ−１阻害剤を投与する。
【００１８】
本技術は、被験体にとっての有効量（例えば、被験体の体重、病状、病歴、他の薬物との共同投与などに対する適切な用量）を提供する用量範囲で、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤の投与を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＤ−１阻害剤を１〜５ｍｇ／ｋｇの用量で投与する。また、いくつかの実施形態では、ワクチンをおよそ１００μｇの量で投与する。さらに、本技術は、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤の投与経路に関して制限されない。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＤ−１阻害剤を静脈内投与する。また、いくつかの実施形態では、ワクチンを皮内投与する。さらに、実施形態は、ＰＤ−１阻害剤を（例えば、静脈内注入によって）ある期間にわたって投与することを提供する。例えば、実施形態は、ＰＤ−１阻害剤を３０分にわたって投与することを提供する。
【００１９】
さらに、方法の実施形態は、数日、数週間、及び／または数か月にわたる一連の投与によるＰＤ−１阻害剤存在下でのワクチンの投与を調整する投与計画に関する。例示的な投与計画のいくつかの実施形態では、ＰＤ−１阻害剤を３週間毎に投与し、及び／またはＰＤ−１阻害剤を４回投与する。また、いくつかの実施形態では、核酸ワクチンを２週間毎に投与し、及び／またはワクチンを６回投与する。
【００２０】
したがって、いくつかの実施形態では、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、重複した投与計画で複数回、被験体に投与する。いくつかの実施形態では、被験体は、去勢抵抗性転移性前立腺癌を有する。いくつかの実施形態では、ワクチンとＰＤ−１阻害剤とを同時に投与し（すなわち、治療計画の１日目に、互いを２４時間以内に投与する）、その後、最大９０日の期間、ワクチンを１０〜２０または２１、好ましくは約１４日毎に投与し、ＰＤ−１阻害剤を１７日〜２４日毎に、好ましくは約２１日毎に投与する。いくつかの実施形態では、本方法は、９１日〜３６５日の期間、ワクチンを１０〜２０または２１、好ましくは約１４日毎に投与し、ＰＤ−１阻害剤を１７日〜２４日、好ましくは約２１日毎に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、９０日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間にわたって、ワクチンを１０〜２０または２１日毎に、及びＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する。いくつかの実施形態では、本方法は、３６６日〜７３０日の期間にわたって、ワクチンを１０〜２０または２１日毎に、好ましくは約１４日毎に投与し、ＰＤ−１阻害剤を１７日〜２４日、好ましくは約２１日毎に投与する。いくつかの実施形態では、３６５日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、３６６日〜７３０日の期間にわたって、ワクチンを１０〜２０または２１日毎に、及びＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する。いくつかの実施形態では、最大９０日の期間、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、１０〜２８日毎に、好ましくは１０〜２０もしくは２１日または１０〜２４日毎に、最も好ましくは約１４日または２１日毎に、重複スケジュールで投与する。いくつかの実施形態では、本方法は、９１日〜３６５日の期間、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤を１０〜２８日毎に、好ましくは１０〜２０もしくは２１日または１０〜２４日毎に、最も好ましくは約１４日毎に、重複スケジュールで投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、９０日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、１０〜２８日毎に、好ましくは１０〜２０もしくは２１日または１０日〜２４日毎に、最も好ましくは約１４日毎に、重複スケジュールで投与する。いくつかの実施形態では、本方法は、３６６日〜７３０日の期間、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、１０〜２８日毎に、好ましくは１０〜２０もしくは２１日または１０〜２４日毎に、最も好ましくは約１４日毎に、重複スケジュールで投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、３６５日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、３６６日〜７３０日の期間、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、１０〜２８日毎に、好ましくは１０〜２０もしくは２１日または１０〜２４日毎に、最も好ましくは約１４日毎に同時投与する。いくつかの実施形態では、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、重複投与計画内で同時投与する。同時投与は、ワクチンとＰＤ−１阻害剤を同じ組成物（例えば、溶液）に投与するか、または薬剤を別々に投与する場合には、同じ日に投与し、好ましくは約１分〜約５時間もしくは２４時間以内に互いを投与するか、または約３０分〜約５時間または約２４時間以内に互いを投与することを包含する。
【００２１】
さらなる実施形態では、本発明は、被験体の前立腺癌の治療方法を提供し、前記方法は：（ａ）前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）遺伝子由来のヌクレオチド配列を有する核酸を含むワクチンを被験体に投与し；（ｂ）ヒトプログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）阻害剤を被験体に投与することを含み、ワクチンとＰＤ−１阻害剤の初回投与後に、ワクチンとＰＤ−１阻害剤を重複スケジュールで複数回投与する。いくつかの実施形態では、被験体は、去勢抵抗性転移性前立腺癌を有する。いくつかの実施形態では、初回投与時に、ワクチンをＰＤ−１阻害剤より先に投与する。いくつかの実施形態では、重複スケジュールの開始時において、ワクチンと前記ＰＤ−１阻害剤を、相互に１２、２４、４８、または７２時間以内に投与する。いくつかの実施形態では、ワクチンとＰＤ−１阻害剤の初回投与後、最大９０日の期間、ワクチンを１０〜２０または２１日毎に投与し、ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する。いくつかの実施形態では、本方法は、９１日〜３６５日の期間、１０〜２０または２１日毎にワクチンを投与し、ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、９０日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、１０〜２０または２１日毎にワクチンを、ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する。いくつかの実施形態では、本方法は、３６６日〜７３０日の期間、１０〜２０または２１日毎にワクチンを投与し、ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、３６５日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、１０〜２０または２１日毎にワクチンを、ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する。
【００２２】
さらに、当業者は、核酸ワクチンを含む適切な医薬組成物及びＰＤ−１阻害剤を含む適切な医薬組成物を提供することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ワクチンはさらに、アジュバント、例えばＧＭ−ＣＳＦ、例えば組換えヒトＧＭ−ＣＳＦを含む。
【００２３】
記載する方法の実施形態は、被験体において様々な生理学的及び免疫学的変化及び応答を誘発する。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、核酸ワクチン単独の投与に比べて向上した抗腫瘍応答を被験体において生じさせる。特定の実施形態では、本方法は、ＰＡＰ特異的Ｔ細胞の数を増加させ、循環ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ−１の発現を増加させ；被験体の血中の循環腫瘍細胞の量を減少させ、被験体のＰＡＰ特異的抗体の量を増加させ、非ＰＡＰ前立腺関連抗原に対する免疫応答を誘発し、被験体の血中の循環腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１、及び／またはＴ細胞上のＰＤ−Ｌ１の発現を増加させる。いくつかの実施形態では、被験体における生理学的及び免疫学的変化及び応答は、被験体におけるバイオマーカーのレベルまたは特徴の変化と関連する。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、腫瘍特異的循環Ｔ細胞または腫瘍常在Ｔ細胞上のＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＣＤ２４４、及び／またはＬＡＧ３の発現を調節し；腫瘍細胞上のＨＶＥＭ、ホスファチジルセリン、またはＰＤ−Ｌ２の発現を調節し；及び／またはＰＤ−１調節ＰＡＰ特異的Ｔ細胞の量を調節する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、方法は、例えば、以下の１つ以上を測定することによって、ＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１発現を測定することを含む：１）循環末梢血単核球と比較した循環ＰＡＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−１；２）腫瘍常在ＰＡＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−１；３）循環末梢血単核球と比較した循環ＣＤ８＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−１（非ＰＡＰ特異的）；４）腫瘍常在ＣＤ８＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−１（非ＰＡＰ特異的）；５）循環末梢血単核球と比較した循環ＰＡＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−Ｌ１；６）腫瘍常在ＰＡＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−Ｌ１；７）循環末梢血単核球と比較した循環ＣＤ８＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−Ｌ１（非ＰＡＰ特異的）；８）腫瘍常在ＣＤ８＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−Ｌ１（非ＰＡＰ特異的）；９）循環末梢血単核球と比較した循環ＰＡＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−１；１０）腫瘍常在ＰＡＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−１；１１）循環末梢血単核球と比較した循環ＣＤ４＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−１（非ＰＡＰ特異的）；１２）腫瘍常在ＣＤ４＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−１（非ＰＡＰ特異的）；１３）循環末梢血単核球と比較した循環ＰＡＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−Ｌ１；１４）腫瘍常在ＰＡＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−Ｌ１；１５）循環末梢血単核球と比較した循環ＣＤ４＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−Ｌ１（非ＰＡＰ特異的）；及び／または１６）腫瘍常在ＣＤ４＋Ｔ細胞が発現するＰＤ−Ｌ１（非ＰＡＰ特異的）。
【００２５】
いくつかの好ましい実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、併用療法が効果的であるかまたは効果的になるであろうことを示すバイオマーカーを提供する。すなわち、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）遺伝子由来のヌクレオチド配列を有する核酸を含むワクチンの投与後の、ＰＤ−Ｌ１の増加（例えば、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞の数の増加であり、これは別のバイオマーカーに対して絶対的または相対的に測定する）は、ヒトプログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）阻害剤（例えば、ＰＤ−１抗体）及び／またはヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）阻害剤（例えば、ＰＤ−Ｌ１抗体）の被験体への投与が、効果的な治療になるであろうという指標を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）遺伝子由来のヌクレオチド配列を有する核酸を含むワクチンによる治療の前に、患者試料をもとにＰＤ−Ｌ１の測定を行い、また、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）遺伝子由来のヌクレオチド配列を有する核酸を含むワクチンによる治療の後に、患者試料をもとにＰＤ−Ｌ１の測定を行う。ＰＤ−Ｌ１の値の増加は、ヒトプログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）及び／またはヒトプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）阻害剤（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体）が有効であろうという、成果の見込みの増加を示す。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１値は、患者の血液試料由来の循環ＰＤ−Ｌ１陽性細胞の数である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１値は、患者の血液試料中のＰＢＭＣに対する循環ＰＤ−Ｌ１陽性細胞の割合である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１陽性であるＣＤ４５陰性ＥＰＣＡＭ陽性生存細胞の数を、患者の血液試料中で測定し、例えば、患者の血液試料中で計数するか、またはＰＢＭＣの百分率として測定する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１陽性であるＣＤ４５陰性ＥＰＣＡＭ陽性生存細胞の存在、またはＰＤ−Ｌ１陽性であるＣＤ４５陰性ＥＰＣＡＭ陽性生存細胞の検出の増加は、治療が、例えばγインターフェロンを分泌するＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれか）の長期Ｔｈ−１優位型の表現型を生成するであろうことを示し、及び／または治療される患者が２年間で進行しなくなるであろうことを示す。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１値は、腫瘍において（例えば、腫瘍微小環境において）測定する。例えば、いくつかの実施形態では、患者の腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１陽性細胞の数は、腫瘍由来の試料中で採取した細胞の割合として測定する（例えば、顕微鏡視野内に認められる全細胞に対するＰＤ−Ｌ１陽性細胞の数）。
【００２８】
いくつかの実施形態では、被験体は、低レベルのＰＤ−Ｌ１、上昇を必要とするレベルのＰＤ−Ｌ１、及び／またはＰＤ−Ｌ１の標的レベル（例えば、ＰＤ−Ｌ１阻害剤が効果的であるために適切な）よりも低いレベルのＰＤ−Ｌ１を有する。例えば、いくつかの実施形態では、被験体は、低レベルのＰＤ−Ｌ１について、測定した、経験的に確立した、または以前に知られたカットオフよりも低いレベルのＰＤ−Ｌ１を有し；いくつかの実施形態では、被験体は、ＰＤ−Ｌ１の標的範囲の、測定した、経験的に確立した、または以前に知られた下限よりも低いレベルのＰＤ−Ｌ１を有する。いくつかの実施形態では、方法は、被験体のＰＤ−Ｌ１レベルを測定すること（例えば、被験体が低レベルのＰＤ−Ｌ１を有するかどうかを決定すること、ＤＮＡワクチンの投与量を決定すること、（例えば、ＰＤ−Ｌ１レベルを高めて標的範囲内に収めることなど））を含み、例えば、いくつかの実施形態では、方法は、被験体由来の試料中のＰＤ−Ｌ１のレベルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１レベルの測定結果を、ＤＮＡワクチンのその後の投与を知らせ、例えば、用量を調節し、例えば、ＰＤ−Ｌ１レベルを高めて標的範囲内に収めるために使用する。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）遺伝子由来のヌクレオチド配列を有する核酸を含むワクチンの被験体への第二の投与をさらに含む。本技術は、一連の投与及び測定に限定されず、例えば、いくつかの実施形態では、方法は、ワクチンを投与する１つ以上の工程及び／または被験体のＰＤ−Ｌ１レベルを測定する１つ以上の工程を含む。
【００２９】
例えば、いくつかの実施形態では、被験体は、ワクチン接種の前にＰＤ−Ｌ１を発現する低レベルまたは検出不可能レベルの循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞を有し、ＰＤ−Ｌ１を発現する循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の数は、ワクチン接種後に増加する。例えば、いくつかの実施形態では、ワクチン接種前の被験体は、循環末梢血単核球１０００個あたり１個未満のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞を有し、被験体は、本明細書において提供する技術によるワクチン接種後の循環末梢血単核球１０００個あたり１個超のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞を有する。いくつかの実施形態では、ワクチン接種前の被験体は、循環末梢血単核球５０００個あたり１個未満のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞を有し、被験体は、本明細書において提供する技術によるワクチン接種後の循環末梢血単核球５０００個あたり１個超のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞を有する。いくつかの実施形態では、ワクチン接種前の被験体は、循環末梢血単核球１０，０００個あたり１個未満のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞を有し、被験体は、本明細書において提供する技術によるワクチン接種後の循環末梢血単核球１０，０００個あたり１個超のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞を有する。いくつかの実施形態では、ワクチン接種前の被験体は、循環末梢血単核球５０，０００個あたり１個未満のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞を有し、被験体は、本明細書において提供する技術によるワクチン接種後の循環末梢血単核球５０，０００個あたり１個超のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞を有する。いくつかの実施形態では、ワクチン接種前の被験体は、循環末梢血単核球１００，０００個あたり１個未満のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞を有し、被験体は、本明細書において提供する技術によるワクチン接種後の循環末梢血単核球１００，０００個あたり１個超のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞を有する。いくつかの実施形態では、ワクチン接種前の被験体は、循環末梢血単核球５００，０００個あたり１個未満のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞を有し、被験体は、本明細書において提供する技術によるワクチン接種後の循環末梢血単核球５００，０００個あたり１個超のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞を有する。いくつかの実施形態では、ワクチン接種前の被験体は、循環末梢血単核球１，０００，０００個あたり１個未満のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞を有し、被験体は、本明細書において提供する技術によるワクチン接種後の循環末梢血単核球１，０００，０００個あたり１個超のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞を有する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する技術によるワクチン接種前の被験体は、ワクチン接種を受けていない被験体であり、いくつかの実施形態では、本明細書に記載する技術によるワクチン接種前の被験体は、提供する技術に従って１回以上ワクチン接種した被験体である。
【００３１】
したがって、いくつかの実施形態では、ワクチン接種前の被験体は、低い割合のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞；増加を必要とするある割合のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞；及び／またはＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の標的割合（例えば、ＰＤ−Ｌ１阻害剤を有効とするのに適切な）未満のある割合のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞を有する。例えば、いくつかの実施形態では、被験体は、全循環末梢血単核球の０．１％、０．０２％、０．０１％、０．００２％、０．００１％、０．０００２％、または０．０００１％未満のある割合のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞を有する（例えば、標的範囲の下位レベル及び／または下限のカットオフを提供する）。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ワクチン接種後の被験体は、増加した割合のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞を有し；及び／またはＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の標的割合（例えば、ＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤を有効とするのに適切な）を上回る割合のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞を有する。例えば、いくつかの実施形態では、被験体は、治療後の全循環末梢血単核球の０．１％、０．０２％、０．０１％、０．００２％、０．００１％、０．０００２％、または０．０００１％を上回る割合のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞を有する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、方法は、被験体由来の試料中のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の割合を測定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ワクチン接種前に、被験体由来の試料中のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の割合を測定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ワクチン接種後に、被験体由来の試料中のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の割合を測定することを含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ワクチン接種前に１回以上、及びワクチン接種後に１回以上、被験体由来の試料中のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の割合を測定することを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、被験体由来の試料中のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の割合を測定した結果を用いて、ＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の割合が低い被験体を同定し、例えば、本明細書において提供する技術によるワクチン接種を必要とする被験体を同定し、（例えば、ＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の割合を高めてＰＤ−Ｌ１を標的範囲内に収めるなどのために）投与するＤＮＡワクチンの用量を決定する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の割合を測定した結果を使用して、ＤＮＡワクチンのその後の投与を知らせ、例えば、用量及び／または投与計画を調整し、ＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の割合を高めて標的範囲内に収める。
【００３６】
いくつかの実施形態では、被験体由来の試料中のＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の割合の測定結果を使用して、ＰＤ−Ｌ１発現循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の量が増加した（例えば、割合が増加した）被験体を同定し、例えば、ワクチン接種が効果的であった被験体を同定する。
【００３７】
本技術は、細胞数を測定（計数、定量、特徴付けなど）するために用いられるアッセイに限定されない。いくつかの実施形態では、バイオマーカー（例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１）を発現する細胞を測定する。いくつかの実施形態では、バイオマーカーを発現する循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の数を測定する。いくつかの実施形態では、別のタイプの細胞または検出可能なすべての細胞に対して細胞数を測定する。例えば、いくつかの実施形態では、バイオマーカー（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、もしくは他のバイオマーカー、または本明細書に記載のバイオマーカーの組み合わせ）を発現する循環腫瘍細胞の数を、循環末梢血単核球の数と比較して測定する。または、いくつかの実施形態では、バイオマーカー（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、もしくは他のバイオマーカー、または本明細書に記載のバイオマーカーの組み合わせ）を発現する腫瘍常在細胞の数を、腫瘍から取り出した細胞の割合として測定し（例えば、顕微鏡視野の視野内に観察される細胞の割合として、腫瘍常在細胞の数を測定する）、例えば、腫瘍マーカーを発現する循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の割合を測定する。例えば、いくつかの実施形態では、バイオマーカーを発現する循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の数及び／またはバイオマーカーを発現する循環末梢血単核球の数を、フローサイトメトリーを用いて測定する。いくつかの実施形態では、バイオマーカーを発現する細胞を測定することは、そのバイオマーカーについての細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定すること（例えば、細胞集団内のＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１などのバイオマーカーのＭＦＩを測定すること）である。いくつかの実施形態では、バイオマーカーを発現する循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の数及び／または循環末梢血単核球の数を、特定の色素または染色剤（例えば、いくつかの実施形態では、バイオマーカーに特異的な抗体に結合した色素または染色剤）を用いて測定する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、循環腫瘍細胞を、フローベースのアッセイを用いて同定する。例えば、いくつかの実施形態では、ＣＤ４５−，ＥｐＣＡＭ＋であるとともにＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１バイオマーカーを発現する生存単一細胞の同定に基づいて細胞を同定する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーを発現する循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の数及び／または循環末梢血単核球の数を、免疫アッセイ、または細胞、細胞型、１つ以上の特定されたバイオマーカーを発現する細胞を計数するための当該分野で公知の他の技術を用いて測定する。いくつかの実施形態では、バイオマーカーを発現する循環腫瘍細胞または腫瘍常在細胞の数及び／または循環末梢血単核球の数を、免疫アッセイ、または細胞、細胞型、１つ以上の特定されたバイオマーカーを発現する細胞を計数するための当該分野で公知の他の技術などを用いて測定する。循環腫瘍細胞を計数するためのいくつかの実施形態は、上皮マーカー（ＥｐＣＡＭ、サイトケラチン）のＣＴＣ発現、共通の白血球マーカー（ＣＤ４５）を発現する細胞の枯渇、特定の物理的特性（細胞サイズ、密度、奇形性）、マイクロ流体プラットフォーム（例えば、サイズ及び／または奇形性によってＣＴＣを選択または同定するための）、またはエピトープと物理的特性による選択との組み合わせに依拠した技術を含む。例えば、いくつかの実施形態では、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４５を、細胞上で染色する（例えば、１つ以上の蛍光抗体を用いて）。いくつかの実施形態では、生存ＥｐＣＡＭ陽性細胞を検出し、微視的に計数する。いくつかの実施形態では、死細胞／生細胞分別染色色素、例えば、ヨウ化プロピジウムを用いて生細胞を同定する。そのような技術に基づく細胞を計数するためのキットは、例えば、循環腫瘍細胞用のＭＡＩＮＴＲＡＣ（ＳＩＭＦＯ  ＧｍｂＨ、Ｂａｙｒｅｕｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）血液検査などの市販品として入手可能である。いくつかの実施形態では、ＣＴＣの検出は、タンパク質バイオマーカー（例えば、免疫蛍光によって検出する）及び遺伝子（例えば、ＦＩＳＨ、ＮＧＳによって検出する）バイオマーカーの両方の使用を含む。いくつかの実施形態では、例えば、Ｅｐｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから市販されている、サイトケラチン（ＣＫ）及びＣＤ４５を標的とする複数の抗体、及び色素４′，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール，二塩酸塩（ＤＡＰＩ）によって、ＣＴＣを同定する（例えば、Ｗｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）“Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｐｉｃ  ＣＴＣ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ：Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ−Ｆｒｅｅ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ”，Ｊ  Ｃｉｒｃ  Ｂｉｏｍａｒｋ，２０１５，４：３参照。いくつかの実施形態では、ＣＤ４５−，ＥｐＣＡＭ＋細胞を検出することによって上皮由来のＣＴＣを計数し、全血中のサイトケラチン８，１８＋，及び／または１９＋）を表示する）（例えば、Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ，Ｒａｒｉｔａｎ，ＮＪのＣＥＬＬＳＥＡＲＣＨ（登録商標）循環腫瘍細胞キットとして市販されている）。
【００４０】
さらなる実施形態は、前立腺癌を有する被験体または前立腺癌を有するリスクのある被験体を治療するためのキットに関する。キットの実施形態は、被験体に投与するための医薬製剤を含む１つ以上の容器を含む。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、ＰＡＰ遺伝子由来のヌクレオチド配列を有する核酸を含むワクチンを含む第一の医薬組成物；及びＰＤ−１阻害剤を含む第二の医薬組成物を含む。本明細書で論じるように、様々な実施形態において、核酸は、ＰＡＰ遺伝子由来のヌクレオチド配列、例えば、ヒトまたはげっ歯類由来のＰＡＰ遺伝子を含む（例えば、核酸は、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３に記載のアミノ酸配列によって提供されるポリペプチドまたはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む）が、本技術は、ＰＡＰ遺伝子または遺伝子配列を取得する由来元のゲノム、生物、株などに限定されない。いくつかの実施形態では、核酸は、ｐＴＶＧ−ＨＰからなるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、第二の医薬組成物は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）、例えば、ペンブロリズマブ及び／またはニボルマブを含む。いくつかのキットの実施形態は、第一及び第二の医薬組成物を単回用量として提供して、例えば投与の便宜を提供し、さらには用量の測定及び／または投与時の誤差を排除及び／または低減する。いくつかの実施形態では、キットは、複数回用量のワクチン及び／またはＰＤ−１阻害剤を含み、複数回用量の投薬計画を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、キットは、核酸ワクチン及びＰＤ−１阻害剤を複数回投与する投与計画にとって十分な用量を提供するのに十分な量の第一の医薬組成物（例えば、投与する回数分の）及び第二の医薬組成物（例えば、投与する回数分の）を含む。いくつかの実施形態では、用量を、個々の容量で提供し（例えば、１用量につき１つの容量及び／または１つの容器、例えば、各用量を別々の容量及び／または容器に提供する）、いくつかの実施形態では、複数回用量を同じ容量及び／または容器に提供する）。
【００４１】
さらなる実施形態は、本明細書に含まれる教示に基づいて当業者には明らかであろう。
【００４２】
本技術のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の図面に関してよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本明細書に記載する２つの投与計画の実施形態を示す概略図。
【図２】ｐＴＶＧ−ＨＰで治療した患者がＰＡＰに対するＴ細胞応答を生じさせ、その機能がＰＤ−１によって調節されることを示すプロット。ｐＴＶＧ−ＨＰによる１２週間の治療の前（青色）または治療の２週間後（赤色）の２人の患者から得られたＰＢＭＣを、列挙される抗原１μｇ（ＴＴ／Ｄ＝破傷風トキソイド、陽性対照、ＰＳＡ＝陰性対照）とともに、１μｇの抗ＣＴＬＡ−４または抗ＰＤ１の存在下または非存在下でＳＣＩＤマウスの足蹠に入れた。２４時間時点でＤＴＨ応答を読み取った。示すように、両方の患者は免疫後のＰＡＰに対する応答を有しており、このことは、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１遮断のいずれかによって「明らかにされた」。
【図３】免疫応答−ＩＦＮγ及びグランザイムＢ  ＥＬＩＳＰＯＴ。ベースライン、６週目、１２週目、及び２４週目において、末梢血単核球をすべての被験体から収集し、ＥＬＩＳＰＯＴによる抗原特異的ＩＦＮγまたはグランザイムＢ分泌について評価した。陽性の抗原特異的応答は、少なくとも１／１００,０００細胞の頻度でベースライン値に対して少なくとも３倍である統計的に有意な応答（培地対照と比較して）として定義した。試験群毎にグループ化した患者を示す。赤い四角は陽性の応答を示す。
【図４】持続性ＰＡＰ特異的免疫を有する個体のＩＦＮγ及びグランザイムＢ  ＥＬＩＳＰＯＴデータ。図３のすべての治療後時点においてＰＡＰ特異的免疫を示した３人の個人のＥＬＩＳＰＯＴデータを示す。上部４パネルは、群１において治療した２人の患者由来であった。下部パネルは、群２において治療した患者由来であった。
【図５】血清ＰＳＡ応答。治療前及び治療経過中の全個体から血清ＰＳＡ値を収集した。血清ＰＡＰ値は、ベースライン時及び治療経過中の個体から収集した。パネルＡ：試験１日目からの血清ＰＳＡ値の変化率を評価した。パネルＢ：ペンブロリズマブ治療の開始日（群１の患者の場合は１日目、群２の患者の場合は１２週目）からの血清ＰＳＡ値の変化率を評価した。パネルＣ：試験１日目からの血清ＰＳＡの最大変化率。パネルＤ：試験１日目からの血清ＰＡＰの最大変化率。（投与計画については図１参照）。
【図６】Ｘ線撮影の客観的変化。群１において治療した２人の患者のベースライン及び２４週目（上部パネル）または１２週目（下部パネル）において収集したＣＴ画像を示す。矢印はリンパ節転移を指す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
図面は必ずしも縮尺通りに描かれておらず、図中の物体は必ずしも互いに関連する縮尺で描かれていないことは理解されたい。図面は、本明細書に開示する装置、システム、及び方法の様々な実施形態を明確にし、理解することを意図して表現したものである。可能な限り、図面全体にわたって同じ参照番号は同一または同様の部分を指すために使用される。さらに、図面は、本教示の範囲を決して限定するものではないことを理解されたい。
【００４５】
〔詳細な説明〕
本明細書では、がんの治療及び予防に関連する技術、特に、限定するものではないが、前立腺癌の治療に関連する組成物及び方法を提供する。この様々な実施形態の詳細な説明では、説明のために多数の特定の詳細を示して、開示する実施形態の完全な理解を提供する。しかしながら、当業者であれば、これらの特定の詳細の有無にかかわらず、これらの様々な実施形態を実施し得ることを理解するであろう。他の例では、構造及び装置をブロック図形式で示す。さらに、当業者であれば、方法を提示し、実施する特定の手順が例示的であり、その手順が様々に変更可能であるとともに、それでもなお、それが本明細書に開示する様々な実施形態の趣旨及び範囲内にとどまり得ると考えられることを容易に理解することができる。
【００４６】
特許、特許出願、記事、書籍、論文及びインターネットウェブページを含むがこれらに限定されない、本願において引用するすべての文献及び類似の資料は、あらゆる目的のためにその全体を参照として明示的に援用する。他に定義されない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本明細書に記載する様々な実施形態が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。援用する参考文献における用語の定義が、本教示において提供する定義と異なるように思われる場合、本教示で提供する定義が優先するものとする。本明細書中で使用する節の見出しは、単に構成上の目的のためのものに過ぎず、決して記載する主題を限定するものとして解釈すべきではない。
【００４７】
［定義］
本技術の理解を容易にするために、いくつかの用語及び語句を以下に定義する。さらなる定義は、詳細な説明の全体を通して説明を行う。
【００４８】
本明細書及び特許請求の範囲全体を通して、以下の用語は、文脈上、他に明確な指示がない限り、本明細書に明示的に関連する意味をとる。本明細書中で使用する語句「一実施形態では」とは、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らないが、同じ実施形態を指す場合もある。さらに、本明細書中で使用する語句「別の実施形態では」とは、必ずしも異なる実施形態を指すとは限らないが、異なる実施形態を指す場合もある。したがって、以下に説明するように、本発明の様々な実施形態は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、容易に組み合わせ得る。
【００４９】
さらに、本明細書中で使用する場合、用語「または」とは、包括的な「または」の演算子であり、文脈上、他に明確な指示がない限り、用語「及び／または」と同等である。用語「基づいて」は、排他的なものではなく、文脈上、他に明確な指示がない限り、記載していない追加の要素に基づくことが許容される。また、明細書全体にわたって、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の意味には、複数の言及が含まれる。「において（ｉｎ）」の意味には、「において（ｉｎ）」及び「において（ｏｎ）」が含まれる。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、「最良総合効果」とは、ベースラインの後に記録される最小の測定値を進行性疾患の基準として取る、ベースラインから疾患進行／再発までの間に記録される最良の応答である。
【００５１】
本明細書中で使用する場合、「応答の最初の文書化」とは、治療の開始から、本明細書中で定義する治療に対する部分奏効または完全奏効の最初の文書化までの間の時間を指す。
【００５２】
本明細書中で使用する場合、「応答の持続時間」とは、治療を開始してから記録される最小の測定値を基準として取り、測定基準が完全または部分奏効（いずれの状態が最初に記録されようとも）を満たす時間から、再発性または進行性疾患が客観的に記録される最初の日までの間の測定期間を指す。
【００５３】
本明細書中で使用する場合、「完全奏効期間」とは、完全奏効に適合する測定基準が満たされた時点から、再発疾患が客観的に記録される最初の日までの測定期間を指す。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、「安定期間」とは、ベースライン以降に記録された最小測定値を基準として、ベースラインから、疾患進行の基準が満たされるまでの測定を指す。
【００５５】
本明細書中で使用する場合、「生存」とは、記載する技術による治療の開始から、任意の原因による死亡までの、または打ち切りとなった患者における最後の追跡までの時間間隔を指す。
【００５６】
本明細書中で使用する場合、用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」とは、ペプチド結合を介して結合したアミノ酸を含む化合物を指し、これらは同じ意味で使用される。遺伝子によってコードされる「タンパク質」または「ポリペプチド」は、その遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に限定されず、タンパク質の翻訳後修飾を含む。用語「アミノ酸配列」が、タンパク質分子のアミノ酸配列を指すために本明細書中に記載されている場合、「アミノ酸配列」及び同様の用語、例えば「ポリペプチド」または「タンパク質」は、そのアミノ酸配列を、記載するタンパク質分子に関する完全な天然のアミノ酸配列に限定することを意図するものではない。さらに、「アミノ酸配列」は、タンパク質をコードする核酸配列から推定することができる。本明細書において、従来の１文字及び３文字のアミノ酸コードを以下のように使用する―アラニン：Ａｌａ、Ａ；アルギニン：Ａｒｇ、Ｒ；アスパラギン：Ａｓｎ、Ｎ；アスパラギン酸：Ａｓｐ、Ｄ；システイン：Ｃｙｓ、Ｃ；グルタミン酸：Ｇｌｕ、Ｅ；グルタミン：Ｇｌｎ、Ｑ；グリシン：Ｇｌｙ、Ｇ；ヒスチジン：Ｈｉｓ、Ｈ；イソロイシン：Ｉｌｅ、Ｉ；ロイシン：Ｌｅｕ、Ｌ；リジン：Ｌｙｓ、Ｋ；メチオニン：Ｍｅｔ、Ｍ；フェニルアラニン：Ｐｈｅ、Ｆ；プロリン：Ｐｒｏ、Ｐ；セリン：Ｓｅｒ、Ｓ；スレオニン：Ｔｈｒ、Ｔ；トリプトファン：Ｔｒｐ、Ｗ；チロシン：Ｔｙｒ、Ｙ；Ｖａｌｉｎｅ：Ｖａｌ、Ｖ。本明細書中で使用する場合、コードＸａａ及びＸは、任意のアミノ酸を指す。
【００５７】
用語「部分」は、タンパク質に関して使用する場合（「所与のタンパク質の一部」のように）、そのタンパク質の断片、例えば、タンパク質の「ペプチド」を指す。断片は、４アミノ酸残基〜全アミノ酸配列−１アミノ酸のサイズ範囲であり得る（例えば、サイズ範囲は、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のアミノ酸〜最大で全アミノ酸配列−１アミノ酸を含む）。
【００５８】
ポリペプチドに関して使用する場合、用語「相同体」または「相同な」とは、２つのポリペプチド間の高度の配列同一性、または三次元構造間の高度の類似性、または活性部位と作用機序との間の高度の類似性を指す。好ましい実施形態では、相同体は、参照配列に対して、６０％を上回る配列同一性、より好ましくは７５％を上回る配列同一性、さらにより好ましくは９０％を上回る配列同一性を有する。
【００５９】
ポリペプチドに対して用いる場合、用語「実質的同一性」とは、２つのペプチド配列をプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによってデフォルトのギャップウェイトを使用して最適にアラインメントする場合に、これらの配列が、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性またはそれ以上（例えば、９９％の配列同一性）を共有することを意味する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なっている。
【００６０】
ポリペプチドに関して使用する場合、用語「変異体」及び「突然変異体」とは、別のアミノ酸、通常は関連するポリペプチドに対し、１つ以上のアミノ酸が異なっているアミノ酸配列を指す。変異体は、類似の構造的または化学的性質を有する「保存的」変化を有し得る。保存的アミノ酸置換の１つのタイプは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。より稀に、変異体は、「非保存的」変化（例えば、グリシンからトリプトファンへの置換）を有し得る。同様のマイナーな変化には、アミノ酸の欠失または挿入（例えば、付加）、またはその両方が含まれ得る。生物学的活性を無効にすることなく、どのアミノ酸残基及び何個のアミノ酸残基を置換、挿入または欠失してもよいかを判定するためのガイダンスは、当該技術分野で周知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳｔａｒソフトウェアを用いて見出し得る。変異体は、機能アッセイで試験することができる。好ましい変異体は、１０％未満、好ましくは５％未満、さらにより好ましくは２％未満の変化を有する（置換、欠失などを問わず）。
【００６１】
核酸またはタンパク質の変異体を記載するために使用する命名法は、変異のタイプ、塩基またはアミノ酸の変化を特定する。ヌクレオチド置換（例えば、７６Ａ＞Ｔ）の場合、数は５′末端からのヌクレオチド位置であり、第一の文字は野生型ヌクレオチドを表し、第二の文字は野生型から置換したヌクレオチドを表す。この例では、７６番目のアデニンをチミンに置換した。ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、及びＲＮＡの突然変異を区別することが必要になる場合、簡易的な慣習が用いられる。例えば、ヌクレオチド配列の１００番目の塩基がＧからＣに変異している場合、ゲノムＤＮＡに突然変異が生じた場合はｇ．１００Ｇ＞Ｃ、ミトコンドリアＤＮＡに突然変異が生じた場合はｍ．１００Ｇ＞Ｃ、ｃＤＮＡに突然変異が生じた場合はｃ．１００Ｇ＞Ｃ、ＲＮＡに突然変異が生じた場合はｒ．１００ｇ＞ｃと記述されるであろう。アミノ酸置換（例えば、Ｄ１１１Ｅ）の場合、第一の文字は野生型アミノ酸の１文字コードであり、数はＮ末端からのアミノ酸位置であり、第二の文字は突然変異に存在するアミノ酸の１文字コードである。ナンセンス変異は、第二のアミノ酸（例えばＤ１１１Ｘ）に対してＸで表される。アミノ酸欠失（例えば、ΔＦ５０８、Ｆ５０８ｄｅｌ）については、ギリシャ文字Δ（デルタ）または文字「ｄｅｌ」は、欠失を示す。文字は野生型に存在するアミノ酸を指し、数は野生型に存在する場合のアミノ酸のＮ末端からの位置である。イントロン突然変異は、イントロン番号またはｃＤＮＡ位置によって指定され、ＧＴスプライスドナー部位のＧから始まる正数、またはＡＧスプライスアクセプター部位のＧから始まる負数のいずれかを提供する。ｇ．３′＋７Ｇ＞Ｃは、ゲノムＤＮＡレベルでのｎｔ＋７におけるＧからＣへの置換を示す。全長ゲノム配列が公知である場合、その突然変異は、ゲノム参照配列のヌクレオチド番号によって最もよく指定される。ｄｅｎ  Ｄｕｎｎｅｎ  ＆  Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ，“Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｄｅｓｃｒｉｂｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ”．  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  １５：７−１２（２０００）；Ｏｇｉｎｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．９（１）：１−６（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２００７）参照。これらの文献はあらゆる目的のためにその全体を参照として援用する。
【００６２】
用語「ドメイン」とは、ポリペプチドに関して使用する場合、ユニークな構造的特徴及び／または機能的特徴を有するポリペプチドのサブセクションを指し；通常、この特徴は多様なポリペプチドにわたって類似している。サブセクションは、通常、隣接するアミノ酸を含むが、フォールディングまたは他の配置構成によって、共同的に作用するアミノ酸、または近接するアミノ酸を含む場合もある。タンパク質ドメインの例には、膜貫通ドメイン及びグリコシル化部位が含まれる。
【００６３】
用語「遺伝子」は、ＲＮＡもしくはポリペプチドまたはその前駆体（例えば、プロインスリン）の産生に必要なコード配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を指す。機能的ポリペプチドは、全長コード配列、またはポリペプチドの所望の活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル伝達など）が保持される限り、コード配列の任意の部分によってコードされ得る。遺伝子に関して使用する場合、用語「部分」とは、その遺伝子の断片を指す。断片は、数ヌクレオチド〜全遺伝子配列−１ヌクレオチドのサイズ範囲であり得る。したがって、「遺伝子の少なくとも一部を含むヌクレオチド」は、遺伝子の断片または遺伝子全体を含み得る。
【００６４】
用語「遺伝子」はまた、構造遺伝子のコード領域を包含し、また、その遺伝子が全長ｍＲＮＡの長さに等しくなるように、コード領域に隣接して５′及び３′両方の末端上に、いずれの末端にも約１ｋｂの距離で位置する配列を含む。コード領域の５′に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５′非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の３′すなわち下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３′非翻訳配列と呼ばれる。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡ形態及びゲノム形態の両方を包含する。ゲノム形態すなわち遺伝子のクローンは、「イントロン」または「介在領域」もしくは「介在配列」と呼ばれる非コード配列で中断されたコード領域を含む。イントロンは、核内ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントであり；イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含む場合がある。イントロンは、核内または一次転写産物から除去または「スプライスアウト」され；したがって、イントロンは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物には存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳中に機能して、新生ポリペプチド中のアミノ酸の配列または順序を指定する。
【００６５】
イントロンを含有することに加えて、ゲノム形態の遺伝子はまた、ＲＮＡ転写産物上に存在する配列の５′及び３′末端の両方に位置する配列を含み得る。これらの配列は、「隣接」配列または領域と呼ばれる（これらの隣接配列は、ｍＲＮＡ転写産物上に存在する非翻訳配列の５′または３′に位置する）。５′隣接領域は、遺伝子の転写を調節または影響を与えるプロモーター及びエンハンサーなどの調節配列を含み得る。３′隣接領域は、転写の終結、転写後切断及びポリアデニル化を指示する配列を含み得る。
【００６６】
用語「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド」または「核酸」とは、２つ以上、好ましくは３つ以上、通常は１０を超えるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む分子を指す。正確なサイズは、多くの因子に依存し、オリゴヌクレオチドの最終的な機能または使用に依存する。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはそれらの組み合わせを含む任意の様式で生成し得る。本用語は、限定されないが、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシ−アミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５′−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリンを含むＤＮＡ及びＲＮＡの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列を包含する。
【００６７】
以下の用語は、２つ以上のポリヌクレオチド間の配列関係：「参照配列」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、及び「実質的同一性」を記載するために使用される。「参照配列」は、配列比較のための基礎として使用する定義された配列であり；参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば配列リストに示す全長ｃＤＮＡ配列のセグメントであってもよく、または完全な遺伝子配列を含んでいてもよい。一般的に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長であり、多くの場合、少なくとも２５ヌクレオチド長であり、多くの場合、少なくとも５０ヌクレオチド長である。２つのポリヌクレオチドは、各々が（１）２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部）を含み得、（２）２つのポリヌクレオチド間で異なる配列をさらに含み得るため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の比較は、一般的には、２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウインドウ」上で比較して、配列類似性の局所領域を同定及び比較することによって行う。本明細書中で使用する場合、「比較ウインドウ」とは、少なくとも２０個の連続したヌクレオチド位置の概念的セグメントを指し、そのセグメント内で、ポリヌクレオチド配列を少なくとも２０個の連続したヌクレオチドの参照配列と比較することができ、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。比較ウインドウをアラインメントするための配列の最適なアラインメント法を、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム［Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈの相同性アルゴリズム［Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）］、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索法［Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４（１９８８）］、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、または検査によって実施してもよく、これらの様々な方法によって生成した最良の（すなわち、比較ウインドウ上で最も高い割合の相同性をもたらす）アラインメントを選択する。用語「配列同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列が、比較ウインドウにわたって同一であることを意味する（すなわち、ヌクレオチド毎に）。用語「配列同一性の割合」は、比較ウインドウにわたって２つの最適にアラインメントした配列を比較し、両方の配列に同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が存在する位置の数を測定して一致する位置の数を取得し、一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置���総数（すなわちウインドウサイズ）で除算し、結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることによって算出される。本明細書で使用する場合、用語「実質的同一性」とは、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、ポリヌクレオチドは、少なくとも２０ヌクレオチド位置の比較ウインドウにわたって、多くの場合には少なくとも２５〜５０ヌクレオチドのウインドウにわたって、参照配列と比較して、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０〜９５％、より多くの場合には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、配列同一性の割合は、参照配列を、比較ウインドウにわたって参照配列の合計２０％以下の欠失または挿入を含み得るポリヌクレオチド配列と比較することによって計算する。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、本発明で請求する組成物の完全長配列のセグメントとしてもよい。
【００６８】
遺伝子に関して用いる場合、用語「野生型」とは、天然起源の供給源から単離された遺伝子の特徴を有する遺伝子を指す。遺伝子産物に関して用いる場合、用語「野生型」とは、天然起源の供給源から単離された遺伝子産物の特徴を有する遺伝子産物を指す。対象物に用いる場合、用語「天然起源の」とは、対象物が自然界に見出され得るという事実を指す。例えば、自然界の供給源から単離することが可能で、実験室内で人手による意図的な改変がなされていない生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然起源である。野生型遺伝子は、集団中に最も頻繁に観察される遺伝子であり、したがって、その遺伝子の「正常」または「野生型」形態と任意に指定される。対照的に、遺伝子または遺伝子産物に関して用いる場合、用語「改変型の」または「突然変異体」とは、それぞれ、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、配列及び／または機能的特性に改変を示す（すなわち、特徴が改変された）遺伝子または遺伝子産物を指す。天然起源の突然変異体を単離することができることには留意されたい；これらは、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、それらが改変された特徴を有するという事実によって同定される。
【００６９】
用語「遺伝子発現」とは、遺伝子にコードされた遺伝情報を、遺伝子の「転写」により（すなわち、ＲＮＡポリメラーゼの酵素作用を介して）ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｓｎＲＮＡ）へ、及びｍＲＮＡの「翻訳」によりタンパク質へ変換するプロセスを指す。遺伝子発現は、プロセスの多くの段階で調節することができる。
【００７０】
本明細書中で使用する場合、バイオマーカーの「レベル」またはバイオマーカー（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＥｐＣａｍ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＴＬＡ−４を含むがこれらに限定されないバイオマーカー、またはＤＡＰＩもしくは生細胞／死細胞染色などの染色によって産生されるバイオマーカー）の発現の「レベル」とは、バイオマーカーを発現する細胞の数（例えば、絶対数として、または別の細胞集団（例えば、全細胞）と比較して計算される）か、または細胞集団の表面上のバイオマーカーの細胞あたりの平均発現を指す。
【００７１】
「上方制御」または「活性化」とは、遺伝子発現産物（すなわち、ＲＮＡまたはタンパク質）の産生を増加させる調節を指し、一方、「下方制御」または「抑制」とは、産生を減少させる調節を指す。上方制御または下方制御に関与する分子（例えば、転写因子）は、多くの場合、「アクチベーター」及び「リプレッサー」と呼ばれる。
【００７２】
抗体とタンパク質またはペプチドとの相互作用に関して用いる場合、用語「特異的結合」または「特異的に結合」とは、相互作用がタンパク質上の特定の構造（すなわち、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味し；言い換えれば、抗体は、タンパク質一般ではなく特定のタンパク質構造を認識して結合している。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識化「Ａ」及び抗体を含有する反応において、エピトープＡを含有するタンパク質（または遊離の非標識Ａ）を存在させると、抗体に結合した標識化Ａの量は減少するであろう。
【００７３】
本明細書中で使用する場合、用語「作動可能に連結した」とは、ヌクレオチド配列の転写または翻訳が、プロモーター、エンハンサー、転写因子結合部位などの別の機能的ヌクレオチド配列の影響下にあることを意味するものとする。「作動可能に連結した」とはまた、各ＤＮＡ断片のコード配列が適切なリーディングフレームを維持するような２つのヌクレオチド配列の連結を意味するものとする。このようにして、被験体において発現させるために、プロモーター、エンハンサーなどのヌクレオチド配列を、関心対象のヌクレオチド配列、例えば、ＰＡＰをコードするヌクレオチド配列とともにＤＮＡ構築物中に提供する。用語「異種ヌクレオチド配列」とは、自然界においては、プロモーター配列と作動可能に連結していない配列を意味するものとする。このヌクレオチド配列はプロモーター配列に対して異種であるが、被験体に対して同種（「天然」）または異種（「外来」）であり得る。
【００７４】
本明細書中で使用する場合、用語「治療」とは、疾患、疾患の症状、もしくは疾患の素因を、治癒、回復、緩和、軽減、変更、治療、寛解、改善するか、もしくは影響を与えることを目的として、本明細書に記載するか、もしくは本明細書に記載する方法によって同定される治療剤（例えば、ＤＮＡワクチン、ＰＤ−１阻害剤）を患者へ塗布もしくは投与すること、または疾患、疾患の症状もしくは疾患の素因を有する患者から単離した組織もしくは細胞株へ治療剤を塗布もしくは投与することとして定義される。
【００７５】
本明細書中で使用する場合、用語「疾患のリスクがある」とは、特定の疾患（例えば、前立腺癌）を経験する素因がある被験体を指す。この素因は、遺伝的（疾患を経験する特定の遺伝的傾向、例えば遺伝性障害）であり得るか、または他の要因（例えば、環境条件、環境中に存在する有害な化合物への曝露など）によるものであり得る。したがって、本発明を特定のリスクに限定することを意図するものではなく、本発明を特定の疾患に限定することも意図していない。
【００７６】
本明細書中で使用する場合、「安定な」化合物とは、調製及び単離することができ、その構造及び特性が、本明細書に記載する目的（例えば、被験体への治療的、予防的、及び／または診断的投与）のために化合物を使用するのに十分な時間、本質的に変化させずに維持するか、維持させることができる化合物である。
【００７７】
本技術による組成物は、薬学的に許容可能な塩の形態で投与することができる。用語「薬学的に許容可能な塩」とは、親化合物の有効性を有し、生物学的またはその他の点で望ましくない（例えば、そのレシピエントに対して毒性でも有害でもない）塩を指す。適切な塩には、例えば、本技術の化合物の溶液を、塩酸、硫酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、または安息香酸などの薬学的に許容可能な酸の溶液と混合することによって形成し得る酸付加塩が含まれる。本技術において使用する特定の化合物は、酸性部分（例えば、ＣＯＯＨまたはフェノール基）を担持していてもよく、その場合、その適切な薬学的に許容可能な塩には、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウムまたはカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウムまたはマグネシウム塩）、及び第四級アンモニウム塩などの適切な有機リガンドで形成される塩が含まれ得る。また、酸（ＣＯＯＨ）またはアルコール基が存在する場合、薬学的に許容可能なエステルを用いて、化合物の溶解度または加水分解特性を改変することができる。例えば、薬学的に許容可能な塩には、金属（無機）塩及び有機塩の両方が含まれ、そのリストが、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｇ．１４１８（１９８５）に記載されている。物理的及び化学的特性に基づいて適切な塩形態を選択することは、当業者には周知である。当業者であれば理解するように、薬学的に許容可能な塩として、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、臭化水素酸塩、及び硝酸塩などの無機酸の塩；リンゴ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩またはパモ酸塩、サリチル酸塩、及びステアリン酸塩などの有機酸の塩が挙げられるが、これらに限定されない。同様に薬学的に許容可能な陽イオンとして、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム、及びアンモニウム（特に、第二級アミンとのアンモニウム塩）が挙げられるが、これらに限定されない。本技術の範囲には、結晶形、水和物、及び溶媒和物も含まれる。
【００７８】
化合物に関して、用語「投与」及びその変形（例えば、化合物、ワクチン、薬物などを「投与すること」）は、治療または予防を必要とする個体に化合物または化合物のプロドラッグを提供することを意味する。本技術の化合物またはそのプロドラッグを１つ以上の他の活性薬剤と組み合わせて提供する場合、「投与」及びその変形は、それぞれ、化合物またはプロドラッグ及び他の薬剤を同時に、または異なる時間に提供することを含むものとして理解される。本明細書中で使用する場合、用語「同時投与」とは、好ましくは互いに２４時間以内に２つの薬剤を投与することを指す。併用薬剤を「同時に」（例えば、互いに２４時間以内に）投与する場合、それらを単一の組成物で一緒に投与することができ、またはそれらを別々に投与することができる。それらを別々に投与する場合、第一の薬剤、例えばＰＡＰワクチンを投与し、患者をモニタリングし、次いで第二の薬剤、例えばＰＤ−１阻害剤を特定の時間内に、好ましくは２４時間以内に投与する。本明細書中で使用する場合、用語「組成物」は、特定の成分を特定の量で含む生成物、及び特定の成分を特定の量で組み合わせることから直接的または間接的に得られる任意の生成物を包含することを意図する。
【００７９】
本明細書中で使用する場合、用語「同時投与」及び「同時投与すること」は、被験体への少なくとも２つの薬剤（複数可）（例えば、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤）または療法の投与を指す。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤または療法の同時投与は同時的である。他の実施形態では、第一の薬剤／療法を、第二の薬剤／療法の前に投与する。いくつかの実施形態では、同時投与は、同じまたは異なる投与経路を介して行うことができる。当業者であれば、使用する様々な薬剤または療法の製剤及び／または投与経路が様々に異なり得ることを理解している。同時投与のための適切な用量は、当業者であれば容易に決定することができる。いくつかの実施形態では、薬剤または療法を同時投与する場合、それぞれの薬剤または療法を、それらを単独で投与する場合に適切である用量よりも低い用量で投与する。したがって、同時投与は、薬剤または療法の同時投与が潜在的に有害な（例えば、毒性の）薬剤（複数可）の必要用量を低下させる実施形態において、及び／または２つ以上の薬剤の同時投与が他の薬剤の同時投与による１つの薬剤の有益な効果に対する被験体の感作をもたらす実施形態において特に望ましい。
【００８０】
本明細書中で使用する場合、用語「薬学的に許容可能な」とは、医薬組成物の成分が互いに適合し、そのレシピエントに有害でないことを意味する。
【００８１】
本明細書中で使用する場合、用語「被験体」とは、治療、観察、または実験の対象である動物、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトを指す。
【００８２】
本明細書中で使用する場合、用語「有効量」とは、研究者、獣医師、医師、または他の臨床医によって求められている細胞、組織、器官、系、動物、またはヒトにおける生物学的または医学的応答を誘発する活性化合物または薬剤の量を意味する。いくつかの実施形態では、有効量は、治療しようとする疾患または病態の症状を緩和するための「治療有効量」である。いくつかの実施形態では、有効量は、予防しようとする疾患または病態の症状を予防するための「予防有効量」である。活性化合物を塩として投与する場合、活性成分の量に対する言及は、化合物の遊離形態（非塩形態）に対するものである。
【００８３】
本技術の方法では、化合物は、場合により塩の形態で、活性薬剤をその薬剤の作用場所に接触させる任意の手段によって投与することができる。それらは、個々の治療剤として、または併用治療剤として、医薬品とともに使用するために利用可能な任意の従来の手段によって投与することができる。それらは単独で投与することができるが、一般的には、選択した投与経路及び標準的な薬務実務に基づいて選択した医薬担体とともに投与する。本技術の化合物は、有効量の化合物及び従来の無毒性の薬学的に許容可能な担体、アジュバント、及びビヒクルを含有する単位用量の医薬組成物の形態で、例えば、経口的に、非経口的に（皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射、または注入技術を含む）、吸入スプレーにより、または直腸投与により、投与することができる。経口投与に適した液体製剤（例えば、懸濁液、シロップ、エリキシルなど）は、当該技術分野で公知の技術に従って調製することができ、水、グリコール、油、アルコールなどの通常の媒体のいずれかを使用することができる。経口投与に適した固形製剤（例えば、粉末、丸剤、カプセル、及び錠剤）は、当該分野で公知の技術に従って調製することができ、例えば、デンプン、糖、カオリン、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などの固形の賦形剤を用いることができる。非経口組成物は、当該技術分野で公知の技術に従って調製することができ、一般的には、担体として滅菌水、及び場合により、他の成分、例えば溶解補助剤を使用する。注入可能な溶液は、当該分野で公知の方法に従って調製することができ、その場合、担体は、生理食塩水、グルコース溶液、または生理食塩水とグルコースの混合物を含有する溶液を含む。本技術で使用する医薬組成物の調製における使用に適した方法、及びその組成物における使用に適した成分のさらなる説明は、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９９０により編集されたＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎに提供されている。本技術は、本明細書において提供する合成反応スキームに示す様々な方法によって作製することができる。これらの化合物の調製に使用する出発材料及び試薬は、一般的に、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．などの商業的供給元から入手可能であるか、またはＦｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−２１；Ｒ．Ｃ．ＬａＲｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９９；Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂ．Ｔｒｏｓｔ  ａｎｄ  Ｉ．Ｆｌｅｍｉｎｇ（Ｅｄｓ．）ｖｏｌ．１−９  Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１；Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ．Ｒ．Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ  ａｎｄ  Ｃ．Ｗ．Ｒｅｅｓ（Ｅｄｓ）Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  １９８４，ｖｏｌ．１−９；Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉ���  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＩ，Ａ．Ｒ．Ｋａｔｒｉｔｚｋｙ  ａｎｄ  Ｃ．Ｗ．Ｒｅｅｓ（Ｅｄｓ）Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  １９９６，ｖｏｌ．１−１１；及びＯｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４０などの参考文献に記載される手順に従って、当業者に公知の方法によって調製される。
【００８４】
本明細書で使用する用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」とは、人工環境、及び人工環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境として、試験管及び細胞培養物が挙げられるが、これらに限定されない。用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」とは、自然環境（例えば、動物または細胞）及び自然環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。
【００８５】
本明細書中で使用する場合、用語「免疫応答を誘導するための組成物」とは、いったんこれを被験体に投与すると（例えば、１回、２回、３回またはそれ以上（例えば、数週間、数か月または数年おきに））、被験体において免疫応答を刺激し、生成し、及び／または誘発する（例えば、抗体の産生をもたらす）組成物を指す。いくつかの実施形態では、組成物は、核酸及び１つ以上の他の化合物または、治療剤、生理学的に許容可能な液体、ゲル、担体、希釈剤、アジュバント、賦形剤、サリチル酸塩、ステロイド、免疫抑制剤、免疫賦活剤、抗体、サイトカイン、抗生物質、結合剤、充填剤、防腐剤、安定剤、乳化剤、及び／または緩衝剤を含むがこれらに限定されない作用物質を含む。免疫応答は、先天的（例えば、非特異的）免疫応答または学習された（例えば、獲得した）免疫応答であり得る。
【００８６】
本明細書で使用する場合、用語「アジュバント」とは、免疫応答を刺激することができる任意の物質を指す。いくつかのアジュバントは、免疫系の細胞の活性化を引き起こすことができる（例えば、アジュバントは、免疫細胞にサイトカインを産生させ、分泌させることができる）。免疫系の細胞の活性化を引き起こすことができるアジュバントの例として、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｑ．ｓａｐｏｎａｒｉａ樹皮から精製したサポニン、例えばＱＳ２１（ＨＰＬＣ分画により、２１番目のピークにおいて溶出される糖脂質；Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓ．）；ポリ（ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン（ＰＣＰＰポリマー；Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ＵＳＡ）；モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ；Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｍｏｎｔ．）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）及びスレオニルムラミルジペプチド（ｔ−ＭＤＰ；Ｒｉｂｉ）などのリポ多糖の誘導体；ＯＭ−１７４（脂質Ａに関連するグルコサミン二糖；ＯＭ  Ｐｈａｒｍａ  ＳＡ、Ｍｅｙｒｉｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；ならびにＬｅｉｓｈｍａｎｉａ属伸長因子（精製Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａタンパク質；Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）が挙げられるが、これらに限定されない。伝統的なアジュバントは、当該技術分野で周知であり、例えば、リン酸アルミニウム塩または水酸化物塩（「ミョウバン」）が挙げられる。いくつかの実施形態では、本技術の組成物を、１つ以上のアジュバントとともに投与する。
【００８７】
本明細書中で使用する場合、用語「免疫応答を誘導するために有効な量」（例えば、免疫応答を誘導するための組成物の）とは、被験体において、免疫応答を刺激し、生成し、及び／または誘発するために必要とされる（例えば、被験体に投与する際に）用量レベルを指す。有効量は、１回以上の投与、塗布、または投薬（例えば、同じまたは異なる経路を介した）において投与することができ、特定の製剤または投与経路に限定することを意図するものではない。
【００８８】
本明細書中で使用する場合、用語「前記被験体が免疫応答を生成するような条件下で」とは、免疫応答の（例えば、先天性または後天性の）任意の定性的または定量的誘導、生成、及び／または刺激を指す。
【００８９】
本明細書中で使用する場合、用語「免疫応答」とは、被験体の免疫系による応答を指す。例えば、免疫応答として、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）活性化、リンホカイン（例えば、サイトカイン（例えば、Ｔｈ１またはＴｈ２型サイトカイン）またはケモカイン）発現及び／または分泌、マクロファージ活性化、樹状細胞活性化、Ｔ細胞活性化（例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＮＫ細胞活性化、及び／またはＢ細胞活性化（例えば、抗体産生及び／または分泌）における検出可能な変化（例えば、増加）が挙げられるが、これらに限定されない。免疫応答のさらなる例として、ＭＨＣ分子への免疫原（例えば、抗原（例えば、免疫原性ポリペプチド））の結合、及び細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）応答の誘導、Ｂ細胞応答（例えば抗体産生）の誘導、及び／またはＴヘルパーリンパ球応答、及び／または免疫原性ポリペプチドの由来元の抗原に対する遅延型過敏（ＤＴＨ）応答、免疫系の細胞増殖（例えば、細胞集団の増殖）（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞（例えば、任意の発達段階の（例えば、形質細胞））、ならびに抗原提示細胞による抗原のプロセシング及び提示の増加が挙げられる。免疫応答は、被験体の免疫系が外来性のものとして認識する免疫原（例えば、非自己抗原、または外来性のものとして認識される自己抗原）に対するものであってもよい。したがって、本明細書中で使用する場合、「免疫応答」とは、先天性免疫応答（例えば、Ｔｏｌｌ受容体シグナル伝達カスケード）、細胞を介した免疫応答（例えば、Ｔ細胞（例えば、抗原特異的Ｔ細胞）及び免疫系の非特異的細胞を介した応答）、ならびに液性免疫応答（例えば、Ｂ細胞を介した応答（例えば、抗体の生成、及び血漿、リンパ液、及び／または組織液中への分泌を介して）を含むがこれらに限定されない任意のタイプの免疫応答を指す。用語「免疫応答」とは、抗原及び／または免疫原に応答する被験体の免疫系の能力のすべての態様（例えば、適応免疫応答の結果である、免疫原に対する初期応答及び獲得された（例えば、記憶）応答の両方）を包含することを意図する。
【００９０】
本明細書中で使用する場合、用語「免疫原」及び「抗原」とは、被験体において免疫応答を誘発することができる作用物質（例えば、ＰＡＰポリペプチド）及び／またはその一部または成分（例えば、ＰＡＰポリペプチド由来のペプチド）を指す。
【００９１】
本明細書中で使用する場合、用語「疾患の進行」とは、診断アッセイ、例えば、分子アッセイまたはイメージングアッセイによる疾患の進展の新たなエビデンスの出現、例えば、骨スキャンにおける新規病変の出現を指す。
【００９２】
〔説明〕
本明細書における開示は、例示する特定の実施形態に言及するが、これらの実施形態は、例として提示するものに過ぎず、限定するものではないことを理解されたい。
【００９３】
［ＰＡＰ］
前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）は、前立腺癌における腫瘍抗原であり、ＰＡＰ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬは、前立腺癌細胞を溶解することができる。ＰＡＰは１９３８年に初めて同定され、当初は前立腺癌を検出するための血清マーカーとして用いられた［２２，３２］。正常及び悪性前立腺細胞におけるＰＡＰ発現は十分に実証されており、依然として転移性癌腫の前立腺起源を確立するための免疫組織化学染色に使用されている［３３］。特定の腫瘍によって発現される場合も発現されない場合がある特定のがん遺伝子とは異なり、前立腺組織において遍在的に発現するＰＡＰは、前立腺癌の免疫誘導療法の潜在的な「普遍的な」標的として魅力的な抗原である。さらに、いくつかの前立腺癌患者には、ＰＡＰに対する抗体及びＴ細胞応答が前もって存在することが示されており、この「自己」タンパク質に対する耐性をｉｎ  ｖｉｖｏで回避することができることが示唆されている［３４，３５］。特に、ＰＡＰに特異的なＴｈ１様免疫応答は、抗腫瘍応答を許容する免疫環境が、免疫化しなくても患者に存在することを示している［３６］。さらに、前立腺癌の細胞溶解活性を有するＰＡＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が前立腺癌患者に存在し、これをワクチン接種で増強することができる実験が以前に示されている［３０，３６］。
【００９４】
［ＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１遮断］
腫瘍が免疫検出を回避する主なメカニズムは、Ｔ細胞受容体ＰＤ−１のリガンドであるＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２を発現させることによるものである。ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２によるＰＤ−１の活性化は、Ｔ細胞機能を低下させ、免疫寛容を高める。臨床試験において観察される有害事象が相対的に少ないこと、及び早期臨床試験におけるいくつかの例で観察される長期の疾患応答を踏まえて、ＰＤ／ＰＤ−Ｌ（例えば、ＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１）阻害剤の開発には、現在大きな情熱が注がれている。特に、ＰＤ−１の標的化は、ＰＤ−１が腫瘍を直接標的とするのではなくＴ細胞区画を標的とするため、普遍的な治療であるべきである。しかしながら、これまでの臨床試験の経験から、いくつかの固形腫瘍型（特に腎細胞癌、メラノーマ、及び非小細胞肺癌）の患者は、前立腺癌を含む他の組織診の患者よりも、より多くの有益な効果を享受することが示唆されている［１８，１９］。応答性の患者及び非応答性の患者のＴ細胞の違いは、この相違の基礎となり得る。特に、より高い頻度の腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）は、前立腺癌よりも腎細胞癌及びメラノーマを有する患者において、一般的に観察される。さらに、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を用いる早期臨床試験は、生検による標的腫瘍細胞上のＰＤ−１（ＰＤ−Ｌ１）のリガンドの少なくとも１つの発現が、治療に対する臨床応答と関連することを同定した［１８］。これは、組織浸潤性Ｔ細胞がＩＦＮγの発現を介してＰＤ−Ｌ１の発現を誘導することができ、ＰＤ−１のリガンド結合がＴ細胞エフェクター機能の低下をもたらすと考えれば、期待されることである。前立腺癌はＰＤ−Ｌ１を発現し、浸潤性ＰＤ−１発現Ｔ細胞を有し得ることが示されている［２０］。まとめると、これらの結果は、例えば、ワクチン接種を介して、及びＰＤ遮断及び／またはＰＤ−Ｌ遮断（例えば、ＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１遮断）により、例えばＰＤ阻害剤及び／またはＰＤ−Ｌ阻害剤（例えば、ＰＤ−１阻害剤（例えば、抗ＰＤ−１抗体）及び／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体））により、腫瘍特異的Ｔ細胞の数を増加させることができる薬剤を併用することによって、抗腫瘍免疫治療の効力が、前立腺癌に対して高まるであろうことを示している。
【００９５】
ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかを標的とする抗体を用いて、早期臨床試験において抗腫瘍応答が観察されたことを受け、いくつかの製薬会社が関連する薬剤を開発した。現在、１つの薬剤ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、Ｍｅｒｃｋ）が、治療薬として承認されている。具体的には、ペンブロリズマブは、イピリムマブによる治療後に進行した進行性（転移性）メラノーマ患者の第Ｉ相臨床試験の非盲検国際多施設拡大コホートに基づいて、イピリムマブ抵抗性進行性メラノーマの治療用の「ブレークスルー」療法として２０１４年９月に承認された［３７］。その試験では、１７３例の患者に、疾患が進行するか、または許容不可能な毒性に至るまで、３週間間隔で、２つのうちの１つの投与（２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ）でペンブロリズマブを投与した。用量にかかわらず、全体的な奏功率は２６％であった［３７］。複数の患者において報告された唯一の薬物関連グレード３または４の有害事象は、グレード３の疲労であった。これらの知見を考慮して、ペンブロリズマブは、イピリムマブ抵抗性メラノーマ患者の治療用に、現在、ＦＤＡ承認を受け、疾患の進行または許容不可能な副作用が生じるまで、３週間毎に２ｍｇ／ｋｇで静脈内に投与されている。しかしながら、注記すべき点として、早期臨床試験では、治療の結果、治療中止後でさえ、長期間の応答が生じ得ることが示唆されている［１５］。
【００９６】
［ＤＮＡワクチンは抗原特異的Ｔｈ１／ＣＴＬ免疫応答を誘発する］
過去１０年間、プラスミドＤＮＡベースのワクチンの開発にかなりの関心が寄せられており、これは他の抗原送達方法よりもいくつかの明確な利点を提供する戦略である。ＤＮＡは迅速かつ安価に精製することができ、ＤＮＡはペプチド及び組換えタンパク質よりもはるかに可溶性である。さらに、核酸ワクチン中のＤＮＡは宿主組織によって取り込まれ、発現され、宿主抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって直接提示されることが実証されているため［３８，３９，４０］、抗原提示は天然にプロセシングされたエピトープを介して起こり、自己細胞処理を必要としない。したがって、ＤＮＡワクチンは、必然的にＨＬＡ拘束性のペプチドベースのワクチンとは異なり、理論的にＨＬＡ非依存的な様式で使用することができる。この戦略は、ＨＬＡの多様なヒト環境において理想的である。多くの点で、この免疫方法はウイルス免疫ベクターの使用に類似しているが、ウイルスベクターに導入する追加の外来抗原がなく、結果的に、ベクター自体に対する抗し難い免疫応答のリスクが低い［２６，４１］。腫瘍免疫モデルにおいて重要なことは、標的抗原をコードするプラスミドＤＮＡを用いた免疫化が、Ｔｈ１偏向性免疫応答［４２］及び標的抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発する強力な手段であることをいくつかのグループが実証していることである［３８，４３，４４，４５，４６］。動物モデルでは、特に、ワクチン投与の皮内経路の使用は、このＴｈ１／ＣＴＬ偏向性免疫応答を促進する傾向がある［４２，４７，４８］。また、口腔メラノーマを有するコンパニオンイヌの生存率の改善を実証した臨床試験［４９，５０］の結果に基づいて、イヌメラノーマ治療用のチロシナーゼをコードするＤＮＡワクチンの臨床効果が、２０１０年初めにＵＳＤＡによって承認されたことも了承すべきである。実際、これは既存のがんの治療のために米国で承認された最初のワクチンである。したがって、このアプローチは、ヒト臨床試験におけるさらなる研究を要する。
【００９７】
［ＰＡＰ（ｐＴＶＧ−ＨＰ）をコードするＤＮＡワクチンは、前立腺癌患者の抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発する］
ＰＡＰのヒトまたはラット相同体のいずれかをコードするＤＮＡワクチンは、ラットにおいてＰＡＰ特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発し、このことは、患者におけるＰＡＰ特異的抗腫瘍免疫応答を誘発する実現可能な手段を示唆するものであると以前に報告されている［２５，２６］。続いて、この同じＤＮＡワクチンを用いて、去勢抵抗性非転移性前立腺癌を有する被験体を２週間間隔で６回免疫化した第Ｉ相／第ＩＩ相臨床試験からのデータが報告されている。これらのデータを収集して、臨床ステージＤ０前立腺癌患者におけるｐＴＶＧ−ＨＰ  ＤＮＡワクチンの安全性及び免疫学的有効性を評価した［５１］。これは、最大耐量で治療する被験体の拡大コホートを用いた用量漸増試験であった。用量漸増部分では、９人の被験体を３つの用量コホート（１００μｇ、５００μｇ、または１５００μｇのＤＮＡ）で２週間毎に全６回の免疫化について皮内投与した。２００μｇのＧＭ−ＣＳＦを各免疫化のワクチンアジュバントとして同時投与した。１３人の追加被験体を、拡大コホートにおいて１５００μｇのＤＮＡ用量で治療した。重篤な有害事象は観察されず、有意な実験室異常は観察されなかった。観察された一般的な事象は、グレード１／２の発熱、寒気、及び通常２４時間未満の局所部位反応であった。本試験の主要な免疫学的エンドポイントは、最終免疫の２週間後に検出可能なＰＡＰ特異的ＩＦＮγ分泌エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導であった。以前に報告されているように、３人の患者については、免疫化後のＰＡＰ特異的ＩＦＮγ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が、各免疫コホートからの１人の患者の予備免疫に比べて有意に増加していた［２９］。いくつかの個体は、治療前に比べて、治療後１年間でＰＳＡ倍加時間の延長を経験した。全般的にＰＳＡの倍加時間の中央値は、治療前４か月において６．５か月、治療中４か月目において８．５か月であった（ｐ＝０．０３３）。免疫化後１年までのいくつかの患者において、長期のＰＡＰ特異的ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞応答が観察され；この持続性免疫の存在は、ＰＳＡ倍加時間の好ましい変化と関連していた［３０］。
【００９８】
第２のセットの実験は、去勢抵抗性非放射線転移性前立腺癌を有する患者における異なる免疫スケジュールを評価した。本試験は、免疫応答を発達させるために６回の免疫化が不十分であったかどうか、及び進行中の反復免疫が必要かどうかという疑問に答えるために計画されたものであった。本試験は、いくつかの個体ではわずか３〜６回の免疫化の後にＰＡＰ特異的免疫応答が生じ、いくつかの個体では隔週、２４回の免疫化後にも検出可能な免疫応答が生じなかったことを示した［３１］。ＰＳＡ倍加時間の好ましい変化は、長期間の免疫のエビデンスを有する患者において再び観察され、最も大きくなる傾向があった［３１］。上記の両方の試験から得られた知見は、この同じＤＮＡワクチンを評価してワクチン接種が疾患進行までの時間を引き延ばすかどうかを判定する現在進行中の多施設試験（ＮＣＴ０１３４１６５２）である無作為化第ＩＩ相臨床試験の理論的根拠を提供する。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチン技術（例えば、組成物、方法などに関する）は、米国特許出願公開第２００４０１４２８９０Ａ１号に記載されているとおりであり、前記文献はその全体を参照として本明細書に明示的に援用する。
【０１００】
［ＰＤ−１経路阻害剤］
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１経路阻害剤はモノクローナル抗体である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ペンブロリズマブ（商品名「Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）」として市販されている）である。ペンブロリズマブは、切除不能または転移性メラノーマを有し、イピリムマブ及び、ＢＲＡＦ  Ｖ６００突然変異陽性である場合にはＢＲＡＦ阻害剤の後に疾患進行を有する患者の治療のために示されるヒトプログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）遮断抗体である。したがって、いくつかの実施形態では、承認されたメラノーマ適応症に使用されたのと同じ用量及びスケジュールを用いる。例えば、いくつかの実施形態では、ペンブロリズマブを、３週間毎（４回までの最大用量）に３０分にわたり静脈内注入として２ｍｇ／ｋｇ（最近傍の５０ｍｇに四捨五入する）で投与する。ペンブロリズマブは、５０ｍｇの注射用凍結乾燥粉末からなる単回使用バイアルで入手可能である。２５ｍｇ／ｍＬ溶液を調製するために、注射用滅菌水（ＵＳＰ）２．３ｍＬをバイアルに加えて調製する。いくつかの実施形態では、これを、希釈溶液の最終濃度が１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬとなるように、０．９％塩化ナトリウム注射液（ＵＳＰ）を含むＩＶバッグに移す。したがって、いくつかの実施形態では、０．２μｍ〜５μｍのインラインまたはアドオンフィルターに結合する滅菌非発熱性低タンパク質を含むＩＶラインを使用して、例えば３０分にわたって静脈内注入として投与する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体は、ニボルマブ（商品名「Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）」として市販されている）である。ニボルマブは、活性化Ｔ細胞上のプログラム細胞死１（ＰＤ−１）受容体のリガンド活性化を遮断することによって免疫調節剤として作用するヒトＩｇＧ４抗ＰＤ−１モノクローナル抗体である。特に、ニボルマブは、Ｔ細胞活性化及びＴ細胞応答の負の調節因子を遮断することによって作用し、したがって免疫系が腫瘍を攻撃することを可能にする。すなわち、ニボルマブは、ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１に結合することを阻止し、Ｔ細胞が腫瘍の攻撃において機能できるようにする。
【０１０３】
本発明はまた：ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）；ＭＥＤＩ０６８０（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＭＥＤＩ４７３６（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（ＥＭＤ  Ｓｅｒｏｎｏ）；及びピジリズマブ（ＣｕｒｅＴｅｃｈ）を含むがこれらに限定されない、本発明の方法及びキットにおける他のＰＤ−１アンタゴニストの使用を企図する。
【０１０４】
［ＤＮＡワクチン］
ペプチドワクチンのようなＤＮＡワクチンは、製造が比較的容易で安価である点で有利であり、また、樹状細胞ベースのワクチンのように患者に対して個別化されていない。抗原提示細胞に抗原が取り込まれ、主にＭＨＣクラスＩＩに関連して発現する組換えタンパク質ワクチンとは異なり、核酸ワクチン中のＤＮＡは、抗原提示細胞によって直接取り込まれ、発現し、自然にプロセシングされるＭＨＣクラスＩ及びＩＩエピトープの両方を介して抗原提示をもたらす［３８］。
【０１０５】
本技術は、タンパク質抗原、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）を発現するＤＮＡベースのワクチン、及びワクチンとＰＤ−１阻害剤を併用した動物の前立腺癌の治療方法を提供する。ＰＡＰ遺伝子は公知であり、ヒト、マウス及びラットからクローニングされている（例えば、それぞれ、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３参照）。当業者によって容易に認識されるように、ＰＡＰ遺伝子をコードする任意のＤＮＡ配列が本発明に適しており、また、他の動物由来の任意の他のＰＡＰ遺伝子もまた、それらを同定し、特徴決定し、クローニングする限りにおいて、本発明に適している。イヌ及び非ヒト霊長類はＰＡＰ遺伝子を有することが知られている。本発明の遺伝子、またはその誘導体、均等物、変異体、または突然変異体によってコードされているタンパク質が、動物における自己抗原性または異種抗原性ＰＡＰタンパク質によって誘導される免疫反応と実質的に同様の免疫反応を宿主動物において誘導する限りにおいて、任意の起源の任意のＰＡＰ遺伝子またはその誘導体、均等物、変異体、突然変異体などが、本技術に適していることは容易に認識することができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ＰＡＰポリペプチドの誘導体、均等物、変異体、断片、または突然変異体は、配列番号１のヒトＰＡＰ配列と少なくとも８５％同一の配列である。より好ましくは、同一性は、少なくとも８８％、好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９５％である。アミノ酸配列間またはヌクレオチド配列間の同一性は、当業者によって手作業で、またはコンピュータベースの配列比較法、及びＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）などのアルゴリズムを採用した同定ツールを用いて、決定してもよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、完全長ＰＡＰタンパク質の一部をコードする全長遺伝子の断片を構築する。タンパク質抗原に対する液性もしくは細胞傷害性反応、またはその両方を誘発するこれらの断片ペプチドは、機能的均等物と考えられる。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、ＰＡＰ遺伝子を、ポリヌクレオチドワクチン接種のために特異的に最適化した発現ベクターに連結する。適切な発現ベクターの特徴として、例えば、当業者に周知のように、転写プロモーター、免疫原性エピトープ、免疫刺激配列、及び免疫促進遺伝子または免疫調節遺伝子をコードする追加のシストロン、ならびにそれらの独自のプロモーター、転写ターミネーター、細菌の複製起点、及び抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。場合により、いくつかの実施形態では、ベクターは、ポリシストロン性ｍＲＮＡ発現用の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有する。
【０１０９】
本技術のいくつかの実施形態では、ＰＡＰタンパク質をコードする遺伝子を、転写プロモーターに直接連結させる。いくつかの実施形態では、組織特異的プロモーターまたはエンハンサー（例えば、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）エンハンサーエレメント）を、特定の組織型でのポリヌクレオチド発現を制限するために用いることができる。例えば、筋細胞は、分裂しない最終分化細胞である。外来ＤＮＡの染色体への組込みは、細胞分裂及びタンパク質合成の両方によって促進されると思われる。したがって、タンパク質発現を、筋細胞などの非分裂細胞のみに制限することが好ましい場合がある。さらに、いくつかの実施形態では、ＰＳＡプロモーターを用いて、タンパク質の発現を前立腺組織に制限する。いくつかの実施形態では、組織特異的または細胞特異的プロモーターを用いて、タンパク質の発現を抗原提示細胞に対して標的化する。例えば、いくつかの実施形態では、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター（例えば、Ｐｅｙｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．９７：１０８９０−１０８９４参照）を用いて、発現を肝組織に制限する。しかしながら、プラスミドＤＮＡワクチンを導入する多くの組織においては、発現を達成するためにＣＭＶプロモーターを使用するのが適切である。
【０１１０】
様々な実施形態において、適切なベクターは、真核生物プロモーターに作動可能に連結し、ＰＡＰ抗原またはその機能的均等物または誘導体をコードする任意のプラスミドＤＮＡ構築物を含む。そのようなベクターの例として、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）から市販されているｐＣＭＶシリーズの発現ベクター；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）によるｐＣＤＮＡまたはｐＲＥＰシリーズの発現ベクターが挙げられる。
【０１１１】
当業者が本明細書から理解することができる本発明の多くの実施形態が存在する。したがって、様々な実施形態において、異なる転写プロモーター、ターミネーター、及び他の転写調節エレメントを使用する。他の真核生物転写プロモーターの例として、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、ヒト伸長因子−１α（ＥＦ−１α）プロモーター及びヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターが挙げられる。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子を発現する「裸の」プラスミドＤＮＡが利用可能であり、例えば、いくつかの実施形態では、裸のプラスミドＤＮＡを、皮内または筋肉内に直接注射し、これが取り込まれ、発現する（例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−８参照）。本アプローチの効率は低い場合があり、この指向性送達によって標的化される筋肉組織の限られた領域内のみにおいて、わずかな割合の筋細胞のみがｉｎ  ｖｉｖｏで直接形質変換される。より高い効率の遺伝子送達方法をもたらす様々な別のアプローチが知られている（例えば、Ａｃｓａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．３：７１−８１；Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ．  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：４７４−８５；Ｂｕｄｋｅｒ  ｅｔ．  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：７６０−４；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１５１−９；Ｄａｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１：１１４−２１；Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４１９−３１参照）。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンはｐＴＶＧ−ＨＰ（例えば、ヒトＰＡＰのｃＤＮＡを含むｐＴＶＧ４ベクター）である。ｐＴＶＧ−ＨＰは、Ｅ．ｃｏｌｉで産生されるプラスミドＤＮＡであり、ヒト前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）のｃＤＮＡをコードする。特に、ｐＴＶＧ−ＨＰプラスミドは、プラスミドベクターｐＮＧＶＬ３（例えば、ミシガン大学のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得られたもの）から構築された。ｐＣＤＮＡ３．１発現ベクターと同様に、本ベクターは、ＣＭＶプロモーターからの転写を駆動するが、ＣＭＶイントロンＡ配列も含み、タンパク質発現を促進する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ７：４９５−５０１）。本ベクターはまた、マルチクローニング部位を含み、真核生物の抗生物質耐性遺伝子を発現せず、その結果、ｐＣＤＮＡベクターとは異なり、真核生物系において期待されるタンパク質発現はＣＭＶプロモーターから駆動されるもののみである。本ベクターには、以前に同定された５′−ＧＴＣＧＴＴ−３′モチーフを含む２コピーの３６ｂｐの免疫刺激（ＩＳＳ）フラグメント（Ｈａｒｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１６１７−２４）（例えば、５′末端にＴｐＣジヌクレオチドを含み、続いてＴｐＴジヌクレオチドによって分断された３つの６量体のＣｐＧモチーフ（５′−ＧＴＣＧＴＴ−３′）を含むポリヌクレオチド）を付加し、ベクターｐＴＶＧ４を作製する。このベクターにヒトＰＡＰのコード配列をクローニングし、ＰＡＰの発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現試験により確認した。この構築物はｐＴＶＧ−ＨＰと命名されている。したがって、いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンは、ＣｐＧ免疫刺激配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫刺激配列は、ＴＣＧ  ＴＣＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＣ  ＧＴＴ（配列番号４）である。
【０１１４】
上記のように、ヒトＰＡＰのｃＤＮＡコード配列をｐＴＶＧにクローニングして構築物ｐＴＶＧ−ＨＰを作製した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の一過性形質移入に続いて、ｃａｐｔｕｒｅ  ＥＬＩＳＡにより、ＰＡＰがｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現することを確認した。さらに、ＰＡＰはｉｎ  ｖｉｖｏで発現し、ヒトにおいて免疫応答を生じる。例えば、米国特許出願公開第２００４０１４２８９０Ａ１号を参照されたく、前記文献は参照として本明細書、例えば、実施例において明示的に援用する。
【０１１５】
ワクチンを発現するマスター細胞バンク細菌株から得られたｐＴＶＧ−ＨＰ  ＤＮＡの配列を、標準的なＤＮＡ配列決定によって確認する。各ワクチンロットの生物学的活性を、ＰＡＰ特異的Ｔ細胞免疫応答が免疫後にｉｎ  ｖｉｖｏで誘発されることを示すげっ歯類の試験において試験する。ロットを、外見、プラスミドの均一性、制限エンドヌクレアーゼ評価によるＤＮＡ同一性、タンパク質コンタミネーション、ＲＮＡコンタミネーション、ゲノムＤＮＡコンタミネーション、無菌性、エンドトキシン、及びｐＨについて試験し、これらの各々に対するロットリリースのための基準を確立した。いくつかの実施形態では、ワクチンは、リン酸緩衝生理食塩水中の０．６ｍｌの０．２ｍｇ／ｍＬ  ｐＴＶＧ−ＨＰを含有する単回使用バイアル中に供給される。バイアルを、使用日まで−８０℃で保存する。
【０１１６】
［ＧＭ−ＣＳＦ］
ＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）、Ｓａｒｇｒａｍｏｓｔｉｍ）は、ワクチンアジュバントである。特に、ＧＭ−ＣＳＦは、樹状抗原提示細胞を含む造血前駆細胞の生存、クローン増殖及び分化をサポートする増殖因子である。ＧＭ−ＣＳＦは安全であり、免疫された抗原に対する抗体及びＴ細胞応答の誘導のための有効なアジュバントとして役立つことが示されている［５８，５９］。ＧＭ−ＣＳＦの使用は、ほとんど毒性と関連していない［６０，６１，６２］。ＧＭ−ＣＳＦは、２５０μｇ用量のバイアルに入った滅菌した白色の防腐剤を含まない凍結乾燥粉末である。静脈内または皮下に投与する場合、組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）は、通常、５０〜５００μｇ／ｍ２／日の範囲の用量で忍容性が良好である。
【０１１７】
本技術の特定の実施形態では、バイアルを解凍し、プラスミドＤＮＡワクチンを用いてＧＭ−ＣＳＦを再構成する。例えば、各ＤＮＡ免疫化のために、０．６ｍＬの０．２ｍｇ／ｍＬ  ｐＴＶＧ−ＨＰを回収し、これを用いて２５０μｇのＧＭ−ＣＳＦを再構成する。次いで、０．２５ｍＬを２つのツベルクリン注射器の各々に引き込む。これは、１００μｇ用量のＤＮＡ及び２０８μｇのＧＭ−ＣＳＦを効果的に提供する。
【０１１８】
［複合ワクチン技術］
従前の結果は、ＰＤ−１遮断のみで治療した患者において、客観的な疾患応答を示さず；本技術の実施形態の開発中に収集したデータは、ＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍細胞の同様のマウスモデルにおいて、ＰＤ経路遮断を腫瘍抗原特異的ワクチン接種と併用しない限り、腫瘍増殖遅延または根絶のエビデンスはなかったことを示した。
【０１１９】
したがって、本明細書において提供する技術のいくつかの実施形態は：１）去勢抵抗性転移性前立腺癌患者において前立腺腫瘍抗原ＰＡＰに特異的な治療用Ｔ細胞を誘導及び／または増加させるためのＰＡＰ（例えば、ｐＴＶＧ−ＨＰ）をコードするプラスミドＤＮＡワクチン；及び２）ＰＤ経路阻害剤（例えば、ペンブロリズマブまたはニボルマブ）の使用に関する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンを、本明細書で論じるようなＰＤ経路阻害剤と同時に投与する（例えば、本明細書に詳細に記載する投与計画参照）。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンを、ＰＤ経路阻害剤による治療の前に投与する（例えば、本明細書に詳細に記載する投与計画参照）。
【０１２０】
抗原特異的ＰＤ−１調節性Ｔ細胞を同定（例えば、検出）することは、併用治療に対する応答を予測するものであることがさらに企図される。
【０１２１】
したがって、本技術のいくつかの実施形態は、がん患者（例えば、去勢抵抗性転移性前立腺癌患者）において、ペンブロリズマブまたはニボルマブをｐＴＶＧ−ＨＰと併用して（例えば、同時にまたは逐次的に）投与することに関する。いくつかの実施形態は、ペンブロリズマブ及びｐＴＶＧ−ＨＰを含む組成物に関する。いくつかの実施形態は、ペンブロリズマブまたはニボルマブ及びｐＴＶＧ−ＨＰを含むキットに関する。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、患者を、ＤＮＡワクチン（例えば、ｐＴＶＧ−ＨＰ）の投与前及び／または投与後に試験する。いくつかの実施形態では、患者を、ＰＤ経路阻害剤（例えば、ペンブロリズマブまたはニボルマブ）の投与の前及び／または後に試験する。いくつかの実施形態では、試験には、例えば、画像化方法（例えば、放射線撮影法、骨イメージング）、抗腫瘍奏効率（客観的奏効率及び／またはＰＣＷＧ２基準を用いるＰＳＡ奏効率）の測定、ＰＡＰ特異的Ｔ細胞応答の大きさの測定、循環Ｔ細胞上のＰＤ−１発現の測定、循環上皮細胞（ＣＥＣ）及び／または腫瘍生検上のＰＤ−Ｌ１発現の測定、腫瘍成長速度の測定、ＰＡＰ特異的抗体の量の測定、前立腺関連抗原（例えば、ＰＳＡ及び／またはＰＡＰ）の量の測定が含まれる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、例えば、治療経過を追跡するために、及び／または治療効果の予測因子として、バイオマーカーをモニタリングする。一般的なバイオマーカーとして、ＣＥＣまたは腫瘍生検上のＰＤ−Ｌ１発現、腫瘍特異的Ｔ細胞上の他の調節分子（例えばＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、及びＬＡＧ３）または腫瘍細胞上の他の調節分子（例えばＨＶＥＭ、ホスファチジルセリン、ＰＤ−Ｌ２）の発現、及びＰＤ−１調節された抗原特異的Ｔ細胞（例えば、ｔｒａｎｓ  ｖｉｖｏでのＤＴＨ試験によって同定される）が挙げられる。
【０１２４】
［医薬製剤］
ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、哺乳類、特にそのような化合物の投与に応答する病態を有するヒト（例えば、前立腺癌を有するヒト被験体）に投与するために製剤化することが一般的に企図されている。したがって、企図する化合物を医薬組成物中に投与する場合、企図する化合物を、薬学的に許容可能な担体との混合物で製剤化することが企図される。例えば、企図する化合物を、薬学的に許容可能な塩として経口的に、または生理食塩水（例えば、ｐＨ約７．２〜７．５に緩衝する）中で静脈内投与してもよい。リン酸塩、炭酸水素塩、またはクエン酸塩などの従来の緩衝剤をこの目的のために使用することができる。もちろん、当業者は、本明細書の教示の範囲内で製剤を改変して、特定の投与経路のための多数の製剤を提供してもよい。特に、企図する化合物を改変して、水または他のビヒクル中でより可溶性になるようにしてもよく、例えば、十分に通常の技術の範囲内にある軽微な改変（塩製剤化、エステル化など）で容易に達成し得る。患者の薬効を最大化するために、特定の化合物の投与経路及び投与計画を改変して本化合物の薬物動態を管理することもまた、十分に通常の技術の範囲内にある。
【０１２５】
特定の医薬剤形において、毒性の低下、臓器または標的細胞の特異性の増加などを含む様々な目的のために、企図する化合物のプロドラッグ形態を形成してもよい。様々なプロドラッグ形態のうち、アシル化（アセチル化または他の）誘導体、ピリジンエステル、及び本発明の化合物の様々な塩形態が好ましい。当業者であれば、本化合物をプロドラッグ形態に容易に修飾し、宿主生物または患者の標的部位への活性化合物の送達を促進する方法を認識するであろう。当業者であれば、宿主生物または患者の標的部位に本化合物を送達する際に、適用可能な場合にはプロドラッグ形態の好ましい薬物動態パラメーターも利用して、化合物の意図する効果を最大にすることを認識するであろう。同様に、企図する化合物を、それらの生物学的に活性な形態に代謝してもよく、したがって、本明細書の化合物のすべての代謝産物が具体的に企図されることを理解されたい。さらに、企図する化合物（及びそれらの組み合わせ）を、さらなる薬剤と併用して投与してもよい。
【０１２６】
被験体への投与に関して、化合物を薬学的有効量で投与することが企図される。当業者であれば、薬学的有効量が、使用する治療剤、被験体の年齢、状態、及び性別、ならびに被験体における疾患の程度に応じて様々に異なることを認識している。一般的に、投薬量は、有害な副作用、例えば、血液学的疾患、肺疾患、大腸炎、肝炎、腎炎、下垂体炎、甲状腺機能障害などを引き起こすほど大きくすべきではない。投薬量は、所望の治療目標を達成するために、個々の医師または獣医師によって調整することもできる。
【０１２７】
本明細書中で使用する場合、用語「薬学的有効量」に包含される実際の量は、投与経路、治療する被験体のタイプ、及び検討中の特定の被験体の物理的特性に依存するであろう。この量を決定するためのこれらの要因及びそれらの関連性は、医学、獣医学、及び他の関連技術の当業者には周知である。この投与量及び投与方法は、調整して効力を最大化することができるが、当業者であれば認識するであろう要因、例えば、重量、食事、同時投薬、及び他の要因に依存するであろう。
【０１２８】
医薬組成物は、好ましくは、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤に関連する本技術の１つ以上の化合物を含む。薬学的に許容可能な担体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されているように、当該分野で公知であり、前記文献はあらゆる目的のために参照として本明細書に明示的に援用する。
【０１２９】
したがって、いくつかの実施形態では、免疫療法剤は、錠剤、カプセル、時限放出錠剤、時限放出カプセル剤；時限放出ペレット剤；徐放性錠剤、徐放性カプセル剤；徐放性ペレット剤；速放性錠剤、速放性カプセル剤；速放性ペレット剤；舌下錠；ゲルカプセル剤；マイクロカプセル剤；経皮送達製剤；経皮ゲル；経皮パッチ；経皮溶解性マイクロニードル製剤（例えば、パッチ中に提供される）；滅菌溶液；筋肉内、皮内、または皮下注射としての使用のために、標的部位への直接注射としての使用のために、または静脈内投与のために調製した滅菌溶液；直腸投与のために調製した溶液；胃栄養管または十二指腸栄養管を介して投与するために調製した溶液；直腸投与のための坐剤；溶液またはエリキシル剤として調製した経口摂取用液剤；局所用クリーム剤；ゲル剤；ローション剤；チンキ剤；シロップ剤；乳剤；または懸濁剤として製剤化する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、時限放出製剤は、徐放性、持続作用性、持続放出性、制御放出性、修飾放出性、または連続放出性のメカニズムであり、例えば、化合物を、経時的に、迅速に、緩やかに、または任意の適切な放出速度で溶解するように組成物を製剤化する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、不溶性物質のマトリックス（例えば、様々なアクリル樹脂、キチン）中に活性成分を包埋するように組成物を製剤化し、溶解性の化合物が、例えば拡散によって、マトリックス中の孔を通って出て行けるようにする。いくつかの実施形態では、一方の側にレーザー穿孔した孔を、他方の側に多孔質膜を有するポリマーベースの錠剤に製剤を封入する。胃酸が多孔質膜内に押し進み、それによって薬物をレーザー穿孔した孔から押し出す。ポリマー容器が損壊していない間に、全薬剤用量が系に放出され、後で通常の消化によって排泄される。いくつかの徐放製剤では、化合物はマトリックス内に溶解し、マトリックスが物理的に膨潤してゲルを形成し、化合物はゲルの外側表面を通って出ることができる。いくつかの実施形態では、製剤は、マイクロカプセル化形態であり、例えば、いくつかの実施形態では、これを用いて複合的な溶解特性を生成する。例えば、不活性コアの周りに化合物をコーティングし、不溶性物質とともにそれを層状にしてミクロスフェアを形成することによって、いくつかの実施形態は、簡便なフォーマットで、より一貫性及び再現性の高い溶出速度を提供し、特定の実施形態ではそれを、他の制御された（例えば、即時）放出医薬成分と組み合わせて、例えばマルチパートゲルカプセルを提供する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本技術の医薬品及び／または製剤は、粒子として提供される。本明細書中で使用する場合、「粒子」とは、本明細書に記載する化合物の全部または一部からなり得るナノ粒子または微粒子（またはいくつかの場合にはより大きな粒子）を意味する。粒子は、限定するものではないが、腸溶コーティングなどのコーティングによって取り囲まれたコア内に医薬品及び／または製剤を含有してもよい。医薬品及び／または製剤は、粒子全体に分散させてもよい。医薬品及び／または製剤はまた、粒子に吸着させてもよい。粒子は、０次放出、１次放出、２次放出、遅延放出、徐放、即時放出、及びそれらの任意の組み合わせなどを含む、任意の次数の放出速度の粒子であってもよい。粒子は、医薬品及び／または製剤に加えて、侵食性、非侵食性、生分解性、または非生分解性の物質またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、薬学及び医学分野において日常的に使用される物質のいずれかを含み得る。粒子は、溶液または半固体状態で製剤を含有するマイクロカプセルであってもよい。粒子は、実質的に任意の形状であり得る。
【０１３３】
非生分解性及び生分解性ポリマー物質の両方を、医薬品及び／または製剤を送達するための粒子の製造に使用することができる。そのようなポリマーは、天然または合成ポリマーであってもよい。放出を所望する期間に基づいてポリマーを選択する。特に興味深い生体接着性ポリマーとして、Ｈ．Ｓ．Ｓａｗｈｎｅｙ，Ｃ．Ｐ．Ｐａｔｈａｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｈｕｂｅｌｌ  ｉｎ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，（１９９３）２６：５８１−５８７に記載されている生分解性ヒドロゲルが挙げられ、その教示は参照として明細書に援用する。それらには、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギン酸塩、キトサン、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（メタクリル酸エチル）、ポリ（メタクリル酸ブチル）、ポリ（メタクリル酸イソブチル）、ポリ（ヘキシルメタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸イソデシル）、ポリ（メタクリル酸ラウリル）、ポリ（メタクリル酸フェニル）、ポリ（アクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸イソプロピル）、ポリ（アクリル酸イソブチル）、及びポリ（アクリル酸オクタデシル）が含まれる。
【０１３４】
本技術はまた、分解産物の形成を阻害するための化合物またはその塩の水溶液を含有する安定な医薬品を調製するための方法を提供する。化合物またはその塩及び少なくとも１つの阻害剤を含有する溶液を提供する。この溶液を、封止可能な容器内に溶液を充填する前及び／または後に、少なくとも１回の滅菌技術の下で処理し、安定な医薬品を形成する。本製剤は、製剤が実質的に均質である限り、例えば製剤内に薬剤が実質的に均一に分布する限り、当該技術分野で公知の様々な方法によって調製してもよい。そのような均一な分布は、製剤からの薬物放出を制御しやすくする。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、緩衝剤とともに化合物を製剤化する。緩衝剤は、任意の薬学的に許容可能な緩衝剤であってもよい。緩衝系には、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、及びリン酸緩衝液が含まれる。緩衝液の例として、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、酢酸、リン酸ナトリウム及びリン酸、アスコルビン酸ナトリウム、酒石酸、マレイン酸、グリシン、乳酸ナトリウム、乳酸、アスコルビン酸、イミダゾール、炭酸水素ナトリウム及び炭酸、コハク酸ナトリウム及びコハク酸、ヒスチジン、ならびに安息香酸ナトリウム及び安息香酸が挙げられる。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、キレート剤とともに化合物を製剤化する。キレート剤は、任意の薬学的に許容可能なキレート剤であってもよい。キレート剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、エデト酸、ｖｅｒｓｅｎｅ  ａｃｉｄ、及びｓｅｑｕｅｓｔｒｅｎｅと同義語）、及びＥＤＴＡ誘導体、例えば、エデト酸二カリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、及びエデト酸カリウムが含まれる。他のキレート剤として、クエン酸及びその誘導体が挙げられる。クエン酸は、クエン酸一水和物としても知られている。クエン酸の誘導体には、無水クエン酸及びクエン酸三ナトリウム二水和物が含まれる。さらに他のキレート剤として、ナイアシンアミド及びその誘導体、ならびにデオキシコール酸ナトリウム及びその誘導体が挙げられる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、抗酸化剤とともに化合物を製剤化する。抗酸化剤は、任意の薬学的に許容可能な抗酸化剤であってもよい。抗酸化剤は、当業者には周知であり、アスコルビン酸、アスコルビン酸誘導体（例えば、パルミチン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビル、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウムなど）、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、没食子酸アルキル、二亜硫酸ナトリウム、二硫酸ナトリウム、亜ジチオン酸ナトリウム、チオグリコール酸ナトリウム、ホルムアルデヒドスルホキシル酸ナトリウム、トコフェロール及びその誘導体（ｄ−αトコフェロール、酢酸ｄ−αトコフェロール、酢酸ｄｌ−αトコフェロール、コハク酸ｄ−αトコフェロール、βトコフェロール、δトコフェロール、γトコフェロール、及びコハク酸ｄ−αトコフェロールポリオキシエチレングリコール１０００）、モノチオグリセロール、ならびに亜硫酸ナトリウムなどの物質が挙げられる。そのような物質は、一般的には０．０１〜２．０％の範囲で添加する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、抗凍結剤とともに化合物を製剤化する。抗凍結剤は、任意の薬学的に許容可能な抗凍結剤であってもよい。一般的な抗凍結剤として、ヒスチジン、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリジン、ラクトース、スクロース、マンニトール、及びポリオールが挙げられる。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、等張剤とともに化合物を製剤化する。等張剤は、任意の薬学的に許容可能な等張剤であり得る。本用語は、当該技術分野では等浸透圧剤と同じ意味で用いられ、浸透圧を増加させるために、例えばいくつかの実施形態では、ヒトの細胞外液、例えば血漿と等張である０．９％塩化ナトリウム溶液の浸透圧へ増加させるために、医薬品に添加する化合物として知られている。好ましい等張剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、デキストロース、及びグリセロールである。
【０１４０】
医薬品は、場合により、防腐剤を含んでいてもよい。一般的な防腐剤には、クロロブタノール、パラベン、チメロサール、ベンジルアルコール、及びフェノールからなる群から選択される防腐剤が含まれる。適切な防腐剤として：クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）、パラベン（０．０１〜５．０％）、チメロサール（０．００４〜０．２％）、ベンジルアルコール（０．５〜５％）、フェノール（０．１〜１．０％）などが挙げられる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、湿潤剤とともに化合物を製剤化し、口腔投与において快適な口当たりを提供する。当該分野で公知の湿潤剤として、コレステロール、脂肪酸、グリセリン、ラウリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ペンタエリスリトール、及びプロピレングリコールが挙げられる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、乳化剤を製剤に含有させ、例えば、確実にすべての賦形剤、特にベンジルアルコールなどの疎水性成分を完全に溶解させる。例えばポリソルベート６０などの多くの乳化剤が当該分野で公知である。
【０１４３】
経口投与に関連するいくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な香味料及び／または甘味料を添加することが望ましい場合がある。サッカリン、グリセリン、シンプルシロップ、ソルビトールなどの化合物は甘味料として有用である。
【０１４４】
［測定法及びアッセイ法］
様々な実施形態において、様々な技術及び観測量を用いてデータを収集し、例えば、被験体のベースラインを測定し、及び／または治療の有効性をモニタリングする。例えば、いくつかの実施形態は、画像化に基づく被験体の評価を含む。いくつかの特定の実施形態では、画像化技術は、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）を含む。いくつかの特定の実施形態では、画像化技術は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＴ及び／またはＭＲＩは、標的病変を測定するための正確で再現可能な方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＴ及びＭＲＩを、スライス厚が１０ｍｍ以下の連続した切断を用いて実施する。いくつかの実施形態では、例えば、胸部、腹部、及び骨盤の腫瘍について、５ｍｍの連続再構成アルゴリズムを使用してスパイラルＣＴを実施する。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、腫瘍マーカーを測定する。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＳＡを測定する。いくつかの実施形態では、ＰＳＡ速度の別個の報告のためにＰＳＡ値を収集する。いくつかの実施形態では、すべての腫瘍病変が消失した際、被験体のＰＳＡ値が＜０．２ｎｇ／ｍＬまで低下している場合、それは完全な臨床応答を示している。いくつかの実施形態では、血清ＰＡＰを測定する。いくつかの実施形態では、ＰＡＰ及び／またはＰＳＡの血清濃度は、ワクチン接種後及び／またはワクチン接種後の低下後に安定化し、ワクチン効力の測定値を提供する。いくつかの実施形態では、血清ＰＳＡ対血清ＰＡＰの比を計算し、ワクチン効力の尺度を提供する。理論に拘泥することなく、また、メカニズムまたは理論の理解は技術を実施するうえで必ずしも必要ないことは理解されるが、いくつかの実施形態では、治療が、ＰＳＡ産生細胞に比べてＰＡＰ産生細胞を選択的に枯渇させるため、ＰＳＡ：ＰＡＰ比が治療により増加し、したがってＰＳＡ濃度に比べてＰＡＰ濃度をより速く低下させる。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、臨床検査を被験体に対して行う。いくつかの実施形態では、臨床的に検出される病変は、それが表面的（例えば、皮膚の結節及び触診可能なリンパ節）である場合、測定可能であると考えられる。いくつかの実施形態では、病変の大きさを推定するための定規を含むカラー写真によって皮膚病変を記録する。
【０１４７】
［組織病理学的評価］
いくつかの実施形態では、治療前及び治療後に（例えば、治療開始後１〜２０週、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１４、１６、１７、１８、１９、または２０週の間に）、転移性病変（例えば、患者あたり同じ病変）から組織生検を採取する。いくつかの実施形態では、腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１発現に免疫化がどのように影響を及ぼすかを評価するための試験を行う。理論に拘泥することなく、本技術を実施するうえでメカニズムの理解が必ずしも必要ないことは認められるが、免疫化は、ＩＦＮγを分泌する腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を誘発することにより、腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１発現に影響を及ぼすと考えられる。さらに、抗ＰＤ−１  ｍＡｂによる同時治療がＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤の増加をもたらすかどうか、及び処置がＴ細胞上の他のＴ細胞調節リガンド（ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ−３）または腫瘍上の他のＴ細胞調節リガンド（例えば、ＨＶＥＭ、ホスファチジルセリン、ＰＤ−Ｌ２）の発現を増加させるかどうかを評価するための試験を行う。したがって、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ−３、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ホスファチジルセリン、及び／またはＨＶＥＭ、及び／または他のマーカーに特異的な抗体を用いて、治療前及び治療開始後に得られた生検組織を染色する。治療群に対して盲検化した病理学者によって染色及び定量をレビューし、視野あたりのＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋（Ｔｒｅｇ）：ＣＤ８＋Ｔ細胞比、ＰＤ−Ｌ１発現（例えば、視野あたり少なくとも５個のＰＤ−Ｌ１陽性細胞で示される）を測定し、治療の前後で測定したこれらのパラメーターを比較して、治療の結果として変化した、測定するかまたは計算したこれらのパラメーターのいずれかを同定する。
【０１４８】
［循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）評価］
いくつかの実施形態では、フローサイトメトリーを使用し、例えば、いくつかの実施形態では、免疫評価と同じ時点で（例えば、治療前、１〜６週間後（例えば、１、２、３、４、５、または６週間後）、及び最大１年間の間隔で（例えば、毎月、年４回で）、ＣＴＣを計数し、特徴決定する。例えば、いくつかの実施形態では、これらの時点で得られたＰＢＭＣを、例えば、ＣＤ４５、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、及びＤＡＰＩの少なくとも１つ以上に特異的な蛍光色素標識抗体で染色する。ＣＴＣを、ＣＤ４５−ＥｐＣＡＭ＋ＤＡＰＩ−細胞として定義し、生細胞のすべての事象におけるこれらの事象の割合を、異なる時点において決定する。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＴＬＡ−４を発現するＣＴＣの割合もまた決定する。異なる時点から結果を報告し、一般的な傾向を評価する。いくつかの実施形態では、結果は定量的であり、いくつかの実施形態では、結果は定性的である（例えば、いくつかの実施形態では、標準偏差を得るために複数の複製を取得することが実現できない）。本技術は、ＣＴＣの捕捉及び計数の他の方法も包含する。
【０１４９】
［被験体］
いくつかの実施形態では、併用療法を被験体に投与する。例えば、いくつかの実施形態では、被験体は、がん患者、例えば前立腺癌患者、例えば去勢抵抗性転移性前立腺癌患者である。いくつかの実施形態では、被験体は成人である（例えば、１８歳以上である）。いくつかの実施形態では、被験体は、組織学によって確認された前立腺癌を有する。いくつかの実施形態では、被験体は、転移性疾患、例えば軟部組織及び／または骨転移の存在を有する（例えば、画像化（ＣＴ（例えば、腹部／骨盤の）、骨シンチグラフィーなど）によって検出する）。いくつかの実施形態では、被験体は去勢抵抗性疾患を有し、例えば、いくつかの実施形態では、被験体はアンドロゲン除去治療（例えば、外科的去勢、ＧｎＲＨ類似体、またはアンタゴニスト治療）を受けている。いくつかの実施形態では、本明細書に記載する併用療法（例えば、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤）による治療中に、被験体にＧｎＲＨ類似体またはアンタゴニストを与える。いくつかの実施形態では、被験体は、以前に非ステロイド性抗アンドロゲン薬の治療を受けており；いくつかの実施形態では、被験体は、以前に非ステロイド性抗アンドロゲン薬の治療を受けていない。被験体が以前に抗アンドロゲン薬の治療を受けているいくつかの実施形態では、被験体は、本明細書に記載する併用療法での治療の前に、少なくとも４週間（フルタミドの場合）または６週間（ビカルタミドまたはニルタミドの場合）、抗アンドロゲン薬の使用を中止した。さらに、いくつかの実施形態では、被験体、例えば、抗アンドロゲン薬離脱応答を示した（例えば、非ステロイド性抗アンドロゲン薬を中止する４〜６週間以内にＰＳＡが＞２５％低下した）被験体においてＰＳＡをモニタリングし、被験体ＰＳＡが抗アンドロゲン除去後に観察される最下点より上に上昇した際に、併用療法を投与する。いくつかの実施形態では、テストステロンの去勢レベルは、治療開始から６週間以内に＜５０ｎｇ／ｄＬである。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、被験体は、アンドロゲン除去療法を受ける一方で、前立腺癌臨床試験ワークグループ２（ＰＣＷＧ２）基準［６４］に従って以下のいずれか１つによって定義される進行性疾患を有することを特徴とする：ａ）最低１週間間隔で取得する血清ＰＳＡ値が少なくとも２連続で上昇し、最終ＰＳＡ値＞２．０ｎｇ／ｍＬである；ｂ）すべての測定可能な病変の外積の合計における５０％の増加または測定可能な新規病変の発生（標的リンパ節の直径は標的病変とみなすためには、ＣＴで少なくとも２．０ｃｍでなければならない）；または去勢療法中の以前の画像化と比較して、転移性疾患と一致する骨スキャン上の２つ以上の新規取込み領域の出現（骨スキャン上の既存の病変の取込みの増加は進行とみなされるものではなく、あいまいな結果は、他の画像化様式（例えば、Ｘ線、ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ（例えば、１８Ｆ  ＮａＦ  ＰＥＴ）、ＳＰＥＣＴなど）によって確認しなければならない）。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、被験体は、事前にアビラテロンまたはエンザルタミドの治療を受けており、いくつかの実施形態では、被験体への事前のコルチコステロイド治療を少なくとも３か月間、止めて（例えば、中止して）いる。いくつかの実施形態では、被験体は、ＥＣＯＧパフォーマンスステータス０、１、または２を有する。いくつかの実施形態では、被験体は、適切な血液機能、腎機能、及び肝機能（例えば、ＷＢＣ＞２０００／ｍｍ３；ＡＮＣ＞１０００／ｍｍ３；ＨｇＢ＞９．０ｇｍ／ｄＬ；血小板数＞１００，０００／ｍｍ３；クレアチニン＜２．０ｍｇ／ｄＬ；及び／またはＡＳＴ，ＡＬＴ＜２．５×制度上の正常値の上限）を有する。いくつかの実施形態では、被験体は、ＨＩＶ１及び２、ＨＴＬＶ−１、または活性型Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎の病歴を有していない。いくつかの実施形態では、被験体は、少なくとも４週間他の治療を受けておらず、以前の治療に起因する急性毒性から回復している（＜グレード２へ）。いくつかの実施形態では、被験体は生検を受けている。
【０１５２】
以下に記載するように、バイオマーカー（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１など）の「レベル」、またはバイオマーカー（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１など）の「発現レベル」は、本技術の実施形態に従って有用であると記載される。いくつかの実施形態では、例えば、特定のバイオマーカーを発現する細胞の数を計数することによって、別の細胞集団（例えば、全細胞、顕微鏡中の全細胞、全生細胞、ＰＢＭＣ、上皮細胞、または任意の他の細胞集団など）に比べて特定のバイオマーカーを発現する細胞の数、または細胞表面上に発現する特定のバイオマーカー（例えば、細胞あたり）の数または濃度（例えば、平均数または濃度）を計算することによって、「レベル」を決定する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、被験体は、低レベルのＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１発現を有する。本明細書中で使用する場合、「低レベルの発現」（例えば、「低レベルのＰＤ−１発現」及び／または「低レベルのＰＤ−Ｌ１発現」）とは、以下のうちの１つのＰＤ−１レベル（例えば、量、数、濃度）：ＤＮＡワクチンを受けていない患者のＰＤ−１レベル未満；ＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤によって被験体に有効な治療を提供する被験体のＰＤ−１レベル未満；及び／またはＰＤ−１の標的範囲内にあるＰＤ−１レベル（例えば、量、数、濃度）未満を指すか、または以下のうちの１つのＰＤ−Ｌ１レベル（例えば、量、数、濃度）：ＤＮＡワクチンを受けていない患者のＰＤ−Ｌ１のレベル未満；ＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１阻害剤によって被験体に有効な治療を提供する被験体のＰＤ−Ｌ１レベル未満；及び／またはＰＤ−Ｌ１の標的範囲内にあるＰＤ−Ｌ１レベル（例えば、量、数、濃度）未満を指す（以下を参照）。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、被験体は、ＰＤ−１の標的範囲よりも低いＰＤ−１レベルを有する。したがって、いくつかの実施形態では、被験体は、本明細書において提供する技術に従って標的範囲まで増加させる必要があるＰＤ−１レベル（例えば、正常なＰＤ−１レベル）を有する。例えば、いくつかの実施形態では、被験体に投与するＰＤ−１阻害剤は、標的範囲内のＰＤ−１レベルを有する被験体に投与する場合に有効である。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、被験体は、ＰＤ−Ｌ１の標的範囲よりも低いＰＤ−Ｌ１レベルを有する。したがって、いくつかの実施形態では、被験体は、本明細書において提供する技術に従って標的範囲まで増加させる必要があるＰＤ−Ｌ１レベル（例えば、正常なＰＤ−Ｌ１レベル）を有する。例えば、いくつかの実施形態では、被験体に投与するＰＤ−Ｌ１阻害剤は、標的範囲内のＰＤ−Ｌ１レベルを有する被験体に投与する場合に有効である。
【０１５６】
したがって、いくつかの実施形態では、被験体（例えば、被験体由来の試料）を試験して、被験体内のＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１のレベルを測定する。そのような試験は、例えば、バイオマーカー、代謝産物、物理的症状、徴候などをアッセイまたは測定し、被験体内または被験体由来の試料中に存在するＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１の量、濃度、数などを測定することによって実施する。いくつかの実施形態では、被験体のＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１レベルを、免疫組織化学的方法によって測定する（例えば、ＰＤ−１に特異的に結合する抗体を用いて、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体を用いて）。いくつかの実施形態では、被験体のＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１レベルを、例えば、ＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１をコードするｍＲＮＡのレベルを測定するための標識核酸プローブを用いて、ハイブリダイゼーション法によって測定する。いくつかの実施形態では、被験体のＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１レベルを、本明細書に記載するＤＮＡワクチンの投与前に試験する。いくつかの実施形態では、被験体のＰＤ−１及び／またはＰＤ−Ｌ１レベルを、本明細書に記載するＤＮＡワクチンの投与後に試験する。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、方法は、被験体のＰＤ−１レベルを上昇させるためのＤＮＡワクチンの投与を含む。方法のいくつかの実施形態は、被験体を試験して被験体のＰＤ−１レベルを測定し、ＤＮＡワクチンを投与して被験体のＰＤ−１レベルを上昇させることを含む。方法のいくつかの実施形態は、ＤＮＡワクチンを投与する前に被験体のＰＤ−１レベルを測定し、ＤＮＡワクチンを投与して被験体のＰＤ−１レベルを上昇させ、ＤＮＡワクチンを投与した後に被験体を試験して被験体のＰＤ−１レベルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、被験体をＤＮＡワクチンで治療し、被験体から試料を採取し、ＰＤ−１レベルを測定し、測定したＰＤ−１レベルに基づいて再度被験体をＤＮＡワクチンで治療し、別の試料を採取し、ＰＤ−１レベルを測定する。いくつかの実施形態では、様々な段階、例えばＤＮＡワクチンを用いた初期治療の前に、他の試験（例えば、ＰＤ−１レベルの測定に基づくものではない）も使用して、例えば、初期用量の指針及び／またはＤＮＡワクチンの投与計画を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンの投与前に被験体について測定したＰＤ−１の１つ以上の測定量に基づいて、ＤＮＡワクチンの用量及び／または投与計画を調整する。いくつかの実施形態では、試験結果に基づいてＤＮＡワクチンによるその後の治療を調整し、例えば、ＤＮＡワクチンの投与量及び／または投与計画を変更する。いくつかの実施形態では、試験結果、例えば、抗原特異的細胞がＰＤ−１遮断に応答するという試験結果に基づいてＤＮＡワクチンによるその後の治療を調整する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、患者のＰＤ−１レベルを測定し、ＤＮＡワクチンを被験体に投与し、次いでＰＤ−１レベルを再度測定して、ＤＮＡワクチンに対する被験体の応答をモニタリングし、及び／またはＤＮＡワクチンの投与量または投与計画を変更する。いくつかの実施形態では、測定と投与のサイクルは、測定及び投与のパターン、周期性、またはそれぞれの測定フェイズと投与フェイズの間の間隔の期間に制限なく生じる。このように、本技術は、ＰＤ−１レベルの測定とＤＮＡワクチンの投与の様々な組み合わせ、例えば、測定／投与、投与／測定、測定／投与／測定、投与／測定／投与、測定／投与／測定／投与、測定／投与／測定／投与／測定、測定／投与／測定／測定／投与／投与／投与／測定、投与／投与／測定／投与、測定／投与／投与／測定／投与／投与などを、制限なく企図する。
【０１５９】
例えば、ＰＤ−１を測定し、ＤＮＡワクチンを投与するサイクルを使用して、被験体のＰＤ−１レベルを標的範囲まで上昇させることができる。いくつかの実施形態では、被験体のＰＤ−１レベルの初期測定値は、被験体に投与して被験体のＰＤ−１レベルを標的範囲まで上昇させるためのＤＮＡワクチンの用量を示す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンの１回以上の投与後に被験体のＰＤ−１レベルを測定し、例えば、被験体のＰＤ−１レベルが標的範囲内にあることを確認する。いくつかの実施形態では、標的範囲は、すべての被験体にとって（例えば、すべての前立腺癌患者にとって）一般的な範囲であり、いくつかの実施形態では、標的範囲は、各被験体毎に個別化した基準で決定する。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、試験は、ＰＤ−１遮断に対する応答を試験することを含む（例えば、ＰＤ−１発現の増加または減少の試験ではなく）。例えば、いくつかの実施形態では、試験は、ＰＤ−１遮断の存在下でＰＡＰ特異的応答（例えば、ＩＦＮγ分泌）についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を試験することを含む。いくつかの実施形態では、試験は、足蹠遅延型過敏症アッセイを含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、方法は、被験体のＰＤ−Ｌ１レベルを上昇させるためのＤＮＡワクチンの投与を含む。方法のいくつかの実施形態は、被験体を試験して被験体のＰＤ−Ｌ１レベルを測定し、ＤＮＡワクチンを投与して被験体のＰＤ−Ｌ１レベルを上昇させることを含む。方法のいくつかの実施形態は、ＤＮＡワクチンを投与する前に被験体のＰＤ−Ｌ１レベルを測定し、ＤＮＡワクチンを投与して被験体のＰＤ−Ｌ１レベルを上昇させ、ＤＮＡワクチンを投与した後に被験体を試験して被験体のＰＤ−Ｌ１レベルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、被験体をＤＮＡワクチンで治療し、被験体から試料を採取し、ＰＤ−Ｌ１レベルを測定し、測定したＰＤ−Ｌ１レベルに基づいて再度被験体をＤＮＡワクチンで治療し、別の試料を採取し、ＰＤ−Ｌ１レベルを測定する。いくつかの実施形態では、様々な段階、例えばＤＮＡワクチンを用いた初期治療の前に、他の試験（例えば、ＰＤ−Ｌ１レベルの測定に基づくものではない）も使用して、例えば、初期用量の指針及び／またはＤＮＡワクチンの投与計画を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンの投与前に被験体について測定したＰＤ−Ｌ１の１つ以上の測定量に基づいて、ＤＮＡワクチンの用量を調整する。いくつかの実施形態では、試験結果に基づいてＤＮＡワクチンによるその後の治療を調整し、例えば、ＤＮＡワクチンの投与量または投与計画を変更する。いくつかの実施形態では、試験結果、例えば、抗原特異的細胞がＰＤ−Ｌ１遮断に応答するという試験結果に基づいてＤＮＡワクチンによるその後の治療を調整する。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、患者のＰＤ−Ｌ１レベルを測定し、ＤＮＡワクチンを被験体に投与し、次いでＰＤ−Ｌ１レベルを再度測定して、ＤＮＡワクチンに対する被験体の応答をモニタリングし、及び／またはＤＮＡワクチンの投与量または投与計画を変更する。いくつかの実施形態では、測定と投与のサイクルは、測定及び投与のパターン、周期性、またはそれぞれの測定フェイズと投与フェイズの間の間隔の期間に制限なく生じる。このように、本技術は、ＰＤ−Ｌ１レベルの測定とＤＮＡワクチンの投与の様々な組み合わせ、例えば、測定／投与、投与／測定、測定／投与／測定、投与／測定／投与、測定／投与／測定／投与、測定／投与／測定／投与／測定、測定／投与／測定／測定／投与／投与／投与／測定、投与／投与／測定／投与、測定／投与／投与／測定／投与／投与などを、制限なく企図する。
【０１６３】
例えば、ＰＤ−Ｌ１を測定し、ＤＮＡワクチンを投与するサイクルを使用して、被験体のＰＤ−Ｌ１レベルを標的範囲まで上昇させることができる。いくつかの実施形態では、被験体のＰＤ−Ｌ１レベルの初期測定値は、被験体に投与して被験体のＰＤ−Ｌ１レベルを標的範囲まで上昇させるためのＤＮＡワクチンの用量を示す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンの１回以上の投与後に被験体のＰＤ−Ｌ１レベルを測定し、例えば、被験体のＰＤ−Ｌ１レベルが標的範囲内にあることを確認する。いくつかの実施形態では、標的範囲は、すべての被験体にとって（例えば、すべての前立腺癌患者にとって）一般的な範囲であり、いくつかの実施形態では、標的範囲は、各被験体毎に個別化した基準で決定する。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、試験は、ＰＤ−Ｌ１遮断に対する応答を試験することを含む（例えば、ＰＤ−Ｌ１発現の増加または減少の試験ではなく）。例えば、いくつかの実施形態では、試験は、ＰＤ−Ｌ１遮断の存在下でＰＡＰ特異的応答（例えば、ＩＦＮγ分泌）についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を試験することを含む。いくつかの実施形態では、試験は、足蹠遅延型過敏症アッセイを含む。
【０１６５】
［投与、治療、用量、及び投与計画］
いくつかの実施形態では、本技術は、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤を被験体に投与する方法に関する。いくつかの実施形態では、本技術は、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−Ｌ１阻害剤を被験体に投与する方法に関する。本方法は、本技術に従ってＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤を被験体に投与する一般的な工程を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチン及び／またはＰＤ−１阻害剤、その誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩を、薬学的有効量で投与する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチン及び／またはＰＤ−１阻害剤、その誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩を、治療有効量で投与する。
【０１６６】
投与量及び頻度は、実質的に有害な影響を及ぼさずに有効量の化合物を生成するように選択する。経口的に、皮内に、経皮的に、または静脈内に投与する場合、ＤＮＡワクチン及び／またはＰＤ−１阻害剤の投与量は、一般的に、０．００１〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ／日または投与（例えば、０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日または投与；０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日または投与）の範囲である。
【０１６７】
薬学的有効量を投与する方法として、非経口、経口、腹腔内、鼻腔内、局所、舌下、直腸、及び膣形態での投与が挙げられるが、これらに限定されない。非経口投与経路として、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内注射、静脈内、皮内、及び注入経路が挙げられる。いくつかの実施形態では、化合物、その誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩を、経口投与する。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、化合物または関連化合物の単回用量を被験体に投与する。他の実施形態では、数時間、数日、数週などの間隔で、複数の投与量を２つ以上の時点にわたって投与する。いくつかの実施形態では、長期間（例えば、慢性的に）、例えば、数週、数か月、または数年の期間（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれ以上の週、月、または年）にわたって化合物を投与する。そのような実施形態では、長期間、定期的なスケジュールに基づいて（例えば、毎日、毎週、隔週などで）化合物を服用してもよい。
【０１６９】
本技術はまた、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤による被験体の治療方法にも関する。本技術の別の態様によれば、そのような治療を必要とする被験体を、有効量のＤＮＡワクチン及び／またはＰＤ−１阻害剤またはその１つ以上の塩で治療する方法を提供する。方法は、上記の、本明細書に詳述する、及び／または特許請求の範囲に記載する医薬品のいずれか１つにおける有効量のＤＮＡワクチン及び／またはＰＤ−１阻害剤またはその塩を、被験体に投与することを含む。被験体は、そのような治療を必要とする任意の被験体であり得る。上記の記載において、本技術は、化合物またはその塩と関連している。そのような塩として、臭化物塩、塩化物塩、ヨウ化物塩、炭酸塩、及び硫酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、この化合物はあるクラスの化合物のメンバーであり、本技術はこのクラス内の関連する誘導体を含む医薬品、方法、及びキットを包含することを意図していることを理解すべきである。したがって、本技術の別の態様は、前述の要約を包含するが、各態様において、「化合物」が出現する随所において、そこへ任意のそのような誘導体が置き換えられるものとして解される。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、被験体を試験して、前立腺癌などの疾患及び／または病態の存在、非存在、またはレベルを評価する。そのような試験は、例えば、バイオマーカー、代謝産物、身体症状、徴候などをアッセイまたは測定して、疾患または病態のリスクまたは存在を判定することによって実施する。いくつかの実施形態では、試験の結果に基づいて、ＤＮＡワクチン及び／またはＰＤ−１阻害剤で被験体を治療する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチン及び／またはＰＤ−１阻害剤で被験体を治療し、試料を採取し、検出可能な薬剤のレベルを測定し、次いで、測定した検出可能な薬剤のレベルに基づいてＤＮＡワクチン及び／またはＰＤ−１阻害剤で被験体を再度治療する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチン及び／またはＰＤ−１阻害剤で被験体を治療し、試料を採取し、検出可能な薬剤のレベルを測定し、測定した検出可能な薬剤のレベルに基づいてＤＮＡワクチン及び／またはＰＤ−１で被験体を再度治療し、次いで別の試料を採取し、検出可能な薬剤のレベルを測定する。いくつかの実施形態では、様々な段階、例えば、ＤＮＡワクチン及び／またはＰＤ−１阻害剤による初期治療の前に、初期用量の指針として、他の試験（例えば、検出可能な薬剤のレベルの測定に基づくものではない）も使用する。いくつかの実施形態では、例えば、投薬量、投薬計画、薬物の同一性などを変更する場合の試験結果に基づいてＤＮＡワクチン及び／またはＰＤ−１阻害剤によるその後の治療を調整する。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、患者を試験し、治療し、次いで再度試験して、治療に対する応答をモニタリングし、及び／または治療を変更する。いくつかの実施形態では、試験と治療のサイクルは、試験及び治療のパターン、周期性、またはそれぞれの試験フェイズと治療フェイズの間の間隔の期間に制限なく生じ得る。このように、本技術は、試験と治療の様々な組み合わせ、例えば、試験／治療、治療／試験、試験／治療／試験、治療／試験／治療、試験／治療／試験／治療、試験／治療／試験／治療／試験、試験／治療／試験／試験／治療／治療／治療／試験、治療／治療／試験／治療、試験／治療／治療／試験／治療／治療などを、制限なく企図する。
【０１７２】
本技術は、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤を投与するために使用する用量及び投与計画に関して制限されない。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチン（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（例えば、２０８μｇ）存在下でのｐＴＶＧ−ＨＰ（例えば、１００μｇ））を、１日目から隔週で６回、皮内に投与し、ＰＤ−１阻害剤を（例えば、ペンブロリズマブまたはニボルマブを２ｍｇ／ｋｇで）、３週毎に４回、静脈内に投与する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチン（例えば、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（例えば、２０８μｇ）存在下でのｐＴＶＧ−ＨＰ（例えば、１００μｇ））を、１日目から隔週で６回、皮内に投与し、ＰＤ−１阻害剤を（例えば、ペンブロリズマブまたはニボルマブを２ｍｇ／ｋｇで）、隔週で６回、静脈内投与し、最初の投与を、最後のｐＴＶＧ−ＨＰワクチン接種の２週間後に投与する。
【０１７３】
したがって、いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチン（例えば、ｐＴＶＧ−ＨＰ）を、およそ１００μｇ（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００μｇまたはそれ以上）の量で投与する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンを、アジュバント、例えばＧＭ−ＣＳＦ（例えば、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）と併用しておよそ２００μｇ（例えば、１００〜５００μｇ、例えば１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００（例えば、いくつかの実施形態では２０８）、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００μｇまたはそれ以上）の量で投与する。上記のように、いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンを、皮内に（例えば、側腕の三角筋領域上に）投与する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンを、およそ０．２５ｍＬ（例えば、１００〜５００μｌ、例えば、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００μｌまたはそれ以上）の容量で投与する。いくつかの実施形態では、その容量のＤＮＡワクチンを、２つの隣接する部位のそれぞれで投与する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンを、隔週投与する（例えば、およそ２週間毎に、例えばおよそ１４日毎に（例えば、１４±３日間（例えば、１１〜１７日間））。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンを、６回（例えば、３〜９回、例えば、３、４、５、６、７、８、または９回）投与する。
【０１７４】
さらに、いくつかの実施形態では、ＰＤ−１経路阻害剤（例えば、ペンブロリズマブまたはニボルマブ）を、２ｍｇ／ｋｇ（例えば、１〜５ｍｇ／ｋｇ、例えば、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５ｍｇ／ｋｇ）の用量で投与する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１経路阻害剤を静脈内投与する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１経路阻害剤を、３０分間（例えば、１５分〜２時間、例えば、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、または１２０分間）にわたって投与する（例えば、静脈内投与で）。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１経路阻害剤を、３週間毎に（例えば、毎週、１．５週間毎に、２週間毎に、２．５週間毎に、３週間毎に（例えば、２１±３日毎に（例えば、１８〜２４日））、３．５週間毎に、４週間毎に、または５週間毎に）投与する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１経路阻害剤を、４回（例えば、２〜９回、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９回）投与する。いくつかの実施形態では、１日目において、ＰＤ−１経路阻害剤を、ＤＮＡワクチンと同時に、例えば、ＤＮＡワクチンを用いた最初のワクチン接種の前に、同時に、または後に投与する。ＰＤ−１経路阻害剤をＤＮＡワクチンと同時に投与するいくつかの実施形態では、ＰＤ−１経路阻害剤を第一の組成物中に入れて投与し、ＤＮＡワクチンを第二の別個の組成物中に入れて投与する。ＰＤ−１経路阻害剤をＤＮＡワクチンと同時に投与するいくつかの実施形態では、ＰＤ−１経路阻害剤とＤＮＡワクチンを同じ組成物中に入れて投与する。別の例示的な実施形態では、ＰＤ−１経路阻害剤を、ＤＮＡワクチンの投与後に、例えば、ＤＮＡワクチンの最終的なワクチン接種から１、２、３、４週またはそれ以上後に、投与する。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、本技術は、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１経路阻害剤をスケジュールに従って投与することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、治療を開始するためにＤＮＡワクチン（例えば、ｐＴＶＧ−ＨＰ）及びＰＤ−１経路阻害剤を同じ日に被験体に投与し（例えば、「１日目」）、例えば、ＰＤ−１経路阻害剤をＤＮＡワクチンの投与から０〜０．５〜５時間及び最大２４時間後に投与する。次いで、いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチン及び／またはＰＤ−１阻害剤を、治療開始から数日後に投与する。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンを、１５日目（例えば、ＤＮＡワクチンとＰＤ−１阻害剤の１日目の投与から１５±３日（例えば、１２〜１８日））に、２９日目（例えば、ＤＮＡワクチンの１５日目の投与から１４±３日（例えば、１１〜１７日））に、４３日目（例えば、ＤＮＡワクチンの２９日目の投与から１４±３日（例えば、１１〜１７日））に、５７日目（例えば、ＤＮＡワクチンの４３日目の投与から１４±３日（例えば、１１〜１７日））に、及び７１日目（例えば、例えば、ＤＮＡワクチンの５７日目の投与から１４±３日（例えば、１１〜１７日））に投与し；ＰＤ−１阻害剤を、２２日目（例えば、ＤＮＡワクチンの１５日目の投与から７±３日（例えば、４〜１０日））に、４３日目（例えば、ＤＮＡワクチンの４３日目の投与から０〜０．５〜５時間後）に、及び６４日目（例えば、ＤＮＡワクチンの５７日目の投与から７±３日（例えば、４〜１０日））に投与する。
【０１７６】
いくつかの好ましい実施形態では、ワクチンとＰＤ−１阻害剤を、重複投与計画で複数回投与する。いくつかの実施形態では、最初にワクチンとＰＤ−１阻害剤を同時に（すなわち、治療計画の１日目に互いを２４時間以内に）投与し、その後、最大９０日の期間にわたって、ワクチンを１０〜２０または２１日毎に、好ましくは約１４日毎に投与し、ＰＤ−１阻害剤を、１７日〜２４日毎に、好ましくは約２１日毎に投与する。いくつかの実施形態では、本方法は、９１日間〜３６５日の期間、ワクチンを１０〜２０または２１日毎に、好ましくは約１４日毎に、ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に、好ましくは約２１日毎に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、９０日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、９１日〜３６５日の期間、ワクチンを１０〜２０または２１日毎に、ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する。いくつかの実施形態では、本方法は、３６６日〜７３０日の期間、ワクチンを１０〜２０または２１日毎に、好ましくは約１４日毎に、ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日、好ましくは約２１日毎に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、３６５日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、３６６日〜７３０日の期間、ワクチンを１０〜２０または２１日毎に、ＰＤ−１阻害剤を１７〜２４日毎に投与する。いくつかの実施形態では、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、最大９０日間、１０〜２８日毎に、好ましくは１０〜２０もしくは２１または２１日または１０〜２４日毎に、最も好ましくは約１４日または２１日毎に、重複スケジュールで投与する。いくつかの実施形態では、本方法は、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、９１日〜３６５日の期間、１０〜２８日毎に、好ましくは１０〜２０もしくは２１日または１０〜２４日毎に、最も好ましくは約１４日毎に投与することを含む。いくつかの実施形態では、９０日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、９１日〜３６５日間、１０〜２８日毎に、好ましくは１０〜２０もしくは２１日または１０〜２４日毎に、最も好ましくは約１４日毎に投与する。いくつかの実施形態では、本方法は、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、３６６日〜７３０日の期間、１０〜２８日毎に、好ましくは１０〜２０もしくは２１日または１０〜２４日毎に、最も好ましくは約１４日毎に投与することを含む。いくつかの実施形態では、３６５日後にＰＳＡの減少または腫瘍退縮を示す患者を選択し、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、３６６日〜７３０日の期間、１０〜２８日毎に、好ましくは１０〜２０もしくは２１日または１０〜２４日毎に、最も好ましくは約１４日毎に同時投与する。いくつかの実施形態では、ワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、重複投与計画内で同時投与する。同時投与は、ワクチンとＰＤ−１阻害剤を同じ組成物（例えば、溶液）に入れて投与するか、または薬剤を別々に投与する場合には、同じ日に投与し、好ましくは互いを約１分〜約５時間または２４時間以内、または互いを約３０分〜約５時間または２４時間以内に投与することを包含する。
【０１７７】
投与計画の他の実施形態では、被験体にＤＮＡワクチン（例えば、ｐＴＶＧ−ＨＰ）を投与して治療を開始し（例えば、「１日目」）、１日目にＰＤ−１阻害剤を投与しない。その後、治療開始から数日後にＤＮＡワクチン及び／またはＰＤ−１阻害剤を投与する。例えば、いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンを、１５日目（例えば、１日目のＤＮＡワクチンの投与後１５±３日（例えば、１２〜１８日））に、２９日目（例えば、１５日目のＤＮＡワクチンの投与後１４±３日（例えば、１１〜１７日））に、４３日目（例えば、２９日目のＤＮＡワクチンの投与後１４±３日（例えば、１１〜１７日））に、５７日目（例えば、４３日目のＤＮＡワクチンの投与後１４±３日（例えば、１１〜１７日））に、及び７１日目（例えば、５７日目のＤＮＡワクチンの投与後１４±３日（例えば、１１〜１７日））に投与し；ＤＮＡワクチンの一連の投与の後、ＰＤ−１阻害剤を、例えば８５日目（例えば、７１日目のＤＮＡワクチンの投与後１４±３日（例えば、１１〜１７日））に、１０６日目（例えば、８５日目のＰＤ−１阻害剤の投与後２１±３日（例えば、１８〜２４日））に、１２７日目（例えば、１０６日目のＰＤ−１阻害剤の投与後２１±３日（例えば、１８〜２４日））に、及び１４８日目（例えば、１２７日目のＰＤ−１阻害剤の投与後、２１±３日（例えば、１８〜２４日））に投与する。例えば、図１参照。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、投与計画の任意の時間の間に、被験体に対して、または被験体から得られた試料を用いて１つ以上の試験を実施してもよい。例示的な試験として、化学物質、バイオマーカー、代謝産物など（例えば、ナトリウム、カリウム、炭酸水素塩、ＢＵＮ、クレアチニン、グルコース、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ビリルビン、アルカリホスファターゼ、アミラーゼ、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ＬＤＨ、血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、血清ＰＡＰ、血清テストステロンのレベルを測定するための１つ以上の検査；血液検査（例えば、ＣＢＣ、例えば、いくつかの実施形態では、ディファレンシャル及び血小板数を含む）；及び例えば、ＣＴスキャン；骨スキャン；身体検査；白血球アフェレーシス；抗体パネル；ＣＴＣカウント；組織生検；脈拍；血圧；呼吸数；体温；Ｔ細胞応答；ＰＥＴスキャン；アンケート；などを含む他の検査が挙げられる。
【０１７９】
［治療応答及びモニタリング］
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載する併用療法による治療への応答により、腫瘍性病変のサイズが縮小し、被験体の生物学的腫瘍量が減少する。例えば、いくつかの実施形態では、被験体の「測定可能な」病変を、治療前、治療中、及び治療後に同定及びモニタリングする。いくつかの実施形態では、最初の治療後の被験体の腫瘍量を評価して、治療経過をモニタリングするためのベースラインを設定し、例えば、その後の測定値の比較対象となる測定値を提供する。いくつかの実施形態では、被験体を画像化することによって、「ベースライン」腫瘍量を決定する。本明細書中で使用する場合、被験体が少なくとも１つの「測定可能な病変」を有する場合、被験体は「測定可能な疾患」を有する。本明細書中で使用する場合、「測定可能な病変」とは、少なくとも１つの寸法（記録される最長直径）において、従来技術では＞２０ｍｍ（２．０ｃｍ）、またはスパイラルＣＴスキャンでは＞１０ｍｍ（１．０ｃｍ）として正確に測定できる病変である。リンパ節転移の場合、「測定可能な病変」は、スパイラルＣＴまたは従来技術による最長直径において少なくとも２．０ｃｍである。いくつかの実施形態では、以前に照射した領域に位置する腫瘍病変は、測定可能とはみなされない。本明細書中で使用する場合、「測定不能な」病変とは、「測定可能」ではない病変、例えば、小さな病変（従来技術では最長直径＜２０ｍｍ（２．０ｃｍ）、またはスパイラルＣＴでは＜１０ｍｍ（１．０ｃｍ））、＜２．０ｃｍのリンパ節、及び高い信頼性で測定値を取得できない病変を含む、すべての他の病変（例えば、骨病変、軟膜疾患、腹水、胸水／心膜液貯留、皮膚／肺リンパ管症、その後の画像化技術において確認及び追跡されない腹部腫瘤、及び嚢胞性病変）である。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、病変を、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、例えば、１８Ｆ  ＮａＦ  ＰＥＴ）で測定する。１８Ｆ  ＮａＦ  ＰＥＴは、例えば組織の３次元測定値を生成する際に用いることができ、病変体積のボリューム定量化を、したがって総腫瘍体積の測定値を提供する。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、関与する臓器を代表する測定可能な病変のサイズをモニタリングすることによって、治療への応答をモニタリングする。いくつかの実施形態では、Ｘ線撮影データの評価にＲＥＣＩＳＴ１．１を使用する。いくつかの実施形態では、免疫腫瘍学の評価に、ＷＨＯ基準に基づく免疫関連応答基準（ｉｒＲＣ）、例えばＲＥＣＩＳＴ  １．１、ｉｒＲＣ、及び参照として本明細書に援用するＮｉｓｈｉｎｏ（２０１３）“Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｌａｎｇｕａｇｅ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ｉｍｍｕｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｕｓｉｎｇ  ｕｎｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ．”，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９（１４）：３９３６−４３に基づくｉｒＲＥＣＩＳＴ基準を使用する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、標的病変を、サイズ（例えば、最長直径を有するもの）及び正確な反復測定に対するそれらの適合性に基づいて選択する。いくつかの実施形態では、すべての標的病変の最長直径の合計を計算して、合計最長直径を提供することにより、治療に対する応答をモニタリングする。いくつかの実施形態では、合計最長直径を使用して腫瘍縮小効果を特徴付ける。２次元または３次元で測定可能な病変については、各評価時での最長直径を使用する。さらに、いくつかの実施形態では、例えば、ＲＥＣＩＳＴ１．１及び／またはｉｒＲＥＣＩＳＴにより、短軸測定値を使用してリンパ節測定を行う。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、被験体を、治療に対する被験体の応答に基づいてクラス分類する。例えば、すべての標的病変が消失する場合に、被験体を「完全奏効（ＣＲ）」クラスに分類する。いくつかの実施形態では、完全奏効の状態を割り当てるために、奏効の基準が最初に満たされてから４週間以上経過した後に繰り返し実施する評価によって腫瘍の測定値の変化を確認する。いくつかの実施形態では、ＰＳＡは＜０．２ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、１．０ｃｍ未満に収縮するリンパ節は正常と考えられる。ベースラインの合計最長直径を基準として標的病変の最長直径の合計が少なくとも３０％減少する場合に、被験体を「部分奏効（ＰＲ）」クラスに分類する。いくつかの実施形態では、部分奏効の状態を割り当てるために、奏効の基準が最初に満たされてから４週間以上経過した後に繰り返し実施する評価によって腫瘍の測定値の変化を確認しなければならない。いくつかの実施形態では、新規病変は存在しない。ベースライン測定値、または１つ以上の新規病変（複数可）の出現後に記録する最小合計最長直径を基準として標的病変の最長直径の合計が少なくとも２０％増加し、同時に最低でも０．５ｃｍ増加する場合に、被験体を「進行性疾患（ＰＤ）」クラスに分類する。部分奏効と認定するための十分な収縮も、進行性疾患と認定するための十分な増加もない場合、被験体を「不変（ＳＤ）」クラスに分類する。いくつかの実施形態では、不変の状態を割り当てるために、測定値は、１２週間の最小間隔での試験開始後、少なくとも１回、不変基準を満たす。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、治療に対する応答をモニタリングすることは、非標的病変、例えば、疾患の標的病変ではないすべての病変または部位をモニタリングすることを含む。いくつかの実施形態では、非標的病変を、例えば、骨シンチグラフィーによってモニタリングする。いくつかの実施形態では、非標的病変のモニタリングに基づいて被験体を被験体クラスに分類する。例えば、すべての非標的病変が消失し、ＰＳＡ腫瘍マーカーレベルが検出不能である場合、被験体を「完全奏効（ＣＲ）」クラスに分類する。いくつかの実施形態では、完全奏効の状態を割り当てるために、奏効の基準が最初に満たされてから４週間以上経過した後に繰り返し実施する評価によって腫瘍の測定値の変化を確認する。いくつかの実施形態では、１つ以上の非標的病変（複数可）が持続的であり、及び／または検出可能な血清ＰＳＡ腫瘍マーカーレベルが持続的である場合、被験体を「不完全奏効／不変（ＳＤ）」クラスに分類する。いくつかの実施形態では、不変の状態を割り当てるために、測定値は、１２週間の最小間隔での試験開始後、少なくとも１回、不変基準を満たす。いくつかの実施形態では、１つ以上の新規病変（複数可）の出現及び／または既存の非標的病変の明白な進行がある場合に、被験体を「進行性疾患（ＰＤ）」クラスに分類する。いくつかの実施形態では、骨スキャンによってのみ検出可能な病変については、＞２の新規病変の出現に症状が伴う場合、疾患の進行とみなされる。症状がなく、疾患の進行の他のエビデンスがない（例えば、ＰＳＡまたは測定可能な疾患基準による進行性疾患がない）場合、いくつかの実施形態では、例えば、少なくとも６週間後に、骨シンチグラフィーを用いて＞２の新規病変を示す進行を記録し、骨スキャンで認められるフレアー応答の可能性を排除する。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、ＰＳＡ進行（例えば、ＰＳＡ量及び／または速度に基づいて）をモニタリングして、治療に対する被験体の応答をモニタリングする。いくつかの実施形態では、ＰＳＡが＜０．２ｎｇ／ｍＬへ減少する場合に被験体を「ＰＳＡ完全奏効」として分類する。いくつかの実施形態では、「ＰＳＡ完全奏効」クラスへの分類を、例えば、最低４週間後（ＰＳＡ  ＣＲを確認した）における、事後のＰＳＡ測定によって確認する。いくつかの実施形態では、「ＰＳＡ完全奏効」への分類はさらに、Ｘ線画像上での進行のエビデンスがないことに基づく。いくつかの実施形態では、ベースラインＰＳＡが５０％以上減少する場合に、被験体を「ＰＳＡ部分奏効」クラスに分類する。いくつかの実施形態では、Ｘ線画像上での進行のエビデンスを含まない場合に「ＰＳＡ部分奏効」クラスへ分類する。いくつかの実施形態では、ＰＳＡ進行までの時間を、治療に対する被験体の応答をモニタリングするために使用する。本明細書中で使用する場合、ＰＳＡ進行とは、３日後またはそれ以降における第二の値によって確認される、最下点のＰＳＡに対するＰＳＡの５０％の増加、及び最下点に対して＞２ｎｇ／ｍＬであること（例えば、確認される上昇傾向）を指す。試験中に減少が生じていない場合、最下点はベースライン値（例えば、治療前）である。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、例えばＰＡＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター免疫の評価、ＰＡＰ特異的記憶Ｔ細胞免疫の評価、ＰＡＰ特異的Ｔ細胞の評価、抗原特異的抗体（例えば、ＰＡＰ特異的抗体）の評価、抗原特異的調節免疫応答の評価、及び／または他の前立腺関連抗原に対する抗原拡散を評価することによって、被験体の免疫系をモニタリングする。いくつかの実施形態では、循環腫瘍細胞を計数し、特徴付けることによって被験体を評価する。いくつかの実施形態では、組織学を用いて、例えば、組織生検の検査により被験体を評価する。いくつかの実施形態では、ＰＥＴ及び／またはＣＴ（例えば、ＮａＦ  ＰＥＴ／ＣＴ）を用いた定量的全骨イメージングによって被験体を評価する。
【０１８７】
免疫学的モニタリングの使用を含む実施形態では、治療の６、１２及び２４週目、ならびに９及び１２か月目（四半期毎に最大１年）に、末梢血液採取（最大１２０ｍＬ）または白血球アフェレーシス（５０〜１００ｍＬ）予備免疫により、血液を採取する。ヘパリン処理した血液から、標準的な技術を用いてＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅによる密度遠心分離によって末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を調製する。ＰＢＭＣは分析に直接使用し、自己由来の９０％を使用して残存物質を液体窒素中で凍結保存し、それらはレッドトップチューブから調製し、抗体分析用に一定分量を−８０℃で保存する。ＩＦＮγ及びグランザイムＢ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析、ＰＡＰ特異的Ｔ細胞増殖、抗原特異的サイトカイン分泌のフローサイトメトリーアッセイ、及び抗原特異的抗体のＥＬＩＳＡ試験を分析する。試験する主要な抗原は、ＰＡＰ（実験用）、ＰＳＡ（陰性対照）、及び破傷風トキソイド（陽性対照）である。一次免疫分析を６か月時点で実施し、治療前の時点と比較し、免疫応答（主要エンドポイント）について評価可能である患者については、この時点からの血液（ＰＢＭＣ及び血清）を分析用に保存する。適切な時点で免疫モニタリングを実施して、免疫の速度測定値を評価し、特定の表現型の持続的な免疫応答が誘発及び／または維持されるかどうかを評価する。いくつかの実施形態では、試料採取（新鮮）時にアッセイを実施し、及び／またはバッチ処理し、異なる時点で採取した複数の凍結保存試料について１回実施する。いくつかの実施形態では、ＰＡＰ及び他のヒト組織抗原に対するエフェクター及び調節性Ｔ細胞応答の他の方法を使用する。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、ＰＡＰ特異的ＩＦＮγ分泌及びグランザイムＢ分泌Ｔ細胞前駆体頻度を評価するためにデータを収集する。いくつかの実施形態では、ＰＡＰ特異的ＩＦＮγ分泌及びグランザイムＢ分泌Ｔ細胞前駆体頻度を、ＥＬＩＳＰＯＴによって定量化する。ＥＬＩＳＰＯＴは、低周波事象（ＬＯＤ約１：１００，０００細胞）を検出し、低温保存したバッチ試験片の同時分析を提供することから、ＰＡＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター免疫を評価する（例えば、定量化する）ために使用される［３０］。炎症性／組織破壊性（Ｔｈ１型、細胞溶解性）免疫応答と特異的に関連しているため、ＩＦＮγ及びグランザイムＢを評価する。具体的には、様々な時点で被験体から採取した凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、静置し、次に予めＩＦＮγまたはグランザイムＢに特異的なモノクローナル捕捉抗体でコーティングした９６ウェルニトロセルロースマイクロタイター（ＥＬＩＳＰＯＴ）プレートに移す。ウェルあたり１０５細胞を培地（例えば、Ｌグルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール、及び１０％ヒトＡＢ血清を補充したＲＰＭＩ１６４０）のみ（抗原なし）、２μｇ／ｍｌのＰＡＰタンパク質、２μｇ／ｍｌのＰＳＡタンパク質（陰性対照）、ＰＡＰまたは対照に特異的な２μｇ／ｍｌのペプチドライブラリー、２５０ｎｇ／ｍｌの破傷風トキソイド、または２．５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（陽性マイトジェン対照）の存在下で２４〜４８時間培養する。次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳでプレートを洗浄し、ＩＦＮγまたはグランザイムＢのいずれかに対する５μｇ／ｍｌのビオチン化検出抗体を含有する５０μｌ／ウェルのＰＢＳとともに室温で２．５時間インキュベートする。インキュベーション後、ウェルをＰＢＳで洗浄し、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン標識アルカリホスファターゼ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）の存在下でさらにインキュベートし、次いで１００μｌ／ウェルのＢＣＩＰ／ＮＢＴ比色基質（ＢｉｏＲａｄ）で発色させた。冷たい水道水でプレートをすすぐことにより比色反応を停止させ、ウェルを完全に乾燥させた後、ＥＬＩＳＰＯＴ自動プレートリーダーでスポットを計数する。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、結果は、１０６個の細胞あたりのスポット形成単位（ｓｆｕ）の平均（±標準偏差）数（頻度）として計算され、これは、８ウェルの複製アッセイに由来する実験ウェルで得られた平均数から抗原なしの対照ウェルで得られたスポット平均数を差し引き、１０６の初期ＰＢＭＣに対して正規化することによって計算される［３１］。ｐ＜０．０５（両側）を有意な抗原特異的Ｔ細胞応答として定義した２サンプルｔ検定を用いて、実験ウェルと対照ウェル（抗原なし）との比較を実施する。いくつかの実施形態では、免疫化から生じる有意な抗原特異的応答は、治療後時点から６か月（または評価する他の治療後時点）で検出可能なＰＡＰ特異的応答であり、これは、培地のみよりも有意に高く（上記のように）、平均ベースライン値よりも少なくとも３倍高く、１０６個のＰＢＭＣあたり＞１０の頻度である。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、例えば、抗原刺激に応答して増殖するＴ細胞株の能力を評価することによってデータを収集し、ＰＡＰ特異的記憶Ｔ細胞免疫を評価する。抗原刺激に応答するＴ細胞増殖は、記憶Ｔ細胞応答の尺度を提供し、いくつかの実施形態では、ＰＫＨ２６色素希釈アッセイによって評価される［３１］。具体的には、製造業者の推奨に従ってＰＢＭＣをＰＫＨ２６色素（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でｉｎ  ｖｉｔｒｏで標識する。Ｌグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、β−メルカプトエタノール、及び１０％ヒトＡＢ血清（ＩＣＮ  Ｆｌｏｗ、Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ、ＣＡ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）を含む培地中、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）にプレーティングした２×１０５末梢血単核球（ＰＢＭＣ）／ウェルを用いて、抗原存在下または非存在下でのＴ細胞培養を反復試験で確立する。様々な実施形態において、抗原は、ＰＡＰ、２μｇ／ｍｌ  ＰＡＰタンパク質（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ＮＪ）、２μｇ／ｍｌ  ＰＳＡ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）、２５０ｎｇ／ｍｌの破傷風トキソイド、及び２．５μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）のアミノ酸配列にまたがる２μｇ／ｍｌのペプチドのプールを含む。３７℃／５％ＣＯ２で６〜７日間培養した後、細胞表面マーカーを染色し、増殖中の細胞のＴ細胞表現型及び免疫記憶細胞表現型（ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７）を特徴付ける。フローサイトメトリーを使用して、ＰＫＨ２６に対するＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の同時染色を同定し、計数する。抗原特異的ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋事象の間のＰＫＨ２６＋事象の前駆体頻度を決定し、（例えば、ＭｏｄＦｉｔソフトウェア、Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ、Ｔｏｐｓｈａｍ、ＭＥを用いた色素希釈による細胞数及び細胞分裂数から推定する）、培地のみの条件下での増殖細胞の平均前駆体頻度を差し引くことによって計算される。いくつかの実施形態では、他の細胞表面マーカーを評価し、他の抗原を評価し、及び／または抗原特異的Ｔ細胞増殖の他の方法を使用する。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、各抗原刺激状態について３回の評価を用いて、１０６個のＰＢＭＣあたりの抗原特異的（ＰＡＰ特異的）増殖前駆体の平均及び標準偏差としてデータを計算する［３１］。有意な抗原特異的増殖性Ｔ細胞応答として定義されるｐ＜０．０５で、両側スチューデントｔ検定を用いて、実験ウェルと対照ウェル（抗原なし）との比較を行う。いくつかの実施形態では、免疫化から生じる有意な抗原特異的応答は、治療後時点から６か月（または評価する他の治療後時点）で検出可能なＰＡＰ特異的応答であり、これは、培地のみよりも有意に高く（上記のように）、平均ベースライン値よりも少なくとも３倍高く、１０６個のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞あたり＞１００の頻度である。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、例えば、細胞内サイトカイン染色によってデータを収集し、ＰＡＰ特異的Ｔ細胞サイトカイン発現を評価する。いくつかの実施形態では、ＡＲ  ＬＢＤ特異的Ｔ細胞応答を評価する別の方法として、細胞内サイトカイン染色を使用する。具体的には、様々な時点での被験体由来の新鮮または凍結保存したＰＢＭＣを迅速に解凍し、試験抗原（例えば、ＰＡＰ（タンパク質またはオーバーラップする１５量体ペプチドのプール）、ＰＳＡ、破傷風、ＰＨＡまたは培地のみ）の存在下で、９６ウェルマイクロタイタープレート中で４〜２４時間培養し、細胞内サイトカイン発現を分析する。具体的には、刺激細胞を３７℃／５％ＣＯ２で４〜８時間モネンシンで処理する。その後、細胞をＰＢＳ／３％ＦＣＳで洗浄し、表面分子（例えば、Ｔ細胞サブセットを同定するためのＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８、ならびに免疫記憶細胞集団を同定するためのＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＯ、ならびに潜在的に他の細胞表面マーカー）を染色する。次いで、細胞を固定し、透過処理し、サイトカインのパネル（例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−１７、及びＩＬ−１０を含むがこれらに限定されない）の細胞内発現か、または適切な蛍光色素で標識した対照ＩｇＧについて染色する。細胞をフローサイトメーターで分析し、個々のサイトカインを発現するＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含む全Ｔ細胞及び／またはＴ細胞サブセット、ならびに様々な免疫記憶細胞集団または調節性集団のいずれか）、または複数のサイトカインを発現する細胞の頻度を同定することによって結果を決定する。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、以前に報告されたように、各抗原刺激状態について３回の評価を用いて、１０６個のＰＢＭＣあたり１つ以上のサイトカインを発現する抗原特異的（例えば、ＰＡＰ特異的）ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の平均及び標準偏差としてデータを報告する［３１］。有意な抗原特異的Ｔ細胞応答として定義されるｐ＜０．０５で、両側スチューデントｔ検定を用いて、実験ウェルと対照ウェル（抗原なし）との比較を行う。いくつかの実施形態では、免疫化から生じる有意な抗原特異的応答は、治療後時点から６か月（または評価する他の治療後時点）で検出可能なＰＡＰ特異的応答であり、これは、培地のみよりも有意に高く（上記のように）、平均ベースライン値よりも少なくとも３倍高く、１０６個のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞あたり＞１００の頻度である。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、抗原特異的抗体免疫を評価するためにデータを収集する。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＡＰに対する抗体応答を検出するために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用する。特定の実施形態では、ＰＡＰ（または他の抗原）に対する共存する液性免疫応答の存在を、以前に記載された方法と同様の間接的方法を用いてＥＬＩＳＡによって評価する［３４］。具体的には、Ｉｍｍｕｌｏｎ−４  ＥＬＩＳＡプレート（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．６）中の２μｇ／ｍｌの精製ＰＡＰタンパク質（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、または他の抗原または市販の供給源）を用いて４℃で一晩コーティングする。ＰＢＳ／１％ＢＳＡで室温、１時間ブロッキングした後、ウェルをＰＢＳ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で洗浄し、次いで１：２５、１：５０、１：１００、及び１：２００に希釈したヒト血清で１時間インキュベートする。洗浄後、プレートを、ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ検出抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、続いてペルオキシダーゼ酵素ＴＭＢ基質（Ｋｉｅｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の存在下で順次インキュベートする。１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で呈色反応を停止させ、光学濃度を４５０ｎｍで測定する。ＰＡＰ特異的ＩｇＧ抗体の抗体力価を、以前に記載されたように決定する［３４］。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、血清希釈曲線を用いて、及び力価（例えば、陰性対照の平均＋３標準偏差を上回るＩｇＧ応答が検出可能な最も高い血清希釈として定義される）により、ＩｇＧ応答を、図表を用いて報告する。いくつかの実施形態では、免疫化から生じる陽性ＩｇＧ応答は、治療後６か月時点で検出可能なベースライン力価（または評価する他の治療後時点）より少なくとも４倍高い抗原特異的（抗ＰＡＰ）ＩｇＧ力価である。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、例えば、ｔｒａｎｓ−ｖｉｖｏ遅延型過敏症（ｔｖＤＴＨ）評価によってデータを収集し、抗原特異的調節免疫応答を評価する。いくつかの実施形態では、免疫化前または免疫化後の患者から得られた７．５〜１０×１０６個のＰＢＭＣを、陰性対照としてリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）のみに対して、１μｇのＰＡＰタンパク質（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ａｃｔｏｎ、ＭＡ）、またはリコール抗原として破傷風トキソイド（ＴＴ／Ｄ；Ａｖｅｎｔｉｓ  Ｐａｓｔｅｕｒ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）を含む６週齢〜８週齢のＳＣＩＤマウスの足蹠に同時注入する。いくつかの実施形態では、他の抗原も評価する。抗原によって誘発される腫脹を、以前に記載されたように測定する［６５］。２４時間後のＤＴＨ反応性は、例えば、ダイヤル厚さ計（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて測定する１０−４インチの倍数で測定する足蹠の厚さの変化として示され、正味の腫脹は、ＰＢＭＣ＋ＰＢＳで得られる寄与分を差し引いた抗原特異的腫脹である。中和抗体の影響を測定するために、ＰＢＭＣを１μｇのＰＡＰ抗原、及び２５μｇの対照ＩｇＧまたはウサギ抗ヒトＴＧＦ−β、ヤギ抗ヒトＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、１μｇのマウス抗ヒトＣＴＬＡ−４モノクローナルＡｂ（クローンＡＳ３２、Ａｂ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）または１μｇのマウス抗ヒトＰＤ−１モノクローナルＡｂ（または、いくつかの実施形態では、他の調節分子に対する他の抗体）のいずれかと混合し、上記のようにＳＣＩＤマウスの足蹠に注射した。抗原特異的調節応答を示すバイスタンダー効果の程度を、以前に記載されたように、ＰＡＰ抗原（または陰性対照として前立腺特異抗原（ＰＳＡ））の存在下でのリコール抗原（破傷風）応答の阻害として測定し、計算する［６６］。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、抗原特異的（ＰＡＰ特異的）調節性応答は、ＰＡＰの存在下で実施する場合、リコール抗原（破傷風トキソイド）ＤＴＨ応答の＞５０％の阻害であり；例えば、ＰＡＰ＋ＴＴの存在下でのＤＴＨ応答は、ＴＴのみで得られる応答の＜５０％である。さらに、いくつかの実施形態では、ＰＤ−１（またはＣＴＬＡ−４）調節性応答の同定は、図２のように、対ＩｇＧ対照に対する、抗ＰＤ−１（または抗ＣＴＬＡ−４）の存在下でのＰＡＰ特異的応答における増加（＞１５×１０−４インチ）である。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、他の前立腺関連抗原への抗原拡散を、例えばハイスループットイムノブロット（ＨＴＩ）によって評価する。いくつかの実施形態では、試験を実施して、治療する患者が、抗原拡散のエビデンスとして「オフターゲット」前立腺癌抗原特異的免疫応答を生じるかどうかを判定する。例えば、いくつかの実施形態では、試験は、非標的抗原に対するＴ細胞応答を評価する。また、いくつかの実施形態では、患者を評価して、前立腺関連抗原のパネルに対するＩｇＧ応答（例えば、ワクチンまたは他の免疫調節剤で治療した患者において観察されたような）を評価する［６７，６８，６９］。試験を実施し、２９種のがん−精巣抗原［７０，７１］を含む１２６の抗原に対するＩｇＧ特異性を評価し；さらにいくつかの実施形態では、免疫学的に高頻度で認識される９７種の前立腺抗原［７２，７３，７４，７５］を、これらの個々の抗原を発現する高密度ファージアレイをスクリーニングすることによって同定する［６７，６９，７０］。いくつかの別の実施形態では、本アプローチは、市販業者によって提供される膜を支持するために固定するタンパク質抗原のパネルに対する応答を評価することを含む。いくつかの実施形態では、６か月目に得られる血清を用いて分析を実施し、ベースラインで同定されるＩｇＧ応答と比較して、個々の抗原に特異的なＩｇＧが経時的に誘発されるかどうかを判定する。いくつかの実施形態では、他の時点を評価して、免疫応答発達の持続性及び速度を決定する。いくつかの実施形態では、確証的ＥＬＩＳＡ試験を実施する。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、陽性ＩｇＧ応答は、規定の抗原に対する免疫反応性スポットであり（例えば、４人の独立したレビュワーのうちの少なくとも３人によってスコアリングされる）、イムノブロット膜あたり３つの反復試験のうちの少なくとも２つで検出可能であるか［６７，７６］、または市販の抗原源を使用して統計的に定義された基準によって検出可能である。いくつかの実施形態では、免疫化から生じるＩｇＧ応答は、治療前の時点では同定されなかった６か月時点（またはその後の分析のための他の治療後時点）で同定される免疫反応性抗原として定義される。
【０２００】
いくつかの実施形態では、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）について被験体を評価する。いくつかの実施形態では、ＣＴＣを計数し、特徴付ける。いくつかの実施形態では、評価は、フローサイトメトリーを用いて、免疫評価と同じ時点で（例えば、治療前、６週間後、及び最大１年の四半期間隔における様々な時点で）実施する。具体的には、例えば、ＣＤ４５、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、及びＤＡＰＩ（例えば、図３参照）のうちの１つ以上に特異的な蛍光色素標識抗体でＰＢＭＣを染色する。いくつかの実施形態では、ＣＴＣをＣＤ４５−ＥｐＣＡＭ＋ＤＡＰＩ−細胞として検出し、すべての生細胞事象中のこれらの事象の割合を異なる時点で決定する。いくつかの実施形態では、ＣＴＣ発現ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＨＶＥＭ、またはガレクチン分子の割合も決定する。いくつかの実施形態では、異なる時点について結果を報告し、一般的な傾向を評価する。いくつかの実施形態では、ＣＴＣの捕捉及び計数の他の方法を使用し、いくつかの実施形態では、これらの方法によって収集したＣＴＣを用いてさらなる試験を実施する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、組織病理学を用いて被験体を評価する。例えば、いくつかの実施形態では、例えば、治療前及び１２週目において、転移性病変（例えば、患者１人につき、同じ病変）から組織生検を採取する。いくつかの実施形態では、試験を実施し、免疫化と、例えば、腫瘍内の（例えば、ＩＦＮγを分泌する腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を誘発することによって）腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１発現との関連性を試験し、抗ＰＤ−１ｍＡｂを用いた同時治療と、ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤との関連性（例えば、浸潤の増加を引き起こす）を試験し、また、治療と、Ｔ細胞上の他のＴ細胞調節性リガンド（例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ−３）または腫瘍上の他のＴ細胞調節性リガンド（例えば、ＨＶＥＭ、ホスファチジルセリン、ＰＤ−Ｌ２）の発現との関連性（例えば、発現の増加）を試験する。続いて、いくつかの実施形態では、生検組織（例えば、治療前及び１２週間後に採取した）を、抗体、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ−３、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ホスファチジルセリン、ＨＶＥＭ、及びいくつかの実施形態では他のマーカーに特異的な抗体を用いて染色する。染色と定量化を治療群に対して盲検化した病理学者によってレビューし、視野あたりのＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋（Ｔｒｅｇ）：ＣＤ８＋Ｔ細胞比、ＰＤ−Ｌ１発現、及びこれらのパラメーターが、例えば、治療前から１２週時点までに、経時的に変化するかどうかを判定する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、ＮａＦ  ＰＥＴ／ＣＴを用いた全骨イメージング（例えば、定量的全骨イメージング、ＱＴＢＩ）を使用して被験体を評価する。例えば、いくつかの実施形態では、ＱＴＢＩを使用して、少量の骨転移性疾患及び腫瘍成長速度の評価を実施する。例えば、いくつかの実施形態では、被験体は、標準的な骨シンチグラフィーでは検出されない骨疾患を有する。いくつかの実施形態では、患者を、様々な時点、例えば、治療の１か月前、ベースライン、及び治療の３か月目で評価する。いくつかの実施形態では、骨内の転移性前立腺癌病変を、ＣＴスキャンによって提供される解剖学的情報を用いて、機能的ＮａＦ  ＰＥＴ取り込みに基づいて局在化し、同定する。いくつかの実施形態では、自動セグメンテーション法を使用して（例えば、固定のＳＵＶ閾値を用いて）セグメンテーションを実行し、医師の指導の下で調整する。いくつかの実施形態では、異なる時点に由来するスキャンを、ＣＴ由来の骨格要素（例えば、骨）の剛体位置合わせを用いた関節型レジストレーション技術を使用して相互に位置合わせし、その後、ＮａＦ  ＰＥＴ／ＣＴ由来の骨及び病変の変形可能な位置合わせと組み合わせることにより、位置合わせを最適化する。いくつかの実施形態では、治療前及び追跡調査でのスキャンの間の病変をマッチングし、病変の縦方向での対応関係を確立する。各患者について、いくつかの実施形態では、例えば、ＳＵＶｔｏｔａｌ（全疾病負荷）、ＳＵＶｍａｘ（最大強度病変）、ＳＵＶｍｅａｎ（平均強度）、病変数、及び骨病変の総体積を含む、包括的な治療応答測定基準を計算する。さらに、イメージング応答測定基準を、いくつかの実施形態では個々の病変毎に計算する。いくつかの実施形態では、この方法論を使用して、例えば治療前からベースラインまでの経時変化を評価し、これをベースラインから３か月目までの測定値と比較することによって、骨転移性疾患の成長率を評価する。
【０２０３】
したがって、本技術は、被験体において臨床成績を得るための、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤による被験体の治療に関する。いくつかの実施形態では、改善とは、検出可能な特性の早期の測定と比較した、被験体の検出可能な特性の増加または減少である。いくつかの実施形態では、早期の測定は、治療開始前に行う測定（例えば、「治療前」測定）である。いくつかの実施形態では、早期の測定は、治療開始後に行う測定である。
【０２０４】
例えば、いくつかの実施形態では、本明細書において提供する方法は：ＰＡＰ特異的Ｔ細胞応答の強度；循環Ｔ細胞（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）上のＰＤ−１の発現の強度；血中の循環上皮（例えば、腫瘍）細胞（例えば、ＣＴＣ）上のＰＤ−Ｌ１の発現の強度；Ｔ細胞（例えば、腫瘍生検において検出される）上のＰＤ−Ｌ１の発現の強度；血中のＣＴＣ量；血中のＰＡＰ特異的抗体定量の誘導、または変化；及び／または非ＰＡＰ前立腺関連抗原に対する免疫応答（抗原拡散）の誘発のうちの１つ以上において、改善をもたらす。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、改善は、ＰＡＰ特異的Ｔ細胞応答の増加；循環Ｔ細胞（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）上のＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の発現レベルの増加；血中のＰＤ−Ｌ１陽性またはＰＤ−Ｌ陽性循環上皮（例えば、腫瘍）細胞（例えば、ＣＴＣ）の数または割合の増加；Ｔ細胞（例えば、腫瘍生検において検出される）上のＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１の発現の増加；血中ＣＴＣ量の減少；血中のＰＡＰ特異的抗体の増加；及び／または非ＰＡＰ前立腺関連抗原に対する免疫応答（抗原拡散）の誘発である。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、改善は、これらの様々な測定の治療前の量に関連する。いくつかの実施形態では、改善は、より早期に得られる測定値に関連する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載するＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤での治療は、腫瘍特異的循環Ｔ細胞または腫瘍常在Ｔ細胞上の１つ以上の調節分子（例えば、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、及び／またはＬＡＧ３）の、既存の、または治療で誘導される発現において改善をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤での治療は、腫瘍細胞（例えば、ＣＴＣ上の、または腫瘍生検内の）上の調節分子（例えば、ＨＶＥＭ、ホスファチジルセリン、ＰＤ−Ｌ２）の、既存の、または治療で誘導される発現において改善をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に記載するＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤を用いた治療は、既存の、または治療で誘導されるＰＤ−１調節ＰＡＰ特異的Ｔ細胞の改善をもたらす。いくつかの実施形態では、ｔｒａｎｓ  ｖｉｖｏ遅延型過敏症（ＤＴＨ）アッセイによって改善を識別する。
【０２０８】
［キット］
いくつかの実施形態では、本技術は、前立腺癌を有するか、または前立腺癌のリスクがある被験体を治療するためのキットを提供する。例えば、いくつかの実施形態は、核酸（例えば、ＤＮＡ）ワクチン（例えば、ＰＡＰ遺伝子由来のヌクレオチド配列を含む核酸を含む）を含む第一の組成物（例えば、第一の医薬組成物）及びＰＤ−１阻害剤を含む第二の組成物（例えば、第二の医薬組成物）を提供する。さらに、いくつかのキットの実施形態は、核酸ワクチン及びＰＤ−１阻害剤の投与に関する指示書を含む投与計画を提供する製品添付文書をさらに含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、核酸ワクチンはｐＴＶＧ−ＨＰを含み、ＰＤ−１阻害剤はＰＤ−１のモノクローナル抗体阻害剤である。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンはｐＴＶＧ−ＨＰを含み、ＰＤ−１阻害剤はペンブロリズマブである。いくつかの実施形態では、核酸ワクチンはｐＴＶＧ−ＨＰを含み、ＰＤ−１阻害剤はニボルマブである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンはアジュバント、例えばＧＭ−ＣＳＦを含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、即時使用可能な医薬組成物として提供する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、投与前に薬学的に適切な溶液中に可溶化及び／または再懸濁するために、乾燥（例えば、凍結乾燥）状態で提供する。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、キットは、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、バイアル、アンプル、ボトルなどの容器中に含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤を、例えば、バイアル、アンプル、ボトルなどの容器中に、単回用量で提供する。例えば、いくつかのキットの実施形態は：１）およそ１００μｇのＤＮＡワクチン（例えば、ｐＴＶＧ−ＨＰ）及びおよそ２０８μｇのＧＭ−ＣＳＦを含有する医薬組成物を含む第一のバイアル；及び２）１０ｍｇ〜１０００ｍｇのＰＤ−１阻害剤を含有する第二のバイアルを含む。いくつかの実施形態では、第一のバイアルは、およそ２００〜３００μｌの医薬組成物を含む。いくつかの実施形態では、キットはＤＮＡワクチンの２つのバイアルを含み、ＤＮＡワクチンの２つの用量を提供する。
【０２１２】
キットのいくつかの実施形態は、ＤＮＡワクチン及びＰＤ−１阻害剤の複数回用量を提供し、例えば、本明細書に記載する投与計画を完了するのに十分な回数分の用量を提供する。例えば、キットのいくつかの実施形態は、５〜２０バイアルのＤＮＡワクチンを含み、キットのいくつかの実施形態は、２〜１０バイアルのＰＤ−１阻害剤を含む。
【実施例】
【０２１３】
〔実施例１―以前にＰＡＰワクチンを接種した患者におけるＰＤ−１の役割〕
ＤＮＡワクチンはヒトにおいて抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発し、細胞は数年のオーダーで存続するが、その一方で、抗原を発現する腫瘍が存続することは、腫瘍エスケープのメカニズムが作用していることを示している。例えば、ヒトの治験で収集したデータは、一部の患者が免疫応答のエビデンスをもたらさなかったことを示し、さらには疾患の進行のエビデンスを示したものさえあった。したがって、ＤＮＡワクチンの免疫学的活性を改善するために（例えば、前立腺癌の治療用のＤＮＡワクチンの開発において）、本技術の実施態様の開発中に実験を実施し、腫瘍耐性のメカニズムに関連するデータを収集した。
【０２１４】
以前にＰＡＰをコードするＤＮＡワクチンを接種した患者におけるＰＤ−１の役割を評価した。特に、以前報告された研究［５６］と同様に、遅延型過敏症（ＤＴＨ）モデルを用いて実験を実施し、免疫調節のメカニズムを評価した。ＰＤ−１遮断は、ＣＴＬＡ−４遮断と同様に、ＤＮＡワクチン接種の前後で評価した２人中２人の患者において（少数ではあるものの）、ワクチン接種によって誘発したＰＡＰ特異的Ｔ細胞のエフェクター機能（ＤＴＨによって測定）を回復させることができることが見出された（図３）。ｐＴＶＧ−ＨＰで以前に治療し、その後、転移性疾患に対してｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ細胞を接種した患者においても、循環ＣＤ４５−ＥｐＣＡＭ＋細胞上でＰＤ−Ｌ１発現を直接検出できることが見出された（図４）。
【０２１５】
ｔｒａｎｓ  ｖｉｖｏ  ＤＴＨ法は、抗原特異的ＰＤ−１を介した調節を有する患者を、予測バイオマーカーまたは応答の指標として同定することができ、循環上皮（腫瘍）細胞上にＰＤ−Ｌ１が存在することは、ＰＤ−１遮断抗体を用いた他の研究で提案されているものと同様の予測バイオマーカーまたは応答の指標になると考えられる［１８］。
【０２１６】
〔実施例２―去勢抵抗性転移性前立腺癌患者におけるペンブロリズマブ及びｐＴＶＧ−ＨＰ  ＤＮＡワクチンの同時投与から得られる臨床結果〕
本実施例は、ペンブロリズマブ及びｐＴＶＧ−ＨＰ  ＤＮＡワクチンの同時投与から得られる結果を、去勢抵抗性転移性前立腺癌患者に提供する。簡潔に述べると、治験中の患者を２つの群に分けた。第一の群（同時群）には、１日目にペンブロリズマブとｐＴＶＧ−ＨＰ  ＤＮＡワクチンを同時投与し、その後１０週間にわたって、その後３週間毎にペンブロリズマブを、その後２週間毎にｐＴＶＧ−ＨＰ  ＤＮＡワクチンを投与した。第二の群（逐次群）には、２週間毎にｐＴＶＧ−ＨＰ  ＤＮＡワクチンを合計１０週間投与した後、１２週目から２１週目まで３週間毎にペンブロリズマブを投与した。投与計画を図１にまとめる。結果：治験登録は継続中だが、登録された最初の１４人の患者について、グレード３の事象は、疲労、下痢、及び肝炎を含み、グレード４の事象は観察されなかったことを報告する。治療中止後に発生した１件の死亡例は、おそらくペンブロリズマブに関連していた。治療中止前に、４／１１（３６％）の評価可能な患者がＰＳＡ低下を経験し、３／１１（２７％）がＸ線画像上での腫瘍体積の縮小を経験した。末梢血試料においてＰＡＰ特異的Ｔｈ１偏向性Ｔ細胞の増殖が検出され、最大のＰＳＡ及びＸ線画像上での変化を有する２人の患者において持続的に上昇した。これらのデータは、抗腫瘍ワクチンとＰＤ−１遮断とを併用した臨床試験の最初の報告であり、ＰＤ−１遮断と併用することによって抗腫瘍ワクチンの効力を増強できることを示唆している。
【０２１７】
［材料及び方法］
試験薬剤及び調節情報：ｐＴＶＧ−ＨＰは、真核生物プロモーター下流の全長ヒトＰＡＰ  ｃＤＮＡをコードするプラスミドＤＮＡである２５。試験プロトコールは、すべての地方及び連邦（ＦＤＡ、ＮＩＨ組換えＤＮＡ諮問委員会）エンティティによってレビューされ承認された。すべての患者に対し、参加のための書面によるインフォームドコンセントを行った。
【０２１８】
患者集団：被験体は、前立腺の腺癌の組織学的診断を有し、転移及び去勢抵抗のエビデンスを有する男性患者であった。患者は、アンドロゲン除去療法（外科的去勢またはＧｎＲＨ類似体またはアンタゴニスト治療）を継続する必要があり、登録時に、血清ＰＳＡの連続的な上昇によって定義されるような進行性疾患、及び／またはＣＴまたは骨シンチグラフィーによる疾病負荷の増加を有している必要があった。登録前２８日以内は、他の併用抗癌療法または治療は容認されなかった。アビラテロン及び／またはエンザルタミドによる前治療は可能であったが、登録から６か月以内の細胞傷害性化学療法による治療は禁止され、ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔによる前治療は禁止された。組み入れ基準は、患者がＥａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐパフォーマンススコア≦２、ＷＢＣ≧２０００／μＬで定義される正常骨髄、肝臓及び腎臓機能、ヘモグロビン≧９．０ｇ／ｄＬ、血小板数≧１００，０００／μＬ、ＡＳＴ及びＡＬＴ≦２．５×正常の制度上の上限、血清クレアチニン≦２．０ｍｇ／ｄＬを有することを条件とした。
【０２１９】
試験デザイン：本試験は、アジュバントとして加える組換えヒトＧＭ−ＣＳＦ存在下で、ペンブロリズマブと同時にまたは逐次的に送達するｐＴＶＧ−ＨＰの免疫学的効果及び臨床効果を評価するように設計した、非盲検、単一施設、無作為化パイロット試験である。片側１０％有意水準で８０％の力で同時治療した場合に、６か月間の無増悪生存率において予測される４５％の増加を検出するという目標に基づいて、全登録目標は、被験体３２人である。
【０２２０】
試験手順：治験スキームを図１に示す。２００ｍｃｇのＧＭ−ＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）、サルグラモスチム）と混合したｐＴＶＧ−ＨＰプラスミドで、１４日間の間隔で患者を６回治療した。ワクチン接種は、側枝に２８ゲージの針を用いて、２回の注射に分けて皮内投与した。群１において治療した患者には、最初の１２週間の治療の間、免疫化の１日日から３週間間隔で４回、ペンブロリズマブを投与した（２ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した）。群２において治療した患者には、３週間の間隔でペンブロリズマブ（２ｍｇ／ｋｇを静脈内投与した）を４回投与したが、最後の免疫化の２週間後に開始し、治療の１２〜２４週目にわたって投与した。すべての患者に、最初の免疫化の２週間以内及び試験開始後６か月以内に白血球アフェレーシス法を受けさせ、免疫学的評価のために６、１２、３６及び４８週目に末梢血を採取した。患者にはまた、ベースラインの白血球アフェレーシス直後に破傷風免疫を受けさせた。血液検査をおよそ３週間毎に実施し、これには、ＣＢＣ、クレアチニン、電解質、グルコース、ビリルビン、ＡＬＴ、ＡＳＴ、アルカリホスファターゼ、アミラーゼ、ＬＤＨ、及びＴＳＨが含まれていた。すべての毒性を、ＮＣＩ共通用語規準評価システム、バージョン４に従って等級付けした。
【０２２１】
臨床応答評価：血清ＰＳＡ値及びＰＡＰ値を、２４週の期間にわたり、すべての個体から３〜６週毎に収集した。ＰＳＡ値は、登録前に全患者から入手可能であった。胸部／腹部／骨盤及び骨スキャンのＣＴは、治療の初日の６週間前、及びその後１日目から１２週間間隔で取得した。腫瘍縮小効果の測定は、前立腺癌ワーキンググループ２（ＰＣＷＧ２）の勧告６４に従って行った。
【０２２２】
免疫学的応答評価：各時点について、以前に記載されたように、新鮮な（凍結保存されていない）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いたＥＬＩＳＰＯＴによって抗原特異的免疫応答の測定を行った３０，３１。具体的には、ＩＦＮγ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）またはグランザイムＢ（ＧｅｎｅＴｅｘ  Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）に特異的なモノクローナル捕捉抗体を用いて試験を実施した。使用した抗原には、破傷風トキソイドタンパク質（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＰＳＡもしくはＰＡＰタンパク質（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｌａｎｄｅｒｓ、ＮＪ）、またはＰＡＰもしくはＰＳＡのアミノ酸配列にわたって、１１残基のアミノ酸が重複した１５量体のペプチドのプール（ＬｉｆｅＴｅｉｎ，ＬＬＣ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏｕｇｈ、ＮＪ）が含まれていた。これらの分析では、使用したすべての抗原及び血清を同じロット由来のものとし、経時的な変動の可能性を制御した。次いで、プレートを洗浄し、ＩＦＮγ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはグランザイムＢ（ＧｅｎｅＴｅｘ  Ｉｎｃ）のいずれかのビオチン化検出抗体で検出可能にし、自動ＥＬＩＳＰＯＴリーダーでスポットを計数した。免疫化から得られた応答は、治療後に検出可能なＰＡＰ特異的応答として定義され、治療前の値に比べて少なくとも３倍高く、＞１：１００，０００  ＰＢＭＣの頻度を有し、いずれも有意であった（培地のみの対照に比べて）３１。
【０２２３】
統計解析：平均、標準偏差、中央値及び範囲または頻度及び割合に関する記述統計を用いて、すべての臨床成績及び免疫学的パラメーターをまとめた。２つの試料の試験を使用して、両側０．０５有意レベルでの培地対照に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を比較した。
【０２２４】
［結果］
患者集団及び試験経過：ウイスコンシン大学カルボーンがんセンターにおいて本治験に１４人の患者が登録された。治療の一般的なスキームを図１に示す。参加者の平均年齢は６９歳（５４〜８３歳）であった。治療の過程で、グレード４の事象は観察されなかった。１人の被験者はグレード３の疲労を経験し、別の個体（群２）は２４週目からグレード３の肝炎を経験し、もう１人はグレード３の下痢を経験した。グレード２の事象は、疲労、便秘、下痢、吐き気、関節痛、まばたき、甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、疼痛を含み、少なくとも潜在的に治験治療に関連すると考えられた。グレード３の下痢を有する患者（群２）は、治験を中止してから３０日以内に死亡し、ペンブロリズマブによる最後の治療の４６日後に、少なくともおそらくペンブロリズマブによる治療に起因する下痢に関連していると思われる多臓器不全により死亡した。各試験群に１人ずつ、２人の患者が、最初の１か月以内に進行性疾患のエビデンスを有し、試験を中止したため、免疫学的応答または臨床応答について評価することができなかった。
【０２２５】
免疫学的応答：ＥＬＩＳＰＯＴによるＰＡＰ標的抗原に対するＴ細胞免疫応答のエビデンスについて、患者を治療前及び６、１２及び２４週目に評価した。図３に示すように、いずれかの試験群において治療した複数の被験体において、ＰＡＰ特異的ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の有意な増加が検出された。４／１２（３３％）の個体は持続性免疫のエビデンスを有し、１つ以上の治療後時点において検出可能なＰＡＰ特異的Ｔ細胞は有意に増加していた。グランザイムＢを分泌するＰＡＰ特異的な細胞溶解型応答もまた検出可能であった。示すように、３／１２（２５％）の個体が持続性免疫のエビデンスを有し、１つ以上の治療後時点において検出されたＰＡＰ特異的グランザイムＢ分泌細胞は有意に増加していた。１人の個体は、ＰＡＰタンパク質に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで応答したが、ＰＡＰのアミノ酸配列にまたがるペプチドライブラリーは応答しなかった。このことは、誘発された応答が、ペプチドライブラリー中に存在しないエピトープまたはおそらくは少数のエピトープに対するものであることを示唆している。陽性対照を提供するために試験治療の前に破傷風予防接種を受けたことを考えると、予想どおり、複数の患者で破傷風に対するＴ細胞応答が検出可能であった。陰性対照としてのＰＳＡに対する応答は、免疫応答の定義に基づいて不連続な時点で検出可能であったが、複数の治療後時点で検出可能な持続性のＰＳＡ特異的ＩＦＮγ分泌応答は検出されなかった。図４にさらに示すように、群１に２人、群２に１人の３人の患者は、すべての治療後時点において、ＰＡＰ特異的ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞のエビデンスを有していた。
【０２２６】
臨床効果：試験を早期に中止した２人の患者に加えて、追加の患者が、１日目においてスクリーニングのＰＳＡが低く、ビカルタミド離脱応答の遅延と一致することが判明した。したがって、この患者の血清ＰＳＡ及び画像は、応答評価に含めなかった。完全な血清ＰＳＡ反応はなかったが、１／１１の個体が、血清ＰＳＡの≧５０％の低下（６５ｎｇ／ｍＬから３１ｎｇ／ｍＬへ）を経験した。試験１日目（最初のワクチン接種、ペンブロリズマブの存在下または非存在下）の血清ＰＳＡ変化率を、治療群に関するすべての患者について図５Ａに示す。さらに、血清ＰＳＡに対するペンブロリズマブの効果を具体的に評価するために、図５Ｂは、ペンブロリズマブによる治療の１日目からの血清ＰＳＡの変化率（群１については試験１日目、及び群２については試験１２週目）を示す。図４Ｃに示すように、ベースラインからの血清ＰＳＡ低下が４／１１（３６％）の患者で観察され、これは群１において治療した患者でのみ観察された。同様に、血清ＰＡＰ低下（図５Ｄ）が５／１１（４５％）の患者で観察され、これも群１において治療した患者でのみ観察された。
【０２２７】
ＣＴスキャン及び骨スキャンを３か月の間隔で評価した。図６に示すように、１人の患者は未確認の部分奏効を経験し、３か月目において測定可能な疾患が≧３０％減少したが、６か月間の治療中止後に測定可能な病変が増加した。別の個体は、６か月目において部分奏効の基準を満たさない測定可能な病変の減少を示した。これらの個体は、図５に示す血清ＰＳＡ及びＰＡＰ低下が最も大きい個体であり、また、図４に示す持続性のＰＡＰ特異的ＩＦＮγ分泌免疫を有する個体でもあった。群１の第三の個体は、治療前の生検によって前立腺癌転移として同定され、治療後の生検では同定できなかった直腸周囲の腫瘤のサイズが減少していた。
【０２２８】
［考察］
免疫系治療は、過去数年間に顕著な臨床効果を示し、Ｓｃｉｅｎｃｅ誌は２０１３年の科学におけるブレークスルーとしてがん免疫療法を挙げた７８。この成功の大部分は、いくつかのがんのタイプへの有効性を示した、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１またはＣＴＬＡ−４を標的とする抗体を含むＴ細胞チェックポイント阻害剤によるものであった。それにもかかわらず、進行性前立腺癌の単独療法としてのこれらのＴ細胞チェックポイント阻害剤の以前の評価は、ほとんどベネフィットを示していなかった７９，２１，２２。可能性のある例外は、ＤＮＡ修復遺伝子の欠損を有する進行性腫瘍またはより多数の浸潤性Ｔ細胞及び／または腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１発現を有する「炎症性」前立腺腫瘍の稀なサブタイプであり得る８０。逆に、ワクチンなどのＴ細胞活性化療法は臨床効果を示しており、実際、ＦＤＡが認可した唯一の抗腫瘍ワクチンは、進行性去勢抵抗性転移性前立腺癌患者の前立腺癌抗原ＰＡＰを標的とするものである。現在の治験において、抗腫瘍ワクチン接種とＰＤ−１遮断との併用が、抗腫瘍免疫を誘発する点に関して相乗的であり得るかどうかを判定しようとした。これは、ＤＮＡワクチンの抗腫瘍効果が、特にＴ細胞チェックポイント遮断により増加し８１，８２、以前にＰＡＰをコードするＤＮＡワクチンで治療した患者においてＰＤ−１調節Ｔ細胞応答が生じた８３ことを示した前臨床試験に基づく。知る限り、これは抗腫瘍ワクチンとＰＤ−１遮断を併用した臨床試験の最初の報告である。結果は、本アプローチが、これまで進行性前立腺癌における抗腫瘍ワクチンの難解なエンドポイントであった客観的な腫瘍縮小効果をもたらすことができ、したがって、ＰＤ−１遮断のみではほとんど効果を示さなかった他の腫瘍についても検討できる可能性があることを示している。
【０２２９】
現在の治験は、ＰＤ−１遮断による同時治療または逐次治療について、選好性が存在し得るかどうかを判定するために構築した。すなわち、ＰＤ−１発現はＴ細胞活性化とともに起こることが示されており、それゆえにワクチン接種による初期Ｔ細胞活性化の時点でＰＤ−１を遮断することは有利であり得る８４。一方、腫瘍のＰＤ−Ｌ１発現は、腫瘍の微小環境においてＩＦＮγに応答して起こる可能性が高く、したがって、免疫化に応答してＩＦＮγを発現する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によって増加する可能性がある。事実、本発明者らは、マウスにおいて免疫化後に腫瘍でＰＤ−Ｌ１発現が増加し、同様に、ＰＡＰ特異的ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞を生じた前立腺癌患者において、ワクチン接種直後に循環前立腺癌細胞上のＰＤ−Ｌ１発現が増加するが、時間とともに低下することを以前に示した１８，２０。したがって、ＰＤ−１遮断の前に、最初にワクチン接種によって細胞を誘発することが好ましい可能性があると考えられる。本治験は進行中であり、現時点では決定的な結論を下すには群あたりの患者数が少なすぎるため予備的ではあるが、結果は、同時治療に対する選好性が存在し得ることを示唆しており、このことは、腫瘍微小環境におけるＰＤ−Ｌ１連結の前にそれらの効果を媒介することができるＴ細胞活性化時のＰＤ−１遮断が、抗腫瘍効力を有する細胞を誘発するために重要であることを示唆している。
【０２３０】
注目すべきことに、ＩＦＮγ分泌ＰＡＰ特異的免疫応答を発達させた同じ個体において、客観的応答及びＰＳＡ低下が観察された。このことは、抗腫瘍応答のメカニズムが、ワクチン接種に特に関連しており、以前にＰＤ−１遮断に対する応答と関連していたようなＤＮＡ修復の欠損に起因するものではないことを示唆している８０。確かに、これは本治験が継続するにつれて詳細に検討されるだろうが、そのような欠損は前立腺癌では稀である。さらに、ペンブロリズマブで治療したＤＮＡ修復欠損を有する個体で観察されたように、観察した治療期間の終了後の応答パターン及びその後の腫瘍増殖の増加パターンは、劇的な低下及び安定した退縮とはあまり一致しない８０，８５。むしろ、本発明者らの発見は、１２週目以後の治療終了時に停止した、同時治療に由来する治療効果とより一致している。結果として、残念ながら、治療中止後の客観的なＸ線応答は確認できなかった。したがって、将来的な方向性として、１２週の治療後に任意に停止させるのではなく、最大限の効果を与えるために長期間の治療を検討する予定である。
【０２３１】
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６．ｄｅ  Ｂｏｎｏ，Ｊ．Ｓ．，Ｏｕｄａｒｄ，Ｓ．，Ｏｚｇｕｒｏｇｌｕ，Ｍ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｓ．，Ｍａｃｈｉｅｌｓ，Ｊ．Ｐ．，Ｋｏｃａｋ，Ｉ．，Ｇｒａｖｉｓ，Ｇ．，Ｂｏｄｒｏｇｉ，Ｉ．，Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，Ｍ．Ｊ．，Ｓｈｅｎ，Ｌ．，Ｒｏｅｓｓｎｅｒ，Ｍ．，Ｇｕｐｔａ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓａｒｔｏｒ，Ａ．Ｏ．（２０１０）．“Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ  ｐｌｕｓ  ｃａｂａｚｉｔａｘｅｌ  ｏｒ  ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｄｏｃｅｔａｘｅｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ  ｔｒｉａｌ．”Ｌａｎｃｅｔ  ３７６：１１４７−５４．
７．Ｋａｎｔｏｆｆ，Ｐ．Ｗ．，Ｈｉｇａｎｏ，Ｃ．Ｓ．，Ｓｈｏｒｅ，Ｎ．Ｄ．，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｅ．Ｒ．，Ｓｍａｌｌ，Ｅ．Ｊ．，Ｐｅｎｓｏｎ，Ｄ．Ｆ．，Ｒｅｄｆｅｒｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｆｅｒｒａｒｉ，Ａ．Ｃ．，Ｄｒｅｉｃｅｒ，Ｒ．，Ｓｉｍｓ，Ｒ．Ｂ．，Ｘｕ，Ｙ．，Ｆｒｏｈｌｉｃｈ，Ｍ．Ｗ．ａｎｄ  Ｓｃｈｅｌｌｈａｍｍｅｒ，Ｐ．Ｆ．（２０１０）．“Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６３：４１１−２２．
８．Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．，Ｆｉｚａｚｉ，Ｋ．，Ｓａａｄ，Ｆ．，Ｔａｐｌｉｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｃ．Ｎ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｋ．，ｄｅ  Ｗｉｔ，Ｒ．，Ｍｕｌｄｅｒｓ，Ｐ．，Ｃｈｉ，Ｋ．Ｎ．，Ｓｈｏｒｅ，Ｎ．Ｄ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ａ．Ｊ．，Ｆｌａｉｇ，Ｔ．Ｗ．，Ｆｌｅｃｈｏｎ，Ａ．，Ｍａｉｎｗａｒｉｎｇ，Ｐ．，Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｍ．，Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｒｍａｎｄ，Ｍ．，Ｓｅｌｂｙ，Ｂ．，Ｓｅｅｌｙ，Ｌ．，ｄｅ  Ｂｏｎｏ，Ｊ．Ｓ．ａｎｄ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ，Ａ．（２０１２）．“Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｆｔｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．”Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６７：  １１８７−９７．
９．ｄｅ  Ｂｏｎｏ，Ｊ．Ｓ．，Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ，Ｃ．Ｊ．，Ｍｏｌｉｎａ，Ａ．，Ｆｉｚａｚｉ，Ｋ．，Ｎｏｒｔｈ，Ｓ．，Ｃｈｕ，Ｌ．，Ｃｈｉ，Ｋ．Ｎ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｏ．Ｂ．，Ｊｒ．，Ｓａａｄ，Ｆ．，Ｓｔａｆｆｕｒｔｈ，Ｊ．Ｎ．，Ｍａｉｎｗａｒｉｎｇ，Ｐ．，Ｈａｒｌａｎｄ，Ｓ．，Ｆｌａｉｇ，Ｔ．Ｗ．，Ｈｕｔｓｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｔ．，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，Ｈ．，Ｈａｉｎｓｗｏｒｔｈ，Ｊ．Ｄ．，Ｒｙａｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｃ．Ｎ．，Ｅｌｌａｒｄ，Ｓ．Ｌ．，Ｆｌｅｃｈｏｎ，Ａ．，Ｓａｌｅｈ，Ｍ．，Ｓｃｈｏｌｚ，Ｍ．，Ｅｆｓｔａｔｈｉｏｕ，Ｅ．，Ｚｉｖｉ，Ａ．，Ｂｉａｎｃｈｉｎｉ，Ｄ．，Ｌｏｒｉｏｔ，Ｙ．，Ｃｈｉｅｆｆｏ，Ｎ．，Ｋｈｅｏｈ，Ｔ．，Ｈａｑｑ，Ｃ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．（２０１１）．“Ａｂｉｒａｔｅｒｏｎｅ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６４：１９９５−２００５．
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１４．Ａｌａｍ，Ｓ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２０１０）．“ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９：７３１−４５．
１５．Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．，Ｋｌｕｇｅｒ，Ｈ．，Ｃａｌｌａｈａｎ，Ｍ．Ｋ．，Ｐｏｓｔｏｗ，Ｍ．Ａ．，Ｒｉｚｖｉ，Ｎ．Ａ．，Ｌｅｓｏｋｈｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｓｅｇａｌ，Ｎ．Ｈ．，Ａｒｉｙａｎ，Ｃ．Ｅ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｒ．Ａ．，Ｒｅｅｄ，Ｋ．，Ｂｕｒｋｅ，Ｍ．Ｍ．，Ｃａｌｄｗｅｌｌ，Ａ．，Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，Ａｇｕｎｗａｍｂａ，Ｂ．Ｕ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｌｏｗｙ，Ｉ．，Ｉｎｚｕｎｚａ，Ｈ．Ｄ．，Ｆｅｅｌｙ，Ｗ．，Ｈｏｒａｋ，Ｃ．Ｅ．，Ｈｏｎｇ，Ｑ．，Ｋｏｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｇｕｐｔａ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｚｎｏｌ，Ｍ．（２０１３）．“Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ  ｐｌｕｓ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ．”Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６９：１２２−３３．
１６．Ｈａｍｉｄ，Ｏ．，Ｒｏｂｅｒｔ，Ｃ．，Ｄａｕｄ，Ａ．，Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．，Ｈｗｕ，Ｗ．Ｊ．，Ｋｅｆｆｏｒｄ，Ｒ．，Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｅｒｓｅｙ，Ｐ．，Ｊｏｓｅｐｈ，Ｒ．Ｗ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｄｒｏｎｃａ，Ｒ．，Ｇａｎｇａｄｈａｒ，Ｔ．Ｃ．，Ｐａｔｎａｉｋ，Ａ．，Ｚａｒｏｕｒ，Ｈ．，Ｊｏｓｈｕａ，Ａ．Ｍ．，Ｇｅｒｇｉｃｈ，Ｋ．，Ｅｌａｓｓａｉｓｓ−Ｓｃｈａａｐ，Ｊ．，Ａｌｇａｚｉ，Ａ．，Ｍａｔｅｕｓ，Ｃ．，Ｂｏａｓｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｔｕｍｅｈ，Ｐ．Ｃ．，Ｃｈｍｉｅｌｏｗｓｋｉ，Ｂ．，Ｅｂｂｉｎｇｈａｕｓ，Ｓ．Ｗ．，Ｌｉ，Ｘ．Ｎ．，Ｋａｎｇ，Ｓ．Ｐ．ａｎｄ  Ｒｉｂａｓ，Ａ．（２０１３）．“Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌａｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ（ａｎｔｉ−ＰＤ−１）ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ．”Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６９：１３４−４４．
１７．Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．，Ｏ’Ｄａｙ，Ｓ．Ｊ．，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｄ．Ｆ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｏｓｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｈａａｎｅｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｒ．，Ｒｏｂｅｒｔ，Ｃ．，Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ，Ｄ．，Ｈａｓｓｅｌ，Ｊ．Ｃ．，Ａｋｅｒｌｅｙ，Ｗ．，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｅｒｔｗｅｇｈ，Ａ．Ｊ．，Ｌｕｔｚｋｙ，Ｊ．，Ｌｏｒｉｇａｎ，Ｐ．，Ｖａｕｂｅｌ，Ｊ．Ｍ．，Ｌｉｎｅｔｔｅ，Ｇ．Ｐ．，Ｈｏｇｇ，Ｄ．，Ｏｔｔｅｎｓｍｅｉｅｒ，Ｃ．Ｈ．，Ｌｅｂｂｅ，Ｃ．，Ｐｅｓｃｈｅｌ，Ｃ．，Ｑｕｉｒｔ，Ｉ．，Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｉ．，Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｔｉａｎ，Ｊ．，Ｙｅｌｌｉｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｎｉｃｈｏｌ，Ｇ．Ｍ．，Ｈｏｏｓ，Ａ．ａｎｄ  Ｕｒｂａ，Ｗ．Ｊ．（２０１０）．“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｍｅｌａｎｏｍａ．”Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６３：７１１−２３．
１８．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．，Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｇｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｃ．，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｄ．Ｆ．，Ｐｏｗｄｅｒｌｙ，Ｊ．Ｄ．，Ｃａｒｖａｊａｌ，Ｒ．Ｄ．，Ｓｏｓｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ａｔｋｉｎｓ，Ｍ．Ｂ．，Ｌｅｍｉｎｇ，Ｐ．Ｄ．，Ｓｐｉｇｅｌ，Ｄ．Ｒ．，Ａｎｔｏｎｉａ，Ｓ．Ｊ．，Ｈｏｒｎ，Ｌ．，Ｄｒａｋｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．，Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ｓｈａｒｆｍａｎ，Ｗ．Ｈ．，Ａｎｄｅｒｓ，Ｒ．Ａ．，Ｔａｕｂｅ，Ｊ．Ｍ．，ＭｃＭｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ｌ．，Ｘｕ，Ｈ．，Ｋｏｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ｊｕｒｅ−Ｋｕｎｋｅｌ，Ｍ．，Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．，ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｄ．，Ｋｏｌｌｉａ，Ｇ．Ｄ．，Ｇｕｐｔａ，Ａ．，Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｚｎｏｌ，Ｍ．（２０１２）．“Ｓａｆｅｔｙ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６：２４４３−５４．
１９．Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｄｒａｋｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｗｏｌｌｎｅｒ，Ｉ．，Ｐｏｗｄｅｒｌｙ，Ｊ．Ｄ．，Ｐｉｃｕｓ，Ｊ．，Ｓｈａｒｆｍａｎ，Ｗ．Ｈ．，Ｓｔａｎｋｅｖｉｃｈ，Ｅ．，Ｐｏｎｓ，Ａ．，Ｓａｌａｙ，Ｔ．Ｍ．，ＭｃＭｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ｌ．，Ｇｉｌｓｏｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．，Ｓｅｌｂｙ，Ｍ．，Ｔａｕｂｅ，Ｊ．Ｍ．，Ａｎｄｅｒｓ，Ｒ．，Ｃｈｅｎ，Ｌ．，Ｋｏｒｍａｎ，Ａ．Ｊ．，Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．，Ｌｏｗｙ，Ｉ．ａｎｄ  Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．（２０１０）．“Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ａｇｅｎｔ  ａｎｔｉ−ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１（ＭＤＸ−１１０６）ｉｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ：ｓａｆｅｔｙ，ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ，ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ．”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８：３１６７−７５．
２０．Ｓｆａｎｏｓ，Ｋ．Ｓ．，Ｂｒｕｎｏ，Ｔ．Ｃ．，Ｍｅｅｋｅｒ，Ａ．Ｋ．，Ｄｅ  Ｍａｒｚｏ，Ａ．Ｍ．，Ｉｓａａｃｓ，Ｗ．Ｂ．ａｎｄ  Ｄｒａｋｅ，Ｃ．Ｇ．（２００９）．“Ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ＣＤ８＋Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｒｅ  ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｄ  ＰＤ−１＋．”Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６９：１６９４−７０３．
２１．Ｏｌｓｏｎ，Ｂ．Ｍ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２０１１）．“Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ：ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｏｐｅｎ  Ａｃｃ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．３：４９−６０．
２２．Ｇｕｔｍａｎ，Ａ．Ｂ．ａｎｄ  Ｇｕｔｍａｎ，Ｅ．Ｂ．（１９３８）．“Ａｎ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｚｉｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｇｌａｎｄ．”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１７：４７３−９．
２３．Ｔｅｒｒａｃｉｏ，Ｌ．，Ｒｕｌｅ，Ａ．，Ｓａｌｖａｔｏ，Ｊ．ａｎｄ  Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｗ．Ｈ．（１９８５）．“Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｓｏｅｎｚｙｍｅ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎ  ｒａｔ  ｖｅｎｔｒａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅ．”Ａｎａｔ  Ｒｅｃ  ２１３：１３１−９．
２４．Ｆｏｎｇ，Ｌ．，Ｒｕｅｇｇ，Ｃ．Ｌ．，Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，Ｄ．，Ｅｎｇｌｅｍａｎ，Ｅ．Ｇ．ａｎｄ  Ｌａｕｓ，Ｒ．（１９９７）．“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｐｒｏｓｔａｔｉｔｉｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ；ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３１１３−７．
２５．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｅ．，Ｆｒｙｅ，Ｔ．Ｐ．，Ａｒｎｏｔ，Ａ．Ｒ．，Ｍａｒｑｕｅｔｔｅ，Ｃ．，Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ｌ．Ａ．，Ｇｅｎｄｒｏｎ−Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，Ａ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２００６）．“Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  （ＰＡＰ）．”Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：２９３−３０３．
２６．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｅ．，Ｆｒｙｅ，Ｔ．Ｐ．，Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ，Ｎ．，Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙ，Ｄ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２００７）．“Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｅｌｉｃｉｔｉｎｇ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．”Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５６：８８５−９５．
２７．Ｌａｕｓ，Ｒ．，Ｙａｎｇ，Ｄ．Ｍ．，Ｒｕｅｇｇ，Ｃ．Ｌ．，Ｓｈａｐｅｒｏ，Ｍ．Ｈ．，Ｓｌａｇｌｅ，Ｐ．Ｈ．，Ｓｍａｌｌ，Ｅ．，Ｂｕｒｃｈ，Ｐ．ａｎｄ  Ｖａｌｏｎｅ，Ｆ．Ｈ．（２００１）．“Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ：ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．”Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  １１：１−１０．
２８．Ｆｏｎｇ，Ｌ．，Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ，Ｄ．，Ｂｅｎｉｋｅ，Ｃ．，Ｂｒｅｅｎ，Ｊ．Ｋ．，Ｓｔｒａｎｇ，Ｇ．，Ｒｕｅｇｇ，Ｃ．Ｌ．ａｎｄ  Ｅｎｇｌｅｍａｎ，Ｅ．Ｇ．（２００１）．“Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ｘｅｎｏａｎｔｉｇｅｎ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７：７１５０−６．
２９．ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．，Ｄｕｎｐｈｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．Ｇ．，Ｆｒｙｅ，Ｔ．Ｐ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｅ．，Ｓｔａａｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｄ．Ｌ．，Ｓｔｒａｕｓ，Ｊ．，Ａｌｂｅｒｔｉ，Ｄ．，Ｍａｒｎｏｃｈａ，Ｒ．，Ｌｉｕ，Ｇ．，Ｅｉｃｋｈｏｆｆ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｄｉｎｇ，Ｇ．（２００９）．“Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｇｅ  Ｄ０  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７：４０４７−５４．
３０．Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｔ．，Ｏｌｓｏｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｅ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．Ｇ．，Ｄｕｎｐｈｙ，Ｅ．Ｊ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２０１０）．“ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  （ＰＡＰ）  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３３：６３９−４７．
３１．ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｔ．，Ｅｉｃｋｈｏｆｆ，Ｊ．Ｃ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｅ．，Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｅ．，Ｐｏｈｌｋａｍｐ，Ｉ．，Ｓｔａａｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｌｉｕ，Ｇ．，Ｗｉｌｄｉｎｇ，Ｇ．ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，Ｂ．Ｍ．（２０１４）．“Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｔｏ  ｇｕｉｄｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０：３６９２−７０４．
３２．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊ．（１９８０）．“Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ｒｅ−ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｉｎ  ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．”Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２６：４３３−６．
３３．Ｊｏｂｓｉｓ，Ａ．Ｃ．，Ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，Ｇ．Ｐ．，Ａｎｈｏｌｔ，Ｒ．Ｒ．ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｇ．Ｔ．（１９７８）．“Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ：ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ．”Ｃａｎｃｅｒ  ４１：１７８８−９３．
３４．ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｌ．Ｄ．，Ｓｔｏｒｅｒ，Ｂ．Ｅ．，Ｖｅｓｓｅｌｌａ，Ｒ．，Ｌａｎｇｅ，Ｐ．Ｈ．ａｎｄ  Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．（２０００）．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６４：１８２５−９．
３５．ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｌ．Ｄ．，Ｅｌｌｉｓ，Ｗ．Ｊ．，Ｈｉｇａｎｏ，Ｃ．Ｓ．，Ｌａｎｇｅ，Ｐ．Ｈ．ａｎｄ  Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．（２００１）．“Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｏｆ  ａ  Ｔｈ１  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｃａｎ  ｂｅ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４７：２２２−９．
３６．Ｏｌｓｏｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｆｒｙｅ，Ｔ．Ｐ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｅ．，Ｆｏｎｇ，Ｌ．，Ｋｎｕｔｓｏｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２０１０）．“ＨＬＡ−Ａ２−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ．”Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５９：９４３−５３．
３７．Ｒｏｂｅｒｔ，Ｃ．，Ｒｉｂａｓ，Ａ．，Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．，Ｈａｍｉｄ，Ｏ．，Ｋｅｆｆｏｒｄ，Ｒ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．，Ｊｏｓｈｕａ，Ａ．Ｍ．，Ｈｗｕ，Ｗ．Ｊ．，Ｇａｎｇａｄｈａｒ，Ｔ．Ｃ．，Ｐａｔｎａｉｋ，Ａ．，Ｄｒｏｎｃａ，Ｒ．，Ｚａｒｏｕｒ，Ｈ．，Ｊｏｓｅｐｈ，Ｒ．Ｗ．，Ｂｏａｓｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｃｈｍｉｅｌｏｗｓｋｉ，Ｂ．，Ｍａｔｅｕｓ，Ｃ．，Ｐｏｓｔｏｗ，Ｍ．Ａ．，Ｇｅｒｇｉｃｈ，Ｋ．，Ｅｌａｓｓａｉｓｓ−Ｓｃｈａａｐ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｘ．Ｎ．，Ｉａｎｎｏｎｅ，Ｒ．，Ｅｂｂｉｎｇｈａｕｓ，Ｓ．Ｗ．，Ｋａｎｇ，Ｓ．Ｐ．ａｎｄ  Ｄａｕｄ，Ａ．（２０１４）．“Ａｎｔｉ−ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ−ｄｅａｔｈ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ  ｉｎ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｄｏｓｅ−ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｃｏｈｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ｐｈａｓｅ  １  ｔｒｉａｌ．”Ｌａｎｃｅｔ  ３８４：１１０９−１７．
３８．Ｉｗａｓａｋｉ，Ａ．，Ｔｏｒｒｅｓ，Ｃ．Ａ．，Ｏｈａｓｈｉ，Ｐ．Ｓ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．ａｎｄ  Ｂａｒｂｅｒ，Ｂ．Ｈ．（１９９７）．“Ｔｈｅ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＣＴＬ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｉｔｅｓ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：１１−４．
３９．Ｌａ  Ｃａｖａ，Ａ．，Ｂｉｌｌｅｔｔａ，Ｒ．，Ｇａｉｅｔｔａ，Ｇ．，Ｂｏｎｎｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｂａｉｒｄ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ  Ａｌｂａｎｉ，Ｓ．（２０００）．“Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｄｊｕｖａｎｔ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：１３４０−５．
４０．Ｃｏｒｒ，Ｍ．，ｖｏｎ  Ｄａｍｍ，Ａ．，Ｌｅｅ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ  Ｔｉｇｈｅ，Ｈ．（１９９９）．“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｃｃｕｒｓ  ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ  ｂｙ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：４７２１−７．
４１．Ｉｒｖｉｎｅ，Ｋ．Ｒ．ａｎｄ  Ｒｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．Ｐ．（１９９５）．“Ｔｈｅ  ｎｅｘｔ  ｗａｖｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．”Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃ  Ｂｉｏｌ  ６：３３７−４７．
４２．Ｒａｚ，Ｅ．，Ｔｉｇｈｅ，Ｈ．，Ｓａｔｏ，Ｙ．，Ｃｏｒｒ，Ｍ．，Ｄｕｄｌｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｒｏｍａｎ，Ｍ．，Ｓｗａｉｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｓｐｉｅｇｅｌｂｅｒｇ，Ｈ．Ｌ．ａｎｄ  Ｃａｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．（１９９６）．“Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｔｈ１  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＥ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３：５１４１−５．
４３．Ｃｈｅｎ，Ｙ．，Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｗｏｏｄｌａｎｄ，Ｄ．Ｌ．（１９９８）．“Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ａｎｄ  ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：２４２５−３２．
４４．Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ａ．，Ｓｈｅｒｒｉｔｔ，Ｍ．Ａ．，Ｍｅｄｖｅｃｚｋｙ，Ｊ．，Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｓ．Ｌ．，Ｍｏｓｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｆｅｒｎａｎｄｏ，Ｇ．Ｊ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｌ．Ｅ．ａｎｄ  Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，Ａ．（１９９８）．“Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＣＤ８  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１７１７−２３．
４５．Ｃｈｏ，Ｈ．Ｊ．，Ｔａｋａｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｐ．Ｍ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｃｏｒｒ，Ｍ．，Ｔｕｃｋ，Ｓ．ａｎｄ  Ｒａｚ，Ｅ．（２０００）．“Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ａ  Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．”Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：５０９−１４．
４６．Ｃｏｒｒ，Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｃａｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ  Ｔｉｇｈｅ，Ｈ．（１９９６）．“Ｇｅｎｅ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎａｋｅｄ  ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ＣＴＬ  ｐｒｉｍｉｎｇ．”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：１５５５−６０．
４７．Ｓｖａｎｈｏｌｍ，Ｃ．，Ｂａｎｄｈｏｌｔｚ，Ｌ．，Ｌｏｂｅｌｌ，Ａ．ａｎｄ  Ｗｉｇｚｅｌｌ，Ｈ．（１９９９）．“Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２８：１２１−３０．
４８．Ｒａｈｍａｎ，Ｆ．，Ｄａｈｍｅｎ，Ａ．，Ｈｅｒｚｏｇ−Ｈａｕｆｆ，Ｓ．，Ｂｏｃｈｅｒ，Ｗ．Ｏ．，Ｇａｌｌｅ，Ｐ．Ｒ．ａｎｄ  Ｌｏｈｒ，Ｈ．Ｆ．（２０００）．“Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ｏｒ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ．”Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３１：５２１−７．
４９．（２０１０）．“ＵＳＤＡ  ｌｉｃｅｎｓｅｓ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ｄｏｇｓ．”Ｊ  Ａｍ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ  ２３６：４９５．
５０．Ｂｅｒｇｍａｎ，Ｐ．Ｊ．，ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｊ．，Ｎｏｖｏｓａｄ，Ａ．，Ｃｈａｒｎｅｙ，Ｓ．，Ｆａｒｒｅｌｌｙ，Ｊ．，Ｃｒａｆｔ，Ｄ．，Ｗｕｌｄｅｒｋ，Ｍ．，Ｊｅｆｆｅｒｓ，Ｙ．，Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，Ｈｏｈｅｎｈａｕｓ，Ａ．Ｅ．，Ｓｅｇａｌ，Ｎ．，Ｇｒｅｇｏｒ，Ｐ．，Ｅｎｇｅｌｈｏｒｎ，Ｍ．，Ｒｉｖｉｅｒｅ，Ｉ．，Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ａ．Ｎ．ａｎｄ  Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．（２００３）．“Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｄｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｆｔｅｒ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ：ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ．”Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：１２８４−９０．
５１．Ｚｌｏｔｏｃｈａ，Ｓ．，Ｓｔａａｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｏｒｖａｔｈ，Ｄ．，Ｓｔｒａｕｓ，Ｊ．，Ｄｏｂｒａｔｚ，Ｊ．，Ｏｌｉｖｅｒ，Ｋ．，Ｗａｓｉｅｌｅｗｓｋｉ，Ｓ．，Ａｌｂｅｒｔｉ，Ｄ．，Ｌｉｕ，Ｇ．，Ｗｉｌｄｉｎｇ，Ｇ．，Ｅｉｃｋｈｏｆｆ，Ｊ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２００５）．“Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｇｅ  Ｄ０  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｃｌｉｎ  Ｇｅｎｉｔｏｕｒｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ４：２１５−８．
５２．Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２０１１）．“Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＳＳＸ−２  ｅｌｉｃｉｔ  ＨＬＡ−Ａ２  ｅｐｉｔｏｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３４：５６９−８０．
５３．Ｐａｊｏｔ，Ａ．，Ｍｉｃｈｅｌ，Ｍ．Ｌ．，Ｆａｚｉｌｌｅａｕ，Ｎ．，Ｐａｎｃｒｅ，Ｖ．，Ａｕｒｉａｕｌｔ，Ｃ．，Ｏｊｃｉｕｓ，Ｄ．Ｍ．，Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ，Ｆ．Ａ．ａｎｄ  Ｌｏｎｅ，Ｙ．Ｃ．（２００４）．“Ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ：ＨＬＡ−Ａ２．１−／ＨＬＡ−ＤＲ１−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｈ−２  ｃｌａｓｓ  Ｉ−／ｃｌａｓｓ  ＩＩ−ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ．”Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３４：３０６０−９．
５４．Ｏｌｓｏｎ，Ｂ．Ｍ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２００７）．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ａ２−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：５１０５．
５５．Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ａ．，Ｒｅｋｏｓｋｅ，Ｂ．Ｔ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２０１４）．“ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ＳＳＸ２  ｅｎｈａｎｃｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．”Ｖａｃｃｉｎｅ  ３２：１７０７−１５．
５６．Ｏｌｓｏｎ，Ｂ．Ｍ．，Ｊａｎｋｏｗｓｋａ−Ｇａｎ，Ｅ．，Ｂｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｔ．，Ｖｉｇｎａｌｉ，Ｄ．Ａ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２０１２）．“Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｒｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ＣＴＬＡ−４  ｏｒ  ＩＬ−３５  Ｂｌｏｃｋａｄｅ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８９：５５９０−６０１．
５７．Ｋａｎｔｏｆｆ，Ｐ．Ｗ．，Ｓｃｈｕｅｔｚ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｌｕｍｅｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．Ａ．，Ｇｌｏｄｅ，Ｌ．Ｍ．，Ｂｉｌｈａｒｔｚ，Ｄ．Ｌ．，Ｗｙａｎｄ，Ｍ．，Ｍａｎｓｏｎ，Ｋ．，Ｐａｎｉｃａｌｉ，Ｄ．Ｌ．，Ｌａｕｓ，Ｒ．，Ｓｃｈｌｏｍ，Ｊ．，Ｄａｈｕｔ，Ｗ．Ｌ．，Ａｒｌｅｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｇｕｌｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．ａｎｄ  Ｇｏｄｆｒｅｙ，Ｗ．Ｒ．（２０１０）．“Ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａ  Ｐｏｘｖｉｒａｌ−ｂａｓｅｄ  ＰＳＡ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８：１０９９−１０５．
５８．Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｅｒｎｈａｒｄ，Ｈ．，Ｓｈｉｏｔａ，Ｆ．Ｍ．，Ｈａｎｄ，Ｓ．Ｌ．，Ｇｒａｌｏｗ，Ｊ．Ｒ．，Ｈｕｓｅｂｙ，Ｅ．Ｓ．，Ｇｉｌｌｉｓ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｅｅｖｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９６）．“Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．”Ｂｌｏｏｄ  ８８：２０２−１０．
５９．Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｈ．，Ｓｌｅａｔｈ，Ｐ．Ｒ．ａｎｄ  Ｃｈｅｅｖｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９９）．“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＨＥＲ−２／ｎｅｕ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ．”Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：１２８９−９７．
６０．Ｂｅｒｎｈａｒｄ，Ｈ．，Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｈｅｉｍｆｅｌｄ，Ｓ．，Ｈａｎｄ，Ｓ．，Ｇｒａｌｏｗ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｃｈｅｅｖｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９５）．“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４＋  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ．”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：１０９９−１０４．
６１．Ｔａｒｒ，Ｐ．Ｅ．，Ｌｉｎ，Ｒ．，Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｅ．Ａ．，Ｋｏｖａｒｉｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ，Ｍ．ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ｃ．（１９９６）．“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  （ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）  ａｎｄ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｓｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖａｃｃｉｎｅ．”Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：１１９９−２０４．
６２．ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．，Ｓｃｈｉｆｆｍａｎ，Ｋ．ａｎｄ  Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．（１９９９）．“Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｓ  ａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｂｏｔｈ  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｈｕｍｏｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ．”Ｂｌｏｏｄ  ９３：２６５３−９．
６３．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｓ．，Ｂｕｌｌ，Ｈ．Ａ．，Ｃａｍｐｏｓ−Ｃｏｓｔａ，Ｄ．，Ｓａｉｂ，Ｒ．ａｎｄ  Ｌｉｎｃｈ，Ｄ．Ｃ．（１９８９）．“Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ：ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ−ｖｉｖｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｍａｎ．”Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ７１：３２３−３０．
６４．Ｓｃｈｅｒ，Ｈ．Ｉ．，Ｈａｌａｂｉ，Ｓ．，Ｔａｎｎｏｃｋ，Ｉ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．，Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｃ．Ｎ．，Ｃａｒｄｕｃｃｉ，Ｍ．Ａ．，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｈｉｇａｎｏ，Ｃ．，Ｂｕｂｌｅｙ，Ｇ．Ｊ．，Ｄｒｅｉｃｅｒ，Ｒ．，Ｐｅｔｒｙｌａｋ，Ｄ．，Ｋａｎｔｏｆｆ，Ｐ．，Ｂａｓｃｈ，Ｅ．，Ｋｅｌｌｙ，Ｗ．Ｋ．，Ｆｉｇｇ，Ｗ．Ｄ．，Ｓｍａｌｌ，Ｅ．Ｊ．，Ｂｅｅｒ，Ｔ．Ｍ．，Ｗｉｌｄｉｎｇ，Ｇ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｍ．（２００８）．“Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｅｎｄ  ｐｏｉｎｔｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｃａｓｔｒａｔｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ：ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ．”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２６：１１４８−５９．
６５．ＶａｎＢｕｓｋｉｒｋ，Ａ．Ｍ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｗ．Ｊ．，Ｊａｎｋｏｗｓｋａ−Ｇａｎ，Ｅ．，Ｃｈｉｎ，Ｔ．，Ｋｕｓａｋａ，Ｓ．，Ｇｅｉｓｓｌｅｒ，Ｆ．，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｒ．Ｐ．ａｎｄ  Ｏｒｏｓｚ，Ｃ．Ｇ．（２０００）．“Ｈｕｍａｎ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０６：１４５−５５．
６６．Ｄｅｒｋｓ，Ｒ．Ａ．，Ｊａｎｋｏｗｓｋａ−Ｇａｎ，Ｅ．，Ｘｕ，Ｑ．ａｎｄ  Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ，Ｗ．Ｊ．（２００７）．“Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍｉｎｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＨＡ−１．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９：３４４３−５１．
６７．Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ａ．，Ｍａｒｉｃｑｕｅ，Ｂ．Ｂ．，Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ，Ｊ．，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｂ．，Ｇｕｌｌｅｙ，Ｊ．Ｌ．，Ｓｃｈｌｏｍ，Ｊ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２０１１）．“ＩｇＧ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｔｉｓｓｕｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｓ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．”Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０１１：４５４８６１．
６８．Ｆｏｎｇ，Ｌ．，Ｋｗｅｋ，Ｓ．Ｓ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｓ．，Ｋａｖａｎａｇｈ，Ｂ．，ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｖ．，Ｌｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．，Ｒｙａｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｒｉｎｉ，Ｂ．Ｉ．ａｎｄ  Ｓｍａｌｌ，Ｅ．Ｊ．（２００９）．“Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＣＴＬＡ４  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ａｎｄ  ＧＭ−ＣＳＦ．”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９：６０９−１５．
６９．Ｚａｂｒａｎｓｋｙ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ａ．，Ｔｈｏｂｕｒｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｚａｈｕｒａｋ，Ｍ．，Ｋｅｉｚｍａｎ，Ｄ．，Ｃａｒｄｕｃｃｉ，Ｍ．，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ａ．，ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．，Ｄｒａｋｅ，Ｃ．Ｇ．ａｎｄ  Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ，Ｅ．Ｓ．（２０１１）．“Ｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ＩＬ−８  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｐｒｏｓｔａｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｐｒｏｓｔａｔｅ：（ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）．
７０．Ｄｕｂｏｖｓｋｙ，Ｊ．Ａ．，Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ，Ｍ．Ｒ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２００７）．“ＭＡＤ−ＣＴ−２  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃａｎｃｅｒ−ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈａｇｅ  ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３０：６７５−８３．
７１．Ｈｏｅｐｐｎｅｒ，Ｌ．Ｈ．，Ｄｕｂｏｖｓｋｙ，Ｊ．Ａ．，Ｄｕｎｐｈｙ，Ｅ．Ｊ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２００６）．“Ｈｕｍｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｔｅｓｔｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｓｅｒａ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ  ６：１−７．
７２．Ｄｕｎｐｈｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｅｉｃｋｈｏｆｆ，Ｊ．Ｃ．，Ｍｕｌｌｅｒ，Ｃ．Ｈ．，Ｂｅｒｇｅｒ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２００４）．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ  ｉｎ  ｓｅｒａ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐｒｏｓｔａｔｉｔｉｓ．”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：４９２−５０１．
７３．Ｄｕｎｐｈｙ，Ｅ．Ｊ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２００５）．“Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｉｎ  ｓｕｂｊｅｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｌｔ３  ｌｉｇａｎｄ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２８：２６８−７５．
７４．Ｍｏｏｎｅｙ，Ｃ．Ｊ．，Ｄｕｎｐｈｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｓｔｏｎｅ，Ｂ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２００６）．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｅｌｉｃｉｔｅｄ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ａｓ  ｄｅｒｍａｔｏｍｙｏｓｉｔｉｓ．”Ｉｎｔ  Ｊ  Ｕｒｏｌ  １３：２１１−７．
７５．Ｍｏｒｓｅ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２０１０）．“Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐ  Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．”Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７１：４９６−５０４．
７６．Ｍａｒｉｃｑｕｅ，Ｂ．Ｂ．，Ｅｉｃｋｈｏｆｆ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ  ＭｃＮｅｅｌ，Ｄ．Ｇ．（２０１１）．“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｓｔａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ７１：１３４−４６．
７７．Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．Ｅ．，Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，Ｒ．，Ｌｅ，Ｔ．，Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｎｏｒｍａｎ，Ｊ．，Ｈｏｂａｒｔ，Ｐ．ａｎｄ  Ｌｅｗ，Ｄ．（１９９９）．“Ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  ｍａｌａｒｉａ  ｖａｃｃｉｎｅ：ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．”Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：７５９−６８．
７８．Ｃｏｕｚｉｎ−Ｆｒａｎｋｅｌ  Ｊ．Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０１３．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｄｅｃ  ２０  ２０１３；３４２（６１６５）：１４３２−１４３３．
７９．Ｂｅｅｒ  ＴＭ，Ｋｗｏｎ  ＥＤ，Ｄｒａｋｅ  ＣＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，Ｄｏｕｂｌｅ−Ｂｌｉｎｄ，Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  Ｖｅｒｓｕｓ  Ｐｌａｃｅｂｏ  ｉｎ  Ａｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｏｒ  Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  Ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−Ｎａｉｖｅ  Ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．Ｊａｎ  ２０１７；３５（１）：４０−４７．
８０．Ｇｒａｆｆ  ＪＮ，Ａｌｕｍｋａｌ  ＪＪ，Ｄｒａｋｅ  ＣＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｅａｒｌｙ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｅｎｚａｌｕｔａｍｉｄｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．Ａｕｇ  １６  ２０１６；７（３３）：５２８１０−５２８１７．
８１．Ｒｅｋｏｓｋｅ  ＢＴ，Ｓｍｉｔｈ  ＨＡ，Ｏｌｓｏｎ  ＢＭ，Ｍａｒｉｃｑｕｅ  ＢＢ，ＭｃＮｅｅｌ  ＤＧ．ＰＤ−１  ｏｒ  ＰＤ−Ｌ１  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ＳＳＸ２  Ｅｐｉｔｏｐｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ａｕｇ  ２０１５；３（８）：９４６−９５５．
８２．Ｃｏｌｌｕｒｕ  ＶＴ，Ｚａｈｍ  ＣＤ，ＭｃＮｅｅｌ  ＤＧ．Ｍｉｎｉ−ｉｎｔｒｏｎｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｔｏｌｅｒａｎｔ  ＬＡＧ３＋ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｒｉｏｒ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１６：（ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）．
８３．Ｒｅｋｏｓｋｅ  ＢＴ，Ｏｌｓｏｎ  ＢＭ，ＭｃＮｅｅｌ  ＤＧ．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊｕｎ  ２０１６；５（６）：ｅ１１６５３７７．
８４．Ｏｅｓｔｒｅｉｃｈ  ＫＪ，Ｙｏｏｎ  Ｈ，Ａｈｍｅｄ  Ｒ，Ｂｏｓｓ  ＪＭ．ＮＦＡＴｃ１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＰＤ−１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｐｏｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｏｃｔ  １  ２００８；１８１（７）：４８３２−４８３９．
８５．Ｌｅ  ＤＴ，Ｕｒａｍ  ＪＮ，Ｗａｎｇ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．ＰＤ−１  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ−Ｒｅｐａｉｒ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．Ｊｕｎ  ２５  ２０１５；３７２（２６）：２５０９−２５２０．。
【０２３２】
上記の明細書に記載される刊行物及び特許（上記の節に引用されているものを含むが、それらに限定するものではない）は、あらゆる目的のためにその全体を参照として本明細書に援用する。記載される技術の範囲及び趣旨から逸脱することのない、記載される組成物、方法、及び使用の様々な改変及び変形が、当業者には明らかであろう。本技術を特定の例示的な実施形態に関連して説明しているが、請求する本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことは理解すべきである。実際、当業者であれば明らかな、本発明を実施するために記載する態様の様々な改変は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図されている。
【図１】
2019512020.tif 000002
【図２】
2019512020.tif 000003
【図３】
2019512020.tif 000004
【図４】
2019512020.tif 000005
【図５】
2019512020.tif 000006
【図６】
2019512020.tif 000007
【配列表】
2019512020000001.app
【国際調査報告】
2019512020.tif 000008
2019512020.tif 000009
2019512020.tif 000010
2019512020.tif 000011