(57)【要約】  細菌組成物を調製する方法が開示される。この方法は、（ａ）有益な細菌と、バイオフィルム産生細菌とのインビトロ共培養を、前記有益な細菌と、前記非病原性細菌とを含むバイオフィルムを生じさせる条件のもと、成長基材において行うこと；および（ｂ）前記バイオフィルムを前記成長基材から単離し、それにより、細菌組成物を調製することを含む。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌組成物を調製する方法であって、
（ａ）有益な細菌と、バイオフィルム産生細菌とのインビトロ共培養を、前記有益な細菌と、前記非病原性細菌とを含むバイオフィルムを生じさせる条件のもと、成長基材において行うこと；および
（ｂ）前記バイオフィルムを前記成長基材から単離し、それにより、細菌組成物を調製すること
を含む方法。
【請求項２】
前記バイオフィルム産生細菌は非病原性細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バイオフィルム産生細菌はバシラス属である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオフィルム産生細菌はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記有益な細菌はプロバイオティック細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記有益な細菌は、治療用ポリペプチドを発現するように遺伝子改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プロバイオティック細菌はラクトバシラス目である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオフィルム産生細菌はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種である、請求項５又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記プロバイオティック細菌はＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ種である、請求項５又は７に記載の方法。
【請求項１０】
前記有益な細菌はバイオレメディエーションで使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオフィルム産生細菌はＫｉｎＤ−Ｓｐｏ０Ａ経路の遺伝子を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記成長基材は成長培地を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記成長培地は、ＬＢ、ＬＢＧＭ、乳汁およびＭＲＳからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオフィルム産生細菌はバシラス属であり、前記有益な細菌はラクトバシラス目であり、前記成長基材は、ＬＢＧＭ、乳汁またはＭＲＳである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記成長基材はＭＲＳである、請求項１１又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記条件は、約６．５〜８のｐＨを含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記条件は、６．８〜７．５のｐＨを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記成長基材はアセトインを含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記バイオフィルムを前記単離後に脱水することをさらに含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記有益な細菌は、最大でも５０種の細菌種を含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記バイオフィルム産生細菌は、１つだけの菌種のバイオフィルム産生細菌である、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれかに記載の方法に従って得ることができる細菌組成物。
【請求項２３】
組成物における細菌の少なくとも５０％が成長可能である、請求項２２に記載の細菌組成物。
【請求項２４】
最大でも５０種の細菌種の有益な細菌を含む、請求項２２に記載の細菌組成物。
【請求項２５】
１つだけの菌種の非病原性細菌を含む、請求項２２又は２４に記載の細菌組成物。
【請求項２６】
食用である、請求項２２に記載の細菌組成物。
【請求項２７】
プロバイオティック細菌組成物である、請求項２２に記載の細菌組成物。
【請求項２８】
粉末、液状物または錠剤として配合される、請求項２２又は２６に記載の細菌組成物。
【請求項２９】
請求項２７に記載の細菌組成物を含む食品／飼料製造物。
【請求項３０】
対象の健康状態を改善または維持する方法であって、請求項２７に記載のプロバイオティック組成物の治療効果的な量を対象に投与し、それにより、対象の健康状態を改善または維持することを含む方法。
【請求項３１】
細菌組成物を調製するために好都合である作用因または培養条件を選択する方法であって、有益な細菌と、バイオフィルム産生細菌との共培養を、有益な細菌と、バイオフィルム産生細菌とを含むバイオフィルムを生じさせるように、前記作用因の存在下、または前記培養条件のもと、成長基材において行うことを含み、前記バイオフィルムの特性における変化により、前記作用因または培養条件が、細菌組成物を調製するために好都合であることが示される、方法。
【請求項３２】
前記バイオフィルム産生細菌はバシラス属である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記バイオフィルム産生細菌はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記有益な細菌はプロバイオティック細菌である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記プロバイオティック細菌はラクトバシラス目である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
作用因は系の培地のｐＨを変化させる、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、細菌組成物の作製方法に関連し、限定的ではないが、より具体的には、プロバイオティック組成物、環境にとって有益なプロバイオティック組成物、および産業において使用されるプロバイオティック組成物に関連する。
【背景技術】
【０００２】
適量で投与される生きた微生物細胞は、有益な生理学的影響を宿主に与えており、「プロバイオティクス」として知られている。様々な研究により、健康な腸を維持すること、そして、いくつかのタイプの胃腸感染症を抑制することにおいてプロバイオティック細菌が宿主にもたらし得る治療効果が示されている。プロバイオティック細菌の認められた健康上の利益のために、プロバイオティック細菌が、ここ数十年の間に様々な食品製造物および飲料製造物にますます取り入れられてきている。プロバイオティクスとして使用される最も一般的なタイプの微生物のいくつかが乳酸菌（ＬＡＢ）であり、これらは主に、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に属している。これらの属の両方がヒトの腸における優勢な生息菌であり、また、安全な使用の長い歴史を有しており、ＧＲＡＳ（一般に安全と認められる）とみなされている。体内におけるそれらの有益な影響を保証するために、これらの生物は、食品加工の期間中、貯蔵期間中、および上部消化管（ＧＩＴ）の通過期間中を生き残り、生きてそれらの作用部位に到達しなければならない。しかしながら、これまでの研究では、最終的な食品製造物におけるプロバイオティック細菌の生存レベルが低いこと、ならびに、胃の高酸性条件および小腸における高い胆汁濃度に対するそれらの生存度が著しく失われることが示されている。加えて、プロバイオティクスは通常の場合、細胞に対する致死的傷害を引き起こす恐れのある手順として確立されている凍結乾燥によって主に調製される乾燥細菌粉末として利用可能である。したがって、食品製造期間中における健康増進細菌の生存を改善すること、同様にまた、ヒトへのプロバイオティクスの送達を維持するために、貯蔵プロセスおよび摂取プロセスを通じて健康増進細菌の生存を改善するために意図される新規な技術を開発することが必要である。
【０００３】
ほとんどの自然界の生態系において、細菌は、自由生活の（プランクトン様）細胞としてではなく、バイオフィルムと呼ばれる多細胞性細胞の複雑な共同体において成長することを好む。バイオフィルム様式の成長はまた、腸管に生息する細菌のためにも好ましい。バイオフィルム中の細胞は、細胞自身が産生する多糖および他の高分子（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、脂質および核酸など）から主になる細胞外マトリックスによって互いに結ばれている。バイオフィルムに埋め込まれた菌種と、それらの環境との間での相互作用は、環境ストレスに耐えることができ、また、抗菌剤にさらされることにも耐えることができる複雑な構造の形成をもたらす。したがって、バイオフィルム形成は、多様な環境における好ましくない条件のもとで持続するための戦略となっている。
【０００４】
主に研究されているバイオフィルム形成菌の１つが、頑強なバイオフィルムを産生するその能力によって特徴づけられるバシラス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（胞子を形成する非病原性細菌）である。主にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓではあるが、バシラス属の様々な菌種が、主として胃腸管における微生物叢の好都合なバランスを保つことによって宿主の健康状態に対してプラスの影響をもたらすことが示されたため、近年ではプロバイオティック微生物として関心を集めている。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの胞子は極端なｐＨ条件および低酸素を生き残ることができるので、休眠状態ではあるが、成長可能な多数の微生物が、いくつかの有益な影響が活性物質の分泌により誘導されることがある下部腸管に到達し得る。そのうえ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞は、おそらくはカタラーゼおよびスブチリシンの産生を介して、乳酸桿菌の成長および生存度を高めていることが見出された（Ｈｏｓｏｉ、Ａｍｅｔａｎｉ、Ｋｉｕｃｈｉ＆Ｋａｍｉｎｏｇａｗａ、２０００）。また、細胞外マトリックスの一部としてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓによって産生されるγ−ポリグルタミン酸が、プロバイオティック細菌の生存を凍結乾燥時（Ａ．Ｒ．Ｂｈａｔ他、２０１３）および貯蔵時（Ａ．Ｒ．Ｂｈａｔ他、２０１５）において改善するために使用され得ることも報告されている。同様に、胃の酸性条件を模擬する模擬胃液の期間中においても報告されている（Ａ．Ｒ．Ｂｈａｔ他、２０１５）。
【０００５】
さらなる背景技術には、米国特許出願公開第２０１００２０３５８１号、およびＳａｌａｓ  Ｊａｒａ他、Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、２０１６、４、３５（ｄｏｉ：１０．３３９０）が含まれる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の１つの局面によれば、細菌組成物を調製する方法であって、
（ａ）有益な細菌と、バイオフィルム産生細菌とのインビトロ共培養を、有益な細菌と、非病原性細菌とを含むバイオフィルムを生じさせる条件のもと、成長基材において行うこと；および
（ｂ）バイオフィルムを成長基材から単離し、それにより、細菌組成物を調製すること
を含む方法が提供される。
【０００７】
本発明の１つの局面によれば、本明細書中に記載される方法に従って得ることができる細菌組成物が提供される。
【０００８】
本発明の１つの局面によれば、本明細書中に記載される細菌組成物を含む食品／飼料製造物が提供される。
【０００９】
本発明の１つの局面によれば、対象の健康状態を改善または維持する方法であって、本明細書中に記載されるプロバイオティック組成物の治療効果的な量を対象に投与し、それにより、対象の健康状態を改善または維持することを含む方法が提供される。
【００１０】
本発明の１つの局面によれば、細菌組成物を調製するために好都合である作用因または培養条件を選択する方法であって、有益な細菌と、バイオフィルム産生細菌との共培養を、有益な細菌と、バイオフィルム産生細菌とを含むバイオフィルムを生じさせるように、前記作用因の存在下、または前記培養条件のもと、成長基材において行うことを含み、バイオフィルムの特性における変化により、前記作用因または培養条件が、細菌組成物を調製するために好都合であることが示される、方法が提供される。
【００１１】
本発明の実施形態によれば、バイオフィルム産生細菌は非病原性細菌である。
【００１２】
本発明の実施形態によれば、バイオフィルム産生細菌はバシラス属である。
【００１３】
本発明の実施形態によれば、バイオフィルム産生細菌はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種である。
【００１４】
本発明の実施形態によれば、有益な細菌はプロバイオティック細菌である。
【００１５】
本発明の実施形態によれば、有益な細菌は、治療用ポリペプチドを発現するように遺伝子改変される。
【００１６】
本発明の実施形態によれば、プロバイオティック細菌はラクトバシラス目である。
【００１７】
本発明の実施形態によれば、バイオフィルム産生細菌はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種である。
【００１８】
本発明の実施形態によれば、プロバイオティック細菌はＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ種である。
【００１９】
本発明の実施形態によれば、有益な細菌はバイオレメディエーションで使用される。
【００２０】
本発明の実施形態によれば、バイオフィルム産生細菌はＫｉｎＤ−Ｓｐｏ０Ａ経路の遺伝子を発現する。
【００２１】
本発明の実施形態によれば、成長基材は成長培地を含む。
【００２２】
本発明の実施形態によれば、成長培地は、ＬＢ、ＬＢＧＭ、乳汁およびＭＲＳからなる群から選択される。
【００２３】
本発明の実施形態によれば、バイオフィルム産生細菌はバシラス属であり、有益な細菌はラクトバシラス目であり、成長基材は、ＬＢＧＭ、乳汁またはＭＲＳである。
【００２４】
本発明の実施形態によれば、成長基材はＭＲＳである。
【００２５】
本発明の実施形態によれば、条件は、約６．５〜８のｐＨを含む。
【００２６】
本発明の実施形態によれば、条件は、６．８〜７．５のｐＨを含む。
【００２７】
本発明の実施形態によれば、成長基材はアセトインを含む。
【００２８】
本発明の実施形態によれば、上記方法はさらに、バイオフィルムを単離後に脱水することを含む。
【００２９】
本発明の実施形態によれば、有益な細菌は、最大でも５０種の細菌種を含む。
【００３０】
本発明の実施形態によれば、バイオフィルム産生細菌は、１つだけの菌種のバイオフィルム産生細菌である。
【００３１】
本発明の実施形態によれば、組成物における細菌の少なくとも５０％が成長可能である。
【００３２】
本発明の実施形態によれば、細菌組成物は、最大でも５０種の細菌種の有益な細菌を含む。
【００３３】
本発明の実施形態によれば、細菌組成物は、１つだけの菌種の非病原性細菌を含む。
【００３４】
本発明の実施形態によれば、細菌組成物は食用である。
【００３５】
本発明の実施形態によれば、細菌組成物はプロバイオティック細菌組成物である。
【００３６】
本発明の実施形態によれば、細菌組成物は、粉末、液状物または錠剤として配合される。
【００３７】
本発明の実施形態によれば、バイオフィルム産生細菌はバシラス属である。
【００３８】
本発明の実施形態によれば、バイオフィルム産生細菌はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種である。
【００３９】
本発明の実施形態によれば、有益な細菌はプロバイオティック細菌である。
【００４０】
本発明の実施形態によれば、プロバイオティック細菌はラクトバシラス目である。
【００４１】
本発明の実施形態によれば、作用因は系の培地のｐＨを変化させる。
【００４２】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【図１】図１Ａ〜図１Ｂは、共培養におけるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの成長を比較するグラフである。共培養生成は、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの成長に対する影響を（純粋培養におけるそれらの成長と比較して）何ら有しておらず、このことは、拮抗的相互作用がこれらの細菌の間にはないことを示していた。
【図２】図２は、改変ＭＲＳ培地がＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓによるバイオフィルム形成を誘発することを例示する写真である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＮＣＩＢ３６１０のバイオフィルム形成に対するＭＲＳのｐＨ改変の影響を、実体顕微鏡を使用して分析した。
【図３】図３は、ＬＢとＭＲＳ培地との組合せがＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓによるバイオフィルム発達を誘発することを例示する写真である。コロニー型（上段）および菌膜型（下段）のバイオフィルム形成に対する、異なる濃度のＭＲＳ（ｐＨ７）が富化されたＬＢ培地の影響。
【図４】図４Ａ〜図４Ｂは、ＬＢとＭＲＳ培地との組合せがＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓによる細胞外マトリックス産生を誘発することを例示するグラフである。ＭＲＳ濃度を増大させることにより、ｔａｐＡ−ｓｉｐＷ−ｔａｓＡオペロン（Ａ）およびｅｐｓＡ−Ｏオペロン（Ｂ）の転写が誘導される。
【図５Ａ】図５Ａは、ＭＲＳのバイオフィルム刺激効果が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいて以前に記載されたマトリックス合成およびバイオフィルム形成のシグナル伝達経路によって調節されることを例示する写真である。野生型菌株（ＷＴ）および様々な変異型菌株によるＭＲＳ（ｐＨ７）でのコロニー発達および菌膜形成を比較した。この場合に使用される菌株は下記の通りであった：野生型（ＮＣＩＢ３６１０）、ΔｋｉｎＣＤ（ＲＬ４５７７）、ΔｋｉｎＡＢ（ＲＬ４５７３）、Δｓｐｏ０Ａ（ＲＬ４６２０）、ΔｅｐｓΔｔａｓＡ（ＲＬ４５６６）、ΔａｂｒＢ（ＹＣ６６８）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＷＴ型細胞におけるＭＲＳの影響がＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいてマトリックス過剰産生変異型細胞（ΔａｂｒＢ）と同等であることを例示する写真である。
【図６】図６は、ＭＲＳがコロニーバイオフィルム形成を種々のバシラス属菌種において誘導することを例示する写真である。ＭＲＳ（ｐＨ７）培地は、Ｂ．ｐａｒａｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＭＳ３０３、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＭＳ３１０、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｓ１２７、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＳ１５７７、およびＢ．ｃｅｒｅｕｓ  １０９８７のコロニー型バイオフィルムの形成を強く誘導した。
【図７】図７は、ＭＲＳが菌膜形成を種々のバシラス属菌種において誘導することを例示する写真である。ＭＲＳ（ｐＨ７）培地は、Ｂ．ｐａｒａｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＭＳ３０３、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＭＳ３１０、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｓ１２７、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＳ１５７７、およびＢ．ｃｅｒｅｕｓ  １０９８７の菌膜形成を強く誘導した。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓが、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍとの二重菌種バイオフィルムを形成しながら細胞外マトリックスを産生することを例示する画像である。８Ａ：３７℃および５０ｒｐｍでのＭＲＳ（ｐＨ７）におけるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの共培養バイオフィルムのＣＬＳＭ画像。左から右に：蛍光光を使用して作成された画像、ノマルスキー微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）を使用して作成された画像、および合成画像。上段パネルは、蛍光標識されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞の発現がＧＦＰの構成的な発現をもたらすことを示す。下段パネルは、マトリックス産生Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞の発現がｔａｐＡプロモーター制御下でのＣＦＰの発現をもたらすことを示す。すべての画像において、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞は染色されていない。８Ｂ：ＬＢＧＭ培地におけるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの共培養バイオフィルムのＣＬＳＭ画像。左から右に：蛍光光を使用して作成された画像、ノマルスキー微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）を使用して作成された画像、および合成画像。上段パネルは、蛍光標識されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞の発現がＧＦＰの構成的な発現をもたらすことを示す。下段パネルは、マトリックス産生Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞の発現がｔａｐＡプロモーター制御下でのＣＦＰの発現をもたらすことを示す。すべての画像において、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞は染色されていない。
【図９】図９Ａ〜図９Ｃは、（Ａ）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞、（Ｂ）Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞、（Ｃ）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍから構成される二重菌種バイオフィルムのＳＥＭ画像である。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｂは、二重菌種バイオフィルムが、好ましくない条件にさらされるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの生存を促進させることを例示するグラフである。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓバイオフィルムの存在下または非存在下（コントロール）におけるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞の生存を、（Ａ）６３℃での１分間〜３分間の加熱時、（Ｂ）４℃での２１日間の貯蔵時において求めた。示される値は、二連で行われた少なくとも３回の独立した実験の平均である。＊ｐ＜０．０５。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｂは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの細胞外マトリックスが熱処理中におけるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの増大した生存を促進することを例示するグラフである。Ａ：ＷＴ型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓと、その誘導体、すなわち、細胞外マトリックスの菌体外多糖成分およびタンパク質成分が欠損している変異体（ΔｅｐｓΔｔａｓＡ）と、マトリックス遺伝子のリプレッサーが欠損している変異体（ΔａｂｒＢ；これはバイオフィルムマトリックスを過剰生産する）とについて、６３℃での３分間の熱処理の影響を調べた。示される結果は、二連で行われた少なくとも３回の独立した実験の平均である。＊ｐ＜０．０５。Ｂ：サンプルを、３０℃で１８時間、２０ｒｐｍで乳汁において成長させた。その後、サンプルを１分間〜３分間、６３℃で熱処理した。コントロールサンプルは熱処理を行わなかった。生Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞の数を、ＣＦＵ法を使用して求めた。＊ｐ＜０．０５
【図１２】図１２は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓバイオフィルムの存在がインビトロ（モデル系）での胃消化期間中および腸消化期間中におけるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの生存を増大させることを例示するグラフである。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓバイオフィルムの存在下または非存在下（コントロール）におけるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞の生存をインビトロでの胃腸消化期間中に求めた。示される結果は、二連で行われた３回の独立した実験の平均である。＊ｐ＜０．０５。
【図１３】図１３は、ＭＲＳ（ｐＨ７）およびＬＢにおけるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ３６１０ＮＣＩＢの成長曲線のグラフである。
【図１４】図１４は、ＭＲＳ（ｐＨ７）でのコロニー表面構造および菌膜形成に対するヒスチジンキナーゼにおける変異の影響を例示する写真である。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｃは、アセトインの存在下および非存在下におけるＬＢ培地での２４時間のインキュベーションの後の蛍光標識されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞（Ｐｓｐａｎｋ−ｇｆｐ）のＣＬＳＭ画像である。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｂは、アセトインがバシラス・スブチリスによるコロニー型バイオフィルムの形成を誘発することを例示する写真である。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｄは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるマトリックス産生を担うｔａｐＡオペロンの転写がアセトインによって非常にアップレギュレーションされることを例示する写真である。バイオフィルム形成を促進させないＬＢ培地での２４時間のインキュベーションの後における、ＰｔａｐＡ−ｃｆｐの転写融合をもたらすＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞のＣＬＳＭ画像。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、細菌組成物の作製方法に関連し、限定的ではないが、より具体的には、プロバイオティック組成物、環境にとって有益なプロバイオティック組成物、および産業において使用されるプロバイオティック組成物に関連する。
【００４５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。
【００４６】
様々な細菌が、これらの微生物は多くの目的のためにヒトによって使用されるために経済的に重要である。細菌の有益な用途には、伝統的食品（例えば、ヨーグルト、チーズおよび酢など）の製造、生物工学および遺伝子工学、物質（例えば、薬物およびビタミンなど）の製造、農業、繊維の発酵精錬、メタンの製造、バイオレメディエーション、ならびに有害生物の生物学的抑制が含まれる。
【００４７】
それらの目的を達成するために、多くの場合、細菌は、その生存度を低下させる、したがって、その有効性を低下させる過酷な条件にさらされる。
【００４８】
例えば、体内におけるプロバイオティクスの有益な影響を保証するために、これらの生物は、食品加工の期間中、貯蔵期間中、および上部消化管（ＧＩＴ）の通過期間中を生き残り、生きてそれらの作用部位に到達しなければならない。しかしながら、これまでの研究では、最終的な食品製造物におけるプロバイオティック細菌の生存レベルが低いこと、ならびに、胃の高酸性条件および小腸における高い胆汁濃度に対するそれらの生存度が著しく失われることが示されている。加えて、プロバイオティクスは通常の場合、細胞に対する致死的傷害を引き起こす恐れのある手順として確立されている凍結乾燥によって主に調製される乾燥細菌粉末として利用可能である。
【００４９】
細菌バイオフィルムに関する研究を行っている間に、本発明者らは、適切な条件のもとでは、バイオフィルム産生細菌がバイオフィルム非産生細菌をそのバイオフィルムの中に取り込み、バイオフィルム非産生細菌を極端な温度（低温および高温）に対してより抵抗性にすることがあることを認めた（それぞれ、図１０および図１１Ａ〜図１１Ｂ）。
【００５０】
具体的には、本発明者らは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種の細菌をプロバイオティック細菌のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍと一緒に共培養した。特定の条件のもとでは、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細菌が、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞がその細胞外マトリックスの中に取り込まれるバイオフィルムを生成することが示された（図９Ａ）。バイオフィルムに取り込まれたＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍは、コントロールよりも、すなわち、バイオフィルムに取り込まれていないＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍよりも、耐熱性および耐冷性の両方が大きいこと、さらには耐酸性が大きいことが示された。
【００５１】
まとめると、本発明者らは、バイオフィルム産生細菌が、バイオフィルム非産生細菌を閉じ込めるために使用され得ることを提案する。したがって、バイオフィルム産生細菌は、有益なバイオフィルム非産生細菌のための保護キャリアとして役立つ。
【００５２】
したがって、本発明の１つの局面によれば、細菌組成物を調製する方法であって、
（ａ）有益な細菌と、バイオフィルム産生細菌とのインビトロ共培養を、有益な細菌と、非病原性細菌とを含むバイオフィルムを生じさせる条件のもと、成長基材において行うこと；および
（ｂ）バイオフィルムを成長基材から単離し、それにより、細菌組成物を調製すること
を含む方法が提供される。
【００５３】
用語「細菌」は、本明細書中で使用される場合、古細菌を含めて原核微生物を示す。細菌はグラム陽性である場合があり、またはグラム陰性である場合がある。細菌はまた、光合成細菌（例えば、シアノバクテリア）である場合がある。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「有益な細菌」は、プラスの影響をヒトにもたらすどのような細菌をも示す。
【００５５】
１つの実施形態において、有益な細菌は、標準的な培養条件のもとで成長培地において単一培養物として増殖させられるときにはバイオフィルムを産生しない。
【００５６】
別の実施形態において、有益な細菌は、その増殖のために最適である培養条件のもとで成長培地において単一培養物として増殖させられるときにはバイオフィルムを産生しない。
【００５７】
さらに別の実施形態において、有益な細菌はＫｉｎＤ−Ｓｐｏ０Ａ経路を利用する（例えば、ヒスチジンキナーゼｋｉｎＤ、ｓｐｏ０Ｆ、ｓｐｏ０Ｂおよび／またはｓｐｏ０Ａの各遺伝子を発現する）−例えば、ＳｈｅｍｅｓｈおよびＣｈａｉ、２０１３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２０１３、第１９５巻、第１２号、２７４７頁〜２７５４頁を参照のこと、その内容は参照によって本明細書中に組み込まれる。
【００５８】
有益な細菌は、Ｍａｎ、ＲｏｇｏｓａおよびＳｈａｒｐｅの培地（ＭＲＳ；寒天を使用して固化されるＭＲＳ、またはＭＲＳブロス）において典型的に培養されるものであり得る。
【００５９】
有益な細菌は典型的には、バイオフィルム生成細菌（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のバイオフィルム形成能を妨げてはならない（すなわち、打ち消してはならない）。細菌が、一緒に培養されるときの他の細菌に対して拮抗活性を有するかどうかを明らかにする様々な方法が、この技術分野では知られている（例えば、図１Ａ〜図１Ｂを参照のこと）。１つの実施形態において、有益な細菌は土壌細菌ではない。
【００６０】
いくつの菌株の有益な細菌であっても、本発明のこの局面の共培養において培養され得る。１つの実施形態において、最大でも５００菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも２５０菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも１００菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも９０菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも８０菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも７０菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも６０菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも５０菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも４０菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも３０菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも２０菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも１０菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも９菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも８菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも７菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも６菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも５菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも４菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも３菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも２菌株の異なる菌株の有益な細菌が単回培養物で培養され、または、ただ１つだけの菌株の有益な細菌が単回培養あたり培養される。
【００６１】
本発明のこの局面の単回培養物の有益な細菌株は、１つだけの種に属する場合があり、または多数の種に属する場合がある。好ましくは、培養物の有益な細菌株は、１つだけの細菌種に属する。他の実施形態において、多数の種の有益な細菌が単回培養で培養される。好ましくは、最大でも１０種の異なる種の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも９種の異なる種の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも８種の異なる種の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも７種の異なる種の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも６種の異なる種の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも５種の異なる種の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも４種の異なる種の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも３種の異なる種の有益な細菌が単回培養物で培養され、最大でも２種の異なる種の有益な細菌が単回培養物で培養され、または、ただ１種だけの有益な細菌が単回培養あたり培養される。
【００６２】
１つの実施形態において、有益な細菌は、摂取されたときにはヒトの健康を増進させる。別の実施形態において、有益な細菌は、ヒトのために有用である製造物（例えば、メタン、石油、殺虫剤など）を生じさせるために産業界において使用される。別の実施形態において、有益な細菌は食品産業において使用される。別の実施形態において、有益な細菌はサイレージ接種物において使用される。さらに別の実施形態において、有益な細菌は、植物の成長を支援するために農業において使用される。さらに別の実施形態において、有益な細菌はバイオレメディエーションにおいて使用される。
【００６３】
１つの実施形態において、有益な細菌はプロバイオティック細菌である。
【００６４】
用語「プロバイオティック細菌」は、本明細書中で使用される場合、適量で投与されたときには健康上の利益を宿主（例えば、ヒト）に与える生細菌を示す。
【００６５】
プロバイオティック作用の主要な機構の中には、乳酸、過酸化水素およびバクテリオシンの産生による腸内病原菌の阻害；接着部位を阻止すること、栄養分についての競合、および（炎症の軽減を含めて）免疫系の調節による腸内病原菌の競合的排除を見出すことが可能である。プロバイオティック細菌はまた、宿主に対する様々な利益（例えば、乳糖不耐性の緩和、同化によるコレステロール減少、腸の正常な微生物叢の持続、およびディスバイオシスを改善する毒素産生抑制、腸における毒素受容体の分解、正常な腸ｐＨの保全など）をもたらし、腸の運動性を増大させ、また、腸透過性の完全性を維持することを助ける。
【００６６】
１つの実施形態において、有益な細菌は、（一般には乳酸菌（ＬＡＢ）として知られる）ラクトバシラス目に属する。これらの細菌は、共通する代謝特徴および生理学的特徴を互いに有するグラム陽性の、低ＧＣの、耐酸性の、一般には非芽胞性の、非呼吸性の、桿状形状または球菌形状のどちらかの細菌である。これらの細菌は乳酸を炭水化物発酵の主要な代謝最終産物として産生する。
【００６７】
好ましくは、ラクトバシラス目の有益な細菌は、ＭＲＳ寒天（ＭＲＳ）で成長する（典型的には培養される）細菌である。
【００６８】
ラクトバシラス目の例示的な意図される属には、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ペジオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、オエノコッカス属（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、スポロラクトバシラス属（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、テトラゲノコッカス属（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、バゴコッカクス属（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）およびワイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
好ましい実施形態によれば、本発明のこの局面の有益な細菌は、ラクトバシラス属に属する。本発明によって想定されるラクトバシラス属の例示的な種は、以下のものを含むが、これらに限定されない：Ｌ．  ａｃｅｔｏｔｏｌｅｒａｎｓ，  Ｌ．  ａｃｉｄｉｆａｒｉｎａｅ，  Ｌ．  ａｃｉｄｉｐｉｓｃｉｓ，  Ｌ．  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，  Ｌ．  ａｇｉｌｉｓ，  Ｌ．  ａｌｇｉｄｕｓ，  Ｌ．  ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ，  Ｌ．  ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ，  Ｌ．  ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ，  Ｌ．  ａｍｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ，  Ｌ．  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ，Ｌ．  ａｎｉｍａｌｉｓ，  Ｌ．  ａｎｔｒｉ，  Ｌ．  ａｐｏｄｅｍｉ，  Ｌ．  ａｖｉａｒｉｕｓ，  Ｌ．  ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ，  Ｌ．  ｂｒｅｖｉｓ，  Ｌ．  ｂｕｃｈｎｅｒｉ，  Ｌ．  ｃａｍｅｌｌｉａｅ，  Ｌ．  ｃａｓｅｉ，  Ｌ．  ｃａｔｅｎａｆｏｒｍｉｓ，  Ｌ．  ｃｅｔｉ，  Ｌ．  ｃｏｌｅｏｈｏｍｉｎｉｓ，  Ｌ．  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ，  Ｌ．  ｃｏｍｐｏｓｔｉ，  Ｌ．  ｃｏｎｃａｖｕｓ，  Ｌ．  ｃｏｒｙｎｉｆｏｒｍｉｓ，  Ｌ．  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ，  Ｌ．  ｃｒｕｓｔｏｒｕｍ，  Ｌ．  ｃｕｒｖａｔｕｓ，  Ｌ．  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ，  Ｌ．  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ，  Ｌ．  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｌａｃｔｉｓ，  Ｌ．  ｄｅｘｔｒｉｎｉｃｕｓ，  Ｌ．  ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ，  Ｌ．  ｅｑｕｉ，  Ｌ．  ｅｑｕｉｇｅｎｅｒｏｓｉ，  Ｌ．  ｆａｒｒａｇｉｎｉｓ，  Ｌ．  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ，  Ｌ．  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ，  Ｌ．  ｆｏｒｎｉｃａｌｉｓ，  Ｌ．  ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ，  Ｌ．  ｆｒｕｍｅｎｔｉ，  Ｌ．  ｆｕｃｈｕｅｎｓｉｓ，  Ｌ．  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ，  Ｌ．  ｇａｓｓｅｒｉ，  Ｌ．  ｇａｓｔｒｉｃｕｓ，  Ｌ．  ｇｈａｎｅｎｓｉｓ，  Ｌ．  ｈｉｌｇａｒｄｉｉ，  Ｌ．  ｈｏｍｏｈｉｏｃｈｉｉ，  Ｌ．  ｉｎｅｒｓ，  Ｌ．  ｉｎｇｌｕｖｉｅｉ，  Ｌ．  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ，  Ｌ．  ｊｅｎｓｅｎｉｉ，  Ｌ．  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ，Ｌ．  ｋａｌｉｘｅｎｓｉｓ，  Ｌ．  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ，  Ｌ．  ｋｅｆｉｒｉ，  Ｌ．  ｋｉｍｃｈｉｉ，  Ｌ．  ｋｉｔａｓａｔｏｎｉｓ，  Ｌ．  ｋｕｎｋｅｅｉ，  Ｌ．  ｌｅｉｃｈｍａｎｎｉｉ，  Ｌ．  ｌｉｎｄｎｅｒｉ，  Ｌ．  ｍａｌｅｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ，  Ｌ．  ｍａｌｉ，  Ｌ．  ｍａｎｉｈｏｔｉｖｏｒａｎｓ，  Ｌ．  ｍｉｎｄｅｎｓｉｓ，  Ｌ．  ｍｕｃｏｓａｅ，  Ｌ．  ｍｕｒｉｎｕｓ，  Ｌ．  ｎａｇｅｌｉｉ，  Ｌ．  ｎａｍｕｒｅｎｓｉｓ，  Ｌ．  ｎａｎｔｅｎｓｉｓ，  Ｌ．  ｏｌｉｇｏｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ，  Ｌ．  ｏｒｉｓ，  Ｌ．  ｐａｎｉｓ，  Ｌ．  ｐａｎｔｈｅｒｉｓ，  Ｌ．  ｐａｒａｂｒｅｖｉｓ，  Ｌ．  ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ，  Ｌ．  ｐａｒａｃａｓｅｉ，  Ｌ．  ｐａｒａｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ，  Ｌ．  ｐａｒａｆａｒｒａｇｉｎｉｓ，  Ｌ．  ｐａｒａｋｅｆｉｒｉ，  Ｌ．  ｐａｒａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ，  Ｌ．  ｐａｒａｐｌａｎｔａｒｕｍ，  Ｌ．  ｐｅｎｔｏｓｕｓ，  Ｌ．  ｐｅｒｏｌｅｎｓ，  Ｌ．  ｐｌａｎｔａｒｕｍ，  Ｌ．  ｐｏｎｔｉｓ，  Ｌ．  ｐｒｏｔｅｃ���ｕｓ，  Ｌ．  ｐｓｉｔｔａｃｉ，  Ｌ．  ｒｅｎｎｉｎｉ  Ｌ．  ｒｅｕｔｅｒｉ，  Ｌ．  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ，  Ｌ．  ｒｉｍａｅ，  Ｌ．  ｒｏｇｏｓａｅ，  Ｌ．  ｒｏｓｓｉａｅ，  Ｌ．  ｒｕｍｉｎｉｓ，  Ｌ．  ｓａｅｒｉｍｎｅｒｉ，  Ｌ．  ｓａｋｅｉ，  Ｌ．  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ，  Ｌ．  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ，  Ｌ．  ｓａｔｓｕｍｅｎｓｉｓ，  Ｌ．  ｓｅｃａｌｉｐｈｉｌｕｓ，  Ｌ．  ｓｈａｒｐｅａｅ，  Ｌ．  ｓｉｌｉｇｉｎｉｓ，  Ｌ．  ｓｐｉｃｈｅｒｉ，  Ｌ．  ｓｕｅｂｉｃｕｓ，  Ｌ．  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ，  Ｌ．  ｕｌｔｕｎｅｎｓｉｓ，  Ｌ．  ｖａｃｃｉｎｏｓｔｅｒｃｕｓ，  Ｌ．  ｖａｇｉｎａｌｉｓ，  Ｌ．  ｖｅｒｓｍｏｌｄｅｎｓｉｓ，  Ｌ．  ｖｉｎｉ，  Ｌ．  ｖｉｔｕｌｉｎｕｓ，  Ｌ．  ｚｅａｅ，及びＬ．  ｚｙｍａｅ。
【００７０】
１つの特定の実施形態において、ラクトバシラス属の種はＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍである。
【００７１】
本発明のこの局面の有益な細菌は発酵産物を生じさせる場合がある。発酵産物の例には、プレバイオティクス、バイオ燃料、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アルコール燃料、タンパク質、組換えタンパク質、ビタミン、アミノ酸、有機酸（例えば、乳酸、プロピオン酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸、グルタミン酸、アスパラギン酸および３−ヒドロキシプロピオン酸）、酵素、抗原、抗生物質、有機化学物質、バイオレメディエーション処理物、保存剤および代謝産物が含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
したがって、有益な細菌は、有益なポリペプチドを発現するように遺伝子改変される場合がある。
【００７３】
有益なポリペプチドは、細胞内ポリペプチド（例えば、細胞質タンパク質）、膜貫通ポリペプチド、または分泌型ポリペプチドである場合がある。タンパク質の異種産生が、研究および産業の様々な状況において、例えば、治療薬、ワクチン、診断薬、バイオ燃料の製造、および関心のある多くの他の応用のために広範囲に用いられている。主題の組成物および方法を用いることによって製造することができる例示的な治療用タンパク質には、ある種の天然型および組換え型のヒトホルモン（例えば、インスリン、成長ホルモン、インスリン様増殖因子１、卵胞刺激ホルモンおよび絨毛性ゴナドトロピン）、造血性タンパク質（例えば、エリスロポイエチン、Ｃ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１１）、血栓性および止血性のタンパク質（例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子および活性化プロテインＣ）、免疫学的タンパク質（例えば、インターロイキン）、抗体および他の酵素（例えば、デオキシリボヌクレアーゼＩ）が含まれるが、これらに限定されない。主題の組成物および方法によって製造することができる例示的なワクチンには、様々なインフルエンザウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型およびＣ型、ならびにそれぞれのタイプについての様々な血清型、例えば、Ａ型インフルエンザウイルスについてのＨ５Ｎ２型、Ｈ１Ｎ１型、Ｈ３Ｎ２型）、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎またはＤ型肝炎）、ライム病、ならびにヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に対するワクチンが含まれるが、これらに限定されない。異種産生されたタンパク質診断薬の例には、セクレチン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ＨＩＶ抗原およびＣ型肝炎抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【００７４】
異種ポリペプチドによって産生されるタンパク質またはペプチドには、サイトカイン、ケモカイン、リンホカイン、リガンド、受容体、ホルモン、酵素、抗体および抗体フラグメント、ならびに増殖因子が含まれ得るが、これらに限定されない。受容体の限定されない例には、Ｉ型ＴＮＦ受容体、ＩＩ型ＩＬ−１受容体、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、ＩＬ−４受容体、および、化学的改変または遺伝子改変されたどのような可溶性受容体も含まれる。酵素の例には、アセチルコリンエステラーゼ、ラクターゼ、活性化プロテインＣ、第ＶＩＩ因子、コラゲナーゼ（例えば、Ａｄｖａｎｃｅ  Ｂｉｏｆａｃｔｕｒｅｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによってＳａｎｔｙｌの名称で上市されるもの）、アガルシダーゼ−ベータ（例えば、ＧｅｎｚｙｍｅによってＦａｂｒａｚｙｍｅの名称で上市されるもの）、ドルナーゼ−アルファ（例えば、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによってＰｕｌｍｏｚｙｍｅの名称で上市されるもの）、アルテプラーゼ（例えば、ＧｅｎｅｎｔｅｃｈによってＡｃｔｉｖａｓｅの名称で上市されるもの）、ペグ化アスパラギナーゼ（例えば、ＥｎｚｏｎによってＯｎｃａｓｐａｒの名称で上市されるもの）、アスパラギナーゼ（例えば、ＭｅｒｃｋによってＥｌｓｐａｒの名称で上市されるもの）、およびイミグルセラーゼ（例えば、ＧｅｎｚｙｍｅによってＣｅｒｅｄａｓｅの名称で上市されるもの）が含まれる。具体的なポリペプチドまたはタンパク質の例には、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロンベータ（ＩＦＮ−ベータ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮガンマ）、インターフェロンガンマ誘導因子Ｉ（ＩＧＩＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＩＧＦ−ベータ）、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｕｐｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ｎｏｒｍａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｕｍａｂｌｙ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）、マクロファージ炎症タンパク質（例えば、ＭＩＰ−１−アルファおよびＭＩＰ−１−ベータ）、Ｌｅｉｓｈｍｎａｎｉａ伸長開始因子（ＬＥＩＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、増殖因子、例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−２（ＮＴ−２）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、ニューロトロフィン−５（ＮＴ−５）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＩＩ型ＴＮＦアルファ受容体、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、インスリンおよび可溶性糖タンパク質（例えば、ｇｐ１２０糖タンパク質およびｇｐ１６０糖タンパク質）が含まれるが、これらに限定されない。ｇｐ１２０糖タンパク質はヒト免疫不全ウイルス（ＷＩＶ）のエンベロープタンパク質であり、ｇｐ１６０糖タンパク質は、ｇｐ１２０糖タンパク質に対する知られている前駆体である。他の例には、セクレチン、ネシリチド（ヒトＢ型ナトリウム利尿ペプチド（ｈＢＮＰ））およびＧＹＰ−Ｉが含まれる。
【００７５】
ヒトインターフェロンベータ１ｂの発現のための意図される細菌には、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が含まれる。
【００７６】
ヒトインターフェロンガンマの発現のための意図される細菌には、例えば、大腸菌が含まれる。
【００７７】
ヒト成長ホルモンの発現のための意図される細菌には、例えば、大腸菌が含まれる。
【００７８】
ヒトインスリンの発現のための意図される細菌には、例えば、大腸菌が含まれる。
【００７９】
インターロイキンＩＩの発現のための意図される細菌には、例えば、大腸菌が含まれる。
【００８０】
特定の実施形態によれば、有益なポリペプチドは抗体である（例えば、Ｈｕｍｉｒａ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ、Ｒｉｔｕｘａｎ、Ｅｎｂｒｅｌ、Ａｖａｓｔｉｎ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）。
【００８１】
抗体の発現のための意図される細菌には、例えば、大腸菌、バシラス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バシラス・スブチリス、およびバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）が含まれる。
【００８２】
本発明によって意図される他の有益な細菌には、細菌ワクチンとして使用される細菌が含まれる。本発明によって意図される例示的なワクチンには、Ｖｉｖｏｔｉｆ  Ｂｅｒｎａ  Ｖａｃｃｉｎｅ（腸チフスワクチン、生ワクチン）、Ｐｒｅｖｎａｒ  １３（肺炎球菌用１３価ワクチン）、Ｍｅｎａｃｔｒａ（髄膜炎菌用コンジュゲートワクチン）、ＡｃｔＨＩＢ（ヘモフィルスｂコンジュゲート（ｐｒｐ−ｔ）ワクチン）、Ｂｅｘｓｅｒｏ（Ｂ群髄膜炎菌用ワクチン）、Ｂｉｏｔｈｒａｘ（沈降炭疽ワクチン）、Ｈｉｂｅｒｉｘ（ヘモフィルスｂコンジュゲート（ｐｒｐ−ｔ）ワクチン）、ＨｉｂＴＩＴＥＲ（ヘモフィルスｂコンジュゲート（ｈｂｏｃ）ワクチン）、Ｌｉｑｕｉｄ  ＰｅｄｖａｘＨＩＢ（ヘモフィルスｂコンジュゲート（ｐｒｐ−ｏｍｐ）ワクチン）、ＭｅｎＨｉｂｒｉｘ（ヘモフィルスｂコンジュゲート（ｐｒｐ−ｔ）ワクチン／髄膜炎菌用コンジュゲートワクチン）、Ｍｅｎｏｍｕｎｅ  Ａ／Ｃ／Ｙ／Ｗ−１３５（髄膜炎菌多糖体ワクチン）、Ｍｅｎｖｅｏ（髄膜炎菌用コンジュゲートワクチン）、Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ  ２３（肺炎球菌用２３価ワクチン）、Ｐｒｅｖｎａｒ（肺炎球菌用７価ワクチン）、Ｔｅ  Ａｎａｔｏｘａｌ  Ｂｅｒｎａ（破傷風トキソイド）、Ｔｅｔａｎｕｓ  Ｔｏｘｏｉｄ  Ａｄｓｏｒｂｅｄ（破傷風トキソイド）、ＴｈｅｒａＣｙｓ（ｂｃｇ）、Ｔｉｃｅ  ＢＣＧ（ｂｃｇ）、Ｔｒｕｍｅｎｂａ（Ｂ群髄膜炎菌用ワクチン）、Ｔｙｐｈｉｍ  Ｖｉ（腸チフスワクチン、不活性化型）、Ｖａｘｃｈｏｒａ、コレラワクチン（生ワクチン）、およびＶｉｖｏｔｉｆ  Ｂｅｒｎａ（腸チフスワクチン、生ワクチン）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８３】
他の意図される有益な細菌は、バイオレメディエーションにおいて有用である細菌である。そのような除染には、重金属、化学物質、放射線および炭化水素汚染が含まれる。
【００８４】
バイオレメディエーションのために使用され得る細菌の例が本明細書中下記に列挙される：
【００８５】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）：シュードモナス・プチダは、トルエン（塗料用シンナーの成分）のバイオレメディエーションに関与するグラム陰性の土壌細菌である。シュードモナス・プチダはまた、ナフタレン（石油精製の産物）を汚染土壌において分解することができる。
【００８６】
デクロロモナス・アロマチカ（Ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｏｎａｓ  ａｒｏｍａｔｉｃａ）：デクロロモナス・アロマチカは、安息香酸（ｂｅｎｚｏａｔｅ）、クロロ安息香酸（ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏａｔｅ）およびトルエンを含む芳香族化合物を、酸素、塩素酸塩または硝酸塩の還元と共役させて酸化することができる桿状形状の細菌である。デクロロモナス・アロマチカは、ベンゼンを嫌気的に酸化することができる唯一の生物である。ベンゼン汚染の傾向がとりわけ地下水および地表水では高いために、Ｄ．ａｒｏｍａｔｉｃが、この物質の現場バイオレメディエーションのためにとりわけ有用である。
【００８７】
硝化細菌および脱窒細菌：工業的バイオレメディエーションが、廃水を浄化するために使用される。ほとんどの処理システムは、望まれない無機窒素化合物（すなわち、アンモニア、亜硝酸塩、硝酸塩）を除去するために微生物活性に頼っている。窒素の除去は、硝化および脱窒を伴う２段階プロセスである。硝化時において、アンモニウムが、ニトロソモナス・ユーロパエア（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ）のような生物によって亜硝酸塩に酸化される。その後、亜硝酸塩がさらに、ニトロバクター・ハンブルゲンシス（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｈａｍｂｕｒｇｅｎｓｉｓ）のような微生物によって硝酸塩に酸化される。嫌気的条件において、アンモニウム酸化時に生成する硝酸塩が、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のような微生物によって最終電子受容体として使用される。その結果がＮ２ガスである。
このプロセスを介して、アンモニウムおよび硝酸塩（天然水域における富栄養化の原因となっている２つの汚染物質）が除染される。
【００８８】
デイノコッカス・ラジオデュランス（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ）：デイノコッカス・ラジオデュランスは、溶媒および重金属のバイオレメディエーションのために遺伝子操作される放射線耐性の極限環境細菌である。デイノコッカス・ラジオデュランスの操作された菌株がイオン性水銀およびトルエンを放射性の混合廃棄物環境において分解することが示されている。
【００８９】
嫌気的条件において、アンモニウム酸化時に生成する硝酸塩が、パラコッカス・デニトリフィカンスのような微生物によって最終電子受容体として使用される。その結果が二窒素ガスである。このプロセスを介して、アンモニウムおよび硝酸塩（天然水域における富栄養化の原因となっている２つの汚染物質）が除染される。
【００９０】
メチリビウム・ペトロレイフィルム（Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）：メチリビウム・ペトロレイフィルム（これは正式にはＰＭ１株として知られている）は、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）のバイオレメディエーションを行うことができる細菌である。ＰＭ１は、この汚染物質を唯一の炭素源およびエネルギー源として使用することによってＭＴＢＥを分解する。
【００９１】
アルカニボラックス・ボルクメンシス（Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ  ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ）：アルカニボラックス・ボルクメンシスは、炭化水素（例えば、燃料に見出される炭化水素など）を消費し、二酸化炭素を生成する桿状形状の海洋細菌である。アルカニボラックス・ボルクメンシスは石油被害環境において迅速に成長し、メキシコ湾におけるＤｅｅｐｗａｔｅｒ  Ｈｏｒｉｚｏｎ原油流出からの８３００００ガロン超の原油を浄化することを助けるために使用されている。原油を除去するために使用することができる他の意図される細菌には、コルウェリア属（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）およびネプツニイバクター属（Ｎｅｐｔｕｎｉｉｂａｃｔｅｒ）が含まれる。
【００９２】
述べられたように、本発明のこの局面の方法は、有益な細菌をバイオフィルム産生細菌とともに培養することを意図する。
【００９３】
用語「バイオフィルム」は、本明細書中で使用される場合、バイオフィルム産生細菌が産生した細胞外ポリマー物質のマトリックスに含まれる（例えば、埋め込まれる、または閉じ込められる）細菌の共同体を示す。典型的には、バイオフィルム中に存在するときの細菌は、成長速度および遺伝子転写に関して、自由に浮遊するプランクトン様細菌と比較して、変化した表現型を示す。バイオフィルム中に存在し得る細胞外ポリマー物質の例には、菌体外多糖（例えば、ｅｐｓＡ−Ｏオペロンの産物によって合成される菌体外多糖など）およびアミロイド繊維（例えば、ｔａｐＡ−ｓｉｐＷ−ｔａｓＡオペロンによってコードされるアミロイド繊維など）が含まれる。したがって、マトリックスは典型的には、炭水化物と同様に、細胞外のＤＮＡおよびタンパクを含む。
【００９４】
バイオフィルム産生細菌もまた、有益な細菌であり得ることが理解されるであろう。
【００９５】
バイオフィルム産生細菌は典型的には、バイオフィルムに取り込まれる有益な細菌とは目および／または属が異なる。したがって、バイオフィルム産生細菌および有益な細菌は、菌株、種、属および／または目が別個である場合がある。
【００９６】
好ましくは、バイオフィルム産生細菌はヒトにおいて非病原性である（すなわち、ヒトに対する身体的危害、またはヒトにおける疾患を引き起こさない）。
【００９７】
いくつの菌株のバイオフィルム産生細菌であっても、本発明のこの局面の共培養において培養され得る。１つの実施形態において、最大でも５００菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも２５０菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも１００菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも９０菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも８０菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも７０菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも６０菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも５０菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも４０菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも３０菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも２０菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも１０菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも９菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも８菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも７菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも６菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも５菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも４菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも３菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、最大でも２菌株の異なる菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養物で培養され、または、ただ１つだけの菌株のバイオフィルム産生細菌が単回培養あたり培養される。
【００９８】
本発明のこの局面の単回培養物のバイオフィルム産生細菌株は１つだけの種に属する場合があり、または多数の種に属する場合がある。好ましくは、培養物のバイオフィルム産生細菌株は１つだけの細菌種に属する。他の実施形態において、多数の種のバイオフィルム産生細菌が単回培養で培養される。好ましくは、最大でも１０種の異なる種のバイオフィルム産生細菌が単回培養で培養され、最大でも９種の異なる種のバイオフィルム産生細菌が単回培養で培養され、最大でも８種の異なる種のバイオフィルム産生細菌が単回培養で培養され、最大でも７種の異なる種のバイオフィルム産生細菌が単回培養で培養され、最大でも６種の異なる種のバイオフィルム産生細菌が単回培養で培養され、最大でも５種の異なる種のバイオフィルム産生細菌が単回培養で培養され、最大でも４種の異なる種のバイオフィルム産生細菌が単回培養で培養され、最大でも３種の異なる種のバイオフィルム産生細菌が単回培養で培養され、最大でも２種の異なる種のバイオフィルム産生細菌が単回培養で培養され、または、ただ１種だけのバイオフィルム産生細菌が単回培養あたり培養される。
【００９９】
１つの実施形態において、バイオフィルム産生細菌はバシラス属に属する。本明細書中で使用される場合、「バシラス属」には、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、およびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（これらに限定されない）を含めて、当業者に知られているすべての構成菌が含まれる。バシラス属は分類学的再編を受け続けていることが認識されている。したがって、この属は、現在は「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と命名されるＢ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのような生物（これらに限定されない）を含めて、再分類されている種を包含することが意図される。  酸素存在下における耐性内生胞子の産生が、バシラス属の定義となるような特徴であると考えられており、だが、この特徴はまた、最近命名されたアリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アンフィバチルス属（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アネウリニバチルス属（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス属（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス属（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス属（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス属（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス属（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、テルモバチルス属（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス属（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）およびビルギバチルス属（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）にも当てはまる。
【０１００】
１つの実施形態において、バイオフィルム産生細菌はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種に属する。
【０１０１】
本発明によって意図されるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの例示的な菌株には、Ｂ．ｐａｒａｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＭＳ３０３、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＭＳ３１０、Ｂ．ｐａｒａｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  Ｓ１２７、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＭＳ１５７７およびＮＣＩＢ３６１０が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
特定の実施形態によれば、バイオフィルム産生細菌はＢ．ｃｅｒｅｕｓ種を含まない。
【０１０３】
共培養物を生じさせるために、典型的には、有益な培養物と、バイオフィルム生成培養物との両方が、スターター培養物を生じさせるために別々に培養される。スターター培養の培地および条件は典型的には、これらの細菌のそれぞれの成長を最適化するように選択される。
【０１０４】
意図された開始された培養物には、乾燥スターター培養物、脱水スターター培養物、凍結スターター培養物、または濃縮スターター培養物が含まれる。
【０１０５】
スターター培養物は、十分な量の細菌が増殖するまで少なくとも２時間にわたって、４時間にわたって、８時間にわたって、１２時間にわたって成長させられる。
【０１０６】
特定の実施形態によれば、上記方法は、有益な細菌がラクトバシラス属の細菌（例えばＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ種の細菌）であり、バイオフィルム産生細菌がバシラス属の細菌（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種の細菌）である共培養方法を含む。
【０１０７】
有益な細菌をバイオフィルム産生細菌と共培養する方法は、両タイプの微生物の増殖と、バイオフィルム内への両方の微生物の取り込みとを可能にするように選択される。
【０１０８】
１つの実施形態において、共培養は、有益な細菌を培養するために典型的に使用される成長基材において（またはその表面で）行われる。成長基材は固体培地である場合があり、または液体培地である場合がある。
【０１０９】
細菌を培養するために使用することができる成長基材の例には、ＭＲＳ培地、ＬＢ培地、ＴＢＳ培地、酵母エキス、大豆ペプトン、カゼインペプトンおよび肉ペプトンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
培地のさらなる例が本明細書中下記の表１に列挙される。
2019522641.tif 000003
2019522641.tif 000004
2019522641.tif 000005
2019522641.tif 000006
2019522641.tif 000007
2019522641.tif 000008
2019522641.tif 000009
【０１１１】
したがって、例えば、有益な細菌がラクトバシラス属の細菌（例えば、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ種の細菌）であり、バイオフィルム産生細菌がバシラス属の細菌（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種の細菌）である場合、共培養が、ＬＢＧＭ、乳汁またはＭＲＳを含む成長基材において行われる場合がある。本発明の共培養を生じさせるために使用することができる他の培地には、ＭＳｇｇ最少培地（Ｓｈｅｍｅｓｈ，Ｍ．他（２０１０）、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９２、６３５２〜６３５６）、ラクトース富化ＬＢ（Ｄｕａｎｉｓ−Ａｓｓａｆ  Ｄ．他（２０１６）、Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６：１５１７）、酪酸添加ＬＢ（Ｐａｓｖｏｌｓｋｙ  Ｒ．他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１８１Ｃ：１９〜２７）が含まれる。典型的には、両方の異なる細菌がバイオフィルムに取り込まれることを促す培養条件が選択される。
【０１１２】
したがって、本発明の別の局面によれば、細菌組成物を調製するために好都合である作用因または培養条件を選択する方法であって、有益な細菌と、バイオフィルム産生細菌との共培養を、有益な細菌と、バイオフィルム産生細菌とを含むバイオフィルムを生じさせるように、前記作用因の存在下、または前記培養条件のもと、成長基材において行うことを含み、バイオフィルムの特性における変化により、前記作用因または培養条件が、細菌組成物を調製するために好都合であることが示される、方法が提供される。
【０１１３】
変更され得る共培養の例示的な条件には、培養が行われる表面の特性が含まれる（例えば、固体表面の表面化学、これには、官能基、静電荷、被覆が含まれるが、これらに限定されない；表面粗さ、表面の表面形態、これには、溝、空洞、隆起部、細孔、六方密集（ＨＰ）ピラー、ＨＰピラーによって取り囲まれる正三角形体、およびＳｈａｒｋｌｅｔ表面形態などが含まれるが、これらに限定されない）。固体表面は、バイオフィルム内への有益な細菌の閉じ込め／取り込みが促進されるような規定された幾何形状および／または表面形態である場合がある。さらには、固体表面は、特定の厚さのバイオフィルムの生成が促進されるような規定された幾何形状および／または表面形態である場合がある。本発明によって意図される他の表面形態パターンが、ＧｒａｈａｍおよびＣａｄｙ、Ｃｏａｔｉｎｇｓ、２０１４、４、３７頁〜５９頁に記載される（その内容は参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１１４】
培養を行うことができる典型的な固体表面には、様々なポリマー材料（シリコーン、ポリスチレン、ポリウレタンおよびエポキシ樹脂）から、金属および金属酸化物（ケイ素、チタン、アルミニウム、シリカおよび金）にまで及ぶ広範囲の様々な基材が含まれる。様々な製造技術（ソフトリソグラフィー技術および二重流し込み成形技術、ミクロ接触プリンティング、電子ビームリソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィー、フォトリソグラフィー、電着法など）を、固体表面の表面形態を変更するためにそのような材料に対して行うことができる。
【０１１５】
変更され得る共培養の他の条件には、様々な環境的パラメーター（例えば、ｐＨ、栄養分濃度、有益な細菌とバイオフィルム産生細菌との比、および温度など）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
１つの実施形態において、共培養はバイオリアクターにおいて行われる。
【０１１７】
本明細書中で使用される場合、用語「バイオリアクター」は、本発明のバイオフィルムを持続させるために適合化される装置を示す。
【０１１８】
バイオリアクターは一般には、薄膜が覆って形成され得るバイオフィルムのための１つまたは複数の支持体を含むであろうし、この場合、支持体は、バイオフィルムの形成を高めるための有意な表面積を提供するように適合化される。本発明のバイオリアクターは連続処理のために適合化される場合がある。
【０１１９】
バイオフィルムがバイオリアクターシステムで生じるときには、共培養の条件が、システムのマイクロ流体工学（例えば、剪断応力）を変更することによって変更され得ることが理解されるであろう。
【０１２０】
述べられたように、バイオフィルムの特性における好都合な変化をもたらす作用因または条件が選択される。１つの実施形態において、特性はバイオフィルムの量である。１つの実施形態において、特性はバイオフィルムの厚さである。別の実施形態において、特性はバイオフィルムの密度である。さらに別の実施形態において、特性は、バイオフィルムが形成される際の速度である。なおさらに別の実施形態において、特性は、バイオフィルムに取り込まれる有益な細菌の量である。なおさらに別の実施形態において、特性は、温度および／またはｐＨに対する抵抗性である。
【０１２１】
なおさらに別の実施形態において、特性は、所定の期間にわたってバイオフィルムから放出される有益な細菌の量である。これは、有益な細菌の制御された放出が必要とされるときには特に関係し得る。例えば、バイオフィルムからの有益な細菌の放出速度がその最大治療効果のために選択されるバイオフィルムでの皮膚適用、頭皮適用または歯適用のために有益である細菌を取り込むことが好都合である場合がある。
【０１２２】
本発明者らは今回、成長基材のｐＨを６超に変化させることにより、ＫｉｎＤ−Ｓｐｏ０Ａ経路を利用する細菌（例えば、バシラス属の細菌、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種の細菌など）が、ＭＲＳにおいて培養されるときにはバイオフィルムに取り込まれることが促進されることを見出している。
【０１２３】
１つの実施形態において、ラクトバシラス属である有益な細菌（例えば、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ種である有益な細菌）と、バシラス属であるバイオフィルム産生細菌（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ種であるバイオフィルム産生細菌）との共培養が、ＬＢＧＭ、乳汁またはＭＲＳにおいて行われる場合（より具体的にはＭＲＳにおいて行われる場合）、６．５〜９の間のｐＨで、６．５〜８の間のｐＨで、６．５〜７．５の間のｐＨで、６．８〜９の間のｐＨで、６．８〜８の間のｐＨで、６．８〜７．５の間のｐＨで達成される。
【０１２４】
本発明のこの局面の共培養は、細菌の増殖を増大させるために、および／またはバイオフィルム形成を高めるために役立つさらなる作用因の存在下で行われる場合がある。そのような作用因には、例えば、アセトインが含まれる。
【０１２５】
アセトインの量および添加時期が、最適なバイオフィルム産生を促進させるように変更される場合がある。１つの実施形態において、約０．０１％〜５％のアセトインが使用される。別の実施形態において、約０．０１％〜４％のアセトインが使用される。別の実施形態において、約０．０１％〜３％のアセトインが使用される。別の実施形態において、約０．０１％〜２％のアセトインが使用される。別の実施形態において、約０．０１％〜１％のアセトインが使用される。別の実施形態において、約０．０１％〜０．５％のアセトインが使用される。
【０１２６】
したがって、本発明者らは、アセトインと、バシラス属細菌を含むバイオフィルムと、培養培地とを含む培養物を意図する。１つの実施形態において、培養培地は、表１において述べられる培地（例えば、ＬＢ）である。
【０１２７】
１つの実施形態において、約０．０５％〜５％のアセトインが使用される。別の実施形態において、約０．０５％〜４％のアセトインが使用される。別の実施形態において、約０．０５％〜３％のアセトインが使用される。別の実施形態において、約０．０５％〜２％のアセトインが使用される。別の実施形態において、約０．０５％〜１％のアセトインが使用される。別の実施形態において、約０．０５％〜０．５％のアセトインが使用される。
【０１２８】
１つの実施形態において、約０．１％〜５％のアセトインが使用される。別の実施形態において、約０．１％〜４％のアセトインが使用される。別の実施形態において、約０．１％〜３％のアセトインが使用される。別の実施形態において、約０．１％〜２％のアセトインが使用される。別の実施形態において、約０．１％〜１％のアセトインが使用される。別の実施形態において、約０．１％〜０．５％のアセトインが使用される。
【０１２９】
本発明のこの局面の共培養物は、有益な細菌と、バイオフィルム生成細菌との両方を取り込むバイオフィルムを生じさせるために十分な期間にわたって増殖させられる。
【０１３０】
１つの実施形態によれば、共培養物は、有益な細菌の最大プラトー増殖期にまで成長させられ、そのような時点で、共培養物が、最大のバイオフィルム生産のために採取される場合がある。
【０１３１】
別の実施形態によれば、共培養物は、バイオフィルム産生細菌の最大プラトー増殖期にまで成長させられ、そのような時点で、共培養物が、最大のバイオフィルム産生のために採取される場合がある。
【０１３２】
したがって、これらの細菌は、少なくとも３時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間または７日間、あるいはそれらよりも長く培養される場合がある。１つの実施形態において、これらの細菌は、１週間を超えて、２週間を超えて、３週間を超えて、４週間を超えて、５週間を超えて、または６週間を超えて培養されない。
【０１３３】
十分な量の有益な細菌が増殖させられ（かつ、バイオフィルムに閉じ込められ）ると、バイオフィルムが採取される（すなわち、成長基材から除かれる）。
【０１３４】
成長基材から単離された後、バイオフィルム（および／またはその中に取り込まれる細菌）は、乾燥（すなわち、脱水）、凍結、噴霧乾燥または凍結乾燥に付される場合がある。好ましくは、バイオフィルムは、細菌の生存度を保つ方法で処理される。
【０１３５】
したがって、本発明の別の局面によれば、本明細書中に記載される方法に従って得ることができる細菌組成物が提供される。
【０１３６】
バイオフィルム産生細菌は、１グラムの細菌組成物（例えば、プロバイオティック組成物）あたり１０３コロニー形成単位から１０１５コロニー形成単位までの量で細菌組成物に存在する。
【０１３７】
組成物における非細胞物質（例えば、菌体外多糖および／またはアミロイド繊維）の（重量での）量が、細胞物質（例えば、細菌細胞）の（重量での）量よりも多い場合がある。例えば、組成物における非細胞物質（例えば、菌体外多糖および／またはアミロイド繊維）の重量が、組成物における細胞物質（例えば、細菌細胞）の重量よりも少なくとも５％多い、１０％多い、２０％多い、３０％多い、４０％多い、５０％多い、６０％多い、７０％多い、８０％多い、９０％多い、または１００％多い場合がある。
【０１３８】
組成物における非細胞物質（例えば、菌体外多糖および／またはアミロイド繊維）の（重量での）量が、細胞物質（例えば、細菌細胞）の（重量での）量よりも少ない場合がある。例えば、組成物における細胞物質（例えば、細菌細胞）の重量が、組成物における非細胞物質（例えば、菌体外多糖および／またはアミロイド繊維）の重量よりも少なくとも５％多い、１０％多い、２０％多い、３０％多い、４０％多い、５０％多い、６０％多い、７０％多い、８０％多い、９０％多い、または１００％多い場合がある。
【０１３９】
したがって、本明細書中に記載される組成物における非細胞物質（例えば、菌体外多糖）：細菌細胞の重量比が９９：１〜１：９９の間である場合がある。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される組成物における非細胞物質（例えば、菌体外多糖）：細菌細胞の重量比が９９：１〜５０：５０の間である場合がある。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される組成物における非細胞物質（例えば、菌体外多糖）：細菌細胞の重量比が９９：１〜７０：３０の間である場合がある。
【０１４０】
１つの実施形態において、細菌組成物はプロバイオティック組成物である。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、プロバイオティック組成物は、１グラムの仕上がった製造物あたり約１０３〜１０１５コロニー形成単位（「ＣＦＵ」）のバイオフィルム産生微生物を含む。いくつかの実施形態において、プロバイオティック組成物は、１グラムの仕上がった製造物あたり約１０４ＣＦＵ〜約１０１４ＣＦＵのバイオフィルム産生微生物を含む。いくつかの実施形態において、プロバイオティック組成物は、１グラムの仕上がった製造物あたり約１０５ＣＦＵ〜約１０１５ＣＦＵのバイオフィルム産生微生物を含む。いくつかの実施形態において、プロバイオティック組成物は、１グラムの仕上がった製造物あたり約１０６コロニー形成単位〜１０１１コロニー形成単位のバイオフィルム産生微生物を含む。いくつかの実施形態において、プロバイオティック組成物は、１グラムの仕上がった製造物あたり約１０２コロニー形成単位〜約１０５コロニー形成単位のバイオフィルム産生微生物を含む。
【０１４２】
組成物の有益な細菌の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上が成長可能である（すなわち、増殖する）ことが理解されるであろう。さらには、組成物のバイオフィルム産生細菌の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上が成長可能である（すなわち、増殖する）。
【０１４３】
特定の実施形態によれば、細菌組成物はプロバイオティック組成物である。
【０１４４】
プロバイオティック組成物において存在し得る例示的な有益な細菌は、（本明細書中上記で記載されるような）ラクトバシラス属に属する細菌である。
【０１４５】
プロバイオティック組成物は、さらなる有益な細菌（例えば、ビフィドバクテリウム属に属する細菌など）を含む場合がある。本発明のこの局面のプロバイオティック組成物において存在し得るビフィドバクテリウム属の意図される種には、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・インファンチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、およびビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、プロバイオティック組成物は、ラクトバシラス属に属する種（例えば、ラクトバシラス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ））と、下記の微生物から選択される少なくとも２つの微生物とを含む：ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレベ、ビフィドバクテリウム・インファンチス、ビフィドバクテリウム・アドレセンチス、ビフィドバクテリウム・ラクチス、およびビフィドバクテリウム・アニマリス。
【０１４６】
１つの実施形態において、本明細書中に開示される細菌組成物は、当該組成物を哺乳動物対象に投与するために好適であるいずれかの形態である。いくつかの実施形態において、組成物は、錠剤、粉末物または液体物の形態である。粉末物として提供されるならば、当該粉末物を好適な液体（例えば、液体乳製品、果汁または野菜ジュース、果汁または野菜ジュースの混合製造物など）と組み合わせることが特に意図される。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、本明細書中に開示される細菌組成物は、抗生物質剤の投与に先立って、抗生物質剤の投与と同時に、または抗生物質剤の投与の後で対象に投与される。共培養物の状態は、生じるバイオフィルムにより、有益な細菌が、抗生物質剤の作用を受けないように体内で放出されるようにする場合がある。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される細菌組成物は局所投与用に配合され、例えば、クリーム、ゲル、ローション、シャンプー、リンスにおいて配合される。細菌組成物は皮膚または頭皮に投与される場合がある。細菌組成物は歯科用途のために有用である場合がある。そのような用途の場合、細菌組成物は歯肉に投与される場合がある。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される組成物は食品製造物に組み込まれる。用語「食品製造物」は、本明細書中で使用される場合、エネルギーを産生するために、健康およびウェルネスを増進させるために、成長を刺激するために、また、生命を維持するために生物によって摂取することができる栄養物を含有するどのような物質をも示す。用語「強化（された）食品製造物」は、本明細書中で使用される場合、本明細書中に記載される組成物を含む組成物を含むように改変されている食品製造物の中で、所与の利益（例えば、健康／ウェルネス増進特性および／または疾患防止／軽減／処置特性など）を、栄養分を供給するという基本的機能を超えてもたらす食品製造物を示す。
【０１５０】
プロバイオティック組成物は、どのような食品製造物に対してでも組み込むことができる。例示的な食品製造物には、タンパク質粉末（ミールセーキ）、焼き製造物（ケーキ、クッキー、クラッカー、パン、スコーンおよびマフィン）、乳製品型の製造物（チーズ、ヨーグルト、カスタード、ライスプディング、ムース、アイスクリーム、フローズンヨーグルト、フローズンカスタードが含まれるが、これらに限定されない）、デザート（シャーベット、ソルベ、氷菓、グラニータ、冷凍果実ピューレが含まれるが、これらに限定されない）、スプレッド／マーガリン、パスタ製品および他の穀類製造物、食事代用製造物、栄養バー、トレイルミックス、グラノーラ、飲料物（スムージー、水または乳飲料および大豆系飲料物が含まれるが、これらに限定されない）、ならびに朝食型穀物製造物（例えば、オートミールなど）が含まれるが、これらに限定されない。飲料物の場合、本明細書中に記載されるプロバイオティック組成物は溶液状態である場合があり、懸濁される場合があり、乳化される場合があり、または固形物として存在する場合がある。
【０１５１】
１つの実施形態において、強化食品製造物は食事代用製造物である。用語「食事代用製造物」は、本明細書中で使用される場合、通常の食事の代わりに食されることが意図される強化食品製造物を示す。食事代用製造物を構成することが意図される栄養バーおよび飲料物として、様々なタイプの食事代用製造物が挙げられる。この用語にはまた、食事代用の減量計画または体重管理計画の一部として食される製造物が含まれ、例えば、食事全体をそれ自体によって置き換えることは意図されず、しかし、食事を置き換えるために他のそのような製造物と一緒に使用され得るスナック製造物、または、そうでなければ、当該計画において使用されることが意図されるスナック製造物が含まれる。これらの後者の製造物は典型的には、カロリー含有量が、一人分あたり５０キロカロリー〜５００キロカロリーの範囲である。
【０１５２】
別の実施形態において、食品製造物は栄養補助食品である。用語「栄養補助食品」は、本明細書中で使用される場合、食事を補うことが意図される「食物成分」を含有する、口から摂られる物質を示す。用語「食物成分」には、本明細書中に記載されるようなプロバイオティック組成物を含む組成物、同様にまた、ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物、アミノ酸、および様々な物質（例えば、酵素、臓器組織、腺および代謝産物など）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５３】
さらに別の実施形態において、食品製造物は医療用食品である。用語「医療用食品」は、本明細書中で使用される場合、完全に医師の監督のもとで消費または投与されるために配合され、かつ、特徴的な栄養学的要求（これは、認められた科学的原理に基づく）が医学的評価によって確立されている疾患または状態の具体的な食事管理のために意図される食品を意味する。
【０１５４】
動物飼料へのプロバイオティック微生物の添加が動物の効率および健康を改善し得ることもまた、十分に確立されている。具体的な例には、米国特許第５５２９７９３号および同第５５３４２７１号によって記載されるように、乳牛による増大した体重増加対飼料摂取比（飼料効率）、改善された平均１日体重増加、改善された乳生産量、および改善された乳組成が含まれる。プロバイオティック生物の投与はまた、米国特許第７０６３８３６号によって報告されるように、ウシにおける病原性生物の発生を減らすことができる。
【０１５５】
したがって、別の実施形態によれば、本明細書中に記載されるプロバイオティック組成物は動物飼料に組み込むことができる。
【０１５６】
１つの実施形態において、プロバイオティック組成物は、下痢および／または全般的健康状態の発生率および重篤度を低減するために、給餌期間中を通した第一胃、盲腸または腸の発酵菌への継続的または定期的な投与のために設計される。この実施形態において、プロバイオティック組成物は、動物の第一胃、盲腸および／または腸に導入することができる。
【０１５７】
さらに別の実施形態において、本明細書中に記載されるプロバイオティック組成物は、医薬用の製造物または組成物に組み込まれる。医薬組成物は、予防効果的または治療効果的な量の本明細書中に記載される組成物と、典型的には１つまたは複数の医薬的に許容され得るキャリアまたは賦形剤（これらは下記において議論される）とを含む。
【０１５８】
本開示では、いくつかの実施形態においては粉末化される、錠剤化される、カプセル封入される、または他の場合には経口投与のために配合される本明細書中に記載される細菌組成物の配合物が意図される。組成物は、米国食品医薬品局によって規定されるように、医薬組成物、栄養補給組成物（例えば、栄養補助食品）として、あるいは食品添加物または飲料添加物として提供される場合がある。上記組成物のための投薬形態物は特に限定されない。例えば、液体溶液、懸濁物、乳化物、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出配合物、粉末、坐剤、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル、無菌の等張性水性緩衝剤溶液などがすべて、好適な投薬形態物として意図される。
【０１５９】
組成物は典型的には、この技術分野において知られている１つまたは複数の好適な希釈剤、増量剤、塩、崩壊剤、結合剤、滑剤、流動促進剤、湿潤化剤、制御放出マトリックス、着色剤、香味剤、キャリア、賦形剤、緩衝剤、安定剤、可溶化剤、商用補助剤および／または他の添加物を含む。
【０１６０】
医薬用のビヒクル、賦形剤または媒体として役立つ医薬的に許容され得る（すなわち、この技術分野において知られているように無菌、かつ、許容され得るほどに非毒性の）液体希釈剤、半固体希釈剤または固体希釈剤はどれも、使用することができる。例示的な希釈剤には、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、鉱油、カカオバターおよびカカオ脂、ヒドロキシ安息香酸メチルおよびヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、アルギン酸塩、炭水化物（とりわけ、マンニトール、アルファ−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、修飾デキストラン、アラビアゴムおよびデンプン）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６１】
医薬的に許容され得る増量剤には、例えば、ラクトース、微結晶セルロース、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、硫酸カルシウム、デキストロース、マンニトールおよび／またはスクロースを挙げることができる。三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムを含めて、塩もまた、医薬組成物における増量剤として使用される場合がある。
【０１６２】
様々な結合剤が、組成物を一緒になるように保持して硬質錠剤を形成するために使用される場合がある。例示的な結合剤には、生物由来物（例えば、アラビアゴム、トラガカント、デンプンおよびゼラチンなど）が含まれる。他の好適な結合剤には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が含まれる。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、強化食品製造物はさらに、身体による吸収可能な天然産物（１つまたは複数）の吸収を増大させるように作用する生物学的利用能強化剤を含む。生物学的利用能強化剤は天然化合物または合成化合物が可能である。１つの実施形態において、本明細書中に記載される組成物を含む強化食品製造物はさらに、生物活性な天然産物（１つまたは複数）の生物学的利用能を高めるために、１つまたは複数の生物学的利用能強化剤を含む。
【０１６４】
天然の生物学的利用能強化剤には、ショウガ、キャラウェー抽出物、コショウ抽出物およびキトサンが含まれる。ショウガにおける活性化合物には、６−ギンゲロールおよび６−ショゴアール（ｓｈｏｇｏａｌ）が含まれる。キャラウェー油もまた、生物学的利用能強化剤として使用することができる（米国特許出願公開第２００３／０２２８３８号）。ピペリンは、生物学的利用能強化剤として作用するコショウ（コショウ（Ｐｉｐｅｒ  ｎｉｇｒｕｍ）またはヒハツ（Ｐｉｐｅｒ  ｌｏｎｇｕｍ））由来の化合物である（米国特許第５７４４１６１号を参照のこと）。ピペリンは、Ｂｉｏｐｅｒｉｎｅ（登録商標）の商品名（Ｓａｂｉｎｓａ  Ｃｏｒｐ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で市販されている。いくつかの実施形態において、天然の生物学的利用能強化剤は、強化食品製造物の総重量に基づいて約０．０２重量％〜約０．６重量％の量で存在する。
【０１６５】
好適な合成された生物学的利用能強化剤の例には、ＰＥＧエステルから構成される界面活性剤、例えば、下記の商品名で市販されている界面活性剤などを含めて、様々な界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない：Ｇｅｌｕｃｉｒｅ（登録商標）、Ｌａｂｒａｆｉｌ（登録商標）、Ｌａｂｒａｓｏｌ（登録商標）、Ｌａｕｒｏｇｌｙｃｏｌ（登録商標）、Ｐｌｅｕｒｏｌ  Ｏｌｅｉｑｕｅ（登録商標）（Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｐａｒａｍｕｓ、ＮＪ）、ならびにＣａｐｍｕｌ（登録商標）（Ａｂｉｔｅｃ  Ｃｏｒｐ．、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ）。
【０１６６】
組成物の量および投与計画は、投与目的に関係する様々な要因に基づいており、例えば、ヒトまたは動物の年齢、性別、体重、ホルモンレベル、あるいはヒトまたは動物の他の栄養学的必要性に基づく。いくつかの実施形態において、組成物は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１ｇ／ｋｇ体重の量で哺乳動物対象に投与される。
【０１６７】
典型的な投薬計画は組成物の多数回の服用を含む場合がある。１つの実施形態において、組成物は１日あたり１回投与される。組成物は、どのようなときにでも個体に投与される場合がある。いくつかの実施形態において、組成物は同時に、あるいは、食事を摂る前に、または食事を摂っているときに投与される。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、本発明のこの局面の細菌組成物は、農業用製造物として使用するために配合される。細菌組成物が農業用担体（例えば、土壌または植物成長培地など）に加えられる場合がある。使用され得る他の農業用担体には、肥料、植物系油、湿潤剤、またはそれらの組合せが含まれる。代替において、農業用担体は、顆粒、ペレットまたは懸濁物を含めて、固形物である場合がある（例えば、珪藻土、ローム、シリカ、アルギン酸塩、粘土、ベントナイト、バーミキュライト、種子ケース、他の植物製造物および動物製造物など、あるいは様々な組合せ）。上述成分のどのような混合物もまた、担体として意図される：例えば、ペスタ（ｐｅｓｔａ）（小麦粉およびカオリン粘土）、ローム、砂または粘土などにおける寒天または小麦粉系ペレットなど（これらに限定されない）。配合物は、栽培生物については食品資源（例えば、オオムギ、イネなど）、あるいは他の生物学的材料（例えば、種子、葉、根、植物要素、サトウキビバガス、穀物加工から生じる殻または茎など）、建築現場廃物からの粉砕された植物材料または木材、紙、布または木材のリサイクルから生じるおがくずまたは小さい繊維を含む場合がある。他の好適な配合物が当業者には知られているであろう。
【０１６９】
１つの実施形態において、農薬用配合物は肥料を含む。好ましくは、肥料は、細菌組成物の生存度を、２０％を超えて、３０％を超えて、４０％を超えて、５０％を超えて、またはそれよりも多く低下させないものである。
【０１７０】
いくつかの場合において、農業用配合物が様々な作用因（例えば、除草剤、殺線虫剤、殺虫剤、植物成長調節剤、殺鼠剤および養分など）を含有することは好都合である。そのような作用因は理想的には、配合物が適用される植物との適合性を有する（例えば、作用因は植物の成長または健康状態に対して有害であってはならない）。さらに、作用因は理想的には、ヒト、動物または産業での使用についての安全上の懸念を生じさせないものである（例えば、安全性の問題がない、または、化合物は、植物由来の汎用植物製造物が当該化合物の無視できる量を含有するように十分に変化しやすい）。
【０１７１】
本発明のバイオフィルムを含む農業用配合物は典型的には、本発明のバイオフィルムに取り込まれた有益な細菌集団を約０．１重量％〜９５重量％の間で含有し、例えば、湿重量で約１％〜９０％の間で、約３％〜７５％の間で、約５％〜６０％の間で、約１０％〜５０％の間で含有する。配合物が１ｍｌの配合物あたり少なくとも約１０２のＣＦＵまたは約１０２個の胞子を含有すること、１ｍｌの配合物あたり少なくとも約１０３のＣＦＵまたは約１０３個の胞子を含有すること、１ｍｌの配合物あたり少なくとも約１０４のＣＦＵまたは約１０４個の胞子を含有すること、１ｍｌの配合物あたり少なくとも約１０５のＣＦＵまたは約１０５個の胞子を含有すること、１ｍｌの配合物あたり少なくとも約１０６のＣＦＵまたは約１０６個の胞子を含有すること、あるいは１ｍｌの配合物あたり少なくとも約１０７のＣＦＵまたは約１０７個の胞子を含有することが好ましい。
【０１７２】
本発明者らはまた、現時点で開示された農業用組成物が、植物の成長を促進させる作用因をさらに含む製造品に含まれ得ることを意図する。
【０１７３】
作用因は単一の組成物においてバイオフィルムと一緒に配合される場合があり、または、代替では、別々に、しかし、単一の容器において包装される場合がある。
【０１７４】
好適な作用因が本明細書中上記に記載される。他の好適な作用因には、本明細書中下記においてさらに記載されるように、肥料、農薬（除草剤、殺線虫剤、殺カビ剤および／または殺虫剤）、植物成長調節剤、殺鼠剤および養分が含まれる。
【０１７５】
１つの実施形態において、植物の成長を促進させる作用因は抗細菌活性を欠いている。
【０１７６】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０１７７】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０１７８】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０１７９】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０１８０】
本明細書中で使用される場合、単数形態（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照物を包含する。例えば、用語「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または用語「少なくとも１つの化合物」は、その混合物を含めて、複数の化合物を包含し得る。
【０１８１】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載は単に便宜上および簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解しなければならない。従って、範囲の記載は、具体的に開示された可能なすべての部分範囲、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値を有すると見なさなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、具体的に開示された部分範囲（例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など）、ならびに、その範囲に含まれる個々の数値（例えば、１、２、３、４、５および６）を有すると見なさなければならない。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【０１８２】
数値範囲が本明細書中で示される場合には常に、示された範囲に含まれる任意の言及された数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の示された数字および第２の示された数字「の範囲である／の間の範囲」という表現、および、第１の示された数字「から」第２の示された数「まで及ぶ／までの範囲」という表現は、交換可能に使用され、第１の示された数字と、第２の示された数字と、その間のすべての分数および整数とを含むことが意味される。
【０１８３】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０１８５】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０１８６】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【０１８７】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９９４）、第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍ���ｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１８８】
実施例１
バイオフィルム形成
材料および方法
菌株および成長条件：本研究で使用されたプロバイオティック細菌株はラクトバシラス・プランタルムであった。この菌株は日常的には、ＭＲＳ（Ｍａｎ、Ｒｏｇｏｓａ＆Ｓｈａｒｐｅ）ブロス、または１．５％の寒天（Ｄｉｆｃｏ（商標））を使用して固化されるＭＲＳブロスのどちらかにおいて成長させられる。バシラス・スブチリスの野生株ＮＣＩＢ３６１０およびその誘導体が典型的には、ＬＢ（１リットルあたり１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌ）ブロス、または１．５％の寒天により固化されるＬＢにおいて培養される。それらの使用に先立って、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを硬寒天平板において、ともに３７℃で、４８時間または一晩にわたってそれぞれ成長させた。それぞれの菌株のスターター培養物を、およそ１．５のＯＤ６００に達するまで、単一細菌コロニーを使用して調製した（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍを、撹拌を伴うことなく８時間にわたって５ｍＬのＭＲＳブロスに接種し、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを、３７℃、１５０ｒｐｍで５時間にわたってＬＢ培地に接種した）。共培養実験については、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓによるバイオフィルム形成を促進させることにおいて効果的であり、かつ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびプロバイオティック乳酸菌（ＬＡＢ）の共培養による培養のために好適であることが見出されたので、ｐＨ７でのＭＲＳ培地を使用した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞を等量のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞と混合して、それぞれの菌株が１０８細胞／ｍＬである最終濃度とし、その後、ＭＲＳ（ｐＨ７）に１：１００で希釈した。混合培養物における細胞を好気的に３７℃において５０ｒｐｍで７時間〜８時間インキュベーションした。
【０１８９】
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの単一種バイオフィルムをＭＲＳ（Ｈｙ−ｌａｂ）培地において、またはＬＢが種々の比率（１：５、１：２、５：１）で補充されるＭＲＳにおいて、３０℃で生じさせた。バシラス属菌株がバイオフィルムを形成するための最適な条件を決定するために、ＭＲＳのｐＨを、１ＭのＮａＯＨを使用して６から８にまで徐々に上昇させた。本研究で使用されたすべての菌株が表２に列挙されており、これらは、別途示される場合を除き、同質遺伝子型である。
【０１９０】
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【０１９１】
コロニーバイオフィルム形成および菌膜バイオフィルム形成についてのアッセイ：コロニー構造分析のために、３μＬのスターター培養物をＭＲＳ寒天平板またはコントロールＬＢにスポットし、３０℃で７２時間インキュベーションした。菌膜形成分析のために、スターター培養物を１２ウエルプレートにおいて３．５ｍＬのＭＲＳブロスまたはコントロールＬＢに１：１００で希釈し、撹拌を伴うことなく、３０℃で４８時間インキュベーションした。画像を、Ｚｅｉｓｓ  Ｓｔｅｍｉ  ２０００−Ｃ顕微鏡を、ａｘｉｏｃａｍ  ＥＲｃ  ５ｓカメラ（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）とともに使用して得た。
【０１９２】
β−ガラクトシダーゼアッセイ：細胞を、ＬＢ、ＭＲＳが種々の比率（１：１、１：５、および５：１）で補充されるＬＢ、または、７にｐＨ調節されるＭＲＳのいずれかで、固体培地において３０℃で成長させられるコロニーから集め、リン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液に再懸濁した。バイオフィルムコロニーにおける典型的な長い、束になった細胞連鎖物を、穏やかな超音波処理を使用して破壊した。細胞サンプルの光学密度（ＯＤ）をＰＢＳにおいて１．０のＯＤ６００に標準化した。１ミリリットルの細菌細胞懸濁物を採取し、標準的な手順に従ってアッセイした。
【０１９３】
共培養における成長時のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの成長曲線分析：Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの一晩培養物をＬＢまたはＭＲＳにおいてそれぞれ、定常期にまで成長させ、ｐＨを（７にまで）上昇させた２５ｍＬの改変ＭＲＳブロスに１：１００で希釈した。上記のように作製される共培養サンプルを３７℃および１５０ｒｐｍで好気的に８時間成長させた。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの単一種培養物もまた調製し、コントロールサンプルとして使用した。１時間毎に、１ｍＬをコロニー形成単位（ＣＦＵ）計数法による微生物計数のためにそれぞれの培養物から採取した。これを、ＰＢＳ緩衝液を使用して適切な希釈物を作製し、希釈物をＭＲＳ寒天に置床することによって行った。平板を好気的に３７℃で４８時間インキュベーションした。
【０１９４】
共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）を使用するバイオフィルム形成細胞の可視化：Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞を改変ＭＲＳブロスにおけるＧＦＰ停止のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＹＣ１６１）またはＣＦＰ停止のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＹＣ１８９）との上記のような共培養で成長させた。単一種培養として成長させられるそれぞれの細菌の細胞懸濁物がコントロールサンプルとして役立った。１ミリリットルのそれぞれの培養物を採取し、５０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清を除いた後、細胞を１ｍＬのＰＢＳ緩衝液により洗浄し、その後、（５０００ｒｐｍでの２分間の）遠心分離の後、１００μｌの同じ緩衝液に再懸濁した。それぞれのサンプルからの５μｌを顕微鏡検査スライドガラスの上に置き、ノマルスキー微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）を使用して透過光顕微鏡で可視化した。
【０１９５】
走査型電子顕微鏡観察（ＳＥＭ）分析：上記のように成長させられる共培養の細胞を、ポリリジンにより被覆されるスライドガラスの上に一晩置いた。その後、スライドガラスを、ＤＤＷを使用して２回洗浄して、非付着細胞および培地残存物を除いた。スライドガラスを４０μｌの４％ホルムアルデヒドにさらし、室温で１５分間インキュベーションした。スライドガラスを、ＤＤＷを使用してもう一度洗浄し、ＳＥＭによって分析した。
【０１９６】
熱処理および低温処理の後における生存率の分析：上記のように作製される共培養サンプルを好気的に３７℃および５０ｒｐｍで７時間〜８時間にわたって成長させた。単一培養物として成長させられるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞をコントロールとして使用した。サンプルを負荷試験（例えば、熱処理または低温処理など）に供した。サンプルを処理前および処理後に採取し、バイオフィルム束を破壊するために超音波処理し（時間：２０秒、パルス：１０秒、停止：５秒、電流：３０％）、ＭＲＳ寒天平板でのＣＦＵ計数に付した。
【０１９７】
インビトロ消化系内における移行時のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ生存の分析：胃腸管における移行時のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの生存能を調べるために、単一培養、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞との共培養におけるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍのサンプルを、インビトロ消化モデル（Ｍｉｎｅｋｕｓ他、２０１４）を使用して４時間にわたってモニターした。消化の胃段階を模擬するために、それぞれのサンプルから得られる５ｍＬの懸濁物アリコートを模擬胃液（ＳＧＦ）と１：１で混合して、１０ｍＬの最終容量にした。ブタペプシン（ＳＩＧＭＡ、Ｐ９７００）を加えて、２０００ＵｍＬ−１を最終的な消化混合物において達成し、その後、ＣａＣｌ２を加えて、０．０７５ｍＭを最終的な消化混合物において達成した。ｐＨを１ＭのＨＣｌにより３．０に下げ、サンプルを３７℃で２時間、磁石撹拌子とともに水浴に置いた。それぞれのサンプルを、それぞれが５ｍＬを含有する２本の試験管に分けた。５０μｌのＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド；ＳＩＧＭＡ、Ｐ７６２６）を１本の試験管に加えて、反応を停止させ、その後、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの生存性を調べた。他方の試験管をその次の消化段階（すなわち、腸）において使用した。消化の腸段階を模擬するために、２．５ｍＬの胃糜粥を模擬腸液（ＳＩＦ）と１：１で混合して、５ｍＬの最終容量にした。１ＭのＮａＯＨを加えて、混合物をｐＨ７．０に中和し、膵酵素を消化混合物に加えて、下記の活性を最終的混合物において達成した：ブタトリプシン（ＳＩＧＭＡ、Ｔ０３０３）（１００ＵｍＬ−１）、ウシキモトリプシン（ＳＩＧＭＡ、Ｃ４１２９）（２５ＵｍＬ−１）、ブタ膵α−アミラーゼ（ＳＩＧＭＡ、Ａ３１７６）（２００ＵｍＬ−１）、ブタ膵リパーゼ（ＳＩＧＡＭ、Ｌ３１２６）（２０００ＵｍＬ−１）。加えて、胆汁塩（ＳＩＧＭＡ、Ｔ４００９）を、１０ｍＭの最終濃度を最終混合物において得るために加え、その後、サンプルを再び２．５時間インキュベーションした。それぞれのサンプルからの１ミリリットルを胃段階および腸段階の後で採取し、生Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞の数を、上記で記載されるようなＣＦＵ計数法を使用して求めた。
【０１９８】
結果
共培養でのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの相互成長のためのシステム開発
バイオフィルムが、見かけ上は細胞外マトリックスの産生に起因すると思われるが、様々な好ましくない環境条件に対する増大した耐性を有することが以前に示された（Ｆｒｉｅｄｍａｎ、Ｋｏｌｔｅｒ＆Ｂｒａｎｄａ、２００５）。したがって、本発明者らは、頑強なバイオフィルムの形成細菌のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓによって産生される細胞外マトリックスが他の細菌種（例えば、プロバイオティック細菌など）に対する増大した保護を共培養バイオフィルム系においてそれらの成長の期間中にもたらしているかもしれないと仮定した。この目的を達成するために、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓが共培養で成長することができる特殊培地を開発した。ＭＲＳのｐＨをｐＨ７に変更することによって、これらの細菌を共培養で成長させることが可能であることが見出された。図１３に示されるように、共培養による培養は、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの成長に対する影響を（純粋培養におけるそれらの成長と比較して）何ら有しておらず、このことは、拮抗的相互作用が所与条件においてこれらの細菌の間にはないことを示していた。驚くべきことに、ＭＲＳ培地の改変はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓによるバイオフィルム形成を強く促進することが見出された（図２）。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓは、酸性ｐＨに対して感受性があるように思われるので、共培養による培養のために使用されるＭＲＳ培地のｐＨを、バシラス属の成長のために好適であるｐＨ値を見出すために徐々に上昇させた。ｐＨを６から８に上げることにより、コロニーバイオフィルムおよび菌膜バイオフィルムの両方のバイオフィルム表現型の堅固性における比例した増大がもたらされた（図２）。ｐＨを６に調節したときには、固体ＭＲＳ培地での弱い成長が見られ、液体培地では成長が見られなかった。６．５へのｐＨ調節により、固体ＭＲＳおよび液体ＭＲＳの両方における細菌成長が認められただけでなく、驚くべきことに、固体培地でのバイオフィルム形成が始まることもまた認められた。ｐＨを７および８に上げた後では、両方の成長設定における極めて頑強なバイオフィルム表現型が認められた。次に、ＭＲＳ（ｐＨ７）およびＬＢにおけるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの成長速度を比較した。図１３において認められ得るように、わずかな遅れが、ＬＢと比較した場合、ＭＲＳにおける微生物成長の開始時に見られた。しかしながら、より大きい速度の成長が、ＬＢと比較した場合、ＭＲＳにおいて成長させられるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞についてはその後に認められた。
【０１９９】
改変ＭＲＳ培地はバイオフィルム形成およびマトリックス遺伝子発現をＫｉｎＤ−Ｓｐｏ０Ａ経路により促進させる
バイオフィルム発達およびマトリックス遺伝子発現を促進させることにおけるＭＲＳ培地の可能性を評価するために、ＬＢ培地（これは通常、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓを培養するために使用される）を種々の量のＭＲＳにより強化した（１：１、１：５、および５：１）。バイオフィルム表現型と、ＭＲＳ濃度の増大との間における正比例的な相関が示された（図３）。ｔａｐＡオペロンおよびｅｐｓオペロンを使用するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるマトリックス遺伝子発現に対する、ＭＲＳ濃度を増大させることの影響もまた、それらの産物が細胞外マトリックスの主要な成分であるので調べた。ｔａｐＡの発現がＬＢにおけるＭＲＳの濃度に関して比例して増大することが見出された（図４）。ｅｐｓの発現が、８０％のＭＲＳまではＭＲＳの濃度に比例して増大し、その後、１００％については発現の低下が検出された（図５）。
【０２００】
次に、本発明者らは、ＭＲＳが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓについて以前に記載されたＫｉｎ−Ｓｐｏ０Ａ経路（ＳｈｅｍｅｓｈおよびＣｈａｉ、２０１３、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２０１３、第１９５巻、第１２号、２７４７頁〜２７５４頁）によりバイオフィルム形成を誘発するかどうかを明らかにした。バイオフィルム形成についての種々のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ変異体（ΔｋｉｎＡ、ΔｋｉｎＢ、ΔｋｉｎＣ、ΔｋｉｎＤ、ΔｋｉｎＥ、ΔｋｉｎＡＢ、ΔｋｉｎＣＤ、Δｓｐｏ０Ａ、ΔｅｐｓΔｔａｓＡ）、またはバイオフィルムを過剰産生するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ変異体（ΔａｂｒＢ）を試験した。最初に、バイオフィルム形成を誘導する環境シグナルを感知することに関わるヒスチジンキナーゼが欠損している変異体のバイオフィルム表現型を明らかにした。いずれかのキナーゼにおける単一変異体はバイオフィルム表現型における有意な欠損を示さず、だが、ΔｋｉｎＣ変異体およびΔｋｉｎＤ変異体は、コントロールと比較して、バイオフィルム形成におけるわずかな低下を示すことが見出された（図１４）。しかしながら、ΔｋｉｎＣＤの二重変異体はバイオフィルム表現型の完全な消失を示した（図５Ａ）。他方で、ΔｋｉｎＡＢにおける二重変異はバイオフィルム形成を妨げず、だが、いくらかの変化がバイオフィルム表現型において認められた（コロニー型バイオフィルムの場合）。マスター転写調節因子ｓｐｏ０Ａにおける変異は、ｅｐｓおよびｔａｓＡにおける二重変異と同様に、バイオフィルム形成を完全に消失させた（図５Ａ）。転写リプレッサーΔａｂｒＢにおける変異は、コントロールのＷＴ細胞と比較して、バイオフィルム形成におけるさらなる増大をもたらさなかった（図５Ｂ）。この結果はまたもや、改変ＭＲＳ培地におけるＷＴ型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞の成長期間中でのマトリックス産生における劇的な増大を強調している。
【０２０１】
ＭＲＳのバイオフィルム促進効果がバシラス属の種の間で保存されているかどうかを調べるために、他のＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株をバシラス属の他の種と同様に調べた。しわのあるコロニー（図６）および頑強な浮遊性菌膜（図７）によって判断されるように、バイオフィルム促進効果が見られた。
【０２０２】
共培養におけるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの成長は二重菌種バイオフィルムの発達をもたらす
改変ＭＲＳ培地を使用して、二重菌種バイオフィルムを、ＧＦＰを構成的に発現する蛍光標識されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞（ＹＣ１６１）をＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞と共培養することによって調べた。生じたバイオフィルムを、ＣＬＳＭを使用して可視化した。図８Ａ（上段パネル）において認められ得るように、生じたバイオフィルムは、蛍光性細胞および非蛍光性細胞の両方からなった。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞が、バイオフィルム関連構造（束）を形成するために互いに付着するＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞によって取り囲まれていた。このことがさらに、ＬＢＧＭ培地におけるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの共培養されたバイオフィルムを例示する図８Ｂにおいて例示される。
【０２０３】
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるバイオフィルム形成は細胞外マトリックスの合成に依存するので、本発明者らは、細胞外マトリックスの産生が二重菌種バイオフィルムの発達時に起こっているかどうかを調べようとした。形成されたバイオフィルムにおけるマトリックス遺伝子発現のレベルを、以前の記載（Ｓｈｅｍｅｓｈ、Ｋｏｌｔｅｒ＆Ｌｏｓｉｃｋ、２０１０、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１９２、６３５２〜６３５６）のように、ｔａｐＡ−ｓｉｐＷ−ｔａｓＡ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるバイオフィルムマトリックスのタンパク質成分の合成を関わるオペロン）のためのプロモーターと、シアン蛍光タンパク質（ＹＣ１８９）をコードするｃｆｐ遺伝子との転写融合（ＰｔａｐＡ−ｃｆｐ）を使用して分析した。著しいＣＦＰ発現が認められ、このことは、ｔａｐＡ−ｓｉｐＷ−ｔａｓＡオペロンが活性化されており、したがって、マトリックス産生が二重菌種バイオフィルムにおいて誘導されたことを示していた（図８、下段パネル）。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞が、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのバイオフィルム形成に由来する細胞外ポリマー物質により取り囲まれ得るかどうかを明らかにするために、二重菌種バイオフィルムを、ＳＥＭを使用して分析した（図９）。得られた画像（図９Ｃ）により、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓによって産生される細胞外マトリックスの中にＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞が取り込まれているようであったバイオフィルムの３次元の不均一な構造が形成されることが明らかにされる。重要なことに、単一培養物として成長させられるＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞もまた、細胞の長い糸状物が細胞外マトリックスによって一緒に結合する均一構造により特徴づけられるバイオフィルムを形成する（図９Ａ）。対照的に、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞は、注目するほどのバイオフィルムを単一種培養で形成することができなかった。上記の観察結果は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞によって産生される細胞外マトリックスがＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞と共有され、したがって、環境ストレスに対する起こり得る保護をＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞に提供し得ることを示している。
【０２０４】
二重菌種バイオフィルムは敵対的環境におけるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの生存を容易にする
共培養バイオフィルムにおいてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓによって産生されるマトリックスが、好ましくない環境条件からの防御をＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍに提供し得るであろうかどうかを明らかにするために、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞の生存を熱処理（工業的加工（例えば、低温殺菌など）を模擬する条件）の期間中に、同様にまた、冷凍（貯蔵条件を模擬する条件）の期間中に調べた。熱処理の低温殺菌については、共培養バイオフィルムで成長させられるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞を６３℃での１分間および３分間の加熱にさらした。低温処理については、共培養バイオフィルムで成長させられるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞を４℃で２１日間まで貯蔵した。単一種培養で成長させられるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞をコントロールとして使用した。１分および３分の熱処理の後では、共培養バイオフィルムで成長させられるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞は、コントロールと比較して、生Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞の数におけるおよそ１．２５Ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬおよび１．０６Ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬの増大をそれぞれもたらした（図１０）。そのうえ、低温処理実験からの結果は、共培養バイオフィルムで成長させられるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞が貯蔵条件の期間中を通してはるかにより多く保護されることを示し、その生存度におけるおよそ０．４４〜０．８９Ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬの増大を明らかにした（図１０）。
【０２０５】
二重菌種バイオフィルムの形成時に産生される細胞外マトリックスは熱処理時のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの生存を容易にする
好ましくない環境条件に対するＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの増大した抵抗性が細胞外マトリックスによって促進されることをさらに証明するために、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍと、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ変異菌株（バイオフィルム形成欠損菌株（ΔｅｐｓΔｔａｓＡ）またはバイオフィルムマトリックス過剰産生菌株（ΔａｂｒＢ）のどちらか）との共培養物を生じさせた。共培養物を熱処理の低温殺菌に供した。単一種培養で成長させられるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞、および、野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓとの共培養で成長させられるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞をコントロールとして使用した。図１１Ａに示されるように、ΔｅｐｓΔｔａｓＡ二重変異体の細胞とともに成長させられるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞は、単一種培養で成長させられるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍと比較して、その生存レベルにおける有意差を示さなかった。しかしながら、野生型Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓとの共培養で成長させられるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞の生存における有意な増大が認められた。興味深いことに、単一培養で成長させられるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの生存率と比較した場合、ΔａｂｒＢ変異細胞の存在下で成長させられるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞の生存率における約１．７８Ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬの増大が認められた。
【０２０６】
別の実験において、サンプルを、３０℃、２０ｒｐｍで１８時間、乳汁において成長させた。その後、サンプルを６３℃で１分間〜３分間にわたって熱処理した。コントロールサンプルは熱処理されなかった。生Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞の数を、ＣＦＵ法を使用して求めた。＊ｐ＜０．０５。図１１Ｂに例示されるように、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓバイオフィルムは、乳汁における加熱時のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの生存を容易にする。
【０２０７】
二重菌種バイオフィルムの形成時に産生される細胞外マトリックスは、ヒト消化系に似る条件のもとでのＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの生存を容易にする
胃腸管における移行時のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの生存能を調べるために、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの生存率を、インビトロ消化モデルを使用して調べた（図１２）。模擬の胃条件における２時間のインキュベーションの後において、およそ０．８６Ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬの生細胞濃度における増大が、単一培養物のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞と比較して、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓとの共培養バイオフィルムで成長させられるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞について認められた。その後、細胞を模擬の腸条件のもとで２時間インキュベーションした。生細胞濃度におけるおよそ０．９Ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍＬの増大が、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの自由生活細胞と比較して、バイオフィルムによって保護されるＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ細胞について認められた。
【０２０８】
実施例２
アセトインはバイオフィルム形成を増強させる
食品製造物は多くの場合、製造物の感覚刺激特性および官能特性を改善し得る種々の食品添加物によって強化される。そのような添加物の中には、種々の食品製造物の風味を改善することができる重要な小分子（例えば、アセトインなど）が含まれる。アセトインは、自然界に広く存在する中性分子である。一部の微生物、高等植物、昆虫および高等動物が、アセトインを合成する能力を有する。そのような添加物は、ヒトの健康に関連する多くの細菌の生理学に影響を及ぼす可能性があり、また、バイオフィルムとして知られている細菌細胞の多細胞共同体の発達に影響を及ぼす可能性がある。バイオフィルム形成は、構成細胞を一緒に保持する細胞外マトリックスの合成に依存する。バシラス・スブチリス（プレバイオティック細菌）において、細胞外マトリックスは、２つの主要な成分（ｅｐｓＡ−Ｏオペロンの産物によって合成される菌体外多糖、およびｔａｐＡ−ｓｉｐＷ−ｔａｓＡオペロンによってコードされるアミロイド繊維）を有する。
【０２０９】
結果
図１５Ａ〜図１５Ｃに例示されるように、アセトインはバシラス・スブチリスにおけるバイオフィルム束形成を誘発する。アセトインの非存在下では、バイオフィルム形成が、ＬＢ培地において成長させられるときには認められない（図１５Ａ）。図１６Ａ〜図１６Ｂは、アセトインがコロニー型バイオフィルムの形成をバシラス・スブチリスにおいて誘発することを例示する。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおけるマトリックス産生に関わるｔａｐＡオペロンの転写が、アセトインによって非常にアップレギュレーションされることが示された（図１７Ａ〜図１７Ｄ）。
【０２１０】
これらの結果は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの細胞がアセトインの存在下において成長時に複合束に発達することを示している。細胞は、バイオフィルム形成のために非常に重要である細胞外マトリックス成分をアセトインに応答して高レベルで発現する。
【０２１１】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０２１２】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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