(57)【要約】本発明は、化合物およびそれらの使用に関する。特に、エンドソームプロテアーゼ活性型受容体−２（ＰＡＲ２）シグナル伝達を阻害する化合物および疼痛の治療でのそれらの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ誘発性疼痛の治療方法であって、プロテアーゼ活性型受容体−２（ＰＡＲ２）のエンドソームシグナル伝達を阻害する化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項２】
エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を阻害する化合物が、活性型受容体のエンドサイトーシスを阻害する化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物が、ダイナミン、クラスリンまたはβ−アレスチンを阻害する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を阻害する化合物が、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を標的および阻害する化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を阻害する化合物が、式（Ｉ）：
【化１】
2019516734.tif 000033
（式中、
Ａは、原形質膜への化合物の挿入を促進させる脂質アンカー；
Ｌは、長さ１ｎｍ〜５０ｎｍのリンカー部分；および
Ｘは、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤；
脂質アンカーは、４℃において非イオン性界面活性剤に不溶の脂質膜に分配する）の三成分化合物またはその医薬上許容し得る塩である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
式（Ｉ）の三成分化合物が、式（Ｉａ）：
【化２】
2019516734.tif 000034
（式中、
Ａは、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：
【化３】
2019516734.tif 000035
（式中、
Ｒ１は、置換されてもよいＣ１−１２アルキル基；
Ｒ２およびＲ３は、独立してＨもしくはＣ１−３アルキル；
Ｒ４は、Ｃ、Ｏ、ＮＨもしくはＳ；および
2019516734.tif 000036
は、単結合または二重結合を表す）で表される原形質膜への化合物の挿入を促進する脂質アンカー；
Ｌは、長さ１ｎｍ〜５０ｎｍのリンカー基；および
Ｘは、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤）で表される；または
その医薬上許容される塩である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
式（Ｉ）の三成分化合物が、式（Ｉｂ）：
【化４】
2019516734.tif 000037
（式中、
Ａは、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：
【化５】
2019516734.tif 000038
（式中、
Ｒ１は、置換されてもよいＣ１−１２アルキル基；
Ｒ２およびＲ３は、独立してＨもしくはＣ１−３アルキル；
Ｒ４は、Ｃ、Ｏ、ＮＨもしくはＳ；
2019516734.tif 000039
は、単結合または二重結合を表す）で表される原形質膜への化合物の挿入を促進する脂質アンカー；
Ｌは、式（ＩＶ）：
【化６】
2019516734.tif 000040
（式中、
Ｚは、リンカーおよび脂質アンカー間の付着基であり、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−、
−Ｃ２−Ｃ１０アルケニル−、−Ｃ２−Ｃ１０アルキニル−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキルＣ（Ｏ）−、−Ｃ２−Ｃ１０アルケニルＣ（Ｏ）−もしくは−Ｃ２−Ｃ１０アルキニルＣ（Ｏ）−；または
Ｚは、隣接するアミンと一緒になって、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリンもしくはトレオニンから選択されるＣ末端アミド化アミノ酸であってもよく（ここで、アミノ酸は、側鎖官能基を介して脂質アンカーに付着する）；
Ｙは、リンカーとエンドソームＧＰＣＲのモジュレーター間の付着基であり、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−もしくは−Ｃ（Ｏ）Ｓ−；または
Ｙは、隣接するアミド基と一緒になって、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリンもしくはトレオニンから選択されるアミノ酸（ここで、アミノ酸は、側鎖官能基を介してエンドソームＧＰＣＲのモジュレーターに付着する）；
ｍは、１もしくは２；
ｎは、１〜２０；
ｐは、１〜８）で表される；および
Ｘは、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達阻害剤である）で表される；または
その医薬上許容される塩である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
式（Ｉ）の三成分化合物が、構造：
【化７】
2019516734.tif 000041
（式中、ＬおよびＡは、本明細書に定義の通りである）、またはその医薬上許容し得る塩を有する、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
１つ以上の受容体のエンドサイトーシスを阻害する化合物および１つ以上のエンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を標的および阻害する化合物の組み合わせをそれを必要とする対象へ投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
プロテアーゼ誘発性疼痛治療のための薬剤の製造におけるプロテアーゼ活性型受容体−２（ＰＡＲ２）のエンドソームシグナル伝達を阻害する化合物の使用。
【請求項１１】
エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を阻害する化合物が、活性型受容体のエンドサイトーシスを阻害する化合物である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を阻害する化合物が、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を標的および阻害する化合物である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を標的および阻害する化合物が、請求項５〜８のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
プロテアーゼ誘発性疼痛の治療に使用するためのプロテアーゼ活性型受容体−２（ＰＡＲ２）のエンドソームシグナル伝達を阻害する化合物。
【請求項１５】
エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を阻害する化合物が、活性型受容体のエンドサイトーシスを阻害する化合物である、請求項１４に記載の使用のための化合物。
【請求項１６】
エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を阻害する化合物が、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を標的および阻害する化合物である、請求項１４に記載の使用のための化合物。
【請求項１７】
エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を標的および阻害する化合物が、請求項５〜８のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物である、請求項１６に記載の使用のための化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物およびそれらの使用に関する。特に、エンドソームプロテアーゼ活性型受容体−２（ＰＡＲ２）シグナル伝達を阻害する化合物および疼痛の治療でのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞表面受容体の最大ファミリーであり、ほとんどの病態生理学的過程に関与し、治療薬の約３０％の標的である(Audet, M. & Bouvier, M. Nat Chem Biol 2008, 4, 397-403)。細胞表面ＧＰＣＲは細胞外リガンドと相互作用し、ヘテロ三量体Ｇタンパク質に結合し、原形質膜で区切られたシグナル（二次メッセンジャー形成、増殖因子受容体トランス活性化、イオンチャネル調節）を引き起こす。リガンドの除去およびβ−アレスチン（βａｒｒ）との受容体の会合は原形質膜シグナルを終結させる。
【０００３】
最近まで、ＧＰＣＲの活性化、その後の下流のシグナル伝達およびシグナル終結は専ら原形質膜で起こると広く考えられていた。原形質膜シグナル伝達は、活性リガンド結合レセプターコンホメーションに対して選択的であるＧＰＣＲキナーゼ（ＧＲＫ）による受容体のリン酸化を介した活性化から数分以内に終了する。ＧＲＫは、ＧＰＣＲのＣ末端Ｓ／Ｔリッチドメインをリン酸化する(Sato, P. Y., et al., Physiological reviews 2015, 95, 377-404)。次にリン酸化された受容体はβａｒｒに結合し、受容体とＧタンパク質との結合を立体的に妨げ、アゴニスト媒介性のＧタンパク質活性化を終結させる。βａｒｒは、さらにダイナミンおよびクラスリン依存性エンドサイトーシスを介して、リガンド結合受容体の細胞表面から初期エンドソームへの移動を促進する。一旦エンドサイトーシスされると、リガンドおよびリン酸基はＧＰＣＲから除去され、受容体は細胞膜に速やかに再分布するか、または分解のためにリソソームに輸送される。
【０００４】
しかしながら、最近、多様な範囲のＧＰＣＲが従来のパラダイムに必ずしも従うとは限らないことが発見されている。いくつかの細胞表面ＧＰＣＲが、受容体のリガンド結合および活性化の後に、ヘテロ三量体Ｇタンパク質シグナル伝達が長期間維持される初期エンドソームに内在化および再分布することが研究によって判明した。したがって、単にリサイクルまたは分解経路へのＧＰＣＲ輸送のための導管として作用するのではなく、エンドソームはシグナル伝達の重要な部位であり得る(Murphy, J. E. et al. Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106, 17615-17622)。ＧＰＣＲおよびマイトジェン活性化プロテインキナーゼをエンドソームに動員することにより、βａｒｒはエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達を媒介することができる(Murphy, J. E. et al. Proc Natl Acad Sci USA 2009, 106, 17615-17622; DeFea, K. A. et al. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97, 11086-11091; DeFea, K. A. et al. J Cell Biol 2000, 148, 1267-1281)。
【０００５】
βａｒｒは、多様なシグナル伝達タンパク質を原形質膜およびエンドソーム膜の活性化受容体に補充し、シグナル伝達の必須メディエーターである。ＭＡＰＫカスケード[ERK, c-Jun amino-terminal kinase(JNK), p38]は、最も完全に特徴付けられたβａｒｒ依存性シグナル伝達経路である。βａｒｒがシグナル伝達に活性に関与するという最初の証拠は、βａｒｒのドミナントネガティブ変異体がβ２ＡＲ誘導性ＥＲＫ１／２活性化を阻害するという所見であった(Daaka Y, et al. J Biol Chem 1998, 273, 685-688)。続いて、βａｒｒがβ２ＡＲをｃ−Ｓｒｃに結合させ、ＥＲＫ１／２活性化を媒介することが見出された（Lutterall L. M.ら、Science 1999,283,665-661）。βａｒｒは、ニューロキニン−１受容体（ＮＫ１Ｒ）、プロテアーゼ活性型受容体２（ＰＡＲ２）、アンギオテンシンＩＩ型１Ａ受容体（ＡＴ１ＡＲ）、およびバソプレシンＶ２受容体（Ｖ２Ｒ）などの他のＧＰＣＲによるＥＲＫ１／２シグナル伝達にも同様に関与する。これらの所見は、βａｒｒが活性化されたＧＰＣＲをＭＡＰＫシグナル伝達複合体と結合させるスカフォールドであるという見解を導いた。βａｒｒは、それによって、原形質膜でのＧタンパク質依存性シグナル伝達とは異なる、ＧＰＣＲシグナル伝達の第２の波を媒介する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、ＰＡＲ２のエンドソームシグナル伝達を阻害することが、プロテアーゼ誘発性疼痛の治療のための新規な方法を提供し得るという発見に基づいている。プロテアーゼ活性型受容体−２（ＰＡＲ２）は、プロテアーゼ誘発炎症および疼痛の主要なメディエーターである。ＰＡＲ２は、神経原性炎症および疼痛伝達を制御する一次感覚ニューロンによって発現される。損傷および炎症の間に生成される、上皮由来トリプシンＩＶ、肥満細胞トリプターゼ、マクロファージカテプシンＳおよび好中球エラスターゼなどの複数のプロテアーゼは、知覚神経上のＰＡＲ２を活性化することができる。これらのプロテアーゼは、一次知覚神経上でＰＡＲ２を切断し活性化し、一過性受容体電位イオンチャネルの感作および神経ペプチド（サブスタンスＰおよびカルシトニン遺伝子関連ペプチド）の放出をもたらす。これらのペプチドは末梢炎症および疼痛の中枢伝達を引き起こす。トリプシンおよびトリプターゼは、β−アレスチンの動員およびＰＡＲ２エンドサイトーシスにつながる標準的メカニズムによってＰＡＲ２を活性化する。
【０００７】
活性型受容体のエンドサイトーシスを防止することによって、またはエンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を標的化および阻害することにより、ＰＡＲ２のエンドソームシグナル伝達を阻害することが、プロテアーゼ誘発性疼痛の治療のための新規な方法を提供することが今見出された。
【０００８】
したがって、一態様では、本発明は、プロテアーゼ誘発性疼痛の治療方法であって、プロテアーゼ活性型受容体−２（ＰＡＲ２）のエンドソームシグナル伝達を阻害する化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
一態様では、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を阻害する化合物は、活性型受容体のエンドサイトーシスを阻害する化合物である。
【００１０】
別の態様では、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を阻害する化合物は、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を標的とし、阻害する化合物である。
【００１１】
さらなる態様において、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を阻害する化合物は、式（Ｉ）：
【００１２】
【化１】
2019516734.tif 000002
【００１３】
（式中、
Ａは、原形質膜への化合物の挿入を促進する脂質アンカーであり；
Ｌは、長さ１ｎｍ〜５０ｎｍのリンカー部分であり；および
Ｘは、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤である；
ここで、脂質アンカーは、４℃において非イオン性界面活性剤に不溶の脂質膜に分配する）のエンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を阻害する三成分化合物またはその医薬上許容し得る塩である。
【００１４】
別の態様では、本発明は、プロテアーゼ誘発性疼痛の治療方法であって、それを必要とする対象に、受容体のエンドサイトーシスを阻害する１つ以上の化合物と、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を標的とし、阻害する１つ以上の化合物との組み合わせを投与することを含む方法を提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、プロテアーゼ誘発性疼痛の治療のための薬剤の製造におけるＰＡＲ２のエンドソームシグナル伝達を阻害する化合物の使用を提供する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、プロテアーゼ誘発性疼痛の治療における使用のためのＰＡＲ２のエンドソームシグナル伝達を阻害する化合物を提供する。
【００１７】
本発明のこれらおよび他の態様は、付随する実施例および請求の範囲に関連して以下の詳細な説明を読むことにより当業者にはより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１：原形質膜マーカー、ＲＩＴ−ｖｅｎｕｓを用いたＢＲＥＴアッセイ。（ａ）ＰＡＲ２の３つの公知のアゴニストによる刺激時のΔＢＲＥＴ動態。（ｂ）トリプシンＣＲＣ（ＡＵＣデータから作成）。（ｃ）様々なエンドサイトーシス阻害剤およびコントロール化合物による３０分間の前処理でのトリプシン誘発性輸送の変化。データは、少なくとも３つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭとして示され、それぞれは１条件につき３つの反復を含む。
【図２】図２：早期エンドソームマーカーＲａｂ５ａ−ｖｅｎｕｓを用いたＢＲＥＴアッセイ。（ａ）ＰＡＲ２の３つの公知のアゴニストによる刺激時のΔＢＲＥＴ動態。（ｂ）トリプシンＣＲＣ（ＡＵＣデータから作成）。（ｃ）様々なエンドサイトーシス阻害剤およびコントロール化合物による３０分間の前処理でのトリプシン誘発性輸送の変化。データは、少なくとも３つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭとして示され、それぞれは１条件につき３つの反復を含む。
【図３】図３：サイトゾルＥＲＫセンサーＣｙｔｏＥＫＡＲを用いたＦＲＥＴアッセイ。（ａ）ＰＡＲ２の２つの公知のアゴニストによる刺激時のΔＦＲＥＴ動態。（ｂ）トリプシンＣＲＣ（ＡＵＣデータから作成）。（ｃ）種々のエンドサイトーシス阻害剤およびコントロール化合物による３０分間の前処理でのトリプシン誘発性シグナル伝達の変化。データは、少なくとも３つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭとして示され、それぞれは１条件につき３つの反復を含む。
【図４】図４．核ＥＲＫセンサーＮｕｃＥＫＡＲを用いたＦＲＥＴアッセイ。（ａ）ＰＡＲ２の２つの公知のアゴニストによる刺激時のΔＦＲＥＴ動態。（ｂ）トリプシンＣＲＣ（ＡＵＣデータから作成）。（ｃ）種々のエンドサイトーシス阻害剤およびコントロール化合物による３０分間の前処理でのトリプシン誘発性シグナル伝達の変化。データは、少なくとも３つの独立した実験からの平均＋ＳＥＭとして示され、それぞれは１条件につき３つの反復を含む。
【図５】図５．ＢＲＥＴ再感作アッセイ。（ａ）ＰＡＲ２の３つの公知のアゴニストによる刺激時のΔＢＲＥＴ動態。（ｂ）種々のシグナル伝達阻害剤による３０分間の前処理でのプロテアーゼ誘発性の輸送パターンの変化。データは、少なくとも２つの独立した実験から平均＋ＳＥＭとして示され、それぞれは１条件につき２つの反復を含む。
【図６】図６．ＰＡＲ２のエンドサイトーシスの阻害剤による単離されたＤＲＧニューロンのニューロン興奮およびその阻害。
【図７】図７．ＰＡＲ２のエンドサイトーシス阻害剤による単離されたＤＲＧニューロンのニューロン興奮およびその阻害。
【図８】図８．マウスにおけるトリプシン誘発性機械的痛覚過敏の阻害。
【図９】図９．マウスにおけるトリプシン誘発性機械的痛覚過敏の阻害。
【００１９】
発明の詳細な説明
プロテアーゼ活性型受容体−２（ＰＡＲ２）のエンドサイトーシスの寄与を、侵害受容器のプロテアーゼ誘発性感作を媒介する細胞内コンパートメントにおけるシグナルの発生に対して評価した。生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を用いて、ＨＥＫ細胞における原形質膜（ＫＲａｓ）およびエンドソーム（Ｒａｂ５ａ）の常在タンパク質に対するＰＡＲ２の近接性を評価した。Ｒ３６↓Ｓ３７でＰＡＲ２を切断する標準的アゴニストトリプシンは、ＰＡＲ２とＲａｂ５ａの間のＢＲＥＴを増加させ、エンドサイトーシスと一致してＰＡＲ２とＫＲａｓの間のＢＲＥＴを減少させる。Ｅ５６↓Ｔ５７およびＡ６６↓Ｓ６７↓Ｖ６８でＰＡＲ２をそれぞれ切断するバイアス型（biased）アゴニストカテプシン−Ｓおよびエラスターゼは、ＰＡＲ２エンドサイトーシスを誘導しなかった。原形質膜、サイトゾルまたは核に標的化されたフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）バイオセンサーを使用して、ＨＥＫ細胞およびラット後根神経節ニューロンの細胞内コンパートメントにおけるシグナルを生成するプロテアーゼの能力を調べた。
【００２０】
トリプシン（内在化）は、原形質膜およびサイトゾルにおける活性化ｃＡＭＰおよびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ならびに核およびサイトゾルにおける細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）を活性化した。カテプシン−Ｓおよびエラスターゼ（非内在化）は、原形質膜ではｃＡＭＰおよびＰＫＣのみ、サイトゾルではＥＲＫのみを活性化した。ダイナミン阻害剤Ｄｙｎｇｏ４ａ、クラスリン阻害剤Ｐｉｔｓｔｏｐ２およびドミナントネガティブβ−アレスチンは、ＰＡＲ２のトリプシン誘発エンドサイトーシスを阻害し、サイトゾルｃＡＭＰおよびＰＫＣおよび核ＥＲＫのトリプシン誘発活性化を防止した。これらの結果は、サイトゾルｃＡＭＰおよびＰＫＣおよび核ＥＲＫの活性化におけるＰＡＲ２エンドサイトーシスの役割と一致する。ＰＡＲ２エンドサイトーシス、区画化シグナリングおよび侵害受容器感作の間の関連性を調べるために、穿孔パッチクランプ記録をマウス後根神経節ニューロンから行った。トリプシン、カテプシン−Ｓまたはエラスターゼとのニューロンのプレインキュベーションは、プロテアーゼウォッシュアウト後３０分間維持されたレオバースの減少および活動電位の発火の増加によって評価される興奮性の即時の増加を誘導した。Ｄｙｎｇｏ４ａおよびＰｉｔｓｔｏｐ２は、いずれのプロテアーゼによって誘導される初期過興奮にも影響を与えなかったが、トリプシンへの持続的な興奮性を妨げた。しかし、カテプシン−Ｓまたはエラスターゼは防げなかった。興奮性に対するプロテアーゼの効果は、ＰＡＲ２アンタゴニストＧＢ８８によってブロックされた。したがって、標準的およびバイアス型（biased）プロテアーゼは、異なるメカニズムによって侵害受容器を感作する。標準的アゴニストの場合、ＰＡＲ２エンドサイトーシスは、侵害受容ニューロンの持続的な興奮性の基礎をなす区画化シグナル細胞内コンパートメントを生成する。ＰＡＲ２のエンドソームシグナル伝達を阻害することは、プロテアーゼ誘発性疼痛を治療する新規な方法を提供し得る。
【００２１】
一態様では、本発明は、ＰＡＲ２のエンドソームシグナル伝達を阻害する化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む、プロテアーゼ誘発性疼痛の治療方法を提供する。
【００２２】
一態様では、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を阻害する化合物は、活性型受容体のエンドサイトーシスを阻害する化合物である。
【００２３】
ＰＡＲ２のエンドサイトーシスを阻害する化合物は、活性型ＰＡＲ２の細胞内Ｃ末端のリン酸化とその後の受容体の初期エンドソームへのダイナミンおよびクラスリン依存性エンドサイトーシスとの間の経路の任意の部位または複数部位で作用し得ることが理解される。
【００２４】
一実施形態において、ＰＡＲ２のエンドサイトーシスの阻害は、それを必要とする対象にβ−アレスチン阻害剤を投与することによって達成され得る。本明細書で使用される用語「β−アレスチン阻害剤」は、β−アレスチンと活性化されたＰＡＲ２の細胞内Ｃ末端との間の相互作用を阻害する化合物を意味する。
【００２５】
一実施形態では、βａｒｒと活性型ＰＡＲ２の細胞内Ｃ末端との間の相互作用の阻害は、活性型ＰＡＲ２の細胞内Ｃ末端のリン酸化部位と競合するβ−アレスチン阻害剤を対象に投与し、ＧＰＣＲキナーゼ−２（ＧＲＫ２）リン酸化の代替部位を提供することにより達成され、それにより活性型ＰＡＲ２の細胞内Ｃ末端へのβａｒｒの結合およびその後の受容体のエンドサイトーシスが低減または改善され得ることが想定される。
【００２６】
別の実施形態において、βａｒｒと活性型ＰＡＲ２の細胞内Ｃ末端との間の相互作用の阻害は、対象に、活性型ＰＡＲ２の細胞内Ｃ末端のＧＰＣＲキナーゼ−２（ＧＲＫ２）リン酸化を阻害するβ−アレスチン阻害剤を投与することによって達成され得ることが想定される。一実施形態では、活性型ＰＡＲ２の細胞内Ｃ末端のＧＰＣＲキナーゼ−２（ＧＲＫ２）リン酸化を阻害するβ−アレスチン阻害剤は、例えば、受容体リン酸化を招くＧＲＫ２の中心触媒ドメインに結合することによってＧＲＫ２と直接相互作用することが想定される。別の実施形態において、β−アレスチン阻害剤は、例えば、活性型ＰＡＲ２の細胞内Ｃ末端上のリン酸化部位の認識を防止するために、ＧＲＫ２にアロステリックに結合し得ると想定される。さらに別の実施形態では、β−アレスチン阻害剤は、ＰＡＲ２の細胞内Ｃ末端内のリン酸化部位またはその近くに結合し、それによってＧＲＫ２による認識およびリン酸化を防止することが想定される。βａｒｒと活性型ＰＡＲ２の細胞内Ｃ末端間の相互作用を阻害する化合物は、β−アレスチンと直接相互作用し、ＰＡＲ２の細胞内Ｃ末端上のリン酸化部位への結合を阻害することによって作用し得ることも想定される。
【００２７】
別の実施形態において、ＰＡＲ２のエンドサイトーシスの阻害は、それを必要とする対象に、活性型ＰＡＲ２のクラスリン依存性エンドサイトーシスを阻害するためのクラスリン阻害剤を投与することによって達成され得る。クラスリン阻害剤は、活性型ＰＡＲ２のクラスリン依存性エンドサイトーシスを阻害する任意の化合物、例えばクラスリンの末端ドメインとのリガンド会合を選択的に阻害する化合物であってもよいことが理解されるであろう。Ｐｉｔｓｔｏｐ  １（商標）およびＰｉｔｓｔｏｐ  ２（商標）などのいくつかのクラスリン阻害剤は、当該技術分野において公知である。
【００２８】
別の実施形態において、ＰＡＲ２のエンドサイトーシスの阻害は、それを必要とする対象に、活性型ＰＡＲ２のダイナミンまたはクラスリン依存性エンドサイトーシスを阻害するためのダイナミン阻害剤を投与することによって達成され得る。ダイナミン阻害剤は、活性型ＰＡＲ２のダイナミンおよびその後のエンドサイトーシスを阻害する任意の化合物、例えば、Ｌ−ホスファチジルセリン・リポソーム刺激ヘリカル・ダイナミンを阻害する化合物であり得、ここで、ダイナミンは、Ｇｒｂ２で刺激されたダイナミンを阻害する化合物、またはダイナミンの単一の環への自己集合を阻害する化合物である。例えばＤｙｎｇｏ  ４ａおよびＤｙｎｏｌｅ  ２−２４などのいくつかのダイナミン阻害剤が当該分野で公知である。
【００２９】
別の実施形態において、ＰＡＲ２のエンドサイトーシスの阻害は、それを必要とする対象に、クラスリンへの結合について内因性アレスチンと競合することによって機能し、それによって活性型ＰＡＲ２のクラスリン依存性エンドサイトーシスを阻害するドミナントネガティブβ−アレスチンを投与することによって達成され得る。
【００３０】
別の態様では、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を阻害する化合物は、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を標的とし、阻害する化合物である。
【００３１】
一実施形態では、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を阻害する化合物は、式（Ｉ）：
【００３２】
【化２】
2019516734.tif 000003
【００３３】
（式中、
Ａは、原形質膜への化合物の挿入を促進する脂質アンカー；
Ｌは、長さ１ｎｍ〜５０ｎｍのリンカー部分；および
Ｘは、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達阻害剤；
ここで、脂質アンカーは、４℃において非イオン性界面活性剤に不溶の脂質膜に分配する）；の三成分化合物、またはその医薬上許容し得る塩である。
【００３４】
本明細書で使用される用語「三成分化合物」は、リンカー基に共有結合したエンドソームＧＰＣＲモジュレーターを含む化合物を指し、リンカー基は、式（Ｉ）の化合物を細胞膜の脂質二重層に、最終的には、初期のエンドソームの膜に固定することができる脂質アンカーに共有結合している。
【００３５】
本明細書で使用される用語「脂質アンカー」は、脂質膜に分配し、それによって式（Ｉ）の化合物を脂質膜に固定することができる部分を意味する。脂質膜への分配は、細胞外もしくは小胞内腔空間から直接的に、または二重層から側方的に起こりうる。脂質アンカーは、脂質膜へ分配する能力により特徴づけられ、その脂質膜は、４℃での非イオン性界面活性剤への不溶性により特徴づけられる。適切な脂質アンカーとしては、コレステロール、コレスタノール、スフィンゴ脂質、ＧＰＩアンカーまたは飽和脂肪酸誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。このような脂質アンカーの多くは、例えばＷＯ２００５／０９７１９９に記載されており、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００３６】
一実施形態では、脂質アンカーは、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：
【００３７】
【化３】
2019516734.tif 000004
【００３８】
（式中、
Ｒ１は、置換されてもよいＣ１−１２アルキル基；
Ｒ２およびＲ３は、独立して、ＨまたはＣ１−３アルキル；
Ｒ４は、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ａＯＰＯ３−−、−ＮＨ（ＣＨ２）ａＳＯ２ＣＦ２−、−ＮＨ（ＣＨ２）ａＳＯ２ＮＨ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣＨ（ＣＯＮＨ２）（ＣＨ２）ｂＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｂＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣＨ（ＣＯＮＨ２）（ＣＨ２）ｂＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｂＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＨ（ＣＯＮＨ）（ＣＨ２）４ＮＨ（（ＣＯ）ＣＨ２Ｏ）ｅ−もしくは−ＮＨＣＨ（ＣＯＯＨ）（ＣＨ２）４ＮＨ（（ＣＯ）ＣＨ２Ｏ）ｅ−；
ａは、２〜３の整数；
ｂは、１〜２の整数；
ｅは、０〜１の整数；および
2019516734.tif 000005
は、単結合または二重結合を表す）
から選択される部分である。
【００３９】
他の実施形態では、脂質アンカーは、式（ＶＩ），（ＶＩＩ），（ＶＩＩＩ）もしくは（ＩＸ）：
【００４０】
【化４】
2019516734.tif 000006
2019516734.tif 000007
【００４１】
（式中、
Ｒ４は、上述した通りであり；
2019516734.tif 000008
は、単結合または二重結合を表す；
2019516734.tif 000009
は、単結合、二重結合もしくは三重結合を表す；
それぞれＲ５は、独立して、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−もしくは−ＮＨＳ（Ｏ２）−；
それぞれＲ６は、独立して、フッ素、好ましくは１ないし４個のフッ素原子で置換されてもよいＣ１４−３０アルキル基；
それぞれＲ７は、独立して、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３、ＯＨ、Ｈ、ハロゲンもしくはＯ、ただしＲ７がＮＨ２、ＮＨＣＨ３、ＯＨ、Ｈ、もしくはハロゲンの時には
2019516734.tif 000010
は単結合およびＲ７がＯの時は
2019516734.tif 000011
は二重結合；
それぞれＲ８は、独立して、Ｈ、ＯＨまたは
2019516734.tif 000012
が三重結合を表すときにはなし；
Ｒ９は、フッ素、好ましくは１ないし４個のフッ素原子で置換されてもよいＣ１０−３０アルキル基；および
それぞれＲ１０は、独立して、フッ素、好ましくは１ないし４個のフッ素原子で置換されてもよい、Ｃ２４−４０アルキレン基、Ｃ２４−４０アルケニレン基もしくはＣ２４−４０アルキニレン基）
から選択される部分である。
【００４２】
さらなる実施形態において、脂質アンカーは、式（Ｘ）もしくは（ＸＩ）：
【００４３】
【化５】
2019516734.tif 000013
【００４４】
（式中、
2019516734.tif 000014
は、単結合または二重結合を表す；
2019516734.tif 000015
は、単結合、二重結合もしくは三重結合を表す；
それぞれＲ１３は、独立して、−Ｏ−もしくは−ＣＯ（ＣＨ２）ａ（ＣＯ）ｂＯ−、（式中、ａは、１〜３の整数およびｂは、０〜１の整数）；
Ｒ１４は、−Ｏ−もしくは−ＯＣ（Ｏ）−；
それぞれＲ１５は、独立して、フッ素、好ましくは１〜４個のフッ素原子で置換されてもよいＣ１６−３０アルキル基から選択される；
Ｒ１６は、−ＰＯ３−ＣＨ２−、−ＳＯ３ＣＨ２−、−ＣＨ２−、−ＣＯ２ＣＨ２−もしくは直接結合；
Ｒ１７は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−もしくは−ＮＨＳ（Ｏ２）−；
Ｒ１８は、ＮＨ２、ＮＨＣＨ３、ＯＨ、Ｈ、、ハロゲンもしくはＯ；
Ｒ１９は、フッ素、好ましくは１〜４個のフッ素原子で置換されてもよいＣ１６−３０アルキル基；および
各Ｒ２０は、下記式：
【００４５】
【化６】
2019516734.tif 000016
【００４６】
（式中、
2019516734.tif 000017
は、単結合または二重結合；
Ｒ２１は、ＰＯ３−ＣＨ２−、−ＳＯ３ＣＨ２−、−ＣＨ２−、−ＣＯ２ＣＨ２−もしくは直接結合；
Ｒ２２は、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−もしくは−ＮＨＳ（Ｏ２）−；
Ｒ２３は、−Ｏ−もしくは−ＯＣ（Ｏ）−；
それぞれＲ２４は、独立して、フッ素、好ましくは１〜４個のフッ素原子で置換されてもよいＣ１６−３０アルキル基から選択される；
Ｒ２５は、−ＣＯ（ＣＨ２）ａ（ＣＯ）ｂＯ−もしくは−ＣＯ（ＣＨ２）ａ（ＣＯ）ｂＮＨ−、（式中、ａは、１〜３の整数およびｂは、０〜１の整数）；および
Ｒ２６はフッ素、好ましくは１〜４個のフッ素原子で置換されてもよいＣ４−２０アルキル基である）の基で置換されてもよいＣ（Ｏ）Ｃ１３−２５アルキル基である））
から選択される部位である。
【００４７】
さらなる態様において、脂質アンカーは、式（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）または（ＸＶ）：
【００４８】
【化７】
2019516734.tif 000018
【００４９】
（式中、
それぞれＲ２７は、独立して、−ＮＨ−、−Ｏ−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｃＯＰＯ３−−、−ＮＨ（ＣＨ２）ｃＳＯ２ＮＨ−、−ＮＨＣＯＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｂ（ＣＯ）ａＮＨ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｂ（ＣＯ）ａＯ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｂＳ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｂＯＰＯ３−−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｂＳＯ２ＮＨ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｂＮＨＣＯＮＨ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｂＯＣＯＮＨ−、−ＣＯ（ＣＨ２）ｂＯＳＯ３−、もしくは−ＣＯ（ＣＨ２）ｂＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、（式中、ａは、０〜１の整数、ｂは、１〜３の整数およびｃは、２〜３の整数）から選択される；
それぞれＲ２８は、独立して、−ＣＨ２−もしくは−Ｏ−；
それぞれＲ２９は、独立して、Ｈもしくはフッ素、好ましくは１ないし４個のフッ素原子で置換されてもよいＣ１６−３０アルキル基から選択される；
それぞれＲ３１は、独立して、Ｈもしくはフッ素、好ましくは１ないし４個のフッ素原子で置換されてもよいＣ１−１５アルキル基、もしくはフッ素、好ましくは１ないし４個のフッ素原子で置換されてもよいＣ１−１５アルコキシ基から選択される；および
ｎは、１〜２の整数）から選択される部位である。
【００５０】
本明細書で使用される用語「リンカー」は、エンドソームＧＰＣＲのモジュレーターを脂質アンカーに連結する化合物の部分に関する。リンカーは、リガンド結合部位でエンドソームＧＰＣＲのモジュレーターと競合しないように選択されるべきであることが理解される。また、リンカーが脂質膜に分配されるべきではない。リンカー基は、脂質アンカーがエンドソーム膜に固定されている場合、エンドソームＧＰＣＲのモジュレーターがレセプターと相互作用することを可能にするために、１ｎｍ〜５０ｎｍの長さでなければならない。一実施形態では、リンカー基は、１つ以上のポリエチレングリコール単位を含む。別の実施形態において、リンカーまたはリンカーのサブユニットは、いずれかの基の機能に干渉することなく、エンドソームＧＰＣＲのモジュレーターと脂質アンカー間の適切な距離を提供するアミノ酸残基、誘導体化または官能化アミノ酸残基、ポリエーテル、尿素、カルバメート、スルホンアミドまたは他のサブユニットであり得ることが想定される。
【００５１】
ひとつの態様において、リンカーは、式（ＩＶ）：
【００５２】
【化８】
2019516734.tif 000019
【００５３】
（式中、
Ｚは、リンカーおよび脂質アンカー間の付着基であり、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−、−Ｃ２−Ｃ１０アルケニル−、−Ｃ２−Ｃ１０アルキニル−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキルＣ（Ｏ）−、−Ｃ２−Ｃ１０アルケニルＣ（Ｏ）−もしくは−Ｃ２−Ｃ１０アルキニルＣ（Ｏ）−；または
Ｚは、隣接するアミンと一緒になって、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリンもしくはトレオニンから選択されるＣ末端アミド化アミノ酸であってもよい；ここで、アミノ酸は、側鎖官能基を介して脂質アンカーに付着する；
Ｙは、リンカーとエンドソームＧＰＣＲのモジュレーター間の付着基であり、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−もしくは−Ｃ（Ｏ）Ｓ−；または
Ｙは、隣接するアミド基と一緒になって、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリンもしくはトレオニンから選択されるアミノ酸である；ここで、アミノ酸は、側鎖官能基を介してエンドソームＧＰＣＲのモジュレーターに付着する；
ｍは、１もしくは２；
ｎは、１〜２０；および
ｐは、１〜８）の部分で表される。
【００５４】
別の実施形態において、リンカーは、式（ＸＸ）：
【００５５】
【化９】
2019516734.tif 000020
【００５６】
（式中、
それぞれＲ１１は、独立して、天然起源、誘導体化もしくは官能基化されたアミノ酸残基の任意の側鎖である；
ｍは、３〜８０の整数；および
ｎは、０〜１の整数）の部分で表される。
【００５７】
他の実施形態においては、リンカーは、式（ＸＸＩ）：
【００５８】
【化１０】
2019516734.tif 000021
（ＸＸＩ）
【００５９】
（式中、
ｍは、０〜４０の整数；
ｎは、０〜１の整数；
それぞれｏは、独立して、１〜５の整数；
それぞれＲ１１は、独立して、天然起源、誘導体化もしくは官能基化されたアミノ酸残基の任意の側鎖である；および
ＳＯ２末端は、脂質アンカーに結合し、またＮ末端は、エンドソームＧＰＣＲのモジュレーターに結合する）の部分で表される。
【００６０】
さらなる実施形態において、リンカーは、式（ＸＸＩＩ）：
【００６１】
【化１１】
2019516734.tif 000022
【００６２】
（式中、
ｍは、０〜４０の整数；
ｎは、０〜１の整数；
それぞれｏは、独立して１〜５の整数；
各Ｒ１２は、独立してＮＨもしくはＯ；
それぞれＲ１１は、独立して、天然起源、誘導体化もしくは官能基化されたアミノ酸残基の任意の側鎖である；および
Ｃ（Ｏ）末端は、脂質アンカーに結合し、Ｒ１２末端は、エンドソームＧＰＣＲのモジュレーターに結合する）の部分で表される。
【００６３】
いくつかの適切なリンカー部分が、国際公開第２００５／０９７１９９号パンフレットに記載されており、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【００６４】
本明細書中で使用される用語「エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤」は、エンドソームにエンドサイトーシスされたＰＡＲ２のアンタゴニストまたは阻害剤を指す。エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤は、限定されないが、有機分子、ポリペプチド配列、ホルモン、これらのいずれかのタンパク質断片または誘導体などの任意の形態であり得る。
【００６５】
本明細書で使用される用語「エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達」は、エンドソーム、好ましくは初期エンドソームにエンドサイトーシスされた活性型ＰＡＲ２によって伝達されたシグナルを指す。
【００６６】
一実施形態では、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達は、原形質膜で最初に伝達され、受容体が初期エンドソームにエンドサイトーシスされたときに維持されるシグナル伝達であろう。
【００６７】
別の実施形態において、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達は、受容体エンドサイトーシスを必要とするシグナル伝達であり、および／またはエンドソーム膜上でのみ起こるシグナル伝達、例えば、β−アレスチン媒介シグナル伝達である。βａｒｒは細胞表面でアゴニストが占めるＧタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）リン酸化ＧＰＣＲと相互作用し、ダイナミンおよびクラスリン依存性エンドサイトーシスを経てリガンド結合レセプターの細胞表面から初期エンドソームへの伝達を促進すると考えられている。最近、この経路は、原形質膜でのＧタンパク質依存性シグナル伝達とは異なるエンドソームＧＰＣＲシグナル伝達の第２の系列を媒介できることが発見された。このメカニズムの重要性は、ＧＲＫによるＧＰＣＲリン酸化の程度に依存して変化する、ＧＰＣＲがβａｒｒと相互作用する親和性に依存すると考えられている。“クラスＡ”のＧＰＣＲ（例えば、β２ＡＲ、α１ｂＡＲ）は、リン酸化部位をほとんど持たず、ほとんどが原形質膜で、βａｒｒ１およびβａｒｒ２と一時的に相互作用し、βａｒｒ２に対してはより高い親和性で相互作用する。“クラスＢ”ＧＰＣＲ（例えば、ＡＴ１ＡＲ、ＮＫ１Ｒ、ＰＡＲ２）は、複数の部位でリン酸化され、原形質膜およびエンドソーム膜で、長期間高親和性でβａｒｒ１および２の両方と相互作用する。“クラスＣ”ＧＰＣＲ（例えば、ブラジキニンＢ２受容体）は、βａｒｒをエンドソームに内在化させ、続いてアゴニスト除去時にβａｒｒを迅速に解離させる。
【００６８】
βａｒｒ誘発ＭＡＰＫシグナル伝達の程度は、βａｒｒに対する受容体の親和性に依存し、親和性は受容体構造や、７つの哺乳動物ＧＲＫのうちのどれが受容体をリン酸化するかに依存すると考えられている。したがって、ＡＴ１ＡＲおよびＶ２Ｒの活性化は、α１ｂＡＲおよびβ２ＡＲの活性化よりも、βａｒｒ結合ＥＲＫ１／２のより大きなリン酸化を引き起こし、クラスＢ受容体がこの経路を通してより強固にシグナルすることを示唆する。上記のように、ＰＡＲ２はクラスＢのＧＰＣＲである。
【００６９】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、一般式（Ｉ）を参照して、以下の実施形態のうちの１つ以上が適用される：
【００７０】
ａ）Ａは、コレステロール、コレスタノール、スフィンゴ脂質、ＧＰＩアンカーまたは飽和脂肪酸誘導体から選択される脂質アンカーである。
【００７１】
ｂ）Ａは、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）および（ＩＸ）の部分から選択される脂質アンカーである。
【００７２】
ｃ）Ａは、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の部分から選択される脂質アンカーである。
【００７３】
ｄ）Ｌは、１つ以上のサブユニットを含むリンカー部分であり、サブユニットは、ポリエチレングリコール単位、アミノ酸残基、誘導体化または官能化アミノ酸残基、ポリエーテル、尿素、カルバメートおよび／またはスルホンアミドを含む。
【００７４】
ｅ）Ｌは、式（ＩＶ）、（ＸＸ）、（ＸＸＩ）もしくは（ＸＸＩＩ）で表されるリンカー部分である。
【００７５】
ｆ）Ｌは、式（ＩＶ）で表されるリンカー部分である。
【００７６】
好ましい実施形態においては、Ａは、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表される脂質アンカーである。
【００７７】
従って、一実施形態において、本発明は、式（Ｉａ）：
【００７８】
【化１２】
2019516734.tif 000023
【００７９】
（式中、
Ａは、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：
【００８０】
【化１３】
2019516734.tif 000024
【００８１】
（式中、
Ｒ１は、置換されてもよいＣ１−１２アルキル基；
Ｒ２およびＲ３は、独立してＨもしくはＣ１−３アルキル；
Ｒ４は、Ｃ、Ｏ、ＮＨもしくはＳ；および
2019516734.tif 000025
は、単結合または二重結合を表す）で表される原形質膜への化合物の挿入を促進する脂質アンカー；
Ｌは、長さ１ｎｍ〜５０ｎｍのリンカー基；および
Ｘは、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤）で表される式（Ｉ）の三成分化合物またはその医薬上許容される塩を提供する。
【００８２】
別の好ましい実施形態においては、Ａは、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）で表される脂質アンカーであり、Ｌは、式（ＩＶ）で表されるリンカーである。
【００８３】
従って、別の実施形態では、本発明は、式（Ｉｂ）：
【００８４】
【化１４】
2019516734.tif 000026
【００８５】
（式中、
Ａは、式（ＩＩ）または（ＩＩＩ）：
【００８６】
【化１５】
2019516734.tif 000027
【００８７】
（式中、
Ｒ１は、置換されてもよいＣ１−１２アルキル基；
Ｒ２およびＲ３は、独立してＨもしくはＣ１−３アルキル；
Ｒ４は、Ｃ、Ｏ、ＮＨもしくはＳ；
2019516734.tif 000028
は、単結合もしくは二重結合を表す）で表される原形質膜への化合物の挿入を促進する脂質アンカー；
Ｌは、式（ＩＶ）：
【００８８】
【化１６】
2019516734.tif 000029
【００８９】
（式中、
Ｚは、リンカーおよび脂質アンカー間の付着基であり、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−、−Ｃ２−Ｃ１０アルケニル−、−Ｃ２−Ｃ１０アルキニル−、−Ｃ１−Ｃ１０アルキルＣ（Ｏ）−、−Ｃ２−Ｃ１０アルケニルＣ（Ｏ）−もしくは−Ｃ２−Ｃ１０アルキニルＣ（Ｏ）−；または
Ｚは、隣接するアミンと一緒になって、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリンもしくはトレオニンから選択されるＣ末端アミド化アミノ酸であってもよい；ここで、アミノ酸は、側鎖官能基を介して脂質アンカーに付着する；
Ｙは、リンカーとエンドソームＧＰＣＲのモジュレーター間の付着基であり、−Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−もしくは−Ｃ（Ｏ）Ｓ−；または
Ｙは、隣接するアミド基と一緒になって、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、システイン、リジン、アルギニン、セリンもしくはトレオニンから選択されるアミノ酸；ここでアミノ酸は、側鎖官能基を介してエンドソームＧＰＣＲのモジュレーターに付着する；
ｍは、１もしくは２；
ｎは、１〜２０；
ｐは、１〜８）で表される；および
Ｘは、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤）；で表される式（Ｉ）の三成分化合物、またはその医薬上許容される塩を提供する。
【００９０】
一実施形態において、式（Ｉ）の化合物は構造：
【００９１】
【化１７】
2019516734.tif 000030
【００９２】
（式中、ＬおよびＡは本明細書に定義の通り）、またはその医薬上許容し得る塩を有する。
【００９３】
他の態様では、本発明は、化合物：
【００９４】
【化１８】
2019516734.tif 000031
【００９５】
またはその医薬上許容し得る塩を提供する。
【００９６】
一態様では、本発明は、プロテアーゼ誘発性疼痛の治療方法であって、有効量の本明細書に定義される式（Ｉ）の化合物をそれを必要とする対象に投与することを含む方法を提供する。
【００９７】
別の態様では、本発明は、プロテアーゼ誘発性疼痛の治療のための薬剤の製造における、本明細書で定義される式（Ｉ）の化合物の使用を提供する。
【００９８】
さらなる態様において、本発明は、プロテアーゼ誘発性疼痛の治療における使用のために本明細書に定義される式（Ｉ）の化合物を提供する。
【００９９】
さらに別の態様では、本発明は、プロテアーゼ誘発性疼痛の治療方法であって、それを必要とする対象に、受容体のエンドサイトーシスを阻害する１つ以上の化合物およびエンドソームＰＡＲ２シグナル伝達を標的および阻害する１つ以上の化合物を含む組み合わせを投与することを含む、治療方法を提供する。
【０１００】
本発明の文脈において、用語「疼痛」としては、慢性炎症性疼痛（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、リウマチ様脊椎炎、痛風性関節炎および若年性関節炎に関連する疼痛）；筋骨格痛、下背部および首部の痛み、捻挫および緊張、神経因性疼痛、交感神経的に維持される疼痛、筋炎、癌および線維筋痛に伴う疼痛、片頭痛に伴う痛み、群発性頭痛および慢性の毎日の頭痛に伴う疼痛、インフルエンザまたは風邪などの他のウイルス感染症に伴う疼痛、リウマチ熱、非潰瘍性ディスペプシア、非心臓性胸痛および過敏性腸症候群などの機能性腸障害に関連する疼痛、心筋虚血に伴う痛み、術後痛、頭痛、歯痛、月経困難症、神経痛、線維筋痛症候群、複合性局所疼痛症候群（ＣＲＰＳ  Ｉ型およびＩＩ型）、神経因性疼痛症候群（糖尿病性ニューロパシー、化学療法誘発性神経障害性疼痛、坐骨神経痛、非特異的腰痛、多発性硬化症疼痛、ＨＩＶ関連神経障害、ヘルペス後症候群神経痛、三叉神経痛など）および身体外傷、切断、癌、毒素または慢性炎症性の状態に起因する疼痛が挙げられる。好ましい実施形態において、疼痛は体性疼痛または内臓痛である。
【０１０１】
本発明の化合物を合成するための一般的な戦略を以下に概説する。
【０１０２】
コレステリルグリコール酸、３−コレステリルアミンおよびコレステリルグリシンの合成は文献に記載されている(Hussey, S. L. et al., J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 12712-12713; Hussey, S. L. et al., Org. Lett. 2002, 4, 415-418; Martin, S. E. et al., Bioconjugate Chem. 2003, 14, 67-74)。ステロイド構造の３位にアミド、スルホンアミド、尿素またはカルバメート官能基を有する式（ＩＩＩ）の脂質アンカーは、３−コレステリルアミンから調製することができ、例えば、３−コレステリルアミンを、ＤＭＡＰの存在下でコハク酸無水物と反応させて対応するスクシニル置換化合物を得ることができる。対応するスルホンアミドは、３−コレステリルアミンとクロロスルホニル酢酸との反応によって得ることができ、これは文献に記載されているように調製することができる(Hinman, R. L. and Locatell, L. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, 5655-5658)。対応する尿素またはカルバメートは、文献の手順に従って、対応するイソシアネートを経て、調製することができ(Knolker, H.-J. T. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1995, 34, 2497; Knolker, H.-J. et al., Synlett 1996, 502;. Knolker, H.-J. and. Braxmeier, T. Tetrahedron Lett. 1996, 37, 5861)、ステロイド構造の３位にホスフェートまたはカルボキシメチル化ホスフェートを有する化合物（III）の中間体は、文献に記載されているように調製することができる(Golebriewski, Keyes, Cushman, Bioorg. Med. Chem. 1996, 4, 1637-1648; Cusinato, Habeler, et al., J. Lipid Res. 1998, 39, 1844-1851; Himber, Missano, et al., J. Lipid Res. 1995, 36, 1567- 1585)。ステロイド構造の３位にチオールを有する式（ＩＩＩ）の脂質アンカーは、文献に記載されているように調製することができる(J. G. Parkes, J. G. et al., Biochim. Biophys. Acta 1982, 691, 24-29)。対応するカルボキシメチル化チオールは、対応するアミンおよびアルコールについて記載したような簡単なアルキル化によって得ることができる。ステロイド構造の３位にジフルオロメチレンスルホン誘導体を有する式（ＩＩＩ）の脂質アンカーは、文献に記載されているように調製することができる(Lapiene, J. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 151-155)。式（ＩＩＩ）の脂質アンカーの１７位の種々の側鎖の導入は、デヒドロイソアンドロステロンまたはプレグネノロンから出発する文献プロトコルの使用によって達成することができる(Bergmann, E. D. et al., J. Am. Chem. Soc. 1959, 81, 1239-1243およびそこでの文献)。コレスタンから誘導される式（ＩＩＩ）の脂質アンカーは、文献のプロトコール、例えば、種々の遷移金属触媒の存在下での水素添加を用いて５，６−二重結合の還元によってコレステロール由来の対応プレカーサーから得られる。
【０１０３】
３位に酸素誘導置換基を有する式（ＩＩ）の脂質アンカーは、エストロンから出発する式（ＩＩＩ）の脂質アンカーについて記載したのと同様の方法で調製する。３位に窒素由来置換基を有する式（ＩＩ）の脂質アンカーは、３−アミノエストロンから出発する式（ＩＩＩ）の脂質アンカーについて記載したのと同様の方法で調製することができ、文献(Zhang, X. and Sui, Z. Tetrahedron Lett. 2003, 44, 3071-3073; Woo, L. W. L. et al., Steroid Biochem. Molec. Biol. 1996, 57, 79-88)に記載されているように調製することができる。３位に硫黄由来の置換基を有する式（ＩＩ）の脂質アンカーは、３−チオエステロンから出発する式（ＩＩＩ）の脂質アンカーについて記載したのと同様の方法で調製することができ、文献(Woo, L. W. L. et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 1996, 57, 79-88)に記載されているように調製することができる。エストロン構造の１７位に種々の側鎖を導入することは、文献(Peters, R. H. et al., J. Org. Chem. 1966, 31, 24-26)に記載されているように、得られた二重結合の水素化に続くＷｉｔｔｉｇアプローチによって達成することができる。側鎖内のさらなる操作（例えば、二重結合構造、シクロアルキル装飾）は、標準的なプロトコル（鈴木カップリングなど）によって達成することができる。
【０１０４】
異なる炭化水素基を有するセラミド、デヒドロセラミドおよびジヒドロセラミドのクラスに属する式（ＶＩ）の脂質アンカーは、文献に概説されているように得ることができる(A. H. Merrill, Jr., Y. A. Hannun(Eds.)、Methods in Enzymology, Vol. 311, Academic Press, 1999;. Koskinen, P. M and Koskinen, A. M. P. Synthesis 1998, 1075)。特に、スフィンゴシン塩基は、スフィンゴシン骨格の１位に酸素由来の置換基を有する式（ＶＩ）の全ての脂質アンカーの重要な中間体として使用することができる。対応するアミノ誘導体は、公知のプロトコルに従ってアルコールから調製することができるスルホネートを置換することによって得ることができる。１−アミノ誘導体または１−ヒドロキシ誘導体のアルキル化およびアシル化は、それぞれブロモ酢酸および無水コハク酸との反応によって達成することができる。チオアセチル化誘導体は、スルホネートをメルカプト酢酸で置換することによって調製することができる。ホスフェートおよびスルフェート誘導体は、文献に記載されているように得ることができる(A. H. Merrill, Jr., YA A. Hannun(Eds.)、Methods in Enzymology, Vol. 311, Academic Press, 1999; Koskinen, P. M. and Koskinen, A. M. P. Synthesis 1998, 1075)。アシル化、スルホニル化、尿素およびカルバメート形成は、標準的な手順によって達成することができる。式（ＶＩ）（式中、Ｒ５がアミノまたはアミノ由来の官能基である）の脂質アンカーは、標準プロトコールを用いて、Ｋｏｓｋｉｎｅｎ(Koskinen, P. M. and Koskinen, A. M. P. Synthesis 1998, 1075)により発表され使用可能なスフィンゴシン塩基から出発して調製することができる。対応する２−酸素置換スフィンゴ脂質は、Ｙａｍａｎｏｉ(Yamanoi, T. et al., Chem. Lett. 1989, 335)によって発表された戦略によって得ることができる。両方のＲ８がヒドロキシ基を表す式（ＶＩ）の脂質アンカーは、公知のプロトコルを用いて対応するアルケンをビスヒドロキシル化することによって得ることができる。対応するモノヒドロキシ誘導体は、文献に記載されるように調製することができる(Howell, A. R. and Ndakala, A. J. Curr. Org. Chem. 2002, 6, 365-391)。式（ＶＩ）の脂質アンカーにおける置換基Ｒ６およびＲ９の修飾は、種々の総説に概説されたプロトコルおよび戦略によって達成され得る(Harwood, H. J. Chem. Rev. 1962, 62, 99-154; Gensler, W. J. Chem. Rev. 1957, 57, 191-280)。
【０１０５】
式（ＶＩＩ）の脂質アンカーは、文献(Muller, S. et al., J. Prakt. Chem. 2000, 342, 779)に記載されたプロトコル、および式（ＶＩＩ）の脂質アンカーの調製のために記載されたプロトコルとの組み合わせによって得られる。
【０１０６】
Ｒ４およびＲ５が酸素由来置換基である式（ＶＩＩＩ）の脂質アンカーは、Ｆｒａｓｅｒ−Ｒｅｉｄ(Schlueter, U. Lu, J. and Fraser-Reid, B. Org. Lett. 2003, 5, 255-257）に概説されているように、市販の（Ｒ）−（−）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノールから出発して、調製することができる。式（ＶＩＩＩ）の化合物における置換基Ｒ６の変化は、種々の総説に概説されたプロトコルおよび戦略によって達成され得る(Harwood, H. J. Chem. Rev. 1962, 62, 99-154; Gensler, W. J. Chem. Rev. 1957, 57, 191-280)。Ｒ４およびＲ５が窒素由来の置換基である式（ＶＩＩＩ）の脂質アンカーは、対応するスルホネートの求核置換系および上記で概説したさらなる修飾によって対応する酸素置換系から出発、または文献(Henrick, K. et al., J Chem. Soc. Dalton Trans. 1982, 225-227)に記載されているように得ることができる、１，２，３−トリアミノプロパンから出発のいずれかで得られる。
【０１０７】
式（ＩＸ）の脂質アンカーは、式（ＶＩＩ）の脂質アンカーと同様に、あるいは式（ＶＩＩＩ）の脂質アンカーのω−エテニル化中間体の閉環メタセシスにより得ることができる。
【０１０８】
式（Ｘ）および（ＸＩ）の脂質アンカーは、文献(Xue, J. and Guo, Z. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002, 12, 2015-2018; Xue, J. and Guo, Z. J. Am. Chem. Soc. 2003, 16334-16339; Xue, J. et al., J. Org. Chem. 2003, 68, 4020-4029; Shao, N., Xue, J. and Guo, Z. Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 1569-1573)に記載の合成戦略により、および式（ＶＩ）および（ＶＩＩＩ）の脂質アンカーの調製のための上記の方法とのそれらの組み合わせによって調製することができる。
【０１０９】
式（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）および（ＸＩＶ）の脂質アンカーは、文献に記載の合成戦略に従って全合成によって得ることができる(Knolker, H.-J. Chem. Soc. Rev. 1999, 28, 151-157; Knolker, H.-J. and Reddy, K. R. Chem. Rev. 2002, 102, 4303-4427; Knolker, H.-J. and Knoll, J. Chem. Commun. 2003, 1170-1171; Knolker, H.-J. Curr. Org. Synthesis 2004, 1)。
【０１１０】
式（ＸＶ）の脂質アンカーは、４−メトキシ−３−メチルベンズアルデヒドから出発して６−メトキシ−５−メチルインドールを得るネニゼスク（Ｎｅｎｉｔｚｅｓｃｕ）型インドール合成によって調製することができる。エーテル開裂、トリフラート形成およびソノガシラカップリングは、対応する６−アルキニル置換５−メチルインドールをもたらす。Ｎｉｌｓｍｅｉｅｒのホルミル化およびそれに続くニトロメタンの添加は、６−アルキル置換５−メチルトリプタミンの形成をもたらす全体的な水素化に供される３−ニトロビニル置換インドール誘導体を生じる。スクシニル無水物を用いたアミノ基のアシル化により、調製が完了する。
【０１１１】
本発明のペプチドの合成には、固体支持体（典型的には樹脂）へのＮまたはＣ末端のカップリング、続いてリニアペプチドの段階的合成などの公知の固溶体相技術を用いることができる。側鎖を含むアミノ酸残基の保護のための基の化学的保護は、当該分野で周知であり、例えばTheodora W. Greene and Peter G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis(Third Edition, John Wiley & Sons, Inc, 1999)に見出される。その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
本明細書に記載の化合物の調製方法は、当業者には明らかであり、
ａ）ホスホリルヘッド基もしくは脂質アンカーの同等のヘッド基とエンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤のモジュレーターの結合および／または相互作用部位との距離（ａ）を決定する工程；
ｂ）（ａ）で定義した距離にスパニング（spanning）しうるリンカーを選択する工程；および
ｃ）（ｂ）で選択したリンカーによる脂質アンカーとエンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤とを結合させる工程
を含むであろう。
【０１１３】
そのような方法の対応する実施例を本明細書に示す。当業者は、所定のまたは潜在的なエンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤の関連する結合部位または相互作用部位を推定し、したがって、（ａ）ホスホリルヘッド基もしくは脂質アンカーの同等のヘッド基とエンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤の結合および／または相互作用部位との距離（ａ）を決定する立場にある。このような方法は、分子モデリング、インビトロおよび／または分子相互作用またはバインディングアッセイ（例えば、酵母２または３ハイブリッド系、ペプチドスポッティング、オーバーレイアッセイ、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、リボソームディスプレイ）、原子力顕微鏡法、ならびに分光法およびＸ線結晶学を含むが、限定されない。さらに、部位特異的突然変異誘発のような方法を用いて、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の所定の阻害剤またはエンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の候補阻害剤およびその対応する標的の推定相互作用部位を確認することができる。
【０１１４】
当業者は、リンカーの選択が、当該分野で公知のリンカーの選択、ならびに新規のリンカーの生成および使用（例えば、分子モデリングおよび対応する合成または当技術分野で公知のさらなる方法による）を含むことを理解するであろう。
工程ｂ）に関して本明細書中で使用される用語「スパニング」は、脂質アンカーがエンドソームの脂質層の一部を形成する場合、受容体上の正しい座にエンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤を配置するように選択されるリンカーの長さをいう。
【０１１５】
当業者は、所与の三成分化合物ならびに本明細書に記載の個々の部分の親油性を推論し、確認および／または評価する立場にある。エンドソームＧＰＣＲ標的を決定するための対応する試験アッセイを本明細書の実施例に提供する。
【０１１６】
当業者は、リンカー部分の目的が、脂質アンカーがエンドソーム膜に固定されているとき、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤がＰＡＲ２と相互作用することを可能にするために、脂質アンカーをエンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤に連結することであることを理解するであろう。脂質アンカーおよびリンカーは、２つが共有結合することを可能にする官能基を含有する。脂質アンカーの官能基の性質は決して限定されず、例えば、リンカーとアミド結合を形成するアミン基、またはリンカーとエーテル結合またはエステル結合を形成するヒドロキシル基またはカルボン酸基を挙げることができる。
【０１１７】
同様に、当業者は、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤と連結するリンカーの末端での官能基の選択が、主として選択されたエンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤上の任意の利用可能な官能基によって決定されることを理解するであろう。例えば、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害剤が遊離のアミンまたはカルボン酸基を含む場合、リンカーの官能基は、アミド結合を形成するための相補的なカルボン酸またはアミンを含むことが想定される。
【０１１８】
本発明の化合物は、１つ以上の立体異性体（例えば、ジアステレオマー）で存在し得ることが理解される。本発明は、その範囲内に、単離された（例えば、エナンチオマー単離で）、または組み合わせ（ラセミ混合物およびジアステレオマー混合物を含む）のこれらの立体異性体のすべてを含む。本発明は、独立してＬ体およびＤ体から選択されるアミノ酸の使用（例えば、ペプチドが２つのセリン残基を含み、各セリン残基は同じまたは反対の絶対立体化学を有してもよい）などの、Ｌ体およびＤ体の両方のアミノ酸の使用を意図している。別段の記載がない限り、アミノ酸はＬ配置であると解釈される。
【０１１９】
したがって、本発明は、またアミノ酸残基の不斉中心に関して、実質的に純粋な立体異性体形態の化合物、例えば約９５％〜９７％ｄｅ、または９９％ｄｅより大きい、などの約９０％ｄｅより大きい化合物、ならびにそれらの混合物（ラセミ混合物など）に関する。そのようなジアステレオマーは、例えばキラル中間体を使用する不斉合成によって調製してもよく、または混合物を常法、例えばクロマトグラフィーまたは分割剤の使用によって分割してもよい。
【０１２０】
本発明の化合物が精製を必要とする場合、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および逆相ＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー技術を使用することができる。ペプチドは、質量分析および／または他の適切な方法によって特徴付けられてもよい。
【０１２１】
化合物がプロトン化または脱プロトン化され得る（例えば、生理学的ｐＨで）１つ以上の官能基を含む場合、化合物は、医薬上許容される塩として調製および／または単離され得る。化合物は、所与のｐＨにおいて両性イオンであり得ることが理解されるであろう。本明細書中で使用される表現「医薬上許容される塩」とは、所与の化合物の塩を指し、その塩は医薬としての投与に適している。このような塩は、例えば、それぞれ酸または塩基とアミンまたはカルボン酸基との反応によって形成することができる。
【０１２２】
医薬上許容される酸付加塩は、無機および有機酸から調製することができる。無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。有機酸の例としては、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などが挙げられる。
【０１２３】
医薬上許容される塩基付加塩は、無機および有機塩基から調製することができる。無機塩基に由来する対応する対イオンには、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウムの塩が挙げられる。有機塩基には、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、Ｎ−アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジンおよびＮ−エチルピペリジンなどの、一級、二級および三級アミン、天然の置換アミンなどの置換アミンならびに環状アミンが挙げられる。
【０１２４】
酸／塩基付加塩は、対応する遊離酸／塩基形態よりも水性溶媒中により可溶性である傾向がある。
【０１２５】
本発明はまた、治療上有効な量の上記で定義した化合物またはその医薬上許容される塩を、少なくとも１つの医薬上許容される担体または希釈剤とともに含む医薬組成物を提供する。
【０１２６】
用語「組成物」は、担体としてのカプセル化材料と一緒に有効成分の製剤を含めて、有効成分（他の担体を伴うかまたは伴わない）が担体によって取り囲まれたカプセルが得られることが意図される。
【０１２７】
前述の化合物またはその医薬上許容される塩は、対象に投与される唯一の有効成分であり得るが、当該化合物を伴う他の有効成分の投与は、本発明の範囲内である。１つ以上の実施形態では、本発明の化合物の２つ以上の組み合わせが対象に投与されることが想定される。化合物（複数可）は、１種以上の追加の治療薬を併用して投与することもできると考えられる。この組み合わせは、上記の化合物の他の有効成分との別々の、連続的なまたは同時の投与を可能にすることができる。この組み合わせは、医薬組成物の形態で提供されてもよい。
【０１２８】
本明細書で使用される用語「組み合わせ」は、上記で定義された組み合わせパートナーが依存的にもしくは独立して、または異なる量の組み合わせパートナーとの異なる固定組み合わせの使用によって、すなわち同時にまたは異なる時点に投与できる組成物または部品のキットを指す。次いで、組み合わせパートナーは、例えば、同時にまたは時間的にずらして（すなわち、異なる時点で、そしてキットの任意の部分について等しいまたは異なる時間間隔で）投与され得る。組み合わせにおいて投与される組み合わせパートナーの総量の比率は、変動し得る、例えば、治療されるべき患者亜集団のニーズまたは単一の患者のニーズに対処するためであり、異なるニーズは、患者の年齢、性別、体重などによるものでありえる。
【０１２９】
当業者によって容易に理解されるように、投与ルートおよび医薬上許容される担体の種類は、治療される状態および哺乳動物の種類に依存する。特定の担体または送達系の選択、および投与ルートは、当業者によって容易に決定され得ると考えられる。活性化合物を含有するいずれかの製剤の調製において、化合物の活性が工程中に破壊されず、化合物が破壊されることなくその作用部位に到達することができるように注意を払うべきである。場合によっては、例えばマイクロカプセル化などの当技術分野で公知の手段によって化合物を保護することが必要な場合がある。同様に、選択される投与ルートは、化合物がその作用部位に到達するようなものでなければならない。
【０１３０】
当業者は、従来のアプローチを用いて本発明の化合物のための適切な製剤を容易に決定することができる。好ましいｐＨ範囲および適切な賦形剤、例えば酸化防止剤の同定は、当技術分野ではルーティンである。緩衝液系は、所望の範囲のｐＨ値を提供するために日常的に使用され、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩およびコハク酸塩などのカルボン酸緩衝液が挙げられる。ＢＨＴまたはビタミンＥなどのフェノール化合物、メチオニンまたは亜硫酸塩などの還元剤、およびＥＤＴＡなどの金属キレート剤を含む、様々な抗酸化剤がこのような製剤に利用可能である。
【０１３１】
前述の化合物またはその医薬上許容される塩は、静脈内、くも膜下腔内、および大脳内または硬膜外送達に適したものなどの非経口剤形で調製することができる。注射用途に適した医薬形態としては、滅菌注射溶液または分散液、および滅菌注射溶液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。それらは、製造および貯蔵の条件下で安定であり、還元または酸化および細菌または真菌などの微生物の汚染作用から守られなければならない。
【０１３２】
注射可能な溶液または分散液のための溶媒または分散媒は、活性化合物のための従来の溶媒または担体系のいずれかを含んでもよく、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、および植物油を含んでもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌剤および抗真菌剤を含有させることによって、必要に応じて行うことができる。多くの場合、浸透圧を調節する薬剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。好ましくは、注射用製剤は血液と等張性である。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物中での使用によってもたらされ得る。注射用に適した医薬形態は、静脈内、筋肉内、大脳内、髄腔内、硬膜外注射または注入を含む任意の適切な経路によって送達することができる。
【０１３３】
滅菌注射溶液は、本発明の化合物を、必要に応じて上に列挙したものなど種々の他の成分を含む適切な溶媒中に必要量加え、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌された有効成分を、基本的な分散媒体および上記のものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、有効成分プラス任意の追加の所望の成分の予め滅菌濾過された溶液の真空乾燥または凍結乾燥である。
【０１３４】
他の医薬形態としては、本発明の経口および経腸製剤が挙げられ、活性化合物は、不活性希釈剤または同化可能な食用担体と共に製剤化することができ、またはハードまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入することができ、錠剤にすることができ、またはそれはダイエットの食品に直接組み込むことができる。経口治療用投与の場合、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、摂取可能な錠剤、バッカル錠または舌下錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形態で使用され得る。そのような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な投与量が得られるような量である。
【０１３５】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、以下に列挙する成分を含んでもよい：ガム、アカシア、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；スクロース、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、ウィンターグリーン油、またはチェリー香味などの香味剤を添加してもよい。投薬単位形態がカプセルである場合、それは、上記タイプの材料に加えて、液体キャリアを含有してもよい。様々な他の材料が、コーティングとして、または他の方法で投与単位の物理的形態を改変するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、シェラック、砂糖、またはその両方でコーティングすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、チェリーまたはオレンジフレーバーなどの色素および香味料を含有してもよい。もちろん、投与単位形態を調製するのに使用される任意の物質は、薬学的に純粋であり、使用される量において実質的に非毒性でなければならない。さらに、本発明の化合物は、活性ペプチドを腸の特定領域に特異的に送達させるものを含む徐放性製剤および処方に組み込んでもよい。
【０１３６】
液体製剤は、胃または食道管を介して経腸的に投与することもできる。経腸製剤は、乳化基剤または水溶性基剤などの適切な基剤と混合することによって坐剤の形態で調製することができる。本発明の化合物を局所、鼻腔内、膣内、眼内などに投与することも可能であるが、必要ではない。
【０１３７】
医薬上許容されるビヒクルおよび／または希釈剤には、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。医薬活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が有効成分と適合しない場合を除いて、治療組成物におけるその使用が企図される。補助的な有効成分も組成物に組み込むことができる。
【０１３８】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために単位投与形態で組成物を処方することが特に有利である。本明細書で使用される投薬単位形態とは、治療される哺乳動物対象のための単位投薬量として適した物理的に別個の単位を意味する；各単位は、所要の医薬上許容されるビヒクルと関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性物質を含有する。本発明の新規な投与単位形態の詳細は、（ａ）活性物質の独特な特性および達成すべき特定の治療効果、および（ｂ）本明細書に詳細に開示されているように身体の健康が損なわれている疾患状態を有する生きている対象における疾患の治療のために配合されている活性物質の技術に固有の制限、によって決定され、それらに直接依存する。
【０１３９】
上記のように、主な有効成分は、投薬単位形態の適切な医薬上許容されるビヒクルを用いて、治療有効量で簡便かつ効果的に投与するために配合され得る。単位投薬形態は、例えば、主要活性化合物を０．２５μｇ〜約２０００ｍｇの範囲の量で含有することができる。比率で表して、活性化合物は、約０．２５μｇ〜約２０００ｍｇ／ｍＬの担体中に存在し得る。補助有効成分を含有する組成物の場合、投与量は、前記成分の通常の投与量および投与様式を参照して決定される。
【０１４０】
本明細書中で使用される場合、用語「有効量」は、所望の投与レジメンに従って投与された場合に、所望の治療活性を提供する化合物の量を指す。投薬は、１回、または数分または数時間の間隔で、またはこれらの期間のいずれかに連続して行ってもよい。適切な投薬量は、投薬当たり約０．１ｎｇ／ｋｇ体重〜１ｇ／ｋｇ体重の範囲内であり得る。典型的な投薬量は、投薬当たり１ｍｇ／ｋｇ体重〜１ｇ／ｋｇ体重の範囲のような、投薬当たり１μｇ／ｋｇ体重〜１ｇ／ｋｇ体重の範囲である。１つの実施形態において、投薬量は、投薬当たり１ｍｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。別の実施形態において、投薬量は、投薬当たり１ｍｇ／ｋｇ体重〜２５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。さらに別の実施形態において、投薬量は、投薬当たり１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、例えば、投薬当たり５０ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲であり得る。
【０１４１】
本明細書で使用される用語「治療（treatment）」および「治療する（treating）」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける状態または疾患の治療を含み、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達によって媒介される疼痛を治療することを含む。本明細書で使用する用語「予防（prevention）」および「予防する（preventing）」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける状態または疾患の予防（prevention）または予防（prophylaxis）を含み、エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達によって媒介される疼痛の予防を含む。
【０１４２】
本願明細書および後の特許請求の範囲を通じて、文脈が他に要求しない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、規定された要素もしくは要素もしくはステップのグループを含有するが、任意の他の要素もしくは要素のグループを除外しないことを示唆すると理解する。
【０１４３】
本明細書において、先行出版物（またはそれから派生した情報）または公知の事項への言及は、先行出版物（またはそれから派生した情報）または公知の事項が、本明細書が関係する努力の分野における共通の一般知識の一部を形成する承認または許可またはいずれかの形態の示唆とはみなされず、またみなされるべきでない。
【０１４４】
本発明を以下の非限定的な実施例を参照して説明する。
【実施例】
【０１４５】
実施例１：受容体輸送のＢＲＥＴ研究
受容体輸送のＢＲＥＴ研究を行って、異なるアゴニストで刺激した際のＰＡＲ２内在化（ＲＩＴ−ｖｅｎｕｓ）および初期エンドソームへの輸送（Ｒａｂ５ａ−ｖｅｎｕｓ）を定量化した。
【０１４６】
方法
１０ｃｍディッシュ内で〜５０％の集密度を達成した後、ＰＥＩをトランスフェクション剤として使用して、ＨＥＫ２９３細胞を１μｇのＰＡＲ２−ＲＬｕｃ８および４μｇのＲＩＴ−ｖｅｎｕｓまたはＲａｂ５ａ−ｖｅｎｕｓで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をポリ−Ｄ−リジンコート９６ウェルイソプレートに播種した。翌日、細胞培養培地を１×ＨＢＳＳ（＋０．２８ｇ  ＨＥＰＥＳ／１００ｍｌ、ｐＨ７．４０）；３０μＭのＤｙｎｇｏ４ａ（Ｄｙｎ４ａ）；３０μＭの不活性Ｄｙｎ４ａコントロール；３０μＭＰｉｔＳｔｏｐ２（ＰＳ２）または３０μＭ非活性ＰＳ２コントロール；のいずれかと交換した。使用時には、エンドサイトーシス阻害剤を１×ＨＢＳＳ＋１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈した。培養培地の交換後、コレンテラジンＨ［５μＭ］を添加する前に、細胞を３７℃で３０分間平衡化させた。さらに５分間インキュベートした後、ＬＵＭＩｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（BMG LabTech、Offenburg、ドイツ）を使用してＢＲＥＴを評価し、発光を５３５ｎｍおよび４７５ｎｍで読み取った。ビヒクル（１×ＨＢＳＳ＋／−１％ＤＭＳＯ）またはプロテアーゼを添加する前に４分のベースラインを得、次いで測定をさらに３０分間続けた。ＢＲＥＴ比は、ＬＵＭＩｓｔａｒ  ＭＡＲＳ分析ソフトウェアを使用して計算し、次にＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１３でベースラインおよびビヒクル処理に補正した。
【０１４７】
結果
最初の輸送実験は、トリプシンがＰＡＲ２の内在化をもたらす唯一のアゴニストであることを示した。１０ｎＭ濃度のトリプシンで受容体を刺激すると、原形質膜マーカーによるＢＲＥＴの時間依存的な減少が生じた（図１ａ）。これは、受容体と初期エンドソームマーカーとの間のＢＲＥＴの増加と一致した（図２ａ）。このような応答は受容体の内在化と一致しており、エラスターゼまたはカテプシンＳで受容体を刺激しても観察されなかった。したがって、エラスターゼおよびカテプシンＳ活性型ＰＡＲ２は原形質膜からのシグナル伝達しかできないと考えられる。
【０１４８】
受容体の内在化を誘導するトリプシンの能力は、細胞に一連の濃度を投与することによってさらに探求された。トリプシン誘発性のＰＡＲ２の内在化は濃度依存的であることが見出された（図１ｂおよび２ｂ）。両方のマーカーを用いたアッセイでも、同様のＥＣ５０濃度が得られた（〜２．８ｎＭ）。
【０１４９】
ＰＳ２によるクラスリンの薬理学的阻害は、内在化の阻害と一致して、トリプシン刺激時のルシフェラーゼタグ付き受容体と両方のマーカーとの間のＢＲＥＴの大きさを減少させた。Ｄｙｎ４ａによるダイナミンの阻害の際に、トリプシン誘発内在化のそれほど顕著ではない阻害が見られた（図１ｃおよび２ｃ）。
【０１５０】
実施例２：区画化されたＥＲＫシグナル伝達を評価するための全集団ＦＲＥＴ
フェルスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して、異なるアゴニストで刺激したときの異なる細胞内コンパートメント内のＰＡＲ２媒介ＥＲＫを特徴付けた。区画化されたシグナルの発生における内在化の役割を評価するために受容体の内在化を廃止することが示されている薬理学的および遺伝学的アプローチを採用した後にアッセイを繰り返した。
【０１５１】
方法
１０ｃｍディッシュ内で〜５０％の密集度を達成した後、ＰＥＩをトランスフェクション剤として使用して、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｎ末端ＨＡエピトープタグ（ＰＡＲ２−ＨＡ）を有する２．５μｇのＰＡＲ２および２．５μｇの所望のＦＲＥＴバイオセンサーでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をポリ−Ｄ−リジンコート黒色９６ウェルイソプレートに播種した。一晩の血清制限後、細胞プレーティングの４８時間後にＦＲＥＴを評価した。ＦＲＥＴ実験を開始する前に、細胞培養培地を１×ＨＢＳＳ（＋０．２８ｇ  ＨＥＰＥＳ／１００ｍｌ、ｐＨ７．４０）；３０μＭ  Ｄｙｎｇｏ４ａ；３０μＭ不活性Ｄｙｎｇｏコントロール；３０μＭ  ＰｉｔＳｔｏｐ２または３０μＭ不活性ＰｉｔＳｔｏｐ２コントロール；のいずれかと交換した。使用時には、エンドサイトーシス阻害剤を１×ＨＢＳＳ＋１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で希釈した。培養培地の交換後、細胞を３７℃で３０分間平衡化させた。次いで、ＦＲＥＲをＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳマイクロプレートリーダー（BMG LabTech、Offenburg、ドイツ）を用いて決定し、細胞を４３０ｎｍで順次励起し、発光を５５０ｎｍおよび４９０ｎｍで読み取った。ビヒクル（１×ＨＢＳＳ＋／−１％ＤＭＳＯ）、プロテアーゼまたは１μＭ  ＰＤＢｕ（陽性コントロールとして供給）を添加する前に４分のベースラインを得た。次いで、測定をさらに３０分間毎分続けた。次にＦＲＥＴ比を計算し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１３でベースラインとビヒクル処理に補正した。
【０１５２】
結果
エラスターゼではなくトリプシンは、細胞質内および核内でＥＲＫシグナルを生成することができた（図３ａおよび４ａ）。これらのコンパートメントにおけるトリプシン誘発ＥＲＫシグナルは濃度依存的であることが示された（図３ｂおよび４ｂ）。サイトゾルＥＲＫリン酸化は、ＰＳ２によるクラスリンの阻害を介して受容体の内在化が遮断された場合には減少するが、ダイナミンが阻害された場合には減少しない（図３ｃ）。クラスリンまたはダイナミンの標的化による内在化の遮断は、核内のＥＲＫリン酸化の程度に影響を及ぼさないようである（図４ｃ）。
【０１５３】
実施例３：ＢＲＥＴ再感作アッセイ
細胞表面に発現された受容体の様々なプロテアーゼでの刺激に際しての、トランスゴルジネットワーク（ＴＧＮ３８−ｖｅｎｕｓ）からのＰＡＲ２のエクスポートを定量するために、ＢＲＥＴ再感作アッセイを使用した。受容体再感作の背後にあるシグナル伝達メカニズムを検証するために、シグナル伝達ノードの様々な阻害剤を用いてアッセイを繰り返した。
【０１５４】
方法
１０ｃｍディッシュ内で〜５０％の密集度を達成した後、ＰＥＩをトランスフェクション剤として用いてＨＥＫ２９３細胞をＰＡＲ２−ＲＬｕｃ８（１μｇ）およびＴＧＮ３８−Ｖｅｎｕｓ（４μｇ）で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をポリ−Ｄ−リジンコート９６ウェルイソプレートに播種した。翌日にＢＲＥＴ実験を行った。細胞を、１×ＨＢＳＳ（＋０．２８ｇＨＥＰＥＳ／１００ｍｌ、ｐＨ７．４０）、１０μＭガレイン（Ｇβγ阻害剤）、１００ｎＭ  ＣＲＴ００６６１０１（ＰＫＤ阻害剤）またはＧＯ６９８３（ＰＫＣ阻害剤）のいずれか中で、コレンテラジンＨ［５μＭ］の添加前に３７℃で３０分間平衡化させた。５分間インキュベートした後、ＬＵＭＩｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈ、Ｏｆｆｅｎｂｕｒｇ、ドイツ）を用いてＢＲＥＴを評価し、発光を５３５ｎｍおよび４７５ｎｍで読み取った。ビヒクル（１×ＨＢＳＳ）またはプロテアーゼを添加する前に４分のベースラインを得、次いで測定をさらに３０分間続けた。ＢＲＥＴ比は、ＬＵＭＩｓｔａｒ  ＭＡＲＳ分析ソフトウェアを使用して計算し、次にＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１３でベースラインおよびビヒクル処理に補正した。
【０１５５】
結果
ルシフェラーゼタグ付きＰＡＲ２は、３つ全てのアゴニストで細胞表面に発現した受容体を刺激すると、トランスゴルジネットワークから離れることが示された（図５ａ）。これらの知見は、トランスゴルジネットワーク内に保存されている既存の受容体プールからの受容体補充によって達成されるＰＡＲ２再感作を支持する。観察されたＢＲＥＴの減少もまた濃度依存的であることが見出された（データ示さず）。
【０１５６】
ガレインによるＧβγの阻害は、３つすべてのプロテアーゼによる刺激の際にトランスゴルジネットワークからＰＡＲ２輸送するのを減少させ、このＧタンパク質が再感作過程に関与することを示唆している。ＣＲＴ００６６１０１およびＧＯ６９８３でそれぞれＰＫＤおよびＰＫＣを阻害した後、正常な輸送に対する顕著ではない効果が見られた。
【０１５７】
実施例４：ニューロン興奮性のエンドサイトーシス阻害
侵害受容器の興奮性に対するプロテアーゼの効果を評価するために、ＤＲＧニューロンをトリプシン、カテプシンＳ、エラスターゼまたはビヒクル（コントロール）と共にプレインキュベートし、洗浄し、レオベースおよび２倍のレオベースの電流での活動電位放電を洗浄後０分または３０分で測定した。
【０１５８】
方法
ＤＲＧニューロンの単離
Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＤＲＧ（Ｔ９−Ｔ１３）をコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｌａｋｅｗｏｏｄ、ＩＮ）およびディスパーゼ（４ｍｇ／ｍｌ、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）中で３７℃１０分間インキュベートすることによって消化し、火で磨いたパスツールピペットで粉砕することによって分散させた。細胞を、２４ウェルプレート中のラミニン（０．０１７ｍｇ／ｍｌ）およびポリ−Ｄ−リジン（２ｍｇ／ｍｌ）で被覆したカバーガラス上にプレーティングした。ニューロンを、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む１０％ウシ胎児血清を含有するＦ１２培地（Cat N668, Lot RNBD5333, Sigma-Aldrich, St Louis, MO USA）中で培養し、電気生理学的研究のため回収（１６時間）まで、９５％空気および５％ＣＯ２加湿雰囲気中３７℃に維持した。
【０１５９】
電気生理学
ニューロンの興奮性は、室温で、電流クランプモードで小径ニューロン（＜３０ｐＦ容量）からのアムホテリシンＢ（２４０μｇ／ｍｌ）を用いた穿孔パッチクランプ記録によって評価した。−４０ｍＶよりも負の静止膜電位を有するニューロンのみを分析した。興奮性の変化は、レオベース（発火活動電位に対する最小電流）および２倍レオベースで放出された活動電位の数を測定することによって定量した。記録はＡｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ｂ増幅器を用いて行い、Ｄｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａによってデジタル化し、ｐＣｌａｍｐ  １０．１ソフトウェア（Molecular Devices、Sunnyvale、CA）を用いて保存および処理した。記録チャンバーを２ｍｌ／分で外部溶液で連続的に灌流した。外部溶液（ｍＭ）は、ＮａＣｌ（１４０）、ＫＣｌ（５）、ＨＥＰＥＳ（１０）、Ｄ−グルコース（１０）、ＭｇＣｌ２（１）、ＣａＣｌ２（２）；３ＭのＮａＯＨでｐＨを７．４、であった。ピペット溶液（ｍＭ）は、Ｋ−グルコン酸塩（１１０）、ＫＣｌ（３０）、ＨＥＰＥＳ（１０）、ＭｇＣｌ２（１）、ＣａＣｌ２（２）；１ＭのＫＯＨでｐＨ７．２５、であった。
【０１６０】
プロテアーゼおよび阻害剤処理
ＤＲＧニューロンを、強力な興奮性亢進を引き起こすことが報告されている条件を用いてビヒクル（コントロール）またはプロテアーゼと共にプレインキュベートした：トリプシン（５０ｎＭ、１０分）、エラスターゼ（１０Ｕ／ｍｌ、３９０ｎＭ、３０分）、Ｃａｔ−Ｓ  ５００ｎＭ、６０分）。次にニューロンを洗浄し、プロテアーゼフリーのＦ１２培地で維持した。洗浄後０または３０分にニューロン興奮性を評価した。いくつかの実験において、プロテアーゼとのインキュベーションの前および間に、ニューロンをビヒクル（０．３％ＤＭＳＯ）、Ｄｙｎｇｏ４ａ（３０μＭ）またはＰｉｔＳｔｏｐ２（１５μＭ）と共に３０分間インキュベートした。
【０１６１】
統計分析
結果は平均値±標準誤差として表す。データを分析するために、二元配置分散分析および事後テューキー検定が使用された。
【０１６２】
結果
興奮性と一致して、すべてのプロテアーゼは０分と３０分でレオベースの減少を引き起こした。興奮性に対するクラスリンおよびダイナミンの重要性を評価するために、プロテアーゼとのインキュベーションの３０分前およびインキュベーション中に、ＤＲＧニューロンをクラスリン阻害剤ＰｉｔＳｔｏｐ２、ダイナミン阻害剤Ｄｙｎｇｏ４ａまたはビヒクル（０．３％ＤＭＳＯ）と共にプレインキュベートした。図６および７に見られるように、ＰｉｔＳｔｏｐ２およびＤｙｍｇｏ４ａは、０分でレオベースに対するトリプシン、カテプシンＳまたはエラスターゼの効果に影響を及ぼさなかった。ＰｉｔＳｔｏｐ２およびＤｙｎｇｏ４ａは、どちらも３０分でレオベースのトリプシン誘発減少を防止したが、３０分でレオベースのカテプシンＳまたはエラスターゼ誘発減少に影響を及ぼさなかった。ビヒクル、ＰｉｔＳｔｏｐ２もＤｙｎｇｏ４ａも単独では０分または３０分でレオベースに影響を及ぼさなかった。
【０１６３】
実施例５：プロテアーゼ誘発疼痛に対するエンドサイトーシス阻害剤の効果
方法
侵害受容アッセイ
実験の直前に、マウスを実験装置、室内および研究者に連続した２日において１〜２時間慣れさせた。機械的侵害受容反応を、較正済みフォンフレイフィラメントを用いた後足の足底表面の刺激に対する足引っ込め（ｐａｗ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）によって評価した。実験前日に各動物のベースラインを確立するためにフォンフレイスコアを３回測定した。足浮腫は、処置の前後にデジタルノギスを使用して後足の厚みを測定することによって評価した。足底内注射のためにマウスを５％イソフルランで麻酔した。Ｄｙｎｇｏ４ａ（５０μＭ）、ＰｉｔＳｔｏｐ２（５０μＭ）またはビヒクル（０．９％ＮａＣｌ中０．２％ＤＭＳＯ）（全て１０μｌ）を左後足に注射した。３０分後、トリプシン（１０ｎＭ）、Ｃａｔ−Ｓ（２．５μＭ）またはエラスターゼ（３０Ｕ）（全て１０μｌ）を同じ左後足に注射した。フォンフレイスコア（左右の足）および足の厚み（左の足）を、プロテアーゼ注射後４時間まで毎時測定した。研究者は試験薬を知らされなかった。
【０１６４】
結果
トリプシン、Ｃａｔ−Ｓおよびエラスターゼの足底内注射は、少なくとも４時間持続した同側足の機械的痛覚過敏、および４時間後に最大となった同側足の浮腫を引き起こした（図８および９）。これらの反応はＰＡＲ２およびＴＲＰＶ４に依存することが以前に報告されている。ＤｙｎｇｏとＰｉｔＳｔｏｐはトリプシン誘発の機械的痛覚過敏を抑制した。Ｄｙｎｇｏは、Ｃａｔ−Ｓまたはエラスターゼ誘発の機械的痛覚過敏には影響を及ぼさなかった。Ｄｙｎｇｏはトリプシン−Ｃａｔ−Ｓまたはエラスターゼ誘発性浮腫には影響を及ぼさなかった。エンドサイトーシス阻害剤は対側性足の引っ込め（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）反応に影響を及ぼさなかった。
【０１６５】
これらの結果は、ＰＡＲ２エンドサイトーシスが、トリプシンによって誘発される侵害受容の中枢伝達に必要であることを示している。ＰＡＲ２エンドサイトーシスはカテプシンＳまたはエラスターゼ誘発機械的疼痛には必要ではない−これらのプロテアーゼはＰＡＲ２エンドサイトーシスを引き起こさない。ＰＡＲ２エンドサイトーシスは、Ｃａを介したＳＰおよびＣＧＲＰ放出に依存するプロテアーゼ誘発浮腫には必要ではない。
【０１６６】
実施例６：エンドソームＰＡＲ２シグナル伝達の阻害
ヒトＰＡＲ２受容体を安定的に発現するＫＮＲＫ細胞または内因的にＰＡＲ２を発現するＨＴ−２９細胞における２−フロイル−ＬＩＧＲＬ−ＮＨ２（２Ｆ）刺激ＩＰ１蓄積を測定するアッセイにおいて、種々の推定上のＰＡＲ２アンタゴニストの阻害効力を決定した。ＫＮＲＫ細胞におけるＡＴＰ刺激ＩＰ１蓄積を阻害するアンタゴニストの能力を測定するアッセイにおいて、非特異的活性を決定した。
【０１６７】
方法
ＫＮＲＫ−ｈＰＡＲ２、ＫＮＲＫまたはＨＴ−２９細胞を、透明なポリ−ｄ−リジンコート９６ウェル組織培養プレートに５０ｘ１０３細胞／ウェルの密度で播種した。３７℃および５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、培地を除去し、８０μｌまたは９０μｌのＩＰ１刺激緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４．２ｍＭ  ＫＣｌ、１４６ｍＭ  ＮａＣｌ、５．５ｍＭグルコース、５０ｍＭ  ＬｉＣｌ）のいずれかに交換した。刺激緩衝液を添加した後、８０μｌの緩衝液を含有するウェルに１０μｌの１０×アンタゴニストを加えた。全てのプレートをさらに３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。１０μｌの２ＦまたはＡＴＰをプレートに添加し、さらに４０分間インキュベートした。インキュベーション後、刺激緩衝液を吸引により素早く除去し、２５μｌの溶解緩衝液（ＩＰ−Ｏｎｅ  ＨＴＲＦ（登録商標）アッセイキット、Ｃｉｓｂｉｏ）と交換した。溶解物を３７℃、５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした後、溶解物１０μｌを３８４ウェルＯｐｔｉＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に移し、ＩＰ−Ｏｎｅ  ＨＴＲＦ（登録商標）アッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ）を用いて検出した。
【０１６８】
３ｎＭから３０μＭ（１０μＬ容量中に１０倍濃度で添加）の範囲のＰＡＲ２アンタゴニストの濃度応答曲線は、３０分間インキュベートした後、１０μＭのＡＴＰまたは１００ｎＭまたは３００ｎＭの２Ｆ（ＥＣ８０、１０μＬ容量中に１０倍濃度で添加）を添加した。その後、さらに４０分間インキュベートした。
【０１６９】
結果
以下に示すＰＡＲ２アンタゴニストは、２Ｆ刺激ＩＰ１蓄積を５．３９±０．１３μＭのＩＣ５０で阻害することが見出された。
【０１７０】
【化１９】
2019516734.tif 000032
【０１７１】
アンタゴニストは、ＫＮＲＫ細胞におけるＡＴＰ誘導性ＩＰ１蓄積に影響を及ぼさず、これは、ｈＰＡＲ２−ＫＮＲＫ細胞における２Ｆの拮抗作用がＰＡＲ２媒介性であることを示唆している。アンタゴニストはどちらもＫＮＲＫ細胞におけるベースラインＩＰ１蓄積に影響を及ぼさなかった。
【０１７２】
本発明を定義する請求項は以下の通りである。
【図１】
2019516734.tif 000042
【図２】
2019516734.tif 000043
【図３】
2019516734.tif 000044
【図４】
2019516734.tif 000045
【図５】
2019516734.tif 000046
【図６】
2019516734.tif 000047
【図７】
2019516734.tif 000048
【図８】
2019516734.tif 000049
【図９】
2019516734.tif 000050
【国際調査報告】
2019516734.tif 000051
2019516734.tif 000052
2019516734.tif 000053
2019516734.tif 000054