(57)【要約】抗ＰＤ−Ｌ１抗体、変異型、変異体、およびこれらの抗原結合フラグメントが提供される。抗ＰＤ−Ｌ１抗体、変異型、変異体、またはこれらの抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸分子、ならびに関連する発現ベクター、および宿主細胞もまた提供される。抗ＰＤ−Ｌ１抗体、変異型、変異体、およびこれらの抗原結合フラグメントを調製する方法が提供される。関連する医薬組成物および対象を治療するためのそれらの使用方法もまた提供される。【選択図】なし
2019535254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号：３５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：５９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＬ１）。
【請求項２】
（１）配列番号：３６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１（ＰＬ２）。
【請求項３】
（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＬ３）
【請求項４】
（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＬ６）。
【請求項５】
（１）配列番号：３８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＬ８）
【請求項６】
（１）配列番号：３９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＬ１２）。
【請求項７】
（１）配列番号：４０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：５０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＬ１５）。
【請求項８】
（１）配列番号：６５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：７７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ２＃３）。
【請求項９】
（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：７８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ３＃７）。
【請求項１０】
（１）配列番号：６６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：６８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：７９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ３＃７−１９）。
【請求項１１】
（１）配列番号：３５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：６９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：８０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ３＃７−４３）。
【請求項１２】
（１）配列番号：６７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：７０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：７６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：８１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ３＃７−５４）。
【請求項１３】
（１）配列番号：９４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：９５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：９６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ２＃４）。
【請求項１４】
（１）配列番号：９７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：９８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：９９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ２＃５）。
【請求項１５】
（１）配列番号：１００で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：９５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：１０１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ２＃３９）。
【請求項１６】
（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：１０６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：１０７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：１０８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：１０９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ３＃１）。
【請求項１７】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型が、Ｎ−グリコシル化部位に１つまたはそれ以上の変異を含むＣＤＲ−Ｌ２を含む、請求項１０に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型。
【請求項１８】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型が、Ｎ−グリコシル化部位に１つまたはそれ以上の変異を含むＣＤＲ−Ｌ２を含む、請求項１１に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型。
【請求項１９】
前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖフラグメント、二特異性抗体、およびリニア抗体からなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその変異型の抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
前記抗体が、多特異性抗体である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
治療薬に抱合された、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
標識に抱合された、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
前記標識が、ラジオアイソトープ、蛍光色素、および酵素からなる群から選択される、請求項２２に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸分子。
【請求項２５】
請求項２４に記載の核酸分子をコードする、発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【請求項２７】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメント調製方法であって、請求項２６に記載の細胞を培養し、次いで前記抗体を前記細胞培養物から回収することを含む、方法。
【請求項２８】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメント、および医薬的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項２９】
患者由来の試料におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質の検出方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメントを前記試料に接触させ、次いで前記ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合した抗ＰＤ−Ｌ１抗体を検出することによる、方法。
【請求項３０】
前記抗ＰＤ−１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメントが、免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）またはＥＬＩＳＡアッセイで用いられる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
有効な量の請求項２８に記載の組成物を前記対象に投与することを特徴とする、対象における癌の治療方法。
【請求項３２】
前記癌が、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頚部癌、尿路上皮癌、三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫 縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＮＨＬ ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣癌、肺癌、食道癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道癌、結腸直腸癌、乳癌、子宮頸癌、甲状腺癌、および唾液腺癌からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が、抗悪性腫瘍薬、化学療法剤、増殖抑制剤、および細胞傷害性薬物からなる群から選択される治療薬をさらに投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記対照が、放射線療法をさらに投与される、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
このＰＣＴ国際出願は、出典明示により本明細書にその内容が取り込まれる２０１６年１０月３０日提出の米国仮特許出願第６２／４１４，７８５号に対する利益および優先権を請求する。
【０００２】
本発明の技術分野
本発明は、一般に、ヒト癌の治療における、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、それらの変異型もしくは変異体、またはこれらの抗原結合フラグメント、およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景技術
プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）およびプログラム細胞死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）は、抗原提示細胞ならびに多くのヒト癌で発現されており、ＰＤ−１への結合によりＴ細胞活性およびサイトカイン分泌を下流調節することが示されている（Freeman et al., 2000; Latchman et al., 2001）。ＣＴＬＡ−４とは異なり、ＰＤ−１は、主に、活性化されたＴ細胞が腫瘍および／または間質細胞によって発現される免疫抑制性ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）リガンドに遭遇しうる末梢組織において機能する（Flies et al., 2011; Topalian et al., 2012a）。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害は、前臨床モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を介在し（米国特許第８，００８，４４９号および第７，９４３，７４３号）、癌治療のためのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の抗体阻害因子の使用は、臨床試験に入っている（Brahmer et al., 2010; Flies et al., 2011; Topalian et al., 2012b; Brahmer et al., 2012）。
【０００４】
ＰＤ−Ｌ１の上流調節は、癌が宿主免疫系を逃れることを可能にしうるようである。多くのＰＤ−Ｌ１阻害因子が免疫腫瘍学的治療として開発中であり、臨床試験において良好な結果を示しているが、ＰＤ−Ｌ１に対する抗癌治療薬の開発が必要とされている。本発明はこれとその他の必要性を満たすものである。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の概要
本発明により提供されるのは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその抗原結合フラグメントである。ある実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、すなわち、ＰＬ１抗体は、（１）配列番号：３５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：５９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【０００６】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、すなわち、ＰＬ２抗体は、（１）配列番号：３６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【０００７】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、すなわち、ＰＬ３抗体は、（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【０００８】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、すなわち、ＰＬ６抗体は、（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【０００９】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、すなわち、ＰＬ８抗体は、（１）配列番号：３８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【００１０】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、すなわち、ＰＬ１２抗体は、（１）配列番号：３９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【００１１】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、すなわち、ＰＬ１５抗体は、（１）配列番号：４０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：５０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【００１２】
本発明は、さらに、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、あるいはそれらの抗原結合フラグメントを提供する。ある実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ２＃３抗体は、（１）配列番号：６５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：７７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【００１３】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ３＃７抗体は、（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：７８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【００１４】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ３＃７−１９抗体は、（１）配列番号：６６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：６８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：７９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の変異体は、Ｎ−グリコシル化部位に１つまたはそれ以上の変異を含むＣＤＲ−Ｌ２を含む。
【００１５】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ３＃７−４３抗体は、（１）配列番号：３５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：６９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：８０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の変異体は、Ｎ−グリコシル化部位に１つまたはそれ以上の変異を含むＣＤＲ−Ｌ２を含む。
【００１６】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ３＃７−５４抗体は、（１）配列番号：６７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：７０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：７６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：８１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【００１７】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ２＃４抗体は、（１）配列番号：９４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：９５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：９６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【００１８】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ２＃５抗体は、（１）配列番号：９７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：９８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：９９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【００１９】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ２＃３９抗体は、（１）配列番号：１００で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：９５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：１０１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【００２０】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ３＃１抗体は、（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：１０６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：１０７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：１０８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：１０９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。各抗ＰＤ−Ｌ１抗体および変異型／変異体の上記に記載のＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２、および−Ｌ３；ならびにＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２、および−Ｈ３）のアミノ酸配列は、下記表１で供される。
表１
【表１】
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【００２１】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその変異型は、（１）配列番号：３５〜４０、６５〜６７、９４、９７、および１００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１〜４３、６８〜７０、および１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；（３）配列番号：４４〜５０、７１〜７４、９５、９８、および１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５１〜５４、７５、および１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５〜５８および７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：５９〜６４、７７〜８１、９６、９９、１０１、および１０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【００２２】
本発明により、配列番号：１〜７、１６、２０、２４、２８、３２、８３、８７、９１、または１０３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）可変領域配列；ならびに配列番号：８〜１４、１８、２２、２６、３０、３４、８５、８９、９３、または１０５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはその抗原結合フラグメントもまた提供される。これらのＬＣおよびＨＣ領域をコードする核酸配列もまた提供される。
【００２３】
上記実施態様のいずれかによる（または適用される）ある実施態様において、本発明の抗体は、可変領域における１つまたはそれ以上のＣＤＲのＮ−グリコシル化部位に１つまたはそれ以上の変異を含む。生じた脱グリコシル化抗体は、親の脱グリコシル化されていない抗体と同様の機能が残る。
【００２４】
上記実施態様のいずれかによる（または適用される）ある実施態様において、前記抗体は、ヒトＩｇＧのＦｃ配列を含む。上記実施態様のいずれかによる（または適用される）ある実施態様において、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖフラグメント、二特異性抗体、およびリニア抗体（linear antibody）からなる群から選択される。上記実施態様のいずれかによる（または適用される）ある実施態様において、抗体は、多特異性抗体である。
【００２５】
上記実施態様のいずれかによる（または適用される）ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメントは、治療薬に抱合される。上記実施態様のいずれかによる（または適用される）ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメントは、標識に抱合される。上記実施態様のいずれかによる（または適用される）ある実施態様において、前記標識は、ラジオアイソトープ、蛍光色素、および酵素からなる群から選択される。
【００２６】
本発明は、上記実施態様のいずれかによる（または適用される）抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、その変異体、またはこれらの抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸分子を提供する。上記実施態様のいずれかによる（または適用される）核酸分子をコードする、発現ベクターもまた提供される。上記実施態様のいずれかによる（または適用される）発現ベクターを含む、細胞もまた提供される。本発明はまた、抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメントの調製方法であって、上記実施態様のいずれかによる（または適用される）細胞を培養し、次いで前記抗体またはこれらの抗原結合フラグメントを前記細胞培養物から回収することを含む方法を提供する。上記実施態様のいずれかによる（または適用される）ある実施態様において、前記細胞は、哺乳類細胞である。上記実施態様のいずれかによる（または適用される）ある実施態様において、前記哺乳類細胞は、ＣＨＯ細胞である。上記実施態様のいずれかによる（または適用される）ある実施態様において、前記細胞は、安定な哺乳類細胞株である。ある実施態様において、安定な哺乳類細胞株のいずれかによる（または適用される）前記細胞は、ＣＨＯ細胞株である。
【００２７】
本発明は、上記実施態様のいずれかによる（または適用される）抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、その変異体、またはこれらの抗原結合フラグメント、および医薬的に許容される担体を含む、組成物を提供する。
【００２８】
本発明は、患者由来の試料におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質を検出する方法であって、上記実施態様のいずれかによる（または適用される）抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、その変異体、またはこれらの抗原結合フラグメントを前記試料に接触し、次いでＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合した抗ＰＤ−Ｌ１抗体を検出することによる方法を提供する。上記実施態様のいずれかによる（または適用される）ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメントは、免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）またはＥＬＩＳＡアッセイにおいて用いられる。
【００２９】
対象における癌の治療方法であって、前記対象による（または適用される）組成物の有効な量を投与することを特徴とする方法もまた提供される。癌の治療における使用のための、上記実施態様のいずれかによる（または適用される）抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、その変異体、またはこれらの抗原結合フラグメントを含む組成物もまた提供される。癌の治療剤の製造における上記実施態様のいずれかによる（または適用される）抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、その変異体、またはこれらの抗原結合フラグメントの使用が提供される。上記実施態様のいずれかによる（または適用される）ある実施態様において、前記癌は、メラノーマ、頭頚部癌、尿路上皮癌、乳癌（例えば、三種陰性乳癌、ＴＮＢＣ）、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫 縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＮＨＬ ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、食道癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌、および唾液腺癌から選択される。上記実施態様のいずれかによる（または適用される）ある実施態様において、前記対象は、抗悪性腫瘍薬、化学療法剤、増殖抑制剤、および細胞傷害性薬物からなる群から選択される治療薬がさらに投与される。上記実施態様のいずれかによる（または適用される）ある実施態様において、前記対象は、放射線療法がさらに投与される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１Ａ−１Ｂ。抗ＰＤ−Ｌ１の選択されたリード物質ＰＬ１、ＰＬ２、ＰＬ３、ＰＬ６、ＰＬ８、ＰＬ１２、ＰＬ１５の軽鎖（Ａ）および重鎖（Ｂ）のアミノ酸配列。後のＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーアッセイにおいてヒトＰＤ−Ｌ１に対して結合および阻害活性を有する７つの選択された抗体リード物質を、ヒトＰＤ−Ｌ１＿ＥＣＤ−ＨｉｓによるヒトＦａｂナイーブファージディスプレイライブラリーのスクリーニングによって同定した。これらの選択されたＦａｂ配列は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ骨格のＮ２９７Ａ変異体にクローン化し、全長抗体とした。前記抗体リード物質の配列を記載し、相補性決定領域（ＣＤＲ）を太い下線で示した。
【図２】図２Ａ−２Ｂ。選択された抗体の組み換えヒトＰＤ−Ｌ１／Ｆｃ融合タンパク質（図２Ａ）および活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞（図２Ｂ）への結合。選択された抗体は、ＥＬＩＳＡによる組み換えヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質およびフローサイトメトリーによる活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞への結合を試験した。抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体および抗ＰＤ−１対照抗体をそれぞれ、陽性対照および陰性対照として用いた。
【図３】図３。選択された抗体によるＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合の阻害。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、フローサイトメトリーアッセイを用いて、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１発現ＣＨＯ−Ｓ細胞への結合を阻害する能力について試験した。抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体およびアバスチンをそれぞれ、陽性対照および陰性対照として用いた。抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定されるように、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞への結合を阻害する。
【図４】図４Ａ−４Ｂ。抗ＰＤ−Ｌ１の効果は、混合白血球反応（ＭＬＲ）におけるサイトカイン産生およびＴ細胞増殖を生じる。ヒトＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体は、混合白血球反応アッセイにおいてＩＦＮ−γ分泌およびＴ細胞増殖を高める。抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体および抗ＰＤ−１対照抗体を陽性対照として用いた。アバスチン（抗ＶＥＧＦ）を陰性対照として用いた。図４Ａは、ＩＦＮ−γ分泌を示す棒グラフであり；図４Ｂは、抗体の示される濃度におけるＣＤ３＋Ｔ細胞増殖を示す棒グラフである。
【図５】図５Ａ−５Ｂ。Ａ３７５／抗原特異的Ｔ細胞異種移植モデルにおけるＰＬ２およびＰＬ３抗体の腫瘍増殖阻害活性。前記マウス（ｎ＝４／群）に、ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５と抗原特異的Ｔ細胞の混合物（Ｔ細胞：癌細胞＝１：１００）を皮下に移植した。試験抗体をマウスの腹腔内に０日目から１週間に２回注入した。ＰＬ２およびＰＬ３で処理したマウスの腫瘍増殖曲線を図５Ａおよび５Ｂに示す。全てのデータ点は、平均±ＳＥＭである。
【図６】図６。混合白血球反応（ＭＬＲ）におけるサイトカイン産生についてのＰＬ２およびＰＬ３変異型の効果。前記ＰＬ２およびＰＬ３変異型は、混合白血球反応アッセイにおいてＩＬ−２分泌を高める。抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体およびアバスチンをそれぞれ、陽性対照抗体および陰性対照抗体として用いた。図６Ａは、ＰＬ２親および変異型によって誘導された分泌ＩＬ−２を示す棒グラフであり；図６Ｂは、ＰＬ３親抗体および変異型の示される濃度におけるＭＬＲのＩＬ−２分泌を示す棒グラフである。
【図７】図７Ａ−７Ｂ。Ａ３７５／抗原特異的Ｔ細胞異種移植モデルにおけるＰＬ２およびＰＬ３トップ変異型の腫瘍増殖阻害活性。前記マウス（ｎ＝４／群）に、ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５と抗原特異的Ｔ細胞の混合物（Ｔ細胞：癌細胞＝１：１００）を皮下に移植した。試験抗体をマウスの腹腔内に０日目から１週間に２回注入した。ＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７で処理したマウスの腫瘍増殖曲線を図７Ａに示した。３５日目における各腫瘍体積を図７Ｂに示した。全てのデータ点は、平均±ＳＥＭである。
【図８】図８Ａ−８Ｄ。混合白血球反応（ＭＬＲ）におけるＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７の異なるＩｇＧ型の効果。ＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７の異なるＩｇＧ型を、ＭＬＲアッセイを用いて試験した。アバスチンを陰性対照抗体として用いた。試験抗体によって誘導された分泌ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を示す棒グラフをそれぞれ、図８Ａおよび８Ｂに示した。図８Ｃは、抗体の様々な濃度におけるＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を示す棒グラフであり；図８Ｄは、抗体の示される濃度におけるＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を示す棒グラフである。
【図９】図９Ａ−９Ｂ。Ａ３７５／抗原特異的Ｔ細胞異種移植モデルにおける様々なＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７ ＩｇＧアイソタイプの腫瘍増殖阻害活性。図９Ａは、３２日目においてＰＬ２＃３の異なるＩｇＧ型で処理したマウス（ｎ＝４／群）の各腫瘍体積を示す。様々なＰＬ３＃７ ＩｇＧサブクラスで処理したマウス（ｎ＝４／群）の３２日目における各腫瘍体積を図９Ｂに示す。
【図１０】図１０。ｈＰＤ１ ＫＩマウスにおけるＰＬ２＃３−ｍｔＩｇＧ１およびＰＬ３＃７−ｍｔＩｇＧ１抗体の腫瘍増殖阻害活性。ヒトＰＤ−１ノックイン（ｈＰＤ１ ＫＩ）マウス（ｎ＝６／群）に、ＭＣ３８−ｈｕＰＤ−Ｌ１（ヒトＰＤ−Ｌ１でトランスフェクトしたＭＣ３８）細胞を皮下に移植した。抗体処理は、腫瘍体積が約８６ｍｍ３に達したら開始した。試験抗体をマウスの腹腔内に３週間にわたり１週間に２回注入した。全てのデータ点は、平均±ＳＥＭである。
【図１１】図１１Ａ−１１Ｂ。抗ＰＤ−Ｌ１トップ変異型の軽鎖（Ａ）および重鎖（Ｂ）のアミノ酸配列。極めて高い親和性と優れた機能活性を有するＰＬ２トップ変異型（ＰＬ２＃３）、ＰＬ３トップ変異型（ＰＬ３＃７）、およびＰＬ３＃７トップ変異型（ＰＬ３＃７−１９、−４３、−５４）は、インビトロファージディスプレイに基づく親和性成熟実験から作成した。一般に、３回のパニングは、ストレプトアビジンでコーティングした磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０に結合させたビオチン化ｈＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓを用いて行った。次いで、トップ変異型のＦａｂをＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ骨格のＮ２９７Ａ変異体にクローン化して、全長抗体とした。トップ変異型の配列を記載し、ＣＤＲ（相補性決定領域）を太い下線で示した。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｂ。混合白血球反応（ＭＬＲ）のサイトカイン産生およびＴ細胞増殖におけるＰＬ３＃７変異型の効果。修飾ＰＬ３＃７変異型は、混合白血球反応アッセイにおいてＩＦＮ−γ分泌およびＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を高める。抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体およびアバスチンをそれぞれ、陽性対照および陰性対照として用いた。図１２Ａは、ＩＦＮ−γ分泌を示す棒グラフであり；図１２Ｂは、抗体の示される濃度におけるＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を示す棒グラフである。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｃ。ＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７変異型のＰＤ−Ｌ１発現細胞の細胞表面への結合。ＰＬ３＃７変異型を、フローサイトメトリーにより、活性化Ｔ細胞（図１３Ａ）、Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞株（図１３Ｂ）、およびＮＣＩ−Ｈ２９２ヒトＮＳＣＬＣ細胞株（図１３Ｃ）の細胞表面への結合について試験した。抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体およびＨＬＸ０１（抗ＣＤ２０ｍＡｂ）をそれぞれ、陽性対照および陰性対照として用いた。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｂ。ＮＣＩ−Ｈ２９２／ＰＢＭＣ異種移植モデルにおけるＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７変異型の腫瘍増殖阻害活性。前記マウス（ｎ＝４／群）に、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２および新たに単離したヒトＰＢＭＣの混合物（癌細胞（Ｔ）：ＰＢＭＣ（Ｅ）＝３：１）を皮下に移植した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体をマウスの腹腔内に０日目から１週間に２回注入した。腫瘍増殖曲線を図１４Ａに示した。２８日目における各腫瘍体積を図１４Ｂに示した。全てのデータ点は、平均±ＳＥＭである。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｂ。Ａ３７５／抗原特異的Ｔ細胞異種移植モデルにおけるＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７変異型の腫瘍増殖阻害活性。前記マウス（ｎ＝４／群）に、ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５と抗原特異的Ｔ細胞の混合物（Ｔ細胞（Ｅ）：癌細胞（Ｔ）＝１：１００）を皮下に移植した。試験抗体をマウスの腹腔内に０日目から１週間に２回注入した。ｍＡｂで処理したマウスの腫瘍増殖曲線を図１５Ａに示した。３１日目における各腫瘍体積を図１５Ｂに示した。全てのデータ点は、平均±ＳＥＭであった。
【図１６】図１６。抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体のマウスメラノーマ細胞への交差結合。ＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７変異型を、フローサイトメトリーにより、マウスＰＤ−Ｌ１発現メラノーマ細胞（Ｂ１６−Ｆ１０）への結合について試験した。抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体をそれぞれ、陽性対照および陰性対照として用いた。
【図１７】図１７Ａ−１７Ｂ。ＰＬ２＃３（図１７Ａ）およびＰＬ３＃７変異型（図１７Ｂ）のカニクイザルＰＤ−Ｌ１への交差結合。ＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７変異型を、ＥＬＩＳＡにより、組み換えカニクイザルＰＤ−Ｌ１＿ＥＣＤ Ｆｃ−融合タンパク質への結合について試験した。ＨＬＸ０１（抗ＣＤ２０ｍＡｂ）を陰性対照として用いた。全てのデータ点は、３回の平均±ＳＤである。
【図１８】図１８。ＰＬ３＃７−１９変異型およびＰＬ３＃７−４３変異型の脱グリコシル化バージョンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列。これらの脱グリコシル化変異型の軽鎖の配列を記載し、ＣＤＲ（相補性決定領域）を太い下線で示した。それらの重鎖は、それらの親変異型と変更なく同一であった（配列は示していない）。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｂ。ＰＬ３＃７−１９変異型（図１９Ａ）およびＰＬ３＃７−４３変異型（図１９Ｂ）の脱グリコシル化バージョンの全細胞結合。ＰＬ３＃７−１９の調製した３つの脱グリコシル化変異型（すなわち、ＰＬ３＃７−１９脱グリコ１、脱グリコ２、脱グリコ３）およびＰＬ３＃７−４３の２つの脱グリコシル化変異型（すなわち、ＰＬ３＃７−４３脱グリコ１、脱グリコ２）のＰＤ−Ｌ１トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞に対する全細胞結合活性をフローサイトメトリーで調べた。全ての試験した脱グリコシル化抗体変異型をヒトＩｇＧ１ Ｆｃ骨格のＮ２９７Ａ変異体にクローン化した。内在性抗ＰＤ−１抗体（すなわち、ＨＬＸ１０）を陰性対照として用いた。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｂ。混合白血球反応（ＭＬＲ）におけるＰＬ３＃７−１９脱グリコ１およびＰＬ３＃７−４３脱グリコ２の異なるＩｇＧアイソタイプの有効性。ＰＬ３＃７−１９脱グリコ１およびＰＬ３＃７−４３脱グリコ２の異なるＩｇＧアイソタイプを、ＭＬＲアッセイを用いて試験した。ＨＬＸ０４およびＨＬＸ２０（ＰＬ２＃３）をそれぞれ、陰性対照抗体および陽性対照抗体として用いた。棒グラフは、試験抗体によって誘導された分泌ＩＦＮ−γ（Ａ）およびＩＬ−２（Ｂ）を示す。
【図２１】図２１Ａ−２１Ｄ。Ａ３７５／抗原特異的Ｔ細胞異種移植モデルにおける脱グリコシル化ＰＬ３＃７−１９およびＰＬ３＃７−４３変異型の腫瘍増殖阻害活性。前記マウス（ｎ＝５／群）に、ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５および抗原特異的Ｔ細胞の混合物（Ｔ細胞：癌細胞＝１：１００）を皮下に移植した。試験抗体をマウスの腹腔内に０日目から１週間に２回注入した。脱グリコシル化ＰＬ３＃７−１９およびＰＬ３＃７−４３変異型で処理したマウスの腫瘍増殖をそれぞれ、図２１Ａおよび２１Ｃに示した。２８日目における各腫瘍体積をそれぞれ、図２１Ｂおよび２１Ｄに示した。全てのデータ点は、平均±ＳＥＭである。
【図２２】図２２Ａ−２２Ｂ。ＮＳＣＬＣ異種移植モデルマウスにおける抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂと抗ＶＥＧＦ ｍＡｂとの腫瘍増殖阻害活性。前記マウス（ｎ＝５／群）に、ヒトＮＳＣＬＣ細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２および新たに単離したヒトＰＢＭＣの混合物（癌細胞：ＰＢＭＣ＝３：１）を皮下に移植した。抗ＰＤ−Ｌ１（ＰＬ２＃３）、および抗ＶＥＧＦ（ＨＬＸ０４）抗体を、マウスの腹腔内に１日目から１週間に２回注入した。腫瘍増殖曲線を図２２Ａに示した。２１日目における各腫瘍体積を図２２Ｂに示した。全てのデータ点は、平均±ＳＥＭである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の詳細な説明
本発明は、新規な抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、その変異体、および／またはこれらの抗原結合フラグメントを提供する。本発明者らは、驚くべきことに、特定の抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびそれらの親和性変異型および／または変異体が、Ｔ細胞によるＩＬ−２およびＩＦＮγの分泌およびＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を亢進することを知見した。本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体はまた、癌を治療するために用いられる一定の抗ＰＤ−Ｌ１対照モノクローナル抗体と比較して高まった有効性および／または抗腫瘍活性を示す。
【００３２】
本明細書に記載されるように、免疫抱合体、新規な抗ＰＤ−Ｌ１抗体をコードする核酸、それらの親和性変異型、あるいはこれらの抗原結合フラグメント、ならびに組成物（例えば、医薬組成物）もまた提供される。本発明はまた、新規な抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その親和性変異型および／または変異体、あるいはこれらの抗原結合フラグメントを用いて、試料（例えば、インビボまたはエクスビボ試料）中のＰＤ−Ｌ１を検出する方法、癌の治療における使用のための、このような抗体、その変異型および／または変異体、あるいはこれらの抗原結合フラグメントを含む組成物、および癌の治療剤の製造における、このような抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメントの使用を提供する。
【００３３】
定義
本明細書で用いられる「治療」または「治療する」は、臨床試験を含む、利益的なまたは所望の結果を得るための方法である。本発明の目的のために、利益的なまたは所望の臨床結果として、下記に限定されないが、下記のうちの１つまたはそれ以上が挙げられる：疾患から生じる１つまたはそれ以上の症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の防止または遅延）、疾患の広がり（例えば、転移）の防止または遅延、疾患の再発の防止または遅延、疾患の進行の遅延または緩徐、病状の軽減、疾患の寛解（部分または全体）、疾患の治療に必要とされる１つまたはそれ以上の他の薬の用量の減少、疾患の進行の遅延、生活の質の向上または改善、体重の増加、および／または生存の延長。「治療」には、癌の病理学的結果（例えば、腫瘍体積など）の減少も包含される。本明細書で提供される方法には、これらの治療態様のうちのいずれか１つまたはそれ以上が包含される。
【００３４】
用語「再発」、「回帰」または「再燃」は、病気の消失の臨床的評価後の癌または疾患の再発を意味する。遠隔転移または局所再発の診断は、再発と考えられうる。
【００３５】
用語「難治性」または「抵抗性」は、治療に反応しない癌または疾患を意味する。
【００３６】
用語「補助療法」は、一次療法、通常、外科手術後に付与される療法を意味する。癌または疾患の補助療法には、免疫療法、化学療法、放射線療法、またはホルモン療法が含まれうる。
【００３７】
用語「維持療法」は、前の治療の効果を維持することを助けるために付与される予定された再処置を意味する。維持療法は、癌の寛解を保つのを助けるため、または疾患の進行に関わらず特定の療法に対する応答を延長させるために付与されることが多い。
【００３８】
用語「浸潤癌」は、組織の層を超えて広がり、周辺の正常組織へと開始した癌を意味する。浸潤癌は、転移性であってもよく、または転移性でなくてもよい。
【００３９】
用語「非浸潤癌」は、非常に初期の癌または元の組織を超えて広がっていない癌を意味する。
【００４０】
腫瘍学における用語「無増悪生存期間」は、癌が増殖しない治療期間および後の時間の長さを意味する。無増悪生存期間には、患者が完全な応答もしくは部分的な応答を経た時間、ならびに患者が安定な疾患を経た時間が含まれる。
【００４１】
腫瘍学における用語「進行性疾患」は、腫瘍における質量増加または広がりのいずれかにより、治療開始から２０％以上の腫瘍増殖を意味しうる。
【００４２】
「疾患」は、抗体による治療から利益が得られるであろう病気のいずれかである。例えば、哺乳類は、異常なＰＤ−Ｌ１活性に罹っているか、または当該活性に対する予防を必要とする。これには、前記哺乳類を問題となっている疾患に罹りやすくする病態を含む慢性および急性疾患もしくは障害が含まれる。本発明で治療されるべき疾患の非限定的な例には、癌（例えば、頭頚部癌、咽頭癌、結腸直腸癌、肺癌など）が含まれる。
【００４３】
本明細書で用いられる「腫瘍」は、全ての腫瘍細胞（悪性または良性の全ての前癌性および癌性細胞および組織）の成長および増殖を意味する。
【００４４】
用語「抗体」は、最も広い意味で用いられ、具体的には、天然ポリペプチドに特異的に結合し、および／または本発明の生物学的活性または免疫学的活性を示す限り、例えば、単一のモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、および中和抗体を含む）、抗体組成物（ポリエピトープ特異性を有する）、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、および抗体フラグメント（下記を参照）を網羅する。１の実施態様によれば、抗体は、標的タンパク質のオリゴマー型、例えば、三量体型に結合する。別の実施態様によると、抗体は、タンパク質に特異的に結合し、この結合は、本発明のモノクローナル抗体（例えば、本発明の沈着（deposited）抗体など）によって阻害することができる。抗体の用語「機能的フラグメントまたはアナログ」は、それが名付けられている抗体と共通した性質の生物学的活性を有する化合物である。例えば、本発明の抗体の機能的フラグメントまたはアナログは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合することができるものでありうる。１の実施態様において、抗体は、細胞増殖を誘導するＰＤ−Ｌ１の能力を妨げるか、または実質的に減少させることができる。
【００４５】
「単離された抗体」は、その自然環境の一部から同定され、分離され、および／または回収されたものである。その自然環境の混入成分は、前記抗体の診断もしくは治療用途を妨げうる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク性もしくは非タンパク性溶質を含みうる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリー法で調べると、９５重量％以上の抗体まで、最も好ましくは、９９重量％以上まで、（２）スピニングカップシークエネーター（spinning cup sequenator）の使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーまたは、好ましくは、銀染色を用いて還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの構成成分も存在しないため、組み換えＴ細胞内の生体内原位置における抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００４６】
基本の四鎖抗体単位は、２個の同一の軽（Ｌ）鎖および２個の同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である（ＩｇＭ抗体は、さらなるポリペプチド（Ｊ鎖と呼ばれる）と共に５個の基本ヘテロテトラマー単位からなり、それゆえ、１０個の抗原結合部位を含む一方、分泌型ＩｇＡ抗体は、多量体化して、Ｊ鎖と共に２〜５個の基本の四鎖単位を含む多価構成を形成することができる）。ＩｇＧの場合、前記四鎖単位は、一般に、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結されているが、これらの２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプによって１つまたはそれ以上のジスルフィド結合によって相互に連結されている。各ＨおよびＬ鎖はまた、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端において、可変領域（ＶＨ）、続いてαおよびγ鎖の各々について３つの定常領域（ＣＨ）およびμおよびεアイソタイプについて４つのＣＨ領域を有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端において、可変領域（ＶＬ）、続いてそのもう一方の末端に定常領域（ＣＬ）を有する。前記ＶＬは、ＶＨと並列しており、ＣＬは、重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）と並列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖可変領域との間に境界を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬは一緒にペアになって、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造と特徴については、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, page 71 and Chapter 6を参照のこと。
【００４７】
脊椎動物種に由来するＬ鎖は、それらの定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパおよびラムダと呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの１つに分けることができる。それらの重鎖（ＣＨ）の定常領域のアミノ酸配列により、免疫グロブリンは、異なるクラスまたはアイソタイプに分けることができる。５つのクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ（それぞれ、α、δ、γ、ε、およびμに属する重鎖を有する）が存在する。γおよびαクラスは、ＣＨ配列および機能における比較的小さい差に基づいてサブクラスに分けられ、例えば、ヒトは、下記サブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を発現する。
【００４８】
用語「可変」は、可変領域の一定の部分が抗体間の配列において広範囲で異なるということを意味する。Ｖ領域は、抗原結合を介在し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、その可変性は、可変領域の１１０アミノ酸の長さにわたり均一に分布しているわけではない。むしろ、Ｖ領域は、各９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極度の可変性のより短い領域によって分けられる１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変な領域からなる。天然の重鎖および軽鎖それぞれの可変領域には、主に３つの超可変領域によって連結されたβシート構造を用いる４個のＦＲ（前記βシート構造を連結するループを形成し、ある場合には、前記シート構造の一部を形成する）が含まれる。各鎖における超可変領域は、ＦＲによって近接近して一緒に保持され、他の鎖からの超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)を参照のこと）。定常領域は、抗体の抗原への結合に直接関わっていないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００４９】
本明細書で用いられるように、用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内で見出される非隣接の抗原結合部位を意味するものとされる。これらの特定の領域は、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991); by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); and MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)に記載されており、これらの定義には、相互に比較したときのアミノ酸残基の重複または部分集団が含まれる。それにも関わらず、抗体もしくは移植した抗体またはこれらの変異型のＣＤＲを意味する定義のいずれの適用も、本明細書で定義され、用いられる用語の範囲内であるものとされる。上記に引用される文献の各々によって定義されるＣＤＲを含むアミノ酸残基は、比較として下記の表２に示される。
表２
【表２】
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【００５０】
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体（すなわち、少量で存在しうる可能性のある天然に存在する変異を除いて同一である集団を含む各抗体）を意味する。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して高度に特異的である。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体が混入することなく合成できる点で有利である。修飾「モノクローナル」は、いずれか特定の方法による抗体の産生が必要とされるものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に有用であるモノクローナル抗体は、Kohler et al. Nature. 256:495 (1975)に最初に記載されたハイブリドーマ法によって調製することができるか、あるいは細菌、真核生物、または植物細胞において組み換えＤＮＡ法を用いて調製することができる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991), Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)および下記の実施例に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００５１】
本明細書に記載のモノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部が、本発明の生物学的活性を示す限り、ある種に由来するか、またはある抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、または相同性を有する一方、前記鎖の残りの部分が、別の種に由来するか、別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか、相同性を有する「キメラ」抗体が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)を参照のこと）。本明細書における目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変領域抗原結合配列を含む「霊長類化」抗体、およびヒト定常領域配列が含まれる。
【００５２】
「インタクトな」抗体は、抗原結合部位、ならびにＣＬおよび少なくとも重鎖定常領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含むものである。定常領域は、天然配列の定常領域（例えば、ヒト天然配列の定常領域）またはそのアミノ酸配列変異型でありうる。好ましくは、前記インタクトな抗体は、１つまたはそれ以上のエフェクター機能を有する。
【００５３】
「抗体フラグメント」には、インタクトな抗体の一部、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合もしくは可変領域が含まれる。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二特異性抗体；リニア抗体（米国特許第５，６４１，８７０号の実施例２；Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]を参照のこと）；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多特異性抗体が挙げられる。用語「リニア抗体」は、一般に、Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)に記載の抗体を意味する。簡単に説明すると、これらの抗体には、タンデムＦｄ部分のペア（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）（相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒になって、抗原結合領域のペアを形成する）が含まれる。リニア抗体は、二特異性または一特異性でありうる。
【００５４】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメント、残りの「Ｆｃ」フラグメントと呼ばれる２個の同一の抗原結合フラグメントを生じ、その名称は、容易に結晶化する能力を反映する。Ｆａｂフラグメントは、Ｈ鎖の可変領域ドメインと共に全体Ｌ鎖（ＶＨ）と１つの重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）とからなる。各Ｆａｂフラグメントは、抗原結合に関して一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィドで連結したＦａｂフラグメントにほぼ相当し、まだ抗原に架橋結合することができる単一の大きなＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じる。Ｆａｂ’フラグメントは、ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端においてさらに数個の残基（抗体ヒンジ領域からの１個またはそれ以上のシステインを含む）を有することによってＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常領域のシステイン残基が遊離チオール基を保有するＦａｂ’についての本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元々、Ｆａｂ’フラグメントのペア（ヒンジシステインをそれらの間に有する）として調製された。抗体フラグメントの他の化学結合もまた公知である。
【００５５】
Ｆｃフラグメントには、ジスルフィドによって結合された両方のＨ鎖のカルボキシル末端部分が含まれる。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域における配列によって決定され、その領域はまた、あるタイプの細胞に見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される一部である。
【００５６】
「変異型Ｆｃ領域」には、少なくとも本明細書で定義されるような「アミノ酸修飾」により、天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、変異型Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域において約１〜約１０個のアミノ酸置換、好ましくは、約１〜約５個のアミノ酸置換を有する。１の実施態様において、本明細書における変異型Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、少なくとも約８５％の相同性、少なくとも約９０％の相同性、少なくとも約９５％の相同性、または少なくとも約９９％の相同性を有する。別の実施態様によると、本明細書における変異型Ｆｃ領域は、親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、少なくとも約８５％の相同性、少なくとも約９０％の相同性、少なくとも約９５％の相同性、または少なくとも約９９％の相同性を有する。
【００５７】
用語「Ｆｃ領域を含むポリペプチド」は、Ｆｃ領域を含む抗体またはイムノアドヘシン（本明細書の他の定義を参照のこと）などのポリペプチドを意味する。前記Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによると残基４４７）は、例えば、ポリペプチドの精製時またはポリペプチドをコードする核酸の組み換え技術によって除去されていてもよい。よって、本発明によるＦｃ領域を有する抗体を含むポリペプチドを含む組成物には、全てのＫ４４７残基が除去されたポリペプチド集団、Ｋ４４７残基が除去されていないポリペプチド集団、またはＫ４４７残基を有するポリペプチドと有しないポリペプチドの混合物を有するポリペプチド集団が含まれうる。
【００５８】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異型Ｆｃ領域）に起因しうる生物学的活性を意味し、抗体アイソタイプにより変動する。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体の下流調節；およびＢ細胞活性化が含まれる。「天然配列Ｆｃ領域」には、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列が含まれる。Ｆｃ配列の例は、例えば、下記に限定されないが、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に記載されている。
【００５９】
「Ｆｖ」は、全ての抗原認識および結合部位を含有する最少の抗体フラグメントである。このフラグメントは、緊密な非共有結合で１つの重鎖および１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインの折り畳み構造から、抗原結合のためのアミノ酸残基を提供し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６個の超可変ループ（ＨおよびＬ鎖からそれぞれ３個のループ）が生じる。
【００６０】
しかしながら、単一の可変領域（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全体結合部位より低い親和性ではあるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
【００６１】
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略称される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に繋がれたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドには、ｓＦｖを抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするＶＨとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーがさらに含まれる。ｓＦｖの総説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995を参照のこと。
【００６２】
用語「二特異性抗体」は、ｓＦｖフラグメント（前段落を参照のこと）をＶＨおよびＶＬドメイン間に短いリンカー（約５〜１０残基）で構築することによって、これによりＶ領域の鎖間ではあるが、鎖内ではないペアが達成され、二価フラグメント（すなわち、２つの抗原結合部位を有するフラグメント）を生じるように調製された小さな抗体フラグメントを意味する。二特異性抗体は、２つの「交差」ｓＦｖフラグメントのヘテロ二量体（前記２つの抗体のＶＨおよびＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖に存在する）である。二特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 90:6444-6448 (1993)において詳細に記載されている。
【００６３】
非ヒト（例えば、例えば、齧歯類）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト抗体に由来する最少配列を含有するキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望される抗体特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト類（ドナー抗体）の超可変領域に由来する残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある例において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。
【００６４】
さらに、ヒト化抗体には、レシピエント抗体またはドナー抗体で見出されることのない残基が含まれうる。これらの改変は、抗体の能力をさらに高めるためになされる。一般に、ヒト化抗体には、実質的に全ての少なくとも１つ、典型的に、２つの可変領域が含まれ、全てまたは実質的に全ての超可変ループが、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ならびに全てまたは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体にはまた、少なくとも一部の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンが含まれてもよい。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００６５】
本明細書で同定されるポリペプチドおよび抗体配列についての「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」または「相同性」は、配列を配列同一性の一部としていずれの保存的置換を考慮して整列させた後、比較されるポリペプチドにおけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当該技術分野内の様々な方法、例えば、公衆に利用可能なコンピューターソフトフェア（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトフェア）を用いて行うことができる。当業者は、比較される配列の全長に対する最大のアライメントを達成するために必要なアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適当なパラメータを決定することができる。しかしながら、本願のために、％アミノ酸配列同一性の数値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて作成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成され、ソースコードは、アメリカ合衆国著作権局（ワシントンＤ．Ｃ．２０５５９）においてユーザー文書とともに提出された（アメリカ合衆国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている）。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サウスサンフランシスコ）により公衆に利用可能である。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーションシステム、好ましくは、デジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変更されるものではない。
【００６６】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載するために用いられる。１の実施態様において、本発明のＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体（これらの受容体の対立形質変異型および選択的にスプライシングされた型）が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、同様のアミノ酸配列（主に、これらの細胞質ドメインで異なる）を有するＦｃγＲＩＩＡ（「受容体活性化」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「受容体阻害」）が含まれる。受容体活性化ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。受容体阻害ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（総説M. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)を参照のこと）。前記用語には、アロタイプ、例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡアロタイプ：ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｐｈｅ１５８、ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｖａｌ１５８、ＦｃγＲＩＩＡ−Ｒ１３１および／またはＦｃγＲＩＩＡ−Ｈ１３１が含まれる。ＦｃＲは、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994);およびHaas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)で総説されている。他のＦｃＲ（今後同定されるものを含む）が本明細書における用語「ＦｃＲ」に包含される。前記用語にはまた、新生児受容体であるＦｃＲｎ（母親ＩｇＧの胎児への移行に関する）が含まれる（Guyer et al., J. Immun Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）。
【００６７】
用語「ＦｃＲｎ」は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を意味する。ＦｃＲｎは、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）に構造的に類似し、β２ミクログロブリンに非共有結合で結合したα鎖からなる。新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎの多機能は、Ghetie and Ward (2000) Annu. Rev. Immunol. 18, 739-766で総説されている。ＦｃＲｎは、母親から子供への免疫グロブリンＩｇＧの受動送達および血清ＩｇＧレベルの調節に重要な役割を果たす。ＦｃＲｎは、飲作用化されたＩｇＧに結合し、無傷な形態で細胞内および細胞の通過の両方において輸送し、そしてそれらを初期の分解経路から救出する救援受容体として作用することができる。
【００６８】
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ１ドメイン」（「Ｈ１」ドメインの「Ｃ１」とも称される）は、通常、約アミノ酸１１８から約アミノ酸２１５までの範囲である（ＥＵナンバリングシステム）。
【００６９】
「ヒンジ領域」は、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までの範囲として定義される（Burton, Molec. Immunol.22:161-206 (1985)）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、前記ＩｇＧ１配列と、重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同一位置に配置することによって整列させてもよい。
【００７０】
Ｆｃ領域の「低ヒンジ領域」は、一般に、Ｃ末端直後からヒンジ領域までの残基の範囲、すなわち、Ｆｃ領域の残基２３３〜２３９として定義される。これまでの報告では、ＦｃＲ結合は、一般に、ＩｇＧ Ｆｃ領域の低ヒンジ領域におけるアミノ酸残基を起因とされた。
【００７１】
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｈ２」ドメインの「Ｃ２」とも称される）は、通常、約アミノ酸２３１から約アミノ酸３４０の範囲である。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接にペアになることはない点で特異的である。むしろ、２つのＮ−連結分岐炭化水素鎖は、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に挿入されている。前記炭化水素鎖は、ドメイン−ドメイン間のペアのための置換を供し、ＣＨ２ドメインの安定性を補助しうることが予測されている。Burton, Molec Immunol. 22:161-206 (1985).
【００７２】
「ＣＨ３ドメイン」（「Ｃ２」または「Ｈ３」ドメインとも称される）には、Ｆｃ領域における残基Ｃ末端からＣＨ２ドメインまでの範囲（すなわち、約アミノ酸残基３４１から抗体配列のＣ末端まで、典型的に、ＩｇＧのアミノ酸残基４４６または４４７）が含まれる。
【００７３】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。典型的な「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下流調節などが挙げられる。このようなエフェクター機能は、一般に、結合ドメインと結合されるべきＦｃ領域（例えば、抗体可変領域）が必要とされ、例えば、本明細書で開示されるような様々なアッセイを用いて測定することができる。
【００７４】
「Ｃ１ｑ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に対する結合部位を含むポリペプチドである。Ｃ１ｑは、２つのセリンプロテアーゼ（Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ）と一緒になって、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）経路の第１の構成成分である複合体Ｃ１を形成する。ヒトＣ１ｑは、例えば、Ｑｕｉｄｅｌ（カリフォルニア州、サンディエゴ）から商業的に購入することができる。
【００７５】
用語「結合ドメイン」は、別の分子に結合するポリペプチドの領域を意味する。ＦｃＲの場合、結合ドメインには、Ｆｃ領域の結合に関連するそのポリペプチド鎖の一部（例えば、そのアルファ鎖）が含まれ得る。１つの有用な結合ドメインは、ＦｃＲアルファ鎖の細胞外ドメインである。
【００７６】
ＦｃＲ結合親和性またはＡＤＣＣ活性の「変化した」変異型ＩｇＧ Ｆｃを有する抗体は、親ポリペプチドまたは天然配列Ｆｃ領域を含むポリペプチドと比較して高まるか、もしくは低下したＦｃＲ結合活性（例えば、ＦｃγＲまたはＦｃＲｎ）および／またはＡＤＣＣ活性を有するものである。ＦｃＲに対して「高まった結合を示す」変異型Ｆｃは、親ポリペプチドまたは天然配列ＩｇＧ Ｆｃより高い親和性（例えば、より低い見掛けのＫｄまたはＩＣ５０値）を有する少なくとも１つのＦｃＲに結合する。ある実施態様によれば、親ポリペプチドと比較した結合の改善は、約３倍、好ましくは、約５、１０、２５、５０、６０、１００、１５０、２００、５００倍まで、または約２５％〜１０００％の結合の改善である。ＦｃＲに対して「低下した結合を示す」ポリペプチド変異型は、親ポリペプチドより低い親和性（例えば、より高い見掛けのＫｄまたは高いＩＣ５０値）を有する少なくとも１つのＦｃＲに結合する。親ポリペプチドと比較した結合の減少は、約４０％またはそれ以上の結合の減少であってもよい。
【００７７】
「抗体依存性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、一定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌型Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を、抗原を有する標的細胞に特異的に結合させ、続いて細胞毒を有する標的細胞を死滅させることを可能にする細胞傷害の形態を意味する。抗体は、細胞傷害性細胞を「武装し」、このような死滅に絶対的に必要とされる。ＡＤＣＣを介在するための一次細胞（ＮＫ細胞）は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の４６４ページの表３にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイ（例えば、米国特許第５，５００，３６２号もしくは第５，８２１，３３７号または下記の実施例に記載のもの）が行われてもよい。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、または加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボ、例えば、モデル動物（例えば、Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示の動物）で評価されてもよい。
【００７８】
「高まったＡＤＣＣを示す」か、またはヒトエフェクター細胞の存在下で野生型ＩｇＧ Ｆｃを有するポリペプチドまたは親ポリペプチドより効率的に抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介在する、変異型Ｆｃ領域を含むポリペプチドは、アッセイにおいて変異型Ｆｃ領域を有するポリペプチドおよび野生型Ｆｃ領域を有するポリペプチド（または親ポリペプチド）の量が実質的に同一である場合、ＡＤＣＣ介在時にインビトロまたはインビボで実質的により有効である。一般に、このような変異型は、当該技術分野で公知のいずれかのインビトロＡＤＣＣアッセイ（例えば、動物モデルなどにおけるＡＤＣＣ活性を調べるためのアッセイもしくは方法）を用いて同定される。１の実施態様において、好ましい変異型は、ＡＤＣＣの介在時に野生型Ｆｃ（または親ポリペプチド）より約５倍から約１００倍、例えば、約２５〜約５０倍有効である。
【００７９】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下における標的細胞の溶解を意味する。古典的補体経路の活性化は、補体系の第１構成成分（Ｃ１ｑ）の（適当なサブクラスの）抗体（それらの同族抗原に結合する）への結合によって開始する。補体活性を評価するために、例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されるようなＣＤＣアッセイが行われてもよい。Ｆｃ領域アミノ酸配列が変化し、Ｃ１ｑ結合能が高まるか、または低下したポリペプチド変異型は、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号およびＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これらの特許公報の内容は、出典明示により本明細書に取り込まれる。Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)もまた参照のこと。
【００８０】
本明細書に開示される抗ＰＤ−１抗体（またはそのフラグメント）または組成物の「有効な量」は、具体的に記載される目的を達成するために十分な量である。「有効な量」は、記載される目的に関して経験的に公知の方法によって決定することができる。用語「治療上有効な量」は、哺乳類（ａｋａ患者）における疾患または病気を「治療する」ために有効である本明細書に開示される抗ＰＤ−Ｌ１抗体（またはその変異型もしくは抗原結合フラグメント）または組成物の量を意味する、癌の場合、本明細書に開示される抗ＰＤ−Ｌ１抗体（またはその変異型もしくは抗原結合フラグメント）または組成物の治療上有効な量は、癌細胞の数を減少させ；腫瘍サイズまたは重量を減少させ；癌細胞の末梢器官への浸潤を阻害し（すなわち、ある程度まで遅延させ、好ましくは停止させ）；腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度まで遅延させ、好ましくは停止させ）；腫瘍増殖をある程度まで阻害し；および／または癌に関連する症状の１つまたはそれ以上をある程度まで軽減させることができる。本明細書に開示される抗ＰＤ−Ｌ１抗体（またはその変異型もしくは抗原結合フラグメント）または組成物は、存在する癌細胞の増殖および／または死滅を阻害することができる程度まで、細胞分裂停止および／または細胞傷害性でありうる。１の実施態様において、治療上有効な量は、増殖阻害量である。別の実施態様において、治療上有効な量は、患者の生存率を高める量である。別の実施態様において、治療上有効な量は、患者の進行に関わらず生存率を改善させる量である。
【００８１】
本発明の本明細書に開示される抗ＰＤ−Ｌ１抗体（またはその変異型もしくは抗原結合フラグメント）または組成物の「増殖阻害量」は、細胞（特に、腫瘍、例えば、癌細胞）の増殖をインビトロまたはインビボで阻害することができる量である。腫瘍の細胞増殖を阻害するための本発明のポリペプチド、抗体、アンタゴニストまたは組成物の「増殖阻害量」は、経験的に公知の方法または本明細書で供される実施例によって決定することができる。
【００８２】
本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体（またはその変異型もしくは抗原結合フラグメント）または組成物の「細胞毒性量」は、インビトロまたはインビボで細胞（特に、腫瘍、例えば、癌細胞）の破壊を引き起こすことができる量である。腫瘍の細胞増殖を阻害するための本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体（またはその変異型もしくは抗原結合フラグメント）または組成物の「細胞毒性量」は、経験的に公知の方法によって決定することができる。
【００８３】
本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体（またはその変異型もしくは抗原結合フラグメント）または組成物の「増殖阻害量」は、細胞（特に、腫瘍、例えば、癌細胞）の増殖をインビトロまたはインビボで阻害することができる量である。腫瘍の細胞増殖を阻害するための本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体（またはその変異型もしくは抗原結合フラグメント）または組成物の「増殖阻害量」は、経験的に公知の方法または本明細書で供される実施例によって決定することができる。
【００８４】
本明細書で用いられるように、「医薬的に許容できる」または「薬学的に適合な」は、生物学的、または所望されないものではない物質、例えば、前記物質は、あまり望ましくない生物学的効果を生じることなく、または含まれている組成物の他の構成成分のいずれとも有害な形で相互作用することなく、患者に投与される医薬組成物に取り込まれうるものとされる。医薬的に許容される担体または賦形剤は、好ましくは、要求される毒性および製造試験の標準基準を満たし、および／または米国食品医薬品局によって作成された不活性成分ガイド（Inactive Ingredient Guide）に含まれる。
【００８５】
用語「検出する」は、物質の存在または非存在を決定するか、または物質（例えば、ＰＤ−Ｌ１）の量を定量化することを含むものとされる。それゆえ、前記用語は、質的および量的試験のための本発明の物質、組成物、および方法の使用を意味する。一般に、検出のために用いられる特定の技術は、本発明の実施に不可欠ではない。
【００８６】
例えば、本発明による「検出する」には、ＰＤ−Ｌ１遺伝子産物、ｍＲＮＡ分子、またはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの存在または非存在を観察すること；ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのレベルまたは標的に結合する量の変化；ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの生物学的機能／活性の変化が含まれうる。ある実施態様において、「検出する」には、野生型ＰＤ−Ｌ１レベル（例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドレベル）を検出することが含まれてもよい。検出するには、対照と比較して１０％〜９０％のいずれかの値、または３０％〜６０％のいずれかの値、または１００％以上の変化（増加または減少）を定量することが含まれてもよい。検出するには、２倍〜１０倍のいずれかの値を含め、または例えば、１００倍以上の変化を定量することが含まれうる。
【００８７】
用語「標識」は、本明細書で用いられる場合、抗体に直接的または間接的に抱合されている検出可能な化合物または組成物を意味する。標識は、それ自体によりそれ自身で検出可能であってもよく（例えば、ラジオアイソトープ標識または蛍光標識）、あるいは酵素学的標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒してもよい。
【００８８】
本明細書における数値またはパラメータの「約」への記載は、当業者に容易に理解される各数値の通常の誤差範囲を意味する。本明細書における数値またはパラメータの「約」への記載には、それ自体の数値またはパラメータに関する態様が含まれる（記載される）。例えば、「約Ｘ」を意味する記載には、「Ｘ」の記載が含まれる。
【００８９】
本明細書に記載の本発明の態様および実施態様には、態様および実施態様「を含む」、「からなる」、および「から本質的になる」が含まれるものと理解される。
【００９０】
本明細書で引用される全ての参考文献（特許出願および刊行物を含む）は、出典明示によりそれらの全体が本明細書に取り込まれる。
【００９１】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体および親和性変異型／変異体
本発明は、ＰＤ−Ｌ１受容体（ＰＤ−Ｌ１）に結合する新規な抗体の同定に基づくものである。抗ＰＤ−Ｌ１抗体、およびそれらの親和性変異型および／または変異体、あるいはそれらの抗原結合フラグメントは、様々な治療方法および診断方法で用いることができる。例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ならびにそれらの親和性変異型および／もしくは変異体または抗原結合フラグメントは、単独で、あるいは異常なＰＤ−Ｌ１発現または異常なＰＤ−Ｌ１活性によって特徴付けられる疾患（例えば、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頚部癌、尿路上皮癌、乳癌（例えば、三種陰性乳癌、ＴＮＢＣ）、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫 縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＮＨＬ ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、食道癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌を含む）を治療するための他の薬剤と組み合わせて用いることができる。本明細書で提供される抗体はまた、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはそれらの親和性変異型／変異体あるいはそれらの抗原結合フラグメントを患者に投与し、次いで患者由来の試料において（例えば、インビボまたはエクスビボで）ＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合した前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはそれらの親和性変異型／変異体あるいはそれらの抗原結合フラグメントを検出することによって、あるいは抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはそれらの親和性変異型／変異体あるいはそれらの抗原結合フラグメントを患者由来の試料と接触させ、次いでＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合した抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはそれらの親和性変異型／変異体あるいはそれらの抗原結合フラグメントを定性的もしくは定量的に検出することによって、患者または患者の試料におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質を検出するために用いることができる。
【００９２】
分化クラスター２７４（ＣＤ２７４）またはＢ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１）としても知られるプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）は、ヒトにおいてＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＰＤ−Ｌ１は、１型膜貫通タンパク質であり、妊娠、組織同種移植、自己免疫疾患、および肝炎などの他の病状のような免疫系の特定の事象を抑制する際に主な役割を果たす。ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１またはＢ７．１への結合は、リンパ節でこれらのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を減少させる阻害シグナルを伝達し、加えて、ＰＤ−１はまた、遺伝子Ｂｃｌ−２の下流調節によってさらに介在されるアポトーシスを介して、リンパ節において前記抗原特異的Ｔ細胞の蓄積を制御することができる。
【００９３】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、十分な親和性と特異性でＰＤ−Ｌ１に結合する抗体である。好ましくは、本明細書で提供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または変異型／変異体あるいはこれらの抗原結合フラグメント）は、ＰＤ−Ｌ１活性が関連する疾患または病気を標的とし、妨げる治療薬として用いることができる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または変異型／変異体あるいはこれらの抗原結合フラグメント）は、通常、他の免疫グロブリンスーパーファミリーに結合することはない。好ましくは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（または変異型／変異体あるいはこれらの抗原結合フラグメント）は、ヒトまたは組み換えヒト化抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体である。
【００９４】
ある実施態様によれば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書に開示の抗体のいずれか１つのＣＤＲ、可変重鎖領域、および／または可変軽鎖領域を含む。
【００９５】
本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、それらの親和性変異型／変異体、および／またはこれらの抗原結合フラグメントを提供する。ある実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、すなわち、ＰＬ１抗体は、（１）配列番号：３５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：５９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【００９６】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、すなわち、ＰＬ２抗体は、（１）配列番号：３６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【００９７】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、すなわち、ＰＬ３抗体は、（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【００９８】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、すなわち、ＰＬ６抗体は、（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【００９９】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、すなわち、ＰＬ８抗体は、（１）配列番号：３８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【０１００】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、すなわち、ＰＬ１２抗体は、（１）配列番号：３９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【０１０１】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、すなわち、ＰＬ１５抗体は、（１）配列番号：４０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：５０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【０１０２】
本発明は、本明細書に記載の重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲが全ての可能なペアとなる組み合わせで組み合わされて多くの抗ＰＤ−Ｌ１抗体を調製することを供する。
【０１０３】
ある実施態様において、前記アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。ある実施態様において、前記アミノ酸置換は、抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない。例えば、ＰＤ−Ｌ１結合親和性を実質的に減少させない保存的変換（例えば、本明細書で供されるような保存的置換）がなされうる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型の結合親和性は、下記実施例に記載の方法を用いて評価することができる。
【０１０４】
保存的置換は、「保存的置換」の表題として表３に示される。より実質的変換は、「典型的な置換」の表題として表３において、アミノ酸側鎖クラスに関して下記にさらに記載されるように供される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入され、当該生成物が、所望される活性、例えば、ＰＤ−Ｌ１結合の保持／改善、免疫原性の低下、あるいはＡＤＣＣまたはＣＤＣの改善についてスクリーニングされうる。
表３：保存的置換
【表３】
2019535254.tif 000008
2019535254.tif 000009
【０１０５】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。典型的な置換の変異型は、親和性成熟抗体であり、例えば、一般に、本明細書に記載される方法などの親和性成熟技術に基づいてファージディスプレイを用いて作成されうる。簡単に説明すると、１つまたはそれ以上のＣＤＲ残基に変異を入れ、変異型抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。変換（例えば、置換）は、例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいてなされてもよい。このような変換は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセス中に高頻度で変異が入るコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照のこと）、および／または結合親和性について試験される生じた変異型ＶＨまたはＶＬを有するＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）においてなされてもよい。二次ライブラリーを構築し、そこから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))に記載されている。
【０１０６】
親和性成熟のある実施態様において、多様性は、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング（chain shuffling）、またはオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発（oligonucleotide-directed mutagenesis）のいずれかによる成熟について選択される可変遺伝子に導入される。そして、二次ライブラリーが作成される。続いて、このライブラリーは、所望される親和性を有する抗体変異型を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入するための別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、１回に４−６残基）にランダムに入るＨＶＲ定方向法に関する。抗原結合に関連するＨＶＲ残基は、例えば、アラニン系統的変異導入法またはモデリングを用いて、具体的に同定されてもよい。
【０１０７】
本発明は、さらに、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、あるいはこれらの抗原結合フラグメントを提供する。ある実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ２＃３抗体は、（１）配列番号：６５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：７７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【０１０８】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ３＃７抗体は、（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：７８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【０１０９】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ３＃７−１９抗体は、（１）配列番号：６６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：６８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：７９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の変異体ＰＬ３＃７−１９は、Ｎ−グリコシル化部位に１つまたはそれ以上の変異を含むＣＤＲ−Ｌ２を含む。ある実施態様において、前記グリコシル化部位は、ＣＤＲ−Ｌ２領域内、例えば、シークオンＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔにおけるものである。シークオンＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔにおいて１つまたはそれ以上の変異を有する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｎ−グリコシル化部位を除去しているが、同等の機能のままである。
【０１１０】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ３＃７−４３抗体は、（１）配列番号：３５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：６９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：８０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の変異体ＰＬ３＃７−４３は、Ｎ−グリコシル化部位に１つまたはそれ以上の変異を含むＣＤＲ−Ｌ２を含む。ある実施態様において、グリコシル化部位は、ＣＤＲ−Ｌ２領域内、例えば、シークオンＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔである。シークオンＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ上に１つまたはそれ以上の変異を有する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｎ−グリコシル化部位を除去しているが、同等の機能のままである。
【０１１１】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ３＃７−５４抗体は、（１）配列番号：６７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：７０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：７６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：８１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【０１１２】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ２＃４抗体は、（１）配列番号：９４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：９５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：９６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【０１１３】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ２＃５抗体は、（１）配列番号：９７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：９８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：９９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【０１１４】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ２＃３９抗体は、（１）配列番号：１００で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：９５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：１０１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【０１１５】
他の実施態様において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型および／または変異体、すなわち、ＰＬ３＃１抗体は、（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：１０６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：１０７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：１０８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：１０９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む。
【０１１６】
本発明は、本明細書に記載の重鎖および軽鎖可変領域ならびにＣＤＲが全ての可能なペアとなる組み合わせで組み合わされて多くの抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型が調製されることを供する。
【０１１７】
ある実施態様において、本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、変異型またはこれらの抗原結合フラグメントが、（１）配列番号：３５−４０、６５−６７、９４、９７、および１００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１−４３、６８−７０、および１０６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４４−５０、７１−７４、９５、９８、および１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）配列、ならびに（１）配列番号：５１−５４、７５、および１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５−５８および７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：５９−６４、７７−８１、９６、９９、１０１、および１０９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖可変領域配列（ＶＨ）を含むものを提供する。重鎖および軽鎖可変領域が全ての可能なペアとなる組み合わせで組み合わされて多くの抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型が調製される。
【０１１８】
本発明はまた、配列番号：１〜７、１６、２０、２４、２８、３２、８３、８７、９１、または１０３で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）可変領域配列；ならびに配列番号：８〜１４、１８、２２、２６、３０、３４、８５、８９、９３、または１０５で示されるアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、それらの変異型および／または変異体、あるいはこれらの抗原結合フラグメントを提供する。これらのＬＣおよびＨＣ領域をコードする核酸配列もまた提供される。重鎖および軽鎖可変領域が全ての可能なペアとなる組み合わせで組み合わされて多くの抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型が調製される。
【０１１９】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、変異型または変異体、あるいはこれらの抗原結合フラグメントは、変化した機能、免疫原性、または安定性を生じる抗体の集団内の相違を引き起こしうる重鎖または軽鎖可変領域内のＮ-グリコシル化モチーフを欠失していてもよい。抗体グリコシル化の解析方法としては、以下に限定されないが、例えば、クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）または液体クロマトグラフィー）、質量分析法（例えば、エレクトロスプレーイオン化質量分析法）、およびキャピラリー電気泳動−硫酸ドデシルナトリウムが挙げられる。このような方法は、例えば、Jung et al. (2011) Curr Op Biotechnol. 22(6):858-67; Cummings RD, Etzler ME. Antibodies and Lectins in Glycan Analysis. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 45; Mulloy B, Hart GW, Stanley P. Structural Analysis of Glycans. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009. Chapter 47; Leymarie, et al. (2012) Anal Chem. 84(7): 3040-3048; Fernandez (2005) European Biopharmaceutical Review. pp 106-110; and Raju, T. (2013) Methods Mol Biol. 988: 169-180に記載されている。
【０１２０】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、変異型および／または変異体、あるいはこれらの抗原結合フラグメントは、ＰＤ−Ｌ１の類似体に対する結合親和性より強いＰＤ−Ｌ１リガンドに対する結合親和性を有する。通常、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および／または変異型、あるいはこれらの抗原結合フラグメントは、ＰＤ−Ｌ１に「特異的に結合する」（すなわち、約１ｘ１０−７Ｍ以下、好ましくは、約１ｘ１０−８以下、最も好ましくは、約１ｘ１０−９Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）の数値を示す）が、そのＰＤ−Ｌ１に対する結合親和性より少なくとも約５０倍、または少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍弱い多くのＰＤ−Ｌ１ファミリーに対する結合親和性を有する。ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、上記で定義される様々なタイプの抗体のいずれかでありうるが、好ましくは、ヒト化もしくはヒト抗体である。
【０１２１】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の非標的タンパク質への結合の程度は、当該技術分野で公知の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）分析、または放射性免疫沈降法（ＲＩＡ））によって調べられると、前記抗体のＰＤ−Ｌ１への結合の約１０％以下である。特異的な結合は、例えば、対照分子（一般に、結合活性を有していない同様の構造の分子である）の結合と比較して分子の結合を調べることによって測定することができる。例えば、特異的な結合は、標的と類似する対照分子（例えば、過剰量の非標識標的）との競合によって調べることができる。この場合、特異的な結合は、標識された標的プローブへの結合が過剰量の非標識標的によって競合的に阻害されるかどうかで示される。本明細書で用いられるような特定のポリペプチド標的上の特定のポリペプチドもしくはエピトープ「の特異的な結合」あるいは「に特異的に結合する」または「に特異的な」なる用語は、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、あるいは少なくとも約１０−５Ｍ、あるいは少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれ以上の前記標的に対するＫｄを有する分子によって示すことができる。１の実施態様において、用語「特異的に結合」は、ある分子が、特定のポリペプチド上の特定のポリペプチドもしくはエピトープに、いずれの他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく結合する結合を意味する。
【０１２２】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、腫瘍細胞に対する治療抗体の作用メカニズムである。ＡＤＣＣは、免疫系のエフェクター細胞が、標的細胞（例えば、癌細胞）（その膜表面抗原が特異的な抗体（例えば、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または親和性変異型など）によって結合されている）を積極的に溶解することによる細胞介在免疫防御である。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または親和性変異型は、例えば、実施例に記載のアッセイによって示されるように、対照抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体と同様の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能を示す。
【０１２３】
例えば、ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその親和性変異型もしくは変異体のＡＤＣＣエフェクター機能活性は、対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＡＤＣＣエフェクター機能活性の少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約１００％、または１００％以上（例えば、約１０５％、約１０６％、約１０７％、約１０８％、約１０９％、約１１０％、約１１１％、約１１２％、約１１３％、約１１４％、約１１５％、約１１６％、約１１７％、約１１８％、約１１９％、約１２０％、約１２１％、約１２２％、約１２３％、約１２４％、約１２５％、または約１３０％）（その数値間のいずれの範囲を含む）である。
【０１２４】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその親和性変異型もしくは変異体は、対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体と同様のＰＤ−Ｌ１に対する結合親和性を示す。ある実施態様において、ＰＤ−Ｌ１への結合は、実施例に記載されるように、ＥＬＩＳＡによって示される。例えば、ＰＤ−Ｌ１に対する抗ＰＤ−Ｌ１および／またはその親和性変異型もしくは変異体の結合親和性は、ＰＤ−Ｌ１に対する対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体の結合親和性より約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、または１００％以上（例えば、約１０５％、約１０６％、約１０７％、約１０８％、約１０９％、約１１０％、約１１１％、約１１２％、約１１３％、約１１４％、約１１５％、約１１６％、約１１７％、約１１８％、約１１９％、約１２０％、約１２１％、約１２２％、約１２３％、約１２４％、約１２５％、または約１２５％以上）高い。
【０１２５】
ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその親和性変異型もしくは変異体は、約０．１ｐＭ〜２００ｐＭ（０．２ｎＭ）、例えば、約０．１ｐＭ、約０．２５ｐＭ、約０．５ｐＭ、約０．７５ｐＭ、約１ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約２０ｐＭ、約３０ｐＭ、約４０ｐＭ、約５０ｐＭ、約６０ｐＭ、約７０ｐＭ、約８０ｐＭ、約９０ｐＭ、約１００ｐＭ、約１１０ｐＭ、約１２０ｐＭ、約１３０ｐＭ、約１４０ｐＭ、約１５０ｐＭ、約１６０ｐＭ、約１７０ｐＭ、約１８０ｐＭ、約１９０ｐＭ、または約１９０ｐＭ以上（これらの数値の間のいずれの範囲も含む）のＫｄでヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその親和性変異型もしくは変異体のＰＤ−Ｌ１への結合親和性は、対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＰＤ−Ｌ１への結合親和性より約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％、または約１００％以上（例えば、約１０５％、約１１０％、約１２０％、または約１３０％）高い。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１および／またはその変異型もしくは変異体のＰＤ−Ｌ１への結合親和性は、対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＰＤ−１への結合親和性より約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３倍、約３．２５倍、約３．５倍、約３．７５倍、約４倍、約４．２５倍、約４．５倍、約４．７５倍、または約４．７５倍以上（これらの数値の間のいずれの範囲も含む）高い。
【０１２６】
ある実施態様において、本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその親和性変異型もしくは変異体は、対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体と比較してインビボ半減期が延長した。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体のインビボ半減期は、対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体のインビボ半減期より短くない。
【０１２７】
ある実施態様において、本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその変異型もしくは変異体は、対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体の薬物動態特性に類似する薬物動態特性を示す。ある実施態様において、本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびそれらの変異型もしくは変異体は、対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体の血清濃度時間プロファイルの約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９５％以上（例えば、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％以上）（これらの数値の間のいずれの範囲も含む）のＡＵＣ（曲線下面積）を示す。
【０１２８】
ある実施態様において、前記抗体には、ヒトＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４）のＦｃ配列が含まれる。ある実施態様において、前記Ｆｃ配列は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）エフェクター機能（それらのＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合に関する場合が多い）を欠失するように変更され、あるいは変化されている。エフェクター機能を変えることができるＦｃ配列に対する変化または変異の例は多く存在する。例えば、ＷＯ００／４２０７２およびShields et al. J Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)は、ＦｃＲへの結合が改善し、または減少した抗体変異型を記載する。これらの刊行物の内容は出典明示により本明細書に取り込まれる。前記抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖフラグメント；二特異性抗体およびリニア抗体の形態でありうる。また、前記抗体およびこれらの変異型または変異体は、ＰＤ−Ｌ１に結合するだけではなく、１つまたはそれ以上の他の標的にも結合し、それらの機能を阻害する多特異性抗体または変異型もしくは変異体でありうる。前記抗体および／またはその変異型もしくは変異体は、治療薬（例えば、細胞傷害性薬物、ラジオアイソトープ、および化学療法剤）またはイメージングにより患者試料もしくはインビボでＰＤ−Ｌ１を検出するための標識（例えば、ラジオアイソトープ、蛍光色素、および酵素）に抱合されうる。他の修飾には、毒素の本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはこれらの変異型もしくは変異体への抱合が含まれる。
【０１２９】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型および／または変異体をコードする核酸分子、本明細書に記載のＣＤＲおよび／または重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域をコードする核酸分子を含む発現ベクター、ならびに前記核酸分子を含む細胞もまた包含される。これらの抗体およびその変異型もしくは変異体は、患者試料（例えば、ＦＡＣＳ、免疫組織化学法（ＩＨＣ）、ＥＬＩＳＡアッセイ）または患者におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質を検出するために、本明細書に記載の治療法で用いることができる。
【０１３０】
モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法、例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)に記載される方法によって調製するか、組み換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって調製するか、あるいは下記実施例の本明細書に記載の方法によって産生することができる。ハイブリドーマ法において、ハムスター、マウス、または他の適当な宿主動物が、典型的に、免疫剤で免疫されることにより、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、前記リンパ球は、インビトロで免疫することができる。
【０１３１】
前記免疫剤には、典型的に、目的のタンパク質のポリペプチドもしくは融合タンパク質または前記タンパク質を含む組成物が含まれる。一般に、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）は、ヒト起源の細胞が望ましい場合に用いられ、あるいは脾臓細胞またはリンパ節細胞は、非ヒト哺乳類供給源が望ましい場合に用いられる。次いで、前記リンパ球を適する融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を用いて不死化された細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成させる（MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE, New York: Academic Press, 1986, pp. 59-103）。不死化された細胞株は、通常、形質転換された哺乳類細胞、特に、齧歯類、ウシ、およびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が用いられる。前記骨髄腫細胞は、好ましくは、融合されていない不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つまたはそれ以上の物質を含有する適切な培地中で培養することができる。例えば、親細胞が、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠乏する場合、ハイブリドーマのための培養培地には、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（「ＨＡＴ培地」）が含まれ、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠失Ｔ細胞の増殖を阻害する。
【０１３２】
好ましい不死化された細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を助け、そしてＨＡＴ培地などの培地に感受性を有するものである。より好ましい不死化された細胞株は、マウス骨髄腫細胞株であり、例えば、Ｓａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（カリフォルニア州、サンディエゴ）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ヴァージニア州、マナッサス）から入手することができる。ヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al. MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCTION TECHNIQUES AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987, pp. 51-63）。
【０１３３】
次いで、ハイブリドーマ細胞が培養された培地は、ポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降法、あるいはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって調べることができる。このような技術およびアッセイは、当該技術分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード解析によって調べることができる。
【０１３４】
所望されるハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈法によってサブクローン化し、標準方法によって増殖させることができる。このための適切な培養培地には、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳類の腹水としてインビボで増殖させることができる。
【０１３５】
サブクローンから分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製方法、例えば、プロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーによって、培養培地または腹水から単離するか、または精製することができる。
【０１３６】
モノクローナル抗体はまた、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載の方法）によって調製することができる。本明細書で供されるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離し、従来の方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）配列決定することができる。本明細書で供されるハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として供する。単離されると、ＤＮＡは、発現ベクター内に組み込まれ、次いで免疫グロブリンタンパク質を特に産生していないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされて、組み換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を可能としうる。ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常領域のコード配列を、同種のマウス配列に置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；上記のＭｏｒｒｉｓｏｎら）、あるいは非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全て又は一部を免疫グロブリンコード配列と共有結合によって改変することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドを、本明細書で供される抗体の定常領域について置換するか、または本明細書で供される抗体の１つの抗原結合部位の可変領域について置換することにより、キメラ二価抗体を調製することができる。
【０１３７】
ある実施態様において、本発明によって供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体は、安定な哺乳類細胞株によって発現される。ある実施態様において、本発明によって供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体は、約２．０グラム／リットル、約２．５グラム／リットル、約３．０グラム／リットル、約３．５グラム／リットル、約４．０グラム／リットル、約４．５グラム／リットル、約５．０グラム／リットル、約５．５グラム／リットル、約６グラム／リットル、約６．５グラム／リットル、約７．０グラム／リットル、または約７．０グラム／リットル以上（これらの数値間のいずれの範囲も含む）の力価で安定な哺乳類細胞株から発現される。。ある実施態様において、本発明によって供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体が発現される安定な哺乳類細胞株は、ＣＨＯ細胞株である。
【０１３８】
ある実施態様において、前記抗体は、一価抗体である。抗体の調製方法は、当該技術分野で公知である。例えば、ある方法は、免疫グロブリン軽鎖および改変された重鎖の組み換え発現に関する。前記重鎖は、一般に、重鎖の架橋を生じないようにするために、Ｆｃ領域におけるいくつかの点で短くされている。あるいは、関連システイン残基は、重鎖の架橋を生じないようにするために、別のアミノ酸残基で置換されているか、または削除されている。
【０１３９】
インビトロ方法はまた、一価抗体を調製するのに適している。抗体のフラグメント、特に、Ｆａｂフラグメントを調製するための抗体の消化は、限定されないが、当該技術分野で公知の技術を用いて行うことができる。
【０１４０】
ヒトおよびヒト化抗体
抗体（および／または変異型）は、ヒト化抗体またはヒト抗体でありうる。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化型は、典型的に、非ヒト免疫グロブリンに由来する最少配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはこれらのフラグメント（例えば、抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または他の抗原結合物質）である。ヒト化抗体としては、レシピエントのＣＤＲ由来の残基が、所望される特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）のＣＤＲ由来の残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。ある例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基に置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも、インポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されていない残基を含むことができる。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン定常配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域の実質的に全てを含むことができる。ヒト化抗体にはまた、好ましくは、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部が含まれる。Jones et al. Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).
【０１４１】
一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が取り込まれている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、「インポート」残基と称されることも多く、典型的には、「インポート」可変領域から取り込まれる。１の実施態様によれば、ヒト化は、基本的に、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に代えて用いることによって、Ｗｉｎｔｅｒと共同研究者（Jones et al. Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al. Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science, 239: 1534-1536 (1988)）の方法に従って行うことができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変領域より実質的に少ない配列が、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。実際には、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのＣＤＲ残基、場合によりいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１４２】
ヒト化に代わる方法として、ヒト抗体を調製することできる。例えば、現在、免疫化により、内在性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の全レパートリーを産生できるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作成することができる。例えば、キメラおよび生殖系列細胞変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失は、内在性抗体の産生の完全な阻害を生じることが記載されている。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列のこのような生殖系列細胞変異マウスへの導入により、抗原誘発によってヒト抗体が産生される。例えば、Jakobovits et al. PNAS USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al.Year in Immunol., 7:33 (1993)；米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，５９１，６６９号；第５，５４５，８０７号；およびＷＯ９７／１７８５２を参照のこと。
【０１４３】
あるいは、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的に、または完全に不活性化されたトランスジェニック動物（例えば、マウス）に導入することによって作成することができる。誘発により、ヒト抗体産生は、遺伝子再構成、会合（assembly）、および抗体レパートリーを含む全ての面においてヒトで見られるものと酷似することが観察される。この方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；および第５，６６１，０１６号、ならびにMarks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al. Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)に記載されている。
【０１４４】
あるいは、ファージディスプレイ技術（McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990）は、免疫されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体および抗体フラグメントを産生するために用いることができる。この技術の１の実施態様によれば、抗体Ｖドメイン配列は、糸状バクテリオファージの主要もしくは小コートタンパク質遺伝子のいずれか（例えば、Ｍ１３またはｆｄ）のフレームにクローン化され、ファージ粒子の表面上に機能的な抗体フラグメントとして提示される。ファージディスプレイは、例えば、下記の実施例の項目に記載されるように、または例えば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)に総説されるように、様々な形式で行うことができる。ｖ−遺伝子断片のいくつかの供給源は、ファージディスプレイに用いることができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)では、免疫化マウスの脾臓に由来するｖ遺伝子の小ランダムコンビナトリアルライブラリー（small random combinatorial library）からの抗オキサゾロン抗体の多様な配列が単離された。免疫されていないヒトドナーに由来するｖ遺伝子のレパートリーを構築し、抗原（自己抗原を含む）の多様な配列に対する抗体を、基本的にMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)またはGriffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)に記載される技術に従って単離することができる。さらに、米国特許第第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号を参照のこと。
【０１４５】
上記に記載されるように、ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞によって調製されてもよい（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号を参照のこと）。
【０１４６】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーを含む当該技術分野で公知の様々な技術を用いて調製することができる。Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991). Ｃｏｌｅら及びＢｏｅｒｎｅｒらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製について利用可能である。Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)およびBoerner et al., J. Immunol., 147(1): 86-95 (1991).
【０１４７】
多特異性抗体
多特異性抗体は、モノクローナル、好ましくは、２種類またはそれ以上の異なる抗原に対して結合特性を有するヒトまたはヒト化抗体である（例えば、二特異性抗体は、少なくとも２種類の抗原に対して結合特異性を有する）。例えば、結合特異性のうちの１つは、ａ５〜１タンパク質に対するものであり、もう１つは、他のいずれかの抗原に対するものでありうる。好ましい実施態様によれば、他の抗原は、細胞表面タンパク質または受容体もしくは受容体サブユニットである。例えば、細胞表面タンパク質は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体でありうる。よって、１の実施態様によれば、本発明の二特異性抗体は、ＰＤ−Ｌ１および例えば、第２の細胞表面受容体の両方に結合しうる。
【０１４８】
二特異性抗体を調製するための適する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、二特異性抗体の組み換え調製は、２つの重鎖が異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖ペアの共発現に基づく。Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983). 免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダム組み合わせ（random assortment）のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の混合物を生じる可能性があるが、そのうちの１つのみが正しい二特異的構造を有する。前記正しい分子の生成は、通常、親和性クロマトグラフィー工程によって行われる。同様の方法は、ＷＯ９３／０８８２９およびTraunecker et al., EMBO, 10: 3655-3659 (1991)に開示されている。
【０１４９】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変領域は、免疫グロブリン定常領域配列に融合させることができる。前記融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域と行われる。前記融合物のうちの少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物をコードするＤＮＡ、好ましくは、前記免疫グロブリン軽鎖が、別々の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物に同時トランスフェクトされる。二特異性抗体を調製するためのさらなる詳細については、例えば、Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)を参照のこと。
【０１５０】
二特異性抗体フラグメントを組み換え細胞培養から直接調製し、単離するための様々な技術もまた開示されている。例えば、二特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて産生される。Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質に由来するロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結された。抗体ヘテロダイマーをヒンジ領域で還元させてモノマーを形成させ、次いで再度酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成させた。この方法はまた、抗体ホモダイマーの調製に用いることもできる。Hollinger et al., PNAS USA, 90:6444-6448 (1993)に記載される「二特異性抗体」技術は、二特異性抗体フラグメントを調製するための別のメカニズムを供する。前記フラグメントには、リンカーによってＶＬに連結されたＶＨ（同一鎖においてこの２つの領域間があまりに短いためペアを形成させることができない）が含まれる。よって、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインとペアを形成し、それにより２つの抗原結合部位を形成させる。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用による二特異性抗体フラグメントを調製するための別の方法が報告されている。Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと。
【０１５１】
２つ以上の結合価を有する抗体が包含される。例えば、三特異性抗体が調製されうる。Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
【０１５２】
ヘテロ抱合抗体
ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合で結合した抗体から構成される。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対する免疫系細胞を標的とし（米国特許第４，６７６，９８０号）、ＨＩＶ感染の治療用であることが提案されてきた。ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９。前記抗体は、合成タンパク質化学における公知の方法（架橋剤に関する方法を含む）を用いてインビトロで調製することができるものとされる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成させることによって構築することができる。このために適する試薬の例には、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート、ならびに例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されるものが含まれる。
【０１５３】
エフェクター機能改変
エフェクター機能に関する本明細書で供される抗体を、例えば、癌の治療における抗体の有効性を高めるように改変することが望まれ得る。例えば、システイン残基がＦｃ領域に導入され、それによりこの領域における鎖内ジスルフィド結合を形成することができる。それにより調製されたホモダイマー抗体は、改善された内在化能力および／または高まった補体介在細胞死滅および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有しうる。Caron et al., J. Exp. Med., 176: 1191- 1195 (1992) and Shapes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照のこと。高まった抗腫瘍活性を有するホモダイマー抗体はまた、Wolff et al., Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993)に記載されるようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、二重Ｆｃ領域を有するように改変され、それにより高まった補体溶解性およびＡＤＣＣ能力を有しうる。Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design3: 219-230 (1989)を参照のこと。
【０１５４】
Ｆｃ領域配列における変異または変換は、ＦｃＲ結合を改善させるようになされうる（例えば、ＦｃγＲ、ＦｃＲｎ）。１の実施態様によれば、本発明の抗体は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および天然ＩｇＧまたは親抗体と比較して改善されたＦｃＲｎ結合からなる群から選択される少なくとも１つの変化したエフェクター機能を有する。いくつかの有用な具体的な変異の例は、例えば、Shields, RL et al. (2001) JBC 276(6)6591-6604; Presta, L.G., (2002) Biochemical Society Transactions 30(4):487-490；およびＷＯ００／４２０７２に記載されている。
【０１５５】
１の実施態様によれば、Ｆｃ受容体の変異は、Ｆｃ領域の２３８、２３９、２４６、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３２０、３２２、３２４、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８、または４３９からなる群から選択される少なくとも１つの位置の置換であって、Ｆｃ領域における残基の番号は、ＥＵナンバリングシステムに従うものである。ある実施態様において、Ｆｃ受容体の変異は、Ｄ２６５Ａ置換である。ある実施態様において、Ｆｃ受容体の変異は、Ｎ２９７Ａ置換である。さらに適する変異は米国特許第７，３３２，５８１号に示されている。
【０１５６】
免疫抱合体
本発明はまた、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物由来の酵素学的に活性な毒素、あるいはこれらのフラグメント）、または放射性同位元素（すなわち、放射性抱合体）などの細胞毒素剤に抱合された、抗体またはその変異型もしくは変異体を含む免疫抱合体に関する。
【０１５７】
用いることができる酵素学的に活性な毒素およびそのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Pseudomonas aeruginosa由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、品アブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（momordica charantia）阻害因子、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害因子、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）、およびトリコテセンが挙げられる。様々な放射性核種が、放射性抱合抗体の調製において利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。このような免疫抱合体の調製に有用な例示的な化学療法剤には、本明細書に別に記載されているものが含まれる。
【０１５８】
ある実施態様において、本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体は、メイタンシン、マイタンシノイド、またはカリチアマイシンに抱合される。ある実施態様において、本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体は、マイタンシノイドＤＭ１に抱合される。
【０１５９】
抗体および細胞傷害性薬物の抱合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒドs（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビスジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾウイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン ２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて調製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987)に記載されるように調製することができる。炭素−１４で標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のための典型的なキレート剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照のこと。
【０１６０】
別の実施態様において、抗体またはその変異型もしくは変異体は、腫瘍の前標的化の利用のために「受容体」（例えば、ストレプトアビジン）に抱合させることができ、抗体−受容体抱合体は、患者に投与され、続いて結合しなかった抱合体が血中から除去剤（clearing agent）を用いて除去され、次いで細胞傷害性薬物（例えば、放射性ヌクレオチド）に抱合されている「リガンド」（例えば、アビジン）が投与されるものである。
【０１６１】
共有結合的修飾
抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、変異体、およびフラグメントの共有結合的修飾は、本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の１つのタイプには、ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、ポリペプチドの選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化薬剤と反応させることが含まれる。二官能性薬剤による誘導体化は、例えば、抗体の精製方法において使用するために、ポリペプチドを水不溶性支持マトリックスまたは表面に架橋するために有用であり、またはその逆のために有用である。一般に用いられる架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル（ジスクシンイミジルエステルを含む）、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジル−プロピオネート）、二官能性マレイミド、例えば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン、およびメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミデートなどの薬剤が含まれる。
【０１６２】
他の修飾には、グルタミニルおよびアスパラギニル残基のそれぞれ対応するグルタミルおよびアスパルチル残基への脱アミド化、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）、Ｎ末端アミンのアセチル化、およびＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０１６３】
ポリペプチドの共有結合的修飾の別のタイプには、ポリペプチドを、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号、または第４，１７９，３３７号に説明される方法で様々な非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）の１つに結合させることが含まれる。
【０１６４】
キメラ分子
本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、変異型、変異体、および／またはこれらのフラグメントはまた、有利な場合、別の異種性ポリペプチドもしくはアミノ酸配列（例えば、イムノアドヘシンまたはペプチボディ）に融合させたポリペプチドを含むキメラ分子を形成させる方法において改変させることもできる。
【０１６５】
１の実施態様において、このようなキメラ分子には、ポリペプチドを、様々な組織へ、より具体的には、血液脳関門を通した送達のために標的とするタンパク質形質導入ドメイン、例えば、ヒト免疫不全ウイルスＴＡＴタンパク質のタンパク質形質導入ドメインを用いる融合物が含まれる（Schwarze et al., 1999, Science 285: 1569-72）。
【０１６６】
別の実施態様において、このようなキメラ分子には、ポリペプチドと、抗タグ抗体が選択的に結合することができるエピトープを供するタグポリペプチドとの融合物が含まれる。前記エピトープタグは、一般に、ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端に配置される。ポリペプチドのこのようなエピトープでタグされた型の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグを供することにより、ポリペプチドを、エピトープタグに結合する抗タグ抗体または別のタイプのアフィニティーマトリックスを用いてアフィニティー精製によって容易に精製することが可能となる。様々なタグポリペプチドおよびそれらの各抗体は、当該技術分野で公知である。例として、ポリ−ヒスチジン（ポリＨｉｓ）またはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリＨｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)）；ｃ−ｍｙｃタグおよびその８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７、および９Ｅ１０抗体（Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)）；ならびに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)）が挙げられる。他のタグポリペプチドには、Ｆｌａｇ−ペプチド（Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)）；ＫＴ３エピトープペプチド（Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)）；α−チュブリンエピトープペプチド（Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163- 15166 (1991)）；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)）が挙げられる。
【０１６７】
別の実施態様において、前記キメラ分子には、ポリペプチドと免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域との融合物が含まれうる。キメラ分子の二価形態（例えば、「イムノアドヘシン」）について、このような融合物は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものでありうる。本発明のＩｇ融合物には、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりに、ヒトの残基９４〜２４３、残基３３〜５３、または残基３３〜５２の前後またはこれらのみを含むポリペプチドが含まれる。特に好ましい実施態様において、免疫グロブリン融合物には、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３、あるいはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３領域が含まれる。免疫グロブリン融合物の作成については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号も参照のこと。
【０１６８】
免疫リポゾーム
本明細書に開示の抗体はまた、免疫リポゾームとして製剤化することができる。抗体を含有するリポゾームは、Epstein et al., PNAS USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., PNAS USA, 77: 4030 (1980)；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載されるような当該技術分野において公知の方法によって調製される。血中時間が上昇したリポゾームが米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１６９】
特に有用なリポゾームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって調製することができる。リポゾームを規定の孔径のフィルターに通して押し出して、所望される直径を有するリポゾームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応により、Martinet al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるように、リポゾームに抱合することができる。抗悪性腫瘍薬、増殖抑制剤、または化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）はまた、リポゾーム内に含有されてもよい。Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)を参照のこと。
【０１７０】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその変異型を用いる治療
抗ＰＤ−Ｌ１抗体、変異型、変異体、および／またはこれらのフラグメント、ならびに／あるいは本明細書で供される組成物は、異常なＰＤ−Ｌ１活性に関する疾患および障害（例えば、癌（例えば、頭頚部癌、咽頭癌、結腸直腸癌、肺癌など）を含む）を治療するために、対象（例えば、ヒトなどの哺乳類）に投与することができる。ある実施態様において、本発明は、対象における癌（例えば、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頚部癌、尿路上皮癌、乳癌（例えば、三種陰性乳癌、ＴＮＢＣ）、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫 縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＮＨＬ ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、食道癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌）の治療剤の製造における使用のための本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または変異型（またはこれらのフラグメント）を提供する。ある実施態様において、本発明は、対象における癌（例えば、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頚部癌、尿路上皮癌、乳癌（例えば、三種陰性乳癌、ＴＮＢＣ）、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫 縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＮＨＬ ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、食道癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌）の治療における使用のための本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または変異型（またはこれらのフラグメント）を提供する。
【０１７１】
ある実施態様において、本発明は、本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（あるいはこれらのフラグメント）を含む医薬組成物であって、対象における癌（メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頚部癌、尿路上皮癌、乳癌（例えば、三種陰性乳癌、ＴＮＢＣ）、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫 縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＮＨＬ ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、食道癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌）の治療における使用のための医薬組成物を提供する。ある実施態様において、治療されるべき対象は、哺乳類（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなど）である。ある実施態様において、前記対象は、ヒトである。ある実施態様において、前記対象は、臨床患者、臨床試験ボランティア、実験動物などである。ある実施態様において、前記対象は、癌（例えば、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頚部癌、尿路上皮癌、乳癌（例えば、三種陰性乳癌、ＴＮＢＣ）、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫 縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＮＨＬ ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、食道癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌）に罹っている疑いがあるか、またはそのリスクがあるか、あるいは癌または異常なＰＤ−Ｌ１発現または活性を示す他の疾患のいずれかと診断されている。
【０１７２】
癌（例えば、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頚部癌、尿路上皮癌、乳癌（例えば、三種陰性乳癌、ＴＮＢＣ）、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫 縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＮＨＬ ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、食道癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌）または異常なＰＤ−Ｌ１活性を示す他の疾患のいずれかのための多くの診断方法およびこれらの疾患の臨床的基準は、当該技術分野で公知である。このような方法として、下記に限定されないが、例えば、免疫組織化学法、ＰＣＲ、蛍光インサイチュ（in situ）ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が挙げられる。異常なＰＤ−Ｌ１活性または発現のための診断方法に関するさらなる詳細は、例えば、Gupta et al. (2009) Mod Pathol. 22(1): 128-133；Lopez-Rios et al. (2013) J Clin Pathol. 66(5): 381-385；Ellison et al. (2013) J Clin Pathol 66(2): 79-89；およびGuha et al. (2013) PLoS ONE 8(6): e67782に記載されている。
【０１７３】
投与は、例えば、静脈内、筋肉内、または皮下を含む適切な経路のいずかによりうる。ある実施態様において、本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または変異型もしくは変異体（またはこれらのフラグメント）ならびに／あるいは組成物は、異常なＰＤ−Ｌ１活性に関する疾患または障害を治療するために、第２、第３、または第４の薬剤（例えば、抗悪性腫瘍薬、増殖抑制剤、細胞傷害性薬物、または化学療法剤を含む）と組み合わせて投与される。このような薬剤として、例えば、ドセタキセル、ゲフィチニブ、ＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン、５−フルオロウラシル、およびロイコボリン）、イリノテカン、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ抗体）、ＦＯＬＦＯＸ−４、フルオロウラシル静注、ロイコボリン、ならびにオキサリプラチン、アファチニブ、ゲムシタビン、カペシタビン、ペメトレキセド、チバンチニブ、エベロリムス、ＣｐＧ−ＯＤＮ、ラパマイシン、レナリドミド、ベムラフェニブ、エンドスタチン、ラパチニブ、ＰＸ−８６６、Ｉｍｐｒｉｍｅ ＰＧＧ、およびエルロチニブが挙げられる。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または変異型（またはこれらのフラグメント）は、さらなる薬剤に抱合される。
【０１７４】
ある実施態様において、本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（あるいはこれらのフラグメント）ならびに／あるいは組成物は、１つまたはそれ以上のさらなる治療、例えば、放射線療法、外科手術、化学療法、および／または標的療法と組み合わせて投与される。ある実施態様において、本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または変異型（あるいはこれらのフラグメント）ならびに／あるいは組成物は、放射線療法と組み合わせて投与される。ある実施態様において、本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または変異型（あるいはこれらのフラグメント）ならびに／あるいは組成物と放射線療法との組み合わせは、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頚部癌 癌、尿路上皮癌、乳癌（例えば、三種陰性乳癌、ＴＮＢＣ）、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫 縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＮＨＬ ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、食道癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、および甲状腺癌からなる軍から選択される癌を治療するために用いられる。
【０１７５】
治療されるべき症状および当該技術分野における医師が精通する投薬に関する因子に従って、本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、変異体、またはこれらのフラグメントは、毒性および副作用を最少にしつつ当該症状の治療に有効な用量で投与される。癌（例えば、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頚部癌、尿路上皮癌、乳癌（例えば、三種陰性乳癌、ＴＮＢＣ）、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫 縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＮＨＬ ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、食道癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌）の治療について、典型的な用量は、例えば、０．００１から１０００ｍｇの範囲でありうるが；この典型的な範囲以下または以上の用量は、本発明の範囲内である。１日の用量は、全体重の約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約５μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、または前記数値のいずれか２つによって定義される範囲）、好ましくは、全体重の約０．３μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．５μｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１５０μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約７５０μｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、または前記数値のいずれか２つによって定義される範囲）、より好ましくは、全体重の約１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ（例えば、約３μｇ／ｋｇ、約１５μｇ／ｋｇ、約７５μｇ／ｋｇ、約３００μｇ／ｋｇ、約９００μｇ／ｋｇ、または前記数値のいずれか２つによって定義される範囲）、ならびにさらにより好ましくは、１日あたり約０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重（例えば、約２ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、または前記数値のいずれか２つによって定義される範囲（前記数値間のいずれかの範囲を含む））でありうる。上記に記載されるように、治療または予防上の有効性は、治療される患者の定期的な評価によってモニターすることができる。数日またはそれ以上にわたる繰り返し投与については、状態に応じて、治療は、病状の望ましい抑制が生じるまで繰り返される。しかしながら、他の投薬計画が有用であることもあり、本発明の範囲内である。望ましい用量は、前記組成物の単回ボーラス投与、前記組成物の複数回ボーラス投与、または前記組成物の連続注入投与によって送達することができる。
【０１７６】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体、変異型、変異体、またはこれらのフラグメントを含む医薬組成物は、１日１回、２回、３回、または４回で投与することができる。前記組成物はまた、１日１回より少ない頻度、例えば、１週間に６回、１週間に５回、１週間に４回、１週間に３回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、または６ヶ月に１回で投与することができる。前記組成物はまた、徐放性製剤、例えば、一定期間にわたり使用するために組成物を徐々に放出し、組成物のより少ない頻度、例えば、１ヶ月に１回、２〜６ヶ月に１回、１年に１回、または単回投与を可能にする移植片（implant）で投与されてもよい。徐放デバイス（例えば、ペレット、ナノ粒子、微小粒子、ナノスフェア、ミクロスフェア等）は、注射によって投与されてもよい。
【０１７７】
前記抗体および／または変異型もしくは変異体（あるいはこれらのフラグメント）は、１日１回の用量で投与されてもよく、あるいは合計の１日用量は、１日２回、３回、または４回の分割用量で投与されてもよい。前記組成物はまた、１日１回より少ない頻度、例えば、１週間に６回、１週間に５回、１週間に４回、１週間に３回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、３ヶ月に１回、または６ヶ月に１回で投与することもできる。前記抗体（またはこれらのフラグメント）は、徐放性製剤、例えば、一定期間にわたり使用するために組成物を徐々に放出し、組成物のより少ない頻度、例えば、１ヶ月に１回、２〜６ヶ月に１回、１年に１回、または単回投与を可能にする移植片で投与されてもよい。徐放デバイス（例えば、ペレット、ナノ粒子、微小粒子、ナノスフェア、ミクロスフェア等）は、注射によって投与されるか、または様々な位置に外科的に移植されてもよい。
【０１７８】
癌治療は、例えば、以下に限定されないが、腫瘍退縮、腫瘍重量または大きさの縮小、進行時間、生存期間、進行なしの生存、全奏効率、応答期間、生活の質、タンパク質の発現および／または活性によって評価することができる。治療の有効性を調べるための方法（例えば、放射線学的画像による応答測定を含む）を用いることができる。
【０１７９】
ある実施態様において、治療の有効性は、式１００−（Ｔ／Ｃｘ１００）［式中、Ｔは、治療された腫瘍の平均相対腫瘍体積であり、Ｃは、治療されなかった腫瘍の平均相対腫瘍体積である］を用いて算出される腫瘍増殖阻害パーセンテージ（ＴＧＩ％）として測定される。ある実施態様において、ＴＧＩ％は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、または９５％以上である。ある実施態様において、抗ＰＤ−Ｌ１および／またはその変異型もしくは変異体のＴＧＩ％は、対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＴＧＩ％と同一またはそれ以上、例えば、約１．１倍、約１．２倍、約１．３倍、約１．４倍、約１．５倍、約１．６倍、約１．７倍、約１．８倍、約１．９倍、約２倍、約２．１倍、約２．２倍、約２．３倍、約２．４倍、約２．５倍、約２．６倍、約２．７倍（これらの数値間のいずれかの範囲を含む）、または約２．７倍以上である。
【０１８０】
医薬製剤
抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／または変異型もしくは変異体（あるいはこれらのフラグメント）は、投与に適するように適切な担体または賦形剤とともに製剤化することができる。前記抗体の適する製剤は、所望の純度を有する抗体（またはそのフラグメント）を、適宜、医薬的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）と混合させることによって凍結乾燥された製剤または水溶液の形態で得られる。許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに対して無毒であり、緩衝液（例えば、リン酸、クエン酸、および他の有機酸）；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルもしくはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基以下）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン）；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール）；塩形成対イオン（salt-forming counter-ion）（例えば、ナトリウム金属錯体（例えば、Ｚｎタンパク質錯体））；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられる。典型的な抗体製剤は、出典明示により本明細書に取り込まれるＷＯ９８／５６４１８に記載されている。皮下投与に用いられる凍結乾燥された製剤は、ＷＯ９７／０４８０１に開示されている。このような凍結乾燥された製剤は、高いタンパク質濃度に適切な希釈により再構成されてもよく、再構成された製剤が本明細書の治療されるべき哺乳類に皮下投与されてもよい。
【０１８１】
本明細書に記載の製剤はまた、治療される特定の用法に必要とされる１つ以上の活性化合物、好ましくは、お互いに有害な影響を及ぼさない補完的な活性を有するものを含んでいてもよい。例えば、抗悪性腫瘍薬、増殖抑制剤、細胞傷害性薬物、または化学療法剤をさらに供することが所望されうる。このような分子は、意図する目的のために有用である量で適切に組み合わせて存在する。このような他の薬剤の有効な量は、製剤に存在する抗体の量、病気もしくは疾患または治療のタイプ、および他の上記に記載の因子による。これらは、一般に、本明細書に記載の同一の用量および投与経路、または前記で用いられる用量の約１〜９９％で用いられる。有効成分はまた、（例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって）調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル各々に、コロイド薬物送達系（例えば、リポゾーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルションに封入されていてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適する例としては、アンタゴニストを含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックス（前記マトリックスは、加工された製品の形態（例えば、フィルムまたマイクロカプセル）である）が挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性エチレン−ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射ミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０１８２】
リポフェクチンまたはリポゾームは、本発明のポリペプチドおよび抗体（またはこれらのフラグメント）または組成物を細胞に送達するために用いることができる。抗体フラグメントが用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最も小さい阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、ペプチド分子は、標的タンパク質配列に結合する能力を保持するように設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成し、および／または組み換えＤＮＡ技術によって調製することができる。例えば、Marasco et al., PNAS USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照のこと。
【０１８３】
前記有効成分はまた、（例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって）調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル各々に、コロイド薬物送達系（例えば、リポゾーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルションに封入されていてもよい。このような技術は、上記Remington's PHARMACEUTICAL SCIENCESに開示されている。
【０１８４】
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の適する例としては、抗体（またはそのフラグメント）を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックス（前記マトリックスは、加工された製品の形態（例えば、フィルムまたマイクロカプセル）である）が挙げられる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−グルタミン酸エチルのコポリマー、非分解性エチレン−ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射ミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、分子を１００日にわたり放出することができる一方で、一定のハイドロゲルは、短時間でタンパク質を放出する。被包された抗体は長期間体内に残ると、３７℃で水分へ曝された結果として変性し、または凝集し、その結果として、生物学的活性を失い、免疫原性が変化する可能性が生じうる。安定性のために関連するメカニズムに応じて合理的な方法を考案することができる。例えば、凝集メカニズムがチオジスルフィド変換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが知見された場合、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含量を調節し、適当な添加剤を使用し、ならびに特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより安定化させることができる。
【０１８５】
ある実施態様において、前記製剤は、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体を、約０．５ｍｇ／ｍｌ以上、約１ｍｇ／ｍｌ以上、約２ｍｇ／ｍｌ以上、約３ｍｇ／ｍｌ以上、約４ｍｇ／ｍｌ以上、約５ｍｇ／ｍｌ以上、約６ｍｇ／ｍｌ以上、約７ｍｇ／ｍｌ以上、約８ｍｇ／ｍｌ以上、約９ｍｇ／ｍｌ以上、約１０ｍｇ／ｍｌ以上、約１１ｍｇ／ｍｌ以上、約１２ｍｇ／ｍｌ以上、約１３ｍｇ／ｍｌ以上、約１４ｍｇ／ｍｌ以上、約１５ｍｇ／ｍｌ以上、約１６ｍｇ／ｍｌ以上、約１７ｍｇ／ｍｌ以上、約１８ｍｇ／ｍｌ以上、約１９ｍｇ／ｍｌ以上、約２０ｍｇ／ｍｌ以上、約２１ｍｇ／ｍｌ以上、約２２ｍｇ／ｍｌ以上、約２３ｍｇ／ｍｌ以上、約２４ｍｇ／ｍｌ以上、約２５ｍｇ／ｍｌ以上、約２６ｍｇ／ｍｌ以上、約２７ｍｇ／ｍｌ以上、約２８ｍｇ／ｍｌ以上、約２９ｍｇ／ｍｌ以上、または約３０ｍｇ／ｍｌ以上（これらの数値間のいずれの範囲も含む）の濃度で含む。
【０１８６】
ある実施態様において、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体は、クエン酸、ＮａＣｌ、酢酸、コハク酸、グリシン、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）、または前記組み合わせのいずれかを含む緩衝液中において、（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌ以上、約１ｍｇ／ｍｌ以上、約５ｍｇ／ｍｌ以上、約１０ｍｇ／ｍｌ以上、約１５ｍｇ／ｍｌ以上、約２０ｍｇ／ｍｌ以上、または約２５ｍｇ／ｍｌ以上（これらの数値間のいずれの範囲も含む）の濃度で）製剤化される。ある実施態様において、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型は、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭのグリシンを含む緩衝液中において、（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌ以上、約１ｍｇ／ｍｌ以上、約５ｍｇ／ｍｌ以上、約１０ｍｇ／ｍｌ以上、約１５ｍｇ／ｍｌ以上、約２０ｍｇ／ｍｌ以上、または約２５ｍｇ／ｍｌ以上（これらの数値間のいずれの範囲も含む）の濃度で）製剤化される。ある実施態様において、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型は、約５０ｍＭ〜約１００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液中で製剤化される。ある実施態様において、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの酢酸を含む緩衝液中において、（例えば、約ｍｇ／ｍｌ以上、約１ｍｇ／ｍｌ以上、約５ｍｇ／ｍｌ以上、約１０ｍｇ／ｍｌ以上、約１５ｍｇ／ｍｌ以上、約２０ｍｇ／ｍｌ以上、または約２５ｍｇ／ｍｌ以上（これらの数値間のいずれの範囲も含む）の濃度で）製剤化される。ある実施態様において、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型は、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのコハク酸を含む緩衝液中において製剤化される。ある実施態様において、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体は、約０．００５％〜約０．０２％のポリソルベート８０を含む緩衝液中において、（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌ以上、約１ｍｇ／ｍｌ以上、約５ｍｇ／ｍｌ以上、約１０ｍｇ／ｍｌ以上、約１５ｍｇ／ｍｌ以上、約２０ｍｇ／ｍｌ以上、または約２５ｍｇ／ｍｌ以上（これらの数値間のいずれの範囲も含む）の濃度で）製剤化される。ある実施態様において、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体は、約５．１〜５．６の間のｐＨを示す緩衝液中において製剤化される。ある実施態様において、前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体は、１０ｍＭ クエン酸、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ グリシン、および０．０１％ ポリソルベート８０を含む緩衝液中において製剤化され、前記製剤は、ｐＨ＝５．５である。
【０１８７】
ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体を（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌ以上、約１ｍｇ／ｍｌ以上、約５ｍｇ／ｍｌ以上、約１０ｍｇ／ｍｌ以上、約１５ｍｇ／ｍｌ以上、約２０ｍｇ／ｍｌ以上、または約２５ｍｇ／ｍｌ以上（これらの数値間のいずれの範囲も含む）の濃度で）含む製剤（例えば、１０ｍＭ クエン酸、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ グリシン、および０．０１％ ポリソルベート８０を含む緩衝液を含む製剤（前記製剤は、ｐＨ＝５．５である））は、室温（例えば、約２０〜２５℃で約０．５週間、１．０週間、１．５週間、２．０週間、２．５週間、３．５週間、４．０週間、４．５週間、または５．０週間（これらの数値間のいずれの範囲も含む））で安定である。ある実施態様において、本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体を（例えば、約０．５ｍｇ／ｍｌ以上、約１ｍｇ／ｍｌ以上、約５ｍｇ／ｍｌ以上、約１０ｍｇ／ｍｌ以上、約１５ｍｇ／ｍｌ以上、約２０ｍｇ／ｍｌ以上、または約２５ｍｇ／ｍｌ以上（これらの数値間のいずれの範囲も含む）の濃度で）含む製剤（例えば、１０ｍＭ クエン酸、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ グリシン、および０．０１％ ポリソルベート８０を含む緩衝液を含む製剤（前記製剤は、ｐＨ＝５．５である））は、加速的な条件（例えば、約３７℃で保存）下で約０．５週間、１．０週間、１．５週間、２．０週間、２．５週間、３．５週間、４．０週間、４．５週間、または５．０週間（これらの数値間のいずれの範囲も含む）安定である。
【０１８８】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、周知であり、物理化学的不安定性に対応する断片化および凝集の可能性を検出するタンパク質安定化実験で広く用いられている。ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体を含む製剤は、３７℃で１週間後に、ＳＥＣを用いて測定されると、最初の高分子量種％に対して約１．６％、１．４％，１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、または０．１％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）以下の高分子量種（ＨＭＷＳ）の増加を示す。ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体を含む製剤は、３７℃で２週間後に、ＳＥＣを用いて測定されると、最初の高分子量種％に対して約２．０％、１．８％、１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、または０．１％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）以下の高分子量種の増加を示す。ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体を含む製剤は、３７℃で４週間後に、ＳＥＣを用いて測定されると、最初の高分子量種％に対して約３．３％、３．２％、３．１％、３．０％、２．９％、２．８％、２．７％、２．６％、２．５％、２．４％、２．２％、２．０％、１．８％、１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、または０．１％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）の高分子量種の増加を示す。
【０１８９】
ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体を含む製剤は、３７℃で１週間後に、ＳＥＣを用いて測定されると、最初の低分子量種％に対して約１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、または０．１％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）以下の低分子量種（ＬＭＷＳ）の増加を示す。ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体を含む製剤は、３７℃で２週間後に、ＳＥＣを用いて測定されると、最初の低分子量種％に対して約２．０％、１．８％、１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、％、０．４％、０．２％、または０．１％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）以下の低分子量種の増加を示す。ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体を含む製剤は、３７℃で４週間後に、ＳＥＣを用いて測定されると、最初の低分子量種％に対して約２．４％、２．２％、２．０％、１．８％、１．６％、１．４％、１．２％、１．０％、０．８％、０．６％、０．４％、０．２％、または０．１％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）以下の低分子量種の増加を示す。
【０１９０】
ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体を含む製剤は、３７℃で１週間後に、ＳＥＣを用いて測定されると、最初のモノマー％に対して約０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、または３．５％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）未満のモノマーの減少を示す。ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体を含む製剤は、３７℃で２週間後に、ＳＥＣを用いて測定されると、最初のモノマー％に対して約０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、または３．５％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）未満のモノマーの減少を示す。ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体を含む製剤は、３７℃で２週間後に、ＳＥＣを用いて測定されると、最初のモノマー％に対して約０．２％、０．４％、０．６％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２．０％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３．０％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、または３．５％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）未満のモノマーの減少を示す。
【０１９１】
陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）は周知であり、脱アミド化または参加などのタンパク質分解現象を検出するために広く用いられる方法である（Moorhouse et al. (1997) J. Pharm. Biomed. Anal. 16, 593-603）。分解産物は、典型的に、より高い見掛け上のｐＩを有するｇｎｔと比較される酸性または塩基性種と称される。酸性種は、ＣＥＸからの主要ピークより早期に溶離する変異型であり、塩基性種は、ＣＥＸからの主要ピークより遅れて溶離する変異型である。ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体を含む製剤の酸性ピークフラクションは、ＣＥＸを用いて測定されると、３７℃で１週間後に、総タンパク質の約７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、または１５％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）未満である。ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体を含む製剤の酸性ピークフラクションは、ＣＥＸを用いて測定されると、３７℃で２週間後に、総タンパク質の約８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、または１８％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）未満である。ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（またはフラグメント）を含む製剤の酸性ピークフラクションは、ＣＥＸを用いて測定されると、３７℃で２週間後に、総タンパク質の約８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、または２７％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）未満である。
【０１９２】
ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（またはフラグメント）を含む製剤の塩基性ピークフラクションは、ＣＥＸを用いて測定されると、３７℃で１週間後に、総タンパク質の約３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、または４６％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）未満である。ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（またはフラグメント）を含む製剤の塩基性ピークフラクションは、ＣＥＸを用いて測定されると、３７℃で２週間後に、総タンパク質の約３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、または４６％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）未満である。ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（またはフラグメント）を含む製剤の塩基性ピークフラクションは、ＣＥＸを用いて測定されると、３７℃で４週間後に、総タンパク質の約３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、または４６％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）未満である。
【０１９３】
ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（またはフラグメント）を含む製剤の主要ピークフラクションは、ＣＥＸを用いて測定されると、３７℃で１週間後に、総タンパク質の約３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、または４６％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）未満である。ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（またはフラグメント）を含む製剤の塩基性ピークフラクションは、ＣＥＸを用いて測定されると、３７℃で２週間後に、総タンパク質の約３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、または４６％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）未満である。ある実施態様において、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または２５ｍｇ／ｍｌの本明細書に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（またはフラグメント）を含む製剤の塩基性ピークフラクションは、ＣＥＸを用いて測定されると、３７℃で４週間後に、総タンパク質の約３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、または４６％（これらの数値間のいずれの範囲も含む）未満である。
【０１９４】
インビボ投与で用いられる製剤は、滅菌されていなければならない。これは、例えば、滅菌濾過メンブレンに通す濾過により容易に行われる。
【０１９５】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその変異型／変異体を用いる診断方法およびイメージング方法
ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドに特異的に結合する標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、変異体、フラグメント、ならびに誘導体および類似体は、ＰＤ−Ｌ１の発現、異常な発現および／または活性に関連する疾患および／または障害を検出し、診断し、またはモニターするための診断目的で用いることができる。例えば、前記本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（またはこれらのフラグメント）は、インサイチュ（in situ）、インビボ、エクスビボ、およびインビトロでの診断アッセイまたはイメージングアッセイに用いることができる。ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの発現を検出するための方法であって、（ａ）本発明の１つまたはそれ以上の抗体を用いて、個体の細胞（例えば、組織）または体液の前記ポリペプチドの発現を測定し、次いで（ｂ）前記発現レベルを標準遺伝子発現レベルと比較し、それにより前記標準発現レベルと比較した測定した遺伝子発現レベルにおける増加もしくは減少が異常な発現の指標である方法である。
【０１９６】
本明細書で供されるさらなる実施態様には、動物（例えば、ヒトなどの哺乳類）におけるＰＤ−Ｌ１の発現または異常な発現に関連する疾患または障害の診断方法が含まれる。前記方法には、哺乳類におけるＰＤ−Ｌ１分子を検出することが含まれる。ある実施態様において、診断には：（ａ）有効な量の標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（またはフラグメント）を哺乳類に投与し、（ｂ）標識された抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（またはフラグメント）をＰＤ−Ｌ１分子が発現される対象の部位に選択的に集めるために（および結合していない標識分子がバックグラウンドレベルまで浄化されるために）投与後一定期間待ち；（ｃ）バックグラウンドレベルを調べ；次いで（ｄ）標識された分子を対象において検出することを含み、バックグラウンドレベルを超える標識された分子の検出は、対象がＰＤ−Ｌ１の発現または異常な発現に関連する特定の疾患または障害に罹っていることを示す。バックグラウンドレベルは、検出された標識分子の量を、特定の系について過去に調べた標準値を比較することを含む、様々な方法によって調べることができる。
【０１９７】
本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（またはフラグメント）は、当業者に公知の従来の免疫組織法を用いて、生物学的試料におけるタンパク質レベルを測定するために用いることができる（例えば、Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)を参照のこと）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体に基づく方法には、免疫アッセイ、例えば、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が含まれる。適切な抗体アッセイ標識は、当該技術分野で公知であり、酵素標識、例えば、グルコースオキシダーゼ；ラジオアイソトープ、例えば、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ；ルミノール；ならびに蛍光標識、例えば、フルオレセインおよびローダミン、ならびにビオチンが挙げられる。
【０１９８】
当該技術分野で公知の技術が、本明細書で供される標識された抗体（またはこれらのフラグメント）に適用されてもよい。このような技術には、下記に限定されないが、二官能性抱合剤の使用（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；第５，７１４，６３１号；第５，６９６，２３９号；第５，６５２，３６１号；第５，５０５，９３１号；第５，４８９，４２５号；第５，４３５，９９０号；第５，４２８，１３９号；第５，３４２，６０４号；第５，２７４，１１９号；第４，９９４，５６０号；および第５，８０８，００３号）が含まれる。
【０１９９】
あるいは、またはさらに、１つは、細胞におけるＰＤ−Ｌ１ポリペプチドをコードする核酸またはｍＲＮＡのレベルを測定することができ、例えば、ＰＤ−Ｌ１をコードする核酸またはその相補物に対応する核酸に基づくプローブを用いる蛍光インサイチュ（in situ）ハイブリダイゼーション；（ＦＩＳＨ；１９９８年１０月に公開されたＷＯ９８／４５４７９を参照のこと）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、またはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術、例えば、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によるものである。１つはまた、例えば、抗体に基づくアッセイ（例えば、１９９０年６月１２日発行の米国特許第４，９３３，２９４号；１９９１年４月１８日公開のＷＯ９１／０５２６４；１９９５年３月２８日発行の米国特許第５，４０１，６３８号；およびSias et al., J. Immunol. Methods 132:73-80 (1990)も参照のこと）を用いて、生物学的液体（例えば、血清）における排出抗原を測定することによってＰＤ−Ｌ１の過剰発現を試験することができる。上記アッセイの他に、様々なインビボおよびエクスビボアッセイが当業者に利用可能である。例えば、１つは、哺乳類の体内の細胞を、検出可能な標識（例えば、放射性同位元素）で適宜標識されている抗体に曝露することができ、抗体の結合は、例えば、放射能について外部走査することによって、または抗体に以前曝露された哺乳類から取得した試料（例えば、バイオプシーまたは他の生物学的試料）を分析することによって評価することができる。
【０２００】
製品およびキット
本明細書で供される別の実施態様は、癌、例えば、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頚部癌、尿路上皮癌、乳癌（例えば、三種陰性乳癌、ＴＮＢＣ）、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫 縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＮＨＬ ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌）、食道癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌、および唾液腺癌の治療に有用な物質を含有する製品である。前記製品には、容器およびその容器上もしくは容器に添付したラベルもしくは添付文書が含まれ得る。適当な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが含まれる。前記容器は、ガラスまたはプラスティックなどの様々な物質からできていてもよい。一般に、前記容器は、前記疾患を治療するために有効である組成物を保持し、滅菌されたアクセスポートを有していてもよい（例えば、前記容器は、皮下注射ニードルによって通すことができるストッパーを有する静脈注射用溶液バッグもしくはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの有効成分は、本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（またはフラグメント）である。前記ラベルもしくは添付文書は、前記組成物が特定の疾患を治療するために用いられることを示す。前記ラベルもしくは添付文書には、前記抗体組成物を前記患者に投与するための説明書がさらに含まれる。本明細書に記載の併用療法を含む製品およびキットもまた包含される。
【０２０１】
添付文書は、治療薬の使用に関する効能、用法、用量、投与、禁忌および／または警告についての情報を含む治療薬の販売用パッケージに慣習的に含まれる説明書を意味する。１の実施態様において、前記添付文書は、前記組成物が癌（例えば、頭頚部癌、肺癌、または結腸直腸癌）を治療するために用いられることを示す。
【０２０２】
さらに、前記製品には、医薬的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液を含む第２の容器がさらに含まれてもよい。他の緩衝液、希釈液、フィルター、ニードル、およびシリンジを含む販売およびユーザーの立場から望まれる他の物質がさらに含まれてもよい。
【０２０３】
様々な目的、例えば、適宜、前記製品と組み合わせた患者におけるＰＤ−Ｌ１の単離または検出に有用であるキットもまた、提供される。ＰＤ−Ｌ１の単離または検出のために、前記キットには、ビーズ（例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ビーズ）に結合させた本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（またはフラグメント）を含ませることができる。例えば、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットにおいて、インビトロでＰＤ−Ｌ１の検出および定量のための抗体（またはそのフラグメント）を含むキットが含まれうる。前記製品と同様に、前記キットには、容器およびその容器上もしくは容器に添付したラベルもしくは添付文書が含まれる。例えば、前記容器は、少なくとも１つの本明細書で供される抗ＰＤ−Ｌ１抗体および／またはその変異型もしくは変異体（またはフラグメント）を含む組成物を含む。例えば、希釈液および緩衝液、対照抗体を含むさらなる容器が含まれてもよい。前記ラベルもしくは添付文書は、前記組成物の説明、ならびに目的とするインビトロまたは診断使用についての説明を供してもよい。
【実施例】
【０２０４】
実施例１
ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体および変異型の開発
抗ＰＤ−Ｌ１抗体の開発について、全体の流れは下記のようにまとめられる。７つの陽性リード物質（すなわち、ＰＬ１、ＰＬ２、ＰＬ３、ＰＬ６、ＰＬ８、ＰＬ１２、ＰＬ１５）は、ヒトＰＤ−Ｌ１＿ＥＣＤ−Ｈｉｓによるヒトファージディスプレイライブラリーのスクリーニングにより同定した。一般に、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１１２０５Ｄ）に結合されたビオチン化ヒトＰＤ−Ｌ１＿ＥＣＤ−Ｈｉｓによる３回のパニング後、リード物質のＦａｂをスクリーニングし、ＥＬＩＳＡによりｈＰＤ−Ｌ１＿ＥＣＤ−ＦｃおよびｈＰＤ−Ｌ１＿ＥＣＤ−Ｈｉｓへのそれらの結合を測定し、次いで、７つの選択されたリード物質のＦａｂ配列をヒトＩｇＧ１ Ｆｃ骨格のＮ２９７Ａ変異体にクローン化して、動力学的特性、全細胞ＰＤ−Ｌ１結合活性、ＰＤ−１阻害活性、インビトロおよびインビボ機能の測定における多くの実験を実施するために用いた全長抗体とした。全てのデータに基づいて、ＰＬ２およびＰＬ３は、他の選択されたリード物質より優れた抗腫瘍活性を有することが見出され、それらの親和性は、ＰＬ２およびＰＬ３のファージディスプレイライブラリーを作成することによってさらに最適化し、少なくとも３回のパニングをインビトロ親和性成熟について行った。高い親和性を有するＰＬ２およびＰＬ３に由来する変異型（すなわち、ＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７）を同定し、活性と機能を、前記抗体リード物質の選択に用いられた方法と非常に類似する方法に従って確認した。また留意すべきは、この段階において、異なるＩｇＧアイソタイプの変異型（すなわち、ＩｇＧ１、ｍｔＩｇＧ１（Ｎ２９７Ａ）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４）を作成し、様々なＦｃ骨格と抱合されたＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７の一団についての親和性およびインビトロとインビボ有効性を同時に比較したことである。腫瘍／抗原特異的Ｔ細胞異種移植モデルに加えて、ｈＰＤ−１ノックインモデルをＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７の有効性を確認するために用い、これらのデータにより、それらは両方とも、抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体と比較可能であることが示された。ＰＬ３＃７の親和性をさらに改善するために、ＰＬ３＃７に基づく別のファージディスプレイライブラリーを前述と同様に親和性成熟のために作成した。これにより、３つの新たな変異型（すなわち、ＰＬ３＃７−１９、−４３、−５４）を同定し、それらの有効性をＰＬ２トップ変異型（ＰＬ２＃３）と比較するために用いた。比較データの詳細を下記の実施例に記載する。
【０２０５】
ここで、７つの選択されたリード物質の結合親和性および反応速度（ｋａ、ｋｄ、およびＫＤ）を、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いて測定し、表４に示した。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃを、まずセンサーチップ上に固定し、次いで抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体および前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体リード物質：ＰＬ１、ＰＬ２、ＰＬ３、ＰＬ６、ＰＬ８、ＰＬ１２、およびＰＬ１５をＲｍａｘ〜２５０ＲＵで捕捉する。実験は２５℃で行い、５５．４ｎＭ〜１１．１ｎＭのｈＰＤ−Ｌ１＿ＥＣＤ−Ｈｉｓの連続希釈液を用いて、捕捉された抗体にＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液（０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを補充）中で２５μＬ／分の流速にて通して行った。全てのデータは評価ソフトウェアで解析し、曲線を１：１ラングミュア結合モデルで適合させた。データは、２つの独立した実験を２回行った代表値である。
表４
【表４】
2019535254.tif 000010
【０２０６】
選択された抗ＰＤ−Ｌ１抗体リード物質（ＰＬ１、ＰＬ２、ＰＬ３、ＰＬ６、ＰＬ８、ＰＬ１２、ＰＬ１５）の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）のアミノ酸配列を図１Ａ−１Ｂに示す。これらのリード物質のこれらのＬＣおよびＨＣにおける相補性決定領域（ＣＤＲ）を太い下線で示した。
【０２０７】
実施例２
抗体ＰＬ２の抗ＰＤ−Ｌ１変異型の結合親和性および反応速度
抗体リード物質ＰＬ２を、インビトロファージディスプレイに基づく親和性成熟実験で用いて、改善された結合能を有するさらなるクローンを作成した。まず、ＣＤＲ−Ｌ１／ＣＤＲ−Ｌ３／ＣＤＲ−Ｈ３（３個のＣＤＲに着目）核酸ライブラリーをＰＣＲにより作成し、ファージディスプレイベクターにクローン化し、次いでＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１またはＳＳ３２０細胞に形質転換させて、ファージのライブラリーを作成した。ストレプトアビジンでコーティングした磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０に結合させたビオチン化ｈＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１１２０５Ｄ）による３回のパニング後、４０個のＦａｂクローンをＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、４つのＦａｂ（すなわち、＃３、＃４、＃５、および＃３９）が、親ＰＬ２より優れた結合能を有することを見出した。さらに、反応速度特性は、ＰＬ２＃３、ＰＬ２＃４、ＰＬ２＃５、およびＰＬ２＃３９の全長ＩｇＧを用いて表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により測定し、抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体と同等またはそれ以上の優れた結合能を有することを見出した。
【０２０８】
下記表５は、Ｌ１、Ｌ３、および−Ｈ３領域に変異を有するＰＬ２変異型のアミノ酸配列を示す。
表５
【表５】
2019535254.tif 000011
【０２０９】
結合親和性および反応速度を、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いて測定した。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃを、まずセンサーチップ上に固定し、次いで抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体およびＰＬ２変異型をＲｍａｘ〜２５０ＲＵで捕捉した。実験は２５℃で行い、測定は、１９．１ｎＭ〜０．７１ｎＭのｈＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓの連続希釈液を捕捉した抗体にＨＢＳ−Ｐ＋緩衝液（０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを添加）中において２５μＬ／分の流速で通して行った。全てのデータは評価ソフトフェアで解析し、曲線を１：１ラングミュア結合モデルで適合させた。全てのデータは、２つの独立した実験を２回行った代表値である。
【０２１０】
表６は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって測定された抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体と比較したＰＬ２変異型の算出された親和性（ＫＤ）とともに、結合および解離反応速度を示す。全ての変異型、親ＰＬ２、および対照抗体は、この試験においてヒトＩｇＧ２骨格にクローン化した。対照抗ＰＤ−１抗体と比較したＰＬ２変異型の親和性の改善も、表６に示した。表６に示されるデータは、ＰＬ２変異型の中で、ＰＬ２＃３は、ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓに対して最も優れた結合親和性を有することを示す。表は、後の試験でＰＬ２＃３の異なるヒトＩｇＧアイソタイプ間の反応速度の比較に注目した結果を示す。ここで、ＰＬ２＃３の異なるアイソタイプは、ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓに対して同様の結合親和性を示した。
表６
【表６】
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表７
【表７】
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【０２１１】
実施例３
抗体ＰＬ３の抗ＰＤ−Ｌ１変異型の結合親和性および反応速度
抗体リード物質ＰＬ３をインビトロファージディスプレイに基づく親和性成熟実験で用いることにより、改善された結合能を有するさらなるクローンを作成した。まず、ＣＤＲ−Ｌ１／ＣＤＲ−Ｌ２／ＣＤＲ−Ｌ３／ＣＤＲ−Ｈ１／ＣＤＲ−Ｈ２／ＣＤＲ−Ｈ３（６個のＣＤＲに着目）核酸ライブラリーをＰＣＲにより作成し、ファージディスプレイベクターにクローン化し、次いでＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１またはＳＳ３２０細胞内に形質転換させて、ファージのライブラリーを作成した。ストレプトアビジンでコーティングした磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０に結合させたビオチン化ｈＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１１２０５Ｄ）で３回のパニング後、２０個のＦａｂクローンをＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、２個のＦａｂ（すなわち、＃１および＃７）が、親ＰＬ３より優れた結合能を有することを見出した。さらなる反応速度特性は、ＰＬ３＃１およびＰＬ３＃７の全長ＩｇＧを用いて表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により測定し、対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体と同等か、またはそれ以上の結合能を有することを見出した
【０２１２】
下記の表８は、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、およびＨ３領域に変異を有するＰＬ３変異型のアミノ酸配列を示す。表９は、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって測定された対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体と比較したＰＬ３変異型の算出された親和性（ＫＤ）とともに、結合および解離反応速度を示す。この結果はまた、ＰＬ３＃１およびＰＬ３＃７の異なるヒトＩｇＧアイソタイプ間の反応速度の比較を示した。対照抗ＰＤ−１抗体に対するＰＬ３変異型の親和性の改善も表９に示した。全てのデータは、データは、２つの独立した実験を２回行った代表値である。
【０２１３】
これらのデータは、ＰＬ３変異型の中で、ＰＬ３＃７が、ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓに対してわずかに高い結合親和性を示したことを表す。ＰＬ３＃７の異なるアイソタイプは、ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓに対して同様の結合親和性を示した。
表８
【表８】
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表９
【表９】
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【０２１４】
親ＰＬ３より著しく高い親和性を示したクローンＰＬ３＃７を、インビトロファージディスプレイに基づく親和性成熟実験にさらに用いて、改善した結合能を有するさらなるクローンを作成した。まず、ＣＤＲ−Ｌ１／ＣＤＲ−Ｌ２／ＣＤＲ−Ｌ３／ＣＤＲ−Ｈ２／ＣＤＲ−Ｈ３（ＣＤＲ−Ｈ１を固定し、５個のＣＤＲに着目）の核酸ライブラリーをＰＣＲにより作成し、ファージディスプレイベクターにクローン化し、次いでＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１またはＳＳ３２０細胞内に形質転換させて、ファージのライブラリーを作成した。ストレプトアビジンでコーティングした磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０に結合させたビオチン化ｈＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃１１２０５Ｄ）による３回のパニング後、５７個のＦａｂクローンをＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、３つのＦａｂ（すなわち、１９、４３、および５４）が、親ＰＬ３＃７より優れた結合能を有することを見出した。さらなる反応速度特性は、バイオレイヤー干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６）をＰＬ３＃７−１９、ＰＬ３＃７−４３、およびＰＬ３＃７−５４の全長ＩｇＧに用いることによって測定し、対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体と同等またはそれ以上の結合能を有することが見出された。
【０２１５】
下記の表１０は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ２、およびＨ３領域に変異を有するＰＬ３＃７変異型のアミノ酸配列を示す。
表１０
【表１０】
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【０２１６】
ＰＬ３＃７変異型の親和性および反応速度は、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）システムをストレプトアビジン（ＳＡ）センサーで２５℃と１０００ｒｐｍの攪拌速度にて使用するバイオレイヤー干渉法を用いることによって測定した。簡単に説明すると、黒色９６ウェルプレートは、親和性の決定に必要とされる試薬の２００μＬ／ウェルを含有するカラムとともに調製した。一般に、Ｏｃｔｅｔ ＳＡセンサーを、まず、１Ｘ反応速度緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ ＢＳＡ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）を含有するウェルに１８０秒間入れて、基準値を設定した。次いで、センサーを、１０μｇ／ｍＬのビオチン化ＰＬ３＃７変異型（抗体：ビオチンの１：１の割合（ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＮＨＳ−ＰＥＧ４−ビオチンを含有）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＃２１３２９）を含有するウェルに３００秒間移して、ＳＡでコーティングしたチップに載せた。続いて、センサーを、再生緩衝液（１０ｍＭ グリシン、ｐＨ１．５）中で３Ｘ５秒のインキュベーション、続いて１×反応速度緩衝液中で５秒のインキュベーションによってそれぞれ再生させた。再生は、各結合／解離サイクルの測定前に繰り返した。次に、センサーを新鮮な１×反応速度緩衝液に１８０秒間入れて、基準値を設定した。次いで、結合は、該センサーをｈＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓを含有するウェル中で５分間インキュベートし、続いて１×反応速度緩衝液を含有するウェルに１０分間移して解離を測定することによって測定した。反応速度（ｋａ、ｋｄ、およびＫＤ）は、３８．２８ｎＭ〜１．４２ｎＭのｈＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓの１：３連続希釈液から得られたデータの４回の結合／解離サイクル（１つの濃度につき１回の結合／解離サイクル）を、１:１のラングミュア結合モデルを用いて網羅的に適合させることによって測定した。全てのデータは、Ｏｃｔｅｔデータ解析ソフトウェアｖ．９．０で解析し、２つの独立した実験を２回行った代表値である。
【０２１７】
表１１は、バイオレイヤー干渉法を用いてＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６装置（米国、カリフォルニア州のＭｅｎｌｏ Ｐａｒｋ）により測定された対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体と比較したＰＬ３＃７変異型の算出された親和性（ＫＤ）とともに、結合および解離反応速度を示す。対照抗ＰＤ−１抗体に対するＰＬ３＃７変異型の親和性の改善も表１１に示した。全てのデータは、２つの独立した実験を２回行った代表値である。表１１に示されるデータは、ＰＬ３＃７−１９、ＰＬ３＃７−４３、およびＰＬ３＃７−５４が、親ＰＬ３＃７より優れた結合親和性を示したことを表す。
表１１
【表１１】
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【０２１８】
それゆえ、優れた高い親和性および優れた機能活性を有するＰＬ２トップ変異型（ＰＬ２＃３）、ＰＬ３トップ変異型（ＰＬ３＃７）、およびＰＬ３＃７トップ変異型（ＰＬ３＃７−１９、−４３、−５４）をインビトロファージディスプレイに基づく親和性成熟実験から作成した。一般に、３回のパニングを、ストレプトアビジンでコーティングした磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０に結合させたビオチン化ｈＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓを用いて行った。トップ変異型のＦａｂをＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ骨格のＮ２９７Ａ変異体にクローン化して、全長抗体とした。これらの抗ＰＤ−Ｌ１トップ変異型の軽鎖（ＬＣ）および重鎖（ＨＣ）のアミノ酸配列を図１１Ａ−１１Ｂに示す。これらの抗ＰＤ−Ｌ１トップ変異型のＬＣおよびＨＣにおける相補性決定領域（ＣＤＲ）を太い下線で示した。
【０２１９】
実施例４
抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組み換えヒトＰＤ−Ｌ１／Ｆｃ融合タンパク質および活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞への結合
ＥＬＩＳＡアッセイを行うことにより、選択された抗体の組み換えヒトＰＤ−Ｌ１／Ｆｃ融合タンパク質への結合を測定した。１ウェルあたり１５μｇのヒトＰＤ−Ｌ１／Ｆｃタンパク質を、９６ウェルＥＩＡマイクロプレートに４℃で終夜コーティングした。５％ スキムミルクでブロッキングし、連続希釈した抗体を加え、ＲＴで１時間インキュベートした。結合しなかった抗体を除去し、ウェルをＰＢＳＴで２回洗浄した。ＨＲＰが抱合された二次抗体をウェルに加え、インキュベートし、過剰な二次抗体を洗い流した。ＴＭＢをウェルに加え、インキュベートし、該反応を停止し、次いでＨＲＰ活性を、４５０ｎｍにおける吸光度の増加をモニターすることによって測定した。
【０２２０】
ヒトＴ細胞は、ＭａｇｎｉＳｏｒｔ（登録商標）ヒトＴ細胞豊富化（enrichment）キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＰＢＭＣから単離した。単離されたＴ細胞を５μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）により３日間活性化して、ＰＤ−Ｌ１発現を活性化した。活性化されたＴ細胞を収集し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（２％ ＦＢＳを含有））中でヒトＦｃブロッカー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに４℃で２０分間インキュベートした。抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の結合は、活性化されたＴ細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で連続希釈した抗体とインキュベートさせることによって測定した。前記細胞をフロー緩衝液で洗浄し、結合をＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ ＡＢ細胞で検出した。細胞はまた、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を開閉するためのマウス抗ヒトＣＤ３ ＰＥ−Ｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。フローサイトメトリー分析は、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）を用いて行った。
【０２２１】
それゆえ、選択された抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＥＬＩＳＡにより組み換えヒトＰＤ−Ｌ１タンパク質およびフローサイトメトリーにより活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞に対するそれらの結合について試験した。抗ＰＤ−Ｌ１対照および抗ＰＤ−１対照抗体をそれぞれ、陽性および陰性対照として用いた。図２Ａおよび２Ｂは、全ての選択された抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ヒトＰＤ−Ｌ１組み換えタンパク質およびＰＤ−Ｌ１発現Ｔ細胞の両方に結合することができることを示す。
【０２２２】
実施例５
抗ＰＤ−Ｌ１抗体によるＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合の阻害
ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ−Ｓ細胞をＦＡＣＳ緩衝液（４％ ＦＢＳを含有するＰＢＳ）中に懸濁した。様々な濃度の試験抗体を該細胞懸濁物（３．５×１０５細胞／ウェル）に加え、４℃で３０分間インキュベートした。結合しなかった抗体を洗い流し、ビオチンで標識したＰＤ−１−Ｆｃ融合タンパク質を加え、４℃で３０分間インキュベートした。該細胞を洗浄し、次いでストレプトアビジン−ＰＥで４℃にて３０分間染色した。フローサイトメトリー分析は、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）を用いて行った。
【０２２３】
選択された抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、フローサイトメトリーアッセイを用いて、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１発現ＣＨＯ−Ｓ細胞への結合を阻害する能力について試験した。抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体およびアバスチンをそれぞれ、陽性対照および陰性対照として用いた。図３に示されるデータは、染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定されるように、全ての選択された抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体が、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞への結合を阻害したことを示す。
【０２２４】
実施例６
混合白血球反応（ＭＬＲ）におけるサイトカイン産生およびＴ細胞増殖における抗ＰＤ−Ｌ１抗体の効果
混合白血球反応は、リンパ球エフェクター細胞に対するＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１経路の阻害効果を示すために用いた。このアッセイにおけるＴ細胞を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の存在または非存在における増殖およびＩＦＮ−ガンマまたはＩＬ−２分泌について試験した。
【０２２５】
ヒトＴ細胞は、Ｌｙｍｐｈｏ−ｋｗｉｋ Ｔ（Ｏｎｅ Ｌａｍｄａ，Ｉｎｃ．）を用いてＰＢＭＣから精製した。単離されたＴ細胞をＰＢＳ中に懸濁させ、１μＭのＣＦＳＥで室温にて１０分間標識した。細胞を完全培地（１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０）で洗浄し、ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を完全培地中に１×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁させた。
【０２２６】
同種樹状細胞は、ＰＢＭＣから作成した。単離されたＰＢＭＣを、２００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトＩＬ−３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と終夜インキュベートさせて、単球／マクロファージ集団をプレートに接着できるようにした。接着しなかったＴ細胞を除去し、プレートを完全培地で２回洗浄した。プレート上の細胞を、２００Ｕ／ｍＬのヒトＩＬ−４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および２００Ｕ／ｍＬのヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する完全培地中で６日間培養した。単球由来の樹状細胞を、ＴＮＦ−アルファ（１００Ｕ／ｍＬ）を６日目に培養物に加え、終夜インキュベートすることにより成熟させた。成熟させたＤＣをトリプシン処理し、収集し、続いて完全培地中に１×１０５細胞／ｍＬの濃度で懸濁させた。
【０２２７】
各反応物は、２００μｌの合計体積中に１０×１０５個のＣＦＳＥ標識Ｔ細胞および１０×１０４個の同種樹状細胞を含有した。抗体を異なる濃度で各培養に加えた。抗体なし、または抗ＶＥＧＦ抗体（アバスチン）のいずれかを陰性対照として用いた。抗ＰＤ−１対照または抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体を陽性対照として用いた。該細胞を３７℃で５日間培養した。５日目に、１００μｌの培地をサイトカイン測定のために各培養物から取得した。サイトカインのレベルは、ヒトＩＦＮ−γまたはＩＬ−２ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（登録商標）Ｄｅｌｕｘｅキット（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて測定した。該細胞を収集し、フローサイトメトリーによるＴ細胞の増殖について分析した。
【０２２８】
図４Ａ−４Ｂに示されるデータは、全ての選択された抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、ＩＦＮ−γ分泌を亢進し、混合白血球反応アッセイにおいてＴ細胞の増殖を促進することを示す。抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＰＤ−１対照抗体を陽性対照として用いた。アバスチン（抗ＶＥＧＦ）を陰性対照として用いた。図４Ａは、ＩＦＮ−γ分泌を示す棒グラフであり、図４Ｂは、示される濃度の抗体でＣＤ３＋Ｔ細胞増殖を示す棒グラフである。
【０２２９】
さらに、抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＬ２親抗体および変異型によって誘導されたＭＬＲにおけるＩＬ−２分泌を図６Ａに示し、示される濃度の抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＬ３親抗体および変異型によって誘導されたＭＬＲにおけるＩＬ−２分泌を図６Ｂに示す。これらのデータは、選択されたＰＬ２変異型ＰＬ２−３／３（ＰＬ２＃３）およびＰＬ３変異型（ＰＬ３＃７）が、Ｔ細胞活性化を刺激する際に親抗体より優れた有効性を示したことを示す。
【０２３０】
さらに、混合白血球反応（ＭＬＲ）における異なるＩｇＧ型の抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＬ２＃３、ＰＬ３＃７、およびＰＬ３＃７変異型の効果を図８Ａ−８Ｄおよび図１２Ａ−１２Ｂに示す。これらの抗ＰＤ−Ｌ１抗体によって誘導された分泌ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２を示す棒グラフを図８Ａ、８Ｂ、および１２Ａに示す。図８Ｃは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ｌ２＃３、ＰＬ３＃７の様々な濃度でのＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を示す棒グラフであり、図８Ｄおよび１２Ｂは、これらの３つの抗ＰＤ−Ｌ１抗体の示される濃度でのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示す棒グラフである。図１２Ａおよび１２Ｂは、特に、抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＬ３＃７変異型、例えば、ＰＬ３＃７−１９、−４３、および−５４が、ＩＦＮ−γ分泌およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の亢進における優れた活性を示したことを示す。
【０２３１】
実施例７
Ａ３７５／抗原特異的Ｔ細胞異種移植モデルにおけるＰＬ２およびＰＬ３抗ＰＤ−Ｌ１抗体の腫瘍増殖阻害活性
抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体のインビボ活性は、易感染性ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病性／重症複合免疫不全）マウスを用いて異種移植マウスモデルで調べた。該マウスに、ヒト癌細胞株（ヒトＰＤ−Ｌ１を発現する）およびヒトＰＢＭＣまたは抗原特異的Ｔ細胞を皮下に移植した。抗体の腹腔内用量を、ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５またはヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２を接種したマウスに与えた。前記抗体の効果は、２０００ｍｍ３の腫瘍体積または肉眼的腫瘍壊死まで腫瘍増殖を観察した。
【０２３２】
抗原特異的Ｔ細胞を作成するために、Ｔ細胞をＭａｇｎｉＳｏｒｔ（登録商標）ヒトＴ細胞豊富化キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて健常なドナーのＰＢＭＣから分離した。単離されたＴ細胞をマイトマイシンＣで処理したＡ３７５細胞およびｒｈＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍＬ）と１０〜１４日間共培養して、抗原特異的Ｔ細胞を増殖させた。ヒトＰＢＭＣは、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、健常なドナーの全血から単離させた。
【０２３３】
Ａ３７５および抗原特異的Ｔ細胞を、示されるエフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）比での皮下投与直前に混合した。ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞を、示されるＥ：Ｔ比で新鮮なヒトＰＢＭＣと混合し、マウスの皮下に接種した。試験品の最初の用量を、癌／エフェクター細胞の移植２時間後に腹腔内に投与した。マウスを抗体で３〜５週間にわたり１週間に２回処理した。腫瘍の形成は、各動物において１週間に２回観察した。腫瘍をキャリパーにより測定しし；腫瘍体積（Ｖ）は、下記式を用いて算出した：
Ｖ（ｍｍ３）＝０．５（長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）／２）。
【０２３４】
該マウス（ｎ＝４／群）に、ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５および抗原特異的Ｔ細胞の混合物（Ｔ細胞：癌細胞＝１：１００）を皮下に移植した。試験抗体を、マウスの腹腔内に０日目から１週間に２回注入した。全ての抗ＰＤ−Ｌ１リード物質のインビボ有効性をＡ３７５／抗原特異的Ｔ細胞異種移植モデルにおいて試験した。ＰＬ２およびＰＬ３で処理したマウスの腫瘍増殖曲線を図５Ａおよび５Ｂに示す。該データは、ＰＬ２およびＰＬ３が、インビボでＡ３７５腫瘍増殖を著しく阻害することができたことを示す。
【０２３５】
さらに、Ａ３７５／抗原特異的Ｔ細胞異種移植モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＬ２およびＰＬ３トップ変異型の腫瘍増殖阻害活性を図７Ａおよび７Ｂに示す。該データは、ＰＬ２＃３ ＩｇＧ２が、３０ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇの用量でＡ３７５腫瘍増殖を阻害し、ＰＬ３＃７ ＩｇＧ２が、３０ｍｇ／ｋｇの用量でのみＡ３７５の増殖を阻害したことを示す。
【０２３６】
さらに、Ａ３７５／抗原特異的Ｔ細胞異種移植モデルにおける様々なＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７ ＩｇＧアイソタイプの腫瘍増殖阻害活性を図９Ａ（ＰＬ２＃３）および９Ｂ（ＰＬ３＃７）に示す。該データは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＬ２＃３の変異ＩｇＧ１およびＩｇＧ４型が、２０ｍｇ／ｋｇの用量でより優れた抗腫瘍効果を示したことを示す。抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＬ３＃７の野生型ＩｇＧ１、変異ＩｇＧ１およびＩｇＧ２は、３０ｍｇ／ｋｇの用量でＡ３７５腫瘍増殖を阻害した。これらのデータに基づいて、変異体ＩｇＧ（Ｎ２９７Ａ）をＦｃ骨格として選択した。
【０２３７】
Ａ３７５／抗原特異的Ｔ細胞異種移植モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７の変異体の腫瘍増殖阻害活性を図１５Ａ−１５Ｂに示す。該マウス（ｎ＝４／群）に、ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５および抗原特異的Ｔ細胞の混合物（Ｔ細胞（Ｅ）：癌細胞（Ｔ）＝１：１００）を皮下に移植した。ＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７の試験抗体変異体を、マウスの腹腔内に０日目から１週間に２回注入した。ｍＡｂで処理したマウスの腫瘍増殖曲線を図１５Ａに示した。３１日目における各腫瘍体積を図１５Ｂに示した。該データは、ＰＬ２＃３ ｍｔＩｇＧ１が、Ａ３７５（メラノーマ）／抗原特異的Ｔ細胞モデルにおいて２０ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇで抗腫瘍活性を示し；ＰＬ３＃７−４３が、２０ｍｇ／ｋｇの用量で優れた抗腫瘍活性を示したことを示す。
【０２３８】
実施例８
ｈＰＤ１ ＫＩマウスにおける変異体抗ＰＤ−Ｌ１抗体の腫瘍増殖阻害活性
抗ヒトＰＤ−１抗体のインビボ活性は、ヒトＰＤ−１ノックインＣ５７ＢＬ／６マウス（ｈＰＤ１ ＫＩマウス）において調べた。該マウスに、ヒトＰＤ−Ｌ１をトランスフェクトしたマウスＭＣ３８癌細胞を皮下に接種した（１匹のマウスあたり５Ｘ１０５個の細胞）。抗体処理は、腫瘍体積が約８６ｍｍ３に達したときに開始した。６匹の動物を処理前に各実験群に割り当てた。該動物は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投薬を３週間にわたり１週間に２回受けた。腫瘍の形成は、各動物において１週間に２回観察した。腫瘍をキャリパーにより測定し、腫瘍体積（Ｖ）を下記の式を用いて算出した：
Ｖ（ｍｍ３）＝０．５（長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）／２）。
【０２３９】
ヒトＰＤ−１ノックイン（ｈＰＤ１ＫＩ）マウス（ｎ＝６／群）に、ＭＣ３８−ｈｕＰＤ−Ｌ１（ヒトＰＤ−Ｌ１でトランスフェクトしたＭＣ３８）細胞を皮下に移植した。抗体処理は、腫瘍体積が約８６ｍｍ３に達したときに開始した。試験抗体（ＰＬ２＃３−ｍｔＩｇＧ１およびＰＬ３＃７−ｍｔＩｇＧ１）を、マウスの腹腔内に３週間にわたり１週間に２回注入した。図１０に示されるデータは、ＰＬ２＃３−ｍｔＩｇＧ１およびＰＬ３＃７−ｍｔＩｇＧ１の抗腫瘍活性が、抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体と同等であるアテゾリズマブ類似体の抗腫瘍活性に相当することを示す。
【０２４０】
実施例９
抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＰＤ−Ｌ１発現細胞の細胞表面への結合
ヒトＴ細胞は、ＭａｇｎｉＳｏｒｔ（登録商標）ヒトＴ細胞豊富化キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、ＰＢＭＣから単離した。単離したＴ細胞を５μｇ／ｍＬのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）により６日間活性化して、ＰＤ−Ｌ１発現を活性化した。活性化Ｔ細胞を収集し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（２％ ＦＢＳを含有））中でヒトＦｃブロッカー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と４℃で２０分間インキュベートした。ブロッキング試薬を除去し、Ｔ細胞を染色工程のためにＦＡＣＳ緩衝液中に懸濁させた。腫瘍細胞（Ａ３７５およびＮＣＩ−Ｈ２９２）を培養プレートから細胞をトリプシン処理することにより採取し、細胞染色のためにＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。
【０２４１】
抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の結合は、該細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ（２％ ＦＢＳを含有））中の連続希釈した抗ＰＤ−１モノクローナル抗体とインキュベートさせることにより評価した。該細胞をフロー緩衝液で洗浄し、結合をビオチン標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ Ａｂおよびストレプトアビジン−ＰＥで検出した。フローサイトメトリー分析は、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）を用いて行った。
【０２４２】
図１３Ａ−１３Ｃは、ＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７変異型のＰＤ−Ｌ１発現細胞の細胞表面：活性化Ｔ細胞（図１３Ａ）、Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞株（図１３Ｂ）、およびＮＣＩ−Ｈ２９２ヒトＮＳＣＬＣ細胞株（図１３Ｃ）への結合を示す。抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体およびＨＬＸ０１（抗ＣＤ２０ ｍＡｂ）をそれぞれ、陽性対照および陰性対照として用いた。活性化Ｔ細胞に対する結合活性の順位は：ＰＬ２＃３ ｍｔＩｇＧ１＞ＰＬ３＃７−５４ ｍｔＩｇＧ１＞ＰＬ３＃７−４３ ｍｔＩｇＧ１＞ＰＬ３＃７−１９ ｍｔＩｇＧ１である。Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞に対する結合活性の順位は：ＰＬ３＃７−５４ ｍｔＩｇＧ１＝ＰＬ２＃３ ｍｔＩｇＧ１＞ＰＬ３＃７−４３ ｍｔＩｇＧ１＞ＰＬ３＃７−１９ ｍｔＩｇＧ１である。ＮＣＩ−Ｈ２９２ヒトＮＳＣＬＣ細胞に対する結合活性の順位は：ＰＬ３＃７−５４ ｍｔＩｇＧ１≧ＰＬ２＃３ ｍｔＩｇＧ１＝ＰＬ３＃７−４３ ｍｔＩｇＧ１≧ＰＬ３＃７−１９ ｍｔＩｇＧ１である。これらのデータは、全てのＰＬ３＃７変異型およびＰＬ２＃３がＰＤ−Ｌ１発現細胞の表面に結合すると結論付ける。
【０２４３】
実施例１０
ＮＣＩ−Ｈ２９２／ＰＢＭＣ異種移植モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型の腫瘍増殖阻害活性
抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体のインビボ活性は、易感染性ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病性／重症複合免疫不全）マウスを用いて異種移植マウスモデルで調べた。癌細胞および単離されたヒトＰＢＭＣは、示されるエフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）比での皮下投与直前に混合した。各マウスに癌細胞およびヒトＰＢＭＣの混合物を両側に接種した。試験品の最初の用量は、癌／エフェクター細胞の移植２時間後に腹腔内に投与した。該動物は、試験抗体の投薬を１週間に２回で３〜４週間にわたり受容した。腫瘍の形成は各動物において１週間に２回観察した。腫瘍をキャリパーにより測定し、腫瘍体積（Ｖ）を下記の式を用いて算出した：
Ｖ（ｍｍ３）＝０．５（長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）／２）。
【０２４４】
マウス（ｎ＝４／群）に、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２および新たに単離したヒトＰＢＭＣの混合物（癌細胞（Ｔ）：ＰＢＭＣ（Ｅ）＝３：１）を皮下に移植した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、マウスの腹腔内に０日目から１週間に２回注入した。腫瘍増殖曲線を図１４Ａで示した。２８日目における各腫瘍体積を図１４Ｂに示した。これらのデータは、全ての試験抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型が、エフェクター細胞（ｈＰＢＭＣ）を加えると腫瘍増殖を阻害することを示す。変異型ＰＬ２＃３、ＰＬ３＃７−１９、およびＰＬ３＃７−４３は、ＰＬ３＃７−５４変異型および対照抗ＰＤ−Ｌ１抗体より優れている同様のインビボ腫瘍増殖阻害効果を示す。抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂの抗癌効果は、免疫細胞を介在するものであった。
【０２４５】
実施例１１
抗ヒトＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体のマウスメラノーマ細胞への交差結合
抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の結合は、Ａ３７５メラノーマ細胞（１．５×１０５細胞／試験）をＦＡＣＳ緩衝液中で連続希釈した抗体とインキュベートすることによって評価した。該細胞をフロー緩衝液で洗浄し、結合は、ＦＩＴＣ標識ウサギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ Ａｂで検出した。フローサイトメトリー分析は、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ ＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）を用いて行った。
【０２４６】
ＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７変異型は、フローサイトメトリーにより、マウスＰＤ−Ｌ１発現メラノーマ細胞（Ｂ１６−Ｆ１０）への結合について試験した。抗ＰＤ−Ｌ１対照抗体をそれぞれ、陽性対照および陰性対照として用いた。図１６に示されるデータは、ＰＬ３＃７−４３およびＰＬ３＃７−５４変異型がマウスＰＤ−Ｌ１に交差結合するが、ＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７−１９変異型は、マウスメラノーマ細胞とほとんど交差反応性を示さないことを示す。
【０２４７】
実施例１２
抗ＰＤ−Ｌ１変異型のカニクイザルＰＤ−Ｌ１交差結合
組み換えカニクイザルＰＤ−Ｌ１＿ＥＣＤ Ｆｃ−融合タンパク質は、Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．から購入した。ＰＤ−Ｌ１＿ＥＣＤ／Ｆｃ（１ウェルあたり９ｎｇ）を、４℃で終夜インキュベートすることによって９６ウェルアッセイプレート上に固定した。非特異的結合部位は、ＰＢＳ中の５％ スキムミルクを用いて室温で１時間ブロックさせた。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、示される濃度の抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびＨＬＸ０１（陰性対照）を固定させたタンパク質と室温で１時間インキュベートした。該プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、続いてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ）’２（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ＰＢＳ中で１／１０，０００に希釈）と室温で１時間インキュベートした。洗浄後、プレートを、ＴＭＢ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて発色させた。吸光度は、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により４５０ｎｍの波長で読み取った。
【０２４８】
ＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７変異型は、ＥＬＩＳＡにより、組み換えカニクイザルＰＤ−Ｌ１＿ＥＣＤ Ｆｃ−融合タンパク質への結合について試験した。ＨＬＸ０１（抗ＣＤ２０ ｍＡｂ）を陰性対照として用いた。図１７で示されるデータは、ＰＬ２＃３およびＰＬ３＃７変異型がカニクイザルＰＤ−Ｌ１と交差反応することを示す。
【０２４９】
実施例１３
脱グリコシル化されたＰＬ３＃７−１９変異型およびＰＬ３＃７−４３変異型の構築
ＰＬ３＃７−１９およびＰＬ３＃７−４３は、ＰＬ３＃７に由来する２つのリード変異型であったが、Ｌ−ＣＤＲ２領域内の望ましくないＮ−グリコシル化部位を取り除くためにさらなる変異誘発をかけることが必要である。Ｎ−グリコシル化はシークオンＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔで生じる。親ＰＬ３＃７−１９およびＰＬ３＃７−４３におけるＮ−グリコシル化部位がＮ−Ｓ−ＴおよびＮ−Ｒ−Ｓとしてコードされていたことから、ＰＬ３＃７において第２のＳ／ＴをＮから同一または類似のアミノ酸に変異させること、すなわち、ＰＬ３＃７−１９およびＰＬ３＃７−４３についてＮ−Ｓ−ＴおよびＮ−Ｒ−ＳをＮ−Ｓ−Ｎ／ＱおよびＮ−Ｒ−Ｐにそれぞれ変異させること（すなわち、ＰＬ３＃７−１９脱グリコ１、脱グリコ３、およびＰＬ３＃７−４３脱グリコ１）、あるいはＮ−Ｘ−Ｓ／ＴシークオンについてＮからＱに直接変異させること、すなわち、ＰＬ３＃７−１９およびＰＬ３＃７−４３についてＮ−Ｓ−ＴおよびＮ−Ｒ−ＳをＱ−Ｓ−ＴおよびＱ−Ｒ−Ｓにそれぞれ変異させること（すなわち、ＰＬ３＃７−１９脱グリコ２およびＰＬ３＃７−４３脱グリコ２）のいずれかによって操作した。その後、Ｌ−ＣＤＲ２におけるＮ−グリコシル化部位の除去を液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（データは示さず）。
【０２５０】
ＰＬ３＃７−１９変異型およびＰＬ３＃７−４３変異型の脱グリコシル化バージョンの軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図１８に示す。これらの脱グリコシル化変異型の軽鎖の配列を記載し、ＣＤＲ（相補性決定領域）を太い下線で示した。それらの重鎖は、変更せず、それらの親変異型と同一であった（配列は示さず）。これらの脱グリコシル化変異型のヒトＰＤ−Ｌ１に対する結合活性は、後の実験でフローサイトメトリーおよびＯｃｔｅｔを用いて調べた。
【０２５１】
実施例１４
脱グリコシル化ＰＬ３＃７−１９変異型およびＰＬ３＃７−４３変異型の全細胞結合
試験脱グリコシル化変異型の結合は、ＰＤ−Ｌ１発現ＣＨＯ−Ｓ細胞（２×１０５細胞／ウェル）を、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ ＦＢＳを含有するＰＢＳ）中で連続希釈した抗体と４℃で３０分間インキュベートすることにより評価した。これらの細胞をフロー緩衝液で洗浄し、次いで抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ−ＦＩＴＣ（１：５００ｘ）で４℃にて３０分間染色して、細胞表面上の抗体結合を検出した。フローサイトメトリー分析は、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｃ．）を用いて行った。
【０２５２】
ＰＬ３＃７−１９変異型およびＰＬ３＃７−４３変異型の脱グリコシル化バージョンの全細胞結合を図１９（Ａ）および（Ｂ）に示す。ＰＬ３＃７−１９およびＰＬ３＃７−４３は、２つのリード変異型であったが、Ｌ−ＣＤＲ２領域内の望ましくないＮ−グリコシル化部位を取り除くために改変が必要である（上記実施例１３を参照のこと）。生じたＰＬ３＃７−１９についての３つの脱グリコシル化変異型（すなわち、ＰＬ３＃７−１９脱グリコ１、脱グリコ２、脱グリコ３）およびＰＬ３＃７−４３についての２つの脱グリコシル化変異型（すなわち、ＰＬ３＃７−４３脱グリコ１、脱グリコ２）のＰＤ−Ｌ１トランスフェクトＣＨＯ−Ｓ細胞に対する全細胞結合活性をフローサイトメトリーで調べた。ここで試験した全ての脱グリコシル化抗体変異型は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ骨格のＮ２９７Ａ変異体中に存在した。内在性抗ＰＤ−１抗体（すなわち、ＨＬＸ１０）を陰性対照として用いた。
【０２５３】
図１９（Ａ）および（Ｂ）に示されるデータは、脱グリコシル化されたＰＬ３＃７−１９およびＰＬ３＃７−４３変異型の全細胞結合活性がＬ−ＣＤＲ２領域内のＮ−グリコシル化部位の除去によって影響を受けなかったことを示す。
【０２５４】
実施例１５
混合白血球反応におけるＰＬ３＃７−１９脱グリコ１およびＰＬ３＃７−４３脱グリコ２のＩｇＧアイソタイプ
ＰＬ３＃７−１９脱グリコ１およびＰＬ３＃７−４３脱グリコ２の異なるＩｇＧアイソタイプの有効性を、混合白血球反応（ＭＬＲ）アッセイを用いて試験し、これらの結果を図２０（Ａ）および（Ｂ）に示した。ＨＬＸ０４およびＨＬＸ２０（ＰＬ２＃３）をそれぞれ、陰性および陽性対照抗体として用いた。棒グラフは、試験抗体によって誘導された分泌ＩＦＮ−γ（図２０Ａ）およびＩＬ−２（図２０Ｂ）を示す。
【０２５５】
グリコシル化されたＰＬ３＃７−１９ ｍｔＩｇＧ１およびＰＬ３＃７−４３ ｍｔＩｇＧ１と同様に、脱グリコシル化されたＰＬ３＃７−１９およびＰＬ３＃７−４３のｍｔＩｇＧ１およびＩｇＧ４アイソタイプは、ＭＬＲにおいてサイトカイン分泌を著しく高める。ＰＬ３＃７−１９脱グリコ１およびＰＬ３＃７−４３脱グリコ１の野生型ＩｇＧ１は、サイトカイン放出の低い亢進を示したが、これは、Ｔ細胞における野生型ＩｇＧ１の潜在的なＡＤＣＣ効果によるものと考えられる。
【０２５６】
実施例１６
Ａ３７５／抗原特異的Ｔ細胞異種移植モデルにおける脱グリコシル化されたＰＬ３＃７−１９およびＰＬ３＃７−４３変異型の腫瘍増殖阻害活性
マウス（ｎ＝５／群）に、ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５および抗原特異的Ｔ細胞の混合物（Ｔ細胞：癌細胞＝１：１００）を皮下に移植した。試験抗体を、マウスの腹腔内に０日目から１週間に２回注入した。脱グリコシル化されたＰＬ３＃７−１９およびＰＬ３＃７−４３変異型で処理したマウスの腫瘍増殖をそれぞれ、図２１Ａおよび２１Ｃに示した。２８日目における各腫瘍体積をそれぞれ、図２１Ｂおよび２１Ｄに示した。全てのデータ点は、平均±ＳＥＭである。
【０２５７】
これらの図に示されるデータは、ＰＬ３＃７−１９ 脱グリコ１ ｍｔＩｇＧ１およびＩｇＧ４変異型、ならびにＰＬ３＃７−４３ 脱グリコ２ ｗｔＩｇＧ１の抗腫瘍効果が、Ａ３７５／抗原特異的Ｔ細胞異種移植モデルにおけるＨＬＸ２０（ＰＬ２＃３）のものに相当したことを示す。
【０２５８】
実施例１７
ＮＳＣＬＣ異種移植マウスモデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂの抗ＶＥＧＦ ｍＡｂとの腫瘍増殖阻害活性
抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体のインビボ活性は、易感染性ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病性／重症複合免疫不全）マウスを用いて異種移植マウスモデルで調べた。癌細胞および単離されたヒトＰＢＭＣは、示されるエフェクターと標的（Ｅ：Ｔ）比で皮下投与直前に混合した。各マウスに、癌細胞およびヒトＰＢＭＣの混合物を両側に接種した。４匹の動物を各実験群に割り当てた。試験品の最初の用量を、癌／エフェクター細胞の移植後１日目に腹腔内に投与した。該動物は、試験品の用量を１週間に２回で３−４週間受容した。腫瘍の形成を各動物において１週間に２回観察した。腫瘍をキャリパーにより測定し、腫瘍体積（Ｖ）を下記の式を用いて算出した：
Ｖ（ｍｍ３）＝０．５（長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）×幅（ｍｍ）／２）。
【０２５９】
マウス（ｎ＝５／群）に、ヒトＮＳＣＬＣ細胞ＮＣＩ−Ｈ２９２および新たに単離されたヒトＰＢＭＣの混合物（癌細胞：ＰＢＭＣ＝３：１）を皮下に移植した。抗ＰＤ−Ｌ１（ＰＬ２＃３）および抗ＶＥＧＦ（ＨＬＸ０４）抗体を、マウスの腹腔内に１日目から１週間に２回注入した。腫瘍増殖曲線を図２２Ａに示した。２１日目における各腫瘍体積を図２２Ｂに示した。全てのデータ点は、平均±ＳＥＭである。
【０２６０】
これらのデータは、抗ＶＥＧＦ ｍＡｂ（ＨＬＸ０４）と組み合わせた抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂ（ＰＬ２＃３）が、いずれの薬剤を単独で用いるよりＮＣＩ−Ｈ２９２異種移植の腫瘍増殖を効果的に抑制することを示す。
【０２６１】
実施例１８
脱グリコシル化されたＰＬ３＃７−１９およびＰＬ３＃７−４３変異型の平衡解離定数（ＫＤ）の決定
Ｎ−グリコシル化は、シークオンＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔで生じる。それゆえ、親ＰＬ３＃７−１９およびＰＬ３＃７−４３におけるＮ−グリコシル化部位はＬ−ＣＤＲ２に位置した。Ｎ−グリコシル化部位の除去は、ＰＬ３＃７と同一または類似するアミノ酸に変異させること（すなわち、ＰＬ３＃７−１９脱グリコ１、脱グリコ３、およびＰＬ３＃７−４３脱グリコ１）、またはグリコシル化されたＮをＱ（すなわち、ＰＬ３＃７−１９脱グリコ２およびＰＬ３＃７−４３脱グリコ２）に直接変異させることによって行った。Ｎ−グリコシル化を除去するために操作したＬ−ＣＤＲ２を除いて、脱グリコシル化変異型のＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３領域は変化させないままにした。ここで試験した全ての脱グリコシル化変異型をヒトＩｇＧ１Ｆｃ骨格のＮ２９７Ａ変異体にクローン化して、親ＰＬ３＃７−１９およびＰＬ３＃７−４３変異型と対照比較した。
【０２６２】
脱グリコシル化された抗ＰＤ−Ｌ１変異型（すなわち、ＰＬ３＃７−１９脱グリコ１、脱グリコ２、脱グリコ３およびＰＬ３＃７−４３脱グリコ１、脱グリコ２）の親和性および反応速度は、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）システムをＡＨＣ抗ヒト−Ｆｃ捕捉センサーで２５℃および１０００ｒｐｍの攪拌速度にて使用するバイオレイヤー干渉法によって測定した。簡単に説明すると、黒色９６ウェルプレートは、親和性の決定に必要な試薬の２００μＬ／ウェルを含有するカラムで調製した。一般に、Ｏｃｔｅｔ 抗ヒト−Ｆｃセンサーを、まず、１×反応速度緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ ＢＳＡ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）を含有するウェルに１８０秒間入れて、基準値を設定した。次いで、センサーを、１０μｇ／ｍＬの抗ＰＤ−Ｌ１変異型を含有するウェルに６００秒間移して、抗ヒト−Ｆｃチップを載せた。続いて、センサーを新鮮な１×反応速度緩衝液に１８０秒間入れて、基準値を設定した。結合は、センサーを、ｈＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓを含有するウェルで３分間インキュベートし、次いで１×反応速度緩衝液を含有するウェルに１０分間移して、解離を測定することによって測定した。次に、センサーを再生緩衝液（１０ｍＭ グリシン、ｐＨ１．５）中で３×５秒インキュベートし、続いて１×反応速度緩衝液中で５秒インキュベートすることによって再生させた。再生は、各結合／解離サイクルの測定前に繰り返した。反応速度（ｋａ、ｋｄ、およびＫＤ）は、２１．３ｎＭ〜０．７９ｎＭのｈＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓの１：３連続希釈液から得られたデータの４回の結合／解離サイクル（１つの濃度につき１回の結合／解離サイクル）を、１：１ラングミュア結合モデルを用いて網羅的に適合させることによって測定した。全てのデータは、Ｏｃｔｅｔデータ解析ソフトウェアｖ．９．０で解析し、２つの独立した実験を２回行った代表値である。
【０２６３】
表１２は、バイオレイヤー干渉法を用いるＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６装置（米国、カリフォルニア州のメンローパーク）によって測定された脱グリコシル化変異型の結合、解離反応速度および算出された親和性（ＫＤ）を示す。脱グリコシル化変異型対親変異型（Ｌ−ＣＤＲ２にＮ−グリコシル化部位を有する）の親和性における倍差も、表１２に示す。全てのデータは、２つの独立した実験を２回行った代表値である。これらのデータは、脱グリコシル化変異型が、親ＰＬ３＃７−１９およびＰＬ３＃７−４３と非常に類似する結合親和性を示したことを示す。親和性は、Ｌ−ＣＤＲ２内のＮ−グリコシル化の除去によって影響を受けなかった。
表１２
【表１２】
2019535254.tif 000018
【０２６４】
前記実施例は、例示のためだけに提示されるものであって、いずれの形でも本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本発明の様々な改変は、本明細書に示され、記載されるものに加えて、前記明細書から当業者にとって明らかであり、本願の特許請求の範囲内である。
【０２６５】
実施態様の記載
本発明によって供される実施態様として、下記に限定されないが、下記が挙げられる:
１．（１）配列番号：３５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：５９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＬ１）。
【０２６６】
２．（１）配列番号：３６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＬ２）。
【０２６７】
３．（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＬ３）。
【０２６８】
４．（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＬ６）。
【０２６９】
５．（１）配列番号：３８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＬ８）。
【０２７０】
６．（１）配列番号：３９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：４９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＬ１２）。
【０２７１】
７．（１）配列番号：４０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：５０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：６１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ＰＬ１５）。
【０２７２】
８．（１）配列番号：６５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：７１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ２＃３）。
【０２７３】
９．（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：７８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ３＃７）。
【０２７４】
１０．（１）配列番号：６６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：６８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７３で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：７９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ３＃７−１９）。
【０２７５】
１１．（１）配列番号：３５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：６９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：８０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ３＃７−４３）。
【０２７６】
１２．（１）配列番号：６７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：７０で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：７２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：７５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：７６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：８１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ３＃７−５４）。
【０２７７】
１３．（１）配列番号：９４で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：９５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：９６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ２＃４）。
【０２７８】
１４．（１）配列番号：９７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：９８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：９９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ２＃５）。
【０２７９】
１５．（１）配列番号：１００で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：４２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：９５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：５２で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：１０１で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ２＃３９）。
【０２８０】
１６．（１）配列番号：３７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（２）配列番号：１０６で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；および（３）配列番号：１０７で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、軽鎖（ＬＣ）可変領域配列、ならびに（１）配列番号：１０８で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（２）配列番号：５５で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；および（３）配列番号：１０９で示されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、重鎖（ＨＣ）可変領域配列を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型（ＰＬ３＃１）。
【０２８１】
１７．前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体 変異型が、Ｎ−グリコシル化部位に１つまたはそれ以上の変異を含むＣＤＲ−Ｌ２を含む、実施態様１０に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型。
【０２８２】
１８．前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型が、Ｎ−グリコシル化部位に１つまたはそれ以上の変異を含むＣＤＲ−Ｌ２を含む、実施態様１１に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体変異型。
【０２８３】
１９．前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｖフラグメント、二特異性抗体、およびリニア抗体からなる群から選択される、実施態様１〜１８のいずれか１項に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメント。
【０２８４】
２０．前記抗体が、多特異性抗体である、実施態様１〜１９のいずれか１項に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその変異型、またはこれらの抗原結合フラグメント。
【０２８５】
２１．治療薬に抱合された、実施態様１〜２０のいずれか１項に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメント。
【０２８６】
２２．標識に抱合された、実施態様１〜２０のいずれか１項に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメント。
【０２８７】
２３．前記標識が、ラジオアイソトープ、蛍光色素、および酵素からなる群から選択される、実施態様２２に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメント。
【０２８８】
２４．実施態様１〜１９のいずれか１項に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸分子。
【０２８９】
２５．実施態様２４に記載の核酸分子をコードする、発現ベクター。
【０２９０】
２６．実施態様２５に記載の発現ベクターを含む、細胞。
【０２９１】
２７．抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメントの調製方法であって、実施態様２６に記載の細胞を培養し、次いで前記抗体を前記細胞培養物から回収することを含む、方法。
【０２９２】
２８．実施態様１〜２３のいずれか１つに記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメント、および医薬的に許容される担体を含む、組成物。
【０２９３】
２９．患者由来の試料におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質の検出方法であって、実施態様１〜２０のいずれか１つに記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメントを前記試料に接触させ、次いでＰＤ−Ｌ１タンパク質に結合した抗ＰＤ−Ｌ１抗体を検出することによる、方法。
【０２９４】
３０．前記抗ＰＤ−１抗体、その変異型、またはこれらの抗原結合フラグメントが、免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）またはＥＬＩＳＡアッセイで用いられる、実施態様２９に記載の方法。
【０２９５】
３１．有効な量の実施態様２８に記載の組成物を前記対象に投与することを特徴とする、対象における癌の治療方法。
【０２９６】
３２．前記癌が、メラノーマ、ＮＳＣＬＣ、頭頚部癌、尿路上皮癌、三種陰性乳癌（ＴＮＢＣ）、胃癌、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、非ホジキンリンパ腫 縦隔原発Ｂ細胞性大細胞型リンパ腫（ＮＨＬ ＰＭＢＣＬ）、中皮腫、卵巣癌、肺癌、食道癌、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、胆道癌、結腸直腸癌、乳癌、子宮頸癌、甲状腺癌、および唾液腺癌からなる群から選択される、実施態様３１に記載の方法。
【０２９７】
３３．前記対象が、抗悪性腫瘍薬、化学療法剤、増殖抑制剤、および細胞傷害性薬物からなる群から選択される治療薬をさらに投与される、実施態様３２に記載の方法。
【０２９８】
３４．前記対象が、放射線療法をさらに投与される、実施態様３２に記載の方法。
【０２９９】
配列表
配列番号：１（ＰＬ１＿ＬＣ  ＡＡ配列、図１Ａを参照）
配列番号：２（ＰＬ２＿ＬＣ  ＡＡ配列、図１Ａを参照）
配列番号：３（ＰＬ３＿ＬＣ  ＡＡ配列、図１Ａを参照）
配列番号：４（ＰＬ６＿ＬＣ  ＡＡ配列、図１Ａを参照）
配列番号：５（ＰＬ８＿ＬＣ  ＡＡ配列、図１Ａを参照）
配列番号：６（ＰＬ１２＿ＬＣ  ＡＡ配列、図１Ａを参照）
配列番号：７（ＰＬ１５＿ＬＣ  ＡＡ配列、図１Ａを参照）
配列番号：８（ＰＬ１＿ＨＣ  ＡＡ配列、図１Ｂを参照）
配列番号：９（ＰＬ２＿ＨＣ  ＡＡ配列、図１Ｂを参照）
配列番号：１０（ＰＬ３＿ＨＣ  ＡＡ配列、図１Ｂを参照）
配列番号：１１（ＰＬ６＿ＨＣ  ＡＡ配列、図１Ｂを参照）
配列番号：１２（ＰＬ８＿ＨＣ  ＡＡ配列、図１Ｂを参照）
配列番号：１３（ＰＬ１２＿ＨＣ  ＡＡ配列、図１Ｂを参照）
配列番号：１４（ＰＬ１５＿ＨＣ  ＡＡ配列、図１Ｂを参照）
配列番号：１５（ＰＬ２＃３＿ＶＬ  ｎｔ配列）
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAATGTCAGCGGCCCCAGGACAGAGAGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCTACATTGAAAGTTCTTACGTCGGGTGGTACCAGCAACTCCCAGGAACAGCCCCCAGACTCCTCATTTATGACGATGATATGCGACCCTCAGGGATCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGCCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGAGATATGGCGGAGCGGCCTGGGAGGCGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
配列番号：１６（ＰＬ２＃３＿ＶＬ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））QSVVTQPPSMSAAPGQRVTISCSGSSSYIESSYVGWYQQLPGTAPRLLIYDDDMRPSGIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQTGDEADYYCEIWRSGLGGVFGGGTKLTVL
配列番号：１７（ＰＬ２＃３＿ＶＨ  ｎｔ配列）
GAGGTTCAGCTGGTACAATCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATACTATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTGGTAGTGATTACTTATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACGAACTACGGTGGTATCCACAAGCAGGTGCTTTTGATCGATGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGC
配列番号：１８（ＰＬ２＃３＿ＶＨ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMNWVRQAPGKGLEWVSSISSGSDYLYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNELRWYPQAGAFDRWGQGTMVTVSS
配列番号：１９（ＰＬ３＃７＿ＶＬ  ｎｔ配列）
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCCTGAGTGCCCGGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
配列番号：２０（ＰＬ３＃７＿ＶＬ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSLSARVVFGGGTKLTVL
配列番号：２１（ＰＬ３＃７＿ＶＨ  ｎｔ配列）
CAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATCCGATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATAGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGGATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGTCTAGAGATGGCTACGCTTTTGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC
配列番号：２２（ＰＬ３＃７＿ＶＨ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYPISWVRQAPGQGLEWIGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRDGYAFGAFDIWGQGTLVTVSS
配列番号：２３（ＰＬ３＃７−１９＿ＶＬ  ｎｔ配列）
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGGGGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCACGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCCTGAGTGCCACGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
配列番号：２４（ＰＬ３＃７−１９＿ＶＬ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGGGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSTRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSLSATVVFGGGTKLTVL
配列番号：２５（ＰＬ３＃７−１９＿ＶＨ  ｎｔ配列）
CAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATCCGATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGTCTAGAGATGGCTACGCTTTTGGTGCTTTTGATGTGTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC
配列番号：２６（ＰＬ３＃７−１９＿ＶＨ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYPISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRDGYAFGAFDVWGQGTLVTVSS
配列番号：２７（ＰＬ３＃７−４３＿ＶＬ  ｎｔ配列）
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACGTGGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGTCTTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCGGGAGTGCCCGGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
配列番号：２８（ＰＬ３＃７−４３＿ＶＬ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNVGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRSSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSGSARVVFGGGTKLTVL
配列番号：２９（ＰＬ３＃７−４３＿ＶＨ  ｎｔ配列）
CAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATCCGATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGTCTAGACCGGGCTACGCTTTTGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC
配列番号：３０（ＰＬ３＃７−４３＿ＶＨ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYPISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRPGYAFGAFDIWGQGTLVTVSS
配列番号：３１（ＰＬ３＃７−５４＿ＶＬ  ｎｔ配列）
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGCAGGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGCTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCCTGAGTGCCCGGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
配列番号：３２（ＰＬ３＃７−５４＿ＶＬ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGQGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYANSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSLSARVVFGGGTKLTVL
配列番号：３３（ＰＬ３＃７−５４＿ＶＨ  ｎｔ配列）
CAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATCCGATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAGATTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGTCTAGACCGGGCTACGCTTTTGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC
配列番号：３４（ＰＬ３＃７−５４＿ＶＨ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYPISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIADYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRPGYAFGAFDIWGQGTLVTVSS
配列番号：３５（ＰＬ１＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：TGSSSNVGAGYDVH
配列番号：３６（ＰＬ２＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：SGSSS.YIESSYVS
配列番号：３７（ＰＬ３＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：TGSSSNIGAGYDVH
配列番号：３７（ＰＬ６＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：TGSSSNIGAGYDVH
配列番号：３８（ＰＬ８＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：QGDSLRSYYVS
配列番号：３９（ＰＬ１２＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：TRSSSNIGAGHDVH
配列番号：４０（ＰＬ１５＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：TGYSSNIGAGYDVH
配列番号：４１（ＰＬ１＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：GNSNRPS
配列番号：４２（ＰＬ２＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：DDDMRPS
配列番号：４１（ＰＬ３＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：GNSNRPS
配列番号：４１（ＰＬ６＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：GNSNRPS
配列番号：４３（ＰＬ８＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：GKNNRPS
配列番号：４１（ＰＬ１２＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：GNSNRPS
配列番号：４１（ＰＬ１５＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：GNSNRPS
配列番号：４４（ＰＬ１＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：QSYDSSLSGWV
配列番号：４５（ＰＬ２＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：EIWDSGLGGV
配列番号：４６（ＰＬ３＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：QSYDSSLSAPVV
配列番号：４７（ＰＬ６＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：QSYDSSLSGGV
配列番号：４８（ＰＬ８＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：NSRDSTGNLLRV
配列番号：４９（ＰＬ１２＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：QSYDSSLTGVV
配列番号：５０（ＰＬ１５＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：QSYDNSLSVSV
配列番号：５１（ＰＬ１＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYAIS
配列番号：５２（ＰＬ２＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYTMN
配列番号：５３（ＰＬ３＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYTIS
配列番号：５４（ＰＬ６＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYTIN
配列番号：５１（ＰＬ８＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYAIS
配列番号：５１（ＰＬ１２＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYAIS
配列番号：５３（ＰＬ１５＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYTIS
配列番号：５５（ＰＬ１＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：RIIPILGIANYAQKFQG
配列番号：５６（ＰＬ２＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：SISSGSDYLYYADSVKG
配列番号：５５（ＰＬ３＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：RIIPILGIANYAQKFQG
配列番号：５７（ＰＬ６＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：KIIPILGIADYAQMFKG
配列番号：５８（ＰＬ８＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：RIIPIFGTANYAQKFQG
配列番号：５５（ＰＬ１２＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：RIIPILGIANYAQKFQG
配列番号：５５（ＰＬ１５＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：RIIPILGIANYAQKFQG
配列番号：５９（ＰＬ１＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：EGSSGWLGVLDY
配列番号：６０（ＰＬ２＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：NELRWYPQAGAFDI
配列番号：６１（ＰＬ３＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：SRDGYSFGAFDI
配列番号：６２（ＰＬ６＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：GGYVGYLNAFDI
配列番号：６３（ＰＬ８＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：EGVLDAFDI
配列番号：６４（ＰＬ１２＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：GIGSYSFGAFDI
配列番号：６１（ＰＬ１５＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：SRDGYSFGAFDI
配列番号：６５（ＰＬ２＃３＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：SGSSSYIESSYVG
配列番号：３７（ＰＬ３＃７＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：TGSSSNIGAGYDVH
配列番号：６６（ＰＬ３＃７−１９＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：TGSSSNIGGGYDVH
配列番号：３５（ＰＬ３＃７−４３＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：TGSSSNVGAGYDVH
配列番号：６７（ＰＬ３＃７−５４＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：TGSSSNIGQGYDVH
配列番号：４２（ＰＬ２＃３＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：DDDMRPS
配列番号：４１（ＰＬ３＃７＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：GNSNRPS
配列番号：６８（ＰＬ３＃７−１９＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：GNSTRPS
配列番号：６９（ＰＬ３＃７−４３＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：GNSNRSS
配列番号：７０（ＰＬ３＃７−５４＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：ANSNRPS
配列番号：７１（ＰＬ２＃３＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：EIWRSGLGGV
配列番号：７２（ＰＬ３＃７＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：QTYDSSLSARVV
配列番号：７３（ＰＬ３＃７−１９＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：QTYDSSLSATVV
配列番号：７４（ＰＬ３＃７−４３＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：QTYDSSGSARVV
配列番号：７２（ＰＬ３＃７−５４＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：QTYDSSLSARVV
配列番号：５２（ＰＬ２＃３＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYTMN
配列番号：７５（ＰＬ３＃７＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYPIS
配列番号：７５（ＰＬ３＃７−１９＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYPIS
配列番号：７５（ＰＬ３＃７−４３＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYPIS
配列番号：７５（ＰＬ３＃７−５４＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYPIS
配列番号：５６（ＰＬ２＃３＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：SISSGSDYLYYADSVKG
配列番号：５５（ＰＬ３＃７＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：RIIPILGIANYAQKFQG
配列番号：５５（ＰＬ３＃７−１９＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：RIIPILGIANYAQKFQG
配列番号：５５（ＰＬ３＃７−４３＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：RIIPILGIANYAQKFQG
配列番号：７６（ＰＬ３＃７−５４＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：RIIPILGIADYAQKFQG
配列番号：７７（ＰＬ２＃３＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：NELRWYPQAGAFDR
配列番号：７８（ＰＬ３＃７＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：SRDGYAFGAFDI
配列番号：７９（ＰＬ３＃７−１９＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：SRDGYAFGAFDV
配列番号：８０（ＰＬ３＃７−４３＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：SRPGYAFGAFDI
配列番号：８１（ＰＬ３＃７−５４＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：SRPGYAFGAFDI
配列番号：８２（ＰＬ２＃４＿ＶＬ  ｎｔ配列）
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAATGTCAGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAGTTAGCTCCTACATTGAAAGTTCTTATGTCTCCTGGTACCAGCAACTCCCAGGAACAGCCCCCAGACTCCTCATTTATGACGATGATATGCGACCCTCAGGGATCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGCCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCAAGATATGGGATAGCGGCCTGGGAGGCGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
配列番号：８３（ＰＬ２＃４＿ＶＬ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QSVVTQPPSMSAAPGQRVTISCSGVSSYIESSYVSWYQQLPGTAPRLLIYDDDMRPSGIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQTGDEADYYCKIWDSGLGGVFGGGTKLTVL
配列番号：８４（ＰＬ２＃４＿ＶＨ  ｎｔ配列）
GAGGTTCAGCTGGTACAATCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATACTATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTGGTAGTGATTACTTATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACGAACTACGGTGGTATCCACTTGCAGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGC
配列番号：８５（ＰＬ２＃４＿ＶＨ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMNWVRQAPGKGLEWVSSISSGSDYLYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNELRWYPLAGAFDIWGQGTMVTVSS
配列番号：８６（ＰＬ２＃５＿ＶＬ  ｎｔ配列）
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAATGTCAGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCAGTGGAAGCAGCTCCTACATTGAAAGTTCTTATGTCTCATGGTACCAGCAACTCCCAGGAACAGCCCCCAGACTCCTCATTTATGACGATGATATGCGACCCTCAGGGATCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGCCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGAGATATGGGATAGCCGGCTGGGAGGCGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
配列番号：８７（ＰＬ２＃５＿ＶＬ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QSVVTQPPSMSAAPGQRVTISCSGSSSYIESSYVSWYQQLPGTAPRLLIYDDDMRPSGIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQTGDEADYYCEIWDSRLGGVFGGGTKLTVL
配列番号：８８（ＰＬ２＃５＿ＶＨ  ｎｔ配列）
GAGGTTCAGCTGGTACAATCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATACTATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTGGTAGTGATTACTTATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACGAACTACGGTGGTATCCATTTGCAGGTGCTTTTGATATTTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGC
配列番号：８９（ＰＬ２＃５＿ＶＨ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMNWVRQAPGKGLEWVSSISSGSDYLYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNELRWYPFAGAFDIWGQGTMVTVSS
配列番号：９０（ＰＬ２＃３９＿ＶＬ  ｎｔ配列）
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCTCAATGTCAGCGGCCCCAGGACAGAGGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCTACATTACGAGTTCTTATGTCTCCTGGTACCAGCAACTCCCAGGAACAGCCCCCAGACTCCTCATTTATGACGATGATATGCGACCCTCAGGGATCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGCCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCAAGATATGGGATAGCGGCCTGGGAGGCGTCTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
配列番号：９１（ＰＬ２＃３９＿ＶＬ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QSVVTQPPSMSAAPGQRVTISCSGSSSYITSSYVSWYQQLPGTAPRLLIYDDDMRPSGIPDRFSGSKSGTSATLAITGLQTGDEADYYCKIWDSGLGGVFGGGTKLTVL
配列番号：９２（ＰＬ２＃３９＿ＶＨ  ｎｔ配列）
GAGGTTCAGCTGGTACAATCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTTATACTATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTGGTAGTGATTACTTATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAAACGAACTACGGTGGTATCCAAAGGCAGGTGCTTTTGATATATGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGC
配列番号：９３（ＰＬ２＃３９＿ＶＨ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
EVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMNWVRQAPGKGLEWVSSISSGSDYLYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNELRWYPKAGAFDIWGQGTMVTVSS
配列番号：９４（ＰＬ２＃４＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：SGVSSYIESSYVS
配列番号：９７（ＰＬ２＃５＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：SGSSSYIESSYVS
配列番号：１００（ＰＬ２＃３９＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：SGSSSYITSSYVS
配列番号：４２（ＰＬ２＃４＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：DDDMRPS
配列番号：４２（ＰＬ２＃５＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：DDDMRPS
配列番号：４２（ＰＬ２＃３９＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：DDDMRPS
配列番号：９５（ＰＬ２＃４＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：KIWDSGLGGV
配列番号：９８（ＰＬ２＃５＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：EIWDSRLGGV
配列番号：９５（ＰＬ２＃３９＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：KIWDSGLGGV
配列番号：５２（ＰＬ２＃４＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYTMN
配列番号：５２（ＰＬ２＃５＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYTMN
配列番号：５２（ＰＬ２＃３９＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYTMN
配列番号：５６（ＰＬ２＃４＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：SISSGSDYLYYADSVKG
配列番号：５６（ＰＬ２＃５＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：SISSGSDYLYYADSVKG
配列番号：５６（ＰＬ２＃３９＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：SISSGSDYLYYADSVKG
配列番号：９６（ＰＬ２＃４＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：NELRWYPLAGAFDI
配列番号：９９（ＰＬ２＃５＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：NELRWYPFAGAFDI
配列番号：１０１（ＰＬ２＃３９＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：NELRWYPKAGAFDI
配列番号：１０２（ＰＬ３＃１＿ＶＬ  ｎｔ配列）
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAGGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACCTATGACAGCAGCCTGAGTCGTCCCGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
配列番号：１０３（ＰＬ３＃１＿ＶＬ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSRRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSLSRPVVFGGGTKLTVL
配列番号：１０４（ＰＬ３＃１＿ＶＨ  ｎｔ配列）
CAGGTCCAGCTGGTGCAATCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATAGGATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGTCTAGAGATGGCTACAGTGTGGGTGCTTTTGATTCGTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC
配列番号：１０５（ＰＬ３＃１＿ＶＨ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYRISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSRDGYSVGAFDSWGQGTLVTVSS
配列番号：３７（ＰＬ３＃１＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ１）：TGSSSNIGAGYDVH
配列番号：１０６（ＰＬ３＃１＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ２）：GNSRRPS
配列番号：１０７（ＰＬ３＃１＿ＬＣのＣＤＲ−Ｌ３）：QTYDSSLSRPVV
配列番号：１０８（ＰＬ３＃１＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ１）：SYRIS
配列番号：５５（ＰＬ３＃１＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ２）：RIIPILGIANYAQKFQG
配列番号：１０９（ＰＬ３＃１＿ＨＣのＣＤＲ−Ｈ３）：SRDGYSVGAFDS
配列番号：１１０（ＰＬ３＃７−１９ 脱グリコ１＿ＶＬ  ｎｔ配列（下線強調部: Ｌ−ＣＤＲ２））
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGGGGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCCTGAGTGCCACGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
配列番号：１１１（ＰＬ３＃７−１９ 脱グリコ１＿ＶＬ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGGGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSLSATVVFGGGTKLTVL
配列番号：１１２（ＰＬ３＃７−１９ 脱グリコ２＿ＶＬ  ｎｔ配列（下線強調部: Ｌ−ＣＤＲ２））
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGGGGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTCAGAGCACGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCCTGAGTGCCACGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
配列番号：１１３（ＰＬ３＃７−１９ 脱グリコ２＿ＶＬ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGGGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGQSTRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSLSATVVFGGGTKLTVL
配列番号：１１４（ＰＬ３＃７−１９ 脱グリコ３＿ＶＬ  ｎｔ配列（下線強調部: Ｌ−ＣＤＲ２））
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGGGGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCCAACGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCCTGAGTGCCACGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
配列番号：１１５（ＰＬ３＃７−１９ 脱グリコ３＿ＶＬ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGGGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSLSATVVFGGGTKLTVL
配列番号：１１６（ＰＬ３＃７−４３ 脱グリコ１＿ＶＬ  ｎｔ配列（下線強調部: Ｌ−ＣＤＲ２））
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACGTGGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCGGGAGTGCCCGGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
配列番号：１１７（ＰＬ３＃７−４３ 脱グリコ１＿ＶＬ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNVGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSGSARVVFGGGTKLTVL
配列番号：１１８（ＰＬ３＃７−４３ 脱グリコ２＿ＶＬ  ｎｔ配列（下線強調部: Ｌ−ＣＤＲ２））
CAGTCTGTCGTGACGCAGCCGCCCCCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACGTGGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTACCAGCAGCTTCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGTAACAGCCAACGGTCTTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGACTTATGACAGCAGCGGGAGTGCCCGGGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
配列番号：１１９（ＰＬ３＃７−４３ 脱グリコ２＿ＶＬ  ＡＡ配列（下線強調部: Kabatが定義したＣＤＲ））
QSVVTQPPPVSGAPGQRVTISCTGSSSNVGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSQRSSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQTYDSSGSARVVFGGGTKLTVL
【図１−１】
2019535254.tif 000019
【図１−２】
2019535254.tif 000020
【図１−３】
2019535254.tif 000021
【図２Ａ】
2019535254.tif 000022
【図２Ｂ】
2019535254.tif 000023
【図３】
2019535254.tif 000024
【図４Ａ】
2019535254.tif 000025
【図４Ｂ】
2019535254.tif 000026
【図５Ａ】
2019535254.tif 000027
【図５Ｂ】
2019535254.tif 000028
【図６Ａ】
2019535254.tif 000029
【図６Ｂ】
2019535254.tif 000030
【図７Ａ】
2019535254.tif 000031
【図７Ｂ】
2019535254.tif 000032
【図８Ａ】
2019535254.tif 000033
【図８Ｂ】
2019535254.tif 000034
【図８Ｃ】
2019535254.tif 000035
【図８Ｄ】
2019535254.tif 000036
【図９Ａ】
2019535254.tif 000037
【図９Ｂ】
2019535254.tif 000038
【図１０】
2019535254.tif 000039
【図１１−１】
2019535254.tif 000040
【図１１−２】
2019535254.tif 000041
【図１１−３】
2019535254.tif 000042
【図１２Ａ】
2019535254.tif 000043
【図１２Ｂ】
2019535254.tif 000044
【図１３Ａ】
2019535254.tif 000045
【図１３Ｂ】
2019535254.tif 000046
【図１３Ｃ】
2019535254.tif 000047
【図１４Ａ】
2019535254.tif 000048
【図１４Ｂ】
2019535254.tif 000049
【図１５Ａ】
2019535254.tif 000050
【図１５Ｂ】
2019535254.tif 000051
【図１６】
2019535254.tif 000052
【図１７Ａ】
2019535254.tif 000053
【図１７Ｂ】
2019535254.tif 000054
【図１８】
2019535254.tif 000055
【図１９】
2019535254.tif 000056
【図２０Ａ】
2019535254.tif 000057
【図２０Ｂ】
2019535254.tif 000058
【図２１Ａ】
2019535254.tif 000059
【図２１Ｂ】
2019535254.tif 000060
【図２１Ｃ】
2019535254.tif 000061
【図２１Ｄ】
2019535254.tif 000062
【図２２Ａ】
2019535254.tif 000063
【図２２Ｂ】
2019535254.tif 000064
【配列表】
2019535254000001.app
【国際調査報告】
2019535254.tif 000065
2019535254.tif 000066
2019535254.tif 000067