(57)【要約】  本発明は、脱毛防止用組成物に関し、より詳しくは、フィナステリドとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物、及びこれを含む脱毛防止または発毛促進用薬学的組成物または化粧料組成物に関する。本発明のフィナステリドとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、脱毛の改善、発毛の促進、細胞増殖の促進などのような生理活性に優れるだけでなく、水に対する安定性及び皮膚透過率に優れるので、脱毛防止及び発毛促進用組成物として有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィナステリドとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物。
【請求項２】
前記ペプチドは、２から３０個のアミノ酸配列からなる請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ペプチドは、８から１５個のアミノ酸配列からなる請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ペプチドは、水溶性ペプチドである請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記水溶性ペプチドは、親水性側鎖を有するアミノ酸の割合が７０％以上である請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記親水性側鎖を有するアミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、グリシン（Ｇｌｙ）及びプロリン（Ｐｒｏ）からなる群より選択される請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記親水性側鎖を有するアミノ酸は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）からなる群より選択される電荷を帯びるアミノ酸である請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
前記水溶性ペプチドは、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）からなる群より選択される、電荷を帯びるアミノ酸が３個以上である請求項４に記載の化合物。
【請求項９】
前記水溶性ペプチドは、疎水性側鎖を有するアミノ酸が５個以下である請求項４に記載の化合物。
【請求項１０】
前記水溶性ペプチドは、疎水性側鎖を有するアミノ酸が３個以下である請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記疎水性側鎖を有するアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）からなる群より選択される請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるノッキンペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるケラミン２ペプチド、及び配列番号３のアミノ酸配列からなるＷＩＮＴペプチドからなる群より選択される請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の化合物を含有する脱毛防止または発毛促進用薬学的組成物。
【請求項１４】
請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の化合物を含有する脱毛防止または発毛促進用化粧料組成物。
【請求項１５】
化粧水、乳液、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、散剤、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアスプレー、ヘアエアロゾル、ポマード、ゾルゲル、エマルション、オイル、ワックス及びエアロゾルからなる群より選択される剤形を有する請求項１４に記載の化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フィナステリド（Ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）とペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物、及びその脱毛防止または発毛促進用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
毛嚢は、哺乳動物の皮膚の独特の器官であって、原始表皮から下に成長してより深い皮膚層に延びている器官である。毛嚢の基部には、小胞または真皮乳頭として知られている細胞のプラグが存在し、乳頭は、正常な毛嚢周期及び毛幹の成長に必須である。毛幹は、ケラチンフィラメントとフィラメント集合タンパク質で充填されて堅く密着された上皮細胞から形成された糸状の構造である。
【０００３】
人間の毛髪は、周期的に成長期、退行期、休止期を繰り返しながら、毛髪が抜けてまた生成される過程を経る。毛髪の周期は、ホルモンや多くの成長因子などにより調節され、ひどいストレスや栄養素欠乏などによって、退行期及び休止期が促進され、深刻な脱毛症状を誘発する可能性がある。
【０００４】
毛髪が頭皮から脱落する現象を脱毛と称する。脱毛に影響を与える要因としては、気候、光または熱への露出などの環境的な要因及び、疾病、出産、ホルモン分泌及び変化、薬物の服用、栄養状態などの内的な要因を含め、様々な要因がある。脱毛メカニズムに関与する主なホルモンとして５−アルファレダクターゼ（５−ａｌｐｈａ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）が挙げられる（韓国公開特許第１０−２００８−００７７７６２号公報）。５−アルファレダクターゼは、男性ホルモン（ａｎｄｒｏｇｅｎ）の一種であるテストステロンをＤＨＴ（ｄｉｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）に変換させて皮脂の分泌を増加させる酵素である。脱毛市場に出回っている脱毛防止及び発毛促進の製品の中にも５−アルファレダクターゼの作用を阻害することを狙った製品が多数販売されている。脱毛は、酵素反応以外にも、栄養素欠乏、頭皮乾燥、ストレスなどによっても発生し得る（リュウ・ウンジュなど、韓国デザイン文化学会誌、第１８巻第２号、ｐ．８９〜１００、２０１２年）。これらの原因による脱毛の場合、十分な栄養の供給、頭皮の管理、及び抗酸化物質の攝取または投与で脱毛を防止し、発毛を促進することができる。
【０００５】
原因を問わず、脱毛は最終的に、自尊心と自負心の喪失と共に、著しい精神的、社会的及び性的な影響を与え得る。このような脱毛現象を治療するため、今までは医薬品として幾多の物質が用いられてきたが、価格が高すぎるか、効果の個人差が大きすぎるという欠点があった。その他、化粧品製品においては、価格は安いが効果が弱い植物抽出物などを利用してきたが、その効果は顕著ではなかった。
【０００６】
脱毛の治療及び解決策は、長い間に大きく変わってきた。かつら、部分かつら及び付け毛により、禿げた場所を隠すことが可能となっているが、新しい毛髪を生えさせることはできず、今まで知られていた２種の利用可能な薬物（ミノキシジル及びフィナステリド）は、更なる脱毛を遅らせることはできるものの、実際に新しい毛嚢の再生を誘導するための用途には適用できなかった。また、多くの頭髪化粧品の中で植物抽出物などを利用した脱毛防止製品がたくさん開発されたが、新生毛の生成にまで効果がある製品を見つけるのが困難であった。
【０００７】
毛髪の成長及び退化の過程には非常に多くの要因が互いに関連しており、例えば、一連の成長因子を利用することによる角質細胞成長因子の促進、血管内皮成長因子の活性の促進、及びＢＭＰ類タンパク質等の活性を抑制することによる毛髪の生成の促進についてのたくさんの研究がなされてきた。しかし、これらの成長因子類は効果が非常に優秀であるものの、天然の成長因子を得るためにリフォールディングというさらなる工程とより多くの時間が必要である。また、精製工程で大腸菌由来の汚染源をとり除くための複雑な精製工程が必要である。また、その安定性及び分子の大きさにより、毛髪の保護膜を透過することが容易でなく、これらの要因とコスト高が相まって、活用度が低くなっている。
【０００８】
さらに、フィナステリドが男性ホルモンに作用することに基づき、フィナステリドの５α−レダクターゼに対する拮抗作用により髪の毛が細くなることを阻み、細くなった毛を再度太くする方法がある。代表的な例としては、米国のメルク社製のプロペシア（Ｐｒｏｐｅｃｉａ）が挙げられ、それは１９９７年１２月で米国ＦＤＡ（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）に薬効及び安定性のために初めての食用脱毛治療剤として認証され、その翌年、脱毛症治療剤として市場に発売し始めた薬である。フィナステリドは、男性ホルモンの一種であるテストステロンを、脱毛を引き起こすＤＨＴに変換する５α−レダクターゼ酵素を抑制するための薬であって、前記薬を服用することによりＤＨＴの生成が抑制されるので、薄くて細くなった髪を再度太くて長い髪に成長させる役割を担う。しかし、フィナステリドは、脱毛防止の効果が現われるまで数ヶ月がかかり、女性が服用する場合は胎児に先天的な奇形が発生する可能性が高く、男性が服用する場合は性欲減退、勃起障害、射精障害などの副作用が生じる恐れがあり、且つ一生薬を服用しなければ脱毛防止の効果が維持できないという負担がある。よって、実際の臨床的な使用では相当な制約が伴うのが実情である（韓国公開特許第１０−２０１２−０１２０９１２号公報）。
【０００９】
この点に関し、本発明者らは、天然成長因子と同一または類似の機能または効果を奏しながらも、天然成長因子より安定性に優れ、天然成長因子の大きい分子量による問題点を改善することができるペプチドとして、配列番号３のアミノ酸配列からなるノッキンペプチド（韓国公開特許第１０−２０１０−００８５４０７号公報）、配列番号２のアミノ酸配列でからなるケラミン２ペプチド（韓国公開特許第１０−２００９−０１０８３２３号公報）、及び配列番号１のアミノ酸配列からなるＷＩＮＴペプチド（韓国公開特許第１０−２０１１−００２３９９１号公報）を開発した。しかし、従来用いられるフィナステリドや前記配列番号１から配列番号３までのアミノ酸配列からなるペプチドは、脱毛防止及び発毛促進効果の向上と副作用の減少及び水への溶解性の向上の各観点から、依然として改善の余地がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記のような従来の発毛剤が有している問題点等を改善することを目的とし、天然成長因子や前記配列番号１から配列番号３までのアミノ酸配列からなるペプチド、またはフィナステリドのような従来の発毛剤に比べて、同一または一層優れる脱毛防止及び／または発毛促進機能を奏し、これらより皮膚透過度及び水に対する安定性などの生理学的特性に優れる物質を提供することを技術的課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記課題を達成するため、本発明は、フィナステリドとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物を提供する。
【００１２】
本発明の一実施形態によれば、前記ペプチドは、２から３０個、好ましくは５から２０個、より好ましくは８から１５個、さらに好ましくは１０から１２個のアミノ酸からなるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
本発明の他の実施形態によれば、前記ペプチドは、水溶性ペプチドであることが好ましいが、これに限定されるものではない。本発明の好ましい実施形態によれば、前記水溶性ペプチドは、親水性側鎖を有するアミノ酸の割合が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％で高いことが好ましい。本発明の一実施形態によれば、前記親水性側鎖を有するアミノ酸は、電荷を帯びるアミノ酸、例えば、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）であってよいが、これらに限定されるものではない。本発明の他の実施形態によれば、前記水溶性ペプチドには、前記電荷を帯びるアミノ酸は、３個以上、好ましくは５個以上、より好ましくは７個以上が含まれてよいが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、前記水溶性ペプチドは、疎水性側鎖を有するアミノ酸が５個以下、好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個以下、さらに一層好ましくは１個以下で存在し、疎水性側鎖を有するアミノ酸が存在しないことが最も好ましい。
【００１５】
本発明の他の実施形態によれば、前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるノッキンペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるケラミン２ペプチド、または配列番号３のアミノ酸配列からなるＷＩＮＴペプチドであってよいが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
また、本発明は、前記で開示されたいずれか一つの化合物を含有する脱毛防止または発毛促進用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は、前記で開示されたいずれか一つの化合物を含有する脱毛防止または発毛促進用化粧料組成物を提供する。
【００１８】
本発明の一実施形態によれば、前記化粧料組成物は、柔軟化粧水、乳液、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、散剤、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアスプレー、ヘアエアロゾル、ポマード、ゾルゲル、エマルション、オイル、ワックス、エアロゾルのような剤形を有してよいが、これらに限定されるものではない。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のフィナステリドとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物は、脱毛防止、発毛促進、細胞増殖の促進などのような生理活性に優れるだけでなく、水に対する安定性及び皮膚透過率に優れるので、脱毛防止及び発毛促進用組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の化合物及びフィナステリドの水への溶解性を示す写真である。
【図２ａ】及び
【図２ｂ】本発明の化合物及びフィナステリドが５α−レダクターゼの活性に及ぼす影響を示すグラフであって、それぞれ本発明の化合物及びフィナステリドで処理した後のＤＨＴ及びテストステロンの相対的な濃度を示す図である。
【図３ａ】本発明の化合物及びフィナステリドで処理した後の角質細胞の形態及び数を示す免疫染色写真である。
【図３ｂ】化合物の処理濃度に応じた角質細胞の相対的な数を示すグラフである。
【図４ａ】本発明の化合物及びフィナステリドで処理した後のヒト毛真皮乳頭細胞（ｈｕｍａｎ  ｈａｉｒ  ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａ  ｃｅｌｌ、ＨＨＤＰＣ）の形態及び数を示す免疫染色写真である。
【図４ｂ】化合物の処理濃度に応じた角質細胞の相対的な数を示すグラフである。
【図５ａ】本発明の化合物及びフィナステリドで処理した後のＨＨＤＰＣ細胞において、ベータ−カテニンの核内への送達を示すウエスタンブロット写真である。
【図５ｂ】上記を陰性対照群に対する相対的な数値に換算したグラフである。
【図６ａ】本発明の化合物及びフィナステリドで処理した後のＨＨＤＰＣ細胞において、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５／８の発現量を示すウエスタンブロット写真である。
【図６ｂ】上記をＢＭＰ２に対する相対的な数値に換算したグラフである。
【図７ａ】本発明の化合物及びフィナステリドで処理した後のＨＨＤＰＣ細胞において、ＤＫＫ−１  ｍＲＮＡの発現量を示す電気泳動写真である。
【図７ｂ】上記を陰性対照群に対する相対的な数値に換算したグラフである。
【図８ａ】本発明の化合物が毛髪の成長に及ぼす影響を動物実験を介して確認した写真であって、フィナステリド、と本発明の化合物を塗布したマウスの毛の成長速度を比較したものである。
【図８ｂ】本発明の化合物が毛髪の成長に及ぼす影響を動物実験を介して確認した写真であって、フィナステリド、と本発明の化合物を塗布したマウスの背中の皮膚の毛をＨ＆Ｅ染色して毛嚢の数を確認したものである。
【図９ａ】本発明の化合物の皮膚透過テストの結果を示すグラフである。
【図９ｂ】本発明の化合物の皮膚透過テストの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
前記課題を解決するため、本発明は、フィナステリドとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物を提供する。
【００２２】
前記フィナステリドは、Ｎ−（１，１−ジメチルエチル）−３−オキソ−（５α，１７β）−４−アザアンドロスト−１−エン−１７−カルボキサミド（Ｎ−（１，１−ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）−３−ｏｘｏ−（５α，１７β）−４−ａｚａａｎｄｒｏｓｔ−１−ｅｎｅ−１７−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）を示すものであって、下記化学式（１）で表される構造を有する。
【００２３】
【化１】
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【００２４】
本明細書において、『ペプチド』という用語は、ペプチド結合によってアミノ酸残基等が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。前記ペプチドは、本技術分野に公知の通常の生物学的または化学的な合成方法、特に、固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）に従って製造されてよい（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−５４（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔ、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２ｎｄ．ｅｄ．、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．：Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、１１１（１９８４））。
【００２５】
前記ペプチドはフィナステリドの水溶性を増加させるためのものであり、この面から、前記ペプチドは水溶性ペプチドであることが好ましいが、これに限定されるものではない。本発明の一実施形態によれば、前記ペプチドは、２から３０個、好ましくは５から２０個、より好ましくは８から１５個、さらに好ましくは１０から１２個のアミノ酸配列からなる。本発明の好ましい実施形態によれば、前記ペプチドは、親水性側鎖を有するアミノ酸の割合が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、さらに一層好ましくは９０％以上、最も好ましくは１００％で高いことが好ましい。その一方、前記ペプチドは、疎水性側鎖を有するアミノ酸の割合が５０％以下、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは２０％以下、さらに一層好ましくは１０％以下、最も好ましくは０％で低いことが好ましい。本発明において、『親水性側鎖を有するアミノ酸』は、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、グリシン（Ｇｌｙ）及びプロリン（Ｐｒｏ）を示し、『疎水性側鎖を有するアミノ酸』は、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）を示すが、これらに限定されるものではなく、前記のような自然界に存在するアミノ酸以外に、これらの変形体なども制限なく用いられてよい。本発明の一実施形態によれば、前記親水性側鎖を有するアミノ酸は、電荷を帯びるアミノ酸、例えば、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）であることが好ましいが、これらに限定されるものではない。本発明の他の実施形態によれば、前記水溶性ペプチドには、前記電荷を帯びるアミノ酸は、３個以上、好ましくは５個以上、より好ましくは７個以上含まれることが好ましいが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記疎水性側鎖を有するアミノ酸は、前記ペプチド内に５個以下、好ましくは４個以下、より好ましくは３個以下、さらに好ましくは２個以下、さらに一層好ましくは１個以下で存在し、存在しないことが最も好ましい。本発明の一実施形態によれば、前記ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列からなるノッキンペプチド、配列番号２のアミノ酸配列からなるケラミン２ペプチド、または配列番号３のアミノ酸配列からなるＷＩＮＴペプチドであってよいが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
本発明の一実施形態によれば、本発明の化合物は、角質細胞及びＨＨＤＰＣ細胞の増殖促進能力を有する。本発明の他の実施形態によれば、本発明の化合物は、ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化させる機能を有する。本発明の他の実施形態によれば、本発明の化合物は、ベータ−カテニンを核内に送達させる。
【００２８】
本発明の化合物は、その自体でも安定性に優れるが、ペプチドを構成する何れかのアミノ酸を修飾し、前記化合物と結合することにより、本発明の前記化合物の安定性をさらに向上することができる。本発明の一実施形態によれば、安定性をさらに向上するために、前記ペプチドのＮ−末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群より選択される一つの保護基と結合してもよい。本発明の他の実施形態によれば、安定性をさらに向上するために、前記ペプチドは、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）からなる群より選択される一つの保護基と結合してもよい。
【００２９】
前述したアミノ酸の修飾は、本発明の化合物の安定性を大幅に改善する。本明細書において、『安定性』という用語は、『生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）』安定性だけでなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）のような『試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）』安定性も包括する意味として用いられる。さらに、前述した保護基は、生体内及び試験管内で本発明の化合物をタンパク質分解酵素の攻撃から保護する作用をする。
【００３０】
さらに、本発明は、前記化合物を有効成分として含む脱毛治療または改善用組成物を提供する。本発明の他の実施形態によれば、本発明は、前記ペプチドを有効成分として含む皮膚状態改善用組成物を提供する。本発明において、前記組成物は、薬学的組成物または健康食品の形態であってよいが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
本発明の組成物は、前述した本発明の化合物を有効成分として含むので、本明細書が長くなり過ぎることにより複雑になることを避けるため、この両方の間に共通される内容の記載を省略する。
【００３２】
本発明の一実施形態によれば、本発明の化合物による脱毛治療または改善は、発毛の促進または毛髪の生成である。本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の化合物は、角質細胞及びＨＨＤＰＣ細胞の増殖促進能力を有し、ＷＮＴタンパク質の代表的なシグナル伝達経路であるベータ−カテニンシグナル伝達経路を促進させる。このような結果に基づいて実施した動物実験を介し、本発明の化合物が毛髪の成長を著しく促進するということが分かった。よって、本発明の組成物は、毛髪の成長及び皮膚状態の改善に非常に効果的である。
【００３３】
さらに、本発明の一実施形態によれば、本発明の化合物による皮膚状態の改善は、しわの改善、皮膚弾力の改善、皮膚老化の防止、皮膚保湿の改善、傷跡の除去または皮膚の再生を含む。
【００３４】
本発明の組成物は、前述した本発明の化合物を有効成分として含むので、本明細書が長くなり過ぎることにより複雑になることを避けるため、この両方の間に共通される内容の記載を省略する。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、（ａ）前述した本発明の化合物の薬学的有効量；及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である。
【００３６】
本明細書において、『薬学的有効量』という用語は、前述した本発明の化合物の効能または活性の達成に十分な量を意味する。
【００３７】
本発明の薬学的組成物に含まれる、薬学的に許容される担体は、製剤の際に通常利用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油などを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物は、前記成分以外に、滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、防腐剤などをさらに含むことができる。好適な薬学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．、１９９５）に詳しく記載されている。
【００３８】
本発明の薬学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法に従い、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位用量の形態に製造されるか、または複数用量の形態に製造されてよい。このとき、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉薬、顆粒剤、錠剤、カプセル剤またはゲル剤（例えば、ハイドロゲル）の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００３９】
本発明に係る薬学的組成物は、臨床投与の際に経口または非経口での投与が可能であり、一般的な医薬品製剤の形態に用いられてよい。すなわち、本発明の薬学的組成物は、実際の臨床投与の際に経口及び非経口の様々な剤形で投与されてよく、製剤化する場合には通常用いられている充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調剤されてよい。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、生薬抽出物または生薬発酵物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。さらに、単なる賦形剤以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑剤等も用いられてよい。経口投与のための液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当され、一般に用いられる単なる希釈剤である水、流動パラフィン以外に多様な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、防腐剤などが含まれてよい。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水溶液、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、と坐剤が含まれる。非水溶液、懸濁溶剤には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが用いられてよい。坐剤の基剤には、ウィテップゾール、マクロゴール、ツイン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが用いられてよい。
【００４０】
単位剤形には、例えば、個別投薬量の１、２、３または４倍、または、１／２、１／３または１／４倍を含有することができる。個別投薬量は、１回に投与される薬物の有効量を含有し、これは通常、１日用量の全部、１／２、１／３または１／４倍に該当する。
【００４１】
本発明の薬学的組成物は、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法に従い、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位用量の形態に製造されるか、または複数用量の形態に製造されてよい。このとき、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、エキス剤、粉薬、顆粒剤、錠剤、カプセル剤またはゲル剤（例えば、ハイドロゲル）の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の組成物は、（ａ）前述した本発明の化合物の化粧品学的有効量（ｃｏｓｍｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）；及び（ｂ）化粧品学的に許容される担体を含む化粧品組成物である。
【００４３】
本明細書において、『化粧品学的有効量』という用語は、前述した本発明の組成物の皮膚改善作用の達成に十分な量を意味する。
【００４４】
本発明の化粧品組成物は、本技術分野で通常製造される任意の剤形に製造されてよく、例えば、溶液、懸濁液、エマルション、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、せっけん、界面活性剤含有クレンジング、オイル、パウダーファンデーション、エマルションファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーなどに剤形化されてよいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、化粧水、乳液、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレー、パウダー、ヘアトニック、ヘアクリーム、ヘアローション、ヘアシャンプー、ヘアリンス、ヘアコンディショナー、ヘアスプレー、ヘアエアロゾル、ポマード、ゲルなどのような溶液、ゾルゲル、エマルション、オイル、ワックス、エアロゾルなどの多様な形態に製造されてよいが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルの場合は、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは酸化亜鉛などが利用されてよい。
【００４６】
本発明の剤形がパウダーまたはスプレーの場合は、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケートまたはポリアミドパウダーが利用されてよく、特にスプレーの場合は、さらにクロロフルオロ炭化水素、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような発射薬を含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
本発明の剤形が溶液またはエマルションの場合は、担体成分として溶媒、可溶化剤または乳濁化剤が利用され、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルが利用されてよいが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本発明の剤形が懸濁液の場合は、担体成分として水、エタノールまたはプロピレングリコールなどの液状の希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルなどの懸濁剤、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラガカントなどが利用されてよいが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングの場合は、担体成分として脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルホサクシン酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシ化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用されてよいが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
本発明の剤形がヘアシャンプーの場合は、本発明の化合物に、増粘剤、界面活性剤、粘度調節剤、保湿剤、ｐＨ調節剤、防腐剤、エッセンシャルオイルなどのようなシャンプーを組成するためのベース成分等を混合する。増粘剤としてはＣＤＥが用いられてよく、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤であるＬＥＳと両性界面活性剤であるココベタイン、粘度調節剤としてはポリクオタニウム、保湿剤としてはグリセリン、ｐＨ調節剤としてはクエン酸、水酸化ナトリウム、防腐剤としてはグレープフルーツ抽出物が用いられてよく、上記以外にもシダーウッド、ペパーミント、ローズマリーなどのエッセンシャルオイルと、シルクアミノ酸、ペンタオール、ビタミンＥが添加されてよい。本発明の一実施形態によれば、前記本発明の化合物を１００重量部とするとき、ＣＤＥ  ５〜１０重量部、ＬＥＳ  ３０〜４０重量部、ココベタイン１０〜２０重量部、ポリクオタニウム０．１〜０．２重量部、グリセリン５〜１０重量部、グレープフルーツ抽出物０．１〜１．０１重量部、シルクアミノ酸０．５〜１重量部、ペンタオール０．５〜１重量部、ビタミンＥ  ０．５〜２重量部、エッセンシャルオイルとしてシダーウッド、ペパーミント、ローズマリーのいずれか一つ  ０．０１〜０．１重量部が混合されてよいが、これらに限定されるものではない。
【００５１】
本発明の化粧品組成物に含まれる成分は、有効成分としての本発明の化合物と担体成分以外に化粧品組成物に通常利用されているる成分等を含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、可溶化剤、ビタミン、顔料及び香料などの通常の補助剤を含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
以下、実施例を介して本発明を詳しく説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するためのものだけでであり、本発明の範囲が下記実施例によって限定されるものではない。
【００５３】
実施例１．本発明の化合物の合成
＜１−１＞  ペプチドの合成
＜１−１−１＞  配列番号３のペプチドの合成
【００５４】
クロロトリチルクロリド樹脂（Ｃｈｌｏｒｏ  ｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ；ＣＴＬ  ｒｅｓｉｎ、Ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ［００６４］Ｃａｔ  Ｎｏ．０１−６４−００２１）７００ｍｇを反応容器に入れ、メチレンクロリド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間撹拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間撹拌した後、再度溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）を入れ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かし、撹拌しながら１時間反応させた。撹拌しながら１時間反応させた後、混合物を洗浄し、ＤＣＭ中に、メタノールおよびＤＩＥＡ（２：１）で溶解させた。１０分間反応させ、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ入れて３分間撹拌した後、再度溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れて１０分間常温で撹拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて再度１０分間反応を維持した後に溶液を除去し、それぞれ３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄してＣｙｓ（ｔｒｔ）−ＣＴＬ樹脂を製造した。
【００５５】
新しい反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ  ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ  ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅのＤＩＥＡを２回の分画で入れた後、全ての固体が溶けるまで少なくとも５分間撹拌した。得られたアミノ酸混合溶液を、脱保護された樹脂のある反応容器に入れ、常温で撹拌しながら１時間反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で３回、５分ずつ撹拌した後に、溶液を除去した。少量の反応した樹脂を取り、カイザーテスト（Ｎｉｈｙｄｒｉｎ  Ｔｅｓｔ）を利用して反応程度を確認した。前述の製造方法と同様に脱保護溶液で２回脱保護反応させてＨｉｓ（ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）−ＣＴＬ樹脂を製造した。ＤＭＦとＭＣで十分洗浄して再度カイザーテストを行った後、前述の製造方法と同様に下記のアミノ酸付着実験を行った。
【００５６】
選定されたアミノ酸配列に基づき、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（ｔｒｔ）及びＦｍｏｃ−Ａｒｇ（ｐｂｆ）の順に連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して脱保護溶液を除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔを入れて１時間アセチル化を行った後、製造されたペプチジル樹脂をＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールでそれぞれ３回を洗浄し、窒素ガスを徐々に流して乾燥した後、Ｐ２Ｏ５下で真空に減圧して完全に乾燥し、脱漏溶液（ｌｅａｖｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）［トリフルオロ酢酸９５％、蒸留水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２．５％を含む］３０ｍｌを入れた後、常温で間欠的に揺り動かしながら２時間反応を維持した。樹脂をろ過し、少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、濾液と母液とを合わせた。減圧を利用して全体体積が半分程度残るまで蒸留し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈澱を生じさせた後、遠心分離して沈澱を集め、さらに２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分乾燥して精製前のＮＨ２−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ−ＯＨペプチド（配列番号３）を０．６５ｇ得た（収率：９２．６％）。分子量測定器を利用して測定したとき、分子量は１２８７．１（理論値：１２８６．５）であった。
【００５７】
＜１−１−２＞  配列番号１及び配列番号２のペプチドの合成
前記実施例＜１−１−１＞と同様の方法を利用し、配列番号１のペプチド（Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ａｓｐ：ＥＬＩＥＨＧＧＧＲＰＡＤ）及び配列番号２のペプチド（Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ：Ａｃ−ＹＫＳＫＫＧＧＷＴＨ）を合成した。
【００５８】
【表１】
2019512502.tif 000004
【００５９】
＜１−２＞  本発明の化合物の合成
ペプチド反応器にペプチジルレジン（１ｍｍｏｌ）と１−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）１０ｍｌを入れ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）２７０ｍｇ（２．０ｅｑｕｉｖ．）とＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート７５９ｍｇ（２．０ｅｑｕｉｖ．）を添加して３０分間反応させた。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）３８８ｍｇ（３ｅｑｕｉｖ．）とフィナステリド類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）６２４ｍｇ（２．０ｅｑｕｉｖ．）を添加して常温で２４〜７２時間反応させ、ろ過して反応されたペプチジル樹脂を収得した。収得された樹脂を、切断溶液（ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を用いて常温で２時間反応した後にレジン及び保護基を除去し、ジエチルエーテル１０ｍｌ（１０ｍｍｏｌ）を用いて再結晶させてハイブリッドペプチドを収得した。下記に、本発明のフィナステリドとペプチドが共有結合で連結された構造を有する化合物の反応式を具体的に示した。
【００６０】
【化２】
2019512502.tif 000005
【００６１】
【化３】
2019512502.tif 000006
【００６２】
【化４】
2019512502.tif 000007
【００６３】
【化５】
2019512502.tif 000008
【００６４】
実験例１．本発明の化合物の溶解性テスト
前記実施例＜１−２＞で製造されたフィナステリド−ＣＧ−ノッキン化合物（化合物１）、フィナステリド−ＣＧ−ケラミン２化合物（化合物２）、フィナステリド−ＣＧ−ＷＩＮＴ化合物（化合物３）及びフィナステリドをそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸留水に溶解させた。
その結果、フィナステリド自体は水に殆ど溶解していないのに対し、本発明の化合物１〜３の全ては水に完全に溶解していることを確認した（図１）。
【００６５】
実験例２．本発明の化合物が５α−レダクターゼの活性に及ぼす効果の分析
本発明の化合物が５α−レダクターゼの活性に及ぼす効果を確認するため、先ず、５α−レダクターゼが多く存在するものとして知られている肝細胞抽出物をタンパク質抽出方法を介して回収した。テストステロンをフィナステリドまたは本発明の化合物１〜３と先ず反応させた後、当該溶液に肝細胞抽出物を入れて３７℃で１時間反応させ、テストステロンに肝細胞抽出物を入れて３７℃で１時間反応させて得られたものを対照群にした。反応を終了させた後、ＨＰＬＣを介してテストステロンとＤＨＴの量を確認した。前記ＨＰＬＣ分析は、次の条件で実施した。
−  Ｃ１８カラム
−  ＵＶ  ２４０ｎｍ
−  流速：１ｍｌ／分
−  移動相：Ａ：０．１％Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｗａｔｅｒ
Ｂ：０．１％Ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ
−  濃度勾配：０分  Ｂ  ５％〜  ３０分  Ｂ  ８０％
【００６６】
その結果、対照群と比べて、フィナステリド及び本発明の化合物で処理した場合はテストステロンの濃度が増加し、これに反比例してＤＨＴの濃度は減少した。さらに、本発明の化合物で処理した場合を、フィナステリドで処理した場合と比べて、テストステロン濃度の増加及びＤＨＴ濃度の減少の効果は一層顕著なものであると確認された（図２ａ及び図２ｂ参照）。
【００６７】
実験例３．本発明の化合物の角質細胞の増殖に対する効果
実施例＜１−２＞で合成された化合物に関し、が成長因子に対する類似効果及び抑制効果を分析するため、リッジノなど（Ｒｉｚｚｉｎｏ、ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：４２６６（１９８８））を参照して、ＨａＣａＴ角質細胞株（韓国細胞株銀行、Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ）を利用したＳＲＢ（Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ、Ｓｉｇｍａ）比色分析法を実施した。
【００６８】
ＨａＣａＴ角質細胞株を９６−ウェルプレートに、各ウェル当り３，０００細胞ずつ接種した後、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、Ｓｉｇｍａ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、米国）で２４時間、３７℃、５％のＣＯ２の条件下で培養した。培養された細胞株等を１％のトリプシン溶液で処理し、培養容器の底から分離した後、遠心分離して細胞沈殿物のみを集めた。これをＦＢＳが含有されていないＤＭＥＭ培地に再度懸濁した後、２４時間、３７℃、５％  のＣＯ２の条件下で培養した。２４時間後、培地を無血清の同様の培地で交換した後、ブランクとしての、滅菌状態で空試料を１０％のＤＭＳＯに溶かしたもの、陽性対照群としての、本発明の化合物１〜３（５０μＭ）、フィナステリド（５０μＭ）及びＥＧＦ（１００ｎＭ）をそれぞれ使って、前記と同様の条件で細胞を７２時間培養した。培養が完了した後に培養上澄液を除去し、エタノールを利用して細胞を固定した後、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ）で細胞を３回洗浄した。洗浄溶液を除去した後に比色ＳＲＢ溶液で処理し、１％の酢酸で十分洗浄した後、顕微鏡で細胞を観察して細胞の生存状態を観察し、５６０ｎｍの波長の紫外線で吸光度を測定して細胞の生存性（cell viability）を分析した。
【００６９】
前記のように本発明の化合物で角質細胞を処理した後、７２時間後、細胞の形態の変化を顕微鏡で観察した結果、本発明の化合物が角質細胞の増殖及び形態学的模様を変えたことを確認した（図３ａ）。さらに、フィナステリドで処理した場合と比べて、本発明の化合物で処理した場合は、角質細胞の増殖が大幅に増加したことを確認した（図３ｂ）。
【００７０】
実験例４．本発明の化合物のＨＨＤＰＣ細胞の増殖に対する効果
前記実験例３と同様の方法により、本発明の化合物がＨＨＤＰＣ細胞（ＡＴＣＣ／米国）の増殖に対する効果を確認した。このとき、陽性対照群としてはＭＮＸ（１０ｕＭ）及びＩＧＦ−１（１ｕＭ）を用いた。
その結果、本発明の化合物がＨＨＤＰＣ細胞の増殖及び形態学的模様を変えたことを確認した（図４ａ）。さらに、フィナステリドで処理した場合と比べて、本発明の化合物で処理した場合は、ＨＨＤＰＣ細胞の増殖が大幅に増加したことを確認した（図４ｂ）。
【００７１】
実験例５．本発明の化合物がベータ−カテニンの核内への送達に及ぼす効果に対する分析
４８時間培養したＨＨＤＰＣ細胞を実施例＜１−２＞で合成した本発明の化合物で処理し、５時間経過した後、ＷＮＴタンパク質の代表的なシグナル伝達経路によって発毛の促進に必須なシグナル物質であるベータ−カテニンの核内への送達（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）に及ぼす効果を測定した。ベータ−カテニンの発現量は、ベータ−カテニンに対する抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、米国）を利用したウエスタンブロットを介して観察し、且つ同一の抗体を利用した免疫染色化学法を介してベータ−カテニンが核内に送達されたか否かを確認した。具体的に、ＨＨＤＰＣ細胞を６−ウェルプレートの各ウェル当りに１００，０００細胞ずつ接種した後、２４時間、３７℃で、ＣＯ２インキュベーターに培養した。培地を無血清ＤＭＥＭ培地に変更し、フィナステリド、フィナステリド−ＷＩＮＴ化合物、ＷＩＮＴをそれぞれ５及び５０μＭの濃度で細胞を処理した後、２４時間培養した。タンパク質抽出キットを利用して核及び細胞質タンパク質をそれぞれ抽出した後、下記の条件下でウエスタンブロットを実施した。
−  １２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを調製
−  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに１５μｇのタンパク質をローディング
−  ＰＶＤＦ膜に転写
−  常温で１時間、５％の乾燥脱脂乳溶液でブロッキング
−  １／３０００の濃度で２時間、常温で１次抗体（抗−ベータ−カテニン抗体、抗−ＨＤＡＣ、抗−アルファチューブリン抗体）を反応
−  ＰＢＳＴで１０分間３回洗浄
−  １／５０００の濃度で１時間、常温で２次抗体を反応
−  ＰＢＳＴで１５分間３回洗浄
−  検出
【００７２】
その結果、本発明の化合物で処理した場合、ベータ−カテニンの発現が増加することが確認された。さらに、ＨＨＤＰＣ細胞で免疫染色化学法を利用して、ベータ−カテニンが核内へ送達されたか否かを測定した時も、ベータ−カテニンが本発明の化合物によって細胞質から核内に送達されたことが確認され、本発明の化合物は依然として細胞質に存在し活性があることが確認された（図５ａ及び図５ｂ）。
【００７３】
実験例６．本発明の化合物がＢＭＰシグナル転移の抑制に及ぼす効果に対する分析
４８時間培養したＨＨＤＰＣ細胞を実施例＜１−２＞で合成した本発明の化合物等で処理し、５時間経過した後、ＢＭＰタンパク質の代表的なシグナル伝達経路によって本発明の化合物の、脱毛の抑制に必須なシグナル物質であるｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５／８の活性に及ぼす効果を測定した。ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５／８の発現量は、ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５／８に対する抗体を利用したウエスタンブロットを介して確認した。具体的に、ＨＨＤＰＣ細胞を６−ウェルプレートの各ウェル当りに１００，０００細胞ずつ接種した後、２４時間、３７℃で、ＣＯ２インキュベーターに培養した。培地を無血清ＤＭＥＭ培地に変更した後、フィナステリド及びフィナステリド−ノッキン化合物をそれぞれ０．５、５及び５０μＭの濃度で細胞を処理した後、２４時間培養した。タンパク質抽出キットを利用して核及び細胞質タンパク質をそれぞれ抽出した後、下記の条件下でウエスタンブロットを実施した。
−  １２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを調製
−  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに１５μｇのタンパク質をローディング
−  ＰＶＤＦ膜に転写
−  常温で１時間、５％の乾燥脱脂乳溶液でブロッキング
−  １／３０００の濃度で２時間、常温で１次抗体（抗−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５／８抗体、抗−ＨＤＡＣ、抗−アルファチューブリン抗体）を反応
−  ＰＢＳＴで１０分間３回洗浄
−  １／５０００の濃度で１時間、常温で２次抗体を反応
−  ＰＢＳＴで１５分間３回洗浄
−  検出
【００７４】
その結果、本発明の化合物で処理した場合、核内でのｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｍａｄ１／５／８の発現が減少したことを確認した（図６ａ及び図６ｂ）。
【００７５】
実験例７．本発明の化合物がＤＫＫ−１の発現に及ぼす効果に対する分析
本発明の化合物がＤＨＴによって発現される代表的な脱毛タンパク質であるＤＫＫ−１のｍＲＮＡ発現に及ぼす効果を確認した。具体的に、ＨＨＤＰＣ細胞を６−ウェルプレートの各ウェル当りに１００，０００細胞ずつ接種した後、２４時間、３７℃で、ＣＯ２インキュベーターに培養した。テストステロンを、フィナステリドまたは本発明の化合物１〜３のフィナステリド−ノッキン化合物、フィナステリド−ケラミン２化合物及びフィナステリド−ＷＩＮＴ化合物と先ず反応させた後、当該溶液に肝細胞抽出物を入れて３７℃で１時間反応させ、テストステロンに肝細胞抽出物を入れて３７℃で１時間反応させたものを陽性対照群とした。培地を無血清ＤＭＥＭ培地に変更した後、フィナステリド及びフィナステリド−ノッキン化合物、フィナステリド−ケラミン２化合物及びフィナステリド−ＷＩＮＴ化合物をそれぞれ５０μＭの濃度で細胞を処理した後、２４時間培養した。ＲＮＡ抽出キットを利用して細胞のＲＮＡを抽出した後、下記プライマーを利用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。
１．ＤＫＫ−１
−  正方向プライマー：（５’）ＴＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＧＣＧＣＴＡＧＴＣ（３’）（配列番号４）
−  逆方向プライマー：（５’）ＣＴＣＣＴＡＴＧＣＴＴＧＧＴＡＣＡＣＡＣ（３’）（配列番号５）
２．ＧＡＰＤＨ
−  正方向プライマー：（５’）ＧＧＡＧＣＣＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴ（３’）（配列番号６）
−  逆方向プライマー：（５’）ＧＴＧＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴ（３’）（配列番号７）
【００７６】
その結果、本発明の化合物は、フィナステリドで処理した場合よりも、陽性対照群における増加したＤＫＫ−１の発現をさらに抑制し、特に、何も処理していない陰性対照群よりもさらに低い水準にＤＫＫ−１の発現を抑制することができることを確認した（図７ａ及び図７ｂ）。
【００７７】
実験例８．毛髪成長テスト
本発明の化合物が毛髪の成長に対する効果を、動物実験を介して確認した。具体的に、７週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背中の毛を、除毛クリームを利用して全て除去した。ＰＢＳ、フィナステリド及び本発明のフィナステリド−ＷＩＮＴ化合物を１００μｇ／ｍｌの濃度で調製した後、一日に１回ずつマウスの背中の皮膚に均一に塗布し、マウスの背中の皮膚の色が黒くなる時点から写真を撮影して観察した。
【００７８】
以後、マウスを殺し、背中の皮膚の毛をＨ＆Ｅ染色を介して観察した。このために、マウスの背中の皮膚を採取して４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に固定した後、パラフィン包埋を実施した。包埋されたマウスの背中の皮膚を４μｍの厚さに切った後、Ｈ＆Ｅ染色を介して毛嚢の数を確認した。
【００７９】
その結果、本発明のフィナステリド−ＷＩＮＴ化合物を塗布したマウスの場合は、ＰＢＳまたはフィナステリドを塗布したマウスと比べてマウスの毛の成長速度が著しく速く（図８ａ）、毛嚢の数も対照群及びフィナステリド投与群と比べて著しく増加したことを確認した（図８ｂ）。
【００８０】
実験例９．皮膚透過テスト
フィナステリドはステロイド系のホルモンを制御するための薬物であるため、これを経口投与する場合は、血液に拡散することによって全身毒性を誘発するなどの副作用が発生し得る。したがって、皮膚に塗布する際にも皮膚を透過する場合は、全身に浸透して毒性を誘発する可能性があり、皮膚を透過しない場合は、頭皮内に残って全身に拡散しないため、フィナステリドの副作用を抑制することが可能である。よって、本発明者達は、３次元人工皮膚にフィナステリドと本発明のフィナステリド−ＷＩＮＴ化合物を塗布した後、皮膚を透過するのか否かを確認した。
【００８１】
このために、エタノール１０％、プロピレングリコール４０％及び精製水５０％の混合溶媒に、フィナステリドと本発明のフィナステリド−ＷＩＮＴ化合物をそれぞれ溶解させた。３次元人工皮膚を利用してフランツ（Ｆｒａｎｚ）拡散セルテストを実施した。フィナステリドとフィナステリド−ＷＩＮＴ化合物溶液を１ｍｌずつ３次元人工皮膚の上に塗布し、２４時間放置した。受容体チャンバ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｈａｍｂｅｒ）の溶液をサンプリングした後、ＨＰＬＣを利用して、皮膚を透過したフィナステリドとフィナステリド−ＷＩＮＴ化合物を検出した。ＨＰＬＣのフィナステリド検出条件は、Ｃ１８カラム、ＵＶ  ２１０ｎｍ、流速１．６ｍｌ／分、アセトニトリル：水  ＝  ４５：５５であり、検出Ｒ．Ｔは９から１０分であった。本発明のフィナステリド−ＷＩＮＴ化合物を検出するため、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（３２００  Ｑｔｒａｐ）装置を利用して当該分子量の検出分析法であるＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）分析を実施した。
【００８２】
その結果、フィナステリドのみで処理した薬物は皮膚を透過して検出されたことを確認し、本発明のフィナステリド−ＷＩＮＴ化合物で処理した薬物は、皮膚を透過する物質が検出されておらず、皮膚に残っていることを確認した（図９ａ及び図９ｂ）。
【００８３】
実験例１〜９の実験の結果をまとめると、本発明の化合物は非常に優れた発毛促進及び脱毛抑制機能を発揮するとともに、抗老化機能も発揮することが分かった。
【００８４】
剤形例１：柔軟化粧水
前記実施例＜１−２＞で製造された本発明の化合物を含み、且つ下記組成からなる柔軟化粧水を、一般的な化粧水の製造方法によって製造した。
【００８５】
【表２】
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【００８６】
剤形例２．栄養クリーム
前記実施例＜１−２＞で製造された本発明の化合物を含み、且つ下記組成からなる栄養クリームを、一般的な栄養クリームの製造方法によって製造した。
【００８７】
【表３】
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【００８８】
剤形例３．乳液
前記実施例＜１−２＞で製造された本発明の化合物を含み、且つ下記組成からなる乳液を、一般的な化粧水の製造方法によって製造した。
【００８９】
【表４】
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【００９０】
剤形例４．エッセンス
前記実施例＜１−２＞で製造された本発明の化合物を含み、且つ下記組成からなるエッセンスを、一般的なエッセンスの製造方法によって製造した。
【００９１】
【表５】
2019512502.tif 000012
【００９２】
剤形例５．ヘアセラム
前記実施例＜１−２＞で製造された本発明の化合物を含み、且つ下記組成からなるヘアセラムを、一般的なヘアセラムの製造方法によって製造した。
【００９３】
【表６】
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【００９４】
剤形例６．ヘアトナー
前記実施例＜１−２＞で製造された本発明の化合物を含み、且つ下記組成からなるヘアトナーを、一般的なヘアトナーの製造方法によって製造した。
【００９５】
【表７】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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