(57)【要約】  本発明は、抗細菌薬の有効性を評価し、細菌を死滅させる溶解素ポリペプチドを含むポリペプチドの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するための成分、アッセイおよび方法を提供する。血清および血液を含むヒトマトリックス中の溶解素ポリペプチド活性を模倣する正確なＭＩＣ決定を可能にするための補充物を含む、改変された微量液体希釈成分および方法が提供される。
2019514439.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物血清および還元剤を補充したブロス中で抗細菌ペプチドを評価することを含む、グラム陽性細菌の微量液体希釈（ＢＭＤ）感受性試験のための方法。
【請求項２】
ブロスに、１０％動物血清から５０％動物血清の間の濃度で動物血清が補充される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ブロスに、１０％動物血清から３０％動物血清の間の濃度で動物血清が補充される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ブロスに、１５％動物血清から３０％動物血清の間の濃度で動物血清が補充される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ブロスに、２０％動物血清から３０％動物血清の間の濃度で動物血清が補充される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ブロスに、２０％ウマ血清から３０％ウマ血清の間の濃度でウマ血清が補充される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ブロスが、カチオン調整されたブロスである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ブロスが、ミューラー・ヒントンブロス（ＭＨＢ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
還元剤が、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
還元剤の量が、０．１ｍＭから１ｍＭの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
還元剤の量が、０．２５ｍＭから１ｍＭの間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
抗細菌ペプチドが溶解素ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
溶解素ポリペプチドが、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効なＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）またはそのバリアントもしくは誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
溶解素ポリペプチドである抗細菌ペプチドを含み、１種または複数の抗細菌剤をさらに含む組成物を評価するための、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
１種または複数の抗細菌剤が抗生物質である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、抗細菌薬の有効性を評価し、細菌を死滅させる溶解素ポリペプチドを含むポリペプチドの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するための成分、アッセイおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
より多くの抗生物質が広範な種々の病気および他の状態に対して使用されるようになるにつれ、薬物耐性細菌の発生が、医学において主要な問題になっている。新規抗菌薬治療アプローチは、酵素ベースの抗生物質（「エンザイバイオティック（ｅｎｚｙｂｉｏｔｉｃ）」）、例えば、バクテリオファージ溶解素を含む。ファージは、自身の細菌宿主の細胞壁を消化するためにこれらの溶解素を使用し、低張溶解を介してウイルス子孫を放出する。グラム陽性病原体に対するその高い致死活性により、溶解素は、治療剤としての開発のための魅力的な候補になっている（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．  （２００８）  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １１：３９３〜４００（非特許文献１）；Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．Ｌ．ら  （２００１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：４１０７〜４１１２（非特許文献２））。バクテリオファージ溶解素は当初、病原性連鎖球菌の鼻咽頭保菌を根絶するために提唱された（Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，  Ｊ．  Ｍ．ら  （２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４：  ２１７０〜２１７２（非特許文献３）；Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．ら  （２００１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：４１０７〜４１１２（非特許文献２））。
【０００３】
バクテリオファージ溶解性酵素は、種々の投与経路を介した対象における種々の型の感染症の査定および特異的処置において有用であることが確立されている。例えば、米国特許第５，６０４，１０９号（特許文献１）（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら）は、半精製されたＣ群連鎖球菌ファージ関連溶解素酵素による酵素消化を介した、臨床検体におけるＡ群連鎖球菌の迅速な検出に関する。この酵素の研究は、疾患を処置する方法をもたらす、さらなる研究の基礎になっている。ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓの特許（米国特許第５，９８５，２７１号（特許文献２）、米国特許第６，０１７，５２８号（特許文献３）および米国特許第６，０５６，９５５号（特許文献４））は、Ｃ１バクテリオファージが感染したＣ群連鎖球菌細菌によって産生される溶解素酵素の使用を開示している。米国特許第６，２４８，３２４号（特許文献５）（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）は、皮膚組織への外用適用に適切な担体中での溶解性酵素の使用による、皮膚科学的感染症のための組成物を開示している。米国特許第６，２５４，８６６号（特許文献６）（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）は、感染性細菌に特異的な溶解性酵素を投与することを含む、消化管の細菌感染症の処置のための方法を開示している。米国特許第６，２６４，９４５号（特許文献７）（ＦｉｓｃｈｅｔｔｉおよびＬｏｏｍｉｓ）は、その細菌に特異的なバクテリオファージに感染した細菌によって産生される少なくとも１種の溶解性酵素および患者中に溶解性酵素を送達するために適切な担体の非経口導入（筋肉内、皮下または静脈内）による細菌感染症の処置のための方法および組成物を開示している。
【０００４】
米国特許第７，４０２，３０９号（特許文献８）、米国特許第７，６３８，６００号（特許文献９）および公開されたＰＣＴ出願ＷＯ２００８／０１８８５４（特許文献１０）は、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）感染症の処置または低減のための抗細菌剤として有用な特徴的なファージ関連溶解性酵素を提供している。米国特許第７，５６９，２２３号（特許文献１１）は、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に対する溶解性酵素を記載している。腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（バンコマイシン耐性株を含む、フェカリス菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）およびフェシウム菌（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ））に対して有用な溶解素は、米国特許第７，５８２，２９１号（特許文献１２）に記載されている。米国特許出願公開第２００８／０２２１０３５号（特許文献１３）は、Ｂ群連鎖球菌を死滅させるのに高度に有効な変異体Ｐｌｙ  ＧＢＳ溶解素を記載している。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を含むブドウ球菌細菌に対する活性を有する、ＣｌｙＳと示されるキメラ溶解素は、ＷＯ２０１０／００２９５９（特許文献１４）で詳述されている。ブタ連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）から単離され、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、腸球菌およびリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）株を死滅させるのに有効なＰｌｙＳｓ２溶解素は、ＷＯ２０１２／１４５６３０（特許文献１５）および米国特許第９，０３４，３２２号（特許文献１６）に記載されている。
【０００５】
ＰｌｙＳｓ２溶解素（ＣＦ−３０１）は、ＦＤＡが許可した第Ｉ相臨床試験に入り、それを完了した最初の溶解素である。この溶解素は、メチシリン感受性および耐性の黄色ブドウ球菌によって引き起こされる心内膜炎を含む血流感染症を処置するために、標準治療の抗生物質（例えば、バンコマイシンまたはダプトマイシン）と組み合わされ得る。臨床試験を支持して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）が、細菌剤（複数可）を評価し、標準化するために利用される。
【０００６】
微量液体希釈（ＢＭＤ）は、黄色ブドウ球菌単離体に対するＰｌｙＳｓ２／ＣＦ−３０１活性など、溶解素を試験するために使用され得るが、標準的な方法（ＣＬＳＩ方法論）は、信頼できるアッセイではなく、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）などの溶解性ポリペプチドに適用した場合、種々の問題点を実証している。これらの問題には、トレーリング効果、ヒト血液、血清または血漿における感受性発見からの断絶またはバリエーション、および凍結薬物希釈パネルにおける酵素活性の喪失が含まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，６０４，１０９号
【特許文献２】米国特許第５，９８５，２７１号
【特許文献３】米国特許第６，０１７，５２８号
【特許文献４】米国特許第６，０５６，９５５号
【特許文献５】米国特許第６，２４８，３２４号
【特許文献６】米国特許第６，２５４，８６６号
【特許文献７】米国特許第６，２６４，９４５号
【特許文献８】米国特許第７，４０２，３０９号
【特許文献９】米国特許第７，６３８，６００号
【特許文献１０】ＷＯ２００８／０１８８５４
【特許文献１１】米国特許第７，５６９，２２３号
【特許文献１２】米国特許第７，５８２，２９１号
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００８／０２２１０３５号
【特許文献１４】ＷＯ２０１０／００２９５９
【特許文献１５】ＷＯ２０１２／１４５６３０
【特許文献１６】米国特許第９，０３４，３２２号
【特許文献１７】ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／３４４５６
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌｙｓｉｎｓ  ａｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１、３９３〜４００  （２００８）．
【非特許文献２】Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．、Ｌｏｏｍｉｓ，  Ｌ．およびＦｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｐｐｅｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９８、４１０７〜４１１２  （２００１）．
【非特許文献３】Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，  Ｊ．Ｍ．、Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．およびＦｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．  Ｒａｐｉｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４、２１７０〜２１７２  （２００１）．
【非特許文献４】Ｃｈａｐｏｔ−Ｃｈａｒｔｉｅｒ  Ｆｒｏｎｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２２：２０１４
【非特許文献５】Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」  （１９８９）
【非特許文献６】「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻  ［Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｍ．編  （１９９４）］
【非特許文献７】「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻  ［Ｊ．  Ｅ．  Ｃｅｌｉｓ編  （１９９４））］
【非特許文献８】「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻  ［Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．  Ｅ．  編  （１９９４）］
【非特許文献９】「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」  （Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ編  １９８４）
【非特許文献１０】「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」  ［Ｂ．Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編  （１９８５）］
【非特許文献１１】「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」  ［Ｂ．Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編  （１９８４）］
【非特許文献１２】「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」  ［Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  編  （１９８６）］
【非特許文献１３】「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」  ［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）］
【非特許文献１４】Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」  （１９８４）
【非特許文献１５】Ｇｉｌｍｅｒら  ２０１３．  Ｎｏｖｅｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｌｙｓｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｂｒｏａｄ  Ｌｙｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｉｘｅｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．  ５７：２７４３〜２７５０．
【非特許文献１６】Ｄａｎｉｅｌ，  Ａ．ら、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｌｙｓｉｎ  ａｎｄ  ｏｘａｃｉｌｌｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５４、１６０３〜１６１２  （２０１０）．
【非特許文献１７】Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら（１９７４）
【非特許文献１８】Ｇａｒｃｉａら（１９８７）
【非特許文献１９】Ｇａｒｃｉａら（１９９０）
【非特許文献２０】ＣａｌｄｅｎｔｅｙおよびＢａｍｆｏｒｄ（１９９２）
【非特許文献２１】Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、１９９６
【非特許文献２２】Ｌｏｐｅｚら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ３：  １９９〜２１１  （１９９７）
【非特許文献２３】Ｇａｒｃｉａら、Ｇｅｎｅ  ８６：  ８１〜８８  （１９９０）
【非特許文献２４】Ｇａｒｃｉａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：  ９１４〜９１８  （１９８８）
【非特許文献２５】Ｇａｒｃｉａら、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （Ｊ．  Ｊ．  ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＣｕｒｔｉｓ編、１９８７）
【非特許文献２６】Ｌｏｐｅｚら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １００：  ４３９〜４４８  （１９９２）
【非特許文献２７】Ｒｏｍｅｒｏら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７２：  ５０６４〜５０７０  （１９９０）
【非特許文献２８】Ｒｏｎｄａら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６４：  ６２１〜６２４  （１９８７）
【非特許文献２９】Ｓａｎｃｈｅｚら、Ｇｅｎｅ  ６１：  １３〜１９  （１９８７）
【非特許文献３０】Ｍ．  Ｊ．  Ｌｏｅｓｓｎｅｒ、Ｇ．  Ｗｅｎｄｌｉｎｇｅｒ、Ｓ．  Ｓｃｈｅｒｅｒ、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １６、１２３１〜４１．  （１９９５）
【非特許文献３１】Ｈａｔｆｕｌ  Ｇ．  ２０１５．  Ｄａｒｋ  Ｍａｔｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ：  ｔｈｅ  Ａｍａｚｉｎｇ  Ｗｏｒｌｄ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  ８９：８１０７〜１０．
【非特許文献３２】Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．、Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．およびＳｃｈｕｃｈ，  Ｒ．  ２００６．    Ｒｅｉｎｖｅｎｔｉｎｇ  ｐｈａｇｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｐａｒｔｓ  ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ  ｔｈｅ  ｓｕｍ？  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ２４：１５０８〜１１．
【非特許文献３３】Ｓｃｈｕｃｈら  ２０１４．  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｗｉｔｈ  Ｌｙｓｉｎ  ＣＦ−３０１  ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｉｓ  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｏ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ａｌｏｎｅ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．  ２０９：１４６９〜７８．
【非特許文献３４】Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｈａｔ  ｇｒｏｗ  ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ．  第３２巻  （Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＵＳ）、Ｗａｙｎｅ  （ＰＡ）、２０１２）．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ３ｒｄ  Ｅｄ．  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、２０１０）．
【非特許文献３５】Ｗｉｅｇａｎｄら  ２００８．  Ａｇａｒ  ａｎｄ  ｂｒｏｔｈ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  （ＭＩＣ）  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  ３：１６３〜１７５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
溶解素ポリペプチドなどの抗細菌剤を評価するための標準的な微量液体希釈方法と関連する欠陥および問題点を考慮すると、臨床試験および評価に適用され得、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性および効果を適切に模倣するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて細菌感受性を評価するための、有効で信頼性および再現性がある方法が、当該分野で必要とされている。
【００１０】
本明細書の参考文献の引用は、かかる参考文献が本発明の先行技術であることの承認として解釈すべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本出願は、ペプチド、特に抗細菌的に有効なペプチド、特に溶解性ペプチドの最小発育阻止濃度を決定するため、およびその抗細菌死滅有効性を評価するための、独自の成分を利用する改変された方法およびアッセイに関する。
【００１２】
本発明は、抗細菌ペプチド、特に溶解性ペプチドのＭＩＣを決定するための系またはアッセイであって、哺乳動物血清および還元剤を補充したブロスまたは培地を利用して実施される系またはアッセイに関する。本発明のある態様では、哺乳動物または患者、特にヒトにおける抗細菌ペプチド、例えば、溶解性ペプチドまたは溶解素の細菌死滅有効性を正確に反映する、抗細菌ペプチドの細菌死滅有効性を決定するためのアッセイが提供される。
【００１３】
本発明によれば、動物血清および還元剤を補充したブロス中で抗細菌ペプチドを評価することを含む、抗細菌ペプチド、例えば、溶解性ポリペプチドまたは溶解素の細菌死滅活性を決定するための方法であって、死滅活性は、ヒトにおける前記抗細菌ペプチドの細菌死滅を正確に模倣する方法が提供される。本発明のある態様では、抗細菌ペプチド、例えば、溶解性ポリペプチドまたは溶解素は、ウマ血清、イヌ血清、ウサギ血清またはマウス血清および還元剤を補充したブロス中で感受性細菌に対して評価される。本発明のある態様では、抗細菌ペプチド、例えば、溶解性ポリペプチドまたは溶解素は、ウマ血清および還元剤を補充したブロス中で感受性細菌に対して評価される。
【００１４】
本発明によれば、ペプチド、特に抗細菌的に有効なペプチド、特に溶解性ペプチドまたは溶解素ペプチドを試験するための、改変および改善された微量液体希釈（ＢＭＤ）法およびアッセイが提供される。本発明のある態様では、評価のためにブロスまたは培地を利用する、改変されたＢＭＤであって、ブロスまたは培地に、哺乳動物血清および還元剤が補充されるＢＭＤが提供される。
【００１５】
ある態様では、評価のためにブロスまたは培地を利用する、改変されたＢＭＤであって、ブロスまたは培地に、動物血清が補充されるＢＭＤが提供される。ある態様では、評価のためにブロスまたは培地を利用する、改変されたＢＭＤであって、ブロスまたは培地に、脊椎動物血清が補充されるＢＭＤが提供される。ある態様では、評価のためにブロスまたは培地を利用する、改変されたＢＭＤであって、ブロスまたは培地に、哺乳動物血清が補充されるＢＭＤが提供される。ある態様では、評価のためにブロスまたは培地を利用する、改変されたＢＭＤであって、ブロスまたは培地に、ウマ血清、ヒト血清、イヌ血清、ウサギ血清、マウス血清、ウシ血清から選択される動物血清が補充されるＢＭＤが提供される。ある態様では、評価のためにブロスまたは培地を利用する微量液体希釈（ＢＭＤ）方法であって、ブロスまたは培地に、ウマ血清、イヌ血清、ウサギ血清、マウス血清、ウシ血清から選択される動物血清が補充される微量液体希釈（ＢＭＤ）方法が提供される。ある態様では、評価のためにブロスまたは培地を利用する微量液体希釈（ＢＭＤ）方法であって、ブロスまたは培地に、ウマ血清が補充される微量液体希釈（ＢＭＤ）方法が提供される。
【００１６】
本発明のＢＭＤ方法のある態様では、ブロスまたは培地に、哺乳動物血清および還元剤が補充される。ある態様では、ブロスまたは培地に、ウマ血清および還元剤が補充される。ある態様では、還元剤は、ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。ある態様では、還元剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）である。
【００１７】
ある態様では、細菌発育に適切なブロスまたは培地に、哺乳動物血清および還元剤が補充される。ある態様では、カチオン調整されたブロスまたは培地に、哺乳動物血清および還元剤が補充される。ある態様では、カチオン調整されたブロスまたは培地に、ウマ血清および還元剤が補充される。ある態様では、還元剤は、ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。ある態様では、還元剤は、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）である。
【００１８】
補充のための血清の量は、ヒト血清との比較によって決定され得る。補充される血清の量は、１０％血清から８０％血清の間であり得る。ある態様では、補充される血清の量は、１０％血清から６０％血清の間であり得る。ある態様では、補充される血清の量は、１０％血清から５０％血清の間であり得る。ある態様では、補充される血清の量は、１５％血清から４０％血清の間であり得る。ある態様では、補充される血清の量は、１５％血清から３０％血清の間であり得る。ある態様では、補充される血清の量は、２０％血清から３０％血清の間であり得る。ある態様では、補充される血清の量は、約２５％血清であり得る。ある態様では、補充される血清の量は、２０％血清から３０％血清の間である。ある態様では、補充される血清の量は、約２５％血清である。ある態様では、補充される血清の量は、２５％動物血清である。ある態様では、補充される血清の量は、約２５％ウマ血清である。
【００１９】
ある態様では、ブロスまたは培地に、ウマ血清および還元剤が補充される。ある態様では、ブロスまたは培地に、約２０％〜３０％ウマ血清および還元剤が補充される。ある態様では、ブロスまたは培地に、約２５％ウマ血清および還元剤が補充される。ある態様では、ブロスまたは培地に、２５％ウマ血清および還元剤が補充される。ある態様では、カチオン調整されたブロスに、ウマ血清および還元剤が補充される。ある態様では、カチオン調整されたブロスに、約２０％〜３０％ウマ血清および還元剤が補充される。ある態様では、カチオン調整されたブロスに、２５％ウマ血清および還元剤が補充される。
【００２０】
ある態様では、細菌発育に適切なブロスまたは培地に、２５％ウマ血清およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）が補充される。ある態様では、カチオン調整されたミューラー・ヒントンブロス（ＣＡ−ＭＨＢ）に、２５％ウマ血清およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）が補充される。ある態様では、カチオン調整されたミューラー・ヒントンブロス（ＣＡ−ＭＨＢ）に、２５％ウマ血清およびトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）が補充される。ある態様では、カチオン調整されたミューラー・ヒントンブロス（ＣＡ−ＭＨＢ）に、２５％ウマ血清および０．５ｍＭ  ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）が補充される。
【００２１】
ある態様では、還元剤の量は、０．１ｍＭから１０ｍＭの間である。ある態様では、還元剤の量は、０．１ｍＭから５ｍＭの間である。ある態様では、還元剤の量は、０．１ｍＭから２ｍＭの間である。ある態様では、還元剤の量は、０．１ｍＭから１ｍＭの間である。ある態様では、還元剤の量は、０．１ｍＭから０．９ｍＭの間である。ある態様では、還元剤の量は、０．１ｍＭから０．６ｍＭの間である。ある態様では、還元剤の量は、０．２ｍＭから０．６ｍＭの間である。ある態様では、還元剤の量は、０．３ｍＭから０．６ｍＭの間である。ある態様では、還元剤の量は、０．４ｍＭから０．６ｍＭの間である。ある態様では、還元剤の量は、約０．５ｍＭである。ある態様では、還元剤の量は、０．２５ｍＭから１ｍＭの間である。ある態様では、還元剤の量は、１ｍＭ未満である。
【００２２】
ある実施形態では、本発明のアッセイおよび方法は、溶解性ポリペプチドの査定および分析において使用される。本発明のある態様では、補充物（複数可）を用いるＢＭＤ方法は、連鎖球菌細菌に対して活性な溶解性ポリペプチドの細菌死滅有効性を決定する際に利用される。本発明のある態様では、補充物（複数可）を用いるＢＭＤ方法は、連鎖球菌およびブドウ球菌細菌に対して活性な溶解性ポリペプチドの細菌死滅有効性を決定する際に利用される。本発明のある態様では、補充物（複数可）を用いるＢＭＤ方法は、連鎖球菌細菌に対して活性な溶解性ポリペプチドのＭＩＣ試験において利用される。本発明のある態様では、補充物（複数可）を用いるＢＭＤ方法は、ブドウ球菌細菌に対して活性な溶解性ポリペプチドのＭＩＣ試験において利用される。本発明のある態様では、補充物（複数可）を用いるＢＭＤ方法は、連鎖球菌およびブドウ球菌細菌に対して活性な溶解性ポリペプチドのＭＩＣ試験において利用される。本発明のある態様では、補充物（複数可）を用いるＢＭＤ方法は、グラム陽性細菌に対する溶解性ポリペプチドのＭＩＣ試験において利用される。本発明のある態様では、補充物（複数可）を用いるＢＭＤ方法は、グラム陽性細菌の１つよりも多い種に対する溶解性ポリペプチドのＭＩＣ試験において利用される。グラム陽性細菌は、連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌およびリステリア細菌から選択され得る。
【００２３】
ある態様では、本発明の成分、方法またはアッセイは、グラム陽性細菌に対する、例えば、ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド（ＣＦ−３０１）またはそのバリアントもしくは誘導体でありこれを含む溶解性ポリペプチドを評価するために利用される。ある態様では、本発明の成分、方法またはアッセイは、抗生物質耐性細菌に対する、ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド（ＣＦ−３０１）またはそのバリアントもしくは誘導体を含む溶解性ポリペプチドを評価するために利用される。ある態様では、本発明の成分、方法またはアッセイは、連鎖球菌およびブドウ球菌細菌に対する、ＰｌｙＳｓ２ポリペプチド（ＣＦ−３０１）またはそのバリアントもしくは誘導体を含む溶解性ポリペプチドを評価するために利用される。ある態様では、本発明の成分、方法またはアッセイは、抗生物質耐性連鎖球菌および／またはブドウ球菌細菌に対するＰｌｙＳｓ２ポリペプチド（ＣＦ−３０１）またはそのバリアントもしくは誘導体を含む溶解性ポリペプチドを評価するために利用される。ある態様では、溶解性ポリペプチドは、ＰｌｙＳｓ２またはその誘導体もしくはバリアントである。ある態様では、このポリペプチドは、図１に提供される配列（配列番号１）を含む。
【００２４】
ウマ血清などの哺乳動物血清を含めることは、ペプチド、特に溶解性ポリペプチド、特に、例示的な溶解性ポリペプチドＰｌｙＳｓ２が、アッセイブロスまたは培地単独中よりも、ヒト血清／血液（ならびに、ウマを含む一部の他の哺乳動物種の血清／血液）中で活性が高いという、本明細書に記載される知見に従う。ポリペプチド、特に、例示的な溶解性ポリペプチドＰｌｙＳｓ２が、血清が添加されていないカチオン調整されたブロス中よりも、ヒト血清／血液（ならびに、ウマを含む一部の他の種の血清／血液）中で顕著に活性が高いことが見出された。抗細菌ポリペプチド、特に、例示的な溶解性ポリペプチドＰｌｙＳｓ２は、血清が添加されていないブロス、例えば、カチオン調整されたブロス中よりも、ヒト血清／血液（ならびに、ウマを含む一部の他の種の血清／血液）中で活性が高い（特に、最大で３２倍〜６４倍活性が高い）。ＣＡ−ＭＨＢ中に２５％で補充した場合、ウマ血清は、トレーリング効果を防止し、１００％ヒト血清において得られるものとほぼ同一のＭＩＣ値を可能にする。ＤＴＴの補充は、溶解素ポリペプチドを安定化するように機能し、ＭＩＣ決定のための凍結マイクロブロス希釈パネルの使用を可能にする。ＤＴＴは、貯蔵の間またはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの状況下での、酵素の酸化および不活性化を防止するために使用される一般的な還元剤である。
【００２５】
本発明のある態様では、連鎖球菌またはブドウ球菌細菌に由来するバクテリオファージ溶解素が、本発明の方法および組成物において利用される。本明細書および図１（配列番号１）に提供される、本発明において使用される例示的な溶解素ポリペプチド（複数可）、特にＰｌｙＳｓ２溶解素は、複数の細菌、特に、ブドウ球菌、連鎖球菌、腸球菌およびリステリア細菌株を含むグラム陽性細菌に対する広い死滅活性を実証することにおいて並ぶものがない。かかる一態様では、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、本明細書で実証されるように、黄色ブドウ球菌株および細菌を死滅させることが可能である。ある態様では、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、ブドウ球菌および連鎖球菌細菌を死滅させることが可能である。ＰｌｙＳｓ２は、抗生物質耐性黄色ブドウ球菌、例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、ダプトマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＤＲＳＡ）およびリネゾリド耐性黄色ブドウ球菌（ＬＲＳＡ）に対して有効である。ＰｌｙＳｓ２は、バンコマイシン中等度耐性感受性の黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）に対して有効である。
【００２６】
単離されたＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドは、グラム陽性細菌を死滅させるのに有効な、図１に提供されるアミノ酸配列、または図１のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性もしくは９９％の同一性を有するそのバリアントを含み得る。単離されたＰｌｙＳｓ２溶解素ポリペプチドは、ブドウ球菌および連鎖球菌細菌を死滅させるのに有効な、図１に提供されるアミノ酸配列、または図１のポリペプチドに対して少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性もしくは９９％の同一性を有するそのバリアントを含み得る。
【００２７】
任意のかかる上記の１つまたは複数の方法では、細菌は、黄色ブドウ球菌、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、スタフィロコッカス・シムランス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｍｕｌａｎｓ）、ブタ連鎖球菌、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ストレプトコッカス・エクイ・ズー（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｚｏｏ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（ＧＢＳ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（ＧＡＳ）、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｇ群連鎖球菌、Ｅ群連鎖球菌、フェカリス菌および肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）から選択され得る。
【００２８】
本発明の方法のいずれかによれば、細菌は、抗生物質耐性細菌であり得る。細菌は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン中等度耐性感受性の黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、ダプトマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＤＲＳＡ）またはリネゾリド耐性黄色ブドウ球菌（ＬＲＳＡ）であり得る。感受性細菌は、特にヒトにとって、臨床的に関連するまたは病原性の細菌であり得る。この方法（複数可）のある態様では、溶解素ポリペプチド（複数可）は、ブドウ球菌、連鎖球菌、腸球菌およびリステリア細菌株を死滅させるのに有効である。
【００２９】
本明細書に提供される方法および組成物のさらなる態様または実施形態では、別の別個のブドウ球菌特異的溶解素が、単独で、または本明細書に提供および記載されるＰｌｙＳｓ２溶解素と組み合わせて、本明細書で使用される。本明細書に提供される方法および組成物のかかる一態様または実施形態では、ブドウ球菌特異的溶解素ＣｌｙＳが、単独で、または本明細書に提供および記載されるＰｌｙＳｓ２溶解素と組み合わせて、本明細書で使用される。
【００３０】
他の目的および利点は、以下の例示的な図面を参照して進む以下の説明の再検討から、当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】（Ａ）示された活性部位残基、ならびにＣＨＡＰファミリー触媒ドメインおよびＳＨ３ファミリー細胞壁結合ドメインを含むドメイン構造を有する、ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）溶解素ポリペプチドのアミノ酸配列；ならびに（Ｂ）予測された３次元構造（Ｉ−ＴＡＳＳＥＲによる表示）を示す図である。
【図２】（Ａ）黄色ブドウ球菌中の細胞壁標的；（Ｂ）構造的安定性に必要なペプチドグリカン網目構造中のブドウ球菌細胞壁におけるＤ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｙ結合の切断（Ｃａｐｏｔ−Ｃｈａｒｔｉｅｒ、Ｆｒｏｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２２：２１０４から適応させた）；ならびに（Ｃ）細胞壁加水分解および浸透圧溶解を示す図である。（Ｃ）では、ペプチドグリカン加水分解が、細菌の浸透圧溶解を生じることが示される。（Ｃ）は、未処理の細菌、ＣＦ−３０１を添加して１５秒後の細菌（１５秒）、およびＣＦ−３０１を添加して１５分後の細菌を提供する。
【図３】ＢＭＤアッセイにおけるトレーリングおよび血液効果の例を提供する図である。（Ａ）トレーリングまたはイーグル効果は、ＭＨＢＩＩ中での正確なＭＩＣ決定を曖昧にする。（Ｂ）黄色ブドウ球菌株による血液効果が示される。利用したヒト血清（ＨｕＳ）および血漿（ＨｕＰ）は、以下の通りである：ＨｕＳ１＝プールされた雄性ＡＢ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ；ＨｕＳ２＝プールされた正常、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ；ＨｕＳ３＝正常個体、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ；ＨｕＳ４＝プールされた雄性ＡＢ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ。
【図４】３０の黄色ブドウ球菌株のセットに対する感受性試験結果を示す図である。特定のアッセイ方法と関連する問題点が示される。
【図５】黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ  ２９２１３およびフェカリス菌ＡＴＣＣ  ２９２１２を評価するための、１４の異なる供給源由来の２５％ウマ血清を用いる新たな方法を使用する、ＰｌｙＳｓ２／ＣＦ３０１のＢＭＤ分析の結果の作表を示す図である。
【図６】新たなＢＭＤ方法論を使用する凍結ＣＦ−３０１試料に対するＭＩＣ決定の時間経過を提供する図である。
【図７】異なる条件下でのＭＲＳＡ株ＡＴＣＣ  ２９２１３のＭＩＣアッセイを示す図である。（Ａ）ＭＨＢＩＩ単独（ＭＩＣ＝１６μｇ／ｍｌ、僅かなトレーリング効果を伴う）；（Ｂ）１００％ヒト血清（ＭＩＣ＝１μｇ／ｍｌ）；および（Ｃ）ＭＨＢＩＩ、２５％ウマ血清、０．５ｍＭ  ＤＴＴ（ＭＩＣ＝０．５μｇ／ｍｌ）。
【図８】２５％ウマ血清および０．５ｍＭ  ＤＴＴを含むＣＡ−ＭＨＢ中の黄色ブドウ球菌株ＡＴＣＣ  ７００６９９のＭＩＣアッセイ（ＭＩＣ＝１μｇ／ｍｌ）を示す図である。
【図９】ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、表皮ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア、肺炎連鎖球菌およびフェカリス菌を含む種々の感受性グラム陽性細菌に対する、ウマ血清およびＤＴＴを補充したＢＭＤ方法論を使用する、ＣＦ−３０１  ＭＩＣ活性の評価を示す図である。
【図１０】補充なしの標準的なＣＡＭＨＢブロスを用いる方法と比較した、改変されたＢＭＤ方法を使用して査定したバンコマイシン活性を示す図である。ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ株を含む種々の黄色ブドウ球菌株を評価した。
【図１１】（Ａ）黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ  ２９２１３および（Ｂ）フェカリス菌ＡＴＣＣ  ２９２１２を用いた、５日間にわたる、２５％ウマ血清および０．５ｍＭ  ＤＴＴを含むＭＨＢ  ＩＩを使用するＢＭＤ分析に基づくＭＩＣ決定の品質管理分析を提供する図である。株１つ当たり５つの複製物を、連続する日に分析した。２つの異なる実験室Ｌａｂ  １およびＬａｂ  ２における評価の比較が示される。バンコマイシンおよびオキサシリンを、それぞれ、ＣＡ−ＭＨＢおよびＣＡ−ＭＨＢ＝２％食塩水中で対照薬剤として使用した。
【図１２】（Ａ）種々の量のウマ血清補充物（１２．５％〜３０％）および（Ｂ）変動する量の還元剤ＤＴＴ補充物（０〜１ｍＭ）を評価する範囲発見研究を示す図である。品質は、暗い色調またはより明るい色調のいずれかとして示される。暗い場合、その方法は、トレーリング効果、高いＭＩＣ値（ヒト血清（ＨｕＳ）と比較した）または凍結できないことに基づいて、不適格とした。より明るい色調は、その方法が、ＨｕＳ様レベルの活性を提供することを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明によれば、当業者の技術範囲内の従来の分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術が使用され得る。かかる技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：    Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」  （１９８９）（非特許文献５）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻  ［Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．  Ｍ．編  （１９９４）］（非特許文献６）；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻  ［Ｊ．  Ｅ．  Ｃｅｌｉｓ編  （１９９４））］（非特許文献７）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」第Ｉ〜ＩＩＩ巻  ［Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．  Ｅ．  編  （１９９４）］（非特許文献８）；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」  （Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ編  １９８４）（非特許文献９）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」  ［Ｂ．Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編  （１９８５）］（非特許文献１０）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」  ［Ｂ．Ｄ．  ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編  （１９８４）］（非特許文献１１）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」  ［Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  編  （１９８６）］（非特許文献１２）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」  ［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）］（非特許文献１３）；Ｂ．  Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」  （１９８４）（非特許文献１４）を参照のこと。
【００３３】
従って、本明細書に出現する場合、以下の用語は、以下に示される定義を有するものとする。
【００３４】
用語「ＰｌｙＳｓ溶解素（複数可）」、「ＰｌｙＳｓ２溶解素」、「ＰｌｙＳｓ２」、「ＣＦ−３０１」、「ＣＦ３０１」および具体的に列挙されていない任意のバリアントは、本明細書で互換的に使用され得、本出願および特許請求の範囲を通じて使用される場合、単一または複数のタンパク質を含むタンパク質性材料を指し、本明細書に記載され、図１および配列番号１に示されるアミノ酸配列データ、ならびに本明細書および特許請求の範囲に示される活性のプロファイルを有するタンパク質に拡張される。従って、実質的に等価なまたは変更された活性を示すタンパク質も、同様に企図される。これらの改変は、例えば、部位特異的変異誘発を通じて得られた改変など、意図的であり得、または複合体もしくはその指名されたサブユニットの産生体である宿主における変異を通じて得られたものなど、偶発的であり得る。また、用語「ＰｌｙＳｓ溶解素（複数可）」、「ＰｌｙＳｓ２溶解素」、「ＰｌｙＳｓ２」、「ＣＦ−３０１」、「ＣＦ３０１」は、それらの範囲内に、本明細書に具体的に列挙されるタンパク質、ならびに全ての実質的に相同なアナログ、断片またはトランケーション、および対立遺伝子バリエーションを含むものとする。ＰｌｙＳｓ２溶解素は、米国特許第９，０３４，３２２号（特許文献１６）およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／３４４５６（特許文献１７）に記載されている。Ｇｉｌｍｅｒらもまた、ＰｌｙＳｓ２溶解素を記載している（Ｇｉｌｍｅｒ  ＤＢら  （２０１３）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２０１３年４月９日に電子出版［ＰＭＩＤ  ２３５７１５３４］（非特許文献１５））。
【００３５】
用語「ＣｌｙＳ」、「ＣｌｙＳ溶解素」とは、黄色ブドウ球菌を含むブドウ球菌細菌に対する活性を有するキメラ溶解素ＣｌｙＳを指し、これは、ＷＯ２０１０／００２９５９（特許文献１４）に詳述され、Ｄａｎｉｅｌら（Ｄａｎｉｅｌ，  Ａら  （２０１０）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５４（４）：１６０３〜１６１２（非特許文献１６））にも記載されている。ＣｌｙＳの例示的なアミノ酸配列は、配列番号２に提供される。
【００３６】
「溶解性酵素」または「溶解性ポリペプチド」には、適切な条件下で、適切な期間の間に、１つまたは複数の細菌を死滅させる細菌細胞壁溶解性酵素が含まれる。溶解性酵素の例には、限定なしに、種々のアミダーゼ細胞壁溶解性酵素が含まれる。特定の態様では、溶解性酵素とは、バクテリオファージ溶解性酵素を指す。「バクテリオファージ溶解性酵素」とは、バクテリオファージから抽出もしくは単離される溶解性酵素、または溶解性酵素の機能性を維持する類似のタンパク質構造を有する合成された溶解性酵素を指す。
【００３７】
溶解性酵素または溶解性ポリペプチドは、細菌細胞壁を破壊するために、細菌細胞のペプチドグリカン中に存在する結合を特異的に切断することが可能である。細菌細胞壁ペプチドグリカンは、ほとんどの細菌間で高度に保存されており、少数のみの結合の切断が、細菌細胞壁を破壊し得ることがまた、現在推論されている。これらの結合を切断する溶解性酵素の例は、ムラミダーゼ、グルコサミニダーゼ、エンドペプチダーゼまたはＮ−アセチル−ムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼである。Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉら（１９７４）（非特許文献１７）は、Ｃ１連鎖球菌ファージ溶解素酵素がアミダーゼであることを報告した。Ｇａｒｃｉａら（１９８７、１９９０）（非特許文献１８）（非特許文献１９）は、Ｃｐ−１ファージ由来の肺炎連鎖球菌からのＣｐｌ溶解素がリゾチームであることを報告した。ＣａｌｄｅｎｔｅｙおよびＢａｍｆｏｒｄ（１９９２）（非特許文献２０）は、φ６シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ファージ由来の溶解性酵素が、メソ−ジアミノピメリン酸（ｍｅｌｏ−ｄｉａｍｉｎｏｐｉｍｉｌｉｃ  ａｃｉｄ）およびＤ−アラニンによって形成されるペプチド架橋を開裂するエンドペプチダーゼであることを報告した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＴ１およびＴ６ファージ溶解性酵素は、リステリア・ファージ由来の溶解性酵素（ｐｌｙ）と同様、アミダーゼである（Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、１９９６）（非特許文献２１）。細菌細胞壁を切断することが可能な、当該分野で公知の他の溶解性酵素もまた存在する。
【００３８】
「バクテリオファージによって遺伝的にコードされる溶解性酵素」には、例えば、宿主細菌に対する少なくとも一部の細胞壁溶解性活性を有することによって、宿主細菌を死滅させることが可能なポリペプチドが含まれる。このポリペプチドは、ネイティブ配列の溶解性酵素およびそのバリアントを包含する配列を有し得る。このポリペプチドは、種々の供給源から、例えば、バクテリオファージ（「ファージ」）から単離され得、または組換えもしくは合成方法によって調製され得る。このポリペプチドは、例えば、カルボキシル末端側にコリン結合部分を含み得、アミノ末端側に細胞壁ペプチドグリカンを切断することが可能な酵素活性（例えば、ペプチドグリカン中のアミド結合に対して作用するアミダーゼ活性）を特徴とし得る。ＰｌｙＧＢＳ溶解素などの、複数の酵素活性、例えば、２つの酵素ドメインを含む溶解性酵素が記載されている。さらに、１つの触媒ドメインのみを含有し細胞壁結合ドメインを含まない他の溶解性酵素が記載されている。
【００３９】
「ネイティブ配列ファージ関連溶解性酵素」には、細菌ゲノム（即ち、プロファージ）に由来する酵素と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。かかるネイティブ配列酵素は、単離され得、または組換えもしくは合成手段によって産生され得る。
【００４０】
用語「ネイティブ配列酵素」は、その酵素の天然に存在する形態（例えば、選択的スプライシングされたまたは変更された形態）および天然に存在するバリアントを包含する。本発明の一実施形態では、ネイティブ配列酵素は、ブタ連鎖球菌に特異的なバクテリオファージ由来の遺伝子によって遺伝的にコードされる成熟または全長ポリペプチドである。もちろん、Ｌｏｐｅｚら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ３：  １９９〜２１１  （１９９７）（非特許文献２２）；Ｇａｒｃｉａら、Ｇｅｎｅ  ８６：  ８１〜８８  （１９９０）（非特許文献２３）；Ｇａｒｃｉａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：  ９１４〜９１８  （１９８８）（非特許文献２４）；Ｇａｒｃｉａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：  ９１４〜９１８  （１９８８）（非特許文献２４）；Ｇａｒｃｉａら、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  （Ｊ．  Ｊ．  ＦｅｒｒｅｔｔｉおよびＣｕｒｔｉｓ編、１９８７）（非特許文献２５）；Ｌｏｐｅｚら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １００：  ４３９〜４４８  （１９９２）（非特許文献２６）；Ｒｏｍｅｒｏら、Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７２：  ５０６４〜５０７０  （１９９０）（非特許文献２７）；Ｒｏｎｄａら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １６４：  ６２１〜６２４  （１９８７）（非特許文献２８）およびＳａｎｃｈｅｚら、Ｇｅｎｅ  ６１：  １３〜１９  （１９８７）（非特許文献２９）などの刊行物において認識されるように、いくつかのバリアントが可能であり、公知である。これらの参考文献の各々の内容、特に、配列表、および配列相同性についての陳述を含む、配列を比較する関連のテキストは、それらの全体が参照により具体的に組み込まれる。
【００４１】
「バリアント配列溶解性酵素」には、溶解性酵素のものとは異なるが機能的活性を保持するポリペプチド配列を特徴とする溶解性酵素が含まれる。溶解性酵素は、一部の実施形態では、図１に提供される本明細書に提供される例示的な溶解素ＰｌｙＳｓ２のように、溶解性酵素配列（複数可）と特定のアミノ酸配列同一性を有するＰｌｙＳｓ２の場合と同様、ブタ連鎖球菌などの細菌に特異的なバクテリオファージによって遺伝的にコードされ得る。例えば、一部の実施形態では、機能的に活性な溶解性酵素は、細菌の細胞壁を破壊することによって、本明細書に示されるものを含む、ブタ連鎖球菌細菌および本明細書に提供される他の感受性細菌を死滅させ得る。活性な溶解性酵素は、図１に提供される本明細書の溶解性酵素配列（複数可）と、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９または９９．５％のアミノ酸配列同一性を有し得る。かかるファージ関連溶解性酵素バリアントには、例えば、１つもしくは複数のアミノ酸残基が付加された、または図１に提供される本明細書の溶解性酵素配列（複数可）の配列のＮ末端もしくはＣ末端において欠失された、溶解性酵素ポリペプチドが含まれる。
【００４２】
特定の態様では、ファージ関連溶解性酵素は、ネイティブファージ関連溶解性酵素配列と、少なくとも約８０％または８５％のアミノ酸配列同一性、特に、少なくとも約９０％（例えば、９０％）のアミノ酸配列同一性を有する。最も特には、ファージ関連溶解性酵素バリアントは、ネイティブファージ関連溶解性酵素配列（複数可）と、少なくとも約９５％（例えば、９５％）のアミノ酸配列同一性を有する。溶解素ＰｌｙＳｓ２についての例示的なファージネイティブ配列は、図１に提供される。
【００４３】
同定されたファージ関連溶解性酵素配列に関して、「パーセントアミノ酸配列同一性」は、同じリーディングフレームで配列をアラインし、必要に応じて、最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後、任意の保存的置換を配列同一性の一部として考慮せずに、ファージ関連溶解性酵素配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として、本明細書で定義される。
【００４４】
「ポリペプチド」には、直線様式で連結された複数のアミノ酸から構成されるポリマー分子が含まれる。ポリペプチドは、一部の実施形態では、天然に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされる分子に対応し得る。ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸が、類似の特性を有するアミノ酸によって置き換えられる保存的置換を含み得、かかる保存的置換は、そのポリペプチドの機能を変更しない。
【００４５】
用語「変更された溶解性酵素」には、シャフルされたおよび／またはキメラの溶解性酵素が含まれる。
【００４６】
特異的ファージに感染した細菌に特異的なファージ溶解性酵素は、問題の細菌の細胞壁を効果的かつ効率的に破壊することが見出されている。溶解性酵素は、タンパク質分解酵素活性を欠くと考えられ、従って、細菌細胞壁の消化の間に存在する場合、哺乳動物のタンパク質および組織に対して非破壊的である。さらに、ファージ溶解性酵素の作用は、抗生物質とは異なり、標的病原体（複数可）に対してかなり特異的であることが見出されているので、正常なフローラが本質的にインタクトなままである可能性が高い（参照により本明細書に組み込まれるＭ．  Ｊ．  Ｌｏｅｓｓｎｅｒ、Ｇ．  Ｗｅｎｄｌｉｎｇｅｒ、Ｓ．  Ｓｃｈｅｒｅｒ、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １６、１２３１〜４１．  （１９９５）（非特許文献３０））。実際、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、独自に広い細菌種および株の死滅を実証するものの、本明細書に記載されるように、大腸菌を含む正常なフローラを構成する細菌に対して、比較的および特に、不活性である。
【００４７】
本発明において使用される溶解性酵素またはポリペプチドは、特定のバクテリオファージに感染した後の細菌生物によって産生され得、または感染症の症状を有する他者に曝露された人の具合が悪くなるのを防止するための予防的処置として、もしくは感染から既に病気になった人に対する治療的処置として、組換えまたは合成によって産生または調製され得る。溶解素ポリペプチド配列および溶解素ポリペプチドをコードする核酸が、本明細書に記載され言及されることを考慮して、溶解性酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）は、好ましくは、本明細書に例示されるものを含む当該分野の標準的な方法を使用して、ファージゲノム由来の溶解性酵素の単離された遺伝子を介して、この遺伝子をトランスファーベクター中に配置し、前記トランスファーベクターを発現系中にクローニングすることによって産生され得る。溶解性酵素（複数可）またはポリペプチド（複数可）は、トランケートされた、キメラの、シャフルされた、または「天然の」ものであってもよく、組み合わせてもよい。関連の米国特許第５，６０４，１０９号（特許文献１）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。「変更された」溶解性酵素は、いくつかの方法で産生され得る。好ましい実施形態では、ファージゲノム由来の変更された溶解性酵素の遺伝子は、トランスファーまたは可動性ベクター、好ましくはプラスミド中に配置され、このプラスミドは、発現ベクターまたは発現系中にクローニングされる。本発明の溶解素ポリペプチドまたは酵素を産生するための発現ベクターは、大腸菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、またはいくつかの他の適切な細菌に適切であり得る。ベクター系は、無細胞発現系であってもよい。遺伝子または遺伝子のセットを発現するこれらの方法は全て、当該分野で公知である。溶解性酵素は、ブタ連鎖球菌に特異的なバクテリオファージをブタ連鎖球菌に感染させることによっても創出され得、前記少なくとも１種の溶解性酵素は、他の、例えば天然のまたは片利共生の細菌フローラの存在に対して、多くても最小限の影響しか有さずに、前記ブタ連鎖球菌の細胞壁を排他的に溶解する。
【００４８】
本明細書に記載される実施形態のタンパク質またはペプチド断片の生物学的に活性な部分には、本開示の溶解素タンパク質のアミノ酸配列と十分に同一なまたはそれに由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれ、これは、溶解素タンパク質の全長タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、対応する全長タンパク質の少なくとも１つの活性を示す。典型的には、生物学的に活性な部分は、対応するタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。例えば、図１に示されるように、ＰｌｙＳｓ２溶解素は、Ｎ末端ＣＨＡＰドメインおよびＣ末端ＳＨ３ドメインを含む。タンパク質またはタンパク質断片の生物学的に活性な部分は、例えば、１０、２５、５０、１００少ないまたは多いアミノ酸長のポリペプチドであり得る。さらに、タンパク質の他の領域が欠失または付加される他の生物学的に活性な部分は、組換え技術によって調製され得、これらの実施形態のポリペプチドのネイティブ形態の機能的活性のうち１つまたは複数について評価され得る。
【００４９】
変異は、アミノ酸配列において、または図１に示される溶解素配列を含む本明細書の方法において使用されるポリペプチドおよび溶解素をコードする核酸配列において、またはそれらの活性断片もしくはトランケーションにおいて作成され得、その結果、特定のコドンは、異なるアミノ酸をコードするコドンに変化され、アミノ酸は別のアミノ酸に置換され、または１つもしくは複数のアミノ酸が欠失される。かかる変異は一般に、最も少ないアミノ酸またはヌクレオチド変化を可能にすることによって作成される。この種類の置換変異は、非保存的様式で（例えば、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から別の分類に属するアミノ酸へとコドンを変化させることによって）、または保存的様式で（例えば、特定のサイズまたは特徴を有するアミノ酸の分類に属するアミノ酸から同じ分類に属するアミノ酸へとコドンを変化させることによって）、得られたタンパク質中のアミノ酸を変化させるために作成され得る。かかる保存的変化は一般に、得られたタンパク質の構造および機能における変化をあまりもたらさない。非保存的変化は、得られたタンパク質の構造、活性または機能を変更する可能性がより高い。本発明は、得られたタンパク質の活性または結合特徴を顕著には変更させない保存的変化を含む配列を含むとみなすべきである。
【００５０】
かかる変異体またはそのバリアントは、ブドウ球菌、連鎖球菌、リステリアもしくは腸球菌細菌を含む細菌を死滅させる、および／または本明細書に記載され、特に提供される溶解素（複数可）と同等な活性を有する機能について予測され得、あるいはそのような機能または能力について試験され得る。従って、変化は、溶解素の配列に対してなされ得、配列中に変化を有する変異体またはバリアントは、例中のものを含む、本明細書に記載および例示されるアッセイおよび方法を使用して試験され得る。当業者は、本明細書の溶解素（複数可）のドメイン構造に基づいて、合理的な保存的または非保存的置換を含む置換もしくは置き換えに適切な１つもしくは複数の、１つもしくはいくつかのアミノ酸、および／または置換もしくは置き換えに適切でない１つもしくは複数のアミノ酸を予測できる。
【００５１】
ＰｌｙＳｓ２溶解素は、ブドウ球菌、連鎖球菌、リステリアまたは腸球菌細菌を含むグラム陽性細菌の多数の別個の株および種を死滅させる活性および能力を示す。特に、意味のあることに、ＰｌｙＳｓ２は、黄色ブドウ球菌、特に、抗生物質感受性および別個の抗生物質耐性株の両方を含むブドウ球菌株を死滅させるのに活性である。ＰｌｙＳｓ２は、連鎖球菌株を死滅させるのにも活性であり、特に、Ａ群およびＢ群の連鎖球菌株に対する有効な死滅を示す。細菌に対するＰｌｙＳｓ２溶解素の能力は、単離された株を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｌｏｇ死滅査定に基づいて、以下の表１に示される。本明細書に提供される感受性細菌は、ＭＩＣ値を決定および比較するために、本発明の改変されたＢＭＤ方法において使用され得る。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は一般に、含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）の意味で使用され、即ち、１つまたは複数の特色または成分の存在を許容する。
【００５４】
用語「から本質的になる」とは、より大きい産物に共有結合していない、規定された数の残基の産物、特にペプチド配列を指す。しかし、本発明のペプチドの場合、当業者は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に対する軽微な改変、例えば、保護基などを付加するための末端の化学的改変、例えば、Ｃ末端のアミド化が企図され得ることを理解する。
【００５５】
用語「単離された」とは、本発明の溶解素ポリペプチド（複数可）またはかかるポリペプチドをコードする核酸が本発明に従うという状態を指す。ポリペプチドおよび核酸は、それらが天然に関連する材料、例えば、それらの天然の環境、またはそのような調製がｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで実施される組換えＤＮＡ技術による場合にはそれらが調製される環境（例えば、細胞培養物）において見出される他のポリペプチドまたは核酸を、含まないまたは実質的に含まない。ポリペプチドおよび核酸は、希釈剤またはアジュバントを用いて製剤化され得、さらに実用目的のために単離され得る−例えば、ポリペプチドは通常、ポリマーもしくは粘膜付着剤（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ）もしくは他の担体と混合され、または診断もしくは治療に使用される場合、薬学的に許容可能な担体もしくは希釈剤と混合される。
【００５６】
本発明で提供される方法および適用において使用される溶解性酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）を含む治療組成物または医薬組成物は、本明細書の方法において利用され得るまたは本明細書の方法に含まれ得る。治療組成物または医薬組成物は、１種または複数の溶解性ポリペプチド（複数可）を含み得、１種または複数の抗生物質と組み合わせて、任意選択で適切な賦形剤、担体またはビヒクルと組み合わせて、天然、トランケートされた、キメラまたはシャフルされた溶解性酵素を任意選択で含む。本発明は、細菌感染症または関連の状態を含む、グラム陽性細菌の死滅、軽減、除菌、予防または処置における使用のための抗生物質と組み合わせた、ＰｌｙＳｓ２を含む溶解素の治療組成物または医薬組成物の評価を含む。本発明は、バンコマイシン、リネゾリドまたはダプトマイシンと組み合わせた、ＰｌｙＳｓ２を含む溶解素の治療組成物または医薬組成物の評価を含む。
【００５７】
治療組成物中に含まれる酵素（複数可）またはポリペプチド（複数可）は、未変更のファージ関連溶解性酵素（複数可）、トランケートされた溶解性ポリペプチド、バリアント溶解性ポリペプチド（複数可）、ならびにキメラおよび／またはシャフルされた溶解性酵素の、１つもしくは複数のまたは任意の組み合わせであり得る。さらに、同じ細菌の処置のために、異なるファージによって遺伝的にコードされる異なる溶解性ポリペプチド（複数可）が使用され得る。これらの溶解性酵素は、「未変更の」溶解性酵素またはポリペプチド、トランケートされた溶解性ポリペプチド（複数可）、バリアント溶解性ポリペプチド（複数可）、ならびにキメラおよびシャフルされた溶解性酵素の任意の組み合わせであってもよい。連鎖球菌、ブドウ球菌、腸球菌およびリステリアを含むグラム陽性細菌に対する治療組成物または医薬組成物中の溶解性酵素（複数可）／ポリペプチド（複数可）は、単独で、もしくは抗生物質と組み合わせて使用され得、または処置すべき他の侵襲性細菌生物が存在する場合、標的化されている他の細菌に特異的な他のファージ関連溶解性酵素と組み合わせて使用され得る。溶解性酵素、トランケートされた酵素、バリアント酵素、キメラ酵素および／またはシャフルされた溶解性酵素は、ホリンタンパク質と組み合わせて使用され得る。ホリンタンパク質の量もまた変動され得る。種々の抗生物質が、任意選択で、酵素（複数可）またはポリペプチド（複数可）と共に、リゾスタフィンの存在ありもしくはなしで、治療組成物中に含まれ得る。１種よりも多い溶解性酵素またはポリペプチドが、治療組成物中に含まれ得る。
【００５８】
医薬組成物は、化学合成またはＤＮＡ組換え技術によって産生された、そのアイソザイム、アナログまたはバリアントを含む、１種または複数の変更された溶解性酵素もまた含み得る。特に、変更された溶解性タンパク質は、アミノ酸置換、欠失、トランケーション、キメラ化、シャッフリング、またはそれらの組み合わせによって産生され得る。医薬組成物は、１種または複数の天然溶解性タンパク質および１種または複数のトランケートされた、バリアント、キメラまたはシャフルされた溶解性タンパク質の組み合わせを含有し得る。医薬組成物はまた、１種または複数の補完的薬剤、および薬学的に許容可能な担体または希釈剤の任意選択の添加を伴って、同じまたは異なる細菌種に由来する少なくとも１種の溶解性タンパク質のペプチドまたはペプチド断片を含有し得る。
【００５９】
治療組成物または医薬組成物は、感受性グラム陽性細菌によって引き起こされる病気を処置するために、種々の担体と組み合わせて溶解性ポリペプチド（複数可）を含み得る。担体は、等張性および化学的安定性を増強する物質などの微量の添加剤を適切に含有する。かかる材料は、使用される投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、これには、緩衝液、例えば、リン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸および他の有機酸またはそれらの塩；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；グリシン；アミノ酸、例えば、グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジンまたはアルギニン；セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロースまたはデキストリンを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール；対イオン、例えば、ナトリウム；非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート、ポロキサマーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ならびに／あるいは中性塩が含まれる。グリセリンまたはグリセロール（１，２，３−プロパントリオール）は、医薬使用のために市販されている。ＤＭＳＯは、多くの局所的に適用される薬物の浸透を増強する顕著な能力を有する非プロトン溶媒である。担体ビヒクルは、特に、静脈内溶液が調製される場合、リンゲル溶液、緩衝溶液およびデキストロース溶液もまた含み得る。
【００６０】
溶解性酵素／ポリペプチド（複数可）は、溶解性酵素／ポリペプチド（複数可）の活性を可能にするｐＨを有する環境中になければならない。安定化緩衝液は、溶解素酵素／ポリペプチド（複数可）の最適な活性を可能にし得る。安定化緩衝液はまた、金属キレート試薬、例えば、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩であり得るまたはそれを含み得、あるいはリン酸もしくはクエン酸−リン酸緩衝液、または別の適切な緩衝液もまた含有し得る。
【００６１】
用語「薬剤」は、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、化学化合物および小分子を含む、任意の分子を意味する。特に、用語薬剤には、試験化合物、添加されたさらなる化合物（複数可）、または溶解素酵素化合物などの化合物が含まれる。
【００６２】
用語「アゴニスト」とは、最も広い意味で、そのリガンドが結合する受容体を刺激するリガンドを指す。
【００６３】
用語「アッセイ」とは、化合物の具体的な特性を測定するために使用される任意のプロセスを意味する。「スクリーニングアッセイ」とは、化合物のコレクションから、それらの活性に基づいて化合物を特徴付けまたは選択するために使用されるプロセスを意味する。
【００６４】
用語「防止すること」または「防止」とは、疾原体に曝露され得る対象、または疾患の発生に先立ってその疾患になる素因がある対象における、疾患または障害を獲得または発症する危険性の低減（即ち、疾患の臨床症状のうち少なくとも１つが発症しないようにすること）を指す。
【００６５】
用語「予防」は、用語「防止」と関連し、この用語中に包含され、疾患を処置または治癒させるのではなく、防止することをその目的とした、手段または手順を指す。予防手段の非限定的な例には、ワクチンの投与；例えば、不動に起因して血栓症の危険性がある入院患者への低分子量ヘパリンの投与；およびマラリアが風土性であるまたはマラリアに接触する危険性が高い地理的領域への訪問に先立つ、クロロキンなどの抗マラリア剤の投与が含まれ得る。
【００６６】
「治療有効量」とは、医師または他の臨床医によって求められる対象の生物学的または医学的応答を惹起する、薬物、化合物、抗菌薬、抗体、ポリペプチドまたは医薬品の量を意味する。特に、グラム陽性細菌感染症およびグラム陽性細菌の発育に関して、用語「有効量」は、殺菌的および／または静菌的効果を有することを含む、グラム陽性細菌の量またはその感染症の程度における生物学的に意味のある減少をもたらす化合物または薬剤の有効量を含む意図である。語句「治療有効量」は、感染性細菌の発育もしくは量、または病理の他の特色、例えば、その存在および活性に伴い得る上昇した熱または白血球数などにおける臨床的に顕著な変化を、少なくとも約３０パーセント、より好ましくは少なくとも５０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセント、防止および好ましくは低減させるのに十分な量を意味するために本明細書で使用される。
【００６７】
任意の疾患または感染症の用語「処置すること」または「処置」とは、一実施形態では、疾患または感染症を寛解させること（即ち、疾患、または感染性因子もしくは細菌の発育を停止させること、あるいはその臨床症状のうち少なくとも１つの顕在化、程度または重症度を低減させること）を指す。別の実施形態では、「処置すること」または「処置」とは、対象によって識別可能でない場合がある少なくとも１つの身体的パラメーターを寛解させることを指す。なお別の実施形態では、「処置すること」または「処置」とは、身体的に（例えば、識別可能な症状の安定化）、生理学的に（例えば、身体的パラメーターの安定化）、またはその両方のいずれかで、疾患または感染症をモジュレートすることを指す。さらなる実施形態では、「処置すること」または「処置」は、疾患の進行を遅延させることまたは感染症を低減させることに関する。
【００６８】
用語「グラム陽性細菌」、「グラム陽性細菌」、「グラム陽性」および具体的に列挙されていない任意のバリアントは、本明細書で互換的に使用され得、本出願および特許請求の範囲を通じて使用される場合、公知の、ならびに／あるいは特定の細胞壁および／もしくは細胞膜特徴の存在によって、および／またはグラム染色を用いて染色することによって同定され得る、グラム陽性細菌を指す。グラム陽性細菌は、公知であり、容易に同定され得、リステリア属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、腸球菌属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属から選択され得るがこれらに限定されず、任意のおよび全ての認識されたまたは認識されていないその種または株が含まれる。本発明のある態様では、ＰｌｙＳ溶解素感受性グラム陽性細菌には、リステリア、ブドウ球菌、連鎖球菌および腸球菌のうち１つまたは複数から選択される細菌が含まれる。
【００６９】
グラム陽性細菌は、ポリペプチドおよび多糖を含有する細胞壁によって取り囲まれている。グラム陽性細菌には、アクチノミセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、バチルス属、リステリア属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、腸球菌属、マイコバクテリウム属、コリネバクテリウム属およびクロストリジウム属が含まれるがこれらに限定されない。医学的に関連する種には、化膿性連鎖球菌、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌およびフェカリス菌が含まれる。芽胞形成性であるバチルス種は、炭疽病および胃腸炎を引き起こす。芽胞形成性クロストリジウム種は、ボツリヌス中毒、破傷風、ガス壊疽および偽膜性大腸炎の原因となる。コリネバクテリウム種は、ジフテリアを引き起こし、リステリア種は、髄膜炎を引き起こす。
【００７０】
用語「殺菌的」とは、細菌細胞を死滅させることが可能であることを指す。
【００７１】
用語「静菌的」とは、発育中の細菌細胞を阻止することを含め、細菌発育を阻止することが可能であることを指す。
【００７２】
語句「薬学的に許容可能な」とは、生理学的に忍容され、典型的には、ヒトに投与した場合にアレルギーまたは類似の望ましくない反応、例えば、胃の不調、眩暈などを生じない、分子実体および組成物を指す。
【００７３】
用語「還元剤」は、別の物質に還元を受けさせ、プロセスにおいて酸化される物質を指し、それを含む。還元剤は、酵素またはタンパク質を還元状態に維持し、その酸化を防止するように機能し得る。ある態様では、還元剤は、一定期間にわたるまたは異なる条件下での貯蔵を伴う場合を含め、ポリペプチドまたは酵素の安定性を維持する。
【００７４】
当業者は、確立または認識された還元剤、特に、臨床アッセイを含むアッセイにおいて使用されるもの、およびかかるアッセイにおける使用のために許容されるものを承知している。還元剤の例には、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ４）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）、ジボラン、βメルカプトエタノール（ＢＭＥ）および水素化ジイソブチルアルミニウム（ＤＩＢＡＬ−Ｈ）が含まれる。
【００７５】
本発明の方法およびアッセイにおける使用および適用に適切なブロスまたは培地に、当業者に受容され当業者に公知の、細菌の発育および維持のためのブロスもしくは培地、または広範な種々の微生物の培養において使用され得る任意のかかる一般的な目的の培地が含まれ、本明細書で利用および／または記載されるブロスまたは培地が含まれるがこれらに限定されない。例示的なブロスまたは培地に、抗菌薬感受性試験のための定量的手順に適切なカチオン調整されたブロスが含まれる。
【００７６】
本発明は、本発明の例示として提供される以下の非限定的な例を参照して、よりよく理解され得る。以下の例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために提示されているが、本発明の広い範囲を限定するとは決して解釈すべきではない。
例１
【００７７】
溶解素は、従来の抗生物質に対する新規代替法を提供する抗菌酵素である。溶解素は、バクテリオファージによってコードされ、自然の状況において細菌を死滅させるために使用されるタンパク質である。生物圏中には、約１０３１のファージが存在し、ファージは、１日に全ての細菌のうちおよそ３分の１を死滅させ、溶解素タンパク質ファミリーは、宿主細菌を死滅させるための主要な手段である（Ｈａｔｆｕｌ  ＧＦ  （２０１５）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８９（１６）：８１０７〜８１１０）（非特許文献３１）。精製された溶解素は、「外からの溶菌（ｌｙｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｗｉｔｈｏｕｔ）」と呼ばれる現象を示し（Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ  ＶＡ  ら  （２００１６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２４：１５０８〜１５１１（非特許文献３２））、合成組換え製造のために修正可能である。精製された溶解素は、細胞壁加水分解を介して、接触すると強力な溶菌効果を示す。溶解素ポリペプチドは、典型的には、２０〜３０ｋＤａのタンパク質である。
【００７８】
ＰｌｙＳｓ２溶解素（ＣＦ−３０１としても示される）は、米国においてヒト臨床試験に進んだ最初で唯一の溶解素を示す。ＣＦ−３０１は、黄色ブドウ球菌菌血症に対してＦＤＡによってファーストトラックステータスが与えられ、第Ｉ相は２０１５年に完了した。ＰｌｙＳｓ２は、ブタにおけるブタ連鎖球菌によって保有されるプロファージに元々由来した。ＰｌｙＳｓ２溶解素は、黄色ブドウ球菌の抗生物質耐性株、例えば、メチシリンおよびバンコマイシン耐性および感受性株（ＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、ＶＲＳＡ、ＶＩＳＡ）、ダプトマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＤＲＳＡ）ならびにリネゾリド耐性黄色ブドウ球菌（ＬＲＳＡ）を含む、臨床的に重要なグラム陽性細菌の種々の株を死滅させることが実証されている。ＰｌｙＳｓ２は、比較的広いが規定された種死滅活性を有するという点で独自の溶解素であり、天然の腸内フローラ中の細菌に対して不活性でありながら、細菌、特に、ブドウ球菌、連鎖球菌、腸球菌およびリステリア細菌株を含むグラム陽性細菌の複数の種を死滅させることができる。
【００７９】
臨床グレードのＰｌｙＳｓ２／ＣＦ−３０１は、大腸菌において組換え産生されており、広いｐＨ（ｐＨ６〜９．７）および温度（１６〜５５℃）範囲にわたって活性である（Ｇｉｌｍｅｒら  （２０１３）  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５７：２７４３〜２７５０（非特許文献１５）；Ｓｃｕｃｈら  （２０１４）  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０９：１４６９〜７８（非特許文献３３））。これは、血液、血清、血漿、唾液、滑液、肺サーファクタントおよび気管支肺胞洗浄液を含む種々のヒトマトリックスにおいて活性である。ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）のアミノ酸配列および構造は、図１に提供される。
【００８０】
ＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）は、黄色ブドウ球菌を含む感受性細菌の細胞壁を標的化する。これは、細胞壁ペプチドグリカン中のＤ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｙ結合を標的化し、細胞壁のＤ−アラニン（ステムペプチド）とＬ−グリシン（架橋）との間を切断する、システイン−ヒスチジンアミノペプチダーゼである（図２）。細菌溶解は迅速である（図２Ｃ）。ＣＦ−３０１は、規定された種特異性を有し、メチシリン、バンコマイシン、ダプトマイシン、リネゾリド抗生物質に対して耐性の細菌である、ＭＳＳＡ、ＭＲＳＡ、ＶＲＳＡ、ＤＲＳＡおよびＬＲＳＡを含む抗生物質耐性細菌を死滅させる（Ｓｃｈｉｃｈ  Ｒら  （２０１４）  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０９：１４６９〜１４７８）（非特許文献３３）。死滅は迅速かつ強力であり、溶解性ペプチドに対する低い耐性プロファイルが見られる。ＣＦ−３０１は、バイオフィルムを根絶し、持続性細菌（ｐｅｒｓｉｓｔａｎｔ  ｐａｃｔｅｒｉａ）を死滅させる。抗生物質との相乗作用が観察されている。
【００８１】
臨床試験設定に含まれる細菌に対する溶解性ポリペプチドの効果の、再現性があり一貫した評価を提供するために、本発明者らは、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の文書Ｍ０７−Ａ９（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｉｌｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｈａｔ  ｇｒｏｗ  ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ．  第３２巻  （Ｗａｙｎｅ  ［ＰＡ］：  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ［ＵＳ］、２０１２（非特許文献３４））に記載されるような標準に従って、種々の方法を評価し、ＢＭＤ方法の変更である微量液体希釈（ＢＭＤ）法を開発した。
【００８２】
本発明者らは、以下の３つの主要な問題を含む、特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）を含む溶解性ポリペプチドのＭＩＣ決定における問題をなくすために、標準的なＣＬＳＩ方法論を改変すべきであることを見出した：１）トレーリング効果；２）ヒト血液、血清または血漿における感受性発見からの別個の断絶；および３）凍結薬物希釈パネルにおける酵素活性の喪失。広範なアッセイ開発の後、正確で再現性がありロバストな感受性試験を提供する、改変されたＢＭＤ方法が開発された。この新たな方法は、ＣＬＳＩ標準を可能な限り厳密に遵守し、慣用的な臨床実験室における使用のために最適化される。
【００８３】
例えばＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）でありこれを含む溶解性ポリペプチドは、感受性試験に課題を提示している。ＰｌｙＳｓ２／ＣＦ−３０１は、物理的特徴、作用様式および代謝に関して抗生物質とは別個の、大きい溶菌酵素である。いくつかの因子が、正確な感受性試験を妨げ得る：化合物のサイズ（２６ｋＤａ）および電荷（９．２のｐＩ）は、固体表面上での拡散を制限する；チオール基（活性部位システイン）は、酸化および不活性化され得る（ＭＨＢ中での半減期は、約５時間である）；正味の正の荷電は、ポリスチレン表面への「固着」を媒介する（ポリプロピレンにはそれほどではない）；微量液体希釈（ＢＭＤ）を使用した、黄色ブドウ球菌株の約７０％についてのトレーリング（またはイーグル）効果；ＣＡ−ＭＨＢ（６４μｇ／ｍｌのＭＩＣ９０）とヒト血液／血清／血漿（ＭＩＣ９０＝１μｇ／ｍｌ）との間のＭＩＣ断絶。従って、代替的なＢＭＤ方法が、例えばＰｌｙＳｓ２／ＣＦ−３０１でありこれを含む溶解性ポリペプチドについての正確な感受性試験を可能にするために求められた。
【００８４】
標準的なＣＬＳＩ  ＢＭＤアッセイにおけるトレーリングおよび血液効果の問題点の例を、図３に示す。黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ  ７００６９９の標準的なＢＭＤ分析を、ＣＡ−ＭＨＢ（図３Ａ）およびヒト血液マトリックス（図３Ｂ）において実施した。トレーリングまたはイーグル効果は、標準的なブロスであるミューラー・ヒントンブロスＩＩ（ＭＨＢＩＩ）における正確なＭＩＣ決定を曖昧にすることが見出された（図３Ａ）。これらの標準的な条件下でのＭＩＣ値は６４μｇ／ｍｌであるが、最大で５１２μｇ／ｍｌのトレーリングおよびイーグル効果が観察された。ＣＦ−３０１は、ＭＨＢＩＩ中よりも、ヒト血液、血漿および血清中ではるかに強力であることが見出された（図３Ｂ）。ヒト血液中でのＭＩＣ値は、１μｇ／ｍｌである。従って、ＭＨＢＩＩは、感受性試験にとって十分でないこと、および標準的な微量液体希釈試験に対する補充物または改変は、ヒトマトリックス中でのＭＩＣ値と類似のＭＩＣ値の達成を補助し得ることが実証された。
【００８５】
２つの改変されたＢＭＤ方法が、ＰｌｙＳｓ２／ＣＦ−３０１を試験するために当初開発された。第１の方法では、主要な改変は、ポリプロピレンプレートを使用し、ＭＨＢＩＩに１ｍＭ  ＤＴＴを補充したことであった。ＤＴＴ（ＤＬ−ジチオスレイトール）は、酵素を還元状態で維持するために使用される一般的な分子生物学の試薬である。この暫定的な方法を使用して、２２３の現代の臨床ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ株を試験したところ、ＭＩＣ９０＝８μｇ／ｍｌ（範囲＝１〜１６μｇ／ｍｌ）が決定された。この手順は、ポリプロピレンの使用、ヒト血液ＭＩＣ値からの残存する断絶、および凍結パネルに関する問題に起因して、暫定的であった。
【００８６】
次の方法を決定するために、優れた方法、ポリスチレンプレートおよびＣＡ−ＭＨＢを利用した。３０の黄色ブドウ球菌株のパネルを、ヒト血液様活性を支持し、凍結パネルの使用を可能にする能力について、多数の手順上のバリエーションおよび補充物（ＡＳＴ性能に影響を与えることが公知）を使用してスクリーニングした。以下を評価した：
異なる動物血清（５〜５０％）−イヌ、ウサギ、ウマ、マウス血清
溶血（Ｌａｋｅｄ）ウマ血液（１〜５％）
ＤＴＴ（０．０５〜５ｍＭ）
動物血清（５〜５０％）＋ＤＴＴ（０．５ｍＭ）
Ｔｗｅｅｎ  ８０（０．００２％）
ＢＳＡ（０．０５〜０．５％）
ＮａＣｌ（１〜５％）
ＢＳＡ  ０．１％、ＮａＣｌ  ２％、２００ｒｐｍ２で撹拌
ＢＳＡ  ０．１％、ＮａＣｌ  ２％
ＣａＣｌ２（５０μｇ／ｍｌまで）
ＭｇＣｌ２（５０μｇ／ｍｌまで）
ＣａＣｌ２（５０μｇ／ｍｌまで）＋ＭｇＣｌ２（５０μｇ／ｍｌまで）
ＴＣＥＰ（０．０１〜５ｍＭ）
種々のブロスおよび培地−ＬＢ、ＴＳＢ、ＢＨＩ、１／４ＭＨＢ、１／２ＭＨＢ
ｐＨ、接種材料および大気のバリエーション
【００８７】
手順上のバリエーションからの結果を、表２中で以下に提供する。
【００８８】
【表２】
2019514439.tif 000004
【００８９】
上記評価に基づいて、新たなＢＭＤ方法のための補充物を決定した。ヒト血清様レベルの活性を可能にし、凍結溶解素ポリペプチド（ＣＦ−３０１）希釈パネルの使用を可能にする、ウマ血清および還元剤（ＤＴＴ）を利用した。特に、２５％ウマ血清および０．５ｍＭ  ＤＴＴを、満足のいくＭＩＣ結果のために補充した。３０の黄色ブドウ球菌株のセットに対する関連する感受性試験結果を、図４に作表する。凍結−解凍のために、−７０℃で２４時間凍結させた示された培地においてＣＦ−３０１について標準的な２倍希釈スキームを利用し、その後、解凍し、細菌を添加し、ＭＩＣを決定した。利用したＢＭＤ方法論を、以下に提供される手順においてさらに詳述する。
【００９０】
ウマ血清／ＤＴＴ法を検証するために、種々のＢＭＤ条件および供給源を使用する、新鮮なおよび解凍したＣＦ−３０１希釈パネルを、２５の黄色ブドウ球菌株に対して査定した。条件および供給源の改変は、以下の通りであった：
２人の異なる個人が実施した連続５日間の分析
ウマ血清の種々の供給源（Ｓｉｇｍａ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｇｉｂｃｏ、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、ＲＡＭＢＩＯ、ＡＴＣＣ、Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉａ、Ｌａｍｐｉｒｅ）
粉末ＣＡ−ＭＨＢ／ＭＨＢ  ＩＩ（ＢＤおよびＳｉｇｍａ）および予め作製された液体ＭＨＢ  ＩＩ（ＢＤおよびＴｅｋｎｏｖａ）の各々の種々の供給源
ＤＴＴの複数の供給源（Ｓｉｇｍａ（液体、粉末）、Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
周囲空気中で３０〜３７℃の発育温度、５％ＣＯ２中３７℃、最大で２００ｒｐｍのプレート撹拌
７．４±０．６の最終／最適な培地ｐＨ範囲を決定した。
５×１０５±１−ｌｏｇ１０の最終／最適な接種材料（ＣＦＵ／ｍｌ）範囲
【００９１】
供給源および条件評価の一部の例示的な結果を、表３、４および５中で以下に提供する。ウマ血清の１４の異なる供給源を使用する、連続５日間の黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ  ２９２１３およびフェカリス菌ＡＴＣＣ  ２９２１２のＢＭＤ分析を比較する研究を、図５に提供する。
【００９２】
【表３】
2019514439.tif 000005
【００９３】
【表４】
2019514439.tif 000006
【００９４】
【表５】
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【００９５】
試験した全ての改変は、０．５／１μｇ／ｍｌ（範囲＝０．２５〜２）のＭＩＣ５０／９０からの≦２倍の相違を生じた。また、−８０℃でのＣＦ−３０１パネルの延長されたインキュベーションは、有意な影響を有さなかった（現在のところ最大で３６５日間アッセイした）（表６）。凍結試料の活性の時間経過を、図６に提供する。
【００９６】
【表６】
2019514439.tif 000008
【００９７】
ＭＨＢＩＩ単独を使用する、１００％ウマ血清単独を使用する、ならびにウマ血清およびＤＴＴを補充したＢＨＢＩＩ中でのＭＩＣアッセイを、異なる条件下でＭＲＳＡ株ＡＴＣＣ  ２９２１３を使用して実施した（図７）。ＭＨＢＩＩ単独は、僅かなトレーリング効果を伴って、１６μｇ／ｍｌのＭＩＣを与えた。１００％ヒト血清中でのＢＭＤアッセイは、ＭＩＣ＝１μｇ／ｍｌを与え、２５％ウマ血清、０．５ｍＭ  ＤＴＴを補充したＭＨＢＩＩ中では、ＭＩＣは、０．５μｇ／ｍｌのＭＩＣで、ヒト血清のものと近かった。
【００９８】
０．２５％ウマ血清および０．５ｍＭ  ＤＴＴを補充したＣＡ−ＭＨＢにおいて新たな方法を使用して黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ  ７００６９を分析する類似のＭＩＣアッセイは、ヒト血清のものを模倣する、トレーリングまたはイーグル効果のないことおよび１μｇ／ｍｌのＭＩＣを示した（図８）。
【００９９】
２５％ウマ血清、０．５ｍＭ  ＤＴＴを補充したＭＨＢＩＩを使用するＢＭＤ方法をさらに評価するために、ＭＳＳＡおよびＭＲＳＡ臨床単離体の大きいセットを評価し、ＭＩＣ決定について１００％ヒト血清と比較した。この分析を、表皮ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア、肺炎連鎖球菌およびフェカリス菌を含む、ＰｌｙＳｓ２溶解素（ＣＦ−３０１）に対して感受性であることが以前に実証された種々のグラム陽性病原体（Ｓｃｈｉｃｈら  （２０１４）  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０９：１４６９〜１４７８）（非特許文献３３）にも拡張した。結果を図９に示す。新たな方法論を使用した場合、ＣＦ−３０１は、活性のそのスペクトルを維持する。
【０１００】
標準的な抗生物質バンコマイシンを、改変されたＢＭＤ方法で評価した。ＭＩＣ５０、ＭＩＣ９０および範囲は、標準的なＣＡ−ＭＨＢ対ウマ血清およびＤＴＴを補充したＣＡ−ＭＨＢを使用して等価であった（図１０）。
【０１０１】
新たなＢＭＤ方法をさらに評価するための試みにおいて、他者による結果の繰り返し性を確認するために、本発明者らの実験室および補助的な場所であるＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＭＩ；Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ、ＯＲ）を含む別個の試験場所で、分析を実施した。査定に使用したＱＣ株は、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ  ２９２１３およびフェカリス菌ＡＴＣＣ  ２９２１２を含んだ。２５％ウマ血清および０．５ｍＭ  ＤＴＴを含むＭＨＢ  ＩＩを使用するＢＭＤ分析を、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ  ２９２１３およびフェカリス菌ＡＴＣＣ  ２９２１２を用いて、５日間にわたって実施した（図１１）。株１つ当たり５つの複製を、５日連続する日に分析した。このアッセイは、連続５日間にわたって、複数の実験室間で繰り返し可能であった。
【０１０２】
変動する量の血清および還元剤補充物を評価する範囲発見実験を実施した。１２．５％から３０％の間のウマ血清を評価し、０ｍＭから１ｍＭの間のＤＴＴ補充物を評価した結果を、図１２に示す。条件は、ヒト血清様活性を模倣する能力に基づいた。血清アッセイでは、各条件は、３０の黄色ブドウ球菌株の同じセットを使用した。ＤＴＴアッセイでは、単一の黄色ブドウ球菌株を、様々な条件に使用した。品質を査定し、それを示す。２０％〜３０％のウマ血清補充物レベルが適切であった。１２．５％のウマ血清は、不満足な結果を与えた。ＤＴＴは、０．２５ｍＭから１ｍＭの間で適切であり、トレーリング効果または高いＭＩＣまたは０．２５ｍＭ以下のＤＴＴでは凍結できないことに起因して、０．５ｍＭから１ｍＭの間が最も理想的であった。これらの研究は、代替的還元剤ＴＣＥＰを用いても実施され、ＤＴＴと類似の結果を与えた。
【０１０３】
まとめると、溶解性ポリペプチド、例えばおよび特にＰｌｙＳｓ２（ＣＦ−３０１）の正確なｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＢＭＤ試験は、２種の補充物を必要とする：血清および還元剤。本発明の場合、補充物として種々の供給源からのウマ血清およびＤＴＴを用いたＢＭＤ評価は、種々の黄色ブドウ球菌株およびフェカリス菌を含む細菌の多数の株にわたって、正確な結果を提供する。添加された哺乳動物血清、特にウマ血清は、トレーリング効果を除去し、ヒト血液、血清または血漿において観察された活性と同等な活性の定量化を可能にする。還元剤、例えば特にＤＴＴの添加は、溶解素を安定化し、酸化を防止するように機能し、凍結溶解性ポリペプチド希釈パネルの使用を可能にする。本発明の改変されたＢＭＤ方法は、正確で繰り返し可能であり、ロバストである。
【０１０４】
改変されたＢＭＤアッセイのための詳細な例示的な方法および手順は、以下により詳細に記載される。
【０１０５】
微量液体希釈手順：
ブロス−微量希釈感受性試験を実施するための一般的手順が、このセクションに提供される。この手順は、ＣＬＳＩ方法論（文書Ｍ０７−Ａ９、２０１５）のバリエーションであり、高度に荷電した抗菌ペプチドのＭＩＣを試験するための、Ｗｉｅｇａｎｄら、２００８（非特許文献３５）（付録Ｄ、セクションＤ１を参照のこと）によって記載された方法に基づく。
【０１０６】
分析のための希釈された溶解性ポリペプチドの調製：溶解性ポリペプチド（ＰｌｙＳｓ２）を、デモ緩衝液中１０．７４ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁される凍結ストック溶液として提供する。デモ緩衝液は、７．２２のｐＨの、リン酸一ナトリウム二水和物（７．６７ｍＭ）、リン酸二ナトリウム二水和物（７．３３ｍＭ）および塩化ナトリウム（１５０ｍＭ）である。ＰｌｙＳＳ２希釈を確立するために、利用した希釈剤は、２５％ウマ血清および０．５ｍＭ  ＤＴＴを補充したＭＨＢ  ＩＩであった。各株または単離体を、１プレート当たり２つの株または単離体で、三連で試験する。
１．２４℃の水浴中で５分間の懸濁によって、凍結溶解素ポリペプチド（例えば、ＣＦ−３０１）ストック溶液を解凍する。解凍した試料を、使用まで、氷上で３０分以下で貯蔵する。未使用のポリペプチド（ＣＦ−３０１）を廃棄する。
２．アッセイに必要な所望の２倍溶解素ポリペプチド（例えば、ＣＦ−３０１）希釈範囲を決定する。ほとんどの黄色ブドウ球菌株について、この範囲は、８または１６μｇ／ｍｌの所望の最終濃度で開始する。一部のバンコマイシン中等度耐性黄色ブドウ球菌株について、この範囲は、５１２μｇ／ｍｌで開始する。
３．各希釈について所望の最終濃度の２倍で溶解素ポリペプチド（例えば、ＣＦ−３０１）マスター希釈ストックを調製し、カラム１〜１０の適切なウェルに０．０５ｍｌを満たす。０．１ｍｌのブロスを、無菌性対照として機能するようにカラム１２のウェル中にピペッティングし、０．０５ｍｌを、発育対照として機能するようにカラム１１のウェル中にピペッティングする。
【０１０７】
接種材料の調製および接種：感受性試験のために接種材料密度を標準化するために、マクファーランド等量濁度標準（Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ  Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄ）（Ｒｅｍｅｌ、カタログ番号Ｒ２０４２１）を利用した。試験の各日に、品質制御株、例として、以下の品質制御株を利用した：黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ  ２９２１３（ＣＦＳ−５８１）、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ  ４３３００（ＣＦＳ−５５３）およびフェカリス菌ＡＴＣＣ  ２９２１２（ＣＦＳ−８０６）。
１．１８〜２４時間の血液寒天プレートから選択される単離されたコロニーの直接的ブロス懸濁を行うことによって、接種材料を調製する。ブロス懸濁は、ＢＢＬ（商標）ミューラー・ヒントンブロス、２ｍｌチューブ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９６１６４）中で実施され得る。
２．Ｇｒａｎｔ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＤＥＮ−１デンシトメーターを使用して、０．５マクファーランド標準と等価な濁度を達成するように懸濁物を調整する。
３．調製の１５分以内に、調整された接種材料をブロス中に希釈し、そうして、接種の後、各ウェルは、およそ５×１０５ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度を含む。カラム１〜１１の各ウェルについての接種材料体積は０．０５ｍｌになるので、０．５マクファーランドの懸濁物は、１×１０６ＣＦＵ／ｍｌにするために１：１００に希釈すべきである。０．０５ｍｌのこの懸濁物をマイクロタイタープレートウェル（既に０．０５ｍｌを含有している）中に接種する場合、細菌の最終試験濃度は、およそ５×１０５ＣＦＵ／ｍｌである。
４．接種材料を上記のように標準化した後１５分以内に、カラム１〜１１の各ウェルに、０．０５ｍｌを接種する。各ウェルの最終体積は、ここで０．１ｍｌである。
５．同時インキュベーションのために血液寒天プレート上にアリコートを継代培養することによって、接種材料懸濁物の純度チェックを実施する。
【０１０８】
インキュベーション：接種したトレイを、接種材料の添加の１５分以内に、周囲空気インキュベーター中で３７℃で１６〜１８時間インキュベートする。４枚よりも高くプレートを積み重ねないことが推奨される。
【０１０９】
ＭＩＣエンドポイントを決定する：
１．ＣＦ−３０１を含有するウェルにおける発育の量を、発育対照ウェルにおける発育の量と比較する。試験が有効であるとみなされるには、許容可能な発育が発育対照ウェル中で起きることが必要である。目視でＭＩＣ値を決定する。
２．独立した記録として、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ３プレートリーダーで決定した各トレイのウェルについてのＯＤ６００値を読み取り、保存する。
【０１１０】
培地および補充物
補充物
粉末からのＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）ストック溶液（１Ｍ）
１．１．５ｇのＤＴＴを１ｍｌ  Ｈ２Ｏ（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ  ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリー蒸留水）中に溶解させる
２．体積を蒸留水で１０ｍｌにし、０．２２μｍフィルターを通過させることによって滅菌する
３．使用の当日に調製する（貯蔵および再使用しない）
ＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液（Ｈ２Ｏ中１Ｍ）
１．ガラスバイアルを無菌的に開封し、適切な量を分配する
２．使用の当日に調製する（貯蔵および再使用しない）
ウマ血清（１００％）
１．４℃で一晩または２４℃で１時間を超えるインキュベーションのいずれかによって、凍結ウマ血清を解凍する
２．オートクレーブして冷却したＭＨＢ  ＩＩブロスに、適切な量の血清を無菌的に添加する
３．５０ｍｌアリコートで−２０℃で凍結貯蔵する
【０１１１】
寒天培地
５％ヒツジ血液を含むトリプシンダイズ寒天
市販の供給源から、予め作製されたトリプシン・ダイズ寒天プレート（５％ヒツジ血液を補充した）を得る
【０１１２】
ブロス培地
カチオン調整されたミューラー・ヒントンブロス
市販の供給源から、脱水ミューラー・ヒントンＩＩブロス（カチオン調整された）を得る。
この形態は、２０〜２５ｍｇのＣａ２＋／Ｌおよび１０〜１２．５ｍｇのＭｇ２＋／Ｌを含有しなければならない。
１．製造業者の推奨に正確に従って、ＭＨＢ  ＩＩを調製し、オートクレーブし、１時間かけて５５℃まで冷却し、０．２２μｍメンブレンを通過させることによって濾過滅菌し、２〜８℃で一晩冷やす。
２．ｐＨをチェックする。最終ｐＨは、７．２〜７．４でなければならない。
３．１週間以下にわたって、光から保護して２〜８℃で貯蔵する。
２５％ウマ血清および０．５ｍＭ  ＤＴＴを含む、カチオン調整されたミューラー・ヒントンブロス
１．セクションＢ３．１に記載されるように、カチオン調整されたミューラー・ヒントンブロスを調製する。
２．ブロスを２〜８℃で一晩冷やした後、必要とされる各１００ｍｌのために、２５ｍｌのウマ血液を７５ｍｌのブロスに添加する。ウマ血液の調製についてはセクションＢ１．２を参照のこと。
３．穏やかに旋回させて混合する。
４．混合した後、必要とされる各１００ｍｌのブロス＋２５％ウマ血清のために、０．０５ｍｌの１Ｍ  ＤＴＴストック溶液を添加する。ＤＴＴの供給源に依存して、調製についてセクションＢ１．１またはＢ１．２を参照のこと。
５．最終ｐＨは、７．４でなければならない。
６．使用の当日にのみ新鮮な培地を調製する。培地は貯蔵および再使用しない。
【０１１３】
試薬および機器
細菌発育培地
ＢＢＬ（商標）ミューラー・ヒントンＩＩブロス、カチオン調整、オートクレーブによって滅菌済み（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号２１２３２２、ロット番号５２５７８６９、有効期限２０１９年５月３１日）
ミューラー・ヒントンブロス２、カチオン調整、オートクレーブによって滅菌済み（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号９０９２２、ロット番号ＢＣＢＲ３３０３Ｖ、有効期限２０２０年１１月）
ＢＢＬ（商標）ミューラー・ヒントンＩＩブロス、カチオン調整、４００ｍｌ、無菌（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号２９７９６３、ロット番号６０１４５４７、有効期限２０１７年１月１２日）
ミューラー・ヒントンＩＩブロス、カチオン調整、１０００ｍＬ、無菌（Ｔｅｋｎｏｖａ、カタログ番号Ｍ５８６０、ロット番号Ｍ５８６０１２Ｂ１６０１、有効期限２０１６年１２月９日）
Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ（商標）ダイズ寒天プレート、５％ヒツジ血液を含む（ＴＳＡ  ＩＩ）（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号２２１２３９、ロット番号６０４９９９６、有効期限２０１６年６月１０日）
【０１１４】
動物およびヒト血液製剤
ウマ血清、ドナー群、濾過滅菌済み（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｈ１２７０、ロット番号１５Ｇ３８２、有効期限２０１６年６月、−２０℃で凍結貯蔵）
ウマ血清、濾過滅菌済み（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、カタログ番号ＨＳＥＳＲＭ、ロット番号ＨＳＥ１２２５、有効期限２０１６年１０月、−２０℃で凍結貯蔵）
ウマ血清、ニュージーランド起源、ドナー群、濾過滅菌済み（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１６０５０−１２２、ロット番号１６７１３１５、有効期限２０１９年２月、−２０℃で凍結貯蔵）
ドナーウマ血清、米国から調達、濾過滅菌済み（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５−０３０−ＣＶ、ロット番号３５０３０１０５、有効期限２０１８年７月、−２０℃で凍結貯蔵）
ドナーウマ血清、米国から調達、濾過滅菌済み（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号１２４４９Ｃ、ロット番号１４Ａ２７７、２０１８年２月２８日、−２０℃で凍結貯蔵）
ヒト雄性ＡＢ血漿由来のヒト血清、米国起源、濾過滅菌済み（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号ＳＬＢＮ４６６４Ｖ、有効期限２０１８年４月、−２０℃で凍結貯蔵）
プールされた正常ヒト雄性ＡＢ血清、濾過滅菌済み（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、カタログ番号ＩＰＬＡ−ＳＥＲＡＢ、ロット番号１９７９９、−２０℃で凍結貯蔵）
プールされた正常ヒト雄性血漿、クエン酸ＮＡ抗凝固剤、濾過滅菌済み（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、カタログ番号ＩＰＬＡ−Ｎ、ロット番号１８９４４、−２０℃で凍結貯蔵）
ウサギ血清、米国起源、濾過滅菌済み（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｒ７１３６、ロット番号１３Ｅ１０８、有効期限２０１７年５月、−２０℃で凍結貯蔵）
イノベーティブグレードの米国起源ビーグル血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、カタログ番号ＩＢＧ−ＳＥＲ、ロット番号１７６５４、有効期限２０１８年６月、−２０℃で貯蔵）
Ｒｅｍｅｌ（商標）溶血ウマ血液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｒ５４０７２、−２０℃で凍結貯蔵）
【０１１５】
化学試薬
ＤＬ−ジチオスレイトール溶液、Ｈ２Ｏ中１Ｍ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号６４６５６３−１０Ｘ．５ＭＬ、ロット番号ＭＫＢＷ５５７５Ｖ、２４℃で未開封貯蔵）
ＤＬ−ジチオスレイトールＢｉｏＵｌｔｒａ、分子生物学用、≧９９．５％（ＲＴ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号４３８１５−２５Ｇ、ロット番号ＢＣＢＢＤ７００９Ｖ、２〜８℃で貯蔵）
ＤＬ−ジチオスレイトール（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＲＣ−０４６、ロット番号１５１１０６、２〜８℃で貯蔵）
トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液、０．５Ｍ、ｐＨ７．０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号６４６５４７−１０Ｘ１ＭＬ、ロット番号ＭＫＢＷ８５０３Ｖ、２４℃で未開封貯蔵）
ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ４７８０−１００ＭＬ、ロット番号ＭＫＢＷ２８９６Ｖ、２４℃で貯蔵）
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）（Ｆｉｓｈｅｒ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＢＰ３５８−１０、ロット番号１５０６６１、２４℃で貯蔵）
塩化カルシウム（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号Ｃ７７−２１２、ロット番号１１０６５１、２４℃で貯蔵）
塩化マグネシウム、無水物、≧９８％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｍ８２６６−１００Ｇ、ロット番号１２０Ｍ００９４Ｖ、２４℃で貯蔵）
ウシ血清アルブミン、凍結乾燥粉末、≧９６％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ２１５３、ロット番号ＳＬＢＬ５４６２Ｖ、２〜８℃で貯蔵）
【０１１６】
供給品および機器
Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）９６ウェル細胞培養プレート、ポリスチレン、無菌、ｕ底、低蒸発蓋（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５１１７７、ロット番号６０２６０２３）
ＢＢＬ（商標）ミューラー・ヒントンブロス、２ｍｌチューブ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２９６１６４、ロット番号６０５４９８４）
ＤＥＮ−１ベンチトップデンシトメーター（Ｇｒａｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号ＤＥＮ−１、ロット番号０５０１０２−１１１１−０４２６）
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ３マルチモードマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．）
【０１１７】
参考文献
１．  Ｗｉｅｇａｎｄら  ２００８．  Ａｇａｒ  ａｎｄ  ｂｒｏｔｈ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  （ＭＩＣ）  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．  ３：１６３〜１７５．
２．  Ｇｉｌｍｅｒら  ２０１３．  Ｎｏｖｅｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｌｙｓｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｂｒｏａｄ  Ｌｙｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｉｘｅｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．  ５７：２７４３〜２７５０．
３．  Ｓｃｈｕｃｈら  ２０１４．  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｗｉｔｈ  Ｌｙｓｉｎ  ＣＦ−３０１  ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｉｓ  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｏ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ａｌｏｎｅ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．  ２０９：１４６９〜７８．
４．  Ｈａｔｆｕｌ  Ｇ．  ２０１５．  Ｄａｒｋ  Ｍａｔｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｐｈｅｒｅ：  ｔｈｅ  Ａｍａｚｉｎｇ  Ｗｏｒｌｄ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  ８９：８１０７〜１０．
５．  Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．、Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．およびＳｃｈｕｃｈ，  Ｒ．  ２００６．    Ｒｅｉｎｖｅｎｔｉｎｇ  ｐｈａｇｅ  ｔｈｅｒａｐｙ：  ａｒｅ  ｔｈｅ  ｐａｒｔｓ  ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ  ｔｈｅ  ｓｕｍ？  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．  ２４：１５０８〜１１．
６．  ＫｕｓｕｍａおよびＫｏｋａｉ−Ｋｕｎ．  ２００５．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｖａｒｉｏｕｓ  Ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．    Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．  ４９：３２５６〜６３．
７．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｈａｔ  ｇｒｏｗ  ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ．  第３２巻  （Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  （ＵＳ）、Ｗａｙｎｅ  （ＰＡ）、２０１２）．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ３ｒｄ  Ｅｄ．  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、２０１０）．
８．  Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌｙｓｉｎｓ  ａｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １１、３９３〜４００  （２００８）．
９．  Ｆｅｎｔｏｎ，  Ｍ．、Ｒｏｓｓ，  Ｐ．、ＭｃＡｕｌｉｆｆｅ，  Ｏ．、Ｏ’Ｍａｈｏｎｙ，  Ｊ．およびＣｏｆｆｅｙ，  Ａ．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌｙｓｉｎｓ  ａｓ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌｓ．  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｂｕｇｓ  １、９〜１６  （２０１０）．
１０．  Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．、Ｌｏｏｍｉｓ，  Ｌ．およびＦｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｐｐｅｒ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９８、４１０７〜４１１２  （２００１）．
１１．  Ｗｉｔｚｅｎｒａｔｈ，  Ｍ．ら、Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ  Ｃｐｌ−１  ｒｅｓｃｕｅｓ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｆａｔａｌ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｃａｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３７、６４２〜６４９  （２００９）．
１２．  Ｐａｓｔａｇｉａ，  Ｍ．ら、Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｌｙｓｉｎ  ｓｈｏｗｓ  ｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙ  ｔｏ  ｍｕｐｉｒｏｃｉｎ  ｆｏｒ  ｓｋｉｎ  ｄｅｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｎｄ  −ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｔｒａｉｎｓ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５５、７３８〜７４４  （２０１１）．
１３．  Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，  Ｊ．Ｍ．、Ｄｊｕｒｋｏｖｉｃ，  Ｓ．およびＦｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．  Ｐｈａｇｅ  Ｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｐｌ−１  ａｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｆｏｒ  Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  Ｂａｃｔｅｒｅｍｉａ．  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ７１、６１９９〜６２０４  （２００３）．
１４．  Ｅｎｔｅｎｚａ，  Ｊ．Ｍ．、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，  Ｊ．Ｍ．、Ｇｒａｎｄｇｉｒａｒｄ，  Ｄ．、Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．およびＭｏｒｅｉｌｌｏｎ，  Ｐ．  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｃｐｌ−１  ｌｙｓｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４９、４７８９〜４７９２  （２００５）．
１５．  Ｇｒａｎｄｇｉｒａｒｄ，  Ｄ．、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，  Ｊ．Ｍ．、Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．およびＬｅｉｂ，  Ｓ．Ｌ．  Ｐｈａｇｅ  ｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｐｌ−１  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９７、１５１９〜１５２２  （２００８）．
１６．  Ｓｃｈｕｃｈ，  Ｒ．、Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．およびＮｅｌｓｏｎ，  Ｄ．Ｃ．  Ａ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｃｒｅｅｎ  ｔｏ  Ｉｄｅｎｔｉｆｙ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｌｙｓｉｎｓ．  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第２巻：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ａｓｐｅｃｔｓ、第５０２巻  ３０７〜３１９  （２００９）．
１７．  Ｂａｔｅｍａｎ，  Ａ．およびＲａｗｌｉｎｇｓ，  Ｎ．Ｄ．  Ｔｈｅ  ＣＨＡＰ  ｄｏｍａｉｎ：  ａ  ｌａｒｇｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ａｍｉｄａｓｅｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ＧＳＰ  ａｍｉｄａｓｅ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２８、２３４〜２３７  （２００３）．
１８．  Ｗｈｉｓｓｔｏｃｋ，  Ｊ．Ｃ．およびＬｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．  ＳＨ３  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２４、１３２〜１３３  （１９９９）．
１９．  Ｒｏｓｓｉ，  Ｐ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｒｅｌａｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ＣＨＡＰ  ｄｏｍａｉｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ．  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７４、５１５〜５１９  （２００９）．
２０．  Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｍ．、ｄｅ  ｌａ  Ｐｅｎａ，  Ａ．およびＤｅｒｅｎｄｏｒｆ，  Ｈ．  Ｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ：  Ｋｉｌｌ  Ｃｕｒｖｅｓ  ｖｅｒｓｕｓ  ＭＩＣ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４８、３６９〜３７７  （２００４）．
２１．  Ｃｏｔｔａｒｅｌ，  Ｇ．およびＷｉｅｒｚｂｏｗｓｋｉ，  Ｊ．  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｄｒｕｇｓ，  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｏｐｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５、５４７〜５５５  （２００７）．
２２．  Ｔａｌｌａｒｉｄａ，  Ｒ．Ｊ．  Ｒｅｖｉｓｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｓｏｂｏｌｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ３４２、２〜８  （２０１２）．
２３．  ＬａＰｌａｎｔｅ，  Ｋ．Ｌ．、Ｌｅｏｎａｒｄ，  Ｓ．Ｎ．、Ａｎｄｅｓ，  Ｄ．Ｒ．、Ｃｒａｉｇ，  Ｗ．Ａ．およびＲｙｂａｋ，  Ｍ．Ｊ．  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ，  ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ，  ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ，  ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ，  ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ−ｓｕｌｆａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ，  ａｎｄ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｈｉｇｈ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍｏｄｅｌｓ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５２、２１５６〜２１６２  （２００８）．
２４．  Ｃｒａｎｄｏｎ，  Ｊ．Ｌ．、Ｋｕｔｉ，  Ｊ．Ｌ．およびＮｉｃｏｌａｕ，  Ｄ．Ｐ．  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅｓ  ｏｆ  ｔｅｌａｖａｎｃｉｎ  ａｎｄ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒａｎｇｅ  ｏｆ  ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ  ＭＩＣｓ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ  ｍｏｄｅｌ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５４、５１１５〜５１１９  （２０１０）．
２５．  Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，  Ｊ．Ｍ．、Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．およびＦｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．Ａ．  Ｒａｐｉｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４、２１７０〜２１７２  （２００１）．
２６．  Ｓｃｈｕｃｈ，  Ｒ．、Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｄ．およびＦｉｓｃｈｅｔｔｉ，  Ｖ．  Ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｄｅｔｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｋｉｌｌｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８、８８４〜８８９  （２００２）．
２７．  Ｍａｎｏｈａｒａｄａｓ，  Ｓ．、Ｗｉｔｔｅ，  Ａ．およびＢｌａｓｉ，  Ｕ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｅｎｚｙｂｉｏｔｉｃ  ｔｏｗａｒｄｓ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３９、１１８〜１２３  （２００９）．
２８．  Ｒａｓｈｅｌ，  Ｍ．ら、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｂｙ  ｃｌｏｎｅｄ  ｌｙｓｉｎ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ｐｈｉ  ＭＲ１１．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９６、１２３７〜１２４７  （２００７）．
２９．  Ｄａｎｉｅｌ，  Ａ．ら、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｌｙｓｉｎ  ａｎｄ  ｏｘａｃｉｌｌｉｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５４、１６０３〜１６１２  （２０１０）．
３０．  Ｋｏｋａｉ−Ｋｕｎ，  Ｊ．Ｆ．、Ｃｈａｎｔｕｒｉｙａ，  Ｔ．およびＭｏｎｄ，  Ｊ．Ｊ．  Ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ  ａｓ  ａ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ６０、１０５１〜１０５９  （２００７）．
３１．  Ｓｏｐｉｒａｌａ，  Ｍ．Ｍ．ら、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｂｙ  Ｅｔｅｓｔ，  ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｃｈｅｃｋｅｒｂｏａｒｄ，  ａｎｄ  ｔｉｍｅ−ｋｉｌｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐａｎ−ｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５４、４６７８〜４６８３  （２０１０）．
３２．  Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．  Ｉ−ＴＡＳＳＥＲ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３Ｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．  ＢＭＣ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ９、４０  （２００８）．
【０１１８】
本発明は、その趣旨または本質的特徴から逸脱することなしに、他の形態で具体化され得、または他の方法で実施され得る。従って、本開示は、全ての態様において、添付の特許請求の範囲によって示される本発明の範囲を例示するが限定的ではないとみなされるべきであり、同等性の意味および範囲内に入る全ての変化は、本発明に包含される意図である。
【０１１９】
種々の参考文献が、本明細書を通じて引用され、それらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2019514439.tif 000009
【図２】
2019514439.tif 000010
【図３】
2019514439.tif 000011
【図４】
2019514439.tif 000012
【図５】
2019514439.tif 000013
【図６】
2019514439.tif 000014
【図７】
2019514439.tif 000015
【図８】
2019514439.tif 000016
【図９】
2019514439.tif 000017
【図１０】
2019514439.tif 000018
【図１１】
2019514439.tif 000019
【図１２】
2019514439.tif 000020
【配列表】
2019514439000001.app
【国際調査報告】
2019514439.tif 000021
2019514439.tif 000022