(57)【要約】  ＭＵＣ１等の腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘起するための組成物及び方法について記載する。本願に記載する組成物及び方法は、改変型ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターとして、前記ベクターを投与する対象に前記腫瘍関連抗原を発現する新生物に対する防御免疫応答を誘起するための１種以上のウイルス抗原をコードするものに関する。本発明の組成物及び方法は、予防及び治療の両面で有用であり、新生物及び関連疾患を予防及び／又は治療するために使用することができる。
2019500907.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＡＡ配列又はその断片及びマトリックスタンパク質配列をコードする配列を含む組換え改変型ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスベクターであって、前記ＴＡＡ配列及びマトリックスタンパク質配列が、いずれもポックスウイルス発現系に適合可能なプロモーターの制御下にある、ベクター。
【請求項２】
前記ＴＡＡ配列及び前記マトリックスタンパク質配列が、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ又はＶＩから選択される前記ＭＶＡの１又は複数の欠失部位に挿入されている、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項３】
前記ＴＡＡ配列及び前記マトリックスタンパク質配列が、天然欠失部位、改変型天然欠失部位、又は必須若しくは非必須ＭＶＡ遺伝子間で前記ＭＶＡに挿入されている、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項４】
前記ＴＡＡ配列及び前記マトリックスタンパク質配列が、同一の天然欠失部位、改変型天然欠失部位、又は同一の必須若しくは非必須ＭＶＡ遺伝子間に挿入されている、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項５】
前記ＴＡＡ配列及び前記マトリックスタンパク質配列が、各々ポックスウイルス発現系に適合可能なプロモーターの制御下で、異なる天然欠失部位、異なる改変型欠失部位、又は異なる必須若しくは非必須ＭＶＡ遺伝子間に挿入されている、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項６】
前記ＴＡＡ配列が、２個の高度に保存された必須ＭＶＡ遺伝子間に挿入されており、前記マトリックスタンパク質配列が、再編成・改変型欠失部位ＩＩＩに挿入されている、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項７】
前記ＴＡＡ配列が、ＭＶＡ遺伝子であるＩ８ＲとＧ１Ｌとの間に挿入されている、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項８】
前記プロモーターが、Ｐｍ２Ｈ５、ＰｓｙｎＩＩ及びｍＨ５プロモーター又はその組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項９】
選択されたコドンをＭＶＡによるタンパク質発現に最適な他の同義コドンに置換する方法、サイレント突然変異を使用してホモポリマー連続部分に割り込む方法、サイレント突然変異を使用して転写ターミネーターモチーフに割り込む方法、又は（分泌型ではなく）膜貫通型のＴＡＡを発現させる方法から選択される１種以上の方法により、前記ＴＡＡ配列が最適化されている、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項１０】
前記組換えＭＶＡウイルスベクターが、ＶＬＰにアセンブリされたＴＡＡタンパク質とマトリックスタンパク質とを発現する、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項１１】
前記ＴＡＡ配列が配列番号１又は配列番号２を含む、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項１２】
前記ＴＡＡ配列が配列番号４を含む、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項１３】
前記ベクターが、ＭＵＣ−１の細胞外断片と、ＭＵＣ−１の細胞内断片と、マールブルグウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）の膜貫通ドメインとをさらに含む、請求項１に記載の組換えベクター。
【請求項１４】
少なくとも１種の組換えＭＶＡベクターと薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物であって、前記組換えＭＶＡベクターがＴＡＡ配列を含み、前記配列がポックスウイルス発現系に適合可能なプロモーターの制御下にある、医薬組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも１種の組換えＭＶＡベクターが、腹腔内、筋肉内、皮内、表皮、粘膜又は静脈内投与用に製剤化されている、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記組換えＭＶＡベクターが、ＭＵＣ−１の細胞外断片と、ＭＵＣ−１の細胞内断片と、マールブルグウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）の膜貫通ドメインとを含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
処置を必要とする対象における免疫応答の誘導方法であって、免疫応答を誘導するために十分な量の少なくとも１種の組換えＭＶＡベクターを前記対象に投与することを含み、
前記組換えＭＶＡベクターが、ＴＡＡ配列及びマトリックスタンパク質配列を含み、これらの配列がポックスウイルス発現系に適合可能なプロモーターと機能的に連結されている、方法。
【請求項１８】
前記免疫応答が、体液性免疫応答、細胞性免疫応答又はその組合せである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫応答が、前記ＴＡＡに対する結合抗体又は中和抗体の産生を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫応答が、前記ＴＡＡに対する非中和抗体の産生を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫応答が、前記ＴＡＡに対する細胞介在性免疫応答の誘起を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
新生物の増殖の予防又は抑制方法であって、処置を必要とする対象に前記新生物の増殖を予防又は抑制するために十分な量の請求項１４に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２３】
がんの治療方法であって、治療を必要とする対象に前記がんを治療するために十分な量の請求項１４に記載の組成物を投与することにより前記がんを治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願に記載する組成物及び方法は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する免疫応答を誘起するための組成物（ワクチン組成物を含む）、その製造方法、及びその使用方法に関する。本発明の組成物及び方法は、予防及び治療の両面で有用である。
【背景技術】
【０００２】
２０１６年に米国内で新たにがんと診断される患者は１，６８５，２１０人、がんによる死亡数は５９５，６９０人になると推定される（Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ＆  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ２０１６，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２０１６）。ヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を利用したがんワクチンが、進行がん又は再発がんの患者で標準治療と併用してか又は標準治療後に、試験されている。腫瘍微小環境の極めて多様な抑制作用及び患者の免疫系に及ぼす標準治療の作用ゆえに、がんワクチンの免疫原性と治療有効性とを正しく評価することは困難であった。ヒトがんの動物モデルにおいて、予防用として投与されたワクチンは免疫原性が高く、がんの発生と進行を有効に予防する。
【０００３】
ヒトＴＡＡを利用したワクチンは、免疫原性で且つ安全であり、がん予防に重要な長期メモリーを誘発することが可能である。
【０００４】
ＴＡＡの特定の１例は、ムチンファミリーのメンバーであって、膜結合型グリコシル化リンタンパク質をコードするＭＵＣ−１である。ＭＵＣ１は、コアタンパク質分子量が１２０〜２２５ｋＤａであり、グリコシル化と共に２５０〜５００ｋＤａまで増加する。また、細胞の表面から２００〜５００ｎｍ突出している（Ｂｒａｙｍａｎ  Ｍ，Ｔｈａｔｈｉａｈ  Ａ，Ｃａｒｓｏｎ  ＤＤ，２００４，Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：４）。このタンパク質は、膜貫通ドメインを介して多数の上皮細胞の頂端面に係留されている。これらの反復配列は、セリン、スレオニン及びプロリン残基に富み、多数のｏ結合型糖鎖を付加することができる（Ｂｒａｙｍａｎ  Ｍ，Ｔｈａｔｈｉａｈ  Ａ，Ｃａｒｓｏｎ  ＤＤ，２００４，Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：４）。この遺伝子の種々のアイソフォームをコードする多様な選択的スプライシング転写産物変異体が、報告されている。
【０００５】
ＭＵＣ−１の細胞質テールは、７２アミノ酸長であり、数個のリン酸化部位を含む（Ｓｉｎｇｈ  ＰＫ，Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ  ＭＡ（Ａｕｇｕｓｔ  ２００６），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６（９）：４６７−４７６）。このタンパク質は、病原体と結合することにより防御機能を発揮すると共に、細胞内シグナル伝達機能ももつ（Ｌｉｎｄｅｎ  ＳＫ  ｅｔ  ａｌ．２００９，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．５（１０）：ｅ１０００６１７）。
【０００６】
このタンパク質の過剰発現、細胞内局在異常及びグリコシル化における変化は、がんに関連付けられている。特に、結腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がん及び膵臓がんでは、ＭＵＣ−１過剰発現を伴うことが多い（Ｇｅｎｄｌｅｒ  ＳＪ（Ｊｕｌｙ  ２００１），Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．６（３）：３３９−３５３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｆａｃｔｓ  ＆  Ｆｉｇｕｒｅｓ  ２０１６，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２０１６
【非特許文献２】Ｂｒａｙｍａｎ  Ｍ，Ｔｈａｔｈｉａｈ  Ａ，Ｃａｒｓｏｎ  ＤＤ，２００４，Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：４
【非特許文献３】Ｓｉｎｇｈ  ＰＫ，Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ  ＭＡ（Ａｕｇｕｓｔ  ２００６），Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６（９）：４６７−４７６
【非特許文献４】Ｌｉｎｄｅｎ  ＳＫ  ｅｔ  ａｌ．２００９，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．５（１０）：ｅ１０００６１７
【非特許文献５】Ｇｅｎｄｌｅｒ  ＳＪ（Ｊｕｌｙ  ２００１），Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ  Ｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．６（３）：３３９−３５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これまでのところ、米国で人体用に承認されたがんワクチンは存在していない。新生物に起因するがんを予防及び治療するための免疫原性ワクチン組成物及び使用方法が、必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願に記載する本発明の組成物及び方法は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘起するのに有用である。有利なことに、前記組成物及び方法を、がん関連抗原に対して対象を免疫するために予防用として使用することもできるし、治療を必要とする対象における疾患の発症及び重症度を治療又は改善するために治療用として使用することもできる。
【００１０】
第１の態様において、本発明は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする配列（ＴＡＡ配列）とマトリックスタンパク質をコードする配列（マトリックスタンパク質配列）とを含む組換え改変型ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ベクターであり、前記ＴＡＡ配列及びマトリックスタンパク質配列は、いずれもポックスウイルス発現系に適合可能なプロモーターの制御下にある。
【００１１】
１実施形態において、前記ＴＡＡ配列及び前記マトリックスタンパク質配列は、前記ＭＶＡベクターの１カ所以上の欠失部位に挿入されている。
【００１２】
１実施形態において、前記ＴＡＡは、腫瘍胎児抗原／未成熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、異常なｒａｓ産物、異常なｐ５３産物又はその免疫原性断片からなる群から選択される。
【００１３】
１実施形態において、前記ＴＡＡは、ＭＵＣ−１である。
【００１４】
１実施形態において、前記ＴＡＡは、ＯＦＡ／ｉＬＲＰである。
【００１５】
１実施形態において、前記ＴＡＡは、ＣＥＡである。
【００１６】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、マールブルグウイルスマトリックスタンパク質である。
【００１７】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、マールブルグウイルスＶＰ４０マトリックスタンパク質である。
【００１８】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、エボラウイルスマトリックスタンパク質である。
【００１９】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、エボラウイルスＶＰ４０マトリックスタンパク質である。
【００２０】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、スーダンウイルスマトリックスタンパク質である。
【００２１】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、スーダンウイルスＶＰ４０マトリックスタンパク質である。
【００２２】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）マトリックスタンパク質である。
【００２３】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、ｇａｇ遺伝子によりコードされる１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）マトリックスタンパク質である。
【００２４】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、ラッサウイルスマトリックスタンパク質である。
【００２５】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、ラッサウイルスＺタンパク質である。
【００２６】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、ラッサウイルスＺタンパク質の断片である。
【００２７】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーにおけるウイルスのマトリックスタンパク質である。
【００２８】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーにおけるウイルスのマトリックスタンパク質である。
【００２９】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーにおけるウイルスのマトリックスタンパク質である。
【００３０】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーにおけるウイルスのマトリックスタンパク質である。
【００３１】
１実施形態において、前記ＴＡＡ配列及び前記マトリックスタンパク質配列は、天然欠失部位、改変型天然欠失部位、又は必須若しくは非必須ＭＶＡ遺伝子間で前記ＭＶＡベクターに挿入されている。
【００３２】
別の実施形態において、前記ＴＡＡ配列及び前記マトリックスタンパク質配列は、同一の天然欠失部位、改変型天然欠失部位、又は同一の必須若しくは非必須ＭＶＡ遺伝子間に挿入されている。
【００３３】
別の実施形態において、前記ＴＡＡ配列は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ又はＶＩから選択される欠失部位に挿入されており、前記マトリックスタンパク質配列は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ又はＶＩから選択される欠失部位に挿入されている。
【００３４】
別の実施形態において、前記ＴＡＡ配列及び前記マトリックスタンパク質配列は、異なる天然欠失部位、異なる改変型欠失部位、又は異なる必須若しくは非必須ＭＶＡ遺伝子間に挿入されている。
【００３５】
別の実施形態において、前記ＴＡＡ配列は、第１の欠失部位に挿入されており、前記マトリックスタンパク質配列は、第２の欠失部位に挿入されている。
【００３６】
特定の実施形態において、前記ＴＡＡ配列は、２個の高度に保存された必須ＭＶＡ遺伝子間に挿入されており、前記マトリックスタンパク質配列は、再編成・改変型欠失部位ＩＩＩに挿入されている。
【００３７】
１実施形態において、前記欠失部位ＩＩＩは、非必須配列を除去して前記マトリックスタンパク質配列を必須遺伝子間に挿入するように改変されている。
【００３８】
特定の実施形態において、前記マトリックスタンパク質配列は、ＭＶＡ遺伝子であるＩ８ＲとＧ１Ｌとの間に挿入されている。
【００３９】
特定の実施形態において、前記ＴＡＡ配列は、生育可能な欠失突然変異体の形成を制限するように、２個の高度に保存された必須ＭＶＡ遺伝子間に挿入されている。
【００４０】
特定の実施形態において、前記ＴＡＡタンパク質配列は、ＭＶＡ遺伝子であるＩ８ＲとＧ１Ｌとの間に挿入されている。
【００４１】
１実施形態において、前記プロモーターは、Ｐｍ２Ｈ５、ＰｓｙｎＩＩ及びｍＨ５プロモーター又はその組合せからなる群から選択される。
【００４２】
１実施形態において、前記ＴＡＡ配列は、最適化されている。特定の実施形態において、前記ＴＡＡ配列は、選択されたコドンをＭＶＡによるタンパク質発現に最適な他の同義コドンに置換する方法、サイレント突然変異を使用してホモポリマー連続部分に割り込む方法、サイレント突然変異を使用して転写ターミネーターモチーフに割り込む方法、又は（分泌型ではなく）膜貫通型のＴＡＡを発現させる方法及びその組合せにより最適化されている。
【００４３】
１実施形態において、前記組換えＭＶＡウイルスベクターは、ＶＬＰにアセンブリされたＴＡＡタンパク質及びマトリックスタンパク質を発現する。
【００４４】
第２の態様において、本発明は、本発明の組換えＭＶＡベクター及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物を提供する。
【００４５】
１実施形態において、前記組換えＭＶＡベクターは、腹腔内、筋肉内、皮内、表皮、粘膜又は静脈内投与用に製剤化されている。
【００４６】
第３の態様において、本発明は、２個の組換えＭＶＡベクターを含有する医薬組成物を提供し、各組換えＭＶＡベクターは、ＴＡＡ配列を含み、（ｉ）第１の組換えＭＶＡベクターのＴＡＡ配列は、第２の組換えＭＶＡベクターのＴＡＡ配列と異なる。
【００４７】
１実施形態において、前記ＴＡＡ配列及び前記マトリックスタンパク質配列は、前記ＭＶＡベクターの１カ所以上の欠失部位に挿入されている。
【００４８】
１実施形態において、前記ＴＡＡは、腫瘍胎児抗原／未成熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、異常なｒａｓ産物及び異常なｐ５３産物又はその免疫原性断片からなる群から選択される。
【００４９】
１実施形態において、前記ＴＡＡは、ＭＵＣ−１である。
【００５０】
１実施形態において、前記ＴＡＡは、腫瘍胎児抗原／未成熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）である。
【００５１】
１実施形態において、前記ＴＡＡは、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）である。
【００５２】
１実施形態において、前記第１の組換えＭＶＡベクターのＴＡＡは、ＭＵＣ−１であり、前記第２の組換えＭＶＡベクターのＴＡＡは腫瘍胎児抗原／未成熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）である。
【００５３】
１実施形態において、前記第１の組換えＭＶＡベクターのＴＡＡは、ＭＵＣ−１であり、前記第２の組換えＭＶＡベクターのＴＡＡはがん胎児性抗原（ＣＥＡ）である。
【００５４】
１実施形態において、前記第１の組換えＭＶＡベクターのＴＡＡは、腫瘍胎児抗原／未成熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）であり、前記第２の組換えＭＶＡベクターのＴＡＡはがん胎児性抗原（ＣＥＡ）である。
【００５５】
１実施形態において、前記ＴＡＡ配列及び前記マトリックスタンパク質配列は、天然欠失部位、改変型天然欠失部位、又は必須若しくは非必須ＭＶＡ遺伝子間で前記ＭＶＡベクターに挿入されている。
【００５６】
別の実施形態において、前記ＴＡＡ配列及び前記マトリックスタンパク質配列は、同一の天然欠失部位、同一の改変型天然欠失部位、又は同一の必須若しくは非必須ＭＶＡ遺伝子間に挿入されている。
【００５７】
別の実施形態において、前記ＴＡＡ配列は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ又はＶＩから選択される欠失部位に挿入されており、前記マトリックスタンパク質配列は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ又はＶＩから選択される欠失部位に挿入されている。
【００５８】
別の実施形態において、前記ＴＡＡ配列及び前記マトリックスタンパク質配列は、異なる天然欠失部位、異なる改変型欠失部位、又は異なる必須若しくは非必須ＭＶＡ遺伝子間に挿入されている。
【００５９】
別の実施形態において、前記ＴＡＡ配列は、第１の欠失部位に挿入されており、前記マトリックスタンパク質配列は、第２の欠失部位に挿入されている。
【００６０】
特定の実施形態において、前記ＴＡＡ配列は、２個の高度に保存された必須ＭＶＡ遺伝子間に挿入されており、前記マトリックスタンパク質配列は、再編成・改変型欠失部位ＩＩＩに挿入されている。
【００６１】
１実施形態において、前記欠失部位ＩＩＩは、非必須配列を除去して前記マトリックスタンパク質配列を必須遺伝子間に挿入するように改変されている。
【００６２】
特定の実施形態において、前記マトリックスタンパク質配列は、ＭＶＡ遺伝子であるＩ８ＲとＧ１Ｌとの間に挿入されている。
【００６３】
特定の実施形態において、前記ＴＡＡ配列は、生育可能な欠失突然変異体の形成を制限するように、２個の高度に保存された必須ＭＶＡ遺伝子間に挿入されている。
【００６４】
特定の実施形態において、前記ＴＡＡタンパク質配列は、ＭＶＡ遺伝子であるＩ８ＲとＧ１Ｌとの間に挿入されている。
【００６５】
１実施形態において、前記プロモーターは、Ｐｍ２Ｈ５、ＰｓｙｎＩＩ及びｍＨ５プロモーター又はその組合せからなる群から選択される。
【００６６】
１実施形態において、前記ＴＡＡ配列は、最適化されている。特定の実施形態において、前記ＴＡＡ配列は、選択されたコドンをＭＶＡによるタンパク質発現に最適な他の同義コドンに置換する方法、サイレント突然変異を使用してホモポリマー連続部分に割り込む方法、サイレント突然変異を使用して転写ターミネーターモチーフに割り込む方法、又は（分泌型ではなく）膜貫通型のＴＡＡを発現させる方法及びその組合せにより最適化されている。
【００６７】
１実施形態において、前記組換えＭＶＡウイルスベクターは、ＶＬＰにアセンブリされたＴＡＡタンパク質及びマトリックスタンパク質を発現する。第２の態様において、本発明は、本発明の組換えＭＶＡベクター及び薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物を提供する。
【００６８】
１実施形態において、前記組換えＭＶＡベクターは、腹腔内、筋肉内、皮内、表皮、粘膜又は静脈内投与用に製剤化されている。
【００６９】
特定の実施形態において、前記第１の組換えＭＶＡベクターのＴＡＡ配列は、前記第２の組換えＭＶＡベクターのＴＡＡ配列と別の生物種に由来する。
【００７０】
第４の態様において、本発明は、３個以上の組換えＭＶＡベクターを含有する医薬組成物を提供し、各組換えＭＶＡベクターは、ＴＡＡ配列を含み、（ｉ）前記３個以上の組換えＭＶＡベクターは、異なるＴＡＡ配列を含む。
【００７１】
１実施形態において、前記ＴＡＡ配列は、ＭＵＣ−１、腫瘍胎児抗原／未成熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）、及びがん胎児性抗原（ＣＥＡ）である。
【００７２】
特定の実施形態において、前記ＴＡＡ配列は、同一生物種に由来する。
【００７３】
特定の実施形態において、前記ＴＡＡ配列は、異なる生物種に由来する。
【００７４】
第５の態様において、本発明は、処置を必要とする対象において新生物に対する免疫応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、免疫応答を誘導するために十分な量の本願に記載する免疫原性ベクターを含有する組成物を、前記対象に投与することを含む。
【００７５】
１実施形態において、前記免疫応答は、体液性免疫応答、細胞性免疫応答又はその組合せである。
【００７６】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する結合抗体の産生を含む。
【００７７】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する中和抗体の産生を含む。
【００７８】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する非中和抗体の産生を含む。
【００７９】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する細胞介在性免疫応答の誘起を含む。
【００８０】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する中和抗体及び非中和抗体の産生を含む。
【００８１】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する中和抗体の産生及び細胞介在性免疫の誘起を含む。
【００８２】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する非中和抗体の産生及び細胞介在性免疫の誘起を含む。
【００８３】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する中和抗体の産生、非中和抗体の産生及び細胞介在性免疫の誘起を含む。
【００８４】
１実施形態において、前記新生物は、白血病（例えば骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病）、リンパ腫（例えばホジキン病及び非ホジキン病）、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング腫瘍、結腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、腎細胞がん、肝細胞がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星細胞腫、乏突起神経膠腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、異形成及び過形成から選択される。
【００８５】
別の実施形態において、前記ＴＡＡは、ＭＵＣ−１であり、前記新生物は腺がん（乳がん、大腸がん、膵臓がん等）、カルチノイド腫瘍、脊索腫、絨毛がん、繊維形成性小円形細胞腫瘍（ＤＳＲＣＴ）、類上皮肉腫、濾胞樹状細胞肉腫、指状嵌入樹状細胞／細網細胞肉腫、肺病変として、ＩＩ型肺胞上皮細胞病変（ＩＩ型細胞過形成、ＩＩ型細胞異形成、肺尖部肺胞過形成）、未分化大細胞型リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（非定型）、形質芽球性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、類上皮型中皮腫、ミエローマ、形質細胞腫、神経周膜腫、腎細胞がん、滑膜肉腫（上皮領域）、胸腺がん（高頻度）、髄膜腫又はパジェット病から選択される。
【００８６】
第６の態様において、本発明は、がんの治療方法として、治療を必要とする対象にがんを治療するために有効な量の本発明の組換えＭＶＡベクターを投与することを含む方法を提供する。
【００８７】
第７の態様において、本発明は、対象における新生物の増殖の抑制方法を提供し、前記方法は、新生物の増殖を抑制するために有効な量の本発明の組換えＭＶＡベクターを前記対象に投与することを含む。
【００８８】
第８の態様において、本発明は、対象における新生物の増殖の予防方法を提供し、前記方法は、予防有効量の本発明の組換えＭＶＡベクターを前記対象に投与することを含む。
【００８９】
１実施形態において、前記対象は、腫瘍細胞マーカーを発現するが、まだ無症候である。特定の実施形態では、治療の結果として症候性疾患が予防される。
【００９０】
別の実施形態において、前記対象は、腫瘍細胞マーカーを発現するが、がん症状を最低限しか示していない。
【００９１】
別の実施形態では、前記方法の結果として少なくとも１種のがん症状が改善される。
【００９２】
第９の態様において、本発明は、組換え改変型ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）ウイルスベクターの製造方法として、少なくとも１種のＴＡＡ配列をＭＶＡベクターに挿入する工程を含む方法を提供し、前記少なくとも１種のＴＡＡ配列は、ポックスウイルス発現系に適合可能なプロモーターと機能的に連結されている。
【００９３】
１実施形態において、前記方法は、少なくとも１種のマトリックスタンパク質配列を前記ＭＶＡベクターに挿入する工程を含み、前記少なくとも１種のＴＡＡ配列は、ポックスウイルス発現系に適合可能なプロモーターと機能的に連結されている。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ＭＵＣ１のシャトルベクター（ｐＧｅｏ−Ｍｕｃ１）の模式図である。
【図２】ＭＶＡベクターのデザインを図解する単純線図である。
【図３】ＭＶＡ−Ｍｕｃ１ＶＰ４０ワクチンを感染させた細胞が（１）Ｍｕｃ１タンパク質を発現すると共に、（２）低グリコシル化Ｍｕｃ１を発現することを実証するウェスタンブロットである。
【図４】（１）Ｍｕｃ１タンパク質、及び（２）低グリコシル化Ｍｕｃ１タンパク質の存在について、免疫染色を行った細胞の画像である。この方法で染色した細胞試料はネガティブコントロール細胞（ＭＣＦ１０Ａ）、ポジティブコントロール細胞（ＭＣＦ７）、ＭＶＡ−Ｍｕｃ１ＶＰ４０ワクチンを接種したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、及びＭＶＡ−Ｍｕｃ１ＶＰ４０ワクチンを接種していないＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を含む。
【図５】Ｍｕｃ１  ＴＡＡタンパク質をコードするＭＶＡワクチンであるＭＶＡ−Ｍｕｃ１ＶＰ４０を接種した細胞によるウイルス様粒子（ＶＬＰ）産生を示す、電子顕微鏡写真である。
【図６】Ｍｕｃ１のＯ−結合型グリコシル化の標的低減の初期改変経路の模式図である。
【図７】Ｍｕｃ１のＯ−結合型グリコシル化の標的低減の別の初期改変経路の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
処置を必要とする対象に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する免疫応答を誘起するための、組成物及び方法を、提供する。本発明の組成物及び方法は、処置を必要とする対象における新生物の形成を予防又は遅延させるために使用されてもよく、あるいは新生物又はそれに関連する疾患（例えばがん）を治療するために使用されてもよい。１実施形態において、治療は、新生物発生、増殖及び／又はがん等の新生物関連疾患の重症度を制限する。
【００９６】
理想的な免疫原性組成物又はワクチンは、安全性、有効性、防御範囲及び長期持続性の特徴を備えるが、これらの特徴の全てを備える組成物でなくても、新生物増殖を予防するために有用であるか、あるいは症状の発現前に投与した対象において症状又は疾患進行を制限するために有用であると思われる。１実施形態において、本発明は、単回免疫後に、完全ではないとしても、少なくとも部分的な防御を可能にするワクチンを提供する。
【００９７】
１実施形態において、前記組成物は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又はその免疫原性断片をコードする１種以上の核酸配列を含む組換えワクチン又は免疫原性ベクターである。
【００９８】
１実施形態において、前記組成物は、ＭＵＣ−１の細胞外断片を含む組換えワクチン又は免疫原性ベクターである。
【００９９】
１実施形態において、前記組成物は、ＭＵＣ−１の細胞内断片を含む組換えワクチン又は免疫原性ベクターである。
【０１００】
１実施形態において、前記組成物は、ＭＵＣ−１の細胞外断片及び細胞内断片を含む組換えワクチン又は免疫原性ベクターである。
【０１０１】
１実施形態において、前記組成物は、ＭＵＣ−１の細胞外断片と、ＭＵＣ−１の細胞内断片と、マールブルグウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）の膜貫通ドメインとを含む組換えワクチン又は免疫原性ベクターである。
【０１０２】
１実施形態において、前記組成物は、ＴＡＡの細胞外断片と、ＴＡＡの細胞内断片と、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーにおけるウイルスのＧＰの膜貫通ドメインとを含む組換えワクチン又は免疫原性ベクターである。
【０１０３】
１実施形態において、前記ベクターは、ＶＬＰを形成してＴＡＡ又はその免疫原性断片に対する免疫応答を誘起するタンパク質を発現する。
【０１０４】
代表的な実施形態において、前記免疫応答は、長時間持続するため、反復ブースターの必要はないが、１実施形態では、初回にプライムした免疫応答をブーストするために本願に記載する組成物を１回以上投与する。
【０１０５】
Ｉ．定義
ある用語を単数形で記載する場合、本願では、その用語の複数形により記載される発明の態様も想定している。文脈からそうでないことが明白である場合を除き、本明細書及び特許請求の範囲で使用する単数形は、複数の場合も含み、例えば「ペプチド」は複数のペプチドを含む。したがって、例えば、「方法」と言う場合には、本願に記載する形式及び／又は本開示の読了後に当業者に想到される形式の１種以上の方法及び／又は工程を含む。
【０１０６】
「抗原」なる用語は、免疫応答を誘導することが可能なタンパク質又はその断片等の物質又は分子を意味する。
【０１０７】
「結合抗体」又は「ｂＡｂ」なる用語は、体液（例えば血清又は粘膜分泌物）から精製されたもの又は体液中に存在するものであって、特定の抗原を認識する抗体を意味する。本願で使用する抗体は、単一抗体でもよいし、複数の抗体でもよい。結合抗体は、中和抗体及び非中和抗体を含む。
【０１０８】
「がん」なる用語は、分化の低下、増殖速度の増加、周囲組織の浸潤を伴う特徴的な退形成を生じており、転移が可能な悪性新生物を意味する。
【０１０９】
「細胞介在性免疫応答」なる用語は、リンパ球により提供される免疫防御作用を意味し、例えば感作Ｔ細胞リンパ球が外来抗原を発現する細胞を直接溶解してサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）を分泌するときに提供される防御であり、これは、マクロファージ及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のエフェクター機能を調節し、Ｔ細胞増殖及び分化を助長することができる。細胞性免疫応答は、獲得免疫応答の２番目の亜分類である。
【０１１０】
「保存的アミノ酸置換」なる用語は、その位置のアミノ酸残基のサイズ、極性、電荷、疎水性又は親水性に殆ど又は全く影響を与えず、免疫原性を実質的に変化させずに天然アミノ酸残基を非天然残基で置換することを意味する。例えば、これらの置換は、バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシンのグループ内の置換とすることができる。ポリペプチドの配列の保存的アミノ酸修飾（及びこれをコードするヌクレオチドの対応する修飾）により、親ポリペプチドと同様の機能的特徴及び化学的特徴をもつポリペプチドを生産することができる。
【０１１１】
ポリペプチド又はタンパク質に関して「欠失」なる用語は、ポリペプチド又はタンパク質配列から１個以上のアミノ酸残基のコドンを除去し、両側の領域を結合することを意味する。核酸に関して、欠失なる用語は、核酸配列から１個以上の塩基を除去し、両側の領域を結合することを意味する。
【０１１２】
「エボラウイルス」なる用語は、ザイールエボラウイルス（Ｚａｉｒｅ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）種のウイルスを意味し、（Ｋｕｈｎ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １５５：２０８３−２１０３）に引証されているように国際ウイルス分類委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）により定められた意味である。
【０１１３】
タンパク性物質に関して「断片」なる用語は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質のアミノ酸配列の少なくとも２個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続するアミノ酸残基、又は少なくとも２５０個の連続するアミノ酸残基のアミノ酸配列を含むペプチド又はポリペプチドを意味する。１実施形態において、前記断片は、参照ポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を構成する。１実施形態において、全長タンパク質の断片は、全長タンパク質の活性を維持する。別の実施形態において、全長タンパク質の前記断片は、全長タンパク質の活性を維持しない。
【０１１４】
核酸に関して「断片」なる用語は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列の少なくとも２個の連続するヌクレオチド、少なくとも５個の連続するヌクレオチド、少なくとも１０個の連続するヌクレオチド、少なくとも１５個の連続するヌクレオチド、少なくとも２０個の連続するヌクレオチド、少なくとも２５個の連続するヌクレオチド、少なくとも３０個の連続するヌクレオチド、少なくとも３５個の連続するヌクレオチド、少なくとも４０個の連続するヌクレオチド、少なくとも５０個の連続するヌクレオチド、少なくとも６０個の連続するヌクレオチド、少なくとも７０個の連続するヌクレオチド、少なくとも８０個の連続するヌクレオチド、少なくとも９０個の連続するヌクレオチド、少なくとも１００個の連続するヌクレオチド、少なくとも１２５個の連続するヌクレオチド、少なくとも１５０個の連続するヌクレオチド、少なくとも１７５個の連続するヌクレオチド、少なくとも２００個の連続するヌクレオチド、少なくとも２５０個の連続するヌクレオチド、少なくとも３００個の連続するヌクレオチド、少なくとも３５０個の連続するヌクレオチド、又は少なくとも３８０個の連続するヌクレオチドの核酸配列を含む核酸を意味する。１実施形態において、前記断片は、参照核酸配列の全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を構成する。好ましい１実施形態において、核酸の断片は、全長タンパク質の活性を維持するペプチド又はポリペプチドをコードする。別の実施形態において、前記断片は、全長タンパク質の活性を維持しないペプチド又はポリペプチドをコードする。
【０１１５】
本願で使用する「増殖阻害量」なる用語は、（例えば細胞増殖抑制、細胞毒性等により）細胞増殖を阻害するメカニズムに関係なく、腫瘍細胞等の標的細胞の成長又は増殖をインビトロ又はインビボで阻害する量を意味する。好ましい１実施形態において、増殖阻害量は、標的細胞の増殖又は成長をインビボ又は細胞培養で約２０％超、好ましくは約５０％超、最も好ましくは約７５％超（例えば約７５％〜約１００％）阻害する（即ちある程度まで遅らせ、好ましくは停止させる）。
【０１１６】
本願で使用する「異種配列」なる用語は、自然界において通常では別の特定の核酸又はタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチド配列と会合しない任意の核酸、タンパク質、ポリペプチド又はペプチド配列を意味する。
【０１１７】
本願で使用する「異種遺伝子インサート」なる用語は、本願に記載する組換えベクターに既に挿入されているか又は挿入される予定である任意の核酸配列を意味する。異種遺伝子インサートは、単に遺伝子産物をコードする配列を意味する場合もあるし、あるいはプロモーターと、遺伝子産物をコードする配列（例えばＧＰ、ＶＰ又はＺ）と、これらに結合又は機能的に連結された任意の調節配列とを含む配列を意味する場合もある。
【０１１８】
「ホモポリマー連続部分」なる用語は、他のヌクレオチドを割り込ませずに同一ヌクレオチドを少なくとも４個含む配列（例えばＧＧＧＧ又はＴＴＴＴＴＴＴ）を意味する。
【０１１９】
「体液性免疫応答」なる用語は、Ａｂ産生の刺激を意味する。体液性免疫応答は、Ｔヘルパー細胞活性化及びサイトカイン産生を含む抗体産生、親和性成熟及びメモリー細胞生成を伴うアクセサリータンパク質及びイベントも意味する。体液性免疫応答は、獲得免疫応答の２つの亜分類の一方である。
【０１２０】
「体液性免疫」なる用語は、新生物と直接結合することができる中和Ａｂ、又は補体（Ｃ’）介在性溶解、貪食作用及びナチュラルキラー細胞等の生得免疫応答により殺傷するために新生物細胞を認識する結合Ａｂ等の抗体により提供される、免疫防御作用を意味する。
【０１２１】
「免疫原性組成物」なる用語は、抗原分子を含有する組成物であり、前記組成物を対象に投与すると、前記抗原分子に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答が前記対象に誘起される。
【０１２２】
「免疫応答」なる用語は、対象（例えばヒト）の免疫系が抗原又は抗原決定基に対して起こす任意の応答を意味する。代表的な免疫応答としては、体液性免疫応答（例えば抗原特異的抗体の産生）と細胞介在性免疫応答（例えば抗原特異的Ｔ細胞の生成）が挙げられる。免疫応答を評価するためのアッセイは、当分野で公知であり、抗体反応及び遅延型過敏反応を測定するためのアッセイ等のインビボアッセイが挙げられる。１実施形態において、抗体反応を測定するためのアッセイは、主にＢ細胞機能及びＢ細胞／Ｔ細胞相互作用を測定することができる。抗体反応アッセイでは、抗原チャレンジ後に血液中の抗体力価を比較することができる。本願で使用する「抗体力価」は、各対象について免疫後の血清中の希釈倍率が免疫前の試料中の値よりも高くなった最高希釈倍率として定義することができる。インビトロアッセイは、細胞分裂能力、又は他の細胞が分裂するのを助ける能力、又はリンホカイン及び他の因子を放出し、活性化マーカーを発現し、標的細胞を溶解する能力の測定を含むことができる。インビトロアッセイでは、マウスのリンパ球とヒトのリンパ球とを比較することができる。１実施形態では、末梢血球、脾細胞又はリンパ節等の類似の起源に由来するリンパ球を比較する。一方、異なる起源に由来するリンパ球を比較することも可能であり、非限定的な例では、ヒトの末梢血球及びマウスの脾細胞が挙げられる。インビトロアッセイの場合、細胞を精製してもよい（例えばＢ細胞、Ｔ細胞及びマクロファージ）し、それらの天然状態のままでもよい（例えば脾細胞又はリンパ節細胞）。精製は、所望の結果が得られるならばどのような方法でもよい。マイトジェン又は特異抗原を使用して細胞の増殖能をインビトロで試験することができる。混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して、特異抗原の存在下における細胞分裂能を試験することができる。培養細胞からの上清を試験し、細胞が特異的リンホカインを分泌する能力を定量することができる。細胞を培養から取出し、活性化抗原を発現する能力について試験することができる。これは、適切な任意の方法で実施することができ、非限定的な例では、活性化抗原と結合する抗体又はリガンドと、活性化抗原をコードするＲＮＡと結合するプローブとを使用する。
【０１２３】
新生物又はがんをもつと診断された対象に関して、「治療転帰の改善」なる用語は、腫瘍の増殖又は腫瘍増殖に伴う検出可能な症状の遅延又は軽減を意味する。
【０１２４】
「免疫応答を誘導する」なる用語は、前記組成物（例えばワクチン）を投与した対象にＴＡＡに対する体液性応答（例えば抗体の産生）又は細胞性応答（例えばＴ細胞の活性化）を誘発することを意味する。
【０１２５】
ポリペプチド又はタンパク質に関して、「挿入」なる用語は、ポリペプチド又はタンパク質配列に１個以上の非天然アミノ酸残基を付加することを意味する。通常では、ポリペプチド又はタンパク質分子内の任意の１カ所に約１〜６残基以内（例えば１〜４残基）を挿入する。
【０１２６】
「マールブルグウイルス」なる用語は、マールブルグマールブルグウイルス（Ｍａｒｂｕｒｇ  ｍａｒｂｕｒｇｖｉｒｕｓ）種のウイルスを意味し、（Ｋｕｈｎ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １５５：２０８３−２１０３）に引証されているように国際ウイルス分類委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）により定められた意味である。
【０１２７】
「マーカー」なる用語は、疾患又は障害に伴って発現レベル又は活性が変化する任意のタンパク質又はポリヌクレオチドを意味する。
【０１２８】
「改変型ワクシニアアンカラ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ、ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ａｎｋａｒａ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ）」又は「ＭＶＡ」なる用語は、Ａｎｔｏｎ  Ｍａｙｒ博士によりニワトリ胚線維芽細胞Ｔ細胞で連続継代により開発された高度弱毒ワクシニアウイルス株又はその変異株若しくは誘導株を意味する。ＭＶＡは、（Ｍａｙｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９７５  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３：６−１４；Ｓｗｉｓｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５６８，３９２）に説明されている。
【０１２９】
本願で使用する「新生物」なる用語は、特にがんの特徴として、身体の何らかの部分における組織の新規又は異常な増殖を意味する。
【０１３０】
「中和抗体」又は「ＮＡｂ」なる用語は、体液（例えば血清又は粘膜分泌物）から精製されたもの又は体液中に存在する抗体であって、特定の抗原を認識し、対象（例えばヒト）における前記抗原の作用を阻害する抗体を意味する。本願で使用する抗体は、単一抗体でもよいし、複数の抗体でもよい。
【０１３１】
「非中和抗体」又は「ｎｎＡｂ」なる用語は、中和抗体以外の結合抗体を意味する。
【０１３２】
「機能的に連結」。第１の核酸配列が第２の核酸配列に対して機能的関係で配置されているときに、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写又は発現に影響を与える場合、前記プロモーターは、前記コーディング配列と機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されたＤＮＡ配列は、相互に隣接しており、必要に応じて２個のタンパク質コーディング領域を結合するように同一読み枠内にある。
【０１３３】
「予防する」、「予防用」及び「予防」なる用語は、療法の適用又は併用療法の適用の結果として、対象における病態（例えば腫瘍又はそれに付随する病態）の発現若しくは発症を阻害すること、又は病態の１種以上の症状の再発、発症若しくは発現を予防することを意味する。
【０１３４】
「プロモーター」なる用語は、転写を誘導するために十分なポリヌクレオチドを意味する。
【０１３５】
「予防有効量」なる用語は、病態若しくはその症状（例えば腫瘍又はそれに付随する病態若しくは症状）の発現、再発若しくは発症を予防するため、又は別の療法の予防効果を強化若しくは改善するために十分な組成物（例えば組換えＭＶＡベクター又は医薬組成物）の量を意味する。
【０１３６】
「組換え」なる用語は、自然界には存在しないか又は自然界には存在しない配置で別のポリヌクレオチドと連結している、半合成又は合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
【０１３７】
ウイルスベクターに関して「組換え」なる用語は、例えば組換え核酸技術を使用して異種ウイルス核酸配列を発現するようにインビトロで操作されているベクター（例えばウイルスゲノム）を意味する。
【０１３８】
「調節配列」、「調節配列群」なる用語は、共同してコーディング配列の転写と翻訳を可能にするプロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、配列内リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）、エンハンサー等の総称である。選択された遺伝子を転写・翻訳できる限り、必ずしもこれらの調節配列の全てが存在している必要はない。
【０１３９】
「シャトルベクター」なる用語は、遺伝子材料をある宿主系から別の宿主系に移動させるために有用な遺伝子ベクター（例えばＤＮＡプラスミド）を意味する。シャトルベクターは、少なくとも１種類の宿主（例えば大腸菌）において、（他のベクターの非共存下で）単独で複製することができる。ＭＶＡベクター作製に関して、シャトルベクターは、通常ではＤＮＡプラスミドであり、大腸菌で操作した後に、ＭＶＡベクターを感染させた培養細胞に導入し、新規組換えＭＶＡベクターを作製することができる。
【０１４０】
「サイレント突然変異」なる用語は、ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の一次構造を変化させないヌクレオチド配列の変異を意味し、例えば（リジンをコードする）ＡＡＡから（同じくリジンをコードする）ＡＡＧへの変異を意味する。
【０１４１】
「対象」なる用語は、任意の哺乳動物を意味し、限定されないが、ヒト、家畜、及び動物園の動物、スポーツ用動物又はペット動物が挙げられ、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。「危険のある」対象の判定は、対象又は医療機関の診断試験又は所見（例えば遺伝子試験、酵素又はタンパク質マーカー、マーカー検査履歴等）による任意の自覚的又は他覚的判定により実施することができる。
【０１４２】
「スーダンウイルス」なる用語は、スーダンエボラウイルス（Ｓｕｄａｎ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）種のウイルスを意味し、（Ｋｕｈｎ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １５５：２０８３−２１０３）に引証されているように国際ウイルス分類委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）により定められた意味である。
【０１４３】
「サロゲートエンドポイント」なる用語は、臨床効果の測定の代用として使用される臨床効果の測定以外の臨床測定を意味する。
【０１４４】
「サロゲートマーカー」なる用語は、対象がどのように感じ、機能し、又は生存するかの直接尺度である臨床的に有意義なエンドポイントの代用として臨床試験又は動物試験で使用され、治療の効果を予測できると期待される実験室測定又は身体的徴候を意味する（Ｋａｔｚ，Ｒ．，ＮｅｕｒｏＲｘ  １：１８９−１９５（２００４）；Ｎｅｗ  ｄｒｕｇ，ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ；ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ａｐｐｒｏｖａｌ−ＦＤＡ．Ｆｉｎａｌ  ｒｕｌｅ．Ｆｅｄ  Ｒｅｇｉｓｔ  ５７：５８９４２−５８９６０，１９９２．）。
【０１４５】
「防御のサロゲートマーカー」なる用語は、新生物増殖の抑制又は予防の臨床的に有意義なエンドポイントの代用として、臨床試験又は動物試験で使用されるサロゲートマーカーを意味する。
【０１４６】
「同義コドン」なる用語は、同一アミノ酸をコードするために別の核酸配列をもつコドンを使用することを意味し、例えば（どちらもリジンをコードする）ＡＡＡ及びＡＡＧが挙げられる。コドン最適化は、あるタンパク質のコドンをベクター又は宿主細胞で最も頻用される同義コドンに置換する。
【０１４７】
「治療有効量」なる用語は、新生物を治療するために哺乳動物に投与したときに前記新生物のこのような治療を行うために十分な前記組成物（例えば組換えＭＶＡベクター又は医薬組成物）の量を意味する。
【０１４８】
「治療用」又は「治療する」なる用語は、１種類以上の療法の適用の結果として新生物が消滅又は抑制され、前記新生物に起因する病態又は１種以上の症状の進行、重症度及び／又は持続時間が抑制又は改善されることを意味する。
【０１４９】
「ワクチン」なる用語は、対象に投与後に免疫応答を誘発し、免疫を付与するために使用される材料を意味する。このような免疫としては、ワクチン投与後に対象が免疫原に暴露されるときに生じる細胞性又は体液性免疫応答が挙げられる。
【０１５０】
「ワクチンインサート」なる用語は、組換えベクターに挿入されたときに発現されるようにプロモーターと機能的に連結された異種配列をコードする核酸配列を意味する。前記異種配列は、本願に記載する糖タンパク質又はマトリックスタンパク質をコードすることができる。
【０１５１】
「ウイルス様粒子」又は「ＶＬＰ」なる用語は、抗原的及び形態的に天然ウイルスに似た構造を意味する。
【０１５２】
ＩＩ．腫瘍関連抗原
本発明の組成物は、腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘導するために有用である。
【０１５３】
特定の実施形態において、前記ベクターは、ＭＵＣ−１を発現する。１実施形態において、前記ベクターは、低グリコシル化型のＭＵＣ−１を発現する。ＭＵＣ１は、ほぼ全ての上皮細胞に存在するが、がん細胞では過剰発現され、その会合体であるグリカンは、非腫瘍関連ＭＵＣ１のグリカンよりも短い（Ｇａｉｄｚｉｋ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３，Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｒｅｖ．４２（１０）：４４２１−４２）。
【０１５４】
膜貫通型糖タンパク質であるムチン１（ＭＵＣ１）は、種々の上皮がんで異常にグリコシル化されて過剰発現され、この疾患の進行に極めて重要な役割を果たす。腫瘍関連ＭＵＣ１は、その生化学的特徴、細胞内分布及び機能に関して正常細胞で発現されるＭＵＣ１と相違する。がん細胞において、ＭＵＣ１は、細胞内シグナル伝達経路に関与し、その標的遺伝子の発現を転写レベル及び転写後レベルの両者で制御する（Ｎａｔｈ，Ｓ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅ  ２０，Ｉｓｓｕｅ  ６，ｐ３３２−３４２，Ｊｕｎｅ  ２０１４）。
【０１５５】
Ａ．ＴＡＡの免疫原性断片
種々の実施形態では、本願に記載するＭＶＡベクターにより、ＴＡＡの免疫原性断片を発現させることができる。
【０１５６】
所定の実施形態では、本願に記載するＭＶＡベクターにより、表１に記載するもの等の免疫原性断片を発現させることができる。
【０１５７】
【表１】
2019500907.tif 000003
【０１５８】
１実施形態において、前記ベクターは、ＭＵＣ１の免疫原性細胞外ドメイン断片を発現する。
【０１５９】
１実施形態において、前記ベクターは、配列
【０１６０】
【化１】
2019500907.tif 000004
からなるＭＵＣ１の細胞外ドメイン断片を発現する。
【０１６１】
１実施形態において、前記ベクターは、配列
【０１６２】
【化２】
2019500907.tif 000005
からなるＭＵＣ１の細胞外ドメイン断片を発現する。
【０１６３】
１実施形態において、前記ベクターは、配列
【０１６４】
【化３】
2019500907.tif 000006
からなるＭＵＣ１の細胞外ドメイン断片を発現する。
【０１６５】
１実施形態において、前記ベクターは、配列
【０１６６】
【化４】
2019500907.tif 000007
からなるＭＵＣ１の細胞外ドメイン断片を発現する。
【０１６７】
１実施形態において、前記ベクターは、ＭＵＣ１の細胞内ドメイン断片を発現する。
【０１６８】
１実施形態において、ベクターは、ＭＵＣ−１の細胞外断片と、ＭＵＣ−１の細胞内断片と、マールブルグウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）の膜貫通ドメインとを発現する。
【０１６９】
１実施形態において、ベクターは、ＴＡＡの細胞外断片と、ＴＡＡの細胞内断片と、マールブルグウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）の膜貫通ドメインとを発現する。
【０１７０】
ＩＩＩ．組換えウイルスベクター
１態様において、本発明は、腫瘍関連抗原又はその免疫原性断片をコードする１種以上の核酸配列を含む組換えウイルスベクターである。所定の実施形態において、前記組換えウイルスベクターは、ワクシニアウイルスベクターであり、より特定的には、腫瘍関連抗原又はその免疫原性断片をコードする１種以上の核酸配列を含むＭＶＡベクターである。
【０１７１】
組換え遺伝子発現用途と組換え生ワクチンとしての潜在的用途とを目的とするウイルスベクターを作製するためにも、ワクシニアウイルスが使用されている（Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ  １９８２  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７９：７４１５−７４１９；Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９８４  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｎｇｉｎ  Ｒｅｖ  ２：３８３−４０７）。このためには、ＤＮＡ組換え技術により外来抗原をコードするＤＮＡ配列（遺伝子）をワクシニアウイルスのゲノムに導入する必要がある。前記遺伝子がウイルスの生活環に非必須のウイルスＤＮＡの部位に組込まれるならば、新規に作製された組換えワクシニアウイルスを感染性にすること、即ち外来細胞に感染させ、したがって、組込まれたＤＮＡ配列を発現させることが可能である（ＥＰ特許出願第８３，２８６号及び１１０，３８５号）。こうして作製された組換えワクシニアウイルスは、感染症の予防用生ワクチンとして使用することもできるし、真核細胞で異種タンパク質を作製するのに使用することもできる。
【０１７２】
天然痘ワクチン接種の望ましくない副作用を避けるために、数種のこのようなワクシニアウイルス株が開発されている。即ち、ニワトリ胚線維芽細胞でワクシニアウイルスアンカラ株（ＣＶＡ）の長期連続継代により改変型ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）が作製されている（Ｍａｙｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９７５  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３：６−１４；スイス特許第５６８，３９２号参照）。ＭＶＡウイルスは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）からＡＴＣＣ  Ｎｏ．：ＶＲ−１５０８として公共入手可能である。ＭＶＡは、良好な免疫原性を維持しながら、ビルレンスの低下と霊長類細胞における複製能の低下とにより明らかなように、高度に弱毒化されていることを特徴とする。ＭＶＡウイルスは、親ＣＶＡ株に対するゲノムの変化を解明するように解析されている。ゲノムＤＮＡの６カ所で合計３１，０００塩基対の主要な欠失（欠失Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶＩ）が確認されている（Ｍｅｙｅｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：１０３１−１０３８）。得られたＭＶＡウイルスは、ニワトリ細胞に厳密に制限された宿主細胞となった。
【０１７３】
さらに、ＭＶＡは、非常に高度に弱毒化されていることを特徴とする。種々の動物モデルで試験した場合に、ＭＶＡは、免疫抑制動物でも無毒であることが分かった。さらに重要な点として、ＭＶＡ株の優れた特性は、多数の臨床試験で実証されている（Ｍａｙｒ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．１９７８  Ｚｅｎｔｒａｌｂｌ  Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ［Ｂ］１６７：３７５−３９０；Ｓｔｉｃｋｌ  ｅｔ  ａｌ．１９７４  Ｄｔｓｃｈ  Ｍｅｄ  Ｗｓｃｈｒ  ９９：２３８６−２３９２）。高リスク患者を含めた１２０，０００人超におけるこれらの試験中に、ＭＶＡワクチンの使用による副作用はなかった。
【０１７４】
ヒト細胞におけるＭＶＡ複製は、感染後期に阻止され、成熟した感染性のビリオンへのアセンブリを防ぐことが判明した。一方、ＭＶＡは、非許容細胞でもウイルス遺伝子及び組換え遺伝子を高レベルで発現することができ、効率的で非常に安全な遺伝子発現ベクターとして機能することが報告されている（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，Ｂ．１９９２  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：１０８４７−１０８５１）。さらに、ＭＶＡゲノム内の欠失部位ＩＩＩに外来ＤＮＡ配列を挿入したＭＶＡに基づいて、新規ワクシニアベクターワクチンが樹立されている（Ｓｕｔｔｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１０３２−１０４０）。
【０１７５】
組換えＭＶＡワクシニアウイルスは、以下に述べるように作製することができる。所定の挿入部位（例えばＩ８Ｒ／Ｇ１Ｌ等の２個の保存された必須ＭＶＡ遺伝子間、再編成・改変型欠失部位ＩＩＩ、又はＭＶＡゲノム内の他の非必須部位）に隣接するＭＶＡ  ＤＮＡ配列の間に外来ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、ＭＶＡに感染させた細胞に導入し、相同組換えを行う。ＤＮＡコンストラクトが真核細胞に導入され、外来ＤＮＡがウイルスＤＮＡと組換えられたら、方法自体は公知である方法により、好ましくはマーカーを使用して、所望の組換えワクシニアウイルスを単離することが可能である。挿入するＤＮＡコンストラクトは、直鎖状でも環状でもよい。プラスミド又はポリメラーゼ連鎖反応産物が好ましい。組換えＭＶＡベクターのこのような作製方法は、本願に援用するＰＣＴ公開ＷＯ／２００６／０２６６６７に記載されている。ＤＮＡコンストラクトは、天然に存在する欠失の左右両側に配置された配列を含む。天然に存在する欠失の両側の配列の間に、外来ＤＮＡ配列を挿入する。ＤＮＡ配列又は遺伝子を発現させるためには、遺伝子の転写に必要な調節配列をＤＮＡに存在させることが必要である。このような調節配列（プロモーターと呼ぶ）は、当業者に公知であり、例えばＥＰ−Ａ−１９８，３２８に記載されているようなワクシニア１１ｋＤａ遺伝子の調節配列及び７．５ｋＤａ遺伝子の調節配列（ＥＰ−Ａ−１１０，３８５）が挙げられる。例えばリン酸カルシウム沈殿法（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．１９７３  Ｖｉｒｏｌ  ５２：４５６−４６７；Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９７９  Ｃｅｌｌ  １６：７７７−７８５）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８２  ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１−８４５）、マイクロインジェクション（Ｇｒａｅｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８３  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １０１：４８２−４９２）、リポソーム（Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８３  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １０１：５１２−５２７）、スフェロプラスト（Ｓｃｈａｆｆｈｅｒ  １９８０  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７７：２１６３−２１６７）又は当業者に公知の他の方法を用いて、トランスフェクションによりＤＮＡコンストラクトをＭＶＡ感染細胞に導入することができる。
【０１７６】
本願に記載・試験するＭＶＡベクターは、意外にも単回プライム又は同種プライム／ブーストレジメン後に有効であることが判明した。他のＭＶＡベクターデザインでは、異種プライム／ブーストレジメンが必要であり、さらに他の試験報告では、ＭＶＡベクターで有効な免疫応答を誘導することができなかった。これに対して、本発明のＭＶＡベクターデザイン及び製造方法は、有効なＴ細胞免疫応答及び抗体免疫応答を誘発するために有効なＭＶＡワクチンベクターを作製するために有用である。さらに、単回同種プライムブースト後に有効な免疫応答及び抗体産生を誘発することが可能なＭＶＡワクチンベクターの有用性は、材料の使用、商品化及び特に第三世界感染地への輸送等の点で有意義である。
【０１７７】
１実施形態において、本発明は、腫瘍関連抗原又はその免疫原性断片をコードする１種以上の核酸配列を含む組換えウイルスベクター（例えばＭＶＡベクター）である。前記ウイルスベクター（例えばＭＶＡベクター）は、当業者に公知の従来の技術を使用して作製することができる。前記１種以上の異種遺伝子インサートは、所望の免疫原性をもつポリペプチド、即ちその投与により免疫反応、細胞性免疫及び／又は体液性免疫をインビボで誘導することができるポリペプチドをコードする。免疫原性をもつポリペプチドをコードする遺伝子を導入するウイルスベクター（例えばＭＶＡベクター）の遺伝子領域の両側に、必須領域を配置する。免疫原性をもつポリペプチドをコードする遺伝子の導入では、所望の免疫原性をもつポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、適切なプロモーターを機能的に連結することができる。
【０１７８】
腫瘍関連抗原又はその免疫原性断片をコードする前記１種以上の核酸配列は、任意のＴＡＡから選択することができる。１実施形態において、前記１種以上のＴＡＡ又はその免疫原性断片は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１の細胞外断片、ＭＵＣ１の細胞内断片、腫瘍胎児抗原／未成熟ラミニン受容体タンパク質（ＯＦＡ／ｉＬＲＰ）、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの細胞外断片、ＯＦＡ／ｉＬＲＰの細胞内断片、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡの細胞外断片、ＣＥＡの細胞内断片又はその組合せからなる群から選択される。代表的な実施形態において、前記遺伝子は投与した対象に免疫応答を提供すること、より特定的には、前記対象に防御及び／又は治療効果を提供することが可能な免疫応答を誘導することが可能なポリペプチド又はタンパク質をコードする。
【０１７９】
１実施形態において、前記核酸配列は、ＭＵＣ１をコードする。前記異種遺伝子インサートは、ポックスウイルス発現系に適合可能なプロモーターの制御下で前記ベクターの１カ所以上の欠失部位に挿入されている。
【０１８０】
別の実施形態において、前記核酸配列は、ＭＵＣ１の免疫原性断片をコードする。
【０１８１】
１実施形態において、前記ベクターは、ＭＵＣ１の免疫原性細胞外ドメイン断片を発現する。
【０１８２】
１実施形態において、前記ベクターは、配列
【０１８３】
【化５】
2019500907.tif 000008
からなるＭＵＣ１の細胞外ドメイン断片を発現する。
【０１８４】
１実施形態において、前記ベクターは、配列
【０１８５】
【化６】
2019500907.tif 000009
からなるＭＵＣ１の細胞外ドメイン断片を発現する。
【０１８６】
１実施形態において、前記ベクターは、配列
【０１８７】
【化７】
2019500907.tif 000010
からなるＭＵＣ１の細胞外ドメイン断片を発現する。
【０１８８】
１実施形態において、前記ベクターは、配列
【０１８９】
【化８】
2019500907.tif 000011
からなるＭＵＣ１の細胞外ドメイン断片を発現する。
【０１９０】
１実施形態において、前記ベクターは、ＭＵＣ１の細胞内ドメイン断片を発現する。
【０１９１】
１実施形態において、前記核酸配列は、ＭＵＣ１の細胞外断片及びＭＵＣ１の細胞内断片をコードする。
【０１９２】
１実施形態において、前記核酸配列は、マールブルグウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）の膜貫通ドメインをコードする。
【０１９３】
１実施形態において、前記核酸配列は、ＭＵＣ１の免疫原性細胞外ドメイン配列及びマールブルグウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）の膜貫通ドメインをコードする。
【０１９４】
１実施形態において、前記核酸配列はＭＵＣ１の免疫原性細胞外ドメイン配列と、マールブルグウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）の膜貫通ドメインと、ＭＵＣ１の細胞内ドメイン配列とをコードする。
【０１９５】
１実施形態において、前記核酸配列は、配列
【０１９６】
【化９】
2019500907.tif 000012
をもつＭＵＣ１の断片を含むＭＵＣ１の免疫原性細胞外ドメイン配列と、マールブルグウイルスの糖タンパク質（ＧＰ）の膜貫通ドメインと、ＭＵＣ１の細胞内ドメイン配列とをコードする。
【０１９７】
１実施形態において、前記欠失部位ＩＩＩは、非必須フランキング配列を除去するように再編成・改変されている。
【０１９８】
代表的な実施形態において、前記ワクチンは、ＴＡＡを発現するように作製されており、例えばシャトルベクターｐＧｅｏ−ＭＵＣ１を使用して２個の保存された必須ＭＶＡ遺伝子（Ｉ８Ｒ及びＧ１Ｌ）の間に挿入されたＭＵＣ１及びシャトルベクターｐＧｅｏ−ＭＵＣ１を使用して欠失部位ＩＩＩに挿入されたＭＵＣ１を、発現するように作製される。ｐＧｅｏ−ＭＵＣ１は、細菌でベクターを複製可能にするアンピシリン耐性マーカーと、ベクターをＭＶＡゲノム内の特定の位置と組換え可能にする２個のフランキング配列と、組換えＭＶＡの選択を可能にする緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）選択マーカーと、ＭＵＣ１をＭＶＡゲノムに挿入後にＭＶＡベクターからＧＦＰ配列を除去できるようにするＭＶＡ配列のフランク１の部分に相同な配列と、挿入した異種遺伝子インサートの転写を可能にする改変型Ｈ５（ｍＨ５）プロモーターと、ＴＡＡ配列とから作製される。
【０１９９】
所定の実施形態において、前記ポリペプチド又は前記ポリペプチドをコードする核酸配列は、突然変異又は欠失（例えば内部欠失、アミノ末端若しくはカルボキシ末端の短縮、又は点突然変異）を含んでいてもよい。
【０２００】
前記組換えウイルスベクターに導入される前記１個以上の遺伝子は、細胞におけるその発現を誘導する調節配列の制御下にある。
【０２０１】
前記ウイルスベクターの核酸材料は、例えば脂質膜に封入されてもよいし、１種以上のウイルスポリペプチドを包み込むことができる構造タンパク質（例えばカプシドタンパク質）に封入されてもよい。
【０２０２】
代表的な実施形態において、本発明は、ＴＡＡに由来する１種以上の遺伝子又は前記１種以上の遺伝子によりコードされる１種以上のポリペプチドを含む、組換えウイルスベクター（例えば組換えＭＶＡベクター）である。
【０２０３】
多数のＴＡＡの核酸配列が公開されており、例えばＧｅｎＢａｎｋ及びＰｕｂＭｅｄ等の種々のデータベースから入手可能である。ＭＵＣ１を含む代表的なＧｅｎＢａｎｋリファレンスとしては、アクセッション番号ＮＭ＿００１２０４２８５に対応するものが挙げられる。
【０２０４】
所定の実施形態において、前記１種以上の遺伝子は、選択されたＴＡＡ又は免疫原活性を維持するその免疫原性断片の少なくとも２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個又は７０個の連続残基にわたって選択されたＴＡＡと実質的に一致する（例えば少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％一致する）、ポリペプチド又はその断片をコードする。
【０２０５】
１実施形態において、ＴＡＡ又はその免疫原性断片をコードする配列は、前記ＭＶＡベクターの欠失部位Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ又はＶＩに挿入されている。
【０２０６】
１実施形態において、ＴＡＡ又はその免疫原性断片をコードする配列は、前記ＭＶＡベクターのＩ８ＲとＧ１Ｌとの間、又は前記ＭＶＡベクターの再編成・改変型欠失部位ＩＩＩに挿入されており、前記ＭＶＡベクターのＩ８ＲとＧ１Ｌとの間、又は前記ＭＶＡベクターの再編成・改変型欠失部位ＩＩＩにはＴＡＡ又はその免疫原性断片をコードする第２の配列が挿入されている。
【０２０７】
１実施形態において、前記組換えベクターは、ポックスウイルス発現系に適合可能なプロモーターと機能的に連結されたＴＡＡ又はその免疫原性断片をコードする核酸配列を第１の欠失部位に含み、ポックスウイルス発現系に適合可能なプロモーターと機能的に連結されたＶＬＰ形成タンパク質をコードする核酸配列を第２の欠失部位に含む。
【０２０８】
代表的な実施形態において、本発明は、細胞におけるその発現を誘導する調節配列の制御下にＴＡＡ又はその免疫原性断片をコードする少なくとも１種の異種核酸配列（例えば１種以上の配列）を含む組換えＭＶＡベクターである。前記配列は、例えばＰｍ２Ｈ５、ＰｓｙｎＩＩ又はｍＨ５プロモーターからなる群から選択されるプロモーターの制御下におくことができる。
【０２０９】
本発明の組換えウイルスベクターを、対象の細胞に感染させるために使用することができ、その結果、ウイルスベクターの１種以上の異種配列（例えばＴＡＡ又はその免疫原性断片）からタンパク質産物への翻訳が促進される。本願にさらに記載するように、前記組換えウイルスベクターを、対象の１個以上の細胞に感染させるように対象に投与することができ、その結果、ウイルスベクターの１種以上のウイルス遺伝子の発現が促進され、新生物に対して治療効果又は防御効果をもつ免疫応答が賦活される。
【０２１０】
１実施形態において、前記組換えＭＶＡワクチンは、前記ＴＡＡ又はその免疫原性断片を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）にアセンブリされたタンパク質を発現する。特定の理論に拘泥する意図はないが、前記ＴＡＡは、防御免疫応答を誘発するように機能し、前記マトリックスタンパク質は、ＶＬＰのアセンブリを可能にすると共にＴ細胞免疫応答の標的として機能し、防御免疫応答が強化されると共に交差防御が提供されると考えられる。
【０２１１】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、マールブルグウイルスマトリックスタンパク質である。
【０２１２】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、エボラウイルスマトリックスタンパク質である。
【０２１３】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、スーダンウイルスマトリックスタンパク質である。
【０２１４】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）マトリックスタンパク質である。
【０２１５】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、ｇａｇ遺伝子によりコードされる１型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）マトリックスタンパク質である。
【０２１６】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、ラッサウイルスマトリックスタンパク質である。
【０２１７】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、ラッサウイルスＺタンパク質である。
【０２１８】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質はラッサウイルスＺタンパク質の断片である。
【０２１９】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーにおけるウイルスのマトリックスタンパク質である。
【０２２０】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーにおけるウイルスのマトリックスタンパク質である。
【０２２１】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーにおけるウイルスのマトリックスタンパク質である。
【０２２２】
１実施形態において、前記マトリックスタンパク質は、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスファミリーにおけるウイルスのマトリックスタンパク質である。
【０２２３】
１種以上の核酸配列を、ＭＶＡベクター用に最適化することができる。最適化としては、天然配列に由来する選択されたコドンを宿主ベクター系により最適に発現される同義コドンに置換するためにサイレント突然変異を利用する、コドン最適化が挙げられる。他の型の最適化としては、ホモポリマー連続部分又は転写終結モチーフに割り込むためにサイレント突然変異を使用する方法が挙げられる。これらの最適化ストラテジーは、各々遺伝子の安定性を改善することができ、転写産物の安定性を改善することができ、又は配列からのタンパク質発現レベルを改善することができる。代表的な実施形態では、ＴＡＡ配列中のホモポリマー連続部分の数を減らしてコンストラクトを安定化させる。ワクシニア終結シグナルと同様の何らかの配列に、サイレント突然変異を導入してもよい。分泌型ではなく膜貫通型の任意のＴＡＡを発現させるために、ヌクレオチドを追加してもよい。
【０２２４】
代表的な実施形態では、前記配列をＭＶＡで発現できるようにコドン最適化し、フレームシフト突然変異による発現低下を最小限にするために、デオキシグアノシン≧５個と、デオキシシチジン≧５個と、デオキシアデノシン≧５個と、デオキシチミジン≧５個との連続を含む配列にサイレント突然変異により割り込み、分泌型ではなく膜貫通型のタンパク質を発現させるためにヌクレオチドの追加によりＧＰ配列を改変する。
【０２２５】
１実施形態において、本発明は、１価であるワクチンベクター組成物を提供する。本願で使用する１価なる用語は、１種のＴＡＡに由来する配列を含むワクチンベクター組成物を意味する。
【０２２６】
別の実施形態において、本発明は、２価であるワクチンを提供する。本願で使用する２価なる用語は、異なるＴＡＡに由来する配列をもつ２個のベクターを含むワクチンベクター組成物を意味する。
【０２２７】
別の実施形態において、本発明は、３価であるワクチンを提供する。本願で使用する３価なる用語は、異なるＴＡＡに由来する配列をもつ３個のベクターを含むワクチンベクター組成物を意味する。
【０２２８】
別の実施形態において、本発明は、４価であるワクチンを提供する。本願で使用する４価なる用語は、異なるＴＡＡに由来する配列をもつ４個のベクターを含むワクチンベクター組成物を意味する。本願で使用する価数４と４価なる用語とは、同義である。
【０２２９】
本発明は、上記組換えウイルスベクターを含む宿主細胞及び前記組換えウイルスベクターを感染させた宿主から作製される単離ビリオンにも及ぶ。
【０２３０】
１実施形態において、前記ＴＡＡは、コア１β３ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｔシンターゼ）又はＣＯＳＭＣに対するｓｉＲＮＡにより過剰発現される。ＣＯＳＭＣは、ムチン型Ｏ−グリカン生合成中にＴｎ抗原（ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｒ）をガラクトシル化してコア１Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｔ抗原）を形成する唯一の酵素である活性型Ｔシンターゼの発現に必要であると考えられている分子シャペロンである（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１０  Ｍａｙ  １８；１０７（２０）：９２２８−９２３３）。
【０２３１】
別の実施形態において、前記ＴＡＡは、シアリルトランスフェラーゼ１により過剰発現される。シアリルトランスフェラーゼは、シアリル酸含有分子の細胞内濃度を調節する主要酵素である。
【０２３２】
特定の実施形態において、前記シアリルトランスフェラーゼは、ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１である。
【０２３３】
別の実施形態において、前記ＴＡＡは、シアリルトランスフェラーゼ１及びコア１β３ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｔシンターゼ）又はＣＯＳＭＣ（Ｔシンターゼ特異的分子シャペロン；Ｃ１ＧＡＬＴ１Ｃ１）に対するｓｉＲＮＡにより過剰発現される。
【０２３４】
ＩＶ．医薬組成物
本発明の組換えウイルスベクターは、単独で又は併用して、獣医学用又は人体用医薬組成物として容易に製剤化される。前記医薬組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、担体又はアジュバントを含有することができる。
【０２３５】
１実施形態において、本発明は、新生物を防御及び／又は治療するために有効であり、少なくとも１種のＴＡＡポリペプチド（例えばＴＡＡ）又はその免疫原性断片を発現する組換えＭＶＡベクターを含むワクチンである。前記ワクチン組成物は、１種以上の別の治療剤を含有していてもよい。
【０２３６】
前記医薬組成物は、１種、２種、３種、４種又は５種以上の異なる組換えＭＶＡベクターを含有することができる。
【０２３７】
１実施形態において、本発明は、１価であるワクチンベクター組成物を提供する。本願で使用する１価なる用語は、１種類のＴＡＡ配列を含むワクチンベクター組成物を意味する。
【０２３８】
別の実施形態において、本発明は、２価であるワクチンを提供する。本願で使用する２価なる用語は、異なるＴＡＡに由来する配列をもつ２個のベクターを含むワクチンベクター組成物を意味する。
【０２３９】
別の実施形態において、本発明は、３価であるワクチンを提供する。本願で使用する３価なる用語は、異なるＴＡＡに由来する配列をもつ３個のベクターを含むワクチンベクター組成物を意味する。
【０２４０】
別の実施形態において、本発明は、４価であるワクチンを提供する。本願で使用する４価なる用語は、異なるＴＡＡに由来する配列をもつ４個のベクターを含むワクチンベクター組成物を意味する。本願で使用する価数４と４価なる用語とは、同義である。
【０２４１】
本願で使用する「薬学的に許容される担体」なる用語は、例えば筋肉内、関節内（関節の内側）、静脈内、皮内、腹腔内及び皮下経路等の非経口投与に適したもの等の標準医薬担体のいずれかを表す。このような製剤の例としては、酸化防止剤、緩衝剤、制菌剤及び製剤を所期レシピエントの血液と等張にする溶質を含有する水性及び非水性の等張滅菌注射溶液と、懸濁化剤、溶解補助剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を添加してもよい水性及び非水性の滅菌懸濁剤とが挙げられる。代表的な薬学的に許容される担体の１例は、生理食塩水である。
【０２４２】
他の生理的に許容される希釈剤、賦形剤、担体又はアジュバント及びそれらの製剤も、当業者に公知である。
【０２４３】
１実施形態では、アジュバントを免疫応答エンハンサーとして使用する。種々の実施形態において、前記免疫応答エンハンサーはミョウバン系アジュバント、油性アジュバント、Ｓｐｅｃｏｌ、ＲＩＢＩ、ＴｉｔｅｒＭａｘ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５０又はＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ７２０、ＧＭ−ＣＳＦ、非イオン性ブロックコポリマー系アジュバント、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）系アジュバントであるＡＳ−１、ＡＳ−２、Ｒｉｂｉ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ系アジュバント、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＳＡＦ（マイクロフルイダイズド型のＳｙｎｔｅｘアジュバント（ＳＡＦ−ｍ））、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）、ヒト補体系アジュバントであるｍ．ｖａｃｃａｅ、ＩＳＣＯＭＳ、ＭＦ−５９、ＳＢＡＳ−２、ＳＢＡＳ−４、Ｅｎｈａｎｚｙｎ（Ｒ）、ＲＣ−５２９、ＡＧＰ類、ＭＰＬ−ＳＥ、ＱＳ７、エスチン、ジギトニン、並びにカスミソウ属（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ）及びキノア（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｑｕｉｎｏａ）のサポニンからなる群から選択される。
【０２４４】
本願に記載する方法で利用される組成物は、例えば非経口、筋肉内、動脈内、血管内、静脈内、腹腔内、皮下、皮膚、経皮、眼内、吸入、口腔、舌下、舌周囲、鼻腔内、局所投与及び経口投与から選択される経路により投与され得る。好ましい投与方法を、種々の因子（例えば投与する組成物の成分及び治療する病態の重症度）により変えることができる。経口投与に適した製剤を、有効量の前記組成物を希釈剤（例えば水、生理食塩水又はＰＥＧ−４００）に溶解したもの等の溶液剤、各々規定量の前記ワクチンを含むカプセル剤、サシェ剤又は錠剤から構成することができる。医薬組成物は、例えば気管支への吸入用エアゾール製剤でもよい。加圧した薬学的に、許容される噴射剤（例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン又は窒素）とエアゾール製剤とを混合すればよい。
【０２４５】
本発明の目的では、治療剤又は生物活性剤を送達するのに適した医薬組成物としては、例えば錠剤、ゼラチンカプセル剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、懸濁剤、乳剤、溶液剤、ゲル剤、ハイドロゲル剤、経口ゲル剤、ペースト剤、点眼剤、軟膏剤、クリーム剤、プラスター剤、ドレンチ剤、デリバリーデバイス、坐剤、浣腸剤、注射剤、インプラント剤、スプレー剤又はエアゾール剤を挙げることができる。これらの製剤は、いずれも当分野で周知の公認方法により製造され得る。例えば、各々本願に援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓｔ  ｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５及びＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ，Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，２００６参照。
【０２４６】
本発明の組成物を免疫賦活剤又はアジュバントと併用投与するならば、組成物（例えばワクチン）の免疫原性を有意に改善することができる。当業者に周知の適切なアジュバントとしては、例えばリン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ  Ａ（並びにその誘導体及び成分）、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質アナログ、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミルジペプチド、ポリホスファゼン、リポタンパク質、ＩＳＣＯＭ−Ｍａｔｒｉｘ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＤＡ、サイトカイン及び他のアジュバント並びにその誘導体が挙げられる。
【０２４７】
本願に記載する本発明の医薬組成物は、投与（例えば標的送達）直後に前記組成物を放出するように製剤化することもできるし、制御又は長期放出製剤を使用して投与後の任意の所定の期間に前記組成物を放出するように製剤化することもできる。前記医薬組成物を単独又は併用投与した場合に、（ｉ）治療指数が狭い場合（例えば有害な副作用又は毒性反応を生じる血漿中濃度と、治療効果を生じる血漿中濃度の差が小さい場合（なお、一般に治療指数ＴＩは半数致死用量（ＬＤ５０）と半数有効用量（ＥＤ５０）との比として定義される））；（ｉｉ）消化管吸収部位が狭い場合；又は（ｉｉｉ）生物学的半減期が短いため、治療レベルを維持するには１日の投与頻度を高くする必要がある場合には、前記組成物を制御又は長期放出製剤として投与すると有用である。
【０２４８】
放出速度が医薬組成物の代謝速度を上回るように制御又は長期放出を得るためには、多くのストラテジーを採用することができる。例えば、製剤パラメーター及び成分（例えば適切な制御放出組成物及びコーティング）の適切な選択により、制御放出を得ることができる。適切な製剤は、当業者に公知である。例としては、１単位又は複数単位の錠剤又はカプセル剤組成物、油性溶液剤、懸濁剤、乳剤、マイクロカプセル剤、マイクロスフェア、ナノ粒子、パッチ及びリポソームが挙げられる。
【０２４９】
経口投与に適した製剤は、（ａ）有効量の前記ワクチンを水、生理食塩水又はＰＥＧ４００等の希釈剤に溶解したもの等の溶液剤；（ｂ）各々規定量の前記ワクチンを液体、固体、顆粒又はゼラチンとして含むカプセル剤、サシェ剤又は錠剤；（ｃ）適切な液体を媒体とする懸濁剤；（ｄ）適切な乳剤；及び（ｅ）キチン等の多糖ポリマーから構成することができる。前記ワクチンを、単独で又は他の適切な成分と共に吸入により例えば気管支に投与するエアゾール製剤に製剤化してもよい。加圧したジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の許容される噴射剤に、エアゾール製剤を注入することができる。
【０２５０】
直腸投与に適した製剤としては、例えば前記ワクチンと坐剤基剤から構成される坐剤が挙げられる。適切な坐剤基剤としては、天然又は合成トリグリセリド又はパラフィン系炭化水素が挙げられる。さらに、前記ワクチン及び例えば液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール及びパラフィン系炭化水素等の基剤の組合せから構成されるゼラチン直腸カプセル剤を使用することも可能である。
【０２５１】
免疫原性をさらに強化するために、本発明のワクチンをサイトカインと併用投与してもよい。サイトカインは、当業者に公知の方法により投与され得、例えば核酸分子をプラスミドとして投与されてもよいし、タンパク質又は融合タンパク質として投与されてもよい。
【０２５２】
本発明は、本発明のワクチンを含むキットも提供する。例えば、ワクチンと使用説明書とを含むキットが、本発明の範囲に含まれる。
【０２５３】
Ｖ．チェックポイント阻害剤及び化学療法との併用
１実施形態において、上記方法は、前記対象に標準処置療法を適用することをさらに含む。実施形態によっては、標準処置療法は、外科処置、放射線、高周波、凍結療法、超音波アブレーション、全身化学療法又はその組合せである。
【０２５４】
本願に記載するベクター組成物は、他の活性成分と組合せた医薬組成物として提供され得る。他の活性剤は、制限なく、限定されないが、放射性核種、免疫調節剤、抗動脈硬化薬、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、薬物、プロドラッグ、酵素、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アポトーシス促進剤、光活性治療剤、細胞毒性剤、化学療法剤、毒素、他の抗体又はその抗原結合断片が挙げられる。
【０２５５】
別の実施形態において、前記医薬組成物は、本願に記載するＴＡＡ発現ベクターと、腫瘍クリアランスを増加するようにＣＤ４＋、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を活性化させるためのチェックポイント阻害剤とを含有する。
【０２５６】
種々の実施形態において、前記チェックポイント阻害剤は、抗体である。
【０２５７】
抗体は、獲得免疫応答の主要成分であり、外来抗原の認識と免疫応答の賦活との両面で中心的な役割を果たす。多くの免疫療法レジメンは、抗体を利用している。併用療法として有用な多数のＦＤＡ承認抗体が、存在する。これらの抗体は、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、ペムブロリズマブ又はリツキシマブから選択され得る。
【０２５８】
ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１を標的とするモノクローナル抗体は、がん細胞に対する免疫応答をブーストすることができ、所定のがんの治療に非常に有望であることが分かっている。ＰＤ−１を標的とする抗体の例としては、ペムブロリズマブとニボルマブとが挙げられる。ＰＤ−Ｌ１を標的とする抗体の１例は、アテゾリズマブである。
【０２５９】
ＣＴＬＡ−４は、所定のＴ細胞表面に発現する別のタンパク質であり、免疫系を抑制するための１種の「オフスイッチ」として作用する。イピリムマブは、ＣＴＬＡ−４と結合して活性を阻害し、新生物に対する免疫応答をブーストするモノクローナル抗体である。
【０２６０】
別の実施形態では、樹状細胞がＴ細胞増殖を誘導する能力を強化するために、前記免疫原性ベクター組成物をアジュバント化学療法と併用投与する。
【０２６１】
種々の実施形態では、化学療法の前、後又はそれと同時に前記ベクター組成物を投与する。
【０２６２】
所定の実施形態において、本発明の組成物は、腫瘍又はがんをもつ対象に化学療法又は放射線療法を行う必要を減らすことが可能である。他の実施形態において、前記組成物は、腫瘍又はがんをもつ対象において放射線又は化学療法に伴う副作用の重篤度を軽減することが可能である。
【０２６３】
本発明の医薬組成物を、単独で投与することもできるし、他の型のがん治療ストラテジー（例えば放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法及び本願に記載するような抗腫瘍剤）と併用投与することもできる。
【０２６４】
これらの方法で有用な適切な化学療法剤としては、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、イマチニブ、エリブリン、ゲムシタビン、カペシタビン、パゾパニブ、ラパチニブ、ダブラフェニブ、スニチニブリンゴ酸塩、クリゾチニブ、エベロリムス、テムシロリムス、シロリムス、アキシチニブ、ゲフィチニブ、アナストロゾール、ビカルタミド、フルベストラント、ラリトレキセド、ペメトレキセド、ゴセレリン酢酸塩、エルロチニブ、ベムラフェニブ、ビスモデギブ、タモキシフェンクエン酸塩、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル、オキサリプラチン、ジブ−アフリベルセプト、ベバシズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、パニツムマブ、タキサン、ブレオマイシン、メルファラン、プルンバギン、カンプトサール、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、スマンクス、ドキソルビシン、ペグ化ドキソルビシン、フォルフィリ、５−フルオロウラシル、テモゾロミド、パシレオチド、テガフール、ギメラシル、オテラシル、イトラコナゾール、ボルテゾミブ、レナリドミド、イリノテカン、エピルビシン及びロミデプシンが挙げられる。好ましい化学療法剤はカルボプラチン、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ゲムシタビン、シクロホスファミド、ドキソルビシン、メトトレキサート、パクリタキセル、トポテカン、エトポシド、メトトレキサート、ソラフェニブ、イリノテカン及びＴａｒｃｅｖａである。
【０２６５】
がん患者で一般的に使用されているがん化学療法薬の一般名としては、ドキソルビシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、パクリタキセル、ドセタキセル、シスプラチン、ブレオマイシン、メルファラン、プルンバギン、イリノテカン、マイトマイシンＣ及びミトキサントロンが挙げられる。例えば、使用可能なもの及び臨床試験段階にあると思われる他のがん化学療法薬をいくつか挙げると、レスミノスタット、タスキニモド、レファメチニブ、ラパチニブ、Ｔｙｖｅｒｂ、Ａｒｅｎｅｇｙｒ、パシレオチド、Ｓｉｇｎｉｆｏｒ、チシリムマブ、トレメリムマブ、ランソプラゾール、ＰｒｅｖＯｎｃｏ、ＡＢＴ−８６９、リニファニブ、チバンチニブ、Ｔａｒｃｅｖａ、エルロチニブ、Ｓｔｉｖａｒｇａ、レゴラフェニブ、フルオロソラフェニブ、ブリバニブ、ドキソルビシンリポソーム製剤、レンバチニブ、ラムシルマブ、ペレチノイン、ルチコ、ムパルフォスタット、Ｔｅｙｓｕｎｏ、テガフール、ギメラシル、オテラシル及びオランチニブが挙げられる。
【０２６６】
本発明で使用することができる抗がん剤の商品名としては、ＮＥＸＡＶＡＲ（ソラフェニブ）、ＳＴＩＶＡＲＧＡ（レゴラフェニブ）、ＡＦＦＩＮＩＴＯＲ（エベロリムス）、ＧＬＥＥＶＥＣ（イマチニブ）、ＨＡＬＡＶＥＮ（エリブリン）、ＡＬＩＭＴＡ（ペメトレキセド）、ＧＥＭＺＡＲ（ゲムシタビン）、ＶＯＴＲＩＥＮＴ（パゾパニブ）、ＴＹＫＥＲＢ（ラパチニブ）、ＴＡＦＩＮＩＡＲ（ダブラフェニブ）、ＳＵＴＥＮＴ（スニチニブリンゴ酸塩）、ＸＡＬＫＯＲＩ（クリゾチニブ）、ＴＯＲＩＳＥＬ（テムシロリムス）、ＩＮＬＹＴＡ（アキシチニブ）、ＩＲＥＳＳＡ（ゲフィチニブ）、ＡＲＩＭＥＤＥＸ（アナストロゾール）、ＣＡＳＯＤＥＸ（ビカルタミド）、ＦＡＳＬＯＤＥＸ（フルベストラント）、ＴＯＭＵＤＥＸ（ラリトレキセド）、ＺＯＬＡＤＥＸ（ゴセレリン酢酸塩）、ＴＡＲＣＥＶＡ（エルロチニブ）、ＸＥＬＯＤＡ（カペシタビン）、ＺＥＬＢＲＯＦ（ベムラフェニブ）、ＥＲＩＶＥＤＧＥ（ビスモデギブ）、ＰＥＲＪＥＴＡ（ペルツズマブ）、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（トラスツズマブ）、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（ドセタキセル）、ＪＥＶＴＡＮＡ（カバジタキセル）、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（オキサリプラチン）、ＺＡＬＴＲＡＰ（ジブ−アフリベルセプト）、ＡＶＡＳＴＩＮ（ベバシズマブ）、Ｎｏｌｖａｄｅｘ、Ｉｓｔｕｂａｌ及びＶＡＬＯＤＥＸ（タモキシフェンクエン酸塩）、ＴＥＭＯＤＡＲ（テモゾロミド）、ＳＩＧＮＩＦＯＲ（パシレオチド）、ベクティビックス（パニツムマブ）、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（ドキソルビシン）、ＤＯＸＩＬ（ペグ化ドキソルビシン）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（パクリタキセル）、ＴＥＹＳＵＮＯ（テガフール、ギメラシル、オテラシル）、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ）及びレナリドミドとの併用、ＩＳＴＯＤＡＸ（ロミデプシン）が挙げられる。
【０２６７】
ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）及びＤＯＸＩＬ（ペグ化ドキソルビシンリポソーム製剤）ががん細胞を殺傷するために作用する方式は、ＤＮＡをインターカレートする方法であると考えられている。ドキソルビシンは、ニトロキシドフリーラジカルになることができ、及び／又はそれによってがん細胞中の細胞内フリーラジカル濃度を上昇させ、その結果、細胞損傷及びプログラム死を誘導することができるとも考えられる。ドキソルビシンには、心臓損傷等の潜在的に重大な全身副作用があるため、その使用が制限されている。
【０２６８】
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ，Ｅｆｕｄｅｘ）は、がんの治療に使用されるピリミジンアナログである。これは、自殺型阻害剤であり、チミジル酸シンターゼの不可逆的阻害により作用する。多くの抗がん剤と同様に、５−ＦＵの効果は、全身で感じられるが、迅速に分裂することによりヌクレオチド合成機構の使用頻度が高いがん細胞等の細胞において、最もよく発揮される。５−ＦＵは、身体の所々で迅速に分裂する非がん細胞（例えば消化管の内壁細胞）を殺傷する。フォルフィリは、５−ＦＵ、カンプトサール及びイリノテカン（ロイコボリン）の併用である。５−ＦＵは、ＤＮＡ分子に取込まれて合成を停止し、カンプトサールは、ＤＮＡの巻き戻し及び重複を防ぐトポイソメラーゼ阻害剤である。イリノテカン（フォリン酸、ロイコボリン）は、高用量の薬物メトトレキサートの「レスキュー」薬として使用されるビタミンＢ誘導体であり、５−ＦＵ（フルオロウラシル）の副作用を調節／増強／抑制する。マイトマイシンＣは、強力なＤＮＡ架橋剤である。長期間使用すると、永続的な骨髄損傷を生じる恐れがある。また、肺線維症及び腎臓損傷を生じる恐れもある。
【０２６９】
タキサン系薬剤としては、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）とドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）とが挙げられる。タキサン系は、細胞微小管機能を阻害する。微小管は、細胞分裂に不可欠である。タキサン系は、微小管におけるＧＤＰ結合型チューブリンを安定化させることにより、細胞分裂プロセスを阻害する。がん細胞は、分裂することができなくなる。しかし、タキサン系は、非がん細胞の細胞分裂も阻害する可能性がある。
【０２７０】
カルボプラチン及びオキサリプラチンを含むシスプラチン系は、有機白金錯体であり、インビボ反応し、ＤＮＡと結合して架橋を生じる。架橋したＤＮＡは、がん細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を誘発する。しかし、シスプラチン系は、非がん細胞のアポトーシスも誘発する可能性がある。
【０２７１】
ブレオマイシンは、ＤＮＡ主鎖切断を誘導する。ブレオマイシンは、ＤＮＡ主鎖へのチミジンの取り込みも阻害するという報告もある。ブレオマイシンは、非がん細胞も殺傷する可能性がある。メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ）は、ＤＮＡのグアニン塩基にアルキル基を付加するナイトロジェンマスタードアルキル化剤である。メルファランの主な副作用としては、嘔吐、口内炎及び骨髄抑制が挙げられる。
【０２７２】
プルンバギンは、多数のがん細胞株で細胞周期停止及びアポトーシスを誘導することが示されている。同剤は、Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路の阻害によりオートファジーを誘発する。同剤は、ＪＮＫ依存性ｐ５３Ｓｅｒ１５リン酸化によりＧ２／Ｍ細胞周期停止及びアポトーシスを誘導する。同剤は、オートファジー細胞死を促進する。同剤は、Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達を阻害する。同剤は、ＰＩ５−キナーゼ依存的に細胞内ＲＯＳ生成を誘導する。プルンバギンは、非がん細胞に対して毒素であり、遺伝毒素であり、突然変異原である。
【０２７３】
化学療法剤は、患者のがん細胞が感受性となり得る細胞経路標的に対するその特異性及び阻害能に基づいて選択され得る。本発明を実施する場合、化学療法剤は、ｍＴＯＲＣ、ＲＡＦキナーゼ、ＭＥＫキナーゼ、ホスホイノシトールキナーゼ３、線維芽細胞増殖因子受容体、マルチチロシンキナーゼ、ヒト上皮成長因子受容体、血管内皮細胞増殖因子、他の血管新生促進因子、熱ショックタンパク質；Ｓｍｏ（スムーズンド）受容体、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体、アポトーシスタンパク質阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ、デアセチラーゼ、ＡＬＫチロシンキナーゼ受容体、セリン／スレオニンプロテインキナーゼＰｉｍ−１、Ｐｏｒｃｕｐｉｎｅアシルトランスフェラーゼ、ヘッジホッグ経路、プロテインキナーゼＣ、ｍＤＭ２、グリピカン３、ＣｈＫ１、肝細胞増殖因子ＭＥＴ受容体、上皮成長因子ドメイン様７、Ｎｏｔｃｈ経路、Ｓｒｃファミリーキナーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡインターカレーター、チミジンシンターゼ、微小管機能阻害剤、ＤＮＡ架橋剤、ＤＮＡ主鎖切断剤、ＤＮＡアルキル化剤、ＪＮＫ依存性ｐ５３Ｓｅｒ１５リン酸化インデューサー、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、Ｂｃｌ−２及びフリーラジカル発生剤からなる群から選択される細胞経路標的を阻害するその能力により、選択することができる。
【０２７４】
１実施形態では、エピジェネティクスモジュレーターの前、後又はそれと同時に前記ベクター組成物を投与する。
【０２７５】
１実施形態では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼの阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼの阻害剤、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤及びリジンデメチラーゼの阻害剤からなる群から選択されるエピジェネティクスモジュレーターの前、後又はそれと同時に、前記ベクター組成物を投与する。
【０２７６】
１実施形態では、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの阻害剤の前、後又はそれと同時に、前記ベクター組成物を投与する。
【０２７７】
１実施形態では、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤の前、後又はそれと同時に、前記ベクター組成物を投与する。
【０２７８】
ＶＩ．使用方法
本発明の組成物は、ＴＡＡに対する免疫応答を誘導するためのワクチンとして使用され得る。
【０２７９】
代表的な実施形態において、本発明は、処置を必要とする対象にＴＡＡに対する免疫応答を誘導する方法を提供し、前記方法は、前記ＴＡＡに対する免疫応答を誘起するために有効な量の少なくとも１種のＴＡＡ又はその免疫原性断片をコードする組換えウイルスベクターを前記対象に投与することを含む。前記方法の結果として、前記対象は、前記ＴＡＡに対して部分的又は完全に免疫性となる。
【０２８０】
１実施形態において、本発明は、本願に記載する組成物を使用して対象における免疫応答を賦活する方法を提供する。実施形態によっては、本発明は、本願に記載する組成物を使用して対象における免疫応答を促進する方法を提供する。実施形態によっては、本発明は、本願に記載する組成物を使用して対象における免疫応答を増強する方法を提供する。実施形態によっては、本発明は、本願に記載する組成物を使用して対象における免疫応答を強化する方法を提供する。
【０２８１】
代表的な実施形態において、本発明は、処置を必要とする対象における新生物の治療、抑制、予防又は増殖遅延方法を提供し、前記方法は、治療有効量の本発明の組成物を前記対象に投与することを含む。治療結果として、対象の前記新生物に関連する疾患の治療プロファイルが改善される。
【０２８２】
代表的な実施形態において、本発明は、処置を必要とする対象におけるがんの治療方法を提供し、前記方法は、治療有効量の本発明の組成物を前記対象に投与することを含む。治療結果として、対象のがんの治療プロファイルが改善される。
【０２８３】
１実施形態において、前記方法は、前記１種以上の腫瘍の増殖を抑制することができ、前記１種以上の腫瘍を縮小させることができ、又は前記１種以上の腫瘍を消滅させることができる。例えば、腫瘍質量は、増加しない。所定の実施形態において、腫瘍は、その元の質量に比較して１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％又は９９％以上（又はその中間の任意の数値）縮小する。所定の実施形態において、前記縮小は、手術不能な腫瘍を必要に応じて切除できるようにするために十分である。実質的縮小の概念は、腫瘍等の身体的発育の減少を意味する「退縮」なる用語で表すこともできる。このような減少は、限定されないが、直径、質量（即ち重量）又は体積等の測定パラメーターの減少により判定することができる。この減少は、サイズが完全に小さくなるという意味ではなく、単に測定パラメーターが以前の測定よりも定量的に少なくなるという意味である。
【０２８４】
１実施形態において、前記方法は、腫瘍転移を予防することができる。
【０２８５】
代表的な実施形態において、本発明は、処置を必要とする対象における増殖性疾患の治療方法を提供し、前記方法は、治療有効量の本発明の組成物を前記対象に投与することを含む。本願で使用する「増殖性疾患」なる用語は、細胞集団の増殖が周囲の細胞よりも過剰になって調和しなくなる疾患を意味する。場合により、増殖性疾患は、腫瘍の形成をもたらす。実施形態により、前記腫瘍は、良性、前悪性又は悪性である。他の実施形態において、前記増殖性疾患は、自己免疫疾患、血管閉塞、再狭窄、アテローム動脈硬化症又は炎症性腸疾患である。１実施形態において、治療する自己免疫疾患は、Ｉ型自己免疫疾患又はＩＩ型自己免疫疾患又はＩＩＩ型自己免疫疾患又はＩＶ型自己免疫疾患からなる群から選択され得、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、関節リウマチ、糖尿病、Ｉ型糖尿病（真性糖尿病）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性多発性関節炎、バセドウ病、自己免疫性慢性肝炎、潰瘍性大腸炎、Ｉ型アレルギー疾患、ＩＩ型アレルギー疾患、ＩＩＩ型アレルギー疾患、ＩＶ型アレルギー疾患、線維筋痛症、脱毛症、ベヒテレフ病、クローン病、重症筋無力症、神経皮膚炎、リウマチ性多発筋痛症、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、乾癬、ライター症候群、関節リウマチ、乾癬、血管炎等、又はＩＩ型糖尿病が挙げられる。
【０２８６】
１実施形態において、前記免疫応答は、体液性免疫応答、細胞性免疫応答又はその組合せである。
【０２８７】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する結合抗体の産生を含む。
【０２８８】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する中和抗体の産生を含む。
【０２８９】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する非中和抗体の産生を含む。
【０２９０】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する細胞介在性免疫応答の誘起を含む。
【０２９１】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する中和抗体及び非中和抗体の産生を含む。
【０２９２】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する中和抗体の産生及び細胞介在性免疫の誘起を含む。
【０２９３】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する非中和抗体の産生及び細胞介在性免疫の誘起を含む。
【０２９４】
特定の実施形態において、前記免疫応答は、前記ＴＡＡに対する中和抗体の産生、非中和抗体の産生及び細胞介在性免疫の誘起を含む。
【０２９５】
所定の実施形態において、本発明の組成物は、新生物を発生する危険のある対象又は既に新生物をもつ対象を治療するためにワクチンとして使用され得る。前記組換えウイルスベクターは、ＴＡＡをコードする遺伝子若しくは配列、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）のアセンブリを促進するためのウイルスタンパク質又は前記ＴＡＡの発現及びグリコシル化を助長するための他の酵素を含む。
【０２９６】
一般的に、前記ワクチンは、混合物に含まれ、同時に投与されるが、別々に投与されてもよい。
【０２９７】
本願に記載する方法により治療する対象は、医師によりこのような病態をもつと診断された者（例えば新生物をもつ対象）とすることができる。診断は、任意の適切な手段により実施され得る。当業者に自明の通り、本発明により治療する対象は、標準検査により同定されたものでもよいし、検査を受けずに１種以上の危険因子の存在により危険が高いと同定されたものでもよい。
【０２９８】
例えば、まだ新生物をもっていないが、新生物を発生し易い対象又は他の点でその危険のある対象に予防投与を行うことができる。
【０２９９】
例えば、既に新生物をもつ対象に、対象の病態を改善するため又は安定化させるために、治療投与を行うことができる。その結果、治療プロファイルが改善される。場合により、任意の標準技術により測定した場合に、同等の未治療コントロールと比較して、治療後に疾患又はその症状を、例えば５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％改善することができる。
【０３００】
例えば、がんの種類に応じて、治療プロファイルの改善は、がんの１種以上の症状の軽減、疾患の程度の低減、疾患の状態の安定化（即ち非増悪）、疾患進行の遅延若しくは減速、疾患状態の改善若しくは解消、検出可能であるか検出不能であるかに拘わらず（部分的又は完全な）寛解、腫瘍退縮、腫瘍増殖の抑制、腫瘍転移の抑制、がん細胞数の減少、末梢臓器への細胞がん細胞浸潤の抑制、無増悪期間（ＴＴＰ）の改善、奏功率（ＲＲ）の改善、全生存期間（ＯＳ）の延長、次の治療開始までの期間（ＴＮＴＴ）の延長、若しくは最初の進行から次の治療開始までの期間の延長、又は上記の２種以上の組合せから選択することができる。
【０３０１】
他の実施形態では、治療の結果として、新生物に関連する疾患（例えばがん）の１種以上の症状を改善することができる。この実施形態によると、症状の改善又は不在を検出することにより、治療の確定を評価することができる。
【０３０２】
１実施形態において、本発明は、少なくとも１種のＴＡＡ又はその免疫原性断片をコードする組換えウイルスベクターを対象（例えばヒト）に投与することにより、前記対象に免疫応答を誘導する方法である。前記免疫応答は、細胞性免疫応答でも体液性免疫応答でもその組合せでもよい。
【０３０３】
前記組成物は、例えば（例えば筋肉内、動脈内、血管内、静脈内、腹腔内又は皮下）注射により投与することができる。
【０３０４】
当然のことながら、２種類以上の投与経路を利用して、本発明のワクチンを同時又は順次（例えばブースト）投与してもよい。さらに、タンパク質抗原、ワクシニアウイルス及び弱毒ウイルスをワクチンとして利用する等の従来の免疫アプローチと、本発明のワクチンとを併用してもよい。したがって、１実施形態では、本発明のワクチンを対象に投与（本発明のワクチンで対象を「プライム」）した後に、従来のワクチンを投与する（従来のワクチンで対象を「ブースト」する）。別の実施形態では、先ず従来のワクチンを対象に投与した後に、本発明のワクチンを投与する。さらに別の実施形態では、従来のワクチンと本発明のワクチンとを同時に投与する。
【０３０５】
特定のメカニズムに拘泥するものではないが、本願に記載する医薬組成物を接種すると、宿主の免疫系は、１種以上のＴＡＡ又はその免疫原性断片に特異的な分泌型及び血清型の抗体を産生し、１種以上のＴＡＡ又はその免疫原性断片に特異的な細胞介在性免疫応答を誘起することにより、前記ワクチンに応答すると考えられる。ワクチン接種の結果として、宿主は、１種以上のＴＡＡ又はその免疫原性断片に対して少なくとも部分的又は完全に免疫性になり、あるいは新生物に起因する中等度又は重度の疾患の発現に対して耐性になる。
【０３０６】
１態様では、新生物に関連する症状の１種以上を軽減するため、その重症度を低下させるため、又はその発生を抑制するための方法として、ＴＡＡの発現及び所望のグリコシル化とを助長する配列を任意に同時発現するＴＡＡ配列及びマトリックスタンパク質配列を含む組換えＭＶＡウイルスベクターを含有する医薬組成物を、有効量投与することを含む方法が、提供される。
【０３０７】
別の態様において、本発明は、抗ＴＡＡ免疫を提供する方法として、ＴＡＡを発現する組換えＭＶＡワクチンと、ＶＬＰの形成を可能にするためのウイルスマトリックスタンパク質とを含有する医薬組成物を有効量投与することを含む方法を、提供する。
【０３０８】
同様に当然のことながら、本発明のワクチン組成物は、単回投与されてもよいし、複数回投与されてもよい。例えば、新生物を発生する危険が特に高い対象には、防御免疫応答を開始及び／又は維持するために、複数回免疫する必要があると思われる。分泌型及び血清型の結合抗体及び中和抗体の量とＴ細胞濃度とを測定することにより、誘導免疫レベルをモニターすることができ、所望の防御レベルを維持するために、必要に応じて投与量を調節又はワクチン接種を反復することができる。
【０３０９】
１実施形態では、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、又は９回以上投与を繰返す。
【０３１０】
１実施形態では、投与を２回繰返す。
【０３１１】
１実施形態では、約２〜８回、約４〜８回、又は約６〜８回投与を行う。
【０３１２】
１実施形態では、約１〜４週間、２〜４週間、３〜４週間、１週間、２週間、３週間、４週間又は４週間超の投与間隔を設ける。
【０３１３】
特定の１実施形態では、２回の投与の間に４週間の間隔を使用する。
【０３１４】
１実施形態において、本発明は、治療進捗のモニター方法を提供する。代表的な実施形態において、前記モニターは、生物学的活性、免疫応答及び／又は臨床応答を主体に重点をおく。
【０３１５】
１実施形態において、前記生物学的活性は、例えばアジュバント疾患状態又は進行した疾患状態の両者におけるＴ細胞免疫応答、制御性Ｔ細胞活性、分子遺伝学的奏功（ＭＲＤ）、細胞遺伝学的奏功又は従来の腫瘍奏功である。
【０３１６】
１実施形態では、例えば、細胞毒性アッセイ、細胞内サイトカインアッセイ、テトラマーアッセイ又はＥＬＩＳＰＯＴアッセイ等の免疫アッセイにより、免疫応答をモニターする。
【０３１７】
１実施形態では、例えば、応答（腫瘍退縮）、無増悪生存期間、無再発生存期間又は全生存期間等の既存定義を使用した帰結により、臨床応答をモニターする。
【０３１８】
１実施形態において、前記方法は、前記疾患又はその症状を治療するために十分な治療量の本願の化合物を投与した対象における診断マーカー（例えば本願の化合物、タンパク質又はその指標等により調節される本願に記載する任意標的）又は診断測定（例えばスクリーニング、アッセイ）のレベルを測定する段階を含む。前記方法で測定したマーカーレベルを健康な正常コントロール又は他の患者における既知マーカーレベルと比較し、前記対象の疾患状態を判定することができる。好ましい実施形態では、第１のレベルの測定よりも後の時点で前記対象における第２のマーカーレベルを測定し、２つのレベルを比較し、疾患の進行又は治療の有効性をモニターする。所定の好ましい実施形態では、本発明の治療の開始前に前記対象における治療前マーカーレベルを測定した後、この治療前マーカーレベルを治療開始後の前記対象におけるマーカーレベルと比較し、治療の有効性を判定することができる。
【０３１９】
１実施形態では、対象の病態の改善（例えば前記対象における疾患レベルの変化（例えば低下））後、必要に応じて維持用量の本発明の化合物、組成物又は併用剤を投与することができる。その後、病態の改善が維持されるレベルまで症状に応じて投与量又は投与頻度又はその両方を減らすことができる。一方、疾患症状が再発した場合には、患者に長期間にわたって間欠的な治療が必要になると思われる。
【０３２０】
Ａ．投与量
前記ワクチンは、治療薬として有効で免疫原性と防御効果を生じるような量を製剤に適合可能な方法で投与される。投与量は、治療する対象により異なり、例えば個体の免疫系が抗体を合成する能力及び必要に応じて細胞介在性免疫応答を生じる能力により異なる。活性成分の厳密な必要投与量を、医師の判断により異なり、患者毎にモニターすることができる。しかし、適切な用量範囲は、当業者により容易に決定され、一般に約５．０×１０６ＴＣＩＤ５０〜約５．０〜１０９ＴＣＩＤ５０である。投与量はさらに、限定されないが、投与経路、患者の健康状態及び体重、並びに製剤の種類によっても異なる場合がある。
【０３２１】
本発明の医薬組成物は、ＴＡＡを発現する新生物に対して治療薬として有効で免疫原性及び／又は防御効果を生じるような量を投与される。投与用量は、治療する対象（例えば投与方法並びに治療する対象の年齢、体重、免疫系の能力及び一般健康状態）により異なる。前記組成物は、過度の有害な生理的影響を生じずに免疫応答を誘発する十分な発現レベルを提供するような量で投与される。本発明の組成物は、１種以上のＴＡＡ又はその免疫原性断片と大型のマトリックスタンパク質とを含有する異種ウイルスベクターであることが好ましく、例えば前記ウイルスベクターの投与量が１．０×１０４〜９．９×１０１２ＴＣＩＤ５０、好ましくは１．０×１０５ＴＣＩＤ５０〜１．０×１０１１ＴＣＩＤ５０  ｐｆｕ、より好ましくは１．０×１０６〜１．０×１０１０ＴＣＩＤ５０  ｐｆｕ、最も好ましくは５．０×１０６〜５．０×１０９ＴＣＩＤ５０となるように投与される。前記組成物は、例えば、少なくとも５．０×１０６ＴＣＩＤ５０の前記ウイルスベクター（例えば１．０×１０８ＴＣＩＤ５０の前記ウイルスベクター）を含有することができる。医師又は研究者は、適切な量及び投与レジメンを決定することができる。
【０３２２】
前記方法の組成物は、例えば１．０×１０４〜９．９×１０１２ＴＣＩＤ５０、好ましくは１．０×１０５ＴＣＩＤ５０〜１．０×１０１１ＴＣＩＤ５０  ｐｆｕ、より好ましくは１．０×１０６〜１．０×１０１０ＴＣＩＤ５０  ｐｆｕ、最も好ましくは５．０×１０６〜５．０×１０９ＴＣＩＤ５０の前記ウイルスベクターを含有することができる。前記組成物は、例えば少なくとも５．０×１０６ＴＣＩＤ５０の前記ウイルスベクター（例えば１．０×１０８ＴＣＩＤ５０の前記ウイルスベクター）を含有することができる。前記方法は、例えば前記組成物を前記対象に２回以上投与することを含むことができる。
【０３２３】
「有効量」なる用語は、対象の病態又は疾患の症状を臨床的に適切な方法で改善、抑制又は回復する（例えば新生物に関連する疾患（例えばがん）を改善、抑制若しくは回復するか又は新生物に対する有効な免疫応答を提供する）ために投与される組成物の量を意味する。前記対象におけるどのような改善も治療を達成するために十分であるとみなされる。治療に十分な量は、新生物に関連する疾患の発現又は１種以上の症状を予防する量であること、あるいは新生物に関連する疾患の１種以上の症状の重症度又は対象がこのような症状を呈する期間を（例えば本発明の組成物を投与していないコントロール対象に比較して少なくとも１０％、２０％又は３０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％又は７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上）低減する量であることが好ましい。本願に記載する方法（例えば新生物に関連する疾患の治療）を実施するために十分な前記医薬組成物の使用量は、投与方法、並びに治療する対象の年齢、体重及び一般健康状態により異なる。
【０３２４】
なお、本発明の価値は、実際の臨床効果として実証することができない。その代わり、本発明の価値は、防御のサロゲートマーカーに対する成功として実証されると思われる。介入の臨床効果を測定しようとすることが非現実的又は非倫理的である適応症（例えば新生物に関連する疾患）について、ＦＤＡの迅速承認（Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  Ａｐｐｒｏｖａｌ）制度は、サロゲートエントポイントに対する有効性に基づく新規ワクチンの承認を認めている。したがって、本発明の価値は、防御のサロゲートマーカーを構成する免疫応答を誘導できる点にあると考えられる。
【０３２５】
同様に、ＦＤＡは、そのアニマルルール（Ａｎｉｍａｌ  Ｒｕｌｅ）に基づくＴＡＡに対するワクチンの承認を認めている。この場合、承認は、動物における有効性に基づいて行われる。
【０３２６】
前記方法の組成物は、例えば１．０×１０４〜９．９×１０１２ＴＣＩＤ５０、好ましくは１．０×１０５ＴＣＩＤ５０〜１．０×１０１１ＴＣＩＤ５０  ｐｆｕ、より好ましくは１．０×１０６〜１．０×１０１０ＴＣＩＤ５０  ｐｆｕ、最も好ましくは５．０×１０６〜５．０×１０９ＴＣＩＤ５０の前記ウイルスベクターを含有することができる。前記組成物は、例えば少なくとも５．０×１０６ＴＣＩＤ５０の前記ウイルスベクター（例えば１．０×１０８ＴＣＩＤ５０の前記ウイルスベクター）を含有することができる。前記方法は、例えば前記組成物を２回以上投与することを含むことができる。
【０３２７】
場合により、他の物質、特に他のＴＡＡに対する防御応答を誘導するワクチンと本発明のＴＡＡワクチンとを併用投与すると望ましいと思われる。例えば、インフルエンザ（Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−１７４９（１９９３）；Ｒａｚ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９１：９５１９−９５２３（１９９４））、マラリア（Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１７３９−１７４６（１９９６）；Ｓｅｄｅｇａｈ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９１：９８６６−９８７０（１９９４））、及び結核（Ｔａｓｃｏｎ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：８８８−８９２（１９９６））のワクチン等の他の遺伝子免疫ワクチンと本発明のワクチン組成物とを同時、別々又は順次投与することができる。
【０３２８】
Ｂ．適応症
特定の実施形態において、本発明で有用な免疫原性ベクターは、新生物をもつ対象に投与されてもよいし、前立腺がん、乳がん、肺がん、肝臓がん、子宮内膜がん、膀胱がん、結腸がん、子宮頸がん、腺がん、メラノーマ、リンパ腫、神経膠腫、又は軟部組織肉腫及び骨肉腫等の肉腫と診断された対象に投与されてもよい。
【０３２９】
別の実施形態において、本発明は、がんの治療又は予防用としての本発明のベクターに関し、がんとしては、限定されないが、新生物、腫瘍、転移、又は無制御な細胞増殖を特徴とする任意の疾患若しくは障害、特にその多剤耐性形態が挙げられる。前記がんは、多病巣性腫瘍とすることができる。本発明の治療薬で治療する種類のがん及び増殖性疾患の例としては、限定されないが、白血病（例えば骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病）、リンパ腫（例えばホジキン病及び非ホジキン病）、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング腫瘍、結腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、腎細胞がん、肝細胞がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣腫瘍、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星細胞腫、乏突起神経膠腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、異形成及び過形成が挙げられる。特定の実施形態では、前立腺がん（例えば前立腺炎、良性前立腺肥大症、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、前立腺傍神経節腫、前立腺腺がん、前立腺上皮内新生物、前立腺直腸瘻及び非定型前立腺間質病変）をもつ患者に本発明の治療用化合物を投与する。特に好ましい実施形態では、がん、神経膠腫、肝臓がん及び／又は結腸がんの治療に本発明の医薬を使用する。がんの治療及び／又は予防としては、限定されないが、がんに伴う症状の緩和、がんの進行の抑制、がんの退縮の促進、及び前記免疫応答の促進が挙げられる。
【０３３０】
本願で使用される新生物なる用語は、組織の異常な増殖を意味する。新生物は、良性でも悪性でもよく、一般に、悪性新生物をがんと呼ぶ。がんは、悪性細胞が浸潤による隣接組織への直接増殖又は転移（即ち血液又はリンパ系による輸送）による遠隔部位への着床により他の組織に浸潤できる点において、良性新生物と相違する。本発明の方法は、良性及び悪性新生物（がん）の治療に適している。
【０３３１】
本願の定義によると、表在性新生物は、身体の外面に局在する新生物であり、周囲組織又は身体の他の部分に広がらずに限局する。深部新生物は、深部臓器又は身体の他の深部に局在する新生物である。浸潤性新生物は、正常な組織関門を通り抜けて周囲領域に浸潤し始めた新生物であり、例えば乳管と小葉とを越えて広がっている浸潤性乳がんである。
【０３３２】
本願に開示する方法による治療に想定される種類の新生物の包括的なリストを分類別に挙げると、（ａ）腹部新生物として、腹膜新生物及び後腹膜新生物；（ｂ）骨新生物として、大腿骨新生物、頭蓋骨新生物、顎骨新生物、下顎骨新生物、上顎骨新生物、口蓋骨新生物、鼻骨新生物、眼窩骨新生物、頭蓋底新生物及び脊椎骨新生物；ｃ）乳房新生物として、男性乳房新生物、乳管がん及び葉状腫瘍；（ｄ）消化管系新生物として、胆道新生物、胆管新生物、総胆管新生物、胆嚢新生物、胃腸新生物、食道新生物、腸新生物、盲腸新生物、虫垂新生物、結腸・直腸新生物、結腸・直腸大腸腺腫性ポリポーシス、結腸・直腸ガードナー症候群、結腸新生物、結腸大腸腺腫性ポリポーシス、結腸ガードナー症候群、Ｓ字結腸新生物、遺伝性非ポリポーシス結腸・直腸新生物、直腸新生物、肛門新生物、十二指腸新生物、回腸新生物、空腸新生物、胃新生物、肝臓新生物、肝細胞腺腫、肝細胞がん、膵臓新生物、膵島細胞腺腫、インスリノーマ、膵島細胞がん、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ソマトスタチノーマ、ビポーマ、膵臓・十二指腸がん及び腹膜新生物；（ｅ）内分泌腺新生物として、副腎新生物、副腎皮質新生物、副腎皮質腺腫、副腎皮質がん、多発性内分泌腫瘍症、多発性内分泌腫瘍症１型、多発性内分泌腫瘍症２ａ型、多発性内分泌腫瘍症２ｂ型、卵巣新生物、顆粒膜細胞腫、黄体腫、メイグス症候群、卵巣セルトリ・ライディッヒ細胞腫、莢膜細胞腫、膵臓新生物、腫瘍随伴内分泌症候群、副甲状腺新生物、下垂体新生物、ネルソン症候群、精巣新生物、精巣セルトリ・ライディッヒ細胞腫及び甲状腺新生物（ｆ）眼の新生物として、結膜新生物、眼窩新生物、網膜新生物、網膜芽細胞腫、ぶどう膜新生物、脈絡膜新生物及び虹彩新生物；（ｇ）脳頭頸部新生物として、食道新生物、顔面新生物、眼瞼新生物、口腔新生物、歯肉新生物、口腔白板症、毛様白板症、口唇新生物、口蓋新生物、唾液腺新生物、耳下腺新生物、舌下腺新生物、顎下腺新生物、舌新生物、耳鼻咽喉頭新生物、耳の新生物、喉頭新生物、鼻腔新生物、副鼻腔新生物、上顎洞新生物、咽頭新生物、下咽頭新生物、上咽頭新生物、上咽頭新生物、中咽頭新生物、扁桃新生物、副甲状腺新生物、甲状腺新生物及び気管新生物；（ｈ）造血器新生物として、骨髄新生物；（ｉ）神経系新生物として、中枢神経系新生物、脳新生物、脳室新生物、脈絡叢新生物、脈絡叢乳頭腫、テント下新生物、脳幹新生物、小脳新生物、神経細胞腫、松果体腫瘍、テント上新生物、視床下部新生物、下垂体新生物、ネルソン症候群、脳神経新生物、視神経新生物、視神経膠腫、聴神経腫瘍、神経線維腫症２型、神経系腫瘍随伴症候群、ランバート・イートン筋無力症候群、辺縁系脳炎、横断性脊髄炎、傍腫瘍性小脳変性症、傍腫瘍性ポリニューロパチー、末梢神経系新生物、脳神経新生物、聴神経腫瘍及び視神経新生物；（ｊ）骨盤新生物；（ｋ）皮膚新生物として、棘細胞腫、皮脂腺新生物、汗腺新生物及び基底細胞がん；（ｌ）軟部組織新生物として、筋肉新生物及び血管新生物；（ｍ）脾臓新生物；（ｎ）胸部新生物として、心臓新生物、縦隔新生物、気道新生物、気管支新生物、肺新生物、気管支原性がん、非小細胞肺がん、肺野コイン状陰影、パンコースト症候群、肺芽細胞腫、肺硬化性血管腫、胸膜新生物、悪性胸水、気管新生物、胸腺新生物及び胸腺腫；（ｏ）尿路生殖器新生物として、女性生殖器新生物、卵管新生物、子宮新生物、子宮頸部新生物、子宮内膜新生物、類内膜がん、子宮内膜間質腫瘍、子宮内膜間質肉腫、膣新生物、外陰新生物、男性生殖器新生物、陰茎新生物、前立腺新生物、精巣新生物、泌尿器新生物、膀胱新生物、腎臓新生物、腎細胞がん、腎芽細胞腫、デニス・ドラッシュ症候群、ＷＡＧＲ症候群、中胚葉性腎腫、尿管新生物及び尿道新生物；並びに（ｐ）その他のがんとして、腎臓がん、肺がん、メラノーマ、白血病、バレット食道、化生前がん細胞が挙げられる。
【０３３３】
１実施形態において、本願に記載する免疫応答賦活ベクターは、ＭＵＣ１又はその免疫原性断片を発現し、特に腺がん（乳がん、大腸がん、膵臓がん等）、カルチノイド腫瘍、脊索腫、絨毛がん、繊維形成性小円形細胞腫瘍（ＤＳＲＣＴ）、類上皮肉腫、濾胞樹状細胞肉腫、指状嵌入樹状細胞／細網細胞肉腫、肺病変として、ＩＩ型肺胞上皮細胞病変（ＩＩ型細胞過形成、ＩＩ型細胞異形成、肺尖部肺胞過形成）、未分化大細胞型リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（非定型）、形質芽細胞性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、類上皮型中皮腫、ミエローマ、形質細胞腫、神経周膜腫、腎細胞がん、滑膜肉腫（上皮領域）、胸腺がん（高頻度）、髄膜腫又はパジェット病を治療するために有用である。
【０３３４】
Ｃ．投与
本願で使用する「投与」なる用語は、適正投薬量の本発明の医薬組成物を対象に与える方法を意味する。本願に記載する方法で利用される組成物は、例えば非経口、皮膚、経皮、眼内、吸入、口腔、舌下、舌周囲、鼻腔内、直腸、局所投与及び経口投与から選択される経路により投与され得る。非経口投与としては、静脈内、腹腔内、皮下、動脈内、血管内及び筋肉内投与が挙げられる。好ましい投与経路は、種々の因子（例えば投与する組成物の成分及び治療する病態の重症度）により変えることができる。
【０３３５】
本発明の医薬組成物（例えばワクチン）の投与は、当業者に公知の経路のいずれかにより実施され得る。投与は、例えば、筋肉内注射により行うことができる。本願に記載する方法で利用される組成物は、例えば非経口、皮膚、経皮、眼内、吸入、口腔、舌下、舌周囲、鼻腔内、直腸、局所投与及び経口投与から選択される経路により投与されてもよい。非経口投与としては、静脈内、腹腔内、皮下及び筋肉内投与が挙げられる。好ましい投与経路は、種々の因子（例えば投与する組成物の成分及び治療する病態の重症度）により変えることができる。
【０３３６】
さらに、本発明の組成物は、対象に単回投与されてもよいし、複数回投与されてもよい。例えば、新生物を発生する可能性が特に高い対象には、前記新生物に対する防御を開始及び／又は維持するために複数回投与される必要があると思われる。本願に記載する医薬組成物により提供される誘導免疫レベルを、例えば分泌型及び血清型の中和抗体の量を測定することによりモニターすることができる。その後、新生物の発生に対する所望の防御レベルを維持するため又は新生物の増殖を抑制するために、必要に応じて投与量を調節又は投与を反復することができる。
【０３３７】
ベクターの投与タイミングを調節することにより、ワクチン接種効果を強化することができる。上記プライミング組成物及びブースター組成物のいずれも、本願に記載する方法で使用されるために適している。
【０３３８】
１実施形態において、ＭＶＡベクターは、プライミング目的とブースト目的との両者で使用される。このようなプロトコールとしては、限定されないが、ＭＭ、ＭＭＭ及びＭＭＭＭが挙げられる。
【０３３９】
実施形態によっては、ＭＶＡブーストを、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回又はそれ以上投与する。
【０３４０】
ベクターは、任意にアジュバントの存在下で単独投与されてもよい（即ち、別種のワクチン製剤の投与下又は非投与下で（例えばタンパク質又は別の型のベクター（例えばウイルスベクター）の投与下又は非投与下で）プラスミドを１回又は数回投与されてもよい）し、代替ブースター免疫（例えば免疫の「プライム」部分のインサートと異なるものでもよいし、同類のワクチンインサートでもよいインサートを含む組換え改変型ワクシニアアンカラベクター（ＭＶＡ）等の生ベクターワクチン）と併用（例えば先行）投与されてもよい。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ又は当業者に公知の他のアジュバントが挙げられる。前記アジュバントは、「遺伝子アジュバント」（即ちＤＮＡ配列により送達されるタンパク質）とすることができる。
【０３４１】
代表的な実施形態において、本発明は、（ｉ）ＴＡＡ又はその免疫原性断片をコードする１種以上の配列を含むＤＮＡプラスミドを含有するプライミング組成物を投与する段階と；（ｉｉ）ＴＡＡ又はその免疫原性断片をコードする１種以上の遺伝子を含む改変型ワクシニアアンカラウイルスベクターを含有するブースター組成物の１回目の投与を行う段階と；（ｉｉｉ）前記１回目の投与から約１２〜２０週間後、より特定的には前記１回目の投与から約１４〜約１８週間後、さらに特定的には前記１回目の投与から約１６週間後にブースター組成物の２回目の投与を行う段階とを含む免疫方法である。
【０３４２】
特定の実施形態において、前記ＴＡＡは、段階（ｉ）〜（ｉｉｉ）で同一である。任意に、前記方法は、さらに１段階以上を含み、例えば、前記プライミング組成物若しくは別のプライミング組成物（即ち第２のプライミング組成物）をさらに１回以上投与する段階及び／又は前記ブースター組成物若しくは別のブースター組成物（即ち第２のブースター組成物）をさらに１回以上投与する段階を含む。
【０３４３】
以下、非限定的な実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。上記開示及び非限定的な例証として記載する以下の実験例に鑑み、さらに添付図面を参照することにより、本発明のその他の態様及び実施形態もまた、当業者に想到されよう。
【実施例】
【０３４４】
［実施例１］ＭＶＡワクチンベクター
本実施例は、代表的なＭＶＡワクチンベクターに関する情報を提供する。マールブルグウイルスのＶＰ４０タンパク質及びヒトＭＵＣ１タンパク質及びマールブルグウイルス糖タンパク質（ＧＰ）の部分から構成されるキメラタンパク質の２種類の他の遺伝子を発現するように遺伝子改変されたＭＶＡ株１９７４／ＮＩＨを使用して、ＭＶＡワクチンを作製する。キメラＭＵＣ１／ＧＰ遺伝子は、さらに膜貫通タンパク質をコードする特定構造をもち、ヒトＭＵＣ１遺伝子に由来する細胞外ドメインと、マールブルグウイルスの糖タンパク質に由来する膜貫通ドメインと、ヒトＭＵＣ１遺伝子の細胞内ドメインとからなる。ＭＵＣ１／ＧＰキメラタンパク質の作製方法については、下記実施例２に詳述する。ＭＵＣ１／Ｇタンパク質とＶＰ４０タンパク質とを発現するように遺伝子改変されたＭＶＡワクチンの作製方法、及びそれによりコードされるＭＵＣ１の低グリコシル化状態の特性決定については、下記実施例３に詳述する。
【０３４５】
表２は、本発明のＭＶＡワクチンベクターのデザインに使用したＧｅｎＢａｎｋ配列のアクセッション番号の一覧である。
【０３４６】
【表２】
2019500907.tif 000013
【０３４７】
［実施例２］配列最適化
実施例２は、ＭＶＡワクチンベクター用としてのＭＵＣ１配列の最適化方法を例証する。本実施例は、ＧＥＯ−ＭＵＣ１に含まれるＭＵＣ１配列の最適化を示す。他の株に対するワクチンに実施される方法もほぼ同様であり、同一セットの操作を含む。
【０３４８】
Ｍｕｃ１／４ＴＲ遺伝子最適化
１．天然配列から出発する。
・ヒトムチン１：ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１２０４２８５．１。
・ＧｅｎＢａｎｋからの配列をコピー／ペーストし、ＳｅｑＢｕｉｌｅｒファイル：Ｍｕｃ１−１ＴＲ＿００１２０４２８５として保存する。
タンデムリピートを１個だけ含むＭｕｃ１配列（１４２８ｎｔ）（配列番号５）
【０３４９】
【化１０】
2019500907.tif 000014
【０３５０】
Ｍｕｃ１／１ＴＲタンパク質（４７５ａａ）（配列番号６）
【０３５１】
【化１１】
2019500907.tif 000015
【０３５２】
【化１２】
2019500907.tif 000016
【０３５３】
２．ＧｅｏＶａｘ社は、４個のタンデムリピートを含むＭｕｃ１遺伝子を採用することに決定した。
・Ｍｕｃ１−１ＴＲ＿００１２０４２８５にタンデムリピートを追加する。
・新しい配列をＧＶＸ−Ｍｕｃ１／４ＴＲ．０１と命名する。
【０３５４】
ＧｅｏＶａｘ  Ｍｕｃ１／４ＴＲ配列（１６０８ｎｔ）（配列番号７）
【０３５５】
【化１３】
2019500907.tif 000017
【０３５６】
Ｍｕｃ１／４ＴＲタンパク質（５３５ａａ）（配列番号８）
【０３５７】
【化１４】
2019500907.tif 000018
【０３５８】
【化１５】
2019500907.tif 000019
【０３５９】
・Ｍｕｃ１−１ＴＲ＿００１２０４２８５配列をＧＶＸ−Ｍｕｃ１／４ＴＲ．０１と整列させる。
【０３６０】
【化１６】
2019500907.tif 000020
2019500907.tif 000021
【０３６１】
【化１７】
2019500907.tif 000022
【０３６２】
マールブルグＶＰ４０に由来するＶＬＰへのＭｕｃ１の取り込み効率を上げるために、Ｍｕｃ１の膜貫通ドメインをマールブルグウイルス糖タンパク質の膜貫通ドメインで置換した。
【０３６３】
マールブルグ糖タンパク質配列（マールブルグＧＰの１９３０〜２０１９位のＴＭ配列）（配列番号９）
【０３６４】
【化１８】
2019500907.tif 000023
【０３６５】
マールブルグ糖タンパク質（マールブルグＧＰの６４４〜６７３位のＴＭ配列）（配列番号１０）
【０３６６】
【化１９】
2019500907.tif 000024
【０３６７】
ＧｅｏＶａｘ  Ｍｕｃ１／４ＴＲ配列（膜貫通ドメイン配列：Ｍｕｃ１／１ＴＲの１１２９〜１２１８位）（配列番号１１）
【０３６８】
【化２０】
2019500907.tif 000025
【０３６９】
（膜貫通ドメイン配列：Ｍｕｃ１／１ＴＲの１５７〜１８６位）（配列番号１２）
【０３７０】
【化２１】
2019500907.tif 000026
【０３７１】
・ＧＶＸ−Ｍｕｃ１／４ＴＲ．０１上のＴＭ配列をマールブルグＧＰのＴＭ配列：ＷＷＴＳＤＷＧＶＬＴＮＬＧＩＬＬＬＬＳＩＡＶＬＩＡＬＳＣＩＣ（配列番号１３）で置換する。
・新しい配列をＧＶＸ−Ｍｕｃ１＿４ＴＲＭＴｍ．０２と命名する（配列番号１４）。
【０３７２】
【化２２】
2019500907.tif 000027
【０３７３】
対応するタンパク質配列（配列番号１５）
【０３７４】
【化２３】
2019500907.tif 000028
【０３７５】
【化２４】
2019500907.tif 000029
【０３７６】
・Ｍｕｃ１−１ＴＲ＿００１２０４２８５配列をＧＶＸ−Ｍｕｃ１／４ＴＲ．０１及びＧＶＸ−Ｍｕｃ１＿４ＴＲＭＴｍ．０２と整列させる。
【０３７７】
【化２５】
2019500907.tif 000030
【０３７８】
３．ＤＮＡ配列をワクシニアウイルス用にコドン最適化する。
【０３７９】
・２．１．ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｇｙウェブサイトのＧｅｎｅＡｒｔ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓツールに進む。
・ＧＯ配列を入力し、指示に従う。
・配列をワクシニアウイルス用に最適化する。
・最適化された配列をコピーし、新しいＳｅｑＢｕｉｌｂｅｒファイルにペーストする。
２．２．最適化された配列とレポートを保存する。
・最適化された配列をＧＶＸ−Ｍｕｃ１＿４ＴＲＭＴｍＶＶｏｐ．０３と命名する（配列番号１６）。
【０３８０】
【化２６】
2019500907.tif 000031
【０３８１】
２．３．最適化された配列を翻訳する（配列番号１７）。
【０３８２】
【化２７】
2019500907.tif 000032
【０３８３】
４．サイレント突然変異によりホモポリマー連続部分（Ｇ／Ｃ又はＴ／Ａリッチ領域）に割り込む。
・≧４Ｇ／Ｃの領域について配列を探索する：
−複数のＧ又はＣは確認されなかった。
・≧５Ａ／Ｔの領域について配列を探索する：
−７個のＡ／Ｔリッチ領域が確認された。
−いずれも一塩基のサイレント突然変異により割り込まれていた。
−表２はＭｕｃ１に行われた全突然変異をまとめる。
【０３８４】
【表３】
2019500907.tif 000033
【０３８５】
・配列をＧＶＸ−Ｍｕｃ１＿４ＴＲＭＴｍＶＶｏｐ．０４（ＳｅｑＢｕｉｌｂｅｒファイル）として保存する（配列番号１８）。
【０３８６】
【化２８】
2019500907.tif 000034
【０３８７】
・ＧＶＸ−Ｍｕｃ１＿４ＴＲＭＴｍＶＶｏｐ．０４を翻訳する（配列番号１９）。
【０３８８】
【化２９】
2019500907.tif 000035
【０３８９】
５．ワクシニアウイルス転写ターミネーターについてＧＰ配列を探索する。
・Ｔ５ＮＴモチーフは確認されなかった。
【０３９０】
６．第２の停止コドンを付加する。
・最適化された配列をＧＶＸ−Ｍｕｃ１＿４ＴＲＭＴｍＶＶｏｐ．０５と命名する。
・組換えを減らすと共にインサート安定性を増すように、タンデムリピートの配列を（可能な場合には）サイレント突然変異により改変する。
【０３９１】
【化３０】
2019500907.tif 000036
【０３９２】
・最適化した配列をＧＶＸ−Ｍｕｃ１＿４ＴＲＭＴｍＶＶｏｐ．０６と命名する。
【０３９３】
７．Ｍｕｃ１をＭＶＡ−シャトルプラスミドｐＬＷ−７３にクローニングするための制限部位を付加する。
・ＳｍａＩ、ＳａｌＩ及びＰｓｔＩ部位についてＧＶＸ−Ｍｕｃ１＿４ＴＲＭＴｍＶＶｏｐ．０６配列を探索する。
−Ｍｕｃ遺伝子にこれらの部位は存在しないので、クローニングに使用することができない。
・ＳｍａＩ及びＳａｌＩ制限部位を夫々Ｍｕｃ１遺伝子の３’及び５’に付加する。
−ＳｍａＩ配列：ｃｃｃｇｇｇ。
−ＳａｌＩ配列：ｇｔｃｇａｃ。
−消化及びクローニングを助長するためにＳｍａＩの上流に５ヌクレオチドを付加し、ＳａｌＩの下流に５ヌクレオチドを付加する：ｇｃｇｃｔ。
・クローニングサイトを付加した配列をＧＶＸ−Ｍｕｃ１＿４ＴＲＭＴｍＶＶｏｐ．０５（ＳｅｑＢｕｉｌｂｅｒファイル）として保存する。
・Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔの最終配列（ＳｅｑＢｕｉｌｅｒファイル）：ＧＶＸ−Ｍｕｃ４ＴＲＭＴＭ（配列番号２９）。
【０３９４】
【化３１】
2019500907.tif 000037
【０３９５】
対応するタンパク質配列（配列番号３０）
【０３９６】
【化３２】
2019500907.tif 000038
【０３９７】
・最終ＧＶＸ−Ｍｕｃ４ＴＲＭＴＭ配列をＭｕｃ１−１ＴＲ＿００１２０４２８５と整列させる。
【０３９８】
【化３３】
2019500907.tif 000039
【０３９９】
・最終ＧＶＸ−Ｍｕｃ４ＴＲＭＴＭ配列をＧＶＸ−Ｍｕｃ１＿４ＴＲＭＴｍ．０１と整列させる。
【０４００】
【化３４】
2019500907.tif 000040
【０４０１】
・最終ＧＶＸ−Ｍｕｃ４ＴＲＭＴＭ配列をＧＶＸ−Ｍｕｃ１＿４ＴＲＭＴｍ．０２と整列させる。
【０４０２】
【化３５】
2019500907.tif 000041
【０４０３】
ＧＶＸ−Ｍｕｃ４ＴＲＭＴＭの名称を「ＧＶＸ−Ｍｕｃ１」と簡略化する。
・ＧＶＸ−Ｍｕｃ４ＴＲＭＴＭ  ＤＮＡ配列をもつ合成遺伝子を注文する。
・ＧＶＸ−Ｍｕｃ４ＴＲＭＴＭ  ＤＮＡ配列をｐＬＷ−７３シャトルプラスミドにクローニングし、新しいプラスミドをｐＧｅｏ−Ｍｕｃ１と命名する（図１参照）。
【０４０４】
［実施例３］ＭＶＡワクチン作製及び低グリコシル化型ＭＵＣ１のインビトロ評価
組換えＭＶＡワクチンは、２個の抗原発現カセットをもつＭＶＡベクターから構成される（ＭＶＡ−Ｍｕｃ１ＶＰ４０）。一方の発現カセットは、上記実施例２に記載したように、作製されるキメラ型ヒトＭｕｃ１（以下、このコンストラクトをＧＶＸ−Ｍｕｃ１と呼ぶ）をコードし、ＭＶＡワクチン作製の目的でそのＤＮＡ配列をｐＧｅｏ−Ｍｕｃ１と呼ぶシャトルプラスミド（プラスミドの画像は上記の通りである）にクローニングしたものである。もう一方の発現カセットは、マールブルグウイルスのＶＰ４０タンパク質をコードする。ＧＶＸ−Ｍｕｃ１とＶＰ４０との発現は、分泌型ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を生成するために十分である。ＧＶＸ−Ｍｕｃ１タンパク質は、ヒトＭｕｃ１の細胞外ドメインと、マールブルグウイルスＧＰの膜貫通ドメインと、ヒトＭｕｃ１の細胞内ドメインとから構成されるキメラタンパク質として発現される。マールブルグＶＰ４０タンパク質は、このタンパク質がＧＶＸ−Ｍｕｃ１の細胞内ドメインと膜貫通ドメインと会合している細胞の細胞質で発現され、ＧＶＸ−Ｍｕｃ１をその表面にもつと共にＶＰ４０をその内部（内腔）空間に封入したＶＬＰの細胞表面出芽をもたらす。ベクタープラットフォーム及び天然抗原構造のこの新規組合せにより、強力で広範且つ持続的な免疫応答を誘発すると予想されるワクチンが得られる。Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｍｏｓｓ博士の実験室で開発されたシャトルベクターを使用して、ＭＶＡ−Ｍｕｃ１ＶＰ４０ワクチン候補が作製され、ＮＩＡＩＤによりワクチン開発用としてＧｅｏＶａｘ社に使用を許諾されつつある。これらのシャトルベクターは、ＨＩＶ及び出血熱ウイルスワクチンを用いた本発明者らの試験において高レベル且つ非毒性の発現を生じる安定したワクチンインサートとなることが判明している。添付の模式図（図２、なお、図中の数字はＭＶＡゲノムにおける座標を表す）に示すように、Ｍｕｃ１配列をＭＶＡの２個の必須遺伝子（Ｉ８Ｒ及びＧ１Ｌ）の間に挿入し、ＶＰ４０をＡ５０Ｒ遺伝子とＢ１Ｒ遺伝子との間で再編成・改変型欠失部位ＩＩＩに挿入した。
【０４０５】
ＧＶＸ−Ｍｕｃ１遺伝子とＶＰ４０遺伝子とをＭＶＡ用にコドン最適化させた。フレームシフトの原因となり得るＲＮＡポリメラーゼエラーを減らすために、ホモポリマー連続部分（＞４Ｇ／Ｃ及び＞４Ａ／Ｔ）に割り込むようにサイレント突然変異を導入した。早期終結の原因となり得るモチーフを除去するために、ワクシニア特異的ターミネーターとなるように挿入配列を編集した。全ワクチンインサートを、従来記載されているように改変型Ｈ５初期／後期ワクシニアプロモーターの制御下においた。完全なトレーサビリティを確保すると共に全工程で牛海綿状脳症／伝達性海綿状脳症（ＢＳＥ／ＴＳＥ）の疑いのない原料を使用していることを完全に文書化した上で、ＧｅｏＶａｘ社の専用ルームで「ＧＬＰ様条件」下にベクターを作製した。
【０４０６】
Ｍｕｃ１特異的抗体を使用するウェスタンブロッティングにより、細胞で発現されるＧＶＸ−Ｍｕｃ１タンパク質の全長天然構造の発現を評価した。ＭＶＡ−Ｍｕｃ１ＶＰ４０ワクチンを使用し、感染多重度１．０で１時間３７℃にてＤＦ１細胞に感染させた後、培地を予め加温した新鮮な培地に交換した。３７℃で４８時間インキュベーション後に、細胞の上清を採取し、５００×ｇで１０分間遠心することにより清澄化した。上清を細胞から除去した後、細胞自体をプレートから回収し、冷温リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄後、ＰＢＳ＋１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００デタージェントの溶液中で１５分間氷上溶解させた。このインキュベーション後に、溶解液を１０００×ｇで１０分間遠心し、上部の液層を回収することにより、除核後上清を調製した（以下、「細胞溶解液」と言う）。細胞溶解液を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにアプライし、電気泳動法により分離した後、ニトロセルロースメンブレンに転写させ、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキングバッファーでプロックした後、（１）試料中に存在するＭｕｃ１の合計量、又は（２）試料中の低グリコシル化Ｍｕｃ１の合計量を認識する一次抗体と共にインキュベートした。コントロールとして、親ＭＶＡ（抗原発現カセットを全く含まないベクターコントロール）を感染させたＤＦ１細胞からの上清と細胞溶解液を使用した。この分析の結果を添付のウェスタンブロット画像に示す（図３）。
【０４０７】
この結果、ＭＶＡ−Ｍｕｃ１ＶＰ４０ワクチンは、ＤＦ１細胞に感染し、Ｍｕｃ１タンパク質を発現することが明らかであり、さらに発現されたＭｕｃ１の一定の割合が低グリコシル化型であることも明らかである。
【０４０８】
低グリコシル化型のＭｕｃ１がＭＶＡ−Ｍｕｃ１ＶＰ４０ワクチンによりコードされることは、前記ワクチンを感染させた細胞を免疫染色することにより又は正常グリコシル化若しくは低グリコシル化Ｍｕｃ１を発現することが分かっているコントロール細胞を同時染色することにより、以下のように確認される。
−コントロール細胞株ＭＣＦ７及びＭＣＦ１０Ａは、いずれもＭｕｃ１を発現するが、２９３Ｔ細胞は発現しない。
−ＭＣＦ７細胞は、低グリコシル化Ｍｕｃ１に特異的なＡｂ（４Ｈ５）により認識される低グリコシル化Ｍｕｃ１を発現する。
−ＭＣＦ１０Ａは、正常Ｍｕｃ１を発現する。全Ｍｕｃ１を検出するためには、汎用Ｍｕｃ１  Ａｂ（ＨＭＰＶ）を使用する。
−２９３Ｔ細胞にＭＶＡ−Ｍｕｃ１ＶＰ４０又はＭＶＡコントロールウイルス（親ＭＶＡ）を感染させた。
−全試料を指定のＡｂで染色した。
−なお、添付画像（図４）では、陰性シグナル（黄色いバックグラウンド）は、染色ネガティブコントロール及びＭＶＡコントロール条件下にあり、陽性シグナルは、黄色いバックグラウンド上の赤茶色である。
【０４０９】
ＭＶＡ−Ｍｕｃ１ＶＰ４０ワクチンを感染させ、Ｍｕｃ１（ＨＭＰＶ）を認識するモノクローナル抗体で染色したＤＦ１細胞を使用して、免疫電子顕微鏡法（ＥＭ）によりＶＬＰ形成を確認した。添付のＥＭ画像（図５）には、（１）細胞表面からのＶＬＰ出芽を誘導するマトリックスタンパク質としてＶＰ４０タンパク質を使用するという事実の派生現象として、ＶＬＰはフィラメント状であるという点と；（２）ＶＬＰはＭｕｃ１に対する抗体で陽性染色されるという点との２点が明白に示され、このタンパク質は、出芽中のＶＬＰに取り込まれていることが実証される。
【０４１０】
［実施例４］Ｍｕｃ１のＯ−結合型グリコシル化の標的低減
緒言
ムチン型Ｏ−グリコシル化は、コア１  Ｏ−グリカンＧａｌβ３−ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの付加によるタンパク質の修飾で開始する。これは、（１）ＧａｌＮＡｃがアミノ酸主鎖のセリン又はスレオニンに共有結合する段階と、（２）その後、ＧａｌがＧａｌＮＡｃに付加される段階との２段階で行われる。コア１構造への他の糖鎖の付加によりこのコア構造から膨大な種類の他のグリコフォームが形成される。この初期修飾経路の模式図は図６に示す通りである。
【０４１１】
この結果、タンパク質主鎖のＳｅｒ又はＴｈｒ残基に、Ｔ抗原糖鎖が形成される。重要な点として、機能的Ｔシンターゼ（別称コア１  β３−ガラクトシルトランスフェラーゼ，遺伝子記号Ｃ１ＧＡＬＴ１）は、Ｔｎ抗原からのＴ抗原の形成に関与することが分かっている唯一の酵素である。その後のコア１糖鎖構造の修飾は、Ｔ抗原の形成に完全に依存する。したがって、Ｔシンターゼの不在下では、コア１構造に依存するＯ−結合型グリコシル化は、Ｔｎ抗原の形成と共に停止する（Ａｒｙａｌ，Ｒ．Ｐ．，Ｊｕ，Ｔ．＆  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８９，１１６３０−１１６４１（２０１４）参照）。なお、低グリコシル化の別のメカニズムでは、図７に示すように、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（遺伝子記号ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１）によるＴｎへのシアリル酸付加の結果、末端（伸長不能な）シアリル−Ｔｎ構造（Ｓｉａα２−６ＧａｌＮＡｃα１−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）が得られる。
【０４１２】
目的は、低グリコシル化Ｍｕｃ１の内因性のインビボ産生を確保することである。細胞におけるＭｕｃ１の過剰発現は、多数の細胞のグリコシル化機構を著しく妨害する可能性が高いが、グリコシル化機構に手を加えることにより、Ｍｕｃ１の低グリコシル化に向けて生合成経路を後押しすることは、本願の目的に適うと思われる。Ｏ−結合型グリコシル化をＴｎ抗原及びシアリル−Ｔｎで終結するＭｕｃ１構造は、多数の癌腫に関連付けられている公知低グリコシル化型のうちで主要な部類である。Ｏ−結合型グリコシル化合成経路に関する情報に鑑みると、Ｍｕｃ１の内因性低グリコシル化を誘導するメカニズムとしては２つの容易に認識し得るメカニズムを想定することができる。
（１）機能的Ｔシンターゼの発現をノックダウンすることにより、Ｔ抗原の形成を防ぎ、Ｔｎ抗原の増加を促進する。これは、
ａ．ｓｉＲＮＡ法によりＴシンターゼ遺伝子の転写産物を直接標的とする方法；又は
ｂ．ＣＯＳＭＣはＥＲにおけるＴシンターゼのフォールディングと機能に必須且つ特異的であることが分かっているので、ｓｉＲＮＡ法によりＣＯＳＭＣ（遺伝子記号Ｃ１ＧＡＬＴ１Ｃ１）の転写産物を標的とする方法の、いずれかにより実施することができ、このＸ関連遺伝子の突然変異は、ヒトでＴｎ症候群と関連付けられている。
（２）Ｏ−結合型グリコシル化をシアリル−Ｔｎで終結するように、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ（遺伝子記号ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１、本願では「ＳＴ１」と略記する）を過剰発現させる。
【０４１３】
方法
該当する３種類の遺伝子に関する概要データを以下に示す。
【０４１４】
Ｔシンターゼ（Ｃ１ＧＡＬＴ１）
Ｃ１ＧＡＬＴ１遺伝子は、６６，１０４ｎｔ長であり、６個のエキソンから構成され、ヒト染色体７ｐ２１．３に位置する。これを転写・スプライシングすると、６２４４ｎｔ長ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０２０１５６）が得られる。開始コドンは、ｍＲＮＡのｎｔ２２４に位置し、ＣＤＳは２２４から１３１５までの１０９２ｎｔであり、分子量計算値４２ｋＤの３６３アミノ酸タンパク質（ＮＰ＿０６４５４１）が得られる。アミノ酸残基７〜２９は、膜貫通ドメインをコードすると予想され、タンパク質の細胞外ドメインは、ＥＲの内腔に位置することが分かっているため、Ｔシンターゼは、ＩＩ型１回膜貫通型膜タンパク質であると考えられる。
【０４１５】
ＣＯＳＭＣ（Ｔシンターゼ特異的シャペロン；Ｃ１ＧＡＬＴ１Ｃ１）
Ｃ１ＧＡＬＴ１Ｃ１遺伝子は、４４７６ｎｔ長であり、３個のエキソンから構成され、ヒトＸ染色体のＸｑ２４に位置する。これを転写・スプライシングすると、１９１５ｎｔ長ｍＲＮＡ（ＮＭ＿１５２６９２）が得られる。開始コドンはｍＲＮＡのｎｔ４１２に位置し、ＣＤＳは４１２から１３６８までの９５７ｎｔであり、分子量計算値３６ｋＤの３１８アミノ酸タンパク質（ＮＰ＿６８９９０５）が得られる。アミノ酸残基７〜２６は膜貫通ドメインをコードすると予想され、タンパク質の細胞外ドメインは、ＥＲの内腔に位置することが分かっているため、ＣＯＳＭＣはＩＩ型１回膜貫通型膜タンパク質であると考えられる。
【０４１６】
ＳＴ１（α−２，６−シアリルトランスフェラーゼＩ；ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１）
ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１遺伝子は２６，０６４ｎｔ長であり、１２個のエキソンから構成され、ヒト染色体１７ｑ２５．１に位置する。これを転写・スプライシングすると、２５９３ｎｔ長ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０１８４１４）が得られる。開始コドンは、ｍＲＮＡのｎｔ２０１に位置し、ＣＤＳは２０１から２００３までの１８０３ｎｔであり、分子量計算値６８ｋＤの６００アミノ酸タンパク質（ＮＰ＿０６０８８４）が得られる。アミノ酸残基１５〜３５は、膜貫通ドメインをコードすると予想され、タンパク質の細胞外ドメインは、転位後にＥＲの内腔に暴露されることが分かっているため、ＳＴ１はＩＩ型１回膜貫通型膜タンパク質であると考えられる。
【０４１７】
ヒトＴシンターゼ遺伝子とＣＯＳＭＣ遺伝子に適用する既存のｓｉＲＮＡ設計方法は、以下の通りである。
【０４１８】
１．標的ｍＲＮＡ中でＡＡジヌクレオチドから開始する２１ｎｔ配列を見つける。
【０４１９】
２．以下のパラメーターに従い、２〜４個の標的配列を選択する。
【０４２０】
ＧＣ含量が３０〜５０％のｓｉＲＮＡは、Ｇ／Ｃ含量が多いものよりも高活性である。
【０４２１】
４〜６ヌクレオチドポリ（Ｔ）トラクトは、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩの終結シグナルとして機能するので、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターから発現させる配列を設計する場合には、標的配列中にＴ又はＡ＞４の連続部分を含まないようにする。
【０４２２】
ｍＲＮＡには、調節タンパク質から構成される割合又は調節タンパク質と結合している割合の高い領域があるので、遺伝子配列の長さ方向の異なる位置でｓｉＲＮＡ標的部位を選択する。ｍＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ力価について標的部位の位置間で相関は認められなかった。
【０４２３】
潜在的な標的部位を適切なゲノムデータベース（ヒト、マウス、ラット等）と比較し、他のコーディング配列と相同である連続塩基対が１６〜１７超である標的配列を対象外とする。
【０４２４】
３．適切なコントロールを設計する。
【０４２５】
ヌクレオチド組成がｓｉＲＮＡと同一であるが、ゲノムに対して有意な配列相同性をもたないネガティブコントロールｓｉＲＮＡを設計する。遺伝子特異的ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列をスクランブルし、探索を行い、他の遺伝子に対して相同性をもたないことを確かめる。
【０４２６】
同一のｍＲＮＡを標的とする他のｓｉＲＮＡ配列。同一遺伝子を標的とする２個以上の異なるｓｉＲＮＡについてｓｉＲＮＡを一度に１個ずつ使用して実験を実施する。
【０４２７】
この遺伝子産物のＣＤＳは〜１８００ｎｔ長しかないため、ＭＶＡによるＳＴ１の発現は簡単なはずである。
【０４２８】
細胞株
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、Ｍｕｃ１の発現に陰性であることが知られている（Ｍｅｈａｎｔａ，ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２００８参照）。（ヒト乳腺がんに由来する）Ｔ４７Ｄ細胞は、内因的にＭｕｃ１を発現し、標準培地（ＲＰＭＩ）で増殖され、トランスフェクション可能である。これらの細胞は、上記文献でＭｕｃ１ノックダウン（ＫＤ）試験に使用されており、本発明者らのＭｕｃ１低グリコシル化の調査／初期特性決定試験にも使用できると思われる。Ｔ４７Ｄ細胞は、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＨＴＢ−１３３）から４３１ドルで購入可能である。Ｏｌｊａ  ＦｉｎｎはＭＣＦ−７株に由来する細胞株系列には、がん検査に有用なものがあると述べている。特に、この系列のうちでＭＣＦ−１０Ａは、完全にグリコシル化されたＭｕｃ１を高レベルで発現することが分かっているので、これを推奨している（Ｏｌｊａの論文であるＣａｓｃｉｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２０１１も参照）。ＭＣＦ−１０Ａは、線維嚢胞症の３６歳白人女性の乳腺に由来する形質転換型の非腫瘍形成性で接着性の上皮細胞株である。この細胞株は、ＡＴＣＣによると、トラクスフェクション宿主として適切であり、４３１ドルで購入可能である（カタログ番号ＣＲＬ−１０３１７）。この細胞株は、Ｌｏｎｚａ社製品乳腺上皮細胞増殖培地（ＭＥＧＭ）にＬｏｎｚａ  ＭＥＧＭ  Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ（ゲンタマイシン／アンホテリシン−Ｂ不添加）と１００ｎｇ／ｍｌコレラ毒素（Ｓｉｇｍａ）を添加したものを使用する。
【０４２９】
一過性発現コンストラクト
Ｏｒｉｇｅｎｅ社（ｗｗｗ．ｏｒｉｇｅｎｅ．ｃｏｍ）から遺伝子操作用に市販されている製品を検討したところ、信頼性の高いレディ・トゥ・ユーズフォーマットのＲＮＡｉ試薬と、レディ・トゥ・ユーズプラスミドで信頼性の高いＯＲＦを提供していることが分かった。ＲＮＡｉ法の場合、本願の目的に最も適切な２種類の試薬は、合成ｓｉＲＮＡデュプレックス又はプラスミドから発現させることができるｓｈＲＮＡコンストラクトであろう。できることならば、ＲＮＡｉ産物をＭＶＡベクター自体から発現させることを目指しているので、ＭＶＡ発現系に容易に導入できるｓｈＲＮＡを採用することがこれらの目的に最も適切であると思われる。Ｏｒｉｇｅｎ社は、多数の異なるフォーマットでｓｈＲＮＡ製品を提供しているが、本発明者らはプラスミドの作製に選択可能である（Ｋａｎ（ｒ）及びＣａｍ（ｒ）を提供する）と共にレポーターの機能をもつ（ＧＦＰ及びＲＦＰを提供する）単純な発現ベクターを必要としている。したがって、（ＧＦＰレポーターを付加したプラスミドｐＧＦＰ−Ｖ−ＲＳ：カタログ番号ＴＧ３０６０６４に含まれる）Ｃ１ＧＡＬＴ１と（ＲＦＰレポーターを付加したプラスミドｐＲＦＰ−Ｃ−ＲＳ：カタログ番号ＴＦ３１７１３０に含まれる）Ｃ１ＧＡＬＴ１Ｃ１とを標的とするｓｈＲＮＡコンストラクトを注文するであろう。どちらのプラスミドも、Ｕ６プロモーターによりｓｈＲＮＡ転写を誘導する。これらのプラスミドのマップを以下に示す。
【０４３０】
上記ｓｈＲＮＡ製品はｓｈＲＮＡを４個ずつ含む。ｓｈＲＮＡ毎に個々にＫＤを試験するであろう。これらの製品は以下の標的配列及びｍＲＮＡ座標をもつ。
【０４３１】
Ｃ１ＧＡＬＴ１（Ｔシンターゼ）を標的とするＯｒｉｇｅｎｅ社ｓｈＲＮＡ製品及びｍＲＮＡ座標（ＮＭ＿０２０１５６）：
【０４３２】
【表４】
2019500907.tif 000042
【０４３３】
Ｃ１ＧＡＬＴ１Ｃ１（ＣＯＳＭＣ）を標的とするＯｒｉｇｅｎｅ社ｓｈＲＮＡ製品及びｍＲＮＡ座標（ＮＭ＿１５２６９２）：
【０４３４】
【表５】
2019500907.tif 000043
【０４３５】
これらの遺伝子産物のＫＤは、ＲＴ−ＰＣＲ又はＷＢにより評価することができる。
【０４３６】
ＳＴ１の発現を誘導するには、Ｏｒｉｇｅｎｅ社からコンストラクトを容易に入手可能である。該当する製品（カタログ番号ＲＣ２１６６９７）は全長ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１遺伝子をＣＭＶプロモーターの駆動下におき、Ｃ末端にＭｙｃ及びＤＤＫ（ＦＬＡＧ）タグを付け、全体をＯｒｉｇｅｎｅ社のｐＣＭＶ６−Ｅｎｔｒｙベクターに挿入したものである（下記ＲＣ２１６６８７参照）。
【０４３７】
実験計画
１．予備実験
ＨＥＫ２９３Ｔ又はＨｅＬａ細胞の全細胞溶解液（ＷＣＬ）を調製する。（ｒｂ  ｐＡｂによる）Ｔシンターゼ及び（ｍｓ  ｍＡｂによる）ＣＯＳＭＣの検出用にＷＢ法を最適化するためにＷＣＬを使用する。抗ｍｓ  ＩＲ７００色素と抗ｒｂ  ＩＲ８００色素とを二次抗体として使用し、その後に同一ＷＢで前記２種類の抗原を同時に検出できるようにするが、このような同時検出は、転写産物のｓｈＲＮＡ  ＫＤの効果をアッセイする場合に重要であろう。
【０４３８】
ＭＣＦ１０Ａ細胞を準備し、貯蔵する。
【０４３９】
無害のＧＦＰをコードするプラスミドをＭＣＦ１０Ａ細胞にトランスフェクトし、基底レベルのトランスフェクション効率を決定する。
【０４４０】
ＭＣＦ１０Ａ  ＷＣＬを調製する。Ｔシンターゼ及びＣＯＳＭＣの発現レベルをＷＢにより試験する。
【０４４１】
ＭＣＦ１０Ａ細胞を使用して抗Ｍｕｃ１  ＡｂをＷＢ及びフローサイトメトリーで試験する。
【０４４２】
２．ピボタル実験
ＭＣＦ１０Ａ細胞におけるＴシンターゼのｓｈＲＮＡ  ＫＤ。
【０４４３】
Ｔシンターゼを標的とする４種類のｓｈＲＮＡプラスミドの各々を、ＭＣＦ１０Ａ細胞に個々にトランスフェクトする。
【０４４４】
トランスフェクトした各集団のＷＣＬを、規定時点で調製する。Ｔシンターゼ、ＣＯＳＭＣ、Ｍｕｃ１及び低グリコシル化Ｍｕｃ１（ｈｇＭｕｃ１）の発現について、ＷＣＬを解析する。
【０４４５】
最良のＫＤ応答を誘起するｓｈＲＮＡを選択する。
【０４４６】
ＭＣＦ１０Ａ細胞に最適なｓｈＲＮＡをトランスフェクトする。フローサイトメトリーを使用し、Ｍｕｃ１とｈｇＭｕｃ１の表面発現について細胞を解析する。
【０４４７】
ＭＣＦ１０Ａ細胞におけるＣＯＳＭＣのｓｈＲＮＡ  ＫＤ。
【０４４８】
ＣＯＳＭＣを標的とする４種類のｓｈＲＮＡプラスミドの各々を、ＭＣＦ１０Ａ細胞に個々にトランスフェクトする。
【０４４９】
トランスフェクトした各集団のＷＣＬを、規定時点で調製する。Ｔシンターゼ、ＣＯＳＭＣ、Ｍｕｃ１及び低グリコシル化Ｍｕｃ１（ｈｇＭｕｃ１）の発現について、ＷＣＬを解析する。
【０４５０】
最良のＫＤ応答を誘起するｓｈＲＮＡを選択する。
【０４５１】
ＭＣＦ１０Ａ細胞に最適なｓｈＲＮＡをトランスフェクトする。フローサイトメトリーを使用し、Ｍｕｃ１及びｈｇＭｕｃ１の表面発現について、細胞を解析する。
【０４５２】
２．ピボタル実験（続き）
ＭＣＦ１０Ａ細胞におけるＳＴ１（ＳＴ６ＧＡＬＮＡＣ１シアリルトランスフェラーゼ）の異所性発現
ＳＴ１をコードするＲＣ２１６６９７プラスミドを、ＣＭＶプロモーターの下流でＭＣＦ１０Ａ細胞にトランスフェクトする。
【０４５３】
生存性を評価し、トランスフェクトした細胞のＷＣＬを、規定時点で調製する。ＳＴ１（抗ＤＤＫ抗体により検出）、Ｍｕｃ１及び低グリコシル化Ｍｕｃ１（ｈｇＭｕｃ１）の発現について、ＷＣＬを解析する。
【０４５４】
ＭＣＦ１０Ａ細胞にＲＣ２１６６９７プラスミドをトランスフェクトする。フローサイトメトリーを使用し、Ｍｕｃ１及びｈｇＭｕｃ１の表面発現について細胞を解析する。
【０４５５】
上記ピボタル実験からの結果に鑑み、検討した単一アプローチの１種を続行すべきか、又はアプローチの組合せを試みるべきかを決定する。どちらからも個別に十分な結果が得られなかった場合には、例えばｓｈＲＮＡによるＴシンターゼとＣＯＳＭＣとの二重ＫＤを試みること、又はＳＴ１の発現を誘導するＲＣ２１６６９７プラスミドと共にいずれかのｓｈＲＮＡをコトランスフェクトすることが考えられる。
【０４５６】
ＳＴ１を使用する場合には、ワクシニアコドン最適化形態で合成されたこの遺伝子で続行する。
【０４５７】
以上の記述は、単に本発明の代表的な実施形態を開示・説明するものに過ぎない。このような記述及び添付図面並びに特許請求の範囲から当業者に容易に理解される通り、以下の特許請求の範囲に記載するような本発明の趣旨及び範囲から逸脱しない限り、種々の置換え、変更及び変形が可能である。
【０４５８】
本願に引用する全参考資料はその内容全体を本願に援用する。
【図１】
2019500907.tif 000044
【図２】
2019500907.tif 000045
【図３】
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【図４】
2019500907.tif 000047
【図５】
2019500907.tif 000048
【図６】
2019500907.tif 000049
【図７】
2019500907.tif 000050
【配列表】
2019500907000001.app
【国際調査報告】
2019500907.tif 000051