(57)【要約】本出願は、腫瘍転移の処置における、腫瘍関連樹状細胞（ＴＡＤＣ）の調製およびその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
本質的に単球由来樹状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）を含まない、通常型樹状細胞前駆細胞（ｐｒｅ−ｃＤＣ）起源の、単離された腫瘍関連樹状細胞（ＴＡＤＣ）サブセットであって、哺乳動物の切除した腫瘍、または切除した腫瘍流入領域リンパ節から得られる、哺乳動物の腫瘍転移の処置における使用のための、単離されたＴＡＤＣサブセット。
【請求項２】
１％未満のＭｏ−Ｄｃを含む、請求項１に記載のＴＡＤＣサブセット。
【請求項３】
ＴＡＤＣサブセットが、少なくともＣＤ１６−ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＢＤＣＡ２−ＣＤ１４−の特徴的な細胞表面表現型を有する、請求項１または２に記載のＴＡＤＣサブセット。
【請求項４】
ＴＡＤＣサブセットが、さらにＢＤＣＡ１−ＢＤＣＡ３＋ＣＤ１１ｂ−を特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＴＡＤＣサブセット。
【請求項５】
ＴＡＤＣサブセットが、さらにＢＤＣＡ１＋ＢＤＣＡ３−ＣＤ１１ｂ＋を特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＴＡＤＣサブセット。
【請求項６】
以下のステップを含むプロセスにより調製された、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＴＡＤＣサブセット：
（ａ）哺乳動物の切除した腫瘍、または切除した腫瘍流入領域リンパ節からＴＡＤＣを単離すること
（ｂ）Ｍｏ−ＤＣを本質的に含まない集団を得るために効果的な方法で、ＴＡＤＣサブセットを濃縮すること。
【請求項７】
濃縮が、浮遊密度遠心分離、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）の１つ以上を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＴＡＤＣサブセット。
【請求項８】
腫瘍転移の処置における使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＴＡＤＣサブセットを含む、医薬組成物。
【請求項９】
哺乳動物において腫瘍転移を処置する方法であって、治療有効量の請求項１〜７のいずれか一項に記載のＴＡＤＣサブセット、または、請求項８に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、腫瘍転移の処置における、腫瘍関連樹状細胞（ＴＡＤＣ）の調製およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫応答を調整する上で重要な役割を果たす、全ての組織に存在する特殊な抗原提示細胞（ＡＰＣ）である（Steinman and Banchereau, 2007）。種々の定常状態の組織、および炎症を起こした組織から単離されたＤＣは、発生的に異なるＤＣサブセットからなる異種集団を表すことが示されており(Guilliams et al., 2010; Helft et al., 2010; Plantinga et al., 2013)、ｃＤＣ１（ＣＤ８α＋様、またはＣＤ１０３＋通常型ＤＣ）、ｃＤＣ２（ＣＤ１１ｂ＋様ｃＤＣ）、形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）および、いわゆる単球由来ＤＣ（Ｍｏ−ＤＣ）(Guilliams et al., 2014; Guilliams et al., 2010; Heath and Carbone, 2009) を含む。ｃＤＣは、Ｆｌｔ３Ｌ依存的に骨髄由来のｐｒｅ−ｃＤＣ前駆細胞から生じ(Onai et al., 2007)、恒常的条件下でＧＭ−ＣＳＦＲシグナル伝達によって維持され(Greter et al., 2012）、ＢＡＴＦ３、ＩＤ２およびＩＲＦ８、またはＲＥＬＢおよびＩＲＦ４の制御下で、それぞれｃＤＣ１およびｃＤＣ２に分化する。Ｍｏ−ＤＣは、ＣＣＲ２依存的に骨髄を出るＬｙ６Ｃｈｉ単球から分化し(Greter et al., 2012; Serbina et al., 2008)、インビボでの分化にＧＭ−ＣＳＦＲシグナル伝達を必要としないことが報告されている(Greter et al., 2012; Serbina et al., 2008)。重要なことに、異なる細胞起源のＤＣは、差次的機能的特殊化を示すことが示されている。ｃＤＣ１は細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答の誘導に特化しているが、ｃＤＣ２はＴｈ１７またはＴｈ２応答の誘導において優れていることが示されている(Gao et al., 2013; Persson et al., 2013; Plantinga et al., 2013; Schlitzer et al., 2013)。Ｍｏ−ＤＣの遊走能が議論されているが、Ｍｏ−ＤＣは炎症を起こした組織ではエフェクターＴ細胞を再活性化することが提唱されている(Plantinga et al., 2013)。腫瘍関連ＤＣ（ＴＡＤＣ）に起因する様々な機能が、実際に異なるＤＣサブセットによって行われているかどうかは不明であるが、腫瘍におけるｃＤＣ１の存在の最近の報告（Broz et al., 2014）は、腫瘍組織には、他の組織と同様に、異なる発生起源、および、場合によっては差次的機能的特殊化を有するＤＣが存在し得ることを強調している。事実、異なる機能を有する腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）の亜集団が同定されている(Laoui et al., 2014; Movahedi et al., 2010)。
【０００３】
腫瘍における成熟ＤＣの存在は、いくつかの腫瘍タイプにおける陽性の予後と関連している（Fridman et al., 2011; Goc et al., 2014）。ＤＣベースの免疫療法は、腫瘍を処置するために、ＤＣの能力、および免疫系の特異性を利用しようと試みている。本プロセスにおいて重要なステップは、腫瘍特異的抗原を提示する成熟ＤＣを提供することである。ＤＣベースの免疫療法における現在の標準的アプローチは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が負荷され、サイトカインによって活性化された、エクスビボで培養されたＤＣの使用である。それにもかかわらず、抗原負荷のプロセスは常に有効ではなく、特定の腫瘍に存在するＴＡＡの最新の知識を必要とし、エクスビボの細胞培養は労働集約的である。さらに、単離および細胞培養手順は、精製されたＤＣの有用性を妨害し得る免疫原性を有する可能性のある外来抗原を含む、ヒツジ赤血球および／またはウシ胎児血清のいずれかを用いることがある。培養培地でのエクスビボでの成熟後のＤＣの表現型分析では、必要な細胞表面マーカーが実証されているが、機能的には、ＤＣは宿主への移動後に有効に免疫応答を駆動できないことがある。実際、エクスビボで生成された成熟ＤＣに対する臨床的応答は中程度である。これは、寛容誘導につながり得る、腫瘍側での有効な炎症の欠如によって部分的に説明されるであろう。当該有効性の欠如は、ＤＣ（主にＭｏ−ＤＣ）の間違った選択と、これらのＤＣのリンパ節への遊走が失敗したことによることが証明されている。腫瘍部位でのＤＣとＴ細胞との相互作用を規定するもの、および、免疫寛容原性モードから応答性モードへと相互作用を推進させるものについての我々の理解は、以前として非常に乏しい。要するに、先行技術では、成熟ＤＣの生成のためにはサイトカインの存在下での複雑な細胞培養方法が必要であると教示しているが、これらのＤＣに対する臨床的応答はむしろ不十分である。上述の制限がなく、有効な抗腫瘍免疫応答を誘導するＤＣまたはＤＣ組成物が必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Steinman and Banchereau, 2007
【非特許文献２】Guilliams et al., 2010
【非特許文献３】Helft et al., 2010
【非特許文献４】Plantinga et al., 2013
【非特許文献５】Guilliams et al. 2014
【非特許文献６】Heath and Carbone, 2009
【非特許文献７】Onai et al., 2007
【非特許文献８】Greter et al., 2012
【非特許文献９】Serbina et al., 2008
【非特許文献１０】Gao et al., 2013
【非特許文献１１】Persson et al., 2013
【非特許文献１２】Schlitzer et al., 2013
【非特許文献１３】Broz et al., 2014
【非特許文献１４】Laoui et al., 2014
【非特許文献１５】Movahedi et al., 2010
【非特許文献１６】Fridman et al., 2011
【非特許文献１７】Goc et al., 2014
【発明の概要】
【０００５】
我々は、腫瘍組織由来のＴＡＤＣを特徴付け、精製し、利用した。驚くべきことに、我々は、腫瘍組織由来のＴＡＤＣが、抗腫瘍性の免疫応答を誘導し得ることを見出した。これは、現在利用可能なＤＣベースの免疫療法戦略よりも有利である。なぜなら、ＴＡＤＣは、ＴＡＡ（未だ規定されていないＴＡＡを含む）を天然に提示しており、エクスビボで培養する必要もないためである。さらに、我々のデータは驚くべきことに、異なる個体発生のＴＡＤＣ集団が、異なる治療効果を誘発することを示している。
【０００６】
本発明の１つの局面は、本質的にＭｏ−ＤＣを含まない、ｐｒｅ−ｃＤＣ起源の単離されたＴＡＤＣサブセットであって、哺乳動物の切除した腫瘍、または切除した腫瘍流入領域リンパ節から得られる、哺乳動物の腫瘍転移の処置における使用のための、ＴＡＤＣサブセットを提供することである。
【０００７】
ある実施形態において、本発明は、１％未満のＭｏ−ＤＣを含むＴＡＤＣサブセットを想定する。
【０００８】
ある実施形態において、本発明は、少なくともＣＤ１６−ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＢＤＣＡ２−ＣＤ１４−の特徴的な細胞表面表現型を有するＴＡＤＣサブセットを想定する。上述のＴＡＤＣサブセットはさらに、ＢＤＣＡ１−ＢＤＣＡ３＋ＣＤ１１ｂ−を特徴とすることができる。
【０００９】
ある実施形態において、本発明は、少なくともＣＤ１６−ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＢＤＣＡ２−ＣＤ１４−の特徴的な細胞表面表現型を有するＴＡＤＣサブセットを想定する。上述のＴＡＤＣサブセットはさらに、ＢＤＣＡ１＋ＢＤＣＡ３−ＣＤ１１ｂ＋を特徴とすることができる。
【００１０】
（a）哺乳動物の切除した腫瘍、または切除した腫瘍流入領域リンパ節からＴＡＤＣを単離するステップ、および（b）Ｍｏ−ＤＣを本質的に含まない集団を得るために効果的な方法で、ＴＡＤＣサブセットを濃縮するステップを含むプロセスによって調製された、上述のＴＡＤＣサブセットもまた、想定される。ある特定の実施形態において、濃縮は、浮遊密度遠心分離、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）の１つ以上を含む。
【００１１】
本発明はまた、腫瘍転移の処置における使用のための、上述のＴＡＤＣサブセットのいずれかに関する。
【００１２】
別の局面によると、本発明はまた、腫瘍転移の処置における使用のための、上述のＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物に関する。
【００１３】
上述のＴＡＤＣサブセットまたは上述の医薬組成物の治療有効量を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において腫瘍転移を処置する方法もまた、想定される。
【００１４】
本発明の目的は、以下の説明から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、様々なＴＡＤＣ亜集団の起源を示している。（Ａ）１２日目の３ＬＬ−Ｒ腫瘍は、（１）ＣＤ６４ｎｅｇＣＤ２４ｐｏｓＣＤ１１ｂｌｏｃＤＣ１、（２）ＣＤ６４ｎｅｇＣＤ２４ｎｅｇＣＤ１１ｂｐｏｓＬｙ６ＣｌｏｃＤＣ２、および（３）ＣＤ６４ｐｏｓＣＤ２４ｉｎｔＣＤ１１ｂｐｏｓＬｙ６ＣｈｉＭｏ−ＤＣに細分された。各サブセットについて、前方散乱対側方散乱のプロットを示す。結果は、ｎ≧４の４つの独立した実験を代表するものである。（Ｂ）Ｐｒｅ−ｃＤＣ（Ｂ２２０−ＣＤ１１ｃ＋Ｓｉｒｐαｉｎｔ）および単球前駆体（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃ＋ＭＨＣ−ＩＩ−）を、ＣＤ４５．２＋骨髄から選別して、ＣｅｌｌＴｒａｃｅで標識した。４×１０５個のｐｒｅ−ｃＤＣまたは１×１０６個の単球のいずれかを、ＣＤ４５．１  ３ＬＬ−Ｒ腫瘍を有するレシピエントマウスに、静脈内（ＩＶ）に養子移入した。３日後に、腫瘍を処理して、移入した細胞をそれらのＣＤ４５．１−ＣＤ４５．２＋ＣｅｌｌＴｒａｃｅ＋表現型に基づいてゲーティングした。結果は、ｎ＝２〜４の２つの独立した実験を代表するものである。（Ｃ）３ＬＬ−Ｒ腫瘍を、ＷＴ、ＣＣＲ２−ＫＯ、Ｆｌｔ３Ｌ−ＫＯおよびＧＭ−ＣＳＦＲ  ＫＯマウスにおいて、１２日間成長させた。腫瘍全体の単一細胞懸濁液における各ＴＡＤＣ亜集団の割合を決定した。結果は、ｎ＝６の２つの独立した実験を代表するものである。二元配置分散分析による統計解析。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。（Ｄ）１２日目の３ＬＬ−Ｒ腫瘍の単一細胞懸濁液を、示したマーカーで染色し、ＴＡＤＣサブセットについてヒストグラムの重ね書きを示す。黒線＝示したマーカーの発現；網掛けのヒストグラム（ｓｈａｄｅｄ  ｈｉｓｔｏｇｒａｍ）＝アイソタイプコントロール。ΔＭＦＩ±ＳＥＭを示しており、これは（ＭＦＩ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＭＦＩコントロール）を表している。結果は、ｎ≧４の２つの独立した実験を代表するものである。一元配置分散分析による統計解析。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【００１６】
【図２】図２は、異なるＴＡＤＣサブセットによる、いくつかの腫瘍タイプの浸潤を示す。（Ａ）同様の体積の腫瘍を有する、２０日目の皮下の（ｓｃ）ＬＬＣ−ＯＶＡ肺癌、１２日目のｓｃ３ＬＬ−Ｒ肺癌、６日目の３ＬＬ−６を同所性注射した肺癌、３５日目のｓｃ３ＬＬ−Ｓ肺癌、１７日目のｓｃＭＣ３８結腸癌、２８日目のＭＣ３８を同所性注射した結腸癌、２０日目のＢ１６−ＯＶＡｓｃメラノーマ、２０日目のＴ２４１ｓｃ線維肉腫および１６週目の自然発生的に成長したＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ乳房癌腫の単一細胞懸濁液において、ＴＡＤＣをｄｏｕｂｌｅｔｓｎｅｇｌｉｖｅ（ＡＱＵＡｎｅｇ）Ｌｙ６ＧｎｅｇＣＤ３ｎｅｇＣＤ１９ｎｅｇＣＤ１１ｃｐｏｓＭＨＣ−ＩＩｐｏｓ細胞としてゲーティングした。（Ｂ）同様の体積の示した腫瘍について、ＴＡＤＣ集団全体における各ＴＡＤＣ亜集団の割合を決定した。（Ｃ）同様の体積の示した腫瘍について、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−集団全体における各ＴＡＭサブセットの割合を決定した。（Ａ〜Ｃ）グラフは、平均±ＳＥＭを示している。結果は、ｎ＝３〜１０の独立した２つの実験を代表するものである。（Ｄ−Ｅ）ＴＡＤＣ全体（Ｄ、左図）、ＴＡＤＣサブセット（Ｄ、右図）およびＴＡＭサブセット（Ｅ）の量を、７日目、１１日目、および１５日目の３ＬＬ−Ｒ腫瘍の単一細胞懸濁液で評価した。（Ｆ−Ｇ）ＴＡＤＣ全体（Ｆ、左図）、ＴＡＤＣサブセット（Ｆ、中央図）およびＴＡＭサブセット（Ｇ）の割合を、２５日目、３０日目、３７日目、４２日目の３ＬＬ−Ｓ腫瘍の単一細胞懸濁系で評価した。（Ｄ−Ｇ）グラフは、平均±ＳＥＭを示している。結果は、ｎ≧の独立した３つの実験を代表するものである。一元配置分散分析による統計解析。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【００１７】
【図３】図３は、異なるＴＡＤＣサブセットの存在が、ヒト腫瘍において再現され得ることを示している。（Ａ）ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍生検標本を、ＣＤ４５＋ＣＤ３−ＣＤ１９−ＣＤ５６−ＢＤＣＡ２−生細胞について予めゲーティングし、ＣＤ１６−ＣＤ１１ｃｈｉｇｈＨＬＡ−ＤＲ＋細胞を、「ｃＤＣ１」（ＢＤＣＡ１−ＩＲＦ８＋ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂｌｏｗ）、「ｃＤＣ２」（ＢＤＣＡ１＋ＩＲＦ８−ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋）および「Ｍｏ−ＤＣ」（ＢＤＣＡ１＋ＩＲＦ８−ＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂｈｉｇｈ）に細分した。（Ｂ−Ｃ）ＴＡＤＣの全体の割合（３つのサブセットの合計）（Ｂ）およびＴＡＤＣ集団全体における各ＴＡＤＣサブセットの割合（Ｃ）を、（ＮＳＣＬＣ）および結腸直腸（ＣＲＣ）腫瘍について決定した。全ての実験について、グラフは平均±ＳＥＭを示す。腫瘍タイプ当たり、ｎ＝４の患者。
【００１８】
【図４】図４は、異なるＴＡＤＣサブセットにおける抗原取り込み、処理および提示の違いを示す。（Ａ−Ｂ）インビトロ食作用アッセイ。（Ａ）１２日目の３ＬＬ−Ｒ腫瘍の単一細胞懸濁液を、ラテックスビーズなし（コントロール）で、または、ラテックスビーズありで、４℃もしくは３７℃で４０分間培養した。（Ｂ）ＴＡＤＣ全体のゲートにおける、または、Ｌａｔｅｘ＋ＴＡＤＣゲートにおける、異なるＴＡＤＣサブセットの割合が示されている。４つの腫瘍のｎ＝３のプール。一元配置分散分析による解析。＊＊、ｐ＜０．０１。（Ｃ）インビボ食作用アッセイ。１２日目の３ＬＬーＲ腫瘍を有するマウスに、屠殺の２時間前に、ラテックスビーズを静脈内注射した。ＴＡＤＣ全体のゲートにおける、または、Ｌａｔｅｘ＋ＴＡＤＣゲートにおける、異なるＴＡＤＣサブセットの割合が示されている。４つの腫瘍のｎ＝３のプール。一元配置分散分析による解析。＊、＜０．０５；＊＊＊、＜０．００１。（Ｄ）ＤＱ−ＯＶＡ処理。１２日目の３ＬＬ−Ｒ腫瘍サブセットに、０℃または３７℃で１５分間、ＤＱ−ＯＶＡを貪食させて、処理させた。続いて、遊離のＤＱ−ＯＶＡを培養培地から除去し、取り込んだＤＱ−ＯＶＡを処理するために細胞にさらに１５、３０、６０または９０分を与えた。ＤＱ−ＯＶＡの処理は、蛍光ペプチドの形成をもたらし、ゲーティングしたサブセットについての蛍光強度の平均±ＳＥＭをグラフに示す。４つの腫瘍のｎ＝３のプール。二元配置分散分析による解析。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。（Ｅ）ＬＬＣ−ＯＶＡにおける異なるＴＡＤＣサブセットによる交差提示を、ＭＨＣ−Ｉに関連するＯＶＡ由来ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬについて染色することによって評価した。黒線＝ＬＬＣ−ＯＶＡ腫瘍におけるＴＡＤＣのＳＩＩＮＦＥＫＬ発現；網掛けのヒストグラム＝ＬＬＣ腫瘍におけるＴＡＤＣのＳＩＩＮＦＥＫＬ発現（コントロール）。ΔＭＦＩを示しており、これは（ＭＦＩ  ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＭＦＩコントロール）を表している。結果はｎ＝４の２つの独立した実験を代表するものである。
【００１９】
【図５】図５は、ＴＡＤＣサブセットの異なるＴ細胞増殖能を示す。（Ａ）１２日目の３ＬＬ−Ｒ腫瘍の単一細胞懸濁液を、示したマーカーについて染色し、ヒストグラムの重ね書きを示す。黒線＝示したマーカーの発現；網掛けのヒストグラム＝アイソタイプコントロール。結果は、ｎ≧４の独立した２つの実験を代表するものである。（Ｂ−Ｃ）ナイーブＣ５７Ｂｌ／６マウス由来の、脾臓のＣＤ１１ｃｈｉＭＨＣ−ＩＩｈｉＢ２２０−Ｌｙ６Ｃ−ｃＤＣと比較した、３ＬＬ−Ｒ腫瘍由来のＴＡＤＣサブセットの抗原提示活性。選別したＴＡＤＣまたは脾臓のｃＤＣを、精製した同種のＢＡＬＢ／ｃＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｂ）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｃ）の存在下で、５日間培養し、応答性Ｔ細胞の増殖を３Ｈ−チミジン取り込み（ｃｐｍ）により測定した。結果は、１０〜１２個の腫瘍のｎ＝３のプールの、独立した２つの実験を代表するものである。一元配置分散分析による統計解析。ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。（Ｄ−Ｅ）選別したＴＡＤＣサブセットを、ＯＴ−Ｉ（Ｄ）またはＯＴ−ＩＩ（Ｅ）Ｔ細胞と、ＤＣ／Ｔ細胞の割合が１／１０で、３日間共培養した。ヒストグラムは、Ｔ細胞増殖を示すＣＦＳＥ希釈度を表す。黒線＝ＴＡＤＣなしの非刺激Ｔ細胞；網掛けのヒストグラム＝ＴＡＤＣ存在下のＴ細胞。結果は、１０〜１２個の腫瘍のｎ＝１のプールの、独立した３つの実験を代表するものである。（Ｆ）ＴＡＤＣサブセットとＯＴ−ＩＩＴ細胞（ＤＣ／ＯＴ−ＩＩ＝１／１０）の共培養物の上清を、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の存在について、ルミネックスにより試験した。ｎ≧４。（Ｇ）ＣＤ１１ｂ＋様ＴＡＤＣまたはＭｏ−ＤＣと、ＤＣ／ＯＴ−ＩＩが１／５の割合で、３日間共培養したＯＴ−ＩＩＴ細胞の細胞内染色を、Ｔｈ誘導転写因子ＲＯＲγｔについて実施した。アイソタイプコントロールおよび転写因子の染色を示している。結果は、８〜１２個の腫瘍のｎ＝１のプールの、独立した３つの実験を代表するものである。一元配置分散分析による解析。＊＊、ｐ＜０．０１。（Ｆ）（Ｈ？）ＴＡＤＣサブセットとＯＴ−ＩＩＴ細胞との共培養物（ＤＣ／ＯＴ−ＩＩ＝１／１０）の上清を、ＩＬ−１７の存在についてルミネックスにより試験した。ｎ≧４。一元配置分散分析による解析。＊＊、ｐ＜０．０１。（Ｉ）ｃＤＣ２と、ＤＣ／ＯＴ−ＩＩが１／５の割合で、３日間共培養したＯＴ−ＩＩＴ細胞の細胞内染色を、Ｔｈ誘導転写因子Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３およびＦＯＸＰ３について実施した。アイソタイプコントロールおよび転写因子の染色を示している。（Ｊ）４８時間培養したＴＡＤＣサブセットの上清を、ＩＬ−６およびＩＬ−１βについてルミネックスで試験した。ｎ≧４。一元配置分散分析による統計解析。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【００２０】
【図６】図６は、Ｍｏ−ＤＣの免疫抑制性ＴＩＰ−ＤＣ表現型を示す。（Ａ）１２日目の３ＬＬ−Ｒ腫瘍の単一細胞懸濁液で、ｉＮＯＳおよびＴＮＦ−αの細胞内染色を実施した。ｎ＝４。（Ｂ）４８時間培養したＴＡＤＣサブセットの上清を、ＴＮＦ−αの存在についてルミネックスで試験した。ｎ≧５。一元配置分散分析による解析。＊、ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１。（Ｃ）１２日目の３ＬＬ−Ｒ腫瘍の単一細胞懸濁液で、ミトコンドリアスーパーオキシドアニオンの染色を実施した。ｎ＝４。（Ｄ）４８時間培養したＴＡＤＣサブセットの上清を、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４およびＣＸＣＬ１の存在について、ルミネックスで試験した。ｎ≧４。一元配置分散分析による解析。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。（Ｅ）４８時間培養したＴＡＤＣサブセットの上清を、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２の存在についてルミネックスで試験した。グラフはＩＬ−１０／ＩＬ−１２の割合を示す。ｎ≧４。一元配置分散分析による解析。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。（Ｆ）選別したＭｏ−ＤＣを、ＯＴ−ＩＴ細胞と、３日間、ＤＣ／ＯＴ−Ｉの割合が１／２で共培養した。ヒストグラムは、Ｔ細胞増殖を示すＣＦＳＥ希釈度を表す。比較した条件は、ｉＮＯＳ阻害薬（ＬＮＭＭＡ）またはα−ＩＦＮ−γの有無での、非刺激Ｔ細胞（Ｎｏ  ＴＡＤＣ）および、Ｍｏ−ＤＣ存在下のＴ細胞である。ｎ＝２。
【００２１】
【図７】図７は、腫瘍関連ｃＤＣサブセットの、腫瘍流入領域リンパ節への遊走と、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の差次的な活性化を示す。（Ａ）１２日目の３ＬＬ−Ｒ腫瘍の単一細胞懸濁液を、ＣＣＲ７について染色し、ヒストグラムの重ね書きを示す。黒線＝ＣＣＲ７の発現；網掛けのヒストグラム＝アイソタイプコントロール。ｎ＝３。（Ｂ）Ｏｖａの発現を、１１日目および２２日目のＬＬＣ−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスの、ＬＬＣ−Ｏｖａ癌細胞、および腫瘍、および腫瘍流入領域リンパ節（腋窩または鼠径部）において、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。発現を、Ｓ１２ハウスキーピング遺伝子に基づいて正規化した。ｎ＝３。（Ｃ−Ｄ）腫瘍流入領域リンパ節から選別した示した量のＤＣサブセットを、１０５個の精製したＣＤ８＋ＯＴ−ＩＴ細胞（Ｃ）またはＣＤ４＋ＯＴ−ＩＩＴ細胞（Ｄ）と、３日間共培養した。ヒストグラムは、Ｔ細胞増殖を示すＣＦＳＥ希釈度を表す。黒線＝ＴＡＤＣなしの非刺激Ｔ細胞；網掛けのヒストグラム＝ＴＡＤＣ存在下のＴ細胞。結果は、ｎ＝１０〜１２個の腫瘍の１つのプールの、３つの独立した実験を代表するものである。（Ｅ）選別した腫瘍流入リンパ節ｃＤＣ２サブセットと３日間共培養したＯＴ−ＩＩＴ細胞の細胞内染色を、Ｔｈ誘導転写因子ＲＯＲγｔについて実施した。アイソタイプコントロールおよび転写因子の染色を示している。ｎ＝１０個のプール。
【００２２】
【図８】図８は、ｃＤＣ２ワクチン投与が、ＬＬＣ−腫瘍を有するマウスにおいてｃＤＣ１ワクチン投与よりも有益であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ１７表現型に再度極性化させることを示す。（Ａ）ワクチン投与プロトコールの略図。（Ｂ−Ｃ）ＬＬＣ−ＯＶＡＴＡＤＣサブセットによるワクチン投与後のＬＬＣ−Ｏｖａ腫瘍の成長曲線（Ｂ）および腫瘍重量（Ｃ）。（Ｄ−Ｊ）（Ａ）で示したプロトコールに続く、ＬＬＣ−ＯＶＡＴＡＤＣサブセットによるワクチン投与後の、ＬＬＣ−Ｏｖａ腫瘍における、ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｄ）、Ｏｖａ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｅ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｆ）、ＲＯＲγｔ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｇ）、ＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｈ）、Ｔｂｅｔ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｉ）、Ｇａｔａ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｊ）の割合。全ての実験について、結果はｎ＝４〜１５個の腫瘍の、独立した２つの実験を代表するものである。一元配置分散分析による統計解析。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【００２３】
【図９】図９は、ｃＤＣ２ワクチン投与がＭＤＳＣ浸潤物を減少させ、ＴＡＭを腫瘍促進性（ｐｒｏｔｕｍｏｒａｌ）のＭ２様からＭ１様の表現型に再プログラムすることを示す。（Ａ−Ｂ）図８Ａで示したプロトコールに続く、ＬＣ−ＯＶＡＴＡＤＣサブセットによるワクチン投与後の、ＬＬＣ−Ｏｖａ腫瘍における、Ｍｏ−ＭＤＳＣ（Ａ）およびＧ−ＭＤＳＣ（Ｂ）の割合。結果は、ｎ＝４〜１５個の腫瘍の、独立した２つの実験を代表するものである。一元配置分散分析による統計解析。＊、ｐ＜０．０５。（Ｃ）ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６ＣｈｉＬｙ６Ｇ−Ｍｏ−ＭＤＳＣおよびＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６ＣｉｎｔＬｙ６Ｇ＋Ｇ−ＭＤＳＣを、１２日目の３ＬＬ−Ｒ腫瘍単一細胞懸濁液から選別し、ＯＶＡ刺激されたＯＴ−Ｉ脾細胞に異なる比率で４２時間添加して、Ｔ細胞の増殖を３Ｈ−チミジン取り込み（ｃｐｍ）により測定した。結果は、ｎ＝６個の腫瘍の１つのプールの、独立した３つの実験を代表するものである。（Ｄ−Ｅ）図８Ａで示したプロトコールに続く、ＬＣ−ＯＶＡＴＡＤＣサブセットによるワクチン投与後の、ＬＬＣ−Ｏｖａ腫瘍における、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ−ＴＡＭの割合（Ｄ）およびＭ２様ＭＨＣ−ＩＩｌｏｗＴＡＭ／Ｍ１様ＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈＴＡＭの割合（Ｅ）。結果は、ｎ＝４〜１２個の腫瘍の、独立した２つの実験を代表するものである。一元配置分散分析による統計解析。＊＊＊、ｐ＜０．００１。（Ｆ）ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−単一細胞についてゲーティングした、ｃＤＣ２またはＨＢＳＳをワクチン接種したマウスのＬＬＣ−Ｏｖａ腫瘍の代表的なプロット。（Ｇ）ｃＤＣ２またはＨＢＳＳをワクチン接種したＬＬＣ−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスの、選別したＭＨＣ−ＩＩｌｏｗおよびＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈＴＡＭサブセットにおいて、示したＭ１およびＭ２関連遺伝子の発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて評価した。発現を、Ｓ１２ハウスキーピング遺伝子に基づいて正規化した。ｎ＝６個の腫瘍の１つのプール。一元配置分散分析による統計解析。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【００２４】
【図１０】図１０はＢ１６メラノーマ腫瘍を有するマウスにおいて、ｃＤＣ１ワクチン投与がｃＤＣ２ワクチン投与よりもより有効であることを示す。（Ａ−Ｂ）図８Ａで示したプロトコールに続く、ＬＬＣ−ＯＶＡＴＡＤＣサブセットによるワクチン投与後の、Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍の成長曲線（Ａ）およびＢ１６−Ｏｖａ腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（Ｂ）。ｎ＝４〜６個の腫瘍。一元配置分散分析による統計解析。＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【００２５】
【図１１】図１１は、ＦＡＣＳ選別したｃＤＣ１およびｃＤＣ２サブセットの純度を示す。代表的なプロットおよびゲーティング戦略を、（ｉ）１２日目のＬＬＣ−ＯＶＡ腫瘍のＣＤ１１ｃ＋磁気選別後の腫瘍全体について（すなわち選別前）、およびワクチン投与実験に用いられた（ｉｉ）ｃＤＣ１および（ｉｉｉ）ｃＤＣ２集団のＦＡＣＳ純度について、示している。
【００２６】
【図１２】図１２は、腫瘍転移におけるＴＡＤＣサブセットの治療効果を評価するためのマウスモデルを示している。ＬＬＣ−ＯＶＡ細胞を、足蹠に（１０５個の細胞を）、または、皮下に（３ｘ１０６個の細胞を）注射する。腫瘍は約８００ｍｍ２のサイズまで成長させ、その後、下肢切断（ａ）または皮下腫瘍除去（ｂ）のいずれかによって、切除する。ＴＡＤＣサブセットを、切除した腫瘍から単離し、さらにＦＡＣＳで濃縮して、同じ哺乳動物に注射する。腫瘍転移における治療効果は、肺の重量、および、転移性肺小結節の重量およびサイズを、顕微鏡法により測定することによって評価する。
【００２７】
【図１３】図１３は、ＬＬＣ−腫瘍を有するマウスにおいて、Ｂ１６−ＯＶＡ由来ｃＤＣ２ワクチン投与は、Ｂ１６−ＯＶＡ由来ｃＤＣ１ワクチン投与よりも有益であるが、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスにおいて、Ｂ１６−ＯＶＡ由来ｃＤＣ１およびｃＤＣ２ワクチン投与の両方が、保護を与えることを示す。（Ａ）ワクチン投与プロトコールの略図。（Ｂ−Ｃ）Ｂ１６−ＯＶＡＴＡＤＣサブセットによるワクチン投与後のＬＬＣ−ＯＶＡ腫瘍の成長曲線（Ｂ）および腫瘍重量（Ｃ）。（Ｄ−Ｅ）Ｂ１６−ＯＶＡＴＡＤＣサブセットによるワクチン投与後のＢ１６−ＯＶＡ腫瘍の成長曲線（Ｄ）および腫瘍重量（Ｅ）。ｎ＝５〜７個の腫瘍。一元配置分散分析による統計解析。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
詳細な説明
本発明は、特定の実施形態に関して、およびいくつかの図面を参照して説明されるが、本発明はそれらに限定されず、請求項によってのみ限定される。特許請求の範囲内のいかなる参照符号も、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。図面において、いくつかの要素の大きさは、説明のために誇張されており、縮尺通りに描かれていない場合がある。用語「含む」が本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、他の要素またはステップを排除するものではない。単数名詞を参照するときに不定冠詞または定冠詞、例えば「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」が使用される場合は、他に何か特に明記されていない限り、その名詞の複数形を含む。
【００２９】
明細書および特許請求の範囲における第１、第２、第３などの用語は、同様の要素を区別するために使用され、必ずしも経時的または経年的な順序を説明するために使用されるのではない。そのように使用された用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載された本発明の実施形態は、本明細書に記載または例示された以外の順序で実施することができることを理解されたい。
【００３０】
本発明に含まれる細胞表面マーカーは、ヒト細胞表面マーカーまたは機能的に等価な任意のオルソガスな細胞表面マーカーを指してよい。従って、細胞表面マーカーはまた、限定されるものではないが、例えばマウス細胞表面マーカーを指してよい。
【００３１】
以下の用語または定義は、単に本発明の理解を助けるためにのみ提供される。本明細書において特に規定されていない限り、本明細書中で使用される全ての用語は、本発明の技術分野の当業者にとっての意味と同じ意味を有する。実施者は特に、当業界の定義および用語については、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (1989); およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, New York (1999)を参照されたい。本明細書で提供される定義は、当業者によって理解されるよりも狭い範囲を有すると解釈されるべきではない。
【００３２】
「樹状細胞」または「ＤＣ」は、典型的にはＭＨＣクラスＩＩ細胞表面抗原ＨＬＡ−ＤＲ（ヒト白血球抗原ＤＲ）および共刺激分子を発現し、顆粒球、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球およびＴリンパ球に特異的なマーカーの発現がない（または低い発現を有する）ＡＰＣである。ＤＣは、インビトロおよびインビボで抗原特異的な一次Ｔリンパ球応答を開始させることができ、末梢血白血球、脾細胞、Ｂ細胞および単球と比較して強い混合白血球反応（ＭＬＲ）を指示する。一般に、ＤＣは食作用またはピノサイトーシスによって抗原を取り込み、分解し、その表面に抗原の断片を提示し、サイトカインを分泌する。
【００３３】
「腫瘍関連樹状細胞」または「ＴＡＤＣ」は、腫瘍微小環境に由来するＤＣである。
【００３４】
本明細書で使用される「通常型ＤＣ前駆細胞」または「ｐｒｅ−ｃＤＣ」は、骨髄に由来し、ＤＣ系統に関与する造血前駆細胞であり、ここで、ｐｒｅ−ｃＤＣは、単球および単球由来ＤＣとは異なり、また、ｐｒｅ−ｃＤＣは、さらに通常型ＤＣに分化する能力を有する、部分的に分化した細胞である。
【００３５】
「通常型ＤＣ」または「ｃＤＣ」は、ｐｒｅ−ｃＤＣに由来する、完全に分化したＤＣである。ｃＤＣは、少なくともＣＤ１６−ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＢＤＣＡ２−およびＣＤ１４−の細胞表面表現型により特徴付けられる。
【００３６】
「単球由来樹状細胞」または「Ｍｏ−ＤＣ」は、末梢血単球に由来し、少なくともＨＬＤ−ＤＲ、ＣＤ１１ｃ、ＢＤＣＡ１、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４の発現により特徴付けられる細胞である。
【００３７】
本明細書で使用される「本質的に単球由来樹状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）を含まない」ＴＡＤＣサブセットは、不純物であるＭｏ−ＤＣを不可避なレベル含み得るが、それ以上は含まない、本質的に純粋なＴＡＤＣサブセットである。このことは、ＴＡＤＣサブセットが本質的に純粋であり、１％未満のＭｏ−ＤＣを含むことを意味する。例えば、「本質的にＭｏ−ＤＣを含まない」は、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％以下のＭｏ−ＤＣを意味することができる。これは、０％のＭｏ−ＤＣを意味することもでき、検出可能量のＭｏ−ＤＣを含まないことを指す。
【００３８】
本明細書で使用される「単離された」という用語は、天然の環境から取り出されたことを意味する。「単離された」は、絶対的な単離を必要としない；むしろ、相対的な用語として意図されている。従って、例えば、単離された細胞サブセットは、組織内の天然の環境における細胞サブセットよりも純粋である細胞サブセットである。
【００３９】
本明細書で使用される「濃縮された」という用語は、細胞集団内での、ある細胞タイプまたは細胞サブセットの純度を増加させることを意味する。「濃縮された」は、絶対的な濃縮を必要としない。むしろ、相対的な用語として意図されている。従って、例えば、濃縮された細胞サブセットは、濃縮前の細胞サブセットの純度よりも純粋である細胞サブセットである。
【００４０】
本明細書で使用される「ＢＤＣＡ３＋」または「ＢＤＣＡ３陽性」という用語は、特徴的な細胞表面表現型を指し、細胞がＢＤＣＡ３に特異的な抗体と免疫反応することを意味する。すなわち、蛍光標識した抗ＢＤＣＡ３抗体で染色した細胞のフローサイトメトリー解析の結果が、同じ手順を用いて、アイソタイプコントロール抗体で染色した同じ細胞と比較して、蛍光強度のシフトを示す。当該細胞は、細胞表面にＢＤＣＡ３を発現していると言われる。同様に、「ＢＤＣＡ−」または「ＢＤＣＡ３陰性」という用語は、細胞がＢＤＣＡ３に特異的な抗体と免疫反応しないことを意味する。すなわち、蛍光標識した抗ＢＤＣＡ３抗体で染色した細胞のフローサイトメトリー解析の結果が、同じ手順を用いて、アイソタイプコントロール抗体で染色した同じ細胞と比較して、検出可能な蛍光強度のシフトを示さない。当該細胞は、細胞表面にＢＤＣＡ３を発現していないと言われる。ＢＤＣＡ１、ＢＤＣＡ２、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＨＬＡ−ＤＲの表面発現についても同じことが当てはまる。「ＢＤＣＡ１＋」細胞は、細胞表面にＢＤＣＡ１を発現していると言われるが、「ＢＤＣＡ１−」細胞は、ＢＤＣＡ１細胞表面発現について陰性であると言われる。「ＢＤＣＡ２−」細胞は、ＢＤＣＡ２細胞表面発現について陰性であると言われる。「ＣＤ１１ｂ＋」細胞は、細胞表面にＣＤ１１ｂを発現していると言われるが、「ＣＤ１１ｂ−」細胞は、ＣＤ１１ｂ細胞表面発現について陰性であると言われる。「ＣＤ１１ｃ＋」細胞は、細胞表面にＣＤ１１ｃを発現していると言われる。「ＣＤ１４−」細胞は、ＣＤ１４細胞表面発現について陰性であると言われる。「ＣＤ１６−」細胞は、ＣＤ１６細胞表面発現について陰性であると言われ、「ＨＬＡ−ＤＲ＋」細胞は、細胞表面にＨＬＡ−ＤＲを発現していると言われる。本発明において、細胞表面表現型は、表面細胞マーカーの有無を特徴としている。上述の表面細胞マーカーは、ヒトのマーカーを表している。とは言うものの、本発明には、上述のヒトのマーカーと機能的に等価なオルソロガスなマーカーもまた含まれる。
【００４１】
本明細書で使用される「哺乳動物」は、哺乳類のクラスの任意のメンバーを指し、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばチンパンジーおよび他の類人猿およびサル種；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ラマおよびウマなどの家畜；犬や猫などの飼育哺乳動物；マウス、ラット、およびモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物などが含まれるが、これらに限定されない。本用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。従って、成体または新生児の対象、並びに胎児が、雄か雌かにかかわらず、本用語の範囲内に含まれることが意図されている。用語「患者」、「個体」、および「対象」は、本明細書において互換的に用いられ、ヒトを含む哺乳動物を包含している。
【００４２】
本明細書で使用される「腫瘍」または「腫瘍組織」は、悪性か良性かにかからわらず、腫瘍性細胞成長（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｉｌａｔｉｏｎ）を有するすべての細胞、および腫瘍関連細胞を指す。腫瘍は、腫瘍環境に存在する異なる細胞タイプを含む、腫瘍組織全体を指す。腫瘍組織には、癌細胞が含まれるが、非形質転換宿主細胞、または、腫瘍関連間質細胞などの腫瘍関連細胞もまた含まれる。腫瘍関連細胞の例には、ＴＡＤＣおよび腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が含まれる。腫瘍は、限定されるものではないが固形腫瘍を含む、任意のタイプの癌であってよい。固形腫瘍は癌性腫瘍であってよく、限定されるものではないが、哺乳動物の前立腺、胃、肝臓、脾臓、膵臓、結腸、腎臓、胆嚢、卵巣、精巣、陰茎、直腸、肺、気管、乳房、心臓、脳、甲状腺、副甲状腺、下垂体、胸腺、筋肉、頭部，頸部、皮膚、網膜、ぶどう膜、結膜、唾液腺、副腎、咽頭、食道、汗腺および皮脂腺に生じる癌性腫瘍を含む。
【００４３】
本明細書で使用される「切除した腫瘍」は、既に外科的に除去された腫瘍を指す。切除は、目に見える全ての癌組織の外科的除去を指してもよい。切除した腫瘍は、従って、手術後に、すなわち、腫瘍が手術で除去された後に得られる。腫瘍切除には、原発性腫瘍および二次性腫瘍の切除が含まれる。切除はまた、限定されるものではないが、生検などの方法による、腫瘍の一部の除去を指してもよい。部分的に切除した腫瘍は、従って、手術後に、すなわち、腫瘍の一部が生検で除去された後に得られる。
【００４４】
本明細書で使用される「切除した腫瘍流入領域リンパ節」は、既に外科的に除去された腫瘍流入領域リンパ節を指す。外科的除去は、1つ以上の群のリンパ節のリンパ節切開（ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ）を意味するリンパ節郭清術を指すことができる。外科的除去はまた、生検を指すことができる。
【００４５】
本明細書で使用される「転移」は、身体のある器官または部分に由来する癌細胞が、身体の別の部分に再配置し、増殖を続けるプロセスを指す。転移した細胞は、続いて、さらに転移する可能性のある腫瘍を形成し得る。したがって、転移は、元々発生していた身体の部分から身体の他の部分への癌の広がりを指す。
【００４６】
本明細書で使用される「処置」および「処置すること」は、たとえ処置が部分的であっても、あるいは、最終的には失敗したとしても、目的が、処置目的の疾患（例えば、癌）または該疾患の症状を、抑制または緩徐化（軽減）することであるか、症状を改善することである、治療的処置（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防の（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指す。処置を必要とする者には、既に疾患と診断されたもの、並びに、疾患に罹りやすい傾向がある者もしくは疾患に罹りやすい素因がある者、または疾患が予防されるべき者が含まれる。例えば、腫瘍（例えば、癌）処置において、治療薬は、腫瘍細胞の病態を直接減少させることができ、あるいは、他の治療薬による、または対象自身の免疫系による処置に、腫瘍細胞をより感受性にすることができる。
【００４７】
本発明の第１の局面は、本質的にＭｏ−ＤＣを含まない、ｐｒｅ−ｃＤＣ起源の、単離されたＴＡＤＣサブセットであって、哺乳動物の切除した腫瘍、または切除した腫瘍流入領域リンパ節から得られる、哺乳動物の腫瘍転移の処置における使用のための、単離されたＴＡＤＣサブセットに関する。従って、単離されたＴＡＤＣサブセットの具体的な実施形態には、（a）ｐｒｅ−ｃＤＣからのＴＡＤＣサブセットの誘導、（ｂ）Ｍｏ−ＤＣの実質的欠如および（ｃ）腫瘍または腫瘍流入領域リンパ節の切除後の、腫瘍または腫瘍流入領域リンパ節からのＴＡＤＣサブセットの回収が含まれる。本明細書で使用されるｐｒｅ−ｃＤＣ起源の単離されたＴＡＤＣサブセットは、１つ以上のｐｒｅ−ｃＤＣ起源のＴＡＤＣサブセットを意味し得る。好ましくは、該ＴＡＤＣサブセットは１つのＴＡＤＣサブセットを含む。あるいは、該ＴＡＤＣサブセットは、Ｐｒｅ−ｃＤＣ起源のいくつかのＴＡＤＣサブセット、すなわち、ＴＡＤＣサブセットの混合物を含む。目的の腫瘍由来ＤＣサブセットは、切除した腫瘍または切除した腫瘍流入領域リンパ節由来であってよいが、該組織からのＴＡＤＣサブセットの単離は、腫瘍または腫瘍流入領域リンパ節の外科的切除後に行われる。好ましい実施形態において、目的のＴＡＤＣには、哺乳動物起源の細胞が含まれ、より好ましくは、ヒト起源の細胞が含まれる。
【００４８】
ＴＡＤＣサブセットは、例えば、標準的な単離技術によって単離され得る。いくつかの実施形態において、ＴＡＤＣサブセットは、腫瘍単一細胞懸濁液を調製することにより、切除した腫瘍、または、切除した腫瘍流入領域リンパ節から単離され得る。具体的な実施形態において、これらの腫瘍単一細胞懸濁液は、切除した腫瘍または切除した腫瘍流入領域リンパ節を小片に切断し、該小片をコラゲナーゼおよびＤＮａｓｅを含む消化培地でインキュベートし、次いで密度勾配遠心分離によってデブリおよび死細胞を除去することによって得ることができる。ＴＡＤＣおよび／またはＴＡＤＣサブセットを単離するための技術の非限定的例は、Laoui et al., 2014において見出すことができ、本文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
ＴＡＤＣサブセット、例えば、腫瘍単一細胞懸濁液由来のＴＡＤＣサブセットは、例えば、ＭＡＣＳおよび／またはＦＡＣＳにより濃縮されてよい。いくつかの実施形態において、ＴＡＤＣサブセットは、腫瘍由来ＤＣサブセットが、細胞調製物中の総細胞含有量の、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を示すように、濃縮される。本発明によれば、単離されたＴＡＤＣサブセットは、本質的にＭｏ−ＤＣを含まない。上述のＴＡＤＣサブセットは、いくつかのＴＡＤＣサブセット、すなわち、ＴＡＤＣサブセットの混合物を含有し得る。いくつかの実施形態において、ＴＡＤＣサブセットの混合物は、腫瘍由来ＤＣサブセットの混合物が、細胞調製物中の総細胞含有量の、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を示すように、濃縮される。本発明によれば、単離されたＴＡＤＣサブセットの混合物は、本質的にＭｏ−ＤＣを含まない。いくつかの実施形態において、異なるＴＡＤＣサブセットは、別々に濃縮され、濃縮後に混合されてよい。代替の実施形態において、異なるＴＡＤＣサブセットは、同一の濃縮手順で濃縮されてよい。
【００５０】
特定の実施形態によれば、本明細書に上述したＴＡＤＣサブセットには、１％以下のＭｏ−ＤＣが含まれ、すなわち、単離されたサブセットは、最大で１％のＭｏ−ＤＣを含有する。コンタミネーションのレベルは、通常、フローサイトメトリー解析により評価されるであろう。
【００５１】
特定の実施形態によれば、上述の単離されたＴＡＤＣサブセットは、ＭＨＣクラスＩＩ細胞表面抗原ＨＬＡ−ＤＲ）および表面抗原ＣＤ１１ｃが陽性であり、表面抗原ＣＤ１６、ＢＣＤＡ２およびＣＤ１４が陰性である表現型を特徴とする。さらなる特定の実施形態において、該ＴＡＤＣサブセットは、表面抗原ＢＤＣＡ３（血液樹状細胞抗原３）が陽性であり、表面抗原ＢＤＣＡ１（血液樹状細胞抗原１）およびＣＤ１１ｂが陰性である表現型をさらに特徴とする。細胞表面表現型ＣＤ１６−ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＢＤＣＡ２−ＣＤ１４−ＢＤＣＡ１−ＢＤＣＡ３＋ＣＤ１１ｂ−を有する当該ＴＡＤＣサブセットは、本明細書において、さらに「ｃＤＣ１」サブセットと呼ばれる。
【００５２】
特定の実施形態によれば、上述の単離されたＴＡＤＣサブセットは、ＭＨＣクラスＩＩ細胞表面抗原ＨＬＡ−ＤＲおよび表面抗原ＣＤ１１ｃが陽性であり、表面抗原ＣＤ１６、ＢＣＤＡ２およびＣＤ１４が陰性である表現型を特徴とし、表面抗原ＢＤＣＡ３が陰性であり、表面抗原ＢＤＣＡ１およびＣＤ１１ｂが陽性である表現型を特徴とする。細胞表面表現型ＣＤ１６−ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＢＤＣＡ２−ＣＤ１４−ＢＤＣＡ１＋ＢＤＣＡ３−ＣＤ１１ｂ＋を有する当該ＴＡＤＣサブセットは、本明細書において、さらに「ｃＤＣ２」サブセットと呼ばれる。ＢＤＣＡ３およびインターフェロン調節因子８（ＩＲＦ８）は、ｃＤＣ２サブセットに対してｃＤＣ１サブセットを規定するのに、同等に良好なマーカーであり、互換的に使用することができる。
【００５３】
具体的な実施形態によれば、当該「ｃＤＣ１」サブセットは、癌を有する哺乳動物において、転移を処置するために特に有用である。さらに特定の実施形態において、ｃＤＣ１サブセットは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に感受性である腫瘍を有する哺乳動物において、転移を処置するために用いられ得る。これらのＣＴＬ感受性腫瘍の非限定的な例には、メラノーマ、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、結腸癌および尿管−消化器腫瘍（ｕｒｏ−ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ）などのマイクロサテライト不安定性腫瘍が含まれる。
【００５４】
具体的な実施形態によれば、当該「ｃＤＣ２」サブセットは、癌を有する哺乳動物において、転移を処置するために特に有用である。さらなる特定の実施形態において、ｃＤＣ２サブセットは、強い免疫抑制性の骨髄球系のコンパートメント（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）を有する腫瘍を有する哺乳動物において、転移を処置するために用いられ得る。強い免疫抑制性の骨髄球系のコンパートメントを有する腫瘍の非限定的な例は、乳癌腫である。
【００５５】
具体的な一実施形態によれば、上述のＴＡＤＣサブセットは、Ｍｏ−Ｄｃをほとんど含まないＴＡＤＣ亜集団を獲得するために、（ａ）哺乳動物の既に切除した腫瘍または腫瘍流入領域リンパ節からＴＡＤＣを調製すること、および（ｂ）当該ＴＡＤＣ調製物からＴＡＤＣサブセットを精製することを含む手順により、得ることができる。特定の実施形態によれば、当該手順は浮遊密度遠心分離、免疫磁気選別および／または除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）並びに蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いることができる。これらの方法は、非限定的であり、組み合わせることができる。当業者に知られている様々な単離方法のいずれかを使用して、ＴＡＤＣサブセットの濃縮を達成することができ、その例は上記に提供されていることに留意されたい。
【００５６】
本発明は、本明細書に記載されるＴＡＤＣサブセット（「有効成分」とも呼ぶ）、および、医薬的に許容される担体または賦形剤を含む、腫瘍転移の処置における使用のための医薬組成物に関する。これらの組成物は、それを必要とする対象に投与することによって、所望の薬理学的効果を達成するのに、利用することができる。医薬的に許容される担体は、好ましくは、担体に起因する任意の副作用が有効成分の有益な効果を損なわないように、有効成分の有効量と一致する濃度で、対象にとって比較的毒性がなく無害である担体である。有効成分の医薬的に有効な量は、好ましくは、処置される特定の状態に結果をもたらすか、影響を及ぼす量である。通常、当該医薬組成物は、１つのＴＡＤＣサブセットを含み得る。当該医薬組成物は、いくつかのＴＡＤＣサブセット／ＴＡＤＣサブセットの混合物を含んでよい。
【００５７】
本発明はまた、哺乳動物において腫瘍転移を処置する方法であって、同じ哺乳動物から得られた単離されたＴＡＤＣサブセットであって、（ａ）ｐｒｅ−ｃＤＣに由来すること、（ｂ）Ｍｏ−ＤＣを含まないこと、および（ｃ）既に切除した腫瘍または腫瘍流入領域リンパ節から単離されたことをさらに特徴とする、単離されたＴＡＤＣサブセットの投与を含む方法を提供する。
【００５８】
単離されたＴＡＤＣサブセットまたは本発明のＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、限定されるものではないが、メラノーマなどのがんの転移を処置するために使用することができる。特定の実施形態において、単離されたＴＡＤＣサブセット「ｃＤＣ１」またはＴＡＤＣサブセット「ｃＤＣ１」を含む医薬組成物は、限定されるものではないが、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、結腸癌およびマイクロサテライト不安定腫瘍などの、ＣＴＬ感受性腫瘍を処置するために使用することができる。
【００５９】
他の実施形態において、単離されたＴＡＤＣサブセット「ｃＤＣ２」またはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、限定されるものではないが、乳癌腫などの、大量の免疫抑制性の骨髄系細胞の存在を特徴とする腫瘍を処置するために使用することができる。
【００６０】
様々な実施形態において、単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、抗原に対する免疫応答（例えば、Ｔ細胞応答）を誘導するのに十分な量で投与される。本発明の他の実施形態は、上述の単離されたＴＡＤＣサブセットまたは上述のＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物を用いて、癌（例えば、メラノーマ、乳癌）を処置する方法を提供する。ある実施形態において、癌を処置する方法は、本明細書に記載される単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物を、哺乳動物に投与することを含む。ある実施形態において、癌を処置する方法は、本明細書に記載される単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物を、ヒト患者に投与することを含む。他の実施形態は、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、結腸癌、マイクロサテライト不安定性腫瘍、または乳癌などの癌の転移を処置する方法を提供する。ある実施形態において、単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、自己ＤＣを含み得る。本明細書に開示されるワクチン投与方法における使用に好適なＤＣは、当該細胞が見出される腫瘍組織から単離するか、または、得ることができる。
【００６１】
単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、例えば、限定されるものではないが化学療法、免疫療法および／または放射線を含む、他の治療的処置と組み合わせて投与することができる。単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、皮内、動脈内、皮下、筋肉内、静脈内、リンパ内または結節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ）経路による注射によって投与することができる。他の実施形態において、本発明の単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、腫瘍に直接的に、もしくは、その近傍に投与されるか、または、切除した腫瘍の部位に直接的に、もしくは、その近傍に投与される。単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、有益な結果を与えるために、哺乳動物に１回以上投与することができる。単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、手術後に、すなわち、腫瘍の切除後に、投与することができる。当業者であれば、単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物を投与する適切なタイミングを決定することができるであろう。単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物の最初の、および／またはその後の投与のタイミングは、限定されるものではないが哺乳動物の健康、安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）、年齢、および体重を含む様々な要因に依存し得る。単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、例えば、限定されるものではないが週に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヵ月に１回などの、任意の適切な時間間隔で投与することができる。ある実施形態において、単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、無期限に投与することができる。ある実施形態において、単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、２週間の間隔で３回投与することができる。単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、調製して凍結し、後で使用することができ、あるいは、単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、調製して直ちに使用することができる。単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物の適切な投与量は、限定されるものではないが哺乳動物の健康、安定性、年齢、および体重を含む様々な要因に依存し得る。ある実施形態において、単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、約１０４個から約１０９個のＴＡＤＣを含む。別の実施形態において、単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、約１０６個から約１０７個のＴＡＤＣを含む。別の実施形態において、単離されたＴＡＤＣサブセットまたはＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物は、約１０７個のＴＡＤＣを含む。
【００６２】
さらなる局面によれば、ｐｒｅ−ｃＤＣ起源であって、Ｍｏ−ＤＣの存在に関して本質的に純粋なＴＡＤＣサブセットを含み、当該ＴＡＤＣサブセットが切除した腫瘍または腫瘍流入領域リンパ節から手術後に得られたものである医薬組成物が提供される。哺乳動物における腫瘍転移の処置のために、該医薬組成物が提供されることが、本明細書において想定される。当該哺乳動物は、ＴＡＤＣサブセットが単離された哺乳動物と同一である。
【００６３】
別の局面において、哺乳動物において腫瘍転移を処置する方法であって、ＴＡＤＣサブセットまたは当該ＴＡＤＣサブセットを含む医薬組成物を、当該哺乳動物に投与することを含む方法が提供され、ここで（ａ）ＴＡＤＣサブセットはｐｒｅ−ｃＤＣに由来し、（ｂ）ＴＡＤＣサブセットはＭｏ−ＤＣを含有せず、（ｃ）ＴＡＤＣサブセットは切除した腫瘍または切除した腫瘍流入領域リンパ節から単離される。
【００６４】
本発明による細胞および方法について、特定の実施形態、具体的な構成、ならびに材料および/または分子が本明細書において議論されているが、形態および詳細における種々の変更または改変が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく行えることは理解されるべきである。以下の実施例は、特定の実施形態をよりよく例示するために提供されるものであり、本出願を限定するものと見なされるべきではない。本出願は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００６５】
実施例の材料および方法
【００６６】
マウス、細胞株、および腫瘍モデル
雌Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ４５．２およびＣＤ４５．１  Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｊａｎｖｉｅｒから得た。ユビキチン−ＧＦマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎから購入した。Ｃｓｆ２ｒｂ−／−、Ｆｌｔ３ｌ−／−、Ｃｃｒ２−／−およびＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスは、それぞれ、Melanie Greter (University of Zurich, Germany)、Bart Lambrecht (UGent, Belgium)、Frank Tacke (Aachen University, Germany)および Massimiliano Mazzone (KULeuven, Belgium)によって提供された。全ての手順は、Belgian Council for Laboratory Animal Scienceのガイドラインに従った。
【００６７】
ＬＬＣは、ＡＴＣＣ細胞生物学コレクションから購入した。３ＬＬ−Ｒおよび３ＬＬ−Ｓ細胞は、以前に記載されたように（Remels and De Baetselier, 1987）、Ｃ５７ＢＬ／６ルイス肺癌細胞から、研究所内で（ｉｎ  ｈｏｕｓｅ）生成した。ＬＬＣ−ＯＶＡ、ＭＣ３８、Ｂ１６−ＯＶＡおよびＴ２４１細胞は、それぞれ、Dmitry Gabrilovich (The Wistar Institute, Philadelphia, USA)、Massimiliano Mazzone (VIB-KULeuven, Leuven, Belgium)、Karine Breckpot (Vrije Universiteit Brussel, Brussels, Belgium)およびLena Claesson-Welsh (University of Uppsala, Uppsala, Sweden)から親切なことに贈与された。
【００６８】
ＬＬＣ−ＯＶＡ、３ＬＬ−Ｒおよび３ＬＬ−Ｓ細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）の熱失活したウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｇｉｂｃｏ）、３００μｇ／ｍｌのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−１６４０培地で維持し、マイコプラズマの存在を毎月試験した。ＭＣ３８、Ｂ１６−ＯＶＡおよびＴ２４１培養物については、ＲＰＭＩをダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）に置き換えた。
【００６９】
ＬＬＣ、ＬＬＣ−ＯＶＡ、３ＬＬ−Ｒ、３ＬＬ−Ｓ肺癌腫細胞、ＭＣ３８結腸癌腫細胞、Ｂ１６−ＯＶＡメラノーマ細胞およびＴ２４１線維肉腫細胞（ｆｉｃｒｏｓａｒｃｏｍａ  ｃｅｌｌ）を回収し、２００μｌのＰＢＳ中の３×１０６個の単一細胞懸濁液を、同系のＣ５７Ｂｌ／６マウスの右側腹部に皮下注射した。雌のＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスは、乳房腫瘍を自然発生的に発症する。
【００７０】
エクスビボのＴＡＤＣおよびＴ細胞培養物については、当該培地に、１ｍＭの非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．０２ｍＭの２−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。
【００７１】
３ＬＬ−Ｒの胸腔内注射については、５×１０５個の３ＬＬ−Ｒ癌腫細胞を回収して、５０μｌのＰＢＳ中の２５μｇのマトリゲルで再懸濁した。細胞懸濁液を注射まで氷上で保管した。マウスを麻酔し、左側臥位に置いた。３０ゲージの皮下針を備えた１ｍｌのツベルクリン注射器を使用して、経皮的に接種細胞を胸郭右側面の、側方背側腋窩であって、肩甲骨の下縁の直下で、下位肋骨のおよそ１．５ｃｍ上部に注射した。針を、胸郭内に６ｍｍを急速に進め、注射後すぐに針を外した。腫瘍注射後、マウスを右側臥位に回転させた。７日目に、マウスを屠殺して、肺組織および肺腫瘍を取り除いた。
【００７２】
経肛門直腸癌注射（ｔｒａｎｓ−ａｎａｌ  ｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）については、マウスを、ネンブタールの１０倍希釈液で麻酔した。肛門外口を、先端の丸い鉗子で、穏やかに広げた。糞便が存在する場合は、軟性カテーテルを用いて、結腸を生理食塩水で洗い流した。ＭＣ３８細胞を、２９ゲージの注射器で、５０μｌＰＢＳ当たり２．５×１０５個の濃度で、遠位後部直腸（ｄｉｓｔａｌ  ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｒｅｃｔｕｍ）の粘膜下に注射した。注射後、注射器を数秒間定位置に保持し、逆流を防いだ。４週間後に、マウスを屠殺して、腫瘍を注意深く取り除いた。
【００７３】
腫瘍体積を、ノギス測定により決定して、公式：Ｖ＝πｘ［ｄ２ｘＤ］／６を用いて計算した。ここで、ｄは腫瘍の短径（ｍｉｎｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ａｘｉｓ）であり、Ｄは腫瘍の長径（ｍａｊｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ａｘｉｓ）である。
【００７４】
肺癌および結腸直腸癌患者
ｐＴ２ａＮ１Ｍ０（ステージＩＩＡ）有棘細胞癌およびｃＴ１ｂＮ０Ｍ０（ステージＩＡ）癌腫を有する２名の男性（年齢は６８歳および６７歳）、並びに、ｐＴ２ａＮ０Ｍ０（ステージＩＢ）腺癌およびｐＴ２ａＮ１Ｍ０（ステージＩＩＡ）有棘細胞癌を有する２名の女性（年齢は６７歳および５９歳）を含む、術前化学療法を受けていない４名の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者を登録した。登録した４名の結腸直腸癌患者は、化学療法を受けておらず、ｐＴ３Ｎ０腺癌を有する３名の男性（年齢は７１歳および６２歳）、ステージＩのＴ２Ｍ０Ｎ０腺癌を有する１名の男性（年齢は７９歳）、およびステージＩＶの腺癌を有する１名の女性（年齢は４９歳）が含まれた。全てのプロトコールは、ガストハイスベルグ大学病院(ルーバン、ベルギー)の倫理委員会によって承認され、全ての対象は、研究への参加に先立ち、書面によるインフォームド・コンセントを提出した。
【００７５】
腫瘍、リンパ節、骨髄および脾臓の調整、フローサイトメトリーおよび細胞選別
腫瘍を切除し、小片に切り、１０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩ、４００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ、および３０Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）により、３７℃で３０分間処理し、潰して濾過した。赤血球を、赤血球溶解バッファーを用いて除去し、密度勾配（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）を用いて、デブリおよび死細胞を除去した。
【００７６】
腫瘍流入領域リンパ節（ＬＮ）を切断し、１０Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩ、４００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ、および３０Ｕ／ｍＬのＤＮａｓｅＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）により、３７℃で４５分間分離させ、濾過した。
【００７７】
脾臓を２００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼＩＩＩ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）で洗い流し、３７℃で３０分間放置した。その後脾臓を濾過して、赤血球を、赤血球溶解バッファーを用いて除去した。
【００７８】
腫瘍、脾臓またはＬＮからＤＣ亜集団を精製するために、ＣＤ１１ｃ＋細胞をＭＡＣＳで濃縮し（抗ＣＤ１１ｃマイクロビーズ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて選別した。
【００７９】
骨髄（ＢＭ）白血球を、脛骨および大腿骨を洗浄することにより単離した。得られた細胞懸濁液を濾過し、赤血球を、赤血球溶解バッファーを用いて除去した。ＢＭ単球を精製するために、ＣＤ１１ｂ＋細胞を、選別に先立ちＭＡＣＳで濃縮した（抗ＣＤ１１ｂマイクロビーズ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）。
【００８０】
細胞表面染色のための市販の抗体を表１に列挙する。特異的結合を防ぐために、細胞をラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とプレインキュベートした。
【００８１】
正規化されたΔ蛍光強度中央値（ｄｅｌｔａ−Ｍｅｄｉａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）（ΔＭＦＩ）は、［（ＭＦＩ染色）−（ＭＦＩアイソタイプ染色）］／（ＭＦＩ染色）として計算した。ＦＡＣＳデータは、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩまたはＬＳＲＩＩ（共に、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて取得し、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて解析した。ＴＡＤＣを精製するために、９〜１５個のプールした腫瘍から、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を選別した。
【００８２】
サイトカインおよびケモカイン産生の測定
サイトカインおよびケモカインの濃度を、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって、供給元のプロトコールに従い測定した。
【００８３】
インビボおよびインビトロ食作用、ＤＱ−ＯＶＡ処理、混合白血球反応アッセイ、並びに、ＯＴ−ＩおよびＯＴ−ＩＩのＴ細胞活性化
インビトロでのラテックスの取り込みのために、新たに単離された腫瘍の単一細胞懸濁液を、１：５０００に希釈したラテックス微粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で、４℃または３７℃で４０分間、９６穴プレートで培養した。ＴＡＤＣによるラテックスの取り込みを、フローサイトメトリーにより評価した。インビボでのＴＡＤＣによるラテックスの取り込みを測定するために、腫瘍を有するマウスに、ＰＢＳ中に１：２５に希釈した黄緑色のラテックス微粒子（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）２５０μｌを、静脈内注射した。１〜２時間後に、腫瘍単一細胞懸濁液を作製し、ＴＡＤＣ亜集団によるラテックス取り込みを、フローサイトメトリーで評価した。
【００８４】
ＴＡＤＣ抗原処理を評価するために、１０μｇ／ｍｌのＤＱ−ＯＶＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の存在下で、０℃または３７℃で１５分間インキュベートし、抗原取り込みを可能にした。完全に洗浄した後、細胞は０℃または３７℃で、異なる時間間隔で、ＤＱ−ＯＶＡを細胞内でさらに処理することができた。それぞれの時間間隔の後、細胞を表面標識し、各サブセットにおけるＤＱ−ＯＶＡの蛍光をフローサイトメトリーで測定した。
【００８５】
ＯＴ−ＩおよびＯＴ−ＩＩ増殖アッセイのために、ＭＡＣＳ選別したＣＤ１１ｃ−ＣＤ８＋ＯＴ−１およびＣＤ１１ｃ−ＣＤ４＋ＯＴ−２Ｔ細胞を、０．２μＭのＣＦＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で、製造者の指示に従って染色した。精製したＴＡＤＣを、１０５個のＯＴ−ＩまたはＯＴ−ＩＩＴ細胞に添加し、ポジティブコントロールとして、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および２μｇ／ｍｌのＣＤ２８で刺激した。
【００８６】
誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）を抑制するために、共培養物に、５μＭのＬ−ＮＭＭＡ（ＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン、Ａｌｅｘｉｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を添加した。７２時間のコインキュベーションの後、Ｔ細胞の増殖を、フローサイトメトリーを用いて、ＣＦＳＥ希釈により測定した。
【００８７】
ｐｒｅ−ｃＤＣおよび単球の養子移入
骨髄Ｌｙ６Ｃｈｉ単球およびｐｒｅ−ｃＤＣを、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識し、ＣＤ４５．２マウスから選別した。１０６個のＬｙ６Ｃｈｉ単球または４×１０５個のｐｒｅ−ｃＤＣを、３ＬＬ−Ｒ腫瘍を有するＣＤ４５．１マウスに、静脈内注射した。７２時間後に、ＣＤ４５．２＋  ＣｅｌｌＴｒａｃｅ＋の子孫の運命を決定した。
【００８８】
ＴＡＤＣワクチン投与実験
ワクチン投与実験のために、ナイーブＣ５７Ｂｌ／６マウスに、ＬＬＣ−ＯＶＡまたはＢ１６−ＯＶＡの皮下接種の６週間前および３週間前に、特定のサブセットの１０４個のＴＡＤＣを皮下注射した。ＴＡＤＣを、ＬＬＣ−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスまたはＢ１６−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスの１０〜１２匹のプールから選別した。１００μｌのＣＦＡに溶解した１００μｇのＯＶＡタンパク質を皮下にワクチン接種したマウスを、ポジティブコントロールとして用いた。
【００８９】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ調製、および定量的リアルタイムＰＣＲ
これらの実験を、以前に記載された通りに実施した（Movahedi et al., 2010）。ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抽出し、オリゴ（ｄＴ）およびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で逆転写した。定量的リアルタイムＰＣＲは、ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてｉＣｙｃｌｅｒで行った。プライマー配列は、補足の表２に列挙している。ＰＣＲサイクルは、９４℃１分、５５℃４５秒、７２℃１分からなる。遺伝子発現は、ハウスキーピング遺伝子としてリボソームタンパク質Ｓ１２（Ｍｒｐｓ１２）を用いて正規化した。プライマーは表２に列挙している。
【００９０】
統計
有意性は、スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡと、その後のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０ソフトウェアを用いた事後検定（ｐｏｓｔ  ｔｅｓｔ）によって決定した。ｐ値＜０．０５を、統計的に有意であるとみなした。全てのグラフは、平均±ＳＥＭを示す。
【００９１】
実施例１：異なる腫瘍関連樹状細胞亜集団は、様々な前駆体に由来する
固形腫瘍における異なる腫瘍関連ＤＣ（ＴＡＤＣ）集団の相対的存在量を説明するために、我々は最初に骨髄系細胞が強く浸潤することが知られている３ＬＬ−Ｒルイス肺癌細胞モデル（Laoui et al.,2014）を採用した。これらの腫瘍は、ＣＤ３ｎｅｇＣＤ１９ｎｅｇＬｙ６ＧｎｅｇＣＤ１１ｃｈｉＭＨＣ−ＩＩｈｉＴＡＤＣのかなりの大きさの集団を含有する（図１Ａ）。以前の研究では、ＣＤ２４、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６ＣおよびＣＤ６４の差次的発現変動に基づき、異なるＤＣ集団が特徴付けられた（Langlet et al.,2012）。当該アプローチを用いて、３つの別々のＴＡＤＣサブセットが明確に識別できた（図１Ａ）：ｙ６ＣｌｏＣＤ６４ｌｏＣＤ２４＋ＣＤ１１ｂｌｏ通常型ＴＡＤＣ（ｃＤＣ１、ゲート１）、Ｌｙ６ＣｌｏＣＤ６４ｌｏＣＤ２４ｉｎｔ−ｌｏＣＤ１１ｂ＋通常型ＴＡＤＣ（ｃＤＣ２、ゲート２）およびＬｙ６ＣｈｉＣＤ６４ｈｉＣＤ２４ｉｎｔＣＤ１１ｂ＋単球由来ＴＡＤＣ（Ｍｏ−ＤＣ、ゲート３）である。当該状況は、いくつかの非癌性組織で報告されている状況(Guilliams et al., 2010)と同様である。
【００９２】
さらに、３ＬＬ−Ｒ腫瘍を有するマウスにおいて、ｐｒｅ−ｃＤＣおよび単球の養子移入により、ＴＡＤＣサブセットの起源を評価した。３ＬＬ−Ｒ腫瘍を有するＣＤ４５．１＋レシピエントマウスに、選別したＣＤ４５．２＋Ｂ２２０−ＣＤ１１ｃ＋ＳｉｒｐαｉｎｔＣｅｌｌＴｒａｃｅ＋骨髄ｐｒｅ−ｃＤＣ前駆細胞（Scott et al., 2015）を養子移入した場合、Ｌｙ６ＣｌｏＣＤ６４ｌｏＣＤ２４＋ＣＤ１１ｂｌｏおよびＬｙ６ＣｌｏＣＤ６４ｌｏＣＤ２４ｉｎｔ−ｌｏＣＤ１１ｂ＋細胞のみを７２時間後に腫瘍から回収することができた（図１Ｂ）。重要なことに、移入されたｐｒｅ−ｃＤＣ前駆細胞は、当該期間中に、ＣＤ６４ｈｉＣＤ１１ｂ＋に分化しなかった。対照的に、移入されたＣＤ４５．２＋ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ−Ｌｙ６Ｃ＋ＭＨＣ−ＩＩ−ｅＦｌｕｏｒ４５０＋骨髄単球は、ＴＡＤＣゲート内で、ＣＤ６４ｈｉＣＤ１１ｂ＋細胞として、全て回収された。ほとんどの移入された単球は、３ＬＬ−Ｒ腫瘍において単球由来細胞の大部分を占めるＭＨＣ−ＩＩｌｏｗおよびＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈＴＡＭを生じたので、比較的少量のＣＤ４５．２＋Ｍｏ−ＤＣが腫瘍から回収されたことに注意されたい（データ不掲載）。全体として、これらのデータは、Ｌｙ６ＣｌｏＣＤ６４ｌｏＣＤ２４＋ＣＤ１１ｂｌｏ、Ｌｙ６ＣｌｏＣＤ６４ｌｏＣＤ２４ｉｎｔ−ｌｏＣＤ１１ｂ＋およびＣＤ６４ｈｉＣＤ１１ｂ＋細胞が、それぞれｃＤＣ１、ｃＤＣ２およびＭｏ−ＤＣを表すことを示す。
【００９３】
養子移入実験の裏付けとして、ＢＭからの単球の放出が著しく減少しているＣＣＲ２欠損マウス（Serbina et al.,  2008）で増殖した３ＬＬ−Ｒ腫瘍は、ＭｏＤＣサブセットのほとんど完全な欠如を示した一方、ｃＤＣ１およびｃＤＣ２は影響を受けなかった（図１Ｃ）。それらのｃＤＣ個体発生と一致して、Ｆｌｔ３Ｌ−ＫＯマウスおよびＧＭ−ＣＳＦＲ−ＫＯマウスの両方において、腫瘍関連ｃＤＣ１およびｃＤＣ２の量は著しく減少し、これらの増殖因子の両方に依存することが示された（図１Ｃ）。両方のＫＯ株において腫瘍でｃＤＣ２が残存していることは、それらの生成および／または生存が腫瘍微小環境における（他の）造血増殖因子の同時作用に依存し得ることを示唆している（Kingston et al., 2009）。重要なことに、Ｍｏ−ＤＣもまた、Ｆｌｔ３Ｌの欠損およびＧＭ−ＣＳＦへの応答不可によって大きく影響された。このＭｏ−ＤＣの低下が、Ｍｏ−ＤＣの分化／維持に対するＦｌｔ３Ｌおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの直接的な影響を反映しているのかどうか、またはこれらのＫＯ腫瘍におけるｃＤＣサブセットの損失がＭｏ−ＤＣの発生に影響を及ぼすかどうかは、現時点では明らかではない。
【００９４】
予定運命地図の作成実験に続いて、様々なＤＣ集団と関連することが報告されているマーカーについて、さらにＴＡＤＣサブセットを特徴付けた。この点において、ｃＤＣ１およびｃＤＣ２の発生におけるＩＲＦ８およびＩＲＦ４の必要性が、それぞれ確立されている（Tamura et al., 2005）。これらの転写因子の細胞内染色により、ｃＤＣ２におけるＩＲＦ４の、およびｃＤＣ１におけるＩＲＦ８の発現がより高いことが確認された（図１Ｄ）。興味深いことに、Ｍｏ−ＤＣは、比較的高レベルのＩＲＦ４と、低レベルのＩＲＦ８を含有しているようであった。それらが単球起源であることと一致して、Ｍｏ−ＤＣは、既に単球由来ＤＣと関連づけられている（Plantinga et al., 2013）、高レベルのＦｃεＲを発現した（図１Ｄ）。さらに、Ｍｏ−ＤＣ集団はまた、マクロファージ関連マーカーであるＭｅｒＴＫを発現する唯一のサブセットでもあった(Gautier et al., 2012; Langlet et al., 2012)。ＣＤ１０３および交差提示関連マーカーＸＣＲ１は両方とも、ｃＤＣ１サブセットに唯一発現するように見えるが、一方で、ＳＩＲＰα発現は、Ｍｏ−ＤＣおよびｃＤＣ２サブセットに限定されていた（図１Ｄ）。最後に、ＤＥＣ２０５は、Ｍｏ−ＤＣ＞ｃＤＣ１＞ｃＤＣ２にて、すべてのＴＡＤＣサブセットに発現される（図１Ｄ）。
【００９５】
実施例２：異なる腫瘍関連樹状細胞亜集団が、複数の腫瘍タイプに存在する。
次に、種々の組織学的起源および異なる遺伝的バックグラウンドのいくつかの移植可能なマウス腫瘍モデル、並びに、自然発症のＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ乳癌腫モデルにおけるＴＡＤＣサブセットの存在を評価した。皮下に増殖するＬＬＣ肺癌腫瘍、その急速進行性３ＬＬ−Ｒおよび緩徐進行性３ＬＬ−Ｓサブクローン（Remels and De Baetselier、1987）、ＭＣ３８結腸癌、Ｂ１６メラノーマおよびＴ２４１線維肉腫、ならびに肺実質に同所性に成長した（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃａｌｌｙ  ｇｒｏｗｉｎｇ）３ＬＬ−Ｒ腫瘍および直腸に同所性に成長したＭＣ３８（全てＣ５７Ｂｌ／６のバックグラウンド）の単一細胞懸濁液は、小さいが、はっきりと識別可能なＣＤ１１ｃｈｉＭＨＣ−ＩＩｈｉＴＡＤＣ画分を含んでいた（図２Ａ）。ＴＡＤＣはまた、ＦＶＢバックグラウンドのＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ乳房腫瘍から回収された（図２Ａ）。
【００９６】
同様のサイズの腫瘍のＤＣ含有量を比較すると、ｃＤＣ１は調査されたすべてのモデルで最も少ないサブセットであったが、ｃＤＣ２は常に良好に表れていた（モデルにより、ＴＡＤＣ全体の３０．１％〜７５．７％の間）（図２Ｂ）。最も大きな変動はＭｏ−ＤＣで見られ、３ＬＬ−ＲおよびＴ２４１腫瘍にはほとんど存在しないが、ＬＬＣ、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ、３ＬＬ−Ｓ、ＭＣ３８およびＢ１６腫瘍ではかなり大きな集団を形成し、後者の３つのモデルでは主要なＴＡＤＣ集団でさえあった。興味深いことに、同所性の腫瘍と比較して皮下に成長した３ＬＬ−ＲまたはＭＣ３８腫瘍のＴＡＤＣ含有量は極めて同等であり、このことは、周囲の組織ではなく腫瘍の微小環境がＴＡＤＣの多様性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）を決定することを示唆している。特に、高Ｍｏ−ＤＣ含有量を有する腫瘍モデルはまた、それらのＭ２様ＭＨＣ−ＩＩｌｏｗ腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）と比較して、比較的多くのＭ１様ＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈ腫瘍関連マクロファージ（高いＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈ／ＭＨＣ−ＩＩｌｏｗの割合）を有し（図２Ｃ）、このことは、これらの腫瘍の微小環境が、浸潤性単球のこれらのＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈマクロファージおよびＤＣへの分化に有利であることを示唆している（図２Ｃ）。注目すべきことに、大きなＭｏ−ＤＣ集団も含有するＭＣ３８腫瘍は、Ｍ１様とＭ２様の混合型の表現型を示す単一のＴＡＭ集団を含有する（図２Ｃ）。Ｍｏ−ＤＣの存在とＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈＴＡＭの存在との相関は同じ腫瘍モデル内で維持され、それによって、腫瘍の成長の過程でのＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈＴＡＭの出現不足（ｕｎｄｅｒｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）と、ＭＨＣ−ＩＩｌｏｗＴＡＭの漸進的蓄積が、Ｍｏ−ＤＣの割合の減少と並行しており、３ＬＬ−Ｒモデルで例示されている（図２Ｄおよび図２Ｅ）。しかしながら、３ＬＬ−Ｒ浸潤性ＴＡＤＣの全体の割合は、腫瘍の成長中に増加する（図２Ｄ）。対照的に、３ＬＬ−Ｓ腫瘍は、腫瘍の成長を通して、一定して、（ＴＡＭコンパートメントにおいては）ＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈＴＡＭ、および（ＴＡＤＣコンパートメントにおいては）Ｍｏ−ＤＣに支配されており、ＴＡＤＣの割合は変化しなかった（図２Ｆおよび図２Ｇ）。
【００９７】
実施例３：異なる腫瘍関連樹状細胞亜集団の存在は、ヒト腫瘍において再現され得る。
先の知見をヒトの状況に転換させるために、肺癌および結腸直腸癌患者の新鮮な腫瘍生検標本で異なるＴＡＤＣ亜集団の存在を評価した。少量のＣＤ１６−ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＴＡＤＣをヒト腫瘍から回収した（図３Ａおよび図３Ｂ）。重要なことに、このＴＡＤＣコンパートメントは、マウスＴＡＤＣサブセットと似た３つの異なるサブセットを包含していた。ヒトＴＡＤＣは、ＢＤＣＡ２−ＢＤＣＡ１−ＩＲＦ８＋ＣＤ１４−ＣＤ１１ｂｌｏｗｃＤＣ１集団およびＢＤＣＡ２−ＩＲＦ８−ＢＤＣＡ１＋ＴＡＤＣ画分を含有し、この画分は、ＣＤ１４とＣＤ１１ｂの差次的な発現を有する２つのサブセットから成っていた（図３Ａおよび図３Ｃ）。既に示されているように（Segura et al., 2013）、これらはＣＤ１４−ＣＤ１１ｂ＋ｃＤＣ２集団およびマウスのＭｏ−ＤＣに類似したＣＤ１４＋ＣＤ１１ｂｈｉｇｈＤＣ集団からなる。注目すべきことに、ＢＤＣＡ２＋形質細胞様ＤＣは回収できなかった。
【００９８】
実施例４：Ｍｏ−ＤＣは、固有の抗原取り込みおよび処理の能力が最も高い
強力な抗腫瘍免疫応答の誘導はいくつかの報告（Goc et al., 2014; Preynat-Seauve et al., 2006）においてＤＣに起因しているが、ＴＡＤＣは、腫瘍の免疫回避を可能にする抗原提示障害、Ｔ細胞刺激性障害および遊走能障害を有し、免疫寛容原性または免疫抑制性の細胞としても記載されている（Gabrilovich, 2004; Ma et al., 2013; Preynat-Seauve et al., 2006; Vesely et al., 2011）。したがって、異なるＴＡＤＣサブセットが異なる機能を発揮すると仮定し得た。最初に、３つの異なるＴＡＤＣ集団による、抗原取り込み、処理、および提示能力を調べた。
【００９９】
それらの固有の食作用能力を、蛍光ラテックスビーズを、３７℃（食作用活性化）または４℃で３ＬＬ−Ｒ腫瘍単一細胞懸濁液に添加することにより、インビトロで試験した（図４Ａ）。全てのＴＡＤＣサブセットは、３７℃でラテックスビーズを取り込むことができた。しかしながら、ＴＡＤＣ集団全体と比較した場合、ラテックス＋ＴＡＤＣ集団内の細胞の割合はＭｏ−ＤＣサブセットでのみ増加し、当該集団が両方のｃＤＣ型よりも食作用が高かったことを示している（図４Ｂ）。興味深いことに、腫瘍を除去する２時間前に、腫瘍を有するマウスに蛍光ラテックスビーズを静脈内注射することにより、インビボでの食作用アッセイを行った場合、Ｍｏ−ＤＣは、ラテックス＋集団内で再び大きな比率を占め、インビボでの優れた食作用能力を裏付けた（図４Ｃ）。
【０１００】
次に、異なるＴＡＤＣサブセットによる抗原処理の効率を評価した。ここでは、３ＬＬ−Ｒ腫瘍単細胞懸濁液をＤＱ−オボアルブミン（ＤＱ−ＯＶＡ）と共に１５分間インキュベートし、抗原取り込みを可能にした。完全に洗浄した後、切断されたＤＱ−ＯＶＡの蛍光を読み取り値として用いて、異なる時間間隔で細胞内処理を評価した。０℃では、ＤＱ−ＯＶＡ処理は生じなかった（データ不掲載）。注目すべきことに、大部分のＭｏ−ＤＣが、ＤＱ−ＯＶＡを迅速に処理したが（１５分後に蛍光細胞の６２．７±３．５％）、この初期の時点ではｃＤＣ１およびｃＤＣ２では処理が起こらなかった（図４Ｄ）。ｃＤＣ１と比較してｃＤＣ２の方がわずかに高い効率で、徐々にｃＤＣはＤＱ−ＯＶＡを処理した（４５分後に、それぞれ、７．８±４．６％に対して３０．５±１１．６％の蛍光細胞に達した）。まとめると、これらのデータは、抗原提示および処理に対するＭｏ−ＤＣの競争優位性を例示するものである。
【０１０１】
最後に、ＬＬＣ−ＯＶＡ腫瘍から新たに単離されたＴＡＤＣサブセットを、Ｈ−２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体に特異的なｍＡｂにより染色することにより、ＴＡＤＣがインビボでＯＶＡを処理し、その免疫優性ＣＴＬエピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を交差提示することができるかどうかを評価した。Ｍｏ−ＤＣは、これらの複合体の最も高い発現を示し、腫瘍微小環境における優れた抗原取り込みおよび処理を示唆した（図４Ｅ）。
【０１０２】
実施例５：両方のｃＤＣ集団がナイーブＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化するが、ｃＤＣ２のみがＴｈ１７ＣＤ４＋Ｔ細胞表現型を誘導する
次に、ナイーブＴ細胞を活性化するＴＡＤＣサブセットの能力を評価した。この点に関して、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤＬ１およびＰＤＬ２などの活性化および抑制性のＴ細胞共刺激分子の発現は、すべてのＴＡＤＣ集団において非常に高かった（図５Ａ）。まず初めに、抗原取り込みおよび処理能力に無関係である、ＴＡＤＣサブセットの内因性抗原提示能力を、古典的混合白血球反応（ＭＬＲ）で評価した。すべてのＣ５７Ｂｌ／６ＴＡＤＣサブセットは、コントロールの脾臓ＣＤ１１ｃｈｉＭＨＣ−ＩＩｈｉＢ２２０−Ｌｙ６Ｃ−ｃＤＣ集団と少なくとも同程度にはナイーブＢａｌｂ／ｃＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を活性化することができた（図５Ｂおよび図５Ｃ）。興味深いことに、ｃＤＣ２は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に対して、最も高い内因性抗原提示能力を示した。
【０１０３】
本発明者らのアッセイにおいて、差次的なインビボでの抗原取り込みおよび処理能力の効果を組み込むために、ＴＡＤＣをＬＬＣ−ＯＶＡ腫瘍から選別し、さらなるエクスビボでのＡｇ負荷または刺激を伴わずに、ＣＦＳＥ標識ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８＋ＯＴ−１Ｔ細胞またはＣＤ４＋ＯＴ−ＩＩＴ細胞と直ちに共培養した。ＤＣ／ＯＴ−Ｉ比が１／１０において、２つのｃＤＣサブセットのみが効果的にＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を誘導することができ、その結果それらのインビボでの免疫賦活性の表現型を示し、ｃＤＣ１はかなり強力であった（図５Ｄ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞の場合においても、ｃＤＣサブセットのみがＤＣ／ＯＴ−ＩＩ比が１／１０においてＴ細胞増殖を誘導することができ、ｃＤＣ２が最も効率的であった（図５Ｅ）。特に、ＯＴ−ＩＩ／ＴＡＤＣ共培養物の上清中では、実験の期間内（刺激の３日以内）にＩＦＮ−γおよびＩＬ−４（図５Ｆ）はほとんど検出されず、並びにＩＬ−１３（データ不掲載）は全く検出されなかったが、これは、ＴＡＤＣサブセットによるＴｈ１およびＴｈ２誘導の欠如を示している。しかしながら、興味深いことに、ｃＤＣ２は、ＯＴ−ＩＩ細胞集団におけるＲＯＲγｔのアップレギュレーション（Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３またはＦｏｘＰ３ではない）および上清におけるＩＬ−１７の分泌によって示されるように、Ｔｈ１７集団の分化を誘導した（図５Ｇ、図５Ｈおよび図５Ｉ）。他の条件では、ＲＯＲγｔ＋Ｔ細胞も、ＩＬ−１７産生も認められなかった。Ｔｈ１７の誘導は、ｃＤＣ２によるＩＬ−１βおよびＩＬ−６などのＴｈ１７誘導性サイトカインの固有の高い産生から生じ得る（図５Ｊ）。しかしながら、Ｍｏ−ＤＣはこれらのサイトカインをより高いレベルで分泌するが、Ｔｈ１７を誘導する能力が欠如していることに留意すべきであり、これは、ＤＣの他の固有の性質がＴｈ１７生成にとって重要であることを示唆している。
【０１０４】
実施例６：Ｍｏ−ＤＣは、免疫抑制性のＴＩＰ−ＤＣ表現型を提示する
腫瘍関連Ｍｏ−ＤＣは、抗原取り込みおよび処理能力が高いにもかかわらず、ナイーブ抗原特異的Ｔ細胞の活性化において、一貫して効率が低かった。従って、本発明者らは、Ｍｏ−ＤＣがＴ細胞刺激機能を消滅させる可能性のある特徴を提示しているのではないかと考えた。本発明者らは、Ｍｏ−ＤＣが高レベルのＴＮＦ−αおよびｉＮＯＳを同時発現し、したがって炎症性ＴＩＰ−ＤＣと似た表現型を示すことに気付いた（図６Ａおよび図６Ｂ）。さらに、Ｍｏ−ＤＣは、すべてのＴＡＤＣ集団の中で、最も高いレベルの炎症性サイトカインＩＬ−６およびＩＬ−１β、単球および好中球を誘引するケモカインＣＣＬ２、ＣＣＬ４およびＣＸＣＬ１、並びに、ミトコンドリアスーパーオキシドアニオンなどの活性酸素種を産生した（図５Ｊ、図６Ｃおよび図６Ｄ）。加えて、Ｍｏ−ＤＣは最も高いＩＬ−１０／ＩＬ−１２バランスを示し（図６Ｅ）、これは免疫原性が低いＤＣの表現型と関連する特徴である。
【０１０５】
重要なことに、より高いｉＮＯＳ発現は、ＮＯのより高い産生をもたらし得、ＮＯは潜在的なＴ細胞抑制分子であると報告されている(Bronte and Zanovello, 2005; Schouppe et al., 2013)。ＬＬＣ−ＯＶＡから選別したＭｏ−ＤＣを、ｉＮＯＳ阻害薬Ｌ−ＮＭＭＡ存在下で、ＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋ＯＴ−ＩＴ細胞と共培養した（図６Ｆ）。Ｔ細胞増殖は、これらの条件下で有意に増強され、Ｍｏ−ＤＣによる活性ＮＯ媒介性のＴ細胞抑制活性を実証した。ｉＮＯＳ発現を含むＴＩＰ−ＤＣの表現型は、以前に、ＩＦＮ−γに依存することが示されている（Bosschaerts et al., 2011）。Ｍｏ−ＤＣ／ＯＴ−１培養物へのブロッキング抗ＩＦＮ−γ抗体の添加は、実際、ｉＮＯＳ阻害と同じ程度までＴ細胞増殖を増加させた。特に、抗−ＩＦＮ−γおよびＬ−ＮＭＭＡは、Ｍｏ−ＤＣ／ＯＴ−ＩＩ共培養物に影響を与えなかった（データ不掲載）。したがって、Ｍｏ−ＤＣはＣＤ８＋Ｔ細胞の強力な活性化を妨げる免疫抑制性のＴＩＰ−ＤＣ表現型を示す。
【０１０６】
実施例７：腫瘍関連ｃＤＣサブセットは共に、腫瘍流入領域リンパ節に遊走し、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を差次的に活性化させる
腫瘍関連ｃＤＣはＴ細胞刺激能力を有していたため、次に、これらの細胞が腫瘍流入領域リンパ節（ｔｄＬＮ）に遊走し、腫瘍抗原を提示できるか否かを検討した。ＤＣのＬＮへの遊走の前提条件であるＣＣＲ７発現は、ｃＤＣサブセット上にのみ存在し、Ｍｏ−ＤＣ上には存在しなかった（図７Ａ）。
【０１０７】
腋窩および鼠径部のｔｄＬＮ（動物の側腹部における皮下の腫瘍の流入領域ＬＮ）では、ｃＤＣ１およびｃＤＣ２サブセットは遊走性ＤＣ集団内に存在するが、Ｍｏ−ＤＣは存在せず（データ不掲載）、Ｍｏ−ＤＣの非遊走性の特徴を確認した。遊走性および常在性ＤＣは、既に報告されている通り、ＣＤ１１ｃおよびＭＨＣ−ＩＩ発現に基づいて区別される(Kissenpfennig et al., 2005; Ohl et al., 2004)。これらのｃＤＣが腫瘍抗原を提示するかどうかを評価するために、それらをＬＬＣ−ＯＶＡ腫瘍を有するマウスのｔｄＬＮから選別し、ＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋ＯＴ−ＩＴ細胞またはＣＤ４＋ＯＴ−ＩＩＴ細胞と共培養した。重要なこととして、ＯＶＡｍＲＮＡの欠損によって示されるように、ｃＤＣ選別時にｔｄＬＮにＯＶＡ＋癌細胞が存在しないように注意した（図７Ｂ）。遊走性ｃＤＣ１は、ＯＴ−Ｉ増殖を強く刺激したが、ｃＤＣ２は刺激せず（図７Ｃ）、このことは、ＳＩＩＮＦＥＫＬを負荷したｃＤＣ１が腫瘍からｔｄＬＮへ、インビボで遊走したことを示唆した。特に、常在性ｃＤＣサブセットは両方とも、ほとんどＯＴ−ＩＴ細胞増殖を誘導できなかった（図７Ｃ）。対照的に、遊走性ｃＤＣ１およびｃＤＣ２は両方とも、ＯＴ−ＩＩＴ細胞増殖を刺激することができた（図７Ｄ）。予想外に、常在性ｃＤＣ１およびｃＤＣ２もＯＴ−ＩＩ増強を誘導し（図７Ｄ）、遊走性腫瘍関連ｃＤＣが効果的なＯＴ−ＩＩプライミングために抗原をＬＮ−常在性ｃＤＣ集団に移すことができることを示唆した。特に、腫瘍関連ｃＤＣ２と同様に、ｔＤＬＮの遊走性および常在性ｃＤＣ２はまた、Ｆｏｘｐ３、Ｔ−ｂｅｔまたはＧＡＴＡ３のアップレギュレートは観察できなかったが、ＯＴ−ＩＩＴ細胞の一部においてＲＯＲγｔを誘導した（図７Ｅ）
【０１０８】
実施例８：ｃＤＣ１およびｃＤＣ２は、ワクチン投与に用いられる場合に、両方とも有益な治療効果を有するが、異なる治療効果を有する
最後に、腫瘍由来ＤＣサブセットが、癌において治療に関連する免疫記憶応答を誘発するのに使用できるかどうかを評価するために、図８Ａに示すワクチン投与実験を設定した。重要なことに、ワクチン投与実験に用いられた選別されたＴＡＤＣサブセットは、サイトカインによりエクスビボで刺激されておらず、腫瘍抗原も負荷されていなかった。Ｍｏ−ＤＣはＬＮ遊走能を示さず、免疫抑制能を保持していたため（図６Ｆ）、ｃＤＣサブセットの潜在的な治療効果に焦点を当てることとした。
【０１０９】
注目すべきことに、ＬＬＣ−ＯＶＡでの負荷（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の際に、ｃＤＣ２をワクチン接種したマウスのみが、非ワクチン接種マウスと比較して、有意に低下した腫瘍成長速度および腫瘍重量を有した（図８Ｂおよび８Ｃ）。これは、ＬＬＣ−ＯＶＡ腫瘍から選別したｃＤＣ２をマウスにワクチン接種した場合だけでなく、ｃＤＣ２がＢ１６−ＯＶＡ腫瘍に由来する場合もそうであった（図１３Ｂおよび図１３Ｃ）。ｃＤＣ１をワクチン接種したコホートにおいても、有意ではないが、同様の傾向が見られた（図８Ｂおよび図１３Ｂ）。予想通り、ＯＶＡをワクチン接種したマウスにおける腫瘍の成長は著しく遅れた。ゆっくりとした腫瘍成長は、両方のワクチン接種したコホートの腫瘍におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の存在のわずかな増加と相関したが、その増加はＯＶＡをワクチン接種したマウスで見られた有意に高いレベルに達しなかった（図８Ｄ）。注目すべきことに、Ｈ２Ｋｂ／ＳＩＩＮＦＥＫＬデキストラマー染色を用いると、全ＣＤ８＋Ｔ細胞集団内の腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、ＯＶＡをワクチン接種したマウスで有意に増加し、ｃＤＣをワクチン接種したマウスでは傾向が見られたが、ｃＤＣ２をワクチン接種したマウスでは見られなかった（図８Ｅ）。これらのデータは、ｃＤＣ１の優れたＣＴＬ刺激能力と一致し、ｃＤＣ２ワクチン投与のより強い抗腫瘍効果が、腫瘍微小環境における他の変化によって媒介されることを示唆している。この点に関して、ｃＤＣ１ではなくｃＤＣ２がインビトロおよびｔｄＬＮにおいてＴｈ１７細胞を刺激することが示された（図５Ｇおよび図７Ｅ）。これらのデータと一致して、ＲＯＲγｔ＋ＣＤ４＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の割合は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の全体的な割合を増加させることなく、ｃＤＣ２をワクチン接種したマウス由来の腫瘍においてのみ有意に増加した（図８Ｆおよび８Ｅ）。いずれの条件においても、ワクチン投与後のＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ、Ｔ−ｂｅｔ＋Ｔｈ１またはＧＡＴＡ３＋Ｔｈ２ＣＤ４＋ＴＩＬの量に変化は見られなかった（図８Ｈ、図８Ｉおよび図８Ｊ）。
【０１１０】
ＬＬＣを含む複数の腫瘍モデルにおいて、腫瘍の成長は、ＴＩＬのみならず、骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）およびＴＡＭなどの腫瘍関連骨髄系細胞の表現型によってもまた制御される。興味深いことに、ＣＤ１１ｂｈｉＬｙ６ＣｈｉＭＨＣ−ＩＩｎｅｇＬｙ６Ｇｎｅｇ単核球細胞およびＣＤ１１ｂｈｉＬｙ６ＣｉｎｔＭＨＣ−ＩＩｎｅｇＬｙ６Ｇｈｉ顆粒球細胞の存在は、ワクチン接種していないコホートおよびｃＤＣ１をワクチン接種したコホートと比較して、ｃＤＣ２をワクチン接種したマウスの腫瘍において、有意に減少している（図９Ａおよび図９Ｂ）。これらの細胞を単核球性および顆粒球性ＭＤＳＣとして分類するＴ細胞抑制能力を、これらの細胞が有するかどうかを評価するために、それらを腫瘍単一細胞懸濁液からＦＡＣＳ選別し、ＯＶＡ刺激されたＯＴ−Ｉ脾細胞に異なる比率で添加した。図９Ｃに示すように、これらの細胞はＯＴ−Ｉ増殖を強力に抑制した。従って、ｃＤＣ２ワクチン投与は、腫瘍におけるＭＤＳＣの存在を強力に減少させる。
【０１１１】
Ｍ２型のＴＡＭ（Ｍ２−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ＴＡＭ）もまた、腫瘍の進行を促進する。全体的なＣＤ１１ｂｈｉＬｙ６ＣｌｏＬｙ６Ｇｎｅｇの数は、ｃＤＣ２をワクチン接種したマウスにおいて、減少傾向を示すのみであった（図９Ｄ）。重要なことに、ＴＡＭコンパートメント内において、ｃＤＣ２ワクチン投与は、よりＭ１様のＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈＴＡＭ（すなわち、より低いＭＨＣ−ＩＩｌｏｗ／ＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈＴＡＭ比）へのシフトを引き起こした（図９Ｅおよび図９Ｆ）。その上、これらのＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈＴＡＭは、Ｍ１関連遺伝子のさらなる発現のアップレギュレートによって証明されるように、ワクチン接種していない動物由来のものと比較してより顕著なＭ１表現型を有したが、Ｍ２関連遺伝子の大部分（Ｍｍｐ９を除く）は有意に変化しなかった（図９Ｇ）。特に、ｃＤＣ２をワクチン接種したマウス由来の残りの少数のＭＨＣ−ＩＩｌｏｗＴＡＭもＭ１遺伝子発現プロファイルを変化させ、いくつかの遺伝子（Ｉｌ１ｂ、Ｐｔｇｓ２、Ｉｌ１２ｐ４０）はアップレギュレートされ、他の遺伝子（Ｔｎｆ、Ｎｏｓ２）はダウンレギュレートされた。これらの細胞におけるＭ２遺伝子は、ほとんど変化しなかった。全体として、これらのデータは、ｃＤＣ２をワクチン接種したマウス由来のＬＬＣ−ＯＶＡ腫瘍の骨髄球系のコンパートメントは、強くＭ１型ＴＡＭ（Ｍ１−ｏｒｉｅｎｔｅｄ  ＴＡＭ）によって支配されていることを示している。
【０１１２】
最後に、ＴＡＭが非常に少ない数で存在し、主にＭ１様のＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈに偏向しているＢ１６−ＯＶＡ腫瘍モデルを調べた（図２Ｃ）。当該モデルでは、抗腫瘍効果は、腫瘍浸潤骨髄系細胞の明白な干渉なしに、細胞傷害性T細胞によって直接媒介される可能性がより高い。実際、ＬＬＣ−ＯＶＡ腫瘍（図１０Ａ）またはＢ１６−ＯＶＡ腫瘍（図１３Ｄおよび図１３Ｅ）から単離されたｃＤＣ１によるワクチン投与は、ｃＤＣ２をワクチン投与と比較して、それぞれより良好または同等の防御をもたらし、このことは、ＬＬＣ−ＯＶＡ腫瘍から選別したｃＤＣ１の場合において、前者のＣＤ８＋Ｔ細胞の有意に増強された浸潤と相関した（図１０Ｂ）。従って、腫瘍免疫におけるＴＡＭまたはＴＩＬの役割に応じて、異なる腫瘍由来の通常型ＴＡＤＣサブセットが、オーダーメイドの（ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ）ＤＣ養子免疫療法を開発するために利用され得る。
【０１１３】
実施例９：ワクチン投与実験に使用するための、１２日目のＬＬＣ−ＯＶＡ腫瘍全体からのｃＤＣ１およびｃＤＣ２集団の選別に適用された、ゲーティング戦略。
実験手順に記載されているように、選別の前に、単一細胞懸濁液を調製し、ＣＤ１１ｃ＋細胞をＭＡＣＳ濃縮した。選別したｃＤＣ１およびｃＤＣ２は、ＴＡＤＣにおいて９４％および９８．５％という非常に高い純度を示し、わずかなＭｏ−ＤＣ夾雑物しか含有しなかった（それぞれ０％および０．７％、図１１）。
【０１１４】
実施例１０：腫瘍転移におけるＴＡＤＣサブセットの治療効果。
１０５個のＬＬＣ−ＯＶＡ細胞を足蹠に投与するか（ａ）、あるいは、３ｘ１０６個のＬＬＣ−ＯＶＡ細胞を皮下に投与し（ｂ）、腫瘍サイズが約８００ｍｍ２になるまで成長させる。その後、原発性腫瘍を、下肢切断（ａ）または皮下腫瘍除去（ｂ）のいずれかによって切除する。ｃＤＣ１および／またはｃＤＣ２集団を、切除した腫瘍および／または切除した腫瘍流入領域リンパ節から単離し、続いて同一の個体に注射する。転移性肺小結節および肺重量を、顕微鏡法によって評価する（図１２）。
【表１−１】
2019506880.tif 000002
【表１−２】
2019506880.tif 000003
【表１−３】
2019506880.tif 000004
【表２】
2019506880.tif 000005
【０１１５】
参考文献
Bosschaerts, T., Morias, Y., Stijlemans, B., Herin, M., Porta, C., Sica, A., Mantovani, A., De Baetselier, P., and Beschin, A. (2011). IL-10 limits production of pathogenic TNF by M1 myeloid cells through induction of nuclear NF-kappaB p50 member in Trypanosoma congolense infection-resistant C57BL/6 mice. Eur J Immunol 41, 3270-3280.
Bronte, V., and Zanovello, P. (2005). Regulation of immune responses by L-arginine metabolism. Nature reviews Immunology 5, 641-654.
Broz, M. L., Binnewies, M., Boldajipour, B., Nelson, A. E., Pollack, J. L., Erle, D. J., Barczak, A., Rosenblum, M. D., Daud, A., Barber, D. L., et al. (2014). Dissecting the tumor myeloid compartment reveals rare activating antigen-presenting cells critical for T cell immunity. Cancer Cell 26, 638-652.
Fridman, W. H., Galon, J., Pages, F., Tartour, E., Sautes-Fridman, C., and Kroemer, G. (2011). Prognostic and predictive impact of intra- and peritumoral immune infiltrates. Cancer Res 71, 5601-5605.
Gabrilovich, D. (2004). Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendritic-cell defects. Nature reviews Immunology 4, 941-952.
Gao, Y., Nish, S. A., Jiang, R., Hou, L., Licona-Limon, P., Weinstein, J. S., Zhao, H., and Medzhitov, R. (2013). Control of T helper 2 responses by transcription factor IRF4-dependent dendritic cells. Immunity 39, 722-732.
Gautier, E. L., Shay, T., Miller, J., Greter, M., Jakubzick, C., Ivanov, S., Helft, J., Chow, A., Elpek, K. G., Gordonov, S., et al. (2012). Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages. Nat Immunol 13, 1118-1128.
Goc, J., Germain, C., Vo-Bourgais, T. K., Lupo, A., Klein, C., Knockaert, S., de Chaisemartin, L., Ouakrim, H., Becht, E., Alifano, M., et al. (2014). Dendritic cells in tumor-associated tertiary lymphoid structures signal a Th1 cytotoxic immune contexture and license the positive prognostic value of infiltrating CD8+ T cells. Cancer Res 74, 705-715.
Greter, M., Helft, J., Chow, A., Hashimoto, D., Mortha, A., Agudo-Cantero, J., Bogunovic, M., Gautier, E. L., Miller, J., Leboeuf, M., et al. (2012). GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity 36, 1031-1046.
Guilliams, M., Ginhoux, F., Jakubzick, C., Naik, S. H., Onai, N., Schraml, B. U., Segura, E., Tussiwand, R., and Yona, S. (2014). Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews Immunology 14, 571-578.
Guilliams, M., Henri, S., Tamoutounour, S., Ardouin, L., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M., and Malissen, B. (2010). From skin dendritic cells to a simplified classification of human and mouse dendritic cell subsets. Eur J Immunol 40, 2089-2094.
Heath, W. R., and Carbone, F. R. (2009). Dendritic cell subsets in primary and secondary T cell responses at body surfaces. Nat Immunol 10, 1237-1244.
Helft, J., Ginhoux, F., Bogunovic, M., and Merad, M. (2010). Origin and functional heterogeneity of non-lymphoid tissue dendritic cells in mice. Immunological reviews 234, 55-75.
Kingston, D., Schmid, M. A., Onai, N., Obata-Onai, A., Baumjohann, D., and Manz, M. G. (2009). The concerted action of GM-CSF and Flt3-ligand on in vivo dendritic cell homeostasis. Blood 114, 835-843.
Kissenpfennig, A., Henri, S., Dubois, B., Laplace-Builhe, C., Perrin, P., Romani, N., Tripp, C. H., Douillard, P., Leserman, L., Kaiserlian, D., et al. (2005). Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity 22, 643-654.
Langlet, C., Tamoutounour, S., Henri, S., Luche, H., Ardouin, L., Gregoire, C., Malissen, B., and Guilliams, M. (2012). CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of immunology 188, 1751-1760.
Laoui, D., Van Overmeire, E., Di Conza, G., Aldeni, C., Keirsse, J., Morias, Y., Movahedi, K., Houbracken, I., Schouppe, E., Elkrim, Y., et al. (2014). Tumor hypoxia does not drive differentiation of tumor-associated macrophages but rather fine-tunes the M2-like macrophage population. Cancer Res 74, 24-30.
Ma, Y., Shurin, G. V., Peiyuan, Z., and Shurin, M. R. (2013). Dendritic cells in the cancer microenvironment. Journal of Cancer 4, 36-44.
Movahedi, K., Laoui, D., Gysemans, C., Baeten, M., Stange, G., Van den Bossche, J., Mack, M., Pipeleers, D., In't Veld, P., De Baetselier, P., and Van Ginderachter, J. A. (2010). Different tumor microenvironments contain functionally distinct subsets of macrophages derived from Ly6C(high) monocytes. Cancer Res 70, 5728-5739.
Ohl, L., Mohaupt, M., Czeloth, N., Hintzen, G., Kiafard, Z., Zwirner, J., Blankenstein, T., Henning, G., and Forster, R. (2004). CCR7 governs skin dendritic cell migration under inflammatory and steady-state conditions. Immunity 21, 279-288.
Onai, N., Obata-Onai, A., Schmid, M. A., Ohteki, T., Jarrossay, D., and Manz, M. G. (2007). Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat Immunol 8, 1207-1216.
Persson, E. K., Uronen-Hansson, H., Semmrich, M., Rivollier, A., Hagerbrand, K., Marsal, J., Gudjonsson, S., Hakansson, U., Reizis, B., Kotarsky, K., and Agace, W. W. (2013). IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation. Immunity 38, 958-969.
Plantinga, M., Guilliams, M., Vanheerswynghels, M., Deswarte, K., Branco-Madeira, F., Toussaint, W., Vanhoutte, L., Neyt, K., Killeen, N., Malissen, B., et al. (2013). Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity 38, 322-335.
Preynat-Seauve, O., Schuler, P., Contassot, E., Beermann, F., Huard, B., and French, L. E. (2006). Tumor-infiltrating dendritic cells are potent antigen-presenting cells able to activate T cells and mediate tumor rejection. Journal of immunology 176, 61-67.
Remels, L. M., and De Baetselier, P. C. (1987). Characterization of 3LL-tumor variants generated by in vitro macrophage-mediated selection. International journal of cancer Journal international du cancer 39, 343-352.
Schlitzer, A., McGovern, N., Teo, P., Zelante, T., Atarashi, K., Low, D., Ho, A. W., See, P., Shin, A., Wasan, P. S., et al. (2013). IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity 38, 970-983.
Schouppe, E., Mommer, C., Movahedi, K., Laoui, D., Morias, Y., Gysemans, C., Luyckx, A., De Baetselier, P., and Van Ginderachter, J. A. (2013). Tumor-induced myeloid-derived suppressor cell subsets exert either inhibitory or stimulatory effects on distinct CD8+ T-cell activation events. Eur J Immunol 43, 2930-2942.
Scott, C. L., Bain, C. C., Wright, P. B., Sichien, D., Kotarsky, K., Persson, E. K., Luda, K., Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Agace, W. W., et al. (2015). CCR2(+)CD103(-) intestinal dendritic cells develop from DC-committed precursors and induce interleukin-17 production by T cells. Mucosal immunology 8, 327-339.
Segura, E., Touzot, M., Bohineust, A., Cappuccio, A., Chiocchia, G., Hosmalin, A., Dalod, M., Soumelis, V., and Amigorena, S. (2013). Human inflammatory dendritic cells induce Th17 cell differentiation. Immunity 38, 336-348.
Serbina, N. V., Jia, T., Hohl, T. M., and Pamer, E. G. (2008). Monocyte-mediated defense against microbial pathogens. Annual review of immunology 26, 421-452.
Steinman, R. M., and Banchereau, J. (2007). Taking dendritic cells into medicine. Nature 449, 419-426.
Tamura, T., Tailor, P., Yamaoka, K., Kong, H. J., Tsujimura, H., O'Shea, J. J., Singh, H., and Ozato, K. (2005). IFN regulatory factor-4 and -8 govern dendritic cell subset development and their functional diversity. Journal of immunology 174, 2573-2581.
Vesely, M. D., Kershaw, M. H., Schreiber, R. D., and Smyth, M. J. (2011). Natural innate and adaptive immunity to cancer. Annual review of immunology 29, 235-271.
【図１−１】
2019506880.tif 000006
【図１−２】
2019506880.tif 000007
【図１−３】
2019506880.tif 000008
【図１−４】
2019506880.tif 000009
【図１−５】
2019506880.tif 000010
【図１−６】
2019506880.tif 000011
【図２−１】
2019506880.tif 000012
【図２−２】
2019506880.tif 000013
【図３−１】
2019506880.tif 000014
【図３−２】
2019506880.tif 000015
【図４−１】
2019506880.tif 000016
【図４−２】
2019506880.tif 000017
【図４−３】
2019506880.tif 000018
【図５−１】
2019506880.tif 000019
【図５−２】
2019506880.tif 000020
【図５−３】
2019506880.tif 000021
【図５−４】
2019506880.tif 000022
【図５−５】
2019506880.tif 000023
【図５−６】
2019506880.tif 000024
【図５−７】
2019506880.tif 000025
【図６−１】
2019506880.tif 000026
【図６−２】
2019506880.tif 000027
【図６−３】
2019506880.tif 000028
【図６−４】
2019506880.tif 000029
【図６−５】
2019506880.tif 000030
【図７−１】
2019506880.tif 000031
【図７−２】
2019506880.tif 000032
【図７−３】
2019506880.tif 000033
【図７−４】
2019506880.tif 000034
【図８−１】
2019506880.tif 000035
【図８−２】
2019506880.tif 000036
【図８−３】
2019506880.tif 000037
【図８−４】
2019506880.tif 000038
【図８−５】
2019506880.tif 000039
【図９−１】
2019506880.tif 000040
【図９−２】
2019506880.tif 000041
【図９−３】
2019506880.tif 000042
【図１０】
2019506880.tif 000043
【図１１】
2019506880.tif 000044
【図１２】
2019506880.tif 000045
【図１３】
2019506880.tif 000046
【配列表】
2019506880000001.app
【国際調査報告】
2019506880.tif 000047
2019506880.tif 000048
2019506880.tif 000049
2019506880.tif 000050