(57)【要約】本発明は、ポリアルキレンイミン（ＰＡＩ）、および界面活性剤可溶化した膜貫通タンパク質、たとえばアクアポリンタンパク質を含む、自己集合ナノ構造体に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリアルキレンイミン（ＰＡＩ）、および界面活性剤可溶化した膜貫通タンパク質を含む、自己集合ナノ構造体。
【請求項２】
ＰＡＩがポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である、請求項１に記載の自己集合ナノ構造体。
【請求項３】
ＰＥＩが、約２，０００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａ、たとえば約３，０００Ｄａ〜約５，０００Ｄａの平均分子量を有する実質的に線状のポリマーである、請求項２に記載の自己集合ナノ構造体。
【請求項４】
膜貫通タンパク質がアクアポリン水チャネルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の自己集合ナノ構造体。
【請求項５】
界面活性剤が、ＬＤＡＯ、ＯＧ、ＤＤＭまたはその組合わせからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の自己集合ナノ構造体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の自己集合ナノ構造体を含む液体組成物。
【請求項７】
さらに緩衝剤を含む、請求項６に記載の液体組成物。
【請求項８】
膜貫通タンパク質がアクアポリン水チャネルである、請求項６または請求項７に記載の液体組成物。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項に記載の液体組成物を調製する方法であって、ポリアルキレンイミンの溶液を、界面活性剤可溶化した膜貫通タンパク質と混合することを含む方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の自己集合ナノ構造体を含む分離膜。
【請求項１１】
膜貫通タンパク質がアクアポリン水チャネルである、請求項１０に記載の分離膜。
【請求項１２】
有効層を備えた基材を含み、その有効層が請求項１〜５のいずれか１項に記載の自己集合ナノ構造体を含む、請求項１０または請求項１１に記載の分離膜。
【請求項１３】
有効層が薄膜複合材料層である、請求項１２に記載の分離膜。
【請求項１４】
有効層が交互積層析出法により形成される、請求項１２に記載の分離膜。
【請求項１５】
膜加工プロセス中に請求項６〜８のいずれか１項に記載の液体組成物を添加することを含む、分離膜の作成方法。
【請求項１６】
薄膜複合材料層の製造中に液体組成物を添加することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
交互積層析出法による有効層の形成中に液体組成物を添加することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の分離膜により水溶液を濾過することを含む、純水濾液を調製する方法。
【請求項１９】
請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の分離膜を使用して生成物溶液から水を抽出することを含む、生成物溶液を浸透作用により濃縮する方法。
【請求項２０】
浸透圧発電を用いて塩分濃度差電力を産生する方法であって、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の分離膜を用いて静水圧を増大させ、この静水圧の増大を塩分濃度差電力の供給源として用いることを含む方法。
【請求項２１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の自己集合ナノ構造体を含む選択層で改質した繊維を有する、中空繊維（ＨＦ）モジュール。
【請求項２２】
選択層が繊維の内面に薄膜複合材料（ＴＦＣ）層を構成する、請求項２１に記載のＨＦモジュール。
【請求項２３】
保護シェルにより囲まれた繊維の束を含む中空繊維（ＨＦ）モジュールを製造する方法であって、繊維は請求項１〜５のいずれか１項に記載の自己集合ナノ構造体を含む選択層で改質され、その方法は、繊維を請求項６〜８のいずれか１項に記載の液体組成物を含む水性ＭＰＤ相と接触させ、その水相を有機ＴＭＣ相と界面重合反応で反応させて自己集合ナノ構造体を含む選択層を形成することを含む、前記方法。
【請求項２４】
繊維の内腔を水相と接触させることを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
保護シェルが細長い形状を有し、繊維の束が保護シェルの内側に縦軸方向に配置される、請求項２３または請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
モジュールのシェル側に真空を適用して水相の均一な乾燥を促進することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
水相乾燥工程中に保護シェルを実質的に水平方向に保持することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
正浸透により純水を抽出するための、請求項２１または請求項２２に記載のＨＦモジュールの使用。
【請求項２９】
血液透析、血液透析濾過または血液濾過により失われた患者血漿から純水を再抽出するための、請求項２１または請求項２２に記載のＨＦモジュールの使用。
【請求項３０】
水源の逆浸透精製のための、請求項２１または請求項２２に記載のＨＦモジュールの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜貫通タンパク質、たとえばアクアポリン(aquaporin)（ＡＱＰ）水チャネルと、ポリアルキレンイミン（ＰＡＩ）との間で形成された、自己集合ナノ構造体、およびナノ構造体を含む濾過膜に関する。本発明はさらに、ナノ構造体および分離膜（たとえば、中空繊維および中空繊維モジュール）を作成する方法、ならびにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
二重層または二重層様の構造をもつ自己集合ベシクルを形成するために、特に両親媒性膜タンパク質、たとえばアクアポリン（ＡＱＰ）水チャネルを固定化するために、両親媒性脂質およびブロックコポリマーを使用することは当技術分野で周知である。次いでＡＱＰを含むベシクルを用いて、一般にそれらのベシクルを支持基材上に層としてまたはフィルム状に析出させることにより、ＡＱＰが固定化された水精製(WO2006/122566)または塩分濃度差電力(salinity power) (WO2007/033675)の産生などの用途のための膜を作成することができ、それにより水分子はナノ濾過、逆浸透、正浸透または浸透圧発電(pressure retarded osmosis)によって選択的に膜を通過できる。
【０００３】
WO2013/043118には、アクアポリン（ＡＱＰ）水チャネルが膜の有効層に組み込まれた薄膜複合材料(thin film composite)（ＴＦＣ）膜が開示されている。さらに、それには、薄膜複合材料膜を製造する方法、および濾過プロセス、たとえばナノ濾過および浸透圧濾過プロセスにおけるそれらの使用が開示されている。ＴＦＣ膜は、ＴＦＣ有効層に組み込まれた脂質−ＡＱＰ／コポリマー−ＡＱＰベシクルを含む。WO2010/146365には、固定化されたＡＱＰを組み込むためのベシクル形成物質として両親媒性トリブロックコポリマーを用いるＴＦＣ−アクアポリン−Ｚ（ＡｑｐＺ）濾過膜の製造が記載されている。
【０００４】
WO2014/108827には、アクアポリン水チャネルを含む薄膜複合材料（ＴＦＣ）層で改質された繊維を有する中空繊維(hollow fiber)（ＨＦ）モジュールが開示され、その際、アクアポリン水チャネルは、ＴＦＣ層に組み込まれる前にベシクルに組み込まれる。
【０００５】
しかし、一般にこれらの先行技術においてベシクル製造に用いる両親媒性脂質およびブロックコポリマーは固体であり、テトラクロロメタン（ＣＣ１４）またはクロロホルム（ＣＨＣｌ３）などの過酷な溶媒に溶解してそれらの主に疎水性である部分を可溶化する必要がある。膜合成中に、この溶媒を蒸発させてフィルムを形成させ、それを次いで再水和して両親媒性物質を種々のエマルジョン形態（たとえば、ベシクル）にし、同時にＡＱＰ膜タンパク質を組み込ませる。しかし、実際には、最終ベシクルサイズを制御するのはしばしば困難であり、直径が約６０〜８０ｎｍから約１０００ｎｍまで、またはそれ以上の範囲のベシクルを含む分散エマルジョンが得られる。膜タンパク質は、それらの両親媒性構造に従って二重層構造中で整列しかつタンパク質およびベシクル膜の疎水性部分の厚さと調和する必要があるので、各ベシクルに組み込むことができるＡＱＰの数が限られる可能性もある。
【０００６】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は高いカチオン密度をもち、それによって負に荷電したＤＮＡと複合体を形成できるので、遺伝子を細胞内へ伝達するための多目的ベクターとして知られている。この用途において、ＰＥＩ−ＤＮＡ複合体は、たとえば、酵素に対する物理的バリヤーを提供して、またはＰＥＩと酵素の間の静電相互作用により、酵素分解に対する安定な環境をＤＮＡに提供する(Thomas & Venkiteswaran, Biophysical Journal, 106(2): 276-277, 2014)。ＰＥＩは共に線状、分枝状およびデンドリマー状の形態で存在する。直鎖は第二級アミン基をもち、一方、分枝鎖またはデンドリマーは第一級、第二級および第三級アミン基をもつ可能性がある。短いポリエチレンイミン（ＰＥＩ，Ｍｗ  ６００）がカチオン性主鎖として選択され、それに脂質テイルが種々の飽和レベルでコンジュゲートすることも文献から知られている。溶液中で、これらのポリマー−脂質ハイブリッドは自己集合して、ｓｉＲＮＡと複合体形成できるナノ粒子を形成する。それらの複合体は遺伝子を特異的にかつ低い細胞毒性でサイレンシングする(Schroeder A, et al., J. of Controlled Release, 160(2): 172-176, 2012)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2006/122566
【特許文献２】WO2007/033675
【特許文献３】WO2013/043118
【特許文献４】WO2010/146365
【特許文献５】WO2014/108827
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Thomas & Venkiteswaran, Biophysical Journal, 106(2): 276-277, 2014
【非特許文献２】Schroeder A, et al., J. of Controlled Release, 160(2): 172-176, 2012
【発明の概要】
【０００９】
概括的に、本発明は、ポリアルキレンイミン（ＰＡＩ）、たとえばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて、膜貫通タンパク質、または特定のタイプの内在性膜タンパク質(integral membrane protein)（ポアタンパク質）、たとえばアクアポリン水チャネルとの自己集合ナノ構造体を形成することに関する。次いでこのＰＡＩ−タンパク質ナノ構造体を用いて、膜貫通タンパク質が固定化された、たとえば水分子が膜を通過するのに有効な分離膜を製造できる。たとえば、膜貫通タンパク質を含む分離膜の製造のためには、水性液体組成物に自己集合ナノ構造体を懸濁し、それを半透性支持体上での界面重合反応に際し含有させて薄膜複合材料の有効膜層を形成するか、あるい有効選択層をもつ交互積層法(layer-by-layer technique)により形成された濾過膜または他のタイプの濾過膜に自己集合ナノ構造体を組み込むことができる。
【００１０】
いずれか特定の理論により拘束されることを望まないが、自己集合ナノ構造体は、ポリアルキレンイミン分子中に存在する正に荷電した窒素原子と、ナノ構造体および／またはナノ構造体を含む膜を形成するために用いた条件（ｐＨ、ｐＫなど）下で負に荷電している膜貫通タンパク質中のアミノ酸残基との、静電相互作用により生成すると考えられる。
【００１１】
したがって、本発明の自己集合ナノ構造体は、膜貫通タンパク質を含む膜が脂質二重層または二重層様の構造体中に固定化された先行技術におけるベシクルとは異なる；それらにおいて、タンパク質は個々のベシクルまたはセルの二重層に組み込まれるか、あるいは液膜中の隣接セル間の境界層に組み込まれている。両方の場合とも、二重層はセル内の内部相をセルが懸濁されている周囲外部相から分離する機能をもつ。これと対照的に、本発明の自己集合ナノ構造体においては、膜貫通タンパク質分子とポリアルキレンイミン分子は、明確な内部相と外部相を生じる境界層を実質的に生じるのではなく、むしろナノ構造体の組成物を提供する様式で会合するかあるいは複合体形成し、それを分離膜の有効層および／または選択的構造体として析出させるかあるいは他の形で得ることができる。
【００１２】
したがって、一側面において、本発明は、正に荷電したポリマー、たとえばポリアルキレンイミン（ＰＡＩ）、たとえばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と、１種類以上の膜貫通タンパク質、たとえばＡＱＰ、特に界面活性剤可溶化した(detergent solubilized)膜貫通タンパク質との間で形成された、自己集合ナノ構造体を提供する。膜貫通タンパク質は負に荷電したアミノ酸残基をもち、それはたとえば正に荷電したポリマーと複合体形成するかあるいはたとえば静電相互作用により電荷相互作用して凝集物を形成するために使われる。より具体的には、形成されたナノ構造体のサイズはＰＡＩ（またはＰＥＩ）ポリマーの分子構造および分子量ならびに使用するポリマーとタンパク質の比率に依存することが見出された。
【００１３】
したがって、本発明は水輸送を促進するためにＡＱＰが有効層に組み込まれた分離膜、たとえば濾過膜またはＴＦＣ膜を提供し、その際、ＡＱＰは自己集合ＰＡＩナノ構造体、たとえば自己集合ＰＥＩナノ構造体内に固定化されている。本発明はさらに、種々の分離膜（濾過膜を含む）、たとえばナノ濾過膜、正浸透膜および逆浸透膜の有効層に組み込むことができるＰＡＩ−タンパク質ナノ構造体を含む、液体組成物を提供する。
【００１４】
さらなる側面において、本発明は、本発明の自己集合ナノ構造体を含む選択層で改質された繊維を有する中空繊維（ＨＦ）モジュールを提供する。選択層は繊維の内面に薄膜複合材料（ＴＦＣ）層を含むのが好都合であるが、特定の態様において、ＴＦＣ層を繊維の外側に形成することができる。
【００１５】
関連する側面において、本発明は、保護シェルにより囲まれた繊維の束を含む中空繊維（ＨＦ）モジュールを製造する方法を提供し、その際、繊維は本発明の自己集合ナノ構造体を含む選択層で改質され、その方法は、自己集合ナノ構造体を含む液体組成物と繊維を接触させ、液体組成物を界面重合反応において反応させて、自己集合ナノ構造体を含む選択層を形成することを含む。この方法はさらに、交互積層析出法による有効層の形成中に液体組成物を添加することを含むことができる。この方法を用いて、種々の他の膜形態、たとえば平坦なシート状の膜および管状の膜の上に、選択層を形成することができる。
【００１６】
ＨＦモジュールにおいて、保護シェルは一般に細長い形状をもち、繊維の束が保護シェルの内側に縦軸方向に配置されている。実施例において設定した実験により、モジュールのシェル側に真空を適用することがＴＦＣコーティング法において有利であることが立証された。さらに、水相乾燥に際して保護シェルを実質的に水平方向に保持することがさらに有利な可能性がある。そのような真空の適用の利点には、有機相の導入前に膜表面が水相からモジュール長さに沿って均一に乾燥すること、および／またはシェル内の繊維の外面上においてモジュールのシェル側の水相の重量流れ(gravimetrical flow)が低減もしくは阻止されることが含まれる。
【００１７】
さらなる側面において、本発明は正浸透により純水を抽出するための、本発明のＨＦモジュールの使用を提供する。
さらなる側面において、本発明は、たとえばWO2015/124716に開示された様式で、血液透析、血液透析濾過または血液濾過により失われた患者血漿から純水を再抽出するための、本発明のＨＦモジュールの使用を提供する。
【００１８】
さらなる側面において、本発明は、天然水源からの重水画分のアップコンセントレーション(up-concentration)のための、本発明のＨＦモジュールの使用を提供する。
本発明の種々の側面は、ポリアルキレンイミン（ＰＡＩ）（たとえばＰＥＩ）および界面活性剤可溶化した膜貫通タンパク質の自己集合により形成された自己集合ナノ構造体を含む選択層で改質された中空繊維膜を有する、中空繊維（ＨＦ）モジュールを使用する。一般に、ＰＥＩは、約２，０００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａ、たとえば約３，０００Ｄａ〜約５，０００Ｄａの平均分子量をもつ実質的に線状のポリマーである；膜貫通タンパク質は、アクアポリン水チャネルである；界面活性剤は、ＬＤＡＯ、ＯＧ、ＤＤＭまたはその組合わせからなる群から選択される；選択層は、繊維の内面に界面重合反応により形成された薄膜複合材料（ＴＦＣ）層を含む；ＴＦＣ層はＰＡＩまたはＰＥＩナノ構造体に機能性状態で封入されたアクアポリン水チャネルを含み、あるいはアクアポリン水チャネルは、両親媒性ベシクル、たとえば後記の実施例１１に記載するジブロックもしくはトリブロックコポリマーベシクル、または脂質ベシクルに組み込まれている；ＨＦモジュールは、本明細書に記載する方法を用いてコートされている。
【００１９】
さらに、膜貫通タンパク質がイオンチャネルまたはアクアポリンなどを含み、その膜貫通タンパク質を含むナノ構造体が有効層または選択層に固定化され、または組み込まれている場合、それは広範な選択性および輸送特性をもつ分離膜または濾過膜、たとえば
膜貫通タンパク質がイオンチャネルである場合にはイオン交換膜、または膜貫通タンパク質がアクアポリンである場合には水濾過膜の製造に適したものになる。膜貫通タンパク質は、複合体形成して自己集合ナノ構造体になり、分解から遮蔽された際、生物活性であるそれのフォールドした構造を維持しているので、実験室規模および工業的規模の分離膜に組み込まれた場合、感受性の高い両親媒性タンパク質ですら十分に安定になり、よってそれらの機能性を保持することができる。
【００２０】
さらに、本発明は、膜貫通タンパク質が前記のアクアポリン水チャネルである自己集合ナノ構造体を含み、場合により緩衝剤を含む、液体組成物、およびその液体組成物を調製する方法に関するものであり、その際、ポリアルキレンイミンの溶液を界面活性剤可溶化した膜貫通タンパク質と混合して、室温以上ですら安定である液体配合物を形成する。液体組成物の形態は中間体として特に有用であり、それを膜加工プロセス中に、たとえばＴＦＣ層を形成する界面重合中にＭＰＤ溶液に添加するか、あるいは他の方法で適用することができる。本発明の特別な特徴は、下記に述べるようにＰＡＩナノ構造体をその界面重合に関与させ、こうして薄膜を強化し、アクアポリン水チャネルをそれに固定化できることである(Kah et al., pH stable thin film composite polyamine nanofiltration membranes by interfacial polymerisation; Journal of Membrane Science, 478: 75-84, 2015)。
【００２１】
本発明の分離膜は、純水濾液を調製する方法、たとえばナノ濾過プロセス、正浸透プロセス、または逆浸透プロセスにおいて分離膜により水溶液を濾過するのに有用である。
さらに、本発明の分離膜は、生成物溶液の濃縮のための方法に有用であり、その方法は、生成物溶液からたとえば正浸透により水を抽出するためのフィルターハウジングまたはモジュールに取り付けた本発明の分離膜を使用し、こうしてそれに含まれる望ましい溶質のより高い最終濃度をもつ生成物溶液を調製することを含む。
【００２２】
本発明の分離膜はさらに、浸透圧発電を用いて塩分濃度差電力を産生するための方法に使用でき、その方法は、その分離膜を用いて静水圧を増大させ、その静水圧の増大を電源として利用することを含む；参照：WO2007/033675およびWO2014128293(Al)。
【００２３】
次いで本発明の態様を、限定ではなく例示のために、付随する例および図面を参照して記載する。ただし、本発明の開示内容を考慮して本発明の種々のさらなる側面および態様が当業者に明らかになるであろう。
【００２４】
本明細書中で用いる“および／または”は、２つの特定した特徴または成分のそれぞれの、他方を含むかまたは含まない具体的開示と解釈すべきである。たとえば、“Ａおよび／またはＢ”は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、および（ｉｉｉ）ＡとＢのそれぞれの具体的開示であって、それぞれを個別に本明細書に述べたと同様であると解釈すべきである。
【００２５】
状況からそうではないことが指示されない限り、前記に述べた特徴の記載および定義は本発明のいずれか特定の側面または態様に限定されず、記載したすべての側面および態様に等しく適用される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１．ＰＥＩ自己集合ナノ構造体中におけるＡＱＰＺの円偏光二色性プロファイル。ＡＱＰＺの二次構造。ＰＥＩ自己集合ナノ構造体に再構成された図１は、２０８ｎｍと比較して２２２ｎｍに負の楕円率バンド(ellipticity band)を示し（２２２／２０８ｎｍ比＝１．１５）、これは大腸菌(E. coli)総脂質中で再構成されたホウレンソウアクアポリンについてレポートされたものと類似し、タンパク質がアンフォールドしていないことの指標となる(Hansen et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1808: 2600-2607, 2011)。
【図２】図２．実施例１１に記載する血液濾過(hemofiltration)（ＨＦ）モジュールに適用した本発明の自己集合ナノ構造体についてのコーティングプロトコルを示す模式図。Ｉ  −  ＭＰＤ−水湿潤、ＩＩＡ  −  １側から乾燥するモジュール、ＩＩＢ  −  ２側から乾燥するモジュール、ＩＩＩ  −  ＴＭＣ−アイソペア(isopare)との反応。ＦＶ  −  流量計、ＲＨ  −  湿度センサー。
【図３】図３．２．３ｍ２のモジュールの試験に用いた適用ＬＰＲＯセットアップの模式図。ＦＶ  −  流量計、Ｐ  −  マノメーター、Ｃ  −  導電率計。
【図４】図４．２．３ｍ２のモジュールの試験に用いた適用シングルパス(single-pass)ＦＯ試験法の模式図。凡例：ＦＶ  −  流量計、Ｐ  −  マノメーター、Ｃ  −  導電率計。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
より具体的には、本発明は本明細書に開示する自己集合ナノ構造体に関するものであり、そのナノ構造体は負に荷電しているタンパク質の存在下で正に荷電したＰＥＩの自己集合により形成される。
【００２８】
膜貫通タンパク質の例は、アクアポリン水チャネル、すなわちアクアポリンおよびアクアグリセロポリン(aquaglyceroporin)、たとえば下記に挙げるものを含めた、内在性膜タンパク質である。ｐＨ７．５では、負の値のゼータ電位値を示すプロテオリポソーム内で再構成された際に証明されるように、タンパク質は負に荷電している(Wang S et al., Membranes, 5(3): 369-384, 2015)。これは負に荷電したアミノ酸残基（アスパラギン酸およびグルタミン酸）の存在によるものである；アスパラギン酸については３．９、グルタミン酸については４．２ののｐＫａ(Kong S et al. RSC Adv., 4: 37592-37599, 2014)。さらに、これらのタンパク質は、適正にフォールドした際には外面に位置するシステイン残基をもち、そのシステインはｐＨ７．５で負に荷電し、Ａｑｐを含有するＺｌ，２−ジフィタノイル(diphytanoyl)−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰｈＰＣ）プロテオリポソームについて示されたように、同様に負の値のゼータ電位を誘導する (Li et al., Fusion behaviour of aquaporin Z incorporated proteoliposomes investigated by quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D); Colloids and Surfaces B-biointerfaces, 111 :. 446-452, 2013)。
【００２９】
本発明はまた、本明細書に開示する自己集合ナノ構造体を含む液体組成物に関するものであり、その際、膜貫通タンパク質はたとえばＬＤＡＯ、ＯＧ、ＤＤＭなど適切な界面活性剤を用いて界面活性剤可溶化されている；場合により、その膜貫通タンパク質の負に荷電したアミノ酸残基を維持するためにｐＨ緩衝剤と組み合わせ、たとえば、ｐＨ４以上に緩衝化するアクアポリンについては負に荷電したアミノ酸残基のｐＫａに対応するリン酸緩衝液を使用する。液体組成物の他の任意成分は、生物学的緩衝液、たとえばＨＥＰＥＳナトリウム塩；参照：５４４６６  ＨＥＰＥＳナトリウム塩，Ｆｌｕｋａ(Industriestrasse 25, CH-9471 Buchs)から、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＴＥＳ、ＭＥＳ、およびＭＯＰＳ緩衝液である。
【００３０】
さらに、本発明は、開示した液体組成物を調製する方法に関するものであり、その際、たとえば、ＰＡＩ、たとえばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の溶液を、負に荷電したアミノ酸残基をもつ負に荷電したタンパク質の懸濁液と混合する。この方法で、ＰＥＩ溶液が荷電タンパク質と複合体形成すると、ＰＥＩ  ＤＮＡおよびＰＥＩ  ＲＮＡ複合体について示されたように構造体が形成される(Sun et al, Molecular Dynamics Simulations of DNA/PEI Complexes: Effect of PEI Branching and Protonation State, Biophysical Journal Volume 100 June 2011 2754-2763; Mansoor M Amiji Polymeric Gene Delivery: Principles and Applications)。ＰＥＩの例は、後記に概説する線状および分枝ポリマーである。
【００３１】
さらに、本発明は、分離膜、たとえば本明細書に開示する自己集合ナノ構造体を含む半透膜または選択的透過膜の形態のものに関する。分離膜は、自己集合ナノ構造体が固定化された分離層または有効層を有する多孔質基材または支持膜（たとえば、ナノ多孔質またはマイクロ多孔質の膜）を含む、濾過膜の形態であってもよい。ある場合には、多孔質支持層は、たとえばポリエステル繊維から形成された成織シートまたは不織シート上にキャストすることによってさらに強化されてもよい。
【００３２】
一例として、その有効層は、界面重合により形成されて薄膜またはＴＦＣ層（たとえば架橋芳香族ポリアミド層）を形成した水選択層であってもよく、あるいは有効層／選択層は交互に正と負に荷電したナノサイズの高分子電解質(polyelectrolyte)の層の析出により形成されたもの、すなわち交互積層(layer-by-layer)（ＬｂＬ）フィルムであってもよい (参照：Wang et al., Membranes, 5(3): 369-384, 2015)。
【００３３】
本発明による濾過膜は、膜加工プロセス中に、自己集合ナノ構造体を含む液体組成物、たとえば構造体を形成するために必要な膜貫通タンパク質としてアクアポリン水チャネルタンパク質を含むものを添加することにより、たとえばＴＦＣ層を形成する場合には液体組成物をＭＰＤ溶液に添加することにより、あるいはＬｂＬスキン(skin)を形成する場合には正に荷電した高分子電解質を液体に添加することにより、製造できる。
【００３４】
本発明方法の一側面において、膜貫通タンパク質はアニオンチャネルタンパク質、たとえば電位依存性アニオンチャネルであってもよく、それは逆電気透析のためのイオン交換膜の製造に有用である：参照：Dlugolecki et al. (Journal of Membrane Science, 319 214-222, 2008)。
【００３５】
定義および用語
本明細書中で用いる用語“膜貫通タンパク質(trans membrane protein)”（ＴＰ）は、それが自然状態で永続的に結合している生体膜の全体を貫通しているタイプの膜タンパク質である。すなわち、自然状態で膜貫通タンパク質は膜の一方側から膜の他方側まで貫通している。膜貫通タンパク質の例は、アンモニアトランスポーター、尿素トランスポーター、塩素チャネル、およびアクアポリン水チャネルである。
【００３６】
本明細書中で用いる用語 “アクアポリン水チャネル(aquaporin water channel)”には、機能性である天然または合成のアクアポリンまたはアクアグリセロポリン水チャネル、たとえばアクアポリンＺ（ＡｑｐＺ）、ＧＩＰｆ、ＳｏＰＩＰ２；ｌ、アクアポリン１および／またはアクアポリン２が含まれる。アクアポリン水チャネルには、細菌アクアポリン、および真核生物アクアポリン、たとえば酵母アクアポリン、植物アクアポリンおよび哺乳類アクアポリン、たとえばアクアポリン９および１２、ならびに関連するチャネルタンパク質、たとえばアクアグリセロポリンが含まれる。アクアポリンおよびアクアグリセロポリンの例には、下記のものが含まれる：原核生物アクアポリン、たとえばＡｑｐＺ；哺乳類アクアポリン、たとえばＡｑｐｌおよびＡｑｐ２；植物アクアポリン、たとえば原形質膜内在性タンパク質(plasma intrinsic protein)（ＰＩＰ）、液胞膜内在性タンパク質(tonoplast intrinsic protein)（ＴＩＰ）、ノデュリン内在性タンパク質(nodulin intrinsic protein)（ＮＩＰ）および小胞体内在性タンパク質(small intrinsic protein)（ＳＩＰ）、たとえばＳｏＰＩＰ２；ｌ、ＰｔｔＰＩＰ２；５およびＰｔＰＩＰ２；２；酵母アクアポリン、たとえばＡＱＹ１およびＡＱＹ２；ならびにアクアグリセロポリン、たとえばＧｌｐＦおよびＹｆｌ０５４。アクアポリン水チャネルタンパク質は、本明細書に記載する方法、またはKarlsson et al. (FEBS Letters 537: 68-72, 2003)に記載の方法、またはJensen et al. US 2012/0080377 Alに記載の方法（たとえば、例6を参照）に従って調製できる。
【００３７】
本明細書中で用いる用語“分離膜(separation membrane)”には、水、ならびに場合によりアニオンおよびカチオンを含めたある種の小サイズの溶質を他の溶質、粒子、コロイドおよび高分子から分離するために有用である、フラットシート、管状または中空繊維構造の膜が含まれる。分離膜の例は、“濾過膜”、たとえばナノ濾過(nano filtration)（ＮＦ）膜、正浸透(forward osmosis)（ＦＯ）膜および逆浸透(reverse osmosis)（ＲＯ）膜である。あるタイプの濾過膜は、“薄膜複合材料”（またはＴＦＣ）膜、しばしばナノ濾過膜および逆浸透膜として分類されるものである。ＴＦＣフラットシート膜は一般に、不織布または織布支持体上にキャストされたポリエーテルスルホンまたはポリスルホン多孔層上に界面重合によりポリアミド層を形成することによって作成される。中空繊維の内面または外面にＴＦＣ層を作成する方法の例は、WO2014/108827に開示されており、それを本明細書に援用する。ポリアミド製の排除層(rejection layer)は、アミンの水溶液と有機溶媒中における酸塩化物の溶液との界面重合により形成される。ＴＦＣ膜は、WO 2013/043118 (Nanyang Technological University & Aquaporin A/S)の記載に従って製造できる。他のタイプの濾過膜は、たとえばGribova et al. (Chem. Mater., 24: 854-869, 2012)およびWang et al. (Membranes, 5(3): 369-384, 2015)に記載される交互積層（ＬｂＬ）析出法により形成されるものである。たとえば、下記に概説されるように、自己集合ナノ構造体を高分子電解質多層(polyelectrolyte multilaye)（ＰＥＭ）フィルムに埋め込むか、または組み込むことができる：図4, Gribova et al. (2012). Polyelectrolyte Multilayer Assemblies on Materials Surfaces: From Cell Adhesion to Tissue Engineering. Chemistry of Materials : A Publication of the American Chemical Society, 24(5), 854-869. http://doi.org/10.1021/cm2032459。
【００３８】
ＨＦモジュールは当技術分野で知られており、一般にポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）繊維、または他の適切な多孔質材料、たとえばポリスルホン、ポリフェニレンスルホン、ポリエーテルイミド、ポリビニルピロリドンおよびポリアクリロニトリル（そのブレンドおよび混合物を含む）の繊維を含有し、それらはたとえば界面重合により薄膜複合材料層を形成することによって改質されている。さらに、中空繊維支持材料を製造する場合には種々のドーピング剤を使用できる。そのようなＨＦモジュールは、食品および飲料用に、たとえばビールおよびワインの濾過に、排水再利用およびプール水再循環を含めたある種の水および排水用に、ならびに血液透析のために、一般に用いられている。たとえば、ドイツの企業Ｍｅｍｂｒａｎａは、数千本の繊維を収容した、モジュール当たりの全表面積７５平方メートルをもつ中空繊維モジュールを提供している。一般的に１〜２平方メートルおよびほぼ８，０００〜２０，０００本の繊維を備えた、より小型のモジュールが、医療透析用途に一般に用いられている（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ，Ｇａｍｂｒｏ）。本発明の方法に使用するためのＨＦモジュールは、一般に、２０から５０ｋＤａまで、またはたとえば３０から４０ｋＤａまでの分子量カットオフ範囲をもつ、精密濾過モジュールまたはナノ濾過モジュールである。原則として、これらの市販製品はすべて、界面重合により本発明の自己集合ナノ構造体または組成物でコートして、たとえばアクアポリン水チャネルが組み込まれた薄膜複合材料層にすることができる。本発明のＨＦモジュールのハウジング材料は、ＨＦモジュールに慣用される適切ないかなる材料であってもよく、たとえばポリカーボネート、ポリスルホン、ＰＯＭ（それらはすべて透明である）、またはポリプロピレン、ポリエチレン、ＰＶＤＦ、およびステンレススチールを使用できる。一般的に知られているポリウレタンまたはエポキシ系の接着剤などを用いて、繊維をＨＦモジュールハウジング内に密閉することができる。管状モジュール、たとえば下記に記載のモジュールも同様な方法でコートすることができる：
http://synderfiltration.com/leaming-center/articles/module-configurations-process/tubular-membranes/。
【００３９】
本発明に従ってＴＦＣ改質できるＨＦモジュールのさらに他の例は、たとえば下記の膜製造業者のウェブサイトにある：
http://www.membranafiltration.com/filtration-modules/documentation.cfrn http://www.kochmembrane.com/PDFs/KMS_Puron_Hollow_Fiber_PSH300_PSH600_PSH1800_Modul.aspx
http://www.kochmembrane.com/Membrane-Products/Hollow-Fiber/Ultrafiltration/PURON-Series.aspx
http://www.daicen.co.jp/english/membrane/kogata.html
http://www.spectrumlabs.com/filtration/hfmods.html
http://www.microdyn-nadir.com/en/Products/。
【００４０】
本明細書中で用いる“薄膜複合材料(thin film composite)”または“ＴＦＣ”膜は、水溶液中のアミン反応体、好ましくは芳香族アミン、たとえばジアミンまたはトリアミン、たとえばｌ，３−ジアミノベンゼン（ｍ−フェニレンジアミン，＞９９％，たとえばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから販売されているもの）、および有機溶媒に溶解したハロゲン化アシル（アミン反応性分子としても知られる）、たとえばジ酸−またはトリ酸塩化物、好ましくは芳香族ハロゲン化アシル、たとえばベンゼン−１，３，５−トリカルボニルクロリド（ＣＡＳ  Ｎｏ．８４２７０−８４−８，トリメソイルクロリド(trimesoyl chloride)（ＴＭＣ），９８％，たとえばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから販売されているもの）を用いて製造でき、その際、それらの反応体は界面重合反応で結合する；参照：US Patent No: 4,277,344；それには、ポリアミドが多孔膜支持体にその支持膜（たとえばポリエーテルスルホン膜）の表面において積層したものを含む複合材料膜の形成が詳細に記載されている。ベンゼン−１，３，５−トリカルボニルクロリドを下記の溶媒に溶解する；たとえば下記を含めたＣ６−Ｃ１２炭化水素：ヘキサン（＞９９．９％，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカンなど（直鎖または分枝鎖炭化水素）、または他の低芳香族の炭化水素系溶媒、たとえばＩｓｏｐａｒ（商標）Ｇ  Ｆｌｕｉｄ：それは石油ベースの原料から触媒の存在下に水素で処理して低臭気の流体を製造することにより製造され、その主成分にはイソアルカンが含まれる。Ｉｓｏｐａｒ（商標）Ｇ  Ｆｌｕｉｄ：化学名：炭化水素，Ｃ１０−Ｃ１２，イソアルカン，＜２％の芳香族；ＣＡＳ  Ｎｏ：６４７４２−４８−９，化学名：ナフサ（石油），水素処理した重油（ＥｘｘｏｎＭｏｂｉｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから）。反応体ｌ，３−ジアミノベンゼンの代替には、ジアミン、たとえばヘキサメチレンジアミンなどが含まれ、反応体ベンゼン−１，３，５−トリカルボニルクロリドの代替には、当技術分野で既知のジアシルクロリド、アジポイルクロリドなどが含まれる。興味深いことに、アミン反応性分子、たとえばＴＭＣは、界面重合反応においてＰＡＩポリマー中のアミン基と縮合生成物またはポリマーを形成することができる；たとえば、X. Feng et al. (Journal of Membrane Science, 472: 141-153, 2014)が記載しており、彼はＰＥＩとＴＭＣの界面重合反応で芳香族ポリアミドの連続層をＰＥＳ支持体上に形成してナノ濾過膜を作成する方法を示した。
【００４１】
“交互積層(layer-by-layer)”または“ＬｂＬ”析出法：１９６６年に初めて言及された(Her,. Colloid Sci. 21 : 569-594, 1966)、反対電荷をもつ高分子電解質の連続的交互積層（ＬｂＬ）吸着は、効率的な薄膜形成法であり、材料科学およびエンジニアリングにおける慣用手法のひとつである(Decher et al., Phys. Chem. 95: 1430-1434, 1991)。高分子電解質多層の形成のための推進力は静電引力であるので、ＬｂＬ法は注文に合わせた組成および調整可能な特性を備えた広範囲の用途をもつ超薄型無欠陥層の加工に適している(Joseph et al., Polym. Chem. 5: 1817-1831, 2015.)。調整可能な特性の一例は層数の制御であり、よってｎｍからμｍまでの範囲の全厚の制御でもある(Jian et al., Adv. Mater 18: 1068-1072, 2006)。ＬｂＬ高分子電解質アセンブリーは、膜分離のために、種々のサイズおよび形態をもつ多くの多孔膜基材に用いられており、それらは最初の高分子電解質層、たとえばポリ（エーテルスルホン）（ＰＥＳ）、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（４−メチル−ｌ−ペンテン）、ポリアミド、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリ（ビニルピロリドン）、アノード性アルミナを、フラットシート、管状または中空繊維構造体に吸着できる(Duong et al., J. Memb. Sci. 427: 41 1-421, 2013.)。多種多様な高分子電解質を用いて膜になる多層を形成することができ、下記の表にまとめるように、二重層の数および支持膜も変更できる(Zhang, Y. (2013)中の表2.2、すなわちZhang, P. et al (2008)に基づく表から)。
【００４２】
【表１】
2019507673.tif 000002
【００４３】
用語“ポリアルキルイミン(polyalkylimine)”（ＰＡＩ）には、少なくとも１つの“イミン”基（−Ｎ（Ｈ）−）を含むアルキルイミンモノマーの重合により製造されたいずれかのオリゴマーもしくはポリマーまたはその混合物が含まれる。一態様において、ポリアルキルイミンは、主鎖中にアルキル−またはアルケニル−由来の単位（たとえば、Ｃ２−Ｃ８アルキル−またはアルケニル−由来の単位）を含むアミン含有ポリマーである。好ましくはＰＡＩはイミン−由来の単位（アミン基）およびアルキル−由来の単位を含み、最も好ましくはＰＡＩはアミン基およびアルキル−由来の単位からなる。好ましくは、ＰＡＩはポリ（エチレンイミン）、ポリ（プロピレンイミン）、ポリ（プロピル−ｃｏ−エチレンイミン）、ポリ（アリルアミン）、およびその混合物からなる群から選択される。いずれの場合も、ＰＡＩは好ましくは、約５００または約１，０００以上、たとえば約２，０００または３，０００または５，０００または１０，０００または２０，０００または４０，０００Ｄａの重量平均分子量（Ｍｗ）をもつ。
【００４４】
本明細書に記載する縮合ポリマーは、一般に水溶液中でアミン反応性分子とＰＡＩを結合させることにより製造される。アミン反応性分子は、アミン／イミンと反応して共有結合またはイオン化学結合、好ましくは共有結合を形成する部分を少なくとも１つ含む分子である。望ましくは、ＰＡＩと結合する０．１または０．２から０．６または０．８または１．０または１．１または１．２または２．０または２．５または３．０までのアミン反応当量(amine-reactive equivalent)(“ＡＲＥ”）のアミン反応性分子がある。望ましくは、生成物を少なくとも８のｐＨの溶液または実質的な溶液中の水性希釈剤から単離することができる。ＰＡＩとアミン反応性分子の縮合反応の生成物は本明細書に記載する縮合ポリマーであるが、特定の態様においては必ずしも縮合ポリマーを反応媒体から特別に単離する必要はなく、よって、特定の態様において縮合ポリマーの有用性は混合物または縮合生成物の全体である。
【００４５】
本明細書中で用いる用語“ポリエチレンイミン”（ＰＥＩ）には、−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−（１つのアミン基および２つのメチレン基）で構成される反復単位をもつポリマーが含まれる：
【００４６】
【化１】
2019507673.tif 000003
【００４７】
線状ポリエチレンイミンは第二級アミンを含み、これに対し、分枝ポリエチレンイミンは第一級、第二級および第三級アミン基を含む可能性がある。１，０００Ｄａまたは１，５００Ｄａまたは２，０００Ｄａまたは２５００Ｄａから４，０００Ｄａまたは５０００Ｄａまたは８，０００Ｄａまたは１０，０００Ｄａまでの範囲の分子量をもつ種々の線状ＰＥＩ、および８００Ｄａから２，０００Ｄａまでの範囲の分子量をもつ分枝ＰＥＩを使用できる。一般に、ＰＥＩの分枝度および分子量が増大するのに伴なって、ＰＥＩとタンパク質の間で形成される構造体中の可能なタンパク質装填量が増大し、形成される構造体のサイズがそれに伴なって一般に増大するであろう。ある用途、たとえば濾過膜の製造のためには、形成される構造体の最終サイズが好ましくは最大２００ｎｍを超えるべきではないことを考慮して、入手できる種々の分子量をもつ線状および分枝状のＰＥＩ全ライブラリーを検討することができる。ＰＥＩ−タンパク質複合体について、有効濾過層に組み込むには２００ｎｍ付近（２５０〜１５０ｎｍ）の狭いサイズ分布が最も有望であると現在は考えられる。ＬｂＬ法による濾過膜の製造のために、形成された構造体は好ましくは２００ｎｍ未満、たとえば１００ｎｍ未満、たとえば５０、２０または１０ｎｍ未満であってもよい  −  すべて、形成された層の数、膜貫通タンパク質のフォールドした構造体の寸法、および有効層中における形成された構造体の位置（単数または複数）に依存する。
【００４８】
現在、４０００、５０００および１００００の分枝鎖（側鎖基＋より利用しやすい正電荷）が良好に機能する。文献および所見によればすべての機能性ポリマーが濃度に依存した正電荷をもつ。自己集合構造体が負であるほど、ＤＬＳにより測定したその構造体は大きくなる。ＬＤＡＯはきわめて希薄であり、ゼータ電位により測定して負電荷をもつ。ゼータ電位が約マイナス３０にまで降下する凝集タンパク質構造体はみられなかった。コロイド系では構造体が懸濁状態に維持されている。
【００４９】
略号Ｍｎは数平均分子量を意味する。それはポリマーの総重量をポリマーの分子数で割ったものを意味する。よって、Ｍｎは数分画(number fraction)に従って秤量した分子量である。略号Ｍｗは重量平均分子量を意味する。この分子量は重量分画(weight fraction)に従って秤量された。分子質量は、テトラヒドロフラン中でのゲル浸透クロマトグラフィー(gel permeation chromatography)（ＧＰＣ）により測定できる。Ｍｎ／Ｍｗとして定義される多分散指数は、ＧＰＣで得られた溶出曲線から決定されるであろう。
【００５０】
ナノ構造体のサイズ：好ましくは、本発明のナノ構造体はナノ構造体の厳密な成分およびそれらの形成に用いた条件に応じて直径約１０ｎｍから直径２００ｎｍ〜約２５０ｎｍまでの粒子サイズをもつ。粒子サイズがあるサイズ範囲を表わすこと、および本明細書中で引用した数値がその範囲の粒子の平均直径、最も一般的には平均流体力学的直径を表わすことは当業者に明らかであろう。本発明のナノ構造体組成物は、約２５０ｎｍから約２００ｎｍまでまたはそれ未満の平均直径、ある場合には２００ｎｍ未満、たとえば約１８０ｎｍ未満または約１５０ｎｍ未満の平均直径をもつナノ粒子を含む。
【００５１】
膜貫通タンパク質とＰＡＩ（たとえばＰＥＩ）のモル比の例は、用いる膜貫通タンパク質、用いるＰＡＩのタイプ、線状ＰＡＩに対比した分枝ＰＡＩの程度または量、およびナノ構造体の希望サイズに依存する。一例として、ＰＥＩおよびアクアポリン水チャネルのナノ構造体について、膜貫通タンパク質とＰＥＩのモル比は１：２００〜１：２０００、たとえば１：４００〜１：１５００、たとえば１：６００〜１：１０００であってよい。
【００５２】
本発明に従って使用できる線状ポリエチレンイミンの例には下記のものが含まれる：ポリエチレンイミン，線状，７６４５８２  ＡＬＤＲＩＣＨ（平均Ｍｎ  ５，０００、ＰＤＩ＜１．２）；ポリエチレンイミン，線状，７６４６０４  ＡＬＤＲＩＣＨ（平均Ｍｎ  ２，５００、ＰＤＩ＜１．２）；およびポリエチレンイミン，線状，７６５０９０  ＡＬＤＲＩＣＨ（平均Ｍｎ  １０，０００、ＰＤＩ＜１．２）。分枝ポリエチレンイミンの例は下記のものである：ポリエチレンイミン，分枝，４０７８１９  ＡＬＤＲＩＣＨ（ＬＳによる平均Ｍｗ  ８００，ＧＰＣによる平均Ｍｎ  ６００），ポリエチレンイミン，分枝，４０８７２７  ＡＬＤＲＩＣＨ（ＬＳによる平均Ｍｗ  約２５，０００，ＧＰＣによる平均Ｍｎ  約１０，０００）。Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃも、ある線状ポリエチレンイミンの提供社である：ポリアリルアミン  Ｍｗ  約１７，０００，４７９１３６  ＡＬＤＲＩＣＨ，ＣＡＳ番号  ３０５５１−８９−４，線状化学式［ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ２ＮＨ２）］ｎ。ＢＡＳＦ  Ｌｕｐａｓｏｌ（登録商標），参照：http://product-finder.basf.com/group/corporate/product-finder/de/brand/LUPASOL（２０１６年２月８日にアクセス）。デンドリマー状ＰＥＩの例は下記のものである：ポリエチレンイミン  デンドリマー状５０００Ｄａおよび２５０００Ｄａ（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃａ）およびポリエチレンイミン  デンドリマー状５０００Ｄａ  アルカン官能化（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃａ）。
【００５３】
本明細書中で用いる用語“自己集合した(self-assembled)”は、ポリアルキレンイミン（たとえばポリエチレンイミン）成分および膜貫通タンパク質成分から形成されたナノ構造体が、成分間のイオンまたは電荷の相互作用の結果として、外部からの指令なしに組織化された(organized)秩序(ordered)構造を形成するプロセスを表わす。本発明において、“自己集合した”は“分子自己集合(molecular self-assembly)”と同義語である。自己集合した系の一般的特性は、
https://en.wikipedia.org/wiki/Self-assembly#Interactionsに記載されている［２０１６年２月８日にアクセス］。本発明において、ポリエチレンイミン成分と（負に）荷電したタンパク質成分との間に形成された自己集合ナノ構造体は、カチオン性荷電したポリエチレンイミン分子とタンパク質成分のアニオン性荷電したアミノ酸残基との間のイオン性相互作用により誘導されると考えられる。
【００５４】
本明細書中で用いる用語“ナノ構造体”は、ナノメートル規模の粒子を表わし、いずれか特定の形状制限を伝えることを意図したものではない。特に、“ナノ構造体”にはナノスフェア、ナノチューブ、ナノクラスター、ナノロッドなどが含まれる。特定の態様において、ナノ構造体は全般的に多面体または球状の幾何学的形状をもつナノ粒子および／またはナノ粒子コアであってもよい。
【００５５】
本明細書中で用いる用語“サイズ”は、自己集合ナノ構造体の流体力学直径を表わす。
【実施例】
【００５６】
限定ではない下記の実施例を参照して本発明をさらに説明する。
実験のセクション
装置：
ＡＫＴＡ  Ｓｔａｒｔ  ＦＰＬＣ，ラップトップと接続，Ｕｎｉｃｏｒｎオペレーティングシステムを使用．
真空流．
無菌０．４５μΜ  真空フィルターカップ．
１５ｍＬ  ＰＰチューブ．
略号：
ＣＶ：カラム体積．
ＡＱＰ：アクアポリンＺ，大腸菌に由来．
ＬＤＡＯ：  Ν，Ν−ジメチルドデシルアミン  Ｎ−オキシド（＃４０２３４，Ｓｉｇｍａ）．
ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動。
【００５７】
材料および化学薬品：
ＨｉｓＴｒａｐゲル濾過材料（Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ＃１７−５３１８−０３，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ），ＸＫ１６／２０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に既知体積で充填、またはプレパックｌｍｌ、５ｍｌ  ＨｉｓＴｒａｐカラム．
ＡＱＰ結合緩衝液：２０ｍＭリン酸ナトリウム，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭイミダゾール，１０％  グリセロール，０．２％  ＬＤＡＯ，ｐＨ８．０．
ＬＤＡＯ−不含  ＡＱＰ結合緩衝液：２０ｍＭリン酸ナトリウム，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭイミダゾール，１０％グリセロール，ｐＨ８．０．
イミダゾール−不含  ＡＱＰ結合緩衝液：２０ｍＭリン酸ナトリウム，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０％  グリセロール，０．２％  ＬＤＡＯ  ｐＨ８．０．
ＡＱＰ溶離緩衝液：２０ｍＭ  リン酸ナトリウム，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，２００ｍＭイミダゾール，１０％グリセロール，０．２％  ＬＤＡＯ，ｐＨ８．０，ｄｄＨ２Ｏ。
【００５８】
アクアポリンの一般的精製およびアクアポリン原液の調製
アクアポリンＺの組換え産生
すべてのタイプおよびバリアントのアクアポリン水チャネルタンパク質（アクアグリセロポリンを含めて）を本発明による膜および組成物の製造に使用できる；WO2010/146365に記載された方法を参照。代表例には、ホウレンソウアクアポリンＳｏＰＩＰ２；ｌタンパク質および大腸菌由来の細菌アクアポリン−Ｚが含まれる。
【００５９】
機能性アクアポリン−Ｚを、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）細菌培養において、タバコエッチウイルス開裂部位を備えたＨｉｓタグ付きタンパク質として過剰産生させた。この融合タンパク質は、２６４個のアミノ酸および２７２３４ＤａのＭｗをもつ。大腸菌ＤＨ５由来のゲノムＤＮＡを、ＡｑｐＺ遺伝子の増幅源として用いた。タバコエッチウイルス(tobacco etch virus)（ＴＥＶ）開裂部位を付加した遺伝子特異的プライマーを用いてＡｑｐＺ遺伝子を増幅した；ＡｑｐＺのＮ−末端にＥＮＬＹＦＱＳＮ。増幅したＡｑｐＺを酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いで同様に消化した６−Ｈｉｓタグ付き発現ｐＥＴ２８ｂベクターＤＮＡにライゲートした。陽性クローンをＰＣＲ−スクリーニングにより証明した。次いで構築体の信憑性をＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【００６０】
大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）をタンパク質の発現に用いた。５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するルリアブロス(Luria Broth)培地を３７℃で１３〜１６時間インキュベートし、新鮮なＬＢブロス中へ１００倍希釈し、約１．２〜１．５（６００ｎｍにおけるＯＤ）の密度まで増殖させた。１ｍＭ  ＩＰＴＧの添加により３５℃で３時間、組換えタンパク質の発現を誘導した後、遠心分離した。採集した細胞を、０．４ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、５０単位のＢｅｎｓｏｎａｓｅおよび３％のｎ−オクチル  β−Ｄ−グルコピラノシドの存在下で、氷冷した結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  β−メルカプトエタノール，１０％  グリセロール）に再懸濁した。試料に１２，０００  Ｐａのマイクロフルイダイザー内で５サイクルの細胞溶解処理を施した。不溶性物質を４０，０００×ｇで３０分間の遠心分離によりペレット化した。上清をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通し、フロースルーを１０採集した。フロースルー画分にＮａＣｌを３００ｍＭになるまで満たした後、予め平衡化したＮｉ−ＮＴＡカラムに装填した。カラムを１００カラム体積の洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，２５ｍＭイミダゾール，２ｍＭ  β−メルカプトエタノール，１０％  グリセロール）で洗浄して、非特異的に結合した物質を除去した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロース結合した物質を５ベッド体積の溶離緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，３００ｍＭイミダゾール，２ｍＭ  β−メルカプトエタノール，１０％  １５  グリセロール；３０ｍＭ  ｎ−オクチル  β−Ｄ−グルコピラノシドを含有）で溶離した。ＡｑｐＺをアニオン交換クロマトグラフィーでさらに精製した；ｍｏｎｏＱカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。試料混合物を希釈し、Ａｍｉｃｏｎ濃縮装置によりメンブレンカットオフ１０，０００Ｄａで濃縮して塩およびイミダゾール濃度をほぼ１０ｍＭにした後、ＭｏｎｏＱカラムに装填した。アニオン交換クロマトグラフィーに際して用いた緩衝液は、（Ａ）２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，３０ｍＭ  ＯＧ，１０％グリセロール、および（Ｂ）２０ｍＭ  ２０  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０，１Ｍ  ＮａＣｌ，３０ｍＭ  ＯＧ，１０％グリセロールであった。イオン交換カラムから溶出したＡｑｐＺ含有ピーク画分をプールした。精製したＡｑｐＺ抽出物を−８０℃で凍結保存した。
【００６１】
アクアポリンタンパク質の精製法
アクアポリンタンパク質、たとえばアクアポリンＺ、たとえば大腸菌発酵からのＡＱＰＺの凍結抽出物のバッチを入手し、本発明のタンパク質−ＰＡＩナノ構造体を含む膜を製造および特性解明する実験に用いるために下記に従って処理した。
【００６２】
精製実験の１日前に、ＡＱＰ抽出物（−８０℃のフリーザーに保存したもの）を氷上または４℃の冷蔵庫内で融解した。緩衝液およびｄｄＨ２Ｏの部分を４℃で用意しておいた。氷浴上で冷却した適宜なビーカー内でマグネチックスティックによりＡＱＰ抽出物を撹拌して、沈殿をいずれも溶解した。１．５体積の予冷したＬＤＡＯ−不含  ＡＱＰ結合緩衝液を１体積の溶解抽出物に徐々に添加し（抽出管および濾過カップをリンスするためにさらに０．５体積の緩衝液を使用）、十分に混合し、無菌０．４５μΜ真空フィルターカップにより濾過した。過度の起泡を避けるためにフィルターカップに真空を施し、濾液を氷上に置いて２時間以内に使用した。
【００６３】
無菌水に続いてＡＱＰ結合緩衝液で室温においてＨｉｓｔｒａｐカラムを平衡化した。流速を１ｍｌ／分（１ｍＬプレパックカラムについて）または２．５ｍｌ／分（５ｍｌプレパックカラムおよびセルフパックカラムについて）に設定した。３倍希釈した抽出物（氷水浴上で）をＨｉｓｔｒａｐカラムにＡＫＴＡプログラムを用いて装填した。流速を１ｍｌ／分（１ｍＬプレパックカラムについて）または２．５ｍｌ／分（５ｍＬプレパックカラムおよびセルフパックカラムについて）に設定した。装填体積は３０ｍｌ／ｍｌ（樹脂）未満であった。抽出物フロースルーを氷水浴で採集し、その後の使用のために４℃で保存した。カラムを１０ＣＶ（カラム体積）の氷冷ＡＱＰ結合緩衝液で洗浄した。流速を２．５ｍｌ／分（５ｍｌプレパックカラムおよびセルフパックカラムについて）に設定し、あるいは１ｍｌプレパックカラムについて１ｍｌ／分に設定した。ＡＱＰタンパク質を氷冷ＡＱＰ溶離緩衝液（１０カラム体積）で流速２．５ｍｌ／分においてＡＫＴＡプログラムを用いて溶離した。分画体積を１０ｍｌに設定し、０．５〜１  ＣＶ後に１５ｍＬのＰＰチューブ内への採集を開始した。
【００６４】
溶出画分に蓋をして氷上または４℃に保存した。ＡＱＰの純度およびコンホメーションを、それぞれ変性およびネイティブＰＡＧＥ(native PAGE）分析により調べた。タンパク質濃度をＮａｎｏｄｒｏｐにより測定した。抽出物フロースルーを必要に応じて２および３回処理して、適切な品質のＡＱＰ組成物を調製することができる。
【００６５】
ＡＱＰ品質分析に合格すると、２％  ＬＤＡＯを含有する氷冷したイミダゾール−不含ＡＱＰ結合緩衝液を添加することにより、タンパク質濃度を５ｍｇ／ｍｌに調整することができる。最後に、０．４５μΜ滅菌カップで濾過することによりＡＱＰを滅菌し、１カ月以内に使用するために４℃の冷蔵庫に保存するか、あるいは−８０℃のフリーザー内で保存した。
【００６６】
実施例１．ＰＥＩ−アクアポリン−Ｚナノ粒子の製造およびストップトフロー(Stopped Flow)試験
４０００ＤａのＭＷをもつポリ（エチレンイミン）（線状）（ＰＥＩ）をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取ったまま何ら他の精製を行なわずに使用した。８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４および０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４を８００ｍＬのＭｉｌｌｉＱ精製Ｈ２Ｏに溶解し、ＨＣ１でｐＨを７．２に調整し、最終体積を１Ｌにすることにより、１０ｍＭリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２，１３６ｍＭ  ＮａＣｌ，２．６ｍＭ  ＫＣｌ）を調製した。Ｎ，Ｎ−ジメチルドデシルアミン  Ｎ−オキシドＢｉｏＸｔｒａ（ラウリルジメチルアミン  Ｎ−オキシド）（９９％の純度）（ＬＤＡＯ）をＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＰＥＩベースの自己集合構造体を直接溶解法により製造した。そのためにまず、５００ｍｇのＰＥＩ粉末を１００ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解することにより、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）中５ｍｇ／ｍＬのＰＥＩを１００ｍｌ調製した。さらに、５ｍｇ／ｍＬのＰＥＩ  １００ｍＬを、５ｍｇ／ｍＬのアクアポリンＺ（ＡＱＰＺ）精製原液（２％  ＬＤＡＯ中）からの０．３ｍＬとしての１．５ｍｇと直接混合した；２成分混合物のＡＱＰＺ／ＰＥＩモル比１／８００に相当する。ＰＥＩ−ＡＱＰＺ混合物を１７０ｒｐｍ（毎分回転数）で一夜、撹拌した；２０時間を超えない（ただし、１２時間未満ではない）。
【００６７】
撹拌した後、翌日、混合物を１００ｍＬのガラスボトルに移し、室温に保持した。この混合物（ＰＥＩ−ＡＱＰＺベースの自己集合構造体の液体配合物  −  または組成物）は２カ月以上保存できる。貯蔵用ガラスボトルへ移した後、ＰＥＩ−ＡＱＰＺ自己集合構造体のサイズおよび透過率を、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  ＮａｎｏＺｓ（Ｍａｌｖｅｒｎから）を用いる動的光散乱およびＢｉｏ−Ｌｏｇｉｃ  ＳＦＭ  ３００を用いるストップトフローにより測定した。
【００６８】
ＰＥＩ−ＡＱＰＺベースの自己集合構造体のサイズは、１１４±２０ｎｍ（８０％）の集団と測定され、一方、２０％はほぼ１４７±１５ｎｍのサイズをもっていた。加えて、ゼータ電位はＰＥＩ−ＡＱＰＺ自己集合構造体について１８．４ｍＶと測定され、これはこの構造体の正電荷の指標となる。
【００６９】
オスモライト(osmolyte)としての０．３Ｍ  ＮａＣｌ中でのストップトフロー測定から得られた透過率データにより高速拡散係数(fast diffusion coefficient)Ｋｉは１６０５  ｓ−１になり、これは浸透圧透過率(osmotic permeability)Ｐｆ  ２２μｍ／ｓｅｃおよび透過率１１  ＬＭＨ／バール（Ｌ／ｍ２／ｈ）／バール）に相当する。
【００７０】
５ｍＬを３０から１００℃までの範囲の種々の温度で１０分間加温することによりＰＥＩベースの自己集合構造体の温度安定性を測定し、さらにそれらのサイズおよび水透過率を動的光散乱およびストップトフロー測定により測定した。
【００７１】
熱処理後の自己集合構造体のサイズを表１に示す。
表１．  熱処理後のＰＥＩ自己集合ポリマー構造体を含む水性組成物中におけるナノ粒子のサイズ分布
【００７２】
【表２】
2019507673.tif 000004
【００７３】
表１から分かるように、６０℃以上ではほぼ１０ｎｍのわずかな低下がみられるが、形成された構造体のサイズは温度曝露により影響されない。この低下は、有効層または濾過膜に組み込まれた場合、ナノ構造体の機能にも、それらにおいて複合体形成したアクアポリン水チャネルにも、影響を及ぼさない。
【００７４】
ＡＱＰＺの存在下で形成されたナノ粒子の熱処理後の透過率をストップトフロー測定から決定した。
表２．  ０．３Ｍ  ＮａＣｌ中における組成物ＰＥＩ−ＡＱＰＺのストップトフロー結果
【００７５】
【表３】
2019507673.tif 000005
【００７６】
この特定の実験の水透過率の観点からは、１００℃まで有意の変化はみられず、透過率および水フラックスのわずかな変動は共にサイズ変化と相関する。
実施例２．ＡＱＰ９およびＡＱＰ１２を含むＰＥＩナノ構造体の製造および試験
同様な方法で、ヒトアクアポリン、より具体的にはアクアポリン−９およびアクアポリン−１２を含むＰＥＩベースの自己集合構造体を直接溶解法により製造した。そのために、まず、５００ｍｇのＰＥＩ粉末を１００ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解することにより、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）中５ｍｇ／ｍＬのＰＥＩを１００ｍｌ調製した。さらに、５ｍｇ／ｍＬのＰＥＩ  １００ｍＬを、１０ｍｇ／ｍＬ  アクアポリン−９からの０．１５ｍＬ、および９ｍｇ／ｍＬ  アクアポリン−１２からの０．１７ｍＬ（２％  ＬＤＡＯ中の精製原液）としての１．５ｍｇと直接混合した；これは２成分混合物のＡＱＰ／ＰＥＩモル比１／８００に相当する。ＰＥＩ−ＡＱＰ混合物を１７０ｒｐｍで一夜、撹拌した；２０時間を超えない（ただし、１２時間未満ではない）。
【００７７】
翌日撹拌した後、混合物を１００ｍＬのガラスボトルに移し、室温に保持し、その翌日に測定した。ＰＥＩ−ＡＱＰＺ自己集合構造体のサイズおよび透過率を、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  ＮａｎｏＺｓ（Ｍａｌｖｅｒｎから）を用いる動的光散乱およびＢｉｏ−Ｌｏｇｉｃ  ＳＦＭ  ３００を用いるストップトフローにより測定した。
【００７８】
ＰＥＩ−ＡＱＰ９ベースの自己集合構造体のサイズは、９１±１５ｎｍ（８５％）の集団と測定され、一方、１５％はほぼ３２５±３２ｎｍのサイズをもっていた。加えて、ゼータ電位はＰＥＩ−ＡＱＰ自己集合構造体について１７．９ｍＶと測定され、これは構造体の正電荷の指標となる。
【００７９】
オスモライトとしての０．３Ｍ  ＮａＣｌ中でのストップトフロー測定から得られた透過率データにより高速拡散係数Ｋｉは１３２６  ｓ−１になる。
ＰＥＩ−ＡＱＰ１２ベースの自己集合構造体のサイズは、２４４±３６ｎｍ（９２％）の集団と測定され、一方、８％はほぼ３±２ｎｍのサイズをもっていた。加えて、ゼータ電位はＰＥＩ−ＡＱＰ自己集合構造体について１７．３ｍＶと測定され、これは構造体の正電荷の指標となる。
【００８０】
オスモライトとしての０．３Ｍ  ＮａＣｌ中でのストップトフロー測定から得られた透過率データにより高速拡散係数Ｋｉは１４３２  ｓ−１になる。
実施例３．ＰＥＩ  ８００  ｂおよび１０００  ｂを含むＰＥＩナノ構造体の製造および試験
ＰＥＩ  ４０００Ｄａの場合と同様な方法で、ＡＱＰＺならびにＰＥＩ  ８００分枝鎖および１００００分枝鎖を含む自己集合構造体を直接溶解法により製造した。そのために、まず、５００ｍｇのＰＥＩ  ８００分枝鎖または１００００分枝鎖の粉末を１００ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．２）に溶解することにより、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．２）中５ｍｇ／ｍＬのＰＥＩ  ８００分枝鎖または１００００分枝鎖を１００ｍｌ調製した。さらに、５ｍｇ／ｍＬのＰＥＩ  １００ｍＬを、５ｍｇ／ｍＬのＡｑｐＺ精製原液（２％  ＬＤＡＯ中）からの０．３ｍＬとしての１．５ｍｇと直接混合した；これは２成分混合物のＡＱＰ／ＰＥＩモル比１／８００に相当する。ＰＥＩ−ＡＱＰ混合物を１７０ｒｐｍで一夜、撹拌した；２０時間を超えない（ただし、１２時間未満ではない）。翌日撹拌した後、混合物を１００ｍＬのガラスボトルに移し、室温に保持し、その翌日に測定した。ＰＥＩ−ＡＱＰＺ自己集合構造体のサイズおよび透過率を、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  ＮａｎｏＺｓ（Ｍａｌｖｅｒｎから）を用いる動的光散乱およびＢｉｏ−Ｌｏｇｉｃ  ＳＦＭ  ３００を用いるストップトフローにより測定した。
【００８１】
ＰＥＩ  ８００  ｂ−ＡＱＰＺベースの自己集合構造体のサイズは、１８０±２３ｎｍ（１００％）の集団と測定された。加えて、ゼータ電位はＰＥＩ−ＡＱＰ自己集合構造体について１４ｍＶと測定され、これは構造体の正電荷の指標となる。
【００８２】
オスモライトとしての０．３Ｍ  ＮａＣｌ中でのストップトフロー測定から得られた透過率データにより高速拡散係数Ｋｉは７４７  ｓ−１になる。
ＰＥＩ  １０００  ｂ−ＡＱＰＺベースの自己集合構造体のサイズは、２２０±３７ｎｍ（１００％）の集団と測定された。加えて、ゼータ電位はＰＥＩ−ＡＱＰ自己集合構造体について４ｍＶと測定され、これは構造体の正電荷の指標となる。
【００８３】
オスモライトとしての０．３Ｍ  ＮａＣｌ中でのストップトフロー測定から得られた透過率データにより高速拡散係数Ｋｉは１５１６  ｓ−１になる。
５ｍＬを３０から１００℃までの範囲の種々の温度で１０分間加温することによりＰＥＩベースの自己集合構造体の温度安定性を測定し、さらにそれらのサイズおよび水透過率を動的光散乱およびストップトフロー測定により測定した。ＰＥＩ  ６００  ｂベースのＡＱＰＺ自己集合ナノ構造体については、サイズは５０℃まで変化せず、５０℃からは２００ｎｍ以上増大し、一方でＫｉ値の変動は１００  ｓ−１未満である。ＰＥＩ  １００００  ｂベースのＡＱＰＺ自己集合ナノ構造体については、サイズは４０℃まで変化せず、４０℃からは１５０ｎｍ以上増大し、一方でＫｉ値の変動は１００  ｓ−１未満である。
【００８４】
実施例４．蛍光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy)
タンパク質上の第一級アミンへのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ−エステル）カップリング反応により、膜貫通タンパク質ＡＱＰＺの蛍光標識を実施した。ＡＱＰＺタンパク質のＮ末端は親水性アミノ酸残基のみを含む。したがって、それは水相での標識反応に利用でき、膜タンパク質の疎水性部分に埋没していない。この場合、蛍光色素Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８（ＯＧ４８８）を用いた。
【００８５】
標識化のために(参照：Itel et al., Nano. Lett., 15 (6): 3871-3878, 2015)、１ｍｇのＡＱＰＺ原液を１０倍モル過剰のＯｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８スクシンイミジルエステル（ＯＧ４８８，ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍｌ）と混合し、氷上で撹拌しながら３時間、暗所でインキュベートした。反応しなかった色素を２０００Ｄａフィルターを通した遠心分離により除去した後、標識されたＡＱＰＺをさらに線状ＰＥＩ  ４０００Ｄａ自己集合ナノ構造体における再構成に用いた。分子の明度から、ＰＥＩナノ構造体当たりのＡＱＰＺテトラマーの数は８±１と判定された。遊離タンパク質は検出されなかった。ＰＥＩ  ６００  ｂおよび１００００  ｂについて、ＰＥＩナノ構造体当たりのＡＱＰＺテトラマーの数は４±１（ＰＥＩ  ６００  ｂ）および５±２（ＰＥＩ  １０００  ｂ）と判定された。
【００８６】
実施例５．円偏光二色性による特性分析
形成された自己集合ナノ構造体のタンパク質コンホメーションは、円偏光二色性(circular dichroism)（ＣＤ）により特性分析することができる。ＣＤは、タンパク質の機能性を決定するそれの二次構造（α−ヘリックスおよびβシート）およびフォールディング特性の迅速判定に適した方法である。ＣＤは分光分析法であり、分子のＣＤスペクトルをある波長範囲にわたって測定する(Greenfield NJ, Nat Protoc. 2006; 1(6): 2876-2890)。そのために、実施例１に従って製造したＰＥＩ−ＡＱＰＺベースの自己集合構造体の液体配合物を測定キュベットに入れ、ＣＤスペクトルを記録し、組み込まれたＡＱＰＺの二次構造をそれの機能性に関して評価するために分析した。図１は、ＰＥＩ自己集合ナノ構造体中におけるＡＱＰＺの円偏光二色性プロファイルを示す。ＡＱＰＺの二次構造；ＰＥＩ自己集合ナノ構造体に再構成された図１は、２０８ｎｍと比較して２２２ｎｍに負の楕円率バンドを示し（２２２／２０８ｎｍ比＝１．１５）、これは大腸菌総脂質中で再構成されたホウレンソウアクアポリンについてレポートされたものと類似し、タンパク質がアンフォールドしていないことの指標となる(Hansen et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1808: 2600-2607, 2011)。
【００８７】
実施例６．ハンドメイドＴＦＣ  ＦＯ濾過膜の製造
これらの膜を下記に概説する工程に従って作成した：
ａ）ＭＰＤをＭｉｌｌｉＱ水に溶解して、２．５％（Ｗ／Ｗ）濃度にする；後記を参照：
ｂ）ＴＭＣをＩｓｏｐａｒに溶解して、０．１５％  Ｗ／Ｖの最終濃度にする；
ｃ）長方形の膜、たとえば５．５ｃｍ×１１ｃｍのＭｅｍｂｒａｎａ  １ＦＰＨ  ＰＥＳ膜を、約２０ｍＬ／ｍ２（膜）のＭＰＤ溶液で覆い、３０秒間、穏やかに撹拌しておく；
ｄ）非有効側（裏側）を実験室用ドライイングペーパー（たとえば、Ｋｉｍ−Ｗｉｐｅ）で５〜１０秒間、乾かす；
ｅ）膜をガラスプレートに乗せ、表面が艶のある状態から艶のない状態になるまでＮ２で穏やかに乾燥させる；
ｆ）膜の縁の周りにテープを貼る（約１ｍｍ）；
ｇ）膜を貼りつけたガラスプレートをガラスまたは金属製の容器に入れ、約１５５ｍＬ／ｍ２（膜）のＴＭＣ−Ｉｓｏｐａｒを一端に添加し、前後に３０秒間、穏やかに搖動する；
ｈ）ガラスプレートをリザバーから取り出し、Ｎ２で１０〜１５秒間乾燥させる；
テープを取り除いた後、新たに形成された有効側を上にして膜をＭｉｌｌｉＱへ移し、必要ならば後続工程に際して湿潤状態に維持することができる。
【００８８】
ＭＰＤ溶液計算：
１．０５ｇのＭＰＤを秤り分け、３５ｍＬのＭｉｌｌｉＱに溶解する。前記で製造した７ｍＬのＰＥＩ−ＡＱＰＺ組成物（３ｍｇのＰＥＩ／ｍＬ）を添加する。可能な限り溶液を不活性ガス（ＡｒまたはＮ２）で覆った状態に維持する。
【００８９】
ＰＥＩ−ＡＱＰＺを含む５．５ｃｍ×１１ｃｍサイズのＴＦＣ膜を、次いでＳｔｅｒｌｉｔｅｃｈ  ＣＦ０４２  ＦＯセル(www.sterlitech.com)内に取り付け、６０分間の試験（５枚の膜）および９００分間の試験（４枚の膜）を行なう；ＦＯモードで、フィード(feed)用としての脱イオン（ＭｉｌｌｉＱ）水およびドロー(draw)用としての１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液をフィードおよびドロー速度２６８ｍＬ／分で使用。結果を下記の表３に示す；再現性のある高い水フラックス，Ｊｗ（ＬＭＨ  Ｌ／ｍ２／ｈ）、低い逆方向の塩排除(reverse salt rejection)，Ｊｓ（ＧＭＨ＝ｇ／ｍ２／ｈ）、およびきわめて高いフィードトレーサー５μΜカルセイン(calcein)の排除率，Ｒｃａ  ％。
【００９０】
表３
【００９１】
【表４】
2019507673.tif 000006
【００９２】
min : 分
実施例７．パイロットマシーン製のＦＯ濾過膜
パイロットコーティングマシーンを用いてＴＦＣ層をＰＥＳ支持膜上に形成した：
ａ）ＭＰＤをＭｉｌｌｉＱ水に溶解して２．５％（Ｗ／Ｗ）濃度にすることにより、ＭＰＤ／水溶液を調製した；
ｂ）６．２５ｇのＭＰＤ、１０ｍＬの組成物、２４０ｍＬのＤｉ水を溶解することにより、アクアポリン／ＭＰＤ／水溶液を調製した；
ｃ）ＴＭＣをＩｓｏｐａｒに溶解して、最終濃度０．１５％  Ｗ／Ｖにした；
ｄ）Ｍｅｍｂｒａｎａ  １ＦＰＨ支持膜のロールをマシーンの巻出しユニットに設置した；
ｅ）膜をコーティングに通した；
ｆ）洗浄浴にＤｉ水を満たした；
ｇ）コーティングプロセスを実行した（０．６ｍ／分で）：
−  膜を巻出し機から繰り出した；
−  次いでフーラード浴(foulard bath)内のＭＰＤ／水に浸漬した；
−  表面水をエアナイフ（０．５バールの空気）により除去した；
−  アクアポリン／ＭＰＤ／水溶液を、スロットダイを通して１．２ｍＬ／分の送出速度で適用した；
−  界面重合前に確実に液滴の無い表面になるように、表面水をエアナイフ（０．７５バール）により除去した；
−  ＴＭＣ／Ｉｓｏｐａｒを、スロットダイを通して４．２ｍＬ／分で適用して、界面重合を開始した；
−  Ｉｓｏｐａｒを膜の表面から周囲空気で乾燥除去した；
−  残留化学薬品を洗浄浴内で除去した；
−  コートされた膜を、有効側がロールの方を向いた状態で巻き取った；
ｈ）コートされた膜に最終乾燥工程５を施し、コートされた膜を５．５ｃｍ×１１ｃｍの形状に切断し、個別にＳｔｅｒｌｉｔｅｃｈ  ＣＦ０４２  ＦＯセル内に取り付け、ＤＩ水中の５μΜカルセインフィード溶液および１Ｍ  ＮａＣｌドロー溶液で２００分間操作した。標準偏差付き平均結果を表４に示す。
【００９３】
表４
【００９４】
【表５】
2019507673.tif 000007
【００９５】
Rcalcein : カルセイン排除率
実施例８．パイロットマシーン製のＦＯ高フラックス濾過膜および高排除濾過膜
実施例４に記載したものと同様な方法を用いて、それぞれ高い水フラックスおよび高い塩排除に適合した不織ポリプロピレン裏層をもつ２タイプの微孔性ＰＥＳ膜上にＴＦＣ層を作成した。第１ロールの微孔性ＰＥＳ膜をパイロットマシーンの一端に取り付け、連続工程を通して移動させ、界面重合層を上に作成した。７ｍＬ／１００ｍＬのＰＥＩ−ＡＱＰ組成物（実施例１に従って製造したもの）、３％のε−カプロラクタム、および０．１％のＳＤＳを含む２％  ＭＰＤ水溶液を収容したタンクに、この膜を通した。この膜を次いで短時間、圧縮空気乾燥させ、Ｉｓｏｐａｒ溶液中の０．２０％のＴＭＣとの反応のために上部に取り付けたスロットダイを通過させて、有効トップ層を形成した。
【００９６】
第２ロールの微孔性ＰＥＳ膜をパイロットマシーンの一端に取り付け、界面重合層を上に作成するためのタンクを通して移動させた。そのタンクには７ｍＬ／１００ｍＬのＰＥＩ−ＡＱＰ組成物（実施例１に従って製造したもの）を含む２．７５％  ＭＰＤ水溶液が収容されていた。この膜を次いで短時間、圧縮空気乾燥させ、Ｉｓｏｐａｒ溶液中の０．２５％のＴＭＣとの反応のために上部に取り付けたスロットダイを通過させて、有効トップ層を形成した。製造した２タイプの膜の断片を５．５ｃｍ×１１ｃｍの長方形に切断し、次いでＳｔｅｒｌｉｔｅｃｈ  ＣＦ０４２チャンバー内に取り付け、ＰＲＯモードで、フィードとしての脱イオン水およびドローとしての１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液ならびに２６８ｍＬ／分のフィードおよびドロー速度を用いる６０分間の試験を５回行なった。結果を下記の表５に示す；高フラックス膜については許容できるほど低い逆方向塩フラックスで一貫して高い水フラックスが測定され、高排除膜については許容できるほど高い水フラックスで一貫して低い逆方向塩フラックスが測定された。
【００９７】
表５
【００９８】
【表６】
2019507673.tif 000008
【００９９】
実施例９．低圧ＲＯのためのハンドメイドＴＦＣ  ＰＥＩ−ＡＱＰＺ濾過膜
膜を下記に概説する工程に従って作成した：
ａ）支持膜、たとえば指状(fingerlike)の構造をもつサイズ５．５ｃｍ×１１ｃｍの不織ＰＥＳを用意する；
ｂ）３ｗｔ％のＭＰＤを３ｗｔ％のε−カプロラクタム、０．５ｗｔ％のＮＭＰ、および９３．５ｗｔ％のＤＩ水と混合して、溶液を得る；
ｃ）０．１ｍｇ／ｍＬのＰＥＩ−ＡＱＰＺ自己集合ナノ構造体を添加して、懸濁液を得る；
ｄ）ｃ）からの懸濁液を２時間インキュベートする；
ｅ）０．０９ｗｔ％のＴＭＣ、０．９ｗｔ％のアセトン、および９９．０１ｗｔ％のＩｓｏｐａｒからＴＭＣ溶液を調製する；
ｆ）支持膜を懸濁液ｄ）中で３０秒間、ディップコートする；
ｇ）エアナイフによる乾燥を適用する；
ｈ）ｅ）からのＴＭＣ溶液を界面重合のために添加する；
ｉ）続いてドラフトチャンバー内で２分間乾燥させる；
場合により下記の工程に従ってＴＦＣ膜を後処理する：
４分間，６５℃，１０％クエン酸
２分間，ＤＩ水
１分間，５％  ＩＰＡ
２分間，ＤＩ水
１分間，０．１％  ＮａＯＣｌ
２分間，ＤＩ水
１分間，０．２％  ＮａＨＳＯ３
４つの膜を作成し、Ｓｔｅｒｌｉｔｅｃｈ  ＣＦ０４２  ＲＯセル(www.sterlitech.com)内に取り付け、５バールで５００ｐｐｍ  ＮａＣｌをフィードとして用いて６０分間操作した。結果を表６に示す。ＲＯ性能は申し分なく良好でかつ再現性が高いことが分かる。
【０１００】
表６
【０１０１】
【表７】
2019507673.tif 000009
【０１０２】
実施例１０．高排除濾過のためのハンドメイドＬｂＬ膜
ＬｂＬ高分子電解質手法を用いて、ＰＥＳ膜（支持基材として）およびＰＥＩ／ＰＡＡ（ポリエチレンイミン／ポリアクリル酸）高分子電解質層をベースとし、アクアポリンを含むＰＥＩベースの自己集合ナノ構造体を組み込んだ濾過膜を製造することができる。
【０１０３】
工程１．不織支持体上の負に荷電したＰＥＳを大気圧プラズマ処理(atmospheric plasma treatment)により選択および製造する；
工程２．基材の負に荷電した表面に静電引力によりＰＥＩを吸着させる；ＰＥＩ溶液（実施例１に従って製造したＰＥＩ−ＡＱＰＺベースの自己集合構造体のＰＥＩ配合物と同様な濃度  −  または層の希望する最終厚に応じた異なる濃度）に荷電ＰＥＳを浸漬することによる；
工程３．表面に強く結合していない過剰のＰＥＩ分子を除去するために、基材表面を脱イオン水で洗浄する；
工程４．ＰＥＩで被覆されたＰＥＳをＰＡＡ溶液（ＰＥＩ濃度と同等なモル濃度）に浸漬する；その際、負電荷が表面に吸着されるであろう；
工程５．過剰のＰＡＡ分子を除去するために、ＰＥＩおよびＰＡＡで被覆されたＰＥＳ表面を脱イオン水で洗浄する；
工程６．目標数の多層−２に達するまで工程２〜５を繰り返す；
工程７．ＰＡＡ被覆されたＰＥＳ多層構造体をＰＥＩ−ＡＱＰＺ自己集合構造体の配合物（実施例１で製造したもの；そのまま使用）に浸漬する；
工程８．脱イオン水で洗浄する；
工程９．ＰＥＩ／アクアポリンＰＡＡ被覆されたＰＥＳ多層構造体をＰＡＡ溶液に浸漬する；
他の電解質対が好ましい場合も、膜を製造するために同様な方法が用いられるであろう。
【０１０４】
この例においては、電解質多層を組み立てるために用いたポリカチオンの代わりに、最終工程でＰＥＩ−ＡＱＰＺ自己集合構造体の配合物を使用する。あるいは、ＬｂＬ層のうちの幾つかを形成する際に、ポリカチオンの代わりにＰＥＩ−ＡＱＰＺ自己集合構造体の配合物を使用できる。
【０１０５】
実施例１１．中空繊維（ＨＦ）血液透析モジュールのコーティング
２．３ｍ２のＨＦ血液透析モジュールのためのコーティングプロトコルには下記の３つの主工程を用いた：Ｉ  −  ＭＰＤ−水湿潤、ＩＩ  −  モジュール乾燥、およびＩＩＩ  −  ＴＭＣ−ｉｓｏｐａｒとの反応。図２に示すように、モジュール乾燥工程（ＩＩの工程）に際して、モジュールをここでは水平に配置し、それによってモジュール内での水の重力移動を制限することができ、それはより長いモジュールについてはより顕著であろう。しかし、モジュール＃７４および＃７５は工程ＩＩに際して垂直配置を用いてコーティングされた。さらに、シェル接続部を閉じる代わりにシェル側部を真空ポンプ（または蠕動ポンプ）に接続し、それによってシェル側部にわずかな真空が形成され、蓄積した水を集める。いずれか特定の理論により拘束されることを望まないが、シェル側部に真空を適用することによって繊維の内腔がモジュールに沿ってより均一に乾燥することを本発明者らは見出した。モジュール内に形成された真空によって繊維の内腔から大部分の水が除去され（シェル側から）、乾燥のために適用された空気は表面に吸着された水のみを除去する。この原理は、モジュールシェルを垂直または水平の配置に保持するのとは無関係に利用できる；表７の性能結果を参照されたい。
【０１０６】
種々の濃度のＭＰＤ水溶液を試験した；参照：表７。ＭＰＤ溶液に、アクアポリン−Ｚの水性配合物、たとえば７ｍＬ／１００ｍＬのＰＥＩ−ＡＱＰ組成物（実施例１に従って製造したもの）を、任意選択的な添加剤と一緒に添加した；参照：実施例８。さらに、種々の濃度のＴＭＣ（有機相）を試験した。すべての組合わせが良好に作動した；参照：表７。
【０１０７】
本明細書に記載する方法によるＨＦモジュールの製造に用いたアクアポリン−Ｚのさらに他の水性配合物は、界面活性剤可溶化したアクアポリンを含むＰＭＯＸＡ２４−ＰＤＭＳ６５＋ＰＭＯＸＡ３２−ＰＤＭＳ６５  ジブロックコポリマーブレンドから形成されたベシクルを含む。そのベシクルは下記の方法に従って製造される：
主ベシクル形成材料：
ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ブロック−ポリ（ジメチルシロキサン）  ジブロックコポリマー  ＰＤＭＳ６５ＰＭＯＸＡ２４（ＤＢ１）；粘稠な白色液体として購入し、受け取った状態のまま使用；
ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ブロック−ポリ（ジメチルシロキサン）  ジブロックコポリマー  ＰＤＭＳ６５ＰＭＯＸＡ３２（ＤＢ２）；粘稠な白色液体として購入し、受け取った状態のまま使用；
添加剤として：
ポリ（２−メチルオキサゾリン）−ブロック−ポリ（ジメチルシロキサン）−ブロック−ポリ−（２−メチルオキサゾリン）  トリブロックコポリマー  ＰＭＯＸＡ１２ＰＤＭＳ６５ＰＭＯＸＡ１２（ＴＢ）；粘稠な白色液体として購入し、受け取った状態のまま疎水剤として使用；およびビス（３−アミノプロピル）末端基付きポリ（ジメチルシロキサン）；２５００Ｄａの分子量をもち、液体としてＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、受け取った状態のまま架橋剤として使用；
リン酸緩衝液１０ｍＭ（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２，１３６ｍＭ  ＮａＣｌ，２．６ｍＭ  ＫＣｌ）は、８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４および０．２４ｇのＫＨ２ＰＯ４を８００ｍＬのＭｉｌｉＱ精製Ｈ２Ｏに溶解し、ＨＣＬでｐＨを７．２に調整し、最後に体積を１Ｌにすることにより調製された。さらなる界面活性剤添加剤Ν，Ν−ジメチルドデシルアミン  Ｎ−オキシドＢｉｏＸｔｒａ（ラウリルジメチルアミン  Ｎ−オキシド）（ＬＤＡＯ）はＣａｒｂｏｓｙｎｔｈから購入され、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  Ｐ１２３はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから水中３０％溶液として購入された；
ＡｑｐＺ  ５ｍｇ／ｍＬ，０．２％  ＬＤＡＯ中の原液（前記に従って精製）。
【０１０８】
製造方法
１．  １５ｍＬのＰ１２３を１ＬのＰＢＳに溶解することにより、Ｐ１２３溶液を調製する；
２．  ５ｇのＬＤＡＯを１００ｍＬのＰＢＳに溶解することにより、ＰＢＳ中の５％  ＬＤＡＯ溶液を調製する；
３．  調製容器内にＤＢ１を秤量して、０．５ｇのＤＢ１／Ｌ（調製配合物）の濃度になるようにする；
４．  同じ調製容器内にＤＢ１を秤量して、０．５ｇのＤＢ２／Ｌ（調製配合物）の濃度になるようにする（ＤＢ１とＤＢ２の重量比１：１）；
５．  同じ調製容器内で、ＴＢ疎水性添加剤を添加して０．１２ｇのＴＢ／Ｌ（調製配合物）の濃度になるようにする；
６．  工程２で調製した５％  ＬＤＡＯを１００ｍＬ／Ｌ（調製した配合物）の割合で添加する；
７．  ビス（３−アミノプロピル）末端基付きポリ（ジメチルシロキサン）を添加して、０．１％の最終濃度にする；
８．  ＡｑｐＺ原液を添加して、５ｍｇ／Ｌ（調製配合物）の濃度および１／４００のタンパク質：ポリマー比になるようにする；
９．  工程６および８で添加したＬＤＡＯ、ビス（３−アミノプロピル）末端基付きポリ（ジメチルシロキサン）およびＡＱＰＺの体積を差し引いて、工程１で調製したポロキサマーＰ１２３溶液を添加して、調製配合物の目的体積になるようにする；
１０．  工程１０からの混合物を１７０ｒｐｍで一夜（２０時間を超えない）、室温で撹拌して、配合物を得る；
１１．  翌朝、工程１〜９のシーケンスで得られる調製された実施例３の配合物を採取し、それを２００ｎｍ細孔サイズのフィルターにより濾過してそれを滅菌し、密閉シールしたボトルに入れ、１２か月を超えない期間、室温で保存する。
【０１０９】
このアクアポリン−Ｚ配合物を用いてモジュール＃７２および＃７３を製造した。性能結果を表７に示す。試験した他のすべてのモジュールを、７ｍＬ／１００ｍＬ（ベシクル）のＡＱＰ組成物を用いてコートした。
【０１１０】
さらに、膜間圧力差(transmembrane pressure)が比較的低いため毛管力が存在し、細孔を水で満たした状態に保持するであろうから、水を繊維細孔から除去することはできない。これらの毛管力の存在により支持体から水相を完全に除去するのが阻止され、よって工程ＩＩＩにおいて膜の表面で界面重合を起こさせることができる。ＴＦＣ層をこの方法でコートすることにより、表７に挙げるようにＦＯ試験は申し分なく良好な結果を伴なうことができた。
【０１１１】
形成されたＨＦ  ＴＦＣ膜の正浸透作用性能を、界面重合プロセスで形成されたポリアミド層の特徴により判定した。そのような層の特性を調整するために、水相と有機相の組成を変動させた。目標は、逆方向塩フラックスＪｓ＜４ｇ／ｍ２  ｈおよび可能な限り低い相対的逆方向塩フラックスＪｓ／Ｊｗを備えた安定なＴＦＣ／アクアポリンＩｎｓｉｄｅ（商標）コーティングを得ることであった。０．６ｍ２のモジュールをコートするために用いた標準プロトコルにおいて、２．５％のＭＰＤおよび０，１５％のＴＭＣを用いた。調べたＭＰＤの濃度は２．５％および５％であった。ＴＭＣの濃度を０．１％から０．５％まで変動させた。その得られたＴＦＣ膜のＦＯ性能を表７に挙げる。
【０１１２】
表７に示すように、ＴＦＣ／アクアポリンＩｎｓｉｄｅ（商標）コーティングは、列記したすべての膜、ならびに種々の濃度のＭＰＤおよびＴＭＣ反応体について成功した。一般に、ＭＰＤの濃度が増大するのに伴なって、Ｊｗは増大し、Ｊｓはわずかに低減し、それは必ずしも層の塩保持性がより高いこととは関係なく、膜を通る水の対流フラックスがより大きいことと関係する。ＴＭＣ濃度を０．１％から０．１５％および０．２％にまで増大させることによってＪｓは低減し、これは層がより大きな架橋度およびより大きな塩排除度を獲得することを意味する。さらに、より高いＴＭＣ濃度増大はＪｓのさらなる低減をもたらした。しかし、Ｊｓと共にＪｗも低減する。その挙動は、層厚増大が塩排除に向かう層選択性増大を伴わないことを示唆する。比較のために、真空を適用せずに２つのモジュール（＃１５および＃１６）をコートすると、漏出性の膜が得られた。乾燥工程ＩＩに際して垂直配置を用いた場合も（参照：図２）、真空を適用する限りは許容できる性能が得られた；参照：表７に示すモジュール＃７３および７４のデータ。
【０１１３】
表７
【０１１４】
【表８】
2019507673.tif 000010
【０１１５】
horizontal : 水平; vertical : 垂直
with vacuum : 真空を付与する; without vacuum : 真空を付与しない
実施例１２．自己集合ＰＥＩ／アクアポリン−Ｚナノ構造体を含む選択層で改質された繊維を有する一組のＨＦモジュールの低圧逆浸透(Low Pressure Reverse Osmosis)(ＬＰＲＯ)性能試験
多数の２．３ｍ２  ｘｅｖｏｎｔａ低フラックス透析器（ＨＦモジュール）をＢ．  Ｂｒａｕｎ  Ａｖｉｔｕｍ  ＡＧ(Schwarzenberger Weg 73-79, 34212 Melsungen, Germany)から購入し、その後、それらの内部繊維表面を本明細書の記載に従って改質する処理をした；参照：https://www.bbraun.com/content/dam/catalog/bbraun/bbraunProductCatalog/CW_01_NEW/en-01/b43/brochure-xevonta.pdf.bb-.25584796/brochure-xevonta.pdf、および前記の実施例１１。
【０１１６】
フィードとして５００ｐｐｍ  ＮａＣｌ溶液を用いる４バールの印加圧力での低圧逆浸透（ＬＰＲＯ，水道水逆浸透(tap water reverse osmosis)ＴＷＲＯとも呼ばれる）操作に改質モジュールを用いた。
【０１１７】
膜試験を５００ｐｐｍ  ＮａＣｌで実施する。この濃度を得るために、１０ｇのＮａＣｌ（９９％）を２０Ｌの水に溶解する。少なくとも１５分間混合した後、良好に調整された溶液の導電率は１１００±１００μＳ／ｃｍのはずである。図３は２．３ｍ２のモジュールの試験に用いた適用ＬＰＲＯセットアップの模式図を示す。ＦＶ  −  流量計、Ｐ  −  マノメーター、Ｃ  −  導電率計。
【０１１８】
用いたセットアップのの模式図を図３に示す。この試験構成を、その後、ラック内で同一フィード溶液に接続して試験した１ないし最大８までのモジュールに適用した。試験前に、すべてのモジュールをＲＯ水（＜１０μＳ／ｃｍ）で少なくとも１時間フラッシした。この後、５００ｐｐｍを含有するフィード溶液をモジュール当たり流速３００〜５００ｍＬ／分でモジュールに導入した。濾過の圧力（１バール）はバルブ３を用いて調整された（参照：図３）。次いでフィード溶液の導入および少なくとも１時間の新たな圧力調整の後、システムは平衡化し、保持液および透過液をフィードリザバーへ戻し（参照：図３，バルブ１を閉じ、バルブ２を開く）、試料を採集しなかった。システムが平衡化した後、透過液をリザパーへ再循環せず、その後、バルブ２を閉じてバルブ１を開くことにより試料採集を開始した（参照：図３）。試料を採集している間、採集時間を測定し、通常は１０から３０秒までの範囲であった。それぞれの透過液試料の採集体積をメスシリンダーで測定し、それと共に透過液の導電率を測定した。透過液の試料を同一圧力で４回採集した。この後、圧力を２バールに高め、バルブ１を閉じてバルブ２を開くことにより透過液をフィードに再循環した（参照：図ｌ）。再びシステムを少なくとも約１時間、平衡化した。１〜４バールでの測定のためにこの操作を繰り返した。測定した試料の採集時間および体積により、水透過係数Ａを方程式１に従って計算することができた：
【０１１９】
【数１】
2019507673.tif 000011
【０１２０】
式中：
Ａは、水透過係数（Ｌ／ｍ−２ｈ−１ｂａｒ−１）である；
△Ｖは、採集した透過液の体積（Ｌ）である；
△ｔは、透過液採集の時間（ｈ）である；
△Ｐは、膜間圧力差（バール）である；
πは、フィードの浸透圧（バール）である。
【０１２１】
塩のプロセス排除率(process rejection)を方程式２に従って計算した：
【０１２２】
【数２】
2019507673.tif 000012
【０１２３】
式中：
ＲＮａＣｌは、塩のプロセス排除率（−）である；
κＦは、フィードの導電率（μＳ／ｃｍ）である；
κＰは、透過液の導電率（μＳ／ｃｍ）である。
【０１２４】
塩の透過係数Ｂを方程式３から計算する：
【０１２５】
【数３】
2019507673.tif 000013
【０１２６】
式中：
Ｂは、塩透過係数（Ｌ／ｍ−２ｈ−１）である；
ＲＮａＣｌは、塩のプロセス排除率（−）である；
ＪＷは、水フラックス（Ｌ／ｍ−２ｈ−１）である；
ｋは、フィード側からの物質移動係数(mass transfer coefficient)（Ｌ／ｍ−２ｈ−１）である。
【０１２７】
性能結果を下記の表８に示す。これらの結果は、飲用水のための一般的に受け入れられている基準と一致する良好な再現性および性能値を示す。
表８
【０１２８】
【表９】
2019507673.tif 000014
【０１２９】
aver : 平均; std : 標準偏差
実施例１３．自己集合ＰＥＩ／アクアポリン−Ｚナノ構造体を含む選択層で改質された繊維を含む一組のＨＦモジュールのシングルパスモードのＦＯ試験
前記の実施例に従って一連の４つのＨＦモジュールを製造した。１Ｍ  ＮａＣｌをドロー溶液として標準的な膜試験を実施し、そのように調製した溶液の導電率は使用前に約９２．５±１．５ｍＳ／ｃｍでなければならない。標準化導電率＜１０μＳ／ｃｍをもつＲＯ水をそれ以上処理することなくフィードとして使用する。図４は、２．３ｍ２のモジュールの試験に適用したシングルパス試験法の模式図である。凡例：ＦＶ  −  流量計、Ｐ  −  マノメーター、Ｃ  −  導電率計。
【０１３０】
フィード溶液を６０Ｌ／ｈでモジュールに導入し、それに対しドロー溶液を２５Ｌ／ｈで導入した。ドローとフィードを向流で連結した。すべての入口からのフィード溶液とドロー溶液の圧力をモニターした。試験をフィード側から０．２バールの平均ＴＭＰで実施した。試験を１時間実施した。フィード溶液（ここでは：ＲＯ水）およびドロー溶液（１Ｍ  ＮａＣｌ）を再循環しなかった。代わりに、フィード溶液の濃縮液を秤上に採集した。方程式４に従って膜を通るフラックスを計算するために、モジュールからのフィードアウト流量(feed out-flow)を計算し、モジュールへのフィードイン流量(feed in-flow)から差し引いた：
【０１３１】
【数４】
2019507673.tif 000015
【０１３２】
式中：
ＪＷは、水フラックス（Ｌ／ｍ２ｈ）である
ＱＦｅｅｄは、フィードの流速（Ｌ／ｈ）である
ＱＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅは、濃縮液の流速（Ｌ／ｈ）である
Ａは、膜面積（ｍ２）である
方程式５に従って逆方向塩フラックスを計算するために、濃縮されたフィード溶液の導電率を測定した：
【０１３３】
【数５】
2019507673.tif 000016
【０１３４】
式中：
ＪＳは、逆方向塩フラックス（Ｌ／ｍ２ｈ）である
ＱＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｅは、濃縮液の流速（Ｌ／ｈ）である
Ａは、膜面積（ｍ２）である
κは、導電率（μＳ／ｃｍ）である
Ｂは、比例係数（１ｍｇ／ＬのＮａＣｌ当たり０，５３６２μＳ／ｃｍ）である。
【０１３５】
モジュールに流入するドロー溶液はドローポンプにより制御された。各モジュールを３〜５回連続試験し、結果を下記の表９に示す。これらの結果は、この方法の再現性が高く、モジュールが性能を維持することを示す。
【０１３６】
表９
【０１３７】
【表１０】
2019507673.tif 000017
【０１３８】
参考文献：
本明細書に引用した参考文献の全体をあらゆる目的で特に本明細書に援用する。
【０１３９】
【表１１】
2019507673.tif 000018
【図１】
2019507673.tif 000019
【図２】
2019507673.tif 000020
【図３】
2019507673.tif 000021
【図４】
2019507673.tif 000022
【国際調査報告】
2019507673.tif 000023
2019507673.tif 000024
2019507673.tif 000025