(57)【要約】  生体試料中の核酸分子を検出する方法は、核酸分子を増幅して単一の５’テールを持つアンプリコンを生成すること、および前記５’テールをセンサー表面の複数の捕捉プローブのうちの１つに結合することを含む。前記アンプリコンは一本鎖分子に変換され、標的特異性の触媒クラスターは前記一本鎖分子に結合される。前記触媒クラスターは、前記標的核酸を検出するために金属化される。
2019516408.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
離間配置されセンサ表面に結合した第１の電極および第２の電極並びに、前記第１の電極と前記第２の電極との間の前記センサ表面に結合した複数の捕捉プローブを含むセンサを用いて、試料中の標的核酸分子を検出する方法であって、
５’テールを持つ第１のプライマーおよび５’テールを持たない第２のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して核酸分子増幅を実施し、５’テールを持つ第１の鎖およびテールを持たない第２の鎖を備える複数の二本鎖アンプリコンを生成すること、
前記複数のアンプリコンを前記複数の捕捉プローブにハイブリダイズすること、
前記複数のアンプリコンを複数の一本鎖分子に変換すること、
前記複数の一本鎖分子のそれぞれの内部区画に触媒クラスターを結合すること、
前記触媒クラスターがその表面に結合した前記複数の一本鎖分子を金属または金属合金と接触させて、前記金属または金属合金を前記触媒クラスターの表面に析出させること、および
前記電極間を試料中の前記標的核酸分子の存在を示す電流が流れるかどうかを判定すること
を含む方法。
【請求項２】
前記複数のアンプリコンの前記複数の一本鎖分子への変換は、エキソヌクレアーゼを用いて前記テールを持たない第２の鎖を消化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記触媒クラスターは、触媒金クラスターを含み、前記金属は金を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに前記アンプリコンの前記第１鎖の内部領域に結合する標的特異性触媒クラスターを形成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記触媒クラスターは、それに結合したアダプターオリゴヌクレオチドを持つ汎用クラスターである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記汎用クラスターは、それに結合した複数のオリゴヌクレオチドを持ち、各オリゴヌクレオチドは、異なるアンプリコンを標的とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記触媒クラスターの結合は、複数の触媒クラスターをそれぞれの一本鎖分子の内部区画に結合することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
離間配置されセンサ表面に結合した第１の電極および第２の電極、ならびに前記第１の電極と前記第２の電極との間の前記センサ表面に結合した複数の捕捉プローブを含む核酸分子検出器を作製する方法であって、
生体試料を受け取ること、
前記生体試料内の核酸分子を増幅して、単一の５’テールを持つアンプリコンを生成すること、
前記アンプリコンの前記５’テールを前記複数の捕捉プローブのうち１つに結合すること、
エキソヌクレアーゼを用い前記アンプリコンの一本鎖を消化して、前記アンプリコンを一本鎖分子に変換すること、
標的特異性の触媒クラスターを合成すること、および
前記触媒クラスターを前記アンプリコンの前記一本鎖分子と接触させて、前記標的特異性の触媒クラスターを前記一本鎖分子の内部領域に結合することを含む、方法。
【請求項９】
前記触媒クラスターは、触媒金クラスターを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的特異性の触媒クラスターの合成は、ベース汎用クラスターをアダプターオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして、複数のアダプターオリゴヌクレオチドがそれに結合した触媒クラスターを生成することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記アダプターオリゴヌクレオチドは、クラスター結合配列およびアンプリコン特異性の結合配列を持つ、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベース汎用クラスターのハイブリダイズは、前記汎用クラスターを複数のアダプターオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることを含み、アダプターオリゴヌクレオチドのそれぞれは、異なるアンプリコンを標的とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子の増幅は、５’テールを持つ第１のプライマーおよび５’テールを持たない第２のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の捕捉プローブのそれぞれは、分子を前記センサ表面に固定する官能化した酸化物表面を含む、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１６年５月１８日に出願の「ＰＣＲ産物のネステッド検出」と題する米国仮特許出願第６２／３３７，９１７号の利益および優先権を主張し、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本明細書に開示される主題は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスに関し、特にＰＣＲ産物のネステッド（入れ子）検出の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＰＣＲは、微量のＤＮＡ断片を分析に十分な量に複製かつ増幅することができる技術である。したがってＰＣＲは、ＤＮＡの配列決定や試料中の病原体の検出のような、試料中のＤＮＡ断片の検出などの様々な用途に使用することができる。
【０００４】
操作時に、ＰＣＲは、ＤＮＡを溶融または変性させる一連の反復する温度変化すなわちサイクルの使用を伴い、その後に鋳型として作用する２本の一本鎖ＤＮＡ分子を生じる。ＤＮＡポリメラーゼとともにＤＮＡの標的領域に相補的な配列を含む短いＤＮＡ断片であるプライマーを使用して、特定のＤＮＡ領域または配列の増幅を選択的に繰り返す。典型的には、２つのプライマーが反応混合物中に含まれる。プライマーは一本鎖配列であるが、ＤＮＡの標的領域の長さより短い。プライマーはＤＮＡ鎖の相補的部分に結合し、ＤＮＡポリメラーゼは、プライマー／ＤＮＡハイブリッドに結合して、ＤＮＡ鋳型鎖に相補的な新規のＤＮＡ鎖のＤＮＡ生成を開始する。このプロセスは、ＤＮＡ鎖の複数のコピーが生成されるまで繰り返される。
【０００５】
しかしながら、いくつかの例では、プライマーは、プライマーの配列がＤＮＡに対してではなくて相互に結合して、プライマー二量体として知られる二量体または人工増幅産物の短鎖を生じるヘテロ二量体化を受ける可能性がある。これらの人工産物は、ＰＣＲの初期段階で生成し、それに続いて増幅される可能性がある。
【０００６】
特定の標的核酸分子を検出する電子センサは、一組の電極対間のセンサ表面に固定化された捕捉プローブを含むことができる。標的核酸分子を検出するシステムおよび方法の一例は、米国特許第７，６４５，５７４号に記載され、その全体が参照により本明細書内に組み込まれる。ＰＣＲに続いて、増幅産物または標的化された病原体配列に由来するアンプリコンは、内部複製ブロックにより作製されたプライマーの使用による増幅プロセス中に、分子内に組み込まれた５’一本鎖テールを介してプローブによって捕捉される。増幅産物の他方端にタグ付けされたユニバーサル５’テールに対する相補的配列を持つ第２の捕捉オリゴヌクレオチドで官能化されたナノ金クラスターは、捕捉された増幅産物を持つセンサー部位のみへの局在的ハイブリダイズ化に使用される。引き続いて、金の現像剤での短時間処理を用いて、ナノ金クラスターは、金属化のための触媒核生成部位として働き、完全な導電性膜の現像に向け段階的に反応する。金膜の存在により、電極間の間隙は短絡し、抵抗の低下が測定され、それにより捕捉された増幅産物の存在を判定することが可能となる。しかしながら、必須の５’テールを持つ両方のプライマーとともに偽性核酸分子に由来するプライマーのみの人工産物または存在しそうなアンプリコンは、ＤＮＡ標的が偽陽性の結果をもたらし得るのと同様の過程で、そのセンサと反応する可能性がある。
【本発明の概要】
【０００７】
生体試料中の核酸分子を検出する方法は、核酸分子を増幅して単一の５’テールを持つアンプリコンを生成し、センサ表面の複数の捕捉プローブのうちの１つに５’テールをハイブリダイズすることを含む。そのアンプリコンは、一本鎖分子に変換され、標的特異性の触媒クラスターがその一本鎖分子に結合する。その触媒クラスターは、標的核酸を検出するために金属化される。
【０００８】
一態様において、センサを用いて試料中の標的核酸分子を検出する方法が開示される。センサは、離間配置されたセンサ表面に結合された第１電極および第２電極、および第１電極と第２電極との間のセンサ表面に結合された複数の捕捉プローブを含む。この方法は、５’テールを持つ第１プライマーおよび５’テールを持たない第２プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介する核酸分子増幅を実施して、５’テールを持つ第１鎖とテールを持たない第２鎖とを備える複数の二本鎖アンプリコンを形成すること、および複数のアンプリコンを複数の捕捉プローブにハイブリダイズすることを含む。この方法はさらに、複数のアンプリコンを複数の一本鎖分子に変換すること、および触媒クラスターを複数の一本鎖分子のそれぞれの内部区画に結合することを含む。さらに、この方法は、その上部に結合した触媒クラスターを持つ複数の一本鎖分子を金属または金属合金と接触させて、触媒クラスター表面に金属または金属合金を析出させること、および電極間に電流を流すことが可能かどうかを判定することを含む。電極間の電流は、試料中の標的核酸分子の存在を示す。
【０００９】
別の態様において、核酸分子検出器を作製する方法が開示される。核酸分子検出器は、センサ表面に結合され、離間配置された第１電極および第２電極、および第１電極と第２電極の間のセンサ表面に結合された複数の捕捉プローブを含む。この方法は、生体試料を受け取ること、生体試料内の核酸分子を増幅して単一の５’テールを持つアンプリコンを生成すること、およびそのアンプリコンの５’テールを複数の捕捉プローブのうちの１つに結合することを含む。この方法はさらに、エキソヌクレアーゼを使用しアンプリコンの一本鎖を消化して、アンプリコンを一本鎖分子に変換すること、および標的特異性の触媒クラスターを合成することを含む。この方法はさらに、触媒クラスターをアンプリコンの一本鎖分子と接触させて、標的特異性の触媒クラスターを一本鎖分子の内部領域に結合することを含む。
【００１０】
いくつかの開示態様の実施において実現できる利点は、プライマー二量体の人工産物または他の意図しない増幅産物の形成による偽陽性を低減または排除することである。
【００１１】
上記の態様は単なる例示である。他の態様は、開示された主題の範囲内にある。
【００１２】
本発明の全容を理解できるように、本発明の詳細な説明は、特定の態様を参照することによって実施され、そのいくつかは添付の図面に示されている。しかしながら、その図面は、本発明の特定の態様のみを示しており、したがって開示される主題の範囲に対してその範囲を限定すると見做されるべきではなく、他の態様も同様に包含することに留意すべきである。図面は必ずしも縮尺通りではなく、本発明の特定の態様の全容を説明する際に通常は拡大されている。図面では、様々な図にわたって、同じ番号が同じ部品を示すように使用されている。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、核酸分子センサ表面の一態様を示す図である。
【図２】図２は、核酸分子の検出方法を示すフローチャートである。
【図３】図３は、単一の５’テールを持つアンプリコンの一態様を示す図である。
【図４】図４は、それに結合する図３のアンプリコンを持つ図１のセンサ表面を示す図である。
【図５】図５は、一本鎖分子に変換したアンプリコンを持つ図４のセンサ表面を示す図である。
【図６】図６は、一本鎖分子に結合した触媒クラスターを持つ図５のセンサ表面を示す図である。
【図７】図７Ａは、触媒クラスターを生成する方法の一態様を示す図である。図７Ｂは、触媒クラスターを生成する別の方法の一態様を示す図である。
【図８Ａ−Ｂ】図８Ａは、多重化触媒クラスターを生成する方法の一態様を示す図である。図８Ｂは、多重化触媒クラスターを混合する方法の一態様を示す図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、一本鎖アンプリコン分子上の多重化触媒クラスターの多重部位でネスト化する方法の一態様を示す図である。
【図９】図９は、試験に使用されるリボソーム遺伝子の一部分を示す図である。
【図１０】図１０は、アンプリコン鎖のエキソヌクレアーゼ消化に対する時間の影響を試験した結果であるマイクロチップ表面の写真である。
【図１１】図１１は、様々なエキソヌクレアーゼ濃度の影響を試験した結果であるマイクロチップ表面の写真である。
【図１２】図１２は、２つの異なる触媒クラスター試薬の結果を比較するマイクロチップ表面の写真である。
【図１３】図１３Ａは、Ｃａｌ／Ｂｕｎプライマーと混合された汎フラビウイルスプライマーを用いた多重化反応におけるデングウイルスＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ複製のゲル分析の写真である。図１３Ｂは、Ｃａｌ／Ｂｕｎウイルスプライマーと混合された汎フラビウイルスプライマーを用いた多重化反応におけるラクロスＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ複製のゲル分析の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
図１は、検出器センサマイクロチップ１０の一態様を示す。この態様において、マイクロチップ１０は、第１電極１２および第２電極１４を複数の捕捉プローブ１６とともに含み、第１電極１２と第２電極１４とは互いに接触しないように配置され、捕捉プローブ１６は、第１電極１２と第２電極１４との間のセンサ表面１８に捕捉プローブ分子１６の付着・固定化を可能にする官能化した酸化物表面の形態である。捕捉プローブ１６は、増幅プロセス中に組み込まれた５’テールとの相互作用によりＰＣＲ増幅産物を捕捉するように設計されている。
【００１５】
図２は、標的核酸分子を検出する方法２０の一態様を示す。区画２２で、生体試料から採取した標的核酸分子は、ＰＣＲによって増幅される。生体試料は、とりわけ、血液、粘液および皮膚などの任意の適切な種類の物質でよい。もちろん任意の適切な種類のＰＣＲ方法を採用できる。この態様において、２つのプライマーがＰＣＲプロセス中に使用される。第１プライマーは、内部複製ブロックを持つ５’テールオリゴヌクレオチドとして合成され、第２プライマーは、テールを持たないオリゴヌクレオチドである。一例では、第２プライマーは５’リン酸基を持つ。図３に示すように、５’テール３２を持つ第１鎖３１とテールを持たないプライマーから伸長した第２鎖３３とを持つ複数の二本鎖アンプリコン３０（標的核酸分子の複製物）が生成されるまで、複数のサイクルが実施される。図３に示す一例では、第２鎖３３は５’リン酸基３４を持つ。図はないが別の例では、第２鎖３３は５’リン酸基を持たない。図２に戻って区画２４で、アンプリコン３０は、図１に示される検出器マイクロチップ１０の表面の捕捉プローブ１６にハイブリダイズされる。特に、図４に示すように、アンプリコン３０の５’テールは捕捉プローブ１６に結合する。
【００１６】
区画２６で、図５に示すように、ハイブリダイズしたアンプリコン３０を一本鎖分子３６に変換する。一例では、熱（捕捉プローブ１６から離れてアンプリコン３０を変性させる）を用いるのではなく、５’→３’方向性のヘリカーゼを用いて、アンプリコン３０を一本鎖分子３６に変換する。別の例では、エキソヌクレアーゼを用いてアンプリコン３０を一本鎖分子３６に変換する。この例では、エキソヌクレアーゼは５’→３’の方向性を有し、優先的にテールを持たないプライマーから伸長した鎖３３を消化する。テールを持つ鎖３１は捕捉プローブ１６に結合されているので、エキソヌクレアーゼは、鎖３１の５’テールへの接近が不可能であり、それゆえに鎖３１を消化できず、テールを持つ鎖３１の分解を抑止する。一例では、センサ表面１８からの特定距離でのヌクレアーゼ処理能力または立体障害に依存して、鎖３３は不完全な消化を経る場合があり、消化された鎖３３の残り部分３８を生じることがある。一例では、テールを持たないプライマーから伸長した鎖３３は、５’リン酸により合成され、エキソヌクレアーゼはλエキソヌクレアーゼである。
【００１７】
鎖３３を消化すると、テールを持つ鎖３１の内部配列領域が露出する。方法２０（図２）の区画２８では、金触媒試薬などの触媒試薬は、図６に示すようにテールを持つ鎖３１に直接ハイブリダイズする。一態様において、触媒試薬は触媒クラスターの形態である。一態様において、単一の触媒クラスター６０はテールを持つ鎖３１に結合する。別の態様において、テールを持つ鎖３１の長さに依存して、複数の触媒クラスター６０はテールを持つ鎖３１のそれぞれに結合する。
【００１８】
汎用的なオリゴヌクレオチドはアンプリコン内の内部配列への結合には適さないので、触媒クラスターは標的特異性であり、すなわち触媒クラスターは鎖３１内の特定の標的配列に結合する。プライマー二量体人工物はこれらの標的配列を含まないので、触媒クラスター６０は、プライマー二量体人工物には結合せず、それにより潜在的な偽陽性の測定を回避する。図７Ａに示すように、一例では、チオール修飾オリゴヌクレオチド４０を触媒クラスター４２と反応させて、少なくとも２０個のオリゴヌクレオチドで官能化された触媒クラスター４４を形成することができる。別の例では、図７Ｂに示すように、ユニバーサルクラスター結合配列４５およびアンプリコン特異性結合配列４７を持つユニバーサルオリゴヌクレオチド４６が、ベース汎用クラスター４８とハイブリダイズして、触媒クラスター５０を形成することができる。その結果、新規のオリゴヌクレオチドの各々は、クラスター汎用オリゴヌクレオチドに相補的なアダプター特異性配列を持つ３’末端で鎖状に繋がる。結果としての触媒クラスター５０は、４個のハイブリダイズしたアダプターオリゴヌクレオチド５２を持つように図７Ｂには示されるが、アダプターの実際の数は、ベースクラスター上の捕捉オリゴヌクレオチドの数を限定するクラスターサイズ、およびクラスターに付加されるアダプターオリゴヌクレオチドの化学量論性に依存することが分かっている。
【００１９】
図８Ａに示すように、ベース汎用クラスター４８は、プローブオリゴヌクレオチドＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄの混合物を用いて調製されて、多重化能力を持つ触媒クラスター５４を形成することができる。機能化に使用可能な表面積を決定するクラスターサイズに応じて、複数の異なるプローブを単一のクラスターに負荷することが可能である。効率的な金属化反応を保持するために、クラスター当たりの各プローブ種の数に対する比の最適化が必要なこともある。図８Ｂに示すように、多重化クラスター５４の調整混合物を生成できる。多重化クラスター５４の混合物は、図８Ｃに示すように、多数の標的アンプリコンを多重化し、かつ複数のクラスターにより各標的アンプリコンを集合化することができる。
【００２０】
図２に戻って、区画３０で、触媒核形成部位として働く触媒クラスター６０の金属化を実施して導電性膜を形成することができ、電極１２、１４（図１）間の抵抗を測定して、区画３２で標的核酸分子を検出することが可能になる。一例では、触媒クラスター６０は金クラスターであり、金現像剤試薬が触媒クラスター６０に塗布されて、この実施例では金膜である導電膜の現像に向けて段階的に反応する。この例では、金膜の存在は、電極１２、１４間の間隙を電気的に短絡し、抵抗の低下により測定される。この例では、陰性のセンサは１００万Ωを超える抵抗を有し、陽性のセンサは約１０００Ωの抵抗を持つ。
【実施例】
【００２１】
実施例１
プラスモジウム・ファリシプリウム用に開発された既存の試験を用いて、上記の方法２０を試験した。図９は、INVITROGENTMプログラムから得られた画面コピーであり、プライマー（太字で示す）が設計された１８Ｓリボソーム遺伝子の一部分を示す。典型的には、この方法のＰＣＲで使用される２つのプライマー、すなわちフォワードプライマー６０およびリバースプライマー６２のそれぞれは、センサおよび触媒と結合する５’テールを持つ。しかし、上記の方法２０を使用すると、元のリバースプライマー６２の下流に位置する新規のリバースプライマー６４が認められた。新規のリバースプライマー６４の合成では、５’リン酸基は含むが、触媒結合のための５’テールを除外していて、エキソヌクレアーゼの分解が促進された。
【００２２】
元のリバースプライマー６２上の５’テールはユニバーサル触媒試薬にハイブリダイズするので、方法２０で使用する触媒クラスターの修飾は、元のリバースプライマーオリゴヌクレオチドをユニバーサルクラスターに予備的にハイブリダイズすることで達成されて、標的特異性の触媒金クラスターを生成した。これらの標的特異性の触媒金クラスターの調製は、１０００倍のモル過剰のプライマー６２を用いた加熱インキュベーション、室温までの冷却、および高速遠心分離および最終的な試薬緩衝液での再懸濁を介して繰り返し２回の洗浄による未結合の過剰オリゴヌクレオチドの除去を含む。同様に、第１のクラスター結合配列の上流に位置する異なる配列要素への特異性を備える第２の触媒試薬６６を調製した。この第２のクラスターが金属化および検出をもたらす能力は、センサ結合したアンプリコンの消化におけるエキソヌクレアーゼの処理能力を評価するための予備試験に役に立っただけである。この特定の誘導されたアンプリコンでは、ヌクレアーゼは、無関係なＤＮＡ鎖を完全に分解する少なくとも９５個のヌクレオチド以内までに消化されて、クラスター結合に利用可能な約８０個のヌクレオチドの一本鎖領域を残していることが必須である。
【００２３】
方法２０に従って消化を実施するのに適した特性を有する選択した５’→３’エキソヌクレアーゼを評価した。２つの適切な市販のエキソヌクレアーゼ、すなわちλおよびＴ７が認められるが、この例ではλを使用した。図１０および図１１は、この実験の結果を示す。
【００２４】
図１０は、マイクロチップにハイブリダイズした誘導アンプリコンでのλエキソヌクレアーゼ処理の時間的経過実験の結果を示す。パネルＡおよびパネルＢ中のすべてのマイクロチップを１００ｎｇのアンプリコンにより４５℃で５分間ハイブリダイズし、１０ｍＬ容量のハイブリダイズ化緩衝液中に浸漬して２回洗浄し、窒素ガス流の下で乾燥した。３７℃のインキュベーター中に保持された加湿シャーレ中で、１単位のエキソヌクレアーゼを含有する２５μＬのλ反応溶液でマイクロチップを染み付けした。１単位のエキソヌクレアーゼは、１μｇの超音波処理された二重鎖［３Ｈ］ＤＮＡを有する１Ｘλエキソヌクレアーゼ反応緩衝液中で、３７℃で３０分間以内に５０μＬの総反応容量の２本鎖基質から１０ｎｍｏｌの酸可溶性デオキシリボヌクレオチドを生成するのに必要な酵素の量として定義される。各マイクロチップの上に表示された指定時間のインキュベーションの後に、２０ｍＬのハイブリダイズ化緩衝液を有するシャーレ中にマイクロチップを移して反応を停止した。続く金属化のために、プライマーオリゴヌクレオチドで修飾されたクラスターによる触媒ハイブリダイズ化を４５℃で５分間実施し、ハイブリダイズ化緩衝液を含むシャーレ内でチップを回転させて２回洗浄を実施し、その後チップ表面に配置された２５μＬの現像剤試薬により５５℃で４分間、金の現像を実施した。図１１は、マイクロチップの表面にハイブリダイズした標的アンプリコンの金の現像に対するλエキソヌクレアーゼの滴定量の影響を示す。マイクロチップに、図１０における上述のようなハイブリダイズを行った。一方で、図１１に示す各マイクロチップに使用されるλエキソヌクレアーゼの単位は、各マイクロチップの上に表示するように変化させた。
【００２５】
これらの実験により、λエキソヌクレアーゼは、５’テールプライマー伸長鎖を消化できずに、それは触媒試薬を捕捉する能力の喪失を引き起こすという一つの知見を得た。この知見は、図１０に示すようにより長い時間的経過消化実験によって裏付けられ、これは、３００分の最も長いλのインキュベーション時間でさえも、チップの金属化の喪失がないことを示している。
【００２６】
アダプター修飾クラスターが５’テール鎖内のより内部の部位にハイブリダイズする能力を、上記の第２のクラスター試薬を調製して調査した。この第２のクラスターは、第１のクラスターのハイブリダイズ化部位の近傍で約３０個のヌクレオチドに結合するように生成された。この調査の結果は、図１２に示され、これは第１のクラスター試薬で処理された第１のマイクロチップ７０と第２のクラスター試薬で処理された第２のマイクロチップ７２との現像を比較している。第１のマイクロチップ７０と第２のマイクロチップ７２の比較において、同等に良好に処理された両方のクラスターが、それぞれの処理されたマイクロチップ表面に同等の金の斑点を生成することを示している。さらにその結果は、ハイブリダイズされたアンプリコンの大部分において、λエキソヌクレアーゼは、最小で９０個のベースを消化し、マイクロチップ表面に近づいても阻害されないことを立証した。さらに、第２のクラスターが相互作用する一本鎖ＤＮＡのより長い伸長部は、第１のクラスターの結合とともに第２のクラスターの結合にも影響を与えないようであった。
【００２７】
プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐ．ｆ．）に対して上記の方法を用いて、５０回の試験カートリッジ操作を実施した。陰性試料および陽性試料は、それぞれ１０μＬの水および緩衝液で１０μＬに希釈したＰ．ｆ．（１０５）細胞の１μＬの血液培養物からなる。試料をピペットで吸い上げて試験カートリッジ内に封入した後に、試料調製、ＰＣＲによる増幅、マイクロチップへのハイブリダイズ、ヌクレアーゼによる消化、および金属化反応を含む完全自動化分析を実施した。試験後の電気測定では、各試験操作後にカートリッジから各マイクロチップ基盤を取り出し、各マイクロチップを目視検査し、電気的結果の収集のためにマイクロチップをプローブステーションに載置した。表１は、５０回の分析からの生データを示す。表１の「結果」欄に「試験せず」と表示され、表１の「注釈」欄にさらに明示するように、機械の故障や操作者のミスが発生した特定の分析を除いた。表２は、取得した正確な実際の陽性および陰性の百分率を示す。表２に示すように、修飾した単一テールアンプリコンを使用すると、１００％の正確な陰性測定値と８８％の正確な陽性測定値が得られた。
【表１−１】
2019516408.tif 000003
【表１−２】
2019516408.tif 000004
【表２】
2019516408.tif 000005
【００２８】
実施例２
汎フラビウイルス／汎アルファウイルス／汎ブンヤウイルス試験の開発のために設計されたプライマー組を用いて、多重化逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の様々な組み合わせを評価した。この分析には、総計で９個のプライマーを使用し、全ての分析物質は、ウイルス、ＶＥＥ−ＴＣ８３ウイルス、デングウイルス、またはラクロスウイルスを取り込んだ、または取り込んでいない貯蔵された６〜８匹の蚊を、超音波駆動したビーズによる叩解を用いた均質化から得られた。核酸物質を、磁気的な粒子精製を用いて均質物から単離し、ゲル濾過により脱塩し、適切な多重プライマー組、すなわち汎フラビウイルスとブンヤウイルスのプライマー組または汎フラビウイルスとアルファウイルスのプライマー組のいずれかによるＲＴ−ＰＣＲ増幅に使用して、一本鎖５’テールアンプリコンを生成した。汎アルファウイルスと汎フラビウイルスのプライマー組では、ＰＣＲ増幅中に互いに阻害し合うことを見出した。この問題に対処するためには、試験カートリッジは、干渉するプライマー組を別々に操作して、センサチップでのハイブリダイズ化の前に混合できるように、２つの別々のＰＣＲチャンバを準備する。図１３Ａは、Ｃａｌ／Ｂｕｎプライマーと混合された汎フラビウイルスプライマーを用いた多重化反応において、取り込んだ蚊から精製されたデングウイルスＲＮＡ（列１〜４）のＲＴ−ＰＣＲの遺伝子複製のゲル分析を示す。列５は、ＲＮＡを投入していない陰性対照である。図１３Ｂは、Ｃａｌ／Ｂｕｎプライマーと混合された汎フラビウイルスプライマーを用いた多重化反応において、取り込んだ蚊から精製されたラクロスＲＮＡ（列１〜５）のＲＴ−ＰＣＲのゲル分析を示す。列６は、ＲＮＡを投入していない陰性対照である。汎ブンヤウイルスプライマーと汎フラビウイルスプライマーの組合わせは、ＰＣＲ反応において同等であることを知見した。
【００２９】
上記方法の可能性のある利点として、プライマー二量体人工物の生成による偽陽性測定の低減または排除が挙げられる。
【００３０】
本発明は、特定の典型的な態様について特に提示して説明してきたが、当業者は、当然のことだが記載された説明および図面により支持できる本発明の趣旨や範囲から逸脱することなく、各種の変更を詳細にその中で実施できる。さらに当然のことだが、典型的な態様が特定の数の要素を参照して記載されている場合に、典型的な態様は、特定の数以下あるいはそれ以上の要素を利用して実施できる。
【００３１】
本発明の特許可能な範囲は、特許請求の範囲によって規定され、当業者が思い当たる他の実施例も含んでもよい。この他の実施例は、それらが特許請求の範囲の文字通りの言葉と異ならない構造要素を有する場合か、あるいはそれらが特許請求の範囲の文字通りの言葉と実質的でない差異を有する同等の構造要素を含む場合にも、特許請求の範囲内にあることを意図している。
【００３２】
特許請求の範囲が複数の要素に対して「少なくとも１つ」という語句を記載する点において、この記載は列挙された要素の少なくとも１つ以上を意味することを意図しており、少なくとも１つの各要素に限定する意図はない。例えば、「要素Ａ、要素Ｂ、および要素Ｃのうちの少なくとも１つ」は、要素Ａのみ、または要素Ｂのみ、または要素Ｃのみ、またはそれらの任意の組合わせを示すことを意図している。「要素Ａ、要素Ｂ、および要素Ｃのうちの少なくとも１つ」は、少なくとも１つの要素Ａ、少なくとも１つの要素Ｂ、および少なくとも１つの要素Ｃに限定する意図ではない。
【図１】
2019516408.tif 000006
【図２】
2019516408.tif 000007
【図３】
2019516408.tif 000008
【図４】
2019516408.tif 000009
【図５】
2019516408.tif 000010
【図６】
2019516408.tif 000011
【図７Ａ】
2019516408.tif 000012
【図７Ｂ】
2019516408.tif 000013
【図８Ａ】
2019516408.tif 000014
【図８Ｂ】
2019516408.tif 000015
【図８Ｃ】
2019516408.tif 000016
【図９】
2019516408.tif 000017
【図１０】
2019516408.tif 000018
【図１１】
2019516408.tif 000019
【図１２】
2019516408.tif 000020
【図１３Ａ】
2019516408.tif 000021
【図１３Ｂ】
2019516408.tif 000022
【国際調査報告】
2019516408.tif 000023
2019516408.tif 000024