(57)【要約】  反芻動物用の飼料添加物としての、少なくとも１つのアルファ−１，４／１，６−グリコシドヒドロラーゼ（ＧＬＣＨ）の使用であって、前記ヒドロラーゼは（ａ）ペプシン存在下のｐＨ６におけるヒドロラーゼの活性と比較して、ペプシン存在下の３以下のｐＨで、少なくとも２０％の活性を有し、（ｂ）前記ヒドロラーゼは第一胃、第四胃、および小腸を含む、反芻動物の３つの消化室の少なくとも２つの中で活性であり、かつ（ｃ）このヒドロラーゼは膵臓アミラーゼと協働して、グルコース収率を増加させる、使用を開示する。【選択図】図１
2019534691.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反芻動物用飼料への飼料添加物として、少なくとも１つのアルファ−１，４／１，６−グリコシドヒドロラーゼ（ＧＬＣＨ）を添加する工程を含む、反芻動物のデンプン消化率およびグルコース収率を増加させる方法であって、前記ヒドロラーゼは（ａ）ペプシン存在下のｐＨ６における前記ヒドロラーゼの活性と比較して、ペプシン存在下の３以下のｐＨで、少なくとも２０％の活性を有し、（ｂ）前記ヒドロラーゼは第一胃、第四胃、および小腸を含む、反芻動物の３つの消化室の少なくとも２つの中で活性であり、かつ（ｃ）前記ヒドロラーゼは前記反芻動物の前記消化室に存在する消化酵素と協働して、デンプン消化率およびグルコース収率を増加させる方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのＧＬＣＨ酵素は、前記第一胃または第四胃で見出される条件に相当する条件下で、生デンプンを加水分解することができる、請求項１に記載のヒドロラーゼ。
【請求項３】
前記ヒドロラーゼは、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびアルファ−グルコシダーゼからなる群から選択される、請求項１に記載のヒドロラーゼ。
【請求項４】
前記ヒドロラーゼは、アルファ−アミラーゼおよびグルコアミラーゼからなる群から選択される、請求項２に記載のヒドロラーゼ。
【請求項５】
前記アルファ−アミラーゼは、ＧＨ１３ファミリーのメンバーであるか、またはアルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）；プルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４１）；シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１９）；シクロマルトデキストリナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５４）；トレハロース−６−リン酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９３）；オリゴ−アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１０）；マルトジェニックアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３３）；ネオプルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３５）；アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）；マルトテトラオース−生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）；イソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）；グルコデキストラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．７０）；マルトヘキサオース−生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９８）；マルトトリオース−生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１１６）；分枝酵素（ＥＣ  ２．４．１．１８）；トレハロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１６）；４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．２５）；マルトペンタオース−生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．−）；アミロスクラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．４）；スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．７）；マルト−オリゴシルトレハローストレハロヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１４１）；イソマルツロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１１）；マルト−オリゴシルトレハロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１５）；アミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３３）；およびアルファ−１，４−グルカン：リン酸アルファ−マルトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．１６）からなる群から選択される、請求項３または４に記載のヒドロラーゼ。
【請求項６】
前記グルコシダーゼは、ＧＨ１３もしくはＧＨ３１ファミリーのメンバーであるか、またはアルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）；アルファ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２２）；アルファ−マンノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２４）；アルファ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８４）；スクラーゼ−イソマルターゼ（ＥＣ  ３．２．１．４８）（ＥＣ  ３．２．１．１０）；アルファ−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１７７）；アルファ−グルカンリアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．１３）；イソマルトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．−）；オリゴ糖アルファ−１，４−グルコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１６１）；スルホキノボシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．−）からなる群から選択される、請求項３または４に記載のヒドロラーゼ。
【請求項７】
前記グルコアミラーゼは、ＧＨ１５ファミリーのメンバーであるか、またはグルコアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３）；グルコデキストラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．７０）；アルファ−トレハラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２８）；およびデキストランデキストリナーゼ（ＥＣ  ２．４．１．２）からなる群から選択される、請求項３または４に記載のヒドロラーゼ。
【請求項８】
反芻動物におけるデンプン消化率を増加させ、グルコース収率を増加させ、乾物の消化を増加させ、かつ醗酵中のガス生成を増加させる方法であって、（ｉ）反芻動物用の飼料添加物としての、少なくとも１つのＧＬＣＨ酵素であって、前記酵素は（ａ）ペプシン存在下のｐＨ６における前記酵素の活性と比較して、ペプシン存在下の３以下のｐＨにおいて、少なくとも２０％の活性を有し、（ｂ）前記酵素は第一胃、第四胃、および小腸を含む、反芻動物の３つの消化室の少なくとも２つの中で活性であり、かつ（ｃ）前記酵素は膵臓アミラーゼと協働して、グルコース収率を増加させる少なくとも１つのＧＬＣＨ酵素と、（ｉｉ）少なくとも１つのプロテアーゼとを含む酵素組成物を前記飼料に添加する工程を含む方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つのＧＬＣＨ酵素は、生デンプンを加水分解することができる、請求項８に記載の酵素組成物。
【請求項１０】
前記ＧＬＣＨ酵素は、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびアルファ−グルコシダーゼからなる群から選択される、請求項８に記載の酵素組成物。
【請求項１１】
前記酵素は、アルファ−アミラーゼおよびグルコアミラーゼからなる群から選択される、請求項９に記載の酵素組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのＧＬＣＨ酵素は、アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）；プルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４１）；シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１９）；シクロマルトデキストリナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５４）；トレハロース−６−リン酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９３）；オリゴ−アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１０）；マルトジェニックアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３３）；ネオプルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３５）；アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）；マルトテトラオース−生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）；イソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）；グルコデキストラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．７０）；マルトヘキサオース−生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９８）；マルトトリオース−生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１１６）；分枝酵素（ＥＣ  ２．４．１．１８）；トレハロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１６）；４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．２５）；マルトペンタオース−生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．−）；アミロスクラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．４）；スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．７）；マルト−オリゴシルトレハローストレハロヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１４１）；イソマルツロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１１）；マルト−オリゴシルトレハロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１５）；アミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３３）；およびアルファ−１，４−グルカン：リン酸アルファ−マルトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．１６）からなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の酵素組成物。
【請求項１３】
前記グルコシダーゼは、アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）；アルファ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２２）；アルファ−マンノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２４）；アルファ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８４）；スクラーゼ−イソマルターゼ（ＥＣ  ３．２．１．４８）（ＥＣ  ３．２．１．１０）；アルファ−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１７７）；アルファ−グルカンリアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．１３）；イソマルトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．−）；オリゴ糖アルファ−１，４−グルコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１６１）；スルホキノボシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．−）からなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の酵素組成物。
【請求項１４】
前記グルコアミラーゼはＧＨ１５グリコシルヒドロラーゼファミリーから選択される、請求項１０または１１に記載の酵素組成物。
【請求項１５】
前記プロテアーゼは、酸性プロテアーゼまたは中性メタロプロテアーゼからなる群から選択される、請求項８に記載の酵素組成物。
【請求項１６】
前記プロテアーゼは、真菌性アスパラギン酸プロテアーゼまたは細菌性中性メタロプロテアーゼである、請求項１５に記載の酵素組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術分野は、動物の栄養および、特に、デンプンの消化を促進する、反芻動物用の飼料添加物としての、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびアルファ−グルコシダーゼなどの、低ｐＨ活性アルファ−１，４／１，６グリコシドヒドロラーゼ（ＧＬＣＨ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
反芻動物は、それらの微生物／酵素消化システムにより、粗飼料をタンパク質およびエネルギーに変換する独特の能力を有する。したがって、反芻動物は、地球の生態学および食物連鎖において重要な役割を果たす。
【０００３】
反芻動物と非反芻動物との主な違いは、反芻動物の胃には第一胃、第二胃、第三胃および第四胃の４つの区画があることである。最初の２つの室、すなわち第一胃と第二胃で食物は唾液と混合され、固体および液体物質の層に分離する。固体は、凝集して、食い戻しすなわち食物塊を形成する。
【０００４】
その後、食い戻しを逆流させ、咀嚼して、これを唾液と完全に混合し、砕いて粒子サイズを小さくする。線維、特にセルロースおよびヘミセルロースは、これらの室内で微生物（大部分が細菌、ならびにいくつかの原生動物、真菌および酵母）によって、主に３つの主要な揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）、すなわち酢酸、プロピオン酸および酪酸に主に分解される。タンパク質および非構造性炭水化物（ペクチン、糖、デンプン）も醗酵させる。
【０００５】
第一胃と第二胃は異なる名前を有するが、それらは消化物と同じ機能空間を表し、それらの間を往復することができる。これらの室は、一緒にして反芻胃と呼ばれる。分解された消化物は今や反芻胃の下部液体部分にあり、その後、水および多くの無機ミネラル成分が血流に吸収される次の室、すなわち第三胃に入る。
【０００６】
この後、消化物は、真の胃、すなわち第四胃に移動する。第四胃は単胃と全く同等であり、消化物は、ここでほとんど同じように消化される。消化物は最終的に小腸に移動し、そこで栄養素の消化と吸収が起こる。反芻胃で生成した微生物も、小腸で消化される。醗酵は、反芻胃と同じように大腸でも継続する。
【０００７】
反芻動物用の飼料添加物として使用する酵素は、主に線維分解酵素、例えばセルラーゼ、ベータ−グルカナーゼおよびヘミセルラーゼである（Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４．Ａ  ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｅｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  ｒｕｍｉｎａｎｔｓ．Ｃａｎ．Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．８４：２３−３６の表１）。反芻動物用のデンプンヒドロラーゼに関する報告は限られている。デンプンヒドロラーゼは、エンドアミラーゼおよびエキソアミラーゼとして分類される。
【０００８】
アルファ−アミラーゼとも呼ばれるエンドアミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、多糖類の内部アルファ−１，４−Ｏ−グリコシド結合の加水分解を触媒するデンプン分解酵素であり、生成物中にアルファ−アノマー立体配置を保持する。ほとんどのアルファ−アミラーゼは、その活性、構造的完全性および安定性のために、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）を必要とする。
【０００９】
アルファ−アミラーゼファミリー、すなわちグリコシドヒドロラーゼのＧＨ−Ｈクランは、ほぼ３０の異なる酵素特異性を含む、グリコシドヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ、およびイソメラーゼの最大ファミリーである。多種多様な酵素がデンプンに作用することができる。これらの酵素は、エンドアミラーゼ、エキソアミラーゼ、枝切り酵素、およびトランスフェラーゼの４つのグループに分けることができる。
【００１０】
エンドアミラーゼは、内部のアルファ−１，４結合を切断し、アルファ−アノマー生成物を与える。
【００１１】
エキソアミラーゼは、外部グルコース残基のアルファ−１，４またはアルファ−１，６結合を切断し、アルファまたはベータ−アノマー生成物を与える。
【００１２】
枝切り酵素は、アルファ−１，６結合を加水分解し、もっぱら長い直鎖の多糖を残す。
【００１３】
トランスフェラーゼは、ドナー分子のアルファ−１，４グリコシド結合を切断し、ドナーの一部をグリコシドアクセプターに転移して新しいグリコシド結合を形成する。
【００１４】
グリコシドヒドロラーゼは、それらの反応様式に基づき、いくつかのクラスと、それらの明確に定められたアミノ酸配列の類似性に基づき、いくつかのファミリーに分けられてきた。ほとんどのデンプン変換酵素はＧＨ−１３ファミリーに属する。ＧＨ−１３ファミリーは、触媒モジュールの三次元構造であるクランと呼ばれる、より大きな単位に基づいてさらに分類することができる。グリコシダーゼおよびトランスグリコシダーゼについて定義された１４クラン（Ａ〜Ｎ）のうち、アルファ−アミラーゼファミリー（ＧＨ−１３）は、第８クランＧＨ−Ｈに属する。
【００１５】
動物は、デンプンの加水分解のために消化性膵臓アルファ−アミラーゼを合成し、分泌する。このアルファ−アミラーゼはｐＨ６〜７付近に最適ｐＨを有し、小腸において活性である。
【００１６】
おそらく、分泌された膵臓アミラーゼが十分でなく、かつ／または小腸の消化管における飼料の移動が非常に速く、その結果、特に家禽の場合、膵臓アミラーゼがデンプンを完全に消化するのに十分な時間を有さないという事実のために、飼料への微生物アミラーゼの添加は動物のデンプン消化をさらに増加させ得る。（Ｉｓａｋｓｅｎ，Ｍ．Ｆ．Ｃｏｗｉｅｓｏｎ，Ａ．Ｊ．Ｋｒａｇｈ，Ｋ．Ｍ．（２０１０）．Ｓｔａｒｃｈ−ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｔｏ  ａｎｉｍａｌ  ｆｅｅｄ  ｕｓｅ．Ｉｎ：Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ／ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍ．Ｒ．Ｂｅｄｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｇ．Ｇ．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ．Ｐａｇｅｓ  ８５−９５）。
【００１７】
このように、エンドアミラーゼは、飼料工業で広く使用されている飼料酵素の１つであった。最も一般的に使用されている飼料用アミラーゼは、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、およびアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）に由来する。
【００１８】
これらの飼料用アミラーゼは、ｐＨ４〜ｐＨ８のｐＨ範囲で最適な活性を有する。それらのほとんどは、ペプシンに対してかなりの耐性を有する。しかし、これらの飼料用酵素は生デンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）を有さず、ゼラチン化していない生デンプンを加水分解する能力が限られている可能性がある。
【００１９】
Ｐｌａｎｃｈｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｓｔａｒｃｈ  ｇｒａｎｕｌｅｓ  ｂｙ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２１，Ｉｓｓｕｅ  ２，１９９５，Ｐａｇｅｓ  １６３−１７１）は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌種由来のアルファ−アミラーゼが、膵臓アミラーゼと比較して粒状デンプンの分解効率が低いことを報告した。ＥＦＳＡ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｒｏｎｏｚｙｍｅ  ＲｕｍｉＳｔａｒ（ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ）ａｓ  ａ  ｆｅｅｄ  ａｄｄｉｔｉｖｅ  ｆｏｒ  ｄａｉｒｙ  ｃｏｗｓ．Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｒ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄ（ＦＥＥＤＡＰ）．ＥＦＳＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１２；１０（７）：２７７７）は、乳牛に対するバチルス・リケノフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のアルファ−アミラーゼの使用について報告した。この効果は時に明らかであり、時にこの効果はそれほどではなかった。Ｄｅｔｔｏｒｉ−Ｃａｍｐｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｇｒａｎｕｌｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｍｙｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＣＡ  ２６．Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２７，Ｉｓｓｕｅ  １，Ｊａｎｕａｒｙ  １９９２，Ｐａｇｅｓ  １７−２１）は、およそ１６のバチルス株由来のアミラーゼを研究し、それらの生デンプンではなく、可溶性デンプンへの嗜好は、Ｂ．アミロリチクス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）株において、可溶性デンプンに対する生デンプン活性の比が最も高く、０．２５であることを示した。
【００２０】
Ｔｒｉｃａｒｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｄｉｅｔａｒｙ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｕｍｉｎａｎｔ  ｄｉｅｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ．Ａｎｉｍａｌ  Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌｕｍｅ  １４５，Ｉｓｓｕｅｓ  １−４，１４  Ａｕｇｕｓｔ  ２００８，Ｐａｇｅｓ  １３６−１５０）は、反芻動物の食餌の、食餌補給におけるアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のアルファ−アミラーゼの使用を報告し、このアミラーゼの補給は、第一胃でのデンプンの消化を必ずしも増加させずに、第一胃のデンプンの消化を改変することによって、動物の生産性を改善し得ることを示唆している。アミラーゼの添加がデンプン消化を増加させることは、当然のこととして予想されるので、そのような効果が、酵素不純物に由来することは十分あり得る（Ｂｅａｕｃｈｅｍｉｎ，Ｈｏｌｔｓｈａｕｓｅｎ，（２０１０）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｕｓａｇｅ  ｉｎ  ｒｕｍｉｎａｎｔｓ．Ｉｎ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｕｓａｇｅ  ｉｎ  ｒｕｍｉｎａｎｔｓ．Ｉｎ：Ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ／ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｍ．Ｒ．Ｂｅｄｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｇ．Ｇ．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ．Ｐａｇｅｓ  ２０６−２３０）。
【００２１】
Ｍｏｎｔｅｉｒｏ  ｄｅ  Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｉｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ−ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１０）４１：８５０−８６１）は、工業的に重要なアルファ−アミラーゼを調べたところ、そのほとんど全てがｐＨ５以上で最適なｐＨを示したが、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ）由来のものだけは、３．０で最適なｐＨと安定性を示した。生デンプンまたは粒状デンプンを分解する能力があることから、コーンスターチのバイオエタノールへの液化と醗酵を同時に行うために、グルコアミラーゼと共に使用されてきたのは、アミラーゼＡ・カワチ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ）である（Ｄｕｎｎ−Ｃｏｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，米国特許第７３５４７５２Ｂ２号明細書）。
【００２２】
飼料中のデンプン消化率は非常に変動しやすく、デンプンおよび飼料マトリックスの両方の物理的構造を含む多くの因子に依存する。
【００２３】
２００５年２月１７日に公開された米国特許出願公開第２００５／００３７０５３号明細書は、アミラーゼ活性を有し、家禽およびブタなどの単胃動物用のデンプンを含む飼料中の難消化性デンプンを分解することができる酵素の使用を開示している。
【００２４】
２００８年１月１７日に公開された国際公開第２００８／０６８８１号パンフレットは、乳量、食餌の見かけの消化率、飼料原料乾物の消失、体重増加および／または飼料変換率を改善するために、ウシ亜科反芻動物の飼料中で細菌アミラーゼを使用することを開示している。
【００２５】
２０１５年９月３日に公開された国際公開第２０１５／１２８３６６号パンフレットは、トウモロコシおよび／またはトウモロコシサイレージの消化率を改善するため、特に乳量、体重増加および／または飼料変換率を改善するために、ウシ亜科反芻動物の飼料中で、１つ以上のプロテアーゼと組み合わせて細菌アミラーゼを使用することを開示している。
【００２６】
したがって、反芻動物のデンプン消化率を増加させ、グルコース収率を増加させ、乾物の消化および／またはガス生成を増加させる要求が依然として存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２７】
一実施形態では、反芻動物用の飼料への飼料添加物として、少なくとも１つのアルファ−１，４／１，６−グリコシドヒドロラーゼ（ＧＬＣＨ）を添加することを含む、反芻動物のデンプン消化率およびグルコース収率を増加させる方法であって、前記ヒドロラーゼは、（ａ）ペプシン存在下のｐＨ６におけるヒドロラーゼの活性と比較して、ペプシン存在下の３以下のｐＨで、少なくとも２０％の活性を有し、（ｂ）前記ヒドロラーゼは第一胃、第四胃、および小腸を含む、反芻動物の３つの消化室の少なくとも２つの中で活性であり、かつ（ｃ）このヒドロラーゼは反芻動物の消化室に存在する消化酵素と協働して、デンプン消化率およびグルコース収率を増加させる方法が開示される。
【００２８】
第２の実施形態では、少なくとも１つのＧＬＣＨ酵素は、第一胃または第四胃で見出される条件に相当する条件下で、生デンプンを加水分解することができる。
【００２９】
第３の実施形態では、ヒドロラーゼは、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびアルファ−グルコシダーゼからなる群から選択される。好ましくは、群は、
アルファ−アミラーゼとグルコアミラーゼからなる。
【００３０】
第４の実施形態では、アルファ−アミラーゼは、ＧＨ１３ファミリーのメンバーであるか、またはアルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）；プルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４１）；シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１９）；シクロマルトデキストリナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５４）；トレハロース−６−リン酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９３）；オリゴ−アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１０）；マルトジェニックアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３３）；ネオプルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３５）、アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）；マルトテトラオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）、イソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）；グルコデキストラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．７０）；マルトヘキサオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９８）；マルトトリオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１１６）；分枝酵素（ＥＣ  ２．４．１．１８）；トレハロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１６）；４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．２５）；マルトペンタオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．−）；アミロスクラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．４）；スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．７）；マルト−オリゴシルトレハローストレハロヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１４１）；イソマルツロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１１）；マルト−オリゴシルトレハロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１５）；アミロ−アルファ−１，６グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３３）；およびアルファ−１，４−グルカン：リン酸アルファ−マルトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．１６）からなる群から選択される。
【００３１】
第５の実施形態では、グルコシダーゼは、ＧＨ１３もしくはＧＨ３１ファミリーのメンバーであるか、またはアルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）；アルファ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２２）；アルファ−マンノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２４）；アルファ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８４）；スクラーゼ−イソマルターゼ（ＥＣ  ３．２．１．４８）（ＥＣ  ３．２．１．１０）；アルファ−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１７７）；アルファ−グルカンリアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．１３）；イソマルトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１−）；オリゴ糖アルファ−１，４−グルコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１６１）；スルホキノボシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．−）からなる群から選択される。
【００３２】
第６の実施形態では、グルコアミラーゼはＧＨ１５ファミリーのメンバーであるか、またはグルコアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３）；グルコデキストラナーゼ．（ＥＣ  ３．２．１．７０）；アルファ−トレハラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２８）；およびデキストランデキストリナーゼ（ＥＣ  ２．４．１．２）からなる群から選択される。
【００３３】
第７の実施形態では、反芻動物におけるデンプン消化率を増加させ、グルコース収率を増加させ、乾物の消化を増加させ、かつ醗酵中のガス生成を増加させる方法であって、（ｉ）反芻動物用の飼料添加物としての、少なくとも１つのＧＬＣＨ酵素（ここで、前記酵素は（ａ）ペプシン存在下、ｐＨ６での酵素活性と比較して、ペプシン存在下、３以下のｐＨで、少なくとも２０％の活性を有し、（ｂ）前記酵素は第一胃、第四胃、および小腸を含む、反芻動物の３つの消化室の少なくとも２つの中で活性であり、かつ（ｃ）この酵素は膵臓アミラーゼと協働して、グルコース収率を増加させる）と、（ｉｉ）少なくとも１つのプロテアーゼとを含む酵素組成物を飼料に添加することを含む方法が開示されている。
【００３４】
第９の実施形態では、少なくとも１つのＧＬＣＨ酵素は、生デンプンを加水分解することができる。
【００３５】
第１０の実施形態では、ＧＬＣＨ酵素は、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、およびアルファ−グルコシダーゼからなる群から選択される。好ましくは、酵素はアルファ−アミラーゼおよびグルコアミラーゼからなる群から選択される。
【００３６】
第１１の実施形態では、少なくとも１つのＧＬＣＨ酵素は、アルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）；プルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４１）；シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１９）；シクロマルトデキストリナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５４）；トレハロース−６−リン酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９３）；オリゴ−アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１０）；マルトジェニックアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３３）；ネオプルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３５）；アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．１．２．１．２０）；マルトテトラオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）；イソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）；グルコデキストラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．７０）；マルトヘキサオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９８）；マルトトリオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１１６）；分枝酵素（ＥＣ  ２．４．１．１８）；トレハロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１６）；４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．２５）；マルトペンタオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．−）；アミロスクラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．４）；スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．７）；マルト−オリゴシルトレハローストレハロヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１４１）；イソマルツロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１１）；マルト−オリゴシルトレハロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１５）；アミロ−アルファ−１，６グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３３）；およびアルファ−１，４−グルカン：リン酸アルファ−マルトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．１６）からなる群から選択される。
【００３７】
第１２の実施形態では、グルコシダーゼはアルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）；アルファ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２２）；アルファ−マンノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２４）；アルファ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８４）；スクラーゼ−イソマルターゼ（ＥＣ  ３．２．１．４８）（ＥＣ  ３．２．１．１０）；アルファ−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１７７）；アルファ−グルカンリアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．１３）；イソマルトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１−）；オリゴ糖アルファ−１，４−グルコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１６１）；スルホキノボシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１−）からなる群から選択される。
【００３８】
第１３の実施形態では、グルコアミラーゼは、ＧＨ１５グリコシルヒドロラーゼファミリーから選択される。
【００３９】
第１４の実施形態では、プロテアーゼは酸性プロテアーゼまたは中性メタロプロテアーゼからなる群から選択され、好ましくは、プロテアーゼは真菌性アスパラギン酸プロテアーゼまたは細菌中性メタロプロテアーゼである。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、ペプシンおよびＡＦＰプロテアーゼの存在下、ＡｋＡＡアルファ−アミラーゼによるトウモロコシ粉からのグルコースおよびマルトースの放出を示す（実施例２）。
【図２】図２は、ＡｋＡＡアルファ−アミラーゼおよびパンクレアチンによるトウモロコシ粉からのグルコース、マルトースおよびマルトトリオースの放出、ならびにＡｋＡＡとパンクレアチンの、グルコース放出の増加およびマルトトリオース放出の減少における相乗効果を示す（実施例４）。
【図３】図３は、ｐＨ２．５のペプシンおよびｐＨ６．７のパンクレアチンの存在下、トウモロコシ粉に対するＡｔＡＡアルファ−アミラーゼの活性、ならびにＡｔＡＡおよびパンクレアチンを同時添加した場合の、マルトトリオースの完全な変換を示す（実施例５）。
【図４】図４は、第一胃液と共にインキュベートした場合の、アルファ−アミラーゼＡｋＡＡおよびＡｃＡＡの安定性、ならびにそれらと、グルコアミラーゼＴｒＧＡおよびＣＳ４ならびにアスパラギン酸プロテアーゼとの混合物の安定性を示す（実施例６）。
【図５】図５は、ペプシンの存在下、ｐＨ３．２〜６．０で試験したＡｋＡＡおよびＡｃＡＡアルファ−アミラーゼの活性を示す（実施例７）。
【図６】図６は、パンクレアチンの存在下、アルファ−アミラーゼＡｋＡＡ、ＡｃＡＡ、およびグルコアミラーゼＴｒＧＡ、ＣＳ４、およびアスパラギン酸ペプチダーゼＡＦＰを含有する酵素カクテルの活性を示す（実施例８）。
【図７】図７は、コーンスターチ顆粒の加水分解の増加における、グルコアミラーゼとパンクレアチンとの相互作用を示す（実施例１０）。
【図８】図８は、コーンスターチの加水分解の増加における、グルコアミラーゼとパンクレアチンとの相互作用を示す（実施例１０）。
【図９】図９は、固定量のパンクレアチンの存在下、酵母マルターゼ（アルファ−グルコシダーゼ）によるコーンスターチ顆粒からのグルコースの放出を示す（実施例１３）。
【図１０】図１０は、第一胃液中での５つのアルファ−グルコシダーゼの安定性およびグルコースの放出におけるパンクレアチンとの相互作用を示す（実施例１５）。
【図１１】図１１は、ｐＨ６．０でのグルコースの放出における、５つのアルファ−グルコシダーゼとパンクレアチンとの相互作用を示す（実施例１６）。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
引用した全ての特許、特許出願および刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４２】
本開示では、多数の用語および略語を使用する。他に特に明記されない限り、下記の定義が適用される。
【００４３】
１つの要素または成分に先行する冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その要素または成分の事例（すなわち、出現）の数に関して非制限的であるものとする。このため「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、１つまたは少なくとも１つを含むと読むべきであり、要素または成分の単数語形は、その数が明らかに単数であることを意味しない限り複数形も含む。
【００４４】
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、特許請求の範囲で言及された特徴、整数、工程または成分の存在を意味するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、成分もしくはそれらの群の存在または追加を排除するものではない。用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「〜から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」によって包含される実施形態を含むものとする。同様に、用語「〜から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、用語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」によって包含される実施形態を含むものとする。
【００４５】
存在する場合、全ての範囲は、包括的であり、かつ結合可能である。例えば、「１〜５」の範囲が示された場合、示された範囲は、「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２および４〜５」、「１〜３および５」などの範囲を含むと解釈すべきである。
【００４６】
本明細書において数値と関連して使用する用語「約」は、その用語がその状況において他に特に定義されていない限り、数値の±０．５の範囲を指す。例えば、語句「約６のｐＨ値」は、ｐＨ値が他に特に定義されていない限り、５．５〜６．５のｐＨ値を指す。
【００４７】
本明細書を通して明示されたあらゆる最高数値限度は、それより低いあらゆる数値限度を、そのようなより低い数値限度が本明細書に明示的に記載されているかのように含むものとする。本明細書を通して明示されたあらゆる最低数値限度は、それより高いあらゆる数値限度を、そのようなより高い数値限度が本明細書に明示的に記載されているかのように含むであろう。本明細書を通して明示されたあらゆる数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に含まれるそれより狭いあらゆる数値範囲を、そのようなより狭い数値範囲が本明細書に明示的に記載されているかのように含むであろう。
【００４８】
用語アルファ−１，４／１，６−グリコシドヒドロラーゼまたはアルファ−１，４；１，６−グリコシドヒドロラーゼは、本明細書中で互換的に使用される（「ＧＬＣＨ」）。それらは、オリゴマーまたはポリマー分子のアルファ−１，４結合および／またはアルファ−１，６結合を加水分解できる酵素を指し、これらのグリコシドヒドロラーゼは、（ａ）ペプシン存在下のｐＨ６でのこれらの酵素の活性と比較して、ペプシン存在下の３以下のｐＨで、少なくとも２０％の活性を有し、（ｂ）このような酵素は第一胃、第四胃、および小腸を含む、反芻動物の３つの消化室の少なくとも２つの中で活性であり、かつ（ｃ）これらの酵素は膵臓アミラーゼと協働して、グルコース収率を増加させる。これらの酵素は１つまたは２つの炭水化物結合モジュールを有し、生デンプンを加水分解できることが好ましい。これらのグリコシドヒドロラーゼ酵素は、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよび／またはアルファ−グルコシダーゼからなる群から選択されることが好ましい。
【００４９】
用語「グリコシドヒドロラーゼ」は、「グリコシダーゼ」および「グリコシルヒドロラーゼ」と互換的に使用される。グリコシドヒドロラーゼは、複合糖類（多糖類）のグリコシド結合の加水分解を補助する。グリコシダーゼは、グリコシルトランスフェラーゼと共に、グリコシド結合の合成および切断用の主要な触媒機構を形成する。グリコシドヒドロラーゼは、Ｏ−またはＳ−グリコシドの加水分解を触媒する酵素としてＥＣ３．２．１に分類されている。グリコシドヒドロラーゼは、加水分解反応の立体化学的結果にしたがって分類することもできる。したがって、それらは、保持酵素または反転酵素のいずれかとして分類することができる。グリコシドヒドロラーゼは、さらにそれらがオリゴ糖鎖／多糖鎖の（通常は非還元型の）末端または中間で機能するかどうかに依存して、それぞれ外部または内部で作用するものとして分類することもできる。グリコシドヒドロラーゼは、さらにまた配列または構造に基づく方法によって分類できる。それらは、典型的にはそれらが作用を及ぼす基質名にちなんで命名される。
【００５０】
用語「グリコシルトランスフェラーゼ」は、単糖類間のグリコシド結合の形成を触媒する酵素を指す。
【００５１】
用語「グリカン」および「多糖」は、本明細書では互換的に使用される。グリカンは、多糖もしくはオリゴ糖、または、例えば、炭水化物がオリゴ糖だけであっても、糖タンパク質、糖脂質もしくはプロテオグリカンなどの複合糖質の炭水化物部分を意味する。グリカンは、単糖残基のホモポリマーまたはヘテロポリマーであってもよい。それらは線状または分岐状分子であってもよい。グリカンは、糖タンパク質およびプロテオグリカンのようにタンパク質に結合した状態で見出すことができる。一般に、それらは細胞の外表面に見出される。Ｏ−およびＮ−結合グリカンは真核生物では極めて一般的であるが、原核生物においてもそれほど一般的ではないが見出すことができる。
【００５２】
用語「アルファ−アミラーゼ」は、アルファ−１，４−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼおよびグリコゲナーゼと互換的に使用される。アルファ−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、通常、しかし常にではないが、機能するにはカルシウムが必要である。これらの酵素は、オリゴ糖および多糖におけるアルファ−１，４−グルコシド結合のエンド型加水分解を触媒する。アルファ−アミラーゼは、デンプン、グリコーゲン、ならびに関連する多糖類およびオリゴ糖類に不規則に作用し、アルファ−立体配置の還元基を放出する。
【００５３】
用語「低ｐＨ活性アルファアミラーゼ（「ＬｐＨＡＡ」）は、ｐＨ６．０でのその活性と比較して、３．０以下のｐＨで少なくとも２０％の活性を有するアルファアミラーゼを指す。用語「グルコアミラーゼ」（ＥＣ３．２．１．３）は、グルカン１，４−アルファ−グルコシダーゼ、アミログルコシダーゼ、ガンマ−アミラーゼ、リソソームアルファ−グルコシダーゼ、酸マルターゼ、エキソ−１，４−アルファ−グルコシダーゼ、グルコースアミラーゼ、ガンマ−１，４−グルカングルコヒドロラーゼ、酸マルターゼ、および１，４−アルファ−Ｄ−グルカンヒドロラーゼと互換的に使用される。この酵素は、アミロースおよびアミロペクチンの非還元末端で、最後のアルファ−１，４−グリコシド結合を切断してグルコースを生成する。また、アルファ−１，６−グリコシド結合も切断する。
【００５４】
用語「アルファ−グルコシダーゼ」（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２０）は、マルターゼ、グルコインベルターゼ、グルコシオスクラーゼ、マルターゼ−グルコアミラーゼ、アルファ−グルコピラノシダーゼ、グルコシドインベルターゼ、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルファ−グルコシドヒドロラーゼ、アルファ−１，４−グルコシダーゼ、およびアルファ−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼと互換的に使用される。この酵素は、末端の非還元（１−４）結合アルファ−グルコース残基を加水分解して、単一のアルファ−グルコース分子を放出する。アルファ−グルコシダーゼは、ベータ−グルコースに対立するものとして、アルファ−グルコースを放出する炭水化物−ヒドロラーゼである。
【００５５】
用語「飼料」は、家畜の飼育で動物に与えられる製品に関して使用される。用語「飼料」および「動物飼料」は、互換的に使用される。好ましい実施形態では、食料または飼料は、非反芻動物および反芻動物が消費するためのものである。
【００５６】
本明細書では、用語「直接給餌微生物」（「ＤＦＭ」）は、生きている（生存できる）天然型微生物源である。ＤＦＭのカテゴリーには、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、乳酸菌および酵母が含まれる。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、胞子を形成するユニークなグラム陽性桿菌である。これらの胞子は極めて安定であり、熱、水分およびｐＨ範囲などの環境条件に耐えることができる。これらの胞子は、動物に摂取されると活性な栄養細胞に成長し、粗挽き粉およびペレット化飼料に使用することができる。乳酸菌は、病原体に対して拮抗性である乳酸を生成するグラム陽性球菌である。乳酸菌は、やや熱に弱いと思われるので、それらはペレット化飼料では使用されない。乳酸菌の種類には、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）が含まれる。酵母は細菌ではない。これらの微生物は、植物群の真菌に属する。
【００５７】
用語「プロテアーゼ」は、本明細書では、ペプチド結合を切断できる酵素を指す。用語「プロテアーゼ」、「ペプチダーゼ」および「プロテイナーゼ」は、互換的に使用できる。プロテアーゼは、動物、植物、細菌、古細菌およびウイルスに見出すことができる。タンパク質分解は、現在は６つの幅広い群、すなわちアスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸性プロテアーゼおよびメタロプロテアーゼに分類されている酵素により達成できる。
【００５８】
特に、用語「プロテアーゼ」は、微生物、例えば真菌、細菌由来の、または植物もしくは動物由来のタンパク質またはポリペプチドドメインを意味し、それはタンパク質骨格（例えば、Ｅ．Ｃ．３．４）の種々の位置の１つ以上で、ペプチド結合の切断を触媒する能力を有する。
【００５９】
用語「酸性プロテアーゼ」は、酸性条件下でタンパク質を加水分解する能力を有するプロテアーゼを意味する。これは、エンドペプチダーゼまたはエキソペプチダーゼなどの、任意の数のタンパク質加水分解物質を包含することができる。
【００６０】
用語「アスパラギン酸プロテアーゼ（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）」および「アスパラギン酸プロテアーゼ（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）」は、本明細書中で互換的に使用され、酸性プロテアーゼの一種である。アスパラギン酸プロテアーゼ（ａｓｐａｒｔｙｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）としても知られるアスパラギン酸プロテアーゼ（ａｓｐａｒｔｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ）（ＥＣ  ３．４．２３）は、ポリペプチド基質中のペプチド結合を加水分解するための、１個以上の触媒アスパラギン酸塩残基に結合した活性化された水分子である。一般に、それらは、活性部位に２つの高度に保存されたアスパラギン酸塩を有し、酸性ｐＨで最も活性である。
【００６１】
略語「ＡＦＰ」はアスパラギン酸真菌プロテアーゼ、すなわち、真菌生物源由来のアスパラギン酸プロテアーゼを指す。
【００６２】
用語「メタロプロテアーゼ」は、その触媒機構が金属を含む任意のプロテアーゼである。ほとんどのメタロプロテアーゼは亜鉛を必要とするが、コバルトを使用するものもある。金属イオンは、３つのリガンドを介してタンパク質に配位される。金属イオンを配位するリガンドは、ヒスチジン、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、リジン、およびアルギニンによって変化し得る。第４の配位位置は、不安定な水分子に取り込まれる。
【００６３】
メタロプロテイナーゼには、（ａ）エキソペプチダーゼ、メタロエキソペプチダーゼ（ＥＣ番号３．４．１７）および（ｂ）メタロエンドペプチダーゼ（３．４．２４）を含む２つのサブグループがある。
よく知られているメタロエンドペプチダーゼには、ＡＤＡＭタンパク質およびマトリックスメタロプロテイナーゼが含まれる。
【００６４】
本明細書では、用語「ペプシン」は、２．０〜３．５の低いｐＨでタンパク質をより小さなペプチドに分解する酵素を指す。すなわち、それはアスパラギン酸ペプチダーゼファミリーＡ１に属するプロテアーゼである。これは、産生されて胃に分泌され、ヒトおよび動物の消化系での主要な消化酵素の１つであり、食料または飼料中のタンパク質の消化を助ける。
【００６５】
本明細書では、用語「反芻動物」は、主に微生物の作用により、消化の前に特殊な胃で栄養素を醗酵させることによって、植物ベースの食物から栄養素を獲得することができる哺乳動物を指す。このプロセスは、通常、醗酵した摂取物（食い戻しとして知られている）を逆流させ、再び咀嚼することを必要とする。植物物質をさらに分解し、消化を刺激するために食い戻しを再咀嚼するプロセスは、反芻と呼ばれる。反芻動物のおよそ１５０種には、家畜および野生種の両方が含まれる。反芻動物には、畜牛、乳牛、ヤギ、ヒツジ、キリン、ヤク、シカ、ヘラジカ、アンテロープ、バッファローなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書では、用語「反芻動物の消化室」は、第一胃、第二胃、第三胃、第四胃および小腸を指す（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），ｐａｇｅｓ  １５６−１９１）。第四胃は、単胃の胃と全くの同等物である。
【００６７】
本明細書では、用語「飼料」は、動物飼料の種類を指し、特に、家畜、例えば畜牛、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリおよびブタに餌を与えるために使用される、任意の農産食品である。「飼料」は、特に、動物に与えられる食物（切り取って動物まで運ぶ植物を含む）をいい、動物が自分であさる食物ではない（餌あさりと呼ぶ）。飼料はプロベンダーとも呼ばれ、干し草、わら、サイレージ、圧縮およびペレット化飼料、油および混合飼料、ならびに発芽穀物およびマメ類（例えば、豆芽、新鮮麦芽、または使用済み麦芽）を含む。ほとんどの動物飼料は、植物由来であるが、一部の製造業者は加工飼料に動物由来の成分を添加する。
【００６８】
用語「飼料」は、家畜の飼育で動物に与えられる製品に関して使用される。用語「飼料」および「動物飼料」は、互換的に使用される。
【００６９】
用語「デンプン」は、「アミラム」と互換的に使用される。それは、グリコシド結合によって連結された多数のグルコース単位からなる高分子炭水化物であり、植物において最も一般的な貯蔵炭水化物である。したがって、「デンプン」は、式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘ（式中、Ｘは任意の数であり得る）を有するアミロースおよびアミロペクチンからなる植物の複合多糖炭水化物からなる、任意の物質を指し得る。特に、この用語は、限定されないが、穀物、草、塊茎および根、より具体的にはコムギ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、コメ、モロコシ、ふすま、キャッサバ、キビ、ジャガイモ、サツマイモ、およびタピオカを含む任意の植物ベースの物質を指す。
【００７０】
用語「デンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）または炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）」は、本明細書では互換的に使用される。ＳＢＤは９つのＣＢＭファミリーに分けられる。デンプンは、エネルギー源として、多数の各種デンプン分解酵素によって分解される。しかし、僅かにそれらの約１０％が生デンプンに結合し、それを分解することができる。これらの酵素は通常、デンプン顆粒への付着を媒介するデンプン結合ドメインと呼ばれる、異なる配列構造モジュールを有する。ＳＢＤは、デンプン（多糖）基質またはマルトサッカリド、アルファ−、ベータおよびガンマ−シクロデキストリンなどに優先的に結合するアミノ酸配列を指す。それらは、通常、約１０％の微生物デンプン分解酵素に見出される約１００アミノ酸残基のモチーフである。
【００７１】
用語「触媒ドメイン」は、ＣＢＭとは異なるものであり、基質の加水分解のための活性部位を含む、ポリペプチドの構造領域を指す。
【００７２】
用語「粒状デンプン」は、生の、すなわち未調理デンプン、例えば糊化を受けていないデンプンを指す。
【００７３】
用語「粒状デンプン加水分解（ＧＳＨ）酵素」および「粒状デンプン加水分解（ＧＳＨ）活性」は、本明細書では互換的に使用され、動物、特に反芻動物の消化管に見出される条件に相当する消化管関連条件下において、粒状のデンプンを加水分解する能力を有する酵素を指す。
【００７４】
用語「糊化」は水および熱の存在下でデンプン分子の分子間結合を切断し、水素結合部位がより多くの水と関わることを可能にすることを指す。これは、デンプン粒子を水に不可逆的に溶解し、粘稠な懸濁液を形成する。
【００７５】
用語「重合度（ＤＰ）」は、高分子すなわちポリマーまたはオリゴマー分子中のモノマー単位の数を指す。例えば、それは、所与の糖類中のモノマー単位数（ｎ）を指し得る。ＤＰ１の例は、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類である。ＤＰ２の例は、マルトースおよびスクロースなどの二糖類である。ＤＰ＞３は、３超の重合度のポリマーを意味する。
【００７６】
用語「単離（された）」は、自然には発生しない形態または環境にある物質を意味する。単離物質の非限定的な例には、（１）天然には存在しない物質、（２）天然ではそれが結びついている天然に存在する成分の１つ以上または全部から、少なくとも部分的に除去されている物質、例えば、限定されないが、宿主細胞、酵素、変異体、核酸、タンパク質、ペプチドまたは補因子；（３）天然に見出される物質に対し、ヒトの手によって改変されている物質；または（４）天然にはそれが結び付いている他の成分に対し、その物質の量を増加させることによって改変されている物質が含まれる。用語「単離核酸分子」、「単離ポリヌクレオチド」および「単離核酸断片」は、互換的に使用され、任意選択的に合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含む、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡのポリマー形態にある単離核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントから構成され得る。
【００７７】
核酸またはポリペプチドに適用される用語「精製（された）」は、一般に、当該技術分野においてよく知られた分析手法によって決定された他の成分を実質的に含まない核酸またはポリペプチドを意味する（例えば、精製ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、電気泳動ゲル、クロマトグラフィー溶出液および／または密度勾配遠心分離法に供された媒体において個別のバンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲルにおいて実質的に１つのバンドを生じる核酸またはポリペプチドは「精製されて」いる。精製核酸または精製ポリペプチドは、少なくとも約５０％純粋であり、通常は、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％（例えば、モルベースでの重量パーセント）以上純粋である。これに関連して、組成物は精製または濃縮手法の適用後に、ある分子の濃度が実質的に増加している場合は、その分子について濃縮されている。「濃縮（された）」という用語は、出発組成物よりより高い相対濃度または絶対濃度で組成物中に存在する、化合物、ポリペプチド、細胞、核酸、または他の特定の物質もしくは成分を指す。
【００７８】
用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は本明細書で互換的に使用され、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」または「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマー配列を含む。アミノ酸に対しては、本開示全体を通して、生物学的命名法に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ連合委員会に準拠して定義された１文字また３文字コードを使用する。１文字のＸは、２０種のアミノ酸のいずれかを指す。ポリペプチドが遺伝子コードの縮重に起因して２つ以上のヌクレオチド配列によってコードできることも理解されている。変異は、親アミノ酸の一文字コード、続いて位置番号、その後に、変異アミノ酸の１文字コードによって名付けることができる。例えば、グリシン（Ｇ）の８７位でのセリン（Ｓ）への変異は、「Ｇ０８７Ｓ」または「Ｇ８７Ｓ」と表される。改変を記載する場合、位置の後に括弧内に列挙されたアミノ酸が続く場合は、列挙したアミノ酸のいずれかによるその位置での置換のリストを示している。例えば、６（Ｌ，Ｉ）は、６位をロイシンまたはイソロイシンで置換できることを意味する。時には、１つの配列内で、置換を定義するためにスラッシュ（／）を使用し、例えば、Ｆ／Ｖは、特定位置がその位置でフェニルアラニンまたはバリンを有する可能性があることを示す。
【００７９】
変異は、親アミノ酸の一文字コードに続いて位置番号、その後に、変異アミノ酸の１文字コードによって名付けることができる。例えば、グリシン（Ｇ）の８７位でのセリン（Ｓ）への変異は、「Ｇ０８７Ｓ」または「Ｇ８７Ｓ」と表される。
【００８０】
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの「成熟」形という用語は、シグナルペプチド配列およびプロペプチド配列を含まないタンパク質、ポリペプチドまたは酵素の機能的形態を指す。
【００８１】
タンパク質またはペプチドの「前駆体」形態という用語は、そのタンパク質のアミノまたはカルボニル末端に作動可能に連結しているプロ配列を有するタンパク質の成熟形態を指す。前駆体はまた、プロ配列のアミノ末端に作動可能に連結している「シグナル」配列を有し得る。前駆体はまた、翻訳後活性に関連する追加のポリペプチド（例えば、タンパク質またはペプチドの成熟形態を残すためにそれから切断されたポリペプチド）を有し得る。
【００８２】
「プロ配列」または「プロペプチド配列」は、酵素の適正なフォールディングおよび分泌に必要である、シグナルペプチド配列と成熟酵素配列（例えば、本明細書に記載のグリコシドヒドロラーゼ）との間のアミノ酸配列を指す；それらは時には分子内シャペロンと呼ばれる。プロ配列またはプロペプチド配列の開裂は、プロ酵素として発現されることが多い成熟活性酵素を生じさせる。
【００８３】
用語「シグナル配列」および「シグナルペプチド」は、タンパク質の成熟形態もしくは前駆体形態の分泌または直接輸送に関与し得るアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、通常、前駆体または成熟タンパク質配列のＮ末端に位置する。シグナル配列は、内因性であっても外因性であってもよい。シグナル配列は、通常、成熟タンパク質には存在しない。シグナル配列は、通常、タンパク質が輸送された後にシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。目的遺伝子は、シグナル配列を伴って、または伴わずに発現し得る。
【００８４】
アミノ酸配列または核酸配列に関連した用語「野生型」は、そのアミノ酸配列もしくは核酸配列が天然の、または天然に存在する配列であることを示す。本明細書では、用語「天然に存在する」は、天然に見出されるもの（例えば、タンパク質、アミノ酸または核酸配列）を指す。逆に、用語「天然に存在しない」は、天然には見出されないもの（例えば、実験室で産生された、または野生型配列の改変で産生された、組換え核酸およびタンパク質配列）を指す。
【００８５】
アミノ酸残基の位置に関連して本明細書で使用する場合、「〜に対応している」または「〜に対応する」または「対応する」は、タンパク質またはペプチド中の列挙された位置におけるアミノ酸残基、あるいはタンパク質またはペプチド中の列挙された残基と類似の、相同の、または同等のアミノ酸残基を指す。本明細書では、「対応する領域」は、一般に、関連タンパク質または参照タンパク質における類似の位置を指す。
【００８６】
用語「〜に由来する」および「〜から得られる」は、問題の生物の菌株によって生成される、または生成可能なタンパク質だけではなく、そのような菌株から単離されたＤＮＡ配列によってコードされ、そのようなＤＮＡ配列を含有する宿主生物中で産生されたタンパク質も指す。さらに、この用語は、合成および／またはｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によってコードされ、問題のタンパク質の識別可能な特徴を有するタンパク質を指す。
【００８７】
用語「アミノ酸」は、タンパク質またはポリペプチドの基本的化学構造単位を指す。したがって、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンに対するコドンは、別の疎水性がより低い残基（例えばグリシン）または疎水性がより高い残基（例えばバリン、ロイシンまたはイソロイシン）をコードするコドンによって置換され得る。同様に、１つの負荷電の残基を別の負荷電の残基で（例えば、アスパラギン酸をグルタミン酸で）または１つの正荷電の残基を別の正荷電の残基で（例えばリシンをアルギニンで）置換するような変化もまた、機能的に同等の生成物を産生すると予測できる。多くの場合に、タンパク質分子のＮ末端およびＣ末端部分に変化を生じさせるようなヌクレオチドの変化もまた、そのタンパク質の活性を変化させるとは予測されないであろう。提案された改変のそれぞれは、コードされた生成物の、生物学的活性が保持されているかどうかを決定するのと同様に、当該技術分野におけるルーチン的技能の範囲に十分含まれる。
【００８８】
用語「コドン最適化（された）」は、それが、各種宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコード領域を指すときには、ＤＮＡがコードするポリペプチドを変化させずに、宿主生物の典型的なコドン使用を反映するよう、核酸分子の遺伝子またはコード領域内のコドンを改変することを意味する。
【００８９】
用語「遺伝子」は、コード配列に先行する調節配列（５’非コード配列）および後続する配列（３’非コード配列）を含む、特定のタンパク質を発現する核酸分子を指す。「ネイティブ遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子ではなく、天然には一緒に見出されることのない調節配列とコード配列を含む任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列とコード配列、または同一起源に由来するが、天然に見出される方法とは異なる方法で配列された調節配列およびコード配列を含み得る。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム内でその天然の場所にある天然遺伝子を意味する。「外来」遺伝子は、宿主生物内で通常は見出されないが、遺伝子導入によって宿主生物中に導入されている遺伝子を意味する。外来遺伝子は、非天然生物内に挿入された天然遺伝子またはキメラ遺伝子を含むことができる。「トランス遺伝子」は、形質転換手法によってゲノム内に導入されている遺伝子である。
【００９０】
用語「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。「好適な調節配列」は、コード配列内の上流（５’非コード配列）、またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置しており、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性または関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を意味する。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含み得る。
【００９１】
用語「作動可能に連結した」は、一方の機能が他方の機能によって影響されるような単一核酸分子上の核酸配列の関連性を指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、すなわちコード配列がプロモーターの転写制御下にある場合に、コード配列と作動可能に連結している。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で調節配列に作動可能に連結することができる。
【００９２】
用語「調節配列」または「制御配列」は、本明細書では互換的に使用され、生物内の特定の遺伝子の発現を増加または減少させることのできるヌクレオチド配列のセグメントを指す。調節配列の例としては、プロモーター、シグナル配列、オペレーターなどが挙げられるがそれらに限定されない。上述のように、調節配列は、目的のコード配列／遺伝子にセンスまたはアンチセンス方向に作動可能に連結することができる。
【００９３】
「プロモーター」または「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼによる遺伝子の転写が始まる場所を規定するＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、典型的には転写開始部位のすぐ上流または５’末端に位置する。プロモーターは、それらの全体が天然の、すなわち天然に存在する遺伝子に由来し得るか、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成され得るか、または合成ＤＮＡセグメントさえも含み得る。当業者であれば、異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞の種類もしくは発達の異なる段階で、または異なる環境もしくは生理的条件に反応して（「誘導性プロモーター」）遺伝子の発現を指示し得ることを理解している。
【００９４】
「３’非コード配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、例えば転写の終結などのｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする配列を含む。
【００９５】
本明細書では、用語「形質転換」は、核酸分子の宿主生物への移動または導入を意味する。核酸分子は、ＤＮＡの直鎖形態または環状形態として導入し得る。核酸分子は、自律的に複製するプラスミドであるか、またはそれは産生宿主のゲノムに組み込まれ得る。形質転換された核酸を含有する産生宿主は、「形質転換された」、「組換えの」、もしくは「遺伝子導入の」生物、または「形質転換体」と呼ばれる。
【００９６】
本明細書では、用語「組換え」は、例えば、化学合成によって、または遺伝子工学手法による核酸の単離セグメントの操作によって、本来なら別々の、核酸配列の２つのセグメントを人工的に組み合わせることを指す。例えば、１つ以上のセグメントまたは遺伝子が、自然にまたは実験室操作のいずれかで、異なる分子から、同一分子の別の部分から、または人工的配列から挿入されているＤＮＡは、新たな配列の導入を遺伝子にもたらし、次に生物にもたらす。用語「組換えの」、「遺伝子導入の」、「形質転換された」、「遺伝子操作された」または「外来遺伝子発現のために改変された」は、本明細書では互換的に使用される。
【００９７】
用語「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「組換え発現コンストラクト」および「発現カセット」は、本明細書では互換的に使用される。組換えコンストラクトは、天然には一緒に見出されるとは限らない、核酸断片、例えば、調節配列およびコード配列の人工的な組み合わせを含む。例えば、コンストラクトは、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列を含み得るか、または同一起源に由来するが、天然に見出されるのとは異なる方法で配列された調節配列およびコード配列を含み得る。そのようなコンストラクトは、それだけで使用し得るか、またはベクターと共に使用し得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者にはよく知られているように、宿主細胞を形質転換するために使用する方法に依存する。例えばプラスミドベクターを使用することができる。熟練した職人は、宿主細胞を成功裡に形質転換し、選択し、そして増殖させるために、ベクター上に存在しなければならない遺伝要素をよく知っている。熟練した職人は、また、異なる、独立した形質転換イベントは、異なる発現レベルとパターンをもたらすこと（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ  ４：２４１１−２４１８；Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８−８６）、したがって、所望の発現レベルとパターンを示す菌株を得るために、多重イベントは通常スクリーニングされることも認識するであろう。そのようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、ＰＣＲ、実時間定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、タンパク質発現の免疫ブロッティング、酵素もしくは活性分析、および／または表現型分析を含む、標準の分子生物学的、生化学的および他の分析法により行い得る。
【００９８】
用語「生成宿主」、「宿主」および「宿主細胞」は、本明細書では互換的に使用され、ヒトであろうと非ヒトであろうと、遺伝子を発現するために、組換えコンストラクトが安定的に、または一過性に導入される任意の生物またはその細胞を指す。この用語は、増殖中に発生する変異に起因して親細胞と同一でない、親細胞の任意の子孫を含む。
【００９９】
用語「パーセント同一性」は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列間、または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野では、「同一性」は、場合によっては、一連のそのような配列間のマッチするヌクレオチドまたはアミノ酸の数によって決定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９１）に記載された方法を含む、既知の方法によって容易に計算することができる。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手できるコンピュータープログラムに成文化されている。
【０１００】
本明細書では、「％同一性」、「パーセント同一性」または「ＰＩＤ」は、タンパク質配列の同一性を指す。パーセント同一性は、当該技術分野で知られた標準的手法を使用して決定し得る。有用なアルゴリズムとしては、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０，１９９０；およびＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９０：５８７３−５７８７，１９９３を参照されたい）が挙げられる。ＢＬＡＳＴプログラムは、数種の検索パラメーターを使用するが、そのほとんどはデフォルト値に設定される。ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、生物学的類似性に関して最も関連する配列を見出すが、２０未満の残基のクエリ配列には推奨されない（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５：３３８９−３４０２，１９９７；ａｎｄ  Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２９：２９９４−３００５，２００１）。核酸配列検索用の典型的なデフォルトＢＬＡＳＴパラメーターとしては、隣接ワード閾値（Ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ  ｗｏｒｄｓ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）＝１１；Ｅ値カットオフ＝１０；スコアリングマトリックス（Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ）＝ＮＵＣ．３．１（マッチ＝１、ミスマッチ＝−３）；ギャップオープニング（Ｇａｐ  Ｏｐｅｎｉｎｇ）＝５；およびギャップエクステンション（Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）＝２が挙げられる。アミノ酸配列検索用の典型的なデフォルトＢＬＡＳＴパラメーターとしては、ワードサイズ（Ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）＝３；Ｅ値カットオフ＝１０；スコアリングマトリックス（Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープニング（Ｇａｐ  Ｏｐｅｎｉｎｇ）＝１１；およびギャップエクステンション（Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）＝１が挙げられる。パーセント（％）アミノ酸配列同一性値は、マッチした同一残基の数を、プログラムによって最適／最大アラインメントに加えられたギャップを含む、「参照」配列の総残基数で除すことによって決定される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、「参照」配列を「クエリ」配列と呼ぶ。
【０１０１】
本明細書では、「相同タンパク質」または「相同酵素」は、一次、二次および／または三次構造において明確な類似性を有するタンパク質を指す。タンパク質相同性は、タンパク質がアラインされた場合の、直鎖アミノ酸配列の類似性を指すことができる。タンパク質配列の相同性検索は、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴのＢＬＡＳＴＰおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用し、０．００１の閾値（Ｅ−値カットオフ）で実施することができる。（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，Ｍａｄｄｅ  ＴＬ，Ｓｈａｆｆｅｒ  ＡＡ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ，Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ．Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ  ＢＬＡＳＴ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９７  Ｓｅｔ  １；２５（１７）：３３８９−４０２）。この情報を使用して、タンパク質配列を分類することができる。系統樹は、アミノ酸配列を使用して構築することができる。
【０１０２】
配列アラインメントおよびパーセント同一性の計算はＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖ．７．０（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）のＡｌｉｇｎＸプログラム、またはＥＭＢＯＳＳ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅを使用して実施することができる（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ；Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）：２７６−２７７（２０００））。配列の多重アラインメントはＣＬＵＳＴＡＬアラインメント法（ＣＬＵＳＴＡＬＷ；例えばバージョン１．８３など）（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４）；およびＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ経由でＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手できるＣｈｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１（１３）：３４９７−５００（２００３））を使用してデフォルトのパラメーターで行うことができる。ＣＬＵＳＴＡＬＷタンパク質アラインメントについての好適なパラメーターとしては、ギャップイグジスタンスペナルティ（ＧＡＰ  Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝１５、ギャップエクステンション（ＧＡＰ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）＝０．２、マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ（例えば、Ｇｏｎｎｅｔ２５０）、タンパク質ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質ＧＡＰＤＩＳＴ＝４およびＫＴＵＰＬＥ＝１が挙げられる。一実施形態では、高速または低速アラインメントは、低速アラインメントのデフォルト設定が使用される。あるいは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法（例えば、バージョン１．８３）を使用するパラメーターは、さらにＫＴＵＰＬＥ＝１、ギャップペナルティ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０、ギャップエクステンション（ＧＡＰ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）＝１、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６４）、ウィンドウ＝５およびトップ・ダイアゴナルズ・セイブド（ＴＯＰ  ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ）＝５も使用するよう変更することができる。
【０１０３】
本明細書では、ある態様の特徴として、各種ポリペプチドのアミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列が開示される。ある実施形態では、本明細書に開示した配列と、少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％または９０％〜９５％同一である、これらの配列の変異体を使用し得る。あるいは、ある実施形態の変異ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は、本明細書に開示した配列と少なくとも６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有することができる。変異アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、開示した配列と同一の機能または開示した配列の機能の少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を有する。
【０１０４】
ポリペプチドに関する用語「変異体」は、１つ以上の自然に生じた、または人為的なアミノ酸の置換、挿入または欠失を含むという点で、特定の野生型、親または参照ポリペプチドと異なるポリペプチドを指す。同様に、ポリヌクレオチドに関する「変異体」という用語は、ヌクレオチド配列が特定の野生型、親または参照ポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドを指す。野生型、親または参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの同一性は、文脈から明らかになるであろう。
【０１０５】
用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子をしばしば運ぶ、追加の染色体要素を指し、通常、二本鎖ＤＮＡの形態をとる。そのような要素は、直鎖または環状形態の、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、任意の起源に由来する、自律的に複製する配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であり得、これらの中では、多くのヌクレオチド配列が、目的のポリヌクレオチドを細胞に導入することができる固有のコンストラクトに連結しているか、組み換えられている。「形質転換カセット」は、遺伝子を含み、かつ、遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特定のベクターを指す。用語「発現カセット」および「発現ベクター」は、本明細書では互換的に使用され、遺伝子を含み、かつ遺伝子に加えて宿主内でその遺伝子の発現を可能にする要素を有する特定ベクターを指す。
【０１０６】
本明細書では、用語「発現」は、前駆体または成熟形のいずれかの形態の、機能的最終産物（例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質）の産生を指す。発現は、またｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指し得る。
【０１０７】
遺伝子の発現は、遺伝子の転写およびｍＲＮＡの前駆体または成熟タンパク質への翻訳を含む。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することができるアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を意味する。「共抑制」は、同一または実質的に類似の外来または内因性遺伝子の発現を抑制することができる、センスＲＮＡ転写物の生成を意味する（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。「成熟」タンパク質は、翻訳後プロセシングされたポリペプチド、すなわち、一次翻訳産物中に存在する任意のプレペプチドまたはプロペプチドが除去されているポリペプチドを指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物、すなわちプレペプチドおよびプロペプチドが依然存在している産物を指す。プレペプチドおよびプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであり得るが、これには限定されない。「安定形質転換」は、核ゲノムおよびオルガネラゲノムの両方を含む、宿主生物のゲノム内へ核酸断片を移動させることを指し、遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす。対照的に、「一過性形質転換」は、宿主生物の核またはＤＮＡ含有オルガネラ内への核酸断片の移動を指し、組み込まれた遺伝形質または安定な遺伝形質を伴わない遺伝子の発現をもたらす。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」生物と呼ばれる。
【０１０８】
発現ベクターは、当該技術分野で知られた、好適な産生宿主の形質転換に有用な、任意の数のベクターまたはカセットの一つとすることができる。通常、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指令する配列、選択可能なマーカーおよび自律複製または染色体への組込みを可能にする配列を含むであろう。好適なベクターには、一般に、転写開始制御配列を有する遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域が含まれる。どちらの制御領域も、形質転換された産生宿主細胞の遺伝子および／または産生宿主にネイティブな遺伝子に相同の遺伝子に由来することができる（そのような制御領域がそのように由来する必要はないのだが）。
【０１０９】
本明細書では、「相同タンパク質」または「相同酵素」は、一次、二次および／または三次構造において明確な類似性を有するタンパク質を指す。タンパク質の相同性は、タンパク質がアラインされた場合の、直鎖アミノ酸配列の類似性を指すことができる。タンパク質配列の相同性検索は、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴのＢＬＡＳＴＰおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用し、０．００１の閾値（Ｅ−値カットオフ）で実施することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ＳＦ，Ｍａｄｄｅ  ＴＬ，Ｓｈａｆｆｅｒ  ＡＡ，Ｚｈａｎｇ  Ｊ，Ｚｈａｎｇ  Ｚ，Ｍｉｌｌｅｒ  Ｗ，Ｌｉｐｍａｎ  ＤＪ．Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ  ＢＬＡＳＴ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９７  Ｓｅｔ  １；２５（１７）：３３８９−４０２）。この情報を使用して、タンパク質配列を分類することができる。系統樹は、アミノ酸配列を使用して構築することができる。アミノ酸配列は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  ｓｕｉｔｅなどのプログラムに入力することができ、ガイドツリーは、Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＪ）法（齋藤および根井、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ，４：４０６−４２５，１９８７）を使用して作成することができる。ツリーの構築は、木村の配列距離補正を使用し、ギャップを含む位置を無視して計算することができる。ＡｌｉｇｎＸなどのプログラムは、系統樹上に示された分子名に続く括弧内に計算距離値を提示することができる。
【０１１０】
分子間の相同性についての理解は、分子の進化史ならびに分子の機能に関する情報を明らかにすることができる；新規に配列決定したタンパク質が、既に特性解析されたタンパク質と相同であれば、新規なタンパク質の生化学的機能を強く示すものとなる。２つの実体間の最も基本的な関係は相同性である。２つの分子は、それらが共通の祖先に由来していれば、相同であるといわれる。相同分子もしくはホモログは、パラログとオルトログの２つのクラスに分類することができる。パラログは、１つの種内に存在するホモログである。パラログは、多くの場合、それらの詳細な生化学的機能が相違する。オルトログは、異なる種に存在するホモログであり、極めて類似したまたは同一の機能を有する。タンパク質スーパーファミリーは、共通の祖先を推察することができる、タンパク質の最大のグループ（系統群）である。通常、この共通の祖先は、配列アラインメントと機構類似性に基づいている。スーパーファミリーは、通常、数種のタンパク質ファミリー（そのファミリー内での配列類似性を示す）を含む。「タンパク質クラン」という用語は、通常、ＭＥＲＯＰＳプロテアーゼ分類系に基づくプロテアーゼスーパーファミリーに対し使用される。
【０１１１】
ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムは、配列アラインメントアルゴリズムの別の例である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２２：４６７３−４６８０，１９９４を参照されたい）。ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムのデフォルトパラメーターには、ギャップオープニングペナルティ（Ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝１０．０；ギャップエクステンションペナルティ（Ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝０．０５；タンパク質重量マトリックス（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭシリーズ；ＤＮＡ重量マトリックス（ＤＮＡ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ）＝ＩＵＢ；ディレイ発散数列（％）（Ｄｅｌａｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ％）＝４０；ギャップ分離距離（Ｇａｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）＝８；ＤＮＡトランジション重量（ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ  ｗｅｉｇｈｔ）＝０．５０；親水性残基のリスト＝ＧＰＳＮＤＱＥＫＲ；負のマトリックスの使用（Ｕｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ）＝ＯＦＦ；トグル残基特異的ペナルティ（Ｔｏｇｇｌｅ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ）＝ＯＮ；トグル親水性ペナルティ（Ｔｏｇｇｌｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ＝ＯＮ；およびトグルエンドギャップ分離ペナルティ（Ｔｏｇｇｌｅ  ｅｎｄ  ｇａｐ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝ＯＦＦが含まれる。ＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズムでは、いずれか一方の末端で発生する欠失が含まれる。例えば、５００個のアミノ酸からなるポリペプチドの一方の末端（またはポリペプチド内）で５個のアミノ酸が欠失した変異体は、「参照」ポリペプチドに対して、９９％（４９５／５００同一残基×１００）のパーセント配列同一性を有する。そのような変異体は、ポリペプチドに対し「少なくとも９９％の配列同一性」を有する変異体に包含される。
【０１１２】
本明細書では、用語「機能分析」は、酵素の活性の指標を提供する分析を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、酵素が通常の能力で機能する能力について分析する分析システムを指す。
【０１１３】
反芻動物は、それらの微生物／酵素消化システムにより、粗飼料をタンパク質およびエネルギーに変換する独特の能力を有する。したがって、反芻動物は、地球の生態学および食物連鎖において重要な役割を果たす。
【０１１４】
反芻動物と非反芻動物との主な違いは、反芻動物は第一胃、第二胃、第三胃、第四胃からなる４区画の胃を有することである。第四胃は、単胃と全くの同等物である。（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ａｎｉｍａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ（７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），ｐａｇｅｓ  １５６−１９１）。
【０１１５】
第一胃は最大の区画であり、１５０〜２００リットル（４０〜５０ガロン）の容積がある。
【０１１６】
消化系には数十億の微生物がいる。それらは、ウシが飼料中の栄養素を消化して利用するのを助ける。効率的な飼料利用および高い乳量を達成するには、細菌に最適な条件を与えなければならない。飼料を消化するのは細菌である。実際、ウシに給餌することは、その第一胃内の微生物に給餌することを含む。
【０１１７】
醗酵プロセスは、第一胃および第二胃で起こる。ウシの第一胃は大きな醗酵槽のようなものである。２００種超の異なる細菌および２０種の原生動物は、ウシが線維状飼料原料および非タンパク質性窒素源を利用するのを助ける。
【０１１８】
醗酵とは、微生物が炭水化物を揮発性脂肪酸およびガスに変換するときのことである。このプロセスは、ウシがセルロース線維をエネルギーに変換することを可能にする。
【０１１９】
醗酵中に第一胃内で生成されるガス（５００〜１５００リットル／日）（１５０〜４００ガロン）のうち、２０〜４０％はメタンと二酸化炭素からなる。醗酵ガスが生成することは、かなりのエネルギー損失があることを表す。イオノフォアなどの特定の醗酵改質剤は、これらのガスエネルギー損失を低減することによって、反芻動物のエネルギー効率を改善する。
【０１２０】
醗酵ガスはおくびによって排出される。おくびが不可能または無効な場合に、ウシは鼓脹に苦しむことがある。飼料が第一胃に入ると、第一胃の内容物の上部に浮かぶ第一胃マット上に層状になる。第一胃壁の律動的な収縮により、新たに食べられた物質はマットの後方域に蓄積する。第一胃マットは、１５％の乾物含量を有する未消化物質からなる。細菌は飼料に付着し、醗酵性物質を徐々に消化する。ウシが反芻すると、前方層の食い戻しが戻される。唾液が口内に分泌され、歯の噛み砕く作用によって、微生物に曝される表面はより大きくなる。
【０１２１】
細菌が働き、反芻プロセスが続くにつれて、飼料粒子は小さくなる。それらは徐々に液体を吸収し、第一胃の底部に沈む。反芻胃の底部の第一胃内容物は、５％の乾物含有量を有する。
【０１２２】
第一胃は毎分１回収縮する。収縮は、第一胃内の液体および固体内容物を混合して醗酵を刺激し、停滞を避ける。収縮はまた、第一胃内容物のマットまたは液体部分のいずれかに捕捉されたガスを放出するのに役立つ。醗酵ガスはおくびによって排出される。このプロセスが支障をきたすと、鼓脹を生じることがある。適切なサイズおよび密度の供給粒子は、第一胃の収縮によって第二胃内の液体中へと分離される。その後の収縮は、これらの粒子および液体内容物の一部を反芻胃から第三胃に押し出す。
【０１２３】
第一胃と第二胃は基本的に１つの区画であるが、異なる機能を有する。醗酵作用の多くは第一胃で起こるが、第二胃は第三胃への通過の、または逆流の開始領域として働く。
理想的な第一胃のｐＨ値は６〜７である。第一胃微生物は、この範囲内で最も健康である。ｐＨ値が過度に変化すると、ある種の微生物が排除され、飼料の利用が低下する。セルロース（干し草、サイレージなど）を消化する微生物は、ｐＨ値が６．０未満では、増殖することができないか、セルロースを醗酵させることができない。第一胃のｐＨが６未満に低下する場合、第一胃はアシドーシスであると考えられる。反芻動物のアシドーシスは急性であって、ｐＨの急激で激しい低下を伴うことがある。高産生群でより一般的なのは、第一胃の低ｐＨの慢性的、間欠的期間を特徴とする、無症状アシドーシスである。
【０１２４】
上で言及したように、飼料中のデンプンの消化性は非常に変動しやすく、デンプンおよび飼料マトリックスの両方の物理的構造を含む多くの因子に依存する。
【０１２５】
反芻動物の食餌におけるデンプンの消化性、特に生デンプンの加水分解は、反芻動物用の飼料添加物としての、少なくとも１つのアルファ−１，４／１，６−グリコシドヒドロラーゼ（ＧＬＣＨ）を使用することによって改善できることが見出されており、前記ヒドロラーゼは、（ａ）ペプシン存在下のｐＨ６での酵素の活性と比較して、ペプシン存在下の３以下のｐＨで、少なくとも２０％の活性を有し、（ｂ）前記ヒドロラーゼは、第一胃、第二胃、第三胃および第四胃を含む、反芻動物の少なくとも２つの消化室で活性であり、かつ（ｃ）このヒドロラーゼは、反芻動物の消化室に存在する消化酵素と協働して、グルコース収率を増加させ、デンプン消化率を増加させる。
【０１２６】
さらに別の態様では、反芻動物におけるデンプン消化率を増加させ、グルコース収率を増加させ、乾物の消化を増加させ、かつ醗酵中のガス生成を増加させるための、（ｉ）反芻動物用の飼料添加物としての、少なくとも１つのＧＬＣＨ酵素（ここで、前記酵素は（ａ）ペプシン存在下のｐＨ６での酵素活性と比較して、ペプシン存在下の３以下のｐＨで、少なくとも２０％の活性を有し、（ｂ）前記酵素は第一胃、第四胃、および小腸を含む、反芻動物の３つの消化室の少なくとも２つの中で活性であり、かつ（ｃ）この酵素は膵臓アミラーゼと協働して、グルコース収率を増加させる）と、（ｉｉ）少なくとも１つのプロテアーゼとを含む酵素組成物を飼料に添加することを含む方法が記載されている。
【０１２７】
反芻動物の消化室に存在するいくつかの消化酵素であって、それらと共にヒドロラーゼが作用し、グルコース収率を増加させる酵としては、反芻動物の微生物デンプン分解酵素、ペプシンまたはパンクレアチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
ヒドロラーゼは、第一胃または第四胃で見出される条件に相当する条件下で、生デンプンを加水分解することができることが好ましい。
【０１２９】
ヒドロラーゼはアルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびアルファ−グルコシダーゼからなる群から選択することができるか、またはヒドロラーゼは、アルファ−アミラーゼおよびグルコアミラーゼからなる群から選択される。
【０１３０】
本明細書に記載の方法では、市販されているか否かにかかわらず、任意の好適なアルファ−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）を使用することができる。
【０１３１】
例示的なアルファ−アミラーゼには、野生型アルファ−アミラーゼ、その変異体もしくは断片、または例えば、ある微生物源からの触媒ドメインおよび別の微生物源からのデンプン結合ドメインに由来する遺伝子操作されたハイブリッドアルファ−アミラーゼが含まれるが、これらに限定されない。このようなハイブリッドを作製するのに有用であり得る、他のアルファ−アミラーゼの非限定的な例は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）およびフミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）に由来することができる。
【０１３２】
粒状デンプン加水分解活性（ＧＳＨ）を有するアルファ−アミラーゼ、またはＧＳＨ活性を有するように組換え操作されたアルファ−アミラーゼも挙げることができる。そのようなＧＳＨ活性は、これらの酵素が、デンプン、特に糖蜜等を含有する任意の飼料中に存在し得る任意の粒状（生）デンプンを、より多く分解するので有利である。ＧＳＨ活性を有するアルファ−アミラーゼとしては、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉ）（例えば、ＡｋＡＡ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（例えば、ＡｎＡＡ）、Ａ．クラバツス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）（ＡｃＡＡ）、Ａ．テレウス（Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ）（ＡｔＡＡ）、およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（例えば、ＴｒＡＡ）から得られるアルファ−アミラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３３】
アルファ−アミラーゼ、ＡｋＡＡ、ＡｃＡＡ、およびＡｔＡＡは、２つの炭水化物結合ドメインを有し、その一方は炭水化物結合モジュール／ドメインファミリー２０（ＣＢＭ２０またはＣＤ２０）に属し、他方は、時に二次結合部位（ＳＢＳ）と呼ばれる。ＳＢＳおよびＣＢＭは、１）酵素をその基質に向けて標的化すること、２）基質を活性部位溝に誘導すること、３）基質破壊、４）処理能を高めること、５）アロステリック調節、６）反応産物を通過させること、および／または７）親微生物の細胞壁に固着することによって機能するようである。
【０１３４】
これらの推定機能の多くは、ＣＢＭの非触媒結合に起因する機能と一致する。ＣＢＭとは対照的に、ＳＢＳは触媒部位に対して固定された位置を有し、それらを多かれ少なかれ特定の機能を取り込むのに適したものにする（Ｃｕｙｖｅｒｓ  Ｓ．，Ｄｏｒｎｅｚ  Ｅ．，Ｄｅｌｃｏｕｒ  Ｊ．Ａ．，Ｃｏｕｒｔｉｎ  Ｃ．Ｍ．（２０１２），Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，９３−１０７）。
【０１３５】
ＧＳＨ活性を有し得るいくつかの市販のアルファ−アミラーゼ、または炭水化物加水分解プロセスで使用される酵素は市販されており、例えば、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓから入手可能なＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）１２０−Ｌ、ＬＣおよびＳＣ  ＳＡＮ  ＳＵＰＥＲ（登録商標）、ＳＵＰＲＡ（登録商標）、ならびにＬＩＱＵＥＺＹＭＥ（登録商標）ＳＣ、ＶｅｒｅｎｉｕｍからのＦＵＥＬＺＹＭＥ（登録商標）ＬＦ、そしてＤａｎｉｓｃｏ，ＵＳ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎから入手可能なＣＬＡＲＡＳＥ（登録商標）Ｌ、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤ、ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＸＴＲＡ、ＧＣ６２６、およびＧＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９９７を参照されたい。
【０１３６】
他の実施形態では、アルファ−アミラーゼが、ｐＨ６．０でのその活性と比較して、ｐＨ３．０以下で２０％の活性を有する、酸に安定なアルファ−アミラーゼであることが望ましい。
【０１３７】
アルファ−アミラーゼは、アルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）；プルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４１）；シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１９）；シクロマルトデキストリナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５４）；トレハロース−６−リン酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９３）；オリゴ−アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１０）；マルトジェニックアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３３）；ネオプルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３５）；アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）；マルトテトラオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）；イソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）；グルコデキストラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．７０）；マルトヘキサオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９８）；マルトトリオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１１６）；分枝酵素（ＥＣ  ２．４．１．１８）；トレハロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１６）；４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．２５）；マルトペンタオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．−）；アミロスクラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．４）；スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．７）；マルト−オリゴシルトレハローストレハロヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１４１）；イソマルツロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１１）；マルト−オリゴシルトレハロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１５）；アミロ−アルファ−１，６グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３３）；およびアルファ−１，４−グルカン：リン酸アルファ−マルトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．１６）からなる群から選択することができる。
【０１３８】
本明細書に記載の方法では、市販されているか否かにかかわらず、任意の好適なアルファ−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）を使用することができる。
【０１３９】
グルコアミラーゼ（同意語、アミログルコシダーゼ（ＧＡ））（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）の好適性は、マルトースに対する活性に依存する。したがって、好適なグルコアミラーゼは、２％（ｗ／ｖ）マルトース、ｐＨ６．０および４０℃で分析したときに、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（ＴｒＧＡ）から得られたグルコアミラーゼの活性と比較して、タンパク質ベースで、マルトースに対して少なくとも２０％の活性を有するべきである。ＴｒＧＡは、デンプンからのグルコース生成能力のために、第一世代バイオエタノール処理において広く使用されている（２００８年の米国特許、米国特許第７４１３８７９Ｂ２号明細書、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ｇｌｕｃｏａｙｌａｓｅ  ａｎｄ  ｈｏｍｏｌｏｇ）。ＳＴＡＲＧＥＮ（商標）００２は、ＤｕＰｏｎｔによって販売されている、エタノール製造用の粒状デンプン加水分解酵素製品である。
【０１４０】
消化管の血流によって吸収されるのはグルコースであり、それに対応する二量体のマルトースではないので、マルトースのグルコースへの加水分解速度は動物栄養にとって重要である。
【０１４１】
したがって、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ（ＡｎＧＡ）は、マルトースに対する活性が低いために、本明細書に記載の方法で使用するには不適当なグルコアミラーゼである。グルコアミラーゼは、結合のための多くのサブサイトを活性部位の近くに有していることが知られている。サブサイト理論は、グルコアミラーゼの基質親和性を分析するために開発された。この理論の仮定の１つは、基質が生産モードまたは非生産モードのいずれかで酵素に結合できるということである。アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ（ＡｎＧＡ）の低い活性は、マルトースが非生産モードでＡｎＧＡに結合している可能性のためではないかと考えられる。（Ｓｗａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１９：１７１５−１７１８）。
【０１４２】
例示的なグルコアミラーゼには、野生型グルコアミラーゼ、その変異体もしくは断片、または例えば、ある微生物源からの触媒ドメインおよび別の微生物源からのデンプン結合ドメインに由来することができる、遺伝子操作されたハイブリッドグルコアミラーゼが含まれるが、これらに限定されない。ハイブリッドグルコアミラーゼは、例えば、ある生物からのＧＡ（例えば、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）ＧＡ）由来の触媒ドメイン、および異なる生物（例えば、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ＧＡ）由来のデンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）を有するグルコアミラーゼを含む。
【０１４３】
そのようなハイブリッドグルコアミラーゼは、ある生物からのＧＡ（例えば、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）ＧＡ）由来の触媒ドメイン、および異なる生物（例えば、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ＧＡ）由来のデンプン結合ドメイン（ＳＢＤ）を並べたペプチドを使用して作製することもできる。
【０１４４】
そのようなハイブリッドグルコアミラーゼの例としてはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）Ｇ１およびＧ２グルコアミラーゼ（例えば、Ｂｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１０９７−１１０２；国際公開第９２／００３８１号パンフレット、同第００／０４１３６パンフレットおよび米国特許第６，３５２，８５１号明細書を参照されたい）；アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（例えば、国際公開第８４／０２９２１号パンフレットを参照されたい）；アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼ（例えば、Ｈａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５：９４１−９４９を参照されたい）およびアスペルギルス・シロウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉ）（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：４９９−５０５；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．８：５７５−５８２；およびＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３０２：２７５−２８１を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
いくつかのグルコアミラーゼは、細菌、植物、および／または真菌によって内因的に発現される。例えば、いくつかのグルコアミラーゼは、糸状菌のいくつかの株によって産生される。
【０１４６】
グルコアミラーゼは粒状デンプン加水分解活性（ＧＳＨ）を有するか、またはＧＳＨ活性を有するように組換え操作されていることが好ましい。そのようなＧＳＨ活性は、これらの酵素が、デンプン、特に糖蜜等を含有する任意の飼料中に存在し得る任意の粒状（生）デンプンを、より多く分解するので有利である。
【０１４７】
本明細書に開示の方法で使用できるグルコアミラーゼは、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）株（（例えば、Ｔ．エメルソニイ（Ｔ．ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、Ｔ．レイセッタヌス（Ｔ．ｌｅｙｃｅｔｔａｎｕｓ）、Ｔ．デュポンティ（Ｔ．ｄｕｐｏｎｔｉ）およびＴ．テルモフィルス（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）グルコアミラーゼ（例えば、国際公開第９９／２８４８８号パンフレット；米国再発行特許第３２，１５３号明細書；米国特許第４，５８７，２１５号明細書を参照されたい））；トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の株（例えば、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））、および、配列番号４に対し少なくとも約８０％、約８５％、約９０％および約９５％の配列同一性を有し、米国特許出願公開第２００６−００９４０８０号明細書に開示されているグルコアミラーゼ；リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）の株（例えば、（Ｒ．ニベウス（Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ）およびＲ．オリザエ（Ｒ．ｏｒｙｚａｅ））；ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）の株およびフミコーラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の株、（（例えば、Ｈ．グリセア（Ｈ．ｇｒｉｓｅａ）（例えば、Ｂｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１０９７−１１０２；国際公開第９２／００３８１号パンフレット；同第００／０４１３６号パンフレット；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．９：４９９−５０５；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．６１：３０１−３０８；米国特許第４，５１４，４９６号明細書；同第４，０９２，４３４号明細書；同第４，６１８，５７９号明細書；Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：２１８−２２３および国際公開第２００５／０５２１４８号パンフレットの配列番号３を参照されたい））から得られるものを含む。いくつかの実施形態では、グルコアミラーゼは、国際公開第０５／０５２１４８号パンフレットに記載の配列番号３のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％および約９９％の配列同一性を有する。本発明で有用な他のグルコアミラーゼとしては、アテリア・ロルフシイ（Ａｔｈｅｌｉａ  ｒｏｌｆｓｉｉ）およびその変異体（例えば、ＷＯ０４／１１１２１８参照）およびペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）の複数の種（例えば、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））から得られるものが挙げられる。
【０１４８】
商業的に入手可能なグルコアミラーゼには、Ｓｐｉｒｉｚｙｍｅ  Ｕｌｔｒａ、Ｓｐｉｒｉｚｙｍｅ（登録商標）Ａｃｈｉｅｖｅ、Ｓｐｉｒｉｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｕｅｌ、Ｓｐｉｒｉｚｙｍｅ（登録商標）ＥＸＣＥＬ、ＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）、ＯＰＴＩＤＥＸ（登録商標）Ｌ−４００およびＧ  ＺＹＭＥ（登録商標）Ｇ９９０  ４Ｘ、ＧＣ４８０、Ｇ−ＺＹＭＥ（登録商標）４８０、ＦＥＲＭＧＥＮ（登録商標）１−４００（Ｄａｎｉｓｃｏ  ＵＳ，Ｉｎｃ，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、ＣＵ．ＣＯＮＣ（登録商標）（新日本化学工業株式会社、日本）、ＧＬＵＣＺＹＭＥ（登録商標）（天野エンザイム株式会社、日本（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９８：６６３−６７１を参照されたい））が挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用される二次酵素は、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）の一種によって産生されるグルコアミラーゼ（例えば、Ｅ．Ｃ．３．２．１．３）の３つの形態、すなわち、「Ｇｌｕｃ１」（ＭＷ  ７４，０００）、「Ｇｌｕｃ２」（ＭＷ  ５８，６００）および「Ｇｌｕｃ３」（ＭＷ  ６１，４００）を含む。
【０１４９】
任意の好適なアルファ−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２０）を、本明細書中に記載されているように使用することができる。
【０１５０】
上記のように、アルファ−グルコシダーゼは、その加水分解モードで、マルトース、イソマルトースおよびマルトサッカリドからグルコースを放出する。それはまた、グルコース単位を、グルコース、マルトース、イソマルトースおよびマルトサッカリドを含むアクセプター分子に、または合成モードにある任意の他の好適な分子に、特により高い基質濃度で、かつ高い生成物濃度で転移することができる。消化管では、生成した生成物グルコースが吸収により除去されるので、合成モードまたは転移反応は最小である。
【０１５１】
プロテアーゼ（ペプチダーゼまたはプロテイナーゼとも呼ばれる）は、ペプチド結合を切断することができる酵素である。プロテアーゼは複数回進化しており、異なるクラスのプロテアーゼが、完全に異なる触媒機構によって同一の反応を実施することができる。プロテアーゼは、動物、植物、細菌、古細菌およびウイルスに見出すことができる。
【０１５２】
タンパク質分解は、現在は６つの幅広い群、すなわちアスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸性プロテアーゼおよびメタロプロテアーゼに分類されている酵素により達成できる。
【０１５３】
好ましくは、プロテアーゼは酸性プロテアーゼであり、より好ましくは酸性真菌プロテアーゼである。
【０１５４】
本開示では、任意の酸性または中性プロテアーゼを使用することができる。例えば、酸性真菌プロテアーゼには、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、およびＭ．ミエヘイ（Ｍ．ｍｉｅｈｅｉ）などの、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、およびリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）から得られるプロテアーゼが含まれる。ＡＦＰは、細菌、植物および真菌源の異種または内因性タンパク質発現に由来することができる。ＡＦＰはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株から分泌されることが好ましい。
【０１５５】
例示的な酸性プロテアーゼには、野生型酸性プロテアーゼ、その変異体もしくは断片、または例えば、ある微生物源からの触媒ドメインおよび別の微生物源からのデンプン結合ドメインに由来する、遺伝子操作されたハイブリッド酸性アミラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５６】
別の態様では、プロテアーゼは、メタロプロテアーゼ（同意語、メタロペプチダーゼ）、より好ましくは細菌性メタロプロテアーゼとすることができる。
【０１５７】
別の態様では、本明細書に記載の、任意のグリコシドヒドロラーゼ活性を有する任意のポリペプチド（任意の融合タンパク質などを含む）をコードするヌクレオチド配列を含む、任意の単離された、組換えの、実質的に純粋な、合成的に得られた、または天然に存在しない核酸を、上で検討してきた。本明細書に記載の、任意のグリコシドヒドロラーゼをコードする、ポリヌクレオチドを含むベクターもまた興味深い。当業者には、ベクターが任意の好適な発現ベクターであってよいこと、およびベクターの選択は、それが挿入される細胞のタイプに依存して変動し得ることは明白であろう。好適なベクターには、ｐＧＡＰＴ−ＰＧ、ｐＲＡＸ１、ｐＧＡＭＤ、ｐＧＰＴ−ｐｙｒＧ１、ｐＣ１９４、ｐＪＨ１０１、ｐＥ１９４およびｐＨＰ１３（Ｈａｒｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｕｔｔｉｎｇ［ｅｄｓ．］，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ［１９９０］を参照されたい。Ｐｅｒｅｇｏ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ｉｎ  Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，［ｅｄｓ．］Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．［１９９３］，ｐｐ．６１５−６２４もまた参照されたい。）およびｐ２ＪＭ１０３ＢＢＩが含まれる。
【０１５８】
発現ベクターは、当該技術分野で知られた、好適な産生宿主の形質転換に有用な、任意の数のベクターまたはカセットの一つとすることができる。典型的には、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指令する配列、選択可能なマーカーおよび自律複製または染色体への組込みを可能にする配列を含むであろう。好適なベクターには、一般に、転写開始制御配列を有する遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域が含まれる。どちらの制御領域も、形質転換された産生宿主細胞の遺伝子および／または産生宿主にネイティブな遺伝子に相同の遺伝子に由来することができる（そのような制御領域がそのように由来する必要はないのだが）。
【０１５９】
転写終結を制御するＤＮＡ断片もまた、好ましい産生宿主細胞にネイティブな各種遺伝子に由来してよい。ある実施形態では、終結制御領域の包含は任意選択的である。ある実施形態では、発現ベクターは、好ましい宿主細胞に由来する終結制御領域を含む。
【０１６０】
発現ベクターは、産生宿主、特に微生物産生宿主の細胞中に含めることができる。産生宿主細胞は、真菌ファミリーまたは細菌ファミリー内で見出され、かつ広範囲の温度、ｐＨ値および溶媒耐性にわたって増殖する微生物宿主とすることができる。例えば、任意の細菌、藻類、例えば糸状菌などの真菌および酵母は、発現ベクターを好適に受け入れられるものと考えられる。
【０１６１】
産生宿主細胞内への発現ベクターの包含は、細胞内、細胞外または細胞の内側および外側の両方の組み合わせで存在できるよう、目的のタンパク質を発現させるのに使用し得る。細胞外発現は、細胞内発現により生成したタンパク質の回収方法よりも、醗酵生成物からの所望のタンパク質の回収を容易にする。
【０１６２】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ法を受けるのに好都合であり、ヌクレオチド配列の発現を導くことができる任意のベクター、例えばプラスミドもしくはウイルスであってよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される産生宿主とベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは、直鎖または閉じた環状のプラスミドであってよい。ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製からは独立している、例えば、プラスミド、染色体外要素、微小染色体または人工染色体であるベクターであってよい。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含有し得る。あるいは、ベクターは、産生宿主内に導入されると、ゲノム内に取り込まれ、それを既に組み込んでいる染色体と一緒に複製されるベクターであってよい。このようなベクターの、いくつかの非限定的な例は、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ（ＦＧＳＣ，＜ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔ＞）により提供されており、好適な発現ベクターおよび／または組込みベクターのさらなる例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，（１９８９）ｓｕｐｒａ、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８７）ｓｕｐｒａ、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌｅｔ  ａｌ．（１９９１）ｉｎ  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ（Ｅｄｓ．）ＭＯＲＥ  ＧＥＮＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＦＵＮＧＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．３９６−４２８および米国特許第５，８７４，２７６号明細書により提供されている。特に有用なベクターには、ｐＴＲＥＸ、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣＩ８、ｐＵＣＩ００およびｐＥＮＴＲ／Ｄが含まれる。細菌の細胞で使用する好適なプラスミドとしては、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）で複製可能なｐＢＲ３２２およびｐＵＣ１９、ならびに例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）で複製可能なｐＥ１９４が挙げられる。
【０１６３】
産生宿主細胞での生産に関して簡潔には、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，（１９８９）ｓｕｐｒａ、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８７）ｓｕｐｒａ、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌｅｔ  ａｌ．（１９９１）ｉｎ  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ（Ｅｄｓ．）ＭＯＲＥ  ＧＥＮＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＦＵＮＧＩ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）ｐｐ．７０−７６  ａｎｄ  ３９６−４２８；Ｎｕｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ＢｉｏＩ．４：２３０６−２３１５；Ｂｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）３０  ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１５８１−１５８５；Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｉｎ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ  ＦＵＮＧＩ，Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ（１９９２），Ｃｈａｐ．６；Ｋｉｎｇｈｏｒｎｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＡＰＰＬＩＥＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＯＦ  ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ  ＦＵＮＧＩ，Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｋｅｌｌｅｙｅｔ  ａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：４７５−４７９；Ｐｅｎｔｔｉｌａｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ６１：１５５−１６４；および米国特許第５，８７４，２７６号明細書を参照することができる。好適なベクターのリストは、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ（ＦＧＳＣ，ｗｗｗ  ａｔ  ｆｇｓｃ．ｎｅｔ）の中に見出すことができる。好適なベクターには、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｅｇａから入手できるものが含まれる。真菌宿主細胞で使用するための、好適な特定のベクターには、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ  １８、ｐＵＣ１００、ｐＤＯＮ（商標）２０１、ｐＤＯＮＲ（商標）２２１、ｐＥＮＴＲ（商標）、ｐＧＥＭ（登録商標）３ＺおよびｐＧＥＭ（登録商標）４Ｚが含まれる。
【０１６４】
ベクターシステムは、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムもしくはトランスポゾンに導入されるべき全ＤＮＡを一緒に含有している、２つ以上のベクターもしくはプラスミドであってよい。
【０１６５】
ベクターは、形質転換細胞の容易な選択を可能にするために、１つ以上の選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーは遺伝子であり、その産物は、バイオサイドまたはウイルス耐性などを提供する。選択マーカーの例としては、抗菌剤耐性を付与するマーカーが挙げられる。本発明では、ａｍｄＳ、ａｒｇＢおよびｐｙｒ４として当該技術分野で知られているマーカーを含む、栄養マーカーもまた利用される。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の形質転換に有用なマーカーは、当該技術分野において知られている（例えば、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ，ｃｈａｐｔｅｒ  ６，ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ，Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＤＳ  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ（１９９２）およびＫｉｎｇｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ，Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎを参照されたい）。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、レプリコン、さらに組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にする、抗生物質耐性をコードする遺伝子、および異種配列の挿入を可能にする、プラスミドの非必須領域内の固有の制限部位も含むであろう。選択された特定の抗生物質耐性遺伝子は重要ではない；当該技術分野で知られている多数の耐性遺伝子はいずれも好適である。原核生物の配列は、それらが好ましくはトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）内でのＤＮＡの複製もしくは組み込みを干渉しないように選択される。
【０１６６】
ベクターは、細胞のゲノムから独立して、産生宿主ゲノム内へのベクターの安定な組み込み、または産生宿主内でのベクターの自律的複製を許容する要素も含み得る。宿主細胞ゲノム内への組み込みのために、ベクターは、アスパラギン酸プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列、または相同もしくは非相同組換えによるゲノム内へベクターを安定に組み込むための任意の他の要素に依存し得る。
【０１６７】
自律的複製のために、ベクターは、ベクターが産生宿主内で自律的に複製することを可能にする、複製起源をさらに含むことができる。
【０１６８】
グリコシドヒドロラーゼをコードするヌクレオチド配列の複数のコピーを、その産生を増加させるために、産生宿主に挿入し得る。ヌクレオチド配列のコピー数の増加は、産生宿主のゲノム内へその配列の少なくとも１つの追加のコピーを組み込むことによって、または増幅可能な選択マーカー遺伝子を含めることによって得ることができ、そうすることで、適切な選択用薬剤の存在下で産生宿主細胞を培養することにより、ヌクレオチド配列の追加のコピーを選択することができる。
【０１６９】
任意のグリコシドヒドロラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクターは、ベクターが染色体構成要素として、または自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、産生宿主内に導入される。ヌクレオチド配列は産生宿主内で安定に維持され易いので、組み込みは、有利であると一般に考えられている。産生宿主染色体内へのベクターの組み込みは、上記で考察したように、相同もしくは非相同組換えにより引き起こし得る。
【０１７０】
例示的なベクターには、ｐＧＸＴ（公開ＰＣＴ出願、国際公開第２０１５／０１７２５６号パンフレットに記載されたｐＴＴＴｐｙｒ２ベクターと同一）が含まれる。さらにまた、バクテリオファージλおよびＭ１３、ならびにｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄなどのプラスミド、およびＭＢＰ、ＧＳＴおよびＬａｃＺなどの融合発現システムを含む標準的な細菌性発現ベクターを挙げることができる。単離に便利な方法を提供するために、組換えタンパク質にエピトープタグ、例えば、ｃ−ｍｙｃを添加することもできる。
【０１７１】
好適な発現ベクターおよび／または組込みベクターの例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）ｓｕｐｒａ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ（Ｅｄｓ．）Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ，（１９９１）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．７０−７６  ａｎｄ  ｐｐ．３９６−４２８およびその引用文献；米国特許第５，８７４，２７６号明細書およびＦｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ，（ＦＧＳＣ，ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔ．）で提供される。有用なベクターは、ＰｒｏｍｅｇａおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手し得る。いくつかの特定の、有用なベクターには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１００、ｐＤＯＮ（商標）２０１、ｐＥＮＴＲ（商標）、ｐＧＥＮ（登録商標）３ＺおよびｐＧＥＮ（登録商標）４Ｚが含まれる。しかし、同等に機能し、当該技術分野で知られている、または知られるようになる他の形態の発現ベクターもまた使用できる。したがって、本明細書で開示したＤＮＡ配列を発現させる際には、多種多様な宿主／発現ベクターの組み合わせを使用できる。有用な発現ベクターは、例えば、ＳＶ４０の既知の各種誘導体、公知の細菌性プラスミドなどの、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメント、例えばｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭｂ９、ｐＵＣ１９およびそれらの誘導体を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のプラスミド、広い宿主範囲のプラスミド、例えば、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、例えばファージラムダの数多くの誘導体、例えばＮＭ９８９および他のＤＮＡファージ、例えばＭ１３および糸状一本鎖ＤＮＡファージ、２．ｍｕプラスミドなどの酵母プラスミドまたはそれらの誘導体からなり得る。
【０１７２】
産生宿主は、細菌、真菌および藻類などの任意の好適な微生物を選択することができる。典型的には、その選択は、目的のグリコシドヒドロラーゼをコードする遺伝子に依存するであろう。
【０１７３】
好適な産生宿主の例には、細菌、真菌、植物細胞などが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、産生宿主はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼニュラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（特にＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（特にＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ））、植物細胞および／またはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、またはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の胞子から選択され得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示した方法および組成物に、組換えグリコシドヒドロラーゼ酵素を使用し得る。好ましい態様では、本明細書に記載のグリコシドヒドロラーゼを含む食料または飼料添加物が提供される。
【０１７５】
所望のグリコシドヒドロラーゼを大量に発現する、細菌および糸状菌（例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）またはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ））細胞系列を生成するには、多数の標準の遺伝子導入法を使用することができる。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）のセルラーゼ産生株にＤＮＡコンストラクトを導入する公開された方法のいくつかには、Ｌｏｒｉｔｏ，Ｈａｙｅｓ，ＤｉＰｉｅｔｒｏ  ａｎｄ  Ｈａｒｍａｎ，（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３４９−３５６；Ｇｏｌｄｍａｎ，ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ  ａｎｄ  Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ，（１９９０）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１７：１６９−１７４；およびＰｅｎｔｔｉｌａ，Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ，Ｒａｔｔｏ，Ｓａｌｍｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｓ，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ６：１５５−１６４が含まれ、また、米国特許第６，０２２，７２５号明細書、同第６，２６８，３２８号明細書およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ，Ｌｅｏｎｇ  ａｎｄ  Ｂｅｒｋａ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９２）ｐｐ  １２９−１４８のＮｅｖａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ」も参照されたく；アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）については、Ｙｅｌｔｏｎ，Ｈａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４が含まれ、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）については、Ｂａｊａｒ，Ｐｏｄｉｌａ  ａｎｄ  Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８２０２−８２１２が含まれ；ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）についてはＨｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫおよびＦｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｂａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １４９：１６２３−１６３２（２００３）が含まれ、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）についてはＢｒｉｇｉｄｉ，ＤｅＲｏｓｓｉ，Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ，Ｒｉｃｃａｒｄｉ  ａｎｄ  Ｍａｔｔｅｕｚｚｉ，（１９９０）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．５５：１３５−１３８）が含まれる。
【０１７６】
しかし、宿主細胞内へ外来ヌクレオチド配列を導入する手順としてよく知られたものであれば、いかなる手順も使用することができる。これらには、リン酸カルシウム遺伝子導入法、ポリブレン法、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、バイオリスティック法、リポソーム法、マイクロインジェクション法、プラズマベクター法、ウイルスベクター法、およびクローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは宿主細胞内への他の外来遺伝子物質を導入するための他のよく知られた方法の使用が含まれる（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。米国特許第６，２５５，１１５号明細書に記載のアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介遺伝子導入法も有用である。必要なのは、使用される特定の遺伝子組換え手順が、その遺伝子を発現することのできる宿主細胞内へ、少なくとも１つの遺伝子を成功裡に導入できるものであるということだけである。
【０１７７】
使用した宿主細胞に応じて、転写後および／または翻訳後修飾がなされ得る。転写後および／または翻訳後修飾の１つの非限定的な例は、ポリペプチドの「クリッピング」または「切断」である。例えば、これは、酵素活性を有する成熟ペプチドへと、さらなる翻訳後プロセシングに供されるプロペプチドの場合のように、グリコシドヒドロラーゼに不活性または実質的不に不活性な状態から活性状態への移行をもたらし得る。別の例では、このクリッピングは、本明細書に記載の成熟グリコシドヒドロラーゼの生成をもたらし、さらにＮ末端またはＣ末端アミノ酸を除去して、酵素活性を保持する切断型の生成をもたらし得る。
【０１７８】
転写後または翻訳後修飾の他の例としては、ミリストイル化、グリコシル化、切断、脂質化およびチロシン、セリンまたはトレオニンのリン酸化が挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、タンパク質が受け得る転写後または翻訳後修飾のタイプは、タンパク質がその中で発現する宿主生物に左右され得ることを理解するであろう。
【０１７９】
アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の形質転換方法は、例えば、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１４７０−１４７４；Ｂｅｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）ｉｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｓ．Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ）；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉ．９：９９１−１００１；Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｃｕｒｒｏ  Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６；Ｐｅｎｔｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ６１：１５５−１６４）；ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：８３９−８４２；米国特許第６，０２２，７２５号明細書；同第６，２６８，３２８号明細書および欧州特許第２３８  ０２３号明細書に記載がある。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）での異種タンパク質の発現は、米国特許第６，０２２，７２５号明細書；同第６，２６８，３２８号明細書；Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌｅ（１９９１）；Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：２２７−２３３；Ｈａｒｋｋｉｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．７：５９６−６０３；欧州特許第２４４，２３４号明細書；同第２１５，５９４；およびＮｅｖａｌａｉｎｅｎｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ」，ｉｎ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＭＹＣＯＬＯＧＹ，Ｅｄｓ．Ｌｅｏｎｇ  ａｎｄ  Ｂｅｒｋａ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９２）ｐｐ．１２９−１４８）に記載がある。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）株の形質転換については、国際公開第９６１００７８７号パンフレットおよびＢａｊａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８２０２−２８２１２を参照されたい。
【０１８０】
発現ベクターが細胞内に導入された後、遺伝子導入細胞または形質転換細胞は、プロモーター配列の制御下、遺伝子の発現に好都合な条件下で培養される。一部の例では、プロモーター配列は、ｃｂｈ１プロモーターである。大バッチの形質転換細胞は、Ｉｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９７（「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８−１３０６）の記載のように培養できる。
【０１８１】
宿主トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）の一種の菌株内へのＤＮＡの取込みは、カルシウムイオン濃度に左右される。一般に、約１０〜５０ｍＭのＣａＣｌ２が取込み液中で使用される。追加の好適な化合物として、緩衝系、例えば、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４；１ｍＭのＥＤＴＡ）または１０ｍＭのＭＯＰＳ、ｐＨ６．０およびポリエチレングリコールが挙げられる。ポリエチレングリコールは、細胞膜を融合させると考えられており、したがって、培地の内容物がトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）の一種の菌株細胞質内に送達されることを許容すると考えられる。この融合は、宿主染色体内に組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数のコピーをそのまま残すことが多い。
【０１８２】
通常、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の一種の形質転換は、典型的には１０５〜１０７／ｍＬ、特に２×１０６／ｍＬの密度で透過性処理を受けているプロトプラストまたは細胞を使用する。体積１００μＬのこれらのプロトプラストまたは細胞を、適切な溶液（例えば、
１．２Ｍのソルビトールおよび５０ｍＭのＣａＣｌ２）中で、所望のＤＮＡと混合し得る。一般には、高濃度のＰＥＧが取込み溶液に加えられる。プロトプラスト懸濁液には０．１〜１体積の２５％のＰＥＧ４０００を加えることができる；しかし、プロトプラスト懸濁液には約０．２５体積を加えることが有用である。例えば、ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウムなどの添加物もまた、形質転換を促進するために取込み溶液に加えられてよい。他の真菌宿主細胞に対しても類似の手順を利用できる。例えば、米国特許第６，０２２，７２５号明細書を参照されたい。
【０１８３】
細胞を培養するのに使用する培地は、宿主細胞を増殖させ、本明細書に記載した任意のグリコシドヒドロラーゼを発現させるのに適した任意の従来の培地であり得る。好適な培地および培地成分は、商業的供給業者から入手可能であるか、公開されたレシピ（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログに記載されたような）にしたがって調製し得る。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、組換え微生物の使用済み全醗酵ブロスの調製は、目的の酵素の発現をもたらす、当該技術分野で知られた任意の培養法を使用して達成することができる。したがって、醗酵は、好適な培地中で、かつ酵素の発現または単離が可能な条件下における、振盪フラスコ培養、実験室用または産業用醗酵槽内での、小規模または大規模醗酵（連続、バッチ、流加バッチもしくは固体醗酵を含む）を含むと理解することができる。本明細書では、用語「使用済み全醗酵ブロス」は、培養培地、細胞外タンパク質（例えば、酵素）および細胞バイオマスを含む醗酵物質の未分画内容物であると定義される。用語「使用済み全醗酵ブロス」は、さらに当該技術分野でよく知られた方法を使用して溶解または透過化されている細胞バイオマスも含むと理解される。
【０１８５】
宿主細胞は、本明細書に記載の任意のグリコシドヒドロラーゼを発現させる、好適な条件下で培養し得る。酵素の発現は、酵素が連続的に生成されるように構成的であってよく、または発現を開始するためには刺激を必要とする誘導性であってよい。誘導性発現の場合には、タンパク質生成は、必要とされる場合は、例えば、培養培地への誘導物質、例えば、デキサメタゾンまたはＩＰＴＧまたはソホロースの添加によって開始することができる。
【０１８６】
ポリペプチドはまた、例えばＴＮＴ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ウサギ網状赤血球系などのインビトロの無細胞系内で組換え技術により産生することができる。発現宿主はまた、好気性条件下で、その宿主に適切な培地中で培養することができる。宿主のニーズおよび所望のアルファ−グルコシダーゼの生成に応じて、例えば、約２５℃〜約７５℃（例えば、３０℃〜４５℃）の、その宿主にとって適切な温度で産生が行われている状況で、振盪または撹拌と通気の組み合わせを提供することができる。培養は、約１２〜約１００時間以上（および、例えば２４〜７２時間などの、それらの間の任意の時間値）にわたって行うことができる。典型的には、培養ブロスはここでも、本明細書に記載のグルコシドヒドロラーゼのような、目的の酵素の生成に対して、宿主が必要とする培養条件に応じて、約４．０〜約８．０のｐＨにある。その後は、産生宿主および形質転換細胞を、従来型の栄養培地中で培養することができる。形質転換宿主細胞のための培養培地は、プロモーターを活性化するため、および形質転換細胞を選択するために適宜修飾されてよい。例えば温度、ｐＨなどの特定の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞のために使用される条件であってよく、当業者には明らかであろう。さらに、好ましい培養条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、（１９８２）ｓｕｐｒａ；Ｋｉｅｓｅｒ，Ｔ，ＭＪ．Ｂｉｂｂ，ＭＪ．Ｂｕｔｔｎｅｒ，ＫＦ  Ｃｈａｔｅｒ，およびＤ．Ａ．Ｈｏｐｗｏｏｄ（２０００）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｗｉｃｈ  ＵＫ；Ｈａｒｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒＢａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙなどの科学文献および／またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）からの科学文献に見出し得る。
【０１８７】
当該技術分野においてよく知られている醗酵方法はいずれも、本明細書に記載の形質転換または誘導真菌株を醗酵させるために好適に使用することができる。
【０１８８】
古典的なバッチ醗酵は、培地の組成が醗酵の開始時に設定され、醗酵中にその組成が変更されない閉鎖系である。醗酵の開始時に、培地には所望の生物が植菌される。言い換えると、全醗酵工程は、全体を通して醗酵系にいかなる成分の追加もせずに行われる。
【０１８９】
あるいは、バッチ醗酵は、炭素源の添加に関して「バッチ」として適格である。さらに、醗酵工程を通して例えばｐＨや酸素濃度などの因子を制御するための頻回な試みが実施される。典型的には、バッチ系の代謝産物およびバイオマス組成は、醗酵が停止する時点まで常に変化する。バッチ培養物内では、細胞は静的誘導期を経由して高増殖対数期へ進行し、最終的には増殖率が減少もしくは停止する静止期に進む。未処理のまま放置すると、静止期にある細胞は最終的には死滅することになる。一般に、対数期にある細胞は、生成物の大量生産に貢献する細胞である。標準バッチ系に対する好適な変形形態は、「流加バッチ醗酵」系である。典型的なバッチ系のこの変形形態では、醗酵の進行につれて基質が徐々に加えられる。流加バッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を抑制することが知られているとき、および／または醗酵培地中に限定量の基質を有することが所望される場合に有用である。フェドバッチ系内で実際の基質濃度を測定することは困難であるので、このためｐＨ、溶存酸素およびＣＯ２などの排気ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加バッチ醗酵は、当該技術分野においてよく知られている。
【０１９０】
連続醗酵は、また別の既知の醗酵方法である。連続醗酵は、定義された醗酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、プロセシングのために等量の馴化培地が同時に除去される開放系である。連続醗酵では、一般に、培養物は一定密度に維持され、細胞は主として対数期増殖が維持される。連続醗酵は、細胞増殖および／または生成物濃度に影響を及ぼす１つ以上の因子の調節を可能にする。例えば、炭素源もしくは窒素源などの制限栄養因子を一定比率に維持することができ、他の全てのパラメーターの調節を可能にする。他の系では、増殖に影響を及ぼす多数の因子は連続的に変化することができるが、培地濁度によって測定される細胞濃度は一定に維持される。連続系は、定常状態の増殖条件を維持しようとする。したがって、流出培地に起因する細胞の減少は、醗酵中の細胞増殖率に対してバランスが取られなければならない。連続醗酵工程のための栄養分および増殖因子を調節する方法ならびに生成物生成速度を最大化するための手法は、工業微生物学の分野でよく知られている。
【０１９１】
分離技術および濃縮手法は当該技術分野において知られており、従来方法を使用して本発明のアルファ−グルコシダーゼポリペプチドを含む濃縮液またはブロスを調製することができる。
【０１９２】
醗酵後には醗酵ブロスが得られ、酵素含有溶液を得るために、従来の分離手法により微生物細胞および残留醗酵原料を含む各種懸濁固体を除去する。ろ過、遠心分離、精密ろ過、回転真空ドラムろ過、限外ろ過、遠心分離後に行われる限外ろ過、抽出またはクロマトグラフィーなどが一般に使用される。
【０１９３】
時には、回収を最適化するために、目的のポリペプチドを含む溶液またはブロスを濃縮することが望ましい場合がある。未濃縮溶液またはブロスの使用は、典型的には、濃縮または精製酵素沈降物を回収するためのインキュベーション時間を増加させるであろう。
【０１９４】
酵素含有溶液は、所望の酵素濃度が得られるまで、従来の濃縮手法を使用して濃縮することができる。酵素含有溶液の濃縮は、本明細書で考察した手法のいずれかによって達成し得る。濃縮および精製方法の例としては、回転真空ろ過および／または限外ろ過が挙げられるがそれらに限定されない。
【０１９５】
本明細書に記載のグリコシドヒドロラーゼは、本明細書に記載したように、当該技術分野で知られている各種試験を使用して活性について試験することができる。例えば、活性は、酵素を糖タンパク質またはオリゴ糖および必要に応じて水と混合することによって試験できる。活性は、反応生成物の分析によって測定することができ、この反応生成物は、例えば、薄層クロマトグラフィーによって、または単糖およびオリゴ糖分析用のカラムを使用するＨＰＬＣによって、グルコース定量化のためのグルコースオキシダーゼ−ペルオキシダーゼおよび一般的な還元糖分析用の３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）試薬を使用した結合酵素分析によって、分離および可視化することができる反応生成物である（以下の実施例を参照されたい）。
【０１９６】
さらに、本明細書に記載のグリコシドヒドロラーゼは、カプセル化されているか否かにかかわらず、粒状であり得る。
【０１９７】
本明細書に記載のグリコシドヒドロラーゼは、１つ以上の追加の酵素と組み合わせて使用し得ると考えられる。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の酵素は、エステラーゼ、ホルムアミダーゼ、−ガラクトシダーゼ、例えば、アルファまたはベータ−ガラクトシダーゼ、エキソグルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンドグルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、例えば、アルファまたはベータ−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペプチダーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、タウマチン、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ（Ｄ−ヘキソース：（３／４オキシドレダクターゼ、ＥＣ  １．１．３．５）、酸性ホスファターゼおよび／もしくはその他、またはそれらの組み合わせを含む。これらには、例えば、組成物または飼料の粘度を調節する酵素が含まれる。
【０１９８】
本明細書で論じる、任意のＧＬＣＨ酵素、好ましくはアルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびアルファ−グルコシダーゼは、直接供給される微生物と組み合わせて使用し得る。ＤＦＭのカテゴリーには、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸菌および酵母が含まれる。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、胞子を形成する独特のグラム陽性桿菌である。これらの胞子は極めて安定性であり、熱、水分およびｐＨ範囲などの環境条件に耐えることができる。これらの胞子は、動物に摂取されると活性な栄養細胞に成長し、食事およびペレット飼料に使用することができる。乳酸菌は、病原体に対して拮抗性である乳酸を生成するグラム陽性球菌である。乳酸菌は、ある程度熱に敏感であると思われるので、それらはペレット化飼料では使用されない。乳酸菌の種類には、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）が含まれる。酵母は細菌ではない。これらの微生物は、植物群の真菌に属する。
【０１９９】
本明細書で論じる、任意のＧＬＣＨ酵素、好ましくはアルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびアルファ−グルコシダーゼは、アシドーシスを減じるため、または第一胃の原生動物を減じるために、好適な獣医学的薬剤と組み合わせて使用し得る。
【０２００】
このような獣医学的薬物は、モネンシンおよびその誘導体などのイオノフォアを含み得る。
【０２０１】
毒素結合剤は飼料中の毒素に結合し、動物をそれらの悪影響から保護するように設計される。したがって、本明細書で論じた任意のＧＬＣＨ酵素はまた、毒素結合剤または毒素吸着剤と組み合わせて使用してもよい。毒素結合剤の例は、異なる水和ナトリウムカルシウムアルミノケイ酸塩（ＨＳＣＡＳ）、ベントナイト、ゼオライト、クレー、酵母細胞壁および毒素分解酵素を含むが、これらに限定されないマイコトキシン結合剤である。
【０２０２】
別の態様では、本明細書中で論じた任意のＧＬＣＨ酵素はまた、ハーブ、エセンシャルオイル、および凝固防止剤と組み合わせて使用し得る。
【０２０３】
エセンシャルオイルは、植物由来の揮発性芳香化合物を含有する濃縮された疎水性液体である。エセンシャルオイルは揮発性油、エーテル性油、エーテロレア（ａｅｔｈｅｒｏｌｅａ）としても知られ、または単に、それらが抽出された植物の油（例えば、クローブの油）としても知られる。油は植物の香り、すなわち油が得られた植物の特徴的な香りの「エッセンス」を含むという意味で「エセンシャル」である。本明細書で使用する、エセンシャルという用語は、必須アミノ酸または必須脂肪酸という用語（所与の生体によって栄養的に必要とされるのでそう呼ばれている）のように必須を意味するものではない。エセンシャルオイルは、一般に、蒸留によって、しばしば水蒸気の使用によって抽出される。他のプロセスとしては、圧搾、溶媒抽出、アブソルートオイル抽出、樹脂タッピング、およびコールドプレスが挙げられる。それらは、香料、化粧品、石けんおよび他の製品中で使用され、食料および飲料の風味付け、ならびに香料および家庭用クリーニング製品の香り付けに使用される。
【０２０４】
動物飼料は、例えばトウモロコシ、コムギ、モロコシ、大豆、カノーラ、ヒマワリなどの植物材料、もしくはこれらの植物材料の混合物、または反芻動物のための植物性タンパク質源を含み得る。成長、飼料摂取量および飼料効率などの動物性能パラメーターだけではなく、さらに改善された均質性は、動物畜舎のアンモニア濃度を低下させ、したがって福祉を改善し、かつ動物の健康状態が改善されるであろうと考えられる。より詳しくは、本明細書では、「動物性能」は、飼料効率および／または動物の体重増加によって、および／または飼料転換率によって、および／または飼料中の栄養素の消化率（例えば、アミノ酸消化率）および／または飼料中の可消化エネルギーもしくは代謝エネルギーによって、および／または窒素の保持によって、および／または動物の壊疽性腸炎の悪影響を回避する能力によって、および／または対象の免疫応答によって決定することができる。
【０２０５】
用語「動物飼料」、「飼料」、「飼料原料」および「家畜飼料」は、互換的に使用され、ａ）穀物類、例えば、小穀物（例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギおよびそれらの組み合わせ）および／または大粒穀類、例えばトウモロコシもしくはソルガム；ｂ）穀物類からの副産物、例えば、トウモロコシグルテンミール、可溶性物質添加乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）（特に、トウモロコシをベースとする可溶性物質添加乾燥穀類蒸留粕（ｃＤＤＧＳ）、ふすま、コムギミドリングス、コムギショーツ、米ヌカ、籾殻、カラスムギ殻、パーム核および柑橘パルプ；ｃ）大豆、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピナス、エンドウマメ、ソラマメ、ワタ、カノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉、ジャガイモタンパク、ホエイ、コプラ、ゴマなどの起源から得られたタンパク質；ｄ）植物源および動物源から得られた油脂類；ならびに／あるいはｅ）ミネラル類およびビタミン類を含む群から選択される１つ以上の飼料材料を含むことができる。
【０２０６】
飼料、機能性飼料などの飼料として、またはその調製において使用する場合、本発明の酵素もしくは飼料添加用組成物は、栄養学上許容される担体、栄養上許容される希釈剤、栄養上許容される賦形剤、栄養上許容されるアジュバント、栄養上許容される有効成分の１つ以上と共に使用し得る。例えば、タンパク質、ペプチド、スクロース、ラクトース、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム、ソルビン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、ギ酸マグネシウム、ソルビン酸マグネシウム、次亜塩素酸ナトリウム、メチルパラベンおよびプロピルパラベンからなる群から選択される少なくとも１つの成分を挙げることができよう。
【０２０７】
１つの好ましい実施形態では、本発明の酵素または飼料添加用組成物は、飼料原料を形成するために飼料成分と混合される。本明細書では、用語「飼料成分」は、飼料原料の全部または一部を意味する。飼料原料の一部は、飼料原料の１つの構成要素または飼料原料の２つ以上、例えば、２つもしくは３つもしくは４つ以上の構成要素を意味し得る。一実施形態では、用語「飼料成分」は、プレミックスもしくはプレミックス構成要素を包含する。好ましくは、飼料は、家畜飼料またはそのプレミックス、配合飼料またはそのプレミックスであってよい。
【０２０８】
本発明による飼料添加用組成物は、配合飼料、配合飼料成分と混合してよく、または配合飼料のプレミックスに、または家畜飼料、家畜飼料成分もしくは家畜飼料のプレミックスに混合してよい。
【０２０９】
本明細書に記載の任意の「飼料原料」は、ａ）穀物類、例えば、小穀物（例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、ライコムギおよびそれらの組み合わせ）および／または大粒穀物、例えばトウモロコシもしくはソルガム；ｂ）穀物類からの生成物、例えば、トウモロコシグルテンミール、ウエットケーキ（特に、トウモロコシをベースとするウエットケーキ）、穀類蒸留粕（ＤＤＧ）（特に、トウモロコシをベースとする穀類蒸留粕（ｃＤＤＧ））、可溶性物質添加乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）（特に、トウモロコシをベースとする可溶性物質添加乾燥穀類蒸留粕（ｃＤＤＧＳ））、ふすま、コムギミドリングス、コムギショーツ、米ヌカ、籾殻、カラスムギ殻、パーム核および柑橘パルプ；ｃ）大豆、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピナス、エンドウマメ、ソラマメ、ワタ、カノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉骨粉、ジャガイモタンパク、ホエイ、コプラ、ゴマなどの起源から得られたタンパク質；ｄ）植物源および動物源から得られた油脂類；ｅ）ミネラル類およびビタミン類を含む群から選択される１つ以上の飼料材料を含み得る。
【０２１０】
本明細書では、用語「家畜飼料」は、（動物が自身で探し回らなければならないというよりむしろ）動物に提供される任意の食料を意味する。家畜飼料は、切断された植物を包含する。さらに、家畜飼料には、サイレージ、圧縮およびペレット化飼料、油および混合飼料ならびにさらに胚芽穀粒およびマメ類が含まれる。
【０２１１】
家畜飼料は、トウモロコシ（トウモロコシ）、アルファルファ（ルーサン）、オオムギ、ミヤコグサ、アブラナ、チョーモエリア（Ｃｈａｕ  ｍｏｅｌｌｉｅｒ）、ケール、ナタネ（カノーラ）、ルタバガ（スウェーデンカブ）、カブ、クローバー、タチオランダゲンゲ、ムラサキツメクサ、サブタレニアンクローバー、シロツメクサ、ウシノケグサ、スズメノチャヒキ、キビ、カラスムギ、ソルガム、大豆、木（木の牧草用に短く刈り込んだ木の芽）、コムギおよびマメ類から選択される１つ以上の植物から得ることができる。
【０２１２】
用語「配合飼料」は、ミール、ペレット、ナッツ、ケーキまたはクランブルの形態にある市販飼料を意味する。配合飼料は、各種原材料および添加物からブレンドし得る。これらのブレンドは、対象動物の特定の要件にしたがって配合される。
【０２１３】
配合飼料は、１日に必要な栄養素の全部を提供する完全飼料、食料の一部（タンパク質、エネルギー）を提供する濃縮物、またはミネラル類およびビタミン類などの追加の微量栄養素だけを提供するサプリメントであってよい。
【０２１４】
配合飼料で使用される主成分は、トウモロコシ、コムギ、カノーラミール、ナタネミール、ルーピン、大豆、ソルガム、カラスムギおよびオオムギを含む飼料用穀物である。
【０２１５】
好適には、本明細書で言及したプレミックスは、微量成分、例えば、ビタミン類、ミネラル類、化学保存料、抗生物質、醗酵生成物および他の必須成分から構成される組成物であり得る。プレミックスは、通常は市販食料にブレンドするための好適な組成物である。
【０２１６】
一実施形態では、飼料原料は、トウモロコシ、ＤＤＧＳ（例えば、ｃＤＤＧＳ）、コムギ、ふすま、またはそれらの任意の組み合わせを含む、またはそれらからなる。
【０２１７】
一実施形態では、飼料成分は、トウモロコシ、ＤＤＧＳ（例えば、ｃＤＤＧＳ）、コムギ、ふすま、またはそれらの組み合わせであり得る。一実施形態では、飼料原料は、トウモロコシ、ＤＤＧＳ（例えば、ｃＤＤＧＳ）またはそれらの組み合わせを含む、またはそれらからなる。
【０２１８】
本明細書に記載の飼料原料は、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％または少なくとも６０重量％のトウモロコシおよび大豆ミールまたはトウモロコシおよび高脂肪大豆、またはコムギミールもしくはヒマワリミールを含有し得る。
【０２１９】
例えば、飼料原料は、約５〜約４０％のトウモロコシＤＤＧＳを含有し得る。家禽類に対しては、飼料原料は、平均して約７〜１５％のトウモロコシＤＤＧＳを含有し得る。ブタに対しては、飼料原料は、平均して５〜４０％のトウモロコシＤＤＧＳを含有し得る。飼料原料は、さらに単一穀粒としてのトウモロコシを含有し得、その場合には、飼料原料は約３５％〜約８０％のトウモロコシを含み得る。
【０２２０】
混合穀粒を含む、例えばトウモロコシおよびコムギを含む飼料原料では、飼料原料は、少なくとも１０％のトウモロコシを含み得る。
【０２２１】
これに加えて、またはこれに代えて、飼料原料はまた、高線維飼料原料を提供するために、少なくとも１つの高線維飼料物質および／または少なくとも１つの高線維飼料材料の少なくとも１つの副産物を含み得る。高線維飼料材料の例としては、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、穀粒類からの副産物、例えばトウモロコシグルテンミール、トウモロコシグルテン飼料、ウエットケーキ、穀類蒸留粕（ＤＤＧ）、可溶性物質添加乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）、ふすま、コムギミドリングス、コムギショーツ、米ヌカ、籾殻、カラスムギ殻、パーム核および柑橘パルプが挙げられる。一部のタンパク質源も、ヒマワリ、ルーピン、ソラマメおよびワタなどの起源から得られる高線維タンパク質であるとみなし得る。一態様では、本明細書に記載の飼料原料は、例えば可溶性物質添加乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）、特にｃＤＤＧＳ、ウエットケーキ、穀類蒸留粕（ＤＤＧ）、特にｃＤＤＧ、ふすま、およびコムギからなる群から選択される少なくとも１つの高線維物質、および／またはその少なくとも１つの高線維飼料材料の少なくとも１つの副産物を含む。一実施形態では、本発明の飼料原料は、例えば可溶性物質添加乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）、特にｃＤＤＧＳ、ふすまおよびコムギからなる群から選択される少なくとも１つの高線維物質および／またはその少なくとも１つの高線維飼料材料の少なくとも１つの副産物を含む。
【０２２２】
飼料は、以下のペレット、ナッツもしくは（ウシ用）ケーキ；作物または作物残渣：トウモロコシ、大豆、ソルガム、カラスムギ、オオムギコプラ、ムギワラ、籾殻、サトウダイコン廃棄物；魚粉；肉骨粉ミール；糖蜜；油かすおよび圧搾ケーキ；オリゴ糖；保存飼料植物：サイレージ；海草；全粒または圧砕、製粉などにより調製された種子および穀物；発芽穀物およびマメ類；酵母抽出物を含む配合飼料およびプレミックスの１つ以上であり得る。
【０２２３】
本明細書で使用される用語「飼料」は、いくつかの実施形態ではペットフードを包含する。ペットフードは、ペットによる消費が意図される、ドッグフードまたはキャットフードなどの、植物または動物物質である。ドッグフードおよびキャットフードなどのペットフードは、犬用粗挽き穀物などの乾燥形態、またはウェットな缶詰形態のいずれかであり得る。キャットフードは、アミノ酸のタウリンを含有することができる。
【０２２４】
動物飼料はまた、フィッシュフードを含むことができる。フィッシュフードは、通常、飼育魚の健康を良好に保つために必要な多量養素、微量元素およびビタミン類を含有する。フィッシュフードは、フレーク、ペレットもしくはタブレット形態であり得る。その一部が急速に沈降するペレット形態は、大型魚または水域の底で餌を取る種のために使用されることが多い。一部のフィッシュフードはまた、観賞魚の発色を人工的に改善するために、ベータカロテンまたは性ホルモンなどの添加物も含有する。
【０２２５】
さらに別の態様では、動物飼料は、バードフードを包含する。バードフードは、バードフィーダーで使用する餌と、ペットの鳥に給餌するために使用する餌の両使用の餌を含む。典型的には、バードフードは種々の種子を含むが、スエット（牛脂もしくは羊脂）もまた包含し得る。
【０２２６】
本明細書では、用語「接触した」は、本明細書に記載のようなグリコシドヒドロラーゼ
（またはグリコシドヒドロラーゼを含む組成物）の、生成物（例えば、飼料）への間接的または直接的適用をいう。使用し得る適用方法の例としては、飼料添加用組成物を含む物質中で生成物を処理する方法、飼料添加用組成物を生成物と混合することにより直接適用する方法、飼料添加用組成物を生成物の表面に噴霧する方法、または生成物を飼料添加用組成物の調製物中に浸漬する方法が挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態では、本発明の飼料添加用組成物は、好ましくは、生成物（例えば、飼料原料）と混合される。あるいは、飼料添加用組成物は、飼料原料のエマルションまたは原料成分に含め得る。これは、組成物が性能上の利点を付与することを可能にする。
【０２２７】
用語「熱的に安定な」は、規定の温度へ加熱する前に添加物中で存在した／活性であった酵素の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％または９８％の酵素が、室温に冷却された後もまだ存在する／活性であることを意味する。好ましくは、規定温度への加熱前に添加剤中に存在し、活性であった酵素成分の少なくとも約８０％が、室温への冷却後も依然として存在し、活性である。
【０２２８】
本明細書に記載のグリコシドヒドロラーゼ（または本明細書に記載のような、そのようなグリコシドヒドロラーゼを含む酵素組成物）を均質化して粉末を製造することもできる。
【０２２９】
代替の、好ましい実施形態では、本明細書に記載のグリコシドヒドロラーゼ（または本明細書に記載のグリコシドヒドロラーゼを含む酵素組成物）は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０４４９６８号パンフレット（ＴＰＴ顆粒と呼ぶ）または同第１９９７／０１６０７６号パンフレットまたは同第１９９２／０１２６４５号パンフレットに記載されているように、顆粒に調製することができる。「ＴＰＴ」は、熱防護技術を意味する。
【０２３０】
別の態様では、飼料添加用組成物が顆粒に調製される場合、顆粒は、タンパク質コアにコーティングされた水和障壁塩を含む。このような塩コーティングの利点は、耐熱性の改善、貯蔵安定性の改善、および、そうしないと酵素に対して有害効果を有する他の飼料添加物からの保護である。好ましくは、塩コーティングに使用される塩は、０．２５超の水分活性、または２０℃で６０％超の一定湿度を有する。いくつかの実施形態では、塩コーティングは、Ｎａ２ＳＯ４を含む。
【０２３１】
本明細書に記載のグリコシドヒドロラーゼ（または本明細書に記載のグリコシドヒドロラーゼを含む酵素組成物）を調製する方法はまた、粉末をペレット化するさらなる工程をも含み得る。粉末は、当該技術分野で知られている他の成分と混合し得る。粉末、または粉末を含む混合物は、ダイスを通過させることができ、得られたストランドは各種長さの好適なペレットに切断される。
【０２３２】
任意選択により、ペレット形成の前に、ペレット化工程は、蒸気処理、またはコンディショニング段階を含み得る。粉末を含む混合物は、コンディショナー、例えば、蒸気噴射装置を備えるミキサー内に配置することができる。混合物は、コンディショナー内で例えば６０〜１００℃などの規定温度まで加熱されるが、典型的温度は、７０℃、８０℃、８５℃、９０℃または９５℃であろう。滞留時間は、秒単位から分単位、さらに時間単位にまでも変動することがある。例えば、５秒間、１０秒間、１５秒間、３０秒間、１分間、２分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間および１時間。本明細書に記載のグリコシドヒドロラーゼ（または本明細書に記載のグリコシドヒドロラーゼを含む酵素組成物）は、任意の適切な試料材料への添加に好適であることが理解されよう。
【０２３３】
当業者であれば、異なる動物は異なる飼料原料を必要とすること、および同じ動物であっても、その動物の飼育目的に応じて異なる飼料原料を必要とし得ることを理解できるであろう。
【０２３４】
任意選択により、飼料原料は、例えば、カルシウムなどの追加のミネラル類および／または追加のビタミン類も含有し得る。いくつかの実施形態では、飼料原料はトウモロコシ大豆ミールミックスである。
【０２３５】
飼料原料は、典型的には、原料物質が最初に好適な粒経に粉砕され、その後適切な添加物と混合される飼料粉砕機中で製造される。その後、飼料原料はマッシュまたはペレットとして生産され得るが、後者は典型的には、温度を目標レベルにまで上昇させ、次に飼料をダイスに通して特定のサイズのペレットを製造するという方法を含む。ペレットは冷却させられる。続いて、脂肪などの液体添加物および酵素を添加し得る。飼料原料の生産は、特に少なくとも蒸気の使用を含み得る好適な手法によって、ペレット化の前に押出し、または膨張を含む追加の工程も包含することができる。
【０２３６】
飼料原料は、家禽類（例えば、ブロイラー、産卵ニワトリ、ブロイラー種鳥、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、水鳥）およびブタ（全年齢カテゴリー）などの単胃動物、ウシ（例えば、乳牛もしくは雄牛（子ウシを含む））、ウマ、ヒツジなどの反芻動物、ペット（例えば、イヌ、ネコ）または魚（例えば、無胃魚、有胃魚、淡水魚、例えばサケ、タラ、マスおよびコイ、例えばコイ（ｋｏｉ  ｃａｒｐ）、シーバスなどの海水魚、ならびにエビ、イガイおよびホタテガイなどの甲殻類）のための飼料原料であり得る。好ましくは、飼料原料はブタ用である。
【０２３７】
飼料添加用組成物および／またはそれを含む飼料原料は、任意の好適な形態で使用し得る。飼料添加用組成物は、固体もしくは液体調製物またはそれらの代替物の形態で使用し得る。固体調製物の例としては、水和型、スプレー乾燥型または凍結乾燥型であり得る粉末、ペースト、ボーラス、カプセル、ペレット、錠剤、ダストおよび顆粒が挙げられる。液体調製物の例としては、限定されないが、水溶液、有機溶液または水性有機溶液、懸濁液およびエマルションが挙げられる。
【０２３８】
いくつかの適用例では、飼料添加用組成物は、飼料と混合し得、または飲料水に入れて投与し得る。
【０２３９】
飼料添加用組成物は、本明細書で教示するグリコシドヒドロラーゼを、飼料として許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤と混合する工程、および（任意選択により）包装する工程を含む方法によって作製し得る。
【０２４０】
飼料原料および／または飼料添加用組成物は、少なくとも１種のミネラルおよび／または少なくとも１種のビタミンと組み合わせ得る。このように得られた組成物は、本明細書ではプレミックスと呼び得る。飼料原料は、少なくとも０．０００１重量％の飼料添加物を含み得る。好適には、飼料原料は、少なくとも０．０００５重量％；少なくとも０．００１０重量％；少なくとも０．００２０重量％；少なくとも０．００２５重量％；少なくとも０．００５０重量％；少なくとも０．０１００重量％；少なくとも０．０２０重量％；少なくとも０．１００重量％；少なくとも０．２００重量％；少なくとも０．２５０重量％；少なくとも０．５００重量％の飼料添加物を含み得る。
【０２４１】
好ましくは、食料または飼料添加用組成物は、さらに少なくとも１種の生理学上許容される担体を含み得る。生理学上許容される担体は、好ましくは、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギまたはコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、およびそれらの混合物の少なくとも１つから選択される。さらなる実施形態では、食料または飼料添加物は、金属イオンキレート剤をさらに含み得る。金属イオンキレート剤は、ＥＤＴＡまたはクエン酸から選択し得る。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、食料もしくは飼料添加用組成物は、本明細書に記載のグリコシドヒドロラーゼを少なくとも０．０００１ｇ／ｋｇ、０．００１ｇ／ｋｇ、少なくとも０．０１ｇ／ｋｇ、少なくとも０．１ｇ／ｋｇ、少なくとも１ｇ／ｋｇ、少なくとも５ｇ／ｋｇ、少なくとも７．５ｇ／ｋｇ、少なくとも１０．０ｇ／ｋｇ、少なくとも１５．０ｇ／ｋｇ、少なくとも２０．０ｇ／ｋｇ、少なくとも２５．０ｇ／ｋｇのレベルで含む。いくつかの実施形態では、食料添加物または飼料添加物は、食料材料または飼料材料に添加される場合、飼料材料が１〜５００ｍｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、２〜５０ｍｇ／ｋｇまたは２〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲で本明細書に記載のグリコシドヒドロラーゼを含むようなレベルで含む。本発明のいくつかの実施形態では、食料材料または飼料材料は、飼料材料または食料材料１ｋｇ当たり、少なくとも１００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１００００、２００００、３００００、５００００、１０００００、５０００００、１００００００または２００００００単位のグリコシドヒドロラーゼを含む。
【０２４３】
範囲には、上記で考察した下限および上限範囲の任意の組み合わせを含むことができるが、それらに限定されない。
【０２４４】
本明細書に記載の任意のグリコシドヒドロラーゼおよび本明細書に記載の組成物を含む配合物は、配合物が確実に活性酵素を含むような、任意の好適な方法で作製し得る。そのような配合物は、液体、乾燥粉末または顆粒である得る。好ましくは、飼料添加用組成物は、飼料ペレット上または飼料ペレット中に添加するのに好適な固体形態である。
【０２４５】
乾燥粉末または顆粒は、高剪断造粒、ドラム造粒、押出し、球形化、流体層凝集、流体層スプレー乾燥などの当業者であれば既知の手段によって調製し得る。
【０２４６】
本明細書に記載のグリコシドヒドロラーゼおよび組成物は、コーティング、例えば、カプセル化され得る。一実施形態では、コーティングは酵素を熱から防護し、熱防護材であると見なすことができる。一実施形態では、コーティングは酵素を低ｐＨから防護する。Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）は、使用できるコーティング材料の１つの例である。
【０２４７】
本明細書に記載の飼料添加用組成物は、国際公開第２００７／０４４９６８号パンフレット（ＴＰＴ顆粒と呼ばれる）または同第１９９７／０１６０７６号パンフレットまたは同第１９９２／０１２６４５号パンフレット（これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載の乾燥粉末または顆粒に調製することができる。
【０２４８】
一実施形態では、動物飼料はコア；活性物質；および少なくとも１つのコーティングを含む飼料組成物の顆粒に調製され得、その顆粒の活性物質は、ａ）飼料ペレット化工程、ｂ）蒸気加熱飼料前処理工程、ｃ）貯蔵、ｄ）非ペレット化混合物中の成分としての貯蔵、ならびにｅ）微量ミネラル、有機酸、還元糖、ビタミン類、塩化コリン、および酸性または塩基性の飼料基剤ミックスまたは飼料プレミックスを生じる化合物から選択される少なくとも１つの化合物を含む飼料基剤ミックスまたは飼料プレミックス中の成分としての貯蔵の１つ以上から選択された条件後に、少なくとも５０％の活性、少なくとも６０％の活性、少なくとも７０％の活性、少なくとも８０％の活性を維持する。
【０２４９】
顆粒に関して、少なくとも１つのコーティングは、顆粒の少なくとも５５ｗ／ｗ％を構成する水分水和材料を含み得、かつ／または少なくとも１つのコーティングは２種のコーティングを含み得る。これら２種のコーティングは、水分水和コーティングおよび水分障壁コーティングであり得る。いくつかの実施形態では、水分水和コーティングは、顆粒の２５ｗ／ｗ％〜６０ｗ／ｗ％であり得、水分障壁コーティングは顆粒の２ｗ／ｗ％〜１５ｗ／ｗ％であり得る。水分水和コーティングは、無機塩、スクロース、デンプンおよびマルトデキストリンから選択され得、水分障壁コーティングは、ポリマー、ガム、ホエイおよびデンプンから選択され得る。
【０２５０】
顆粒は、飼料ペレット化工程を使用して製造することができ、飼料前処理工程は、８５℃〜９５℃などの７０℃〜９５℃で数分間まで実施され得る。
【０２５１】
飼料添加用組成物は、コア；活性物質、すなわち顆粒が成分である場合に貯蔵後および蒸気加熱ペレット化工程の後で少なくとも８０％の活性を維持する顆粒の活性物質；水分障壁コーティング；および顆粒の少なくとも２５ｗ／ｗ％である水分水和コーティングを含む動物飼料用の顆粒に調製し得、この顆粒は蒸気加熱ペレット化工程の前で０．５未満の水分活性を有する。
【０２５２】
顆粒は、ポリマーおよびガムから選択された水分障壁コーティングを有し得、水分水和材料は無機塩であり得る。水分水和コーティングは、顆粒の２５ｗ／ｗ％〜４５ｗ／ｗ％であり得、水分障壁コーティングは顆粒の２ｗ／ｗ％〜１０ｗ／ｗ％であり得る。
【０２５３】
顆粒は、８５℃〜９５℃で数分間まで実施し得る蒸気加熱ペレット化工程を使用して生成し得る。
【０２５４】
あるいは、本組成物は、消費に好適な液体調製物の形態であり、そのような液体消費は以下の緩衝液、塩、ソルビトールおよび／またはグリセロールの１つ以上を含有する。
【０２５５】
また、飼料添加用組成物は、粉砕コムギなどの担体基質上に、例えば酵素をスプレーすることによって調製し得る。
【０２５６】
一実施形態では、飼料添加用組成物は、プレミックスとして調製し得る。ほんの一例ではあるが、プレミックスは、１種以上のミネラル類および／または１種以上のビタミン類などの１種以上の飼料成分を含み得る。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、グリコシドヒドロラーゼは、生理学的に受容可能なキャリア中に加えられるであろう。好適な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子などの、大きくてゆっくりと代謝される高分子であり得る。医薬上許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩などの鉱酸塩、または酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩などの有機酸の塩を使用できる。治療用組成物中の医薬上許容される担体は、さらに水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体を含有し得る。さらに、そのような組成物中には、湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝物質などの補助物質が存在し得る。そのような担体は、医薬組成物を患者が摂取するための錠剤、ピル剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤および懸濁剤として調製することを可能にする。いったん調整されると、本発明の組成物は、反芻動物に直接投与することができる。
【０２５８】
本明細書で開示した組成物および方法の非限定的な例としては、以下が挙げられる：
１．反芻動物用の飼料への飼料添加物として、少なくとも１つのアルファ−１，４／１，６−グリコシドヒドロラーゼ（ＧＬＣＨ）を添加することを含む、デンプン消化率およびグルコース収率を増加させる方法であって、前記ヒドロラーゼは、（ａ）ペプシン存在下のｐＨ６でのヒドロラーゼの活性と比較して、ペプシン存在下の３以下のｐＨで、少なくとも２０％の活性を有し、（ｂ）前記ヒドロラーゼは第一胃、第四胃、および小腸を含む、反芻動物の３つの消化室の少なくとも２つの中で活性であり、かつ（ｃ）このヒドロラーゼは反芻動物の消化室に存在する消化酵素と協働して、デンプン消化率およびグルコース収率を増加させる方法。
２．少なくとも１つのＧＬＣＨ酵素は、第一胃または第四胃で見出される条件に相当する条件下で、生デンプンを加水分解することができる、実施例１のヒドロラーゼ。
３．前記ヒドロラーゼは、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびアルファ−グルコシダーゼからなる群から選択される、実施例１のヒドロラーゼ。
４．前記ヒドロラーゼは、アルファ−アミラーゼおよびグルコアミラーゼからなる群から選択される、実施例２のヒドロラーゼ。
５．アルファ−アミラーゼは、ＧＨ１３ファミリーのメンバーであるか、またはアルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）；プルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４１）；シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１９）；シクロマルトデキストリナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５４）；トレハロース−６−リン酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９３）；オリゴ−アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１０）；マルトジェニックアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３３）；ネオプルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３５）；アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）；マルトテトラオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）；イソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）；グルコデキストラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．７０）；マルトヘキサオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９８）；マルトトリオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１１６）；分枝酵素（ＥＣ  ２．４．１．１８）；トレハロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１６）；４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．２５）；マルトペンタオース生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．−）；アミロスクラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．４）；スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．７）；マルト−オリゴシルトレハローストレハロヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１４１）；イソマルツロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１１）；マルト−オリゴシルトレハロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１５）；アミロ−アルファ−１，６グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３３）；およびアルファ−１，４−グルカン：リン酸アルファ−マルトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．１６）からなる群から選択される、実施形態３または４のヒドロラーゼ。
６．グルコシダーゼは、ＧＨ  １３もしくはＧＨ３１ファミリーのメンバーであるか、またはアルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）；アルファ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２２）；アルファ−マンノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２４）；アルファ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８４）；スクラーゼ−イソマルターゼ（ＥＣ  ３．２．１．４８）（ＥＣ  ３．２．１．１０）；アルファ−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１７７）；アルファ−グルカンリアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．１３）；イソマルトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．−）；オリゴ糖アルファ−１，４−グルコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１６１）；スルホキノボシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．−）からなる群から選択される、実施例３または４のヒドロラーゼ。
７．グルコアミラーゼは、ＧＨ１５ファミリーのメンバーであるか、またはグルコアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３）；グルコデキストラナーゼ．（ＥＣ  ３．２．１．７０）；アルファ−トレハラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２８）；およびデキストランデキストリナーゼ（ＥＣ  ２．４．１．２）からなる群から選択される、実施形態３または４のヒドロラーゼ。
８．反芻動物におけるデンプン消化率を増加させ、グルコース収率を増加させ、乾物の消化を増加させ、かつ醗酵中のガス生成を増加させる方法であって、（ｉ）反芻動物用の飼料添加物としての、少なくとも１つのＧＬＣＨ酵素（前記酵素は（ａ）ペプシン存在下、ｐＨ６での酵素活性と比較して、ペプシン存在下、３以下のｐＨで、少なくとも２０％の活性を有し、（ｂ）前記酵素は第一胃、第四胃、および小腸を含む、反芻動物の３つの消化室の少なくとも２つの中で活性であり、かつ（ｃ）この酵素は膵臓アミラーゼと協働して、グルコース収率を増加させる）と、（ｉｉ）少なくとも１つのプロテアーゼとを含む酵素組成物を飼料に添加することを含む方法。
９．少なくとも１つのＧＬＣＨ酵素は、生デンプンを加水分解することができる、実施形態８の酵素組成物。
１０．前記ＧＬＣＨ酵素は、アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼおよびアルファ−グルコシダーゼからなる群から選択される、実施例８の酵素組成物。
１１．前記酵素は、アルファ−アミラーゼおよびグルコアミラーゼからなる群から選択される、実施例９の酵素組成物。
１２．少なくとも１つのＧＬＣＨ酵素は、アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１）；プルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．４１）；シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１９）；シクロマルトデキストリナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．５４）；トレハロース−６−リン酸ヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９３）；オリゴ−アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１０）；マルトジェニックアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３３）；ネオプルラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１３５）；アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）；マルトテトラオース−生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）；イソアミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．６８）；グルコデキストラナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．７０）；マルトヘキサオース−生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．９８）；マルトトリオース−生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１１６）；分枝酵素（ＥＣ  ２．４．１．１８）；トレハロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１６）；４−アルファ−グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．２５）；マルトペンタオース−生成アルファ−アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．−）；アミロスクラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．４）；スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．７）；マルト−オリゴシルトレハローストレハロヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１４１）；イソマルツロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１１）；マルト−オリゴシルトレハロースシンターゼ（ＥＣ  ５．４．９９．１５）；アミロ−アルファ−１，６−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３３）；およびアルファ−１，４−グルカン：リン酸アルファ−マルトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．９９．１６）からなる群から選択される、実施形態１０または１１の酵素組成物。
１３．グルコシダーゼは、アルファ−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２０）；アルファ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２２）；アルファ−マンノシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．２４）；アルファ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．８４）；スクラーゼ−イソマルターゼ（ＥＣ  ３．２．１．４８）（ＥＣ  ３．２．１．１０）；アルファ−キシロシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１７７）；アルファ−グルカンリアーゼ（ＥＣ  ４．２．２．１３）；イソマルトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．−）；オリゴ糖アルファ−１，４−グルコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．１６１）；スルホキノボシダーゼ（ＥＣ  ３．２．１．−）からなる群から選択される、実施形態１０または１１の酵素組成物。
１４．グルコアミラーゼはＧＨ１５グリコシルヒドロラーゼファミリーから選択される、実施形態１０または１１の酵素組成物。
１５．プロテアーゼは、酸性プロテアーゼまたは中性メタロプロテアーゼからなる群から選択される、実施形態８の酵素組成物。
１６．プロテアーゼは、真菌性アスパラギン酸プロテアーゼまたは細菌性中性メタロプロテアーゼである、実施形態１５の酵素組成物。
【実施例】
【０２５９】
本明細書で他に特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ  ＥＤ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、本開示で使用する用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
【０２６０】
以下の実施例で本開示をさらに定義する。これらの実施例は、ある実施形態を示しているが、単に説明のためにのみ提供されていると理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者であれば、本開示の本質的な特徴を確証することができ、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適応させるために様々な変化や修飾を加えることができる。
【０２６１】
実施例１
以下の実施例で使用する材料
表１に掲げたタンパク質試料を以下の実施例で使用した。表１は、酵素の種類、供給源生物（既知である場合）、およびサンプルについての内部供給源または商業的供給源、ならびに配列についての特許参考文献を示す。
【０２６２】
【表１】
2019534691.tif 000003
【０２６３】
実施例２
酸性アスパラギン酸プロテアーゼ豚ペプシンおよびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＡＦＰの存在下におけるＡｋＡＡアミラーゼによるトウモロコシ粉の加水分解
反応混合物は、１ｍＬのトウモロコシ粉スラリー（２０ｗ／ｗ％、ｐＨ３．２）、ＡｋＡＡ（２０９ｍｇ／ｍＬ）２０μＬ、ブタペプシン（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７０００、１００００Ｕ／ｍＬ−水）５０μＬ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）からのＡＦＰ（５ｍｇ／ｍＬ）５μＬおよび５０μＬ、ならびに最終容量１．０７ｍＬまでの水を含有した。反応は、２００ｒｐｍで振盪しながら４０℃で５時間行った。反応の最後に、３０μＬの反応上清を０．２３ｍＬの水と混合し、０．２２μｍメンブランフィルターを通してろ過した。濾液（４０μＬ）を、Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｎ  ＨＰＬＣカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により、０．６ｍＬ／分の流量、７８℃で１５分間、水を溶離剤として使用し、ＨＰＬＣ分析に供した。グルコースおよびマルトースのピークを、インラインＲＩ（示差屈折率）検出器を用いて検出し、ピーク面積はＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェア（Ｄｉｏｎｅｘ）を用いて、製造業者の指示に従って積分した。
【０２６４】
反芻動物に対する飼料酵素の活性は、それが第四胃および小腸で機能することが想定されている場合、ペプシンによって影響を受けるべきではない。
【０２６５】
図１は、ペプシンおとびＡＦＰのいずれも、ｐＨ３．２でのトウモロコシ粉からのグルコース（Ｇ１）およびマルトース（Ｇ２）の放出に負の影響を与えなかったことを示す。ｐＨ３．２は、特に飼料の摂取後に第四胃で起こり得るｐＨ値の１つである（Ｃｏｎｓｔａｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｕｃｋｌｉｎｇ  ｃｏｗ’ｓ  ｍｉｌｋ  ｏｒ  ｍｉｌｋ  ｒｅｐｌａｃｅｒ  ｏｎ  ａｂｏｍａｓａｌ  ｌｕｍｉｎａｌ  ｐＨ  ｉｎ  ｄａｉｒｙ  ｃａｌｖｅｓ，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１９：９７−１０２）。実際、ＡｋＡＡを含有する反応混合物へペプシンおよびＡＦＰを添加すると、Ｇ１の放出がそれぞれ４および２２％増加した。ペプシン単独では、トウモロコシ粉からのＧ１およびＧ２の放出はほとんどまたは全くなかったが、ＡＦＰ単独ではＧ１をいくらか放出したが、Ｇ２は放出しなかった。ＡｋＡＡを含有する反応混合物に添加されたＡＦＰは、Ｇ１の放出を増加させただけでなく、Ｇ２よりもＧ１の量を増加させ、ＡＦＰはグルコース、すなわち単量体（Ｇ１）の放出に、より有利であることを示した。動物が血流中に直接吸収できるのはＧ１である。
【０２６６】
第一胃および第四胃に見られる条件に相当する条件下では、２つのアスパラギン酸プロテアーゼが、顆粒周りのタンパク質および顆粒内に存在するタンパク質を加水分解することにより、コーンスターチ顆粒をＡｋＡＡにより接近させ得たと考えられる（Ｍｕ−Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６．Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｒｃｈ  ｇｒａｎｕｌｅｓ  ｏｆ  ｍａｉｚｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ  ｇｒａｎｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｓｔａｒｃｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｉ  ａｎｄ  ｓｔａｒｃｈ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  ＩＩ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１１：８２１−８２９；Ｍｕ−Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｓｕｒｆａｃｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｚｅｉｎ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｓｔａｒｃｈ  ｇｒａｎｕｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍａｉｚｅ  ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ，ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｂｙ  ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ｇｒａｎｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１６：１５６３−１５７１）。ペプシンは、胃および第四胃で産生される主要なタンパク質分解酵素である。それは、内部のペプチド結合を切断することによってタンパク質を消化するのであるが、その最適なｐＨは２〜４である。ＡＦＰはＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来の細胞外エンドペプチダーゼであり、その最適ｐＨ範囲は３〜４．５である（表１）。
【０２６７】
実施例２および他の実施例で使用したトウモロコシは、特に明記されていない限り、８８．２％の乾物（ＤＭ）、９．３％の粗タンパク質（ＣＰ）、２．０％の酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）、アミラーゼ（ａＮＤＦ）で処理した６．６％の中性デタージェント繊維、７８．５％の非繊維性炭水化物（ＮＦＣ）、８９．０％の全消化性栄養素（ＴＤＮ）からなるものであった。
【０２６８】
実施例３
ルーメン液の存在下におけるＡｋＡＡアミラーゼの安定性
動物飼料酵素添加物が反芻動物に有効であるためには、酵素が、第一胃液中および第一胃条件下でかなり高い安定性を有することが重要である。表２のデータは、グルコースおよびマルトースの放出がルーメン液量の増加によって有意に影響されなかったことから、ＡｋＡＡは４０℃で４．５時間インキュベートされた無細胞ルーメン液の存在下で安定であることを示している。
【０２６９】
使用したＡｋＡＡは２０９ｍｇ／ｍＬの総タンパク質濃度を有し、ｐＨを３．２に調整した８％（ｗ／ｗ）のスラリーで、コメデンプン顆粒（Ｓｉｇｍａ  Ｓ７２６０）を水中で調製した。プレインキュベーション混合物と混合した後、ｐＨはｐＨ５．３になった。牧草（４１．６６％）、全大麦（１４．７９％）、トウモロコシ（１６．７８％）、乾燥テンサイパルプおよびサトウダイコン残渣ケーキ（３．０２％）、粉砕大麦（６．６６％）、菜種粉（４．８８％）、大豆粉（４．４６％）、Ｋｏｍｉｘ（ビタミンおよびミネラルのミックス、０．２％）、Ｒｏｅｄ  Ｓｕｐｌｅｘ  Ｃａｐｓ（ビタミンミックス０．０５％）、Ｓｕｐｌｅｘ  Ｅ‐５０００（ビタミンＥおよびセレン、０．０３％）、チョーク（０．０７％）、塩（０．０６％）および水（７．３３％）の混合飼料を与えた乳牛から採取した、無細胞ルーメン液はｐＨ６．１であった。ルーメン液は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａａｒｈｕｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂｌｉｃｈｅｒｓ  Ａｌｌｅ  ２０，ＤＫ−８８３０  Ｔｊｅｌｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から提供された。反応で放出された糖を、実施例２に記載したように、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｎ  ＨＰＬＣカラムを用いたＨＰＬＣで分析した。
【０２７０】
【表２】
2019534691.tif 000004
【０２７１】
実施例４
パンクレアチンに対するＡｋＡＡの安定性、およびグルコース収率の増加およびマルトトリオース収率の減少におけるパンクレアチンとＡｋＡＡの併用の効果
反応混合物は、０、５、１０および２０μＬのブタパンクレアチン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７５４５、０．１％ＮａＣｌ中で調製した２５ｍｇ／ｍＬ）、ＡｋＡＡ（２０９ｍｇ／ｍＬ）２０μＬ、５ｍＭのＣａＣｌ２を有する０．１ＭのＭｅｓ（ｐＨ６．７）６０μＬ、Ｔｗｅｅｎ８０（０．０１ｗ／ｖ％）を含有した。０．１％のＮａＣｌ溶液を加えて、最終反応容量を０．１２ｍＬとした。反応混合物を４０℃で３時間インキュベートし、次いで、基質である１．５ｍＬのトウモロコシ粉スラリー（１０ｗ／ｗ％）を添加し、さらに４０℃で１３時間インキュベートした。得られた上清を８．３３倍に希釈し、実施例２に記載したように、４０μＬをＲＩ検出器によりグルコース、マルトースおよびマルトトリオースについてＨＰＬＣで分析した。
【０２７２】
図２は、ＡｋＡＡが第一胃小腸の条件をシミュレートする条件下で活性であったことを示す。それは、試験したブタパンクレアチン（Ｐａｎ）の３種の用量で、付加的効果および補完的効果の両方を示した。ＡｋＡＡにＰａｎを含有させると、グルコースおよびマルトースの産生を増加させ、そしてマルトリオースの生成／蓄積を減少させるが、これは、グルコースが直接吸収され得る一方で、マルトースは腸粘膜アルファ−グルコシダーゼ（マルターゼ）によって加水分解され得るので、栄養学的に有利である（Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｈｕｍａｎ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍａｌｔａｓｅ−ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｓｕｃｒａｓｅ−ｉｓｏｍａｌｔａｓｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３０７６−３０８１）。パンクレアチンは、動物、特に単胃動物および反芻動物の主要な消化酵素カクテルである。それは、ブタ膵臓の外分泌細胞によって産生される、トリプシン、アミラーゼおよびリパーゼ、リボヌクレアーゼ、ならびにプロテアーゼなどの酵素成分を含有する。このように、パンクレアチンは、タンパク質、デンプンおよび脂肪を加水分解することを可能にする酵素の組み合わせである。
【０２７３】
実施例５
ペプシンおよびパンクレアチンの存在下におけるトウモロコシ粉に対するＡｔＡＡアミラーゼの活性
ペプシン反応のために、反応混合物は、６０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）中で調製された１０％（ｗ／ｗ）（Ｓｉｇｍａ  Ｓ４１２６）のコーンスターチスラリー０．１ｍＬ、ペプシン１０μＬ（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７０００、水中１００００Ｕ／ｍＬ）、およびＡｔＡＡアミラーゼ０．６μＬ（１６．７６ｍｇ／ｍＬ）を有した。４０℃で３時間、反応を行った。サンプルを遠心分離した。上清を希釈し、ろ過し、実施例２に記載したように、糖分析のためにＲＩ検出器を用いてＨＰＬＣで分析した。パンクレアチン反応は、コーンスターチスラリーを０．１ＭのＭｅｓ（ｐＨ６．７）中で調製し、５μＬの２５ｍｇ／ｍＬブタパンクレアチン（Ｐａｎ）（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７５４５、０．１％ＮａＣｌに溶解）を添加した以外は、ペプシン反応と同じであった。
【０２７４】
図３は、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）アルファ−アミラーゼＡｔＡＡ（ＡｔＡｍｙ１）が、ｐＨ２．５のペプシンまたはｐＨ６．７のパンクレアチンのいずれの存在下で試験した場合にも活性であったことを示す。さらに、ＡｔＡＡおよびパンクレアチンは、すべてのマルトトリオースを、動物によって直接吸収され得るグルコースに基本的に変換する際に補完的な効果を示した。
【０２７５】
実施例６
第一胃液の存在下におけるＡｋＡＡおよびＡｃＡＡアミラーゼによるコーンスターチの加水分解
２４０μＬの細胞を含まない第一胃液を１０μＬの酵素試料、すなわちＡｋＡＡ（２０９ｍｇ／ｍＬ）、ＡｃＡＡ（１７２ｍｇ／ｍＬ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＧＡ（ＴｒＧＡ）およびトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＡＦＰ（２２３ｍｇ／ｍＬ）を含むＡｋＡＡ、またはＴｒＧＡ変異体ＣＳ４およびＡＦＰ（１２５ｍｇ／ｍＬ）（表１）を含むＡｃＡＡと混合し、４０℃で４時間インキュベートし、続いて、５ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ４．５）を含有する０．１Ｍ酢酸塩に溶解した２５０μＬのコーンスターチ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ４１２６）スラリーを添加し、さらに３０分間インキュベートした。反応の最後に、反応試料をろ過し、上清を用い、Ｙｕら（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ，１９９７．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  １，５−ａｎｈｙｄｒｏ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−１，４−ｇｌｕｃａｎ  ｌｙａｓｅ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０５：７３−８２）の方法を少し修正して、アルカリ性３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）試薬を使用した全還元糖検出分析を行った。すなわち、希釈した反応試料１０μＬを、１２０μＬのＤＮＳ試薬を含む９６ウェルＰＣＲプレートに移した。プレートを９５℃で５分間インキュベートし、続いて５分間の冷却で２０℃とし、その後、１００μＬのこれらの混合物を新しい９６ウェルプレートに移し、これを使用して分光光度計により５５０ｎｍの光学密度を測定した。
【０２７６】
図４は、第一胃液中でインキュベーションを行った後で試験した４つの酵素試料すべてで、トウモロコシ加水分解活性が極めて僅かに減少したことを示す。トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＧＡおよびその変異体（ＣＳ４）ならびにトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＡＦＰ酵素の存在は、ＡｋＡＡおよびＡｃＡＡアミラーゼ試料の両者によって触媒される基質の全加水分解に有益な効果を有した。アミラーゼ／グルコアミラーゼ／プロテアーゼの両方の酵素混合物は、全タンパク質の２９：７０：１の比で調製した。図４に示すように、アミラーゼＡｋＡＡ、ＡｃＡＡおよびそれらとグルコアミラーゼＴｒＧＡおよびＣＳ４ならびにアスパラギン酸プロテアーゼＡＦＰとの混合物は、第一胃液中で４０℃、４時間のプレインキュベーションを行い、その後、コーンスターチと共に４０℃、ｐＨ４．５で３０分間インキュベートした後では、全活性の１３％未満が失われた（未処理の混合物と比較した場合）。
【０２７７】
シミュレートした第一胃条件下におけるこれらの結果は、これら２つのアミラーゼ、ならびにグルコアミラーゼおよびアスパラギン酸ペプチダーゼとのそれらの混合物が、反芻動物の消化管内で生き残れたことを示す。
【０２７８】
実施例７
異なるｐＨ条件下におけるペプシンの存在下のＡｋＡＡおよびＡｃＡＡアミラーゼの活性
反応混合物は、全て５ｍＭのＣａＣｌ２を有する、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．２）、０．１Ｍ酢酸塩（ｐＨ４．１、４．７）または０．１Ｍ  Ｍｅｓ（ｐＨ６．０）中で調製した１．０ｍＬのトウモロコシ粉スラリー（２０ｗ／ｗ％）、２５μＬのＡｋＡＡ（２０９ｍｇ／ｍＬ）またはＡｃＡＡ（１７２ｍｇ／ｍＬ）、２５μＬのペプシン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７０００、水中１００００Ｕ／ｍＬ）を含有した。反応は４０℃で２時間行った。反応の最後に、遠心分離によって得た上清を０．４５μｍフィルターでろ過し、２０倍に希釈した。希釈した試料を、実施例６に詳述するように、全還元糖について分析した。
【０２７９】
図５は、ペプシンの非存在下または存在下で、ｐＨ３．２、４．１、４．７および６．０でインキュベートした、ＡｋＡＡおよびＡｃＡＡ試料によるトウモロコシ粉の加水分解を示す。ＡｋＡＡおよびＡｃＡＡにより放出された全還元糖の量として測定されたアミラーゼ活性は、ペプシンの非存在下と比較して、ペプシンの存在下で有意には影響されなかった。さらに、７０％の同一性を共有するこれら２つのアミラーゼは、反芻動物の消化管で見られる条件に相当する条件下で、例えば、第四胃の酸性の条件（ｐＨ３．２）、上部小腸の条件（ｐＨ４．１〜４．７）、ならびに小腸および第一胃で見られる条件に相当する条件（いずれもｐＨ６．０またはｐＨ６．０付近）の１つで活性であることが示される。したがって、ＡｋＡＡおよびＡｃＡＡアミラーゼは、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケノホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）およびＡ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来のアルファ−アミラーゼなどの、単胃飼料添加物として現在使用されている他のアミラーゼよりも、第一胃関連ｐＨでより活性であるように見える（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ  ｄｅ  Ｓｏｕｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｉｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ  −ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１０）４１：８５０−８６１）。
【０２８０】
実施例８
パンクレアチン存在下におけるエンド／エキソグルカンヒドロラーゼおよびエンドプロテアーゼ混合物の活性
反応混合物は、１．０ｍＬのトウモロコシ粉スラリー（２０ｗ／ｗ％、０．１Ｍ  Ｍｅｓ中、５ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０）、２５μＬのＡｋＡＡ＋ＴｒＧＡ＋ＡＦＰ（２２３ｍｇ／ｍＬ）またはＡｃＡＡ＋ＣＳ４＋ＡＦＰ（１２５ｍｇ／ｍＬ）の酵素カクテル、２５μＬのブタパンクレアチン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７５４５、０．１％ＮａＣｌ中で調製した２５ｍｇ／ｍＬ）を含有した。反応は４０℃で２時間行った。反応の最後に、遠心分離によって得た上清を０．４５μｍフィルターでろ過し、２０倍に希釈した。希釈した試料を、実施例６に詳述するように、全還元糖について分析した。図６は、パンクレアチンの存在下、４０℃、ｐＨ６．０でトウモロコシ粉（２０ｗ／ｗ％）と共に２時間インキュベートした後、ＡｋＡＡ＋ＴｒＧＡ＋ＡＦＰの酵素混合物およびＡｃＡＡ＋ＣＳ４＋ＡＦＰの酵素混合物が、還元糖産生をそれぞれ４．２倍および３．８倍増加させたことを示す。この研究は、第一胃および第四胃を生き残って通過した、ＡｋＡＡ＋ＴｒＧＡ＋ＡＦＰおよびＡｃＡＡ＋ＣＳ４＋ＡＦＰ混合物が、パンクレアチン酵素と相乗的に作用して糖の放出を促進し得ることを示す。
【０２８１】
ＡｋＡＡ（実施例４）と同様に、ＡｃＡＡもパンクレアチンと相乗的に作用することが見出された。表３は、ＡｃＡＡをパンクレアチンと一緒に投与した場合、還元力（ＤＮＳ値）の発生は、ｐＨ６．０のとき、２つの酵素によって個別に生じた還元力の合計の１．６倍であり、ｐＨ６．７では、対応する値は１．２５倍であることを示す。
【０２８２】
反応混合物は、４０℃で２時間、５ｍＭのＣａＣｌ２を有する０．１ＭのＭｅｓ（ｐＨ６．０および６．７）中に１ｍＬの２０ｗ／ｖ％のコーンスターチスラリーを含み、２５μＬのブタパンクレアチン（２．５ｗ／ｖ％）を含むか、または含まず、２５μＬのＡｃＡＡ（１７．２ｍｇ／ｍＬ）を含んだ。生成した還元糖を実施例６に記載したように分析した。
【０２８３】
【表３】
2019534691.tif 000005
【０２８４】
実施例９
ｐＨ６．０と比較した場合の、ｐＨ２．５でのペプシンの存在下における、エンド−、エキソ−グルカンヒドロラーゼおよびエンドプロテアーゼ混合物ＡＦＰの還元糖放出活性
表４は、ｐＨ６．０と比較した場合の、ｐＨ２．５でのペプシンの非存在下および存在下での、ＡｋＡＡ、ＡｃＡＡ、ＴｒＧＡ、ＣＳ４およびＡＦＰ混合物の活性を示す。ｐＨ２．５における活性は、実験条件下で両酵素カクテルについてｐＨ６．０に対して２０％を超えることが分かる。酵素カクテル中の酵素が、比較的低いｐＨが優勢である反芻動物の胃または第四胃に見られる条件に相当する条件下で、安定かつ活性であるのが有利であろう。
【０２８５】
反応混合物は、５ｍＭのＣａＣｌ２を有する０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）中の、または５ｍＭのＣａＣｌ２を有する０．１Ｍ  Ｍｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）中の１．０ｍＬのコーンスターチスラリー（１０ｗ／ｗ％）、２５μＬのＡｋＡＡ＋ＴｒＧＡ＋ＡＦＰ（２２３ｍｇ／ｍＬ）またはＡｃＡＡ＋ＣＳ４＋ＡＦＰ（１２５ｍｇ／ｍＬ）の酵素カクテルおよび２５μＬのペプシン（１００００Ｕ／ｍＬ）を含有した。反応は、３００ｒｐｍで振盪しながら４０℃で２時間行った。反応の最後に、０．４５μｍフィルターの９６ウェルフィルタープレート中、３５００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、酵素および生成物から基質を分離した。濾液を２倍に希釈し、実施例６に記載したように還元糖値について分析した。
【０２８６】
【表４】
2019534691.tif 000006
【０２８７】
実施例１０
パンクレアチン存在下の小腸消化条件下におけるグルコアミラーゼによるコーンスターチの加水分解
反応混合物は、０．１Ｍ  Ｍｅｓ（ｐＨ６．０）中の、０．５ｍＬのコーンスターチスラリー（Ｓｉｇｍ  Ｓ４１２６）またはトウモロコシ粉スラリー（１０ｗ／ｖ％）、５０μＬのパンクレアチン（反応混合物中の最終濃度０．２５％）および最終体積０．５６ｍＬで４００ｐｐｍのグルコアミラーゼを含有した。反応は、３００ｒｐｍで振盪しながら４０℃で１時間行った。反応の最後に、ベンチトップ遠心分離機を用いてデンプン顆粒から遠心分離により上清を得、実施例６に記載のようにＤＮＳ試薬法により全還元糖について分析した。すなわち、１０μＬの上清または希釈した上清を、９６ウェルＰＣＲプレート中で１００μＬのＤＮＳ試薬と混合した。次いで、ＰＣＲプレートを９５℃で５分間インキュベートし、続いて５分間冷却して２０℃にした。反応混合物９０μＬを９６ウェル読み取りプレートに移し、５５０ｎｍの吸光度をＤＮＳ値として測定した。
【０２８８】
コーンスターチを基質とした図７、およびトウモロコシ粉を基質とした図８は、ＣＳ４、ＴｒＧＡ、Ｂｒｅｗ１、ＡｆｕＧＡおよびＦｖＧＡ（詳細については表１を参照されたい）の５つの全てのグルコアミラーゼが、ＤＮＳ値で示されるように、還元糖を産生する際にパンクレアチンと相乗的に作用することを示している。グルコアミラーゼ（ＧＡ）（１，４−アルファ−Ｄ−グルカングルコヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．３））は、アルファ−１，４およびアルファ−１，６−グルコシド結合の加水分解を触媒して、デンプンおよび関連する多糖およびオリゴ糖の非還元末端からベータ−Ｄ−グルコースを放出する（Ｓａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ，ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１５４３：２７５−２９３）。したがって、ある種のアルファ−グルコシダーゼとは対照的に、ＧＡはまた、生デンプンを、またアルファ−グルカンおよびそのオリゴマーに見られるアルファ−１，４、およびアルファ−１，６−グルコシド結合を加水分解することができる。
【０２８９】
図７および８は、ブタパンクレアチンおよび５つ全てのＧＡが、コーンスターチ顆粒を加水分解する一定の能力を有すること、その中でＦｖＧＡがｐＨ６．０、４０℃で最も高い活性を有することを示している。反応混合物は、ＧＡおよびブタパンクレアチンの両者を含有する場合に、有意な相乗作用が観察された。このような相乗作用は、Ｓｉｇｍａから購入したパンクレアチン製品中に存在する膵臓アルファ−アミラーゼに起因し得るだけでなく、コーンスターチ顆粒の表面上および顆粒内に存在し得る任意のタンパク質と相互作用することができ、同じくこのパンクレアチン製品中に存在するプロテアーゼに多分に起因し得ると考えられる。
【０２９０】
この実施例は、グルコアミラーゼが膵臓消化酵素と相乗的に作用して、本明細書に記載の化学組成を有するトウモロコシからグルコースを生成できることを示している（実施例２を参照されたい）。この実験で使用した５つのＧＡ、および上記実施例２〜９で使用した３つのアルファアミラーゼＡｋＡＡ、ＡｃＡＡ、およびＡｔＡＡは全て、ファミリー２０（ＣＢＭ２０）に属する炭水化物結合モジュールを有する（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｕｌｅ  ｆａｍｉｌｙ  ２０  −  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２７６：５００６−５０２９；Ｊａｎｅｃｅｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１。Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｓｔａｒｃｈ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏｂｅｓ，ｐｌａｎｔｓ  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌｓ．Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４９：４２９−４４０）。これらの酵素は、炭水化物結合モジュールの他にも、追加の炭水化物結合部位を有し得る（Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒａｎｕｌａｒ  ｓｔａｒｃｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  ｂｏｕｎｄ  ｔｏｂｅｔａ−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：６４７−６６１）。これらの炭水化物結合モジュールおよび炭水化物結合部位は、デンプン顆粒およびマルトサッカリドに対する活性に必要であり得、したがって、パンクレアチンと組み合わせた場合、相乗効果に寄与する。
【０２９１】
実施例１１
第一胃条件下におけるグルコアミラーゼによるコーンスターチの加水分解
表５は、デンプン基質の非存在下、第一胃液中で４時間のインキュベーションを行った後の、５つのグルコアミラーゼの残留活性が、６５％の活性を残すＡｆｕＧＡを除いて、少なくとも８０％であることを示している。反芻動物の飼料用酵素として、４０℃で４時間は、第一胃液中でかなりの安定性を有することが必要である。
【０２９２】
したがって、これらの酵素は４０℃で４時間、第一胃液中で安定であり、活性を保持していたので、反芻動物の飼料用酵素としての有用であることを示している。
【０２９３】
プレインキュベーション混合物は、０．２５ｍＬの無細胞第一胃液、５つのグルコアミラーゼを４００ｐｐｍでそれぞれ５μＬ含有した。プレインキュベーションは、４８ウェルプレート中、３００ｒｐｍで振盪しながら４０℃で４時間行った。対照えは、プレインキュベーション時間はゼロであった。プレインキュベーション後、０．１Ｍ  Ｍｅｓ（ｐＨ６．０）中の０．２５ｍＬのコーンスターチ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ４１２６）スラリー（１０ｗ／ｖ％）を加え、振盪しながら４０℃で３０分間反応させた。ベンチトップ遠心分離機を用いて、デンプン顆粒から遠心分離することにより上清を得、実施例１０に記載のようにＤＮＳ法により全還元糖について分析した。
【０２９４】
【表５】
2019534691.tif 000007
【０２９５】
実施例１２
ｐＨ６．０と比較した場合の、ｐＨ２．５でのペプシン存在下の５つのグルコアミラーゼの活性
酵素は、比較的低いｐＨが優勢である第一胃の胃または第四胃に見られる条件を模擬する条件下で、安定かつ活性であることは有利であると考えられる。ｐＨ２．５における活性は、デンプン質食を基準にするとｐＨが約６の、第一胃および小腸における活性と比較して、この低ｐＨ消化室の消化率において有意性を有するのに十分なだけの、かなり高い値でなければならない。表６は、５つの全グルコアミラーゼが、ｐＨ６．０でのそれらの活性と比較して、ｐＨ２．５で２０％を超える活性を有することを示している。したがって、第一胃、第四胃および小腸におけるバランスのとれた活性は、デンプン室栄養素を消化する機会を増加させるであろう。
【０２９６】
反応混合物は、４８ウェルのマイクロプレート中に、グリシン−ＨＣｌ（６０ｍＭ  ｐＨ２．５）またはＭｅｓ−ＮａＯＨ（１００ｍＭ、ｐＨ６．０）中で調製した０．５ｍＬのトウモロコシ粉スラリー（１０ｗ／ｖ％）、５０μＬのブタペプシン（最終濃度１０００Ｕ／ｍＬ）および５μＬのグルコアミラーゼ（最終濃度４００ｐｐｍ）を含有した。反応は４０℃で６０分間行った。放出された還元糖は、実施例１０に記載のようにＤＮＳ試薬によって分析した。ｐＨ６．０での活性を１００％として用いる。
【０２９７】
【表６】
2019534691.tif 000008
【０２９８】
実施例１３
小腸シミュレーション条件下、パンクレアチン存在下での酵母アルファ−グルコシダーゼによるコーンスターチからのグルコース放出
反応混合物は、全体積０．５６ｍＬ中に、５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する０．１Ｍ  Ｍｅｓ（ｐＨ６．０）に懸濁した０．５ｍＬのコーンスターチ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ４１２６）スラリー（１０ｗ／ｖ％）、０、１０、２０または３５μＬの酵母アルファ−グルコシダーゼ（Ｅ−ＭＡＬＴＳ、１０００Ｕ／ｍＬ、Ｍｅｇａｚｙｍｅから購入したもので、マルターゼとも呼ぶこともできる）、０〜２５μＬのブタパンクレアチン（１％のＮａＣｌ中２．５ｗ／ｖ％、Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｐ７５４５から購入）、および０〜６０μＬの水を含んだ。振盪インキュベーター中、反応混合物を４０℃で６０分間、４８ウェルプレートに入れてインキュベートした。ベンチトップ遠心分離機を用いて３５００ｒｐｍで１０分間、プレートを遠心分離し、未消化デンプン顆粒を分離した。グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ（ＧＯＰＯＤ）ベースの、グルコース分析キットを使用したグルコース分析を行うために、得られた上清を９６ウェルプレートに移した。
【０２９９】
ＧＯＰＯＤグルコース分析のために、８μＬの上清を、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｋ−ＧＬＵＣ  ０９／１４）からの２４０μＬのＧＯＰＯＤ試薬を有する９６ウェル読み取りプレートに移した。プレートを５０℃で２０分間インキュベートし、Ｍｅｇａｚｙｍｅからの指示に従って５１０ｎｍの吸光度を読み取った。
【０３００】
パンクレアチン製品（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７５４５）は、膵臓アルファ−アミラーゼ、リパーゼ、リボヌクレアーゼ、およびトリプシン、キモトリプシン、エラスターゼを含むいくつかのプロテアーゼを含むことはよく知られている。ブタおよびウシアルファ−アミラーゼによる食餌性デンプンの加水分解生成物は、主にマルトースである（Ｂａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ，１９７６．Ｔｈｅ  ａｃｔｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ．Ｉｎｔｌ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７：１０７−１１０）。単胃動物および反芻動物を含む動物は、小腸膜結合酵素を使用してマルトースを加水分解することが知られている（Ｎｉｃｈｏｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｈｕｍａｎ  Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｍａｌｔａｓｅ−ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ  ｃＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｓｕｃｒａｓｅ−ｉｓｏｍａｌｔａｓｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：３０７６−３０８１）。自由に動く酵素は、膜結合（固定化）酵素よりも触媒効果が大きい。
【０３０１】
図９は、パンクレアチンが存在しないと、０、１０、２０〜３５μＬを投与した酵母アルファ−グルコシダーゼは、コーンスターチ顆粒からのグルコース放出を増加させられなかったことを示している。
【０３０２】
しかしながら、２．５μＬのパンクレアチンの存在下では、グルコースは放出され、１０μＬのアルファ−グルコシダーゼの添加により、放出グルコース量は２倍になった。アルファ−グルコシダーゼの用量の増加とともに、グルコース収率はさらに増加した。これは、酵母アルファ−グルコシダーゼが、パンクレアチン中に存在する酵素と相乗的に作用し、コーンスターチからグルコースを放出したことを示す。プロテアーゼは、デンプン顆粒の表面に存在するタンパク質および顆粒内部に存在するタンパク質を加水分解することができるので、パンクレアチン中に存在するプロテアーゼは、この相乗作用をある程度促進することができると考えられる。デンプン顆粒上およびデンプン顆粒内部のこれらのタンパク質は、デンプン消化に悪影響を及ぼす可能性がある（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍａｔｒｉｘ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｒｅａｌ  ｇｒａｉｎｓ  ｂｙ  ｒｕｍｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ．Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．７１：２０５−２１２）。
【０３０３】
実施例１３で使用されたアルファ−グルコシダーゼは、Ｍｅｇａｚｙｍｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｒｅｌａｎｄ（ＥＣ  ３．２．１．２０、ＣＡＺｙファミリー：ＧＨ１３、タンパク質データベースエントリ：Ｐ５３３４１，Ｐ３８１５８，ＣＡＳ：９００１−４２−７）から購入した、サッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の、高度に精製された形態である。この実施例は、フリーの微生物アルファ−グルコシダーゼが、膵臓消化酵素と良好な相乗作用を有することを示す。しかし、この酵母アルファ−グルコシダーゼは、第一胃および第一胃第四胃（ｒｕｍｉｎａｌ  ａｂｏｍａｓｕｍ）で見出される条件に相当する条件下で不安定であり、かつ不活性であることが見出された。この酵母アルファ−グルコシダーゼが、第一胃小腸で機能し得るには、ペプシンの存在下、そのような低ｐＨ下でそれを安定化させるために、そのコーティングまたはタンパク質工学などのさらなる努力が必要であろうと考えられる。
【０３０４】
実施例１４
小腸の模擬条件下、パンクレアチン存在下における真菌アルファ−グルコシダーゼによるコーンスターチからのグルコース放出
３つの真菌アルファ−グルコシダーゼ：ＴＧ  Ｌ−２０００、Ａｃｌｇｌｕ１およびＮｆｉｇｌｕ１（表１）を、ペプシン、パンクレアチンおよび第一胃液の存在下、安定性および活性について試験した（下記表７．１、７．２および７．３）。表７．１〜７．３は、３種類のアルファ−グルコシダーゼすべてが、コーンスターチからのグルコース放出の増加に際して、パンクレアチンとの相乗作用があったことを示している。
【０３０５】
パンクレアチンとの相乗作用試験は以下のように行った。５ｍＭのＣａＣｌ２を有する０．１Ｍ  Ｍｅｓ（ｐＨ６．０）中の０．５ｍＬのコーンスターチ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ４１２６）スラリー（１０ｗ／ｖ％）を、０または２．５μＬのアルファ−グルコシダーゼＴＧ  Ｌ−２０００（３．１ｍｇ／ｍＬ）および０または２．５μＬのブタパンクレアチン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７５４５、１％ＮａＣｌ中２．５ｗ／ｖ％）と共にインキュベートした。反応は４０℃で１時間行った。次いで、反応混合物を０．２２μｍフィルターでろ過した。濾液中の放出されたグルコースの、Ｍｅｇａｚｙｍｅグルコース分析キット（ＧＯＰＯＤ）（Ｋ−ＧＬＵＣ  ０９／１４）を用いた（上記実施例１３に記載したように）分析は、以下のように実施した。９６ウェルプレート中で８μＬのろ液を０．２４ｍＬのＧＯＰＯＤ試薬と混合し、５０℃で２０分間インキュベートした後、５１０ｎｍで読み取った。グルコース放出の定量として、５１０ｎｍで測定したＯＤ単位を使用した。
【０３０６】
ペプシンとパンクレアチン（Ｐａｎ）との相乗作用試験を以下のように行った。プレインキュベーション混合物は、０．１ｍＬのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）、５ｍＭのＣａＣｌ２、２５μＬのブタペプシン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７０００、５０００Ｕ／ｍＬ）および２．５μＬのＴＧ  Ｌ−２０００を含有した。この混合物を４℃で２時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、０．１Ｍ  Ｍｅｓ（ｐＨ６．０）中の０．５ｍＬコーンスターチスラリー（１０ｗ／ｖ％、）および２．５μＬパンクレアチン（２．５％）を加え、さらに４０℃で１時間インキュベートした。放出されたグルコースの分析は、Ｍｅｇａｚｙｍｅグルコース分析キットを用いてパンクレアチン研究に関して上述したように行った。
【０３０７】
第一胃デンプンヒドロラーゼとの安定性および相互作用の研究は、以下のように行った：  ０．２４ｍＬの無細胞第一胃液と共に、２．５μＬのアルファ−グルコシダーゼＴＧ  Ｌ−２０００および４０℃で４時間のインキュベーション。インキュベーションの終わりに、０．１Ｍ酢酸塩（ｐＨ４．５）中の０．２５ｍＬのコーンスターチ（１０ｗ／ｖ％）を加え、さらに４０℃で３０分間インキュベートした。放出されたグルコースを、パンクレアチン研究について上で記載したように、Ｍｅｇａｚｙｍｅグルコース分析キットを用いて分析した。
【０３０８】
個別に使用したアルファ−グルコシダーゼと豚パンクレアチンは、コーンスターチからの制限された量のグルコースを放出した（表７．１）。アルファ−グルコシダーゼＴＧ  Ｌ−２０００とパンクレアチンの組み合わせは、２つの酵素調製物のそれぞれによる個別のグルコース放出の合計より５．２倍高いグルコース量を放出した（表７．１）。同様に、Ａｃｌｇｌｕ１およびＮｆｉｇｌｕ１を同じ条件下でパンクレアチンと組み合わせた場合、グルコース放出の増加は、Ａｃｌｇｌｕ１とパンクレアチンまたはＮｆｉｇｌｕ１とパンクレアチンによる個々の放出の合計と比較して、それぞれ８．３倍（表７．２）および７．８倍（表７．３）であった。
【０３０９】
３つのアルファ−グルコシダーゼのペプシン安定性を、ペプシンの存在下、ｐＨ３．０で試験した（表７．１）。２．５μＬのアルファ−グルコシダーゼＴＧ  Ｌ−２０００とパンクレアチンの組み合わせは、基質の非存在下、ｐＨ３．０、４０℃で、ペプシンと共に２時間の事前インキュベーションを行った後でさえ、グルコース放出を７．３倍増加させたことは明らかである（表７．１）。同じ条件下で試験したアルファ−グルコシダーゼＡｃｌｇｌｕ１およびＮｆｉｇｌｕ１では、組み合わせによるグルコース放出の増加は４．１倍（表７．２）および６．９倍（表７．３）であった。３つのアルファ−グルコシダーゼは、全てペプシン安定性を示したが、その理由はペプシンとのプレインキュベーションにもかかわらず、分析混合物中でパンクレアチンと組み合わせたとき、それらの全てが、依然相乗効果を示したからである。
【０３１０】
同様に、第一胃液中の３種類のアルファ−グルコシダーゼの相乗作用と安定性を評価した（表７．１−７．３）。表７．１は、第一胃液に添加したアルファ−グルコシダーゼＴＧ  Ｌ−２０００では、グルコース放出はアルファ−グルコシダーゼＴＧ  Ｌ−２０００および第一胃液によって個別に放出されたグルコースの合計と比較して２．０倍増加し、第一胃液中でプレインキュベーションを行うと、ＴＧ  Ｌ−２０００存在下のグルコース放出は、また、アルファ−グルコシダーゼ非存在下での放出と比較して２．０倍増加したことを示し（表７．１）、これはアルファ−グルコシダーゼＴＧＬ−２０００が第一胃液中で安定であることを意味する。アルファ−グルコシダーゼＡｃｌｇｌｕ１およびＮｆｉｇｌｕ１では、それらの存在は、第一胃液との「プレインキュベーション不実施とプレインキュベーション実施」（表７．２〜７．３）のそれぞれで、２．０および２．８倍のグルコース放出の増加をもたらした。
【０３１１】
【表７】
2019534691.tif 000009
【０３１２】
【表８】
2019534691.tif 000010
【０３１３】
【表９】
2019534691.tif 000011
【０３１４】
実施例１５
第一胃液中における真菌アルファ−グルコシダーゼの安定性、およびグルコース放出におけるパンクレアチンとの相互作用
プレインキュベーション混合物は、２４ウェルプレートのウェル中で混合した、２．５μＬおよび２４０μＬの無細胞第一胃液に溶解した各５０μｇの真菌アルファ−グルコシダーゼ：ＴＧ  Ｌ−２０００、Ａｃｌｇｌｕ１、Ｎｆｉｇｌｕ１、ＴａｕＳｅｃ０９８、およびＴａｕＳｅｃ０９９（表１）を含んだ。対照には、アルファ−グルコシダーゼを加えなかった。混合物を４０℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、０．１Ｍ  Ｍｅｓ中に溶解した２５０μＬのコーンスターチスラリー（１０ｗ／ｖ％、Ｓｉｇｍａ  Ｓ４１２６）、５ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ６）および２．５μＬのパンクレアチン（０．１％ＮａＣｌ中のＳｉｇｍａ  Ｐ７５４５、２．５ｗ／ｖ％）を加え、４０℃で３０分間の反応を行った（ｎ＝４）。遠心分離後に得られた上清を１０倍に希釈し、Ｍｅｇａｚｙｍｅのグルコース分析キットを用いて、実施例１３に記載したように放出されたグルコースを定量した。
【０３１５】
図１０は、第一胃液中の５つのアルファ−グルコシダーゼの４０℃、４時間のプレインキュベーションが「プレインキュベーション不実施」の処置と比較して、活性の損失を引き起こさなかったことを示している。プレインキュベーション不実施のサンプルよりも、プレインキュベーションしたサンプルでより多くのグルコースが放出されたようである（図１０）。これは、これらのアルファ−グルコシダーゼが、残存レベルのデンプン基質を有する第一胃液中に存在する、デンプンヒドロラーゼと相互作用していることの示唆なのかもしれない。
【０３１６】
実施例１６
コーンスターチからのグルコースの放出における、ｐＨ６．０での５つのアルファ−グルコシダーゼとパンクレアチンの相乗作用
反応混合物は、５ｍＭのＣａＣｌ２、を含有する０．１Ｍ  Ｍｅｓ（ｐＨ６．０）中の、０．５ｍＬのコーンスターチ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ４１２６）スラリー（１０ｗ／ｖ％）、２．５μＬ容積の５０μｇアルファ−グルコシダーゼ、および０または２．５μＬのパンクレアチン溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７５４５、０．１％ＮａＣｌ中２．５ｗ／ｖ％）を含んだ。対照では、アルファ−グルコシダーゼを加えなかった。４０℃で６０分間反応を行い（ｎ＝４）、実施例１３に記載のグルコース分析キットを用いて放出されたグルコースを定量した。
【０３１７】
図１１は、パンクレアチンのみを使用し、追加の酵素を使用しない対照では、グルコースの産生は限定的であった（０．６７ｍｇ／ｍＬ−反応混合物）ことを示している。アルファ−グルコシダーゼのみを使用した場合、グルコースの放出を示したＴＧ  Ｌ−２０００（０．８０ｍｇ／ｍＬ−反応混合物）を除いて、グルコース放出は低かった。アルファグルコシダーゼおよびパンクレアチンの両方を一緒に使用した場合、グルコース放出は、使用したアルファグルコシダーゼの量に依存して１１〜２０倍の範囲で増加した。これは、５つのアルファ−グルコシダーゼのいずれかとパンクレアチンが使用される場合に得ることができる、コーンスターチからのグルコース放出における相乗効果を示す。
【０３１８】
実施例１７
ｐＨ２．５およびｐＨ６．０においてペプシンで処理したアルファ−グルコシダーゼの活性
反応混合物は、２．５μＬ、７５μＬペプシン（Ｓｉｇｍａ  Ｐ７０００、ストック溶液５０００Ｕ／ｍＬ）中の５０μｇの５つのアルファ−グルコシダーゼ、すなわちＴＧ  Ｌ−２０００、Ａｃｌｇｌｕ１、Ｎｆｉｇｌｕ１、ＴａｕＳｅｃ０９８およびＴａｕＳｅｃ０９９（表１）、および５ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ２．５を有する０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ中、または５ｍＭ  ＣａＣｌ２  ｐＨ６．０を有する０．１Ｍ  Ｍｅｓ−ＮａＯＨ中の１．５ｍＬマルトース（２１．５ｍｇ／ｍＬ）を含有した。４０℃で３０分間反応を行った。反応の終わりに、反応混合物を１０回希釈し、上記実施例１３に記載したように、Ｍｅｇａｚｙｍｅからのグルコース分析キットを用いて、グルコース放出を分析した。
【０３１９】
【表１０】
2019534691.tif 000012
【０３２０】
表８は、ｐＨ６．０と比較してｐＨ２．５で８４％の活性を示すＮｆｉｇｌｕ１を除いて、４つのグルコシダーゼの全てが、ペプシンの存在下でｐＨ６．０よりもｐＨ２．５でより活性であったことを示している。これらの酵素は４０℃で４時間、第一胃液中で安定であり、活性を保持しており、したがって、反芻動物の飼料用酵素としての有用であることを示している。
【０３２１】
実施例１８
トウモロコシの第一胃醗酵における乾物消化およびガス産生を増加させるための、メタロペプチダーゼＰ１４ＬおよびＰ７Ｌと組み合わせたグルコアミラーゼの使用
４種のグルコアミラーゼ（ＣＳ４、ＴｒＧＡ、ＡｆｕＧＡ、ＦｖＧＡ）および２種のメタロペプチダーゼ／プロテアーゼ（Ｐ１４Ｌ、Ｐ７Ｌ）およびそれらの組み合わせの、０、３、７、９、１２、および２４時間のインキュベーション／醗酵における、乾物消化（ＤＭＤ）およびガス産生に対する影響を、以下に記載のように評価した。グルコアミラーゼおよびプロテアーゼは両者とも、０．２５ｍｇ／ｇの濃度で適用した。
【０３２２】
第一胃液のインビトロバッチ培養の基質としてデントトウモロコシを使用し、４種のグルコアミラーゼ（ＣＳ４、ＴｒＧＡ、ＡｆｕＧＡ、ＦｖＧＡ）および２種のメタロペプチダーゼ／プロテアーゼ（Ｐ１４Ｌ、Ｐ７Ｌ）およびそれらの組み合わせの、第一胃微生物醗酵に対する影響を評価した。実験は、以前に確立され発表されたプロトコールに基づき行った（Ａｄｅｓｏｇａｎ，Ａ．Ｔ．，Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｎ．Ａ．，ａｎｄ  Ｋｉｍ，Ｓ．Ｃ．２００５．Ａｎｉｍ．Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１２３：２１１−２２３）。このインビトロのバッチ醗酵システムで使用したデントトウモロコシは、８８．８％の乾物（ＤＭ）、９．３％の粗タンパク質（ＣＰ）、３．２％の酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）、アミラーゼ（ａＮＤＦ）で処理した８．３％の中性デタージェント繊維、７６．９％の非繊維性炭水化物（ＮＦＣ）、８８．０％の全消化性栄養素（ＴＤＮ）を有した。それを４ｍｍに粉砕した。全ての酵素についてデントトウモロコシ１ｇ当たり０．２５ｍｇの酵素タンパク質を３つの個別の実験で適用し、１つの処理についてこれを４回繰り返し、醗酵またはインキュベーションは３９℃で０、３、７、９、１２、および２４時間継続した。粉砕したデントトウモロコシを、１回の実験当たり６回繰り返して秤量し、Ｆ５７フィルターバッグ（ＡＮＫＯＭ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｃｅｄｏｎ，ＮＹ）に入れた。ボトルに入れる前に、０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で酵素を希釈し、Ｆ５７バッグ中の粉砕デントトウモロコシ０．５ｇに加えた（Ｋｒｕｅｇｅｒ，Ｎ．Ａ．，ａｎｄ  Ａ．Ｔ．Ａｄｅｓｏｇａｎ．２００８．Ａｎｉｍ．Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．１４５：８４−９４；Ｇｏｅｒｉｎｇ，Ｈ．Ｋ．ａｎｄ  Ｐ．Ｊ．Ｖａｎ  Ｓｏｅｓｔ．１９７０．Ａｇｒｉｃ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｎｏ．３７９．ＡＲＳ  ＵＳＤＡ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，ｐｐ．２０）。Ｆ５７フィルターバッグを、Ｕｌｉｎｅ  Ｔａｂｌｅｔｏｐ  Ｐｏｌｙ  Ｂａｇ  Ｓｅａｌｅｒ（Ｉｍｐｕｌｓｅ（登録商標）ｔｙｐｅ  ＡＩＥ−２００）で密封し、その後直ちに、１６０ｍＬの血清ボトルである醗酵容器に入れた。フィルターバッグのみからなるブランクボトル、および酵素を含まずに、粉砕デントトウモロコシのみを含む対照も含めた。トータル混合飼料（ＴＭＲ）を摂取してから２〜３時間後に、３頭の乳を出すホルスタイン乳牛であって、第一胃にカニューレを挿入した乳牛から第一胃液を代表的に吸引した。フィステル装着乳牛に給餌されたＴＭＲ成分組成物は、乾物基準で、３８．２％のトウモロコシサイレージ、２７．３％の粉砕された殻抜きトウモロコシ、４４％の粗タンパク質を含む１４．５％の大豆粉、９．１％の柑橘パルプ、４．５％のＦｅｅｄｌｏｔプレミックス、４．０％のアルファルファヘイミッドブルーム、１．８％のエネルギーブースター（ＭＳ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｄｕｎｄｅｅ，ＩＬ）、０．５％のＮｏｖａｓｉｌ（ＢＡＳＦ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、合計１００％からなった。
【０３２３】
採取した第一胃液を４層のチーズクロスでろ過し、あらかじめ温めた人工唾液（３９℃）と混合した。人工唾液の成分は、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ２・６Ｈ２Ｏのミクロミネラル溶液、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏのマクロミネラル溶液、（ＮＨ４）２ＨＣＯ３およびＮａＨＣＯ３の緩衝溶液、トリプチカーゼペプトン溶液（トリプトン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓｅ，ＭＯ，ＵＳＡ）、酸化還元指示薬レサズリンおよびシステインＨＣｌ、１Ｍ  ＮａＯＨ、Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏおよび蒸留水を含む還元溶液を含んだ。第一胃液と人工唾液の体積比は１：２である。フィルターバッグを含む１６０ｍＬの血清ボトルに緩衝第一胃液（５２ｍＬ）を加え、ゴム栓でボトルを閉じ、アルミニウムシールで密封した。強制空気インキュベーター中、３９℃で０、３、７、９、１２、および２４時間、ボトルをインキュベートした。インキュベーションの最後に、６０℃で４８時間、残渣を含むフィルターバッグをオーブン乾燥し、ＤＭＤを定量するために秤量した。ボトル内のガス圧を圧力トランスデューサーで測定し、０、３、７、９、１２および２４時間のインキュベーションで後からガス容量に変換した。ガス圧力をガス体積に変換するために次の式を使用した：
ガス体積（ｍＬ）＝（ガス圧力（ｐｓｉ）×４．８８４３）＋３．１２９６
【０３２４】
この式は、１６０ｍＬの血清ボトルを用いた実験条件に基づいて定式化され、表９．１〜９．２の全ての実験に用いた。
【０３２５】
統計的分析：実施例１８の全ての実験について、収集したデータを、ＳＡＳのＧＬＩＭＭＩＸ手順（バージョン９．１；ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ、ＮＣ）を用いて分析した。実験は、各実験を１つのブロックとみなして、完全な無作為ブロック設計として設計した。異なる用量で酵素を試験した場合、モデルでは用量を固定効果として使用した。応答変数には、インビトロＤＭＤおよびガス産生を含めた。実験は１つのランダム因子と考えた。このモデルの固定効果は、インキュベーション後の異なる時間で測定された、醗酵パラメーターのサンプリング時間を含んだ。最終分析を実施する前に、ＳＡＳのＵＮＩＶＡＲＩＡＴＥ手順を使用して、外れ値および正規性について残差を検査した。処理効果はＰ＜０．０５で有意とされ、一方、傾向は０．０５≦Ｐ≦０．１０と定義された。
【０３２６】
４種のグルコアミラーゼ（ＣＳ４、ＴｒＧＡ、ＡｆｕＧＡ、ＦｖＧＡ）および２種のメタロペプチダーゼ／プロテアーゼ（Ｐ１４Ｌ、Ｐ７Ｌ）ならびにそれらの組み合わせの、０、３、７、９、１２、および２４時間のインキュベーション／醗酵における、乾物消化（ＤＭＤ）およびガス産生に対する評価結果を表９．１．１〜表９．１．４に示す。グルコアミラーゼおよびプロテアーゼは両者とも、０．２５ｍｇ／ｇの濃度で適用した。
【０３２７】
ＣＳ４＋／−Ｐ１４Ｌ処理：インキュベーションまたは醗酵の０、３、および７時間の時点で補給した、ＣＳ４に対する応答で、ＤＭＤへの効果は明確には観察されなかった（表９．１．１）。しかし、ＤＭＤは、９、１２、および２４時間のインキュベーションにより、それぞれ５６、３６、および２５％改善された（Ｐ＜０．０５）。同様に、プロテアーゼＰ１４Ｌは、９、１２、および２４時間のインキュベーションにより、ＤＭＤをそれぞれ７９、５９、および３２％改善した（Ｐ＜０．０５）。ＣＳ４とＰ１４Ｌの併用は、９、１２、および２４時間のインキュベーションにより、ＤＭＤをそれぞれ１０９、８６、および４５％改善した（Ｐ＜０．０５）。
【０３２８】
ＴｒＧＡ＋／−Ｐ１４Ｌ処理：ＤＭＤは、９時間のインキュベーションにより、ＴｒＧＡおよびＰ１４Ｌでそれぞれ６２％および７９％増加した（表９．１．２）。両酵素の組み合わせで、９時間のインキュベーションでは、対照と比較してＤＭＤを１２４％に増加させた（Ｐ＜０．０１）。
【０３２９】
ＡｆｕＧＡ＋／−Ｐ１４Ｌ処理：第一胃醗酵パラメーターに対するＡｆｕＧＡとＰ１４Ｌの併用の効果を表９．１．３に示す。ＤＭＤは、ＡｆｕＧＡ、Ｐ１４Ｌ、および両者との７、９、１２、および２４時間のインキュベーションで増加した（Ｐ＜０．０５）。両酵素の併用は、７、９、１２、および２４時間のインキュベーションでＤＭＤをそれぞれ１１９、１４６、１０８、および６０％増加させ、効果の大きさは単独で提供される酵素よりも大きかったことから、両酵素の併用効果は明らかである（Ｐ＜０．０５）。
【０３３０】
ＦｖＧＡ＋／−Ｐ１４Ｌ処理：第一胃醗酵パラメーターに対するＦｖＧＡとＰ１４Ｌの併用の影響を表９．１．４に示す。インキュベーションの０、３、７時間の時点で補給したＦｖＧＡに対する応答で、ＤＭＤに対する効果は観察されなかったが、ＤＭＤは９時間のインキュベーションでＦｖＧＡ、Ｐ１４Ｌ、およびそれらの併用により、それぞれ４２、７９、および９３％改善された（Ｐ＜０．０１）。
【０３３１】
４種のグルコアミラーゼ、メタロペプチダーゼＰ１４Ｌおよびそれらの併用はすべて、少なくとも１２および２４時間のインキュベーションで醗酵ガス産生を有意に増加させることが見出された（Ｐ＜０．０５）（表９．１．１〜９．１４）。
【０３３２】
ＣＳ４、ＴｒＧＡ、ＡｆｕＧＡ、ＦｖＧＡ＋／Ｐ７Ｌ処理：０、３、７、９、１２、および２４時間のインキュベーション／醗酵で、４種類のグルコアミラーゼ（ＣＳ４、ＴｒＧＡ、ＡｆｕＧＡ、ＦｖＧＡ）とメタロペプチダーゼ／プロテアーゼＰ７Ｌの併用が、ＤＭＤに及ぼす影響を表９．２．１〜９．２．４に示す。表９．１．１〜９．１．４のように、グルコアミラーゼおよびプロテアーゼは両者とも、０．２５ｍｇ／ｇの濃度で適用した。
【０３３３】
観察された結果に基づけば、インキュベーション時間にかかわらず、Ｐ７Ｌと併用した４種のグルコアミラーゼの相乗効果または追加効果が観察される。ＣＳ４とＰ７Ｌの組み合わせによる追加効果は、０、３、７、９、１２、および２４時間のインキュベーションでそれぞれ４９、１１２、７２、６０、５５、および１９％ＤＭＤを改善した（表９．２．１；Ｐ＜０．０１）。ＴｒＧＡとＰ７Ｌの併用で、ＤＭＤはまた、０、３、７、９、１２および２４時間でそれぞれ４１、１０９、７３、６４、６０および２５％増加した（表９．２．２；Ｐ＜０．０１）。
【０３３４】
ＡｆｕＧＡ（表９．２．３）とＰ７Ｌの併用は、０、３、７、９、１２、および２４時間でそれぞれ２３、１１６、８５、６６、５８、および２１％ＤＭＤを改善した（Ｐ＜０．０１）。Ｐ７Ｌと併用したＦｖＧＡの有効性は３、７、９、および１２時間のインキュベーションでＤＭＤの改善に有効であったが、対照と比較した場合、０および２４時間では効果は観察されなかった（表９．２．４）。ＤＭＤの改善は、４種のグルコアミラーゼ、プロテアーゼＰ７Ｌおよびそれらの組み合わせの全てについて、インキュベーションのほとんどの時点で観察された、より大きな累積ガス容量によってさらに支持された（Ｐ＜０．０５）（表９．２．１〜９．２．４）。
【０３３５】
【表１１】
2019534691.tif 000013
【０３３６】
【表１２】
2019534691.tif 000014
【０３３７】
【表１３】
2019534691.tif 000015
【０３３８】
【表１４】
2019534691.tif 000016
【０３３９】
【表１５】
2019534691.tif 000017
【０３４０】
【表１６】
2019534691.tif 000018
【０３４１】
【表１７】
2019534691.tif 000019
【０３４２】
【表１８】
2019534691.tif 000020
【０３４３】
実施例１９
グルコアミラーゼによるマルトースの加水分解
通常、動物に吸収されるのはグルコースである。マルトースは、２単位のグルコースから形成される二糖類である。したがって、マルトースが吸収されるには、グルコースモノマーに加水分解される必要がある。グルコアミラーゼが、飼料添加酵素として使用するための他の好ましい特性に加えて、基質マルトースに対して高い触媒活性を有することは有利である。好ましくは、グルコアミラーゼは、本明細書に記載の試験条件下でのＴｒＧＡの活性と比較して、基質マルトースに対して少なくとも２０％の活性を有するべきである。
【０３４４】
マルトースに対するグルコアミラーゼ活性を以下のように測定した。５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する５０ｍＭ  Ｍｅｓ−ＮａＯＨ（ｐＨ６．０）中に、２％（ｗ／ｖ）または８％（ｗ／ｖ）マルトース（Ｍ−５８８５、Ｓｉｇｍａ）および１０μｇグルコアミラーゼを含有する反応混合物を、９６ウェルマイクロプレート中で、最終容量を０．０５ｍＬとして調製した。各グルコアミラーゼ−マルトース反応を３回繰り返した。
【０３４５】
反応は４０℃で２０分間行い、これはグルコース放出に関して直線範囲であった。反応を９５℃で５分間、ＰＣＲ装置中で行った。室温（２３℃）に冷却した後、反応混合物１０μＬを、１ｍＬ当たり０．５〜０．９ｍｇグルコースの範囲の濃度に希釈し、マイクロプレート中で０．２４ｍＬのＧＯＰＯＤ試薬（Ｄ−グルコース分析キット、Ｍｅｇａｚｙｍｅから購入したＧＯＰＯＤフォーマット）と混合した。その後、混合物を５０℃で２０分間インキュベートし、５１０ｎｍの吸光度を読み取った。製造業者からのグルコース標準を使用して、較正用標準曲線を作成した。
【０３４６】
表１０のデータは、試験した全てのグルコアミラーゼが、インビボ消化条件で見出されるものと類似または近い条件、例えば、６．０のほぼ中性のｐＨで、マルトースに対して活性を有することを示している。
【０３４７】
ＡｎＧＡは、これらの試験条件下で基質マルトースに関してはＡｎＧＡが例外であったことが観察された。したがって、ＡｎＧＡは、本明細書に記載される使用に好適なグルコアミラーゼではない。
【０３４８】
【表１９】
2019534691.tif 000021
【図１】
2019534691.tif 000022
【図２】
2019534691.tif 000023
【図３】
2019534691.tif 000024
【図４】
2019534691.tif 000025
【図５】
2019534691.tif 000026
【図６】
2019534691.tif 000027
【図７】
2019534691.tif 000028
【図８】
2019534691.tif 000029
【図９】
2019534691.tif 000030
【図１０】
2019534691.tif 000031
【図１１】
2019534691.tif 000032
【国際調査報告】
2019534691.tif 000033
2019534691.tif 000034
2019534691.tif 000035