(57)【要約】  ａ）ＷＧＡライブラリー汎用配列アダプターを含むフラグメントを含む一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーを準備する工程と、ｂ）一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーを、少なくとも１つの第１プライマー及び少なくとも１つの第２プライマーを用いて再増幅する工程とを含み、少なくとも１つの第１プライマーが、少なくとも１つの第１シークエンシングアダプターと、少なくとも１つの第１シークエンシングバーコードと、ＷＧＡライブラリー汎用配列アダプター又はその逆相補鎖のいずれかにハイブリダイズする第１プライマー３’セクションとを含み、少なくとも１つの第２プライマーが、少なくとも１つの第１シークエンシングアダプターとは異なる少なくとも１つの第２シークエンシングアダプターと、ＷＧＡライブラリー汎用配列アダプター又はその逆相補体のいずれかにハイブリダイズする第２プライマー３’セクションとを含む、超並列シークエンシングライブラリー生成方法。【選択図】図３
2019514360.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
超並列シークエンシングライブラリーを生成する方法であって、
ａ．  既知の５’配列セクション（５ＳＳ）と、中央配列セクション（ＭＳＳ）と、該既知の５’配列セクションに逆相補的な既知の３’配列セクション（３ＳＳ）とを含むフラグメントを含む一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリー（ｐＷＧＡｌｉｂ）を準備する工程であって、前記既知の５’配列セクション（５ＳＳ）がＷＧＡライブラリー汎用配列アダプターを含み、前記中央配列セクション（ＭＳＳ）が、ＷＧＡ前の元の非増幅ＤＮＡのＤＮＡ配列に対応する挿入セクション（ＩＳ）を少なくとも含み、前記中央配列セクションが任意に、隣接５’中間セクション（Ｆ５）及び／又は隣接３’中間セクション（Ｆ３）を更に含む、工程と、
ｂ．  前記一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーを、少なくとも１つの第１プライマー（１ＰＲ）及び少なくとも１つの第２プライマー（２ＰＲ）を用いて再増幅する工程と、
を含み、
前記少なくとも１つの第１プライマー（１ＰＲ）が、第１プライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）と第１プライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）とを含み、該第１プライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）が、少なくとも１つの第１シークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）と、該少なくとも１つの第１シークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）の３’位かつ前記第１プライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）の５’位に少なくとも１つの第１シークエンシングバーコード（１ＰＲ５ＢＣ）とを含み、前記第１プライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）が、前記既知の５’配列セクション（５ＳＳ）又は前記既知の３’配列セクション（３ＳＳ）のいずれかにハイブリダイズし、
前記少なくとも１つの第２プライマー（２ＰＲ）が、第２プライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）と第２プライマー３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）とを含み、該第２プライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）が、前記少なくとも１つの第１シークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）とは異なる少なくとも１つの第２シークエンシングアダプター（２ＰＲ５ＳＡ）を含み、前記第２プライマー３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）が、前記既知の５’配列セクション（５ＳＳ）又は前記既知の３’配列セクション（３ＳＳ）のいずれかにハイブリダイズする、方法。
【請求項２】
前記第２プライマー（２ＰＲ）が、前記少なくとも１つの第２シークエンシングアダプター（２ＰＲ５ＳＡ）の３’位かつ前記第２プライマー３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）の５’位に少なくとも１つの第２シークエンシングバーコード（２ＰＲ５ＢＣ）を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＷＧＡライブラリー汎用配列アダプターが、ＤＲＳ−ＷＧＡライブラリー汎用配列アダプター又はＭＡＬＢＡＣライブラリー汎用配列アダプターである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＷＧＡライブラリー汎用配列アダプターがＤＲＳ−ＷＧＡライブラリー汎用配列アダプターである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＲＳ−ＷＧＡライブラリー汎用配列アダプターが配列番号２８２であり、前記ＭＡＬＢＡＣライブラリー汎用配列アダプターが配列番号２８３（ＭＡＬＢＡＣ）である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
ローパス全ゲノムシークエンシングの方法であって、
ｃ．  請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法によって得られる複数のバーコード化された超並列シークエンシングライブラリーを準備すると共に、種々のシークエンシングバーコード（ＢＣ）を用いて得られるサンプルをプールする工程と、
ｄ．  プールしたライブラリーをシークエンシングする工程と、
を含む、方法。
【請求項７】
種々のシークエンシングバーコード（ＢＣ）を用いたサンプルをプールする工程が、
ｅ）前記バーコード化された超並列シークエンシングライブラリーの各々におけるＤＮＡを定量化する工程と、
ｆ）バーコード化された超並列シークエンシングライブラリーの量を正規化する工程と、
を更に含む、請求項６に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項８】
種々のシークエンシングバーコード（ＢＣ）を用いたサンプルをプールする工程が、少なくとも１つの選択塩基対範囲を有するＤＮＡフラグメントを選択する工程を更に含む、請求項７に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項９】
前記塩基対範囲が６５０ｂｐを中心とする、請求項８に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項１０】
前記塩基対範囲が４００ｂｐを中心とする、請求項８に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項１１】
前記塩基対範囲が２００ｂｐを中心とする、請求項８に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項１２】
前記塩基対範囲が１５０ｂｐを中心とする、請求項８に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項１３】
前記塩基対範囲が１００ｂｐを中心とする、請求項８に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項１４】
前記塩基対範囲が５０ｂｐを中心とする、請求項８に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項１５】
第１シークエンシングアダプターと第２シークエンシングアダプターとを含むＤＮＡフラグメントを選択する工程を更に含む、請求項８〜１４のいずれか一項に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項１６】
前記第１シークエンシングアダプター及び前記第２シークエンシングアダプターを含むＤＮＡフラグメントを選択する工程を、前記超並列シークエンシングライブラリーを少なくとも１つの固相に接触させることによって行う、請求項１５に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの固相が官能化常磁性ビーズを含む、請求項１６に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項１８】
前記常磁性ビーズがストレプトアビジンコーティングで官能化される、請求項１７に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの第１プライマー（１ＰＲ）及び少なくとも１つの第２プライマー（２ＰＲ）の一方が５’末端でビオチン化され、選択フラグメントが前記ビーズから非ビオチン化ｓｓＤＮＡフラグメントを溶出させることで得られる、請求項１８に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの第２プライマーが５’末端でビオチン化される、請求項１９に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項２１】
ｇ）再増幅されたＷＧＡ  ｄｓＤＮＡライブラリーを前記官能化常磁性ビーズと共に設計条件下でインキュベートすることにより、ビオチンと該官能化常磁性ビーズに割り当てられたストレプトアビジンとの間に共有結合を生じさせる工程と、
ｈ）結合していない非ビオチン化ｄｓＤＮＡフラグメントを洗い流す工程と、
ｉ）前記官能化常磁性ビーズから残留ｓｓＤＮＡフラグメントを溶出させる工程と、
の更なる工程を更に含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のローパス全ゲノムシークエンシングの方法。
【請求項２２】
超並列シークエンシングライブラリー調製キットであって、
第１プライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）と第１プライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）とを含み、該第１プライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）が、少なくとも１つの第１シークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）と、該少なくとも１つの第１シークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）の３’位かつ前記第１プライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）の５’位に少なくとも１つの第１シークエンシングバーコード（１ＰＲ５ＢＣ）とを含み、前記第１プライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）が、一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリー（ｐＷＧＡｌｉｂ）のフラグメントのＷＧＡライブラリー汎用配列アダプターを含む既知の５’配列セクション（５ＳＳ）又は該既知の５’配列セクションに逆相補的な既知の３’配列セクション（３ＳＳ）のいずれかにハイブリダイズし、前記フラグメントが前記既知の５’配列セクション（５ＳＳ）の３’かつ前記既知の３’配列セクション（３ＳＳ）の５’の中央配列セクション（ＭＳＳ）を更に含む、１つの第１プライマー（１ＰＲ）、
第２プライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）と第２  ３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）とを含み、該第２プライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）が、前記少なくとも１つの第１シークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）とは異なる少なくとも１つの第２シークエンシングアダプター（２ＰＲ５ＳＡ）を含み、前記第２  ３’セクションが、前記フラグメントの前記既知の５’配列セクション（５ＳＳ）又は前記既知の３’配列セクション（３ＳＳ）のいずれかにハイブリダイズする、１つの第２プライマー（２ＰＲ）、
を少なくとも含む、超並列シークエンシングライブラリー調製キット。
【請求項２３】
超並列シークエンシングライブラリー調製キットであって、
ａ．  配列番号９７（表２）のプライマー及び配列番号１〜配列番号９６（表２）からなる群から選択される１つ以上のプライマー、又は、
ｂ）配列番号１９４（表２）のプライマー及び配列番号９８〜配列番号１９３（表２）からなる群から選択される１つ以上のプライマー、又は、
ｃ）配列番号１９５〜配列番号２０２（表４）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー及び配列番号２０３〜配列番号２１４（表４）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、又は、
ｄ）配列番号２１５〜配列番号２２２（表６）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー及び配列番号２２３〜配列番号２３４（表６）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、又は、
ｅ）配列番号２３５〜配列番号２４２（表７）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー及び配列番号２４３〜配列番号２５４（表７）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、又は、
ｆ）配列番号２５９〜配列番号２６６（表８）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー及び配列番号２６７〜配列番号２７８（表８）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、
を含む、超並列シークエンシングライブラリー調製キット。
【請求項２４】
超並列シークエンシングライブラリー調製キットであって、
最適なシングルリードシークエンシングプロセスが行われるように設計された、
配列番号２３５〜配列番号２４２（表７）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号２４３〜配列番号２５４（表７）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号２５５のカスタムシークエンシングプライマー、及び配列番号２５６若しくは配列番号２５８のプライマー、又は、
配列番号２５９〜配列番号２６６（表８）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号２６７〜配列番号２７８（表８）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、並びに配列番号２７９及び配列番号２８０のプライマー、
を含む、超並列シークエンシングライブラリー調製キット。
【請求項２５】
選択シークエンシングプラットホームにおいて最適なペアエンドシークエンシングプロセスが行われるように設計された、配列番号２５７（表７）及び配列番号２８１（表８）から選択されるプライマーを更に含む、請求項２４に記載の超並列シークエンシングライブラリー調製キット。
【請求項２６】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを更に含む、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の超並列シークエンシングライブラリー調製キット。
【請求項２７】
ゲノムワイドコピー数プロファイリングの方法であって、
ａ．  請求項２２又は２３に記載のシークエンシングライブラリー調製キットを用いて開発されたＤＮＡライブラリーをシークエンシングする工程と、
ｂ．  ゲノムの異なる領域にわたるシークエンシングリード密度を分析する工程と、
ｃ．  前記ゲノムの領域についてのコピー数の値を、該領域におけるリード数を参照ゲノムの同じ領域において予測されたリード数に対して比較することによって決定する工程と、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全ゲノム増幅（ＷＧＡ：Whole Genome Amplification）産物の全ゲノムシークエンシングのための超並列シークエンシングライブラリーを生成する方法及びキットに関する。特に、該方法は、確定的制限部位全ゲノム増幅（ＤＲＳ−ＷＧＡ：Deterministic Restriction-Site, Whole Genome Amplification）のＤＮＡ産物に適用することもできる。
【０００２】
このライブラリーは、ローパス全ゲノムシークエンシング及びゲノムワイドコピー数プロファイリングに有利に使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
単一細胞では、単純化のため及び／又はシークエンシング、ＳＮＰ検出等を含む異なるタイプの遺伝分析を行うことを可能にするために、より多くのＤＮＡが得られる全ゲノム増幅（ＷＧＡ）を行うことが有益である。
【０００４】
確定的制限部位に基づくＬＭ−ＰＣＲによるＷＧＡ（例えば特許文献１に記載される）が、当該技術分野で既知である（以下、単にＤＲＳ−ＷＧＡと称する）。ＤＲＳ−ＷＧＡは、単一細胞の増幅により良好な解決法であり（非特許文献１を参照）、更には固定によるＤＮＡ分解により強い（非特許文献２を参照）ことが実証されている。
【０００５】
ＬＭ−ＰＣＲによるＤＲＳ−ＷＧＡの市販のキット（Ａｍｐｌｉ１（商標）  ＷＧＡキット、Silicon Biosystems）が非特許文献３において使用されている。この研究では、単一細胞ＷＧＡ材料に対してローパス全ゲノムシークエンシングによるコピー数分析が行われた。しかしながら、非特許文献３で用いられる標準ワークフローについては、ｉ）ＷＧＡアダプターの消化、ｉｉ）ＤＮＡ断片化、並びにｉｉｉ）末端修復（EndRepair）、ｉｖ）Ａ−テーリング、ｖ）バーコード化アダプターライゲーション等の標準Ｉｌｌｕｍｉｎａワークフロー工程、加えてｖｉ）バーコード化ＮＧＳライブラリーのサンプルプーリング及びｖｉｉ）シークエンシングという通常の工程を含む幾つかの工程がＩｌｌｕｍｉｎａライブラリーの作製に必要とされた。非特許文献３（図５ｂ）において示されるように、ＷＢＣは偽陽性と推定されるコピー数コールを殆ど提示しなかったが、ＣＴＣは概して、はるかに多くの異常を示した。
【０００６】
Ａｍｐｌｉ１（商標）  ＷＧＡは、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ：array Comparative Genomic Hybridization）に適合する。実際に、幾つかのグループ（非特許文献４、非特許文献５）により、それが高分解能コピー数分析に好適であることが示されている。しかしながら、ａＣＧＨ法は高コストかつ労働集約的であり、体細胞性コピー数変化（ＣＮＡ）の検出のためのローパス全ゲノムシークエンシング（ＬＰＷＧＳ）等の異なる方法が望ましい可能性がある。
【０００７】
Baslan et al（非特許文献６）は、ＤＯＰ−ＰＣＲ全ゲノム増幅から出発し、ＷＧＡアダプター消化、Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターのライゲーション、ＰＣＲ増幅を含む幾つかの酵素工程を用いて全ゲノムコピー数プロファイリングを達成した。
【０００８】
非特許文献７は、染色体異常及び単一遺伝子疾患についての同時の着床前遺伝子診断へのＭＡＬＢＡＣ  ＷＧＡ（Yikon Genomics Inc）の使用を教示している。
【０００９】
特許文献２は、特別な縮重オリゴヌクレオチドプライミングＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ：Degenerate-Oligonucleotide-Priming-PCR）を採用するアプローチを教示している。特許文献２には種々のＷＧＡ法及び現行の技術水準の概要も掲載されている。特許文献２は、市販のキットＰｉｃｏＰｌｅｘのベースとなっている。
【００１０】
非特許文献８は、ＭＡＬＢＡＣ及び多重置換増幅（ＭＤＡ：Multiple Displacement Amplification）を含む幾つかのＷＧＡ法の性能比較を報告している。ＬＰＷＧＳ及びＷＧＳが非特許文献８に用いられている。ライブラリー調製がワークフローにより行われる。
【００１１】
ＤＲＳ−ＷＧＡはアレイＣＧＨ（比較ゲノムハイブリダイゼーション）、中期ＣＧＨ、及びヘテロ接合性の消失等の他の遺伝分析アッセイを用いた場合に、微量の顕微解剖ＦＦＰＥ材料からのコピー数プロファイルの分析にＤＯＰ−ＰＣＲよりも良好であることが示されている（非特許文献２、非特許文献９）。
【００１２】
特許文献３は、突然変異を導入、除去した、又は制限部位を変更した遺伝子座においてＤＲＳ−ＷＧＡ産物から突然変異を検出する方法を教示している。
【００１３】
特許文献４は、非特許文献１０に更に詳述及び報告されるような、細胞のゲノム完全性及び／又はＤＲＳ−ＷＧＡ産物の品質を多重ＰＣＲにより評定する方法を教示している。
【００１４】
ＤＲＳ−ＷＧＡは、一様かつバランスの取れた増幅に関して最良の結果をもたらすが、ａＣＧＨ又は中期ＣＧＨに基づく現行のプロトコルは、困難及び／又は高コストである。ローパス全ゲノムシークエンシングが、幾つかのサンプルをａＣＧＨよりも高い処理能力及び低いコストで分析するハイスループット方法として提案されている。しかしながら、ＷＧＡ産物（ＤＲＳ−ＷＧＡ等）の超並列シークエンシングライブラリーを生成する既知の方法では、幾つかの酵素工程及び反応を含むプロトコルが依然として必要とされる。
【００１５】
上記に引用されるＣＴＣ分析への適用以外に、胚盤胞に対する出生前診断等の他の単一細胞分析用途、及び母体血から採取された循環胎児細胞についても、ＤＲＳ−ＷＧＡの再現性及び品質と、ゲノムワイドコピー数多型（ＣＮＶ：Copy-Number Variant）を分析する能力とを兼ね備えた、より簡素化された方法を行うことが望ましい場合がある。加えて、微量の細胞、ＦＦＰＥ又は組織生検材料から全ゲノムコピー数プロファイルを決定することも望ましい場合がある。
【００１６】
特許文献５は、ステムループアダプターオリゴを断片化ゲノムＤＮＡに付加することを含む、シークエンシングのためのライブラリーを調製する方法を開示している。次いで、ループを切断することで、二本鎖アダプターによって隣接したゲノムフラグメントを生じる。次いで、バーコードを含むプライマーによりフラグメントを増幅し、Ｉｏｎ  ＴｏｒｒｅｎｔシークエンシングプラットホームでのＤＮＡシークエンシングに使用する。
【００１７】
この方法は一連の欠点を有し、以下が最も重要な欠点である：
方法は、幾つかの反応及び幾つかの酵素が関わる多数の後続工程を伴う。
方法は、それ自体で単一細胞サンプルに由来するＤＮＡに適用可能でない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】国際公開第２０００／０１７３９０号
【特許文献２】米国特許第８２０６９１３号（Kamberov et al, Rubicon Genomics）
【特許文献３】国際公開第２０１４０６８５１９号（Fontana et al.）
【特許文献４】国際公開第２０１５０８３１２１号（Klein et al.）
【特許文献５】国際公開第２０１４／０７１３６１号
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Lee YS, et al: Comparison of whole genome amplification methods for further quantitative analysis with microarray-based comparative genomic hybridization. Taiwan J Obstet Gynecol. 2008, 47(1):32-41.
【非特許文献２】Stoecklein et al., SCOMP is superior to degenerated oligonucleotide primed-polymerase chain reaction for global amplification of minute amounts of DNA from microdissected archival tissue samples, Am J Pathol. 2002 Jul;161(1):43-51
【非特許文献３】Hodgkinson C.L. et al., Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer, Nature Medicine 20, 897-903 (2014)
【非特許文献４】Moehlendick B, et al. (2013) A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH. PLoS ONE 8(6): e67031
【非特許文献５】Czyz ZT, et al (2014) Reliable Single Cell Array CGH for Clinical Samples. PLoS ONE 9(1): e85907
【非特許文献６】Optimizing sparse sequencing of single cells for highly multiplex copy number profiling, Genome Research, 25:1-11, April 9, 2015
【非特許文献７】Yan et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Dec 29;112(52):15964-9
【非特許文献８】Hou et al., Comparison of variations detection between whole-genome amplification methods used in single-cell resequencing, GigaScience  (2015) 4:37
【非特許文献９】Arneson et al., Comparison of whole genome amplification methods for analysis of DNA extracted from microdissected early breast lesions in formalin-fixed paraffin-embedded tissue, ISRN Oncol. 2012;2012:710692. doi: 10.5402/2012/710692. Epub 2012 Mar 14.
【非特許文献１０】Polzer et al. EMBO Mol Med. 2014 Oct 30;6(11):1371-86
【発明の概要】
【００２０】
本発明の一目的は、ＮＧＳ（Next Generation Sequencing；次世代シークエンシング）ライブラリーをＷＧＡ産物から出発して簡素化された形で生成する方法を提供することである。特に、文献中に一般に報告されるよりも少ない酵素反応を含む方法を提供することが本発明の一目的である。
【００２１】
本発明の別の目的は、本発明によるライブラリー調製方法を用いてゲノムワイドコピー数プロファイルをＷＧＡ産物から出発して生成する方法を提供することである。
【００２２】
本発明の更なる目的は、上述の方法を行うためのキットを提供することである。作製されるライブラリーは選択シークエンシングプラットホーム、例えばＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔプラットホーム又はＩｌｌｕｍｉｎａプラットホームに適合するのが好ましい。
【００２３】
本発明は、添付の特許請求の範囲に規定されるような全ゲノム増幅産物からの全ゲノムシークエンシングのための超並列シークエンシングライブラリーを生成する方法及びキットに関する。本発明は、本発明の方法により先に調製したライブラリーを用い、ＷＧＡ産物から出発してゲノムワイドコピー数プロファイルを生成する方法に更に関する。
【００２４】
プライマー配列及び操作プロトコルも提供する。
【００２５】
ライブラリー生成反応は、幾つかのサンプルを同じＮＧＳランで多重化するためのシークエンシングバーコードの導入を含むのが好ましい。好ましくは、ＷＧＡはＤＲＳ−ＷＧＡであり、ライブラリーを単一チューブ一段階ＰＣＲ反応により生成する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ＤＲＳ−ＷＧＡにより生成されたＤＮＡライブラリーに含まれる、本発明の第１の実施形態に使用される出発産物を示す図である。単一フラグメントを概略的にのみ示す。
【図２】ＭＡＬＢＡＣにより生成されたＤＮＡライブラリーに含まれる、本発明の第２の実施形態に使用される出発産物を示す図である。単一フラグメントを概略的にのみ示す。
【図３】図１に示されるようなＤＲＳ−ＷＧＡにより生成されたＤＮＡライブラリーのフラグメントに適用され、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ又はＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットホームのようなシークエンシングプラットホームに適合するＤＮＡライブラリーをもたらすように指向された、本発明による方法の再増幅工程の一実施形態を概略的に示す図である。
【図４】図１に示されるようなＤＲＳ−ＷＧＡのフラグメントに適用される、本発明に従って得られる再増幅反応工程、続いてフラグメントライブラリー選択を含むプロトコルワークフローを概略的に示す図である。本方法は、ＩＬＬＵＭＩＮＡシークエンシングプラットホームに適合するＤＮＡライブラリーを直接提供する。
【図５】図４に示す工程に続いてＤＲＳ−ＷＧＡのフラグメントに適用される、本発明の方法の第３の実施形態に従って得られる最終一本鎖ＤＮＡライブラリーを概略的に示す図である。さらに、シークエンシングされた最終ｓｓＤＮＡライブラリー及び本発明に従って設計されたカスタムシークエンシングプライマーを図５に示す。ＤＥＰＡｒｒａｙシステム（Bolognesi et al.）によりＦＦＰＥからデジタル処理で選別された数百個の腫瘍細胞から出発して、ＤＲＳ−ＷＧＡライブラリーが生成される。
【図６】本発明に従って調製され、ＰＧＭプラットホームによってシークエンシングされたＤＮＡライブラリーに対してＤＥＰＡｒｒａｙシステムによりＦＦＰＥからデジタル処理で選別された数百個の腫瘍細胞から出発して行われたローパス全ゲノムシークエンシングのシークエンシング結果を示す図である。
【図７】２つの異なる腫瘍細胞での本発明に従って調製されたＤＮＡライブラリーに対するＰＧＭプロトコルによって行ったローパス全ゲノムシークエンシングのシークエンシング結果を示す図である。
【図８】本発明に従って調製されたＤＮＡライブラリーに対するＩＬＬＵＭＩＮＡプロトコル１によって行ったローパス全ゲノムシークエンシングのシークエンシング結果を示し、正常ＷＢＣ細胞及び異常（腫瘍）細胞から得られた結果を比較する図である。
【図９】本発明に従って調製されたＤＮＡライブラリーに対する本発明の一態様に従うＩＬＬＵＭＩＮＡプロトコル２によって行ったローパス全ゲノムシークエンシングのシークエンシング結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
定義
他に定義されていなければ、本明細書に使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有するものである。本明細書に記載されるものと同様な又は均等な多くの方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を下に記載している。他に言及されていなければ、本発明に使用される本明細書に記載の技法は当業者に既知の標準的な方法である。
【００２８】
「消化部位（ＤＳ：Digestion Site）」又は「制限部位（ＲＳ：Restriction Site）」という用語は、制限酵素がポリヌクレオチド鎖に沿って切り取る、制限酵素によって認識されるＤＮＡ分子に沿ったヌクレオチドの配列（通例、４塩基対〜８塩基対（ｂｐ）長）を意図するものである。
【００２９】
「切断部位」という用語は、制限酵素がヌクレオチド間のホスホジエステル結合を加水分解することによってヌクレオチドを切断する、ポリヌクレオチド鎖中の部位を意図するものである。
【００３０】
「アンプリコン」という用語は、ＰＣＲ増幅によって生じるＤＮＡの領域を意図するものである。
【００３１】
「ＤＲＳ−ＷＧＡアンプリコン」又は短縮して「ＷＧＡアンプリコン」という用語は、ライゲートしたアダプターによって隣接した２つのＲＳ間のＤＮＡ配列を含む、ＤＲＳ−ＷＧＡ中に増幅されたＤＮＡフラグメントを意図するものである。
【００３２】
「元のＤＮＡ」という用語は、ＤＲＳ−ＷＧＡによる増幅前のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を意図するものである。
【００３３】
「アダプター」又は「ＷＧＡアダプター」又は「ＷＧＡ  ＰＣＲプライマー」又は「ＷＧＡライブラリー汎用配列アダプター」という用語は、ＤＲＳ−ＷＧＡの場合には、制限酵素の作用によって生成する各フラグメントにライゲートした付加的なオリゴヌクレオチド、又はＭＡＬＢＡＣの場合には、伸長及びＰＣＲプロセスの結果としてＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーの各分子の５’セクションに存在する既知のポリヌクレオチド配列を意図するものである。
【００３４】
「コピー数変化（ＣＮＡ：Copy Number Alteration）」という用語は、概して同じ個体のゲノムに関して規定される、ゲノム領域のコピー数の体細胞性変化を意図するものである。
【００３５】
「コピー数多型（ＣＮＶ：Copy Number Variation）」という用語は、概して参照ゲノムに関して規定される、ゲノム領域のコピー数の生殖細胞系列変異を意図するものである。本明細書全体を通して、ＣＮＡ及びＣＮＶは、理論の殆どをどちらの状況にも当てはめることができるため、区別なく使用される場合がある。逆の指定がない限り、これらの用語の各々が両方の状況を指すことが意図されるものとする。
【００３６】
「超並列（Massive-parallel）次世代シークエンシング（ＮＧＳ）」という用語は、空間的及び／又は時間的に分離され、クローン的に（clonally）シークエンシングされた（事前のクローン増幅（clonal amplification）を含む又は含まない）、ＤＮＡ分子のライブラリーの作製を含む、ＤＮＡをシークエンシングする方法を意図するものである。例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットホーム（Illumina Inc）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔプラットホーム（ThermoFisher Scientific Inc）、Pacific Biosciencesのプラットホーム、ＭｉｎＩＯＮ（Oxford Nanopore Technologies Ltd）が挙げられる。
【００３７】
「標的配列」という用語は、元のＤＮＡ上の対象の領域を意図するものである。
【００３８】
「一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリー（ｐＷＧＡｌｉｂ：Primary WGA DNA library）」という用語は、ＷＧＡ反応によって得られるＤＮＡライブラリーを意図するものである。
【００３９】
「多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法（ＭＡＬＢＡＣ：Multiple Annealing and Looping Based Amplification Cycles）」という用語は、準線形全ゲノム増幅法を意図するものである（Zong et al., Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell, Science. 2012 Dec 21;338(6114):1622-6. doi: 10.1126/science.1229164.）。ＭＡＬＢＡＣプライマーは、鋳型にハイブリダイズする８ヌクレオチドの３’ランダム配列、及び２７ヌクレオチドの５’共通配列（ＧＴＧ  ＡＧＴ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＡＧＴ  ＧＴＧ  ＧＡＧ）を有する。最初の伸長後にセミアンプリコン（semiamplicons）を、相補的な５’末端及び３’末端を有する完全なアンプリコンをもたらす別の伸長の鋳型として使用する。数サイクルの準線形増幅の後、完全なアンプリコンを後続のＰＣＲサイクルにより指数関数的に増幅することができる。
【００４０】
「ＤＮＡライブラリー精製」という用語は、ＤＮＡライブラリー材料を酵素、ｄＮＴＰ、塩、及び／又は所望のＤＮＡライブラリーの一部ではない他の分子等の不要な反応成分から分離するプロセスを意図するものである。ＤＮＡライブラリー精製プロセスの例は、Beckman CoulterのＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ若しくは固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）ビーズ等の磁性ビーズを用いた技術、又はMerck MilliporeのＡｍｉｃｏｎスピンカラム等のスピンカラム精製による精製である。
【００４１】
「ＤＮＡライブラリーサイズ選択」という用語は、ＤＮＡライブラリーを構成する種々のフラグメントの塩基対分布を変更するプロセスを意図するものである。概して、或る特定の範囲内に含まれるＤＮＡライブラリーの一部が実質的に保持されるのに対し、その範囲外のＤＮＡライブラリー成分は実質的に廃棄される。ＤＮＡライブラリーサイズ選択プロセスの例は、電気泳動ゲル（例えば、ThermoFisher ScientificのＥ−ｇｅｌ）の切出し、又は磁性ビーズを用いた精製システム（例えば、Beckman CoulterのＳＰＲＩビーズ）による二重精製である。
【００４２】
「ＤＮＡライブラリー選択」という用語は、ＤＮＡライブラリー精製若しくはＤＮＡライブラリーサイズ選択のいずれか、又はその両方を行うプロセスを意図するものである。
【００４３】
「ＮＧＳ再増幅」という用語は、一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーの全て又は大部分が更に増幅されるＰＣＲ反応を意図するものである。ＮＧＳという用語は、本書全体を通して簡略化のために省略される場合があり、単に「再増幅」を参照されたい。
【００４４】
「シークエンシングアダプター（ＳＡ）」という用語は、ＤＮＡ挿入断片のシークエンシングに役立つ１つ以上の分子を意図するものであり、各分子はポリヌクレオチド配列、官能基を含まないか、１つ以上含む場合がある。特に、シークエンサーがアウトプット配列を正確に生成するために超並列シークエンシングライブラリー中に存在する必要があるが、情報を保有しないポリヌクレオチド配列が意図される（非限定的な例：ｓｓＤＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングの場合にはフローセル、若しくはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシークエンシングの場合にはｉｏｎ−ｓｐｈｅｒｅにハイブリダイズさせるポリヌクレオチド配列、又は合成時解読（sequencing-by-synthesis）反応の開始に必要とされるポリヌクレオチド配列）。
【００４５】
「シークエンシングバーコード」という用語は、１つのシークエンサーリード内でシークエンシングする場合に、そのリードをそのバーコードと関連付けられた特定のサンプルに割り当てることを可能にするポリヌクレオチド配列を意図するものである。
【００４６】
「選択シークエンシングプラットホームに機能的な」という用語は、シークエンシングプロセス中にシークエンシングプラットホームに用いる必要があるポリヌクレオチド配列（例えば、バーコード又はシークエンシングアダプター）を意図するものである。
【００４７】
「ローパス全ゲノムシークエンシング」という用語は、１未満の平均シークエンシング深度での全ゲノムシークエンシングを意図するものである。
【００４８】
「平均シークエンシング深度」という用語は本明細書において、全参照ゲノムサイズで除算した、１サンプル当たりの、シークエンシングされ、参照ゲノムにマッピングされる塩基の総数を意図するものである。シークエンシング及びマッピングされる塩基の総数は、マッピングされるリードの数×平均リード長に近似することができる。
【００４９】
「二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）」という用語は、塩基対合則（ＡとＴ及びＣとＧ）に従って、両者の窒素塩基の結合によって水素結合した２つの別個のポリヌクレオチド相補鎖を意図するものである。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）：ＤＮＡの２つの鎖は、２つの一本鎖ＤＮＡ分子を形成し得る。すなわち、ＤＮＡ分子はワトソン−クリック塩基対合によって連結した２つのｓｓＤＮＡ分子で構成される。
【００５０】
「一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）」という用語は、例えば二本鎖ＤＮＡに由来する、又は相補的な一本鎖ＤＮＡと対合することができるポリヌクレオチド鎖、すなわち典型的ならせん型の２つのヌクレオチド鎖とは対照的に、一本鎖のみからなるポリヌクレオチドＤＮＡ分子を意図するものである。
【００５１】
「均等化する（equalizing）」は、１つ以上のサンプルの濃度を均等にするために調整する行為を意図するものである。
【００５２】
「正規化する（normalizing）」は、１つ以上のサンプルの濃度を所望の割合に対応するように調整する行為を意図するものである（均等化は、その割合が１である特別な例である）。本明細書では便宜上、「正規化する」及び「均等化する」という用語は、明らかに概念上同一であることから、区別せずに使用される。
【００５３】
「常磁性ビーズ」は、ストレプトアビジンコンジュゲート磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）  ＭｙＯｎｅ（商標）  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１、ThermoFisher Scientific）を意図するものである。常磁性ビーズのインキュベーションに言及する場合の「設計条件」という表現は、ストレプトアビジンコンジュゲート磁性ビーズを以下のバッファー：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＮａＣｌで２回洗浄することに含まれる（consists in）活性化工程に必要とされる条件を指す。
【００５４】
ワークフロー
以下の表に本発明による幾つかの考え得るワークフローをまとめる。
【００５５】
【表１】
2019514360.tif 000003
【００５６】
プロセスインプット材料
本明細書全体で一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーに言及する。同じワークフローを、例えばｄｓＤＮＡ合成、又は標準ＷＧＡプライマーを用いた（例えば、可能な場合はＡｍｐｌｉ１（商標）  ＲｅＡｍｐ／ｄｓキット（Menarini Silicon Biosystems spa，Italy）を用いた）ライブラリー再増幅等の付加的なプロセスに更に供した一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーに適用することができる。便宜上、本明細書においては、これらの付加的なプロセスを考慮することなく一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーのみに言及する。この種の全てのインプットサンプルを、特許請求の範囲に報告されているものについても好適なサンプルインプットとして使用することができることが意図されるものとする。
【００５７】
初期精製
無視することができない量の一次ＷＧＡプライマーが一次ＷＧＡアウトプット産物中に存在する場合、ＤＮＡライブラリー精製を含む初期ＤＮＡライブラリー選択を行うことが有利である場合がある。実際、本発明によるプライマーは、一次ＷＧＡプライマー中に見られる共通配列に対応する配列を３’末端に有するため、無視することができない量の残留一次ＷＧＡプライマーの存在は、本発明による超並列シークエンシングライブラリーを得るために使用される再増幅プライマーと競合し、所望に応じて再増幅プライマー（複数の場合もある）（又はそれらの逆相補鎖（reverse complementary））を両末端に有するＤＮＡライブラリー分子の収率を減少させる可能性がある。
【００５８】
サンプルにわたるリード数の均等化のための定量化
再増幅ＤＮＡライブラリーの量の変動が、共にプール及びシークエンシングされるサンプル間で比較的大きい場合、ライブラリーを等分し、各サンプルについてシークエンシングされるリード数を均等化するために、各サンプルからのＤＮＡライブラリーの量を定量化することが有利である場合がある。
【００５９】
シークエンサーリード長及びＷＧＡサイズピークの間のミスマッチは不正確な均等化を生じ得る
幾つかの超並列シークエンサー（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔプラットホーム及びＩｌｌｕｍｉｎａプラットホームを含む）は、用いられる種々の化学作用に応じて５０ｂｐ〜８００ｂｐに含まれるサイズ分布ピークを有するＤＮＡフラグメント、例えば１５０ｂｐ、２００ｂｐ、４００ｂｐ、６５０ｂｐに分布ピーキング（peaking）を有するＤＮＡフラグメントのシークエンシングを用いる。ｐＷＧＡｌｉｂサイズ分布は約１ｋｂｐ等のより大きなフラグメントのピーク及び１５０ｂｐ、２００ｂｐ、４００ｂｐのはるかに少量のＤＮＡを有し得るため、所望の範囲の再増幅ＤＮＡライブラリー量の定量化は、所望のフラグメント範囲の事前サイズ選択なしに大量の再増幅ＤＮＡライブラリーに対して行った場合に不正確となる可能性がある。結果として、大量のＤＮＡ定量化及びプール中の様々なサンプルの均等化は、シークエンサーサイズ範囲内のフラグメントの数がライブラリー内のＤＮＡフラグメントの分布の不正確さにより確率的に変動することから、１サンプル当たりの実際のリード数の比較的大きな変動を生じる可能性がある（このため、完全に均等化された総量のＤＮＡライブラリーであっても、シークエンシングされるフラグメントの数の顕著な変動を生じる）。
【００６０】
均等化を改善するためにシークエンサーリード長内のＤＮＡライブラリーの量を増大する
（再増幅前のサイズ選択による）
全ＤＮＡライブラリーに対するシークエンサーリード長範囲内のＤＮＡライブラリーの量の割合を増大するために、一次ＷＧＡ産物サイズ分布を変更する必要がある場合、ＤＮＡライブラリーサイズ選択を含む初期ＤＮＡライブラリー選択を行うことが有利である場合がある。
【００６１】
（選択的再増幅による）
代替的又は付加的には、所望の範囲のＤＮＡライブラリーフラグメントの選択的増幅に好都合な条件下で再増幅反応を行うことが有利である場合がある。
【００６２】
ポリメラーゼの選択又は伸長サイクルの短縮による選択的再増幅
より短いフラグメントに好都合な反応条件は、より短いフラグメントを選択的に増幅するポリメラーゼを用いた再増幅ＰＣＲ反応、又はより短い伸長段階によって長いフラグメントが完全長まで複製するのを防ぎ、不完全ライブラリーフラグメントを生成する初期ＰＣＲサイクルを含み得る。不完全ライブラリーフラグメントは再増幅プライマー（複数の場合もある）の３’セクションに逆相補的な３’末端部分を欠くため、このフラグメントは該再増幅プライマー（複数の場合もある）を用いた更なる複製工程から除外され、不完全フラグメントの指数関数的増幅が妨げられ、より長い一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーフラグメントに由来する線形の（サイクルによる）数の不完全増幅フラグメントしか生成することができない（consenting）。
【００６３】
表１によるワークフローの例
Ｗｆ１）は、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ（例えば、サンプルバーコードを必要としない単一サンプルを処理する３１４チップ）でのＷＧＡライブラリーのＬＰＷＧＳに適用することができる。２つのプライマーを用いた再増幅により、バーコードを用いない２つのシークエンシングアダプターの導入が可能となる。
【００６４】
Ｗｆ２）は、一次ＷＧＡの元のインプットサンプルが均一なタイプの非増幅材料、例えば同じ処理を受けた（例えば、新鮮な又は固定された）、非アポトーシス性の単一細胞に由来する場合に、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ又はＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑでの多数の一次ＷＧＡサンプルのＬＰＷＧＳに適用することができる。このため、一次ＷＧＡ収率が全体的におおむね同じであることから、定量化は必要とされない。バーコード化され、シークエンサーに適合したライブラリーをプールした後、サイズ選択して、シークエンサーリード長内の適切なサイズを有するフラグメントを単離し、精製し、シークエンシングする。サイズ選択をゲルによって行う場合、その後に精製が行われる。サイズ選択を例えば両側ＳＰＲＩビーズ精製によって行う場合、得られるアウトプットは既に精製されており、更なる精製工程は必要でない。
【００６５】
Ｗｆ３）は、一次ＷＧＡの元のインプットサンプルが、例えば異なる元のＤＮＡの品質を有する（一部が非アポトーシス性、一部がアポトーシス性であり、不均一なゲノム完全性指数を有する；Polzer et al. EMBO Mol Med. 2014 Oct 30;6(11):1371-86を参照されたい）、異なる処理を受けた（例えば、一部が新鮮で一部が固定された）、一部が単一細胞、一部が細胞プールの均一でないタイプの非増幅材料に由来する、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭ又はＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑでの多数の一次ＷＧＡサンプルのＬＰＷＧＳに適用することができる。このため、一次ＷＧＡ収率がサンプル間で顕著に異なる可能性があることから、定量化が必要である。Ｗｆ２に対し、定量化が行われる。定量化の前に、例えば残留プライマー及びｄＮＴＰ又はプライマー二量体が除去され、定量化に影響を及ぼさないことから、定量化工程の信頼性を高めるために精製することが有利である。
【００６６】
バーコード化され、シークエンサーに適合したライブラリーをプールした後、サイズ選択して、シークエンサーリード長内の適切なサイズを有するフラグメントを単離し、精製し、シークエンシングする。サイズ選択をゲルによって行う場合、その後に精製が行われる。サイズ選択を例えば両側ＳＰＲＩビーズ精製によって行う場合、得られるアウトプットは既に精製されており、更なる精製工程は必要でない。
【００６７】
Ｗｆ４）は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅシークエンシングのための超並列シークエンシングライブラリーの調製に適用することができる。Ｎａｎｏｐｏｒｅはより長いリード長に対応することができるため、サイズ選択が不必要である可能性があり、ライブラリー内の実質的に全てのフラグメント長に対してシークエンシングを行うことができる。
【００６８】
Ｗｆ５）は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅシークエンシングのための多重超並列シークエンシングライブラリーの調製に適用することができる。ｗｆ４に対し、再増幅プライマーは、より多くのサンプルを同じランで多重化するためのサンプルバーコードを更に含む。Ｎａｎｏｐｏｒｅはより長いリード長に対応することができるため、サイズ選択が不必要である可能性がある。
【００６９】
Ｗｆ６）は、特殊アダプターの付加を必要としないＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅシークエンサーのための多重超並列シークエンシングライブラリーの調製に適用することができる。ｗｆ５に対し、再増幅プライマーはシークエンシングアダプターを含まず、より多くのサンプルを同じランで多重化するためのサンプルバーコードのみを含む。Ｎａｎｏｐｏｒｅはより長いリード長に対応することができるため、サイズ選択が不必要である可能性がある。
【００７０】
Ｗｆ７）は、より短いリード長のシステム、例えば２００ｂｐケミストリー（chemistry：化学的性質）のシークエンシングを用いるＩｏｎＰｒｏｔｏｎでの異なるＤＮＡ品質を有する不均一な処理後の均一でないサンプルから得られるＤＲＳ−ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーのシークエンシングのための多重超並列ライブラリーの調製に適用することができる。２００ｂｐ前後の一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーの量は、一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリー中の全ＤＮＡと比較して非常に少ないため、シークエンシングリード長外の全て又は実質的に全てのｐＷＧＡｌｉｂフラグメントを排除し、２００ｂｐ前後のｐＷＧＡｌｉｂフラグメントを富化するサイズ選択を行うことが有利である場合がある。
【００７１】
次いで、ＩｏｎＰｒｏｔｏｎシステムに適合するバーコード及びシークエンシングアダプターを含む再増幅プライマーを用いて再増幅を行う。再増幅産物をこのように精製し、各サンプルについて定量化し、各サンプルバーコードについてリード数を均等化するために種々のサンプルの種々のアリコートを共にプールした後、シークエンシングしてＬＰＷＧＳを行う。
【００７２】
上述のようなワークフローに含まれる工程の種々の組合せが、本発明の範囲から逸脱することなく可能であり、これが本明細書に開示されるような特別なプライマーによる一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーの再増幅に左右されることが当業者には明らかである。
【００７３】
ＷＧＡ産物からの超並列シークエンシングライブラリー調製
本発明の第１の実施形態において、
ａ．  既知の５’ＷＧＡ配列セクション（５ＳＳ）と、中央ＷＧＡ配列セクション（ＭＳＳ）と、該既知の５’ＷＧＡ配列セクションに逆相補的な既知の３’ＷＧＡ配列セクション（３ＳＳ）とを含むフラグメントを含む一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリー（ｐＷＧＡｌｉｂ）を準備する工程であって、上記既知の５’ＷＧＡ配列セクション（５ＳＳ）がＷＧＡライブラリー汎用配列アダプターを含み、上記中央ＷＧＡ配列セクション（ＭＳＳ）が、ＷＧＡ前の元の非増幅ＤＮＡのＤＮＡ配列に対応する挿入セクション（ＩＳ）を少なくとも含み、上記中央ＷＧＡ配列が任意に、隣接５’中間セクション（Ｆ５）及び／又は隣接３’中間セクション（Ｆ３）を更に含む、工程と、
ｂ．  上記一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリーを、少なくとも１つの第１プライマー（１ＰＲ）及び少なくとも１つの第２プライマー（２ＰＲ）を用いて再増幅する工程と、
を含み、
上記少なくとも１つの第１プライマー（１ＰＲ）が、第１プライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）と第１プライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）とを含み、該第１プライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）が、少なくとも１つの第１シークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）と、該少なくとも１つの第１シークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）の３’位かつ上記第１プライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）の５’位に少なくとも１つの第１シークエンシングバーコード（１ＰＲ５ＢＣ）とを含み、上記第１プライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）が、上記既知の５’配列セクション（５ＳＳ）又は上記既知の３’配列セクション（３ＳＳ）のいずれかにハイブリダイズし、
上記少なくとも１つの第２プライマー（２ＰＲ）が、第２プライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）と第２プライマー３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）とを含み、該第２プライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）が、上記少なくとも１つの第１シークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）とは異なる少なくとも１つの第２シークエンシングアダプター（２ＰＲ５ＳＡ）を含み、上記第２プライマー３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）が、上記既知の５’配列セクション（５ＳＳ）又は上記既知の３’配列セクション（３ＳＳ）のいずれかにハイブリダイズする、方法が提供される。
【００７４】
既知の５’配列セクション（５ＳＳ）は、ＷＧＡライブラリー汎用配列アダプターからなるのが好ましい。一例として、ＤＲＳ−ＷＧＡ（Menarini Silicon BiosystemsのＡｍｐｌｉ１（商標）  ＷＧＡキット等）及びＭＡＬＢＡＣ（Yikon Genomics）が、本発明による方法のインプットについての要望により上記既知の５’配列セクションに逆相補的な既知の３’配列セクションを有するｐＷＧＡｌｉｂを生じる。
【００７５】
したがって、ＷＧＡライブラリー汎用配列アダプターは、好ましくはＤＲＳ−ＷＧＡライブラリー汎用配列アダプター（例えば、配列番号２８２）又はＭＡＬＢＡＣライブラリー汎用配列アダプター（例えば、配列番号２８３）、より好ましくはＤＲＳ−ＷＧＡライブラリー汎用配列アダプターである。
【００７６】
上記第２プライマー（２ＰＲ）が、上記少なくとも１つの第２シークエンシングアダプター（２ＰＲ５ＳＡ）の３’位かつ上記第２プライマー３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）の５’位に少なくとも１つの第２シークエンシングバーコード（２ＰＲ５ＢＣ）を更に含むことが好ましい。
【００７７】
シークエンシングバーコードの存在から、ローパス全ゲノムシークエンシングの方法であって、
ｃ．  複数のバーコード化された超並列シークエンシングライブラリーを準備すると共に、種々のシークエンシングバーコード（ＢＣ）を用いて得られるサンプルをプールする工程と、
ｄ．  プールしたライブラリーをシークエンシングする工程と、
を含む、方法が、本発明の一実施形態に従って実行される。
【００７８】
種々のシークエンシングバーコード（ＢＣ）を用いたサンプルをプールする工程が、
ｅ．上記バーコード化された超並列シークエンシングライブラリーの各々におけるＤＮＡを定量化する工程と、
ｆ．バーコード化された超並列シークエンシングライブラリーの量を正規化する工程と、
を更に含む。
【００７９】
種々のシークエンシングバーコード（ＢＣ）を用いたサンプルをプールする工程が、少なくとも１つの選択塩基対範囲内に含まれるＤＮＡフラグメントを選択する工程を更に含む。このような選択塩基対範囲は、下流のシークエンシングプラットホームの選択を考慮して異なる値を中心とする。例えばＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプラットホームについては、塩基対範囲は６５０ｂｐ、好ましくは４００ｂｐを中心とする。他のシークエンシングプラットホーム、例えばＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔについては、塩基対範囲は４００ｂｐ、好ましくは２００ｂｐ、より好ましくは１５０ｂｐ又は１００ｂｐ又は５０ｂｐを中心とする。
【００８０】
本発明の更なる一実施形態によると、上記で言及されたローパス全ゲノムシークエンシングの方法は、第１シークエンシングアダプターと第２シークエンシングアダプターとの両方を含むＤＮＡフラグメントを選択する工程を更に含む。
【００８１】
上記第１シークエンシングアダプターと上記第２シークエンシングアダプターとを含むＤＮＡフラグメントを選択する工程は、超並列シークエンシングライブラリーを、例えば官能化常磁性ビーズに含まれる（consisting in）／それを含む少なくとも１つの固相に接触させることによって行うのが好ましい。本発明の方法の一実施形態において、上記常磁性ビーズがストレプトアビジンコーティングで官能化される。
【００８２】
本発明によるローパス全ゲノムシークエンシングの一方法において、少なくとも１つの第１プライマー（１ＰＲ）及び少なくとも１つの第２プライマー（２ＰＲ）の一方が５’末端でビオチン化され、選択フラグメントが上記ビーズから非ビオチン化ｓｓＤＮＡフラグメントを溶出させることで得られる。
【００８３】
図４から分かるように、上記の場合、再増幅されたＷＧＡ  ｄｓＤＮＡライブラリーは、１）非ビオチン化ｄｓＤＮＡフラグメント、一方の鎖がビオチン化されたｄｓＤＮＡフラグメント、及び両方の鎖がビオチン化されたｄｓＤＮＡフラグメントを含む。本発明の方法は、
ｇ．再増幅されたＷＧＡ  ｄｓＤＮＡライブラリーを上記官能化常磁性ビーズと共に設計条件下でインキュベートすることにより、ビオチンと該官能化常磁性ビーズに割り当てられたストレプトアビジンとの間に共有結合を生じさせる工程と、
ｈ．結合していない非ビオチン化ｄｓＤＮＡフラグメントを洗い流す工程と、
ｉ．上記官能化常磁性ビーズから残留ｓｓＤＮＡフラグメントを溶出させる工程と、
の更なる工程を含む。
【００８４】
本発明はまた、超並列シークエンシングライブラリー調製キットであって、
第１プライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）と第１プライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）とを含み、該第１プライマー５’セクション（１ＰＲ５Ｓ）が、少なくとも１つの第１シークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）と、該少なくとも１つの第１シークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）の３’位かつ上記第１プライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）の５’位に少なくとも１つの第１シークエンシングバーコード（１ＰＲ５ＢＣ）とを含み、上記第１プライマー３’セクション（１ＰＲ３Ｓ）が、一次ＷＧＡ  ＤＮＡライブラリー（ｐＷＧＡｌｉｂ）のフラグメントのＷＧＡライブラリー汎用配列アダプターを含む既知の５’配列セクション（５ＳＳ）又は該既知の５’配列セクションに逆相補的な既知の３’配列セクション（３ＳＳ）のいずれかにハイブリダイズし、上記フラグメントが上記既知の５’配列セクション（５ＳＳ）の３’かつ上記既知の３’配列セクション（３ＳＳ）の５’の中央配列セクション（ＭＳＳ）を更に含む、１つの第１プライマー（１ＰＲ）、
第２プライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）と第２  ３’セクション（２ＰＲ３Ｓ）とを含み、該第２プライマー５’セクション（２ＰＲ５Ｓ）が、上記少なくとも１つの第１シークエンシングアダプター（１ＰＲ５ＳＡ）とは異なる少なくとも１つの第２シークエンシングアダプター（２ＰＲ５ＳＡ）を含み、上記第２  ３’セクションが、上記フラグメントの上記既知の５’配列セクション（５ＳＳ）又は上記既知の３’配列セクション（３ＳＳ）のいずれかにハイブリダイズする、１つの第２プライマー（２ＰＲ）、
を少なくとも含む、超並列シークエンシングライブラリー調製キットに関する。
【００８５】
特に、超並列シークエンシングライブラリー調製キットは、
ａ）  配列番号９７（表２）のプライマー及び配列番号１〜配列番号９６（表２）からなる群から選択される１つ以上のプライマー、又は、
ｂ）配列番号１９４（表２）のプライマー及び配列番号９８〜配列番号１９３（表２）からなる群から選択される１つ以上のプライマー、又は、
ｃ）配列番号１９５〜配列番号２０２（表４）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー及び配列番号２０３〜配列番号２１４（表４）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、又は、
ｄ）配列番号２１５〜配列番号２２２（表６）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー及び配列番号２２３〜配列番号２３４（表６）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、又は、
ｅ）配列番号２３５〜配列番号２４２（表７）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー及び配列番号２４３〜配列番号２５４（表７）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、又は、
ｆ）配列番号２５９〜配列番号２６６（表８）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー及び配列番号２６７〜配列番号２７８（表８）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、
を含む。
【００８６】
本発明の一実施形態によると、超並列シークエンシングライブラリー調製キットは、
最適なシングルリードシークエンシングプロセスが行われるように設計された、
配列番号２３５〜配列番号２４２（表７）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、及び配列番号２４３〜配列番号２５４（表７）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号２５５のカスタムシークエンシングプライマー、及び配列番号２５６若しくは配列番号２５８のプライマー、又は、
配列番号２５９〜配列番号２６６（表８）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、配列番号２６７〜配列番号２７８（表８）からなる群から選択される少なくとも１つのプライマー、並びに配列番号２７９及び配列番号２８０のプライマー、
を含む。
【００８７】
上記キットは、選択シークエンシングプラットホームにおいて最適なペアエンドシークエンシングプロセスが行われるように設計された、配列番号２５７（表７）及び配列番号２８１（表８）から選択されるプライマーを更に含むことができる。
【００８８】
超並列シークエンシングライブラリー調製キットは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを更に含むことが好ましい。
【００８９】
本発明はまた、最後に、ゲノムワイドコピー数プロファイリングの方法であって、
ａ．  上記のシークエンシングライブラリー調製キットを用いて開発されたＤＮＡライブラリーをシークエンシングする工程と、
ｂ．  ゲノムの異なる領域にわたるシークエンシングリード密度を分析する工程と、
ｃ．  上記ゲノムの領域についてのコピー数の値を、該領域におけるリード数を参照ゲノムの同じ領域において予測されたリード数に対して比較することによって決定する工程と、
を含む、方法に関する。
【００９０】
単一ＣＴＣからのローパス全ゲノムシークエンシング
ＬＰＷＧＳによるＣＮＡプロファイリングは、ａＣＧＨが十分に明らかな結果を生じることができない場合がある、より低いゲノム完全性指数により寛容である。実際に、ａＣＧＨプローブはゲノムの定位置に設計される。これらの位置がＤＮＡの架橋のために確率的に増幅することができない場合、対応するプローブはハイブリダイゼーション後に適切な量のシグナルを生成せず、試験ＤＮＡと参照ＤＮＡとのシグナル比にノイズピクセル（noisy pixel）を生じる。
【００９１】
これに対し、ＬＰＷＧＳを用いる場合、フラグメントはサイズ選択にのみ基づく。或る特定のフラグメントが例えばＤＮＡの架橋又はアポトーシスによって誘導される切断のために確率的に増幅しない場合、依然として同じローパスビンに分けられる近接ゲノム領域における増幅に適した同じサイズの付加的なフラグメントが存在し得る。したがって、例えば図６〜図９に明らかに示されるように、シグナル対ノイズはライブラリーのゲノム完全性指数により柔軟である（resilient）。
【００９２】
ＤＲＳ−ＷＧＡからの超並列シークエンシングライブラリー調製
サイズ選択は、シークエンシングライブラリーの塩基対サイズとしての実質的に同じ長さ（アダプター挿入の正味）のＤＲＳ−ＷＧＡフラグメントで構成される領域内のゲノムのサブサンプリングを意味する。
【００９３】
それにもかかわらず、これらのサブサンプリングは、コピー数多型コーリングの標準アルゴリズムを用いる場合であってもコピー数プロファイルの品質に影響を及ぼさないことが驚くべきことに見出された。
【００９４】
ＴＴＡＡ確定的制限部位を有するＤＲＳ−ＷＧＡを（Ａｍｐｉ１（商標）  ＷＧＡキットとして）選択するのが有利である。このように、より短いフラグメントはゲノムの低ＧＣ含量領域でより高密度であり、フラグメント密度はより高いＧＣ含量と負に相関する。
【００９５】
微量のデジタル処理で選別されたＦＦＰＥ細胞からのローパス全ゲノムシークエンシング
ＤＥＰＡｒｒａｙシステム（Bolognesi et al.）を用いてＦＦＰＥからデジタル処理で選別された数百個の腫瘍細胞から出発して、ＤＲＳ−ＷＧＡライブラリーを生成した。図６に示されるように、このライブラリーを用いて本発明によるＩｏｎ／ＰＧＭのための超並列シークエンシングライブラリーを生成した。超並列ライブラリーを０．０５未満の平均深度でシークエンシングした。
【実施例】
【００９６】
実施例１：
ＤＲＳ−ＷＧＡ後のＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭでのＬＰＷＧＳのプロトコル
１）確定的制限部位全ゲノム増幅（ＤＲＳ−ＷＧＡ）
単一細胞ＤＮＡを、Ａｍｐｌｉ１（商標）  ＷＧＡキット（Silicon Biosystems）を用い、製造業者の使用説明書に従って増幅した。
【００９７】
Ａｍｐｌｉ１（商標）  ＷＧＡキットは、１つの単一細胞から得られたＤＮＡからの全ゲノム増幅をもたらすように設計される。細胞溶解に続いて、ＤＮＡを制限酵素、好ましくはＭｓｅＩで消化し、汎用アダプター配列をＤＮＡフラグメントにライゲートする。増幅は、ゲノム全体に分布する２００ｂｐ〜１０００ｂｐ長の範囲サイズの生成される全てのフラグメントについて、単一特異的ＰＣＲプライマーによって媒介される。
【００９８】
２）ＷＧＡ産物の再増幅
５μＬのＷＧＡにより増幅されたＤＮＡを、５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒを添加することによって希釈し、結合していないオリゴヌクレオチド、並びに過剰なヌクレオチド、塩及び酵素を除去するためにＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰシステム（Beckman Coulter）を用いて精製する。
【００９９】
ビーズを用いたＤＮＡ精製を以下のプロトコルに従って行った。１８μＬのビーズ（サンプル体積の１．８倍）を各サンプルに添加した。ビーズ及び反応産物を短時間のボルテックスにより混合した後、遠沈して液滴を収集した。次いで、混合反応物（mixed reactions）をＲＴで１５分間、マグネット外で（off-magnet）インキュベートした後、ＤｙｎａＭａｇ−９６  Ｓｉｄｅマグネット（Life Technologies）に移し、５分間静置した。上清を廃棄し、ビーズを１５０μＬの新たに作製した８０％ＥｔＯＨで洗浄した。２回目のＥｔＯＨ洗浄の後、ビーズをマグネット上で５分〜１０分間乾燥させた。次いで、乾燥ビーズをマグネット外で１５μＬのＬｏｗ  ＴＥバッファーに再懸濁し、１０分間インキュベートし、続いてマグネット上で５分間のインキュベーションを行った。１２マイクロリットルの溶出物を別のチューブに移し、続いて２５ｎｇのＷＧＡにより精製されたＤＮＡを含有する１０μＬアリコートを調製するために、Ｑｕｂｉｔ（商標）  ２．０  ＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒでのｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイによって定量化した。
【０１００】
バーコード化再増幅を、Ａｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲキット（Menarini Silicon Biosystems）を用いて５０μｌ容量で行った。各ＰＣＲ反応物は、以下のもので構成される：５μｌのＡｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０倍）、１μＬの配列番号１〜配列番号９６の１つの２５μＭプライマー：
（１）（５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧ［ＢＣ−］ＡＧＴＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧＴ−３’）
（ここで、［ＢＣ］＝バーコード配列である）、１μＬの配列番号９７の２５μＭプライマー：
（２）（５’−ＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧＴ−３’）
、１．７５μｌのＡｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１．２５μｌのＢＳＡ、０．５  Ａｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、３７．５μｌのＡｍｐｌｉ１（商標）水及び２５ｎｇのＷＧＡにより精製されたＤＮＡ。
【０１０１】
Applied Biosystems（商標）の２７２０  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒは以下のように設定した：９５℃で４分間、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間の１サイクル、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間の１０サイクル（２０秒／サイクルで延長）、及び７２℃で７分間の最終伸長。
【０１０２】
図３に再増幅プロセスを概略的に示す。
【０１０３】
バーコード化再増幅したＷＧＡ産物を１．８倍（９０μｌ）のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを用いて精製し、上記の工程に従って３５μｌのＬｏｗ  ＴＥバッファー中で溶出させた。
【０１０４】
３）サイズ選択
Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔアダプターが設けられたフラグメントライブラリーに対応するバーコード化再増幅したＷＧＡ産物を、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（商標）（Agilent）でAgilentのＤＮＡ  ７５００キットによって適格にし、Ｑｕｂｉｔ（商標）  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイキットを用いて定量化し、最終プールを得た。
【０１０５】
異なるＡ−ＬＩＢ−ＢＣ−Ｘアダプターを有する個々の７つのライブラリーを同じ量で合わせることによって等モルプールを作製し、４２μＬの最終容量で３４ｎｇ／μＬの濃度の最終プールを得た。プールの濃度をＱｕｂｉｔ（商標）法によって確認した。
【０１０６】
Ｓｉｚｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ２％プレキャストアガロースゲル（Invitrogen）と組み合わせたＥ−Ｇｅｌ（商標）  ＳｉｚｅＳｅｌｅｃｔ（商標）システムを、製造業者の使用説明書に従って対象のフラグメントのサイズ選択に使用した。
【０１０７】
２０μＬの最終プールをＥ−ｇｅｌの２つのレーンにロードし、サイズ標準（５０ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ、Invitrogen）を用いて３００ｂｐ〜４００ｂｐのセクション範囲をゲルから選択した。
【０１０８】
サイズ選択後に、１．８倍（９０μｌ）のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを用いてクリーンアップを行った。最終ライブラリーを上記の工程に従って３０μｌのＬｏｗ  ＴＥバッファー中で溶出させ、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ高感度チップ（Agilent Technologies）を用いて評価した。
【０１０９】
４）Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭシークエンシング
鋳型調製を、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（商標）  Ｈｉ−Ｑ  ＯＴ２キット−４００ｂｐのユーザーガイドに従って行った。
【０１１０】
簡潔に述べると、ライブラリーフラグメントをＩｏｎ  Ｓｐｈｅｒｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ（ＩＳＰ）上でエマルジョンＰＣＲによりクローン的に増幅した後、鋳型陽性ＩＳＰについて富化した。ＰＧＭエマルジョンＰＣＲ反応を、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（商標）  Ｈｉ−Ｑ  ＯＴ２キット（Life Technologies）を用いて行い、エマルジョン及び増幅物（amplifications）を、Ｉｏｎ  ＯｎｅＴｏｕｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Life Technologies）を用いて生成した。回収後に、増幅されたライブラリーフラグメントを含有するＩＳＰをストレプトアビジンコーティング磁性ビーズに選択的に結合させ、空のＩＳＰを洗浄工程により除去し、鋳型陽性ＩＳＰが収集されるようにライブラリー鎖を変性させることによって富化を行った。
【０１１１】
記載の富化工程は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＥＳシステム（Life Technologies）を用いて達成した。
【０１１２】
Ｉｏｎ  ３１８ｖ２（商標）チップを、「Simplified Ion PGMTM Chip loading with the Ion PGMTM weighted chip bucket」プロトコル説明書（ＭＡＮ０００７５１７）に従ってロードした。
【０１１３】
全てのサンプルを、Ｉｏｎ  ＰＧＭ（商標）  Ｈｉ−Ｑ（商標）  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（Life Technologies）を用い、５２０フローランフォーマットを設定するＩｏｎ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ）（Life Technologies）によって処理した。
【０１１４】
最後に、シークエンシングされたフラグメントを、それらの独自バーコードに基づいて特定のサンプルに割り当てた。
【０１１５】
【表２】
2019514360.tif 000004
2019514360.tif 000005
2019514360.tif 000006
2019514360.tif 000007
2019514360.tif 000008
2019514360.tif 000009
2019514360.tif 000010
2019514360.tif 000011
2019514360.tif 000012
【０１１６】
実施例２：
ＤＲＳ−ＷＧＡ後のＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰｒｏｔｏｎでのＬＰＷＧＳのプロトコル
１．  確定的制限部位全ゲノム増幅（ＤＲＳ−ＷＧＡ）
単一細胞ＤＮＡを、先の実施例に詳述されるようにＡｍｐｌｉ１（商標）  ＷＧＡキット（Menarini Silicon Biosystems）を用い、製造業者の使用説明書に従って増幅した。
【０１１７】
２．  二本鎖ＤＮＡ合成
５μＬのＷＧＡにより増幅されたＤＮＡを、Ａｍｐｌｉ１（商標）  ＲｅＡｍｐ／ｄｓキットを用い、製造プロトコルに従って二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）へと変換した。このプロセスにより、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）分子のｄｓＤＮＡ分子への変換が確実となる。
【０１１８】
３．  ｄｓＤＮＡ産物の精製
６μＬのｄｓＤＮＡ合成産物を、４４μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒを添加することで希釈し、結合していないオリゴヌクレオチド、並びに過剰なヌクレオチド、塩及び酵素を除去するためにＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Beckman Coulter）によって精製した。ビーズを用いたＤＮＡ精製を以下のプロトコルに従って行った。７５μＬ（比率：サンプル体積の１．５倍）のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを各５０μｌのサンプルに添加し、ボルテックスによって混合した。次いで、混合反応物を室温（ＲＴ）で１５分間、マグネット外でインキュベートした後、溶液が透明になり、ペレットが形成されるまで（約５分間）マグネットプレート上に置いた。次いで、上清を除去し、ペレットをかき乱すことなく廃棄し（およそ５μｌが残り得る）、チューブをマグネットプレート上に置いたままでビーズを１５０μＬの新たに作製した７０％ＥｔＯＨで２回洗浄した。残留エタノール溶液を全てチューブの底から除去した後、ビーズペレットを短時間風乾した。２２μＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ（ｐＨ８．０）及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｌｏｗ  ＴＥ）バッファーを添加し、混合反応物を室温で２分間、マグネットプレート外でインキュベートし、続いてマグネットプレート上で５分間のインキュベーションを行った。２０μＬの溶出物を新たなチューブに移した。
【０１１９】
そうでなければ、平均サイズ前後の一様な分布のフラグメントを生じさせるために代替工程３（下記）を用いた。
【０１２０】
代替工程３）ｄｓＤＮＡ産物の二重精製
ＳＰＲＩ選択は、次世代シークエンシングのためのフラグメントライブラリー調製の核酸サイズ選択を促進し、単純化するＳＰＲＩベースのケミストリーである。この工程を工程３に代替して行うことができた。６μＬのｄｓＤＮＡ合成産物を、４４μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒを添加することで希釈し、結合していないオリゴヌクレオチド、並びに過剰なヌクレオチド、塩及び酵素を除去し、平均サイズ前後のフラグメントの一様な分布を生じさせるためにＳＰＲＩ選択ビーズ（Beckman Coulter）によって精製した。ＳＰＲＩによるＤＮＡ精製を以下のプロトコルに従って行った。３７．５μＬ（比率：サンプル体積の０．７５倍）のＳＰＲＩ選択ビーズを各５０μｌのサンプルに添加し、ボルテックスによって混合した。次いで、混合反応物をＲＴで１５分間、マグネット外でインキュベートした後、溶液が透明になり、ペレットが形成されるまで（約５分間）マグネットプレート上に置いた。次いで、上清を回収し、新たなチューブに移した。２回目の精製を、３７．５μＬのＳＰＲＩ選択ビーズを上清に添加して行い、ボルテックスによって混合した。次いで、混合反応物をＲＴで１５分間、マグネット外でインキュベートした後、溶液が透明になり、ペレットが形成されるまで（約５分間）マグネットプレート上に置いた。次いで、上清を除去し、ペレットをかき乱すことなく廃棄し（およそ５μｌが残り得る）、チューブをマグネットプレート上に置いたままでビーズを１５０μＬの新たに作製した８０％ＥｔＯＨで２回洗浄した。残留エタノール溶液を全てチューブの底から除去した後、ビーズペレットを短時間風乾した。２２μＬのＬｏｗ  ＴＥバッファーを添加し、混合反応物を室温で２分間、マグネット外でインキュベートし、続いてマグネットプレート上で５分間のインキュベーションを行った。２０μＬの溶出物を新たなチューブに移した。
【０１２１】
４．  バーコード化再増幅
バーコード化再増幅を、Ａｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲキット（Menarini Silicon Biosystems）を用いて５０μｌ容量で行った。各ＰＣＲ反応物は、以下のもので構成される：５μｌのＡｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０倍）、１μｌの配列番号１〜配列番号９６の１つの２５μＭプライマー：
（１）（５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣＴＣＡＧ［ＢＣ］ＡＧＴＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧＴ−３’）
（ここで、［ＢＣ］＝バーコード配列である）、１μｌの配列番号９７の２５μＭプライマー：
（２）（５’−ＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧＧＧＣＡＧＴＣＧＧＴＧＡＴＡＧＴＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧＴ−３’）
、１．７５μｌのＡｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１．２５μｌのＢＳＡ、０．５  Ａｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＦＡＳＴ  ｓｔａｒｔ）、３７．５μｌのＡｍｐｌｉ１（商標）水及び２μｌのｄｓにより精製されたＤＮＡ。これらは、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭに使用される同じプライマーであり、上記に示したＩｏｎ  ＴｏｒｒｅｎｔライブラリーのためのＮＧＳ再増幅プライマー（ＰＧＭ／ＰｒｏｔｏｎのためのＤＲＳ  ＷＧＡ）の対応する表に報告する。
【０１２２】
Applied Biosystems（商標）の２７２０  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒは以下のように設定した：９５℃で４分間、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で１５秒間の１１サイクル、その後７２℃で３０秒間の最終伸長。
【０１２３】
５．  バーコード化再増幅したｄｓＤＮＡ産物の精製
バーコード化再増幅したｄｓＤＮＡ産物を、１．５倍（７５μｌ）の比率のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを用い、上記の工程３に従って精製し、３５μｌのＬｏｗ  ＴＥバッファー中で溶出させた。溶出物を新たなチューブに移し、続いてＱｕｂｉｔ（商標）  ２．０  ＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒでｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイによって定量化し、最終等モルサンプルプールを得た。異なるＡ−ＬＩＢ−ＢＣ−Ｘアダプターを有する各々のライブラリーを同じ量で合わせることによって等モルプールを作製し、４２μＬの最終容量で３４ｎｇ／μＬの濃度の最終プールを得た。
【０１２４】
６．  サイズ選択
Ｓｉｚｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ２％プレキャストアガロースゲル（Invitrogen）と組み合わせたＥ−Ｇｅｌ（商標）  ＳｉｚｅＳｅｌｅｃｔ（商標）システムを、製造業者の使用説明書に従って対象のフラグメントのサイズ選択に使用した。
【０１２５】
２０μＬの最終プールをＥ−ｇｅｌの２つのレーンにロードし、サイズ標準（５０ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ、Invitrogen）を用いて３００ｂｐ〜４００ｂｐのセクション範囲をゲルから選択した。サイズ選択後に、上記の工程３に従って１．８倍（９０μｌ）のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを用いてクリーンアップを行った。最終ライブラリーを３０μｌのＬｏｗ  ＴＥバッファー中で溶出させた。
【０１２６】
７．  Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｎシークエンシング
精製工程後の等モルプールを、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（商標）（Agilent）でAgilentのＤＮＡ高感度キットによって適格にし、Ｑｕｂｉｔ（商標）  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイキットを用いて定量化した。最後に、等モルプールを１００ｐＭの最終濃度まで希釈した。
【０１２７】
鋳型調製をＩｏｎ  ＰＩ（商標）  Ｈｉ−Ｑ（商標）  Ｃｈｅｆのユーザーガイドに従って行った。Ｉｏｎ  Ｃｈｅｆ（商標）システムは、Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（商標）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで用いられる自動化ハイスループット鋳型調製及びチップのローディングをもたらす。Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（商標）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにより、Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ（商標）  Ｈｉ−Ｑ（商標）シークエンシングキット（Life Technologies）を用いて、Ｉｏｎ  ＰＩ（商標）チップ上にロードされたライブラリーの自動化ハイスループットシークエンシングを行う。最後に、シークエンシングしたフラグメントを、それらの独自バーコードに基づいて特定のサンプルに割り当てた。
【０１２８】
実施例３：
Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑでのローパス全ゲノムシークエンシングのプロトコル
プロトコル１
確定的制限部位全ゲノム増幅（ＤＲＳ−ＷＧＡ）：
単一細胞ＤＮＡを、Ａｍｐｌｉ１（商標）  ＷＧＡキット（Silicon Biosystems）を用い、製造業者の使用説明書に従って増幅した。５μＬのＷＧＡにより増幅されたＤＮＡを、５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒの添加によって希釈し、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰシステムを用いて精製した（比率１．８倍）。ＤＮＡを１２．５μＬ中で溶出させ、Ｑｕｂｉｔ（商標）  ２．０  ＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒでのｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイによって定量化した。
【０１２９】
バーコード化再増幅
バーコード化再増幅を、５０μｌの容量でＡｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲキット（Menarini Silicon Biosystems）を用いて図４に概略的に示されるように行った。各ＰＣＲ反応物は、以下のもので構成される：５μｌのＡｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０倍）、１μｌの配列番号１９５〜配列番号２０２の１つのプライマー（２５μＭ）、１μｌの配列番号２０３〜配列番号２１４の１つのプライマー（２５μＭ）、１．７５μｌのＡｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１．２５μｌのＢＳＡ、０．５  Ａｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２５ｎｇのＷＧＡにより精製されたＤＮＡ、及び５０μｌの最終容量に達するまでのＡｍｐｌｉ１（商標）水。
【０１３０】
Applied Biosystems（商標）の２７２０  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒは以下のように設定した：９５℃で４分間、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間の１サイクル、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間の１０サイクル（２０秒／サイクルで延長）、及び７２℃で７分間の最終伸長。
【０１３１】
次いで、バーコード化再増幅したＷＧＡ産物（リストＳＥＱ＿ＩＤｓ＿ＩＬＬ＿ＰＲ１から選び出したＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングアダプター配列を含有する）を、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（商標）でAgilentのＤＮＡ  ７５００キットによって適格にし、Ｑｕｂｉｔ（商標）  ２．０  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒによって定量化した。
【０１３２】
サイズ選択
次いで、ライブラリーを等モル濃度で合わせ、濃度２８．６ｎｇ／μＬ及び最終容量１００μＬで得られるプールを、ＳＰＲＩビーズを用いた二重精製によってサイズ選択した。簡潔に述べると、ＳＰＲＩビーズをＰＣＲグレード水で２倍希釈した。１６０μＬの希釈ＳＰＲＩビーズを１００μｌのプールに添加した。インキュベーション後に、２５μＬの上清を新たなバイアルに移し、３０μＬの希釈ＳＰＲＩビーズを添加した。ＤＮＡを２０μＬのｌｏｗ  ＴＥ中で溶出させた。フラグメントサイズを２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ高感度チップ（Agilent Technologies）によって検証し、ライブラリー定量化を、Ｋａｐａ  Ｌｉｂｒａｒｙ定量化キットを用いるｑＰＣＲによって行った。
【０１３３】
ＭｉＳｅｑシークエンシング
４ｎＭのサイズ選択プールを、ＮａＯＨ（０．１Ｎに等しいＮａＯＨ最終濃度）で５分間変性させた。次いで、変性させたサンプルをＨＴ１で希釈して、１ｍＭ  ＮａＯＨ中の２０ｐＭ変性ライブラリーを得た。５７０μＬの２０ｐＭ変性ライブラリー及び３０μｌの２０ｐＭ変性ＰｈｉＸ対照をＭｉＳｅｑ（Illumina）でロードした。
【０１３４】
１５０塩基のシングルエンドリードを、IlluminaのＭｉＳｅｑのｖ３ケミストリーを用いて生成した。
【０１３５】
配列番号リスト＿第１プライマー＿［ＩＬＬＵＭＩＮＡ／ＤＲＳ−ＷＧＡ］プロトコル１
以下の表に、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットホームに適合するプライマーＤＲＳ−ＷＧＡの構造（５’→３’方向の配列、５’及び３’を除外）を示す。
【０１３６】
【表３】
2019514360.tif 000013
【０１３７】
以下の表に最終プライマー配列を報告する。
【０１３８】
【表４】
2019514360.tif 000014
【０１３９】
配列番号リスト＿第１プライマー＿［ＩＬＬＵＭＩＮＡ／ＭＡＬＢＡＣ］プロトコル１
以下の表に、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットホームに適合するプライマーＭＡＬＢＡＣ−ＷＧＡの構造（５’→３’方向の配列、５’及び３’を除外）を示す。
【０１４０】
【表５】
2019514360.tif 000015
【０１４１】
以下の表に最終プライマー配列を報告する。
【０１４２】
【表６】
2019514360.tif 000016
【０１４３】
プロトコル１の制限
Ｉｌｌｕｍｉｎａプロトコル１によって得られるライブラリーは、考え得る全てのＰ５／Ｐ７アダプター組合せ対を有する二本鎖ｐＷＧＡ  ｌｉｂである。
【０１４４】
フローセル内で同種のシークエンシングアダプター（Ｐ５／Ｐ５ｒｃ、Ｐ７ｒｃ／Ｐ７）を有するフラグメントによってもハイブリダイゼーションが生じたため、クラスター密度及び／又はクラスターの品質は、Ｉｌｌｕｍｉｎａプロトコル２の場合と比較して僅かに低くなる可能性がある。
【０１４５】
プロトコル２
本発明による第２のプロトコルを例として提示する。本プロトコルは、ｐＷＧＡｌｉｂから両方のシークエンシングアダプター（Ｐ５／Ｐ７）を含むフラグメントのみを選択し、同種のシークエンシングアダプター（Ｐ５／Ｐ５ｒｃ、Ｐ７ｒｃ／Ｐ７）を有するフラグメントを切り捨てることによってＩｌｌｕｍｉｎａフローセルにおけるクラスターの品質を高めるために有利であり得る。
【０１４６】
図４に概略的に示されるプロトコル２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ／ＤＲＳ＿ＷＧＡ）のワークフローの説明
ＷＧＡにより増幅されたＤＮＡ産物は全て、長さが異なり、特定のタグ：個々のｓｓＤＮＡ分子の各々の５’末端のＬＩＢ配列及び３’末端の相補的なＬＩＢ配列（図面中に青色で示される）を有する分子によって構成される。
【０１４７】
本発明によると、両方の逆相補ＬＩＢ配列がＮＧＳ  Ｒｅ−Ａｍｐ（再増幅）プライマーの標的である。
【０１４８】
それぞれ図面中で緑色−黄色−青色及び赤色−ピンク色−青色の２つのタイプのプライマー：ＬＰｂ＿ＤＩ＿Ｄ５０Ｘ（配列番号２３５〜配列番号２４２の範囲のプライマー）及びビオチン化プライマーＬＰｂ＿ＤＩ＿Ｄ７０Ｘ（配列番号２４３〜配列番号２５４の範囲のプライマー）を設計した。
【０１４９】
予測されるように、両方のタイプのプライマーがＬＩＢ配列及び相補的なＬＩＢ配列を結合することができ、実際のところ、図面に示されるように３つのタイプのアンプリコンがＮＧＳ  Ｒｅ−Ａｍｐプロセスによって生じる。
【０１５０】
本発明による本プロトコルは、５’末端にビオチンタグを得るＬＰｂ＿ＤＩ＿Ｄ７０Ｘ（図面中にＰ７ｒｃアダプターとして示される）によってもたらされる。この特定のタグを用いて、図面に示されるようにビオチンタグを有しない唯一のフラグメント：
５’−Ｐ５−ｉ５−ＬＩＢ−挿入断片−ＬＩＢ相補鎖−ｉ７−Ｐ７−３’
をストレプトアビジンビーズにより選択する。
【０１５１】
望ましい構成のｓｓＤＮＡを得るために（単純化のためにリードプライマーセクションを省略すると、望ましいｓｓＤＮＡは、５’−Ｐ５−ｉ５−ｎｎｎｎｎ−ｉ７−Ｐ７−３’である）、プライマーは以下のようなものであるとする：
（１ＰＲ）５’−Ｐ５−ｉ５−ＬＩＢ−３’、及び、
（２ＰＲ）ビオチン−５’−Ｐ７ｒｃ−ｉ７ｒｃ−ＬＩＢ−３’（以下ではビオチンを説明の単純化のために省略するが、Ｐ７ｒｃで始まるフラグメントの全てに、５’末端にのみ存在することが明らかである）。
【０１５２】
再増幅により、以下のものが得られる：
開始：（ＷＧＡ  ｓｓＤＮＡフラグメントは全て、５’−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−３’として形成される）
伸長サイクルｎ＝１）：
１．５  ５’−Ｐ５−ｉ５−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−３’、
１．７  ５’−Ｐ７ｒｃ−ｉ７ｒｃ−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−３’
２＾ｎのフラグメント（０％シークエンシング可能）
サイクルｎ＝２）：
２．５．５  ５’−Ｐ５−ｉ５−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ５ｒｃ−Ｐ５ｒｃ−３’
２．５．７  ５’−Ｐ７ｒｃ−ｉ７ｒｃ−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ５ｒｃ−Ｐ５ｒｃ−３’
２．７．５  ５’−Ｐ５−ｉ５−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ７−Ｐ７−３’
２．７．７  ５’−Ｐ７ｒｃ−ｉ７ｒｃ−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ７−Ｐ７−３’
２＾ｎ＝４のフラグメント（２５％のシークエンシング可能なフラグメント）
サイクルｎ＝３）：
２．５．５．５  ５’−Ｐ５−ｉ５−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ５ｒｃ−Ｐ５ｒｃ−３’＝２．５．５
２．５．５．７  ５’−Ｐ７ｒｃ−ｉ７ｒｃ−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ５ｒｃ−Ｐ５ｒｃ−３’＝２．５．７
２．５．７．５  ５’−Ｐ５−ｉ５−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ７−Ｐ７−３’＝２．７．５
２．５．７．７  ５’−Ｐ７ｒｃ−ｉ７ｒｃ−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ７−Ｐ７−３’＝２．７．７
２．７．５．５  ５’−Ｐ５−ｉ５−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ５ｒｃ−Ｐ５ｒｃ−３’＝２．５．５
２．７．５．７  ５’−Ｐ７ｒｃ−ｉ７ｒｃ−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ５ｒｃ−Ｐ５ｒｃ−３’＝２．５．７
２．７．７．５  ５’−Ｐ５−ｉ５−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ７−Ｐ７−３’＝２．７．５
２．７．７．７  ５’−Ｐ７ｒｃ−ｉ７ｒｃ−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ７−Ｐ７−３’＝２．７．７
２＾ｎ＝８のフラグメント（２５％のシークエンシング可能なフラグメント）  シークエンシング可能なフラグメント＝２＾ｎ／４＝２＾ｎ／２＾２＝２＾（ｎ−２）
サイクルｍ）  ．．．  ２＾（ｍ−２）  シークエンシング可能
【０１５３】
最終的に、以下の４つのタイプのフラグメントが指数関数的増幅後に形成される。
２．５．５  ５’−Ｐ５−ｉ５−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ５ｒｃ−Ｐ５ｒｃ−３’（→全てのビオチン化フラグメントが常磁性ビーズ上に保持される一方で第１の液体除去時に洗い流されるか、又は洗い流されない場合には、フローセル内の唯一の結合部位に連結するが、架橋増幅が起こらないことからシークエンシングクラスターを生成しない）
２．５．７  ビオチン−５’−Ｐ７ｒｃ−ｉ７ｒｃ−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ５ｒｃ−Ｐ５ｒｃ−３’（→ストレプトアビジンコーティングビーズによって除去される）
２．７．５  ５’−Ｐ５−ｉ５−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ７−Ｐ７−３’（→シークエンシング可能）
２．７．７  ビオチン−５’−Ｐ７ｒｃ−ｉ７ｒｃ−ＬＩＢ−ｎｎｎ−ＬＩＢｒｃ−ｉ７−Ｐ７−３’（→ストレプトアビジンコーティングビーズによって除去される）。
【０１５４】
実施例４：
１．確定的制限部位全ゲノム増幅（ＤＲＳ−ＷＧＡ）
単一細胞ＤＮＡを、Ａｍｐｌｉ１（商標）  ＷＧＡキット（Silicon Biosystems）を用い、製造業者の使用説明書に従って増幅した。
【０１５５】
２．ＷＧＡ産物の再増幅
５μＬのＷＧＡにより増幅されたＤＮＡを、５μＬのＮｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒを添加することによって希釈し、結合していないオリゴ、並びに過剰なヌクレオチド、塩及び酵素を除去するためにＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰシステム（Beckman Coulter）を用いて精製する。
【０１５６】
ビーズを用いたＤＮＡ精製を以下のプロトコルに従って行った。１８μＬのビーズ（サンプル体積の１．８倍）を各サンプルに添加した。ビーズ及び反応産物を短時間のボルテックスにより混合した後、遠沈して液滴を収集した。次いで、混合反応物を室温で１５分間、マグネット外でインキュベートした後、ＤｙｎａＭａｇ−９６  Ｓｉｄｅマグネット（Life Technologies）に移し、５分間静置した。上清を廃棄し、ビーズを１５０μＬの新たに作製した８０％ＥｔＯＨで洗浄した。２回目のＥｔＯＨ洗浄の後、ビーズをマグネット上で５分〜１０分間乾燥させた。次いで、乾燥ビーズをマグネット外で１５μＬのＬｏｗ  ＴＥバッファーに再懸濁し、１０分間インキュベートし、続いてマグネット上で５分間のインキュベーションを行った。１２マイクロリットルの溶出物を別のチューブに移し、続いて２５ｎｇのＷＧＡにより精製されたＤＮＡを含有する１０μＬアリコートを調製するために、Ｑｕｂｉｔ（商標）  ２．０  ＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒでのｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイによって定量化した。
【０１５７】
バーコード化再増幅を、５０μｌの容量でＡｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲキット（Silicon Biosystems）を用いて行った。各ＰＣＲ反応物は、以下のように構成される：５μｌのＡｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０倍）、１μＬの配列番号２３５〜配列番号２４２の１つの２５μＭプライマー：
（３）５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ［ｉ５］ＧＣＴＣＴＣＣＧＴＡＧＴＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧＴＴＡＡ３’）
１μＬの配列番号２４３〜配列番号２５４の１つの２５μＭプライマー：
（４）（５’／Ｂｉｏｓｇ／ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ［ｉ７］ＧＣＴＣＡＣＣＧＡＡＧＴＧＧＧＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＣＡＧＴＴＡＡ３’）
、１．７５μｌのＡｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲ  ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）、１．２５μｌのＢＳＡ、０．５  Ａｍｐｌｉ１（商標）  ＰＣＲ  Ｔａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及び２５ｎｇのＷＧＡにより精製されたＤＮＡ、及び３７．５μｌのＡｍｐｌｉ１（商標）水。
【０１５８】
Applied Biosystems（商標）の２７２０  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒは以下のように設定した：９５℃で４分間、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間の１サイクル、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で２分間の１０サイクル（２０秒／サイクルで延長）、及び７２℃で７分間の最終伸長。
【０１５９】
３）サイズ選択
Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプターが設けられたフラグメントライブラリーに対応するバーコード化再増幅したＷＧＡ産物を、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（商標）（Agilent）でAgilentのＤＮＡ  ７５００キットによって適格にし、Ｑｕｂｉｔ（商標）  ｄｓＤＮＡ  ＨＳアッセイキットを用いて定量化し、最終プールを得た。
【０１６０】
異なるＬＰｂ＿ＤＩデュアルインデックスアダプターを有する個々のライブラリーを同じ量で合わせることによって等モルプールを作製し、５０μＬの最終容量で３５ｎｇ／μＬの濃度の最終プールを得た。プールの濃度をＱｕｂｉｔ（商標）法によって確認した。
【０１６１】
２００ｂｐ〜１Ｋｂのフラグメントセクション範囲を、ＳＰＲＩビーズシステム（Beckman Coulter）をそれぞれＲ：０．４７×及びＬ：０．８５×の比率で用いる二重精製によって選択した。大きなＤＮＡフラグメントを除去するために８２μＬの希釈ＳＰＲＩ（４２μＬのＳＰＲＩビーズ＋４２μＬのＰＣＲグレード水）を添加し、小さなＤＮＡフラグメントを除去するために３４．２μＬの不希釈ＳＰＲＩビーズを上清に添加した。
【０１６２】
最終ライブラリーを５０μｌのＬｏｗ  ＴＥバッファー中で溶出させ、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ高感度チップ（Agilent Technologies）を用いて評価した。
【０１６３】
４）異種Ｐ５／Ｐ７アダプター一本鎖ライブラリー選択
フラグメント選択を、Ｐ５／Ｐ７アダプターを含有する非ビオチン化ＤＮＡのみを解離させるためにＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）  ＭｙＯｎｅ（商標）  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１システムを用いて行ったが、これは熱又はＮａＯＨをそれぞれ用いて得ることができた。２つの方法を下記に説明する。
【０１６４】
１．５ｍｌチューブ中の２０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）  ＭｙＯｎｅ（商標）  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１を、１倍Ｂ＆Ｗ溶液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；２Ｍ  ＮａＣｌ）で２回洗浄した。
【０１６５】
５０μＬの分画プールライブラリーをＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）  ＭｙＯｎｅ（商標）  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃ１ビーズに添加し、完全に混合するために５分間隔でピペッティングしながら１５分間インキュベートした。ＤＮＡでコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）を５０μＬの１倍ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）で２回洗浄し、新たな５０μＬの１倍ＳＳＣを用いてビーズを再懸濁した。
【０１６６】
９５℃で５分間のインキュベーションの後、チューブをマグネットプレートに１分間置き、５０μＬの上清を新たなチューブに移し、氷上で５分間インキュベートした。
【０１６７】
この点で、上清はＰ５／Ｐ７アダプターを有する非ビオチン化ＤＮＡ鎖ライブラリーを含有する。
【０１６８】
洗浄がより厳しくなるように、ストレプトアビジン選択手順を再度繰り返した。
【０１６９】
熱を用いる代わりに、ＤＮＡでコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）の洗浄を、２０μｌの新たに調製した０．１５Ｍ  ＮａＯＨを用いて再懸濁することによって行うことができる。
【０１７０】
室温で１０分間のインキュベーションの後、チューブをマグネット内に１分〜２分間静置し、上清を新たなチューブに移した。
【０１７１】
上清は非ビオチン化ＤＮＡ鎖を含有する。一本鎖ライブラリーを、２．２μＬの１０倍ＴＥ（ｐＨ７．５）及び１．３μＬの１．２５Ｍ酢酸を添加することによって中和した。
【０１７２】
Ｑｕｂｉｔ（商標）  ｓｓＤＮＡアッセイキットによって定量化された最終ライブラリー濃度は、２５μＭに相当する５ｎｇ／μＬであった。
【０１７３】
５）ＭｉＳｅｑシークエンシング
４ｎＭの最終プールをＮａＯＨ（０．１Ｎに等しいＮａＯＨ最終濃度）で５分間変性させた。次いで、変性サンプルをＨＴ１で希釈し、１ｍＭ  ＮａＯＨ中の２０ｐＭ変性ライブラリーを得た。５７０μＬの２０ｐＭ変性ライブラリー及び３０μｌの２０ｐＭ変性ＰｈｉＸ対照をＭｉＳｅｑ（Illumina）でロードした。
【０１７４】
１５０塩基のシングルエンドリードを、IlluminaのＭｉＳｅｑのｖ３ケミストリーを用い、標準リード１プライマー及び標準プライマーインデックス１を、それぞれ６００μＬの配列番号２５５のプライマー（カスタムリード１プライマー）及び６００μＬの配列番号２５６又は配列番号２５８のプライマー（カスタムプライマーインデックス１ａ（ｉ７）及び１ｂ（ｉ７））と交換して生成した。
【０１７５】
配列番号リスト＿第１プライマー＿［ＩＬＬＵＭＩＮＡ＿ＤＲＳ＿ＷＧＡ］プロトコル２
以下の表に、Ｉｌｌｕｍｉｎａプロトコル２の最終プライマー配列を報告する。
【０１７６】
【表７】
2019514360.tif 000017
【０１７７】
配列番号リスト＿第１プライマー＿［ＩＬＬＵＭＩＮＡ／ＭＡＬＢＡＣ］プロトコル２
以下の表に、出発物質がＷＧＡ−ＭＡＬＢＡＣライブラリーに由来する場合に適合したＩｌｌｕｍｉｎａ最終プライマー配列を報告する。
【０１７８】
【表８】
2019514360.tif 000018
【０１７９】
本発明によると、図４に示されるように両方のＬＩＢ逆相補鎖がＮＧＳ  Ｒｅ−Ａｍｐ（再増幅）プライマーの標的である。さらに、リードが同じヌクレオチドで開始せず、シークエンシング性能が影響を受けるか、又はマトリックス、フェージング及びプレフェージングの算出のためのより多様なクラスターセットを確実にする高濃度スパイクイン（spike-in）の使用が回避される可能性があることから、ライブラリーの複雑さを増大するために、カスタムリード１シークエンシングプライマー（配列番号２５５）を設計した。図４に示されるように、カスタムリード１シークエンシングプライマー（配列番号２５５）はＬＩＢ配列を含有し、ＬＩＢ逆相補配列に相補的である。
【０１８０】
さらに、ＮＧＳ  Ｒｅ−Ａｍｐ（再増幅）産物は、インデックス１を読み取るためにＩｌｌｕｍｉｎａシステムに用いられるカノニカル配列を有さず、この理由から、インデックスｉ７の正確な読取りを可能にするためにカスタムシークエンシングプライマーインデックス１（ｉ７）（配列番号２５６又は配列番号２５８）を使用する必要がある。カスタムシークエンシングプライマーインデックス１が逆相補的ＬＩＢ配列を含有することに注目すべきである。
【０１８１】
手順ＰＧＭ／Ｐｒｏｔｏｎ及びＩｌｌｕｍｉｎａプロトコル１／２ワークフローを含む上記の全ての実施例は、上記表に挙げられる適合するプライマーＭＡＬＢＡＣ（配列番号９８〜配列番号１９４及び配列番号２１５〜配列番号２３４及び配列番号２５９〜配列番号２８１）を用いて行うことができる。
【０１８２】
データ分析
シークエンシングリードを、ＢＷＡ  ＭＥＭアルゴリズム（Li H. and Durbin R., 2010）を用いてｈｇ１９ヒト参照ゲノムにアラインメントした。ＰＣＲ重複、二次／補助／ＱＣ不合格（not-passing-QC）アラインメント及びｍｕｌｔｉｍａｐｐｅｒリードを、Ｐｉｃａｒｄ  ＭａｒｋＤｕｐｌｉｃａｔｅｓ（http://broadinstitute.github.io/picard/）及びｓａｍｔｏｏｌｓ（Li H. et al, 2009）を用いてフィルタリングした。カバレッジ分析を、ＢＥＤＴｏｏｌｓ（Quinlan A. et al, 2010）を用いて行った。
【０１８３】
Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＦＲＥＥＣ（Boeva V. et al., 2011）アルゴリズムを用いて、対照サンプルを用いずにコピー数コールを得た。リード数をＧＣ含量によって補正し、マッピング可能性（mappability）（ｕｎｉｑＭａｔｃｈオプション）及びウィンドウサイズを、変動係数＝０．０６を用いるソフトウェアによって決定した。倍数性を２に設定し、汚染調整は用いなかった。
【０１８４】
ＣＮＶプロファイルのプロットを、図６〜図９に示されるようにカスタムｐｙｔｈｏｎスクリプトを用いて得た。
【０１８５】
本発明をＡｍｐｌｉ１  ＷＧＡの方法のみを参照して説明したが、記載の技法は、当業者には明白であるように、変更すべき点を変更して、自己相補的５’及び３’領域を有するライブラリーを含む任意の他の種類のＷＧＡ（例えば、ＭＡＬＢＡＣ）にも明らかに適用される。
【図１】
2019514360.tif 000019
【図２】
2019514360.tif 000020
【図３】
2019514360.tif 000021
【図４】
2019514360.tif 000022
【図５】
2019514360.tif 000023
【図６】
2019514360.tif 000024
【図７】
2019514360.tif 000025
【図８】
2019514360.tif 000026
【図９】
2019514360.tif 000027
【配列表】
2019514360000001.app
【国際調査報告】
2019514360.tif 000028
2019514360.tif 000029
2019514360.tif 000030
2019514360.tif 000031