(57)【要約】本発明は、部分的に、新規ＵＳＰ１０バイオマーカーおよびモジュレーターの同定、ならびにＡＭＬを同定、評価、予防および処置するための、その使用方法に基づく。急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）に罹患した対象を処置する方法であって、少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を阻害する薬剤を該対象に投与し、これにより、該ＡＭＬに罹患した該対象を処置するステップを含み、必要に応じて、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される、方法。
2019534321.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）に罹患した対象を処置する方法であって、少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を阻害する薬剤を該対象に投与し、これにより、該ＡＭＬに罹患した該対象を処置するステップを含み、必要に応じて、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される、方法。
【請求項２】
前記薬剤が、薬学的に許容される製剤で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記薬剤が、前記少なくとも１種のバイオマーカーに直接的に結合し、必要に応じて、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーが、ヒトＵＳＰ１０またはそのオーソログである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１種のさらなる抗がん剤を投与するステップをさらに含み、必要に応じて、該少なくとも１種のさらなる抗がん剤が、表２に列挙されている少なくとも１種のバイオマーカーのコピー数、量および／または活性を阻害する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長を阻害する方法であって、少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を阻害する薬剤と該ＡＭＬ細胞を接触させ、これにより、該ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長を阻害するステップを含み、必要に応じて、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される、方法。
【請求項７】
前記接触させるステップを、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行い、必要に応じて、前記ＡＭＬ細胞が死滅する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が、薬学的に許容される製剤で投与される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記薬剤が、前記少なくとも１種のバイオマーカーに直接的に結合し、必要に応じて、前記ＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーが、ヒトＵＳＰ１０またはそのオーソログである、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１種のさらなる抗がん剤を投与するステップをさらに含み、必要に応じて、該少なくとも１種のさらなる抗がん剤が、表２に列挙されている少なくとも１種のバイオマーカーのコピー数、量および／または活性を阻害する、請求項６から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＡＭＬに罹患したまたはＡＭＬを発症する危険性がある対象が、ＵＳＰ１０阻害剤療法から利益を得るかどうかを決定する方法であって、
ａ）該対象から生体試料を得るステップと、
ｂ）対象試料における少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を決定するステップであって、必要に応じて、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーからなる群から選択される、ステップと、
ｃ）対照における該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を決定するステップと、
ｄ）ステップｂ）およびｃ）において検出された該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を比較するステップと
を含み、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの該対照コピー数、量および／または活性と比べた、該対象試料における該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性の存在または有意な増加が、該ＡＭＬに罹患したまたは該ＡＭＬを発症する危険性がある該対象が、ＵＳＰ１０阻害剤療法から利益を得ることを示す、方法。
【請求項１３】
前記ＡＭＬが、ＵＳＰ１０阻害剤療法から利益を得ると決定される場合、ＵＳＰ１０阻害剤療法を推奨するか、処方するか、または施行するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＡＭＬが、ＵＳＰ１０阻害剤療法から利益を得ないと決定される場合、ＵＳＰ１０阻害剤療法以外の抗ＡＭＬ療法を推奨するか、処方するか、または施行するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗ＡＭＬ療法が、標的化療法、化学療法、放射線療法および／またはホルモン療法からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対照試料が、前記患者または該患者が属する同じ種のメンバーのいずれかに由来するがん性または非がん性試料から決定される、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対照試料が、細胞を含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
臨床的有用率、死亡までの生存期間、病理学的完全奏効、病理的応答の半定量的尺度、臨床的完全寛解、臨床的部分寛解、臨床的安定疾患、無再発生存期間、無転移生存期間、無病生存期間、循環腫瘍細胞減少、循環マーカー応答およびＲＥＣＩＳＴ基準からなる群から選択される少なくとも１種の基準によって測定される、ＵＳＰ１０阻害剤療法に対する応答性を決定するステップをさらに含む、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
対象におけるＡＭＬを処置するための薬剤の有効性を評価する方法であって、
ａ）第１の対象試料において、該薬剤の存在下で維持された、少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量または活性を検出するステップであって、必要に応じて、該ＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される、ステップと、
ｂ）第２の対象試料において、該被験化合物の非存在下で維持された、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を検出するステップと、
ｃ）ステップａ）およびｂ）由来の該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を比較するステップであって、該第２の対象試料と比べた、該第１の対象試料における該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの有意に増加したコピー数、量および／または活性が、該薬剤が、該対象における該ＡＭＬを処置することを示す、ステップと
を含む方法。
【請求項２０】
対象におけるＡＭＬの進行をモニタリングする方法であって、
ａ）対象試料において、第１の時点において、少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を検出するステップであって、必要に応じて、該ＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される、ステップと、
ｂ）治療剤の投与後の少なくとも１つのその後の時点において、ステップａ）を反復するステップと、
ｃ）ステップａ）およびｂ）において検出されたコピー数、量および／または活性を比較するステップであって、少なくとも１種のその後の対象試料と比べた、該第１の対象試料における該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの有意に増加したコピー数、量および／または活性が、該薬剤が、該対象における該ＡＭＬを処置することを示す、ステップと
を含む方法。
【請求項２１】
前記第１の時点と前記その後の時点との間に、前記対象が、処置を受けている、処置を完了している、および／または前記ＡＭＬが寛解している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の時点と前記その後の時点との間に、前記対象が、ＵＳＰ１０阻害剤療法を受けている、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１のおよび／または少なくとも１種のその後の試料が、ｅｘ  ｖｉｖｏ試料およびｉｎ  ｖｉｖｏ試料からなる群から選択される、請求項２０から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のおよび／または少なくとも１種のその後の試料が、ＡＭＬの動物モデルから得られる、請求項２０から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１のおよび／または少なくとも１種のその後の試料が、前記対象から得られる単一の試料またはプールされた試料の部分である、請求項２０から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長および／またはＡＭＬ細胞死をモジュレートする薬剤を同定するための細胞に基づく方法であって、
ａ）被験薬剤と、少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーを発現する細胞を接触させるステップであって、必要に応じて、該ＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される、ステップと
ｂ）該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、発現レベルまたは活性レベルに対する該被験薬剤の効果を決定して、これにより、ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長および／またはＡＭＬ細胞死をモジュレートする薬剤を同定するステップと
を含む方法。
【請求項２７】
前記細胞が、ＡＭＬの動物モデルから単離される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、ＡＭＬに罹患した対象に由来する、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、ＵＳＰ１０阻害剤療法に対して非応答性である、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記接触させるステップを、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行い、必要に応じて、前記薬剤が、ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長を阻害する、および／またはＡＭＬ細胞死を促進する、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、発現レベルまたは活性レベルに対する前記被験薬剤の効果を決定する前または後に、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーに結合する該被験薬剤の能力を決定するステップをさらに含み、必要に応じて、該薬剤が、ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長を阻害する、および／またはＡＭＬ細胞死を促進する、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料が、前記対象から得られる細胞、細胞系、組織学的スライド、パラフィン包埋組織、新鮮凍結組織、新鮮組織、生検、血液、血漿、血清、口腔内切屑、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、粘液または骨髄を含む、請求項１２から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長を阻害する、および／またはＡＭＬ細胞死を促進する薬剤を同定するための無細胞の方法であって、
ａ）被験薬剤と接触した、少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの量または活性に対する被験薬剤の効果を決定するステップであって、必要に応じて、該ＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される、ステップと、
ｂ）該被験薬剤の非存在下で維持された該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの量または活性を決定するステップと、
ｃ）ステップａ）およびｂ）由来の該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの量および／または活性を比較するステップであって、ステップｂ）と比べた、ステップａ）における該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの有意に減少した量および／または活性が、ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長を阻害する、および／またはＡＭＬ細胞死を促進する薬剤として該被験薬剤を同定する、ステップと
を含む方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの量または活性に対する前記被験薬剤の効果を決定する前または後に、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーに結合する該被験薬剤の能力を決定するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記被験薬剤と、前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーを発現するＡＭＬ細胞を接触させて、接触するステップを含む、ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長を阻害する、および／またはＡＭＬ細胞死を促進する該被験薬剤の能力を確認するステップをさらに含む、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記コピー数が、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ハイスループットシークエンシング、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）または蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって評価される、請求項１２から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの量が、前記試料における、該バイオマーカーをコードするポリヌクレオチド分子または該ポリヌクレオチド分子の部分の存在を検出することにより評価される、請求項１２から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ポリヌクレオチド分子が、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはその機能的改変体もしくは断片である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記検出するステップが、前記ポリヌクレオチド分子を増幅するステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記少なくとも１種のバイオマーカーの量が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、該１種もしくは複数種のバイオマーカーをコードする前記ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチド分子の部分の前記試料と核酸プローブをアニールすることにより評価される、請求項１２から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１種のバイオマーカーの量が、前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのポリペプチドの存在を検出することにより評価される、請求項１２から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリペプチドの存在が、該ポリペプチドと特異的に結合する試薬を使用して検出される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記試薬が、抗体、抗体誘導体および抗体断片からなる群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの活性が、前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの少なくとも１種の下流標的の活性または発現レベルのモジュレーションの大きさを決定することにより評価される、請求項１２から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの前記少なくとも１種の下流標的が、ヒトＦＬＴ３またはそのオーソログである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ヒトＦＬＴ３またはそのオーソログが、表２に列挙されているバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１種のヒトＦＬＴ３である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＵＳＰ１０阻害剤療法または被験薬剤が、小分子、抗ＵＳＰ１０イントラボディまたはその抗原結合性断片、アンチセンス核酸、干渉ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉｗｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、ゲノム編集、ドミナントネガティブタンパク質結合パートナー、およびこれらの組合せからなる群から選択される阻害剤である、請求項１から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＵＳＰ１０阻害剤療法または被験薬剤が、小分子である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記小分子が、図１〜２２および表８に列挙されている小分子からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＵＳＰ１０阻害剤療法または被験薬剤が、ハイスループットスクリーニングにおいて同定される、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＵＳＰ１０阻害剤療法または被験薬剤が、ＵＳＰ７の活性または発現レベルも阻害する、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＵＳＰ１０阻害剤療法または被験薬剤が、ｐ５３の活性または発現レベルを阻害しない、請求項１から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれよりも多いＵＳＰ１０バイオマーカーである、請求項１から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＵＳＰ１０阻害剤療法または被験薬剤が、ＵＳＰ１０の少なくとも１種の下流標的の活性または発現レベルをモジュレートする、請求項１から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
ＵＳＰ１０の前記少なくとも１種の下流標的の活性または発現レベルが減少する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＵＳＰ１０の前記少なくとも１種の下流標的が、ヒトＦＬＴ３またはそのオーソログである、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ヒトＦＬＴ３またはそのオーソログが、表２に列挙されているバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１種のヒトＦＬＴ３である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＡＭＬが、成人ＡＭＬまたは小児ＡＭＬである、請求項１から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記対象が、哺乳動物である、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記哺乳動物が、ＡＭＬの動物モデルである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年９月２０日に出願された米国仮出願第６２／３９７，１００号の利益を主張する；上記出願の全体の内容は、この参照によってその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、成人における最も一般的な種類の急性白血病である。全体的に見て、現在の化学療法による生存は、僅か２０〜４０％であり、これは加齢と共に着実に減退する。シークエンシング研究は、ＡＭＬゲノム当たりの癌遺伝子の数が、上皮性腫瘍と比較して相対的に少なく、大部分の患者が、２〜１０個の同定可能な変異を有することを示した。変異は典型的に、造血系分化を調節する、クロマチン構造を変更する、または増殖を誘導してアポトーシスを阻害する遺伝子が関与する。最も一般的な遺伝的変更は全般的に、その正常機能が造血の制御にある遺伝子である、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）が関与する。正常細胞において、ＦＬＴ３細胞外ドメインへのＦＬＴ３リガンドの結合に応答して、ＦＬＴ３は、ホモ二量体化し、自己リン酸化し、造血細胞のアポトーシス、増殖および分化に関与する下流エフェクターを活性化する。造血の調節であるＦＬＴ３の主要機能と一致して、ＦＬＴ３ノックアウトマウスは、生存可能であるが、血液学的異常を有する。
【０００３】
ＡＭＬ患者の約３０％が、ＦＬＴ３遺伝子を構成的に活性化する変異を有する。最も一般的な種類のＦＬＴ３変異は、顕著に低下した生存期間に関連する、ＡＭＬ患者の２０〜２５％に観察される膜近傍ドメイン内の縦列重複をもたらす（遺伝子内縦列重複、ＩＴＤ）（Levis（２０１３年）ASH  Edu.  Book  ２０１３年：２２０〜２２６頁）。患者の追加の７％は、ＦＬＴ３の「活性化ループ」内に点変異を有し、ＦＬＴ３をこの疾患における最も一般的に変異された遺伝子にする（Levis（２０１３年）ASH  Edu.  Book  ２０１３年：２２０〜２２６頁）。
【０００４】
ＳＵ１１２４８、ＳＵ５４１６、ＣＥＰ−７０１およびＰＫＣ４１２（ミドスタウリン）を含むいくつかのＦＬＴ３キナーゼドメイン阻害剤は、単剤として投与された場合に、再発したＡＭＬ患者の臨床治験において部分的で通常短時間の寛解を誘導することが示された（Weisbergら（２００９年）Drug  Resist.  Updates  １２巻：８１〜８９頁）。しかし、新たに診断された患者の大規模治験において、ミドスタウリンは、標準化学療法と組み合わされた場合、生存期間を増加させることが示された。この治験（ＲＡＴＩＦＹ（ＣＡＬＧＢ  １０６０３））は、ミドスタウリンとプラセボとの間にランダム化した、ＦＬＴ３変異を有する７１７名のＡＭＬ患者を登録した。全生存期間は、プラセボアームと比較して、ミドスタウリンアームにおいて増加した（２６．０カ月間に対して７４．７カ月間；ｐ＝０．００７）（Stoneら（２０１５年）「The  Multi-Kinase  Inhibitor  Midostaurin  (M)  Prolongs  Survival  Compared  with  Placebo  (P)  in  Combination  with  Daunorubicin  (D)/Cytarabine  (C)  Induction  (ind),  High-Dose  C  Consolidation  (consol),  and  As  Maintenance  (maint)  Therapy  in  Newly  Diagnosed  Acute  Myeloid  Leukemia  (AML)  Patients  (pts)  Age  18-60  with  FLT3  Mutations  (muts):  An  International  Prospective  Randomized  (rand)  P-Controlled  Double-Blind  Trial  (CALGB  10603/RATIFY  [Alliance])」ASH  57th  Annual  Meeting  &  Exposition、Plenary;  Program:  General  Sessions;  Session:  Plenary  Scientific  Session（２０１５年１２月６日））。この研究は、特に、ＦＬＴ３の阻害が、少なくとも、ＦＬＴ３遺伝子に変異を有する患者において重要となりうるという概念を支持する。他の受容体チロシンキナーゼに当てはまるように、リガンド結合によって加速されると考えられる、ＦＬＴ３の合成および分解が進行している。しかし、ＡＭＬにおける受容体恒常性の詳細は、十分に研究されたとは言えない。薬物耐性は、新たに診断されたＡＭＬを有する一部の患者および進行型の疾患を有する実際上全ての患者において発症するため、ＦＬＴ３を標的とするさらなる戦略には価値があるはずである。したがって、ＡＭＬなどのがんの同定、評価、予防および処置に有用な、新たながん関連標的およびバイオマーカーを同定する必要が大いにある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Levis（２０１３年）ASH  Edu.  Book  ２０１３年：２２０〜２２６頁
【非特許文献２】Weisbergら（２００９年）Drug  Resist.  Updates  １２巻：８１〜８９頁
【非特許文献３】Stoneら（２０１５年）「The  Multi-Kinase  Inhibitor  Midostaurin  (M)  Prolongs  Survival  Compared  with  Placebo  (P)  in  Combination  with  Daunorubicin  (D)/Cytarabine  (C)  Induction  (ind),  High-Dose  C  Consolidation  (consol),  and  As  Maintenance  (maint)  Therapy  in  Newly  Diagnosed  Acute  Myeloid  Leukemia  (AML)  Patients  (pts)  Age  18-60  with  FLT3  Mutations  (muts):  An  International  Prospective  Randomized  (rand)  P-Controlled  Double-Blind  Trial  (CALGB  10603/RATIFY  [Alliance])」ASH  57th  Annual  Meeting  &  Exposition、Plenary;  Program:  General  Sessions;  Session:  Plenary  Scientific  Session（２０１５年１２月６日）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、少なくとも部分的に、キナーゼ阻害とは対照的にまたはこれに加えてＦＬＴ３分解に焦点が置かれている処置法が、ＦＬＴ３によって駆動されるがんの処置に有用であるという発見に基づく。例えば、ＡＭＬにおいて最も一般的に変異する遺伝子であるＦＬＴ３は、予後不良に関連する。ＦＬＴ３キナーゼ阻害剤は、活性化ＦＬＴ３変異を有する急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）に対して有意な臨床活性を提示する。しかし、薬物耐性は、急速に発症することが多い。モデル系において、薬物処置は、臨床薬物耐性に寄与しうる、ＦＬＴ３タンパク質の代償性増加をもたらす。ＦＬＴ３と直接的に相互作用する脱ユビキチン化酵素ＵＳＰ１０の遺伝的ノックダウン（ＫＤ）または薬理学的阻害が、ＦＬＴ３分解を引き起こし、ＦＬＴ３変異体陽性ＡＭＬ細胞生存を低下させることが本明細書において決定された。これらの結果は、新たなＦＬＴ３調節因子としてＵＳＰ１０を同定し、ＡＭＬに対する代替および補完的療法を提供する。重要なことに、この結果は、脱ユビキチン化（ＤＵＢ）酵素によるＡＭＬ変異体ドライバータンパク質の安定化を裏付ける。本発明の方法は、ＦＬＴ３の酵素機能および足場機能の両方を同時に遮断し、一部のキナーゼ阻害剤に関連するＦＬＴ３タンパク質または耐性点変異の代償性増加を遮断することができる。
【０００７】
１つの態様では、急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）に罹患した対象を処置する方法が提供され、この方法は、少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を阻害する薬剤を該対象に投与し、これにより、該ＡＭＬに罹患した該対象を処置するステップを含み、必要に応じて、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される。
【０００８】
本発明の任意の態様に適用することができる、および／または本明細書に記載されている任意の他の実施形態と組み合わせることができる、多数の実施形態がさらに提供される。例えば、一実施形態では、上記薬剤は、薬学的に許容される製剤で投与される。別の実施形態では、上記薬剤は、上記少なくとも１種のバイオマーカーに直接的に結合し、必要に応じて、ここで上記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーは、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される。また別の実施形態では、上記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーは、ヒトＵＳＰ１０またはそのオーソログである。さらに別の実施形態では、本方法は、少なくとも１種のさらなる抗がん剤を投与するステップをさらに含み、必要に応じて、上記少なくとも１種のさらなる抗がん剤は、表２に列挙されている少なくとも１種のバイオマーカーのコピー数、量および／または活性を阻害する。
【０００９】
別の態様では、ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長を阻害する方法が提供され、この方法は、少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を阻害する薬剤と該ＡＭＬ細胞を接触させ、これにより、該ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長を阻害するステップを含み、必要に応じて、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される。
【００１０】
上記の通り、本発明の任意の態様に適用することができる、および／または本明細書に記載されている任意の他の実施形態と組み合わせることができる、多数の実施形態がさらに提供される。例えば、一実施形態では、接触させるステップを、必要に応じて、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行い、ここでＡＭＬ細胞は死滅する。別の実施形態では、上記薬剤は、薬学的に許容される製剤で投与される。また別の実施形態では、上記薬剤は、上記少なくとも１種のバイオマーカーに直接的に結合し、必要に応じて、上記ＵＳＰ１０バイオマーカーは、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される。さらに別の実施形態では、上記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーは、ヒトＵＳＰ１０またはそのオーソログである。別の実施形態では、本方法は、少なくとも１種のさらなる抗がん剤を投与するステップをさらに含み、任意選択で、該少なくとも１種のさらなる抗がん剤は、表２に列挙されている少なくとも１種のバイオマーカーのコピー数、量および／または活性を阻害する。
【００１１】
さらに別の態様では、ＡＭＬに罹患したまたはＡＭＬを発症する危険性がある対象が、ＵＳＰ１０阻害剤療法から利益を得るかどうかを決定する方法が提供され、この方法は、ａ）該対象から生体試料を得るステップと、ｂ）対象試料における少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を決定するステップであって、必要に応じて、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーからなる群から選択される、ステップと、ｃ）対照における該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を決定するステップと、ｄ）ステップｂ）およびｃ）において検出された該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を比較するステップとを含み、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの該対照コピー数、量および／または活性と比べた、該対象試料における該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性の存在または有意な増加が、該ＡＭＬに罹患したまたは該ＡＭＬを発症する危険性がある該対象が、ＵＳＰ１０阻害剤療法から利益を得ることを示す。一つの実施形態では、上記方法は、前記ＡＭＬが、ＵＳＰ１０阻害剤療法から利益を得ると決定される場合、ＵＳＰ１０阻害剤療法を推奨するか、処方するか、または施行するステップをさらに含む。別の実施形態では、上記方法は、前記ＡＭＬが、ＵＳＰ１０阻害剤療法から利益を得ないと決定される場合、ＵＳＰ１０阻害剤療法以外の抗ＡＭＬ療法を推奨するか、処方するか、または施行するステップをさらに含む。さらに別の実施形態では、前記抗ＡＭＬ療法が、標的化療法、化学療法、放射線療法および／またはホルモン療法からなる群から選択される。なお別の実施形態では、前記対照試料が、前記患者または該患者が属する同じ種のメンバーのいずれかに由来するがん性または非がん性試料から決定される。別の実施形態では、前記対照試料が、細胞を含む。さらに別の実施形態では、上記方法は、臨床的有用率、死亡までの生存期間、病理学的完全奏効、病理的応答の半定量的尺度、臨床的完全寛解、臨床的部分寛解、臨床的安定疾患、無再発生存期間、無転移生存期間、無病生存期間、循環腫瘍細胞減少、循環マーカー応答およびＲＥＣＩＳＴ基準からなる群から選択される少なくとも１種の基準によって測定される、ＵＳＰ１０阻害剤療法に対する応答性を決定するステップをさらに含む。
【００１２】
なお別の態様では、対象におけるＡＭＬを処置するための薬剤の有効性を評価する方法が提供され、この方法は、ａ）第１の対象試料において、該薬剤の存在下で維持された、少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量または活性を検出するステップであって、必要に応じて、該ＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される、ステップと、ｂ）第２の対象試料において、該被験化合物の非存在下で維持された、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を検出するステップと、ｃ）ステップａ）およびｂ）由来の該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を比較するステップであって、該第２の対象試料と比べた、該第１の対象試料における該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの有意に増加したコピー数、量および／または活性が、該薬剤が、該対象における該ＡＭＬを処置することを示す、ステップとを含む。
【００１３】
別の態様では、対象におけるＡＭＬの進行をモニタリングする方法が提供され、この方法は、ａ）対象試料において、第１の時点において、少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、量および／または活性を検出するステップであって、必要に応じて、該ＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される、ステップと、ｂ）治療剤の投与後の少なくとも１つのその後の時点において、ステップａ）を反復するステップと、ｃ）ステップａ）およびｂ）において検出されたコピー数、量および／または活性を比較するステップであって、少なくとも１種のその後の対象試料と比べた、該第１の対象試料における該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの有意に増加したコピー数、量および／または活性が、該薬剤が、該対象における該ＡＭＬを処置することを示す、ステップとを含む。１つの実施形態では、前記第１の時点と前記その後の時点との間に、前記対象が、処置を受けている、処置を完了している、および／または前記ＡＭＬが寛解している。別の実施形態では、前記第１の時点と前記その後の時点との間に、前記対象が、ＵＳＰ１０阻害剤療法を受けている。さらに別の実施形態では、前記第１のおよび／または少なくとも１種のその後の試料が、ｅｘ  ｖｉｖｏ試料およびｉｎ  ｖｉｖｏ試料からなる群から選択される。なお別の実施形態では、前記第１のおよび／または少なくとも１種のその後の試料が、ＡＭＬの動物モデルから得られる。別の実施形態では、前記第１のおよび／または少なくとも１種のその後の試料が、前記対象から得られる単一の試料またはプールされた試料の部分である。
【００１４】
さらに別の態様では、ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長および／またはＡＭＬ細胞死をモジュレートする薬剤を同定するための細胞に基づく方法が提供され、この方法は、ａ）被験薬剤と、少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーを発現する細胞を接触させるステップであって、必要に応じて、該ＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される、ステップと、ｂ）該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、発現レベルまたは活性レベルに対する該被験薬剤の効果を決定して、これにより、ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長および／またはＡＭＬ細胞死をモジュレートする薬剤を同定するステップとを含む。１つの実施形態では、前記細胞が、ＡＭＬの動物モデルから単離される。さらに別の実施形態では、前記細胞が、ＡＭＬに罹患した対象に由来する。なお別の実施形態では、前記細胞が、ＵＳＰ１０阻害剤療法に対して非応答性である。別の実施形態では、前記接触させるステップを、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行い、必要に応じて、前記薬剤が、ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長を阻害する、および／またはＡＭＬ細胞死を促進する。さらに別の態様では、さらに別の実施形態では、前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのコピー数、発現レベルまたは活性レベルに対する前記被験薬剤の効果を決定する前または後に、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーに結合する該被験薬剤の能力を決定するステップをさらに含み、必要に応じて、該薬剤が、ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長を阻害する、および／またはＡＭＬ細胞死を促進する。なお別の実施形態では、前記試料が、前記対象から得られる細胞、細胞系、組織学的スライド、パラフィン包埋組織、新鮮凍結組織、新鮮組織、生検、血液、血漿、血清、口腔内切屑、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、粘液または骨髄を含む。
【００１５】
なお別の態様では、ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長を阻害する、および／またはＡＭＬ細胞死を促進する薬剤を同定するための無細胞の方法が提供され、この方法は、ａ）被験薬剤と接触した、少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの量または活性に対する被験薬剤の効果を決定するステップであって、必要に応じて、該ＵＳＰ１０バイオマーカーが、表１に列挙されているＵＳＰ１０バイオマーカーの群から選択される、ステップと、ｂ）該被験薬剤の非存在下で維持された該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの量または活性を決定するステップと、ｃ）ステップａ）およびｂ）由来の該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの量および／または活性を比較するステップであって、ステップｂ）と比べた、ステップａ）における該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの有意に減少した量および／または活性が、ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長を阻害する、および／またはＡＭＬ細胞死を促進する薬剤として該被験薬剤を同定する、ステップとを含む。１つの実施形態では、上記方法は、前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの量または活性に対する前記被験薬剤の効果を決定する前または後に、該少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーに結合する該被験薬剤の能力を決定するステップをさらに含む。別の実施形態では、上記方法は、前記被験薬剤と、前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーを発現するＡＭＬ細胞を接触させるステップを含む、ＡＭＬ細胞の過剰増殖性成長を阻害する、および／またはＡＭＬ細胞死を促進する該被験薬剤の能力を確認するステップをさらに含む。
【００１６】
上記の通り、本発明の任意の態様に適用することができる、および／または本明細書に記載されている任意の他の実施形態と組み合わせることができる、多数の実施形態がさらに提供される。例えば、１つの実施形態では、前記コピー数が、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ハイスループットシークエンシング、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）または蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって評価される。別の実施形態では、前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの量が、前記試料における、該バイオマーカーをコードするポリヌクレオチド分子または該ポリヌクレオチド分子の部分の存在を検出することにより評価される。さらに別の実施形態では、前記ポリヌクレオチド分子が、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはその機能的改変体もしくは断片である。なお別の実施形態では、前記検出するステップが、前記ポリヌクレオチド分子を増幅するステップをさらに含む。別の実施形態では、前記少なくとも１種のバイオマーカーの量が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、該１種もしくは複数種のバイオマーカーをコードする前記ポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチド分子の部分の前記試料と核酸プローブをアニールすることにより評価される。さらに別の実施形態では、前記少なくとも１種のバイオマーカーの量が、前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーのポリペプチドの存在を検出することにより評価される。なお別の実施形態では、前記ポリペプチドの存在が、該ポリペプチドと特異的に結合する試薬を使用して検出される。別の実施形態では、前記試薬が、抗体、抗体誘導体および抗体断片からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの活性が、前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの少なくとも１種の下流標的の活性または発現レベルのモジュレーションの大きさを決定することにより評価される。なお別の実施形態では、前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーの前記少なくとも１種の下流標的が、ヒトＦＬＴ３またはそのオーソログである。別の実施形態では、前記ヒトＦＬＴ３またはそのオーソログが、表２に列挙されているバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１種のヒトＦＬＴ３である。
【００１７】
一部の実施形態では、前記ＵＳＰ１０阻害剤療法または被験薬剤が、小分子、アンチセンス核酸、干渉ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉｗｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、ゲノム編集、ドミナントネガティブタンパク質結合パートナー、およびこれらの組合せからなる群から選択される阻害剤である。なお別の実施形態では、前記ＵＳＰ１０阻害剤療法または被験薬剤が、小分子である。別の実施形態では、前記小分子が、図１〜２２および表８に列挙されている小分子からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、前記ＵＳＰ１０阻害剤療法または被験薬剤が、ハイスループットスクリーニングにおいて同定される。なお別の実施形態では、前記ＵＳＰ１０阻害剤療法または被験薬剤が、ＵＳＰ７の活性または発現レベルも阻害する。別の実施形態では、前記ＵＳＰ１０阻害剤療法または被験薬剤が、ｐ５３の活性または発現レベルを阻害しない。さらに別の実施形態では、前記少なくとも１種のＵＳＰ１０バイオマーカーが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれよりも多いＵＳＰ１０バイオマーカーである。なお別の実施形態では、前記ＵＳＰ１０阻害剤療法または被験薬剤が、ＵＳＰ１０の少なくとも１種の下流標的の活性または発現レベルをモジュレートする。別の実施形態では、ＵＳＰ１０の前記少なくとも１種の下流標的の活性または発現レベルが減少する。さらに別の実施形態では、ＵＳＰ１０の前記少なくとも１種の下流標的が、ヒトＦＬＴ３またはそのオーソログである。なお別の実施形態では、前記ヒトＦＬＴ３またはそのオーソログが、表２に列挙されているバイオマーカーからなる群から選択される少なくとも１種のヒトＦＬＴ３である。別の実施形態では、前記ＡＭＬが、成人ＡＭＬまたは小児ＡＭＬである。さらに別の実施形態では、前記対象が、哺乳動物（例えば、ＡＭＬの動物モデルまたはヒト）である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１は、変異体ＦＬＴ３発現細胞に対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪとして同定される１０個のパネルを含む。パネルＡは、変異体ＦＬＴ３の新規調節因子の同定のためのスクリーニング戦略を示す。パネルＢは、５μＭのスクリーニング濃度を使用したＤＵＢ阻害剤のスクリーニングにおいて同定された、変異体ＦＬＴ３発現細胞を有効に死滅させることができる、ＨＢＸ１９８１８の化学構造を示す。パネルＣ〜Ｄは、７２時間処置後の、２０％ＷＥＨＩ馴化培地（ＩＬ−３の供給源として使用）の非存在または存在下で培養されたＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ（パネルＣ）細胞およびＢａ／Ｆ３−Ｄ８３５Ｙ（パネルＤ）細胞に対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＥは、約２２時間処置後のＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞およびＢａ／Ｆ３−Ｄ８３５Ｙ細胞に対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＦおよびＧは、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞（パネルＦ）およびＢａ／Ｆ３−Ｄ８３５Ｙ細胞（パネルＧ）におけるＦＬＴ３タンパク質発現に対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＨは、Ｂａ／Ｆ３−ｗｔＦＬＴ３細胞におけるＦＬＴ３タンパク質レベルに対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＩは、２４時間処置後の、２０μＭの濃度における、ヌルＦＬＴ３またはｗｔ  ＦＬＴ３発現白血病細胞と比較した、ＨＢＸ１９８１８処置した変異体ＦＬＴ３陽性ＭＶ４，１１、ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞およびＭＯＬＭ１４細胞の増殖の解析を示す。パネルＪは、ＨＢＸ１９８１８で処置したＡＭＬ細胞系におけるミトコンドリアプライミングを示す。ミトコンドリアプライミングは、薬物曝露１４ｈ（時間）後の、Ｂｉｍペプチドに応答したチトクロムｃ放出を測定することにより検出された。プライミングの％変化  ＝  ＤＭＳＯ処置細胞のプライミング  −  薬物処置細胞のプライミング。本明細書に示すイムノブロットは、同様の結果が観察された１〜２回の追加の研究を代表する。
【図１Ｂ−Ｇ】図１は、変異体ＦＬＴ３発現細胞に対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪとして同定される１０個のパネルを含む。パネルＡは、変異体ＦＬＴ３の新規調節因子の同定のためのスクリーニング戦略を示す。パネルＢは、５μＭのスクリーニング濃度を使用したＤＵＢ阻害剤のスクリーニングにおいて同定された、変異体ＦＬＴ３発現細胞を有効に死滅させることができる、ＨＢＸ１９８１８の化学構造を示す。パネルＣ〜Ｄは、７２時間処置後の、２０％ＷＥＨＩ馴化培地（ＩＬ−３の供給源として使用）の非存在または存在下で培養されたＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ（パネルＣ）細胞およびＢａ／Ｆ３−Ｄ８３５Ｙ（パネルＤ）細胞に対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＥは、約２２時間処置後のＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞およびＢａ／Ｆ３−Ｄ８３５Ｙ細胞に対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＦおよびＧは、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞（パネルＦ）およびＢａ／Ｆ３−Ｄ８３５Ｙ細胞（パネルＧ）におけるＦＬＴ３タンパク質発現に対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＨは、Ｂａ／Ｆ３−ｗｔＦＬＴ３細胞におけるＦＬＴ３タンパク質レベルに対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＩは、２４時間処置後の、２０μＭの濃度における、ヌルＦＬＴ３またはｗｔ  ＦＬＴ３発現白血病細胞と比較した、ＨＢＸ１９８１８処置した変異体ＦＬＴ３陽性ＭＶ４，１１、ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞およびＭＯＬＭ１４細胞の増殖の解析を示す。パネルＪは、ＨＢＸ１９８１８で処置したＡＭＬ細胞系におけるミトコンドリアプライミングを示す。ミトコンドリアプライミングは、薬物曝露１４ｈ（時間）後の、Ｂｉｍペプチドに応答したチトクロムｃ放出を測定することにより検出された。プライミングの％変化  ＝  ＤＭＳＯ処置細胞のプライミング  −  薬物処置細胞のプライミング。本明細書に示すイムノブロットは、同様の結果が観察された１〜２回の追加の研究を代表する。
【図１Ｈ−Ｊ】図１は、変異体ＦＬＴ３発現細胞に対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪとして同定される１０個のパネルを含む。パネルＡは、変異体ＦＬＴ３の新規調節因子の同定のためのスクリーニング戦略を示す。パネルＢは、５μＭのスクリーニング濃度を使用したＤＵＢ阻害剤のスクリーニングにおいて同定された、変異体ＦＬＴ３発現細胞を有効に死滅させることができる、ＨＢＸ１９８１８の化学構造を示す。パネルＣ〜Ｄは、７２時間処置後の、２０％ＷＥＨＩ馴化培地（ＩＬ−３の供給源として使用）の非存在または存在下で培養されたＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ（パネルＣ）細胞およびＢａ／Ｆ３−Ｄ８３５Ｙ（パネルＤ）細胞に対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＥは、約２２時間処置後のＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞およびＢａ／Ｆ３−Ｄ８３５Ｙ細胞に対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＦおよびＧは、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞（パネルＦ）およびＢａ／Ｆ３−Ｄ８３５Ｙ細胞（パネルＧ）におけるＦＬＴ３タンパク質発現に対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＨは、Ｂａ／Ｆ３−ｗｔＦＬＴ３細胞におけるＦＬＴ３タンパク質レベルに対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＩは、２４時間処置後の、２０μＭの濃度における、ヌルＦＬＴ３またはｗｔ  ＦＬＴ３発現白血病細胞と比較した、ＨＢＸ１９８１８処置した変異体ＦＬＴ３陽性ＭＶ４，１１、ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞およびＭＯＬＭ１４細胞の増殖の解析を示す。パネルＪは、ＨＢＸ１９８１８で処置したＡＭＬ細胞系におけるミトコンドリアプライミングを示す。ミトコンドリアプライミングは、薬物曝露１４ｈ（時間）後の、Ｂｉｍペプチドに応答したチトクロムｃ放出を測定することにより検出された。プライミングの％変化  ＝  ＤＭＳＯ処置細胞のプライミング  −  薬物処置細胞のプライミング。本明細書に示すイムノブロットは、同様の結果が観察された１〜２回の追加の研究を代表する。
【００１９】
【図２Ａ】図２は、ＵＳＰ１０標的化阻害剤による細胞の処置後のＦＬＴ３レベルの測定を示す、パネルＡおよびＢとして同定される２個のパネルを含む。パネルＡは、ＵＳＰ１０標的化阻害剤によるＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞の約２０時間処置後の、細胞表面ＦＬＴ３発現の測定を示す。Ｃ５９８−０４６６は、ＨＢＸ１９８１８のアナログである。Ｂａ／Ｆ３−ｔｐｏ細胞は、トロンボポエチン（thrombopoitein）（ｔｐｏ）受容体を過剰発現するように操作された増殖因子依存性Ｂａ／Ｆ３細胞である。このような細胞は、ｗｔ  ＦＬＴ３を発現し、発癌性ＦＬＴ３過剰発現Ｂａ／Ｆ３細胞との比較のための対照として本研究で使用される。パネルＢは、Ｂａ／Ｆ３−ｗｔＦＬＴ３細胞におけるＦＬＴ３タンパク質レベルに対するＰ２２０７７の効果を示す。
【図２Ｂ】図２は、ＵＳＰ１０標的化阻害剤による細胞の処置後のＦＬＴ３レベルの測定を示す、パネルＡおよびＢとして同定される２個のパネルを含む。パネルＡは、ＵＳＰ１０標的化阻害剤によるＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞の約２０時間処置後の、細胞表面ＦＬＴ３発現の測定を示す。Ｃ５９８−０４６６は、ＨＢＸ１９８１８のアナログである。Ｂａ／Ｆ３−ｔｐｏ細胞は、トロンボポエチン（thrombopoitein）（ｔｐｏ）受容体を過剰発現するように操作された増殖因子依存性Ｂａ／Ｆ３細胞である。このような細胞は、ｗｔ  ＦＬＴ３を発現し、発癌性ＦＬＴ３過剰発現Ｂａ／Ｆ３細胞との比較のための対照として本研究で使用される。パネルＢは、Ｂａ／Ｆ３−ｗｔＦＬＴ３細胞におけるＦＬＴ３タンパク質レベルに対するＰ２２０７７の効果を示す。
【００２０】
【図３Ａ−Ｄ】図３は、ＵＳＰ１０標的化阻害剤が、アポトーシスのために変異体ＦＬＴ３陽性細胞をプライミングすることを示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧとして同定される７個のパネルを含む。パネルＡ〜Ｄは、ＵＳＰ１０阻害剤処置したＭＶ４，１１細胞（パネルＡ）、ＭＯＬＭ−１４細胞（パネルＢ）、ＭＯＬＭ−１３細胞（パネルＣ）およびＴＨＰ−１細胞（パネルＤ）におけるプライミングと  との間の相関を示す。ミトコンドリアプライミングは、処置１４時間後にＢｉｍペプチドに応答したチトクロムｃ放出を測定することにより検出された。細胞死は、処置７２時間後にアネキシン／ＰＩ染色によって決定された。パネルＥ〜Ｇは、Ｃ５９８−０１０５（パネルＥ）、Ｃ５９８−０５７１（パネルＦ）およびＰ２２０７７（パネルＧ）で処置したＡＭＬ細胞系におけるミトコンドリアプライミングを示す。ミトコンドリアプライミングは、薬物曝露１４時間後にＢｉｍペプチドに応答したチトクロムｃ放出を測定することにより検出された。Δプライミング  ＝  ＤＭＳＯ処置細胞のプライミング  −  薬物処置細胞のプライミング。
【図３Ｅ−Ｇ】図３は、ＵＳＰ１０標的化阻害剤が、アポトーシスのために変異体ＦＬＴ３陽性細胞をプライミングすることを示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧとして同定される７個のパネルを含む。パネルＡ〜Ｄは、ＵＳＰ１０阻害剤処置したＭＶ４，１１細胞（パネルＡ）、ＭＯＬＭ−１４細胞（パネルＢ）、ＭＯＬＭ−１３細胞（パネルＣ）およびＴＨＰ−１細胞（パネルＤ）におけるプライミングと  との間の相関を示す。ミトコンドリアプライミングは、処置１４時間後にＢｉｍペプチドに応答したチトクロムｃ放出を測定することにより検出された。細胞死は、処置７２時間後にアネキシン／ＰＩ染色によって決定された。パネルＥ〜Ｇは、Ｃ５９８−０１０５（パネルＥ）、Ｃ５９８−０５７１（パネルＦ）およびＰ２２０７７（パネルＧ）で処置したＡＭＬ細胞系におけるミトコンドリアプライミングを示す。ミトコンドリアプライミングは、薬物曝露１４時間後にＢｉｍペプチドに応答したチトクロムｃ放出を測定することにより検出された。Δプライミング  ＝  ＤＭＳＯ処置細胞のプライミング  −  薬物処置細胞のプライミング。
【００２１】
【図４Ａ−Ｄ】図４は、ＨＢＸ１９８１８が、変異体ＦＬＴ３のユビキチン化を増加させることを示す、パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤとして同定される４個のパネルを含む。パネルＡは、ＨＢＸ１９８１８処置４時間後の、ＦＬＴ３−ＩＴＤのユビキチン化の解析を示す。パネルＢは、ＨＢＸ１９８１８処置８時間後の、ＦＬＴ３−ＩＴＤのユビキチン化の解析を示す。パネルＣは、ＨＢＸ１９８１８処置２２時間後の、ＦＬＴ３−Ｄ８３５Ｙのユビキチン化の解析を示す。パネルＤは、ＨＢＸ１９８１８処置２２時間後の、ＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３のユビキチン化の解析を示す。
【００２２】
【図５Ａ−Ｃ】図５は、クレノラニブ耐性ＦＬＴ３  Ｆ６９１Ｌ変異体を発現する細胞の成長に対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す、パネルＡ、ＢおよびＣとして同定される３個のパネルを含む。この結果は、クレノラニブ（パネルＡ）またはＨＢＸ１９８１８（パネルＢ）によるＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞またはＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−Ｆ６９１Ｌ細胞の約２日間処置に由来する。パネルＣは、ＨＢＸ１９８１８で処置したＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞のＩＬ−３レスキューを示す。
【００２３】
【図６Ａ−Ｆ】図６は、変異体ＦＬＴ３のリソソーム分解の転写非依存性促進およびＨＢＸ１９８１８のＵＳＰ１０ターゲットエンゲージメント（target  engagement）を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦとして同定される６個のパネルを含む。パネルＡは、リソソーム阻害剤のクロロキン（ＣＱ）によるＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７（ＵＳＰ１０標的化ケモカイン）処置したＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞のレスキューを示す。パネルＢは、処置２２時間後の、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３転写に対するＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７の効果を示す。ＦＬＴ３発現は、ＧＡＰＤＨ発現と比べて示されている。パネルＣは、ＤＵＢプロファイリングデータが、ＨＢＸ１９８１８がＵＳＰ１０に対して最も強い活性を示すことを示すことを示す。ＩＣ５０は、基質としてＫ１１−ジユビキチンを使用して計算された。パネルＤ〜Ｅは、ＨＢＸ１９８１８処置したＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞およびＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３レベルおよびベクリン−１レベルの解析を示す。パネルＦは、ＨＢＸ１９８１８が、細胞においてＵＳＰ１０に結合することを示す。Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞は、表示濃度の化合物で処置され、溶解され、ＨＡ−Ｕｂ−ＶＳと共にインキュベートされた。
【００２４】
【図７Ａ−Ｅ】図７は、ＨＢＸ１９８１８によって誘導されるＦＬＴ３分解のメディエータとしてのＵＳＰ１０の調査結果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＮおよびＯとして同定される１５個のパネルを含む。パネルＡは、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞における外因性に発現されたＦＬＴ３−ＩＴＤと内在性ＵＳＰ１０との会合を示す。パネルＢは、ＵＳＰ１０  ｓｈＲＮＡ感染細胞のピューロマイシン選択後の約１週間後に決定された細胞計数（トリパンブルー排除アッセイ）を示す。パネルＣ〜Ｄは、ＭＯＬＭ１４細胞（パネルＣ）およびＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞（パネルＤ）におけるＦＬＴ３発現およびｐ５３発現に対するそれぞれＨＢＸ１９８１８処置と対比したＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＥは、ＵＳＰ１０が、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｗｔ  ＦＬＴ３よりも広範囲にＦＬＴ３−ＩＴＤを安定化することを示す。図示されているイムノブロットは、同様の結果が観察された３回の独立した実験を代表する。パネルＦは、ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７処置が、２４時間処置後に、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦＬＴ３−ＩＴＤの分解をもたらすことを示す。図示されているイムノブロットは、同様の結果が観察された３回の独立した実験を代表する。パネルＧ〜Ｉは、ＨＢＸ１９８１８が、ｗｔ  ＦＬＴ３よりも広範囲に、ＦＬＴ３−ＩＴＤの半減期を短縮することを示す。パネルＧにおける実験は、同様の結果が観察された３回の独立した実験を代表する（他の２回の実験は、パネルＨおよびパネルＩに示されている）。ＣＨＸ＝シクロヘキシミド；Ｆ／Ｈ  −  Ｆｌａｇ／ＨＡ。パネルＪは、ＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３、ＡＫＴおよびＥＲＫ１／２タンパク質レベルに対するＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＫ〜Ｍは、ｗｔ  ＦＬＴ３発現Ｋ５６２、ＫＵ８１２ＦおよびＵ９３７細胞におけるＦＬＴ３発現に対するＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＮは、ＵＳＰ１０  ｗｔおよび触媒的に不活性なＵＳＰ１０であるＵＳＰ１０Ｃ４２４Ｓを過剰発現するＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３レベルの解析を示す。図示されているイムノブロットは、同様の結果が観察された３回の追加の研究を代表する（パネルＯ）。パネルＯは、ＵＳＰ１０  ｗｔおよび触媒的に不活性なＵＳＰ１０Ｃ４２４Ｓ（「ＵＳＰ１０  ｍｕｔ」）を過剰発現するＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３レベルの解析を示す。
【図７Ｆ−Ｇ】図７は、ＨＢＸ１９８１８によって誘導されるＦＬＴ３分解のメディエータとしてのＵＳＰ１０の調査結果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＮおよびＯとして同定される１５個のパネルを含む。パネルＡは、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞における外因性に発現されたＦＬＴ３−ＩＴＤと内在性ＵＳＰ１０との会合を示す。パネルＢは、ＵＳＰ１０  ｓｈＲＮＡ感染細胞のピューロマイシン選択後の約１週間後に決定された細胞計数（トリパンブルー排除アッセイ）を示す。パネルＣ〜Ｄは、ＭＯＬＭ１４細胞（パネルＣ）およびＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞（パネルＤ）におけるＦＬＴ３発現およびｐ５３発現に対するそれぞれＨＢＸ１９８１８処置と対比したＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＥは、ＵＳＰ１０が、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｗｔ  ＦＬＴ３よりも広範囲にＦＬＴ３−ＩＴＤを安定化することを示す。図示されているイムノブロットは、同様の結果が観察された３回の独立した実験を代表する。パネルＦは、ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７処置が、２４時間処置後に、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦＬＴ３−ＩＴＤの分解をもたらすことを示す。図示されているイムノブロットは、同様の結果が観察された３回の独立した実験を代表する。パネルＧ〜Ｉは、ＨＢＸ１９８１８が、ｗｔ  ＦＬＴ３よりも広範囲に、ＦＬＴ３−ＩＴＤの半減期を短縮することを示す。パネルＧにおける実験は、同様の結果が観察された３回の独立した実験を代表する（他の２回の実験は、パネルＨおよびパネルＩに示されている）。ＣＨＸ＝シクロヘキシミド；Ｆ／Ｈ  −  Ｆｌａｇ／ＨＡ。パネルＪは、ＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３、ＡＫＴおよびＥＲＫ１／２タンパク質レベルに対するＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＫ〜Ｍは、ｗｔ  ＦＬＴ３発現Ｋ５６２、ＫＵ８１２ＦおよびＵ９３７細胞におけるＦＬＴ３発現に対するＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＮは、ＵＳＰ１０  ｗｔおよび触媒的に不活性なＵＳＰ１０であるＵＳＰ１０Ｃ４２４Ｓを過剰発現するＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３レベルの解析を示す。図示されているイムノブロットは、同様の結果が観察された３回の追加の研究を代表する（パネルＯ）。パネルＯは、ＵＳＰ１０  ｗｔおよび触媒的に不活性なＵＳＰ１０Ｃ４２４Ｓ（「ＵＳＰ１０  ｍｕｔ」）を過剰発現するＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３レベルの解析を示す。
【図７Ｈ−Ｉ】図７は、ＨＢＸ１９８１８によって誘導されるＦＬＴ３分解のメディエータとしてのＵＳＰ１０の調査結果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＮおよびＯとして同定される１５個のパネルを含む。パネルＡは、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞における外因性に発現されたＦＬＴ３−ＩＴＤと内在性ＵＳＰ１０との会合を示す。パネルＢは、ＵＳＰ１０  ｓｈＲＮＡ感染細胞のピューロマイシン選択後の約１週間後に決定された細胞計数（トリパンブルー排除アッセイ）を示す。パネルＣ〜Ｄは、ＭＯＬＭ１４細胞（パネルＣ）およびＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞（パネルＤ）におけるＦＬＴ３発現およびｐ５３発現に対するそれぞれＨＢＸ１９８１８処置と対比したＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＥは、ＵＳＰ１０が、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｗｔ  ＦＬＴ３よりも広範囲にＦＬＴ３−ＩＴＤを安定化することを示す。図示されているイムノブロットは、同様の結果が観察された３回の独立した実験を代表する。パネルＦは、ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７処置が、２４時間処置後に、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦＬＴ３−ＩＴＤの分解をもたらすことを示す。図示されているイムノブロットは、同様の結果が観察された３回の独立した実験を代表する。パネルＧ〜Ｉは、ＨＢＸ１９８１８が、ｗｔ  ＦＬＴ３よりも広範囲に、ＦＬＴ３−ＩＴＤの半減期を短縮することを示す。パネルＧにおける実験は、同様の結果が観察された３回の独立した実験を代表する（他の２回の実験は、パネルＨおよびパネルＩに示されている）。ＣＨＸ＝シクロヘキシミド；Ｆ／Ｈ  −  Ｆｌａｇ／ＨＡ。パネルＪは、ＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３、ＡＫＴおよびＥＲＫ１／２タンパク質レベルに対するＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＫ〜Ｍは、ｗｔ  ＦＬＴ３発現Ｋ５６２、ＫＵ８１２ＦおよびＵ９３７細胞におけるＦＬＴ３発現に対するＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＮは、ＵＳＰ１０  ｗｔおよび触媒的に不活性なＵＳＰ１０であるＵＳＰ１０Ｃ４２４Ｓを過剰発現するＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３レベルの解析を示す。図示されているイムノブロットは、同様の結果が観察された３回の追加の研究を代表する（パネルＯ）。パネルＯは、ＵＳＰ１０  ｗｔおよび触媒的に不活性なＵＳＰ１０Ｃ４２４Ｓ（「ＵＳＰ１０  ｍｕｔ」）を過剰発現するＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３レベルの解析を示す。
【図７Ｊ−Ｎ】図７は、ＨＢＸ１９８１８によって誘導されるＦＬＴ３分解のメディエータとしてのＵＳＰ１０の調査結果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＮおよびＯとして同定される１５個のパネルを含む。パネルＡは、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞における外因性に発現されたＦＬＴ３−ＩＴＤと内在性ＵＳＰ１０との会合を示す。パネルＢは、ＵＳＰ１０  ｓｈＲＮＡ感染細胞のピューロマイシン選択後の約１週間後に決定された細胞計数（トリパンブルー排除アッセイ）を示す。パネルＣ〜Ｄは、ＭＯＬＭ１４細胞（パネルＣ）およびＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞（パネルＤ）におけるＦＬＴ３発現およびｐ５３発現に対するそれぞれＨＢＸ１９８１８処置と対比したＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＥは、ＵＳＰ１０が、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｗｔ  ＦＬＴ３よりも広範囲にＦＬＴ３−ＩＴＤを安定化することを示す。図示されているイムノブロットは、同様の結果が観察された３回の独立した実験を代表する。パネルＦは、ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７処置が、２４時間処置後に、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦＬＴ３−ＩＴＤの分解をもたらすことを示す。図示されているイムノブロットは、同様の結果が観察された３回の独立した実験を代表する。パネルＧ〜Ｉは、ＨＢＸ１９８１８が、ｗｔ  ＦＬＴ３よりも広範囲に、ＦＬＴ３−ＩＴＤの半減期を短縮することを示す。パネルＧにおける実験は、同様の結果が観察された３回の独立した実験を代表する（他の２回の実験は、パネルＨおよびパネルＩに示されている）。ＣＨＸ＝シクロヘキシミド；Ｆ／Ｈ  −  Ｆｌａｇ／ＨＡ。パネルＪは、ＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３、ＡＫＴおよびＥＲＫ１／２タンパク質レベルに対するＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＫ〜Ｍは、ｗｔ  ＦＬＴ３発現Ｋ５６２、ＫＵ８１２ＦおよびＵ９３７細胞におけるＦＬＴ３発現に対するＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＮは、ＵＳＰ１０  ｗｔおよび触媒的に不活性なＵＳＰ１０であるＵＳＰ１０Ｃ４２４Ｓを過剰発現するＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３レベルの解析を示す。図示されているイムノブロットは、同様の結果が観察された３回の追加の研究を代表する（パネルＯ）。パネルＯは、ＵＳＰ１０  ｗｔおよび触媒的に不活性なＵＳＰ１０Ｃ４２４Ｓ（「ＵＳＰ１０  ｍｕｔ」）を過剰発現するＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３レベルの解析を示す。
【図７Ｏ】図７は、ＨＢＸ１９８１８によって誘導されるＦＬＴ３分解のメディエータとしてのＵＳＰ１０の調査結果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、ＮおよびＯとして同定される１５個のパネルを含む。パネルＡは、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞における外因性に発現されたＦＬＴ３−ＩＴＤと内在性ＵＳＰ１０との会合を示す。パネルＢは、ＵＳＰ１０  ｓｈＲＮＡ感染細胞のピューロマイシン選択後の約１週間後に決定された細胞計数（トリパンブルー排除アッセイ）を示す。パネルＣ〜Ｄは、ＭＯＬＭ１４細胞（パネルＣ）およびＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞（パネルＤ）におけるＦＬＴ３発現およびｐ５３発現に対するそれぞれＨＢＸ１９８１８処置と対比したＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＥは、ＵＳＰ１０が、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｗｔ  ＦＬＴ３よりも広範囲にＦＬＴ３−ＩＴＤを安定化することを示す。図示されているイムノブロットは、同様の結果が観察された３回の独立した実験を代表する。パネルＦは、ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７処置が、２４時間処置後に、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＦＬＴ３−ＩＴＤの分解をもたらすことを示す。図示されているイムノブロットは、同様の結果が観察された３回の独立した実験を代表する。パネルＧ〜Ｉは、ＨＢＸ１９８１８が、ｗｔ  ＦＬＴ３よりも広範囲に、ＦＬＴ３−ＩＴＤの半減期を短縮することを示す。パネルＧにおける実験は、同様の結果が観察された３回の独立した実験を代表する（他の２回の実験は、パネルＨおよびパネルＩに示されている）。ＣＨＸ＝シクロヘキシミド；Ｆ／Ｈ  −  Ｆｌａｇ／ＨＡ。パネルＪは、ＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３、ＡＫＴおよびＥＲＫ１／２タンパク質レベルに対するＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＫ〜Ｍは、ｗｔ  ＦＬＴ３発現Ｋ５６２、ＫＵ８１２ＦおよびＵ９３７細胞におけるＦＬＴ３発現に対するＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＮは、ＵＳＰ１０  ｗｔおよび触媒的に不活性なＵＳＰ１０であるＵＳＰ１０Ｃ４２４Ｓを過剰発現するＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３レベルの解析を示す。図示されているイムノブロットは、同様の結果が観察された３回の追加の研究を代表する（パネルＯ）。パネルＯは、ＵＳＰ１０  ｗｔおよび触媒的に不活性なＵＳＰ１０Ｃ４２４Ｓ（「ＵＳＰ１０  ｍｕｔ」）を過剰発現するＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３レベルの解析を示す。
【００２５】
【図８Ａ−Ｂ】図８は、ＦＬＴ３およびＵＳＰ１０会合、ならびにＦＬＴ３−ＵＳＰ１０複合体形成のＤＵＢ阻害剤誘導性干渉の調査結果を示す、パネルＡおよびＢとして同定される２個のパネルを含む。パネルＡは、ＰＥＩ試薬をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞における、外因性に発現されたｗｔ  ＦＬＴ３またはＦＬＴ３−ＩＴＤと外因性に発現されたＵＳＰ１０との会合を示す。ＵＳＰ１０−ＣＳは、触媒的に不活性な変異体Ｃ４２４Ｓを表わす。パネルＢは、ＰＥＩ試薬をトランスフェクトし、ＵＳＰ１０およびＦＬＴ３を過剰発現するようにされた２９３Ｔ細胞におけるＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７によるＵＳＰ１０およびＦＬＴ３の相互作用の阻害を示す。このゲルに示されている第１のレーンは、ＦＬＴ３のためのＩＰ対照である。
【００２６】
【図９Ａ−Ｆ】図９は、成長のためにＦＬＴ３に依存しないヒト白血病細胞系におけるＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦとして同定される６個のパネルを含む。パネルＡ〜Ｄは、ＵＳＰ１０遺伝子ＫＤ効率の解析を示す。パネルＥ〜Ｆは、ｗｔ  ＦＬＴ３発現白血病細胞におけるＦＬＴ３発現に対するＵＳＰ１０  ＫＤまたはＨＢＸ１９８１８処置の効果を示す。
【００２７】
【図１０Ａ−Ｂ】図１０は、ＦＬＴ３−ＩＴＤまたはｗｔ  ＦＬＴ３を発現するヒト形質転換造血細胞系におけるＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す、パネル（panesl）Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥとして同定される５個のパネルを含む。パネルＡは、ＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３発現に対するＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＢ〜Ｃは、ｗｔ  ＦＬＴ３発現白血病細胞におけるＵＳＰ１０遺伝子ＫＤ効率の解析、およびＦＬＴ３発現に対するＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＤは、ｗｔ  ＦＬＴ３発現Ｋ０６２細胞におけるＵＳＰ１０遺伝子ＫＤ効率の解析を示す。パネルＥは、ヒト形質転換造血細胞系のパネルにおけるＵＳＰ１０およびＦＬＴ３の発現の調査を示す。変異体ＦＬＴ３発現系統は、ＭＯＬＭ１３、ＭＯＬＭ１４およびＭＶ４１１である。上記細胞系の残りは、変異体ＦＬＴ３を発現しない。
【図１０Ｃ−Ｅ】図１０は、ＦＬＴ３−ＩＴＤまたはｗｔ  ＦＬＴ３を発現するヒト形質転換造血細胞系におけるＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す、パネル（panesl）Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥとして同定される５個のパネルを含む。パネルＡは、ＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３発現に対するＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＢ〜Ｃは、ｗｔ  ＦＬＴ３発現白血病細胞におけるＵＳＰ１０遺伝子ＫＤ効率の解析、およびＦＬＴ３発現に対するＵＳＰ１０  ＫＤの効果を示す。パネルＤは、ｗｔ  ＦＬＴ３発現Ｋ０６２細胞におけるＵＳＰ１０遺伝子ＫＤ効率の解析を示す。パネルＥは、ヒト形質転換造血細胞系のパネルにおけるＵＳＰ１０およびＦＬＴ３の発現の調査を示す。変異体ＦＬＴ３発現系統は、ＭＯＬＭ１３、ＭＯＬＭ１４およびＭＶ４１１である。上記細胞系の残りは、変異体ＦＬＴ３を発現しない。
【００２８】
【図１１Ａ−Ｅ】図１１は、ＨＢＸ１９８１８によって誘導されるＦＬＴ３分解の潜在的メディエータとしてのＵＳＰ７の調査の結果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧとして同定される７個のパネルを含む。パネルＡは、ＵＳＰ７  ｓｈＲＮＡ感染ＭＯＬＭ１４細胞のピューロマイシン選択の約９日後に決定された細胞計数（トリパンブルー排除アッセイ）を示す。パネルＢは、ＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３、ｐ５３およびベクリン−１発現に対するＵＳＰ１０  ＫＤおよびＵＳＰ７  ＫＤの効果の並行調査の結果を示す。パネルＣは、スクランブル対照細胞と対比した、ＵＳＰ７  ｓｈＲＮＡ感染ＭＯＬＭ１４細胞における、ＫＤ効率およびＵＳＰ７の発現の解析の検証を示す。パネルＤは、ＵＳＰ１０  ｓｈＲＮＡ感染ＭＯＬＭ１４細胞およびＵＳＰ７  ｓｈＲＮＡ感染ＭＯＬＭ１４細胞におけるＵＳＰ１０発現を示す。パネルＥは、処置約７２時間後の、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞の成長に対する化合物２と対比したＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＦは、化合物２と対比した、ＨＢＸ１９８１８で処置したＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３タンパク質レベルの解析の結果を示す。パネルＧは、化合物２が、ＤＵＢ酵素のパネルと比べてＵＳＰ７を選択的に阻害することを示す。
【図１１Ｆ−Ｇ】図１１は、ＨＢＸ１９８１８によって誘導されるＦＬＴ３分解の潜在的メディエータとしてのＵＳＰ７の調査の結果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧとして同定される７個のパネルを含む。パネルＡは、ＵＳＰ７  ｓｈＲＮＡ感染ＭＯＬＭ１４細胞のピューロマイシン選択の約９日後に決定された細胞計数（トリパンブルー排除アッセイ）を示す。パネルＢは、ＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３、ｐ５３およびベクリン−１発現に対するＵＳＰ１０  ＫＤおよびＵＳＰ７  ＫＤの効果の並行調査の結果を示す。パネルＣは、スクランブル対照細胞と対比した、ＵＳＰ７  ｓｈＲＮＡ感染ＭＯＬＭ１４細胞における、ＫＤ効率およびＵＳＰ７の発現の解析の検証を示す。パネルＤは、ＵＳＰ１０  ｓｈＲＮＡ感染ＭＯＬＭ１４細胞およびＵＳＰ７  ｓｈＲＮＡ感染ＭＯＬＭ１４細胞におけるＵＳＰ１０発現を示す。パネルＥは、処置約７２時間後の、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞の成長に対する化合物２と対比したＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＦは、化合物２と対比した、ＨＢＸ１９８１８で処置したＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３タンパク質レベルの解析の結果を示す。パネルＧは、化合物２が、ＤＵＢ酵素のパネルと比べてＵＳＰ７を選択的に阻害することを示す。
【００２９】
【図１２Ａ−Ｆ】図１２は、変異体ＦＬＴ３発現細胞におけるＦＬＴ３レベルまたはベクリン−１レベルに対するＰ２２０７７、ＨＢＸ１９８１８およびアナログの効果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦとして同定される５個のパネルを含む。パネルＡは、ＨＢＸ１９８１８アナログの化学構造を示す。パネルＢ〜Ｅは、Ｃ５９８−０５７１（パネルＢ）、Ｃ６７３−０１０５（パネルＣ）、Ｃ５９８−０５１５（パネルＤ）またはＣ５９８−０６４６（パネルＥ）で約２５時間処置したＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３の発現の解析の結果を示す。パネルＦは、１０μＭ  Ｐ２２０７７で処置したＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるベクリン−１およびＦＬＴ３の発現の解析を示す。
【００３０】
【図１３Ａ−Ｅ】図１３は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ駆動細胞の成長に対するＨＢＸ１９８１８およびＨＢＸ１９８１８の構造アナログの標的化効果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨとして同定される８個のパネルを含む。パネルＡは、処置約７２時間後の、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞の増殖に対するＨＢＸ１９８１８およびＨＢＸ１９８１８の構造アナログの効果を示す。パネルＢは、基質としてＵｂ−ＡＭＣを使用した、ＨＢＸ１９８１８、ＨＢＸ１９８１８アナログ、Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１のＵＳＰ１０生化学的ＩＣ５０を示す。パネルＣ〜Ｅは、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３タンパク質発現に対する、Ｃ５９８−０５６３（パネルＣ）、Ｃ５９８−０４６６（パネルＤ）またはＣ５９８−０４６８（パネルＥ）による処置約２５時間の効果の比較を示す。パネルＦは、０、５、１０および２０ｕＭ濃度における、２４時間後の、ＦＬＴ３−ＩＴＤ発現ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞およびＭＯＬＭ１４細胞と対比したＣ５９８−０４６６処置ＦＬＴ３ヌルＴＦ−１細胞の増殖の解析の結果を示す。パネルＧ〜Ｈは、Ｃ５９８−０５６３（パネルＧ）またはＣ５９８−０４６６（パネルＨ）で処置したＡＭＬ細胞系におけるミトコンドリアプライミングを示す。ミトコンドリアプライミングは、薬物曝露１４時間後に、Ｂｉｍペプチドに応答したチトクロムｃ放出を測定することにより検出された。Δプライミング  ＝  ＤＭＳＯ処置細胞のプライミング  −  薬物処置細胞のプライミング。
【図１３Ｆ−Ｈ】図１３は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ駆動細胞の成長に対するＨＢＸ１９８１８およびＨＢＸ１９８１８の構造アナログの標的化効果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨとして同定される８個のパネルを含む。パネルＡは、処置約７２時間後の、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞の増殖に対するＨＢＸ１９８１８およびＨＢＸ１９８１８の構造アナログの効果を示す。パネルＢは、基質としてＵｂ−ＡＭＣを使用した、ＨＢＸ１９８１８、ＨＢＸ１９８１８アナログ、Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１のＵＳＰ１０生化学的ＩＣ５０を示す。パネルＣ〜Ｅは、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３タンパク質発現に対する、Ｃ５９８−０５６３（パネルＣ）、Ｃ５９８−０４６６（パネルＤ）またはＣ５９８−０４６８（パネルＥ）による処置約２５時間の効果の比較を示す。パネルＦは、０、５、１０および２０ｕＭ濃度における、２４時間後の、ＦＬＴ３−ＩＴＤ発現ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞およびＭＯＬＭ１４細胞と対比したＣ５９８−０４６６処置ＦＬＴ３ヌルＴＦ−１細胞の増殖の解析の結果を示す。パネルＧ〜Ｈは、Ｃ５９８−０５６３（パネルＧ）またはＣ５９８−０４６６（パネルＨ）で処置したＡＭＬ細胞系におけるミトコンドリアプライミングを示す。ミトコンドリアプライミングは、薬物曝露１４時間後に、Ｂｉｍペプチドに応答したチトクロムｃ放出を測定することにより検出された。Δプライミング  ＝  ＤＭＳＯ処置細胞のプライミング  −  薬物処置細胞のプライミング。
【００３１】
【図１４Ａ−Ｉ】図１４は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ発現ＡＭＬ細胞に対するＵＳＰ１０阻害剤、Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１の標的化効果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫとして同定される１１個のパネルを含む。パネルＡは、Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１の化学構造を示す。パネルＢは、Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１で約２２〜２３時間処置したＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３タンパク質レベルの解析の結果を示す。ＨＢＸ１９８１８を比較のために示す。パネルＣ〜Ｄは、０、５、１０および２０μＭ濃度における、処置約２４時間後の、ＦＬＴ３変異体ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞およびＭＯＬＭ１４細胞と対比したＦＬＴ３ヌルＴＦ−１細胞の成長に対するＰ２２０７７（パネルＣ）または１２４７８２５−３７−１（パネルＤ）の効果を示す。パネルＥは、Ｐ２２０７７で約１６時間処置したＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞およびＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３タンパク質レベルの解析の結果を示す。パネルＦは、Ｐ２２０７７で約２４時間処置したＭＯＬＭ１４細胞におけるベクリン−１レベルの解析の結果を示す。パネルＧは、Ｐ２２０７７で約２４時間処置したＭＯＬＭ１４細胞におけるｐ５３レベルの解析の結果を示す。パネルＨは、ターゲットエンゲージメント研究（Ｐ２２０７７、ＵＳＰ１０）の結果を示す。ＭＯＬＭ１４細胞は、表示濃度の化合物で処置し、溶解し、０．２５ｕｇ  ＨＡ−Ｕｂ−ＶＳと共に３０分間ＲＴでインキュベートした。ＨＡ−Ｕｂ−ＶｓによるＵＳＰ１０標識を遮断するＰ２２０７７の能力は、阻害剤による酵素の結合を示す。パネルＩは、Ｐ２２０７７、１２４７８２５−３７−１またはＨＢＸ１９８１８で約２３時間処置したＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３、ＥＲＫ１／ＥＲＫ２およびＡＫＴ発現の解析の結果を示す。パネルＪは、処置約２３時間後のＭＶ４，１１細胞におけるＡＫＴタンパク質レベルと対比したＦＬＴ３タンパク質レベルに対する１２４７８２５−３１−１の効果を示す。パネルＫは、処置２２時間後の、２０％ＷＥＨＩ馴化培地（ＩＬ−３の供給源として使用）の非存在または存在下で培養したＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞に対するＰ２２０７７の効果を示す。エラーバーは、二連で設定された試料の標準偏差を表す。
【図１４Ｊ−Ｋ】図１４は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ発現ＡＭＬ細胞に対するＵＳＰ１０阻害剤、Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１の標的化効果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫとして同定される１１個のパネルを含む。パネルＡは、Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１の化学構造を示す。パネルＢは、Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１で約２２〜２３時間処置したＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３タンパク質レベルの解析の結果を示す。ＨＢＸ１９８１８を比較のために示す。パネルＣ〜Ｄは、０、５、１０および２０μＭ濃度における、処置約２４時間後の、ＦＬＴ３変異体ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞およびＭＯＬＭ１４細胞と対比したＦＬＴ３ヌルＴＦ−１細胞の成長に対するＰ２２０７７（パネルＣ）または１２４７８２５−３７−１（パネルＤ）の効果を示す。パネルＥは、Ｐ２２０７７で約１６時間処置したＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞およびＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３タンパク質レベルの解析の結果を示す。パネルＦは、Ｐ２２０７７で約２４時間処置したＭＯＬＭ１４細胞におけるベクリン−１レベルの解析の結果を示す。パネルＧは、Ｐ２２０７７で約２４時間処置したＭＯＬＭ１４細胞におけるｐ５３レベルの解析の結果を示す。パネルＨは、ターゲットエンゲージメント研究（Ｐ２２０７７、ＵＳＰ１０）の結果を示す。ＭＯＬＭ１４細胞は、表示濃度の化合物で処置し、溶解し、０．２５ｕｇ  ＨＡ−Ｕｂ−ＶＳと共に３０分間ＲＴでインキュベートした。ＨＡ−Ｕｂ−ＶｓによるＵＳＰ１０標識を遮断するＰ２２０７７の能力は、阻害剤による酵素の結合を示す。パネルＩは、Ｐ２２０７７、１２４７８２５−３７−１またはＨＢＸ１９８１８で約２３時間処置したＭＯＬＭ１４細胞におけるＦＬＴ３、ＥＲＫ１／ＥＲＫ２およびＡＫＴ発現の解析の結果を示す。パネルＪは、処置約２３時間後のＭＶ４，１１細胞におけるＡＫＴタンパク質レベルと対比したＦＬＴ３タンパク質レベルに対する１２４７８２５−３１−１の効果を示す。パネルＫは、処置２２時間後の、２０％ＷＥＨＩ馴化培地（ＩＬ−３の供給源として使用）の非存在または存在下で培養したＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞に対するＰ２２０７７の効果を示す。エラーバーは、二連で設定された試料の標準偏差を表す。
【００３２】
【図１５Ａ−Ｃ】図１５は、化学変種（chemotype）Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１の特徴付けを示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥとして同定される５個のパネルを含む。パネルＡは、Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１の構造および選択性プロファイリングデータを示す。パネルＢ〜Ｅは、変異体ＦＬＴ３発現細胞の成長に対するＰ２２０７７および１２４７８２５−３７−１の効果ならびに１２４７８２５−３７−１によるＵＳＰ１０の標的化を示す。パネルＢ〜Ｃは、約２２〜２４時間後のＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞の成長に対するＰ２２０７７、ＨＢＸ１９８１８および１２４７８２５−３７−１処置の効果を示す。パネルＤは、処置約７２時間後の、ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞およびＭＯＬＭ１４細胞の成長に対する化合物２と対比した１２４７８２５−３７−１の効果を示す。パネルＥは、図１４のパネルＨに記載されているものと同様の、ターゲットエンゲージメント研究（１２４７８２５−３７−１、ＵＳＰ１０）の結果を示す。
【図１５Ｄ−Ｅ】図１５は、化学変種（chemotype）Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１の特徴付けを示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥとして同定される５個のパネルを含む。パネルＡは、Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１の構造および選択性プロファイリングデータを示す。パネルＢ〜Ｅは、変異体ＦＬＴ３発現細胞の成長に対するＰ２２０７７および１２４７８２５−３７−１の効果ならびに１２４７８２５−３７−１によるＵＳＰ１０の標的化を示す。パネルＢ〜Ｃは、約２２〜２４時間後のＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞の成長に対するＰ２２０７７、ＨＢＸ１９８１８および１２４７８２５−３７−１処置の効果を示す。パネルＤは、処置約７２時間後の、ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞およびＭＯＬＭ１４細胞の成長に対する化合物２と対比した１２４７８２５−３７−１の効果を示す。パネルＥは、図１４のパネルＨに記載されているものと同様の、ターゲットエンゲージメント研究（１２４７８２５−３７−１、ＵＳＰ１０）の結果を示す。
【００３３】
【図１６Ａ−Ｃ】図１６は、ＦＬＴ３タンパク質およびシグナル伝達に対するＨＢＸ１９８１８の効果を示す、パネルＡ、ＢおよびＣとして同定される３個のパネルを含む。パネルＡおよびＢは、処置約２３時間後のＫ５６２細胞およびＫＵ８１２Ｆ細胞における、ＦＬＴ３タンパク質レベルに対するＨＢＸ１９８１８処置の効果を示す。パネルＣは、ＨＢＸ１９８１８によるＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞の約２３時間処置の総細胞チロシンリン酸化に対する効果を示す。
【００３４】
【図１７Ａ−Ｋ】図１７は、ＦＬＴ３キナーゼ阻害剤に対して耐性の細胞に対するＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７の標的化効果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、ＪおよびＫとして同定される１１個のパネルを含む。クレノラニブ（パネルＡ）、ミドスタウリン（パネルＢ）、ＡＣ２２０（パネルＣ）、ＨＢＸ１９８１８（パネルＤ）またはＰ２２０７７（パネルＥ）によるＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞またはＴＫＤ点変異体を発現するＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤの約２４時間処置。エラーバーは、二連で設定された試料の標準偏差を表す。パネルＦ〜Ｈは、ＴＫＤ点変異体を発現するＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３発現に対するＨＢＸ１９８１８（パネルＦ）およびＰ２２０７７（パネルＧおよびＨ）の効果を示す。パネルＩ〜Ｋは、ＭＯＬＭ１３細胞およびミドスタウリン耐性ＭＯＬＭ１３細胞の増殖に対するミドスタウリン（パネルＩ）、ＨＢＸ１９８１８（パネルＪ）およびＰ２２０７７（パネルＫ）の効果の比較を示す。エラーバーは、二連で設定された試料の標準偏差を表す。
【００３５】
【図１８Ａ−Ｅ】図１８は、ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７が、ＴＫＤ点変異を発現するＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞における構成的に活性なＦＬＴ３の分解を誘導することを示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧとして同定される７個のパネルを含む。パネルＡおよびＢは、ＨＢＸ１９８１８処置が、Ａ６２７Ｔ  ＴＫＤ変異体を発現するＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞（パネルＡ）およびＦ６９１Ｌ変異体を発現するＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞（パネルＢ）におけるＦＬＴ３の分解をもたらすことを示す。パネルＣは、Ｐ２２０７７処置が、Ａ６２７Ｔ、Ｆ６９１ＬおよびＧ６９７Ｒ  ＴＫＤ変異体を発現するＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３の分解をもたらすことを示す。パネルＤおよびＥは、Ｂａ／Ｆ３−ｗｔ  ＦＬＴ３細胞、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞、およびＴＫＤ点変異体を発現するＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３リン酸化状態の比較を示す。Ｂａ／Ｆ３−ｗｔ  ＦＬＴ３細胞および変異体ＦＬＴ３発現細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地の存在下で培養した。Ｂａ／Ｆ３−ｗｔ  ＦＬＴ３細胞は増殖因子依存性であるため、Ｂａ／Ｆ３−ｗｔ  ＦＬＴ３細胞のための培養培地には、ＩＬ−３の供給源として使用される１５〜２０％ＷＥＨＩを補充した。パネルＦは、処置約３日後の、ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞の増殖に対するＰＫＣ４１２と組み合わせたＨＢＸ１９８１８の効果を示す。エラーバーは、二連で設定された試料の標準偏差を表す。パネルＧは、ミドスタウリンおよびＨＢＸ１９８１８によるＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞の共処置に対応する組合せ指数を示す。
【図１８Ｆ−Ｇ】図１８は、ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７が、ＴＫＤ点変異を発現するＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞における構成的に活性なＦＬＴ３の分解を誘導することを示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧとして同定される７個のパネルを含む。パネルＡおよびＢは、ＨＢＸ１９８１８処置が、Ａ６２７Ｔ  ＴＫＤ変異体を発現するＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞（パネルＡ）およびＦ６９１Ｌ変異体を発現するＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞（パネルＢ）におけるＦＬＴ３の分解をもたらすことを示す。パネルＣは、Ｐ２２０７７処置が、Ａ６２７Ｔ、Ｆ６９１ＬおよびＧ６９７Ｒ  ＴＫＤ変異体を発現するＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３の分解をもたらすことを示す。パネルＤおよびＥは、Ｂａ／Ｆ３−ｗｔ  ＦＬＴ３細胞、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞、およびＴＫＤ点変異体を発現するＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３リン酸化状態の比較を示す。Ｂａ／Ｆ３−ｗｔ  ＦＬＴ３細胞および変異体ＦＬＴ３発現細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地の存在下で培養した。Ｂａ／Ｆ３−ｗｔ  ＦＬＴ３細胞は増殖因子依存性であるため、Ｂａ／Ｆ３−ｗｔ  ＦＬＴ３細胞のための培養培地には、ＩＬ−３の供給源として使用される１５〜２０％ＷＥＨＩを補充した。パネルＦは、処置約３日後の、ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞の増殖に対するＰＫＣ４１２と組み合わせたＨＢＸ１９８１８の効果を示す。エラーバーは、二連で設定された試料の標準偏差を表す。パネルＧは、ミドスタウリンおよびＨＢＸ１９８１８によるＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞の共処置に対応する組合せ指数を示す。
【００３６】
【図１９Ａ−Ｃ】図１９は、変異体ＦＬＴ３発現細胞に対するＦＬＴ３阻害剤とＨＢＸ１９８１８との組合せの効果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦとして同定される６個のパネルを含む。パネルＡ〜Ｂは、処置約３日後の、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞の増殖に対するミドスタウリン（パネルＡ）またはクレノラニブ（パネルＢ）と組み合わせたＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＣは、パネルＡ〜Ｂに示すデータに対応する組合せ指数を示す。パネルＤは、ＭＯＬＭ１４細胞の増殖に対するミドスタウリン（パネルＤ）またはクレノラニブ（パネルＥ）と組み合わせたＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＦは、パネルＤ〜Ｅに示すデータに対応する組合せ指数を示す。
【図１９Ｄ−Ｆ】図１９は、変異体ＦＬＴ３発現細胞に対するＦＬＴ３阻害剤とＨＢＸ１９８１８との組合せの効果を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦとして同定される６個のパネルを含む。パネルＡ〜Ｂは、処置約３日後の、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞の増殖に対するミドスタウリン（パネルＡ）またはクレノラニブ（パネルＢ）と組み合わせたＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＣは、パネルＡ〜Ｂに示すデータに対応する組合せ指数を示す。パネルＤは、ＭＯＬＭ１４細胞の増殖に対するミドスタウリン（パネルＤ）またはクレノラニブ（パネルＥ）と組み合わせたＨＢＸ１９８１８の効果を示す。パネルＦは、パネルＤ〜Ｅに示すデータに対応する組合せ指数を示す。
【００３７】
【図２０】図２０は、変異体ＦＬＴ３陽性ＡＭＬに対するＵＳＰ１０阻害の標的化効果を示す、パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤとして同定される４個のパネルを含む。パネルＡ〜Ｂは、処置約７２時間後の、ＦＬＴ３−ＩＴＤ発現原発性ＡＭＬ患者細胞に対するＤＵＢ阻害剤の効果を示す。原発性ＡＭＬ１：女性；５９歳；＜５％骨髄芽球；２．６Ｋ  ＷＢＣ計数；ｃｒｉｔ：３０；１％末梢芽球；以前の療法：３＋７化学療法；細胞遺伝学：正常；変異：ＩＤＨ２（５％）、ＲＵＮＸ１（１５％）、ＳＲＳＦ２（１６．８％）、ＦＬＴ３−ＩＴＤ（２４ａａ）。原発性ＡＭＬ２：男性；６９歳；９０％骨髄芽球；２３Ｋ  ＷＢＣ計数；ｃｒｉｔ：２４；５％末梢芽球；以前の療法：アザシチジン、シタラビン（cytarabline）、高用量Ａｒａ−ｃ；細胞遺伝学：正常；変異：ＳＲＳＦ２（５４％）、ＡＳＸＬ１（４６％）、ＲＵＮＸ１（３９．４％）、ＴＥＴ２（ｉｎｓ）（４６％）、ＴＥＴ２（点変異）（２．８％）、ＴＥＴ２（ｄｅｌ）（３．５％）、ＦＬＴ３−ＩＴＤ（５１ａａ）。パネルＣは、７２時間後の、変異体ＦＬＴ３発現ＡＭＬプリマグラフト（primagraft）（Ｄ８３５Ｙ＋、ＦＬＴ３−ＩＴＤ＋）細胞と対比した正常ＰＢＭＣに対するＵＳＰ１０阻害剤の効果を示す。パネルＤは、白血病の非侵襲性ｉｎ  ｖｉｖｏバイオルミネセンスモデルにおけるＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋細胞成長に対するＰ２２０７７処置の効果を示す。
【００３８】
【図２１】図２１は、変異体ＦＬＴ３発現ＡＭＬプリマグラフトに対するＵＳＰ１０阻害剤効果の解析の結果を示す、パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤとして同定される４個のパネルを含む。パネルＡ〜Ｃは、ｅｘ  ｖｉｖｏでの処置約７２時間後の、変異体ＦＬＴ３発現ＡＭＬプリマグラフトの増殖に対するＤＵＢ阻害剤の効果を示す。パネルＤは、７２時間後の、変異体ＦＬＴ３発現ＡＭＬプリマグラフト（Ｄ８３５Ｙ＋、ＦＬＴ３−ＩＴＤ＋）細胞と対比した正常ＰＢＭＣに対するＵＳＰ１０阻害剤の効果を示す。
【００３９】
【図２２】図２２は、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＦＬＴ３タンパク質発現に対するＰ２２０７７の効果を示す、パネルＡおよびＢとして同定される２個のパネルを含む。パネルＡは、ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７  ｅｘ  ｖｉｖｏ処置したＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＡＭＬプリマグラフト細胞におけるＦＬＴ３タンパク質完全性の解析の結果を示す。パネルＢは、Ｐ２２０７７（１５ｍｇ／ｋｇ）処置したＦＬＴ３変異体ＡＭＬプリマグラフトマウスと対比した、２１日間ビヒクル（ＤＭＳＯ）処置したＦＬＴ３変異体ＡＭＬプリマグラフトマウスから抽出した骨髄細胞におけるＦＬＴ３タンパク質完全性の解析の結果を示す。３匹のＰ２２０７７処置したマウス由来のプールされたタンパク質ライセートと対比した、３匹のビヒクル対照マウス由来のプールされたタンパク質ライセートにおいてＦＬＴ３免疫沈降を行った。
【００４０】
【図２３Ａ−Ｄ】図２３は、ルシフェラーゼ発現Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＵＢ阻害剤誘導性喪失を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧとして同定される７個のパネルを含む。パネルＡ〜Ｂは、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋細胞およびルシフェラーゼを発現しないＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞のＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７処置が、培養物においてＦＬＴ３分解をもたらすことを示す。パネルＣ〜Ｄは、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋細胞およびルシフェラーゼを発現しないＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞のミドスタウリン処置およびＰ２２０７７処置（２２時間）が、同程度まで細胞の成長を阻害することを示す。パネルＥは、Ｐ２２０７７が、処置２４時間後のＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋細胞におけるＦＬＴ３表面発現の喪失を誘導したことを示す。パネルＦおよびＧは、ビヒクルまたは５０ｍｇ／ｋｇ  Ｐ２２０７７、ＩＰ  ＢＩＤまたは５０ｍｇ／ｋｇ  Ｐ２２０７７、ＰＯ  ＱＤで最大１１日間処置したマウスの体重（グラム（パネルＦ）または％（パネルＧ）単位）を示す。
【図２３Ｅ−Ｇ】図２３は、ルシフェラーゼ発現Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＵＢ阻害剤誘導性喪失を示す、パネルＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧとして同定される７個のパネルを含む。パネルＡ〜Ｂは、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋細胞およびルシフェラーゼを発現しないＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞のＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７処置が、培養物においてＦＬＴ３分解をもたらすことを示す。パネルＣ〜Ｄは、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋細胞およびルシフェラーゼを発現しないＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞のミドスタウリン処置およびＰ２２０７７処置（２２時間）が、同程度まで細胞の成長を阻害することを示す。パネルＥは、Ｐ２２０７７が、処置２４時間後のＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋細胞におけるＦＬＴ３表面発現の喪失を誘導したことを示す。パネルＦおよびＧは、ビヒクルまたは５０ｍｇ／ｋｇ  Ｐ２２０７７、ＩＰ  ＢＩＤまたは５０ｍｇ／ｋｇ  Ｐ２２０７７、ＰＯ  ＱＤで最大１１日間処置したマウスの体重（グラム（パネルＦ）または％（パネルＧ）単位）を示す。
【００４１】
【図２４Ａ−Ｂ】図２４は、ＦＬＴ３キナーゼ阻害剤とＨＢＸ１９８１８との組合せの効果、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの変異体ＦＬＴ３陽性ＡＭＬ原発性細胞に対するＵＳＰ１０阻害の標的化効果を示す、パネルＡ、ＢおよびＣとして同定される３個のパネルを含む。パネルＡは、Ｐ２２０７７（５０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ  ＢＩＤ）処置したマウス（パイロット研究、４日の処置）由来の骨髄試料と対比した、ビヒクル処置マウス由来の骨髄試料における、Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏアッセイおよびｌｕｍｉｎｏｓｋａｎによって測定されるルシフェラーゼ陽性白血病負荷（左パネル）、ならびにＣＤ１３５−ＰＥコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによって測定されるパーセントＦＬＴ３（右パネル）の間の相関を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を代表する。パネルＢおよびＣは、白血病の非侵襲性ｉｎ  ｖｉｖｏバイオルミネセンスモデルにおける、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋細胞成長に対するＰ２２０７７処置の効果を示す。パネルＢは、グラフとしてプロットされた全光束バイオルミネセンス（total  flux  bioluminescence）を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。パネルＣは、マッチした出発白血病負荷を有する代表的なマウスのバイオルミネセント画像を示す。スチューデントｔ検定（両側）：ビヒクル  ｖｓ  ＩＰ  ＢＩＤ：４日目（ｐ＝０．００６９２１２）、６日目（ｐ＝０．１０３３９３４）。ビヒクル  ｖｓ  ＰＯ  ＱＤ：４日目（ｐ＝０．００３４５０１）、６日目（ｐ＝０．０４２５３８３）。
【図２４Ｃ】図２４は、ＦＬＴ３キナーゼ阻害剤とＨＢＸ１９８１８との組合せの効果、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの変異体ＦＬＴ３陽性ＡＭＬ原発性細胞に対するＵＳＰ１０阻害の標的化効果を示す、パネルＡ、ＢおよびＣとして同定される３個のパネルを含む。パネルＡは、Ｐ２２０７７（５０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ  ＢＩＤ）処置したマウス（パイロット研究、４日の処置）由来の骨髄試料と対比した、ビヒクル処置マウス由来の骨髄試料における、Ｂｒｉｇｈｔ  Ｇｌｏアッセイおよびｌｕｍｉｎｏｓｋａｎによって測定されるルシフェラーゼ陽性白血病負荷（左パネル）、ならびにＣＤ１３５−ＰＥコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによって測定されるパーセントＦＬＴ３（右パネル）の間の相関を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を代表する。パネルＢおよびＣは、白血病の非侵襲性ｉｎ  ｖｉｖｏバイオルミネセンスモデルにおける、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋細胞成長に対するＰ２２０７７処置の効果を示す。パネルＢは、グラフとしてプロットされた全光束バイオルミネセンス（total  flux  bioluminescence）を示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。パネルＣは、マッチした出発白血病負荷を有する代表的なマウスのバイオルミネセント画像を示す。スチューデントｔ検定（両側）：ビヒクル  ｖｓ  ＩＰ  ＢＩＤ：４日目（ｐ＝０．００６９２１２）、６日目（ｐ＝０．１０３３９３４）。ビヒクル  ｖｓ  ＰＯ  ＱＤ：４日目（ｐ＝０．００３４５０１）、６日目（ｐ＝０．０４２５３８３）。
【００４２】
【図２５Ａ−Ｃ】図２５は、処置９日目に及ぶｉｎ  ｖｉｖｏバイオルミネセンス研究における個々のマウスの経時的なバイオルミネセンスの結果を示す、パネルＡ、ＢおよびＣとして同定される３個のパネルを含む。
【００４３】
【図２６Ａ】図２６は、ＵＳＰ１０の阻害が、発癌性ＦＬＴ３の分解を誘導し、これにより、白血病治療のための新たな手法を提供することを裏付けるデータを提供する概要図を示す、パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤとして同定される４個のパネルを含む。パネルのそれぞれにおいて、ＵＳＰ１０ｉ−１という用語は、ＨＢＸ１９８１８を指す。
【図２６Ｂ】図２６は、ＵＳＰ１０の阻害が、発癌性ＦＬＴ３の分解を誘導し、これにより、白血病治療のための新たな手法を提供することを裏付けるデータを提供する概要図を示す、パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤとして同定される４個のパネルを含む。パネルのそれぞれにおいて、ＵＳＰ１０ｉ−１という用語は、ＨＢＸ１９８１８を指す。
【図２６Ｃ】図２６は、ＵＳＰ１０の阻害が、発癌性ＦＬＴ３の分解を誘導し、これにより、白血病治療のための新たな手法を提供することを裏付けるデータを提供する概要図を示す、パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤとして同定される４個のパネルを含む。パネルのそれぞれにおいて、ＵＳＰ１０ｉ−１という用語は、ＨＢＸ１９８１８を指す。
【図２６Ｄ】図２６は、ＵＳＰ１０の阻害が、発癌性ＦＬＴ３の分解を誘導し、これにより、白血病治療のための新たな手法を提供することを裏付けるデータを提供する概要図を示す、パネルＡ、Ｂ、ＣおよびＤとして同定される４個のパネルを含む。パネルのそれぞれにおいて、ＵＳＰ１０ｉ−１という用語は、ＨＢＸ１９８１８を指す。
【００４４】
ヒストグラムを含有する全図について、バーは、左から右へと、別々の（discreet）測定毎に、示されている通り、図の凡例中の上から下へと図のボックスに対応することに留意されたい。加えて、数値を使用した化合物を指す全図について、数値は、次の通りの化合物名を指す：
化合物１は、Ｃ５９８−０４６６である；化合物２は、Ｃ５９８−０４６８である；化合物３は、Ｃ５９８−０５１５である；化合物４は、Ｃ５９８−０５６３である；化合物５は、Ｃ５９８−０５７１である；化合物６は、Ｃ５９８−０６４６である；化合物７は、Ｃ６７３−０１０５である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
ＦＬＴ３キナーゼ阻害剤は、活性化ＦＬＴ３変異による急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）に対する有意な臨床活性を提示する。しかし、薬物耐性は、急速に発症することが多い。モデル系において、薬物処置は、臨床薬物耐性に寄与しうるＦＬＴ３タンパク質の代償性増加をもたらす。脱ユビキチン化（ＤＵＢ）酵素のＵＳＰ１０が、ＦＬＴ３調節因子（例えば、ＡＭＬを駆動するＦＬＴ３活性化変異体の安定化因子）であること、また、ＦＬＴ３キナーゼ阻害に焦点が置かれていることとは対照的に、ＵＳＰ１０のモジュレートによるＦＬＴ３分解に焦点を置くことによりＡＭＬを処置しうることが、本明細書において決定された。例えば、本明細書において、ＦＬＴ３と直接的に相互作用するＵＳＰ１０の遺伝的ノックダウン（ＫＤ）または薬理学的阻害が、ＦＬＴ３分解を引き起こし、ＦＬＴ３変異体陽性ＡＭＬ細胞生存を低下させることが裏付けられる。ＵＳＰ１０の阻害または遮断によるなど、その分解を促進することによるＡＭＬを駆動する活性化変異体ＦＬＴ３の活性の阻害または遮断は、ＦＬＴ３キナーゼ活性の単なる阻害または遮断よりも効果的であると考えられるが、その理由として、このような分解が、単独で、またはＦＬＴ３キナーゼ活性阻害もしくは遮断と組み合わせて、ＦＬＴ３の酵素機能および足場機能の両方を同時に阻害または遮断することができ、ＦＬＴ３タンパク質の代償性増加または一部のキナーゼ阻害剤に関連する耐性点変異を抑えることができるからである。
【００４６】
Ｉ．定義
本明細書では、冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」を使用して、冠詞の文法的目的語のうちの１つまたは１つを超える（すなわち、少なくとも１つ）を指す。例を目的として述べると、「要素」とは、１つの要素または１つを超える要素を意味する。
【００４７】
「投与すること」という用語は、薬剤が、その意図される機能を実行することを可能にする投与経路を含むことが意図される。使用されうる身体の処置のための投与経路の例は、注射（皮下、静脈内、非経口的、腹腔内、髄腔内（intrathecal）など）、経口、吸入および経皮経路を含む。注射は、ボーラス注射でありうる、または持続注入でありうる。投与経路に応じて、上記薬剤は、選択される材料でコーティングして、またはその中に配置して、その意図される機能を実行するその能力を有害に影響しうる天然条件からこれを保護することができる。上記薬剤は、単独で、または薬学的に許容される担体と併せて投与することができる。上記薬剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏでその活性型に変換されるプロドラッグとして投与することもできる。
【００４８】
「変更された量」または「変更されたレベル」という用語は、バイオマーカー核酸の増加または減少されたコピー数（例えば、生殖細胞系列および／または体細胞の）、例えば、対照試料中のバイオマーカー核酸の発現レベルまたはコピー数と比較したがん試料中の増加または減少された発現レベルを指す。バイオマーカーの「変更された量」という用語はまた、正常な対照試料中の対応するタンパク質レベルと比較した、試料、例えば、がん試料中の、バイオマーカータンパク質の増加または減少されたタンパク質レベルも含む。さらに、バイオマーカータンパク質の変更された量は、バイオマーカータンパク質の発現または活性に影響を及ぼしうる、マーカーのメチル化状態など、翻訳後修飾を検出することにより決定することができる。
【００４９】
バイオマーカーの量が、それぞれ、正常または対照のレベルより、量を評価するのに採用されるアッセイの標準誤差を超える量だけ大きいかまたは小さく、好ましくはその正常量より、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、３５０％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％大きいかまたは小さい場合に、対象におけるバイオマーカーの量は、バイオマーカーの正常および／または量より「有意に」高量または低量である。代替的に、対象におけるバイオマーカーの量は、量が、バイオマーカーの正常および／または対照量よりも少なくとも約２、好ましくは少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１６５％、１７０％、１７５％、１８０％、１８５％、１９０％、１９５％、２倍、３倍、４倍、５倍もしくはそれよりも多い、または５％〜１００％などのその間の任意の範囲だけ、それぞれ高いまたは低い場合、正常および／または対照量よりも「有意に」高量または低量と考えることができる。このような有意なモジュレーション値は、例えば、発現の変更されたレベル、変更された活性、がん細胞過剰増殖性成長の変化、がん細胞死の変化、バイオマーカー阻害の変化、被験薬剤結合の変化など、本明細書に記載されている任意の測定基準に適用することができる。
【００５０】
バイオマーカーの「発現の変更されたレベル」という用語は、被験試料、例えば、がんを患う患者に由来する試料中のバイオマーカーの発現レベルまたはコピー数であって、発現またはコピー数を評価するのに採用されるアッセイの標準誤差より大きいかまたは小さく、対照試料（例えば、関連疾患を有さない健常対象に由来する試料）、好ましくは、いくつかの対照試料中のバイオマーカーの平均発現レベルまたはコピー数の、好ましくは少なくとも２倍または２分の１であり、より好ましくは３、４、５、もしくは１０倍、または最大で約３、４、５、もしくは１０分の１である、発現レベルまたはコピー数を指す。発現の変更されたレベルは、発現またはコピー数を評価するのに採用されるアッセイの標準誤差より大きいかまたは小さく、対照試料（例えば、関連疾患を有さない健常対象に由来する試料）、好ましくは、いくつかの対照試料中のバイオマーカーの平均発現レベルまたはコピー数の、好ましくは少なくとも２倍または２分の１であり、より好ましくは３、４、５、もしくは１０倍、または最大で約３、４、５、もしくは１０分の１である。
【００５１】
バイオマーカーの「変更された活性」という用語は、正常な対照試料中のバイオマーカーの活性と比較して、疾患状態、例えば、がん試料中において増加または低下するバイオマーカーの活性を指す。バイオマーカーの変更された活性は、例えば、バイオマーカーの変更された発現、バイオマーカーの変更されたタンパク質レベル、バイオマーカーの変更された構造、あるいは、例えば、バイオマーカーと同じもしくは異なる経路に関与する他のタンパク質との変更された相互作用、または転写の活性化因子もしくは阻害剤との変更された相互作用の結果でありうる。
【００５２】
バイオマーカーの「変更された構造」という用語は、バイオマーカー核酸またはタンパク質内の変異または対立遺伝子改変体、例えば、バイオマーカー核酸またはタンパク質の発現または活性に、正常または野生型遺伝子またはタンパク質と比較して影響を及ぼす変異の存在を指す。例えば、変異は、置換、欠失、または付加変異を含むがこれらに限定されない。変異は、バイオマーカー核酸のコードまたは非コード領域内に存在しうる。
【００５３】
本明細書でそうでないことが明記されない限りにおいて、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）の天然に存在する形態、ならびに単鎖抗体、キメラ、およびヒト化抗体などの組換え抗体、ならびに多特異性抗体のほか、前出の全ての断片および誘導体であって、少なくとも抗原結合性部位を有する断片および誘導体を広く包含する。抗体の誘導体は、抗体とコンジュゲートさせたタンパク質または化学的部分を含みうる。
【００５４】
加えて、イントラボディ（intrabody）は、抗体の特徴を有するが、目的の細胞内標的に結合および／またはこれを阻害するために細胞内で発現されうる、周知の抗原結合性分子である（Chenら（１９９４年）Human  Gene  Ther.５巻：５９５〜６０１頁）。例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）の使用、超安定性のための免疫グロブリンＶＬドメインの修飾、還元性細胞内環境に抵抗するための抗体の修飾、細胞内安定性を増加させるおよび／または細胞内局在化をモジュレートする融合タンパク質の生成など、細胞内部分を標的と（例えば、阻害）するように抗体を適応させるための方法は、当技術分野で周知である。細胞内抗体は、例えば、予防および／または治療目的で（例えば、遺伝子治療として）、多細胞生物の１個または複数の細胞、組織または臓器において導入および発現させることもできる（少なくともＰＣＴ公開ＷＯ０８／０２００７９、ＷＯ９４／０２６１０、ＷＯ９５／２２６１８およびＷＯ０３／０１４９６０；米国特許第７，００４，９４０号；CattaneoおよびBiocca（１９９７年）Intracellular  Antibodies:  Development  and  Applications（Landes  and  Springer-Verlag  publs.）；Kontermann（２００４年）Methods  ３４巻：１６３〜１７０頁；Cohenら（１９９８年）Oncogene  １７巻：２４４５〜２４５６頁；Auf  der  Maurら（２００１年）FEBS  Lett.５０８巻：４０７〜４１２頁；Shaki-Loewensteinら（２００５年）J.  Immunol.  Meth.３０３巻：１９〜３９頁を参照されたい）。
【００５５】
本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、抗体の「抗原結合性部分」（または単に、「抗体の部分」）も含む。本明細書で使用される「抗原結合性部分」という用語は、抗原（例えば、バイオマーカーポリペプチドまたはその断片）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１または複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片により果たされうることが示されている。抗体の「抗原結合性部分」という用語の中に包含される結合性断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる、Ｆｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬおよびＶＨドメインからなる、Ｆｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９年）、Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：５４４〜５４６頁）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によりコードされているが、組換え法を使用して、それらが単一のタンパク質鎖となることを可能とする合成リンカーにより結合することができ、この場合、ＶＬ領域とＶＨ領域とは、対合して、一価ポリペプチドを形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３〜４２６頁；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８５巻：５８７９〜５８８３頁；およびＯｓｂｏｕｒｎら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６巻：７７８頁を参照されたい）。抗体の「抗原結合性部分」という用語の中にはまた、このような単鎖抗体も包含することを意図する。完全なＩｇＧポリペプチドまたは他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、特異的なｓｃＦｖの任意のＶＨおよびＶＬ配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域のｃＤＮＡまたはゲノム配列に連結することができる。ＶＨおよびＶＬはまた、タンパク質化学反応または組換えＤＮＡ技術を使用する、免疫グロブリンのＦａｂ、Ｆｖ、または他の断片の生成においても使用することができる。また、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）など、単鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディとは、ＶＨおよびＶＬドメインを、単一のポリペプチド鎖上で、但し同じ鎖上の２つのドメインの間の対合を可能とするには短過ぎるリンカーを使用して発現させ、これにより、ドメインに、別の鎖の相補的なドメインと対合させ、２つの抗原結合性部位を創出する、二価の二特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．、９０巻：６４４４〜６４４８頁；Ｐｏｌｊａｋら（１９９４年）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２巻：１１２１〜１１２３頁を参照されたい）。
【００５６】
なおさらに、抗体またはその抗原結合性部分は、抗体または抗体の部分の、１または複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合的または非共有結合的会合により形成される、より大型の免疫接着ポリペプチドの一部でありうる。このような免疫接着ポリペプチドの例は、四量体のｓｃＦｖポリペプチドを作る、ストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９５年）、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、６巻：９３〜１０１頁）、ならびに二価のビオチン化ｓｃＦｖポリペプチドを作る、システイン残基、バイオマーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９４年）、Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１巻：１０４７〜１０５８頁）を含む。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片など、抗体の部分は、それぞれ、抗体全体のパパインまたはペプシン消化など、従来の技法を使用して、抗体全体から調製することができる。さらに、抗体、抗体の部分、および免疫接着ポリペプチドは、本明細書で記載される、標準的な組換えＤＮＡ法を使用して得ることができる。
【００５７】
抗体は、ポリクローナルの場合もあり、モノクローナルの場合もあり、異種の場合もあり、同種の場合もあり、同系の場合もあり、これらの修飾形態（例えば、ヒト化、キメラなど）の場合もある。抗体はまた、完全にヒトのものである場合もある。好ましくは、本発明の抗体は、バイオマーカーポリペプチドまたはその断片に、特異的または実質的に特異的に結合する。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」という用語は、抗原の特定のエピトープと免疫反応することが可能な、抗原結合性部位の１つの分子種だけを含有する、抗体ポリペプチドの集団を指すのに対し、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用することが可能な、抗原結合性部位の複数の分子種を含有する、抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、それが免疫反応する特定の抗原に対する、単一の結合アフィニティーを提示することが典型的である。
【００５８】
抗体はまた、「ヒト化」されてもよく、これはヒト細胞により作られる抗体により酷似するように変更された可変および定常領域を有する、非ヒト細胞により作られる抗体を含むように意図される。例えば、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列中に見出されるアミノ酸を組み込むように、非ヒト抗体アミノ酸配列を変更することを介する。本発明のヒト化抗体は、例えば、ＣＤＲ内に、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるランダムもしくは部位特異的変異誘発、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおける体細胞変異により導入される変異）を含みうる。本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語はまた、マウスなど、別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列を、ヒトフレームワーク配列へとグラフトした抗体も含む。
【００５９】
「割り当てられたスコア」という用語は、患者試料中で測定された後で、バイオマーカーの各々について指定される数値を指す。割り当てられたスコアは、試料中のバイオマーカーの非存在、存在、または推定量と相関する。割り当てられたスコアは、手作業で（例えば、目視により）、または画像の取得および解析のための装置の補助により生成することができる。ある特定の実施形態では、割り当てられたスコアを、定性的評価、例えば、グレード付けされたスケール上の蛍光リードアウトの検出、または定量的評価により決定する。一実施形態では、複数の測定されたバイオマーカーに由来する、割り当てられたスコアの組合せを指す、「集合スコア（ａｇｇｒｅｇａｔｅ  ｓｃｏｒｅ）」を決定する。一実施形態では、集合スコアとは、割り当てられたスコアの合計である。別の実施形態では、割り当てられたスコアの組合せは、割り当てられたスコアに対する数学的演算を実行してから、それらを集合スコアへと組み合わせることを伴う。ある特定の実施形態では、本明細書ではまた、集合スコアを、予測スコア」とも称する。
【００６０】
「バイオマーカー」という用語は、抗ＡＭＬ療法（例えば、ＵＳＰ１０阻害剤療法）の効果を予測することが決定されている、本発明の測定可能な実体を指す。バイオマーカーは、限定なしに述べると、核酸（例えば、ゲノム核酸および／または転写された核酸）、およびタンパク質、特に、表１に示される、関与するものを含みうる。表１に列挙されている多くのバイオマーカーは、治療標的としても有用である。一実施形態では、このような標的は、表１に示すＵＳＰ１０メンバーおよび／または表２に示すＦｌｔ３メンバーである。
【００６１】
「遮断」抗体または抗体「アンタゴニスト」とは、それが結合する抗原の少なくとも１つの生物学的活性を、阻害または低減する抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される遮断抗体もしくはアンタゴニスト抗体またはそれらの断片は、抗原の所与の生物学的活性を、実質的または完全に阻害する。
【００６２】
「体液」という用語は、体内から排出または分泌される流体のほか、通常体内から排出または分泌されない流体（例えば、羊水、房水、胆汁、血液および血漿、脳脊髄液、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎおよびｅａｒｗａｘ）、カウパー腺液または尿道球腺液（ｐｒｅ−ｅｊａｃｕｌａｔｏｒｙ  ｆｌｕｉｄ）、乳び、びじゅく、糞便、スキーン腺液（ｆｅｍａｌｅ  ｅｊａｃｕｌａｔｅ）、間質液、細胞内液、リンパ、経血、母乳、粘液、胸膜液、膿、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑膜液、涙、尿、膣液（ｖａｇｉｎａｌ  ｌｕｂｒｉｃａｔｉｏｎ）、硝子体液、および吐瀉物）も指す。
【００６３】
「がん」または「腫瘍」または「過剰増殖性」という用語は、制御されない増殖、不死性、転移能、急速な成長および増殖速度、ならびにある特定の特徴的な形態学的特色など、がんを引き起こす細胞に典型的な特徴を保有する細胞の存在を指す。一部の実施形態では、このような細胞は、ＦＬＴ３キナーゼ活性を活性化する変異を有するＦＬＴ３などの癌遺伝子の発現および活性に部分的にまたは完全に起因する、このような特徴を呈する。がん細胞は、多くの場合、腫瘍の形態であるが、このような細胞は、動物内に単独で存在しうる、または白血病細胞などの非腫瘍形成性がん細胞でありうる。本明細書で使用される通り、「がん」という用語は、前悪性および悪性がんを含む。がんは、Ｂ細胞がん、例えば、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病およびミュー鎖病などの重鎖病、良性単クローン性ガンマグロブリン血症、ならびに免疫細胞アミロイドーシス、メラノーマ、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸部がん、子宮または子宮内膜がん、口腔または咽頭のがん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆管がん、小腸または虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液学的組織のがんなどを含むがこれらに限定されない。本発明によって包含される方法に適用可能ながんの種類の他の非限定的な例は、ヒトの肉腫および癌、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、肝臓がん、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸部がん、骨がん、脳腫瘍、精巣がん、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、アストロサイトーマ、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、ニューロブラストーマ、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ球性白血病および急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病）；ならびに真性多血症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症および重鎖病を含む。一部の実施形態では、がんは、上皮性（epithlelial）の性質であり、膀胱がん、乳がん、子宮頸部がん、結腸がん、婦人科がん、腎がん、喉頭がん、肺がん、口腔がん、頭頸部がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がんまたは皮膚がんを含むがこれらに限定されない。他の実施形態では、がんは、乳がん、前立腺がん、肺がんまたは結腸がんである。また他の実施形態では、上皮がんは、非小細胞肺がん、非乳頭状腎細胞癌、子宮頸部癌、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌）または乳癌である。上皮がん���、漿液性、類内膜、粘液性、明細胞、ブレンナーまたは未分化型を含むがこれらに限定されない、様々な他の方式で特徴付けることができる。
【００６４】
ある特定の実施形態では、がんは、急性骨髄芽球性白血病（ＡＭＬ）である。ＡＭＬは、成人ＡＭＬ、小児ＡＭＬまたはその両方でありうる。急性骨髄性白血病（acute  myelogenous  leukemia）、急性骨髄芽球性白血病、急性顆粒球性白血病または急性非リンパ球性白血病としても公知の急性骨髄性白血病（acute  myeloid  leukemia）（ＡＭＬ）は、疲労、息切れ、胆管癌および出血になり易いことならびに感染の危険性の増大によって特徴付けられる血液および骨髄の急成長型のがんである。ＡＭＬは、最も一般的な種類の急性白血病である。骨髄が、未だ完全には成熟していない細胞である芽球を作り始めると、ＡＭＬが起こる。このような芽球は正常では、白血球に発生する。しかし、ＡＭＬにおいて、このような細胞は、発生せず、感染を回避することができない。ＡＭＬにおいて、骨髄は、異常赤血球および血小板を作ることもできる。このような異常細胞の数は、急速に増加し、異常（白血病）細胞は、身体が必要とする正常白血球、赤血球および血小板を締め出し始める。ＡＭＬは、他の白血病よりも多くの芽球（骨髄芽球、単芽球および巨核芽球）を含む、より高い百分率の脱分化および未分化細胞が関与する。ＡＭＬ亜型は、白血病が発症する細胞型に基づき分類される。８種の共通ＡＭＬ亜型は、特殊解析における骨髄芽球性（Ｍ０）、成熟なしの骨髄芽球性（Ｍ１）、成熟ありの骨髄芽球性（Ｍ２）、前骨髄球性（promyeloctic）（Ｍ３）、骨髄単球性（Ｍ４）、単球性（Ｍ５）、赤白血病（Ｍ６）および巨核球性を含む。一般に、ＡＭＬを処置する標準治療は、寛解誘導を目標とする化学療法による初期処置であるが、さらなる化学療法または造血幹細胞移植が後に続いてもよい。
【００６５】
ＡＭＬの早期徴候は、多くの場合、はっきりとせずかつ非特異的であり、インフルエンザまたは他の一般的疾病の初期徴候と同様のものでありうる。一部の全身性症状は、発熱、疲労、体重減少または食欲不振、息切れ、貧血、胆管癌または出血になり易いこと、点状出血（出血に起因する皮膚下の扁平な帽針頭大の斑点）、骨および関節痛、ならびに持続性または高頻度感染を含む。脾臓の拡張は、ＡＭＬにおいて起こることがあるが、典型的には軽度かつ無症候性である。リンパ節腫脹は、急性リンパ芽球性白血病とは対照的にＡＭＬでは稀である。皮膚は、約１０％の割合で、皮膚白血病の形態で関与する。稀に、皮膚の腫瘍随伴炎症であるスイート症候群が、ＡＭＬに伴い起こることがある。一部のＡＭＬ患者は、歯肉組織への白血病性細胞の浸潤により、歯肉の腫脹を経験しうる。稀に、白血病の最初の徴候は、緑色腫と呼ばれる骨髄外部の固形白血病性腫瘤または腫瘍の発症でありうる。ＡＭＬ診断の最初の手がかりは、典型的に、全血球計算に関する異常結果である。過剰な異常白血球（白血球増加症）が共通所見であり、白血病性芽球が観察されることがあるが、ＡＭＬは、血小板、赤血球の孤立した減少、またはさらには低い白血球計数（白血球減少症）を提示する場合もある。循環白血病性芽球が存在する場合、末梢血スメアの検査によってＡＭＬの推定診断を為すことができるが、確定診断は通常、適切な骨髄穿刺および生検を要求する。骨髄または血液は、光学顕微鏡検査やフローサイトメトリー下で検査されて、白血病の存在を診断し、他の種類の白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病  −  ＡＬＬ）からＡＭＬを鑑別し、疾患の亜型を分類する。骨髄または血液の試料は典型的に、慣用的な細胞遺伝学または蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって染色体異常についても調べられる。遺伝的研究を行って、疾患のアウトカムに影響しうるＦＬＴ３、ヌクレオフォスミンおよびＫＩＴなど、遺伝子における特異的変異を探すこともできる。血液および骨髄スメアにおける細胞化学的染色は、ＡＬＬからのＡＭＬの区別およびＡＭＬの細分類に役立つ。ミエロペルオキシダーゼまたはスダンブラック染色および非特異的エステラーゼ染色の組合せは、大抵の場合、所望の情報を提供する。ミエロペルオキシダーゼまたはスダンブラック反応は、ＡＭＬの同定の確立およびＡＭＬのＡＬＬからの識別において最も有用である。非特異的エステラーゼ染色は、ＡＭＬにおける単球性成分の同定および低分化単芽球性白血病のＡＬＬからの識別に使用される。
【００６６】
２種の最も一般的に使用されているＡＭＬの分類スキーマは、古い方のフレンチアメリカンブリティッシュ（French-American-British）（ＦＡＢ）方式および新しい方の世界保健機関（World  Health  Organization）（ＷＨＯ）方式である。広く使用されているＷＨＯ基準に従うと、遺伝的異常の存在が芽球パーセントに無関係に診断的である、反復性遺伝的異常（ｔ（８；２１）、ｉｎｖ（１６）およびｔ（１５；１７））を有するＡＭＬの３種の最良の予後形態の場合を除いて、ＡＭＬの診断は、白血病性骨髄芽球による血液および／または骨髄の２０％超の関与を裏付けることにより確立される。フレンチアメリカンブリティッシュ（ＦＡＢ）分類は、ＡＭＬの診断のための骨髄（ＢＭ）または末梢血（ＰＢ）における少なくとも３０％の芽球百分率が関与する。ＡＭＬは、異なって処置される、骨髄異形成症候群または骨髄増殖性症候群などの「前白血病」状態から慎重に鑑別される必要がある。血液または骨髄において行われる蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、ＡＭＬとは異なるＡＰＬを特徴付ける染色体転座［ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ１２）；］（ＰＭＬ／ＲＡＲＡ融合タンパク質癌遺伝子）を同定することができるため、多くの場合、診断のために使用される。
【００６７】
「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含む、ヌクレオチド配列の領域を指すのに対し、「非コード領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されない、ヌクレオチド配列の領域（例えば、５’および３’側非翻訳領域）を指す。
【００６８】
「相補的な」という用語は、２つの核酸鎖の領域の間または同じ核酸鎖の２つの領域の間の配列相補性についての広範な概念を指す。残基が、チミンまたはウラシルである場合、第１の核酸領域のアデニン残基は、第１の領域とアンチパラレルな、第２の核酸領域の残基と、特異的な水素結合（「塩基対合」）を形成することが可能であることが公知である。同様に、残基が、グアニンである場合、第１の核酸鎖のシトシン残基は、第１の鎖とアンチパラレルな、第２の核酸鎖の残基との塩基対合が可能であることが公知である。２つの領域が、アンチパラレルに配置される場合に、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が、第２の領域の残基との塩基対合が可能であれば、核酸の第１の領域は、同じまたは異なる核酸の第２の領域と相補的である。第１の領域は、第１の部分を含み、第２の領域は、第２の部分を含むことが好ましく、これにより、第１および第２の部分が、アンチパラレルに配置されている場合、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％は、第２の部分内のヌクレオチド残基との塩基対合が可能である。より好ましくは、第１の部分の全てのヌクレオチド残基は、第２の部分内のヌクレオチド残基との塩基対合が可能である。
【００６９】
「対照」という用語は、被験試料中の発現産物との比較をもたらすのに適する、任意の基準物質を指す。一実施形態では、対照は、それに由来する発現産物のレベルを検出し、被験試料に由来する発現産物のレベルと比較する、「対照試料」を得ることを含む。このような対照試料は、アウトカムが既知である、対照がん患者に由来する試料（保存された試料による測定値の場合もあり、かつての試料測定値の場合もある）；正常患者もしくはがん患者などの対象から単離された正常組織もしくは細胞、正常対象もしくはがん患者などの対象から単離された培養初代細胞／組織、がん患者の同じ臓器もしくは身体の場所から得られた、隣接正常細胞／組織、正常対象から単離された組織もしくは細胞試料、または受託機関から得られた初代細胞／組織を含むがこれらに限定されない、任意の適切な試料を含みうる。別の好ましい実施形態では、対照は、ハウスキーピング遺伝子、正常組織（または他の既に解析された対照試料）からの発現産物レベルの範囲、ある特定のアウトカム（例えば、１、２、３、４年間にわたる生存など）を伴うか、またはある特定の処置（例えば、がん療法の標準治療）を施される、患者群または患者のセットに由来する被験試料中の、既に決定された発現産物レベルの範囲を含むがこれらに限定されない、任意の適切な供給源に由来する、基準物質の発現産物レベルを含みうる。当業者は、このような対照試料および基準物質の発現産物レベルを、本発明の方法において、対照として組み合わせて使用しうることを理解するであろう。一実施形態では、対照は、正常または非がん性の細胞／組織試料を含みうる。別の好ましい実施形態では、対照は、がん患者のセットなど、患者のセット、またはある特定の処置を施されるがん患者のセット、または別のアウトカムと対比した１つのアウトカムを伴う患者のセットについての発現レベルを含みうる。前者の場合、各患者の特異的な発現産物レベルを、百分位数による発現レベルへと割り当てることもでき、基準物質による発現レベルの平均値または平均より高いまたは低いレベルとして表すこともできる。別の好ましい実施形態では、対照は、正常細胞、組合せ化学療法により処置した患者に由来する細胞、および良性がんを有する患者に由来する細胞を含みうる。別の実施形態では、対照はまた、測定値、例えば、同じ集団内のハウスキーピング遺伝子の発現レベルと比較した、集団内の特定の遺伝子の平均発現レベルも含みうる。このような集団は、正常対象、いかなる処置も受けていないがん患者（すなわち、処置ナイーブ）、標準治療ケアを受けているがん患者、または良性がんを有する患者を含みうる。別の好ましい実施形態では、対照は、被験試料中の２つの遺伝子の発現産物レベルの比を決定し、これを、基準物質中の、同じ２つの遺伝子の任意の適切な比と比較すること；被験試料中の２つまたはそれ超の遺伝子の発現産物レベルを決定し、任意の適切な対照中の発現産物レベルの差異を決定すること；ならびに被験試料中の２つまたはそれ超の遺伝子の発現産物レベルを決定し、それらの発現を、被験試料中のハウスキーピング遺伝子の発現に照らして正規化し、任意の適切な対照と比較することを含むがこれらに限定されない、発現産物レベルの比への変換を含む。特に好ましい実施形態では、対照は、被験試料と同じ系統および／または種類の対照試料を含む。別の実施形態では、対照は、がんを有する全ての患者など、患者試料のセット中の百分位数または患者試料のセットに基づく百分位数として群分けされた発現産物レベルを含みうる。一実施形態では、対照の発現産物レベルを確立し、この場合、例えば、特定の百分位数と比べて高いまたは低い発現産物レベルを、アウトカムを予測するためのベースとして使用する。別の好ましい実施形態では、既知のアウトカムを伴うがん対照患者からの発現産物レベルを使用して、対照の発現産物レベルを確立し、被験試料に由来する発現産物のレベルを、アウトカムを予測するためのベースとして、対照の発現産物レベルと比較する。下記のデータにより裏付けられる通り、本発明の方法は、被験試料中の発現産物レベルを、対照と比較するときの特異的な切断点（ｃｕｔ−ｐｏｉｎｔ）の使用に限定されない。
【００７０】
バイオマーカー核酸の「コピー数」とは、特定の遺伝子産物をコードする、細胞（例えば、生殖細胞系列および／または体細胞）中のＤＮＡ配列の数を指す。一般に、所与の遺伝子について、哺乳動物は、各遺伝子の２つずつのコピーを有する。しかし、コピー数は、遺伝子増幅または重複により増加する場合もあり、欠失により低減される場合もある。例えば、生殖細胞系列のコピー数変化は、１または複数のゲノム遺伝子座における変化であって、前記１または複数のゲノム遺伝子座が、対照中の生殖細胞系列のコピーのうちの、正常相補体中のコピー数（例えば、特異的な生殖細胞系列のＤＮＡおよび対応するコピー数を決定した種と同じ種についての、生殖細胞系列のＤＮＡ内の正常コピー数）により説明されない変化を含む。体細胞のコピー数変化は、１または複数のゲノム遺伝子座における変化であって、前記１または複数のゲノム遺伝子座が、対照の生殖細胞系列のＤＮＡ中のコピー数（例えば、体細胞のＤＮＡおよび対応するコピー数を決定した対象と同じ対象についての、生殖細胞系列のＤＮＡ中のコピー数）により説明されない変化を含む。
【００７１】
バイオマーカー核酸の「正常」コピー数（例えば、生殖細胞系列および／または体細胞）またはバイオマーカー核酸もしくはタンパク質の「正常」発現レベルとは、生体試料、例えば、がんに罹患していない対象、例えば、ヒト、またはがんを有する同じ対象における、対応する非がん性組織に由来する組織、全血、血清、血漿、口腔内切屑、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、および骨髄を含有する試料中の発現の活性／レベルまたはコピー数である。
【００７２】
「対象に適する処置レジメンを決定すること」という用語は、本発明に従う解析の結果に基づくか、または本質的に基づくか、または少なくとも部分的に基づき、開始、改変、および／または終了させる対象のための処置レジメン（すなわち、対象におけるがんを予防および／または処置するために使用される、単一の療法または異なる療法の組合せ）の決定を意味するように理解する。一例は、がんに対する標的化療法を提供して、抗がん療法（例えば、ＵＳＰ１０阻害剤療法）を提供するかどうかの決定である。別の例は、その目的が再発の危険性を減少させることである、外科手術後のアジュバント療法の開始であり、その他は、特定の化学療法の投与量を修飾することである。決定は、本発明に従う解析の結果に加えて、処置される対象の個人的な特徴にも基づきうる。大半の場合、対象に適する処置レジメンの実際の決定は、主治医（ａｔｔｅｎｄｉｎｇ  ｐｈｙｓｉｃｉａｎまたはａｔｔｅｎｄｉｎｇ  ｄｏｃｔｏｒ）により実施する。
【００７３】
「発現シグネチャ」または「シグネチャ」という用語は、２つまたはそれ超の協同的に発現するバイオマーカーの群を指す。例えば、このシグネチャを構成する遺伝子、タンパク質などは、特異的な細胞系統、分化段階、または特定の生物学的応答中において発現されうる。バイオマーカーは、がんの起源の細胞、生検における非悪性細胞の性質、およびがんの原因である発癌性機構など、それが発現される腫瘍の生物学的態様を反映することができる。発現データおよび遺伝子の発現レベルは、コンピュータ可読媒体、例えば、マイクロアレイまたはチップ読取りデバイスと共に使用されるコンピュータ可読媒体上に保存することができる。このような発現データを操作して、発現シグネチャを生成することができる。
【００７４】
分子は、分子の実質的な画分が基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）から解離することなく流体（例えば、標準クエン酸食塩水（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ）、ｐＨ７．４）で基材をすすぎうるように、分子が基材と共有結合的または非共有結合的に会合している場合、基材に「固定」されているか、または「付着」している。
【００７５】
「ＦＬＴ３」という用語は、受容体チロシンキナーゼクラスＩＩＩに属するサイトカイン受容体としてのＦｍｓ関連チロシンキナーゼ３を指し、代替的に、「Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３」、「幹細胞チロシンキナーゼ１」、「Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３」、「ＦＬサイトカイン受容体」、「ＣＤ１３５」、「ＣＤ１３５抗原」、「ＥＣ  ２．７．１０．１」、「ＥＣ  ２．７．１０」、「ＦＬＫ−２」、「ＳＴＫ１」、「増殖因子受容体チロシンキナーゼＩＩＩ型」、「胎児肝臓キナーゼ２」および「受容体型チロシン−タンパク質キナーゼＦＬＴ３」として公知である。ＦＬＴ３の構成的活性化をもたらす体細胞変異は、ＡＭＬ患者において高頻度で存在する。このような変異は、２クラスに分けられ、最も一般的なのは、キナーゼ活性の正常調節を破壊する、膜近傍領域における可変長のインフレーム遺伝子内縦列重複である。同様に、キナーゼドメインの活性化ループにおける点変異は、構成的に活性化されたキナーゼをもたらすことができる。
【００７６】
ＦＬＴ３核酸およびタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列は、当技術分野で公知であり、Ｕ．Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより維持されているＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて公的に利用可能である。例えば、ヒトＦＬＴ３核酸配列は、周知であり、例えば、ＮＭ＿００４１１９．２（改変体１、短い方の転写物を表し、そのタンパク質をコードする）およびＮＲ＿１３０７０６．１（改変体２、これは、改変体１と比較して、代替内部エクソン（alternate  internal  exon）を含有する）を含む。改変体１において使用される通りに、最も５’にある予想される翻訳開始コドンを使用することは、転写物をナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）の候補にするため、改変体２は、非コードである。さらなるＦｌｔ３ヒト配列は、ＸＭ＿０１７０２０４８６．１、ＸＭ＿０１７０２０４８９．１、ＸＭ＿０１７０２０４８７．１、ＸＭ＿０１７０２０４８８．１、ＸＭ＿０１１５３５０１５．２、ＸＭ＿０１１５３５０１７．２およびＸＭ＿０１１５３５０１８．２を限定することなく含む。ヒトＦＬＴ３アミノ酸配列は、周知であり、例えば、ＮＰ＿００４１１０．２（改変体１、上記の通り）、ＸＰ＿０１６８７５９７５．１、ＸＰ＿０１６８７５９７８．１、ＸＰ＿０１６８７５９７６．１、ＸＰ＿０１６８７５９７７．１、ＸＰ＿０１１５３３３１７．１、ＸＰ＿０１１５３３３１９．１およびＸＰ＿０１１５３３３２０．１を含む。
【００７７】
他の種におけるＦＬＴ３オーソログの核酸配列およびアミノ酸配列もまた、周知であり、例えば、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）ＦＬＴ３（ＸＭ＿５０９６０１．５およびＸＰ＿５０９６０１．２）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）ＦＬＴ３（ＸＭ＿０１５１２０８０１．１およびＸＰ＿０１４９７６２８７．１、ＸＭ＿０１５１２０８０２．１およびＸＰ＿０１４９７６２８８．１、ＸＭ＿００１１１７９１３．２およびＸＰ＿００１１１７９１３．１、ＸＭ＿０１５１２０８０３．１およびＸＰ＿０１４９７６２８９．１）、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）ＦＬＴ３（ＮＭ＿００１０２０８１１．１およびＮＰ＿００１０１８６４７．１、ＸＭ＿００５６３５３８２．２およびＸＰ＿００５６３５４３９．１、ＸＭ＿０１４１０７３３３．１およびＸＰ＿０１３９６２８０８．１、ＸＭ＿０１４１０７３３１．１およびＸＰ＿０１３９６２８０６．１、ＸＭ＿０１４１０７３３２．１およびＸＰ＿０１３９６２８０７．１）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）ＦＬＴ３（ＸＭ＿０１０８１０８０５．２およびＸＰ＿０１０８０９１０７．２、ＸＭ＿０１５４６５６９７．１およびＸＰ＿０１５３２１１８３．１）、イエハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＦＬＴ３（ＮＭ＿０１０２２９．２およびＮＰ＿０３４３５９．２、ＸＭ＿００６５０４８０５．３およびＸＰ＿００６５０４８６８．１、ＸＭ＿００６５０４８０４．３およびＸＰ＿００６５０４８６７．１）、ノルウェーラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＦＬＴ３（ＮＭ＿００１１００８２２．２およびＮＰ＿００１０９４２９２．１）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）ＦＬＴ３（ＸＭ＿０１５２７８７７６．１およびＸＰ＿０１５１３４２６２．１、ＸＭ＿００３６４０６１２．３およびＸＰ＿００３６４０６６０．２）、熱帯ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＦＬＴ３（ＸＭ＿０１２９５７９３２．２およびＸＰ＿０１２８１３３８６．１）およびゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）ＦＬＴ３（ＸＭ＿００１９２１７２５．４およびＸＰ＿００１９２１７６０．２）を含む。加えて、ＦＬＴ３阻害剤は、当技術分野で周知であり、スニチニブ、ソラフェニブ、ミドスタウリン（ＰＫＣ４１２）、レスタウルチニブ（ＣＥＰ−７０１）、タンダウチニブ（ＭＬＮ５１８）、キザルチニブ（ＡＣ２２０）およびＫＷ−２４４９を限定することなく含む（Wiernikら（２０１０年）Clin.  Adv.  Hematol.  Oncol.８巻：４２９〜４３７頁）。同様に、抗ＦＬＴ３検出剤は、当技術分野で周知であり、抗体ＯＡＡＦ００４４２（Ａｖｉｖａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、８Ｆ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ａｂ６６０３５（Ａｂｃａｍ）、ＰＥ  Ａ２Ｆ１０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を限定することなく含む（Juら（２０１１年）Hybridoma  ３０巻：６１〜６７頁；Pilotoら（２００５年）Cancer  Res.６５巻：１５１４〜１５２２頁））。
【００７８】
「相同」という用語は、同じ核酸鎖の２つの領域の間または２つの異なる核酸鎖の領域の間のヌクレオチド配列の類似性を指す。両方の領域内のヌクレオチド残基の位置が、同じヌクレオチド残基で占有されている場合、領域は、その位置において相同である。各領域の、少なくとも１つのヌクレオチド残基の位置が、同じ残基で占有されている場合、第１の領域は、第２の領域と相同である。２つの領域の間の相同性は、同じヌクレオチド残基で占有された、２つの領域のヌクレオチド残基の位置の比率との関係で表される。例を目的として述べると、ヌクレオチド配列である５’−ＡＴＴＧＣＣ−３’を有する領域と、ヌクレオチド配列である５’−ＴＡＴＧＧＣ−３’を有する領域とは、５０％の相同性を共有する。第１の領域は、第１の部分を含み、第２の領域は、第２の部分を含むことが好ましく、これにより、部分の各々のヌクレオチド残基の位置の少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％は、同じヌクレオチド残基で占有されている。より好ましくは、部分の各々の全てのヌクレオチド残基の位置は、同じヌクレオチド残基で占有されている。
【００７９】
「免疫細胞」という用語は、免疫応答における役割を果たす細胞を指す。免疫細胞は、造血起源のものであり、Ｂ細胞およびＴ細胞などのリンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球および顆粒球などの骨髄性細胞を含む。
【００８０】
「免疫チェックポイント」という用語は、抗腫瘍免疫応答を下方モジュレートまたは阻害することにより免疫応答を微調整する、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面における分子の群を指す。免疫チェックポイントタンパク質は、当技術分野で周知であり、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴおよびＡ２ａＲを限定することなく含む（例えば、ＷＯ２０１２／１７７６２４を参照されたい）。この用語は、生物学的活性タンパク質断片、ならびに全長免疫チェックポイントタンパク質およびその生物学的活性タンパク質断片をコードする核酸をさらに包含する。一部の実施形態では、この用語は、本明細書に提供されている相同性の記載に従った任意の断片をさらに包含する。
【００８１】
免疫チェックポイントおよびその配列は、当技術分野で周知であり、代表的実施形態を以下に記載する。例えば、「ＰＤ−１」という用語は、公知リガンドとしてＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を有する共阻害受容体として機能する、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーを指す。ＰＤ−１は、ＴＣＲ誘導性活性化Ｔ細胞死において上方調節される遺伝子を選択するためのサブトラクションクローニングに基づく手法を使用して、以前に同定された。ＰＤ−１は、ＰＤ−Ｌ１に結合するその能力に基づく分子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ−４と同様に、ＰＤ−１は、抗ＣＤ３に応答してＴ細胞の表面において急速に誘導される（Agataら、２５（１９９６年）Int.  Immunol.８巻：７６５頁）。しかし、ＣＴＬＡ−４とは対照的に、ＰＤ−１は、Ｂ細胞の表面においても誘導される（抗ＩｇＭに応答して）。ＰＤ−１は、胸腺および骨髄性細胞のサブセットにおいても発現される（Agataら（１９９６年）前出；Nishimuraら（１９９６年）Int.  Immunol.８巻：７７３頁）。
【００８２】
「抗免疫チェックポイント」療法は、免疫チェックポイント核酸および／またはタンパク質を阻害する薬剤の使用を指す。免疫チェックポイントは、免疫応答を抑制する阻害シグナルを提供する共通機能を共有し、１種または複数種の免疫チェックポイントの阻害は、阻害シグナル伝達を遮断するまたはさもなければ中和して、これにより、がんをより効果的に処置するために免疫応答を上方調節することができる。免疫チェックポイントの阻害に有用な例示的な薬剤は、免疫チェックポイントタンパク質またはその断片に結合することができる、および／またはこれを不活性化もしくは阻害することができる、抗体、小分子、ペプチド、ペプチド模倣剤、天然リガンドおよび天然リガンドの誘導体；ならびに免疫チェックポイント核酸またはその断片の発現および／または活性を下方調節することができる、ＲＮＡ干渉、アンチセンス、核酸アプタマーなどを含む。免疫応答を上方調節するための例示的な薬剤は、１種または複数種の免疫チェックポイントタンパク質とその天然受容体（複数可）との間の相互作用を遮断する、該タンパク質に対する抗体；非活性化型の１種または複数種の免疫チェックポイントタンパク質（例えば、ドミナントネガティブポリペプチド）；１種または複数種の免疫チェックポイントタンパク質とその天然受容体（複数可）との間の相互作用を遮断する小分子またはペプチド；その天然受容体（複数可）に結合する融合タンパク質（例えば、抗体または免疫グロブリンのＦｃ部分に融合させた免疫チェックポイント阻害タンパク質の細胞外部分）；免疫チェックポイント核酸転写または翻訳を遮断する核酸分子などを含む。このような薬剤は、上記１種または複数種の免疫チェックポイントとその天然受容体（複数可）（例えば、抗体）との間の相互作用を直接的に遮断して、阻害シグナル伝達を防止し、免疫応答を上方調節することができる。あるいは、薬剤は、１種または複数種の免疫チェックポイントタンパク質とその天然受容体（複数可）との間の相互作用を間接的に遮断して、阻害シグナル伝達を防止し、免疫応答を上方調節することができる。例えば、安定化された細胞外ドメインなど、可溶性バージョンの免疫チェックポイントタンパク質リガンドは、その受容体に結合して、適切なリガンドに結合するための受容体の有効濃度を間接的に低下させることができる。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ２抗体は、単独でまたは組み合わせてのいずれかで、免疫チェックポイントの阻害に使用される。これらの実施形態は、ＰＤ−１経路（例えば、抗ＰＤ−１経路療法、これはさもなければ、ＰＤ−１経路阻害剤療法として公知である）など、特定の免疫チェックポイントに対する特異的療法にも適用可能である。例えば、Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）（ペムブロリズマブ；抗ＰＤ−１抗体）、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）（ニボルマブ；抗ＰＤ−１抗体）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標）（アテゾリズマブ；抗ＰＤ−Ｌ１抗体）、デュルバルマブ（抗ＰＤ−Ｌ１抗体）などを含む、多数の免疫チェックポイント阻害剤が公知であり公に入手可能である。
【００８３】
「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞媒介性および／またはＢ細胞媒介性免疫応答を含む。例示的な免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生および細胞の細胞傷害性を含む。加えて、免疫応答という用語は、Ｔ細胞活性化によって間接的に影響される免疫応答、例えば、抗体産生（液性応答）およびサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化を含む。
【００８４】
「免疫療法剤」という用語は、宿主免疫系を刺激して、対象における腫瘍またはがんに対する免疫応答を生成することができる、任意の分子、ペプチド、抗体または他の薬剤を含むことができる。様々な免疫療法剤は、本明細書に記載されている組成物および方法において有用である。
【００８５】
「阻害する」または「欠損している」という用語は、例えば、特定の作用、機能または相互作用の低下、制限、または遮断を含む。一部の実施形態では、がんの少なくとも１つの症状が、緩和されるか、終結するか、緩徐化するか、または防止される場合、そのがんは、「阻害される」。本明細書で使用される通り、がんの再発または転移が、低減されるか、緩徐化するか、遅延するか、または防止される場合もまた、そのがんは、「阻害される」。同様に、タンパク質の機能など、生物学的機能が野生型状況のような対照などの参照状況と比較して低下する場合、それは阻害される。例えば、ＵＳＰ１０阻害剤と接触していないＵＳＰ１０タンパク質と比較して、ＦＬＴ３キナーゼの安定性が、ＵＳＰ１０阻害剤との接触により低下する場合、ＵＳＰ１０阻害剤と接触しているＵＳＰ１０タンパク質のＵＳＰ１０活性は、阻害されるまたは欠損している。同様に、変異体ＦＬＴ３キナーゼのキナーゼ活性は、野生型ＦＬＴ３キナーゼおよび／または上記阻害剤と接触していない変異体ＦＬＴ３キナーゼと比較して、上記キナーゼ活性が、上記変異および／または上記阻害剤との接触により低下する場合、それは阻害されるまたは欠損している。このような阻害または欠損は、特定の時間および／または場所における薬剤の適用によるなど、誘導することができる、または遺伝性変異によるなど、構成的でありうる。このような阻害または欠損は、部分的または完全でありうる（例えば、野生型状況のような対照など、参照状況と比較して、測定可能な活性が本質的にない）。本質的に完全な阻害または欠損は、遮断されたと称される。
【００８６】
２つの分子の間の相互作用に言及する場合の「相互作用」という用語は、分子の、互いとの物理的接触（例えば、結合）を指す。一般に、このような相互作用は、前記分子の一方または両方の活性（生物学的効果を生み出す）を結果としてもたらす。
【００８７】
「単離されたタンパク質」とは、細胞から単離されるかもしくは組換えＤＮＡ法により作製される場合の、他のタンパク質、細胞物質、分離媒体、および培養培地、または化学合成される場合の、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まないタンパク質を指す。「単離された」または「精製された」タンパク質またはそれらの生物学的に活性な部分は、抗体、ポリペプチド、ペプチド、もしくは融合タンパク質が由来する細胞もしくは組織供給源に由来する、細胞物質もしくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成される場合の、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という表現は、バイオマーカーポリペプチドまたはその断片の調製物であって、タンパク質を、それが単離されるか、または組換えにより作製される細胞の細胞成分から分離した調製物を含む。一実施形態では、「細胞物質を実質的に含まない」という表現は、バイオマーカータンパク質またはその断片の調製物であって、約３０％（乾燥重量で）未満の非バイオマーカータンパク質（本明細書ではまた、「夾雑タンパク質」とも称する）、より好ましくは約２０％未満の非バイオマーカータンパク質、さらにより好ましくは約１０％未満の非バイオマーカータンパク質、最も好ましくは約５％未満の非バイオマーカータンパク質を有する調製物を含む。抗体、ポリペプチド、ペプチド、もしくは融合タンパク質、またはそれらの断片、例えば、それらの生物学的に活性な断片を組換えにより作製する場合、それはまた、培養培地も実質的に含まないことが好ましい、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満である。
【００８８】
「キット」とは、発明のマーカーの発現を特異的に検出し、かつ／またはこの発現に影響を及ぼすための、少なくとも１つの試薬、例えば、プローブまたは小分子を含む、任意の製造物（例えば、パッケージまたは容器）である。キットは、本発明の方法を実行するためのユニットとして宣伝、流通、または販売することができる。キットは、本発明の方法において有用な組成物を発現するのに必要な、１または複数の試薬を含みうる。ある特定の実施形態では、キットは、基準物質、例えば、細胞の増殖、分裂、遊走、生存、またはアポトーシスを制御するシグナル伝達経路に影響を及ぼさず、これを調節しないタンパク質をコードする核酸をさらに含みうる。当業者は、一般的な分子タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質およびベータ−ガラクトシダーゼ）、遺伝子オントロジー基準により、細胞の増殖、分裂、遊走、生存、またはアポトーシスを包含する経路のうちのいずれにも分類されないタンパク質、または普遍的なハウスキーピングタンパク質を含むがこれらに限定されない、多くのこのような対照タンパク質を想定しうる。キット中の試薬は、個別の容器により供給することもでき、単一の容器内の、２つまたはそれ超の試薬の混合物として供給することもできる。加えて、キット内の組成物の使用について記載する指示材料も含まれ得る。
【００８９】
「ネオアジュバント療法」という用語は、一次処置の前に与えられる処置を指す。ネオアジュバント療法の例は、化学療法、放射線療法およびホルモン療法を含みうる。
【００９０】
バイオマーカーの「正常」発現レベルは、がんに罹患していない対象、例えば、ヒト患者の細胞内のバイオマーカーの発現レベルである。バイオマーカーの「過剰発現」または「有意に高い発現レベル」とは、発現を評価するのに採用されるアッセイの標準誤差よりも大きい、対照試料（例えば、バイオマーカー関連疾患を有さない健常対象に由来する試料）中のバイオマーカーの発現活性またはレベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のバイオマーカーの平均発現レベルより少なくとも１０％高く、より好ましくは、この１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍またはそれ超である被験試料中の発現レベルを指す。バイオマーカーの「有意に低い発現レベル」とは、対照試料（例えば、バイオマーカー関連疾患を有さない健常対象に由来する試料）中のバイオマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のバイオマーカーの平均発現レベルより少なくとも１０％低く、より好ましくは、この１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０分の１またはそれ未満の被験試料中の発現レベルを指す。バイオマーカーの「過剰発現」または「有意に高い発現レベル」は、発現を評価するのに採用されるアッセイの標準誤差よりも大きい、対照試料（例えば、バイオマーカー関連疾患を有さない健常対象に由来する試料）中のバイオマーカーの発現活性またはレベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のバイオマーカーの平均発現レベルより好ましくは少なくとも１０％高く、より好ましくは、これより１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍またはそれよりも多い被験試料中の発現レベルを指す。バイオマーカーの「有意に低い発現レベル」とは、対照試料（例えば、バイオマーカー関連疾患を有さない健常対象に由来する試料）中のバイオマーカーの発現レベル、好ましくは、いくつかの対照試料中のバイオマーカーの平均発現レベルより少なくとも１０％低く、より好ましくは、この１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０分の１またはそれよりも低い、被験試料中の発現レベルを指す。
【００９１】
このような「有意性」レベルはまた、発現、阻害、細胞傷害作用、細胞増殖などについて本明細書で記載される、他の任意の測定されるパラメータにも適用することができる。
【００９２】
「Ｐ５３」という用語は、周知腫瘍抑制因子、ｐ５３を指す（例えば、Meek  (2015年)  Biochem  J.  469巻:325-346;  Ballingerら(2015年)  Curr.  Opin.  Oncol.  27:332〜337頁;  AmelioおよびMelino  (2015年)  Trends  Biochem.  Sci.  40巻:425〜434頁;  Sahaら(2014年)  Prog.  Biophys.  Mol.  Biol.  117巻:250〜263頁;  Tchelebitら(2014年)  Subcell.  Biochem.  85巻:133〜159頁;  Yeudall  (2014年)  Subcell.  Biochem.  85巻:105〜117頁;  Santoroら(2014年)  Subcell.  Biochem.  85巻:91〜103頁;  Girardiniら(2014年)  Subcell.  Biochem.  85巻:41〜70頁;  Soussiら(2014年)  Hum.  Mutat.  35巻:766〜778頁;  Leroyら(2014年)  Hum.  Mutat.  35巻:756〜765頁;  Leoryら(2014年)Hum.  Mutat.  35巻:672〜688頁;  Nguyenら(2014年)  Hum.  Mutat.  35巻:738〜755頁;  Bertheauら(2013年)  Breast  22巻:S27〜S29頁;  Brachovaら(2013年)  Int.  J.  Mol.  Sci.  14巻:19257〜19275頁;  CarvajalおよびManfredi  (2013年)  EMBO  Rep.  14巻:414〜421頁;  Torneselloら(2013)  Gynecol.  Oncol.  128巻:442〜448頁;  LehmannおよびPietenpol  (2012年)  J.  Clin.  Oncol.  30巻:3648〜3650頁;  Belliniら(2012年)  J.  Biomed.  Biotechnol.  2012巻:891961頁;  Liら(2012年)  Biochim.  Biophys.  Acta.  1819巻:684〜687頁;ならびにNaccaratiら(2012年)  Mutagenesis  27巻:211-218頁を参照されたい）。ｐ５３タンパク質をコードする遺伝子は、脊椎動物の間で高度に保存されており、ヒトがんの５０％超において、ｐ５３タンパク質機能の欠損を引き起こすように変異される（Surgetら（２０１３年）OncoTargets  Therapy  ７巻：５７〜６８頁）。ヒトにおいて、１７ｐ１３．１に位置するｐ５３遺伝子は、少なくとも１５種のタンパク質アイソフォームをコードする。ｐ５３タンパク質のタンパク質構造は、周知であり、ある特定のドメインによって特徴付けられる。例えば、一実施形態では、野生型の機能的なヒトｐ５３は、次のものを含む：
１）活性化ドメイン１（ＡＤ１）としても公知の酸性Ｎ末端転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）、これは、転写因子を活性化する（例えば、残基１〜４２）。Ｎ末端は、２個の相補的転写活性化ドメインを含有し、大きいドメインは、残基１〜４２にあり、小さいドメインは、残基５５〜７５にあり、いくつかのアポトーシス促進性遺伝子の調節に特異的に関与する（Venotら（１９９８年）EMBO  J.１７巻：４６６８〜４６７９頁）；
２）活性化ドメイン２（ＡＤ２）、これは、アポトーシス活性に重要である（例えば、残基４３〜６３）；
３）プロリンリッチドメイン、これは、ＭＡＰＫを介した核外排出によるｐ５３のアポトーシス活性に重要である（例えば、残基６４〜９２）；
４）中央ＤＮＡ結合コアドメイン（ＤＢＤ）、これは、１個の亜鉛原子およびいくつかのアルギニンアミノ酸を含有する（例えば、残基１０２〜２９２）。この領域は、ｐ５３コリプレッサーＬＭＯ３の結合に関与する（Larsenら（２０１０年）Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.３９２巻：２５２〜２５７頁）；
５）核局在化シグナル伝達ドメイン（例えば、残基３１６〜３２５）；
６）ホモオリゴマー化ドメイン（ＯＤ）（例えば、残基３０７〜３５５）。四量体化は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのｐ５３の活性に必須である；ならびに
７）Ｃ末端ドメイン、これは、中央ドメインのＤＮＡ結合の下方調節に関与する（例えば、残基３５６〜３９３）（Harmsら（２００５年）Mol.  Cell.  Biol.２５巻：２０１４〜２０３０頁）。
【００９３】
がんにおいてｐ５３欠損にする変異は通常、ＤＢＤにおいて起こる。このような変異の多くは、その標的ＤＮＡ配列に結合する上記タンパク質の能力を破壊し、これにより、このような遺伝子の転写活性化を妨げる。それ自体として、ＤＢＤにおける変異は、劣性機能喪失型変異である。ＯＤに変異を有するｐ５３の分子は、野生型ｐ５３と二量体化し、これらが転写を活性化することを妨げる。したがって、ＯＤ変異は、ｐ５３の機能にドミナントネガティブ効果を有する。機能的ｐ５３タンパク質をコードしないかまたは機能が低下したｐ５３タンパク質をコードするかのいずれかであるｐ５３核酸における変異（まとめてｐ５３欠損）は、上記の通り当技術分野で周知であり、例えば、ミスセンス変異（コードされるアミノ酸を変更する塩基変化）、ナンセンス変異（コードされるアミノ酸を中途終止コドンに変更する塩基変化）、フレームシフト変異（３の倍数ではない様式での塩基付加または喪失）、挿入変異（コードされるタンパク質の機能を変更する、数が多いまたは少ない任意の塩基付加）、欠失変異（コードされるタンパク質の機能を変更する、数が多いまたは少ない任意の塩基欠失）または再配列変異（塩基の出発量を保持しつつ、コードされるタンパク質の機能を変更する、大規模または小規模の任意の変更）を含む、任意の数の周知の種類の変異によって生成することができる。一部の実施形態では、再配列が付加および／または欠失を有する、または複数のミスセンス変異が組み合わされる場合など、変異を組み合わせることができる。一部の実施形態では、変異は、生殖細胞系列に、体細胞にまたはその両方に生じる遺伝的ヌル（コードされるタンパク質の機能を完全に除去する任意の変異）である。変異の種類に関するこの記載は、本明細書に記載されている任意のマーカーに適用される。
【００９４】
ｐ５３活性またはその低下を決定するためのアッセイは、周知であり、市販されている（例えば、Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｉｇｎａｌ（登録商標）ｐ５３レポーターキット、Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ（登録商標）ＴｒａｎｓＡＭ（登録商標）ｐ５３レポーターキット；Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐ５３転写因子アッセイキット品目番号６０００２０、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ（商標）ＴＦ−Ｄｅｔｅｃｔ（商標）ヒトｐ５３活性アッセイキット；Hirakiら（２０１５年）Cell  Chem.  Biol.２２巻：１２０６〜１２１６頁；Flamanら（１９９５年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９２巻：３９６３〜３９６７頁（１９９５年）；およびKovvaliら（２００１年）Nucl.  Acids  Res.２９巻：ｅ２８頁を参照されたい）。
【００９５】
ｐ５３核酸およびタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列は、当技術分野で公知であり、Ｕ．Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより維持されているＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて公的に利用可能である。例えば、ヒトｐ５３核酸配列およびアミノ酸配列は、周知であり、例えば、ＮＭ＿０００５４６．５（改変体１）およびＮＰ＿０００５３７．３（アイソフォームａ）；ＮＭ＿００１１２６１１２．２（改変体２）およびＮＰ＿００１１１９５８４．１（アイソフォームａ）；ＮＭ＿００１１２６１１４．２（改変体３）およびＮＰ＿００１１１９５８６．１（アイソフォームｂ）；ＮＭ＿００１１２６１１３．２（改変体４）およびＮＰ＿００１１１９５８５．１（アイソフォームｃ）；ＮＭ＿００１１２６１１５．１（改変体５）およびＮＰ＿００１１１９５８７．１（アイソフォームｄ）；ＮＭ＿００１１２６１１６．１（改変体６）およびＮＰ＿００１１１９５８８．１（アイソフォームｅ）；ＮＭ＿００１１２６１１７．１（改変体７）およびＮＰ＿００１１１９５８９．１（アイソフォームｆ）；ＮＭ＿００１１２６１１８．１（改変体８）およびＮＰ＿００１１１９５９０．１（アイソフォームｇ）；ＮＭ＿００１２７６６９５．１（改変体９）およびＮＰ＿００１２６３６２４．１（アイソフォームｈ）；ＮＭ＿００１２７６６９６．１（改変体１０）およびＮＰ＿００１２６３６２５．１（アイソフォームｉ）；ＮＭ＿００１２７６６９７．１（改変体１０）およびＮＰ＿００１２６３６２６．１（アイソフォームｊ）；ＮＭ＿００１２７６６９８．１（改変体１１）およびＮＰ＿００１２６３６２７．１（アイソフォームｋ）；ＮＭ＿００１２７６６９９．１（改変体１２）およびＮＰ＿００１２６３６２８．１（アイソフォームｌ）；ＮＭ＿００１２７６７６０．１（改変体１３）およびＮＰ＿００１２６３６８９．１（アイソフォームｇ）；ならびにＮＭ＿００１２７６７６１．１（改変体１４）およびＮＰ＿００１２６３６９０．１（アイソフォームｇ）を含む。他の種におけるｐ５３オーソログの核酸配列およびアミノ酸配列も、周知であり、例えば、マウスｐ５３（ＮＭ＿００１１２７２３３．１、ＮＰ＿００１１２０７０５．１、ＮＭ＿０１１６４０．３およびＮＰ＿０３５７７０．２）、チンパンジーｐ５３（ＸＭ＿００１１７２０７７．４およびＸＰ＿００１１７２０７７．２）、サルｐ５３（ＮＭ＿００１０４７１５１．２およびＮＰ＿００１０４０６１６．１）、イヌｐ５３（ＮＭ＿００１００３２１０．１およびＮＰ＿００１００３２１０．１）、ウシｐ５３（ＮＭ＿１７４２０１．２およびＮＰ＿７７６６２６．１）、カエルｐ５３（ＮＭ＿００１００１９０３．１およびＮＰ＿００１００１９０３．１）およびゼブラフィッシュｐ５３（ＮＭ＿００１２７１８２０．１、ＮＰ＿００１２５８７４９．１、ＮＭ＿１３１３２７．３およびＮＰ＿５７１４０２．１）を含む。この用語が、ｐ５３に関する本明細書に記載されている特色の任意の組合せを指すためにさらに使用することができることに留意されたい。例えば、クラス、配列組成、同一性百分率、配列長さ、ドメイン構造、機能活性などの任��の組合せは、本発明に従って使用されている通りのｐ５３を記載するために使用することができる。
【００９６】
「所定の」バイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）という用語は、例だけを目的として述べると、特定の処置のために選択されうる対象を評価する、１種もしくは複数種のＵＳＰ１０阻害剤単独、もしくは１種もしくは複数種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせるなどの、処置に対する応答を評価する、および／または上記疾患状況を評価するのに使用される、バイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）でありうる。所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）は、がんを有するかまたは有さない患者の集団内で決定することができる。上記所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）は、あらゆる患者に同等に適用可能な、単一の数である場合があり、または所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）は、患者の特定の部分集団に従い変動しうる。対象の年齢、体重、身長および他の因子は、個体の所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）に影響を及ぼしうる。さらに、上記所定のバイオマーカーの量および／または活性は、各対象について個別に決定することができる。一実施形態では、本明細書で記載される方法により決定および／または比較される量は、絶対測定値に基づく。別の実施形態では、本明細書に記載される方法により決定および／または比較される量は、比（例えば、ハウスキーピングまたはその他の一般に一定のバイオマーカーの発現に対して正規化された血清バイオマーカー）などの相対測定値に基づく。所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）は、任意の適切な標準物質でありうる。例えば、所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）は、患者の選択を評価するための、同じまたは異なるヒトから得ることができる。一実施形態では、所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）は、同じ患者についてのかつての評価から得ることができる。このようにして、患者の選択の進行を、ある時間にわたりモニタリングすることができる。加えて、対照は、別のヒトまたは複数のヒト、例えば、対象が、ヒトである場合に、選択されたヒトの群についての評価から得ることができる。このようにして、選択を評価するための、ヒトの選択の範囲を、適切な他のヒト、例えば、同様もしくは同じ状態を患うヒトおよび／または同じ民族（ｅｔｈｎｉｃ）群のヒトなど、目的のヒトと同様の状況にある他のヒトと比較することができる。
【００９７】
「予測」という用語は、治療の前、その最中またはその後のバイオマーカー核酸および／またはタンパク質状態、例えば、腫瘍の過剰なまたは低い、活性、出現、発現、成長、寛解、再発または耐性を使用して、ＵＳＰ１０阻害剤療法（例えば、ＵＳＰ１０阻害剤単独、またはＦＬＴ３阻害剤と組み合わせたＵＳＰ１０阻害剤）など、抗がん療法に対するがんの応答の確度を決定することを含む。バイオマーカーの、このような予測的使用により、例えば、（１）コピー数の増加もしくは減少（例えば、ＦＩＳＨ、ＦＩＳＨおよびＳＫＹ、例えば、当技術分野では、少なくとも、J.  Biotechnol.、８６巻：２８９〜３０１頁において記載されている、単一分子シークエンシング、またはｑＰＣＲによる）、バイオマーカー核酸の過剰発現もしくは過少発現（例えば、ＩＳＨ、ノーザンブロット、またはｑＰＣＲによる）、バイオマーカータンパク質（例えば、ＩＨＣによる）および／またはバイオマーカー標的の増加または減少、または、例えば、アッセイされるヒトがん型またはがん試料の約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、１００％超またはそれよりも多くの、活性の増加もしくは減少；（２）生体試料、例えば、がんに罹患した対象、例えば、ヒトに由来する、組織、全血、血清、血漿、口腔内切屑（buccal  scrape）、唾液、脳脊髄液、尿、糞便または骨髄を含有する試料中の、その絶対的なまたは相対的にモジュレートされた存在または非存在；（３）がんを有する患者（例えば、特定の抗がん療法（例えば、ＵＳＰ１０阻害剤単独、またはＦＬＴ３阻害剤と組み合わせたＵＳＰ１０阻害剤）に応答する患者、またはこれに対する耐性を発生させる患者）の臨床サブセットにおける、その絶対的なまたは相対的にモジュレートされた存在または非存在により確認することができる。
【００９８】
「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」などの用語は、疾患、障害、または状態を有さないが、これらを発症する危険性があるか、またはこれらに感受性の対象における、疾患、障害、または状態を発症する確率を低減することを指す。
【００９９】
「プローブ」という用語は、具体的に意図される標的分子、例えば、バイオマーカー核酸によりコードされるかまたはこれに対応する、ヌクレオチド転写物またはタンパク質に選択的に結合することが可能な任意の分子を指す。プローブは、当業者により合成される場合もあり、適切な生物学的調製物に由来する場合もある。標的分子の検出を目的として、プローブは、本明細書で記載される通りに標識されるように、特異的にデザインすることができる。プローブとして活用されうる分子の例は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子を含むがこれらに限定されない。
【０１００】
「予後」という用語は、がんの可能性のある経過およびアウトカムまたは疾患からの回復の確度についての予測を含む。一部の実施形態では、統計学的アルゴリズムの使用により、個体におけるがんの予後をもたらす。例えば、予後は、手術、がんの臨床亜型（例えば、肺がん、メラノーマおよび腎細胞癌などの固形腫瘍）の発症、１もしくは複数の臨床因子の発症、腸がんの発症、または上記疾患からの回復でありうる。
【０１０１】
「抗がん療法（例えば、ＵＳＰ１０阻害剤単独、またはＦＬＴ３阻害剤と組み合わせたＵＳＰ１０阻害剤）に対する応答」という用語は、抗がん療法（例えば、ＵＳＰ１０阻害剤単独、またはＦＬＴ３阻害剤と組み合わせたＵＳＰ１０阻害剤）に対する過剰増殖性障害（例えば、がん）の任意の応答に関し、好ましくは、ネオアジュバントまたはアジュバント化学療法の開始後のがん細胞数、腫瘍量および／または体積の変化に関する。過剰増殖性障害応答は、例えば、有効性に関してまたはネオアジュバントもしくはアジュバント状況において評価することができ、全身性介入後の腫瘍のサイズは、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波または触診によって測定された初期サイズおよび寸法と比較することができる。応答は、生検または外科的切除後の腫瘍のノギス測定または病理学的検査によって評価することもできる。応答は、腫瘍体積の百分率の変化のように、定量的に記録することもでき、「病理学的完全奏効」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的安定疾患」（ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ）、または他の定性的基準のように、定性的に記録することもできる。過剰増殖性障害応答の評価は、ネオアジュバントまたはアジュバント療法の開始後早期に、例えば、数時間後、数日後、数週間後、または、好ましくは数カ月後に行うことができる。応答評価のための典型的エンドポイントは、ネオアジュバント化学療法の終結後、または残存する腫瘍細胞および／または腫瘍床の外科的除去後である。これは典型的に、ネオアジュバント療法の開始３カ月後である。一部の実施形態では、本明細書で記載される治療的処置の臨床有効性は、臨床的有用率（clinical  benefit  rate）（ＣＢＲ）を測定することにより決定することができる。臨床的有用率は、治療の終了から少なくとも６カ月後の時点において完全寛解（ＣＲ）している患者の百分率と、部分寛解（ＰＲ）している患者の数と、安定病態（ＳＤ）である患者の数との合計を決定することにより測定する。この式の略記は、６カ月間にわたるＣＢＲ＝ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。一部の実施形態では、特定のがん治療レジメンについてのＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％またはそれよりも多い。がん療法に対する応答を評価するためのさらなる基準は、以下：全生存期間としてもまた公知の死亡までの生存期間（ここで、前記死亡は、原因を問わない場合もあり、腫瘍に関連する場合もある）；「無再発生存期間」（ここで、再発という用語は、限局的および遠隔的再発の両方を含むものとする）；無転移生存期間；無病生存期間（ここで、疾患という用語は、がんおよびこれと関連する疾患を含むものとする）の全てを含む「生存期間」に関する。前記生存期間の長さは、規定された開始点（例えば、診断のときまたは処置の開始）および終了点（例えば、死、再発または転移）を参照することにより計算することができる。加えて、処置の有効性についての基準は、化学療法に対する応答、生存の確率、所与の期間内の転移の確率、および腫瘍再発の確率を含むように拡張することができる。例えば、���切な閾値を決定するために、特定のがん治療レジメンを、対象の集団に施行することができ、アウトカムを、任意のがん療法を施行する前に決定されたバイオマーカー測定値と相関させることができる。アウトカム測定値は、ネオアジュバント状況において施される治療に対する病理的応答でありうる。代替的に、全生存期間および無病生存期間などのアウトカム尺度を、バイオマーカー測定値が既知であるがん治療後の対象について、ある期間にわたりモニタリングすることができる。ある特定の実施形態では、投与される用量は、がん治療剤のための当技術分野で公知の標準用量である。対象をモニタリングする期間は、変動しうる。例えば、対象を、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０カ月間にわたりモニタリングすることができる。がん療法のアウトカムと相関する、バイオマーカーの測定閾値は、実施例節で記載される方法など、当技術分野で周知の方法を使用して決定することができる。
【０１０２】
「耐性」という用語は、５％またはそれよりも多く、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれよりも多く、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍またはそれよりも多く、治療的処置に対して応答が低下することなど、がん療法に対するがん試料または哺乳動物の後天的または天然の耐性（すなわち、治療的処置に対して非応答性であることまたはこれに対して応答が低下したかもしくは応答が限定されること）を指す。応答の低下は、耐性が獲得される前の同じがん試料もしくは哺乳動物と比較することにより、または治療的処置に対する耐性がないことが既知の異なるがん試料もしくは哺乳動物と比較することにより測定することができる。化学療法に対する典型的な後天的耐性は、「多剤耐性」と呼ばれる。多剤耐性は、Ｐ−糖タンパク質によって媒介されうる、または他の機構によって媒介されうる、または哺乳動物が多剤耐性微生物もしくは微生物の組合せに感染すると起こりうる。治療的処置に対する耐性の決定は、当技術分野で日常的であり、通常の技能を有する臨床医の技能の範囲内にあり、例えば、「感作」として本明細書に記載されている細胞増殖アッセイおよび細胞死アッセイによって測定することができる。一部の実施形態では、「耐性を逆転させる」という用語は、一次がん療法（例えば、化学療法薬または放射線療法）単独が、無処置腫瘍の腫瘍体積と比較して腫瘍体積の統計的に有意な減少を生じることができない環境における無処置腫瘍の腫瘍体積と比較して、該一次がん療法（例えば、化学療法薬または放射線療法）と組み合わせた第２の薬剤の使用が、統計的有意性のレベル（例えば、ｐ＜０．０５）で腫瘍体積の有意な減少を生じることができることを意味する。これは一般に、無処置腫瘍が対数的に（log  rhythmically）成長する時点に為される腫瘍体積測定に適用される。
【０１０３】
「応答」または「応答性」という用語は、例えば、腫瘍サイズ低下または腫瘍成長阻害の意味での、抗がん応答を指す。これらの用語は、例えば、最初の再発までの期間であり、再発のエビデンスを伴わない最初の事象もしくは死としての第２の原発性がんについては打ち切る、再発までの時間の延長、または処置から、任意の原因による死までの期間である、全生存期間の延長により反映される、予後の改善も指す場合がある。応答するまたは応答を有するとは、刺激に曝露された場合に達せられる有益なエンドポイントがあることを意味する。代替的に、刺激に曝露されると、負の（ｎｅｇａｔｉｖｅ）または有害な症状は、最小化されるか、軽減されるか、または緩和される。腫瘍または対象が、好適な応答を呈する可能性を評価することは、腫瘍または対象が、好適な応答を呈さない（すなわち、応答の欠如を呈するか、または非応答性である）可能性を評価することと同等であることが理解されるであろう。
【０１０４】
本明細書で使用される「ＲＮＡ干渉剤」は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、標的バイオマーカー遺伝子の発現に干渉するか、またはこれを阻害する任意の薬剤として定義される。このようなＲＮＡ干渉剤は、本発明の標的バイオマーカー遺伝子またはその断片と相同なＲＮＡ分子を含む核酸分子、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、標的バイオマーカー核酸の発現に干渉するか、またはこれを阻害する小分子を含むがこれらに限定されない。
【０１０５】
「ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）」とは、進化において保存された過程であって、標的バイオマーカー核酸と同一であるか、または高度に類似する配列のＲＮＡを、発現させるか、または導入する結果として、その標的化遺伝子から転写されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の、配列特異的分解または特異的な転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）をもたらし（Ｃｏｂｕｒｎ，  Ｇ．およびＣｕｌｌｅｎ，  Ｂ．（２００２年）、Ｊ．  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、７６巻（１８号）：９２２５頁を参照されたい）、これにより、標的バイオマーカー核酸の発現を阻害する過程である。一実施形態では、ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。この過程は、植物、無脊椎動物、および哺乳動物細胞において記載されている。天然では、ＲＮＡｉは、長鎖ｄｓＲＮＡの、ｓｉＲＮＡと称する二本鎖断片への加工的切断を促進する、ｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼであるＤｉｃｅｒにより誘発される。ｓｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡを認識および切断するタンパク質複合体に組み込まれる。ＲＮＡｉはまた、核酸分子、例えば、合成ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、または他のＲＮＡ干渉剤を導入して、標的バイオマーカー核酸の発現を阻害またはサイレンシングすることによっても誘発することができる。本明細書で使用される場合、「標的バイオマーカー核酸の発現の阻害」または「マーカー遺伝子の発現の阻害」は、標的バイオマーカー核酸または標的バイオマーカー核酸によりコードされるタンパク質の発現またはタンパク質活性またはレベルの任意の低下を含む。低下は、ＲＮＡ干渉剤により標的化されていない、標的バイオマーカー核酸の発現または標的バイオマーカー核酸によりコードされるタンパク質の活性もしくはレベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％またはそれ超の低下でありうる。
【０１０６】
ＲＮＡｉに加えて、ゲノム編集を使用して、目的のＵＳＰ１０バイオマーカーの構成的もしくは誘導性ノックアウトまたは変異など、目的のバイオマーカーのコピー数または遺伝子配列をモジュレートすることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を、ゲノム核酸の正確な編集（例えば、非機能的またはヌル変異の創出）に使用することができる。このような実施形態では、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡおよび／またはＣａｓ酵素を発現させることができる。例えば、上記ガイドＲＮＡのみを含有するベクターを、Ｃａｓ９酵素に対してトランスジェニックな動物または細胞に投与することができる。同様の戦略を使用することができる（例えば、デザイナージンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）またはホーミングメガヌクレアーゼ）。このような系は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第８，６９７，３５９号；SanderおよびJoung（２０１４年）Nat.  Biotech.３２巻：３４７〜３５５頁；Haleら（２００９年）Cell  １３９巻：９４５〜９５６頁；KarginovおよびHannon（２０１０年）Mol.  Cell  ３７巻：７頁；米国特許出願公開第２０１４／００８７４２６号および同第２０１２／０１７８１６９号；Bochら（２０１１年）Nat.  Biotech.２９巻：１３５〜１３６頁；Bochら（２００９年）Science  ３２６巻：１５０９〜１５１２頁；MoscouおよびBogdanove（２００９年）Science  ３２６巻：１５０１頁；Weberら（２０１１年）PLoS  One  ６巻：ｅ１９７２２頁；Liら（２０１１年）Nucl.  Acids  Res.３９巻：６３１５〜６３２５頁；Zhangら（２０１１年）Nat.  Biotech.２９巻：１４９〜１５３頁；Millerら（２０１１年）Nat.  Biotech.２９巻：１４３〜１４８頁；Linら（２０１４年）Nucl.  Acids  Res.４２巻：ｅ４７頁を参照されたい）。このような遺伝的戦略は、当技術分野の周知方法に従って構成的発現系または誘導性発現系を使用することができる。
【０１０７】
少なくとも１つのバイオマーカーの存在またはレベルを検出または決定するために使用される「試料」という用語は、全血、血漿、血清、唾液、尿、糞便（例えば、排泄物）、涙、および他の任意の体液（例えば、上記の「体液」の定義下で記載した）、または小腸、結腸試料、または手術による切除組織などの組織試料（例えば、生検材料）であることが典型的である。ある特定の場合には、本発明の方法は、試料中の少なくとも１つのマーカーの存在またはレベルを検出または決定する前に、試料を個体から得るステップをさらに含む。
【０１０８】
生物学的に活性な薬剤に適用される「選択的阻害」または「選択的に阻害する」という用語は、標的との直接的または間接的（interact）相互作用による、オフターゲットシグナル伝達活性と比較して、標的シグナル伝達活性を選択的に低下させる該薬剤の能力を指す。例えば、ＵＳＰ７などの別の脱ユビキチン化（ＤＵＢ）酵素よりもＵＳＰ１０を選択的に阻害する薬剤は、比較タンパク質に対する化合物の活性よりも少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％または２×（倍）大きい（例えば、少なくとも約３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１０５倍、１１０倍、１２０倍、１２５倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、１５００倍、２０００倍、２５００倍、３０００倍、３５００倍、４０００倍、４５００倍、５０００倍、５５００倍、６０００倍、６５００倍、７０００倍、７５００倍、８０００倍、８５００倍、９０００倍、９５００倍、１００００倍もしくはそれを超える、またはその間の任意の範囲を全て含んで）、ＵＳＰ１０に対する活性を有する。このような測定基準は典型的に、活性を半分に低下させるのに要求される薬剤の相対量に関して表現される。特に、ＵＳＰ７／ＨＡＵＳＰ（ヘルペスウイルス関連ＵＳＰ）は、ＤＵＢ酵素のＵＳＰファミリーにおける１３５ｋＤａタンパク質として、当技術分野で周知である（Reverdyら（２０１２年）Chem.  Biol.１９巻：５６７〜４７７頁）。ＤＵＢドメインに加えて、ＵＳＰ７は、Ｎ末端ＴＲＡＦ様ＭＡＴＨドメイン（Zapataら（２００１年）J.  Biol.  Chem.２７６巻：２４２４２〜２４２５２頁）、および少なくとも５個のユビキチン様ドメインを含有するＣ末端ドメイン（Faesenら（２０１１年）Mol.  Cell  ４４巻：１４７〜１５９頁）も含有する。このタンパク質は、遍在性に産生され、真核生物において高度に保存されている（例えば、当技術分野で周知であり、受託番号ＮＭ＿００１２８６４５７．１およびＮＰ＿００１２７３３８６．１；ＮＭ＿００１２８６４５８．１およびＮＰ＿００１２７３３８７．１；ＮＭ＿００１３２１８５８．１およびＮＰ＿００１３０８７８７．１；ならびにＮＭ＿００３４７０．２およびＮＰ＿００３４６１．２の下で公的に入手可能であるヒトＵＳＰ７核酸配列およびタンパク質配列を参照されたい）。ＵＳＰ７は主に、核タンパク質であり、ＰＭＬ体のサブセットに局在化する（Everettら（１９９９年）J.  Virol.７３巻：４１７〜４２６頁；Murataniら（２００２年）Nat.  Cell  Biol.４巻：１０６〜１１０頁）。分子レベルでは、その脱ユビキチン化活性のおかげで、ＵＳＰ７は、いくつかのポリユビキチン化基質の定常状態レベルを調節することが示された。例えば、ＵＳＰ７は、それぞれＭｄｍ２安定化およびＢｍｉ１／Ｍｅｌ１８安定化により、ｐ５３およびｐ１６ＩＮＫ４ａ腫瘍抑制因子のレベルを変更する（Cumminsら（２００４年）Nature  ４２８巻；Liら（２００４年）Mol.  Cell  １３巻：８７９０〜８９６頁；Maertensら（２０１０年）EMBO  J.２９巻：２５５３〜２５６５頁）。ｐ５３へのＵＳＰ７結合は近年、ＵＳＰ７の同じ領域への結合に関するそのｐ５３との競合により乳房の腫瘍形成に潜在的に関与するタンパク質である、ＴＳＰＹＬ５によって調節されることが示された（Eppingら（２０１１年）Nat.  Cell  Biol.１３巻：１０２〜１０８頁）。ＤＮＭＴ１  ＤＮＡメチラーゼおよびクラスピンアダプターなど、ゲノム完全性および調節に関与するさらなるタンパク質も、ＵＳＰ７によって安定化される（Duら（２０１０年）Sci.  Signal.３巻：ｒａ８０頁；Faustrupら（２００９年）J.  Cell  Biol.１８４巻：１３〜１９頁）。ＵＳＰ７は、脱ユビキチン化によっていくつかのモノユビキチン化基質の細胞区画化を調節することも示された。この点において、ＰＴＥＮおよびＦＯＸＯ４腫瘍抑制因子は、ＵＳＰ７誘導性核外搬出によって不活性化される（Songら（２００８年）Nature  ４５５巻：８１３〜８１７頁；van  der  Horstら（２００６年）Nat.  Cell  Biol.８巻：１０６４〜１０７３頁）。ＵＳＰ７過剰発現は、ヒト前立腺がんにおいても報告されており、腫瘍攻撃性に直接的に関連付けられた（Songら（２００８年）Nature  ４５５巻：８１３〜８１７頁）。以前のｉｎ  ｖｉｖｏデータも、がん細胞増殖におけるＵＳＰ７の関与を強調した（Beckerら（２００８年）Cell  Cycle  ７巻：７〜１０頁）。ＵＳＰ１０選択的およびＵＳＰ７選択的薬剤は、公知である（例えば、表８に列挙されている例示的な薬剤、D’Arcyら（２０１５年）Pharmacol.  Ther.１４７巻：３２〜５４頁および本明細書に記載されているその他を参照されたい）。
【０１０９】
【表８−１】
2019534321.tif 000003
【表８−２】
2019534321.tif 000004
【表８−３】
2019534321.tif 000005
【０１１０】
「感作する」という用語は、がん療法（例えば、ＵＳＰ１０阻害剤単独、またはＦＬＴ３阻害剤；化学療法薬；および／または放射線療法と組み合わせたＵＳＰ１０阻害剤）による関連がんのより有効な処置を可能にする方式で、がん細胞または腫瘍細胞を変更することを意味する。一部の実施形態では、正常細胞は、抗がん療法（例えば、ＵＳＰ１０阻害剤単独、またはＦＬＴ３阻害剤と組み合わせたＵＳＰ１０阻害剤）によって正常細胞が過度に傷害される程度まで影響を受けない。治療的処置に対する感受性の増加または感受性の低下は、細胞増殖アッセイ（Tanigawa  N、Kern  D  H、Kikasa  Y、Morton  D  L、Cancer  Res  １９８２年；４２巻：２１５９〜２１６４頁）、細胞死アッセイ（Weisenthal  L  M、Shoemaker  R  H、Marsden  J  A、Dill  P  L、Baker  J  A、Moran  E  M、Cancer  Res  １９８４年；９４巻：１６１〜１７３頁；Weisenthal  L  M、Lippman  M  E、Cancer  Treat  Rep  １９８５年；６９巻：６１５〜６３２頁；Weisenthal  L  M、In:  Kaspers  G  J  L,  Pieters  R,  Twentyman  P  R,  Weisenthal  L  M,  Veerman  A  J  P編、Drug  Resistance  in  Leukemia  and  Lymphoma.、Langhorne,  P  A:  Harwood  Academic  Publishers、１９９３年：４１５〜４３２頁；Weisenthal  L  M、Contrib  Gynecol  Obstet  １９９４年；１９巻：８２〜９０頁）を含むがこれらに限定されない、特定の処置のための当技術分野の公知方法および本明細書に以下に記載されている方法に従って測定される。上記感受性または耐性は、ある期間、例えば、ヒトでは６カ月間、マウスでは４〜６週間にわたって腫瘍サイズ低下を測定することにより、動物において測定することもできる。処置感受性の増加または耐性の低下が、組成物または方法の非存在下での処置感受性または耐性と比較して、５％またはそれよりも多い、例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれよりも多い、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍までまたはそれよりも多い場合、このような組成物または方法は、治療的処置に対する応答を感作する。治療的処置に対する感受性または耐性の決定は、当技術分野で日常的であり、通常の技能を有する臨床医の技能の範囲内にある。がん療法の有効性を増強するための本明細書に記載されている任意の方法を、過剰増殖性または他の面でがん性の細胞（例えば、耐性細胞）を該がん療法に対して感受性にするための方法に等しく適用することができることを理解されたい。
【０１１１】
「相乗効果」という用語は、例えば、２つまたはそれよりも多いＵＳＰ１０阻害剤、ＵＳＰ１０阻害剤およびＦＬＴ３阻害剤、ＵＳＰ１０阻害剤単独、またはＦＬＴ３阻害剤と組み合わせたＵＳＰ１０阻害剤など、２種またはそれよりも多い治療剤の組合せ効果が、抗がん剤単独の個別の効果の合計より大きくなりうることを指す。
【０１１２】
本明細書において「低分子干渉ＲＮＡ」とも称される「短鎖干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）は、例えばＲＮＡｉにより、標的バイオマーカー核酸の発現を阻害するように機能する作用物質（agent）として定義される。ｓｉＲＮＡは、化学合成されてもよい、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって産生されてもよい、または宿主細胞内に産生されてもよい。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１５〜約４０ヌクレオチドの長さ、好ましくは約１５〜約２８ヌクレオチド、より好ましくは約１９〜約２５ヌクレオチドの長さ、より好ましくは約１９、２０、２１または２２ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であり、約０、１、２、３、４または５ヌクレオチドの長さを有する３’および／または５’突出を各鎖に含有することができる。突出の長さは、２本の鎖の間で独立的である、すなわち、一方の鎖における突出の長さは、第２の鎖における突出の長さに依存しない。好ましくは、上記ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解または特異的な転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）によりＲＮＡ干渉を促進することができる。
【０１１３】
別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、低分子ヘアピン型（ステムループとも呼ばれる）ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。一実施形態では、このようなｓｈＲＮＡは、短い（例えば、１９〜２５ヌクレオチド）アンチセンス鎖と、それに続く５〜９ヌクレオチドループおよび類似のセンス鎖で構成される。あるいは、上記センス鎖は、ヌクレオチドループ構造に先行することができ、上記アンチセンス鎖がそれに続くことができる。このようなｓｈＲＮＡは、プラスミド、レトロウイルスおよびレンチウイルス中に含有されて、例えば、ｐｏｌ  ＩＩＩ  Ｕ６プロモーターまたは別のプロモーターから発現されてよい（例えば、参照により本明細書に組み込まれるStewartら（２００３年）RNA  Apr；９巻（４号）：４９３〜５０１頁を参照されたい）。
【０１１４】
ＲＮＡ干渉剤、例えば、ｓｉＲＮＡ分子は、がんを有するまたはそれを有する危険性がある患者に投与して、がんにおいて過剰発現されるバイオマーカー遺伝子の発現を阻害し、それにより、該対象におけるがんを処置、予防または阻害することができる。
【０１１５】
「対象」という用語は、任意の健常な動物、哺乳動物、もしくはヒト、またはがん、例えば、肺癌、卵巣癌、膵癌、肝臓癌、乳癌、前立腺癌および結腸癌ならびにメラノーマおよび多発性骨髄腫に罹患した、任意の動物、哺乳動物、もしくはヒトを指す。「対象」という用語は、「患者」と互換的である。
【０１１６】
「生存期間」という用語は、以下：全生存期間としてもまた公知の死亡までの生存期間（ここで、前記死亡は、原因を問わない場合もあり、腫瘍に関連する場合もある）；「無再発生存期間」（ここで、再発という用語は、限局的および遠隔的再発の両方を含むものとする）；無転移生存期間；無病生存期間（ここで、疾患という用語は、がんおよびこれと関連する疾患を含むものとする）の全てを含む。前記生存期間の長さは、規定された開始点（例えば、診断のときまたは処置の開始）および終了点（例えば、死、再発または転移）を参照することにより計算することができる。加えて、処置の有効性についての基準は、化学治療への応答、生存の確率、所与の期間内の転移の確率および腫瘍再発の確率などを含むように拡張することができる。
【０１１７】
「治療効果」という用語は、薬理学的活性物質により引き起こされる、動物、特に哺乳動物、より特定すると、ヒトにおける局所または全身効果を指す。したがって、用語は、疾患の診断、治癒、軽減、処置、もしくは予防、または動物もしくはヒトにおける、所望の身体もしくは精神の発達および状態の増強における使用のために意図される任意の物質を意味する。「治療有効量」という語句は、いくらかの所望の局所または全身効果を、任意の処置に適用可能な、妥当なベネフィット／リスク比で生み出す、このような物質の量を意味する。ある特定の実施形態では、化合物の治療有効量は、その治療指数、溶解度などに依存するであろう。例えば、本発明の方法により発見されるある特定の化合物は、このような処置に適用可能な、妥当なベネフィット／リスク比をもたらすのに十分な量で投与することができる。
【０１１８】
本明細書で使用される「治療有効量」および「有効量」という用語は、任意の医学的処置に適用可能な、妥当なベネフィット／リスク比で、動物における細胞の少なくとも部分集団においてある所望の治療効果を生み出すのに有効な、本発明の化合物を含む化合物、材料または組成物の量を意味する。主題の化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０およびＥＤ５０を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準の薬学的手順によって決定することができる。大きい治療指数を呈する組成物が好まれる。一部の実施形態では、上記ＬＤ５０（致死的投与量）は、測定することができ、例えば、薬剤投与なしと比べて、薬剤に関して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれよりも多く低減し得る。同様に、上記ＥＤ５０（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する濃度）は、測定することができ、例えば、薬剤投与なしと比べて、薬剤に関して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれよりも多く増加し得る。また、同様に、上記ＩＣ５０（すなわち、がん細胞に対する最大半量細胞傷害性または細胞増殖抑制効果を達成する濃度）は、測定することができ、例えば、薬剤投与なしと比べて、薬剤に関して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％またはそれよりも多く増加し得る。一部の実施形態では、アッセイにおけるがん細胞成長は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには１００％阻害されうる。がん細胞死は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには１００％促進されうる。別の実施形態では、がん細胞数および／または固形悪性疾患の少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには１００％減少が達成されうる。
【０１１９】
「転写されたポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド転写物」とは、バイオマーカー核酸の転写、ならびに、存在する場合、ＲＮＡ転写物の正常な転写後プロセシング（例えば、スプライシング）およびＲＮＡ転写物の逆転写により作られる成熟ｍＲＮＡの全部または一部に相補的であるか、またはそれと相同なポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはこのようなＲＮＡもしくはｃＤＮＡのアナログ）である。
【０１２０】
「ＵＳＰ１０」という用語は、システインプロテアーゼのユビキチン特異的プロテアーゼファミリーのメンバーとしてのユビキチン特異的ペプチダーゼ１０を指し、代替的に、「ユビキチン特異的プロセシングプロテアーゼ１０」、「ユビキチン特異的プロテアーゼ１０」、「脱ユビキチン化酵素１０」、「ユビキチンチオエステラーゼ１０」、「ユビキチンチオールエステラーゼ１０」、「ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼ１０」、「ＥＣ  ３．４．１９．１２」、「ＫＩＡＡ０１９０」、「ＵＢＰＯ」および「ＵＢＰＯ  ３」として公知である。一般に、ＵＳＰ１０は、アタキシン−２  Ｃ末端ドメインおよび脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）ドメインを含有する。ＵＳＰ１０は、ユビキチン特異的プロテアーゼ（ＵＳＰ）ファミリーと称されるＤＵＢ酵素の最大ファミリーに属する。このファミリーは、プロテオソーム分解のために基質をマークする翻訳後ユビキチンタグを除去し、これにより、該基質の安定化をもたらすその能力について最も周知である、５６種のシステインプロテアーゼメンバーで構成される。ＵＳＰ１０の報告される基質は、ベクリン１（Liuら（２０１１年）Cell  １４７巻：２２３〜２３４頁）、ＣＦＴＲ（Bombergerら（２００９年）J.  Biol.  Chem.２８４巻：１８７７８〜１８７８９頁）およびｐ５３（Yuanら（２０１０年）Cell  １４０巻：３８４〜３９６頁）を含む。ＵＳＰ１０は、遍在性に発現されており、多くのＤＵＢに当てはまるように、細胞の状況に依存して多様な機能を有することができる。例えば、ＵＳＰ１０は、ＤＮＡ結合アンドロゲン受容体複合体の補助因子として機能し、Ｒａｓ−ＧＴＰａｓｅ経路においてＲａｓ−ＧＡＰ  ＳＨ３ドメイン結合タンパク質（Ｇ３ＢＰ）によって阻害される（Fausら（２００５年）Mol.  Cell  Endocrinol.２４５巻：１３８〜１４６頁；Sonciniら（２００１年）Oncogene  ２０巻：３８６９〜３８７９頁）。
【０１２１】
ＵＳＰ１０核酸およびタンパク質についての核酸およびアミノ酸配列は、当技術分野で周知であり、Ｕ．Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎにより維持されているＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて公的に利用可能である。例えば、ヒトＵＳＰ１０核酸配列は、周知であり、例えば、ＮＭ＿００１２７２０７５．１（改変体１、これは、最長転写物を表し、最長アイソフォーム１をコードする）およびＮＭ＿００５１５３．２（改変体２、これは、改変体１と比較して、５’末端における代替エクソン（alternate  exon）を欠く）を含む。改変体２によってコードされるアイソフォーム２は、アイソフォーム１と比較して、より短い別個のＮ末端を有する）。加えて（in  adition）、ＮＲ＿０７３５７７（転写物改変体３）は、改変体１と比較して、３個の代替内部エクソンを欠く。この改変体は、最長ＯＲＦの翻訳に干渉することが予測される上流ＯＲＦの存在のため、非コードである。上流ＯＲＦの翻訳は、転写物を、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）の候補にする。ＮＲ＿０７３５７８．１（転写物改変体４）は、改変体１と比較して、４個の代替内部エクソンを欠く。この改変体は、最長ＯＲＦの翻訳に干渉することが予測される２個の上流ＯＲＦの存在により、非コードとして表される；上流ＯＲＦのどちらかの翻訳は、転写物を、ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）の候補にし、予測される配列は、ＸＭ＿０１７０２３８６９．１、ＸＭ＿０１７０２３８６４．１、ＸＭ＿０１１５２３４４１．１、ＸＭ＿０１１５２３４４０．１、ＸＭ＿０１７０２３８６８．１、ＸＭ＿０１１５２３４４３．１、ＸＭ＿０１７０２３８６３．１、ＸＭ＿００６７２１３３２．１、ＸＭ＿０１７０２３８６７．１、ＸＭ＿０１７０２３８６５．１およびＸＭ＿０１７０２３８６６．１である。ヒトＦＬＴ３アミノ酸配列は、周知であり、例えば、ＮＰ＿００１２５９００４．１（アイソフォーム１）、ＮＰ＿００５１４４．２（アイソフォーム２）ならびに予測される配列ＸＰ＿０１６８７９３５８．１、ＸＰ＿０１６８７９３５３．１、ＸＰ＿０１１５２１７４３．１、ＸＰ＿０１１５２１７４２．１、ＸＰ＿０１６８７９３５７．１、ＸＰ＿０１１５２１７４５．１、ＸＰ＿０１６８７９３５２．１、ＸＰ＿００６７２１３９５．１、ＸＰ＿０１６８７９３５６．１、ＸＰ＿０１６８７９３５４．１およびＸＰ＿０１６８７９３５５．１を含む。
【０１２２】
他の種におけるＵＳＰ１０オーソログの核酸およびアミノ酸配列も、周知であり、例えば、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）ＵＳＰ１０（ＸＭ＿０１６９３０２９５．１およびＸＰ＿０１６７８５７８４．１、ＸＭ＿００９４３１３３７．２およびＸＰ＿００９４２９６１２．２）；アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）ＵＳＰ１０（１ＸＭ＿０１５１２６７２３．１およびＸＰ＿０１４９８２２０９．１、ＸＭ＿０１５１２６７２４．１およびＸＰ＿０１４９８２２１０．１）；イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）ＵＳＰ１０（ＸＭ＿００５６２０８８３．１およびＸＰ＿００５６２０９４０．１）；ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）ＵＳＰ１０（ＢＣ１４２２２３．１およびＡＡＩ４２２２４．１）；マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＵＳＰ１０（ＮＭ＿００１３１０６３０．１およびＮＰ＿００１２９７５５９．１、ＮＭ＿００９４６２．２およびＮＰ＿０３３４８８．１、ＸＭ＿００６５３０８４５．３およびＸＰ＿００６５３０９０８．１、ＸＭ＿００６５３０８４６．３およびＸＰ＿００６５３０９０９．１）；ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＵＳＰ１０（ＮＭ＿００１０３４１４６．１およびＮＰ＿００１０２９３１８．１、ＸＭ＿００８７７２６０９．２およびＸＰ＿００８７７０８３１．１、ＸＭ＿００８７７２６１０．２およびＸＰ＿００８７７０８３２．１、ＢＣ１０５８９２．１およびＡＡＩ０５８９３．１）；ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）ＵＳＰ１０（ＮＭ＿００１００６１３０．１およびＮＰ＿００１００６１３０．１、ＡＪ７２０４００．１およびＣＡＧ３２０５９．１）；熱帯ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）ＵＳＰ１０（ＮＭ＿００１００６７６０．１およびＮＰ＿００１００６７６１．１、ＸＭ＿０１２９６０８５５．２およびＸＰ＿０１２８１６３０９．２、ＸＭ＿０１８０９２９９３．１およびＸＰ＿０１７９４８４８２．１、ＢＣ０７５５４４．１およびＡＡＨ７５５４４．１、ＣＲ８５５７０２．２およびＣＡＪ８３５１４．１）；およびゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ）ＵＳＰ１０（ＸＭ＿００５１６９０５２．３およびＸＰ＿００５１６９１０９．１、ＸＭ＿００５１６９０５１．３およびＸＰ＿００５１６９１０８．１、ＸＭ＿６８０５２９．８およびＸＰ＿６８５６２１．５）を含む。
【０１２３】
ＵＳＰ１０の阻害剤も、当技術分野で周知であり、ＵＳＰ１０に結合し、デユビキチナーゼ活性を阻害するＭＢＣＱの誘導体である、スパウチン−１（特異的かつ強力なオートファジー阻害剤−１）を含む。様々な抗ＵＳＰ１０抗体が市販されており、ＵＳＰ１０のＮ末端、Ｃ末端または内部領域を認識する。
【０１２４】
ＵＳＰ１０改変体および変異も、周知であり、例えば、配列番号４の３３７位におけるＳからＡへの置換と組み合わせると、毛細血管拡張性運動失調症変異（ＡＴＭ）によるそのリン酸化を消失させる、配列番号４の４２位におけるＴからＡへの置換（Yuanら、２０１０年）；配列番号４の３３７位におけるＳからＤへの置換と組み合わせると、遺伝毒性ストレスの非存在下で核に移動するホスホ模倣変異体（Phospho-mimetic  mutant）をもたらす、配列番号４の４２位におけるＴからＥへの置換（Yuanら、２０１０年）；その脱ユビキチン化活性を消失させる、配列番号４の４２４位におけるＣからＡへの置換（Sonciniら、２００１年）を含む。同様に、配列番号４の２位におけるアセチル化、ならびに配列番号４の２４、４２、１００、２１１、２２６、３２１、３３７、３６５、３７０、５４７、５６３および５７６位におけるリン酸化（Bianら、J.  Proteomics  ９６巻：２５３〜２６２頁（２０１４年）Olsenら（２０１０年）Sci.  Signal.３巻：ＲＡ３〜ＲＡ３頁；Yuanら、２０１０年）が起こることが公知である。翻訳後に、ＵＳＰ１０は、ＤＮＡ損傷後にＡＴＭによってリン酸化され、安定化（stablization）をもたらし、これは核に移動する（Yuanら、２０１０年）。ＵＳＰ１０は、ＵＳＰ１３によって脱ユビキチン化されうる（Liuら、２０１１年）。
【０１２５】
遺伝暗号（下記に示される）により規定される通り、特定のタンパク質のアミノ酸配列と、タンパク質をコードしうるヌクレオチド配列との間には、公知で明確な対応が見られる。同様に、遺伝暗号により規定される通り、特定の核酸のヌクレオチド配列とこの核酸によりコードされるアミノ酸配列との間に、公知で明確な対応が見られる。
【０１２６】
遺伝暗号
【化１】
2019534321.tif 000006
【０１２７】
遺伝暗号の重要で周知の特色は、タンパク質を作るのに使用されるアミノ酸の大半について、１つを超えるコードヌクレオチドトリプレット（上記で例示された）を利用しうる、その冗長性である。したがって、いくつかの異なるヌクレオチド配列が、所与のアミノ酸配列をコードしうる。このようなヌクレオチド配列は、全ての生物において、同じアミノ酸配列の産生を結果としてもたらすので（ある特定の生物は、一部の配列を、他の配列より効率的に翻訳しうるが）、機能的に同等であると考えられる。さらに、時折、所与のヌクレオチド配列内では、プリンまたはピリミジンのメチル化改変体を見出すことができる。このようなメチル化は、トリヌクレオチドコドンと、対応するアミノ酸とのコード関係には影響を及ぼさない。
【０１２８】
前出の点では、ＤＮＡまたはＲＮＡを、アミノ酸配列に翻訳する遺伝暗号を使用して、ポリペプチドのアミノ酸配列を導出するのに、バイオマーカータンパク質（またはその任意の部分）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列を使用することができる。同様に、ポリペプチドのアミノ酸配列については、ポリペプチドをコードしうる、対応するヌクレオチド配列を、遺伝暗号から推定することができる（その冗長性のために、任意の所与のアミノ酸配列について、複数の核酸配列をもたらすであろう）。したがって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列についての、本明細書における記載および／または開示は、ヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列についての記載および／または開示も含むと考えるものとする。同様に、本明細書における、ポリペプチドのアミノ酸配列についての記載および／または開示は、アミノ酸配列をコードしうる、全ての可能なヌクレオチド配列についての記載および／または開示も含むと考えるものとする。
【０１２９】
最後に、本発明の遺伝子座およびバイオマーカーならびに関連バイオマーカー（例えば、表１に列挙されているバイオマーカー）についての核酸およびアミノ酸配列情報は、当技術分野で周知であり、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）などの公開データベース上で直ぐに入手できる。例えば、公開配列データベースに由来する例示的な核酸配列およびアミノ酸配列を下に提供する。
【０１３０】
上記のバイオマーカーの代表的配列を下表１および２に示す。上記の用語を、上記バイオマーカーに関する本明細書に記載されている特色の任意の組合せを指すためにさらに使用することができることに留意されたい。例えば、配列組成、同一性百分率、配列長さ、ドメイン構造、機能活性などの任意の組合せを、本発明のバイオマーカーを記載するために使用することができる。
【０１３１】
【表１−１】
2019534321.tif 000007
【表１−２】
2019534321.tif 000008
【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
2019534321.tif 000011
【０１３２】
＊表１には、ＲＮＡ核酸分子（例えば、チミンをウリジン（ｕｒｅｄｉｎｅ）で置きかえた）、コードされるタンパク質のオーソログをコードする核酸分子のほか、それらの全長にわたり、表１に列挙された任意の配列番号の核酸配列、またはその部分と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ超の同一性を有する核酸配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ核酸配列が含まれる。本明細書でさらに記載される通り、このような核酸分子は、全長核酸の機能を有しうる。
【０１３３】
＊表１には、タンパク質のオーソログのほか、それらの全長にわたり、表１に列挙された任意の配列番号のアミノ酸配列、またはその部分と、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれ超の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子が含まれる。本明細書でさらに記載される通り、このようなポリペプチドは、全長ポリペプチドの機能を有しうる。
【０１３４】
【表２−１】
2019534321.tif 000012
【表２−２】
2019534321.tif 000013
【表２−３】
2019534321.tif 000014
【表２−４】
2019534321.tif 000015
【０１３５】
＊表２には、ＲＮＡ核酸分子（例えば、ウリジン（uredine）で置きかえたチミン）、コードされたタンパク質のオーソログをコードする核酸分子、およびその全長にわたり、表２に列挙されている任意の配列番号の核酸配列またはその部分と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれよりも多い同一性を有する核酸配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ核酸配列が含まれている。このような核酸分子は、本明細書にさらに記載されている全長核酸の機能を有しうる。
【０１３６】
＊表２には、タンパク質のオーソログ、およびその全長にわたり、表２に列挙されている任意の配列番号のアミノ酸配列またはその部分と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれよりも多い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子が含まれている。このようなポリペプチドは、本明細書にさらに記載されている全長ポリペプチドの機能を有しうる。
【０１３７】
＊表２には、以下に記載するおよび／または実施例に記載されているＦＬＴ３変異体、特に、周知である、ＦＬＴ３キナーゼ活性を増強してがんを駆動する活性化変異が含まれている。このような変異体は、例えば、リガンド結合に応答してリン酸化を低下させ、ＳＴＡＴ５Ａの活性化を消失させるが、構成的に活性化された変異体キナーゼ改変体のリン酸化には効果がない、配列番号８の５８９位におけるＹからＦへの置換（Kiyoiら（１９９８年）Leukemia  １２巻：１３３３〜１３３７頁；Rocnikら（２００６年）Blood  １０８巻：１３３９〜１３４５頁；Heissら（２００６年）Blood  １０８巻：１５４２〜１５５０頁）；ＳＴＡＴ５Ａの活性化を消失させるが、チロシンリン酸化には有意な効果がない、配列番号８の５９１位におけるＹからＦへの置換（Kiyoiら、１９９８年；Rocnikら、２００６年）；そのＰＴＰＮ１１／ＳＨＰ２との相互作用およびＰＴＰＮ１１／ＳＨＰ２のリン酸化を消失させる、配列番号８の５９９位におけるＹからＦへの置換（Heissら、２００６年）；ならびにそのキナーゼ活性を消失させる、配列番号８の６４４位におけるＫからＡへの置換を含む。
【０１３８】
ＦＬＴ３の潜在的アミノ酸修飾も、周知であり、例えば、配列番号８の３５／６５、１０３／１１４、１９９／２０６、２３２／２４１、２７２／３３０、３６８／４０７および３８１／３９２位におけるジスルフィド結合、配列番号８の４３、１００、１５１、３０６、３２３、３５１、３５４、４７３、５０２および５４１の位置におけるグリコシル化、ならびに配列番号８の５７２、５７４、５８９、５９１、５９９、７２６、７５９、７６８、７９３、８４２、９５５、９６９および９９３位におけるリン酸化を含む（Verstraeteら（２０１１年）Blood  １１８巻：６０〜６８頁；Heissら、２００６年；Aroraら（２０１１年）J.  Biol.  Chem.２８６巻：１０９１８〜１０９２９頁；Razumovskayaら（２００９年）Exp.  Hematol.３７巻：９７９〜９８９頁；Schmidt-Arrasら（２００５年）Mol.  Cell  Biol.２５巻：３６９０〜３７０３頁；Rocnikら、２００６年；Oppermannら（２００９年）Mol.  Cell  Proteomics  ８巻：１７５１〜１７６４頁）。
【０１３９】
ＦＬＴ３についての翻訳後修飾は、例えば、シアル酸との複合Ｎ−グリカンによるＮ−グリコシル化（Schmidt-Arrasら、２００５年；Aroraら、２０１１年；Verstraeteら、２０１１年）、ＦＬＴ３ＬＧ結合に応答したいくつかのチロシン残基における自己リン酸化（これはまた、構成的に活性化されている変異体キナーゼのリン酸化を増加させる）、ＰＴＰＲＪ／ＤＥＰ−１、ＰＴＰＮ１、ＰＴＰＮ６／ＳＨＰ−１による、また、より低い程度であるが、ＰＴＰＮ１２による脱リン酸化（脱リン酸化は、小胞体からのＦＬＴ３搬出および細胞膜における位置付けに重要である）、ならびにそのプロテアソーム分解をもたらす、自己リン酸化後のＵＢＥ２Ｌ６およびＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼＳＩＡＨ１による急速ユビキチン化（Buchwaldら（２０１０年）Leukemia  ２４巻：１４１２〜１４２１頁；Aroraら、２０１１年）を含む。
【０１４０】
ヒトＦＬＴ３アミノ酸配列の天然改変体は、例えば、配列番号８の７位におけるＤからＧへの改変体、１５８位におけるＶからＡへの改変体、１９４位におけるＶからＭへの改変体、２２７位におけるＴからＭへの改変体、３２４位におけるＤからＮへの改変体、３５８位におけるＤからＶへの改変体、４１７位におけるＩからＬへの改変体、５５７位におけるＶからＩへの改変体、８３５位におけるＤからＥ、ＤからＨ、ＤからＮ、ＤからＶまたはＤからＹへの改変体、および８３６位におけるＩからＭへの改変体を含む。これらのうち、８３５位における改変体は、急性リンパ芽球性白血病患者および急性骨髄性白血病患者に見出され、体細胞変異は、構成的に活性化されたＦＬＴ３をもたらす（Yamamotoら（２００１年）Blood  ９７巻：２４３４〜２４３９頁；Taketaniら（２００４年）Blood  １０３巻：１０８５〜１０８８頁；Abu-Duhierら（２００１年）Br.  J.  Haematol  １１３巻：９８３〜９８８頁）。８３６位における改変体も、急性リンパ芽球性白血病患者に見出された（Taketaniら、２００４年）。
【０１４１】
ＦＬＴ３における変異は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者に見出された。ＡＭＬ患者の約３０％が、いくらかの形態のＦＬＴ３変異を有するが、いずれか所与の患者におけるこれらの遺伝的病変のうちの臨床的有意性のあるもの（clinical  significance  one）は、変異の性質およびそれが起こる状況に応じて変動する。一般に、ＦＬＴ３変異は、２つのカテゴリーに分けることができる：（１）受容体の膜近傍ドメイン内のまたはその付近の遺伝子内縦列重複（ＦＬＴ３／ＩＴＤ変異）、および（２）チロシンキナーゼドメインの活性化ループ内で起こる単一アミノ酸置換をもたらす点変異（ＦＬＴ３／ＴＫＤ変異、例えば、配列番号８の８３５および／または８３６位における）。エクソン１４〜１５のインフレーム遺伝子内縦列重複（ＩＴＤ）変異が、ＡＭＬの症例の１５〜３０％で認められた。これは、ｆｌｔ−３の膜近傍セグメントを伸長させ、その二量体化および構成的活性化をもたらす（Yokotaら（１９９７年）Leukemia  １１巻：１６０５〜１６０９頁）。このようなＩＴＤ変異は、ＦＡＢ型にわたって起こり、特にＭ３においてよくある。このような変異は、「中等度リスク」患者で主に起こり、子供よりも成人で高頻度である（GillilandおよびGriffine（２００２年）Blood  １００巻：１５３２〜１５４２頁）。ＦＬＴ３のＩＴＤ変異は、いくつかの研究において独立予後不良因子であることが示され（Schnittgerら（２００２年）Blood  １００巻：５９〜６６頁；Thiedeら（２００２年）Blood  ９９巻：４３２６〜４３３５頁）、変異状態は、以前は均一であった「中等度リスク」群から「不良リスク」群を描写することができる。二対立遺伝子変異が約１０％で認められ、さらにより不良なアウトカムに関連付けられる。
【０１４２】
その上、ＦＬＴ３のコドン８３５の点変異が、ｄｅ  ｎｏｖｏ  ＡＭＬの症例の７〜８％において報告された（Yamamotoら、２００１年）。この変異は、キナーゼドメインの機能の上方調節をもたらし、その予後有意性には議論の余地がある。このような変異も、ＭＬＬの細胞遺伝学的高二倍性または異常に関連するＡＬＬ（Stubbsら（２００８年）Leukemia  ２２巻：６６〜７７頁）および骨髄性肉腫（Ansari-Lariら（２００４年）Br.  J.  Haematol.１２６巻：７８５〜７９１頁）に見出された。他のコドンにおいてチロシンキナーゼドメイン変異の数が増加していることが報告されている（Smithら（２００５年）Br.  J.  Haematol.１２８巻：３１８〜３２３頁）。例えば、急性骨髄性白血病（例えば、異常骨髄好酸球ｉｎｖ（１６）（ｐ１３ｑ２２）またはｔ（１６；１６）（ｐ１３；ｑ２２）を伴う、ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）転座を伴う、および成熟を伴うまたは伴わない）、急性二表現型白血病、最小分化型急性骨髄芽球性白血病、前駆Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病および前駆Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病とＦＬＴ３変異との関連に関する総説は、Ｏｒｐｈａｎｅｔのウェブサイトに見出すことができる（参照コードＯＲＰＨＡ９８８２９、１０２７２４、９８８３７、９８８３４、９８８３３、９８８３２、９９８６０、９９８６１などによる）。
【０１４３】
ＩＩ．対象
一実施形態では、がん処置が施行されるか、または抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）の有効性の確度が予測される対象が、決定され、この対象は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長動物、非ヒト哺乳動物、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどの飼育動物）であり、好ましくは、ヒトである。
【０１４４】
本発明の方法の別の実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、標的化療法および／または抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）などの処置を受けていない。さらに別の実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、標的化療法および／または抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）などの処置を受けている。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、上記対象は、血液区画精製（blood  compartment  purification）によるなど、がん性または前がん性組織を除去するための手術を行ったことがある。他の実施形態では、上記がん性組織は、除去されていない、例えば、上記がん性組織は、生命に必須の組織、または外科的手順が患者にとって害となる相当な危険性を生じ得る領域など、身体の手術不能領域に位置する場合がある。
【０１４６】
本発明の方法を使用して、上記のものなど、対象における多くの異なるがんの抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）に対する応答性を決定することができる。一実施形態では、上記がんは、白血病など、血液学的がんである。別の実施形態では、上記がんは、肺がん、メラノーマおよび／または腎細胞癌など、固形腫瘍である。別の実施形態では、上記がんは、脳がん（例えば、神経膠芽腫）、膀胱がん、乳がん、子宮頸部がん、結腸がん、婦人科系がん、腎がん、喉頭がん、肺がん、口腔がん、頭頸部がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がんまたは皮膚がんなどであるがこれらに限定されない、上皮がんである。
【０１４７】
ＩＩＩ．試料の回収、調製、および分離
一部の実施形態では、対象に由来する試料中の、バイオマーカーの存在、非存在、量、および／または活性の測定値（複数可）を、所定の対照（標準）試料と比較する。対象に由来する試料は、がん細胞または組織などの罹患組織に由来することが典型的である。対照試料は、同じ対象に由来する場合もあり、異なる対象に由来する場合もある。対照試料は、正常な非罹患試料であることが典型的である。しかし、疾患の病期分類のため、または処置の有効性を評価するためなど、一部の実施形態では、対照試料は、罹患組織に由来する場合がある。対照試料は、何例かの異なる対象に由来する試料の組合せでありうる。一部の実施形態では、対象に由来するバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）を、所定のレベルと比較する。この所定のレベルは、被験試料が得られた種と同じ種のメンバーの細胞もしくは組織型、または被験試料が得られた対象に由来する非罹患細胞もしくは組織における、バイオマーカーの正常なコピー数、量、または活性など、正常試料から得られることが典型的である。本明細書に記載されている通り、「所定の」バイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）は、例だけを目的として述べると、処置のために選択されうる対象を評価する、抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）に対する応答を評価する、かつ／または併用抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤、プラス、抗免疫阻害療法）に対する応答を評価するのに使用されるバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）でありうる。所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）は、がんを有するかまたは有さない患者の集団内で決定することができる。所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）は、あらゆる患者に同等に適用可能な、単一の数である場合があり、または所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）は、患者の特定の部分集団に従い変動しうる。対象の年齢、体重、身長、および他の因子は、個体の所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）に影響を及ぼしうる。さらに、所定のバイオマーカーの量および／または活性は、各対象について個別に決定することができる。一実施形態では、本明細書で記載される方法により決定および／または比較される量は、絶対測定値に基づく。別の実施形態では、本明細書で記載される方法により決定および／または比較される量は、比（例えば、ハウスキーピング遺伝子の発現、または多様な時点における遺伝子発現に照らして正規化されたバイオマーカーの発現）などの相対測定値に基づく。
【０１４８】
所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）は、任意の適切な標準物質でありうる。例えば、所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）は、患者の選択を評価するための、同じまたは異なるヒトから得ることができる。一実施形態では、所定のバイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）は、同じ患者についてのかつての評価から得ることができる。このようにして、患者の選択の進行を、ある時間にわたりモニタリングすることができる。加えて、対照は、別のヒトまたは複数のヒト、例えば、対象が、ヒトである場合に、選択されたヒトの群についての評価から得ることができる。このようにして、選択を評価するための、ヒトの選択の範囲を、適切な他のヒト、例えば、同様もしくは同じ状態を患うヒトおよび／または同じ民族（ｅｔｈｎｉｃ）群のヒトなど、目的のヒトと同様の状況にある他のヒトと比較することができる。
【０１４９】
本発明の一部の実施形態では、バイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）の、所定のレベルからの変化は、約０．５倍、約１．０倍、約１．５倍、約２．０倍、約２．５倍、約３．０倍、約３．５倍、約４．０倍、約４．５倍、または約５．０倍、またはそれ超である。一部の実施形態では、倍数変化は、約１倍未満、約５倍未満、約１０倍未満、約２０倍未満、約３０倍未満、約４０倍未満、または約５０倍未満である。他の実施形態では、バイオマーカーの量および／または活性の測定値（複数可）の、所定のレベルと比較した倍数変化は、約１倍を超える、約５倍を超える、約１０倍を超える、約２０倍を超える、約３０倍を超える、約４０倍を超える、または約５０倍を超える。
【０１５０】
生体試料は、核酸および／またはタンパク質を含む、体液試料、細胞試料、または組織試料を含む、患者に由来する様々な供給源から回収することができる。「体液」とは、身体から排出または分泌される流体のほか、通常身体から排出または分泌されない流体（例えば、羊水、房水、胆汁、血液および血漿、脳脊髄液、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎおよびｅａｒｗａｘ）、カウパー腺液または尿道球腺液、乳び、びじゅく、糞便、スキーン腺液、間質液、細胞内液、リンパ、経血、母乳、粘液、胸膜液、膿、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑膜液、涙、尿、膣液、硝子体液、吐瀉物）も指す。好ましい実施形態では、対象および／または対照試料は、細胞、細胞系、組織学スライド、パラフィン包埋組織、生検材料、全血、乳首吸引物、血清、血漿、口腔内切屑、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、および骨髄からなる群より選択される。一実施形態では、試料は、血清、血漿、または尿である。別の実施形態では、試料は、血清である。
【０１５１】
試料は、個体から、長期にわたり繰り返し（例えば、日、週、月、毎年、隔年などのオーダーで１回または複数回）回収することができる。多数の試料を、個体から、ある期間にわたり得ることを使用して、早期の検出からの結果を検証し、かつ／または、例えば、疾患の進行、薬物処置などの結果としての、生物学的パターンの変更を同定することができる。例えば、対象試料を、本発明に従い、毎月、隔月、または１、２、もしくは３カ月間隔の組合せで採取およびモニタリングしうる。加えて、ある時間にわたり得られる、対象のバイオマーカーの量および／または活性の測定値は、モニタリング期間中に、互いと比較するほか、正常対照と比較し、これにより、長期モニタリングのための内部または個人対照としての対象自身の値をもたらしうると好都合である。
【０１５２】
試料の調製および分離は、回収される試料の種類および／またはバイオマーカー測定値の解析に応じる手順のうちのいずれかを伴いうる。このような手順は、例だけを目的として述べると、濃縮、希釈、ｐＨの調整、存在度の大きなポリペプチド（例えば、アルブミン、ガンマグロブリン、およびトランスフェリンなど）の除去、保存剤および較正物質の添加、プロテアーゼ阻害剤の添加、変性剤の添加、試料の脱塩、試料タンパク質の濃縮、脂質の抽出および精製を含む。
【０１５３】
また、試料の調製により、非共有結合的複合体中で、他のタンパク質（例えば、担体タンパク質）と結合した分子を単離することもできる。この工程により、特異的な担体タンパク質（例えば、アルブミン）に結合した分子を単離することもでき、例えば、酸を使用するタンパク質変性と、それに続く、担体タンパク質の除去を介する、全ての担体タンパク質からの、結合した分子の放出など、より一般的な工程を使用することもできる。
【０１５４】
所望されないタンパク質（例えば、存在度が大きいか、情報を与えないか、または検出不能なタンパク質）の、試料からの除去は、高アフィニティー試薬、高分子量フィルター、超遠心分離、および／または電気透析を使用して達成することができる。高アフィニティー試薬は、存在度の大きなタンパク質に選択的に結合する、抗体または他の試薬（例えば、アプタマー）を含む。試料の調製はまた、イオン交換クロマトグラフィー、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水性クロマトグラフィー、等電点電気泳動（ｃｈｒｏｍａｔｏｆｏｃｕｓｉｎｇ）、吸着クロマトグラフィー、等電点電気泳動（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）、および類縁の技法も含みうる。分子量フィルターは、サイズおよび分子量に基づき、分子を分離する膜を含む。このようなフィルターは、逆浸透、ナノ濾過、限外濾過、および微細濾過をさらに利用しうる。
【０１５５】
超遠心分離とは、所望されないポリペプチドを、試料から除去するための方法である。超遠心分離とは、光学システムで、粒子の沈降（またはその欠如）をモニタリングしながらの、約１５，０００〜６０，０００ｒｐｍにおける、試料の遠心分離である。電気透析とは、電位勾配の影響下で、半透膜を介して、イオンを、１つの溶液から別の溶液へと輸送する工程において、電気膜（ｅｌｅｃｔｒｏｍｅｍｂｒａｎｅ）または半透膜を使用する手順である。電気透析において使用される膜は、正もしくは負の電荷を有するイオンを選択的に輸送し、反対の電荷を有するイオンを棄却する能力、または分子種が、サイズおよび電荷に基づき、半透膜を介して移動することを可能とする能力を有しうるので、電気透析を、電解質の濃縮、除去、または分離に有用とする。
【０１５６】
本発明における分離および精製は、当技術分野で公知の任意の手順、例えば、キャピラリー電気泳動（例えば、キャピラリー内またはチップ上）またはクロマトグラフィー（例えば、キャピラリー内、カラム内、またはチップ上）などを含みうる。電気泳動とは、電界の影響下で、イオン性分子を分離するのに使用しうる方法である。電気泳動は、ゲル内、キャピラリー内、またはチップ上のマイクロチャネル内で行うことができる。電気泳動のために使用されるゲルの例は、デンプン、アクリルアミド、ポリエチレンオキシド、アガロース、またはこれらの組合せを含む。ゲルは、その架橋、洗浄剤または変性剤の添加、酵素または抗体（アフィニティー電気泳動）または基質（ザイモグラフィー）の固定化、およびｐＨ勾配の組込みにより修飾することができる。電気泳動のために使用されるキャピラリーの例は、エレクトロスプレーと接続するキャピラリーを含む。
【０１５７】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、複合体である親水性分子と、高度に荷電した溶質とを分離するのに好ましい。ＣＥ技術はまた、マイクロ流体チップ上でも実装することができる。使用されるキャピラリーおよび緩衝液の種類に応じて、ＣＥは、キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリー等速回転電気泳動（ｃＩＴＰ）、およびキャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）などの分離法へと、さらに分けることができる。ＣＥ法を、エレクトロスプレーによるイオン化とカップリングさせる実施形態は、揮発性溶液、例えば、揮発性の酸および／または塩基と、アルコールまたはアセトニトリルなどの有機物とを含有する水性混合物の使用を伴う。
【０１５８】
キャピラリー等速回転電気泳動（ｃＩＴＰ）は、解析物が、キャピラリーを介して、一定の速度で移動するが、それらのそれぞれの移動度により分離される技法である。自由溶液ＣＥ（ＦＳＣＥ）としてもまた公知のキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、分子上の電荷と、移動中に分子にかかる摩擦抵抗であって、分子のサイズに正比例することが多い摩擦抵抗とにより決定される、分子種の電気泳動移動度の差異に基づく。キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）は、弱くイオン化可能な両親媒性分子を、ｐＨ勾配下の電気泳動により分離することを可能とする。ＣＥＣとは、従来の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）とＣＥとのハイブリッド法である。
【０１５９】
本発明で使用される分離法および精製法は、当技術分野で公知の、任意のクロマトグラフィー手順を含む。クロマトグラフィーは、ある特定の解析物の差次的な吸着および溶出または移動相と固定相との間における、解析物の分配に基づきうる。クロマトグラフィーの異なる例は、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などを含むがこれらに限定されない。
【０１６０】
ＩＶ．バイオマーカー核酸およびポリペプチド
本発明の一態様は、バイオマーカーポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの部分をコードするバイオマーカー核酸に対応する、単離された核酸分子の使用に関する。本明細書で使用される通り、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチドアナログを使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含むことが意図される。上記核酸分子は、一本鎖または二本鎖でありうるが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
【０１６１】
「単離された」核酸分子は、該核酸分子の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、「単離された」核酸分子は、該核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて該核酸に天然で隣接する配列（好ましくは、タンパク質コード配列）（すなわち、該核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々な実施形態では、上記単離された核酸分子は、該核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて該核酸分子に天然で隣接する約５ｋＢ、４ｋＢ、３ｋＢ、２ｋＢ、１ｋＢ、０．５ｋＢまたは０．１ｋＢ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。さらに、ｃＤＮＡ分子など、「単離された」核酸分子は、組換え技法によって産生される場合は他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まなくてよい、または化学合成される場合は化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まなくてよい。
【０１６２】
本発明のバイオマーカー核酸分子は、標準分子生物学技法および本明細書に記載されているデータベース記録における配列情報を使用して単離することができる。このような核酸配列の全体または部分を使用して、本発明の核酸分子は、標準ハイブリダイゼーションおよびクローニング技法を使用して単離することができる（例えば、Sambrookら編、Molecular  Cloning:    A  Laboratory  Manual、第２版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor,  NY、１９８９年に記載されている通り）。
【０１６３】
本発明の核酸分子は、標準ＰＣＲ増幅技法に従って、鋳型としてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅することができる。このようにして増幅された核酸分子は、適切なベクターにクローニングし、ＤＮＡ配列解析によって特徴付けることができる。さらに、本発明の核酸分子の全体または部分に対応するオリゴヌクレオチドは、例えば、自動化ＤＮＡ合成機を使用した、標準合成技法によって調製することができる。
【０１６４】
さらに、本発明の核酸分子は、核酸配列の部分のみを含むことができ、この場合、全長核酸配列は、本発明のマーカーを含む、または本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする。このような核酸分子は、例えば、プローブまたはプライマーとして使用することができる。上記プローブ／プライマーは典型的に、１種または複数種の実質的に精製されたオリゴヌクレオチドとして使用される。上記オリゴヌクレオチドは典型的に、バイオマーカー核酸配列の少なくとも約７、好ましくは約１５、より好ましくは約２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０もしくは４００またはそれよりも多い連続したヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。バイオマーカー核酸分子の配列に基づくプローブを使用して、本発明の１種または複数種のマーカーに対応する転写物またはゲノム配列を検出することができる。上記プローブは、それに結合させた標識基、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補助因子を含む。
【０１６５】
遺伝暗号の縮重に起因して、バイオマーカーに対応するタンパク質をコードする核酸分子のヌクレオチド配列と異なり、したがって、同じタンパク質をコードする、該バイオマーカー核酸分子も想定される。
【０１６６】
加えて、当業者は、集団（例えば、ヒト集団）内には、アミノ酸配列の変化をもたらす、ＤＮＡ配列の多型が存在しうることを理解するであろう。このような遺伝子多型は、自然の対立遺伝子変異に起因して、集団内の個体間に存在しうる。対立遺伝子とは、所与の遺伝子座において代替的に生じる遺伝子群のうちの１つである。加えて、ＲＮＡの発現レベルに影響を及ぼすＤＮＡ多型はまた、その遺伝子の全発現レベルにも影響を及ぼしうる（例えば、調節または分解に影響を及ぼすことにより）ことが理解されるであろう。
【０１６７】
本明細書では「対立遺伝子改変体」と互換的に使用される「対立遺伝子」という用語は、遺伝子またはその部分の代替的形態を指す。対立遺伝子は、相同な染色体上の、同じ遺伝子座または位置を占有する。対象が、遺伝子の２つの同一な対立遺伝子を有する場合、対象は、遺伝子または対立遺伝子についてホモ接合性であるという。対象が、遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を有する場合、対象は、遺伝子または対立遺伝子についてヘテロ接合性であるという。例えば、バイオマーカーの対立遺伝子は、単一のヌクレオチドにおいて互いに異なる場合もあり、いくつかのヌクレオチドにおいて互いに異なる場合もあり、ヌクレオチドの置換、欠失、および挿入を含みうる。遺伝子の対立遺伝子はまた、１または複数の変異を含有する遺伝子の形態でもありうる。
【０１６８】
本明細書で互換的に使用される「遺伝子の多型領域の対立遺伝子改変体」または「対立遺伝子改変体」という用語は、集団内の遺伝子のこの領域内で見出される、いくつかの可能なヌクレオチド配列のうちの１つを有する、遺伝子の代替的形態を指す。本明細書で使用される場合、対立遺伝子改変体は、機能的な対立遺伝子改変体、非機能的な対立遺伝子改変体、ＳＮＰ、変異、および多型を包含することを意図する。
【０１６９】
「一塩基多型」（ＳＮＰ）という用語は、対立遺伝子の配列間の変異部位である、単一のヌクレオチドにより占有された多型部位を指す。部位は通例、対立遺伝子の高度に保存された配列（例えば、集団のメンバー１００例中１例または１０００例中１例未満において変動する配列）を先行させ、これを後続させる。ＳＮＰは通例、多型部位における、１つのヌクレオチドによる、別のヌクレオチドの置換に起因して起こる。ＳＮＰはまた、基準対立遺伝子と比べた、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入からも起こりうる。多型部位は、基準塩基以外の塩基により占有されていることが典型的である。例えば、基準対立遺伝子が、多型部位において、塩基「Ｔ」（チミジン）を含有する場合、変更された対立遺伝子は、多型部位において、「Ｃ」（シチジン）、「Ｇ」（グアニン）、または「Ａ」（アデニン）を含有しうる。ＳＮＰは、タンパク質をコードする核酸配列内で生じる可能性があり、この場合、ＳＮＰは、欠損性の改変体タンパク質もしくは他の形の改変体タンパク質、または遺伝子疾患をもたらしうる。このようなＳＮＰは、遺伝子のコード配列を変更し、したがって、別のアミノ酸を指定する（「ミスセンス」ＳＮＰ）場合があり、またはＳＮＰは、終止コドンを導入する（「ナンセンス」ＳＮＰ）場合がある。ＳＮＰが、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない場合、ＳＮＰは、「サイレント」と呼ばれる。ＳＮＰはまた、ヌクレオチド配列の非コード領域内でも生じうる。これは、例えば、選択的スプライシングの結果としての欠損性のタンパク質発現を結果としてもたらす場合もあり、タンパク質の機能に対して影響を及ぼさない場合もある。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。このような自然の対立遺伝子変異は、所与の遺伝子のヌクレオチド配列内で、１〜５％の分散を結果としてもたらしうることが典型的である。代替的な対立遺伝子は、いくつかの異なる個体において、目的の遺伝子をシークエンシングすることにより同定することができる。これは、様々な個体における同じ遺伝子座を同定するハイブリダイゼーションプローブを使用することにより、たやすく実行することができる。自然の対立遺伝子変異の結果であり、機能的活性を変更しない、あらゆるかつ全てのこのようなヌクレオチド変異および結果として生じるアミノ酸多型または変異は、本発明の範囲内にあることが意図される。
【０１７１】
別の実施形態では、バイオマーカー核酸分子は、少なくとも７、１５、２０、２５、３０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５５０、６５０、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２２００、２４００、２６００、２８００、３０００、３５００、４０００、４５００、またはそれ超のヌクレオチドの長さであり、ストリンジェントな条件下で、本発明のマーカーに対応する核酸分子または本発明のマーカーに対応するタンパク質をコードする核酸分子とハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件であって、その下では、互いと少なくとも６０％（６５％、７０％、７５％、８０％、好ましくは８５％）同一なヌクレオチド配列が、互いとハイブリダイズしたままであることが典型的である条件について記載することを意図する。このようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ（１９８９年）の、６．３．１〜６．３．６節において見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の、好ましい、非限定的な例は、約４５℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーションとそれに続く、５０〜６５℃で、０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中の、１回または複数回の洗浄である。
【０１７２】
集団内に存在しうる、本発明の核酸分子の天然に存在する対立遺伝子改変体に加えて、当業者は、配列の変化を、変異により導入し、これにより、核酸分子によりコードされるタンパク質の生物学的活性を変更せずに、コードされるタンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらしうることをさらに理解するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基においてアミノ酸置換をもたらす、ヌクレオチド置換を施すことができる。「非必須」アミノ酸残基が、生物学的活性を変更せずに、野生型配列から変更されうる残基であるのに対し、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。例えば、多様な種のホモログの間で保存されないか、または半保存的であるに過ぎないアミノ酸残基は、活性に必須ではない可能性があるので、変更のための標的となる可能性があるであろう。代替的に、多様な種（例えば、マウスおよびヒト）のホモログの間で保存されるアミノ酸残基は、活性に必須でありうるので、変更のための標的とならない可能性があるであろう。
【０１７３】
したがって、発明の別の態様は、活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含有する、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子に関する。このようなポリペプチドは、アミノ酸配列が、本発明のマーカーに対応する、天然に存在するタンパク質とは異なるが、生物学的活性を保持する。一実施形態では、バイオマーカータンパク質は、本明細書で記載されるバイオマーカータンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも約４０％同一であり、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８７．５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ超同一なアミノ酸配列を有する。
【０１７４】
改変体タンパク質をコードする単離された核酸分子は、１または複数のアミノ酸残基の置換、付加、または欠失を、コードされるタンパク質に導入するように、１または複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失を、本発明の核酸のヌクレオチド配列に導入することにより創出することができる。変異は、部位指向変異誘発およびＰＣＲ媒介型変異誘発など、標準的な技法により導入することができる。保存的アミノ酸置換は、１または複数の、予測される非必須アミノ酸残基において施すことが好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を、類似する側鎖を有するアミノ酸残基で置きかえた置換である。当技術分野では、類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが規定されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分枝型側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。代替的に、変異は、飽和変異誘発などにより、コード配列の全部または一部に沿って、ランダムに導入することができ、結果として得られる変異体を、生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持する変異体を同定することができる。変異誘発に続き、コードされるタンパク質を、組換えにより発現させ、タンパク質の活性を決定することができる。
【０１７５】
一部の実施形態では、本発明は、抗バイオマーカーアンチセンス核酸分子、すなわち、本発明のセンス核酸に相補的な、例えば、本発明のマーカーに対応する二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的な、または本発明のマーカーに対応するｍＲＮＡ配列に相補的な分子の使用をさらに想定する。したがって、本発明のアンチセンス核酸分子は、本発明のセンス核酸に水素結合する（すなわち、これとアニールする）ことができる。上記アンチセンス核酸は、コード鎖全体に、またはその部分のみ、例えば、タンパク質コード領域（またはオープンリーディングフレーム）の全体もしくは一部に相補的でありうる。アンチセンス核酸分子はまた、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域の全体または一部に対するアンチセンスでありうる。上記非コード領域（「５’および３’非翻訳領域」）は、上記コード領域に隣接する５’および３’配列であり、アミノ酸に翻訳されない。
【０１７６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０個またはそれよりも多いヌクレオチドの長さでありうる。アンチセンス核酸は、当技術分野で公知の手順を使用した、化学合成および酵素ライゲーション反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または上記分子の生物学的安定性を増加させるように、もしくは上記アンチセンス核酸およびセンス核酸の間で形成された二重鎖の物理的安定性を増加させるようにデザインされた様々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。上記アンチセンス核酸の生成に使用することができる修飾されたヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン（beta-D-galactosylqueosine）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン（wybutoxosine）、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリンを含む。あるいは、上記アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向性でサブクローニングされた（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、次のサブ節においてさらに記載される、目的の標的核酸に対してアンチセンス配向性のものとなる）発現ベクターを使用して生物学的に産生することができる。
【０１７７】
本発明のアンチセンス核酸分子は典型的に、本発明の選択されたマーカーに対応するポリペプチドをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするまたはこれに結合して、これにより、例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより、上記マーカーの発現を阻害するように、対象に投与される、またはｉｎ  ｓｉｔｕで生成される。上記ハイブリダイゼーションは、安定した二重鎖を形成するための従来のヌクレオチド相補性によるものでありうる、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重らせんの主溝における特異的相互作用を介したものでありうる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位における直接的注射、または血液もしくは骨髄関連体液への該アンチセンス核酸の注入を含む。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするように修飾し、次いで、全身性投与することができる。例えば、全身性投与のため、アンチセンス分子は、例えば、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体に上記アンチセンス核酸分子を連結することにより、選択された細胞表面に発現された受容体または抗原に特異的に結合するように、修飾することができる。上記アンチセンス核酸分子は、本明細書に記載されているベクターを使用して、細胞に送達することもできる。上記アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するために、該アンチセンス核酸分子が強いｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれたベクター構築物が、好まれる。
【０１７８】
本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子でありうる。α−アノマー核酸分子は、通常のα−単位に反して、鎖が互いに平行に延びている（run  parallel  to  each  other）、相補的ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Gaultierら、１９８７年、Nucleic  Acids  Res.１５巻：６６２５〜６６４１頁）。上記アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoueら、１９８７年、Nucleic  Acids  Res.１５巻：６１３１〜６１４８頁）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Inoueら、１９８７年、FEBS  Lett.２１５巻：３２７〜３３０頁）を含むこともできる。
【０１７９】
本発明は、リボザイムも包含する。リボザイムは、相補的領域を有するｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。よって、リボザイム（例えば、HaselhoffおよびGerlach、１９８８年、Nature  ３３４巻：５８５〜５９１頁に記載されているハンマーヘッド型リボザイム）を使用して、ｍＲＮＡ転写物を触媒的に切断して、これにより、上記ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の翻訳を阻害することができる。本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸分子に対する特異性を有するリボザイムは、該マーカーに対応するｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づきデザインすることができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、切断されるべきヌクレオチド配列に相補的である、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  Ｌ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築することができる（Cechら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびCechら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照されたい）。あるいは、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することができる（例えば、BartelおよびSzostak、１９９３年、Science  ２６１巻：１４１１〜１４１８頁を参照されたい）。
【０１８０】
本発明は、三重らせん構造を形成する核酸分子も包含する。例えば、バイオマーカータンパク質の発現は、ポリペプチドをコードする遺伝子の調節領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列を標的化して、標的細胞における遺伝子の転写を防止する三重らせん構造を形成することにより阻害されうる。全般的に、Helene（１９９１年）Anticancer  Drug  Des.６巻（６号）：５６９〜８４頁；Helene（１９９２年）Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.６６０巻：２７〜３６頁；およびMaher（１９９２年）Bioassays  １４巻（１２号）：８０７〜１５頁を参照されたい。
【０１８１】
様々な実施形態では、本発明の核酸分子は、塩基部分、糖部分またはリン酸骨格において修飾して、例えば、該分子の安定性、ハイブリダイゼーションまたは溶解度を改善することができる。例えば、上記核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格を修飾して、ペプチド核酸分子を生成することができる（Hyrupら、１９９６年、Bioorganic  &  Medicinal  Chemistry  ４巻（１号）：５〜２３頁を参照されたい）。本明細書で使用される通り、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」という用語は、上記デオキシリボースリン酸骨格がシュードペプチド骨格によって置きかえられ、４種の天然核酸塩基のみが保持された、核酸模倣物、例えば、ＤＮＡ模倣物を指す。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でのＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示された。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Hyrupら（１９９６年）前出；Perry-O’Keefeら（１９９６年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９３巻：１４６７０〜６７５頁に記載されている標準固相ペプチド合成プロトコールを使用して行うことができる。
【０１８２】
ＰＮＡは、治療および診断適用において使用することができる。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写もしくは翻訳抑止を誘導するまたは複製を阻害することによる、遺伝子発現の配列特異的モジュレーションのためのアンチセンス剤またはアンチジーン剤として使用することができる。ＰＮＡは、例えば、例えばＰＮＡ指向性ＰＣＲクランピングによる遺伝子における単一塩基対変異の解析において；他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼと組み合わせて使用される場合、人工制限酵素として（Hyrup（１９９６年）前出）；またはＤＮＡシーケンスおよびハイブリダイゼーションのためのプローブもしくはプライマーとして（Hyrup、１９９６年、前出；Perry-O’Keefeら、１９９６年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９３巻：１４６７０〜６７５頁）、使用することもできる。
【０１８３】
別の実施形態では、ＰＮＡは、例えば、親油性基もしくは他のヘルパー基をＰＮＡに結合させることにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの形成により、またはリポソームもしくは当技術分野で公知の他の薬物送達技法の使用により、その安定性または細胞取込みを増強するように修飾することができる。例えば、ＰＮＡおよびＤＮＡの有利な特性を組み合わせることができる、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを生成することができる。このようなキメラは、ＰＮＡ部分が、高い結合アフィニティーおよび特異性をもたらしつつ、ＤＮＡ認識酵素、例えば、ＲＮＡＳＥ  ＨおよびＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡ部分と相互作用することを可能にする。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基の間の結合の数、および配向性に関して選択された適切な長さのリンカーを使用して連結することができる（Hyrup、１９９６年、前出）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Hyrup（１９９６年）、前出およびFinnら（１９９６年）Nucleic  Acids  Res.２４巻（１７号）：３３５７〜６３頁に記載されている通りに行うことができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準ホスホラミダイトカップリング化学および修飾されたヌクレオシドアナログを使用して、固体支持体において合成することができる。５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホラミダイトなどの化合物は、ＰＮＡとＤＮＡの５’末端との間の連結として使用することができる（Magら、１９８９年、Nucleic  Acids  Res.１７巻：５９７３〜８８頁）。続いて、ＰＮＡ単量体を、段階的様式でカップリングして、５’ＰＮＡセグメントおよび３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を産生する（Finnら、１９９６年、Nucleic  Acids  Res.２４巻（１７号）：３３５７〜６３頁）。あるいは、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを有するキメラ分子を合成することができる（Peterserら、１９７５年、Bioorganic  Med.  Chem.  Lett.５巻：１１１９〜１１１２４頁）。
【０１８４】
他の実施形態では、上記オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで宿主細胞受容体を標的化するための）、または細胞膜（例えば、Letsingerら、１９８９年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８６巻：６５５３〜６５５６頁；Lemaitreら、１９８７年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８４巻：６４８〜６５２頁；ＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０９８１０を参照されたい）もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８９／１０１３４を参照されたい）を越えた輸送を容易とする剤など、他の付属基を含むことができる。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤（例えば、Krolら、１９８８年、Bio/Techniques  ６巻：９５８〜９７６頁を参照されたい）またはインターカレート剤（例えば、Zon、１９８８年、Pharm.  Res.５巻：５３９〜５４９頁を参照されたい）により修飾することができる。この目的のために、上記オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発性切断剤などにコンジュゲートすることができる。
【０１８５】
本発明の別の態様は、バイオマーカータンパク質およびその生物学的に活性な部分の使用に関する。一実施形態では、マーカーに対応する天然ポリペプチドは、標準的なタンパク質精製法を使用する、適切な精製スキームにより、細胞または組織供給源から単離することができる。別の実施形態では、本発明のマーカーに対応するポリペプチドを、組換えＤＮＡ法により作製する。組換え発現に対する代替法として、本発明のマーカーに対応するポリペプチドは、標準的なペプチド合成法を使用して、化学的に合成することができる。
【０１８６】
「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、該タンパク質が由来する細胞もしくは組織供給源に由来する、細胞物質もしくは他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成される場合の、化学的前駆物質もしくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という表現は、タンパク質を、それが細胞から単離されるか、または組換えにより作製される該細胞の細胞成分から分離した、該タンパク質の調製物を含む。よって、細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量で）未満の異種タンパク質（本明細書ではまた、「夾雑タンパク質」とも称する）を有するタンパク質の調製物を含む。上記タンパク質またはその生物学的に活性な部分を組換えにより作製する場合、それはまた、培養培地も実質的に含まないことが好ましい、すなわち、培養培地は、上記タンパク質調製物の体積の約２０％、１０％または５％未満である。上記タンパク質を、化学合成によって産生する場合、これは、好ましくは、化学的前駆物質または他の化学物質を実質的に含まない、すなわち、該タンパク質の合成に関与する化学的前駆物質または他の化学物質から分離される。したがって、このような上記タンパク質の調製物は、約３０％、２０％、１０％、５％（乾燥重量で）未満の、目的のポリペプチド以外の化学的前駆物質または化合物を有する。
【０１８７】
バイオマーカーポリペプチドの生物学的に活性な部分は、本明細書で記載される、バイオマーカータンパク質のアミノ酸配列と十分に同一であるか、またはこれに由来するが、全長タンパク質よりも少ない数のアミノ酸を含み、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの活性を呈するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。生物学的に活性な部分は、対応するタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含むことが典型的である。本発明のタンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００個またはそれよりも多いアミノ酸の長さのポリペプチドでありうる。さらに、タンパク質の他の領域を欠失させた、他の生物学的に活性な部分は、組換え法により調製し、本発明のポリペプチドの天然形態の機能的活性のうちの１または複数について評価することができる。
【０１８８】
好ましいポリペプチドは、本明細書で記載される核酸分子によりコードされるバイオマーカータンパク質のアミノ酸配列を有する。他の有用なタンパク質は、これらの配列のうちの１つと実質的に同一（例えば、少なくとも約４０％、好ましくは、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）であり、対応する天然に存在するタンパク質のタンパク質の機能的活性を保持するが、自然の対立遺伝子変異または変異誘発に起因して、アミノ酸配列が異なる。
【０１８９】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性パーセントを決定するには、最適の比較を目的として、配列をアラインする（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適のアラインメントのために、第１のアミノ酸または核酸配列の配列内に、ギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有される場合、分子は、その位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントとは、配列により共有される同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置の総数（例えば、重複する位置）×１００）。一実施形態では、２つの配列は、同じ長さである。
【０１９０】
２つの配列の間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較のために活用される数学的アルゴリズムの、好ましい、非限定的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８７巻：２２６４〜２２６８頁のアルゴリズムであって、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９０巻：５８７３〜５８７７頁における通りに改変されたアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴによるヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るように、スコア＝１００、ワード長＝１２とするＮＢＬＡＳＴプログラムにより実施することができる。ＢＬＡＳＴによるタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るように、スコア＝５０、ワード長＝３とするＸＢＬＡＳＴプログラムにより実施することができる。比較を目的として、ギャップを施されたアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁において記載されている通り、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを活用することができる。代替的に、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠隔的関係を検出する反復的検索を実施することができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを活用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の、デフォルトのパラメータを使用することができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおけるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトを参照されたい。配列の比較のために活用される数学的アルゴリズムの、別の好ましい、非限定的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８年）、Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ、４巻：１１〜７頁のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するために、ＡＬＩＧＮプログラムを活用する場合、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用することができる。局所的配列類似性の領域およびアラインメントを同定するための、さらに別の有用なアルゴリズムは、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８５巻：２４４４〜２４４８頁において記載されている、ＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較するために、ＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用する場合、ＰＡＭ１２０重みづけ残基表は、例えば、ｋ−タプル値を２として使用することができる。
【０１９１】
２つの配列の間の同一性パーセントは、ギャップの許容を伴うかまたは伴わずに、上記で記載した技法と同様の技法を使用して決定することができる。同一性パーセントの計算では、正確なマッチだけをカウントする。
【０１９２】
本発明はまた、バイオマーカータンパク質に対応する、キメラまたは融合タンパク質も提供する。本明細書で使用される場合、「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、異種ポリペプチド（すなわち、マーカーに対応するポリペプチド以外のポリペプチド）に作動可能に連結した、本発明のマーカーに対応するポリペプチドの全部または一部（好ましくは、生物学的に活性な部分）を含む。融合タンパク質内で、「作動可能に連結された」という用語は、本発明のポリペプチドと、異種ポリペプチドとを、互いとインフレームで融合させていることを示すように意図する。異種ポリペプチドは、本発明のポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端と融合させることができる。
【０１９３】
１つの有用な融合タンパク質は、本発明のマーカーに対応するポリペプチドを、ＧＳＴ配列のカルボキシル末端と融合させた、ＧＳＴ融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、本発明の組換えポリペプチドの精製を容易としうる。
【０１９４】
別の実施形態では、融合タンパク質は、異種シグナル配列、免疫グロブリン融合タンパク質、毒素、または他の有用なタンパク質配列を含有する。本発明のキメラおよび融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ法により作製することができる。別の実施形態では、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成機を含む従来の技法により合成することができる。代替的に、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続的な遺伝子断片の間の相補的な突出をもたらすアンカープライマーを使用して実行することができ、その後、これを、アニールさせ、再増幅して、キメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照されたい）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をあらかじめコードする、多くの発現ベクターが、市販されている。本発明のポリペプチドをコードする核酸は、融合部分を、本発明のポリペプチドに、インフレームで連結するように、このような発現ベクターへとクローニングすることができる。
【０１９５】
シグナル配列を使用して、分泌されるタンパク質または目的の他のタンパク質の分泌および単離を容易とすることができる。シグナル配列は、１または複数の切断事象において、分泌中に成熟タンパク質から一般に切断される疎水性アミノ酸のコアを特徴とすることが典型的である。このようなシグナルペプチドは、それらが、分泌経路を通過するときに、シグナル配列の、成熟タンパク質からの切断を可能とするプロセシング部位を含有する。したがって、本発明は、シグナル配列を有する、記載されるポリペプチドのほか、シグナル配列が、タンパク質分解により切断されたポリペプチド（すなわち、切断産物）に関する。一実施形態では、シグナル配列をコードする核酸配列を、発現ベクター内で、通常分泌されないか、またはその他の点で、単離することが困難なタンパク質など、目的のタンパク質に作動可能に連結することができる。シグナル配列は、発現ベクターが形質転換される真核生物宿主などからのタンパク質の分泌を導き、シグナル配列は、その後、または共時的に、切断される。次いで、タンパク質は、細胞外培地から、当技術分野で認知された方法により、たやすく精製することができる。代替的に、ＧＳＴドメインを有するなど、精製を容易とする配列を使用して、シグナル配列を、目的のタンパク質に連結することができる。
【０１９６】
本発明はまた、本明細書で記載されるバイオマーカーポリペプチドの改変体にも関する。このような改変体は、アゴニスト（模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ））またはアンタゴニストとして機能しうる、変更されたアミノ酸配列を有する。改変体は、変異誘発、例えば、個別の点変異または切断により生成することができる。アゴニストは、タンパク質の天然に存在する形態と実質的に同じ生物学的活性、またはタンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを保持しうる。タンパク質のアンタゴニストは、例えば、目的のタンパク質を含む、細胞内シグナル伝達カスケードの下流または上流のメンバーに競合的に結合することにより、タンパク質の天然に存在する形態の活性のうちの１または複数を阻害しうる。したがって、限定された機能の改変体による処置により、特異的な生物学的効果を誘発することができる。タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する改変体による対象の処置は、タンパク質の天然に存在する形態による処置と比べて、対象における少ない副作用を有しうる。
【０１９７】
アゴニスト（模倣物）またはアンタゴニストのいずれかとして機能するバイオマーカータンパク質の改変体は、アゴニストまたはアンタゴニスト活性に関して、本発明のタンパク質の変異体、例えば、トランケーション変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。一実施形態では、改変体の多様化したライブラリーが、核酸レベルにおけるコンビナトリアル変異誘発によって生成され、これは、多様化された遺伝子ライブラリーによってコードされる。改変体の多様化されたライブラリーは、例えば、潜在的タンパク質配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、または、あるいは、より大きい融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイのための）発現できるように、遺伝子配列へと合成オリゴヌクレオチドの混合物を酵素によりライゲーションすることにより産生することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から本発明のポリペプチドの潜在的改変体のライブラリーを産生するために使用することができる、様々な方法が存在する。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、Narang、１９８３年、Tetrahedron  ３９巻：３頁；Itakuraら、１９８４年、Annu.  Rev.  Biochem.５３巻：３２３頁；Itakuraら、１９８４年、Science  １９８巻：１０５６頁；Ikeら、１９８３年、Nucleic  Acid  Res.１１巻：４７７頁を参照されたい）。
【０１９８】
加えて、本発明のマーカーに対応するポリペプチドのコード配列の断片のライブラリーを使用して、改変体のスクリーニングおよびその後の選択のための、ポリペプチドの多様化された集団を生成することができる。例えば、コード配列断片のライブラリーは、ニッキングが１分子当たり約１回のみ起こる条件下で、目的のコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処置し、二本鎖ＤＮＡを変性し、ＤＮＡを復元して、異なるニッキング産物から、センス／アンチセンス対を含むことができる二本鎖ＤＮＡを形成させ、Ｓ１ヌクレアーゼ処置により再形成された二重鎖から一本鎖部分を除去し、その結果得られる断片ライブラリーを発現ベクター中にライゲーションすることにより生成することができる。この方法により、目的のタンパク質のアミノ末端および様々なサイズの内部断片をコードする発現ライブラリーを得ることができる。
【０１９９】
点変異またはトランケーションによって作られたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、また、選択された特性を有する遺伝子産物に関してｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技法が、当技術分野で公知である。大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット解析に受け入れられる最も広く使用されている技法は典型的に、複製可能な発現ベクターに上記遺伝子ライブラリーをクローニングするステップと、その結果得られるベクターのライブラリーにより適切な細胞を形質転換するステップと、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易とする条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させるステップとを含む。上記ライブラリーにおける機能的変異体の頻度を増強する技法である再帰的アンサンブル変異誘発（recursive  ensemble  mutagenesis）（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、本発明のタンパク質の改変体を同定することができる（ArkinおよびYourvan、１９９２年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８９巻：７８１１〜７８１５頁；Delgraveら、１９９３年、Protein  Engineering  ６巻（３号）：３２７〜３３１頁）。
【０２００】
本明細書に記載されているバイオマーカー核酸および／またはバイオマーカーポリペプチド分子の産生および使用は、標準組換え技法を使用することにより容易とすることができる。一部の実施形態では、このような技法は、バイオマーカーポリペプチドまたはこのようなポリペプチドの部分をコードする核酸を含有するベクター、好ましくは、発現ベクターを使用する。本明細書で使用される通り、「ベクター」という用語は、それが連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの一つのタイプは、その中にさらなるＤＮＡセグメントをライゲーションすることができる、環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、この場合、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中にライゲーションすることができる。ある特定のベクターは、それが導入された宿主細胞における自律的複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入後に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、これにより、該宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクター、すなわち発現ベクターは、それに作動可能に連結された遺伝子の発現を方向付けることができる。一般に、組換えＤＮＡ技法において有用性がある発現ベクターは、多くの場合、プラスミド（ベクター）の形態である。しかし、本発明は、均等な機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）など、発現ベクターのこのような他の形態を含むことが意図される。
【０２０１】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含む。これは、上記組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結された、発現に使用されるべき宿主細胞に基づいて選択される１種または複数種の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」は、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で、調節配列（複数可）に連結されている（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、または上記ベクターが宿主細胞に導入される場合は該宿主細胞において）ことを意味することが意図される。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Goeddel、Methods  in  Enzymology:  Gene  Expression  Technology  １８５巻、Academic  Press、San  Diego,  CA（１９９１年）に記載されている。調節配列は、多くの型の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を方向付ける調節配列、およびある特定の宿主細胞のみにおけるヌクレオチド配列の発現を方向付ける調節配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。当業者であれば、上記発現ベクターのデザインが、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現のレベルなどの因子に依存しうることが理解される。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して、これにより、本明細書に記載されている核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを産生することができる。
【０２０２】
本発明における使用のための組換え発現ベクターは、原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核細胞（例えば、昆虫細胞｛バキュロウイルス発現ベクターを使用｝、酵母細胞または哺乳動物細胞）における本発明のマーカーに対応するポリペプチドの発現のためにデザインすることができる。適切な宿主細胞は、Goeddel、前出においてさらに考察されている。あるいは、上記組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写および翻訳されてよい。
【０２０３】
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を方向付ける構成的または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉにおいて実行される。融合ベクターは、その中にコードされるタンパク質に、通常、上記組換えタンパク質のアミノ末端に、いくつかのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは典型的に、３つの目的を果たす：１）組換えタンパク質の発現を増加させること；２）該組換えタンパク質の溶解度を増加させること；および３）アフィニティー精製におけるリガンドとして作用することにより、該組換えタンパク質の精製に役立つこと。多くの場合、融合発現ベクターにおいて、タンパク分解性切断部位が、該融合部分および該組換えタンパク質の結合部に導入されて、融合タンパク質の精製の後での、融合部分からの組換えタンパク質の分離を可能にする。このような酵素およびその同族認識配列は、第Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合する、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；SmithおよびJohnson、１９８８年、Gene  ６７巻：３１〜４０頁）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を含む。
【０２０４】
適切な誘導性非融合Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Amannら、１９８８年、Gene  ６９巻：３０１〜３１５頁）およびｐＥＴ  １１ｄ（Studierら、６０〜８９頁、Gene  Expression  Technology:    Methods  in  Enzymology  １８５巻、Academic  Press、San  Diego,  CA、１９９１年）を含む。上記ｐＴｒｃベクターからの標的バイオマーカー核酸発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依拠する。上記ｐＥＴ  １１ｄベクターからの標的バイオマーカー核酸発現は、共発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎ１）によって媒介されるＴ７  ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依拠する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ  ５プロモーターの転写制御下で、Ｔ７  ｇｎ１遺伝子を有する常在性プロファージから、宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。
【０２０５】
Ｅ．ｃｏｌｉにおける組換えタンパク質発現を最大化するための一戦略は、組換えタンパク質をタンパク分解性切断する能力が損なわれた宿主細菌において該タンパク質を発現させることである（Gottesman、１１９〜１２８頁、Gene  Expression  Technology:  Methods  in  Enzymology  １８５巻、Academic  Press、San  Diego,  CA、１９９０年）。別の戦略は、アミノ酸毎の個々のコドンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優先的に活用されるコドンになるように、発現ベクターに挿入されるべき核酸の核酸配列を変更することである（Wadaら、１９９２年、Nucleic  Acids  Res.２０巻：２１１１〜２１１８頁）。本発明の核酸配列のこのような変更は、標準ＤＮＡ合成技法によって実行することができる。
【０２０６】
別の実施形態では、上記発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldariら、１９８７年、EMBO  J.６巻：２２９〜２３４頁）、ｐＭＦａ（KurjanおよびHerskowitz、１９８２年、Cell  ３０巻：９３３〜９４３頁）、ｐＪＲＹ８８（Schultzら、１９８７年、Gene  ５４巻：１１３〜１２３頁）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびｐＰｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含む。
【０２０７】
あるいは、上記発現ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞（例えば、Ｓｆ  ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用できるバキュロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Smithら、１９８３年、Mol.  Cell  Biol.３巻：２１５６〜２１６５頁）およびｐＶＬシリーズ（LucklowおよびSummers、１９８９年、Virology  １７０巻：３１〜３９頁）を含む。
【０２０８】
さらに別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８（Seed、１９８７年、Nature  ３２９巻：８４０頁）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufmanら、１９８７年、EMBO  J.６巻：１８７〜１９５頁）を含む。哺乳動物細胞において使用される場合、上記発現ベクターの制御機能は多くの場合、ウイルス調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０に由来する。原核細胞および真核細胞の両方のための他の適切な発現系については、Sambrookら、前出の第１６章および第１７章を参照されたい。
【０２０９】
別の実施形態では、上記組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を方向付けることができる（例えば、組織特異的調節エレメントが、該核酸の発現に使用される）。組織特異的調節エレメントは、当技術分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例は、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkertら、１９８７年、Genes  Dev.１巻：２６８〜２７７頁）、リンパ系特異的プロモーター（CalameおよびEaton、１９８８年、Adv.  Immunol.４３巻：２３５〜２７５頁）、特に、Ｔ細胞受容体（WinotoおよびBaltimore、１９８９年、EMBO  J.８巻：７２９〜７３３頁）および免疫グロブリン（Banerjiら、１９８３年、Cell  ３３巻：７２９〜７４０頁；QueenおよびBaltimore、１９８３年、Cell  ３３巻：７４１〜７４８頁）のプロモーター、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；ByrneおよびRuddle、１９８９年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８６巻：５４７３〜５４７７頁）、膵臓特異的プロモーター（Edlundら、１９８５年、Science  ２３０巻：９１２〜９１６頁）、ならびに乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）を含む。発生的に調節されたプロモーターも包含され、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（KesselおよびGruss、１９９０年、Science  ２４９巻：３７４〜３７９頁）およびα−フェトプロテインプロモーター（CamperおよびTilghman、１９８９年、Genes  Dev.３巻：５３７〜５４６頁）である。
【０２１０】
本発明は、さらに、アンチセンス配向性で組換え発現ベクター中にクローニングされたＤＮＡ分子を含む該発現ベクターを提供する。すなわち、上記ＤＮＡ分子は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（該ＤＮＡ分子の転写による）を可能にする様式で、調節配列に作動可能に連結されている。様々な細胞型におけるアンチセンスＲＮＡ分子の持続的発現を方向付ける、上記アンチセンス配向性でクローニングされた核酸に作動可能に連結された調節配列、例えばウイルスプロモーターおよび／またはエンハンサーを選択することができ、またはアンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的もしくは細胞型特異的発現を方向付ける調節配列を選択することができる。アンチセンス発現ベクターは、組換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であってもよく、この場合、高効率調節領域の制御下でアンチセンス核酸が産生され、その活性は、該ベクターが導入された細胞型によって決定することができる。アンチセンス遺伝子を使用した遺伝子発現の調節の考察については、（Weintraubら、１９８６年、Trends  in  Genetics、１巻（１号））を参照されたい。
【０２１１】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターを導入した宿主細胞に関する。本明細書では、「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」という用語を、互換的に使用する。このような用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。続く世代には、変異または環境的影響に起因して、ある特定の修飾が生じうるため、このような子孫は、実のところ、親細胞と同一でない場合もあるが、本明細書で使用される用語の範囲内に依然として含まれる。
【０２１２】
宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核細胞（例えば、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞）でありうる。
【０２１３】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション法を介して、原核細胞または真核細胞に導入することができる。本明細書で使用される場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、外来核酸を、宿主細胞に導入するための、当技術分野で認知された様々な技法であって、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔を含む技法を指すことを意図する。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに適する方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）、および他の実験室マニュアルにおいて見出すことができる。
【０２１４】
哺乳動物細胞の安定的なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション法に応じて、ほんのわずかな割合の細胞だけが、外来ＤＮＡを、それらのゲノムに組み込みうることが公知である。これらの組込み体を同定および選択するために、選択可能マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性についての）をコードする遺伝子を、一般に、目的の遺伝子と共に、宿主細胞に導入する。好ましい選択可能マーカーは、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する選択可能マーカーを含む。導入される核酸を、安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬物による選択（例えば、選択可能マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は存続する一方、他の細胞は死滅する）により同定することができる。
【０２１５】
Ｖ．バイオマーカー核酸およびポリペプチドの解析
バイオマーカー核酸および／またはバイオマーカーポリペプチドは、本明細書に記載されている方法および当業者に公知の技法に従って解析して、１）バイオマーカー転写物またはポリペプチドのレベルの変更、２）バイオマーカー遺伝子からの１個または複数のヌクレオチドの欠失または付加、４）バイオマーカー遺伝子の１個または複数のヌクレオチドの置換、５）発現調節領域など、バイオマーカー遺伝子の異常修飾などを含むがこれらに限定されない、本発明に有用なこのような遺伝的変更または発現変更を同定することができる。
【０２１６】
ａ．コピー数および／またはゲノム核酸変異の検出のための方法
当業者には、バイオマーカー核酸のコピー数および／またはゲノム核酸の状態（例えば、変異）を評価する方法が周知である。染色体の増加または減少の存在または非存在は、本明細書で同定される領域またはマーカーのコピー数の決定により、簡単に評価することができる。
【０２１７】
一実施形態では、生体試料を、ゲノムマーカーを含有するゲノム遺伝子座のコピー数の変化の存在について調べる。一部の実施形態では、表１に列挙されている少なくとも１種のバイオマーカーのコピー数減少（dereased）は、ＵＳＰ１０阻害剤療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）のより良好なアウトカムを予測する。表１に列挙されている少なくとも１種のバイオマーカーの少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０個のコピー数は、ＵＳＰ１０阻害剤療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）に対する応答性の可能性があることを予測する。
【０２１８】
バイオマーカー遺伝子座のコピー数を評価する方法は、ハイブリダイゼーションベースのアッセイを含むがこれに限定されない。ハイブリダイゼーションベースのアッセイは、サザンブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＦＩＳＨおよびＳＫＹを加えたＦＩＳＨ）法など、従来の「直接プローブ」法、および比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、例えば、ｃＤＮＡベースまたはオリゴヌクレオチドベースのＣＧＨなど、「比較プローブ」法を含むがこれらに限定されない。方法は、基材（例えば、膜またはガラス）結合法またはアレイベースの手法を含むがこれらに限定されない、多種多様なフォーマットで使用することができる。
【０２１９】
一実施形態では、試料中のバイオマーカー遺伝子のコピー数の評価は、サザンブロットを伴う。サザンブロットでは、ゲノムＤＮＡ（断片化され、電気泳動ゲル上で分離されることが典型的である）を、標的領域に特異的なプローブとハイブリダイズさせる。標的領域についてのプローブに由来するハイブリダイゼーションシグナルの強度の、正常ゲノムＤＮＡ（例えば、同じまたは類縁の細胞、組織、臓器などのうちの、増幅されない部分）の解析に由来する対照プローブシグナルとの比較は、標的核酸の相対的なコピー数についての推定値をもたらす。代替的に、ノーザンブロットを、試料中のコード核酸のコピー数を評価するために活用することができる。ノーザンブロットでは、ｍＲＮＡを、標的領域に特異的なプローブとハイブリダイズさせる。標的領域についてのプローブに由来するハイブリダイゼーションシグナルの強度の、正常ＲＮＡ（例えば、同じまたは類縁の細胞、組織、臓器などのうちの、増幅されない部分）の解析に由来する対照プローブシグナルとの比較は、標的核酸の相対的なコピー数についての推定値をもたらす。代替的に、適切な対照と比べて高いまたは低い発現（例えば、同じまたは類縁の細胞、組織、臓器などのうちの、増幅されない部分）により、標的核酸の相対的なコピー数についての推定値がもたらされるように、当技術分野で周知の、ＲＮＡを検出する他の方法を使用することができる。
【０２２０】
ゲノムコピー数を決定するための代替的手段は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、Ａｎｇｅｒｅｒ（１９８７年）、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５２巻：６４９頁）である。一般に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、以下のステップ：（１）解析される組織または生物学的構造の固定；（２）標的ＤＮＡのアクセス可能性を増大させ、非特異的結合を低減する、生物学的構造のプレハイブリダイゼーション処理；（３）核酸混合物の、生物学的構造または組織内の核酸とのハイブリダイゼーション；（４）ハイブリダイゼーションにおいて結合しなかった核酸断片を除去するハイブリダイゼーション後の洗浄；および（５）ハイブリダイズさせた核酸断片の検出を含む。これらのステップの各々において使用される試薬と、使用のための条件は、特定の適用に応じて変動する。典型的なｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞を、固体支持体、典型的には、スライドガラスに固定する。核酸をプロービングする場合、細胞は、熱またはアルカリにより変性させることが典型的である。次いで、細胞を、ハイブリダイゼーション溶液と、タンパク質をコードする核酸配列に特異的な標識プローブのアニーリングを許容する、中程度の温度で接触させる。次いで、適切なシグナル対ノイズ比が得られるまで、標的（例えば、細胞）を、所定のストリンジェンシーで、またはストリンジェンシーを増大させて洗浄することが典型的である。プローブは、例えば、放射性同位元素または蛍光レポーターで標識することが典型的である。一実施形態では、プローブは、ストリンジェントな条件下で標的核酸と特異的にハイブリダイズするように、十分に長い。プローブは一般に、約２００塩基〜約１０００塩基の長さの範囲である。一部の適用では、反復配列のハイブリダイゼーション能を遮断することが必要である。したがって、一部の実施形態では、ｔＲＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡ、またはＣｏｔ−Ｉ  ＤＮＡを使用して、非特異的なハイブリダイゼーションを遮断する。
【０２２１】
ゲノムコピー数を決定するための代替的手段は、比較ゲノムハイブリダイゼーションである。一般に、ゲノムＤＮＡを、正常基準細胞のほか、被験細胞（例えば、腫瘍細胞）からも単離し、必要な場合は、増幅する。２つの核酸を、差次的に標識し、次いで、ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて、基準細胞の中期染色体とハイブリダイズさせる。基準ＤＮＡおよび被験ＤＮＡの両方における反復配列を除去するか、またはそれらのハイブリダイゼーション能を、いくつかの手段により、例えば、適切な遮断核酸によるプレハイブリダイゼーションおよび／または前記ハイブリダイゼーション中における前記反復配列に対するこのような遮断核酸配列を含むことにより低減する。次いで、必要な場合、結合させ、標識されたＤＮＡ配列を、視覚化可能な形態とする。コピー数が増加または減少している、被験細胞内の染色体領域は、２つのＤＮＡに由来するシグナルの比が変更された領域を検出することにより同定することができる。例えば、被験細胞内のコピー数を減少させた領域は、ゲノムの他の領域と比較して、基準より比較的低い、被験ＤＮＡに由来するシグナルを示すであろう。被験細胞内のコピー数を増加させた領域は、被験ＤＮＡに由来する、比較的高いシグナルを示すであろう。染色体の欠失または増倍が存在する場合は、２つの標識に由
来するシグナルの比の差異が検出され、比は、コピー数の尺度をもたらすであろう。ＣＧＨの別の実施形態である、アレイＣＧＨ（ａＣＧＨ）では、固定化された染色体エレメントを、アレイ上の固体支持体に結合させた標的核酸のコレクションで置きかえ、ゲノムの大部分または全体を、固体支持体に結合させた標的のコレクションにより表すことを可能とする。標的核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、オリゴヌクレオチド（例えば、一塩基多型を検出する）などを含みうる。アレイベースのＣＧＨはまた、単色の標識化（対照試料と、可能な腫瘍試料とを、２つの異なる色素で標識化し、それらをハイブリダイゼーションの前に混合し、ハイブリダイゼーションにより、アレイ上のプローブの競合的ハイブリダイゼーションに起因する比をもたらすことと対照的に）により実施することもできる。単色ＣＧＨでは、対照を、標識し、１つのアレイとハイブリダイズさせ、絶対シグナルを読み取り、可能な腫瘍試料を、標識し、第２のアレイ（同一な内容物を伴う）とハイブリダイズさせ、絶対シグナルを読み取る。コピー数の差異は、２つのアレイに由来する絶対シグナルに基づき計算する。当技術分野では、固定化された染色体またはアレイを調製し、比較ゲノムハイブリダイゼーションを実行する方法が周知である（例えば、米国特許第６，３３５，１６７号；同第６，１９７，５０１号；同第５，８３０，６４５号；および同第５，６６５，５４９号；ならびにＡｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４年）、ＥＭＢＯ  Ｊ．、３巻：１２２７〜１２３４頁；Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８５巻：９１３８〜９１４２頁；欧州特許公開第４３０，４０２号；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３３巻、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｃｈｏｏ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ．Ｊ．（１９９４年）などを参照されたい）。別の実施形態では、Ｐｉｎｋｅｌら（１９９８年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２０巻：２０７〜２１１頁、またはＫａｌｌｉｏｎｉｅｍｉ（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９巻：５３２１〜５３２５頁（１９９２年）のハイブリダイゼーションプロトコールを使用する。
【０２２２】
さらに別の実施形態では、増幅ベースのアッセイを使用して、コピー数を測定することができる。このような増幅ベースのアッセイでは、核酸配列は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））内の鋳型として作用する。定量的増幅では、増幅産物の量は、元の試料中の鋳型の量と比例するであろう。適切な対照、例えば、健常な組織との比較は、コピー数の尺度をもたらす。
【０２２３】
当業者には、「定量的」増幅法が周知である。例えば、定量的ＰＣＲは、同じプライマーを使用して、既知の量の対照配列を、同時に共増幅することを伴う。これは、ＰＣＲ反応を較正するのに使用しうる、内部標準をもたらす。定量的ＰＣＲのための詳細なプロトコールは、Ｉｎｎｉｓら（１９９０年）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）において提示されている。定量的ＰＣＲ解析を使用する、マイクロサテライト遺伝子座におけるＤＮＡコピー数の測定は、Ｇｉｎｚｏｎｇｅｒら（２０００年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６０巻：５４０５〜５４０９頁において記載されている。遺伝子についての既知の核酸配列は、当業者が、遺伝子の任意の部分を増幅するプライマーを日常的に選択することを可能とするのに十分である。本発明の方法ではまた、蛍光発生定量的ＰＣＲも使用することができる。蛍光発生定量的ＰＣＲでは、定量は、蛍光シグナル、例えば、ＴａｑＭａｎおよびＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎの量に基づく。
【０２２４】
他の適切な増幅法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ（１９８９年）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４巻：５６０頁、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：１０７７頁；ならびにＢａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０年）、Ｇｅｎｅ、８９巻：１１７頁を参照されたい）、転写増幅（Ｋｗｏｈら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８６巻：１１７３頁）、自己持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８７巻：１８７４頁）、ドットＰＣＲ、およびリンカーアダプターＰＣＲなどを含むがこれらに限定されない。
【０２２５】
ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）およびＭＣＰ（ｍａｊｏｒ  ｃｏｐｙ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）によるマッピング（Ｗａｎｇ，  Ｚ．Ｃ．ら（２００４年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６４巻（１号）：６４〜７１頁；Ｓｅｙｍｏｕｒ，  Ａ．  Ｂ．ら（１９９４年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５４巻、２７６１〜４頁；Ｈａｈｎ，  Ｓ．  Ａ．ら（１９９５年）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５５巻、４６７０〜５頁；Ｋｉｍｕｒａ，  Ｍ．ら（１９９６年）、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ、１７巻、８８〜９３頁；Ｌｉら、（２００８年）、ＭＢＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．、９巻、２０４〜２１９頁）もまた、増幅または欠失の領域を同定するのに使用することができる。
【０２２６】
ｂ．バイオマーカー核酸の発現を検出するための方法
バイオマーカーの発現は、転写された分子またはタンパク質の発現を検出するための、多種多様な周知の方法のうちのいずれかにより評価することができる。このような方法の非限定的な例は、分泌タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞質タンパク質、または核タンパク質を検出するための免疫学的方法、タンパク質の精製法、タンパク質機能または活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法、および核酸増幅法を含む。
【０２２７】
好ましい実施形態では、特定の遺伝子の活性は、遺伝子転写物（例えば、ｍＲＮＡ）の尺度、翻訳されるタンパク質の量の尺度、または遺伝子産物の活性の尺度により特徴付けられる。バイオマーカーの発現は、それらのいずれもが標準的な技法を使用して測定されうる、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、またはタンパク質活性を検出することを含む、様々な方式でモニタリングすることができる。検出は、遺伝子発現（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、または酵素活性）のレベルの定量を伴う場合もあり、代替的に、特に対照レベルと比較した遺伝子発現のレベルについての定性的評価である場合もある。検出されるレベルの種類は、文脈から明らかであろう。
【０２２８】
別の実施形態では、バイオマーカーおよび機能的に類似するそのホモログであって、その断片または遺伝子の変更（例えば、その調節性またはプロモーター領域内の）を含むホモログの発現レベルの検出または決定は、目的のマーカーについてのＲＮＡレベルの検出または決定を含む。一実施形態では、被験対象に由来する１または複数の細胞を得、ＲＮＡを、細胞から単離する。好ましい実施形態では、乳腺組織（ｂｒｅａｓｔ  ｔｉｓｓｕｅ）細胞の試料を、対象から得る。
【０２２９】
一実施形態では、ＲＮＡを、単一の細胞から得る。例えば、細胞は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）により、組織試料から単離することができる。この技法を使用して、細胞を、染色された組織切片を含む組織切片から単離し、これにより、所望の細胞が単離されたことを確認することができる（例えば、Ｂｏｎｎｅｒら（１９９７年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８巻：１４８１頁；Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋら（１９９６年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４巻：９９８頁；Ｆｅｎｄら（１９９９年）、Ａｍ．  Ｊ．  Ｐａｔｈ．、１５４巻：６１頁；およびＭｕｒａｋａｍｉら（２０００年）、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、５８巻：１３４６頁を参照されたい）。例えば、Ｍｕｒａｋａｍｉら、前出は、細胞の、以前に免疫染色された組織切片からの単離について記載している。
【０２３０】
また、ＲＮＡを抽出しうるより大きな細胞集団を得るように、細胞を対象から得、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養することも可能である。当技術分野では、非形質転換細胞の培養物、すなわち、初代細胞培養物を確立するための方法が公知である。
【０２３１】
ＲＮＡを、個体に由来する組織試料または細胞から単離する場合、組織または細胞を、対象から取り出した後における、遺伝子発現の、任意のさらなる変化を防止することが重要でありうる。発現レベルの変化は、摂動後、例えば、熱ショック後、またはリポ多糖（ＬＰＳ）もしくは他の試薬による活性化後において、急速に変化することが公知である。加えて、組織および細胞内のＲＮＡは、迅速に分解されうる。したがって、好ましい実施形態では、対象から得られる組織または細胞を、可能な限り速やかに、瞬時凍結させる。
【０２３２】
ＲＮＡは、様々な方法、例えば、チオシアン酸グアニジウム溶解と、それに続く、ＣｓＣｌ遠心分離により、組織試料から抽出することができる（Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８巻：５２９４〜５２９９頁）。単一細胞に由来するＲＮＡは、Ｄｕｌａｃ，  Ｃ．  （１９９８年）、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．、３６巻、２４５頁；およびＪｅｎａら（１９９６年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９０巻：１９９頁において記載されている方法など、単一の細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーを調製するための方法において記載されている通りに得ることができる。例えば、ＲＮＡｓｉｎの包含により、ＲＮＡの分解を回避するように、注意を払わなければならない。
【０２３３】
次いで、ＲＮＡ試料を、特定の分子種において濃縮することができる。一実施形態では、ポリ（Ａ）＋  ＲＮＡを、ＲＮＡ試料から単離する。一般に、このような精製は、ｍＲＮＡ上のポリＡテールを利用する。特に、かつ、上記で言及した通り、ポリＴオリゴヌクレオチドを、固体支持体上に固定化して、ｍＲＮＡに対するアフィニティーリガンドとして用いることができる。これを目的とするキット、例えば、ＭｅｓｓａｇｅＭａｋｅｒキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が市販されている。
【０２３４】
好ましい実施形態では、マーカー配列内のＲＮＡ集団を、濃縮する。濃縮は、例えば、プライマー特異的ｃＤＮＡ合成、またはｃＤＮＡ合成に基づく、複数ラウンドの線形増幅、および鋳型指向的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（例えば、Ｗａｎｇら（１９８９年）、ＰＮＡＳ、８６巻、９７１７頁；Ｄｕｌａｃら、前出；およびＪｅｎａら、前出を参照されたい）により着手することができる。
【０２３５】
ＲＮＡの集団は、特定の分子種または配列が濃縮されている場合であれ、そうでない場合であれ、さらに増幅することができる。本明細書で規定される場合、「増幅工程」は、ＲＮＡ中の分子を強化するか、増加させるか、または増進するようにデザインされる。例えば、ＲＮＡが、ｍＲＮＡである場合、シグナルが検出可能であるか、または検出が増強されるように、ＲＴ−ＰＣＲなどの増幅工程を活用して、ｍＲＮＡを増幅することができる。このような増幅工程は、特に、生体、組織、または腫瘍試料のサイズまたは体積が小さい場合に有益である。
【０２３６】
多様な増幅法および検出法を使用することができる。例えば、ｍＲＮＡを、ｃＤＮＡへと逆転写するのに続いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を施すこと；または、米国特許第５，３２２，７７０号において記載されている通り、両方のステップのために単一の酵素を使用すること；または、Ｒ．  Ｌ．  Ｍａｒｓｈａｌｌら、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、４巻：８０〜８４頁（１９９４年）により記載されている通り、ｍＲＮＡを、ｃＤＮＡへと逆転写するのに続いて、シンメトリックギャップリガーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）を施すことは、本発明の範囲内にある。また、リアルタイムＰＣＲも、使用することができる。
【０２３７】
本明細書で活用されうる、他の公知の増幅法は、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８７巻：１８７４〜１８７８頁（１９９０年）において記載されており、また、Ｎａｔｕｒｅ、３５０巻（６３１３号）：９１〜９２頁（１９９１年）においても記載されている、いわゆる「ＮＡＳＢＡ」または「３ＳＲ」法；欧州特許出願（ＥＰＡ）公開第４５４４６１０号において記載されているＱベータ増幅；鎖置換増幅（Ｇ．  Ｔ．  Ｗａｌｋｅｒら、Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．、４２巻：９〜１３頁（１９９６年）；および欧州特許出願第６８４３１５号において記載されている）；ＰＣＴ公開ＷＯ９３２２４６１号により記載されている標的媒介型増幅；ＰＣＲ；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４巻、５６０頁（１９８９年）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻、１０７７頁（１９８８年）を参照されたい）；自己持続配列複製（ＳＳＲ）（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８７巻、１８７４頁（１９９０年）を参照されたい）；および転写増幅（例えば、Ｋｗｏｈら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８６巻、１１７３頁（１９８９年）を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。
【０２３８】
現況技術では、遺伝子発現の絶対および相対レベルを決定するための多くの技法が公知であり、本発明における使用に適する一般に使用される技法は、ノーザン解析、ＲＮアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）、マイクロアレイ、ならびに定量的ＰＣＲおよびディファレンシャルディスプレイＰＣＲなど、ＰＣＲベースの技法を含む。例えば、ノーザンブロット法は、ＲＮＡの調製物を、変性アガロースゲル上で泳動させ、これを、活性化セルロース、ニトロセルロース、またはガラス、またはナイロン膜など、適切な支持体に転写するステップを伴う。次いで、放射性標識されたｃＤＮＡまたはＲＮＡを、調製物とハイブリダイズさせ、洗浄し、オートラジオグラフィーにより解析する。
【０２３９】
放射性標識されたアンチセンスＲＮＡプローブを、生検試料の薄い切片とハイブリダイズさせ、洗浄し、ＲＮアーゼにより切断し、オートラジオグラフィーのために、感光性エマルジョンに曝露する、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる可視化もまた利用することができる。試料を、ヘマトキシリンで染色して、試料の組織学的組成を裏付けることができ、適切な光フィルターによる暗視野イメージングは、現像されたエマルジョンを示す。ジゴキシゲニンなどの非放射性標識もまた、使用することができる。
【０２４０】
代替的に、ｍＲＮＡの発現は、ＤＮＡアレイ、チップ、またはマイクロアレイ上で検出することができる。対象から得られた被験試料の、標識された核酸を、バイオマーカーＤＮＡを含む固体表面とハイブリダイズさせることができる。バイオマーカー転写物を含有する試料については、陽性ハイブリダイゼーションシグナルが得られる。当技術分野では、ＤＮＡアレイを調製する方法およびそれらの使用が周知である（例えば、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第６，６１８，６７９６号；同第６，３７９，８９７号；同第６，６６４，３７７号；同第６，４５１，５３６号；同第５４８，２５７号；Ｕ．Ｓ．２００３０１５７４８５；ならびにＳｃｈｅｎａら（１９９５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０巻、４６７〜４７０頁；Ｇｅｒｈｏｌｄら（１９９９年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．、２４巻、１６８〜１７３頁；およびＬｅｎｎｏｎら（２０００年）、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ、５巻、５９〜６５頁を参照されたい）。ＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）もまた、実施することができる（例えば、米国特許出願第２００３０２１５８５８号を参照されたい）。
【０２４１】
ｍＲＮＡレベルをモニタリングするために、例えば、ｍＲＮＡを、被験生体試料から抽出し、逆転写させ、蛍光標識されたｃＤＮＡプローブを生成する。次いで、マーカーｃＤＮＡとハイブリダイズすることが可能なマイクロアレイを、標識されたｃＤＮＡプローブでプロービングし、スライドを走査し、蛍光強度を測定する。この強度は、ハイブリダイゼーション強度および発現レベルと相関する。
【０２４２】
本明細書で記載される方法において使用されうるプローブの種類は、ｃＤＮＡ、リボプローブ、合成オリゴヌクレオチド、およびゲノムプローブを含む。使用されるプローブの種類は一般に、例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのためのリボプローブ、およびノーザンブロット法のためのｃＤＮＡなど、特定の状況により指示されるであろう。一実施形態では、プローブを、ＲＮＡに固有なヌクレオチド領域へと方向付ける。プローブは、マーカーｍＲＮＡ転写物を差次的に認識するのに必要となる程度に短くすることが可能であり、例えば、１５塩基程度に短くすることも可能であるが、少なくとも１７、１８、１９または２０またはそれ超の塩基のプローブを使用することができる。一実施形態では、プライマーおよびプローブは、ストリンジェントな条件下で、マーカーに対応するヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片と特異的にハイブリダイズする。本明細書で使用される場合、「ストリンジェントな条件」という用語は、ヌクレオチド配列内に少なくとも９５％の同一性が見られる場合に限り、ハイブリダイゼーションが生じることを意味する。別の実施形態では、「ストリンジェントな条件」下におけるハイブリダイゼーションは、配列間で、少なくとも９７％の同一性が見られる場合に生じる。
【０２４３】
プローブを標識化する形態は、放射性同位元素、例えば、３２Ｐおよび３５Ｓの使用など、適切な任意の形態でありうる。放射性同位元素による標識化は、プローブが化学合成されるのであれ、生体により合成されるのであれ、適切に標識された塩基の使用により達成することができる。
【０２４４】
一実施形態では、生体試料は、被験対象に由来するポリペプチド分子を含有する。代替的に、生体試料は、被験対象に由来するｍＲＮＡ分子または被験対象に由来するゲノムＤＮＡ分子を含有しうる。
【０２４５】
別の実施形態では、方法は、対照生体試料を、対照対象から得るステップと、マーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらの断片の存在が、生体試料中に検出されるように、対照試料を、マーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらの断片を検出することが可能な化合物または薬剤と接触させるステップと、対照試料中の、マーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらの断片の存在を、被験試料中の、マーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらの断片の存在と比較するステップとをさらに伴う。
【０２４６】
ｃ．バイオマーカータンパク質の発現を検出するための方法
バイオマーカータンパク質の活性またはレベルは、発現したポリペプチドを検出または定量することにより、検出および／または定量することができる。ポリペプチドは、当業者に周知の多数の手段のうちのいずれかにより、検出および定量することができる。バイオマーカー核酸および機能的に類似するそのホモログであって、その断片または遺伝子の変更（例えば、その調節性またはプロモーター領域内の）を含むホモログによりコードされるポリペプチドのポリペプチド発現の異常なレベルは、がんの、抗がん療法（例えば、ＵＳＰ１０阻害剤療法）に対する応答の可能性と関連する。ポリペプチドを検出するための、当技術分野で公知の任意の方法を使用することができる。このような方法は、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロット法、結合剤−リガンドアッセイ、免疫組織化学法、凝集反応、補体アッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ハイパーディフュージョンクロマトグラフィー（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）など（例えば、参照により組み込まれる、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＳｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ編、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎ．、２１７〜２６２頁、１９９１年）を含むがこれらに限定されない。抗体を、１または複数のエピトープと反応させるステップと、標識されたポリペプチドまたはその誘導体を、競合的に置換するステップとを含む、結合剤−リガンド免疫アッセイ法が好ましい。
【０２４７】
例えば、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡ手順は、所望のバイオマーカータンパク質の標準物質を標識し（１２５Ｉもしくは３５Ｓなどの放射性同位元素、または西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどのアッセイ可能な酵素により）、非標識の試料と併せて、対応する抗体と接触させ、このとき、第１の抗体に結合するように、第２の抗体を使用し、放射能または固定化された酵素をアッセイするように行う（競合アッセイ）。代替的に、試料中のバイオマーカータンパク質を、対応する固定化された抗体と反応させ、放射性同位元素または酵素で標識された、抗バイオマーカータンパク質抗体を、系と反応させ、放射能または酵素をアッセイする（ＥＬＩＳＡサンドイッチアッセイ）。適切な場合、他の従来の方法もまた、利用することができる。
【０２４８】
上記の技法は本質的に、「１ステップ」または「２ステップ」アッセイとして行うことができる。「１ステップ」アッセイは、抗原を、固定化された抗体と接触させ、洗浄を伴わずに、混合物を、標識された抗体と接触させるステップを伴う。「２ステップ」アッセイは、混合物を、標識された抗体と接触させる前に、洗浄を伴う。適切な場合、他の従来の方法もまた、利用することができる。
【０２４９】
一実施形態では、バイオマーカーのタンパク質レベルを測定するための方法は、生物学的検体を、バイオマーカータンパク質に選択的に結合する、抗体またはその改変体（例えば、断片）と接触させるステップと、前記抗体またはその改変体が、前記試料に結合するかどうかを検出するステップと、これにより、バイオマーカータンパク質のレベルを測定するステップとを含む。
【０２５０】
バイオマーカータンパク質および／または抗体の酵素標識および放射性標識は、従来の手段により行うことができる。このような手段は一般に、とりわけ、酵素の活性に有害な影響を及ぼさないように、酵素の、問題の抗原または抗体への、グルタルアルデヒドなどによる共有結合的連結を含むであろうが、これは、全ての酵素が活性であることは必要でないが、アッセイを行うことを可能とするのに十分な活性が残存するという条件で、酵素が、なおも、その基質と相互作用することが可能であることを意図する。実際、酵素を結合させるための一部の技法は、非特異的（ホルムアルデヒドを使用するなど）であり、ある比率の活性酵素をもたらすに過ぎない。
【０２５１】
通例、アッセイ系の１つの構成要素を、支持体上に固定化し、これにより、系の他の構成要素を、この構成要素と接触させ、煩瑣で時間のかかる作業を伴わずに、たやすく除去することを可能とすることが所望される。第１の相と離れて、第２の相を固定化することも可能であるが、通例は、１つの相で十分である。
【０２５２】
酵素自体を支持体上に固定化することが可能であるが、固相の酵素が必要である場合、これは一般に、抗体に結合させ、抗体を支持体に取り付けることにより、最も良く達成され、そのモデルおよび系は、当技術分野で周知である。単純なポリエチレンは、適切な支持体を提供することができる。
【０２５３】
標識化のために利用可能な酵素は、特に限定されないが、例えば、オキシダーゼ群のメンバーから選択することができる。これらは、それらの基質との反応により、過酸化水素の生成を触媒するが、その良好な安定性、入手の容易さ、および安価であることのほか、その基質（グルコース）の入手のたやすさのためにも、グルコースオキシダーゼを使用することが多い。オキシダーゼの活性は、当技術分野で周知の制御条件下における、酵素標識された抗体の、基質との反応の後において形成される、過酸化水素の濃度を測定することによりアッセイすることができる。
【０２５４】
本開示に基づき、バイオマーカータンパク質を検出するのに、実施者の好みに従い、他の技法を使用することができる。１つのこのような技法は、適切に処置した試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させてから、ニトロセルロースフィルターなどの固体支持体に転写する、ウェスタンブロット法（Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、７６巻：４３５０頁（１９７９年））である。次いで、抗バイオマーカータンパク質抗体（非標識）を、支持体と接触させ、標識されたプロテインＡまたは抗免疫グロブリン（１２５Ｉ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼを含む、適切な標識）などの二次的免疫試薬によりアッセイする。クロマトグラフィーによる検出もまた使用することができる。
【０２５５】
免疫組織化学を使用して、例えば、生検試料中のバイオマーカータンパク質の発現を検出することができる。適切な抗体を、例えば、細胞の薄層と接触させ、洗浄し、次いで、第２の標識された抗体と接触させる。標識化は、蛍光のマーカー、ペルオキシダーゼなどの酵素、アビジン、または放射性標識による標識化でありうる。アッセイは、顕微鏡を使用して、目視によりスコア付ける。
【０２５６】
イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）などの抗バイオマーカータンパク質抗体もまた、例えば、対象の細胞および組織内のバイオマーカータンパク質の存在を検出する、イメージング目的で使用することができる。適切な標識は、放射性同位元素である、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）、およびテクネシウム（９９ｍＴｃ）、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光標識、ならびにビオチンを含む。
【０２５７】
ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングの目的のために、抗体は、それ自体として、体外から検出可能ではないので、検出を可能とするように、標識するか、または他の方式で修飾しなければならない。この目的のマーカーは、抗体の結合に実質的に干渉しないが、外部からの検出を可能とする、任意のマーカーでありうる。適切なマーカーは、Ｘ線撮影、ＮＭＲ、またはＭＲＩにより検出されうるマーカーを含みうる。Ｘ線撮影法では、適切なマーカーは、例えば、バリウムまたはセシウムなど、検出可能な放射線を放射するが、対象に明らかに有害ではない、任意の放射性同位元素を含む。ＮＭＲおよびＭＲＩに適切なマーカーは一般に、例えば、関与するハイブリドーマのための栄養素の適切な標識化により、抗体に組み込みうる重水素など、検出可能な特徴的スピンを伴うマーカーを含む。
【０２５８】
対象のサイズおよび使用されるイメージングシステムが、診断画像をもたらすのに必要とされるイメージング部分の量を決定するであろう。放射性同位元素部分の場合、ヒト対象については、注射される放射能の量は通常、約５〜２０ミリキュリーのテクネチウム９９の範囲であろう。次いで、標識された抗体または抗体断片は、バイオマーカータンパク質を含有する細胞の場所に優先的に蓄積されるであろう。次いで、公知の技法を使用して、標識された抗体または抗体断片を検出することができる。
【０２５９】
バイオマーカータンパク質を検出するのに使用しうる抗体は、自然であれ、合成であれ、全長であれ、その断片であれ、モノクローナルであれ、ポリクローナルであれ、検出されるバイオマーカータンパク質に、十分に強力かつ特異的に結合する、任意の抗体を含む。抗体は、最大で、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍ、または１０−１２ＭのＫｄを有しうる。「特異的に結合する」という語句は、例えば、抗体の、エピトープまたは抗原または抗原性決定基への結合であって、同
一または同様のエピトープ、抗原、または抗原決定基の第２の調製物により置換される場合もあり、これと競合する場合もある結合を指す。抗体は、類縁のタンパク質など、他のタンパク質と比べて、バイオマーカータンパク質に優先的に結合しうる。
【０２６０】
抗体は、市販されているか、または当技術分野で公知の方法に従い調製することができる。
【０２６１】
使用されうる抗体およびその誘導体は、ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、キメラ、ヒト、ヒト化、霊長動物化（ＣＤＲグラフト抗体）、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）、または単鎖抗体のほか、抗体の機能的な断片、すなわち、バイオマーカータンパク質結合性断片を包含する。例えば、バイオマーカータンパク質またはその部分に結合することが可能な抗体断片であって、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片を含むがこれらに限定されない抗体断片を使用することができる。このような断片は、酵素的切断または組換え法により作製することができる。例えば、パパインまたはペプシン切断により、それぞれ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を生成することができる。また、必須の基質特異性を有する他のプロテアーゼも、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片を生成するのに使用することができる。抗体はまた、１または複数の終止コドンを、自然の終結部位の上流に導入した、抗体遺伝子を使用して、様々な切断形態でも作製することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２の重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むようにデザインすることができる。
【０２６２】
合成および操作抗体については、例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３Ｂ１号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４Ｂ１号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、ＷＯ８６／０１５３３；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第０，１９４，２７６Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００Ｂ１号；Ｑｕｅｅｎら、欧州特許第０４５１２１６Ｂ１号；およびＰａｄｌａｎ，Ｅ．Ａ．ら、ＥＰ０５１９５９６Ａ１において記載されている。霊長動物化抗体に関しては、Ｎｅｗｍａｎ，  Ｒ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１４５５〜１４６０頁（１９９２年）、単鎖抗体に関しては、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号およびＢｉｒｄ，  Ｒ．  Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３〜４２６頁（１９８８年）もまた参照されたい。ライブラリー、例えば、ファージディスプレイライブラリーから作製される抗体もまた使用することができる。
【０２６３】
一部の実施形態では、バイオマーカータンパク質に特異的に結合する薬剤であって、ペプチドなど、抗体以外の薬剤を使用する。バイオマーカータンパク質に特異的に結合するペプチドは、当技術分野で公知の任意の手段により同定することができる。例えば、ペプチドのファージディスプレイライブラリーを使用して、バイオマーカータンパク質の特異的なペプチド結合剤についてスクリーニングすることができる。
【０２６４】
ｄ．バイオマーカーの構造的変更を検出するための方法
以下の例示的な方法を使用して、例えば、鉄硫黄クラスター生合成関連遺伝子の翻訳に影響を及ぼす配列または薬剤を同定するために、バイオマーカー核酸および／またはバイオマーカーポリペプチド分子における構造的変更の存在を同定することができる。
【０２６５】
ある特定の実施形態では、変更の検出は、アンカーＰＣＲもしくはＲＡＣＥ  ＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号を参照されたい）、または、代替的に、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１巻：１０７７〜１０８０頁；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９１巻：３６０〜３６４頁を参照されたい）におけるプローブ／プライマーの使用を伴うが、これらのうちの後者は、バイオマーカー遺伝子など、バイオマーカー核酸内の点変異を検出するのに、特に有用でありうる（Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２３巻：６７５〜６８２頁を参照されたい）。この方法は、細胞の試料を対象から回収するステップと、核酸（例えば、ゲノム核酸、ｍＲＮＡ、またはこれらの両方）を、試料の細胞から単離するステップと、核酸試料を、バイオマーカー遺伝子（存在する場合）のハイブリダイゼーションおよび増幅が生じるような条件下で、バイオマーカー遺伝子と特異的にハイブリダイズする、１または複数のプライマーと接触させるステップと、増幅産物の存在もしくは非存在を検出するか、または増幅産物のサイズを検出するステップと、長さを対照試料と比較するステップとを含みうる。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書で記載される、変異を検出するために使用される技法のうちのいずれかと共に、予備的な増幅ステップとして使用するのに所望されうることが予期される。
【０２６６】
代替的な増幅法は、自己持続配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，  Ｊ．  Ｃ．ら（１９９０年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８７巻：１８７４〜１８７８頁）、転写増幅系（Ｋｗｏｈ，  Ｄ．  Ｙ．ら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８６巻：１１７３〜１１７７頁）、Ｑベータ複製（Ｌｉｚａｒｄｉ，  Ｐ．  Ｍ．ら（１９８８年）、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻：１１９７頁）、または他の任意の核酸増幅法に続き、当業者に周知の技法を使用する、増幅された分子の検出を含む。これらの検出スキームは、とりわけ、このような分子が、非常に少数で存在する場合、核酸分子の検出に有用である。
【０２６７】
代替的な実施形態では、試料細胞に由来するバイオマーカー核酸内の変異は、制限酵素の切断パターンの変更により同定することができる。例えば、試料および対照ＤＮＡを、単離し、増幅し（必要に応じて）、１または複数の制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル電気泳動により断片長サイズを決定し、比較する。試料ＤＮＡと対照ＤＮＡとの間の断片長サイズの差異は、試料ＤＮＡ内の変異を示す。さらに、配列特異的なリボザイム（例えば、米国特許第５，４９８，５３１号を参照されたい）を使用して、リボザイム切断部位の発生または喪失により、特異的な変異の存在についてスコア付けすることができる。
【０２６８】
他の実施形態では、バイオマーカー核酸内の遺伝子変異は、試料核酸および対照核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイとハイブリダイズさせること（Ｃｒｏｎｉｎ，  Ｍ．  Ｔ．ら（１９９６年）、Ｈｕｍ．  Ｍｕｔａｔ．、７巻：２４４〜２５５頁；Ｋｏｚａｌ，  Ｍ．  Ｊ．ら（１９９６年）、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、２巻：７５３〜７５９頁）により同定することができる。例えば、バイオマーカー遺伝子の変異は、Ｃｒｏｎｉｎら（１９９６年）、前出において記載されている通り、発光型ＤＮＡプローブを含有する二次元アレイにより同定することができる。略述すると、プローブの第１のハイブリダイゼーションアレイを、一連の重複するプローブの直線状のアレイを作ることにより、試料および対照内のＤＮＡの長い連なりを通して走査して、配列間の塩基変化を同定するのに使用することができる。このステップは、点変異の同定を可能とする。このステップに続いて、検出される全ての改変体または変異に相補的な、小型で特化したプローブアレイを使用することにより、特異的な変異の特徴付けを可能とする、第２のハイブリダイゼーションアレイを施す。各変異アレイは、一方は、野生型遺伝子に相補的であり、他方は、変異体遺伝子に相補的である、パラレルなプローブセットから構成される。このようなバイオマーカー遺伝子の変異は、例えば、生殖細胞系列および体細胞変異を含む、様々な状況で同定することができる。
【０２６９】
さらに別の実施形態では、当技術分野で公知の様々なシークエンシング反応のうちのいずれかを使用して、バイオマーカー遺伝子を直接シークエンシングし、試料バイオマーカーの配列を、対応する野生型（対照）配列と比較することにより、変異を検出することができる。シークエンシング反応の例は、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９７７年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、７４巻：５６０頁またはＳａｎｇｅｒ（１９７７年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７４巻：５４６３頁により開発された技法に基づく反応を含む。また、診断アッセイを実行する場合に、質量分析によるシークエンシング（例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９４／１６１０１号；Ｃｏｈｅｎら（１９９６年）、Ａｄｖ．  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、３６巻：１２７〜１６２頁；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３年）、Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３８巻：１４７〜１５９頁を参照されたい）を含む、様々な自動化シークエンシング手順（Ｎａｅｖｅ（１９９５年）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９巻：４４８〜５３頁）のうちのいずれかを活用しうることも想定される。
【０２７０】
バイオマーカー遺伝子内の変異を検出するための他の方法は、切断剤からの保護を使用して、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖内のミスマッチ塩基を検出する方法（Ｍｙｅｒｓら（１９８５年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０巻：１２４２頁）を含む。一般に、当技術分野における「ミスマッチ切断」法は、野生型バイオマーカー配列を含有する（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料から得られる、潜在的に変異体である、ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることにより形成されるヘテロ二重鎖を提供することによって開始される。二本鎖状の二重鎖を、対照鎖と試料鎖との間の塩基対のミスマッチに起因して存在するものなど、二重鎖の一本鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ＲＮアーゼで処理することができ、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、ＳＩヌクレアーゼで処理して、ミスマッチ領域を酵素的に消化する。他の実施形態では、ミスマッチした領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムおよびピペリジンで処理することができる。ミスマッチ領域の消化の後、次いで、結果として得られる材料を、変性ポリアクリルアミドゲル上で、サイズにより分離して、変異部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８５巻：４３９７頁およびＳａｌｅｅｂａら（１９９２年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１７巻：２８６〜２９５頁を参照されたい。好ましい実施形態では、対照ＤＮＡまたはＲＮＡを、検出のために標識することができる。
【０２７１】
さらに別の実施形態では、ミスマッチ切断反応では、細胞の試料から得られたバイオマーカーｃＤＮＡ内の点変異を検出およびマッピングするための、規定された系において、二本鎖ＤＮＡ内のミスマッチ塩基対を認識する、１または複数のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を利用する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチにおけるＡを切断し、ＨｅＬａ細胞に由来するチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／ＴミスマッチにおけるＴを切断する（Ｈｓｕら（１９９４年）、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、１５巻：１６５７〜１６６２頁）。例示的な実施形態に従い、バイオマーカー配列、例えば、ＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理された野生型バイオマーカーと、存在する場合、切断産物とに基づくプローブを、電気泳動プロトコールなど（例えば、米国特許第５，４５９，０３９号）により検出することができる。
【０２７２】
他の実施形態では、電気泳動移動度の変更を使用して、バイオマーカー遺伝子内の変異を同定することができる。例えば、一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）を使用して、変異体核酸と、野生型核酸との間の電気泳動移動度の差異を検出することができる（Ｏｒｉｔａら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８６巻：２７６６頁；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３年）、Ｍｕｔａｔ．  Ｒｅｓ．、２８５巻：１２５〜１４４頁およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２年）、Ｇｅｎｅｔ．  Ａｎａｌ．  Ｔｅｃｈ．  Ａｐｐｌ．、９巻：７３〜７９頁もまた参照されたい）。試料および対照バイオマーカー核酸の一本鎖ＤＮＡ断片を、変性させ、復元する。一本鎖核酸の二次構造は、配列に従い変動し、結果として得られる電気泳動移動度の変更は、単一の塩基変化さえも検出可能とする。ＤＮＡ断片は、標識されたプローブにより標識または検出することができる。アッセイの感度は、二次構造が配列の変化に対してより感受性であるＲＮＡ（ＤＮＡではなく）を使用することにより増強することができる。好ましい実施形態では、対象の方法により、ヘテロ二重鎖解析を活用して、電気泳動移動度の変化に基づいて、二本鎖ヘテロ二重鎖分子を分離する（Ｋｅｅｎら（１９９１年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．、７巻：５頁）。
【０２７３】
さらに別の実施形態では、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用して、変性剤の勾配を含有するポリアクリルアミドゲル中の変異体または野生型断片の移動についてアッセイする（Ｍｙｅｒｓら（１９８５年）、Ｎａｔｕｒｅ、３１３巻：４９５頁）。ＤＧＧＥを、解析法として使用する場合、例えば、ＰＣＲにより、約４０ｂｐの高融点のＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを添加することにより、ＤＮＡを修飾して、それが完全に変性しないことを確認する。さらなる実施形態では、温度勾配を、変性勾配の代わりに使用して、対照ＤＮＡと、試料ＤＮＡとの、移動度の差異を同定する（ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７年）、Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．、２６５巻：１２７５３頁）。
【０２７４】
点変異を検出するための他の技法の例は、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長を含むがこれらに限定されない。例えば、既知の変異を中央部に配したオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで、完全なマッチが見出される場合に限り、ハイブリダイゼーションを許容する条件下で、標的ＤＮＡとハイブリダイズさせることができる（Ｓａｉｋｉら（１９８６年）、Ｎａｔｕｒｅ、３２４巻：１６３頁；Ｓａｉｋｉら（１９８９年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８６巻：６２３０頁）。オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイズする膜に結合させ、標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズさせる場合は、このような対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたはいくつかの異なる変異とハイブリダイズさせる。
【０２７５】
代替的に、選択的ＰＣＲ増幅に依存する、対立遺伝子特異的増幅技術を、本発明と共に使用することができる。特異的増幅のためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、分子の中央部（増幅が、差次的ハイブリダイゼーションに依存するように）（Ｇｉｂｂｓら（１９８９年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１７巻：２４３７〜２４４８頁）または、適切な条件下で、ミスマッチが、ポリメラーゼによる伸長を防止または低減しうる、一方のプライマーの３’端の最末端（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３年）、Ｔｉｂｔｅｃｈ、１１巻：２３８頁）において、目的の変異を保有しうる。加えて、新規の制限部位を、変異領域内に導入して、切断ベースの検出を創出することは、所望でありうる（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２年）、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅ、６巻：１頁）。ある特定の実施形態では、増幅はまた、増幅のために、Ｔａｑリガーゼを使用して実施することもできることが予期される（Ｂａｒａｎｙ（１９９１年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８巻：１８９頁）。このような場合、ライゲーションは、５’側配列の３’末端において完全なマッチがなされる場合に限り生じることから、増幅の存在または非存在を調査することにより、特異的な部位における、既知の変異の存在を検出することが可能となる。
【０２７６】
３．抗がん療法
抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）の有効性は、本明細書に記載されている方法に従って、対象におけるがん（例えば、がん）に関連するバイオマーカーの存在、非存在、量および／または活性に従って予測される。一実施形態では、このような抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）または療法の組合せ（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤と、抗免疫阻害療法）は、所望の対象に投与することもでき、対象が、抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）に対するレスポンダーの可能性があると示された場合に投与することもできる。別の実施形態では、このような抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）は、対象が、上記抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）に対するレスポンダーである可能性がないと示される場合は回避することができ、標的化および／または非標的化抗がん療法などの代替的処置レジメンを施行することができる。併用療法も想定され、これは、例えば、１種もしくは複数種の化学療法剤と放射線照射、１種もしくは複数種の化学療法剤と免疫療法、または１種もしくは複数種の化学療法剤と放射線照射と化学療法を含むことができ、これらの各組合せは、抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）ありまたはなしでありうる。
【０２７７】
ＵＳＰ１０およびＵＳＰ１０の阻害に有用な例示的な薬剤、または本明細書に記載されている他のバイオマーカーが上記されている。
【０２７８】
「標的化療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用して、これにより、がんを処置する薬剤の投与を指す。例えば、免疫チェックポイント阻害剤の阻害に関する標的化療法（therepy）は、本発明の方法と組み合わせて有用である。「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面上の分子群であって、抗腫瘍免疫応答を下方モジュレートまたは阻害することにより、免疫応答を微調整する分子群を意味する。免疫チェックポイントタンパク質は、当技術分野で周知であり、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリーの受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴおよびＡ２ａＲ（例えば、ＷＯ２０１２／１７７６２４を参照されたい）を限定することなく含む。１種または複数種の免疫チェックポイント阻害剤の阻害は、阻害シグナル伝達を遮断さもなければ中和して、これにより、がんをより効果的に処置するために免疫応答を上方調節することができる。
【０２７９】
免疫療法は、例えば、がんワクチンおよび／または感作された抗原提示細胞の使用を含み得る、標的化療法の一形態である。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞を無傷に保ちつつ、がん細胞に感染しこれを溶解することができるウイルスであり、がん療法において潜在的に有用なものとされる。腫瘍溶解性ウイルスの複製は、腫瘍細胞破壊を容易とすると共に、腫瘍部位における用量増幅も産生する。これは、抗がん遺伝子のためのベクターとして作用することもでき、これを腫瘍部位に特異的に送達させることができる。上記免疫療法は、がん抗原または疾患抗原に対して指向された、あらかじめ形成された抗体の投与（例えば、化学療法剤または毒素に必要に応じて連結された、腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体の投与）によって達成される、宿主の短期保護のための受動免疫を伴うことができる。例えば、抗ＶＥＧＦおよびｍＴＯＲ阻害剤は、腎細胞癌の処置において有効であることが公知である。免疫療法は、がん細胞系の細胞傷害性リンパ球認識エピトープの使用に焦点を置くこともできる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉分子、三重らせんポリヌクレオチドなどを使用して、腫瘍またはがんの開始、進行および／または病変に関連付けられた生体分子を選択的にモジュレートすることができる。
【０２８０】
「非標的化療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用しないが、がんを処置する薬剤の投与を指す（referes）。非標的化療法の代表例は、化学療法、遺伝子治療および放射線療法を限定することなく含む。
【０２８１】
一実施形態では、化学療法が使用される。化学療法は、化学療法剤の投与を含む。このような化学療法剤は、次の化合物群の中から選択される化学療法剤でありうるが、これらに限定されない：白金化合物、細胞傷害性抗生物質、代謝拮抗薬（antimetabolities）、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、ヒ素化合物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、タキサン、ヌクレオシドアナログ、植物アルカロイドおよび毒素；ならびにこれらの合成誘導体。例示的な化合物は、アルキル化剤：シスプラチン、トレオスルファンおよびトロホスファミド；植物アルカロイド：ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキソール（docetaxol）；ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤：テニポシド、クリスナトール（crisnatol）およびマイトマイシン；葉酸代謝拮抗薬：メトトレキサート、ミコフェノール酸およびヒドロキシウレア；ピリミジンアナログ：５−フルオロウラシル、ドキシフルリジンおよびシトシンアラビノシド；プリンアナログ：メルカプトプリンおよびチオグアニン；ＤＮＡ代謝拮抗薬：２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、アフィディコリングリシン酸塩およびピラゾロイミダゾール；ならびに有糸分裂阻害剤：ハリコンドリン、コルヒチンおよびリゾキシンを含むがこれらに限定されない。１種または複数種の化学療法剤を含む組成物（例えば、ＦＬＡＧ、ＣＨＯＰ）を使用することもできる。ＦＬＡＧは、フルダラビン、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）およびＧ−ＣＳＦを含む。ＣＨＯＰは、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシンおよびプレドニゾンを含む。別の実施形態では、ＰＡＲＰ（例えば、ＰＡＲＰ−１および／またはＰＡＲＰ−２）阻害剤が使用され、このような阻害剤は、当技術分野で周知である（例えば、オラパリブ、ＡＢＴ−８８８、ＢＳＩ−２０１、ＢＧＰ−１５（Ｎ−Ｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＮＯ−１００１（Ｉｎｏｔｅｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）；ＰＪ３４（Sorianoら、２００１年；Pacherら、２００２ｂ年）；３−アミノベンズアミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；４−アミノ−１，８−ナフタルイミド；（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；６（５Ｈ）−フェナントリジノン（phenanthridinone）（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；ベンズアミド（米国特許再発行（U.S.  Pat.  Re.）３６，３９７）；およびＮＵ１０２５（Bowmanら））。作用機構は一般に、ＰＡＲＰに結合し、その活性を減少させるＰＡＲＰ阻害剤の能力に関する。ＰＡＲＰは、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）からニコチンアミドおよびポリ−ＡＤＰ−リボース（ＰＡＲ）への変換を触媒する。ポリ（ＡＤＰ−リボース）およびＰＡＲＰの両方が、転写調節、細胞増殖、ゲノム安定性および発癌に関連付けられた（Bouchard  V.  J.ら、Experimental  Hematology、３１巻、６号、２００３年６月、４４６〜４５４頁（９）；Herceg  Z.；Wang  Z.-Q.Mutation  Research/Fundamental  and  Molecular  Mechanisms  of  Mutagenesis、４７７巻、１号、２００１年６月２日、９７〜１１０頁（１４））。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）は、ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）の修復において重要な分子である（de  Murcia  J.ら、１９９７年、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  ９４巻：７３０３〜７３０７頁；Schreiber  V、Dantzer  F、Ame  J  C、de  Murcia  G（２００６年）Nat  Rev  Mol.  Cell  Biol  ７巻：５１７〜５２８頁；Wang  Z  Qら（１９９７年）Genes  Dev  １１巻：２３４７〜２３５８頁）。ＰＡＲＰ１機能の阻害によるＳＳＢ修復のノックアウトは、欠損相同性指向性ＤＳＢ修復（defective  homology-directed  DSB  repair）によるがん細胞における合成致死性を誘発し得るＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する（Bryant  H  Eら（２００５年）Nature  ４３４巻：９１３〜９１７頁；Farmer  Hら（２００５年）Nature  ４３４巻：９１７〜９２１頁）。化学療法剤の上記の例は例示的であり、限定を意図するものではない。
【０２８２】
別の実施形態では、放射線療法が使用される。放射線療法において使用される放射線は、電離放射線でありうる。放射線療法はまた、ガンマ線、Ｘ線または陽子線でありうる。放射線療法の例は、外照射放射線療法、放射性同位元素（Ｉ−１２５、パラジウム、イリジウム）の間質移植、ストロンチウム−８９などの放射性同位元素、胸部放射線療法、腹腔内Ｐ−３２放射線療法、および／または全腹部および骨盤放射線療法を含むがこれらに限定されない。放射線療法の概要については、Hellman、第１６章：Principles  of  Cancer  Management:  Radiation  Therapy、第６版、２００１年、DeVitaら編、J.  B.  Lippencott  Company、Philadelphiaを参照されたい。上記放射線療法は、外照射放射線または遠隔療法として施行することができ、この場合、上記放射線は、遠隔供給源から方向付けられる。放射線処置は、内部療法または密封小線源治療として施行することもでき、この場合、放射性供給源は、身体の内側にがん細胞または腫瘍塊の近くに置かれる。ヘマトポルフィリンおよびその誘導体、ベルテポルフィン（Vertoporfin）（ＢＰＤ−ＭＡ）、フタロシアニン、光増感剤（photosensitizer）Ｐｃ４、デメトキシ−ヒポクレリンＡ；ならびに２ＢＡ−２−ＤＭＨＡなど、光増感剤の投与を含む光線力学的療法の使用も包含されている。
【０２８３】
別の実施形態では、ホルモン療法が使用される。ホルモン治療処置は、例えば、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト（例えば、フルタミド、ビカルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、リュープロリド酢酸塩（リュープロン）、ＬＨ−ＲＨアンタゴニスト）、ホルモン生合成およびプロセシングの阻害剤、ならびにステロイド（例えば、デキサメタゾン、レチノイド、デルトイド（deltoid）、ベタメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）、ビタミンＡ誘導体（例えば、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ））；ビタミンＤ３アナログ；抗ゲスターゲン（antigestagen）（例えば、ミフェプリストン、オナプリストン））または抗アンドロゲン薬（例えば、酢酸シプロテロン）を含むことができる。
【０２８４】
別の実施形態では、身体組織が高温（最大１０６°Ｆ．）に曝露される手順である、温熱療法が使用される。熱は、細胞を損傷することにより、または細胞が生きるのに必要な物質を細胞から奪うことにより、腫瘍の縮小を助けることができる。温熱療法の治療は、外部および内部加熱デバイスを使用した、局所、領域性および全身温熱療法でありうる。温熱療法は、ほとんどの場合、他の形態の療法（例えば、放射線療法、化学療法および生物学的療法）と共に使用されて、それらの有効性の増加を試みる。局所温熱療法は、腫瘍など、非常に小さい領域に加えられる熱を指す。上記領域は、身体外のデバイスから腫瘍を目標とする高周波波動により、外部で加熱することができる。内部加熱を達成するために、細い加熱されたワイヤーまたは温水で満たされた中空管；植え込まれたマイクロ波アンテナ；および無線周波数電極を含む、いくつかの型の滅菌プローブのうち１種を使用することができる。領域性温熱療法において、臓器または四肢が加熱される。高エネルギーを産生する磁石およびデバイスが、加熱されるべき領域の上に置かれる。灌流と呼ばれる別の手法において、患者の血液の一部が除去され、加熱され、次いで内部で加熱されるべき領域へとポンピングされる（灌流される）。全身加熱が使用されて、体中に拡散した転移性がんを処置する。これは、温水毛布、ホットワックス、誘導コイル（電気毛布中のものなど）または熱チャンバー（大型インキュベーターと同様の）を使用して達成することができる。温熱療法は、放射線副作用または合併症のいかなる著しい増加も引き起こさない。しかし、皮膚に直接的に加えられた熱は、処置した患者の約半数で不快感またはさらには有意な局所疼痛を引き起こし得る。これは、一般に急速に治癒する疱疹を引き起こすこともある。
【０２８５】
また別の実施形態では、光線力学的療法（ＰＤＴ、光線照射療法、光線療法または光化学療法とも呼ばれる）は、一部の型のがんの処置に使用される。これは、単一細胞の生物が特定の型の光に曝露されると、光感作剤（photosensitizing  agent）として公知のある特定の化学物質が、単細胞の生物を死滅させることができるという発見に基づく。ＰＤＴは、光感作剤と組み合わせた固定周波数レーザー光の使用によりがん細胞を破壊する。ＰＤＴにおいて、上記光感作剤は、血流中に注射され、身体の至るところにある細胞によって吸収される。上記薬剤は、正常細胞中よりも長い時間がん細胞中に残る。処置したがん細胞が、レーザー光に曝露されると、上記光感作剤は、光を吸収し、処置したがん細胞を破壊する活性型の酸素を産生する。露光は、上記光感作剤の大部分が健常な細胞から去ったが、依然として上記がん細胞中に存在するときに起こるように、慎重に時間調整される必要がある。ＰＤＴで使用されるレーザー光は、光ファイバー（極細ガラスストランド）を通して方向付けることができる。上記光ファイバーは、上記がんの近くに置かれて、適切な量の光を送達する。上記光ファイバーは、肺がんの処置のために肺へと気管支鏡を通って、または食道がんの処置のために食道へと内視鏡を通って方向付けることができる。ＰＤＴの利点は、健常な組織に最小の損傷を引き起こすことである。しかし、現在使用されているレーザー光は、約３センチメートルを超える組織（１と８分の１インチ強）を通過することができないため、ＰＤＴは、皮膚の上もしくはその真下または内臓内壁（lining  of  internal  organ）における腫瘍の処置に主に使用される。光線力学的療法は、処置後６週間またはそれよりも多い期間、皮膚および眼を、光に対して感受性にする。患者は、直射日光および明るい室内光を少なくとも６週間回避するように勧められる。患者が屋外に出なければならない場合は、サングラスを含む防護衣類を着用する必要がある。ＰＤＴの他の一時的副作用は、特異的領域の処置に関係し、咳嗽、嚥下困難、腹痛および有痛性呼吸または息切れを含みうる。１９９５年１２月に、米国食品医薬局（ＦＤＡ）は、閉塞を引き起こす食道がんの症状を和らげるための、また、レーザー単独では満足に処置することができない食道がんのための、ポルフィマーナトリウムまたはＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）と呼ばれる光感作剤を承認した。１９９８年１月に、ＦＤＡは、肺がんのための通常の処置が適切でない患者における早期非小細胞肺がんの処置のためにポルフィマーナトリウムを承認した。国立癌研究所（National  Cancer  Institute）および他の施設は、膀胱、脳、喉頭および口腔のがんを含むいくつかの型のがんのための光線力学的療法の使用を評価するための治験（研究試験）を支持している。
【０２８６】
さらに別の実施形態では、レーザー療法が使用されて、がん細胞の破壊に高強度光を利用する。この技法は、多くの場合、特に、がんが、他の処置によって治癒できない場合、出血または閉塞など、該がんの症状を和らげるために使用される。これは、腫瘍の縮小または破壊による、がんの処置に使用することもできる。「レーザー」という用語は、励起誘導放射による光増幅を表わす。電球からの光など、通常の光は、多くの波長を有し、全方向に拡散する。他方では、レーザー光は、特異的波長を有し、狭ビームに集束される。この型の高強度光は、大量のエネルギーを含有する。レーザーは、非常に強力であり、鋼の切断またはダイヤモンドの成形に使用することができる。レーザーは、眼内の損傷した網膜の修復または組織の切断（メスの代わり）など、非常に正確な外科的作業に使用することもできる。いくつかの異なる種類のレーザーが存在するが、３種類のみが、医学において広く使用されている：二酸化炭素（ＣＯ２）レーザー  −−  この型のレーザーは、より深い層を浸透することなく、皮膚の表面から薄層を除去することができる。この技法は、皮膚深くに拡散していない腫瘍およびある特定の前がん性状態の処置において特に有用である。伝統的なメスによる手術の代替として、このＣＯ２レーザーは、皮膚をカットすることもできる。上記レーザーがこのようにして使用されて、皮膚がんを除去する。ネオジム（neodymium）：イットリウム・アルミニウム・ガーネット（Ｎｄ：ＹＡＧ）レーザー  −−  このレーザー由来の光は、他の型のレーザー由来の光よりも深く組織へと浸透することができ、これは、血液を迅速に凝固させることができる。これは、光ファイバーを通して、身体の到達可能性が低い部分へと運ぶことができる。この型のレーザーは、咽喉がんの処置に使用される場合もある。アルゴンレーザー  −−  このレーザーは、組織の表在層のみを通過することができ、したがって、皮膚科学および眼の手術において有用である。これはまた、感光色素と共に使用されて、光線力学的療法（ＰＤＴ）として公知の手順において腫瘍を処置する。レーザーは、次のことを含む、標準外科的ツールを上回るいくつかの利点を有する：レーザーは、メスよりも正確である。周囲の皮膚または他の組織との接触がほとんどないため、切開付近の組織は保護される。レーザーによって産生される熱は、手術部位を滅菌し、これにより、感染の危険性を低下させる。上記レーザーの精度は、より小さい切開を可能にするため、少ない手術時間が必要とされ得る。治癒時間は、多くの場合、短縮される；レーザー熱は、血管を密封するため、出血、腫脹または瘢痕が少ない。レーザー手術は、複雑さを少なくすることができる。例えば、光ファイバーを用いて、レーザー光は、大きい切開を入れずに、身体の部分へと方向付けることができる。より多くの手順を外来で行うことができる。レーザーを２通りの方式で使用して、がんを処置することができる：熱で腫瘍を縮小もしくは破壊することによる、またはがん細胞を破壊する化学物質（光感作剤として公知）を活性化することによる。ＰＤＴにおいて、光感作剤は、がん細胞に保持され、光によって刺激されて、がん細胞を死滅させる反応を引き起こし得る。ＣＯ２およびＮｄ：ＹＡＧレーザーは、腫瘍の縮小または破壊に使用される。これらは、医師が、膀胱など、身体のある特定の領域を調べることができるチューブである内視鏡と共に使用することができる。一部のレーザー由来の光は、光ファイバーを備えた軟性内視鏡を通して伝導することができる。これは、医師が、手術を除く他の仕方では達することができない身体の部分を調べ、該部分において作業することを可能にし、したがって、上記レーザービームの非常に正確な照準（aiming）を可能にする。レーザーは、処置されている部位の明瞭な視野を医者にもたらす、低倍率顕微鏡と共に使用することもできる。他の機器と共に使用されると、レーザーシステムは、直径２００ミクロン（極細糸の幅未満）もの小ささのカット面積を生成することができる。レーザーは、多くの型のがんの処置に使用される。レーザー手術は、ある特定の段階の喉頭蓋（声帯）がん、子宮頸部がん、皮膚がん、肺がん、腟がん、外陰部がんおよび陰茎がんのための標準処置である。上記がんを破壊するためのその使用に加えて、レーザー手術は、がんに起因する症状を和らげるのを助けるためにも使用される（緩和ケア）。例えば、レーザーを使用して、患者の気管（trachea/windpipe）を遮断している腫瘍を縮小または破壊して、呼吸をより容易とすることができる。これは、結腸直腸および肛門がんにおける緩和に使用される場合もある。レーザー誘導性間質性熱療法（ＬＩＴＴ）は、レーザー療法における最新の発展の１種である。ＬＩＴＴは、温熱療法と呼ばれるがん処置と同じ考えを使用する；熱は、細胞を損傷することにより、または細胞が生きるのに必要な物質を細胞から奪うことにより、腫瘍縮小を助けることができる。この処置において、レーザーは、身体の間質性領域（臓器間の領域）に方向付けられる。続いて上記レーザー光は、上記腫瘍の温度を高め、これにより、がん細胞が損傷または破壊される。
【０２８７】
抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）による処置の持続期間および／または用量は、特定のＵＳＰ１０阻害薬剤またはその組合せに応じて変動しうる。特定のがん治療剤に適切な処置時間は、当業者に理解される。本発明は、がん治療剤毎の最適な処置スケジュールの継続的評価を想定し、本発明の方法によって決定される対象のがんの表現型は、最適処置用量およびスケジュールの決定における因子である。
【０２８８】
哺乳動物、ヒトもしくは非ヒトまたはそれらの細胞へとポリヌクレオチドを導入するための任意の手段は、本発明の多様な構築物を、意図されるレシピエントに送達するための本発明の実施に適合させることができる。本発明の一実施形態では、ＤＮＡ構築物を、細胞に、トランスフェクションにより、すなわち、「ネイキッド」ＤＮＡの送達により、またはコロイド分散系との複合体により送達する。コロイド系は、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合型ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースの系を含む。本発明の好ましいコロイド系は、脂質複合体化ＤＮＡまたはリポソーム−製剤化ＤＮＡである。前者の手法では、ＤＮＡを、例えば、脂質により製剤化する前に、まず、所望のＤＮＡ構築物を持つ導入遺伝子を含有するプラスミドを、発現について、実験的に最適化することができる（例えば、５’側非翻訳領域内のイントロンの含有および不要な配列の排除（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１２６〜１３９頁、１９９５年））。次いで、公知の方法および材料を使用して、例えば、種々の脂質またはリポソーム材料によるＤＮＡの製剤化を行い、レシピエントの哺乳動物に送達することができる。例えば、Ｃａｎｏｎｉｃｏら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１０巻：２４〜２９頁、１９９４年；Ｔｓａｎら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２６８巻；Ａｌｔｏｎら、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．、５巻：１３５〜１４２頁、１９９３年；およびＣａｒｓｏｎらによる米国特許第５，６７９，６４７号を参照されたい。
【０２８９】
リポソームの標的化は、切開学的および機構的因子に基づき、分類することができる。切開学的分類は、選択性のレベル、例えば、臓器特異的、細胞特異的、および細胞小器官特異的選択性に基づく。機構的標的化は、それが、受動的であるか、能動的であるかに基づき、識別することができる。受動的標的化は、洞様毛細血管を含有する、臓器内の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞へと分布する、リポソームの自然の傾向を活用する。他方、能動的標的化は、リポソームを、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、もしくはタンパク質など、特異的なリガンドとカップリングさせることによる、または天然に存在する局在化部位以外の臓器および細胞型への標的化を達成するために、リポソームの組成またはサイズを変化させることによる、リポソームの変更を伴う。
【０２９０】
標的化される送達系の表面は、様々な方式で修飾することができる。リポソームによる標的化送達系の場合、標的化リガンドの、リポソーム二重層との安定的な会合を維持するために、脂質基を、リポソームの脂質二重層に組み込むことができる。脂質鎖を、標的化リガンドに結合させるために、多様な連結基を使用することができる。ネイキッドＤＮＡまたは送達ビヒクル、例えば、リポソームと会合させたＤＮＡを、対象におけるいくつかの部位に投与することができる（下記を参照されたい）。
【０２９１】
核酸は、任意の所望のベクターにおいて送達することができる。これらは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびプラスミドベクターを含む、ウイルスまたは非ウイルスベクターを含む。例示的なウイルスの種類は、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）、およびＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）を含む。核酸は、十分に効率的な送達レベルをもたらす、任意の所望のフォーマットであって、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ粒子、およびポリマーへの複合体化を含むフォーマットで投与することができる。
【０２９２】
目的のタンパク質をコードする核酸または目的の核酸は、プラスミドもしくはウイルスベクターまたは当技術分野で公知の他のベクターにありうる。このようなベクターは、周知であり、任意のベクターを、特定の適用のために選択することができる。本発明の一実施形態では、遺伝子送達ビヒクルは、プロモーターおよびデメチラーゼコード配列を含む。好ましいプロモーターは、組織特異的プロモーター、ならびにチミジンキナーゼおよびチミジル酸シンターゼプロモーターなど、細胞増殖により活性化するプロモーターである。他の好ましいプロモーターは、α−およびβ−インターフェロンプロモーターなど、ウイルスの感染により活性化可能なプロモーター、ならびにエストロゲンなどのホルモンにより活性化可能なプロモーターを含む。使用されうる他のプロモーターは、モロニーウイルスＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターを含む。プロモーターは、構成的または誘導性でありうる。
【０２９３】
別の実施形態では、ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号において記載されている通り、ネイキッドポリヌクレオチド分子を、遺伝子送達ビヒクルとして使用する。このような遺伝子送達ビヒクルは、増殖因子ＤＮＡまたはＲＮＡである場合があり、ある特定の実施形態では、死滅させたアデノウイルスに連結される（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ．  Ｔｈｅｒ．、３巻：１４７〜１５４頁、１９９２年）。必要に応じて使用されうる他のビヒクルは、ＤＮＡ−リガンドの組合せ（Ｗｕら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６４巻：１６９８５〜１６９８７頁、１９８９年）、脂質−ＤＮＡの組合せ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８４巻：７４１３〜７４１７頁、１９８９年）、リポソーム（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、８４巻：７８５１〜７８５５頁、１９８７年）、および微粒子銃（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、８８巻：２７２６〜２７３０頁、１９９１年）を含む。
【０２９４】
遺伝子送達ビヒクルは、必要に応じて、ウイルス複製起点またはパッケージングシグナルなどのウイルス配列を含みうる。これらのウイルス配列は、アストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルスまたはアデノウイルスなどのウイルスから選択することができる。好ましい実施形態では、増殖因子の遺伝子送達ビヒクルは、組換えレトロウイルスベクターである。組換えレトロウイルスおよびそれらの多様な使用については、例えば、Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ、３３巻：１５３頁、１９８３年；ＣａｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻：６３４９頁、１９８４年；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１巻：５〜１４頁、１９９０年；米国特許第４，４０５，７１２号、同第４，８６１，７１９号、および同第４，９８０，２８９号；ならびにＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０２，４６８号、同第ＷＯ８９／０５，３４９号、および同第ＷＯ９０／０２，８０６号を含む、多数の参考文献において記載されている。本発明では、例えば、ＥＰ０，４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３１１２３０；ＷＯ９３１０２１８；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻：３８６０〜３８６４頁、１９９３年；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻：９６２〜９６７頁、１９９３年；Ｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻：８３〜８８頁、１９９３年；Ｔａｋａｍｉｙａら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｒｅｓ．、３３巻：４９３〜５０３頁、１９９２年；Ｂａｂａら、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、７９巻：７２９〜７３５頁、１９９３年（米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ２，２００，６５１、ＥＰ０，３４５，２４２、およびＷＯ９１／０２８０５）において記載されているレトロウイルスによる遺伝子送達ビヒクルを含む、多数のレトロウイルスによる遺伝子送達ビヒクルを活用することができる。
【０２９５】
本発明のポリヌクレオチドを送達するのに使用しうる、他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルス（１９９７年５月２０日に交付された、Ｗｏｏらによる、米国特許第５，６３１，２３６号、およびＮｅｕｒｏｖｅｘによるＷＯ００／０８１９１）、ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ（１９８８年）、「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｒ  Ｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ  Ｄ  Ｔ編、Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ（１９８６年）、「Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ：  Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｇｅｎｅｓ」、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  Ｒ編、Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｕｐａｒら（１９８８年）、Ｇｅｎｅ、６８巻：１〜１０頁）、およびいくつかのＲＮＡウイルスから導出されている。好ましいウイルスは、アルファウイルス、ポックスウイルス（ｐｏｘｉｖｉｒｕｓ）、アレナウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどを含む。これらは、多様な哺乳動物細胞のために、いくつかの魅力的な特色を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１２７５〜１２８１頁；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８年、前出；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６年、前出；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８年；Ｈｏｒｗｉｃｈら（１９９０年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６４巻：６４２〜６５０頁）。
【０２９６】
他の実施形態では、当技術分野で周知の方法を使用して、ゲノム内の標的ＤＮＡを操作することができる。例えば、ゲノム内の標的ＤＮＡは、欠失、挿入、および／または変異、例えばレトロウイルスの挿入、人工染色体法、遺伝子挿入、組織特異的なプロモーターによるランダムな挿入、遺伝子標的化、転移因子、および／または外来ＤＮＡを導入するかもしくは修飾ＤＮＡ／修飾核ＤＮＡを作製するための他の任意の方法により操作することができる。他の修飾法は、ゲノムからＤＮＡ配列を欠失させるステップおよび／または核ＤＮＡ配列を変更するステップを含む。核ＤＮＡ配列は、例えば、部位指向変異誘発により変更することができる。
【０２９７】
他の実施形態では、組換えバイオマーカーポリペプチドおよびその断片を、対象に投与することができる。一部の実施形態では、生物学的特性を増強した融合タンパク質を構築し、投与することができる。加えて、バイオマーカーポリペプチドおよびその断片は、バイオアベイラビリティーの増加およびタンパク質分解の低下など、所望の生物学的活性をさらに増強するために、当技術分野で周知の薬理学的方法（例えば、ＰＥＧ化、グリコシル化、オリゴマー化など）に従い、修飾することができる。
【０２９８】
４．臨床有効性（clincal  efficacy）
臨床有効性は、当技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。例えば、抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）に対する応答は、該療法に対する、好ましくは、ネオアジュバントまたはアジュバント化学療法の開始後の腫瘍量および／または体積の変化に対する上記がん、例えば、腫瘍の任意の応答に関する。腫瘍応答は、ネオアジュバントまたはアジュバント状況において評価することができ、全身性介入後の腫瘍のサイズは、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波または触診によって測定される、初期サイズおよび寸法と比較することができ、腫瘍の細胞充実性は、組織学的に推定し、処置開始前に採取された腫瘍生検の細胞充実性と比較することができる。応答は、生検または外科的切除後の腫瘍のノギス測定または病理学的検査によって評価することもできる。応答は、腫瘍体積もしくは細胞充実性の百分率の変化など、定量的に記録することができ、または残存するがん負荷（Symmansら、J.  Clin.  Oncol.（２００７年）２５巻：４４１４〜４４２２頁）もしくはＭｉｌｌｅｒ−Ｐａｙｎｅスコア（Ogstonら（２００３年）Breast  (Edinburgh、Scotland)  １２巻：３２０〜３２７頁）などの半定量的スコアリング方式を使用して、「病理学的完全奏効」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的安定疾患」（ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ）または他の定性的基準など、定性的に記録することもできる。腫瘍応答の評価は、ネオアジュバントまたはアジュバント療法の開始後早期に、例えば、数時間後、数日間後、数週間後または好ましくは数カ月間後において実施することができる。応答評価のための典型的エンドポイントは、ネオアジュバント化学療法の終結後、または残存する腫瘍細胞および／または腫瘍床の外科的除去後である。
【０２９９】
一部の実施形態では、本明細書で記載される治療的処置の臨床有効性は、臨床的有用率（ＣＢＲ）を測定することにより決定することができる。臨床的有用率は、治療の終了時から少なくとも６カ月後の時点において、完全寛解（ＣＲ）している患者の百分率と、部分寛解（ＰＲ）している患者の数と、安定病態（ＳＤ）である患者の数との合計を決定することにより測定する。この式の略記は、６カ月間にわたるＣＢＲ＝ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。一部の実施形態では、特定のＵＳＰ１０阻害剤治療レジメンのＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％またはそれよりも多い。
【０３００】
抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）に対する応答を評価するためのさらなる基準は、以下：全生存期間としてもまた公知の死亡までの生存期間（ここで、前記死亡は、原因を問わない場合もあり、腫瘍に関連する場合もある）；「無再発生存期間」（ここで、再発という用語は、限局的および遠隔的再発の両方を含むものとする）；無転移生存期間；無病生存期間（ここで、疾患という用語は、がんおよびこれと関連する疾患を含むものとする）の全てを含む「生存期間」と関連する。前記生存期間の長さは、規定された開始点（例えば、診断のときまたは処置の開始）および終了点（例えば、死、再発または転移）を参照することにより計算することができる。加えて、処置の有効性についての基準は、化学療法への応答、生存の確率、所与の期間内の転移の確率、および腫瘍再発の確率を含むように拡張することができる。
【０３０１】
例えば、適切な閾値を決定するために、特定のＵＳＰ１０阻害剤治療レジメンを対象の集団に施行することができ、そのアウトカムを、任意の抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）を施行する前に決定されたバイオマーカー測定値と相関させることができる。上記アウトカム測定値は、上記ネオアジュバント状況において施される療法に対する病理的応答でありうる。代替的に、全生存期間および無病生存期間などのアウトカム尺度を、対象のバイオマーカー測定値が既知である、抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）後の対象について、ある期間にわたりモニタリングすることができる。ある特定の実施形態では、ＵＳＰ１０阻害薬剤の同じ用量が、各対象に投与される。関連する実施形態では、投与される用量は、ＵＳＰ１０阻害薬剤のための当技術分野で公知の標準用量である。対象をモニタリングする期間は、変動し得る。例えば、対象を、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０カ月間にわたりモニタリングすることができる。抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）のアウトカムと相関する、バイオマーカーの測定閾値は、実施例節で記載される方法などの、方法を使用して決定することができる。
【０３０２】
５．本発明のさらなる使用および方法
本明細書に記載されている組成物は、表１および２に列挙されているものなど、本明細書に記載されているバイオマーカーに関する様々な診断適用、予後診断適用および治療適用において使用することができる。診断方法、予後診断方法（prognostic  method）、治療方法またはこれらの組合せなど、本明細書に記載されている任意の方法において、該方法の全ステップは、単独の作業者によって、あるいは２名以上の作業者によって行うことができる。例えば、診断は、治療的処置を提供する作業者によって直接的に行うことができる。あるいは、治療剤を提供する人物は、診断アッセイが行われることを要請することができる。診断医および／または治療介入者は、診断アッセイ結果を解釈して、治療戦略を決定することができる。同様に、このような代替プロセスは、予後診断アッセイなど、他のアッセイに適用することができる。
【０３０３】
ａ．スクリーニング方法
本発明の一態様は、細胞に基づかないアッセイを含むスクリーニングアッセイに関する。一実施形態では、上記アッセイは、がんが、抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）に応答する可能性があるかどうか、および／または薬剤が、抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）に応答する可能性がないがん細胞の成長を阻害するまたはこれを死滅させることができるかどうかを同定するための方法を提供する。
【０３０４】
一実施形態では、本発明は、表１および／または表２に列挙されている少なくとも１種のバイオマーカーに結合するまたはその生物学的活性をモジュレートする被験薬剤をスクリーニングするためのアッセイに関する。一実施形態では、このような薬剤を同定するための方法は、表１および／または表２に列挙されている少なくとも１種のバイオマーカーをモジュレート、例えば、阻害する薬剤の能力を決定するステップを伴う。
【０３０５】
一実施形態では、アッセイは、表１および／または表２に列挙されている少なくとも１種のバイオマーカーを被験薬剤と接触させるステップと、基質の直接的結合を測定することによる、または以下に記載する間接的パラメータを測定することによるなど、該バイオマーカーの酵素活性をモジュレート（例えば、阻害）する該被験薬剤の能力を決定するステップとを含む、無細胞または細胞に基づくアッセイである。
【０３０６】
別の実施形態では、アッセイは、表１および／または表２に列挙されている少なくとも１種のバイオマーカーを被験薬剤と接触させるステップと、基質の直接的結合を測定することによる、または以下に記載する間接的パラメータを測定することによるなど、ＵＳＰ１０および／またはＦＬＴ３を調節する該バイオマーカーの能力をモジュレートする該被験薬剤の能力を決定するステップとを含む、無細胞または細胞に基づくアッセイである。
【０３０７】
例えば、直接的結合アッセイにおいて、結合が、複合体における標識タンパク質または分子の検出によって決定されうるように、バイオマーカータンパク質（またはそれぞれの標的ポリペプチドまたは分子）は、放射性同位元素または酵素標識とカップリングすることができる。例えば、上記標的は、直接的または間接的のいずれかで、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３Ｈで標識することができ、該放射性同位元素は、放射線放出の直接的計数によるかまたはシンチレーション計数によって検出される。あるいは、上記標的は、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはルシフェラーゼで酵素標識することができ、該酵素標識は、適切な基質から産物への変換の決定によって検出することができる。バイオマーカーと基質との間の相互作用の決定は、標準結合アッセイまたは酵素解析アッセイを使用して達成することもできる。上記のアッセイ方法の１種または複数種の実施形態では、ポリペプチドまたは分子を固定化して、上記タンパク質または分子の一方または両方の非複合体形成形態から複合体形成形態の分離を容易とすると共に、該アッセイの自動化を適応させることが望ましい場合がある。
【０３０８】
標的への被験薬剤の結合は、反応物の収容に適した任意の容器内で達成することができる。このような容器の非限定的な例は、マイクロタイタープレート、試験管および微量遠心分離管を含む。固定化形態の本発明の抗体は、膜、セルロース、ニトロセルロースもしくはガラス繊維；アガロースもしくはポリアクリルアミドもしくはラテックス製などのビーズ；またはポリスチレン製のものなどのディッシュ、プレートもしくはウェルの表面など、多孔性、微孔性（約１ミクロン未満の平均ポア直径を有する）またはマクロ多孔性（約１０ミクロン超の平均ポア直径を有する）材料のような固相に結合された抗体を含むこともできる。
【０３０９】
代替実施形態では、上記バイオマーカーとその天然結合パートナーとの間の相互作用をモジュレートする薬剤の能力の決定は、ＵＳＰ１０内のその位置の下流または上流で機能するポリペプチドまたは他の産物の活性をモジュレートする被験薬剤の能力を決定することにより達成することができる。
【０３１０】
本発明は、さらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規薬剤に関する。したがって、適切な動物モデルにおいて本明細書に記載されている通りに同定される薬剤をさらに使用することは、本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載されている通りに同定される薬剤は、動物モデルにおいて使用して、このような薬剤による処置の有効性、毒性または副作用を決定することができる。あるいは、本明細書に記載されている通りに同定される抗体は、動物モデルにおいて使用して、このような薬剤の作用機構を決定することができる。
【０３１１】
ｂ．予測医学
本発明はまた、診断アッセイ、予後診断アッセイ、および臨床試験のモニタリングを、予後診断（予測）の目的で使用して、これにより、個体を予防的に処置する予測医学の分野にも関する。したがって、本発明の一態様は、表１で列挙されるバイオマーカーなど、本明細書で記載されるバイオマーカーの存在、非存在、量、および／または活性レベルを、生体試料（例えば、血液、血清、細胞、または組織）の状況で決定して、これにより、元のがんにおいてであれ、再発性のがんにおいてであれ、がんに罹患した個体が、抗がん療法（例えば、単独の、または少なくとも１つのＦＬＴ３阻害剤と組み合わせたかのいずれかの、少なくとも１つのＵＳＰ１０阻害剤）に応答する可能性があるかどうかを決定するための診断アッセイに関する。このようなアッセイを、予後診断または予測の目的で使用して、これにより、バイオマーカーポリペプチド、核酸の発現または活性を特徴とするか、またはこれらと関連する障害の発症の前、または再発の後で、個体を予防的に処置することができる。当業者は、任意の方法により、表１および／または表２で列挙されるバイオマーカーなど、本明細書で記載されるバイオマーカーのうちの１または複数（例えば、組合せ）を使用しうることを理解するであろう。
【０３１２】
本発明の別の態様は、薬剤（例えば、薬物、化合物、および核酸ベースの小分子）の、表１および／または表２で列挙されるバイオマーカーの発現または活性に対する影響のモニタリングに関する。上記および他の薬剤は、次の節にさらに詳細に記載されている。
【０３１３】
当業者はまた、ある特定の実施形態では、本発明の方法は、コンピュータプログラムおよびコンピュータシステムを実装することも理解するであろう。例えば、コンピュータプログラムを使用して、本明細書で記載されるアルゴリズムを実施することができる。コンピュータシステムはまた、本発明の方法により生成されるデータであって、本発明の方法の実装において、コンピュータシステムが使用しうる、複数のバイオマーカーシグナルの変化／プロファイルを含むデータを保存し、操作することも可能である。ある特定の実施形態では、コンピュータシステムは、バイオマーカーの発現データを受容し；（ｉｉ）データを保存し；（ｉｉｉ）本明細書で記載されるいくつかの方式（例えば、適切な対照と比べた解析）で、データを比較して、がん性組織または前がん性組織に由来する、情報を与えるバイオマーカーの状態を決定する。他の実施形態では、コンピュータシステムは、（ｉ）決定されたバイオマーカーの発現レベルを、閾値と比較し；（ｉｉ）前記バイオマーカーレベルが、閾値に対して（例えば、閾値を上回るかまたは下回るように）有意にモジュレートされているかどうかについての表示、または前記表示に基づく表現型を出力する。
【０３１４】
ある特定の実施形態では、このようなコンピュータシステムはまた、本発明の一部と考えることもできる。多数の種類のコンピュータシステムを使用して、バイオインフォマティクスおよび／またはコンピュータの技術分野における当業者が所有する知識に従い、本発明の解析法を実装することができる。このようなコンピュータシステムの作動中に、いくつかのソフトウェアコンポーネントを、メモリにロードすることができる。ソフトウェアコンポーネントは、当技術分野で標準的なソフトウェアコンポーネント、および本発明に特有のコンポーネント（例えば、Ｌｉｎら（２００４年）、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０巻、１２３３〜１２４０頁において記載されている、ｄＣＨＩＰソフトウェア；当技術分野で公知の、放射基底型機械学習アルゴリズム（ｒａｄｉａｌ  ｂａｓｉｓ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（ＲＢＭ））の両方を含みうる。
【０３１５】
本発明の方法はまた、式の記号入力と、使用される特殊なアルゴリズムを含む、高レベルの処理仕様とを可能とする、数学ソフトウェアパッケージへとプログラム化またはモデル化し、これにより、使用者を、個々の式およびアルゴリズムを手順通りにプログラミングする必要から解放することもできる。このようなパッケージは、例えば、Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ（Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓ．）製のＭａｔｌａｂ、Ｗｏｌｆｒａｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、Ｉｌｌ．）製のＭａｔｈｅｍａｔｉｃａ、またはＭａｔｈＳｏｆｔ（Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）製のＳ−Ｐｌｕｓを含む。
【０３１６】
ある特定の実施形態では、コンピュータは、バイオマーカーデータを保存するためのデータベースを含む。このような保存されたプロファイルは、後の時点において、目的の比較を実施するのに、アクセスおよび使用することができる。例えば、対象の非がん性組織に由来する試料についての、バイオマーカー発現プロファイルおよび／または同じ種の関与する集団内の、情報を与える、目的の遺伝子座の、集団ベースの分布から生成されるプロファイルを保存し、後に、対象のがん性組織に由来する試料またはがん性であることが疑われる対象の組織のプロファイルと比較することができる。
【０３１７】
本明細書で記載される例示的なプログラム構造およびコンピュータシステムに加えて、当業者には、他の代替的なプログラム構造およびコンピュータシステムが、たやすく明らかであろう。したがって、上記で記載されたコンピュータシステムおよびプログラム構造から、精神または範囲において逸脱しない、このような代替的システムは、付属の特許請求の範囲内に包含されることを意図する。
【０３１８】
ｃ．診断アッセイ
本発明は、部分的に、生体試料が、抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）に応答する可能性があるがんと関連するかどうかを正確に分類するための方法、系、およびコードを提供する。一部の実施形態では、本発明は、統計学的アルゴリズムおよび／または経験的データ（例えば、表１および／または表２に列挙されている少なくとも１種のバイオマーカーの量または活性）を使用して、試料（例えば、対象に由来する）を抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）に応答することまたは応答しないことと関連するかまたはこの危険性があるものとして分類するのに有用である。
【０３１９】
表１および／または表２に列挙されているバイオマーカーの量または活性を検出するための例示的な方法であり、したがって、試料が、抗がん療法（例えば、単独か、または少なくとも１つのＦＬＴ３阻害剤と組み合わせたかのいずれかの、少なくとも１つのＵＳＰ１０阻害剤）に応答する可能性があるか、その可能性が低いかを分類するのに有用な方法は、被験対象から生体試料を得るステップと、生体試料を、生体試料中のバイオマーカーの量または活性を検出することが可能な薬剤であって、抗体もしくはその抗原結合性断片のようなタンパク質結合性薬剤、またはオリゴヌクレオチドのような核酸結合性薬剤などの薬剤と接触させるステップとを伴う。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗体またはその抗原結合性断片を使用し、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ超のこのような抗体または抗体断片を、組み合わせて（例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡにおいて）または逐次的に使用することができる。ある特定の場合には、統計学的アルゴリズムは、単一の学習統計分類子システム（ｌｅａｒｎｉｎｇ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）である。例えば、単一の学習統計分類子システムを使用して、バイオマーカーの予測または確率値および存在またはレベルに基づき、試料を分類することができる。単一の学習統計分類子システムの使用は、試料を、例えば、抗がん療法（例えば、単独か、または少なくとも１つのＦＬＴ３阻害剤と組み合わせたかのいずれかの、少なくとも１つのＵＳＰ１０阻害剤）の、レスポンダーまたはプログレッサー試料である可能性が高いと、少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の感度、特異度、陽性予測値、陰性予測値、および／または全体精度で分類することが典型的である。
【０３２０】
当業者には、他の適切な統計学的アルゴリズムが周知である。例えば、学習統計分類子システムは、複雑なデータセット（例えば、目的のマーカーのパネル）に適応し、このようなデータセットに基づき、決定を下すことが可能な、機械学習アルゴリズム技術を含む。一部の実施形態では、分類木（例えば、ランダムフォレスト）など、単一の学習統計分類子システムを使用する。他の実施形態では、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ超の学習統計分類子システムの組合せを、好ましくはタンデムで使用する。学習統計分類子システムの例は、帰納学習（例えば、ランダムフォレスト、分類および回帰木（Ｃ＆ＲＴ）、ブースティングツリー（ｂｏｏｓｔｅｄ  ｔｒｅｅ）などの決定／分類木）、ＰＡＣ（Ｐｒｏｂａｂｌｙ  Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ  Ｃｏｒｒｅｃｔ）学習、コネクショニスト学習（例えば、ニューラルネットワーク（ＮＮ）、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、ニューロファジーネットワーク（ＮＦＮ）、ネットワーク構造、パーセプトロン、例えば、多層パーセプトロン、多層フィードフォワードネットワーク、ニューラルネットワークの応用、信念ネットワークにおけるベイジアン学習など）、強化学習（例えば、ナイーブ学習、適応動的学習、および時間差学習など、既知の環境における受動学習、未知の環境における受動学習、未知の環境における能動学習、学習行動値関数、強化学習の応用など）、ならびに遺伝的アルゴリズムおよび進化的プログラミングを使用する、学習統計分類子システムを含むがこれらに限定されない。他の学習統計分類子システムは、サポートベクターマシン（例えば、カーネル法）、ＭＡＲＳ（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｐｌｉｎｅｓ）、レーベンバーグ−マーカートアルゴリズム、ガウス−ニュートンアルゴリズム、ガウス混合、勾配降下アルゴリズム、および学習ベクトル量子化法（ＬＶＱ）を含む。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、試料の分類結果を、臨床医、例えば、腫瘍学者に送るステップをさらに含む。
【０３２１】
別の実施形態では、対象の診断に続いて、診断に基づき、個体に、治療有効量の、規定された処置を施行する。
【０３２２】
一実施形態では、本方法は、対照生体試料（例えば、がんがない対象、もしくは対象のがんが抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）に感受性である対象由来の生体試料）、寛解中の対象由来の生体試料、または抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）にもかかわらず進行するがん発症に対する処置中の対象由来の生体試料を得るステップをさらに伴う。
【０３２３】
ｄ．予後診断アッセイ
本明細書で記載される診断方法はさらに、抗がん療法（例えば、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤単独、または少なくとも１種のＦＬＴ３阻害剤と組み合わせた、少なくとも１種のＵＳＰ１０阻害剤）に応答性である可能性があるか、またはその可能性がないがんを有するか、またはこれを発症する危険性がある対象を同定するのに活用することができる。前出の診断アッセイまたは以下のアッセイなど、本明細書で記載されるアッセイを活用して、がんなどにおける、例えば、表１および／または表２に記載されている少なくとも１種のバイオマーカーの量または活性の誤調節と関連する障害を有するか、またはこれを発症する危険性がある対象を同定することができる。代替的に、上記予後診断アッセイを活用して、がんなどにおける、表１および／または表２に記載されている少なくとも１種のバイオマーカーの誤調節と関連する障害を有するか、またはこれを発症する危険性がある対象を同定することができる。さらに、本明細書で記載される予後診断アッセイを使用して、対象に、薬剤（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチド模倣物、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子、または他の薬物候補）を投与して、異常なバイオマーカーの発現または活性と関連する疾患または障害を処置しうるかどうかを決定することができる。
【０３２４】
ｅ．処置法
本発明の別の態様は、本明細書で記載される１または複数のバイオマーカー（例えば、表１、表２および実施例で列挙されるバイオマーカーまたはそれらの断片）の発現または活性を、治療目的でモジュレートする方法に関する。本発明のバイオマーカーは、がんと相関することが裏付けられている。したがって、バイオマーカーの活性および／または発現のほか、１または複数のバイオマーカーまたはそれらの断片と、その自然の結合パートナーまたはそれらの断片との間の相互作用も、がんを処置するためにモジュレートすることができる。
【０３２５】
本発明のモジュレート法は、細胞を、表１、表２および実施例で列挙される１もしくは複数のバイオマーカーを含めた、本発明の１もしくは複数のバイオマーカーまたはそれらの断片を含む、本発明の１または複数のバイオマーカー、あるいは細胞と関連するバイオマーカー活性のうちの１または複数をモジュレートする薬剤と接触させるステップを伴う。バイオマーカー活性をモジュレートする薬剤は、核酸もしくはポリペプチド、バイオマーカーの天然に存在する結合パートナー、バイオマーカーに対する抗体、バイオマーカーに対する抗体と他の免疫関連標的に対する抗体との組合せ、１もしくは複数のバイオマーカーアゴニストもしくはアンタゴニスト、１もしくは複数のバイオマーカーアゴニストもしくはアンタゴニストのペプチド模倣剤、１もしくは複数のバイオマーカーのペプチド模倣剤、他の小分子、または１もしくは複数のバイオマーカー核酸の遺伝子発現産物を指向する低分子ＲＮＡもしくはこれらの模倣剤など、本明細書で記載される薬剤でありうる。
【０３２６】
表１、表２および実施例で列挙される１もしくは複数のバイオマーカーまたはそれらの断片を含む、本発明の１または複数のバイオマーカーの発現をモジュレートする薬剤は、例えば、アンチセンス核酸分子、ＲＮＡｉ分子、ｓｈＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ＊、抗ｍｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ結合性部位、もしくはそれらの改変体、または他の低分子ＲＮＡ分子、三重鎖オリゴヌクレオチド、リボザイム、あるいは１または複数のバイオマーカーポリペプチドを発現させるための組換えベクターである。例えば、１または複数のバイオマーカーポリペプチドの翻訳開始部位の周囲の領域に相補的なオリゴヌクレオチドを合成することができる。１または複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞培地に、典型的には、２００μｇ／ｍｌで添加することもでき、１または複数のバイオマーカーポリペプチドの合成を防止するように、患者に投与することもできる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞により取り込まれ、１または複数のバイオマーカーｍＲＮＡとハイブリダイズして、翻訳を防止する。代替的に、三重鎖構築物を形成して、ＤＮＡの巻き戻しおよび転写を防止するように、二本鎖ＤＮＡに結合するオリゴヌクレオチドを使用することができる。いずれの結果としても、バイオマーカーポリペプチドの合成が遮断される。バイオマーカーの発現をモジュレートする場合、このようなモジュレーションは、バイオマーカー遺伝子をノックアウトすることによる以外の手段により生じることが好ましい。
【０３２７】
発現をモジュレートする薬剤は、それらが、細胞内のバイオマーカーの量を制御するという事実のために、また、細胞内のバイオマーカー活性の総量もモジュレートする。
【０３２８】
一実施形態では、薬剤は、表１および実施例で列挙される１もしくは複数のバイオマーカーまたはそれらの断片を含む本発明の１または複数のバイオマーカーの１または複数の活性を刺激する。このような刺激性薬剤の例は、活性なバイオマーカーポリペプチドまたはその断片、および細胞に導入された、バイオマーカーまたはその断片をコードする核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ＊、抗ｍｉＲＮＡ、もしくはｍｉＲＮＡ結合性部位、もしくはそれらの改変体、または当業者に公知の、他の機能的に同等の分子）を含む。別の実施形態では、薬剤は、１または複数のバイオマーカー活性を阻害する。一実施形態では、薬剤は、バイオマーカーの、その自然の結合パートナーとの相互作用を阻害または増強する。このような阻害性薬剤の例は、アンチセンス核酸分子、抗バイオマーカー抗体、バイオマーカー阻害剤、および本明細書で記載されるスクリーニングアッセイで同定される化合物を含む。
【０３２９】
これらのモジュレート法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて（例えば、細胞を薬剤と接触させることにより）実施することもでき、代替的に、薬剤を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、細胞と接触させることにより（例えば、薬剤を対象に投与することにより）実施することもできる。そのようなものとして、本発明は、表１もしくは２および実施例に列挙されている本発明の１種または複数種のバイオマーカーまたはその断片の上方または下方モジュレーションから利益を得るはずである状態または障害、例えば、該バイオマーカーまたはその断片の望ましくない、不十分なまたは異常な発現または活性によって特徴付けられる障害に罹患した個体を処置する方法を提供する。一実施形態では、方法は、薬剤（例えば、本明細書で記載されるスクリーニングアッセイにより同定される薬剤）、またはバイオマーカーの発現もしくは活性をモジュレートする（例えば、上方調節または下方調節する）薬剤の組合せを投与するステップを伴う。別の実施形態では、方法は、低減した、異常な、または望ましくないバイオマーカーの発現または活性を補完する治療としての、１または複数のバイオマーカーポリペプチドまたは核酸分子を投与するステップを伴う。
【０３３０】
バイオマーカーが異常に下方調節されている状況、および／またはバイオマーカー活性の増加が、有益な効果を及ぼす可能性がある状況では、バイオマーカー活性の刺激が所望される。同様に、バイオマーカーが異常に上方調節されている状況、および／またはバイオマーカー活性の低下が、有益な効果を及ぼす可能性がある状況では、バイオマーカー活性の阻害が所望される。
【０３３１】
加えて、これらのモジュレート剤はまた、例えば、化学療法剤、ホルモン、抗血管新生剤（ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎ）、放射性標識化合物との組合せ治療において投与することもでき、手術、寒冷療法、および／または放射線治療との組合せ治療において投与することもできる。前出の処置法は、従来の治療の他の形態（例えば、当業者に周知のがんのための標準治療処置）と共に施行することができ、従来の治療と連続的に、その前に、またはその後に施行することができる。例えば、このようなモジュレート剤は、治療有効用量の化学療法剤と共に投与することができる。別の実施形態では、このようなモジュレート剤は、化学療法と併せて投与されて、上記化学療法剤の活性および有効性を増強する。米医薬品便覧（Physicians’  Desk  Reference）（ＰＤＲ）は、様々ながんの処置において使用されてきた化学療法剤の投与量を開示する。治療に有効であるこのような上記の化学療法薬の投与レジメンおよび投与量は、処置されている特定のメラノーマ、疾患の程度、および当業者である医師であれば熟知しており、該医師が決定することができる他の因子に依存する。
【０３３２】
６．医薬組成物
別の態様では、本発明は、１種または複数種の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤と併せて製剤化された、バイオマーカー発現および／または活性をモジュレート（例えば、低減）する治療有効量の薬剤を含む、薬学的に許容される組成物を提供する。詳細に以下に記載する通り、本発明の医薬組成物は、以下：（１）経口投与、例えば、水薬（水性または非水性の液剤または懸濁剤）、錠剤、ボーラス剤、粉剤・散剤（powder）、顆粒剤、ペースト剤；（２）例えば、滅菌液剤もしくは懸濁剤としての、例えば、皮下、筋内もしくは静脈内注射による、非経口投与；（３）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏もしくはスプレーとしての、局所適用；（４）例えば、ペッサリー剤、クリーム剤もしくはフォーム剤として、腟内投与もしくは直腸内投与または（５）例えば、水性エアゾール剤としてのエアゾール剤、リポソーム調製物、もしくは上記化合物を含有する固体粒子に適合させたものを含む、固体形態または液体形態での投与のために、特別に製剤化することができる。
【０３３３】
本明細書で使用される「治療有効量」という語句は、いくらかの所望の治療効果、例えば、がん処置を生じるのに有効な、バイオマーカー発現および／または活性を妥当なベネフィット／リスク比でモジュレート（例えば、阻害）する薬剤の量を意味する。
【０３３４】
本明細書では、「薬学的に許容される」という語句は、健全な医療判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適し、妥当なベネフィット／リスク比に適う、薬剤、材料、組成物、および／または剤形を指すように用いられる。
【０３３５】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語句は、対象の化学物質を、１つの臓器または身体の部分から、別の臓器または身体の部分へと運ぶかまたは輸送することに関与する、液体または固体の、充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入材料など、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、対象に対して傷害性でないという意味で、「許容可能」でなければならない。薬学的に許容される担体として用いられうる材料の一部の例は、（１）ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；（２）トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンなどのデンプン；（３）セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなど、その誘導体；（４）粉末トラガント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）滑石；（８）カカオ脂および坐剤用の蝋などの賦形剤；（９）ラッカセイ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質非含有水；（１７）等張性食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝化溶液；ならびに（２１）医薬製剤中で利用される、他の非毒性の適合性物質を含む。
【０３３６】
「薬学的に許容される塩」という用語は、バイオマーカー発現および／または活性をモジュレート（例えば、阻害）する薬剤の相対的に非毒性の無機酸付加塩および有機酸付加塩を指す。このような塩は、呼吸脱共役剤（respiration  uncoupling  agent）の最終単離および精製の間にｉｎ  ｓｉｔｕで、またはその遊離塩基形態の精製された呼吸脱共役剤を適切な有機酸もしくは無機酸と別々に反応させ、このようにして形成された塩を単離することにより、調製することができる。代表的な塩は、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナプチル酸塩（napthylate）、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩およびラウリルスルホン酸塩などを含む（例えば、Bergeら（１９７７年）「Pharmaceutical  Salts」J.  Pharm.  Sci.６６巻：１〜１９頁を参照されたい）。
【０３３７】
他の場合では、本発明の方法において有用な薬剤は、１種または複数種の酸性官能基を含有することができ、よって、薬学的に許容される塩基との薬学的に許容される塩を形成することができる。このような例における「薬学的に許容される塩」という用語は、バイオマーカー発現をモジュレート（例えば、阻害）する薬剤の相対的に非毒性の無機塩基付加塩および有機塩基付加塩を指す。このような塩は同様に、呼吸脱共役剤の最終単離および精製の間にｉｎ  ｓｉｔｕで、またはその遊離酸形態の精製された呼吸脱共役剤を、薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩もしくは炭酸水素塩などの適切な塩基と、アンモニアと、もしくは薬学的に許容される有機一級、二級もしくは三級アミンと別々に反応させることにより、調製することができる。代表的アルカリ塩またはアルカリ土類塩は、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩およびアルミニウム塩などを含む。塩基付加塩の形成に有用な代表的有機アミンは、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどを含む（例えば、Bergeら、前出を参照されたい）。
【０３３８】
ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなど、湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および香料、保存剤および抗酸化剤が、上記組成物中に存在することもできる。
【０３３９】
薬学的に許容される抗酸化剤の例は：（１）アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど、油溶性抗酸化剤；および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など、金属キレート剤を含む。
【０３４０】
本発明の方法において有用な製剤は、経口、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、直腸、膣、エアゾール、および／または非経口投与に適する製剤を含む。製剤は、単位剤形で好都合に提示することができ、製薬技術分野で周知の任意の方法により調製することができる。単一の剤形を作製するのに、担体材料と組み合わされうる有効成分の量は、処置される宿主、特定の投与方式に応じて変動するであろう。単一の剤形を作製するのに、担体材料と組み合わされうる有効成分の量は一般に、治療効果をもたらす化合物の量であろう。一般に、１００パーセントのうち、この量は、約１パーセント〜約９９パーセントの有効成分の範囲であり、好ましくは約５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント〜約３０パーセントの範囲であろう。
【０３４１】
このような製剤または組成物を調製する方法は、バイオマーカー発現および／または活性をモジュレート（例えば、阻害）する薬剤を、担体および必要に応じて１種または複数種のアクセサリー成分と会合させるステップを含む。一般に、上記製剤は、呼吸脱共役剤を液体担体もしくは微粉化固体担体またはその両方と均一にかつ密接に会合させ、次いで必要であれば、産物を成形することにより調製される。
【０３４２】
経口投与に適した製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、トローチ剤（風味付けされた基剤、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガントを使用）、粉剤・散剤、顆粒剤、または水性もしくは非水性液体での液剤もしくは懸濁剤として、または水中油型もしくは油中水型液体エマルジョンとして、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、または香錠（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなど、不活性基剤を使用）として、および／または洗口液などとしての形態であってよく、これらはそれぞれ、活性成分として所定量の呼吸脱共役剤を含有する。化合物は、ボーラス剤、舐剤またはペースト剤として投与することもできる。
【０３４３】
経口投与のための固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉剤・散剤、顆粒剤など）において、上記活性成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなど、１種または複数種の薬学的に許容される担体、および／または次のうちのいずれかと混合される：（１）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよび／またはケイ酸など、充填剤または増量剤；（２）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなど、結合剤；（３）グリセロールなど、保水剤；（４）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩および炭酸ナトリウムなど、崩壊剤；（５）パラフィンなど、溶解遅延剤；（６）四級アンモニウム化合物など、吸収加速剤；（７）例えば、アセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなど、湿潤剤；（８）カオリンおよびベントナイト粘土など、吸収剤；（９）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物など、滑沢剤；ならびに（１０）着色剤。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、上記医薬組成物は、緩衝剤を含むこともできる。同様の型の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖などの賦形剤および高分子量ポリエチレングリコールなどを使用して、軟および硬充填ゼラチンカプセルにおいて充填剤として用いることもできる。
【０３４４】
錠剤は、圧縮または成形によって、必要に応じて１種または複数種のアクセサリー成分と共に作ることができる。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散化剤を使用して調製することができる。成形錠剤は、適切な機械において、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化ペプチドまたはペプチド模倣剤の混合物を成形することにより作ることができる。
【０３４５】
錠剤、ならびに糖衣錠、カプセル剤、丸剤および顆粒剤などの他の固体剤形は、必要に応じて切れ目を入れる（score）ことができる、または腸溶コーティングおよび医薬品製剤化技術分野で周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルにより調製することができる。これらは、例えば、所望の放出プロファイルをもたらすように様々な比率のヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはマイクロスフェアを使用して、その中にある上記活性成分の緩徐または制御放出をもたらすように製剤化することもできる。これらは、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、または使用直前に滅菌水または他のいくつかの滅菌注射用媒体に溶解することができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み入れることにより、滅菌することができる。このような組成物は、乳白剤を必要に応じて含有することもでき、必要に応じて遅延様式にて、胃腸管のある特定の部分において活性成分（複数可）のみをまたはそれを優先的に放出する組成物のものであってよい。使用することができる包埋組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを含む。上記活性成分は、適切であれば、上記の賦形剤の１種または複数種と共に、マイクロカプセル化形態であってもよい。
【０３４６】
経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤を含む。上記活性成分に加えて、上記液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物など、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含有することができる。
【０３４７】
不活性希釈剤に加えて、上記経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤、着色料、香料および保存剤など、アジュバントを含むこともできる。
【０３４８】
懸濁剤は、活性薬剤に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガント、ならびにこれらの混合物など、懸濁化剤を含有することができる。
【０３４９】
直腸または腟投与のための製剤は、坐剤として提示することができ、これは、１種または複数種の呼吸脱共役剤を、例えば、カカオバター、ポリエチレングリコール、坐剤用ワックスまたはサリチル酸塩を含む１種または複数種の適切な非刺激性賦形剤または担体と混合することにより調製することができ、これは、室温で固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸または腟腔内で融解し、上記活性薬剤を放出する。
【０３５０】
腟投与に適した製剤は、適切であることが当技術分野で公知のこのような担体を含有する、ペッサリー製剤、タンポン製剤、クリーム製剤、ゲル製剤、ペースト製剤、フォーム製剤またはスプレー製剤も含む。
【０３５１】
バイオマーカー発現および／または活性をモジュレート（例えば、阻害）する薬剤の局所または経皮投与のための剤形は、粉剤・散剤、スプレー剤、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチ剤および吸入薬を含む。活性成分は、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体と、また、要求され得る任意の保存剤、緩衝剤または噴霧剤と混合することができる。
【０３５２】
軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤およびゲル剤は、呼吸脱共役剤に加えて、動物および植物脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクならびに酸化亜鉛、またはこれらの混合物などの賦形剤を含有することができる。
【０３５３】
粉剤・散剤およびスプレー剤は、バイオマーカー発現および／または活性をモジュレート（例えば、阻害）する薬剤に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有することができる。スプレー剤は、その上、クロロフルオロ炭化水素ならびにブタンおよびプロパンなどの揮発性非置換炭化水素などの通例の噴霧剤を含有することができる。
【０３５４】
バイオマーカー発現および／または活性をモジュレート（例えば、阻害）する薬剤は、あるいは、エアゾールによって投与することができる。これは、上記化合物を含有する水性エアゾール、リポソーム調製物または固体粒子を調製することにより達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴霧剤）懸濁液を使用することができる。音波ネブライザーが好まれる。なぜなら、音波ネブライザーは、上記化合物の分解を生じうる剪断への上記薬剤の曝露を最小化するからである。
【０３５５】
通常、水性エアゾールは、従来の薬学的に許容される担体および安定剤と共に、上記薬剤の水性溶液または懸濁液を製剤化することにより作られる。上記担体および安定剤は、特定の化合物の要件により様々であるが、典型的に、非イオン性界面活性物質（Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃまたはポリエチレングリコール）、血清アルブミンのような無害のタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、グリシンなどのアミノ酸、バッファ、塩、糖または糖アルコールを含む。エアゾールは一般に、等張性溶液から調製される。
【０３５６】
経皮パッチは、身体への呼吸脱共役剤の制御された送達をもたらす追加的な利点を有する。このような剤形は、適切な媒体に上記薬剤を溶解または分散させることにより作ることができる。吸収促進剤を使用して、皮膚を横切るペプチド模倣剤のフラックスを増加させることもできる。このようなフラックスの速度は、速度制御膜を提供すること、またはポリマーマトリックスもしくはゲルにペプチド模倣剤を分散させることのいずれかにより制御することができる。
【０３５７】
眼科製剤、眼軟膏剤、粉剤・散剤、液剤なども、本発明の範囲内であると想定される。
【０３５８】
非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質、または懸濁化剤または増粘剤を含有することができる、１種または複数種の薬学的に許容される滅菌等張性水性もしくは非水性液剤、分散剤、懸濁剤もしくはエマルジョン、または使用直前に滅菌注射用溶液もしくは分散液へと再構成され得る滅菌粉末と組み合わせた、１種または複数種の呼吸脱共役剤を含む。
【０３５９】
本発明の医薬組成物において用いることができる適切な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）およびこれらの適した混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルを含む。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合は要求される粒径の維持により、また、界面活性物質の使用により維持することができる。
【０３６０】
このような組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散化剤など、アジュバントを含有することもできる。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含により確実にすることができる。上記組成物中に、例えば、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが所望される場合もある。加えて、注射用医薬品形態の吸収の延長は、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンなど、吸収を遅延させる剤の包含によってもたらすことができる。
【０３６１】
一部の場合では、薬物の効果を延長させるために、皮下または筋肉内注射からの該薬物の吸収を緩徐化することが所望される。これは、不十分な水溶性を有する結晶性またはアモルファス材料の液体懸濁液の使用によって達成することができる。そこで、薬物の吸収の速度は、その溶解速度に依存し、これは続いて、結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与される薬物形態の遅延吸収は、油ビヒクルに該薬物を溶解または懸濁することにより達成される。
【０３６２】
注射用デポー形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマーにおいて、バイオマーカー発現および／または活性をモジュレート（例えば、阻害）する薬剤のマイクロカプセル（microencapsule）マトリックスを形成することにより作られる。薬物のポリマーに対する比、および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）を含む。デポー注射用製剤は、身体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョン中に上記薬物を捕捉することによっても調製される。
【０３６３】
本発明の呼吸脱共役剤は、医薬品としてヒトおよび動物に投与される場合、それ自体で、または例えば、薬学的に許容される担体と組み合わせた０．１〜９９．５％（より好ましくは、０．５〜９０％）の活性成分を含有する医薬組成物として与えることができる。
【０３６４】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、特定の対象に対する毒性を伴わない、該対象、組成物および投与方式にとって所望の治療応答の達成に有効な活性成分の量を得るために、本発明の方法によって決定することができる。
【０３６５】
本発明の核酸分子は、ベクターに挿入することができ、遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。遺伝子治療用ベクターは、対象に、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照されたい）、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４年）、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９１巻：３０５４〜３０５７頁を参照されたい）により送達することができる。遺伝子治療用ベクターによる医薬調製物は、許容可能な希釈剤中に遺伝子治療用ベクターを含む場合もあり、遺伝子送達ビヒクルを包埋した緩徐放出マトリックスを含む場合もある。代替的に、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターを、組換え細胞から、無傷で作製しうる場合、医薬調製物は、遺伝子送達系をもたらす、１または複数の細胞を含みうる。
【０３６６】
本発明はまた、本明細書で記載されるバイオマーカーを検出および／またはモジュレートするためのキットも包含する。本発明のキットはまた、本明細書で提示される、開示される発明の方法における、開示される発明のキットまたは抗体の使用を開示または記載する指示材料も含みうる。キットはまた、キットがデザインされる特定の適用を容易とする、さらなる構成要素も含みうる。例えば、キットは加えて、標識を検出する手段（例えば、酵素標識のための酵素基質、蛍光の標識、ヒツジ抗マウス−ＨＲＰなどの適切な二次標識を検出するフィルターセットなど）、および対照（例えば、対照生体試料または標準物質）のために必要な試薬を含有しうる。キットは加えて、開示される発明の方法における使用のための、認知された緩衝液および他の試薬を含みうる。非限定的な例は、担体タンパク質または洗浄剤など、非特異的結合を低減する薬剤を含む。
【０３６７】
以下の実施例では、本発明の他の実施形態について記載する。本発明を、以下の実施例によりさらに例示するが、これらは、さらに限定的を加えるものとみなされるべきでない。
【実施例】
【０３６８】
（実施例１）
実施例２〜８の材料と方法
ａ．細胞系および細胞培養
以前に記載された通りに、ＦＬＴ３−ＩＴＤ含有ＭＳＣＶレトロウイルスまたはＦＬＴ３−Ｄ８３５Ｙ含有ＭＳＣＶレトロウイルスを、ＩＬ−３依存性マウス造血細胞系Ｂａ／Ｆ３にトランスフェクトした（Kellyら、２００２年）。Ｎｏｍｏ−１、Ｐ３１−ＦＵＪおよびＮＢ４は、Ｇａｒｙ  Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ博士から得た。ＭＶ４，１１細胞は、Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｌｅｔａｉ博士から得た。Ｈｅｌ細胞、Ｋ５６２細胞、ＴＨＰ細胞、Ｕ９３７細胞、ＴＦ−１細胞およびＫ０５２細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American  Type  Culture  Collection）（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入した。ヒトＡＭＬ由来のＦＬＴ３−ＩＴＤ発現系統、ＭＯＬＭ１４（Matsuoら、１９９７年）は、Ｓｃｏｔｔ  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ博士、Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＤＦＣＩ）、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡによって本発明者らに提供された。ヒトＡＭＬ由来のＦＬＴ３−ＩＴＤ発現細胞系、ＭＯＬＭ−１３（ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌ））は、以前に記載された通りに、ＶＳＶＧ−シュードタイプ化レトロウイルスによる形質導入によって、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼに融合させたルシフェラーゼ（ｐＭＭＰ−ＬｕｃＮｅｏ）を発現するように操作された（Armstrongら、２００３年）。本研究において使用された全細胞系は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有し、２％  Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）中２×１０５〜５×１０５の濃度で、５％  ＣＯ２、３７℃にて培養した。例外として、ＴＦ−１細胞およびＯＣＩ−ＡＭＬ５細胞が挙げられ、これらは、１０％ＦＢＳを含有し、２％  Ｌ−グルタミンおよび１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐおよびヒトＧＭ−ＣＳＦ（２ｎｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ培地において培養した。親Ｂａ／Ｆ３細胞は、１０％  ＦＢＳを含有し、２％  Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（streptomcyin）と共に１５％ＷＥＨＩ（ＩＬ−３の供給源として）を補充したＲＰＭＩにおいて培養した。細胞系は、細胞系認証のために提出し、細胞系の短いタンデム反復（ＳＴＲ）プロファイリング（ＤＤＣ  Ｍｅｄｉｃａｌ、Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ、ＯＨおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）により原稿準備の６カ月以内に認証された。調べた全細胞系は、ＡＴＣＣまたはＤＳＭＺ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｂａｎｋ  ＳＴＲに列挙されている系統と≧８０％マッチした。全細胞系は、ウイルスおよびマイコプラズマフリーであると確認された。ＰＢＭＣは、ありがたいことに、Ｓｔｅｖｅｎ  Ｔｒｅｏｎ博士およびＧｕａｎｇ  Ｙａｎｇ博士によって提供された。
【０３６９】
ｂ．化学的化合物および生物学的試薬
ＤＵＢ阻害剤のＨＢＸ１９８１８、Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１は、Ｍｅｄｃｈｅｍ  Ｅｘｐｒｅｓｓから購入し、ＤＭＳＯに溶解して、１０ｍＭストック溶液を得た。ＨＢＸ１９８１８アナログは、ＣｈｅｍＤｉｖから購入し、ＤＭＳＯに溶解して、１０ｍＭストック溶液を得た。次に、段階希釈物を作製して、細胞アッセイのための最終希釈物を得たが、ＤＭＳＯの最終濃度は０．１％を超えない。
【０３７０】
ｃ．ＨＡ−ユビキチン−ビニルメチルスルホン（ＨＡ−Ｕｂ−ＶＳ）による標識
ＭＯＬＭ１４細胞は、Ｐ２２０７７で３時間処置し、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞は、ＨＢＸ−１９８１８で７時間処置した。細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、１％ＮＰ−４０、１０％グリセロール、２％オルトバナジン酸ナトリウムおよびＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に溶解した。１％ＤＴＴを含有する３０ｕＬ溶解緩衝液中５０ｕｇとなるようにライセートを希釈し、氷上で１５分間インキュベートした。０．２５ｕｇ  ＨＡ−Ｕｂ−ＶＳを添加し、試料を室温で３０分間穏やかに揺らし、次いで、ＬＤＳ試料緩衝液により変性させた。１２ｕｇライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に転写し、ミルク中でブロッキングし、ＵＳＰ１０抗体（Ｄ７Ａ５）（ウサギ、＃８５０１）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）で処置した。洗浄後に、上記膜を７８０−ｎｍ  ＩＲｄｙｅヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｌｉｃｏｒ）で処置し、Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナ（Ｌｉｃｏｒ）を使用してイメージングした。
【０３７１】
ｄ．定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
Ｂａ／Ｆ３細胞を表示化合物で２３時間処置し、次いで採取し、ＰＢＳで洗浄した。ＲＮＥａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してｍＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＳｉｍｐｌｉＡｍｐ（商標）サーマルサイクラー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してｃＤＮＡに変換した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）７５００  ＦＡＳＴリアルタイムＰＣＲシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、９６ウェルプレートにおいてリアルタイムＰＣＲを実行した。相対的遺伝子発現は、ＧＡＰＤＨ参照プローブとの比較により計算した。
【０３７２】
ｅ．クロロキンレスキュー
細胞を２４ウェルプレートに入れ、２５ｕＭクロロキンを添加した。６０分後に、表示濃度のＨＢＸ−１９８１８またはＰ２２０７７を添加した。それぞれＰ２２０７７またはＨＢＸ−１９８１８について３または７時間後に、細胞を採取し、１×ＰＢＳで洗浄し、溶解した。３０ｕｇライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜に転写し、ミルク中でブロッキングし、ＦＬＴ３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）で処置した。洗浄後に、上記膜を、西洋わさびペルオキシダーゼをコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧで処置し、Ｐｅｉｒｃｅ  ＥＣＬウエスタンブロッティング基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と共にインキュベートし、暗室内でイメージングした。
【０３７３】
ｆ．ユビキチンＡＭＣアッセイ
タンパク質発現および精製。ｐＥＴ２８ａベクターにおける残基３７６〜７９８を網羅するヒトＵＳＰ１０の構築物を、５０ｍｇ／ｍｌのカナマイシンの存在下、ＴＢ培地中のＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）において過剰発現させた。ＯＤ０．８まで細胞を３７℃で成長させ、１７℃に冷却し、５００μＭイソプロピル−１−チオ−Ｄ−ガラクトピラノシドで誘導し、１７℃で一晩インキュベートし、遠心分離によって回収し、−８０℃で保存した。緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭイミダゾールおよび３ｍＭ  ＢＭＥ）において細胞ペレットを超音波処理し、その結果得られるライセートを３０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）をライセート上清と３０分間混合し、緩衝液Ａで洗浄した。ビーズをＦＰＬＣ適合性カラムに移し、結合したタンパク質を１５％緩衝液Ｂ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、３００ｍＭイミダゾールおよび３ｍＭ  ＢＭＥ）で洗浄し、１００％緩衝液Ｂで溶出した。溶出したタンパク質にトロンビンを添加し、４℃で一晩インキュベートした。次に、その試料を、イミダゾールなしの緩衝液Ａであらかじめ平衡化したＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通し、溶出したタンパク質を２回目のＮｉ−ＮＴＡステップに供して、Ｈｉｓ−タグおよびトロンビンを除去した。溶離液を濃縮し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含有する緩衝液中のＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００  １０／３００ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通した。画分をプールし、２０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、−８０℃で凍結した。
【０３７４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＵＳＰ１０活性アッセイ。組換えＵＳＰ１０、残基３７６〜７９８を、阻害剤の存在または非存在下、ユビキチン−ＡＭＣアッセイにおいてその活性に関して調べた。このアッセイのため、１０ｎＭ  ＵＳＰ１０を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１１ｕＭオボアルブミンおよび５ｍＭ  ＤＴＴ中、異なる濃度の阻害剤または対照としてのＤＭＳＯと共にプレインキュベートした。反応物を６時間室温でインキュベートし、その後、２ｕＭユビキチン−ＡＭＣ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）基質を添加した。それぞれ３４５および４４５ｎｍの励起および発光波長でＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ（登録商標）蛍光プレートリーダーを使用して、３０分間の期間にわたって１分間間隔で蛍光データを回収することにより、上記反応物の初期速度を測定した。計算された初期速度値を阻害剤濃度に対してプロットしてＩＣ５０値を決定した。
【０３７５】
ｇ．抗体、イムノブロッティングおよび免疫沈降
次の抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）から購入した：総ＡＫＴ（ウサギ、＃９２７２）および総ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（３Ａ７）（マウス、＃９１０７）は、１：１０００希釈で使用した。抗ＧＡＰＤＨ（Ｄ１６Ｈ−１１）ＸＰ（Ｒ）（ウサギｍＡｂ、＃５１７４）は、１：１０００希釈で使用した。ベクリン−１（ウサギ、＃３７３８）は、１：１０００で使用した。ＵＳＰ１０（Ｄ７Ａ５）（ウサギ、＃８５０１）は、１：１０００希釈で使用した。Ｐ５３（ウサギ、＃９２８２）は、１：１０００希釈で使用した。β−チューブリン（ウサギ、＃２１４６ｓ）は、１：１０００で使用した。
【０３７６】
ＦＬＴ３／Ｆｌｋ−２（Ｃ−２０）（ｓｃ−４７９）およびＵｂ（Ｐ４Ｄ１）（マウス、ｓｃ−８０１７）は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）から購入し、イムノブロッティングのために１：１０００希釈で使用した。抗ｐＴｙｒ（マウス、クローン４Ｇ１０）は、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）から購入し、１：１０００希釈で使用した。抗ＨＡＵＳＰ／ＵＳＰ７抗体（ウサギ、ａｂ４０８０）および抗ユビキチン抗体（ウサギ、ａｂ７７８０）は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から購入し、１：１０００希釈で使用した。
【０３７７】
タンパク質ライセート調製、イムノブロッティングおよび免疫沈降は、Weisbergら（２００２年）Cancer  Cell  １巻：４３３〜４４３頁において以前に記載された通りに実行した。
【０３７８】
ｈ．２９３Ｔ細胞のＰＥＩトランスフェクション
１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭにおいて、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター内でＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞を培養し、製造元の指示に従ってポリエチレンイミン（polyethylenimine）（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してトランスフェクトした。１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地において、３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーター内でＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞およびＭＯＬＭ１４細胞を維持した。内在性ユビキチン化アッセイのため、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞またはＭＯＬＭ１４細胞を、０、５、１０もしくは２０μＭのＨＢＸ１９８１８もしくはＰ２２０７７、またはＤＭＳＯ対照で、４または２４時間処置した。次に、細胞を回収し、溶解した。抗ＦＬＴ３抗体を使用して免疫沈降を実行した。抗ユビキチン抗体または抗ＦＬＴ３抗体を使用してイムノブロットを解析した。
【０３７９】
ｉ．薬物組合せ研究
薬物組合せ研究のため、トリパンブルー排除アッセイを使用して細胞生存率をまず決定して、細胞播種のために細胞を定量し、次いで増殖研究のためにＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を実行した。固定比率で同時に単剤を細胞に添加した。細胞生存率は、対照細胞と対比した、成長に影響を与えた（ＦＡ）薬物処置の関数として表現した；データは、相乗作用測定に活用され、アイソボログラム生成およびＣｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙの方法（１９８４年）（ＲＥＦ）に基づく、Ｃａｌｃｕｓｙｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、ＭＯおよびＣａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）によって解析した。この方法は、半有効（median  effect）原理を活用して、薬物組合せの効果を定量して、薬物組合せが、個々の効果の単純な合計から予測されるものよりも優れた効果を一緒になって与えるかどうかを決定する。各薬物のＥＤ５０またはＩＣ５０を決定した後に、組合せを研究したところ、濃度は、ＥＤ／ＩＣ５０の倍数または分数であった。本明細書に記載されている相乗作用研究のため、各薬物のＩＣ５０値（これは、薬物組合せに適切な比を選択するために一般的に使用されている）に基づき、薬物毎の濃度を単独でおよび一緒に使用した。特に、ＤＵＢ阻害剤およびキナーゼ阻害剤の濃度を次の通り単独でおよび組み合わせて調べた：０．２５×ＩＣ５０、０．５×ＩＣ５０、ＩＣ５０、２×ＩＣ５０および４×ＩＣ５０。Ｃａｌｃｕｓｙｎプログラム生成された組合せ指数（ＣＩ）値は、相乗性の定量的測定を可能にし、ここで、相乗性は、ＣＩ＜１によって定義され、相加効果は、ＣＩ＝１によって定義され、アンタゴニズムは、ＣＩ＞１によって定義される。統計解析は、自動的に算出の一部である。
【０３８０】
ｊ．ｓｈＲＮＡによる遺伝子のノックダウン（ＫＤ）
ＵＳＰ１０およびＵＳＰ７に対するｐＬＫＯ．１ｐｕｒｏレンチウイルスｓｈＲＮＡベクター粒子は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。細胞を、８μｇ／ｍｌポリブレン（登録商標）の存在下で上記ウイルス粒子と共に２４時間インキュベートし、該細胞を１〜２μｇ／ｍｌピューロマイシンにより７２時間選択した。選択後に、細胞を記載されている研究のために使用した。
【０３８１】
ＭＯＬＭ１４細胞における反復ＵＳＰ１０ノックダウン研究：ＬＥＮＴＩ−Ｘ濃縮器（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して濃縮された、ｐｓＰＡＸ２（ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２６０）およびｐＭＤ２．Ｇ（ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５９）と一緒にｐＬＫＯ．１含有ｓｈＲＮＡまたはスクランブル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入）をコトランスフェクトしてウイルス粒子を産生した。続いて、５ｕｇ／ｍｌポリブレンの存在下、ＭＯＬＭ１４細胞に感染させ、１ｕｇ／ｍｌピューロマイシンを使用して、感染４８時間後に選択を開始した。
【０３８２】
ｋ．動的ＢＨ３プロファイリング（ＤＢＰ）
ミトコンドリアプライミングの薬物誘導性変化を決定するために、Monteroら（２０１５年）Cell  １６０巻：９７７〜９８９頁およびPanら（２０１４年）Cancer  Discov.４巻：３６２〜３７５頁に以前に記載された通りに、動的ＢＨ３プロファイリングを行った。略述すると、０．４×１０６細胞／ウェルを薬物処置に１４時間曝露した。インキュベーション時間の終わりに、細胞をＰＢＳで洗浄し、５００×ｇで５分間ペレットとし、ＭＥＢ緩衝液に再懸濁した。２０μｇ／ｍＬジギトニンおよびその最終濃度の２倍のＢＨ３ペプチドを含有する１５μｌのＭＥＢ緩衝液を含有する３８４ウェルプレートの各ウェルに、１５μｌの細胞懸濁液を添加し、この混合物を６０分間２６℃でインキュベートして、ミトコンドリア脱分極させた。次に、１０μｌのＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドを１５分間添加し、続いてＮ２緩衝液（１．７Ｍ  Ｔｒｉｓ、１．２５Ｍグリシン、ｐＨ９．１）により１０分間中和することにより、ペプチド曝露を終結した。チトクロムＣレベルを決定するために、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７にコンジュゲートされた抗チトクロムＣクローン６Ｈ２．Ｂ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を１０×染色緩衝液（ＰＢＳ中の１０％ＢＳＡ、２％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．０２％アジ化ナトリウム）に１：５０希釈し、１：４００の最終希釈のため、この抗体含有緩衝液のうち１０μｌを各ウェルに添加した。細胞を暗所にて一晩４℃で染色し、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）分析計（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）においてデータを取得した。プライミング変化（Δ）は、処置細胞におけるチトクロムＣ存在量を、ＤＭＳＯ処置対照細胞のそれと比較することにより計算した。
【０３８３】
ｌ．プリマグラフト研究
全動物研究は、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの施設内実験動物委員会（Institutional  Animal  Care  and  Use  Committee）に承認されたプロトコールに従って行った。白血病負荷が、末梢血におけるパーセント二重陽性ＣＤ４５＋ＣＤ３３＋細胞によって決定される次のレベルに達したら、雌ＮＳＧマウス（６週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）に、総計２１日間、ビヒクル（１０％ＤＭＳＯ、＋９０％Ｄ５Ｗ  ＩＰ  ＱＤ）（ｎ＝３）またはＰ２２０７７、１５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ  ＱＤ（１０％ＤＭＳＯに溶解、＋９０％Ｄ５Ｗ）（ｎ＝３）のいずれかを投与した：２Ｅ＃０（ビヒクル）（３．０７％）、２Ｅ＃１（ビヒクル）（０．３４％）、２Ｅ＃３０（ビヒクル）（１．６３％）、２Ｄ＃０（Ｐ２２０７７、１５ｍｇ／ｋｇ）（４．６８％）、２Ｄ＃１（Ｐ２２０７７、１５ｍｇ／ｋｇ）（１．５％）、２Ｅ＃１０（Ｐ２２０７７、１５ｍｇ／ｋｇ）（０．２９％）。処置２１日目にマウスを屠殺した。骨髄をマウス大腿骨から流し出し、脾臓および肝臓を切開し、まずホルマリンに保存し、続いて２４時間後、７０％エタノールに保存した。２１日処置期間、１５ｍｇ／ｋｇのＰ２２０７７は全般に良好に忍容し、体重にはほとんど変化がなかった（ビヒクル処置およびＰ２２０７７処置の両方で平均約２〜３ｇの減少；マウスのうち、１５％より多く体重減少したマウスはいなかった）。本明細書に記載されている研究で使用した全ＡＭＬプリマグラフト試料は、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ（ｐｒｏｘｅ．ｏｒｇ）により得た。
【０３８４】
ｍ．非侵襲性ｉｎ  ｖｉｖｏバイオルミネセンス研究
全動物研究は、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの施設内実験動物委員会によって承認されたプロトコールに従って行った。Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞に、ＰＭＳＣＶ  ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）中にクローニングされたホタルルシフェラーゼコード領域（ｐＧＬ３ベーシック由来；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）で構成されたＶＳＶＧ−シュードタイプ化レトロウイルスを形質導入した。Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ（ｌｕｃ＋）細胞系を産生するように、細胞をネオマイシン選択した。Weisbergら（２００５年）Cancer  Cell  ７巻：１２９〜１４１頁に以前に記載された通りに、バイオルミネセンスイメージングを実行した。略述すると、雌ＮＣＲ−ヌードマウス（６〜８週齢；Ｔａｃｏｎｉｃ、ＮＹ）への投与のため、ウイルスおよびマイコプラズマフリーＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋細胞を洗浄し、１×ＰＢＳに再懸濁し、ＩＶ尾静脈注射により投与した（０．５×１０６細胞／２５０ｕＬ）。処置群当たり８匹以上のマウスの試料サイズを選択して、統計的有意性を確実にした。細胞注射２日後に処置を開始し、ＩＶ注射２日後に麻酔した（anesthesized）マウスをイメージングして、マッチした腫瘍負荷を有する処置コホートの確立に使用されるベースラインを生成し（マウスを無作為化し、研究者を群割り当てに関して盲検化した）、Armstrongら（２００３年）Cancer  Cell  ３巻：１７３〜１８３頁に以前に記載された通りに、全身ルミネセンスを測定した。マウスをビヒクル（１０％ＤＭＳＯ、＋９０％Ｄ５Ｗ  ＩＰ  ＱＤ）（ｎ＝５）、Ｐ２２０７７（１５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ  ＱＤ）（ｎ＝６）またはＰ２２０７７（５０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ  ＱＤ）（ｎ＝６）で表示時間処置した。マウスをビヒクル（９０％［２０％］ＨＰＢＣＤ−１０％ＤＭＳＯ、ＩＰ  ＢＩＤ）（ｎ＝８）、Ｐ２２０７７（５０ｍｇ／ｋｇ、９０％［２０％］ＨＰＢＣＤ−１０％ＤＭＳＯ、ＩＰ  ＢＩＤ）（ｎ＝８）、Ｐ２２０７７（５０ｍｇ／ｋｇ、９０％ＰＥＧ３００−１０％ＮＭＰ）で表示時間処置した。注：全時点にわたってビヒクル処置群における他の７匹のビヒクルマウスよりも≧１０倍低い白血病負荷を示した１匹のビヒクルマウスは、最終統計解析から外れ値として除去した。１匹のＰ２２０７７（ＰＯ、ＱＤ）処置マウスは、処置とは無関係の技術的合併症により早くに死に、結果的に、この処置群の他の７匹のマウスと一緒にイメージングしなかった。
【０３８５】
ビヒクル処置およびＰ２２０７７処置マウスにおけるＦＬＴ３タンパク質レベルのｉｎ  ｖｉｖｏ評価のため、８匹の雌ＮＣＲ−ヌードマウス（６〜８週齢；Ｔａｃｏｎｉｃ、ＮＹ）に、上記の通り、尾静脈注射によりＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋細胞を投与した。マウスをイメージングし、２日後に無作為化して、マッチした腫瘍負荷を有する処置コホートの確立に使用されるベースラインを生成した。この時点で、マウスをビヒクル（９０％［２０％］ＨＰＢＣＤ−１０％ＤＭＳＯ、ＩＰ  ＢＩＤ）（ｎ＝４）またはＰ２２０７７（５０ｍｇ／ｋｇ、９０％［２０％］ＨＰＢＣＤ−１０％ＤＭＳＯ、ＩＰ  ＢＩＤ）（ｎ＝４）で総計４日間処置した。次に、ＣＤ１３５−ＰＥコンジュゲート抗体（Ｃａｔ．＃ＩＭ２２３４Ｕ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用したフローサイトメトリーによって、ＦＬＴ３レベルに関して骨髄細胞懸濁液を解析した。標準プロトコール（Weisbergら、２０１１年）に従って、以前に記載された通りにフローサイトメトリーを実行した。略述すると、ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）解析ソフトウェアを備えるＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメトリー機械を、ＦＬＴ３陽性細胞の百分率の解析に使用した。
【０３８６】
両側スチューデントｔ検定を使用することにより、２群間のバイオルミネセンスにおける統計的有意性を決定した。Ｐ＜０．０５が、統計的に有意であるとみなした。データは、同様の分散を有し、検定の仮定を満たした。
【０３８７】
ｎ．フローサイトメトリー
標準プロトコールに従って、Weisbergら（２０１１年）PLoS  One  ６巻：ｅ２５３５１頁に以前に記載された通りに、フローサイトメトリーを実行した。略述すると、ＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）解析ソフトウェアを備えるＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）フローサイトメトリー機械を、ＦＬＴ３陽性細胞の百分率を解析するために使用した。
【０３８８】
ｏ．増殖研究
トリパンブルー排除アッセイは、Weisbergら（２００２年）Cancer  Cell  １巻：４３３〜４４３頁に以前に記載されており、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイのための播種に先立つ細胞の定量に使用した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を増殖研究に使用し、製造元の指示に従って実行した。細胞生存率は、対照（無処置）細胞に対する百分率として報告し、エラーバーは、データ点毎の平均の標準誤差を表す。
【０３８９】
ｐ．ＡＭＬ患者細胞
変異体ＦＬＴ３を有すると同定されたＡＭＬ患者由来の試料から単核細胞を単離した。異なる濃度の単一および組み合わせた薬剤の存在下の液体培養（２０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ）における細胞を調べた。ＡＭＬ患者由来の全血液試料および骨髄試料は、Ｄａｎａ  Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ施設内審査委員会（Institutional  Review  Board）の承認の下に得た。
【０３９０】
ｒ．ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＤＵＢアッセイ
３１種のヒトＤＵＢを、異なる濃度で反応緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．００５％ＢＳＡ）において新鮮に希釈した（表１０を参照されたい）。ユビキチントポイソマー（Ｋ６３、Ｋ４８、Ｋ１１およびＭ１）を、０．２μｌ／μｇとなるようダイマー緩衝液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、０．００５％ＢＳＡ）において希釈し、固定濃度（１．５μＭ）で基質として使用した。酵素を１０μＭ最終濃度の化合物と共に３０分間室温でプレインキュベートした。０．４８μｌのジユビキチントポイソマーを反応混合物に添加して、反応を開始した。反応物を密封し、３０分間室温でインキュベートし、最終濃度２％（ｖ／ｖ）までＴＦＡを添加することにより停止した。新鮮プレートにおいて１．０５０μｌの各反応物をコピーし、内部標準として０．１５μｌの１６μＭ  １５Ｎ−ユビキチンをスパイクし、新鮮に調製された２．５  ＤＨＡＰマトリックスと１：１混合した（３７５ｍｌエタノールおよび１２５ｍｌの水性１２ｍｇ／ｍｌクエン酸水素二アンモニウム中の７．６ｍｇの２，５  ＤＨＡＰ）。反応物およびマトリックスを混合し、２００ｎｌの混合物を、ＭＴＰ  ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ  １，５３６  ＴＦ（６００ｍｍアンカー、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）上に二連でスポットした。
【０３９１】
Ｃｏｍｐａｓｓ  １．３制御および処理ソフトウェアを備えるＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）において、質量分析データを取得した。各解析前に試料キャリアにレーザーシューティングを最適化し集中させるようにした。１５Ｎ−Ｕｂピーク［Ｍ＋Ｈ］＋平均＝８，５６９．３）を使用して、各解析前に内部較正を行った。自動モードで試料を解析した（ＡｕｔｏＸｅｃｕｔｅ、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）。固定初期レーザー出力６０％（レーザー減衰器オフセット６８％、範囲３０％）による２−ｋＨｚ  ｓｍａｒｔｂｅａｍ−ＩＩソリッドステートレーザーによってイオン化を達成し、検出器ゲイン×１０でＦｌａｓｈＤｅｔｅｃｔｏｒによって検出した。反射器−１（２６．４５ｋＶ）および反射器−２（１３．４０ｋＶ）、イオン源（ＩｏｎＳｏｕｒｃｅ−１：２５．０ｋＶ、ＩｏｎＳｏｕｒｃｅ−２：２２．８７ｋＶ）およびパルスイオン抽出（３２０ｎｓ）のために最適化された電圧により反射器モードを使用した。「ランダムウォーク」において、また、「大（large）」ｓｍａｒｔｂｅａｍレーザー焦点により、３，５００ショットの量を合計した。スペクトルを１５Ｎ−Ｕｂ  ｍ／ｚにおいて自動的に較正し、非分解同位体分布（non-resolved  isotope  distribution）における再現性があるピークアノテーションのためのスムージング（Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙアルゴリズム）およびベースライン減算（「ＴｏｐＨａｔ」）を使用して処理した：１サイクル、幅について０．２ｍ／ｚ。面積計算のため、完全同位体分布を考慮に入れた。社内（in-house）で作られたスクリプトを使用して、−１５Ｎおよびモノユビキチン面積を報告した；グラフのプロット、標準偏差および変動係数（％）の計算は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌで処理した。
【０３９２】
【表１１−１】
2019534321.tif 000016
【表１１−２】
2019534321.tif 000017
【０３９３】
ｓ．ＭＯＬＭ１４細胞におけるＵＳＰ１０野生型および変異体の過剰発現
ＦＬＡＧ−ＨＡ−ＵＳＰ１０は、Ｗａｄｅ  Ｈａｒｐｅｒ研究室から寄贈された［Ａｄｄｇｅｎｅ（＃２２５４３）］（Sowaら、２００９年）。この構築物を使用して、製造元の指示に従った部位特異的変異誘発を使用して、対応するＵＳＰ１０触媒的に無効の（dead）構築物（ＵＳＰ１０  Ｃ４２４Ｓ）を作製した。２９３Ｔ細胞においてＧＡＧ／ＰＯＬおよびＶＳＶ−Ｇ含有ベクターと共にＵＳＰ１０  ＷＴ、Ｃ４２４Ｓまたは対照ベクターをコトランスフェクトしてウイルス粒子を産生し、ＬＥＮＴＩ−Ｘ濃縮器（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して濃縮した。次に、５ｕｇ／ｍｌポリブレンの存在下、ＭＯＬＭ１４細胞を感染させ、１ｕｇ／ｍｌピューロマイシンを使用して、感染４８時間後に選択を開始した。外因性ＵＳＰ１０の発現をＨＡブロットによって確認した。
【０３９４】
（実施例２）
変異体ＦＬＴ３依存性ＡＭＬの成長を選択的に阻害し、変異体ＦＬＴ３分解を誘導するＤＵＢ阻害剤のスクリーニングは、ＨＢＸ１９８１８を同定する
発癌性ＦＬＴ３のタンパク質恒常性を調節する新規標的および化合物を同定するために、ＤＵＢの幅広いパネルにわたる阻害活性をアノテートした、報告されるＤＵＢ阻害剤の大部分を表す、２９種の報告される小分子ＤＵＢ阻害剤（表１０）のホールセル表現型スクリーニング（Ritortoら（２０１４年）Nat.  Commun.５巻：４７６３頁）を、癌遺伝子依存性および対照細胞系を使用して行い、続いて、ヒット検証および標的デコンボリューションおよびトランスレーショナル研究を行った（図１Ａ）。ＩＬ−３依存性親Ｂａ／Ｆ３細胞よりも、ＦＬＴ３−ＩＴＤを発現する増殖因子非依存性Ｂａ／Ｆ３細胞およびＦＬＴ３−Ｄ８３５Ｙを発現するＢａ／Ｆ３細胞を選択的に死滅させる能力に関して化合物を評価した。報告されたＵＳＰ７阻害剤である、スクリーニング由来の上位ヒットであるＨＢＸ１９８１８（Reverdyら（２０１２年）Chem.  Biol.１９巻：４６７〜４７７頁）（図１Ｂ；示されているエチル基が、表８に示されている通りメチル基となるべきであることに留意されたい）は、約７２時間の処置後に、１桁のマイクロモル濃度範囲内のＥＣ５０（図１Ｃ〜図１Ｄ）、および親Ｂａ／Ｆ３細胞と比較して約２倍の治療ウィンドウで、ＦＬＴ３−ＩＴＤおよびＦＬＴ３−Ｄ８３５Ｙ陽性Ｂａ／Ｆ３細胞の増殖を阻害した。Ｂａ／Ｆ３−Ｄ８３５Ｙ細胞の成長に対する阻害効果は、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞よりも控えめであることが観察され、これは、約２２時間の細胞の処置後により明らかである（図１Ｅ）。ＨＢＸ１９８１８の抗増殖活性は、同じ濃度におけるＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３タンパク質の喪失（図１Ｆ）およびＢａ／Ｆ３−Ｄ８３５Ｙ細胞におけるＦＬＴ３タンパク質のより少ない喪失（図１Ｇ）と相関した。これらの結果と符合して、フローサイトメトリーは、ＨＢＸ１９８１８で処置したＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３の細胞表面発現の喪失を明らかにした（図２Ａ）。対照的に、ＦＬＴ３タンパク質レベルは、阻害剤処置野生型ＦＬＴ３−Ｂａ／Ｆ３細胞において変化しなかった（図１Ｈおよび図２Ｂ）。ＦＬＴ３−Ｄ８３５Ｙ陽性細胞系の欠如のために、その後の研究は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異に焦点を置いた。
【０３９５】
ＦＬＴ３変異体発現細胞に対するＨＢＸ１９８１８の効果は、Ｂａ／Ｆ３システムに固有でないことが確認された。例えば、ＨＢＸ１９８１８は、同じ範囲内の濃度による用量依存性様式で、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＡＭＬ細胞系のＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋、ＭＯＬＭ１４およびＭＶ４，１１の成長も抑制した（図１Ｉおよび表３）。変異体ＦＬＴ３に向けたＨＢＸ１９８１８の選択性は、２４時間の処置後に、野生型（ｗｔ）ＦＬＴ３またはヌルＦＬＴ３発現ヒト白血病系統のパネルと比較して、ＨＢＸ１９８１８に対する３種の変異体ＦＬＴ３発現（expessing）ヒトＡＭＬ系統の実質的により高い感受性によって裏付けられた（図１Ｉおよび表３）。例えば、ＨＢＸ１９８１８に関して、それぞれＴＦ−１細胞、Ｕ９３７細胞、ＨＥＬ細胞、Ｋ０５２細胞およびＫ５６２細胞に対する１２．８、２０．７、２５．７、１６．６および１８．５のＩＣ５０と比較して、４．４、９．６および８．１μＭのＩＣ５０が、それぞれＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋、ＭＯＬＭ１４およびＭＶ４，１１に対して観察された（表３）。薬物応答性における差は、最大で７２時間の処置まで持続した。ＨＢＸ１９８１８処置は、アポトーシスのための変異体ＦＬＴ３発現細胞のプライミング増加をもたらした（図１Ｊ）。このプライミングは、アポトーシスの誘導と有意に相関し、ＭＯＬＭ１３、ＭＯＬＭ１４およびＭＶ４，１１細胞に対して、ｗｔ  ＦＬＴ３発現ＴＨＰ細胞またはヌルＦＬＴ３発現ＴＦ−１細胞に対するよりも強かった（図３Ａ〜３Ｄ）。調べた変異体ＦＬＴ３発現マウス細胞系および変異体ＦＬＴ３発現ヒト細胞系は、ミドスタウリン、ＡＣ２２０（キザルチニブ）およびクレノラニブを含む臨床検査されたＦＬＴ３阻害剤に対し、これらの化合物について報告されるものと同様の効力で、薬理学的に応答することが示されたことに留意されたい。
【０３９６】
【表３−１】
2019534321.tif 000018
【表３−２】
2019534321.tif 000019
【０３９７】
タンパク質レベルの低下が、ユビキチン依存性分解の帰結であるかどうかを明確にするために、変異体ＦＬＴ３ユビキチン化に対する阻害剤媒介性変化および分解機構の同時発生的阻害によるタンパク質喪失のレスキューを調べた。ユビキチン依存性である分解と符合して、ＦＬＴ３ユビキチン化の増加は、ＨＢＸ１９８１８による処置４〜８時間後にＦＬＴ３−ＩＴＤに観察され、化合物処置２２時間後にＤ８３５Ｙ変異体に観察された（図４Ａ〜４Ｃ）。これらの結果は、Ｂａ／Ｆ３システムに固有ではない。ＦＬＴ３ユビキチン化の増加に関する同様の所見は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＡＭＬがん細胞系ＭＯＬＭ１４において観察された（図４Ｄ）。
【０３９８】
ユビキチン媒介性分解機構によりＦＬＴ３−ＩＴＤの喪失を促進するＨＢＸ１９８１８と符合したデータにより、次に、この機構が、関連するＤＵＢの同定および検証に費やす前に、薬物耐性の無効化に関してキナーゼ阻害と比較して有利になり得ることを確認しようとした。実際に、ＦＬＴ３キナーゼ阻害剤クレノラニブによる、チロシンキナーゼドメイン点変異Ｆ６９１Ｌを共発現するＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞の処置は、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤと比較して、用量応答曲線における右方向へのシフトをもたらし（図５Ａ）、これにより、クレノラニブに対するＦ６９１点変異体の耐性を検証した（Smithら（２０１４年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.１１１巻：５３１９〜５３２４頁）。対照的に、ＨＢＸ１９８１８処置は、部分的にＩＬ−３レスキュー可能な濃度において（図５Ｃ）、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−Ｆ６９１Ｌ細胞およびＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞の両方に対して等効力であった（図５Ｂ）。
【０３９９】
ユビキチンタグは、プロテアソームまたはリソソーム分解のいずれかをコードすることができる。ＦＬＴ３は、両方の経路によって分解を受けることが報告された。ＨＢＸ１９８１８と共にＰ２２０７７（別のＵＳＰ１０標的化阻害剤であり、さらに詳細に以下に記載する）誘導性ＦＬＴ３−ＩＴＤ分解が、リソソームの阻害によって部分的にレスキューされることが決定され（図６Ａ）、ｑＰＣＲ解析は、ＦＬＴ３レベルの低下がタンパク質レベルのみで起こったことを確認した（図６Ｂ）。
【０４００】
（実施例３）
ＨＢＸ１９８１８のＵＳＰ１０阻害活性は、ＦＬＴ３−ＩＴＤの分解を駆動する
ＨＢＸ１９８１８と共に実施例４におけるＰ２２２０７７は、ＭＤＭ２の安定化におけるその役割で最も良く公知の脱ユビキチン化酵素である、ユビキチン特異的プロテアーゼ７（ＵＳＰ７）の２種の不可逆的阻害剤であると報告された（Reverdyら（２０１２年）Chem.  Biol.１９巻：４６７〜４７７頁；Chauhanら（２０１２年）Cancer  Cell  ２２巻：３４５〜３５８頁）。しかし、基質としてジユビキチンを使用した、３３種の組換えＤＵＢ酵素のパネルに対する、１０μＭの濃度のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの化合物のプロファイリングは、最も強力に阻害されるＤＵＢとしてＵＳＰ１０を同定した（ＵＳＰ１０  ＩＣ５０＝１４μＭ）（Ritortoら（２０１４年）Nat.  Commun.５巻：４７６３頁）（図６Ｃ）。プロファイリングデータは、ＨＢＸ１９８１８が、１０μＭの濃度で２０％を超える程度までＵＳＰ１０以外のＤＵＢを阻害しない、優れたＤＵＢオーム（DUBome）選択性を呈することをさらに示す（図６Ｃ）。ＵＳＰ７は、同じアッセイを使用して、５７μＭのＩＣ５０で阻害された。ＨＢＸ１９８１８の潜在的標的としてＵＳＰ１０をさらに調査するために、ＵＳＰ１０の確立された基質であるベクリン−１（Liuら（２０１１年）Cell  １４７巻：２２３〜２３４頁）のレベルを、ＨＢＸ１９８１８処置した、変異体ＦＬＴ３発現細胞において解析した。ベクリン−１およびＦＬＴ３のタンパク質レベルは、２０μＭ  ＨＢＸ１９８１８処置したＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞およびＭＯＬＭ１４細胞において強く減少し、この結果は、ＵＳＰ１０が、ＨＢＸ１９８１８の活性を媒介しうることを示唆し、この化合物のＤＵＢオームプロファイリング結果と符合する（図６Ｄ〜６Ｅ）。加えて、活性確立に基づくプローブプロファイリング方法（establishing  activity-based  probe  profiling  method）を使用して、ＨＢＸ１９８１８が、細胞においてＵＳＰ１０に結合することが確認された（Altunら（２０１１年）Chem.  Biol.１８巻：１４０１〜１４１２頁）。ＨＢＸ１９８１８で処置した生細胞由来のライセートにおけるＵＳＰ１０は、低マイクロモル濃度範囲内の阻害剤濃度で、ＤＵＢの活性部位システインを共有結合により標識するように修飾されたＨＡタグ付きユビキチンプローブ（ＨＡ−Ｕｂ−ＶＳ）による標識から遮断された（図６Ｆ）。
【０４０１】
ＵＳＰ１０が、ＦＬＴ３を脱ユビキチン化するＤＵＢであるかどうかを調査するために、ＵＳＰ１０およびＦＬＴ３が、ＦＬＴ３変異体細胞において複合体で存在するかどうかをまず検査した。ＦＬＴ３−ＩＴＤ  Ｂａ／Ｆ３細胞におけるＦＬＴ３とＵＳＰ１０の頑強な共免疫沈降が観察され、逆共免疫沈降研究は、ＵＳＰ１０とＦＬＴ３の会合を確認した（図７Ａ）。逆向き実験において、ＵＳＰ１０の発現増加は、安定にトランスフェクトされたＭＯＬＭ１４および一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞において、ＦＬＴ３−ＩＴＤタンパク質の、ｗｔ  ＦＬＴ３タンパク質よりも高い安定化と相関することが観察された（図７Ｅ、７Ｎおよび７Ｏ）。発癌性ＦＬＴ３駆動ＡＭＬ細胞と同様に、ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７の両方が、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞においてＦＬＴ３の分解を誘導することができたが、変異体ＦＬＴ３駆動細胞において両方の化合物により観察される効果を再現するために、約２倍高い濃度が必要とされたことに留意することが重要である（図７Ｆ）。触媒システインがセリンで置きかえられたＵＳＰ１０、ＵＳＰ１０Ｃ４２４ＳのＭＯＬＭ１４細胞への導入は、ｗｔと比較して、変異体ＦＬＴ３の安定化低下をもたらし、ＦＬＴ３−ＩＴＤタンパク質レベルの調節におけるＵＳＰ１０触媒活性の重要性が確認された（図７Ｎ）。まとめると、ＳＡＲ、ＫＤおよび過剰発現研究は、ＵＳＰ１０が、ＦＬＴ３−ＩＴＤ安定性の極めて重要な調節因子であることを強く裏付けるが、影響が、直接的であるか間接的であるかについて取り組むものではない。続いて、ＵＳＰ１０およびＦＬＴ３が、ＦＬＴ３変異体細胞において複合体で存在するかどうかを検査した。Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３とＵＳＰ１０の頑強な共免疫沈降（共Ｉ．Ｐ．）が観察された一方、逆共Ｉ．Ｐ．研究は、ＵＳＰ１０とＦＬＴ３の会合を確認した（図７Ａ）。ＵＳＰ１０およびＦＬＴ３（ｗｔおよび変異体の両方）の間の同様の相互作用が、これらのタンパク質を外因性に発現するように操作された２９３Ｔ細胞において実証された（図８Ａ）。重要なことに、２、４および６時間のＨＢＸ１９８１８ならびに４および６時間のケモカイン、Ｐ２２０７７は、ＵＳＰ１０とＦＬＴ３−ＩＴＤとの間の相互作用を遮断することが観察された（図８Ｂ）。
【０４０２】
変異体ＦＬＴ３の安定化におけるＵＳＰ１０の潜在的役割を明確にするために、３種の別々のヘアピンを使用してＵＳＰ１０ノックダウン（ＫＤ）を行った。ＵＳＰ１０依存性であるＨＢＸ１９８１８の抗増殖および分解効果と符合して、各ヘアピンによるＵＳＰ１０  ＫＤは、スクランブル対照ヘアピンと比較して、ＦＬＴ３−ＩＴＤの頑強な分解と共に、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性細胞（ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋、ＭＯＬＭ１４）における実質的成長阻害をもたらした（図７Ｂ〜７Ｄ、図１０Ａ）。ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７に観察される通り、ＵＳＰ１０  ＫＤは、ＦＬＴ３下流の、ＡＫＴおよびＥＲＫ１／２を含むシグナル伝達分子に影響がほとんどないか全くなかった（図７Ｊ）。同じヘアピンによる有効なＵＳＰ１０  ＫＤは、発癌性ＦＬＴ３によって駆動されない、形質転換されたヒト造血系統細胞系の成長を抑制せず（Ｋ０５２、Ｋ５６２、ＫＵ８１２Ｆ、Ｕ９３７）（図７Ｂおよび図１０Ｂ〜１０Ｅ）、ＵＳＰ１０標的化小分子阻害と同様に、ｗｔ  ＦＬＴ３タンパク質レベルをモジュレートしなかった（図４Ｋ〜Ｍ、図１０Ｂ〜Ｄ）。
【０４０３】
ＵＳＰ１０薬理学的阻害およびＫＤならびに酵素過剰発現によるＦＬＴ３  ｗｔおよび変異体タンパク質に対する観察される差次的影響は、活性化されたＦＬＴ３が、ユビキチン媒介性分解の傾向がよりあるという報告と符合する（OSHIKAWA  G.ら（２０１１年）J  Biol  Chem、２８６巻、３０２６３〜７３頁）。ＵＳＰ１０の過剰発現ありまたはなしでの、ならびにＨＢＸ１９８１８の非存在および存在下での、ｗｔ  ＦＬＴ３およびＦＬＴ３−ＩＴＤの半減期を解析して、タンパク質安定性の差が、ＤＵＢ阻害剤処置に対するその２種のタンパク質の差次的応答性における役割を果たしうるかをみた。Ｂａ／Ｆ３細胞において、ＨＢＸ１９８１８は、３〜４時間から２時間前後へとＦＬＴ３−ＩＴＤの半減期を短縮し、ｗｔ  ＦＬＴ３よりも大きい程度までＦＬＴ３−ＩＴＤの半減期を短縮することが観察された（図７Ｇ〜７Ｉ）。データは、ｗｔ  ＦＬＴ３とＦＬＴ３−ＩＴＤとの間のＨＢＸ１９８１８に対するこの差次的応答性が、これらのタンパク質の固有の全体的安定性／半減期のわずかな差によるものである可能性を示唆する。同様に、ＨＢＸ１９８１８は、２０μＭで、これら２種の細胞系におけるＦＬＴ３分解を強く誘導した（図７Ｃ〜７Ｄ）。対照的に、同じヘアピンによる有効なＵＳＰ１０  ＫＤは、ＦＬＴ３  ｗｔがん細胞の成長を抑制しなかった（例えば、Ｋ０５２、Ｋ５６２、ＫＵ８１２ＦおよびＵ９３７；図７Ｂおよび図９Ａ〜９Ｄを参照されたい）。ｗｔ  ＦＬＴ３発現細胞増殖およびＦＬＴ３タンパク質発現に対するＨＢＸ１９８１８の最小効果と符合して、両者共に低レベルのｗｔ  ＦＬＴ３を発現すると特徴付けられた、ｗｔ  ＦＬＴ３発現ＡＭＬ細胞系Ｕ９３７およびＫ５６２におけるＵＳＰ１０  ＫＤは、ＦＬＴ３タンパク質レベルを変化させなかった（図９Ｅ〜９Ｆ）。加えて、ＵＳＰ１０のレベルは、全般に、ＭＯＬＭ１４およびＭＶ４，１１を含む、より高レベルのＦＬＴ３を発現する細胞系においてより高いことが観察され、ＦＬＴ３タンパク質調節におけるＵＳＰ１０の安定化役割と符合した（図１０）。
【０４０４】
ＵＳＰ７も、変異体ＦＬＴ３分解およびＡＭＬ細胞の成長阻害に寄与しうるかどうかを解明するために、本発明者らは、３種の別々のヘアピンを使用して、ＵＳＰ７をノックダウンした。ＵＳＰ１０  ＫＤとは対照的に、ＦＬＴ３−ＩＴＤ発現ＭＯＬＭ１４細胞において、ＦＬＴ３レベルまたはベクリン−１レベルに変化がほとんどないか全くないことが観察され、ＵＳＰ７ヘアピンによる形質導入は、スクランブルヘアピン対照と比較して、細胞生存率に効果がほとんどないか全くなかった（図１１Ａ〜１１Ｃ）。重要なことに、ＵＳＰ１０のレベルは、予測通りであるが、ＵＳＰ１０  ＫＤ細胞において減少したが、ＵＳＰ７  ＫＤ細胞において変化しないままであったため、ＵＳＰ７  ＫＤは、選択的であることが実証された（図１１Ｄ）。さらに、選択的ＵＳＰ７阻害剤の化合物２（Kessler（２０１４年）Exp.  Opin.  Ther.  Pat.２４巻：５９７〜６０２頁）を使用したＵＳＰ７の薬理学的阻害（図１１Ｇ）は、細胞生存率にほとんど影響がなく、最大で２０μＭの濃度でＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３  ＩＴＤ細胞におけるＦＬＴ３レベル低下をもたらさなかった（図１１Ｅ〜１１Ｇ）。
【０４０５】
次に、７種のＨＢＸ１９８１８アナログ（化学構造を図１２Ａに示し、それらの抗増殖ＩＣ５０を表９に示す）を得、生化学的アッセイにおいてそれらのＵＳＰ１０阻害活性を調べ、ＦＬＴ３タンパク質レベルにおける影響、およびＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞に対する抗増殖効果を調べた。これらのパラメータの間の優れた相関が観察され、ＨＢＸ１９８１８の関連する標的としてのＵＳＰ１０を裏付けた（図１２Ｂ〜１２Ｅおよび１３Ａ〜１３Ｅ）。例えば、ＨＢＸ１９８１８と比較できるほどにＵＳＰ１０を阻害するＣ５９８−０５６３（図１３Ｂ）は、同様の濃度で細胞成長を抑制し、ＦＬＴ３の喪失を誘導することが観察された一方（図１３Ａおよび１３Ｃ）、ＨＢＸ１９８１８と比較できるほどにＵＳＰ１０を阻害する（図１３Ｂ）が、ＵＳＰ７は阻害しない（ＩＣ５０＞＞１００μＭ、表９）Ｃ６７３−０１０５は、Ｃ５９８−０５６３と同様の機能を有した（図１２Ｃおよび１３Ａ）。より強力なＵＳＰ１０阻害剤のＣ５９８−０４６６（図１３Ｂ）は、より低い抗増殖ＥＣ５０を有し、より低い濃度でＦＬＴ３分解を誘導する（図１３Ａ〜１３Ｂおよび１３Ｄ）。対照的に、Ｃ５９８−０４６８は、精製酵素アッセイにおいてＵＳＰ１０の阻害をほとんど呈さず（ＩＣ５０＝＞＞１００μＭ）（図１３Ｂ）、有意に右にシフトした抗増殖曲線を示し、ＨＢＸ１９８１８がＦＬＴ３を分解した同じ濃度でＦＬＴ３レベルに効果がなかった（図１３Ａおよび１３Ｅ）。より強力なＨＢＸ１９８１８アナログのＣ５９８−０４６６は、ＦＬＴ３ヌル細胞系ＴＦ−１およびＦＬＴ３によって駆動されない他の白血病系統と比べて、ＦＬＴ３変異体ＭＯＬＭ１３、ＭＯＬＭ１４およびＭＶ４，１１細胞系に対する特異性を維持し（図１３Ｆおよび表９）、細胞表面ＦＬＴ３発現において喪失をもたらした（図２）。また、ＨＢＸ１９８１８と同様に、２種のアナログの５および７は、ｗｔまたはヌルＦＬＴ３発現細胞よりも強く、変異体ＦＬＴ３発現細胞をプライミングした（図３Ｅ〜３Ｆおよび１３Ｇ〜１３Ｈ）。まとめると、共免疫沈降、ヘアピンＫＤおよびＳＡＲ研究は、ＵＳＰ１０が、ＦＬＴ３−ＩＴＤを直接的に脱ユビキチン化することを強く裏付ける。
【０４０６】
（実施例４）
別個のＵＳＰ１０阻害剤化学変種は、ＨＢＸ１９８１８表現型を模倣する
ＨＢＸ１９８１８処置により観察されるＦＬＴ３分解および抗増殖効果が、ＵＳＰ１０阻害の結果であることをさらに検証するために、別個のＵＳＰ１０阻害剤化学変種を同定し、その作用物質が、ＨＢＸ１９８１８プロファイルを模倣するかどうかを調査しようと試みた。実施例１に記載されているスクリーニングにおいて、メンバーＰ２２０７７および１２４７８２５−３７−１（図１４Ａにおける構造）を含む、チオフェンに基づくＤＵＢ阻害剤シリーズ（Chauhanら（２０１２年）Cancer  Cell  ２２巻：３４５〜３５８頁；Weinstockら（２０１２年）ACS  Med.  Chem.  Lett.３巻：７８９〜７９２頁）が、ＵＳＰ１０を阻害し（Ritortoら（２０１４年）Nat.  Commun.５巻：４７６３頁）、ＦＬＴ３変異体がん細胞系に対する、ＨＢＸ１９８１８と同じ活性パターンを呈することも発見された。基質としてジユビキチンを使用した、３３種の組換えＤＵＢのパネルに対する１０μＭの濃度でのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける化合物のプロファイリングは、両方の化合物についての強力なＵＳＰ１０阻害を明らかにした（図１５Ａ；それぞれ６μＭおよび１０μＭのＩＣ５０でＰ２２０７７がＵＳＰ１０およびＵＳＰ７を阻害することを示す）。基質としてユビキチン−ＡＭＣを使用した、Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１についての生化学的ＩＣ５０は、それぞれ１５μＭおよび３６μＭであった（図１３Ｂ）。しかし、１２４７８２５−３７−１が、Ｐ２２０７７よりも特徴的にマルチターゲットの性質であるため、この化合物が、オフターゲット効果の研究対象となりうることを、生化学的アッセイが明らかにしたことに留意されたい（図１５Ａ）。Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１によるＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性Ｂａ／Ｆ３細胞、ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞およびＭＯＬＭ１４細胞の処置は、ＨＢＸ１９８１８と同様のＦＬＴ３およびベクリン−１分解をもたらし、２２〜２４時間の処置後に細胞生存率を低下させた（図１４Ｂ〜１４Ｇおよび１５Ｂ〜１５Ｄ）。ベクリン−１は、ＦＬＴ３と同様に、１０μＭ  Ｐ２２０７７処置ＭＯＬＭ１４細胞において強く減少し（図１４Ｆ）、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞において部分的に分解された（図１２Ｆ）。ＵＳＰ１０阻害剤およびＵＳＰ７阻害剤としてのみ検証されたが、ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７の両方が、ＵＳＰ１０が化合物によって十分に阻害されるものを下回る濃度で観察される抗増殖効果に寄与する可能性がある、さらなるＤＵＢおよび潜在的に非ＤＵＢ標的に対して少なくともある程度の阻害活性を呈することに留意されたい。ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７の両方が、ｗｔまたはヌルＦＬＴ３発現細胞と対比して変異体ＦＬＴ３発現細胞に向けての選択性によって、用量依存性様式で、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＡＭＬ細胞系、ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋、ＭＯＬＭ１４およびＭＶ４，１１の成長を抑制した（図１Ｉ、図１４Ｃ、表３）。しかし、発癌性ＦＬＴ３によって駆動されないいくつかのヒト造血細胞系が、Ｐ２２０７７に対する相対的感受性を提示したが、これは、この作用物質のマルチターゲット性質に起因する可能性があり得ることに留意されたい。ＨＢＸ１９８１８と同様に、Ｐ２２０７７は、約２２時間の処置後に、１桁���マイクロモル濃度範囲内のＥＣ５０で、ＦＬＴ３−ＩＴＤおよびＦＬＴ３−Ｄ８３５Ｙ陽性Ｂａ／Ｆ３細胞の増殖を阻害した（図１４Ｊ）。加えて、ＨＢＸ１９８１８と同様に、活性確立に基づくプローブプロファイリング方法を使用して、Ｐ２２０７７が、細胞においてＵＳＰ１０に結合することが確認された（Altunら（２０１１年）Chem.  Biol.１８巻：１４０１〜１４１２頁）。特に、Ｐ２２０７７または１２４７８２５−３７−１で処置した生細胞由来のライセートにおけるＵＳＰ１０は、低マイクロモル濃度範囲内で、修飾されたＨＡタグ付きユビキチンプローブによる標識から遮断された（図１４Ｈおよび１５Ｅ）。特に、１２４７８２５−３７−１は、ＵＳＰ１０を同様に阻害し（図１３Ｂおよび図１５Ａ）、ヌルＦＬＴ３発現ＴＦ−１細胞を上回る変異体ＦＬＴ３発現細胞の増殖の選択的阻害、ＦＬＴ３分解に随伴する標的化誘導と、ＦＬＴ３シグナル伝達の下流エフェクターの分解なし、およびＵＳＰ１０ターゲットエンゲージメントに関してＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７を表現型模写する（図１４Ｂ、１４Ｄ、１４Ｊ、１５Ｃおよび１５Ｅ）、Ｐ２２０７７に由来する第二世代ＵＳＰ７阻害剤として見出された。
【０４０７】
重要なことに、Ｐ２２０７７、１２４７８２５−３７−１およびＨＢＸ１９８１８による変異体ＦＬＴ３の分解は、ＡＫＴおよびＥＲＫ１／ＥＲＫ２を含むＦＬＴ３下流のシグナル伝達分子の発現が、薬物処置ＭＯＬＭ１４細胞において変化しなかったという点において選択的であると観察された（図１４Ｉ）。薬物処置ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞およびＭＶ４，１１細胞において同様の結果が観察された。Ｂａ／Ｆ３システムにおけるデータと符合して、ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７は、ｗｔ  ＦＬＴ３発現白血病細胞系におけるＦＬＴ３タンパク質に影響がほとんどないか全くなかった（図１６Ａ〜Ｂ）。総細胞チロシンリン酸化の阻害は、ＨＢＸ１９８１８処置変異体ＦＬＴ３陽性細胞において実証され、これは、変異体ＦＬＴ３の薬物誘導性分解と符合することに留意されたい（図１６Ｃ）。
【０４０８】
ＨＢＸ１９８１８と同様に、クロロキンは、Ｐ２２０７７処置細胞におけるＦＬＴ３分解をレスキューし、ｑＰＣＲ解析は、Ｐ２２０７７が、ＦＬＴ３タンパク質分解をもたらす濃度でＦＬＴ３転写物レベルの低下をもたらさなかったことを確認した（図６Ａ〜６Ｂ）。最後に、ＨＢＸ１９８１８およびそのアナログと同様に、Ｐ２２０７７は、ＴＦ−１（１０．２μＭ）、ＨＥＬ（６．９μＭ）、Ｋ０５２（５．７μＭ）およびＫ５６２（１０．６μＭ）を含む、ＦＬＴ３によって駆動されないいくつかの他の白血病細胞系と比べて、ＦＬＴ３変異体ＭＯＬＭ１３、ＭＯＬＭ１４およびＭＶ４，１１細胞系（０．４、０．８、２．９μＭ）に対するより高い効力を呈した（表３）。Ｐ２２０７７処置は、ｗｔ  ＦＬＴ３またはヌルＦＬＴ３発現細胞と比較して、アポトーシスのための変異体ＦＬＴ３発現細胞のプライミング増加ももたらした（図３Ｇ）。ＨＢＸ１９８１８の効果を表現型模写する第２シリーズの化合物（Ｐ２２０７７および１２４７８２５−３７−１で表す）の同定は、ＵＳＰ１０が、上記システムにおけるＤＵＢ安定化ＦＬＴ３−ＩＴＤであるという概念をさらに裏付ける。
【０４０９】
（実施例５）
ＵＳＰ１０リード阻害剤は、ｐ５３を分解しない
ＵＳＰ１０は、腫瘍抑制因子ｐ５３局在化および安定性の調節因子として報告された。ｗｔ  ｐ５３を分解する薬物は、望ましくない場合があるため、薬理学的ＵＳＰ１０阻害が、転写因子を発現するＡＭＬ細胞系においてｐ５３レベルに影響するかどうかを解明しようとした。ＨＢＸ１９８１８またはＰ２２０７７によるＭＯＬＭ１３細胞およびＭＯＬＭ１４細胞の処置は、ｐ５３レベルの減少をもたらさず、実際にはそれどころか、ｐ５３レベルの中程度の増加が観察された（図７Ｃ〜７Ｄおよび１４Ｇ）。しかし、以前の報告と符合して、ＵＳＰ１０のヘアピンＫＤは、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＡＭＬ細胞系の両方におけるｐ５３レベルの低下をもたらす（図７Ｃ〜７Ｄ）。ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７は両者共に、ＵＳＰ７阻害剤として本来報告された。ＵＳＰ７は、ＭＤＭ２を安定化し、ｐ５３のユビキチン化および分解増加をもたらす。予測される通り、薬理学的ＵＳＰ７阻害は、ＭＤＭ２レベルを減少させ、ｐ５３レベルを増加させた。上記阻害剤のＵＳＰ７阻害活性は、ＵＳＰ１０によるｐ５３分解に対するいかなる潜在的効果も相殺することができる。選択的ＵＳＰ１０阻害剤のさらなる開発は、ｐ５３レベルに対するＵＳＰ７およびＵＳＰ１０脱ユビキチン化活性の阻害の潜在的に反対の効果を明確にすることを助けるはずである。まとめると、上記の小分子および遺伝的ＫＤ結果は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異体ＡＭＬについての新規標的としてのＵＳＰ１０の強い検証を提供する。
【０４１０】
（実施例６）
変異体ＦＬＴ３の分解の促進は、キナーゼ阻害に対する耐性を克服する
さらなる研究を行って、ユビキチン媒介性分解が、薬物耐性無効化に関してＦＬＴ３キナーゼ阻害と比較して有利であることを確認した。ＦＬＴ３キナーゼ阻害剤による、ＴＫＤ点変異を発現するＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞の処置は、用量応答曲線における右方向へのシフトをもたらし（図１７Ａ〜１７Ｃ）、これらの阻害剤に対する以前に報告された差次的耐性が検証された（Smithら、２０１４年）。対照的に、ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７処置は、ＴＫＤ点変異を発現するＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞と対比した、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞に対して等効力であったが、ｗｔ  ＦＬＴ３を過剰発現するように操作されたＢａ／Ｆ３細胞に対する効力は低かった（図１７Ｄ〜１７Ｅ）。重要なことに、ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７は、Ｂａ／Ｆ３−ｗｔ  ＦＬＴ３細胞におけるＦＬＴ３分解促進において無効であった濃度で、ＦＬＴ３キナーゼ阻害剤耐性細胞におけるＦＬＴ３の分解を誘導した（図１７Ｆ〜１７Ｈ、図２Ｂ、図１Ｈおよび図１８Ａ〜１８Ｃ）。全ＴＫＤ点変異体は、構成的に活性化されたＦＬＴ３を発現することが確認された（図１８Ｄ〜１８Ｅ）。加えて、ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７は、親ＭＯＬＭ１３細胞、およびミドスタウリンの存在下での長期の培養後に該薬物に対して耐性にされたＭＯＬＭ１３細胞に対する同様の効力を示した（Weisbergら、２０１１年）（図１７Ｉ〜１７Ｋ）。ミドスタウリン耐性ＭＯＬＭ１３細胞は、その耐性に寄与すると考えられる、ＦＬＴ３タンパク質を高度に過剰発現すると特徴付けられた（Weisbergら、２０１１年）。
【０４１１】
（実施例７）
ＨＢＸ１９８１８は、ＦＬＴ３キナーゼ阻害剤と協同する
ＵＳＰ１０阻害の治療ポテンシャルのさらなる評価として、相乗的に相互作用するＤＵＢ阻害剤およびＦＬＴ３キナーゼ阻害剤の能力を調査した。特に、Ｃａｌｃｕｓｙｎソフトウェア（Ｂｉｏｓｏｆｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を使用して成長阻害曲線から組合せ指数（ＣＩ）が計算される、薬物効果中央値分析（median-drug  effect  analysis）を使用した。固定比率段階希釈の、ＨＢＸ１９８１８およびＦＬＴ３キナーゼ阻害剤、ミドスタウリンまたはクレノラニブによるＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ、ＭＯＭ１３−ｌｕｃ＋およびＭＯＬＭ１４細胞の二重処置は、単剤処置と比較して細胞成長減少をもたらした（図１８Ｆ、１９Ｂおよび１９Ｅ）。組合せ指数（ＣＩ）解析は、キナーゼ阻害剤のいずれかによる処置および併用のＨＢＸ１９８１８処置後に、ＭＯＬＭ１３−ｌｕｃ＋細胞およびＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞に関しては２５％、５０％、７５％および９０％成長阻害、ＭＯＬＭ１４細胞に関しては５０％、７５％および９０％成長阻害の相乗的抗増殖効果（１未満の値は相乗効果を示す）を示した（図１８Ｇ、１９Ｃおよび１９Ｆ）。
【０４１２】
（実施例８）
ＵＳＰ１０の薬理学的阻害は、ＦＬＴ３変異体ＰＤＸおよび原発性腫瘍試料の成長を阻害し、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗白血病活性をもたらす
原発性患者腫瘍試料およびＰＤＸに対する成長阻害効果を調べることにより、リードＵＳＰ１０阻害剤シリーズの治療ポテンシャルをさらに調査しようとも試みた。ＨＢＸ１９８１８、選択されたＨＢＸ１９８１８アナログ、Ｐ２２０７７、１２４７８２５−３７−１および化合物２を、２名のＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＡＭＬ患者および２種のＦＬＴ３変異体プリマグラフトから単離された原発性腫瘍細胞の成長を遮断する能力に関して評価した。調べた全ＵＳＰ１０阻害剤は、患者試料およびプリマグラフトの両方に対して生存率の用量依存性低下を引き起こした（図２０Ａ〜２０Ｃおよび２１）。ＨＢＸ１９８１８は、健常ドナー由来の２種のドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料に対して効力が低かったが、Ｐ２２０７７は、調べた２種のＰＢＭＣ試料のうち１種に対して効力が低かった（図２０Ｃ、表４〜７、図２１Ｄ）。選択的ＵＳＰ７阻害剤、化合物２は、これらの試料の生存率に効果がほとんどないか全くなかった（図２０Ａ〜２０Ｃ、２１Ａおよび２１Ｃ）。健常ドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を上回るＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性腫瘍細胞のためのＵＳＰ１０阻害剤の治療ウィンドウを評価するために、ＨＢＸ１９８１８、Ｐ２２０７７、１２４７８２５−３７−１、およびＨＢＸ１９８１８アナログのうちいくつかを、ＰＢＭＣに対する活性に関して評価した。変異体ＦＬＴ３発現ＡＭＬプリマグラフト細胞は、２４〜７２時間の処置後に、上記阻害剤の全てに対して、２種のドナーＰＢＭＣ試料よりも感受性であった（図２０Ｃおよび２１Ｄおよび表４〜７）。イムノブロッティングによりＦＬＴ３レベルの解析を可能にするために、１種のプリマグラフトから十分な細胞を得た。２０μＭの濃度のＨＢＸ１９８１８またはＰ２２０７７のいずれかによる２１時間の処置後にＦＬＴ３の痕跡はなく、ＦＬＴ３レベルの強い低下が示された（図２２Ａ）。
【０４１３】
【表４】
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【０４１４】
【表５−１】
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【表５−２】
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【０４１５】
【表６】
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【０４１６】
【表７】
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【０４１７】
【表９】
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【０４１８】
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【０４１９】
これらの結果は、ｅｘ  ｖｉｖｏでＰ２２０７７誘導性ＦＬＴ３分解を示すことが観察された、同じＦＬＴ３−ＩＴＤ＋、Ｄ８３５Ｙ＋ＡＭＬプリマグラフトを使用した、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰ２２０７７の試験の着想をもたらした。Fanら（２０１３年）Cell  Death  Dis.４巻：ｅ８６７頁に概要を述べるＰ２２０７７のｉｎ  ｖｉｖｏ投与のための方法に従って、ビヒクルとしてＤＭＳＯをプリマグラフトマウス（ｎ＝３）に、Ｐ２２０７７をプリマグラフトマウス（ｎ＝３）にＩＰ  １×毎日、２１日間投与した。確立された疾患がフローサイトメトリーによって観察されたら、処置を開始した。処置２１日目にマウスを屠殺し、固定された脾臓および肝臓試料を疾患の存在に関して解析した。マウス脾臓および肝臓に明らかな疾患はほとんどから全く観察されなかったが、それぞれ各処置群由来のプールしたマウス骨髄細胞からのタンパク質ライセートのイムノブロット解析は、ビヒクル対照処置マウスにおいて強いＦＬＴ３シグナルを示し、これは、Ｐ２２０７７処置マウスにおいて検出不能であり（図２２Ｂ）、このことから、ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物誘導性ＦＬＴ３分解が示唆された。２１日の処置期間、１５ｍｇ／ｋｇのＰ２２０７７が全般に良好に忍容され、体重に変化がほとんどなかった（ビヒクル処置およびＰ２２０７７処置の両方で平均約２〜３ｇの減少；マウスのうち、１５％より多く体重減少したマウスはいなかった）ことに留意することが重要である。
【０４２０】
加えて、非侵襲性ｉｎ  ｖｉｖｏバイオルミネセンスモデルを使用して、変異体ＦＬＴ３陽性細胞の成長を抑制するＰ２２０７７の能力を調べた。ＨＢＸ１９８１８およびＰ２２０７７はまず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋細胞においてＦＬＴ３分解を誘導するその能力に関して検証した。Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋細胞が、成長抑制およびＦＬＴ３分解（図２３Ａ〜２３Ｂ）ならびにＦＬＴ３表面発現のＤＵＢ阻害剤誘導性喪失（図２３Ｅ）に関して、非ルシフェラーゼ発現細胞と同様に、ミドスタウリンおよびＰ２２０７７に応答することが見出された。小規模パイロット研究において、５０ｍｇ／ｋｇ  Ｐ２２０７７  ＩＰ  ＢＩＤで４日間処置した、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋を有する雌ＮＣＲヌードマウス（ｎ＝４）は、ビヒクル対照マウス（ｎ＝４）から抽出した骨髄と比較して、ＣＤ３５−ＰＥコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによって測定される通り、抽出した骨髄におけるＦＬＴ３発現のより低い百分率（約２倍）を有した（図２４Ａ）。骨髄試料のアリコートは、ビヒクルと比較して、Ｐ２２０７７処置マウス骨髄試料においてルシフェラーゼ陽性シグナルの同様の約２倍低下を示した（図２４Ａ）。まとめると、これらの結果は、オンターゲット効果による腫瘍負荷の低下を示唆する。続いて、より大規模な３アーム（アーム当たりｎ＝８）研究を、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋を有する雌ＮＣＲヌードマウスへの５０ｍｇ／ｋｇ  Ｐ２２０７７  ＩＰ  ＢＩＤ、Ｐ２２０７７  ＰＯ  ＱＤまたはビヒクルの投与により実行した。Ｐ２２０７７処置は、ｉｎ  ｖｉｖｏバイオルミネセンス測定によって測定される通り、４〜６日間の処置後に認められる、ビヒクル対照マウスと比較して白血病負荷の統計的に有意な減少により、ｉｎ  ｖｉｖｏで変異体ＦＬＴ３−ＩＴＤ発現細胞の殺滅をもたらすことが観察された（図２４Ｂ〜２４Ｃ）。加えて、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋細胞は、Ｂａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ細胞と同様に、ミドスタウリンおよびＰ２２０７７に対する感受性についての対照として調べた。これらの対照は、両方の化合物に対して成長阻害に関して同様に応答することが観察された（図２３Ｃ〜２３Ｄ）。毎日１回ＩＰで投与された１５ｍｇ／ｋｇ  Ｐ２２０７７および５０ｍｇ／ｋｇ  Ｐ２２０７７は、９日間の処置後に、ビヒクル対照と比較して、マウスにおけるＢａ／Ｆ３−ＦＬＴ３−ＩＴＤ−ｌｕｃ＋細胞の成長を目に見えて抑制した（図２０Ｄおよび２５）。重要なことに、最大で１１日間処置したビヒクル処置マウスと薬物処置マウスとの間で観察される体重に有意差はなかった（図２３Ｆ〜２３Ｇ）。全般に、マウス研究における重要臓器の毒性の証拠もなかった。
【０４２１】
ＡＭＬ患者の５年生存率は、わずか２０％である（De  KouchkovskyおよびAbdul-Hay（２０１６年）Blood  Cancer  J、６巻、ｅ４４１頁）。予後は、侵襲性および致死性の疾患に関連するためにＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を有するＡＭＬ患者にとって特に不良である（Martelliら（２０１３年）Blood  Rev、２７巻、１３〜２２頁）。ＦＬＴ３キナーゼ阻害剤による処置は残念ながら、薬物耐性の出現により、短い持続期間のみの応答をもたらす（Weisbergら（２０１０年）Mol  Cancer  Ther、９巻、２４６８〜７７頁）。その上、ＦＬＴ３キナーゼ阻害剤で処置した患者は、ｗｔ  ＦＬＴ３の阻害の結果として骨髄抑制などの副作用を経験する（Warkentinら（２０１４年）Elife、３巻）。これらの制約により、新規の標的化薬剤の開発は正当な理由がある。そのキナーゼ活性の阻害とは違って、その分解を促進することによる変異体ＦＬＴ３の治療標的化は、現在のＦＬＴ３キナーゼ阻害剤に対する耐性の克服に潜在的に有益な新規手法であり、さらに、ＦＬＴ３の酵素機能および足場機能の両方を同時に遮断することにより、キナーゼ阻害剤よりも効果的であると立証することができる。
【０４２２】
ＤＵＢ  ＵＳＰ１０は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異体陽性ＡＭＬにおける腫瘍成長および生存の極めて重要なエフェクター酵素として本明細書に示されている。ＦＬＴ３分解を促進し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで抗増殖効果を付与するＵＳＰ１０阻害剤の２種のケミカルクラス。目的の基質の安定化の原因であるＤＵＢの同定を目標とする大部分の研究は、遺伝学に基づくスクリーニング、典型的には、個々のＤＵＢのノックダウンまたは過剰発現、タンパク質レベルの測定から開始する。しかし、キナーゼ分野において高頻度で活用されるが、ＤＵＢ分野において未だ報告されていない新規手法が、ｗｔ  ＦＬＴ３発現細胞よりも変異体ＦＬＴ３発現細胞の成長を選択的に抑制する能力に関する小分子ＤＵＢ阻害剤のスクリーニングによって本明細書で示されている。この新規戦略は、ＤＵＢ阻害剤ライブラリーのアセンブリおよびＤＵＢの大規模パネルにわたる阻害活性に関するライブラリーのアノテーションによって可能になった。例示的なスクリーニング由来の上位ヒットであるＨＢＸ１９８１８は、上記化合物の以前に報告されていない標的として、ＵＳＰ１０の阻害に起因する、変異体ＦＬＴ３陽性細胞に対する際立ったかつ選択的な抗増殖効果をもたらした。本明細書で考察される小分子に集中した手法は、ＦＬＴ３−ＩＴＤの調節に関する新規機構の同定のみならず、前臨床モデルにおける変異体ＦＬＴ３駆動ＡＭＬにおけるＵＳＰ１０の薬理学的阻害のトランスレーショナルポテンシャルの迅速な調査も助けた。複数のモデルにわたって生成されたデータは、ＵＳＰ１０阻害が、臨床的に、変異体ＦＬＴ３  ＡＭＬの標的化のための新規戦略を提供することができ、キナーゼ阻害剤耐性機構を克服するポテンシャルを有するという概念を強く支持する。
【０４２３】
変異体ＦＬＴ３の観察される選択的分解は、正常造血細胞にｗｔ  ＦＬＴ３を温存することによりｗｔ酵素および変異体酵素の両方を阻害する、ＦＬＴ３キナーゼ阻害剤を上回る有意な臨床利点を提供することができる。ＦＬＴ３受容体のリン酸化は、Ｅ３ユビキチンリガーゼＣＢＬによるＦＬＴ３ユビキチン化および分解に必要であることが示された（Lavagna-Se’venierら（１９９８年）Leukemia、１２巻、３０１〜１０頁；Sarginら（２００７年）Blood  １１０巻、１００４〜１２頁）。以前の報告（Griffithら、２００４年）と符合して、ＦＬＴ３リガンドの非存在下で、変異体ＦＬＴ３の、ｗｔ  ＦＬＴ３よりも有意なリン酸化が観察され、最高レベルの自己リン酸化が、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異およびＴＫＤ変異の両方を発現する細胞において観察された。特に、ＨＢＸ１９８１８処置後のＦＬＴ３−ＩＴＤの半減期は、ｗｔ  ＦＬＴ３よりも短い。データは、自己リン酸化されたＦＬＴ３−ＩＴＤが、ｗｔ  ＦＬＴ３と比較して、プロテアソーム媒介性経路およびリソソーム媒介性経路によりより急速な分解を受けることを示す他の報告と符合しており、分解は、Ｅ３ユビキチンリガーゼｃ−Ｃｂｌおよびｃ−Ｃｂｌ−ｂによって容易となった（OSHIKAWA  G.ら（２０１１年）J  Biol  Chem、２８６巻、３０２６３〜７３頁）。全体的に見て、データは、変異体ＦＬＴ３が、ｗｔ  ＦＬＴ３よりもユビキチン化の傾向がある状況で存在することを示し、これは、ＵＳＰ１０阻害による、ｗｔ  ＦＬＴ３と比較した変異体ＦＬＴ３の観察される選択的分解を説明すると考えられる。
【０４２４】
まとめると、図２６に要約されている結果など、本明細書に記載されている結果は、ＵＳＰ１０が、ＡＭＬ変異体ドライバータンパク質のその脱ユビキチン化および安定化に起因する、ＦＬＴ３−ＩＴＤ変異体陽性ＡＭＬにおける腫瘍成長および生存の極めて重要なエフェクター酵素であることを実証する。さらに、ＡＭＬ細胞系における変異体ＦＬＴ３の分解を促進し、ＦＬＴ３変異体陽性ＡＭＬ細胞系および原発性患者試料における抗増殖効果を付与する、ＵＳＰ１０阻害剤の２種のケミカルクラスが同定された。結果は、ＵＳＰ１０の治療標的化が、キナーゼ阻害剤耐性ＦＬＴ３変異体を含む、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性ＡＭＬに強力な抑制効果を有し、この疾患のための代替処置戦略としてのさらなる調査を保証することをさらに実証する。
【０４２５】
参照による組込み
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが、具体的かつ個別に示された場合と同様に、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。利益相反の場合は、本明細書における任意の定義を含む本出願により処理する。
【０４２６】
また、ワールドワイドウェブ上のＴｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）および／またはワールドワイドウェブ上のｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）により維持されているデータベースなど、公表されているデータベースへの登録と対応する受託番号を参照する、任意のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列も、参照によりそれらの全体において組み込まれる。
【０４２７】
同等物
当業者は、慣用的な実験だけを使用して、本明細書で記載される、本発明の具体的な実施形態に対する多くの同等物を認識するか、またはこれらを確認することが可能であろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲により包含されることを意図する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−Ｇ】
2019534321.tif 000032
【図１Ｈ−Ｊ】
2019534321.tif 000033
【図２Ａ】
2019534321.tif 000034
【図２Ｂ】
2019534321.tif 000035
【図３Ａ−Ｄ】
2019534321.tif 000036
【図３Ｅ−Ｇ】
2019534321.tif 000037
【図４Ａ−Ｄ】
2019534321.tif 000038
【図５Ａ−Ｃ】
2019534321.tif 000039
【図６Ａ−Ｆ】
2019534321.tif 000040
【図７Ａ−Ｅ】
2019534321.tif 000041
【図７Ｆ−Ｇ】
2019534321.tif 000042
【図７Ｈ−Ｉ】
2019534321.tif 000043
【図７Ｊ−Ｎ】
2019534321.tif 000044
【図７Ｏ】
2019534321.tif 000045
【図８Ａ−Ｂ】
2019534321.tif 000046
【図９Ａ−Ｆ】
2019534321.tif 000047
【図１０Ａ−Ｂ】
2019534321.tif 000048
【図１０Ｃ−Ｅ】
2019534321.tif 000049
【図１１Ａ−Ｅ】
2019534321.tif 000050
【図１１Ｆ−Ｇ】
2019534321.tif 000051
【図１２Ａ−Ｆ】
2019534321.tif 000052
【図１３Ａ−Ｅ】
2019534321.tif 000053
【図１３Ｆ−Ｈ】
2019534321.tif 000054
【図１４Ａ−Ｉ】
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【図１４Ｊ−Ｋ】
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【図１５Ａ−Ｃ】
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【図１５Ｄ−Ｅ】
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【図１６Ａ−Ｃ】
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【図１７Ａ−Ｋ】
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【図１８Ａ−Ｅ】
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【図１８Ｆ−Ｇ】
2019534321.tif 000062
【図１９Ａ−Ｃ】
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【図１９Ｄ−Ｆ】
2019534321.tif 000064
【図２０】
2019534321.tif 000065
【図２１】
2019534321.tif 000066
【図２２】
2019534321.tif 000067
【図２３Ａ−Ｄ】
2019534321.tif 000068
【図２３Ｅ−Ｇ】
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【図２４Ａ−Ｂ】
2019534321.tif 000070
【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ−Ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
2019534321.tif 000074
【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
2019534321.tif 000076
【配列表】
2019534321000001.app
【国際調査報告】
2019534321.tif 000077
2019534321.tif 000078
2019534321.tif 000079