(57)【要約】  本出願は、糖鎖工学の分野に、より具体的には、高度に均一な形態の複合Ｎ−グリカンを組み換えタンパク質上に生成するのに最適化された、グリコシル化−操作された真菌細胞、より具体的にはグリコシル化−操作された酵母細胞に関する。本発明は具体的には、均一な形態の複合Ｎ−グリカンを有する組み換え糖タンパク質を含む医薬組成物を得るための方法に関する。加えて、本発明は、本発明の方法によって生じる新規医薬組成物に関する。
2019514403.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え糖タンパク質の複数個のグリコフォームを含む組成物であって、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンが、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体との混合物を含み、およびここで該複合Ｎ−グリカンが、該組成物中、総Ｎ−グリカンの９０％より高いレベルにて存在する、前記組成物。
【請求項２】
組み換え糖タンパク質の複数個のグリコフォームを含む組成物であって、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンが、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなる構造体との混合物を含み、ここで該複合Ｎ−グリカンが、該組成物中、総Ｎ−グルカンの９０%より高いレベルにて存在し、ここで該組成物が、該糖タンパク質をコードする遺伝子構築物を含む、組み換え複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物を、該糖タンパク質が発現される条件下で増殖させること、および該組み換え糖タンパク質を好適な量のエンドグルコサミニダーゼにin vitroで接触させることを含む、組み換え複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物における該糖タンパク質の生成によって得られる、前記組成物。
【請求項３】
糖タンパク質をコードする遺伝構築物を含む複合グリコシル化−操作された真菌生物を、該糖タンパク質が発現されおよび培地中へ分泌される条件下で増殖させること、および該糖タンパク質を、これが生成された後、好適な量のエンドグルコサミダーゼ酵素にin vitroで接触させることを含む、請求項１に記載の組成物を生成する方法。
【請求項４】
該接触させることが、糖タンパク質の精製の間に生じる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該接触させることが、糖タンパク質の精製の後に生じる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
該エンドグルコサミニダーゼに接触させることが、高塩濃度にて起こる、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
医薬としての使用のための、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項８】
請求項１または２に記載の組成物を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本出願は、糖鎖工学(glyco-engineering)の分野に、より具体的には、高度に均一な形態の複合Ｎ−グリカンを組み換えタンパク質上に生成するのに最適化された、グリコシル化−操作された(glycosylation-engineered)真菌細胞、より具体的にはグリコシル化−操作された酵母細胞に関する。本発明は具体的には、均一な形態の複合Ｎ−グリカンを有する組み換え糖タンパク質を含む医薬組成物を得るための方法に関する。加えて、本発明は、本発明の方法によって生じる新規医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ＣＨＯ細胞株は、バイオ医薬品にとって最適な発現系(an expression system of choice for biopharmaceuticals)であり、例えば、Rituxan、HumiraおよびEnbrelなどの画期的新薬(blockbuster)モノクローナル抗体を作製するために使用されている。しかしながら、ＣＨＯ細胞株での製造コストは極めて高く、より低いコストにて良心的な価格の薬を作製したい場合、代わりの宿主生物へシフトする必要がある。例えばPichia pastorisなどの糖−操作された真菌生物は、複合Ｎ−グリコシル化構造体をもつ組換え糖タンパク質を生成することができるが、真菌生物のグリコシル化能をさらに操作する必要がある。
【０００３】
実際、酵母様糖のバックグラウンド(background)が、組み換えたんぱく質上にはまだ、著しく存在する。Pichia pastoris ＯＣＨ１の新しい完全ノックアウト（これは、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを主にもつその糖タンパク質を修飾する）が近年記載されたものの（Krainer FW et al (2013) Sci Rep 3:3279）、組み換え糖タンパク質がこの突然変異株において生成されたとき、酵母型高マンノース糖修飾物(glycomodificaitions)のバックグラウンドはまだ、相当量存在していた。ＯＣＨ１ノックアウト株についての以前のレポートの中に、類似の知見がなされていた（Davidson RC et al (2004) Glycobiology 14(5):399）。
【０００４】
後者の研究において、バックグラウンドは、主としてホスホマンノシル化に起因すると考えられ、まだ知られていないマンノシルトランスフェラーゼがゲノム中に存在することに起因すると考えられていた。本出願において、我々は、複合糖−操作されたPichia pastoris株において、ＩＬ−２２の種々の複合グリコフォームを生成した。徹底した糖鎖工学によっても(Desptite extensive glyco-engineering)、我々はまた、生成されたグリコフォームに、相当高度に不均一なバックグラウンドが存在することをも観察した。不均一性の一部は、複合型Ｎ−グリカンに対して完全には処理されなかった試料中の中間体を起源とするが、相当のＮ−グリカン画分が、他のオリゴ−マンノース型および過剰マンノシル型の広範なＮ−グリカンからなることが見出された。
【０００５】
その株中のわずかな細胞が、ノックイン構築物の不安定さのために、野生型ＯＣＨ１に戻ることもあるという可能性が存在するものの、他の内因性グリコシルトランスフェラーゼが原因であることの方が、より見込みが高い。我々は、まだ特徴付けられていないグリコシルトランスフェラーゼが、Pichia pastorisにおけるＯｃｈ１ｐと類似の活性を有すこともあり、およびグリコフォームにおいて、複合糖−操作された株においてでさえも、不均一性を引き起こすこともあると考える。
【０００６】
これに加えて、本出願において、我々はまた、高度に予想外の構造を有したテトラ−サッカライド修飾物をもつ、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを含む、ＯＣＨ１が突然変異したPichia株において生成されたヒトＩＬ−２２上の新規タイプのネオグリカンも特徴付けた。このテトラ−サッカライド（Ｇｌｃα１−２Ｍａｎβ１−２Ｍａｎβ１−３Ｇｌｕｃα−）置換は、マンノシルコア(core)の最内側α―１，３アーム(arm)へ付着されている見込みが最も高い。我々はまた、糖−操作されたマウスＩＬ−２２上に類似のＮ−グリカンも観察した（データは示さず）。
【０００７】
同定された構造が、記載されたC. albicansの免疫原性エピトープであるβ−１，２−マンノース残基を含有していたという理由から、かかるＮ−グリカンの存在は、治療的使用の潜在性を阻んでいたであろう。この具体的なＮ−グリカンは、その構造において、先に記載されたネオグリコイドフォームから逸脱しており（Gomathinayagam S.et al.（2011）Glycobiology 21（12）：1606-15）、これはＮ−グリコシル化経路および内因性グリコトランスフェラーゼに対する我々の理解がまだ制限されていることを示している。その上、なぜある糖タンパク質がさらなる修正を受けやすい一方で、他はそうではないのかについてもまた理解されていない。
【０００８】
P. pastorisのゲノム配列が利用可能であるにもかかわらず、どのグリコシルトランスフェラーゼが、この具体的なネオグリコフォームを産生する原因であるのかは知られていない。したがって、特定の追加の内因性グリコシルトランスフェラーゼをノックアウトすることは、簡単ではない。さらなる操作が、内在性グリコシルトランスフェラーゼを打ち負かすこと(outcompeting)によって、その置換を部分的に解決することができたであろうが、操作の後半段階において、数多の中間体（ハイブリットＮ−グリカンのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を包含するが、また現在の技術ではその構造の決定が困難なオリゴマンノースバックグラウンドも包含する）が、再び現れる見込みが高い。
【０００９】
加えて、またネオグリコフォームは、高度に糖−操作された株においてでさえも、組換え糖タンパク質上にも形成されることがある見込みが高い。ネオグリコフォーム形成を予防または改善する唯一の道は、すべての潜在的グリコシルトランスフェラーゼ／グリコシダーゼを特徴付けること、およびこれらの酵素を、それらがなにか望ましくない活性を示すことがある場合にノックアウトすることであろう。後者は、非実用的な取り組みであろうし、それでさえも、ネオグリコフォーム形成に対する影響は予想不可能であろう。バックグラウンド、再び現れる中間体、およびネオグリコフォーム形成の可能性のせいで、糖−操作された真菌生物において生成された糖タンパク質上に存在する複合Ｎ−グリカンから、残存する真菌型グリコシル化バックグラウンドを取り除かせるストラテジーを策定する明確な必要性が存在する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の概要
これまでのところ、複合糖−操作された真菌細胞系の使用は、その目的がＮ−グリカンを保持することであって糖タンパク質を脱グリコシル化することではないから、網羅的な操作プロセスに対して大きく焦点を合わせており、バックグラウンドを取り除くため、糖タンパク質が生成された後の酵素的処置（例として、特定のグリコシダーゼ酵素での）には焦点を合わせていない。Pichia pastorisの複合Ｎ−グリカン操作された株において生成される糖タンパク質のバックグラウンドを取り除くために、T. reeseiエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＥｎｄｏＴを使用してin vitroでの酵素的脱グリコシル化を統合することが試験された。組み換えＥｎｄｏＴは、ヒトゴルジ型オリゴマンノースＮ−グリカンを放出することができることが示されているが、ヒト複合Ｎ−グリカンは、この酵素のための基質ではない（Stals I. et al（2012）PLOS One 7（7）e40854を参照）。
【００１１】
しかしながら、ＯＣＨ１の突然変異によって始動されるいくつかのグリコフォームを包含する、多く種々のタイプの酵母Ｎ−グリカンが、ふさわしい基質であって、ネオグリコフォームを形成するかどうかは知られていなかった。驚くべきことに、ＥｎｄｏＴは、ハイブリットＮ−グリカン、酵母高マンノースＮ−グリカンおよび予想外のネオグリコフォームからなるバックグラウンドの９０％超が処置後に消失したのに、糖タンパク質の生物活性が保たれ得たことから、極めて良好にこの役割を果たした。
【００１２】
その上、in vitroでの反応は、精製の間、硫酸アンモニウム画分に存在する高塩濃度に適応したこと、および驚くべきことにこの反応は、４℃にてなされ得たことが見出された。我々が、ＥｎｄｏＴが、これらの好ましくない条件において働くことができることを観察したことから、それは、その応用可能性を広げるものである。
【００１３】
望ましくないバックグラウンドを取り除くためのin vitroでのエンドグルコサミニダーゼ一掃(clean-up)ステップと組み合わせて、主要なヒト複合型Ｎ−グリコフォームを糖タンパク質上に生成する、複合Ｎ−グリコシル化糖−操作されたPichia株の使用は、複合型Ｎ−グリカンの、高度に純粋でカスタマイズされたＮ−グリコフォームを作製するための強力なツールを提供する。
【００１４】
よって、複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物において生成される組み換え糖タンパク質が、１つの機能的なＮ−グリコシル化アクセプター部位を有する場合、この組み換え糖タンパク質が、培地から精製され、および好適な量のエンドグルコサミナーゼに細胞外で(exogenously)接触されたときに、複数個のグリコフォームがその結果生成される。これらのグリコフォームが生じる理由は、複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物において、様々なＮ−グリカンが形成されるからである：ｉ）ハイブリットＮ−グリカン、ｉｉ）高マンノース型Ｎ−グリカン、ｉｉｉ）予測不可能なＮ−グリカンのネオグリコフォーム（さらに例の節において参照）、およびｉｖ）特定の複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物について予想されるとおりの意図した複合Ｎ−グリカン。
【００１５】
エンドグルコサミナーゼに接触させること（例として、細胞外で適用されおよび培地中に加えられるか、または精製状態の間に加えらるかまたは組み換えタンパク質の精製の後に加えられる）は、ハイブリットＮ−グリカンおよび高マンノース型Ｎ−グリカンの９０％超を除去するであろうし、および予測不可能なＮ−ネオグリコフォームもまた除去し、およびこれは、単一ＧｌｃＮＡｃグリカン構造体からなるＮ−グリカンの形成をもたらすであろう。調子が外れるが(Off note)、単一ＧｌｃＮＡｃグリカンを有するグリコフォームは、例２および３において概説される方法によっては、可視化されないであろう（または、決定され得ない）。質量分光分析方法による検出でしかなされ得ない。
【００１６】
結果として生じる複合Ｎ−グリカンは、エンドグルコサミナーゼに接触させる際、消化されないであろう。結果として、組み換え糖タンパク質の「複数個のグリコフォーム」が得られるであろう（複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物において生成される組み換え糖タンパク質上に存在するすべてのＮ−グリカン全体の可視化によって推定される）。これ故に、複数は、複合型のＮ−グリカン、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン、およびハイブリット型Ｎ−グリカンまたは高マンノース型Ｎ−グリカンまたはＮ−グルカンネオグリコフォームの２０％未満、好ましくは１５％未満、１０％未満、５％未満またはなおも１％未満のＮ−グリカンを指す。
【００１７】
WO2010/015722は、エンドグルコサミナーゼ、哺乳動物グルコシルトランスフェラーゼおよび異種の糖タンパク質の共発現を記載する。後者の操作された細胞系において、エンドグルコシダーゼ酵素は、ゴルジにおける特定のコンパートメントに対して標的化させられる。後者の系が、外因性の糖タンパク質を含む真菌において適用されたとき、そのとき単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンを含む組み換え糖タンパク質が生成される。後者は、in vitroで適用される本発明の方法論とは対称的である。本発明において複合糖−操作された真菌細胞は、エンドグルコサミナーゼを共発現せず、および複合Ｎ−グリカンと単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンとの混合物を有する組み換え糖タンパク質が生成される。
【００１８】
これをなおもさらに明確にすると、たった１つのＮ−グリコシル化アクセプター部位を有する糖タンパク質が、複合糖−操作された真菌生物において生成され、およびその生成後、結果として生じる糖タンパク質が続いて、in vitroでエンドグルコサミニダーゼで処置され（または接触され）るとき、そのとき結果として生じる糖タンパク質上に存在するグリコフォームは、複合Ｎ−グリカンと単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンとの混合物からなる。２つのＮ−グリコシル化アクセプター部位を有する糖タンパク質が、複合糖−操作された真菌生物において生成され、およびその生成後、結果として生じる糖タンパク質が続いて、in vitroでエンドグルコサミニダーゼで処置され（または接触され）るとき、そのとき単一糖タンパク質上に存在するＮ−グリコシル化部位は、ｉ）一方が複合Ｎ−グリカンおよび他方が単一ＧｌｃＮＡｃ、またはｉｉ）両方とも単一ＧｌｃＮＡｃ、またはｉｉｉ）両方とも複合Ｎ−グリカン、のいずれかからなり得る。
【００１９】
ＥｎｄｏＨなどのエンドグルコサミニダーゼは、一般的に、ＰＮＧａｓｅＦ消化と同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の分析論の一部として、糖タンパク質を脱グリコシル化するために使用される。しかしながら、後者の消化は、変性されたタンパク質に対して実行されることで、タンパク質を脱グリコシル化する意図からＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のＮ−グリコシル化プロファイルが決定される。同様に、結晶学の目的から、糖タンパク質はまた、しばしば脱グリコシル化をもなされる。しかしながら、消化は、変性なく実施されなければならないか、またはタンパク質構造を決定するために再生／再折り畳みステップが実施されなければならないかのいずれかである。
【００２０】
得られた糖タンパク質を医薬使用のためにさらに使用することを目指す、in vitroでの一掃ツールとしてのエンドグルコサミニダーゼの使用（発酵後、例として精製の間または精製後）は、当該技術分野において調査されたことはない。複合Ｎ−グリカンもつ糖タンパク質を生成する複合糖−操作された酵母プラットフォーム上のエンドグルコシダーゼの一掃は、これまでのところ報告されてはおらず、およびエンドグルコサミナーゼとのin vitroでのインキュベートステップは、直観に反するとさえ見なされている。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
図の簡単な記載
【図１】図１．可溶化されたＧａｌ２Ｇｎ２Ｍ３ＩＬ−２２ＷＴ硫酸アンモニウム画分に対する４℃でのＥｎｄｏＴ用量の用量設定(dose-finding)。硫酸アンモニウム沈殿画分は可溶化され、および等量の総タンパク質（μｇ／ｍｇ総タンパク質）は、終夜４℃にて、漸増量の組み換えＥｎｄｏＴで消化された。対照は、等体積の２５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）で補充されたが、ＥｎｄｏＴはない。Ｎ−グリカン構造体案が示される。上のパネル（デキストラン）および下のパネルは、デキストラン参照標準およびＲＮＡｓｅＢからのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍ５〜９）参照Ｎ−グリカンである。凡例における記号は、コアであるＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンのモノサッカライドを考慮していない。＊は、未同定のＮ−グリカンを表す。
【００２２】
【図２】図２．可溶化されたＧａｌ２Ｇｎ２Ｍ３ＩＬ−２２Ｎ２１硫酸アンモニウム画分に対する４℃でのＥｎｄｏＴ用量設定。硫酸アンモニウム沈殿画分は可溶化され、および等量の総タンパク質は、終夜４℃にて、漸増量の組み換えＥｎｄｏＴ（μｇＥｎｄｏＴ／ｍｇ総タンパク質）で消化された。対照は、等体積の２５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）で補充されたが、ＥｎｄｏＴはない。Ｎ−グリカン構造体案が示される。上のパネル（デキストラン）および下のパネルは、デキストラン参照標準およびＲＮＡｓｅＢからのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍ５〜９）参照Ｎ−グリカンである。凡例における記号は、コアであるＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンのモノサッカライドを考慮していない。＊は、未同定のＮ−グリカンに印を付す。
【００２３】
【図３】図３．タチナタマメタチナタマメα−マンノシダーゼ消化は、残留バックグラウンドを明らかにする。Ｇａｌ２Ｇｎ２Ｍ３ＩＬ−２２ＷＴ試料からの硫酸アンモニウム画分から放出されるＡＰＴＳ標識Ｎ−グリカンは、ＥｎｄｏＴで４℃にて先に消化され（μｇＥｎｄｏＴ／ｍｇで指し示される）、タチナタマメタチナタマメα−マンノシダーゼとともに短時間インキュベートされた。対照試料は、ＥｎｄｏＴでも、α−マンノシダーゼでも消化されず、および未処置の硫酸アンモニウム画分のＮ−グリカンのプロファイルを反映する。対照試料のＮ−グリカンが、α−マンノシダーゼで消化されると、コアのＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２は、オリゴ−マンノースＮ−グリカンの加水分解の結果として現れる。上のパネルは、デキストラン参照ラダー（デキストラン）である。凡例における記号は、コアであるＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンのモノサッカライドを考慮していない。
【００２４】
【図４】図４．タチナタマメタチナタマメα−マンノシダーゼ消化は、マイナーなバックグラウンドを明らかにする。Ｇａｌ２Ｇｎ２Ｍ３ＩＬ−２２Ｎ２１試料から放出されるＡＰＴＳ標識Ｎ−グリカンは、ＥｎｄｏＴで４℃にて先に消化され（μｇ／ｍｇで指し示される）、タチナタマメタチナタマメα−マンノシダーゼとともに短時間インキュベートされた。対照試料は、ＥｎｄｏＴでも、α−マンノシダーゼでも消化されず、および未処置の硫酸アンモニウム画分のＮ−グリカンのプロファイルを反映する。対照試料のＮ−グリカンがα−マンノシダーゼで消化されると、コアであるＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２は、オリゴ−マンノースＮ−グリカンの加水分解の結果として現れる。上のパネルは、デキストラン参照ラダー（デキストラン）である凡例における記号は、コアであるＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２Ｎ−グリカンのモノサッカライドを考慮していない。
【００２５】
【図５】図５．ＥｎｄｏＴで処置されたｈＩＬ−２２ＷＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＥｎｄｏＴで処置された硫酸アンモニウム画分からの試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。パネルａ．用量設定のクマシー染色ゲル（μｇＥｎｄｏＴ／ｍｇ総タンパク質で示される）は、４℃にて実施した。矢印は、組み換えＥｎｄｏＴに対応するバンドを指し示す。非グリコシル化ＩＬ−２２ＷＴには、「０」との印が付され、Ｎ−グリカンを最大３つ持つグリコフォームには、１〜３との印が付される。オリゴ−マンノースバックグラウンドに起因するスメアリング(Smearing)は、アスタリスクで指し示される。パネルｂ．先のパネルにおける試料と同じ試料上のｈＩＬ−２２に対するウェスタンブロット。パネルｃ．明白なスメアリングによって証明されるとおり、過度の曝露は、いずれのいかなる残存バックグラウンドをも明確に可視化する。分子マーカー（ＭＭ）が指し示され、分子量はｋＤａ単位である。
【００２６】
【図６】図６．ＥｎｄｏＴで処置されたｈＩＬ−２２Ｎ２１のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ＥｎｄｏＴで処置されたＧａｌ２Ｇｎ２Ｍ３−ＩＬ２２Ｎ２１の硫酸アンモニウム画分からの試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。パネルａ．用量設定実験のクマシー染色ゲル（μｇ／ｍｇ総タンパク質で示す）は、４℃にて実施した。矢印は、組み換えＥｎｄｏＴを指し示す。非グリコシル化ＩＬ−２２には、「０」との印が付され、単一Ｎ−グリコフォームには、「１」との印が付される。潜在的な分解には、Δとの印が付される。パネルｂ．先のパネルにおける試料と同じ試料上のｈＩＬ−２２に対するウェスタンブロット。分子量マーカー（ＭＭ）は、ｋＤａで指し示される。
【００２７】
【図７】図７．ＥｎｄｏＴで処置されたｈＩＬ−２２ＷＴの精製。SephadexG25カラム上での脱塩（左上）に先立ち、Ｇａｌ２Ｇｎ２Ｍ３−ｈＩＬ−２２ＷＴからの硫酸アンモニウム画分は、０．５μgＥｎｄｏＴ／（ｍｇ総タンパク質）でスパイクされ、および４℃にて終夜その状態を保たれた。脱塩された試料は、Q-Sepharose上にロードされ、およびフロースルーは収集され、大量の夾雑物および組換えＥｎｄｏＴがカラム上に残された（右上）。ＩＬ−２２グリコフォームは、次いでS15 Source上の溶出の間に分離された（左下）。純粋なＩＬ−２２グリコフォームはプールされ、およびSuperdex75カラムを過ぎて洗練された(polished over)（右下）。ＩＬ−２２を含有する画分は、灰色で指し示される。黒色実線：２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）、灰色線：導電率（ｍＳ／ｃｍ単位）、灰色点線：カラムを溶出するために適用されたＮａＣｌ勾配（０〜１００％緩衝液Ｂ、軸上には指し示されない）。
【００２８】
【図８】図８．ＥｎｄｏＴで処置されたｈＩＬ−２２の精製。Ｇａｌ２Ｇｎ２Ｍ３ｈＩＬ−２２Ｎ２１硫酸アンモニウム画分は、SephadexG25カラム上での脱塩（左上）に先立ち、１μｇＥｎｄｏＴ／（ｍｇ総タンパク質）でスパイクされた。脱塩された試料は、Q-Sepharose上にロードされ、およびフロースルーは収集された。組み換えＥｎｄｏＴを包含する大量の夾雑物は、それらが１Ｍ ＮａＣｌで溶出されるまで、カラム上に保持される（右上）。ＩＬ−２２グリコフォームは、次いでS15 Source上での溶出の間に分離された（左下）。純粋なＩＬ−２２グリコフォームはプールされ、およびSuperdex75コラムを過ぎて洗練された（右下）。ＩＬ−２２を含有する画分は、灰色で指し示される。黒色実線：２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）、灰色線：導電率（ｍＳ／ｃｍ単位）、灰色点線：カラムを溶出するために適用された勾配（０〜１００％緩衝液Ｂ、軸上には指し示されていない）。
【００２９】
【図９】図９．ＥｎｄｏＴで処置されたｈＩＬ−２２の精製の間のグリコフォームの分離。パネルａ．Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２ｈＩＬ−２２ＷＴのS15 Source溶出プロファイルの詳細が示される。明らかなピークは、１〜３つのＮ−グリカンを持つグリコフォームを夫々表す、１〜３との番号が付される。非グリコシル化画分は、「０」で指し示される。収集された画分は、図上に指し示される。黒色実線：２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）、灰色線：導電率（ｍＳ／ｃｍ単位）、灰色点線：カラムを溶出するために適用されたＮａＣｌ勾配（軸上には指し示されていない）。パネルｂ．S15 Source溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。１〜３つのＮ−グリカンを持つかまたはＮ−グリカンがないグリコフォームは、それに応じて番号が付される。崩壊生成物に関連するピークには、Δとの印が付される。パネルｃ．S-Sourceカラムの溶出に基づき、試料はプールされ、およびSuperdex75カラムを過ぎて洗練され、異なるグリコシル化度をもつ、３つの高度に純粋な画分（Ｎ−グリコシル化の、混合画分、および大部分が非グリコシル化された画分）を産出する。パネルｄ．Ｎ−グリコシル化された画分からの試料が、還元（＋ＤＴＴ）、および非還元条件（−ＤＴＴ）下で比較された。パネルｅ．Ｎ−グリコシル化されたプールは、オリゴ−マンノースおよび複合Ｎ−グリカンの両方を取り除き得るＰＮＧａｓｅＦ（＜）で、およびオリゴ−マンノースまたはハイブリットＮ−グリカンのみを切断するが、複合Ｎ−グリカンは切断しないＥｎｄｏＨ（＊）で、個別に消化された。異なるＮ−グリカン数をもつグリコフォームは、前のとおりに番号が付される（０、１〜３および崩壊物についてはΔ）。分子量マーカー（ＭＭ）、質量は、ｋＤａで与えられる。
【００３０】
【図１０】図１０．ＥｎｄｏＴで処置されたｈＩＬ−２２Ｎ２１の精製の間のグリコフォームの分離。パネルａ．Ｇａｌ２Ｇｎ２Ｍ３−ｈＩＬ−２２Ｎ２１のS15 Source溶出プロファイルの詳細が示される。非グリコシル化ＩＬ−２２Ｎ２１には、「０」との印が付される。単一グリコフォームには、「１」との注釈が付される。想定される崩壊生成物は、「Δ」と指し示される。収集された画分は、図上に指し示される。青色線：２８０ｎｍでの吸光度（ｍＡＵ）、茶色線：導電率（ｍＳ／ｃｍ単位）、緑色線：カラムを溶出するのために適用された勾配（軸上には指し示されない）。パネルｂ．S15 Source溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。１つのＮ−グリカンを持つかまたはＮ−グリカンがないグリコフォームは、それに応じて番号が付される。崩壊生成物には、「Δ」および「Δ２」との印が付される。パネルｃ．S-Sourceカラムの溶出に基づき、試料はプールされ、およびSuperdex75カラムを過ぎて洗練され、異なるグリコシル化度をもつ３つの高度に純粋な画分（Ｎ-グリコシル化の混合画分、および大部分が非グリコシル化された画分）を産出する。パネルｄ．大部分がＮ−グリコシル化された画分からの試料が、還元（＋ＤＴＴ）、および非還元条件（−ＤＴＴ）下で比較された。パネルｅ．Ｎ−グリコシル化されたプールは、オリゴ−マンノースおよび複合Ｎ−グリカンの両方を取り除き得るＰＮＧａｓｅＦ（＜）で個別に消化され、およびオリゴ−マンノースまたはハイブリットＮ−グリカンのみを切断するが、複合Ｎ−グリカンは切断しないＥｎｄｏＨ（＊）と比較された。異なるＮ−グリカン数をもつグリコフォームは、前のとおりに番号が付される（０、１および、崩壊物についてはΔ）。分子量マーカー（ＭＭ）、質量は、ｋＤａで与えられる。
【００３１】
【図１１】図１１．ＥｎｄｏＴで処置されたｈＩＬ−２２ＷＴに対する対照消化。パネルａ．硫酸アンモニウム画分を含有する未処置のｈＩＬ−２２からの（レーン２＆３）、またはＥｎｄｏＴ処置された精製ｈＩＬ−２２からの（レーン４＆５）ＡＰＴＳ標識Ｎ−グリカンは、タチナタマメα−マンノシダーゼで消化されて、いかなるオリゴ−マンノースバックグラウンドの存在を明らかにしたタチナタマメ（レーン３および５）。対照試料のＮ−グリカンが、α−マンノシダーゼで消化されると、コアであるＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２は、オリゴマンノースＮ−グリカンの加水分解の結果として現れる。パネルｂ．ＥｎｄｏＴ処置後の精製されたｈＩＬ−２２からのＡＰＴＳ標識Ｎ−グリカンに対するエキソグリコシダーゼ対照消化。未消化の試料は、プロファイルにおいて、残留ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に加え、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびマイナーなＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２異性体を表す主要なピークをを示す（レーン２）。β−１，４−ガラクトシダーゼでの消化は、非還元末端にてガラクトース残基を取り除くことで、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンのみが残される（レーン３）。β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼでのさらなる消化は、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を取り除くことで、トリマンノシルＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コアのみが残される（レーン４）。タチナタマメタチナタマメα−マンノシダーゼでのさらなる消化は、Ｎ−グリカンをコアに至るまで切り詰める。対照試料は、ＥｎｄｏＴでも、α−マンノシダーゼでも消化されず、および処置されていない硫酸アンモニウム画分のＮ−グリカンプロファイルを反映する。上のパネルは、デキストラン参照ラダーである（デキストラン）。下のパネルは、ＲＮＡｓｅＢからの参照Ｍａｎ５〜９ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカン（Ｍ５〜９）を表す。＊は、未同定のＮ−グリカンを表す。我々が説明し得なかった別のシグナルには、「？」との印が付される。凡例における記号は、コアであるＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンのモノサッカライドを考慮にしていない。
【００３２】
【図１２】図１２．ＥｎｄｏＴで処置されたｈＩＬ−２２Ｎ２１に対する対照消化。パネルａ．硫酸アンモニウム画分を含有する未処置ｈＩＬ−２２からの（レーン２＆３）、またはＥｎｄｏＴ処置された精製ｈＩＬ−２２からの（レーン４＆５）ＡＰＴＳ標識Ｎ−グリカンは、タチナタマメα-マンノシダーゼで消化されることで、いかなるオリゴ−マンノースバックグラウンドの存在を明らかにしたタチナタマメた（レーン３および５）。パネルｂ．ＥｎｄｏＴ処置された精製ｈＩＬ−２２からの、ＡＰＴＳ標識Ｎ−グリカンに対するエキソグリコシダーゼ対照消化。未消化の試料は、プロファイルにおいて、想定では、残留ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に加え、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびマイナーなＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２異性体を表す主要なピークを示す（レーン２）。β−１，４−ガラクトシダーゼでの消化は、非還元末端にてガラクトース残基を取り除くことで、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンのみが残される（レーン３）。β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼでのさらなる消化は、末端ＧｌｃＮＡｃ部分を取り除くことで、トリマンノシルＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２コアのみが残される（レーン４）。タチナタマメタチナタマメα−マンノシダーゼでのさらなる消化は、Ｎ−グリカンをコアに至るまで切り詰める。対照試料は、ＥｎｄｏＴでも、α−マンノシダーゼでも消化されず、および処置されていない硫酸アンモニウム画分のＮ−グリカンプロファイルを反映する。対照試料のＮ−グリカンが、α−マンノシダーゼで消化されると、コアであるＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２は、オリゴ−マンノースＮ−グリカンの加水分解の結果として現れる。上のパネルは、デキストラン参照ラダーである（デキストラン）。凡例における記号は、コアであるＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンのモノサッカライドを考慮していない。
【００３３】
【図１３】図１３．Ｃｏｌｏ−２０５細胞におけるＩＬ−２２依存型ＩＬ−１０分泌。結腸癌Ｃｏｌｏ−２０５細胞株は、精製されたＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２−ｈＩＬ２２Ｎ２１の１０段階希釈、またはE.coliから精製された商業用の標準で、終夜刺激された。翌日ＩＬ−１０分泌が、ＥＬＩＳＡによって測定された。用量応答曲線がフィッティングされ、ＥＣ５０が決定された。
【００３４】
【図１４】図１４．ＥｎｄｏＴは、Ｎ−グリカンネオグリコフォームを切断する。レーン２は、プレート方法を使用して調製された精製Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のＮ−グリカンを示し、これは、予想されるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を示すが、Ｍａｎ８〜９ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンもまた示す。後者は、Ｎ−グリカンを操作するプロセスの結果として、新規構造体として同定された。同じ試料が、組み換えＥｎｄｏＴで前処置されるとき、我々はもはや、試料がプレート方法に従って調製されるときのいずれのシグナルをも得ることはない（レーン３）。しかしながら、ＥｎｄｏＴで消化される試料が、直接標識される場合、ＥｎｄｏＴで放出されるＮ−グリカンは、分析され得る（レーン４）。ＥｎｄｏＴで消化されたＮ−グリカンは、ＰＮＧａｓｅＦで消化されたＮ−グリカンと類似のプロファイルを有するが、還元性のＧｌｃＮＡｃ残基を欠落する。レーン５は、直接標識後のＥｎｄｏＴのＮ−グリカンプロファイルを示す。レーン１は、デキストラン参照標準を示し、レーン６は、ＲＮＡｓｅＢからのＭａｎ５〜９ＧｌｃＮＡｃ２参照Ｎ−グリカンを示す（Ｍ５〜９）。ｈＩＬ−２２上のモノサッカライド残基の置換は、完全には特徴付けられていない。したがって、すべてのモノサッカライド構成要素は、同様に描写される。
【００３５】
【図１５】図１５．ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＰｒｏＤｅｒｐ１のキャピラリー電気泳動プロファイル。パネル１は、デキストラン標準を示す。パネル２は、精製されたＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＰｒｏＤｅｒｐ１のプロファイルを示す。パネル３は、ＲＮＡｓｅＢ標準を示す。
【００３６】
【図１６】図１６．ＥｎｄｏＴで処置されたＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＰｒｏＤｅｒｐ１のキャピラリー電気泳動プロファイル。パネル１は、デキストラン標準を示す。パネル２は、高マンノースバックグラウンドを取り除くためにＥｎｄｏＴで処置されたＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＰｒｏＤｅｒｐ１のプロファイルを示す。ピークのアイデンティティは、以下のエキソグルコシダーゼ消化を実施することによって確認される：β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（パネル３）、α−１,２−マンノシダーゼ（パネル４）、α−１，２／３／６−マンノシダーゼ（パネル５）、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとα−１，２／３／６−マンノシダーゼとの組み合わせ（パネル６）。パネル７は、ＲＮＡｓｅＢ標準を示す。
【００３７】
【図１７】図１７．ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＰｒｏＤｅｒｐ１のキャピラリー電気泳動プロファイル。パネル１は、デキストラン標準を示す。パネル２は、ＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＰｒｏＤｅｒｐ１のプロファイルを示す。パネル３は、ＲＮＡｓｅＢ標準を示す。
【００３８】
【図１８】図１８．ＥｎｄｏＴで処置されたＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＰｒｏＤｅｒｐ１のキャピラリー電気泳動プロファイル。パネル１は、デキストラン標準を示す。パネル２は、高マンノースバックグラウンドを取り除くためにＥｎｄｏＴで処置されたＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＰｒｏＤｅｒｐ１のキャピラリー電気泳動プロファイルを示す。ピークのアイデンティティは、以下のエキソグルコシダーゼ消化を実施することによって確認される：α−１,２−マンノシダーゼ（パネル３）、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（パネル４）、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（パネル５）、α−１，２／３／６−マンノシダーゼ（パネル６）、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼとα−１，２／３／６−マンノシダーゼとの組み合わせ（パネル７）。ＧａｌＮＡｃとＧｌｃＮＡｃとの間の差を検出するために、我々は、末端のＧａｌＮＡｃおよびＧｌｃＮＡｃ残基の両方を取り除くことができる、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ消化を実施する。一方で、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは末端のＧｌｃＮＡｃ残基を取り除くことのみできる。パネル８は、ＲＮＡｓｅＢ標準を示す。
【００３９】
【図１９】図１９．Ｎ−グリカン定量化。ＩＬ−２２糖タンパク質の生成後に実施されるＮ−グリカン定量化およびエンドグルコサミニダーゼ一掃ステップの効果。データは、一掃手順後の複合Ｎ−グリカン構造体の劇的な増加を示す。
【００４０】
【図２０】図２０．組み換えで生成されたＩＬ−２２の、ガラクトシル化されたグリコフォームの定量化。特定の複合Ｎ−グリカンの定量化は、エンドグルコサミニダーゼ一掃ステップの後に計算された。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
詳細な記載
本明細書に使用されるとき、以下の用語の各々は、この節においてそれに関連する意味を有する。冠詞「a」および「an」は、１つの、または１つより多くの（すなわち、少なくとも１つの）冠詞の文法的目的語を指すために本明細書に使用される。例として、「要素(an element)」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。本明細書に使用されるときの「約」は、計測可能な値、例えば量、時間的な期間等を指すとき、明示される値からの±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、なおより好ましくは±１％、およびさらにより好ましくは±０．１％の変差を網羅することが意味されるところ、かかる変差は、本開示方法を実施するために適切である。
【００４２】
用語「異常な」は、生物、組織、細胞またはこれらの構成物に関連して使用されるとき、観察可能または検出可能な少なくとも１つの特徴（例として、年齢、処置、時刻等）において、「正常な」（予想される）夫々の特徴を見せるそれらの生物、組織、細胞またはこれらの構成物とは異なるそれらの生物、組織、細胞またはこれらの構成物を指す。細胞または組織のあるタイプにとっては正常であるか、またはそう予想される特徴は、細胞または組織の異なるタイプにとっては異常であることもある。
【００４３】
記載される図面は、図解のためだけであって、非限定的である。図面において、いくつかの要素の大きさは、強調されていることもあり、および説明のための縮尺では描かれていないこともある。用語「を含んでいる(comprising)」が、本記載および本クレームに使用される場合、それは、他の要素またはステップを除外しない。さらにまた、第一、第二、第三等の用語は、本記載においておよび本クレームにおいて、類似の要素どうしを区別するために使用され、および必ずしも連続的または年代的順序を記載するためではない。そのように使用される用語が、適切な状況下で交換可能であること、および本明細書に記載の本発明の様態が、本明細書に記載されるかまたは説明される順番より他の順番において運用することが可能であることは、理解されるべきである。
【００４４】
本明細書中、具体的に定義されない限り、本明細書に使用されるすべての用語は、本発明の当該技術分野における当業者にとってそれらが意味するであろうものと同じ意味を有する。専門家らは、具体的には、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Plainsview, New York (2012)；およびAusubel et al., current Protocols in Molecular Biology (Supplement 100), John Wiley & Sons, New York (2012)を、当該技術分野の定義および用語のために対象としている。本明細書に提供される定義は、当業者によって理解されるより小さい範囲を有するように解釈されるべきではない。
【００４５】
本明細書に使用されるとき、用語「ヌクレオチド配列」は、ポリマー形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体の、いずれの長さのヌクレオチドをも指す。ヌクレオチド配列は、いずれの３次元構造をも有していてもよく、および知られているかまたは知られていないいずれの機能をも実施してもよい。ヌクレオチド配列の非限定例は、遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボサームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれの配列の単離されたＤＮＡ、制御領域、いずれの配列の単離されたＲＮＡ、核酸プルーブ、およびプライマーを包含する。ヌクレオチドの配列は、線状であっても、または環状であってもよい。
【００４６】
本明細書に使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、ポリマー形態のいずれの長さのアミノ酸をも指し、それらは、コードされたおよび非コードされたアミノ酸、化学的にまたは生化学的に修飾されたまたは誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを包含し得る。ポリペプチド配列は、ここで下に描写されるとおり、単一の文字（または１文字）のアミノ酸コード、または３文字のアミノ酸コードで描写され得る：
【００４７】
【表１】
2019514403.tif 000003
【００４８】
用語「発現ベクター」は、本明細書に使用されるとき、当業者に知られているいずれのベクターをも包含し、プラスミドベクター、コスミッドベクター、ラムダファージなどのファージベクター、アデノウィルス、ＡＶＶまたはバキュロウイルスベクターなどのウイルスベクター、または細菌の人工染色体（ＢＡＣ）、酵母の人工染色体（ＹＡＣ）、またはＰ１の人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体ベクターを包含する。発現ベクターは、一般に、所望するコード配列、および具体的な宿主生物（例として、高等真核生物、下等真核生物、原核生物）における作動可能に(operably)連結されたコード配列の発現に要する適切なプロモーター配列を含有する。
【００４９】
典型的には、ベクターは、発現可能なプロモーターまたは調節ヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡをコードするヌクレオチド配列またはＤＮＡ領域と、動作可能に連結されているかまたは結び付けられているところのヌクレオチド配列を含むが、前記調節ヌクレオチド配列は、前記結び付けられたヌクレオチド配列の転写または発現を調節することができるようになっている。典型的には、ベクターの調節ヌクレオチド配列またはプロモーターは、自然界に見出されるとおりの前記結び付けられたヌクレオチド配列には、動作可能に連結されておらず、これ故、作動可能に連結されたＤＮＡ領域のコード配列と異種である。
【００５０】
用語「動作可能に」または「作動可能に」「連結されている（された）」は、本明細書に使用されるとき、プロモーター配列が、関心のある遺伝子の転写を開始することができるように、発現可能なプロモーター配列とＤＮＡ領域または関心のある遺伝子との間の機能的結合を指し、および真核生物細胞における転写の適正な終結を保証するために、関心のある遺伝子と転写を終結する配列との間の機能的連結を指す。「誘導性プロモーター」は、温度、ｐＨ、ある栄養素、特定の細胞シグナル等に限定されないが、これらなどの外部の刺激に応答して「オン」または「オフ」に切り替えられ得る（それ故、遺伝子転写を調節する）プロモーターを指す。それは、「構成的プロモーター」と区別するために使用されるが、前記「構成的プロモーター」とは、絶え間なく「オン」に切り替えられているプロモーターが意味され、すなわち前記「構成的プロモーター」から、遺伝子転写が、構成的に活性である。
【００５１】
本明細書に使用されるとき、「グリカン」は一般に、グリコシド連結されたモノサッカライド、オリゴサッカライドおよびポリサッカライドを指す。これ故、複合多糖の炭水化物の部分、例えば糖タンパク質、糖脂質、またはプロテオグリカンなどの、複合糖質(a glycoconjugate)の炭水化物部分は、本明細書中「グリカン」として言及される。グリカンは、モノサッカライド残基のホモ−またはヘテロポリマーであり得、および線状または分枝状であり得る。Ｎ連結のグリカンは、また本明細書中さらに例示されてもいるとおり、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、および他のモノサッカライドから構成されていてもよい。
【００５２】
真核生物において、Ｏ連結のグリカンは、ゴルジ装置においてペプチド鎖のセリン残基またはスレオニン残基上に、１回に１つの糖が構築される。Ｎ連結のグリカンとは違い、知られているコンセンサス配列はないが、−１または＋３のいずれかでのプロリン残基の位置が、セリンまたはスレオニンと比べて、Ｏ連結のグリコシル化とって好ましい。
【００５３】
「糖−操作された細胞」は、遺伝的に修飾された細胞を指すが、それは、改変されたＮ−グリカン構造および／またはＯ−グリカン構造をもつタンパク質を、野生型バックグラウンドにおけるのと比較して、発現できるようにされている。典型的には、糖タンパク質上の天然に存在する修飾は、グリコシル化経路に関与する酵素の遺伝的操作よって改変されている。一般に、Ｎ連結のグリコシル化における糖鎖は、３つの型に分けられてもよい：高マンノース（典型的には酵母）、複合（典型的には哺乳動物）およびハイブリット型のグリコシル化。それの他、様々なＯ−グリカンのパターンが存在し、例えば酵母のオリゴマンノシルグリカンでは、哺乳動物細胞におけるムチン型Ｏ−グリコシル化とは異なる。
【００５４】
種々のタイプのＮ−およびＯ−グリコシル化は、当業者にすべて周知であり、および文献において定義されている。相当の労力が、所望のＮ−および／またはＯ−グリコシル化のパターンを有する糖タンパク質を生成する真核生物細胞の操作のためのストラテジーの同定および最適化に向けられてきており、および当該技術分野において知られている（例として、De Pourcq、K. et al., Appl Microbiol Biotechnol. 87(5), 2010）。かかる糖−操作された発現系の１つの非限定例は、特許出願WO2010015722に記載されており、およびエンドグルコサミニダーゼと標的タンパク質との両方を発現する（高等または下等）真核生物細胞に関し、およびここで組み換え分泌標的タンパク質は、均一なＮ−グリコシル化パターン（とりわけ１つの単一ＧｌｃＮＡｃ残基（下等真核生物において））またはガラクトース（ＬａｃＮＡｃ）またはシアリル−ＬａｃＮＡｃ（哺乳動物細胞において）で修飾されるＧｌｃＮＡｃなどの、前記パターンの修飾物によって特徴付けられる。
【００５５】
また網羅されるのには、遺伝的に修飾された細胞もあるが、それらが、グリコシル化パターンがヒト様であるかまたはヒト化されたタンパク質または糖タンパク質（すなわち複合型糖タンパク質）を発現できるようになされている。これは、内因性グリコシル化酵素を有し、および／または複合グリコシル化に必要な少なくとも１つの酵素をコードする少なくとも１つの他の外因性の核酸配列を含む、細胞、とりわけ下等真核生物細胞を提供することによって、成し遂げられ得る。不活性化され得た内因性グリコシル化酵素は、アルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ、Ｏｃｈ１ｐ、Ａｌｇ３ｐ、Ｍｎｎ１ｐαファミリーのアルファ−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ、ベータ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼを包含する。複合グリコシル化に必要な酵素は、これらに限定はされないが：Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、マンノシダーゼＩＩ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、フルコシルランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ、およびドナーである糖ヌクレオチドの合成または輸送に関与する酵素を包含する。
【００５６】
ここで想定される、さらに他の糖−操作された細胞、とりわけ酵母細胞は、高マンノース構造（高マンノース型グリカン）の生成に関与する少なくとも１つの酵素が発現されていない点で特徴付けられる。高マンノース構造の生成に関与する酵素は、典型的には、マンノシルトランスフェラーゼである。とりわけ、アルファ−１，６−マンノシルトランスフェラーゼＯｃｈ１ｐ、Ａｌｇ３ｐ、Ｍｎｎ１ｐファミリーのアルファ−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ、ベータ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼは、発現されていないことがある。よって、細胞は、加えてまたは代わりに、具体的なＮ−グリカン構造を高収量にて生成することを可能にする１種以上の酵素または酵素活性を発現するように操作され得る。かかる酵素は、宿主の細胞内小器官に標的にされ得るが、前記小器官において、酵素は、例えば通常酵素とは関連しないシグナルペプチドを用いて、最適な活性を有するであろう。本明細書に記載の酵素およびそれらの活性は、当該技術分野において周知であることが明確であるはずである。
【００５７】
本出願において使用されるとき「糖タンパク質」は、タンパク質の正常な生理学的な文脈および／またはタンパク質の機能的な形態において、タンパク質のポリペプチド側鎖に共有結合により付着されているオリゴサッカライド鎖（グリカン）を含有するタンパク質を指す。加えて、糖タンパク質は、人工的に導入されたグリコシル化部位をもついずれのタンパク質でもある。典型的には糖タンパク質、典型的には組み換え糖タンパク質、例えば異種の組み換え糖タンパク質（真菌または酵母生物において通常には起こらない）は、グリコシル化−操作された真菌または酵母生物において作製されるとき、数種のグリコフォームとして生成される。種々のグリコフォーム（（組み換え）糖タンパク質上の特定の機能的なＮ−グリコシル化部位を起源にするものさえも）が、Ｎ−グリコシル化のプロセスの性質そのもののせいで起こる。
【００５８】
生来、複合Ｎ−グリコシル化グリカンの形成（とくに、複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物における）は、決して１００％効率的ではなく、およびこれ故、種々のグリコフォームが、糖タンパク質上に存在する特定のＮ−グリカン位に起こる。よって、糖タンパク質（例として、２つのＮ−グリカンアクセプター部位をもつ糖タンパク質）において、一方のＮ−グリカンが、複合Ｎ−グリカンであり、および他方のＮ−グリカンが、ハイブリットグリカンまたは高マンノース型グリカンであることは、起こり得ることである。とりわけ、糖タンパク質は、本明細書に使用されるとき、生理学的に活性な形態においてＮ−グリコシル化を示すタンパク質である。よって、糖タンパク質は典型的には、1つのアスパラギン残基上に少なくとも糖鎖を含有する。非限定的な糖タンパク質のリストは、本明細書に提供される。用語「糖タンパク質」は、全長の(the length of)アミノ酸鎖を指すことは意図しておらず、「糖ペプチド」は、「糖タンパク質」の定義内に包含される。
【００５９】
用語「（糖）タンパク質」および「酵素」（例として、エンドグルコサミニダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、マンノシダーゼ、マンノシルトランスフェラーゼ）はまた、本出願において使用されるとき、天然に存在するタンパク質の機能的に活性なフラグメントおよび変異体をもカバーすることを意図する。実際、多くの（例として、治療用）タンパク質にとって、一部のタンパク質は、（例として、治療的、酵素的）効果を成し遂げるのに十分であってもよい。同じことが、変異体にも（すなわち、１個以上のアミノ酸が、他のアミノ酸と置換されてはいるが、機能性を保持するかまたは改善された機能性を示しさえもするタンパク質）、とりわけ酵素的活性のために最適化された酵素の変異体にも適用される。
【００６０】
本出願の文脈において、糖タンパク質は、タンパク質それ自体を指す；糖タンパク質は、そのグリコシル化された形態またはグリコシル化されていない形態のいずれかであってもよい。「グリコシル化（された）」タンパク質は、少なくとも１つのオリゴサッカライド鎖を持つ（糖）タンパク質である。Ｎ−グリコシル化されたタンパク質、具体的には、Ｎ−グリコシル化された組み換え糖タンパク質は、Ｎ−グリカン上に少なくとも１つのオリゴサッカライド鎖を持つ糖タンパク質である。
【００６１】
本発明において使用されるとき「グリコフォーム」は、グリコシル化された糖タンパク質の変異体であり、ここでその変異度(the variation)は、該糖タンパク質上に存在するＮ−グリカン組成における。
【００６２】
「糖鎖」、「オリゴサッカライド鎖」または「炭水化物鎖」は、本明細書に使用されるとき、クレームにおいて、Ｎ−グリカン（このＮ−は、Ｎ−グリコシル化を指す）と言及される。糖鎖は、分枝状であってもまたはそうでなくてもよく、および１つ以上のタイプのオリゴサッカライドを含んでいてもよい。一般に、Ｎ−連結グリコシル化における糖鎖は、３つのタイプ：高マンノース、複合およびハイブリッド型のグリコシル化に分けられることがある。それらの用語は、当業者に周知であり、および文献に定義される。簡単には、高マンノース型グリコシル化は、典型的には、（ことによると多くの）マンノースおよび／またはマンノシルホスファート残基をもつ（が典型的には、他のモノサッカライドは何らない）２つのＮ−アセチルグルコサミンを含むオリゴサッカライド鎖を指す。
【００６３】
複合グリコシル化は、ほとんどの場合に内側コア構造体のＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２へ連結されている、典型的には１つ、２つまたはそれより多く（例として最大６つまで）の外側分枝をもつ構造体を指す。実例として、複合Ｎ−グリカンは、ＧｌｃＮＡｃを交互に、および任意に、ガラクトース（Ｇａｌ）残基をもまたもつ、少なくとも１つの分枝またはすくなくとも２つの分枝を有していてもよい。前記残基は、様々なオリゴサッカライドにおいて終端となり得るが、典型的にはマンノース残基とは終端とならないであろう。複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物において作製された複合Ｎ−グリカンの数例は、添付の例の節に示されている。明確さのために、糖タンパク質のＮ−グリコシル化部位上に存在する単一ＧｌｃＮＡｃは、複合Ｎ−グリカンとして見なされない。
【００６４】
ハイブリッド型のグリコシル化は、中間体の形態、すなわち、末端マンノース残基と末端非マンノース残基との両方を、２つのＮ−アセチルグルコサミン残基に加えて持つそれらのグリコシル化されたタンパク質をカバーする。複合グリコシル化とは対照的に、ハイブリット型グリコシル化構造体の少なくとも１つの分枝は、マンノース残基で終わる。ハイブリットＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物に存在する異種のグリコシルトランスフェラーゼ酵素の非効率的なグリコシル化を起源とし得る。
【００６５】
「複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物」は、本出願に使用されるとき、野生型の真菌生物において発現されていない複合Ｎ−グリコシル化に必要な酵素をコードする少なくとも１つの外因性核酸配列を発現するか、および／または野生型の真菌において通常発現される高マンノース型構造体の生成に関与する少なくとも１つの酵素も発現しない、真菌細胞である。具体的には、複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物は、複合Ｎ−グリコシル化操作された酵母である。複合Ｎ−グリコシル化−操作された酵母を目指して(towards)操作され得る酵母の非限定例は、Saccharomyces種（例として、Saccharomyces cerevisiae）、Hansenula種（例として、Hansenula polymorpha）、Arxula種（例として、Arxula adeninivorans）、Yarrowia種（例として、Yarrowia lipolytica）、Kluyveromyces種（例として、Kluyveromyces lactis）、またはKomagataella phaffii（Kurtzman, C.P. (2009) J Ind Microbiol Biotechnol. 36(11)）を含む。前記Komagataella phaffiiは、古い命名法の下Pichia pastorisとして先に名付けられてより良く知られており、また本明細書中もさらに使用される。
【００６６】
特定の態様に従うと、下等真核生物の細胞は、Pichia細胞であり、および最も具体的な態様において、Pichia pastoris細胞である。さらに他の「複合Ｎ−グリコシル化−操作された真菌生物は、Mycelioptopla thermophila（Dyadic社によるC1としてもまた知られる）、Aspergillus種（例として、Aspergillus nidulans、Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Aspergillus japonicus）、Fusarium種（例として、Fusarium venenatum）、HypocreaおよびTrichoderma種（例として、Trichoderma reesei）を含む。
【００６７】
具体的な態様に従うと、複合Ｎ−グリコシル化に必要な酵素は、マンノシルトランスフェラーゼ以外に、マンノシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼである。さらに具体的な態様に従うと、複合グリコシル化に必要な少なくとも1つの酵素は、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、マンノシダーゼＩＩ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、およびシアリルトランスフェラーゼからなる群から選択される。
【００６８】
具体的な態様に従うと、複合Ｎ−グリコシル化酵母細胞（または要するに、グリコシル化−操作された酵母細胞または糖−操作された酵母細胞）は、高マンノース構造体（高マンノース型グリカン）の生成に関与する少なくとも１つの酵素も発現されない（または前記酵素は、その細胞において、野生型の細胞おけるのと同程度には機能的に活性ではない）点で特徴付けられてもよい。さらに具体的な態様に従うと、少なくとも１つのマンノシルトランスフェラーゼも、糖−操作された酵母細胞において発現されない。典型的には、糖−操作された酵母細胞において発現されないマンノシルトランスフェラーゼは、その酵母細胞の野生型に相当するものにおいて発現される。
【００６９】
その上さらなる具体的な態様に従うと、マンノシルトランスフェラーゼは、α−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ、α−１，３−マンノシルトランスフェラーゼ、α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼ、またはβ−１，４−マンノシルトランスフェラーゼである。それらのタンパク質は、しばしば、酵母において特定の名称を有する（例として、Ａｌｇ、Ｏｃｈ、Ｍｎｎ）が、それらの活性は当該技術分野において周知である。代わりに、または加えて、少なくとも1つのマンノシルホスファートトランスフェラーゼは、複合Ｎ−グリコシル化−操作された酵母細胞において、機能的に活性ではない。
【００７０】
「エンドグルコサミニダーゼ」は、本明細書に使用されるとき、糖タンパク質または糖脂質のオリゴサッカライドにおける非末端ベータ−連結Ｎ−アセチルグルコサミン基のアノマー炭素と、そのアグリコンとの間の結合を加水分解し、それによって糖タンパク質または糖脂質または糖ポリマーから、モノ−またはオリゴサッカライドを放出する酵素を指す。エンドグルコサミニダーゼは、グリコシダーゼの部分集合であり、他の酵素的活性（例としてグリコシルトランスフェラーゼ活性など）を有しても、または有さなくてもよい。エンドグルコサミニダーゼの具体的な分類は、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼまたはマンノシル−糖タンパク質エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによって形成され、International Union of Biochemistry and Molecular Biology（ＩＵＢＭＢ）命名法において、EC 3.2.1.96として指し示される。
【００７１】
酵素のこの具体的な分類は、高マンノース糖ペプチドおよび−［Ｍａｎ（ＧｌｃＮＡｃ）２］Ａｓｎ−構造を含有する糖タンパク質中のＮ，Ｎ’−ジアセチルキトビオシル単位の内部加水分解(endohydrolysis)を触媒することが可能である。１つのＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基は、タンパク質に付着されたままである；残りのオリゴサッカライドは、完全に放出される。よって、その結果は、単一のＧｌｃＮＡｃ修飾されたＮ−グリコシル化部位が糖タンパク質上に存在する。修飾ＧｌｃＮＡｃ残基をもつ糖タンパク質がまだ、単一のＧｌｃＮＡｃ−修飾タンパク質と言及されるのは、ＧｌｃＮＡｃ残基の位置４上に、第２の糖残基がないからである（すなわち、典型的な糖鎖がない)。エンドグルコサミニダーゼの非限定的リストは、さらに本出願において提供される。
【００７２】
具体的には、Ｎ−グリコシル化−操作された真菌または酵母細胞に関して、「複合グルコシル化に必要な酵素」は、本明細書に使用されるとき、高等真核生物に見出されるとおりの、とりわけ哺乳動物に見出されるとおりの、さらにとりわけヒトに見出されるとおりの複合グリカンの合成に関与することのある宿主真菌または酵母細胞において、天然には存在しないいずれの酵素をも指す。最も具体的には、かかる酵素は、マンノース残基を糖鎖から取り除く酵素（すなわち、マンノシダーゼ）またはグリコシルトランスフェラーゼ、とりわけマンノシルトランスフェラーゼ以外のグリコシルトランスフェラーゼ（すなわち、高マンノースグリカンにおいては見出されないモノサッカライドを転移するグリコシルトランスフェラーゼ）、および／またはホスホマンノシルトランスフェラーゼである。
【００７３】
「グリコシルトランスフェラーゼ」は、本出願に使用されるとき、生化学的反応におけるグリコシル基の転移、とりわけ、Ｎ連結の糖タンパク質を与えるための、アスパラギンで連結された糖残基への転移を触媒する酵素群のうちのいずれかである。グリコシルトランスフェラーゼは、ＩＵＢＭＢ命名法におけるEC 2.4に該当し、グリコシルトランスフェラーゼの具体的な分類は、ヘキソシルトランスフェラーゼである（EC2.4.1）。ペプチドを処理して糖タンパク質にする広範囲のこれら翻訳後酵素は、これらに限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、シアリルトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルトランスフェラーゼ、およびマンノシルトランスフェラーゼなどの酵素である。
【００７４】
特目すべきは、外因性マンノシルトランスフェラーゼは、本出願に記載されるＮ−グルコシル化−操作された酵母細胞の特定の様態から除外される。「マンノシルトランスフェラーゼ」は、本出願に使用されるとき、ゴルジ装置における、アクセプター分子、典型的には別の炭水化物へのマンノシル基の転移を触媒する酵素を指す。マンノシルトランスフェラーゼは、典型的には、真菌および酵母における内因性酵素であり、および高マンノース型グリカンの合成に関与する。
【００７５】
注目に値するのは、酵素が、グリコシルトランスフェラーゼ活性を、そのエンドグルコサミニダーゼ活性とは別に保有していてもよいことである。１つの酵素を使用して、それら２つの活性を発揮することはあり得ることではあるものの、典型的には、使用される酵素は、１つの機能しか果たさないであろう。よって、必ず酵素が１つの機能しか奏しないように修飾または突然変異させられた酵素、または酵素が特定の機能をより効率的に実行するのを保証するように修飾または突然変異させられた酵素を使用することが想定される。かかる修飾酵素は、当該技術分野において知られている。
【００７６】
本発明は、組み換え糖タンパク質上に存在する、均一な形態のＮ−グリカン、具体的には複合Ｎ−グリカンを含む、組成物、具体的には医薬組成物を提供することを目的とする。かかる組み換え糖タンパク質は、複合Ｎ−グリコシル化−操作された真菌生物において生成される。
【００７７】
一態様において、本発明は、複数個の組み換え糖タンパク質を含む組成物を提供し、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体との混合物を含み、およびここで該組み合わせられた複合Ｎ−グリカンおよび単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンは、該組成物中、総Ｎ−グリカンの９０％より高いレベルにて存在する。
【００７８】
更に別の態様において、本発明は、組み換え糖タンパク質の複数個のグリコフォームを含む組成物を提供し、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体との混合物を含み、およびここで該複合Ｎ−グリカンは、該組成物中、総Ｎ−グリカンの９０％より高いレベルにて存在する。
【００７９】
更に別の態様において、本発明は、複数個の組み換え糖タンパク質を含む精製された組成物を提供し、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体との混合物を含み、およびここで該組み合わせられた複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンとは、該組成物中、総Ｎ−グリカンの９０％より高いレベルにて存在する。
【００８０】
更に別の態様において、本発明は、組み換え糖タンパク質の複数個のグリコフォームを含む精製された組成物を提供し、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体との混合物を含み、およびここで該複合Ｎ−グリカンは、該組成物中、総Ｎ−グリカンの９０％より高いレベルにて存在する。
【００８１】
これは、特定の側面に従うと、糖タンパク質をコードする外因性核酸配列をもつ複合Ｎ−グリコシル化−操作された真菌生物を提供すること、および分泌された糖タンパク質をin vitroで（例として、発酵培地への添加によって、または精製された糖タンパク質にへの添加によって、または糖タンパク質精製の間の添加によって）好適な量のエンドグルコサミニダーゼに接触させることによって、成し遂げられる。典型的には、該エンドグルコサミニダーゼは、好適な宿主細胞において組み換えで生成され、その規模が拡大され(upscaled)および精製され、および複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物の成長培地に存在する分泌された糖タンパク質へ加えられる。
【００８２】
重要なことに、該エンドグルコサミニダーゼは、関心のある糖タンパク質をもまた発現する同じ細胞よっては生成されない。特定の態様において、該エンドグルコサミニダーゼは、組み換え糖タンパク質の精製の間に、組み換え糖タンパク質へ適用される。更に別の特定の態様において、該エンドグルコサミニダーゼは、組み換え糖タンパク質の精製の後に、組み換え糖タンパク質へ適用される。
【００８３】
更に別の態様において、本発明は、組み換え糖タンパク質の複数個のグリコフォームを含む組成物を提供し、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体との混合物を含み、ここで該組み合わせられた複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンとは、該組成物中、総Ｎ−グリカンの９０％より高いレベルにて存在し、ここで該組成物は、複合Ｎ−グリコシル化−操作された真菌生物における該糖タンパク質の生成によって得られ、前記生成が、該糖タンパク質をコードする外因性遺伝構築物を含む該組み換え複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物を、該糖タンパク質が発現される条件下で増殖させること、および該組み換え糖タンパク質をエンドグルコサミニダーゼの添加に接触させることを含む。
【００８４】
更に別の様態において、本発明は、組み換え糖タンパク質の複数個のグリコフォームを含む組成物を提供し、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体との混合物を含み、ここで該複合Ｎ−グリカンは、該組成物中、総Ｎ−グリカンの９０％より高いレベルにて存在し、ここで該組成物は、複合Ｎ−グリコシル化−操作された真菌生物における該糖タンパク質の生成によって得られ、前記生成は、該糖タンパク質をコードする外因性遺伝構築物を含む該組み換え複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物を、該糖タンパク質が発現される条件下で増殖させること、および該組み換え糖タンパク質をエンドグルコサミニダーゼの添加に接触させることを含む。
【００８５】
糖タンパク質の性質は、本発明にとって重大なことではないが、糖タンパク質は、典型的には、均一なＮ−グリコシル化が重要である薬および／または産業に関係のあるタンパク質であるであろう。非限定例は、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒト上皮成長因子受容体−２（ＨＥＲ−２）、線維芽細胞成長因子−アルファ（ＦＧＦ−α）、線維芽細胞成長因子−ベータ（ＦＧＦ−β）、形質転換成長因子−アルファ（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、インスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経成長因子−ベータ（ＮＧＦ−β）などの、多くのホルモン、成長因子、サイトカインおよびこれらに対応する受容体；前述の受容体、成長ホルモン（例として、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン）；
【００８６】
インスリン（例として、インスリンＡ鎖およびインスリンＢ鎖）、プロインスリン；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；コロニー刺激因子（例として、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）；インターロイキン（例として、ＩＬ−１からＩＬ−３３）；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびその受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）；インターフェロン（例として、ＩＦＮ−α、β、またはγ）；腫瘍壊死因子（例として、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）およびそれらの受容体、ＴＮＦＲ−１およびＴＮＦＲ−２；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；トロンビン；脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）；凝固因子（例として、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、フォンウィルブラント因子等）；抗凝固因子；組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）、例として、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織タイプＴＰＡ；カルシトニン；ＣＤタンパク質（例として、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１９等）；ＣＴＬＡタンパク質（例として、ＣＴＬＡ４）;
【００８７】
Ｔ細胞およびＢ細胞受容体タンパク質；抗体、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ、例として、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３等）；神経栄養因子、例として、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；ニューロトロフィン、例として、ＮＴ３〜６；レニン；リウマチ因子；ランテス；アルブミン；リラキシン；マクロファージ炎症性タンパク質（例として、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−２）;ウイルスタンパク質または抗原；表面膜タンパク質；イオンチャネルタンパク質；酵素；アルカリホスファターゼ；レクチン；調節タンパク質；抗体；免疫調節タンパク質、（例として、ＨＬＡ、ＭＨＣ、Ｂ７ファミリー）；ホーミング受容体；輸送タンパク質；スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）；Ｇタンパク質共役型受容体タンパク質（ＧＰＣＲ）；神経調節タンパク質；アルツハイマー病に関連するタンパク質およびペプチド（例として、Ａ−ベータ）、および当該技術分野において知られているその他のものを包含し、上の融合タンパク質またはキメラタンパク質も包含する。
【００８８】
エンドグルコサミニダーゼの性質は、糖タンパク質の所望の糖集団(glycopopulation)に依存するであろう。実例として、エンドグルコサミニダーゼは、それらの基質特異性について選択されてもよい。いくつかのエンドグルコサミニダーゼ、例としてＥｎｄｏ ＨおよびＥｎｄｏ Ｔは、高マンノース型糖鎖およびハイブリット型糖を加水分解するが、複合炭水化物構造体を無傷(intact)のまま残す。
【００８９】
かかる酵素は、例として、複合Ｎ−グリカンからなるＮ−グリカンを得ることにとって、および望ましくない高マンノースおよび／またはハイブリット型糖を生成された糖タンパク質から取り除くことにとって、および我々が本発明の例において予想外に観察し示したとおり、複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物において発現される組み換え糖タンパク質上のＮ−グリカンネオグリコフォームを取り除くことにとってもまた、理想的である。具体的な態様に従うと、エンドグルコサミニダーゼは、高マンノース型糖鎖、ハイブリッド型グルカン、Ｎ−グルカンネオグリコフォームを加水分解するが、複合型グルカンを加水分解しない。
【００９０】
エンドグルコサミニダーゼはまた、糖タンパク質（糖鎖のみの代わりに）に関して基質特異性をも有していてもよく、いくつかのエンドグルコサミニダーゼは、例として、糖鎖を（具体的には、コンパクトに折り畳まれた）タンパク質から加水分解することにおいて、他のエンドグルコサミニダーゼ（例として、Ｅｎｄｏ Ｔ）よりも成功しており、その他のものは（もまた）、具体的には、糖鎖を、糖ペプチドまたはコンパクトに折り畳まれていないタンパク質（例として、Ｅｎｄｏ Ｈ、Ｅｎｄｏ Ｔ）から加水分解することにおいて成功していてもよい。重要なことに、これが、典型的には、エンドグルコサミニダーゼの特異性によるというよりはむしろ、基質への接近または基質の利用可能性によるものであることから、これは、特定のタンパク質のためのある酵素の使用を除外しないが、いくつかのエンドグルコサミニダーゼは、すべてのＮ連結糖構造体の加水分解を完了するのにより多くの時間を要求することがある。複合糖−操作された真菌細胞（Pichia pastoris等）において生成されたＮ−グリコシル化されたタンパク質上に存在する、高マンノースＮ−グリカンまたはハイブリットＮ−グリカンの、Ｅｎｄｏ ＴまたはＥｎｄｏ Ｈによる加水分解は、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンへ繋がる。
【００９１】
エンドグルコサミニダーゼの具体的な好ましい分類は、ＩＵＢＭＢ命名法におけるEC 3.2.1.96として指示される、マンノシル−糖タンパク質、エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによって形成される。これらの酵素は、タンパク質上の１つのＧｌｃＮＡｃ残基を残しつつ、糖鎖（本明細書に示されるとおりのハイブリッドＮ−グリカン、高マンノースＮ−グリカンおよびＮ−グリカンのネオグリコフォーム）を取り除き得る。これらの例は、これらに限定されないが、Ｅｎｄｏ Ａ、Ｅｎｄｏ ＢＨ、Ｅｎｄｏ ＣＥ、Ｅｎｄｏ Ｄ、Ｅｎｄｏ Ｆ１、Ｅｎｄｏ Ｈ、Ｅｎｄｏ Ｍ、Ｅｎｄｏ Ｔ（またWO2006/050584も参照）、およびＥＮＧａｓｅを包含する。他の例も、当業者に知られており、実例としてwww.cazy.orgから、とりわけGlycoside Hydrolase Family 85および18の下で見出され得る。具体的には、WO2006/050584に記載されるHypocrea jecorina（以前はTrichoderma reeseiとして知られていた）からのＥｎｄｏ Ｔ酵素（例として、その文献中(therein)配列番号９〜１２を参照）の使用が想定される。
【００９２】
「ネオグリコフォーム」は、異種の発現、遺伝子欠失または他のプロセスを通したＮ−グリコシル化経路における介入の結果として、高度に操作された株においてでさえも形成することがある予想外のＮ−グリカンであり得る。原因となるグリコシルトランスフェラーゼは、同定されてこれらのノックアウトに着手する(initiate)べきであろう。
【００９３】
本発明において、我々は、ネオグリコフォームが、エンドグルコサミニダーゼによって取り除かれ得ること、およびそれらが取り除かれることが、酵母−特定のバックグラウンドの存在は低減されつつも、より均一なグリコシル化プロファイルを提供するかまたはより高い純度を提供する糖タンパク質へ繋がることを示す。
【００９４】
ネオグリコフォームは、例えば、テトラ−サッカライド修飾をもつＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを含む。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンのテトラ−サッカライド（Ｇｌｃα１−２Ｍａｎβ１−２Ｍａｎβ１−３Ｇｌｕｃα−）置換は、マンノシルコアの最内側α―１，３アームへ付着されている見込みが最も高い。ネオグリコフォームは、再び現れる数多の中間体を含み得、および再び現れる中間体は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を含み得る。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンは、β−マンノースおよび／またはグルコースを含有する線状ヘキソシル−サッカライドで置換され得る。ネオグリコフォームは、Ｈｅｘ６〜９ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを、およびＨｅｘ６〜１１ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンさえも、含み得る。加えて、あるネオグリコフォームは、１つ以上のホスホマンノース残基を含有していてもよい。
【００９５】
特定の態様において、本発明は、組み換え糖タンパク質の複数個のグリコフォームを含む組成物を提供し、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体との混合物からなる。
【００９６】
複合Ｎ−グリカンの混合物内の１つの主なグリコフォームを得ることは、有利であり得る。かかる主なグリコフォームは、典型的には、複合Ｎ−グリコシル化−操作された真菌生物における糖タンパク質の生成によって生じる。
【００９７】
特定の態様において、組成物は、組み換え糖タンパク質の複数個のグリコフォームを含み、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンの混合物からなり、および単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体は実質的に、高マンノース型Ｎ−グリカン構造体を欠いており、ハイブリッドグリカン構造体を欠いており、およびＮ−グリカンネオグリコフォームを欠いている。文言「高マンノース型Ｎ−グリカン構造体を欠いており、ハイブリッドグリカン構造体を欠いており、およびＮ−グリカンネオグリコフォームを欠いている」は、組み換え糖タンパク質上に存在するＮ−グリカンが本質的に、複合型Ｎ−グリカンからなることを意味する。特定の態様において、組成物は、組み換え糖タンパク質の複数個のグリコフォームを含み、ここで該糖タンパク質は、複合Ｎ−グリコシル化−操作された真菌生物において生成され、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンからなり、および単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体は実質的に、高マンノース型Ｎ−グリカン構造体を欠いており、ハイブリッドグリカン構造体を欠いており、およびＮ−グリカンネオグリコフォームを欠いている
【００９８】
更に別の特定の態様において、本発明は、組み換え糖タンパク質の複数個のグリコフォームを含む組成物を提供し、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体との混合物を含み、該複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンとの合計は、該糖タンパク質上に存在する総Ｎ−グリカンの９０％より高いレベルにて存在する。
【００９９】
文言「該複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンとの合計」は、「組み合わせられた複合Ｎ−グリカンおよび単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン」と同等であり、本発明のプロセス（または方法）は、すべての非複合Ｎ−グリカン（言い換えれば、複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物に由来する、ハイブリッドＮ−グリカンおよび高マンノースＮ−グリカン）が完全に取り除かれたことを除外し得ないという事実を指す。いずれのケースにおいても、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンとの合計は、組み換え糖タンパク質上に存在するＮ−グリカンの総量に関し、９０％より高い、９３％より高い、および多くの実例においてなお９８％より高いレベルにて存在する。
【０１００】
更に別の特定の態様において、本発明は、組み換え糖タンパクの複数個のグリコフォームを含む組成物を提供し、ここで該糖タンパク質は、複合Ｎ−グリコシル化−操作された真菌生物において生成され、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体との混合物を含み、ここで該複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンとは、該糖タンパク質上に存在する総Ｎ−グリカンの９０％より高い、９３％より高い、またはなお９８％より高いレベルにて存在する。
【０１０１】
更に別の特定の態様において、本発明は、組み換え糖タンパクの複数個のグリコフォームを含む医薬組成物を提供し、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体との混合物を含み、ここで該複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンとは、該混合物中９０％より高い、９３％より高い、またはなお９８％より高いレベルにて存在する。
【０１０２】
更に別の特定の態様において、本発明は、組み換え糖タンパク質の複数個のグリコフォームを含む医薬組成物を提供し、ここで該糖タンパク質は、複合Ｎ−グリコシル化−操作された真菌生物において生成され、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体との混合物を含み、ここで該複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンとは、該混合物中９０％より高い、９３％より高い、またはなお９８％より高いレベルにて存在する。
【０１０３】
更に別の特定の態様において、複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物において生成された組み換え糖タンパク質が、少なくとも２つの機能的なＮ−グリコシル化アクセプター部位を有する場合、そのときはまた複数個のグリコフォームも生成されるが、このときこの組み換え糖タンパク質は、培地から精製され、および細胞外で好適な量のエンドグルコサミニダーゼに接触させられる。このケースにおいて、またこの組み換え糖タンパク質のグリコフォームも、単一ＧｌｃＮＡｃと、複合Ｎ−グリカンからなるＮ−グリカンからなる同じ組み換え糖タンパク質上に生じるであろう。
【０１０４】
よって、２つの機能的なＮ−グリコシル化部位は、糖タンパク質上に存在するケースにおいて、理論的に数多の異なって混合されたグリコフォーム（例として、単一ＧｌｃＮＡｃ Ｎ−グリカンと複合Ｎ−グリカンとの混合物）が生じるであろう。該組み換え糖タンパク質上に存在する総Ｎ−グリカンに関し、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンとの合計は、９０％より高くなるであろうことが理解される。
【０１０５】
結果的に、更に別の態様において、本発明は、少なくとも２つのＮ−グリコシル化部位を有する組み換え糖タンパク質のグリコフォームを提供し、ここで該糖タンパク質上に存在する少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位は、単一ＧｌｃＮＡｃからなり、および該同じ糖タンパク質上の少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位は、複合Ｎ−グリカンからなる。
【０１０６】
更に別の態様において、本発明は、少なくとも２つのＮ−グリコシル化部位を有する組み換え糖タンパク質のグリコフォームを含む医薬組成物を提供し、ここで該糖タンパク質上に存在する少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位は、単一ＧｌｃＮＡｃからなり、および該同じ糖タンパク質上の少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位は、複合Ｎ−グリカンからなる。
【０１０７】
更に別の態様において、本発明は、組み換え糖タンパク質の複数個のグリコフォームを含む組成物を提供し、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体との混合物を含み、ここで該複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンとは、該混合物中９０％より高いレベルにて存在し、ここで該組成物は、複合Ｎ−グリコシル化−操作された真菌生物における該糖タンパク質の生成によって得られ、前記生成は、該糖タンパク質をコードする遺伝構築物を含む発現ベクターを含む組み換え複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物を、該糖タンパク質が発現される条件下で増殖させること、および該組み換え糖タンパク質を、これが生成された後に、エンドグルコサミニダーゼに接触させることを含む。
【０１０８】
更に別の態様において、本発明は、組み換え糖タンパク質の複数個のグリコフォームを含む医薬組成物を提供し、ここで該グリコフォーム上に存在するＮ−グリカンは、複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカン構造体との混合物を含み、ここで該複合Ｎ−グリカンと、単一ＧｌｃＮＡｃからなるＮ−グリカンとは、該混合物中９０％より高いレベルにて存在し、ここで該組成物は、複合Ｎ−グリコシル化−操作された真菌生物における該糖タンパク質の生成によって得られ、前記生成は、該糖タンパク質をコードする遺伝構築物を含む発現ベクターを含む組み換え複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物を、該糖タンパク質が発現される条件下で増殖させること、該組み換え糖タンパク質を、これが生成された後にエンドグルコサミニダーゼに接触させることおよび精製すること、および結果として得られた組み換えタンパク質の複数個のグリコフォームを適切な医薬賦形剤（または担体）とともに製剤化することを含む。
【０１０９】
本発明に従って生成される特定の糖タンパク質の組成物またはグリコフォームを含有する医薬組成物は、所望の薬理効果を、これを必要とする患者への投与によって成し遂げるために利用され得る。患者は、本発明の目的において、具体的な状態または疾患のための処置を必要とする、ヒトを包含する哺乳動物である。
【０１１０】
したがって、本発明は、薬学的に許容し得る担体および薬学的に有効な量の本発明の特定の糖タンパク質またはその塩の組成物またはグリコフォームから構成される医薬組成物を包含する。薬学的に許容し得る担体は好ましくは、担体に帰せられるいずれの副作用も活性成分の有益な効果を損なわないように、活性成分の有効な活性と合致する濃度にて患者にとって相対的に無毒性および無害である担体である。
【０１１１】
薬学的に有効な量の組成物または特定の糖タンパク質のグリコフォームは、好ましくは、結果をもたらすか、または処置されている具体的な状態に対する影響を発揮するその量である。本発明の特定の糖タンパク質の組成物またはグリコフォームは、当該技術分野において周知の薬学的に許容し得る担体とともに、いずれか有効な従来の剤形（即時放出、徐放および持続放出の(immediate、slow and timed release)調製物を包含する）を使用して、経口で、非経口で、局所的に、経鼻で、眼から(ophthalmically)、髄腔内に、脳室内に、舌下に、直腸内に、経膣的に等、投与され得る。
【０１１２】
本明細書のとおり複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌細胞は、組み換え糖タンパク質の複数個のグリコフォームを生成してもよい。唯一の機能的Ｎ−グリコシル化部位が、組み換え糖タンパク質上で起こるケースにおいて、主なあるグリコフォームは、複合Ｎ−グリカンを持つであろう一方、別のグリコフォームは、単一ＧｌｃＮＡｃを持つであろう。特定の側面において、グリカンのこれら２つの集団を分離することは、有利なこともある。例えば、複合Ｎ−グリカンしか持たない組み換え糖タンパク質とともに働くことは、ある実例において、望ましいことであり得る。これらのケースにおいて、単一ＧｌｃＮＡｃしか持たないグリコフォームは、複合Ｎ−グリカンを持つグリコフォームから容易に分離され得る。
【０１１３】
代わりの具体的な態様に従うと、該組み換え糖タンパク質は、該糖タンパク質の同じＮ−グリコシル化部位上に、単一ＧｌｃＮＡｃと複数個の複合Ｎ−グリカンとの両方を提示する１つ以上のＮ−グリコシル化部位を有する。
【０１１４】
具体的な態様に従うと、組み換え糖タンパク質は、２つ以上のＮ−グリコシル化部位を有し、ここで該糖タンパク質上に存在する１つ以上のＮ−グリコシル化部位は、単一ＧｌｃＮＡｃからなり、および該同じ糖タンパク質上の１つ以上のグリコシル化部位は、複数個の複合Ｎ−グリカンからなる。
【０１１５】
具体的な態様に従うと、該組み換え糖タンパク質の該グリコフォームは、少なくとも３つのグリコシル化部位を有し、ここで該糖タンパク質上の少なくとも１つのＮ−グリコシル化部位は、単一ＧｌｃＮＡｃからなり、少なくとももう１つのＮ−グリコシル化部位は、複数個の複合Ｎ−グリカンからなる。
【０１１６】
具体的な態様に従うと、複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物において生成後に分泌された糖タンパク質へ細胞外で加えられたエンドグルコサミニダーゼ酵素は、マンノシル−糖タンパク質エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである、すなわちそれは、ＩＵＢＭＢ命名法におけるE.C. 3.2.1.96の活性を有する、暗にそれは、タンパク質上の糖鎖を取り除きつつ、あるＧｌｃＮＡｃ残基は残すことを示す。代わりの態様に従うと、エンドグルコサミニダーゼは、種々のタイプのグリコシル化構造体に対して種々の親和性を有する。
【０１１７】
後者の典型例は、ハイブリッド型の糖および／または高マンノース糖を加水分解することができるが、複合型グリカンを切断することが可能ではないエンドグルコサミニダーゼである。さらに具体的な態様に従うと、エンドグルコサミニダーゼは、種々のタイプのグリコシル化構造体に対し種々親和性を有するマンノシル−糖タンパク質エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼである。更にさらなる具体的な態様に従うと、エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼは、ハイブリッド型の糖および／または高マンノース糖を切断することができるが、複合型グリカンは切断できない。なおより具体的な態様に従うと、エンドグルコサミニダーゼは、ＥｎｄｏＨまたはＥｎｄｏＴである。最も具体的な態様に従うと、エンドグルコサミニダーゼは、ＥｎｄｏＴである。
【０１１８】
具体的な態様に従うと、複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌（例として、酵母）生物を操作するのに必要な少なくとも１種の酵素は、１種より多くの酵素である。より具体的には、少なくとも１種の酵素は、複合グリコシル化のための経路を形成するのに必要な数の酵素である。より具体的には、複合グリコシル化に必要なこれらの酵素の各々は、それらが連続的におよび正しい順序で作用するように、標的にされる（典型的には、ある酵素は、次の酵素のための基質に対し糖鎖を修飾するであろう）。具体的な態様に従うと、複合グリコシル化に必要な少なくとも１種の酵素は、少なくとも１種のＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（例として、ＧｎＴ Ｉ、ＧｎＴ ＩＩ、ＧｎＴ ＩＩＩ、ＧｎＴ ＩＶ、ＧｎＴ Ｖ、ＧｎＴ ＶＩ）、少なくとも１種のマンノシダーゼ（とりわけ、マンノシダーゼＩＩ）、少なくとも１種のフコシルトランスフェラーゼ、少なくとも１種のガラクトシルトランスフェラーゼ、少なくとも１種のシアリルトランスフェラーゼ、またはこれらの酵素のいずれかの組み合わせである。
【０１１９】
複合グリコシル化経路が操作された糖−操作された酵母の例は、当該技術分野において広く記載されている（例として、Choi et al., 5022 2003；Hamilton et al.；Science 1244；Wildt et al., 119 2005；Hamilton et al., 387 2007；EP1211310；WO02/000879；US2006148039を参照）。加えて、数多の他の遺伝子もまた、本明細書に記載の糖−操作された酵母細胞において形質転換されて、ＥＲおよびゴルジの特定のトランスポーター（例として、ＵＤＰ−ガラクトースのための共輸送および対向輸送トランスポーターおよび他の前駆体）などの複合型グリコシル化糖タンパク質、またはＵＤＰ−ガラクトースおよびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸などの活性化されたオリゴサッカライド前駆体の合成に関与する酵素の最適な生成を確実にしてもよい。実際、複合グリコシル化に必要な少なくとも１種の酵素と接触することは、効率的で的確なグリコシル化を確実にする特定のグリコシルドナー（例として、糖ヌクレオチドドナー）の存在下で起こってもよい。
【０１２０】
本明細書に記載のとおりの方法は、糖タンパク質とエンドグルコサミニダーゼとの間の接触が、最適な状況下で起こることを確実にするために（すなわち、例として、特定のｐＨ、温度、塩および緩衝液の条件に依存して、糖タンパク質上でのエンドグルコサミニダーゼの最適な活性を確実にするために）さらに順応されてもよい。
【０１２１】
「接触した」または「接触させること」は、本明細書に使用されるとき、生成された組み換え糖タンパク質とエンドグルコサミニダーゼとの間の物理的な近接を指す。本発明において「接触させること」は、in vitroで起こる。
【０１２２】
本明細書に記載の方法は、糖タンパク質とエンドグルコサミニダーゼとの間の接触が、最適な状況下で起こることを確実にするために（すなわち、糖タンパク質上でのエンドグルコサミニダーゼの最適な活性を確実にするため、または糖タンパク質の生体活性の保持を、そのエンドグルコサミニダーゼとの接触の間およびそれの後に確実にするために）さらに順応されてもよい。
【０１２３】
エンドグルコサミニダーゼと糖タンパク質との間で接触することは、細胞外で起こってもよい。エンドグルコサミニダーゼと糖タンパク質との間での接触が、糖タンパク質の分泌後、細胞外で発生することもあり得る。しかしながら、使用される細胞およびエンドグルコサミニダーゼに依存して、細胞にとっての最適な成長および生成条件（例として、ｐＨ、温度）は、酵素的活性にとっての最適な条件とは異なっていてもよい。
【０１２４】
よって、糖タンパク質とエンドグルコサミニダーゼとの間の細胞外接触が起こる培地は、糖タンパク質の最適な生体活性のために調整されてもよい。培地の温度は、糖タンパク質の最適な生体活性を保持するために調整されてもよい。本発明の具体的な態様に従うと、エンドグルコサミニダーゼと糖タンパク質との間の接触が起こる培地の温度は、４〜３７℃へ調整される。培地の温度を４℃へ調整することは、有利なこともある。他の態様において、温度を、３７℃を上回って保つことは、有利なこともある。
【０１２５】
別の具体的な態様に従うと、エンドグルコサミニダーゼ活性は、培地の高塩濃度にて保持される。培地（ここでエンドグルコサミニダーゼと糖タンパク質との間に接触が起こる）の塩濃度が高い場合であっても、エンドグルコサミニダーゼはまた、糖タンパク質上でその機能を発揮することができてもよい。
【０１２６】
特定の態様において、本発明は、組み換えＮ−グリコシル化ＩＬ−２２、またはこれと少なくとも９７％のアミノ酸同一性をもつ組み換えＮ−グリコシル化ＩＬ−２２を含む組成物を提供し、ここで該ＩＬ−２２は、該組み換えＩＬ−２２上に存在する総複合Ｎ−グリカンの６５％超にて存在する複合Ｎ−グリカンＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む。
【０１２７】
別の態様において、本発明は、組み換えＮ−グリコシル化ＩＬ−２２、またはこれと少なくとも９７％のアミノ酸同一性をもつ組み換えＮ−グリコシル化ＩＬ−２２を含む組成物を提供し、ここで該ＩＬ−２２は、該組み換えＩＬ−２２上に存在する総複合Ｎ−グリカンの８５％超にて、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％超にて、または１００％にて、存在する複合Ｎ−グリカンＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む。
【０１２８】
「少なくとも１つの突然変異Ｎ−グリコシル化アクセプター部位」は、Ｎ−グリコシル化アクセプター部位における突然変異を指す。潜在的なＮ−グリコシル化アクセプター部位が、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒに特異的であることは、当該技術分野において周知である。コンセンサスのトリペプチドの存在が、アスパラギン残基（Ａｓｎ）がグリコシル化されると結論付けるには十分ではない（これは、タンパク質の折り畳みがＮ−グリコシル化の調節において重要な役割を果たすという事実に起因する）ことは、注目されなければならない。ＡｓｎとＳｅｒ／Ｔｈｒとの間のプロリンの存在が、Ｎ−グリコシル化を阻害するであろうこともまた、示されている。糖タンパク質ＩＬ−２２において、通常（哺乳動物種の起源に依存する）３つの異なるＮ−グリコシル化アクセプター部位が存在する。
【０１２９】
更に別の態様において、本発明は、１つの機能的Ｎ−グリコシル化アクセプター部位を有する組み換えＮ−グリコシル化ＩＬ−２２、またはこれと少なくとも９７％のアミノ酸同一性をもつ組み換えＮ−グリコシル化ＩＬ−２２を含む組成物を提供し、ここで該ＩＬ−２２は、該組み換えＩＬ−２２上に存在する総複合Ｎ−グリカンの８５％超にて存在する複合Ｎ−グリカンＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む。
【０１３０】
更に別の態様において、本発明は、配列番号１に描写される配列中の位置Ｎ２１上に存在する１つの機能的Ｎ−グリコシル化アクセプター部位を有する組み換えＮ−グリコシル化ヒトＩＬ−２２、またはこれと少なくとも９７％のアミノ酸同一性をもつ組み換えＮ−グリコシル化ヒトＩＬ−２２を含む組成物を提供し、ここで該ヒトＩＬ−２２は、該組み換えヒトＩＬ−２２上に存在する総複合Ｎ−グリカンの８５％超にて、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または１００％超にて、存在する複合Ｎ−グリカンＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含む。
【０１３１】
配列番号１は、１つの機能的グリコシル化部位のみ（下線が付されている）をもつ、言い換えればグリコシル化アクセプター部位Ｎ２１をもつ、ヒトＩＬ−２２のアミノ酸配列を描写する（ｈＩＬ−２２  Ｎ２１突然変異体）。他の２つのグリコシル化アクセプター部位（配列番号１中、印が付されている）は、非機能的Ｎ−グリコシル化アクセプター部位に突然変異されている。
【０１３２】
配列番号１
ｈＩＬ−２２  Ｎ２１
アミノ末端−APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADQNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLQFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI−カルボキシ末端
【０１３３】
配列番号２は、２つの機能的グリコシル化部位（下線が付されている）をもつ、言い換えればグリコシル化アクセプター部位Ｎ２１およびＮ３５をもつ、ヒトＩＬ−２２のアミノ酸配列を描写する（ｈＩＬ−２２  Ｎ２１−Ｎ３５突然変異体）。他のグリコシル化アクセプター部位（配列番号２中、印が付されている）は、非機能的Ｎ−グリコシル化アクセプター部位に突然変異されている。
配列番号２
ｈＩＬ−２２  Ｎ２１−Ｎ３５
アミノ末端−APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLQFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI−カルボキシ末端
【０１３４】
配列番号３は、３つの機能的グリコシル化部位（下線が付されている）をもつ野生型ヒトＩＬ−２２（ｈＩＬ−２２  ＷＴ）アミノ酸配列を描写する。
配列番号３
ｈＩＬ−２２  ＷＴ
アミノ末端−APISSHCRLDKSNFQQPYITNRTFMLAKEASLADNNTDVRLIGEKLFHGVSMSERCYLMKQVLNFTLEEVLFPQSDRFQPYMQEVVPFLARLSNRLSTCHIEGDDLHIQRNVQKLKDTVKKLGESGEIKAIGELDLLFMSLRNACI−カルボキシ末端
【０１３５】
更に別の態様において、本発明は、組み換えＮ−グリコシル化ＩＬ−２２またはこれと少なくとも９７％のアミノ酸同一性をもつ組み換えＮ−グリコシル化ＩＬ−２２を含む組成物の生成のための方法を提供し、ここで該ＩＬ−２２は、本明細書の前に記載のとおりの該組み換えＩＬ−２２上に存在する総複合Ｎ−グリカンの６５％超にて存在する複合Ｎ−グリカンＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含み、ここで該組成物は、複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物において生成され、前記方法は、ｉ）ＩＬ−２２をコードする遺伝構築物を含む組み換え複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物を、ＩＬ−２２が発現される条件下で増殖させること、および生成された後の該ＩＬ−２２を、エンドグルコサミニダーゼ酵素の添加に接触させることを含む。
【０１３６】
更に別の態様において、本発明は、組み換えＮ−グリコシル化ＩＬ−２２またはこれと少なくとも９７％のアミノ酸同一性をもつ組み換えＮ−グリコシル化ＩＬ−２２を含む組成物を提供し、ここで該ＩＬ−２２は、該組み換えＩＬ−２２上に存在する総複合Ｎ−グリカンの６５％超にて存在する複合Ｎ−グリカンＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２を含み、ここで該組成物は、複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物における該組み換えＩＬ−２２の生成によって得られ、前記生成は、ＩＬ−２２をコードする遺伝構築物を含む発現ベクターを含む組み換え複合Ｎ−グリコシル化操作された真菌生物を、該ＩＬ−２２が発現される条件下で増殖させること、および該組み換えＩＬ−２２をエンドグルコサミニダーゼの添加に接触させることを含む。
【０１３７】
具体的な態様、特定の形状(configurations)ならびに材料および／または分子が、本発明に従う細胞および方法について本明細書に論じられるが、様々な変化または修飾が、形式上および詳細に(in form and detail)、本発明の範囲および精神から逸脱せずになされてもよいことは理解されるべきである。以下の例は、具体的な態様をより良好に説明するために提供され、それらは、本出願を制限するものとは考慮されるべきではない。本出願は、クレームのみによって制限される。
【０１３８】
材料および方法
具体的には例１のための材料および方法：複合グリコフォームを富化させるためのエンドグルコサミニダーゼ一掃
株および培地
Pichia pastoris GS115（his4）を、野生型の発現宿主として使用した（De Schutter, K. et al., Nat. Biotechnol. 27, 561-566 (2009)）。Ｇａｌ２Ｇｎ２Ｍ３−ｈＩＬ−２２Ｎ２１および−ＩＬ−２２ＷＴ株を構築するため、Ｎ−グリカン操作を、主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンおよびＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを夫々もつそれらの糖たんぱく質を修飾するＭ５株（Ｍａｎ５）およびＧｎＭ５株（ＧｎＭａｎ５）から始めた（Vervecken, W. et al., Appl. Environ. Microbiol. 70, 2639-2646 (2004)）。
【０１３９】
最も均一なハイブリッド型ＧｌｃＮＡｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンをもつＧｎＭ５株のクローンを、ｐＧＡＰＫａｎＭｎｎ２ＤｍＭａｎ−ＩＩで、ＥｃｏＲＩでの線形化の後に、形質転換することで、複合型ＧｌｃＮＡｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンで修飾された糖たんぱく質が発現された。ｐＧＡＰＫａｎＭｎｎ２ＤｍＭａｎ−ＩＩベクターは、S. cerevisiaeのＭｎｎ２ｐ（初期ゴルジ(early-Golgi)に局在化したグリコシルトランスフェラーゼ）のＮ末端ドメインを通してゴルジを標的にするDrosophila melanogasterからのマンノシダーゼ−ＩＩをコードする。ＧｎＭ３株からの最も均一なＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ Ｎ−グリカンをもつクローンを、Rattus norvegicusからのゴルジ局在化β−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−ＩＩをコードする、ＢｇｌＩで線形化されたｐＧＡＰＨｙｇＭｎｎ２ｒＧｎＴ−ＩＩを形質転換することによるさらなる操作のために使用することで、二分岐の複合型ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンをもつ糖タンパク質を発現する株（Ｇｎ２Ｍ３株）が得られた。
【０１４０】
次いで、最も均一なＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンをもつＧｎ２Ｍ３株のクローンを、ＥｃｏＲＶで線形化されたｐＧＡＰＮｏｒＭｎｎ２ＳｐＧａｌ１０ＧａｌＴで形質転換した。このベクターは、Ｍｎｎ２ｐ−ゴルジ局在化ドメイン、Schizosaccharomyces pombeのＵＤＰ−グルコース／−ガラクトース４−エピメラーゼ、およびヒトβ−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ−Ｉ（ＧａｌＴ−Ｉ）の三者融合(a tri-partite fusion)をコードする。結果として生じる株は、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２をもつその糖タンパク質を修飾する。ベクターおよび構築物は、（Jacobs, P. P. et al., Nat. Protocols 4, 58-70 (2008)）に記載されている。方法論は、Laukens, B. et al., Methods Mol. Biol. 1321, 103-22 (2015)に徹底的に記載した。
【０１４１】
株を、グリセロールストックとして−８０℃にて保った。実験に先立ち、新たな培養物をグリセロールストックから、ブラストサイジンＳ−ＨＣｌ（１００μｇ／ｍＬ）、Zeocin（登録商標）（１００μｇ／ｍＬ）、Ｇ４１８（５００μｇ／ｍＬ）、ハイグロマイシン（１００μｇ／ｍＬ）およびノーセオトリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）（１００μｇ／ｍＬ）で補充されたＹＰＤ上に播くことによって、始動させた。すべての培養物を２８℃にて成長させ、さらなる実験法を待っている間(awaiting further experimentation)４℃にて保管した。
【０１４２】
ＥｎｄｏＴの組み換え生成
ＥｎｄｏＴの組み換え生成のため、ＡＯＸ１プロモーターの制御下で全長の成熟ＥｎｄｏＴを発現する野生型の株（NRRL-Y11430）を構築した。ラージスケールの生成を、６リットルのレベルでバッフル付き振盪フラスコ（２４×２５０ｍｌ／２リットルフラスコ）において実施した（Schoonooghe, S., Leoen, J. & Haustraete, J., Pichia pastoris. Methods Mol. Biol. Clifton NJ 907, 325-340 (2012)）。誘導の終了時に、培地を、１８，０００×ｇにて３０ｍｉｎ、４℃での遠心分離によって収集し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）に対し透析濾過した(diafiltered)。澄んだ上清を、１３８ｍｌ Q sepharose FFカラム XK26 x 26（GE Healthcare）へ適用し、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）で平衡化した。
【０１４３】
カラムを、５カラム体積にわたる、同じ緩衝液中１Ｍ ＮａＣｌまでの勾配で溶出した。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し、ＥｎｄｏＴ含有画分を一緒にプールした。最終的に、タンパク質を、製剤化のため(for formulation)およびマイナーな夾雑物を取り除くために、移動溶液(running solution)としてＰＢＳをもつSuperdex 75ゲル濾過カラムXK26 x 52上に投入した。得られた画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、濃度をMicro-BCAアッセイ（Pierce）を使用して決定し、ＬＰＳ含量（Endosafe-PTS）を測定した（＜１ＥＵ／ｍｌ）。精製後の最終収量は、＞９５％純度をもつ０．１８３ｇ／Ｌであった。
【０１４４】
ＩＬ−２２グリコフォームの生成および精製
ｈＩＬ−２２発現株の前培養物を、適切な抗生物質で補充された１０ｍＬ ＹＰＤに植菌し、終夜成長させた。翌日、前培養物を使用して、２Ｌバッフル付き振盪フラスコ中８×２５０ｍＬ ＢＭＧＹ（ｐＨ５．５）に播種した。培養物を成長させ、培地にＢＭＭＹを補給した。培養物を４８時間誘導した後、上清を回収し、硫酸アンモニウム沈殿に供した。簡単には、凝集タンパク質および残りの細胞を取り除くため、上清を、硫酸アンモニウム塩を最大３０％まで添加することによって飽和させた。試料を１６，８００ｇにて遠心分離し、結果として生じたペレットを捨てた。上清を、持続的な撹拌下で、さらに８０％まで飽和させた。ｈＩＬ−２２を含有する沈殿物を遠心分離によって回収した。残存する上清を捨て、ペレットを、さらに精製するまで−２０℃にて保管した。
【０１４５】
精製のため、ｈＩＬ−２２硫酸アンモニウムペレットを、２５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）に溶解し、０．２２μｍのボトルトップフィルター（Millipore）上で濾過することで、可溶化後の不純物を取り除いた。濾過物を、２５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）で移動するSephadex G25 XK26/80カラム（GE Healthcare）を通じて脱塩した。前記カラムは先に、同じ緩衝液で平衡化した。大量のPichia宿主タンパク質を取り除くため、および潜在的な内毒素（ＬＰＳ）を取り除くため、脱塩画分をプールし、移動緩衝液としての２５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）で平衡化されたQ-Sepharose XK16/32カラム（GE Healthcare）上にロードした。ｈＩＬ−２２を含有するフロースルーを収集し、２５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）中１Ｍ ＮａＣｌで溶出するのに先立ち、カラムを徹底的に洗浄した。次いで、Q-Sepharoseのフロースルーを、同じ移動緩衝液で平衡化されたSource 15Sカラム上にロードした。
【０１４６】
ローディング後、カラムを移動緩衝液で徹底的に洗浄し、ｈＩＬ−２２を、２５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）中０Ｍから１Ｍ ＮａＣｌまでの段階的線形勾配で溶出した。主にＮ−グリコシル化ｈＩＬ−２２を含有する画分を、ｐＨ８．０へ設定されたＰＢＳで平衡化されたSuperdex75カラム（GE Healthcare）を通じて洗練した。洗練後、ｈＩＬ−２２含有画分を、１０ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）をもつAmiconスピンカラム（Millipore）を使用して濃縮し、Millex低分子量(low)タンパク質結合０．２２μｍシリンジフィルター（Millipore）を通じて滅菌し、濃度をＢＣＡ（Pierce）によって決定した。試料を一定分量に(in aliquots)分け、−８０℃にて保管した。精製ステップを、Akta ExplorerまたはAkta Pure精製プラットフォーム（GE Healthcare）を使用して実施した。クロマトグラムを、Unicorn 5.11において分析し、その後CorelDraw 11において形式を整えた。
【０１４７】
タンパク質の分析技術
タンパク質を、１５％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。ローディングに先立ち、試料を、Laemliローディング染料（別段明示的に述べられない限り、３０ｍＭ ＤＴＴとともに、４０％グリセロール、１０％ＳＤＳ、０．８％ブロモフェノールブルーを含有する２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８））で補充し、９８℃にて１０分間熱変性させた。分子量ラダーとして、Precision Plus Protein All Blue Standard（Bio-Rad）を包含させた。可視化のため、ゲルをクマシー染色するか、またはSemi-Dry Western Blot（１ｍＡ／ｃｍ２）によるニトロセルロース膜へ転移した。ヒトＩＬ−２２を、ＰＢＳＴ−３％ミルク中１：１０００に希釈された抗ｈＩＬ−２２マウスモノクローナル抗体（Abcam、ab134035）を使用して可視化した。ブロットを、ＰＢＳＴ−３％ミルク中１：５０００に希釈された抗マウスＨＲＰ結合ＩｇＧ（GE Healthcare）を使用し、Lightning ECL Enhanced Chemiluminescence Substrate（Perkin Elmer）で明らかにした。
【０１４８】
ＥｎｄｏＨまたはＰＮＧａｓｅＦ（New England Biolabs）を使用するタンパク質の脱グリコシル化を、製造元の指示を守って行った。簡単には、５〜１０μｇの精製タンパク質を、１×糖タンパク質変性緩衝液（０．５％ＳＤＳ、４０ｍＭ ＤＴＴ）中、熱変性させた（５分間、９８℃）。試料を冷却した後、ＰＮＧａｓｅＦ消化のための試料を、１％ＮＰ−４０および１×緩衝液Ｇ７で補充し、１０００ＮＥＢ単位のＰＮＧａｓｅＦ（１５．４ＩＵＢｍＵ／μｌと同等のもの、社内で生成された）を加えた。ＥｎｄｏＨ消化のための試料を、１×緩衝液Ｇ５および５００単位のＥｎｄｏＨ（NEB）で補充した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上へのローディングに先立ち、すべての消化を３７℃にて２〜４時間保った。
【０１４９】
キャピラリー電気泳動によるグリコシル化分析
キャピラリー電気泳動によるＮ−グリカン分析のため、５０μｌの硫酸アンモニウム画分または１０μｇの精製ｈＩＬ−２２のいずれかを、Laroy, W., Contreras, R. & Callewaert, N., Nat. Protoc. 1, 397-405 (2006)によって記載のプレート方法を守って調製した。
【０１５０】
１００ｎｇの組み換え精製ＥｎｄｏＴの添加に先立ち、溶液中のＥｎｄｏＴ消化のための試料を、２５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）に希釈した。試料を終夜インキュベートし、乾燥させた。標識付けを、前に記載のとおりに行った。ＡＰＴＳ誘導体化Ｎ−グリカンを、先に記載のとおりABI 3130キャピラリーＤＮＡシークエンサー上で分析した（Laroy, W., Contreras, R. & Callewaert, N., Nat. Protoc. 1, 397-405 (2006)）。ウシＲＮａｓｅＢのＮ−グリカン（Ｍａｎ５〜９ＧｌｃＮＡｃ２、Ｍ５〜９）、およびα−１，６−連結グルコース残基からなるデキストランラダー（グルコース単位、Ｇ．Ｕ）を両方とも参照として包含させた。データを、Genemapperソフトウェア（Applied Biosystems）で分析した。
【０１５１】
エキソグリコシダーゼ配列決定のため、標識グリカンのエキソグリコシダーゼ処置を、Streptococcus pneumoniaeのβ−１，４−ガラクトシダーゼまたはβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（Prozyme、１消化につき４ｍＵ）、Trichoderma reeseiのα−１，２−マンノシダーゼ（我々の研究室で生成された、１消化につき０．３３μｇ）およびタチナタマメα−１，２／−３／−６−マンノシダーゼ（Sigma、１消化につき２０ｍＵ）で行った。すべての反応を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中３７℃にて終夜実施した。
【０１５２】
Ｎ−グリコフォーム一掃のためのＥｎｄｏＴ用量設定
ＥｎｄｏＴ処置の影響を決定するために、単一の硫酸アンモニウムペレット（２５０ｍＬ培養と同等のもの）を、２５ｍＬの２５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）に再溶解し、０．２２μｍのSteriTop/SteriCupボトルトップフィルター（Millipore）上で濾過した。濾過物の総タンパク質濃度をＢＣＡ（Pierce）によって決定した。タンパク質を、２つのエッペンドルフチューブにわたり順番に分けたが、各エッペンドルフチューブが１ｍｇの総タンパク質を含有するように行った。組み換えＥｎｄｏＴの段階希釈を、２５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）に組み換えＥｎｄｏＴを希釈することによって行い、ＩＬ−２２含有硫酸アンモニウム画分中へスパイクした。各段階（１０μｇＥｎｄｏＴ／ｍｇ総タンパク質から０．００１μｇ／ｍｇ）を二重に調製し、試料を終夜（〜１４時間）４℃または３７℃のいずれかにてインキュベートした。翌日、試料を沈殿について評価した。ＥｎｄｏＴ処置の影響を査定するため、両段階の各試料から１μＬを、ウェスタンブロットによる転移のためＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にロードした。クマシー分析のため、５μｌの各反応物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上にロードした。
【０１５３】
Ｎ−グリコシル化分析のため、５０μｌの各試料を、上に記載のとおりキャピラリー電気泳動（ＤＳＡ−ＦＡＣＥ）のために調製した。Ｎ−グリカンプロファイルにおけるオリゴ−マンノースバックグラウンドを、順応させたタチナタマメα−マンノシダーゼ消化を使用して明らかにした。したがって、１μＬのＡＰＴＳ標識Ｎ−グリカン試料を、タチナタマメα−１，２／−３／−６−マンノシダーゼ（Sigma、１消化につき１０ｍＵ）で消化した。キャピラリー電気泳動による分析に先立ち、消化を２０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中３７℃にて２時間実施した。商業用タチナタマメ調製物において夾雑β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼおよびガラクトシダーゼが低レベルであることに起因し、より長いインキュベーションによって、複合型Ｎ−グリカンの分解がもたらされる。
【０１５４】
ＥｎｄｏＴで処置されたＩＬ−２２グリコフォームの精製
ｈＩＬ−２２を精製するために、硫酸アンモニウムペレットを、１００ｍＬの最終体積まで、２５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）に溶解し、０．２２μｍのボトルトップフィルター上で濾過した。濾過物の総タンパク質濃度をＢＣＡによって決定した。次に、濾過物を、組み換えＥｎｄｏＴ（０．５〜１．０μｇ／ｍｇ総タンパク質）でスパイクした。反応を４℃にて保ちつつ（終夜）、シェーカー台(shaker-platform)上でやさしくかき混ぜた。翌日、反応物を沈殿について査定した。沈殿物を、０．２２μｍのSteriTop/SteriCupボトルトップフィルター上で取り除き、濾過物を上に記載のとおりに精製した。
【０１５５】
ＩＬ−２２の生体活性のためのin vitroでのＣｏｌｏ−２０５アッセイ
American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）からのヒトＣｏｌｏ−２０５癌細胞を注文し、データシートに提供されるガイドラインに従って培養した。簡単には、細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で補充されたＲＰＭＩ１６４０（Gibco）中３７℃、５％ＣＯ２にて半接着(semi-adherent)細胞として培養した。継代するため、懸濁液中で成長する細胞を収集し、接着細胞を、標準組織培養手順を守ってトリプシン処理した。Ｃｏｌｏ−２０５アッセイのため、細胞を、９６ウェルＵ底プレート中３．０×１０５細胞／ｍＬ（１００μｌ／ウェル）にて播種した。細胞をｈＩＬ−２２の段階希釈で刺激するのに先立ち、細胞を、２４時間順応させた。
【０１５６】
すべての刺激を終夜継続させた。対照として、E. coliで生成された市販の組み換えｈＩＬ−２２（無担体）の段階希釈（BioLegend）を使用した。翌日、プレートを、４００ｇにて１０分４℃にて遠心分離し、上清を収集した。上清を、hIL-10 DuoSet ELISA（R&D Systems）を使用しＩＬ−１０についてアッセイした。データをGraphPad Prism 6において分析した。特定の活性を、ＥＣ５０を決定するために使用された用量応答曲線に基づき決定した。
【０１５７】
具体的には例２のための材料および方法：ＥｎｄｏＴを使用するＰｒｏＤｅｒｐ１グリコフォームの一掃
種々のＰｒｏＤｅｒｐ１グリコフォームを得るため、Pichia pastoris発現ベクターであるｐＰＩＣ９ＰｒｏＤｅｒｐ１を、主にＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンをもつその糖タンパク質を修飾するＭ５−（Ｍａｎ５）ＯＣＨ１突然変異Pichia株（Jacobs, P. P. et al., Nat. Protocols 4, 58-70 (2008)、Vervecken, W. et al., Appl. Environ. Microbiol. 70, 2639-2646 (2004)）中へ形質転換した。
【０１５８】
次に以下の酵素を、この株中へ、これらの対応するＯＣＨ１突然変異Pichia株ベクターを使用して連続的に形質転換した：Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ、マンノシダーゼＩＩ、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ、およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＶ。各形質転換ステップ間において、ＰｒｏＤｅｒｐ１のＮ−グリカンプロファイルを、キャピラリー電気泳動を使用して分析し、ＰｒｏＤｅｒｐ１の発現を分析した。最終的に、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＰｒｏＤｅｒｐ１発現株が得られた。
【０１５９】
ラージスケール発現実験の後、ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＰｒｏＤｅｒｐ１を、疎水性相互作用クロマトグラフィー、陰イオン交換およびゲル濾過（最終緩衝液：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））の組み合わせを使用して精製した。次のステップにおいて、in vitroでのＧａｌＮＡｃ転移を、以下の条件：１５０μＭ 末端ＧｌｃＮＡｃ、１０ｍＭ ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）＋１０ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．５μｇ ヒトベータ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＹ２８５Ｌ（特定の活性＞２，０００ｐｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ、R&D Systems）（Ramakrishnan, B. & Qasba, P. K., J. Biol. Chem. 277, 20833-20839 (2002)）、３７℃での終夜インキュベーションを使用して実施した。ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２試料およびＧａｌＮＡｃ３ＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＰｒｏＤｅｒｐ１試料に存在する高マンノースバックグラウンドを取り除くため、両試料を、ＥｎｄｏＴで処置した（１０μｇの糖タンパク質に対し２００ｎｇのＥｎｄｏＴ、３７℃での終夜インキュベーション）。
【０１６０】
例
例１：ｈＩＬ−２２ＷＴおよびｈＩＬ−２２Ｎ２１の複合グリコフォームのためのエンドグルコサミニダーゼ一掃
導入およびストラテジー
Pichia pastorisを、複合型Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンで修飾されたｈＩＬ−２２ＷＴ（３つの機能的Ｎ−グリコシル化部位を有する）を発現するように操作した。ＩＬ−２２Ｎ２１ Ｎ−グリコシル化部位の突然変異体（１つの機能的グリコシル化部位を有する）を発現するＧａｌ２Ｇｎ２Ｍ３株も、材料および方法の節において記載されるとおり、すべて同様に操作した。
【０１６１】
Ｎ−グリカンの構造的に不均一なバックグラウンドを取り除くために、Trichoderma Reeseiからの組み換えエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（ＥｎｄｏＴ）を適用した。
【０１６２】
結果
１．１  バックグラウンドのＮ−グリカンを一掃するためのＥｎｄｏＴ用量設定
精製プロセスにおいてＥｎｄｏＴをまとめるために、精製に先立ち、硫酸アンモニウムペレットを溶解した直後にエンドグルコサミニダーゼを加えることによって、組み換え酵素を加えることができるか調査した。高塩濃度が、酵素活性には最適ではないことがあるため、第１に、Ｇaｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２−ｈＩＬ−２２ＷＴ試料におけるすべてのＮ−グリカンバックグラウンドを分解するために、どの程度のＥｎｄｏＴが要求されるであろうか査定するために、用量設定実験を４℃にて実施した（図１）。
【０１６３】
次いで、Ｎ−グリカンをキャピラリー電気泳動で分析し、および高い温度でインキュベートされた試料と類似する、ＥｎｄｏＴのＮ−グリカンのプロファイルへの効果を（データは示されない）観察した。詳細には、インキュベーションを、４℃にて行うとき、同じ効果に到達するためには、より多くのＥｎｄｏＴが要求される。実例として、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に対応するピークのみが、０．０１μｇＥｎｄｏＴ／ｍｇから減少し始め、および最大０．１μｇＥｎｄｏＴ／ｍｇまでが、残存Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を完全に除去するために要求される。同様に、高マンノースＮ−グリカン（Ｍ９〜１０）は、最大０．０１μｇＥｎｄｏＴ／ｍｇまで存続する。Ｎ−グリカンを含有する荷電ホスホマンノースを取り除くために、最大０．５μｇＥｎｄｏＴ／ｍｇまでが要求される。しかしながら、１μｇＥｎｄｏＴ／ｍｇを加えたとき、Ｎ−グリカンのプロファイルは、Ｎ−グリカンを含有するいずれのオリゴマンノース、ハイブリットまたはホスホマンノースも欠いていた。残存するＮ−グリカンは、より高い温度にてインキュベートされた試料のときと同じであり、他の条件にわたってＮ−グリカン種を比較したとき、ピーク強度に何ら差がない。
【０１６４】
ＩＬ−２２Ｎ２１発現株のキャピラリー電気泳動（図２）によって、ＥｎｄｏＴで処置されなかった硫酸アンモニウム画分のＮ−グリカンプロファイルは、相対的に均一であるとすでに見えていることが明らかになった（図２における対照を参照）。試料をＥｎｄｏＴとともに終夜インキュベートしたとき、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に対応するピークの強度はすでに、１ｎｇＥｎｄｏＴ／ｍｇ総タンパク質にて減少し始めていたこと、およびいずれの残留Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２も、０．０５μｇＥｎｄｏＴ／ｍｇでのＮ−グリカンプロファイルからは完全に消失していたことが見られた。消化後、高マンノースおよびホスホマンノシルＮ−グリカンに対応するマイナーな(minor)バックグラウンドピークのいずれも、０．０１μｇ/ｍｇＥｎｄｏＴから消失していた。この濃度にて、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンに対応するほぼ単一の主要なピークを得た。加えて、不十分なガラクトシル化しかされていない(undergaractosylated)ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２異性体からなり、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２はほとんどないマイナーな画分が見られた。
【０１６５】
結論として、Ｎ−グリカンの不均一性は、利用可能なＮ−グリコシル化部位数と相関することが観察された。よって、ＩＬ−２２のＮ−グリカンプロファイルを一掃するために要求されるＥｎｄｏＴの量に関して差があるであろうかもまた決定した。上の結果から、ＩＬ−２２ＷＴの場合の０．１μｇＥｎｄｏＴ／ｍｇ総タンパク質と比較して、現行のＩＬ−２２Ｎ２１試料の場合０．０５μｇＥｎｄｏＴ／ｍｇしか要求されなかったところ、Ｎ−グリカンの不均一性（例としてＩＬ−２２Ｎ２１対ＩＬ−２２ＷＴ）における減少は、一掃を実施するために要求される組み換えＥｎｄｏＴの量における減少に適合していると結論付けることができる。
【０１６６】
１．２  タチナタマメマンノシダーゼ消化によって、バックグラウンドが明らかにされ、および確認される
バックグラウンドの一部が、複雑な高マンノースＮ−グリカンからなるため、かかるＮ−グリカンに対応するシグナルは、極めて散在し得、およびしたがって、キャピラリー電気泳動などの方法を使用して区別するのが難しい。これを回避するために、先にＥｎｄｏＴとともに４℃にてインキュベートされた試料に対するタチナタマメα−１，２／−３／−６−マンノシダーゼ消化（図３および図４）を包含させた。
【０１６７】
Ｇａｌ２Ｇｎ２Ｍ３ＩＬ−２２ＷＴ試料を調査するため、対照試料（ＥｎｄｏＴまたはタチナタマメマンノシダーゼで処置されていない）を、タチナタマメマンノシダーゼで消化された同じ試料と比較した（図３）。Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンのＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２コアへ至るまでの即時加水分解が見られた。しかしながら、後者のピークのピーク強度は、未消化試料におけるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ピークの強度を超過しており、このことは、他のＮ−グリカンもまた加水分解されていることを指し示している。ＥｎｄｏＴで処置された試料が消化されたとき、Ｍａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２コアのＮ−グリカンのピーク強度の着実な下落が観察された。後者のピークの下落は、硫酸アンモニウム試料を前処置するために使用されたＥｎｄｏＴの量と反比例的に相関する。０．５μｇＥｎｄｏＴ／ｍｇが使用された時点で、Ｍａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２のコアは、タチナタマメマンノシダーゼ消化の後にはもはや、ほぼないことが観察され得た。
【０１６８】
Ｇａｌ２Ｇｎ２Ｍ３ＩＬ−２２Ｎ２１試料のＮ−グリカンプロファイルに関し、ＥｎｄｏＴまたはタチナタマメα−マンノシダーゼで処置されていない対照試料はすでに、相対的に均一なＮ−グリカンプロファイルを有する（図４）。いくらかのＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のみに加えて、いくらかのマイナーな他の高マンノースおよびリン酸化された種が存在していた。これらの対照試料（ＥｎｄｏＴで処置されていない）が、α−マンノシダーゼで消化されたとき、Ｍａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２コアに対応する明確なピークが現れた。
【０１６９】
後者のピークの強度は、対照試料において観察されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の量をよりも相当大きく、このことは、Ｎ−グリカンプロファイルが相対的にクリーンであるにもかかわらず、検出され得なかったいくらかのバックグラウンドがまだ存在することを指し示している。しかしながら、Ｍａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２のピークは、ＥｎｄｏＴの濃度が最大０．２μｇ/ｍｇＥｎｄｏＴまで増大するにつれ、容易に下落する。結論として、我々は、０．５μｇ／ｍｇからずっと(and onwards)、コアのＮ−グリカンがもはや現れなかったこと、および主要なＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ピーク、少量のＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の不十分なガラクトシル化しかされていない異性体、および微量のＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のみが残存し、すべてが複合グリカンであることを実証し得た。
【０１７０】
１．３  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、ＩＬ−２２ＷＴおよびＩＬ−２２Ｎ２１のＥｎｄｏＴ消化後のＩＬ２２の安定性をモニタリングすること。
終夜のＥｎｄｏＴ消化の、ＩＬ−２２の安定性に対する影響を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で試料を分析することによって調査した（図５、パネルａおよび図６、パネルａ）。
【０１７１】
非グリコシル化ＩＬ−２２ＷＴおよび１または２のＮ−グリカンをもつグリコフォームに対応するバンド間を明確に識別することができた。完全にＮ−グリコシル化されたグリコフォーム（３つのＮ−グリカン）は、クマシー染色ゲル上で区別することが難しかった。加えて、タンパク質分解的刈り込み(clipping)におそらく対応するであろうバンドが観察された（Δ）。このバンドの量は、試料へ加えられているＥｎｄｏＴの濃度が上昇するにつれ増加する。類似のパターンが、脱グリコシル化された／Ｎ−グリコシル化されていない種（０）についても観察された。対照試料において、増加するＥｎｄｏＴの濃度とともに徐々に消失する１５ｋＤａと３７ｋＤａとの間で散在しているスメアに気づいた。０．５μｇＥｎｄｏＴ／ｍｇ総タンパク質にて、もはやスメアリングは観察され得なかった。
【０１７２】
ＩＬ−２２に反応する抗体を使用するウェスタンブロットによる分析によって、観察された散在性のスメアが、実のところＩＬ−２２であったこと、およびそれが実際にＥｎｄｏＴの増大する濃度とともに消失することが明らかになった（図５、パネルｂおよびｃ）。クマシー染色されたゲル上とウェスタンブロット上の両方で、このことに気づくことができた；ＥｎｄｏＴの増加は、非グリコシル化ＩＬ−２２（無傷のものと、タンパク質分解的に刈り込まれたものとの両方）の増加に加えて、スメアリングの減少を引き起こす。このことによって、スメアが、ＩＬ−２２ＷＴのグリコフォームを含有することが確認される。
【０１７３】
ＥｎｄｏＴで処置されたＩＬ−２２Ｎ２１試料もＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図６、パネルａ）。クマシー染色されたゲル上の、Ｎ−グリコシル化ＩＬ−２２Ｎ２１に対応するバンドを明確に同定し得たが、スメアリングは、試料中には存在しなかった。試料をウェスタンブロットによって分析したが、ここでもまた、スメアリングは見られ得なかった（図６、パネルｂ）。
【０１７４】
過剰グリコシル化バックグラウンドのシングナルは、ブロットのバックグラウンドのシグナルを超過しなかった（示さず）。しかしながら、非グリコシル化画分が、増加するＥｎｄｏＴの用量とともに増加することが見られた。このことは、検出され得なかったいくらかの既存のバックグラウンドが取り除かれたことを指し示している。
【０１７５】
１．４  ＥｎｄｏＴで処置されたＧａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ｈＩＬ−２２ＷＴの精製。
ＥｎｄｏＴ一掃手順が、精製実験に統合され得るかを調査し、および既存のプロトコールもまた、組み換えＥｎｄｏＴを再度取り除くことを可能するかを試験した。その用量の用量設定実験において、およそ０．５μｇ／ｍｇＥｎｄｏＴ（１ｍｇ総タンパク質当たり）が、４℃にてインキュベートするときでさえ、いずれのオリゴ−マンノースバックグラウンドをも除去するのに十分であるはずであるということが立証された。これらの知見を、２Ｌ培養物と同等のものに対して当てはめ(implement)、および可溶化された硫酸アンモニウム画分の総タンパク質濃度を決定した後に、ＥｎｄｏＴを、それに応じてスパイクした。４℃での終夜インキュベーション後、試料を標準プロトコールに従い精製した（図７）。
【０１７６】
SephadexG25を通じて脱塩した後（図７、左上）、大量の夾雑物を、Q-Sepharoseカラムを通じて取り除いた。ＥｎｄｏＴのｐＩは、プロセシング（Expasy、Compute ＭＷ／ｐＩ）に依存して、４．３から４．４まで変動する；したがって、ＥｎｄｏＴは、培地からの大量の夾雑物が存在するとおり、ｐＨ５．５にてQ-Sepharoseカラムに保持されるはずであるが（示されず）、ＩＬ−２２ＷＴは通過してフロースルーにある（図７、右上）。次にS15 Sourceカラムを使用して混合物中の種々のＮ−グリコフォームを分離した。残存するいずれのＥｎｄｏＴも、フロースルーにおいて無くなるはずであるのに対し、ＩＬ−２２ＷＴは、結合したまま残存する。
【０１７７】
ＥｎｄｏＴはまた、酸性のｐＩ（〜４．２）をも有するため、標準のクロマトグラフィーステップを使用する精製の間に、いずれの残留ＥｎｄｏＴをも除去することは、非常に簡単なはずである。その上、要求されるＥｎｄｏＴの量はむしろ制限され、および精製プロセスに影響を与えるはずがない。相当の不均一性をもつｈＩＬ−２２ＷＴなどの試料についてでさえ、我々は、０．５〜１．０μｇＥｎｄｏＴ／ｍｇ総タンパク質を加えること、および４℃にてインキュベートすることによって、高度に純粋なＮ−グリコフォームを得た。これは、他の糖タンパク質に対しても試験される必要があるものの、１：１０００の比率が、さらなる最適化のための開始点として示唆される。
【０１７８】
S15 SourceからのＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２−ＩＬ−２２ＷＴの溶出プロファイルにおいて、数個のピークを区別し得る（図７、左下および図９）。
【０１７９】
S15 SourceカラムからｈＩＬ−２２WTを溶出するとき、いかなる不均一さをも速やかに検出し得る。ＥｎｄｏＴで処置されたＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３−ｈＩＬ−２２ＷＴの溶出プロファイルにおいて、むしろ離散的なピークが観察された（図９、パネルａ）。我々が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の溶出画分を分析したとき、我々は、グリコフォームが、事実上スメアリングがない明確なバンドとして移動したことを見出した。このことは、Ｎ−グリカンの強固な均一性を指し示している（図９、パネルｂ）。その上、溶出プロファイルのピークは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で観察される種々のグリコフォームの溶出時間と一致している。次いで溶出画分を、それらのＮ−グリカンの中容に基づいてプールし、およびSuperdex75カラム上で洗練した（図７、右下）。
【０１８０】
ＩＬ−２２は、凝集または極度の(extensive)崩壊の兆候なく、単一ピークとして溶出し、および保管に好適な緩衝液へ切り替えた。洗練された最終画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。このことによって、大部分がＮ−グリコシル化された画分を、混合画分および大部分がグリコシル化されていない画分に加えて、分離し得たことを示す最終プールの概観が提供された（図９、パネルｃ）。より多くの分解が還元条件下で観察されたものの、オリゴマー化の兆候は、還元条件下および非還元条件下では見られなかった（図９、パネルｄ）。いずれの残存バックグラウンドについても試験するために、ＰＮＧａｓｅＦおよびＥｎｄｏＨでの個別の消化を実施した（図９、パネルｅ）。Ｎ−グリコシル化された画分を、ＰＮＧａｓｅＦによって完全に脱グリコシル化した。対照的に、事実上、何の効果も、ＥｎｄｏＨ消化後には見られなかった。このことは、Ｎ−グリカンが、その大部分がＥｎｄｏＨに対して不応性であり、およびしたがって複合型Ｎ−グリカンに違いないことを指し示している。
【０１８１】
未処置粗上清のＮ−グリコシル化プロファイルを、ＥｎｄｏＴで処置され新たに精製されたＩＬ−２２のそれと比較した（図１１、パネルａ）。未処置の試料（レーン２）において、種々の経路の中間体ならびにオリゴ−マンノースＮ−グリカンおよびホスホ−マンノシルＮ−グリカンに対応する様々なピークが見られた。タチナタマメα−マンノシダーゼは、ほとんどの不均一性を取り除き、およびそれを単一のＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２のピークにまで低減させる。後者のピークは、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のピークさえも超過する（レーン３）。
【０１８２】
対照的に、ＥｎｄｏＴで処置された試料は、より均一であり（レーン４）、予想される複合Ｎ−グリカン（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２異性体、および残留ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２）に対応する唯一のピークを示している。注目すべきことに、α−マンノシダーゼ消化は、いずれのバックグラウンド（レーン５）をも全く明らかにはさせず、この取り組みの効率を実証している。
【０１８３】
スペクトルにおける主要なピークのアイデンティティもまた、連続的なエキソグリコシダーゼ消化を使用して確認した（図１１、パネルｂ）。精製されてＥｎｄｏＴで処置されたｈＩＬ−２２ＷＴからのＮ−グリカン（レーン２）の、β−１，４−ガラクトシダーゼでの消化によって、非還元末端上のガラクトース残基から切断し、これによって、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２のピーク、およびＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の不十分なガラクトシル化しかされていない異性体の両方を低減させる（レーン３）。β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼでの消化によって、トリマンノシルコアが産出され（レーン４）、これがタチナタマメα−マンノシダーゼ消化後にＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２コアまで完全に還元される（レーン５）。
【０１８４】
１．５  ＥｎｄｏＴで処置されたＧａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ ＩＬ−２２Ｎ２１の精製。
ＥｎｄｏＴ一掃手順を、精製スキーム中に統合した。それから、これを、クリーンなＧａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＩＬ−２２Ｎ２１を単離するために試験した。その用量の用量設定実験において、０．５μｇＥｎｄｏＴ／（ｍｇ総タンパク質）からが、４℃にてインキュベートするときでさえ、いずれのオリゴ−マンノースバックグラウンドをも除去するのに十分であるはずだということが立証された。予備的消化(the preparative digest)のために、２Ｌ培養物と同等のものを使用し、および可溶化された硫酸アンモニウム画分の総タンパク質濃度を決定した後、ＥｎｄｏＴを、完全な消化を確実にするために、１μｇ／ｍｇ総たんぱく質にてスパイクした。４℃での終夜インキュベーション後、試料を、標準プロトコールを使用して精製した（図８は、精製プロセスの概観を提供する）。
【０１８５】
最初に、試料を、SephadexG25カラムを通じて脱塩し（図８、左上）、および溶出画分を、Q-Sepharoseカラム上にロードした。フロースルーおよびＩＬ−２２を含有する洗浄画分を収集したが、大量の夾雑物およびＥｎｄｏＴしか、１Ｍ ＮａＣｌでのカラムから溶出されなかった（示されず）（図８、右上）。次いでＩＬ−２２を含有する画分を、S15 Sourceカラム上にロードした。Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２−ＩＬ−２２Ｎ２１の種々のＮ−グリコフォームは、１００ｍＭと３００ｍＭとの間のＮａＣｌで溶出したが、非グリコシル化ＩＬ−２２Ｎ２１は、３００ｍＭ ＮａＣｌにてしか溶出されなかった（図８、左下および図１０、パネルａ）。S15 Sourceカラムからの溶出の間、種々のピークを区別し得たが、それらは、完全には分けられない（図８、左下および図１０パネルａ）。
【０１８６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の溶出画分の分析によって、非グリコシル化ＩＬ−２２Ｎ２１およびその単一グリコフォームに対応する一連の明確なバンドが示された（図１０、パネルｂ）。スメアリングは、溶出画分の中には観察されなかった。このことは、高度に均一なＮ−グリコフォームを指し示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからの結果は、溶出プロファイルにおけるピークの注釈と一致する。溶出画分を、Ｎ−グリカンの中容に基づいてプールし、およびSuperdex75カラムを通じて洗練した（図８、右下）。ＩＬ−２２は、凝集または極度の崩壊を指し示すピークもなく、単一のピークとして溶出した。洗練された最終画分もまたＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し、大部分がＮ−グリコシル化された画分の分離を、混合画分および大部分がグリコシル化されていない画分に加えて、示した（図１０、パネルｃ）。
【０１８７】
次いで、Ｎ−グリコシル化された画分を、還元条件下および非還元条件下にで比較した。タンパク質を還元条件下で分析したとき、崩壊生成物の存在を除くと何らの差異も見られなかった（図１０、パネルｄ）。次いで、オリゴ−マンノースバックグラウンドがまだ存在するであろうかを、ＰＮＧａｓｅＦおよびＥｎｄｏＨでの個別の消化を使用して、試験した（図１０、パネルｅ）。ＰＮＧａｓｅＦでの消化の後、Ｎ−グリコシル化された画分は、完全に脱グリコシル化されたが、ＥｎｄｏＨでの消化に感受性のあるバンドはなかった。このことは、複合Ｎ−グリカンが存在していたこと、およびハイブリットＮ−グリカンまたはオリゴマンノースＮ−グリカンはほとんど存在していかったことを指し示す。
【０１８８】
ＥｎｄｏＴ一掃が、精製されたＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２−ｈＩＬ２２Ｎ２１のＮ−グリカンプロファイルにどのように影響するかを立証するために、未処置の硫酸アンモニウム画分のＮ−グリコシル化プロファイルを、キャピラリー電気泳動によって、精製されたｈＩＬ−２２Ｎ２１のそれと比較した（図１２、パネルａ）。当初の試料（レーン２）において、Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２異性体、および残留ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２に対応するピークは、明確に可視化されたが、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２のかなりの部分もまた見られた一方で、ほんの微量のオリゴ−マンノースＮ−グリカンおよびホスホ−マンノシル化Ｎ−グリカンが存在していた。
【０１８９】
タチナタマメα−マンノシダーゼ消化を、未処置の試料に対して実施するとき、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２は、Ｍａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２−コアに至るまで消化される。しかしながら、後者のピークのサイズは、消化に先立ち、我々が観察したＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２の量よりも多い。このことは、他のオリゴ−マンノースＮ−グリカンが、試料中に存在していたことを指し示す（レーン３）。対照的に、ＥｎｄｏＴで処置された試料は、より均一であり（レーン４）、予想される複合Ｎ−グリカン（Ｇａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２異性体、および残留ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２)に対応する唯一のピークを示す。
【０１９０】
α−マンノシダーゼ消化を使用して、いずれの残存バックグラウンドをも明らかにし、一掃ステップの効果を説明することは可能ではなかった（レーン５）。この結果から、商業用タチナタマメの調製物のわずかな(trace)β−ガラクトシダーゼ活性もまた、不十分なガラクトシル化しかされていないピークの増加によって、明確に見られ得る。しかしながら、この実験において、これが問題ではないのは、複合型Ｎ−グリカンの消化が、ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２よりさらに先までは進まなかったからである。さらなる消化はまた、何らかのトリ−マンノシル−コアをも最も産出しそうであろうし、およびこれは、試料中には存在しない。
【０１９１】
次いで、エキソグリコシダーゼ消化を使用して、グリコフォームの純度をさらに確認し、およびスペクトルにおける主要なピークのアイデンティティを確認した（図１２、パネルｂ）。未処置の対照において、主要なＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の外側に、数個のより小さなピークが見られた。しかしながら、β−１，４ガラクトシダーゼ消化の後、いずれの夾雑物の兆候もなく、単一のＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ピークのみが残存していた。ＨｅｘＮＡｃ’ａｓｅでのさらなる消化によって、後者のピークは、Ｍａｎ３ＧｌｕｃＮＡｃ２−コアまで低減した。タチナタマメ消化の後、後者のピークは次いで、Ｍａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２コアまで低減した。注目すべきは、複合型中間体の外側に、何らの夾雑ピークも、エキソグリコシダーゼ消化の間には見られなかった。
【０１９２】
１．６  ＥｎｄｏＴで処置されたグリコフォームの生体活性(Bio-activity)。
精製されたＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２−ｈＩＬ−２２ＷＴおよび−ｈＩＬ−２２Ｎ２１の生体活性を決定するために、グリコフォームを、ヒトＣｏｌｏ−２０５大腸癌細胞株におけるＩＬ−１０のそれらの誘発能について試験した。漸増する用量のＩＬ−２２で刺激することによって、ＥｎｄｏＴで処置されたＩＬ−２２のＥＣ５０を決定し、およびE. coliから精製された商業用の組み換えＩＬ−２２標準と比較した（図１３）。Pichiaで生成されたｈＩＬ−２２は、E. coliで生成されたＩＬ−２２と少なくとも同程度に活性があることを見出した（ｈＩＬ−２２ＷＴおよびｈＩＬ−２２Ｎ２１について夫々０．０９４±０．１５ｎｇ/ｍＬおよび０．０８２±０．１３ｎｇ/ｍＬ、対、E. coliで生成されたについてＩＬ−２２０．２６９±０．１４ｎｇ/ｍＬ；（ＥＣ５０±ＳＥ））。
【０１９３】
１．７  予想外のネオグリコフォームへの適用性
様々なｈＩＬ−２２発現株のＮ−グリカン操作の間、内因性グルコシルトランスフェラーゼによって産出された人工的なＮ−グリカン中間体の認識に起因しそうな、まれなグリコフォームに遭遇した。先に、マウスＩＬ−２２のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを、α１，３−連結グルコース、２つの連続するβ１，２−連結マンノース残基およびキャッピングのα−１，２−グルコースを含有する線状テトラ−サッカライドで置換し得ることを見出した（データ示されず）。Ｍａｎ５株において発現されるヒトＩＬ−２２についても、類似の観察を行った。しかしながら、そのＮ−グリカン置換によって、一方のヘキソース残基がより小さくなった。
【０１９４】
ＥｎｄｏＴ一掃がまた、同定されたネオグリコフォームにも働くであろうか評価するために、精製されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ｈＩＬ−２２ＷＴに対するＥｎｄｏＴでのin vitro消化を試験した（図１４）。精製されたＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２−ｈＩＬ−２２ＷＴからのＮ−グリカンが、プレート方法（Laroy, W., Contreras, R.& Callewaert, N., Nat. Protoc. 1, 397-405 (2006))を使用するＰＮＧａｓｅＦで放出されたとき、α−マンノシダーゼ消化に対して不応性であるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンおよびＨｅｘ８〜９ＧｌｃＮＡｃ２ Ｎ−グリカンを同定し得る（レーン２）。試料を、プレート方法を使用するＮ−グリカンの調製の間に、ＰＮＧａｓｅＦ放出に先立ち、ＥｎｄｏＴで処置したとき、もはや何のシグナルも検出し得なかった（レーン３）。しかしながら、いくつかのピークが移動するのは電気泳動図の早期に見られた。これらのピークは、試料中に存在する夾雑ポリマーであって（これらのピーク間の等間隔に注目）、およびＮ−グリカンではないようである。
【０１９５】
同じことがレーン５にもまた見られ、したがって、それは、精製されたＥｎｄｏＴであって分析に使用されたものに存在する、夾雑ポリマーであり得た。ＥｎｄｏＴ消化の上清を、直接標識を使用して分析し、およびＰＮＧａｓｅＦが放出された試料についてと類似のプロファイルが見られたが、残基は、プロファイルの左手へ、〜１ＧＵ分シフトした（レーン４）。これが、ＥｎｄｏＴなどのエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼによる切断と合致するのは、それが、キトビオースコアのＧｌｃＮＡｃ残基間を切断するからである。グリカンプロファイルにおけるシフトを除くと、プロファイルは、ＰＮＧａｓｅＦが放出された試料とほぼ同一であった。このことは、ＥｎｄｏＴのための知られている基質であるＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２に加えて、潜在的に免疫原生のβ−マンノシル残基を含有するまれなＮ−グリカンもまた、消化されることを示す。加えて、組み換えＥｎｄｏＴ上のＮ−グリカンは、プレート方法を使用しても何ら検出されなかった（レーン５）。
【０１９６】
例２：ＩＬ−２２上の複合Ｎ−グリカンの相対的な存在度(abundance)を決定すること
Ｎ−グリカンの単離および分析を、ABI3130ＤＮＡ配列決定装置上、Jacobsらによって記載されるとおりに（Jacobs PP et al. (2009) Nat. Protoc. 4(1): 58-70)実施した。ピークの割り当てを、ABI GeneMapperソフトウェアv3.7（Applied Biosysems）を使用して行った。このソフトウェアを使用して、各データポイントのピーク強度および曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。Ｎ−グリカンのアイデンティティを、先にエキソグリコシダーゼ消化を使用して割り当てた。不均一なバックグラウンド（不均一なオリゴ−マンノースＮ−グリカンを含む）を明らかにするため、各試料をタチナタマメα−マンノシダーゼで消化した。タチナタマメα−マンノシダーゼの後、コアのＭａｎ1ＧｌｃＮＡｃ2が、オリゴ−マンノースＮ−グリカンの加水分解の結果として現れ、このことによって、バックグラウンドのより正確な推定が可能となる。
【０１９７】
エンドグリコサミニダーゼ一掃の前または後に、ＩＬ−２２Ｎ２１またはＩＬ−２２ＷＴグリコフォームのＮ−グリカンプロファイル内の各グリコフォームの相対的な分量を決定した。相対的な存在度を決定するために、エキソグリコシダーゼ消化によって確認されたピークのＡＵＣを、すべての割り当てられたピークの総ＡＵＣにわたって計算した。バックグランドを、コアのＭａｎ１ＧｌｃＮＡｃ２ピークの総ＡＵＣ（タチナタマメα―マンノシダーゼ消化によって明らかにされた）、およびエキソグリコシダーゼ消化によって確認され得なかったピークとして定義した。
【０１９８】
具体的には、エンドグルコサミニダーゼ処置に先立つＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＩＬ−２２ＷＴグリコフォームは、６２．５％の複合Ｎ−グリカン（３７．８５％のバックグラウンドに対して）を有する−図１１、パネル３において得られたピークから計算されるとおり。しかしながら、エンドグルコサミニダーゼ処置の後、複合Ｎ−グリカンの内容は、９３．４４％に達し、および６．５６%のバックグラウンドしか残存しない−図１１、パネル５において得られたピークから計算されるとおり。計算されたデータを図１９、下のパネルに示す。
【０１９９】
具体的には、エンドグルコサミニダーゼ処置に先立つＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＩＬ−２２Ｎ２１のグリコフォームは、図１２、パネル３において得られたピークから計算されるとおり、８０．３％の複合Ｎ−グリカン（１９．７％のバックグラウンドに対して）を有する。しかしながら、エンドグルコサミニダーゼ処置の後、複合Ｎ−グリカンの内容は、９８．３％に達し、および１．７％のバックグラウンドしか残存しない−図１２、パネル５において得られたピークから計算されるとおり。計算されたデータを図１９、上のパネルに示す。
【０２００】
例３：ＩＬ−２２上のガラクトシル化グリコフォームの相対的な存在度を決定すること
Ｎ−グリカンの単離および分析を、ABI3130ＤＮＡ配列決定装置上で、Jacobsらによって記載されるとおりに（Jacobs et al. (2009) Nat. Protoc. 4(1): 58-70)実施した。ピークの割り当てを、ABI GeneMapperソフトウェアv3.7（Applied Biosystems）を使用して行った。このソフトを使用して、各データポイントのピークの強度および曲線下面積（ＡＵＣ）を計算した。Ｎ−グリカンのアイデンティティを、先にエキソグリコシダーゼ消化を使用して割り当てた。ＩＬ−２２ＷＴのＮ−グリコシル化プロファイル上のピークの計算は、図１１、パネル４に基づいた（エンドグルコサミニダーゼ一掃の後に精製されたＩＬ−２２ＷＴ）。ＩＬ−２２Ｎ２１のＮ−グリコシル化プロファイル上のピークの計算は、図１２、パネル４に基づいた（エンドグルコサミニダーゼ一掃の後に精製されたＩＬ−２２Ｎ２１）。前者および後者のＮ−グリカンプロファイルおよび対応するピークの計算において、タチナタマメ消化が何ら包含されていないのは、ガラクトシル化Ｎ−グリカンの相対的な存在度が、タチナタマメの粗調製物中の報告されたわずかなβ−ガラクトシダーゼおよびヘキソサミニダーゼの活性のせいで、減少するからである。
【０２０１】
エンドグルコサミニダーゼ一掃後、ＩＬ−２２Ｎ２１またはＩＬ−２２ＷＴグリコフォームのＮ−グリカンプロファイル内の各グリコフォームの相対的な分量を決定した。相対的な存在度を決定するために、エキソグリコシダーゼ消化によって確認されたピークのＡＵＧを、総ＡＵＧにわたって計算した。ピークの計算は、図２、パネル１０に基づいた（１．０μｇ／ｍｇとして描写される）。
【０２０２】
ＩＬ−２２Ｎ２１上の二分岐のＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の相対的な分量は、総複合Ｎ−グリカンプールの８８．８９％に達するが、８．９３％は、単一の末端ガラクトースを持つか、またはすべての複合Ｎ−グリカンの最大９７％までが、少なくとも単一の末端ガラクトースを持つ二分岐の複合Ｎ−グリカンである。計算されたデータを図２０、上のパネルに示す。
【０２０３】
ＩＬ−２２ＷＴ上の二分岐のＧａｌ２ＧｌｃＮＡｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２の相対的な分量は、総複合Ｎ−グリカンのプールの６６．１９％に達する。加えて、２２．０６％が、単一の末端ガラクトースを持つ。まとめると、最大８８．２５％までが、少なくとも単一の末端ガラクトースを持つ二分岐の複合Ｎ−グリカンである。計算されたデータを図２０、下部パネルに示す。
【０２０４】
例４：ＥｎｄｏＴを使用するＰｒｏＤｅｒｐ１グリコフォームの一掃
導入およびストラテジー
この目的は、ＧａｌＮＡｃ残基を含有する、主要なイエダニアレルゲンであるＤｅｒｐ１の酵素的に非活性なプロ形態(proform)、ＰｒｏＤｅｒｐ１の種々のグリコフォームを生成することであった。
【０２０５】
結果
図１５は、精製されたＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＰｒｏＤｅｒｐ１のキャピラリー電気泳動プロファイルを示す。図１６は、ＥｎｄｏＴで処置され、精製されたＧｌｃＮＡｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＰｒｏＤｅｒｐ１キャピラリー電気泳動プロファイルを示し、および種々のピークに注釈を付すためにエキソグリコシダーゼ消化を実施した。図１７は、ＧａｌＮＡｃ３Ｇｎ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＰｒｏＤｅｒｐ１のキャピラリー電気泳動プロファイルを示す。図１８は、ＥｎｄｏＴで処置されたＧａｌＮＡｃ３Ｇｎ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２ ＰｒｏＤｅｒｐ１キャピラリー電気泳動プロファイルを示し、および種々のピークに注釈を付すためにエキソグリコシダーゼ消化を実施した。
【図１】
2019514403.tif 000004
【図２】
2019514403.tif 000005
【図３】
2019514403.tif 000006
【図４】
2019514403.tif 000007
【図５】
2019514403.tif 000008
【図６】
2019514403.tif 000009
【図７】
2019514403.tif 000010
【図８】
2019514403.tif 000011
【図９ａ】
2019514403.tif 000012
【図９ｂ−ｅ】
2019514403.tif 000013
【図１０ａ】
2019514403.tif 000014
【図１０ｂ−ｅ】
2019514403.tif 000015
【図１１Ａ】
2019514403.tif 000016
【図１１Ｂ】
2019514403.tif 000017
【図１２Ａ】
2019514403.tif 000018
【図１２Ｂ】
2019514403.tif 000019
【図１３】
2019514403.tif 000020
【図１４】
2019514403.tif 000021
【図１５】
2019514403.tif 000022
【図１６】
2019514403.tif 000023
【図１７】
2019514403.tif 000024
【図１８】
2019514403.tif 000025
【図１９】
2019514403.tif 000026
【図２０】
2019514403.tif 000027
【配列表】
2019514403000001.app
【国際調査報告】
2019514403.tif 000028
2019514403.tif 000029
2019514403.tif 000030
2019514403.tif 000031
2019514403.tif 000032