(57)【要約】創傷を治療するための方法が、本明細書で提供される。このような方法は、創傷を有効量のＢＲＡＦ阻害剤と接触させる工程を含む。いくつかの態様では、ＢＲＡＦ阻害剤は、医薬組成物の一部であることとしてもよい。このような場合には、医薬組成物は、有効量のＢＲＡＦ阻害剤および薬学的に許容される担体を含むこととしてもよい。ある態様では、医薬組成物は、軟膏、クリーム液、ゲル、ヒドロゲル、またはスプレーを含む外用薬である。さらに、いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤またはその医薬組成物は、創傷治療時に使用するための創傷被覆材の一部であることとしてもよい。この場合には、創傷被覆材は、ＢＲＡＦ阻害剤またはその医薬組成物をしみ込ませているか、あるいは、ＢＲＡＦ阻害剤またはその医薬組成物でコートされていることとしてもよい。
2019522652.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
障害または病気に起因する創傷を治療するための方法であって、有効量のＢＲＡＦ阻害剤を対象の創傷に接触させ、前記対象は障害または病気を患っている、方法。
【請求項２】
前記障害または病気は、表皮水疱症（ＥＢ）、スティーブンス−ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、ブドウ球菌性皮膚炎症候群（ＳＳＳＳ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、または中毒性ショック症候群（ＴＳＳ）である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は、式（Ｉ）〜（ＩＶ）または薬学的に許容されるその塩のいずれか１つに係る構造を有する、請求項１の方法。
【請求項４】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は、ＡＭＧ５４２、ＡＲＱ１９７、ＡＲＱ７３６、ＡＺ６２８、ＣＥＰ−３２４９６、ＧＤＣ−０８７９、ＧＳＫ１１２０２１２、ＧＳＫ２１１８４３６（ダブラフェニブ、Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標））、ＬＧＸ８１８（エンコラフェニブ）、ＮＭＳ−Ｐ１８６、ＮＭＳ−Ｐ３４９、ＮＭＳ−Ｐ３８３、ＮＭＳ−Ｐ３９６、ＮＭＳ−Ｐ７３０、ＰＬＸ３６０３（ＲＯ５２１２０５４）、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標））、ＰＬＸ４７２０（ジフルオロフェニル−スルホンアミン）、ＰＦ−０４８８０５９４、ＰＬＸ４７３４、ＲＡＦ２６５（ＣＨＩＲ−２６５）、ＲＯ４９８７６５５、ＳＢ５９０８８５、ソラフェニブ、トシル酸ソラフェニブ，およびＸＬ２８１（ＢＭＳ−９０８６６２）からなる群から選択される、請求項１または３の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つの方法であって、ＢＲＡＦ阻害剤は医薬組成物の一部であり、
該医薬組成物は、
有効量のＢＲＡＦ阻害剤と、
薬学的に許容される担体とを含む、方法。
【請求項６】
前記医薬組成物は、創傷被覆材にしみ込ませている、または、創傷被覆材をコートしている、請求項５の方法。
【請求項７】
前記創傷被覆材は、アルギン酸塩被覆材、抗菌被覆材、包帯、バンドエイド（登録商標）、生合成被覆材、生物学的被覆材、コラーゲン被覆材、複合被覆材、圧縮被覆材、接触層被覆材、フォーム被覆材、ガーゼ被覆材、親水コロイド被覆材、ヒドロゲル被覆材、スキンシーラントまたは液体スキン被覆材、特殊吸収性被覆材、透明フィルム被覆材、または創傷フィラーである、請求項６の方法。
【請求項８】
創傷に接触させることは、軟膏、クリーム液、ゲル、ヒドロゲル、またはスプレーの局所投与により達成される、請求項１の方法。
【請求項９】
前記ＢＲＡＦ阻害剤と組み合わせて第２の血管新生促進剤を投与することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１つの方法。
【請求項１０】
第２の血管新生促進剤は、線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、アンジオポエチン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、デルタ様リガンド４（Ｄｌｌ４）、またはクラス３セマフォリン（ＳＥＭＡ３）である、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は、ＬＧＸ８１８（エンコラフェニブ）である、請求項１〜１０のいずれか１つの方法。
【請求項１２】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は、ＧＳＫ２１１８４３６（ダブラフェニブ、Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標））である、請求項１〜１０のいずれか１つの方法。
【請求項１３】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標））である、請求項１〜１０のいずれか１つの方法。
【請求項１４】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は、増強されたＭＡＰＫ活性化の活性を有する、請求項１〜１３のいずれか１つの方法。
【請求項１５】
有効量のＢＲＡＦ阻害剤、
第２の血管新生促進剤、および
薬学的に許容される担体、
を含む、創傷を治療するための医薬組成物。
【請求項１６】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は、式（Ｉ）〜（ＩＶ）または薬学的に許容されるその塩のいずれか１つに係る構造を有する、請求項１５の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は、ＡＭＧ５４２、ＡＲＱ１９７、ＡＲＱ７３６、ＡＺ６２８、ＣＥＰ−３２４９６、ＧＤＣ−０８７９、ＧＳＫ１１２０２１２、ＧＳＫ２１１８４３６（ダブラフェニブ、Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標））、ＬＧＸ８１８（エンコラフェニブ）、ＮＭＳ−Ｐ１８６、ＮＭＳ−Ｐ３４９、ＮＭＳ−Ｐ３８３、ＮＭＳ−Ｐ３９６、ＮＭＳ−Ｐ７３０、ＰＬＸ３６０３（ＲＯ５２１２０５４）、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標））、ＰＬＸ４７２０（ジフルオロフェニル−スルホンアミン）、ＰＦ−０４８８０５９４、ＰＬＸ４７３４、ＲＡＦ２６５（ＣＨＩＲ−２６５）、ＲＯ４９８７６５５、ＳＢ５９０８８５、ソラフェニブ、トシル酸ソラフェニブ、およびＸＬ２８１（ＢＭＳ−９０８６６２）からなる群から選択される、請求項１５または１６の医薬組成物。
【請求項１８】
軟膏、クリーム液、ゲル、ヒドロゲル、またはスプレーを含む外用薬である、請求項１５〜１７のいずれか１つの医薬組成物。
【請求項１９】
前記第２の血管新生促進剤は、線維芽細胞増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、アンジオポエチン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、デルタ様リガンド４（Ｄｌｌ４）、またはクラス３セマフォリン（ＳＥＭＡ３）である、請求項１５〜１８のいずれか１つの医薬組成物。
【請求項２０】
前記医薬組成物は、創傷被覆材にしみ込ませている、または、創傷被覆材をコートしている、請求項１５〜１９のいずれか１つの医薬組成物。
【請求項２１】
前記創傷被覆材は、アルギン酸塩被覆材、抗菌被覆材、包帯、バンドエイド（登録商標）、生合成被覆材、生物学的被覆材、コラーゲン被覆材、複合被覆材、 圧縮被覆材、接触層被覆材、フォーム被覆材、ガーゼ被覆材、親水コロイド被覆材、ヒドロゲル被覆材、スキンシーラントまたは液体スキン被覆材、特殊吸収性被覆材、透明フィルム被覆材、または創傷フィラーである、請求項２０の医薬組成物。
【請求項２２】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は、ＬＧＸ８１８（エンコラフェニブ）である、請求項１５〜２１のいずれか１つの医薬組成物。
【請求項２３】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は、ＧＳＫ２１１８４３６（ダブラフェニブ、Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標））である、請求項１５〜２１のいずれか１つの医薬組成物。
【請求項２４】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標））である、請求項１５〜２１のいずれか１つの医薬組成物。
【請求項２５】
前記ＢＲＡＦ阻害剤は、増強されたＭＡＰＫ活性化の活性を有する、請求項１５〜２４のいずれか１つの医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本出願は、２０１６年６月２１日に出願された米国特許仮出願第６２／３５２，９７６号の優先権を主張し、その開示は参照により本明細書（図面を含む）に組み込まれる。
【０００２】
政府の利益に関する声明
本発明は、それぞれ国立衛生研究所（ＮＩＨ）から授与されたＰ０１ ＣＡ１６８５８５およびＲ３５ ＣＡ１９７６３３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
セリン／スレオニンタンパク質キナーゼＢ‐Ｒａｆ（「Ｂ‐Ｒａｆ」または「ＢＲＡＦ」）は、ＭＡＰキナーゼ／ＥＲＫシグナル伝達経路の調節に関与し、細胞分化、分裂、および分泌に影響を及ぼすシグナル伝達タンパク質キナーゼである。ＢＲＡＦＶ６００Ｅは一般的な発癌性ＢＲＡＦ変異で、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路を介して構成的シグナル伝達を誘導し、癌細胞の増殖と生存を刺激します。ＢＲＡＦキナーゼの活性立体配座を遮断する発癌性ＢＲＡＦの阻害剤の臨床開発は、標準的な化学療法と比較して、客観的な腫瘍反応の高い割合および全生存期間の改善をもたらした。それにもかかわらず、非黒色腫皮膚癌（例えば、高分化型皮膚扁平上皮癌およびケラトアカントーマ）は、ベムラフェニブおよびダブラフェニブ（ＧＳＫ‐２１１８４３６）などのＢＲＡＦ阻害剤で治療された患者の約１５〜３０％に発症する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
リン酸化ＥＲＫ（ｐＥＲＫ）、リン酸化時に活性であるＢＲＡＦの下流エフェクターの阻害によって証明されるように、細胞培養、動物モデル、およびヒトにおけるＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異細胞に対するベムラフェニブなどのＢＲＡＦ阻害剤の抗腫瘍活性は、発癌性ＭＡＰＫシグナル伝達の阻害と関連している。しかしながら、ＢＲＡＦ阻害剤は反対の効果、すなわち発癌性ＲＡＳまたは上方制御された受容体チロシンキナーゼのような上流経路活性化を有する野生型ＢＲＡＦを有する細胞株においてｐＥＲＫを増加させることを誘導する。ＢＲＡＦ野生型細胞におけるこのＲＡＦ阻害剤依存的なＭＡＰＫシグナル伝達の活性化は、「逆説的なＭＡＰＫ経路活性化」として知られており、ＣＲＡＦを介したシグナル伝達、ひいてはＭＡＰＫ経路過剰活性化をもたらすＲＡＦダイマーの形成によって促進される。逆説的なＭＡＰＫ活性化を誘導することによって皮膚創傷治癒を促進するために、非癌性の状況においてＢＲＡＦ阻害剤のこれらの皮膚増殖性副作用を利用することが望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書に記載される実施形態によれば、対象における障害または病気に起因する創傷を治療するための方法が提供される。このような方法は、障害または病気を患っている対象における創傷治癒を刺激する有効量のＢＲＡＦ阻害剤を創傷と接触させる工程を含む。ある態様では、障害または病気は、表皮水疱症（ＥＢ）、スティーブンス−ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、ブドウ球菌性皮膚炎症候群（ＳＳＳＳ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、または中毒性ショック症候群（ＴＳＳ）である。
【０００６】
ＢＲＡＦ阻害剤は、他の薬剤の中でもとりわけ、ＡＭＧ５４２、ＡＲＱ１９７、ＡＲＱ７３６、ＡＺ６２８、ＣＥＰ−３２４９６、ＧＤＣ−０８７９、ＧＳＫ１１２０２１２、ＧＳＫ２１１８４３６（ダブラフェニブ、Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標））、ＬＧＸ８１８（エンコラフェニブ）、ＮＭＳ−Ｐ１８６、ＮＭＳ−Ｐ３４９、ＮＭＳ−Ｐ３８３、ＮＭＳ−Ｐ３９６、ＮＭＳ−Ｐ７３０、ＰＬＸ３６０３（ＲＯ５２１２０５４）、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標））、ＰＬＸ４７２０（ジフルオロフェニル−スルホンアミン）、ＰＦ−０４８８０５９４、ＰＬＸ４７３４、ＲＡＦ２６５（ＣＨＩＲ−２６５）、ＲＯ４９８７６５５、ＳＢ５９０８８５、ソラフェニブ、トシル酸ソラフェニブ，およびＸＬ２８１（ＢＭＳ−９０８６６２）を含む、ＢＲＡＦの活性を阻害する任意の適切な薬剤であり得る。
【０００７】
いくつかの態様では、ＢＲＡＦ阻害剤は医薬組成物の一部であることとしてもよい。そのような場合には、医薬組成物は、有効量のＢＲＡＦ阻害剤と、薬学的に許容される担体とを含むこととしてもよい。ある態様では、医薬組成物は、軟膏、クリーム液、ゲル、ヒドロゲル、またはスプレーを含む外用薬である。また、医薬組成物は、第２の血管新生促進剤のような第２の治療薬を含むこととしてもよい。いくつかの実施形態では、第２の血管新生促進剤は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、ＦＧＦ−１などのあらゆるＦＧＦメンバーを含む）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、アンジオポエチン（例えば、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２）マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、デルタ様リガンド４（Ｄｌｌ４）、クラス３セマフォリン（ＳＥＭＡ３）、セルピン１、ＰＥＣＡＭ１、ＭＭＰ３、および／またはＴＨＢＳ１の１つ以上（例えば、１つ）を含むこととしてもよい。
【０００８】
さらに、いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤またはその医薬組成物は、創傷を治療するときに使用するための創傷被覆材の一部であることとしてもよい。この場合には、創傷被覆材は、ＢＲＡＦ阻害剤またはその医薬組成物をしみ込ませている、または、これらでコートされていることとしてもよい。本明細書に記載される実施形態に従って使用され得る適切な創傷被覆材は、アルギン酸塩被覆材、抗菌被覆材、包帯、バンドエイド（登録商標）、生合成被覆材、生物学的被覆材、コラーゲン被覆材、複合被覆材、 圧縮被覆材、接触層被覆材、フォーム被覆材、ガーゼ被覆材、親水コロイド被覆材、ヒドロゲル被覆材、スキンシーラントまたは液体スキン被覆材、特殊吸収性被覆材、透明フィルム被覆材、または創傷フィラーを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異体黒色腫（図１Ａ）におけるＢＲＡＦ阻害の異なる効果、ＨＲＡＳ変異体由来の皮膚扁平上皮癌および角膜実質細胞腫（ｃｕＳＣＣ／ＫＡ）を発症する黒色腫患者におけるＢＲＡＦ野生型細胞におけるＢＲＡＦ阻害（図１Ｂ）、健常人のＢＲＡＦおよびＲＡＳ野生型細胞におけるＢＲＡＦ阻害（図１Ｃ）を説明する概略図である。
【図２】図２は、ＢＲＡＦ阻害がヒトケラチノサイトにおいて逆説的なＭＡＰＫ活性化を誘導して増殖の増加をもたらすことを示す。図２Ａは、自動顕微鏡分析装置により、ベムラフェニブの存在下または非存在下でＨＥＫａの複製培養物中で、異なる時点における細胞の相対的創傷密度の割合としての増殖およびスクラッチ治癒の定量分析である。ｔ検定によるＰ値は＜０．００４４。代表的な画像を図３Ａに示す。図２Ｂは、０時間（ベースライン）および２４時間でのベムラフェニブの存在下または非存在下でのヒト上皮成人ケラチノサイト（ＨＥＫａ）の細胞増殖創傷治癒アッセイの代表的な画像を示す。図２Ｃは、０および２４時間でのマイトマイシンＣ（「Ｍ」）および／またはＮＳＣ２９５６４２（「Ｎ」）の存在下または非存在下でのインビトロでのＨＥＫａ細胞遊走および創傷治癒アッセイの代表的な画像を示す。図２Ｄは、ベムラフェニブへの曝露の有無にかかわらず、軟寒天中で増殖させたＨＥＫａおよびＭ２４９細胞のコロニー定量化の倍数変化表現を示す。図２Ｄは、ベムラフェニブへの曝露の有無にかかわらず、軟寒天中で増殖させたＨＥＫａおよびＭ２４９細胞のコロニー定量化の倍数変化の表現を示す。代表的な画像を図３Ｂに示す。図２Ｅは、ベムラフェニブへの曝露の有無にかかわらず、ＨＥＫａコロニーについての平均スポットサイズの増加を示す。図２Ｆは、ベムラフェニブおよび／またはトラメチニブを含むおよび含まないＨＥＫａコロニーの平均数を示す。図２Ｇは、ベムラフェニブで処理したＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異体メラノーマ細胞株Ｍ２４９と比較した、ＨＥＫａ中のｐＥＲＫおよびＫｉ６７の発現レベルのウエスタンブロット分析である。図２Ｈは、ベムラフェニブ（ＶＥＭ）、トラメチニブ（ＴＲＡＭＥ）、またはＶＥＭとＴＲＡＭＥとの組み合わせで２４時間処理した場合の、ＢＥＡＦＶ６００Ｅ変異型メラノーマ細胞株Ｍ２４９と比較した、ＨＥＫａ細胞中のｐＥＲＫおよびｐＭＥＫのレベルを示すウエスタンブロット分析である。図２Ｉは、ビヒクルまたはＶＥＭ（１．５μＭ）で処理し、そしてｐＥＲＫおよびＫｉ６７で染色したＨＥＫａおよびＭ２４９細胞のホスホフローサイトメトリー分析である。図２Ｊは、ベムラフェニブで処理したＨＥＫａおよびＭ２４９細胞の３つの複製培養物におけるビヒクルと比較したｐＥＲＫおよびｋｉ６７レベルの倍数変化の定量化を示す。エラーバー、平均値±標準偏差；ｎ＝３。
【図３】図３は、図２に記載された実験の代表的な結果を示す。図３Ａは、ベムラフェニブの存在下または非存在下でのヒト上皮成体ケラチノサイト（ＨＥＫａ）の細胞増殖スクラッチアッセイの経時的画像を示す。増殖の定量分析は図２Ａに表されている。図３Ｂは、ＤＭＳＯまたはＶＥＭで処理したＭ２４９およびＨＥＫａの３Ｄ培養画像を示す。図３Ｄは、ベムラフェニブ（「ＶＥＭ」）、トラメチニブ（「ＴＲＡＭＥ」）、またはベムラフェニブとトラメチニブの組み合わせ（「ＶＥＭ＋ＴＲＡＭＥ」）の存在下および非存在下（対照）で、染色像化された代表的な顕微鏡写真ヘマトキシリンおよびエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）を示す。
【図４】図４は、図２Ｉに提示されたデータを生成するためのゲーティング戦略を示す代表的なホスホフローサイトメトリー画像を示す。図４Ａは、Ｍ２４９細胞についてのホスホフローサイトメトリー画像を示し、図４Ｂは、ＨＥＫａ細胞についてのホスホフローサイトメトリー画像を示す。
【図５】図５は、ＢＲＡＦ阻害がマウスにおける創傷治癒を促進することを示す。図５Ａは、いくつかの実施形態による、ＣＨ３マウスにおいて行われた創傷治癒アッセイの概略図である。図５Ｂは、２、６および１４日目に、ビヒクル、ベムラフェニブ（ＶＥＭ、２ｍｇ）、トラマテニブ（ＴＲＡＭＥ、０．２ｍｇ）、およびベムラフェニブとトラメチニブの組み合わせ（ＶＥＭ＋ＴＲＡＭＥ）で局所処置したマウスの代表的な画像を示す。図５Ｃは、３つの反復実験（ビヒクル（ＤＭＳＯ／生理食塩水）およびＶＥＭ；実験＃１〜３）における創傷引張強度（ＷＴＳ）を、それぞれ１群あたり８匹のマウスを用いて、ビヒクル、ベムラフェニブ（ＶＥＭ）、およびＶＥＭとトラメチニブ（ＴＲＡＭＥ）の組み合わせを比較する（実験＃４）、別々の実験において示す一連のグラフを示す。ＷＴＳは、２ｍｍストリップ当たりのグラム力（ｇｆ）として表される（全ての実験についてｔ検定によりｐ＜０．０００１）。エラーバーは±標準偏差を意味し、ｎ＝８。
【図６】図６は、治療後１日目（Ｄ１）、２日目（Ｄ２）および６日目（Ｄ６）の創傷治癒の病理学的分析の略図である。図６Ａは、ベムラフェニブ（ＶＥＭ）、トラメチニブ（ＴＲＡＭＥ）または組合せ（ＶＥＭ＋ＴＲＡＭＥ）の存在下および非存在下での代表的な顕微鏡写真Ｈ＆Ｅ画像（２００倍）を示す。各グループにおいて、切開創の治癒は同じ標準プロセスを含んでいた。創傷に隣接する表皮は過形成および増殖を受け、そしてこのプロセスからの表皮細胞は中心に移動して切開された表皮欠乏を封鎖する。切開部の空間は最初にフィブリンで満たされ、それは次に線維芽細胞、マクロファージ、多形核細胞および新しい毛細血管によってコロニー形成される。ベムラフェニブ（パネルＶ１、Ｖ２、Ｖ６）の存在下では、治癒プロセスは加速される。創傷隣接表皮過形成は、対照標本（パネルＣ２）と比較して、ベムラフェニブ群（パネルＶ２）においては、切開後２日でより広範囲である。表皮下線維症の開始とともに６日以内に皮膚表面の完全性が再確立された（パネルＶ６）が、この時点で再上皮化は完了せず、真皮修復線維症は対照群には存在しない（パネルＣ６）。トラメチニブ単独で処置した群は、２日目にわずかな病変周囲過形成を示し（パネルＭ２）、６日目までに修復の証拠は示されない（パネルＭ６）。ベムラフェニブ＋トラメチニブ併用群（パネルＶＭ１、ＶＭ２、ＶＭ６）では、２日目にベムラフェニブで治療した群（パネルＶ２）よりも周辺病変過形成が少ないが、トラメチニブ単独よりも多い（パネルＭ２）。さらに、再上皮化は６日目には存在しない（パネルＶＭ６）。図６Ｂは、ビヒクル、ベムラフェニブ、トラメチニブまたは組合せによる処置後１、２および６日目の創傷の右側および左側からの表皮過形成の長さの定量化を示す。各バーは４つのサンプルからのデータを含む。
【図７】図７は、ベムラフェニブへの曝露の有無にかかわらずマウスにおける皮膚創傷治癒の遺伝子発現プロファイリングを示す。上のパネルは、ＢＲＡＦシグネチャ遺伝子のヒートマップと、Ｇｅｎｅ  Ｓｅｔ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＶＳＡ）を使用して計算されたその全体的な濃縮スコアを示しており、下のパネルは、創傷治癒の特徴的な遺伝子と全体的なＧＶＳＡスコアのヒートマップを示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、ベムラフェニブ（「ＶＥＭ」）、トラメチニブ（「ＴＲＡＭＥ」）、またはベムラフェニブとトラメチニブの組み合わせ（「ＶＥＭ＋ＴＲＡＭＥ」）への曝露ありまたはなし（対照）の軟寒天中で増殖したＨＥＫａのコロニー数および平均スポットサイズ（ｍｍ２）定量化を示す。
【図９】図９Ａは、皮膚収縮による創傷閉鎖を防ぐために、誘導創傷の上にスプリンティングリング（添え輪）を取り付けたＢａｌｂ／ｃマウスの背部に６ｍｍの円形創傷を誘発した後、０日目および１４日目のビヒクル処置（「ビヒクル」）およびベムラフェニブ処置（「ＶＥＭ」）マウスの代表的な画像を示す。図９Ｂは、これらのマウスについて、２、６、および１４日目の創傷閉鎖率を示す。図９Ｃは、１４日目までのベムラフェニブの存在下（「ＶＥＭ」）および非存在下（「ビヒクル」）における代表的な顕微鏡写真ヘマトキシリンおよびエオシン（「Ｈ＆Ｅ」）、ｐＥＲＫおよびＫｉ６７染色像を示す。図９Ｄは、１４日目のビヒクル処置創傷およびベムラフェニブ処置創傷におけるｐＥＲＫ＋およびＫｉ６７＋細胞の定量化を示す。
【図１０】図１０Ａは、対照（「コントロール」）創傷およびベムラフェニブ処置（「ＶＥＭ」）創傷の２日目（上のパネル）および６日目（下のパネル）の代表的な顕微鏡写真免疫組織化学画像を示す。図１０Ｂは、６日目のビヒクル処置創傷およびベムラフェニブ処置創傷上のｐＥＲＫ＋およびＫｉ６７＋細胞の定量化を示す（エラーバーは平均±標準偏差を指し、ｐ＝０．０２；ｎ＝４）。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂは、早期創傷治癒サイン（図１１Ａ）および術後サイン（図１１Ｂ）と比較した、ベムラフェニブへの曝露あり（「ＶＥＭ」）または曝露なし（「ＣＴＲＬ」）のマウスにおける皮膚創傷の遺伝子発現プロファイリングを示す。
【図１２】図１２は、ベムラフェニブ（「ＶＥＭ」）の投与によるＢＲＡＦの阻害が、対照（「ＣＴＲＬ」）と比較して皮膚の創傷治癒に関与する複数の細胞サブセットを活性化することを示す。
【図１３】図１３は、マクロファージがベムラフェニブ（「ＶＥＭ」）で処置されたマウス創傷において増加し、そしてトラメチニブ（「ＴＲＡＭＥ」）の存在下で逆転することを示す。図１３Ａは、処置後６日目にビヒクル（「ビヒクル」）またはベムラフェニブ（「ＶＥＭ」）で処置したマウスの切開創傷スプリントモデルにおけるＣＤ６８＋細胞の代表的な顕微鏡写真免疫組織化学像を示し、矢印は創傷部位を示す。図１３Ｂは、６日目のＣＤ６８＋細胞の定量化を示す（ｔ検定によりｐ＝０．１４；ｎ＝４）。図１３Ｃは、ビヒクル（「ビヒクル」）、ベムラフェニブ（「ＶＥＭ」）、トラメチニブ（「ＴＲＡＭＥ」）、またはベムラフェニブとトラメチニブの組み合わせ（「ＶＥＭ＋ＴＲＡＭＥ」）で処置されたマウスの切除創傷スプライシングモデルにおけるＣＤ６８＋細胞の代表的な顕微鏡写真免疫組織化学像を示し、矢印は創傷部位を示す。図１３Ｄは、６日目のＣＤ６８＋細胞の定量化を示す（一元配置分散分析によるｐ＝０．００１８；ｎ＝４）。図１３Ｂおよび図１３Ｄのエラーバーは平均±ＳＤを示す。
【図１４】図１４Ａは、ＣｌｕｅＧＯによって可視化された濃縮遺伝子オントロジー（ＧＯ）クラスターに基づくベムラフェニブ治療の６日目までに有意に活性化された生物学的プロセス／経路を示す。図１４Ｂは、６日目までにベムラフェニブで処置したマウス創傷のトランスクリプトームにおける特定の創傷治癒細胞サブセット（赤色；シグネチャ濃縮を伴う）、それらの上方制御遺伝子（黄色）および濃縮創傷治癒関連プロセス（青色）を強調する統合図を示す。遺伝子ノードサイズは、６日目の誘導を表し、最大ノードは４．５４のｌｏｇ２（ＦＣ）を表し、最小ノードは１．０３のｌｏｇ２（ＦＣ）を表す。図１４Ｃは、切開創傷モデルにおける、６日目のビヒクル処置およびベムラフェニブ処置創傷における、ＩＬ−６＋細胞の代表的な顕微鏡写真免疫組織化学画像および右側には棒グラフを示し、ＩＬ−６＋細胞の定量化を表す（ｔ検定でｐ＝０．０２  ｎ＝４）。図１４Ｄは、６日目のビヒクル処置およびベムラフェニブ処置創傷上のＣＯＸ‐２＋細胞の代表的な顕微鏡写真免疫組織化学画像および右側には棒グラフを示し、ＣＯＸ‐２＋細胞の定量化を示す（ｔ検定によりｐ＝０．０１；ｎ＝４）。エラーバー、平均±標準偏差。図１４Ｅは、切開後６日目にベムラフェニブで治療したおよび治療していない全皮膚創傷のＥｇｒ‐１、ＴＮＦＡＩＰ３およびＦ７のｍＲＮＡレベルを示す。棒グラフは３つの生物学的複製の実験的平均を表し、エラーバーは平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を表す。ＲＮＡレベルをβ−アクチンに対して正規化した。＊＊＊ｐ＝０．０００６（Ｅｇｒ‐１）および０．０００２（Ｆ７）および＊＊ｐ＝０．００２３（ＴＮＦＡＩＰ３）、すべてｔ検定による。
【図１５】図１５Ａは、処置後６日目にビヒクルまたはベムラフェニブで処置したマウスの切開創傷スプリントモデルにおけるＰＥ‐ＣＡＭ‐１＋細胞の代表的な顕微鏡写真免疫組織化学像および右側には棒グラフを示し、６日目のビヒクル処置創傷およびベムラフェニブ処置創傷におけるＰＥＣＡＭ−１＋細胞の定量を表す（ｔ検定によりｐ＝０．００６；ｎ＝４）。矢印は創傷部位を示す。図１５Ｂは、ビヒクル、ベムラフェニブ（ＶＥＭ）、トラメチニブ（ＴＲＡＭＥ）または組み合わせ（ＶＥＭ＋ＴＲＡＭＥ）で処置したマウスの切開創傷モデルにおけるＰＥ‐ＣＡＭ‐１＋細胞の代表的な顕微鏡写真免疫組織化学画像を示す（一元配置分散分析によるｐ＝０．０００２）。トラメチニブ単独では、ＰＥＣＡＭ−１＋細胞の数を完全に枯渇させた。二重頭の矢印は創傷部位を示す。図１５Ａ〜１５Ｂのエラーバーは平均±ＳＤに対応する。
【図１６】図１６Ａは、治療の１５週目の各研究群からのマウスの代表的な画像を示す。７，１２‐ジメチルベンズ［ａ］アントラセン（ＤＭＢＡ）をＦｖＢ／Ｎマウスに局所投与した後、１２‐Ｏ‐テトラデカノイルホルボール‐１３‐アセテート（ＴＰＡ）を投与したところ、８週目の処置で皮膚乳頭腫および扁平上皮癌が誘発された。対照（ＤＭＢＡ＋ＴＰＡ）群では、８匹全てのマウスが腫瘍を発症した。ＤＭＢＡまたはアセトン対照の群、続いてベムラフェニブ（ＶＥＭ、マウスあたり２または４ｍｇ）の局所適用は、皮膚腫瘍を誘発しなかった。図１６Ｂは、週あたりの腫瘍数および腫瘍発生率をグラフ形式で表す。図１６Ｂのエラーバーは平均±ＳＤを指し、ｎ＝８。
【図１７】図１７は、術後および早期創傷治癒のサインに関与する遺伝子のリストを含む表である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
ＢＲＡＦ阻害剤を使用して創傷を治療するための方法、医薬組成物、および創傷被覆材が本明細書に提供される。本明細書に記載の実施形態によれば、ＢＲＡＦ阻害剤は医薬組成物の一部として、または創傷治癒を促進するための創傷被覆材の一部として、単独で使用することができる。
【００１１】
現在、ＢＲＡＦ阻害剤は、癌などの疾患および病気における変異型のＢＲＡＦに関連してそれらの抗増殖活性を利用するために使用されている（図１Ａ）。しかしながら、黒色腫などの癌に対するＢＲＡＦ阻害剤で治療された患者は、変異型のＢＲＡＦに対するＢＲＡＦ阻害剤の抗増殖効果にもかかわらず、二次増殖状態を発症することが観察されている。
【００１２】
逆説的なＭＡＰＫ活性化は、ＢＲＡＦ阻害剤で治療された患者におけるこれらの二次増殖状態（例えば、浸潤性扁平上皮癌および角膜棘細胞腫）の発症の背後にある病原性の基礎である（Su et al. 2012; Oberholzer et al. 2012）。これらの続発性皮膚病変における非変異ＢＲＡＦの上流のＲＡＳ変異の頻繁な存在は、強力なＲＡＳ−ＧＴＰ活性化をもたらし、それは逆説的にＥＲＫのリン酸化を増加させ、ＭＡＰＫ経路出力を増加させ、細胞増殖を増強させる（図１Ｂ）。逆説的なＭＡＰＫ活性化は、強い上流ＲＡＳ−ＧＴＰシグナル伝達の設定においてＢＲＡＦプロトマーへの優先的結合がそのＣＲＡＦヘテロ二量体パートナーのトランス活性化をもたらすＲＡＦ阻害剤（Hall-Jackson et al. 1999）の特性である（Heidorn et al. 2010; Poulikakos et al. 2010; Holderfield et al. 2013）。その結果、ＢＲＡＦ阻害剤療法を受けているＢＲＡＦ変異転移性黒色腫の患者は他の様々な皮膚増殖状態を発症し（Belum et al. 2013）、そのほとんどはＭＥＫ阻害剤を同時に投与すると改善し（Flaherty et al. 2012）、これは逆説的なＲＡＦ活性化の下流効果を遮断する（Su et al. 2012; Escuin-Ordinas et al. 2013）。以下の実施例において、癌治療におけるＢＲＡＦ阻害剤の皮膚増殖性副作用のこの機構的理解は、あるいは健康な対象において利用され得ることが実証され（すなわち、野生型（ｗｔ）ＲＡＳおよびＢＲＡＦ）、野生型細胞において逆説的なＭＡＰＫ活性化を誘導することによって皮膚創傷治癒を促進する（図１Ｃ）。
ＢＲＡＦ阻害剤
【００１３】
本明細書に記載の実施形態に従って使用することができるＢＲＡＦ阻害剤は、野生型ＢＲＡＦまたは変異型のＢＲＡＦ（例えば、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ、ＢＲＡＦＶ６００Ｋ、ＢＲＡＦＶ６００Ｄ、ＢＲＡＦＶ６００Ｌ、ＢＲＡＦＶ６００Ｒ）の生物学的活性（例えば、シグナル伝達活性）の少なくとも一部を選択的に阻害する任意の薬剤を含み得る。いくつかの態様では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ＢＲＡＦ単独に対して選択的であり得るか、またはＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路における１つ以上のさらなる標的に対して阻害活性を有し得る。一態様では、例えば、ＢＲＡＦ阻害剤はＲＡＦキナーゼ阻害剤であり得、すなわち、阻害剤はＢＲＡＦに加えてＡＲＡＦ、ＣＲＡＦ、またはその両方などのＲＡＦキナーゼに対して阻害活性を有し得る。特定の実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、逆説的ＭＡＰＫ活性化活性が増大するように選択される。そのため、本明細書に記載の実施形態に従って使用されるＢＲＡＦ阻害剤は、ＭＡＰＫパラドックス活性化剤として作用することができ、これは、ＢＲＡＦ阻害剤がＭＡＰＫシグナル伝達の増加を引き起こすことを意味する。いくつかの態様では、ＭＡＰＫパラドックスアクチベーターは、標的ＢＲＡＦキナーゼが野生型ＢＲＡＦキナーゼである場合にＭＡＰＫシグナル伝達の増加を示すＢＲＡＦ阻害剤である。さらに、以下の実施例に記載されるように、本明細書に記載される実施形態に従って使用されるＢＲＡＦ阻害剤による有益な効果は、少なくとも部分的には創傷治癒の増殖段階中の血管新生の改善によって引き起こされる。
【００１４】
いくつかのＢＲＡＦキナーゼ阻害剤が当技術分野において記載されており、そのいずれも本明細書に記載の方法、被覆材および組成物における使用に適している可能性がある。適切なＢＲＡＦ阻害剤としては、１，２‐ジシクリル置換アルキン化合物または誘導体、１‐メチル‐５‐（２‐（５‐（トリフルオロメチル）‐１Ｈ‐イミダゾール‐２‐イル）ピリジン‐４‐イルオキシ）‐Ｎ‐（４‐（トリフルオロメチル）フェニル）‐１Ｈ‐ベンゾ［ｄ］イミダゾール‐２‐アミン）；２，６‐二置換キナゾリン、キノキサリン、キノリン、およびイソキノリン化合物または誘導体；４‐アミノ‐５‐オキソ‐８‐フェニル‐５Ｈ‐ピリド‐［２，３‐Ｄ］‐ピリミジン化合物または誘導体；４‐アミノ‐チエノ［３，２‐Ｃ］ピリジン‐７‐カルボン酸化合物または誘導体；５‐（４‐アミノフェニル）‐イソキノリン化合物またはその誘導体；ベンゼンスルホンアミドチアゾール化合物または誘導体；ベンズイミダゾール化合物または誘導体；二環式化合物または誘導体；ピラゾロ［１，５‐ａ］ピリミジン化合物または誘導体の架橋二環式複素環式またはスピロ二環式複素環式誘導体；シンナミドおよびヒドロシンナミド化合物または誘導体；二置換イミダゾール化合物または誘導体；縮合三環ピラゾロ［１，５‐ａ］ピリミジン化合物または誘導体；ヘテロアリール化合物または誘導体；複素環式化合物または誘導体；１Ｈ‐ベンゾ［Ｄ］イミダゾール化合物または誘導体；イミダゾ［４，５‐Ｂ］ピリジン化合物または誘導体；Ｎ‐（６‐アミノピチジン‐３‐イル）‐３‐（スルホンアミド）ベンズアミド化合物または誘導体；Ｎ‐［３‐（１‐アミノ‐５，６，７，８‐テトラヒドロ‐２，４，４Ｂ‐トリアザフルオレン‐９‐イル）‐フェニル］ベンズアミド化合物または誘導体；含窒素二環式ヘテロアリール化合物または誘導体；複素環置換ビスアリール尿素化合物または誘導体のＮ‐オキシド；オメガ‐カルボキシアリール置換ジフェニル尿素化合物または誘導体；オキサゾール化合物または誘導体；フェネチルアミド化合物または誘導体；フェニルスルホンアミド置換ピラゾロ［１，５‐ａ］ピリミジン化合物または誘導体；フェニルトリアゾール化合物または誘導体；複素環式化合物または誘導体；１ｈ‐ピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン化合物または誘導体；プリン化合物または誘導体；ピラゾール［３，４‐Ｂ］ピリジン化合物または誘導体；ピラゾール化合物または誘導体；ピラゾリン化合物または誘導体；ピラゾロ［３，４‐ｂ］ピリジン、ピロロ［２，３‐ｂ］ピリジン化合物または誘導体；ピラゾロ［３，４‐ｄ］ピリミジン化合物または誘導体；ピラゾロ［５，１‐ｃ］［１，２，４］トリアジン化合物または誘導体；ピラゾリル化合物または誘導体；ピリミジン化合物または誘導体；ピロール化合物または誘導体；ピロロ［２，３‐Ｂ］ピリジン化合物または誘導体；置換６‐フェニル‐ピリド［２，３‐Ｄ］ピリミジン‐７‐オン化合物または誘導体；置換ベンザゾール化合物または誘導体；置換ベンズイミダゾール化合物または誘導体；置換ビスアリール‐尿素化合物または誘導体；チエノピリジン化合物または誘導体；チエノピリミジン、チエノピリジン、またはピロロピリミジン化合物または誘導体；チオフェンアミド化合物または誘導体、ならびに他の任意の適切なアリールおよび／またはヘテロアリール化合物または誘導体が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの態様では、本明細書に記載の適切なＢＲＡＦ阻害剤は、化合物または誘導体自体を含むことができ、またはそれらの薬学上許容される塩もしくは溶媒和物であることができる。
【００１５】
いくつかの特許および特許出願は、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１１１１７３８１、ＷＯ２０１１１１９８９４、ＷＯ２０１１１１７３８１、ＷＯ２０１１０９７５９４、ＷＯ２０１１０９７５２６、ＷＯ２０１１０８５２６９、ＷＯ２０１１０９０７３８、ＷＯ２０１１０２５９６８、ＷＯ２０１１０２５９２７、ＷＯ２０１１０２３７７３、ＷＯ２０１１０２８５４０、ＷＯ２０１０１１１５２７、ＷＯ２０１０１０４９７３、ＷＯ２０１０１００１２７、ＷＯ２０１００７８４０８、ＷＯ２０１００６５８９３、ＷＯ２０１００３２９８６、ＷＯ２００９１１５５７２、ＷＯ２００９１０８８３８、ＷＯ２００９１１１２７７、ＷＯ２００９１１１２７８、ＷＯ２００９１１１２７９、ＷＯ２００９１１１２８０、ＷＯ２００９１０８８２７、ＷＯ２００９１１１２６０、ＷＯ２００９１００５３６、ＷＯ２００９０５９２７２、ＷＯ２００９０３９３８７、ＷＯ２００９０２１８６９、ＷＯ２００９００６４０４、ＷＯ２００９００６３８９、ＷＯ２００８１４０８５０、ＷＯ２００８０７９２７７、ＷＯ２００８０５５８４２、ＷＯ２００８０３４００８、ＷＯ２００８１１５２６３、ＷＯ２００８０３０４４８、ＷＯ２００８０２８１４１、ＷＯ２００７１２３８９２、ＷＯ２００７１１５６７０、ＷＯ２００７０９０１４１、ＷＯ２００７０７６０９２、ＷＯ２００７０６７４４４、ＷＯ２００７０５６６２５、ＷＯ２００７０３１４２８、ＷＯ２００７０２７８５５、ＷＯ２００７００２４３３、ＷＯ２００７００２３２５、ＷＯ２００６１２５１０１、ＷＯ２００６１２４８７４、ＷＯ２００６１２４７８０、ＷＯ２００６１０２０７９、ＷＯ２００６１０８４８２、ＷＯ２００６１０５８４４、ＷＯ２００６０８４０１５、ＷＯ２００６０７６７０６、ＷＯ２００６０５０８００、ＷＯ２００６０４０５６９、ＷＯ２００５１１２９３２、ＷＯ２００５０７５４２５、ＷＯ２００５０４９６０３、ＷＯ２００５０３７２８５、ＷＯ２００５０３７２７３、ＷＯ２００５０３２５４８；並びに、米国特許番号ＵＳ８６４２７５９、ＵＳ８５５７８３０、ＵＳ８５０４７５８、ＵＳ７８６３２８８、ＵＳ７４９１８２９、ＵＳ７４８２３６７、およびＵＳ７２３５５７６を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の実施形態に従って使用することができる例示的なＢＲＡＦ阻害剤を開示しており、それらすべての明細書は、あたかも完全に本明細書に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１６】
特定の実施形態において、ＢＲＡＦ阻害剤は、ＡＭＧ５４２、ＡＲＱ１９７、ＡＲＱ７３６、ＡＺ６２８、ＣＥＰ‐３２４９６、ＧＤＣ‐０８７９、ＧＳＫ１１２０２１２、ＧＳＫ２１１８４３６（ダブラフェニブ、Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標））、ＬＧＸ８１８（エンコラフェニブ）、ＮＭＳ‐Ｐ１８６、ＮＭＳ‐Ｐ３４９、ＮＭＳ‐Ｐ３８３、ＮＭＳ‐Ｐ３９６、ＮＭＳ‐Ｐ７３０、ＰＬＸ３６０３（ＲＯ５２１２０５４）、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標））、ＰＬＸ４７２０（ジフルオロフェニル−スルホンアミン）、ＰＦ‐０４８８０５９４、ＰＬＸ４７３４、ＲＡＦ２６５（ＣＨＩＲ‐２６５）、ＲＯ４９８７６５５、ＳＢ５９０８８５、ソラフェニブ、トシル酸ソラフェニブ、またはＸＬ２８１（ＢＭＳ‐９０８６６２）から選択される分子の群から選択され得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の構造を有する：
【化１】
2019522652.tif 000003
ここで、
Ｒ１は、Ｈ、シアノで任意に置換されるＣ３‐Ｃ６シクロアルキル、シアノ、‐Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ヒドロキシ、‐Ｘ１ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ１ａ、‐Ｘ１ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１ａで任意に置換されていてもよいＣ１‐Ｃ３アルキルであって、式中、Ｘ１は、ハロ、Ｃ１‐Ｃ４アルキルまたはハロ置換Ｃ１‐Ｃ４アルキルからそれぞれ独立して選択される１〜３個の基で任意に置換されるＣ１‐Ｃ４アルキレンであり、かつ、Ｒ１ａは、Ｈ、Ｃ１‐Ｃ４アルキル、またはハロ置換Ｃ１‐Ｃ４アルキルであり；
Ｒ１ｂはＨまたはメチルであり；
Ｒ２は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１‐Ｃ４アルコキシ、Ｃ１‐Ｃ４アルキル、ハロ置換Ｃ１‐Ｃ４アルコキシ、またはハロ置換Ｃ１‐Ｃ４アルキルであり；
Ｒ４は、ハロゲン、Ｈ、またはＣ１‐Ｃ４アルキルであり；
Ｒ５は、Ｃ１‐Ｃ６アルキル、Ｃ３‐Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３‐Ｃ８分岐アルキル、ハロ置換Ｃ１‐Ｃ６アルキル、ハロ置換Ｃ３‐Ｃ８分岐アルキル、Ｃ３‐Ｃ６シクロアルキル‐（Ｃ１‐Ｃ３）−アルキレン、またはフェニルであり、ここで、前記フェニルは、ハロ、ＣＨ３、またはＣＦ３を形成するそれぞれ独立して選択される１〜３個の置換基で任意に置換されており；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１‐Ｃ４アルキル、またはハロゲンであり；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１‐Ｃ６アルキル、Ｃ３‐Ｃ６シクロアルキル、１‐メチル‐（Ｃ３‐Ｃ６）‐シクロアルキル、１‐（ハロ置換‐メチル）‐（Ｃ３‐Ｃ６）‐シクロアルキル、Ｃ３‐Ｃ８分岐アルキル、ハロ置換Ｃ１‐Ｃ６アルキル、ハロ置換Ｃ３‐Ｃ８分岐アルキル、またはフェニルであり、ここで、前記フェニルは、ハロゲン、Ｃ１‐Ｃ４アルキルまたはハロ置換Ｃ１‐Ｃ４アルキルから選択される１‐３個の置換基で任意に置換され、好ましくは、Ｒ７はＨ、Ｃ１‐Ｃ６アルキル、Ｃ３‐Ｃ６シクロアルキル、１‐メチル−（Ｃ３‐Ｃ６）−シクロアルキル、Ｃ３‐Ｃ８分岐アルキル、またはフェニルであり；ここで、前記フェニルは、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはハロ置換Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択される１〜３個の置換基で任意に置換されており；またはその薬学的に許容される塩である。
【００１８】
式（Ｉ）の化合物の１つの特定の実施形態において、Ｒ１は、シアノ、‐Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ヒドロキシ、‐Ｘ１ＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ１ａで任意に置換されるＣ１‐Ｃ３アルキルであり、Ｘ１は、ハロ、Ｃ１‐Ｃ４アルキル、またはハロ置換Ｃ１‐Ｃ４アルキルからそれぞれ独立して選択される１〜３個の基で任意に置換されるＣ１‐Ｃ４アルキレンあり、Ｒ１ａは、Ｈ、Ｃ１‐Ｃ４アルキル、またはハロ置換Ｃ１‐Ｃ４アルキルであり；
【００１９】
Ｒ２は、Ｈまたはハロゲンであり；
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１‐Ｃ４アルコキシ、Ｃ１‐Ｃ４アルキル、ハロ置換Ｃ１‐Ｃ４アルコキシ、またはハロ置換Ｃ１‐Ｃ４アルキルであり；
Ｒ４は、ハロゲン、Ｈ、またはＣ１‐Ｃ４アルキルであり；
Ｒ５は、Ｃ１‐Ｃ６アルキル、Ｃ３‐Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３‐Ｃ８分岐アルキル、ハロ置換Ｃ１‐Ｃ６アルキル、またはハロ置換Ｃ３‐Ｃ８分岐アルキルであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１‐Ｃ４アルキル、またはハロゲンであり；
Ｒ７は、Ｈ、Ｃ１‐Ｃ６アルキル、Ｃ１‐Ｃ６シクロアルキル、１‐メチル‐（Ｃ３‐Ｃ６）‐シクロアルキル、１‐（ハロ置換‐メチル）‐（Ｃ３‐Ｃ６）‐シクロアルキル、Ｃ３‐Ｃ８分岐アルキル、ハロ置換Ｃ１‐Ｃ６アルキル、またはハロ置換Ｃ３‐Ｃ８分岐アルキルまたはフェニルであり、ここで、ここで、前記フェニルは、ハロゲン、Ｃ１‐Ｃ４アルキルまたはハロ置換Ｃ１‐Ｃ４アルキルから選択される１〜３個の置換基で任意に置換され、好ましくは、Ｒ７はＨ、Ｃ１‐Ｃ６アルキル、Ｃ３‐Ｃ６シクロアルキル、１−メチル−（Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル）、またはフェニルであり、ここで、前記フェニルは、ハロゲン、Ｃ１‐Ｃ４アルキルまたはハロ置換Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択される１〜３個の置換基で任意に置換され；またはその薬学的に許容されるその塩である。
【００２０】
好ましい実施形態では、式（ＩＩ）の化合物が提供され、ここで、
Ｒ１は、−ＣＨ２−（Ｓ）−ＣＨ（ＣＨ３）ＮＨＣ（Ｏ）ＯＣＨ３であり；
Ｒ１ｂは、Ｈであり；
Ｒ２は、Ｈであり；
Ｒ３は、Ｃｌであり；
Ｒ４は、Ｈであり；
Ｒ５は、ＣＨ３であり；
Ｒ６は、Ｆであり；
Ｒ７は、イソプロピル、または、薬学的に許容されるその塩（本明細書では、「ＬＧＸ８１８」または「エンコラフェニブ」としても言及される）である。
【００２１】
別の実施形態では、式（ＩＩ）の化合物が提供され、ここで、
Ｒ２は、ＨまたはＦであり；
Ｒ３は、Ｈ、ハロゲン、Ｃ１‐Ｃ２アルコキシ、Ｃ１‐Ｃ２アルキル、ハロ置換Ｃ１‐Ｃ２アルコキシ、またはハロ置換Ｃ１‐Ｃ２アルキルであり；
Ｒ４は、Ｈまたはメチルであり；
Ｒ５は、Ｃ１‐Ｃ４アルキル、Ｃ３‐Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３‐Ｃ５分岐アルキル、ハロ置換Ｃ１‐Ｃ４アルキル、ハロ置換Ｃ３‐Ｃ６分岐アルキル、またはＣ３‐Ｃ６シクロアルキル‐（Ｃ１‐Ｃ３）‐アルキレンであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｃ１‐Ｃ２アルキル、またはハロゲンであり；
Ｒ７は、Ｃ３‐Ｃ６シクロアルキル、１‐メチル‐（Ｃ３‐Ｃ６）−シクロアルキル、またはＣ３‐Ｃ６分岐アルキルであり；または薬学的に許容されるその塩である。
【００２２】
別の実施形態において、式（ＩＩ）の化合物が提供され、ここで、
Ｒ２は、Ｈであり；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃｌ、Ｆ、メトキシ、メチル、またはジフルオロメトキシであり；
Ｒ４は、Ｈであり；
Ｒ５は、メチル、シクロプロピル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｓｅｃ‐ブチル、イソブチル、トリフルオロメチル、または３，３，３‐トリフルオロプロピルであり；
Ｒ６は、Ｈ、メチル、Ｆ、またはＣｌであり；
Ｒ７は、ｔ‐ブチル、シクロプロピル、または１‐メチルシクロプロピルであり；またはその薬学的に許容される塩である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は式（ＩＩＩ）の化合物であり、
【化２】
2019522652.tif 000004
ここで、
ａは０、１、２または３であり；
各Ｒ１は同一または異なり、ハロ、アルキル、ハロアルキル、‐ＯＲ６、‐ＣＯ２Ｒ６、‐ＮＲ６Ｒ７、および‐ＣＮから独立して選択され；
環Ａは、Ｃ３‐Ｃ６シクロアルキル、フェニル、５〜６員ヘテロ環および５‐６員ヘテロアリールから選択され、前記ヘテロ環および前記ヘテロアリールはそれぞれＮ、ＯおよびＳから選択される１または２個のヘテロ原子を有し；
Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４のそれぞれは、ＣＨ、ＣＲ２またはＮであり、ここで、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４のうちの１つ以下がＮであり；
各Ｒ２は同一または異なり、ハロ、アルキル、ハロアルキル、および‐ＯＲ６から独立して選択され；
Ｗは−Ｏ−および−Ｓ−から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、アルキル、ハロアルキル−、−アルキレン−ＯＨ、−ＮＲ５Ｒ７、−Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、−アルキレン−Ｃ（Ｏ）−ＯＨ、−アルキレン‐ＮＨ２、およびＨｅｔから選択され；
式中、Ｒ３がＣ３‐Ｃ６シクロアルキルである場合、前記Ｃ３‐Ｃ６シクロアルキルは、同一または異なり、ハロ、Ｃ１‐Ｃ３アルキル、ハロ−（Ｃ１‐Ｃ３）−アルキル、ＯＨ、Ｏ−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル、オキソ、Ｓ−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル）、ＳＯ２、ＮＨ２、Ｎ（Ｈ）（Ｃ１−Ｃ３）−アルキルおよびＮ（Ｃ１−Ｃ３アルキル）２から独立して選択される、１または２個の置換基で任意に置換され；
Ｈｅｔは、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１または２個のヘテロ原子を有し、同一または異なり、それぞれ独立してハロ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、ハロ−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル、Ｏ−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキレン−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ３アルキレン−ＯＨ、オキソ、ＳＯ２（（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル）、Ｃ１−Ｃ３アルキレン‐ＳＯ２（（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル）、ＮＨ２、Ｎ（Ｈ）（（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ３アルキル）２、ＣＮ、および−ＣＨ２ＣＮから選択される１または２個の置換基で任意に置換される５〜６員複素環であり；
Ｒ４は、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、−ＯＲ６、−Ｒ５−ＯＲ６、−Ｒ５−ＣＯ２Ｒ６、−Ｒ５−ＳＯ２Ｒ６、−Ｒ５−Ｈｅｔ、−Ｒ５−Ｃ（Ｏ）−Ｈｅｔ、−Ｎ（Ｈ）Ｒ８、−Ｎ（ＣＨ３）Ｒ８、および−Ｒ５−ＮＲ６Ｒ７から選択され；各Ｒ５は同一または異なり、かつ、独立してＣ１−Ｃ４アルキレンであり；
各Ｒ６および各Ｒ７は、同一または異なり、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、および−Ｃ（Ｏ）−シクロアルキルから独立して選択され；
Ｒ８は、Ｈ、アルキル（−ＯＨで置換されていてもよい）、ハロアルキル、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、−Ｒ５−（Ｃ３−Ｃ６）−シクロアルキル、Ｈｅｔ２、−Ｒ５−Ｈｅｔ２、−Ｒ５−ＯＲ６、−Ｒ５−Ｏ−Ｒ５−ＯＲ６、−Ｒ５−Ｃ（Ｏ）２Ｒ６、−Ｒ５−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６Ｒ７、−Ｒ５−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−Ｒ６、−Ｒ５−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）−Ｒ５−ＯＲ６、−Ｒ５−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）２−Ｒ５−Ｒ５−ＮＲ５Ｒ７、−Ｒ５−Ｓ（Ｏ）２Ｒ６、−Ｒ５−ＣＮ、および−Ｒ５−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ６から選択され；
式中、Ｒ８がＣ３−Ｃ６シクロアルキルである場合、前記Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルは、同一または異なり、ハロ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、ハロ−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル、ＯＨ、Ｏ−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル、オキソ、Ｓ−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル、ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ３アルキル）、ＮＨ２、Ｎ（Ｈ）−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキルおよびＮ（Ｃ１−Ｃ３アルキル）２、およびＮ（Ｈ）ＳＯ２−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキルから独立して選択される１または２個の置換基で任意に置換され；
Ｈｅｔ２は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１または２個のヘテロ原子を有し、１または２、３、４または５個のＣ１−Ｃ３アルキルまたは同一または異なり、かつ、ハロ、Ｃ１−Ｃ３アルキル、ハロ−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル、Ｏ−（Ｃ１−Ｃ３）−アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキレン−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ３アルキル）、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ３アルキレン−ＯＨ、オキソ、ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ３アルキル）、Ｃ１−Ｃ３アルキレン−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ３アルキル）、ＮＨ２、Ｎ（Ｈ）−（Ｃ１−Ｃ３アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ３アルキル）２、Ｎ（Ｈ）ＳＯ２−（Ｃ１−Ｃ３アルキル）、Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ３アルキル）、ＣＯ２（Ｃ１−Ｃ４アルキル）、ＣＮ、および−ＣＨ２ＣＮからそれぞれ独立に選択される、１または２個の置換基で任意に置換される４−６員複素環であり；
Ｒ９およびＲ１０は、Ｈおよびアルキル、ならびにそれらの薬学的に許容される塩から独立して選択される。
【００２４】
好ましい実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物が提供され、ここで、
ａは２であり；
Ｒ１はＦであり；
各Ｒ２はＦであり；
Ｒ３はｔ‐ブチルであり；
Ｒ４は、Ｎ（Ｈ）Ｒ８であり；
Ｒ８は、Ｈであり；
ＷはＳ（本明細書では「ＧＳＫ２１１８４３６」、「ダブラフェニブ」、または「Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標）」と称する）、または薬理学的に許容されるその塩である。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は式（ＩＶ）の化合物：
【化３】
2019522652.tif 000005
であり、
ここで、
Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、水素、ハロゲン、任意に置換される低級アルキル、任意に置換される低級アルケニル、任意に置換される低級アルキニル、任意に置換されるシクロアルキル、任意に置換されるヘテロシクロアルキル、任意に置換されるアリール、任意に置換されるヘテロアリール、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＲａＲｂＲ２６、および−ＬＲ２６からなる群から独立して選択され；
Ｒ３は、水素、ハロゲン、任意に置換される低級アルキル、任意に置換される低級アルケニル、任意に置換される低級アルキニル、任意に置換されるシクロアルキル、任意に置換されるヘテロシクロアルキル、任意に置換されるアリール、任意に置換されるヘテロアリール、−ＣＮ、−ＮＯ２、−ＣＲａＲｂＲ２６、−ＬＲ２６、および−Ａ−Ａｒ−Ｌ１−Ｒ２４からなる群から選択され；
Ａは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＲａＲｂ−、−ＮＲ１−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ）−、および−Ｓ（Ｏ）２−からなる群から選択され；
Ｒ１は、水素、低級アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｒ７、−Ｃ（Ｓ）Ｒ７、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ７、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ７、−Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ７、および−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ７からなる群から選択され；
ここで、低級アルキルは、フルオロ、−ＯＨ、−ＮＨ２、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、および‐ＮＲ８Ｒ９からなる群から選択される１以上の置換基で任意に置換され；
ここで、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、またはジ−アルキルアミノのアルキル鎖は、フルオロ、−ＯＨ、−ＮＨ２、低級アルコキシ、フルオロ置換低級アルコキシ、低級アルキルチオ、フルオロ置換低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、およびシクロアルキルアミノからなる群から選択される１以上の置換基で任意に置換され、ただし、アルコキシのＯ、チオアルキルのＳまたはモノ−もしくはジ−アルキルアミノのＮに結合したアルキル鎖炭素の置換はいずれもフルオロであるように提供され、さらに、ただし、Ｒ１が低級アルキルであるとき、−ＮＲ１−のＮに結合した低級アルキル炭素上の任意の置換はフルオロであるように提供され、
シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールまたはヘテロアリールは、ハロゲン、−ＯＨ、−ＮＨ２、低級アルキル、フルオロ置換低級アルキル、低級アルコキシ、フルオロ置換低級アルコキシ、低級アルキルチオ、フルオロ置換低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、およびシクロアルキルアミノからなる群から選択される１以上の置換基で任意に置換され；Ｒ７は、低級アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリールからなる群から選択され、
ここで、低級アルキルは、フルオロ、−ＯＨ、−ＮＨ２、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、および−ＫＲ８Ｒ９、からなる群から選択される１以上の置換基で任意に置換され、ただし、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ７、−Ｃ（Ｓ）ＮＨＲ７または−Ｓ（Ｏ）２ＮＨＲ７のＮに結合したアルキル炭素の任意の置換基は、フルオロであるように提供され、
ここで、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、またはジ−アルキルアミノのアルキル鎖は、フルオロ、−ＯＨ、−ＮＨ２、低級アルコキシ、フルオロ置換低級アルコキシ、低級アルキルチオ、フルオロ置換低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、およびシクロアルキルアミノからなる群から選択される１以上の置換基で任意に置換され、ただし、アルコキシのＯ、チオアルキルのＳまたはモノ−もしくはジ−アルキルアミノのＮに結合したアルキル鎖炭素の置換はいずれもフルオロであるように提供され、
シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールは、ハロゲン、−ＯＨ、−ＮＨ２、低級アルキル、フルオロ置換低級アルキル、低級アルコキシ、フルオロ置換低級アルコキシ、低級アルキルチオ、フルオロ置換低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、およびシクロアルキルアミノからなる群から選択される１以上の置換基で任意に置換され；
Ａｒは、任意に置換されるアリーレンおよび任意に置換されるヘテロアリーレンからなる群から選択され；
各出現時のＬは、−（ａｌｋ）ａ−Ｓ−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−Ｏ−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−ＮＲ２５−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ〜Ｃ（Ｏ）−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−Ｃ（Ｓ）−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａＵｃ）ａ−Ｓ（Ｏ）−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−Ｓ（Ｏ）２−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−ＯＣ（Ｏ）−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−ＯＣ（Ｓ）−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−Ｃ（Ｓ）Ｏ−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２５−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２５−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２５−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−ＮＲ２５Ｃ（Ｏ）−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−ＮＲ２５Ｃ（Ｓ）−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−ＮＲ２５Ｓ（Ｏ）２−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−ＮＲ２５Ｃ（Ｏ）Ｏ−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−ＮＲ２５Ｃ（Ｓ）Ｏ−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２５−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−ＯＣ（Ｓ）ＮＲ２５−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−ＮＲ２５Ｃ（Ｏ）ＮＲ２５−（ａｌｋ）ｂ−、−（ａｌｋ）ａ−ＮＲ２５Ｃ（Ｓ）ＮＲ２５−（ａｌｋ）ｂ−、および−（ａｌｋ）ａ−ＮＲ２５Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２５−（ａｌｋ）ｂ−からなる群から独立して選択され；ａおよびｂは独立して０または１であり；ａｌｋは、Ｃ１−Ｃ３アルキレン、または、フルオロ、−ＯＨ、−ＮＨ２、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、および−ＮＲ８Ｒ９、からなる群から選択される１以上の置換基で置換されたＣ１−Ｃ３アルキレンであり、ここで、低級アルキル、または、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノもしくはジ−アルキルアミノのアルキル鎖は、フルオロ、−ＯＨ、−ＮＨ２、低級アルコキシ、フルオロ置換低級アルコキシ、低級アルキルチオ、フルオロ置換低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノおよびシクロアルキルアミノからなる群から選択される１以上の置換基で任意に置換され、ただし、アルコキシのＯ、チオアルキルのＳ、またはモノ−またはジ−アルキルアミノのＮに結合したアルキル鎖炭素の置換はいずれもフルオロであり；
Ｌ１は−（ＣＲａＲｂ）ｖ−またはＬであり、ここでｖは１、２または３であり、式中、ＲａおよびＲｂは、それぞれの場合、水素、フルオロ、−ＯＨ、−ＮＨ２、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、および−ＮＲ８Ｒ９からなる群から独立して選択され、ここで、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、またはジ−アルキルアミノのアルキル鎖は、フルオロ、−ＯＨ、−ＮＨ２、低級アルコキシ、フルオロ置換低級アルコキシ、低級アルキルチオ、フルオロ置換低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、およびシクロアルキルアミノからなる群から選択される１以上の置換基で任意に置換され、ただし、アルコキシのＯ、チオアルキルのＳ、またはモノ−またはジ−アルキルアミノのＮに結合したアルキル鎖炭素の置換はいずれもフルオロであり；あるいは、同じまたは異なる炭素上のＲａおよびＲｂのうちの任意の２つが結合して、３−７員の単環式シクロアルキルまたは５−７員の単環式ヘテロシクロアルキルを形成し、そしてＲａおよびＲｂの他のものは独立して水素、フルオロ、−ＯＨ、−ＮＨ２、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、および−ＮＲ８Ｒ９、からなる群から選択され、ここで、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、またはジ−アルキルアミノのアルキル鎖は、フルオロ、−ＯＨ、−ＮＨ２、低級アルコキシ、フルオロ置換低級アルコキシ、低級アルキルチオ、フルオロ置換低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、およびシクロアルキルアミノからなる群から選択される１以上の置換基で任意に置換され、ただし、アルコキシのＯ、チオアルキルのＳまたはモノ−もしくはジ−アルキルアミノのＮに結合したアルキル鎖炭素の置換はいずれもフルオロであるように提供され、ここで、３−７員単環式シクロアルキルまたは５−７員単環式ヘテロシクロアルキルは、ハロゲン、−ＯＨ、−ＮＨ２、低級アルキル、フルオロ置換低級アルキル、低級アルコキシ、フルオロ置換低級アルコキシ、低級アルキルチオ、フルオロ置換低級アルキルチオ、モノ−アルキルアミノ、ジ−アルキルアミノ、およびシクロアルキルアミノからなる群から選択される１以上の置換基で任意に置換され；
Ｒ８およびＲ９はそれらが結合している窒素と一緒になって、フルオロ、−ＯＨ、−ＮＨ２、低級アルキル、フルオロ置換低級アルキル、低級アルコキシ、フルオロ置換低級アルコキシ、低級アルキルチオ、およびフルオロ置換低級アルキルチオからなる群から選択される１以上の置換基で場合により置換される５−７員ヘテロシクロアルキルを形成し；
Ｒ２５はそれぞれの場合独立して、水素、任意に置換される低級アルキル、任意に置換されるシクロアルキル、任意に置換されるヘテロシクロアルキル、任意に置換されるアリール、および任意に置換されるヘテロアリールからなる群から選択され；
各出現におけるＲ２４およびＲ２６は独立して水素からなる群から選択され、ただし、水素は、ＬまたはＬｉのＳ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ（Ｏ）またはＣ（Ｓ）、任意に置換される低級アルキル、任意に置換される低級アルケニル、のいずれにも結合しないように提供され、ただし、Ｒ２４またはＲ２６が任意に置換される低級アルケニルであるとき、そのアルケン炭素はＬまたはＬ１、のＮ、Ｓ、Ｏ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ（Ｏ）またはＣ（Ｓ）、または任意に置換される低級アルキニルに結合しないように提供され、ただし、Ｒ２４またはＲ２６が任意に置換される低級アルキニルであるとき、それらのアルキン炭素はＬまたはＬｉののＮ、Ｓ、Ｏ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ（Ｏ）またはＣ（Ｓ）、任意に置換されるシクロアルキル、任意に置換されたヘテロシクロアルキル、任意に置換されるアリール、および任意に置換されたヘテロアリールに結合しないように提供される。
【００２６】
好ましい実施形態では、式（ＩＩＩ）の化合物が提供され、ここで、
Ｒ２はＨであり；
Ｒ３は−Ａ−Ａｒ−Ｌ１−Ｒ２４であり；
Ａは−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ａｒは２，４−ジフルオロフェニルであり；
Ｌ１は‐ＳＯ２−であり；
Ｒ４はＨであり；
Ｒ５は４‐クロロフェニルであり；
Ｒ６はＨであり；
Ｒ２４は、ｎ−プロピル（本明細書中で「ＰＬＸ４０３２」、「ベムラフェニブ」、または「Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標）」と呼ばれる）または薬学的に許容されるその塩である。
【００２７】
他の実施形態では、当業者は、インビトロ、インビボ、インシリコ、または当該分野で公知の他のスクリーニング方法を使用して、新規のＢＲＡＦ阻害剤を生成または同定し得る。例えば、野生型ＢＲＡＦのＢＲＡＦ阻害剤は、ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードにおいてＢＲＡＦの下流にある分子のリン酸化を検出するためのアッセイ（例えば、ＭＥＫおよび／またはＥＲＫ）を用いて小分子、ペプチドまたは核酸のトレーニングセットから同定することができる。ＢＲＡＦ阻害剤は、ＢＲＡＦ発現および／またはシグナル伝達機能を抑制または阻害するように作用し得、それによってＭＥＫおよびＥＲＫのリン酸化を減少させる。キナーゼ活性アッセイ（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）によって販売されているもの）；イムノアッセイ、例えば、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫組織化学などで使用するためのリン酸化特異的抗体；質量分析、プロテオミクス、およびリン酸化タンパク質マルチプレックスアッセイを含むがこれらに限定されない、そのような実施形態において使用され得るいくつかのリン酸化アッセイが利用可能である。特定の実施形態では、本明細書に記載の実施形態で使用するためのＢＲＡＦ阻害剤は、ＭＡＰＫ経路を活性化する候補阻害剤能力を測定するスクリーニング方法を使用して同定することができる。ＭＡＰＫ経路のこの活性化は、ＣＲＡＦをトランス活性化することによって達成され得る。癌および異常なＢＲＡＦ発現に関連する他の疾患の治療に使用するための典型的なＢＲＡＦ阻害剤スクリーニングとは対照的に、このようにして同定されたＢＲＡＦ阻害剤（本明細書ではＭＡＰＫパラドックス活性化剤とも呼ぶ）が、皮膚細胞の増殖の増加を誘導することによって皮膚創傷治癒を促進するために逆説的なＭＡＰＫ活性化を利用するために使用され得る。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的に許容される塩」とは、対象への適用に対して安全かつ有効であり、そして所望の生物学的活性を有する本発明の化合物の塩を意味する。薬学的に許容される塩は、本発明の化合物中に存在する酸性または塩基性基の塩を含む。薬学的に許容される塩は、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、パントテン酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、サッカレート、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ‐トルエンスルホン酸塩およびパモエート（すなわち、１，１１−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、亜鉛、およびジエタノールアミン塩を含むが、これらに限定されない。本発明の特定の化合物は、様々なアミノ酸と薬学的に許容される塩を形成することができる。薬学的に許容される塩に関する総説については、これは、参照により本明細書に組み込まれる、Berge, et al., 66 J. Pharm. Sci. 1-19 (1977)を参照されたい。
医薬組成物
【００２９】
いくつかの実施形態では、上記の１つ以上のＢＲＡＦ阻害剤は医薬組成物の一部であり得る。いくつかの態様では、医薬組成物は少なくとも１つのＢＲＡＦ阻害剤および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、ある場所、体液、組織、器官（内部または外部）、すなわち身体の一部から、別の場所、体液、組織、器官、すなわち身体の一部への、ＢＲＡＦ阻害剤の運搬または輸送に関与する、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料などを意味する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体と、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）またはそれらの薬学的に許容される塩と一致するＢＲＡＦ阻害剤とを含む。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ＬＧＸ８１８（エンコラフェニブ）またはその塩もしくは誘導体である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体および式（ＩＩＩ）と一致するＢＲＡＦ阻害剤またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤はＧＳＫ２１１８４３６（ダブラフェニブ、Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標））またはその塩もしくは誘導体である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体および式（ＩＶ）と一致するＢＲＡＦ阻害剤またはその薬学的に許容されるその塩を含む。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤はＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標））またはその塩もしくは誘導体である。
【００３３】
各担体は、製剤の他の成分、例えばＢＲＡＦ阻害剤と相溶性であるという意味で「薬学的に許容される」、そして、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、合理的な利益／危険率に見合った、生体系の組織または器官と接触しての使用に適している。
【００３４】
薬学的に許容される担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、以下が含まれる。（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチ、ポテトスターチなどのデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）カカオバター；座剤用ワックス等の賦形剤；（９）ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール類；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコールなどのポリオール類；（１２）オレイン酸エチル、ラウリン酸エチルなどのエステル類；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム等の緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール、プロパンアルコール等のアルコール；（２０）リン酸緩衝液；（２１）アセトンなどの医薬製剤に使用される他の非毒性適合性物質。
【００３５】
医薬組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤などのおおよその生理学的条件に必要な薬学的に許容される補助物質、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有してもよい。さらに、医薬組成物の製剤はまた、湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、芳香剤、防腐剤、抗酸化剤、または他の補助成分を含んでもよい。
【００３６】
一実施形態では、薬学的に許容される担体は、例えば、食塩水などの水性担体である。特定の実施形態では、薬学的に許容される担体は、例えば、アセトンとアルコールなどの極性溶媒である。ある態様では、薬学的に許容される担体は、経皮投与、局所投与、エアロゾル投与、吸入投与、または以下に詳細に記載される投与経路などの任意の他の投与様式を可能にし、促進し、または増強する、適切な材料のものである。
【００３７】
これらの製剤中のＢＲＡＦ阻害剤の濃度は広く変動し得、そして選択された特定の投与様式および生物学的システムの必要性に従って、主に体液量、粘度、体重などに基づいて選択されるであろう。概して、医薬組成物中に存在するＢＲＡＦ阻害剤（単数または複数）の量は、治療効果を生み出す量であろう。例えば、いくつかの実施形態では、医薬組成物中の１つまたは複数のＢＲＡＦ阻害剤の体積当たりの重量（ｗ／ｖ）または重量パーセント（ｗｔ％）の濃度は、約０．００１％〜１００％、０．００１％〜９０％、０．００１％〜８０％、０．００１％〜７０％、０．００１％〜６０％、０．００１％〜５０％、０．００１％〜４０％、０．００１％〜３０％、０．００１％〜２０％、０．００１％〜１０％、０．００１％〜１％、０．０１％〜１００％、０．０１％〜９０％、０．０１％〜８０％、０．０１％〜７０％、０．０１％〜６０％、０．０１％〜５０％、０．０１％〜４０％、０．０１％〜３０％、０．０１％〜２０％、０．０１％〜１０％、０．０１％〜１％、０．１％〜１００％、０．１％〜９０％、０．１％〜８０％、０．１％〜７０％、０．１％〜６０％、０．１％〜５０％、０．１％〜４０％、０．１％〜３０％、０．１％〜２０％、０．１％〜１０％、０．１％〜１％、１％〜１００％、１％〜９０％、１％〜８０％、１％〜７０％、１％〜６０％、１％〜５０％、１％〜４０％、１％〜３０％、１％〜２０％、１％〜１０％、１％〜５％、１％〜４％、１％〜３％、１％〜２％、０．１％〜０．９％、０．１％〜０．８％、０．１％〜０．７％、０．１％〜０．６％、０．１％〜０．５％、０．１％〜０．４％、０．１％〜０．３％、０．１％〜０．２％、０．２％〜１％、０．３％〜１％、０．４％〜１％、０．５％〜１％、０．６％〜１％、０．７％〜１％、０．８％〜１％、または０．９％〜１％の間であり得る。
【００３８】
他の実施形態において、医薬組成物中の１つまたは複数のＢＲＡＦ阻害剤の濃度は、約１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、８００ｍＭ、９００ｍＭ、または１Ｍであり得る。いくつかの態様では、対象（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物）において治療効果をもたらすＢＲＡＦ阻害剤の濃度（モル濃度または重量％）は、以下の実施例に記載されるもののような、細胞培養および／または動物実験からのインビトロまたはインビボデータから推定することができる。
【００３９】
いくつかの態様では、医薬組成物は少なくとも１つの追加の治療薬も含む。１つ以上のＢＲＡＦ阻害剤に加えて、適切な治療薬が医薬組成物の一部として含まれてもよい。特定の実施形態では、治療薬は第２の血管新生促進剤である。適切な第２の血管新生促進剤としては、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、ＦＧＦ‐１などの全てのＦＧＦメンバーを含む）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、デルタ様リガンド４（Ｄｌｌ４）、およびクラス３セマフォリン（ＳＥＭＡ３）、セルピン１、ＰＥＣＡＭ１、ＭＭＰ３、および／またはＴＨＢＳが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
医薬組成物の一部として含まれ得る他の適切な治療薬としては、増殖因子（例えば、組換え血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ；Ｒｅｇｒａｎｅｘ（登録商標）／ベカプレルミンゲル））、魚皮ベースのＭａｒｉＧｅｎオメガ３組織再生技術、砂糖、制酸剤、ビタミンＡ、ビタミンＤ、抗菌剤、防腐剤（例えば、酢酸、酸性亜硝酸塩、ａｃｔｉｃｏａｔ７、ａｑｕａｃｅｌ‐Ａｇ、抗菌ペプチド、バシトラシン、ＢＣＴＰナノエマルション、カデキソマーヨウ素、ヨウ素、セントリミド、クロルヘキシジン、エッセンシャルオイル、フラマセリウム（flammacerium）、ＦＰＱＣ、フシジン酸、ゲンタマイシン、グルコン酸塩、ヘキサクロロフェン、蜂蜜、ヨウ素化合物、ヨウ素チンキ剤、リポソームヨウ素、酢酸マフェニド、メトロニダゾール、ムピロシン、ムピロシンカルシウム、硫酸ネオマイシン、ネオスポリン、ニトロフラゾン、ナイスタチン、ファージ療法、パパイヤ、プロバイオティクス、ポリミキシンＢ、ヨウ化ポビドン、レタパムリン、次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素、銀、シルバーセル（silvercel）、銀の羊膜、硝酸銀、銀の包帯、銀の泡、スルファジアジン銀、スルファセタミドＮａ＋、および超酸化水）；引赤薬などの鎮痛薬（例えば、サリチル酸、ニコチン酸、カプサイシン、トウガラシ抽出物）、ＮＳＡＩＤ（例えば、イブプロフェン、ジクロフェナク、フェルビナク、ケトプロフェン、ピロキシカム、ナプロキセン、フルルビプロフェン）、ヒドロコルチゾン、塩化ベンザルコニウム、ベンジダミン、ムコ多糖多硫酸、サリチルアミド、フェノール、冷却スプレー、カラミン、および局所麻酔薬（例えば、リドカイン、リグノカイン、プリロカイン、ベンゾカイン、プラモキシン、ジブカイン）などの創傷治療剤が挙げられるが、これらに限定されない。
創傷被覆材
【００４１】
本明細書に記載のＢＲＡＦ阻害剤およびその医薬組成物は、１つまたは複数の創傷被覆材と組み合わせて、または創傷被覆材とともに使用することができる。特定の実施形態において、１つ以上のＢＲＡＦ阻害剤またはその医薬組成物は、創傷被覆材にしみ込ませるためまたはコートするために使用される。以下に記載されるものなどの任意の創傷被覆材は、１つ以上のＢＲＡＦ阻害剤または１つ以上のＢＲＡＦ阻害剤を含む医薬組成物に含浸されまたはこれにより被覆されてもよい。そのような医薬組成物は上記に詳細に記載されている。
【００４２】
一実施形態では、１つまたは複数のＢＲＡＦ阻害剤を含む医薬組成物に含浸またはこれにより被覆された創傷被覆材（包帯）は、単一の創傷治癒被覆材または個別に包装された１組の創傷治癒被覆材として販売することができる。そのような場合、被覆材およびＢＲＡＦ阻害剤は、創傷に適用されたときに、単一の被覆材単ユニットとともに供給され、被覆材の典型的な創傷治癒特性を付与するだけでなく（例えば、出血を止め、疼痛を軽減し、さらなる害や怪我から保護し、感染から保護する）だけでなく、創傷治癒機能を強化および／または加速するようにも作用する。
【００４３】
創傷治癒を促進し、開放創を保護し、疼痛を軽減し、そして感染および／または汚染を防止するために、いくつかの適切な創傷被覆材が当該分野で公知であり使用され、そのいずれも本明細書に記載の実施形態に従って使用され得る。適切な創傷被覆材の例としては、アルギン酸塩、抗菌剤、包帯、バンドエイド（登録商標）、生合成、生物製剤、コラーゲン、複合材料、圧縮包帯、接触層、フォーム、ガーゼ、ヒドロコロイド、ヒドロゲル、皮膚シーラント／液状皮膚、特殊吸収剤、透明フィルム、創傷充填剤が挙げられる。いくつかの態様では、１つまたは複数のＢＲＡＦ阻害剤で含浸またはコーティングした複数の創傷被覆材を創傷に使用することができる。他の態様では、創傷被覆材は、局所軟膏剤、ゲル剤、スプレー剤、ペースト剤、液体剤または他の製剤と組み合わせて使用することができ、それぞれは１つまたは複数のＢＲＡＦ阻害剤またはその組成物を含み得る。
【００４４】
いくつかの実施形態によれば、創傷被覆材は、単独で、または医薬組成物の一部として、上記の１つまたは複数のＢＲＡＦ阻害剤で含浸またはコーティングされている。特定の態様では、創傷被覆材を含浸またはコーティングするために使用することができる１つまたは複数のＢＲＡＦ阻害剤は、ＡＭＧ５４２、ＡＲＱ１９７、ＡＲＱ７３６、ＡＺ６２８、ＣＥＰ−３２４９６、ＧＤＣ−０８７９、ＧＳＫ１１２０２１２、ＧＳＫ２１１８４３６（ダブラフェニブ、Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標））、ＬＧＸ８１８（エンコラフェニブ）、ＮＭＳ−Ｐ１８６、ＮＭＳ−Ｐ３４９、ＮＭＳ−Ｐ３８３、ＮＭＳ−Ｐ３９６、ＮＭＳ−Ｐ７３０、ＰＬＸ３６０３（ＲＯ５２１２０５４）、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標））、ＰＬＸ４７２０（ジフルオロフェニル−スルホンアミン）、ＰＦ−０４８８０５９４、ＰＬＸ４７３４、ＲＡＦ２６５（ＣＨＩＲ−２６５）、ＲＯ４９８７６５５、ＳＢ５９０８８５、ソラフェニブ、トシル酸ソラフェニブ、およびＸＬ２８１（ＢＭＳ−９０８６６２）の１つまたは複数から選択される。被覆材が１つ以上のＢＲＡＦ阻害剤の治療効果を創傷に付与するように、含浸またはコートした創傷被覆材を創傷に直接適用することができる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、創傷被覆材は、単独でまたは医薬組成物の一部として、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）またはその製薬上許容される塩と一致するＢＲＡＦ阻害剤に含浸され、または、コーティングされている。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ＬＧＸ８１８（エンコラフェニブ）またはその塩もしくは誘導体である。
【００４６】
いくつかの実施形態では、創傷被覆材は、単独でまたは医薬組成物の一部として、式（ＩＩＩ）または薬学的に許容されるその塩と一致するＢＲＡＦ阻害剤で含浸またはコーティングされている。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤はＧＳＫ２１１８４３６（ダブラフェニブ、Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標））またはその塩もしくは誘導体である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、創傷被覆材は、単独でまたは医薬組成物の一部として、式（ＩＶ）または薬学的に許容されるその塩と一致するＢＲＡＦ阻害剤で含浸またはコーティングされている。いくつかの実施形態において、ＢＲＡＦ阻害剤はＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標））またはその塩もしくは誘導体である。
使用方法
【００４８】
いくつかの実施形態では、上記のＢＲＡＦ阻害剤は、単独で、または医薬組成物の一部として、対象の創傷を治療する方法に使用することができる。
本明細書に記載のそのような方法は、限定されるものではないが急性の非貫通創傷（例えば、擦過傷、裂傷、挫傷）、急性穿刺性創傷（例えば、穿刺創傷、表面の切り傷、引っ掻き傷または裂傷、外科的切開および創傷、銃創）、熱傷（例えば、火傷、日焼け、凍傷）、潰瘍（例えば、慢性糖尿病性潰瘍、褥瘡／じょく創）、水疱、発疹、化学的創傷、動物または昆虫の刺されおよび刺傷、ならびに電気的創傷を含む任意の種類の創傷を治療するために使用することができる。
【００４９】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、対象における根本的な障害または状態から生じるかまたはそれによって引き起こされる創傷を治療することができる。したがって、上記のＢＲＡＦ阻害剤は、単独で、または医薬組成物の一部として、障害または状態を治療するための方法において使用され得る。単独で、または医薬組成物の一部として、上記のＢＲＡＦ阻害剤によって治療可能な創傷を引き起こす可能性がある障害または状態には、表皮水疱症（ＥＢ）、スティーブンス−ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、ブドウ球菌鱗屑性皮膚症候群（ＳＳＳＳ）、尋常性天疱瘡（ＰＶ）、および中毒性ショック症候群（ＴＳＳ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００５０】
創傷を引き起こす根本的な障害または病気を治療するための方法を含む、創傷を治療するための方法は、創傷の治癒を促進するために創傷を有効量の１つまたは複数のＢＲＡＦ阻害剤と接触させるステップを含み得る。本明細書に記載の方法に従って使用することができる適切なＢＲＡＦ阻害剤としては、上記のものが挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様では、１つまたは複数のＢＲＡＦ阻害剤は、ＡＭＧ５４２、ＡＲＱ１９７、ＡＲＱ７３６、ＡＺ６２８、ＣＥＰ−３２４９６、ＧＤＣ−０８７９、ＧＳＫ１１２０２１２、ＧＳＫ２１１８４３６（ダブラフェニブ、Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標））、ＬＧＸ８１８（エンコラフェニブ）、ＮＭＳ−Ｐ１８６、ＮＭＳ−Ｐ３４９、ＮＭＳ−Ｐ３８３、ＮＭＳ−Ｐ３９６、ＮＭＳ−Ｐ７３０、ＰＬＸ３６０３（ＲＯ５２１２０５４）、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標））、ＰＬＸ４７２０（ジフルオロフェニル−スルホンアミン）、ＰＦ−０４８８０５９４、ＰＬＸ４７３４、ＲＡＦ２６５（ＣＨＩＲ−２６５）、ＲＯ４９８７６５５、ＳＢ５９０８８５、ソラフェニブ、トシル酸ソラフェニブ、およびＸＬ２８１（ＢＭＳ−９０８６６２）のうちの１つまたは複数から選択され得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に従って使用され得るＢＲＡＦ阻害剤は、式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）または薬学的に許容されるその塩と一致する。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤はＬＧＸ８１８（エンコラフェニブ）またはその塩もしくは誘導体である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に従って使用され得るＢＲＡＦ阻害剤は、式（ＩＩＩ）または薬学的に許容されるその塩と一致する。いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤はＧＳＫ２１１８４３６（ダブラフェニブ、Ｔａｆｉｎｌａｒ（登録商標））またはその塩もしくは誘導体である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法に従って使用され得るＢＲＡＦ阻害剤は、式（ＩＶ）または薬学的に許容されるその塩と一致する。いくつかの実施形態において、ＢＲＡＦ阻害剤はＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ、Ｚｅｌｂｏｒａｆ（登録商標））またはその塩もしくは誘導体である。
【００５４】
本明細書に記載の方法によれば、創傷を１つまたは複数のＢＲＡＦ阻害剤またはその医薬組成物と接触させることは、任意の適切な送達経路または投与経路によって達成することができる。創傷を治療するために、ＢＲＡＦ阻害剤またはその医薬組成物は、経口、経鼻、局所、エアロゾル、経粘膜、表皮、経皮、経皮、眼、肺、皮下および／または吸入を含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の任意の投与経路によって送達または投与することができる。医薬組成物は、投与方法に応じて様々な単位剤形で投与することができる。例えば、経皮投与に適した単位剤形には、含浸またはコートされたパッチ、包帯、ガーゼ、または本明細書に記載の他の任意の被覆材が含まれる。
【００５５】
いくつかの実施形態によれば、ＢＲＡＦ阻害剤またはその医薬組成物は、各投与経路に適した製剤または調製物の形態で対象に投与することができる。本発明の方法において有用な製剤は、１つ以上のＢＲＡＦ阻害剤、そのための１つ以上の薬学的に許容される担体、および任意に１つ以上の追加の治療薬または成分を含み得る。製剤は、便利には単位剤形で提供されてもよく、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製されてもよい。単一剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される対象および特定の投与様式に応じて変わるであろう。薬学的に有効な用量を生成するために担体材料と組み合わせることができるＢＲＡＦ阻害剤の量は、概して、治療効果をもたらすＢＲＡＦ阻害剤の量であろう。
【００５６】
いくつかの実施形態では、製剤は口腔創傷または潰瘍の治療に使用するための経口投与に適していることとしてもよい。そのような実施形態では、製剤は固体剤形（例えば、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤（フレーバーベース、通常、ショ糖およびアカシアまたはトラガカントを使用）、粉末剤、顆粒剤）、または液体剤形（例えば、水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として、水中油型または油中水型液体エマルジョンまたはマイクロエマルジョンとして、エリキシル剤またはシロップとして、トローチとして（ゼラチンとグリセリン、スクロースとアカシアなどの不活性塩基を使用）および／または洗口剤等として）であり得、それぞれ所定量のＢＲＡＦ阻害剤を有効成分として含有する。
【００５７】
経口投与用の固体剤形（例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣剤、散剤、顆粒剤など）では、ＢＲＡＦ阻害剤を、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの１つまたは複数の薬学的に許容される担体、および／または以下：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤；（２）結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアラビアゴム；（３）グリセロールなどの湿潤剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカ澱粉、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムなどの崩壊剤；（５）パラフィンなどの溶解遅延剤；（６）４級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；（７）湿潤剤、例えばアセチルアルコール、グリセリンモノステアレート；（８）カオリン、ベントナイトクレー等の吸収剤；（９）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物；並びに（１０）着色剤、と混合することができる。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、医薬組成物は緩衝剤も含み得る。ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して、同様の種類の固体組成物を軟質および硬質ゼラチンカプセルの充填剤として使用することもできる。
【００５８】
液体剤形では、ＢＲＡＦ阻害剤は、当技術分野で通常使用される不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に綿実油、落花生油、とうもろこし、胚芽、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物と混合することができる。不活性希釈剤の他に、経口組成物は湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味剤、香味剤、着色剤、芳香剤および保存剤のような補助剤も含み得る。さらに、懸濁液は、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにそれらの混合物のような懸濁剤を含有してもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤組成物の局所投与、経皮投与、表皮投与、または経皮投与用の製剤としては、散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチ剤、包帯剤および吸入剤が挙げられる。活性成分は、無菌条件下で薬学的に許容される担体と、そして必要とされ得る任意の防腐剤、緩衝剤、または噴射剤と混合され得る。このような軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤およびゲル剤は、ＢＲＡＦ阻害剤組成物に加えて、動物性および植物性脂肪、油脂、パラフィン、ワックス、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含み得る。粉末剤およびスプレー剤は、ＢＲＡＦ阻害剤組成物に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末などの賦形剤、またはこれらの物質の混合物を含むことができる。スプレーは、クロロフルオロヒドロカーボンのような慣用の噴射剤ならびにブタンおよびプロパンのような揮発性の非置換炭化水素をさらに含み得る。
【００６０】
特定の態様では、ＢＲＡＦ阻害剤またはその医薬組成物はエアロゾルによって投与することができる。これは、水性エアロゾル、リポソーム製剤、またはＢＲＡＦ阻害剤を含有する固体粒子もしくは粉末を調製することによって達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴射剤）懸濁液を使用することができる。音波ネブライザーもまた使用することができる。水性エアロゾルは、薬剤の水溶液または懸濁液を従来の薬学的に許容される担体および安定剤と一緒に製剤化することによって製造される。担体および安定剤は特定の化合物の要件によって変わるが、典型的には非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、またはポリエチレングリコール）、血清アルブミン、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、アミノ酸（グリシンなど）、緩衝液、塩、糖、糖アルコールなどの無害なタンパク質を含む。エアロゾルは一般に等張液から調製される。
【００６１】
経皮パッチまたは創傷被覆材を用いて、ＢＲＡＦ阻害剤またはその医薬組成物を創傷部位に送達することもできる。使用され得る創傷被覆材の例は、上に詳細に記載されている。そのような製剤は、薬剤を適切な媒体に溶解または分散させることによって製造することができる。吸収促進剤もまた、皮膚を通過するペプチド模倣物の流動を増加させるために使用され得る。そのような流動の速度は、速度制御膜を提供するか、またはペプチド模倣物をポリマーマトリックスまたはゲルに分散させることによって制御することができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、創傷を治療する方法で使用されるＢＲＡＦ阻害剤またはその医薬組成物は創傷被覆材の一部である。いくつかの態様では、これは、上記のように、ＢＲＡＦ阻害剤またはその医薬組成物が創傷被覆材の全部または一部をコーティングまたは含浸するために使用されることを意味する。この実施形態に従って使用され得る創傷被覆材は、アルギン酸塩被覆材、抗菌被覆材、包帯、バンドエイド（登録商標）、生合成被覆材、生物学的被覆材、コラーゲン被覆材、複合被覆材、圧縮被覆材、接触層被覆材、フォーム被覆材、ガーゼ被覆材、親水コロイド被覆材、ヒドロゲル被覆材、スキンシーラントまたは液体スキン被覆材、特殊吸収性被覆材、透明フィルム被覆材、または創傷フィラーを含む。
【００６３】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の効果を生じるＢＲＡＦ阻害剤の量を指す。例えば、細胞集団を有効量のＢＲＡＦ阻害剤と接触させてその効果をインビトロ（例えば細胞培養）で研究するか、または所望の治療効果をエクスビボまたはインビトロで生じさせることができる。有効量のＢＲＡＦ阻害剤を使用して、標的とする病気の治療、その病気に関連する症状の軽減、または所望の生理学的効果の生成などの対象における治療効果を生み出すことができる。例えば、有効量のＢＲＡＦ阻害剤は、創傷治癒を刺激する量であり得る。そのような場合、ＢＲＡＦ阻害剤の有効量は「治療上有効な量」、「治療上有効な濃度」または「治療上有効な用量」である。正確な有効量または治療有効量は、所与の対象または細胞集団における治療の有効性に関して最も有効な結果をもたらすであろうＢＲＡＦ阻害剤の量である。この量は、ＢＲＡＦ阻害剤の特性（活性、薬物動態、薬力学、および生物学的利用能を含む）、対象の生理学的状態（年齢、性別、創傷の種類および状態、一般的な体調、所与の投与量に対する反応性、および薬物の種類を含む）または細胞、製剤中の薬学的に許容される担体（単数または複数）の性質、投与経路を含むがこれらに限定されない様々な要因に応じて変わるであろう。さらに、有効量または治療有効量は、ＢＲＡＦ阻害剤を単独で投与するのか、あるいは化合物、薬物、治療法もしくは他の治療方法もしくは治療法と組み合わせて投与するのかに応じて変わり得る。臨床および薬理学の当業者は、日常的な実験を通して、すなわちＢＲＡＦ阻害剤の投与に対する細胞または対象の応答をモニターし、それに応じて用量を調整することによって、有効量または治療有効な量を決定することができるだろう。追加のガイダンスについては、あたかも完全に本明細書に記載されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21stEdition, Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005を参照されたい。
【００６４】
創傷の「治療」または「療法」は、急性または慢性の創傷、損傷または罹患組織の構造および機能を治癒、保護、修復、または回復；病気を予防し、病気の発症または発症速度を遅くし、創傷に続発する病気を発症するリスクを予防または低減し、創傷部位に存在する抗菌感染を死滅させ、疼痛および創傷に関連するその他の症状の発症を予防または遅延させること、疼痛および創傷に関連する他の症状を軽減または終了させること、創傷の完全なまたは部分的な後退、またはそれらの何らかの組み合わせを助けるための任意の薬剤または被覆材の使用を指すこととしてもよい。
【００６５】
いくつかの実施形態では、上記のＢＲＡＦ阻害剤またはその医薬組成物は、１つまたは複数の追加の治療薬と組み合わせてまたは合わせて投与または送達することができる。ＢＲＡＦ阻害剤および治療薬は、相加的にまたは相乗的に一緒に作用することができる。本明細書で使用される「組み合わせて」、「と組み合わせて」または「と合わせて」は、２つ以上の薬剤、包帯剤、薬物、治療計画、治療様式、またはそれらの組み合わせを用いて同じ対象の同じ創傷を治療する過程において、任意の順序で、そして任意の適用の数を意味する。これには、同時投与のほか、数日までの時間間隔での順序での投与も含まれる。２つ以上の薬剤、被覆材、薬物、治療計画、治療様式またはそれらの組み合わせは、単一の適用または投与の一部であり得るか、あるいは別々に適用または投与され得る。例えば、ＢＲＡＦ阻害剤は医薬組成物または製剤の成分として投与することができる。この組成物または処方物は、単一の局所組成物として適用されるべき１つ以上のさらなる治療剤を含み得るか、あるいはこの組成物は、１つ以上のさらなる治療剤を含む第２の医薬組成物または処方物と共に創傷に適用され得る。組成物または製剤が適用されれば、創傷被覆材を局所用組成物の上に適用することができる。別の例では、ＢＲＡＦ阻害剤を単独でまたは医薬組成物の一部として創傷被覆材に含浸させるために使用することができる。併用治療はまた、薬剤、薬物、治療計画または治療様式のうちの任意の１つ以上の単回投与を超えてもよい。さらに、２つ以上の薬剤、被覆材、薬物、治療計画、治療様式またはそれらの組み合わせの投与は、同じまたは異なる投与経路によってもよい。
【００６６】
一実施形態において、ＢＲＡＦ阻害剤（すなわち、血管新生促進剤）およびその医薬組成物は、ＢＲＡＦ阻害剤の血管新生効果を増強するために、第２の血管新生促進剤と組み合わせてまたは合わせて投与または送達することができる。適切な第二の血管新生促進剤としては、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ、ＦＧＦ−１などのすべてのＦＧＦメンバーを含む）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、デルタ様リガンド４（Ｄ１１４）、およびクラス３セマフォリン（ＳＥＭＡ３）、セルピン１、ＰＥＣＡＭ１、ＭＭＰ３、および／またはＴＨＢＳ１が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００６７】
ＢＲＡＦ阻害剤およびその医薬組成物と組み合わせてまたはそれらと合わせて投与または送達され得る他の適切な治療剤としては、成長因子（例えば、組換え血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ；  Ｒｅｇｒａｎｅｘ（登録商標）／Ｂｅｃａｐｌｅｒｍｉｎゲル）））、魚皮ベースのＭａｒｉＧｅｎ  Ｏｍｅｇａ３組織再生技術、砂糖、制酸剤、ビタミンＡ、ビタミンＤ、抗菌剤および防腐剤（例、酢酸、酸性亜硝酸塩、ａｃｔｉｃｏａｔ７、ａｑｕａｃｅｌ−Ａｇ、抗菌ペプチド、バシトラシン、ＢＣＴＰナノエマルジョン、ヨウ化カドリマー、ヨウ素、セントリミド、クロルヘキシジン、エッセンシャルオイル、フラマセリウム、ＦＰＱＣ、フシジン酸、ゲンタマイシン、グルコン酸塩、ヘキサクロロフェン、蜂蜜、ヨウ素化合物、ヨウ素チンキ剤、リポソームヨウ素、酢酸マフェニド、メトロニダゾール、ムピロシン、ムピロシンカルシウム、硫酸ネオマイシン、ネオスポリン、ニトロフラゾン、ナイスタチン、ファージ療法、パパイヤ、プロバイオティクス、ポリミキシンB、ポビドンヨード、レタパムリン、次亜塩素酸ナトリウム、過酸化水素、銀、銀セル、銀羊膜、硝酸銀、銀包帯、銀発泡体、銀スルファジアジン、スルファセタミドＮａ＋、および超酸化水）；鎮痛剤、例えば、発赤薬（例えば、サリチレート、ニコチネート、カプサイシン、トウガラシ抽出物）、ＮＳＡＩＤ（例えば、イブプロフェン、ジクロフェナク、フェルビナク、ケトプロフェン、ピロキシカム、ナプロキセン、フルビプロフェン）、ヒドロコルチゾン、塩化ベンザルコニウム、ベンジダミン、ムコ多糖多硫酸、サリチルアミド、フェノール、冷却スプレー、カラミン、および局所麻酔薬（例えば、リドカイン、リグノカイン、プリロカイン、ベンゾカイン、プラモキシン、ジブカイン）などの創傷治療剤が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００６８】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を説明することを意図している。したがって、論じられた特定の実施形態は、本発明の範囲に対する限定として解釈されるべきではない。当業者には明らかなように、本発明の範囲から逸脱することなく様々な均等物、変更、および修正を加えることができ、そのような均等物の実施形態は本明細書に含まれるべきであることが理解される。例えば、以下の実施例はベムラフェニブでの処置を用いて行われた実験に関するものであるが、当業者は、ベムラフェニブの代わりに他のＢＲＡＦ阻害剤を使用して同様の結果を得ることができることを理解するであろう。さらに、本開示において引用された全ての参考文献は、本明細書に完全に記載されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６９】
実施例
ＢＲＡＦ阻害剤は、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異体転移性黒色腫を有する患者の治療に非常に活性であり、それらの主な副作用は、角質増殖から浸潤性扁平上皮癌への一連の皮膚増殖性変化である。これらの副作用の病理学的根拠は、ＭＡＰＫ経路の逆説的活性化によって媒介され、ここで、ＢＲＡＦ阻害剤は、ＢＲＡＦについて野生型である細胞においてＭＡＰＫ経路シグナル伝達を増加させる。この現象は、皮膚細胞の増殖の増加を誘導することによって皮膚の創傷治癒を促進するために以下の研究において利用された。ＢＲＡＦ阻害剤ベムラフェニブは、スクラッチアッセイにおいてヒトケラチノサイトの増殖および遊走を促進し、これは、ＥＲＫリン酸化および細胞周期進行の増加によって媒介された。創傷治癒マウスモデルにおいて、局所的に適用されたベムラフェニブは、遺伝子発現プロファイリングによって評価されるように、逆説的なＭＡＰＫ活性化を通して治癒創傷の引張強度を改善した。したがって、局所ＢＲＡＦ阻害剤は、皮膚創傷の治癒を促進することにおいて用途を有し得る。
実施例１：材料と方法
【００７０】
特に明記しない限り、以下の実施例２〜８では以下の材料および方法を使用した。
【００７１】
細胞増殖および遊走アッセイ。ヒト表皮成体ケラチノサイト（ＨＥＫａ）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（グランドアイランド，ＮＹ；Ｃ‐００５‐５Ｃ）から購入した。ＨＥＫａ細胞（２５，０００／ウェル）を９６ウェルＩｍａｇｅＬｏｃｋ細胞遊走プレート（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）にプレーティングし、一晩インキュベートした。次に、細胞単層を９６ピンＷｏｕｎｄＭａｋｅｒ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で引っ掻き、細胞培地を添加する前に細胞をＰＢＳで洗浄した。完全なスクラッチ閉鎖まで細胞を１．５μＭの濃度のベムラフェニブと共に培養物中に維持した。細胞遊走は、画像データを収集および処理するネットワーク化装置外部コントローラハードドライブに接続された細胞インキュベーター内の顕微鏡ガントリーによってモニターされた（Ｉｎｃｕｃｙｔｅ，Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）。これにより、培養中の生細胞をモニターするための自動化された非侵襲的方法が可能になる。ＨＥＫαおよびＭ２４９細胞を、ビヒクル、ベムラフェニブ（１．５μＭ）、トラメチニブ（１μＭ）、マイトマイシンＣ（１０μｇ／ｍｌ）、ＮＳＣ２９５６４２（１μｇ／ｍｌ）、またはそれらの組み合わせで処理したＯｒｉｓ（商標）細胞移動プレート（Ｐｌａｔｙｐｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）上にプレーティングし、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ（５‐クロロメチルフルオレセインジアセテート）プローブ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を充填した。マイトマイシンＣおよびＮＳＣ２９５６４２は、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。細胞遊走は、ＢｉｏＳｐｏｔ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５ＵＶアナライザー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）を用いて評価した。
【００７２】
コロニー形成アッセイ。２４ウェルプレートを、０．６％Ｎｏｂｌｅ寒天（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州サンノゼ）を有する３００μｌの無血清ＲＰＭＩ １６４０（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ハンプトン、ＮＨ）で覆い、そして３７℃で一晩、固化するまでインキュベートした。１．５μＭの濃度のベムラフェニブを有する増殖培地と増殖因子減少マトリゲル（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）との１：１混合物中のＨＥＫαおよびＭ２４９細胞（１５，０００細胞／ｍｌ）の懸濁液３００μｌを各ウェルに添加した。一週間後、ＢｉｏＳｐｏｔ  Ｓｅｒｉｅｓ５ＵＶアナライザーを用いて自動コロニー定量を行った。
【００７３】
細胞内フローサイトメトリー分析：１．５μＭの濃度のベムラフェニブまたはビヒクル対照で処理したＨＥＫａおよびＭ２４９細胞をホルムアルデヒドで最終濃度１．６％に固定し、メタノール（９０％）を用いて透過処理した。その後、染色緩衝液（滅菌ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０１％アジ化ナトリウム、ＮａＮ３）で洗浄し、Ｃｏｍｉｎ−Ａｎｄｕｉｘ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ５：ｅ１２７１１（２０１０）によって記載されているように、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ６４７マウス抗ＥＲＫ１／２（ｐＴ２０２／ｐＹ２０４）抗体およびＰＥマウス抗ヒトＫｉ６７抗体で染色した（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）。インキュベーション後、細胞を再度洗浄し、そして３ｍｌの染色緩衝液中に再懸濁した。分析のために合計３０，０００の細胞事象を取得した。ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いてデータを分析した。ＨＥＫａ細胞およびＭ２４９細胞をマイコプラズマについて日常的に試験したところ、陰性であることがわかった。
【００７４】
ウエスタンブロッティング。Ｍ２４９細胞およびＨＥＫａ細胞を１．５μＭの濃度のベムラフェニブまたはビヒクル対照で二重に処理した。ウエスタンブロッティングは、Escuin-Ordinas, et al., Mol. Oncol. 8:250-60 (2014)によって、以前に記載されているように実施した。一次抗体は、ｐ‐ＥＲＫ Ｔｈｒ２０４／２０５、ＥＲＫ、Ｋｉ６７およびβ‐アクチン（すべてＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡから）を含む。免疫反応性は、Ｔｙｐｈｏｏｎスキャナーを用いてＥＣＬ−Ｐｌｕｓキットで明らかにされた（いずれもAmersham Biosciences Co, Piscataway, NJから）。
【００７５】
切開背側創傷モデル。Ｃ３Ｈｆ／Ｋａｍ（Ｈ２−ｋ）雌マウスは、８〜１０週齢の創傷治癒研究に使用された。それらはＵＣＬＡで飼育され、動物研究評議会（ＡＲＣ）プロトコル＃２０１３‐０６６‐０１「ＢＲＡＦ阻害剤による創傷治癒」の下で使用された。麻酔薬としてケタミン／キシラジンを用いて、記載されているように（Kim et al. 2013）、麻酔したマウスの剃毛した背部皮膚に長さ約２．５ｃｍの全層創傷を作った。臨床グレードのベムラフェニブ丸剤（Ｚｅｌｂｏｒａｆ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を粉砕し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１：４）に４０μｇ／μｌの濃度に溶解し、５０μｌの混合物（またはビヒクルコントロールとしてＰＢＳ中のＤＭＳＯ）を局所的に添加した。創傷は３〜４本のクリップで閉じられ、２日後に取り除かれた。２、４、６、８、１０および１２日目に、ベムラフェニブ懸濁液（２ｍｇ）またはビヒクル対照を創傷部位に局所的に再適用した。創傷から２週間後、創傷を含む四角形の皮膚を安楽死させたマウスから取り出し、マルチブレード装置を用いて長さ２０ｍｍの２つの２ｍｍストリップに切断し、各２ｍｍ幅のストリップに水平創傷サンプルを入れた(Gorodetsky et al. 1988)。前述のように（Ｇｏｒｏｄｅｔｓｋｙ ２００８）、Ｉｎｓｔｒｏｎテンシオメータを用いて、ＷＴＳ測定まで、ストリップを蓋付きペトリ皿中の氷冷ＰＢＳに浸した濾紙上に広げた。スキンストリップを破断点まで１ｃｍ／分の速度で引き伸ばして、２ｍｍあたりのｇｆでのピークＷＴＳを得た。１２週齢のマウスの傷のない皮膚のＷＴＳは２５０（ｇｆ）である（Gorodetsky et al. 1988）。
【００７６】
切除皮膚創傷副子モデル。７〜９週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスをＡＣＲプロトコル＃２０１０−０１１−１３Ｆの下でこれらの研究に使用した。誘導チャンバー内でマウスを２〜３％イソフルランで麻酔し、手術全体を通して麻酔下に保った。マウスの背部を剃毛し、ベタジンおよび７０％エタノールで洗浄し、そして手術の前にブプレノルフィン（２．５ｍｇ／ｋｇ）の用量を皮下投与した。６ｍｍの生検パンチを用いて動物の正中線の脇に２つの切除創傷を皮膚に作った。２０μｌのベムラフェニブ（０．１ｍｇ／μｌ）またはＤＭＳＯを、スプリンティングリング（splinting ring）の縫合の１分前に創傷に局所塗布した。スプリンティングリングは８ｍｍの透明な窓を有し、それはＴｅｇａｄｅｒｍで覆われて創傷サイズの視覚化と測定を可能にした。手術後の最初の４８時間は、すべての動物の炎症と疼痛の徴候を毎日観察した。ベムラフェニブまたはＤＭＳＯを２日目および４日目に繰り返し適用した。創傷を０日目、２日目、６日目および１４日目に写真撮影し、それに基づいて創傷閉鎖率を計算した。
【００７７】
組織学的分析。ベムラフェニブ懸濁液または食塩水対照懸濁液中のＤＭＳＯで処置したＣＨ３マウスからの背部皮膚創傷を２、６および１４日目に切除した。それらを１０％中性緩衝ホルマリン中で固定しそしてパラフィン中に包埋しそして標準的方法を用いてヘマトキシリン‐エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。Ｂａｌｂ／ｃマウスを２、６および１４日目にイソフルラン過量投与で屠殺した。全創傷領域ならびに周囲の組織および皮膚を含む各Ｂａｌｂｃ／ｃマウスから２つの８ｍｍ円形組織片を収集し、創傷の正中線で正確に半分に切断し、そして１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で１６〜１８時間、４℃で固定し、７０％ＥｔＯＨ中で脱水し、次いでパラフィン包埋した。切片を４μｍに切断し、キシレンおよび派生（descendant）エタノールで脱パラフィン処理し、次いで３％Ｈ２Ｏ２中で１０分間インキュベートした。蒸留水で洗浄した後、スライドを、野菜スチーマーを用いて９５℃でクエン酸緩衝液ｐＨ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２５分間インキュベートした。スライドを室温にし、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ‐２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水）ですすぎ、次いで１：１００抗マウスＫｉ‐６７抗体（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）と共に室温で１時間、１：１０ホスホ‐ＥＲＫ  Ａｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）と共に一晩、インキュベートした。Ｋｉ６７染色スライドをＰＢＳＴですすぎ、室温で１：２００ポリクローナルウサギ抗ラット免疫グロブリン／ビオチン化Ａｂ（Ｄａｋｏ、Ｅ０４６８）と共に３０分間インキュベートした。すべてのスライドをＰＢＳＴですすぎ、Ｄａｋｏ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ‐ＨＲＰ標識ポリマー抗ウサギ（Ｄａｋｏ）と共に室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴですすいだ後、スライドを視覚化のためにＤＡＢ（３，３’‐ジアミノベンジジン）と共にインキュベートした。その後、スライドを水道水で洗浄し、Ｈａｒｒｉｓのヘマトキシリンで対比染色し、エタノールで脱水し、培地でマウントした。細胞ベースの免疫組織化学の画像化および定量化は、ＨＡＬＯ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ分析ソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ  Ｌａｂｓ；Ｃｏｒｒａｌｅｓ，ＮＭ）を用いて行った。ＨＡＬＯは、個々の細胞データを測定して報告し、細胞測定基準と細胞画像の間の双方向リンクを維持する。ｐＥＲＫ＋、Ｋｉ６７＋、およびＰＥＣＡＭ−１＋細胞の数をＨＡＬＯソフトウェアを用いて自動的に計数した。創傷の両側からの３つの２０倍視野をｐＥＲＫおよびＫｉ６７染色について自動的に計数した。ＰＥＣＡＭ−１＋およびＣＤ６８＋細胞は、切除創傷スプリンティングモデルの肉芽組織が始まる創傷縁部の両側（両側約１ｍｍ）、および切開創傷モデルの創傷領域全体で自動的に計数された。
【００７８】
ＲＮＡ配列分析。各処置群のマウス皮膚サンプルからのＲＮＡを２、６および１４日目に抽出し（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、２×１００ｂｐペアエンドのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）シークエンスランを用いてＲＮＡ配列分析に送った。生配列をＴＯＰＨＡＴによりマウスｍｍ９参照配列にマッピングした。正規化されたそれぞれの遺伝子発現レベルは、ＴＯＰＨＡＴのＢＡＭ出力２０でプログラムｃｕｆｆｑｕａｎｔおよびｃｕｆｆｎｏｒｍによって生成されたＦＰＫＭ値で表された。オプション"--frag-bias-correct"、"-multi-read-correct"、および "--compatible-hits-norm"がカフクァント実行（cuffquant run）に適用された。ＭＡＰＫと創傷治癒シグネチャのヒートマップは、Ｒパッケージｇｐｌｏｔｓによるシグネチャ遺伝子の行正規化ＦＰＫＭレベルに基づいて生成された。ＧＳＶＡスコアは、以前に記載されたように（Hanzelmann et al. 2013）、正規化された読み取りカウントを使用して計算された。２、６および１４日目のベムラフェニブの処理あり／なしのマウス組織の正規化された読み取りカウント（ＲＮＡｓｅｑ ＢＡＭファイルについてＣｕｆｆｎｏｒｍによって計算された）をｄｅｒｍＤＢデータベース（Inkeles et al. 2015に記載されたｄｅｒｍＤＢデータベース）に供給した。使用された異なる免疫細胞型遺伝子セットが以前に報告されている（Jacomy et al. 2014）。濃縮スコアは、全サンプルにわたるその平均に対する遺伝子セット中の各遺伝子の平均差として計算した。免疫遺伝子セットの行正規化濃縮スコアを可視化し、濃縮スコア差のｐ値を遺伝子ラベルの順列によって生成された帰無分布（null distribution）に基づいて計算した（ｎ＝１０００００）。Ｐ値はＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いて調整した。ベムラフェニブ治療を伴う６日目（参照として６日目を対照として）の特定の生物学的プロセスは、治療群における上方制御（最小２倍上方制御）された遺伝子に対する遺伝子オントロジー（ＧＯ）濃縮分析を用いることが指定された。濃縮されたＧＯ用語は、ＣｌｕｅＧＯを用いて計算され視覚化された（Bindea, G. et al., (2009)）。濃縮遺伝子、遺伝子プロセスおよび特異的免疫サブセット間の関係を強調する統合パネルは、Ｇｅｐｈｉソフトウェアを使用して作成された（Abel et al。2009）。データはＧＥＯリポジトリに登録された（アクセッション番号ＧＳＥ７４５５８）。
【００７９】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応。ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎベースのリアルタイムＰＣＲ（Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＲＮＡ-to-ＣＴ（商標）１ステップキット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のために特別に開発されたワンステップ逆転写キットを用いて、製造者によって設定された標準的な定量比較Ｃｔ手順を用いて、Ｑ‐ＰＣＲを行った。各実験サンプルの三重反応物（２５μｌ）を以下のプライマー：ＴＮＦＡＩＰ３（Ｆｗｄ：５’−ＣＴＧＡＣＣＴＧＧＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧ−３’；Ｒｅｖ：５’−ＧＣＡＡＡＧＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡ−３’），Ｆ７（Ｆｗｄ：５’ＧＡＣＴＴＴＧＡＣＧＧＴＣＧＧＡＡＣＴＧＴＧ３’；Ｒｅｖ：５’ＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＴＴＴＣＴＴＴ３’）およびＥｇｒ−１（Ｆｗｄ：５−ＧＡＣＧＡＧＴＴＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＡＡ−３；Ｒｅｖ：５−ＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＧＡＴＧＡＡＧ−３）を用いて調製した。データをバクチン（Bactin）レベルに対して正規化した。
【００８０】
発癌研究。メスＦＶＢ／ＮマウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。腫瘍誘発手順は、ＡＲＣプロトコル＃２０１３−０６６に従って実施した。二段階発癌手順は、各群８匹のマウスで以前にAbel, et al., Nature protocols 4:1350-62 (2009);およびIshikawa, et al., Mol. Oncol. 4:347-56 (2010)に記載されているように実施した。ＤＭＢＡおよびＴＰＡはＳｉｇｍａから購入した。臨床グレードのベムラフェニブ丸剤を粉砕し、ＤＭＳＯに溶解した。０．０２および０．０４ｍｇ／μｌの濃度になるまで混合物（またはビヒクルコントロールとしてＤＭＳＯ）１００μｌをマウスの背中に局所的に加えた。ベムラフェニブ懸濁液（２または４ｍｇ）またはビヒクル対照を、週に２回、１５週間、マウスの背部に局所的に再適用した。
【００８１】
統計分析。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ５）ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて分析した。有意性は、対応のない両側スチューデントのｔ検定または一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定した。統計的に比較された群間で分散は類似していた。
実施例２：ＢＲＡＦ阻害剤はケラチノサイトの再成長を増強してインビトロのスクラッチ（引っ掻き傷）部位をカバーする。
【００８２】
９６ウェルプレート中で単層として培養したヒト上皮成体ケラチノサイト（ＨＥＫａ）をスクラッチアッセイにかけたところ、増殖しているケラチノサイトが再成長してスクラッチを覆うはずであった。ＢＲＡＦ阻害剤ベムラフェニブを含むまたは含まない複製培養物を自動顕微鏡分析装置を備えたインキュベーターに入れ、そして元のスクラッチ中の有核細胞の数を経時的に記録した。ベムラフェニブの存在は、元のスクラッチの被覆において統計的に有意な改善を誘導し、それは研究の開始後６、８および１２時間で明らかに明白であった（図２Ａおよび図３Ａ）。ベムラフェニブの存在下で培養されたＨＥＫａの増殖上の利点はまた、各ウェルの中央にシーダーストッパーを有する９６ウェルプレートを用いて明らかであり、ベムラフェニブで処理した増殖性ケラチノサイトは２４時間後にウェルの中心を覆ったが、対照処理したウェルは中央の細胞を欠いたままであった（図２Ｂ）。増強された遊走は、ベムラフェニブで処理した培養物にトラメチニブ、ＭＥＫ阻害剤を添加することによって阻害された（図２Ｂ；「ＴＲＡＭＥ」）。
【００８３】
また、ベムラフェニブ（１．５μＭ）は、１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ、有糸分裂阻害剤を含有する組合せ培養物として（図２Ｃ；「Ｍ」）、または、アッセイ中の細胞運動性の阻害剤であるＮＳＣ２９５６４２を１μｇ／ｍＬを含有する組合せ培養物として（図２Ｃ；「Ｎ」）、インビトロでＨＥＫａ細胞に対する増殖および遊走効果の両方を誘導し、ここで、移動および成長は、中央の空間シーラントの除去によって開始された。
【００８４】
さらに、三次元軟寒天コロニーアッセイＨＥＫａコロニーはベムラフェニブへの曝露により増殖したが、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異体メラノーマ株Ｍ２４９はコロニーの減少を示した（図２Ｄおよび図３Ｂ）。ＨＥＫａコロニーは数が増加しただけでなく、それらの平均スポットサイズもまた有意に増加した（ｔ検定によりｐ＝０．００７、図２Ｅ）。トラメチニブの添加は、ベムラフェニブによって誘導されたＨＥＫａコロニーの数およびサイズを減少させた（図２Ｆ、８Ａ〜８Ｂ）。これらの培養物を使用して、ＭＡＰＫシグナル伝達をウエスタンブロットにより分析し（図２Ｇ〜２Ｈ）、ｐＥＲＫおよび細胞増殖を定量的細胞内流動（ホスホフロー）サイトメトリーによって分析した（図２Ｉおよび図４Ａ〜４Ｂ）。ベムラフェニブは、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ変異体ヒトメラノーマ細胞株Ｍ２４９においてｐＥＲＫおよび細胞周期停止を減少させたが、ＨＥＫａ細胞においてｐＥＲＫおよび細胞周期進行において逆説的な増加があった（ｔ検定によりｐ＝０．０２２５）。さらに、ベムラフィナブの存在下では、増殖マーカーＫｉ６７はＭ２４９メラノーマ細胞において減少したが、それはＨＥＫａ細胞において増加した（図２Ｉ〜２Ｊ）。
実施例３：ＢＲＡＦ阻害剤は上皮細胞の逆説的増殖のために皮膚創傷の治癒を促進する
【００８５】
切開創傷治癒マウスモデルにおける制御創傷治癒アッセイ（図５Ａ）では、２．５ｃｍの背側皮膚創傷が誘発され、ビヒクルコントロール（ＤＭＳＯ／食塩水）または２ｍＭのベムラフェニブのビヒクルにおける懸濁液（本剤の臨床グレードの丸薬を粉砕して得たもの）のいずれかで満たされた。皮膚創傷を０日目に外科的に切り取り、そしてマウスを１４日目まで追跡した（図５Ａ〜５Ｂ）。この期間にわたって、ベムラフェニブまたはビヒクル対照を、試験群の２４匹のマウスまたは対照群の２４匹のマウスにそれぞれ一日おきに局所投与し、マウス１匹あたり合計７回投与した。１４日目に、マウスを安楽死させ、創傷を含む皮膚を取り出し、各ストリップに水平創傷サンプルを入れた２０ｍｍのストリップに載せた。創傷引張強度（ＷＴＳ、２ｍｍあたりの重量グラム（gram force）‐ｇｆ／２ｍｍ）は、ストリップを引き伸ばしそしてＷＴＳを記録する張力計を使用して分析された。３つの独立した反復実験（各実験において１群当たりマウス８匹；創傷当たり７片）において、ベムラフェニブで治療したマウスはビヒクル治療対照と比較して統計的に有意なＷＴＳの改善を示した（それぞれ５２％、３３％および４２％；３つすべての実験についてｔ検定によりｐ＜０．０００１；図５Ｃ、実験＃１〜３）。ベムラフェニブに加えてトラメチニブを投与すると、ベムラフェニブ単独を使用した場合と比較して、ＷＴＳが５１％減少した（ｔ検定によりｐ＜０．０００１）。別の皮膚創傷治癒アッセイでは、ベムラフェニブでの処置による３７％のＷＴＳの改善（ビヒクル対照に対してｔ検定によりｐ＝０．０１）は、１ｍｇ／ｋｇのトラメチニブの添加により部分的に逆転した（図５Ｂ；「ＴＲＡＭＥ」、「ＶＥＭ＋ＴＲＡＭＥ」）。これらの創傷について、ＷＴＳはビヒクル対照と比較して２９％まで減少した（ｔ検定によりｐ＜０．０００１；図５Ｃ、実験＃４）。
【００８６】
創傷の領域およびそれらの周囲は、研究グループを知らされていない２人の病理学者によって組織学的に分析された。ベムラフェニブ処置創傷は、創傷治癒の両側の表皮過形成の程度を定量化することによって証明されるように、創傷治癒の増殖段階の促進を示した。図３Ｄに示すように、タルメチニブ単独群（「ＴＲＡＭＥ」）またはベルムラフェニブとトラメチニブの組み合わせで治療した群（「ＶＥＭ＋ＴＲＡＭＥ」）において再上皮化は観察されなかった。
【００８７】
創傷の面積およびそれらの周囲を２人の病理学者によるＨ＆Ｅ染色によって組織学的に分析し、治療創傷の両側の表皮過形成の程度を治療後１、２および６日目に測定した（図６Ａおよび６Ｂ）。切開後１日目に、創傷隣接表皮炎症はベムラフェニブの存在下でより広範囲であり、２日目から強くて急速な再上皮化が始まった。６日目までに、ベムラフェニブ処置群で表面の完全性が再確立されたが、ビヒクル、トラメチニブまたは組合せで処置されたマウスでは皮膚修復性線維症の証拠は観察されなかった。トラメチニブまたはベムラフェニブおよびトラメチニブ処置マウスでは治癒または再上皮化の徴候は観察されず、創傷は潰瘍化し、特にトラメチニブ単独で処置したものは潰瘍化した（図６Ａ）。１日目および２日目に、ベムラフェニブ群からの皮膚は他の処置群よりも長い距離にわたって表皮過形成を示す傾向があり（一方向ＡＮＯＶＡによりそれぞれｐ ＝０．０１３２およびｐ＝０．０３３８）、一方、６日目までにベムラフェニブ群は、表皮過形成が少なく、より速い創傷消散と一致する（一方向ＡＮＯＶＡによるｐ＝０．００１２；図４Ｂ）。６日目までに、対照創傷の７９％が再上皮化を示したのに対して、ベムラフェニブ治療創傷の１００％は完全に再上皮化した。トラメチニブ単独およびベムラフェニブとトラメチニブの併用群では再上皮化は観察されなかった。
実施例４：ベムラフェニブは皮膚収縮が予防されるマウスにおいて再上皮化を増強する
【００８８】
Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける切除創傷スプリンティングモデル（Wu, et al., Stem Cells 25, 2648-2659 (2007)）では、６ｍｍの丸い創傷がマウスの背中に誘発され；スプリンティングリングがしっかりと接着され縫合され、傷の周りの皮膚、皮膚の収縮による傷の閉鎖を防いだ。０、２および４日目にベムラフェニブ（２ｍｇ）またはＤＭＳＯを創傷に塗布し、創傷閉鎖率を逐次的に測定した。図９Ａ〜９Ｂに示されるように、ベムラフェニブで治療された創傷は、２、６および１４日目にビヒクルで治療された創傷と比較して有意に高い割合の創傷閉鎖を示した（ｔ検定により、それぞれ、ｐ＝０．００４、ｎ＝６、ｐ＝０．０２、ｎ＝４、ｐ＝０．０００２、ｎ＝６）。創傷の面積およびそれらの周囲を組織学的に分析し、そしてデジタル病理学を使用してｐＥＲＫ＋およびＫｉ６７＋細胞を定量した（図９Ｃ〜９Ｄ）。対照と比較して、ベムラフェニブの存在下での治癒プロセスは加速され、６日目までに再上皮化が示された（図１０Ａ〜１０Ｂ）。皮膚表面の完全性は、１４日目までにベムラフェニブ処置創傷において再確立されたが、リモデリングおよび皮膚修復性線維症は対照群において遅延した（図９Ｃ）。ベムラフェニブで治療した創傷におけるｐＥＲＫ＋およびＫｉ６７＋細胞の数は、対照群（ｔ検定によりｐ＝０．０２；ｎ＝４；図９Ｃ〜図９Ｄ）と比較して１４日目までに統計的に有意に高く、これは上皮細胞増殖の増強をもたらす逆説的なＭＡＰＫを実証する。
実施例５：ベムラフェニブはＭＡＰＫおよび創傷治癒関連サインを上方制御する
【００８９】
上皮皮膚修復をさらに特徴付けるために、切開創傷治癒モデルから得られた皮膚サンプルをＲＮＡＳｅｑによって分析した。２、６および１４日目に示差的に発現された遺伝子のリストは、本明細書と共に提出される付属書１に示される。付属書１は、２、６および１４日目にベムラフェニブで治療した創傷における上方制御および下方制御遺伝子のリストを含む。列挙された値は、低いＦＰＫＭ値（＜０．１）によって引き起こされた大きな倍率変化を除去するために０．１の擬似ＦＰＫＭ値を加えた後にｌｏｇ２変換される。付属書１に示される示差的に発現される遺伝子のリストは、ＢＲＡＦ阻害剤(Nazarian et al. 2010)を用いて変異型ＢＲＡＦＶ６００Ｅの下流の発癌性ＭＡＰＫシグナル伝達を遮断することによって示差的に調節された転写物についての公開データと、遺伝子オントロジー用語「創傷治癒」（GO：0042060）(Ashburner et al. 2000)内の遺伝子と比較された。
【００９０】
図７の遺伝子発現ヒートマップによって示されるように、２日目（「Ｄ２」）までに、ベムラフェニブ処置時にＢＲＡＦサインがわずかに増加したが、創傷治癒サインはほとんど変化しなかった。６日目（「Ｄ６」）までに、両方のシグネチャーは、それらのそれぞれの対照と比較して、ベムラフェニブ処理サンプルにおいて有意に濃縮された。より迅速な治癒と一致して、１４日目までにＢＲＡＦと創傷治癒の両方の徴候のより顕著な減少がベムラフェニブ治療創傷において観察された。シグネチャの遺伝子セット変動分析（Gene Set Variation Analysis：ＧＳＶＡ）濃縮スコアは同じ傾向を示した（全濃縮スコアは、単一サンプル遺伝子セット変動分析（ＧＳＶＡ）に基づいて計算された。Hanzelmann et al. 2013）。
【００９１】
加えて、遺伝子出力を初期の創傷治癒サインと比較したが、その大部分は炎症誘発性遺伝子が創傷治癒の第一段階（(Deonarine, K. et al., J. Transl. Med. 5:11 (2007)）および術後の創傷治癒サイン（Inkeles, M. S. et al., J. Invest. Dermatol. 135:151-159 (2015)）に関与していた。図１１Ａ〜１１Ｂおよび図１７に示されるように、これら２つの創傷治癒サインは、対照群とは対照的に、ベムラフェニブ処置群においても６日目までに濃縮された。
【００９２】
創傷治癒に関連すると認識された遺伝子(Fitsialos, G. et al., J. Biol. Chem. 282:15090-102 (2007))は、対照創傷と比較してベムラフェニブ促進創傷治癒創傷においてアップレギュレートされた（図７、１１Ａ〜１１Ｂ）。
実施例６：ベムラフェニブ処置創傷は、白血球、内皮細胞および線維芽細胞に特異的な転写シグネチャーに富む。
【００９３】
樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞、ならびに血管内皮細胞およびリンパ内皮細胞についてのシグネチャの濃縮が、対照創傷と比較して、ベムラフェニブで処置された創傷において観察された（図１２）。局所用ベムラフェニブによるマクロファージの増加は、ＩＨＣ分析によって確認された（図１３Ａ〜１３Ｄ）。マクロファージの増加は、トラメチニブの同時投与で停止させた。この時点での創傷治癒細胞サブセットの存在増加に関連する活性化経路を詳しく説明するために、ベムラフェニブ処置創傷において上方発現された（up-expressed）遺伝子を、ＣｌｕｅＧｏを使用して強化されたＧＯ生物学的プロセス（２倍以上増加）について分析した(Bindea, G. et al., Bioinformatics 25:1091-93 (2009))。リンパ球活性化、血管発生および創傷に対する応答に関与する経路が明らかに見出された（図１４Ａ〜１４Ｂ）。細胞サブセットシグネチャー、遺伝子および経路アップレギュレーションの濃縮の統合は、創傷治癒特異的細胞サブセットの動員の増強を示し、これは炎症性および血管新生性の創傷治癒過程のより強い活性化をもたらす（図１４Ｂ）。これらの知見を確認するために、ＣＯＸ−２＋およびＩＬ−６＋細胞のレベルを免疫組織化学によって定量した。ベムラフェニブで処置された創傷は、６日目の増殖段階でより高いＩＬ−６＋およびＣＯＸ−２＋細胞を有し（図１４Ｃ〜１４Ｄ）、これは図１４Ｂに示される統合されたＲＮＡ配列データと一致する。ＲＮＡｓｅｑデータのさらなる検証として、全皮膚創傷についての、Ｅｇｒ−１、ＴＮＦＡＩＰ３およびＦ７についてのＲＴＰＣＲを実施した。これら３つの遺伝子は遺伝子サインにおいてアップレギュレートされ（図５ｂ）、ＲＴ‐ＰＣＲの結果は治療後６日目までにベムラフェニブ治療創傷におけるこの増加を確認した（図１４Ｅ）。
実施例７：血管新生はベムラフェニブで治療された創傷において増強され、トラメチニブを添加すると阻害される
【００９４】
血管新生に対するベムラフェニブ治療の有益な効果を確認するために、切除創傷領域および切開創傷領域におけるＰＥＣＡＭ−１＋細胞を定量した。切除創傷モデルでは、治療後６日目の対照創傷と比較して、ベムラフェニブ治療創傷におけるＰＥＣＡＭ−１＋細胞数の７４％の増加があった（ｔ検定ｎ＝４によりｐ＝０．００６；図１５Ａ）。ＲＮＡＳｅｑデータで観察された内皮細胞の濃縮と一致して、ベムラフェニブで処置した創傷での切開創傷モデルにおいて６５％のＰＥＣＡＭ−１＋細胞の増加が観察された（ｔ検定によりｐ＝０．０２）（図１５Ｂ）。この増加は、局所トラメチニブ（０．２ｍｇ）の添加によって逆転し、６日目にＰＥＣＡＭ−１＋細胞の数が６７％減少した（ｔ検定によりｐ＝０．０１；ベムラフェニブ対ベムラフェニブ＋トラメチニブ）。トラメチニブ単独は、ＰＥＣＡＭ−１＋細胞を完全に枯渇させた（図１５Ｂ）。
実施例８：マウスに局所適用した場合、ベムラフェニブは皮膚表皮腫瘍を誘発しない
【００９５】
局所適用したベムラフェニブの皮膚腫瘍促進活性の可能性を分析するために、十分に確立された二段階皮膚発癌モデルを使用した(例えば、Balmain, et al., Nature 307:658-60 (1984); Escuin-Ordinas, et al., Mol. Oncol. 8:250-60 (2014))。手短に言えば、ＤＭＢＡまたはアセトンの局所適用を、皮膚発癌に対する陽性対照としての局所ＴＰＡまたは局所ベムラフェニブのいずれかを用いて１週間に２回、１５週間続けた。皮膚発癌を発症した唯一のマウスは、ＤＭＢＡ＋ＴＰＡで処置した群であった（図１６Ａ；「ＤＭＢＡ＋ＴＰＡ」）。創傷治癒を促進する濃度（２ｍｇ）またはそれ以上（４ｍｇ）のＤＭＢＡ＋ベムラフェニブで処置したマウスでは、皮膚乳頭腫、角膜実質細胞腫または扁平上皮癌は発生しなかった（図１６Ａ、中央の２列）。したがって、マウスが、ＲＡＳ変異を有する上皮細胞の存在をもたらす発癌物質の適用開始にさらされた後であっても、局所用ベムラフェニブは皮膚発癌を促進しなかった（図１６Ｂ）。
【００９６】
まとめると、上記の実施例に記載された研究は、ＢＲＡＦ阻害剤による逆説的なＭＡＰＫ活性化の現象が皮膚創傷治癒を増強するために利用され得ることを実証している。ＢＲＡＦ阻害剤の局所適用は、創傷治癒の増殖期に主に作用することによって皮膚創傷の治癒を加速させ、炎症および血管形成を含む創傷治癒における他の複数の事象の改善をもたらした。これらの利益は、逆説的なＭＡＰＫ活性化を阻害することが知られているＭＥＫ阻害剤を添加することによって相殺されたが、この局所療法は腫瘍促進をもたらさなかった。それ故、局所ＢＲＡＦ阻害剤は、擦過傷および外科的切開などの急性皮膚創傷の治癒を促進するために使用され得る。
【００９７】
参考文献
以下に列挙される参考文献、特許および公開された特許出願、ならびに上記の明細書において引用される全ての参考文献は、本明細書に完全に記載されるかのように、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
2019522652.tif 000032
【図１６】
2019522652.tif 000033
【図１７−１】
2019522652.tif 000034
【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【国際調査報告】
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