(57)【要約】本発明は、改善された抗がん活性を示す、ＣＤＫ９遺伝子に対するＲＮＡｉエフェクター（好ましくはｓｈＲＮＡ）を発現する革新的なプロトパルボウイルス（ＰＶ）に関する。これらの新しいウイルスは、ＮＳ領域内のインフレームの欠失（ΔＨ−１ＰＶ）を特色とし、ｓｈＲＮＡの発現がＨ１ポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって制御されるｓｈＲＮＡ発現カセットを保有する、プロトパルボウイルスＨ−１ＰＶからなるΔＨ−１ＰＶサイレンサープラットフォームに基づく。本発明において、本発明者は、ΔＨ−１ＰＶサイレンサーを使用して、ＣＤＫ９遺伝子（その活性はがん細胞中で頻繁に調節異常になり、腫瘍形成に寄与することが公知である）をサイレンシングさせることを目的とした。本発明は、前記パルボウイルスを含む細胞又は生物体も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオチド２０２２〜２１３５にわたる欠失を含有するパルボウイルスＨ−１欠失変異体に由来するという点で特徴づけられる、細胞におけるサイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）の発現のダウンレギュレートのためのパルボウイルスであって、ＣＤＫ９特異的核酸が、前記Ｈ−１パルボウイルスＶＰの遺伝子の下流の非翻訳領域中に挿入され、前記細胞中のＲＮＡポリメラーゼによって認識可能なプロモーター又はプロモーター領域の制御下で発現可能であり、前記ＣＤＫ９特異的核酸がＲＮＡｉにおいて転写可能であり、前記パルボウイルスが細胞中で複製し伝播することが可能である、前記パルボウイルス。
【請求項２】
前記ＣＤＫ９特異的核酸が、前記Ｈ−１ＰＶゲノムのヌクレオチド４６８３で挿入される、請求項１に記載のパルボウイルス。
【請求項３】
前記細胞のＲＮＡポリメラーゼによって認識可能な前記プロモーター又はプロモーター領域が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーター又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）プロモーターである、請求項１又は２に記載のパルボウイルス。
【請求項４】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ  Ｈ１プロモーターである、請求項３に記載のパルボウイルス。
【請求項５】
ＣＤＫ９特異的核酸がｓｈＲＮＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のパルボウイルス。
【請求項６】
前記ＣＤＫ９特異的核酸が少なくとも１５のヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のパルボウイルス。
【請求項７】
前記ＣＤＫ９特異的核酸が、配列ＩＤ：ＸＭ＿０１７０１４１８４．１のＣＤＫ９配列２３５〜２５３にマッチする、請求項５に記載のパルボウイルス。
【請求項８】
腫瘍を治療する方法における使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のパルボウイルス。
【請求項９】
前記腫瘍の前記細胞が化学療法及び／又は放射線療法に耐性があるという点で特徴づけられる、請求項８に記載の使用のためのパルボウイルス。
【請求項１０】
前記パルボウイルスが、静脈内（ｉ．ｖ．）投与、腫瘍内投与、又は気管支内投与によって投与されるという点で特徴づけられる、請求項８又は９に記載の使用のためのパルボウイルス。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のパルボウイルスを含有する、細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の細胞を含む、遺伝子導入非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された抗がん活性を示す、ＣＤＫ９遺伝子に対するＲＮＡｉエフェクター（好ましくはｓｈＲＮＡ）を発現する革新的なプロトパルボウイルス（ＰＶ）に関する。これらの新しいウイルスは、ＮＳ領域内のインフレームの欠失（ΔＨ−１ＰＶ）を特色とし、ＲＮＡの発現がＨ１ポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって制御されるＲＮＡ発現カセット（好ましくはｓｈＲＮＡカセット）を保有する、プロトパルボウイルスＨ−１ＰＶからなるΔＨ−１ＰＶサイレンサープラットフォームに基づく。本発明において、本発明者は、ΔＨ−１ＰＶサイレンサーを使用して、ＣＤＫ９遺伝子（その活性はがん細胞中で頻繁に調節異常になり、腫瘍形成に寄与することが公知である）をサイレンシングさせることを目的とした。本発明は、前記パルボウイルスを含む細胞又は生物体も提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡｉ干渉、ＲＮＡｉエフェクター及び送達
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、最初にＡｎｄｒｅｗ  Ｆｉｒｅ及びＣｒａｉｇ  Ｍｅｌｌｏ（彼らは後にそれらの発見で１９９８年にノーベル賞を授与された）によって、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ中で認識された。ＲＮＡｉの機構は、標的配列に相補的な二本鎖ＲＮＡを用いた、宿主ｍＲＮＡの配列に特異的な分解に基づく。ＲＮＡｉは遺伝子発現を制御する天然に存在する細胞プロセスであり、したがって発生を包含する多くの細胞プロセスにおいて中心的な役割を果たす［１］。それは、ウイルス及びトランスポゾンのような病原体に対して細胞を防御する免疫応答の重要な構成要素でもある［２］。その発見のすぐ後に、ＲＮＡｉ技術は、既知の遺伝子配列の強力なノックダウンを達成するその高度な特異性及び能力に起因して、疾患についての生物学的疑問及び治療選択肢に取り組むために利用された［３］。治療的には、ＲＮＡｉは、小分子ＲＮＡ二重らせん（マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）模倣体、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びダイサー基質ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）が挙げられる）の送達を経由して作動する［４］。すべての４つのクラスのＲＮＡｉエフェクターは、複数のタイプのがんを包含する様々な疾患に対する第Ｉ〜ＩＩＩ相の多くの臨床試験において現在試験されている［５］。
【０００３】
ＲＮＡｉ媒介性の抗がん治療によって標的とされる遺伝子の例は、ＫＲＡＳ、ポロ様キナーゼ１、フューリン、エフリンＡ型受容体、及びｃ−ｍｙｃである。大部分の臨床試験は、裸のｓｉＲＮＡに比較して優れた安定性を有する、ナノ粒子（例えば脂質ナノ粒子）へコンジュゲートされたｓｉＲＮＡを包含する。しかしながら、有意な改善にもかかわらず、ｓｉＲＮＡの急速な下降は注入後最初の７２時間以内に観察され、大部分のｓｉＲＮＡは肝細胞によって取り込まれる（注入された用量のおよそ５０％は、注入から３０分後の肝臓において既に見出される）。したがって、ｓｉＲＮＡの有効な送達は、この分野における主要な障害として残っている［５］。大部分の送達系は一過性であり、ｓｉＲＮＡの細胞内濃度は細胞分裂の間に希釈されるので、ｓｉＲＮＡの反復投与がしばしば要求される。
【０００４】
短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は別のクラスのＲＮＡｉエフェクターである［６］。ｓｈＲＮＡは典型的には、４〜１１の対合しない（ｉｍｐａｉｒｅｄ）ヌクレオチドの短いループによって分離された、２つの相補的な（センス及びアンチセンス）１９〜２９の塩基対配列からなる。典型的には、発現は、ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｏｌ）ＩＩＩプロモーター（例えばＵ６、Ｈ１）又は修飾されたｐｏｌ  ＩＩプロモーターによって制御される。ｓｈＲＮＡの転写後に、ループによって接続されたセンス鎖及びアンチセンス鎖は一緒に対合し、特徴的なヘアピン構造を形成する。この構造は、遺伝子発現を調節するために細胞によって天然に使用されるプレｍｉＲＮＡに似ており、核プロセシングを要求する［３］。ｓｈＲＮＡのプロモーター駆動性の発現の解明後に、ウイルスＲＮＡｉベクターのデザインが可能になった［７］。がん遺伝子治療におけるｓｈＲＮＡの送達及び発現のために用いられるウイルスの例は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス及びレトロウイルスである。しかしながら、大部分のこれらのウイルスは複製を欠損し、したがって、サイレンシング効果は初代感染細胞に制限される。
【０００５】
腫瘍溶解性ウイルス及びＲＮＡｉ
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、がん細胞中で選択的に複製し、がん細胞を死滅させ、正常組織を温存しながら腫瘍の全体にわたって広がる能力を有するウイルスである。それらの抗がん能力は広く多様な腫瘍モデルに対して前臨床レベルで実証され、現在少なくとも１２のＯＶが第Ｉ〜ＩＩＩ相の臨床評価下である。特に、Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ（Ｔ−Ｖｅｃ；Ａｍｇｅｎ）（免疫刺激サイトカインの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を発現する、修飾された単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ））は、切除不可能な転移性メラノーマの治療のために、ＦＤＡ及びＥＭＡによって最近承認された。しかしながら、前臨床レベルでＯＶにより得られた有望な結果は、クリニックで必ずしも再現されるとは限らなかった。腫瘍は多くの場合天然で高度に不均一であり、それは、ある特定の腫瘍がウイルス誘導性の腫瘍溶解に対して穏やかに影響を受けるということであろう。ある特定の腫瘍内で、細胞のごく一部分がウイルス治療から生き延び、腫瘍再増殖を導くという可能性もある。したがって、ＯＶベースの治療のコンテキストにおけるＲＮＡｉ技術の適用は非常に魅力的である。なぜならば、感染に不十分な感受性のがん細胞の殺傷のための追加の作用モードをウイルスに提供することによって、ＯＶの有効性を強化する手段を提示するからである。加えて、ＲＮＡｉエフェクターのＯＶ媒介性送達は、特に静脈内投与後に特にがん細胞中でこれらの分子の高レベルの発現をどのように達成するのかという、ＲＮＡｉ技術の一般的な障害を克服することができる。さらに、ＯＶは腫瘍を通して複製し広がることができ、それによってｓｈＲＮＡの産生及び送達を増幅する能力を有する。根拠のあるアプローチであることが証明されたＲＮＡｉエフェクターを装備したＯＶは、腫瘍溶解性アデノウイルス（Ａｄ）（例えば多くの腫瘍関連遺伝子（ＶＥＧＦ、ＭＹＣＮ、ＳＡＴＢ１、ｃ−Ｍｅｔ、Ｋｉ６７、ＩＬ−８、ｈＴＥＲＴ及びＦＡＫが挙げられる）を標的とするｓｈＲＮＡを発現するＡｄ）の事例において、それらの親ウイルスよりも優れた抗がん活性を有する［８〜１５］。腫瘍溶解性ＨＳＶは、ＲＮＡｉエフェクター（ｓｈＲＮＡ及び人工ｍｉＲＮＡ）を効率的に発現するように操作され得ることも示される［１６］。
【０００６】
本発明の目的
上記のように、ｓｈＲＮＡがアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス及びレトロウイルスによって送達されるならば、ウイルスは多くの場合複製を欠損し、したがって、サイレンシング効果は初代感染細胞に制限される。
【０００７】
したがって、より永続的な手法で、細胞又は生物体におけるがん関連遺伝子の発現を効率的にダウンレギュレートするための手段を提供することが、本発明の目的である。
【０００８】
本発明によれば、これは請求項中で定義される発明特定事項の提供によって達成される。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、がん関連遺伝子であるＣＤＫ９遺伝子に対する、ＲＮＡｉエフェクター（好ましくはｓｈＲＮＡ）を発現する自律的なパルボウイルスＨ−１の欠失変異体を扱う。
【００１０】
Ｈ−１  ＰＶは、ヒトに非病原性であり、腫瘍溶解性且つ腫瘍抑制性の特性を保持するので、抗がん能力について高い注目を集めていた。ヒトは通常は齧歯類パルボウイルス感染に曝露されないので、先に存在する抗ウイルス免疫は通常これらのウイルスについて問題ではない。パルボウイルスゲノムは、非構造タンパク質（ＮＳ１及びＮＳ２）及びカプシドタンパク質（ＶＰ１及びＶＰ２）の発現を調節する、それぞれ２つのプロモーター（Ｐ４及びＰ３８）を含有するおよそ５１００塩基の一本鎖ＤＮＡからなる。Ｐ４プロモーターの活性化はＰＶ生活環における重要なステップである。Ｐ４プロモーターの活性は後に自身の遺伝子産物ＮＳ１によって修飾されるが、その初期活性化は、宿主の細胞性因子（それは主として細胞周期のＳ相の間に発現される）に完全に依存する。ウイルスが静止細胞を分裂増殖するように刺激することができないという事実と共に、この依存性は、ウイルスの腫瘍指向性（それは増殖細胞、形質転換細胞、又は悪性細胞中で優先的に複製する）に寄与する。加えて、パルボウイルス細胞毒性は、新生物性形質転換と関連する細胞性変化によっても刺激される。ＮＳ１は主要なウイルス毒性タンパク質である。Ｈ−１ＰＶはがん細胞において複数の死経路を活性化することが示された。ＰＶの抗がん能力は前臨床試験の多数のセットによって支持されるが、有効性が臨床適用における限定因子であると予想することができる。若干のがん細胞がウイルス治療から生き延びて、腫瘍再燃を引き起こす可能性がある。
【００１１】
本発明をもたらす実験の間に、ＣＤＫ９遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡ発現カセットをパルボウイルスゲノムの特定の部位で挿入することで、パルボウイルスパッケージング能力と適合性があり、ウイルス複製を妨害せず、ウイルスの内因性細胞毒性を促進することを示すことができた。ウイルスは高レベルのｓｈＲＮＡを発現し、遺伝子サイレンシングにおいて非常に有効である。複製欠損ベクターと比較したＨ−１ＰＶサイレンサーの大きな利点は、増殖細胞（例えばがん細胞）中で複製し伝播する能力である。すべての感染細胞／形質導入細胞は理論的には、新規のウイルス粒子の生産者になることができた。感染の第２のラウンドを介する子孫ビリオンは腫瘍を介して広がり、治療用ｓｈＲＮＡを効率的に送達及び発現することができた。この設定において、最初の接種物を超えてサイレンシングシグナルを増幅することができた。総合すると、パルボウイルスベースのベクター及びｓｈＲＮＡ技術は、限定を互いに償い合う。パルボウイルスの天然の腫瘍指向性は、特異的且つ有効にｓｈＲＮＡを増殖細胞（例えばがん細胞）へ送達し、その中へのｓｈＲＮＡの形質導入を媒介するに違いない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｈ−１ＰＶサイレンサーベクターの図解表示。ΔＨ−１ＰＶウイルスゲノムは、ヌクレオチド（ｎｔ）２０２２〜２１３５にわたるインフレームの欠失を特色とする。左側パリンドローム配列（ＬＰ）及び右側パリンドローム配列（ＲＰ）はセルフプライミング複製起点として働く。Ｐ４プロモーターはＮＳ遺伝子（非構造タンパク質ＮＳ１及びＮＳ２をコードする）の発現を調節し、Ｐ３８プロモーターはＶＰ遺伝子（ＶＰ１及びＶＰ２ウイルスタンパク質をコードする）の発現を調節する。非コーディング領域（ＮＣＲ）はＶＰ領域の下流であり、それはウイルスゲノムの複製及びカプシド形成の調節に関与すると思われる。Ｈ１−ＰｏｌＩＩＩプロモーター及び標的ｓｈＲＮＡ配列からなるｓｈＲＮＡ発現カセットは、ΔＨ−１ＰＶゲノムのＮＣＲ内のＨｐａＩ制限部位の中へ挿入される。
【図２】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｐΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９のトランスフェクションは、完全な感染性のウイルス粒子の生成をもたらす。Ａ）形態的な表現型。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で産生されたウイルスを、材料及び方法のセクション中で記載されるように、電子顕微鏡法によって分析した。様々なウイルスの中で形態の差は見出されなかった。Ｂ）プラークサイズの比較。示されたウイルスの１０倍連続希釈を、材料及び方法のセクション中で記載されるように、ＮＢ３２４Ｋ指示細胞におけるプラークアッセイのために使用した。染色を６日後に実行したΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ｂを例外として、すべてのウイルスについてプラークの染色を感染後５日目に実行した。
【図３】ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９は高力価で産生され得る。Ａ）トランスフェクション経由でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞における産生。ウイルスゲノムを保有するＤＮＡプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に一過性にトランスフェクションした。ウイルス精製後に、ウイルスバッチをｑＰＣＲ及びプラークアッセイによって力価測定した。ｑＰＣＲによって得られた値を、播種した細胞あたりのカプシド形成されたウイルスゲノム（Ｖｇ）として表現する一方で、プラークアッセイによって得られたものを、播種した細胞あたりの溶菌斑形成単位（ＰＦＵ）として表現する。Ｂ）感染経由でのＮＢ３２４Ｋ細胞における産生。ＮＢＫ３２４細胞に、示されたウイルスを同じＭＯＩ（０．１  ＰＦＵ／細胞）で感染させた。次いで産生したウイルスを上記のように精製及び力価測定した。
【図４】ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９は遺伝子サイレンシングにおいて有効である。Ａ）ＰＣ３細胞に、ＭＯＩ  ５（ＰＦＵ／細胞）の示されたウイルスを感染させた。細胞を感染後４８時間で収穫し、全ＲＮＡを単離し逆転写した。ＣＤＫ９  ｍＲＮＡのレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲ使用して特異的プライマーによって定量化した。値をＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング遺伝子として使用した）により正規化した。モック処理した細胞において得た値に比べたパーセンテージとして標準偏差バーと共に、値を表現した。三重で遂行した代表的な実験からの平均値を提示する。Ｂ）ＰＣ３細胞に、ＭＯＩ  ５（ＰＦＵ／細胞）の示されたウイルスを感染させ、溶解の前に７２時間増殖させた。全細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥへかけ、後続して、特異的抗体を使用して、ＣＤＫ９及びβ−チューブリン（ローディング対照）のタンパク質レベルのイムノブロット分析を行った。
【図５】ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９は優れた腫瘍溶解活性を有する（Ｉ）。ＰＣ３細胞に、ＭＯＩ（ＰＦＵ／細胞）１（上部パネル）又は５（下部パネル）で、示されたウイルスを感染させた。感染後７２時間で、細胞膜全体性を、材料及び方法のセクション中で記載されるプロトコールに従って、ＡｐｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用してアッセイした。
【図６】ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９は優れた腫瘍溶解活性を有する（ＩＩ）。ＰＣ３細胞に、ＭＯＩ（ＰＦＵ／細胞）１（上部パネル）又は５（下部パネル）で、示されたウイルスを感染させた。７２、９６又は１２０時間後に、細胞を収穫し、固定し、材料及び方法セクション中で記載されるように、ヨウ化プロピディウムによる細胞の染色及び断片化したＤＮＡを含有するアポトーシス性のサブＧ１細胞集団の分析によって、フローサイトメトリーのためにプロセシングした。
【図７】ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９は優れた腫瘍溶解活性を有する（ＩＩＩ）。ＰＣ３がん細胞を９６ウェルＥ−プレート中に播種し、ＭＯＩ  １（ＰＦＵ／細胞）（上部パネル）もしくはＭＯＩ  １５（下部パネル）で示されたウイルスを感染させたか、又はバッファー（モック）により処理した。細胞の分裂増殖及び生存率を、ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍにより３０分ごとにリアルタイムでおよそ７日間モニターした。値を、正規化した細胞指数（それはウェルの底部に接着した生存細胞の数を反映する）として表現した。細胞増殖曲線の表示として、細胞指数を時間に対してプロットする。各々の実験条件を少なくとも三重で遂行し、平均値を示す。矢印は、処理の時間（細胞プレーティング後およそ２４時間）を示す。
【図８】ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９は優れた腫瘍溶解活性を有する（ＩＶ）。ＡｓＰＣ−１を９６ウェルＥ−プレート中に播種し、ＭＯＩ  １（ＰＦＵ／細胞）（上部パネル）もしくはＭＯＩ  １５（下部パネル）で示されたウイルスを感染させたか、又はバッファー（モック）により処理した。細胞の分裂増殖及び生存率を、図７において記載されるように、ＸＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  ｓｙｓｔｅｍによりリアルタイムでモニターした。矢印は、処理の時間（細胞プレーティング後およそ２４時間）を示す。
【図９】ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９は腫瘍抑制能力を促進した。Ａ）実験的なスケジュール。５×１０６の膵臓がん由来ＡｓＰＣ−１細胞を、５週齢のメスのヌードラットの右脇腹に皮下注射した。７〜１０日後（腫瘍が２００〜２５０ｍｍ３の体積に達した時）に、腫瘍を持つ動物を、４群へと無作為化した（ｎ＝６）。群を、ＰＢＳ（対照）、又はウイルス（１×１０８ｐｆｕ／動物の全用量、４回の腫瘍内投与に細分した）のいずれかにより処理した。Ｂ）腫瘍増殖。腫瘍体積を示された日にデジタルカリパスで測定し、式：体積（ｃｍ３）＝幅２×長さ／２に従って計算した。動物福祉条令に沿って、腫瘍量が４０００ｍｍ３に達した場合にラットを屠殺した。示されたデータは、標準偏差バーと共に平均値を表わす。Ｃ）生存曲線。示されるように処理した腫瘍を持つラットの生存を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して分析した。腫瘍が４０００ｍｍ３のサイズに達した場合に、動物は死亡したとして便宜的に判断した。生存率における統計的有意差を、両側ログランク検定を有意性のために使用して計算し、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ法による多重検定のために調整した。＊＊Ｐ＜０．０１を統計的に有意であると判断した。
【図１０】Ｈ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９は、ヒト前立腺がんの異種移植ラットモデルにおいて腫瘍抑制能力を促進した。図９凡例中で記載されるように、実験を遂行した。５×１０６の前立腺がん由来ＰＣ３細胞をオス動物の右脇腹へ皮下注射することによって、異種移植を確立した。Ａ）腫瘍増殖のモニターから、Ｈ−１ＰＶ野生型、ΔＨ−１ＰＶｓｈ−ＥＧＦＰ、及びΔＨ−１ＰＶ対照ウイルスと比較して、ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９の優れた抗がん活性が示される。Ｂ）Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線から、Ｈ−１ＰＶ野生型及び対照ウイルスが腫瘍増殖を阻止するのに非効率的な条件下で、ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９については全体的な腫瘍生存が促進され、９匹の動物のうちの２匹の動物が完全に治癒したことが示された。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
したがって、本発明は、パルボウイルスＨ−１欠失変異体がヌクレオチド２０２２〜２１３５にわたる欠失を含有するという点で特徴づけられる、細胞におけるＣＤＫ９の発現のダウンレギュレートのためのパルボウイルスＨ−１欠失変異体に基づくパルボウイルスであって、ＣＤＫ９特異的核酸が、Ｈ−１パルボウイルスＶＰの遺伝子の下流の非翻訳領域中に挿入され、細胞中のＲＮＡポリメラーゼによって認識可能なプロモーター又はプロモーター領域の制御下で発現可能であり、前記ＣＤＫ９特異的核酸がＲＮＡｉにおいて転写可能であり、前記パルボウイルスが細胞中で複製し伝播することが可能である、前記パルボウイルスを提供する。
【００１４】
パルボウイルスＨ−１欠失変異体（ΔＨ−１ＰＶ）は、野生型パルボウイルスＨ−１のヌクレオチド（ｎｔ）２０２２〜２１３５にわたるインフレームの欠失を特色とする（図１）。左側パリンドローム配列（ＬＰ）及び右側パリンドローム配列（ＲＰ）はセルフプライミング複製起点として働く。Ｐ４プロモーターはＮＳ遺伝子（非構造タンパク質ＮＳ１及びＮＳ２をコードする）の発現を調節し、Ｐ３８プロモーターはＶＰ遺伝子（ＶＰ１及びＶＰ２ウイルスタンパク質をコードする）の発現を調節する。非コーディング領域（ＮＣＲ）はＶＰ領域の下流であり、それはウイルスゲノムの複製及びカプシド形成の調節に関与すると思われる。
【００１５】
サイクリン依存性キナーゼ９（ＣＤＫ９）は、Ｐ−ＴＥｆｂに会合するサイクリン依存性キナーゼである。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）ファミリーのメンバーである。ＣＤＫファミリーメンバーは、重要な細胞周期調節因子として公知である。このキナーゼは、マルチタンパク質複合体ＴＡｋ／Ｐ−ＴＥＦＢｂ（これは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ指令転写のための伸長因子であり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの最大のサブユニットのＣ末端のドメインのリン酸化によって機能する）の構成要素であることが見出された。ＣＤＫ９は、ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質との相互作用によってＡＩＤＳに関与し、骨格筋の分化に関与し、がん発生における役割を果たす。
【００１６】
ＣＤＫ９特異的核酸は、ウイルス複製及び細胞毒性が影響されないような手法で（すなわちパルボウイルスのカプシドタンパク質をコードするパルボウイルスＶＰ遺伝子の下流に）、ウイルスゲノムの中へ挿入される。好ましくは、ＣＤＫ９特異的核酸は、Ｈ−１ＰＶゲノムのヌクレオチド４６８３で挿入される。
【００１７】
「ＣＤＫ９特異的核酸」という用語は、本明細書において使用される時、ＣＤＫ９標的遺伝子の転写されたヌクレオチド配列の相補物と、少なくとも約７５％、特に少なくとも約８０％、より特に少なくとも約８５％、かなり特に約９０％、とりわけ約９５％の配列同一性を有する、少なくとも１５、２０、２５、５０、１００又は２００の連続するｎｔを含む核酸を指す。
【００１８】
本発明において、ＣＤＫ９遺伝子は、インビボの細胞又はインビトロの細胞（エクスビボ）においてダウンレギュレートされ得る。細胞は初代細胞もしくはある期間の間培養された細胞であり得るか、又は細胞は培養された細胞株から構成され得る。細胞は、疾患細胞（がん細胞もしくは腫瘍細胞又はウイルスが感染した細胞のような）であり得る。細胞は、幹細胞（それは、すべての造血細胞系譜の、前駆細胞、より成熟した細胞、及び完全に成熟した細胞を生じさせる）、前駆細胞（それは、すべての造血細胞系譜の成熟細胞を生じさせる）、コミットした前駆細胞（それは、特異的造血器系譜、Ｔリンパ球前駆細胞、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、骨髄性前駆細胞、又は単球／マクロファージ細胞を生じさせる）であり得る。細胞は、万能性もしくは全能性の幹細胞又は胚性幹細胞であり得る。細胞は、神経細胞、神経系細胞、上皮細胞、筋細胞、心臓細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、幹細胞、胚性幹細胞もしくは胎児幹細胞、又は受精した卵子であり得る。
【００１９】
好ましくは、前記パルボウイルス変異体は医薬組成物として製剤化され、そこで、パルボウイルスは有効用量で存在し、薬学的に許容される担体と組み合わせられる。
【００２０】
「薬学的に許容される」は、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、それが投与される患者への毒性はない任意の担体を網羅することを意味する。好適な医薬担体の例は当技術分野において周知であり、リン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルション（油／水エマルション等）、様々なタイプの湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。追加の薬学的適合性のある担体としては、ゲル、生体吸収性マトリックス材、パルボウイルス（治療剤）を含有する埋込み要素、又は他の好適なベヒクル、送達もしくは分注の手段もしくは材料（複数可）が挙げられ得る。かかる担体は従来の方法によって製剤化され、有効用量で被験者へ投与され得る。
【００２１】
「有効用量」は、有効な処理に十分な活性成分の量を指す。「有効用量」は当業者に公知の方法を使用して決定され得る（例えばＦｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍｏｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ編、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１〜４６ページ（１９７５）を参照）。
【００２２】
パルボウイルスの投与は、異なる手法によって（例えば静脈内投与、腫瘍内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与又は皮内投与によって）達成され得る。投与経路は、もちろん治療の種類に依存する。好ましい投与経路は、静脈内（ｉ．ｖ．）投与、腫瘍内投与、又は気管支内投与である。血液脳関門を介して浸透する能力を有する感染性ウイルス粒子が使用されるならば、例えばＨ１ウイルスの静脈注射によって処理を遂行するか、又は少なくとも開始することができるだろう。
【００２３】
パルボウイルスの投薬量レジメンは、患者データ、観察、及び他の臨床学的因子（例えば患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の修飾されたパルボウイルスなど、時間及び投与経路、間葉腫瘍のタイプ、患者の全体的な健康、ならびに患者に行われている他の薬物療法が挙げられる）に基づいて、担当医によって当業者の技能の範囲内で容易に決定できる。
【００２４】
別の特異的投与方法として、パルボウイルスは、患者中に埋込まれた源から患者へ投与され得る。例えば、シリコーンなど又は他の生体適合性のある材料のカテーテルは、例えば腫瘍摘出の間に又は分離した手順によって患者中に設置された小さな皮下リザーバー（Ｒｉｃｋｈａｍリザーバー）へ接続されて、パルボウイルスがさらなる外科的介入無しで様々な時間に局部的に注入されることを可能にすることができる。パルボウイルスは、定位外科手術技法又はニューロナビゲーション標的化技法によっても腫瘍の中へ注入され得る。
【００２５】
パルボウイルスの投与は、好適なポンプ系（例えば蠕動輸液ポンプ又は対流強化送達（ＣＥＤ）ポンプ）を使用して、埋込みカテーテルを介してウイルス粒子又はウイルス粒子を含有する流体を低流速で持続点滴することによっても遂行され得る。
【００２６】
今までのところ、パルボウイルスの投与の別の方法は、埋込みデバイスから所望される組織へパルボウイルスを分注するように構築及びアレンジされるものである。例えば、パルボウイルス（例えばパルボウイルスＨ１）を浸透させたウエファースを用いることができ、そこで、ウエファースは外科的腫瘍摘出の終了時に切除空洞の端へ接着される。複数のウエファースはかかる治療的介入において用いられ得る。パルボウイルスＨ１変異体を活発に産生する細胞は、腫瘍摘出後に腫瘍又は腫瘍空洞の中へ注入され得る。
【００２７】
本発明の特に好ましい実施形態において、標的特異的核酸はＨ−１ＰＶゲノムのＨｐａＩ制限部位で挿入される。しかしながら、パルボウイルスゲノムの他の領域中でのカセットの挿入も、他のＲＮＡｉトリガー分子（マイクロＲＮＡ及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチド等）に加えて考慮される。
【００２８】
本発明のさらに特に好ましい実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼによって認識可能なプロモーター又はプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩ）プロモーター（例えばＣＭＶ及びヒトユビキチンＣ等）又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）プロモーター（Ｕ６、Ｈ１、７ＳＫ及びｔＲＮＡ等）である。特に好ましいＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩＩ）プロモーターの例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ  Ｈ１プロモーターである。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態において、ＣＤＫ９特異的核酸はｓｈＲＮＡである。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉経由の遺伝子発現のサイレンシングに使用され得る緊密なヘアピンカーブを生じさせるＲＮＡ配列である、小分子ヘアピンＲＮＡ又は短鎖ヘアピンＲＮＡである。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は細胞性機構によってｓｉＲＮＡへと切断され、次いでそれはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へ結合される。この複合体は、ｓｉＲＮＡ（それは複合体へ結合される）にマッチするｍＲＮＡに結合し切断する。
【００３０】
本発明のさらに特に好ましい実施形態において、ＣＤＫ９特異的核酸（例えばｓｈＲＮＡ）は、少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有する。特定の好ましい実施形態において、ＣＤＫ９配列は、配列ＩＤ：ＸＭ＿０１７０１４１８４．１のｎｔ２３５〜２５３を含有する。別の好ましい実施形態において、ＣＤＫ９配列は、配列ＩＤ：ＸＭ＿０１７０１４１８４．１のｎｔ５９４〜６１４を含有する。より短い配列（ｎｔ２３５〜２５３）がより長い配列よりも良好な感染性（図３Ｂ）を示したので、より短い配列はわずかに好ましい。これに関しては、より短い配列が、より長い配列よりもがん細胞について高い細胞毒性を示したことを示す例４及び図８も参照される。
【００３１】
本発明は、がんの治療における使用のための、上で特徴づけられるような齧歯類パルボウイルスにも関する。
【００３２】
好ましい実施形態において、前記パルボウイルスは、腫瘍、特に（しかし排他的でなく）前立腺がん、膵臓がん、脳腫瘍（好ましくは神経膠腫）、子宮頚がん、肺がん、頭頸部がん、乳がん、結腸がんの治療のために使用され得る。
【００３３】
さらに好ましい実施形態において、前記パルボウイルスは、腫瘍の細胞が化学療法及び／又は放射線療法へ耐性のあることで特徴づけられる前記腫瘍の治療のために使用され得る。
【００３４】
本発明に記載のパルボウイルスによって治療可能な患者は、ヒトに加えて非ヒト動物も含む。後者の例としては、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、及びネコ等の動物が、限定されずに挙げられる。
【００３５】
本発明は、上述されるようなパルボウイルスを含む、動物、真菌、又は原生生物の細胞も提供する。一実施形態において、細胞はインビトロである。細胞は好ましくは、動物細胞、単離されたヒト細胞、インビトロのヒト細胞、非ヒト脊椎動物細胞、非ヒト哺乳類細胞、魚類細胞、ウシ細胞、ヤギ細胞、ブタ細胞、ヒツジ細胞、齧歯類細胞、ハムスター細胞、マウス細胞、ラット細胞、モルモット細胞、ウサギ細胞、非ヒト霊長類細胞、線虫細胞、甲殻類細胞、クルマエビ細胞、カニ細胞、ロブスター細胞、昆虫細胞、ショウジョウバエ細胞、Ｃｏｌｅａｐｔｅｒａｎ目の昆虫細胞、Ｄｉｐｔｅｒａｎ目の昆虫細胞、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ目の昆虫細胞、又はＨｏｍｅｏｐｔｅｒａｎ目の昆虫細胞である。
【００３６】
最終的に、本発明は、上述されるようなパルボウイルスを含む、遺伝子導入の非ヒト動物、真菌又は原生生物も提供する。遺伝子導入動物は、受精卵母細胞の前核の中へのパルボウイルスの注入、キメラ胚を産生する発生中の胚の中への細胞（好ましくは未分化（ｕｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）細胞）の移植、除核胚又は活性化卵母細胞の中への組換え細胞から核の移植、及び同種のものによって、産生され得る。遺伝子導入動物の産生のための方法は当技術分野において十分に確立され、例えば米国特許第４，８７３，１９１号中で記載される。
【００３７】
要約すると、新しいウイルスは、ＮＳ領域内のインフレームの欠失（ΔＨ−１ＰＶ）を特色とし、ｓｈＲＮＡの発現がＨ１ポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって制御されるＲＮＡ発現カセット（好ましくはｓｈＲＮＡ発現カセット）を保有する、プロトパルボウイルスＨ−１ＰＶからなるΔＨ−１ＰＶサイレンサープラットフォームに基づく。ΔＨ−１ＰＶサイレンサーは、遺伝子サイレンシングに有効である一方で、複製し完全に感染性である能力を維持する。本発明において、ΔＨ−１ＰＶサイレンサーを使用して、ＣＤＫ９遺伝子（その活性はがん細胞中で頻繁に調節異常になり、腫瘍形成に寄与することが公知である）をサイレンシングさせた。ＣＤＫ９遺伝子の異なる領域を標的とする２つの異なるｓｈＲＮＡ配列がデザインされ、ｐΔＨ−１ＰＶサイレンサーベクター中に挿入され、ｐΔＨ−１ＰＶｓｈ−ＣＤＫ９ａ及びｐΔＨ−１ＰＶｓｈ−ＣＤＫ９ｂプラスミドの構築をもたらした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるプラスミドのトランスフェクションは完全な感染性のウイルス粒子を生成し、それは、典型的なパルボウイルス産生プロトコールに従って、ＮＢ３２４Ｋ細胞における感染を経由してさらに増幅され得る。顕著なことには、ＣＤＫ９を標的とするｓｈＲＮＡを発現するウイルスは、前立腺がん（ＰＣ３）又は膵臓がん（ＡｓＰＣ−１）に由来する２つの細胞株において、親ΔＨ−１ＰＶ及び野生型Ｈ−１ＰＶと比較して、優れた腫瘍溶解活性を示した（図９、１０）。細胞殺傷の促進は、ＣＤＫ９遺伝子のウイルス媒介性ダウンレギュレーションと関連した。ヒト膵臓がん及びヒト前立腺がんの異種移植ラットモデルにおけるこれらの結果の検証は、ＣＤＫ９を標的とするｓｈＲＮＡを発現するパルボウイルスの抗がん活性の改善を確認した。
【００３８】
以下の実施例はより詳細に本発明について説明する。
【００３９】
例１
材料及び方法
プラスミド構築及びウイルス
ｐΔＨ−１ＰＶサイレンサー、ｐΔＨ−１ＰＶｓｈＳＣＲ（スクランブルｓｈＲＮＡを含有する）、ｐΔＨ−１ＰＶｓｈＥＧＦＰ（ＥＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡを備えた）ベクターは以前に記載されている［１９］。ｐΔＨ−１ＰＶサイレンサーは、以下を特色とするＨ−１ＰＶウイルスゲノムを含有する。
（ｉ）ＮＳコーディング領域内の１１４ヌクレオチドのインフレームの欠失（ＮＣＢＩジーンバンク参照配列Ｘ０１４５７．１に従ってヌクレオチド２０２２〜２１３５に及ぶ）［１８］；
ｉｉ）ウイルスが高いレベルのｓｈＲＮＡを発現する一方で、自律的に複製し伝播する能力を維持することを可能にする、Ｈ−１ＰＶゲノムのユニークなＨｐａＩ（ＧＴＴＡＡＣ）制限酵素部位（野生型ウイルスの位置４６８６〜４６９１に対応する）で挿入された、ｓｈＲＮＡ発現カセット（図１）。ｓｈＲＮＡ発現カセットは、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩで事前に消化したプラスミドの中へ直接ライゲーションされるオーバーラップオリゴヌクレオチドを使用してｓｈＲＮＡ配列を容易にクローニングするために、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩの制限酵素部位を含有する。この研究においてｐΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９ａ及びｐΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９ｂの生成のために使用されたオリゴヌクレオチドは以下の通りであった（ｓｈＲＮＡループ配列に下線を引いた）。
Ｃｄｋ９ａセンス（配列ＩＤ：ＸＭ＿０１７０１４１８４．１のＣＤＫ９配列２３５〜２５３にマッチする）
【化１】
2019535297.tif 000002
Ｃｄｋ９ａアンチセンス：
【化２】
2019535297.tif 000003
Ｃｄｋ９ｂセンス（配列ＩＤ：ＸＭ＿０１７０１４１８４．１のＣＤＫ９配列５９４〜６１４にマッチする）
【化３】
2019535297.tif 000004
Ｃｄｋ９ｂアンチセンス：
【化４】
2019535297.tif 000005
【００４０】
ウイルス産生
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０ｍｌの培地（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、スイス）中で２２ｃｍ２ディッシュ中に５．５×１０５細胞／ディッシュの密度で播種した。翌日に、製造者の指示に従って、１：２比（μｇのＤＮＡ：μｌの試薬）でトランスフェクション試薬Ｘ−ｔｒｅｍｅＧｅｎｅ（商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を使用して、ウイルスゲノム（ｐΔＨ−１ＰＶ、ｐΔＨ−１ＰＶｓｈＳＣＲ、ｐΔＨ−１ＰＶｓｈＥＧＦＰ、ｐΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ａ、又はｐΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ｂ）を保有する、１５μｇのプラスミドを、細胞に一過性にトランスフェクションした。細胞をトランスフェクション３日後に収穫し、細胞内のウイルス粒子を３回の凍結融解サイクルを介してＶＴＥバッファー（５０ｍＭのトリスｐＨ８．７、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）中に放出させた。細胞残屑を５，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって除去し、粗製ウイルス抽出物を、５０Ｕ／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ、超高純度グレード）により３７℃で３０分間消化して、カプシド形成されなかったウイルスゲノムを除去した。
【００４１】
ＮＢ３２４Ｋ細胞をウイルスストック増幅のために使用した。細胞を、４０ｍｌの培地中で３×１０６細胞／ディッシュの密度で、１４８ｃｍ２ディッシュ（ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、スイス）中に播種した。翌日に、０．１プラーク形成単位（ＰＦＵ／細胞）の低い感染多重度（ＭＯＩ）、又はいくつかの実験において、１００ウイルスゲノム（Ｖｇ）／細胞で、異なるウイルスバッチ（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるプラスミドトランスフェクションを介して以前に産生した）を、細胞に感染させた。感染の４日後に、細胞変性効果（ＣＰＥ）が細胞単層の８０％に達した場合に細胞を収穫し、粗製ウイルス抽出物を上記のように調製した。
【００４２】
ウイルス粒子の精製
Ｌｅｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．［２６］に従って、ウイルスを精製した。精製したビリオンを小分けにし、−８０℃で保存した。
【００４３】
ウイルスストックの力価測定
ａ）プラークアッセイ
ＮＢ３２４Ｋ細胞を、２２ｃｍ２ディッシュ中に５×１０５細胞／ディッシュの密度で播種した。翌日に、増殖培地を除去し、４００μｌのウイルスストックの連続的な１０倍の希釈物を、細胞に３７℃で１時間感染させた。接種物を除去し、０．６５％のバクトアガー（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）、ＭＥＭ（２×ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンからなる半固形培地を、細胞に重層した。細胞を、５％のＣＯ２で３７℃４日間インキュベーションした。生細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．２ｍｇ／ｍｌのニュートラルレッド、０．８５％のバクトアガーからなるニュートラルレッド染色溶液により、１８時間染色した。プラークをカウントし、力価を１播種細胞あたりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）として表現した。
【００４４】
ｂ）ｑＰＣＲによるウイルスゲノムの定量化
製造者の指示に従ってＱｉａＡｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ｖｉｒｕｓ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用して、ウイルスＤＮＡを抽出した。カプシド形成されたウイルスＤＮＡの定量化を、Ｈ−１ＰＶのＮＳ１遺伝子を標的とする、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって実行した。１４１のヌクレオチドの断片を、フォワードプライマー：５’−ＧＣＧＣＧＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＴ−３’、及びリバースプライマー：５’−  ＣＣＡＣＣＴＧＧＴＴＧＡＧＣＣＡＴＣＡＴ−３’により増幅し、ＮＳ１特異的ＴａｑＭａｎプローブ：５’−６−ＦＡＭ−ＡＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＴＴＡ−ＭＧＢ−３’（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）により検出した。ＮＳ１配列を含有するプラスミドを、１０１〜１０８のコピーの範囲中で連続的な１０倍希釈のスタンダードとして反応のために使用した。ＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）、１０ｐｍｏｌ／μｌの各々のプライマー及びプローブ、ならびに６．７μｌのウイルスＤＮＡ希釈物を含有する反応混合物を、スタンダード条件下で実行し、各々のサンプルについての蛍光の閾値サイクル（ｃｔ）を、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ＥＰ  ｒｅａｌｐｌｅｘ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｈａｍｂｕｒｇ、ドイツ）を使用して、リアルタイムＰＣＲによって決定した［２６］。ウイルス収率の絶対的定量は１播種細胞あたりのウイルスゲノム（Ｖｇ）として計算し表現した。
【００４５】
電子顕微鏡法
ウイルス調製物の定性分析のために、電子顕微鏡写真を撮った。この目的に向けて、５μｌの０．０５％のＢＳＡ溶液を、即時使用可能な炭素コーティング銅グリッド（Ｐｌａｎｏ  ＧｍｂＨ、Ｗｅｔｚｌａｒ、ドイツ）へ添加し、１分間インキュベーションした。次いでグリッドを５μｌのＢｉｄｅｓｔ水により３回洗浄し、２％の酢酸ウラニルにより３０秒間コーティングした。液滴をＷｈａｔｍａｎ  ５０フィルターペーパーによりグリッドから吸収し、グリッドをおよそ１分間乾燥した。画像を、８５，０００×拡大でＺｅｉｓｓ  ＥＭ  ９００透過型電子顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ＧｍｂＨ、Ｊｅｎａ、ドイツ）により取得した。
【００４６】
細胞株
２つのヒトがん細胞株を選択して（すなわち膵臓がんに由来するＡｓＰＣ−１及び前立腺がんに由来するＰＣ３）、ＣＤＫ９に対するｓｈＲＮＡを発現するパルボウイルスの優れた抗がん活性を試験する。これらの細胞株を、以下の理由のために選択した。（ｉ）それらは野生型Ｈ−１ＰＶ細胞毒性に半許容性である（高濃度のウイルスの存在下においてのみ殺傷される）、及び、（ｉｉ）ＣＤＫ９のｓｉＲＮＡ媒介性サイレンシングが細胞死の誘導において有効であったことを、本発明者のパイロットトランスフェクション実験が示した（データ不掲載）。すべての細胞株をＡＴＣＣ（ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ＧｍＢＨ、Ｗｅｓｅｌ、ドイツ）から得て、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）を補足したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた。細胞を５％のＣＯ２及び９２％の湿度で３７℃で増殖させた。Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ＤＫＦＺ  ｃｏｒｅ  ｆａｃｉｌｉｔｙによって、マイコプラズマの混入及び認証について細胞を定期的にチェックした。
【００４７】
定量的ＣＤＫ９  ｍＲＮＡリアルタイムＰＣＲ
ＲＮＡを、製造者の指示に従ってＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）を使用して単離した。１μｇの全ＲＮＡを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ（ＣＡ）及び米国）を使用して、逆転写した。蛍光性ＤＮＡインターカレートレポーター色素のＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎの取り込みを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００  ｑＲＴ−ＰＣＲ  ｃｙｃｌｅｒ（ソフトウェア：７５００  ２．０．３）を使用して検出した。二重測定のためのマスターミックスを、以下に従って調製した。
テンプレートｃＤＮＡ      １μｌ
フォワードプライマー（５μＭ）    ５．１μｌ
リバースプライマー（５μＭ）    ５．１μｌ
Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲｃ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２×）    ４２．５μｌ
脱イオン蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）    ３０．３μｌ
全体積    ８５μｌ
プライマーの配列は以下の通りである：
【化５】
2019535297.tif 000006
【００４８】
反応を、９６ウェルプレート中で１反応あたり２５μｌの最終体積により二重で実行した。Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘは、３００μｌの１０×ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎバッファー、３６０μｌの２５ｍＭのＭｇＣｌ２、２４０μｌのｄＮＴＰ（各々の１０ｍＭ）、１５μｌ  Ｕ／μｌのＨｏｔ  Ｇｏｌｄ  Ｓｔａｒ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及び３０μｌ  Ｕ／μｌのウラシル−Ｎｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅを含有する。相対的遺伝子発現レベルを、参照遺伝子としてのハウスキーピング遺伝子のグリセルアルデヒド−３リン酸塩（ＧＡＰＤＨ）への正規化によってサイクル閾値（Ｃｔ）を介して、決定した。結果を、無感染の細胞（モック）（１に設定した）の転写レベルに比較して倍発現として提示する。倍発現を、以下の式：相対的ｍＲＮＡ発現＝２−（対象となる遺伝子のＣｔ−ＧＡＰＤＨのＣｔ）に従って、ΔΔＣｔ方法（Ｐｆａｆｆｌ，２００１）を使用して計算した。
【００４９】
細胞溶解及びタンパク質定量
細胞を遠心分離によってペレットにし、氷冷ＰＢＳにより一回洗浄した。続いて、ペレットを、１×１０６細胞あたり２０μｌの氷冷溶解バッファー（１０×バッファー；２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のトリトンＸ１００、２．５ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭのβ−グリセロホスフェート、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１μｇ／ｍｌのロイペプチン）中で再懸濁した。溶解物を少なくとも２０分間氷上でインキュベーションした。全細胞溶解物を、卓上遠心分離機中で１０，０００ｒｐｍで４℃で１５分間の遠心分離によって不溶性細胞含有物から透明化した。全細胞溶解物のタンパク質濃度を、製造者の指示に従ってＲｏｔｉ−Ｑｕａｎｔ（登録商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ａｓｓａｙ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅドイツ）を使用して決定した。溶解バッファー中の０〜２μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンの希釈物を、スタンダードとして使用した。１μｌのサンプルを、１ｍｌのＲｏｔｉ−Ｑｕａｎｔ（登録商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄ試薬と混合し、暗所で５分間インキュベーションした。インキュベーション後に、５９５ｎｍでの吸光度を光度計で測定し、濃度をスタンダードカーブに従って決定した。
【００５０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロット分析
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）のために、溶解物（等タンパク質レベルに調整した）を、適切な量の２×又は５×還元ＳＤＳサンプルバッファー［２７］と混合し、９５℃まで５分間加熱した。タンパク質の分離のために、８〜１２％のポリアクリルアミド分離ゲル及び５％のポリアクリルアミド濃縮ゲルを使用した。電気泳動分離を、１．５〜２時間２５〜３０ｍＡの定電流で遂行した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに後続して、タンパク質を、冷却条件下で１．５〜２時間１００Ｖ（約３００ｍＡ）でウェットブロッティングを介してニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎ、英国）へ電気泳動的に移すことによって、ポリアクリルアミドゲルでイムノブロットを行った。その後に、膜を、ロータリーシェーカーでＴＢＳ−Ｔ中の５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳又はＢＳＡにより室温で１時間ブロッキングした。インキュベーション後に、膜をＴＢＳ−Ｔにより３回各々１０分間洗浄した。ＣＤＫ９タンパク質の検出のために、膜を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ、米国）からのＣＤＫ９抗体により１：１０００希釈で４℃で一晩インキュベーションした。スタンダードの対照のために、抗チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１：１０，０００の希釈で室温で１時間使用した。次いで、膜を、ロータリーシェーカー上でＴＢＳ−Ｔにより６回各々１０分間室温で洗浄した。次に、膜を、要求されるＨＲＰコンジュゲート二次抗体により室温で１時間インキュベーションした。続いて、膜をＴＢＳ−Ｔにより３回１０分間洗浄した。最終的に、タンパク質バンドを、Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍにおいてＥＣＬ基質溶液により検出した（ソフトウェア、Ｃｈｅｍｉ−Ｃａｐｔ  ５０００）。
【００５１】
アポトーシスの決定
アポトーシス性細胞死をＮｉｃｏｌｅｔｔｉの方法［２８］に記載のＤＮＡ断片化によって検討した。感染細胞及びモック細胞を、１，５００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集し、２００μｌのＰＢＳにより洗浄し、１，５００ｒｐｍで５分間再び遠心分離した。次いで、細胞を、２００μｌのＮｉｃｏｌｅｔｔｉ溶解バッファー（０．１％（ｗ／ｖ）のクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．１％（ｖ／ｖ）のトリトンＸ−１００、５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピディウム）中で溶解し、４℃で一晩暗所で保存した。ヨウ化プロピディウム染色ＤＮＡ断片を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって定量化した。結果を、以下の式：（％実験のＤＮＡ断片化−％自然発生のＤＮＡ断片化）／（１００−％自然発生のＤＮＡ断片化）×１００に従って、特異的ＤＮＡ断片化％として提示する。
【００５２】
細胞毒性アッセイ
細胞毒性を、ＡｐｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を使用して決定した。生細胞プロテアーゼ活性はインタクトな生存細胞に制限されるものであり、その活性を、蛍光発生性細胞不透過性ペプチド基質（ビス−アラニルアラニル−フェニルアラニル−ローダミン１１０；ビス−ＡＡＦ−Ｒ１１０）を使用して測定して、死細胞のプロテアーゼ活性（それは膜の全体性を損失した細胞から放出される）を測定する。アッセイを、以下の変化により、製造者の指示に従って遂行した。１ウェルあたり異なる量のＰＣ３細胞（１２５０、２５００、５０００）を、１００μｌの培地を含有する９６ウェルアッセイプレート（Ｎｕｎｃ（商標）ＭｉｃｒｏＷｅｌｌ（商標）９６−Ｗｅｌｌ−Ｐｌａｔｔｅ）中に播種した。次の日に、細胞に、１００μｌの培地中の特異的ウイルスを１時間感染させた。感染させた細胞を、追加の７２、９６及び１２０時間培養した。１ウェルあたり２０μｌのＧＦ−ＡＦＣ基質及びビス−ＡＡＦ−Ｒ１１０基質の両方を含有する試薬をすべてのウェルへ添加すること、及び旋回振盪（約３０秒間３００〜５００ｒｐｍ）によって短時間混合することによって、生存率及び細胞毒性を選択したタイムポイントで測定した。プレートを３７℃で３０分間インキュベーションし、蛍光を以下の２つの波長セット：４００Ｅｘ／５０５Ｅｍ（生存率）及び４８５Ｅｘ／５２０Ｅｍ（細胞毒性）で測定した。
【００５３】
同じアッセイにおいて、１ウェルあたり１００μｌのＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ（登録商標）３／７  ｒｅａｇｅｎｔをすべてのウェルへ添加すること（データ不掲載）、及び旋回振盪（約３０秒間３００〜５００ｒｐｍ）によって短時間混合することによって、カスパーゼ活性を検出した。室温で１〜２時間のインキュベーション後に、発光を測定した（集積時間０．５〜１秒）。
【００５４】
細胞生存率アッセイ（＊ＡＴＰレベル）
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を使用して、細胞生存率も９６ウェルフォーマットで査定した。このアッセイは、ＡＴＰの細胞内含有量の測定によって生存細胞の数を決定する。ＡＴＰの量は代謝的に活性のある細胞の量と相関する。アッセイを、以下の変化により、製造者の指示に従って遂行した。１ウェルあたり異なる量のＰＣ３細胞（１２５０、２５００、５０００）を、１００μｌの培地を含有する９６ウェルアッセイプレート（不透明壁のＮｕｎｃ（商標）ＭｉｃｒｏＷｅｌｌ（商標）９６−Ｗｅｌｌ−Ｐｌａｔｔｅ）中に播種した。次の日に、細胞に、１００μｌの選択したウイルスを１時間感染させた。感染させた細胞を、追加の７２、９６及び１２０時間培養した。生存率を、注意深く培地を除去すること、及び１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）試薬（培地により１：１希釈した）を添加することによって、選択したタイムポイントで測定した。次いで、プレートを暗所の旋回振盪機上で室温で５分間インキュベーションして、細胞溶解を誘導した。発光をＯｒｉｏｎ  Ｌ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した（集積時間１．０秒）。
【００５５】
細胞の分裂増殖及び生存率のリアルタイム検出
細胞を、５％のＦＢＳを補足したＤＭＥＭ中で９６ウェルＥプレート（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）中に３×１０３細胞／ウェルの密度で播種した。翌日に、細胞に、増加するＭＯＩのＰＶ又はウイルス希釈バッファー（モック）を感染させた。モック処理細胞及びウイルス感染細胞の増殖を、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国）を使用して、５〜７日間リアルタイムでモニターした。リアルタイム細胞増殖を、正規化した細胞指数（ＣＩ）（１ウェルあたりの接着細胞の数に正比例し、したがって細胞増殖速度と厳密に相関するパラメーター）として、表現した。細胞の分裂増殖をリアルタイムで３０分ごとにモニターした。示された増殖曲線は、３つの重複検体の結果の平均を相対的標準偏差と共に表わす。
【００５６】
動物モデルによる実験
ヒト膵臓がんのＡｓＰＣ−１異種移植ラットモデルによる実験を、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．［２９］中で記載されているように遂行したが、１×１０８ＰＦＵ／動物（１．２５×１０８ＰＦＵ／動物のＭＯＩで使用した野生型Ｈ−１ＰＶを例外として）を等しい４用量に細分し、０、７、１４及び２１日目に腫瘍内注射してウイルス処理を実行したという違いが有った。
【００５７】
例２
ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９の生成
ｐΔＨ−１ＰＶサイレンサーベクターの中へ２つのｓｈＲＮＡ  ＤＮＡ配列を挿入することによって、ｐΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ａ及びｐΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ｂを構築した（図１）［１９］。これらの配列は、ＣＤＫ９遺伝子のサイレンシングに有効なｓｉＲＮＡを同定するために遂行された小規模のｓｉＲＮＡスクリーニングを介して選択された（データ不掲載）。次いで選択したｓｉＲＮＡをｓｈＲＮＡに変換した。ΔＨ−１ＰＶサイレンサーの中へのＣＤＫ９  ｓｈＲＮＡの挿入が、１ラウンドの産生におけるウイルス生活環及び適応度と適合性があったかどうかを、最初にチェックした。典型的には、パルボウイルス産生の第１のステップを、ウイルスゲノムを保有するプラスミドＤＮＡの一過性トランスフェクションによって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において実行する。トランスフェクションの３日後に、細胞を収穫し、溶解し、新しいアセンブルされた子孫ウイルス粒子を溶解物から精製し、リアルタイムｑＰＣＲ及び／又はプラークアッセイによって力価測定した。ウイルス増幅のために、ＮＢ３２４Ｋ細胞をパッケージング細胞株として使用する。これらの細胞に、低ＭＯＩ（０．０１〜１のプラーク形成単位／ｍｌの範囲で）の以前にＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＤＮＡ感染を経由して産生されたウイルスを感染させる。細胞変性が起こる場合に、ウイルスの複製及び放出のための指標は細胞の８０％で検出される。上記のように、細胞を収穫し、ウイルス粒子を精製し、力価測定する。
【００５８】
ｐΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ａプラスミド、ｐΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ｂプラスミドを、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞中に一過性にトランスフェクションした。対照として、ｐＳＲ１９（野生型Ｈ−１ＰＶゲノムを保有する［３０］）、ｐΔＨ−１ＰＶ（ＮＳ領域中で２０２２〜２１３５のインフレームの欠失を特色とするΔＨ−１ＰＶゲノムを保有する）、及びｐΔＨ−１ＰＶｓｈＥＧＦＰ（ＥＧＦＰを標的とするｓｈＲＮＡ配列を含むΔＨ−１ＰＶサイレンサーゲノムを含有する）を使用した。トランスフェクションの３日後に、細胞変性効果（ＣＰＥ）の明らかな徴候はすべてのトランスフェクションした細胞培養において観察され、ウイルス産生が起こっていたことが示された（データ不掲載）。これとは矛盾なく、ウイルスが、細胞溶解物から成功裡に精製された。様々なウイルスの形態における明らかな差は電子顕微鏡法によって観察されなかった（図２Ａ）。得られたプラークのサイズも非常に類似していた（図２Ｂ）。ウイルス収率をｑ−ＰＣＲ及びプラークアッセイによって決定した。以前の結果に一致して、ΔＨ−１ＰＶ及びΔＨ−１ＰＶｓｈＥＧＦＰは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において野生型Ｈ−１ＰＶよりも高いレベルで産生された［１８、１９］（図３Ａ）。興味深いことには、ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ａとΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ｂとの間の産生の差があり、ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ａはΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ｂよりも高い収率で産生されたことも指摘された（図３Ａ）。ＮＢ３２４Ｋ細胞において、すべてのウイルスは、ｑＰＣＲによって遂行した定量化によれば類似する力価で産生された（図３Ｂ、淡灰色のカラム）。しかしながら、これらの結果はプラークアッセイによって完全には確認されず、そこで、野生型Ｈ−１ＰＶ及びΔＨ−１ＰＶは、ΔＨ−１ＰＶｓｈＥＧＦＰ及びΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ａよりも高いレベルで産生された（およそ１対数の差）。産生のさらにより劇的な低減が、ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ｂについて観察され（ΔＨ−１ＰＶと比較しておよそ２対数）（図３Ｂ、暗灰色カラム）、この特定のカセットの挿入がウイルス感染性を損なうことを示唆した。それにもかかわらず、これらの結果は、ＣＤＫ９遺伝子に対するｓｈＲＮＡを発現する感染性のＰＶを産生することが可能であると指摘する。
【００５９】
例３
ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９は遺伝子サイレンシングにおいて有効である
ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ａのサイレンシング効率を評価するために、ＰＣ３細胞に、ΔＨ−１ＰＶ、ΔＨ−１ＰＶｓｈＥＧＦＰ、又はΔＨ−１ＰＶｓｈＳＣＲもしくはΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ａのいずれかを、ＭＯＩ  １及び５  ＰＦＵ／細胞で感染させた。感染後４８及び７２時間後に、細胞を、全ＲＮＡ及びタンパク質抽出のためにそれぞれ収穫した。ｑＲＴ−ＰＣＲを、ＣＤＫ９  ｍＲＮＡの定常状態レベルの分析のために実行した。細胞にΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９ウイルスを感染させた場合に、ＣＤＫ９  ｍＲＮＡのレベルの強い低減が観察された（図４Ａ、データ不掲載）。これらの結果に一致して、全細胞溶解物でのウエスタンブロット分析は、ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９を感染させた細胞においてＣＤＫ９タンパク質レベルの低減を示し、ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９がＣＤＫ９遺伝子発現をサイレンシングさせる能力を有することを確認した（図４Ｂ）。
【００６０】
例４
ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９ウイルスは促進された腫瘍毒性を有する
概念の証明として、ＰＣ３前立腺がん細胞株を使用して、ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ａの腫瘍毒性活性を評価した。この目的に向けて、ＰＣ３細胞に、増加する濃度（ＭＯＩ  １及び５  ＰＦＵ／細胞）のΔＨ−１ＰＶ、ΔＨ−１ＰＶｓｈＳＣＲ、ΔＨ−１ＰＶｓｈＥＧＦＰ、もしくはΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ａを感染させるか、又はウイルス希釈バッファー（モック）により処理した。感染後３日で、ＡｐｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔを使用して細胞膜全体性（ウイルス誘導性細胞溶解）を分析することによって、ウイルス誘導性の細胞毒性を決定した。図５中で示されるように、細胞毒性の増加が、ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ａにより処理した細胞において観察された。ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ａの腫瘍毒性の促進を、断片化ＤＮＡを含有するサブＧ１アポトーシス性細胞集団の検出についてフローサイトメトリーによって細胞を分析することによっても確認した（図６）。これらの結果は、細胞生存率（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）及びウイルス誘導性細胞溶解（ＬＤＨアッセイ）分析によってさらに補強された（データ不掲載）。これとは対照的に、ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ａは健康なドナー（それはウイルス侵入についての能力がある）からの末梢血核細胞に影響せず、ＣＤＫ９に対するｓｈＲＮＡを発現する能力がウイルス安全性プロファイルを変更しなかったという証拠の提供した（データ不掲載）。
【００６１】
最終的に、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ技術を使用して、ＣＤＫ９に対するｓｈＲＮＡを発現するＰＶの細胞毒性の改善を確認した。ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９ａに加えて、そのｓｈＲＮＡがＣＤＫ９遺伝子の異なる領域を標的とするΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ｂの細胞毒性も試験した。図７中で示されるように、ＣＤＫ９遺伝子に対するｓｈＲＮＡを発現するウイルスは、同じ濃度で使用されるΔＨ−１ＰＶ及びΔＨ−１ＰＶｓｈＥＧＦＰよりも細胞の殺傷においてより強力であった。類似する結果が、膵臓がん（すなわちＡｓ−ＰＣ１）からの別のがん細胞株を使用しても得られた（図８）。概して言えば、これらの結果から、ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９ウイルスの優れた腫瘍溶解活性が実証された。
【００６２】
例５
ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９は腫瘍抑制活性を改善した
インビトロで得られたポジティブな結果により、ヒトがんの動物モデルにおけるΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９の腫瘍抑制活性を評価することにした。この目的に向けて、本発明者の研究室において以前に使用したヒト膵臓がんのＡｓＰＣ−１異種移植ヌードラットモデルを使用した［２９］。腫瘍を持つ動物を、ＰＢＳ（モック）、野生型Ｈ−１ＰＶ、ΔＨ−１ＰＶ、又はΔＨ−１ＰＶｓｈＧＦＰ、又はΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ａにより１×１０８ｐｆｕ／動物の濃度で処理し、例外として、野生型Ｈ−１ＰＶは１．２５×１０８ｐｆｕ／動物のＭＯＩで使用した（図９Ａ）。ΔＨ−１ＰＶが腫瘍増殖の遅延において野生型Ｈ−１ＰＶよりも有効であることが見出され、この群の以前の結果が確認される。腫瘍抑制能力のさらなる増加はΔＨ−１ＰＶ−ｓｈＣＤＫ９−ａにより達成され、それは、試験した濃度で、腫瘍増殖の遅延においてΔＨ−１ＰＶ及びΔＨ−１ＰＶ−ｓｈＧＦＰよりも有意に有効であった（Ｐ＜０．０１）（図９Ｂ）。腫瘍毒性の増加も、他の群と比較したΔＨ−１ＰＶ−ｓｈＣＤＫ９−ａ処理動物の全生存率の有意な改善によって反映される（図９Ｃ）。体重減少又は他の明らかな細胞毒性副作用はウイルス処理動物において観察されなかった。結論として、これらの結果は、ΔＨ−１ＰＶｓｈＣＤＫ９−ａは野生型Ｈ−１ＰＶ又はそのΔＨ−１ＰＶ天然変異体よりも優れた抗がん活性を有するという概念の証明を提供し、がん患者におけるこのウイルスの臨床応用を保証する。
【００６３】
例６
Ｈ１−ＰＶ  ｓｈＣＤＫ９は、ヒト前立腺がんの異種移植ラットモデルにおいて腫瘍抑制能力を促進した
ΔＨ−１ＰＶｓｈ−ＣＤＫ９の抗がん活性の促進をさらに検証するために、第２の動物モデル（すなわちヒト前立腺がんのＰＣ３異種移植ラットモデル）を使用した。ΔＨ−１ＰＶｓｈ−ＣＤＫ９−ａの腫瘍抑制能力を、野生型Ｈ−１ＰＶ（臨床試験において試験したウイルス）、親ΔＨ−１ＰＶ（上で記載されるＮＳ１領域の中の欠失を特色とする）、及びΔＨ−１ＰＶｓｈ−ＧＦＰ（ＥＧＦＰ遺伝子に対するｓｈＲＮＡを発現する）のものと比較した。５×１０６の前立腺がん由来ＰＣ３細胞を、５週齢のメスのヌードラットの右脇腹に皮下注射した。１週間後に（腫瘍が２００〜４００ｍｍ３の体積に達した場合に）、腫瘍を持つ動物を、４群へと無作為化した。群を、示されたウイルス又は希釈バッファー（対照）により処理した（０．２５×１０８ｐｆｕ／動物で腫瘍内に一週一回の４用量）。図９の図凡例において記載されるように、腫瘍を測定した。ＣＤＫ９に対するｓｈＲＮＡを発現するウイルスは、他のウイルスがわずかな治療有効性のみを有する条件下で、この前立腺がんモデルにおいても、この腫瘍抑制活性の促進を確認した（図１１Ａ）。すべてのΔＨ−１ＰＶｓｈ−ＣＤＫ９処理動物は全生存率の改善を有し、９匹の動物のうちの２匹の動物はΔＨ−１ＰＶｓｈ−ＣＤＫ９治療によって完全に治癒した（図１０Ｂ）。この抗がん効果は長く、任意の明らかな毒性副作用とも関連しなかった。
参考文献：
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2019535297.tif 000008
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【配列表フリーテキスト】
【００６４】
配列番号１：＜２２３＞ｓｈＲＮＡ
配列番号２：＜２２３＞ｓｈＲＮＡ
配列番号３：＜２２３＞ｓｈＲＮＡ
配列番号４：＜２２３＞ｓｈＲＮＡ
配列番号５：＜２２３＞プライマー
配列番号６：＜２２３＞プライマー
配列番号７：＜２２３＞プローブ
配列番号８：＜２２３＞プライマー
配列番号９：＜２２３＞プライマー
配列番号１０：＜２２３＞プライマー
配列番号１１：＜２２３＞プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019535297.tif 000017
【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
2019535297.tif 000019
【図９Ｃ】
2019535297.tif 000020
【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019535297.tif 000023
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