(57)【要約】  ＨＩＶ診断方法を提供する。本発明の一実施例に係るＨＩＶ診断方法は、ナノフィルターを含むＨＩＶ診断装置を用いたＨＩＶ診断方法であって、前記ナノフィルターは、細胞を捕捉する上部本体（１００）を含み、前記上部本体（１００）は、基板（１１０）を貫通する複数の濾過孔（１２０）を含み、前記複数の濾過孔（１２０）のうちいずれか一つの濾過孔は、他の濾過孔と隣接し、前記いずれかの濾過孔と隣接する他の濾過孔との中心間隔は２３μｍ乃至２７μｍであり、前記ＨＩＶ診断方法は、（ａ）前記ナノフィルターが前記細胞中の白血球を捕捉する段階と、（ｂ）光源ユニット（５００）が前記ナノフィルターの全体面積に向かって光を照射する段階と、（ｃ）光感知ユニット（６００）が、前記ナノフィルターを通過した光を感知する段階と、（ｄ）表示手段（７００）が、前記光感知ユニット（６００）によって取得される情報に基づいて前記ナノフィルターの全体面積のイメージを出力する段階と、（ｅ）分析手段（８００）が、前記表示手段（７００）に出力されたイメージを分析する段階とを含み、前記（ｅ）段階は、前記分析手段（８００）がＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ８陽性Ｔ細胞数の比情報を分析する段階を含むことができる。
2019516117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノフィルターを含むＨＩＶ診断装置を用いたＨＩＶ診断方法であって、
前記ナノフィルターは、
細胞を捕捉する上部本体（１００）を含み、
前記上部本体（１００）は、基板（１１０）を貫通する複数の濾過孔（１２０）を含み、
前記複数の濾過孔（１２０）のうちいずれかの濾過孔は他の濾過孔と隣接し、
前記いずれかの濾過孔と隣接する他の濾過孔との中心間隔は２３μｍ乃至２７μｍであり、
前記ＨＩＶ診断方法は、
（ａ）前記ナノフィルターが前記細胞中の白血球を捕捉する段階と、
（ｂ）光源ユニット（５００）が前記ナノフィルターの全体面積に向かって光を照射する段階と、
（ｃ）光感知ユニット（６００）が、前記ナノフィルターを通過した光を感知する段階と、
（ｄ）表示手段（７００）が、前記光感知ユニット（６００）によって取得される情報に基づいて前記ナノフィルターの全体面積のイメージを出力する段階と、
（ｅ）分析手段（８００）が、前記表示手段（７００）に出力されたイメージを分析する段階とを含み、
前記（ｅ）段階は、
前記分析手段（８００）がＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ８陽性Ｔ細胞数の比情報を分析する段階を含む、ＨＩＶ診断方法。
【請求項２】
前記（ｅ）段階は、前記分析手段（８００）がＣＤ４陽性Ｔ細胞数、およびＣＤ４陽性細胞数に対するリンパ球細胞数の比情報をさらに分析する段階をさらに含み、
前記分析手段（８００）によって分析された情報に基づいて、前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞数が３５０ｃｅｌｌｓ／μｌ未満である、或いは前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ８陽性Ｔ細胞数の比が１未満である、或いは前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するリンパ球細胞数の比が０．２５以下である場合には、ＡＩＤＳ治療開始時点として判定する段階をさらに含む、請求項１に記載のＨＩＶ診断方法。
【請求項３】
前記濾過孔（１２０）の平面視形状が円形であり、
前記濾過孔（１２０）の直径が３μｍ乃至５μｍである、請求項１に記載のＨＩＶ診断方法。
【請求項４】
前記基板（１１０）が金属材質またはプラスチック材質からなる、請求項１に記載のＨＩＶ診断方法。
【請求項５】
前記基板（１１０）の上部に位置し、サンプル溶液が投入される濾過部（１３０）と、
前記基板（１１０）の下部に位置し、前記濾過孔（１２０）に濾過されていない物質が移動する吸入部（１４０）と、
前記吸入部（１４０）と下部本体（４００）とを連結する流路（３００）とをさらに含み、
前記（ａ）段階の前に、前記下部本体（４００）が前記上部本体（１００）から一定速度で離隔することにより、前記濾過部（１３０）に投入されたサンプル溶液が、予め定められた速度で吸入部（１４０）に吸入される段階をさらに含む、請求項１に記載のＨＩＶ診断方法。
【請求項６】
前記予め定められた速度が１００μｌ／ｍｉｎ乃至５００μｌ／ｍｉｎである、請求項５に記載のＨＩＶ診断方法。
【請求項７】
前記光感知ユニット（６００）は、
前記ナノフィルターを通過した光を平行光の形態に変換させるレンズ（６１０）と、
前記レンズ（６１０）を通過した光成分のうち特定の波長の光を通過させる励起光フィルター（６２０）と、
前記励起光フィルター（６２０）を通過した光を感知するイメージセンサー（６３０）とを含む、請求項１に記載のＨＩＶ診断方法。
【請求項８】
前記（ｅ）段階の後、前記表示手段（７００）が、前記分析手段（８００）で分析された情報をさらに表示する段階をさらに含む、請求項１に記載のＨＩＶ診断方法。
【請求項９】
前記細胞がＪＭ細胞またはＩＭＭＵＮＯ−ＴＲＯＬ細胞をさらに含む、請求項１に記載のＨＩＶ診断方法。
【請求項１０】
前記（ａ）段階の前に、前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞及び前記ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、それぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ヒトＣＤ４  ｌｇＧ抗体とＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０標識抗ヒトＣＤ８  ｌｇＧで１０分乃至３０分反応させる段階をさらに含む、請求項１に記載のＨＩＶ診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ４、ＣＤ８細胞情報を用いたＨＩＶ診断方法に関し、より詳細には、ナノフィルターを用いて細胞を捕捉し、捕捉されたＣＤ４陽性Ｔ細胞、及びＣＤ８陽性Ｔ細胞を観察してＡＩＤＳ治療開始の判定及びＡＩＤＳ治療過程の効果的なモニタリングが可能な診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＩＤＳ感染者は、全世界に４０００万人とも言われており、主に発展途上国でほとんどの感染者が発生している。ＡＩＤＳの原因ウイルスであるＨＩＶは、血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞に感染して数ヶ月〜１０年間の潜伏期間を経てＣＤ４陽性Ｔ細胞を益々破壊することにより、患者の免疫機能を低下させ、免疫力が弱まった患者は様々な合併症によって死亡に至る。
【０００３】
ＡＩＤＳの治療が必要であるかどうかを判定するために、血中のＣＤ４陽性Ｔ細胞を計測する方法がある。このような計測方法には、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の絶対数をカウントする方法と、全体リンパ球数にＣＤ４陽性Ｔ細胞数が占める割合を算出する方法（ＣＤ４／リンパ球）、ＣＤ８陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ４陽性Ｔ細胞数の比を算出する方法（ＣＤ４／ＣＤ８）がある。ＣＤ４／リンパ球とＣＤ４／ＣＤ８は、年齢に関係なくその値の変動が比較的少ないので、ＣＤ４／リンパ球とＣＤ４／ＣＤ８の比を算出する方法が主に用いられている。ＷＨＯのガイドラインでは、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数が３５０ｃｅｌｌｓ／μｌ以下である、或いは５歳未満の乳幼児のＣＤ４／リンパ球が０．２５以下である場合、ＣＤ４／ＣＤ８が１未満である場合をＡＩＤＳ治療の開始時点としている。
【０００４】
上述したようなＣＤ４陽性Ｔ細胞数を計測する方法は、通常、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）方法によって行われている。フローサイトメトリー方法は、精度が高いという利点はあるものの、専門人力を必要とし且つ装置が高価なので、発展途上国では、フローサイトメトリー方法を利用し難い。
【０００５】
次に、関連した従来技術について考察する。
【０００６】
米国公開特許第２０１４−０２７３０１８号は、ＡＩＤＳ発病リスク判定のために、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の絶対数のカウント、ＣＤ４／リンパ球、ＣＤ８／リンパ球の比を算出する機器及びシステムを開示するが、白血球を捕捉するナノフィルターの孔間の間隔がランダムであって、抗原−抗体反応で再現性を得ることができず、非特異的抗体がよく洗い落とされないため結果観察が容易ではない。
【０００７】
韓国公開特許第２０１２−００４２５１８号は、癌細胞の捕捉のための金属スクリーンフィルターを開示するか、癌細胞の捕捉後に癌細胞を回収するためのものであって、発明の目的が相違する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ナノフィルターを介して標的細胞を高効率で濾過するとともに、ＡＩＤＳ治療開始の判定及びＡＩＤＳ治療過程の効果的なモニタリングが可能な診断方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の課題を解決するための本発明の一実施例は、ナノフィルターを含むＨＩＶ診断装置を用いたＨＩＶ診断方法であって、前記ナノフィルターは、細胞を捕捉する上部本体(１００)を含み、前記上部本体(１００)は、基板(１１０)を貫通する複数の濾過孔(１２０)を含み、前記複数の濾過孔(１２０)のうちいずれか一つの濾過孔は他の濾過孔と隣接し、前記いずれか一つの濾過孔と隣接する他の濾過孔との中心間隔は２３μｍ乃至２７μｍであり、前記ＨＩＶ診断方法は、（ａ）前記ナノフィルターが前記細胞中の白血球を捕捉する段階と、（ｂ）光源ユニット(５００)が前記ナノフィルターの全体面積に向かって光を照射する段階と、（ｃ）光感知ユニット(６００)が、前記ナノフィルターを通過した光を感知する段階と、（ｄ）表示手段(７００)が、前記光感知ユニット(６００)によって取得される情報に基づいて前記ナノフィルターの全体面積のイメージを出力する段階と、（ｅ）分析手段(８００)が、前記表示手段(７００)に出力されたイメージを分析する段階とを含み、前記（ｅ）段階は、前記分析手段(８００)がＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ８陽性Ｔ細胞数の比情報を分析する段階を含む、ＨＩＶ診断方法を提供する。
【００１０】
一実施例において、前記（ｅ）段階は、前記分析手段(８００)がＣＤ４陽性Ｔ細胞数、およびＣＤ４陽性細胞数に対するリンパ球細胞数の比情報をさらに分析する段階をさらに含み、前記分析手段(８００)によって分析された情報に基づいて、前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞数が３５０ｃｅｌｌｓ／μｌ未満である場合、或いは前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ８陽性Ｔ細胞数の比が１未満である場合、或いは前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するリンパ球細胞数の比が０．２５以下である場合、ＡＩＤＳ治療開始時点として判定する段階をさらに含むことが好ましい。
【００１１】
一実施例において、前記濾過孔(１２０)の平面視形状が円形であり、前記濾過孔(１２０)の直径が３μｍ乃至５μｍであることが好ましい。
【００１２】
一実施例において、前記基板(１１０)は金属材質またはプラスチック材質からなることが好ましい。
【００１３】
一実施例において、前記基板(１１０)の上部に位置し、サンプル溶液が投入される濾過部(１３０)と、前記基板(１１０)の下部に位置し、濾過孔(１２０)に濾過されていない物質が移動する吸入部(１４０)と、前記吸入部(１４０)と下部本体(４００)とを連結する流路(３００)とをさらに含み、前記（ａ）段階の前に、前記下部本体(４００)が前記上部本体(１００)から一定の速度で離隔することにより、前記濾過部(１３０)に投入されたサンプル溶液が、予め定められた速度で吸入部(１４０)に吸入される段階をさらに含むことが好ましい。
【００１４】
一実施例において、前記予め定められた速度は１００μｌ／ｍｉｎ乃至５００μｌ／ｍｉｎであることが好ましい。
【００１５】
一実施例において、前記光感知ユニット(６００)は、前記ナノフィルターを通過した光を平行光の形態に変換させるレンズ(６１０)、前記レンズ(６１０)を通過した光成分のうち特定の波長の光を通過させる励起光フィルター(６２０)、及び前記励起光フィルター(６２０)を通過した光を感知するイメージセンサー(６３０)を含むことが好ましい。
【００１６】
一実施例において、前記（ｅ）段階の後、前記表示手段(７００)が、前記分析手段(８００)で分析された情報をさらに表示する段階をさらに含むことが好ましい。
【００１７】
一実施例において、前記細胞はＪＭ細胞またはＩＭＭＵＮＯ−ＴＲＯＬ細胞をさらに含むことが好ましい。
【００１８】
一実施例において、前記（ａ）段階の前に、前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞及び前記ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、それぞれ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識抗ヒトＣＤ４  ｌｇＧ抗体とＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０標識抗ヒトＣＤ８  ｌｇＧで１０分乃至３０分反応させる段階をさらに含むことが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、いずれか一つの濾過孔と隣接する他の濾過孔との中心間隔が一定であり、細胞捕捉のための濾過孔の大きさを調節することにより、標的細胞を高効率で捕捉することが可能である。
【００２０】
また、本発明に係るナノフィルターは、金属材質またはプラスチック材質の基板を含んでおり、抗原と反応していない抗体を簡単に洗い落とすことが可能である。
【００２１】
また、サンプル溶液を一定の速度で吸入することができるので、標的細胞を高効率で捕捉することが可能である。
【００２２】
また、標的細胞を捕捉するとともに、ナノフィルターの全体面積のイメージをリアルタイムで観察することが可能である。
【００２３】
また、本発明に係る分析装置を用いた診断方法は、ＣＤ４／リンパ球、ＣＤ４／ＣＤ８の比算出が可能なので、ＡＩＤＳ治療開始の判定を下すことが可能である。
【００２４】
また、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の観察が可能であるうえ、白血球に存在するＣＤ抗原、例えばＣＤ１９やＣＤ４５などの観察が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１ａ】本発明の実施例に係るナノフィルターの斜視図である。
【図１ｂ】図１ａのナノフィルターの下部本体が上部本体から離隔することにより、濾過部に投入されたサンプル溶液が吸入されることを示す。
【図１ｃ】図１ｂのナノフィルターの断面図であって、Ａ−Ａ’に沿った図である。
【図２ａ】図１ａのナノフィルターを用いた分析装置の概略図である。
【図２ｂ】図１ａのナノフィルターの顕微鏡写真である。
【図３ａ】図１ａのナノフィルターに捕捉された白血球を染色の後に観察した蛍光顕微鏡像である。
【図３ｂ】本発明の実施例に係る分析装置を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞を観察したものであって、（１）ＰＥ標識ＣＤ８陽性Ｔ細胞、（２）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｒ  ４８８標識ＣＤ４陽性Ｔ細胞を示す。
【図４】（４ａ）は蛍光顕微鏡及び本発明の実施例に係る分析装置で計測したＣＤ４／ＣＤ８比の相関関係を示すグラフ、（４ｂ）は本発明の実施例に係る分析装置を用いてＣＤ４／ＣＤ８比を示すグラフである。
【図５】濾過孔の大きさによる白血球回収率のグラフである。
【図６】サンプル溶液の吸入速度による白血球回収率のグラフである。
【図７】ＣＤ４／ＣＤ８比の算出などのための従来方法であるフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）方法との計測比較結果である。
【図８】本発明の分析装置を用いた診断方法のフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
〔１．ナノフィルターの説明〕
以下、本発明の実施例に係るナノフィルターについて説明する。
【００２７】
図１Ａ及び図１Ｂを参照すると、本発明の実施例に係るナノフィルターは、細胞を捕捉する上部本体(１００)を含む。
【００２８】
上部本体(１００)は、基板(１１０)を貫通する複数の濾過孔(１２０)を内部に含み、複数の濾過孔(１２０)を介して標的細胞（例えば、白血球）を捕捉する。白血球捕捉の際に、血液内に存在する赤血球も捕捉できるが、濾過部(１３０)に血液を投入する前に、赤血球溶解過程を経て赤血球の大きさを従来よりも低減させるので、濾過孔(１２０)に濾過されない。よって、所望する白血球のみが濾過孔(１２０)に捕捉されるようにすることができる。赤血球溶解過程についての詳細な説明は省略する。
【００２９】
複数の濾過孔(１２０)それぞれの大きさを調節して標的細胞を捕捉可能である。標的細胞よりも小さい大きさで濾過孔(１２０)を形成する場合、標的細胞は、濾過孔(１２０)を抜け出すことができないので、所望の標的細胞を捕捉することができる。いずれか一つの濾過孔と隣接する他の濾過孔との中心間隔は２３μｍ乃至２７μｍであることが好ましい。離隔距離が短すぎる場合には、後述する表示手段(７００)に表示された映像において各濾過孔(１２０)のイメージが重なって見えることがあり、離隔距離が短長すぎる場合には、標的細胞を捕捉するための濾過孔(１２０)の個数が十分でないことがある。
【００３０】
前記複数の濾過孔(１２０)の平面視形状は円形であり、濾過孔(１２０)の直径は３μｍ乃至５μｍであることが好ましい。
【００３１】
濾過孔(１２０)の直径がこれより大きい場合、白血球をまともに捕捉することができないため、サンプル血液に含まれている白血球の回収率が低下する。濾過孔(１２０)の孔径による白血球回収率実験の詳細については後述する。
【００３２】
前記基板(１１０)は金属材質またはプラスチック材質からなることが好ましい。基板(１１０)が金属材質またはプラスチック材質からなることにより、標的細胞の抗原と蛍光標識抗体との抗原−抗体反応の後に、抗原と反応していない抗体を簡単に洗い落とすことができる（ｗａｓｈｉｎｇ過程）。
【００３３】
本発明の実施例に係るナノフィルターは、基板(１１０)に連結され、基板(１１０)の上部に位置する濾過部(１３０)と、基板(１１０)に連結され、基板(１１０)の下部に位置する吸入部(１４０)とをさらに含む。
【００３４】
濾過部(１３０)は、標的細胞が含まれているサンプル溶液が投入される空間である。一定容量を担持することが可能な空間からなっており、濾過部(１３０)に投入されたサンプル溶液は濾過孔(１２０)を介して濾過され、濾過されていない物質は吸入部(１４０)へ移動する。
【００３５】
吸入部(１４０)は、濾過孔(１２０)に濾過されていない物質が移動する空間である。濾過孔(１２０)の大きさよりも小さい物質は濾過孔(１２０)に濾過されないので、濾過孔(１２０)を通過して吸入部(１４０)へ移動する。
【００３６】
本発明の実施例に係るナノフィルターは、前記吸入部(１４０)と下部本体(４００)とを連結する流路(３００)をさらに含む。
【００３７】
前記下部本体(４００)は、前記上部本体(１００)から一定速度で離隔することにより、サンプル溶液を吸入するポンプの役割を果たす。図１Ｂを参照すると、下部本体(４００)が上部本体から離隔しながら濾過部(１３０)の空気を吸入することにより、濾過部(１３０)に投入されたサンプル溶液を吸入する。サンプル溶液を吸入しない場合、濾過部(１３０)のサンプル溶液が濾過されず濾過部(１３０)にそのまま留まることになる。サンプル溶液を吸入することにより、サンプル溶液を吸入していないナノフィルターの場合と比較して濾過が行われるようにする。
【００３８】
このとき、下部本体(４００)は、上部本体(１００)から一定速度で離隔するので、サンプル溶液も予め定められた速度で吸入されるが、予め定められた速度は１００μｌ／ｍｉｎ乃至５００μｌ／ｍｉｎであることが好ましい。
【００３９】
吸入速度が遅い場合には、吸入していないナノフィルターのそれとは違いがなく、吸入速度が速い場合には、サンプル溶液に含まれている白血球が縮んで濾過孔(１２０)を通過するようになるので、白血球の回収率が低下する。吸入速度による白血球回収率実験の詳細については後述する。
【００４０】
〔２．ナノフィルターを用いた分析装置の説明〕
以下、本発明の実施例に係るナノフィルターを用いた分析装置について説明する。
【００４１】
図２Ａを参照すると、本発明の実施例に係る分析装置は、本発明の実施例に係るナノフィルターと、前記ナノフィルターの下部に位置し、前記ナノフィルターに向かって光を照射する光源ユニット(５００)と、前記ナノフィルターを挟んで前記光源ユニット(５００)と向かい合うように配置され、前記ナノフィルターを通過した光を感知する光感知ユニット(６００)とを含む。
【００４２】
ナノフィルターは、上部本体(１００)を介して標的細胞（例えば、白血球）を捕捉する。標的細胞を捕捉する方法については前述したので、詳細な説明は省略する。
【００４３】
光源ユニット(５００)は、前記ナノフィルターに向かって光を照射する。ナノフィルターに捕捉された標的細胞は、蛍光標識抗体と結合された状態にある。このとき、蛍光物質は、特定の波長の光を吸収して励起状態（ｅｘｃｉｔｅｄ  ｓｔａｔｅ）になる。白色光は、可視光線領域の全波長の光が含まれるので、蛍光物質の種類に関係なく、励起状態に作ることができる。よって、前記光源ユニット５００は、白色光を照射するＬＥＤまたは水銀灯またはハロゲンランプであることが好ましい。
【００４４】
光感知ユニット(６００)は、ナノフィルターを通過した光を感知する。光感知ユニット(６００)は、下部に位置するレンズ(６１０)、レンズ(６１０)の上部に位置する励起光フィルター(６２０)、及び励起光フィルター(６２０)の上部に位置するイメージセンサー(６３０)を含む。
【００４５】
レンズ(６１０)は、ナノフィルターを通過した光を平行光の形態に変換させる。レンズ(６１０)は、光を平行にする光学部品であることが好ましい。光を平行光の形態に変換させることにより、イメージセンサー(６３０)に平行光形態の光が到達するので、イメージ観測を容易にする。
【００４６】
励起光フィルター(６２０)は特定の波長の光のみを通過させる。抗体に標識された蛍光物質は、光源ユニット(５００)に照射された光の特定の波長を吸収した後、励起状態（ｅｘｃｉｔｅｄ  ｓｔａｔｅ）になる。このとき、再び基底状態（ｇｒｏｕｎｄ  ｓｔａｔｅ）に戻りながら特定の領域の波長を放出する。励起光フィルター(６２０)は、特定の領域の波長のみを通過させ、残りの波長を遮断することにより、蛍光標識された標的細胞のみ観測されるようにする。
【００４７】
イメージセンサー(６３０)は、励起光フィルター(６２０)を通過した光を感知して電気信号に変換してデジタルイメージを形成する。よって、ナノフィルターを通過した光がデジタルイメージに変換される。イメージセンサー(６３０)はＣＭＯＳセンサーであることが好ましい。
【００４８】
本発明の実施例に係る分析装置は、光感知ユニット(６００)によって取得される情報を出力する表示手段(７００)と、表示手段(７００)に表示された映像から情報を分析する分析手段(８００)とをさらに含む。
【００４９】
表示手段(７００)は、イメージセンサー(６３０)で変換されたデジタルイメージを示す。これにより、視覚的に蛍光標識された標的細胞を確認可能である（図３Ａ及び図３Ｂを参照）。
【００５０】
分析手段(８００)は、表示手段(７００)に表示された映像を分析する。分析される情報はＣＤ４／リンパ球比またはＣＤ４／ＣＤ８比であり得る。
【００５１】
表示手段(７００)は、分析手段(８００)によって分析された情報をさらに表示する。これにより、視覚的にＣＤ４／リンパ球比またはＣＤ４／ＣＤ８比を視覚的に確認可能である。
【００５２】
表示手段(７００)は、通知部を含んでおり、分析手段(８００)によって分析される情報に基づいてＣＤ４陽性Ｔ細胞数が３５０ｃｅｌｌｓ／μｌ未満である、或いはＣＤ４／ＣＤ８比が１未満である場合には、通知部が作動する。よって、ＡＩＤＳ発病リスク有無を聴覚的に確認可能である。
【００５３】
〔３．分析装置を用いた診断方法の説明〕
以下、本発明の実施例に係る分析装置を用いた診断方法について説明する。
【００５４】
本発明の実施例による診断方法は、（ａ）ナノフィルターが標的細胞中の白血球を捕捉する段階と、（ｂ）光源ユニット(５００)がナノフィルターの全体面積に向かって光を照射する段階と、（ｃ）光感知ユニット(６００)が、ナノフィルターを通過した光を感知する段階と、（ｄ）表示手段(７００)が、光感知ユニット(６００)によって取得される情報に基づいてナノフィルターの全体面積のイメージを出力する段階と、（ｅ）分析手段(８００)が、表示手段(７００)に出力されたイメージを分析する段階とを含み、前記（ｅ）段階は、分析手段(８００)がＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ８陽性Ｔ細胞数の比情報を分析する段階を含む、
（ａ）段階は、標的細胞がナノフィルターに捕捉される段階であって、標的細胞は、標的細胞が含まれているサンプル溶液が上部本体(１００)に投入される前に、蛍光標識抗体と反応させる。標的細胞は白血球であることが好ましく、白血球と反応する抗体の種類は一つ以上になることができる。これにより、視覚的に複数種類の標的細胞を同時に観察可能である。
【００５５】
（ｂ）段階は、ナノフィルターの全体面積に向かって光源ユニット(５００)が光を照射する段階であって、抗体に標識された蛍光物質が特定の波長の光を吸収して励起状態（ｅｘｃｉｔｅｄ  ｓｔａｔｅ）になる。
【００５６】
（ｃ）段階は、光感知ユニット(６００)が、ナノフィルターを通過した光を感知する段階である（Ｓ２２０）。光感知ユニット(６００)は、レンズ(６１０)、励起光フィルター(６２０)及びイメージセンサー(６３０)を含む。
【００５７】
レンズ(６１０)は、ナノフィルターを通過した光を平行光の形態に変換させることにより、イメージ観察を容易にする。レンズ(６１０)を通過した平行光形態の光は、励起光フィルター(６２０)を通過する。
【００５８】
励起光フィルター(６２０)は、特定の領域の波長のみを通過させるが、光源ユニット(５００)から照射された光を吸収した蛍光物質は、励起状態（ｅｘｃｉｔｅｄ  ｓｔａｔｅ）から基底状態（ｇｒｏｕｎｄ  ｓｔａｔｅ）に戻りながら特定の領域の波長を放出する。励起光フィルター(６２０)は、蛍光物質の種類に応じて、通過させる波長の領域を変化させることにより、蛍光標識された標的細胞のみ観察されるようにする。
【００５９】
イメージセンサー(６３０)は、励起光フィルター(６２０)を通過した光を感知して電気信号に変換することにより、デジタルイメージを形成する。よって、ナノフィルターを通過した光がデジタルイメージに変換される。
【００６０】
（ｄ）段階は、表示手段(７００)が、光感知ユニット(６００)によって取得される情報に基づいてナノフィルターの全体面積のイメージを出力する段階であって、光感知ユニット(６００)によって変換されたデジタルイメージを表示手段(７００)によって視覚的に確認可能である。（ａ）段階で抗体を複数種類使用した場合、抗体に標識された蛍光物質の種類に応じてそれぞれ異なる色のイメージを同時に確認することができる。
【００６１】
（ｅ）段階は、分析手段(８００)が、表示手段(７００)に出力されたイメージを分析する段階であって、例えば、（ａ）段階で抗ＣＤ４抗体（緑色蛍光物質標識）と抗ＣＤ８抗体（黄色蛍光物質標識）を用いた場合、表示手段(７００)に表示された映像からＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ８陽性Ｔ細胞数の比情報を分析することができる。
【００６２】
（ｅ）段階における分析手段(８００)は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ８陽性Ｔ細胞数の比情報だけではなく、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数、およびＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するリンパ球数の比率情報も分析することができる。
【００６３】
また、本発明の実施例に係る診断方法は、分析手段(８００)によって分析された情報に基づいて前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞数が３５０ｃｅｌｌｓ／μｌ未満である、或いは前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するＣＤ８陽性Ｔ細胞数の比が１未満である、或いは前記ＣＤ４陽性Ｔ細胞数に対するリンパ球細胞数の比が０．２５以下である場合、ＡＩＤＳ治療開始時点として判定する段階をさらに含む。よって、本発明の実施例に係る診断方法を用いてＡＩＤＳ治療開始時点を簡単かつ正確に判定することができる。
【００６４】
〔４．濾過孔の大きさによる白血球回収率の実験〕
本発明の実施例に係るナノフィルターの濾過孔(１２０)の大きさによる白血球回収率を確認するために、実験を行った。
【００６５】
濾過部(１３０)に投入された血液サンプルを２００μｌ／ｍｉｎの速度で吸入し、５つの血液サンプルを用いて実験を行った。
【００６６】
図５に示すように、濾過孔(１２０)の孔径が３μｍ乃至５μｍである場合には、白血球回収率が高いことを確認することができるが、濾過孔の孔径が６μｍである場合には、白血球回収率が急減することを確認することができる。このような結果から、濾過孔(１２０)の孔径は３μｍ乃至５μｍであることが好ましいことが確認された。
【００６７】
〔５．サンプル溶液の吸入速度による白血球回収率の実験〕
本発明の実施例に係るナノフィルターのサンプル溶液の吸入速度による白血球回収率を確認するために実験を行った。
【００６８】
濾過部(１３０)に投入された血液サンプルをそれぞれ異なる速度で吸入し、濾過孔(１２０)の孔径は３μｍと固定し、５つの血液サンプルを用いて実験を行った。
【００６９】
図６に示すように、吸入速度が１００μｌ／ｍｉｎ乃至５００μｌ／ｍｉｎである場合に白血球回収率が高いことを確認することができるが、これよりも高い場合、白血球回収率が減少することを確認することができる。このような結果から、サンプル溶液の吸入速度は１００μｌ／ｍｉｎ乃至５００μｌ／ｍｉｎであることが好ましいことが確認された。
【００７０】
〔６．検証実験１〕
本発明の実施例に係る分析装置の標的細胞捕捉効率の優秀性を確認するために実験を行った。
【００７１】
図２Ａの分析装置によって、Ｔリンパ種由来培養細胞株であるＪＭ細胞を用いて捕捉を行った。培養したＪＭ細胞を染色及び洗浄した後、セルストレーナー（Ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ）（４０μｍ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて免疫細胞を濾過した。その後、ヘモトサイトメーター（Ｆｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）を用いて細胞数を計測し、細胞サンプル（５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を調製した。調製したサンプルをもってナノフィルターの吸入部(１４０)をＰＢＳで満たした後、濾過部(１３０)に蛍光標識ＪＭ細胞サンプル２００μｌを投入し、２００μｌ／ｍｉｎでナノフィルターに投入されたサンプルを吸入することにより、ナノフィルターを用いた細胞捕捉を行った。捕捉の後に４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を用いて、ナノフィルターに濾過された細胞を１５分間固定し、ナノフィルター上の水を完全に除去した。
【００７２】
本発明の分析装置を用いてイメージを観察する前に、一般な蛍光顕微鏡を用いて観察を行い、細胞がナノフィルター上に捕捉されたことを確認した。続いて、ナノフィルター上の細胞捕捉効率を算出するために、コントロール血球サンプルを用いて細胞捕捉実験を行った。精度管理用コントロール血球（ヒト白血球・赤血球保存液、ＩＭＭＵＮＯ−ＴＲＯＬ  Ｃｅｌｌｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅ社）に標準化抗体カクテル、核染色試薬（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、濃度：５μｇ／ｍｌ、Ｅｘ／Ｅｍ＝３４３／４８３ｎｍ）を添加した後、光遮断条件の下に室温で４５分間反応を行った。染色処理の後にセルカウンター（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ）で細胞濃度を確認した後、ＰＢＳをもって希釈して調製した細胞懸濁液２００μｌ（４５００ｃｅｌｌｓ）を新しいナノフィルターに投入・吸入することにより細胞捕捉を行い、蛍光顕微鏡による観察を行った（図３Ａ）。その結果、９７±２．２％の効率で細胞の捕捉が可能であった。この結果から、本発明の実施例に係る分析装置は十分な細胞捕捉能力を持っていることが確認された。
【００７３】
〔７．検証実験２〕
本発明の実施例に係る分析装置のＣＤ４陽性Ｔ細胞の計測可否についての実験を行った。実験では、ＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞を用いた。このとき、同じ励起光と互いに異なる波長の蛍光によって２種類の細胞を検出するために、２種類の蛍光色素で染色して分離するデュアルカラーイメージング（ｄｕａｌ  ｃｏｌｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ）を用いた。このため、励起光フィルター(６２０)が通過させる波長は、緑色蛍光と黄色蛍光を同時に観察可能な波長（λｅｘ＝４６４．５−４９９．５ｎｍ、λｅｍ≧５１９ｎｍ）とした。まず、マウス由来Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（λｅｘ＝４９９ｎｍ、λｅｍ＝５２０ｎｍ）標識抗ヒトＣＤ４ＩｇＧ抗体およびマウス由来ＰＥ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０（λｅｘ＝５６７ｎｍ、λｅｍ＝６２７ｎｍ）標識抗ヒトＣＤ８ＩｇＧ抗体を用いて抗原−抗体反応を行うことにより、免疫染色されたＣＤ４陽性Ｔ細胞とＣＤ８陽性Ｔ細胞をナノフィルター上に捕捉し、本発明に実施例に係る分析装置を用いて観察した結果、表示手段(７００)を介して、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞に標識された蛍光を同時に観察することが可能であった（図３Ｂ）。この結果から、本発明に使用された分析装置はＣＤ４陽性Ｔ細胞の計測が可能であることを確認した。
【００７４】
〔８．検証実験３〕
本発明の実施例に係る分析装置を用いたＣＤ４陽性Ｔ細胞計測の優秀性を確認するために、既存の細胞集団サンプルを用いて実験を行った。
【００７５】
血液サンプルとして、血中Ｔ細胞の濃度が表示された精度管理用コントロール血球（ＩＭＭＵＮＯ−ＴＲＯＬ  ＣｅｌｌｓまたはＩＭＭＵＮＯ−ＴＲＯＬ  Ｌｏｗ  Ｃｅｌｌｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた。抗レトロウイルス治療薬の使用開始基準である３５０ｃｅｌｌｓ／μｌの値を用いて、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数が多くＣＤ４／ＣＤ８比が１よりも大きい血液サンプルをＨｉｇｈサンプル（ＣＤ４陽性Ｔ細胞数：５６６±１６５ｃｅｌｌｓ／μｌ、ＣＤ８陽性Ｔ細胞数：２６３±１１８ｃｅｌｌｓ／μｌ、ＣＤ４／ＣＤ８＝２．１５）として定義し、ＣＤ４陽性Ｔ細胞数が３５０ｃｅｌｌｓ／μｌよりも少なくＣＤ４／ＣＤ８比が１よりも少ない血液サンプルをＬｏｗサンプル（ＣＤ４陽性Ｔ細胞数：１４０±７０ｃｅｌｌｓ／μｌ、ＣＤ８陽性Ｔ細胞数：２３２±１１６ｃｅｌｌｓ／μｌ、ＣＤ４／ＣＤ８＝０．６０）として定義した。各血液サンプルを、ラット（Ｒａｔ）由来抗ヒトＣＤ４  ＩｇＧとマウス由来抗ヒトＣＤ８  ＩｇＧとの混合溶液（濃度：１０μｇ／ｍｌ）を用いてそれぞれＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞と３０分間抗原−抗体反応を行った。血液サンプル２００μｌを、１μｌの血液に相当する血球を含むように０．１ＭのＰＢＳを用いて希釈して、濾過部(１３０)に投入されるサンプルとした。また、Ｌｏｗサンプル及びＨｉｇｈサンプル（それぞれ６サンプルずつ）を用いて実験を行った。
【００７６】
細胞をナノフィルターに捕捉した後、まず緑色（ＣＤ４陽性Ｔ細胞）及び黄色（ＣＤ８陽性Ｔ細胞）で染色された細胞を蛍光顕微鏡によって計測した。その後、本発明の実施例に係る分析装置を用いて、ナノフィルター全体領域を対象として細胞数を計測し、ＣＤ４／ＣＤ８比を算出して、蛍光顕微鏡観察結果と比較した。その結果、両者の高い相関性を得ることができた（図４Ａ）。この結果から、本発明の実施例に係る分析装置を用いてデュアルカラーイメージング（ｄｕａｌ  ｃｏｌｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ）による、蛍光顕微鏡と同等の精度でＣＤ４／ＣＤ８比の算出が可能でることが確認された。また、本発明の実施例に係る分析装置を用いてＣＤ４／ＣＤ８比を算出した結果、期待値と同等の値を得ることができた（図４Ｂ）。この結果から、本発明の実施例に係る分析装置を用いてＡＩＤＳ治療開始基準（ＣＤ４陽性Ｔ細胞の数が３５０ｃｅｌｌｓ／μｌ未満、またはＣＤ４／ＣＤ８＜１）に基づいたＣＤ４陽性Ｔ細胞数のＨｉｇｈ／Ｌｏｗ判定が可能であることが検証された。
【００７７】
〔９．検証実験４〕
血液サンプル１μｌの白血球（１０３〜１０４ｃｅｌｌｓ）を本発明の実施例に係るナノフィルターに捕捉し、本発明の実施例に係る分析装置を用いて計測した結果の値を用いて実験を行った。
【００７８】
対照群は、従来のＣＤ４陽性Ｔ細胞計測方法であるフリーサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で計測した結果の値とした。その結果、図７の結果を得ることができた。図７に示すように、従来の方法であるフローサイトメトリー方法の結果値との差があまり大きくないことを確認することができる。このような結果は、本発明の実施例に係る分析装置は、ＡＩＤＳの適切な治療開始の判定及び治療後の効果的なモニタリングが可能であることを示す。
【００７９】
以上、本明細書には、本発明を当業者が容易に理解し再現することができるように、図示した実施例を参考に説明されたが、これ例示的なものに過ぎず、当業者であれば、本発明の実施例から様々な変形及び均等な他の実施例が可能であるという点を理解するだろう。よって、本発明の保護範囲は特許請求の範囲によって定められるべきである。
【図１ａ】
2019516117.tif 000003
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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