(57)【要約】  被験者に対する癌のスクリーニング、モニタリング、治療、診断において、循環癌細胞によるＰＤ−Ｌ１発現の検出を用いる方法を開示する。当該方法は、ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から単離された、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、上皮間葉転換ＣＴＣ（ＥＭＴＣＴＣ）、癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）、及び癌関連血管内皮細胞（ＣＡＶＥ）のうちの１つ以上をアッセイすることに基づく。
2019514028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性について、癌を有する対象をスクリーニングする方法であって、
ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から単離された、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、上皮間葉転換ＣＴＣ（ＥＭＴＣＴＣ）、癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）、及び癌関連血管内皮細胞（ＣＡＶＥ）のうちの１つ以上をアッセイすることを含み、
ＰＤ−Ｌ１発現が検出された場合、前記対象は、免疫チェックポイント阻害剤が有効であるとみなす、前記方法。
【請求項２】
免疫チェックポイント阻害剤による治療に対する、癌を有する対象の応答性を予測する方法であって、
ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から単離された、ＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることを含み、
ＰＤ−Ｌ１発現が検出された場合、前記対象は、免疫チェックポイント阻害剤による処置に応答性があると予測する、前記方法。
【請求項３】
癌を有する対象の治療を選択する方法であって、
ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から単離された、ＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥの１つ以上をアッセイすることを含み、
ＰＤ−Ｌ１発現が検出された場合、前記対象の治療として前記対象への治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤の投与を選択する、前記方法。
【請求項４】
免疫チェックポイント阻害剤治療を受ける癌を有する対象を同定するためのアッセイの方法であって、
ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から単離された、ＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることを含み、
ＰＤ−Ｌ１発現が検出された場合、前記対象は、免疫チェックポイント阻害剤治療を受ける対象として同定される、前記方法。
【請求項５】
癌を有する対象を治療する方法であって、
（ａ）ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から単離された、ＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることと、
（ｂ）ＰＤ−Ｌ１発現が検出された場合、前記対象に治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤を投与することと、
を含む方法。
【請求項６】
癌を有する対象を治療する方法であって、
癌を有する対象に治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、前記免疫チェックポイント阻害剤は、前記癌を有する対象から単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上において、ＰＤ−Ｌ１発現が検出された後に投与される、前記方法。
【請求項７】
癌を有する対象におけるＰＤ−Ｌ１発現をモニタリングする方法であって、
（ａ）ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から第１の時点で単離された、ＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることと、
（ｂ）ＰＤ−Ｌ１発現について、前記癌を有する対象から第２の時点で単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることと、
（ｃ）前記第１及び第２の時点で単離された細胞においてアッセイされたＰＤ−Ｌ１発現を比較することと、
を含む方法。
【請求項８】
前記対象は、癌の治療を受けている、請求項８に記載の方法。
【請求項９】
癌を有する対象における治療をモニタリングする方法であって、
（ａ）ＰＤ−Ｌ１発現について、癌の治療を受けている対象から第１の時点で単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることと、
（ｂ）ＰＤ−Ｌ１発現について、前記癌の治療を受けている対象から第２の時点で単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることと、
（ｃ）前記第１及び第２の時点で単離された細胞においてアッセイされたＰＤ−Ｌ１発現を比較することにより、前記癌を有する対象における治療をモニタリングすることと、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記対象は免疫チェックポイント阻害剤を用いて治療されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＰＤ−１アンタゴニスト、及びＣＴＬＡ−４アンタゴニストのうちの１つ以上である、請求項１〜６及び１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との間の結合を阻害する、請求項１〜６及び１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１のその結合パートナーへの結合を阻害する、請求項１〜６及び１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１のその結合パートナーへの結合を阻害する、請求項１〜６及び１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４のその結合パートナーへの結合を阻害する、請求項１〜６及び１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、抗体である、請求項１〜６及び１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、モノクローナル抗体である、請求項〜６及び１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である、請求項１〜６及び１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ（オプジーボ）、イピリムマブ（ヤーボイ）、ペムブロリズマブ（キイトルーダ）、アテゾリズマブ（テセントリク）、トレメリムマブ、及びデュルバルマブ（ＭＥＤ１４７３６）のうちの１つ以上である、請求項１〜６及び１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
１つ以上の追加の抗癌剤の治療有効量を対象に投与することを更に含む、請求項５、６、８、及び１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の追加の抗癌剤は、免疫療法剤、化学療法剤、放射線療法剤、既存の癌剤、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上の追加の抗癌剤は、Ｔ−ＶＥＣ、ＡＭ−００１０、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＴＧＦ−βキナーゼ阻害剤ガルニセルチブ、抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体、アベマシクリブ、ファスロデックス、ネシツムマブ、ＡＺＤ９２９１、サイラムザ（ラムシルマブ）、ＴＰＩＶ２００、ガルニセルチブ、癌ワクチン、サイトカイン、細胞ベースの療法、二重及び多重特異性抗体、腫瘍ターゲティングｍＡｂｓ、リツキシマブ、腫瘍溶解性ウイルス、レオウイルス、ブリナツモマブ、シプリューセル−Ｔ、Ｔ−Ｖｅｃ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、トラスツズマブ、セルキシマブ、ベバシズマブ、Ｔｉｍ−３、ＢＴＬＡ、抗ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、抗血管新生治療、ＶＥＧＦ遮断薬、ＨＭＧＢ１、Ｎｒｐ１、ＴＡＭ受容体チロシンキナーゼ、Ａｘｌ、ＭｅｒＴＫ、ＡＬＴ−８０３、ＩＬ−１５、免疫抑制リガンドホスファチジルセリン（ＰＳ）、バビツキシマブ、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、コブルメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、ベムラフェニブ（ＢＲＡＦ阻害剤）、エルロチニブ（ＥＧＦＲ）、アレクチニブ（ＡＬＫ阻害剤）、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ）、パゾパニブ（チロシンキナーゼ阻害剤）、ダブラフェニブ（ＢＲＡＦ阻害剤）、トラメチニブ（ＭＥＫ阻害剤）、デュルバルマブ（抗ＰＤ−Ｌ１）、スニチニブ（ＲＴＫ阻害剤）、パゾパニブ（ＲＴＫ阻害剤）、サルグラモスチム、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＰＲＳ−３４３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）／ＨＥＲ２二重特異性抗体、ＵＳＰ７、抗ＨＥＲ２、ＳＥＭＡ４Ｄ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＰＤ−Ｌ１発現のアッセイは、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を検出すること及びＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡ産生を検出することのうちの１つ以上によって行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって検出される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＩＨＣは、膜染色、細胞質染色、又はこれらの組み合わせによって行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＩＨＣは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて行われる、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、ＩＨＣによって低染色強度として検出される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、ＩＨＣによって高染色強度として検出される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、ＩＨＣによって誘導可能であるとして検出される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、単離された細胞の染色として検出される、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ＩＨＣは、ＰＤ−Ｌ１に対する結合特異性を有する１つ以上の抗体を利用する免疫蛍光（ＩＦ）染色を用いて行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
ＰＤ−Ｌ１への抗ＰＤ−Ｌ１抗体の結合は、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体にコンジュゲートされた蛍光化合物を介して検出される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＰＤ−Ｌ１への抗ＰＤ−Ｌ１抗体の結合は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対する結合特異性を有するフルオロフォアコンジュゲート二次抗体を介して検出される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ＰＤ−Ｌ１発現レベルが、癌に罹患していない同じ種の対象由来の間質細胞の集団のＰＤ−Ｌ１発現よりも大きい場合、ＰＤ−Ｌ１発現が検出される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥは、前記癌を有する対象から得た血液から単離される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記血液は末梢血である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌を有する対象は、標的薬剤、化学療法、又は放射線療法のうちの１つ以上を用いて治療を受けている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌は、固形腫瘍である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記固形腫瘍は、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、又はステージＩＶの癌である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記固形腫瘍は、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、又はメラノーマである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４１】
前記癌は、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、メラノーマ、膀胱癌、腎臓癌、頭頸部癌、大腸癌、肝臓癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、肉腫、骨肉腫、食道癌、脳及びその他神経系癌、喉頭癌、気管支癌、口腔及び咽頭癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮頸癌、又は子宮体癌の１つ以上である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
少なくとも１つのＣＴＣ、ＥＭＴセル、ＣＡＭＬ、又はＣＡＶＥは、少なくとも１つのＲＡＤ５０巣を示す、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
癌は、米国における死因の第二位であり、男性の４２％、女性の３８％が生涯のうちで癌を発症する[51-54]。免疫療法は、起原にかかわらず、患者の免疫系を利用して癌を攻撃する治療法である。免疫系は、細菌やウイルスなど、体内に侵入した異物を攻撃するために進化したチェックとバランスのネットワークによって調整されている。しかしながら、癌は、例えば、ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２等のタンパク質を発現することによって免疫系を回避でき、これらによって免疫系が癌細胞を攻撃することを阻害する。
【０００２】
具体的には、腫瘍細胞とＴ細胞との間の相互作用は、腫瘍細胞上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）とＴ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）とが接触することを含む[54]。ＭＨＣとＴ細胞受容体とが接触すると、Ｔ細胞が活性化され、腫瘍細胞が破壊される。
【０００３】
腫瘍細胞は、表面に免疫チェックポイントタンパク質ＰＤ−Ｌ１を発現している場合、Ｔ細胞免疫監視を免れてしまうことがある。ＰＤ−Ｌ１は、存在する場合、Ｔ細胞によって発現されるＰＤ−１に結合し、これにより、Ｔ細胞の活性化が阻止され、Ｔ細胞免疫監視が抑制される。
【０００４】
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を遮断できる免疫チェックポイント阻害剤が開発されている。このような薬物は、Ｔ細胞免疫監視機構が再び正常に機能することを可能にし、従って、対象における正常な免疫応答によって腫瘍細胞を破壊できる。
【０００５】
Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４の遮断も同様の効果を有する可能性がある。ＦＤＡは、メラノーマについてのＣＴＬＡ−４に基づく最初の免疫療法剤を２０１１年に承認した。ＦＤＡ免疫療法承認のペースは、２０１４年に高まり、２０１６年末までに、メラノーマ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、頭頸部癌、膀胱癌及びホジキンリンパ腫に対する１８件の免疫療法が承認されている[55-59]。現在、複数の腫瘍にわたる広範な有効性の可能性を示す１００以上のオープン免疫療法臨床試験が存在する。
【０００６】
免疫チェックポイント阻害剤の有効な使用の鍵は、癌を有する特定の対象が薬物に応答するか否かを判定することである。ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−１に結合し、免疫チェックポイント阻害剤として働く抗体を、腫瘍細胞がＰＤ−Ｌ１を発現しない患者に投与しても、治療の効果はない。このような抗体ベースの治療は非常に高価であるため、患者がその治療に応答する少なくとも幾つかの徴候を確認することが重要である。
【０００７】
ＰＤ−Ｌ１発現を検査するために腫瘍生検によって癌細胞を取得することは、患者に痛みや不快感を与えること、単離された腫瘍の領域以外を検査できないこと、腫瘍微小環境においてタンパク質発現プロファイルの変化が経時的に起こる可能性があることを含む重大な欠点を有する。
【０００８】
血液ベースの生検は、腫瘍によって放出されるか、さもなくば分離する細胞のリアルタイムシーケンシャルトラッキングを提供できる点で優れた組織生検である。血液サンプルは、患者からより容易に及びより頻繁に取得できる。更に、タンパク質発現プロファイルの変化を経時的にモニタリングできる。循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）は、末梢血から容易に単離でき、組織生検から得られる腫瘍細胞の代替物として使用できる癌関連細胞型の１つである[1-4]。ＣＴＣは、固形腫瘍から離れて血流中に流入する腫瘍細胞である。ＣＴＣは、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、及びメラノーマ患者の血液中に見出される。
【０００９】
血液ベースの生検から得ることができる更なる細胞型の同定は、この技術を更に発展させて、免疫チェックポイント阻害剤による治療が有効な癌患者を特定するために重要である。
【００１０】
本発明は、癌を有する対象にとって、免疫チェックポイント阻害剤での治療が有益であるかを判定するための有効な手段を提供すること、並びに他の重要な目的を含む。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、その発現が対象における癌のスクリーニング、モニタリング、及び診断に使用される末梢ベースのバイオマーカー及び細胞に関する。また、本発明は、バイオマーカーの発現の有無又は発現の変化に基づいて癌を治療する方法に関する。本明細書で定義する方法により、腫瘍医は、従来の細胞傷害性療法と免疫療法のより良好な組合せ及び順序を選択でき、並びに免疫療法に対する耐性を有する応答を示す可能性が高い患者を識別しうる。
【００１２】
第１の実施形態では、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性について、癌を有する対象をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から単離された循環腫瘍細胞（circulating tumor cell：ＣＴＣ）、上皮間葉転換ＣＴＣ（epithelial to mesenchymal transition CTC cell：ＥＭＴＣＴＣ）、癌関連マクロファージ様細胞（cancer associated macrophage-like cell：ＣＡＭＬ）、及び癌関連血管内皮細胞（cancer associated vascular endothelial cell：ＣＡＶＥ）のうちの１つ以上をアッセイすることを含み、ＰＤ−Ｌ１発現が検出された場合、対象は、免疫チェックポイント阻害剤が有効であるとみなす。
【００１３】
第２の実施形態では、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤による治療に対する、癌を有する対象の応答性を予測する方法を提供する。この方法は、ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることを含み、ＰＤ−Ｌ１発現が検出された場合、対象は、免疫チェックポイント阻害剤による処置に応答性があると予測する。
【００１４】
第３の実施形態では、本発明は、癌を有する対象の治療を選択する方法を提供する。この方法は、ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることを含み、ＰＤ−Ｌ１発現が検出された場合、対象の治療として対象への治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤の投与を選択する。
【００１５】
第４の実施形態では、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤治療を受ける癌を有する対象を同定するためのアッセイの方法を提供する。この方法は、癌を有する対象から単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることを含み、ＰＤ−Ｌ１発現が検出された場合、対象は、免疫チェックポイント阻害剤治療を受ける対象として同定される。
【００１６】
第５の実施形態では、本発明は、癌を有する対象を治療する方法を提供する。この方法は、（ａ）ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることと、（ｂ）ＰＤ−Ｌ１発現が検出された場合、対象に治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤を投与することとを含む。
【００１７】
第６の実施形態では、本発明は、癌を有する対象を治療する方法を提供する。この方法は、癌を有する対象に治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤を投与することを含み、免疫チェックポイント阻害剤は、癌を有する対象から単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上において、ＰＤ−Ｌ１発現が検出された後に投与される。
【００１８】
第７の実施形態では、本発明は、癌を有する対象におけるＰＤ−Ｌ１発現をモニタリングする方法を提供する。この方法は、（ａ）ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から第１の時点で単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることと、（ｂ）ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から第２の時点で単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることと、（ｃ）第１及び第２の時点で単離された細胞においてアッセイされたＰＤ−Ｌ１発現を比較することとを含む。この実施形態の特定の側面では、対象は、癌の治療を受けている。
【００１９】
第８の実施形態では、本発明は、癌を有する対象における治療をモニタリングする方法を提供する。この方法は、（ａ）ＰＤ−Ｌ１発現について、癌の治療を受けている対象から第１の時点で単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることと、（ｂ）ＰＤ−Ｌ１発現について、癌の治療を受けている対象から第２の時点で単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥの１つ以上をアッセイすることと、（ｃ）第１及び第２の時点で単離された細胞においてアッセイされたＰＤ−Ｌ１発現を比較することにより、癌を有する対象における治療をモニタリングすることとを含む。この実施形態の特定の側面では、対象は、免疫チェックポイント阻害剤を用いて治療されている。
【００２０】
関連する実施形態及び側面において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＰＤ−１アンタゴニスト、及びＣＴＬＡ−４アンタゴニストのうちの１つ以上である。
【００２１】
上述のように定められる、所定の関連実施形態及び側面において、免疫チェックポイント阻害剤は、（ｉ）ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との間の結合、（ｉｉ）ＰＤ−Ｌ１のその結合パートナーへの結合、（ｉｉｉ）ＰＤ−１のその結合パートナーへの結合、及び（ｉｖ）ＣＴＬＡ−４のその結合パートナーへの結合のうちの１つ以上を阻害する。
【００２２】
上述のように定められる、所定の関連実施形態及び側面において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体、例えば、モノクローナル抗体である。特定の側面において、免疫チェックポイント阻害剤は、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である。
【００２３】
具体的な免疫チェックポイント阻害剤の例は、以下に限定されるものではないが、ニボルマブ（Nivolumab）（オプジーボ：Opdivo）、イピリムマブ（Ipilimumab）（ヤーボイ：Yervoy）、ペムブロリズマブ（Pembrolizumab）（キイトルーダ：Keytruda）、アテゾリズマブ（Atezolizumab）（テセントリク：Tecentriq）、トレメリムマブ（Tremelimumab）、及びデュルバルマブ（Durvalumab）（ＭＥＤ１４７３６）のうちの１つ以上を含む。
上述のように定められる、所定の関連関連する実施形態及び側面において、方法は、１つ以上の治療有効量の追加の抗癌剤を対象に投与することを更に含む。追加の抗癌剤は、以下に限定されるものではないが、免疫療法剤、化学療法剤、放射線治療薬、既存の癌剤、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４等を含む。
【００２４】
具体的な抗癌剤の例は、以下に限定されるものではないが、Ｔ−ＶＥＣ、ＡＭ−００１０、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＴＧＦ−βキナーゼ阻害剤ガルニセルチブ（galunisertib）、抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体、アベマシクリブ（Abemaciclib）、ファスロデックス（Faslodex）、ネシツムマブ（necitumumab）、ＡＺＤ９２９１、サイラムザ（Cyramza）（ラムシルマブ（ramucirumab））、ＴＰＩＶ２００、ガルニセルチブ（Galunisertib）、癌ワクチン、サイトカイン、細胞ベースの療法、二重及び多重特異性抗体、腫瘍ターゲティングｍＡｂｓ、リツキシマブ（Rituximab）、腫瘍溶解性ウイルス、レオウイルス、ブリナツモマブ（Blinatumomab）、シプリューセル−Ｔ（Sipuleucel-T）、Ｔ−Ｖｅｃ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、トラスツズマブ（Trastuzumab）、セルキシマブ（Celuximab）、ベバシズマブ（bevacizumab）、Ｔｉｍ−３、ＢＴＬＡ、抗ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、抗血管新生治療、ＶＥＧＦ遮断薬、ＨＭＧＢ１、Ｎｒｐ１、ＴＡＭ受容体チロシンキナーゼ、Ａｘｌ、ＭｅｒＴＫ、ＡＬＴ−８０３、ＩＬ−１５、免疫抑制リガンドホスファチジルセリン（Ligand Phosphatidylserine：ＰＳ）、バビツキシマブ（bavituximab）、ベバシズマブ（bevacizumab）（抗ＶＥＧＦ）、コブルメチニブ（coblmetinib）（ＭＥＫ阻害剤）、ベムラフェニブ（vemurafenib）（ＢＲＡＦ阻害剤）、エルロチニブ（erlotinib）（ＥＧＦＲ）、アレクチニブ（alectinib）（ＡＬＫ阻害剤）、ベバシズマブ（bevacizumab）（抗ＶＥＧＦ）、パゾパニブ（pazopanib）（チロシンキナーゼ阻害剤）、ダブラフェニブ（dabrafenib）（ＢＲＡＦ阻害剤）、トラメチニブ（trametinib）（ＭＥＫ阻害剤）、デュルバルマブ（durvalumab）（抗ＰＤ−Ｌ１）、スニチニブ（sunitinib）（ＲＴＫ阻害剤）、パゾパニブ（pazopanib）（ＲＴＫ阻害剤）、サルグラモスチム（sargramostim）、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＰＲＳ−３４３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）／ＨＥＲ２二重特異性抗体、ＵＳＰ７、抗ＨＥＲ２、ＳＥＭＡ４Ｄ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２のうちの１つ以上を含むことができる。
【００２５】
上述のように定められる、所定の関連する実施形態及び側面において、ＰＤ−Ｌ１発現のアッセイは、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を検出すること及びＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡ産生を検出することの１つ以上によって行ってもよい。ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、例えば、免疫組織化学（immunohistochemistry：ＩＨＣ）によって検出してもよい。ＩＨＣは、膜染色、細胞質染色、又はこれらの組み合わせによって行ってもよい。ＩＨＣは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、すなわち、ＰＤ−Ｌ１に対する結合特異性を有する抗体を用いて行ってもよい。ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、ＩＨＣによる弱い染色強度、中程度染色強度、又は強い染色強度として検出してもよい。また、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、ＩＨＣによる低染色強度、中程度染色強度、又は高染色強度として検出してもよい。また、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現の検出は、低染色強度から高染色強度への変化から導いてもよく、低染色強度から中程度染色強度への変化から導いてもよく、中程度染色強度から高染色強度への変化から導いてもよい。ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、単離された細胞の染色として検出してもよい。
【００２６】
ある側面において、ＩＨＣは、ＰＤ−Ｌ１に対する結合特異性を有する１つ以上の抗体を利用する免疫蛍光（ＩＦ）染色を用いて行われる。ＰＤ−Ｌ１への抗ＰＤ−Ｌ１抗体の結合は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体にコンジュゲートされた蛍光化合物を介して検出してもよく、抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対する結合特異性を有する標識コンジュゲート二次抗体を介して検出してもよい。適切な検出可能な標識としては、フルオロフォア（fluorophore）が挙げられる。
【００２７】
上述のように定められる、所定の関連する実施形態及び側面では、ＰＤ−Ｌ１発現レベルが、癌に罹患していない同じ種の対象由来の間質細胞の集団のＰＤ−Ｌ１発現よりも大きい場合、ＰＤ−Ｌ１発現が検出される。
【００２８】
上述のように定められる、所定の関連する実施形態及び側面では、ＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥは、癌を有する対象から得た血液から単離される。特定の側面では、血液は末梢血である。
【００２９】
上述のように定められる、所定の関連する実施形態及び側面では、癌を有する対象は、標的薬剤、化学療法、又は放射線療法の１つ以上を用いて治療を受けていてもよい。
【００３０】
上述のように定められる、所定の関連する実施形態及び側面では、癌は、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、メラノーマ、膀胱癌、腎臓癌、頭頸部癌、大腸癌、肝臓癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、肉腫、骨肉腫、食道癌、脳及びその他神経系癌、喉頭癌、気管支癌、口腔及び咽頭癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮頸癌、又は子宮体癌である。癌は、固形腫瘍であってもよく、例えば、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、又はステージＩＶの固形腫瘍等の癌であってもよい。固形腫瘍は、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫、又はメラノーマであってもよい。肺癌の例には、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が含まれるが、これに限定されない。
【００３１】
上で定義した特定の関連する実施形態及び側面において、少なくとも１つのＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、又はＣＡＶＥは、少なくとも１つのＲＡＤ５０巣（RAD50 foci）を示す。
【００３２】
以上の記述は、以下の本発明の詳細な説明をより理解しうるように、本発明の特徴及び技術的利点を包括的に概説したものである。以下では、本発明の特許請求の範囲の主題を構成する本発明の更なる特徴及び利点について記述する。本明細書に開示する任意の概念及び特定の実施形態は、本発明と同じ目的を達成するための他の構造を変更又は設計するための基礎として利用できることは、当業者によって理解されよう。このような均等な構成は、特許請求の範囲に記載されている本発明の思想及び範囲から逸脱するものではないことは、当業者によって理解されよう。その構成と運用方法の両方に関して本発明の特徴であると考えられる新規な特徴は、更なる目的及び利点と共に、添付図面を参照する以下の説明から一層理解される。なお、任意の説明、図、実施例等は、例示及び説明のためにのみ提供され、本発明の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】血液ベースの生検を用いて、ＤＡＰＩ、サイトケラチン、ＥｐＣＡＭ、及びＣＤ４５によって循環細胞を同定及び亜型化し、ＱＵＡＳ−Ｒ蛍光クエンチ技術を使用してＲＡＤ５０及びＰＤ−Ｌ１について細胞を再染色した。（図１Ａ）細胞のＥＭＴＣＴＣクラスターの例では、サイトケラチンについては弱陽性であり、ＥｐＣＡＭについては陰性であり、ＣＤ４５については陰性である。ボックススケール＝９０μｍ。（図１Ｂ）タンパク質エピトープに害を与えることなく蛍光体がクエンチされるＱＵＡＳ−Ｒによってサンプルをクエンチした[13]。次いで、ＰＤ−Ｌ１、ＲＡＤ５０及びＰＤ−１についてサンプルを再染色した。ボックススケール＝９０μｍ。（図１Ｃ）Ｚｅｎソフトウェアで細胞を追跡し、各細胞又は細胞クラスターの平均強度を算出することによってＰＤ−Ｌ１を測定した。ボックススケール＝３５μｍ。（図１Ｄ）ＲＡＤ５０巣（赤色）が、個々の核（シアン）で数えられる。ボックススケール＝３５μｍ。
【００３４】
【図２】図３のＤＡＰＩ、サイトケラチン及びＣＤ４５の個別及び拡大画像。（図２Ａ）線維性サイトケラチンシグナル、病理学的に異常な核あり、及びＣＤ４５なしのＰＤＣＴＣ。白い矢印は、ＤＡＰＩ及びＣＤ４５陽性の典型的な白血球を示す。（図２Ｂ）拡散性サイトケラチンシグナルあり、ＣＤ４５も異常な核もなしのＥＭＴＣＴＣ。（図２Ｃ）ＣＤ４５+及びサイトケラチン+の両方である複数の凝集した核及び拡大した細胞を有するＣＡＭＬ。ボックス＝６５μｍ。
【００３５】
【図３】ベースライン（Ｔ０）及び放射線療法の導入後（Ｔ１）、においてＰＤ−Ｌ１を定量化するために使用できる細胞を含むサンプルのパーセンテージを示す図であり、血液ベースの生検には、循環腫瘍細胞及び循環間質細胞の２つの亜型が含まれる。標準的な生検は、初期のベースラインの時点のみで行われ、ＰＤ−Ｌ１についての分析のために十分な量の腫瘍を有していたものは、これらのサンプルのうち２２％のみであった。茶色染色は、ＰＤ−Ｌ１／青色染色は、ヘマトキシリンである。血液ベースの生検では、ベースラインサンプルの４９％、及び治療後サンプルの６６％においてＥＭＴ腫瘍細胞が同定された。更に、ベースラインサンプルの８１％及びフォローアップサンプルの１００％において、循環間質細胞（ＣＡＭＬ）が利用可能であった。青色＝ＤＡＰＩ、緑色＝サイトケラチン、紫色＝ＣＤ４５、ボックス＝６５ミクロン。
【００３６】
【図４】ダコ（DAKO）の臨床的に承認されたＩＨＣ  ＰＤ−Ｌ１クローンとＢＢＢ  ＰＤ−Ｌ１クローンの試験及び比較。（図４Ａ）腫瘍の１０％において１＋とスコアリングされた患者ＩＤ＃８サンプル由来のクローン２２ｃ３。（図４Ｂ）腫瘍の２０％において２＋とスコアリングされた患者ＩＤ＃８の平行サンプル由来のクローン２８−８。（図４Ｃ）ＢＢＢに最適化されたＰＤ−Ｌ１クローンを使用して、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞数及びセルシーブ（CellSieve：商標）マイクロフィルター上に見出される各細胞の強度を判定した。ＳＩ＝ピクセル強度四分位数、％＝最大ピクセル強度四分位数の陽性細胞のパーセント、Ｎ／Ａ＝テスト可能なサンプルなし。
【００３７】
【図５】循環細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現をスコアリングするための閾値の決定。ＺｅｎＢｌｕｅによって各ＢＢＢ細胞（ｎ＝３７４）のＰＤ−Ｌ１シグナルを判定し、それぞれの画像の相対的なバックグラウンドから減算した。バックグラウンドの標準偏差（ｎ＝３７３）をＢＢＢ  ＩＨＣスコア０（全細胞の２６％）の閾値として用いた。標準偏差の２倍をＢＢＢ  ＩＨＣスコア１（全細胞の４２％）の閾値として用いた。バックグラウンドの２倍をＢＢＢ  ＩＨＣスコア２（全細胞の２２％）の閾値として用いた。残りの全ての強度、バックグラウンドの２倍〜６倍は、≧３（全細胞の１０％）とスコアリングした。
【００３８】
【図６】血液ベースの生検法を使用した、治療期間を通しての循環腫瘍細胞及び間質細胞の両方における、核内のＲＡＤ５０遺伝子座（RAD50 loci）の形成における動的変化及びＰＤ−Ｌ１の細胞へのアップレギュレーションの分析。（図６Ａ）ＲＡＤ５０巣の形成を正確に数えることができ、放射線療法の導入後のＲＡＤ５０遺伝子座の明らかな増加が観察された。このことは、ＥＭＴＣＴＣ及びＣＡＭＬの両方が放射線照射部位に由来していることを示唆している。（図６Ｂ）ＰＤ−Ｌ１は、原発腫瘍部位に由来するＥＭＴＣＴＣ及びＣＡＭＬの両方で評価できる。エラーバー＝標準誤差。
【００３９】
【図７】細胞型別での、放射線療法導入前後の各患者の平均ＰＤ−Ｌ１及びＲＡＤ５０の変化。（図７Ａ及び図７Ｂ）ＣＡＭＬ細胞では、患者の５９％においてＲＡＤ５０の増加が見られ、患者の１５％は、変化がなく、患者の２７％は、一方の時点でＣＡＭＬを有していなかった。ＥＭＴＣＴＣでは、患者の４４％においてＲＡＤ５０の増加が見られ、患者の２％は、変化がなく、患者の５４％は、一方の時点でＥＭＴＣＴＣを有していなかった。（図７Ｃ及び図７Ｄ）ＣＡＭＬ細胞では、患者の５１％において平均ＰＤ−Ｌ１の増加が見られ、患者の２２％において減少が見られ、患者の２７％は、一方の時点でＣＡＭＬを有していなかった。ＥＭＴＣＴＣでは、患者の２９％で平均ＰＤ−Ｌ１の増加が見られ、患者の１７％において減少が見られ、患者の５４％は、一方の時点でＥＭＴＣＴＣを有していなかった。
【００４０】
【図８】放射線療法導入中の各患者におけるＥＭＴＣＴＣ（図８Ｂ及び図８Ｄ）及びＣＡＭＬ（図８Ａ及び図８Ｃ）のＰＤ−Ｌ１発現のスコアリング及び追跡。各患者の最高発現細胞を０〜３（陰性、低、中、又は高）でスコアリングした。放射線療法の導入後に低発現細胞が高発現になる患者、一貫してＰＤ−Ｌ１高発現の循環細胞を有する患者、一貫して低発現の循環細胞を有する患者といった３つの異なるパターンが出現した、ｎ＝３５。
【００４１】
【図９】高／低ＰＤ−Ｌ１発現又はＲＡＤ５０遺伝子座形成の前及び後の放射線療法に基づく患者のＰＦＳを比較。（図９Ａ）Ｔ０における高ＰＤ−Ｌ１発現（２−３ＢＢＢ  ＩＨＣ）患者と低ＰＤ−Ｌ１発現（０−１ＢＢＢ  ＩＨＣ）患者のＰＦＳ、ＰＦＳ中央値１６対＞２４ヶ月。（図９Ｂ）Ｔ１における高ＰＤ−Ｌ１発現患者と低ＰＤ−Ｌ１発現患者のＰＦＳ、ＰＦＳ中央値１６対１８ヶ月、ｐ＝０．９５８。（図９Ｃ）Ｔ０において循環細胞あたり平均≦１のＲＡＤ５０遺伝子座の患者のＰＦＳ、ＰＦＳ中央値１９対１８ヶ月、ｐ＝０．２４６。（図９Ｄ）Ｔ１において循環細胞当たり平均≦１のＲＡＤ５０遺伝子座の患者のＰＦＳ、ＰＦＳ中央値１０対１９ヶ月、ｐ＝０．０３４。
【００４２】
【図１０】図１のＥＭＴＣＴＣクラスターの核内のＲＡＤ５０を上部から底部まで画像化した共焦点画像。ＲＡＤ５０遺伝子座が細胞の核領域内にあることを確認するために、図３からのＥＭＴＣＴＣのクラスターを、Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡で画像化した。クラスタの上部（図１０Ａ）からクラスターの底部（図１０Ｇ）までを画像化した。全てのＲＡＤ５０巣は、核構造内に局在していることが見出され、ＲＡＤ５０巣は、核特有の成分であることが検証される。
【００４３】
【図１１】ＣＤ３１（図１１Ｃ）、ＣＤ１４６（図１１Ｂ）、ビメンチン（Vimentin）（図１１Ｂ）、及びＣＤ１４４（図１１Ｃ）について陽性に染色され、これらの内皮起源を確認するサイトケラチン陽性ＣＡＶＥの代表例。全てのＣＡＶＥは、ＣＤ４５陰性（図１１Ａ）及びＣＤ１４陰性（図１１Ｂ）である。このＣＡＶＥは、ＥｐＣＡＭ陰性（図１１Ａ）に見えるが、一部のＣＡＶＥは、ＥｐＣＡＭを発現することが判明している。
【００４４】
【図１２】１１６人の患者のステージ毎のＣＴＣ及びＣＡＶＥの割合。
【００４５】
【図１３】ＣＡＶＥ集団（ｎ＝１１９サンプル）における各ＥＣマーカーの割合。
【００４６】
【図１４】染色によってＣＡＶＥと同定された細胞クラスターの画像。追加の染色は、併用免疫療法、ＰＤ−Ｌ１及びＣＸＣＲ４の能力を示す。
【００４７】
【図１５】併用免疫療法、ＰＤ−Ｌ１及びＣＣＲ５について染色されたＣＡＭＬの画像を示す図である。
【００４８】
【図１６】ＰＤ−Ｌ１及びＣＣＲ５について染色されたＣＡＭＬの画像。ＰＤ−Ｌ１は、染色されていない。
【００４９】
【図１７】ＰＤ−Ｌ１について染色されたＣＡＭＬの画像。（図１７Ａ）ペムブロリズマブによる治療前のＰＤ−Ｌ１染色。（図１７Ｂ）ペムブロリズマブによる１カ月間治療後のＰＤ−Ｌ１染色。
【００５０】
【図１８】核、ＰＤ１、ビメンチン、及びＣＤ４５について染色されたＣＡＭＬの画像。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
Ｉ．定義
本明細書で使用する不定冠詞「a」又は「an」は、一以上を意味することがある。本明細書において、用語「comprising（含む、有する、備える）」等と関連して使用される場合、不定冠詞「a」又は「an」は、一又は複数を意味することがある。本明細書で使用する「他の（another）」は、少なくとも第２の又はこれ以上を意味することがある。更に、文脈による要求がない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。
【００５２】
本明細書で使用する「約」は、明示の有無にかかわらず、数値、例えば、整数、分数、及び百分率について言及する。「約」という用語は、包括的に、指示された値と等価である（例えば、同じ機能又は結果を有する）と当業者がみなすことができる数値の範囲（例えば、指示された値の＋／−５〜１０％）を意味する。場合によっては、用語「約」は、最も近い有効数字に丸められた数値を含むことができる。
【００５３】
ＩＩ．本発明
液体生検は、末梢血中に見出される循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のリアルタイムで連続的な追跡を提供し、このようなアッセイは組織生検の代替物として使用できる[1-4]。末梢血中の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を評価することによって、特定の治療を受ける特定の対象における癌診断、並びに腫瘍のスクリーニング、モニタリング治療、及び感受性判定のための手段として、上皮間葉転換が進行しているＣＴＣ亜型（ＥＭＴＣＴＣ）[2,3,5-9]及び予後に関連する病理学的に定義可能なＣＴＣ（ＰＤＣＴＣ）[6-10]を含むＣＴＣの異種集団を検査できる。
【００５４】
近年、癌患者の末梢血において、癌に関連する他の循環細胞が同定されており、本明細書に開示する方法により、これをアッセイしうる。この癌間質細胞亜型は、癌関連マクロファージ様細胞、略してＣＡＭＬと呼ばれている。ＣＡＭＬは、ＣＴＣとＣＡＭＬの両方を捕捉する非親和性マイクロフィルトレーションベースの方法を用いて血液中で同定されており、これにより、これらの癌特異的循環細胞亜型の特異的又は並行分析が可能である[1,6-16]。ＣＡＭＬは、侵襲性悪性腫瘍及び様々な固形悪性腫瘍（例えば、乳癌、前立腺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び膵臓癌）の全てのステージで見出される、近年定義された循環骨髄由来間質細胞である[11,13,14,17]。ＣＡＭＬは、固形腫瘍の全てのステージにおける血液中の特殊化された骨髄性倍数体細胞である。これらは、大きなサイズ（２５μｍより大）、倍数体核、及び形態、すなわち、丸型、棒状、１つ又は２つの尾部が１８０度離れていることによって容易に同定できる。ＣＡＭＬは、通常、ＣＤ３１、ＣＤ１４、ＣＤ４５及びサイトケラチンを発現し、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１４６、ＣＤ１１ｃ及びｔｉｅ２を発現することもある[11,13,14,17]。ＣＡＭＬは、癌特異的であり、悪性臓器の臓器部位から播種すると考えられるが、これらが実際に原発腫瘍部位に存在するか、又はこれらの臨床的有用性は、不明のままである。
【００５５】
ＣＴＣの異なるサブグループは、腫瘍の増悪、腫瘍の拡散、及び腫瘍治療に応答して、表現型をアップレギュレート及び／又はダウンレギュレートする。上皮間葉転換のように状態を転換させる個々の癌細胞の能力によって、本明細書で定義される方法においてアッセイ可能な更なる循環癌細胞亜型、すなわち、上皮間葉転換ＣＴＣ（ＥＭＴＣＴＣ）が生じる。ＥＭＴは、段階的形態形成過程であり、ＥＭＴＣＴＣは、様々な遷移段階の細胞を包含する[6]。ＥＭＴＣＴＣは、通常、上皮タンパク質、例えば、ＥｐＣＡＭ及びＣＫのダウンレギュレーション、及び間葉系幹細胞タンパク質、例えば、ビメンチン及びＣＤ３４のアップレギュレーションによって表される[13]。ＥＭＴＣＴＣ亜型分類は、通常、非プロテオーム法、すなわち、ｍＲＮＡ発現又はＤＮＡ分析を用いて行われる[13]。
【００５６】
本明細書で定義される方法においてアッセイ可能な癌に関連する更なる循環細胞型は、癌関連血管内皮細胞、略してＣＡＶＥである。ＣＡＶＥは、循環内皮細胞の亜型である。腫瘍は、腫瘍血管内皮細胞によって提供される血液供給を必要とする。ＣＡＶＥは、腫瘍部位から離脱して血流中に流入する腫瘍血管内皮細胞である。ＣＡＶＥは、クラスター内に見出されることが多い。ＣＡＶＥは、サイトケラチン及びＣＤ３１、ＣＤ１４６、ＣＤ１４４、ＣＤ１０５等の様々な亜型の内皮細胞マーカーを発現するが、ＣＤ１４又はＣＤ４５を発現しない[50]。
【００５７】
このような循環細胞の利用は、液体生検では十分に研究されておらず、本発明は、異なる癌、特に、関連するＣＴＣ、ＣＡＭＬ、ＣＡＶＥ、及びＥＭＴＣＴＣがその表面にＰＤ−Ｌ１を発現する癌のスクリーニング、モニタリング、診断、及び治療において、ＣＴＣ、ＣＡＭＬ、ＣＡＶＥ、及びＥＭＴＣＴＣを使用する方法を提供する。
【００５８】
免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性のスクリーニング方法
上述のように、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤に対する感受性について癌を有する対象をスクリーニングする方法に関する。この方法は、ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から単離された、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、上皮間葉転換ＣＴＣ（ＥＭＴＣＴＣ）、癌関連マクロファージ様細胞（ＣＡＭＬ）、及び癌関連血管内皮細胞（ＣＡＶＥ）のうちの１つ以上をアッセイすることを含み、ＰＤ−Ｌ１発現が検出された場合、対象は免疫チェックポイント阻害剤の感受性を有するとみなす。
【００５９】
免疫チェックポイント阻害剤への応答性を予測する方法
また、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤による治療に対する癌を有する対象の応答性を予測する方法に関する。この方法は、ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から単離された、ＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることを含み、ＰＤ−Ｌ１発現が検出された場合、対象は、免疫チェックポイント阻害剤による処置に応答性を有すると予測する。
【００６０】
免疫チェックポイント阻害剤治療を選択する方法
更に、本発明は、癌を有する対象の治療法を選択するための方法に関する。この方法は、ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から単離された、ＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることを含み、ＰＤ−Ｌ１発現が検出された場合、対象の治療として、治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤の対象への投与を選択する。
【００６１】
免疫チェックポイント阻害剤治療のための対象を特定するためのアッセイ
更に、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤治療を受ける癌を有する対象を特定するためのアッセイに関する。この方法は、ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から単離された、ＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることを含み、ＰＤ−Ｌ１発現が検出された場合、対象は、免疫チェックポイント阻害剤処置を受ける対象として特定される。
【００６２】
免疫チェックポイント阻害剤を用いた治療方法
また、本発明は、癌を有する対象を治療する方法に関する。この方法は、（ａ）ＰＤ−Ｌ１発現について、癌を有する対象から単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることと、（ｂ）ＰＤ−Ｌ１の発現が検出された場合、治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤を対象に投与することとを含む。免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント阻害剤及び薬学的に許容される担体を含む医薬製剤として投与できる。
【００６３】
関連する実施形態において、本発明は、癌を有する対象を治療する方法に関する。この方法は、治療有効量の免疫チェックポイント阻害剤を癌を有する対象に投与することを含み、免疫チェックポイント阻害剤は、癌を有する対象から単離された、ＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上においてＰＤ−Ｌ１発現が検出された後に投与される。免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント阻害剤及び薬学的に許容される担体を含む医薬製剤として投与できる。
【００６４】
治療方法に関する本発明の各実施形態及び側面において、この方法は、単独の免疫チェックポイント阻害剤を用いて実施してもよく、対象の癌を治療及び阻害するための追加の手段（例えば、本明細書で定義する追加の抗癌剤）を用いて実施してもよい。このような追加の手段は、当業者に周知であり、以下に限定されるものではないが、抗癌化学療法剤及び放射線療法、並びに腫瘍の外科的除去を含む。
【００６５】
本明細書で使用する、用語「治療する（treat, treating）」及び「治療（treatment）」は、通常の及び慣習的な意味を有し、対象から腫瘍又は癌を完全に又は部分的に除去すること、対象の腫瘍のサイズを縮小すること、対象の腫瘍又は癌の細胞を死滅させること、対象の癌又は腫瘍の症状を改善することの１つ以上を含む。治療は、免疫チェックポイント阻害剤が投与されていない対象と対比して、約１％〜約１００％の除去、縮小、死滅、又は改善を意味する。除去、縮小、死滅又は改善は、好ましくは、約１００％、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％又は約１％である。治療の結果は、永久的であってもよく、数日間（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７日間）、数週間（例えば、１、２、３、又は４週間）、数カ月間（１、２、３、４、５、又は６カ月間以上、又は数年間（例えば、１、２、３、４、５、又は６年間以上）継続するものであってもよい。
【００６６】
本明細書で使用する場合、用語「阻害する（inhibit, inhibiting）」及び「阻害（inhibition）」は、通常の及び慣習的な意味を有し、癌又は腫瘍の形成、癌又は腫瘍の発症、癌又は腫瘍の成長及び転移を遅らせること（hindering）、妨げること（impeding）、遮ること（obstructing）、防ぐこと（deterring）、又は抑制すること（restraining）の１つ以上を意味する。阻害は、免疫チェックポイント阻害剤が投与されていない対象と対比して、約１％〜約１００％の抑制を意味する。この抑制は、好ましくは、約１００％、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、４０％、約３０％、約２０％、約１０％、約５％又は約１％である。阻害の方法は、癌又は腫瘍の臨床症状の発症前、発症時、又は発症後に対象において実施しうる。したがって、対象は、癌又は腫瘍を有する者であってもよく、単に癌又は腫瘍を発症する傾向がある者であってもよい。阻害の結果は、永久的であってもよく、数日間（例えば、１、２、３、４、５、６、又は７日間）、数週間（例えば、１、２、３、又は４週間）、数カ月間（１、２、３、４、５、又は６カ月間以上、又は数年間（例えば、１、２、３、４、５、又は６年間以上）継続するものであってもよい。
【００６７】
考慮すべき複数の要因の僅かな例として、この方法の特定の目的又は目標、対象の年齢及び体型、対象の包括的な健康状態に応じて、免疫チェックポイント阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤を含む薬学的製剤を異なるスケジュールで対象に投与しうる。包括的に言えば、免疫チェックポイント阻害剤及び医薬製剤は、治療又は阻害の過程に亘って、１回又は２回、３回、４回、５回、６回又はこれ以上の回数投与しうる。投薬スケジュールにおける各投薬のタイミングは、日、週、月、又は年を単位とすることができ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０週毎、又はこれ以上の週毎に行ってもよい。投薬スケジュールにおいて、同量の免疫チェックポイント阻害剤を投与してもよく、投与毎に投与量を変化させてもよい。また、免疫チェックポイント阻害剤の同一性は、投薬スケジュールにおける投与毎に変化させてもよく、同じであってもよい。
【００６８】
本発明の各方法において、「治療有効量」の免疫チェックポイント阻害剤又は免疫チェックポイント阻害剤を含む医薬製剤が対象に投与される。治療有効量は、対象によって異なる。なお、治療有効量は、阻害又は治療のいずれかにおいて、その方法の目的又は目標を達成するために十分な量を意味する。例えば、本発明の方法において使用される免疫チェックポイント阻害剤の治療有効量は、通常、ペプチドが投与される対象の体重１ｋｇあたり、約０．１μｇ〜約１０，０００μｇの免疫チェックポイント阻害剤の量である。また、治療有効量は、対象の体重１ｋｇあたり、約０．５μｇ〜約５０００μｇ、約１μｇ〜約５００μｇ、約１０μｇ〜約２００μｇ、約１μｇ〜約８００μｇ、約１０μｇ〜約１０００μｇ、約５０μｇ〜約５０００μｇ、約５０μｇ〜約５００μｇ、約１００μｇ〜約１０００μｇ、約２５０μｇ〜約２５００μｇ、約５００μｇ〜約２０００μｇ、約１０μｇ〜約８００μｇ、約１０μｇ〜約１０００μｇ、約１μｇ〜約３００μｇ、及び約１０μｇ〜約３００μｇの免疫チェックポイント阻害剤であってもよい。
【００６９】
当業者は、必要以上の実験を行うことなく、周知の技術によって、適切な用量及び投与スケジュールを容易に決定できる。このような決定は、部分的に、特定の用量の忍容性及び有効性に基づいて行われる。
【００７０】
免疫チェックポイント阻害剤又は医薬製剤の投与は、ペプチド送達の分野で一般的に知られている手段のいずれかを用いて行いうる。このような経路には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下及び皮内の経路、並びに鼻腔内投与が含まれ、これらは、吸入、眼科的手法、経口的手法、直腸的手法、経膣的手法、又は免疫チェックポイント阻害剤又は医薬製剤を粘膜組織に接触させる他の任意の手法を含む。
【００７１】
本発明の医薬製剤は、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤及び薬学的に許容される担体を含む。担体の適切な例は、当業者に周知であり、水、注射用水、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ−８０（商標））、ポリ（エチレン）グリコール３００及び４００（ＰＥＧ３００及び４００）、ＰＥＧ化ヒマシ油（例えば、クレモフォールＥＬ）、ポロキサマー４０７及び１８８、親水性及び疎水性担体、及びこれらの組み合わせ等が含まれる。疎水性担体は、例えば、脂肪乳剤、脂質、ＰＥＧ化リン脂質、ポリマーマトリックス、生体適合性ポリマー、リポスフィア、小胞、粒子、及びリポソームを含む。これらの用語は、特に、細胞培養培地を除外する。製剤は、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び防腐剤、等張化剤、増量剤、乳化剤、懸濁剤又は粘度剤、不活性希釈剤、充填剤、及びこれらの組み合わせを更に含んでいてもよい。
【００７２】
本明細書に開示する方法を実施するために必要な成分を含むキットも本発明の範囲内である。キットは、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤及び使用説明書を含む。幾つかの側面では、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント阻害剤及び薬学的に許容される担体を含む医薬製剤中に存在する。
【００７３】
ＰＤ−Ｌ１発現をモニタリングする方法
また、本発明は、癌を有する対象におけるＰＤ−Ｌ１発現をモニタリングする方法も包含する。この方法は、（ａ）ＰＤ−Ｌ１発現について、第１の時点で癌を有する対象から単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることと、（ｂ）ＰＤ−Ｌ１発現について、第２の時点で癌を有する対象から単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることと、（ｃ）第１の時点及び第２の時点で単離された細胞においてアッセイされたＰＤ−Ｌ１発現を比較することとを含む。この実施形態の特定の側面では、対象は、癌の治療を受けている。
【００７４】
治療をモニタリングする方法
また、本発明は、癌を有する対象における治療をモニタリングする方法を更に包含する。本発明は、（ａ）ＰＤ−Ｌ１発現について、第１の時点で癌治療中対象から単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることと、（ｂ）ＰＤ−Ｌ１発現について、第２の時点で癌治療中対象から単離されたＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上をアッセイすることと、（ｃ）第１の時点及び第２の時点で単離された細胞においてアッセイされたＰＤ−Ｌ１発現を比較することにより、癌を有する対象における治療をモニタリングすることを含む。この実施形態の特定の側面では、対象は、免疫チェックポイント阻害剤を用いて治療されている。
【００７５】
免疫チェックポイント阻害剤
本明細書で使用する「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、例えば、Ｔ細胞等の免疫系の細胞及び幾つかのタイプの癌細胞によって発現されるタンパク質を阻害又は遮断する薬物（抗体を含む）を指す。これらのタンパク質は、免疫応答を阻害し、Ｔ細胞が癌細胞を死滅させることを阻止することがある。これらのタンパク質がブロックされると、免疫系の阻害が克服され、Ｔ細胞が癌細胞を死滅させることができる。Ｔ細胞又は癌細胞について見出されるチェックポイントタンパク質の例としては、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２が挙げられる。このように、免疫チェックポイント阻害剤は、免疫系攻撃に対する癌の主な防御（すなわち、Ｔ細胞）の１つを克服しようとするものである。
【００７６】
本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、以下に限定されるものではないが、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＰＤ−１アンタゴニスト、及びＣＴＬＡ−４アンタゴニストが挙げられる。
【００７７】
また、本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、以下に限定されるものではないが、（ｉ）ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との間の結合、（ｉｉ）ＰＤ−Ｌ１のその結合パートナーへの結合、（ｉｉｉ）ＰＤ−１のその結合パートナーへの結合、及び（ｉｖ）ＣＴＬＡ−４のその結合パートナーへの結合のうちの１つ以上の阻害剤が挙げられる。
【００７８】
更に、本発明の免疫チェックポイント阻害剤は、以下に限定されるものではないが、モノクローナル抗体等の抗体が挙げられる。特定の側面において、免疫チェックポイント阻害剤は、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体である。また、免疫チェックポイント阻害剤としては、その阻害活性を保持する抗体断片も挙げられる。このような抗体断片は、以下に限定されるものではないが、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。一側面では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−１、又はＣＴＬＡ−４に対する結合特異性を有する抗体又はその抗体断片である。
【００７９】
具体的な免疫チェックポイント阻害剤の例は、以下に限定されるものではないが、ニボルマブ（Nivolumab）（オプジーボ：Opdivo）、イピリムマブ（Ipilimumab）（ヤーボイ：Yervoy）、ペムブロリズマブ（Pembrolizumab）（キイトルーダ：Keytruda）、アテゾリズマブ（Atezolizumab）（テセントリク：Tecentriq）、トレメリムマブ（Tremelimumab）、及びデュルバルマブ（Durvalumab）（ＭＥＤ１４７３６）のうちの１つ以上が挙げられる。
【００８０】
抗癌剤
癌の治療に関する本発明の実施形態及び側面において、方法には、免疫チェックポイント阻害剤に加えて治療有効量の１つ以上の抗癌剤を対象に投与することが含まれうる。
【００８１】
抗癌剤は、同じ対象に投与される免疫チェックポイント阻害剤と適合性を有するという点においてのみ限定される。
【００８２】
追加の抗癌剤としては、以下に限定されるものではないが、免疫療法剤、化学療法剤、放射線治療薬、既存の癌剤、ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４が挙げられる。具体的な抗癌剤の例には、以下に限定されるものではないが、Ｔ−ＶＥＣ、ＡＭ−００１０、ＣＸＣＲ４アンタゴニスト、ＴＧＦ−βキナーゼ阻害剤ガルニセルチブ（galunisertib）、抗ＣＳＦ−１Ｒモノクローナル抗体、アベマシクリブ（Abemaciclib）、ファスロデックス（Faslodex）、ネシツムマブ（necitumumab）、ＡＺＤ９２９１、サイラムザ（Cyramza、ラムシルマブ（ramucirumab））、ＴＰＩＶ２００、ガルニセルチブ（Galunisertib）、癌ワクチン、サイトカイン、細胞ベースの療法、二重及び多重特異性抗体、腫瘍ターゲティングｍＡｂｓ、リツキシマブ（Rituximab）、腫瘍溶解性ウイルス、レオウイルス、ブリナツモマブ（Blinatumomab）、シプリューセル−Ｔ（Sipuleucel-T）、Ｔ−Ｖｅｃ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、トラスツズマブ（Trastuzumab）、セルキシマブ（Celuximab）、ベバシズマブ（bevacizumab）、Ｔｉｍ−３、ＢＴＬＡ、抗ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＳＦ、抗血管新生治療、ＶＥＧＦ遮断薬、ＨＭＧＢ１、Ｎｒｐ１、ＴＡＭ受容体チロシンキナーゼ、Ａｘｌ、ＭｅｒＴＫ、ＡＬＴ−８０３、ＩＬ−１５、免疫抑制リガンドホスファチジルセリン（Ligand Phosphatidylserine：ＰＳ）、バビツキシマブ（bavituximab）、ベバシズマブ（bevacizumab、抗ＶＥＧＦ）、コブルメチニブ（coblmetinib、ＭＥＫ阻害剤）、ベムラフェニブ（vemurafenib、ＢＲＡＦ阻害剤）、エルロチニブ（erlotinib、ＥＧＦＲ）、アレクチニブ（alectinib、ＡＬＫ阻害剤）、ベバシズマブ（bevacizumab、抗ＶＥＧＦ）、パゾパニブ（pazopanib、チロシンキナーゼ阻害剤）、ダブラフェニブ（dabrafenib、ＢＲＡＦ阻害剤）、トラメチニブ（trametinib、ＭＥＫ阻害剤）、デュルバルマブ（durvalumab、抗ＰＤ−Ｌ１）、スニチニブ（sunitinib、ＲＴＫ阻害剤）、パゾパニブ（pazopanib、ＲＴＫ阻害剤）、サルグラモスチム（sargramostim）、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＰＲＳ−３４３、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）／ＨＥＲ２二重特異性抗体、ＵＳＰ７、抗ＨＥＲ２、ＳＥＭＡ４Ｄ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、及びＰＤ−Ｌ２のうちの１つ以上が含まれる。
【００８３】
ＰＤ−Ｌ１発現をアッセイするための手段
本説明から明らかなように、本発明の方法は、細胞におけるＰＤ−Ｌ１発現のアッセイ、すなわち、検出及び／又は測定に基づいている。本発明の一側面では、単に、選択された細胞がＰＤ−Ｌ１を発現しているか否かを判定することで、本明細書で定義する方法のそれぞれを使用できる。したがって、これらの方法は、細胞内のＰＤ−Ｌ１発現の量を定量化する必要なく実施できる。なお、本発明の別の側面では、本明細書で定義する方法のそれぞれは、細胞によるＰＤ−Ｌ１発現の相対量又は特定量を判定することによって使用できる。相対量は、例えば、細胞が他の細胞又は標準よりも多くのＰＤ−Ｌ１を発現しているか否かを判定することによって判定してもよい。特定量は、例えば、細胞中のＰＤ−Ｌ１発現のレベルを定量化することによって判定してもよい。
【００８４】
ＰＤ−Ｌ１発現は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を検出／測定すること、及びＰＤ−Ｌ１ｍＲＮＡ産生を検出／測定することの１つ以上によってアッセイしうる。ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、例えば、免疫組織化学（immunohistochemistry：ＩＨＣ）を介して検出／測定しうる。ＩＨＣは、膜染色、細胞質染色、又はこれらの組み合わせによって行いうる。ＩＨＣは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、以下に限定されるものではないが、Ｅ１Ｌ３Ｎ、ＳＰ１４２．２、２８−８、２２Ｃ３、ＥＰＲ１９７５９、ＭＩＨ２、ＭＩＨ５、ＭＩＨ６、ＡＢＭ４Ｅ５４、１３００２１、ＥＰＲ２０５２９、１０Ｆ．９Ｇ２、及びＣＤ２７４を用いて行いうる。ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、弱い染色強度、中程度染色強度、又は強い染色強度として検出／測定しうる。また、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、低染色強度、中程度染色強度、又は高染色強度として検出しうる。また、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現の検出は、低染色強度から高染色強度へ経時的に誘導可能であるとして検出してもよく、低染色強度から中程度染色強度へ経時的に誘導可能であるとして検出してもよく、中程度染色強度から高染色強度へ経時的に誘導可能であるとして推定してもよい。また、ＰＤ−Ｌ１タンパク質発現は、単に単離された細胞のいずれかの染色、例えば、バックグラウンド上の任意の量の染色として検出／測定してもよい。
【００８５】
特定の側面において、ＩＨＣは、免疫蛍光（immunofluorescence：ＩＦ）染色を用いて実施される。ＰＤ−Ｌ１に対する結合特異性を有する１つ以上の抗体を利用してＰＤ−Ｌ１タンパク質発現を検出してもよい。ＰＤ−Ｌ１に対する抗ＰＤ−Ｌ１抗体の結合は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体にコンジュゲートされた蛍光化合物又は他の検出可能な標識を介して検出してもよく、抗ＰＤ−Ｌ１抗体に対する結合特異性を有する、二次抗体にコンジュゲートされたフルオロフォア又は他の検出可能な標識を介して検出してもよい。
【００８６】
上で定義した特定の関連する実施形態及び側面では、ＰＤ−Ｌ１発現レベルが癌に罹患していない同じ種の対象由来の間質細胞の集団のＰＤ−Ｌ１発現よりも大きい場合に、ＰＤ−Ｌ１発現が検出されたと判定する。
【００８７】
細胞のソース
本発明の方法で使用される細胞は、ＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、及びＣＡＶＥのうちの１つ以上を含む。したがって、これらの方法は、これらのタイプの循環細胞の１つ、２つ、３つ、又は４つ全てを使用して実施しうる。
【００８８】
細胞は、末梢血等の血液を含む、細胞を見出すことができる任意の体液から取得しうる。例えば、セルセーブ保存チューブ（登録商標：CellSave preservative tubes）内に血液サンプルを採取し、例えば、低圧真空システムを使用するセルシーブ（CellSieve：商標）マイクロフィルトレーションアッセイ（CellSieve Microfiltration Assay）によって血液を処理してもよい。
【００８９】
対象（Subject(s)）
本発明の方法において言及される対象は、ヒト、非ヒト霊長類、トリ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、並びにイヌ、ネコ、齧歯類等のペット動物、又は他の哺乳類が挙げられる。
【００９０】
癌を有する対象は、癌の治療を受けている者であってもよい。このような治療には、以下に限定されるものではないが、標的薬剤投与、化学療法、及び放射線療法が挙げられる。癌は、肺癌、乳癌、前立腺癌、膵臓癌、メラノーマ、膀胱癌、腎臓癌、頭頸部癌、大腸癌、肝臓癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、肉腫、骨肉腫、食道癌、脳及びその他神経系癌、喉頭癌、気管支癌、口腔及び咽頭癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮頸癌、又は子宮体癌の１つ以上でありうる。癌は、固形腫瘍、例えば、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ又はステージＩＶの固形腫瘍であってもよい。固形腫瘍は、以下に限定されるものではないが、癌腫、肉腫、神経芽細胞腫又はメラノーマであってもよい。肺癌の例には、以下に限定されるものではないが、非小細胞肺癌（non-small cell lung carcinoma：ＮＳＣＬＣ）でありうる。
【００９１】
ＲＡＤ５０巣（RAD50 Foci）
上で定義した特定の関連する実施形態及び側面において、少なくとも１つのＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、ＣＡＭＬ、又はＣＡＶＥは、少なくとも１つのＲＡＤ５０巣を示す。
【００９２】
部位指向性放射線を受ける腫瘍に由来する細胞は、電離放射線誘発性ＤＮＡ損傷によってマーキングされ、腫瘍及び間質細胞を含む[18-24]。したがって、放射線治療における腫瘍部位に由来する循環細胞は、電離放射線誘発病巣（ＩＲＩＦ）等のＤＮＡ損傷の証拠を有するはずであり、これは、ＲＡＤ５０で視覚化できる[18-24]。ＲＡＤ５０は、タンパク質ＮＢＳ１及びＭＲＥ１１と複合体を形成するタンパク質であり、放射線及び／又は化学薬品による治療に続くＤＮＡ二本鎖修復プロセスにおいて重要である。正常な哺乳類細胞では、ＲＡＤ５０は、細胞質と核の両方に分布する。ＤＮＡの二本鎖切断に続いて、ＲＡＤ５０／ＮＢＳ／ＭＲＥ１１複合体は、破壊された部位に急速に転位し、破壊が修復されるまで、凝集した核病巣、例えば、ＩＲＩＦを形成する[18,20,23,25]。したがって、ＲＡＤ５０は、腫瘍塊を標的とした放射線に直接暴露された患者からの細胞の生物学的タグとして機能する、高レベルの放射線に曝された細胞の特定の識別子として使用できる[18-24,26-28]。
【００９３】
ＩＩＩ．実施例
実施例１
血液サンプル採取
ステージＩ〜ＩＶ肺癌を有する４１人の患者について、前向きパイロット研究を行った（表１）。書面によるインフォームドコンセント及び現地ＩＲＢの承認に従って、匿名化された末梢血サンプルを採取した。２０１３年７月から２０１４年５月の期間、原発性肺癌の放射線療法を開始する前の患者を募集した。４例の患者はステージＩ疾患のための体幹部定位放射線治療（Stereotactic Body Radiation Therapy：ＳＢＲＴ）を受け、３７例の患者は、ステージＩＩ−ＩＶ疾患のための、プロトン療法（ｎ＝１６）又は強度変調放射線療法（Intensity-modulated radiation therapy：ＩＭＲＴ）（ｎ＝２１）を用いた化学放射線療法を受けた。匿名の血液サンプル（７．５ｍＬ）を採取し、ＭＤアンダーソン癌センター（MD Anderson Cancer Center：ＭＤＡ）においてオンサイトで処理した。スライドを匿名化し、クリーティービーマイクロテック社（CreatvMicroTech, Inc.）の臨床試験室に搬送し、ここで分析を行った。製造業者のプロトコール（ダコ（DAKO））に従って、原発腫瘍由来の匿名化生検サンプルをＭＤＡにおいて処理した。この施設からの結果は、研究の完了までは、共有されず、伝達されなかった。
【表１】
2019514028.tif 000003
【００９４】
セルシーブ（CellSieve：商標）低フローマイクロフィルトレーション手順
低圧真空システムを用いたセルシーブ（商標）マイクロフィルトレーションアッセイ（CellSieve Microfiltration Assay）によって、セルセーブ保存チューブ（CellSave preservative tubes：商標）に採取した血液サンプル（７．５ｍＬ）を処理した[1,12]。セルシーブ（商標）マイクロフィルトレーションアッセイは、＞７ミクロンのサイズ排除に基づいて循環細胞を分離する。形態学的特徴及びＣＤ４５、ＥｐＣＡＭ、サイトケラチン８，１８，１９及びＤＡＰＩの表現型発現に基づいて、事前に知られている細胞学的特徴[6,11,14]を用いて、熟練した細胞学者が予後に病理学的に定義可能なＣＴＣ（ＰＤＣＴＣ）、ＥＭＴＣＴＣ、及びＣＡＭＬを同定した（図１及び図２）[1,6,12]。イメージングの全てにおいて、オリンパスＢＸ５４ＷＩ蛍光顕微鏡と共にカールツァイス（CarlZeiss）ＡｘｉｏＣａｍ及びＺｅｎ２０１１Ｂｌｕｅ（カールツァイス）を使用した。
【００９５】
ＰＤＣＴＣ／ＥＭＴＣＴＣ亜型及びＣＡＭＬの列挙
癌患者に見出される２つの最も一般的なＣＴＣ亜型（ＰＤＣＴＣＳ及びＥＭＴＣＴＣ）の定義的な特徴及びＣＡＭＬ同定のための特徴は、既に開示されている[1,6,10~14]。本研究では、無傷のＰＤＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、及びＣＡＭＬのみを特徴付けた（図２及び図３）[1,6,10~14]。ＰＤＣＴＣは、ＣＤ４５陰性であり、線維性サイトケラチン陽性であり、悪性病理学的基準を有するＤＡＰＩ陽性核を有し、ＣＴＣのセルサーチ（CellSearch：登録商標）亜型として分類される[1,6,10~14]。ＥＭＴＣＴＣは、これまでに定義されているように、ＣＤ４５陰性であり、拡散性サイトケラチンシグナル及び異常な基準を有するＤＡＰＩ陽性核を有する[1,6,9,12,13]。ＣＡＭＬは、拡大された（＞３０μｍ）、拡散した細胞質サイトケラチン染色を伴う多核細胞、及び／又はＣＤ４５＋／ＣＤ１４＋として記述される[6,11,14,17,22,43]。３つの細胞型については、全て、熟練したＣＴＣ細胞学者が同定し、画像化し、病理学者が確認した。上述のような細胞学的分類ができなかったアポトーシス性ＣＴＣ及びＣＴＣは、含まれなかった。同定の後、細胞を画像化し、将来の分析のために各セルのｘ−ｙ軸をマークした。サンプルは、４℃で１〜３年間保存した。
【００９６】
ＰＤ−Ｌ１及びＲＡＤ５０のＱＵＡＳ−Ｒクエンチング及び再染色
ＰＤＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、及びＣＡＭＬの最初の同定及び定量化の後、蛍光をクエンチし、ＲＡＤ５０−ＤｙＬｉｇｈｔ５５０（Pierce Thermo）、ＰＤ−Ｌ１−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（R&D systems社）、及びＤＡＰＩ核染色（図１）によってサンプルを再染色した。既に開示された、ＱＵＡＳ−Ｒ（クエンチ、非誘導体化、アミンストリップ及び再染色（Quench, Underivatize, Amine-Strip and Restain）技術を使用した[13]。簡単に説明すると、サンプルを撮像し、マークした後のフィルターに、クエンチング溶液、トリス、及び洗浄ステップの順次的化学処理を施した。化学的クエンチングの後、フィルターをＰＢＳで洗浄し、１ＸＰＢＳ／２０％ＦＢＳでインキュベートし、次に、ＲＡＤ５０−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５０及びＰＤ−Ｌ１−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８に対する抗体と共に、室温で１時間インキュベートした。抗体インキュベーションの後、フィルターを１ｘＰＢＳＴで洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ／ＤＡＰＩ（Southern Biotech社）によってスライドマウントした。サンプルをｘ／ｙ軸に沿って配向させ、Ｚｅｎ２０１１Ｂｌｕｅ（カールツァイス）マーク及び発見ソフトウェアを用いて先に画像化した細胞を再配置した。Ｚｅｎ２０１１Ｂｌｕｅ（Carl Zeiss社）を用いて画像を処理した。
【００９７】
原発腫瘍生検におけるＰＤ−Ｌ１の定量化
ダコｐｈａｒｍＤｘクローン２２ｃ３及びダコｐｈａｒｍＤｘクローン２８−８の両方を用いて、製造業者のガイドラインに従い、利用可能な全ての原発腫瘍生検からのＰＤ−Ｌ１発現を分析した（図４）。この研究の８人の患者については、両方のクローンをスクリーニングするために十分な腫瘍サンプルが保存されており、１つのサンプルは、クローン２２ｃ３に対する単一のＩＨＣ試験のために十分な腫瘍を保存していた。両方のクローンを、既に開示されている標準操作手順[29-31,38]に従って染色した。
【００９８】
循環細胞におけるＲＡＤ５０及びＰＤ−Ｌ１の定量化
各細胞の核局在化ＲＡＤ５０遺伝子座を列挙することによってＲＡＤ５０遺伝子座の形成を判定した（図１及び図５）[23]。細胞全体の面積を用いて、ＺｅｎＢｌｕｅソフトウェアにより各細胞のＰＤ−Ｌ１ピクセル強度を測定した。各画像の局所的バックグラウンドの平均ピクセル強度から各セルの平均ピクセル強度を減算した（図１Ｃ）。細胞の平均ピクセル強度を０−負（ピクセル平均０〜１５０）、１−低（ピクセル平均１５１−３００）、２−中（ピクセル平均３０１−７５０）、及び３−高（ピクセル平均７５１＋）の４つのＩＨＣ群に四分化した（図５）。ＩＨＣスコアリングのためのＰＤ−Ｌ１強度のＩＨＣ範囲閾値は、１５０ピクセル強度を、局所化されたバックグラウンドシグナルの標準偏差とし、３００ピクセル強度を、局所化されたバックグラウンドの標準偏差の２倍とし、７５０を、局所化されたバックグラウンドの強度の２倍とすることによって定義した（図５）。
【００９９】
統計的方法
ＭＡＴＬＡＢ  Ｒ２０１３Ａにおいて、全ての亜型及び既知の患者集団からのカウントを用いて解析を行った。無増悪生存期間（progression free survival）分析のために、増悪までの時間を、Ｔ０血液サンプルを取得したときから、増悪の日までと定義し、２４ヶ月のエンドポイントまで全ての患者について研究を行い、すなわち、研究を打ち切った患者はなかった。ＲＡＤ５０巣形成及びＰＤ−Ｌ１発現の平均変化の有意性は、スチューデントのＴ検定によって判定した。個々の測定値について、ピアソン係数を使用して、ＲＡＤ５０巣とＰＤ−Ｌ１発現との間の相関を判定した。カプランマイヤープロットの有意性は、ログランク分析によって判定した。
【０１００】
結果
ＬＣ患者におけるＰＤＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、及びＣＡＭＬ
セルサーチ（CellSearch：登録商標）プラットフォームを使用するＮＳＣＬＣ患者におけるＣＴＣ亜集団は、通常、非転移性症例のうち、０〜５％にしか見出されないことが報告されている。これに対し、ＥＭＴＣＴＣ集団は、通常、非転移性患者集団の約８０％に見出され、ＣＡＭＬについては、ＮＳＣＬＣにおける広範に亘る評価は行われていない[3-6,8,15,17,43-45]。放射線療法の開始前に採取された最初のベースライン血液サンプル（Ｔ０）では、４１サンプル中３５サンプル（８５％）において、少なくとも１つのサイトケラチン陽性細胞（すなわち、ＰＤＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、又はＣＡＭＬ）を同定できた（図１及び図３）。その後、放射線療法開始から２〜３週間後、又はＳＢＲＴ患者については最後の分画の後に、患者の第２のフォローアップサンプル（Ｔ１）を採取した。Ｔ１については、４１サンプル全て（１００％）に少なくとも１つのサイトケラチン陽性細胞（すなわち、ＰＤＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、又はＣＡＭＬ）が見出された。具体的には、ＥＭＴＣＴＣは、Ｔ０サンプルの４９％及びＴ１サンプルの６６％に見出された。ＣＡＭＬは、Ｔ０サンプルの８１％及びＴ１サンプルの１００％に見出された（図３）。ＰＤＣＴＣは、Ｔ０において１サンプル（２％）のみ、Ｔ１において３サンプルのみ（７％）に見出された（図３）。ＰＤＣＴＣは、セルサーチ（CellSearch：登録商標）ＣＴＣシステムによって単離された同じＣＴＣ集団であることが示されており、これらの数値は、これまでの報告[7-9,15]に合致する。セルサーチシステムは、ステージＩＩＩのＮＳＣＬＣでは０〜５％の陽性、ステージＩＶでは２１〜３２％の範囲で、ＮＳＣＬＣ患者のＣＴＣを単離した[7-9,15]。患者のうちの３５人がステージＩ−ＩＩＩとして病期分類されたので、２〜７％は、通例的なＣＴＣ集団の範囲内である（表１）[7-9,15]。通例的なＰＤＣＴＣ集団の発生率が低いことは、サンプルの８５％（Ｔ０）及び１００％（Ｔ１）に存在するＥＭＴＣＴＣ及びＣＡＭＬとは対照的である（図３）。ＥＭＴＣＴＣ単独では、ＮＳＣＬＣにおける液体生検に対する感度が幾らか向上する可能性があると推論されてきたが[7-9,16]、これらの結果は、ＥＭＴＣＴＣ及びＣＡＭＬの両方の組み合わせによって、腫瘍由来細胞を分析する血液ベースの診断の感度が向上することを示唆している。
【０１０１】
放射線照射された細胞の生物学的トラッカーとしてのＲＡＤ５０
これまで、原発腫瘍の部位からの末梢血への播種としてＣＴＣ及びＣＡＭＬが記述されてきたが、これらの細胞が循環に入る前に存在する正確な位置を確認した研究は未だなされていない。このように起原が不明であることの主な理由は、患者の腫瘍／間質細胞を標識し、これらの播種を追跡することが困難であり、このような実験が患者に危険をもたらす可能性があるためである。哺乳類細胞におけるＩＲＩＦ形成物内のＲＡＤ５０巣が、細胞への直接放射線曝露の生物学的トラッカーとして示されることはあったが、これは、放射線治療を受けている患者の循環腫瘍又は間質細胞においては、未だ評価されていない。Ｔ０ベースラインにおける非照射ＬＣ患者において、ＥＭＴＣＴＣ細胞内のＲＡＤ５０巣の核当たりの巣数は、０〜４の範囲であり、平均は０．５９±０．９７であり、ＣＡＭＬでは、巣数は、０〜５の範囲であり、平均０．３８±１．０７であった（図６及び図７）。ＲＡＤ５０巣は、通常、少数の未治療細胞で同定される正常な生物学的修復メカニズムであるため、細胞内に幾つかのＲＡＤ５０巣が存在することは、驚くべきことではない[21,23,24]。Ｔ１において患者を腫瘍指向性放射線療法に曝露した後、ＲＡＤ５０巣数は、ＥＭＴＣＴＣにおいて、核当たり０〜９、平均４．２７±２．６３及びＣＡＭＬにおいて、核当たり０〜２０、平均３．９±３．９３に有意に増加した（図６）。この増加は、Ｔ０及びＴ１の両方の時点（ｎ＝３５）で検出可能な細胞を有する全ての患者において観察され、正常なＣＤ４５＋白血球のバックグラウンドでは殆ど見いだされなかった（図１Ｂ）。このように、ＥＭＴＣＴＣ及びＣＡＭＬの両方において、ＲＡＤ５０は、Ｔ０における平均０．４８からＴ１における平均４．０５（ｐ＜０．０００１）に増加した（図６）。これらの結果は、ＲＡＤ５０を使用して、腫瘍部位に由来する照射された細胞を標識及び追跡でき、したがって、腫瘍動態を追跡できることを示唆している。
【０１０２】
循環細胞におけるＰＤ−Ｌ１の動的発現
放射線を含む様々な細胞傷害性療法によって、腫瘍にＰＤ−Ｌ１が誘発され得ることが示唆されている[29-34,36-40,42]。ＢＢＢを使用してこれを視認できるかを判定するために、Ｔ０及びＴ１の時点でＰＤ−Ｌ１染色を評価した。従来の０−３ＩＨＣ組織生検スコアリングと同様の方法で、標準化された比較スコアリングシステムを開発した（図５及び図８）。染色及び画像化の後、ＬＣ患者において見出された全ての３７３細胞のＰＤ−Ｌ１発現及び局所バックグラウンドを測定した。各画像の局所的バックグラウンドのピクセル強度を３７５±１５０に平均化した（図５）。局所化されたバックグラウンド効果を考慮するために、測定された各細胞から各画像のバックグラウンドを減算し、ＰＤ−Ｌ１ピクセル強度範囲を１７−３０９０に補正した（図５）。次に、０〜１５０ピクセルのバックグラウンドの標準偏差をスコア０（細胞の２６％）とし、標準偏差の２倍（１５１−３００ピクセル）をスコア１（低発現、細胞の４２％）として、補正したピクセル強度で細胞を分類した。中程度の発現、すなわちスコア２（細胞の２２％）は、平均バックグラウンドシグナル（３０１−７５０ピクセル）の２倍として判定し、高発現、すなわちスコア３（細胞の１０％）を平均バックグラウンドシグナルの＞２倍（＞７５０ピクセル）に設定した（図５）。
【０１０３】
ＰＤ−Ｌ１のピクセル強度は、ＥＭＴＣＴＣでは、Ｔ０で平均３８４±４８４、Ｔ１で６７２±６６９（ｐ＝０．０２１）であり、ＣＡＭＬでは、Ｔ０で平均１８２±８９、Ｔ１で２８２±１６９（ｐ＝０．００４）であった（図８）。回帰分析により、Ｔ０からＴ１にかけて、ＲＡＤ５０とＰＤ−Ｌ１との間に弱いが有意な正の相関が見出された（ピアソンＲ２＝０．０７９、ｐ＜０．０００１、ｎ＝３７３）。患者間で、ＲＡＤ５０は、Ｔ０からＴ１にかけて確実に誘発されたが、個々の患者におけるＰＤ−Ｌ１発現の変化は、遥かに多様であった（図８）。Ｔ０およびＴ１の両時点で評価可能であった３５人の患者において、Ｔ０とＴ１との間にＰＤ−Ｌ１発現の３つの異なるパターンを見出した。１８人の患者（５１％）は、両方の時点でＰＤ−Ｌ１の発現がなく／低く、６人の患者（１７％）は、両方の時点で持続的に中／高ＰＤ−Ｌ１を有し、１１人の患者（３２％）は、低い０／１スコアから２／３スコアに増加した（図８）。
【０１０４】
原発組織、ＣＴＣ及びＣＡＭＬにおけるＰＤ−Ｌ１レベルの比較
クローン２２ｃ３及び２８−８（ダコ（DAKO））を使用する市販の２つのＣＬＩＡ認定試験を使用して、ＩＨＣによる元の診断生検から利用可能な組織を染色した。病理学的アーカイブから有用な組織又は細胞ブロックを回収できたのは、４１人の患者のうち９人のみであり、１回のＩＨＣ検査に十分な組織を有していたのは、これらの９人の患者のうち１人のみであった（図４）。これは、腫瘍壊死又は小結節の結果、ＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣ試験を行うために十分な集団が得られなかったためである。９個のアーカイブサンプルのうち、２個のみがＰＤ−Ｌ１染色陽性であり、２個の試験間で発現スコア及びパーセンテージの変動があった（図４Ｃ）。これに対し、ＰＤ−Ｌ１発現は、ＢＢＢを使用して、Ｔ０患者サンプルの８５％（ｎ＝３５／４１）及びＴ１患者サンプルの１００％（ｎ＝４１／４１）で定量可能であった。具体的には、Ｔ０において、ＥＭＴＣＴＣ及びＣＡＭＬは、２１人の患者（６０％）において低／負（スコア０／１）のＰＤ−Ｌ１発現を示し、９人の患者（２６％）において中等度（スコア２）の発現を示し、５人の患者（１４％）において高（スコア３）の発現を示した（図４Ｃ）。
【０１０５】
Ｔ０において、循環細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現は、２８−８ＩＨＣクローン結果を用いて評価した２つのＩＨＣ陽性染色サンプルについてのＩＨＣ生検結果との整合性が高かった（図４Ｃ）。３人の患者は、ＩＨＣによる陰性のＰＤ−Ｌ１組織に一致し及び循環細胞での低い発現（０／１）を示したが、３人の患者は、陰性組織ＩＨＣ  ＰＤ−Ｌ１では不一致の結果を示し、循環細胞では２／３のスコアを示し、１人の患者は、Ｔ０サンプルにおいて循環細胞を欠いていた（図４）。サンプル数が限られているため、適切な統計解析は不可能であった。しかしながら、これらの結果は、一次生検では、ＰＤ−Ｌ１発現をアッセイするために組織が不十分であるが、血液ベースの生検（Blood Based Biopsy：ＢＢＢ）法によって、内因性レベルを測定し、原発性肺腫瘍に見出される細胞集団に由来する循環細胞中に存在するＰＤ−Ｌ１発現の変化をモニタリングできることを示唆している。
【０１０６】
潜在的な予後マーカーとしての循環細胞中のＰＤ−Ｌ１及びＲＡＤ５０
組織生検では、バイオマーカーＰＤ−Ｌ１の発現のみでは、肺癌における生存の予後指標にならず、一方、ＲＡＤ５０の巣形成は、生存と正の相関を有することが示されている[14,18,20,24,29,30,32,35,39,40,42]。Ｔ０とＴ１の両方の時点でのＰＤ−Ｌ１の発現又はＲＡＤ５０の平均数に基づいて患者の臨床転帰を分析した（図９）。ＰＤ−Ｌ１の発現を用いてＰＦＳを比較するために、カットオフ基準として中程度の発現、すなわち、２つのコホートについて、＜２対≧２を使用した。Ｔ０においてＰＤ−Ｌ１が低い患者は、１．８の僅かに悪いハザード比（hazard ratio：ＨＲ）を有し、これは、有意ではなかった（ｐ＝０．３０５）。Ｔ１では、ＰＤ−Ｌ１が低い患者は、全体的ＰＦＳがやや良好（ＨＲ＝０．７）であったが、これも有意ではなかった（ｐ＝０．５８１）。このデータは、Ｔ０又はＴ１におけるＰＤ−Ｌ１レベルの発現に基づく全体的ＰＦＳとの相関が限定的又は相関が認められないことを示唆している。ＰＦＳ中央値を使用することにより、Ｔ０においてより高いＰＤ−Ｌ１を有する細胞において、ＰＦＳ中央値へのより良好な傾向（１６ヶ月対＞２４ヶ月間）を見出したが、これを確認するには、遥かに大きなサンプルサイズが必要である。
【０１０７】
組織生検におけるＲＡＤ５０巣の形成は、生存と正の相関を有することが示されているため[18,20,24,26]、循環細胞におけるその予後値を評価した（図９）。Ｔ０におけるＥＭＴＣＴＣ及びＣＡＭＬのＲＡＤ５０巣数は、全体的ＰＦＳにおいて臨床的に差がなかった（ＨＲ＝１．０、ｐ＝０．７７５）。一方、Ｔ１においてＲＡＤ５０巣が多い患者では、全体的ＰＦＳが改善される有意ではない傾向があった（ＨＲ２．３、ｐ＝０．２７）（図９）。このように、全体的ＰＦＳは、有意差がなかったが、ＲＡＤ５０巣／細胞が≦１の患者と比較して、ＲＡＤ５０巣／細胞が＞１の患者では、ＰＦＳ中央値が１．９倍長かった（それぞれ、９．８ヶ月対１８．５ヶ月）。このデータは、放射線療法後の循環細胞におけるＲＡＤ５０の増加は予後値を有する可能性があり、更なる検証とより大きなサンプルサイズの観察が必要であることを示唆している。
【０１０８】
前段に示した結果の通り、（化学療法）放射線療法を受けている４１人の肺癌患者からの３つの循環血液細胞亜型ＰＤＣＴＣ、ＥＭＴＣＴＣ、及びＣＡＭＬにおけるＰＤ−Ｌ１レベル及びＲＡＤ５０巣を前向きに及び逐次的に追跡した。放射線誘導ＲＡＤ５０巣形成に基づいて、循環細胞を表現型分類し、原発性肺腫瘍塊に現れる細胞の明確な生物学的変化を定量的に追跡した。更に、これらの動的変化の追跡を用いて、放射線療法に対してより感受性が高まった腫瘍を有する患者を区別できる可能性があるが、より大規模な研究が必要である。
【０１０９】
多くのグループが、放射線損傷細胞の核におけるＲＡＤ５０巣形成によって、ＩＲＩＦの形成が観察されることを立証し（図１０）[18,20,23]、ＤＮＡ損傷ストレッサーによる事前の感作によるＩＲＩＦ形成の阻害が、多くの癌（すなわち、ＮＳＣＬＣ、乳癌、扁平上皮癌等）において、臨床転帰と正の相関を有することが示された[18,20,23,24,26]。まず、放射線療法前の未治療のＮＳＣＬＣ患者は、ＲＡＤ５０巣の数が少なく、放射線療法の導入に直接的に並行して、ＲＡＤ５０巣が大幅に増加することを観察した。このＲＡＤ５０の増加は、放射線治療導入によって誘発されるＤＮＡ損傷の結果である可能性が高く、循環細胞におけるＲＡＤ５０巣形成は、部位特異的放射線療法を受けている癌患者の非侵襲的トレーサーとして機能すると考えられる。ＲＡＤ５０は、循環細胞の原発部位の器官を確認するために液体生検分析と同様に使用でき、これは、患者の原発肺塊からＥＭＴＣＴＣ及びＣＡＭＬの両方が播種していることを示唆していると考えられる。
【０１１０】
ＰＤ−Ｌ１発現に関する現在承認されている生検組織のＩＨＣ試験は、非常に高レベルのＰＤ−Ｌ１発現を伴う患者における応答の予測因子に過ぎないものの、やがて多くのＰＤ−Ｌ１陰性患者も利益を得るであろう[29,30,33,39-42,46]。この不一致は、免疫調節発現の動的性質及び／又は間質細胞成分を分析できないことに起因する可能性がある。免疫チェックポイントタンパク質発現は、動的であり、複数の微小環境、炎症、及び治療因子の影響を受けるため、血液ベースの分析が患者における現在のＰＤ−Ｌ１発現のより正確な表現を提供し得るとの仮説が立てられてきた[29,30,39,42,43,47,48]。興味深い点として、我々は、患者の循環細胞において持続的に低、持続的に高、又は低から高へ誘導可能の３つのクラスのＰＤ−Ｌ１応答を見出し、これは、患者の約３分の１（３２％）で生じた。これは、患者の約半分（４９％）において、本質的に高レベル又は誘導性のＰＤ−Ｌ１レベルが免疫療法応答を予測できることを示唆しており、これは、免疫療法と放射線療法を組み合わせた臨床試験において、将来の検証が必要な仮説である。
【０１１１】
実施例２
腫瘍血管内皮細胞（tumor endothelial cell：ＴＥＣ）[60-62]は、血管新生及び新生血管形成のための重要な構造を形成することによって、腫瘍の開始、生存及び成長に必要とされる間質細胞の集団である。ＴＥＣは、全ての腫瘍部位において必須成分であり、腫瘍脈管構造に必要とされ、転移性ニッチのプライミングを補助し、腫瘍の分子不安定性に寄与する。循環において、共通のＴＥＣ集団が同定されており、これらは、これらの大きなサイズ、多細胞クラスター化、及び周知のＥＣマーカーＣＤ３１及びビメンチン（Vimentin）[60]に基づいて、癌関連血管内皮細胞（ＣＡＶＥ）として定義されている。
【０１１２】
サイズ排除は、これらの表面マーカー発現にかかわらず、末梢患者の血液から大きな細胞を単離し、循環腫瘍ＥＣの多くの亜型の捕捉を可能にする技術である。セルシーブ（ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ：商標）マイクロフィルターは、全血からＣＡＶＥ、ＣＡＭＬ、及びＣＴＣを迅速かつ効率的に分離できるサイズ排除膜であり、これにより、悪性疾患と共に、及びこれと関連して、全ての細胞タイプを研究することが可能である[13,60-62]。更に、セルシーブ（ＣｅｌｌＳｉｅｖｅ：商標）マイクロフィルターを使用して、単離された細胞上の亜型のバイオマーカーの質量スクリーニングを可能にする多重表現型技術（multi-phenotyping technique）が開発されている
【０１１３】
この手法を実証するために、２０１２〜２０１４年に亘って、１１６人の癌患者（ステージＩ〜ＩＶ）の胸部（ｎ＝４２）、肺（ｎ＝３９）、及び前立腺（ｎ＝３５）を含む末梢血サンプル並びに３４人の健常対照群から血液を採取した。確立されたフィルタリング法、すなわち、セルシーブ（CellSieve：商標）マイクロフィルトレーション技術（クリエイティブマイクロテック社：Creatv MicroTech）によって血液を処理し、サイズ排除によって血液を濾過し、ＣＫ８、１８、１９、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４５について細胞を染色した（図１１Ａ）。同定及び画像化の後、ＱＵＡＳ−Ｒ（クエンチ、非誘導体化、アミンストリップ及び再染色（Quench, Underivatize, Amine-Strip and Restain）技術を使用して、蛍光シグナルを除去し、ＣＤ１４６、ＣＤ１４、ビメンチン、及びＤＡＰＩについて全ての細胞を再染色した（図１１Ｂ）。再イメージングの後、再びＱＵＡＳ−Ｒを用いて蛍光を除去し、ＣＤ１４４、ＣＤ３４（又はＣＤ１０５）、ＣＤ３１、及びＤＡＰＩについて細胞を再染色した（図１１Ｃ）。ＣＡＭＬで観察されたＣＤ１４＋及び倍数体核構造を用いて、ＣＡＶＥの多核クラスターが癌関連マクロファージ様細胞と区別された。
【０１１４】
ＣＡＶＥは、ＣＤ３１、ＣＤ１４４又はＣＤ１４６の陽性に基づいて、１１６人中６３人（５４％）で同定されたが、健常対照群では検出されなかった。ＣＡＶＥは、ステージＩ患者の４３％、ステージＩＩ患者の６６％、ステージＩＩＩ患者の７４％、及びステージＩＶ患者の８２％において見出された（図１２）。ＣＡＶＥは、胸部の６９％、肺の６０％、及び前立腺の７７％のサンプルで見出された。ＣＡＶＥは、ＣＤ１４及びＣＤ４５について全て陰性であった。ＣＤ３１がＣＡＶＥの９６％で見出された最も多く存在するマーカーであり、これに、ＣＤ１４４（８５％）、サイトケラチン（６８％）、ＣＤ３４（６４％）、ＣＤ１４６（４５％）、ＥｐＣＡＭ（２３％）及びＣＤ１０５（４％）が続いた（図１３）。
【０１１５】
この結果は、マイクロフィルトレーションによって単離されたＣＥＣは、サイトケラチン陽性であり、ＣＤ４５陰性であり、これは、固形腫瘍を有する患者の循環系に共通に現れるが、健常対照群には現れないことを示している。複数の表現型の亜型によって、複数の固形腫瘍タイプの癌患者のＣＥＣを適切に識別し、亜型化できる。このデータは、ＣＥＣのサブセット、例えば、ＣＡＶＥがＣＫ＋／ＣＤ４５−として循環細胞に見出され、癌特異的循環細胞の異種集団として存在することを示唆している。
【０１１６】
実施例３
図１４は、細胞のクラスター中に出現するＣＡＶＥを検証するための染色を示している。癌腫患者から捕捉された全ての細胞の最初の染色において、ＤＡＰＩ、サイトケラチン８、１８及び１９、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４５についてサンプルを染色した。図１４の一番上の列は、サイトケラチン発現、及びＥｐＣＡＭ、ＣＤ４５発現なしのクラスターを示している。図１４の二番目の列は、ＤＡＰＩ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ１４及びＣＤ３１について細胞が再染色されたことを示している。ＣＤ３１＋膜染色及び陰性ＣＤ４５及びＣＤ１４染色は、これがＣＡＶＥクラスターであることを示している。このＣＡＶＥのクラスターは、ＰＤ−Ｌ１の高発現を有する。図１４の三番目の列は、ＣＤ１４４、ＣＸＣＲ４及びビメンチンについて細胞が再染色されたことを示している。ＣＸＣＲ４は、他の薬剤標的である。再染色のためにＱＵＡＳ−Ｒを使用し[13]、この再染色は、蛍光色素をクエンチングし、続いて再染色することからなる。この再染色は、併用免疫療法を分析する方法を示している。この例では、ＰＤ−Ｌ１とＣＸＣＲ４の両方の発現が高く、この併用療法は、この患者にとって有効である可能性があることを示している。
【０１１７】
図１５は、ＤＡＰＩ、サイトケラチン８、１８及び１９、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４５について初期的に染色されたＣＡＭＬ細胞を示している（一番上の列）。図１５の二番目の列は、ＤＡＰＩ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＣＲ５及びＰＤ−１について細胞が再染色されたことを示している。この例では、ＰＤ−Ｌ１とＣＣＲ５の両方の発現が高く、この併用免疫療法がこの患者にとって有効である可能性があることを示している。
【０１１８】
図１６は、ＤＡＰＩ、サイトケラチン８、１８及び１９、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４５について初期的に染色されたＣＡＭＬ細胞を示している（一番上の列）。図１６の二番目の列は、ＤＡＰＩ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＣＲ５及びＰＤ−１について細胞が再染色されたことを示している。この例では、ＣＣＲ５が存在するがＰＤ−Ｌ１の発現はなく、この併用免疫療法がこの患者にとって有効である可能性があることを示している。
【０１１９】
実施例４
現在の免疫療法コンパニオン診断は、組織生検におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質発現に基づいている。しかしながら、ＩＨＣ組織生検法は、生検を繰り返すことの臨床的実現可能性及びコスト、固有の腫瘍異質性、及びＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣ陰性患者が依然として免疫療法に応答する可能性があるとの知識のために制限されている。
【０１２０】
図１７Ａ及び図１７Ｂに示すように、ＰＤ−Ｌ１の発現は、ＣＡＭＬ及びＣＴＣ上で検出できる。末梢循環細胞からＰＤ−Ｌ１発現をリアルタイムでモニタリングできるか否かを判定するために、抗ＰＤ１免疫療法であるペムブロリズマブ（pembrolizumab）の開始前及び開始後のＲＣＣについて、患者からの連続サンプルを評価した。ＰＤ−Ｌ１発現を定量的に測定し、（シグナル−バックグラウンド）／バックグラウンド、又は（Ｓ−Ｎ）／Ｎとして、蛍光シグナル強度に基づいて、これをスコアリングした。ＣＡＭＬを用いて、治療中のＰＤ−Ｌ１タンパク質発現の動的変化をモニタリングできることを実証した。
【０１２１】
１人の患者のペムブロリズマブによる最初の治療の前に、この発現は、ＣＡＭＬ上で約６であった（図１７Ａ）。ペムブロリズマブ投与の１ヶ月後、ＣＡＭＬ上のＰＤ−Ｌ１発現は、バックグラウンドのレベルまで低下した（図１７Ｂ）。図１７Ｂは、（Ｓ−Ｎ）／Ｎ＜０．５である長さ７４μｍの棒状ＣＡＭＬであり、ＰＤ−Ｌ１蛍光チャネルでは、殆ど不可視である。
【０１２２】
図１８は、細胞の視覚化を可能にする他の染色を含む。この時点では、患者は依然として１本の血液管から２６個のＣＡＭＬを有していたが、これらすべてにおいて、ＰＤ−Ｌ１は、ノイズレベルであった。ペムブロリズマブ治療を続けたが、患者は、数カ月後に死亡した。ＰＤ−Ｌ１発現の喪失は、異なるＲＣＣサブクローンの存在又はペムブロリズマブに応答するＰＤ−Ｌ１低発現サブクローンの選択を示している可能性がある。
【０１２３】
本発明について、特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の思想及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることは、当業者にとって明らかである。特許請求の範囲は、ここに記述した特定の実施形態に限定されない。
【０１２４】
参考文献
本明細書で言及した全ての特許文献及び刊行物は、本発明が関係する当業者の技術水準を示すものである。引用された特許文献及び刊行物のそれぞれは、引用によってその全体が本明細書に援用される。以下の参考文献の全てが本出願に引用されている。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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