(57)【要約】本開示は、様々なハイブリダイゼーションアッセイおよび他の関連技術に使用される、高性能のハイブリダイゼーション試薬を提供する。ハイブリダイゼーション試薬は、オリゴヌクレオチドプローブおよび架橋抗原を含み、架橋抗原が、検出可能な抗体により高親和性で認識される。複数の異なる標的核酸に特異的なハイブリダイゼーション試薬のパネルを含む組成物、およびハイブリダイゼーション試薬とそれらの相補的な検出可能な抗体のペアを含む組成物もまた提供される。ペアになったハイブリダイゼーション試薬と検出可能な抗体は、様々なハイブリダイゼーションアッセイ、特に、高度に多重化されたアッセイにおいて有用であり、単一アッセイにおいて標的核酸の多重性を同時に検出することができるハイブリダイゼーション試薬の多重性が提供されるように、架橋抗原の構造は、検出可能な抗体のバリエーションと並行して変わる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋抗原とカップリングしたオリゴヌクレオチドプローブ；および
検出可能な抗体
を含むハイブリダイゼーション試薬組成物であって、該検出可能な抗体が該架橋抗原に対して高親和性で特異的である、ハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項２】
前記架橋抗原がペプチドである、請求項１に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項３】
前記架橋抗原が複数の抗原決定基を含む、請求項１に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項４】
前記複数の抗原決定基における各抗原決定基が同じである、請求項３に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項５】
前記複数の抗原決定基が線状反復構造を含む、請求項３に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項６】
前記線状反復構造が線状反復ペプチド構造である、請求項５に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項７】
前記複数の抗原決定基が少なくとも３個の抗原決定基を含む、請求項３に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項８】
前記架橋抗原が分岐型構造を含む、請求項３に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項９】
前記架橋抗原が、非天然残基を含むペプチドである、請求項１に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項１０】
前記非天然残基が非天然立体異性体である、請求項９に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項１１】
前記非天然残基がβ−アミノ酸である、請求項９に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドプローブおよび前記架橋抗原が、コンジュゲーション部分を介して化学的カップリング反応によりカップリングしている、請求項１に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドプローブおよび前記架橋抗原が高効率コンジュゲーション部分を介してカップリングしている、請求項１２に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項１４】
前記高効率コンジュゲーション部分がシッフ塩基である、請求項１３に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項１５】
前記シッフ塩基がヒドラゾンまたはオキシムである、請求項１４に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項１６】
前記高効率コンジュゲーション部分がクリック反応によって形成される、請求項１３に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項１７】
前記コンジュゲーション部分が切断可能なリンカーを含む、請求項１２に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、細胞マーカーをコードする遺伝子または前記遺伝子によって発現されるＲＮＡの少なくとも断片に相補的である、請求項１に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項１９】
前記細胞マーカーが、４−１ＢＢ、ＡＦＰ、ＡＬＫ１、アミロイドＡ、アミロイドＰ、アンドロゲン受容体、アネキシンＡ１、ＡＳＭＡ、ＢＣＡ２２５、ＢＣＬ−１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−６、ＢｅｒＥＰ４、ベータ−カテニン、ベータ−ＨＣＧ、ＢＧ−８、ＢＯＢ−１、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、カルシトニン、カルデスモン、カルポニン−１、カルレチニン、ＣＡＭ５．２、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４３、ＣＤ４５  ＬＣＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６１、ＣＤ６８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６３、ＣＤＸ２、ＣＥＡ、クロモグラニンＡ、ＣＭＶ、ｃ−ｋｉｔ、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＭＹＣ、ＩＶ型コラーゲン、補体３ｃ（Ｃ３ｃ）、ＣＯＸ−２、ＣＸＣＲ５、ＣＫ１、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１４、ＣＫ１８、ＣＫ１７、ＣＫ１９、ＣＫ２０、ＣＫ９０３、ＣＫ  ＡＥ１、ＣＫ  ＡＥ１／ＡＥ３、Ｄ２−４０、デスミン、ＤＯＧ−１、Ｅ−カドヘリン、ＥＧＦＲ、ＥＭＡ、ＥＲ、ＥＲＣＣ１、第ＶＩＩＩ因子関連抗原、活性化第ＸＩＩＩ因子、ファスシン、ＦｏｘＰ１、ＦｏｘＰ３、ガレクチン−３、ＧＡＴＡ−３、ＧＣＤＦＰ−１５、ＧＣＥＴ１、ＧＦＡＰ、グリコホリンＡ、グリピカン３、グランザイムＢ、ＨＢＭＥ−１、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｙｌｏｒｉ、ヘモグロビンＡ、Ｈｅｐ  Ｐａｒ１、ＨＥＲ２、ＨＨＶ−８、ＨＭＢ−４５、ＨＳＶ  ｌ／ｌｌ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮガンマ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩＬ１７、ＩＬ４、インヒビン、ｉＮＯＳ、カッパＩｇ軽鎖、Ｋｉ６７、ＬＡＧ−３、ラムダＩｇ軽鎖、リゾチーム、マンマグロビンＡ、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、マスト細胞トリプターゼ、ＭＬＨ１、ＭＯＣ−３１、ＭＰＯ、ＭＳＡ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＭ１、ＭｙｏＤ１、ミオゲニン、ミオグロビン、ナプシンＡ、ネスチン、ＮＳＥ、Ｏｃｔ−２、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ４０、ｐ５３、ｐ６３、ｐ５０４ｓ、ＰＡＸ−５、ＰＡＸ−８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＨＨ３、ＰＩＮ−４、ＰＬＡＰ、ＰＭＳ２、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉ（ｃａｒｉｎｉｉ）、ＰＲ、ＰＳＡ、ＰＳＡＰ、ＲＣＣ、Ｓ−１００、ＳＭＡ、ＳＭＭ、スムーセリン、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ１１、サーファクタントアポプロテインＡ、シナプトフィジン、ＴＡＧ７２、ＴｄＴ、トロンボモジュリン、チログロブリン、ＴＩＡ−１、ＴＩＭ３、ＴＲＡｃＰ、ＴＴＦ−１、チロシナーゼ、ウロプラキン、ＶＥＧＦＲ−２、ビリン、ビメンチン、およびＷＴ−１からなる群から選択される、請求項１８に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項２０】
前記検出可能な抗体が検出可能な標識を含む、請求項１に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項２１】
前記検出可能な標識が、フルオロフォア、酵素、アップコンバージョンナノ粒子、量子ドット、または検出可能なハプテンである、請求項２０に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項２２】
前記検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項２１に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項２３】
前記酵素が、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはグルコースオキシダーゼである、請求項２１に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項２４】
前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼまたはダイズペルオキシダーゼである、請求項２３に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項２５】
前記架橋抗原が検出可能な標識を含む、請求項１に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項２６】
前記架橋抗原の前記検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項２５に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項２７】
前記検出可能な抗体が検出可能な標識を含む、請求項２５に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項２８】
前記架橋抗原の前記検出可能な標識および前記二次抗体の前記検出可能な標識がどちらも、同じ波長の蛍光によって検出可能である、請求項２７に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項２９】
前記検出可能な抗体が、前記架橋抗原に対して特異的であり、最大で１００ｎＭ、最大で３０ｎＭ、最大で１０ｎＭ、最大で３ｎＭ、最大で１ｎＭ、最大で０．３ｎＭ、最大で０．１ｎＭ、最大で０．０３ｎＭ、最大で０．０１ｎＭ、または最大で０．００３ｎＭの解離定数を有する、請求項１に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項３０】
複数の、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーション試薬組成物を含む、多重化ハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項３１】
少なくとも３個のハイブリダイゼーション試薬組成物を含む、請求項３０に記載の多重化ハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項３２】
少なくとも５個のハイブリダイゼーション試薬組成物を含む、請求項３０に記載の多重化ハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項３３】
少なくとも１０個のハイブリダイゼーション試薬組成物を含む、請求項３０に記載の多重化ハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項３４】
架橋抗原とカップリングしたオリゴヌクレオチドプローブを含むハイブリダイゼーション試薬。
【請求項３５】
前記架橋抗原がペプチドである、請求項３４に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項３６】
前記架橋抗原が複数の抗原決定基を含む、請求項３４に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項３７】
前記複数の抗原決定基における各抗原決定基が同じである、請求項３６に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項３８】
前記複数の抗原決定基が線状反復構造を含む、請求項３６に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項３９】
前記線状反復構造が線状反復ペプチド構造である、請求項３８に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項４０】
前記複数の抗原決定基が少なくとも３個の抗原決定基を含む、請求項３６に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項４１】
前記架橋抗原が分岐型構造を含む、請求項３６に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項４２】
前記架橋抗原が、非天然残基を含むペプチドである、請求項３４に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項４３】
前記非天然残基が非天然立体異性体である、請求項４２に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項４４】
前記非天然残基がβ−アミノ酸である、請求項４２に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項４５】
前記オリゴヌクレオチドプローブおよび前記架橋抗原が、コンジュゲーション部分を介して化学的カップリング反応によりカップリングしている、請求項３４に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項４６】
前記オリゴヌクレオチドプローブおよび前記架橋抗原が高効率コンジュゲーション部分を介してカップリングしている、請求項４５に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項４７】
前記高効率コンジュゲーション部分がシッフ塩基である、請求項４６に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項４８】
前記シッフ塩基がヒドラゾンまたはオキシムである、請求項４７に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項４９】
前記高効率コンジュゲーション部分がクリック反応によって形成される、請求項４６に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項５０】
前記コンジュゲーション部分が切断可能なリンカーを含む、請求項４５に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項５１】
前記オリゴヌクレオチドプローブが、細胞マーカーをコードする遺伝子または該遺伝子によって発現されるＲＮＡの少なくとも断片に相補的である、請求項３４に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項５２】
前記細胞マーカーが、４−１ＢＢ、ＡＦＰ、ＡＬＫ１、アミロイドＡ、アミロイドＰ、アンドロゲン受容体、アネキシンＡ１、ＡＳＭＡ、ＢＣＡ２２５、ＢＣＬ−１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−６、ＢｅｒＥＰ４、ベータ−カテニン、ベータ−ＨＣＧ、ＢＧ−８、ＢＯＢ−１、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、カルシトニン、カルデスモン、カルポニン−１、カルレチニン、ＣＡＭ５．２、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４３、ＣＤ４５  ＬＣＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６１、ＣＤ６８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６３、ＣＤＸ２、ＣＥＡ、クロモグラニンＡ、ＣＭＶ、ｃ−ｋｉｔ、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＭＹＣ、ＩＶ型コラーゲン、補体３ｃ（Ｃ３ｃ）、ＣＯＸ−２、ＣＸＣＲ５、ＣＫ１、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１４、ＣＫ１８、ＣＫ１７、ＣＫ１９、ＣＫ２０、ＣＫ９０３、ＣＫ  ＡＥ１、ＣＫ  ＡＥ１／ＡＥ３、Ｄ２−４０、デスミン、ＤＯＧ−１、Ｅ−カドヘリン、ＥＧＦＲ、ＥＭＡ、ＥＲ、ＥＲＣＣ１、第ＶＩＩＩ因子関連抗原、活性化第ＸＩＩＩ因子、ファスシン、ＦｏｘＰ１、ＦｏｘＰ３、ガレクチン−３、ＧＡＴＡ−３、ＧＣＤＦＰ−１５、ＧＣＥＴ１、ＧＦＡＰ、グリコホリンＡ、グリピカン３、グランザイムＢ、ＨＢＭＥ−１、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｙｌｏｒｉ、ヘモグロビンＡ、Ｈｅｐ  Ｐａｒ１、ＨＥＲ２、ＨＨＶ−８、ＨＭＢ−４５、ＨＳＶ  ｌ／ｌｌ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮガンマ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩＬ１７、ＩＬ４、インヒビン、ｉＮＯＳ、カッパＩｇ軽鎖、Ｋｉ６７、ＬＡＧ−３、ラムダＩｇ軽鎖、リゾチーム、マンマグロビンＡ、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、マスト細胞トリプターゼ、ＭＬＨ１、ＭＯＣ−３１、ＭＰＯ、ＭＳＡ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＭ１、ＭｙｏＤ１、ミオゲニン、ミオグロビン、ナプシンＡ、ネスチン、ＮＳＥ、Ｏｃｔ−２、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ４０、ｐ５３、ｐ６３、ｐ５０４ｓ、ＰＡＸ−５、ＰＡＸ−８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＨＨ３、ＰＩＮ−４、ＰＬＡＰ、ＰＭＳ２、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉ（ｃａｒｉｎｉｉ）、ＰＲ、ＰＳＡ、ＰＳＡＰ、ＲＣＣ、Ｓ−１００、ＳＭＡ、ＳＭＭ、スムーセリン、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ１１、サーファクタントアポプロテインＡ、シナプトフィジン、ＴＡＧ７２、ＴｄＴ、トロンボモジュリン、チログロブリン、ＴＩＡ−１、ＴＩＭ３、ＴＲＡｃＰ、ＴＴＦ−１、チロシナーゼ、ウロプラキン、ＶＥＧＦＲ−２、ビリン、ビメンチン、およびＷＴ−１からなる群から選択される、請求項５１に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項５３】
前記架橋抗原が検出可能な標識を含む、請求項３４に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項５４】
前記検出可能な標識が、フルオロフォアである、請求項５３に記載のハイブリダイゼーション試薬。
【請求項５５】
複数の、請求項３４〜５４のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーション試薬を含む、多重化ハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項５６】
少なくとも３個のハイブリダイゼーション試薬を含む、請求項５５に記載の多重化ハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項５７】
少なくとも５個のハイブリダイゼーション試薬を含む、請求項５５に記載の多重化ハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項５８】
少なくとも１０個のハイブリダイゼーション試薬を含む、請求項５５に記載の多重化ハイブリダイゼーション試薬組成物。
【請求項５９】
第１の標的核酸を含む第１の試料を供給するステップ；
該第１の標的核酸を第１のハイブリダイゼーション試薬と反応させるステップであって、該第１のハイブリダイゼーション試薬が、該第１の標的核酸に相補的な、請求項３４〜５４のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーション試薬である、ステップ；
該第１のハイブリダイゼーション試薬を第１の検出可能な抗体と反応させるステップであって、該第１の検出可能な抗体が、該第１のハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原に対して、高親和性で特異的である、ステップ；および
該第１のハイブリダイゼーション試薬の該架橋抗原と会合している該第１の検出可能な抗体を検出するステップ
を含む、ハイブリダイゼーションアッセイのための方法。
【請求項６０】
前記第１のハイブリダイゼーション試薬の前記オリゴヌクレオチドプローブが、細胞マーカーをコードする遺伝子または該遺伝子によって発現されるＲＮＡの少なくとも断片に相補的である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞マーカーが、４−１ＢＢ、ＡＦＰ、ＡＬＫ１、アミロイドＡ、アミロイドＰ、アンドロゲン受容体、アネキシンＡ１、ＡＳＭＡ、ＢＣＡ２２５、ＢＣＬ−１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−６、ＢｅｒＥＰ４、ベータ−カテニン、ベータ−ＨＣＧ、ＢＧ−８、ＢＯＢ−１、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、カルシトニン、カルデスモン、カルポニン−１、カルレチニン、ＣＡＭ５．２、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４３、ＣＤ４５  ＬＣＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６１、ＣＤ６８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６３、ＣＤＸ２、ＣＥＡ、クロモグラニンＡ、ＣＭＶ、ｃ−ｋｉｔ、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＭＹＣ、ＩＶ型コラーゲン、補体３ｃ（Ｃ３ｃ）、ＣＯＸ−２、ＣＸＣＲ５、ＣＫ１、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１４、ＣＫ１８、ＣＫ１７、ＣＫ１９、ＣＫ２０、ＣＫ９０３、ＣＫ  ＡＥ１、ＣＫ  ＡＥ１／ＡＥ３、Ｄ２−４０、デスミン、ＤＯＧ−１、Ｅ−カドヘリン、ＥＧＦＲ、ＥＭＡ、ＥＲ、ＥＲＣＣ１、第ＶＩＩＩ因子関連抗原、活性化第ＸＩＩＩ因子、ファスシン、ＦｏｘＰ１、ＦｏｘＰ３、ガレクチン−３、ＧＡＴＡ−３、ＧＣＤＦＰ−１５、ＧＣＥＴ１、ＧＦＡＰ、グリコホリンＡ、グリピカン３、グランザイムＢ、ＨＢＭＥ−１、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｙｌｏｒｉ、ヘモグロビンＡ、Ｈｅｐ  Ｐａｒ１、ＨＥＲ２、ＨＨＶ−８、ＨＭＢ−４５、ＨＳＶ  ｌ／ｌｌ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮガンマ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩＬ１７、ＩＬ４、インヒビン、ｉＮＯＳ、カッパＩｇ軽鎖、Ｋｉ６７、ＬＡＧ−３、ラムダＩｇ軽鎖、リゾチーム、マンマグロビンＡ、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、マスト細胞トリプターゼ、ＭＬＨ１、ＭＯＣ−３１、ＭＰＯ、ＭＳＡ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＭ１、ＭｙｏＤ１、ミオゲニン、ミオグロビン、ナプシンＡ、ネスチン、ＮＳＥ、Ｏｃｔ−２、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ４０、ｐ５３、ｐ６３、ｐ５０４ｓ、ＰＡＸ−５、ＰＡＸ−８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＨＨ３、ＰＩＮ−４、ＰＬＡＰ、ＰＭＳ２、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｊｉｒｏｖｅｃｉ（ｃａｒｉｎｉｉ）、ＰＲ、ＰＳＡ、ＰＳＡＰ、ＲＣＣ、Ｓ−１００、ＳＭＡ、ＳＭＭ、スムーセリン、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ１１、サーファクタントアポプロテインＡ、シナプトフィジン、ＴＡＧ７２、ＴｄＴ、トロンボモジュリン、チログロブリン、ＴＩＡ−１、ＴＩＭ３、ＴＲＡｃＰ、ＴＴＦ−１、チロシナーゼ、ウロプラキン、ＶＥＧＦＲ−２、ビリン、ビメンチン、およびＷＴ−１からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１の検出可能な抗体が検出可能な標識を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記検出可能な標識が、フルオロフォア、酵素、アップコンバージョンナノ粒子、量子ドット、または検出可能なハプテンである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記酵素が、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはグルコースオキシダーゼである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼまたはダイズペルオキシダーゼである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記第１の検出可能な抗体が、前記第１のハイブリダイゼーション試薬の前記架橋抗原に対して特異的であり、最大で１００ｎＭ、最大で３０ｎＭ、最大で１０ｎＭ、最大で３ｎＭ、最大で１ｎＭ、最大で０．３ｎＭ、最大で０．１ｎＭ、最大で０．０３ｎＭ、最大で０．０１ｎＭ、または最大で０．００３ｎＭの解離定数を有する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６８】
前記第１の標的核酸が組織切片内にある、請求項５９に記載の方法。
【請求項６９】
前記検出するステップが蛍光検出ステップである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記検出するステップが酵素的検出ステップである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記第１の標的核酸が細胞内または細胞上にある、請求項５９に記載の方法。
【請求項７２】
前記第１の標的核酸が前記細胞の細胞質内にある、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１の標的核酸が前記細胞の核内にある、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記検出するステップが蛍光検出ステップである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記第１の検出可能な抗体に結合している細胞を選別するステップをさらに含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記第１の試料における第２の標的核酸を第２のハイブリダイゼーション試薬と反応させるステップであって、該第２のハイブリダイゼーション試薬が、該第２の標的核酸に相補的な、請求項３４〜５４のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーション試薬である、ステップ；
該第２のハイブリダイゼーション試薬を第２の検出可能な抗体と反応させるステップであって、該第２の検出可能な抗体が、該第２のハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原に対して、高親和性で特異的である、ステップ；および
該第２のハイブリダイゼーション試薬の該架橋抗原と会合している該第２の検出可能な抗体を検出するステップ
をさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項７７】
前記試料において少なくとも３個の標的核酸を検出するステップをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記試料において少なくとも５個の標的核酸を検出するステップをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記試料において少なくとも１０個の標的核酸を検出するステップをさらに含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
第２の試料における第２の標的核酸を第２のハイブリダイゼーション試薬と反応させるステップであって、該第２のハイブリダイゼーション試薬が、該第２の標的核酸に相補的な、請求項３５〜５６のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーション試薬である、ステップ；
該第２のハイブリダイゼーション試薬を第２の検出可能な抗体と反応させるステップであって、該第２の検出可能な抗体が、該第２のハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原に対して、高親和性で特異的である、ステップ；および
該第２のハイブリダイゼーション試薬の該架橋抗原と会合している該第２の検出可能な抗体を検出するステップ
をさらに含み、前記第１の試料および該第２の試料が、組織試料の連続切片である、請求項５９に記載の方法。
【請求項８１】
前記第１の試料において複数の標的核酸が検出され、前記第２の試料において複数の標的核酸が検出される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記第１の試料において少なくとも３個の標的核酸が検出され、前記第２の試料において少なくとも３個の標的核酸が検出される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
少なくとも３個の試料において、少なくとも３個の標的核酸が検出され、該少なくとも３個の試料が組織試料の連続切片である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記少なくとも３個の試料のそれぞれにおいて、複数の標的核酸が検出される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記少なくとも３個の試料のそれぞれにおいて、少なくとも３個の標的核酸が検出される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
第１の標的核酸を含む試料を供給するステップ；
該第１の標的核酸を第１のハイブリダイゼーション試薬と反応させるステップであって、該第１のハイブリダイゼーション試薬が、該第１の標的核酸に相補的な、請求項３４〜５４のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーション試薬である、ステップ；
該第１のハイブリダイゼーション試薬を第１の反応性抗体と反応させるステップであって、該第１の反応性抗体が、該第１のハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原と高親和性で結合する、ステップ；および該第１の反応性抗体を第１の検出可能な試薬と反応させるステップであって、該第１の検出可能な試薬が、該第１の標的核酸の近くで該試料と結合している、ステップ
を含む、ハイブリダイゼーションアッセイのための方法。
【請求項８７】
前記第１の反応性抗体が酵素活性を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記酵素活性がペルオキシダーゼ活性である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ペルオキシダーゼ活性が西洋ワサビペルオキシダーゼ活性である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記第１の検出可能な試薬がチラミドを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
前記第１の検出可能な試薬がフルオロフォアまたは発色団を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９２】
前記第１の反応性抗体を前記試料から解離させるステップをさらに含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９３】
前記第１の反応性抗体が選択的処理により前記試料から解離する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記選択的処理が可溶性架橋抗原での処理を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記選択的処理が切断可能なリンカーの切断を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記第１の反応性抗体が熱処理により前記試料から解離する、請求項９２に記載の方法。
【請求項９７】
前記試料における第２の標的核酸を第２のハイブリダイゼーション試薬と反応させるステップであって、該第２のハイブリダイゼーション試薬が、該第２の標的核酸に相補的な、請求項３４〜５４のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーション試薬である、ステップ；
該第２のハイブリダイゼーション試薬を第２の反応性抗体と反応させるステップであって、該第２の反応性抗体が、該第２のハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原と高親和性で結合する、ステップ；および
該第２の反応性抗体を第２の検出可能な試薬と反応させるステップであって、該第２の検出可能な試薬が、該第２の標的核酸の近くで該試料に結合している、ステップ
をさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９８】
前記第２の反応性抗体が酵素活性を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記酵素活性がペルオキシダーゼ活性である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記ペルオキシダーゼ活性が西洋ワサビペルオキシダーゼ活性である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第２の検出可能な試薬がチラミドを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
前記第２の検出可能な試薬がフルオロフォアまたは発色団を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０３】
前記第１の反応性抗体が選択的処理により前記試料から解離する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０４】
前記選択的処理が可溶性架橋抗原での処理を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記選択的処理が切断可能なリンカーの切断を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記第１の反応性抗体が熱処理により前記試料から解離する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０７】
前記試料において前記第１の検出可能な試薬および前記第２の検出可能な試薬を検出するステップをさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０８】
請求項３４〜５４のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーション試薬、
前記架橋抗原に対して、高親和性で特異的な検出可能な抗体、および
キットを使用するための指示
を含む、ハイブリダイゼーションアッセイのためのキット。
【請求項１０９】
前記検出可能な抗体が検出可能な標識を含む、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１０】
前記検出可能な標識が、フルオロフォア、酵素、アップコンバージョンナノ粒子、量子ドット、または検出可能なハプテンである、請求項１０９に記載のキット。
【請求項１１１】
前記検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項１１０に記載のキット。
【請求項１１２】
前記酵素が、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはグルコースオキシダーゼである、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１３】
前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼまたはダイズペルオキシダーゼである、請求項１１２に記載のキット。
【請求項１１４】
前記検出可能な抗体が、前記架橋抗原に対して特異的であり、最大で１００ｎＭ、最大で３０ｎＭ、最大で１０ｎＭ、最大で３ｎＭ、最大で１ｎＭ、最大で０．３ｎＭ、最大で０．１ｎＭ、最大で０．０３ｎＭ、最大で０．０１ｎＭ、または最大で０．００３ｎＭの解離定数を有する、請求項１０８に記載のキット。
【請求項１１５】
請求項１０８に記載のキットであって、
請求項３４〜５４のいずれか一項に記載の少なくとも３個のハイブリダイゼーション試薬、
前記架橋抗原に対して、高親和性で特異的な、少なくとも３個の検出可能な抗体、および
該キットを使用するための指示
を含む、キット。
【請求項１１６】
請求項１０８に記載のキットであって、
請求項３４〜５４のいずれか一項に記載の少なくとも５個のハイブリダイゼーション試薬、
前記架橋抗原に対して、高親和性で特異的な、少なくとも５個の検出可能な抗体、および
該キットを使用するための指示
を含む、キット。
【請求項１１７】
請求項１０８に記載のキットであって、
請求項３４〜５４のいずれか一項に記載の少なくとも１０個のハイブリダイゼーション試薬、
前記架橋抗原に対して、高親和性で特異的な、少なくとも１０個の検出可能な抗体、および
該キットを使用するための指示
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年７月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／３６３，８２５号に対する利益を主張し、この米国仮特許出願の開示内容は、その全体が参照により本明細書において援用される。
【背景技術】
【０００２】
細胞アッセイにおいて高い感度および特異性で、タンパク質および核酸を含む低発現標的マーカー（いくつかの場合にはピコグラム未満のレベル）を検出する能力は、依然として満たされていないニーズである。分析に利用可能な細胞および組織の試料サイズが小さくなるにつれて、そのようなアプローチはさらにより重要になる。さらに、単一のアッセイで複数の低発現標的を同時に検出することが可能であることには、さらなる利益がある。
【０００３】
インサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、生物学的試料中の核酸を検出するために使用される強力な標識技術である。一般的な方法は、典型的には、固定された組織または細胞試料中の目的の標的核酸に相補的である標識されたＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾核酸プローブの使用を伴う。標識されたプローブは、試料中の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列とハイブリダイズさせられ、そうすることで、１つもしくは複数の遺伝子座（例えば、ゲノムＤＮＡ標的について）または１つもしくは複数の発現遺伝子（例えば、ＲＮＡ標的について）についての時間的情報および空間的情報を提供する。
【０００４】
インサイチュハイブリダイゼーション技術は、プローブを修飾するために使用される標識の種類、そして結果として標的を同定するために使用される検出方法に従って互いに区別することができる。発色インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）アッセイについて、ＩＨＣ染色において従来使用されている反応および標識などのペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ反応が、標的の位置に発色シグナルを生成するために使用される。続いて、シグナルは、明視野顕微鏡法を用いて可視化される。ＣＩＳＨは、例えば、遺伝子増幅、遺伝子欠失、染色体転座、および染色体数を測定するために使用され得る。それは、特に、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織、中期染色体スプレッド、固定細胞、および血液または骨髄塗抹標本（smear）に適用することができる。
【０００５】
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイについて、蛍光標識が検出プロセスにおいて使用され、シグナルは、蛍光顕微鏡法または関連する分光学的技術を使用して検出される。分光的に明確に異なる蛍光特性を有する複数の蛍光標識の使用は、単一の試料内の複数の核酸標的の同時検出および共局在化を可能にする。したがって、ＤＮＡ標的について、ＦＩＳＨは、例えば、目的のゲノム遺伝子座の存在、コピー数、および位置を検出するため、および遺伝子変異体および染色体欠損を同定するために使用することができる。ＲＮＡ標的について、ＦＩＳＨは、例えば、時間的および空間的の両方で遺伝子発現を評価するために使用し、そうすることで、生理学的プロセスおよび疾患の病因に対する洞察を提供することができる。
【０００６】
インサイチュハイブリダイゼーション技術はさらに、免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色技術と組み合わせて使用されて、組織試料中または別の適切な表面上の標的核酸および発現標的タンパク質を同時に標識することができる。
【０００７】
しかし、上記のアプローチの有用性にもかかわらず、感度がより高く、特異性がより高く、単一のアッセイにおいて複数の核酸標的を検出する能力がより高い、向上したハイブリダイゼーションアッセイの試薬、方法、およびキットの開発が引き続き、必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、一態様では、様々なハイブリダイゼーションアッセイにおいて有用性がある、ハイブリダイゼーション試薬組成物を提供することにより、これらおよびその他の必要性に対処する。具体的には、本発明のこの態様によれば、ハイブリダイゼーション試薬組成物は、
架橋抗原とカップリングしたオリゴヌクレオチドプローブ；および
検出可能な抗体
を含み、該検出可能な抗体が該架橋抗原に対して高親和性で特異的である。
【０００９】
一部の実施形態では、架橋抗原はペプチドまたは低分子ハプテンである。
【００１０】
一部の実施形態では、架橋抗原は複数の抗原決定基を含む。具体的な実施形態では、複数の抗原決定基における各抗原決定基は同じである。別の具体的な実施形態では、複数の抗原決定基は線状反復構造を含む。より具体的には、線状反復構造は線状反復ペプチド構造である。
【００１１】
別の具体的な実施形態では、複数の抗原決定基は少なくとも３個の抗原決定基を含むか、または架橋抗原は分岐型構造を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、架橋抗原は、非天然残基を含むペプチドである。具体的には、  非天然残基は、非天然立体異性体またはβ−アミノ酸であり得る。
【００１３】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブおよび架橋抗原は、コンジュゲーション部分を介して化学的カップリング反応によりカップリングしている。具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブおよび架橋抗原が、高効率コンジュゲーション部分によりカップリングされる。これらの実施形態の一部では、高効率コンジュゲーション部分は、ヒドラゾンまたはオキシムなどのシッフ塩基である。一部の実施形態では、高効率コンジュゲーション部分は、クリック反応により形成される。一部の実施形態では、コンジュゲーション部分は、開裂可能なリンカーを含む。
【００１４】
実施形態では、検出可能な抗体は検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、検出可能な標識は、フルオロフォア、酵素、アップコンバージョンナノ粒子、量子ドット、または検出可能なハプテンである。具体的な実施形態では、検出可能な標識はフルオロフォアである。他の具体的な実施形態では、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはダイズペルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼであり、アルカリホスファターゼであり、またはグルコースオキシダーゼである。
【００１５】
一部の実施形態によれば、検出可能な抗体は、架橋抗原に対して特異的であり、最大で１００ｎＭ、最大で３０ｎＭ、最大で１０ｎＭ、最大で３ｎＭ、最大で１ｎＭ、最大で０．３ｎＭ、最大で０．１ｎＭ、最大で０．０３ｎＭ、最大で０．０１ｎＭ、または最大で０．００３ｎＭまたはさらに低い解離定数を有する。
【００１６】
一部の組成物の実施形態は、複数の、架橋抗原をカップリングさせた（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ）オリゴヌクレオチドプローブ、および複数の検出可能な抗体を含み、それらには、３個、５個、１０個、またはさらにそれ超の試薬ペアを含む組成物が挙げられる。
【００１７】
別の態様では、本開示は、架橋抗原にカップリングしたオリゴヌクレオチドプローブを含む免疫試薬を提供する。
【００１８】
具体的な実施形態では、ハイブリダイゼーション試薬は、上記のハイブリダイゼーション試薬組成物のハイブリダイゼーション試薬の特徴のうちの１つまたは複数を含む。
【００１９】
別の態様によれば、本開示は、上記のハイブリダイゼーション試薬のいずれか複数を含む多重化ハイブリダイゼーション試薬組成物を提供する。具体的な実施形態では、組成物は、少なくとも３個、少なくとも５個、少なくとも１０個、またはさらにそれ超のハイブリダイゼーション試薬を含む。
【００２０】
別の態様では、本開示は、
第１の標的核酸を含む第１の試料を供給するステップ；
該第１の標的核酸を第１のハイブリダイゼーション試薬と反応させるステップであって、該第１のハイブリダイゼーション試薬が、該第１の標的核酸に相補的な上記ハイブリダイゼーション試薬のいずれかである、ステップ；
該第１のハイブリダイゼーション試薬を第１の検出可能な抗体と反応させるステップであって、該第１の検出可能な抗体が、該第１のハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原に対して、高親和性で特異的である、ステップ；および
該第１のハイブリダイゼーション試薬の該架橋抗原と会合している該第１の検出可能な抗体を検出するステップ
を含む、ハイブリダイゼーションアッセイのための方法を提供する。
【００２１】
具体的な実施形態では、第１の検出可能な抗体は検出可能な標識を含む。より具体的には、検出可能な標識は、フルオロフォア、酵素、アップコンバージョンナノ粒子、量子ドット、または検出可能なハプテンである。一部の実施形態では、検出可能な標識はフルオロフォアであり、一部の実施形態では、酵素は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはグルコースオキシダーゼである。具体的な実施形態では、ペルオキシダーゼは西洋ワサビペルオキシダーゼまたはダイズペルオキシダーゼである。
【００２２】
一部の実施形態では、第１の標的核酸は組織切片内にある。これらの実施形態では、検出するステップは、蛍光検出ステップまたは酵素的検出ステップであり得る。
【００２３】
一部の実施形態では、第１の標的核酸は、細胞内または細胞上に存在し得る。これらの実施形態では、第１の標的核酸は、細胞の細胞質内、または細胞の核内に存在し得る。
【００２４】
一部の実施形態では、検出するステップは、蛍光検出ステップであり、具体的な実施形態では、方法は、第１の検出可能な抗体を結合している細胞を選別するステップをさらに含み得る。
【００２５】
一部の実施形態では、方法は、
前記第１の試料における第２の標的核酸を第２のハイブリダイゼーション試薬と反応させるステップであって、該第２のハイブリダイゼーション試薬が、該第２の標的核酸に相補的な上記ハイブリダイゼーション試薬のいずれかである、ステップ；
該第２のハイブリダイゼーション試薬を第２の検出可能な抗体と反応させるステップであって、該第２の検出可能な抗体が、該第２のハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原に対して、高親和性で特異的である、ステップ；および
該第２のハイブリダイゼーション試薬の該架橋抗原と会合している該第２の検出可能な抗体を検出するステップ
をさらに含む。
【００２６】
より具体的な方法の実施形態は、試料における少なくとも３個の標的核酸、試料における少なくとも５個の標的核酸、またはさらに、試料における少なくとも１０個の標的核酸を検出することをさらに含む。
【００２７】
一部の方法の実施形態は、第２の試料における第２の標的核酸を第２のハイブリダイゼーション試薬と反応させるステップであって、該第２のハイブリダイゼーション試薬が、該第２の標的核酸に相補的な上記ハイブリダイゼーション試薬のいずれかである、ステップ；
該第２のハイブリダイゼーション試薬を第２の検出可能な抗体と反応させるステップであって、該第２の検出可能な抗体が、該第２のハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原に対して、高親和性で特異的である、ステップ；および
該第２のハイブリダイゼーション試薬の該架橋抗原と会合している該第２の検出可能な抗体を検出するステップ
をさらに含み、前記第１の試料および該第２の試料が、組織試料の連続切片である。
【００２８】
別の方法の実施形態は、第１の標的核酸を含む試料を供給するステップ；
該第１の標的核酸を第１のハイブリダイゼーション試薬と反応させるステップであって、該第１のハイブリダイゼーション試薬が、該第１の標的核酸に相補的な上記ハイブリダイゼーション試薬のいずれかである、ステップ；
該第１のハイブリダイゼーション試薬を第１の反応性抗体と反応させるステップであって、該第１の反応性抗体が、該第１のハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原と高親和性で結合する、ステップ；および
該第１の反応性抗体を第１の検出可能な試薬と反応させるステップであって、該第１の検出可能な試薬が、該第１の標的核酸の近くで該試料と結合している、ステップ
を含む。
【００２９】
一部の実施形態では、これらの方法は、第１の反応性抗体を前記試料から解離させるステップをさらに含む。
【００３０】
一部の実施形態では、これらの方法は、前記試料における第２の標的核酸を第２のハイブリダイゼーション試薬と反応させるステップであって、該第２のハイブリダイゼーション試薬が、該第２の標的核酸に相補的な上記ハイブリダイゼーション試薬のいずれかである、ステップ；
該第２のハイブリダイゼーション試薬を第２の反応性抗体と反応させるステップであって、該第２の反応性抗体が、該第２のハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原と高親和性で結合する、ステップ；および
該第２の反応性抗体を第２の検出可能な試薬と反応させるステップであって、該第２の検出可能な試薬が、該第２の標的核酸の近くで該試料に結合している、ステップ
をなおさらに含む。
【００３１】
一部の実施形態では、これらの方法は、前記試料において前記第１の検出可能な試薬および前記第２の検出可能な試薬を検出するステップを含む。
【００３２】
別の態様によれば、本開示は、ハイブリダイゼーションアッセイのためのキットを提供する。実施形態では、キットは、上記のハイブリダイゼーション試薬のいずれか、ハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原に対して高親和性で特異的である検出可能な抗体、およびキットを使用するための指示（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を含む。具体的な実施形態では、キットは、上記のハイブリダイゼーション試薬のいずれかの少なくとも３個、少なくとも５個、またはさらに、少なくとも１０個；ハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原に対して高親和性で特異的である、少なくとも３個、少なくとも５個、またはさらに、少なくとも１０個の検出可能な抗体；およびキットを使用するための指示を含む。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
抗原をカップリングさせたハイブリダイゼーション試薬
本開示は、一態様では、オリゴヌクレオチドプローブおよび架橋抗原を含む高性能のハイブリダイゼーション試薬であって、オリゴヌクレオチドプローブおよび架橋抗原がカップリングされており、架橋抗原が、高親和性の検出可能な抗体により認識可能である、ハイブリダイゼーション試薬を提供する。
【００３４】
本ハイブリダイゼーション試薬は、ハイブリダイゼーションアッセイに使用されて、そのアッセイにおいて、目的の標的核酸を同定し、それと結合し得、標的結合の特異性は、ハイブリダイゼーション試薬を調製するために使用されたオリゴヌクレオチドプローブの相補性によって決定される。特に、本ハイブリダイゼーション試薬のオリゴヌクレオチドプローブは、細胞内か、または細胞の無細胞系のいずれかで、これらに限定されないがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、および任意のそれらの天然または合成のバリアントを含む目的の標的核酸に向けられ得る。標的核酸は、ある場合には、細胞内小器官内、例えば、細胞の核内またはミトコンドリア内に見出され得る。あるいは、標的核酸は、目的の表面上、例えば、核酸ブロットまたは他の型の２次元媒体上などにディスプレイされ得る。標的核酸は、ある場合には、不純な形態、部分的に精製された形態、または精製された形態であり得る。一般的に、標的核酸は、ハイブリダイゼーション試薬と特異的に相互作用することが有効である限り、任意の適切な表面上、もしくはその中にあり得、またはさらに溶液中で遊離していてもよい。
【００３５】
本ハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原は、二次抗体により、理想的には高親和性で認識可能であるように選択される。したがって、架橋抗原の構造は、適切な動物において免疫応答を誘発することができる分子、または別の手段により適切な二次抗体を生じるように使用することができる分子によってのみ限定される。
【００３６】
一部の実施形態では、架橋抗原と、オリゴヌクレオチドプローブとは別々に調製され、化学的カップリング反応により互いに結合される。これらの実施形態では、架橋抗原は、架橋抗原をハイブリダイゼーション試薬のオリゴヌクレオチドプローブに化学的にカップリングすることができる少なくとも１つの基を含有するように設計される。下記でより詳細に記載されているように、カップリング基は、具体的な実施形態では、架橋抗原が、オリゴヌクレオチドプローブに、高い特異性および効率性でコンジュゲートされるように、選択され得る。加えて、架橋抗原のオリゴヌクレオチドプローブへのカップリングは、検出可能な抗体により認識される架橋抗原の能力に有意には影響を及ぼすべきではない。架橋抗原およびカップリング基は、いかなるバックグラウンドシグナルも避けるために、それら自体、干渉する吸光度（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）または蛍光を有しないことも望ましい。さらに、架橋抗原およびカップリング基は、高純度で、理想的には低費用で、利用可能であるべきである。
【００３７】
一部の実施形態では、本開示の架橋抗原は合成架橋抗原である。一部の実施形態では、架橋抗原は、天然産物である。具体的な実施形態では、架橋抗原はペプチドである。
【００３８】
合成か、または天然源から単離されたかのいずれかのペプチドは、当業者により広く知られ、理解されているように、様々な手段により特異的な高親和性抗体を生じるために広範囲に使用されている。ペプチドに関して可能な構造バリエーションの範囲は、ほとんど無制限であり、したがって、そのことが、ペプチドを、本ハイブリダイゼーション試薬における架橋抗原としての使用に理想的に適したものにさせている。さらに、合成ペプチドは、例えば、固相ペプチド合成中、または合成後、Ｃ末端もしくはＮ末端に、または内部に取り込まれたアミノ酸残基または他の連結部分を含むことにより、ペプチド配列内の望ましい反応特性と共に、オリゴヌクレオチドプローブへのそれらのカップリングを促進するための反応基を含むように設計することができる。ペプチド架橋抗原は、天然および人工のどちらも、任意のサイズであり得、任意の適切なアミノ酸または他の残基を含有し得る。それらは線状または環状であり得る。ペプチド架橋抗原は、これらの実施形態では、目的の抗体にコンジュゲートするそれらの能力、および検出可能な抗体により認識可能であるそれらの能力によってのみ限定される。
【００３９】
一部の実施形態では、架橋抗原は、非天然残基を含むペプチドである。例えば、架橋抗原は、Ｄ−アミノ酸などの非天然立体異性体を含み得る。一部の実施形態では、非天然残基は、β−アミノ酸などの非天然アミノ酸であり得る。一部の実施形態では、架橋抗原の残基は、当業者により理解されているように、非ペプチド結合を使用してカップリングされ得る。
【００４０】
本ハイブリダイゼーション試薬に有用に含まれる他の適切な架橋抗原には、非ペプチドの小分子抗原が挙げられる。ペプチド架橋抗原に関して当てはまるように、そのような抗原は、オリゴヌクレオチドプローブにカップリングされるそれらの能力、および検出可能な抗体により認識可能であるそれらの能力によってのみ限定される。本明細書で「ハプテン」とも呼ばれる場合がある、例示的な非ペプチドの小分子抗原には、非限定的に、ニトロフェニル、ジニトロフェニル、トリニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ビオチン、５−ブロモデオキシウリジン、３−ニトロチロシン、小分子薬物、および任意の他の類似した化学的タグが挙げられる。
【００４１】
ハイブリダイゼーション試薬あたりの結合部位の数を増加させるために、ある場合には、単一の架橋抗原が、複数の抗原決定基またはエピトープを含むことが有利であり得る。架橋抗原における抗原決定基の多重度は、そのハイブリダイゼーション試薬と結合することができる二次抗体の数、および、それにしたがって、そのハイブリダイゼーション試薬を使用するアッセイの感度を増加させ得る。一部の実施形態では、複数の抗原決定基は、同じ抗原決定基の複数のコピーを含み得、一方、一部の実施形態では、複数の抗原決定基は、異なる抗原決定基を含み得る。一部の実施形態では、複数の抗原決定基は、線状反復構造を含み得る。より具体的には、線状反復構造は、線状反復ペプチド構造であり得る。一部の実施形態では、複数の抗原決定基は、少なくとも２個の抗原決定基、少なくとも３個の抗原決定基、少なくとも４個の抗原決定基、少なくとも６個の抗原決定基、またはさらにより多くの抗原決定基を含み得る。
【００４２】
一部の実施形態では、架橋抗原は、分岐型構造を含み得る。例えば、分岐型構造は、当業者により理解されているように、例えば、他の重合構築物などのデンドリマー構造などを含み得る。
【００４３】
さらに、複数の抗原決定基を含む架橋抗原は、抗原決定基間、例えば、ペプチド抗原決定基間に１つまたは複数のポリエチレングリコールリンカーなどを含み得ることが理解されるものとする。
【００４４】
一部の実施形態では、ペプチド抗原決定基は、抗原決定基あたり、少なくとも４個、少なくとも６個、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、またはさらにより多くのアミノ酸残基を含む。
【００４５】
オリゴヌクレオチドプローブおよび架橋抗原が別々の分子実体から調製される場合、オリゴヌクレオチドプローブと架橋抗原のカップリングは、所望の結果に依存して多種多様な方法で達成され得ることが理解されるものとする。架橋抗原のオリゴヌクレオチドプローブへのカップリングの位置および度合の制御が重要ではない場合には、非特異的化学クロスリンカーがカップリングを達成するのに使用され得る。しかしながら、架橋抗原が、オリゴヌクレオチドプローブに、制御された特異的な様式でカップリングされることは一般的に望ましく、カップリング方法およびカップリング剤の選択は、カップリングの位置、度合、および効率に影響し得る。例えば、反応性のチオールおよびアミノ基は、核酸中に天然には見出されないが、それらは、オリゴヌクレオチドの合成の間にオリゴヌクレオチドプローブ内の様々な位置に含まれて、チオールまたはアミノ反応性架橋抗原の結合のための特定の位置を提供することができる。
【００４６】
一部のハイブリダイゼーション試薬の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブと架橋抗原は、コンジュゲーション部分を介して化学的カップリング反応によりカップリングされる。具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブと架橋抗原は、高効率コンジュゲーション部分によりカップリングされる。ハイブリダイゼーション試薬は、好ましくは、相対的に低いモル濃度の出発材料で合成されるため、およびそれらの出発材料は、高価で相対的に少ない化学量で入手可能であり得るため、コンジュゲーション部分の形成は、できる限り効率的で特異的であること、およびそれの形成は、低いモル濃度の反応物で完了、またはほぼ完了することが非常に望ましい。具体的には、コンジュゲーション部分は、オリゴヌクレオチドプローブと架橋抗原を速い反応速度および／または高い会合定数でカップリングすることができること、および、したがって、会合反応が、それの完了に関してできる限り効率的であることが望ましい。
【００４７】
本ハイブリダイゼーション試薬の高効率コンジュゲーション部分は、典型的には、下記でより詳細に記載されているように、ハイブリダイゼーション試薬の各構成成分の相補的コンジュゲート試薬での別々の修飾により、形成される。相補的コンジュゲート試薬は、追加として、コンジュゲート試薬が、関連したハイブリダイゼーション試薬構成成分、例えば、オリゴヌクレオチドプローブへ、および架橋抗原へ結合するのを可能にする、さらなる反応性部分、例えば、チオール反応性部分またはアミノ反応性部分を含む。オリゴヌクレオチドプローブおよび架橋抗原が、それぞれの相補的コンジュゲート試薬により、修飾された後、修飾された構成成分上の相補的コンジュゲート形体（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ  ｆｅａｔｕｒｅ）は、非常に効率的で特異的な様式でお互いに会合して、コンジュゲーション部分を形成する。
【００４８】
状況に応じて、本ハイブリダイゼーション試薬の高効率コンジュゲーション部分は、共有結合性または非共有結合性コンジュゲーション部分であり得る。具体的な実施形態では、高効率コンジュゲーション部分は、共有結合性コンジュゲーション部分、例えば、ヒドラゾン、オキシム、または別の適切なシッフ塩基部分である。そのようなコンジュゲーション部分の非限定的例は、例えば、米国特許第７，１０２，０２４号に見出すことができ、その特許は、全ての目的のために、その全体が、本明細書に参照により組み入れられている。これらのコンジュゲーション部分は、ハイブリダイゼーション試薬の一方の構成成分（例えば、アミノ基で修飾された合成オリゴヌクレオチドプローブ）に結合したコンジュゲート試薬上の一級アミノ基の、免疫試薬の他方の構成成分（例えば、架橋抗原）に結合したコンジュゲート試薬上の相補的カルボニル基との反応により、形成され得る。
【００４９】
例えば、ヒドラゾンコンジュゲーション部分は、ヒドラジノ基、または保護されたヒドラジノ基の、カルボニル部分との反応により形成され得る。例示的なヒドラジノ基には、脂肪族、芳香族、もしくはヘテロ芳香族のヒドラジン基、セミカルバジド基、カルバジド基、ヒドラジド基、チオセミカルバジド基、チオカルバジド基、炭酸ジヒドラジン（ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｉｈｙｄｒａｚｉｎｅ）基、またはヒドラジンカルボキシレート基が挙げられる。米国特許第７，１０２，０２４号参照。オキシムコンジュゲーション部分は、オキシアミノ基、または保護されたオキシアミノ基の、カルボニル部分との反応により形成され得る。例示的なオキシアミノ基は下に記載されている。ヒドラジノ基およびオキシアミノ基は、ヒドラジノ基またはオキシアミノ基の塩の形成（非限定的に塩酸塩および硫酸塩などの鉱酸塩、ならびに非限定的に、酢酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、およびフマル酸塩などの有機酸の塩が挙げられるが、それらに限定されない）により、または当業者に公知の任意のアミノもしくはヒドラジノ保護基（例えば、Ｇｒｅｅｎｅら（１９９９年）Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第３版）（Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）参照）により保護され得る。シッフ塩基コンジュゲーション部分を生成するために使用されるカルボニル部分は、上記のヒドラジノ部分またはオキシアミノ部分の１つまたは複数とヒドラゾン結合またはオキシム結合を形成することができる任意のカルボニル含有基である。好ましいカルボニル部分には、アルデヒドおよびケトン、特に芳香族アルデヒドおよびケトンが挙げられる。本開示の好ましい実施形態では、高効率コンジュゲーション部分は、オキシアミノ含有構成成分と芳香族アルデヒド含有構成成分の、アニリン触媒の存在下での反応により形成される（Ｄｉｒｋｓｅｎら（２００６年）Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  ４５巻：７５８１〜７５８４頁（ＤＯＩ：１０．１００２／ａｎｉｅ．２００６０２８７７））。
【００５０】
あるいは、本免疫試薬の高効率コンジュゲーション部分は、「クリック」反応、例えば、トリアゾールコンジュゲーション部分を形成する、アジド置換構成成分のアルキン置換構成成分との銅触媒による反応により形成され得る。Ｋｏｌｂら（２００１年）Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ４０巻：２００４頁；Ｅｖａｎｓ（２００７年）Ａｕｓ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  ６０巻：３８４頁参照。この反応の銅を含まない変形型、例えば、歪促進アジド−アルキンクリック反応もまた、高効率コンジュゲーション部分を形成するために使用され得る。例えば、Ｂａｓｋｉｎら（２００７年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １０４巻：１６７９３〜９７頁参照。他のクリック反応の変形型には、テトラジン置換構成成分の、イソニトリル置換構成成分（Ｓｔｏｅｃｋｍａｎｎら（２０１１年）Ｏｒｇ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ９巻：７３０３頁）か、または歪んだアルケン置換構成成分（Ｋａｒｖｅｒら（２０１１年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２２巻：２２６３頁）のいずれかとの反応が挙げられる。
【００５１】
クリック反応の基本的特徴は、当業者によってよく理解されている。Ｋｏｌｂら（２００１年）Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ４０巻：２００４頁参照。有用なクリック反応には、一般的に、［３＋２］環化付加、例えば、ヒュスゲン１，３−双極子環化付加、および、特に、Ｃｕ（Ｉ）触媒による段階的変形型、チオール−エンクリック反応、ディールス−アルダー反応および逆電子要求ディールス−アルダー反応、イソニトリル（イソシアニド）とテトラジンの間の［４＋１］環化付加、特にエポキシおよびアジリジン化合物のような小さい歪んだ環への、求核置換、尿素のカルボニル化学反応様形成、ならびに炭素−炭素二重結合へのいくつかの付加反応が挙げられるが、それらに限定されない。上記の反応のいずれも、非限定的に、本ハイブリダイゼーション試薬において共有結合性の高効率コンジュゲーション部分を生成するために使用され得る。
【００５２】
一部の実施形態では、本ハイブリダイゼーション試薬のコンジュゲーション部分は切断可能なリンカーを含む。本高効率コンジュゲーション部分に有用に含まれる例示的な切断可能なリンカーは、当技術分野において公知である。例えば、Ｌｅｒｉｃｈｅら（２０１２年）Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２０巻：５７１〜５８２頁（ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｍｃ．２０１１．０７．０４８）参照。高効率コンジュゲーション部分に切断可能なリンカーを含ませることにより、本ハイブリダイゼーション試薬において、架橋抗原のオリゴヌクレオチドプローブからの選択的切断が可能になる。そのような選択的切断は、いくつかのハイブリダイゼーションアッセイ方法において、例えば、架橋抗原およびそれの会合した二次抗体の試料表面からの放出が望ましい場合、有利であり得る。
【００５３】
他の実施形態では、高効率コンジュゲーション部分は、非共有結合性コンジュゲーション部分である。非共有結合性コンジュゲーション部分の非限定的例には、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションペアまたはタンパク質−リガンド結合ペアが挙げられる。具体的な実施形態では、タンパク質−リガンド結合ペアは、アビジン−ビオチンペア、ストレプトアビジン−ビオチンペア、または別のタンパク質−ビオチン結合ペア（一般的には、Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９０年）１８４巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（２００８年）ＭｃＭａｈｏｎ編、Ｈｕｍａｎａ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）Ｈａｎｄｂｏｏｋ、４章（２０１０年）参照）、抗体−ハプテン結合ペア（一般的には、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）Ｈａｎｄｂｏｏｋ、４章（２０１０年）参照）、Ｓ−ペプチドタグ−Ｓ−タンパク質結合ペア（ＫｉｍおよびＲａｉｎｅｓ（１９９３年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．  ２巻：３４８〜５６頁）、または任意の他の高親和性ペプチド−ペプチドもしくはペプチド−タンパク質結合ペアである。そのような高親和性非共有結合性コンジュゲーション部分は、当技術分野において周知である。それぞれのコンジュゲートペアの反応性バージョン、例えば、チオール反応性バージョンまたはアミノ反応性バージョンもまた、当技術分野において周知である。これらのコンジュゲート試薬は、それぞれのオリゴヌクレオチドプローブおよび架橋抗原を修飾するために使用され得る。修飾されたオリゴヌクレオチドプローブおよび架橋抗原は、その後、相補的形体、例えば、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションペアまたはタンパク質−リガンド結合ペアが、お互いに会合し、非共有結合性高効率コンジュゲーション部分を形成することを可能にするために、混合され得る。上記の共有結合性および非共有結合性連結基は高効率の会合反応を行うことができ、したがって、本ハイブリダイゼーション試薬の作製に使用するのによく適している。
【００５４】
一部の実施形態では、高効率コンジュゲーション部分は、オリゴヌクレオチドプローブと架橋抗原をカップリングすることにおいて、少なくとも５０％、８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはさらにより効率的である。より具体的な実施形態では、高効率コンジュゲーション部分は、０．５ｍｇ／ｍＬ以下の反応物濃度において、少なくとも５０％、８０％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはさらにより効率的である。一部の実施形態では、効率は、０．５ｍｇ／ｍＬ以下、０．２ｍｇ／ｍＬ以下、０．１ｍｇ／ｍＬ以下、０．０５ｍｇ／ｍＬ以下、０．０２ｍｇ／ｍＬ以下、０．０１ｍｇ／ｍＬ以下、またはそれよりも低い反応物濃度で達成される。
【００５５】
別の態様では、本開示は、複数の上記のハイブリダイゼーション試薬を含む、ハイブリダイゼーション試薬パネルとも呼ばれる、ハイブリダイゼーション試薬組成物を提供する。実施形態では、組成物は、少なくとも３個、５個、１０個、２０個、３０個、５０個、１００個、またはさらにそれ超のハイブリダイゼーション試薬を含む。一部の実施形態では、含まれるハイブリダイゼーション試薬のオリゴヌクレオチドプローブは、特定の細胞マーカーをコードする遺伝子、またはそれらの遺伝子によって発現されるＲＮＡの少なくとも断片（segment)に相補的であり、そうすることで、マーカーについての遺伝子またはマーカーについての遺伝子の発現のいずれかにハイブリダイズし、これを検出することができる。具体的な実施形態では、細胞マーカーは、少なくともＥＲおよびＰＲである。他の具体的な実施形態では、細胞マーカーは、少なくともＨＥＲ２、ＥＲ、およびＰＲ、または少なくともＨＥＲ２、ＥＲ、およびＫｉ６７である。なお他の具体的な実施形態では、細胞マーカーは、少なくともＨＥＲ２、ＥＲ、ＰＲ、およびＫｉ６７である。まだなお他の具体的な実施形態では、細胞マーカーは、少なくともＫｉ６７、ＥＧＦＲ、およびＣＫ５である。さらに他の具体的な実施形態では、細胞マーカーは、少なくともＫｉ６７、ＥＧＦＲ、ＣＫ５、およびＣＫ６であり、または少なくともＣＫ５、ＣＫ６、およびＫｉ−６７である。なお他の具体的な実施形態では、細胞マーカーは、少なくともＣＫ５、ＥＧＦＲ、ｐ４０、およびＫｉ−６７であり、または少なくともＩｇＡ、補体３ｃ（Ｃ３ｃ）、コラーゲンＩＶ型アルファ鎖５（ＣＯＬ４Ａ５）、およびＩｇＧである。一部の実施形態では、含まれる免疫試薬の架橋抗原はペプチドである。
【００５６】
一部の実施形態では、本開示の免疫試薬組成物は、免疫細胞上の細胞マーカー、例えば、任意の組合せでの、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８、および／またはＦｏｘＰ３、ならびに上記で列挙された細胞マーカーのいずれかに特異的である。一部の実施形態では、免疫試薬組成物は、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１などのようなチェックポイント経路に関連するマーカーに特異的である。
【００５７】
架橋抗原にカップリングした一次抗体を含む抗原をカップリングさせた免疫試薬は、両方とも２０１６年２月６日に出願された米国特許出願第１５／０１７，６２６号およびＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／１６９１３号において以前に開示されており、これらの開示は、その全体が、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される。当業者に理解されるように、架橋抗原連結免疫試薬を作製および使用するためのそれらの開示において例示される方法は、本ハイブリダイゼーション試薬の合成および使用に容易に適合させることができる。
検出可能な抗体
【００５８】
上記で言及されているように、本ハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原は、検出可能な抗体により認識可能である。本ハイブリダイゼーション試薬を使用するハイブリダイゼーションアッセイにおいて感度を増加させ、バックグラウンドを減少させるために、それぞれの検出可能な抗体の、それの対応する架橋抗原に対する親和性および／または特異性を最大限にすることが一般的に望ましい。当業者により理解されているように、抗体の抗原に対する親和性は、典型的には、平衡パラメータ、解離定数または「ＫＤ」を使用して評価される。所定の濃度の抗体について、解離定数は、大まかに、抗体の半分が抗原に結合しており、抗体の半分が抗原に結合していない場合の抗原の濃度に対応する。したがって、より低い解離定数は、抗体の抗原に対するより高い親和性に対応する。
【００５９】
解離定数はまた、抗体と抗原の解離および会合についての動力学速度定数の比に関係する。したがって、解離定数は、平衡結合測定によるか、または反応速度測定によるかのいずれかで、推定され得る。そのようなアプローチは当技術分野において周知である。例えば、抗体−抗原結合パラメータは、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴に基づいた装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）、Ｏｃｔｅｔバイオレイヤー干渉法システム（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｃｏｒｐ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）などを使用して得られるセンサーグラムの動態分析から日常的に決定される。例えば、一連の抗体クローンおよびそれらの対応するペプチド抗原結合パートナーについての解離定数の決定の記載に関する米国特許出願公開第２０１３／０３３１２９７号参照。
【００６０】
典型的な抗体は、マイクロモル濃度から高いナノモル濃度まで（すなわち、１０−６Ｍ〜１０−８Ｍ）の範囲の平衡解離定数を有する。高親和性抗体は、一般的に、より低いナノモル濃度から高いピコモル濃度（すなわち、１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ）の範囲の平衡解離定数を有する。超高親和性抗体は、一般的に、ピコモル濃度範囲（すなわち、１０−１０Ｍ〜１０−１２Ｍ）の平衡解離定数を有する。ペプチドまたは他の大分子に対する抗体は、典型的には、小分子ハプテンに対する抗体（マイクロモル濃度範囲またはさらにより高い解離定数を示し得る）より、それらの抗原に対するより高い親和性（より低いＫＤ）を有する。
【００６１】
本ハイブリダイゼーション試薬組成物の二次抗体は、抗原をカップリングさせたオリゴヌクレオチドプローブに対するそれらの親和性を増加させるために最適化され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１３／０３３１２９７号は、本ハイブリダイゼーション試薬組成物に利用される検出可能な抗体を生じるために適切に修飾され得る、高親和性の抗体クローンを同定するための方法を開示する。これらの方法において、合成ペプチドをコードする短いＤＮＡフラグメントが、目的の抗体ライブラリーをコードする遺伝子プールの重鎖に融合され、酵母細胞が、酵母ディスプレイ抗体ライブラリーを作製するように形質転換される。酵母細胞は、高特異性を有する高親和性抗体クローンを単離するために、高速蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）でスクリーニングされる。Ａｇａ２などの他の酵母ディスプレイシステムと比較して、このシステムは、形質転換された酵母細胞が、十分な量の抗体を培養培地へ分泌して、所望の特異性および親和性を有する候補クローンの同定のためのクローニングおよび抗体精製の追加のステップを必要とすることなしに、個々の酵母クローンの培養培地を直接アッセイして、発現した抗体の特異性および親和性を決定することができるという追加の利点を有する。
【００６２】
上記の酵母ディスプレイライブラリーシステムは、高特異性および親和性を有するウサギモノクローナル抗体を産生するために免疫されたウサギから作製される抗体ライブラリーを使用し、したがって、優れた親和性および特異性を有する抗体クローンを単離するための酵母ディスプレイの効率と共に、小さいハプテンまたはペプチドに対する抗体を生じるためのウサギ免疫系の優れた能力を利用している。このアプローチを使用して、＜０．０１〜０．８ｎＭの範囲の抗体親和性を有する、小分子、ペプチド、およびタンパク質に対するウサギモノクローナル抗体のパネルが作製された。これらの親和性は、従来のハイブリドーマ技術を使用して生じるげっ歯類由来のほとんどのモノクローナル抗体の親和性を凌ぐ。そのアプローチはまた、ウサギハイブリドーマ技術で遭遇する低い融合効率および乏しい安定性の固有の問題を克服する。
【００６３】
上記の酵母ディスプレイライブラリーシステムは、本ハイブリダイゼーション試薬組成物に使用される二次抗体の結合親和性を最適化するための１つのアプローチであるが、任意の適切なアプローチが、非限定的に、親和性を最適化するために使用され得ることが理解されるものとする。場合によっては、適切な高親和性抗体が最適化なしに利用可能であり得る。
【００６４】
したがって、一部の実施形態では、検出可能な抗体は、架橋抗原に対して特異的であり、最大で１００ｎＭ、最大で３０ｎＭ、最大で１０ｎＭ、最大で３ｎＭ、最大で１ｎＭ、最大で０．３ｎＭ、最大で０．１ｎＭ、最大で０．０３ｎＭ、最大で０．０１ｎＭ、最大で０．００３ｎＭ、またはそれよりも低い解離定数を有する。より具体的な実施形態では、検出可能な抗体は、架橋抗原に対して特異的であり、最大で１ｎＭ、最大で０．３ｎＭ、最大で０．１ｎＭ、最大で０．０３ｎＭ、最大で０．０１ｎＭ、最大で０．００３ｎＭ、またはそれよりも低い解離定数を有する。さらにより具体的な実施形態では、検出可能な抗体は、架橋抗原に対して特異的であり、最大で１００ｐＭ、最大で３０ｐＭ、最大で１０ｐＭ、最大で３ｐＭ、またはそれよりも低い解離定数を有する。
【００６５】
本ハイブリダイゼーション試薬組成物の抗体は、好ましくは、検出可能な抗体であり、したがって、実施形態では、それは、検出可能な標識を含む。当業者により理解されているように、検出可能な抗体の検出可能な標識は、抗体への適切な結合が可能であるべきであり、その結合は、その抗体の架橋抗原との相互作用を有意に損なうことなく、実行されるべきである。
【００６６】
一部の実施形態では、検出可能な標識は、それが、いかなる追加の構成成分も必要とすることなく検出され得るように、直接検出可能であり得る。例えば、直接検出可能な標識は、蛍光色素、生物蛍光タンパク質、例えば、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（「ＰｅｒＣＰ」）、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）、もしくはそれらの誘導体（例えば、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、または青色蛍光タンパク質）、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、遺伝子改変型ルシフェラーゼ、またはコメツキムシルシフェラーゼ）、もしくはサンゴ由来シアンおよび赤色蛍光タンパク質（加えて、サンゴ由来の赤色蛍光タンパク質のバリアント、例えば、黄色、オレンジ色、および遠赤のバリアント）、化学発光種、電気化学発光種、もしくは生物発光種を含む発光種、リン光種、放射性物質、ナノ粒子、ＳＥＲＳナノ粒子、量子ドットもしくは他の蛍光結晶ナノ粒子、回折粒子、ラマン粒子、キレート金属を含む金属粒子、磁気粒子、ミクロスフェア、ＲＦＩＤタグ、マイクロバーコード粒子、またはこれらの標識の組合せであり得る。
【００６７】
他の実施形態では、検出可能な標識は、それが、検出のために１つまたは複数の追加の構成成分の使用を必要とし得るように、間接的に検出可能であり得る。例えば、間接的に検出可能な標識は、適切な基質において色の変化をもたらす酵素、および標識を有する別の物質によって特異的に認識され得、または標識を有する物質と反応し得る他の分子であり得る。適切な間接的に検出可能な標識の非限定的例には、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの酵素が挙げられる。具体的な実施形態では、ペルオキシダーゼは、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはダイズペルオキシダーゼである。間接的に検出可能な標識の他の例には、ハプテン、例えば、小分子またはペプチドなどのハプテンが挙げられる。非限定的例示的ハプテンには、ニトロフェニル、ジニトロフェニル、ジゴキシゲニン、ビオチン、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｓタグ、Ｓｔｒｅｐｔａｇ、Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、ＲｅＡｓｈタグ、ＦｌＡｓｈタグ、ビオチン化タグ、Ｓｆｐタグ、または別の化学的タグもしくはペプチドタグが挙げられる。
【００６８】
具体的な実施形態では、検出可能な標識は蛍光色素である。適切な蛍光色素の非限定的例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）およびＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）のカタログに見出され得る。例示的な色素には、フルオレセイン、ローダミン、および他のキサンテン色素誘導体、シアニン色素およびそれらの誘導体、ナフタレン色素およびそれらの誘導体、クマリン色素およびそれらの誘導体、オキサジアゾール色素およびそれらの誘導体、アントラセン色素およびそれらの誘導体、ピレン色素およびそれらの誘導体、ならびにＢＯＤＩＰＹ色素およびそれらの誘導体が挙げられる。好ましい蛍光色素には、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから入手できるＤｙＬｉｇｈｔフルオロフォアファミリーが挙げられる。
【００６９】
一部の実施形態では、検出可能な標識は、二次抗体へ直接結合しなくてもよいが、通常結合し得るよりも多数の検出可能な標識が二次抗体に結合することを可能にする、ポリマーまたは他の適切なキャリア中間体に結合し得る。
【００７０】
具体的な実施形態では、検出可能な標識はオリゴヌクレオチドバーコードタグ、例えば、ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ２０１２／０７１４２８Ａ２号（その開示はその全体が参照により本明細書に組み入れられている）に開示されたバーコードタグである。そのような検出可能な標識は、標的とされた試料の単離および／または選別を含むハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、フローサイトメトリに基づいた多重化アッセイなどにおいて、特に有利である。これらの標識はまた、試料中の標的核酸のレベルが低く、検出の可能な限りの感度が必要とされる場合のハイブリダイゼーションアッセイにおいても有用である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本開示の検出可能な抗体は、複数の検出可能な標識を含み得る。これらの実施形態では、所定の二次抗体と会合した複数の検出可能な標識は、同じ標識の複数のコピーであってもよいし、または適切な検出可能なシグナルを生じる異なる標識の組合せでもよい。
【００７２】
一部のハイブリダイゼーション試薬組成物の実施形態では、１つまたは複数の検出可能な標識を架橋抗原自体に結合させることは、組成物からのシグナル出力を増加させるために有利であり得る。架橋抗原へ有用に結合する検出可能な標識は、上記の検出可能な標識のいずれでもあり得る。そのような検出可能な標識は、オリゴヌクレオチドプローブ−架橋抗原と二次抗体のペアからのシグナルが相加的であるように、理想的には、二次抗体の検出可能な標識と検出能において重なるべきである。さらに、検出可能な標識の架橋抗原への結合は、理想的には、架橋抗原への二次抗体の結合に有意には影響するべきではない。同様に、架橋抗原への二次抗体の結合は、理想的には、検出可能な標識の検出能に有意には影響するべきではない。
【００７３】
好ましい実施形態では、架橋抗原の検出可能な標識は、フルオロフォアである。より好ましい実施形態では、架橋抗原の検出可能な標識および二次抗体の検出可能な標識は、どちらもフルオロフォアである。他の好ましい実施形態では、架橋抗原の検出可能な標識および二次抗体の検出可能な標識は、同じ波長の蛍光によってどちらも検出可能である。まだ他の好ましい実施形態では、架橋抗原の検出可能な標識および二次抗体の検出可能な標識は、同じである。
ハイブリダイゼーション試薬組成物ペア
【００７４】
上記の通り、本開示は、いくつかの場合において、架橋抗原とカップリングしたオリゴヌクレオチドプローブ、および架橋抗原に特異的な検出可能な抗体を含むハイブリダイゼーション試薬組成物を提供する。これらの組成物において、検出可能な抗体および抗原コンジュゲート化オリゴヌクレオチドプローブは、架橋抗原に対する二次抗体の高親和性によりペアになる。ペアになった組成物は、組成物の別々の構成成分が水溶液中で一緒に混合された時はいつでも、例えば、その試薬がハイブリダイゼーションアッセイに一緒に使用された時はいつでも、形成されると理解される。
【００７５】
オリゴヌクレオチドプローブおよびカップリングした架橋抗原を含むハイブリダイゼーション試薬は、本ハイブリダイゼーション試薬ペアに使用されるのに適した検出可能な抗体と同様、上記で詳細に記載される。当業者により理解されているように、これらの構成成分を含む組成物は、ハイブリダイゼーションッセイの実施に有用性が見出され、そのハイブリダイゼーションアッセイには、ＣＩＳＨ、ＦＩＳＨなど単独、またはこれらを以下のような他の診断アッセイと組み合わせたもの、ＩＨＣ、サイトメトリ、フローサイトメトリ、例えば、蛍光活性化細胞選別、顕微鏡画像化、プレターゲティングイメージング、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍および組織画像化の他の型、ハイコンテンツスクリーニング（ＨＣＳ）、免疫細胞化学法（ＩＣＣ）、免疫磁気細胞除去（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）、免疫磁気細胞捕捉、サンドイッチアッセイ、一般的なアフィニティアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩＳｐｏｔ、マスサイトメトリ（ＣｙＴＯＦ）、マイクロスフェアアレイ、多重化マイクロスフェアアレイ、マイクロアレイ、抗体アレイ、細胞アレイを含むアレイ、液相捕捉、側方フローアッセイ、化学発光検出、赤外線検出、ウェスタンブロット、サウスウェスタンブロット、ドットブロット、組織ブロットなどを含むブロッティング方法、またはそれらの組合せが挙げられる。
多重化ハイブリダイゼーション試薬ペア
【００７６】
別の態様にしたがうと、本開示は、複数の架橋抗原にカップリングした複数のオリゴヌクレオチドプローブ、および複数の検出可能な抗体を含むハイブリダイゼーション試薬組成物を提供する。これらの組成物における各架橋抗原は、異なるオリゴヌクレオチドプローブにカップリングされており、少なくとも１個の検出可能な抗体は各架橋抗原と高親和性で結合する。これらの組成物における複数の抗原をカップリングさせたオリゴヌクレオチドプローブおよび検出可能な抗体は、前のセクションに記載されたハイブリダイゼーション試薬組成物ペアのいずれかであり得る。
【００７７】
具体的な実施形態では、組成物は、少なくとも３個のハイブリダイゼーション試薬組成物ペアを含む。より具体的な実施形態では、組成物は、少なくとも５個のハイブリダイゼーション試薬組成物ペアを含む。なおより具体的な実施形態では、組成物は、少なくとも１０個のハイブリダイゼーション試薬組成物ペアを含む。さらにより具体的な実施形態では、組成物は、少なくとも２０個、３０個、５０個、１００個、またはさらにより多いハイブリダイゼーション試薬組成物ペアを含む。
ハイブリダイゼーション試薬パネル
【００７８】
上記のハイブリダイゼーション試薬は、目的のある特定の組織、特に、腫瘍組織などの目的の罹患組織において、特定の遺伝子座または染色体パターンを同定することに、または遺伝子マーカーの特定の組合せの発現をモニターすることに使用される診断パネルを作製するためにあらかじめ定義された群に組み合わせることができる。そのようなパネルは、そのような罹患組織を同定するための診断アッセイに有用であり、さらに、コンパニオン診断として有用であり、その場合、パネルは、特定の処置レジメンの経過中に時間と共に罹患組織において核酸マーカーをモニターするために使用される。そのようなコンパニオン診断は、処置レジメンの有効性の適時で信頼できる評価を提供し、さらに、処置投与量および頻度を特定の患者について最適化することを可能にし得る。当該技術分野において公知のように、現在のインサイチュハイブリダイゼーション技術を使用する標的組織のモニタリングは、組織切片あたりのオリゴヌクレオチドプローブの数に制限され得るし、または異なるオリゴヌクレオチドプローブでの別々の、もしくは逐次的な組織切片の染色を必要とし得る。対照的に、本明細書に開示されたハイブリダイゼーション試薬パネルは、目的の組織または他の試料の染色が、単一組織切片または他の試料において多数のオリゴヌクレオチドプローブで同時に実施することができるような、高レベルの多重化を可能にする。
【００７９】
したがって、この態様によれば、本発明は、本開示の少なくとも３個のハイブリダイゼーション試薬を含むハイブリダイゼーション試薬を提供する。具体的な実施形態では、ハイブリダイゼーション試薬は、上記で詳細に記載されているように、本開示の少なくとも５個、少なくとも少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、またはさらにより多いハイブリダイゼーション試薬を含む。
【００８０】
特に関心が高いのは、例えば自己免疫疾患およびがんの処置において、免疫療法のレジメンを使用して処置される患者において組織試料をプロファイリングするための本ハイブリダイゼーション試薬パネルの使用である。例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２）を標的とする抗体（例えば、イピリムマブ）またはプログラム死受容体もしくはそれらのリガンド（ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１）を標的とする抗体（例えば、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブなど）を使用する、チェックポイント経路の遮断における最近の進歩は、特に効果的であることが示されている。例えば、Ａｄａｍｓら（２０１５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  １４巻：６０３〜２２頁；Ｍａｈｏｎｅｙら（２０１５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  １４巻：５６１〜８４頁；Ｓｈｉｎら（２０１５年）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３３巻：２３〜３５頁参照。
【００８１】
他の最近承認された抗がん剤は、腫瘍および他の疾患において上方制御または増幅される他の細胞表面タンパク質または遺伝子産物を標的とする（例えば、リンパ腫細胞におけるＣＤ２０に対するリツキシマブ、乳がん細胞におけるＨＥＲ２／ｎｅｕに対するトラスツズマブ、様々な腫瘍細胞におけるＥＧＦＲに対するセツキシマブ、様々ながん細胞および目におけるＶＥＧＦに対するベバシズマブ、ならびに骨における破骨細胞に対するデノスマブ参照）。したがって、これらの薬剤で処置される患者由来の組織試料のプロファイリングもまた、臨床医学において大きな現在の関心事となっている。
【００８２】
同様に、抗がん剤での処置前か、または処置中のいずれかで患者から得られた組織試料もまた、分子プロファイリングから恩恵を受け得る。例えば、イマチニブ、レナリドミド、ペメトレキセド、ボルテゾミブ、リュープロレリン、アビラテロン酢酸エステル、イブルチニブ、カペシタビン、エルロチニブ、エベロリムス、シロリムス、ニロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブなどで処置される患者は、有利には、本免疫試薬パネルを使用する、組織、特に罹患組織のプロファイリングによりモニターすることができる。
【００８３】
免疫モジュレーターの分析を含む組織の分子プロファイリングのための方法およびシステム、ならびに疾患処置を評価およびモニターするためのそれらのプロファイルの使用もまた報告されている。例えば、米国特許第８，７００，３３５Ｂ２号；同第８，７６８，６２９Ｂ２号；同第８，８３１，８９０Ｂ２号；同第８，８８０，３５０Ｂ２号；同第８，９１４，２３９Ｂ２号；同第９，０５３，２２４Ｂ２号；同第９，０５８，４１８Ｂ２号；同第９，０６４，０４５Ｂ２号；同第９，０９２，３９２Ｂ２号；ＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ２０１５／１１６８６８号参照。そのようなアプローチは、有利には、本ハイブリダイゼーション試薬の適切なパネルを使用して実施される。
【００８４】
例示的なパネルは、以下のマーカーを含む腫瘍細胞、免疫細胞および種々の疾患関連遺伝子マーカーの組み合わせの発現を同定する：４−１ＢＢ、ＡＦＰ、ＡＬＫ１、アミロイドＡ、アミロイドＰ、アンドロゲン受容体、アネキシンＡ１、ＡＳＭＡ、ＢＣＡ２２５、ＢＣＬ−１、ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−６、ＢｅｒＥＰ４、ベータ−カテニン、ベータ−ＨＣＧ、ＢＧ−８、ＢＯＢ−１、ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５、カルシトニン、カルデスモン、カルポニン−１、カルレチニン、ＣＡＭ５．２、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４３、ＣＤ４５  ＬＣＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ６１、ＣＤ６８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６３、ＣＤＸ２、ＣＥＡ、クロモグラニンＡ、ＣＭＶ、ｃ−ｋｉｔ、ｃ−ＭＥＴ、ｃ−ＭＹＣ、ＩＶ型コラーゲン、補体３ｃ（Ｃ３ｃ）、ＣＯＸ−２、ＣＸＣＲ５、ＣＫ１、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１４、ＣＫ１８、ＣＫ１７、ＣＫ１９、ＣＫ２０、ＣＫ９０３、ＣＫ  ＡＥ１、ＣＫ
ＡＥ１／ＡＥ３、Ｄ２−４０、デスミン、ＤＯＧ−１、Ｅ−カドヘリン、ＥＧＦＲ、ＥＭＡ、ＥＲ、ＥＲＣＣ１、第ＶＩＩＩ因子関連抗原、活性化第ＸＩＩＩ因子、ファスシン、ＦｏｘＰ１、ＦｏｘＰ３、ガレクチン−３、ＧＡＴＡ−３、ＧＣＤＦＰ−１５、ＧＣＥＴ１、ＧＦＡＰ、グリコホリンＡ、グリピカン３、グランザイムＢ、ＨＢＭＥ−１、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｙｌｏｒｉ、ヘモグロビンＡ、Ｈｅｐ  Ｐａｒ１、ＨＥＲ−２、ＨＨＶ−８、ＨＭＢ−４５、ＨＳＶ  ｌ／ｌｌ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮガンマ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩＬ１７、ＩＬ４、インヒビン、ｉＮＯＳ、カッパＩｇ軽鎖、Ｋｉ−６７、ＬＡＧ−３、ラムダＩｇ軽鎖、リゾチーム、マンマグロビンＡ、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、マスト細胞トリプターゼ、ＭＬＨ１、ＭＯＣ−３１、ＭＰＯ、ＭＳＡ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＭ１、ＭｙｏＤ１、ミオゲニン、ミオグロビン、ナプシンＡ、ネスチン、ＮＳＥ、Ｏｃｔ−２、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ４０、ｐ５３、ｐ６３、ｐ５０４ｓ、ＰＡＸ−５、ＰＡＸ−８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＨＨ３、ＰＩＮ−４、ＰＬＡＰ、ＰＭＳ２、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ
ｊｉｒｏｖｅｃｉ（ｃａｒｉｎｉｉ）、ＰｇＲ、ＰＳＡ、ＰＳＡＰ、ＲＣＣ、Ｓ−１００、ＳＭＡ、ＳＭＭ、スムーセリン、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ１１、サーファクタントアポプロテインＡ、シナプトフィジン、ＴＡＧ７２、ＴｄＴ、トロンボモジュリン、チログロブリン、ＴＩＡ−１、ＴＩＭ３、ＴＲＡｃＰ、ＴＴＦ−１、チロシナーゼ、ウロプラキン、ＶＥＧＦＲ−２、ビリン、ビメンチン、およびＷＴ−１など。
【００８５】
好ましくは、パネルは、以下のマーカーの１個または複数の発現を同定する：ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ６８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＦｏｘＰ３、ＳＯＸ１０、グランザイムＢ、ＣＤ３、ＣＤ１６３、ＩＬ１７、ＩＬ４、ＩＦＮガンマ、ＣＸＣＲ５、ＦｏｘＰ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ３、ＣＤ３４、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、および４−１ＢＢ。
【００８６】
パネルは、下で詳細に記載されたインサイチュハイブリダイゼーションのための方法での使用のための、キットの形態か、または別々に提供される一群の異なるハイブリダイゼーション試薬としてかのいずれかで、提供される。特に、パネルは、試料を同時検出のために複数のハイブリダイゼーション試薬と反応させる多重化方法において、使用される。ハイブリダイゼーション試薬は、上記のハイブリダイゼーション試薬のいずれかであり、特に、上記で定義された遺伝子マーカーのいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドプローブおよび架橋抗原を含むハイブリダイゼーション試薬であって、オリゴヌクレオチドプローブおよび架橋抗原がカップリングされており、架橋抗原が検出可能な抗体により高親和性で認識されるハイブリダイゼーション試薬である。
【００８７】
具体的な実施形態では、パネルは、遺伝子マーカーの以下の例示的な組合せの発現を同定する：
ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６８、およびＰＤ−Ｌ１；
ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３、およびＣＤ６８（任意の固形腫瘍について）；
ＣＤ８、ＣＤ６８、ＰＤ−Ｌ１、加えて、腫瘍関連マーカー（頭頚部腫瘍および膵腫瘍について）；
ＳＯＸ１０、ＣＤ８、ＰＤ−１、およびＰＤ−Ｌ１（メラノーマについて）；
ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、およびサイトケラチン（乳がんＴＩＬについて）；
ＣＤ８、ＣＤ３４、ＦｏｘＰ３、およびＰＤ−Ｌ１（メラノーマ免疫学について）；
ＣＤ８、ＣＤ３４、ＰＤ−Ｌ１、およびＦｏｘＰ１（がん免疫学について）；
ＣＤ３、ＰＤ１、ＬＡＧ−３、およびＴＩＭ３（Ｔ細胞疲弊について）；
ＣＤ４およびＦｏｘＰ３（Ｔｒｅｇについて）；
ＣＤ４およびＩＬ１７（Ｔｈ１７について）；
ＣＤ８およびグランザイムＢ（活性化ＣＤ８について）；
ＣＤ４およびＣＸＣＲ５（ＴＦｈについて）；
ＣＤ４およびＩＬ４（Ｔｈ２について）；
ＣＤ４およびＩＦＮｇ（Ｔｈ１について）；
ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、およびＣＤ２０（一般的なリンパ球について）；
ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６８、およびＣＤ２０（リンパ球およびマクロファージについて）；
ＣＤ４、ＦｏｘＰ３、ＣＤ８、およびＣＤ２０（Ｔｒｅｇおよびリンパ球について）；
ＣＤ４、ＦｏｘＰ３、ＣＤ８、およびグランザイムＢ（ＴｒｅｇおよびＡｃｔ  ＣＴＬについて）；
ＣＤ６８（マクロファージについて）；
ＣＤ６８およびＣＤ１６３（Ｍ２マクロファージについて）；
ＣＤ２０（Ｂ細胞について）；ならびに
ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳ、および４１ＢＢ（目的の他の分子について）。
インサイチュハイブリダイゼーションの方法
【００８８】
別の態様では、本開示は、ハイブリダイゼーション試薬を標的核酸と反応させるステップ、検出可能な抗体をハイブリダイゼーション試薬と反応させるステップであって、検出可能な抗体がハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原と高親和性で結合する、ステップ、および結合した検出可能な抗体を検出するステップを含む、インサイチュハイブリダイゼーションの方法を提供する。これらの方法におけるハイブリダイゼーション試薬および検出可能な抗体は、有用には、任意の適切な組合せでの、上記のハイブリダイゼーション試薬および検出可能な抗体のいずれかであり得る。
【００８９】
実施形態では、検出の方法は、インサイチュハイブリダイゼーション方法である。上で記載されているように、インサイチュハイブリダイゼーションは、腫瘍細胞などの異常細胞の診断に頻繁に適用される、広く使用されている技術である。具体的な遺伝子マーカーの発現は、特定の腫瘍細胞、例えば、乳がん細胞の特性を示す。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイもまた、染色体マーカー、および生物学的組織の異なる部分における差次的に発現した核酸マーカーの分布および局在化を理解するために頻繁に使用される。
【００９０】
具体的な実施形態では、標的核酸は、組織切片内に存在する。組織切片内の核酸の検出は、臨床病理学分野の当業者によってよく理解されている。このようなアプローチは、単一分子/単一細胞レベルで無傷な細胞および組織中のｍＲＮＡの全コピー数を同定するために今まで使用されてきた。例えば、Ｒａｊら、（２００８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５：８７７；Ｌａｒｓｏｎら、（２００９）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９：６３０；ｗｗｗ．ｓｉｎｇｌｅｍｏｌｅｃｕｌｅｆｉｓｈ．ｃｏｍを参照のこと。典型的には固定化プロセス後の、固形組織試料が、試料の表面上の目的の１個または複数の標的核酸を露出させるために、薄片に切り分け得ることが理解されるものとする。連続組織切片、すなわち、最初の組織試料においてお互いに隣接、またはほとんど隣接していた切片の分析は、下でより詳細に記載されているように、最初の組織試料の３次元モデルの再構築、または標的核酸の多重化に関する能力の増加を可能にする。好ましい実施形態では、第１の標的核酸は、腫瘍試料の組織切片内の標的核酸である。
【００９１】
他の具体的な実施形態では、方法により検出される核酸は、細胞内または細胞上にある。そのような検出は、例えば、サイトメトリの分野の当業者によって、よく理解されている。一部の実施形態では、核酸は細胞の表面上に存在し得る。他の実施形態では、核酸は、細胞の細胞質内に存在し得る。まだ他の実施形態では、核酸は細胞の核内に存在し得る。一部の実施形態では、核酸は、細胞内の１つより多い位置に存在し得る。
【００９２】
上記方法に従って分析される組織は、任意の適切な組織試料であり得る。例えば、一部の実施形態では、組織は、結合組織、筋肉組織、神経組織、または上皮組織であり得る。同様に、分析される組織は、目的の任意の器官から入手され得る。適切な組織の非限定的例には、乳房、結腸、卵巣、皮膚、膵臓、前立腺、肝臓、腎臓、心臓、リンパ系、胃、脳、肺、および血液が挙げられる。
【００９３】
一部の実施形態では、検出するステップは、蛍光検出ステップである。適切な蛍光検出標識は上で詳細に記載されている。
【００９４】
一部の実施形態では、検出の方法は、検出可能な抗体に結合している細胞を選別するステップをさらに含む。細胞選別は、フローサイトメトリの分野内のよく理解された技術である。例示的なフローサイトメトリ検出方法は、例えば、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、第４版、Ｓｈａｐｉｒｏ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、２００３年；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、１９９３年；およびＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ、第４版、Ｃａｒｅｙら編、ＡＳＣＰ
Ｐｒｅｓｓ、２００７年に提供されている。定量的多重化免疫学的アッセイ、特に、定量的フローサイトメトリアッセイにおけるヒドラゾン連結抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１３／１８８７５６号およびＦｌｏｒら（２０１３年）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．  １５巻：２６７〜７５頁に記載されている。
【００９５】
一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイの方法は、多重化アッセイにおいて追加のハイブリダイゼーション試薬を追加の標的核酸と反応させるステップであって、追加のハイブリダイゼーション試薬が追加の標的核酸に相補的な上記で定義されたハイブリダイゼーション試薬のいずれかである、ステップ、追加のハイブリダイゼーション試薬を追加の検出可能な抗体と反応させるステップであって、追加の検出可能な抗体が追加のハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原と高親和性で結合する、ステップ、および結合した検出可能な追加の抗体を検出するステップを含む。多重化方法における追加のハイブリダイゼーション試薬および抗体の反応の順番は、当業者によって理解されているように、所望の結果を達成するために、任意の適切な方法において変わり得る。一部の実施形態では、異なるハイブリダイゼーション試薬の全部が、複数の標的核酸を含有する標的試料へ同時に加えられ得る。他の実施形態では、異なるハイブリダイゼーション試薬が、任意の順番で逐次的に加えられ得る。二次抗体に関しても同様に、同時か、または任意の順番で逐次的かのいずれかで加えられ得る。多重化アッセイにおいて、方法は、単一のアッセイにおいて、２個、３個、５個、１０個、２０個、３０個、５０個、１００個、またはさらにより多い異なる標的核酸を検出し得る。上で詳細に記載されているように、本ハイブリダイゼーション試薬をそのようなより高いレベルの多重化ハイブリダイゼーションアッセイに使用できることは、本ハイブリダイゼーション試薬の主な利点である。特に、これらのハイブリダイゼーション試薬は、優れた感度、選択性、およびバックグラウンドシグナルの極めて低いレベルを有するハイブリダイゼーションアッセイを可能にする。
【００９６】
一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションアッセイの本方法は、所定の組織試料について可能な、検出可能な核酸の多重化のレベルを増加させるために、または試料の３次元画像を再構築するために、固定化組織試料の隣接した、またはほとんど隣接した切片の分析を含む。例えば、一部の実施形態では、方法は、第２のハイブリダイゼーション試薬を第２の試料上の第２の標的核酸と反応させるステップをさらに含む。これらの方法の一部において、第１の試料および第２の試料は、組織試料の連続切片（すなわち、試料においてお互いに隣接し、またはほとんど隣接している切片）であり得、第２のハイブリダイゼーション試薬は、第２の核酸に相補的な上記のハイブリダイゼーション試薬のいずれかである。方法は、第２の検出可能な抗体を第２のハイブリダイゼーション試薬と反応させるステップであって、第２の検出可能な抗体が第２のハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原に対して高親和性で特異的である、ステップ、および第２のハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原と会合している第２の検出可能な抗体を検出するステップをさらに含む。
【００９７】
所定の組織試料の連続切片のハイブリダイゼーションアッセイは、現在のハードウェアおよびソフトウェアの限界を考慮しても、核酸検出の多重化の著しい増加を提供することは理解される。例えば、本明細書に記載されたハイブリダイゼーション試薬および方法は、原理上は、架橋抗原および二次抗体の無制限のバリエーションに起因して無制限の多重化を可能にするが、それでもやはり、そのようなアッセイは、現在、利用可能な検出デバイスで単一の組織切片上で同時に区別することができる蛍光色素の数によって制限される。しかしながら、同じ組織試料の連続切片を、オリゴヌクレオチドプローブの異なるパネルで染色して、異なる切片上での検出可能な標識、例えば、蛍光標識の同じパネルの再使用により標的核酸の異なるセットを同定することができる。検出可能な標識は、第１の試料切片を標識するのに使用された同じセットの二次抗体に結合し得、その場合、オリゴヌクレオチドプローブの第２のパネルは、オリゴヌクレオチドプローブの第１のパネルと共に使用されたのと同じセットの架橋抗原で標識される。代替として、および任意選択で、検出可能な標識は、第１の試料切片を標識するのに使用されたのとは異なるセットの二次抗体に結合し得、その場合、オリゴヌクレオチドプローブの第２のパネルは、オリゴヌクレオチドプローブの第１のパネルと共に使用されたのとは異なるセットの架橋抗原で標識される。
【００９８】
所定の組織試料の連続切片のハイブリダイゼーションアッセイは、３次元での標的組織核酸の分析を可能にし、それにしたがって、例えば、断層撮影技術により、試料組織の全体的構造に関するさらなる情報を提供することもまた理解される。一部の実施形態では、第１の試料および第２の試料は、試料の連続切片ではなく、代わりに、最初の組織内の空間で引き離されている場合があり、それゆえに、３次元における標的核酸の相対的空間的配置についてのなおさらなる情報を提供する。当業者は、３次元組織構造の再構築における連続切片画像の利用を理解している。
【００９９】
一部の実施形態では、試料のそれぞれにおいて、複数の標的核酸が検出される。具体的な実施形態では、試料のそれぞれにおいて、少なくとも２個の標的核酸、少なくとも３個の標的核酸、少なくとも５個の標的核酸、少なくとも１０個の標的核酸、少なくとも１５個の標的核酸、少なくとも２５個の標的核酸、またはさらにより多い標的核酸が検出される。一部の実施形態では、１個または複数の標的核酸が、少なくとも３個の試料、少なくとも４個の試料、少なくとも５個の試料、少なくとも１０個の試料、少なくとも１５個の試料、少なくとも２５個の試料、またはさらにより多くの試料において検出される。
【０１００】
別の態様では、本開示は、試料中の複数の標的核酸が、架橋抗原を含むオリゴヌクレオチドプローブでの最初の処理、および架橋抗原に特異的な反応性抗体でのその後の逐次処理により標識される、ハイブリダイゼーションアッセイの方法を提供する。具体的には、第１の標的核酸および第２の標的核酸を含む試料を、第１の標的核酸に相補的な第１のハイブリダイゼーション試薬および第２の標的核酸に相補的な第２のハイブリダイゼーション試薬と反応させ、その場合、第１のハイブリダイゼーション試薬および第２のハイブリダイゼーション試薬が上記のハイブリダイゼーション試薬のいずれかである。第１のハイブリダイゼーション試薬を、第１の反応性抗体と反応させ、その場合、第１の反応性抗体が第１のハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原と高親和性で結合する。その後、試料中の第１の核酸の位置は、第１の反応性抗体を第１の検出可能な試薬と反応させることにより強調され、それにより、第１の検出可能な試薬が、第１の核酸の近くで試料に結合している。その後、第１の反応性抗体を、試料から選択的に解離させ、第２のハイブリダイゼーション試薬を、第２の反応性抗体と反応させ、その場合、第２の反応性抗体が第２のハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原と高親和性で結合する。その後、試料中の第２の核酸の位置は、第２の反応性抗体を第２の検出可能な試薬と反応させることにより強調され、それにより、第２の検出可能な試薬が、第２の抗原の近くで試料に結合している。その後、第１の検出可能な試薬および第２の検出可能な試薬を検出し、それにしたがって、試料における第１の標的核酸および第２の標的核酸の位置を同定する。
【０１０１】
これらの方法の具体的な実施形態では、第１の反応性抗体および第２の反応性抗体はそれぞれ、酵素活性、より具体的には、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性などのペルオキシダーゼ活性を含む。他の具体的な実施形態では、第１の検出可能な試薬か、もしくは第２の検出可能な試薬のいずれかが、チラミドを含み、または第１の検出可能な試薬および第２の検出可能な試薬のそれぞれが、チラミドを含む。まだ他の具体的な実施形態では、第１の検出可能な試薬か、もしくは第２の検出可能な試薬のいずれかが、フルオロフォアもしくは発色団を含み、または第１の検出可能な試薬および第２の検出可能な試薬のそれぞれが、フルオロフォアもしくは発色団を含む。
【０１０２】
好ましい実施形態では、第１の反応性抗体は、選択的処理により試料から解離する。具体的には、選択的処理は、オリゴヌクレオチドプローブを試料から解離させることなく、第１の反応性抗体を試料から解離させ得る。より具体的には、選択的処理は、可溶性架橋抗原での処理を含み得る。そのような処理は、当業者により理解されているように、相対的に高い濃度の可溶性架橋抗原、例えば、少なくとも１μＭ、少なくとも１０μＭ、少なくとも１００μＭ、少なくとも１ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、またはさらにより高い濃度の可溶性架橋抗原の使用を含み得る。
【０１０３】
上記方法において、反応性抗体を試料から解離させるステップ、追加のハイブリダイゼーション試薬を試料上の追加の標的核酸と反応させるステップ、追加の反応性抗体を追加のハイブリダイゼーション試薬と反応させるステップ、および追加の反応性抗体を追加の検出可能な試薬と反応させるステップであって、その結果、追加の検出可能な試薬が追加の標的核酸の近くで試料に結合している、ステップが、試料上の望まれるだけの数の標的核酸の位置を検出するために、必要とされるだけの回数、繰り返され得ることも理解されるものとする。一部の実施形態では、ステップは、試料上の少なくとも３個の標的核酸、少なくとも４個の標的核酸、少なくとも５個の標的核酸、少なくとも１０個の標的核酸、またはさらにより多い標的核酸の位置を検出するために繰り返される。
【０１０４】
これらのアッセイ方法に使用されるステップの順番は、使用される特定の反応条件に依存し得ること、および場合によっては、アッセイを完了させるために追加の反応ステップもまた必要であり得ることも理解されるものとする。例えば、反応性抗体を試料から解離させるために、非選択的方法（例えば、熱、変性など）が使用される場合には、アッセイにおいて追加の反応ステップを含むことが必要になる場合がある。具体的には、解離条件がまたオリゴヌクレオチドプローブを試料から除去する場合には、追加の反応性抗体および追加の検出可能な試薬との反応の前に、追加のハイブリダイゼーション試薬とのさらなる反応がプロセスに含まれてよい。言い換えれば、新しいハイブリダイゼーション試薬の新しい標的核酸との反応が、各標的核酸についてのプロセスに含まれる。しかしながら、好ましい実施形態では、反応性抗体が選択的に解離する場合、所望の標的核酸の全部との反応のために所望のハイブリダイゼーション試薬の全部を、最初の反応ステップに加えることができ、反応性抗体だけが、次のサイクルにおいて加えられる。反応性抗体を試料から解離させるための選択的処理の使用は、過酷な処理からの試料への損傷を最小限にし、それにしたがって、アッセイからの結果を向上させる。
【０１０５】
本開示のハイブリダイゼーション試薬は、様々なインサイチュハイブリダイゼーション検出方法に有用に用いられ得、そのインサイチュハイブリダイゼーション検出方法には、非限定的に、発色インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）など単独または組み合わせ、および任意選択でこれらを以下のような他の診断アッセイと組み合わせたもの、顕微鏡画像化、プレターゲティングイメージング、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍および組織画像化の他の型、ハイコンテンツスクリーニング（ＨＣＳ）、免疫細胞化学法（ＩＣＣ）、免疫磁気細胞除去、免疫磁気細胞捕捉、サンドイッチアッセイ、一般的なアフィニティアッセイ、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩＳｐｏｔ、マスサイトメトリ（ＣｙＴＯＦ）、マイクロスフェアアレイ、多重化マイクロスフェアアレイ、マイクロアレイ、抗体アレイ、細胞アレイを含むアレイ、液相捕捉、側方フローアッセイ、化学発光検出、赤外線検出、ウェスタンブロット、サウスウェスタンブロット、ドットブロット、組織ブロットなどを含むブロッティング方法、またはそれらの組合せが挙げられる。これらのアッセイのそれぞれは、本ハイブリダイゼーション試薬を使用して達成される高レベルの多重化から恩恵を受け得る。
【０１０６】
上記方法は、制限なしに、研究および臨床実践場面に使用される。それらは、予測スクリーニングを含め診断を目的として、および他の型の予後アッセイにおいて、例えば、診断検査室の環境において、または臨床現場即時検査として、使用され得る。当該多重化ハイブリダイゼーション技術はまた、ハイスループットスクリーニングにおける使用にも十分適している。
【０１０７】
架橋抗原標識一次抗体および検出可能な抗架橋抗原二次抗体を用いた組織切片の多重化免疫組織化学染色を含む免疫組織化学染色は、米国特許出願第１５／０１７，６２６号およびＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／１６９１３に例示されている。そのような技術は、当業者に理解されるように、本開示のハイブリダイゼーション試薬組成物を使用したインサイチューハイブリダイゼーションアッセイにおける使用に適合させることができる。
調製の方法
【０１０８】
別の態様では、本開示は、上記のハイブリダイゼーション試薬などの抗原をカップリングさせたハイブリダイゼーション試薬を調製する新規な方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、化学的カップリング反応を使用して、オリゴヌクレオチドプローブを架橋抗原にカップリングするステップを含む。具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブと架橋抗原は、高効率コンジュゲーション部分によってカップリングされる。一部の実施形態では、方法は、オリゴヌクレオチドプローブを第１のコンジュゲート試薬で修飾するステップ、架橋抗原を第２のコンジュゲート試薬で修飾するステップ、および修飾されたオリゴヌクレオチドプローブを修飾された架橋抗原と反応させて、抗原をカップリングさせたハイブリダイゼーション試薬を生成するステップを含む。具体的な実施形態では、第１のコンジュゲート試薬および第２のコンジュゲート試薬は、高効率でお互いに会合する。
【０１０９】
高効率とは、オリゴヌクレオチドプローブの抗原をカップリングさせたオリゴヌクレオチドプローブへの変換の効率が、コンジュゲーション反応の条件下で、少なくとも５０％、７０％、９０％、９５％、または９９％完了であることを意味する。一部の実施形態では、これらの効率は、０．５ｍｇ／ｍＬ以下、０．２ｍｇ／ｍＬ以下、０．１ｍｇ／ｍＬ以下、０．０５ｍｇ／ｍＬ以下、０．０２ｍｇ／ｍＬ以下、０．０１ｍｇ／ｍＬ以下、またはそれよりも低いタンパク質濃度で達成される。
【０１１０】
調製方法に有用に用いられるオリゴヌクレオチドプローブおよび架橋抗原には、上記のオリゴヌクレオチドプローブおよび架橋抗原のいずれかが挙げられる。第１および第２のコンジュゲート試薬は、所望の結果に従って選択される。特に、アミノ基またはチオール基と特異的で選択的に反応することができる高効率コンジュゲート試薬が、アミノまたはチオール修飾オリゴヌクレオチドプローブおよびアミノまたはチオール含有架橋抗原の修飾において特に有用である。加えて、第１および第２のコンジュゲート試薬は、高効率でお互いに会合するそれらの能力、および、それにしたがって、上記の抗原をカップリングさせたハイブリダイゼーション試薬の一部において高効率コンジュゲーション部分を生じるそれらの能力について選択される。
【０１１１】
上で記載されているように、生じたコンジュゲーション部分は、共有結合性部分または非共有結合性部分であり得、それに応じて、修飾されたオリゴヌクレオチドプローブおよび修飾された架橋抗原を調製するために使用される第１および第２のコンジュゲート試薬が選択される。例えば、非共有結合性コンジュゲーション部分の場合、第１のコンジュゲート試薬は、好ましくは、その試薬をオリゴヌクレオチドの特定の反応性残基に結合させるための選択的反応基、およびコンジュゲーションペアの第１の構成成分を含む。同様に、第２のコンジュゲート試薬は、好ましくは、その試薬を架橋抗原の特定の反応性残基に結合させるための選択的反応基、およびコンジュゲーションペアの第２の構成成分を含む。コンジュゲーションペアの第１および第２の構成成分は、高効率で、非共有結合的にお互いに会合することができ、それにしたがって、抗原をカップリングさせたハイブリダイゼーション試薬を生成することができる。
【０１１２】
前に記載されているように、非共有結合性コンジュゲーション部分の例には、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションペアおよびタンパク質−リガンド結合ペアが挙げられる。例えば、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションペアの場合、オリゴヌクレオチドプローブを、ハイブリダイゼーションペアの１つのメンバーを含む第１のコンジュゲート試薬と反応させ、架橋抗原を、ハイブリダイゼーションペアの第２のメンバーを含む第２のコンジュゲート試薬と反応させる。したがって、修飾されたオリゴヌクレオチドプローブおよび修飾された架橋抗原は、お互いと混合することができ、ハイブリダイゼーションペアの２つのメンバーの会合により、高効率コンジュゲーション部分が生じる。
【０１１３】
同様に、抗原をカップリングさせたハイブリダイゼーション試薬の非共有結合性コンジュゲーション部分を生じるためにタンパク質−リガンド結合ペアが使用される場合、オリゴヌクレオチドを、タンパク質−リガンドペアの一方または他方を含む第１のコンジュゲート試薬と反応させ、架橋抗原を、タンパク質−リガンドペアの相補的メンバーを含む第２のコンジュゲート試薬と反応させる。そのように修飾されたオリゴヌクレオチドおよび架橋抗原は、その後、お互いと混合され、高効率コンジュゲーション部分が生じる。
【０１１４】
上で詳細に記載されているように、高効率共有結合性コンジュゲーション部分の例には、ヒドラゾン、オキシム、他のシッフ塩基、および様々なクリック反応のいずれかの生成物が挙げられる。高効率コンジュゲーション部分を形成するのに使用される例示的なヒドラジノ、オキシアミノ、およびカルボニルコンジュゲート試薬は、米国特許第７，１０２，０２４号に例証されており、本反応方法での使用に適応することができる。そこに記載されているように、ヒドラジン部分は、脂肪族、芳香族、もしくはヘテロ芳香族のヒドラジン、セミカルバジド、カルバジド、ヒドラジド、チオセミカルバジド、チオカルバジド、炭酸ジヒドラジン、またはヒドラジンカルボキシレートであり得る。カルボニル部分は、上記のヒドラジンまたはオキシアミノ部分の１つまたは複数とヒドラジンまたはオキシム結合を形成することができる任意のカルボニル含有基であり得る。好ましいカルボニル部分には、アルデヒドおよびケトンが挙げられる。本方法においてコンジュゲート試薬として使用されるこれらの試薬の一部の活性化バージョンは、例えば、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＪｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ（Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から市販されている。一部の実施形態では、試薬は、オリゴヌクレオチドまたは架橋抗原の合成中、例えば、固相合成反応中に、オリゴヌクレオチドまたは架橋抗原へ取り込まれ得る。
【０１１５】
固定化および他のコンジュゲーション反応に使用される、オリゴヌクレオチドへのヒドラジン、オキシアミノ、およびカルボニルに基づいたモノマーの取り込みは、米国特許第６，６８６，４６１号；同第７，１７３，１２５号；および同第７，９９９，０９８号に記載されている。生体分子のコンジュゲーションおよび固定化に使用されるヒドラジンに基づいた、およびカルボニルに基づいた二官能性架橋試薬は、米国特許第６，８００，７２８号に記載されている。様々な検出アッセイおよび他の適用においてオリゴヌクレオチドコンジュゲートを形成するための高効率ビスアリール−ヒドラゾンリンカーの使用は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１２／０７１４２８号に記載されている。上記参考文献のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【０１１６】
一部の実施形態では、本開示のハイブリダイゼーション試薬は、新規なコンジュゲート試薬および条件を使用して調製される。例えば、抗原をカップリングさせたハイブリダイゼーション試薬の調製に有用なチオール反応性マレイミドオキシアミノ（ＭＯＡ）コンジュゲート試薬は、スキーム１に示されているように調製され得る：
【化１】
2019523000.tif 000002
アミノ反応性オキシアミノコンジュゲート試薬（ＡＯＡ）は、スキーム２に示されているように調製され得る：
【化２】
2019523000.tif 000003
【０１１７】
代替のチオール反応性およびアミノ反応性コンジュゲート試薬は、合成化学の分野の当業者によって理解されているように、上記の反応スキームの変形型を使用して調製され得る。そのような代替試薬は、本明細書に開示された調製方法の範囲内と見なされるべきである。
【０１１８】
上記のオキシアミノ含有試薬の一方または他方を使用して修飾されたオリゴヌクレオチドおよび架橋抗原は、有用には、カルボニル含有試薬、例えば、ホルミルベンゾエート基などの芳香族アルデヒドでそれ自体、修飾される相補的オリゴヌクレオチドまたは架橋抗原と反応し得る。そのようなコンジュゲーション反応の代替の例は、スキーム３および４（Ｒ１基およびＲ２基は、独立して、オリゴヌクレオチドプローブまたは架橋抗原を表す）に示されている。
【化３】
2019523000.tif 000004
【０１１９】
オリゴヌクレオチドプローブ上および架橋抗原上のコンジュゲーション部分を形成する基の異なるメンバーの相対的配向は、その基がお互いに反応して、高効率コンジュゲーション部分を形成することができる限り、重要であるとは一般的に考えられていないことが理解されるものとする。言い換えれば、スキーム３および４の例において、Ｒ１基はオリゴヌクレオチドプローブであり得、Ｒ２基は架橋抗原であり得、またはＲ１基は架橋抗原であり得、Ｒ２基はオリゴヌクレオチドプローブであり得る。上記のコンジュゲートペアの全部について、共有結合性であろうと非共有結合性であろうと、一般的に同じことが当てはまる。
【０１２０】
上記のコンジュゲーション方法は、従来の架橋方法、例えば、二官能性架橋試薬を使用する方法と比べていくつかの利点を提供する。特に、その反応は、特異的、効率的、安定的である。特異性は、ホモ共役反応などの副反応が起こらず、または極めて低レベルで起こることを意味する。効率は、反応が、低試薬濃度でさえも完了、または完了近くまで進み、したがって、化学量論的量で、またはそれ近くで生成物を生じることを意味する。形成されるコンジュゲーション部分の安定性は、生じたハイブリダイゼーション試薬が、コンジュゲートされた生成物が使用中に解離するという心配なしに、多種多様な目的のために使用することができることを意味する。場合によっては、上記コンジュゲーション方法は、その反応の一部において反応が起こるにつれて、発色団（ｃｈｒｏｍａｐｈｏｒｅ）が形成されるため、コンジュゲーション反応の過程が分光学的にモニターされ得るというさらなる利点を与える。
【０１２１】
ヒドラゾン連結アドリアマイシン／モノクローナル抗体コンジュゲートの合成および安定性は、Ｋａｎｅｋｏら（１９９１年）Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ２巻：１３３〜４１頁に記載されている。一連の芳香族ヒドラジド、ヒドラジン、およびチオセミカルバジドの合成およびタンパク質修飾特性は、米国特許第５，２０６，３７０号；同第５，４２０，２８５号；および同第５，７５３，５２０号に記載されている。コンジュゲーション的に拡張されたヒドラジン化合物および蛍光ヒドラジン化合物の作製は、米国特許第８，５４１，５５５号に記載されている。
【０１２２】
架橋抗原標識一次抗体の調製は、米国特許出願第１５／０１７，６２６号およびＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／１６９１３に例示されている。当業者に理解されるように、同様の手法を本ハイブリダイゼーション試薬の調製のために使用することができる。
診断キット
【０１２３】
別の態様では、本開示は、診断または研究を目的としたハイブリダイゼーションアッセイに使用されるキットを提供する。診断キットは、本開示の１つまたは複数のハイブリダイゼーション試薬を、ハイブリダイゼーションアッセイにおける使用のための指示と共に含む。一部の実施形態では、キットはさらに、二次抗体、例えば、ハイブリダイゼーション試薬の架橋抗原に対して、高親和性で特異的である二次抗体を含む。さらに、本キットに含まれるハイブリダイゼーション試薬は、典型的には、特異的遺伝子マーカーに向けられたオリゴヌクレオチドプローブを含み、それにより、キットは、特異的な遺伝子座または染色体パターンを同定するため、または組織試料内の１つまたは複数の遺伝子マーカーの発現をモニターするためのハイブリダイゼーションアッセイに使用され得ることが理解されるべきである。
【０１２４】
さらなる実施形態では、キットは、さらなる構成成分、例えば、細胞または組織を染色するためのキットの利用を可能にするための様々な組成のバッファー、および試料形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）の可視化を可能にするための細胞の対比染色剤などを含み得る。キットは、様々な様式で提供されて、上記の列挙された構成成分の一部もしくは全部を含み得、または本明細書に列挙されていない追加の構成成分を含み得る。
【０１２５】
本発明の他の態様は、米国特許出願第１５／０１７，６２６号およびＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１６／１６９１３を参照することによって理解される。
【０１２６】
本明細書において記述した全ての特許、特許刊行物、および他の公表された参照文献は、それぞれが本明細書において参照により個々にかつ具体的に組み込まれているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１２７】
具体的な例を提供してきたが、上記の説明は例示的なものであり、限定されるものではない。上記実施形態の特色のうちの任意の１つまたは複数は、本発明における任意の他の実施形態のうちの１つまたは複数の特色と任意の様式で合わせることができる。さらに、本発明の多くのバリエーションは、明細書を見直せば当業者には明らかであろう。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲をそれらの均等物の完全な範囲と共に参照することにより決定すべきである。
【国際調査報告】
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