(57)【要約】  本発明は特に、ペプチド、特に、配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のプロペプチドの誘導体に対するポリクローナル抗体に関する。本発明はまた、該抗体を生成するための方法、および該ペプチドをアッセイするための方法にも関する。さらに、本発明は、個体におけるうつ病を検出／決定するための方法、およびうつ病治療の有効性を監視するための方法にも関する。【選択図】 なし
2019534259.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号２）のペプチド（スパジン）に対するポリクローナル抗体（ＡＢ１）であって、前記抗体は、ペプチドＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号６）を唯一の例外として、
ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）、ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号２）、ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬ（配列番号３）、ＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷ（配列番号４）およびＷＳＧＰＩ（配列番号５）を含む群から選択されるペプチドに結合する、ポリクローナル抗体（ＡＢ１）。
【請求項２】
配列ＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号６）を含むペプチド（ミニスパジン）に対する、ポリクローナル抗体（ＡＢ２）。
【請求項３】
前記抗体は、
ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）、ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号２）およびＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号６）を含む群から選択されるペプチドに結合している、請求項２に記載のポリクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１に記載の抗体を生成するための方法であって、
ａ．配列ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号２）のペプチドを含む組成物の動物への投与、
ｂ．前記動物からの抗体の回収、および
ｃ．前記抗体の単離、を含む、抗体を生成するための方法。
【請求項５】
請求項２または３のいずれか一項に記載の抗体を生成するための方法であって、
ａ．配列ＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号６）のペプチドを含む組成物の動物への投与、
ｂ．前記動物からの抗体の回収、および
ｃ．前記抗体の単離、を含む、抗体を生成するための方法。
【請求項６】
生体試料中のスパジンの検出および／またはアッセイのための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項７】
生体試料中のミニスパジンの検出のための、請求項２〜３のいずれか一項に記載の抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項８】
うつ状態の検出のために個体の生体試料から配列番号１のペプチドを検出するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項９】
以下のステップを含む、患者におけるうつ病を検出／決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であって、
ａ．うつ病個体の生体試料中における、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体を用いた配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のペプチドの濃度（Ｃｍ）の測定のステップ、
ｂ．ステップａ）で測定された前記ペプチドの前記濃度と健康な個体の基準濃度（Ｃｒｅｆ）との比較、および以下の式に従ったスコア（Ｓ１）の算出のステップ
Ｓ１＝Ｃｍ／Ｃｒｅｆ
１未満のＳ１の値は、前記試料が得られた個体がうつ病であることを示唆する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法。
【請求項１０】
うつ病治療の有効性を監視するための方法であって、
ａ）個体の生体試料中で、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体を用いて配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のペプチドの濃度Ｃ１を測定することと、
ｂ）前記治療後に前記個体の生体試料中で、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体を用いて配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のペプチドの濃度Ｃ２を測定することと、
ｃ）前記濃度値を比較して、以下の式に従ってスコア（Ｓ２）を算出することと、を含み
Ｓ２＝Ｃ２／Ｃ１
１．２より高いＳ２の値は、その治療が抗うつに有効であることを示唆する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特に、これ以降ＰＥと称される、配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のプロペプチドに特に由来するペプチドに対するポリクローナル抗体に関する。
【０００２】
本発明はまた、これ以降ミニスパジンと称される、該プロペプチドの断片１２〜１８を除いて配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のプロペプチドに特に由来するペプチドに対するポリクローナル抗体にも関する。
【０００３】
本発明はまた、うつ病を検出するための方法、および抗うつ療法の有効性を監視するための方法にも関する。
【０００４】
有利には、本発明は、成熟ミニスパジンまたはその修飾末端を用いた治療によって影響を受けることなく、大うつ病における抗うつ療法に対する反応を診断するためにペプチドアッセイを使用できるようにする。本発明は、特に医薬品産業において、特にうつ病に罹患しているまたは罹患したことのある患者の精神疾患の予防および／または調査に使用される診断ツールの開発において、特に適用可能である
【０００５】
以下の記載において、括弧（［  ］）内の参照番号は、本明細書の末尾に提供される参考文献のリストに言及するものである。
【背景技術】
【０００６】
精神疾患は、公衆衛生にとって深刻な問題である。最新の研究によってうつ病の高い有病率が確認されている：一生を通じて、女性の２０％および男性の１０％がうつ病エピソードを経験したことがあるか、経験しているか、または経験する［１］。これらの数値は明らかに重要である：これはフランス等の国において年間１２，０００件の死亡の原因となっている、うつ病の主要な合併症である自殺を考慮に入れるとさらに重要である［２］。
【０００７】
うつ病は、非常に一般的な、しばしば日常生活に支障をきたす疾患である。うつ病は、先進国の人口の最大２０％に影響を及ぼし得る。その原因は多種多様である。この病態は、患者の精神および行動の両方ならびに生理機能に影響を及ぼす。うつ病の治療薬もまた非常に数が多く、使用される薬物の作用機序は明確に確立されていない。
【０００８】
世界保健機関（ＷＨＯ）は、２０２０年には単極性うつ病が障害の原因の第２位になると予測している。そのうつ病が意味する個人および家族の苦しみが、この病態の大きな社会的負担の一因となっている。うつ病は、既に欠勤の主要原因の１つとなっており、経済的負担は年間３００億ユーロ超を占めている。医療従事者が利用できる治療手段、具体的には、ＳＳＲＩ（選択的セロトニン再取り込み阻害薬）およびＳＮＲＩ（セロトニンノルエピネフリン再取り込み阻害薬）があるにもかかわらず、うつ病人口の３０％には治療薬が存在しない。さらに、抗うつ薬の作用が発現するには約３〜６週間の期間がかかり、副作用が重篤であることが多い。
【０００９】
一般的に、うつ病患者の１５％が自殺を図ると推測されている。ほとんどの罹患者の場合、うつ病は、遺伝的素因とストレスまたは心的外傷等の環境的要因との相互作用によるものである［３］。この疾病は一般的であり、抗うつ薬（ＡＤ）の市場は巨大（少なくとも年間１００億ユーロ）である。
【００１０】
しかしながら、これらの抗うつ薬が約７０％の症例において患者の状態を改善するとしても、それらは患者のわずか３０〜４０％に疾病の完全寛解をもたらすに過ぎない。さらには、治療を受ける対象のほぼ３分の１が、既存の治療に抵抗性を示す。したがって、これは、うつ病の機序を考慮に入れることが可能な新しい治療が構想されなければならないことを意味する［３］。
【００１１】
医療従事者が利用できる治療手段において、アミトリプチリンおよびイミプラミンを含む三環系抗うつ薬（ＴＣＡ）が最初に発見され、その後、フェネルジンおよびパルギリン等の不可逆的かつ非選択的なモノアミン酸化酵素阻害薬（ＭＡＯＩ）が発見された。有害作用、特にＴＣＡの心毒性（特に過剰摂取の場合）およびＭＡＯＩの高血圧緊急症（「チーズ効果」として広く知られている食事性チラミンとの相互作用）は、同一の治療有効性を示すがより良好な認容性を示す新しい分子の研究を推進した。
【００１２】
次いで、ノルアドレナリン（ＮＡ）またはセロトニン（５−ヒドロキシトリプタミンまたは５ＨＴ）再取り込み選択的阻害薬とともに選択性の概念が出現した。これらの新しい分子については、第ＩＩＩ相臨床試験によって、第一世代抗うつ薬に相当する有効性、および特に過剰摂取の場合に、改善された安全性が示されている。
【００１３】
選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）および選択的ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（ＳＮＲＩ）は、現在、最も広く使用されている分子である［４〜５］。したがって、ＡＤは、ほとんどの場合、モノアミン作動系における伝達の促進と関連している。
【００１４】
セロトニン、ノルアドレナリンおよびドパミンが確かに関与しているものの、ＡＤによって生成されるモノアミンの割合の変化およびそれに起因する適応プロセス、特にそれらの受容体のいくつかの感受性の変化だけでは、抗うつ薬の作用機序を説明できないということで現在合意がなされている。
【００１５】
したがって、ＡＤが効力を発揮するのに必要な３〜６週間という期間を、製品の最初の投与によって起こるモノアミンのシナプスの割合の増加と相関させることは困難である。ほぼ半世紀もの間、うつ病の発症原因およびその治療に関する理論の数は増え続けている。
【００１６】
例えば、高濃度のグルココルチコイド、ならびにＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）合成の低下、グルタミン酸の過剰分泌および／またはグルコース取り込みの低下による海馬の構造変化は、概して気分に対する悪影響と関連している［６］。これらの観察によれば、グルココルチコイドの合成の阻害薬およびグルココルチコイド受容体の拮抗薬は、ＡＤ様作用をもたらす［７］。
【００１７】
ある程度の有効性を有する、サブスタンスＰ受容体、特にＮＫ１、またはＣＲＦ受容体（コルチコトロピン放出因子）に作用する拮抗薬、およびＮＭＤＡ受容体の拮抗薬が開発されている［８〜１０］。
【００１８】
ストレスの状況において行われた種々の最近の研究、およびいくつかのうつ病モデルは、大うつ病性障害の病因において神経発生に関与していた［１１〜１３］。電気ショック療法を含む全ての長期抗うつ治療は、海馬の顆粒層にニューロンを形成する前駆細胞の増殖を刺激することが証明されている。
【００１９】
また、抗うつ薬は、ＣＲＥＢ、Ｂｃｌ２またはＭＡＰキナーゼ等の、細胞の生存および成長に関与する異なる因子の発現を調節することも分かっている。しかしながら、気分障害の生理病理学におけるこれらの新生ニューロンの機能的重要性には議論の余地がある［１４］。
【００２０】
これらの兆候は全て、うつ病が多因子性の生理病理学を伴う複雑な疾病であり、結果的にそのような病態の治療は依然として課題であるということを示している。
【００２１】
４０年以上もの間、うつ病に関する研究および有効な薬物の開発はモノアミン作動性理論が主流であった。モノアミン作動性神経伝達物質（セロトニン、ノルアドレナリンおよびドパミン）が関与していることは間違いないが、うつ病の生理病理学および抗うつ薬の作用機序に関する理論の数は増え続けている。
【００２２】
今日使用されている抗うつ薬は、口腔乾燥、霧視および腸管機能の変化（下痢または便秘）を含む様々な有害作用をもたらす。多くの副作用は一時的なものであるが（悪心等）、中には経時的に一定であると考えられるものもあり（性的作用等）、長期間にわたる治療への取り組みに影響を及ぼす危険がある。これが、うつ病において新たに同定された受容体またはチャネルに作用する新しい分子に関する研究が極めて重要である理由である。
【００２３】
いくつかのタンパク質、受容体およびチャネルは、うつ病の分子機構に関与してきた。これは、元々はソルチリンと呼ばれていたニューロテンシン受容体３（ＮＴＲＳ３）の場合に特に当てはまり、マウスにおいてそれが不活性化されると、欠損マウスにおいてＴＲＥＫ−１背景カリウムチャネルについて観察されたものと同様のうつ病抵抗性の表現型を生じる。
【００２４】
最近のＳＴＡＲ＊Ｄ研究（うつ病軽減のための代替的連続治療法）［１５］は、ヒトにおける抗うつ反応に関与する遺伝子としてＴＲＥＫ−１を遺伝薬理学的に同定した。この研究はまた、ヒトに対する試験のための候補遺伝子の同定において抗うつ薬治療を研究するための動物モデルの使用も提案している。したがって、ＴＲＥＫ１チャネル遮断薬は、抗うつ薬設計の分野において新しい概念を表している。
【００２５】
大うつ病性障害（ＭＤＤ）のエピソードは、異なるクラスの薬物を用いて治療される。しかしながら、既存の主な治療薬は、数週間後に約３５％の寛解を可能にし、大うつ病性障害患者の約３０％は治療抵抗性うつ病（ＴＲＤ）に罹患していると分類される［１、１６、１７］。大うつ病性障害（ＭＤＤ）の神経生物学的基盤を理解することを目的とした集中的な研究にもかかわらず、治療は依然として症状の比較的主観的な評価のみに基づいている。低い寛解率に起因して、大うつ病性障害の臨床的出現を予測し、かつ治療結果の程度を特徴付ける信頼できる生物学的マーカーの同定は、したがって必須であると考えられる［３］。臨床試験および前臨床試験は、大うつ病性障害の診断および治療のための推定上のバイオマーカーとして機能し得るいくつかの因子を同定した。しかしながら、任意の所与のマーカーがＭＤＤの臨床的に有用なバイオマーカーとして機能する有用性は、感受性および特異性の欠如によって限定される［１８〜１９］。
【００２６】
最近の研究により、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）が、抗うつ薬療法における臨床反応および臨床転帰の潜在的なバイオマーカーとして同定された［２０〜２１］。
【００２７】
ソルチリンは、ＢＤＮＦの分泌経路上で細胞内輸送の調節を制御することが知られている［２２］。さらに、ソルチリンの血清レベルの増加がＭＤＤと関連していることおよびＢＤＮＦと相関していることが示されている［２３〜２４］。
【００２８】
タンパク質もまたうつ病に関連して同定されている。スパジンは、ニューロテンシン受容体−３とも称されるソルチリンの成熟化によって形成される［２５］、４４アミノ酸のプロペプチド（ＰＥ）の部分ペプチド（１２−２８）である［２６］。マウスに静脈内注射または腹腔内注射した場合、スパジンおよびプロペプチドは、ＴＲＥＫ−１カルシウムチャネルの活性を阻害することによって強力な抗うつ（ＡＤ）活性を示しており［２７］、これはうつ病の治療における目標の１つである［２８］。
【００２９】
しかしながら、うつ病の病態生理学の発症機序に関する集中的な研究にもかかわらず、抗うつ薬治療に対する反応を評価するための信頼できるバイオマーカーは依然として不足している。
【００３０】
したがって、従来技術のこれらの短所、欠点、および障害に対処する手段、具体的には、うつ状態、特に大うつ病性障害を生理学的に検出することができる方法を見出すことが真に求められている。
【００３１】
また、うつ病、特に大うつ病性障害の治療の費用を削減し、かつその効率を特に改善するために、従来技術のこれらの短所、欠点、および障害に対処する手段、具体的には、うつ病治療の有効性を評価することができる方法を見出すことも真に求められている。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明は、興味深いことに、スパジンおよびプロペプチドが、うつ病、特に大うつ病性障害の効果的な生物学的マーカーであることを示した。
【００３３】
したがって、本発明は、スパジンおよびそのプロペプチドには特に結合するがミニスパジンには結合しないＡＢ１ポリクローナル抗体を提供することにより、特に、うつ病の信頼できるマーカーおよびその治療が存在しない場合に、前述の先行技術の障害および欠点を正確に解決および克服する。
【００３４】
本発明はまた、断片１２〜１８を除いてＰＥに由来する抗ペプチドポリクローナル抗体、およびＰＥの１２〜１８配列に対する抗体にも関する。
【００３５】
本発明者は、生体試料中のスパジンおよびプロペプチドならびにその断片の濃度の測定を可能にする抗体を最初に開発した。具体的には、本発明者は、本発明の抗体のおかげで、２つのヒトペプチド、すなわち、プロペプチドならびに／またはスパジンおよびミニスパジンを、ヒト血清試料を基準にして独立して測定できることを示した。具体的には、本発明の主題は、配列ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号２）のペプチド（スパジン）に対するポリクローナル抗体（ＡＢ１）に関する。
【００３６】
本発明はまた、配列ＧＶＳＷＧＬＲを含むペプチド（ミニスパジン）に対するポリクローナル抗体（ＡＢ２）にも関する。
【００３７】
驚くべきことに、本発明者は、ＡＢ１ポリクローナル抗体が、ペプチドＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号６）を唯一の例外として、ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）、ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号２）、ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬ（配列番号３）、ＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷ（配列番号４）およびＷＳＧＰＩ（配列番号５）を含む群から選択されるペプチドに結合することを示した。
【００３８】
本発明は、ペプチドＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号６）を唯一の例外として、ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）、ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号２）、ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬ（配列番号３）、ＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷ（配列番号４）およびＷＳＧＰＩ（配列番号５）を含む群のペプチドに対するポリクローナル抗体（ＡＢ１）に関する。
【００３９】
具体的には、ポリクローナル抗体（ＡＢ１）は、ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）、ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号２）、ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬ（配列番号３）、ＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷ（配列番号４）およびＷＳＧＰＩ（配列番号５）からなる群のペプチドに対するものである。
【００４０】
驚くべきことに、本発明者はまた、ＡＢ２ポリクローナル抗体が、
ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）、ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号２）およびＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号６）を含む群から選択されるペプチドに結合することも示した。
【００４１】
本発明は、ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）、ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号２）およびＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号６）を含む群のペプチドに対するポリクローナル抗体（ＡＢ２）に関する。
【００４２】
具体的には、ポリクローナル抗体（ＡＢ２）は、ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）、ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号２）およびＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号６）からなる群のペプチドに対するものである。
【００４３】
さらに、本発明者は、生体試料中のスパジンおよびプロペプチドならびにその断片の濃度の測定を可能にする抗体を最初に開発した。具体的には、本発明者は、２つのヒトペプチド、すなわち、プロペプチドならびに／またはスパジンおよびミニスパジンを、ヒト血清試料から独立して測定できることを示した。
【００４４】
本発明において、プロペプチドまたはＰＥは、配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のペプチドを意味する。
【００４５】
本発明において、１２−２８ＰＥまたはスパジンは、１２〜２８プロペプチドアミノ酸配列、すなわちＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号２）のペプチド断片を意味する。本明細書において、１２−２７ＰＥは、プロペプチド、すなわち、ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬ（配列番号３）のペプチド１２〜２７ペプチド断片を意味する。
【００４６】
本発明において、１４−２５ＰＥは、１４〜２５プロペプチドアミノ酸配列、すなわち、ＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷ（配列番号４）のペプチド断片を意味する。
【００４７】
本発明において、１−１６ＰＥまたはプロスパジンは、１〜１６プロペプチドアミノ酸配列、すなわち、ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲ（配列番号７）のペプチド断片を意味する。
【００４８】
本発明において、２２−２８ＰＥまたはスパジン（１２−１８）またはミニスパジンは、２２〜２８プロペプチドアミノ酸配列のペプチド断片、または１２〜１８スパジンペプチド、すなわち、ＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号６）のペプチド断片を意味する。
【００４９】
本発明は特に、本発明のポリクローナル抗体を生成するための方法に関する。
【００５０】
本発明のポリクローナル抗体を生成するための方法は、以下のステップを含み得る：
ａ．配列ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号２）のペプチドまたは配列ＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号６）のペプチドを含む組成物の動物への投与のステップ、
ｂ．該動物からの抗体の回収のステップ、および
ｃ．該抗体の単離のステップ。
【００５１】
本発明において、動物に投与するための配列ＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号２）のペプチドまたは配列ＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号６）のペプチドを含む組成物は、免疫原性組成物であり得る。これは、例えば、当業者に既知の任意の免疫原性組成物を含んでもよい。これは、例えば、少なくとも１つのアジュバントを含む組成物を含んでもよい。
【００５２】
本発明において、アジュバントは、当業者に既知の任意の免疫原性アジュバントを意味する。これは、例えば、フロイントアジュバントまたはアルミニウムアジュバントを含んでもよい。
【００５３】
本発明において、動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ロバまたはウマを含む、抗体の生成に好適な、当業者に既知の任意の動物であり得る。
【００５４】
本発明において、投与は、当業者に既知の任意の手段および／または方法を用いて達成することができる。これは、例えば、例えば、注射器を介した、注射による投与を含んでもよい。投与は、例えば、皮下経路、皮内経路、筋肉内経路および／または静脈内経路による投与を含む、当業者に既知の任意の経路によって達成することができる。
【００５５】
本発明において、ペプチドは、動物１匹当たり１〜４ｍｇの濃度で、例えば、動物１匹当たり１．５ｍｇ〜３ｍｇ、例えば、動物一匹当たり２ｍｇの濃度で、ステップａ）において投与され得る。
【００５６】
本発明において、抗体の回収は、当業者に既知の任意の方法によって達成することができる。これは、例えば、動物からの血清の採取、放血、および／または動物からの血清の回収を可能にする任意の手段／方法を含んでもよい。
【００５７】
本発明において、抗体の単離は、当業者に既知の任意の方法によって達成することができる。これは、例えば、濾過、例えば、膜を通した濾過を含んでもよい。溶液の濾過は、０．２〜０．４５μｍの範囲の細孔径を有する細孔を含む膜を介して行うことができる。これは、例えば、滅菌膜を含んでもよい。膜は、例えば、セルロース、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、またはナイロンの膜であってもよい。また、例えば、１５〜２５℃の範囲の温度で１〜３時間の血液凝固、形成した血餅の除去、溶液の濾過、遠心分離、およびポリクローナル抗体を含有する上清の回収のステップを含む方法も含まれてもよい。遠心分離は、５〜２０分の範囲の期間、例えば１０〜１７分、例えば１５分行うことができる。遠心分離は、例えば、５，０００〜２５，０００ｒｐｍの速度、例えば１０，０００〜２０，０００ｒｐｍ、例えば、１５，０００ｒｐｍに等しい速度で行うことができる。
【００５８】
当業者は、その一般的知識から、ポリクローナル抗体を得るための方法をどのように適応させるかおよび／または選択するかを理解するであろう。
【００５９】
本発明において、本発明の抗体は、任意の好適な方法、例えば、Ｌｅｅ，Ｂ．Ｓ．，Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｊａｙａｔｈｉｌａｋａ，Ｌ．Ｐ．，Ｌｅｅ，Ｊ．，Ｇｕｐｔａ，Ｓ．２０１６．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙシリーズ１４７４巻２５−４７）［２９］に記載される方法によって生成することができる。
【００６０】
本発明者はまた、本発明による抗体が、スパジンおよびプロペプチドならびにその断片の濃度を生体試料中で測定することを可能にすることも示した。具体的には、本発明者は、２つのヒトペプチド、すなわち、プロペプチドまたはスパジンおよびミニスパジンを、ヒト血清試料から独立して測定できることを示した。
【００６１】
したがって、本発明はまた、生体試料中のプロペプチド、スパジンおよびミニスパジンから選択されるペプチドの検出／アッセイのための本発明の抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用にも関する。
【００６２】
プロペプチド、スパジンおよびミニスパジンの検出および／またはアッセイに好適な抗体は、上で定義した抗体である。これらは、例えば、ポリクローナル抗体ＡＢ１またはＡＢ２を含んでもよい。
【００６３】
本発明者はまた、本発明による抗体が、ミニスパジンの濃度を生体試料中で検出および／または測定することを可能にすることも示した。本発明者はまた、本発明による抗体が、有利には、哺乳動物、例えば、動物またはヒトに注射されたミニスパジンの濃度を、生体試料中で検出および／または測定することを可能にすることも示した。
【００６４】
具体的には、本発明者は、２つのヒトペプチド、すなわち、プロペプチドまたはスパジンおよびミニスパジンを、ヒト血清試料から独立して測定できることを示した。
【００６５】
本発明者はまた、本発明による抗体が、有利には、抗体ＡＢ１によってＰＥ濃度（ミニスパジンではなくスパジン）の検出／測定を可能にし、抗体ＡＢ２によってＰＥ濃度（スパジンおよびミニスパジン）の検出／測定を可能にし、抗体ＡＢ２およびＡＢ１による測定間の濃度の差の絶対値がミニスパジン濃度に対応することも示した。
【００６６】
したがって、本発明はまた、生体試料中のミニスパジンの濃度の検出および／または測定のための本発明の抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用にも関する。
【００６７】
本発明において、「生体試料」は、哺乳動物、例えば、単孔目、オポッサム目、ケノレステス目、ミクロビオテリウム目、フクロモグラ目、フクロネコ目、バンディクート目、双前歯目、ツチブタ目、ジュゴン目、アフリカトガリネズミ目、ハネジネズミ目、イワダヌキ目、ゾウ目、被甲目、有毛目、ツパイ目、ヒヨケザル目、霊長目、ネズミ目、ウサギ目、ハリネズミ目、トガリネズミ目、コウモリ目、センザンコウ目、食肉目、奇蹄目、偶蹄目およびクジラ目といった目を含む群から選択される哺乳動物から得られる任意の試料を意味する。これらは、例えば、ヒトまたは動物を含んでもよい。
【００６８】
本発明において、生体試料は任意の生体液であってもよく、例えば、これは血液、血漿、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、膣粘液、鼻粘液、唾液、尿および／または乳汁の試料を含んでもよい。好ましくは、生体試料は、血液の試料または血清の試料である。
【００６９】
本発明によれば、本発明の抗体は、当業者に既知の任意の好適なアッセイ法／検出法に用いることができる。これは免疫測定法、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを含み得る。これは、例えば、文献Ｉｍｍｕｎｏａｎａｌｙｓｅ：Ｄｅ  ｌａ  ｔｈｅｏｒｉｅ  ａｕｘ  ｃｒｉｔｅｒｅｓ  ｄｅ  ｃｈｏｉｘ  ｅｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｅ  ｃｌｉｎｉｑｕｅ［Ｉｍｍｕｎｏａｎａｌｙｓｉｓ：Ｆｒｏｍ  ｔｈｅｏｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ］，Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｍａｓｓａｒｔ，ＥＰＤ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９に記載されるアッセイ法を含み得る。
【００７０】
当業者は、その一般的知識によって、本発明による抗体アッセイ法／検出法の条件／使用をどのように適応させるかを理解するであろう。
【００７１】
本発明者はまた、うつ状態にある個体において、配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のペプチドの濃度が低下することも最初に示した。
【００７２】
本発明者はまた、本発明による抗体が、配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のペプチドの濃度を、健康な対照個体およびうつ病個体の生体試料中で決定することを可能にすることも示した。
【００７３】
したがって、本発明はまた、個体の生体試料からうつ状態を検出するための本発明の抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用にも関する。
【００７４】
本出願において、「うつ状態」または「うつ病個体」は、悲嘆および精神的苦痛を伴う気分障害に罹患する個体を意味する。これは、例えば、当業者に既知の任意のうつ状態、例えば、大うつ病性障害（ＭＤＤ）、神経症性うつ病／精神病性うつ病、心因性うつ病／内因性うつ病および／または反応性うつ病／自律性うつ病を含んでもよい。
【００７５】
本発明において、「健康な対照個体」は、うつ状態、例えば、悲嘆および精神的苦痛を伴う気分障害を呈していない、ならびに／またはうつ状態を呈したことがない、ならびに／または大うつ病性障害を呈していない、ならびに／または大うつ病性障害を呈したことがない個体、例えばヒトを意味する。
【００７６】
本発明によれば、「個体」は、単孔目、オポッサム目、ケノレステス目、ミクロビオテリウム目、フクロモグラ目、フクロネコ目、バンディクート目、双前歯目、ツチブタ目、ジュゴン目、アフリカトガリネズミ目、ハネジネズミ目、イワダヌキ目、ゾウ目、被甲目、有毛目、ツパイ目、ヒヨケザル目、霊長目、ネズミ目、ウサギ目、ハリネズミ目、トガリネズミ目、コウモリ目、センザンコウ目、食肉目、奇蹄目、偶蹄目およびクジラ目といった目からなる群から選択される哺乳動物を意味する。これは、例えば、ヒトまたは動物を含んでもよい。
【００７７】
本発明において、「生体試料」は、哺乳動物、例えば、単孔目、オポッサム目、ケノレステス目、ミクロビオテリウム目、フクロモグラ目、フクロネコ目、バンディクート目、双前歯目、ツチブタ目、ジュゴン目、アフリカトガリネズミ目、ハネジネズミ目、イワダヌキ目、ゾウ目、被甲目、有毛目、ツパイ目、ヒヨケザル目、霊長目、ネズミ目、ウサギ目、ハリネズミ目、トガリネズミ目、コウモリ目、センザンコウ目、食肉目、奇蹄目、偶蹄目およびクジラ目といった目を含む群から選択される哺乳動物から得られる任意の試料を意味する。これは、例えば、ヒトまたは動物を含んでもよい。
【００７８】
本発明において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出法は、抗体の使用に好適な、当業者に既知の任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏ法であってもよい。これは、例えば、免疫化学的方法、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫細胞化学的方法、例えば、共焦点顕微鏡法、免疫電子顕微鏡法、および／または免疫組織化学的方法を含んでもよい。
【００７９】
本発明はまた、以下のステップを含む、患者におけるうつ病を検出／決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法にも関し、
ａ．個体の生体試料中の配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のペプチドの濃度（Ｃｍ）を測定するステップ
ｂ．ステップａ）で測定されたペプチドの濃度（Ｃｍ）を健康な個体の基準濃度（Ｃｒｅｆ）と比較するステップ、および以下の式に従ってスコア（Ｓ１）を算出するステップ
Ｓ１＝Ｃｍ／Ｃｒｅｆ
１未満のＳ１の値は、その試料が得られた個体がうつ病であることを示唆する。
【００８０】
本発明によれば、配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のペプチドの濃度の測定は、参照により本明細書に含まれるＭａｚｅｌｌａ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｐａｄｉｎ，ａ  ｓｏｒｔｉｌｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｒｏｄｅｎｔ  ＴＲＥＫ−１  ｃｈａｎｎｅｌｓ：ａ  ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ．ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ８，ｅ１０００３５５（２０１０）［２７］に記載される方法に従って、および／または上で定義した本発明のポリクローナル抗体を使用して、当業者に既知の任意の好適な免疫学的方法を用いて、達成することができる。当業者は、その一般的知識によって、本発明によるポリクローナル抗体を使用して既知の方法を実施するために、どのように条件を適応させるかを理解するであろう。
【００８１】
本出願において、「基準健康対象」は、うつ状態を呈していない、および／またはうつ状態を呈したことがない、および／または大うつ病性障害を呈していない、および／または大うつ病性障害を呈したことがない哺乳動物、例えばヒトを意味する。
【００８２】
本発明によれば、「基準対象の群」は、信頼できる基準値を定義することを可能にする群を意味する。これは、例えば、上で定義した少なくとも２人の基準対象、例えば、少なくとも４０人の基準対象を含む群を含んでもよい。これは、例えば、４０〜２００人の基準対象を含む群を含んでもよい。
【００８３】
本発明によれば、測定されたペプチドの濃度（Ｃｍ）をペプチドの基準濃度（Ｃｒｅｆ）と比較するステップの間、ペプチドの基準濃度（Ｃｒｅｆ）は、好ましくは、例えば、年齢、体重（ｗｅｉｇｈｔ）、性別、体重（ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ）、ならびに薬物、たばこ、およびアルコールの乱用を含む群から選択される同様の生理学的特徴を有する基準健康対象または健康対象の群の生体試料から測定された濃度に対応する。
【００８４】
本発明によれば、「ペプチド基準濃度」（Ｃｒｅｆ）は、基準健康対象および／または健康対象の基準群における該ペプチドの濃度であり得る。例えば、生体試料が血液試料である場合、ペプチド基準濃度は、２０〜３０ｎＭ、例えば２２〜２８ｎＭの範囲であってもよい。
【００８５】
本発明者はまた、個体におけるうつ状態の薬理学的治療の間に、配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のペプチドの濃度が変化することも示した。具体的には、本発明者は、有効な薬理学的治療が、配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のペプチドの濃度を「回復させる」ことを可能にし、またその濃度を増加させること、またはさらには基準濃度に戻すことを可能にすることを示した。
【００８６】
本発明者はまた、本発明による抗体が、個体の生体試料中の配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のペプチドの濃度を監視することにより、うつ病治療の有効性を監視することを可能にすることも示した。
【００８７】
したがって、本発明はまた、以下を含むうつ病治療の有効性を監視するための方法にも関し、
ａ）うつ病個体の生体試料中の配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のペプチドの濃度Ｃ１を測定することと、
ｂ）該治療後に該個体の生体試料中の配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のペプチドの濃度Ｃ２を測定することと、
ｃ）濃度値を比較して、以下の式に従ってスコア（Ｓ２）を算出することと、を含み
Ｓ２＝Ｃ２／Ｃ１、
１．２より高いＳ２の値は、その治療が抗うつに有効であることを示唆する。
【００８８】
本出願において、「治療」は、例えば、医学的処置、例えば、分子、例えば、化学分子、例えば、有機合成によって得られる分子、生体起源の分子、例えば、タンパク質、生物、例えば、哺乳動物、微生物、植物由来の分子、および／もしくは生物によって合成される分子、例えば、タンパク質、核酸分子を摂取することを含むアロパシー治療、または任意の他の非化学的治療、例えば、再教育、または細胞治療、例えば、幹細胞の注射に基づく任意の他の治療を意味する。
【００８９】
本発明において、治療は、当業者に既知の任意の抗うつ薬治療であり得る。これは、例えば、ＳＳＲＩ（選択的セロトニン再取り込み阻害薬）、例えば、フルオキセチン（Ｐｒｏｚａｃ（登録商標））、パロキセチン（Ｄｅｒｏｘａｔ、Ｄｉｖａｒｉｕｓ、Ｐａｘｉｌ（登録商標））、セルトラリン（Ｚｏｌｏｆｔ（登録商標））；シタロプラム（Ｓｅｒｏｐｒａｍ、Ｃｅｌｅｘａ（登録商標））、エスシタロプラムシュウ酸塩（Ｓｅｒｏｐｌｅｘ、Ｃｉｐｒａｌｅｘ（登録商標））、インダルピン、ジメルジン、ダポキセチン（Ｐｒｉｌｉｇｙ（登録商標））、フルボキサミンマレイン酸塩のマレイン酸（Ｆｌｏｘｙｆｒａｌ（登録商標））；ＳＮＲＩ（セロトニンノルエピネフリン再取り込み阻害薬）、例えば、ベンラファキシン（Ｅｆｆｅｘｏｒ（登録商標））、ミルナシプラン（Ｉｘｅｌ、Ｓａｖｅｌｌａ（登録商標））、デュロキセチン（Ｃｙｍｂａｌｔａ（登録商標））、トラマドール（Ｔｏｐａｌｇｉｃ（登録商標））、ネファゾドン、デスベンラファキシン（Ｐｒｉｓｔｉｑ（登録商標））、三環系抗うつ薬（ＴＣＡ）、例えば、アミトリプチリン（Ｌａｒｏｘｙｌ（登録商標）、Ｅｌａｖｉｌ（登録商標））、アモキサピン（Ｄｅｆａｎｙｌ（登録商標））、クロミプラミン（Ａｎａｆｒａｎｉｌ（登録商標）、Ｃｌｏｍｉｐｒａｍｉｎｅ  Ｍｅｒｃｋ（登録商標））、ドスレピン塩酸塩（Ｐｒｏｔｈｉａｄｅｎ、（登録商標））、ドキセピン（Ｑｕｉｔａｘｏｎ、（登録商標））、イミプラミン（Ｔｏｆｒａｎｉｌ、（登録商標））、マプロチリン（Ｌｕｄｉｏｍｉｌ、（登録商標））、オピプラモール（Ｉｎｓｉｄｏｎ、（登録商標））、キヌプラミン（Ｋｉｎｕｐｒｉｌ、（登録商標））、トリミプラミン（Ｓｕｒｍｏｎｔｉｌ、（登録商標））、不可逆的かつ非選択的なモノアミン酸化酵素阻害薬（ＭＡＯＩ）、例えば、モクロベミド、トロキサトン、サブスタンスＰの受容体に作用する拮抗薬、ＮＭＤＡおよびノルアドレナリンの受容体の拮抗薬、ならびに特異的セロトニン作動性抗うつ薬（ＮＡＳＳＡ）を用いた治療を含んでもよい。
【００９０】
本発明において、生体試料は上に定義される。
【００９１】
本発明において、個体は上に定義される。
【００９２】
本発明において、濃度の測定は、好適かつ当業者に既知の任意の方法を用いて行うことができる。これは、上に定義したような方法を含んでもよい。
【００９３】
有利には、本発明は、特定の哺乳動物において、生体試料、例えば、個体の血液試料中のソルチリン由来ペプチドの量を測定することを可能にする一方で、抗うつ薬治療に使用される活性分子に反応し得るミニスパジンのアッセイと区別する。
【００９４】
さらに、本発明は、有利には、ミニスパジン（１２−１８）が抗うつ薬として使用される場合、各個体／患者における有効用量を監視および制御することを可能にする。換言すると、本発明の抗体は、有利には、ソルチリン由来の内因性ペプチドをヒト血清中に存在する外因性ペプチドであるミニスパジン（１２−１８）と区別することを可能にする。
【００９５】
本発明に従って濃度を測定するための方法および／または抗うつ薬治療の有効性を監視するための方法における抗体の使用は、有利には、図１Ａに記載されるように、健康な対照／個体およびうつ病の個体／患者がたとえミニスパジン（１２−１８）で治療される場合でも、ＡＢ１を用いて彼らのソルチリン由来ペプチドの血清レベルを測定することを可能にし、また、ＡＢ２を用いて測定されるペプチドおよびＡＢ１を用いて測定されるペプチドから得られる差によって、ミニスパジン（１２−１８）の有効性である生物学的利用能を測定することを可能にする。
【００９６】
有利には、本発明は、個体、例えば患者において、既知の方法よりも高い感度および特異性でうつ状態を検出することを可能にする。さらに、本発明は、有利には、どのような治療が用いられようと、うつ病治療の有効性を監視することを可能にする。具体的には、本発明の方法は、特に抗体ＡＢ１の有利な使用によって、たとえ個体および／または個体がペプチド、例えば、外因性ペプチド、例えば、配列番号６のペプチドで治療される場合でも、うつ病治療の有効性を監視することを可能にする。
【００９７】
有利には、本発明は、抗体ＡＢ１およびＡＢ２を使用することによって、例えば、配列番号６のペプチドの、例えば、濃度の変化を監視することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１Ａは、異なる断片ごとに抗体ＡＢ１およびＡＢ２の構造／認識関係を表す図である。この図中、＋は抗体が断片を認識することを意味し、−は断片が認識されないことを意味し、ｎ．ｔ．は未試験であることを意味する。図１Ｂおよび１Ｃは、検出法によってアッセイされたスパジン、ＰＥ、および類似体の相対的親和性を表す。図１Ｄは、抗うつ薬のスクリーニングにおいて現在使用されているＰｏｒｓｏｌｔの強制水泳試験（ＦＳＴ）の結果を表している。スパジンまたは部分ペプチドで処置したマウスは、生理食塩水で得られたものよりも短い不動時間を示した。（通常ＡＮＯＶＡ、Ｆ５．５４＝２０．２１、＊＊＊＊生理食塩水で処置した食塩水マウスと比較したスパジン、１２−２７ＰＥ、および２２−２８ＰＥ断片の場合ｐ＜０．０００１、＊＊生理食塩水で処置した食塩水マウスと比較した１４−２５ＰＥ断片の場合ｐ＝０．００２６；エラーバー、平均値±ＳＥＭ）。
【図２】図２は、健康な患者、治療を受けていないＭＤＤ患者（Ｔ０）、および１２週間治療を受けたＭＤＤ患者（Ｔ１）の血清中ＰＥ濃度を表している。患者（ＭＤＤ  Ｔ０、ｎ＝３７）と対照（ｎ＝４９）との間のマン・ホイットニーの検定、および未治療の個体（Ｔ０）と治療を受けた個体（Ｔ１）との間のウィルコクソン順位和検定を用いて統計分析を行った。＊Ｐ＜０．０５：ｎ．ｓ．有意ではない。また図２は、１２週間の治療前（Ｔ０）および治療後（Ｔ１）のＭＤＤ患者についてモンゴメリー・アズバーグうつ病評価尺度（ＭＡＤＲＳ）の平均値±ＳＥＭも表している（棒線）。＊＊＊Ｐ＜０．００１
【図３】図３は、ヒト血清中のＰＥの安定性を表すヒストグラムである。健康な供血者からのＥＤＴＡを含むまたは含まない血清（各マトリックスｎ＝７）を、それらの安定性について室温で２４時間試験した。各インキュベーション期間のＰＥは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ法を用いて決定した。異なる時点での平均濃度が平均値±ＳＥＭとして表される。ＡＮＯＶＡによって、ＥＤＴＡを含まない血清群とＥＤＴＡを含む血清群との間に差がないことが明らかになった。血清とＥＤＴＡ血清との間のＰＥ濃度の独立ｔ検定は、各時点で有意差がないことを示した。
【実施例】
【００９９】
実施例１：スパジンの検出および大うつ病性障害（ＭＤＤ）を検出するための方法
以下の実施例では、後述する製品および方法を用いて実験を行った。本発明の実施例において、室温は、１９〜２５℃の温度、例えば、２２℃に等しい温度を意味する。
【０１００】
動物
実験は、８〜１０週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（２０〜２５ｇ）（Ｊａｎｕａｒｙ  Ｆｒａｎｃｅ  Ｅｌｅｖａｇｅ）に対して、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ２０１０／６３／ＥＵに記載される実験動物の福祉および使用に関するポリシーに準拠して行った。地域の倫理委員会（ＣＩＥＰＡＬ）が、本試験で使用されたプロトコルを承認した（プロトコル番号００．８９３．０２）。
【０１０１】
抗体、およびビオチン化ペプチドの調製
ペプチドはＧｅｎｅＣｕｓｔ（Ｄｕｄｅｌａｎｇｅ、Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ）によって合成された。スパジン（ＹＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲ（配列番号８））に対するウサギポリクローナル抗体は、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって調製された。使用した抗体は、前述したとおりのＡＢ１抗体であった。スパジン（５．４ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）を１．５ｍｌの２５ｎＭリン酸緩衝（ｐＨ６．７）に溶解した。７００μｌの７０％アセトニトリル／３０％ジメチルホルムアミドに再懸濁したビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１３．５ｍｍｏｌ）の一部をスパジン溶液に加え、室温で一晩インキュベートした。半調製用Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ  ＲＰ１８カラムを装備したＷａｔｅｒｓ社製システムを使用して、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりビオチン化スパジンを精製した。質量分析により同定されたビオチン化スパジン（２７分で溶出）を回収し、２８０ｎｍでの吸収により定量化し、アリコートで凍結乾燥させた。
【０１０２】
Ａｌｐｈａ−Ｌｉｓａ（登録商標）試験
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ技術（登録商標（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））の原理に従って、ストレプトアビジンドナーマイクロビーズをビオチン化スパジンによって認識させる一方で、ウサギ抗ＩｇＧを含むアクセプターマイクロビーズに抗スパジン抗体を結合させた。２つのマイクロビーズ（アクセプターおよびドナー）が接近すると、ビーズ上の結合パートナー間の分子相互作用によってシグナルが生成される。血清試料中に存在するプロペプチドは、この競合を引き起こす相互作用に干渉することができた。９６ウェルプレートで、室温で１時間、スパジンの濃度を増加させずにまたは増加させながら（１０−１１から１０−６Ｍへ）、１０ｎＭのビオチン化スパジンをＡｌｐｈａＬｉｓａ（登録商標）緩衝液中の抗スパジン抗体（１：１０００）でインキュベーションすることにより較正曲線を得た。ドナービーズおよびアクセプタービーズを加え、さらに２時間室温でインキュベーションした後、Ｅｎｓｐｉｒｅリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ）を使用してプレートを読み取った。血清の測定では、非標識スパジンの代わりに同じ体積の血清を加えた。プロペプチドの量をそのシグナルのパーセント阻害から決定し、検量線を用いて算出した。
【０１０３】
Ｐｏｒｓｏｌｔの強制水泳試験（ＦＳＴ）
生理食塩水または種々の試験ペプチドを静脈内注射した後、１２ｃｍの深さまで水（温度：２２±１℃）を充填したシリンダー（高さ：３０ｃｍ、直径：１５ｃｍ）にマウス（ｎ＝群当たり１０〜１２匹）を個別に６分間入れた。最後の４分間の間に合計不動時間を記録した（Ｐｏｒｓｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。
【０１０４】
ヒト血液試料
対照個体のコホートは、精神疾患簡易構造化面接法（ＭＩＮＩ）を用いて熟練の心理学者によってＤＳＭ−ＩＶ  Ａｘｉｓ  Ｉ障害の診断のために選択された４９人の健康な非血縁ボランティアから構成されていた［３０］。薬物またはアルコールの乱用または依存の履歴がなく、精神障害の個人歴または第一度近親者の家族歴がない健康なボランティアのみが治験に登録された。さらには、関連する神経疾患、すなわち、てんかんおよびパーキンソン症候群が存在しないことが、治験に登録するために必須であった。最後に、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）で２７／３０未満のスコアを得た対象は、治験から除外された。
【０１０５】
患者のコホートは、精神障害の診断と統計マニュアルＩＶ（ＤＳＭ−ＩＶ）の分類システムの基準を満たした、中程度から重度のうつ病に罹患する大うつ病性障害（ＭＤＤ）を有する３７人の患者から構成されていた。単極性うつ病の診断は、ＤＳＭ−ＩＶ  Ａｘｉｓ  Ｉ障害（ＳＣＩＤ−Ｉ）の構造化臨床診断面接によって確認した。除外基準は以下の通りであった：ａ）精神遅滞または認知障害、ｂ）統合失調症、統合失調感情障害、または双極性障害の生活史、ｃ）一次診断としてのパーソナリティ障害、嗜癖、アルコール乱用または依存、強迫性障害または外傷後ストレス障害、およびｄ）摂食障害との併存症。
【０１０６】
精神病症状を示した患者は存在しなかった：１１人（２９．７％）が特定不能（ＮＯＳ）のＡｘｉｓ  Ｉの既存の併存症（全般不安症（ＧＡＤ））、パニック発作、パニック症または不安症を示し、２人（５．４％）が、二次診断として、Ａｘｉｓ  ＩＩ障害（依存性パーソナリティ障害）の症状を示したがアルコール乱用の症状は示さなかった（併存症の存在に起因して、合計数が対象の数を超過した）。
【０１０７】
全ての患者は、「薬物耐性がなく」、抗うつ薬による前治療を受けたことがないか、または「薬物を休止している」、換言すると、患者は以前に１種または２種の抗うつ薬による治療を受けたことがあるが、新しい抗うつ薬治療を開始する前に少なくとも２週間の休薬期間を設けたか、のいずれかであった。全ての患者を単剤療法で治療した：３５人の患者をセロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）、すなわちエスシタロプラムで治療し、他の患者をセロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（ＳＮＲＩ）（ベンラファキシン、デュロキセチン、三環系抗うつ薬（ＴＣＡ）（ノルトリプチリン）またはノルアドレナリン作動性・特異的セロトニン作動性抗うつ薬（ＮＳＳＡ）（ミルタザピン）で治療した。疾病の重症度は、新しい抗うつ薬治療の開始前（Ｔ０）および１２週間の治療後（Ｔ１）に、モンゴメリー・アズバーグうつ病評価尺度（ＭＡＤＲＳ）により評価した。患者治療の社会人口学的、臨床的および薬理学的特徴の全てを下の表１に示す。
【表１】
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【０１０８】
午前中、８：００〜９：００に、抗凝固薬を含まない試験管に患者および対照の静脈血試料を採取した。遠心分離（１６２０ｇで１５分間）により血清を分離した。ＰＥ測定のための血液試料を各時点で採取した。
【０１０９】
本治験は地域の倫理委員会（ＣＥＩＯＣ、ＩＲＣＣＳ、Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｃｅｎｔｒｏ  Ｓａｎ  Ｇｉｏｖａｎｎｉ  ｄｉ  Ｄｉｏ  Ｆａｔｅｂｅｎｅｆｒａｔｅｌｌｉ，Ｂｒｅｓｃｉａ  Ｎｏ：５０／２００８およびＥｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｖｉｎｃｅ  ｏｆ  Ｖｅｒｏｎａ  Ｎｏ：４９９７／０９．１１．０１）により承認され、書面によるインフォームドコンセントを得た。
【０１１０】
統計
結果は平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ（バージョン６．０）を使用して行った。患者由来の試料における人口学的および臨床的特徴は、平均値±標準偏差（ＳＤ）で定量的に、または割合として記載される。正規性を確認した後、必要であればスチューデントｔ検定を用いて定量的変数の差を評価し、一方、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて連続変数について考えられる群間の差を算出した（図１Ｄ）。薬物治療の間に起こる臨床的および生物学的変化は、被験者内要因等の経時的（Ｔ０、Ｔ１）に繰り返される測定の設計において一般線形モデルを用いて分析し、Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ−Ｇｅｉｓｓｅｒの相関を適用した。ノンパラメトリックなマン・ホイットニーのＵ検定およびウィルコクソン順位和検定を用いて群間の差を評価した。
【０１１１】
結果
使用した抗体の特異性を調べた。具体的には、アッセイ法に使用した抗体の特異性を調べた。使用した抗体の特異性を特徴付けるために、ヒトＰＥの一連の部分配列を調製した（図１Ａ）。図１Ｂに示すように、スパジンおよび全てのＰＥが、２．５０ｎＭ（９５％でのＩＣ：３．３７〜１．８５、ｎ＝６）および２．１８ｎＭ（９５％でのＩＣ：１．５３〜３．０９、ｎ＝３）のＩＣ５０で抗スパジン抗体によって認識された。ニューロテンシン（ＮＴ、黒い四角）およびソマトスタチン−１４（ＳＳ１４、白い四角）は抗体によって認識されなかった。
【０１１２】
図１Ｃに示すように、１４−２５ＰＥ断片は１．７３ｎＭのＩＣ５０で抗体に結合し、１２−２７ＰＥ断片のＩＣ５０は３．４４ｎＭであった。２２−２８ＰＥ断片（ミニスパジン、白い四角）および１−１６  ＰＥ断片（黒い四角）は、抗体によって認識されなかった。各点は３〜６つの独立した実験の平均値±ＳＥＭに対応する。
【０１１３】
したがって、これらのペプチドの認識構造の分析（図１Ｂおよび１Ｃ）から、ＰＥ、スパジン、１２−２７ＰＥ、および１４−２５ＰＥは、同一の親和性を有する抗体によって認識されたが、１−１６ＰＥおよび２２−２８ＰＥ（ミニスパジン）は認識されなかったことが観察された。ニューロテンシンまたはソマトスタチン等の無関係のペプチドは、アッセイ法に干渉することができなかった（図１Ｂおよび１Ｃ）。これらの結果から、使用した抗体のエピトープ、すなわち、配列ＷＳＧＰＩを同定することが可能となった。
【０１１４】
プロペプチドおよびスパジンの濃度を特異的に測定することを可能にするポリクローナル組成物が得られた。
【０１１５】
ＦＳＴを用いて類似体の抗うつ活性を調べた。図１Ｄは、Ｐｏｓｏｌｔの強制水泳試験（ＦＳＴ）の結果を示す。図示されるように、スパジンまたは部分ペプチドで処置したマウスは、生理食塩水を投与したマウスで得られたものと比較してより短い不動時間を示した。（通常ＡＮＯＶＡ、Ｆ５．５４＝２０．２１、＊＊＊＊生理食塩水で処置した食塩水マウスと比較したスパジン、１２−２７ＰＥ、および２２−２８ＰＥ断片の場合ｐ＜０．０００１、＊＊生理食塩水で処置した食塩水マウスと比較した１４−２５ＰＥ断片の場合ｐ＝０．００２６；エラーバー、平均値±ＳＥＭ）。したがって、図１Ｄに示すように、エピトープ配列を有する全てのペプチド（ＰＥ、スパジン、１４−２５ＰＥ、および１２−２７ＰＥ）が、Ｐｏｒｓｏｌｔの強制水泳試験においてスパジン自体の抗うつ活性と同様の抗うつ活性を示した。試験したペプチドの相対的親和性および検出値の範囲を下の表２にまとめる。これらの結果は、同時に、ＰＥ、スパジン、およびＰＥの主な部分配列が、定量化され得る活性ペプチドに反応していたことを示唆している（スパジン様免疫反応性、ＳＬＩ）。ヒト血清中のＰＥの安定性試験を行った。図３は、ヒト血清中のＰＥの安定性を表すヒストグラムである。健康な供血者からのＥＤＴＡを含むまたは含まない血清（各マトリックスｎ＝７）を、それらの安定性について室温（２２℃）で２４時間試験した。各インキュベーション期間のＰＥは、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイ法を用いて決定した。図３中、異なる時点での平均濃度が平均値±ＳＥＭとして表される。ＡＮＯＶＡによる決定を行い、ＥＤＴＡを含まない血清群とＥＤＴＡを含む血清との間に差がないことが明らかになった。血清とＥＤＴＡ血清との間のＰＥ濃度の独立ｔ検定は、各時点で有意差がないことを示した。結果的に、室温で２４時間行ったＳＬＩ測定の安定性（図３）は、マウスおよびヒトに対する後続の測定の正当性を立証した。
【表２】
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【０１１６】
うつ病の病態におけるＰＥレベルの変動をよりよく理解するために、イタリアの臨床センターからの全てのヒト血清を収集し、ＰＥ濃度の測定を行った。
【０１１７】
コホートにおいて、健康な対照（２３．７±１．５ｎＭ）（ｚ＝−２．１１、ｐ＝０．０３５）よりも大うつ病性障害（ＭＤＤ）に罹患する患者（１８．９±１．３ｎＭ）においてＰＥ濃度が有意に低かったことが分かった（図２）。抗うつ薬で１２週間治療を受けた大うつ病性障害患者は、治療前よりも有意に高いＰＥレベルを示した（２１．０±１．５ｎＭ）（ｚ＝−１．９８、ｐ＝０．０４７）（図２）。治療の有効性は、モンゴメリー・アズバーグうつ病評価尺度（ＭＡＤＲＳ）の有意な低下によって確認した（図２）。具体的には、１２週間の治療後（Ｔ１）にスコアの２．５倍の低下が示された。
【０１１８】
考察
この実施例で示されるように、使用した抗体は、一連のヒトＰＥに由来するペプチド、およびＰＥ自体のみを認識し、ニューロテンシンまたはソマトスタチン等の無関係なペプチドは認識しなかった。
【０１１９】
示されるように、抗体によって認識されたペプチドは、マウスの強制水泳試験によって示されるように抗うつ活性を有する（図１Ｄ）。
【０１２０】
したがって、この実施例は、健康対象と比較して大うつ病性障害（ＭＤＤ）患者の血清中ＰＥ濃度が下方制御されること、すなわちより低いことを明らかに示している。この実施例はまた、ＰＥ濃度は、抗うつ薬治療によって変化し、特に正常未満のプロペプチド濃度を示す患者において、うつ病の治療薬の臨床開発と相関して正常に戻ることも明らかに示している。
【０１２１】
したがって、この実施例は、プロペプチド濃度がうつ状態のマーカーであり、うつ状態、例えば、大うつ病性障害を検出／決定するために、また、抗うつ薬治療の有効性を決定／監視するためにも使用できることを明らかに示している。血清ＰＥ濃度は、既知の血清レベルマーカー、例えば、ＢＤＮＦに対する追加のマーカーである［３１］。
【０１２２】
示されるように、血清ＰＥ濃度はＭＤＤ患者において有意により低く、本発明の実施例で測定したペプチドはソルチリンから作られているという事実を考慮に入れて、ソルチリンのレベルおよび／または発現との潜在的な相関の試験を行った。興味深いことに、ＭＤＤに罹患する患者において、血中ソルチリンの発現の変動が以前に観察されている。第一に、血液の単核細胞において、臨床的改善とともにソルチリンの遺伝子発現が低下し［２３］、一方で、ＭＤＤに罹患する患者、特にノンレスポンダーにおいて、ソルチリンが過剰発現される［３２］。さらに、ヒト血清において、ソルチリンレベルの増加はうつ病の状態と関連している［２４］。
【０１２３】
得られた結果は、血清ＰＥ濃度が、ヒトの気分症状に依存して変化すること、ならびにそれがＢＤＮＦおよび／またはＶＥＧＦに加えてまたはそれらの代わりとなる、うつ病の追加のバイオマーカーであることを示している［２４］。さらに、この病態に対する効果的な療法としての、血清レベルも制御することができるペプチドであるスパジンの将来的に可能な使用は、うつ病を効果的に管理するための新戦略の見通しを世界規模で確実に大きく改善するであろう。
【０１２４】
したがって、この実施例は、本発明が、特に前述の実施例１の抗体ＡＢ１を使用することによって、うつ状態を検出／決定すること、うつ病治療の有効性を監視すること、生体試料中の配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）のプロペプチドもしくはＰＥの濃度を測定することおよび／またはそれらを検出することを特に可能にすることを明らかに示している。
【０１２５】
実施例２：抗体ＡＢ１およびＡＢ２を得てそれらの特性を決定するための方法
ウサギから２つの抗体を調製し、得られた体積は各々約２００ｍｌであった。実験プロトコルにおいて、これらの抗体を１／１０００および１／５０００の希釈率で使用した。血中のプロペプチドレベルを測定するために、免疫学的または蛍光といった複数の技術を用いた。ペプチドアッセイは、１００μｌの血液を用いて達成することができ、再現可能である。
【０１２６】
図１は、各抗体に対する結合の特異性を示す。
【０１２７】
具体的には、抗体ＡＢ１およびＡＢ２は、０日目、Ｄ０（１ｍｇ）、７日目、Ｄ７（１ｍｇ）、１４日目、Ｄ１４（１ｍｇ）および２９日目、Ｄ２９（１ｍｇ）に、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニンタンパク質）に結合させたスパジン（ＡＢ１）またはＫＬＨに結合させたミニスパジン（２２−２８ＰＥ）（ＡＢ２）を２匹のウサギ、すなわちＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓに注射することによって得た。２７日目（Ｄ２７）および４２日目（Ｄ４２）に、血液試料、すなわち２０ｍｌを採取した。ポリクローナル血清は、１２００×ｇで１０分間遠心分離することによって得た。上清に対応するポリクローナル血清を回収した。各抗体についてＥＬＩＳＡにより免疫応答を確認した。血清中に含有された抗体を−２０℃に維持した。
【０１２８】
実施例３：うつ病治療の有効性を検出／監視するための方法
以下の実施例では、上記実施例１および２に記載したポリクローナル抗体ＡＢ１を用いて実験を行った。
【０１２９】
実施例１に記載される方法に従って、配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲのペプチドの血清濃度の測定を行った。
【０１３０】
対照個体のコホートは、精神疾患簡易構造化面接法（ＭＩＮＩ）を用いて熟練の心理学者によってＤＳＭ−ＩＶ  Ａｘｉｓ  Ｉ障害の診断のために選択された４９人の健康な非血縁ボランティアから構成されていた。［３０］。薬物またはアルコールの乱用または依存の履歴がなく、精神障害の個人歴または第一度近親者の家族歴がない健康なボランティアのみが治験に登録された。さらには、関連する神経疾患、すなわち、てんかんおよびパーキンソン症候群が存在しないことが、治験に登録するために必須であった。最後に、ミニメンタルステート検査（ＭＭＳＥ）で２７／３０未満のスコアを得た対象は、治験から除外された。
【０１３１】
対照対象の試料中で測定された濃度の平均値を決定したところ、得られた値は健康な個体の基準濃度（Ｃｒｅｆ）に対応していた。
【０１３２】
ある個体からの試料中の配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲのペプチドの血清濃度（Ｃｍ）の測定を行った。
【０１３３】
以下の式に従ってスコア（Ｓ１）を算出することにより、うつ病対象において測定されたペプチドの濃度（Ｃｍ）と健康対象の基準濃度（Ｃｒｅｆ）との比較を行った：Ｓ１＝Ｃｍ／Ｃｒｅｆ。１未満のＳ１の値は、その試料が得られた個体がうつ病であることを示唆する。
【０１３４】
この実施例では、うつ病治療の有効性を監視する。
【０１３５】
患者のコホートは、精神障害の診断と統計マニュアルＩＶ（ＤＳＭ−ＩＶ）の分類システムの基準を満たした、中程度から重度のうつ病に罹患する大うつ病性障害（ＭＤＤ）を有する患者から構成されていた。単極性うつ病の診断は、ＤＳＭ−ＩＶ  Ａｘｉｓ  Ｉ障害（ＳＣＩＤ−Ｉ）の構造化臨床診断面接によって確認した。除外基準は以下の通りであった：ａ）精神遅滞または認知障害、ｂ）統合失調症、統合失調感情障害、または双極性障害の生活史、ｃ）一次診断としてのパーソナリティ障害、嗜癖、アルコール乱用または依存、強迫性障害または外傷後ストレス障害、およびｄ）摂食障害との併存症。
【０１３６】
任意の抗うつ薬治療の投与前に、実施例１に記載される方法に従って、配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲのペプチドの血清濃度の測定を行った。具体的には、濃度の測定は血液試料から行った。濃度は、任意の治療前に各患者ごとに独立して測定した。測定された濃度は１９ｎＭであった。
【０１３７】
次いで、患者を選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）、選択的セロトニン・ノルアドレナリン阻害薬（ＳＮＲＩ）、三環系抗うつ薬（ＴＣＡ）またはノルアドレナリン作動性・特異的セロトニン作動性抗うつ薬（ＮＳＳＡ）を用いた単剤療法により治療した。
【０１３８】
治療様式、頻度、アッセイ、および用量は、Ｖｉｄａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙで言及されている使用法または指示に記載されているものに対応していた。
【０１３９】
１２週間の治療後に、実施例１に記載される方法に従って、配列ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲのペプチドの血清濃度の測定を各患者ごとに独立して行った。測定された濃度は２１ｎＭであった。
【０１４０】
以下の式に従ってスコア（Ｓ１）を算出することにより、うつ病患者において測定されたペプチドの濃度（Ｃｍ）と基準濃度（Ｃｒｅｆ）との比較を行った：Ｓ１＝ＣＭ／Ｃｒｅｆ。１未満のＳ１の値は、その試料が得られた個体がうつ病であることを示唆する。
【０１４１】
以下の式に従ってスコア（Ｓ２）を算出することにより、測定された濃度値の比較を測定した：Ｓ２＝Ｃ２／Ｃ１（Ｃ１は治療前の濃度、Ｃ２は治療後の濃度）。Ｓ２の値が１．２より高い場合、投与された治療薬は有効な抗うつ薬であった。
【０１４２】
この結果は、精神障害の診断と統計マニュアルＩＶ（ＤＳＭ−ＩＶ）の分類システムの基準の評価を通して患者の精神状態を評価することによって確認した。
参考文献リスト
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２１．Ｎａｓｅ，Ｓ．，Ｋｏｈｌｅｒ，Ｓ．，Ｊｅｎｎｅｂａｃｈ，Ｊ．，Ｅｃｋｅｒｔ，Ａ．，Ｓｃｈｗｅｉｎｆｕｒｔｈ，Ｎ．，Ｇａｌｌｉｎａｔ，Ｊ．，Ｌａｎｇ，Ｕ．Ｅ．，Ｋｕｈｎ，Ｓ．，２０１６．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｅｒｕｍ  Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎ−Ａｃｅｔｙｌａｓｐａｒｔａｔｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｕｎｄｅｒ  Ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎｅｕｒｏｓｉｇｎａｌｓ  ２４，１−１４．
２２．Ｃｈｅｎ，Ｚ．Ｙ．，Ｉｅｒａｃｉ，Ａ．，Ｔｅｎｇ，Ｈ．，Ｄａｌｌ，Ｈ．，Ｍｅｎｇ，Ｃ．Ｘ．，Ｈｅｒｒｅｒａ，Ｄ．Ｇ．，Ｎｙｋｊａｅｒ，Ａ．，Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，Ｂ．Ｌ．，Ｌｅｅ，Ｆ．Ｓ．，２００５．Ｓｏｒｔｉｌｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２５，６１５６−６１６６．
２３．Ｂｅｌｚｅａｕｘ，Ｒ．，Ｆｏｒｍｉｓａｎｏ−Ｔｒｅｚｉｎｙ，Ｃ．，Ｌｏｕｎｄｏｕ，Ａ．，Ｂｏｙｅｒ，Ｌ．，Ｇａｂｅｒｔ，Ｊ．，Ｓａｍｕｅｌｉａｎ，Ｊ．Ｃ．，Ｆｅｒｏｎ，Ｆ．，Ｎａｕｄｉｎ，Ｊ．，Ｉｂｒａｈｉｍ，Ｅ．Ｃ．，２０１０．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｆｉｎｅ  ｂｌｏｏｄ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ  Ｒｅｓ  ４４，１２０５−１２１３．
２４．Ｂｕｔｔｅｎｓｃｈｏｎ，Ｈ．Ｎ．，Ｄｅｍｏｎｔｉｓ，Ｄ．，Ｋａａｓ，Ｍ．，Ｅｌｆｖｉｎｇ，Ｂ．，Ｍｏｌｇａａｒｄ，Ｓ．，Ｇｕｓｔａｆｓｅｎ，Ｃ．，Ｋａｅｒｌｅｖ，Ｌ．，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｂｏｒｇｌｕｍ，Ａ．Ｄ．，Ｍｏｒｓ，Ｏ．，Ｇｌｅｒｕｐ，Ｓ．，２０１５．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｓｏｒｔｉｌｉｎ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＢＤＮＦ  ａｎｄ  ＶＥＧＦ．Ｔｒａｎｓｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５，ｅ６７７．
２５．Ｍｕｎｃｋ  Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｃ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｃ．，Ｔａｕｒｉｓ，Ｊ．，Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｌ．，Ｇｌｉｅｍａｎｎ，Ｊ．，Ｍｏｅｓｔｒｕｐ，Ｓ．Ｋ．，Ｍａｄｓｅｎ，Ｐ．，１９９９．Ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｓｏｒｔｉｌｉｎ／ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−３  ｆｏｒ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ．ＥＭＢＯ  Ｊ  １８，５９５−６０４．
２６．Ｍａｚｅｌｌａ，Ｊ．，Ｚｓｕｒｇｅｒ，Ｎ．，Ｎａｖａｒｒｏ，Ｖ．，Ｃｈａｂｒｙ，Ｊ．，Ｋａｇｈａｄ，Ｍ．，Ｃａｐｕｔ，Ｄ．，Ｆｅｒｒａｒａ，Ｐ．，Ｖｉｔａ，Ｎ．，Ｇｕｌｌｙ，Ｄ．，Ｍａｆｆｒａｎｄ，Ｊ．Ｐ．，Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｊ．Ｐ．，１９９８．Ｔｈｅ  １００−ｋＤａ  ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｓ  ｇｐ９５／ｓｏｒｔｉｌｉｎ，ａ  ｎｏｎ−Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３，２６２７３−２６２７６．
２７．Ｍａｚｅｌｌａ，Ｊ．，Ｐｅｔｒａｕｌｔ，Ｏ．，Ｌｕｃａｓ，Ｇ．，Ｄｅｖａｌ，Ｅ．，Ｂｅｒａｕｄ−Ｄｕｆｏｕｒ，Ｓ．，Ｇａｎｄｉｎ，Ｃ．，Ｅｌ−Ｙａｃｏｕｂｉ，Ｍ．，Ｗｉｄｍａｎｎ，Ｃ．，Ｇｕｙｏｎ，Ａ．，Ｃｈｅｖｅｔ，Ｅ．，Ｔａｏｕｊｉ，Ｓ．，Ｃｏｎｄｕｃｔｉｅｒ，Ｇ．，Ｃｏｒｉｎｕｓ，Ａ．，Ｃｏｐｐｏｌａ，Ｔ．，Ｇｏｂｂｉ，Ｇ．，Ｎａｈｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｈｅｕｒｔｅａｕｘ，Ｃ．，Ｂｏｒｓｏｔｔｏ，Ｍ．，２０１０．Ｓｐａｄｉｎ，ａ  ｓｏｒｔｉｌｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｒｏｄｅｎｔ  ＴＲＥＫ−１  ｃｈａｎｎｅｌｓ：ａ  ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ  ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ．ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ８，ｅ１０００３５５．
２８．Ｈｅｕｒｔｅａｕｘ，Ｃ．，Ｌｕｃａｓ，Ｇ．，Ｇｕｙ，Ｎ．，Ｅｌ  Ｙａｃｏｕｂｉ，Ｍ．，Ｔｈｕｍｍｌｅｒ，Ｓ．，Ｐｅｎｇ，Ｘ．Ｄ．，Ｎｏｂｌｅ，Ｆ．，Ｂｌｏｎｄｅａｕ，Ｎ．，Ｗｉｄｍａｎｎ，Ｃ．，Ｂｏｒｓｏｔｔｏ，Ｍ．，Ｇｏｂｂｉ，Ｇ．，Ｖａｕｇｅｏｉｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｄｅｂｏｎｎｅｌ，Ｇ．，Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ，Ｍ．，２００６．Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ＴＲＥＫ−１  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ａ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ９，１１３４−１１４１．
２９．Ｌｅｅ，Ｂ．Ｓ．，Ｈｕａｎｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｊａｙａｔｈｉｌａｋａ，Ｌ．Ｐ．，Ｌｅｅ，Ｊ．，Ｇｕｐｔａ，Ｓ．２０１６．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｖｏｌ  １４７４  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５−４７．
３０．Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｄ．Ｖ．，Ｌｅｃｒｕｂｉｅｒ，Ｙ．，Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｋ．Ｈ．，Ａｍｏｒｉｍ，Ｐ．，Ｊａｎａｖｓ，Ｊ．，Ｗｅｉｌｌｅｒ，Ｅ．，Ｈｅｒｇｕｅｔａ，Ｔ．，Ｂａｋｅｒ，Ｒ．，Ｄｕｎｂａｒ，Ｇ．Ｃ．，１９９８．Ｔｈｅ  Ｍｉｎｉ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ（Ｍ．Ｉ．Ｎ．Ｉ．）：ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｖｉｅｗ  ｆｏｒ  ＤＳＭ−ＩＶ  ａｎｄ  ＩＣＤ−１０．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５９  Ｓｕｐｐｌ  ２０，２２−３３；ｑｕｉｚ  ３４−５７．
３１．Ｍｏｌｅｎｄｉｊｋ，Ｍ．Ｌ．，Ｓｐｉｎｈｏｖｅｎ，Ｐ．，Ｐｏｌａｋ，Ｍ．，Ｂｕｓ，Ｂ．Ａ．，Ｐｅｎｎｉｎｘ，Ｂ．Ｗ．，Ｅｌｚｉｎｇａ，Ｂ．Ｍ．，２０１４．Ｓｅｒｕｍ  ＢＤＮＦ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ａｓ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｎ  １７９  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ（Ｎ＝９４８４）．Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １９，７９１−８００．
３２．Ｂｅｌｚｅａｕｘ，Ｒ．，Ｂｅｒｇｏｎ，Ａ．，Ｊｅａｎｊｅａｎ，Ｖ．，Ｌｏｒｉｏｄ，Ｂ．，Ｆｏｒｍｉｓａｎｏ−Ｔｒｅｚｉｎｙ，Ｃ．，Ｖｅｒｒｉｅｒ，Ｌ．，Ｌｏｕｎｄｏｕ，Ａ．，Ｂａｕｍｓｔａｒｃｋ−Ｂａｒｒａｕ，Ｋ．，Ｂｏｙｅｒ，Ｌ．，Ｇａｌｌ，Ｖ．，Ｇａｂｅｒｔ，Ｊ．，Ｎｇｕｙｅｎ，Ｃ．，Ａｚｏｒｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｎａｕｄｉｎ，Ｊ．，Ｉｂｒａｈｉｍ，Ｅ．Ｃ．，２０１２．Ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ａｎｄ  ｎｏｎｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｅｐｉｓｏｄｅ．Ｔｒａｎｓｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ２，ｅ１８５．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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