(57)【要約】ＨＰＶ１８および／またはＨＰＶ１６に対する治療剤として使用するためのベクター、ワクチン、ワクチン組成物およびワクチン組み合わせが記載される。
2019514943.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチン組み合わせであって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を共に含む、免疫学的有効量の１つ以上の組換えアデノウイルスベクターを、薬学的に許容される担体と共に含む第１のワクチン；ならびに
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸を含む、免疫学的有効量の組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを、薬学的に許容される担体と共に含む第２のワクチン
を含み、前記ＭＶＡベクターはＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体を含む、ワクチン組み合わせ。
【請求項２】
前記第１のワクチンおよび前記第２のワクチンはそれぞれ、配列番号２８のアミノ酸配列を含む第５のポリペプチドをコードする核酸、および配列番号３１のアミノ酸配列を含む第６のポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項１に記載のワクチン組み合わせ。
【請求項３】
前記第１のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドはそれぞれ配列番号２８のアミノ酸配列をさらに含み、前記第２のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドはそれぞれ配列番号３１のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載のワクチン組み合わせ。
【請求項４】
前記第１の核酸および前記第３の核酸はそれぞれ配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、前記第２の核酸および前記第４の核酸はそれぞれ、配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載のワクチン組み合わせ。
【請求項５】
前記第１の核酸および前記第３の核酸はそれぞれ、配列番号２のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、前記第２の核酸および前記第４の核酸はそれぞれ、配列番号２１のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン組み合わせ。
【請求項６】
前記第１の核酸および前記第３の核酸はそれぞれ、配列番号４または配列番号２４のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、前記第２の核酸および前記第４の核酸はそれぞれ、配列番号２３または配列番号２５のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項４に記載のワクチン組み合わせ。
【請求項７】
前記組換えアデノウイルスベクターはｒＡｄ２６である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン組み合わせ。
【請求項８】
前記第１のワクチンは、前記第１の核酸を含む第１の組換えアデノウイルスベクター、および前記第２の核酸を含む第２の組換えアデノウイルスを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のワクチン組み合わせ。
【請求項９】
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも１つをコードする第１の核酸、ならびに（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも１つをコードする第２の核酸を含む組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターであって、
前記ＭＶＡベクターは、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体である、組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター。
【請求項１０】
前記第１の核酸は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、前記第２の核酸は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項９に記載の組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター。
【請求項１１】
前記第１の核酸は、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、前記第２の核酸は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項９に記載の組換えＭＶＡベクター。
【請求項１２】
前記第１の核酸は、配列番号２のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、前記第２の核酸は、配列番号２１のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１０に記載の組換えＭＶＡベクター。
【請求項１３】
前記第１の核酸は、配列番号４または配列番号２４のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、前記第２の核酸は、配列番号２３または配列番号２５のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１１に記載の組換えＭＶＡベクター。
【請求項１４】
配列番号１、配列番号３、配列番号２０および配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含む組換えＭＶＡベクターであって、前記少なくとも１つの核酸は、配列番号２６および配列番号２７のポリヌクレオチド配列の少なくとも１つを含むプロモーターに作動可能に連結している、組換えＭＶＡベクター。
【請求項１５】
請求項９〜１４のいずれか一項に記載の組換えＭＶＡベクター、および薬学的に許容される担体を含む、ワクチン。
【請求項１６】
その治療を必要としている対象における持続性ヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）感染、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸癌（子宮頸部扁平上皮癌（ＳＣＣ）など）、中咽頭癌、陰茎癌、膣癌または肛門癌を治療する方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のベクター、ワクチンまたはワクチン組み合わせを前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１７】
それを必要としている対象におけるヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）免疫学的有効量の
（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および配列番号２０を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む組換えアデノウイルスベクター、または
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含む第１の組換えアデノウイルスベクター、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む第２の組換えアデノウイルスベクター
を、薬学的に許容される担体と共に含む第１のワクチンを前記対象に投与する工程；ならびに
（ｂ）免疫学的有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸を含む組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを、薬学的に許容される担体と共に含む第２のワクチンを前記対象に投与する工程を含み、
前記第１のワクチンはプライミングワクチンとして前記対象に投与され、前記第２のワクチンはブースティングワクチンとして前記対象に投与される、方法。
【請求項１８】
前記第１のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドはそれぞれ、配列番号２８のアミノ酸配列をさらに含み、前記第２のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドはそれぞれ、配列番号３１のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のワクチンは、配列番号１または配列番号３のアミノ酸配列を含む前記第１のポリペプチドをコードする前記第１の核酸を含む前記第１の組換えアデノウイルスベクター、および配列番号２０または配列番号２２のアミノ酸配列を含む前記第２のポリペプチドをコードする前記第２の核酸を含む前記第２の組換えアデノウイルスベクターを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に従い、２０１５年８月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／２０９，０９１号、および２０１５年８月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／２１０，６５５号の優先権を有するものであり、それらの開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、医薬の分野に関し、より詳しくはヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）１８型および／または１６型に対する治療に使用可能な核酸コンストラクト、ポリペプチド、ベクター、ワクチン、ワクチン組み合わせに関する。
【０００３】
電子的に提出された配列表の参照
本願は、ファイル名「０２６９＿ＵＳ＿Ｐ００＿ＰＲＯ＿ＳＴ２５」、作成日が２０１６年４月２５日であり、約６４，７００バイトのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表を含む。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
ヒトパピローマウイルス（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）のファミリーは、皮膚または粘膜のケラチノサイトに感染することが可能な１００を超える型（亜型とも称される）からなる。ＨＰＶの４０を超える型が概して性交渉を介して感染し、男女双方において肛門性器領域のＨＰＶ感染は極めて一般的である。一部の性感染性ＨＰＶ型は、性器疣贅を引き起こし得る。「高リスク」ＨＰＶ型（例えば、１６、１８、３１、４５型）（皮膚疣贅を引き起こすものと異なる）を伴う持続性感染は、例えば、頸部、外陰部、腟、陰茎、中咽頭および肛門の前癌性病変および浸潤性癌に進行し得る。ＨＰＶ感染の大半は、感染後１〜２年以内に自発的に除去される。健常者では、ＨＰＶ−１６のウイルス初期タンパク質Ｅ２、Ｅ６およびＥ７に特異的な循環性Ｔｈ１型およびＴｈ２型ＣＤ４＋Ｔ細胞、ならびにＥ６に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞が抗原負荷時に皮膚に遊走し、これはＨＰＶ−１６感染に対する奏効的防御が一般にこれらのウイルス初期抗原に対する全身性エフェクターＴ細胞応答に関連することを示す。感染個体の少数派（約１％）では、ＨＰＶ感染は持続し、最終的に性器腫瘍性病変をもたらす。高リスクＨＰＶの中のＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８は、子宮頸癌の主因であり、共に症例の約７０％を引き起こし、またこれら２つの型は、肛門癌および中咽頭癌などの他のＨＰＶ誘発癌においても主要な役割を果たす。世界的に、ＨＰＶは癌を引き起こす最も重要な感染性病原体の１つである。
【０００５】
ＨＰＶに対するワクチン接種は、ＨＰＶによる感染の発生率または影響を低下させることが可能な方法であると思われる（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｅｌｉｅｆ，２０１１，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：２５２−２５７）。
【０００６】
ＨＰＶ１６型および１８型の（エンベロープ）タンパク質Ｌ１によって形成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）に基づく予防用ＨＰＶワクチンは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８による持続性感染および関連疾患の予防に非常に有効である。これらのワクチンは、Ｌ１タンパク質に対する中和抗体の誘導を介して無菌免疫をもたらすと考えられる。追加的な高リスクＨＰＶ型由来のＬ１に基づくＶＬＰの添加は、かかるワクチンによって与えられる幅広い保護をさらに増強する場合がある。
【０００７】
しかし、かかるワクチンが初期感染を予防し得る（すなわち、それらは予防をもたらす）一方、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８によって引き起こされる確立された性器病変に対する有益な効果の証拠が存在しないことから、それらはＨＰＶに対する治療ワクチンと考えられていない（Ｈｉｌｄｅｓｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＪＡＭＡ  ２９８：７４３−５３）。
【０００８】
これらの予防ワクチンの導入にもかかわらず、多くの人々が、持続性の高リスクＨＰＶ感染を既に受けているかまたは受けるリスクが依然としてあり、それ故、癌を患うリスクがある。確立されたＨＰＶ感染および関連疾患の根絶のための治療ワクチンは、未だ対処されていない緊急の医学的需要である。
【０００９】
この需要に対処するための試みは既にいくつか報告されている。例えば、種々の異なるワクチン接種方法、例えば、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ）由来の熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）およびＨＰＶ−１６  Ｅ７からなる融合タンパク質、またはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８に由来するＥ６、Ｅ７およびＬ２からなる融合タンパク質、キメラＬ１−Ｅ７  ＶＬＰ、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８のＥ６およびＥ７またはウシパピローマウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）Ｅ２を発現する組換えワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８のＥ６およびＥ７のＣＴＬエピトープを発現するＤＮＡワクチン、ＨＰＶ−１６  Ｅ７抗原を分泌する弱毒化生リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（Ｌｍ）、ならびにＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７ペプチドを含む合成ロングペプチド（ＳＬＰ）を用いた臨床試験が実施されている。これらの手法の一部が限定はされないがいくらかの臨床有効性を示す一方、大部分が奏功しておらず、これは現行の方法の改善が必要であることを示している。
【００１０】
初期ＨＰＶタンパク質Ｅ６およびＥ７をコードする遺伝子の組み込みは、感染から癌に至る過程における必要なステップであり、子宮頸癌細胞の腫瘍性表現型の維持にとって、Ｅ６およびＥ７の持続的発現が必要とされる。したがって、Ｅ６およびＥ７は、治療ワクチン接種にとっての良好な標的と考えられる。前述のように、一部の試験によると、高リスクＨＰＶに感染した女性への治療ワクチン接種が既存の病変の退縮を誘導し得ることが示されている。Ｋｅｎｔｅｒらは、治療ワクチンとしてＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質に由来するＳＬＰおよびアジュバントを用いることで、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）を有する患者の４７％が持続的かつ完全な退縮を示した（Ｋｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１：１８３８−４７）。同様に、タンパク質に基づくワクチン（ＴＡ−ＣＩＮ、ＨＰＶ１６  Ｅ６、Ｅ７およびＬ２の融合タンパク質からなる）をＶＩＮの２／３の患者における局所免疫調節と組み合わせた試験によると、患者の６３％において完全な退縮が示された（Ｄａａｙａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０２：１１２９−３６）。ワクチンとしての合成ロングペプチドの考えられる欠点として、大規模での製造可能性およびそれに伴うコスト、潜在的に反応源性を示すアジュバントの必要性およびそれに伴う免疫に関連した有害作用（特に疼痛および腫脹）が挙げられる。高レベルの不快感のために、自発的クリアランス速度が依然として高い場合、ＳＬＰを初期ステージの疾患において用いる可能性は高くない。同様に、ＴＡ−ＣＩＮ治療においては局所的なイミキモド治療を必要とするため、耐容性は重要な課題である。というのも、女性の大半がイミキモド治療が持続している間続く局所性および全身性副作用を経験し、それは日々の活動に影響し得るからである。
【００１１】
考えられる代替案は、ワクチン接種用にＨＰＶ  Ｅ６および／またはＥ７タンパク質をコードするＤＮＡワクチンまたはウイルスベクターワクチンなどの核酸に基づくワクチン接種を用いることである。
【００１２】
しかし、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７タンパク質は、発癌可能性を有し、それ故にこれらのタンパク質をコードする核酸を含むワクチンを用いるワクチン接種は、抗原の持続的発現の可能性に起因して細胞形質転換を誘導するリスクを提起する。
【００１３】
したがって、遺伝子ワクチン接種の場合、ワクチン接種に起因する細胞形質転換のリスクを排除するため、Ｅ６および／またはＥ７の非発癌性／解毒化バージョンを用いることができる。野生型Ｅ６およびＥ７の発癌能の喪失は、一般に、これらのタンパク質の機能に重要であることが知られている残基の欠失および／または置換によって達成される（例えば、Ｓｍａｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８１：２３１−３８；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７）：４３１−４０；Ｗｉｅｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １９：６６７−７４）。しかし、これらの手法の不利な点は、それらが、タンパク質から重要なＴ細胞エピトープを除去し、かつ／または新たな望ましくないＴ細胞エピトープをタンパク質に導入するというリスクを有し、それ故、所望される免疫応答をもたらさない可能性があることである。
【００１４】
ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の発癌能を除去するための代替の方法においては、Ｅ６およびＥ７タンパク質のシャッフルされたバージョン（すなわち、野生型タンパク質の断片が再配列されたポリペプチド）が構築されている（例えば、Ｏｅｈｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：２８８０−９３；Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９：３９７−４０６；Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｈｕｍ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ２３：１３０１−１２）。しかし、これらの手法の場合、Ｅ６およびＥ７タンパク質の双方の考えられるあらゆるエピトープの包含を確保するための複数分子の作製、配合および投与がさらに必要になり、最適以下のロジスティックスおよび比較的高いコストをもたらし、さらに記載された方法はＥ６およびＥ７中に存在しない潜在的に強力な非天然エピトープを導入し、また免疫応答が関連のあるＥ６／Ｅ７エピトープからかかる非天然エピトープの方へ転用され得ることから、記載されたコンストラクトは最適な免疫学的特性を有しない可能性がある。遺伝子アジュバントを内蔵し、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８双方のＥ６およびＥ７断片が混ざった細胞内標的化融合タンパク質を発現する治療用ＤＮＡワクチンもまた報告されており、それでエレクトロポレーション強化免疫化することにより、ＣＩＮ３の患者において有意なＥ６／Ｅ７特異的Ｔ細胞応答が誘発された（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、当該技術分野では、ＨＰＶに対する治療ワクチン、好ましくは前述の手法が有する欠点がより少ないワクチンが依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、ＨＰＶ感染に対する免疫応答を生成するために使用され得る１つ以上のベクター、ワクチン、およびワクチン組み合わせを提供する。種々の実施形態において、本発明は、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８腫瘍性タンパク質Ｅ６およびＥ７の本質的に全ての可能なＴ細胞エピトープを含むが、それにもかかわらず、再配列されているＥ６およびＥ７タンパク質の断片を含む一方、同時に望ましくない強力なネオエピトープの含有数が最少であることにより、（野生型Ｅ６およびＥ７と比べて）著しく低下した検出不能なまでの形質転換活性を有するポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。これは、既に他で報告されている分子と対照的である。本発明は、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８に対する治療ワクチンにおいて使用可能な分子を提供する。
【００１７】
種々のさらなる実施形態において、ベクター、ワクチンおよびワクチン組み合わせは、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８腫瘍性タンパク質Ｅ６およびＥ７の本質的に全ての可能なＴ細胞エピトープを含むが、それにもかかわらず、（野生型Ｅ６およびＥ７と比べて）著しく低下した検出不能なまでの形質転換活性を有するポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸分子を含む。少なくとも１つの態様では、これは、ベクター、ワクチンおよびワクチン組み合わせが、再配列されたＥ６およびＥ７タンパク質の断片を含む一方、同時に望ましくない強力なネオエピトープの含有数が最少であるときに達成される。これは、既に他で報告されている分子と対照的である。好ましい実施形態では、ベクター、ワクチンまたはワクチン組み合わせによってコードされるポリペプチドまたは融合タンパク質は、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のＥ２タンパク質またはその断片をさらに含む。本発明は、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８に対する治療ワクチンにおいて使用可能な分子を提供する。そのような分子はまた、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の双方に対する治療ワクチンにおいて組み合わせられ得る。
【００１８】
特定の実施形態では、ＨＰＶ１６に関する本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２８、またはそれらの組み合わせで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター、ワクチンおよびワクチン組み合わせを提供する。特定の好ましい実施形態では、ＨＰＶ１６に関する本発明は、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター、ワクチンおよびワクチン組み合わせを提供する。他の実施形態では、ＨＰＶ１８に関する本発明は、配列番号２０、配列番号２２、配列番号３１、またはそれらの組み合わせで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター、ワクチンおよびワクチン組み合わせを提供する。特定の好ましい実施形態では、ＨＰＶ１８に関する本発明は、配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター、ワクチンおよびワクチン組み合わせを提供する。
【００１９】
いくつかの態様では、本発明のコードされるポリペプチドは、リーダー配列をさらに含み得る。
【００２０】
特定の実施形態では、コードされるポリペプチドは、ＨＰＶ１６  Ｅ２タンパク質またはＨＰＶ１８  Ｅ２タンパク質の少なくとも１つのエピトープを含む。Ｅ２タンパク質は、例えばそのトランス活性化および／またはＤＮＡ結合ドメインが、例えば、欠失、変異またはタンパク質の他の部分の構造的再編成によって不活化されていてもよい。ＨＰＶ１６に関する特定の実施形態では、コードされるポリペプチドは、配列番号２８で示されるアミノ酸配列を含む。ＨＰＶ１８に関する特定の実施形態では、コードされるポリペプチドは、配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
ＨＰＶ１６に関する特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３０、またはそれらの組み合わせで示されるポリヌクレオチド配列を含む。ＨＰＶ１６に関する特定の好ましい実施形態では、核酸配列は、配列番号２、配列番号４または配列番号２４で示されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
ＨＰＶ１８に関する特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号３２、配列番号３３、またはそれらの組み合わせで示されるポリヌクレオチド配列を含む。ＨＰＶ１８に関する特定の好ましい実施形態では、核酸配列は、配列番号２１、配列番号２３または配列番号２５で示されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
本発明はまた、本発明による組換えウイルスベクターおよび薬学的に許容される賦形剤を含むワクチンおよびワクチン組み合わせを提供する。組換えウイルスベクターは、本発明による１つ以上の核酸分子を含み、ポリペプチドをコードする配列はプロモーターに作動可能に連結されている。
【００２４】
特定の実施形態では、ベクターは、組換えポックスウイルスベクターまたは組換えアデノウイルスベクターなどのウイルスベクターである。特定の好ましい実施形態では、ベクターは、組換えアデノウイルスまたは組換えＭＶＡウイルスである。さらなる好ましい実施形態では、ＭＶＡウイルスベクターは、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体である。なおさらなる好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターはｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５から選択され、最も好ましくはｒＡｄ２６である。
【００２５】
特定の好ましい実施形態には、
ａ）共に配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む、免疫学的有効量の１つ以上の組換えアデノウイルスベクターを、薬学的に許容される担体と共に含む第１のワクチン；ならびに
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸を含む、免疫学的有効量の組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを、薬学的に許容される担体と共に含む第２のワクチン
を含み、ＭＶＡベクターは、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体を含むワクチン組み合わせがある。
【００２６】
本発明の実施形態によれば、第１のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは同一であっても異なっていてもよい。例えば、第１および第３のポリペプチドの一方は他方のポリペプチドに存在しない追加のアミノ酸配列を含むことができ、または第１および第３のポリペプチドは、互いに異なる追加のアミノ酸配列を含むことができる。同様に、第２および第４のポリペプチドも同一であっても異なっていてもよい。第１の核酸および第３の核酸は、同一であっても異なっていてもよい。例えば、第１および第３の核酸は、異なる第１および第３のポリペプチドをコードし、かつ／または同じアミノ酸に対して異なるコドンを使用するため、異なる可能性がある。同様に、第２および第４の核酸も同一であっても異なっていてもよい。
【００２７】
特定のさらなる好ましい実施形態では、ａ）およびｂ）双方の第１のワクチンおよび第２のワクチンはそれぞれ、配列番号２８のアミノ酸配列を含む第５のポリペプチドをコードする核酸、および配列番号３１のアミノ酸配列を含む第６のポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。第５および第６のポリペプチドはそれぞれ、独立して、または好ましくは本発明のＥ６およびＥ７ポリペプチドを含む融合タンパク質の一部として、発現され得る。
【００２８】
他のさらなる好ましい実施形態では、第１のワクチンおよび第２のワクチンのそれぞれの配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸は、第５のポリペプチドをさらにコードする。好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび第５のポリペプチドは、配列番号３または配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペチドなどの融合タンパク質において共に発現する。第１および第２のワクチンのそれぞれの配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸は、好ましくは第６のポリペプチドをさらにコードする。好ましくは、配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび第６のポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペチドなどの融合タンパク質において共に発現する。
【００２９】
さらに他の好ましい実施形態では、第１のワクチンおよび第２のワクチンの一方または両方の配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸の一部である。なおさらなる好ましい実施形態では、第１のワクチンおよび第２のワクチンの一方または両方の配列番号２０を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２２を含むポリペプチドをコードする核酸の一部である。
【００３０】
種々の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２１のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する。他の実施形態では、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号４または配列番号２４のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２３または配列２５のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【００３１】
本発明はまた、対象におけるＨＰＶ、特にＨＰＶ１６もしくはＨＰＶ１８、またはＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に対する免疫応答を誘導する方法であって、本発明によるベクター、ワクチンまたはワクチン組み合わせを対象に投与する工程を含む方法を提供する。本発明はまた、ＨＰＶ、特にＨＰＶ１６もしくはＨＰＶ１８、またはＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両方に対する免疫応答の誘導に使用するための、本発明によるベクター、ワクチンまたはワクチン組み合わせを提供する。
【００３２】
特定の実施形態では、本発明のベクターまたはワクチンは、対象に２回以上投与される。
【００３３】
特定の実施形態では、本発明によるベクター、ワクチン、またはワクチン組み合わせは、プライムブーストレジメンとして、それを必要とする対象、好ましくはヒト対象に投与される。好ましい実施形態では、プライムブーストレジメンは、免疫学的有効量の（ｉ）本発明によるポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と共に；または免疫学的有効量の（ｉｉ）本発明によるポリペプチドをコードする核酸を含む第１の組換えアデノウイルスベクター、および本発明による異なるポリペプチドをコードする核酸を含む第２の組換えアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と共に含むプライミングワクチンを含む。免疫学的有効量の、本発明によるポリペプチドをコードする、好ましくは本発明による２つの異なるポリペプチドをコードする核酸を含む組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを、薬学的に許容される担体と共に含むブースティングワクチンも存在する。
【００３４】
他の種々の実施形態では、プライムブーストレジメンは、免疫学的有効量の、本発明によるポリペプチドをコードする核酸を含む組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを、薬学的に許容される担体と共に含む。免疫学的有効量の（ｉ）本発明によるポリペプチドをコードする核酸を含む組換えアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と共に；または免疫学的有効量の（ｉｉ）本発明によるポリペプチドをコードする核酸を含む第１の組換えアデノウイルスベクター、および本発明による異なるポリペプチドをコードする核酸を含む第２の組換えアデノウイルスベクターを薬学的に許容される担体と共に含むブースティングワクチンも存在する。
【００３５】
本発明はまた、その治療を必要としている対象における持続性ＨＰＶ感染（特に、持続性ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８感染）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸癌（子宮頸部扁平上皮癌（ＳＣＣ）など）、中咽頭癌、陰茎癌、膣癌または肛門癌のいずれかを治療する方法であって、本発明によりベクター、ワクチンまたはワクチン組み合わせを対象に投与する工程を含む方法を提供する。本発明はまた、その治療を必要としている対象における持続性ＨＰＶ感染（特に、持続性ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８感染）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸癌（子宮頸部扁平上皮癌（ＳＣＣ）など）、中咽頭癌、陰茎癌、膣癌または肛門癌のいずれかの治療に使用するための本発明によるベクター、ワクチンまたはワクチン組み合わせを提供する。
【００３６】
上述の概要および下記の本発明の詳細な説明は、添付した図面と共に読む場合により良く理解されるであろう。本発明は図面に示される明確な実施形態に限定されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の融合タンパク質の発現。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、図の上部に示される導入遺伝子を発現するＤＮＡベクターが一過性にトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後、細胞が収集され、細胞抽出物がＨＰＶ１６  Ｅ７に対する抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより分析された（上パネル）。ＮＦ−ｋＢを示すローディング対照（下パネル）により、全レーンにおいて細胞溶解物の類似したローディングが確認される。分子量マーカーは左側に示される。融合タンパク質の予想サイズ：Ｅ６Ｅ７ＳＨ  約３８ｋＤａ；Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＥ６Ｅ７Ｅ２ＳＨ  約７５ｋＤａ、ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ  約７８ｋＤａ。
【図２】軟寒天中のコロニー形成。Ａ）軟寒天アッセイの手順の略図。Ｂ）播種の６週後、寒天中の細胞の倍率４０倍での代表的な顕微鏡画像。白色矢印はＥ７ｗｔトランスフェクト細胞内で観察されたコロニーを強調する。Ｃ）ＧｅｌｃｏｕｎｔＴＭおよび関連ソフトウェアを用いた、寒天中、播種の６週後でのコロニーの定量化。＊：ｐ＜０．０５（ポアソン回帰モデル）；＊＊：非劣性（５％の非劣性マージンを伴う一般化線形モデル）。
【図３−１】図３：ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨはＥ６およびＥ７活性を失っている。Ａ）Ｅ６Ｅ７ＳＨによるｐ５３分解の欠如を示す代表的なウエスタンブロット。ヒトｐ５３ヌルＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞に、ｐ５３を発現するプラスミドが、ＨＰＶ１６  Ｅ６野生型、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するプラスミド、またはエンプティベクターと組み合わされてコトランスフェクトされた。非ＴＦは非トランスフェクト細胞を示す。トランスフェクションから２４時間後、細胞溶解物が調製され、３０μｇの総タンパク質がゲル上にロードされた。上パネル−ｐ５３染色、中間パネル−Ｅ６染色、下パネル−ＮＦ−ｋＢ染色（ローディング対照）。（Ｂ）４つの独立アッセイにおけるｐ５３レベルの定量化。ｐ５３シグナルはＮＦ−κＢシグナルに正規化された。Ｃ）Ｅ６Ｅ７ＳＨによるｐＲｂ分解の欠如を示すウエスタンブロット。ｐＲｂヌルＳａｏｓ−２細胞に、ｐＲｂを発現するプラスミドが、ＨＰＶ１６  Ｅ７野生型、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するプラスミド、またはエンプティベクターと組み合わされてコトランスフェクトされた。非ＴＦは非トランスフェクト細胞を示す。トランスフェクションから２４時間後、細胞溶解物が調製され、１０μｇの総タンパク質がゲル上にロードされた。上パネル−ｐＲｂ染色、中間パネル−Ｅ７染色、下パネル−ＮＦ−κＢ染色（ローディング対照）。Ｄ）４つの独立アッセイにおけるｐＲｂレベルの定量化。ｐＲｂシグナルはＮＦ−κＢシグナルに正規化された。＊：ｐ＜０．０５（ＡＮＯＶＡモデル）；＊＊：非劣性（試験はＡＮＯＶＡモデル由来の９５％ＣＩに基づいた。非劣性マージンは７５％に設定された）。
【図３−２】（上記の通り）
【図４】ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨは一次ヒト上皮ケラチノサイトを不死化しない。一次ヒト上皮ケラチノサイトに、ＨＰＶ１６の野生型Ｅ６およびＥ７をコードするオープンリーディングフレーム（Ｅ６Ｅ７ｗｔ）、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨ配列またはｅＧＦＰをコードするレンチウイルスが形質導入された。非形質導入ドナー細胞が対照として用いられた。Ｅ６Ｅ７ｗｔの発現のみが、寿命延長および約２００日目のｈＴＥＲＴ活性化（記載せず）によって示される通り、一次ケラチノサイトの不死化を誘導する。十字記号は、細胞が老化で死滅し、さらなる培養ができなかったことを示す。詳細については、実施例２を参照されたい。２つの追加ドナーにおいて同様の結果が得られた（記載せず）。
【図５】ＤＮＡ免疫後、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨによって誘導される免疫応答−ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析。Ａ．免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＤＮＡプラスミドまたは導入遺伝子を発現しないプラスミド（対照）で免疫された。免疫付与の２週後、マウスはサクリファイスされ、単離された脾細胞がＥ７に対応する１５ｍｅｒペプチドプールで終夜刺激された。Ｂ．個々のマウスにおけるＨＰＶ１６  Ｅ７に特異的な免疫応答が、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる測定で、１０６個の脾細胞当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として与えられる。
【図６】ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨの免疫原性−ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ分析。（Ａ）．免疫スキーム。マウスが、示された通りのインサートを有するアデノベクターで免疫された。２週後（Ｂ）および８週後（Ｃ）でのＥ７に特異的な応答が、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより分析された（１０６個の脾細胞当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として表される）。黒丸は、１×１０１０ｖｐの用量で免疫されたマウスを表し、白丸は５×１０９ｖｐで免疫されたマウスを表す。黒棒は、応答の幾何平均を表す。点線は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける検出下限を示す。ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ統計解析が対数変換データに対して実施された。＊：ｐ＜０．０５。詳細については、実施例３を参照されたい。
【図７】ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの免疫原性−Ｅ７四量体染色。（Ａ）．免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、示された通りの導入遺伝子を発現する１×１０１０ｖｐのアデノベクターで免疫された。免疫付与の２週後、マウスはサクリファイスされ、単離された脾細胞が、Ｅ７４９−５７−Ｈ２−Ｄｂ四量体と相互作用可能なＣＤ８＋細胞の存在について分析された（Ｂ）。Ｅ７四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合がｙ軸に示される。ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ統計解析が対数変換データに対して実施され、異なるＥ６Ｅ７ＳＨ変異体間の差異は統計学的に有意でなかった。
【図８】ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの免疫原性−ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析。（Ａ）．免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、パネルＢおよびＣの下部に示される導入遺伝子を発現するアデノベクターで免疫された。免疫付与の２週後、マウスはサクリファイスされ、単離された脾細胞が、Ｅ２（Ｂ）、Ｅ６（記載せず）またはＥ７（Ｃ）に対応する１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激された。応答が１０６個の脾細胞当たりのＳＦＵとして与えられる。ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ統計解析が対数変換データに対して実施された。Ｅ２のみをコードするアデノベクターによって誘導されるＥ２応答は、Ｅ６およびＥ７断片を含む本発明のポリペプチドによって誘導される応答よりも高い。Ｅ２対Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ、およびＥ２対Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨの差異は有意である（＊：ｐ＜０．０５）。ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ統計解析が対数変換データに対して実施された。
【図９】免疫マウスにおけるＨＰＶ１６の持続的免疫応答。特に、（Ａ）免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、変異体ＨＰＶ１６  ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現する１×１０１０ｖｐのＡｄ３５ベクター、または導入遺伝子を発現しないアデノベクター（エンプティ）で免疫された。四量体染色によりＥ７に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を測定するため、血液試料が２週毎に採取された。（Ｂ）免疫付与の２週後の免疫応答。リーダー配列を含むベクターは、リーダー配列を伴わないベクターよりも高い応答を誘導した。ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ対Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（＊：ｐ＜０．０５）。（Ｃ）応答の動態。ＡＮＯＶＡ後のボンフェローニ統計解析が２週目のデータセットの対数変換データに対して実施された。Ｅ２を含む分子によって誘導されるＥ７応答は、Ｅ２を含まない分子と比べてより高い傾向があるが、結果は統計学的には有意でなかった。
【図１０】免疫応答を増加させるための異なるアデノウイルスベクターの使用。（Ａ）．免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６ベクター（ＨＰＶ１６−Ｔｘ）、または導入遺伝子を発現しないＡｄ２６ベクター（エンプティ）で免疫された。２週後、免疫が、同図の下部に示すようなＡｄ３５に基づくベクターを用いて繰り返された。２回目の免疫付与の４週後、マウスはサクリファイスされ、四量体染色によりＥ７に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を測定するため、血液試料が用いられた。＊Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｔｘ／Ａｄ３５．ＨＰＶ１６−Ｔｘ対Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｔｘ／Ａｄ３５．Ｅｍｐｔｙの比較を示す（ｐ＜０．０５）（多重比較におけるアルファ＝０．０１を伴う対数変換データに対するスチューデントｔ検定）。
【図１１】アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）におけるＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの細胞免疫原性。（Ａ）免疫スキーム。アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）が０日目に免疫された。すなわち、筋肉内免疫（ｉ．ｍ）により、動物８匹がＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを受け、対照動物２匹がＡｄ２６．エンプティを受けた。ブースト免疫（Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはＡｄ２６．エンプティ）が８週後に与えられた。１６週後、動物は同じＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ３５ベクターにより２回目のブースト免疫を受けた一方、対照動物はＡｄ３５．エンプティを受けた。アデノベクターの用量は１×１０１１ｖｐ／免疫であった。採血は数回の時点で実施された。（Ｂ）ＰＢＭＣにおける細胞免疫応答がＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより測定された。ＰＢＭＣは、ＨＰＶ１６  Ｅ２、Ｅ６またはＥ７に対応するペプチドプールで刺激され、１×１０６個のＰＢＭＣにおけるスポット形成単位（ＳＦＵ）数が図示される。エンプティ対照動物（ｎ＝２）は、検出可能な応答を全く示さなかった。詳細については、実施例４を参照されたい。
【図１２−１】図１２：ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノベクターの治療効果。（Ａ）ＴＣ−１注射および免疫スキーム。０日目、ＣＢ６Ｆ１マウスに１×１０５個のＴＣ−１細胞が皮下注射された。６日後、腫瘍が触知可能であった場合、マウスは、５ｎｍｏｌのＯＤＮ１８２６−ＣｐＧを添加した最終容量２００μｌの０．９％生理食塩水中に１５０μｇで含まれる、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７免疫優性エピトープを覆う２つのＳＬＰ（すなわち、ＨＰＶ１６  Ｅ６  ａａ４１−６５（ＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮ；配列番号１８）およびＨＰＶ１６  Ｅ７  ａａ  ４３−７７（ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲ；配列番号：１９）（Ｂ）、またはＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（Ｃ）で免疫された。対照マウスは、ＣｐＧ単独（Ｄ）またはＡｄ２６．エンプティを受けた。全てのマウスが、２０日目にブースト免疫を受けた。プライム免疫においてＡｄ２６ベクターを受けたマウスは、その後、対応するＡｄ３５ベクターで免疫された。その他のマウスは、プライム免疫などの場合、ＣｐＧで免疫賦活されたＳＬＰまたはＣｐＧ単独を受けた。（Ｂ〜Ｅ）ＴＣ−１注射マウスにおける腫瘍測定。腫瘍体積は、（幅２×長さ）／２として算出された。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えると、マウスはサクリファイスされた。２匹のマウスは、２０％を超える体重減少が原因でサクリファイスされなければならなかった（アスターリスクで表示される）。（Ｆ〜Ｇ）最初の３５日間のパネルＢおよびＣのクローズアップ。（Ｈ）ＴＣ−１注射後の生存。Ａｄ．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨで治療されたマウスの生存は、ＳＬＰおよびＣｐＧで免疫されたマウスと比べて有意に増加した（ログランク検定ｐ＜０．０５）。Ａｄ．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨで免疫されたマウス３匹は、実験の終了時に腫瘍がなかった（９２日目）。
【図１２−２】（上記の通り）
【図１３】ＨＰＶＡｇまたはＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードする導入遺伝子を有するアデノウイルスベクターは、導入遺伝子発現を抑制可能な細胞でウイルス収量の増加を示す。Ａ）Ａｄ３５ベクターにおけるウイルス収量アッセイ。ＰＥＲ．Ｃ６、ＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ、およびＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ細胞は、ＧＦＰ−ＬｕｃまたはＨＰＶＡｇをコードする導入遺伝子を有するＡｄ３５ベクターによる感染を受けた。これらの導入遺伝子は、ＣｕＯまたはＴｅｔＯ含有ＣＭＶプロモーターにより駆動された。ウイルス収量は、感染の４日後に、Ａｄ３５ヘキソンに特異的なｑＰＣＲに基づく方法により測定された。Ｂ）Ａｄ２６ベクターにおけるウイルス収量アッセイ。ＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ細胞は、ＧＦＰ−Ｌｕｃ、ＨＰＶＡｇ、またはＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードする導入遺伝子を有するＡｄ２６ベクターによる感染を受け、それらの導入遺伝子は全て、ＴｅｔＯ含有ＣＭＶプロモーターにより駆動された。ウイルス収量は、感染の３日後に、Ａｄ２６ヘキソンに特異的なｑＰＣＲに基づく方法により測定された。詳細については、実施例６を参照されたい。
【図１４】ベクター産生中での導入遺伝子発現を抑制するためのリプレッサー系の使用により、ＨＰＶＡｇをコードする導入遺伝子を有するアデノウイルスベクターにおける導入遺伝子カセットの不安定化が阻止される。ＣＭＶＣｕＯの制御下でＨＰＶＡｇを発現するＡｄ３５ベクターは、ＰＥＲ．Ｃ６細胞株またはＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ細胞株でのＤＮＡトランスフェクションにより救出された。得られたウイルスプラークが、１細胞株当たり５個採取され、各々の細胞株での継続的感染にわたって用いられた。Ａ）１０回のウイルス継代後のベクター導入遺伝子カセット領域の完全性のＰＣＲによる分析。ＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲで継代されたウイルス単離物から得られたＰＣＲ産物が各々、中間および右パネルに示される。ＰＥＲ．Ｃ６で継代されたウイルス単離物１、２、４および５において得られた完全長と見られるＰＣＲ産物、ならびにＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲで継代された単離物１〜５において認められたものが、サンガーＤＮＡ塩基配列決定法により分析された。クロマトグラムトレースの分析（記載せず）により、ＰＥＲ．Ｃ６で増殖した全ての単離物（ＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲで増殖したものでない）が、ＨＰＶＡｇにおけるコード配列内に少しのフレームシフト欠失または中途での停止変異を有することが示された。Ｂ）７回のウイルス継代後でのベクターがＨＰＶＡｇを発現する能力の分析。Ａ５４９細胞が、ＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲで増殖されたウイルス単離物により形質導入され、ＨＰＶＡｇの発現がＨＰＶ１６  Ｅ７特異的抗体を用いるウエスタンブロットにより分析された。ＨＰＶＡｇにおいて予測されたサイズは８３ｋＤａである。詳細については、実施例６を参照されたい。
【図１５】ＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７の融合タンパク質の発現。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、図の上部に示される導入遺伝子を発現するＤＮＡベクターが一過性にトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後、細胞が収集され、細胞抽出物がＨＰＶ１８  Ｅ６に対する抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより分析された（上パネル）。ＮＦ−ｋＢを示すローディング対照（下パネル）により、両レーンにおいて細胞溶解物の類似したローディングが確認される。分子量マーカーは左側に示され、矢印は融合タンパク質を示す。予想サイズ：Ｅ６Ｅ７ＳＨ  約３８ｋＤａ；Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ  約７５ｋＤａ。
【図１６】ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨデザイナーコンストラクトによる軟寒天中のコロニー形成は見られなかった。Ａ）播種の６週後、寒天中の細胞の倍率４０倍での代表的な顕微鏡画像。Ｅ７ｗｔトランスフェクト細胞内に大きいコロニーが認められる。Ｂ）ＧｅｌｃｏｕｎｔＴＭおよび関連ソフトウェアを用いた、寒天中、播種の６週後でのコロニーの定量化。＊：ｐ＜０．０５（ポアソン回帰モデル）；＊＊：非劣性（５％の非劣性マージンを伴う一般化線形モデル）。
【図１７】ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨは、ｐ５３およびｐＲｂを分解する能力を失った。Ａ）ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨによるｐ５３分解の欠如を示す代表的なウエスタンブロット。ヒトｐ５３ヌルＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞に、ｐ５３を発現するプラスミドが、ＨＰＶ１８  Ｅ６野生型、Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはエンプティベクターを発現するプラスミドと組み合わされてコトランスフェクトされた。非ＴＦは非トランスフェクト細胞を示す。トランスフェクションから２４時間後、細胞溶解物が調製され、３０μｇの総タンパク質がゲル上にロードされた。上パネル−ｐ５３染色、中間パネル−Ｅ６染色、下パネル−ＮＦ−ｋＢ染色（ローディング対照）。（Ｂ）４つの独立アッセイにおけるｐ５３レベルの定量化。ｐ５３シグナルはＮＦ−κＢシグナルに正規化された。Ｃ）ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨによるｐＲｂ分解の欠如を示すウエスタンブロット。ｐＲｂヌルＳａｏｓ−２細胞に、ｐＲｂを発現するプラスミドが、ＨＰＶ１８  Ｅ７野生型、ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するプラスミド、またはエンプティベクターと組み合わされてトランスフェクトされた。非ＴＦは非トランスフェクト細胞を示す。トランスフェクションから２４時間後、細胞溶解物が調製され、１０μｇの総タンパク質がゲル上にロードされた。上パネル−ｐＲｂ染色、中間パネル−Ｅ７染色、下パネル−ＮＦ−κＢ染色（ローディング対照）。Ｄ）４つの独立アッセイにおけるｐＲｂレベルの定量化。ｐＲｂシグナルはＮＦ−κＢシグナルに正規化された。＊：ｐ＜０．０５（ＡＮＯＶＡモデル）；＊＊：非劣性（試験はＡＮＯＶＡモデル由来の９５％ＣＩに基づいた。非劣性マージンは７５％に設定された）。
【図１８】ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨは一次ヒト生殖器ケラチノサイトを不死化しない。一次ヒト生殖器ケラチノサイトに、ＨＰＶ１８の野生型Ｅ６およびＥ７をコードするオープンリーディングフレーム（Ｅ６Ｅ７ｗｔ）、Ｅ６Ｅ７ＳＨ配列またはｅＧＦＰをコードするレンチウイルスが形質導入された。非形質導入ドナー細胞は対照として用いられた。ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ｗｔの発現のみが、寿命延長（および約２００日目のｈＴＥＲＴ活性化、データは記載せず）によって示される通り、一次ケラチノサイトの不死化を誘導する。十字記号は、細胞が老化で死滅し、さらなる培養ができなかったことを示す。詳細については、実施例８を参照されたい。２つの追加ドナーにおいて同様の結果が得られた（記載せず）。
【図１９−１】図１９：ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ変異体の免疫原性−細胞内サイトカインの染色。ＣＢ６Ｆ１マウスが、パネルの下部に示される導入遺伝子を発現するアデノベクターで免疫された。免疫付与の２週後、マウスはサクリファイスされ、単離された脾細胞がＨＰＶ１８  Ｅ６に対応する１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激された。応答がＩＦＮγ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合として与えられる。
【図１９−２】（上記の通り）
【図２０−１】図２０：ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の組み合わせベクターの免疫原性−ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析。ＣＢ６Ｆ１マウスが、ＨＰＶ１６（配列番号３をコードする）およびＨＰＶ１８（配列番号２２をコードする）の双方に由来するＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ導入遺伝子を発現するアデノベクター（２６型）で免疫された。プライム免疫の４週後、マウスは、同じＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ導入遺伝子を有する３５型のアデノウイルスベクターで異種ブースト免疫を受けた。ブースト免疫の２週後、マウスはサクリファイスされ、単離された脾細胞がＨＰＶ１６  Ｅ７（Ａ）またはＨＰＶ１８  Ｅ６（Ｂ）に対応する１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激された。応答が１０６個の脾細胞当たりのＳＦＵとして与えられる。
【図２０−２】（上記の通り）
【図２１】アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）におけるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の組み合わせワクチンの細胞免疫原性。アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）が、図１１に示されるスキームに従い、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のデザイナーコンストラクトの組み合わせで免疫された。０日目：筋肉内免疫（ｉ．ｍ．）により、動物８匹がＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＡｄ２６．ＨＰＶ１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの混合物を受けた。８週後、同じベクターによりブースト免疫が与えられた。１６週後、動物は同じＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合タンパク質を発現する２つのＡｄ３５ベクターの混合物により２回目のブースト免疫を受けた。アデノベクターの用量は、１×１０１１ｖｐ／ベクター／免疫であった。採血は数回の時点で実施された。ＰＢＭＣにおける細胞免疫応答がＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより測定された。ＰＢＭＣは、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＥ２、Ｅ６またはＥ７に対応するペプチドプールで刺激され、１×１０６個のＰＢＭＣにおけるスポット形成単位（ＳＦＵ）数が決定された。この図は、各免疫の２週後の、試験された６種全てのペプチドプールの累積応答を示している。詳細については、実施例１１を参照されたい。
【図２２】ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１８のＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現する組み合わせアデノベクターの治療効果。０日目、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０４個のＴＣ−１細胞が皮下注射された。６日後、腫瘍が触知可能になったとき、マウスはＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ、またはＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＡｄ２６．ＨＰＶ１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの混合物で免疫された。対照マウスはＡｄ２６．エンプティを受けた。全てのマウスが、２０日目に、対応するＡｄ３５ベクターによってブースト免疫を受けた。腫瘍体積は、（幅２×長さ）／２として算出された。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えると、マウスはサクリファイスされた。グラフはＴＣ−１注射後の生存を示す。ＨＰＶ１６＋ＨＰＶ１８組み合わせワクチンで免疫されたマウス３匹は、実験の終了時に腫瘍がなかった。Ａｄ．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨで治療されたマウスの生存期間の中央値は、Ａｄ．ＨＰＶ１６／１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨで免疫されたマウスと比べて有意な差はなかった。
【図２３】免疫応答を増加させるための変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）の使用。（Ａ）．免疫スキーム。ＣＢ６Ｆ１マウスが、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６ベクター（ＨＰＶ１６）およびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６ベクターの混合物、または導入遺伝子を発現しないＡｄ２６ベクター（エンプティ）で免疫された。８週後、ＭＶＡ−ＢＮ、またはＡｄ２６ベクターと同じ抗原を発現するＡｄ３５ベクターを用いて免疫が繰り返された。対照動物が、導入遺伝子を発現しないＭＶＡ−ＢＮベクター（対照）でブースト免疫された。２回目の免疫付与の２週後、マウスはサクリファイスされ、単離された脾細胞が、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８  Ｅ６のＥ２、Ｅ６またはＥ７に対応する１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激された。（Ｂ）は、１群当たりの全ＩＦＮγ応答を１０６個の脾細胞当たりのＳＦＵとして示す。（アルファ＝０．０５を伴う対数変換データに対するスチューデントｔ検定、陰性対照を除く）。
【図２４】アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）においてＡｄ２６プライムおよびＭＶＡブーストによって誘導される細胞免疫原性。アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）が、図２４Ａに示されるスキームに従い、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のデザイナーコンストラクトの組み合わせで免疫された。０日目：筋肉内免疫（ｉ．ｍ．）により、動物数匹がＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＡｄ２６．ＨＰＶ１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの混合物を受けた。８週後、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨベクターをコードするＭＶＡ−ＢＮによりブースト免疫が与えられた。アデノベクターの用量は、１×１０１１ｖｐ／ベクターであった。ＭＶＡの用量は、１．８×１０８ＴＣＩＤ５０であった。採血は数回の時点で実施された。ＰＢＭＣにおける細胞免疫応答がＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより測定された。ＰＢＭＣは、ＨＰＶ１６  Ｅ２（Ｂ）、ＨＰＶ１６  Ｅ６（Ｃ）、ＨＰＶ１６  Ｅ７（Ｄ）、ＨＰＶ１８  Ｅ２（Ｅ）、ＨＰＶ１８  Ｅ６（Ｆ）、ＨＰＶ１８  Ｅ７（Ｇ）に対応するペプチドプールで刺激され、１×１０６個のＰＢＭＣにおけるスポット形成単位（ＳＦＵ）数がそれぞれ決定され、図２４Ｂ〜２４Ｇに示される。図２４Ｈは、１時点当たりの動物１匹当たりの抗原数を示す。カットオフは、１×１０６個のＰＢＭＣ当たり５０ＳＦＵに設定した。図２４Ｉは、異なる時点での、試験された６種全てのペプチドプールの累積応答を示している。パネルＢ〜Ｈの統計学的解析：１３週と２週、および２４週と１３週を比較するウィルコクソンの符号順位検定。２つの比較に対しボンフェローニ補正を適用した（ｐ値を調整）。
【図２５】Ａｄ２６プライミング、ならびにＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ３５ベクターまたはＭＶＡベクターによるブーストの治療効果。０日目、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０４個のＴＣ−１細胞が皮下注射された。６日後、腫瘍が触知可能になったとき、マウスはＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＡｄ２６．ＨＰＶ１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの混合物で免疫された。対照マウスはＡｄ２６．エンプティを受けた。マウスは、２０日目に、ＨＰＶ１６／１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードするＡｄ３５ベクターまたはＭＶＡによってブースト免疫を受けた。対照動物は、導入遺伝子をコードしないＭＶＡによって免疫された。腫瘍体積は、（幅２×長さ）／２として算出された。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えると、マウスはサクリファイスされた。グラフはＴＣ−１注射後の生存を示す。Ａｄ３５．ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＡｄ３５．ＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨでブースト免疫された１匹のマウス、およびＭＶＡ−ＢＮ  ＨＰＶ１６／１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨでブースト免疫された１匹のマウスは、実験の終わりに腫瘍がなかった。Ａｄ３５．ＨＰＶ１６／１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨでブーストされたマウスの生存期間の中央値は、ＭＶＡ−ＢＮ  ＨＰＶ１６／１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨでブースト免疫されたマウスと比べて有意な差はなかった。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
背景技術において、また本明細書全体を通して、様々な刊行物、論文および特許が引用され、または記載されており、これらの参考文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれている文献、行為、材料、装置、物品などの議論は、本発明に関する文脈を提供することを目的とする。そのような議論は、これらの内容のいずれかまたは全てが、開示されているまたは特許請求されているあらゆる発明に関する先行技術の一部を形成することを承認するものではない。
【００３９】
別途定義されていない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が関係する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。そうでなければ、本明細書で使用する、ある特定の用語は、本明細書で規定されている意味を有する。本明細書に引用されている全ての特許、公開されている特許出願および公報は、本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み込まれる。本明細書で使用する場合、および添付した特許請求の範囲においては、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別途文脈が明白に規定していない限り、複数の言及を含むことに留意しなければならない。
【００４０】
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度または濃度範囲などの任意の数値は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、数値は、通常、列挙された値の±１０％を含む。例えば、濃度１ｍｇ／ｍＬは、０．９ｍｇ／ｍＬ〜１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は、０．９％（ｗ／ｖ）〜１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、全ての可能な部分的範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含み、文脈に明らかに別段の指示がない限り、そのような範囲内の整数および値の分数を含む。
【００４１】
本発明は、ＨＰＶ感染およびそれに伴う疾患に対する免疫応答を生成するために使用され得る１つ以上のベクター、ワクチン、およびワクチン組み合わせを提供する。
【００４２】
本発明の実施形態のベクター、ワクチン、およびワクチン組み合わせは、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質の（実質的に）全てのＴ細胞エピトープが存在するように、再配列され、部分的に重なる断片の形態の、ＨＰＶ１６の実質的に完全なＥ６およびＥ７アミノ酸配列、ならびにいくつかの実施形態ではＥ２アミノ酸配列も含む注意深く設計された分子である１つ以上のポリペプチドをコードする核酸分子を含む。本発明の実施形態のベクター、ワクチン、およびワクチン組み合わせは、ＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７タンパク質の（実質的に）全てのＴ細胞エピトープが存在するように、再配列され、部分的に重なる断片の形態の、ＨＰＶ１８の実質的に完全なＥ６およびＥ７アミノ酸配列、ならびにいくつかの実施形態ではＥ２アミノ酸配列も含む注意深く設計された分子である１つ以上のポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む。ＨＰＶワクチンとしての可能性のある初期分子については、既に他で報告されている（例えば、Ｋｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１：１８３８−４７；Ｄａａｙａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０２：１１２９−３６；Ｓｍａｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８１：２３１−３８；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７：４３１−４０；Ｏｅｈｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：２８８０−９３；Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９：３９７−４０６；欧州特許第１１８３３６８号明細書、国際公開第２０１３／０８３２８７号パンフレット）が、これらの分子はそれぞれ１つ以上の欠点を有している。本発明のベクター、ワクチン、およびワクチン組み合わせは、先に記載したアプローチに関して、少なくとも１つ、典型的にはいくつかの観点において有利である。特に、本発明の利点は以下を含むが、これらに限定されない：（ｉ）（天然のＥ６およびＥ７タンパク質と比較して）検出不可能な程度まで核酸分子の形質転換活性が大きく減少しているので、それらは所望の安全性プロフィールを有する；（ｉｉ）それらは、経済的に実現可能な方法による工業規模での製造が容易に可能であり、複数の分子アプローチとは異なりロジスティックな課題を提起しない単一の核酸分子である；（ｉｉｉ）ワクチンおよびワクチン組み合わせのコードポリペプチドは、天然のＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質の全てのＴ細胞エピトープを実質的に含む；（ｉｖ）コードポリペプチドの設計により望ましくない強力な潜在的ネオエピトープ（すなわち、天然のＥ６およびＥ７タンパク質に存在しないエピトープ）の導入が最小限にされている；（ｖ）特定の実施形態では、それらは、所望の免疫応答を得るために、反応原性の高いアジュバントに依存しない；および（ｖｉ）本明細書に示すように、特定の実施形態において、アデノウイルスワクチンおよびＭＶＡワクチンの組み合わせ投与（例えば、プライム−ブーストスケジュールで）は、ワクチンの単独投与と比較して、免疫応答を増大させる。
【００４３】
したがって、本発明の実施形態のベクター、ワクチン、およびワクチン組み合わせは、単一の設計において様々な有利な特徴を組み合わせることによって大きな進歩を示し、主にＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に対する治療ワクチン接種のための優れた候補である。これらのベクター、ワクチン、およびワクチン組み合わせはまた、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に対する予防ワクチンとして使用され得、これは、それらが、ワクチン接種された対象のＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、またはＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８両方の持続的感染を予防する可能性があることを意味する。
【００４４】
本発明の特定の実施形態を開発する中で、本発明者らは、異なるＥ６およびＥ７断片間の新たに形成された接合部に導入され得る非天然の強力なエピトープの形成可能性を決定するためにＩＥＤＢ−ＡＲを使用した。ＨＰＶ１６デザイナー分子の特定の実施形態では、入念な設計により、再配列されたＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７配列における、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ａ、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｂ、および２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子に対する予測される結合親和性＜５０ｎＭを有する９アミノ酸長のネオエピトープの数は、わずか１つに最少化された。単一のシャッフルされたＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質が３０を超えるかかるネオエピトープを既に有し、またコンストラクトが、エピトープの欠如を阻止するためにこれらのコンストラクトに付加された配列中にさらにいくつかのより多くのネオエピトープを含む可能性が高くなることから、これは他者によって記述されたコンストラクトをしのぐ有意な改善である（Ｏｅｈｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：２８８０−９３）。それ故、本発明の分子において改変される免疫応答の機会が天然Ｅ６およびＥ７と比べて最少化されていることから、本発明のコンストラクトは、他者によって記述された手法と比べて有意に改善された免疫学的プロフィールを有する。
【００４５】
当業者は、通常の手法を用いて、ポリペプチドが発現される予定である任意の特定の宿主生物でのコドン使用を反映するように記述されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を与えないようにヌクレオチド置換を行うことができる。したがって、特に指定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列、およびＲＮＡは、イントロンを含み得る。
【００４６】
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドまたはＨＰＶ融合タンパク質をコードする核酸分子は、本発明の１つ以上のベクターにおける最適な発現および有効性のために構成されている。例えば、特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＰＶ１６ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号２のポリヌクレオチド配列を含み、特定の実施形態では、配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＰＶ１６ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号４または配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含み、また、特定の実施形態では、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＰＶ１６ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号６のポリヌクレオチド配列を含む。さらに、特定の実施形態では、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＰＶ１８ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号２１のポリヌクレオチド配列を含み、特定の実施形態では、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＰＶ１８ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号２３または配列番号２５のポリヌクレオチド配列を含む。
【００４７】
特定の実施形態では、本発明の核酸は、相同配列または変異配列を包含する。これらの配列は、本発明の核酸に対して一定の割合の配列同一性を有するものと定義される。
【００４８】
好ましくは、そのような相同体または変異体は、参照核酸配列に対して少なくとも約５０％、少なくとも約６０％または６５％、少なくとも約７０％または７５％、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％または８９％、より典型的には少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％または９４％、さらにより典型的には少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、最も典型的には少なくとも約９９％の配列同一性を有する。相同体または変異体という用語はまた、短縮、欠失、または他の方法で改変されたヌクレオチド配列を包含する。
【００４９】
核酸間の配列同一性を決定するための手法は、当該技術分野で知られている。２つ以上の配列は、それらの「同一性パーセント」を決定することによって比較され得る。２つの配列の同一性パーセントはアラインした２つの配列間で完全に一致した数を、より短い配列の長さで除し、１００を乗じたものである。
【００５０】
ヌクレオチド配列または核酸に関する「配列同一性パーセント（％）」は、必要に応じて、配列をアラインし、ギャップを導入して、配列同一性の最大パーセントを達成した後の、参照配列（すなわち、それが由来する核酸配列）におけるヌクレオチド残基と同一である候補配列中のヌクレオチド残基のパーセントとして定義され、保存的置換は配列同一性の一部と見なさない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的でのアラインメントは当業者の範囲内の種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に利用可能なコンピューターソフトウェアを用いて達成することができる。当業者は、アラインメントを測定するための適切なパラメータ、例えば、比較される配列の全長にわたる最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを決定することができる。
【００５１】
例えば、核酸配列に適切なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、（１９８１），Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９の局地的相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｄ．，５ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡによって開発され、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ（１９８６），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４（６）：６７４５−６７６３によって標準化されたスコアマトリックスを使用することによって、アミノ酸配列に適用することができる。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実施は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）により、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティーアプリケーションにおいて提供される。この方法のデフォルトパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（１９９５）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．から入手可能）に記載されている。本発明との関連で、同一性パーセントを確立する好ましい方法は、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈに著作権があり、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）によって販売されているＭＰＳＲＣＨプログラムパッケージを使用することである。このパッケージスイートから、スミス−ウォーターマンアルゴリズムを使用することができ、デフォルトパラメータがスコア表に使用される（例えば、ギャップオープンペナルティ１２、ギャップエクステンションペナルティ１、およびギャップ６）。生成されたデータから、「マッチ」値が「配列同一性」を反映する。配列間の同一性または類似性のパーセントを算出するための他の好適なプログラムは当該技術分分野で一般に知られており、例えば、他のアラインメントプログラムには、デフォルトパラメータと共に使用されるＢＬＡＳＴがある。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用することができる：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；イクスペクト＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ディスクリプション＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見ることができる：ｈｔｔｐ：／／ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／。
【００５２】
核酸配列は、通常の分子生物学的手法を使用してクローン化することができ、またはＤＮＡ合成により新規に作製することができ、これは、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野の事業を有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）により、通常の手順を使用して実施することができる。
【００５３】
例えば通常の分子生物学的手順を用いて、例えばアミノ酸の置換、欠失、付加などにより、例えばタンパク質を改変することができることは当業者には理解されるであろう。一般に、ポリペプチドの機能または免疫原性を喪失させることなく、保存的アミノ酸置換を適用することができる。これは、当業者によく知られた通常の方法に従って検討することができる。
【００５４】
特定の実施形態では、本発明の少なくとも１つの態様によるコードポリペプチドは、シグナル配列またはシグナルペプチドとも称されるリーダー配列をさらに含む。これは、分泌経路に向かう新規に合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短い（通常、５〜３０アミノ酸長）ペプチドである。かかる配列の存在は、発現および免疫原性の増強をもたらし得る。使用することができる非限定的な例は、ＩｇＥリーダーペプチド（例えば、米国特許第６，７３３，９９４号を参照；例えば、配列ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ（配列番号７）を有する）、またはＨＡＶＴ２０リーダーペプチド（例えば、配列ＭＡＣＰＧＦＬＷＡＬＶＩＳＴＣＬＥＦＳＭＡ（配列番号９）を有する）である。これらの１つは、任意選択により、本発明のポリペプチドのＮ末端に付加することができる。他の実施形態では、本発明のポリペプチドはリーダー配列を含まない。
【００５５】
種々の型のＨＰＶが存在し（１２０を超える型が同定されており、番号により参照される）、一般にワクチンにより包含される必要がある各型に対しては型特異的抗原がワクチン中に組み込まれる必要があり得るが、いくつかの抗原に対してはいくらかの交差反応性が存在し得る。１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３、および８２型は、発癌性のある「高リスク」の性感染性ＨＰＶであり、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、陰茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、および／または肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）の発症を引き起こし得る。本発明によるＨＰＶ（すなわち、コードポリペプチド中のＥ６およびＥ７断片の由来元であるＨＰＶ）は、ＨＰＶ１６（配列番号１〜６について）、またはＨＰＶ１８（配列番号２０〜２３について）である。それはＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８それぞれに感染している対象に対して用いることができる。それはまた、特定の実施形態では、他のＨＰＶ型に対するワクチンと好適に組み合わせることができる。特定の実施形態では、この組み合わせは、上記に示したような高リスク型のＨＰＶに対するワクチン、例えばＨＰＶ１６に対するワクチン、ＨＰＶ１８に対するワクチンを伴う。他の実施形態では、本発明のワクチンは、ＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３、−３５、−３９、−４５、−５１、−５２、−５６、−５８、−５９、−６８、−７３、または−８２の１つ以上に対するワクチンと組み合わされる。かかる組み合わせは、例えば、ＨＰＶ感染の正確な型がまだ確定されない場合、または予防効果を伴う免疫応答が２つ以上のＨＰＶ型に対して所望される場合、用いることができる。本発明のワクチンと、性器疣贅を引き起こすＨＰＶ型、例えばＨＰＶ６および／またはＨＰＶ１１に対するワクチンとの組み合わせもまた想定される。これらのＨＰＶ型およびそれらによりコードされるタンパク質（例えば、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ２）の配列は、公的データベース、例えば、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）によって提供されるＧｅｎＢａｎｋ配列データベースにて当業者が利用可能である。
【００５６】
ＨＰＶ１６のための本発明の一態様によるポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含み、一実施態様では、本発明による核酸分子は、配列番号２のポリヌクレオチド配列を含む。ＨＰＶ１８のための本発明によるポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、一実施態様では、本発明による核酸分子は、配列番号２１のポリヌクレオチド配列を含む。
【００５７】
本明細書中の配列は、当該技術分野における慣例として、５’から３’方向へ、またはＮ末端からＣ末端へ提示される。
【００５８】
本発明よるコードポリペプチドは、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質のエピトープ、または代わりにＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７タンパク質のエピトープを含む。特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドは、かかるさらなる抗原の少なくとも１つのさらなる抗原またはエピトープをさらに含む（それ故、ポリペプチドをコードする核酸はそれらをさらにコードする）。かかるさらなる抗原は、好ましくは、ＨＰＶ抗原、好ましくはポリペプチド中のＥ６およびＥ７タンパク質と同じＨＰＶ型、すなわちＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８それぞれに属するものである。したがって、かかるさらなる抗原は、ＨＰＶタンパク質またはその免疫原性断片であり得、また特定の実施形態では、ＨＰＶの、好ましくはＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８由来のＥ２の少なくとも１つのエピトープを含むＥ２タンパク質またはその断片を含む。かかるさらなる抗原またはエピトープは、本発明によるＥ６およびＥ７ポリペプチドとは独立して発現され得る。かかるさらなる抗原またはエピトープはまた、融合タンパク質の一部として発現され得、例えば、配列番号１または配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドにおけるＥ６および／またはＥ７の２つのフラグメントの間に配置されるが、好ましくは、配列番号１または配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチド中のＥ６／Ｅ７のＮ末端またはＣ末端に融合される。その代わりに、またはそれに加えて、免疫応答を刺激するアミノ酸配列が存在し得る。したがって、特定の実施形態において、本発明は、配列番号１または配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、本発明による核酸分子であって、そのポリペプチドは少なくとも１つの他の抗原、例えば、ＨＰＶ  Ｅ２タンパク質またはその少なくとも１つのエピトープ、好ましくはより多くのエピトープをさらに含む核酸分子を提供する。本発明におけるＥ２抗原の付加の１つの利点は、Ｅ２が、感染の初期／Ｅ６およびＥ７の発現がまだ極めて低い軽度の病変において発現することが知られていることである。
【００５９】
子宮頸癌の発生過程で、Ｅ２の発現は低下し、その結果、Ｅ６およびＥ７レベルは上昇する（Ｙｕｇａｗａ  ａｎｄ  Ｋｉｙｏｎｏ，２００９，Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ  １９：９７−１１３）。１つのワクチン中にＥ２、Ｅ６およびＥ７由来のエピトープを組み合わせることにより、持続性感染から浸潤性子宮頸癌（または、他のＨＰＶ１６誘発性癌）に至る範囲を有する広範な標的患者群の治療が可能になる。特定の実施形態では、Ｅ２タンパク質は野生型Ｅ２タンパク質である。特定の他の実施形態では、Ｅ２タンパク質は、（野生型Ｅ２タンパク質と比べて）そのＤＮＡ結合ドメイン内に欠失または１つ以上の変異を有する。ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８  Ｅ２タンパク質の配列は、ＮＣＢＩタンパク質データベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ）中に、ＮＰ＿０４１３２８．１およびＡＡＰ２０５９７．１の番号でそれぞれ見出すことができる。このタンパク質のＣ末端部分におけるＧ２９３Ｖ、Ｋ２９９Ｍ、またはＣ３００ＲなどのＨＰＶ１６  Ｅ２中のいくつかの単一のアミノ酸変化は、ＤＮＡ結合性を抑制することが知られている。ＨＰＶ１８  Ｅ２では、対応するアミノ酸変化は、Ｇ２９４Ｖ、Ｋ３００Ｍ、Ｃ３０１Ｒである。
【００６０】
ＤＮＡ結合能が欠如したＥ２の変異体または断片を用いる利点は、それが、予測不能な転写変化を、それが発現する細胞内での宿主細胞ＤＮＡへの直接的結合を介して阻止し得る点である。上に記載したＤＮＡ結合ドメインにおける変異に加え、またはその代替としてのＥ２活性を阻害するためのさらなるアプローチは、よりＮ末端側に位置するＥ２トランス活性化ドメインの活性を抑制し、かつ／またはＥ２ポリペプチドの構造に影響を及ぼすと報告されている変異を導入することである。ＨＰＶ１６  Ｅ２に関し、過去に記載された位置（例えば、Ｂｒｏｋａｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）におけるアミノ酸変化の非限定的な例は、Ｒ３７Ａ、Ｉ７３Ａ、Ｗ９２Ａ、Ｅ３９Ａ、Ｗ３３Ａ、Ｐ１０６ＡおよびＧ１５６Ａであり、本発明によるＨＰＶ１６  Ｅ２は、トランス活性化ドメイン中に任意選択的に１つ以上の変異を含み得る。１つの好ましい実施形態においては、ＨＰＶ１６  Ｅ２断片は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。より特定の実施形態では、配列番号２８をコードする核酸配列は、配列番号２９または配列番号３０のポリヌクレオチド配列を含む。ＨＰＶ１８  Ｅ２に関し、対応するアミノ酸変化は、Ｒ４１Ａ、Ｉ７７Ａ、Ｗ９６Ａ、Ｅ４３Ａ、Ｗ３７Ａ、Ｐ１１０ＡおよびＧ１６１Ａであり、本発明によるＨＰＶ１８  Ｅ２は、トランス活性化ドメイン中に任意選択的に１つ以上の変異を含み得る。１つの好ましい実施形態においては、ＨＰＶ１８  Ｅ２断片は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。より特定の実施形態では、配列番号３１をコードする核酸配列は、配列番号３２または配列番号３３のポリヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
特定の実施形態では、Ｅ２は、トランス活性化ドメインに変異を有し、他の実施形態では、Ｅ２はＤＮＡ結合ドメインに変異を有し、さらなる実施形態では、Ｅ２はトランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインの両方に変異を有する。さらに別の代替の実施形態では、本発明によるＥ２ポリペプチドは、並べ替えられた（シャッフルされた）断片に分割され、免疫原性のＥ２エピトープを維持しながらＥ２活性を抑制する。このような実施形態は、例えばＤＮＡ結合ドメイン中および／またはトランス活性化ドメイン中で、任意選択的に１つ以上の上述した変異と組み合わせることができる。野生型ＨＰＶ  Ｅ２ポリペプチドの他にも、全てのそのようなＥ２変異体は、本発明によるＥ２タンパク質またはその一部もしくは変異体として使用することができる。
【００６２】
Ｅ２タンパク質またはその一部もしくは変異体（例えば、限定はされないが、本明細書中に記載されるもの）は内部において付加され得るが、好ましくは配列番号１または配列番号２０のアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合される。ＨＰＶ１６に関し、１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。その１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号４または配列番号２４のポリヌクレオチド配列を含む。ＨＰＶ１６に関し、他の１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。その１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号６のポリヌクレオチド配列を含む。ＨＰＶ１８に関し、１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。その１つの実施形態では、本発明の核酸分子は、配列番号２３または配列番号２５のポリヌクレオチド配列を含む。
【００６３】
本発明のデザイナーポリペプチドとさらなるタンパク質、例えば、いわゆる担体タンパク質、例えば、カルレティキュリン、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｔｕｂｅｒｃｅｌｏｓｉｓ）熱ショックタンパク質７０、ＩＰ１０、またはテタヌス毒素フラグメントＣとのさらなる融合を行うことも可能であり（さらなる例として、Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，２０１２（上記）を参照）、その場合、ＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７（および任意選択的にはＥ２）エピトープに対する免疫応答をさらに増強することができる。したがって、本発明はまた、かかるさらなる融合タンパク質、およびそれらをコードする核酸を提供する。
【００６４】
特定の実施形態では、本発明による核酸分子の１つまたは複数がベクターに組み込まれる。「ベクター」は、本明細書で用いられる場合、典型的には、外来遺伝子材料を、それが複製および／または発現可能な別の細胞へ人工的に運ぶための媒体であり、本発明によると、本発明による核酸分子を組み込む任意の核酸分子であり得る。これらは、クローニングなどの通常の分子生物学的手法に従って調製され得る。通常、かかるベクターは、細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞などの好適な宿主の少なくとも１つのタイプにおいて増殖され得る。ベクターの４つの主要なタイプは、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体である。ベクター自体は一般に、挿入物（導入遺伝子；本発明では本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸）およびベクターの「骨格」として機能する配列からなるＤＮＡ配列である。遺伝情報を別の細胞に移すベクターの目的は、典型的には、挿入物を標的細胞内で単離する、増殖させる、または発現させることである。
【００６５】
好ましくは、ポリペプチドをコードする配列は、ベクター中のプロモーターに作動可能に連結される。用語「作動可能に連結される」は、目的のヌクレオチド配列がヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で（例えば、ベクターが宿主細胞に導入される場合の宿主細胞内で）プロモーターに連結されることを意味するように意図されている。発現調節配列は、導入遺伝子に作動可能に連結され得る。特定の実施形態では、ベクターは、標的細胞内での導入遺伝子の発現を意図して設計され、一般に導入遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列を有する。特定の実施形態では、転写ターミネーター配列、ポリアデニル化テール配列、コザック配列、ＵＴＲ、複製起点、複数のクローニング部位、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、およびさらなる配列などの通常用いられるベクター要素の１つ以上が存在してもよく、当業者は、ベクターを、例えば、ベクターの伝播および増殖用の特定の細胞内での複製のため、またベクターが導入される標的細胞内でのベクターの導入遺伝子の発現のため、所望される特性を有するように設計することができる。好ましくは哺乳動物細胞内での発現を意図して設計された、本発明による融合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターは、本発明によるワクチンとして好適である。特定の実施形態では、本発明によるベクターは、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体、細菌人工染色体、ウイルスベクターなどである。当業者は、宿主細胞内での遺伝子の発現を得るのに様々なプロモーターが使用可能であることを認識している。真核生物細胞内での発現用の、いくつかのよく知られ、また多用されているプロモーターは、ウイルス、例えばアデノウイルス由来のプロモーター、例えばＥ１Ａプロモーター、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）由来のプロモーター、例えばＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーター（本明細書中でＣＭＶプロモーターと称する）（例えばｐｃＤＮＡ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）、シミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０）（ＳＶ４０）由来のプロモーター（例えば、ｐＩＲＥＳ、カタログ番号６３１６０５、ＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）などを含む。好適なプロモーターはまた、真核生物細胞由来の、例えば、メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ユビキチンＣもしくはＵＢ６プロモーター、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどであり得る（例えば国際公開第２００６／０４８４５９号パンフレットを参照）。真核細胞内での発現を得るのに好適なプロモーターの非限定的な例として、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号明細書）、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、例えばＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロモーターからのｎｔ．−７３５〜＋９５を含むもの、例えば配列番号１３で示される配列を有する、本明細書に提供されるようなＣＭＶプロモーター、が挙げられる。ポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンのポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）を導入遺伝子の後に存在させることができる。他の非限定的な例では、プロモータ��は、ＰｒＭＶＡ１３．５ロングプロモーター（国際公開第２０１４／０６３８３２号パンフレット）またはＰｒＨｙｂプロモーター（米国特許第８，３９４，３８５号明細書、同第８，６１３，９３６号明細書）であり得る。これらはそれぞれ配列番号２６および配列番号２７のポリヌクレオチド配列を含み、ＭＶＡベクターにおける導入遺伝子の発現を駆動するのに特に有用である。
【００６６】
さらに、調節配列もまた付加されてもよい。「調節配列」という用語は、本明細書においては「調節要素」と同義的に使用され、それが作動可能に連結している核酸配列の転写を調節し、したがって転写調節因子として働く核酸断片（典型的には、ＤＮＡであるが、これに限定はされない）を指す。調節配列は、転写結合ドメインであり、転写タンパク質および／または転写因子の核酸結合ドメイン、エンハンサーまたはリプレッサーなどによって認識される核酸配列を含むことが多い。例えば、リプレッサー配列をプロモーターに対して作動可能に結合させることが可能であり、そこでリプレッサー配列は、リプレッサータンパク質（このリプレッサータンパク質を発現する産生細胞株中での導入遺伝子の発現を低下または阻止し得る）によって結合され得る。これは、核酸分子の、継代時および／またはこれが産生細胞株中で大量に生成される時の遺伝的安定性および／または発現レベルを改善し得る。かかる系は、当該技術分野で報告されている。例えば、調節配列は、１つ以上のテトラサイクリンオペロンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）を含み得ることから、発現はテトラサイクリンオペロンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）の存在下で阻害される。テトラサイクリンの非存在下では、ｔｅｔＲタンパク質は、ｔｅｔＯ部位に結合して、ｔｅｔＯ部位に作動可能に連結した遺伝子の転写を抑制することができる。しかし、テトラサイクリンの存在下では、ｔｅｔＲタンパク質の立体構造の変化によって、オペレーター配列への結合が妨げられ、作動可能に連結した遺伝子の転写を生じさせる。特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、例えば組換えアデノウイルスベクター中に存在する場合、任意選択的にプロモーターに作動可能に連結したｔｅｔＯを含み得ることから、１つ以上の導入遺伝子の発現が、ｔｅｔＲタンパク質が発現するプロデューサー細胞株中で産生される組換えアデノウイルスにおいて阻害される。その後、組換えアデノウイルスが対象またはｔｅｔＲタンパク質を発現しない細胞に導入されると、発現は阻害されなくなる（例えば、国際特許出願の国際公開第０７／０７３５１３号パンフレット）。特定の他の実施形態では、本発明の核酸分子は、例えば組換えアデノウイルス中に存在する場合、任意選択的にｃｕｍａｔｅ遺伝子スイッチ系を含み得、そこでは、発現の調節は、リプレッサー（ＣｙｍＲ）の、プロモーターの下流に位置するオペレーター部位（ＣｕＯ）への結合によって媒介される（例えば、Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００６  ６：４３）。本明細書で用いられる場合、用語「リプレッサー」は、組換え発現ベクターの異種タンパク質産物の生成に対して阻害し、干渉し、遅延させ、かつ／または抑制する能力を有する実体（例えば、タンパク質または他の分子）を指す。例えば、例えば発現カセット内の発現ベクターに沿う適切な位置での結合部位への干渉により。リプレッサーの例としては、ｔｅｔＲ、ＣｙｍＲ、ｌａｃリプレッサー、ｔｒｐリプレッサー、ｇａｌリプレッサー、ラムダリプレッサー、および当該技術分野で知られた他の適切なリプレッサーが挙げられる。ｔｅｔＯ／ｔｅｔＲオペレーター／リプレッサー系およびＣｕＯ／ＣｙｍＲオペレーター／リプレッサー系の使用例が本明細書に示されている。ベクター伝播中のベクター・導入遺伝子発現の抑制により、導入遺伝子の不安定性を阻止し得、また本発明の導入遺伝子を有するベクターの生成中の収量を増加させ得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のベクターはリプレッサータンパク質の結合によって、例えば、リプレッサータンパク質（例えば、ＴｅｔＲタンパク質、例えば配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するもの、またはＣｙｍＲタンパク質、例えば配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するもの）が結合し得る、リプレッサーオペレーター配列（例えば、非限定的な実施形態では、ＴｅｔＯ含有配列、例えば、配列番号１１のポリヌクレオチド配列に記載の配列、またはＣｕＯ含有配列、例えば、配列番号１２のポリヌクレオチド配列に記載の配列）に作動可能に結合するプロモーターを有することによって、抑制され得るプロモーターを有する。
【００６７】
好ましい実施形態では、ベクターは、組換えウイルスベクターであり、それは複製コンピテントであっても複製欠損であってもよい。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、組換えＤＮＡゲノムを含む。特定の実施形態では、本発明によるベクターは、例えば、組換えアデノウイルス、オルトポックスウイルスなどの組換えポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）、変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ））である。
【００６８】
１つ以上の好ましい実施形態では、本発明によるベクターは、組換えポックスウイルス、例えば、限定はされないが、オルトポックスウイルスである。組換えオルトポックスウイルスは、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）（ＶＶ）、ワイス株（Ｗｙｅｔｈ  ｓｔｒａｉｎ）、ＡＣＡＭ  １０００、ＡＣＡＭ  ２０００、ＭＶＡ、またはＭＶＡ−ＢＮであり得る。
【００６９】
より好ましい実施形態では、組換えポックスウイルスはＭＶＡである。特定の好ましい実施形態では、ＭＶＡはＭＶＡ−ＢＮである。ＭＶＡ−ＢＮは複製不能であり、これは、他のタイプのＭＶＡに優る有意な利点である。ＭＶＡ−ＢＮは２０００年８月３０日に、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）に番号Ｖ０００８３００８で寄託され、国際公開第２００２／０４２４８０号パンフレットに記載されている（また、例えば欧州特許第１３３５９８７号、米国特許第６，７６１，８９３号明細書、同第６，９１３，７５２号明細書、同第７，３３５，３６４号明細書、同第７，４５９，２７０号明細書、同第７，９３９，０８６号明細書、および同第８，２６８，３２５号を参照）。これらの特許公報に記載されているように、ＭＶＡ−ＢＮは、細胞株２９３、１４３Ｂ、ＨｅＬａおよびＨａＣａｔにおいて生殖的に複製しない。
【００７０】
特定の実施形態では、組換えＭＶＡはＭＶＡ−ＢＮの誘導体である。かかる「誘導体」としては、寄託株（ＥＣＡＣＣ番号Ｖ０００８３００８）と実質的に同じ複製特性を示すが、そのゲノムの１つ以上の部分において差異を示すウイルスが挙げられる。本明細書で使用する場合、ＭＶＡ−ＢＮ誘導体は、以下のような特徴を有する：ｉ）ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）およびベビーハムスター腎臓細胞株ＢＨＫにおいては生殖的複製が可能であるが、ヒト細胞株のＨａＣａｔ、ＨｅＬａ、および１４３Ｂにおいては生殖的複製はできない；ならびにｉｉ）成熟Ｂ細胞およびＴ細胞を産生することができず、それ自体、免疫力が著しく低く、複製ウイルスに対して高い感受性を有するマウス株において複製することができない。これらの特性、およびそのための試験は当該技術分野で十分に定義されている（例えば、国際公開第２００２／０４２４８０号パンフレット、米国特許第６，７６１，８９３号明細書および同第６，９１３，７５２号明細書）。
【００７１】
特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸分子は、ＭＶＡゲノムまたはＭＶＡ−ＢＮゲノムの様々な挿入部位または遺伝子間領域に組み込まれる。核酸分子は、本明細書中に記載されるように、個別の転写単位として、または融合遺伝子として、組換えＭＶＡ、またはＭＶＡ−ＢＮに挿入され得る。特定の実施形態では、核酸分子は、ＭＶＡ、またはＭＶＡ−ＢＮの１つ以上の遺伝子間領域（ＩＧＲ）に挿入される。ＩＧＲは、ＩＧＲ０７／０８、ＩＧＲ４４／４５、ＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、ＩＧＲ１３６／１３７、およびＩＧＲ１４８／１４９から、好ましくはＩＧＲ６４／６５、ＩＧＲ８８／８９、および／またはＩＧＲ１４８／１４９から選択され得る。これらのＩＧＲは、国際公開第０３／０９７８４５号パンフレットにおいてさらに特徴付けられている（例えば、欧州特許第１４０７０３３号明細書、ならびに米国特許第７，５５０，１４７号明細書、同第７，９６４，３７４号明細書、同第８，０３４，３５４号明細書および同第８，７４１，３０８号明細書も参照）。核酸分子は、さらに、またはその代わりに、ＭＶＡ、またはＭＶＡ−ＢＮの天然に存在する欠失部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖ、またはＶＩの１つ以上に挿入され得る。特定の実施形態では、５、４、３、または２未満の組み込み部位が本開示の核酸分子を含む。
【００７２】
核酸分子を含むＭＶＡ、またはＭＶＡ−ＢＮの挿入部位の数は、１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上であり得る。組換えＭＶＡ、またはＭＶＡ−ＢＮは、４、３、２、または１の挿入部位に挿入された核酸分子を含む。
【００７３】
特定の好ましい実施形態では、本開示の核酸分子は、単一の挿入部位に挿入される。好ましい一実施形態では、単一の挿入部位に挿入される核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２０、配列番号２２、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子である。他の好ましい実施形態では、単一の挿入部位に挿入される核酸分子は、配列番号３および配列番号２２のアミノ酸配列をコードする。さらに他の好ましい実施形態では、単一の挿入部位に挿入される核酸分子は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４および配列番号２５からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、好ましくは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸分子である。さらにより好ましい実施形態では、単一の挿入部位に２つ以上の核酸分子が挿入され、それらの核酸分子はそれぞれ配列番号２４および配列番号２５のポリヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、好ましくはそれぞれ配列番号２４および配列番号２５のポリヌクレオチド配列を含む。他の好ましい実施形態では、単一の挿入部位はＩＧＲ８８／８９である。
【００７４】
本明細書中に提示される組換えＭＶＡウイルスは、本開示を考慮して当該技術分野で知られた通常の方法によって生成し得る。組換えポックスウイルスを得る方法、または異種ヌクレオチド配列をポックスウイルスゲノムに挿入する方法は、当業者によく知られている。例えば、ＤＮＡのクローニング、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、ウエスタンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ増幅法などの標準的な分子生物学的手法のための方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．）［Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）（１９８９）］に記載され、また、ウイルスの取り扱いおよび操作のための技術は、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ［Ｂ．Ｗ．Ｊ．Ｍａｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）］に記載されている。同様に、ＭＶＡの取り扱い、操作および遺伝子操作のための技術およびノウハウは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ［Ａ．Ｊ．Ｄａｖｉｓｏｎ  ＆  Ｒ．Ｍ．Ｅｌｌｉｏｔｔ（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ（１９９３）（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  ９：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｂｙ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓを参照）］およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．（１９９８）（例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ  １６，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＩＶ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒを参照）］に記載されている。
【００７５】
本明細書中に開示される種々の組換えＭＶＡの生成のために、種々の方法が適用可能であり得る。ウイルスに挿入するヌクレオチド配列は、ＭＶＡのＤＮＡ断片に相同なＤＮＡが挿入された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）プラスミドコンストラクトに配置することができる。これとは別に、挿入するＤＮＡ配列をプロモーターに結合させることができる。プロモーター−遺伝子連鎖は、プロモーター−遺伝子連鎖が非必須遺伝子座を含むＭＶＡ  ＤＮＡの領域に隣接するＤＮＡ配列に相同なＤＮＡによって両末端に隣接されるように、プラスミドコンストラクト中に位置させることができる。得られたプラスミドコンストラクトは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌内での増殖によって増幅させ、単離することができる。挿入するＤＮＡ遺伝子配列を含む単離されたプラスミドは、細胞培養物、例えば、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の培養物にトランスフェクトすることができ、それと同時に、この培養物はＭＶＡに感染される。プラスミドとウイルスゲノムそれぞれの相同ＭＶＡ  ＤＮＡ間の組換えにより、外来ＤＮＡ配列の存在によって改変されたＭＶＡを生成することができる。
【００７６】
好ましい実施形態によれば、例えばＣＥＦ細胞などの好適な細胞培養物の細胞をポックスウイルスに感染させることができる。感染細胞は、その後、好ましくはポックスウイルス発現制御エレメントの転写制御下に、外来遺伝子を含む第１のプラスミドベクターでトランスフェクトされ得る。上記で説明したように、プラスミドベクターはまた、ポックスウイルスゲノムの選択された部分への外因性配列の挿入を指示することができる配列を含む。プラスミドベクターはまた、任意選択的に、ポックスウイルスプロモーターに作動可能に連結されたマーカー遺伝子および／または選択遺伝子を含むカセットを含む。好適なマーカー遺伝子または選択遺伝子は、例えば、緑色または赤色蛍光タンパク質、ベータ−ガラクトシダーゼ、ネオマイシン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ｅｃｏｇｐｔ、または他のマーカーをコードする遺伝子である。選択カセットまたはマーカーカセットの使用は、生成された組換えポックスウイルスの同定および単離を簡単にする。しかし、組換えポックスウイルスは、ＰＣＲ技術によっても同定することができる。続いて、さらなる細胞が、上記のように得られた組換えポックスウイルスで感染され、第２の外来遺伝子または外来遺伝子群を含む第２のベクターでトランスフェクトされ得る。この場合、この遺伝子は、ポックスウイルスゲノムの異なる挿入部位に導入され得、第２のベクターはまた、ポックスウイルスのゲノムへの第２の外来遺伝子または外来遺伝子群の組み込みを指示するポックスウイルス相同配列において異なる。相同組換えが起こった後、２つ以上の外来遺伝子を含む組換えウイルスを単離することができる。さらなる外来遺伝子を組換えウイルスに導入するために、感染およびトランスフェクションの工程を、感染の前工程で単離された組換えウイルスを使用することによって、またトランスフェクション用のさらなる外来遺伝子または遺伝子群を含むさらなるベクターを使用することによって、繰り返すことができる。
【００７７】
あるいは、上記のような感染およびトランスフェクションの工程は交換可能である。すなわち、好適な細胞を最初に外来遺伝子を含むプラスミドベクターによってトランスフェクトし、その後、ポックスウイルスに感染させることができる。さらなる代替として、各外来遺伝子を異なるウイルスに導入し、細胞を全ての得られた組換えウイルスに同時感染させ、全ての外来遺伝子を含む組換えについてスクリーニングすることも可能である。第３の選択肢は、インビトロでのＤＮＡゲノムおよび外来配列のライゲーション、ならびにヘルパーウイルスを用いた組換えワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）ＤＮＡゲノムの再構築である。第４の選択肢は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてクローニングされたワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）ゲノムと、ワクシニアウイルスゲノムにおける所望の組み込み部位に隣接する配列に相同なＤＮＡ配列に隣接した線状外来配列との間の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または他の細菌種における相同組換えである。
【００７８】
他の好ましい実施形態では、本発明によるベクターは、組換えアデノウイルスである。ワクチンとして使用するアデノウイルスの利点として、報告されている膨大な数のアデノウイルスベクターを用いた研究、開発、製造および臨床試験における長年の経験に基づく、操作の容易性、良好な大規模での製造可能性、および優れた安全性の記録が挙げられる。ワクチンとして用いられるアデノウイルスベクターは一般に、導入遺伝子にコードされたタンパク質に対する良好な免疫応答、例えば細胞免疫応答をもたらす。本発明によるアデノウイルスベクターは、アデノウイルスの任意の型をベースとすることができ、特定の実施形態ではヒトアデノウイルスであり、それは任意の血清型であってよい。他の実施形態では、それはサルアデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルスまたはゴリラアデノウイルスであり、それらは任意の血清型であってよい。特定の実施形態では、本発明によるベクターは、ヒトアデノウイルス血清型２６または３５に属する。組換えアデノウイルスベクターの調製は、当該技術分野で周知である。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１領域、例えばＥ１ａ領域および／またはＥ１ｂ領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能が欠損している。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。特定の実施形態では、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能と、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部とが欠損している。
【００７９】
アデノウイルスベクター、その構築方法およびその増殖方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、同第５，８３７，５１１号明細書、同第５，８４６，７８２号明細書、同第５，８５１，８０６号明細書、同第５，９９４，１０６号明細書、同第５，９９４，１２８号明細書、同第５，９６５，５４１号明細書、同第５，９８１，２２５号明細書、同第６，０４０，１７４号明細書、同第６，０２０，１９１号明細書、および同第６，１１３，９１３号明細書、ならびにＴｈｏｍａｓ  Ｓｈｅｎｋ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｍ．Ｓ．Ｈｏｒｗｉｔｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ”、それぞれＣｈａｐｔｅｒ  ６７およびＣｈａｐｔｅｒ  ６８，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｄ  ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）、および本明細書中に記載される他の参考文献に記載されている。通常、アデノウイルスベクターの構築は、標準的な分子生物学的手法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．  （１９８９）、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ，２ｄ  ｅｄ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ（１９９２）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ（１９９５）、ならびに本明細書中に記載の他の参考文献に記載される手法の使用を含む。
【００８０】
組換えアデノウイルスに特に好ましい血清型は、ヒト血清型３５またはヒト血清型２６であり、最も好ましくはヒト血清型２６（ｒＡｄ２６）である。ｒＡｄ２６ベクターの調製については、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットおよびＡｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８１：４６５４−６３に記載されている。Ａｄ２６のゲノム配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ  １５３４７４、および国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットの配列番号１中に見出される。ｒＡｄ３５ベクターの調製については、例えば、米国特許第７，２７０，８１１号明細書、国際公開第００／７００７１号パンフレット、およびＶｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：  ８２６３−７１に記載されている。Ａｄ３５のゲノム配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ＿００００１９、および国際公開第００／７００７１号パンフレットの図６中に見出される。
【００８１】
特定の実施形態では、アデノウイルスは複製欠損であり、例えばこれは、このアデノウイルスがゲノムのＥ１領域に欠失を含むためである。当業者に知られているように、アデノウイルスゲノムの必須領域が欠失している場合、これらの領域でコードされる機能は、好ましくはプロデューサー細胞によってトランスに提供される必要がある。すなわち、Ｅ１、Ｅ２および／またはＥ４領域の一部または全部がアデノウイルスから欠失した場合、これらはプロデューサー細胞内に、例えばそのゲノムに組み込まれ、またはいわゆるヘルパーアデノウイルスもしくはヘルパープラスミドの形態で存在する必要がある。アデノウイルスはまた、Ｅ３領域に欠失を有し得るが、これは複製に不要であり、それ故、そのような欠失は補完する必要はない。
【００８２】
使用可能なプロデューサー細胞（当該技術分野および本明細書中では、時に「パッケージング細胞」または「補完細胞」とも称される）は、所望のアデノウイルスが増殖し得る任意のプロデューサー細胞であり得る。例えば、組換えアデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルス内の欠損を補完するプロデューサー細胞内で行われる。そのようなプロデューサー細胞は、好ましくはそれらのゲノム内に少なくとも１つのアデノウイルスＥ１配列を有し、それによりＥ１領域内に欠失を有する組換えアデノウイルスを補完することができる。任意のＥ１を補完するプロデューサー細胞、例えばＥ１により不死化されたヒト網膜細胞、例えば９１１もしくはＰＥＲ．Ｃ６細胞（米国特許第５，９９４，１２８号明細書を参照）、Ｅ１形質転換羊膜細胞（欧州特許第１２３０３５４号明細書を参照）、Ｅ１形質転換Ａ５４９細胞（例えば、国際公開第９８／３９４１１号パンフレット、米国特許第５，８９１，６９０号明細書を参照）、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１：２１３−１９）、２９３などを用いることができる。特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えばＨＥＫ２９３細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞、または９１１細胞、またはＩＴ２９３ＳＦ細胞などである。プロデューサー細胞内でのアデノウイルスベクターの作製は（Ｋｏｖｅｓｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｖｉｒｕｓｅｓ  ２：１６８１−７０３）に概説されている。
【００８３】
特定の実施形態では、Ｅ１欠損アデノウイルスは、Ａｄ５などのサブグループＣのアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列を含む。これは、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現する、よく知られた補完細胞株、例えば２９３細胞またはＰＥＲ．Ｃ６細胞におけるそのようなアデノウイルスの増殖を可能にする（例えば、Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：２１３５−４３；国際公開第０３／１０４４６７号パンフレット（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）。
【００８４】
本発明のベクター中の「異種核酸」（本明細書中、「導入遺伝子」とも称される）は、ベクター中に天然には存在しない核酸であり、本発明によれば、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸は、ベクター中に存在する場合、異種核酸と考えられる。それは、例えば標準の分子生物学的手法によりベクター中に導入される。それは例えば、アデノウイルスベクターの欠失したＥ１またはＥ３領域内、またはＥ４領域とｒＩＴＲとの間の領域内にクローン化され得る。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列と作動可能に連結される。好ましい実施形態では、導入遺伝子は、アデノウイルスベクターのＥ１領域内にクローン化される。
【００８５】
ＭＶＡベクターなどのベクター、または組換えアデノウイルスベクターは、本開示を考慮し、当業者によく知られた様々な方法に従って作製し得る。一般に、作製は、相当量のベクター材料を生成するための培養細胞内での増殖、続く、細胞培養液からのベクターの収集、また、通常は、その後の、他の物質を除去し、医薬組成物に配合し得る精製ベクターを得るためのベクターのさらなる精製を必要とする（例えば、Ｈｏｇａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊ  １：４３−８；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９３：２４５８−７５）。例えば、アデノウイルスをプロデューサー細胞の培養液から収集するための方法は、例えば国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットに幅広く記載されている。例えば、国際公開第２０１０／０６０７１９号パンフレット、および国際公開第２０１１／０９８５９２号パンフレット（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）には、大量の組換えアデノウイルスを得て精製するのに好適な方法が記載されている。
【００８６】
さらなる態様において、本発明は、本発明による核酸分子、ベクター、または組換えウイルスを含むワクチン、およびワクチン組み合わせをさらに提供し、これらの各態様の実施形態は、本明細書に記載のものを含むことができる。特定の実施形態では、本発明によるワクチンは、本明細書に記載の核酸分子を含む。好ましい実施形態では、ワクチンは、本発明によるベクター、好ましくはＭＶＡベクター、好ましくはＭＶＡ−ＢＮベクターもしくはその誘導体などの組換えポックスウイルスベクター、および／またはｒＡｄ２６ベクターなどの組換えアデノウイルスベクターを含む。
【００８７】
特定の実施形態では、ＨＰＶ１６デザイナーポリペプチドをコードする本発明によるワクチンは、さらなる活性成分、例えば、ＨＰＶ１６と異なる少なくとも１つのＨＰＶ型、例えば、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、もしくはＨＰＶ８２などの高リスクＨＰＶ型のＥ６および／またはＥ７タンパク質の少なくとも１つのエピトープをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、ＨＰＶ１８デザイナーポリペプチドをコードする本発明によるワクチンは、さらなる活性成分、例えば、ＨＰＶ１８と異なる少なくとも１つのＨＰＶ型、例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３、もしくはＨＰＶ８２などの高リスクＨＰＶ型のＥ６および／またはＥ７タンパク質の少なくとも１つのエピトープをコードする核酸を含む。
【００８８】
本発明のＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８デザイナーポリペプチドの両方をコードする核酸、例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、例えば、配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチド、および配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、ワクチン、またはワクチン組み合わせが特に好ましい。このようなベクター、ワクチン、ワクチン組成物、またはワクチン組み合わせにおいては、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８成分は、別々の分子として同じ組成物中にあってもよく、また、同じ分子にあっても、例えば、同じベクター上にコードされていてもよい。そのような組み合わせの１つの利点は、そのようなワクチンは、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８（共に大部分のＨＰＶ誘導性癌の原因となる最も一般的な高リスクＨＰＶ型の２つ）に感染した対象において治療的に作用し得ることであり、そのため、そのようなワクチンは、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８デザイナー分子を有する単一型のワクチンより高い適用性を有する。
【００８９】
他の実施形態では、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８成分は、ワクチン接種における併用のため、例えば、投与前の再構成、または別々であるが実質的には同時投与のための、個別のＨＰＶ１６成分および個別のＨＰＶ１８成分を含むキットまたは組成物として提供され得る。このような組み合わせの１つの利点は、このようなワクチンはＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８に感染した対象において治療的に作用し得ることである。用語「ワクチン」は、特定の病原体または疾患に対する対象の予防および／または治療度合いの免疫（この場合、ＨＰＶに対して治療的）を誘導するのに有効な活性成分を含有する薬剤または組成物を指す。ワクチンは、通常、本発明による核酸分子、またはベクター、または組換えウイルス、および薬学的に許容される賦形剤を含む。対象へ投与されると、本発明による核酸分子によってコードされるポリペプチドが、対象において発現し、それがコードされたポリペプチド中に存在する抗原断片に対する免疫応答をもたらすことになる。本発明のワクチンの利点は、ＨＰＶ１６（（例えば、配列番号１〜６および２４）またはＨＰＶ１８（例えば、配列番号２０〜２３および２５）のＥ６およびＥ７の実質的に全てのＴ細胞エピトープおよび、任意選択的にＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のＥ２のエピトープが存在し、したがって野生型のＥ６もしくはＥ７、または任意選択的にＥ２に存在するエピトープに対するＴ細胞応答をワクチン接種者にマウントすることができることである。さらに、本ワクチンは、本発明による核酸分子について、上で概説されるようなあらゆる安全性および有効性の利点を有する。
【００９０】
ヒトへの投与については、本発明では、ベクター、および薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む医薬組成物を用いてもよい。この場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体または賦形剤が、使用する投与量および濃度で、それらを投与する対象に望ましくない影響も悪影響も何ら引き起こさないことを意味する。かかる薬学的に許容される賦形剤は、当該技術分野でよく知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照）。賦形剤は一般に、薬物の活性成分と共に配合される薬理学的に不活性な物質である。賦形剤は一般に、強力な活性成分を含有する製剤を増量するために用いられ（それ故、しばしば「増量剤」、「充填剤」または「希釈剤」と称される）、それにより製剤化の際の製剤原料の便宜的かつ正確な調剤を可能にする。賦形剤はまた、様々な治療増強の目的、例えば薬剤の吸収または溶解性の促進、または他の薬物動態学的考慮に寄与し得る。賦形剤はまた、製造過程において、想定される有効期間にわたる変性の阻止などのインビトロ安定性に寄与することに加えて、粉末流動性または非粘着性を促進するなど、関係する活性物質の取り扱いを容易にする上で有用であり得る。適切な賦形剤の選択はまた、投与経路および剤形、ならびに活性成分および他の要素に依存する。
【００９１】
精製された核酸分子、ベクターまたはポリペプチドは、凍結乾燥製剤を利用することも可能であるが、滅菌溶液として製剤化し、投与することが好ましい。滅菌溶液は、滅菌濾過または当該技術分野でそれ自体知られている他の方法によって調製される。その後、溶液は凍結乾燥されるか、または医薬投与容器に充填される。一般に、溶液のｐＨは、ｐＨ３．０〜９．５、例えば、ｐＨ５．０〜７．５である。核酸分子またはベクターまたはポリペプチドは、通常、好適な緩衝液を含む溶液中に存在し、ベクターの溶液はまた、塩を含有してもよい。任意選択により、アルブミンなどの安定剤が含まれる。特定の実施形態では、洗浄剤が添加される。特定の実施形態では、ワクチンは、注射用製剤に配合され得る。これらの製剤は、核酸分子、ベクターまたはポリペプチドを有効量含有し、滅菌溶液、懸濁液または凍結乾燥バージョンであり、任意選択的に安定剤または賦形剤を含有する。
【００９２】
例えば、組換えアデノウイルスベクターは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｈｏｇａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｊ  １：４３−８）にも使用される緩衝液：２０ｍＭのトリス  ｐＨ８、２５ｍＭのＮａＣｌ、２．５％のグリセロール、に保存し得る。ヒトへの投与に好適な別の有用な調合緩衝液は、２０ｍＭのトリス、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０％ｗ／ｖのスクロース、０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０である。組換えアデノウイルスに好適な別の調合緩衝液は、１０〜２５ｍＭのクエン酸緩衝液ｐＨ５．９〜６．２、４〜６％（ｗ／ｗ）のヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）、７０〜１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１８〜０．０３５％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０、および任意選択による０．３〜０．４５％（ｗ／ｗ）のエタノールを含む。ＭＶＡベクターに好適な調合緩衝液の例は、１０ｍＭのトリス、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．７（または７．４）であり得る。明らかに、多くの他の緩衝液を用いることができ、貯蔵や精製ベクターの医薬投与に適した製剤が数例知られている。
【００９３】
特定の実施形態では、ベクターを含む組成物は、１つ以上のアジュバントをさらに含む。適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに高めるアジュバントは、当該技術分野において知られている。「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１種以上の物質と定義される。これに関連して、アジュバントは、本発明のベクター中の核酸分子によってコードされるポリペプチドに対する免疫応答を増強するために用いられる。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムカリウムなどのアルミニウム塩；油エマルション組成物（または水中油型組成物）、例えばスクアレン−水エマルション、例えばＭＦ５９（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照）；サポニン製剤、例えばＱＳ２１および免疫賦活性複合体（ＩＳＣＯＭＳ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照）；細菌または微生物誘導体（その例は、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ−モチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰリボシル化細菌性毒素またはその変異体、例えば大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）熱不安定性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなどである）が挙げられる。また、例えば、Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のオリゴマー化ドメインと目的抗原との融合物をコードする異種核酸を使用すること（例えば、Ｓｏｌａｂｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７６：３８１７−２３）、または、目的導入遺伝子と異種ｄｓＲＮＡなどのＴＬＲ−３アゴニストの両方をコードするベクターを使用すること（例えば、国際公開第２００７／１００９０８号明細書）などにより、ベクターにコードされたアジュバントを使用することも可能である
【００９４】
他の実施形態では、本発明の組成物は、アジュバントを含まない。
【００９５】
医薬組成物は、対象、例えばヒト対象に投与することができる。１回の投与の間に対象に提供されるワクチン活性成分の総用量は当業者に知られているように変化させることができ、アデノウイルスについては一般に１×１０７ウイルス粒子（ｖｐ）〜１×１０１２ｖｐ、好ましくは１×１０８ｖｐ〜１×１０１１ｖｐ、例えば３×１０８〜５×１０１０ｖｐ、例えば１０９〜３×１０１０ｖｐ；ＭＶＡウイルスについてはワクチンの総用量は一般に１×１０５ＴＣＩＤ５０（組織培養感染量）〜１×１０１０ＴＣＩＤ５０、好ましくは１×１０７ＴＣＩＤ５０〜１×１０１０、より好ましくは１×１０８ＴＣＩＤ５０〜１×１０９ＴＣＩＤ５０である。医薬組成物の投与は、標準的な投与経路を用いて実施され得る。非限定的な実施形態としては、例えば注射による非経口投与、例えば、皮内、筋肉内など、または皮下もしくは経皮、または粘膜投与、例えば、鼻腔内、経口、腟内、直腸などが挙げられる。一実施形態では、組成物は、例えば、腕の三角筋内、または腿の外側広筋内への筋肉内注射によって投与される。特定の実施形態では、ワクチンはＤＮＡワクチンであり、例えばこれは、例えばＤＮＡタトゥーイング（例えば、Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５１：２２１−５０を参照）により皮内投与され得る。この経路はまた、アデノウイルスベクターおよびポックスウイルスベクターにも適している。特定の実施形態では、本発明による組成物は、アデノウイルスベクターもしくはポックスウイルスベクター、またはアデノウイルスベクターとポックスウイルスベクターの両方を含み、筋肉内注射によって投与される。当業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するため、ワクチンなどの組成物を投与する様々な可能性を理解している。
【００９６】
本明細書で用いられる対象は、好ましくは哺乳動物、例えば齧歯類、例えばマウス、または非ヒト霊長類、またはヒトである。対象は、好ましくは、ヒト対象である。
【００９７】
本発明のワクチンは、偶発的かつ持続的なＨＰＶ感染それ自体（例えば、ＨＰＶ  ＤＮＡ試験によって検出される）、したがって（前）癌性病変が形成される前、および子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ；子宮頸部異形成および子宮頸部間質腫瘍としても知られ、子宮頸部表面の扁平上皮細胞の潜在的な前癌形質転換および異常成長（異形成）である）から、子宮頸癌（子宮頚部扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ）など）に至るまで、ＨＰＶ（特に、配列番号１〜６、２４および２８のいずれかを含むかもしくはコードするワクチンでは１６型、または配列番号２０〜２３、２５および３１のいずれかを含むかもしくはコードするワクチンでは１８型、または本明細書に記載のＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両デザイナー分子を含むかワクチンでは両方の型）によって引き起こされる疾患の種々のステージの１つに罹患している患者を治療するために使用することができる。さらに、他のＨＰＶ誘発腫瘍、例えば外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、陰茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、ならびに中咽頭癌（頭頚部癌としても知られる）、陰茎癌、膣癌、外陰部癌および肛門癌のより進行したステージを、標的とし得る。したがって、本発明のワクチンは、広範なＨＰＶ誘発性病変を標的にし得、またＨＰＶ誘発性疾患の前癌ステージ、例えば（持続性）感染、ならびに／または腫瘍ステージ（Ｅ２、Ｅ６および／もしくはＥ７の発現が最高である場合）では最も有効である可能性が高い。本発明のワクチンを用いる治療を、進行した癌細胞における免疫回避機構に対して相互作用するかまたは克服し得る化合物、例えば、抗ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１抗体、イピリムマブなどの抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＤ２５抗体、ＩＤＯ阻害剤、ＣＤ４０アゴニスト抗体、ＣＤ１３７アゴニスト抗体などと組み合わせることも可能である（例えば、Ｈａｍｉｄ  ａｎｄ  Ｃａｒｖａｊａｌ，２０１３，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３：８４７−８６１；Ｍｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  ４８０：４８０−８９）。
【００９８】
本明細書で用いられる場合、「治療する」は、患者におけるＨＰＶ１６または１８のＥ６および／またはＥ７および／または任意選択的にＥ２（のエピトープ）を発現する細胞に対する治療的免疫応答を誘導するためのワクチンの投与を意味し、それによりＨＰＶ１６または１８感染のレベルが少なくとも低下、好ましくは完全に除去され、その結果、腫瘍などのＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８誘発性疾患および／またはその症状の進行が少なくとも緩徐化し、好ましくは停止する。ワクチンによる治療はまた、より進行したステージのＨＰＶ誘発性癌の寛解をもたらすことが好ましい。ワクチンを、分類されている確立されたＨＰＶ感染を有する患者に投与することが好ましいことから、対応するＨＰＶ型のポリペプチドをコードするワクチンが投与され得る。スクリーニングの不在下で、ワクチンはまた、ＨＰＶ感染の可能性が高い集団、すなわち性交好きな人々の一部において投与され得る。本発明のワクチンは、ＨＰＶ１６または１８に感染していない対象に、例えば予防用途で、おそらくは患者が感染している、または感染していない、別のＨＰＶ型に対するワクチンと組み合わせて投与することも可能である。本発明のワクチンはまた、他の手段、例えば手術（ＨＰＶ１６または１８感染によって引き起こされる病変の除去）よるさらなる治療、またはイミキモドによる治療（ＴＬＲ−７／８作動薬を含む、例えば、Ｄａｙａａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０２：１１２９−３６を参照）を受けている対象に投与され得る。治療の効果は、細胞診またはＨＰＶ試験により測定され得る。
【００９９】
特定の実施形態では、本明細書に記載のワクチン接種および方法は、本発明のワクチンを対象または患者に少なくとも１回投与することを含む。１種以上のさらなるワクチンの１回以上のブースター投与を提供することも可能である。ブースティングワクチン接種が実施される場合、一般に、かかるブースティングワクチン接種は、同じ抗原を有する免疫原性組成物を初めて対象に投与（この場合「プライミングワクチン接種」と称される）後、１週〜１年の間、好ましくは２週〜４か月の間のある時に同じ対象に投与される。代替のブースティングレジメンでは、異なるベクター、例えば異なる血清型の１つ以上のアデノウイルス、またはＭＶＡなどの他のベクター、またはＤＮＡ、またはタンパク質をプライミングまたはブースティングワクチン接種として対象に投与することも可能である。特定の実施形態では、本発明の同じ形態のワクチンは、例えば本発明による同じ組換えアデノウイルス（Ａｄ２６など）を用いたプライムブーストレジメンで同じ患者に少なくとも２回投与される。
【０１００】
特定の好ましい実施形態において、本発明のワクチンはプライム−ブーストレジメンで少なくとも２回投与されるが、ワクチンのベクターは異なり、例えば、異なる２種類のウイルスベクター（例えば、組換えＡｄ２６によるプライミングおよび組換えポックスウイルスによるブースティング、またはその逆）が使用される。非限定的な実施形態の例として、ａ）組換えＡｄ２６ベクターによるプライミングと、組換えＭＶＡベクターによるブースティング、ｂ）組換えＡｄ２６ベクターおよび組換えＡｄ３５ベクターによるプライミングと、組換えＭＶＡベクターによるブースティング、ｃ）組換えポックスウイルスベクター（例えば、ＭＶＡ）によるプライミングと、組換えＡｄ２６ベクターによるブースティング、ｄ）組換えポックスウイルスベクター（例えば、ＭＶＡ）によるプライミングと、組換えＡｄ２６ベクターおよび組換えＡｄ３５ベクターによるブースティングが挙げられる。ここで、それぞれの場合において、プライミングベクターおよびブースティングベクターはそれぞれ、本発明のデザイナーポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含む。特定の好ましい実施形態では、プライミングベクターおよびブースティングベクターはそれぞれ、本発明の同じデザイナーポリペプチドをコードする。プライミング投与および／またはブースティング投与のそれぞれは、任意選択により、同じ対象に２回以上投与し得る。
【０１０１】
特定の実施形態では、本発明によるワクチンまたは組換えウイルスがプライム−ブースト−ブーストレジメンで少なくとも３回、例えば、初回はプライミング投与で、２回目および３回目はその続の２回のブースティング投与で投与される。さらなる実施形態では、さらなるブースター投与がレジメンに加えられ得る。アデノウイルスベクターおよびＭＶＡベクター（これらは同じ組成物に含まれても、異なる組成物に含まれてもよい）を、同時に、または実質的に同時に（例えば、１０分以内の間隔で）投与して、免疫応答を誘導することもできる（例えば、国際公開第２０１０／０７３０４３号パンフレットを参照）。
【０１０２】
対象にＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８に対するＣＴＬ応答を誘導することも本発明の態様であり、本発明によるベクター、ワクチン、またはワクチン組み合わせを対象に投与する工程を含む。当業者は、ＨＰＶ１６配列を含むワクチン（例えば、配列番号１〜６、２４および２８のいずれかをコードするかまたは含む）は、ＨＰＶ１６感染に対して最も有効であって、ＨＰＶ１６感染に対する使用が意図されており、一方、ＨＰＶ１８配列を含むワクチン（例えば、配列番号２０〜２３、２５および３１のいずれかをコードするかまたは含む）は、ＨＰＶ１８感染に対して最も有効であって、ＨＰＶ１８感染に対する使用が意図されていることを理解するであろう。
１．本発明はまた、以下の非限定的な実施形態を提供する。
１）ワクチン組み合わせであって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む、免疫学的有効量の１つ以上の組換えアデノウイルスベクターを、薬学的に許容される担体と共に含む第１のワクチン；ならびに
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸を含む、免疫学的有効量の組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを、薬学的に許容される担体と共に含む第２のワクチン
を含み、
２．ＭＶＡベクターは、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体を含むワクチン組み合わせ。
２）第１のワクチンおよび第２のワクチンはそれぞれ、配列番号２８のアミノ酸配列を含む第５のポリペプチドをコードする核酸、および配列番号３１のアミノ酸配列を含む第６のポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、実施形態１のワクチン組み合わせ。
３）第１および第３のポリペプチドはそれぞれ配列番号２８をさらに含み、第２および第４のポリペプチドはそれぞれ配列番号３１をさらに含む、実施形態１〜２のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
４）第１の核酸および第３の核酸はそれぞれ、配列番号３または配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、第２の核酸および第４の核酸はそれぞれ、配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、実施形態１のワクチン組み合わせ。
５）配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２０を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２１のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態１〜４のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
６）配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号２０を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２１に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態１〜５のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
７）配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２を含み、配列番号２０を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２１を含む、実施形態１〜６のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
８）配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号４または配列番号２４のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２２は、配列番号２３または配列番号２５のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態４のワクチン組み合わせ。
９）配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号４または配列番号２４に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号２２を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２３または配列番号２５に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態４および８のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
１０）配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号４または配列番号２４を含み、配列番号２２を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２３または配列番号２５を含む、実施形態４および８〜９のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
１１）配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号４に対し少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２２を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２３に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態４および８〜１０のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
１２）配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号４に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号２２を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２３に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態４および８〜１１のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
１３）配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号４を含み、配列番号２２を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２３を含む、実施形態４および８〜１２のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
１４）配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２４に対し少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２２を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２５に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態４および８〜１０のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
１５）配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２４に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号２２を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２５に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態４、８〜１０および１４のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
１６）配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２４を含み、配列番号２２を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２５を含む、実施形態４、８〜１０および１４〜１５のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
１７）配列番号２８を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２９または配列番号３０のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号３１をコードする核酸は、配列番号３２または配列番号３３のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態２〜３のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
１８）配列番号２８を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２９または配列番号３０に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号３１をコードする核酸は、配列番号３２または配列番号３３に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態２〜３および１７のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
１９）配列番号２８を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２９または配列番号３０を含み、配列番号３１をコードする核酸は、配列番号３２または配列番号３３を含む、実施形態２〜３および１７〜１８のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
２０）配列番号２８を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２９に対し少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号３１をコードする核酸は、配列番号３２に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態２〜３および１７〜１９のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
２１）配列番号２８を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２９に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号３１をコードする核酸は、配列番号３２に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態２〜３および１７〜２０のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
２２）配列番号２８を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２９を含み、配列番号３１をコードする核酸は、配列番号３２を含む、実施形態２〜３および１７〜２１のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
２３）配列番号２８を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号３０に対し少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号３１をコードする核酸は、配列番号３３に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態２〜３および１７〜１９のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
２４）配列番号２８を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号３０に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号３１をコードする核酸は、配列番号３３に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態２〜３、１７〜１９および２３のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
２５）配列番号２８を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２９を含み、配列番号３１をコードする核酸は、配列番号３２を含む、実施形態２〜３、１７〜１９および２３〜２４のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
２６）ＭＶＡ−ＢＮの誘導体は、ｉ）ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）およびベビーハムスター腎臓細胞株ＢＨＫにおいては生殖的複製が可能であるが、ヒト細胞株のＨａＣａｔ、ＨｅＬａ、および１４３Ｂにおいては生殖的複製はできない；ならびにｉｉ）成熟Ｂ細胞およびＴ細胞を産生することができず、それ自体、免疫力が著しく低く、複製ウイルスに対して高い感受性を有するマウス株において複製することができないという特徴を有する実施形態１〜２５のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
２７）前記組換えアデノウイルスベクターが、ｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５からなる群から選択される、実施形態１〜２６のいずれか１つに記載のワクチン組み合わせ。
２８）組換えアデノウイルスベクターはｒＡｄ２６である、実施形態１〜２７のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
２９）組換えアデノウイルスベクターはｒＡｄ３５である、実施形態１〜２７のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
３０）第１のワクチンは、配列番号１を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含む第１の組換えアデノウイルスベクターを含み、配列番号２０を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む第２の組換えアデノウイルスベクターを含む、実施形態１〜２９のいずれか１つに記載のワクチン組み合わせ。
３１）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸、ならびに（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも１つをコードする他の核酸を含み、
ＭＶＡベクターは、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体である、組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター。
３２）ＭＶＡベクターは、配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸、および配列番号２０を含むポリペプチドをコードする核酸を含む、実施形態３１の組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター。
３３）ＭＶＡベクターは、配列番号２８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸、および配列番号３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１つをさらに含む、実施形態３１〜３２のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
３４）配列番号１を含むポリペプチドは、配列番号２８をさらに含み、配列番号２０を含むポリペプチドは、配列番号３１をさらに含む、実施形態３１〜３３のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
３５）ＭＶＡベクターは、配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸、および配列番号２２を含むポリペプチドをコードする核酸を含む、実施形態３１の組換えＭＶＡベクター。
３６）配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸の一部であり、配列番号２０を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２２をコードするポリペプチドをコードする核酸の一部である、請求項３１の組換えＭＶＡベクター。
３７）配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２０を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２１のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態３１〜３６のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
３８）配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号２０を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２１に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態３１〜３７のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
３９）配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２を含み、配列番号２０を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２１を含む、実施形態３１〜３８のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
４０）配列番号３をコードする核酸は、配列番号４または配列番号２４のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２２をコードする核酸は、配列番号２３または配列番号２５のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態３１および３５のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
４１）配列番号３をコードする核酸は、配列番号４または配列番号２４に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号２２をコードする核酸は、配列番号２３または配列番号２５に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態３１、３５および４０のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
４２）配列番号３をコードする核酸は、配列番号４または配列番号２４を含み、配列番号２２をコードする核酸は、配列番号２３または配列番号２５を含む、実施形態３１、３５および４０〜４１のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
４３）配列番号３をコードする核酸は、配列番号４に対し少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２２をコードする核酸は、配列番号２３に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態３１、３５および４０〜４２のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
４４）配列番号３をコードする核酸は、配列番号４に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号２２をコードする核酸は、配列番号２３に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態３１、３５および４０〜４３のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
４５）配列番号３をコードする核酸は、配列番号４を含み、配列番号２２をコードする核酸は、配列番号２３を含む、実施形態３１、３５および４０〜４４のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
４６）配列番号３をコードする核酸は、配列番号２４に対し少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号２２をコードする核酸は、配列番号２５に対し少なくとも９０％の配列同一性を有する、実施形態３１、３５および４０〜４２のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
４７）配列番号３をコードする核酸は、配列番号２４に対し少なくとも９５％の配列同一性を有し、配列番号２２をコードする核酸は、配列番号２５に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する、実施形態３１、３５、４０〜４２および４６のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
４８）配列番号３をコードする核酸は、配列番号２４を含み、配列番号２２をコードする核酸は、配列番号２５を含む、実施形態３１、３５、４０〜４２および４６〜４７のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
４９）配列番号１、配列番号３、配列番号２０および配列番号２２からなる群から選択される配列を含むポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸を含む組換えＭＶＡベクターであって、少なくとも１つの核酸は、配列番号２６のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸、および配列番号２７のポリヌクレオチド配列に対し少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸の少なくとも１つを含むプロモーターに作動可能に連結している、組換えＭＶＡベクター。
５０）プロモーターは、配列番号２６および配列番号２７の少なくとも１つを含む、実施形態４９の組換えＭＶＡベクター。
５１）プロモーターは、配列番号２６である、実施形態４９〜５０のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
５２）プロモーターは、配列番号２７である、実施形態４９〜５０のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
５３）配列番号１または配列番号３は、配列番号２６に作動可能に連結している、実施形態４９〜５１のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
５４）配列番号３は、配列番号２６に作動可能に連結している、実施形態５３の組換えＭＶＡベクター。
５５）配列番号２０または配列番号２２は、配列番号２７に作動可能に連結している、実施形態４９〜５０および５２のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
５６）配列番号２２は、配列番号２７に作動可能に連結している、実施形態５５の組換えＭＶＡベクター。
５７）配列番号１は、実施形態５〜７および３６〜３９のいずれか１つによる核酸によってコードされる、実施形態４９および５３の組換えＭＶＡベクター。５８）配列番号３は、実施形態４、８〜１６、３５、３６および４０〜４８のいずれか１つによる核酸によってコードされる、実施形態４９および５３〜５４のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
５９）配列番号２０は、実施形態３〜７、３２、３４および３６〜３９のいずれか１つによる核酸によってコードされる、実施形態４９および５５のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
６０）配列番号２２は、実施形態４、８〜１６、３５、３６および４０〜４８のいずれか１つによる核酸によってコードされる、実施形態４９および５５〜５６のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
６１）実施形態３１〜６０のいずれか１つの組換えＭＶＡベクターおよび薬学的に許容される担体を含む、ワクチン。
６２）対象における、持続性ＨＰＶ感染、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸癌（子宮頸部扁平上皮癌（ＳＣＣ）など）、中咽頭癌、陰茎癌、膣癌または肛門癌を治療するための方法であって、実施形態１〜６１のいずれか１つのベクター、ワクチン、またはワクチン組み合わせを対象に投与する工程を含む、方法。
６３）対象においてヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）免疫学的有効量の
１．（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む組換えアデノウイルスベクター、または
２．（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含む第１の組換えアデノウイルスベクター、および配列番号のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む第２の組換えアデノウイルスベクターを
薬学的に許容される担体と共に含む第１のワクチンを対象に投与する工程と；
かつ
（ｂ）免疫学的有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸を含む組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを、薬学的に許容される担体と共に含む第２のワクチンを対象に投与する工程と
を含み、
第１のワクチンはプライミングワクチンとして対象に投与され、第２のワクチンはブースティングワクチンとして対象に投与される方法。
６４）対象においてヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）に対する免疫応答を誘導する方法であって、
（ａ）免疫学的有効量の
３．（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む組換えアデノウイルスベクター、または
（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含む第１の組換えアデノウイルスベクター、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む第２の組換えアデノウイルスベクターを
薬学的に許容される担体と共に含む第１のワクチンを対象に投与する工程と；
かつ
（ｂ）免疫学的有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸を含む組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを、薬学的に許容される担体と共に含む第２のワクチンを対象に投与する工程と
を含み、
第１のワクチンまたは第２のワクチンがプライミングワクチンとして対象に投与され、他のワクチンがブースティングワクチンとして対象に投与される方法。
６５）第１のワクチンおよび第２のワクチンはそれぞれ、配列番号２８のアミノ酸配列を含む第５のポリペプチドをコードする核酸、および配列番号３１のアミノ酸配列を含む第６のポリペプチドをコードする核酸をさらに含む、実施形態６３〜６４のいずれか１つの方法。
６６）第１および第３のポリペプチドはそれぞれ配列番号２８をさらに含み、第２および第３のポリペプチドはそれぞれ配列番号３１をさらに含む、実施形態６３〜６５のいずれか１つの方法。
６７）第１のワクチンは、配列番号１または配列番号３を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含む第１の組換えアデノウイルスベクター、および配列番号２０または配列番号２２を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む第２の組換えアデノウイルスベクターを含む、実施形態６３〜６６のいずれか１つの方法。
６８）配列番号１は、実施形態５〜７および３６〜３９のいずれか１つによる核酸によってコードされる、実施形態６３〜６７のいずれか１つの方法。
６９）配列番号３は、実施形態４、８〜１６、３５、３６および４０〜４８のいずれか１つによる核酸によってコードされる、実施形態６３〜６７のいずれか１つの方法。
７０）配列番号２０は、実施形態３〜７、３２、３４および３６〜３９のいずれか１つによる核酸によってコードされる、実施形態６３〜６７のいずれか１つの方法。
７１）配列番号２２は、実施形態４、８〜１６、３５、３６および４０〜４８のいずれか１つによる核酸によってコードされる、実施形態６３〜６７のいずれか１つの方法。
７２）配列番号２８は、実施形態１７〜２４のいずれか１つによる核酸によってコードされる、実施形態６５〜６６のいずれか１つの方法。
７３）配列番号３１は、実施形態１７〜２４のいずれか１つによる核酸によってコードされる、実施形態６５〜６６のいずれか１つの方法。
７４）配列番号２４、配列番号２５、配列番号３０および配列番号３３からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
７５）配列番号２４を含む、核酸分子。
７６）配列番号２５を含む、核酸分子。
７７）配列番号３０を含む、核酸分子。
７８）配列番号３３を含む、核酸分子。
７９）実施形態７４〜７８のいずれか１つの核酸分子に対し少なくとも９０％または９５％の配列同一性を有する、核酸分子。
８０）実施形態７４〜７９のいずれか１つの核酸分子を含む、単離された核酸分子。
８１）実施形態７４〜７９のいずれか１つの核酸分子を含む、ベクター。
８２）ベクターはポックスウイルスおよびアデノウイルスから選択される、実施形態８１のベクター。
８３）ベクターはポックスウイルスである、実施形態８１〜８２のいずれか１つのベクター。
８４）ポックスウイルスは、オルトポックスウイルスまたはアビポックスウイルスである、実施形態８３のベクター。
８５）ポックスウイルスは、オルトポックスウイルスある、実施形態８４のベクター。
８６）オルトポックスウイルスは、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）である、実施形態８５のベクター。
８７）ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）は、ＭＶＡウイルスである、実施形態８６のベクター。
８８）ＭＶＡウイルスは、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体である、実施形態８７のベクター。
８９）ベクターはアデノウイルスである、実施形態８１〜８２のいずれか１つのベクター。
９０）アデノウイルスは、ｒＡｄ２６およびｒＡｄ３５から選択される、実施形態８９のベクター。
９１）ワクチン組み合わせであって、
ａ）免疫学的有効量の
（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および配列番号２２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸、または
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含む第１の組換えアデノウイルスベクター、および配列番号２２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む第２の組換えアデノウイルスベクター
を、薬学的に許容される担体と共に含む第１のワクチン；
ならびに
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸、および配列番号２２のアミノ酸配列を含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸を含む、免疫学的有効量の組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを、薬学的に許容される担体と共に含む第２のワクチン
を含み、第１のワクチンまたは第２のワクチンはプライミングワクチンとして対象に投与され、他のワクチンはブースティングワクチンとして対象に投与され、かつ
ＭＶＡベクターは、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体を含む、ワクチン組み合わせ。
９２）配列番号３を含むポリペプチドは、実施形態４、８〜１６、３５、３６および４０〜４８のいずれか１つによる核酸によってコードされる、実施形態９１のワクチン組み合わせ。
９３）配列番号２２を含むポリペプチドは、実施形態４、８〜１６、３５、３６および４０〜４８のいずれか１つによる核酸によってコードされる、実施形態９１のワクチン組み合わせ。
９４）それを必要としている対象の持続性ＨＰＶ感染、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸癌（子宮頸部扁平上皮癌（ＳＣＣ）など）、中咽頭癌、陰茎癌、膣癌または肛門癌の治療における、実施形態１〜６１および７４〜９３のいずれか１つの核酸、ポリペプチド、ベクター、ワクチン、またはワクチン組み合わせのいずれか１つの使用。
９５）それを必要としている対象のヒトパピローマウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＨＰＶ）に対する免疫応答を誘導するための医薬組成物または医薬の調製における、実施形態１〜６１および７４〜９３のいずれか１つの核酸、ポリペプチド、ベクター、ワクチン、またはワクチン組み合わせのいずれか１つの使用。
９６）実施形態１〜６１および７４〜９３のいずれか１つの核酸、ポリペプチド、ベクター、ワクチン、またはワクチン組み合わせのいずれか１つを含むキット。
９７）第１の組換えアデノウイルスベクターはｒＡｄ２６であり、第２の組換えアデノウイルスベクターはｒＡｄ２６である実施形態３０のワクチン組み合わせ。
９８）第１の組換えアデノウイルスベクターは、配列番号３を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含み、第２の組換えアデノウイルスベクターは、配列番号２２を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む実施形態９７のワクチン組み合わせ。
９９）第１のワクチンは、配列番号３を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および配列番号２２を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む、免疫学的有効量の組換えアデノウイルスベクターを、薬学的に許容される担体と共に含む、実施形態９１のワクチン組み合わせ。
１００）組換えアデノウイルスベクターはｒＡｄ２６である、実施形態９９のワクチン組み合わせ。
１０１）第１のワクチンは、免疫学的有効量の、配列番号３を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含む第１の組換えアデノウイルスベクター、および配列番号２２を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む第２の組換えアデノウイルスベクターを含む、実施形態９１のワクチン組み合わせ。
１０２）第１の組換えアデノウイルスベクターはｒＡｄ２６であり、第２の組換えアデノウイルスベクターはｒＡｄ２６である実施形態１０１のワクチン組み合わせ。
１０３）第１のワクチンはプライミングワクチンであり、第２のワクチンがブースティングワクチンである実施形態９１および９９〜１０２のいずれか１つのワクチン組み合わせ。
１０４）それを必要としている対象の持続性ＨＰＶ感染、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、腟上皮内腫瘍（ＶａＩＮ）、肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）、子宮頸癌（子宮頸部扁平上皮癌（ＳＣＣ）など）、中咽頭癌、陰茎癌、膣癌または肛門癌を治療する方法であって、
（ａ）免疫学的有効量の
４．（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む組換えアデノウイルスベクター、または
５．（ｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含む第１の組換えアデノウイルスベクター、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む第２の組換えアデノウイルスベクターを、
薬学的に許容される担体と共に含む第１のワクチンを対象に投与する工程と；
かつ
（ｂ）免疫学的有効量の、配列番号１のアミノ酸配列を含む第３のポリペプチドをコードする第３の核酸、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第４のポリペプチドをコードする第４の核酸を含む組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターを、薬学的に許容される担体と共に含む第２のワクチンを対象に投与する工程と
を含み、
第１のワクチンはプライミングワクチンとして対象に投与され、第２のワクチンはブースティングワクチンとして対象に投与される方法。
１０５）第１のワクチンは、免疫学的有効量の、配列番号１を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸を含む第１の組換えアデノウイルスベクター、および配列番号２０を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む第２の組換えアデノウイルスベクターを、薬学的に許容される担体と共に含む、実施形態６３、６４および１０４のいずれか１つの方法。
１０６）第１の組換えアデノウイルスベクターはｒＡｄ２６であり、第２の組換えアデノウイルスベクターはｒＡｄ２６である実施形態１０５の方法。
１０７）第１のワクチンは、配列番号１を含む第１のポリペプチドをコードする第１の核酸、および配列番号２０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをコードする第２の核酸を含む、免疫学的有効量の組換えアデノウイルスベクターを、薬学的に許容される担体と共に含む、実施形態６３、６４および１０４のいずれか１つの方法。
１０８）組換えアデノウイルスベクターはｒＡｄ２６である、実施形態１０７の方法。
１０９）配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸の一部であり、配列番号２０を含むポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２２をコードするポリペプチドをコードする核酸の一部である実施形態１０４〜１０８のいずれか１つの方法。
１１０）（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号３のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも１つをコードする核酸、ならびに（ｂ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび配列番号２２のアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも１つをコードする他の核酸を含み、
６．（ａ）および（ｂ）の核酸の少なくとも１つは、ＭＶＡ遺伝子間領域（ＩＧＲ）８８／８９に挿入されている、組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター。
１１１）（ａ）および（ｂ）の両方の核酸は、ＭＶＡ遺伝子間領域（ＩＧＲ）８８／８９に挿入されている、実施形態１１０の組換えＭＶＡベクター。
１１２）ＭＶＡは、ＭＶＡ−ＢＮまたはその誘導体である、実施形態１１０〜１１１のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
１１３）ＭＶＡベクターは、配列番号１を含むポリペプチドをコードする核酸、および配列番号２０を含むポリペプチドをコードする核酸を含む、実施形態１１０〜１１２のいずれか１つの組換え変異ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクター。
１１４）ＭＶＡベクターは、配列番号２８を含むポリペプチドをコードする核酸、および配列番号３１を含むポリペプチドをコードする核酸の少なくとも１つをさらに含む、実施形態１１０〜１１３のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
１１５）配列番号１を含むポリペプチドは、配列番号２８をさらに含み、配列番号２０を含むポリペプチドは、配列番号３１をさらに含む、実施形態１１０〜１１４のいずれか１つの組換えＭＶＡベクター。
１１６）ＭＶＡベクターは、配列番号３を含むポリペプチドをコードする核酸、および配列番号２２を含むポリペプチドをコードする核酸を含む、実施形態１１０の組換えＭＶＡベクター。
【０１０３】
本発明の実施には、別段の指示がない限り、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来の手法が使用されるが、それらの手法は当該技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ、１９８７；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＭＪ，Ｈａｍｓ  ＢＤ，Ｔａｙｌｏｒ  ＧＲ，ｅｄｓ，１９９５；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ，１９８８を参照されたい。
【０１０４】
以下の実施例で本発明をさらに説明する。実施例は、決して本発明を限定するものではない。それらは、発明を明確化する役割を果たすのみである。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：実質的に全てのＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７  ＣＴＬエピトープを含むデザイナーポリペプチドの構築
本発明者らは、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質の実質的に全てのＣＴＬエピトープを有し、期待／予測される強力なネオエピトープ（ネオエピトープは野生型ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質中に存在しないエピトープを意味する）を最少数有する新規の非腫瘍形成性ポリペプチド（およびそれをコードする核酸）を設計した。ＨＰＶ１６に関する本発明のポリペプチド（本明細書中で「Ｅ６Ｅ７ＳＨ」とも称されるときがある）は、配列番号１で示される配列を含む。このポリペプチドをコードするコドン最適化核酸は、配列番号２で示される。
【０１０６】
本発明の分子は、複数分子が用いられる方法よりも作製上の利点を提供する単一分子である。さらに、本発明のポリペプチドは、ＨＰＶ１６の野生型Ｅ６およびＥ７中に存在する実質的に全ての推定されるＣＴＬエピトープを含み、それと同時に、潜在的には免疫優勢であり得る期待／予測される強力なネオエピトープを最少数有し、それ故に免疫応答を関連のある野生型ＣＴＬエピトープから転用する。それ故、本発明のコンストラクトは、あり得るＣＴＬエピトープがいずれか欠如し、かつ／または、より多いもしくはより強力なネオエピトープを有する、他者によって記載された分子よりも免疫学的に好都合である。
【０１０７】
例えば、配列番号１のコンストラクトは、ＩＥＤＢウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ａｎａｌｙｚｅ／ｈｔｍｌ／ｍｈｃ＿ｂｉｎｄｉｎｇ．ｈｔｍｌ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２００９−０９−０１Ｂ）での「ＭＨＣクラスＩ分子に対するペプチド結合（Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」における予測ツールの、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂに対するＡＮＮ（Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６：Ｗ５０９−１２）およびＳＭＭ法（Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１９：１７６５−７２）、ならびにＨＬＡ−Ｃに対するＮｅｔＭＨＣｐａｎ法（Ｈｏｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６１：１−１３）を用いた判定として、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ａ、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｂ、および２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子（ＨＬＡ−Ａ＊０１：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０７、ＨＬＡ−Ａ＊０３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ−Ａ＊２６：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２９：０２、ＨＬＡ−Ａ＊３０：０１、ＨＬＡ−Ａ＊３０：０２、ＨＬＡ−Ａ＊３１：０１、ＨＬＡ−Ａ＊３２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊３３：０１、ＨＬＡ−Ａ＊３３：０３、ＨＬＡ−Ａ＊３４：０１、ＨＬＡ−Ａ＊６８：０１、ＨＬＡ−Ａ＊６８：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊０７：０４、ＨＬＡ−Ｂ＊０８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１５：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３５：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３７：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３９：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊４０：０６、ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０２、ＨＬＡ−Ｂ＊４４：０３、ＨＬ−Ｂ＊４６：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４８：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５１：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５２：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５３：０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５８：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０７：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０４：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０３：０４、ＨＬＡ−Ｃ＊０１：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０７：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０６：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０３：０３、ＨＬＡ−Ｃ＊０８：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊１５：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊１２：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０２：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０５：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊１４：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０３：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊１６：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０８：０２、ＨＬＡ−Ｃ＊１２：０３、ＨＬＡ−Ｃ＊０４：０３、ＨＬＡ−Ｃ＊１７：０１、ＨＬＡ−Ｃ＊１４：０３）に対し＜５０ｎＭの予測結合親和性を有する９アミノ酸長の１つのネオエピトープのみを有する。
【０１０８】
非限定的な例として、ＩＥＤＢウェブサイトにおけるＳＭＭ予測ツールを使用して、Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９：３９７−４０６およびＯｅｈｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｖａｃｃｉｎｅ２４：２８８０−９３によって記載されるシャッフルされたＥ６およびＥ７配列：はそれぞれ、コア部分に、２０の最も一般的なＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂに対し、９つの強力で固有の潜在的ネオエピトープ（ＡＮＮまたはＳＭＭ  ＩＣ５０＜５０ｎＭ）を有する。これはさらに、その手法で用いられる付録（ａｐｐｅｎｄｉｃｅｓ）を除外する（ここで付録は、付加的なネオエピトープにさらに寄与することになり、また「重複」の長さが制限されていることに起因してより多くの天然ＭＨＣＩＩエピトープに対する機会を逃す可能性がある）。当然ながら、国際公開第２０１３／０８３２８７号パンフレットに記載された、報告としてシャッフルされたＥ６およびＥ７タンパク質を伴う変異体を有する改善された分子は、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ａ、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｂおよび２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子に対して予測されたＩＣ５０＜５０ｎＭ（ＡＮＮ、ＳＭＭもしくはＮｅｔＭＨＣＰａｎ）を伴う、９アミノ酸長を有する２２の固有のネオエピトープを有する。
【０１０９】
したがって、本発明のデザイナー分子は、Ｅ６およびＥ７が機能性を除去するためにシャッフルされる場合の他の公表された手法と比べて極めて数が少ない予測されるネオエピトープを有する点で明らかに有利である。
【０１１０】
本発明者らのこのように設計されたＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨ分子（すなわち、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする核酸を合成した。この核酸配列は、配列番号２を含み、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位およびコザック配列、３’部位にＸｂａＩ部位が隣接している（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ、でのカスタム合成および標準的な分子クローニング）。
【０１１１】
合成された断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いて、細菌耐性マーカー（アンピシリン）および哺乳動物耐性マーカー（ネオマイシン）の双方を有する標準の発現ベクターｐＣＤＮＡ２００４．Ｎｅｏにクローン化して、例えば（一過性）遺伝子導入に基づく実験用に本発明の分子をコードするプラスミドベクターを得た。
【０１１２】
これらの分子は、それ自体として用いることができるが、さらなる特徴を有するさらなる分子のためのベースとしても用いることができた。非限定例として、いくつかのさらなる変異体を下記のように調製した。
【０１１３】
ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合タンパク質配列は他のＨＰＶ１６初期タンパク質の配列と組み合わせることで、持続性感染を有する個体を標的にすることができ、免疫される個体の免疫レパートリーを広げることができる。Ｅ２に対する免疫応答が、ＨＰＶ１６感染のクリアランスにおいて重要な役割を果たすことが示唆されている（ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６２：４７２−４７９）。Ｅ２のＥ６Ｅ７ＳＨへの融合は、持続性感染からＬＥＥＰ手術後の浸潤性癌または再発性／難治性疾患といったＨＰＶ関連癌の諸ステージに対する抗原を有するワクチン成分を供することになろう。したがって、かかる実施形態の非限定的な例として、本発明者らは、Ｅ６Ｅ７ＳＨとそのＮ末端でのＥ２との融合タンパク質をコードする配列を調製した。Ｅ２配列内で、融合タンパク質を発現する細胞内での遺伝子発現に影響を与え得るＤＮＡ結合活性を抑制するための改変を行うことができる。本発明者らは、野生型ＨＰＶ１６  Ｅ２タンパク質の、２９３位のグリシン、２９９位のリジン、および３００位のシステインをそれぞれ、バリン、メチオニンおよびアルギニンに変異させた。これらの自然に生じる各変異は既に、Ｅ２結合ドメインを有するＤＮＡ配列へのＥ２の結合を完全に阻害する（Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ６：１０５−１６）。
【０１１４】
得られたポリペプチドは、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨと称し、配列番号３を含む。このポリペプチドをコードするコドン最適化核酸を調製し、配列番号４に示す。
【０１１５】
本発明者らはまた、同じＥ２変異タンパク質がＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合ポリペプチドのＣ末端に融合した変異体を構築した。融合によりＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨと称されるポリペプチド生成され、これは配列番号５を含む。このコンストラクトをコードする配列を、配列番号６として示す。
【０１１６】
対照を目的として、本発明者らはまた、融合タンパク質として完全長ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の野生型配列を有するポリペプチド（ａａ１〜１５８のＥ６がａａ１〜９８のＥ７に直接融合されたものであり、本明細書中でＥ６Ｅ７ｗｔと称される）をコードする配列を構築した。
【０１１７】
本発明者らはまた、リーダー配列をポリペプチドに付加する効果について試験した。非限定的な例として、ＩｇＥリーダー配列をコードする配列（例えば、米国特許第６，７３３，９９４号明細書を参照）［リーダーペプチドの配列が、配列番号７に示されている］が、いくつかのコンストラクト、例えば、Ｅ６Ｅ７ｗｔコンストラクト（これはＬＳＥ６Ｅ７ｗｔを与える）、およびＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨコンストラクト（これはＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを与える）のＮ末端で融合した。その効果は、免疫マウスにおけるＥ７四量体分析による測定によると、ＬＳ配列を有しない同じ抗原と比べて免疫原性が有意に（ｐ＜０．０５）増強された（例えば、図９中に見られる通りである）。
【０１１８】
本発明のＥ６Ｅ７ＳＨポリペプチドをコードする配列は、Ｅ２の有無にかかわらず、例えば、ＤＮＡコンストラクトから、ＲＮＡから、またはウイルスベクターから発現され得る。図１は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞内での、上記のような導入遺伝子を発現するＤＮＡベクターによる一過性のトランスフェクト時の発現を示す。トランスフェクト後、細胞が収集され、細胞抽出物がＨＰＶ１６  Ｅ７に対する抗体を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより分析された。この実験は、発現ベクターのトランスフェクション時での適切なサイズの想定される融合タンパク質の発現を示す。
【０１１９】
Ｅ２の有無にかかわらず、またコードされた融合タンパク質の免疫原性を増強するための追加の配列の有無にかかわらず、アデノウイルスベクターを用いてＥ６Ｅ７を発現させることができる。
【０１２０】
上記のＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ｗｔ対照またはＨＰＶ１６デザイナー配列をコードする遺伝子は、Ｇｅｎｅａｒｔで、ヒト発現のために最適化され、合成された遺伝子であった。コザック配列（５’ＧＣＣＡＣＣ３’）をＡＴＧ開始コドンの直前に含め、また２つの停止コドン（５’ＴＧＡ  ＴＡＡ３’）はそれぞれのコード配列の終端に付加した。遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位を介して、ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵプラスミド中およびｐＡｄＡｐｔ２６プラスミド中に挿入した（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７，２１３５−４３）。
【０１２１】
全てのアデノウイルスはＰＥＲ．Ｃ６細胞で単一の相同組換えにより生成し、前述のように産生した（ｒＡｄ３５について：Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：２１３５−４３；ｒＡｄ２６について：Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：４６５４−６３）。ＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：１９０９−１７）は、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。
【０１２２】
簡潔に記せば、ＰＥＲ．Ｃ６細胞に、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が提供する説明書に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して、Ａｄベクタープラスミドをトランスフェクトした。十分な細胞変性効果（ＣＰＥ）に達した１日後に細胞を収集し、凍結融解させ、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、−２０℃で貯蔵した。ウイルスを、マルチウェル２４組織培養プレートの単一のウェル内で培養したＰＥＲ．Ｃ６細胞内でプラーク精製し、増幅した。Ｔ２５組織培養フラスコ内と、その後のＴ１７５組織培養フラスコ内で培養したＰＥＲ．Ｃ６細胞内でさらに増幅させた。Ｔ１７５フラスコ後に得られた細胞から調製した粗ライセートからの３〜５ｍｌを用いて、ＰＥＲ．Ｃ６細胞の７０％コンフルエント層を有する２４×Ｔ１０００の５層の組織培養フラスコに接種した。ウイルスを、２段階ＣｓＣｌ精製法を使用して精製した。最終的に、ウイルスを一定分量に分割して−８５℃に保存した。
【０１２３】
Ａｄ３５．ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ｗｔ、およびＡｄ３５．ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ＳＨは、野生型ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質の融合タンパク質（Ｅ６Ｅ７ｗｔ）、ならびに上述したようなデザイナー融合タンパク質変異体（Ｅ６Ｅ７ＳＨ、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する）をそれぞれ発現するためのコドン最適化ヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）ベクターである。Ｅ６およびＥ７の組み合わせ配列は、Ｅ１、Ｅ３が欠失したアデノウイルスゲノムのＥ１領域内のＣＭＶプロモーターの制御下に置いた。Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ｗｔ、およびＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ＳＨは、組換えアデノウイルス血清型２６に基づく等価なベクターである。
【０１２４】
同様に、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（配列番号３）変異体をコードするＡｄ２６およびＡｄ３５に基づく組換えアデノウイルスベクターを生成した。同様に、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨ（配列番号５）変異体をコードするＡｄ２６およびＡｄ３５を生成した。また、Ｎ末端にＩｇＥリーダー配列を有するＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合タンパク質をコードするＡｄ３５ベクターを生成し、Ａｄ３５．ＨＰＶ１６−ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨと称した。また、Ｎ末端でＩｇＥリーダー配列に融合したＥ６Ｅ７ｗｔを有する対照アデノウイルスを生成した。
【０１２５】
組換えアデノウイルスをＰＥＲ．Ｃ６細胞で生成し、塩化セシウム勾配の遠心分離により精製した。
【０１２６】
リプレッサー系に結合させたコンストラクトのさらなる例を、下の後述する実施例で提示する。
【０１２７】
実施例２．ＨＰＶ１６デザイナーコンストラクトの形質転換活性の欠損
野生型ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質は、特定のアッセイにおける形質転換活性（例えば、軟寒天アッセイにおけるコロニー形成）として明白な腫瘍形成能を有する（Ｍａｓｓｉｍｉ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １１９：３８１−３９５）。実施例１に記載のＥ６Ｅ７ＳＨポリペプチドは、並び替えられた様式でのＥ６およびＥ７タンパク質の断片を含む。これは、例えばかかるアッセイにおける野生型Ｅ６タンパク質および野生型Ｅ７タンパク質のいずれかと比べて形質転換活性が有意に低下することにより測定可能である通り、腫瘍形成能を排除することが期待される。
【０１２８】
他の研究者らは、遺伝子がシャッフルされたＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の変異体は実際にその発癌性を失ったと報告し（Ｏｅｈｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ２４：２８８０−９３；Ｈｅｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：４２５９−６６）、遺伝子シャッフリングがＥ６およびＥ７タンパク質の野生型機能を破壊することを実証した。
【０１２９】
腫瘍化特性の欠如を評価するため、本発明者らは、Ｅ６Ｅ７ＳＨコンストラクトがＮＩＨ  ３Ｔ３細胞上の軟寒天中での増殖能を与える能力を評価した（例えば、Ｍａｓｓｉｍｉ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １１９：３８１−３９５で記載の通り）。ＮＩＨ３Ｔ３細胞への野生型ＨＰＶ１６  Ｅ７を発現するプラスミドのトランスフェクションでは、常にコロニーが形成された。これらのアッセイでは、野生型ＨＰＶ１６  Ｅ６単独の発現では、バックグラウンドを超えるコロニー形成は生じなかった。これは、このアッセイではＥ７ｗｔがＥ６ｗｔよりもはるかに効率的であるという公表された観察結果と一致している（Ｓｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：４８６０−６６）。本発明者らのＥ６Ｅ７ＳＨコンストラクトのトランスフェクションは、４つの独立実験において軟寒天中での細胞のコロニーの増殖をもたらさず（図２）、本発明のポリペプチドＥ６Ｅ７ＳＨをコードする核酸がＥ７に関連する形質転換能力を失っていることを示した。
【０１３０】
Ｅ６およびＥ７の腫瘍形成能は、それぞれ細胞タンパク質のｐ５３およびｐＲｂのレベルを低下させるそれらの能力に関連している。本発明のポリペプチドＥ６Ｅ７ＳＨをコードする核酸のコンストラクトが分子レベルで野生型Ｅ６およびＥ７に関連した生物学的活性を有さないことを示すため、ｐ５３およびｐＲｂ分解アッセイを実施した。つまり、ＨＰＶ１６  Ｅ６ｗｔおよび本発明者らのＥ６Ｅ７ＳＨコンストラクトを、ｐ５３分解アッセイにおいて、内因性ｐ５３が欠如したＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞内で発現させた。ｐＲｂ分解アッセイにおいては、ＨＰＶ１６  Ｅ７ｗｔおよびＥ６Ｅ７ＳＨコンストラクトをｐＲｂヌルＳａｏｓ−２細胞内で発現させた。図３で分かるように、ｐ５３と（Ｅ６Ｅ７ＳＨとでなく）Ｅ６ｗｔとの同時発現は、ｐ５３レベルの低下をもたらす（パネルＡおよびＢ）。同様に、パネル３Ｃおよび３Ｄは、ｐＲｂと（Ｅ６Ｅ７ＳＨとでなく）Ｅ７ｗｔとの同時発現がｐＲＢレベルの低下をもたらすことを示す。これらのデータは、本発明のポリペプチドをコードする核酸が軟寒天中でのコロニー形成能を全く有さず、また野生型Ｅ６およびＥ７ポリペプチドの主な生物学的活性、すなわち、それぞれｐ５３およびｐＲｂを不活化する活性を有さないことを示している。
【０１３１】
本発明のポリペプチドをコードする核酸コンストラクトの安全性をさらに実証するため、本発明者らは、ＨＰＶ媒介性形質転換に対する天然標的細胞である一次ヒト包皮ケラチノサイトを用いた。一次ヒトケラチノサイトの不死化は、Ｅ６およびＥ７野生型双方の作用を必要とする（Ｍｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６３：４４１７−２１）。このアッセイは、おそらくは本発明者らのコンストラクトの安全性を実証するための生理学的に最も関連性のあるインビトロアッセイである（Ｍａｓｓｉｍｉ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １１９：３８１−３９５）。ＨＰＶ１６由来の野生型Ｅ６およびＥ７（Ｅ６Ｅ７ｗｔ）を発現するレンチウイルスを形質導入した細胞は、それらの寿命が非形質導入対照細胞と比べて延長し（図４）、かつテロメラーゼの触媒サブユニットであるｈＴＥＲＴが活性化した（データは示さず）ことによって示されるように、一次ケラチノサイトにおける不死化を誘導する。本発明のポリペプチド（Ｅ６Ｅ７ＳＨ）の発現では、ＧＦＰが形質導入されたケラチノサイトまたは形質導入されないケラチノサイトと比べて寿命を延ばすことができない。２つの追加した独立ドナーにおいて同様の結果が得られた（データは示さず）。まとめると、これらのデータは、本発明者らのコンストラクトが、高度に生理学的なモデルと考えられる、一次ヒトケラチノサイトにおける不死化を誘導する能力を失っていることを示す。
【０１３２】
ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の同等の断片を異なる順序で組み換えた別のコンストラクトもまた、一次ヒト包皮ケラチノサイトを不死化することができなかった。しかし、そのコンストラクトにおいては、最大で約１２０〜１５０日の寿命の延長が認められた。これは、この分野では一部予測不能であることを示し、また、この安全性に関連した態様における本発明の選択されたデザイナー分子の優位性を示している。
【０１３３】
本実施例における実験は、本発明によるＨＰＶ１６デザイナーポリペプチドをコードする核酸の形質転換活性の欠如と、それ故にＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７  ｗｔコンストラクトよりも著しく改善された安全性に関する強力な証拠を同時に提供する。
【０１３４】
実施例３．ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨデザイナーコンストラクトに対する免疫応答
本発明者らは、実施例１に記載のように、ＤＮＡベクターおよびアデノウイルスベクターを調製した。
【０１３５】
本発明者らは、マウスが野生型Ｅ２、またはＥ６もしくはＥ７をコードするＤＮＡプラスミドで免疫され、またＨＰＶ１６  Ｅ２、Ｅ６およびＥ７抗原による免疫により、Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＢａｌｂ／ｃマウスよりも広範な細胞免疫応答がＣＢ６Ｆ１で誘導される初期実験に基づいて、免疫応答を測定するのにＣＢ６Ｆ１マウス株を用いた。個々の実験において、マウスを本発明の分子をコードするＤＮＡベクターで免疫し、細胞の免疫応答を測定した。Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＤＮＡプラスミドで免疫したマウスにおいて、ＨＰＶ１６  Ｅ７に特異的な免疫応答を測定することができた（図５）。
【０１３６】
本実施例中に示す以下のデータは、アデノウイルスベクターを用いて実施したマウス実験から得られたものである。
【０１３７】
ワクチンに誘導される免疫原性を評価するため、ＣＢ６Ｆ１マウスを、ＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ｗｔ、ＬＳＥ６Ｅ７ｗｔ、Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノベクター（Ａｄ３５）または導入遺伝子をコードしないアデノベクター（エンプティ）で免疫した。マウスへの投与について２つの用量を試験した：５×１０９ウイルス粒子（ｖｐ）および１×１０１０ｖｐ。免疫付与の２週後および８週後、マウスをサクリファイスし、単離した脾細胞をＨＰＶ１６  Ｅ７の１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激した。２週後および８週後のＥ７に特異的な応答を、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴにより分析した。データを図６に示す。
【０１３８】
これは、ＥＬＩＳＰＯＴ分析による測定で、マウスのＡｄ３５．ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ＳＨによる免疫がＥ７に特異的な免疫応答を誘導することを示している。さらに、図６の結果は、Ｎ末端リーダー配列を導入遺伝子に付加することにより、アデノウイルスにより発現する導入遺伝子に対する免疫応答が増強する可能性があることを示す。
【０１３９】
次に、免疫原性に関してＨＰＶ１６  Ｅ２をＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨポリペプチドに付加する効果を試験した。Ａｄ３５ベクターは、Ｎ末端（Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ）またはＣ末端（Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨ）に融合したＥ２を有するポリペプチドをコードした。ＣＢ６Ｆ１マウスを、１×１０１０ｖｐの用量で免疫した。図７（Ｅ７四量体染色）および図８（パネルＣ、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ）は、Ｅ７に対する免疫応答を示し、Ｅ２を含むデザイナーコンストラクトの免疫応答は、Ｅ２を含まないコンストラクトと比べてより高い傾向があるが、差異は統計学的に有意なものではなかった。Ｅ２に対する応答は、Ｅ６Ｅ７ＳＨデザイナーポリペプチドに融合されたＥ２を有するアデノウイルスベクターに対する応答と比べて、Ｅ２のみをコードするアデノウイルスベクターの場合がより高く（図８Ｂ）、差異はＥ２対Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＥ２対Ｅ６Ｅ７Ｅ２ＳＨの双方において有意であった（Ｐ値：＜０．０５）。
【０１４０】
Ｅ２をさらに含むデザイナーコンストラクトはＥ７に対する免疫応答をさらにもたらし、加えてＥ２に対する免疫応答ももたらし、それ故、Ｅ２を含まないコンストラクトよりも免疫応答の幅が増加すると結論づけられる。
【０１４１】
リーダー配列の付加により、野生型Ｅ６およびＥ７の融合タンパク質のＮ末端に融合されるとき、より高いＥ７に特異的な応答がもたらされることが示された（図６Ｃ）。同様に、Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合タンパク質の免疫原性に対するリーダー配列の効果を決定した。したがって、Ｎ末端Ｅ２の有無にかかわらずＨＰＶ１６デザイナーポリペプチドをコードするＡｄ３５ベクター、およびＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードするＡｄ３５ベクターを、マウスの免疫のために用い、血液試料を２週間隔で採取して、Ｅ７に特異的な免疫応答を測定した（図９）。図７および８に示すように、Ｅ６Ｅ７ＳＨにＮ末端またはＣ末端で融合したＥ２の存在は、免疫応答を増強する傾向があった。ＩｇＥリーダー配列の付加により、Ｅ７に特異的な応答がさらに増強された（図９Ｂ）。本発明によるデザイナー分子をコードする３つ全てのアデノウイルスベクターにおいて、経時的に持続的な免疫応答が認められ、また免疫後の最高の応答は実験期間中の最高の応答に対応した。
【０１４２】
Ｎ末端Ｅ２をさらに含むデザイナーコンストラクトによって誘導される応答は、コード化タンパク質を特定の細胞区画に標的化する特定の配列、例えばＩｇＥリーダー配列の付加により増強され得ると結論づけられる。
【０１４３】
本発明のペプチドに対する細胞免疫応答は、異なるタイプのアデノウイルスベクターを用いて誘導され得る。先行実験では、本発明者らは、Ａｄ３５ベクターを用いたが、図１０の実験では、マウスを、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６アデノウイルスベクターで免疫した。データは、Ａｄ２６に基づくワクチンによる免疫もまた、Ｅ７に特異的なＴ細胞を誘導したことを示す。さらに、その結果は、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ３５アデノウイルスベクターでの２回目の免疫が細胞免疫応答をさらに増強させることを示す（図１０）。
【０１４４】
実施例４．アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）におけるＨＰＶ１６デザイナーコンストラクトの免疫原性。
本発明のデザイナー配列を発現するアデノウイルスベクターが非ヒト霊長類における免疫応答を誘導する能力を評価するため、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノベクター（Ａｄ２６）または導入遺伝子をコードしないアデノベクター（エンプティ）を１×１０１１ｖｐの用量で筋肉内注射することにより、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）を免疫した。免疫付与の８週後、同じ抗原を発現するＡｄ２６ベクターによる免疫により免疫応答を増大させた。１６週後、動物は、同じ抗原を発現するＡｄ３５ベクターの注射をさらに１回受けた。血液試料は数回の時点で採取し、単離した白血球をＨＰＶ１６  Ｅ２、Ｅ６またはＥ７に対応するペプチドプールで一晩刺激した。特異的応答をＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。データを図１１に示す。さらにプライム免疫の１０週後および１８週後、本発明における新規な接合に及ぶペプチドに特異的な細胞免疫応答を評価した。ＩＦＮγ応答の誘導は、全ての動物で、１×１０６ＰＢＭＣ当たり＜５０ＳＦＵの検出限界未満であった（データは示さず）。
【０１４５】
データは、Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨによる非ヒト霊長類の免疫により、コードされた導入遺伝子中に存在する３つ全てのＨＰＶ１６タンパク質に対する細胞免疫応答は生じたが、新規な接合に対する細胞免疫応答は生じなかったことを示す。Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨによる追加免疫により応答が増大され得、また対応するＡｄ３５ベクターによる１６週目での追加ブーストにより、ＨＰＶ１６  Ｅ２、Ｅ６およびＥ７に特異的な免疫応答がさらに増強された。
【０１４６】
別の実験（記載せず）において、２つのアデノウイルスベクター（一方はＨＰＶ１６  Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現し、他方はＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質を発現する）の組み合わせの腟内投与により、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）を免疫した。Ｅ６およびＥ７の双方に対する低いものの測定可能な細胞応答を、末梢単核血液細胞内で測定した。これらの実験では、Ｌ１に対する強力な細胞免疫応答が検出された。
【０１４７】
実施例５．マウス腫瘍モデルにおける治療効果
ＨＰＶ１６のための本発明のポリペプチド（配列番号１を含む）は、動物においてＨＰＶ１６に特異的な細胞免疫応答を誘導することができ、ＨＰＶ１６  Ｅ６および／またはＥ７を発現する細胞に対して治療効果を発揮し得る。治療的免疫、すなわち腫瘍増殖が開始してからの免疫は、治療用ＨＰＶワクチン候補の有効性を実証するのに用いることができる。Ａｄ２６およびＡｄ３５ベクターの治療効果を、ＴＣ−１細胞（ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７を発現するマウス細胞）が注射されたマウスにおいて試験した（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５６：２１−６）。ＴＣ−１細胞は、マウスに皮下注射後、数日から数週以内に固形腫瘍を形成する。ワクチンなしでは、腫瘍は急速に増殖し、３０日以内に１０００ｍｍ３の所定のサイズに達した（パネルＤおよびＥ）。このサイズに達したところで、倫理的理由でマウスをサクリファイスする。
【０１４８】
ＳＬＰ（陽性対照として用いられる；Ｋｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１：１８３８−４７；Ｚｗａｖｅｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：３５０−８）またはＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノウイルスベクターを用いるプライムブースト免疫スキームでは、ＴＣ−１誘発腫瘍の増殖の著しい低下が認められた（図１２、パネルＢおよびＣ）。プライム免疫後の最初の３０日でのより詳細な検査（パネルＦおよびＧ）により、Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノベクターによる免疫が、腫瘍増殖に対してＳＬＰによる免疫よりも実質的に大きな影響を有することが示される。初期増殖速度が大きく低下し、ほとんどの場合、腫瘍は収縮した。アデノウイルスベクターによって免疫した１１匹のマウス中の３匹において、腫瘍は完全に根絶されたが、それは生存プロットに反映されている（パネルＨ）。
【０１４９】
結論として、本発明のＨＰＶ１６デザイナーポリペプチドを発現するアデノウイルスベクターによる免疫により、ＨＰＶ１６誘発癌に対する十分に確立されたチャレンジモデルにおいて、腫瘍増殖が有意に抑制されるかまたは定着腫瘍が完全に根絶された。
【０１５０】
実施例６：ＨＰＶ由来の抗原を発現するアデノウイルスベクターの生産性および遺伝的安定性を改善するためのリプレッサー系の利用
強力で構成的に活性なプロモーターの制御下でアデノウイルスベクターに挿入される導入遺伝子が、導入遺伝子産物の特性に応じてベクター産生に負の影響を与え得ることは先行的に報告されている（Ｙｏｓｈｉｄａ  ＆  Ｙａｍａｄａ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２３０：４２６−３０；Ｒｕｂｉｎｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７：８７５−８５；Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：３４５−５３；Ｅｄｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：９５７９−８４；Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３５：２６３−７３）。導入遺伝子依存性ベクターの生産性での課題の例として、非効率的なベクターの救出および増殖、低い最終ベクターの収量、また深刻な場合では欠陥のある導入遺伝子カセットを有するウイルス変異体の急速な増殖が挙げられる。これらの課題を解決するため、複数の研究において、ベクター導入遺伝子の発現をプロデューサー細胞内でのベクター複製中に抑制する可能性が探索された（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：３４５−５３；Ｅｄｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７５：９５７９−８４；Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３５：２６３−７３；Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０９：７１９−２８；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０８：１７７−８８）。これに関して、異なる抑制系がＡｄベクターとの関連で先行的に組み入れられており、実際、異なるタイプの（阻害性）導入遺伝子をコードするベクターにおいてベクターの生産性および遺伝的安定性を改善することを示している。
【０１５１】
本明細書に記載のアデノウイルスベクターの一部、ならびに特定のＨＰＶ抗原変異体をコードする一部の他のアデノウイルスベクターが、上記の導入遺伝子依存性ベクターの生産性の課題の一部を提示し、それ故、おそらくはその観点でさらに改善され得ることが認められた。したがって、本発明者らは、ベクター導入遺伝子の発現を抑制する系の使用により、本明細書に記載されるようなＨＰＶ由来の抗原を発現するＡｄベクターの生成特性が改善され得るか否かを検討しようと努力した。この目的のため、本発明者らは、２つの既存のリプレッサー−オペレーター系、すなわちＴｅｔＲ／ＴｅｔＯ（Ｙａｏ  ＆  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，１９９９，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：４１９−２２、欧州特許第０９９００４１Ｂ１号明細書）およびＣｙｍＲ／ＣｕＯ（Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：４３）を本発明者らのアデノウイルスベクタープラットフォームに組み込んだ。ＴｅｔＲ／ＴｅｔＯ系およびＣｙｍＲ／ＣｕＯ系の双方が、アデノウイルスベクターの生産性をベクター複製中でのベクター導入遺伝子のサイレンシングを介して改善するため、他者により先行的に用いられている（Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３５：２６３−７３；Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０９：７１９−２８；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０８：１７７−８８）。これら２つの系の組み込みは、ＴｅｔＯまたはＣｕＯ配列を有するＣＭＶプロモーターの制御下での目的遺伝子を発現するアデノウイルスベクターの作製を含んだ。さらに、その組み込みは、各々の同族のリプレッサータンパク質（すなわちＴｅｔＲまたはＣｙｍＲ）を安定的に発現する細胞株の作製を必要とした。
【０１５２】
異種ポリペプチドをコードする配列がＴｅｔＯまたはＣｕＯオペレーター配列を有するＣＭＶプロモーターに作動可能に連結された、いくつかのＥ１が欠失したＡｄ２６およびＡｄ３５に基づくベクターを作製した。まず、特定のＴｅｔＯまたはＣｕＯ含有配列（それぞれ配列番号１１および配列番号１２）を、ｐＡｄａｐｔ２６およびｐＡｄａｐｔ３５．ＢｓｕプラスミドのＣＭＶプロモーター（配列番号１３）の転写開始部位（ＴＳＳ）の近くに挿入した（Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：４６５４−６３；Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：２１３５−４３）。オペレーター含有配列を、ＣＭＶプロモーターの２つの系についての前述の場合と正確に同じ位置に挿入した（Ｙａｏ  ＆  Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，１９９９，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：４１９−２２；欧州特許第０９９００４１Ｂ１号明細書；Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：４３；欧州特許第１３８５９４６Ｂ１号明細書）。特に、ＴＳＳ（当初割り当てられた通り；Ｓｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．１９８４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ４９：１９０−９））に対して、ＴｅｔＯ−およびＣｕＯ−含有配列を、それぞれ、−２０位および＋７位の直ぐ下流に挿入した。配列番号１３では、これら２つの位置はそれぞれ、位置７１６および７４２に対応する。得られたオペレーター含有ＣＭＶプロモーターはそれぞれ、ＣＭＶＴｅｔＯおよびＣＭＶＣｕＯと称する。次に、異なる導入遺伝子を、得られたコンストラクトの（改変）ＣＭＶプロモーターの下流にＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位を用いて挿入した。これらの導入遺伝子は、緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼの融合タンパク質（ＧＦＰ−Ｌｕｃ）をコードする遺伝子、上の実施例１において記載のＨＰＶ１６  ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ、およびＨＰＶ１６  ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨにいくらかの類似性を有する別のポリペプチド（本実施例で「ＨＰＶＡｇ」と称するコンストラクト）を含んだ。ＨＰＶＡｇは、ＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ中に存在するのと同じリーダー配列、ならびにＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６、およびＥ７配列を含む。本明細書に記載の方法により、得られた改変ｐＡｄａｐｔ２６およびｐＡｄａｐｔ３５．Ｂｓｕプラスミドを用いて、ＣＭＶＴｅｔＯまたはＣＭＶＣｕＯプロモーターの制御下で上記のレポーターおよびＨＰＶ導入遺伝子を発現するアデノウイルスベクターを作製した。
【０１５３】
ＴｅｔＲまたはＣｙｍＲを発現する細胞株を、それぞれプラスミドｐｃＤＮＡＴＭ６／ＴＲ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖ１０２５−２０）、およびＴｅｔＲコード配列（配列番号１４、これは配列番号１５のポリペプチドをコードする）がコドン最適化ＣｙｍＲコード配列（配列番号１６、これは配列番号１７のポリペプチドをコードする）によって置換されているｐｃＤＮＡＴＭ６／ＴＲの誘導体を用い、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞の安定なトランスフェクションによって生成した。安定な細胞株の作製は、主に、ＣＭＶＴｅｔＯまたはＣＭＶＣｕＯ駆動遺伝子の発現を抑制する能力がある細胞クローンについてスクリーニングするための一過性トランスフェクションに基づくアッセイを用いて、ｐｃＤＮＡＴＭ６／ＴＲの供給業者による説明に従って実施した。得られたＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲおよびＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ細胞株について、これらの細胞内でのベクター複製中の導入遺伝子発現の抑制能力を分析した。オペレーター含有ＣＭＶプロモーターの制御下でＧＦＰ−Ｌｕｃを発現するベクターを用いて実施された実験により、それぞれのオペレーター配列に対応するリプレッサーを発現する細胞株中での完全なウイルス複製サイクル全体を通じて、ルシフェラーゼ遺伝子の発現が少なくとも１０倍低下することが示された（データは示さず）。これにより、ＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲおよびＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ細胞株がアデノウイルスベクターの複製との関連でベクター導入遺伝子の発現を抑制する能力があることが確認された。
【０１５４】
アデノベクター導入遺伝子発現のＴｅｔＲおよびＣｙｍＲを媒介とした抑制のベクター収量に対する効果を、ＨＰＶＡｇを発現するＡｄ３５に基づくベクターについて検討した（図１３Ａ）。このため、２４ウェルのプレートウェル内に１ウェル当たり３×１０５個を播種したＰＥＲ．Ｃ６、ＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ、およびＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ細胞株に対して、１細胞当たり１０００個のウイルス粒子で３時間の間、ＣＭＶＴｅｔＯプロモーターまたはＣＭＶＣｕＯプロモーターからＨＰＶＡｇを発現するベクターにより、４通りの感染を施した。対照として、ＨＰＶＡｇの代わりにＧＦＰ−Ｌｕｃを発現する対応するベクターを用いて並行感染を実施した。感染の４日後、粗ウイルスライセートを、ウェルの内容物（すなわち感染細胞および培地）に対して２回の凍結−解凍サイクルを施すことにより調製した。その後、標準として既知のウイルス粒子力価を有する精製Ａｄ３５ベクターを用いる、Ａｄ３５ヘキソン配列に特異的な定量ＰＣＲに基づくプロトコルによって、アデノベクター力価を測定した。結果により、ＴｅｔＯおよびＣｕＯの双方を含有するＨＰＶＡｇをコードするＡｄ３５ベクターが、ＧＦＰ−Ｌｕｃを発現する対照ベクターと比べて、正常なＰＥＲ．Ｃ６細胞でのベクター収量が低下することが示される。それに対して、これらの同じベクターで、それらの同族のリプレッサー（すなわち、それぞれＴｅｔＲおよびＣｙｍＲ）を発現する細胞で生成されると、対照ベクターを用いて得られる収量と同程度に高い収量が得られた。これらのデータは、プロデューサー細胞内でのベクター産生中における導入遺伝子発現の抑制が、導入遺伝子としてＨＰＶＡｇを保有するＡｄ３５ベクターの生産性にとって有利であり得ることを示している。
【０１５５】
アデノベクター導入遺伝子発現の抑制がベクター収量に対して有し得る効果もまた、アデノウイルス血清型２６（Ａｄ２６）由来のベクターについて検討した（図１３Ｂ）。Ａｄ３５ベクターについて実質的に上記のように実施したアッセイでは、ＧＦＰ−Ｌｕｃ、ＨＰＶＡｇ、またはＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードする、ＣＭＶＴｅｔＯプロモーターに制御される導入遺伝子を保有するＡｄ２６ベクターを使用して、ＰＥＲ．Ｃ６およびＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ細胞を１５００ウイルス粒子／細胞で感染させた。３日後、感染物を収集し、ウイルス粒子力価を、Ａｄ２６ヘキソン配列に特異的な定量ＰＣＲに基づく方法により測定した。結果により、ＰＥＲ．Ｃ６細胞でのＨＰＶＡｇおよびＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードするベクターにおける収量がＧＦＰ−Ｌｕｃをコードする対照ベクターを用いて得られる場合よりも低いことが示される。それに対し、ＰＥＲ．Ｃ６／ＴｅｔＲ細胞では、これらのベクターの双方が、対照ベクターにおいて得られる場合と同程度に高い力価を示した。（Ａｄ３５ベクターにおける）上記の結果をまとめると、これらのデータは、アデノベクター産生中の導入遺伝子の発現の抑制によって、ＨＰＶＡｇおよびＬＳＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するベクターの収量が増加することを示している。
【０１５６】
本発明者らは、ＨＰＶＡｇに対するＣＭＶプロモーター駆動導入遺伝子を保有するアデノウイルスベクターの遺伝的安定性に関する主要な課題について認めている。例えば、ＰＥＲ．Ｃ６上でこのベクターが数継代経た後、ベクター集団の大半がＨＰＶＡｇコード配列内に大規模な欠失を保有する変異ベクターからなることが認められた（データは示さず）。
【０１５７】
本発明者らは、導入遺伝子発現抑制系、例えば上記の２つのうちの１つを利用すれば、導入遺伝子、例えばベクターの増殖に対して阻害性を示すＨＰＶＡｇに関連した遺伝的安定性の課題が防止され得ると判断した。このことを試験するため、ＣＭＶＣｕＯプロモーターに駆動されるＨＰＶＡｇの発現を伴うＡｄ３５に基づくベクターを、ＰＥＲ．Ｃ６またはＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ細胞でのベクターの増殖時の導入遺伝子カセットの安定性について評価した（図１４）。つまり、ベクターＤＮＡを２つの異なる細胞株にトランスフェクトし、得られたウイルスプラークをアガロース層下で増殖させておいた。２つのトランスフェクションのそれぞれから、５つのウイルスプラークを単離し、さらに同じ細胞株（すなわち、トランスフェクションに用いたもの）で別々に１０回のウイルス連続継代にわたり継代した。導入遺伝子の完全性を、ウイルス継代数１０（ＶＰＮ１０）での導入遺伝子カセットのＰＣＲ増幅、ならびにその後の得られたＰＣＲ産物のゲル電気泳動およびサンガー配列決定による分析により評価した。さらに、ＶＰＮ７の継代したウイルスクローンを、そのＨＰＶＡｇを発現する能力について評価した。これは、継代したウイルス単離物を用いて、Ａ５４９細胞を１０００ウイルス粒子／細胞で感染させ、その４８時間後に細胞を溶解し、その後、ＨＰＶＡｇの発現をＨＰＶ１６  Ｅ７に特異的なモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティング（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により分析することにより行った。ゲル電気泳動および配列決定分析の結果は、それぞれＰＥＲ．Ｃ６で継代された５つのウイルス単離物の全てが、導入遺伝子カセット内に、わずかのフレームシフト欠失または中途での停止変異を保有していることを示した。それに対し、かかる欠失または変異は、ＣｙｍＲを発現する細胞株（ＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ）で継代されたベクター単離物では検出することができなかった。これらのデータと一致して、ＰＥＲ．Ｃ６／ＣｙｍＲ増殖ベクター単離物は全てＨＰＶＡｇを発現することができたが、ＰＥＲ．Ｃ６増殖ベクターは全てこの能力を完全に失っており、これらのベクターにおける欠陥導入遺伝子カセットが示唆された。結論として、我々のデータは、ベクター増殖中でのベクター導入遺伝子の発現を抑制するための、例えばＣｙｍＲ／ＣｕＯ系のようなリプレッサー系の使用は、例えばＨＰＶＡｇを発現する導入遺伝子を保有するベクターにおいて見られる、深刻な導入遺伝子カセットの不安定性を防止するための有効な手段である。
【０１５８】
実施例７：実質的に全てのＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７  ＣＴＬエピトープを含むデザイナーポリペプチドの構築
ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７に関する本発明者らの設計と同様に、本発明者らは、ＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７タンパク質の実質的に全てのＣＴＬエピトープを有し、期待／予測される強力なネオエピトープ（ネオエピトープは野生型ＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７タンパク質中に存在しないエピトープを意味する）を最少数有する新規の非腫瘍形成性ポリペプチド（およびそれをコードする核酸）を設計した。ＨＰＶ１８に関する本発明のポリペプチド（本明細書中でＨＰＶ１８「Ｅ６Ｅ７ＳＨ」とも称されるときがある）は、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む。このポリペプチドをコードするコドン最適化核酸は、配列番号２１で示される。
【０１５９】
ＨＰＶ１８に関する本発明の分子は、ＨＰＶ１６に関し実施例１で説明したのと同じ利点を有する。分子は単一分子であり、複数分子が用いられる方法よりも作製上の利点を提供する。さらに、本発明のポリペプチドは、ＨＰＶ１８の野生型Ｅ６およびＥ７中に存在する実質的に全ての推定されるＣＴＬエピトープを含み、それと同時に、潜在的には免疫優勢であり得る期待／予測される強力なネオエピトープを最少数有し、それ故に免疫応答を関連のある野生型ＣＴＬエピトープから転用する。それ故、本発明のコンストラクトは、あり得るＣＴＬエピトープがいずれか欠如し、かつ／または、より多いもしくはより強力なネオエピトープを有する、他者によって記載された分子よりも免疫学的に好都合である。
【０１６０】
例えば、配列番号２０のＨＰＶ１８デザイナーコンストラクトは、ＨＰＶ１６デザイナーコンストラクト（配列番号１を有する）について実施例１に記載したような、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ａ、２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｂおよび２０の最も一般的なＨＬＡ−Ｃ対立遺伝子に対する予測される結合親和性＜５０ｎＭを有する９アミノ酸長のネオエピトープを、５つしか有さない。
【０１６１】
本発明者らのこのように設計されたＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ分子（すなわち、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）をコードする核酸を合成した。この核酸配列は、配列番号２１を含み、５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位およびコザック配列、３’部位にＸｂａＩ部位が隣接している（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ、でのカスタム合成および標準的な分子クローニング）。
【０１６２】
合成された断片を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いて、細菌耐性マーカー（アンピシリン）および哺乳動物耐性マーカー（ネオマイシン）の双方を有する標準の発現ベクターｐＣＤＮＡ２００４．Ｎｅｏにクローン化して、例えば（一過性）遺伝子導入に基づく実験用に本発明のＨＰＶ１８デザイナー分子をコードするプラスミドベクターを得た。
【０１６３】
これらの分子は、それ自体として用いることができるが、さらなる特徴を有するさらなる分子のためのベースとしても用いることができた。非限定例として、いくつかのさらなる変異体を下記のように調製した。
【０１６４】
ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ融合タンパク質配列は他のＨＰＶ１８初期タンパク質の配列と組み合わせることで、持続性感染を有する個体を標的にすることができ、免疫される個体の免疫レパートリーを広げることができる。かかる実施形態の非限定例として、本発明者らは、Ｅ６Ｅ７ＳＨとそのＮ末端でのＥ２との融合タンパク質をコードする配列を調製した。本発明者らは、野生型ＨＰＶ１８  Ｅ２タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＡＡＰ２０５９７．１）の、２９４位のグリシン、３００位のリジン、および３０１位のシステインをそれぞれ、バリン、メチオニンおよびアルギニンに変異させて、ＤＮＡ結合活性を失活させた。これらの自然に生じる各変異は既に、Ｅ２結合ドメインを有するＤＮＡ配列へのＥ２の結合を完全に阻害する（Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ６：１０５−１６）。
【０１６５】
得られたポリペプチドは、ＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨと称し、配列番号２２を含む。このポリペプチドをコードするコドン最適化核酸を調製し、配列番号２３に示す。
【０１６６】
本発明のＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨポリペプチドをコードする配列は、Ｅ２の有無にかかわらず、例えば、ＤＮＡコンストラクトから、ＲＮＡから、またはウイルスベクターから発現され得る。図１５は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞内での、上記のような導入遺伝子を発現するＤＮＡベクターによる一過性のトランスフェクト時の発現を示す。トランスフェクション後、細胞を収集し、細胞抽出物を、ＨＰＶ１８のＥ６を認識する抗体を用いてのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングにより分析した。この実験は、発現ベクターのトランスフェクション時での適切なサイズの想定される融合タンパク質の発現を示す。
【０１６７】
Ｅ２の有無にかかわらず、またコードされた融合タンパク質の免疫原性を増強するための追加の配列の有無にかかわらず、アデノウイルスベクターを用いてＥ６Ｅ７を発現させることができる。
【０１６８】
上記のＨＰＶ１８デザイナー配列をコードする遺伝子は、Ｇｅｎｅａｒｔで、ヒト発現のために最適化され、合成された遺伝子であった。コザック配列（５’ＧＣＣＡＣＣ３’）をＡＴＧ開始コドンの直前に含め、また２つの停止コドン（５’ＴＧＡ  ＴＡＡ３’）はそれぞれのコード配列の終端に付加した。遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ部位を介して、ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵプラスミド中およびｐＡｄＡｐｔ２６プラスミド中に挿入した（Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７，２１３５−４３）。
【０１６９】
Ａｄ３５．ＨＰＶ１８−Ｅ６Ｅ７ＳＨは、上述したようなＨＰＶ１８デザイナー融合タンパク質変異体（ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ、配列番号２０に示すアミノ酸配列を有する）の発現のための、コドン最適化されたヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）ベクターである。Ｅ６およびＥ７の組み合わせ配列は、Ｅ１、Ｅ３が欠失したアデノウイルスゲノムのＥ１領域内のＣＭＶプロモーターの制御下に置いた。Ａｄ２６．ＨＰＶ１８−Ｅ６Ｅ７ＳＨは、組換えアデノウイルス血清型２６に基づく等価なベクターである。
【０１７０】
同様に、ＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（配列番号２２）変異体をコードするＡｄ２６およびＡｄ３５に基づく組換えアデノウイルスベクターを生成した。
【０１７１】
全てのアデノウイルスベクターは、上記実施例１に記載されるように作製され、調製され、精製され、そして保存された。
【０１７２】
実施例８．ＨＰＶ１８デザイナーコンストラクトの形質転換活性の欠如
ＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７タンパク質は、特定のアッセイにおける形質転換活性（例えば、軟寒天アッセイにおけるコロニー形成）として明白な腫瘍形成能を有する（Ｍａｓｓｉｍｉ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １１９：３８１−３９５）。実施例７に記載のＥ６Ｅ７ＳＨポリペプチドは、並び替えられた様式でのＥ６およびＥ７タンパク質の断片を含む。これは、例えばかかるアッセイにおける野生型Ｅ６タンパク質および野生型Ｅ７タンパク質のいずれかと比べて形質転換活性が失われることにより測定可能である通り、腫瘍形成能を排除することが期待される。
【０１７３】
他の研究者らは、遺伝子がシャッフルされたＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７の変異体は実際にその発癌性を失ったと報告し（Ｏｅｈｌｓｃｈｌａｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ２４：２８８０−９３；Ｈｅｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：４２５９−６６）、遺伝子シャッフリングがＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質の野生型機能を破壊することを実証した。実施例２において、本発明者らは、本発明者らのＨＰＶ１６に関するデザイナーコンストラクトがそのＥ６およびＥ７活性を失っていることを示した。
【０１７４】
腫瘍化特性の欠如を評価するため、本発明者らは、ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨコンストラクトが（例えば、Ｍａｓｓｉｍｉ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １１９：３８１−３９５で記載されるよう）ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞上の軟寒天中での増殖能を与える能力を評価した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞への野生型ＨＰＶ１８  Ｅ７を発現するプラスミドのトランスフェクションでは、常にコロニーが形成された。ＨＰＶ１６  Ｅ６で得られた結果と同様に、野生型ＨＰＶ１８  Ｅ６単独の発現によってはバックグラウンドを超えるコロニー形成は生じなかった。本発明者らのＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨコンストラクトのトランスフェクションは、４つの独立実験において軟寒天中での細胞のコロニーの増殖をもたらさず（図１６）、本発明のポリペプチドＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードする核酸がＥ７に関連した形質転換能力を失っていることを示した。
【０１７５】
Ｅ６およびＥ７の腫瘍形成能は、それぞれ細胞タンパク質のｐ５３およびｐＲｂのレベルを低下させるそれらの能力に関連している。本発明のポリペプチドＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードする核酸が分子レベルで野生型Ｅ６およびＥ７に関連した生物学的活性を有さないことを示すため、ｐ５３およびｐＲｂ分解アッセイを実施した。つまり、ＨＰＶ１８  Ｅ６ｗｔおよび本発明者らのＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨコンストラクトを、ｐ５３分解アッセイにおいて、内因性ｐ５３が欠如したＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞内で発現させた。ｐＲｂ分解アッセイにおいては、ＨＰＶ１８  Ｅ７ｗｔおよびＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨコンストラクトをｐＲｂヌルＳａｏｓ−２細胞内で発現させた。図１７で分かるように、ｐ５３と（ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨとでなく）ＨＰＶ１８  Ｅ６ｗｔとの同時発現は、ｐ５３レベルの低下をもたらす（パネルＡおよびＢ）。同様に、パネル１７Ｃ、Ｄは、ｐＲｂと（ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨとでなく）ＨＰＶ１８  Ｅ７ｗｔとの同時発現がｐＲＢレベルの低下をもたらすことを示す。これらのデータは、本発明のＨＰＶ１８デザイナーポリペプチドをコードする核酸が軟寒天中でのコロニー形成能を全く有さず、また野生型ＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７ポリペプチドの主な生物学的活性、すなわち、それぞれｐ５３およびｐＲｂを不活化する活性を有さないことを示している。
【０１７６】
本発明のポリペプチドをコードする核酸コンストラクトの安全性をさらに実証するため、本発明者らは、ＨＰＶ媒介性形質転換に対する天然標的細胞に非常に類似した、新生児包皮（ＨＥＫｎ細胞）由来の一次ヒト生殖器ケラチノサイトを用いた。一次ヒトケラチノサイトの不死化は、Ｅ６およびＥ７野生型双方の作用を必要とする（Ｍｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６３：４４１７−２１）。このアッセイは、おそらくは本発明者らのコンストラクトの安全性を実証するための生理学的に最も関連性のあるインビトロアッセイである（Ｍａｓｓｉｍｉ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １１９：３８１−３９５）。ＨＰＶ１８由来の野生型Ｅ６およびＥ７（Ｅ６Ｅ７ｗｔ）を発現するレンチウイルスを形質導入した細胞は、それらの寿命が非形質導入対照細胞と比べて延長し（図１８）、かつテロメラーゼの触媒サブユニットであるｈＴＥＲＴが活性化した（データは示さず）ことによって示されるように、一次ケラチノサイトにおける不死化を誘導する。本発明のＨＰＶ１８デザイナーポリペプチド（ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨ）の発現では、ＧＦＰが形質導入されたケラチノサイトまたは形質導入されないケラチノサイトと比べて寿命を延ばすことができない。２つの追加した独立ドナーにおいて同様の結果が得られた（データは示さず）。まとめると、これらのデータは、本発明者らのコンストラクトが、高度に生理学的なモデルと考えられる、一次ヒトケラチノサイトにおける不死化を誘導する能力を失っていることを示す。
【０１７７】
ＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７の同等の断片を異なる順序で組み換えた別のコンストラクトもまた、一次ヒト包皮ケラチノサイトを不死化することができなかった。しかし、ＨＰＶ１６の代替Ｅ６Ｅ７配列を用いた結果と同様に（実施例２を参照）、その代替ＨＰＶ１８コンストラクトでは寿命の延びが認められた。これは、この分野では一部予測不能であることを示し、また、この安全性に関連した態様における本発明の選択されたデザイナー分子の優位性を示している。
【０１７８】
本実施例における実験は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸の形質転換活性の欠如と、それ故にＨＰＶ１８  Ｅ６およびＥ７  ｗｔコンストラクトよりも著しく改善された安全性に関する強力な証拠を同時に提供する。
【０１７９】
実施例９．ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨデザイナーコンストラクトに対する免疫応答
本発明者らは、実施例７に記載のようなＤＮＡベクターおよびアデノウイルスベクターを調製した。ワクチンに誘導される免疫原性を評価するため、ＣＢ６Ｆ１マウスを、ＨＰＶ１８  Ｅ６Ｅ７ＳＨもしくはＥ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノベクター（Ａｄ３５）で、または対照として導入遺伝子をコードしないアデノベクター（エンプティ）で免疫した。プライム免疫の２週後、マウスをサクリファイスし、単離した脾細胞をＨＰＶ１８  Ｅ６の１５ｍｅｒペプチドプールで一晩刺激した。Ｅ６特異的免疫応答を、細胞内サイトカイン染色により分析した。別個の実験において、ＣＢ６Ｆ１マウスを、ＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノベクター（Ａｄ３５もしくはＡｄ２６）で、または対照として導入遺伝子をコードしないアデノベクター（エンプティ）で免疫した。
【０１８０】
図１９Ａは、ＩＣＳ分析による測定で、マウスのＡｄ３５．ＨＰＶ１８−Ｅ６Ｅ７ＳＨによる免疫がＥ６に特異的な免疫応答を誘導することを示している。さらに、図１９Ａの結果は、トランスフェクション時に観察された当該Ｅ２Ｅ６Ｅ７変異体の発現がより低かったにもかかわらず（図１５）、デザイナーコンストラクトのＮ末端へのＥ２の融合が免疫原性を減少させないことを示している。図１９Ｂは、マウスのＡｄ３５．ＨＰＶ１８−Ｅ６Ｅ７ＳＨまたはＡｄ２６．ＨＰＶ１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨによる免疫が、ＩＦＮγ産生ＨＰＶ１８−Ｅ６特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を同程度の割合で誘導することを示している。
【０１８１】
本発明のペプチドに対する細胞免疫応答は、異なるタイプのアデノウイルスベクターを用いて誘導され得る。図１９Ｂに示す実験では、マウスを、ＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６またはＡｄ３５アデノウイルスベクターで免疫した。データは、これらのアデノウイルスベクターがＨＰＶ１８  Ｅ６特異的Ｔ細胞を同程度に誘導したことを示している。
【０１８２】
実施例１０．ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８デザイナーコンストラクトを発現するアデノベクターの組み合わせ。
異なるＨＰＶ型に応じたデザイナーコンストラクトの組み合わせは、異なるＨＰＶ型を治療するワクチンを作製する可能性を提供する。異なるデザイナー配列を発現するアデノウイルスベクターの免疫応答誘導能力を評価するために、マウスを、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする）を発現するアデノベクター（Ａｄ２６）、およびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする）を発現するＡｄ２６を、それぞれ１×１０１０ｖｐの用量で、または、導入遺伝子をコードしないアデノベクター（エンプティ）を筋肉内注射することによって免疫した。免疫付与の４週後、同じ抗原を発現するＡｄ３５ベクターによる免疫により免疫応答を増大させた。ブースト免疫の２週後に免疫応答を測定した。細胞をＨＰＶ１８のＥ６またはＨＰＶ１６のＥ７に対応するペプチドプールで一晩刺激し、応答をＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴで測定した。データを図２０に示す。
【０１８３】
データは、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６／３５ベクターでのマウスの免疫により、両方（すなわち、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８）のデザイナータンパク質に対する細胞免疫応答が生じたことを示す。
【０１８４】
同様の免疫付与スケジュール（Ａｄ２６プライムおよびＡｄ３５ブースト）による独立した実験において、本発明者らは、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄが一緒に誘導する免疫応答を、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ単独で、またはＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ単独での免疫によりマウスに誘導する免疫応答と比較した。免疫応答はブースト免疫の２週後に測定し、細胞をＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＥ２、Ｅ６またはＥ７に対応するペプチドプールで一晩刺激し、応答をＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴおよび細胞内サイトカイン染色で測定した。ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄの単一組成物での同時投与により、個々のワクチン成分のみで免疫された動物と比較して、全体的にＣＤ４およびＣＤ８応答幅がより小さいという結果がもたらされたにもかかわらず、同時投与は、同様の幅の免疫応答を誘導した（データは示さず）。
【０１８５】
したがって、本発明のコンストラクトを発現するＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの同時投与により、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８両方に対する細胞免疫応答を誘導することができる。
【０１８６】
実施例１１．アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）における組み合わせデザイナーコンストラクトの免疫原性。
本発明のデザイナー配列を発現するアデノウイルスベクターが非ヒト霊長類における免疫応答を誘導する能力を評価するため、前の例のような２つの別個のアデノベクター、すなわち、共にＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６ベクターの混合物を各ベクター当たり１×１０１１ｖｐの用量で、または導入遺伝子をコードしないアデノベクター（エンプティ）を、筋肉内注射することにより、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）を免疫した。免疫付与の８週後、動物は同じ抗原を発現するＡｄ２６ベクターによりブースト免疫を受けた。１６週後、動物は、同じ抗原を発現するＡｄ３５ベクターの注射をさらに１回受けた。血液試料は数回の時点で採取し、単離した白血球をＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８両方のＥ２、Ｅ６またはＥ７に対応するペプチドプールで一晩刺激した。特異的応答をＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。データを図２１に示す。さらにプライム免疫の１０週後および１８週後、本発明のＨＰＶ１８デザイナー分子における新規な接合に及ぶペプチドに特異的な細胞免疫応答を評価した。このような接合ペプチドに対するＩＦＮγ応答の誘導は、全ての動物で、１×１０６ＰＢＭＣ当たり＜５０ＳＦＵの検出限界未満であった（データは示さず）。
【０１８７】
データは、共にＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６ベクターの組み合わせでの非ヒト霊長類の免疫により、コードされた導入遺伝子中に存在するいくつかのＨＰＶタンパク質に対する細胞免疫応答が生じたことを示す。応答はＡｄ２６ベクターによる追加免疫により増進され得た。対応するＡｄ３５ベクターでの１６週目での追加ブースト免疫により、免疫応答がさらに増強された。
【０１８８】
実施例１２．マウス腫瘍モデルにおける組み合わせコンストラクトの治療効果。
ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７に対応する本発明のポリペプチドは、ＴＣ−１モデルにおいて治療効果を導く、マウスにおける細胞免疫応答を誘導することができる（実施例５に示される通り）。共にＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の両デザイナータンパク質を発現するアデノウイルスベクターの組み合わせの治療効果を、この同じモデルにおいて試験した。ワクチンの不在下では、腫瘍は急速に増殖し、３０日以内に１０００ｍｍ３の所定のサイズに達し、この時点において倫理的理由でマウスをサクリファイスした。
【０１８９】
この実験では、０日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０４個のＴＣ−１細胞を皮下注射した。６日後、腫瘍が触知可能になったとき、マウスをＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ、またはＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＡｄ２６．ＨＰＶ１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの混合物で免疫した。全てのマウスはまた、対応するＡｄ３５ベクターによって２０日目にブースト免疫を受けた。ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するアデノウイルスベクターによるプライムブースト免疫は、マウスの生存を有意に延長することが観察された（図２２）。ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの両方を一緒に発現するアデノウイルスベクターの組み合わせを用いて、同様の平均生存時間を観察した。組み合わせワクチンを受けたマウスのグループ中、３匹の動物には９０日間のモニタリング期間終了時に腫瘍がなかった。
【０１９０】
他の実験の結果は、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを一緒に発現するアデノウイルスベクターでのプライム−ブースト免疫がまた、プライム免疫をより早期に（例えば、マウスにＴＣ−１細胞を皮下注射した４日後）投与した場合、マウスの生存を有意に延長することを示した（データは示さず）。
【０１９１】
結論として、本発明のＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に特異的なデザイナーポリペプチドを一緒に発現するアデノウイルスベクターの組み合わせによる免疫により、ＨＰＶ１６誘発癌に対する十分に確立されたチャレンジモデルにおいて、腫瘍増殖が有意に抑制されるかまたは定着腫瘍が完全に根絶された。
【０１９２】
実施例１３：ＨＰＶ１６Ｅ２Ｅ６Ｅ７およびＨＰＶ１８Ｅ２Ｅ６Ｅ７のためのＭＶＡベクター（ＭＶＡ−ＢＮ  ｍＢＮ４１１）の構築
本実施例では、本発明者らは、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７およびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７を含むＭＶＡ−ＢＮベクターを生成した。Ｅ２の有無にかかわらず、またコードされたポリペプチドの免疫原性を増強する追加の配列の有無にかかわらず、ＭＶＡ−ＢＮベクターを用いてＥ６Ｅ７を発現させることができると理解されている。
【０１９３】
本発明者らは、ポリペプチドＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７（配列番号３）をコードする新規の核酸（配列番号２４）、およびポリペプチドＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７（配列番号２２）をコードする新規の核酸（配列番号２５）を設計した。新規の核酸は、ヒトの発現および互いの間の最小の相同性のために設計された。核酸配列はＧｅｎｅａｒｔで合成した。
【０１９４】
ＰｒＭＶＡ１３．５ロングプロモーター（配列番号２６）は、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７のＡＴＧ開始コドンの前に含まれ、２つの停止コドン（５’ＴＧＡ  ＴＧＡ３’）はコード配列の終端に付加された。ＰｒＨｙｂプロモーター（配列番号２７）は、ＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７のＡＴＧ開始コドンの前に含まれ、２つの停止コドン（５’ＴＧＡ  ＴＧＡ３’）はコード配列の終端に付加された。初期終結シグナル（５’ＴＴＴＴＴＡＴ３’）は両核酸配列のそれぞれの終止コドンの後に挿入された。
【０１９５】
遺伝子が、ＳａｃＩＩおよびＮｈｅＩにより、ＩＧＲ８８／８９  ＭＶＡ−ＢＮ相同領域をコードするトランスファーベクターであるｐＢＮＸ２０２へ挿入され、したがって、相同組換えによるＭＶＡ−ＢＮのＩＧＲ８８／８９の挿入部位への挿入を可能にする。さらに、ｐＢＮＸ２０２は、正の選択のためのｍＲＦＰ１およびｅｃｏｇｐｔ、ならびに選択圧の非存在下での相同組換えによる選択カセットの後の切除のためのＩＧＲ８８／８９  ＭＶＡ−ＢＮ相同領域Ｆｌａｎｋ２の反復配列をコードする。
【０１９６】
ＭＶＡベースのベクターを、初代ニワトリ線維芽細胞（ＣＥＦ）において生成し、本明細書中に記載されるように産生した。
【０１９７】
ＣＥＦ細胞を毎週ニワトリ胚から単離し、ＦＢＳを含まないＶＰ−ＳＦＭ培地中で維持した。
【０１９８】
簡潔に記すと、ＣＥＦ細胞に、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって提供される説明書に従ってＦｕｇｅｎｅを使用して、ＭＶＡベクタープラスミドをトランスフェクトし、ＭＶＡ−ＢＮによる同時感染を行った。２日後に細胞を収集し、超音波処理し、さらにプラーク精製を行った。ウイルスをプラーク精製し、マルチウェル２４組織培養プレートの単一ウェルまたはマルチウェル９６組織培養プレートの単一ウェルでそれぞれ培養したＣＥＦ細胞で増幅した。マルチウェル６組織プレートの単一ウェルと、その後のＴ１７５組織培養フラスコ内で培養したＣＥＦ細胞内でさらなる増幅を実施した。
【０１９９】
ウイルスｍＢＮ  ４１１Ａを生成するために、１１継代を生成し、そのうちの３継代は、ミコフェノール酸／キサンチンおよびヒポキサンチンを含むＶＰ−ＳＦＭ培地におけるプラーク精製であった。ｍＢＮ４１１Ｂを生成するために、１７継代を生成し、そのうちの６継代は、相同組換えによる選択カセットの切除を可能にするための選択圧なしのＶＰ−ＳＦＭ培地中でのプラーク精製であった。
【０２００】
したがって、ＭＶＡ  ｍＢＮ  ４１１ウイルスは、そのＩＧＲ８８／８９領域に、ＰｒＭＶＡ１３．５ロングプロモーター（配列番号２６）の制御下、デザイナーポリペプチドＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（配列３）をコードする核酸、およびＰｒＨｙｂプロモーター（配列番号２７）の制御下、デザイナーポリペプチドＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（配列２２）をコードする核酸を含むＭＶＡ−ＢＮである。その後の実験において、ＭＶＡ  ｍＢＮ４１１ウイルスを、デザイナーポリペプチドをコードするアデノウイルスベクターを用いるプライム−ブーストレジメンにおいて使用した。
【０２０１】
実施例１４．Ａｄ２６プライムおよびＭＶＡブースト免疫におけるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８デザイナーコンストラクトのマウスにおける免疫原性
アデノベクター（Ａｄ２６）によるプライム免疫および変異ワクシニアアンカラウイルス（ＭＶＡ）によるブースト免疫によって誘導されるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８特異的免疫応答を評価した。プライミング免疫として、マウスに、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする）を発現するアデノベクター（Ａｄ２６）、およびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ（配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする）を発現するＡｄ２６を、各ベクター当たり１×１０１０ｖｐの用量で、または、対照として導入遺伝子をコードしないアデノベクター（エンプティ）を筋肉内注射することによってワクチン接種した。プライム免疫の８週間後、動物を、プライム免疫中と同じ抗原を発現するＭＶＡでブースト免疫し（ＭＶＡ  ＢＮ  ｍＢＮ  ４１１Ａ、８．９×１０７ＴＣＩＤ５０／マウスの用量で）、一方、別の群のマウスを、プラーム免疫中と同じ抗原を発現するＡｄ３５ベクターでブースト免疫した。対照動物は、導入遺伝子を発現しないＭＶＡベクター（対照）でブースト免疫した。
【０２０２】
ブースト免疫の２週後に免疫応答を測定した。細胞をＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８のＥ２、Ｅ６またはＥ７に対応するペプチドプールで一晩刺激し、応答をＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴで測定した。データを図２３に示す。
【０２０３】
データは、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６／３５ベクターまたはＡｄ２６／ＭＶＡベクターでのマウスの免疫により、両方（すなわち、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８）のデザイナータンパク質に対する細胞免疫応答が生じたことを示す。全体応答は、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＭＶＡでブースト免疫した動物において最も高かった。
【０２０４】
実施例１５．Ａｄ２６プライムおよびＭＶＡブースト免疫におけるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８デザイナーコンストラクトのアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）における免疫原性
本発明者らは、非ヒト霊長類において免疫応答を誘導する本発明のデザイナー配列を発現するアデノウイルスベクターおよびＭＶＡベクターの能力を評価した。アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）（非ヒト霊長類、ＮＨＰ）を、実施例１１におけるように、２つの別々のアデノベクター、すなわち、ＨＰＶ１６Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６およびＨＰＶ１８Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ２６の混合物を、各アデノウイルスベクター当たり１×１０１１ｖｐの用量で筋肉内注射することによってプライム免疫した。プライム免疫の８週間後、動物をＭＶＡ−ＢＮ（ｍＢＮ  ４１１Ａ、これらの同じ抗原を発現するベクター、約１．８０×１０８ＴＣＩＤ５０／ＮＨＰの用量で）でブーストした。
【０２０５】
血液試料は数回の時点で採取し、単離した白血球をＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８両方のＥ２、Ｅ６またはＥ７に対応するペプチドプールで一晩刺激した。特異的応答をＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴにより測定した。データを図２４に示す。
【０２０６】
データは、ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＨＰＶ１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨを発現するＡｄ／ＭＶＡを用いたアカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）の免疫化が、設計された抗原に対する細胞性免疫応答をもたらしたことを示している。さらに、誘導された細胞応答はワクチンベクターによって発現される６つの異なるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８抗原のうちの３〜５に対する応答と共に、ＭＶＡブースティングによって拡大されるようである。
【０２０７】
実施例１６．Ａｄ２６プライムおよびＭＶＡブースト免疫におけるＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８デザイナーコンストラクトのマウスにおける治療効果
アデノウイルスベクターおよびＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８デザイナータンパク質を発現するＭＶＡによるプライムブースト免疫の治療効果を、実施例１２に記載のものと同じＴＣ−１モデルにおいて試験した。腫瘍増殖を経時的に追跡し、腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えた時点で、倫理的理由から動物をサクリファイスした。
【０２０８】
実験計画は以下の通りである：
【０２０９】
【表１】
2019514943.tif 000003
【０２１０】
治療群。プライミング当日、腫瘍は最低５０％の動物で触知可能であった。（ＨＰＶ１６−ＴｘおよびＨＰＶ１８−Ｔｘは、それぞれ配列番号３および２０を有するポリペプチドをコードする本発明のコンストラクトの表示である）。
【０２１１】
血液を、ＴＣ−１腫瘍細胞接種の前、１９日目（すなわち、ブースト投与の１日前）および３４日目（すなわち、ブースト投与の２週間後）に採取し、数匹のマウスにおいて、ＴＣ−１腫瘍細胞接種の９０日後にも血液を採取した。
【０２１２】
この実験では、０日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに５×１０４個のＴＣ−１細胞を皮下注射した。６日後、腫瘍が触知可能になったとき、マウスをＡｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＡｄ２６．ＨＰＶ１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨの混合物で免疫した。マウスは２０日目に、Ａｄ２６．ＨＰＶ１６−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨおよびＡｄ２６．ＨＰＶ１８−Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨ、またはＭＶＡ−ＢＮ−ＨＰＶ１６／１８−Ｔｘによるブースト免疫を受けた。対照マウスには導入遺伝子をコードしないＡｄ２６でプライミングし、導入遺伝子をコードしないＭＶＡでブースト免疫した。Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードするＡｄ２６／Ａｄ３５、またはＨＰＶ１６／１８  Ｅ２Ｅ６Ｅ７ＳＨをコードするＭＶＡ−ＢＮで免疫した動物は、生存期間の延長および平均生存期間が同等であり、両方の群において、１匹のマウスが９０日のモニタリング期間の終わりに生存しており、腫瘍がなかった。データを図２５に示す。
【０２１３】
明細書中の例は単なる例示とみなされ、本発明の真の範囲と精神は以下の特許請求の範囲によって示される。
【０２１４】
参考文献
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Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ  ＭＧ，Ｃａｒｒｏｌｌ  Ｆ，Ｍｏｒｒｉｓ  ＳＪ，Ｔｕｒｎｅｒ  ＡＶ，Ｖａｕｇｈａｎ  ＡＭ，Ｋａｐｕｌｕ  ＭＣ，Ｃｏｌｌｏｃａ  Ｓ，Ｓｉａｎｉ  Ｌ，Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＳＣ，Ｈｉｌｌ  ＡＶ（２０１２）Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １０９：７１９−７２８
Ｄａａｙａｎａ  Ｓ，Ｅｌｋｏｒｄ  Ｅ，Ｗｉｎｔｅｒｓ  Ｕ，Ｐａｗｌｉｔａ  Ｍ，Ｒｏｄｅｎ  Ｒ，Ｓｔｅｒｎ  ＰＬ，Ｋｉｔｃｈｅｎｅｒ  ＨＣ（２０１０）Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ  ａｎｄ  ＨＰＶ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｖｕｌｖａｌ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０２：１１２９−１１３６
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Ｆａｌｌａｕｘ  ＦＪ，Ｂｏｕｔ  Ａ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｌｄｅ  Ｉ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｗｏｌｌｅｎｂｅｒｇ  ＤＪ，Ｈｅｈｉｒ  ＫＭ，Ｋｅｅｇａｎ  Ｊ，Ａｕｇｅｒ  Ｃ，Ｃｒａｍｅｒ  ＳＪ，ｖａｎ  Ｏｒｍｏｎｄｔ  Ｈ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ  ＡＪ，Ｖａｌｅｒｉｏ  Ｄ，Ｈｏｅｂｅｎ  ＲＣ（１９９８）Ｎｅｗ  ｈｅｌｐｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｇｉｏｎ  １−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：１９０９−１９１７
Ｆｒｏｋｊａｅｒ  Ｓ，  Ｈｏｖｇａａｒｄ  Ｌ  （２０００）  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ
Ｇａｌｌ  ＪＧ，Ｌｉｚｏｎｏｖａ  Ａ，ＥｔｔｙＲｅｄｄｙ  Ｄ，ＭｃＶｅｙ  Ｄ，Ｚｕｂｅｒ  Ｍ，Ｋｏｖｅｓｄｉ  Ｉ，Ａｕｇｈｔｍａｎ  Ｂ，Ｋｉｎｇ  ＣＲ，Ｂｒｏｕｇｈ  ＤＥ（２００７）Ｒｅｓｃｕｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３５：２６３−２７３
Ｇａｏ  ＧＰ，Ｅｎｇｄａｈｌ  ＲＫ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＭ（２０００）Ａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｙｉｅｌｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ１−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１：２１３−２１９
Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ（１９９０）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｍａｃｋ
Ｇｉｌｂｅｒｔ  Ｒ，Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ  Ｃ，Ｇａｇｎｏｎ  Ｄ，Ｂｅｒｎｉｅｒ  Ａ，Ｂｏｕｒｇｅｔ  Ｌ，Ｅｌａｈｉ  ＳＭ，Ｋａｍｅｎ  Ａ，Ｍａｓｓｉｅ  Ｂ（２０１４）Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｗ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅ１−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０８：１７７−１８８
Ｈａｍｉｄ  Ｏ，  Ｃａｒｖａｊａｌ  ＲＤ  （２０１３）  Ａｎｔｉ−ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−１  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ  １  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  １３：８４７−８６１
Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ，  Ｌａｎｅ  Ｄ  （１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
Ｈａｖｅｎｇａ  Ｍ，Ｖｏｇｅｌｓ  Ｒ，Ｚｕｉｊｄｇｅｅｓｔ  Ｄ，Ｒａｄｏｓｅｖｉｃ  Ｋ，Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｓ，Ｓｉｅｕｗｅｒｔｓ  Ｍ，Ｗｅｉｃｈｏｌｄ  Ｆ，Ｄａｍｅｎ  Ｉ，Ｋａｓｐｅｒｓ  Ｊ，Ｌｅｍｃｋｅｒｔ  Ａ，ｖａｎ  Ｍｅｅｒｅｎｄｏｎｋ  Ｍ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｕｇｔ  Ｒ，Ｈｏｌｔｅｒｍａｎ  Ｌ，Ｈｏｎｅ  Ｄ，Ｓｋｅｉｋｙ  Ｙ，Ｍｉｎｔａｒｄｊｏ  Ｒ，Ｇｉｌｌｉｓｓｅｎ  Ｇ，Ｂａｒｏｕｃｈ  Ｄ，Ｓａｄｏｆｆ  Ｊ，Ｇｏｕｄｓｍｉｔ  Ｊ（２００６）Ｎｏｖｅｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｂ−ｇｒｏｕｐ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ｈｉｇｈ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｙｉｅｌｄ  ｉｎ  ＰＥＲ．Ｃ６  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：２１３５−２１４３
Ｈｅｎｋｅｎ  ＦＥ，Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  Ｋ，Ｏｈｌｓｃｈｌａｇｅｒ  Ｐ，Ｂｏｓｃｈ  Ｌ，Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇ  Ｅ，Ｈａａｎｅｎ  ＪＢ，Ｓｔｅｅｎｂｅｒｇｅｎ  ＲＤ（２０１２）Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＨＰＶ１６  Ｅ６  ａｎｄ  Ｅ７．Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０：４２５９−４２６６
Ｈｉｌｄｅｓｈｅｉｍ  Ａ，Ｈｅｒｒｅｒｏ  Ｒ，Ｗａｃｈｏｌｄｅｒ  Ｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＡＣ，Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｄ，Ｂｒａｔｔｉ  ＭＣ，Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ＪＴ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｐ，Ｄｕｂｉｎ  Ｇ，Ｐｏｒｒａｓ  Ｃ，Ｊｉｍｅｎｅｚ  ＳＥ，Ｌｏｗｙ  ＤＲ（２００７）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  １６／１８  Ｌ１  ｖｉｒｕｓｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｍｏｎｇ  ｙｏｕｎｇ  ｗｏｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ．ＪＡＭＡ  ２９８：７４３−７５３
Ｈｏｇａｎｓｏｎ  ＤＫ，Ｍａ  ＪＣ，Ａｓａｔｏ  Ｌ，Ｏｎｇ  Ｍ，Ｐｒｉｎｔｚ  ＭＡ，Ｈｕｙｇｈｅ  ＢＧ，Ｓｏｓｎｏｗｓｈｉ  ＢＡ，Ｄ’Ａｎｄｒｅａ  ＭＪ（２００２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｊ  １：４３−４８
Ｈｏｏｆ  Ｉ，Ｐｅｔｅｒｓ  Ｂ，Ｓｉｄｎｅｙ  Ｊ，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ＬＥ，Ｓｅｔｔｅ  Ａ，Ｌｕｎｄ  Ｏ，Ｂｕｕｓ  Ｓ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｍ（２００９）ＮｅｔＭＨＣｐａｎ，ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｂｅｙｏｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６１：１−１３
Ｈｏｒｗｉｔｚ  ＭＳ  （１９９６）  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｉｎ：  Ｆｉｅｌｄｓ  ＢＮ，  Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ，  Ｂａｉｎｅｓ  ＪＤ  （ｅｄｓ）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
Ｋｅｎｔｅｒ  ＧＧ，Ｗｅｌｔｅｒｓ  ＭＪ，Ｖａｌｅｎｔｉｊｎ  ＡＲ，Ｌｏｗｉｋ  ＭＪ，Ｂｅｒｅｎｄｓ−ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ  ＤＭ，Ｖｌｏｏｎ  ＡＰ，Ｅｓｓａｈｓａｈ  Ｆ，Ｆａｔｈｅｒｓ  ＬＭ，Ｏｆｆｒｉｎｇａ  Ｒ，Ｄｒｉｊｆｈｏｕｔ  ＪＷ，Ｗａｆｅｌｍａｎ  ＡＲ，Ｏｏｓｔｅｎｄｏｒｐ  Ｊ，Ｆｌｅｕｒｅｎ  ＧＪ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  ＳＨ，Ｍｅｌｉｅｆ  ＣＪ（２００９）Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＰＶ−１６  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｖｕｌｖａｒ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１：１８３８−１８４７
Ｋｉｂｂｅ  ＡＨ  （２０００）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌｏｎｄｏｎ
Ｋｉｍ  ＴＪ，  Ｊｉｎ  ＨＴ，  Ｈｕｒ  ＳＹ，  Ｙａｎｇ  ＨＧ，  Ｓｅｏ  ＹＢ，  Ｈｏｎｇ  ＳＲ，  Ｌｅｅ  ＣＷ，  Ｋｉｍ  Ｓ，  Ｗｏｏ  ＪＷ，  Ｐａｒｋ  ＫＳ，  Ｈｗａｎｇ  ＹＹ，  Ｐａｒｋ  Ｊ，  Ｌｅｅ  ＩＨ，  Ｌｉｍ  ＫＴ，  Ｌｅｅ  ＫＨ，  Ｊｅｏｎｇ  ＭＳ，  Ｓｕｒｈ  ＣＤ，  Ｓｕｈ  ＹＳ，  Ｐａｒｋ  ＪＳ，  Ｓｕｎｇ  ＹＣ  （２０１４）  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ＨＰＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｌｅｓｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｉｎ  ＣＩＮ３  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ５：５３１７  （ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ６３１７）
Ｋｏｖｅｓｄｉ  Ｉ，  Ｈｅｄｌｅｙ  ＳＪ  （２０１０）  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｖｉｒｕｓｅｓ  ２：１６８１−１７０３
Ｌｉｎ  ＫＹ，Ｇｕａｒｎｉｅｒｉ  ＦＧ，Ｓｔａｖｅｌｅｙ−Ｏ’Ｃａｒｒｏｌｌ  ＫＦ，Ｌｅｖｉｔｓｋｙ  ＨＩ，Ａｕｇｕｓｔ  ＪＴ，Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ，Ｗｕ  ＴＣ（１９９６）Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５６：２１−２６
Ｌｕｎｄｅｇａａｒｄ  Ｃ，Ｌａｍｂｅｒｔｈ  Ｋ，Ｈａｒｎｄａｈｌ  Ｍ，Ｂｕｕｓ  Ｓ，Ｌｕｎｄ  Ｏ，Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｍ（２００８）ＮｅｔＭＨＣ−３．０：ａｃｃｕｒａｔｅ  ｗｅｂ  ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ，ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｍｏｎｋｅｙ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  ｌｅｎｇｔｈ  ８−１１．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６：Ｗ５０９−５１２
Ｍａｓｓｉｍｉ  Ｐ，  Ｂａｎｋｓ  Ｌ  （２００５）  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ＨＰＶ  Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉｎ：  Ｄａｖｙ  Ｃ，  Ｄｏｏｒｂａｒ  Ｊ  （ｅｄｓ）  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ  ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｖｏｌ  １１９：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  Ｂｅｒｌｉｎ，  ｐｐ  ３８１−３９５
Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ＤＡ，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｄ，Ｅｖｅｌｅｇｈ  Ｃ，Ｇｒａｈａｍ  ＦＬ，Ｐｒｅｖｅｃ  Ｌ（１９９９）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ２９３  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｌａｃ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ８０（Ｐｔ  ２）：３４５−３５３
ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ＭＪ，  Ｈａｍｅｓ  ＢＤ，  Ｔａｙｌｏｒ  ＧＲ  （１９９５）  ＰＣＲ  ２  ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ
Ｍｅｌｌｍａｎ  Ｉ，  Ｃｏｕｋｏｓ  Ｇ，  Ｄｒａｎｏｆｆ  Ｇ  （２０１１）  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ａｇｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８０：４８０−４８９
Ｍｕｌｌｉｃｋ  Ａ，Ｘｕ  Ｙ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｒ，Ｋｏｕｔｒｏｕｍａｎｉｓ  Ｍ，Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ  Ｃ，Ｂｒｏｕｓｓａｕ  Ｓ，Ｍａｌｅｎｆａｎｔ  Ｆ，Ｂｏｕｒｇｅｔ  Ｌ，Ｌａｍｏｕｒｅｕｘ  Ｌ，Ｌｏ  Ｒ，Ｃａｒｏｎ  ＡＷ，Ｐｉｌｏｔｔｅ  Ａ，Ｍａｓｓｉｅ  Ｂ（２００６）Ｔｈｅ  ｃｕｍａｔｅ  ｇｅｎｅ−ｓｗｉｔｃｈ：ａ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：４３
Ｍｕｎｇｅｒ  Ｋ，Ｐｈｅｌｐｓ  ＷＣ，Ｂｕｂｂ  Ｖ，Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ，Ｓｃｈｌｅｇｅｌ  Ｒ（１９８９）Ｔｈｅ  Ｅ６  ａｎｄ  Ｅ７  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  ｔｏｇｅｔｈｅｒ  ａｒｅ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ａｎｄ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６３：４４１７−４４２１
Ｏｇｕｎ  ＳＡ，Ｄｕｍｏｎ−Ｓｅｉｇｎｏｖｅｒｔ  Ｌ，Ｍａｒｃｈａｎｄ  ＪＢ，Ｈｏｌｄｅｒ  ＡＡ，Ｈｉｌｌ  Ｆ（２００８）Ｔｈｅ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｃ４−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃ４ｂｐ）ａｃｔｓ  ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  １９−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ｆｕｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍｕｒｉｎｅ  Ｃ４ｂｐ  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌａｒｉａ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７６：３８１７−３８２３
Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  Ｋ，Ａｌｅｙｄ  Ｅ，Ｖｒｉｊｌａｎｄ  Ｋ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ＴＮ，Ｈａａｎｅｎ  ＪＢ（２０１２ａ）Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １６  Ｅ６−  ａｎｄ  Ｅ７−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２３：１３０１−１３１２
Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  Ｋ，Ｏｈｌｓｃｈｌａｇｅｒ  Ｐ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ＪＨ，Ｔｏｅｂｅｓ  Ｍ，Ｇｏｍｅｚ  Ｒ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ＴＮ，Ｈａａｎｅｎ  ＪＢ（２０１１）Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＰＶ  １６  Ｅ６  ａｎｄ  Ｅ７．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９：３９７−４０６
Ｏｏｓｔｅｒｈｕｉｓ  Ｋ，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ＪＨ，  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ＴＮ，  Ｈａａｎｅｎ  ＪＢ  （２０１２ｂ）  ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｔａｔｔｏｏｉｎｇ．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５１：２２１−２５０
Ｐｅｔｅｒｓ  Ｂ，Ｔｏｎｇ  Ｗ，Ｓｉｄｎｅｙ  Ｊ，Ｓｅｔｔｅ  Ａ，Ｗｅｎｇ  Ｚ（２００３）Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｔｏ  ＭＨＣ−Ｉ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９：１７６５−１７７２
Ｐｒａｋａｓｈ  ＳＳ，Ｇｒｏｓｓｍａｎ  ＳＲ，Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  ＲＢ，Ｌａｉｍｉｎｓ  ＬＡ，Ａｎｄｒｏｐｈｙ  ＥＪ（１９９２）Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｃｏｎｔａｃｔ  ａｎｄ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｍｐｌｙ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｅ２  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ６：１０５−１１６
Ｒｕｂｉｎｃｈｉｋ  Ｓ，Ｄｉｎｇ  Ｒ，Ｑｉｕ  ＡＪ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ，Ｄｏｎｇ  Ｊ（２０００）Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｗｈｉｃｈ  ｄｅｌｉｖｅｒｓ  ＦａｓＬ−ＧＦＰ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｅｔ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７：８７５−８８５
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＪＦＥＦＭＴ  （１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．
Ｓａｋａｉ  Ｈ，  Ｙａｓｕｇｉ  Ｔ，  Ｂｅｎｓｏｎ  ＪＤ，  Ｄｏｗｈａｎｉｃｋ  ＪＪ，  Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ  （１９９６）  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １６  Ｅ２  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ｓｅｐａｒａｂｌｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：  １６０２−１６１１
Ｓｅｄｍａｎ  ＳＡ，Ｂａｒｂｏｓａ  ＭＳ，Ｖａｓｓ  ＷＣ，Ｈｕｂｂｅｒｔ  ＮＬ，Ｈａａｓ  ＪＡ，Ｌｏｗｙ  ＤＲ，Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  ＪＴ（１９９１）Ｔｈｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  Ｅ６  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １６  ｈａｓ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅ７  ｔｏ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６５：４８６０−４８６６
Ｓｈｅｎｋ  Ｔ  （１９９６）  Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎ：  Ｆｉｅｌｄｓ  ＢＮ，  Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ，  Ｂａｉｎｅｓ  ＪＤ  （ｅｄｓ）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ
Ｓｍａｈｅｌ  Ｍ，Ｓｉｍａ  Ｐ，Ｌｕｄｖｉｋｏｖａ  Ｖ，Ｖｏｎｋａ  Ｖ（２００１）Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＨＰＶ１６  Ｅ７  Ｇｅｎｅｓ  ａｓ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｅ７−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  Ｃｅｌｌｓ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８１：２３１−２３８
ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  ＳＨ，  Ｍｅｌｉｅｆ  ＣＪ  （２０１１）  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：２５２−２５７
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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