(57)【要約】  配列決定ステージおよび顕微鏡を含む配列決定装置。配列決ステージは、平坦な基準面を有する基準プレートを有する。顕微鏡の光軸は、基準面に対して垂直である。配列決定ステージは、フィルムの第１の側部に固定された複数のＤＮＡ鋳型を有する可撓性フィルムを受け取り、複数のＤＮＡ鋳型の少なくともいくつかを、顕微鏡の光軸に対して垂直である物体平面内に有する平坦な基準面に対して可撓性フィルムを保持するように構成される。
2019500871.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列決定装置のためのフローセルシステムであって、フローセルシステムは、
１つ以上の液体試薬を受容するように構成された流体入口；
前記１つ以上の液体試薬を通過させるように構成された流体出口；及び
流体入口と流体出口の間に延在し、流体接続しているチャネル
を含み、ここで、
チャネルの少なくとも一部は、その上に固定化された複数のＤＮＡ鋳型を受容するように構成された可撓性材料を含む膜を含む、上記フローセルシステム。
【請求項２】
前記膜が、ポリマー又は環状オレフィンコポリマーを含む、請求項１に記載のフローセルシステム。
【請求項３】
前記膜が、１μｍ〜１００μｍの厚さを有する、請求項１に記載のフローセルシステム。
【請求項４】
前記膜が、４μｍ〜５０μｍの厚さを有する、請求項１に記載のフローセルシステム。
【請求項５】
前記膜が、１０μｍ〜２０μｍの厚さを有する、請求項１に記載のフローセルシステム。
【請求項６】
前記膜が、複数のＤＮＡ鋳型を含む膜の少なくとも一部が平坦な物体平面にある位置に移動可能である、請求項１に記載のフローセルシステム。
【請求項７】
平坦な基準面をさらに備え、前記膜が、前記平坦な基準面上の前記膜の部分を位置決めするように移動可能であり、それによって前記ＤＮＡ鋳型を前記平坦な物体平面に配置する、請求項６に記載のフローセルシステム。
【請求項８】
前記平坦な基準面が、前記平坦な基準面の所定のスパンにわたって最大ピークから谷までの高さ変動によって計算すると、０．０５％の平坦度を有する、請求項７に記載のフローセルシステム。
【請求項９】
前記平坦な基準面と動作可能に付随する１つ以上の空気通路と、前記１つ以上の空気通路に流体接続された１つ以上の空気ポンプとをさらに備え、前記膜の側部に陰圧を発生させるように構成され、それにより、平坦な基準面上に前記膜の部分を位置決めする、請求項７にフローセルシステム。
【請求項１０】
剛性材料を含むフローセルプレートであって、フローセルプレートの少なくとも一部が透明プレート領域を含むフローセルプレートをさらに含み、
ここで、前記膜は、前記フローセルプレートに前記膜の周辺領域で取り付けられ、前記膜の少なくとも一部は前記透明プレート領域に面しており、前記膜と前記フローセルプレートとの間にチャネルを形成し、複数のＤＮＡ鋳型を含む膜の一部が、フローセルプレートから離れる方向に移動可能であり、平坦な物体平面上に膜の部分を配置する、請求項１に記載のフローセルシステム。
【請求項１１】
前記流体入口及び前記流体出口の少なくとも１つが、前記フローセルプレートを通るそれぞれの通路を含む、請求項１０に記載のフローセルシステム。
【請求項１２】
前記フローセルプレートが、関連した配列決定装置の一部に嵌合するように構成され、寸法決めされ、前記膜は、膜を横切る差圧を加えると、付随する配列決定装置上の基準面と接触するように配置される、請求項１０に記載のフローセルシステム。
【請求項１３】
前記膜が、第１の膜部分と第２の膜部分とを含み、前記第１の膜部分と前記第２の膜部分は、それぞれの周縁部において互いに接続されて、前記第１の膜と前記第２の膜との間にチャネルを形成する、請求項１に記載のフローセルシステム。
【請求項１４】
前記第１の膜部分及び前記第２の膜部分が、前記周縁部において互いに接着された膜材料の別々のシート、折り畳まれた膜材料の単一シート、又は膜材料の単一のチューブを含む、請求項１３に記載のフローセルシステム。
【請求項１５】
前記フローセルは、関連配列決定装置の一部に嵌合するように構成され、寸法決めされており、前記第１の膜部分は、第１の膜部分を横切る差圧を加えると、付随する配列決定装置上の第１の基準面と接触して配置されるように構成され、第２の膜部分は、第２の膜部分を横切る差圧を加えると、付随する配列決定装置の第２の基準面と接触して配置されるように構成される、請求項１３に記載のフローセルシステム。
【請求項１６】
前記第１の基準面及び前記第２の基準面の少なくとも一方が平坦な表面を含む、請求項１５に記載のフローセルシステム。
【請求項１７】
カバーと膜との間にチャネルを形成するように膜の第１の側部に面するように構成されたカバー；及び
膜の第１の側部に対向する膜の第２の側部に面するように構成された基準プレート
をさらに含む、請求項１に記載のフローセルシステム。
【請求項１８】
前記カバー及び前記基準プレートの少なくとも１つが、前記膜を除去するように選択的に移動可能である、請求項１７に記載のフローセルシステム。
【請求項１９】
前記膜が、膜材料の供給部の別個の部分を含む、請求項１８に記載のフローセルシステム。
【請求項２０】
前記膜材料の供給部が、前記膜材料の供給部の別個の部分を、前記カバーと前記基準プレートとの間から移動させるために回転するように構成された膜材料のスプールロールを含む、請求項１９に記載のフローセルシステム。
【請求項２１】
前記カバーがカバープレートを含み、前記カバープレートの少なくとも一部は、透明なカバー領域と、前記カバープレートから伸長して前記膜の前記第１の側部に面する空洞を形成するギャップスペーサとを含み、前記ギャップスペーサは、カバープレートに恒久的に取り付けられているか、又はカバープレートから選択的に取り外し可能である、請求項１７に記載のフローセルシステム。
【請求項２２】
前記流体入口及び前記流体出口が、前記カバーを通るそれぞれの通路を含む、請求項１７に記載のフローセルシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容が参照により本明細書の援用される、２０１５年１２月２８日に出願された、「薄層フローセルシステム」と題する米国仮特許出願第６２／２７１，４２３号の利益を請求する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、合成による配列決定又は他の配列決定プロセスを実行するための装置に関し、より具体的には、このような機器で使用されるフローセルに関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
ＤＮＡ配列決定装置を用いてＤＮＡ分子配列を決定する。このような装置は、臨床研究、診断、いわゆる「パーソナライズド・メディカル」（個人の遺伝的内容に合わせた治療など）などに有用である。ＤＮＡ配列決定を実施するための現在の装置は、ＤＮＡ配列を形成する塩基対を分析するために様々な技術を使用する。例えば、一部の装置は、フローセル内の固定された一本鎖ＤＮＡ分子断片（ＤＮＡ鋳型）の配列決定を実行します。フローセルは、本質的に、ＤＮＡ鋳型が一連の核酸塩基伸長プロセスを受ける小さなチャンバである。それぞれの連続した伸長を検出して、各ＤＮＡ鋳型の塩基対配列を決定する。フローセルは、伸長プロセス中、及び検査プロセス中にＤＮＡ鋳型を保持する環境を提供し、各伸長した塩基対を読み取る。
【０００４】
合成による配列決定装置の多くは、非光学系も知られているが、核酸塩基の伸長を検出するために顕微鏡などの光学系を使用する。典型的な光学装置は、可視化学標識を使用して各伸長塩基対の同一性を決定する。例えば、ＤＮＡ分子を構成する各核酸塩基（アデニン、グアニン、シトシン及びチミン）は、顕微鏡を介して見える独特な蛍光プローブで標識されてもよい。ＤＮＡ鋳型が伸長されるたびに標識が読み取られ、次に標識が除去されて次の塩基対伸長のための経路が作られる。
【０００５】
最新の「次世代」装置では、単一のフローセルで何百万ものＤＮＡ鋳型を同時に処理できる。ＤＮＡ鋳型は、フローセル内でランダムに秩序づけられてもよいし、特定の所定の位置に配列されてもよい。固定化されたＤＮＡ鋳型を保持するために様々なフローセル設計が開発されているが、通常それらはいくつかの共通の特徴を含む。典型的なフローセルは、剛性の流路、チャネルを囲む光学的に透明なカバー、及び適切な試薬が通過してＤＮＡ鋳型の成長及び伸長を制御する流体入口及び流体出口を含む。このようなフローセルの例は、米国特許第８，４８１，２５９号、同第８，９４０，４８１号及び同第９，１４６，２４８号、米国特許出願公開第２００９／０２９８１３１号及び同第２０１４／０２６７６６９号に見出され、これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。
【０００６】
塩基対延長の光学的検出を用いる配列決定装置は、非常に小さく、光をほとんど放射しない標識を検出できなければならない。所望の倍率を得るために顕微鏡タイプの光学系がしばしば使用されるが、そのような装置は、高倍率、低光環境、及び異なるＤＮＡ鋳型を区別するための光学的精度の必要性を考慮に入れるため、極めて高い公差で動作しなければならない。この環境では、光路は、典型的には、非常に浅い被写界深度（すなわち、焦点が合っているか又は少なくとも許容可能に鮮明な近物体と遠物体との間の距離）を有する。この環境では、被写界深度内にないフローセル上に固定化されたＤＮＡ鋳型はいずれも判読不能である可能性がある。したがって、典型的なフローセルは、ＤＮＡ鋳型が固定化されている表面の平坦性を最大にするために、非常に高い公差に製造された剛性の熱的及び寸法的に安定な材料から構築される。これは、光学読み取りプロセスの間に焦点を合わせるであろうＤＮＡ鋳型の集団を最大にする。フローセルはまた、典型的には、（少なくとも読み取りプロセスで使用される光の波長に対して）高い光透過性、フローセル内で行われる化学反応を支援する効率的な熱伝達特性、光学的忠実度を改善するための多層コーティング、インサイチュＤＮＡ鋳型部位又は足場などを有する。
【０００７】
本発明者らは、配列決定装置及び同様の装置のためのフローセルの技術水準を進歩させる必要性が引き続き存在すると判断した。
【発明の概要】
【０００８】
１つの例示的な態様では、配列決定装置のためのフローセルシステムが提供され、フローセルシステムは、１つ以上の液体試薬を通過させるように構成された流体出口と、１つ以上の液体試薬を受容するように構成された流体入口と、１つ以上の液体試薬を受け入れるように構成された流体入口と、流体入口と流体出口の間を伸長して、流体接続するチャネルを含み、チャネルの少なくとも一部が、固定化された複数のＤＮＡ鋳型を受容するように構成された可撓性材料を含む膜を含む。
【０００９】
別の例示的な態様では、配列決定装置のためのフローセルが提供される。フローセルは、剛性材料を含むフローセルプレートを有し、フローセルプレートの少なくとも一部は透明プレート領域を含み、可撓性材料の膜はフローセルプレートに膜の周囲領域に取り付けられ、膜の少なくとも一部は透明プレート領域に面し、膜は、フローセルプレートから離れた方向に移動可能であり、フローセルプレートと膜との間にチャネルを形成する。フローセルは、１つ以上の液体試薬を受容するように構成された流体入口と、１つ以上の液体試薬を通過させるように構成された流体出口とを有することができる。流体入口及び流体出口の少なくとも一方は、フローセルプレートを通るそれぞれの通路であってもよい。膜は、環状オレフィンコポリマーなどのポリマーであってもよい。膜は、１μｍ〜１００μｍ、４μｍ〜５０μｍ、又は１０μｍ〜２０μｍの厚さを有することができる。膜は、化学的処理、ＤＮＡ鋳型足場、又は可視マーカーを含む光学的コーティングなどの１つ以上のコーティングを有することができる。フローセルプレートに面する膜の表面は、その上に固定化された複数のＤＮＡ鋳型を有することができる。フローセルプレートは、付随する配列決定装置の一部に嵌合するように構成され、かつ寸法決めされてもよく、膜は、膜に差圧が加えられると、関連付けられた配列決定装置の基準面と接触するように構成される。
【００１０】
別の例示的な態様では、配列決定装置のためのフローセルが提供される。フローセルは、第１の可撓性材料の第１の膜であって、第１の膜の少なくとも一部分が透明膜領域を有し；第２の可撓性材料の第２の膜であって、第２の膜の少なくとも一部分が透明膜領域に面している周縁部で第１の膜に接続されていて；フローセルに作動可能に連結された流体入口；及びフローセルに作動可能に連結された流体出口を有する。第１の膜及び第２の膜のそれぞれの部分は、互いに離れて移動可能であり、流体入口から流体出口まで延びるチャネルを形成する。第１の膜及び第２の膜は、環状オレフィンコポリマーであってもよい。第１の膜及び第２の膜はそれぞれ、１μｍ〜１００μｍ、４μｍ〜５０μｍ、又は１０μｍ〜２０μｍの厚さを有することができる。第１の膜及び第２の膜の少なくとも１つは、化学処理、ＤＮＡ鋳型足場、又は可視マーカーを含む光学コーティングなどの１つ以上のコーティングを有することができる。第１の膜及び第２の膜の少なくとも１つは、その上に固定化されたそれぞれ複数のＤＮＡ鋳型を有することができる。第１の膜及び第２の膜のそれぞれは、その上に固定化されたそれぞれ複数のＤＮＡ鋳型を有することができる。第１の膜及び第２の膜は、周縁部で互いに接着された膜材料の別個のシート、折り畳まれた膜材料の単一シート、又は膜材料の単一のチューブであってもよい。フローセルは、付随する配列決定装置の一部に嵌合するように構成及び寸法決めされてもよく、第１の膜は、第１の膜を横切る差圧を加えると、付随する配列決定装置上の第１の基準面と接触するように配置されてもよく、第２の膜は、第２の膜を横切る差圧を加えると、付随する配列決定装置上の第２の基準面と接触するように構成されてもよい。
【００１１】
別の例示的な態様では、配列決定装置のためのフローセルが提供される。フローセルは、可撓性材料の膜；膜の第１の側部に面する空洞を有するカバーアセンブリ；及び膜の第１の面側部に対向する膜の第２の側部に面する基準プレートを有する。基準プレート及びカバーアセンブリの少なくとも一方は、カバーアセンブリと基準プレートとの間に膜を保持するように選択的に移動可能であり、流体入口から流体出口に延びる空洞内に通路を形成する。膜は、環状オレフィンコポリマーであってもよい。膜は、１μｍ〜１００μｍ、４μｍ〜５０μｍ、又は１０μｍ〜２０μｍの厚さを有することができる。膜は、化学的処理、ＤＮＡ鋳型足場、又は可視マーカーを含む光学的コーティングなどの１つ以上のコーティングを有することができる。膜の表面は、複数のＤＮＡ鋳型がその上に固定化されてもよい。カバーアセンブリは、カバープレートを含み、カバープレートの少なくとも一部は透明なカバー領域であり、空洞を形成するためにカバープレートから延びるギャップスペーサを含み得る。流体入口及び流体出口は、カバーアセンブリを通る通路であってもよい。基準プレートは、空気ポンプに接続された１つ以上の空気通路を有して、膜の第２の側部に陰圧を発生させ、それによって膜を基準プレートと接触させるようにすることができる。膜は、膜の供給部の別個の部分であってもよく、膜のスプールロールであって、膜の供給部の個別の部分をカバーアセンブリと基準プレートとの間から移動させるように構成されてもよい。
【００１２】
別の例示的な態様では、配列決定装置のための平坦なフローセル物体平面を提供するための方法が提供される。この方法は、膜の第１の側部に複数のＤＮＡ鋳型を受容するように構成された可撓性材料を含む膜を提供する工程；膜の第１の側部に対向する膜の第２の側部を平坦な基準面に押し付ける工程を含む。膜は、環状オレフィンコポリマーなどのポリマーであってもよい。膜は、１μｍ〜１００μｍ、４μｍ〜５０μｍ、又は１０μｍ〜２０μｍの厚さを有することができる。膜は、化学的処理、ＤＮＡ鋳型足場、又は可視マーカーを含む光学的コーティングなどの１つ以上のコーティングを有することができる。この方法はまた、複数のＤＮＡ鋳型を膜に固定化することを含むことができる。この方法はまた、膜の第１の側部がフローセルプレートに面している剛性材料のフローセルプレートに膜を取り付けることを含むことができ、その結果、少なくとも差圧を膜に加えて、膜の第２の側部を平坦な基準面に対して押し付ける場合、膜とフローセルプレートは、流体入口と流体出口との間に通路を形成する。この方法はまた、流体入口と流体出口との間に通路を形成するために、周縁部で膜に隣接して接続された第２の可撓性材料の第２の膜を提供する工程；及び第２の膜に差圧を加えて、第２の平坦な基準面に対して第２の膜を押圧する工程を含み得る。この方法はまた、平坦な基準面と、空洞を含むカバーアセンブリとの間に膜を保持することを含み得て、空洞及び膜は一緒になって、流体入口と流体出口との間に通路を形成する。この方法はまた、平坦な基準面から離してカバーアセンブリを移動させる工程；平坦な基準面とカバーアセンブリとの間から膜を除去する工程；平坦な基準表面とカバーアセンブリとの間に新しい膜を配置する工程；カバーアセンブリを平坦な基準面に向けて移動させて、新しいフローセルを形成する工程を含み得る。この方法では、平坦な基準面に対して膜の第１の面と反対側に膜の第２の側部を押し付けることは、膜の第１の側部と膜の第２の側部との間に差圧を加えることによって行うことができる。差圧を加えることは、膜の第２の側部を減圧に曝露し、膜の第１の側部を高圧に曝露するか、又はその両方によって行うことができる。平坦な基準面に対して膜の第１の側部の反対側の膜の第２の側部を加圧することは、平坦な基準面に対して膜を引き伸ばすことによって行うことができる。
【００１３】
別の例示的な態様では、配列決定装置のためのフローセルが提供される。フローセルは、複数のＤＮＡ鋳型がその上に固定化された可撓性材料を含む膜を有する。膜は、環状オレフィンコポリマーであってもよい。膜は、１μｍ〜１００μｍ、４μｍ〜５０μｍ、又は１０μｍ〜２０μｍの厚さを有することができる。膜は、化学的処理、ＤＮＡ鋳型足場、又は可視マーカーを含む光学的コーティングなどの１つ以上のコーティングを有することができる。膜は、平坦な物体平面に沿って複数のＤＮＡ鋳型の少なくともいくつかを位置付けるように移動可能であってもよい。膜は、平坦な基準面に隣接して移動させて、平坦な物体平面に沿ってＤＮＡ鋳型を配置するように構成されてもよい。フローセルはまた、剛性材料のフローセルプレートを含むことができ、フローセルプレートの少なくとも一部は、透明プレート領域を含み；膜は、膜の周辺領域でフローセルに取り付けられてもよく、膜の少なくとも一部が透明なプレート領域に面し、膜は、フローセルプレートから離れていく方向に移動可能であり、フローセルプレートと膜との間にチャネルを形成することができる。フローセル膜は、第１の膜；周辺部で第１の膜に接続された第２の膜、ここで、第２の膜の少なくとも一部は第１の膜に面し；フローセルに作動可能に連結された流体入口；フローセルと動作可能に関連付けられた流体出口を含み得て；第１の膜及び第２の膜のそれぞれの部分は互いに離れるように移動可能であり、流体入口から流体出口まで延びるチャネルを形成する。第１の膜及び第２の膜は、周縁部で互いに接着された膜材料の別個のシート、折り畳まれた膜材料の単一シート、又は膜材料の単一のチューブであってもよい。フローセルは、その上に固定化されたＤＮＡ鋳型を有する膜の第１の側部に面する空洞を有するカバーアセンブリ；膜の第１の側部に対向する膜の第２の側部に面する基準プレートを含み得て；ここで、基準プレート及びカバーアセンブリの少なくとも一方が、カバーアセンブリと基準プレートとの間に膜を保持するように選択的に可動であり、流体入口から流体出口に延びる空洞内に通路を形成する。膜は、膜材料の供給部の別個の部分であってもよい。
【００１４】
別の例示的な態様では、平坦な基準面を有する基準プレートを有する配列決定ステージと、平坦な基準面に対して垂直である光軸を有する顕微鏡とを有する配列決定装置が提供される。配列決定ステージは、膜の第１の側部に固定された複数のＤＮＡ鋳型を有する可撓性膜を受容し、光軸に対して垂直である物体平面に複数のＤＮＡ鋳型の少なくともいくつかを有する平坦な基準面に対して可撓性膜を保持するように構成される。平坦な基準表面は、０．０５％の平坦度を有することができ、これは、表面の所定のスパンにわたる最大「ピークから谷」の高さ変化として計算される（例えば、５０ｍｍの距離にわたって０．０２５ｍｍ以下の高さの変化）。他の好ましい平坦度及び他の測定技術（例えば、平均線からの粗さプロファイルの逸脱の算術平均）は、他の実施形態で使用することができる。配列決定ステージは、少なくとも１つの真空源に接続されたより多くの空気通路を有して、膜の第１の側部の反対側にある膜の第２の側部に減圧を生成し、膜の第２の側部を平坦な基準面に対して差圧を生じさせることができる。空気通路は平坦な基準面を通過することができる。可撓性膜は、剛性材料のフローセルプレート上に提供され得、膜は、膜の周辺領域においてフローセルプレートに取り付けられ、膜の第１の側部は、フローセルプレートに面し、膜は、フローセルプレートから離れる方向に移動可能であり、フローセルプレートと膜との間にチャネルを形成する。膜は、第１の膜；周辺部で第１の膜に接続された膜、ここで、第２の膜の少なくとも一部は、第１の膜の第１の側部に面している、を含み得て、ここで、第１の膜及び第２の膜の少なくとも一部は、互いに離れて移動可能であり、第１の膜と第２の膜との間で伸長するチャネルを形成する。配列決定ステージは、膜の第１の側部に面した空洞を含むカバーアセンブリを含むことができ、ここで、基準プレート及びカバーアセンブリの少なくとも１つは、カバーアセンブリと基準プレートとの間で膜を保持するために選択的に移動可能であり、流体入口から流体出口まで延びる空洞内に通路を形成する。カバーアセンブリは、カバープレートと、カバープレートから延びるギャップスペーサとを含むことができ、空洞を形成する。流体入口及び流体出口は、カバーアセンブリを通る通路であってもよい。膜は、膜材料の供給部の別個の部分であってもよい。
【００１５】
他の代替物は、本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【００１６】
本発明のこの概要の列挙は、これ又は任意の関連する又は関連のない適用の請求を制限することを意図するものではない。請求された発明の他の態様、実施形態、改変及び特徴は、本明細書の開示を考慮して当業者には明らかである。
【００１７】
例示的な実施形態のより良い理解は、添付の図面を参照することによって理解することができ、同様の参照番号は同様の部分を示す。図面は例示的なものであり、決して請求項を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、フローセル及び関連する装置の第１の例示的な実施形態の分解等角図である。
【図２】図２は、第１の例示的な実施形態の断面正面図である。
【図３】図３は、フローセル及び関連する装置の第２の例示的な実施形態の部分切取平面図である。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、２つの異なる動作状態における第２の例示的な実施形態の等角図である。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、２つの異なる動作状態で示された、フローセル及び関連するデバイスの第３の例示的な実施形態の断面立面図である。
【図６】様々な例示的な実施形態で使用される例示的な装置の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者らは、典型的な配列決定装置で使用される精密に製造されたフローセルが、そのような装置を操作するコストを大幅に増加させることを見出した。特に、単一の装置は、各自動運転中に処理されるＤＮＡ鋳型を保持するために多数のフローセルが必要となる場合があり、そのようなフローセルは再利用できない可能性がある。典型的な光学装置の狭い被写界深度内で適切な光学的読み取りを確実にするために、ＤＮＡ鋳型を保持するための１つ以上の平坦な基準プレートを提供するために、各フローセルは厳しい公差に作製される必要がある。フローセルはまた、高価な及び／又は機械材料が困難な材料を必要とすることがある。
【００２０】
例示的な既存のフローセルはガラスで形成される。ガラスフローセルは機能的であるが、ガラス上に使用される多層光学コーティングを作製するプロセスが複雑であるため、特に費用効果的ではない。さらに、製造スケーラビリティは比較的限られています。プラスチックフローセルもまた知られており、射出成形技術を使用することにより、比較的高いスケーラビリティ及び潜在的に低いベースコストを提供する。しかしながら、プラスチックフローセルは、部品が成形空洞から射出されるときに生じる急激で不均一な冷却のために、高い物理的公差で製造することが依然として困難である。また、射出成形されたプラスチック部品（約０．５ｍｍ）の最小厚さは、フローセル内外での熱伝達効率を低下させ、フローセル内で行われる化学プロセスを損なう可能性がある。別のタイプの既知のフローセルは、金属ベース（例えば、チタン−シリコン合金）及び透明カバー（例えば、ホウケイ酸ガラス）などのハイブリッド構造を使用する。このようなフローセルは、高価な材料を使用することがあり、製造コストが高くなり、構成要素の異種性質が、異なる表面エネルギー又は層間剥離を引き起こす熱膨張係数などの困難を引き起こす可能性がある。フローセルを形成するための異種材料の使用はまた、両面にＤＮＡ鋳型を固定するための適切な表面化学物質を選択することをより困難にし（場合によっては望ましいが、必ずしも必要ではない）、したがって、配列決定をフローセル内の単一表面に限定する。
【００２１】
本発明者らは、次世代配列決定装置が、大量の膜コーティング工業プロセスなどに適合する薄いプラスチック膜などの薄膜に基づく、より費用効果の高いフローセルを使用することにより利益を得ることができると判断した。特定の例示的な実施形態の説明が続くが、本発明の範囲はいずれかの特定の例に限定されず、当業者に理解されるように、実施例は、本開示の観点から、様々な方法で組み合わせて修正することができることが理解される。
【００２２】
図１及び２は、剛性のフローセルプレート１０２及び薄膜１０４を含むフローセル１００の第１の例示的な実施形態を示す。フローセルプレート１０２は、少なくとも１つの流体入口１０６及び少なくとも１つの流体出口１０８を含み得る。フローセルプレート１０２は、ガラス（例えば、ホウケイ酸ガラスなど）、プラスチック（例えば、ポリカーボネートなど）、又は他の適切な材料を含むことができる。フローセルプレート１０２はまた、好ましくは、光学読み取りプロセスで使用される波長の範囲において高度に光学的に透明であり、自己蛍光特性が低い。この目的のために、フローセルプレート１０２は完全に透明な材料で作られてもよいが、膜１０４の上にあるフローセルプレート１０２の少なくとも一部が透明であればよい。フローセルプレート１０２はまた、当該技術分野で知られているように、光学性能を高めるために適切なコーティングで処理されてもよい。フローセルプレート１０２は、プラスチックの射出成形及び機械加工、又はガラスのフロートキャスティングなどの任意の適切なプロセスによって作製することができる。例えば、プラスチックフローセルプレート１０２は、流体入口１０６及び流体出口１０８がフローセルプレート１０２の残りと同時に形成される射出成形プロセスを使用して、適切な光学特性を有するように都合よく形成されることが期待される。流体入口１０６と流体出口１０８はまた、試薬供給部への流体接続を形成するための一体型又は取り付けられた取付具及び器具内の廃棄導管を含み得る。また、流体入口１０６及び流体出口１０８は、常に開いたままであってもよく、又は時折閉鎖又は密閉されてもよいことも想定される。
【００２３】
膜１０４は、流体入口１０６及び流体出口１０８を囲む周辺領域１２０に沿ってフローセルプレート１０２の底面に取り付けられた柔軟な薄膜材料を含み、その結果、流体入口１０６を通過する試薬が、流体出口１０８を通って出る前に、膜１０４とフローセルプレート１０２との間の空間に入る。膜１０４は、好ましくは、環状オレフィンコポリマーなどの材料を含む。典型的な環状オレフィンコポリマーには、米国ケンタッキー州フィレンツェのＴＯＰＡＳ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃから入手可能なＴＯＰＡＳ（商標）、及び米国ケンタッキー州ＬｏｕｉｓｖｉｌｌｅのＺｅｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｌ．Ｐ．から入手可能なＺＥＯＮＯＲＴＭが含まれる。他の可能な材料には、ポリプロピレン、ポリエチレン、環式オレフィンポリマー（例えば、日本合成ゴム社のＡＲＴＯＮ、及び米国ケンタッキー州ルイスビルのＺｅｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＬＰのＺＥＯＮＥＸ（商標））、ポリエチレンテレフタレート、フッ素化エチレンプロピレン、及び本明細書に記載の目的に適した薄膜に形成することができる他の材料が含まれる。
【００２４】
膜１０４は、本明細書に記載される用途において有益であり得る特定の特性を有するように選択され得る。例えば、膜１０４は、好ましくは低い自己蛍光特性を有する（すなわち、それは、塩基対読み取りプロセス中に有意な蛍光バックグラウンドを生成しない）。膜１０４はまた、好ましくは、以下により詳細に記載されるように、可撓性であり、真空を使用して容易に関節接合される。膜１０４は、１〜１００マイクロメートル（「μｍ」）、より好ましくは４〜５０μｍ、最も好ましくは１０〜２０μｍの厚さを有することができる。このような厚さは、圧力差を利用した操作を可能にし、比較的効率的な熱伝達を提供しながら、適切な強度を提供することが期待される。また、膜１０４は、かなり均一な膜厚さ及び低い熱収縮特性を有することも好ましい。例えば、一実施形態では、膜の温度を１５分間１５０℃に上昇させることによって、又は無制限線形熱収縮を測定するためのＡＳＴＭインターナショナルのアクティブスタンダードＡＳＴＭ  Ｄ２７３２などの他の試験を用いることによって測定した場合、膜１０４は縦方向及び横方向に２％未満収縮し得る。他の実施形態では、他の値及び試験方法を使用することができる。膜１０４はまた、フローセルに組み込まれる前に、その物理的特性を均質化するのを助けるために、使用前に熱処理（例えば、アニール）されてもよい。
【００２５】
膜１０４は、フローセルプレート１０２の周囲に接続され、流体入口１０６から流体出口１０８まで延びる流体密封チャネル２００を形成する。膜１０４は、熱接着、接着接合、超音波溶接等によってフローセルプレート１０２に永久的に接続されてもよい。あるいは、膜１０４は、膜１０４を適切なクランプ構造を用いてフローセルプレート１０２の周囲に挟むことによって、フローセルプレート１０２に一時的に接続されてもよい。
【００２６】
１つ以上のコーティング又は処理を膜１０４に適用することができる。例えば、膜１０４は、様々な技術を使用して化学物質のいくつかの層でコーティングすることができる。化学物質は、スロットダイコーティング、カーテンコーティング、グラビアコーティング、フレキソグラフィー印刷及び輪転グラビア印刷などの様々なロールツーロール膜プロセスによって適用することができる。コーティングは、様々な機能を果たすように選択することができる。例えば、迅速なオートフォーカスを提供するのを助けるために、視覚マーカー（例えば、グリッドパターン又は順序付けられたスポット）を含む光学コーティングを膜１０４に適用することができる。コーティング又は処理はまた、ＤＮＡ鋳型コロニーを増殖させるための足場を形成するために提供され得て、このような足場は、膜１０４上のコロニーの密度を最大にしながらＤＮＡ鋳型コロニーの重複を最小化するようにパターン化され得る。例えば、スキャフォールドパターンを膜１０４に熱成形して、ＤＮＡ鋳型を捕捉するための物理的位置を提供することができ、又は膜１０４を化学結合部位のパターンで処理してＤＮＡ鋳型を特定の位置に固定することなどができる。膜１０４はまた、エンボス加工技術を使用してウェルを形成することによって、又はＤＮＡ鋳型コロニーの位置付け又は固定化を補助するため、又は他の利益を提供するために格子様層を加えることなどにより構造操作によって処理することができる。他の代替物は、本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【００２７】
図２に示すように、フローセル１００の膜１０４部分は、その上にＤＮＡ鋳型２０２が固定されている基材表面を提供する。ＤＮＡ鋳型２０２は、（図２の左側に示すような）規則正しいパターンであってもよく、（図２の右側に示すように）ランダムに分布してもよい。当然に、フローセル１００が、鋳型足場コーティング、ビーズウェルなどを介してＤＮＡ鋳型の規則的な分布を提供するように構成されている場合でさえ、いくつかのランダム分布が起こり得る。
【００２８】
フローセル１００は、基準プレート１１０と共に使用される。基準プレート１１０は、平坦な基準面１１２を備えて形成され、平坦な基準面１１２には、膜１０４が少なくともいくつかの装置動作段階で押圧される。ＤＮＡ鋳型が固定されている物体面（すなわち、膜１０４の上面）の全体的な平面度は、基準面１１２の平坦度及び膜１０４の厚さの均一性によって規定される。これは、各フローセルが、所望の平坦性を得るために極めて高い公差で製造されていた従来のフローセル設計よりもはるかに優れた利点を提供する。それは、単一の基準面１１２のみを製造する必要があり、フローセル１００は、比較的均一な厚さの膜材料を有するだけで、ＤＮＡ鋳型２０２の撮像対象平面Ｐへの配置を確実にすることができるからである。
【００２９】
基準面１１２は、非常に高い平坦度（すなわち、表面平坦度の非常に低い変動）を有するように機械加工又は他の方法で形成された金属材料（例えば、チタン−シリコン合金）を含むことができる。あるいは、基準面１１２は、グラフェンシート又は劈開された雲母面のような自然に平坦な材料を含むことができる。さらに他の実施形態では、基準面１１２は、所望の平坦度に機械加工されるか又は他の方法で製造されるガラス、プラスチック又はセラミックシートを含むことができる。好ましい実施形態では、基準面１１２は、高い熱伝導率を有し、面の所定のスパンにわたる最大「ピークから谷」の高さの変動（例えば、５０ミリメートルの距離に亘って０．０２５ミリメートル以下の高さの変化）として算出される０．０５％の平坦性に機械加工された、例えばチタンシリコンなどの金属材料を含む。他の実施形態では、他の材料、平坦度値及び測定技術（例えば、平均線からの粗さプロファイルの逸脱の算術平均）を使用することができる。
【００３０】
膜１０４は、膜１０４と基準面１１２との間の密閉された空間に適用される真空差を用いて基準面１１２に押し付けられてもよい。例えば、基準板１１０は、基準プレート１１０を通過する多数の真空通路１１４を含み得て、これらは、真空ポンプ（図示せず）に接続され、膜１０４の下面に陰圧を生成する。真空通路１１４は、単純な円形の開口部、又は他の適切な形状を含み得る。通路１１４はまた、基準面１１２に沿った溝１２２を含むことができる。異なる実施形態では、開口部及び／又は溝の任意の適切な組み合わせを使用することができる。この陰圧は、膜１０４の少なくとも一部を基準面１１２と緊密に接触させるように圧力差を生じさせる。膜１０４全体が基準面１１２に押し付けられる必要はないが、膜１０４の残りの部分と共通の物体平面内に位置していなくてもよく、基準ペア読み取りプロセスの間に焦点が合っていなくてもよい。
【００３１】
一実施形態では、圧力差は、膜１０４の上部に対する膜１０４の底部の圧力降下として、０．５〜５ポンド／平方インチ（「ｐｓｉ」）、より好ましくは１〜２ｐｓｉであってもよい。また、膜１０４の底面に真空を適用する代わりに（又はそれに沿って）、正の圧力を膜１０４の上面に加えることも想定される。陽圧は、例えば、チャネル２００を通過する試薬を所望の量に加圧して、膜１０４の少なくとも一部を基準面１１２と密接に接触させるのに十分な圧力差を生じさせることによって行うことができる。さらに、いくつかの実施形態では、試薬は、陰圧下でチャネル２００を通って引き込まれてもよく、この場合、圧力差は、基準面１１２に対して所定の位置に、膜を移動させる圧力差を得るために十分な量だけチャネル２００内に発生する陰圧を超えることによって提供され得る。他の選択肢は、本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【００３２】
前述の記載から、圧力差は、膜１０４をフローセルプレート１０２から遠ざけてチャネル２００を形成することを理解する。圧力差は、膜１０４（又は両方）を弾性的又は塑性変形させて、所望のフローセルチャネル２００の形状を得ることができる。このような変形は、膜１０４を加熱することによって補助され得る。例えば、フローセル１００は、加熱ブロック内に配置され、配列決定プロセスが始まる前に、チャネル２００の一般的な形状を形成するために圧力差を受けるか、又は配列決定プロセスのステップとしてなされ得る。この変形はまた、膜１０４をフローセルプレート１０２に取り付ける前に、チャネル２００のような形状になるように膜１０４を予め形成することによって補助されてもよい。これは、膜１０４をチャネル２００のおよその形状に真空成形又はエンボス加工することにより、又は他の公知の製造方法を用いて形成することができる。
【００３３】
インサイチュ配列決定を可能にするために、基準プレート１１０は、好ましくは、加熱及び／又は冷却システムに接続される。例えば、基準プレート１１０は、熱電気ヒートポンプ２０４（すなわち、いわゆる「ペルチェ」デバイス）に取り付けられるか、又はその一部として形成されてもよい。ヒートポンプ２０４は、チャンバ２００の内容物を加熱する（及び任意に冷却する）ために、基準プレート１１０を加熱する（及び任意に冷却する）ために作動させることができる。好ましい実施形態では、ヒートポンプ２０４及び基準プレート１１０は、チャネル２００内の温度を、４℃〜９９℃の範囲、より好ましくは室温（名目上２２℃）〜８０℃の範囲に制御するように構成される。
【００３４】
フローセル１００はまた、フローセル１００と基準プレート１１０との間に嵌合するギャップスペーサ１１６と組み合わせて使用することができる。ギャップスペーサ１１６は、ギャップスペーサ１１６を垂直に貫通する開口部１１８を形成する平坦な、好ましくは連続した壁を含む。ギャップスペーサ１１６は、フローセル１００及び基準プレート１１０にそれぞれ当接するように、精密に製造された上面及び下面を有することができる。図２に示すように、ギャップスペーサ１１６を使用して、フローセルチャネル２００の高さＨを画定することができる。いくつかの実施形態では、チャネル高さＨは、１０〜２００μｍ、より好ましくは５０〜１５０μｍ、最も好ましくは８０〜１２０μｍであってもよい。
【００３５】
ギャップスペーサ１１６は、図示のように別個の部品として設けられてもよい。この実施形態では、ギャップスペーサ１１６は、配列決定動作間でチャネル２００の高さを変更するために交換可能であってもよい。また、配列決定動作中にチャネルの高さを変更することが望ましい場合、ギャップスペーサ１１６は、例えば垂直に移動するラックに取り付けられることによって、基準プレート１１０に移動可能に接続されてもよい。このような動きは、例えば、図３〜４Ｂの実施形態に関してより詳細に説明するように、流抵抗を周期的に減少させるようにチャネル高さＨを変更することが望ましい場合がある。このような実施形態では、基準プレート１１０とギャップスペーサ１１６との間の相対移動を可能にするために、例えば、基準プレート１１０をギャップスペーサ開口部１１８内に完全に嵌合するように成形することができる。あるいは、ギャップスペーサ１１６は、基準プレート１１０又はフローセル１００の永久部分として形成されてもよい。例えば、ギャップスペーサ１１６は、フローセルの底面に接着又は他の方法で取り付けられ、フローセルプレート１０２に対して所定位置に膜１０４をクランプするために使用される。別の例として、ギャップスペーサ１１６は、基準プレート１１０の一体部分として機械加工されてもよい。ギャップスペーサ１１６は、好ましくは、金属又はプラスチックのような一般に剛性の材料から形成され、材料は、配列決定及び塩基対読み取り操作に影響を及ぼし得る熱膨張及び収縮を最小にするように選択され得る。
【００３６】
ギャップスペーサ開口部１１８の形状は、差圧が印加される場合、特に、膜１０４がフローセルプレート１０２と基準プレート１１０との間の空間にしっかりと形成されるような柔軟性を有する実施形態では、チャネル２００の形状及びサイズを画定するように選択されてもよい。例えば、ギャップスペーサ開口部１１８は、流体入口１０６と流体出口１０８との間の狭いチャネル２００として構成されてもよく、又は比較的広いチャネル２００を形成してもよい。チャネルの形状は、必要に応じて変更することもできる。例えば、図示されたチャネル２００は、開口部１１８を充填する長方形の形状を有する。別の例として、チャネル２００は、流体入口１０６及び流体出口１０８に隣接する比較的大きなリザーバと、リザーバ間に延びる比較的狭い通路とを有する「ドッグボーン」又は「ダンベル」形状を有してもよい。また、差圧が加えられる場合、膜１０４を別個の通路に変形させる基準プレート１１０から上方に延びる隆起部を設けることなどにより、チャネル２００を複数の別個のチャネルに分割することも考えられる。チャネル２００のサイズを変更することは、フローセルで実施される配列決定操作の数、ならびに試薬消費の速度に影響し得る。
【００３７】
ギャップスペーサ１１６はまた、真空が膜１０４を基準面１１２に対して適切に引っ張ることができるように、膜１０４の下面が収容された一般的に密閉されたチャンバを形成するために、他の部品と協働することができる。この目的のために、ギャップスペーサ１１６は、フローセル１００及び基準プレート１１０に対して気密シールを形成するシール２０８を含むことができる。ギャップスペーサ１１６はまた、（空気通路１１４と同様の）１つ以上の空気通路を含み得て、これを通じて、真空が膜１０４の下面に適用され得る。本開示を考慮すれば、当業者には他の選択肢が明らかとなる。例えば、フローセルプレート１０２の底部にシールを設けて、ギャップスペーサ１１６又は基準プレート１１０の対応する表面と係合して、密閉された真空チャンバを形成することができる。
【００３８】
使用時には、ギャップスペーサ１１６が基準プレート１１０上に配置され、フローセル１００がギャップスペーサ１１６上に配置され、膜１０４が基準面１１２に面している。クランプ又は他の機構を設けて、フローセル１００を適所に保持してもよい。次に、圧力差は、基準プレート１１０を通る真空通路１１４を通って真空を引くなどして、膜１０４の２つの側面に加えられる。圧力差は、膜１１４の少なくとも作動部分（すなわち、配列決定用塩基対の読み取りに使用される部分）を基準面１１２と接触させるように促す。したがって、膜１０４の作用部分は、基準面１１２の平坦度及び膜１０４の厚さの均一性によって画定される平坦な形状をとる。
【００３９】
配列決定処理は、膜１０４が基準面１１２に対して平坦になった後に開始することが好ましい。配列決定処理は、任意の適切なプロトコルに従うことができ、膜１０４上にＤＮＡ鋳型を固定化し、チャネル２００を通って試薬を通過させ、チャネル２００の内容物を加熱及び／又は冷却することなどの処理ステップを含んでもよい。化学反応の具体的な詳細は、本開示とは無関係であり、本明細書に記載されていない。しかしながら、配列決定処理の例は、米国特許出願公開第２０１３／０３０１８８８号、第２０１３／０３１６９１４号、及び第２０１４／００４５１７５号、米国特許第９，０１７，９７３号に記載され、これらの全ては参照により本明細書に援用される。また、いくつかの実施形態では、処理のいくつかのステップは、膜１０４が基準面１１２に押し付けられる前に実行されてもよいことが理解される。例えば、ＤＮＡ鋳型２０２は、膜１０４がフローセルプレート１０２に接続される前に膜１０４に固定化されてもよい。別の例として、ある種の化学反応をフローセルチャネル２００内で行うことができ、次いで差圧を加えて、各塩基対読み取りを行う前に膜１０４を平坦化する。他の代替案は、本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【００４０】
配列決定処理の間に周期的に、顕微鏡２０６又は他の光学装置を用いて、ＤＮＡ鋳型２０２上の伸長した塩基対を読み取る。この読み取り工程の間、平坦な基準面１１２及び膜１０４の比較的均一な厚さが協働して、顕微鏡の光軸Ａに垂直に配向された物体面Ｐを与える。顕微鏡２０６は、その焦点平面を物体面Ｐに整列させて、ＤＮＡ鋳型２０２が顕微鏡２０６の焦点深度内にあるように操作することができる。平坦な物体平面Ｐは、顕微鏡の被写界深度内にあるＤＮＡ鋳型の集団を増加させ、より多くの塩基対延長を正確に読み取る能力を高める。
【００４１】
前述の実施形態は、従来の精密製造フローセルよりも一定の利点を提供することができる。例えば、フローセル１００は、塩基対読み取り処理を容易にする均一で平坦な表面を提供するために、装置上の単一の精密製造された基準面１１２と関連して比較的安価な膜を使用することができる。これは、精密製造された平坦な表面を有するフローセルを使用するシステムと比較して、コストを削減し、性能を向上させることが期待される。また、フローセル１００の製造速度及び利用可能性を高めることができる直接的な製造技術を使用して、フローセル１００を比較的迅速に製造することができることも期待される。
【００４２】
フローセル１００を精密に製造する必要性を減らすことの利点が望ましいが、それにも関わらず、いくつかの実施形態において、フローセル１００にフローセルプレート１０２の底部に精密製造された平坦な表面を設けることができることは理解され、この表面は、固定化されたＤＮＡ鋳型コロニーをイメージング化のための共通の平面に保持するためにも使用できる。他の代替物は、本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【００４３】
フローセル３００の第２の実施形態を図３〜４Ｂに示す。このフローセル３００は、上部膜３０２及び下部膜３０４を含む。図３では、下部膜３０４を示すために、上部膜３０２の一部分３０６が図示の目的のために切り取られている。上部膜302及び下部膜304は、周縁部308の周りに互いに取り付けられている。この実施形態では、上部膜３０２及び下部膜３０４は、互いに接合された別個の材料シートであるが、他の実施形態では、膜３０２、３０４は、単一シートの別々の部分であってもよく、それは、それ自体の上に折り畳まれ、周縁部の一部を形成する折り目を有する。膜３０２、３０４はまた、周縁部３０８の側部を形成する連続的な表面を有する材料の連続的なチューブとして提供されてもよい。
【００４４】
フローセル３００はまた、流体入口３１０及び流体出口３１２を含む。流体入口３１０及び流体出口３１２は、上部膜３０２と下部膜３０４との間の適所に捕捉される固定具（例えば、チューブ）として、又は他の適切な構造又は構造の組み合わせを使用して、下部膜３０４を通る通路として上部膜３０２（図示されている）を通る通路として形成されてもよい。示される実施形態では、流体入口３１０及び流体出口３１２は、膜を貫通するそれぞれの開口部に結合されたフランジを有する射出成形チューブとして提供されるが、他の構造を使用することもできる。例えば、流体入口３１０及び流体出口３１２は、試薬を注入及び除去するために針が通される自己治癒ゴムブロックを含むことができる。
【００４５】
周囲部３０８は、上部膜３０２と下部膜３０４とを接合して、流体入口３１０から流体出口３１２まで伸びる上部膜３０２と下部膜３０４との間に位置するチャネル４００を形成する。この実施例では、周辺部３０８は、細長い十字形状を有するが、他の実施形態では、長方形、楕円形、又は他の形状を使用することができる。例えば、フローセル３００は、「ドッグボーン」又は「ダンベル」形状を含むことができる。フローセル３００はまた、複数の平行なチャネル４００を提供するために、フローセル３００の流れ方向に沿って延びる結合ストリップを含むことができる。
【００４６】
この実施形態では、上部膜３０２及び下部膜３０４の少なくとも１つ（好ましくは上部膜３０２）は、塩基対読み取り処理で使用される波長において光学的に透明である。上部膜３０２及び下部膜３０４も同じ材料であってもよいし、異なっていてもよい。上部膜３０２及び下部膜３０４は、膜材料（例えば、環状オレフィンコポリマーなど）及び上記のような化学的コーティング及び処理、又は他の適切な材料及びコーティング及び処理を含むことができる。外周部３０８は、接着結合、超音波溶接、熱溶接、又は他の適切な処理及び材料によって形成された永久的な結合であってもよい。外周３０８はまた、適切な形状のマンドレルの間に膜３０２、３０４を一緒に挟んで形成された一時的な結合であってもよく、次いで配列決定及び読み取り処理が完了した後にマンドレルを解放し膜３０２、３０４を除去する。必要に応じて、フローセル３００は、フローセル３００を適所に保持するための装置の関連するピン（図示せず）の上に嵌合するか、又は他にはフローセル３００を操作するために使用され得るアンカー穴３１４などの追加の特徴を含むことができる。
【００４７】
上部膜３０２及び下部膜３０４の一方又は両方はまた、第１の実施形態に関連して上述したような化学コーティング又は他の処理で処理することができる。例えば、下部膜３０４は、ＤＮＡ鋳型４０２がフローセルチャネル４００のこの部分にのみ結合するように、ＤＮＡ鋳型足場で処理される領域３１６を含むことができる。あるいは、ＤＮＡ鋳型４０２は、上部膜３０２と下部膜３０４の両方の内部表面上に固定化され得て、塩基対の伸長及び読み取りに利用可能なＤＮＡ鋳型コロニーの数を最大にする。この実施形態では、上部膜３０２及び下部膜３０４は、同じ材料組成及び表面処理を有し、ＤＮＡ鋳型４０２を固定化及び画像化するための同一の表面を提供することができる。
【００４８】
フローセル３００は、上部基準プレート４０４及び下部基準プレート４０６と共に使用される。上部基準プレート４０４及び下部基準プレート４０６の少なくとも１つは、塩基対読み取りプロセスで使用される波長で光学的に透明である。上側基準プレート４０４の下面は、比較的高い平坦度を有するように製造された平坦な上側基準面４０８を含む。同様に、下部基準プレート４０６の上面は、比較的高い平坦性を有するように製造された平坦な下部基準面４１０を含む。好ましい実施形態では、上側基準面４０８及び下側基準面はそれぞれ、０．０５％の平坦度を有し、これは、表面の所定のスパンにわたる最大「ピークから谷まで」高さ変化として計算される（例えば、５０ｍｍの距離にわたって０．０２５ｍｍ以下の高さの変化）。その他の好ましい平坦度値及び他の測定技術（例えば、平均線からの粗さプロファイルの逸脱の算術平均）は、他の実施形態で使用することができる。しかしながら、膜３０２、３０４の１つにのみＤＮＡ鋳型を固定することが望ましい場合、基準プレート４０４、４０６のうちの１つに平坦な基準面を設けることが必要である。基準プレート４０４、４０６の一方又は両方は、上述のような熱電ヒートポンプ又は同様のデバイスに接続されるか、又はその一部として形成されてもよい。
【００４９】
上側基準プレート４０４及び下側基準プレート４０６は、好ましくは、配列決定装置の一部として提供され、これらは、装置と一体的に形成され得るか、又は交換可能な部品として提供され得る。基準板４０４、４０６は、第１の例示的な実施形態に関連して先に説明したような任意の適切な材料で作ることができるが、塩基対読み取りプロセスを可能にするために、少なくとも１つは透明である（例えば、ホウケイ酸ガラス）。上部基準プレート４０４及び下部基準プレート４０６は、低い自己蛍光特性を有して、それらが塩基対読み取りプロセスの間に過度の量のバックグラウンド光を生成しないことも好ましい。
【００５０】
使用時には、フローセル３００は、図４Ａに示すように、上部基準プレート４０４に隣接する上部膜３０２、及び下部基準プレート４０６に隣接する下部膜３０４とともに配置される。この位置では、フローセルチャネル４００内の陽圧及びフローセル３００の外側の陰圧の一方又は両方が、上部基準面４０８に接触する上部膜３０２、及び下部基準面４１０に接触する下部膜３０４を保持するために使用される。陰圧は、上述されるように、上部基準プレート４０４及び下部基準プレート４０６の一方又は両方を通って伸びる真空通路（図示せず）によって加えられてもよい。陽圧は、１つ以上のポンプ、バルブなどを使用して適切な陽圧でチャネル４００内の試薬を維持することによって提供され得る。一実施形態では、上部基準面４０８及び下部基準面４１０に対してそれぞれ上部膜３０２及び下部膜３０４を保持するために、０．５〜５ｐｓｉ、より好ましくは１〜２ｐｓｉの圧力差が使用される。
【００５１】
フローセルチャネル４００の高さＨは、上部基準面４０８と下部基準面４１０との間の距離と、上部膜３０２及び下部膜３０４の厚さによって規定される。上部基準プレート４０４及び下部基準プレート４０６は、配列決定動作の間に互いに対して所定の位置に固定され、この場合、チャネル高さＨは一定のままである。あるいは、いくつかの実施形態では、上部基準プレート４０４及び下部基準プレート４０６は、図４Ａ及び図４Ｂに示すように、フローセルのチャネル高さＨを変更するために互いに対して移動可能であってもよい。これは、本開示を考慮すると当業者には理解されるように、モータ駆動ラックなどの従来のロボット機構を使用して達成され得る。
【００５２】
可動基準プレート４０４、４０６を設けることにより、一定の利点を提供することが期待される。例えば、基準プレート４０４、４０６は、図４Ａに示すように、基準プレート４０４、４０６が比較的近接している第１の位置と、４Ｂに示すように、基準プレート４０４、４０６が比較的遠い第２の位置との間を移動することができる。第１の位置は、比較的低いチャネル高さＨを提供する。これは、第２の位置と比較して、相対的に高い領域対体積比（すなわち、チャネル４００の体積に対する、上部膜３０２及び下部膜３０４の内面の合計表面積の比）を与える。高い面積対体積比は、ＤＮＡ鋳型４０２上で所望の化学プロセスを実施するのに必要な試薬の量を減少させ、装置の操作コストを低減させることができる。これは、特定の試薬が有意な部分の操作コストを含み得るためである。第１の位置はまた、それぞれの基準面４０８、４１０に密接している膜３０２、３０４の面積を増加させ、膜３０２、３０４の操作部分のサイズを増加させ、結果として顕微鏡の焦点面の被写界深度内にあるＤＮＡ鋳型の集団数を増加させる。これは、顕微鏡２０６又は他の光学系による迅速で正確な塩基対読み取りを容易にする。
【００５３】
図４Ｂに示される第２の位置は、第１の位置と比較して、面積対容積比が比較的小さい。これにより、チャネル４００内の流抵抗が低減され、流入口３１０から流出口３１２への圧力降下が比較的小さい状態でチャネルを介して試薬を圧送することができる。流抵抗が減少することにより、より簡単でより正確な試薬圧送が容易になる。減少した流抵抗は、試薬圧送プロセスの間に膜３０２、３０４からＤＮＡ鋳型４０２を剥がす可能性のあるせん断力の大きさを減少させる、膜３０２、３０４に隣接する液体速度の大きさを減少させることも期待される。
【００５４】
図３の実施形態は、第１の実施形態と本質的に同じ方法で使用される。しかしながら、所望であれば、配列決定プロセス中にチャンバ４００の表面対体積比を変更するために追加のステップを追加することができる。この実施形態はまた、第１の実施形態と同様の利点を提供する。例えば、上部膜３０２及び下部膜３０４は、配列決定プロセス中に平坦な基準面４０８、４１０と接触するように押し付けられるが、他の点では要求される平坦度公差にまで作られる必要はない。これは、フローセルのコストを低減し、システムの光学性能を改善することができる。さらに、第２の実施形態は、フローセルプレート１０２を外部基準面４０８で置き換え、フローセル３００に平坦な上面を設ける必要なしに、ＤＮＡ鋳型を上部膜上に固定して正確に画像化することができる。２つの接合された膜の使用はまた、２つの膜を一緒に接合するための簡単な接着技術を使用してフローセル３００を製造する能力を向上させることができ、フローセル３００の使い捨て性も改善する。他の代替物及び利点は、本開示に照らして当業者に明らかとなる。
【００５５】
第３の実施形態を図５Ａ及び５Ｂに示す。ここでは、フローセル５００は、カバー５０４と基準プレート５０６との間の適所に捕捉された膜５０２によって形成される。ギャップスペーサ５０８は、カバー５０４と基準プレート５０６との間に配置される。カバー５０４とギャップスペーサ５０８は、フローセル５００が形成される空洞を画定するアセンブリを形成する。カバー５０４は空洞の頂部を形成し、ギャップスペーサ５０８は空洞の外周形状を形成する。カバー５０４及びギャップスペーサ５０８は、空洞の形状によって画定されるフローセル通路５１０を形成するために膜５０２に隣接して配置される。ギャップスペーサ５０８の高さは、フローセル通路５１０の高さＨを規定する。
【００５６】
膜５０２、カバー５０４、基準プレート５０６及びギャップスペーサ５０８は、先の実施形態で説明したものと同様に作成されてもよいし、又は異なる構造を有してもよい。例えば、膜５０２は、様々な化学的コーティング又は処理を有する環状オレフィンコポリマー材料を含むことができる。カバー５０４は、光学コーティングなどを含み、好ましくは自己蛍光特性が低い透明材料を含む。基準プレート５０６は、好ましくは０．０５％の平坦度を有する精密製造された平坦な基準面５１２を含み、これは、表面の所定のスパンにわたる最大「ピークから谷まで」の高さの変化として計算される（例えば、５０ｍｍの距離にわたって０．０２５ｍｍ以下の高さの変化）。他の好ましい平坦度値及び他の測定技術（例えば、平均線からの粗さプロファイルの逸脱の算術平均）は、他の実施形態で使用することができる。ギャップスペーサ５０８は、任意の適切な材料（例えば、金属、セラミック又はプラスチック）を含むことができ、カバー５０４の一体部分として、カバー５０４への取り付けとして、又は完全に別個の部品として提供することができる。ギャップスペーサ５０８は、カバー５０４とギャップスペーサ５０８との間、及びギャップスペーサ５０８と膜５０２との間に流体密封接続を形成するために、ガスケットなどの１つ以上のシール（図示せず）を含むことができる。ギャップスペーサ５０８はまた、先の実施形態に関連して論じたように、長方形、「ドッグボーン」形状、「ダンベル」形状、複数のチャネルなどの任意の望ましい周囲形状を有することができる。
【００５７】
カバー５０４、基準プレート５０６、及びギャップスペーサ５０８のうちの１つ以上は、装置の一体的又は動作可能な部分として提供されてもよい。例えば、カバー５０４、基準プレート５０６、及びギャップスペーサ５０８は、複数の連続した独自の配列決定操作中、装置に取り付けられ、装置上にとどまることができる。
【００５８】
フローセル５００はまた、流体入口５１４及び流体出口５１６を含む。流体入口５１４及び流体出口５１６は、（図示の）カバー５０４を通る通路として、又は基準プレート５０６又はギャップスペーサ５０８などの他の部分を通る通路として形成することができる。
【００５９】
差圧は、膜５０２を平坦な基準面５１２に押し付けるために使用される。差圧は、流路５１０の内容物を加圧するか、膜５０２の底面の圧力を低下させるか、又はその両方によって発生させることができる。基準プレート５０６は、好ましくは、本明細書で前述したような１つ以上の真空通路５２４を含む。基準プレート５０６はまた、上述のような熱電ヒートポンプ又は同様のデバイス（又はその一部）に接続されてもよい。
【００６０】
この実施形態は、それ自体、使い捨てフローセルの必要性を排除する。代わりに、フローセル５００は、使い捨て膜５０２と、再使用可能なカバー５０４及びギャップスペーサ５０８との組み合わせとして形成される。膜５０２は、上述の実施形態と同様に、基準面５１２と相互作用して、顕微鏡又は他の撮像システムの光路に垂直な平坦な物体面を形成し、ＤＮＡ鋳型５１８の大きな集団が顕微鏡の被写界深度内にあることを保証する他の実施形態と同様に、膜５０２によって形成されるプレートの平坦度は、基準面５１２の平坦度及び膜５０２の厚さの均一性によって決定される。
【００６１】
使用時には、膜５０２は、流体入口５１４から流体出口５１６まで延びるチャネル５１０を形成するために、基準表面５１２の上方で、カバー５０４及びギャップスペーサ５０８の下に配置される。配列決定は、例えば、膜５０２上にＤＮＡ鋳型５１８を固定化し、試薬をチャネル５１０に通し、チャネル５１０の内容物を加熱及び／又は冷却するなどして、チャネル５１０内で行われる。配列決定の間、顕微鏡又は他の適切な光学系によって、カバー５０４を介して塩基対延長物が読み取られる。本明細書中に記載される他の実施形態と同様に、塩基対読み取りは、定期的に又は連続的に実施され得る。少なくとも塩基対読み取りステップの間、差圧が膜５０２を基準面５１２に対して保持するために加えられる。
【００６２】
新しい配列決定操作を開始することが望ましい場合、カバー５０４及びギャップスペーサ５０８は、基準プレート５０６から離れるように移動される。これにより、ギャップスペーサ５０８と膜５０２との間のシールが破壊され、チャンバ５１０内の残留流体が急速に放出される。チャンバ５１０が開くときに流体の動きを制御するために、基準プレート５０６内に又はそれに隣接して形成された１つ以上の流体ダクト（図示せず）を設け、基準プレート５０６は、傾動プラットフォーム上に配置されてもよいし、又はガイド流体の除去を助けるような角度で取り付けられてもよい。カバー５０４、ギャップスペーサ５０８、及び他の部品はまた、フッ素化化合物のナノメートル厚の層（例えば、デラウェア州ウィルミントンのＥＩ  ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙから入手可能なＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ＡＦ非晶質フッ素樹脂）などの材料で被覆され得て、操作サイクル間のキャリーオーバーを低減するのに役立つ。カバー５０４及びギャップスペーサ５０８は、漂白化学化合物で洗浄して、配列決定実行間の交差汚染を排除することができる。例えば、カバー５０４及びギャップスペーサ５０８は、ロボットを使用して移動させて、配列決定実行間に漂白化合物の浴中にそれらを入れることができる。既存の膜５０２は除去され廃棄されて、新しい膜５０２が基準プレート５０６上に置かれ、新しいＤＮＡ鋳型コロニーの成長又は配置を開始する。
【００６３】
示された例示的な実施形態は、膜５０２を除去し、交換するためにスプールシステムを使用する。膜５０２は、供給スプール５２０と巻き取りスプール５２２との間に延びる。供給スプール５２０は未使用膜５０２を保持し、巻き取りスプール５２２は使用済み膜５０２を保持する。カバー５０４及びギャップスペーサ５０８が膜５０２から離れるように移動されると、１つ以上のモータＭ1、Ｍ2を使用してスプール５２０、５２２の一方又は両方を操作して、膜５０２の使用済み部分を基準プレート５０８から除去し、膜５０２の新しい部分を基準プレート５０８上に進める。例えば、モータＭ1は時計回りに（図５Ｂで見て）回転させて膜５０２の使用済み部分を巻くことができ、モータＭ2（設けられている場合）又は適切な抗力ブレーキを使用して膜５０２に張力を加えて、それを基準面５１２上で概ね平坦にすることができる。
【００６４】
膜５０２は、他の機構を使用して置き換えることができることが理解される。例えば、膜５０２は、個々のシートとして提供されてもよく、折り畳まれたり分解されたりすることなく動きを容易にするのに役立つように、フレームなどを使用してそれらの周囲で補強されてもよい。別の例として、シート５０２は、その周囲に保持される大きなシートを含むことができ、シート５０２の異なる部分は、各配列決定を実行中にフローセル位置に選択的に配置される。他の代替物は、本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【００６５】
第３の実施形態は、消耗品資源の使用をさらに低減し、さらに運用コストを低減することが期待される。
【００６６】
前述の実施形態は、平坦な基準面に対して膜を平坦に保持するために差圧を使用するものとして説明したが、他の実施形態は、これを達成するために差圧を使用しなくてもよい。例えば、図５Ａ及び図５Ｂの実施形態は、真空通路５２４を省略し、その代わりに、基準面５１２にわたって膜５０２をしっかりと引き伸ばすことによって変更することができる。他の代替物は、本開示を考慮すれば当業者には明らかである。
【００６７】
図６は、実施形態を装置６００にどのように統合することができるかを示す。装置６００は、前述の実施形態のいずれか又はその変形として構成された配列決定ステージ６０２を含む。例えば、ステージ６０２は、剛性プレートに取り付けられた膜を有する自立型フローセル６０６を受け入れる固定された基準面／ギャップスペーサアセンブリ６０４を備えることができる。又は、ステージ６０４は、固定された基準面６０８、可動カバー／ギャップスペーサアセンブリ６１０、及び交換可能な膜供給部６１２を備えることができる。ステージ６０４はまた、下部基準面６１４及び固定又は可動上部基準面６１６を含むことができ、これは、上部膜及び下部膜に接合された上部を含む自立型フローセル６１８を受け入れる。
【００６８】
配列決定ステージ６０２は、熱電ヒートポンプなどの加熱デバイス６２０に関連付けられている（好ましくは、その上に搭載されている）。エアポンプ、遠心ファンなどの真空源６２２を設けて、膜を関連する基準面に押し付けるために膜の底部に真空を引くことができる。ステージ６０２は、第１流体ポンプシステム６２６を介して試薬供給源６２４に接続され、第２流体ポンプシステム６３０を介して試薬廃棄物６２８に接続されてもよい。撮像システム６３２（例えば、顕微鏡、光源、ミラー、カメラなど）は、ステージ６０２の上に取り付けられ、ロボットユニット６３４に移動可能に取り付けられてもよい。
フローセル、可動基準プレート、可動カバーなどの様々な部品を移動させるために、１つ以上のロボットユニット６３６が設けられてもよい。適切な電源、電子制御装置、ネットワークインターフェースなども、装置６００とともに設けることができる。本開示を考慮すると、当業者には他の代替物が明らかである。
【００６９】
本開示は、単独で又は一緒に使用され得る、多数の新規で有用であり、非自明な特徴及び／又は特徴の組み合わせを記載する。実施形態は、ハイスループット核酸配列決定システムに関連する商品のコストを低減するのに特に有用であると予想されるが、他の利益が提供されてもよく、低減されたコストは必ずしもすべての実施形態で必要とされるわけではない。本明細書に記載された実施形態は、合成プロセスによる配列決定の文脈において一般的に説明されているが、化学的標識の視覚的観察を用いる他の配列決定プロセスでの使用のために実施形態を構成することができる。
本明細書に記載の実施形態はすべて例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。本明細書に記載された発明は、様々な等価な方法で修飾され、適合され得、そのような改変及び適合は全て、本開示及び添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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