(57)【要約】肺腺癌の遺伝子シグネチャーの群から選択される少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現レベルを検出することにより、個体の肺腺癌（ＡＤ）のサブタイプを判定するための方法および組成物が提供される。また本明細書では、ある腺癌サブタイプを有する個体の免疫療法などの療法に対する応答を判定するための方法および組成物も提供される。患者から得られた肺組織試料の腺癌（ＡＤ）サブタイプを判定するための方法であって、前記方法が、表１の少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現レベルを検出するステップを含み、前記分類指標バイオマーカーの前記発現レベルの前記検出が、終末呼吸単位（ＴＲＵ）、近位増殖性（ＰＰ）、または近位炎症性（ＰＩ）ＡＤサブタイプを特異的に特定する、方法。
2019516407.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から得られた肺組織試料の腺癌（ＡＤ）サブタイプを判定するための方法であって、前記方法が、表１の少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現レベルを検出するステップを含み、前記分類指標バイオマーカーの前記発現レベルの前記検出が、終末呼吸単位（ＴＲＵ）、近位増殖性（ＰＰ）、または近位炎症性（ＰＩ）ＡＤサブタイプを特異的に特定する、方法。
【請求項２】
表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの前記検出された発現レベルを、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットにおける表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現と比較するステップであって、前記少なくとも１種のサンプルトレーニングセットが、参照ＡＤ  ＴＲＵ試料からの表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現データ、参照ＡＤ  ＰＰ試料からの表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現データ、参照ＡＤ  ＰＩ試料からの表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現データ、またはそれらの組合せを含む、ステップと、前記比較するステップの結果に基づいて前記試料をＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩサブタイプに分類するステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記比較するステップが、前記試料から得られた前記発現データと、前記少なくとも１種のトレーニングセットからの前記発現データとの間の相関を判定することを含む、統計的アルゴリズムを適用することと、前記統計的アルゴリズムの結果に基づいて前記試料をＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩサブタイプに分類することとを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記分類指標バイオマーカーの前記発現レベルが、核酸レベルで検出される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記核酸レベルがＲＮＡまたはｃＤＮＡである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記発現レベルを検出するステップが、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ、遺伝子チップ、ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現アッセイ、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現高速解析（ＲＡＧＥ）、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ノーザンブロッティング、または任意の他の均等な遺伝子発現検出技術を行うことを含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記発現レベルが、ｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより検出される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記発現レベルの前記検出が、表１の少なくとも１種の分類指標バイオマーカーに特異的な少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮なもしくは冷凍組織試料、エキソソーム、洗浄液、細胞ペレット、または前記患者から得られた体液である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記体液が、血液もしくはその画分、尿、唾液、または喀痰である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーが、複数の分類指標バイオマーカーを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数の分類指標バイオマーカーが、表１の少なくとも２種の分類指標バイオマーカー、少なくとも８種の分類指標バイオマーカー、少なくとも１６種の分類指標バイオマーカー、少なくとも２４種の分類指標バイオマーカー、少なくとも３２種の分類指標バイオマーカー、少なくとも４０種の分類指標バイオマーカー、または少なくとも４８種の分類指標バイオマーカーを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーが、表１の分類指標バイオマーカーのすべてを含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
肺がん細胞において特異的な発現パターンを有する分類指標バイオマーカーをコードする少なくとも１種の核酸分子の発現レベルを検出するステップを含む、患者から得られた肺組織試料の腺癌（ＡＤ）サブタイプを判定するための方法であって、前記分類指標バイオマーカーが、表１に記載されている分類指標遺伝子からなる群から選択され、前記方法が、（ａ）患者由来の肺組織試料から核酸物質を単離するステップと、（ｂ）前記核酸物質を、前記分類指標バイオマーカーの核酸分子の一部分に対して実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドと混合するステップと、（ｃ）前記分類指標バイオマーカーの発現を検出するステップとを含む方法。
【請求項１５】
表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの前記検出された発現レベルを、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットにおける表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現と比較するステップであって、前記少なくとも１種のサンプルトレーニングセットが、参照ＡＤ  ＴＲＵ試料からの表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現データ、参照ＡＤ  ＰＰ試料からの表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現データ、参照ＡＤ  ＰＩ試料からの表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現データ、またはそれらの組合せを含む、ステップと、前記比較するステップの結果に基づいて前記試料をＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩサブタイプに分類するステップとをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記比較するステップが、前記試料から得られた前記発現データと、前記少なくとも１種のトレーニングセットからの前記発現データとの間の相関を判定することを含む、統計的アルゴリズムを適用することと、前記統計的アルゴリズムの結果に基づいて前記試料をＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩサブタイプに分類することとを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記発現レベルを検出する前記ステップが、ｑＲＴ−ＰＣＲまたは任意のハイブリダイゼーションベースの遺伝子アッセイを行うことを含む、請求項１４から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記発現レベルが、ｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより検出される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記発現レベルの前記検出が、表１の少なくとも１種の分類指標バイオマーカーに特異的な少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記分類指標バイオマーカーの前記検出された発現レベルに基づいて、肺腺癌（ＡＤ）のサブタイプを処置するための療法に対する応答を予測するステップをさらに含む、請求項１４から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記療法が、化学療法、血管新生阻害剤、および／または免疫療法である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
肺ＡＤの前記サブタイプがＴＲＵであり、前記療法が化学療法または血管新生阻害剤である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
肺ＡＤの前記サブタイプがＰＰであり、前記療法が化学療法である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
肺ＡＤの前記サブタイプがＰＩであり、前記療法が免疫療法である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮なもしくは冷凍組織試料、エキソソーム、洗浄液、細胞ペレット、または前記患者から得られた体液である、請求項１４から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記体液が、血液もしくはその画分、尿、唾液、または喀痰である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
分類指標バイオマーカーをコードする前記少なくとも１種の核酸分子が、複数の分類指標バイオマーカーをコードする複数の核酸分子を含む、請求項１４から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記複数の分類指標バイオマーカーが、表１の少なくとも２種の分類指標バイオマーカー、少なくとも５種の分類指標バイオマーカー、少なくとも１０種の分類指標バイオマーカー、少なくとも２０種の分類指標バイオマーカー、または少なくとも３０種の分類指標バイオマーカーを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーが、表１の分類指標バイオマーカーのすべてを含む、請求項１４から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
患者から得られた肺組織試料中のバイオマーカーを検出する方法であって、増幅、ハイブリダイゼーション、および／または配列決定アッセイを使用して、表１から選択される複数のバイオマーカー核酸の発現レベルを測定するステップを含む方法。
【請求項３１】
前記肺組織試料が腺癌であると過去に診断された、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記過去の診断が組織学的検査によるものであった、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記配列決定アッセイが、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ、遺伝子チップ、ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現アッセイ、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現高速解析（ＲＡＧＥ）、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ノーザンブロッティング、または任意の他の均等な遺伝子発現検出技術を行うことを含む、請求項３０から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記発現レベルが、ｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより検出される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記発現レベルの前記検出が、表１から選択される前記複数のバイオマーカー核酸の各々あたり少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮なもしくは冷凍組織試料、エキソソーム、洗浄液、細胞ペレット、または前記患者から得られた体液である、請求項３０から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記体液が、血液もしくはその画分、尿、唾液、または喀痰である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記複数のバイオマーカー核酸が、表１の少なくとも２種のバイオマーカー核酸、少なくとも１０種のバイオマーカー核酸、少なくとも２０種のバイオマーカー核酸、少なくとも３０種のバイオマーカー核酸、少なくとも４０種のバイオマーカー核酸、少なくとも５０種のバイオマーカー核酸、少なくとも６０種のバイオマーカー核酸、または少なくとも７０種のバイオマーカー核酸を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、請求項３０から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記複数のバイオマーカー核酸が、表１の分類指標バイオマーカー核酸のすべてを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、請求項３０から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
患者から得られた肺組織試料中のバイオマーカーを検出する方法であって、増幅、ハイブリダイゼーション、および／または配列決定アッセイを使用して、表１から選択される複数のバイオマーカー核酸の発現レベルを測定するステップから本質的になる方法。
【請求項４１】
前記肺組織試料が腺癌であると過去に診断された、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記過去の診断が組織学的検査によるものであった、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記配列決定アッセイが、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ、遺伝子チップ、ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現アッセイ、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現高速解析（ＲＡＧＥ）、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ノーザンブロッティング、または任意の他の均等な遺伝子発現検出技術を行うことを含む、請求項４０から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記発現レベルが、ｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより検出される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記発現レベルの前記検出が、表１から選択される前記複数のバイオマーカー核酸の各々あたり少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮なもしくは冷凍組織試料、エキソソーム、洗浄液、細胞ペレット、または前記患者から得られた体液である、請求項４０から４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記体液が、血液もしくはその画分、尿、唾液、または喀痰である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記複数のバイオマーカー核酸が、表１の少なくとも２種のバイオマーカー核酸、少なくとも１０種のバイオマーカー核酸、少なくとも２０種のバイオマーカー核酸、少なくとも３０種のバイオマーカー核酸、少なくとも４０種のバイオマーカー核酸、少なくとも５０種のバイオマーカー核酸、少なくとも６０種のバイオマーカー核酸、または少なくとも７０種のバイオマーカー核酸を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、請求項４０から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記複数のバイオマーカー核酸が、表１の分類指標バイオマーカー核酸のすべてを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、請求項４０から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
患者から得られた肺組織試料中のバイオマーカーを検出する方法であって、増幅、ハイブリダイゼーション、および／または配列決定アッセイを使用して、表１から選択される複数のバイオマーカー核酸の発現レベルを測定するステップからなる方法。
【請求項５１】
前記肺組織試料が腺癌であると過去に診断された、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記過去の診断が組織学的検査によるものであった、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記配列決定アッセイが、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ、遺伝子チップ、ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現アッセイ、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現高速解析（ＲＡＧＥ）、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ノーザンブロッティング、または任意の他の均等な遺伝子発現検出技術を行うことを含む、請求項５０から５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記発現レベルが、ｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより検出される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記発現レベルの前記検出が、表１から選択される前記複数のバイオマーカー核酸の各々あたり少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮なもしくは冷凍組織試料、エキソソーム、洗浄液、細胞ペレット、または前記患者から得られた体液である、請求項５０から５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記体液が、血液もしくはその画分、尿、唾液、または喀痰である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記複数のバイオマーカー核酸が、表１の少なくとも２種のバイオマーカー核酸、少なくとも１０種のバイオマーカー核酸、少なくとも２０種のバイオマーカー核酸、少なくとも３０種のバイオマーカー核酸、少なくとも４０種のバイオマーカー核酸、少なくとも５０種のバイオマーカー核酸、少なくとも６０種のバイオマーカー核酸、または少なくとも７０種のバイオマーカー核酸を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、請求項５０から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記複数のバイオマーカー核酸が、表１の分類指標バイオマーカー核酸のすべてを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、請求項５０から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
腺癌患者が免疫療法に応答する可能性が高いかどうかを判定する方法であって、
前記患者由来の肺組織試料の腺癌サブタイプを判定するステップであって、前記腺癌サブタイプが、スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、およびマグノイド（近位増殖性）からなる群から選択される、ステップと、
前記サブタイプに基づいて、前記患者が免疫療法に応答する可能性が高いかどうかを査定するステップと
を含む方法。
【請求項６１】
免疫療法のための腺癌患者を選択するための方法であって、前記患者由来の肺組織試料の腺癌サブタイプを判定するステップと、前記サブタイプに基づいて、免疫療法のための前記患者を選択するステップとを含む方法。
【請求項６２】
前記免疫療法がチェックポイント阻害剤療法を含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記チェックポイント阻害剤がＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を標的とする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４を標的とする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記チェックポイント阻害剤が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、またはそれらの抗原断片結合性断片である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記チェックポイント阻害剤が、イピリムマブまたはその抗原結合性断片である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記患者が腺癌を有することが試料の組織学的解析により初めに判定される、請求項６０から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記患者の腺癌分子サブタイプが、スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）から選択され、前記患者から得られた試料の組織学的解析によって判定される、請求項６０から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮なもしくは冷凍組織試料、エキソソーム、または前記患者から得られた体液である、請求項６７から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記体液が、血液もしくはその画分、尿、唾液、または喀痰である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記腺癌サブタイプを判定する前記ステップが、複数の分類指標バイオマーカーの発現レベルを判定することを含む、請求項６０から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記複数の分類指標バイオマーカーの前記発現レベルを判定することが、ＲＮＡ配列決定、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはハイブリダイゼーションベースの解析を行うことにより核酸レベルでなされる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記腺癌サブタイプを判定するための前記複数の分類指標バイオマーカーが、公的に利用可能な肺腺癌データセットから選択される、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記公的に利用可能な肺腺癌データセットが、ＴＣＧＡ肺ＡＤ  ＲＮＡｓｅｑデータセットである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記腺癌サブタイプを判定するための前記複数の分類指標バイオマーカーが、表１から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＲＴ−ＰＣＲが、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＲＴ−ＰＣＲが、表１の前記複数の分類指標バイオマーカーに特異的なプライマーを用いて行われる、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
表１の前記複数の分類指標バイオマーカーの前記検出された発現レベルを、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットにおける表１の前記複数の分類指標バイオマーカーの発現と比較するステップであって、前記少なくとも１種のサンプルトレーニングセットが、参照腺癌ＴＲＵ試料からの表１の前記複数の分類指標バイオマーカーの発現データ、参照腺癌ＰＰ試料からの表１の前記複数の分類指標バイオマーカーの発現データ、参照腺癌ＰＩ試料からの表１の前記複数の分類指標バイオマーカーの発現データ、またはそれらの組合せを含む、ステップと、前記比較するステップの結果に基づいて第１の試料をＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩに分類するステップとをさらに含む、請求項７１から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記比較するステップが、前記試料から得られた前記発現データと、前記少なくとも１種のトレーニングセットからの前記発現データとの間の相関を判定することを含む、統計的アルゴリズムを適用することと、前記統計的アルゴリズムの結果に基づいて前記試料をＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩサブタイプに分類することとを含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記複数の分類指標バイオマーカーが、表１に記載されている分類指標バイオマーカーの各々を含む、請求項７１から７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
対象において肺がんを処置する方法であって、
前記対象から得られた肺がん試料中の少なくとも１種のバイオマーカー核酸の発現レベルを測定するステップであって、前記少なくとも１種のバイオマーカー核酸が、表１に列挙される一組のバイオマーカーから選択され、前記少なくとも１種のバイオマーカーの存在、非存在、および／またはレベルが、前記肺がんのサブタイプを示す、ステップと、
前記肺がんの前記サブタイプに基づいて免疫療法剤を投与するステップと
を含む、方法。
【請求項８２】
前記肺がん試料が、腺癌の肺がん試料である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記一組のバイオマーカーから選択される前記少なくとも１種のバイオマーカー核酸が、表１の少なくとも２種のバイオマーカー核酸、少なくとも８種のバイオマーカー核酸、少なくとも１６種のバイオマーカー核酸、少なくとも３２種のバイオマーカー核酸、または４８種のバイオマーカー核酸すべてを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記肺組織試料が腺癌であると過去に診断された、請求項８１から８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
前記過去の診断が組織学的検査によるものであった、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
さらなる一組のバイオマーカーからの少なくとも１種のバイオマーカーの発現を測定するステップをさらに含む、請求項８１から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記さらなる一組のバイオマーカーが、自然免疫細胞（ＩＩＣ）、適応免疫細胞（ＡＩＣ）、１つもしくは複数の個々の免疫バイオマーカー、１つもしくは複数のインターフェロン（ＩＦＮ）遺伝子、１つもしくは複数の主要組織適合遺伝子複合体、クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）遺伝子、またはそれらの組合せの遺伝子発現シグネチャーを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記さらなる一組のバイオマーカーが、表４Ａ、４Ｂ、５、６、７、またはそれらの組合せから選択される遺伝子を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
ＡＩＣの前記遺伝子発現シグネチャーが、表４Ａから選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
ＩＩＣの前記遺伝子発現シグネチャーが、表４Ｂから選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記１つまたは複数の個々の免疫バイオマーカーが、表５から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
前記１つまたは複数のＩＦＮ遺伝子が、表６から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９３】
前記１つまたは複数のＭＨＣＩＩ遺伝子が、表７から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項９４】
前記発現レベルを測定する前記ステップが、増幅、ハイブリダイゼーション、および／または配列決定アッセイを使用して遂行される、請求項８１から９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９５】
前記増幅、ハイブリダイゼーション、および／または配列決定アッセイが、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ、遺伝子チップ、ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現アッセイ、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現高速解析（ＲＡＧＥ）、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ノーザンブロッティング、または任意の他の均等な遺伝子発現検出技術を行うことを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記発現レベルが、ｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより検出される、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮なもしくは冷凍組織試料、エキソソーム、洗浄液、細胞ペレット、または前記患者から得られた体液である、請求項８１から９６のいずれかに記載の方法。
【請求項９８】
前記体液が、血液もしくはその画分、尿、唾液、または喀痰である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記対象の腺癌サブタイプが、スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）から選択される、請求項８１から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記肺がんサブタイプが近位炎症性であり、前記免疫療法剤がチェックポイント阻害剤を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記チェックポイント阻害剤がＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を標的とする、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４を標的とする、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記チェックポイント阻害剤が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、またはそれらの抗原断片結合性断片である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記チェックポイント阻害剤が、イピリムマブまたはその抗原結合性断片である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記少なくとも１種のバイオマーカー核酸が、複数のバイオマーカー核酸であり、前記複数のバイオマーカー核酸が、公的に利用可能な肺腺癌データセットからの１つまたは複数のバイオマーカー核酸と組み合わせた、表１に列挙される少なくとも１種のバイオマーカー核酸を含み、前記複数のバイオマーカー核酸の存在、非存在、および／またはレベルが、前記肺がんのサブタイプを示す、請求項８１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記少なくとも１種のバイオマーカー核酸が、複数のバイオマーカー核酸であり、前記複数のバイオマーカー核酸が、公的に利用可能な肺腺癌データセットからの１つまたは複数のバイオマーカー核酸と組み合わせた、表１に列挙される前記バイオマーカー核酸のすべてを含み、前記複数のバイオマーカー核酸の存在、非存在、および／またはレベルが、前記肺がんのサブタイプを示す、請求項８１に記載の方法。
【請求項１０７】
前記公的に利用可能な肺腺癌データセットが、ＴＣＧＡ肺ＡＤ  ＲＮＡｓｅｑデータセットである、請求項１０５または１０６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１６年５月１７日に出願された米国仮出願番号第６２／３３７，５９１号、２０１６年５月１７日に出願された米国仮出願番号第６２／３３７，６４５号、２０１６年９月１９日に出願された米国仮出願番号第６２／３９６，５８７号、２０１６年１１月１１日に出願された米国仮出願番号第６２／４２０，８３６号、および２０１６年１１月２３日に出願された米国仮出願番号第６２／４２５，７１７号に基づく優先権を主張しており、これら仮出願の各々は、すべての目的のためにその全体が本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、肺試料の腺癌サブタイプを判定するため、および特定のサブタイプの肺がんに苦しむ患者の処置に対する応答を予測するための方法に関する。
【０００３】
配列表に関する記載
本出願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれている。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＧＮＣＮ＿００９＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは１９４ＫＢであり、２０１７年５月１６日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂによって電子的に提出されている。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
肺がんは、米国および世界的規模の両方において、がんによる死亡原因の第１位である。２００５年にはおよそ１７２，０００件の肺腫瘍が診断され、推定死亡件数は結腸、乳房、および前立腺の合計を超える１６３，０００件であった。患者の少なくとも７５％は局所進行性疾患を示す。高解像度ＣＴなどの技術を使用してスクリーニングを改善するために多くの試みが行われてきたが、これらの方法は偽陽性結果をもたらすことが多く、通常はアウトカムを変化させない。したがって、早期に検出される小さな腫瘍でさえ、ステージＩ肺がんの術後５年生存率が４７〜６３パーセントと推定される患者に対しては多大な脅威となる。進行性疾患を有する患者の予後はより悪く、生存期間中央値は１年を優に下回る。概して、緩和療法は効果的であるが持続可能ではなく、全生存期間に対する影響の平均はおよそ３か月である。
【０００５】
集団レベルにおいて、肺がんの根底にある原因は明らかにタバコの使用であり、すべての肺がんの９０％が喫煙に直接起因する。肺がんリスク因子としてはアスベスト、ラドン、およびいくつかの肺刺激物質が一般的に認められているものの、喫煙は肺がんと非常に密接に相関しているため、ほとんどの他のリスク因子との決定的な関連性と交絡する。遺伝的関連性が強く疑われるが、厳密な機構は、稀なメンデル型（Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ）がん症候群の選択群以外で今後判定される必要がある。多くの分類スキームおよび進行中の臨床治験があるにもかかわらず、臨床診断および治療学の分野における進歩は全体的に期待外れなものとなっている。
【０００６】
ほとんどの肺がんは、気道全体で生じるサブタイプを有する多様な群である非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（＞８５％）と分類される。ＮＳＣＬＣの２種の主なサブタイプである腺癌（ＡＤ）および扁平上皮癌（ＳＣＣまたはＳＱ）は、ほぼ等しい頻度で診断されるが、異なる場所で見出されることが多く、ＳＣＣがより中心で生じる。世界保健機関（ＷＨＯ）により開発された肺がんのコンセンサス分類の第６版には、９０以上の悪性の形態的クラスおよびバリアントが記載されている。とりわけ＞１．５ｃｍの大きな腫瘍では不均一性があることが多く、形態学的分類がより困難になり、腺扁平上皮癌などの名称につながり得る。さらに、組織診断再現性の研究は、病理学者中の一致率および病理学者間の一致率が限定されていることを示している。形態の変動性、限定された組織試料、および治療標的となるマーカーの増え続けるリストを査定する必要性は、現在の診断基準に対する課題をもたらす。これは、肺がんの種々の形態的サブタイプ間の区別が患者管理を進めるうえで必要不可欠であり得、さらなる分子試験を使用することで特異的な治療標的マーカーを特定することができるという考えによってさらに強調されている。
【０００７】
現在、遺伝子発現ベースの肺腺癌（ＡＤ）サブタイピングは主に、新鮮な冷凍肺腫瘍からのＲＮＡの抽出に続いて５００個を超える遺伝子の定量的遺伝子発現を使用した最近隣重心予測因子の適用を含む研究プロトコールに制限されている。遺伝子発現ベースの腺癌サブタイピングは、遺伝子発現、突然変異スペクトル、およびコピー数変化をはじめとするゲノムプロファイルが異なり得る、３種の生物学的に異なるサブタイプ（終末呼吸単位（ＴＲＵ；旧称ブロンキオイド）、近位炎症性（ＰＩ；旧称スクアモイド）、および近位増殖性（ＰＰ；旧称マグノイド））に腺癌腫瘍を分類することが示されている。さらに、これら３種のサブタイプは、予後、喫煙者対非喫煙者における分布、ＥＧＦＲ変異、ＡＬＫ再編成、ＴＰ５３突然変異の発生率、血管新生の特徴、および免疫原性応答の特徴において異なり得る。ＡＤサブタイピングによる予後および予測的な利益の証拠があるにもかかわらず、＞５００個の遺伝子の遺伝子発現の要件は、複雑な生物情報学解析と相まって、薬物開発および／または診療所におけるＡＤサブタイピングの応用を妨げてきた。
【０００８】
がん免疫監視とは、免疫系が前がん性およびがん性細胞を特定し、これらの細胞が臨床的意義をもつ前にそれらを死滅させることができるという原理であり、これは免疫不全マウスモデルにおいて実証されている。自然および適応免疫応答は、がん増殖を促進または阻害するように連携する場合があり、免疫破壊の回避は、がんの新たな特質である。歴史的に、免疫刺激の方法は、診療所における肺がん患者に対して効果的ではなかった。腫瘍抗原発現および抗原提示細胞（ＡＰＣ）における提示の不全、免疫抑制細胞およびサイトカインの浸潤、ならびに効果的でないＴ細胞活性化は、腫瘍部位における免疫抑制をもたらし得る。がんおよび免疫系の理解が進み、肺がんなどの高度に発達した免疫回避法を有する腫瘍においても抗腫瘍応答を活性化する効果的な療法がもたらされている。しかしながら、患者における免疫活性化と免疫抑制とのバランスが繊細であるため、肺腫瘍により引き起こされる高い免疫抑制効果は、これらの進歩の有益な効果を限定する。例えばＮＳＣＬＣでは、腫瘍のタイプ、疾患の進行期、および腫瘍量に関係すると示唆されている、免疫活性化を妨害する免疫抑制細胞の役割が大きい。
【０００９】
したがって、内因性の肺腺癌サブタイプを効果的に弁別する方法の開発は、臨床診断および疾患管理に重要である。したがって、免疫療法に応答する可能性が高いと考えられ得る集団をさらに定義するための新しい方法が必要とされている。本発明は、患者の腺癌サブタイプ（終末呼吸単位（ＴＲＵ）、近位炎症性（ＰＩ）、近位増殖性（ＰＰ））に部分的に基づいて腺癌患者集団の予後または疾患アウトカムを判定するための当分野におけるこれらのおよび他の必要性に対処する。本発明の方法は、肺がんの細胞および分子起源を判定するための手段（例えば、ＡＤのサブタイピング）を提供し、当技術分野で公知の診断法と比較してより正確な診断および適用可能な処置を提供し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
１つの態様では、本明細書において提供されるのは、患者から得られた肺組織試料の腺癌（ＡＤ）サブタイプを判定するための方法であって、前記方法が、表１の少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現レベルを検出するステップを含み、前記分類指標バイオマーカーの前記発現レベルの前記検出が、終末呼吸単位（ＴＲＵ）、近位増殖性（ＰＰ）、または近位炎症性（ＰＩ）ＡＤサブタイプを特異的に特定する、方法である。一部の場合では、前記方法は、表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの前記検出された発現レベルを、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットにおける表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現と比較するステップであって、前記少なくとも１種のサンプルトレーニングセットが、参照ＡＤ  ＴＲＵ試料からの表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現データ、参照ＡＤ  ＰＰ試料からの表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現データ、参照ＡＤ  ＰＩ試料からの表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現データ、またはそれらの組合せを含む、ステップと、前記比較するステップの結果に基づいて前記試料をＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩサブタイプに分類するステップとをさらに含む。一部の場合では、前記比較するステップが、前記試料から得られた前記発現データと、前記少なくとも１種のトレーニングセットからの前記発現データとの間の相関を判定することを含む、統計的アルゴリズムを適用することと、前記統計的アルゴリズムの結果に基づいて前記試料をＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩサブタイプに分類することとを含む。一部の場合では、前記分類指標バイオマーカーの前記発現レベルが、核酸レベルで検出される。一部の場合では、前記核酸レベルがＲＮＡまたはｃＤＮＡである。一部の場合では、前記発現レベルを検出するステップが、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ、遺伝子チップ、ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現アッセイ、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現高速解析（ＲＡＧＥ）、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ノーザンブロッティング、または任意の他の均等な遺伝子発現検出技術を行うことを含む。一部の場合では、前記発現レベルが、ｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより検出される。一部の場合では、前記発現レベルの前記検出が、表１の少なくとも１種の分類指標バイオマーカーに特異的な少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む。一部の場合では、前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮なもしくは冷凍組織試料、エキソソーム、洗浄液、細胞ペレット、または前記患者から得られた体液である。一部の場合では、前記体液が、血液もしくはその画分、尿、唾液、または喀痰である。一部の場合では、前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーが、複数の分類指標バイオマーカーを含む。一部の場合では、前記複数の分類指標バイオマーカーが、表１の少なくとも２種の分類指標バイオマーカー、少なくとも８種の分類指標バイオマーカー、少なくとも１６種の分類指標バイオマーカー、少なくとも２４種の分類指標バイオマーカー、少なくとも３２種の分類指標バイオマーカー、少なくとも４０種の分類指標バイオマーカー、または少なくとも４８種の分類指標バイオマーカーを含む。一部の場合では、前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーが、表１の分類指標バイオマーカーのすべてを含む。
【００１１】
別の態様では、本明細書において提供されるのは、肺がん細胞において特異的な発現パターンを有する分類指標バイオマーカーをコードする少なくとも１種の核酸分子の発現レベルを検出するステップを含む、患者から得られた肺組織試料の腺癌（ＡＤ）サブタイプを判定するための方法であって、前記分類指標バイオマーカーが、表１に記載されている分類指標遺伝子からなる群から選択され、前記方法が、（ａ）患者由来の肺組織試料から核酸物質を単離するステップと、（ｂ）前記核酸物質を、前記分類指標バイオマーカーの核酸分子の一部分に対して実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドと混合するステップと、（ｃ）前記分類指標バイオマーカーの発現を検出するステップとを含む方法である。一部の場合では、前記方法は、表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの前記検出された発現レベルを、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットにおける表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現と比較するステップであって、前記少なくとも１種のサンプルトレーニングセットが、参照ＡＤ  ＴＲＵ試料からの表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現データ、参照ＡＤ  ＰＰ試料からの表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現データ、参照ＡＤ  ＰＩ試料からの表１の前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現データ、またはそれらの組合せを含む、ステップと、前記比較するステップの結果に基づいて前記試料をＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩサブタイプに分類するステップとをさらに含む。一部の場合では、前記比較するステップが、前記試料から得られた前記発現データと、前記少なくとも１種のトレーニングセットからの前記発現データとの間の相関を判定することを含む、統計的アルゴリズムを適用することと、前記統計的アルゴリズムの結果に基づいて前記試料をＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩサブタイプに分類することとを含む。一部の場合では、前記発現レベルを検出する前記ステップが、ｑＲＴ−ＰＣＲまたは任意のハイブリダイゼーションベースの遺伝子アッセイを行うことを含む。一部の場合では、前記発現レベルが、ｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより検出される。一部の場合では、前記発現レベルの前記検出が、表１の少なくとも１種の分類指標バイオマーカーに特異的な少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む。一部の場合では、前記方法は、前記分類指標バイオマーカーの前記検出された発現レベルに基づいて、肺腺癌（ＡＤ）のサブタイプを処置するための療法に対する応答を予測するステップをさらに含む。一部の場合では、前記療法が、化学療法、血管新生阻害剤、および／または免疫療法である。一部の場合では、肺ＡＤの前記サブタイプがＴＲＵであり、前記療法が化学療法または血管新生阻害剤である。一部の場合では、肺ＡＤの前記サブタイプがＰＰであり、前記療法が化学療法である。一部の場合では、肺ＡＤの前記サブタイプがＰＩであり、前記療法が免疫療法である。一部の場合では、前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮なもしくは冷凍組織試料、エキソソーム、洗浄液、細胞ペレット、または前記患者から得られた体液である。一部の場合では、前記体液が、血液もしくはその画分、尿、唾液、または喀痰である。一部の場合では、分類指標バイオマーカーをコードする前記少なくとも１種の核酸分子が、複数の分類指標バイオマーカーをコードする複数の核酸分子を含む。一部の場合では、前記複数の分類指標バイオマーカーが、表１の少なくとも２種の分類指標バイオマーカー、少なくとも５種の分類指標バイオマーカー、少なくとも１０種の分類指標バイオマーカー、少なくとも２０種の分類指標バイオマーカー、または少なくとも３０種の分類指標バイオマーカーを含む。一部の場合では、前記少なくとも１種の分類指標バイオマーカーが、表１の分類指標バイオマーカーのすべてを含む。
【００１２】
なお別の態様では、本明細書において提供されるのは、患者から得られた肺組織試料中のバイオマーカーを検出する方法であって、増幅、ハイブリダイゼーション、および／または配列決定アッセイを使用して、表１から選択される複数のバイオマーカー核酸の発現レベルを測定するステップを含む方法である。一部の場合では、前記肺組織試料が腺癌であると過去に診断された。一部の場合では、前記過去の診断が組織学的検査によるものであった。一部の場合では、前記配列決定アッセイが、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ、遺伝子チップ、ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現アッセイ、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現高速解析（ＲＡＧＥ）、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ノーザンブロッティング、または任意の他の均等な遺伝子発現検出技術を行うことを含む。一部の場合では、前記発現レベルが、ｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより検出される。一部の場合では、前記発現レベルの前記検出が、表１から選択される前記複数のバイオマーカー核酸の各々あたり少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む。一部の場合では、前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮なもしくは冷凍組織試料、エキソソーム、洗浄液、細胞ペレット、または前記患者から得られた体液である。一部の場合では、前記体液が、血液もしくはその画分、尿、唾液、または喀痰である。一部の場合では、前記複数のバイオマーカー核酸が、表１の少なくとも２種のバイオマーカー核酸、少なくとも１０種のバイオマーカー核酸、少なくとも２０種のバイオマーカー核酸、少なくとも３０種のバイオマーカー核酸、少なくとも４０種のバイオマーカー核酸、少なくとも５０種のバイオマーカー核酸、少なくとも６０種のバイオマーカー核酸、または少なくとも７０種のバイオマーカー核酸を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。一部の場合では、前記複数のバイオマーカー核酸が、表１の分類指標バイオマーカー核酸のすべてを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。
【００１３】
一つの態様では、本明細書において提供されるのは、患者から得られた肺組織試料中のバイオマーカーを検出する方法であって、増幅、ハイブリダイゼーション、および／または配列決定アッセイを使用して、表１から選択される複数のバイオマーカー核酸の発現レベルを測定するステップから本質的になる方法である。一部の場合では、前記肺組織試料が腺癌であると過去に診断された。一部の場合では、前記過去の診断が組織学的検査によるものであった。一部の場合では、前記配列決定アッセイが、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ、遺伝子チップ、ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現アッセイ、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現高速解析（ＲＡＧＥ）、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ノーザンブロッティング、または任意の他の均等な遺伝子発現検出技術を行うことを含む。一部の場合では、前記発現レベルが、ｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより検出される。一部の場合では、前記発現レベルの前記検出が、表１から選択される前記複数のバイオマーカー核酸の各々あたり少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む。一部の場合では、前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮なもしくは冷凍組織試料、エキソソーム、洗浄液、細胞ペレット、または前記患者から得られた体液である。一部の場合では、前記体液が、血液もしくはその画分、尿、唾液、または喀痰である。一部の場合では、前記複数のバイオマーカー核酸が、表１の少なくとも２種のバイオマーカー核酸、少なくとも１０種のバイオマーカー核酸、少なくとも２０種のバイオマーカー核酸、少なくとも３０種のバイオマーカー核酸、少なくとも４０種のバイオマーカー核酸、少なくとも５０種のバイオマーカー核酸、少なくとも６０種のバイオマーカー核酸、または少なくとも７０種のバイオマーカー核酸を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。一部の場合では、前記複数のバイオマーカー核酸が、表１の分類指標バイオマーカー核酸のすべてを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。
【００１４】
別の態様では、本明細書において提供されるのは、患者から得られた肺組織試料中のバイオマーカーを検出する方法であって、増幅、ハイブリダイゼーション、および／または配列決定アッセイを使用して、表１から選択される複数のバイオマーカー核酸の発現レベルを測定するステップからなる方法である。一部の場合では、前記肺組織試料が腺癌であると過去に診断された。一部の場合では、前記過去の診断が組織学的検査によるものであった。一部の場合では、前記配列決定アッセイが、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ、遺伝子チップ、ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現アッセイ、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現高速解析（ＲＡＧＥ）、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ノーザンブロッティング、または任意の他の均等な遺伝子発現検出技術を行うことを含む。一部の場合では、前記発現レベルが、ｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより検出される。一部の場合では、前記発現レベルの前記検出が、表１から選択される前記複数のバイオマーカー核酸の各々あたり少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することを含む。前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮なもしくは冷凍組織試料、エキソソーム、洗浄液、細胞ペレット、または前記患者から得られた体液である。一部の場合では、前記体液が、血液もしくはその画分、尿、唾液、または喀痰である。一部の場合では、前記複数のバイオマーカー核酸が、表１の少なくとも２種のバイオマーカー核酸、少なくとも１０種のバイオマーカー核酸、少なくとも２０種のバイオマーカー核酸、少なくとも３０種のバイオマーカー核酸、少なくとも４０種のバイオマーカー核酸、少なくとも５０種のバイオマーカー核酸、少なくとも６０種のバイオマーカー核酸、または少なくとも７０種のバイオマーカー核酸を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。一部の場合では、前記複数のバイオマーカー核酸が、表１の分類指標バイオマーカー核酸のすべてを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。
【００１５】
別の態様では、本明細書において提供されるのは、腺癌患者が免疫療法に応答する可能性が高いかどうかを判定する方法であって、前記患者由来の肺組織試料の腺癌サブタイプを判定するステップであって、前記腺癌サブタイプが、スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、およびマグノイド（近位増殖性）からなる群から選択される、ステップと、前記サブタイプに基づいて、前記患者が免疫療法に応答する可能性が高いかどうかを査定するステップとを含む方法である。一部の場合では、前記免疫療法がチェックポイント阻害剤療法を含む。一部の場合では、前記チェックポイント阻害剤がＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を標的とする。一部の場合では、前記チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４を標的とする。一部の場合では、前記チェックポイント阻害剤が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、またはそれらの抗原断片結合性断片である。一部の場合では、前記チェックポイント阻害剤が、イピリムマブまたはその抗原結合性断片である。一部の場合では、前記患者が腺癌を有することが試料の組織学的解析により初めに判定される。一部の場合では、前記患者の腺癌分子サブタイプが、スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）から選択され、前記患者から得られた試料の組織学的解析によって判定される。一部の場合では、前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮なもしくは冷凍組織試料、エキソソーム、または前記患者から得られた体液である。一部の場合では、前記体液が、血液もしくはその画分、尿、唾液、または喀痰である。一部の場合では、前記腺癌サブタイプを判定する前記ステップが、複数の分類指標バイオマーカーの発現レベルを判定することを含む。一部の場合では、前記複数の分類指標バイオマーカーの前記発現レベルを判定することが、ＲＮＡ配列決定、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはハイブリダイゼーションベースの解析を行うことにより核酸レベルでなされる。一部の場合では、前記腺癌サブタイプを判定するための前記複数の分類指標バイオマーカーが、公的に利用可能な肺腺癌データセットから選択される。一部の場合では、前記公的に利用可能な肺腺癌データセットが、ＴＣＧＡ肺ＡＤ  ＲＮＡｓｅｑデータセットである。一部の場合では、前記腺癌サブタイプを判定するための前記複数の分類指標バイオマーカーが、表１から選択される。一部の場合では、前記ＲＴ−ＰＣＲが、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。一部の場合では、前記ＲＴ−ＰＣＲが、表１の前記複数の分類指標バイオマーカーに特異的なプライマーを用いて行われる。一部の場合では、前記方法は、表１の前記複数の分類指標バイオマーカーの前記検出された発現レベルを、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットにおける表１の前記複数の分類指標バイオマーカーの発現と比較するステップであって、前記少なくとも１種のサンプルトレーニングセットが、参照腺癌ＴＲＵ試料からの表１の前記複数の分類指標バイオマーカーの発現データ、参照腺癌ＰＰ試料からの表１の前記複数の分類指標バイオマーカーの発現デー���、参照腺癌ＰＩ試料からの表１の前記複数の分類指標バイオマーカーの発現データ、またはそれらの組合せを含む、ステップと、前記比較するステップの結果に基づいて第１の試料をＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩに分類するステップとをさらに含む。一部の場合では、前記比較するステップが、前記試料から得られた前記発現データと、前記少なくとも１種のトレーニングセットからの前記発現データとの間の相関を判定することを含む、統計的アルゴリズムを適用することと、前記統計的アルゴリズムの結果に基づいて前記試料をＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩサブタイプに分類することとを含む。一部の場合では、前記複数の分類指標バイオマーカーが、表１に記載されている分類指標バイオマーカーの各々を含む。
【００１６】
なお別の態様では、本明細書において提供されるのは、免疫療法のための腺癌患者を選択するための方法であって、前記患者由来の肺組織試料の腺癌サブタイプを判定するステップと、前記サブタイプに基づいて、免疫療法のための前記患者を選択するステップとを含む方法である。一部の場合では、前記免疫療法がチェックポイント阻害剤療法を含む。一部の場合では、前記チェックポイント阻害剤がＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を標的とする。一部の場合では、前記チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４を標的とする。一部の場合では、前記チェックポイント阻害剤が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、またはそれらの抗原断片結合性断片である。一部の場合では、前記チェックポイント阻害剤が、イピリムマブまたはその抗原結合性断片である。一部の場合では、前記患者が腺癌を有することが試料の組織学的解析により初めに判定される。一部の場合では、前記患者の腺癌分子サブタイプが、スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）から選択され、前記患者から得られた試料の組織学的解析によって判定される。一部の場合では、前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮なもしくは冷凍組織試料、エキソソーム、または前記患者から得られた体液である。一部の場合では、前記体液が、血液もしくはその画分、尿、唾液、または喀痰である。一部の場合では、前記腺癌サブタイプを判定する前記ステップが、複数の分類指標バイオマーカーの発現レベルを判定することを含む。一部の場合では、前記複数の分類指標バイオマーカーの前記発現レベルを判定することが、ＲＮＡ配列決定、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはハイブリダイゼーションベースの解析を行うことにより核酸レベルでなされる。一部の場合では、前記腺癌サブタイプを判定するための前記複数の分類指標バイオマーカーが、公的に利用可能な肺腺癌データセットから選択される。一部の場合では、前記公的に利用可能な肺腺癌データセットが、ＴＣＧＡ肺ＡＤ  ＲＮＡｓｅｑデータセットである。一部の場合では、前記腺癌サブタイプを判定するための前記複数の分類指標バイオマーカーが、表１から選択される。一部の場合では、前記ＲＴ−ＰＣＲが、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。一部の場合では、前記ＲＴ−ＰＣＲが、表１の前記複数の分類指標バイオマーカーに特異的なプライマーを用いて行われる。一部の場合では、前記方法は、表１の前記複数の分類指標バイオマーカーの前記検出された発現レベルを、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットにおける表１の前記複数の分類指標バイオマーカーの発現と比較するステップであって、前記少なくとも１種のサンプルトレーニングセットが、参照腺癌ＴＲＵ試料からの表１の前記複数の分類指標バイオマーカーの発現データ、参照腺癌ＰＰ試料からの表１の前記複数の分類指標バイオマーカーの発現データ、参照腺癌ＰＩ試料からの表１の前記複数の分類指標バイオマーカーの発現データ、またはそれらの組合せを含む、ステップと、前記比較するステップの結果に基づいて第１の試料をＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩに���類するステップとをさらに含む。一部の場合では、前記比較するステップが、前記試料から得られた前記発現データと、前記少なくとも１種のトレーニングセットからの前記発現データとの間の相関を判定することを含む、統計的アルゴリズムを適用することと、前記統計的アルゴリズムの結果に基づいて前記試料をＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩサブタイプに分類することとを含む。一部の場合では、前記複数の分類指標バイオマーカーが、表１に記載されている分類指標バイオマーカーの各々を含む。
【００１７】
１つの態様では、本明細書において提供されるのは、対象において肺がんを処置する方法であって、前記対象から得られた肺がん試料中の少なくとも１種のバイオマーカー核酸の発現レベルを測定するステップであって、前記少なくとも１種のバイオマーカー核酸が、表１に列挙される一組のバイオマーカーから選択され、前記少なくとも１種のバイオマーカーの存在、非存在、および／またはレベルが、前記肺がんのサブタイプを示す、ステップと、前記肺がんの前記サブタイプに基づいて免疫療法剤を投与するステップとを含む、方法である。一部の場合では、前記肺がん試料が、腺癌の肺がん試料である。一部の場合では、前記一組のバイオマーカーから選択される前記少なくとも１種のバイオマーカー核酸が、表１の少なくとも２種のバイオマーカー核酸、少なくとも８種のバイオマーカー核酸、少なくとも１６種のバイオマーカー核酸、少なくとも３２種のバイオマーカー核酸、または４８種のバイオマーカー核酸すべてを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。一部の場合では、前記肺組織試料が腺癌であると過去に診断された。一部の場合では、前記過去の診断が組織学的検査によるものであった。一部の場合では、前記方法は、さらなる一組のバイオマーカーからの少なくとも１種のバイオマーカーの発現を測定するステップをさらに含む。一部の場合では、前記さらなる一組のバイオマーカーが、自然免疫細胞（ＩＩＣ）、適応免疫細胞（ＡＩＣ）、１つもしくは複数の個々の免疫バイオマーカー、１つもしくは複数のインターフェロン（ＩＦＮ）遺伝子、１つもしくは複数の主要組織適合遺伝子複合体、クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）遺伝子、またはそれらの組合せの遺伝子発現シグネチャーを含む。一部の場合では、前記さらなる一組のバイオマーカーが、表４Ａ、４Ｂ、５、６、７、またはそれらの組合せから選択される遺伝子を含む。一部の場合では、ＡＩＣの前記遺伝子発現シグネチャーが、表４Ａから選択される。一部の場合では、ＩＩＣの前記遺伝子発現シグネチャーが、表４Ｂから選択される。一部の場合では、前記１つまたは複数の個々の免疫バイオマーカーが、表５から選択される。一部の場合では、前記１つまたは複数のＩＦＮ遺伝子が、表６から選択される。一部の場合では、前記１つまたは複数のＭＨＣＩＩ遺伝子が、表７から選択される。一部の場合では、前記発現レベルを測定する前記ステップが、増幅、ハイブリダイゼーション、および／または配列決定アッセイを使用して遂行される。一部の場合では、前記増幅、ハイブリダイゼーション、および／または配列決定アッセイが、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＮＡｓｅｑ、マイクロアレイ、遺伝子チップ、ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子発現アッセイ、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）、遺伝子発現高速解析（ＲＡＧＥ）、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、ノーザンブロッティング、または任意の他の均等な遺伝子発現検出技術を行うことを含む。一部の場合では、前記発現レベルが、ｑＲＴ−ＰＣＲを行うことにより検出される。一部の場合では、前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺組織試料、新鮮なもしくは冷凍組織試料、エキソソーム、洗浄液、細胞ペレット、または前記患者から得られた体液である。一部の場合では、前記体液が、血液もしくはその画分、尿、唾液、または喀痰である。一部の場合では、前記対象の腺癌サブタイプが、スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）から選択される。一部の場合では、前記肺がんサブタイプが近位炎症性であり、前記免疫療法剤がチェックポイント阻害剤を含む。一部の場合では、前記チェックポイント阻害剤がＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を標的とする。一部の場合では、前記チェックポイント阻害剤がＣＴＬＡ−４を標的とする。一部の場合では、前記チェックポイント阻害剤が、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、またはそれらの抗原断片結合性断片である。一部の場合では、前記チェックポイント阻害剤が、イピリムマブまたはその抗原結合性断片である。一部の場合では、前記少なくとも１種のバイオマーカー核酸が、複数のバイオマーカー核酸であり、前記複数のバイオマーカー核酸が、公的に利用可能な肺腺癌データセットからの１つまたは複数のバイオマーカー核酸と組み合わせた、表１に列挙される少なくとも１種のバイオマーカー核酸を含み、前記複数のバイオマーカー核酸の存在、非存在、および／またはレベルが、前記肺がんのサブタイプを示す。一部の場合では、前記少なくとも１種のバイオマーカー核酸が、複数のバイオマーカー核酸であり、前記複数のバイオマーカー核酸が、公的に利用可能な肺腺癌データセットからの１つまたは複数のバイオマーカー核酸と組み合わせた、表１に列挙される前記バイオマーカー核酸のすべてを含み、前記複数のバイオマーカー核酸の存在、非存在、および／またはレベルが、前記肺がんのサブタイプを示す。一部の場合では、前記公的に利用可能な肺腺癌データセットが、ＴＣＧＡ肺ＡＤ  ＲＮＡｓｅｑデータセットである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、肺がんサブタイピングならびに扁平上皮癌（ＳＣＣまたはＳＱ）および腺癌（ＡＣまたはＡＤ）の生物学的サブタイプを例示する。
【００１９】
【図２】図２は、実施例１に記載される研究において使用した肺ＡＤデータセットを例示する。
【００２０】
【図３】図３は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）の肺ＡＤデータセットにおける免疫細胞シグネチャー発現（すなわち、実施例１のＢｉｎｄｅａらによる参考文献）、他の免疫マーカー、および個々の免疫マーカーのヒートマップを例示する。ＴＲＵは終末呼吸単位であり、ＰＰは近位増殖性であり、ＰＩは近位炎症性である。
【００２１】
【図４】図４は、ＴＣＧＡのＡＤデータセットにおける免疫細胞シグネチャーを階層的クラスタリングによって並べたシグネチャーの相関行列を例示する。より濃い赤色は、一対の遺伝子がより強く正の相関を示すことを意味する。白色は、相関がないことを意味する。より濃い青色は、負の相関を意味する。
【００２２】
【図５−１】図５は、実施例１に記載される複数のＡＤデータセット間のＴ細胞シグネチャー遺伝子発現サブタイプパターンの再現性を例示する。ＴＲＵは終末呼吸単位であり、ＰＰは近位増殖性であり、ＰＩは近位炎症性である。ＲＮＡｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）ならびにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）およびＡｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）の両方によるマイクロアレイ。
【図５−２】図５は、実施例１に記載される複数のＡＤデータセット間のＴ細胞シグネチャー遺伝子発現サブタイプパターンの再現性を例示する。ＴＲＵは終末呼吸単位であり、ＰＰは近位増殖性であり、ＰＩは近位炎症性である。ＲＮＡｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）ならびにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）およびＡｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）の両方によるマイクロアレイ。
【図５−３】図５は、実施例１に記載される複数のＡＤデータセット間のＴ細胞シグネチャー遺伝子発現サブタイプパターンの再現性を例示する。ＴＲＵは終末呼吸単位であり、ＰＰは近位増殖性であり、ＰＩは近位炎症性である。ＲＮＡｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）ならびにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）およびＡｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）の両方によるマイクロアレイ。
【００２３】
【図６】図６は、ＴＣＧＡデータセットの腺癌（ＡＤ）評価におけるＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）発現と適応免疫細胞（ＡＩＣ）シグネチャーとの間の関連性（調整済み決定係数（ａｄｊｕｓｔｅｄ  Ｒ−ｓｑｕａｒｅｄ））を例示する。関連性は、ＰＤ−Ｌ１よりもサブタイプに対して一貫して強かった。Ｔｃｍは、セントラルメモリーＴ細胞であり、Ｔｅｍは、エフェクターメモリーＴ細胞であり、Ｔｈ１は、１型Ｔヘルパー細胞であり、Ｔｈ２は、２型Ｔヘルパー細胞であり、ＴＦＨは、濾胞性ヘルパーＴ細胞であり、Ｔｈ１７は、Ｔヘルパー１７細胞であり、Ｔｒｅｇは、制御性Ｔ細胞であり、Ｔｇｄは、ガンマデルタＴ細胞である。
【００２４】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂは、実施例１に記載されるように、全体的およびサブタイプ別のシグネチャーと生存期間の関連性を例示する。層別ｃｏｘモデルから算出されたハザード比（ＨＲ）および信頼区間（ＣＩ）は、正規化された免疫マーカーの単位増加に対応し、病理学的ステージに合わせて調整した。サブタイプ特有のＨＲはステージに合わせて調整し（全体はステージおよびサブタイプによって調整した）、少なくとも１種のサブタイプに対して有意な関連性（名目上ｐ＜０．０５）を有する免疫特徴のみが示されている。ＡＤは、腺癌であり、ＴＲＵは、終末呼吸単位であり、ＰＰは、近位増殖性であり、ＰＩは、近位炎症性であり、ＭＨＣ  ＩＩは、主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子シグネチャーであり、Ｔｈ１は、１型Ｔヘルパー細胞であり、Ｔｈ２は、２型Ｔヘルパー細胞であり、ＴＦＨは、濾胞性ヘルパーＴ細胞であり、Ｔｈ１７は、Ｔヘルパー１７細胞であり、Ｔｒｅｇは、制御性Ｔ細胞であり、ＤＣは、樹状細胞であり、ｉＤＣは、未成熟樹状細胞である。図７Ａ〜７Ｂは、ＴＣＧＡコホート（図７Ａ）またはＴＧＣＡ、Ｓｈｅｄｄｅｎ、およびＴｏｍｉｄａコホート（図７Ｂ）における、ＡＤサブタイプによる免疫細胞シグネチャーおよびマーカーの生存期間関連性を示す。サブタイプ特有の免疫マーカーハザード比および９５％信頼区間は、図７ＡのＴＣＧＡコホート（ｎ＝５１５  ＡＤ）における５年の全生存期間に対するものであった。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂは、実施例１に記載されるように、全体的およびサブタイプ別のシグネチャーと生存期間の関連性を例示する。層別ｃｏｘモデルから算出されたハザード比（ＨＲ）および信頼区間（ＣＩ）は、正規化された免疫マーカーの単位増加に対応し、病理学的ステージに合わせて調整した。サブタイプ特有のＨＲはステージに合わせて調整し（全体はステージおよびサブタイプによって調整した）、少なくとも１種のサブタイプに対して有意な関連性（名目上ｐ＜０．０５）を有する免疫特徴のみが示されている。ＡＤは、腺癌であり、ＴＲＵは、終末呼吸単位であり、ＰＰは、近位増殖性であり、ＰＩは、近位炎症性であり、ＭＨＣ  ＩＩは、主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子シグネチャーであり、Ｔｈ１は、１型Ｔヘルパー細胞であり、Ｔｈ２は、２型Ｔヘルパー細胞であり、ＴＦＨは、濾胞性ヘルパーＴ細胞であり、Ｔｈ１７は、Ｔヘルパー１７細胞であり、Ｔｒｅｇは、制御性Ｔ細胞であり、ＤＣは、樹状細胞であり、ｉＤＣは、未成熟樹状細胞である。図７Ａ〜７Ｂは、ＴＣＧＡコホート（図７Ａ）またはＴＧＣＡ、Ｓｈｅｄｄｅｎ、およびＴｏｍｉｄａコホート（図７Ｂ）における、ＡＤサブタイプによる免疫細胞シグネチャーおよびマーカーの生存期間関連性を示す。サブタイプ特有の免疫マーカーハザード比および９５％信頼区間は、図７ＡのＴＣＧＡコホート（ｎ＝５１５  ＡＤ）における５年の全生存期間に対するものであった。
【００２５】
【図８】図８は、ＡＤのサブタイピングのために含めるのに最適な遺伝子数を判定するために、ＲＮＡＳｅｑ肺腺癌（ＡＤ）データセットに対してＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）から行われた５分割交差検証研究を例示する。終末呼吸単位（ＴＲＵ）は、旧称ブロンキオイドである。近位増殖性（ＰＰ）は、旧称マグノイドである。近位炎症性（ＰＩ）は、旧称スクアモイドである。
【００２６】
【図９】図９は、本明細書に記載されるＡＤ予測因子の遺伝子シグネチャートレーニングのためのシルエットスコアによるプロトタイプ試料の選択を例示する。
【００２７】
【図１０】図１０は、ブロンキオイド試料（終末呼吸単位）を区別するために選択された４８種の遺伝子分類指標のうち１６種の遺伝子サブセットの遺伝子発現中央値を例示する。
【００２８】
【図１１】図１１は、マグノイド試料（近位増殖性）を区別するために選択された４８種の遺伝子分類指標のうち１６種の遺伝子サブセットの遺伝子発現中央値を例示する。
【００２９】
【図１２】図１２は、スクアモイド試料（近位炎症性）を区別するために選択された４８種の遺伝子分類指標のうち１６種の遺伝子サブセットの遺伝子発現中央値を例示する。
【００３０】
【図１３】図１３は、複数の検証データセットについて至適基準のサブタイプを定義するための５０６遺伝子分類指標を用いた本明細書において提供される４８種の遺伝子シグネチャーによるＡＤサブタイプ予測の一致率を例示する。至適基準（ＴＣＧＡ）との一致率は８７％である。Ｓｈｅｄｄｅｎ、Ｔｏｍｉｄａ、ＵＮＣ、およびＦＦＰＥとの一致率は、それぞれ、８７％、７９％、９２％、および８４％である。
【００３１】
【図１４】図１４は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）の肺ＡＤデータセットにおける免疫細胞シグネチャー（すなわち、実施例３のＢｉｎｄｅａらによる参考文献）および他の免疫マーカーのヒートマップを例示する。
【００３２】
【図１５−１】図１５は、実施例３に記載される複数のＡＤデータセット間のＴ細胞シグネチャー遺伝子発現サブタイプパターンの再現性を例示する。
【図１５−２】図１５は、実施例３に記載される複数のＡＤデータセット間のＴ細胞シグネチャー遺伝子発現サブタイプパターンの再現性を例示する。
【図１５−３】図１５は、実施例３に記載される複数のＡＤデータセット間のＴ細胞シグネチャー遺伝子発現サブタイプパターンの再現性を例示する。
【００３３】
【図１６】図１６は、実施例３に記載されるように、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）発現と適応免疫細胞（ＡＩＣ）シグネチャーとの間の関連性（調整済み決定係数）をサブタイプおよびＡＩＣシグネチャーと対比して例示する。Ｔｃｍは、セントラルメモリーＴ細胞であり、Ｔｅｍは、エフェクターメモリーＴ細胞であり、Ｔｈ１は、１型Ｔヘルパー細胞であり、Ｔｈ２は、２型Ｔヘルパー細胞であり、ＴＦＨは、濾胞性ヘルパーＴ細胞であり、Ｔｈ１７は、Ｔヘルパー１７細胞であり、Ｔｒｅｇは、制御性Ｔ細胞であり、Ｔｇｄは、ガンマデルタＴ細胞である。
【００３４】
【図１７】図１７は、実施例３に記載されるように、全体的およびサブタイプ別のＡＤシグネチャーと生存期間の関連性を例示する。ハザード比（ＨＲ）および信頼区間は、層別ｃｏｘモデルから算出された。サブタイプ特有のＨＲはステージに合わせて調整し（全体はステージおよびサブタイプによって調整した）、有意な関連性（ｐ＜０．０５）を有する免疫特徴のみが示されている。
【００３５】
【図１８−１】図１８は、ＡＤによるすべての免疫細胞およびイムノマーカー（すなわち、ＩＦＮ遺伝子、ＭＨＣＩＩ遺伝子、ならびに個々のイムノマーカーＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤＣＤ１、およびＣＴＬＡ４）のボックスプロットを例示する。ＴＲＵは終末呼吸単位であり、ＰＰは近位増殖性であり、ＰＩは近位炎症性である。ＡＣは腺癌である。
【図１８−２】図１８は、ＡＤによるすべての免疫細胞およびイムノマーカー（すなわち、ＩＦＮ遺伝子、ＭＨＣＩＩ遺伝子、ならびに個々のイムノマーカーＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤＣＤ１、およびＣＴＬＡ４）のボックスプロットを例示する。ＴＲＵは終末呼吸単位であり、ＰＰは近位増殖性であり、ＰＩは近位炎症性である。ＡＣは腺癌である。
【図１８−３】図１８は、ＡＤによるすべての免疫細胞およびイムノマーカー（すなわち、ＩＦＮ遺伝子、ＭＨＣＩＩ遺伝子、ならびに個々のイムノマーカーＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤＣＤ１、およびＣＴＬＡ４）のボックスプロットを例示する。ＴＲＵは終末呼吸単位であり、ＰＰは近位増殖性であり、ＰＩは近位炎症性である。ＡＣは腺癌である。
【図１８−４】図１８は、ＡＤによるすべての免疫細胞およびイムノマーカー（すなわち、ＩＦＮ遺伝子、ＭＨＣＩＩ遺伝子、ならびに個々のイムノマーカーＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤＣＤ１、およびＣＴＬＡ４）のボックスプロットを例示する。ＴＲＵは終末呼吸単位であり、ＰＰは近位増殖性であり、ＰＩは近位炎症性である。ＡＣは腺癌である。
【図１８−５】図１８は、ＡＤによるすべての免疫細胞およびイムノマーカー（すなわち、ＩＦＮ遺伝子、ＭＨＣＩＩ遺伝子、ならびに個々のイムノマーカーＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤＣＤ１、およびＣＴＬＡ４）のボックスプロットを例示する。ＴＲＵは終末呼吸単位であり、ＰＰは近位増殖性であり、ＰＩは近位炎症性である。ＡＣは腺癌である。
【００３６】
【図１９】図１９は、腺癌（ＡＤ）サブタイプ非サイレント突然変異量、ＡＤにおけるＳＴＫ１１不活性化（突然変異および／または欠失）、ならびにＭＨＣクラスＩＩシグネチャーを、クラスカル−ウォリス関連性検定のｐ値とともに例示する。ＴＲＵは、終末呼吸単位であり、ＰＰは、近位増殖性であり、ＰＩは、近位炎症性であり、ＭＨＣ  ＩＩは、主要組織適合性クラスＩＩ遺伝子シグネチャーである。
【００３７】
【図２０−１】図２０は、増殖、非サイレント突然変異量、ならびに肝要な薬物標的であるＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＤＣＤ１（ＰＤ−１）、およびＣＴＬＡ４における腺癌（ＡＤ）サブタイプの有意差を例示する。ＡＤは、実施例４に記載するように判定した。
【図２０−２】図２０は、増殖、非サイレント突然変異量、ならびに肝要な薬物標的であるＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＤＣＤ１（ＰＤ−１）、およびＣＴＬＡ４における腺癌（ＡＤ）サブタイプの有意差を例示する。ＡＤは、実施例４に記載するように判定した。
【図２０−３】図２０は、増殖、非サイレント突然変異量、ならびに肝要な薬物標的であるＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＤＣＤ１（ＰＤ−１）、およびＣＴＬＡ４における腺癌（ＡＤ）サブタイプの有意差を例示する。ＡＤは、実施例４に記載するように判定した。
【００３８】
【図２１】図２１は、臨床的な固形腫瘍突然変異パネル（表８に開示されている３２２種の遺伝子）における過半数の遺伝子に関するＡＤサブタイプの薬物標的遺伝子発現の有意差を例示する。ＡＤサブタイプでは、パネル遺伝子の６５％が、有意に変化する発現（ＫＷボンフェローニ閾値ｐ＜０．０００１５５）を示した。ＡＤサブタイピングは、実施例４に記載するように判定した。
【００３９】
【図２２】図２２は、臨床的な固形腫瘍突然変異パネル（表８に開示されている３２２種の遺伝子）における過半数の遺伝子に関するＡＤの薬物標的遺伝子発現の有意差を例示する。ＡＤサブタイプでは、パネル遺伝子の６３％が、有意に変化する発現（ＫＷボンフェローニ閾値ｐ＜０．０００１５５）を示した。ＡＤサブタイピングは、実施例５に記載するように判定した。
【００４０】
【図２３】図２３は、増殖における腺癌（ＡＤ）サブタイプの有意差を例示する。ＡＤサブタイピングは、実施例５に記載するように判定した。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
発明の詳細な説明
概説
本発明は、肺がんを特定または診断するためのキット、組成物、および方法を提供する。すなわち、本方法は、肺がん、特に肺腺癌（ＡＤ）のサブセットを分子的に定義するために有用であり得る。本方法は、治療応答の予後診断能および予測能を有し得る肺がんの分類を提供する。疫学的目的で有用な用語であるが、「肺がん」は特定の疾患を指さない場合があり、むしろ、肺、気管支、および胸膜の腫瘍の異種集合を表す場合がある。実用的な目的では、肺がんは概して、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の２種の組織学的サブタイプに分けることができる。これらの主な腫瘍タイプは、異なる頻度で提示される場合があり、異なる解剖学的位置を有する場合があり、異なる転移偏向を有する場合があり、療法への応答が異なる場合があり、異なる細胞先駆体に由来する可能性が高い場合がある。
【００４２】
「腺癌サブタイプを判定すること」には、例えば、肺腺癌の存在およびタイプを診断または検出すること、疾患の進行をモニタリングすること、ならびにサブタイプを示す細胞または試料を特定または検出することが含まれ得る。
【００４３】
一実施形態では、肺がんの状態は、１つまたは複数の対象試料における複数の分類指標遺伝子またはバイオマーカーの発現パターンまたはプロファイルの評価によって査定される。論述を目的として、対象または対象試料という用語は、健康および／または疾患状態を問わず個体を指す。対象は、本発明の文脈においては、試料が得られ査定される対象、研究参加者、対照対象、スクリーニング対象、または任意の他のクラスの個体であり得る。したがって、対象は、肺腺癌（そのサブタイプまたはグレードを含む）と診断されている場合があったり、肺ＡＤがんの１つもしくは複数の症状、または肺がんの素因、例えば家族（遺伝的）もしくは病歴（医学的）因子を提示する場合があったり、肺がんの処置または療法を受けている場合があったりする。代替的には、対象は、前述の因子または基準のいずれに関しても健常であり得る。「健常」という用語は任意の絶対的な評価または状態に対応するよう定義することができないため、本明細書で使用される「健常」という用語は、肺がん状態に関するものであることが理解されよう。したがって、任意の規定の疾患または疾患基準に関して健常と定義される個体は、実際には任意の他の１つもしくは複数の疾患と診断されていたり、または１つもしくは複数の他のがんを含む任意の他の１つもしくは複数の疾患基準を呈したりする場合がある。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「発現プロファイル」または「バイオマーカープロファイル」または「遺伝子シグネチャー」は、判別的または分類指標遺伝子またはバイオマーカーの発現の相対的な存在量、レベル、存在、または非存在の測定に対応する１つまたは複数の値を含む。発現プロファイルは、肺がんの診断の前もしくは後の対象に由来してもよく、処置もしくは療法の前もしくは後の１つもしくは複数の時点で対象から収集された生物学的試料に由来してもよく、処置もしくは療法が行われない（例えば、肺がんと診断されているかもしくはそのリスクがある対象における疾患の進行をモニタリングするため、もしくは疾患の発症を査定するため）１つもしくは複数の時点で対象から収集された生物学的試料に由来してもよく、または健常な対象から収集されてもよい。対象という用語は、患者と互換的に使用され得る。患者はヒト患者であり得る。本明細書において提供されるバイオマーカープロファイルの１つまたは複数のバイオマーカーは、表１の１つまたは複数のバイオマーカーから選択される。
【００４５】
本明細書で使用される場合、バイオマーカーまたは分類指標に関して使用される「発現レベルを判定すること」または「発現プロファイルを判定すること」または「発現レベルを検出すること」または「発現プロファイルを検出すること」という用語は、バイオマーカー（単数または複数）の量、例えばバイオマーカーポリペプチドまたはｍＲＮＡ（またはそれに由来するｃＤＮＡ）の量を定量的、半定量的、または定性的に確認または測定するために、プローブ、プライマー、もしくは抗体などのバイオマーカー特異的試薬および／または方法を、試料、例えば対象もしくは患者の試料および／または対照試料に適用することを意味する。例えば、バイオマーカーのレベルは、例えば、バイオマーカー検出剤、例えば抗体、例えば標識抗体がバイオマーカーに特異的に結合し、例えばポリペプチドバイオマーカーの量の相対的または絶対的な確認を可能にする、例えば免疫組織化学的検査、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫沈降などを含むイムノアッセイや、例えばマイクロアレイ解析、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）などのＲＴ−ＰＣＲ、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）、ノーザンブロット、デジタル分子バーコード技術、例えばＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｃｏｕｎｔｅｒ解析、およびＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲアッセイを含む、例えばプローブベースおよび増幅ベースの方法を含む、プローブまたはプライマーもしくはプライマーセットを使用して核酸バイオマーカーの量を確認する、ハイブリダイゼーションおよびＰＣＲプロトコールを含むいくつかの方法によって判定することができる。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料または細胞におけるｍＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどの、ｍＲＮＡ検出および数量化の他の方法を適用してもよい。この技術は現在、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ＶｉｅｗＲＮＡ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって提供されており、これは、増幅系に特異的に結合してハイブリダイゼーションシグナルを増幅するプローブセットを各ｍＲＮＡに使用する；これらの増幅されたシグナルは、標準的な蛍光顕微鏡または撮像系を使用して可視化することができる。例えばこの系は、例えば同じ組織切片中に存在する正常および腫瘍細胞を試料が有する場合、不均一試料中の転写物レベルを検出および測定することができる。言及したように、組織試料中の遺伝子発現レベルを測定するために、ＴａｑＭａｎプローブベースの遺伝子発現解析（ＰＣＲベース）を使用することもでき、この技術は、ＦＦＰＥ試料中のｍＲＮＡレベルを測定するのに有用であることが示されている。手短に述べると、ＴａｑＭａｎプローブベースのアッセイは、ｍＲＮＡ標的と特異的にハイブリダイズするプローブを利用する。このプローブは、各末端に結合したクエンチャー色素およびレポーター色素（蛍光分子）を含み、ｍＲＮＡ標的との特異的なハイブリダイゼーションが起こったときにのみ蛍光が発せられる。増幅ステップ中、ポリメラーゼ酵素のエキソヌクレアーゼ活性がクエンチャーおよびレポーター色素をプローブから脱離させ、蛍光発光が生じ得る。検出系によってこの蛍光発光が記録され、シグナルが測定される；これらのシグナル強度を使用して、試料中の所与の転写物の存在量（遺伝子発現）を算出する。
【００４６】
一実施形態では、本明細書（例えば表１および２）に記載される遺伝子カセットまたは分類指標遺伝子に関連付けられる「発現プロファイル」または「バイオマーカープロファイル」または「遺伝子シグネチャー」は、正常試料と腫瘍試料とを弁別するのに有用であり得る。別の実施形態では、腫瘍試料は肺腺癌（ＡＤ）である。別の実施形態では、ＡＤは、本明細書において提供される方法を使用して判定された発現プロファイルに基づいて、ブロンキオイド、スクアモイド、およびマグノイドにさらに分類され得る。腫瘍生検組織を使用したブロンキオイド、スクアモイド、およびマグノイド腺癌の特徴付けは、Hayesら（２００６年）、J.  Clin  Oncol.、２４巻（３１号）：５０７９〜９０頁に記載されている。本明細書（例えば表１）に開示される分類指標遺伝子を使用した発現プロファイルは、肺腺癌サブタイプを特異的に特定するため、および肺腺癌の処置における治療有効性を評価するために役立つ分子ツールを提供し得る。したがって、本発明は、分子ＡＤサブタイプについて対象をスクリーニングおよび分類するための方法、ならびに肺ＡＤのためのある特定の治療的処置の有効性をモニタリングするための方法を提供する。
【００４７】
一部の事例では、本明細書において提供される単一の分類指標遺伝子は、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、最大１００％の予測成功率で肺腺癌のサブタイプを特定する能力を有する。
【００４８】
一部の事例では、本明細書において提供される単一の分類指標遺伝子は、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、最大１００％の感度または特異度で肺腺癌サブタイプを判定する能力を有する。
【００４９】
本発明は、現在の方法を使用して検出することができない肺腺癌の種々のサブタイプを弁別する能力を有する系も包含する。この系は、多数の対象ならびに発現プロファイルおよび他の診断基準などの対象変数を処理する能力を有し得る。本明細書に記載される方法は、例えば、療法に対する応答の予測能を有するファーマコゲノミクスと同様に「ファーマコメタボノミクス（ｐｈａｒｍａｃｏｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ）」のために使用することもできる。この実施形態では、「応答」の証拠としての発現プロファイルを使用して対象を「レスポンダー」および「非レスポンダー」に分けてもよく、次いで、発現プロファイルの特徴を使用して、特定の治療過程に応答する可能性が高い将来の対象を標的としてもよい。
【００５０】
発現プロファイルは、肺組織の組織学評価または形態計測評価を含む、組織化学的、免疫組織化学的、細胞学的、免疫細胞学的、および視覚的な診断法を含む、他の診断法と組み合わせて使用することができる。
【００５１】
本発明の種々の実施形態では、対象に由来する発現プロファイルは、参照発現プロファイルと比較される。「参照発現プロファイル」は、処置もしくは療法の前の対象に由来するプロファイルであってもよく、特定の時点（通常は処置もしくは療法の前もしくは後だが、肺がんの診断の前もしくは後の特定の時点を含む場合もある）において対象試料から生成されたプロファイルであってもよく、または健常な個体もしくは健常な個体からプールされた参照に由来してもよい。参照発現プロファイルは、肺がんに対して包括的であってもよく、または肺腺癌の異なるサブタイプに特異的であってもよい。
【００５２】
参照発現プロファイルは、試験発現プロファイルと比較され得る。「試験発現プロファイル」は、後の時点（例えば、参照発現プロファイルの収集から１日または複数日、数週間または数か月後）であることを除いては参照発現プロファイルと同じ対象に由来してもよく、または異なる対象に由来してもよい。まとめると、対象の任意の試験発現プロファイルが、ＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩサブタイプを有する対象から過去に収集されたプロファイルと比較され得る。
【００５３】
本発明の分類指標バイオマーカーは、核酸（ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＤＮＡ）およびタンパク質、ならびにそれらのバリアントおよび断片を含み得る。そのようなバイオマーカーには、バイオマーカーをコードする核酸配列またはかかる配列の相補体の全体または一部の配列を含むＤＮＡが含まれ得る。本明細書に記載されるバイオマーカーは、目的の核酸配列のうちのいずれかの全体もしくは一部の配列を含むＲＮＡ、または逆転写反応においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成的に得られたその非天然ｃＤＮＡ産物を含む場合がある。バイオマーカー核酸は、目的の核酸配列の任意の発現産物またはその一部分を含む場合もある。バイオマーカータンパク質は、本発明のＤＮＡバイオマーカーによってコードされる、またはそれに対応するタンパク質であってもよい。バイオマーカータンパク質は、バイオマーカータンパク質またはポリペプチドのいずれかの全体または一部のアミノ酸配列を含み得る。バイオマーカー核酸は、細胞から抽出される場合もあり、またはセルフリーである場合もあり、またはエキソソームなどの細胞外小胞実体から抽出される場合もある。
【００５４】
「分類指標バイオマーカー」または「バイオマーカー」または「分類指標遺伝子」は、組織または細胞内の発現レベルが正常または健常な細胞または組織のものと比較して変化している任意の遺伝子またはタンパク質であり得る。例えば、「分類指標バイオマーカー」または「バイオマーカー」または「分類指標遺伝子」は、組織または細胞内の発現レベルが特定の肺腺癌サブタイプにおいて変化している任意の遺伝子またはタンパク質であり得る。本発明のバイオマーカーの検出は、特定のサブタイプの判定を可能にし得る。「分類指標バイオマーカー」または「バイオマーカー」または「分類指標遺伝子」は、本明細書において提供される参照または対照と比べて上方制御された（例えば、発現が増加した）もの、または下方制御された（例えば、発現が減少した）ものであり得る。この参照または対照は、本明細書において提供される任意の参照または対照であり得る。一部の実施形態では、肺腺癌の特定のサブタイプにおいて上方制御または下方制御される遺伝子の発現値は、１つの遺伝子カセットにプールすることができる。各遺伝子カセットにおける全体的な発現レベルは、本明細書において「発現プロファイル」と呼ばれ、肺腺癌のサブタイプに従って試験試料を分類するために使用される。しかしながら、本明細書において開示される遺伝子の各々の発現の独立した評価を使用すれば、上方制御および下方制御される遺伝子を１つまたは複数の遺伝子カセットにグループ分けする必要なく、腫瘍サブタイプの分類が可能であることが理解される。一部の場合では、表２に示されるように、合計４８種のバイオマーカーをＡＤサブタイプ判定に使用することができる。各ＡＤサブタイプについて、１６種中８種のバイオマーカーは負の相関を示す遺伝子であり得、８種は、特定のＡＤサブタイプの遺伝子シグネチャーとして選択され得る正の相関を示す遺伝子であり得る。
【００５５】
本発明の分類指標バイオマーカーは、本明細書上文に定義されるように、肺腺癌において選択的に発現される任意の遺伝子またはタンパク質を含む。サンプルバイオマーカー遺伝子を以下の表１または２に列挙する。表２中、表の第１の縦列は、終末呼吸単位（ＴＲＵ）を弁別するために選択されるバイオマーカーのリストを表す。表の中央の縦列は、近位増殖性（ＰＰ）を弁別するために選択されるバイオマーカーのリストを表す。表の最後の縦列は、近位炎症性（ＰＩ）を弁別するために選択されるバイオマーカーのリストを表す。
【００５６】
肺ＡＤサブタイピングのための分類指標バイオマーカーの本明細書に記載されるｔｓａｔにより表される相対的な遺伝子発現レベルを表１に示す。一実施形態では、肺腺癌サブタイピングのための分類指標バイオマーカーの遺伝子発現レベルは、表１に示されている。一実施形態では、ＡＤのサブタイプを分類するために、４８種すべての遺伝子を使用することができる。一実施形態では、最初の１６種の遺伝子が、終末呼吸単位のための選択された遺伝子シグネチャーバイオマーカーであり、非ＴＲＵ試料と比較して遺伝子番号１〜８は上方制御され、遺伝子番号９〜１６は下方制御される。別の実施形態では、遺伝子番号１７〜３２が、近位増殖性（ＰＰ）に特異的な選択された遺伝子シグネチャーバイオマーカーであり、非ＰＰ試料と比較して遺伝子番号１７〜２４は上方制御され、遺伝子番号２５〜３２は下方制御される。さらに別の実施形態では、遺伝子番号３３〜４８が、近位炎症性（ＰＩ）に特異的な選択された遺伝子シグネチャーバイオマーカーであり、非ＰＩ試料と比較して遺伝子番号３３〜４０は上方制御され、遺伝子番号４１〜４８は下方制御される。
【００５７】
【表１−１】
2019516407.tif 000003
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
2019516407.tif 000007
*各GenBank受託番号は列挙される遺伝子の代表的または例示的なGenBank受託番号であり、その全体はあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれている。さらに、列挙される代表的または例示的な各受託番号は、特定の受託番号に特許請求の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
診断的使用
一実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物は、腺癌の３種のサブタイプ：（１）終末呼吸単位（ＴＲＵ）、旧称ブロンキオイド；（２）近位増殖性（ＰＰ）、旧称マグノイド；および（３）近位炎症性（ＰＩ）、旧称スクアモイドの区別を可能にし、当技術分野で公知の分子ＡＤサブタイピング法よりも少ない遺伝子が必要とされる。
【００６０】
概して、本明細書において提供される方法は、特定の肺がんサブタイプ（例えば腺癌のサブタイプ）として肺がん試料を分類するために使用される。一実施形態では、本方法は、任意の公的に利用可能な肺ＡＤ発現データセットの分類指標バイオマーカーのうちの少なくとも１種の発現レベルを測定するステップ、検出するステップ、または判定するステップを含む。一実施形態では、本方法は、患者または対象から得られた肺がん試料中の、表１の分類指標バイオマーカーのうちの少なくとも１種の発現レベルを検出または判定するステップを含む。本明細書に記載される検出または区別方法のための肺がん試料は、過去に腺癌試料と判定または診断された試料であってもよい。過去の診断は、組織学的解析に基づき得る。組織学的解析は、１名または複数名の病理学者によって行われてよい。
【００６１】
一実施形態では、測定または検出するステップは、少なくとも１種の分類指標バイオマーカー（例えば表１の分類指標バイオマーカー）のｃＤＮＡ分子の一部分に対して実質的に相補的であるオリゴヌクレオチドを用い、ＲＮＡ−ｓｅｑ、ＲＴ−ＰＣＲ、またはハイブリダイゼーションに好適な条件下でＲＮＡ−ｓｅｑ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはハイブリダイゼーションアッセイを行うこと、および検出するステップに基づいて少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現レベルを得ることにより、核酸レベルでなされる。次いで、分類指標バイオマーカーのうちの少なくとも１種の発現レベルが、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットにおける分類指標バイオマーカー（例えば表１の分類指標バイオマーカー）のうちの少なくとも１種の参照発現レベルと比較される。少なくとも１種のサンプルトレーニングセットは、（ｉ）少なくとも１種のバイオマーカーを過剰発現する試料からの少なくとも１種のバイオマーカーの発現レベル、（ｉｉ）参照スクアモイド（近位炎症性）、ブロンキオイド（終末呼吸単位）、もしくはマグノイド（近位増殖性）試料からの発現レベル、または（ｉｉｉ）腺癌不含肺試料からの発現レベル、および肺組織試料をスクアモイド（近位炎症性）、ブロンキオイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）サブタイプに分類することを含み得る。次いで、比較するステップの結果に基づいて、腺癌のブロンキオイド、スクアモイド、またはマグノイドサブタイプに肺がん試料を分類することができる。一実施形態では、比較するステップは、肺組織またはがん試料から得られた発現データと、少なくとも１種のトレーニングセットからの発現データとの間の相関を判定するステップを含む、統計的アルゴリズムを適用するステップと、統計的アルゴリズムの結果に基づいて肺組織またはがん試料をスクアモイド（近位炎症性）、ブロンキオイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）サブタイプに分類するステップとを含み得る。
【００６２】
一実施形態では、本方法は、患者から得られた肺がん試料中の、本明細書において提供される分類指標バイオマーカー、例えば表１の分類指標バイオマーカーのうちの少なくとも１種のレベルを、核酸レベルでプローブするステップを含む。肺がん試料は、過去に腺癌試料と判定または診断された試料であってもよい。過去の診断は、組織学的解析に基づき得る。組織学的解析は、１名または複数名の病理学者によって行われてよい。プローブするステップは、一実施形態では、試料を、本明細書において提供される少なくとも１種の分類指標バイオマーカー、例えば表１の分類指標バイオマーカーのｃＤＮＡ分子の一部分に対して実質的に相補的である１つまたは複数のオリゴヌクレオチドと、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドをそれらの相補体または実質的な相補体とハイブリダイズさせるのに好適な条件下で混合するステップと；１つまたは複数のオリゴヌクレオチドと、それらの相補体または実質的な相補体との間でハイブリダイゼーションが生じるかどうかを検出するステップと；検出するステップに基づいて少なくとも１種の分類指標バイオマーカーのハイブリダイゼーション値を得るステップとを含む。次いで、少なくとも１種の分類指標バイオマーカーのハイブリダイゼーション値は、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットからの参照ハイブリダイゼーション値と比較される。例えば、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットは、参照ＴＲＵ腺癌、ＰＰ腺癌、および／またはＰＩ腺癌試料からのハイブリダイゼーション値を含む。肺がん試料は、比較するステップの結果に基づいて、例えば、ＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩと分類される。
【００６３】
肺組織試料は、ヒト対象または患者から単離された任意の試料であり得る。例えば、一実施形態では、パラフィンワックスに包埋された肺生検に対して解析が行われる。一実施形態では、試料は、新鮮な冷凍肺組織試料であり得る。別の実施形態では、試料は、患者から得られた体液であってよい。体液は、血液もしくはその画分（すなわち、血清、血漿）、尿、唾液、喀痰、または脳脊髄液（ＣＳＦ）であり得る。試料は、本明細書において提供される方法で使用するための核酸の細胞源ならびに細胞外源を含有し得る。細胞外源は、セルフリーＤＮＡおよび／またはエキソソームであり得る。一実施形態では、試料は、細胞ペレットまたは洗浄液であってもよい。本発明のこの態様は、小さな生検からであっても主要な組織学的タイプを正確に特定することにより、現在の診断学を改善する手段を提供する。本発明の方法は、ＲＴ−ＰＣＲ法を含め、高感度、高精度であり、パラフィン包埋試料で使用するための多試料分析能（ｍｕｌｔｉ−ａｎａｌｙｔｅ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ）を有する。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Croninら（２００４年）、Am.  J  Pathol.、１６４巻（１号）：３５〜４２頁を参照されたい。
【００６４】
ホルマリン固定およびパラフィンワックスへの組織包埋は、光学顕微鏡評価の前に組織を処理するための普遍的手法である。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）検体により得られる主な利点は、組織切片における細胞および構築的な形態的詳細の保存である（Foxら（１９８５年）、J  Histochem  Cytochem、３３巻：８４５〜８５３頁）。生検検体を処理する標準的な緩衝ホルマリン固定剤は、典型的には、３７％のホルムアルデヒドおよび１０〜１５％のメチルアルコールを含有する水溶液である。ホルムアルデヒドは、タンパク質−核酸間およびタンパク質−タンパク質間の架橋のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの形成をもたらす、反応性の高い双極性化合物である（Clarkら（１９８６年）、J  Histochem  Cytochem、３４巻：１５０９〜１５１２頁；McGheeおよびvon  Hippel（１９７５年）、Biochemistry、１４巻：１２８１〜１２９６頁、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている）。
【００６５】
一実施形態では、本明細書において使用される試料は個体から得られ、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を含む。しかしながら、他の組織および試料タイプは本明細書における使用に適している。一実施形態では、他の組織および試料タイプは、新鮮な冷凍組織、洗浄液、または細胞ペレットなどであり得る。一実施形態では、試料は、個体から得られた体液であってよい。体液は、血液もしくはその画分（例えば、血清、血漿）、尿、喀痰、唾液、または脳脊髄液（ＣＳＦ）であり得る。本明細書において提供されるバイオマーカー核酸は、細胞から抽出される場合もあり、またはセルフリーである場合もあり、またはエキソソームなどの細胞外小胞実体から抽出される場合もある。
【００６６】
ＦＦＰＥ組織からＲＮＡを単離するための方法は、当技術分野で公知である。一実施形態では、参照により本明細書に組み込まれている、Bibikovaら（２００４年）、American  Journal  of  Pathology、１６５巻：１７９９〜１８０７頁に記載されるように、全ＲＮＡがＦＦＰＥ組織から単離され得る。同様に、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）が使用され得る。パラフィンは、キシレン抽出後にエタノール洗浄を行うことによって除去される。ＲＮＡは、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を使用して組織ブロックの切片から単離され得る；ＤＮａｓｅＩ処置ステップが含まれる。ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を供給元の説明（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）に従って使用して冷凍試料から抽出してもよい。測定可能な残存するゲノムＤＮＡを含む試料は、再度ＤＮａｓｅＩ処置にかけてＤＮＡ混入についてアッセイしてもよい。すべての精製、ＤＮａｓｅ処置、および他のステップは、製造元のプロトコールに従って行ってよい。全ＲＮＡの単離後、試料は、使用まで−８０℃で保管することができる。
【００６７】
ｍＲＮＡ抽出の一般的な方法は当技術分野で周知であり、Ausubelら編、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  &  Sons、New  York、１９８７〜１９９９年を含む、分子生物学の標準的な教本に開示されている。パラフィン包埋組織からＲＮＡを抽出するための方法は、例えば、RuppおよびLocker（Lab  Invest.、５６巻：Ａ６７頁、１９８７年）ならびにDe  Andresら（Biotechniques、１８巻：４２〜４４頁、１９９５年）において開示されている。特に、ＲＮＡ単離は、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆ．）などの商業的な製造元からの精製キット、バッファーセット、およびプロテアーゼを製造元の説明に従って使用して行うことができる。例えば、培養下の細胞の全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラムを使用して単離することができる。他の市販のＲＮＡ単離キットとしては、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）が挙げられる。組織試料の全ＲＮＡは、例えば、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ、Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ、Ｔｅｘ．）を使用して単離することができる。腫瘍から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離によって単離することができる。さらに、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉの単一ステップＲＮＡ単離プロセス（米国特許第４，８４３，１５５号、その全体はあらゆる目的のために参照により組み込まれている）などの当業者に周知の技術を使用して、多数の組織試料を容易に処理することができる。
【００６８】
一実施形態では、試料は、肺組織試料、例えば、腺癌試料から採取された細胞を含む。細胞は、当技術分野で公知の標準的技術を使用して、生物学的試料から採取され得る。例えば、一実施形態では、細胞試料を遠心分離し、ペレット化された細胞を再懸濁することによって細胞が採取される。細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液中に再懸濁してよい。細胞懸濁液を遠心分離して細胞ペレットを得た後、細胞を溶解して、核酸、例えばメッセンジャーＲＮＡを抽出することができる。対象から得られたすべての試料は、任意の種類のさらなる処理にかけたものを含め、対象から得られたものとみなされる。
【００６９】
この試料は、一実施形態では、本明細書に記載のバイオマーカーの組合せのバイオマーカーレベルの検出前に、さらに処理される。例えば、細胞または組織試料中のｍＲＮＡは、試料の他の成分から分離してもよい。ｍＲＮＡがその天然の環境にない場合、ｍＲＮＡをその非天然状態で単離するために、試料を濃縮および／または精製してもよい。例えば、ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏの高次構造は同じ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ構造と異なることが研究により示されている（例えば、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれている、Rouskinら（２０１４年）、Nature、５０５巻、７０１〜７０５頁を参照されたい）。
【００７０】
試料のｍＲＮＡは、一実施形態では、合成ＤＮＡプローブとハイブリダイズされ、合成ＤＮＡプローブは、一部の実施形態では、検出部分（例えば、検出可能な標識、捕捉配列、バーコード報告配列）を含む。したがって、これらの実施形態では、非天然ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡ複合体が最終的に作製され、バイオマーカーの検出のために使用される。別の実施形態では、試料のｍＲＮＡは、検出可能な標識、例えばフルオロフォアで直接標識される。さらなる実施形態では、非天然の標識ｍＲＮＡ分子がｃＤＮＡプローブとハイブリダイズされ、複合体が検出される。
【００７１】
一実施形態では、ｍＲＮＡが試料から得られると、ｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション反応において相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換されるか、または、ハイブリダイゼーション反応において１つもしくは複数のｃＤＮＡプローブとともに使用される。ｃＤＮＡはｉｎ  ｖｉｖｏで存在せず、したがって非天然分子である。さらに、ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドは合成であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しない。ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないことに加え、デオキシリボ核酸を含み、リボ核酸を含まないため、ｃＤＮＡはｍＲＮＡとは必然的に異なる。ｃＤＮＡは次いで、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当業者に公知の他の増幅方法によって増幅される。例えば、用いることができる他の増幅方法としては、その全体があらゆる目的のために参照により組み込まれている、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（WuおよびWallace、Genomics、４巻：５６０頁（１９８９年）、Landegrenら、Science、２４１巻：１０７７頁（１９８８年）、その全体はあらゆる目的のために参照により組み込まれている）、転写増幅（Kwohら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８６巻：１１７３頁（１９８９年）、その全体はあらゆる目的のために参照により組み込まれている）、自家持続配列複製法（Guatelliら、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA、８７巻：１８７４頁（１９９０年）、その全体はあらゆる目的のために参照により組み込まれている）、および核酸ベースの配列増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。ＰＣＲ増幅のためのプライマーを選択するための指針は、当業者には公知である。例えば、その全体があらゆる目的のために参照により組み込まれている、McPhersonら、PCR  Basics:  From  Background  to  Bench、Springer-Verlag、２０００年を参照されたい。この増幅反応の産物、すなわち、増幅されたｃＤＮＡもまた、必然的に非天然産物である。第１には、上述のように、ｃＤＮＡは非天然分子である。第２に、ＰＣＲの場合、増幅プロセスは、出発物質の個々のｃＤＮＡ分子すべてについて何億ものｃＤＮＡコピーを作出する役割を果たす。生成されるコピーの数は、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在するｍＲＮＡのコピーの数とはかけ離れている。
【００７２】
一実施形態では、断片上にさらなるＤＮＡ配列（例えば、アダプター、レポーター、捕捉配列または部分、バーコード）を導入するプライマーを用いて（例えば、アダプター特異的プライマーを使用して）ｃＤＮＡが増幅されるか、または、さらなる配列（例えば、アダプター、レポーター、捕捉配列または部分、バーコード）を含むｃＤＮＡプローブに直接ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡバイオマーカー配列がハイブリダイズされる。したがって、ｍＲＮＡの増幅および／またはｃＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションは、さらなる配列を導入し、非天然ハイブリッドを形成することにより、非天然の一本鎖ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡから非天然の二本鎖分子を作出する役割を果たす。さらに、当業者には公知であるように、増幅手順は、それに関連した誤差率を有する。したがって、増幅は、さらなる修飾をｃＤＮＡ分子に導入する。一実施形態では、アダプター特異的プライマーを用いた増幅中、検出可能な標識、例えばフルオロフォアが一本鎖ｃＤＮＡ分子に付加される。したがって、増幅は、天然に生じないＤＮＡ複合体を作出する役割も果たし、それは少なくとも（ｉ）ｃＤＮＡはｉｎ  ｖｉｖｏで存在しない、（ｉ）アダプター配列がｃＤＮＡ分子の末端に付加されて、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないＤＮＡ配列が作られる、（ｉｉ）増幅に関連した誤差率が、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないＤＮＡ配列をさらに作出する、（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ分子の構造は天然に存在するものと比較して異なる、そして（ｉｖ）検出可能な標識がｃＤＮＡ分子に化学的に付加されるからである。
【００７３】
一部の実施形態では、目的のバイオマーカーの発現は、非天然ｃＤＮＡ分子の検出により核酸レベルで検出される。
【００７４】
一部の実施形態では、肺がんＡＤサブタイピングのための方法は、分類指標バイオマーカーセットの発現レベルを検出するステップを含む。一部の実施形態では、この検出するステップは、核酸レベルまたはタンパク質レベルにおける表１の分類指標バイオマーカーのすべてを含む。別の実施形態では、表１のうち単一の分類指標バイオマーカーまたはそれらのサブセット、例えば、約８種〜約１６種が検出される。例えば、一実施形態では、肺がんＡＤサブタイプを判定する方法において、表１のバイオマーカーのうち約５種〜約１０種、約５種〜約１５種、約５種〜約２０種、約５種〜約２５種、約５種〜約３０種、約５種〜約３５種、約５種〜約４０種、約５種〜約４５種、約５種〜約４８種が検出される。別の実施形態では、肺がんサブタイプを判定する方法において、表１のバイオマーカーの各々が検出される。別の実施形態では、表１のバイオマーカーのうち１６種が、特定の肺がんＡＤサブタイプの遺伝子シグネチャーとして選択される。
【００７５】
検出するステップは、ＲＮＡ−ｓｅｑ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ、または別のハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイ、例えば、分類指標バイオマーカーに特異的なプライマーおよび／もしくはプローブを用いるもの、ならびに／または同様のものを含むがこれらに限定されない、任意の好適な技術によって行うことができる。一部の場合では、増幅方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはｑＲＴ−ＰＣＲ）に有用なプライマーは、表１に列挙された分類指標バイオマーカーなどの本明細書において提供される分類指標遺伝子に結合するのに好適な任意のフォワードおよびリバースプライマーである。
【００７６】
本明細書に記載されるバイオマーカーは、目的の核酸配列のうちのいずれかの全体もしくは一部の配列を含むＲＮＡ、または逆転写反応においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成的に得られたその非天然ｃＤＮＡ産物を含む。「断片」という用語は、少なくとも１０、１５、２０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、８００、９００、１，０００、１，２００、もしくは１，５００個の連続したヌクレオチド、または最大で本明細書において開示される全長バイオマーカーポリヌクレオチドに存在する数のヌクレオチドを概して含むポリヌクレオチドの一部分を指すよう意図される。バイオマーカーポリヌクレオチドの断片は、概して、少なくとも１５、２５、３０、５０、１００、１５０、２００、もしくは２５０個の連続したアミノ酸、または最大で本発明の全長バイオマーカータンパク質に存在する総数のアミノ酸をコードする。
【００７７】
一部の実施形態では、例えばＲＮＡ転写物またはその発現産物などの過剰発現は、すべて試料中の測定された転写物（もしくはそれらの産物）、またはＲＮＡ転写物（もしくはそれらの非天然ｃＤＮＡ産物）の特定の参照セットであり得る、参照ＲＮＡ転写物またはそれらの発現産物のレベルに対する正規化によって判定される。正規化は、アッセイしたＲＮＡもしくはｃＤＮＡの量と、使用したＲＮＡもしくはｃＤＮＡの質の変動性との両方の差を補正するか、または正規化により除去するために行われる。したがって、アッセイは典型的に、例えばＧＡＰＤＨおよび／またはβ−アクチンなどの周知のハウスキーピング遺伝子を含むある特定の正規化遺伝子の発現を測定し、それを組み込む。代替的には、正規化は、アッセイされるバイオマーカーのすべてまたはそれらの大きなサブセットのシグナルの平均値または中央値に基づいてもよい（大域的正規化手法）。
【００７８】
単離されたｍＲＮＡは、サザンまたはノーザン解析、ＰＣＲ解析およびプローブアッセイ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイを含むがこれらに限定されない、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイにおいて使用することができる。ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの方法は、単離されたｍＲＮＡまたは合成されたｃＤＮＡを、検出される遺伝子によってコードされるｍＲＮＡとハイブリダイズし得る核酸分子（プローブ）と接触させるステップを含む。核酸プローブは、例えば、ｃＤＮＡ、またはその一部分、例えば、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０、または５００ヌクレオチドの長さで、ストリンジェントな条件下で本発明の非天然ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡバイオマーカーと特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。
【００７９】
上記で説明したように、一実施形態では、ｍＲＮＡが試料から得られると、ｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション反応において相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換される。ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの変換は、特定のｍＲＮＡの一部分に対して相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドまたはプライマーを用いて行うことができる。ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの変換は、ランダム配列を含むオリゴヌクレオチドまたはプライマーを用いて行ってもよい。ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの変換は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールに対して相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドまたはプライマーを用いて行ってもよい。ｃＤＮＡはｉｎ  ｖｉｖｏで存在せず、したがって非天然分子である。さらなる実施形態では、ｃＤＮＡは次いで、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当業者に公知の他の増幅方法によって増幅される。ＰＣＲは、本明細書において提供される分類指標遺伝子、例えば表１の分類指標バイオマーカーの少なくとも一部分に対して相補的な配列を含むフォワードおよび／またはリバースプライマーを用いて行うことができる。この増幅反応の産物、すなわち、増幅されたｃＤＮＡは、必然的に非天然産物である。上述のように、ｃＤＮＡは非天然分子である。第２に、ＰＣＲの場合、増幅プロセスは、出発物質の個々のｃＤＮＡ分子すべてについて何億ものｃＤＮＡコピーを作出する役割を果たす。生成されるコピーの数は、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在するｍＲＮＡのコピーの数とはかけ離れている。
【００８０】
一実施形態では、断片上にさらなるＤＮＡ配列（アダプター配列）を導入するプライマーを用いて（アダプター特異的プライマーを使用して）ｃＤＮＡが増幅される。アダプター配列は、テール配列がｃＤＮＡに対して相補的でないテールであってよい。例えば、本明細書において提供される分類指標遺伝子、例えば表１の分類指標バイオマーカーの少なくとも一部分に対して相補的な配列を含むフォワードおよび／またはリバースプライマーは、テール配列を含み得る。したがって、増幅は、すでに非天然のｃＤＮＡにバーコード、アダプター、および／またはレポーター配列を導入することにより、非天然の一本鎖ｃＤＮＡから非天然の二重鎖分子を作出する役割を果たす。一実施形態では、アダプター特異的プライマーを用いた増幅中、検出可能な標識、例えばフルオロフォアが一本鎖ｃＤＮＡ分子に付加される。したがって、増幅は、天然に生じないＤＮＡ複合体を作出する役割も果たし、それは少なくとも（ｉ）ｃＤＮＡはｉｎ  ｖｉｖｏで存在しない、（ｉｉ）アダプター配列がｃＤＮＡ分子の末端に付加されて、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないＤＮＡ配列が作られる、（ｉｉｉ）増幅に関連した誤差率が、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しないＤＮＡ配列をさらに作出する、（ｉｖ）ｃＤＮＡ分子の構造は天然に存在するものと比較して異なる、そして（ｖ）検出可能な標識がｃＤＮＡ分子に化学的に付加されるからである。
【００８１】
一実施形態では、合成されたｃＤＮＡ（例えば、増幅されたｃＤＮＡ）は、例えばマイクロアレイによるプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、固体表面上に固定化される。別の実施形態では、ｃＤＮＡ産物は、ｃＤＮＡ産物とハイブリダイズする蛍光プローブの導入により、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって検出される。例えば、一実施形態では、バイオマーカーの検出は、定量的蛍光発生ＲＴ−ＰＣＲにより（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いて）査定される。ＰＣＲ解析に関しては、解析に使用するプライマー配列の判定のための周知の方法が当技術分野で利用可能である。
【００８２】
一実施形態において本明細書に提供されるバイオマーカーは、捕捉プローブおよび／またはレポータープローブを用いるハイブリダイゼーション反応により検出される。例えば、ハイブリダイゼーションプローブは、ビーズ、ガラス、またはシリコン基質などの固体表面に誘導体化されたプローブである。別の実施形態では、捕捉プローブは溶液中に存在し、患者の試料と混合され、その後、例えばビオチン−アビジン相互作用により（例えば、ビオチンが捕捉プローブの一部であり、アビジンが表面上にある場合）、表面にハイブリダイゼーション産物が結合する。ハイブリダイゼーションアッセイは、一実施形態では、捕捉プローブとレポータープローブとの両方を用いる。レポータープローブは、捕捉プローブまたはバイオマーカー核酸のいずれともハイブリダイズすることができる。例えばレポータープローブは、次いで、試料中のバイオマーカーのレベルを判定するために計数され、検出される。捕捉および／またはレポータープローブは、一実施形態では、検出可能な標識、および／または表面への官能基付与を可能にする基を含有する。
【００８３】
例えば、ｎＣｏｕｎｔｅｒ遺伝子解析系（例えば、その全体があらゆる目的のために参照により組み込まれている、Geissら（２００８年）、Nat.  Biotechnol.、２６巻、３１７〜３２５頁を参照されたい）は、本明細書において提供される方法で使用するのに適している。
【００８４】
開示内容の全体があらゆる目的のために参照により組み込まれている、米国特許第７，４７３，７６７号および同第８，４９２，０９４号に記載されているハイブリダイゼーションアッセイは、本明細書において提供される方法で使用するのに、すなわち、本明細書に記載されるバイオマーカーおよびバイオマーカーの組合せを検出するのに適している。
【００８５】
バイオマーカーレベルは、膜ブロット（例えば、ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション解析で使用されるもの）、またはマイクロウェル、試料管、ゲル、ビーズ、もしくは繊維（または結合した核酸を含む任意の固体支持体）を使用してモニタリングすることができる。例えば、それぞれそれらの全体が参照により組み込まれている、米国特許第５，７７０，７２２号、同第５，８７４，２１９号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６７７，１９５号、および同第５，４４５，９３４号を参照されたい。
【００８６】
一実施形態では、バイオマーカーレベルを検出するためにマイクロアレイが使用される。マイクロアレイは、異なる実験間で再現性があるため、この目的にとりわけ適している。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルの同時測定のための１つの方法を提供する。各アレイは、固体支持体に結合した再現可能なパターンの捕捉プローブからなる。標識されたＲＮＡまたはＤＮＡがアレイ上の相補的プローブとハイブリダイズされ、次いでレーザー走査により検出され、アレイ上の各プローブのハイブリダイゼーション強度が判定され、相対的な遺伝子発現レベルを表す定量的値に変換される。例えば、それぞれそれらの全体が参照により組み込まれている、米国特許第６，０４０，１３８号、同第５，８００，９９２号、および同第６，０２０，１３５号、同第６，０３３，８６０号、および同第６，３４４，３１６号を参照されたい。試料中の多数のＲＮＡの遺伝子発現プロファイルを判定するためには、高密度オリゴヌクレオチドアレイが特に有用である。
【００８７】
機械的合成方法を使用してこれらのアレイを合成するための技術は、例えば、米国特許第５，３８４，２６１号に記載されている。平面的なアレイ表面が一般的に使用されるが、アレイは、事実上いかなる形状の表面またはさらには多重の表面上にも製作することができる。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、繊維（例えば光学繊維）、ガラス、または任意の他の適切な基質上の核酸（またはペプチド）であり得る。例えば、それぞれそれらの全体が参照により組み込まれている、米国特許第５，７７０，３５８号、同第５，７８９，１６２号、同第５，７０８，１５３号、同第６，０４０，１９３号、および同第５，８００，９９２号を参照されたい。アレイは、包括的なデバイスの診断または他の操作を可能にするような様式でパッケージングされていてもよい。例えば、それぞれそれらの全体が参照により組み込まれている、米国特許第５，８５６，１７４号および同第５，９２２，５９１号を参照されたい。
【００８８】
一実施形態では、本明細書に記載される方法において、遺伝子発現連続解析（ＳＡＧＥ）が用いられる。ＳＡＧＥは、各転写物に対して個々のハイブリダイゼーションプローブを準備する必要なく、多数の遺伝子転写物を同時かつ定量的に解析することを可能にする方法である。まず、タグが各転写物中の一意的な位置から得られることを条件として、転写物を一意的に特定するのに十分な情報を含有する短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）を生成する。次いで、多くの転写物をひとつにつなげて長い連続的な分子を形成し、これの配列決定を行うことで、複数のタグの同一性を同時に明らかにすることができる。個々のタグの存在量を判定し、各タグに対応する遺伝子を特定することにより、転写物の任意の集団の発現パターンを定量的に評価することができる。その全体が参照により組み込まれている、Velculescuら、Science、２７０巻：４８４〜８７頁、１９９５年；Cell、８８巻：２４３〜５１頁、１９９７年を参照されたい。
【００８９】
核酸レベルにおけるバイオマーカーレベル解析のさらなる方法は、配列決定法、例えば、ＲＮＡｓｅｑ、次世代配列決定、およびBrennerら（Nat.  Biotech.、１８巻：６３０〜３４頁、２０００年、その全体は参照により組み込まれている）により記載されている超並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）の使用である。これは、ゲルに基づかないシグネチャー配列決定を、５μｍ直径の別々のマイクロビーズ上での数百万の鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニングと組み合わせた、配列決定手法である。まず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニングにより、ＤＮＡ鋳型のマイクロビーズライブラリーを構築する。これには、高い密度における（典型的には３．０×１０６マイクロビーズ／ｃｍ２を超える）フローセル内の鋳型含有マイクロビーズの平面的アレイのアセンブリが続く。ＤＮＡ断片の分離を必要としない蛍光に基づくシグネチャー配列決定法を使用して、各マイクロビーズ上のクローニングした鋳型の遊離末端を同時に解析する。この方法は、酵母ｃＤＮＡライブラリーから単回の作業において数十万の遺伝子シグネチャー配列を同時かつ正確に提供することが示されている。
【００９０】
核酸レベルでのバイオマーカーレベル解析の別の方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたは定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）などの増幅方法の使用である。試料中のバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを判定するための方法は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Mullis、１９８７年、米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている実験的実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Barany（１９９１年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８８巻：１８９〜１９３頁）、自家持続配列複製法（Guatelliら（１９９０年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８７巻：１８７４〜１８７８頁）、転写増幅系（Kwohら（１９８９年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８６巻：１１７３〜１１７７頁）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Lizardiら（１９８８年）、Bio/Technology、６巻：１１９７頁）、ローリングサークル複製（Lizardiら、米国特許第５，８５４，０３３号）、または任意の他の核酸増幅方法による核酸増幅のプロセスに続き、当業者に周知の技術を使用する増幅された分子の検出を含み得る。数多くの異なるＰＣＲまたはｑＲＴ−ＰＣＲプロトコールは、当技術分野において公知であり、試料中の判別的遺伝子の発現の検出および／または数量化のために本明細書に記載される組成物を使用して直接適用するか、または使用のために適合させることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Fanら（２００４年）、Genome  Res.、１４巻：８７８〜８８５頁を参照されたい。一般的に、ＰＣＲにおいては、標的ポリヌクレオチド配列を、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドプライマーまたは一対のオリゴヌクレオチドプライマーとの反応によって増幅する。プライマーが標的核酸の相補性領域とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長して標的配列を増幅する。ポリメラーゼベースの核酸増幅産物をもたらすのに十分な条件下では、１つのサイズの核酸断片が反応産物（増幅産物である標的ポリヌクレオチド配列）の大半を占める。増幅サイクルを繰り返して、単一の標的ポリヌクレオチド配列の濃度を増加させる。この反応は、ＰＣＲのために一般的に使用されている任意のサーモサイクラーで行ってよい。
【００９１】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲとも呼ばれる）は、定量的測定のみならず時間および混入の低減ももたらすため、一部の状況下で好ましい。本明細書で使用される場合、「定量的ＰＣＲ」（または「リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ」）とは、反応産物のサンプリングを繰り返す必要なしに、ＰＣＲ増幅が起こっている際にその進行を直接的にモニタリングすることを指す。定量的ＰＣＲでは、シグナルがバックグラウンドレベルを超えて上昇した後、しかし反応がプラトーに達する前に反応産物が生成および追跡されるとき、シグナル伝達機構（例えば蛍光）によって反応産物をモニタリングすることができる。蛍光の検出可能なまたは「閾値」レベルを達成するために要求されるサイクル数は、ＰＣＲプロセスの開始時の増幅可能な標的の濃度に正比例して変化するため、試料中の標的核酸の量の尺度をリアルタイムで提供するシグナル強度の測定が可能である。ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲグリーン）または標識プローブを使用することで、ＰＣＲ増幅により生成された伸長産物を検出することができる。本発明の配列を含む標識プローブを利用する任意のプローブフォーマットを使用してよい。
【００９２】
本発明のバイオマーカーのレベルを検出するには、免疫組織化学的検査法も好適である。試料は、後の調製のために冷凍してもよいし、または直ちに固定剤溶液に入れてもよい。組織試料は、ホルマリン、グルタルアルデヒド（gluteraldehyde）、メタノールなどの試薬での処置により固定し、パラフィンに包埋してもよい。ホルマリン固定パラフィン包埋組織試料から免疫組織化学的解析のためのスライドを調製するための方法は、当技術分野で周知である。
【００９３】
一実施形態では、本明細書において提供されるバイオマーカー、例えば表１の分類指標バイオマーカー（またはそれらのサブセット、例えば８〜１６、１６〜３２、または３２〜４８種のバイオマーカー）のレベルは、すべてのＲＮＡ転写物もしくはそれらの非天然ｃＤＮＡ発現産物、または試料中のタンパク質産物、またはＲＮＡ転写物の参照セットもしくはそれらの非天然ｃＤＮＡ発現産物の参照セット、または試料中のそれらのタンパク質産物の参照セットの発現レベルに対して正規化される。
【００９４】
一実施形態では、肺腺癌サブタイプは、本明細書において提供される分類指標遺伝子、例えば表１に列挙される分類指標バイオマーカーのうちの１つまたは複数のタンパク質発現レベルを使用して評価することができる。タンパク質発現レベルは、免疫学的検出法を使用して測定してもよい。本明細書において使用され得る免疫学的検出法としては、例えばウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの技術を使用した競合および非競合アッセイ系が挙げられるが、これらに限定されない。このようなアッセイは当技術分野では日常的かつ周知である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ausubelら編、１９９４年、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Ｉ巻、John  Wiley  &  Sons,  Inc.、New  Yorkを参照されたい）。
【００９５】
一実施形態では、身体試料中のバイオマーカータンパク質の発現を検出するために、バイオマーカータンパク質に特異的な抗体が利用される。本方法は、患者または対象から身体試料を得るステップと、身体試料を肺がん細胞内で選択的に発現されるバイオマーカーに対する少なくとも１種の抗体と接触させるステップと、抗体の結合を検出して、患者試料中でバイオマーカーが発現されているかどうかを判定するステップとを含む。本発明の好ましい態様は、肺がんサブタイプを診断するための免疫細胞化学技術を提供する。本明細書以下に記載される免疫細胞化学法が、手作業で行われてもよいし、または自動化された様式で行われてもよいことは、当業者には認識されよう。
【００９６】
随所に提示されるように、本明細書に記載の方法は、患者の肺がんＡＤサブタイプを判定するための方法を提供する。バイオマーカーレベルが、例えば非天然ｃＤＮＡバイオマーカーレベルまたは非天然ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡバイオマーカー複合体を測定することによって判定されたら、このバイオマーカーレベルが、例えば統計学的方法の使用または検出されたレベルの直接的な比較によって参照値または参照試料と比較されて、肺がんの分子的ＡＤサブタイプの判定が行われる。この比較に基づいて、患者の肺がん試料が、例えばＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩにＡＤ分類される。
【００９７】
一実施形態では、本明細書において提供される少なくとも１種の分類指標バイオマーカー、例えば表１の分類指標バイオマーカーの発現レベル値が、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットからの参照発現レベル値と比較され、ここで、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットは、参照試料からの発現レベル値を含む。さらなる実施形態では、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットは、近位炎症性（スクアモイド）、近位増殖性（マグノイド）、終末呼吸単位（ブロンキオイド）試料、またはそれらの組合せからの、本明細書において提供される少なくとも１種の分類指標バイオマーカー、例えば表１の分類指標バイオマーカーの発現レベル値を含む。
【００９８】
別個の実施形態では、本明細書において提供される少なくとも１種の分類指標バイオマーカー、例えば表１の分類指標バイオマーカーのハイブリダイゼーション値が、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットからの参照ハイブリダイゼーション値と比較され、ここで、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットは、参照試料からのハイブリダイゼーション値を含む。さらなる実施形態では、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットは、近位炎症性（スクアモイド）、近位増殖性（マグノイド）、終末呼吸単位（ブロンキオイド）試料、またはそれらの組合せからの、本明細書において提供される少なくとも１種の分類指標バイオマーカー、例えば表１の分類指標バイオマーカーのハイブリダイゼーション値を含む。バイオマーカーの検出されたレベルを参照値および／または参照試料と比較するための方法は、本明細書において提供される。この比較に基づいて、一実施形態では、対象の試料から得られたバイオマーカーレベルと参照値との間の相関が得られる。次いで、肺がんＡＤサブタイプの査定が行われる。
【００９９】
患者から得られたバイオマーカーレベルと、例えば、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットからの参照バイオマーカーレベルとの比較を支援するためには、種々の統計学的方法を使用することができる。
【０１００】
一実施形態では、教師ありパターン認識法が用いられる。教師ありパターン認識法の例としては、最近隣重心法（Dabney（２００５年）、Bioinformatics、２１巻（２２号）：４１４８〜４１５４頁およびTibshiraniら（２００２年）、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９９巻（１０号）：６５７６〜６５７２頁）；クラス解析のソフト独立モデリング（ＳＩＭＣＡ）（例えば、Wold、１９７６年を参照されたい）；部分最小二乗法解析（ＰＬＳ）（例えば、Wold、１９６６年；Joreskog、１９８２年；Frank、１９８４年；Bro,  R.、１９９７年を参照されたい）；線形判別分析（ＬＤＡ）（例えば、Nillson、１９６５年を参照されたい）；Ｋ最近傍解析（ＫＮＮ）（例えば、Brownら、１９９６年を参照されたい）；人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）（例えば、Wasserman、１９８９年；Ankerら、１９９２年；Hare、１９９４年を参照されたい）；確率ニューラルネットワーク（ＰＮＮ）（例えば、Parzen、１９６２年；Bishop、１９９５年；Speckt、１９９０年；Broomheadら、１９８８年；Patterson、１９９６年を参照されたい）；規則帰納（ＲＩ）（例えば、Quinlan、１９８６年を参照されたい）；およびベイズ法（例えば、Bretthorst、１９９０年ａ、１９９０年ｂ、１９８８年を参照されたい）を挙げることができるが、これらに限定されない。一実施形態では、遺伝子発現データに基づいて腫瘍サブタイプを特定するための分類指標は、Mullinsら（２００７年）、Clin  Chem.、５３巻（７号）：１２７３〜９頁に記載されている重心ベースの方法であり、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１０１】
他の実施形態では、教師なしトレーニング手法が用いられ、したがってトレーニングセットは使用されない。
【０１０２】
教師あり学習手法のサンプルトレーニングセットに再度言及すると、一部の実施形態では、サンプルトレーニングセットは、腺癌試料由来の分類指標バイオマーカーのうちの複数またはすべて（例えば、表１の分類指標バイオマーカーのすべて）の発現データを含み得る。複数の分類指標バイオマーカーは、表１のうち少なくとも２種の分類指標バイオマーカー、少なくとも８種の分類指標バイオマーカー、少なくとも１６種の分類指標バイオマーカー、少なくとも２４種の分類指標バイオマーカー、少なくとも３２種の分類指標バイオマーカー、少なくとも４０種の分類指標バイオマーカー、または少なくとも４８種の分類指標バイオマーカーを含み得る。一部の実施形態では、サンプルトレーニングセットは、サンプル間のばらつきを除去するために正規化される。
【０１０３】
一部の実施形態では、比較することは、例えば、パラメトリックでもノンパラメトリックでもよい任意の好適な多変量統計解析モデルなどの統計的アルゴリズムを適用することを含み得る。一部の実施形態では、統計的アルゴリズムを適用することは、ヒト肺組織試料から得られた発現データと、腺癌トレーニングセットからの発現データとの間の相関を判定することを含み得る。一部の実施形態では、（例えば）一個抜き交差検証（ＬＯＯＣＶ）などの交差検証が行われる。一部の実施形態では、統合相関（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）が行われる。一部の実施形態では、スピアマン相関が行われる。一部の実施形態では、その全体が参照により本明細書に組み込まれているMullinsら（２００７年）、Clin  Chem.、５３巻（７号）：１２７３〜９頁に記載されている統計的アルゴリズムに関し、および遺伝子発現データに基づいて、重心に基づく方法が用いられる。
【０１０４】
対象由来の試料（試験試料）に対して行われた遺伝子発現の結果は、正常であることが既知であるかまたは正常であると思われる生物学的試料または生物学的試料に由来するデータ（「参照試料」または「正常試料」、例えば非腺癌試料）と比較され得る。一部の実施形態では、参照試料または参照遺伝子発現データは、腺癌（adenocarcimona）の特定の分子サブタイプ、すなわち、スクアモイド（近位炎症性）、ブロンキオイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）を有することが既知である個体から得られるか、またはそれに由来する。
【０１０５】
参照試料は、試験試料と同時にまたはそれと異なる時点でアッセイしてもよい。代替的には、参照試料からのバイオマーカーレベル情報は、データベースまたは後日アクセスするための他の手段に記憶してもよい。
【０１０６】
試験試料に対するアッセイのバイオマーカーレベル結果は、参照試料に対する同じアッセイの結果と比較され得る。一部の場合では、参照試料に対するアッセイの結果は、データベースまたは参照値から得られる。一部の場合では、参照試料に対するアッセイの結果は、既知の、または当業者に一般的に許容される値または値の範囲である。一部の場合では、比較は定性的である。他の場合では、比較は定量的である。一部の場合では、定性的または定量的比較は、蛍光値、スポット強度、吸光度値、化学発光シグナル、ヒストグラム、臨界閾値、統計的有意値、本明細書に記載される遺伝子の発現レベル、ｍＲＮＡコピー数のうちの１つまたは複数を比較することを含み得るが、これらに限定されない。
【０１０７】
一実施形態では、各バイオマーカーレベルパネル測定に関し、オッズ比（ＯＲ）が算出される。ここでＯＲとは、患者のバイオマーカー測定値と、アウトカム、例えば肺腺癌サブタイプとの間の関連性の尺度である。例えば、その全体があらゆる目的のために参照により組み込まれている、J.  Can.  Acad.  Child  Adolesc.  Psychiatry、２０１０年；１９巻（３号）：２２７〜２２９頁を参照されたい。
【０１０８】
一実施形態では、肺がんサブタイプに関する信頼レベルを提供するために、規定の統計的信頼レベルが判定され得る。例えば、９０％超の信頼レベルが肺がんサブタイプの有用な予測因子であり得ると判定される場合がある。他の実施形態では、多かれ少なかれストリンジェントな信頼レベルが選択されてもよい。例えば、約または少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７．５％、９９％、９９．５％、または９９．９％の信頼レベルが選択され得る。提供される信頼レベルは、一部の場合では、試料の質、データの質、解析の質、使用される具体的な方法、および／または解析される遺伝子発現値の数（すなわち遺伝子の数）に関係することがある。応答の尤度を提供するための規定の信頼レベルは、予想される偽陽性数または偽陰性数に基づいて選択され得る。規定の信頼レベルを達成するためまたは診断能力のあるマーカーを特定するためのパラメータを選択するための方法としては、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線解析、従法線ＲＯＣ、主成分解析、オッズ比解析、部分最小二乗法解析、特異値分解、最小絶対収縮および選択演算子解析、最小角回帰、ならびに閾値勾配正則化法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０９】
一部の場合では、肺腺癌サブタイプを判定することは、遺伝子発現データを正規化するためおよび／またはその信頼度を改善するためにデザインされたアルゴリズムの適用によって改善することができる。本発明の一部の実施形態では、データ解析において多数の個々のデータ点が処理されるため、本明細書に記載される種々のアルゴリズムを適用するためにコンピュータまたは他のデバイス、機械もしくは装置が利用される。「機械学習アルゴリズム」とは、例えば肺腺癌サブタイプを判定するために遺伝子発現プロファイル（単数または複数）を特徴付けるために用いられる、当業者には「分類指標」としても公知である計算ベースの予測方法論を指す。例えばマイクロアレイベースのハイブリダイゼーションアッセイ、配列決定アッセイ、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイなどにより判定されるバイオマーカーレベルは、一実施形態では、プロファイルを分類するためにアルゴリズムにかけられる。教師あり学習は、概して、スクアモイド（近位炎症性）陽性、ブロンキオイド（終末呼吸単位）陽性、またはマグノイド（近位増殖性）陽性などのサブタイプ間の差別を認識するよう分類指標を「トレーニング」することと、次いで独立した試験セットで分類指標の正確度を「試験」することとを含む。したがって、新しい未知の試料についてこの分類指標を使用して、例えば、試料が属するクラス（例えば、スクアモイド対ブロンキオイド対マグノイド）を予測することができる。
【０１１０】
一部の実施形態では、ロバストマルチアレイ平均（ＲＭＡ）法を使用して、生データを正規化してもよい。ＲＭＡ法は、いくつかのマイクロアレイ上の各マッチセルに関してバックグラウンド補正後の強度を計算することから始まる。一実施形態では、その全体があらゆる目的のために参照により組み込まれているIrizarryら（２００３年）、Biostatistics、４月、４巻（２号）：２４９〜６４頁によって記載されているように、バックグラウンド補正後の値は正値に制限される。バックグラウンド補正後、次いで、各々のバックグラウンド補正後のマッチセル強度の２を底とする対数が得られる。次いで、各マイクロアレイ上の、バックグラウンド補正後、対数変換後のマッチした強度が、分位正規化法を使用して正規化される。分位正規化法では、各入力アレイおよび各プローブ値についてアレイパーセンタイルプローブ値がすべてのアレイパーセンタイル点の平均に置き換えられる。この方法は、その全体が参照により組み込まれている、Bolstadら、Bioinformatics、２００３年によって、より全面的に記載されている。分位正規化後、正規化されたデータを次いで線形モデルに当てはめ、各マイクロアレイ上の各プローブに関する強度基準を得ることができる。次いで、Ｔｕｋｅｙの中央値洗練アルゴリズム（Tukey,  J.  W.、Exploratory  Data  Analysis、１９７７年、その全体はあらゆる目的のために参照により組み込まれている）を使用して、正規化されたプローブセットデータに関する対数スケールの強度レベルを判定してもよい。
【０１１１】
種々の他のソフトウェアプログラムを実施してもよい。ある特定の方法において、特徴選択およびモデル推定は、ｇｌｍｎｅｔを使用してｌａｓｓｏペナルティを用いるロジスティック回帰により行うことができる（Friedmanら（２０１０年）、Journal  of  statistical  software、３３巻（１号）：１〜２２頁、その全体は参照により組み込まれている）。生のリードは、ＴｏｐＨａｔを使用してアラインすることができる（Trapnellら（２００９年）、Bioinformatics、２５巻（９号）：１１０５〜１１頁、その全体は参照により組み込まれている）。諸方法において、ｅ１０７１ライブラリー（Meyer  D.、Support  vector  machines:  the  interface  to  libsvm  in  package  e1071、２０１４年、その全体は参照により組み込まれている）を使用して、線形サポートベクターマシン（ＳＶＭ）（Suykens  JAK、Vandewalle  J.、Least  Squares  Support  Vector  Machine  Classifiers、Neural  Processing  Letters、１９９９年；９巻（３号）：２９３〜３００頁、その全体は参照により組み込まれている）をトレーニングするために、トップフィーチャ（１０〜２００の範囲のＮ）が使用される。信頼区間は、一実施形態では、ｐＲＯＣパッケージ（Robin  X、Turck  N、Hainard  Aら、pROC:  an  open-source  package  for  R  and  S+  to  analyze  and  compare  ROC  curves、BMC  bioinformatics、２０１１年；１２巻：７７頁、その全体は参照により組み込まれている）を使用して計算される。
【０１１２】
加えて、疑わしいとみなされ得るデータを除去するためにデータをフィルタリングしてもよい。一実施形態では、約４、５、６、７、または８より少ないグアノシン＋シトシンヌクレオチドを有するマイクロアレイプローブに由来するデータは、それらの異常なハイブリダイゼーション傾向または二次構造の問題に起因して信頼できないとみなされる場合がある。同様に、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２２より多くのグアノシン＋シトシンヌクレオチドを有するマイクロアレイプローブに由来するデータは、一実施形態では、それらの異常なハイブリダイゼーション傾向または二次構造の問題に起因して信頼できないとみなされる場合がある。
【０１１３】
本発明の一部の実施形態では、プローブセットからのデータは、それらが検出可能なレベル（バックグラウンドを超える）で特定されない場合は解析から除外される場合がある。
【０１１４】
本開示の一部の実施形態では、分散を呈さない、または低分散を呈するプローブセットは、さらなる解析から除外される場合がある。低分散プローブセットは、カイ二乗検定によって解析から除外される。一実施形態では、プローブセットは、その変換後の分散が自由度（Ｎ−１）のカイ二乗分布の９９パーセント信頼区間の左側にある場合、低分散であるとみなされる。（Ｎ−１）＊プローブセット分散／（遺伝子プローブセット分散）。Ｃｈｉ−Ｓｑ（Ｎ−１）について、式中、Ｎは、入力ＣＥＬファイルの数であり、（Ｎ−１）は、カイ二乗分布の自由度であり、「遺伝子のプローブセット分散」は、遺伝子全部のプローブセット分散の平均である。本発明の一部の実施形態では、所与のｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ群のプローブセットに含まれる、ＧＣ含量、信頼度、分散などに関してこれまでに記載されているフィルタステップを通過するプローブの数が最小数に満たない場合、これらはさらなる解析から除外され得る。例えば、一部の実施形態では、所与の遺伝子または転写物クラスターのプローブセットは、それらが約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個未満、または約２０個未満のプローブを含む場合、さらなる解析から除外されてよい。
【０１１５】
バイオマーカーレベルのデータ解析方法は、一実施形態では、本明細書において提供される特徴選択アルゴリズムの使用をさらに含む。本発明の一部の実施形態では、特徴選択は、ＬＩＭＭＡソフトウェアパッケージ（Bioinformatics  and  Computational  Biology  Solutions  using  R  and  Bioconductor、R.  Gentleman、V.  Carey、S.  Dudoit、R.  Irizarry、W.  Huber（編）、Springer、New  York、３９７〜４２０頁のSmyth,  G.  K.（２００５年）Limma:  linear  models  for  microarray  data、その全体はあらゆる目的のために参照により組み込まれている）の使用によって行われる。
【０１１６】
バイオマーカーレベルのデータ解析方法は、一実施形態では、予備分類（ｐｒｅ−ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）アルゴリズムの使用を含む。例えば、アルゴリズムは、特異的な分子指紋を使用して、試料の組成に従って試料を予備分類し、次いで補正／正規化係数を適用することができる。次いで、このデータ／情報を最終分類アルゴリズムに供給することができ、最終分類アルゴリズムは、最終診断を支援するためにこの情報を組み込む。
【０１１７】
バイオマーカーレベルのデータ解析方法は、一実施形態では、本明細書において提供される分類指標アルゴリズムの使用をさらに含む。本発明の一実施形態では、マイクロアレイデータの分類のために、対角線形判別解析（ｄｉａｇｏｎａｌ  ｌｉｎｅａｒ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）、ｋ最近傍アルゴリズム、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズム、線形サポートベクターマシン、ランダムフォレストアルゴリズム、もしくは確率モデルに基づく方法、またはそれらの組合せが用いられる。一部の実施形態では、試料（例えば、バイオマーカーレベルプロファイルが異なるもの、および／または腺癌の分子サブタイプ（例えば、スクアモイド、ブロンキオイド、マグノイド）が異なるもの）を弁別する特定されたマーカーは、目的のクラス間のバイオマーカーレベルの差の統計的有意性に基づいて選択される。一部の場合では、統計的有意性は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法または別の偽発見率（ＦＤＲ）補正法を適用することにより調整される。
【０１１８】
一部の場合では、分類指標アルゴリズムは、その全体があらゆる目的のために参照により組み込まれている、FishelおよびKaufmanら、２００７年、Bioinformatics、２３巻（１３号）：１５９９〜６０６頁に記載されているものなどのメタ解析手法で補完されてもよい。一部の場合では、分類指標アルゴリズムは、反復性解析などのメタ解析手法で補完されてもよい。
【０１１９】
事後確率を求めこれをバイオマーカーレベルのデータ解析に適用するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、その全体があらゆる目的のために参照により組み込まれている、Smyth,  G.  K.、２００４年、Stat.  Appi.  Genet.  Mol.  Biol.、３巻：論文３に記載されている。一部の場合では、事後確率は、分類指標アルゴリズムによりもたらされるマーカーのランク付けのために本発明の方法において使用される場合がある。
【０１２０】
バイオマーカーレベルプロファイリング結果の統計的評価は、腺癌の分子サブタイプ（スクアモイド、ブロンキオイド、またはマグノイド）；特定の治療介入、例えば血管新生阻害剤療法、化学療法、または免疫療法の成功の尤度のうちの１つまたは複数を示す定量的値（単数または複数）を提供し得る。一実施形態では、このデータは、患者ケアの指針とするために最も有用な形態で医師に直接提示されるか、または臨床治験における患者集団もしくは所与の医薬のための患者集団を定義するために使用される。分子プロファイリングの結果は、スチューデントＴ検定、両側Ｔ検定、ピアソン順位和解析、隠れマルコフモデル解析、ｑ−ｑプロットの解析、主成分解析、一元配置分散分析、二元配置分散分析、ＬＩＭＭＡなどを含むがこれらに限定されない、当技術分野に公知のいくつかの方法を使用して統計的に評価することができる。
【０１２１】
一部の場合では、正確度は、元の診断の正確度を判定するために経時的に対象を追跡することによって判定され得る。他の場合では、正確度は、決定論的に確立されてもよく、または統計学的方法を使用して確立されてもよい。例えば、特定レベルの正確度、特異度、陽性予測値、陰性予測値、および／または偽発見率を達成するために最適なアッセイパラメータを判定するために、受信者動作特性（ＲＯＣ）解析が使用され得る。
【０１２２】
一部の場合では、バイオマーカーレベルプロファイリングアッセイの結果は、分子プロファイリング事業、個人、医療提供者、または保険提供者の代表または代理人がアクセスできるようデータベースに入力される。一部の場合では、アッセイ結果は、医療従事者などの事業の代表、代理人、またはコンサルタントによる試料分類、特定、または診断を含む。他の場合では、コンピュータまたはアルゴリズムによるデータ解析が自動的に提供される。一部の場合では、分子プロファイリング事業は、行った分子プロファイリングアッセイ、コンサルティングサービス、データ解析、結果報告、またはデータベースアクセスのうちの１つまたは複数について、個人、保険提供者、医療提供者、研究者、または政府機関に対価請求する場合がある。
【０１２３】
本発明の一部の実施形態では、バイオマーカーレベルプロファイリングアッセイの結果は、コンピュータスクリーンでのレポートとして提示されるか、または紙による記録として提示される。一部の実施形態では、レポートには、これらに限定されないが、参照試料または参照値と比較した（例えば、コピー数または蛍光強度などによって報告される）バイオマーカーのレベル；バイオマーカーレベル値および肺腺癌サブタイプならびに提案される療法に基づいて対象が特定の療法に応答する尤度のうちの１つまたは複数のような情報が含まれ得る。
【０１２４】
一実施形態では、遺伝子発現プロファイリングの結果は、スクアモイド（近位炎症性）陽性、ブロンキオイド（終末呼吸単位）陽性、マグノイド（近位増殖性）陽性、スクアモイド（近位炎症性）陰性、ブロンキオイド（終末呼吸単位）陰性、マグノイド（近位増殖性）陰性；血管新生阻害剤、免疫療法、もしくは化学療法に応答する可能性が高い；血管新生阻害剤、免疫療法、もしくは化学療法に応答する可能性が低い；またはそれらの組合せのうちの１つまたは複数に分類され得る。
【０１２５】
本発明の一部の実施形態では、トレーニングされたアルゴリズムを使用して結果が分類される。本発明のトレーニングされたアルゴリズムには、遺伝子発現値が既知の参照セット、および／または正常試料、例えば、腺癌の特定の分子サブタイプと診断された個体からの試料を使用して開発されたアルゴリズムが含まれる。一部の場合では、遺伝子発現値が既知の参照セットは、腺癌の特定の分子サブタイプと診断されたことがあり、かつ血管新生阻害剤療法に応答すること（または応答しないこと）が既知の個体から得られる。一部の場合では、遺伝子発現値が既知の参照セットは、腺癌の特定の分子サブタイプと診断されたことがあり、かつ免疫療法に応答すること（または応答しないこと）が既知の個体から得られる。一部の場合では、遺伝子発現値が既知の参照セットは、腺癌の特定の分子サブタイプと診断されたことがあり、かつ化学療法に応答すること（または応答しないこと）が既知の個体から得られる。
【０１２６】
試料のカテゴリー化に好適なアルゴリズムとしては、ｋ最近傍アルゴリズム、サポートベクターマシン、線形判別解析、対角線形判別解析、上下調整、単純ベイズアルゴリズム、ニューラルネットワークアルゴリズム、隠れマルコフモデルアルゴリズム、遺伝子アルゴリズム、またはそれらの任意の組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
二項分類指標を実際の真値（例えば、生物学的試料由来の値）と比較すると、典型的には、可能性のあるアウトカムは４種ある。予測からのアウトカムがｐであり（ここで「ｐ」は欠失または重複症候群の存在などの陽性の分類指標出力である）、実際値もまたｐである場合、これは真陽性（ＴＰ）と呼ばれる；しかしながら、実際値がｎである場合、これは偽陽性（ＦＰ）と言われる。逆に、予測アウトカムおよび実際値の両方がｎである（ここで「ｎ」は欠失または重複症候群の不在などの陰性の分類指標出力である）場合に真陰性が生じ、偽陰性は、予測アウトカムはｎであるが実際値がｐであるときである。一実施形態では、ある人物が血管新生阻害剤療法に応答する可能性が高いかまたは低いかを判定しようとする検定を考慮されたい。この場合の偽陽性は、この人物が試験で陽性を示すが実際には応答するときに生じる。一方で偽陰性は、この人物が試験で陰性を示し、応答する可能性が低いことが示唆されるものの、実際には応答する可能性が高いときに生じる。肺がんサブタイプを分類する際にも同じことが言える。
【０１２８】
陽性予測値（ＰＰＶ）、または精度率、または疾患の検査後確率とは、陽性試験結果を有する対象で、応答する可能性が高いもしくは低いと正しく診断されたもの、または正しい肺がんサブタイプを診断されたもの、またはそれらの組合せの割合である。これは、試験されている基礎状態を陽性試験が反映する確率を反映する。しかしながら、その値は、様々であり得る疾患の有病率に依存する。一例では、次の特徴が提供される：ＦＰ（偽陽性）；ＴＮ（真陰性）；ＴＰ（真陽性）；ＦＮ（偽陰性）。偽陽性率（α）＝ＦＰ／（ＦＰ＋ＴＮ）−特異度；偽陰性率（β）＝ＦＮ／（ＴＰ＋ＦＮ）−感度；検出力（Ｐｏｗｅｒ）＝感度＝１−β；正の尤度比＝感度／（１−特異度）；負の尤度比＝（１−感度）／特異度。陰性予測値（ＮＰＶ）は、正しく診断されている陰性試験結果を有する対象の割合である。
【０１２９】
一部の実施形態では、本方法によるバイオマーカーレベル解析の結果は、所与の診断が正しい統計的信頼レベルを提供する。一部の実施形態では、そのような統計的信頼レベルは、少なくとも約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％もしくはそれを超える値であるか、または約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％もしくはそれを超える値よりも高い。
【０１３０】
一部の実施形態では、この方法は、試料中のバイオマーカーレベルと、例えば少なくとも１種のトレーニングセットに存在する参照バイオマーカーレベルとの比較に基づいて、肺組織試料を特定の肺がんサブタイプに分類するステップをさらに含む。一部の実施形態では、比較の結果が、例えば、最小一致パーセント、（例えば）カッパ統計量などの一致百分率に基づいて算出された統計量の値、最小の相関（例えばピアソンの相関）、および／または同様のものなどの１つまたは複数の基準を満たす場合、肺組織試料が特定のサブタイプに分類される。
【０１３１】
本明細書に記載される方法は、ソフトウェア（メモリに記憶されたものおよび／もしくはハードウェアで実行されるもの）、ハードウェア、またはそれらの組合せによって行われ得ることが意図される。ハードウェアモジュールは、例えば、汎用プロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、および／または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）を含み得る。ソフトウェアモジュール（ハードウェアで実行されるもの）は、Ｕｎｉｘ（登録商標）ユーティリティ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｒｕｂｙ、ＳＱＬ、ＳＡＳ（登録商標）、Ｒプログラミング言語／ソフトウェア環境、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ（商標）、および他のオブジェクト指向言語、プロシージャ言語、または他のプログラミング言語を含む様々なソフトウェア言語（例えばコンピュータコード）ならびに開発ツールにおいて表現され得る。コンピュータコードの例としては、マイクロコードまたはマイクロ命令、機械命令、例えばコンパイラにより生成されるもの、ウェブサービスを作成するために使用されるコード、およびインタープリターを使用してコンピュータにより実行される高レベル命令を含むファイルが挙げられるが、これらに限定されない。コンピュータコードのさらなる例としては、制御信号、暗号化コード、および圧縮コードが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
本明細書に記載される一部の実施形態は、コンピュータにより実施される種々の操作および／または本明細書に開示される方法を行うための命令またはコンピュータコードを有する非一時的コンピュータ可読媒体（非一時的プロセッサ可読媒体またはメモリと呼ばれる場合もある）を備えたデバイスに関する。コンピュータ可読媒体（またはプロセッサ可読媒体）は、それ自体が一時的伝搬信号（例えば、空間またはケーブルなどの伝送媒体で情報を伝える伝搬電磁波）を含まないという意味で非一時的である。この媒体およびコンピュータコード（コードと呼ばれる場合もある）は、特定の目的（単数または複数）のためにデザインされ構築されたものであってもよい。非一時的コンピュータ可読媒体の例としては、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、および磁気テープなどの磁気記憶媒体；コンパクトディスク／デジタルビデオディスク（ＣＤ／ＤＶＤ）、コンパクトディスク読み取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、およびホログラフィックデバイスなどの光学式記憶媒体；光ディスクなどの磁気光学式記憶媒体；搬送波信号処理モジュール；ならびにプログラムコードを記憶し実行するように特別に構成されたハードウェアデバイス、例えば特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、プログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、およびランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）デバイスが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される他の実施形態は、例えば、本明細書で論じられる命令および／またはコンピュータコードを含み得るコンピュータプログラム製品に関する。
【０１３３】
一部の実施形態では、単一のバイオマーカー、または約５〜約１０、約８〜約１６、約５〜約１５、約５〜約２０、約５〜約２５、約５〜約３０、約５〜約３５、約５〜約４０、約５〜約４５、約５〜約４８種のバイオマーカー（例えば、表１に開示されるもの）が、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、最大１００％、およびこの間のすべての値の予測成功率で、肺腺癌のサブタイプを分類することができる。一部の実施形態では、本明細書（例えば、表１）に開示されるバイオマーカーの任意の組合せを使用して、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、最大１００％、およびこの間のすべての値の予測成功率を得ることができる。
【０１３４】
一部の実施形態では、単一のバイオマーカー、または約５〜約１０、約８〜約１６、約５〜約１５、約５〜約２０、約５〜約２５、約５〜約３０、約５〜約３５、約５〜約４０、約５〜約４５、約５〜約４８種のバイオマーカー（例えば、表１に開示されるもの）が、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、最大１００％、およびこの間のすべての値の感度または特異度で、肺腺癌サブタイプを分類することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるバイオマーカーの任意の組合せを使用して、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、最大１００％、およびこの間のすべての値の感度または特異度を得ることができる。
【０１３５】
分類指標遺伝子の選択
一実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物は、一組のバイオマーカーの発現を解析することによって患者由来の試料（例えば、肺組織試料）のＡＤサブタイプを判定するのに有用であり、一組のバイオマーカーは、肺ＡＤサブタイプを分子的に分類するための当技術分野で公知の方法よりも少ない数のバイオマーカーを含む。一部の場合では、一組のバイオマーカーは、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１５０、１００、９５、または９０個未満のバイオマーカーである。一部の場合では、一組のバイオマーカーは、５０個未満のバイオマーカーである。一部の場合では、一組のバイオマーカーは、表１に列挙される４８種一組のバイオマーカーである。一部の場合では、一組のバイオマーカーは、表１に列挙されるバイオマーカーのサブセットである。本明細書において提供される方法および組成物において有用なバイオマーカーまたは分類指標遺伝子は、１つまたは複数のデータベースからの１つまたは複数の肺腺癌データセットから選択してよい。データベースは、公開データベースであってもよい。一実施形態では、肺腺癌サブタイプを検出または診断するための本明細書において提供される方法および組成物において有用な分類指標遺伝子（例えば、表１および表２に列挙される１つまたは複数の遺伝子）は、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）の肺腺癌ＲＮＡｓｅｑデータセットから選択された。一実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物に有用な分類指標遺伝子、例えば表１のものは、対象から得られた試料のＡＤサブタイプを判定するために発現プロファイルが使用され得る遺伝子の最小数を判定するために、分類指標遺伝子の大きなセットをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏベースのプロセスにかけることによって選択される。一部の場合では、分類指標遺伝子の大きなセットは、例えば、ＴＣＧＡなどからの肺ＡＤ  ＲＮＡｓｅｑデータセットであり得る。一部の場合では、分類指標遺伝子の大きなセットは、本明細書に記載される５０６遺伝子分類指標であってもよく、この５０６遺伝子分類指標は、至適基準サブタイプを定義する役割を果たし得る。本明細書において提供される、患者由来の試料の肺ＡＤサブタイプを判定するための遺伝子カセットを選択するためのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏプロセスは、各サブタイプに対して負の相関を示す遺伝子および正の相関を示す遺伝子を同数選択するように改変された最近隣重心へのアレイ分類（ＣＬａＮＣ）アルゴリズムを標準的な５０６分類指標遺伝子に適用または使用することを含み得る。シグネチャーに含める遺伝子の最適な数（例えば、表１に示されるようにサブタイプ当たり１６個）の判定に関し、このプロセスは、本明細書において提供されるＴＣＧＡ肺腺癌データセットを使用した５分割交差検証を行って、図８に示されるような交差検証曲線を作成することをさらに含み得る。遺伝子分類指標の最終的なリストを得るために、この方法は、図９に示されるように、至適基準サブタイプ予測強度が最も低い試料の２０％を全体から差し引いたＴＣＧＡデータセットに、最近隣重心へのアレイ分類（ＣＬａＮＣ）を適用するステップと、各サブタイプから同数を除去するステップとをさらに含み得る。
【０１３６】
一実施形態では、この方法は、遺伝子分類指標を検証するステップをさらに含む。検証は、いくつかの新鮮冷凍された公的に利用可能なアレイおよびＲＮＡｓｅｑデータセットにおいて分類指標の発現を試験し、前記発現レベルに基づいてサブタイプをコールし、その後この発現を、過去に公開されている５０６遺伝子シグネチャーにより定義される至適基準サブタイプコールと比較することを含み得る。次いで、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腺癌試料のアーカイブから新たに収集されたＲＮＡｓｅｑデータセットにおいて遺伝子シグネチャー（例えば表１）の最終検証を行って、ＦＦＰＥ試料における同等の性能を確かめることができる。一実施形態では、表１の分類指標バイオマーカーは、本明細書に記載されるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏのＣＬａＮＣプロセスに基づいて選択された。遺伝子略号および公式遺伝子名をそれぞれ縦列２および縦列３に列挙する。
【０１３７】
一実施形態では、本発明の方法は、ＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩ肺腺癌サブタイプを特定するために、患者から得られた肺がん細胞試料における、発現が変化した少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも１１種、少なくとも１２種、少なくとも１３種、少なくとも１４種、少なくとも１５種、または最大１６種の分類指標バイオマーカーの検出を必要とする。本明細書において提供される他の分類指標遺伝子発現データセットについても同じことが当てはまる。
【０１３８】
別の実施形態では、本発明の方法は、ＴＲＵ、ＰＰ、またはＰＩ肺腺癌サブタイプを特定するために、患者から得られた肺がん細胞試料（例えば、肺ＡＤ試料）における、表１の４８種の遺伝子バイオマーカーのうち合計で少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも５種、少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１６種、少なくとも２０種、少なくとも３０種、少なくとも３２種、または最大４８種の分類指標バイオマーカーの検出を必要とする。本明細書において提供される他の分類指標遺伝子発現データセットについても同じことが当てはまる。
【０１３９】
一実施形態では、表１のうちの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、または最大８種のバイオマーカーが、肺腺癌の特定のサブタイプにおいて「上方制御」される。別の実施形態では、表１のうちの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、または最大８種のバイオマーカーが、肺腺癌の特定のサブタイプにおいて「下方制御」される。本明細書において提供される他の分類指標遺伝子発現データセットについても同じことが当てはまる。
【０１４０】
一実施形態では、本明細書において提供される「上方制御される」バイオマーカーの発現レベルは、約０．５倍、約１倍、約１．５倍、約２倍、約２．５倍、約３倍、約３．５倍、約４倍、約４．５倍、約５倍、およびこの間の任意の値だけ上昇する。別の実施形態では、本明細書において提供される「下方制御される」バイオマーカーの発現レベルは、約０．８倍、約１．４倍、約２倍、約２．６倍、約３．２倍、約３．６倍、約４倍、およびこの間の任意の値だけ低下する。
【０１４１】
本発明の実践においては、さらなる遺伝子またはタンパク質が使用され得ることが認識されている。例えば、中間径フィラメントタンパク質ファミリーのメンバーであるビメンチンを使用すると、腺癌サブタイプの近位増殖性（マグノイド）を特定することができ、ＳＭＡを使用すると、近位炎症性（スクアモイド）のサブタイプを特定することができる。概して、肺腺癌のサブタイプを分類する際に有用な遺伝子は、正常と腫瘍、または異なるクラスもしくはグレードの肺がんの間の弁別を独立して行うことができるものを含む。遺伝子は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積がおよそ１である場合、サブタイプ間の弁別を高信頼性で行うことができるとみなされる。
【０１４２】
臨床的／治療的使用
一実施形態では、がんを患う患者の疾患アウトカムまたは予後を判定するための方法が本明細書において提供される。一部の場合では、がんは肺がんである。疾患アウトカムまたは予後は、一定期間または間隔（例えば、０〜３６か月または０〜６０か月）にわたって全生存期間を検査することにより測定することができる。一実施形態では、生存期間は、サブタイプ（例えば、肺がんの場合、腺癌（ＴＲＵ、ＰＩ、およびＰＰ））の関数として解析される。無再発生存期間および全生存期間は、標準的なカプラン・マイヤープロットならびにＣｏｘ比例ハザードモデリングを使用して査定することができる。
【０１４３】
一実施形態では、患者の肺がんサブタイプが判定されたら、この患者は、好適な療法、例えば化学療法、または血管新生阻害剤を用いた薬物療法、または免疫療法のために選択される。一実施形態では、患者の肺がんサブタイプが判定されたら、この患者には、好適な治療剤、例えば化学療法剤、または血管新生阻害剤、または免疫療法剤が投与される。一実施形態では、療法は免疫療法であり、免疫療法剤は、チェックポイント阻害剤、モノクローナル抗体、生体応答修飾因子、治療用ワクチン、または細胞免疫療法である。
【０１４４】
本発明の方法はまた、療法に対する臨床応答を評価するのに加えて、新しい療法の有効性の臨床治験におけるエンドポイントにも有用である。順次の診断的発現プロファイルが正常に向かって移動する程度は、候補療法の有効性の１つの尺度として使用することができる。
【０１４５】
一実施形態では、本発明の方法はまた、異なる次数の療法に対する応答を肺腺癌（ＡＤ）のサブタイプに基づいて予測する際に役立つ。例えば、化学療法応答は、腫瘍サブタイプをより正確に割り当てることにより改善され得る。同様に、処置レジメンは、腫瘍サブタイプに基づいて処方され得る。例えば、ＶＥＧＦ阻害剤であるベバシズマブがＮＳＣＬＣの処置において有効であり得る有力な証拠が臨床治験により示されている。
【０１４６】
一実施形態では、終末呼吸単位（ＴＲＵ）サブタイプは、ＥＧＦＲ阻害剤およびペメトレキセドに対して向上した応答を有し得る。別の実施形態では、近位増殖性（ＰＰ）は、化学療法に対して向上した応答を有し得る。別の実施形態では、近位炎症性（ＰＩ）は、免疫療法に対して向上した応答を有し得る。別の実施形態では、すべてのサブタイプが、化学療法、血管新生阻害剤処置、および免疫療法に対して向上した応答を有し得る。
【０１４７】
血管新生阻害剤
一実施形態では、患者の肺腺癌サブタイプが判定されたら、この患者は、血管新生阻害剤を用いた薬物療法のために選択される。
【０１４８】
一実施形態では、血管新生阻害剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤、ＶＥＧＦ受容体阻害剤、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）阻害剤、またはＰＤＧＦ受容体阻害剤である。
【０１４９】
各バイオマーカーパネルは、腺癌患者が血管新生阻害剤療法に応答する可能性が高いかどうかを査定するため；血管新生阻害剤療法のための腺癌患者を選択するため；「低酸素スコア」を判定するため、および／または腺癌試料をスクアモイド（近位炎症性とも呼ばれる）、ブロンキオイド（終末呼吸単位とも呼ばれる）、もしくはマグノイド（近位増殖性とも呼ばれる）の分子サブタイプにサブタイピングするために分類指標（「分類指標バイオマーカー」とも呼ばれる）により使用可能な、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、またはそれよりも多くのバイオマーカーを含み得る。本明細書で使用される場合、「分類指標」という用語は、統計的分類のための任意のアルゴリズムを指し得、これは、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組合せにおいて実施され得る。分類指標には、２レベル、３レベル、４レベル、またはそれよりも高次の分類を行う能力があり得、これは、分類されるエンティティの性質に依存し得る。本明細書に開示される態様を達成するためには、１つまたは複数の分類指標を用いてよい。
【０１５０】
概して、腺癌患者が血管新生阻害剤療法に応答する可能性が高いかどうかを判定する方法、または血管新生阻害剤療法のための腺癌患者を選択する方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、この方法は、本明細書に記載される方法を使用して患者の腺癌サブタイプがスクアモイド（近位炎症性）、ブロンキオイド（終末呼吸単位）、またはマグノイド（近位増殖性）であるかどうかを査定するステップ（例えば、表１の１つまたは複数の分類指標バイオマーカーの発現を査定するステップ）と、ＲＲＡＧＤ、ＦＡＢＰ５、ＵＣＨＬ１、ＧＡＬ、ＰＬＯＤ、ＤＤＩＴ４、ＶＥＧＦ、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＮＤＲＧ１、ＮＰ、ＳＬＣ１６Ａ３、およびＣ１４ＯＲＦ５８（表３参照）からなる群から選択される少なくとも５種のバイオマーカーのレベルについて患者由来の腺癌試料を核酸レベルでプローブするステップとを含む。さらなる実施形態では、プローブするステップは、試料を、少なくとも５種のバイオマーカーの核酸分子の一部分に対して実質的に相補的である５種またはそれよりも多くのオリゴヌクレオチドと、５種またはそれよりも多くのオリゴヌクレオチドをそれらの相補体または実質的な相補体とハイブリダイズさせるのに好適な条件下で混合するステップと、５種またはそれよりも多くのオリゴヌクレオチドと、それらの相補体または実質的な相補体との間でハイブリダイゼーションが生じるかどうかを検出するステップと、検出するステップに基づいて試料のハイブリダイゼーション値を得るステップとを含む。試料のハイブリダイゼーション値は、次いで、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットからの参照ハイブリダイゼーション値と比較され、ここで、少なくとも１種のサンプルトレーニングセットは、（ｉ）少なくとも５種のバイオマーカーを過剰発現するか、もしくは少なくとも５種のバイオマーカーのサブセットを過剰発現する試料からの少なくとも５種のバイオマーカーのハイブリダイゼーション値、（ｉｉ）参照スクアモイド（近位炎症性）、ブロンキオイド（終末呼吸単位）もしくはマグノイド（近位増殖性）試料からの少なくとも５種のバイオマーカーのハイブリダイゼーション値、または（ｉｉｉ）腺癌不含肺試料からの少なくとも５種のバイオマーカーのハイブリダイゼーション値を含む。次いで、患者が血管新生阻害剤療法に応答する可能性が高いかどうかの判定、または血管新生阻害剤のための患者の選択が、（ｉ）患者の腺癌サブタイプおよび（ｉｉ）比較の結果に基づいて行われる。
【表３】
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【０１５１】
前述の１３種一組のバイオマーカーまたはそれらのサブセットは、本明細書では「低酸素プロファイル」とも呼ばれる。
【０１５２】
一実施形態では、本明細書において提供される方法は、対象から得られた腺癌試料中の、ＲＲＡＧＤ、ＦＡＢＰ５、ＵＣＨＬ１、ＧＡＬ、ＰＬＯＤ、ＤＤＩＴ４、ＶＥＧＦ、ＡＤＭ、ＡＮＧＰＴＬ４、ＮＤＲＧ１、ＮＰ、ＳＬＣ１６Ａ３、およびＣ１４ＯＲＦ５８から選択される少なくとも５種のバイオマーカー、少なくとも６種のバイオマーカー、少なくとも７種のバイオマーカー、少なくとも８種のバイオマーカー、少なくとも９種のバイオマーカー、もしくは少なくとも１０種のバイオマーカー、または５〜１３、６〜１３、７〜１３、８〜１３、９〜１３、もしくは１０〜１３種のバイオマーカーのレベルを判定するステップを含む。一部の事例では、バイオマーカー発現は、試料中のすべてのＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物の発現レベルに対して、またはＲＮＡ転写物もしくはそれらの発現産物の参照セットに対して正規化され得る。随所で説明される参照セットは、腺癌試料と並行して試験される実際の試料であってもよいし、またはデータベースもしくは記憶されているデータセットの値の参照セットであってもよい。発現レベルは、一実施形態では、コピー数、相対的な蛍光値、または検出された蛍光値として報告される。低酸素プロファイルのバイオマーカーの発現レベルは、本明細書において提供される方法を使用して判定された腺癌サブタイプと併せて、患者が血管新生阻害剤療法に応答する可能性が高いかどうかを判定するために、本明細書に記載される方法において使用することができる。
【０１５３】
一実施形態では、１３種のバイオマーカー（または上述のようにそれらのサブセット、例えば５種またはそれよりも多く、約５種〜約１３種）の発現レベルは、すべてのＲＮＡ転写物もしくはそれらの非天然ｃＤＮＡ発現産物、または試料中のタンパク質産物、またはＲＮＡ転写物の参照セットもしくはそれらの非天然ｃＤＮＡ発現産物の参照セット、または試料中のそれらのタンパク質産物の参照セットの発現レベルに対して正規化される。
【０１５４】
一実施形態では、血管新生阻害剤処置としては、インテグリンアンタゴニスト、セレクチンアンタゴニスト、接着分子アンタゴニスト、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、血小板内皮接着分子（ＰＣＡＭ）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ））のアンタゴニスト、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）のアンタゴニスト、塩基性線維芽細胞増殖因子アンタゴニスト、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）調節因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）調節因子（例えば、ＰＤＧＦアンタゴニスト）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５５】
対象がインテグリンアンタゴニストに応答する可能性が高いかどうかを判定する一実施形態では、インテグリンアンタゴニストは、小分子インテグリンアンタゴニスト、例えば、Paolilloら（Mini  Rev  Med  Chem、２００９年、１２巻、１４３９〜１４４６頁、その全体は参照により組み込まれている）に記載されているアンタゴニスト、または、その全体が参照により組み込まれている米国特許第６，５２４，５８１号に記載されている白血球接着誘導性サイトカインもしくは増殖因子アンタゴニスト（例えば、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））である。
【０１５６】
本明細書において提供される方法は、対象が、次の血管新生阻害剤：インターフェロンガンマ１β、インターフェロンガンマ１β（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ（登録商標））とピルフェニドン、ＡＣＵＨＴＲ０２８、αＶβ５、アミノ安息香酸カリウム、アミロイドＰ、ＡＮＧ１１２２、ＡＮＧ１１７０、ＡＮＧ３０６２、ＡＮＧ３２８１、ＡＮＧ３２９８、ＡＮＧ４０１１、抗ＣＴＧＦ  ＲＮＡｉ、Ａｐｌｉｄｉｎ、ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ抽出物とｓａｌｖｉａおよびｓｃｈｉｓａｎｄｒａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、動脈硬化プラーク遮断薬、Ａｚｏｌ、ＡＺＸ１００、ＢＢ３、結合組織増殖因子抗体、ＣＴ１４０、ダナゾール、Ｅｓｂｒｉｅｔ、ＥＸＣ００１、ＥＸＣ００２、ＥＸＣ００３、ＥＸＣ００４、ＥＸＣ００５、Ｆ６４７、ＦＧ３０１９、フィブロコリン（Ｆｉｂｒｏｃｏｒｉｎ）、フォリスタチン、ＦＴ０１１、ガレクチン−３阻害剤、ＧＫＴ１３７８３１、ＧＭＣＴ０１、ＧＭＣＴ０２、ＧＲＭＤ０１、ＧＲＭＤ０２、ＧＲＮ５１０、Ｈｅｂｅｒｏｎ  Ａｌｆａ  Ｒ、インターフェロンα−２β、ＩＴＭＮ５２０、ＪＫＢ１１９、ＪＫＢ１２１、ＪＫＢ１２２、ＫＲＸ１６８、ＬＰＡ１受容体アンタゴニスト、ＭＧＮ４２２０、ＭＩＡ２、マイクロＲＮＡ  ２９ａオリゴヌクレオチド、ＭＭＩ０１００、ノスカピン、ＰＢＩ４０５０、ＰＢＩ４４１９、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＰＦ−０６４７３８７１、ＰＧＮ００５２、Ｐｉｒｅｓｐａ、Ｐｉｒｆｅｎｅｘ、ピルフェニドン、プリチデプシン、ＰＲＭ１５１、Ｐｘ１０２、ＰＹＮ１７、ＰＹＮ２２とＰＹＮ１７、Ｒｅｌｉｖｅｒｇｅｎ、ｒｈＰＴＸ２融合タンパク質、ＲＸＩ１０９、セクレチン、ＳＴＸ１００、ＴＧＦ−β阻害剤、形質転換増殖因子、β−受容体２オリゴヌクレオチド、ＶＡ９９９２６０、ＸＶ６１５、またはそれらの組合せのうちの１つまたは複数に応答する可能性が高いかどうかを判定するのにも有用である。
【０１５７】
別の実施形態では、対象が１つまたは複数の内在性血管新生阻害剤に応答する可能性が高いかどうかを判定するための方法が提供される。さらなる実施形態では、内在性血管新生阻害剤は、エンドスタチン、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンに由来する２０ｋＤａ  Ｃ末端断片、アンジオスタチン（プラスミンの３８ｋＤａ断片）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ）タンパク質ファミリーのメンバーである。さらなる実施形態では、血管新生阻害剤は、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、ＴＳＰ−３、ＴＳＰ−４、およびＴＳＰ−５である。次の血管新生阻害剤：可溶性ＶＥＧＦ受容体、例えば、可溶性ＶＥＧＦＲ−１およびニューロピリン１（ＮＰＲ１）、アンジオポエチン−１、アンジオポエチン−２、バソスタチン、カルレティキュリン、血小板因子−４、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）（例えば、ＴＩＭＰ１、ＴＩＭＰ２、ＴＩＭＰ３、ＴＩＭＰ４）、軟骨由来血管新生阻害剤（例えば、ペプチドトロポニンＩおよびコンドロモジュリン（chrondomodulin）Ｉ）、トロンボスポンジンモチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ１、インターフェロン（ＩＦＮ）、（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、ケモカイン、例えば、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフを有するケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ１０、別称インターフェロンガンマ誘導性タンパク質１０または低分子誘導性サイトカインＢ１０）、インターロイキンサイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８）、プロトロンビン、アンチトロンビンＩＩＩ断片、プロラクチン、ＴＮＦＳＦ１５遺伝子によりコードされるタンパク質、オステオポンチン、マスピン、カンスタチン、プロリフェリン関連タンパク質のうちの１つまたは複数に対する尤度を判定するための方法も提供される。
【０１５８】
一実施形態では、次の血管新生阻害剤：アンジオポエチン−１、アンジオポエチン−２、アンジオスタチン、エンドスタチン、バソスタチン、トロンボスポンジン、カルレティキュリン、血小板因子４、ＴＩＭＰ、ＣＤＡＩ、インターフェロンα、インターフェロンβ，血管内皮増殖因子阻害剤（ＶＥＧＩ）メタ−１、メタ−２、プロラクチン、ＶＥＧＩ、ＳＰＡＲＣ、オステオポンチン、マスピン、カンスタチン、プロリフェリン関連タンパク質（ＰＲＰ）、レスチン、ＴＳＰ−１、ＴＳＰ−２、インターフェロンガンマ１β、ＡＣＵＨＴＲ０２８、αＶβ５、アミノ安息香酸カリウム、アミロイドＰ、ＡＮＧ１１２２、ＡＮＧ１１７０、ＡＮＧ３０６２、ＡＮＧ３２８１、ＡＮＧ３２９８、ＡＮＧ４０１１、抗ＣＴＧＦ  ＲＮＡｉ、Ａｐｌｉｄｉｎ、ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ抽出物とｓａｌｖｉａおよびｓｃｈｉｓａｎｄｒａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、動脈硬化プラーク遮断薬、Ａｚｏｌ、ＡＺＸ１００、ＢＢ３、結合組織増殖因子抗体、ＣＴ１４０、ダナゾール、Ｅｓｂｒｉｅｔ、ＥＸＣ００１、ＥＸＣ００２、ＥＸＣ００３、ＥＸＣ００４、ＥＸＣ００５、Ｆ６４７、ＦＧ３０１９、フィブロコリン（Ｆｉｂｒｏｃｏｒｉｎ）、フォリスタチン、ＦＴ０１１、ガレクチン−３阻害剤、ＧＫＴ１３７８３１、ＧＭＣＴ０１、ＧＭＣＴ０２、ＧＲＭＤ０１、ＧＲＭＤ０２、ＧＲＮ５１０、Ｈｅｂｅｒｏｎ  Ａｌｆａ  Ｒ、インターフェロンα−２β、ＩＴＭＮ５２０、ＪＫＢ１１９、ＪＫＢ１２１、ＪＫＢ１２２、ＫＲＸ１６８、ＬＰＡ１受容体アンタゴニスト、ＭＧＮ４２２０、ＭＩＡ２、マイクロＲＮＡ  ２９ａオリゴヌクレオチド、ＭＭＩ０１００、ノスカピン、ＰＢＩ４０５０、ＰＢＩ４４１９、ＰＤＧＦＲ阻害剤、ＰＦ−０６４７３８７１、ＰＧＮ００５２、Ｐｉｒｅｓｐａ、Ｐｉｒｆｅｎｅｘ、ピルフェニドン、プリチデプシン、ＰＲＭ１５１、Ｐｘ１０２、ＰＹＮ１７、ＰＹＮ２２とＰＹＮ１７、Ｒｅｌｉｖｅｒｇｅｎ、ｒｈＰＴＸ２融合タンパク質、ＲＸＩ１０９、セクレチン、ＳＴＸ１００、ＴＧＦ−β阻害剤、形質転換増殖因子、β−受容体２オリゴヌクレオチド、ＶＡ９９９２６０、ＸＶ６１５、またはそれらの組合せのうちの１つまたは複数に対する応答の尤度を判定するための方法が提供される。
【０１５９】
さらに別の実施形態では、血管新生阻害剤は、パゾパニブ（Ｖｏｔｒｉｅｎｔ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）、ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）、アキシチニブ（Ｉｎｌｙｔａ）、ポナチニブ（Ｉｃｌｕｓｉｇ）、バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ）、カボザンチニブ（Ｃｏｍｅｔｒｉｇ）、ラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ）、レゴラフェニブ（Ｓｔｉｖａｒｇａ）、ｚｉｖ−アフリベルセプト（Ｚａｌｔｒａｐ）、モテサニブ、またはそれらの組合せを含み得る。別の実施形態では、血管新生阻害剤はＶＥＧＦ阻害剤である。さらなる実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、アキシチニブ、カボザンチニブ、アフリベルセプト、ブリバニブ、チボザニブ、ラムシルマブ、またはモテサニブである。なおもさらなる実施形態では、血管新生阻害剤はモテサニブである。
【０１６０】
一実施形態では、本明細書において提供される方法は、対象が、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ファミリーのメンバーのアンタゴニスト、例えば、ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）のシグナル伝達および／または活性を阻害、低減、または調節する薬物に対して応答する尤度を判定することに関する。例えば、ＰＤＧＦアンタゴニストは、一実施形態では、抗ＰＤＧＦアプタマー、抗ＰＤＧＦ抗体もしくはその断片、抗ＰＤＧＦＲ抗体もしくはその断片、または小分子アンタゴニストである。一実施形態では、ＰＤＧＦアンタゴニストは、ＰＤＧＦＲ−αまたはＰＤＧＦＲ−βのアンタゴニストである。一実施形態では、ＰＤＧＦアンタゴニストは、抗ＰＤＧＦ−βアプタマーＥ１００３０、スニチニブ、アキシチニブ、ソラフェニブ（sorefenib）、イマチニブ、イマチニブメシル酸塩、ニンテダニブ、パゾパニブＨＣｌ、ポナチニブ、ＭＫ−２４６１、ドビチニブ、パゾパニブ、クレノラニブ、ＰＰ−１２１、テラチニブ、イマチニブ、ＫＲＮ６３３、ＣＰ６７３４５１、ＴＳＵ−６８、Ｋｉ８７５１、アムバチニブ、チボザニブ、マシチニブ、モテサニブ二リン酸塩、ドビチニブ二乳酸、リニファニブ（ＡＢＴ−８６９）である。
【０１６１】
患者が血管新生阻害剤療法に応答する可能性が高いかどうかの判定、または血管新生阻害剤療法のための患者の選択が行われたら、一実施形態では、患者に血管新生阻害剤が投与される。血管新生阻害剤は、本明細書に記載される血管新生阻害剤のうちのいずれでもよい。
【０１６２】
免疫療法
一実施形態では、患者から得られた試料のＡＤのサブタイプを判定し、ＡＤ肺がんサブタイプに基づいて、患者が免疫療法に応答する可能性が高いかどうかを査定することによる、腺癌（ＡＤ）肺がん患者が免疫療法に応答する可能性が高いかどうかを判定するための方法が、本明細書において提供される。別の実施形態では、患者由来の試料のＡＤサブタイプを判定し、ＡＤサブタイプに基づいて、免疫療法のための患者を選択することによる、ＡＤを患う患者を免疫療法のために選択する方法が、本明細書において提供される。患者から得られた試料のＡＤサブタイプの判定は、当技術分野で公知の任意のＡＤサブタイピング方法を使用して行うことができる。一実施形態では、患者から得られた試料はＡＤであると過去に診断されており、本明細書において提供される方法が試料のＡＤサブタイプを判定するために使用される。過去の診断は、組織学的解析に基づき得る。組織学的解析は、１名または複数名の病理学者によって行われてよい。一実施形態では、発現プロファイルを生成するためのバイオマーカーのセットもしくはパネルまたはそれらのサブセットの遺伝子発現解析によってＡＤサブタイピングが行われる。遺伝子発現解析は、本明細書に記載される公的に利用可能な肺がんデータベースおよび／または本明細書において提供される表１から選択される１つまたは複数のバイオマーカーの存在、非存在、または発現レベルを判定するために、患者から得られた肺がん試料（例えば、肺がんＡＤ試料）に行われ得る。ＡＤサブタイプは、スクアモイド（近位炎症性）、ブロンコイド（終末呼吸単位）、およびマグノイド（近位増殖性）からなる群から選択され得る。免疫療法は、本明細書において提供される任意の免疫療法であってよい。一実施形態では、免疫療法は、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤を投与することを含む。チェックポイント阻害剤は、本明細書において提供される任意のチェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−ＬＩ、またはＣＴＬＡ４を標的とするチェックポイント阻害剤であり得る。
【０１６３】
本明細書において開示されるように、バイオマーカーパネルまたはそのサブセットは、任意の公的に利用可能なＡＤ遺伝子発現データセット（単数または複数）において開示されているものであってよい。一実施形態では、肺がんはＡＤであり、バイオマーカーパネルまたはそのサブセットは、例えば、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）の肺ＡＤ  ＲＮＡｓｅｑ遺伝子発現データセット（ｎ＝５１５）である。一実施形態では、肺がんはＡＤであり、バイオマーカーパネルまたはそのサブセットは、例えば、Sheddenら（Nat  Med、２００８年；１４巻（８号）：８２２〜８２７頁）に開示されているＡＤ遺伝子発現データセット（ｎ＝４４２）であり、この文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。一実施形態では、肺がんはＡＤであり、バイオマーカーパネルまたはそのサブセットは、例えば、Tomidaら（J  Clin  Oncol、２００９年；２７巻（１７号）：２７９３〜２７９９頁）に開示されているＡＤ遺伝子発現データセット（ｎ＝１１７）であり、この文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。一実施形態では、肺がんはＡＤであり、バイオマーカーパネルまたはそのサブセットは、例えば、Wilkersonら（PLoS  One、２０１２年；７巻（５号）：ｅ３６５３０頁）に開示されているＡＤ遺伝子発現データセット（ｎ＝１１６）であり、この文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。一実施形態では、肺がんはＡＤであり、バイオマーカーパネルまたはそのサブセットは、例えば、表１に開示されているＡＤ遺伝子発現データセットである。一実施形態では、肺がんはＡＤであり、バイオマーカーパネルまたはそのサブセットは、例えば、公的に利用可能なＡＤ発現データセットからの１つまたは複数のバイオマーカーと組み合わせた、表１に開示されているＡＤ遺伝子発現データセットである。表２中、表の第１の縦列は、終末呼吸単位（ＴＲＵ）を弁別するためのバイオマーカーのリストを表す。表の中央の縦列は、近位増殖性（ＰＰ）を弁別するためのバイオマーカーのリストを表す。表の最後の縦列は、近位炎症性（ＰＩ）を弁別するためのバイオマーカーのリストを表す。一部の場合では、表２に示されるように、合計４８種のバイオマーカーをＡＤサブタイプ判定に使用することができる。各ＡＤサブタイプについて、１６種中８種のバイオマーカーは負の相関を示す遺伝子であり得、８種は、特定のＡＤサブタイプの遺伝子シグネチャーとして選択され得る正の相関を示す遺伝子であり得る。
【０１６４】
一部の実施形態では、肺がんサブタイピング（例えば、ＡＤサブタイピング）のための方法は、分類指標バイオマーカーセットの発現レベルを検出するステップを含む。分類指標バイオマーカーセットは、公的に利用可能なデータベースからの一組のバイオマーカー、例えば、ＴＣＧＡ肺ＡＤ  ＲＮＡＳｅｑ遺伝子発現データセットまたは本明細書において提供される任意の他のデータセットなどであり得る。一部の実施形態では、この検出するステップは、核酸レベルまたはタンパク質レベルにおける表１または本明細書において提供される任意の他のデータセットの分類指標バイオマーカーのすべてを含む。別の実施形態では、表１のうち単一の分類指標バイオマーカーまたは表１もしくは本明細書において提供される任意の他のデータセットの分類指標バイオマーカーのサブセット、例えば、約５種〜約２０種が検出される。別の実施形態では、表１のうち単一の分類指標バイオマーカーまたは表１および／もしくは本明細書において提供される任意の他のデータセットの分類指標バイオマーカーのサブセット、例えば、約１６種〜約４８種が検出される。別の実施形態では、表１または本明細書において提供される任意の他のデータセットの分類指標バイオマーカーのすべてが検出される。別の実施形態では、表１の分類指標バイオマーカーのうちの少なくとも１種またはすべてが、本明細書において提供される任意の他のＡＤデータセットの１つまたは複数の分類指標バイオマーカーと組み合わせて検出される。検出するステップは、ＲＮＡ−ｓｅｑ、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ、または別のハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイ、例えば、分類指標バイオマーカーに特異的なプライマーおよび／もしくはプローブを用いるもの、および／または同様のものを含むがこれらに限定されない、任意の好適な技術によって行うことができる。一部の場合では、増幅方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはｑＲＴ−ＰＣＲ）に有用なプライマーは、単独または組合せで本明細書において提供されるデータセットからの分類指標遺伝子と結合するのに好適な任意のフォワードおよびリバースプライマーである。
【０１６５】
一実施形態では、例えば、ＡＤ肺試料に関する表１を含め、本明細書において提供されるＡＤ遺伝子発現データセットのうちのいずれかにおけるバイオマーカーのうちの約１〜約５種、約５〜約１０種、約５〜約１５種、約５〜約２０種、約５〜約２５種、約５〜約３０種、約５〜約３５種、約５〜約４０種、約５〜約４５種、約５〜約５０種、約５〜約５５種、約５〜約６０種、約５〜約６５種、約５〜約７０種、約５〜約７５種、または約５〜約８０種が、本明細書において提供される肺がんサブタイプを判定する方法において検出される。別の実施形態では、例えば、ＡＤ肺試料に関する表１を含め、本明細書において提供されるＡＤ遺伝子発現データセットのうちのいずれか１つからのバイオマーカーの各々が、本明細書において提供される肺がんサブタイプを判定する方法において検出される。
【０１６６】
一実施形態では、本明細書において提供される方法は、ＡＤサブタイプにおける免疫活性化の存在、非存在、またはレベルを判定するステップをさらに含む。免疫細胞活性化の存在またはレベルは、患者から得られた試料（例えば、肺がん試料）中の各ＡＤサブタイプに関連する、自然免疫細胞および／または適応免疫細胞に関連する１つまたは複数のバイオマーカーの発現プロファイルを作出すること、またはそれらの発現を検出することによって判定することができる。一実施形態では、ＡＤサブタイプに関連する免疫細胞活性化は、Bindeaら（Immunity、２０１３年；３９巻（４号）；７８２〜７９５頁）の免疫細胞シグネチャーをモニタリングすることによって判定され、この文献の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。一実施形態では、この方法は、単一遺伝子免疫バイオマーカー、例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１およびＣＤ２７４（ＰＤ−ＬＩ）、ＰＤＣＤＬＧ２（ＰＤ−Ｌ２）ならびに／またはＩＦＮ遺伝子シグネチャーを測定するステップをさらに含む。ＡＤサブタイプに関連する免疫活性化（自然および／または適応）の存在または検出可能なレベルは、前記ＡＤサブタイプを有する患者が免疫療法に適している可能性があることを示すか、または予測することができる。免疫療法は、本明細書において提供されるチェックポイント阻害剤を用いた処置であり得る。一実施形態では、ＰＩサブタイプのＡＤは免疫発現を有する。一実施形態では、患者から得られた試料（例えば、肺がんＡＤ試料）中の、本明細書において提供される少なくとも１種の分類指標バイオマーカーの発現を検出するための本明細書において提供される方法は、本明細書において提供される前記試料中の免疫活性化の検出後に免疫療法剤を投与するステップをさらに含む。
【０１６７】
一実施形態では、この方法は、肺がんＡＤ試料のサブタイプを判定し、その後、前記サブタイプの免疫細胞活性化のレベルを判定するステップを含む。一実施形態では、サブタイプは、本明細書に記載される配列決定（例えば、ＲＮＡＳｅｑ）、増幅（例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲ）、またはハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、マイクロアレイ解析）を使用して１つまたは複数の分類指標バイオマーカーの発現レベルを判定することによって判定される。１つまたは複数のバイオマーカーは、公的に利用可能なデータベース（例えば、ＴＣＧＡ肺ＡＤ  ＲＮＡＳｅｑ遺伝子発現データセットまたは本明細書において提供される任意の他の公的に利用可能なＡＤ遺伝子発現データセット）から選択してよい。一部の実施形態では、表１のバイオマーカーを使用して、患者から得られたＡＤ肺試料のサブタイプを特異的に判定することができる。一実施形態では、免疫細胞活性化のレベルは、イムノマーカーの遺伝子発現シグネチャーを測定することにより判定される。イムノマーカーは、本明細書に記載される肺がん試料のサブタイピングを行うために使用されるものと同じ試料および／または異なる試料中で測定され得る。測定され得るイムノマーカーは、自然免疫細胞（ＩＩＣ）および／または適応免疫細胞（ＡＩＣ）遺伝子シグネチャー、インターフェロン（ＩＦＮ）遺伝子シグネチャー、個々のイムノマーカー、主要組織適合抗原クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）遺伝子、またはそれらの組合せを含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる場合がある。ＩＩＣおよびＡＩＣの両方に関する遺伝子発現シグネチャーは、当技術分野で公知の前記細胞型に関するいずれの公知の遺伝子シグネチャーであってもよい。例えば、免疫遺伝子シグネチャーは、Bindeaら（Immunity、２０１３年、３９巻（４号）；７８２〜７９５頁）に記載のものであってもよい。一実施形態では、本明細書において提供される方法で使用するためのイムノマーカーは、表４Ａおよび／または表４Ｂから選択される。個々のイムノマーカーは、ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、およびＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）であり得る。一実施形態では、本明細書において提供される方法で使用するための個々のイムノマーカーは、表５から選択される。イムノマーカーは、１つまたは複数のインターフェロン（ＩＮＦ）遺伝子であり得る。一実施形態では、本明細書において提供される方法で使用するためのイムノマーカーは、表６から選択される。イムノマーカーは、１つまたは複数のＭＨＣＩＩ遺伝子であり得る。一実施形態では、本明細書において提供される方法で使用するためのイムノマーカーは、表７から選択される。さらに別の実施形態では、本明細書において提供される方法で使用するためのイムノマーカーは、表４Ａ、４Ｂ、５、６、７、またはそれらの組合せから選択される。
【０１６８】
【表４Ａ−１】
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【表４Ａ−２】
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【表４Ａ−３】
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【表４Ａ−４】
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【表４Ａ−５】
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【表４Ａ−６】
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【表４Ａ−７】
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【表４Ａ−８】
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【表４Ａ−９】
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【表４Ａ−１０】
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【表４Ａ−１１】
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【表４Ａ−１２】
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【表４Ａ−１３】
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【０１６９】
【表４Ｂ−１】
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【表４Ｂ−２】
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【表４Ｂ−３】
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【表４Ｂ−４】
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【表４Ｂ−５】
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【表４Ｂ−６】
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【表４Ｂ−７】
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【表４Ｂ−８】
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【表４Ｂ−９】
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【表４Ｂ−１０】
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【表４Ｂ−１１】
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【０１７０】
【表５】
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【０１７１】
【表６】
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【０１７２】
【表７】
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【０１７３】
一実施形態では、患者のＡＤ肺がんサブタイプの判定が、本明細書において提供される方法および分類指標バイオマーカーパネルまたはそのサブセットのいずれかを使用して単独で、または、本明細書において提供される１つもしくは複数の免疫細胞マーカーの発現の判定と組み合わせて行われたら、その患者は、免疫療法剤を用いた処置のために選択されるか、またはこれを投与される。免疫療法剤は、チェックポイント阻害剤、モノクローナル抗体、生体応答修飾因子、治療用ワクチン、または細胞免疫療法であり得る。
【０１７４】
別の実施形態では、免疫療法剤はチェックポイント阻害剤である。一部の場合では、１つまたは複数のチェックポイント阻害剤に対する応答の尤度を判定するための方法が提供される。一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１／ＰＤ−ＬＩチェックポイント阻害剤である。ＰＤ−１／ＰＤ−ＬＩチェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ランブロリズマブ、またはアベルマブであり得る。一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤である。ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤は、イピリムマブまたはトレメリムマブであり得る。一実施形態では、チェックポイント阻害剤は、例えば、１つまたは複数のＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用される１つまたは複数のＰＤ−１／ＰＤ−ＬＩチェックポイント阻害剤の組合せなどの、チェックポイント阻害剤の組合せである。
【０１７５】
一実施形態では、免疫療法剤はモノクローナル抗体である。一部の場合では、１つまたは複数のモノクローナル抗体に対する応答の尤度を判定するための方法が提供される。モノクローナル抗体は、腫瘍細胞に対するもの、または腫瘍産物に対するものであり得る。モノクローナル抗体は、パニツムマブ、マツズマブ、ネシツムマブ（necitumunab）、トラスツズマブ、アマツキシマブ、ベバシズマブ、ラムシルマブ、バビツキシマブ、パトリツマブ、リロツムマブ、セツキシマブ、ｉｍｍｕ−１３２、またはデミシズマブであってもよい。
【０１７６】
さらに別の実施形態では、免疫療法剤は治療用ワクチンである。一部の場合では、１つまたは複数の治療用ワクチンに対する応答の尤度を判定するための方法が提供される。治療用ワクチンは、ペプチドまたは腫瘍細胞ワクチンであり得る。ワクチンは、ＭＡＧＥ−３抗原、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原、ｐ５３抗原、サバイビン抗原、またはＭＵＣ１抗原を標的とし得る。治療用がんワクチンは、ＧＶＡＸ（ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をトランスフェクトした腫瘍細胞ワクチン）、ベラゲンプマツセル−Ｌ（ＴＧＦ−ベータ２アンチセンスプラスミドで修飾し、放射線照射した４種のＮＳＣＬＣ細胞株を用いて作製された同種腫瘍細胞ワクチン）、ＭＡＧＥ−Ａ３ワクチン（ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質およびアジュバントＡＳ１５からなる）、（ｌ）−ＢＬＰ−２５抗ＭＵＣ−１（腫瘍細胞で発現するＭＵＣ−１を標的とする）、ＣｉｍａＶａｘ  ＥＧＦ（担体タンパク質にコンジュゲートされたヒト組換え上皮増殖因子（ＥＧＦ）からなるワクチン）、ＷＴ１ペプチドワクチン（４種のウィルムス腫瘍抑制遺伝子アナログペプチドからなる）、ＣＲＳ−２０７（ヒトメソテリンをコードする生弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓベクター）、Ｂｅｃ２／ＢＣＧ（抗ＧＤ３抗体を誘導する）、ＧＶ１００１（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を標的とする）、テルゲンプマツセル−Ｌ（tergenpumatucel-L）（免疫系が強く応答するマウス遺伝子を含むように遺伝子修飾されたヒト肺がん細胞からなる）、ＴＧ４０１０（ＭＵＣ１抗原を標的とする）、ラコツモマブ（複数のヒトがんにおいて発現するＮＧｃＧＭ３ガングリオシドを模倣する抗イディオタイプ抗体）、テセモチド（リポソームＢＬＰ２５；ＭＵＣ１のタンデムリピート領域から作製されたリポソームベースのワクチン）、またはＤＲｉｂｂｌｅ（９つのがん抗原に加えてＴＬＲアジュバントから作製されたワクチン）であり得る。
【０１７７】
一実施形態では、免疫療法剤は生体応答修飾因子である。一部の場合では、１つまたは複数の生体応答修飾因子に対する応答の尤度を判定するための方法が提供される。生体応答修飾因子は、例えば、ＰＦ−３５１２６７６（ＣｐＧ  ７９０９）（ｔｏｌｌ様受容体９アゴニスト）、ＣｐＧ−ＯＤＮ  ２００６（Ｔｒｅｇを下方制御する）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）、ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ（ＳＲＬ１７２）（現在アジュバントとして頻繁に試験されている非特異的免疫刺激薬）など、炎症を誘発し得る。生体応答修飾因子は、例えば、ＩＬ−２＋腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）またはインターフェロンアルファ（Ｔ細胞増殖を誘導する）、インターフェロンガンマ（腫瘍細胞アポトーシスを誘導する）、またはＭｄａ−７（ＩＬ−２４）（Ｍｄａ−７／ＩＬ−２４は、腫瘍細胞アポトーシスを誘導し、腫瘍血管新生を阻害する）などのサイトカイン療法であってもよい。生体応答修飾因子は、例えば顆粒球コロニー刺激因子などのコロニー刺激因子であってもよい。生体応答修飾因子は、例えば、マルチターゲットＶＥＧＦＲ：サリドマイドおよびアナログ、例えばレナリドマイドおよびポマリドミド、シクロホスファミド、シクロスポリン、デニロイキンジフチトクス、タラクトフェリン、トラベクテジン（trabecetedin）または全トランス型レチノイン酸（retinmoic  acid）などの多面的エフェクターであってもよい。
【０１７８】
一実施形態では、免疫療法は細胞免疫療法である。一部の場合では、１つまたは複数の細胞治療剤に対する応答の尤度を判定するための方法が提供される。細胞免疫療法剤は、樹状細胞（ＤＣ）（腫瘍抗原が負荷されたｅｘ  ｖｉｖｏで生成されたＤＣワクチン）、Ｔ細胞（ｅｘ  ｖｉｖｏで生成されたリンホカイン活性化キラー細胞；サイトカイン誘導性キラー細胞；活性化Ｔ細胞；ガンマデルタＴ細胞）、またはナチュラルキラー細胞であり得る。
【０１７９】
一部の場合では、特定のサブタイプのＡＤは、異なるレベルの免疫活性化（例えば、自然免疫および／または適応免疫）を有するため、免疫活性化（例えば、自然免疫および／または適応免疫）が上昇しているまたは検出可能であるサブタイプが、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫療法剤による処置のために選択される。一実施形態では、ＰＰサブタイプのＡＤは、他のＡＤサブタイプまたは肺がんサブタイプと比較して低い免疫活性化（例えば、自然免疫および／または適応免疫）を有する。一部の場合では、特定のサブタイプのＡＤは、高レベルまたは上昇したレベルの免疫活性化を有する。一部の場合では、ＰＩサブタイプのＡＤは、他のＡＤサブタイプまたは肺がんサブタイプと比較して上昇したレベルの免疫活性化（例えば、自然免疫および／または適応免疫）を有する。一実施形態では、免疫活性化（例えば、自然免疫および／または適応免疫）のレベルが低いかまたは全くないＡＤサブタイプは、本明細書に記載される１つまたは複数の免疫療法剤による処置のために選択されない。
【０１８０】
検出法
一実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物は、対象から得られた肺がん試料（例えば腺癌の肺がん試料）中の少なくとも１種の核酸の検出を可能にする。少なくとも１種の核酸は、本明細書において提供される分類指標バイオマーカーであり得る。一実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物を使用して検出される少なくとも１種の核酸は、表１から選択される。一実施形態では、対象から得られた肺がん試料中の核酸（例えば、分類指標バイオマーカー）を検出する方法は、本明細書において提供される方法のうちのいずれかを使用して少なくとも１種または複数のバイオマーカーの発現レベルを測定するステップを含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。バイオマーカーは、表１から選択され得る。一部の場合では、複数のバイオマーカー核酸は、表１の少なくとも２種のバイオマーカー核酸、少なくとも８種のバイオマーカー核酸、少なくとも１６種のバイオマーカー核酸、少なくとも２４種のバイオマーカー核酸、少なくとも３２種のバイオマーカー核酸、または４８種すべてのバイオマーカー核酸を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。検出は、核酸レベルでなされてもよい。検出は、本明細書に開示される任意の増幅、ハイブリダイゼーション、および／または配列決定アッセイを使用することによりなされてもよい。
【０１８１】
別の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物は、対象から得られた肺がん試料（例えば腺癌の肺がん試料）中の少なくとも１種の核酸または複数の核酸の検出を可能にし、その結果、少なくとも１種の核酸または複数の核酸は、表１に列挙されるバイオマーカーから選択され、存在、非存在、および／または発現レベルが免疫活性化を示す一組のバイオマーカーから少なくとも１種のバイオマーカーの検出が行われる。免疫活性化を示す一組のバイオマーカーは、適応免疫細胞（ＡＩＣ）（例えば、表４Ａ）および／または自然免疫細胞（ＩＩＣ）（例えば、表４Ｂ）、個々の免疫バイオマーカー（例えば、表５）、インターフェロン遺伝子（例えば、表６）、主要組織適合抗原クラスＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）遺伝子（例えば、表７）、またはそれらの組合せであり、かつ／またはこれらの遺伝子発現シグネチャーであってもよい。ＩＩＣおよびＡＩＣの両方の遺伝子発現シグネチャーは、例えば、Bindeaら（Immunity、２０１３年；３９巻（４号）；７８２〜７９５頁）に列挙されている遺伝子シグネチャーなど、当技術分野で公知の任意の遺伝子シグネチャーであってよい。検出は、核酸レベルでなされてもよい。検出は、本明細書に開示される任意の増幅、ハイブリダイゼーション、および／または配列決定アッセイを使用することによりなされてもよい。
【０１８２】
キット
本発明の方法を実践するためのキットがさらに提供され得る。「キット」には、本発明のバイオマーカーの発現を特異的に検出するための少なくとも１種の試薬、例えば抗体、核酸プローブまたはプライマーなどを含む任意の製造品（例えば、パッケージまたは容器）が包含され得る。このキットは、本発明の方法を行うためのユニットとして宣伝されても、配布されても、または販売されてもよい。さらにこのキットは、キットおよびその使用のための方法を説明する添付文書を含んでいてもよい。
【０１８３】
一実施形態では、本発明の方法を実践するためのキットが提供される。かかるキットには、手動および自動の両方の免疫細胞化学技術（例えば細胞染色）との適合性がある。これらのキットは、目的のバイオマーカーに対する少なくとも１種の抗体と、バイオマーカーに結合する抗体の検出のための化学物質と、対比染色液と、任意選択で、陽性染色細胞の特定を容易にするための青味剤とを含む。本発明の実践においては、抗原−抗体の結合を検出する任意の化学物質を使用してよい。これらのキットは、本発明の方法で使用するための、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、またはそれよりも多くの抗体を含み得る。
【実施例】
【０１８４】
以下の実施例を参照することにより本発明をさらに例示する。しかしながら、これらの実施例は上述の実施形態のように例示的であり、本発明の範囲をいかようにも制限するものと解釈されてはならないことに留意されたい。
【０１８５】
（実施例１）
肺腺癌内因性サブタイプ間の免疫細胞活性化の差およびＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）発現との変動のある相関。
序論
肺腺癌（ＡＤ）における遺伝子発現ベースのサブタイピングは、変動のある生物学的および臨床的特徴を有する異なるサブタイプにＡＤ腫瘍を分類する。遺伝子発現ベースのサブタイピングは、肺ＡＤの３種の異なる生物学的タイプである終末呼吸単位（ＴＲＵ）、旧名ブロンキオイド、近位増殖性（ＰＰ）、旧名マグノイド、および近位炎症性（ＰＩ）、旧名スクアモイド（１、２）を一貫して特定した（図１参照）。ＡＤサブタイプは、ゲノム変化、腫瘍ドライバー、予後、および種々の療法に対する可能性の高い応答における肝要な差を明示する（１〜２）。
【０１８６】
方法
過去に公開されているBindeaら（３）の免疫細胞遺伝子シグネチャー（合計２４種）およびＡＤサブタイピング遺伝子発現シグネチャー（１〜２）を使用し、ＡＤサブタイプに関連する免疫細胞の特徴について、いくつかの公的に利用可能な肺ＡＤデータセット（２、４、および５）、ならびに最近収集された１つの遺伝子発現データセット（図２参照）を検査した。このサブタイプによる免疫の差の精査では、各々異なる数の遺伝子を有し、適応または自然免疫細胞シグネチャーと分類されたBindeaら［３］の２４種の免疫細胞遺伝子シグネチャー（表４Ａ〜４Ｂ参照）を使用した。適応免疫細胞（ＡＩＣ）シグネチャー（表４Ａ）は、Ｔ細胞、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔｃｍ）、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）、１型Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ１）、２型Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ２）、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）、Ｔヘルパー１７細胞（Ｔｈ１７）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ガンマデルタＴ細胞（Ｔｇｄ）、ＣＤ８  Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、Ｂ細胞を含み、自然免疫細胞（ＩＩＣ）シグネチャー（表４Ｂ）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）、ＮＫ  ＣＤ５６ｄｉｍ細胞、ＮＫ  ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）、樹状細胞（ｐＤＣ）、活性化樹状細胞（ａＤＣ）、マスト細胞、好酸球、マクロファージ、および好中球を含んだ。自然免疫細胞（ＩＩＣ）および適応免疫細胞（ＡＩＣ）の両方の遺伝子発現シグネチャーに加えて、１３遺伝子ＩＦＮシグネチャー（ＩＦＮ；表６）、１３遺伝子ＭＨＣクラスＩＩシグネチャースコア（Forero［６］；表７）、ならびに表５の単一遺伝子免疫バイオマーカー（ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、およびＰＤＣＤＬＧ２（ＰＤ−Ｌ２））を３種のＡＤサブタイプ（ＴＲＵ、ＰＰ、およびＰＩ）において検査した。
【０１８７】
ＡＤデータセットは、上述したいくつかの公的に利用可能な肺がん遺伝子発現データセットと、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）肺腫瘍試料（ｎ＝８８）から新たに収集された腺癌データセットとを含んだ。８８個のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料から新たに収集されたＡＤデータセットは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  ａｔ  Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ（ＵＮＣ−ＣＨ）にて認可済みのＩＲＢプロトコールのもと収集された残存肺腫瘍試料のアーカイブであった。ＦＦＰＥ試料切片（３種の１０μｍ切片）のマイクロダイセクションを行ってからＲＮＡ抽出を行った。１００ｎｇ／試料のインプットを用い、ＩｌｌｕｍｉｎａのＲＮＡ−Ａｃｃｅｓｓキット（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、トランスクリプトームエンリッチメントＲＮＡｓｅｑを行った。ｈｇ１９を参照として使用して配列データをアラインし、ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（Trapnell、２０１０年）を使用してトランスクリプトーム（transciptome）を構築した。Ｃｕｆｆ  ｃｏｍｐａｒｅを使用してトランスクリプトームのアノテーションを行い、遺伝子発現計数を算出した。
【０１８８】
ＡＤについては、患者試料合計１２７８個の肺腺癌試料の４種の公開データセットおよび１つの最近収集された遺伝子発現データセット（すなわち、ＧｅｎｅＣｅｎｔｒｉｃ発現データセット）を使用した。公開データセットは、新鮮冷凍検体由来のＴＣＧＡ［２］、Sheddenら［４］、Tomidaら［５］、およびWilkersonら［１］を含んだ。ＧｅｎｅＣｅｎｔｒｉｃ発現データセットはホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）検体由来であった。ＴＣＧＡについては、上位分位点正規化ＲＳＥＭデータをＦｉｒｅｈｏｓｅからダウンロードし、ｌｏｇ２変換した。Sheddenら［４］によるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＣｅｌファイルをｃａＩｎｔｅｇｒａｔｏｒウェブサイトからダウンロードし、ＲのＡｆｆｙパッケージを使用してロバストマルチアレイ平均による発現測定値を生成した。Tomidaら［５］（ＧＳＥ１３２１３）およびWilkersonら［１］（ＧＳＥ２６９３９）に関しては、正規化されたＡｇｉｌｅｎｔアレイデータをＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）のウェブサイトからダウンロードした。
【０１８９】
腺癌サブタイプ（ＴＲＵ、ＰＰ、およびＰＩ）を判定するために、過去にWilkersonら［１］において記載された公開されている５０６遺伝子最近隣重心分類指標を使用した。シグネチャー中の遺伝子の中央値センタリングを行った後、相関（ピアソン）が最大であった重心に対応するサブタイプを各試料に割り当てた。
【０１９０】
腺癌のＴＣＧＡデータを使用し、マーカーを階層的クラスタリングにより順序付けしたペアワイズのスピアマン順位相関係数行列をプロットすることにより、３０種のマーカー間の相関を査定した（図４参照）。サブタイプによる全体的な免疫性マーカーの傾向を精査するため、試料をサブタイプにより並べ、Bindeaら［３］における順序付けに従ってマーカーをグループ分けした発現ヒートマップをプロットした（図３参照）。サブタイプ間の免疫性マーカーの差の再現性を評価するため、各データセットで正規化されたＴ細胞シグネチャーをサブタイプ別にプロットした（図５参照）。
【０１９１】
線形回帰を使用し、腫瘍サブタイプおよびＣＤ２７４発現との免疫細胞シグネチャーの関連性を評価した。より明確に述べると、免疫マーカーの予測因子としてのサブタイプの予測強度をＰＤ−Ｌ１のものと比べて査定するために、サブタイプを唯一の予測因子とし、そしてまたＰＤ−Ｌ１を唯一の予測因子として、各シグネチャーの線形回帰モデルをＴＣＧＡデータセットに当てはめた。ＰＤ−Ｌ１発現は、各群内で等しい割合の低／中／高のカテゴリー変数として扱った。ＰＤ−Ｌ１が予測因子である場合にサブタイプが調整済み決定係数に対する予測因子であるときの調整済み決定係数の散布プロットを、全体的な傾向について調べた（図６参照）。
【０１９２】
ＴＣＧＡ腺癌の補足情報（Lawrence、２０１３年）において入手可能なＭｂ当たりの非サイレント突然変異量データを使用し、突然変異量−Ｔ細胞発現の関連性を、それぞれクラスカルウォリス検定およびスピアマン相関係数を使用して精査した。ＴＣＧＡ腺癌については、ＳＴＫ１１  ＣＮＶおよび突然変異のステータスをＦｉｒｅｈｏｓｅからダウンロードし、フィッシャー正確検定を使用してＳＴＫ１１不活性化−サブタイプの関連性を評価した。ここでは、試料が欠失および／または突然変異と報告された場合、これを不活性とした。ＡＤのＳＴＫ１１がサブタイプに合わせた調整後に関連性の証拠を示したかどうかを試験するため、ＡＤの不活性ＳＴＫ１１を唯一の予測因子として用いたＴ細胞発現の線形モデルの当てはめを行い、サブタイプに合わせた調整後に再度行った。
【０１９３】
リスト（表７）中のすべての遺伝子の平均として算出された、１３遺伝子ＭＨＣクラスＩＩシグネチャー［Forero［６］；表７］とサブタイプおよび免疫シグネチャーの関連性を、クラスカル−ウォリス検定を使用して精査した。免疫シグネチャー−ＭＨＣクラスＩＩの関連性については、スピアマン相関係数を算出した。
【０１９４】
免疫シグネチャーの階層的クラスタリングおよびペアワイズのシグネチャーの相関も解析した。各データセットにおいて異なるベースラインハザードを可能にする層別ｃｏｘ比例ハザードモデルを用い、ステージＩ〜ＩＩＩ試料の生存期間とシグネチャーの関連性を評価した。より明確に述べると、Ｃｏｘ比例ハザードモデルを使用して、ＴＣＧＡデータセットにおける免疫マーカー−生存期間の関連性を、全体的に、また各サブタイプ内で別々に試験した。平均０および分散１となるように免疫マーカーのセンタリングおよびスケーリングを行い、ステージＩＶ患者は除外した。特定のサブタイプ内の評価はステージに合わせて調整し、全体的評価はステージおよびサブタイプの両方に合わせて調整した。各シグネチャーについてハザード比および信頼区間を示すフォレストプロットを作成した（図７Ａおよび７Ｂ参照）。統計解析はすべて、Ｒ  ３．２．０ソフトウェア（http://www.R-project.org）を使用して遂行した。
【０１９５】
結果
免疫細胞遺伝子シグネチャーのヒートマップ解析および教師なし階層的クラスタリングにより、ＡＤの内因性サブタイプが分離された（図３および４参照）。免疫細胞遺伝子シグネチャー（ＡＩＣおよびＩＩＣの両方）ならびに個々の免疫遺伝子マーカーの検査により、ＡＤサブタイプ間の明らかな差が明らかになった（図３参照）。ＡＤにおける免疫発現は、検査したほとんどの細胞型で、ＰＰサブタイプにおいて一貫して低かった。ほとんどのＴ細胞における発現はＴＲＵおよびＰＩで同様であったが、一部の自然免疫細胞（樹状細胞、ＮＫ  ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ、マスト細胞、好酸球）およびいくつかの適応免疫細胞（Ｂ細胞、ＴＦＨ、Ｔｃｍ、Ｔｈ１７、ＣＤ８  Ｔ細胞）の発現はＴＲＵサブタイプにおいてより高く、一方でＰＩサブタイプはより高いＴｈ１およびＴｈ２、Ｔｒｅｇ、細胞傷害性Ｔ細胞、ならびにＮＫＣＤ５６ｄｉｍ細胞の発現を示したことにより、ＴＲＵとＰＩとで区別可能であった（ＡＤサブタイプによるすべての免疫細胞およびマーカーのボックスプロットは図１８で確認することができる）。免疫療法の標的であるＣＴＬＡ４およびＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）は、複数のデータセット間でＰＩサブタイプにおいて一貫して高い発現を明示した（図１８の補足的なボックスプロット）。ＰＰ腫瘍では、適応免疫細胞および自然免疫細胞の両方の発現、ならびに免疫療法標的の発現が、他のＡＤと比べて抑制された（図１８）。
【０１９６】
全体的に、免疫活性化は、自然免疫細胞ならびに適応免疫細胞の両方の活性化を明示したＰＩサブタイプのＡＤにおいて最も顕著であった。対照的に、ＰＰサブタイプのＡＤは、より低い免疫活性化を明示した。
【０１９７】
階層的クラスタリングを使用すると、相関行列により、適応免疫細胞および自然免疫細胞のクラスタリングが明らかになった（図４参照）。ＡＤでは、Ｔ細胞、細胞傷害性細胞、ＣＤ８細胞、Ｔｈ１細胞、ＰＤＣＤ１、ＣＴＬＡ４、およびＴｒｅｇなどの適応免疫特徴は高いペアワイズの相関を有し、ｉＤＣ、ＤＣ、マクロファージ、好中球、マスト細胞、および好酸球を含む自然免疫細胞も同様に相関している（図４）。
【０１９８】
適応免疫細胞シグネチャーとＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）発現の関連性強度をＡＤサブタイプと比較した。図６に示されるように、ＡＤサブタイプに関する関連性強度（調整済み決定係数）はまちまちであり、ＣＤ２７４関連性は一部の細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、Ｔｈ１、Ｔｒｅｇ、細胞傷害性細胞、Ｔヘルパー、Ｔｅｍ、Ｔｇｄ）で高い一方、ＡＤサブタイプ関連性は他の細胞（ＴＦＨ、Ｔｈ２、ＣＤ８、Ｔｈ１７、およびＴｃｍ）に関して高いことが示された。
【０１９９】
免疫細胞シグネチャーは、ＴＣＧＡデータセットにおいて主に評価したが、免疫細胞シグネチャーにより測定されたＡＤサブタイプの免疫の差は複数のデータセット間で極めて再現性が高いことが見出された（図５参照）。ＡＤサブタイプ別のＴ細胞における免疫細胞シグネチャー発現のサブタイプ別差は、冷凍試料およびＦＦＰＥ試料の両方に由来する様々な遺伝子発現データセット間で、またＲＮＡｓｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）ならびにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）およびＡｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）の両方のマイクロアレイを含む様々な遺伝子発現プラットフォームを用いて、再現性が非常に高かった。全体的に、免疫細胞シグネチャー遺伝子発現パターンは、複数のＡＤ（図５参照）データセット間で一貫していた。
【０２００】
ＴＣＧＡ  ＡＤデータにおける非サイレント突然変異量はサブタイプ毎に異なり、ＰＩが最も高い量を示し、ＴＲＵが最も低い量を示した（図１９）。ＴＰ５３突然変異が集中しているＰＩサブタイプは免疫細胞発現の上昇に関連していたが、ＴＲＵは、比較的高い免疫発現を有しながらも最も低い突然変異量を有した。突然変異量は、ＡＤデータセットにおけるＴ細胞免疫細胞発現と強い相関を示さなかった（ＡＤにおけるスピアマン相関＝−０．０７）。
【０２０１】
ＡＤにおけるＳＴＫ１１の欠損（Cao［７］、Shabath［８］、Koyama［９］）などのいくつかの他のゲノム特徴が、ＮＳＣＬＣにおける免疫応答の低減に寄与する可能性のある因子として示唆されている。ＳＴＫ１１不活性化は、免疫応答の低い腺癌ＰＰサブタイプに集中していた。ＡＤにおけるＳＴＫ１１不活性化はより低い免疫細胞発現に関連していたが、線形回帰を使用してサブタイプに合わせて調整した後のＳＴＫ１１は有意な予測因子ではなかった（サブタイプに合わせた調整後のＡＤにおけるＳＴＫ１１  ｐ＝０．０００７〜ｐ＝０．４３）。
【０２０２】
公開されている１３遺伝子ＭＨＣクラスＩＩシグネチャー（Forero［６］）を使用し、ＡＤ肺がんにおける免疫細胞発現のＭＨＣクラスＩＩ遺伝子との関連性を精査した。ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子発現は、Ｔ細胞発現（ＡＤにおけるスピアマン相関＝０．６６）、Ｂ細胞発現（ＡＤにおけるスピアマン相関＝０．５）、およびＤＣ発現（ＡＤにおけるスピアマン相関＝０．６９）を含め、ＡＤにおけるいくつかの免疫細胞と強い相関を示した。ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子発現は、腫瘍と比較して、腫瘍に隣接した正常な肺組織において著しく高く、腫瘍サブタイプ間で発現に差があった（図１９）。Ｔ細胞免疫細胞発現の予測因子としてのＭＨＣクラスＩＩシグネチャーの線形モデルでは、ＭＨＣクラスＩＩは、ＡＤサブタイプに合わせた調整後にも依然として有意であった（ＭＨＣ  ＩＩに対するｐ＜１Ｅ−５０）。
【０２０３】
ｃｏｘ比例ハザードモデルを使用し、発現増大の１単位当たりのサブタイプ特異的ハザード比（ＨＲ）を算出した。サブタイプ特異的ＨＲを病理学的ステージに合わせて調整し、信頼区間（ＣＩ）を算出した。少なくとも１種のサブタイプに対して有意（名目ｐ値＜０．０５）であったマーカーに関するハザード比および信頼区間を図７Ａ〜７Ｂに示す。サブタイプのうちの１つまたは複数に対して有意な生存期間の関連性を示した細胞シグネチャーまたは遺伝子のＨＲおよびＣＩを図７Ａ〜７Ｂに示す。ＡＤサブタイプについては、多くの自然および適応免疫細胞、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）ＭＨＣクラスＩＩシグネチャー、ならびにＣＴＬＡ４の発現における１単位の増大は、ＰＩサブタイプのＡＤにおける生存期間の改善と有意な関連性を示したが、他のサブタイプではこれを示さなかった（図７Ａ〜７Ｂ）。全体的に、免疫細胞シグネチャーの生存期間解析は、Ｔヘルパー１７および濾胞性ヘルパーＴ免疫細胞がＡＤにおける生存期間の改善を予測したことを示唆した（ｐ＜０．００１）（図７Ａ〜７Ｂ参照）。
【０２０４】
結論
肺ＡＤ遺伝子発現サブタイプはそれらの免疫ランドスケープにおいて異なる。内因性の生物学的ＡＤサブタイプは免疫細胞活性化における肝要な差を明らかにし、これはＣＤ２７４発現と常に相関するとは限らず、生存期間との変動のある関連性を明示した。ＡＤ  ＰＰサブタイプは最小限の免疫浸潤（抑制された免疫細胞発現）を示し、ｉｍｍｕｎｏＲＸに対する応答の低減が示唆された。ＡＤ  ＰＩサブタイプは、生存期間の改善と関連する免疫特徴の発現を示した。さらに、非サイレント突然変異量は、サブタイプをまたいだ免疫細胞発現との相関を示さなかったが、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子発現は高い相関を示した。免疫およびＭＨＣ  ＩＩ遺伝子発現の増大は、ＴＲＵおよびＰＩサブタイプのＡＤにおける生存期間の改善と関連していた。
【０２０５】
参照による組み込み
以下の参考文献は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために組み込まれている。
【０２０６】
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【０２０７】
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【０２１０】
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【０２１２】
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【０２１４】
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【０２１５】
（実施例２）
肺腺癌サブタイピングシグネチャーの開発および検証
背景
いくつかのゲノム研究により、遺伝子発現、突然変異スペクトル、およびコピー数変化を含むゲノムプロファイルが異なり得る３種の異なる内因性肺腺癌サブタイプが明示された［１〜３］。この３種の生物学的ＡＤサブタイプ、ＴＲＵ、ＰＰ、およびＰＩは、それらのゲノム特徴が異なるのみならず、潜在的に重要な臨床的特徴の差も明示する［１〜４］。ＡＤの遺伝子発現サブタイプは、腫瘍分化度の有意差、遠隔再発の尤度、ステージ特異的生存期間、根底にある腫瘍ドライバーおよび炎症応答を明示し得［１〜４］、標準的な形態学ベースの技術（顕微鏡法および免疫組織化学的検査）では容易に弁別可能でない場合がある。化学療法［２］、ペメトレキセド［５］、および／またはＥＧＦＲ阻害剤療法に対する応答に差がある可能性も示唆されている［２］。終末呼吸単位（ＴＲＵ）サブタイプにおいてはＥＧＦＲ過剰発現のエンリッチメントが明示された［２、３］。ＬＫＢ１／ＳＴＫ１１欠失と組み合わさったＫＲＡＳ突然変異の頻度上昇は、近位増殖性（ＰＰ）サブタイプにおいてより可能性が高い［２、３］。ＴＰ５３突然変異および免疫遺伝子の活性化は近位炎症性（ＰＩ）サブタイプの特質である［２〜４］。予備データは、ＴＲＵサブタイプにおいてＥＧＦＲ阻害剤に対する応答が向上する可能性、ＰＰサブタイプにおいて化学療法に対する応答が向上する可能性、ＴＲＵサブタイプにおいてペメトレキセドへの応答が向上する可能性、およびＰＩサブタイプにおける免疫療法への応答の可能性を明示し得る［２〜６］。新たに得られたデータは、遺伝子発現サブタイプによるＡＤ分類により、薬物標的突然変異試験を補完し、肺がん患者管理のための情報を与える有益な情報が提供され得ることを示唆する。
【０２１６】
目的
肺腺癌（ＡＤ）サブタイピングは主に、新鮮な冷凍肺腫瘍からのＲＮＡの抽出に続いて５００個を超える遺伝子の定量的遺伝子発現を使用した最近隣重心予測因子の適用を含む研究プロトコールに制限されている。腺癌サブタイピングによる予後および予測的な利益の証拠があるにもかかわらず、新鮮冷凍組織の必要性や、＞５００個の遺伝子の遺伝子発現の要件は、複雑な生物情報学解析と相まって、薬物開発および／または診療所におけるＡＤサブタイピングの応用を妨げてきた。この研究の目標は、腺癌の３種のサブタイプ（終末呼吸単位（ＴＲＵ）；旧称ブロンキオイド、近位増殖性（ＰＰ）；旧称マグノイド、および近位炎症性（ＰＩ）；旧称スクアモイド）を区別するためのロバストで効率的な（より少ない遺伝子を必要とする）遺伝子シグネチャーを開発することであった。新しい効率的な遺伝子シグネチャーは、新鮮冷凍またはＦＦＰＥ腫瘍試料からＡＤを高信頼性でサブタイピングするのに役立ち得るため、利用可能な定量的ＲＮＡプラットフォーム（ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡｓｅｑ、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘまたはＡｇｉｌｅｎｔアレイ）のうち任意のものを使用した診断用途および／または薬物開発に適している。腺癌のサブタイプを区別するための４８遺伝子シグネチャーの開発は、本明細書の方法において記載したように行った。
【０２１７】
方法
トレーニングのための５１５の肺腺癌のＴｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）ＲＮＡｓｅｑデータセットと、至適基準サブタイプを定義するための５０６遺伝子分類指標とを使用して、いくつかの独立した試験セットに適用したときに低い誤分類率を維持する４８遺伝子シグネチャーを開発した。標準的な５０６分類指標遺伝子から開始し、各サブタイプについて負の相関を示す遺伝子および正の相関を示す遺伝子を同数選択するように改変された最近隣重心へのアレイ分類（ＣＬａＮＣ）［７］アルゴリズムを使用した。ＴＣＧＡ肺腺癌データセットを使用して行った５分割交差検証曲線（図８参照）に基づいて、シグネチャーに含める遺伝子の最適な数（サブタイプ当たり１６個）を選択した。予測因子のトレーニングのためのプロトタイプ試料の選択を図９に示す。ここでは、４８種の遺伝子の最終的なリストを得るために、至適基準サブタイプ予測強度が最も低い試料の２０％を全体から差し引いたＴＣＧＡデータセットにＣＬａＮＣを適用し、各サブタイプから同数を除去した（図９）。次いで、いくつかの新鮮冷凍された公的に利用可能なアレイおよびＲＮＡｓｅｑデータセット［２、８、９］において４８遺伝子シグネチャーを試験し、この結果を、過去に公開されている５０６遺伝子シグネチャー［２］により定義される至適基準サブタイプコールと比較した。次いで、ＦＦＰＥ腺癌試料のアーカイブから新たに収集されたＲＮＡｓｅｑデータセットにおいて４８遺伝子シグネチャー（表１）の最終検証を行って、ＦＦＰＥ試料における同等の性能を確かめた。
【０２１８】
選択された４８遺伝子シグネチャーの一貫した性能を検証するため、新たに収集されたＦＦＰＥ試料は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  ｉｎ  Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ、ＮＣにてＩＲＢ認可済みのプロトコールのもと収集された肺腺癌（ＡＤ）の残存するアーカイブ試料（主に外科的試料）であった。病理学者により試料を腫瘍細胞について点検し、３種の１０μｍ組織切片のマイクロダイセクションを行ってから腫瘍細胞を集中させるための抽出を行った。ＲＮＡを定量化し、試料毎に１００ｎｇをインプットした。トランスクリプトームを集中させるＩｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡ−Ａｃｃｅｓｓキットを使用して配列決定ライブラリーを構築した。配列決定ライブラリーはＢＡアナライザーを使用することによる品質管理下におき、ｑＰＣＲを使用して数量化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑプラットフォーム（５０ｂｐ  ＰＥ、２千万〜３千万リード）において配列データを生成し、ｆａｓｔＱＣを使用することによる品質管理下においた。ＳＴＡＲアライナーを使用して配列結果をｈｇ１９参照配列に対してアラインし、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ［１０］を使用してトランスクリプトームを構築した。Ｃｕｆｆｃｏｍｐａｒｅを使用してトランスクリプトームのアノテーションを行い、発現した種々の遺伝子の計数を算出した。ＲＳＥＭ発現計数推定値の上位分位点正規化を行い、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ肺腺癌解析において使用された手法に従ってｌｏｇ２変換した［３、１１］。
【０２１９】
結果
この研究において開発した４８遺伝子シグネチャー遺伝子リストは表２に示されており、各ＡＤサブタイプに関する４８遺伝子シグネチャー遺伝子リストのＴ統計量は表１で確認することができる。各ＡＤサブタイプ（ブロンキオイド、マグノイド、スクアモイド）について選択された１６種の遺伝子の遺伝子発現中央値を、それぞれ図１０、１１、および１２に示す。図１３には、いくつかの異なる試験データセットにおける、４８遺伝子シグネチャーを使用したサブタイプコールと、公開されている５０６遺伝子シグネチャーサブタイプコールとの一致率を示す。新たに開発された４８遺伝子シグネチャーは、新たに収集されたＦＦＰＥデータセットにおいては０．８４、そして他の３種の新鮮冷凍試験データセットにおいては０．７９〜０．９２の範囲の一致率を明示した。以下は、試験データセット、ＲＮＡプラットフォームのタイプ、および使用した腺癌試料の数の要旨である。
【表１２】
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【０２２０】
結論
ＡＤサブタイピングのための効率的な４８遺伝子シグネチャーの開発および検証について記載した。結果として得られた４８遺伝子シグネチャーは、いくつかの独立した試験セットに適用したとき、低い誤分類率を維持する。したがって、この新しいシグネチャーは、新鮮冷凍またはＦＦＰＥ腫瘍試料からＡＤを高信頼性でサブタイピングし、ＲＮＡｓｅｑおよびアレイを含む様々なプラットフォームから生成された遺伝子発現データを使用して高信頼性で機能することができる。
【０２２１】
参照による組み込み
以下の参考文献は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために組み込まれている。
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1.)  Hayes  DN,  Monti  S,  Parmigiani  Gら、Gene  expression  profiling  reveals  reproducible  human  lung  adenocarcinoma  subtypes  in  multiple  independent  patient  cohorts.    J  Clin  Oncol  2006.  24(31):  5079-5090.    
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【０２２８】
7.)  Dabney  AR.  ClaNC:  Point-and-click  software  for  classifying  microarrays  to  nearest  centroids.  Bioinformatics.  2006;22:  122−123.  doi:10.1093/bioinformatics/bti756
【０２２９】
8.)  Shedden  K,  Taylor  JMG,  Enkemann  SAら、Gene  expression-based  survival  prediction  in  lung  adenocarcinoma:    a  multi-site,  blinded  validation  study:    director’s  challenge  consortium  for  the  molecular  classification  of  lung  adenocarcinoma.      Nat  Med  2008.  14(8):    822-827.  doi:  10.1038/nm.1790.
【０２３０】
9.)  Tomida  S,    Takeuchi  T,    Shimada  Y,  Arima  C,  Maatsuo  Kら、Relapse-Related  Molecular  Signature  Identifies  Patients  With  Dismal  Prognosis.    J  Clin  Oncol  2009;  27(17):  2793-99.    
【０２３１】
10.)  Trapnell  C,  Williams  BA,  Pertea  G,  Mortazavi  A,  Kwan  G,  van  Baren  MJら、Transcript  assembly  and  quantification  by  RNA-Seq  reveals  unannotated  transcripts  and  isoform  switching  during  cell  differentiation.  Nature  biotechnology  2010;28(5):511-5.
【０２３２】
11.)  Li  B,  and  Dewey  CN.  RSEM:  accurate  transcript  quantification  from  RNA-Seq  data  with  or  without  a  reference  genome.    BMC  Bioinformatics  2011,  12:323    doi:10.1186/1471-2105-12-323
【０２３３】
（実施例３）
実施例２の肺腺癌サブタイピング４８遺伝子シグネチャーを使用して判定された肺腺癌内因性サブタイプ間の免疫細胞活性化の差。
方法
過去に公開されているBindeaら（３）の免疫細胞遺伝子シグネチャー（合計２４種）および実施例２に記載したＡＤのサブタイピングのための肺ＡＤサブタイピング遺伝子シグネチャーを使用し、実施例２に記載した肺ＡＤ遺伝子シグネチャーを使用して判定されたＡＤサブタイプに関連する免疫細胞の特徴について、いくつかの公的に利用可能な肺ＡＤデータセット（１〜２、４〜５；図２参照）を検査した。自然免疫細胞（ＩＩＣ）および適応免疫細胞（ＡＩＣ）の両方の遺伝子発現シグネチャー、１３遺伝子ＩＦＮシグネチャー（ＩＦＮ）、ならびに単一遺伝子免疫バイオマーカー（ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１、およびＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＤＣＤＬＧ２（ＰＤ−Ｌ２））を３種のＡＤサブタイプ（ＴＲＵ、ＰＰ、およびＰＩ）において検査した。線形回帰を使用し、腫瘍サブタイプおよびＣＤ２７４発現との免疫細胞シグネチャーの関連性を評価した。免疫シグネチャーの階層的クラスタリングおよびペアワイズのシグネチャーの相関も解析した。各データセットにおいて異なるベースラインハザードを可能にする層別ｃｏｘ比例ハザードモデルを用い、ステージＩ〜ＩＩＩ試料の生存期間とシグネチャーの関連性を評価した。
【０２３４】
結果
ＴＣＧＡ  ＡＤデータセットおよび実施例２の４８遺伝子ＡＤサブタイピングシグネチャーを使用すると、免疫細胞遺伝子シグネチャーのヒートマップ解析および教師なし階層的クラスタリングにより、実施例１で観察されたものと同様の様式でＡＤの内因性サブタイプが分離された（図３および図１４参照）。さらに、免疫細胞シグネチャー遺伝子発現パターンは、実施例１で観察されたものと同様（図５参照）、複数のＡＤ（図１５参照）データセット間で一貫していた。適応免疫細胞シグネチャーとＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）発現の関連性強度をＡＤサブタイプと比較した。図１６に示されるように（実施例１の図６と同様）、ＡＤサブタイプに関する関連強度（調整済み決定係数）はまちまちであり、ＣＤ２７４関連性は一部の細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、Ｔｈ１、Ｔｒｅｇ、細胞傷害性細胞、Ｔヘルパー、Ｔｅｍ、Ｔｇｄ）で高い一方、ＡＤサブタイプ関連性は他の細胞（ＴＦＨ、Ｔｈ２、ＣＤ８、Ｔｈ１７、およびＴｃｍ）に関して高いことが示された。実施例１のように、免疫活性化はＰＩサブタイプのＡＤにおいて最も顕著であり、一方でＰＰサブタイプのＡＤはより低い免疫活性化を明示し、ＡＤサブタイプおよびＣＤ２７４発現は同様にＡＩＣ発現の予測能を有した（図６および図１６参照）。
【０２３５】
ｃｏｘ比例ハザードモデルを使用し、発現増大の１単位当たりのサブタイプ特異的ハザード比を算出した。サブタイプ特異的ＨＲを病理学的ステージに合わせて調整し、信頼区間を算出した。サブタイプのうちの１つまたは複数に対して有意な生存期間の関連性を示した細胞シグネチャーまたは遺伝子のＨＲおよびＣＩを図１７に示す。ＡＤサブタイプについては、実施例１のように、多くの自然および適応免疫細胞、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ならびにＣＴＬＡ４の発現における１単位の増大は、ＰＩサブタイプのＡＤにおける生存期間の改善と有意な関連性を示したが、他のサブタイプではこれを示さなかった（図７Ａ〜７Ｂおよび１７参照）。全体的には実施例１のように、免疫細胞シグネチャーの生存期間解析は、Ｔヘルパー１７および濾胞性ヘルパーＴ免疫細胞がＡＤにおける生存期間の改善を予測したことを示唆した（ｐ＜０．００１）（図７Ａ〜７Ｂおよび１７参照）。
【０２３６】
結論
実施例２に記載したＡＤサブタイピングのための４８遺伝子シグネチャーは、肺ＡＤサブタイプの免疫ランドスケープがどのように異なるかを示すという点で、実施例１で使用したＡＤサブタイピング遺伝子シグネチャーと同様の結果を示す。実施例１のＡＤサブタイピング遺伝子シグネチャーと一致して、この実施例で使用したＡＤサブタイピング遺伝子シグネチャーは、肺ＡＤ遺伝子発現サブタイプが免疫ランドスケープにおいて異なることを示す。内因性の生物学的ＡＤサブタイプは免疫細胞活性化における肝要な差を明らかにし、これはＣＤ２７４発現と常に相関するとは限らず、生存期間との変動のある関連性を明示した。ＡＤ  ＰＰサブタイプは最小限の免疫浸潤を示し、ｉｍｍｕｎｏＲＸに対する応答の低減が示唆された。ＡＤ  ＰＩサブタイプは、生存期間の改善と関連する免疫特徴の発現を示した。
【０２３７】
参照による組み込み
以下の参考文献は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために組み込まれている。
【０２３８】
1.)  Wilkerson  MDら、PLoS  One  2012;  7(5):  e36530.  PMID  22590557
【０２３９】
2.)  TCGA  Lung  AdenoC.  Nature  2014;  511(7511):  543-550.  PMID  25079552
【０２４０】
3.)  Bindeaら、Immunity  2013;  39(4):  782-95.  PMID  24138885
【０２４１】
4.)  Shedden  Kら、Nat  Med  2008;  14(8):  822-827.  PMID  18641660
【０２４２】
5.)  Tomida  Sら、J  Clin  Oncol  2009;  27(17):  2793-99.  PMID  19414676
【０２４３】
6.)  Lee  ESら、Cancer  Res  2008;  14(22):  7397-7404.  PMID  19010856
【０２４４】
7.)  Raponi  Mら、Cancer  Res  2006;  66(7):  466-72.  PMID  16885343
【０２４５】
（実施例４）
肺腺癌の発現サブタイプは異なる免疫ランドスケープおよび独特の体細胞遺伝学的特徴を明らかにし、複数の薬物標的に対する差次的な応答を示唆する
導入：肺腺癌（ＡＤ）における遺伝子発現ベースのサブタイピングは、変動のあるアウトカムおよび療法への応答の可能性を有する異なるサブタイプにＡＤ腫瘍を分類する。遺伝子発現ベースのサブタイピングは、肺ＡＤの３種の異なる生物学的タイプである終末呼吸単位（ＴＲＵ）、旧名ブロンキオイド、近位増殖性（ＰＰ）、旧名マグノイド、および近位炎症性（ＰＩ）、旧名スクアモイド（１、２）を一貫して特定した（図１参照）。ＡＤサブタイプは、ゲノム変化、腫瘍ドライバー、予後、および種々の療法に対する可能性の高い応答における肝要な差を明示する（１〜２）。
【０２４６】
方法：実施例１において遂行した実験のフォローアップとして、図２に示したＴＣＧＡ肺がん遺伝子発現データセット（ＡＤ  ｎ＝５１５）２を使用して判定された、実施例１の肺ＡＤサブタイプにおける差次的な薬物標的遺伝子発現を評価した。過去に公開されているＡＤサブタイプ（ＴＲＵ、ＰＰ、およびＰＩ）は、実施例１で遺伝子発現パターンを使用して定義した。この実施例では、実施例１で行った免疫細胞遺伝子シグネチャー（Bindeaらの２４種の免疫細胞タイプ）４、単一免疫遺伝子バイオマーカー（ＣＴＬＡ４、ＰＤＣＤ１（ＰＤ−１）、およびＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１））の発現、増殖（１１遺伝子シグネチャー；表９参照）５、および非サイレント突然変異量の検査への補足として、臨床腫瘍学固形腫瘍突然変異パネル（３２２遺伝子、表８参照）３からの遺伝子の変動のある発現を実施例１のＡＤサブタイプとの関連で検査した。差次的遺伝子発現は、ボンフェローニ補正を用いたクラスカル−ウォリス（ＫＷ）検定を使用して査定し、非サイレント突然変異量、腫瘍サブタイプ、およびＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）発現の免疫細胞発現との関連性を評価するためには線形回帰およびスピアマン相関を使用した。
【０２４７】
結果：図２１に示されるように、ＡＤサブタイプにおいて２０８／３２２の腫瘍パネル遺伝子（６５％）の変動のある発現が観察された（ＫＷボンフェローニ閾値ｐ＜０．０００１５５）。ＡＤにおいてＡＵＲＫＡ、ＣＨＥＫ１、ＲＯＳ１、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＳＦ１ＲおよびＥＲＢＢ４を含むがこれらに限定されないほとんどの薬物標的遺伝子がサブタイプ間で強い差次的発現を呈した（ｐ＜１Ｅ−２８）。さらに、ＡＤサブタイプ間で差次的遺伝子発現を示す臨床腫瘍学固形腫瘍突然変異パネルの３２２種の遺伝子のうち上位２５種の遺伝子は、表１０で確認することができる。免疫細胞発現も、サブタイプ間で高度に変動があった（図３参照）。ＰＩサブタイプのＡＤは最も高い免疫細胞発現を明示し、一方でＰＰサブタイプのＡＤは免疫細胞の低発現を明示した（図３参照）。非サイレント突然変異量は、免疫細胞発現と強い相関を示さなかった（ＡＤにおけるスピアマン相関＝−０．０７）が、ＴＰ５３突然変異が集中しているＰＩサブタイプのＡＤは、上昇した免疫細胞発現および高い突然変異量に関連していた（図２０参照）。全体的に、図２０に示されるように、増殖、非サイレント突然変異量、および肝要な薬物標的のＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＤＣＤ１（ＰＤ−１）、およびＣＴＬＡ４において、ＡＤサブタイプの有意差が存在した。
【０２４８】
結論：肺ＡＤの分子サブタイプは、臨床的固形腫瘍配列決定パネルに含まれる肝要な薬物標的遺伝子の過半数の発現において異なる。肺ＡＤの分子サブタイプは、宿主免疫応答および免疫標的の差次的発現を明らかにした。薬物感受性の潜在的なバイオマーカーとしてのサブタイプの評価は、単独で、また免疫細胞特徴および肝要な突然変異標的との組合せで精査されるべきである。
【０２４９】
参照による組み込み
以下の参考文献は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために組み込まれている。
【０２５０】
1.)  Wilkerson  MDら、PLoS  One  2012;  7(5):  e36530.  PMID  22590557
【０２５１】
2.)  TCGA  Lung  AdenoC.  Nature  2014;  511(7511):  543-550.  PMID  25079552
【０２５２】
3.)  Foundation  Medicine  Solid  Tumor  Mutation  Panel  accessed  October  2014.
【０２５３】
4.)  Bindeaら、Immunity  2013;  39(4):  782-95.  PMID  24138885
【０２５４】
5.)  Neilson  TOら、Clin  Cancer  Res  2010;  16(21):  522-5232.  PMID  20837693.
【０２５５】
（実施例５）
肺腺癌の発現サブタイプは異なる免疫ランドスケープおよび独特の体細胞遺伝学的特徴を明らかにし、複数の薬物標的に対する差次的な応答を示唆する
導入：ちょうど実施例４のように、この実施例の目的は、過去に定義された腺癌（ＡＤ）の遺伝子発現サブタイプ間での臨床的に重要な遺伝子の差次的発現を査定することであった。実施例１に記載したＴＣＧＡ肺がん遺伝子発現データセット（ＡＤ  ｎ＝５１５）２を使用してＡＤおよび遺伝子発現ベースのサブタイピングを行った実施例４とは対照的に、この実施例における遺伝子発現ベースのＡＤサブタイピングは、実施例２に記載した４８遺伝子セットを使用して行った。さらに、臨床的に重要な遺伝子は、治療管理に影響するゲノム変化の特定および／または標的薬物臨床治験への適格性の判定のために腫瘍学患者の管理に使用される臨床的固形腫瘍突然変異配列決定パネルを構成した３２２種の遺伝子（表８参照）であった。ちょうど実施例４のように、１１遺伝子増殖シグネチャー（表９参照）を使用してＡＤサブタイプ間の腫瘍増殖の差も査定した。
【０２５６】
方法：ＴＣＧＡ肺がん遺伝子発現データセット（腺癌（ＡＤ）ｎ＝５１５）１を使用し、肺ＡＤサブタイプにおける差次的な薬物標的遺伝子発現を評価した。これまでに記載したＣｌａｎｃ４８  ＡＤサブタイパー（実施例２および本明細書の記載を参照のこと）（最近隣重心予測）２を使用してＡＤのサブタイプを定義した。終末呼吸単位（ＴＲＵ）、近位増殖性（ＰＰ）、および近位炎症性（ＰＩ）のＡＤサブタイプを検査した。臨床腫瘍学固形腫瘍突然変異パネル（３２２種の遺伝子）３からの遺伝子の変動のある発現を、ＡＤとの関連において検査した。差次的遺伝子発現は、ボンフェローニ補正を用いたクラスカル−ウォリス（ＫＷ）検定を使用して査定した。さらに、１１遺伝子ＰＡＭ５０増殖シグネチャー４において利用可能な遺伝子の平均発現（ｌｏｇ２（ＲＳＥＭ＋１））として増殖スコアを算出した。クラスカル−ウォリス検定を使用してサブタイプ−増殖の関連性を試験した。
【０２５７】
結果：図２１と同様に、図２２は、観察されたＡＤサブタイプ間の２０３／３２２の腫瘍パネル遺伝子（６３％）の変動のある発現を示した（ＫＷボンフェローニ閾値ｐ＜０．０００１５５）。さらに、ちょうど図２０の実施例４のように、増殖におけるＡＤサブタイプの有意差が存在した（図２３参照）。さらに、表１１に見られるＡＤサブタイプ間で差次的遺伝子発現を示す臨床腫瘍学固形腫瘍突然変異パネルの３２２種の遺伝子のうち上位２５種の遺伝子は、表１０に見られるものと酷似している。
【０２５８】
結論：ちょうど実施例４のように、肺ＡＤの分子サブタイプは、臨床的固形腫瘍配列決定パネルに含まれる肝要な薬物標的遺伝子の過半数の発現において異なる。肺ＡＤの分子サブタイプは、宿主免疫応答および免疫標的の差次的発現を明らかにした。
【０２５９】
参照による組み込み
以下の参考文献は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために組み込まれている。
【０２６０】
1.)  TCGA  Lung  AD.  Nature  2014;  511(7511):  543-550.  PMID  25079552
【０２６１】
2.)  Wilkerson  MDら、PLoS  One  2012;  7(5):  e36530.  PMID  22590557
【０２６２】
3.)  Foundation  Medicine  Solid  Tumor  Mutation  Panel  accessed  October  6,  2014.
【０２６３】
4.)  Neilson  TO,  Parker  JS,  Leung  Sら、Clin  Cancer  Res  2010;  16(21):  5222-5232.  PMID  20837693
【表８−１】
2019516407.tif 000038
【表８−２】
2019516407.tif 000039
【表８−３】
2019516407.tif 000040
【表８−４】
2019516407.tif 000041
【表８−５】
2019516407.tif 000042
【表９】
2019516407.tif 000043
【０２６４】
【表１０】
2019516407.tif 000044
【０２６５】
【表１１−１】
2019516407.tif 000045
【表１１−２】
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【０２６６】
上述の種々の実施形態は、さらなる実施形態を提供するように組み合わせることができる。本明細書において言及され、かつ／または出願データシートに列挙される米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許公開文献はすべて、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。種々の特許、出願、および公開文献の概念を用いて、なおもさらなる実施形態を提供するために必要な場合は、諸実施形態の態様を改変してもよい。
【０２６７】
上記の詳細な記載を踏まえ、これらのおよび他の変更を諸実施形態に行うことができる。概して、続く特許請求の範囲において、使用される用語は、本明細書および特許請求の範囲において開示される特定の実施形態に特許請求の範囲を限定するものと解釈されてはならず、かかる特許請求の範囲が権利とする均等物の全範囲と併せて可能性のあるすべての実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示によって限定されない。
【図１】
2019516407.tif 000047
【図２】
2019516407.tif 000048
【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
2019516407.tif 000053
【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１】
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【図２２】
2019516407.tif 000079
【図２３】
2019516407.tif 000080
【配列表】
2019516407000001.app
【国際調査報告】
2019516407.tif 000081
2019516407.tif 000082
2019516407.tif 000083
2019516407.tif 000084
2019516407.tif 000085
2019516407.tif 000086