(57)【要約】本発明は、ミクログリア再構成可能性に富む造血細胞の移植に際し、脳骨髄細胞およびミクログリアの再構成による、神経系疾患、または中枢神経系（例えば、貯蔵障害、リソソーム貯蔵障害、神経変性疾患など）の障害の処置または予防のための組成物および方法を提供する。本発明はまた、ミクログリアをアブレーションして再構成するための組成物および方法を提供する。本発明は、例えば、対象に造血幹細胞（ＨＳＣ）を送達する方法であって、アブレーション前処理と組み合わせた脳室内注入（ＩＣＶ）によって、前記ＨＳＣを投与するステップを含む、方法を提供する。
2019534898.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に造血幹細胞（ＨＳＣ）を送達する方法であって、アブレーション前処理と組み合わせた脳室内注入（ＩＣＶ）によって、前記ＨＳＣを投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記造血幹細胞（ＨＳＣ）が、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−のうちの１つまたは複数である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記造血幹細胞（ＨＳＣ）が、マウスのｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｆｇｄ５＋、ＣＸ３ＣＲ１−およびＣＤ１１ｂ−のうちの１つまたは複数である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）が、Ｆｇｄ５＋である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記造血幹細胞（ＨＳＣ）が、移植に際し、ミクログリア前駆細胞と機能的に等価である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記対象が、リソソーム貯蔵障害または神経変性疾患を発症するリスクの増大を有する、またはリスクの増大している、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記リソソーム貯蔵障害が、副腎白質ジストロフィー、アクチベーター欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル貯蔵病、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病、グロボイド細胞白質ジストロフィー、ＧＭ１ガングリオシドーシス、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸貯蔵症／ＩＳＳＤ、若年型ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、乳児型ニューロンセロイドリポフスチン症、クラッベ病、リソソーム酸リパーゼ欠乏症、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症障害、多発性スルファターゼ欠損症、ニーマン−ピック病、ニューロンセロイド脂褐素症、ポンペ病／ＩＩ型糖原病、ピクノディスオストシス、サンドホフ病、シンドラー病、サラ病／シアル酸貯蔵病、テイ−サックス／ＧＭ２ガングリオシドーシスおよびウォルマン病から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン疾患およびアルツハイマー病から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記アブレーション前処理が、前記ＨＳＣを投与する前に行われる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アブレーション前処理が、前記対象に細胞毒性剤を投与するステップを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
アルキル化剤がブスルファンである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現するベクターを形質導入した単離造血幹細胞（ＨＳＣ）であって、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−およびＦｇｄ５＋のうちの１つまたは複数である、単離造血幹細胞（ＨＳＣ）。
【請求項１３】
治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現するベクターを形質導入した単離造血幹細胞（ＨＳＣ）であって、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−およびＦｇｄ５＋のうちの１つまたは複数について選択される単離造血幹細胞（ＨＳＣ）。
【請求項１４】
治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現するベクターを形質導入した単離造血幹細胞（ＨＳＣ）であって、ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｆｄｇ５＋、ＣＸ３ＣＲ１−およびＣＤ１１ｂ−のうちの１つまたは複数である、単離造血幹細胞（ＨＳＣ）。
【請求項１５】
前記治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、リソソーム酵素、ＡＢＣＤタンパク質、ｍｉＲ１５５およびＮＯＸ２のうちの１つまたは複数を標的とする阻害性核酸またはｓｈＲＮＡ；ＴＲＥＭ２；ＡＰＯＥ２；およびＡＰＰアルファである、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の単離造血幹細胞（ＨＳＣ）。
【請求項１６】
前記リソソーム酵素が、α−グルコシダーゼ；グルコセレブロシダーゼ；β−ガラクトシダーゼ；β−ヘキソサミニダーゼＡ；β−ヘキソサミニダーゼＢ；酸性スフィンゴミエリナーゼ；ガラクトセレブロシダーゼ；β−ガラクトセレブロシダーゼ；酸性セラミダーゼ；アリールスルファターゼＡ；α−Ｌ−イズロニダーゼ；イズロン酸−２−スルファターゼ；ヘパランＮ−スルファターゼ；α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ；アセチルＣｏＡ：α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ；Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ；Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ；酸性β−ガラクトシダーゼ；アリールスルファターゼＢ；β−グルクロニダーゼ；酸性α−マンノシダーゼ；酸性β−マンノシダーゼ；酸性α−Ｌ−フコシダーゼ；シアリダーゼ；α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ；およびパルミトイルタンパク質−チオエステラーゼ−１のうちの１つまたは複数である、請求項１５に記載の単離造血幹細胞（ＨＳＣ）。
【請求項１７】
前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現が、ＴＳＰＯプロモーターによる、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の単離造血幹細胞（ＨＳＣ）。
【請求項１８】
前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、ＴＳＰＯ遺伝子座に挿入されたポリヌクレオチドから発現する、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の単離造血幹細胞（ＨＳＣ）。
【請求項１９】
ミクログリア細胞に分化することができる、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の単離造血幹細胞（ＨＳＣ）。
【請求項２０】
アブレーションされたミクログリア細胞を再構成することができる、請求項１２から１９のいずれか一項に記載の単離造血幹細胞（ＨＳＣ）。
【請求項２１】
リソソーム貯蔵障害または神経変性疾患を有する、またはそれを発症するリスクの増大している対象を処置する方法であって、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−およびＦｇｄ５＋のうちの１つまたは複数である造血幹細胞（ＨＳＣ）を投与するステップを含み、前記ＨＳＣが、静脈内（ＩＶ）に、またはアブレーション前処理と組み合わせて脳室内注入（ＩＣＶ）によって投与される、方法。
【請求項２２】
リソソーム貯蔵障害または神経変性疾患を有する、またはそれを発症するリスクの増大している対象を処置する方法であって、ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｆｄｇ５＋、ＣＸ３ＣＲ１−およびＣＤ１１ｂ−のうちの１つまたは複数である造血幹細胞（ＨＳＣ）を投与するステップを含み、前記ＨＳＣが、静脈内（ＩＶ）に、またはアブレーション前処理と組み合わせて脳室内注入（ＩＣＶ）によって投与される、方法。
【請求項２３】
ミクログリア細胞またはその前駆体を標的とすることができるナノ粒子。
【請求項２４】
細胞毒性剤をさらに含む、請求項２３に記載のナノ粒子。
【請求項２５】
前記細胞毒性剤が、ミクログリア細胞またはその前駆体に前記細胞毒性剤を送達のために固定用量で提供される、請求項２４に記載のナノ粒子。
【請求項２６】
アルキル化剤が、アルキル化剤、ブスルファン、エトポシドのうちの１つまたは複数である、請求項２５に記載のナノ粒子。
【請求項２７】
最適化した薬物負荷効率、最適化した薬物放出および最適化した安定性のうちの１つまたは複数を有する、請求項２３から２６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項２８】
対象にナノ粒子を送達する方法であって、前記対象に脳室内注入（ＩＣＶ）によってナノ粒子を投与するステップを含む、方法。
【請求項２９】
前記ナノ粒子が、前記ナノ粒子の表面に共有結合により連結されている１つまたは複数の捕捉分子を含み、前記捕捉分子が、ミクログリア細胞またはその前駆体に発現する１つまたは複数のマーカーに特異的に結合する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ナノ粒子が、細胞毒性剤をさらに含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞毒性剤が、アルキル化剤である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記アルキル化剤が、ブスルファン、エトポシドのうちの１つまたは複数である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
対象において、ミクログリア細胞またはその前駆体をアブレーションする方法であって、前記対象にナノ粒子を投与するステップを含み、前記ナノ粒子が、細胞毒性剤、および前記ナノ粒子の表面に共有結合により連結されている１つまたは複数の捕捉分子を含み、前記捕捉分子が、ミクログリア細胞またはその前駆体に発現する１つまたは複数のマーカーに特異的に結合する、方法。
【請求項３４】
前記細胞毒性剤がアルキル化剤である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記アルキル化剤が、ブスルファンおよびエトポシドのうちの１つまたは複数である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ナノ粒子が、静脈内（ＩＶ）に、または脳室内注入（ＩＣＶ）によって前記対象に投与される、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
対象において、ＨＳＣの生着により、内因性ミクログリアをアブレーションし、および前記ミクログリアを再構成する方法であって、
（ａ）前記対象にナノ粒子を投与するステップであって、前記ナノ粒子が、細胞毒性剤、および前記ナノ粒子の表面に共有結合により連結されている１つまたは複数の捕捉分子を含み、前記捕捉分子が、ミクログリア細胞またはその前駆体に発現する１つまたは複数のマーカーに特異的に結合する、ステップ、および
（ｂ）前記対象に、静脈内（ＩＶ）に、または脳室内注入（ＩＣＶ）によって、造血幹細胞（ＨＳＣ）を投与するステップ
を含む、方法。
【請求項３８】
対象における、リソソーム貯蔵障害を処置する方法であって、
（ａ）前記対象にナノ粒子を投与するステップであって、前記ナノ粒子が、細胞毒性剤、および前記ナノ粒子の表面に共有結合により連結されている１つまたは複数の捕捉分子を含み、前記捕捉分子が、ミクログリア細胞またはその前駆体に発現する１つまたは複数のマーカーに特異的に結合するステップ、および
（ｂ）前記対象に、静脈内（ＩＶ）に、または脳室内注入（ＩＣＶ）によって、造血幹細胞（ＨＳＣ）を投与するステップであって、前記ＨＳＣが、治療ポリペプチドを発現する、ステップ
を含む方法。
【請求項３９】
前記リソソーム貯蔵障害が、副腎白質ジストロフィー、アクチベーター欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル貯蔵病、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病、グロボイド細胞白質ジストロフィー、ＧＭ１ガングリオシドーシス、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸貯蔵症／ＩＳＳＤ、若年型ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、乳児型ニューロンセロイドリポフスチン症、クラッベ病、リソソーム酸リパーゼ欠乏症、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症障害、多発性スルファターゼ欠損症、ニーマン−ピック病、ニューロンセロイド脂褐素症、ポンペ病／ＩＩ型糖原病、ピクノディスオストシス、サンドホフ病、シンドラー病、サラ病／シアル酸貯蔵病、テイ−サックス／ＧＭ２ガングリオシドーシスおよびウォルマン病から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記治療ポリペプチドが、リソソーム酵素またはＡＢＣＤタンパク質である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記リソソーム酵素が、α−グルコシダーゼ；グルコセレブロシダーゼ；β−ガラクトシダーゼ；β−ヘキソサミニダーゼＡ；β−ヘキソサミニダーゼＢ；酸性スフィンゴミエリナーゼ；ガラクトセレブロシダーゼ；β−ガラクトセレブロシダーゼ；酸性セラミダーゼ；アリールスルファターゼＡ；α−Ｌ−イズロニダーゼ；イズロン酸−２−スルファターゼ；ヘパランＮ−スルファターゼ；α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ；アセチルＣｏＡ：α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ；Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ；Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ；酸性β−ガラクトシダーゼ；アリールスルファターゼＢ；β−グルクロニダーゼ；酸性α−マンノシダーゼ；酸性β−マンノシダーゼ；酸性α−Ｌ−フコシダーゼ；シアリダーゼ；α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ；およびパルミトイルタンパク質−チオエステラーゼ−１のうちの１つまたは複数である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
対象における、神経変性疾患を処置する方法であって、
（ａ）前記対象にナノ粒子を投与するステップであって、前記ナノ粒子が、細胞毒性剤、および前記ナノ粒子の表面に共有結合により連結されている１つまたは複数の捕捉分子を含み、前記捕捉分子が、ミクログリア細胞またはその前駆体に発現する１つまたは複数のマーカーに特異的に結合するステップ、および
（ｂ）前記対象に、静脈内（ＩＶ）に、または脳室内注入（ＩＣＶ）によって、造血幹細胞（ＨＳＣ）を投与するステップであって、前記ＨＳＣが、治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現する、ステップ
を含む方法。
【請求項４３】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびアルツハイマー病から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、ｍｉＲ１５５およびＮＯＸ２のうちの１つまたは複数を標的とする阻害性核酸またはｓｈＲＮＡ；ＴＲＥＭ２；ＡＰＯＥ２；ならびにＡＰＰアルファのうちの１つまたは複数である、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現が、ＴＳＰＯプロモーターによる、請求項４２から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、ＴＳＰＯ遺伝子座に挿入されたポリヌクレオチドから発現する、請求項４２から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ブスルファン骨髄アブレーションの０〜５日後、ＨＳＰＣをＩＣＶ移植および全骨髄細胞をＩＶ移植することによる、ＣＮＳ外造血組織キメラ現象とは独立して、対象の脳にミクログリアキメラ現象を発生させる方法。
【請求項４８】
対象において、ブスルファン骨髄アブレーション後に、ＩＣＶおよびＩＶ移植した外因性細胞により、短期間、脳およびＣＮＳ外組織中に、持続性の造血混合キメラ現象を発生させる方法。
【請求項４９】
前記外因性細胞が、ＨＳＰＣであり、０日目に、ＩＣＶおよびＩＶ移植される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記キメラ現象が、マイナーＨＬＡ不一致移植状況で発生する、請求項４７から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
操作されたミクログリア内の外因性遺伝子の発現調節を達成する方法であって、ＴＳＰＯプロモーターの制御下、目的の遺伝子をコードするウイルスベクターによる、ミクログリア前駆体の造血性等価体の形質導入を含む、方法。
【請求項５２】
前記ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ミクログリア前駆体の造血性等価体におけるＴＳＰＯ遺伝子座で、目的とする遺伝子の、標的化された付加の方法。
【請求項５４】
ミクログリア前駆体の、操作された自己移植集団を対象に投与するステップを含む、請求項５１から５３のいずれか一項に記載の方法であって、前記対象が、選択的ミクログリア再構成するための脳のアブレーションＩＣＶの投与を受ける、方法。
【請求項５５】
未操作自己移植骨髄細胞を投与するステップをさらに含む、請求項５１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
γＨ２ＡＸシグナルを検出することによる、脳常在性ミクログリア前駆細胞の機能的同定を行うための方法であって、γＨ２ＡＸシグナルの検出が、脳常在性ミクログリア前駆細胞の存在を示す方法。
【請求項５７】
請求項１２から２０のいずれか一項に記載の単離造血幹細胞（ＨＳＣ）または請求項２３から２７のいずれか一項に記載のナノ粒子を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府により出資された研究の下でなされた発明に対する権利の陳述
本発明に至る作業は、贈与契約ｎ°［［６１７１６２］］の下の第７次欧州研究開発フレームワーク計画（ＦＰ７／２００７−２０１３）から、および契約ｎ°ＧＲ−２０１１−０２３４７２６１の下のイタリア保健省からの資金を受けた。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
中枢神経系（ＣＮＳ）障害（ニューロＳＤ）を伴う貯蔵障害（ＳＤ）の大部分は、有効かつ治癒的処置がなく、患者は、最終的に、その破壊性疾患で死亡する。多くの場合、疾患の発症は、非常に早期の幼児期に起こり、わずかな兆候を特徴とし、そのため、進行性段階ではないとしても明確に症候性になった場合に診断が下されることになる。ニューロＳＤはまた、特に早期発症の変形体では、迅速な早期疾患進行を特徴とする。このような理由のため、例えば、クラッベ病および副腎白質ジストロフィーにおける造血細胞移植（ＨＣＴ）、または異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）における造血幹細胞（ＨＳＣ）遺伝子治療法（ＨＳＣ  ＧＴ）を含めた発症前ニューロＳＤ児童において、ある程度の成功を伴う適用された治療的手法は、ニューロＳＤ患者の大部分にとって利益をもたらさず、利益は、発症前または発症早期の患者において適用された手順にしかほとんど結びついていない。迅速な進行性ＳＤ脳疾患を改善するのにこれらのＨＳＣに基づく手法が成功しない重要な理由の１つは、一次神経系疾患の迅速な進行と比べて、常在性ＣＮＳ組織マクロファージ／組織球およびミクログリアが移植造血細胞子孫によって置き換えられる速度が遅いからである。実際に、ドナー由来細胞による内臓マクロファージの迅速再構成は、ＨＣＴ後に明確に実証されているが、ドナー細胞による脳実質の一層限定された遅い浸潤が起こると予想されている。したがって、この現象を強化して、一層迅速にすることを試みる戦略が、大いに必要とされている。このような戦略はまた、成人期の後天性神経変性状態の一部にとって、治療上、適切である可能性を有しており、このことは、移植した造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の子孫、ならびに／またはこれらの状態の大部分を特徴付ける活性化ミクログリア表現型のモジュレートにより、治療分子が血液脳関門を通って送達するという利益をもたらすことができる。例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）およびパーキンソン病（ＰＤ）を含む、これらの障害は、神経炎症およびミクログリアの活性役割などのニューロＬＳＤと、いくつかの共通した疾患／病原性機構を共有している。したがって、処置の新しい組成物および方法が、差し迫って必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の要旨
以下に記載される通り、本発明は、タンパク質送達または局所炎症などの調節などの様々な機構により疾患改善に寄与することができる、ドナー由来細胞または操作された（enginnered）細胞のどちらか一方を用いてＣＮＳ骨髄細胞／ミクログリアキメラ現象を確立することによって、中枢神経系の神経系疾患または障害（例えば、神経変性貯蔵障害、後天性神経変性疾患など）を処置または予防するための組成物および方法を特徴とする。本発明は、以下：（ｉ）上に列挙した状態における治療的目的のために、ミクログリア再構成可能性に富む細胞を含めた、ミクログリア特徴を有するＣＮＳ細胞、またはミクログリア特徴を獲得するＣＮＳ細胞において、ミクログリア前駆細胞を効果的に生着させること、（ｉｉ）上で列挙した状態において、治療的目的のために、ミクログリア再構成可能性に富む細胞を含めた、ミクログリア特徴を有するＣＮＳ遺伝子組換え細胞、またはミクログリア特徴を獲得するＣＮＳ遺伝子組換え細胞において、ミクログリア前駆細胞を選択的かつ排他的に生着させること、および（ｉｉｉ）ＣＮＳ選択的方法（これらの方法は、ミクログリアおよびまたはミクログリア前駆体を標的とするナノ粒子を含むことができる）によって、脳において、増殖能力（ablity）を有する細胞などの常在性骨髄集団をアブレーションすることのうちの１つまたは複数を行うための組成物および方法を提供する。この方法は、首尾よく、タイミング良く、かつＣＮＳ障害しかない場合、細胞のプールを一部更新する際に、治療分子を送達するおよび／または骨髄／ミクログリア特徴をモジュレートするために、脳における移植細胞の選択的ＣＮＳ生着および骨髄／ミクログリア特徴の獲得を達成するために使用することができる。
【０００４】
一態様では、本発明は、アブレーション前処理（conditioning）と組み合わせた脳室内注入（ＩＣＶ）によって、対象に造血幹細胞（ＨＳＣ）を投与するステップを含む、ＨＳＣの送達方法を提供する。別の態様では、本発明は、治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現するベクターで形質転換した単離ＨＳＣを提供し、この場合、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−およびＦｇｄ５＋（例えば、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−；ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−およびＦｇｄ５＋）のうちの１つまたは複数である。
【０００５】
別の態様では、本発明は、治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現するベクターで形質転換した単離造血幹細胞（ＨＳＣ）を提供し、この場合、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−およびＦｇｄ５＋（例えば、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−；ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−およびＦｇｄ５＋）のうちの１つまたは複数に関して選択される。
【０００６】
別の態様では、本発明は、治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現するベクターで形質転換した単離造血幹細胞（ＨＳＣ）を提供し、この場合、ＨＳＣは、ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｆｄｇ５＋、ＣＸ３ＣＲ１−およびＣＤ１１ｂ−（例えば、ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋；ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−；ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｆｄｇ５＋；ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、ＣＸ３ＣＲ１−；ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｆｄｇ５＋、ＣＸ３ＣＲ１−；およびｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｆｄｇ５＋、ＣＸ３ＣＲ１−およびＣＤ１１ｂ−）のうちの１つまたは複数である。
【０００７】
別の態様では、本発明は、リソソーム貯蔵障害または神経変性疾患を有する、またはそれを発症するリスクの増大している対象を処置する方法であって、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−およびＦｇｄ５＋（例えば、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−；ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−およびＦｇｄ５＋）のうちの１つまたは複数である造血幹細胞（ＨＳＣ）を投与するステップを含み、ＨＳＣが、静脈内（ＩＶ）に、またはアブレーション前処理と組み合わせて脳室内注入（ＩＣＶ）によって投与される方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、本発明は、リソソーム貯蔵障害または神経変性疾患を有する、またはそれを発症するリスクの増大している対象を処置する方法であって、ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｆｄｇ５＋、ＣＸ３ＣＲ１−およびＣＤ１１ｂ−（例えば、ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋；ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−；ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｆｄｇ５＋；ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、ＣＸ３ＣＲ１−；ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｆｄｇ５＋、ＣＸ３ＣＲ１−；およびｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｆｄｇ５＋、ＣＸ３ＣＲ１−およびＣＤ１１ｂ−）のうちの１つまたは複数である造血幹細胞（ＨＳＣ）を投与するステップを含み、ＨＳＣが、静脈内（ＩＶ）に、またはアブレーション前処理と組み合わせて脳室内注入（ＩＣＶ）によって投与される方法を提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明は、対象において、内因性ミクログリアをアブレーションして、ＨＳＣ生着によってミクログリアを再構成させる方法であって、細胞毒性剤を含有するナノ粒子を対象に投与するステップを含む方法を提供する。ナノ粒子は、１つまたは複数の捕捉分子の表面に共有結合させて（この捕捉分子は、ミクログリア細胞またはその前駆体に発現する１つまたは複数のマーカーに特異的に結合する）、ＨＳＣを対象にＩＶまたはＩＣＶ投与することにより、上記の捕捉分子と一緒にすることができる。
【００１０】
別の態様では、本発明は、対象におけるリソソーム貯蔵障害を処置する方法であって、ナノ粒子を対象に投与するステップであって、ナノ粒子が、細胞毒性剤、およびナノ粒子の表面に共有結合により連結されている１つまたは複数の捕捉分子を含有し、捕捉分子がミクログリア細胞またはその前駆体に発現する１つまたは複数のマーカーに特異的に結合するステップ、および造血幹細胞（ＨＳＣ）を、静脈内（ＩＶ）または脳質内注入（ＩＣＶ）によって対象に投与するステップであって、ＨＳＣが治療ポリペプチドを発現するステップを含む、方法を提供する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、対象における神経変性疾患を処置する方法であって、ナノ粒子を対象に投与するステップであって、ナノ粒子が、細胞毒性剤、およびナノ粒子の表面に共有結合により連結されている１つまたは複数の捕捉分子を含有し、捕捉分子がミクログリア細胞またはその前駆体に発現する１つまたは複数のマーカーに特異的に結合するステップ、および造血幹細胞（ＨＳＣ）を、静脈内（ＩＶ）または脳質内注入（ＩＣＶ）によって対象に投与するステップであって、ＨＳＣが治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現するステップを含む、方法を提供する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、ＣＮＳ外造血組織キメラ現象とは独立して、対象の脳にミクログリアキメラ現象を発生させる方法であって、ブスルファン骨髄アブレーション後の０〜５日に、ＨＳＰＣをＩＣＶ移植および全骨髄細胞をＩＶ移植するステップを含む、方法を提供する。
【００１３】
別の態様では、本発明は、対象において、ブスルファン骨髄アブレーション後に、ＩＣＶおよびＩＶ移植した外因性細胞により、短期間、脳およびＣＮＳ外組織において持続性の造血混合キメラ現象を発生させる方法を提供する。
【００１４】
別の態様では、本発明は、操作されたミクログリア内の外因性遺伝子の発現調節を達成する方法であって、ＴＳＰＯプロモーターの制御下、目的の遺伝子をコードするウイルスベクターによる、ミクログリア前駆体の造血性等価体の形質導入を含む方法を提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、γＨ２ＡＸシグナルを検出することによる、脳常在性ミクログリア前駆細胞の機能的同定を行うための方法であって、γＨ２ＡＸシグナルの検出が、脳常在性ミクログリア前駆細胞の存在を示す方法を提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載されている任意の態様によるナノ粒子である、特許請求の範囲の単離造血幹細胞（ＨＳＣ）を含むキットを提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、ミクログリア細胞またはその前駆体を標的とすることができるナノ粒子を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、対象にナノ粒子を送達する方法であって、対象に脳室内注入（ＩＣＶ）によってナノ粒子を投与するステップを含む方法を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、対象において、ミクログリア細胞またはその前駆体をアブレーションする方法であって、対象にナノ粒子を投与するステップを含み、ナノ粒子が、細胞毒性剤、およびナノ粒子の表面に共有結合により連結された１つまたは複数の捕捉分子を含有し、捕捉分子が、ミクログリア細胞またはその前駆体に発現する１つまたは複数のマーカーに特異的に結合する方法を提供する。
【００２０】
本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、造血幹細胞（ＨＳＣ）（例えば、ヒト）は、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−およびＦｇｄ５＋（例えば、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−；ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−およびＦｇｄ５＋）のうちの１つまたは複数である。本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、造血幹細胞（ＨＳＣ）（例えば、マウス）は、ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｆｇｄ５＋、ＣＸ３ＣＲ１−およびＣＤ１１ｂ−（例えば、ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋；ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−；ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｆｄｇ５＋；ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、ＣＸ３ＣＲ１−；ｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｆｄｇ５＋、ＣＸ３ＣＲ１−；およびｋｉｔ＋、Ｌｉｎ−、Ｓｃａ１＋、ＣＤ１５０＋、ＣＤ４８−、Ｆｄｇ５＋、ＣＸ３ＣＲ１−およびＣＤ１１ｂ−）のうちの１つまたは複数である。ある特定の実施形態では、ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）は、Ｆｇｄ５＋である。本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、移植に際し、ミクログリア前駆細胞と機能的に等価である。本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、ＨＳＣは、ミクログリア細胞内に分化することが可能である。本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、ＨＳＣは、アブレーションされたミクログリア細胞を再構成することが可能である。
【００２１】
本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、対象は、リソソーム貯蔵障害を発症するリスクの増大を有するか、またはそのようなリスクが増大している。様々な実施形態では、リソソーム貯蔵障害は、副腎白質ジストロフィー、アクチベーター欠損症／ＧＭ２ガングリオシドーシス、アルファ−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステリルエステル貯蔵病、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファブリー病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病、グロボイド細胞白質ジストロフィー、ＧＭ１ガングリオシドーシス、Ｉ細胞病／ムコリピドーシスＩＩ、乳児遊離シアル酸貯蔵症／ＩＳＳＤ、若年型ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、乳児型ニューロンセロイドリポフスチン症、クラッベ病、リソソーム酸リパーゼ欠乏症、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症障害、多発性スルファターゼ欠損症、ニーマン−ピック病、ニューロンセロイド脂褐素症、ポンペ病／ＩＩ型糖原病、ピクノディスオストシス、サンドホフ病、シンドラー病、サラ病／シアル酸貯蔵病、テイ−サックス／ＧＭ２ガングリオシドーシスおよびウォルマン病から選択される。本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、リソソーム酵素は、α−グルコシダーゼ；グルコセレブロシダーゼ；β−ガラクトシダーゼ；β−ヘキソサミニダーゼＡ；β−ヘキソサミニダーゼＢ；酸性スフィンゴミエリナーゼ；ガラクトセレブロシダーゼ；β−ガラクトセレブロシダーゼ；酸性セラミダーゼ；アリールスルファターゼＡ；α−Ｌ−イズロニダーゼ；イズロン酸−２−スルファターゼ；ヘパランＮ−スルファターゼ；α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ；アセチルＣｏＡ：α−グルコサミニドＮ−アセチルトランスフェラーゼ；Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸スルファターゼ；Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ；酸性β−ガラクトシダーゼ；アリールスルファターゼＢ；β−グルクロニダーゼ；酸性α−マンノシダーゼ；酸性β−マンノシダーゼ；酸性α−Ｌ−フコシダーゼ；シアリダーゼ；α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ；およびパルミトイルタンパク質−チオエステラーゼ−１のうちの１つまたは複数である。
【００２２】
本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、対象は、神経変性疾患を発症するリスクの増大を有するか、またはそのようなリスクが増大している。様々な実施形態では、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病およびパーキンソン病から選択される。
【００２３】
本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、治療ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、リソソーム酵素、ＡＢＣＤタンパク質、ｍｉＲ１５５およびＮＯＸ２（例えば、ＡＬＳにおいて）のうちの１つまたは複数を標的とする阻害性核酸またはｓｈＲＮＡ；ＴＲＥＭ２；ＡＰＯＥ２；およびＡＰＰアルファ（例えば、アルツハイマー病において）である。
【００２４】
本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、ＨＳＣは、アブレーション前処理と組み合わせて投与される。様々な実施形態では、アブレーション前処理は、対象に細胞毒性剤を投与することを含む。様々な実施形態では、アルキル化剤は、ブスルファン、エトポシドおよびロムスチンのうちの１つまたは複数である。様々な実施形態では、アブレーション前処理は、ＨＳＣを投与する前に行われる。
【００２５】
本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現は、ＴＳＰＯプロモーターによる。本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、ＴＳＰＯ遺伝子座に挿入されたポリヌクレオチドから発現する。
【００２６】
本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、ナノ粒子は、細胞毒性剤をさらに含有する。様々な実施形態では、細胞毒性剤は、ミクログリア細胞またはその前駆体に細胞毒性剤を送達するための固定用量で供給される。ある特定の実施形態では、アルキル化剤は、アルキル化剤、ブスルファン、エトポシドおよびロムスチンのうちの１つまたは複数である。本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、ナノ粒子は、最適化した薬物負荷効率、最適化した薬物放出および最適化した安定性のうちの１つまたは複数を有する。本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に共有結合により連結されている１つまたは複数の捕捉分子を含み、捕捉分子は、ミクログリア細胞またはその前駆体に発現する１つまたは複数のマーカーに特異的に結合する。本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、ナノ粒子は、静脈内（ＩＶ）に、または脳室内注入（ＩＣＶ）によって対象に投与される。
【００２７】
本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、外因性細胞は、０日目にＩＣＶおよびＩＶ移植されたＨＳＣである。本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、キメラ現象は、マイナーＨＬＡ不一致移植状況で発生する。
【００２８】
本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、本方法は、ミクログリア前駆体の造血性等価体におけるＴＳＰＯ遺伝子座で、目的とする遺伝子の、標的化された付加を含む。本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、本方法は、ミクログリア前駆体の、操作された自己移植集団を対象に投与するステップを含み、対象は、選択的にミクログリアを再構成するための脳のアブレーションをＩＣＶで受ける。本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、本方法は、未操作自己移植骨髄細胞を投与するステップをさらに含む。本明細書に記載されている任意の態様の様々な実施形態では、本方法は、脳常在性ミクログリア前駆細胞を特定するために、Ｆｄｇ５発現を検出するステップをさらに含む。
【００２９】
本発明の他の特徴および利点は、詳細説明および特許請求の範囲から明白になろう。
【００３０】
定義
別段の規定がない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されている意味を有する。以下の参照文献は、本発明において使用される用語の多数の一般定義を当業者に提示する：Singletonら、Dictionary  of  Microbiology  and  Molecular  Biology（第２版、１９９４年）；The  Cambridge  Dictionary  of  Science  and  Technology（Walker編、１９８８年）；The  Glossary  of  Genetics、第５版、R.  Riegerら（編）、Springer  Verlag（１９９１年）；ならびにHaleおよびMarham、The  Harper  Collins  Dictionary  of  Biology（１９９１年）。本明細書で使用する場合、以下の用語は、特に指定しない限り、以下にこれらの用語に帰属される意味を有する。
【００３１】
「薬剤」とは、任意の低分子化学化合物、抗体、核酸分子、もしくは、ポリペプチド、またはその断片を意味する。
【００３２】
「改善する」とは、疾患の発症または進行を低下させる、抑制する、弱化させる、軽減する、抑止するまたは安定化させることを意味する。
【００３３】
用語「抗体」は、本明細書において使用する場合、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。用語「抗体断片」とは、無傷抗体の一部を指し、無傷抗体の抗原決定可変領域を指す。
【００３４】
「変質」または「変化」とは、向上または低下を意味する。変質は、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％と低くてもよく、または４０％、５０％、６０％であってもよく、または７０％、７５％、８０％、９０％または１００％と高いことさえあってもよい。
【００３５】
「生物試料」とは、任意の組織、細胞、流体、または生物から誘導される他の物質を意味する。
【００３６】
「捕捉試薬」とは、核酸分子またはポリペプチドを選択または単離するために、核酸分子またはポリペプチドに特異的に結合する試薬を意味する。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「決定すること」、「評価すること」、「アッセイすること」、「測定すること」および「検出すること」とは、定量的および定性的決定の両方を指し、したがって、用語「決定すること」は、「アッセイすること」、「測定すること」などと本明細書において互換的に使用される。定量的決定が意図される場合、分析対象などの「量を決定する」という言い回しが使用される。定性的および／または定量的決定が意図される場合、分析対象の「レベルを決定する」、または分析対象を「検出する」という言い回しが使用される。
【００３８】
「検出する」とは、検出される分析対象の存在、非存在またはその量を特定することを指す。
【００３９】
「検出可能な標識」とは、目的の分子に連結すると、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的または化学的手段によって、目的分子を検出可能にする組成物を意味する。例えば、有用な標識には、放射活性同位体、磁気ビーズ、金属性ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されている）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテンが含まれる。
【００４０】
「疾患」とは、細胞、組織または臓器の正常な機能を損なう、またはこれと相互作用する、任意の状態または障害を意味する。
【００４１】
「有効量」とは、未処置患者に比べて、疾患の症状の改善を必要とする量を意味する。疾患の治療的処置のため、本発明を実施するために使用される活性化合物の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重および一般健康に応じて様々となる。最終的に、主治医または獣医師が、適量および投与量レジメンを決定するであろう。このような量は、「有効な」量と呼ばれる。
【００４２】
「Ｆｇｄ５ポリペプチド」とは、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿６８９７４９、ＮＰ＿００１３０７２０５、ＮＰ＿７６６３１９に対して約８５％またはそれより高いアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはその断片、およびクロマチン結合活性または転写調節活性を有するタンパク質またはその断片を意味する。例示的なヒトＦｇｄ５タンパク質の配列を、以下に提示する：
【化１−１】
2019534898.tif 000003
【化１−２】
2019534898.tif 000004
【００４３】
例示的なマウスＦｇｄ５タンパク質の配列を、以下に提示する：
【化２】
2019534898.tif 000005
【００４４】
「断片」とは、参照タンパク質または核酸と実質的に同一のタンパク質または核酸の一部を意味する。一部の実施形態では、この一部分は、本明細書に記載されている参照タンパク質または核酸の生物活性の、少なくとも５０％、７５％もしくは８０％、またはより好ましくは９０％、９５％、もしくは９９％も保持している。
【００４５】
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」とは、その天然状態において見出される通り、通常それに伴う構成成分を様々な程度で含まない物質を指す。「単離する」は、元の供給源または周囲からのある程度の分離を意味する。「精製する」は、単離よりも高い分離の程度を意味する。「精製した」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、いかなる不純物も、タンパク質の生物学的特性に実質的に影響を及ぼさない、または他の有害結果を引き起こさないように、他の物質が十分に排除されている。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えＤＮＡ技法によって産生される場合、細胞物質、ウイルス性物質もしくは培養培地を、または化学的に合成した場合、化学プレカーサーもしくは他の化学物質を実質的に含まない場合に、精製されている。純度および均質性は、通常、分析化学技法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。用語「精製した」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中で本質的に１つのバンドしか生じないことを意味することができる。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化が施され得るタンパク質の場合、様々な修飾により、個別に精製され得る、様々な単離タンパク質が生じ得る。
【００４６】
「単離されたポリペプチド」とは、それに天然に付随する構成成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。通常、ポリペプチドは、タンパク質、およびそれに天然に付随する天然の有機分子を重量基準で少なくとも６０％含まない場合、単離されている。好ましくは、調製物は、本発明のポリペプチドが、重量基準で少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％となる。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然源からの抽出により、このようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により、またはタンパク質を化学的に合成することにより得ることができる。純度は、任意の適切な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「貯蔵障害（ＳＤ）」とは、リソソームまたは他の細胞の小器官において、基質（例えば、スルファチド、ヘパラン硫酸、糖脂質、セラミド）の蓄積に至る代謝異常に起因する疾患の群のいずれかを指す。例えば、リソソーム貯蔵障害（ＬＳＤ）は、通常、脂質、グリコタンパク質（糖含有タンパク質）、またはいわゆるムコ多糖類の代謝に必要な単一酵素の欠乏の結果としてのリソソーム機能不全により引き起こされる。
【００４８】
「マーカー」とは、疾患、障害または状態に関連する変質を有する、任意の臨床的指標、タンパク質、代謝産物またはポリヌクレオチドを意味する。
【００４９】
「ミクログリア」とは、中枢神経系の免疫細胞を意味する。
【００５０】
「ナノ粒子」とは、ナノスケールの寸法の複合構造体を意味する。特に、ナノ粒子は、通常、約１〜約１０００ｎｍの範囲のサイズの粒子であり、通常、球状であるが、ナノ粒子組成に応じて、様々な形態が可能である。ナノ粒子に対して外部環境と接触するナノ粒子の一部は、一般に、ナノ粒子の表面として特定される。本明細書において記載されているナノ粒子では、サイズの制限は、２つの寸法に制限され得、したがって、本明細書に記載されているナノ粒子は、約１〜約１０００ｎｍの直径を有する複合構造体を含み、具体的な直径は、実験設計に応じたナノ粒子組成、およびナノ粒子の所期の使用による。例えば、いくつかの治療用途に使用されることになるナノ粒子は、通常、約２００ｎｍまたはそれ未満のサイズを有しており、特に、治療剤を伴う送達向けに使用されるナノ粒子は、通常、約１〜約１００ｎｍの直径を有する。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「神経変性疾患」とは、ニューロンの死亡を含めた、ニューロンの構造および／または機能の進行性喪失を特徴とする、疾患の群のいずれかを指す。例示的な神経変性疾患には、非限定的に、筋萎縮性側索硬化症およびアルツハイマー病が含まれる。
【００５２】
「増殖を向上させる」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、細胞の細胞分裂を向上させることを意味する。
【００５３】
本明細書で使用する場合、用語「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」などは、障害または状態を有していないが、それらを発症するリスクにあるまたは発症し易い対象において、障害または状態を発症する可能性を低減することを指す。
【００５４】
用語「対象」または「患者」は、処置、観察または実験の対象である、動物を指す。単なる例として、対象には、以下に限定されないが、ヒト、または非ヒト霊長類、マウス、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジまたはネコなどの非ヒト哺乳動物を含めた、哺乳動物が含まれる。
【００５５】
「低減」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％または１００％の負の変質を意味する。
【００５６】
「参照」とは、比較または対照の状態の標準を意味する。
【００５７】
「実質的に同一の」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されているアミノ酸配列のいずれか１つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載されている核酸配列のいずれか１つ）に対して少なくとも５０％の同一性を示す、ポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列は、比較のために使用される配列に対して、アミノ酸レベルまたは核酸において、少なくとも６０％、より好ましくは８０％または８５％、およびより好ましくは９０％、９５％、９６％、９７％、９８％またはさらには９９％もしくはそれより高く同一である。
【００５８】
配列同一性は、通常、配列解析ソフトウェア（例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．５３７０５、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ）の配列解析ソフトウェアパッケージ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失および／または他の修飾に対する相同性の程度を帰属することにより、同一の配列または類似の配列を一致させる。保存的置換は、通常、以下：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンの基内の置換を含む。同一性の程度を決定する例示的な手法では、ＢＬＡＳＴプログラムは、密接に関連した配列を示す、ｅ−３〜ｅ−１００の間のスコア確率と共に使用され得る。
【００５９】
本発明の方法において有用な核酸分子は、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子を含む。このような核酸分子は、内因性核酸配列と１００％同一である必要はないが、通常、実質的に同一性を示すことになろう。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、通常、二本鎖核酸分子のうちの少なくとも１つの鎖とハイブリダイズすることができる。「ハイブリダイズする」とは、厳密な様々な条件下で、相補性ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載されている遺伝子）またはその一部の間に二本鎖分子を形成する対を意味する（例えば、Wahl,  G.  M.およびS.  L.  Berger（１９８７年）Methods  Enzymol.  １５２巻：３９９頁；Kimmel,  A.  R.（１９８７年）Methods  Enzymol.  １５２巻：５０７頁を参照されたい）。
【００６０】
例えば、厳密な塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、好ましくは約５００ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、およびより好ましくは約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムとなろう。厳密度の低いハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で得ることができる一方、厳密度の高いハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドの存在下で得ることができる。厳密な温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃となる温度を含むであろう。ハイブリダイゼーション時間、洗剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、および担体ＤＮＡを含ませるまたは含ませないなどの様々な追加パラメータは、当業者に周知である。厳密度の様々なレベルは、必要に応じて、このような様々な条件を組み合わせることによって行うことができる。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび１％のＳＤＳ中、３０℃で行われる。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、３５％のホルムアミドおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で行われる。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％のＳＤＳ、５０％のホルムアミドおよび２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡ中、４２℃で行われる。これらの条件に関する有用な変形体は、当業者に容易に明白になろう。
【００６１】
大部分の用途にとって、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程もやはり、厳密度が様々となろう。洗浄の厳密条件は、塩濃度によって、および温度によって規定することができる。上記の通り、洗浄の厳密度は、塩濃度の低下により、または温度の上昇により高めることができる。例えば、洗浄工程に関する厳密な塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウム、最も好ましくは約１５ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムとなろう。洗浄工程に関する厳密な温度状態には、通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、およびさらにより好ましくは少なくとも約６８℃となる温度を含むであろう。好ましい実施形態では、洗浄工程は、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび０．１％のＳＤＳ中、２５℃で行われる。より好ましい実施形態では、洗浄工程は、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび０．１％のＳＤＳ中、４２℃で行われる。より好ましい実施形態では、洗浄工程は、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウムおよび０．１％のＳＤＳ中、６８℃で行われる。これらの条件に関するさらなる変形体は、当業者に容易に明白になろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えば、BentonおよびDavis（Science  １９６巻：１８０頁、１９７７年）；GrunsteinおよびHogness（Proc.  Natl.  Acad.  Sci．、USA  ７２巻：３９６１頁、１９７５年）；Ausubelら（Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Wiley  Interscience、New  York、２００１年）；BergerおよびKimmel（Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques、１９８７年、Academic  Press、New  York）；ならびにSambrookら、Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、New  Yorkに記載されている。
【００６２】
「特異的に結合する」とは、分子（例えば、ポリペプチド）を認識して結合するが、試料中、例えば生物試料中の他の分子を実質的に認識して結合しない化合物（例えば、ペプチド）を意味する。
【００６３】
本明細書で使用する場合、用語「処置する」、「処置すること」、「処置」などは、それに関連する障害および／もしくは症状を低減または改善することを指す。限定しないが、障害または状態を処置することは、その障害、状態、またはそれらに関連する症状を完全になくすことを必要とするものではないことが理解されるであろう。
【００６４】
具体的に明記しない、または文脈から明白ではない限り、用語「約」は、本明細書で使用する場合、当技術分野において正常な許容性の範囲内、例えば平均値の２標準偏差内として理解される。約は、明記した値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％内として理解することができる。文脈から特に明瞭ではない限り、本明細書において提示されている数値はすべて、約という用語により修飾されている。
【００６５】
本明細書において提示されている範囲は、その範囲内の値のすべてに関する簡潔表現と理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０からなる群からの任意の数、数の組合せ数または部分範囲を含むことが理解される。
【００６６】
本明細書において提示されている任意の化合物、組成物または方法は、本明細書において提示されている他の組成物および方法のいずれかのうちの１つまたは複数と組み合わせることができる。
【００６７】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に明確に指示しない限り、複数形を含む。したがって、例えば、「バイオマーカー」を言う場合、１種を超えるバイオマーカーの言及が含まれる。
【００６８】
具体的に明記しない限り、または文脈から明白ではない限り、本明細書で使用する場合、用語「または」は、包括的であると理解される。
【００６９】
用語「含む」とは、本明細書では、言い回し「を含むが、それらに限定されない」を意味するよう使用され、この言い回しと互換的に使用される。
【００７０】
本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法において、それらに属する意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」など、「から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」も同様に、米国特許法に属する意味を有しており、この用語はオープンエンドであり、列挙されているものの基本的または新規な特徴が、列挙されているもの以外の存在によって変化を受けない限り、列挙されているもの以外の存在を認めるが、先行技術の実施形態を除外する。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｈは、マウスおよびヒトＨＳＰＣの脳室内注入後の脳における、骨髄細胞の再構成を図示している。図１Ａは、骨髄アブレーションマウス（ＢＵ：ブスルファン処置による骨髄アブレーション；ＩＲＲ：致死照射）における、（マウスにおいて、ＨＳＰＣとなる）系統−（Ｌｉｎ−）細胞のＩＣＶ移植に関する実験スキームを図示している。分析の様々な時間点を示している。Ｌｉｎ−細胞に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＬＶを形質導入した。図１Ｂは、ＢＵ処置した（ＢＵ−ＴＸ）マウスおよび照射（ＩＲＲ）マウスにおける、ＩＣＶおよびＩＶ  ＨＳＰＣ移植後、様々な時間点における、全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）脳コンパートメント内で特定されたＧＦＰ＋細胞の存在率（frequency）を図示しているグラフである。時間点および群あたり、Ｎ≧５のマウスである；平均値およびＳＤを示している。二元配置ＡＮＯＶＡにより、ＢＵおよびＩＲＲマウスにおいて、細胞投与の経路および時間に有意な効果（ＩＣＶ対ＩＶおよび時間ｐ＜０．００５）があることが示された。これらのデータは、ＨＳＰＣの脳室内注入後の脳において、迅速かつ頑強な骨髄細胞生着があることを示している。グラフの棒は、４本の棒からなる３組で示されている。左から右に、ＩＲＲ  ＩＶ（グレー）、ＩＲＲ  ＩＣＶ（白）、ＢＵ  ＩＶ（濃いグレー）、ＢＵ  ＩＣＶ（さらに濃いグレー）である。図１Ｃは、代表的なＩＣＶ移植ＢＵ−ＴＸマウスの脳の矢状面の区域の再構築を図示しており、ＧＦＰを形質導入したＨＳＰＣをＩＣＶ注入して９０日目に、ＧＦＰ＋細胞の分布の広がりを示している。核に関するＧＦＰ（緑／グレー）およびＴｏｐｒｏ  ＩＩＩ（ＴＰＩＩＩ、薄い青色／薄いグレー）を示している。画像は、２０×の拡大率のＤｅｌｔａ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｏｌｙｍｐｕｓで取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。再構築は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ  ８．０ソフトウェアを用いて行った。図１Ｄは、ＧＦＰ形質導入ＨＳＰＣのＩＣＶ移植後の９０日目に、ＢＵ＿ＴＸマウスからの脳の薄片における、ＧＦＰ（緑／グレー）およびＩｂａ−１（赤色／薄いグレー）に関する免疫蛍光解析を図示している。Ｍ＝融合したものである。関連するドット付きの箱の２０×および４０×倍率を示している。画像は、共焦点顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｉｘ７０で取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。図１Ｅは、ＢＵ１６ｍｇ／ｋｇ×４日間で事前処置した（ＮＳＧ）もしくは致死未満照射で事前処置した（ＲａｇＭＬＤ）、ＮＳＧマウスまたはＲａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−（ＲａｇＭＬＤ）マウスにおいて、ＧＦＰまたはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）をコードするＬＶを形質導入したヒトＣＤ３４＋細胞（ヒトにおいてＨＳＰＣとなり、マウスに由来するＬｉｎ−細胞に等価な集団と見なす）の移植に関する実験スキームである。ＮＳＧマウスは、ＮＳＧドナーに由来する未操作単核細胞も受けた。グラフは、４組の棒を含む。各組における一番左の棒から、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図１Ｆは、ＧＦＰ  ＬＶを形質導入したヒトＣＤ３４＋細胞を、２０週間早く、移植したＮＳＧマウスに由来する、脳単核細胞の解析からの代表的なドットのプロットを図示している。マウス脳中のヒト細胞の存在率は、２つの代表的な動物中で、および２つの解析方法（ＳＳＣについてヒトＣＤ４５、およびマウスＣＤ４５についてヒトＣＤ４５）で示されている。これらのプロットはまた、移植後のＮＳＧ脳において特定されたヒトＣＤ４５＋細胞は、ＣＤ１１ｂ、ＣＸ３Ｃｒ１およびＧＦＰを発現していることを示している。図１Ｇは、移植後の１２〜２０週間のＢＵ処置または致死未満の照射Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−（ＮＳＧ）、および５週間（Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−）後の臍帯血に由来するＣＤ３４＋細胞を、ＩＶまたはＩＣＶ移植したＮＳＧおよびＲａｇＭＬＤマウスの脳から回収した、ヒトＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の存在率を図示したグラフである。値は、ＩＶに対する倍率として表しており、ＩＶは、ＮＳＧマウスでは、３＋／−１．３に等しく、ＲａｇＭＬＤでは、２，９＋／−０．７に等しい。Ｎ≧５のマウス／群；平均値およびＳＤを示している。ＮＳＧマウスでは、スチューデントｔ検定で、Ｐ＜０．００１である；ＲａｇＭＬＤマウスでは、ボンフェローニ事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡでｐ＜０．０５である。図１Ｈは、ＧＦＰを形質導入したＣＤ３４＋細胞のＩＣＶ移植後の９０日目のＮＳＧマウスからの脳薄片上のＧＦＰ、Ｉｂａ−１（共染色）、ＣＤ１１ｂ（共染色）、ＣＤ６８（共染色なし）およびＣＤ１６３（共染色なし）に関する免疫蛍光解析からの結果を図示している。青色では、核は、ＴＰ  ＩＩＩによって染色された。関連するドット付きの箱の、２０×および４０×倍率を示している。Ｍ＝融合したものである。
【図１ＢＣＤ】図１Ａ〜１Ｈは、マウスおよびヒトＨＳＰＣの脳室内注入後の脳における、骨髄細胞の再構成を図示している。図１Ａは、骨髄アブレーションマウス（ＢＵ：ブスルファン処置による骨髄アブレーション；ＩＲＲ：致死照射）における、（マウスにおいて、ＨＳＰＣとなる）系統−（Ｌｉｎ−）細胞のＩＣＶ移植に関する実験スキームを図示している。分析の様々な時間点を示している。Ｌｉｎ−細胞に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＬＶを形質導入した。図１Ｂは、ＢＵ処置した（ＢＵ−ＴＸ）マウスおよび照射（ＩＲＲ）マウスにおける、ＩＣＶおよびＩＶ  ＨＳＰＣ移植後、様々な時間点における、全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）脳コンパートメント内で特定されたＧＦＰ＋細胞の存在率（frequency）を図示しているグラフである。時間点および群あたり、Ｎ≧５のマウスである；平均値およびＳＤを示している。二元配置ＡＮＯＶＡにより、ＢＵおよびＩＲＲマウスにおいて、細胞投与の経路および時間に有意な効果（ＩＣＶ対ＩＶおよび時間ｐ＜０．００５）があることが示された。これらのデータは、ＨＳＰＣの脳室内注入後の脳において、迅速かつ頑強な骨髄細胞生着があることを示している。グラフの棒は、４本の棒からなる３組で示されている。左から右に、ＩＲＲ  ＩＶ（グレー）、ＩＲＲ  ＩＣＶ（白）、ＢＵ  ＩＶ（濃いグレー）、ＢＵ  ＩＣＶ（さらに濃いグレー）である。図１Ｃは、代表的なＩＣＶ移植ＢＵ−ＴＸマウスの脳の矢状面の区域の再構築を図示しており、ＧＦＰを形質導入したＨＳＰＣをＩＣＶ注入して９０日目に、ＧＦＰ＋細胞の分布の広がりを示している。核に関するＧＦＰ（緑／グレー）およびＴｏｐｒｏ  ＩＩＩ（ＴＰＩＩＩ、薄い青色／薄いグレー）を示している。画像は、２０×の拡大率のＤｅｌｔａ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｏｌｙｍｐｕｓで取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。再構築は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ  ８．０ソフトウェアを用いて行った。図１Ｄは、ＧＦＰ形質導入ＨＳＰＣのＩＣＶ移植後の９０日目に、ＢＵ＿ＴＸマウスからの脳の薄片における、ＧＦＰ（緑／グレー）およびＩｂａ−１（赤色／薄いグレー）に関する免疫蛍光解析を図示している。Ｍ＝融合したものである。関連するドット付きの箱の２０×および４０×倍率を示している。画像は、共焦点顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｉｘ７０で取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。図１Ｅは、ＢＵ１６ｍｇ／ｋｇ×４日間で事前処置した（ＮＳＧ）もしくは致死未満照射で事前処置した（ＲａｇＭＬＤ）、ＮＳＧマウスまたはＲａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−（ＲａｇＭＬＤ）マウスにおいて、ＧＦＰまたはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）をコードするＬＶを形質導入したヒトＣＤ３４＋細胞（ヒトにおいてＨＳＰＣとなり、マウスに由来するＬｉｎ−細胞に等価な集団と見なす）の移植に関する実験スキームである。ＮＳＧマウスは、ＮＳＧドナーに由来する未操作単核細胞も受けた。グラフは、４組の棒を含む。各組における一番左の棒から、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図１Ｆは、ＧＦＰ  ＬＶを形質導入したヒトＣＤ３４＋細胞を、２０週間早く、移植したＮＳＧマウスに由来する、脳単核細胞の解析からの代表的なドットのプロットを図示している。マウス脳中のヒト細胞の存在率は、２つの代表的な動物中で、および２つの解析方法（ＳＳＣについてヒトＣＤ４５、およびマウスＣＤ４５についてヒトＣＤ４５）で示されている。これらのプロットはまた、移植後のＮＳＧ脳において特定されたヒトＣＤ４５＋細胞は、ＣＤ１１ｂ、ＣＸ３Ｃｒ１およびＧＦＰを発現していることを示している。図１Ｇは、移植後の１２〜２０週間のＢＵ処置または致死未満の照射Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−（ＮＳＧ）、および５週間（Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−）後の臍帯血に由来するＣＤ３４＋細胞を、ＩＶまたはＩＣＶ移植したＮＳＧおよびＲａｇＭＬＤマウスの脳から回収した、ヒトＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の存在率を図示したグラフである。値は、ＩＶに対する倍率として表しており、ＩＶは、ＮＳＧマウスでは、３＋／−１．３に等しく、ＲａｇＭＬＤでは、２，９＋／−０．７に等しい。Ｎ≧５のマウス／群；平均値およびＳＤを示している。ＮＳＧマウスでは、スチューデントｔ検定で、Ｐ＜０．００１である；ＲａｇＭＬＤマウスでは、ボンフェローニ事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡでｐ＜０．０５である。図１Ｈは、ＧＦＰを形質導入したＣＤ３４＋細胞のＩＣＶ移植後の９０日目のＮＳＧマウスからの脳薄片上のＧＦＰ、Ｉｂａ−１（共染色）、ＣＤ１１ｂ（共染色）、ＣＤ６８（共染色なし）およびＣＤ１６３（共染色なし）に関する免疫蛍光解析からの結果を図示している。青色では、核は、ＴＰ  ＩＩＩによって染色された。関連するドット付きの箱の、２０×および４０×倍率を示している。Ｍ＝融合したものである。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｈは、マウスおよびヒトＨＳＰＣの脳室内注入後の脳における、骨髄細胞の再構成を図示している。図１Ａは、骨髄アブレーションマウス（ＢＵ：ブスルファン処置による骨髄アブレーション；ＩＲＲ：致死照射）における、（マウスにおいて、ＨＳＰＣとなる）系統−（Ｌｉｎ−）細胞のＩＣＶ移植に関する実験スキームを図示している。分析の様々な時間点を示している。Ｌｉｎ−細胞に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＬＶを形質導入した。図１Ｂは、ＢＵ処置した（ＢＵ−ＴＸ）マウスおよび照射（ＩＲＲ）マウスにおける、ＩＣＶおよびＩＶ  ＨＳＰＣ移植後、様々な時間点における、全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）脳コンパートメント内で特定されたＧＦＰ＋細胞の存在率（frequency）を図示しているグラフである。時間点および群あたり、Ｎ≧５のマウスである；平均値およびＳＤを示している。二元配置ＡＮＯＶＡにより、ＢＵおよびＩＲＲマウスにおいて、細胞投与の経路および時間に有意な効果（ＩＣＶ対ＩＶおよび時間ｐ＜０．００５）があることが示された。これらのデータは、ＨＳＰＣの脳室内注入後の脳において、迅速かつ頑強な骨髄細胞生着があることを示している。グラフの棒は、４本の棒からなる３組で示されている。左から右に、ＩＲＲ  ＩＶ（グレー）、ＩＲＲ  ＩＣＶ（白）、ＢＵ  ＩＶ（濃いグレー）、ＢＵ  ＩＣＶ（さらに濃いグレー）である。図１Ｃは、代表的なＩＣＶ移植ＢＵ−ＴＸマウスの脳の矢状面の区域の再構築を図示しており、ＧＦＰを形質導入したＨＳＰＣをＩＣＶ注入して９０日目に、ＧＦＰ＋細胞の分布の広がりを示している。核に関するＧＦＰ（緑／グレー）およびＴｏｐｒｏ  ＩＩＩ（ＴＰＩＩＩ、薄い青色／薄いグレー）を示している。画像は、２０×の拡大率のＤｅｌｔａ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｏｌｙｍｐｕｓで取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。再構築は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ  ８．０ソフトウェアを用いて行った。図１Ｄは、ＧＦＰ形質導入ＨＳＰＣのＩＣＶ移植後の９０日目に、ＢＵ＿ＴＸマウスからの脳の薄片における、ＧＦＰ（緑／グレー）およびＩｂａ−１（赤色／薄いグレー）に関する免疫蛍光解析を図示している。Ｍ＝融合したものである。関連するドット付きの箱の２０×および４０×倍率を示している。画像は、共焦点顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｉｘ７０で取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。図１Ｅは、ＢＵ１６ｍｇ／ｋｇ×４日間で事前処置した（ＮＳＧ）もしくは致死未満照射で事前処置した（ＲａｇＭＬＤ）、ＮＳＧマウスまたはＲａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−（ＲａｇＭＬＤ）マウスにおいて、ＧＦＰまたはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）をコードするＬＶを形質導入したヒトＣＤ３４＋細胞（ヒトにおいてＨＳＰＣとなり、マウスに由来するＬｉｎ−細胞に等価な集団と見なす）の移植に関する実験スキームである。ＮＳＧマウスは、ＮＳＧドナーに由来する未操作単核細胞も受けた。グラフは、４組の棒を含む。各組における一番左の棒から、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図１Ｆは、ＧＦＰ  ＬＶを形質導入したヒトＣＤ３４＋細胞を、２０週間早く、移植したＮＳＧマウスに由来する、脳単核細胞の解析からの代表的なドットのプロットを図示している。マウス脳中のヒト細胞の存在率は、２つの代表的な動物中で、および２つの解析方法（ＳＳＣについてヒトＣＤ４５、およびマウスＣＤ４５についてヒトＣＤ４５）で示されている。これらのプロットはまた、移植後のＮＳＧ脳において特定されたヒトＣＤ４５＋細胞は、ＣＤ１１ｂ、ＣＸ３Ｃｒ１およびＧＦＰを発現していることを示している。図１Ｇは、移植後の１２〜２０週間のＢＵ処置または致死未満の照射Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−（ＮＳＧ）、および５週間（Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−）後の臍帯血に由来するＣＤ３４＋細胞を、ＩＶまたはＩＣＶ移植したＮＳＧおよびＲａｇＭＬＤマウスの脳から回収した、ヒトＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の存在率を図示したグラフである。値は、ＩＶに対する倍率として表しており、ＩＶは、ＮＳＧマウスでは、３＋／−１．３に等しく、ＲａｇＭＬＤでは、２，９＋／−０．７に等しい。Ｎ≧５のマウス／群；平均値およびＳＤを示している。ＮＳＧマウスでは、スチューデントｔ検定で、Ｐ＜０．００１である；ＲａｇＭＬＤマウスでは、ボンフェローニ事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡでｐ＜０．０５である。図１Ｈは、ＧＦＰを形質導入したＣＤ３４＋細胞のＩＣＶ移植後の９０日目のＮＳＧマウスからの脳薄片上のＧＦＰ、Ｉｂａ−１（共染色）、ＣＤ１１ｂ（共染色）、ＣＤ６８（共染色なし）およびＣＤ１６３（共染色なし）に関する免疫蛍光解析からの結果を図示している。青色では、核は、ＴＰ  ＩＩＩによって染色された。関連するドット付きの箱の、２０×および４０×倍率を示している。Ｍ＝融合したものである。
【図１Ｆ】図１Ａ〜１Ｈは、マウスおよびヒトＨＳＰＣの脳室内注入後の脳における、骨髄細胞の再構成を図示している。図１Ａは、骨髄アブレーションマウス（ＢＵ：ブスルファン処置による骨髄アブレーション；ＩＲＲ：致死照射）における、（マウスにおいて、ＨＳＰＣとなる）系統−（Ｌｉｎ−）細胞のＩＣＶ移植に関する実験スキームを図示している。分析の様々な時間点を示している。Ｌｉｎ−細胞に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＬＶを形質導入した。図１Ｂは、ＢＵ処置した（ＢＵ−ＴＸ）マウスおよび照射（ＩＲＲ）マウスにおける、ＩＣＶおよびＩＶ  ＨＳＰＣ移植後、様々な時間点における、全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）脳コンパートメント内で特定されたＧＦＰ＋細胞の存在率（frequency）を図示しているグラフである。時間点および群あたり、Ｎ≧５のマウスである；平均値およびＳＤを示している。二元配置ＡＮＯＶＡにより、ＢＵおよびＩＲＲマウスにおいて、細胞投与の経路および時間に有意な効果（ＩＣＶ対ＩＶおよび時間ｐ＜０．００５）があることが示された。これらのデータは、ＨＳＰＣの脳室内注入後の脳において、迅速かつ頑強な骨髄細胞生着があることを示している。グラフの棒は、４本の棒からなる３組で示されている。左から右に、ＩＲＲ  ＩＶ（グレー）、ＩＲＲ  ＩＣＶ（白）、ＢＵ  ＩＶ（濃いグレー）、ＢＵ  ＩＣＶ（さらに濃いグレー）である。図１Ｃは、代表的なＩＣＶ移植ＢＵ−ＴＸマウスの脳の矢状面の区域の再構築を図示しており、ＧＦＰを形質導入したＨＳＰＣをＩＣＶ注入して９０日目に、ＧＦＰ＋細胞の分布の広がりを示している。核に関するＧＦＰ（緑／グレー）およびＴｏｐｒｏ  ＩＩＩ（ＴＰＩＩＩ、薄い青色／薄いグレー）を示している。画像は、２０×の拡大率のＤｅｌｔａ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｏｌｙｍｐｕｓで取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。再構築は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ  ８．０ソフトウェアを用いて行った。図１Ｄは、ＧＦＰ形質導入ＨＳＰＣのＩＣＶ移植後の９０日目に、ＢＵ＿ＴＸマウスからの脳の薄片における、ＧＦＰ（緑／グレー）およびＩｂａ−１（赤色／薄いグレー）に関する免疫蛍光解析を図示している。Ｍ＝融合したものである。関連するドット付きの箱の２０×および４０×倍率を示している。画像は、共焦点顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｉｘ７０で取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。図１Ｅは、ＢＵ１６ｍｇ／ｋｇ×４日間で事前処置した（ＮＳＧ）もしくは致死未満照射で事前処置した（ＲａｇＭＬＤ）、ＮＳＧマウスまたはＲａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−（ＲａｇＭＬＤ）マウスにおいて、ＧＦＰまたはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）をコードするＬＶを形質導入したヒトＣＤ３４＋細胞（ヒトにおいてＨＳＰＣとなり、マウスに由来するＬｉｎ−細胞に等価な集団と見なす）の移植に関する実験スキームである。ＮＳＧマウスは、ＮＳＧドナーに由来する未操作単核細胞も受けた。グラフは、４組の棒を含む。各組における一番左の棒から、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図１Ｆは、ＧＦＰ  ＬＶを形質導入したヒトＣＤ３４＋細胞を、２０週間早く、移植したＮＳＧマウスに由来する、脳単核細胞の解析からの代表的なドットのプロットを図示している。マウス脳中のヒト細胞の存在率は、２つの代表的な動物中で、および２つの解析方法（ＳＳＣについてヒトＣＤ４５、およびマウスＣＤ４５についてヒトＣＤ４５）で示されている。これらのプロットはまた、移植後のＮＳＧ脳において特定されたヒトＣＤ４５＋細胞は、ＣＤ１１ｂ、ＣＸ３Ｃｒ１およびＧＦＰを発現していることを示している。図１Ｇは、移植後の１２〜２０週間のＢＵ処置または致死未満の照射Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−（ＮＳＧ）、および５週間（Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−）後の臍帯血に由来するＣＤ３４＋細胞を、ＩＶまたはＩＣＶ移植したＮＳＧおよびＲａｇＭＬＤマウスの脳から回収した、ヒトＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の存在率を図示したグラフである。値は、ＩＶに対する倍率として表しており、ＩＶは、ＮＳＧマウスでは、３＋／−１．３に等しく、ＲａｇＭＬＤでは、２，９＋／−０．７に等しい。Ｎ≧５のマウス／群；平均値およびＳＤを示している。ＮＳＧマウスでは、スチューデントｔ検定で、Ｐ＜０．００１である；ＲａｇＭＬＤマウスでは、ボンフェローニ事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡでｐ＜０．０５である。図１Ｈは、ＧＦＰを形質導入したＣＤ３４＋細胞のＩＣＶ移植後の９０日目のＮＳＧマウスからの脳薄片上のＧＦＰ、Ｉｂａ−１（共染色）、ＣＤ１１ｂ（共染色）、ＣＤ６８（共染色なし）およびＣＤ１６３（共染色なし）に関する免疫蛍光解析からの結果を図示している。青色では、核は、ＴＰ  ＩＩＩによって染色された。関連するドット付きの箱の、２０×および４０×倍率を示している。Ｍ＝融合したものである。
【図１Ｇ】図１Ａ〜１Ｈは、マウスおよびヒトＨＳＰＣの脳室内注入後の脳における、骨髄細胞の再構成を図示している。図１Ａは、骨髄アブレーションマウス（ＢＵ：ブスルファン処置による骨髄アブレーション；ＩＲＲ：致死照射）における、（マウスにおいて、ＨＳＰＣとなる）系統−（Ｌｉｎ−）細胞のＩＣＶ移植に関する実験スキームを図示している。分析の様々な時間点を示している。Ｌｉｎ−細胞に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＬＶを形質導入した。図１Ｂは、ＢＵ処置した（ＢＵ−ＴＸ）マウスおよび照射（ＩＲＲ）マウスにおける、ＩＣＶおよびＩＶ  ＨＳＰＣ移植後、様々な時間点における、全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）脳コンパートメント内で特定されたＧＦＰ＋細胞の存在率（frequency）を図示しているグラフである。時間点および群あたり、Ｎ≧５のマウスである；平均値およびＳＤを示している。二元配置ＡＮＯＶＡにより、ＢＵおよびＩＲＲマウスにおいて、細胞投与の経路および時間に有意な効果（ＩＣＶ対ＩＶおよび時間ｐ＜０．００５）があることが示された。これらのデータは、ＨＳＰＣの脳室内注入後の脳において、迅速かつ頑強な骨髄細胞生着があることを示している。グラフの棒は、４本の棒からなる３組で示されている。左から右に、ＩＲＲ  ＩＶ（グレー）、ＩＲＲ  ＩＣＶ（白）、ＢＵ  ＩＶ（濃いグレー）、ＢＵ  ＩＣＶ（さらに濃いグレー）である。図１Ｃは、代表的なＩＣＶ移植ＢＵ−ＴＸマウスの脳の矢状面の区域の再構築を図示しており、ＧＦＰを形質導入したＨＳＰＣをＩＣＶ注入して９０日目に、ＧＦＰ＋細胞の分布の広がりを示している。核に関するＧＦＰ（緑／グレー）およびＴｏｐｒｏ  ＩＩＩ（ＴＰＩＩＩ、薄い青色／薄いグレー）を示している。画像は、２０×の拡大率のＤｅｌｔａ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｏｌｙｍｐｕｓで取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。再構築は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ  ８．０ソフトウェアを用いて行った。図１Ｄは、ＧＦＰ形質導入ＨＳＰＣのＩＣＶ移植後の９０日目に、ＢＵ＿ＴＸマウスからの脳の薄片における、ＧＦＰ（緑／グレー）およびＩｂａ−１（赤色／薄いグレー）に関する免疫蛍光解析を図示している。Ｍ＝融合したものである。関連するドット付きの箱の２０×および４０×倍率を示している。画像は、共焦点顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｉｘ７０で取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。図１Ｅは、ＢＵ１６ｍｇ／ｋｇ×４日間で事前処置した（ＮＳＧ）もしくは致死未満照射で事前処置した（ＲａｇＭＬＤ）、ＮＳＧマウスまたはＲａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−（ＲａｇＭＬＤ）マウスにおいて、ＧＦＰまたはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）をコードするＬＶを形質導入したヒトＣＤ３４＋細胞（ヒトにおいてＨＳＰＣとなり、マウスに由来するＬｉｎ−細胞に等価な集団と見なす）の移植に関する実験スキームである。ＮＳＧマウスは、ＮＳＧドナーに由来する未操作単核細胞も受けた。グラフは、４組の棒を含む。各組における一番左の棒から、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図１Ｆは、ＧＦＰ  ＬＶを形質導入したヒトＣＤ３４＋細胞を、２０週間早く、移植したＮＳＧマウスに由来する、脳単核細胞の解析からの代表的なドットのプロットを図示している。マウス脳中のヒト細胞の存在率は、２つの代表的な動物中で、および２つの解析方法（ＳＳＣについてヒトＣＤ４５、およびマウスＣＤ４５についてヒトＣＤ４５）で示されている。これらのプロットはまた、移植後のＮＳＧ脳において特定されたヒトＣＤ４５＋細胞は、ＣＤ１１ｂ、ＣＸ３Ｃｒ１およびＧＦＰを発現していることを示している。図１Ｇは、移植後の１２〜２０週間のＢＵ処置または致死未満の照射Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−（ＮＳＧ）、および５週間（Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−）後の臍帯血に由来するＣＤ３４＋細胞を、ＩＶまたはＩＣＶ移植したＮＳＧおよびＲａｇＭＬＤマウスの脳から回収した、ヒトＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の存在率を図示したグラフである。値は、ＩＶに対する倍率として表しており、ＩＶは、ＮＳＧマウスでは、３＋／−１．３に等しく、ＲａｇＭＬＤでは、２，９＋／−０．７に等しい。Ｎ≧５のマウス／群；平均値およびＳＤを示している。ＮＳＧマウスでは、スチューデントｔ検定で、Ｐ＜０．００１である；ＲａｇＭＬＤマウスでは、ボンフェローニ事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡでｐ＜０．０５である。図１Ｈは、ＧＦＰを形質導入したＣＤ３４＋細胞のＩＣＶ移植後の９０日目のＮＳＧマウスからの脳薄片上のＧＦＰ、Ｉｂａ−１（共染色）、ＣＤ１１ｂ（共染色）、ＣＤ６８（共染色なし）およびＣＤ１６３（共染色なし）に関する免疫蛍光解析からの結果を図示している。青色では、核は、ＴＰ  ＩＩＩによって染色された。関連するドット付きの箱の、２０×および４０×倍率を示している。Ｍ＝融合したものである。
【図１Ｈ】図１Ａ〜１Ｈは、マウスおよびヒトＨＳＰＣの脳室内注入後の脳における、骨髄細胞の再構成を図示している。図１Ａは、骨髄アブレーションマウス（ＢＵ：ブスルファン処置による骨髄アブレーション；ＩＲＲ：致死照射）における、（マウスにおいて、ＨＳＰＣとなる）系統−（Ｌｉｎ−）細胞のＩＣＶ移植に関する実験スキームを図示している。分析の様々な時間点を示している。Ｌｉｎ−細胞に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするＬＶを形質導入した。図１Ｂは、ＢＵ処置した（ＢＵ−ＴＸ）マウスおよび照射（ＩＲＲ）マウスにおける、ＩＣＶおよびＩＶ  ＨＳＰＣ移植後、様々な時間点における、全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）脳コンパートメント内で特定されたＧＦＰ＋細胞の存在率（frequency）を図示しているグラフである。時間点および群あたり、Ｎ≧５のマウスである；平均値およびＳＤを示している。二元配置ＡＮＯＶＡにより、ＢＵおよびＩＲＲマウスにおいて、細胞投与の経路および時間に有意な効果（ＩＣＶ対ＩＶおよび時間ｐ＜０．００５）があることが示された。これらのデータは、ＨＳＰＣの脳室内注入後の脳において、迅速かつ頑強な骨髄細胞生着があることを示している。グラフの棒は、４本の棒からなる３組で示されている。左から右に、ＩＲＲ  ＩＶ（グレー）、ＩＲＲ  ＩＣＶ（白）、ＢＵ  ＩＶ（濃いグレー）、ＢＵ  ＩＣＶ（さらに濃いグレー）である。図１Ｃは、代表的なＩＣＶ移植ＢＵ−ＴＸマウスの脳の矢状面の区域の再構築を図示しており、ＧＦＰを形質導入したＨＳＰＣをＩＣＶ注入して９０日目に、ＧＦＰ＋細胞の分布の広がりを示している。核に関するＧＦＰ（緑／グレー）およびＴｏｐｒｏ  ＩＩＩ（ＴＰＩＩＩ、薄い青色／薄いグレー）を示している。画像は、２０×の拡大率のＤｅｌｔａ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｏｌｙｍｐｕｓで取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。再構築は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ  ８．０ソフトウェアを用いて行った。図１Ｄは、ＧＦＰ形質導入ＨＳＰＣのＩＣＶ移植後の９０日目に、ＢＵ＿ＴＸマウスからの脳の薄片における、ＧＦＰ（緑／グレー）およびＩｂａ−１（赤色／薄いグレー）に関する免疫蛍光解析を図示している。Ｍ＝融合したものである。関連するドット付きの箱の２０×および４０×倍率を示している。画像は、共焦点顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｉｘ７０で取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。図１Ｅは、ＢＵ１６ｍｇ／ｋｇ×４日間で事前処置した（ＮＳＧ）もしくは致死未満照射で事前処置した（ＲａｇＭＬＤ）、ＮＳＧマウスまたはＲａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−（ＲａｇＭＬＤ）マウスにおいて、ＧＦＰまたはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）をコードするＬＶを形質導入したヒトＣＤ３４＋細胞（ヒトにおいてＨＳＰＣとなり、マウスに由来するＬｉｎ−細胞に等価な集団と見なす）の移植に関する実験スキームである。ＮＳＧマウスは、ＮＳＧドナーに由来する未操作単核細胞も受けた。グラフは、４組の棒を含む。各組における一番左の棒から、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図１Ｆは、ＧＦＰ  ＬＶを形質導入したヒトＣＤ３４＋細胞を、２０週間早く、移植したＮＳＧマウスに由来する、脳単核細胞の解析からの代表的なドットのプロットを図示している。マウス脳中のヒト細胞の存在率は、２つの代表的な動物中で、および２つの解析方法（ＳＳＣについてヒトＣＤ４５、およびマウスＣＤ４５についてヒトＣＤ４５）で示されている。これらのプロットはまた、移植後のＮＳＧ脳において特定されたヒトＣＤ４５＋細胞は、ＣＤ１１ｂ、ＣＸ３Ｃｒ１およびＧＦＰを発現していることを示している。図１Ｇは、移植後の１２〜２０週間のＢＵ処置または致死未満の照射Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−（ＮＳＧ）、および５週間（Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−）後の臍帯血に由来するＣＤ３４＋細胞を、ＩＶまたはＩＣＶ移植したＮＳＧおよびＲａｇＭＬＤマウスの脳から回収した、ヒトＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞の存在率を図示したグラフである。値は、ＩＶに対する倍率として表しており、ＩＶは、ＮＳＧマウスでは、３＋／−１．３に等しく、ＲａｇＭＬＤでは、２，９＋／−０．７に等しい。Ｎ≧５のマウス／群；平均値およびＳＤを示している。ＮＳＧマウスでは、スチューデントｔ検定で、Ｐ＜０．００１である；ＲａｇＭＬＤマウスでは、ボンフェローニ事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡでｐ＜０．０５である。図１Ｈは、ＧＦＰを形質導入したＣＤ３４＋細胞のＩＣＶ移植後の９０日目のＮＳＧマウスからの脳薄片上のＧＦＰ、Ｉｂａ−１（共染色）、ＣＤ１１ｂ（共染色）、ＣＤ６８（共染色なし）およびＣＤ１６３（共染色なし）に関する免疫蛍光解析からの結果を図示している。青色では、核は、ＴＰ  ＩＩＩによって染色された。関連するドット付きの箱の、２０×および４０×倍率を示している。Ｍ＝融合したものである。
【００７２】
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、ＧＦＰ＋Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣをＩＣＶ移植したマウスの短期間モニタリングを示している。図２ＡおよびＢは、ＧＦＰをコードするＬＶを形質導入したＬｉｎ−  ＨＳＰＣのＩＣＶ注入後の表示した時間点において、ＢＵ処置したおよび移植した（ＢＵ＿ＴＸ）マウスの脳（図２Ａ）および骨髄（図２Ｂ）のＣＤ４５＋細胞内で特定したＧＦＰ＋細胞の存在率を示す２つのグラフを図示している。各時間点において、Ｎ≧３のマウス；平均値およびＳＤを示している。ボンフェローニ事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡによって解析すると、１、３、６および２４時間と比較すると、４日目にＰ値＜０．００１を示す。ＩＣＶ移植細胞の生着は、脳中の大部分に存在し、移植マウスの骨髄において、ＧＦＰ＋細胞が少量だけしか存在しない、またはまったく存在しないことが検出された。図２Ｃおよび２Ｄは、２つのグラフ中に、形質導入したＬｉｎ−  ＨＳＰＣ（導入は、注入時のＨＳＰＣを表す）をＩＣＶ注入した後の、様々な時間点における、ＢＵ＿ＴＸマウスの脳から回収した、ＧＦＰ＋（ドナー）およびＧＦＰ−（レシピエント）ＣＤ４５＋細胞による、表示した造血幹細胞（図２Ｃ）および骨髄／ミクログリア（図２Ｄ）マーカーの発現を示している。各時間点において、Ｎ≧３のマウス；平均値およびＳＤを示している。二元配置Ａｎｏｖａは、マーカーおよび時間の有意な効果（ｐ＜０．０００１）を示した。図２Ｃにおいて、ＧＦＰ＋細胞の場合、矢印は、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ１、ＣＤ３４、ＣＸＣＲ４、ＣＤ９３およびＴｉｅ２の％発現を示している。図２Ｃにおいて、ＧＦＰ−細胞の場合、丸は、各列において、上部から下部に、ＣＸＣＲ４、ＣＤ３４、ＣＤ９３、ｃ−Ｋｉｔ、Ｓｃａ１およびＴｉｅ２である。図２Ｄにおいて、ＧＦＰ＋細胞の場合、矢印はＣＤ１１ｂ、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＤ１１５の％発現を示している。図２Ｄにおいて、ＧＦＰ−細胞の場合、丸は、各列において、上部から下部に、ＣＤ１１ｂ、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＤ１１５である。移植細胞／その子孫は、造血幹細胞の発現を一過的に増加させ、続いて、骨髄／ミクログリアマーカーの発現レベルを向上させる。
【００７３】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｊは、コンビナトリアル移植プロトコルの最適化により、適切な臨床用途について、移植後のドナー骨髄脳キメラ現象に対するＩＶ対ＩＣＶ移植細胞の寄与をモジュレートすることが可能になることを示している。図３Ａは、全骨髄ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、ミクログリア（μ）、一過的に増幅したμ（ＴＡμ）およびＣＮＳマクロファージ内で、０日目（ブルスルファンの最後の用量の２４時間後）に、または５日後（５日目）にＩＶ移植したドナー（ＧＦＰ＋）Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣの脳の生着を示すグラフである。このグラフは、２つの時間点におけるＨＳＰＣの移植が、試験集団において、類似の脳生着をもたらすことを示している。図３Ｂは、出生して３日後（ｐｎｄ）の新生マウス、２１ｐｎｄおよび６０ｐｎｄの成体マウス、ならびに移植後２か月時の成体ＨＳＰＣ移植動物において、ＣＤ４５＋ｌｏｗＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、ＣＤ４５＋ｌｏｗ、ＣＤ１１ｂ＋ｌｏｗおよびＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ１１ｂｈｉｇｈとして、μ、ＴＡμおよびＣＮＳマクロファージ（ＣＮＳｍａｃ）の同定に関するゲーティング戦略を図示している。図３Ｃは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示している。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣ、またはｃ−ｋｉｔ＋Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−（ＫＳＬ）細胞、または全骨髄（ＢＭ）である。図３Ｄは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスのＢＭ内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、強固な生着を示さない。図３Ｅは、０日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒から、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｆは、０日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。図３Ｇは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示しており、この場合、化学療法の５日後にＩＶ細胞を移植した一方、ＩＣＶ細胞は０日目に移植した。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣまたはＫＳＬ細胞または全ＢＭである。図３Ｈは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスから回収した全ＢＭ細胞内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、生着しない。図３Ｉは、５日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒は、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｊは、５日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内で細胞を発現するドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。これらの棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。ボンフェローニ事後検定による一元配置Ａｎｏｖａ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｊは、コンビナトリアル移植プロトコルの最適化により、適切な臨床用途について、移植後のドナー骨髄脳キメラ現象に対するＩＶ対ＩＣＶ移植細胞の寄与をモジュレートすることが可能になることを示している。図３Ａは、全骨髄ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、ミクログリア（μ）、一過的に増幅したμ（ＴＡμ）およびＣＮＳマクロファージ内で、０日目（ブルスルファンの最後の用量の２４時間後）に、または５日後（５日目）にＩＶ移植したドナー（ＧＦＰ＋）Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣの脳の生着を示すグラフである。このグラフは、２つの時間点におけるＨＳＰＣの移植が、試験集団において、類似の脳生着をもたらすことを示している。図３Ｂは、出生して３日後（ｐｎｄ）の新生マウス、２１ｐｎｄおよび６０ｐｎｄの成体マウス、ならびに移植後２か月時の成体ＨＳＰＣ移植動物において、ＣＤ４５＋ｌｏｗＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、ＣＤ４５＋ｌｏｗ、ＣＤ１１ｂ＋ｌｏｗおよびＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ１１ｂｈｉｇｈとして、μ、ＴＡμおよびＣＮＳマクロファージ（ＣＮＳｍａｃ）の同定に関するゲーティング戦略を図示している。図３Ｃは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示している。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣ、またはｃ−ｋｉｔ＋Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−（ＫＳＬ）細胞、または全骨髄（ＢＭ）である。図３Ｄは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスのＢＭ内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、強固な生着を示さない。図３Ｅは、０日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒から、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｆは、０日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。図３Ｇは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示しており、この場合、化学療法の５日後にＩＶ細胞を移植した一方、ＩＣＶ細胞は０日目に移植した。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣまたはＫＳＬ細胞または全ＢＭである。図３Ｈは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスから回収した全ＢＭ細胞内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、生着しない。図３Ｉは、５日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒は、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｊは、５日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内で細胞を発現するドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。これらの棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。ボンフェローニ事後検定による一元配置Ａｎｏｖａ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図３ＣＤ】図３Ａ〜３Ｊは、コンビナトリアル移植プロトコルの最適化により、適切な臨床用途について、移植後のドナー骨髄脳キメラ現象に対するＩＶ対ＩＣＶ移植細胞の寄与をモジュレートすることが可能になることを示している。図３Ａは、全骨髄ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、ミクログリア（μ）、一過的に増幅したμ（ＴＡμ）およびＣＮＳマクロファージ内で、０日目（ブルスルファンの最後の用量の２４時間後）に、または５日後（５日目）にＩＶ移植したドナー（ＧＦＰ＋）Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣの脳の生着を示すグラフである。このグラフは、２つの時間点におけるＨＳＰＣの移植が、試験集団において、類似の脳生着をもたらすことを示している。図３Ｂは、出生して３日後（ｐｎｄ）の新生マウス、２１ｐｎｄおよび６０ｐｎｄの成体マウス、ならびに移植後２か月時の成体ＨＳＰＣ移植動物において、ＣＤ４５＋ｌｏｗＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、ＣＤ４５＋ｌｏｗ、ＣＤ１１ｂ＋ｌｏｗおよびＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ１１ｂｈｉｇｈとして、μ、ＴＡμおよびＣＮＳマクロファージ（ＣＮＳｍａｃ）の同定に関するゲーティング戦略を図示している。図３Ｃは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示している。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣ、またはｃ−ｋｉｔ＋Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−（ＫＳＬ）細胞、または全骨髄（ＢＭ）である。図３Ｄは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスのＢＭ内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、強固な生着を示さない。図３Ｅは、０日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒から、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｆは、０日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。図３Ｇは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示しており、この場合、化学療法の５日後にＩＶ細胞を移植した一方、ＩＣＶ細胞は０日目に移植した。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣまたはＫＳＬ細胞または全ＢＭである。図３Ｈは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスから回収した全ＢＭ細胞内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、生着しない。図３Ｉは、５日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒は、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｊは、５日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内で細胞を発現するドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。これらの棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。ボンフェローニ事後検定による一元配置Ａｎｏｖａ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図３Ｅ】図３Ａ〜３Ｊは、コンビナトリアル移植プロトコルの最適化により、適切な臨床用途について、移植後のドナー骨髄脳キメラ現象に対するＩＶ対ＩＣＶ移植細胞の寄与をモジュレートすることが可能になることを示している。図３Ａは、全骨髄ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、ミクログリア（μ）、一過的に増幅したμ（ＴＡμ）およびＣＮＳマクロファージ内で、０日目（ブルスルファンの最後の用量の２４時間後）に、または５日後（５日目）にＩＶ移植したドナー（ＧＦＰ＋）Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣの脳の生着を示すグラフである。このグラフは、２つの時間点におけるＨＳＰＣの移植が、試験集団において、類似の脳生着をもたらすことを示している。図３Ｂは、出生して３日後（ｐｎｄ）の新生マウス、２１ｐｎｄおよび６０ｐｎｄの成体マウス、ならびに移植後２か月時の成体ＨＳＰＣ移植動物において、ＣＤ４５＋ｌｏｗＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、ＣＤ４５＋ｌｏｗ、ＣＤ１１ｂ＋ｌｏｗおよびＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ１１ｂｈｉｇｈとして、μ、ＴＡμおよびＣＮＳマクロファージ（ＣＮＳｍａｃ）の同定に関するゲーティング戦略を図示している。図３Ｃは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示している。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣ、またはｃ−ｋｉｔ＋Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−（ＫＳＬ）細胞、または全骨髄（ＢＭ）である。図３Ｄは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスのＢＭ内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、強固な生着を示さない。図３Ｅは、０日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒から、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｆは、０日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。図３Ｇは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示しており、この場合、化学療法の５日後にＩＶ細胞を移植した一方、ＩＣＶ細胞は０日目に移植した。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣまたはＫＳＬ細胞または全ＢＭである。図３Ｈは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスから回収した全ＢＭ細胞内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、生着しない。図３Ｉは、５日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒は、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｊは、５日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内で細胞を発現するドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。これらの棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。ボンフェローニ事後検定による一元配置Ａｎｏｖａ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図３Ｆ】図３Ａ〜３Ｊは、コンビナトリアル移植プロトコルの最適化により、適切な臨床用途について、移植後のドナー骨髄脳キメラ現象に対するＩＶ対ＩＣＶ移植細胞の寄与をモジュレートすることが可能になることを示している。図３Ａは、全骨髄ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、ミクログリア（μ）、一過的に増幅したμ（ＴＡμ）およびＣＮＳマクロファージ内で、０日目（ブルスルファンの最後の用量の２４時間後）に、または５日後（５日目）にＩＶ移植したドナー（ＧＦＰ＋）Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣの脳の生着を示すグラフである。このグラフは、２つの時間点におけるＨＳＰＣの移植が、試験集団において、類似の脳生着をもたらすことを示している。図３Ｂは、出生して３日後（ｐｎｄ）の新生マウス、２１ｐｎｄおよび６０ｐｎｄの成体マウス、ならびに移植後２か月時の成体ＨＳＰＣ移植動物において、ＣＤ４５＋ｌｏｗＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、ＣＤ４５＋ｌｏｗ、ＣＤ１１ｂ＋ｌｏｗおよびＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ１１ｂｈｉｇｈとして、μ、ＴＡμおよびＣＮＳマクロファージ（ＣＮＳｍａｃ）の同定に関するゲーティング戦略を図示している。図３Ｃは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示している。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣ、またはｃ−ｋｉｔ＋Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−（ＫＳＬ）細胞、または全骨髄（ＢＭ）である。図３Ｄは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスのＢＭ内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、強固な生着を示さない。図３Ｅは、０日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒から、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｆは、０日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。図３Ｇは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示しており、この場合、化学療法の５日後にＩＶ細胞を移植した一方、ＩＣＶ細胞は０日目に移植した。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣまたはＫＳＬ細胞または全ＢＭである。図３Ｈは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスから回収した全ＢＭ細胞内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、生着しない。図３Ｉは、５日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒は、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｊは、５日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内で細胞を発現するドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。これらの棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。ボンフェローニ事後検定による一元配置Ａｎｏｖａ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図３ＧＨ】図３Ａ〜３Ｊは、コンビナトリアル移植プロトコルの最適化により、適切な臨床用途について、移植後のドナー骨髄脳キメラ現象に対するＩＶ対ＩＣＶ移植細胞の寄与をモジュレートすることが可能になることを示している。図３Ａは、全骨髄ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、ミクログリア（μ）、一過的に増幅したμ（ＴＡμ）およびＣＮＳマクロファージ内で、０日目（ブルスルファンの最後の用量の２４時間後）に、または５日後（５日目）にＩＶ移植したドナー（ＧＦＰ＋）Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣの脳の生着を示すグラフである。このグラフは、２つの時間点におけるＨＳＰＣの移植が、試験集団において、類似の脳生着をもたらすことを示している。図３Ｂは、出生して３日後（ｐｎｄ）の新生マウス、２１ｐｎｄおよび６０ｐｎｄの成体マウス、ならびに移植後２か月時の成体ＨＳＰＣ移植動物において、ＣＤ４５＋ｌｏｗＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、ＣＤ４５＋ｌｏｗ、ＣＤ１１ｂ＋ｌｏｗおよびＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ１１ｂｈｉｇｈとして、μ、ＴＡμおよびＣＮＳマクロファージ（ＣＮＳｍａｃ）の同定に関するゲーティング戦略を図示している。図３Ｃは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示している。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣ、またはｃ−ｋｉｔ＋Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−（ＫＳＬ）細胞、または全骨髄（ＢＭ）である。図３Ｄは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスのＢＭ内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、強固な生着を示さない。図３Ｅは、０日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒から、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｆは、０日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。図３Ｇは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示しており、この場合、化学療法の５日後にＩＶ細胞を移植した一方、ＩＣＶ細胞は０日目に移植した。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣまたはＫＳＬ細胞または全ＢＭである。図３Ｈは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスから回収した全ＢＭ細胞内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、生着しない。図３Ｉは、５日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒は、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｊは、５日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内で細胞を発現するドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。これらの棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。ボンフェローニ事後検定による一元配置Ａｎｏｖａ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図３Ｉ】図３Ａ〜３Ｊは、コンビナトリアル移植プロトコルの最適化により、適切な臨床用途について、移植後のドナー骨髄脳キメラ現象に対するＩＶ対ＩＣＶ移植細胞の寄与をモジュレートすることが可能になることを示している。図３Ａは、全骨髄ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、ミクログリア（μ）、一過的に増幅したμ（ＴＡμ）およびＣＮＳマクロファージ内で、０日目（ブルスルファンの最後の用量の２４時間後）に、または５日後（５日目）にＩＶ移植したドナー（ＧＦＰ＋）Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣの脳の生着を示すグラフである。このグラフは、２つの時間点におけるＨＳＰＣの移植が、試験集団において、類似の脳生着をもたらすことを示している。図３Ｂは、出生して３日後（ｐｎｄ）の新生マウス、２１ｐｎｄおよび６０ｐｎｄの成体マウス、ならびに移植後２か月時の成体ＨＳＰＣ移植動物において、ＣＤ４５＋ｌｏｗＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、ＣＤ４５＋ｌｏｗ、ＣＤ１１ｂ＋ｌｏｗおよびＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ１１ｂｈｉｇｈとして、μ、ＴＡμおよびＣＮＳマクロファージ（ＣＮＳｍａｃ）の同定に関するゲーティング戦略を図示している。図３Ｃは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示している。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣ、またはｃ−ｋｉｔ＋Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−（ＫＳＬ）細胞、または全骨髄（ＢＭ）である。図３Ｄは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスのＢＭ内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、強固な生着を示さない。図３Ｅは、０日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒から、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｆは、０日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。図３Ｇは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示しており、この場合、化学療法の５日後にＩＶ細胞を移植した一方、ＩＣＶ細胞は０日目に移植した。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣまたはＫＳＬ細胞または全ＢＭである。図３Ｈは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスから回収した全ＢＭ細胞内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、生着しない。図３Ｉは、５日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒は、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｊは、５日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内で細胞を発現するドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。これらの棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。ボンフェローニ事後検定による一元配置Ａｎｏｖａ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図３Ｊ】図３Ａ〜３Ｊは、コンビナトリアル移植プロトコルの最適化により、適切な臨床用途について、移植後のドナー骨髄脳キメラ現象に対するＩＶ対ＩＣＶ移植細胞の寄与をモジュレートすることが可能になることを示している。図３Ａは、全骨髄ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、ミクログリア（μ）、一過的に増幅したμ（ＴＡμ）およびＣＮＳマクロファージ内で、０日目（ブルスルファンの最後の用量の２４時間後）に、または５日後（５日目）にＩＶ移植したドナー（ＧＦＰ＋）Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣの脳の生着を示すグラフである。このグラフは、２つの時間点におけるＨＳＰＣの移植が、試験集団において、類似の脳生着をもたらすことを示している。図３Ｂは、出生して３日後（ｐｎｄ）の新生マウス、２１ｐｎｄおよび６０ｐｎｄの成体マウス、ならびに移植後２か月時の成体ＨＳＰＣ移植動物において、ＣＤ４５＋ｌｏｗＣＤ１１ｂｈｉｇｈ、ＣＤ４５＋ｌｏｗ、ＣＤ１１ｂ＋ｌｏｗおよびＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ１１ｂｈｉｇｈとして、μ、ＴＡμおよびＣＮＳマクロファージ（ＣＮＳｍａｃ）の同定に関するゲーティング戦略を図示している。図３Ｃは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示している。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣ、またはｃ−ｋｉｔ＋Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−（ＫＳＬ）細胞、または全骨髄（ＢＭ）である。図３Ｄは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスのＢＭ内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、強固な生着を示さない。図３Ｅは、０日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒から、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｆは、０日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。図３Ｇは、ブスルファン前処理レシピエントに、区別して標識した（ＧＦＰまたはΔＮＧＦＲをコードするＬＶ）造血細胞のＩＶおよび／またはＩＣＶの移植戦略を示す実験スキームを図示しており、この場合、化学療法の５日後にＩＶ細胞を移植した一方、ＩＣＶ細胞は０日目に移植した。移植造血細胞は、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣまたはＫＳＬ細胞または全ＢＭである。図３Ｈは、移植して３か月後の犠牲時の移植マウスから回収した全ＢＭ細胞内のドナー由来細胞（ＣＤ４５．１＝ＩＶ移植細胞の子孫であり、ＧＦＰ発現細胞＝ＩＣＶ移植細胞の子孫である）の存在率を図示するグラフである。ＧＦＰ＋ＩＣＶ移植細胞は、ＢＭにおいて、生着しない。図３Ｉは、５日目において色分けによって表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内の、ドナー由来細胞の存在率（ΔＮＧＦＲおよびＧＦＰを発現する細胞の合計として）を図示するグラフである。造血細胞のＩＣＶおよびＩＶによる共送達により、Ｌｉｎ−移植のみのＩＶと比較して、試験したすべての組合せにおいて、移植後の脳ドナーキメラ現象が向上する。各組における一番左の棒は、ＩＶのみ（白）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（濃いグレー）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（中間グレー）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（グレー）である。図３Ｊは、５日目において表示した移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞、μ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ内で細胞を発現するドナー由来のΔＮＧＦＲ（ＩＶ移植細胞の子孫）およびＧＦＰ（ＩＣＶ移植細胞の子孫）の存在率の差異を図示するグラフである。全ＢＭのＩＶ移植につながるＬｉｎ−  ＩＣＶ送達により、脳におけるＩＶ移植細胞／その子孫の生着が最低になる。これらの棒の組（４本の棒／一組）は、左から右に：ＩＶのみ（ＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＬＩＮ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）、ＫＬＳ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）、ＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＤＮＧＦＲ）およびＢＭ  ＩＶ  ＬＩＮ  ＩＣＶ（ＧＦＰ）である。ボンフェローニ事後検定による一元配置Ａｎｏｖａ、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【００７４】
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｅは、移植マウスの脳から回収した骨髄細胞中に、ミクログリアシグネチャが存在していることを示している。図４Ａは、ＧＦＰ＋ＨＳＰＣをＩＶまたはＩＣＶ（群あたりｎ＝５）での移植後の９０日目の、マウスの脳におけるμおよびＴＡμ細胞の存在率を図示するグラフである。図４Ｂは、遺伝子発現を解析するために、分類した細胞集団を示す、代表的なドットプロットを図示している。特に、ＨＣＴ後の９０日目における、ナイーブなＰ１０および成体対照（ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ）動物、およびブスルファン処置マウス、および移植マウス（ＢＵ＿ＴＸ）の脳における、ＣＤ４５およびＣＤ１１ｂマーカーにより特定されたμおよびＴＡμが示されている。ドット付きの正方形中に含まれているドットのプロットは、代表的な移植ＢＵ処置マウスのμおよびＴＡμ集団内の、ＧＦＰ−内因性細胞とＧＦＰ＋ドナー由来細胞のキメラ現象の両方を示している。図４Ｃは、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴμ細胞における同一遺伝子の発現に基づいて算出した、ブスルファン処置したＩＶおよびＩＣＶ移植マウスの脳またはＰ１０マウスから回収した各表示集団において、リアルタイムＰＣＲによって得られた、選択ミクログリア遺伝子の発現の倍率変化（２−ＤＤＣＴとして算出）を図示するグラフである。平均値が示されている。図４Ｄは、主要な構成成分解析（ＰＣＡ）であり、図４Ｅは、ヒートマップであり、どちらも、ミクログリアおよびマクロファージ（ＬＰＭ＝大型腹腔マクロファージ；ＳＰＭ＝小型腹腔マクロファージ；ＢＭＤＭ＝骨髄由来マクロファージ；ＴＧＥＭ＝チオグリコレート誘発性腹腔マクロファージ）を含めた、Ｂｕｔｏｖｓｋｙ（Butovskyら、Nature  neuroscience  １７巻、１３１〜１４３頁（２０１４年））（ナイーブなＰ１０、およびＡＤＵＬＴ＿ＣＴおよびＨＣＴ動物から回収したμおよびＴＡμ）によってミクログリアシグネチャとして特定した試料内と、Ｇｏｓｓｅｌｉｎら（Gosselinら、Cell  １５９巻、１３２７〜１３４０頁（２０１４年））において報告された試料内の遺伝子の発現解析を示している。全体として、これらのデータは、ＩＣＶおよびＩＶ移植マウスの脳から単離した細胞は、マクロファージよりも、対照マウスから単離したμ細胞のレベルと同様のレベルで、これらの遺伝子が発現することを示すことを示している。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｅは、移植マウスの脳から回収した骨髄細胞中に、ミクログリアシグネチャが存在していることを示している。図４Ａは、ＧＦＰ＋ＨＳＰＣをＩＶまたはＩＣＶ（群あたりｎ＝５）での移植後の９０日目の、マウスの脳におけるμおよびＴＡμ細胞の存在率を図示するグラフである。図４Ｂは、遺伝子発現を解析するために、分類した細胞集団を示す、代表的なドットプロットを図示している。特に、ＨＣＴ後の９０日目における、ナイーブなＰ１０および成体対照（ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ）動物、およびブスルファン処置マウス、および移植マウス（ＢＵ＿ＴＸ）の脳における、ＣＤ４５およびＣＤ１１ｂマーカーにより特定されたμおよびＴＡμが示されている。ドット付きの正方形中に含まれているドットのプロットは、代表的な移植ＢＵ処置マウスのμおよびＴＡμ集団内の、ＧＦＰ−内因性細胞とＧＦＰ＋ドナー由来細胞のキメラ現象の両方を示している。図４Ｃは、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴμ細胞における同一遺伝子の発現に基づいて算出した、ブスルファン処置したＩＶおよびＩＣＶ移植マウスの脳またはＰ１０マウスから回収した各表示集団において、リアルタイムＰＣＲによって得られた、選択ミクログリア遺伝子の発現の倍率変化（２−ＤＤＣＴとして算出）を図示するグラフである。平均値が示されている。図４Ｄは、主要な構成成分解析（ＰＣＡ）であり、図４Ｅは、ヒートマップであり、どちらも、ミクログリアおよびマクロファージ（ＬＰＭ＝大型腹腔マクロファージ；ＳＰＭ＝小型腹腔マクロファージ；ＢＭＤＭ＝骨髄由来マクロファージ；ＴＧＥＭ＝チオグリコレート誘発性腹腔マクロファージ）を含めた、Ｂｕｔｏｖｓｋｙ（Butovskyら、Nature  neuroscience  １７巻、１３１〜１４３頁（２０１４年））（ナイーブなＰ１０、およびＡＤＵＬＴ＿ＣＴおよびＨＣＴ動物から回収したμおよびＴＡμ）によってミクログリアシグネチャとして特定した試料内と、Ｇｏｓｓｅｌｉｎら（Gosselinら、Cell  １５９巻、１３２７〜１３４０頁（２０１４年））において報告された試料内の遺伝子の発現解析を示している。全体として、これらのデータは、ＩＣＶおよびＩＶ移植マウスの脳から単離した細胞は、マクロファージよりも、対照マウスから単離したμ細胞のレベルと同様のレベルで、これらの遺伝子が発現することを示すことを示している。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｅは、移植マウスの脳から回収した骨髄細胞中に、ミクログリアシグネチャが存在していることを示している。図４Ａは、ＧＦＰ＋ＨＳＰＣをＩＶまたはＩＣＶ（群あたりｎ＝５）での移植後の９０日目の、マウスの脳におけるμおよびＴＡμ細胞の存在率を図示するグラフである。図４Ｂは、遺伝子発現を解析するために、分類した細胞集団を示す、代表的なドットプロットを図示している。特に、ＨＣＴ後の９０日目における、ナイーブなＰ１０および成体対照（ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ）動物、およびブスルファン処置マウス、および移植マウス（ＢＵ＿ＴＸ）の脳における、ＣＤ４５およびＣＤ１１ｂマーカーにより特定されたμおよびＴＡμが示されている。ドット付きの正方形中に含まれているドットのプロットは、代表的な移植ＢＵ処置マウスのμおよびＴＡμ集団内の、ＧＦＰ−内因性細胞とＧＦＰ＋ドナー由来細胞のキメラ現象の両方を示している。図４Ｃは、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴμ細胞における同一遺伝子の発現に基づいて算出した、ブスルファン処置したＩＶおよびＩＣＶ移植マウスの脳またはＰ１０マウスから回収した各表示集団において、リアルタイムＰＣＲによって得られた、選択ミクログリア遺伝子の発現の倍率変化（２−ＤＤＣＴとして算出）を図示するグラフである。平均値が示されている。図４Ｄは、主要な構成成分解析（ＰＣＡ）であり、図４Ｅは、ヒートマップであり、どちらも、ミクログリアおよびマクロファージ（ＬＰＭ＝大型腹腔マクロファージ；ＳＰＭ＝小型腹腔マクロファージ；ＢＭＤＭ＝骨髄由来マクロファージ；ＴＧＥＭ＝チオグリコレート誘発性腹腔マクロファージ）を含めた、Ｂｕｔｏｖｓｋｙ（Butovskyら、Nature  neuroscience  １７巻、１３１〜１４３頁（２０１４年））（ナイーブなＰ１０、およびＡＤＵＬＴ＿ＣＴおよびＨＣＴ動物から回収したμおよびＴＡμ）によってミクログリアシグネチャとして特定した試料内と、Ｇｏｓｓｅｌｉｎら（Gosselinら、Cell  １５９巻、１３２７〜１３４０頁（２０１４年））において報告された試料内の遺伝子の発現解析を示している。全体として、これらのデータは、ＩＣＶおよびＩＶ移植マウスの脳から単離した細胞は、マクロファージよりも、対照マウスから単離したμ細胞のレベルと同様のレベルで、これらの遺伝子が発現することを示すことを示している。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｅは、移植マウスの脳から回収した骨髄細胞中に、ミクログリアシグネチャが存在していることを示している。図４Ａは、ＧＦＰ＋ＨＳＰＣをＩＶまたはＩＣＶ（群あたりｎ＝５）での移植後の９０日目の、マウスの脳におけるμおよびＴＡμ細胞の存在率を図示するグラフである。図４Ｂは、遺伝子発現を解析するために、分類した細胞集団を示す、代表的なドットプロットを図示している。特に、ＨＣＴ後の９０日目における、ナイーブなＰ１０および成体対照（ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ）動物、およびブスルファン処置マウス、および移植マウス（ＢＵ＿ＴＸ）の脳における、ＣＤ４５およびＣＤ１１ｂマーカーにより特定されたμおよびＴＡμが示されている。ドット付きの正方形中に含まれているドットのプロットは、代表的な移植ＢＵ処置マウスのμおよびＴＡμ集団内の、ＧＦＰ−内因性細胞とＧＦＰ＋ドナー由来細胞のキメラ現象の両方を示している。図４Ｃは、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴμ細胞における同一遺伝子の発現に基づいて算出した、ブスルファン処置したＩＶおよびＩＣＶ移植マウスの脳またはＰ１０マウスから回収した各表示集団において、リアルタイムＰＣＲによって得られた、選択ミクログリア遺伝子の発現の倍率変化（２−ＤＤＣＴとして算出）を図示するグラフである。平均値が示されている。図４Ｄは、主要な構成成分解析（ＰＣＡ）であり、図４Ｅは、ヒートマップであり、どちらも、ミクログリアおよびマクロファージ（ＬＰＭ＝大型腹腔マクロファージ；ＳＰＭ＝小型腹腔マクロファージ；ＢＭＤＭ＝骨髄由来マクロファージ；ＴＧＥＭ＝チオグリコレート誘発性腹腔マクロファージ）を含めた、Ｂｕｔｏｖｓｋｙ（Butovskyら、Nature  neuroscience  １７巻、１３１〜１４３頁（２０１４年））（ナイーブなＰ１０、およびＡＤＵＬＴ＿ＣＴおよびＨＣＴ動物から回収したμおよびＴＡμ）によってミクログリアシグネチャとして特定した試料内と、Ｇｏｓｓｅｌｉｎら（Gosselinら、Cell  １５９巻、１３２７〜１３４０頁（２０１４年））において報告された試料内の遺伝子の発現解析を示している。全体として、これらのデータは、ＩＣＶおよびＩＶ移植マウスの脳から単離した細胞は、マクロファージよりも、対照マウスから単離したμ細胞のレベルと同様のレベルで、これらの遺伝子が発現することを示すことを示している。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｅは、移植マウスの脳から回収した骨髄細胞中に、ミクログリアシグネチャが存在していることを示している。図４Ａは、ＧＦＰ＋ＨＳＰＣをＩＶまたはＩＣＶ（群あたりｎ＝５）での移植後の９０日目の、マウスの脳におけるμおよびＴＡμ細胞の存在率を図示するグラフである。図４Ｂは、遺伝子発現を解析するために、分類した細胞集団を示す、代表的なドットプロットを図示している。特に、ＨＣＴ後の９０日目における、ナイーブなＰ１０および成体対照（ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ）動物、およびブスルファン処置マウス、および移植マウス（ＢＵ＿ＴＸ）の脳における、ＣＤ４５およびＣＤ１１ｂマーカーにより特定されたμおよびＴＡμが示されている。ドット付きの正方形中に含まれているドットのプロットは、代表的な移植ＢＵ処置マウスのμおよびＴＡμ集団内の、ＧＦＰ−内因性細胞とＧＦＰ＋ドナー由来細胞のキメラ現象の両方を示している。図４Ｃは、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴμ細胞における同一遺伝子の発現に基づいて算出した、ブスルファン処置したＩＶおよびＩＣＶ移植マウスの脳またはＰ１０マウスから回収した各表示集団において、リアルタイムＰＣＲによって得られた、選択ミクログリア遺伝子の発現の倍率変化（２−ＤＤＣＴとして算出）を図示するグラフである。平均値が示されている。図４Ｄは、主要な構成成分解析（ＰＣＡ）であり、図４Ｅは、ヒートマップであり、どちらも、ミクログリアおよびマクロファージ（ＬＰＭ＝大型腹腔マクロファージ；ＳＰＭ＝小型腹腔マクロファージ；ＢＭＤＭ＝骨髄由来マクロファージ；ＴＧＥＭ＝チオグリコレート誘発性腹腔マクロファージ）を含めた、Ｂｕｔｏｖｓｋｙ（Butovskyら、Nature  neuroscience  １７巻、１３１〜１４３頁（２０１４年））（ナイーブなＰ１０、およびＡＤＵＬＴ＿ＣＴおよびＨＣＴ動物から回収したμおよびＴＡμ）によってミクログリアシグネチャとして特定した試料内と、Ｇｏｓｓｅｌｉｎら（Gosselinら、Cell  １５９巻、１３２７〜１３４０頁（２０１４年））において報告された試料内の遺伝子の発現解析を示している。全体として、これらのデータは、ＩＣＶおよびＩＶ移植マウスの脳から単離した細胞は、マクロファージよりも、対照マウスから単離したμ細胞のレベルと同様のレベルで、これらの遺伝子が発現することを示すことを示している。
【００７５】
【図５Ａ−１】図５Ａ〜５Ｅは、移植マウスの脳に由来する骨髄細胞は、ミクログリアの成熟の機能を示すことを示している。図５Ａは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に上方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｂは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｃは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に上方調節される遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｄは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）による予備ランク付け解析を、デフォルトパラメータを使用する、遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセスに対するＲＮＡ−Ｓｅｑ差次的遺伝子発現データ（http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collection）を使用して行った。ＧＯ（ＧＯＳｅｍＳｉｍ）の意味類似性を使用して、有意に濃縮したＧＯをクラスター形成させる（上方調節の場合、ＦＤＲ＜０．０５、および下方調節の場合、ＦＤＲ＜０．００１を有するＧＯを選択して、表示の明瞭性を増強した）。図５Ｅは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、成体マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。図５Ｆは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、ｐ１０マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。統計的検定に関しては、表２を参照されたい。
【図５Ａ−２】図５Ａ〜５Ｅは、移植マウスの脳に由来する骨髄細胞は、ミクログリアの成熟の機能を示すことを示している。図５Ａは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に上方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｂは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｃは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に上方調節される遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｄは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）による予備ランク付け解析を、デフォルトパラメータを使用する、遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセスに対するＲＮＡ−Ｓｅｑ差次的遺伝子発現データ（http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collection）を使用して行った。ＧＯ（ＧＯＳｅｍＳｉｍ）の意味類似性を使用して、有意に濃縮したＧＯをクラスター形成させる（上方調節の場合、ＦＤＲ＜０．０５、および下方調節の場合、ＦＤＲ＜０．００１を有するＧＯを選択して、表示の明瞭性を増強した）。図５Ｅは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、成体マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。図５Ｆは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、ｐ１０マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。統計的検定に関しては、表２を参照されたい。
【図５Ａ−３】図５Ａ〜５Ｅは、移植マウスの脳に由来する骨髄細胞は、ミクログリアの成熟の機能を示すことを示している。図５Ａは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に上方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｂは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｃは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に上方調節される遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｄは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）による予備ランク付け解析を、デフォルトパラメータを使用する、遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセスに対するＲＮＡ−Ｓｅｑ差次的遺伝子発現データ（http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collection）を使用して行った。ＧＯ（ＧＯＳｅｍＳｉｍ）の意味類似性を使用して、有意に濃縮したＧＯをクラスター形成させる（上方調節の場合、ＦＤＲ＜０．０５、および下方調節の場合、ＦＤＲ＜０．００１を有するＧＯを選択して、表示の明瞭性を増強した）。図５Ｅは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、成体マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。図５Ｆは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、ｐ１０マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。統計的検定に関しては、表２を参照されたい。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｅは、移植マウスの脳に由来する骨髄細胞は、ミクログリアの成熟の機能を示すことを示している。図５Ａは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に上方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｂは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｃは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に上方調節される遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｄは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）による予備ランク付け解析を、デフォルトパラメータを使用する、遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセスに対するＲＮＡ−Ｓｅｑ差次的遺伝子発現データ（http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collection）を使用して行った。ＧＯ（ＧＯＳｅｍＳｉｍ）の意味類似性を使用して、有意に濃縮したＧＯをクラスター形成させる（上方調節の場合、ＦＤＲ＜０．０５、および下方調節の場合、ＦＤＲ＜０．００１を有するＧＯを選択して、表示の明瞭性を増強した）。図５Ｅは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、成体マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。図５Ｆは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、ｐ１０マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。統計的検定に関しては、表２を参照されたい。
【図５Ｃ−１】図５Ａ〜５Ｅは、移植マウスの脳に由来する骨髄細胞は、ミクログリアの成熟の機能を示すことを示している。図５Ａは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に上方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｂは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｃは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に上方調節される遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｄは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）による予備ランク付け解析を、デフォルトパラメータを使用する、遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセスに対するＲＮＡ−Ｓｅｑ差次的遺伝子発現データ（http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collection）を使用して行った。ＧＯ（ＧＯＳｅｍＳｉｍ）の意味類似性を使用して、有意に濃縮したＧＯをクラスター形成させる（上方調節の場合、ＦＤＲ＜０．０５、および下方調節の場合、ＦＤＲ＜０．００１を有するＧＯを選択して、表示の明瞭性を増強した）。図５Ｅは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、成体マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。図５Ｆは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、ｐ１０マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。統計的検定に関しては、表２を参照されたい。
【図５Ｃ−２】図５Ａ〜５Ｅは、移植マウスの脳に由来する骨髄細胞は、ミクログリアの成熟の機能を示すことを示している。図５Ａは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に上方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｂは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｃは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に上方調節される遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｄは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）による予備ランク付け解析を、デフォルトパラメータを使用する、遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセスに対するＲＮＡ−Ｓｅｑ差次的遺伝子発現データ（http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collection）を使用して行った。ＧＯ（ＧＯＳｅｍＳｉｍ）の意味類似性を使用して、有意に濃縮したＧＯをクラスター形成させる（上方調節の場合、ＦＤＲ＜０．０５、および下方調節の場合、ＦＤＲ＜０．００１を有するＧＯを選択して、表示の明瞭性を増強した）。図５Ｅは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、成体マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。図５Ｆは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、ｐ１０マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。統計的検定に関しては、表２を参照されたい。
【図５Ｃ−３】図５Ａ〜５Ｅは、移植マウスの脳に由来する骨髄細胞は、ミクログリアの成熟の機能を示すことを示している。図５Ａは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に上方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｂは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｃは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に上方調節される遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｄは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）による予備ランク付け解析を、デフォルトパラメータを使用する、遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセスに対するＲＮＡ−Ｓｅｑ差次的遺伝子発現データ（http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collection）を使用して行った。ＧＯ（ＧＯＳｅｍＳｉｍ）の意味類似性を使用して、有意に濃縮したＧＯをクラスター形成させる（上方調節の場合、ＦＤＲ＜０．０５、および下方調節の場合、ＦＤＲ＜０．００１を有するＧＯを選択して、表示の明瞭性を増強した）。図５Ｅは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、成体マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。図５Ｆは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、ｐ１０マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。統計的検定に関しては、表２を参照されたい。
【図５Ｄ−１】図５Ａ〜５Ｅは、移植マウスの脳に由来する骨髄細胞は、ミクログリアの成熟の機能を示すことを示している。図５Ａは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に上方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｂは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｃは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に上方調節される遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｄは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）による予備ランク付け解析を、デフォルトパラメータを使用する、遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセスに対するＲＮＡ−Ｓｅｑ差次的遺伝子発現データ（http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collection）を使用して行った。ＧＯ（ＧＯＳｅｍＳｉｍ）の意味類似性を使用して、有意に濃縮したＧＯをクラスター形成させる（上方調節の場合、ＦＤＲ＜０．０５、および下方調節の場合、ＦＤＲ＜０．００１を有するＧＯを選択して、表示の明瞭性を増強した）。図５Ｅは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、成体マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。図５Ｆは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、ｐ１０マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。統計的検定に関しては、表２を参照されたい。
【図５Ｄ−２】図５Ａ〜５Ｅは、移植マウスの脳に由来する骨髄細胞は、ミクログリアの成熟の機能を示すことを示している。図５Ａは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に上方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｂは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｃは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に上方調節される遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｄは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）による予備ランク付け解析を、デフォルトパラメータを使用する、遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセスに対するＲＮＡ−Ｓｅｑ差次的遺伝子発現データ（http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collection）を使用して行った。ＧＯ（ＧＯＳｅｍＳｉｍ）の意味類似性を使用して、有意に濃縮したＧＯをクラスター形成させる（上方調節の場合、ＦＤＲ＜０．０５、および下方調節の場合、ＦＤＲ＜０．００１を有するＧＯを選択して、表示の明瞭性を増強した）。図５Ｅは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、成体マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。図５Ｆは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、ｐ１０マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。統計的検定に関しては、表２を参照されたい。
【図５Ｄ−３】図５Ａ〜５Ｅは、移植マウスの脳に由来する骨髄細胞は、ミクログリアの成熟の機能を示すことを示している。図５Ａは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に上方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｂは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｃは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に上方調節される遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｄは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）による予備ランク付け解析を、デフォルトパラメータを使用する、遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセスに対するＲＮＡ−Ｓｅｑ差次的遺伝子発現データ（http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collection）を使用して行った。ＧＯ（ＧＯＳｅｍＳｉｍ）の意味類似性を使用して、有意に濃縮したＧＯをクラスター形成させる（上方調節の場合、ＦＤＲ＜０．０５、および下方調節の場合、ＦＤＲ＜０．００１を有するＧＯを選択して、表示の明瞭性を増強した）。図５Ｅは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、成体マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。図５Ｆは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、ｐ１０マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。統計的検定に関しては、表２を参照されたい。
【図５ＥＦ】図５Ａ〜５Ｅは、移植マウスの脳に由来する骨髄細胞は、ミクログリアの成熟の機能を示すことを示している。図５Ａは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に上方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｂは、μＣＴ細胞対μ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｃは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に上方調節される遺伝子の機能的な濃縮を示している。図５Ｄは、μＣＴ細胞対ＴＡμ移植細胞において、差次的に下方調節された遺伝子の機能的な濃縮を示している。遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）による予備ランク付け解析を、デフォルトパラメータを使用する、遺伝子オントロジー（ＧＯ）生物学的プロセスに対するＲＮＡ−Ｓｅｑ差次的遺伝子発現データ（http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/collection）を使用して行った。ＧＯ（ＧＯＳｅｍＳｉｍ）の意味類似性を使用して、有意に濃縮したＧＯをクラスター形成させる（上方調節の場合、ＦＤＲ＜０．０５、および下方調節の場合、ＦＤＲ＜０．００１を有するＧＯを選択して、表示の明瞭性を増強した）。図５Ｅは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、成体マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。図５Ｆは、ＲＮＡ−Ｓｅｑにより正規化した遺伝子の発現値の倍率変化を示すグラフであり、遺伝子の発現は、ＡＤＵＬＴ＿ＣＴ  μ細胞に対して、ブスルファン処置移植マウスまたはＰ１０マウスの脳から回収した表示集団において、ｐ１０マウス（Matcovitch-Natanら、Science.  ３５３巻：６３０１頁（２０１６年））で上方調節されている。統計的検定に関しては、表２を参照されたい。
【００７６】
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、ナイーブマウスまたは移植後マウスの脳実質に関連する造血細胞は、クローン形成および造血性再増殖可能性、ならびにミクログリア再構成可能性を有することを示している。図６Ａは、ＨＣＴに関する実験スキームを図示している。ＣＦＵは、ナイーブ（ＵＴ）マウス、ＢＵ処置マウスおよび照射（ＩＲＲ）マウスの骨髄（ＢＭ）および脳から、ならびにＣＤ４５．２  ＧＦＰを形質導入したＨＳＰＣ（ＢＵ−ＨＣＴ）を既に移植したマウスからプレート培養したものであった。図６Ｂは、ＢＵおよびＩＲＲ動物の組織から得た、コロニー数（＃ＣＦＣ）を図示するグラフである。図６Ｃは、ＢＵ−ＨＣＴ動物の組織から得た、コロニー数（＃ＣＦＣ）およびＧＦＰ＋ＣＦＣを図示するグラフである。図６Ｄは、一次レシピエントに由来するＢＭまたは脳細胞または末梢血単核球細胞の投与を受けた二次レシピエントマウスのＢＭおよび脳における、ＦＡＣＳ解析により回収した、ＧＦＰ＋細胞（および、ＢＭの場合、系統分化）の存在率を図示するグラフである。マウスは、移植して４か月後に犠牲にした。
【００７７】
【図７】図７Ａ〜図７Ｅは、２匹のＬＳＤ動物モデルにおいて、ＨＳＰＣのＩＣＶの共送達は、治療的妥当性を有することを示している。図７Ａは、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）の免疫不全動物モデルである、致死未満照射（Ｓｕｂ−Ｌ−ＩＲＲ）Ｒａｇ２−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−新生マウスへの、ＩＶ、ＩＶ＋ＩＣＶまたはＩＣＶのみのいずれかの経路によって移植した、ヒトＣＢ  ＣＤ３４＋ＨＳＰＣに関する、移植プロトコルの実験スキームを図示している。形質導入前に、ＨＳＰＣは、アリールスルファターゼ（ＡＲＳＡ）をコードするＬＶを形質導入した（Sessaら、Lancet  ２０１６年）。図７Ｂは、表示されている通り、ＡＲＳＡ−形質導入細胞をＩＣＶまたはＩＶまたはＩＣＶ＋ＩＶ移植したＲａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−マウスの脳および骨髄（ＢＭ）において測定された、ＡＲＳＡ活性（Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２＋／＋野生型マウスの組織中で測定された値に対する倍率として表す）を示すグラフである。Ｎ＝３のマウス／群である。移植マウスは、移植して５週間後に犠牲にした。全体として、形質導入したＨＳＰＣの共送達（ＩＶ＋ＩＣＶ）により、ＩＶ単独またはＩＣＶ単独手法と比べて、脳へのＡＲＳＡ送達が一層大きくなる。図７Ｃは、野生型（ＩＤＳ＋／＋）ドナーに由来するＬｉｎ−  ＨＳＰＣのイズロン酸スルファターゼ活性（ＩＤＳ−／−、ＩＩ型ムコ多糖症、すなわちＭＰＳ  ＩＩの動物モデル）における、欠損マウスでの移植実験のスキームである。野生型細胞を、ＩＶのみまたはＩＶ＋ＩＣＶでのブスルファン骨髄アブレーション後の、２か月齢のＩＤＳ−／−マウスに投与した。移植マウスは、挙動検討によって１８０日間、追跡調査した。図７Ｄ〜７Ｅは、ロータロッド試験における、移植および対照ＩＤＳ−／−マウスの成績を示すグラフである。図７Ｄは、動物のロータロッドに対する潜時を示す。図７Ｅは、４日目（最後の試行）および１日目（最初の試行）との間の、ロータロッドに対する潜時の差異を示している。ＩＣＶ＋ＩＶ移植マウスは、ＩＶのみおよび対照マウスと比べて、優れたロータロッド成績を示す。平均値およびＳＥＭを示す。コホートあたりＮ＝３〜８マウスである。
【００７８】
【図８】図８Ａ〜８Ｆは、マウスにおける、ＨＬＡマイナー抗原不一致ＨＳＰＣ  ＩＶ＋ＩＣＶ移植を示している。図８Ａは、マウスにおける、ＨＬＡマイナー抗原不一致ＨＳＰＣ  ＩＶ＋ＩＣＶ移植を行うための実験スキームを図示している。マウスは、１０×１０６の全ＢＭ細胞をＩＶで、および０．３または１×１０６  Ｌｉｎ−細胞（ヒトＣＤ３４＋細胞のマウス等価体）をＩＣＶで受けた。図８Ｂは、移植動物のカプラン−マイヤー生存曲線である。実験の終了時に、０日目のＩＶ＋ＩＣＶ  ３ｅ５およびＩＶのみの群は、０日目のＩＶ＋ＩＣＶ  １ｅ６群とは対照的に、１００％生存となることを示した。図８Ｃは、犠牲時の移植マウスの末梢血液（ＰＢ）、ＢＭ、脾臓（Ｓｐｌ）および胸腺（Ｔｈｙ）における、ドナーＣＤ４５．２細胞のキメラ現象を図示するグラフである。図８Ｄは、移植動物に由来する組織における、ドナーＣＤ４５．２細胞内のＧＦＰ＋細胞存在率を示しており、ＩＣＶ移植ＧＦＰ＋細胞は、移植マウスの造血組織中に生着されなかったことを示す。群あたりＮ＝５である。図８Ｅは、犠牲時の移植マウスの脳骨髄集団（全ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞）における、ドナーＣＤ４５．２細胞のキメラ現象を図示するグラフである。図８Ｆは、移植動物に由来する脳骨髄細胞における、ドナーＣＤ４５．２細胞内のＧＦＰ＋細胞存在率を示しており、ＩＣＶ移植ＧＦＰ＋細胞は、ドナー脳のキメラ現象の増大に寄与したことを示している。群あたりＮ＝５である。
【００７９】
【図９】図９Ａ〜９Ｆは、マウスにおける、ＭＨＣ不一致ＨＳＰＣ  ＩＶ＋ＩＣＶ移植を示している。この状況では、ＩＣＶ送達の脳ドナーキメラ現象への相加作用が維持されている。図９Ａは、マウスにおける、ＨＬＡマイナー抗原不一致ＨＳＰＣ  ＩＶ＋ＩＣＶ移植を行うための実験スキームを図示している。マウスは、１０×１０６の全ＢＭ細胞をＩＶで、および０．３×１０６  Ｌｉｎ−細胞（ヒトＣＤ３４＋細胞のマウス等価体）をＩＣＶで受けた。図９Ｂは、移植動物のカプラン−マイヤー生存曲線である。実験の終了時に、０日目のＩＶ＋ＩＣＶ  ３ｅ５の群は、ＩＶのみの群とは対照的に、１００％生存となることを示した。図９Ｃは、犠牲時の移植マウスのＰＢ、ＢＭ、ＳｐｌおよびＴｈｙにおける、ドナーＣＤ４５．２細胞のキメラ現象を図示するグラフである。図９Ｄは、移植動物に由来する組織における、ドナーＣＤ４５．２細胞内のＧＦＰ＋細胞存在率を示しており、ＩＣＶ移植ＧＦＰ＋細胞は、移植マウスの造血組織中に生着されなかったことを示す。群あたりＮ＝５である。図９Ｅは、犠牲時の移植マウスの脳骨髄集団における、ドナーＣＤ４５．２細胞のキメラ現象を図示するグラフである。図９Ｆは、移植動物に由来する脳骨髄細胞における、ドナーＣＤ４５．２細胞内のＧＦＰ＋細胞存在率を示しており、ＩＣＶ移植ＧＦＰ＋細胞は、ドナー脳のキメラ現象の増大に寄与したことを示している。群あたりＮ＝５である。
【００８０】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｂは、マウスにおける鞘内（ＩＴ）ＨＳＰＣ移植を示している。図１０Ａは、マウスにおける、ＩＣＶ＋ＩＶおよびＩＶのみ（対照ＩＶ）との比較時の、差次的に標識したＨＳＰＣ移植ＩＴ＋ＩＶに関する実験スキームを図示している。図１０Ｂは、犠牲時における、移植マウスのＢＭ、脳および脊髄における、ＧＦＰ＋およびＣｈｅｒｒｙ＋細胞の生着の合計により作製した、ドナー細胞のキメラ現象を図示するグラフを示す。各列において、ＧＦＰは下部であり、Ｃｈｅｒｒｙは上部である。群あたりＮ＝３〜５である。ＩＴ  ＨＳＰＣ送達は、強固な造血キメラ現象およびＣＮＳキメラ現象を達成するための、貴重な経路を構成することができる。
【００８１】
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｊは、早期造血幹細胞／前駆細胞に由来する、移植後脳骨髄細胞を示している。図１１Ａは、ＨＳＰＣのプール内の長期（ＬＴ）−ＨＳＣおよび前駆体が、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１および系統陰性染色、ならびにＳＬＡＭ受容体マーカーＣＤ１５０およびＣＤ４８を使用して、どのように予め単離されたかを示す実験スキームを図示している。次に、表示された分類集団を、ＧＦＰ（ＫＳＬ）およびΔＮＧＦＲ（ＮＯＴ−ＫＳＬ）、ならびにＧＦＰ（ＬＴ−ＨＳＣ）、ΔＮＧＦＲ（ＭＰＰ）、タグ−ＢＦＰ（ＨＰＣ−１）およびＣＨＥＲＲＹ（ＨＰＣ−２）をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）を差次的に形質導入し、続いて、ブスルファン−骨髄アブレーションマウスに、その元の比で競合的にＩＶまたはＩＣＶを移植した。ＩＣＶ移植された動物は、移植後５日目に、造血レスキューのため、未操作全ＢＭ細胞の投与も受けた。図１１Ｂは、Ａに記載されているマウスにおいて、表示したＬＶを形質導入して移植した細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの液体子孫における、マーカー遺伝子の発現のヒストグラムを示している。図１１Ｃは、犠牲時における、ブスルファン処置移植（ＢＵ＿ＴＸ）マウスの全ＣＤ４５＋造血ＢＭ細胞、骨髄（ＣＤ１１ｂ）およびリンパ球（ＣＤ３およびＢ２２０）系統内の、移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示したグラフである。Ｎ＝１０のマウス／群である。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄いグレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。図１１Ｄは、移植後９０日目における、ＢＵ＿ＴＸマウスの脳の全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞、μおよびＴＡμ内のＩＶ移植したＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部まで、ＫＳＬ（グレー）およびｎｏｔ−ＫＳＬ（白）である。図１１Ｅは、移植後９０日目における、ＢＵ＿ＴＸマウスの脳の全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞、μおよびＴＡμ内のＩＣＶ移植したＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部まで、ＫＳＬ（グレー）およびｎｏｔ−ＫＳＬ（白）である。図１１Ｆは、ＨＣＴ後の様々な時間点における、ＩＶ移植したブスルファン−骨髄アブレーションマウスの脳の全骨髄細胞、μおよびＴＡμ内の移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。群あたりＮ＝１０のマウスである。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄グレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。図１１Ｇは、ＨＣＴ後の様々な時間点における、ＩＣＶ移植したブスルファン−骨髄アブレーションマウスの脳の全骨髄細胞、μおよびＴＡμ内の移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄グレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。群あたりＮ＝１０のマウスである。図１１Ｈおよび図１１Ｉは、移植後９０日目において、ＫＳＬ  部分集団をＩＶ移植したＢＵ処置マウスの脳のスライスの免疫蛍光解析を図示している。図１１Ｈでは、ＬＴ−ＨＳＣの子孫細胞は、ＧＦＰ＋であり、ＭＰＰの子孫細胞は、ΔＮＧＦＲ＋（薄いグレー）である。Ｉｂａ１染色は、青色チャネルにおけるものである。拡大率２０×。Ｍ＝融合したものである。右側のパネルに、２０×（上部）およびその４０×の拡大率（下部）における他の代表的な融合図を示している。図１１Ｉでは、ＨＰＣ２の子孫細胞は、Ｃｈｅｒｒｙ＋であり、ＭＰＰの子孫細胞は、ΔＮＧＦＲ＋（グレー）である。ＧＦＰ＋染色は、ΔＮＧＦＲ免疫蛍光の非存在下では検出されなかった。核に関するＴＰＩＩＩ（濃いグレー）を示している。上部パネルには、拡大率２０×である。下部のパネルでは、２０×（上部）およびその４０×の拡大率（下部）における他の代表的な融合図を示している。画像は、共焦点顕微鏡（Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０．１００によって処理した。図１１Ｊは、移植に際しおける、ＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬ細胞およびＫＳＬ部分集団における、ＣＸＣＲ４発現の差次的レベルを示す、ヒストグラムのプロットを図示している。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｊは、早期造血幹細胞／前駆細胞に由来する、移植後脳骨髄細胞を示している。図１１Ａは、ＨＳＰＣのプール内の長期（ＬＴ）−ＨＳＣおよび前駆体が、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１および系統陰性染色、ならびにＳＬＡＭ受容体マーカーＣＤ１５０およびＣＤ４８を使用して、どのように予め単離されたかを示す実験スキームを図示している。次に、表示された分類集団を、ＧＦＰ（ＫＳＬ）およびΔＮＧＦＲ（ＮＯＴ−ＫＳＬ）、ならびにＧＦＰ（ＬＴ−ＨＳＣ）、ΔＮＧＦＲ（ＭＰＰ）、タグ−ＢＦＰ（ＨＰＣ−１）およびＣＨＥＲＲＹ（ＨＰＣ−２）をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）を差次的に形質導入し、続いて、ブスルファン−骨髄アブレーションマウスに、その元の比で競合的にＩＶまたはＩＣＶを移植した。ＩＣＶ移植された動物は、移植後５日目に、造血レスキューのため、未操作全ＢＭ細胞の投与も受けた。図１１Ｂは、Ａに記載されているマウスにおいて、表示したＬＶを形質導入して移植した細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの液体子孫における、マーカー遺伝子の発現のヒストグラムを示している。図１１Ｃは、犠牲時における、ブスルファン処置移植（ＢＵ＿ＴＸ）マウスの全ＣＤ４５＋造血ＢＭ細胞、骨髄（ＣＤ１１ｂ）およびリンパ球（ＣＤ３およびＢ２２０）系統内の、移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示したグラフである。Ｎ＝１０のマウス／群である。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄いグレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。図１１Ｄは、移植後９０日目における、ＢＵ＿ＴＸマウスの脳の全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞、μおよびＴＡμ内のＩＶ移植したＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部まで、ＫＳＬ（グレー）およびｎｏｔ−ＫＳＬ（白）である。図１１Ｅは、移植後９０日目における、ＢＵ＿ＴＸマウスの脳の全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞、μおよびＴＡμ内のＩＣＶ移植したＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部まで、ＫＳＬ（グレー）およびｎｏｔ−ＫＳＬ（白）である。図１１Ｆは、ＨＣＴ後の様々な時間点における、ＩＶ移植したブスルファン−骨髄アブレーションマウスの脳の全骨髄細胞、μおよびＴＡμ内の移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。群あたりＮ＝１０のマウスである。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄グレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。図１１Ｇは、ＨＣＴ後の様々な時間点における、ＩＣＶ移植したブスルファン−骨髄アブレーションマウスの脳の全骨髄細胞、μおよびＴＡμ内の移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄グレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。群あたりＮ＝１０のマウスである。図１１Ｈおよび図１１Ｉは、移植後９０日目において、ＫＳＬ  部分集団をＩＶ移植したＢＵ処置マウスの脳のスライスの免疫蛍光解析を図示している。図１１Ｈでは、ＬＴ−ＨＳＣの子孫細胞は、ＧＦＰ＋であり、ＭＰＰの子孫細胞は、ΔＮＧＦＲ＋（薄いグレー）である。Ｉｂａ１染色は、青色チャネルにおけるものである。拡大率２０×。Ｍ＝融合したものである。右側のパネルに、２０×（上部）およびその４０×の拡大率（下部）における他の代表的な融合図を示している。図１１Ｉでは、ＨＰＣ２の子孫細胞は、Ｃｈｅｒｒｙ＋であり、ＭＰＰの子孫細胞は、ΔＮＧＦＲ＋（グレー）である。ＧＦＰ＋染色は、ΔＮＧＦＲ免疫蛍光の非存在下では検出されなかった。核に関するＴＰＩＩＩ（濃いグレー）を示している。上部パネルには、拡大率２０×である。下部のパネルでは、２０×（上部）およびその４０×の拡大率（下部）における他の代表的な融合図を示している。画像は、共焦点顕微鏡（Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０．１００によって処理した。図１１Ｊは、移植に際しおける、ＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬ細胞およびＫＳＬ部分集団における、ＣＸＣＲ４発現の差次的レベルを示す、ヒストグラムのプロットを図示している。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｊは、早期造血幹細胞／前駆細胞に由来する、移植後脳骨髄細胞を示している。図１１Ａは、ＨＳＰＣのプール内の長期（ＬＴ）−ＨＳＣおよび前駆体が、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１および系統陰性染色、ならびにＳＬＡＭ受容体マーカーＣＤ１５０およびＣＤ４８を使用して、どのように予め単離されたかを示す実験スキームを図示している。次に、表示された分類集団を、ＧＦＰ（ＫＳＬ）およびΔＮＧＦＲ（ＮＯＴ−ＫＳＬ）、ならびにＧＦＰ（ＬＴ−ＨＳＣ）、ΔＮＧＦＲ（ＭＰＰ）、タグ−ＢＦＰ（ＨＰＣ−１）およびＣＨＥＲＲＹ（ＨＰＣ−２）をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）を差次的に形質導入し、続いて、ブスルファン−骨髄アブレーションマウスに、その元の比で競合的にＩＶまたはＩＣＶを移植した。ＩＣＶ移植された動物は、移植後５日目に、造血レスキューのため、未操作全ＢＭ細胞の投与も受けた。図１１Ｂは、Ａに記載されているマウスにおいて、表示したＬＶを形質導入して移植した細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの液体子孫における、マーカー遺伝子の発現のヒストグラムを示している。図１１Ｃは、犠牲時における、ブスルファン処置移植（ＢＵ＿ＴＸ）マウスの全ＣＤ４５＋造血ＢＭ細胞、骨髄（ＣＤ１１ｂ）およびリンパ球（ＣＤ３およびＢ２２０）系統内の、移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示したグラフである。Ｎ＝１０のマウス／群である。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄いグレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。図１１Ｄは、移植後９０日目における、ＢＵ＿ＴＸマウスの脳の全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞、μおよびＴＡμ内のＩＶ移植したＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部まで、ＫＳＬ（グレー）およびｎｏｔ−ＫＳＬ（白）である。図１１Ｅは、移植後９０日目における、ＢＵ＿ＴＸマウスの脳の全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞、μおよびＴＡμ内のＩＣＶ移植したＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部まで、ＫＳＬ（グレー）およびｎｏｔ−ＫＳＬ（白）である。図１１Ｆは、ＨＣＴ後の様々な時間点における、ＩＶ移植したブスルファン−骨髄アブレーションマウスの脳の全骨髄細胞、μおよびＴＡμ内の移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。群あたりＮ＝１０のマウスである。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄グレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。図１１Ｇは、ＨＣＴ後の様々な時間点における、ＩＣＶ移植したブスルファン−骨髄アブレーションマウスの脳の全骨髄細胞、μおよびＴＡμ内の移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄グレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。群あたりＮ＝１０のマウスである。図１１Ｈおよび図１１Ｉは、移植後９０日目において、ＫＳＬ  部分集団をＩＶ移植したＢＵ処置マウスの脳のスライスの免疫蛍光解析を図示している。図１１Ｈでは、ＬＴ−ＨＳＣの子孫細胞は、ＧＦＰ＋であり、ＭＰＰの子孫細胞は、ΔＮＧＦＲ＋（薄いグレー）である。Ｉｂａ１染色は、青色チャネルにおけるものである。拡大率２０×。Ｍ＝融合したものである。右側のパネルに、２０×（上部）およびその４０×の拡大率（下部）における他の代表的な融合図を示している。図１１Ｉでは、ＨＰＣ２の子孫細胞は、Ｃｈｅｒｒｙ＋であり、ＭＰＰの子孫細胞は、ΔＮＧＦＲ＋（グレー）である。ＧＦＰ＋染色は、ΔＮＧＦＲ免疫蛍光の非存在下では検出されなかった。核に関するＴＰＩＩＩ（濃いグレー）を示している。上部パネルには、拡大率２０×である。下部のパネルでは、２０×（上部）およびその４０×の拡大率（下部）における他の代表的な融合図を示している。画像は、共焦点顕微鏡（Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０．１００によって処理した。図１１Ｊは、移植に際しおける、ＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬ細胞およびＫＳＬ部分集団における、ＣＸＣＲ４発現の差次的レベルを示す、ヒストグラムのプロットを図示している。
【図１１ＤＥＦＧ】図１１Ａ〜１１Ｊは、早期造血幹細胞／前駆細胞に由来する、移植後脳骨髄細胞を示している。図１１Ａは、ＨＳＰＣのプール内の長期（ＬＴ）−ＨＳＣおよび前駆体が、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１および系統陰性染色、ならびにＳＬＡＭ受容体マーカーＣＤ１５０およびＣＤ４８を使用して、どのように予め単離されたかを示す実験スキームを図示している。次に、表示された分類集団を、ＧＦＰ（ＫＳＬ）およびΔＮＧＦＲ（ＮＯＴ−ＫＳＬ）、ならびにＧＦＰ（ＬＴ−ＨＳＣ）、ΔＮＧＦＲ（ＭＰＰ）、タグ−ＢＦＰ（ＨＰＣ−１）およびＣＨＥＲＲＹ（ＨＰＣ−２）をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）を差次的に形質導入し、続いて、ブスルファン−骨髄アブレーションマウスに、その元の比で競合的にＩＶまたはＩＣＶを移植した。ＩＣＶ移植された動物は、移植後５日目に、造血レスキューのため、未操作全ＢＭ細胞の投与も受けた。図１１Ｂは、Ａに記載されているマウスにおいて、表示したＬＶを形質導入して移植した細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの液体子孫における、マーカー遺伝子の発現のヒストグラムを示している。図１１Ｃは、犠牲時における、ブスルファン処置移植（ＢＵ＿ＴＸ）マウスの全ＣＤ４５＋造血ＢＭ細胞、骨髄（ＣＤ１１ｂ）およびリンパ球（ＣＤ３およびＢ２２０）系統内の、移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示したグラフである。Ｎ＝１０のマウス／群である。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄いグレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。図１１Ｄは、移植後９０日目における、ＢＵ＿ＴＸマウスの脳の全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞、μおよびＴＡμ内のＩＶ移植したＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部まで、ＫＳＬ（グレー）およびｎｏｔ−ＫＳＬ（白）である。図１１Ｅは、移植後９０日目における、ＢＵ＿ＴＸマウスの脳の全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞、μおよびＴＡμ内のＩＣＶ移植したＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部まで、ＫＳＬ（グレー）およびｎｏｔ−ＫＳＬ（白）である。図１１Ｆは、ＨＣＴ後の様々な時間点における、ＩＶ移植したブスルファン−骨髄アブレーションマウスの脳の全骨髄細胞、μおよびＴＡμ内の移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。群あたりＮ＝１０のマウスである。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄グレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。図１１Ｇは、ＨＣＴ後の様々な時間点における、ＩＣＶ移植したブスルファン−骨髄アブレーションマウスの脳の全骨髄細胞、μおよびＴＡμ内の移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄グレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。群あたりＮ＝１０のマウスである。図１１Ｈおよび図１１Ｉは、移植後９０日目において、ＫＳＬ  部分集団をＩＶ移植したＢＵ処置マウスの脳のスライスの免疫蛍光解析を図示している。図１１Ｈでは、ＬＴ−ＨＳＣの子孫細胞は、ＧＦＰ＋であり、ＭＰＰの子孫細胞は、ΔＮＧＦＲ＋（薄いグレー）である。Ｉｂａ１染色は、青色チャネルにおけるものである。拡大率２０×。Ｍ＝融合したものである。右側のパネルに、２０×（上部）およびその４０×の拡大率（下部）における他の代表的な融合図を示している。図１１Ｉでは、ＨＰＣ２の子孫細胞は、Ｃｈｅｒｒｙ＋であり、ＭＰＰの子孫細胞は、ΔＮＧＦＲ＋（グレー）である。ＧＦＰ＋染色は、ΔＮＧＦＲ免疫蛍光の非存在下では検出されなかった。核に関するＴＰＩＩＩ（濃いグレー）を示している。上部パネルには、拡大率２０×である。下部のパネルでは、２０×（上部）およびその４０×の拡大率（下部）における他の代表的な融合図を示している。画像は、共焦点顕微鏡（Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０．１００によって処理した。図１１Ｊは、移植に際しおける、ＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬ細胞およびＫＳＬ部分集団における、ＣＸＣＲ４発現の差次的レベルを示す、ヒストグラムのプロットを図示している。
【図１１ＨＩ】図１１Ａ〜１１Ｊは、早期造血幹細胞／前駆細胞に由来する、移植後脳骨髄細胞を示している。図１１Ａは、ＨＳＰＣのプール内の長期（ＬＴ）−ＨＳＣおよび前駆体が、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１および系統陰性染色、ならびにＳＬＡＭ受容体マーカーＣＤ１５０およびＣＤ４８を使用して、どのように予め単離されたかを示す実験スキームを図示している。次に、表示された分類集団を、ＧＦＰ（ＫＳＬ）およびΔＮＧＦＲ（ＮＯＴ−ＫＳＬ）、ならびにＧＦＰ（ＬＴ−ＨＳＣ）、ΔＮＧＦＲ（ＭＰＰ）、タグ−ＢＦＰ（ＨＰＣ−１）およびＣＨＥＲＲＹ（ＨＰＣ−２）をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）を差次的に形質導入し、続いて、ブスルファン−骨髄アブレーションマウスに、その元の比で競合的にＩＶまたはＩＣＶを移植した。ＩＣＶ移植された動物は、移植後５日目に、造血レスキューのため、未操作全ＢＭ細胞の投与も受けた。図１１Ｂは、Ａに記載されているマウスにおいて、表示したＬＶを形質導入して移植した細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの液体子孫における、マーカー遺伝子の発現のヒストグラムを示している。図１１Ｃは、犠牲時における、ブスルファン処置移植（ＢＵ＿ＴＸ）マウスの全ＣＤ４５＋造血ＢＭ細胞、骨髄（ＣＤ１１ｂ）およびリンパ球（ＣＤ３およびＢ２２０）系統内の、移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示したグラフである。Ｎ＝１０のマウス／群である。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄いグレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。図１１Ｄは、移植後９０日目における、ＢＵ＿ＴＸマウスの脳の全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞、μおよびＴＡμ内のＩＶ移植したＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部まで、ＫＳＬ（グレー）およびｎｏｔ−ＫＳＬ（白）である。図１１Ｅは、移植後９０日目における、ＢＵ＿ＴＸマウスの脳の全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞、μおよびＴＡμ内のＩＣＶ移植したＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部まで、ＫＳＬ（グレー）およびｎｏｔ−ＫＳＬ（白）である。図１１Ｆは、ＨＣＴ後の様々な時間点における、ＩＶ移植したブスルファン−骨髄アブレーションマウスの脳の全骨髄細胞、μおよびＴＡμ内の移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。群あたりＮ＝１０のマウスである。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄グレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。図１１Ｇは、ＨＣＴ後の様々な時間点における、ＩＣＶ移植したブスルファン−骨髄アブレーションマウスの脳の全骨髄細胞、μおよびＴＡμ内の移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄グレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。群あたりＮ＝１０のマウスである。図１１Ｈおよび図１１Ｉは、移植後９０日目において、ＫＳＬ  部分集団をＩＶ移植したＢＵ処置マウスの脳のスライスの免疫蛍光解析を図示している。図１１Ｈでは、ＬＴ−ＨＳＣの子孫細胞は、ＧＦＰ＋であり、ＭＰＰの子孫細胞は、ΔＮＧＦＲ＋（薄いグレー）である。Ｉｂａ１染色は、青色チャネルにおけるものである。拡大率２０×。Ｍ＝融合したものである。右側のパネルに、２０×（上部）およびその４０×の拡大率（下部）における他の代表的な融合図を示している。図１１Ｉでは、ＨＰＣ２の子孫細胞は、Ｃｈｅｒｒｙ＋であり、ＭＰＰの子孫細胞は、ΔＮＧＦＲ＋（グレー）である。ＧＦＰ＋染色は、ΔＮＧＦＲ免疫蛍光の非存在下では検出されなかった。核に関するＴＰＩＩＩ（濃いグレー）を示している。上部パネルには、拡大率２０×である。下部のパネルでは、２０×（上部）およびその４０×の拡大率（下部）における他の代表的な融合図を示している。画像は、共焦点顕微鏡（Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０．１００によって処理した。図１１Ｊは、移植に際しおける、ＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬ細胞およびＫＳＬ部分集団における、ＣＸＣＲ４発現の差次的レベルを示す、ヒストグラムのプロットを図示している。
【図１１Ｊ】図１１Ａ〜１１Ｊは、早期造血幹細胞／前駆細胞に由来する、移植後脳骨髄細胞を示している。図１１Ａは、ＨＳＰＣのプール内の長期（ＬＴ）−ＨＳＣおよび前駆体が、ｃ−ｋｉｔ、Ｓｃａ−１および系統陰性染色、ならびにＳＬＡＭ受容体マーカーＣＤ１５０およびＣＤ４８を使用して、どのように予め単離されたかを示す実験スキームを図示している。次に、表示された分類集団を、ＧＦＰ（ＫＳＬ）およびΔＮＧＦＲ（ＮＯＴ−ＫＳＬ）、ならびにＧＦＰ（ＬＴ−ＨＳＣ）、ΔＮＧＦＲ（ＭＰＰ）、タグ−ＢＦＰ（ＨＰＣ−１）およびＣＨＥＲＲＹ（ＨＰＣ−２）をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）を差次的に形質導入し、続いて、ブスルファン−骨髄アブレーションマウスに、その元の比で競合的にＩＶまたはＩＣＶを移植した。ＩＣＶ移植された動物は、移植後５日目に、造血レスキューのため、未操作全ＢＭ細胞の投与も受けた。図１１Ｂは、Ａに記載されているマウスにおいて、表示したＬＶを形質導入して移植した細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの液体子孫における、マーカー遺伝子の発現のヒストグラムを示している。図１１Ｃは、犠牲時における、ブスルファン処置移植（ＢＵ＿ＴＸ）マウスの全ＣＤ４５＋造血ＢＭ細胞、骨髄（ＣＤ１１ｂ）およびリンパ球（ＣＤ３およびＢ２２０）系統内の、移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示したグラフである。Ｎ＝１０のマウス／群である。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄いグレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。図１１Ｄは、移植後９０日目における、ＢＵ＿ＴＸマウスの脳の全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞、μおよびＴＡμ内のＩＶ移植したＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部まで、ＫＳＬ（グレー）およびｎｏｔ−ＫＳＬ（白）である。図１１Ｅは、移植後９０日目における、ＢＵ＿ＴＸマウスの脳の全骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞、μおよびＴＡμ内のＩＣＶ移植したＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部まで、ＫＳＬ（グレー）およびｎｏｔ−ＫＳＬ（白）である。図１１Ｆは、ＨＣＴ後の様々な時間点における、ＩＶ移植したブスルファン−骨髄アブレーションマウスの脳の全骨髄細胞、μおよびＴＡμ内の移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。群あたりＮ＝１０のマウスである。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄グレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。図１１Ｇは、ＨＣＴ後の様々な時間点における、ＩＣＶ移植したブスルファン−骨髄アブレーションマウスの脳の全骨髄細胞、μおよびＴＡμ内の移植ＫＳＬ部分集団のそれぞれに由来する細胞の存在率を図示するグラフである。各列において、下部から上部に、ＬＴ−ＨＳＣ（薄グレー）、ＭＰＰ（濃いグレー）、ＨＰＣ２（グレー）およびＨＰＣ１（さらに薄いグレー）である。群あたりＮ＝１０のマウスである。図１１Ｈおよび図１１Ｉは、移植後９０日目において、ＫＳＬ  部分集団をＩＶ移植したＢＵ処置マウスの脳のスライスの免疫蛍光解析を図示している。図１１Ｈでは、ＬＴ−ＨＳＣの子孫細胞は、ＧＦＰ＋であり、ＭＰＰの子孫細胞は、ΔＮＧＦＲ＋（薄いグレー）である。Ｉｂａ１染色は、青色チャネルにおけるものである。拡大率２０×。Ｍ＝融合したものである。右側のパネルに、２０×（上部）およびその４０×の拡大率（下部）における他の代表的な融合図を示している。図１１Ｉでは、ＨＰＣ２の子孫細胞は、Ｃｈｅｒｒｙ＋であり、ＭＰＰの子孫細胞は、ΔＮＧＦＲ＋（グレー）である。ＧＦＰ＋染色は、ΔＮＧＦＲ免疫蛍光の非存在下では検出されなかった。核に関するＴＰＩＩＩ（濃いグレー）を示している。上部パネルには、拡大率２０×である。下部のパネルでは、２０×（上部）およびその４０×の拡大率（下部）における他の代表的な融合図を示している。画像は、共焦点顕微鏡（Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０．１００によって処理した。図１１Ｊは、移植に際しおける、ＫＳＬおよびＮＯＴ−ＫＳＬ細胞およびＫＳＬ部分集団における、ＣＸＣＲ４発現の差次的レベルを示す、ヒストグラムのプロットを図示している。
【００８２】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｅは、Ｆｇｄ５＋ＨＳＣが、ＩＣＶおよびＩＶ移植時の両方で、脳中のミクログリア様子孫を発生させることを示している。図１２Ａは、Ｆｇｄ５＋ＨＳＣ（Ｌｉｎ−  ｃｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋  Ｆｌｋ２−  ＣＤ３４−）が、ＣＤ４５．２  Ｆｄｇ５−グリーンドナーマウスから単離された、実験スキームを図示している。Ｆｇｄ５＋  ＨＳＣ（ｎ＝５００）を、ブスルファン骨髄アブレーションまたは致死的に照射したＣＤ４５．１レシピエントマウスに、ＩＶまたはＩＣＶ移植した。移植動物は、移植後５日目に、造血レスキューのため、未操作ＣＤ４５．１  全ＢＭ細胞の投与も受けた。図１２Ｂは、ブスルファンおよび照射の前処理後に、Ｆｇｄ５細胞をＩＶ移植したマウスの脳骨髄ＣＤ１１ｂ＋細胞内のドナー細胞（ＣＤ４５．２＋）の存在率を図示するグラフである。群あたりＮ≧４である。図１２Ｃは、ブスルファンおよび照射前処理後に、Ｆｇｄ５細胞をＩＣＶ移植したマウスの脳骨髄ＣＤ１１ｂ＋細胞内のドナー細胞（ＣＤ４５．２＋）の存在率を図示するグラフである。群あたりＮ≧４である。図１２Ｄは、ＩＶ移植したブスルファン−前処理マウスにおける、ドナー由来細胞内のμ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ集団を図示するグラフである。群あたりＮ≧４である。図１２Ｅは、ＩＣＶ移植したブスルファン−前処理マウスにおける、ドナー由来細胞内のμ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ集団を図示するグラフである。群あたりＮ≧４である。
【図１２ＢＣＤＥ】図１２Ａ〜１２Ｅは、Ｆｇｄ５＋ＨＳＣが、ＩＣＶおよびＩＶ移植時の両方で、脳中のミクログリア様子孫を発生させることを示している。図１２Ａは、Ｆｇｄ５＋ＨＳＣ（Ｌｉｎ−  ｃｋｉｔ＋  Ｓｃａ−１＋  Ｆｌｋ２−  ＣＤ３４−）が、ＣＤ４５．２  Ｆｄｇ５−グリーンドナーマウスから単離された、実験スキームを図示している。Ｆｇｄ５＋  ＨＳＣ（ｎ＝５００）を、ブスルファン骨髄アブレーションまたは致死的に照射したＣＤ４５．１レシピエントマウスに、ＩＶまたはＩＣＶ移植した。移植動物は、移植後５日目に、造血レスキューのため、未操作ＣＤ４５．１  全ＢＭ細胞の投与も受けた。図１２Ｂは、ブスルファンおよび照射の前処理後に、Ｆｇｄ５細胞をＩＶ移植したマウスの脳骨髄ＣＤ１１ｂ＋細胞内のドナー細胞（ＣＤ４５．２＋）の存在率を図示するグラフである。群あたりＮ≧４である。図１２Ｃは、ブスルファンおよび照射前処理後に、Ｆｇｄ５細胞をＩＣＶ移植したマウスの脳骨髄ＣＤ１１ｂ＋細胞内のドナー細胞（ＣＤ４５．２＋）の存在率を図示するグラフである。群あたりＮ≧４である。図１２Ｄは、ＩＶ移植したブスルファン−前処理マウスにおける、ドナー由来細胞内のμ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ集団を図示するグラフである。群あたりＮ≧４である。図１２Ｅは、ＩＣＶ移植したブスルファン−前処理マウスにおける、ドナー由来細胞内のμ、ＴＡμおよびＣＮＳｍａｃ集団を図示するグラフである。群あたりＮ≧４である。
【００８３】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｂは、ＣＸ３ＣＲ１発現細胞および脳骨髄キメラ現象に対して陰性の細胞の寄与を記載している。図１３Ａは、ＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰマウスの骨髄の特徴、特に、表示されている、様々な骨髄部分集団におけるＧＦＰの発現を示す、一連のグラフである。各列において底部から上部まで、ＧＦＰ  ｎｅｇ（薄いグレー）、ＧＦＰ  ｌｏｗ（濃いグレー）およびＧＦＰ  ｈｉｇｈ（薄いグレー）である。図１３Ｂは、リポータマウスであるＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰマウスおよび脳中で生じたキメラ現象から単離した細胞を用いてキメラマウスを発生させるために使用した実験設定を図示している。ＧＦＰ＋／ｈｉｇｈＬｉｎ−ＨＳＰＣの投与を受けたマウスは、脳中でＣＸ３ＣＲ１  ＣＤ４５．２ドナー細胞により生着されなかった（代表的なドットのプロットは、左側の箱に示されている）一方、ＣＸ３ＣＲ１で分類されなかった全骨髄を移植すると、ドナー細胞の持続的な生着を示し、これはミクログリアの分化の際に、ＧＦＰを強固に発現した（代表的なドットプロットが、左側の箱に示されている）。これにより、ＧＦＰ−細胞（ＣＸ３ＣＲ１を発現しない）は、脳骨髄キメラ現象の定着のために移植されることを示している。
【図１３Ｂ−１】図１３Ａ〜１３Ｂは、ＣＸ３ＣＲ１発現細胞および脳骨髄キメラ現象に対して陰性の細胞の寄与を記載している。図１３Ａは、ＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰマウスの骨髄の特徴、特に、表示されている、様々な骨髄部分集団におけるＧＦＰの発現を示す、一連のグラフである。各列において底部から上部まで、ＧＦＰ  ｎｅｇ（薄いグレー）、ＧＦＰ  ｌｏｗ（濃いグレー）およびＧＦＰ  ｈｉｇｈ（薄いグレー）である。図１３Ｂは、リポータマウスであるＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰマウスおよび脳中で生じたキメラ現象から単離した細胞を用いてキメラマウスを発生させるために使用した実験設定を図示している。ＧＦＰ＋／ｈｉｇｈＬｉｎ−ＨＳＰＣの投与を受けたマウスは、脳中でＣＸ３ＣＲ１  ＣＤ４５．２ドナー細胞により生着されなかった（代表的なドットのプロットは、左側の箱に示されている）一方、ＣＸ３ＣＲ１で分類されなかった全骨髄を移植すると、ドナー細胞の持続的な生着を示し、これはミクログリアの分化の際に、ＧＦＰを強固に発現した（代表的なドットプロットが、左側の箱に示されている）。これにより、ＧＦＰ−細胞（ＣＸ３ＣＲ１を発現しない）は、脳骨髄キメラ現象の定着のために移植されることを示している。
【図１３Ｂ−２】図１３Ａ〜１３Ｂは、ＣＸ３ＣＲ１発現細胞および脳骨髄キメラ現象に対して陰性の細胞の寄与を記載している。図１３Ａは、ＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰマウスの骨髄の特徴、特に、表示されている、様々な骨髄部分集団におけるＧＦＰの発現を示す、一連のグラフである。各列において底部から上部まで、ＧＦＰ  ｎｅｇ（薄いグレー）、ＧＦＰ  ｌｏｗ（濃いグレー）およびＧＦＰ  ｈｉｇｈ（薄いグレー）である。図１３Ｂは、リポータマウスであるＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰマウスおよび脳中で生じたキメラ現象から単離した細胞を用いてキメラマウスを発生させるために使用した実験設定を図示している。ＧＦＰ＋／ｈｉｇｈＬｉｎ−ＨＳＰＣの投与を受けたマウスは、脳中でＣＸ３ＣＲ１  ＣＤ４５．２ドナー細胞により生着されなかった（代表的なドットのプロットは、左側の箱に示されている）一方、ＣＸ３ＣＲ１で分類されなかった全骨髄を移植すると、ドナー細胞の持続的な生着を示し、これはミクログリアの分化の際に、ＧＦＰを強固に発現した（代表的なドットプロットが、左側の箱に示されている）。これにより、ＧＦＰ−細胞（ＣＸ３ＣＲ１を発現しない）は、脳骨髄キメラ現象の定着のために移植されることを示している。
【００８４】
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｄは、ＣＤ３４＋およびＣＤ３８−として定義されるヒトＬＴ−ＨＳＣの、脳骨髄子孫細胞の発生への寄与を示している。図１４Ａは、ヒト動員末梢血液からのヒトＣＤ３４＋ＣＤ３８＋（前駆体）およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−（幹濃縮細胞）の同定に関するゲーティング戦略を示す、代表的なドットプロットである。細胞に、表示した存在率で、ＧＦＰおよびタグ−ＢＦＰをコードするＬＶを差次的に形質導入し、移植するためＮＳＧ骨髄アブレーションマウスに混合した。図１４Ｂは、Ａに表示されている細胞を移植したＮＳＧマウスの脳において回収したヒトＣＤ４５＋細胞画分内の、ＧＦＰ（ＣＤ３８−）またはタグ−ＢＦＰ（ＣＤ３８＋）により印を付けた細胞の存在率を示すグラフである。Ｎ≧５のマウス／群である。平均値およびＳＥＭを示している。各列において、下部から上部まで、ＣＤ３８−（グレー）およびＣＤ３８＋（白）である。図１４Ｃは、ヒト動員末梢血液から回収したＣＤ３４＋細胞に対する、マーカーＣＤ３８およびＣＤ９０の発現による、長期間および短期間ヒトＨＳＣおよび前駆体の同定に関するゲーティング戦略を示す、代表的なドットプロットである。細胞に、表示した存在率で、ＧＦＰ、Ｃｈｅｒｒｙ、タグ−ＢＦＰ（シアン）およびｍＯ２（オレンジ）をコードするＬＶを差次的に形質導入し、移植するためＮＳＧ前処理マウスに混合した。図１４Ｄは、１４Ａに表示されている細胞を移植したＮＳＧマウスの脳において回収したヒトＣＤ４５＋細胞画分内の、表示マーカーにより印を付けた細胞の存在率を示すグラフである。底部から上部：ＣＤ３８−ＣＤ９０＋（グレー）、ＣＤ３８−ＣＤ９０−ｌｏｗ（薄いグレー）、ＣＤ３８＋ＣＤ９０−（中間グレー）およびＣＤ３８＋ＣＤ９０＋ｈｉｇｈ（さらに薄いグレー）。Ｎ≧５のマウス／群である。平均値およびＳＥＭを示している。全体として、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−は、脳骨髄細胞のキメラ現象に最も大きく寄与することを示した。
【００８５】
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｃは、ＢＵ感受性による、脳常在性の推定上のμ前駆体の同定を図示している。図１５Ａは、ブスルファンの１用量または４用量分後の５日目に、アポトーシス性アネキシン＋細胞の画分の増加が、造血骨髄、および最も重要なことにＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞内で検出されたことを示している。各組における、一番左の棒から、ＣＯ（白）、１×ＢＵ（濃いグレー）および４×ＢＵ（黒）である。図１５Ｂは、対照動物、およびＢＵ処置したマウスのバイタルＣＤ４５＋脳細胞内の、γＨ２ＡＸ＋細胞による代表的なＦＡＣＳプロットを示している。図１５Ｃは、ブスルファン前処理マウスまたは対照の未処置マウス（ＣＴＲ）後の１日目に解析したマウスの脳におけるγＨ２ＡＸマーカー分布を示している。挿入図は、γＨ２ＡＸ、ニューロン（ＮｅｕＮ）、ミクログリア（Ｉｂａ１）または星状細胞（ＧＦＡＰ）に関する、共免疫染色した代表的なレーザースキャニング共焦点顕微鏡の顕微鏡写真である。スケールバー＝１０μｍ。画像は、２０×の拡大率の共焦点顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｉｘ７０で取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。再構築は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ８．０ソフトウェアを用いて行った。挿入図では、拡大率４０×である。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｃは、ＢＵ感受性による、脳常在性の推定上のμ前駆体の同定を図示している。図１５Ａは、ブスルファンの１用量または４用量分後の５日目に、アポトーシス性アネキシン＋細胞の画分の増加が、造血骨髄、および最も重要なことにＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞内で検出されたことを示している。各組における、一番左の棒から、ＣＯ（白）、１×ＢＵ（濃いグレー）および４×ＢＵ（黒）である。図１５Ｂは、対照動物、およびＢＵ処置したマウスのバイタルＣＤ４５＋脳細胞内の、γＨ２ＡＸ＋細胞による代表的なＦＡＣＳプロットを示している。図１５Ｃは、ブスルファン前処理マウスまたは対照の未処置マウス（ＣＴＲ）後の１日目に解析したマウスの脳におけるγＨ２ＡＸマーカー分布を示している。挿入図は、γＨ２ＡＸ、ニューロン（ＮｅｕＮ）、ミクログリア（Ｉｂａ１）または星状細胞（ＧＦＡＰ）に関する、共免疫染色した代表的なレーザースキャニング共焦点顕微鏡の顕微鏡写真である。スケールバー＝１０μｍ。画像は、２０×の拡大率の共焦点顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｉｘ７０で取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。再構築は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ８．０ソフトウェアを用いて行った。挿入図では、拡大率４０×である。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｃは、ＢＵ感受性による、脳常在性の推定上のμ前駆体の同定を図示している。図１５Ａは、ブスルファンの１用量または４用量分後の５日目に、アポトーシス性アネキシン＋細胞の画分の増加が、造血骨髄、および最も重要なことにＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞内で検出されたことを示している。各組における、一番左の棒から、ＣＯ（白）、１×ＢＵ（濃いグレー）および４×ＢＵ（黒）である。図１５Ｂは、対照動物、およびＢＵ処置したマウスのバイタルＣＤ４５＋脳細胞内の、γＨ２ＡＸ＋細胞による代表的なＦＡＣＳプロットを示している。図１５Ｃは、ブスルファン前処理マウスまたは対照の未処置マウス（ＣＴＲ）後の１日目に解析したマウスの脳におけるγＨ２ＡＸマーカー分布を示している。挿入図は、γＨ２ＡＸ、ニューロン（ＮｅｕＮ）、ミクログリア（Ｉｂａ１）または星状細胞（ＧＦＡＰ）に関する、共免疫染色した代表的なレーザースキャニング共焦点顕微鏡の顕微鏡写真である。スケールバー＝１０μｍ。画像は、２０×の拡大率の共焦点顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｉｘ７０で取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。再構築は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ８．０ソフトウェアを用いて行った。挿入図では、拡大率４０×である。
【００８６】
【図１６Ａ−１】図１６Ａ〜１６Ｄは、調節された治療的遺伝子発現のためのミクログリアの分子工学操作を図示している。図１６Ａは、マウスＴＳＰＯプロモーターの代表例および配列を図示している。図１６Ｂは、ＧＦＰ  ｃＤＮＡの上流のＳＩＮ  ＬＶプラスミドに、Ｔｓｐｏ遺伝子の上流の２．７Ｋｂｐをクローニングして得られたＬＶを示している。本発明者らは、このベクターＢＶ−２細胞（マウスのミクログリア細胞系）を形質導入して、このプロモーターにより推進される発現を評価した。ＴＳＰＯ発現は、ストレスに応答したミクログリア細胞中で刺激されることが公知であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＰＳ注入により模擬され得る。図１６Ｃは、ＬＰＳ刺激後の、ＧＦＰポジティブな形質導入ＢＶ２細胞およびＧＦＰ平均蛍光強度のシフトを示すヒストグラムである。図１６Ｄは、ＬＰＳ刺激時における、基底条件での形質導入されたＢＶ２細胞のＧＦＰ（ベクター含有量に対して正規化した）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである（ｎ＝４：平均値±ＳＥＭ）。＊＝ｐ＜０．０００１スチューデントＴ検定。
【図１６Ａ−２】図１６Ａ〜１６Ｄは、調節された治療的遺伝子発現のためのミクログリアの分子工学操作を図示している。図１６Ａは、マウスＴＳＰＯプロモーターの代表例および配列を図示している。図１６Ｂは、ＧＦＰ  ｃＤＮＡの上流のＳＩＮ  ＬＶプラスミドに、Ｔｓｐｏ遺伝子の上流の２．７Ｋｂｐをクローニングして得られたＬＶを示している。本発明者らは、このベクターＢＶ−２細胞（マウスのミクログリア細胞系）を形質導入して、このプロモーターにより推進される発現を評価した。ＴＳＰＯ発現は、ストレスに応答したミクログリア細胞中で刺激されることが公知であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＰＳ注入により模擬され得る。図１６Ｃは、ＬＰＳ刺激後の、ＧＦＰポジティブな形質導入ＢＶ２細胞およびＧＦＰ平均蛍光強度のシフトを示すヒストグラムである。図１６Ｄは、ＬＰＳ刺激時における、基底条件での形質導入されたＢＶ２細胞のＧＦＰ（ベクター含有量に対して正規化した）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである（ｎ＝４：平均値±ＳＥＭ）。＊＝ｐ＜０．０００１スチューデントＴ検定。
【図１６ＢＣ】図１６Ａ〜１６Ｄは、調節された治療的遺伝子発現のためのミクログリアの分子工学操作を図示している。図１６Ａは、マウスＴＳＰＯプロモーターの代表例および配列を図示している。図１６Ｂは、ＧＦＰ  ｃＤＮＡの上流のＳＩＮ  ＬＶプラスミドに、Ｔｓｐｏ遺伝子の上流の２．７Ｋｂｐをクローニングして得られたＬＶを示している。本発明者らは、このベクターＢＶ−２細胞（マウスのミクログリア細胞系）を形質導入して、このプロモーターにより推進される発現を評価した。ＴＳＰＯ発現は、ストレスに応答したミクログリア細胞中で刺激されることが公知であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＰＳ注入により模擬され得る。図１６Ｃは、ＬＰＳ刺激後の、ＧＦＰポジティブな形質導入ＢＶ２細胞およびＧＦＰ平均蛍光強度のシフトを示すヒストグラムである。図１６Ｄは、ＬＰＳ刺激時における、基底条件での形質導入されたＢＶ２細胞のＧＦＰ（ベクター含有量に対して正規化した）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである（ｎ＝４：平均値±ＳＥＭ）。＊＝ｐ＜０．０００１スチューデントＴ検定。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｄは、調節された治療的遺伝子発現のためのミクログリアの分子工学操作を図示している。図１６Ａは、マウスＴＳＰＯプロモーターの代表例および配列を図示している。図１６Ｂは、ＧＦＰ  ｃＤＮＡの上流のＳＩＮ  ＬＶプラスミドに、Ｔｓｐｏ遺伝子の上流の２．７Ｋｂｐをクローニングして得られたＬＶを示している。本発明者らは、このベクターＢＶ−２細胞（マウスのミクログリア細胞系）を形質導入して、このプロモーターにより推進される発現を評価した。ＴＳＰＯ発現は、ストレスに応答したミクログリア細胞中で刺激されることが公知であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＰＳ注入により模擬され得る。図１６Ｃは、ＬＰＳ刺激後の、ＧＦＰポジティブな形質導入ＢＶ２細胞およびＧＦＰ平均蛍光強度のシフトを示すヒストグラムである。図１６Ｄは、ＬＰＳ刺激時における、基底条件での形質導入されたＢＶ２細胞のＧＦＰ（ベクター含有量に対して正規化した）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示すグラフである（ｎ＝４：平均値±ＳＥＭ）。＊＝ｐ＜０．０００１スチューデントＴ検定。
【００８７】
【図１７Ａ】図１７Ａ〜１７Ｉは、ＩＣＶ送達時の、ナノ粒子（ＮＰ）特徴および生体内分布を図示している。図１７Ａは、使用した第１世代のローダミンナノ粒子のサイズを示している。図１７Ｂ〜１７Ｄは、フローサイトメトリーにより評価した、ＩＣＶ注入した第１世代のナノ粒子の脳における分布を示している。ＣＤ４５＋細胞によるナノ粒子取り込みは、マンニトールの存在下で増大し（図１７Ｂ）、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞と比べて、ＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞において高く（図１７Ｃ）、ＣＤ４５＋Ｅｄｕ−細胞と比べて、ＣＤ４５＋Ｅｄｕ＋細胞の範囲内にある（図１７Ｄ）。図１７Ｅは、ＮＰをＩＣＶ注入して３日後に解析したマウスからの脳の矢状面のスライスにおける、ローダミン化したＮＰシグナル（赤色／薄いグレー）およびＤＡＰＩ核染色（青／濃いグレー）の代表的な落射蛍光顕微鏡写真である。画像は、２０×の拡大率のＤｅｌｔａ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｏｌｙｍｐｕｓで取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。再構築は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ８．０ソフトウェアを用いて行った。図１７Ｆは、Ｒｈｏ＋である合計面積を％として表した、表示されている脳領域における、ナノ粒子の分布を示すグラフである。図１７Ｇは、ＮＰのＩＣＶ注入の３日後に解析したマウスに由来する、脳の矢状面のスライスにおける、脳室下（ＳＶＺ）帯および吻側移動流（ＲＭＳ）（右側パネル）に近い、ＮＰ（赤色、ＤＡＰＩ核は青色）の卓越した分布、ならびにローダミン化したＮＰシグナル（赤）、Ｉｂａ１（緑）、ｋｉ６７（増殖マーカー、青色）およびＤＡＰＩ核染色（薄い青）の代表的な共焦点顕微鏡画像を強調した図１７Ｅの挿入図である。ＮＰは、Ｋｉ６７＋ミクログリア細胞の内にある。図１７Ｈは、ＮＰが、細胞の増殖により内在化され、Ｉｂａ１＋、Ｆ４／８０、ローダミンおよび増殖マーカーＥｄｕに対する共免疫染色の代表的なレーザースキャニング共焦点顕微鏡の顕微鏡写真であることを示している。Ｒｈ＋ＮＰは、Ｉｂａ１＋（矢印）、およびＩｂａ１−（矢印）増殖細胞において検出され得る。図１７Ｉは、ＥｄｕおよびＮＰシグナルの共局在化を示す、ＮＰ注入マウスの脳に由来する薄片に関する蛍光顕微鏡観察により回収されたＥｄｕおよびローダミンシグナル伝達の再構築である。画像は、共焦点顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｉｘ７０で取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ  ３．５．０によって処理した。
【図１７ＢＣＤ】図１７Ａ〜１７Ｉは、ＩＣＶ送達時の、ナノ粒子（ＮＰ）特徴および生体内分布を図示している。図１７Ａは、使用した第１世代のローダミンナノ粒子のサイズを示している。図１７Ｂ〜１７Ｄは、フローサイトメトリーにより評価した、ＩＣＶ注入した第１世代のナノ粒子の脳における分布を示している。ＣＤ４５＋細胞によるナノ粒子取り込みは、マンニトールの存在下で増大し（図１７Ｂ）、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞と比べて、ＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞において高く（図１７Ｃ）、ＣＤ４５＋Ｅｄｕ−細胞と比べて、ＣＤ４５＋Ｅｄｕ＋細胞の範囲内にある（図１７Ｄ）。図１７Ｅは、ＮＰをＩＣＶ注入して３日後に解析したマウスからの脳の矢状面のスライスにおける、ローダミン化したＮＰシグナル（赤色／薄いグレー）およびＤＡＰＩ核染色（青／濃いグレー）の代表的な落射蛍光顕微鏡写真である。画像は、２０×の拡大率のＤｅｌｔａ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｏｌｙｍｐｕｓで取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。再構築は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ８．０ソフトウェアを用いて行った。図１７Ｆは、Ｒｈｏ＋である合計面積を％として表した、表示されている脳領域における、ナノ粒子の分布を示すグラフである。図１７Ｇは、ＮＰのＩＣＶ注入の３日後に解析したマウスに由来する、脳の矢状面のスライスにおける、脳室下（ＳＶＺ）帯および吻側移動流（ＲＭＳ）（右側パネル）に近い、ＮＰ（赤色、ＤＡＰＩ核は青色）の卓越した分布、ならびにローダミン化したＮＰシグナル（赤）、Ｉｂａ１（緑）、ｋｉ６７（増殖マーカー、青色）およびＤＡＰＩ核染色（薄い青）の代表的な共焦点顕微鏡画像を強調した図１７Ｅの挿入図である。ＮＰは、Ｋｉ６７＋ミクログリア細胞の内にある。図１７Ｈは、ＮＰが、細胞の増殖により内在化され、Ｉｂａ１＋、Ｆ４／８０、ローダミンおよび増殖マーカーＥｄｕに対する共免疫染色の代表的なレーザースキャニング共焦点顕微鏡の顕微鏡写真であることを示している。Ｒｈ＋ＮＰは、Ｉｂａ１＋（矢印）、およびＩｂａ１−（矢印）増殖細胞において検出され得る。図１７Ｉは、ＥｄｕおよびＮＰシグナルの共局在化を示す、ＮＰ注入マウスの脳に由来する薄片に関する蛍光顕微鏡観察により回収されたＥｄｕおよびローダミンシグナル伝達の再構築である。画像は、共焦点顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｉｘ７０で取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ  ３．５．０によって処理した。
【図１７ＥＦ】図１７Ａ〜１７Ｉは、ＩＣＶ送達時の、ナノ粒子（ＮＰ）特徴および生体内分布を図示している。図１７Ａは、使用した第１世代のローダミンナノ粒子のサイズを示している。図１７Ｂ〜１７Ｄは、フローサイトメトリーにより評価した、ＩＣＶ注入した第１世代のナノ粒子の脳における分布を示している。ＣＤ４５＋細胞によるナノ粒子取り込みは、マンニトールの存在下で増大し（図１７Ｂ）、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞と比べて、ＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞において高く（図１７Ｃ）、ＣＤ４５＋Ｅｄｕ−細胞と比べて、ＣＤ４５＋Ｅｄｕ＋細胞の範囲内にある（図１７Ｄ）。図１７Ｅは、ＮＰをＩＣＶ注入して３日後に解析したマウスからの脳の矢状面のスライスにおける、ローダミン化したＮＰシグナル（赤色／薄いグレー）およびＤＡＰＩ核染色（青／濃いグレー）の代表的な落射蛍光顕微鏡写真である。画像は、２０×の拡大率のＤｅｌｔａ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｏｌｙｍｐｕｓで取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。再構築は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ８．０ソフトウェアを用いて行った。図１７Ｆは、Ｒｈｏ＋である合計面積を％として表した、表示されている脳領域における、ナノ粒子の分布を示すグラフである。図１７Ｇは、ＮＰのＩＣＶ注入の３日後に解析したマウスに由来する、脳の矢状面のスライスにおける、脳室下（ＳＶＺ）帯および吻側移動流（ＲＭＳ）（右側パネル）に近い、ＮＰ（赤色、ＤＡＰＩ核は青色）の卓越した分布、ならびにローダミン化したＮＰシグナル（赤）、Ｉｂａ１（緑）、ｋｉ６７（増殖マーカー、青色）およびＤＡＰＩ核染色（薄い青）の代表的な共焦点顕微鏡画像を強調した図１７Ｅの挿入図である。ＮＰは、Ｋｉ６７＋ミクログリア細胞の内にある。図１７Ｈは、ＮＰが、細胞の増殖により内在化され、Ｉｂａ１＋、Ｆ４／８０、ローダミンおよび増殖マーカーＥｄｕに対する共免疫染色の代表的なレーザースキャニング共焦点顕微鏡の顕微鏡写真であることを示している。Ｒｈ＋ＮＰは、Ｉｂａ１＋（矢印）、およびＩｂａ１−（矢印）増殖細胞において検出され得る。図１７Ｉは、ＥｄｕおよびＮＰシグナルの共局在化を示す、ＮＰ注入マウスの脳に由来する薄片に関する蛍光顕微鏡観察により回収されたＥｄｕおよびローダミンシグナル伝達の再構築である。画像は、共焦点顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｉｘ７０で取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ  ３．５．０によって処理した。
【図１７ＧＨＩ】図１７Ａ〜１７Ｉは、ＩＣＶ送達時の、ナノ粒子（ＮＰ）特徴および生体内分布を図示している。図１７Ａは、使用した第１世代のローダミンナノ粒子のサイズを示している。図１７Ｂ〜１７Ｄは、フローサイトメトリーにより評価した、ＩＣＶ注入した第１世代のナノ粒子の脳における分布を示している。ＣＤ４５＋細胞によるナノ粒子取り込みは、マンニトールの存在下で増大し（図１７Ｂ）、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞と比べて、ＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞において高く（図１７Ｃ）、ＣＤ４５＋Ｅｄｕ−細胞と比べて、ＣＤ４５＋Ｅｄｕ＋細胞の範囲内にある（図１７Ｄ）。図１７Ｅは、ＮＰをＩＣＶ注入して３日後に解析したマウスからの脳の矢状面のスライスにおける、ローダミン化したＮＰシグナル（赤色／薄いグレー）およびＤＡＰＩ核染色（青／濃いグレー）の代表的な落射蛍光顕微鏡写真である。画像は、２０×の拡大率のＤｅｌｔａ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｏｌｙｍｐｕｓで取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０によって処理した。再構築は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ８．０ソフトウェアを用いて行った。図１７Ｆは、Ｒｈｏ＋である合計面積を％として表した、表示されている脳領域における、ナノ粒子の分布を示すグラフである。図１７Ｇは、ＮＰのＩＣＶ注入の３日後に解析したマウスに由来する、脳の矢状面のスライスにおける、脳室下（ＳＶＺ）帯および吻側移動流（ＲＭＳ）（右側パネル）に近い、ＮＰ（赤色、ＤＡＰＩ核は青色）の卓越した分布、ならびにローダミン化したＮＰシグナル（赤）、Ｉｂａ１（緑）、ｋｉ６７（増殖マーカー、青色）およびＤＡＰＩ核染色（薄い青）の代表的な共焦点顕微鏡画像を強調した図１７Ｅの挿入図である。ＮＰは、Ｋｉ６７＋ミクログリア細胞の内にある。図１７Ｈは、ＮＰが、細胞の増殖により内在化され、Ｉｂａ１＋、Ｆ４／８０、ローダミンおよび増殖マーカーＥｄｕに対する共免疫染色の代表的なレーザースキャニング共焦点顕微鏡の顕微鏡写真であることを示している。Ｒｈ＋ＮＰは、Ｉｂａ１＋（矢印）、およびＩｂａ１−（矢印）増殖細胞において検出され得る。図１７Ｉは、ＥｄｕおよびＮＰシグナルの共局在化を示す、ＮＰ注入マウスの脳に由来する薄片に関する蛍光顕微鏡観察により回収されたＥｄｕおよびローダミンシグナル伝達の再構築である。画像は、共焦点顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｉｘ７０で取得し、Ｓｏｆｔ  Ｗｏｒｋ  ３．５．０によって処理した。
【００８８】
【図１８】図１８は、自己集合ＮＰおよび化学治療薬複合体の調製を示している。
【００８９】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｅは、ＮＰに封入した化学治療剤のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの作用を図示している。図１９Ａは、ブスルファンに曝露した（esposed）ＢＶ２ミクログリア様細胞系において、γＨ２ＡＸに関する代表的なフローサイトメトリー解析および免疫蛍光染色法である。このグラフは、ブスルファンをロードしたまたはロードしない様々なナノ粒子製剤への曝露後の、γＨ２ＡＸ＋細胞の割合（フローサイトメトリーにより決定）を示している（ヒストグラムは、ｎ＞＝３となる独立した実験の平均値＋／−ＳＥＭを表す）。図１９Ｂは、ＮＰに封入したブスルファンへの曝露により発揮される細胞毒性を強調した、ＢＵ−ＮＰに曝露したＢＶ２ミクログリア様細胞系に対するＭＴＴ細胞生存アッセイの結果を図示するグラフである。図１９Ｃは、ＮＰをＩＣＶ投与した３日目に評価した（フローサイトメトリーによる）マウス脳におけるγＨ２ＡＸ＋ミクログリア細胞の存在率を図示するグラフである（ヒストグラムは、ｎ＝４の動物／群の平均値＋／−ＳＥＭを表す）。図１９Ｄおよび１９Ｅは、エトポシド化学治療剤（chmetherapic）を含有するまたは含有していないＮＰ（５０および１００ｎｍサイズの自己集合製剤、およびＰＬＣ製剤）に曝露させて、表示濃度の遊離製剤としてエトポシサイズ（etoposize）する、ＢＶ２ミクログリア細胞の生存率を示す２つのグラフである。ＭＴＴアッセイを使用して、生存率を評価した。生存率は、インキュベートの４８時間および７２時間後に測定した。ＮＰ内へのエトポダイス（etopodise）の送達により、遊離製剤と比較して、細胞を死滅するその能力が増大する。図１９Ｄおよび１９Ｅでは、各組における一番左の棒は、自己集合ＮＰ（５０ｎｍ）（濃いグレー）、自己集合ＮＰ（１００ｎｍ）、ＰＣＬ  ＮＰ（１００ｎｍ）（グレー）およびエトポシド（中間グレー）である。
【００９０】
【図２０ＡＢ】図２０Ａ〜２０Ｅは、ミクログリア前駆体の増殖の誘発後、およびＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋およびＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞のＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞プール誘発性アポトーシスの拡張後に投与したＮＰを含有するエトポシドを示す。図２０Ａおよび２０Ｃは、単回ブスルフスン（busulfsn）用量、または１０日間のＣＳＦ  １Ｒ阻害剤（Elmoreら、Neuron.  ８２巻（２号）：３８０〜３９７頁（２０１４年））の経口投与によりミクログリア前駆細胞増殖を誘発させて、次に、成体の野生型マウスにＮＰを含有するエトポシドをＩＶで投与するために使用した実験設計である。図２０Ｂおよび２０Ｄは、ＮＰ投与の５日後に得た脳試料に関して、フローサイトメトリーで測定したアネキシン＋早期アポトーシス細胞の％を示すグラフである。％アネキシン＋細胞は、表示されている細胞の副画分に基づいて算出する。空のＮＰを対照として使用した。図２０Ｅは、同一試料中のＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞の％を示す。総合的に、４回のブスルファン用量の投与を受けた観察されたどのイオン対照マウスに一致するアポトーシスの向上が、ＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋およびＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞内のエトポシド帯電ＮＰの投与を受けた動物において検出された。
【図２０ＣＤＥ】図２０Ａ〜２０Ｅは、ミクログリア前駆体の増殖の誘発後、およびＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋およびＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞のＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞プール誘発性アポトーシスの拡張後に投与したＮＰを含有するエトポシドを示す。図２０Ａおよび２０Ｃは、単回ブスルフスン（busulfsn）用量、または１０日間のＣＳＦ  １Ｒ阻害剤（Elmoreら、Neuron.  ８２巻（２号）：３８０〜３９７頁（２０１４年））の経口投与によりミクログリア前駆細胞増殖を誘発させて、次に、成体の野生型マウスにＮＰを含有するエトポシドをＩＶで投与するために使用した実験設計である。図２０Ｂおよび２０Ｄは、ＮＰ投与の５日後に得た脳試料に関して、フローサイトメトリーで測定したアネキシン＋早期アポトーシス細胞の％を示すグラフである。％アネキシン＋細胞は、表示されている細胞の副画分に基づいて算出する。空のＮＰを対照として使用した。図２０Ｅは、同一試料中のＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞の％を示す。総合的に、４回のブスルファン用量の投与を受けた観察されたどのイオン対照マウスに一致するアポトーシスの向上が、ＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋およびＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞内のエトポシド帯電ＮＰの投与を受けた動物において検出された。
【発明を実施するための形態】
【００９１】
発明の詳細な説明
本発明は、ＨＳＰＣの移植に際しミクログリアを再構成するため、ならびに神経系疾患、または中枢神経系（例えば、リソソーム貯蔵障害、神経変性疾患などを含む貯蔵障害）の障害の処置および予防のために有用な組成物および方法を特徴とする。
【００９２】
本発明は、本明細書に記載されているいくつかの発見に少なくとも一部、基づいている。ＨＳＣ移植を使用して貯蔵症および神経変性疾患を処置するための現在の方法は、移植細胞の子孫による常在性ミクログリアの置き換えが遅いため、ＣＮＳ疾患の兆候に及ぼす効果に乏しい。ＳＤおよび神経変性障害を罹患している患者へのＨＳＣ移植の現在の方法は、自己移植遺伝子治療法の場合、全骨髄もしくはアフェレティック（apheretic）生成物もしくは臍帯血の使用、または造血幹細胞および前駆細胞（ＣＤ３４発現に選択的なＨＳＰＣ）の使用を含む。ここで、ミクログリア再増殖活性に富む細胞集団は、これらの細胞源内で特定することができ、その使用は、移植後のドナーによるミクログリア再構成を最終的に改善することができる。さらに、脳室内注入（ＩＣＶ）を使用して脳に直接送達された造血幹細胞、および前駆細胞（ＨＳＰＣ）、またはＨＳＰＣプールの画分により、移植したドナー細胞によるミクログリア再構成の速度および程度が改善され、単回静脈内（ＩＶ）移植手法と比べて、脳への治療用タンパク質送達が向上する。したがって、この手法は、大きな治療可能性をもたらし、移植細胞によって、造血組織ではなく専らミクログリアの置き換えを目的とする先進的戦略のための、ＩＣＶ移植細胞のミクログリアへの広範な寄与を得るために最適化することができる。これは、神経炎症または神経変性刺激に応答する調節された治療的遺伝子発現のために、ミクログリアの分子工学操作を本明細書において開発する、新規な戦略と連携して大きく関連する。
【００９３】
本明細書において実証される通り、ＨＳＰＣ移植は、出生後の生理学的なミクログリア成熟を連想させる段階的プロセスにより、転写依存性の新規ミクログリアを発生させることができる。骨髄アブレーションレシピエントへの移植時の新しいミクログリアを発生させることが可能な造血細胞は、ヒトおよびマウスの長期造血幹細胞（ＨＳＣ）内に維持される。同様の転写依存性の新規ミクログリア細胞はまた、ＨＳＰＣの脳室内送達によって発生され得る。重要なことに、この新規な経路は、ＨＳＰＣの全身注入と比べて、臨床的に適切な一層迅速で範囲の一層広いミクログリアの置き換えを伴う。したがって、以下が示された：
・マウスおよびヒトの静脈内（ＩＶ）および脳室内（ＩＣＶ）でのＨＳＰＣ移植により、脳骨髄子孫が発生する。
・マウスおよびヒトＨＳＰＣのＩＣＶ送達により、ＩＶと比べて、一層迅速な速度およびより多くの量で、脳内に子孫骨髄細胞が発生する。
・ＩＣＶ注入したＨＳＰＣは、脳内で生着して拡張する一方、それらは、造血臓器中では生着しない。
・脳骨髄キメラ現象へのＨＳＰＣのＩＣＶ注入の寄与は、特定の条件において、ＩＶを共注入したＨＳＰＣへの寄与よりも勝ることができる。
・脳骨髄キメラ現象にＨＳＰＣをＩＶおよびＩＣＶ注入した寄与は、特定の条件では等価となり得る。
・ＩＶとＩＣＶ移植ＨＳＰＣの両方の子孫細胞は、ミクログリアに一致する転写プロファイルを有する。
・脳中における、ＩＣＶ注入されたＨＳＰＣの子孫細胞は、ＩＶ注入したＨＳＰＣの子孫よりもミクログリアに一層よく似ている。
・移植後マウスの脳実質に関連する造血細胞は、クローン形成および造血性再増殖可能性、ならびにミクログリア再構成可能性を有する。
・操作されたＨＳＰＣのＩＣＶ＋ＩＶ送達の組合せは、２つの代表的なＬＳＤに治療的関連性を有する。
・ＨＳＰＣのＩＣＶ＋ＩＶ送達の組合せは、同種異系移植状況において実現可能である。
・ＨＳＰＣの鞘内（ＩＴ）送達は、コンビナトリアルＨＳＰＣ移植戦略の文脈において、脳および造血キメラ現象に寄与することができる。
・特定のナノ粒子は、脳における目的領域において、ｃ−ｋｉｔ＋およびネスチン＋骨髄増殖性細胞によりアップロードされ得る。
・ナノ粒子は、効率的にエトポシドを封入することができる。
・エトポシドは、ＮＰに封入されると、標準製剤中よりむしろ、細胞死滅に有効である。
・Ｅｔｏ−ＮＰは、ミクログリア前駆体の増殖の誘発時に、マウス脳において、ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ４５＋細胞により取り込まれる。
・Ｅｔｏ−ＮＰは、ミクログリア前駆体の増殖の誘発時に、マウス脳において、ｃ−ｋｉｔ＋ＣＤ４５＋およびＣＤ４５＋細胞の早期アポトーシスを誘発することができる。
【００９４】
以前の検討は、ＣＮＳ常在性ミクログリア前駆体が存在し、ＨＣＴの前にそのアブレーションをすることが、ミクログリア再構成の定着にとって必須であるという仮説が立てられてきた。本明細書では、新規な手段の使用は、全身性およびＣＮＳキメラ現象、または移植細胞子孫による選択的ＣＮＳキメラ現象を発生させるため、これらの細胞を特定して、それらを移植する新規な方法について提案される。したがって、本発明は、以下のための新規な手段を提供する：
・移植に際し、脳の骨髄のキメラ現象および転写依存性の新規ミクログリア発生させるために使用される、ＨＳＰＣのプール内の、細胞の同定（「ミクログリア前駆体の機能的等価体」として定義）。
・持続性の脳および造血臓器のキメラ現象が、疾患の処置に必要となる場合、ミクログリア前駆体の機能的等価体の移植を行うために使用される最適経路および条件。
・選択的な脳のキメラ現象が疾患の処置に十分である、および／または必要となる場合、ミクログリア前駆体の機能時等価体の移植を行うために使用される最適経路および条件。
・ナノ担体を使用する、ミクログリア前駆体の局在化および標的化。
・選択的な脳の前処理のための、ミクログリア前駆体へのアブレーション薬物の標的送達。
・神経変性疾患に対する骨髄ＣＮＳ細胞／ミクログリア再構成のための先進的ＨＳＣ移植プロトコルの文脈における新規治療的戦略の実施。
【００９５】
本明細書に記載されている結果は、ＨＳＣ移植の最適化プロトコルは、疾患を受けたミクログリアを新規／治療的機能をもたらす新規細胞に置き換えることにより、例えば、貯蔵障害および神経変性疾患を含む、神経系疾患または中枢神経系の障害の処置に使用することができることを示す。このため、最適化されたミクログリア再構成手法によって神経変性疾患を処置するために使用されるよう、分子標的を特定した。したがって、以下が示された：
・マウスおよびヒトＬＴ−ＨＳＣは、ＩＶとＩＣＶ送達の両方の時に、脳骨髄子孫を発生させることができる。
・それほど成熟していないＫＳＬ画分は、ＩＣＶ送達時に、脳骨髄子孫の発生に寄与する。
・ＨＳＰＣプール内のμ前駆体の機能的等価体は、ＬＴ＿ＨＳＣ（マウス細胞とヒト細胞の両方）に含まれる。
・マウスのＨＳＰＣプールの内のμ前駆体の機能的等価体は、Ｆｄｇ５＋である。
・マウスのＨＳＰＣプールの内のμ前駆体の機能的等価体は、ＣＤ１１ｂ陰性である。
・マウスのＨＳＰＣプールの内のμ前駆体の機能的等価体は、ＣＸ３Ｃｒ１陰性である。
・μ前駆体の機能的等価体は、ＣＤ３４＋ヒトＨＳＰＣ内に含まれる。
・μ前駆体の機能的等価体は、ＣＤ３４＋ヒトＨＳＰＣのＣＤ３８−画分内で濃縮される。
【００９６】
造血細胞移植（ＨＣＴ）
最近の前臨床的および臨床的証拠により、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）、ならびに／またはそれらの子孫は、脳内における骨髄細胞集団の代謝回転に寄与することにより、治療分子が血液脳関門を通過して送達されるためのビヒクルとして働くことができることが示されている。しかし、移植後に再構成した細胞の分化および機能的特徴、特に、正真正銘のミクログリアが、評価される移植後のドナー細胞の子孫により再構成され得るかどうかは、依然として確立されていない。最近の３０年間で、造血細胞移植（ＨＣＴ）および造血幹細胞（ＨＳＣ）に基づく遺伝子治療法は、ペルオキシソーム障害およびリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）（Cartierら、Science  ３２６巻、８１８〜８２３頁（２００９年）；Biffiら、Science  ３４１巻、１２３３１５８頁（２０１３年）；Sessaら．Lancet  ３８８巻、４７６〜４８７頁（２０１６年））および神経変性疾患（Simardら、Neuron  ４９巻、４８９〜５０２頁（２００６年））などの、神経系に影響を及ぼす非血液学的および非オンコロジー疾患に罹患している患者にある程度の利益を伴って適用されてきた。これらの早期臨床的証拠は、臨床前の支持データと共に、造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）、ならびに／またはそれらの子孫は、治療分子が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して送達されるためのビヒクルとして働くことができることを示唆している。実際に、ＨＳＰＣおよび／またはそれらの子孫は、可能性として、ミクログリアであって、これらの障害の進行および転帰におけるその重要な役割が広範に記載されている、ミクログリアを含めた（Jeyakumarら  Brain  １２６巻、９７４〜９８７頁（２００３年）；Wadaら  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  ９７巻、１０９５４〜１０９５９頁（２０００年）；Ohmiら  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  １００巻、１９０２〜１９０７頁（２００３年）；Eichlerら  Ann  Neurol  ６３巻、７２９〜７４２頁（２００８年））、脳における骨髄細胞集団の代謝回転（Ajamiら  Nat  Neurosci  １０巻、１５３８〜１５４３頁（２００７年）；Ajamiら  Nat  Neurosci  １４巻、１１４２〜１１４９頁（２０１１年）；Biffiら  J.  Clin.  Invest.  １１６巻、３０７０〜３０８２頁（２００６年）；Mildnerら  Nat  Neurosci  １０巻、１５４４〜１５５３頁（２００７年）；Capotondoら  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  １０９巻、１５０１８〜１５０２３頁（２０１２年））に寄与することができる。重要なことに、移植に由来する細胞は、罹患した組織に一旦組み込まれると、すなわち、移植マウスまたは患者の脳内に治療分子を放出することによって、局所環境に都合よく影響を及ぼすことが証明された。この概念は、ＨＳＣ遺伝子治療法によって処置された、脱髄性のＬＳＤ異染性白質ジストロフィーに罹患した患者において実証された（Biffiら  Science  ３４１巻、１２３３１５８頁（２０１３年）；Sessaら  Lancet  ３８８巻、４７６〜４８７頁（２０１６年））。患者において欠損している、アリールスルファターゼＡ酵素の正常なまたは上記の正常な活性、およびその発現は、患者のＨＳＣおよびそれらの子孫に組み込まれたレンチウイルスベクター（ＬＶ）によって誘発され、処置された児童の脳脊髄液（ＣＳＦ）において、処置後の長い間、測定された（Biffiら  Science  ３４１巻、１２３３１５８頁（２０１３年）；Sessaら  Lancet  ３８８巻、４７６〜４８７頁（２０１６年））。留意すべきことに、酵素は、ＢＢＢそれ自体を効率的に通過することができない（Biffiら  J.  Clin.  Invest.  １１６巻、３０７０〜３０８２頁（２００６年）；Matznerら  Human  Molecular  Genetics  １４巻、１１３９〜１１５２頁（２００５年））。発症前の段階において処置された患者における顕著な臨床的利益に関連するこれらの知見は、患者の脳が遺伝子により修正されたＨＳＰＣ子孫細胞によって播種されることを正式に証明するものである。しかし、脳において、移植に由来する細胞の分化および機能的特徴、特に、正真正銘のミクログリアが、実証されるＨＣＴ後のドナー細胞の子孫により再構成され得るかどうかは、依然として確立されていない（Ajamiら  Nat  Neurosci  １０巻、１５３８〜１５４３頁（２００７年）；Capotondoら  Proc  Natl  Acad  Sci  USA．  １０９巻、１５０１８〜１５０２３頁（２０１２年）；Bennettら  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １１３巻、Ｅ１７３８〜１７４６頁（２０１６年））。
【００９７】
ミクログリアは、骨髄由来の骨髄単球のそれとは区別される発生学的起源を有するにもかかわらず（Ginhouxら  Science  ３３０巻、８４１〜８４５頁（２０１０年））、他のものおよび本発明者らは、最近、特定の実験条件下で、ミクログリア様表現型を示す、および一部のミクログリア表面マーカーを発現するドナー源の細胞は、ドナーＨＳＰＣを移植したマウスの脳で首尾良く発生し得ることを実証した。このことが再現性よく、かつ高い割合で発生するために必須なことは、機能的に規定されている脳常在性ミクログリアプレカーサーをアブレーションすることが可能な、アルキル化剤であるブスルファンに基づいた前処理レジメンの移植前投与である（Capotondoら  Proc  Natl  Acad  Sci  USA．  １０９巻、１５０１８〜１５０２３頁（２０１２年）；Wilkinsonら  Mol  Ther  ２１巻、８６８〜８７６頁（２０１３年））。この状況では、移植動物の脳中に見出されたドナー源の細胞は、移植の直後の脳に移動したＨＳＰＣの局所増殖および分化に由来することが示された。
【００９８】
ここでの検討で、よりよくこれらの事象を理解し、それらを、神経系疾患の処置のために臨床移行する可能性を高めることに向け、大きなステップが前に踏み出された。実際に、ブスルファンをベースとする前処理後のＨＳＰＣの投与を受けたマウスの脳において現れるドナー由来の骨髄細胞は、ミクログリアの形態および表面マーカーを共有するばかりでなく、非常に類似した転写プロファイルも共有することが最初に実証される。さらに、ゲノムワイド発現解析を使用することにより、移植したＨＳＰＣは、生理学的な出生後ミクログリア成熟の一部の態様を反復するプロセスにより、ミクログリア様子孫細胞を発生することが示されている。重要なことに、移植後ミクログリオーシスは、ＣＸＣＲ４発現により脳へのその輸送に好都合となり得る、マウスおよびヒトの早期造血幹細胞／前駆体に由来することが、やはり明確に証明された。最後に、ドナー源のミクログリア様細胞の発生は、ここでは、静脈内（endovenously）の代わりに、前処理マウスの脳の側脳室に直接、ＨＳＰＣを投与した際にも最初に得られる。留意すべきことに、全身性注入と比べて、臨床的に関連して迅速かつ一層範囲の広いミクログリアの置き換えを可能にする、この新規な送達経路により、ミクログリオーシスは、静脈内移植したＨＳＰＣによる脳の独立した播種に由来することができることが確認される（Capotondoら  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  １０９巻、１５０１８〜１５０２３頁（２０１２年））。
【００９９】
総合的に、この研究は、中枢神経系（ＣＮＳ）において治療作用を発揮することができる能力をもたらす新しい集団により、脳骨髄およびミクログリア細胞を更新するためにＨＳＰＣを使用する妥当性および実現可能性を支持するものであり、ミクログリオーシスへの移植細胞の実際の寄与を増大するため、濃縮した幹細胞画分の移植およびＨＳＰＣの直接的な脳への送達などの新規なモダリティを特定する。
【０１００】
貯蔵症（ＳＤ）
貯蔵障害（ＳＤ）は、正常なリソソームの機能の破壊を特徴とする遺伝性疾患のクラスを含み、エンドサイトーシスまたはオートファジーの後の分解を標的とする、不完全に分解した基質の蓄積をもたらす。基質自体のその後の蓄積またはリソソームにおける代替的な代謝経路の産生物の蓄積は、細胞の構造および機能に影響を及ぼし、細胞の機能不全または死亡に至らしめる。さらに、一次欠損は、二次応答によって頻繁に悪化する。これは、神経炎症が起こり、ミクログリアおよび星状細胞内の基質蓄積への一次反応、および／または一次ニューロンもしくは希突起神経膠細胞の損傷への炎症応答を呈する中枢神経系（ＣＮＳ）において特に関連性がある。
【０１０１】
ＳＤの例には、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）（ＧＭ１およびＧＭ２ガングリオシドーシスなど）、アルファ−マンノシドーシス、グロボイド細胞白質ジストロフィー（ＧＬＤ）、ニューロンセロイド脂褐素症（ＮＣＬ）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ムコ多糖症障害（ＭＰＳ）、多発性スルファターゼ欠損症（ＭＳＤ）、ニーマン−ピック病およびペルオキソーム貯蔵障害（副腎白質ジストロフィーなど）が含まれる。ＬＳＤの約５０％は、上に列挙された例の場合と同様に、ＣＮＳの障害（inovement）を有する。例示的なＳＤおよびそれらの関連する欠損タンパク質の非限定的なリストが、表１に提示されている。
【表１】
2019534898.tif 000006
【０１０２】
情報は、本発明において記載されているＨＳＣ移植プロトコルの使用に関する、具体的な関連のあるＬＳＤの一部を提供する。
【０１０３】
異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）
アリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）遺伝子における変異のために脱髄したＬＳＤである、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）は、神経系および二次神経炎症および変性における、未分解基質の進行性蓄積を伴うＬＳＤの原型例である。ＭＬＤの遺伝的伝播は、常染色体劣性であり、その全体的な出現率は、１：４０．０００〜１：１００．０００と見積もられている。
【０１０４】
重症かつ緩和することがない、運動および認知障害からなる臨床症状、および疾患進行が、早期発症臨床変形体において一層、重症であり、人生の最初の１０年以内に、通常、死亡する。ＭＬＤ患者の表現型と患者らが有するＡＲＳＡ変異のタイプとの間の相関は、最近に、実証されている（Cesaniら  Hum  Mutat  ３０巻、Ｅ９３６〜９４５頁（２００９年）；Cesaniら  Ann  Neurol  ７５巻、１２７〜１３７頁（２０１４年））。自己移植ＨＳＣ形質導入するためのレンチウイルスベクター、および全身性ブスルファン前処理への曝露を使用するＨＳＣ遺伝子治療法は、最も重症なＭＬＤ変形体により影響を受けた児童、および症状の発症前に処置を受けた児童において、疾患の兆候の予防または弱化に有効であることが示された（Biffiら  Science  ３４１巻、１２３３１５８頁（２０１３年）；Sessaら  Lancet  ３８８巻、４７６〜４８７頁（２０１６年））。
【０１０５】
グロボイド細胞白質ジストロフィー（ＧＬＤ）
クラッベ病としても公知のグロボイド細胞白質ジストロフィー（ＧＬＤ）は、重要なミエリン構成体である、ガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）の異化作用を触媒する、リソソーム酵素ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）の欠乏によって引き起こされる常染色体劣性ＬＳＤである。ＧＬＤは、１００，０００名の誕生に約１名で起こる。それは、通常、幼児の間に起こり、致死的な経路を迅速にとるが、発症が遅い希な形態も存在する。壊滅的な神経変性障害は、ＧＡＬＣ欠乏症により引き起こされる糖スフィンゴ脂質異化作用における変質によるものである。その結果生じた不完全に代謝されたＧａｌＣｅｒの蓄積は、ＣＮＳと末梢神経系（ＰＮＳ）の両方に影響を及ぼす、進行性白質脳疾患に至る。ガラクトシルスフィンゴシン（または、サイコシン）もまた、ＧＡＬＣの基質であり、病因において重要な役割を果たすと考えられている。ＧＬＤの児童は、発症前および４歳未満の時に、疾患発症を遅延させて兆候を弱化する、健常な適合ドナーからのＨＣＴによって、処置され得る（Escolarら  N  Engl  J  Med.  ３５２巻、２０６９〜２０８１頁（２００５年））。ＨＳＣ遺伝子治療法はまた、ＧＬＤ前臨床モデルにおいて、潜在的に有効であることが証明された（Gentnerら  Sci  Transl  Med  ２巻（２０１０年））。
【０１０６】
ムコ多糖症（ＭＰＳ）
ムコ多糖症（ＭＰＳ）は、グリコサミノグリカンを分解するために必要なリソソーム酵素がない、または機能不全していることによって引き起こされるＬＳＤの群である。ＭＰＳ  Ｉは、症状の重症度に基づいて、３つのサブタイプに分類される。３つのタイプは、酵素であるアルファ−Ｌ−イズロニダーゼが存在しない、またはそのレベルが不十分であることに起因している。ＭＰＳ  Ｉ  Ｈ（ハーラー症候群またはα−Ｌ−イズロニダーゼ欠乏症とも呼ばれる）は、ＭＰＳ  Ｉサブタイプの最も重症なものである一方、ＭＰＳ  Ｉ  Ｓ、すなわちシャイエ症候群は、ＭＰＳ  Ｉの最も軽度な形態である。ＭＰＳ  Ｉ  Ｈ−Ｓ（ハーラー−シャイエ症候群）は、ハーラー症候群単独ほど重症ではない。ＭＰＳ  ＩＩ、ハンター症候群またはイズロン酸スルファターゼ欠乏症は、酵素であるイズロン酸スルファターゼの欠乏により引き起こされる。ＭＰＳ  ＩＩＩである、サンフィリポ症候群は、重症な神経学的な症状が特徴である。サンフィリポ症候群の４つの個別のタイプが存在し、それぞれは、硫酸ヘパリンの糖鎖を完全に分解するために必要な様々な酵素の変質によって引き起こされる。サンフィリポＡは、ＭＰＳ  ＩＩＩ障害の最も重症なものであり、酵素であるヘパランＮ−スルファターゼの喪失または改変により引き起こされる。サンフィリポＡを有する児童は、ＭＰＳ  ＩＩＩ障害を有するものの中で、生存率が最も低い。サンフィリポＢは、酵素であるアルファ−Ｎアセチルグルコサミニナーゼの喪失または欠損により引き起こされる。サンフィリポＣは、酵素である、アセチル−Ｃｏアルファ−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼの喪失または改変に起因する。サンフィリポＤは、酵素であるＮ−アセチルグルコサミン６−スルファターゼの喪失または欠損により引き起こされる。
【０１０７】
ＭＰＳ  ＩＶであるモルキオ症候群は、硫酸ケラタンの糖鎖を分解するために必要な、酵素であるＮ−アセチルガラクトサミン６−スルファターゼ（タイプＡ）またはベータ−ガラクトシダーゼ（タイプＢ）の喪失または欠損から生じる。ＭＰＳ  ＶＩである、マロトーラミー症候群は、ハーラー症候群において見られる身体症状の多くを共有しており、酵素であるＮ−アセチルガラクトサミン４−スルファターゼの欠損により引き起こされる。ムコ多糖症の最も少ない共通の形態の１つである、ＭＰＳ  ＶＩＩであるスライ症候群は、酵素であるベータ−グルクロニダーゼの欠乏によって引き起こされる。
【０１０８】
一部のＭＰＳ患者は、健常な適合ドナーからのＨＣＴから利益を受けることが示された一方、一部のＭＰＳの場合、ＨＳＣ  ＧＴ戦略は、最適化されている（Visigalliら、Blood  １１６巻、５１３０〜５１３９頁（２０１０年））。
【０１０９】
ニューロンセロイド脂褐素症（ＮＣＬ）
ニューロンセロイド脂褐素症は、進行性神経学的変性に至る、遺伝性貯蔵障害のクラスである。乳児型ＮＣＬ（ＩＮＣＬ）などの一部の変形体は、リソソーム酵素の欠乏によって引き起こされる。ＩＮＣＬは、膜タンパク質の分解を担うリソソーム酵素である、ＰＰＴ１の欠乏に至るＣＬＮ２遺伝子における変異により引き起こされる。同様に、幼児後期のＮＣＬ（ＬＩＮＣＬ）は、リソソーム酵素ＴＰＰ１の欠乏による。ニューロンは、この貯蔵物質のリソソーム蓄積に特に敏感であり、ＩＮＣＬおよびＬＩＮＣＬを有する個体は、脳のすべての部分における広範な進行性神経変性を有しており、植物状態および８〜１２歳までに死亡する。
【０１１０】
Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）
Ｘ連鎖性副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）は、脳における進行性の炎症性脱髄を特徴とする、１：１７．０００の頻度で男性である代謝性遺伝性疾患である。染色体Ｘｑ２８に位置するＡＢＣＤ１遺伝子の変異が、関連ＡＬＤタンパク質の機能の喪失を決定し、これにより、ひいては、特に、脳および副腎皮質において、リソファチジルコリン（ＬＰＣ）などのリン脂質画分内の非分岐状の超長鎖飽和脂肪酸（ＶＬＣＦＡ）が蓄積する。Ｘ−ＡＬＤの表現型の変動は、ほとんどの場合は児童においてであるがＸ−ＡＬＤを有する成人でも進行性の神経学的減退を引き起こす脳炎症にリンクしているように思われる。脳の脱髄の開始は、複合体脂質におけるＶＬＣＦＡの量、およびミクログリア細胞によるその不十分な分解に、直接リンクし得る。したがって、血管周囲マクロファージが、脱髄性病変の最先端部に密接に追随し、ミエリン遺残の除去に重要な役割を果たすことが示されているにもかかわらず、ミクログリア細胞が異なる挙動を示し、同一領域にほとんど存在せず、周辺領域ではアポトーシス性となる（Eichlerら  Ann  Neurol  ６３巻、７２９〜７４２頁（２００８年））。Ｅｉｃｈｌｅｒらは、ミクログリアは、この領域において、ＶＬＣＦＡを分解することができず、ひいては、ミクログリア活性化およびアポトーシスを引き起こすことがあると推測した。ミクログリアの喪失および／またはミクログリア機能不全は、主に炎症誘発性サイトカイン（cytochine）（ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＩＬ−１ａ、ＣＸＣＬ８）の生成、および希突起神経膠細胞の欠失に対する神経保護性因子を供給する能力の改変のため、脱髄の早期段階において重要な役割を果たし得る。このシナリオでは、ミクログリア細胞は、大脳の脱髄の証拠を有するＸ−ＡＬＤ患者における、介入に対する適切な標的となり得る。このような見方では、ＨＳＣ移植（Aubourgら  N  Engl  J  Med  ３２２巻、１８６０〜１８６６頁（１９９０年））、およびより最近には遺伝子治療法（Cartierら  Science  ３２６巻、８１８〜８２３頁（２００９年）；Eichlerら  N  Engl  J  Med  doi:10.1056/NEJMoa１７００５５４（２０１７年））は、Ｘ−ＡＬＤに対する処置選択肢として調べられてきた。
【０１１１】
神経変性疾患
神経変性疾患は、ニューロンの構造および／もしくは機能の進行性喪失、ならびに／またはニューロンの細胞死を特徴とする神経系疾患のクラスである。炎症は、いくつかの神経変性疾患における役割に関与している。運動および感覚ニューロン、ならびに精神能力の進行性喪失とは、様々な種類の神経変性疾患に影響を受ける、外部物体に対する感覚情報を指す。神経変性疾患の非限定例には、ＡＬＳ、例えば、家族性ＡＬＳまたは散発性ＡＬＳ、およびアルツハイマー病が含まれる。
【０１１２】
ミクログリアと神経変性との間の関係が観察されている。ＡＬＳにおけるグリア細胞の活性化は、疾患進行、および他のＣＮＳ領域への病理の拡大において重要な役割を果たす。ＡＬＳにおけるミクログリア細胞の活性化異常により、神経毒性環境が再編される。ミクログリア細胞の活性化は、ＡＤ脳において、Ａβプラークの近接近部で見出される。
【０１１３】
医療専門家は、対象における神経変性疾患のうちの１つまたは複数の症状の評価によって、対象は神経変性疾患を有すると診断することができる。対象における神経変性疾患の非限定的な症状には、脚およびつま先の前部の持ち上げが困難になる；腕、脚、足またはくるぶしの脱力感；手の脱力感または不自由；不明瞭な言語；嚥下困難；筋肉痙攣；腕、肩および舌の単収縮；咀嚼困難；呼吸困難；筋肉麻痺；視力の部分または完全喪失；複視；身体部分のヒリヒリ感または疼痛；頭部の動きに伴って起こる電気ショック感覚；振戦；不安定歩行；倦怠感；めまい；記憶喪失；見当識障害；空間的関係の誤解釈；読み書き困難；集中および思考の困難；判断および決定の困難；慣れた作業の計画および実行が困難である；うつ；不安症；社会的離脱；情緒不安定；過敏性；攻撃性；睡眠習慣の変化；遊走性；認知症；自動運動の喪失；姿勢およびバランスの障害；筋肉の硬直；運動緩慢；眼動作の遅さおよび異常；不随意の振れまたはねじるような動き（舞踏病）；不随意の持続性筋肉拘縮（ジストニア）；柔軟性不足；衝動制御の欠如；および食欲変化が含まれる。医療専門家はまた、神経変性疾患の対象の家族歴に、一部基づいた診断に基づくことがある。医療専門家は、健康管理施設（例えば、クリニックまたは病院）に対象が現れた際に、対象を神経変性疾患を有すると診断することがある。一部の例では、医療専門家は、健康支援施設に対象が入院している間に、対象を神経変性疾患を有すると診断することがある。通常、医師は、１つまたは複数の症状が現れた後に、対象において神経変性疾患と診断する。
【０１１４】
処置の方法
本発明は、疾患および／もしくは障害、またはそれらの症状を処置する方法であって、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に、本明細書に記載されているミクログリア前駆体を含む治療有効量の医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。したがって、一実施形態は、疾患もしくは障害、またはそれらの症状に罹患しているか、あるいはこれらに罹患し易い対象を処置する方法である。本方法は、疾患または障害が処置されるような条件下で、疾患もしくは障害、またはそれらの症状を処置するのに十分となる、本明細書における細胞の治療量を哺乳動物に投与するステップを含む。
【０１１５】
本明細書における方法は、対象（このような処置を必要とするものとして特定された対象を含む）に、このような効果を生じるよう、有効量の、本明細書に記載されている細胞または本明細書に記載されている組成物を投与するステップを含む。このような処置を必要とする対象の特定は、対象または医療専門家の判断であってよく、主観的（例えば、意見）または客観的（例えば、試験法または診断法により測定可能である）であってよい。
【０１１６】
移植細胞の生着は、ポリペプチドまたは他の治療剤の発現または活性をもたらす。例えば、リソソーム酵素の機能の欠乏または喪失により、リソソーム貯蔵障害がもたらされる。静脈内に、または組換え方法によってのどちらか一方で治療用タンパク質（例えば、酵素）を発現する移植造血細胞は、ミクログリアに生着して分化し、これにより、酵素の欠乏症を治療する。さらに、移植細胞は、神経変性疾患において、治療ポリペプチド用のビヒクルとして働くことができる。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、生着は、既存のミクログリアをアブレーションすることにより増強される（例えば、アルキル化剤による）。特に、アルキル化剤のナノ粒子送達は、専ら脳中の移植細胞に由来するミクログリア前駆体の生着を可能にする環境の構築に有効となることがある。さらに、標準品または革新的経路による骨髄由来のミクログリア前駆体に富む集団の送達により、ドナー細胞または操作された細胞により、脳ミクログリアの持続的再構成が可能になる。
【０１１８】
本明細書における方法は、対象（このような処置を必要とするものとして特定された対象を含む）に、このような効果を生じるよう、有効量の、本明細書に記載されている化合物または本明細書に記載されている組成物を投与するステップを含む。このような処置を必要とする対象の特定は、対象または医療専門家の判断であってよく、主観的（例えば、意見）または客観的（例えば、試験法または診断法により測定可能である）であってよい。このような処置は、対象、特に、疾患、障害もしくはそれらの症状に罹患しているヒト、またはこれらを有するヒト、これらに罹患し易いヒト、またはこれらのリスクにあるヒトに好適に投与されるであろう。そのような「リスクのある」対象の決定は、診断試験、または対象もしくは医療供給者の意見により、客観的または主観的に行うことができる（例えば、遺伝子試験、酵素またはタンパク質マーカー、マーカー（本明細書で定義されている）、家族歴など）。本明細書における化合物はまた、任意の他の障害の処置に使用することもでき、多発性硬化症を含む、髄鞘形成欠乏または喪失が関与され得る。
【０１１９】
本発明は、細胞毒性剤を含むナノ粒子を送達し、および／またはミクログリア細胞もしくはその前駆体をアブレーションする方法であって、細胞毒性剤を含むナノ粒子を対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与するステップを含む、方法を提供する。
【０１２０】
一般に、「ナノ粒子」とは、１０００ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。ある特定の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、５００ｎｍまたはそれより短い最大寸法（例えば、直径）を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、２５ｎｍ〜２００ｎｍの間の範囲の最大寸法を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、１００ｎｍまたはそれより短い最大寸法を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、３５ｎｍ〜６０ｎｍの間の範囲の最大寸法を有する。本発明において包含されるナノ粒子は、例えば、固体ナノ粒子（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属）、非金属、脂質をベースとする固体、ポリマー）、ナノ粒子の懸濁液、またはそれらの組合せとして、様々な形態で提供され得る。金属ナノ粒子、誘電ナノ粒子および半導体ナノ粒子、ならびにハイブリッド構造体（例えば、コア−シェルナノ粒子）が調製されてもよい。半導体材料からなるナノ粒子は、電子エネルギーレベルの量子化が起こるほど十分に小さい場合（通常、１０ｎｍ未満）、それは、標識量子ドットとすることもできる。このようなナノスケールの粒子は、薬物担体またはイメージング剤として生物医学的用途に使用され、本発明の類似の目的に適合されてもよい。半固体ナノ粒子および軟質ナノ粒子が製造され、これらは本発明の範囲内にある。半固体天然物のプロトタイプナノ粒子は、リポソームである。様々なタイプのリポソームナノ粒子が、現在、抗がん薬およびワクチンの送達系として臨床的に使用されている。半分が親水性であり、もう半分が疎水性であるナノ粒子は、ヤヌス粒子と呼ばれ、特に、エマルションの安定化に有効である。それらは、水／油界面で自己集合し、固体界面活性剤として作用することができる。一実施形態では、自己集合性バイオ接着性ポリマーに基づくナノ粒子が企図され、これは、すべて脳への薬剤の経口送達、薬剤の静脈内送達、および薬剤の経鼻送達に適用可能である。疎水性薬物の経口吸収および眼送達などの他の実施形態もまた企図される。分子エンベロープ技術には、保護されて、疾患の部位に送達される操作されたポリマーエンベロープを含む（Mazzaら  ACS  Nano  ７巻、１０１６〜１０２６頁（２０１３年）；Siewら  Mol  Pharm  ９巻、１４〜２８頁（２０１２年）；Lalatsaら  J  Control  Release  １６１巻、５２３〜５３６頁（２０１２年）；Lalatsaら  Mol  Pharm  ９巻、１６６５〜１６８０頁（２０１２年）；Garrettら  J  Biophotonics  ５巻、４５８〜４６８頁（２０１２年）；Uchegbu、Expert  Opin  Drug  Deliv  ３巻、６２９〜６４０頁（２００６年）；Uchegbuら  Int  J  Pharm  ２２４巻、１８５〜１９９頁（２００１年）；Quら  Biomacromolecules  ７巻、３４５２〜３４５９頁（２００６年））。
【０１２１】
いくつかのタイプの粒子送達系および／または製剤が、生物医学用途の多様な範囲に有用であることが公知である。一般に、粒子は、全体として、その輸送および特性に関する単位として挙動する小さな物体として定義される。粒子は、直径に従い、さらに分類される。粗粒子は、２，５００〜１０，０００ナノメートルの間の範囲に及ぶ。微細粒子は、１００〜２，５００ナノメートルの間のサイズである。超微粒子、またはナノ粒子は、一般に、サイズが１〜１００ナノメートルの間である。１００ｎｍの境界値の基本は、粒子がバルク物質と区別される新規な特性が、通常、１００ｎｍ未満の限界長さスケールで発達するということである。
【０１２２】
本明細書で使用する場合、粒子送達系／製剤は、本発明による粒子を含む、任意の生物学的送達系／製剤として定義される。本発明による粒子は、１００ミクロン（．ｍｕ．ｍ）未満の最大寸法（例えば、直径）を有する任意の実体である。一部の実施形態では、本発明の粒子は、１０ｐ．ｍ．未満の最大寸法を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、２０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大寸法を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大寸法を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、９００ｎｍ、８００ｎｍ、７００ｎｍ、６００ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍまたは１００ｎｍ未満の最大寸法を有する。通常、本発明の粒子は、５００ｎｍまたはそれより短い最大寸法（例えば、直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、２５０ｎｍまたはそれより短い最大寸法（例えば、直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、２００ｎｍまたはそれより短い最大寸法（例えば、直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、１５０ｎｍまたはそれより短い最大寸法（例えば、直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、１００ｎｍまたはそれより短い最大寸法（例えば、直径）を有する。例えば、５０ｎｍまたはそれより短い最大寸法を有するより小さな粒子は、本発明の一部の実施形態において使用される。一部の実施形態では、本発明の粒子は、２５ｎｍ〜２００ｎｍの間の範囲の最大寸法を有する。
【０１２３】
粒子の特徴付け（例えば、形態学、寸法などの特徴付けを含む）は、様々な異なる技法を使用して行われる。一般的な技法は、電子顕微鏡法（ＴＥＭ、ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、動的光散乱法（ＤＬＳ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、マトリックス支援レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、紫外−可視分光法、二面偏波式干渉法および核磁気共鳴（ＮＭＲ）である。特徴付け（寸法測定）は、生来の粒子（すなわち、事前ロード）またはカーゴのロード後（本明細書において、カーゴとは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つまたは複数の構成成分、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素もしくはｍＲＮＡ、もしくはガイドＲＮＡ、またはそれらの任意の組合せを指し、追加の担体および／または添加剤を含むことができる）に関して行われ、本発明のｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ用途のいずれか向けの送達用の最適サイズの粒子をもたらす。ある特定の好ましい実施形態では、粒子寸法（例えば、直径）の特徴付けは、動的レーザー散乱（ＤＬＳ）を使用した測定に基づく。
【０１２４】
本発明の範囲内の粒子送達系は、以下に限定されないが、固体、半固体、エマルションまたはコロイド状粒子を含めた、任意の形態で提供されてもよい。したがって、本明細書に記載されている送達系のいずれも、本発明の範囲内の粒子送達系として提供され得る。
【０１２５】
抗体
本明細書において報告されている通り、（例えば、ミクログリア細胞またはそのプレカーサーの）マーカーに特異的に結合する抗体は、治療的方法を含めた、本発明の方法に有用である。特定の実施形態では、本発明は、ミクログリアをアブレーションする方法であって、ミクログリア細胞のマーカーに特異的に結合する捕捉分子を有する、および細胞毒性剤（例えば、アルキル化剤）を含有するナノ粒子にミクログリアを接触させるステップを含む、方法を提供する。
【０１２６】
抗体は、天然源または組換え源に由来する無傷免疫グロブリンであってよく、無傷免疫グロブリンの免疫反応性部分であってよい。抗体は、通常、免疫グロブリン分子の四量体である。四量体は、天然であってもよく、または単鎖抗体もしくは抗体断片から再構築され得る。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、無傷抗体分子だけではなく、免抗原−結合能力を保持する抗体分子の断片も意味する。このような断片はまた、当技術分野で周知であり、ｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方に、定期的に使用される。抗体断片の例には、以下に限定されないが、標的に対する十分な親和性を示す、ＶＬまたはＶＨドメインのどちらかからなる、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、ラクダ抗体などの単一ドメイン抗体（Riechmann、１９９９年、Journal  of  Immunological  Methods  ２３１巻：２５〜３８頁）、および抗体断片から形成される多重特異的抗体が含まれる。
【０１２７】
本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体およびヒト抗体を含めた、様々な形態で存在することができる（Harlowら、１９９９年、In:Using  Antibodies:A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、NY；Harlowら、１９８９年、In:Antibodies:A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor、New  York；Houstonら、１９８８年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８５巻：５８７９〜５８８３頁；Birdら、１９８８年、Science  ２４２巻：４２３〜４２６頁）。例えば、無傷抗体のＦｃ断片を欠くＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片は循環から一層迅速にクリアランスされ、無傷抗体ほど非特異的ではない組織結合を有することがある（Wahlら、J.  Nucl.  Med.  ２４巻：３１６〜３２５頁（１９８３年））。したがって、本発明の抗体は、非限定的に、全自然抗体、二重特異性抗体；キメラ抗体；Ｆａｂ、Ｆａｂ’、単鎖Ｖ領域断片（ｓｃＦｖ）、融合ポリペプチドおよび非慣用的抗体を含む。
【０１２８】
非慣用的抗体には、以下に限定されないが、ナノボディ、線状抗体（Zapataら、Protein  Eng．  ８巻（１０号）：１０５７〜１０６２頁、１９９５年）、単一ドメイン抗体、単鎖抗体、および多原子価を有する抗体（例えば、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディおよびペンタボディ）が含まれる。ナノボディは、軽鎖の非存在下で、完全に機能的となるよう進化した天然重鎖抗体の最小断片である。ナノボディは、慣用的な抗体の親和性と特異性を有するが、それらは、単鎖Ｆｖ断片のサイズの半分しかない。安定性が著しく高いこと、およびヒト抗体フレームワークと相同性の程度が高いことを兼ね備えた、この特異的な構造の結果は、ナノボディが、慣用的な抗体に接近できない、治療標的に結合することができるということである。複数の原子価を備えた組換え抗体断片は、がん細胞に対して、高い結合親和性および固有の標的特異性をもたらす。これらのｓｃＦｖ多量体（例えば、ダイアボディ、テトラボディ）は、サイズが約６０〜１００ｋＤａの低分子が、より迅速な血液クリアランスおよび迅速な組織取り込みを達成するので、親抗体よりも改善をもたらす。Powerら、（Generation  of  recombinant  multimeric  antibody  fragments  for  tumor  diagnosis  and  therapy.  Methods  Mol  Biol、２０７巻、３３５〜５０頁、２００３年）；およびWuら（Anti-carcinoembryonic  antigen(CEA)diabody  for  rapid  tumor  targeting  and  imaging.  Tumor  Targeting、４巻、４７〜５８頁、１９９９年）を参照されたい。
【０１２９】
非慣用的抗体を作製して使用するための様々な技法が記載されている。ロイシンジッパーを使用して生成した二重特異性抗体は、Kostelnyらによって記載されている（J.  Immunol.  １４８巻（５号）：１５４７〜１５５３頁、１９９２年）。ダイアボディ技術は、Hollingerらによって記載されている（Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ９０巻：６４４４〜６４４８頁、１９９３年）。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイナの使用により二重特異的抗体断片を作製するための別の戦略が、Gruberらによって記載されている（J.  Immunol.  １５２巻：５３６８頁、１９９４年）。三重特異的抗体は、Tuttらによって記載されている（J.  Immunol.  １４７巻：６０号、１９９１年）。単鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Hustonら（Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA、８５巻：５８７９〜５８８３頁、１９８８年）によって記載されているペプチドをコードするリンカーによって直接結合している、またはこれにより結合しているＶＨ−およびＶＬ−コード配列を含めた、核酸から発現され得る、共有結合により連結されているＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を含む。米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号および同第４，９５６，７７８号；ならびに米国特許公開第２００５０１９６７５４号および同第２００５０１９６７５４号も参照されたい。
【０１３０】
様々な実施形態では、抗体はモノクローナルである。代替的に、抗体はポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体の調製および使用は、当業者にやはり公知である。本発明はまた、ハイブリッド抗体も包含し、一対の重鎖および軽鎖が、第１の抗体から得られる一方、もう一方の対の重鎖および軽鎖は、異なる第２の抗体から得られる。このようなハイブリッドはまた、ヒト化重鎖および軽鎖を使用して形成され得る。このような抗体は、多くの場合、「キメラ」抗体と呼ばれる。
【０１３１】
一般に、無傷抗体は、「Ｆｃ」および「Ｆａｂ」領域を含有すると言われる。Ｆｃ領域は、補体活性化に関与し、抗原結合には関与しない。そこからＦｃ’領域が酵素により開裂されるか、またはＦｃ’領域なしに産生される抗体（「Ｆ（ａｂ’）２」断片と表示される）は、無傷抗体の抗原結合部位の両方を保持している。同様に、そこからＦｃ領域が酵素により開裂されるか、またはＦｃ領域なしに産生される抗体（「Ｆａｂ’」断片と表示される）は、無傷抗体の抗原結合部位の１つを保持している。Ｆａｂ断片は、共有結合している抗体軽鎖、および抗体重鎖の一部（「Ｆｄ」と表示される）からなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主要決定因子である（単一Ｆｄ断片は、抗体特異性が改変されることなく、最大で１０本の異なる軽鎖と結合し得る）。単離したＦｄ断片は、免疫原性エピトープに特異的に結合する能力を保持する。
【０１３２】
抗体を調製する方法は、免疫学の科学の当業者に周知である。抗体は、可溶性ポリペプチド、または免疫源としてその免疫原性断片を利用する、当技術分野において公知の方法のいずれかによって作製され得る。抗体を得る方法の１つは、免疫原を好適な宿主動物に免役すること、およびポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生するための標準的手順に従うことである。免抗原は、細胞表面上の免抗原の提示を促進するであろう。好適な宿主の免疫処置は、いくつかの方法で実行することができる。ポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする核酸配列は、宿主の免疫細胞により摂取される、送達用ビヒクルで、宿主に供給され得る。細胞は、次に、ポリペプチドを発現して、それにより、宿主における免疫原性応答を生じる。代替的に、ヒトポリペプチドまたはその免疫原性断片をコードする核酸配列は、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞中で発現され、次いで、ポリペプチドを単離して、抗体が成長する好適な宿主にポリペプチドを投与することができる。
【０１３３】
代替的に、抗体は、所望の場合、抗体ファージディスプレライブラリから誘導されてもよい。バクテリオファージは、細菌に感染すること、およびその内部での増殖が可能であり、この細菌は、ヒト抗体遺伝子と組み合わされて、ヒト抗体タンパク質を提示するよう操作され得る。ファージディスプレイは、その表面上にヒト抗体タンパク質を「提示する」よう作製されるプロセスである。ヒト抗体遺伝子ライブラリに由来する遺伝子は、ファージの集団に挿入される。ファージはそれぞれ、様々な抗体に対する遺伝子を有し、こうして、その表面に異なる抗体を提示する。
【０１３４】
当技術分野において公知の任意の方法により作製された抗体は、次に、宿主から精製することができる。抗体精製方法は、塩沈殿（例えば、硫酸アンモニウムによる）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン性または陰イオン性交換カラム上、好ましくは中性ｐＨで実施し、イオン強度を向上させた段階グラジエントにより溶出）、ゲルろ過クロマトグラフィー（ゲルろ過ＨＰＬＣを含む）およびアフィニティー樹脂上でのクロマトグラフィー（プロテインＡ、プロテインＧ、ヒドロキシアパタイトおよび抗免疫グロブリンなど）を含むことができる。
【０１３５】
抗体は、抗体を発現するよう操作されているハイブリドーマ細胞から都合よく産生され得る。ハイブリドーマを作製する方法は、当技術分野で周知である。ハイブリドーマ細胞は、好適な媒体中で培養することができ、消費した媒体は、抗体源として使用され得る。次に、目的の抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体を産生するハイブリドーマから得ることができ、次に、この抗体は、合成により、またはこれらのＤＮＡ配列からの組換えにより産生することができる。抗体の大量の産生に関すると、一般に、腹水を得るのに一層便利である。腹水を増加させる方法は、一般に、免疫学的にナイーブな組織適合性または免疫耐性哺乳動物、とりわけマウスにハイブリドーマ細胞を注入するステップを一般に含む。哺乳動物は、好適な組成物（例えば、プリスタン）の投与前までに、腹水生成用に準備が整えられていてもよい。
【０１３６】
本発明の方法によって産生されるモノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、当技術分野において公知の方法によって、「ヒト化」することができる。「ヒト化」抗体は、配列の少なくとも一部が、その初期形態から改変されて、ヒト免疫グロブリン様に一層近くなった抗体である。抗体をヒト化する技法は、特に、非ヒト動物（例えば、マウス）抗体が産生される場合、特に有用である。マウス抗体をヒト化する方法の例は、米国特許第４，８１６，５６７号、同第５，５３０，１０１号、同第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号および同第５，８５９，２０５号に提示されている。
【０１３７】
組換えポリペプチド発現
本発明のポリペプチドを発現するため、本明細書に記載されている方法のいずれか、または当技術分野で公知の方法によって得られたＤＮＡ分子は、当技術分野で周知の技法によって、適切な発現ベクターに挿入することができる。例えば、二本鎖ＤＮＡは、合成ＤＮＡリンカーの使用を含む制限酵素の連結によって、または平滑末端ライゲーションによって、好適なベクターにクローニングすることができる。ＤＮＡリガーゼは、ＤＮＡ分子をライゲーションするために通常、使用され、望ましくない結合は、アルカリホスファターゼによる処置によって回避することができる。
【０１３８】
したがって、本発明は、本明細書に記載されている核酸分子（例えば、遺伝子、または遺伝子をコードする組換え核酸分子）を含むベクター（例えば、組換えプラスミド）を含む。用語「組換えベクター」は、組換えベクターが誘導される生来または天然の核酸分子に含まれているものよりも、多量の、少量のまたは異なる核酸配列を含有するよう、改変、修飾または操作されたベクター（例えば、プラスミド、ファージ、ファスミド（phasmid）、ウイルス、コスミド、フォスミドまたは他の精製核酸ベクター）を含む。例えば、組換えベクターは、調節配列、例えば本明細書で定義されている、プロモーター配列、ターミネータ配列などに操作可能に連結されている、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその断片を含むことができる。それらに含まれる遺伝子または核酸の発現を可能にする組換えベクターは、「発現ベクター」と呼ばれる。
【０１３９】
本明細書に記載されている本発明の分子の一部では、本発明の１つまたは複数のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する１つまたは複数のＤＮＡ分子は、原核生物の宿主細胞に所望のＤＮＡ分子を組み込むことが可能な、１つまたは複数の調節配列に操作可能に連結されている。導入されたＤＮＡによって安定的に形質転換された細胞は、例えば、発現ベクターを含有する、宿主細胞の選択を可能にする、１つまたは複数のマーカーを導入することにより選択することができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現される核酸配列に直接連結することができるか、または同時トランスフェクトによって同じ細胞に導入することができる。追加的な要素はまた、本明細書に記載されているタンパク質の最適合成に必要となり得る。どの追加の要素を使用するかは、当業者に明白と思われる。
【０１４０】
特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する際の重要な要因は、以下に限定されないが、ベクターを含有するレシピエント細胞が認識されて、ベクターを含有しないそのようなレシピエント細胞から選択されることが容易であること、特定の宿主において所望のベクターの複製数、および異なる生物種の宿主細胞間のベクターを「シャトルさせる（shuttle）」ことが可能となることが望ましいかどうかを含む。
【０１４１】
ベクターが、一旦、発現用のＤＮＡ配列を含むよう構築されると、以下に限定されないが、例えば、変換、トランスフェクト、コンジュゲート、プロトプラスト融合、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロ注入などを含めた、当技術分野で公知の好適な様々な方法の１つまたは複数により、適切な宿主に導入されてもよい。
【０１４２】
１つまたは複数のベクターの導入の後、宿主細胞を、ベクター含有細胞の成長のために選択する、選択培地において、通常、成長させる。組換えタンパク質の発現は、ウエスタンブロット解析、イムノブロットおよび免疫蛍光法を含めた、免疫アッセイにより検出され得る。組換えタンパク質の精製は、当技術分野において公知であるかまたは本明細書に記載されている方法のいずれか、例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィーおよび電気泳動を含む任意の従来の手順によって行うことができる。タンパク質を精製するために使用され得る、さらなる精製手順は、標的タンパク質に結合するモノクローナル抗体を使用する、アフィニティークロマトグラフィーである。一般に、組換えタンパク質を含有する粗製調製物は、好適なモノクローナル抗体が固定されているカラムに通す。タンパク質は、通常、不純物が通過している間、特異的抗体を介してカラムに結合する。カラムの洗浄後に、タンパク質は、例えば、ｐＨまたはイオン強度を変えることによってゲルから溶出する。
【０１４３】
治療効力を評価する方法
手法の１つでは、処置の効力は、例えば、処置された臓器の生物学的機能（例えば、ニューロンの機能）を測定することにより評価される。このような方法は、当技術分野において標準的なものであり、例えば、Textbook  of  Medical  Physiology（第１０版）（Guytonら、W.B.  Saunders  Co.、２０００年）に記載されている。特に、本発明の方法は、組織または臓器の生物学的機能を、少なくとも、５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％向上させ、または３００％、４００％もしくは５００％も高く向上させることさえある。好ましくは、組織は、ニューロン組織であり、好ましくは臓器は脳である。
【０１４４】
別の手法では、本発明の方法の治療効力は、対応する対照組織または臓器（例えば、処置を受けなかった組織または臓器）と比べて、処置組織または臓器における、細胞数の増加を測定することによりアッセイされる。好ましくは、組織または臓器中の細胞数は、対応する組織または臓器に対して、少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１５０％または２００％、増加する。細胞増殖をアッセイする方法は、当業者に公知であり、例えば、Bonifacinoら（Current  Protocols  in  Cell  Biology  Loose-leaf、John  Wiley  and  Sons,  Inc.、San  Francisco、Calif.）に記載されている。例えば、細胞増殖のためのアッセイは、細胞複製中、ＤＮＡ合成の測定を含むことがある。一実施形態では、ＤＮＡ合成は、［３Ｈ］−チミジンまたは５−ブロモ−２＊−デオキシウリジン［ＢｒｄＵ］などの標識ＤＮＡプレカーサーを使用して検出し、これらを細胞（または動物）に加えて、次に、細胞周期のＳ期（複製）の間に、ゲノムＤＮＡへのこれらのプレカーサーへの取り込みを検出する（Ruefli-Brasseら、Science  ３０２巻（５６５０号）：１５８１〜４頁、２００３年；Guら、Science  ３０２巻（５６４４号）：４４５〜９頁、２００３年）。
【０１４５】
キット
本発明は、神経系疾患、または中枢神経系（例えば、貯蔵障害、リソソーム貯蔵障害、神経変性疾患など）の障害の処置もしくは予防のためのキットを提供する。一実施形態では、キットは、治療ポリペプチドを発現する単離造血幹細胞を含有する組成物を含む。別の実施形態では、キットは、内因性ミクログリア細胞のアブレーション前処理のためのナノ粒子を含む。
【０１４６】
一部の実施形態では、キットは、治療用または予防用細胞組成物を含有する滅菌容器を含む。このような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、管、バッグ、ポーチ、ブリスターパック、または他の好適な当技術分野で公知の容器形態であってよい。このような容器は、プラスチック製、グラス製、ラミネート紙、金属箔、または医薬を保持するのに好適な他の物質から作製され得る。
【０１４７】
所望の場合、本発明の薬剤は、神経系疾患、もしくは中枢神経系の障害を有する、またはこれらを発症するリスクにある対象に、薬剤を投与するための指示書と一緒に供給される。指示書は、一般に、疾患もしくは障害の処置または予防のための組成物の使用に関する情報を含む。他の実施形態では、指示書は、以下：治療剤の説明、神経系疾患またはその症状の処置または予防のための投与量スケジュールおよび投与、注意、警告、適応症、対応適応（counter-indication）、過剰投与情報、有害反応、動物薬理学、臨床検討および／または参照文献のうちの少なくとも１つを含む。指示書は、容器（提供される場合）に直接印刷されていてもよく、または容器にラベルとして貼り付けられてもよく、または容器内もしくは容器に付随した個別のシート、パンフレット、カードまたはホルダーであってよい。
【０１４８】
本発明の実施は、特に示さない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学という従来の技法を使用し、これらは、当業者の範囲内に十分ある。このような技法は、「Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual」、第２版（Sambrook、１９８９年）；「Oligonucleotide  Synthesis」（Gait、１９８４年）；「Animal  Cell  Culture」（Freshney、１９８７年）；「Methods  in  Enzymology」、「Handbook  of  Experimental  Immunology」（Weir、１９９６年）；「Gene  Transfer  Vectors  for  Mammalian  Cells」（MillerおよびCalos、１９８７年）；「Current  Protocols  in  Molecular  Biology」（Ausubel、１９８７年）；「PCR:The  Polymerase  Chain  Reaction」（Mullis、１９９４年）；「Current  Protocols  in  Immunology」（Coligan、１９９１年）などの文献において、十分に説明されている。これらの技法は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に適用され、こうして、本発明を作製および実施する際に考慮されてもよい。特定の実施形態に関する特に有用な技法は、以下に続く、項目において記載されている。
【０１４９】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニングおよび治療方法の作製および使用方法の完全な開示および説明を当業者に提供するよう提示されており、本発明者がその発明として見なすものに関する範囲に限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１５０】
（実施例１）
マウスＨＳＰＣの脳室内注入により、脳内の迅速かつ強固な骨髄細胞生着がもたらされる。
最近の結果（Capotondoら、PNAS  ２０１２年）により、ＨＣＴ後の脳において骨髄細胞の再構成を得るために、骨髄造血ニッチにおける生着および永続的なドナーキメラ現象が必ずしも必要とされないことが提唱されている。これらの知見に基づいて、骨髄およびミクログリア様細胞の再構成が、前処理マウスにおける脳室空間にＨＳＰＣの直接移植に際し起こるかどうかを評価した。マウス系統陰性（Ｌｉｎ−）ＨＳＰＣ（３×１０５個の細胞）を、ＧＦＰをコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）で標識し、骨髄アブレーション用ブスルファン用量または致死照射に曝露した後に、マウスにＩＣＶ注入することにより移植した（図１Ａ）。興味深いことに、移植により、ＩＣＶ移植マウスのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋脳骨髄コンパートメントにおいて、移植細胞の局所増殖に由来すると考えられる、ＧＦＰキメラ現象が高度に、かつ次第に増大した（図１Ｂ）。各時間点および状態に関して、ＧＦＰ＋ＨＳＰＣをＩＶ移植した対照マウスを比較条件として使用した。留意すべきことに、ミクログリア再構成の速度は一層迅速になり、ＧＦＰ＋  ＨＳＰＣをＩＣＶ移植した場合、ＩＶと比べて、ＧＦＰキメラ現象の程度は高かった（図１Ｂ）（細胞投与の経路の有意な効果および時間は、二元配置ＡＮＯＶＡ解析により示した）。これは、ＩＶと比較して、細胞をＩＣＶ移植する数が少なくなることを考慮すると驚くべきことである。ＩＶ注入の場合のように、ブスルファンにより事前処置されたレシピエントマウスは、ＩＣＶ細胞移植すると、照射動物と比べて、より高い脳脊髄ドナーキメラ現象を示した。
【０１５１】
ＩＣＶ移植マウスの細胞注入の反対側からの矢状面の脳区域の免疫蛍光解析により、レシピエントマウス脳全体に分布した、ＧＦＰを発現する多量のドナー由来細胞となることが一貫して実証された（図１Ｃ）。ＧＦＰ＋Ｉｂａ１＋分岐実質細胞は、小型クラスターに多くの場合、分類され、最高のＧＦＰ＋細胞存在率を、嗅球中、視床下部領域、基底核、脳室下帯および周辺領域、線条体において、および橋において回収した（図１Ｄ）。重要なことに、ＧＦＰ＋細胞の形態は、移植の比較的短期間（４５〜６０日）後に既に分岐構造および薄いプロセスが細胞本体から出ており、柔組織内ミクログリア細胞の形態に類似していた。
【０１５２】
（実施例２）
ヒトＨＳＰＣの脳室内注入により、脳内の迅速かつ強固な骨髄細胞生着がもたらされる。
この現象の臨床的関連性に対する洞察を得るため、前処理した免疫不全動物モデルにおいて、ヒトＨＳＰＣがＩＣＶ送達時にミクログリア様細胞を発生する能力を試験した。ＩＣＶまたはＩＶヒトＣＤ３４＋細胞は、ＧＦＰをコードするＬＶを形質導入した臍帯血から単離して、ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊＩ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに注入した（図１Ｅ）。さらに、治療分子が脳に送達されるための移植の可能性の増大時の、ＩＣＶ細胞移植の実際の役割を決定するため、免疫不全背景でアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）欠乏症のために、リソソーム疾患である異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）を再現する、新しく生成したマウスモデルであるＲａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／を使用した。これらのマウスは、ＩＶ注入単独もしくはＩＣＶ注入単独によって、またはＩＶ経路とＩＣＶ経路との組合せによって、ＡＲＳＡをコードするＬＶを形質導入したヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞の投与を受けた（Biffiら、Science  ３４１巻、１２３３１５８頁（２０１３年）；Sessaら、Lancet  ３８８巻、４７６〜４８７頁（２０１６年））（図１Ｅ）。
【０１５３】
興味深いことに、明確に定義されたヒト骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞子孫は、ＩＶ移植とＩＣＶ移植の両方の後で、長期間、移植マウスの脳内で特定された（図１Ｆ）。ＩＣＶ細胞の送達により、ＩＶ送達と比較して、脳中でのヒト細胞生着がより多くなった（図１Ｇ）。ＩＶと組み合わせたＩＣＶ細胞の送達により、脳中でさらに一層多くのヒト細胞が生着した（図１Ｇ）。すべての試験済み移植状況において、ヒト細胞は、細胞蛍光分析において、ミクログリアマーカーであるＣＸ３ＣＲ１およびＣＤ１１ｂをかなり発現した（図１Ｆ）。生着した細胞は、脳実質内に分布し、ミクログリア細胞の形態的特徴を示した。生着細胞はまた、Ｉｂａ１およびＣＤ１１ｂ（図１Ｈ）マーカーを発現したが、マクロファージに大部分関連するＣＤ６８およびＣＤ１６３を発現しなかった（図１Ｈ）。ＩＣＶ送達の場合、子孫細胞は、特定されて、同一領域内の小型クラスターに通常、分類され、この場合、ＩＣＶ移植したマウスのＨＳＰＣの子孫細胞が、すなわち脳室下帯で特定された。
【０１５４】
（実施例３）
ＩＣＶ注入したＨＳＰＣは、脳内で生着および拡張する一方、それらは、造血臓器中では生着しない。
ＧＦＰ標識したＬｉｎ−  ＨＳＰＣをＩＶまたはＩＣＶ移植したマウスの短期間のフローサイトメトリーのモニタリングによって、レシピエント動物の脳中にＩＣＶにより送達された細胞の存在、持続性および適度な拡張が実証された（図２Ａ）。反対に、ＩＣＶ移植マウスの骨髄では、検出された無視できる量のＧＦＰ＋細胞しか検出されなかった（＜１％）（図２Ｂ）。ＧＦＰ＋細胞は、早期造血マーカー（図２Ｃ）を一過的に上方調節し、この後、ＣＤ１１ｂ、ＣＸ３ＣＲ１およびＣＤ１１５ミクログリアマーカーを、内因性ミクログリアに類似するレベルまで上方調節した（図２Ｄ）。ＧＦＰ−ＣＤ４５＋内因性細胞は、ブスルファン処置の可能な効果として、ＣＤ１１５を一過的に、およびわずかに下方調節した（図２Ｄ）。
【０１５５】
（実施例４）
コンビナトリアル移植プロトコルの最適化により、適切な臨床用途について、ＩＶ対ＩＣＶ移植細胞の寄与をモジュレートすることが可能になる。
前処理したレシピエントにおいて、細胞および遺伝子治療法に関するＩＣＶ細胞送達の開発は、様々な予想される標的疾患に従い、移植条件の最適化を必要とする。目的とする疾患による様々な目標により適合可能な様々な選択肢が適用可能となる。特に、以下の２つのシナリオを考えることができる：
Ａ）ミクログリア再構成を効率的かつ迅速にすることを目標とするため、ｉ）修正した自己移植遺伝子、またはｉｉ）全身性および神経性障害を伴うＳＤの処置のための健常ドナーの移植後ＨＳＣによる、造血組織（ＣＮＳ外骨髄集団を含む）とミクログリア両方の再構成；この手法に適合可能な疾患の例には、ＭＬＤ、ＧＬＤ、ＭＰＳＩ、ＭＰＳＩＩおよびＭＰＳＩＩＩが含まれる。
Ｂ）専ら神経障害または神経変性疾患を有するＳＤを処置するため、移植後の自己移植遺伝子修正ＨＳＣによる、ミクログリアの再構成；この手法に適合可能な疾患の例には、ＩＮＣＬ、ＧＭ１ガングリオシド蓄積症、ＰＤ、ＡＬＳ、ＡＤが含まれる。
【０１５６】
ドナー源の細胞により脳骨髄集団を更新するために、これらの２つの状況において使用される有効なプロトコルを開発するため、本発明者らは、様々なタイミングで（ＩＶおよびＩＣＶ移植は同日に送達するか、ＩＣＶ後５日目にＩＶ送達する）、ＩＶ移植（起源、およびＬｉｎ−、ｃ  ｋｉｔ＋Ｓｃａ１＋Ｌｉｎ−（ＫＳＬ）細胞および全ＢＭにおける成熟段階に基づいて区別する）およびＩＣＶ移植（Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣ）する細胞を差次的に標識した（図３Ｂおよび３Ｇ）。これらの状況では、ＩＣＶ移植細胞の子孫は、ＣＮＳに限定されたままであり、造血組織において、すなわちＢＭにおいて有意なレベルで検出されなかった（図３Ｄおよび３Ｈ）。重要なことに、ＨＳＰＣのＩＣＶとＨＳＰＣ、またはＫＳＬ、または全ＢＭの組合せ送達により、試験状況のそれぞれにおいて、Ｌｉｎ−をＩＶのみとなる対照条件と比較して、脳骨髄細胞キメラ現象が増大した。さらに：
Ａ）脳骨髄キメラ現象へのＩＶおよびＩＣＶ注入ＨＳＰＣの寄与は、特定の条件において等しかった；特に、ＩＣＶとＩＶの細胞子孫の両方からなる、脳キメラ現象による脳およびＢＭのレベルにおける細胞のより大きなキメラ現象が、ＩＶとＩＣＶの両方でＬｉｎ−  ＨＳＰＣを組み合わせて、両方の部位において、同日に細胞を移植することによって実現された；類似した結果が、Ｌｉｎ−  ＩＣＶを全ＢＭのＩＶと組み合わせることにより得られた一方、すべての試験条件において、わずかに低いキメラ現象がＫＳＬ  ＩＶの使用に伴った；こうして、このプロトコルを、図６に記載されている、ＭＬＤまたはＭＰＳ  ＩＩなどの条件に適用することができた。移植細胞／その子孫の脳の生着を留める帯域を成長させる際に意図される組合せ／共移植手法としてのこのプロトコルの臨床移行に関して、本発明者らは、以下の選択肢を想定する：遺伝子治療法の場合、各疾患に対して目的の遺伝子をコードするベクターを形質導入した、自己移植ＣＤ３４＋細胞である、Ｌｉｎ−細胞のヒト等価体を、同日に、ＩＣＶとＩＶの両方で移植する。同種異型の健常ドナー細胞を使用した場合、ドナーＣＤ３４＋細胞は、ＩＣＶ投与される一方、未操作骨髄またはアフェレティック生成物のどちらか一方は、ＩＣＶ移植の同日に、ＩＶ移植される。
Ｂ）ＩＣＶ注入したＨＳＰＣの脳骨髄キメラ現象への寄与は、特定の条件における、ＩＶで共注入したＨＳＰＣの寄与よりも勝る。特に、ＩＶ細胞子孫による脳キメラ現象への最低の寄与は、５日目に、ＩＣＶ移植したＬｉｎ−細胞とＩＶ移植した全ＢＭ細胞との組合せにおける、高いキメラ現象の値の文脈において実現された；このプロトコルにより、ＩＣＶ細胞子孫のキメラ現象をほとんど独占的に得ることができ、こうして、図７Ａ〜７Ｅに記載されている、ＩＮＣＬなどのＣＮＳ障害だけに関連する条件に適用される。移植した操作された細胞／その子孫の専ら脳への、多くのしっかりした生着を促すことを意図した組合せ／共移植手法として、このプロトコルの臨床移行に関して、本発明者らは、以下の選択肢を想定する：各疾患に対して、目的の遺伝子をコードするベクターを形質導入した自己移植ＣＤ３４＋細胞は、ＩＣＶ移植される一方、未操作自己移植骨髄／アフェレティック生成物を、同日に、または理想的にはＩＣＶ注入後の５日目のどちらかにＩＶ注入し、ＩＣＶ移植細胞との競合をさらに低下させる；本発明者らは、移植細胞の造血生着が、ドナーの耐容性の定着に必要となる、同種異型状況におけるこのプロトコルの使用を予期していない。
【０１５７】
（実施例５）
ＩＶとＩＣＶ移植したＨＳＰＣの両方の子孫細胞は、ミクログリアに一致する転写プロファイルを有する。
ＨＣＴ後の脳骨髄細胞のドナー再構成は、早期脳のＨＳＰＣ移入物の一部が局所拡張および分化して、骨髄アブレーションしたレシピエントの脳における都合のよい条件を見出す結果であることが示された（Capotondoら  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  １０９巻、１５０１８〜１５０２３頁（２０１２年））。移植後の脳骨髄細胞は、新生マウスの脳から単離された骨髄細胞と抗原特徴を共有する（図３Ｂおよび４Ｂ）。実際に、両方の状況において、ミクログリア（ＴＡμ）を一過的に増幅するものとして、本発明者らにより既に記載された、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂｌｏｗ骨髄細胞が多量に存在する。興味深いことに、移植マウス脳に由来するＴＡμ細胞は、移植後フェーズの早期に、ドナー要素が高度にかつ優先的に濃縮される（図４Ｂ）一方、後期移植後段階においてのみ、抗原特徴および形態特徴に基づいてミクログリア（μ）として特定された、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋／ｈｉｇｈ細胞内で、類似の高いレベルのドナーキメラ現象が観察される（Capotondoら  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  １０９巻、１５０１８〜１５０２３頁（２０１２年））。興味深いことに、本発明者らは、ＩＣＶ注入したＨＳＰＣのＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂｈｉｇｈＧＦＰ＋μ子孫は、ＴＡμ細胞に対して、類似しているが、前者の全体的に一層高い寄与の存在下では、ＩＶ注入した細胞のμ子孫よりも多量であることを観察した（図４Ａ）。これらの知見を解釈して、ドナー由来細胞をさらに特徴付けるため、本発明者らは、ブルスルファン前処理後にＧＦＰ＋ＨＳＰＣを９０日間早くＩＣＶまたはＩＶ移植したマウスから、ならびに成体およびｐ１０対照動物からのμおよびＴＡμ細胞（合計集団および／またはＧＦＰ＋対ＧＦＰ−画分）（図４Ｂ）をＦＡＣＳで分類した。先に特定したミクログリア遺伝子は、分類した脳骨髄細胞に対して、および対照の成体動物からの骨髄マクロファージに対して、リアルタイムＰＣＲ（Ｔｍｅｍ１１９、Ｔｇｆｂｒ１、Ｐ２ｒｙ１３、Ｍｅｒｔｋ、Ｏｌｆｍｌ３）により増幅した（Bennetら、Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  of  the  United  States  of  America  １１３巻、Ｅ１７３８〜１７４６頁（２０１６年）；Butovskyら、Nature  neuroscience  １７巻、１３１〜１４３頁（２０１４年）；Chiuら、Cell  Rep  ４巻、３８５〜４０１頁（２０１３年）；Hickmanら、Nature  neuroscience  １６巻、１８９６〜１９０５頁（２０１３年）；Grommesら、Journal  of  neuroimmune  pharmacology  ３巻、１３０〜１４０頁（２００８年））。ＩＣＶおよびＩＶ移植マウスの脳から単離された細胞を、ミクログリア遺伝子発現プロファイルと比較し、テューキーの事後検定によるＡＮＯＶＡ  Ｐ値を得た。興味深いことに、ＩＣＶおよびＩＶ移植マウスの脳から単離した細胞は、マクロファージよりも、対照マウスから単離したμ細胞のレベルと同様のレベルで、これらの遺伝子の発現を示した（図４Ｃ）。さらに、μとＴＡμの画分内において、ＩＣＶ移植したＨＳＰＣのＧＦＰ＋子孫は、ＩＶ移植マウスからの成人対照μおよび（ＧＦＰ−およびＧＦＰ＋）μのそれとは非常に類似した発現レベルとなることを示した。選択された遺伝子は、ＩＶ移植マウス（特に、ＧＦＰ＋）のＴＡμ集団、およびｐ１０マウスから単離したＴＡμにおいて、わずかに低いレベルで発現した。この���とはすべて、ｉ）ＩＶ移植とＩＣＶ移植の両方のＨＳＰＣの子孫細胞は、ミクログリアと一致した転写プロファイルを有すること、およびｉｉ）脳におけるＩＣＶ注入したＨＳＰＣの子孫細胞は、ＩＶ注入したＨＳＰＣの子孫よりも一層ミクログリアに類似していることを示している。
【０１５８】
（実施例６）
移植マウスの脳に由来する骨髄細胞は、成熟ミクログリアの機能的特徴との類似性を示す。
移植マウスからのμおよびＴＡμ細胞と、対照のナイーブな動物から回収した成熟μとの間のトランスクリプトーム差異を解析するため、ゲノムワイド発現解析を、ＧＦＰを発現するＨＳＰＣを３か月早く移植したマウスから、ならびに成体およびｐ１０対照ナイーブマウスからの分類したμおよびＴＡμ集団に対して、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＲＮＡ−Ｓｅｑプラットフォームにより行った（図４Ｄおよび４Ｅ）。それらの遺伝子発現の差異を試験するため、得られた発現データセットを、Ｇｏｓｓｅｌｉｎおよび共同研究者からのもの（Gosselinら、Cell  １５９巻、１３２７〜１３４０頁（２０１４年））と一緒に単離し、Ｂｕｔｏｖｓｋｙにより特定された２３９の遺伝子に特に着目した（Butovskyら、Nature  neuroscience  １７巻、１３１〜１４３頁（２０１４年））（図４Ｄおよび４Ｅ）。興味深いことに、すべてのミクログリア試料は、互いに近いクラスター化させたこの解析に含み（図４Ｄおよび４Ｅ）、移植後に再構成されたμおよびＴＡμ細胞は、ミクログリアのそれと一致した遺伝子発現のパターンを共有することが確認された。ＧＳＥＡ事前ランク付けした解析（Subramanianら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０２巻、１５５４５〜１５５５０頁（２００５年））に連携した差次的遺伝子発現を、ＲＮＡ−Ｓｅｑデータに対して行った（図５Ａ〜５Ｆ）。成体対照対μからのμ（図５Ａ）、および移植マウスからのＴＡμ（図５Ｃ）に富む、生じた遺伝子のオンコロジー生物学的プロセスは、免疫細胞の分化、免疫応答、ＤＮＡ／ＲＮＡプロセス、およびＤＮＡのメチル化、対照μの成熟免疫機能への指定に関連した。一方、移植マウス（図５Ｂ）からのμ細胞に富むプロセスは、ニューロンの移動、分化およびシナプス可塑性の調節などのニューロン関連プロセスの範囲に及んだ（Colonna  and  Butovsky、Annu  Rev  Immunol、（２０１７年）；Tayら、J  Physiol  ５９５巻、１９２９〜１９４５頁（２０１７年））。濃縮されるプロセスの中で、本発明者らはまた、グリア細胞分化、グリオーシス、ならびに代謝および細胞呼吸を見出し、移植に由来するμ細胞は、ニューロン環境と相互作用する／これらに影響を及ぼす（これは、かなりの量のエネルギーを消費するプロセスである）傾向が一層強いという考えを支持している（Miyamotoら、Front  Cell  Neurosci  ７巻、７０頁（２０１３年））。移植後ＴＡμ濃縮プロセス（図５Ｄ）は、μ細胞に関する成熟の様々な推定上の段階の基礎をなす一層、強い神経機能シグネチャを提示し、ミクログリアが、その成熟状態に従い、様々な機能を必要とするという概念と一致する（Matcovitch-Natanら、Science  ３５３巻、ａａｄ８６７０頁（２０１６年））。興味深いことに、移植マウスからのμおよびＴＡμ細胞は、ミクログリアの発達の間に強固にモジュレートされることが示された遺伝子を発現する（Matcovitch-Natanら、Science  ３５３巻、ａａｄ８６７０頁（２０１６年））。留意すべきことに、移植動物からのμは、成熟ミクログリア機能に関連する５つの選択遺伝子のうちの４つの発現レベルに関して、対照μと一致した一方、異なる経路が、移植マウス（図５Ｅおよび表２）からのＴＡμにおいて、および新生段階（図５Ｆおよび表２）に関連する遺伝子において観察され、可能性として、異なるおよび動的な成熟段階に関連した。
【表２】
2019534898.tif 000007
【０１５９】
（実施例７）
ナイーブな、または移植後マウスの脳実質に関連する造血細胞は、クローン形成および造血性再増殖可能性、ならびにミクログリア再構成可能性を有する。
ＨＳＰＣは、髄外組織内で特定され、それらの部位で一過的に局在化すると考えられ、局部的に増殖することができ、組織常在性骨髄細胞、優先的には樹状細胞を生じる。クローン形成可能性は、これらの細胞が脳内にも存在するためだとされたが、並体結合対の定着時、他の骨髄外組織に観察されるものと異なって、２種の動物間のキメラ現象は、脳中で観察されなかった。このことは、脳クローン形成活性が、ミクログリア前駆体の場合に仮説が立てられているように、並体結合対において、キメラ現象に適合可能ではない固定組織細胞に帰することができることを示唆する可能性がある。したがって、脳においてクローン形成可能性を有する細胞をよりよく特徴付けること、ならびに前処理マウスにおいて、これらが移植可能かどうか、ならびに前処理時のアブレーションおよびＨＳＣ移植時の置き換えに適合可能かどうかを評価することを試みた。さらなる研究はまた、これらの（hese）細胞が、実際に、ミクログリアの再増殖可能性を有するかどうかの判定時に意図される。単核細胞は、ＧＦＰ−ＬＶを形質導入した系統ＨＳＰＣを添加しない、または添加した、ナイーブマウスおよび致死性骨髄アブレーションの投与を受けた動物（ブスルファンまたは照射の前処理による）の骨髄および脳（造血系統細胞のパーコール濃縮時）から単離した（図６Ａ）。これらの細胞は、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を得るためにサイトカイン（citokyne）を補充したメチルセルロース中でプレート培養した。プレート培養して１４日後に、予期されるように、離散性の造血コロニーを骨髄から、およびナイーブマウスに由来する脳培養物から回収した（図６Ｂ）。ブスルファンおよび照射前処理時に、骨髄と脳組織の両方からＣＦＵアウトプットの劇的な低下が観察され、ブスルファンのより大きな効果が、脳のＣＦＵアウトプットに関して記録された。重要なことに、ＣＦＵアウトプットは氷中で回復し、骨髄と脳の両方において、ＨＳＰＣ移植（図６Ｃ）時に前処理から回収した。両方の部位のＧＦＰ＋コロニーにおいて、ＣＦＵアウトプットはキメラ度が高く、このことは、ＨＳＰＣ移植が、固定化された脳造血性クローン形成性前駆体に寄与し得ることを示している。一次移植レシピエントからの骨髄および脳のパーコール濃縮単核細胞もまた、ブスルファン前処理レシピエントへの二次移植に使用した（図６Ａ）。驚くべきことに、一次レシピエントに由来するＧＦＰ＋細胞は、移植後、長期の、二次レシピエントの造血組織および脳において特定された（図６Ｄ）。造血組織常在性ＧＦＰ＋細胞は、多系統マーカー発現を示した一方、脳常在性細胞は、ほとんどＣＤ１１ｂ発現性であった。
【０１６０】
（実施例８）
操作されたＨＳＰＣのＩＣＶ＋ＩＶの組合せ送達は、神経変性およびＣＮＳ外特徴を有する代表的なＬＳＤである、異染性白質ジストロフィーに対する治療的妥当性を有する。
治療分子が脳に送達されるための移植の可能性の増大において、ＩＣＶ細胞移植の実際の役割を決定するため、免疫不全背景で、ＡＲＳＡ欠乏のために、リソソーム疾患ＭＬ）を再現する、新しく生成したマウスモデルであるＲａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／を使用した。これらのマウスは、ＡＲＳＡをコードするレンチウイルス（ＬＶ）を形質導入したヒト臍帯血  ＣＤ３４＋細胞を、ＩＶ単独注入もしくはＩＣＶ単独注入で、またはＩＶ経路とＩＣＶ経路との組合せにより投与を受けた（Biffiら、Science  ３４１巻、１２３３１５８頁（２０１３年）；Sessaら、Lancet  ３８８巻、４７６〜４８７頁（２０１６年））（図１Ｄおよび図６Ａ）。興味深いことに、明確に定義されたヒト骨髄（ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞子孫が、ＩＶ移植とＩＣＶ移植の両方の後で、長期間、移植マウスの脳内で特定された（図１Ｄ〜１Ｇ）。ＩＣＶ細胞の送達により、ＩＶ送達と比較して、脳中でのヒト細胞生着がより多くなった（図１Ｇ）。ＩＶと組み合わせたＩＣＶ細胞の送達により、脳中でさらに一層多くのヒト細胞が生着した（図１Ｇ）。次に、Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−マウスの脳におけるより大きなヒト細胞骨髄キメラ現象が、脳へのＡＲＳＡ酵素のより大きな送達を決めるかどうかを評価した。重要なことに、ＩＣＶ移植ヒトＨＳＰＣの脳骨髄キメラ現象への寄与の増大により、移植マウスの脳により大きなＡＲＳＡ酵素送達がもたらされた（図１Ｇ）。これは、特に、ＩＶ＋ＩＣＶの組合せ送達の場合に顕著であり、この送達により、Ａｓ２＋／＋対照とは区別が付かないレベルに到達した。移植の１６週間後、同程度の、正常を超えるＡＲＳＡ活性レベルが、形質導入細胞をＩＶ単独で、またはＩＶ＋ＩＣＶ移植したマウスの骨髄において測定された（図６Ｂ）。興味深いことに、酵素活性の回復もまた、移植マウスの脳において測定され、ＩＶおよびＩＣＶによる組み合わせで形質導入細胞の投与を受けた動物において、野生型レベルに近づく有利な増大傾向を伴った（図６Ｂ）。このデータにより、移植手法を組み合わせると、標準的なＩＶ移植手法と比較して、脳への酵素送達が一層大きくなり、こうして、ＣＮＳ障害を有するＳＤに対するＨＳＣ遺伝子治療法の総合的な治療的可能性を向上させる有望な戦略と思われることが実証される。さらに、ＨＳＰＣのＩＣＶ単独送達は、ＩＶ細胞送達としてＭＬＤ脳に同量の治療酵素を送達するのに十分であることが示されている。
【０１６１】
共移植により、造血系において酵素活性は増大しなかった。理論によって拘泥されることを意図するものではないが、このことは、ＩＣＶ送達された細胞の寄与は、ＣＮＳ外造血集団よりもむしろ、脳に大部分、制限されたことを示している。
【０１６２】
この動物モデルの短い生存間隔および短期間におけるその表現型の限定される重症度により、脳ＡＲＳＡ送達の増大の表現型作用の評価が阻まれた。しかし、ＬＶ形質導入したＨＳＣ（ＨＳＣ遺伝子治療法）をＭＬＤマウス（Biffiら、J.  Clin.  Invest.  １１６巻、３０７０〜３０８２頁（２００６年）；Biffiら、J.  Clin.  Invest.  １１３巻、１１１８〜１１２９頁（２００４年））および患者（Biffiら、Science  ３４１巻、１２３３１５８頁（２０１３年）；Sessaら、Lancet  ３８８巻、４７６〜４８７頁（２０１６年））、ならびに他のリソソーム蓄積症モデル（Gentnerら、Sci  Transl  Med  ２巻、５８ｒａ８４（２０１０年）；Visigalliら、Blood  １１６巻、５１３０〜５１３９頁（２０１０年））に投与すると、用量効果の関係が存在し、造血細胞および脳において酵素活性の再構成が高まるほど、ＣＮＳ疾患の兆候の制御に治療効力が向上することが実証される。したがって、ＩＣＶ細胞の送達の使用は、遺伝子により修正されたＨＳＰＣの移植の治療的効力を増強する可能性を有する。
【０１６３】
（実施例９）
野生型ＨＳＰＣの組合せＩＣＶ＋ＩＶ送達は、神経変性およびＣＮＳ外特徴を有する代表的なＬＳＤである、ＩＩ型ムコ多糖症における治療的関連性を有する。
これらの知見、特に脳に治療分子を送達するため、および脳と全身性障害の両方を有するＬＳＤに対する利益を発揮するため、ＨＳＰＣ移植の可能性を増大する際のＩＣＶ細胞移植の実際の役割を確認するため、ＩＩ型ムコ多糖症（ＭＰＳ  ＩＩ）のマウスモデルである、２か月齢の骨髄アブレーションしたイズロン酸スルファターゼ（ＩＤＳ）−／−レシピエントに、Ｌｉｎ−  ＨＳＰＣおよび全ＢＭを野生型ドナーから移植した（図６Ｃ）。ＩＶ単独のマウスは、野生型ＩＤＳ＋／＋ドナーのＩＶから専ら全ＢＭを受けた。対照は、未処置のままにした。１８０日後、処置マウスおよび対照マウスの挙動を、ロータロッドによって試験した。興味深いことに、両方の処置（tretament）により、４回の試行にわたりマウスのロータロッド成績が改善し（図６Ｄ）、ＩＶとＩＣＶ＋ＩＶの両方で処置したマウスは、第１の試験と比べて、第４回目でロッド上で消費した時間が増加した（図６Ｅ）。しかし、ＩＣＶ＋ＩＶで処置したマウスの成績は、ＩＶ単独の移植動物の成績を超えた。理論によって拘泥されることを意図するものではないが、このことは、ＩＣＶ細胞の送達の使用は、ＭＰＳ  ＩＩにおいて、野生型ＨＳＰＣの移植の治療的効力を増強する可能性を有することを示している。
【０１６４】
（実施例１０）
マウスにおけるＨＬＡマイナーおよびＭＨＣ抗原不一致ＨＳＰＣ  ＩＶ＋ＩＣＶ移植は、実現可能であり、高い脳ドナーキメラ現象に関連する。
患者における、同種異型移植の文脈におけるＩＣＶ  ＨＳＰＣ移植手法の適用可能性、特に、マイナー抗原とＭＣＨ不一致移植状況との両方の文脈におけるＩＣＶおよびＩＶ移植の組合せを評価した。不一致ドナーからの造血細胞移植を受けたマウスにおける、全生存およびＣＮＳミクログリア生着に及ぼす同種異型ＨＳＰＣのＩＣＶ送達の影響を試験した。ＭＣＨ不一致（Ｂ６．ＳＪＬ  ＣＤ４５．１レシピエントへはＢＡＬＢ／ｃＪ  ＣＤ４５．２ドナー；１つの細胞のＩＣＶ用量を試験した、３×１０５個の細胞／マウス）、およびマイナー抗原不一致（ＭＨＣ一致；Ｂ６．ＳＪＬ  ＣＤ４５．１レシピエントへのＢＡＬＢ＿Ｂ  ＣＤ４５．２ドナー；２つのＩＣＶ細胞用量を試験した、３×１０５および１×１０６／マウス）移植状況の文脈においてＩＣＶ＋ＩＶ  ＨＣＴを適用した。−１日目に、レシピエントマウスの前処理に全身体照射（ＴＢＩ）（１０００Ｒａｄ）を使用した。マウスは、新しい全骨髄（ｔＢＭ）のみの投与を受けるか、またはＩＣＶ注入したＧＦＰ形質導入Ｌｉｎ−細胞と一体にした（図８Ａおよび９Ａ）。移植後、それらのマウスを最大で９〜１０週間（マイナー抗原不一致）および１６週間（ＭＨＣ不一致）、追跡した。レシピエントにおいて、希なインターカレント死（inter-current  death）（ＩＣＤ）が観察され、特定の処置に関連するものではなかった（図８Ｂおよび９Ｂ）。生存動物はすべて、体重の安定な増加および総合的な良好な健康を有した。ＰＢ、ＢＭ、脾臓および胸腺（マイナー抗原不一致移植の場合、後者の胸腺）に関する、サイトフローメトリック解析により、ドナー細胞の生着の成功が実証された（図８Ｃおよび９Ｃ）。重要なことに、ＩＣＶ移植したＨＳＰＣの子孫であるＧＦＰ＋細胞は、試験した造血組織において検出されなかった（図８Ｄおよび９Ｄ）。ＩＶのみのレシピエントと比べると、ＩＶ＋ＩＣＶでのマイナー抗原不一致動物により、脳内のドナー由来細胞からの用量依存的生着が実証された。両方のマイナー抗原およびＭＨＣ不一致動物において、ＨＳＰＣのＩＣＶ送達は、ＩＶのみの移植と比べて、ＣＮＳにおけるドナー由来ミクログリアキメラ現象に利点をもたらした。結論として、側脳室への同種異型造血幹細胞／前駆細胞の送達は、組合せ送達法で実現可能であり、マイナー不一致およびＭＨＣ不一致状況の両方において、脳内のドナー由来キメラ現象を増強することができる。このデータは、ＣＮＳ関連利点を強めるために、同種異型の造血細胞移植手順の文脈において、ＩＣＶ移植が適用可能であることを支持する。
【０１６５】
（実施例１１）
ＨＳＰＣの鞘内送達は、コンビナトリアルＨＳＰＣ移植戦略の文脈において、脳および造血キメラ現象に寄与することができる。
ＨＳＰＣのクモ膜下送達は、ＩＣＶ細胞送達と同様に、ＣＮＳドナーキメラ現象に寄与することができるかどうかを評価した。Ｌｉｎ−ＨＳＰＣは、ＣＤ４５．２ドナーマウスから単離し、これに、ＧＦＰをコードするＬＶを形質導入した。形質導入後、細胞をＣＤ４５．１骨髄アブレーションしたレシピエントにＩＶ（１．０×１０６個の細胞／マウス）で、ＩＣＶ８（０．３×１０＾６個の細胞／マウス）またはクモ膜下（ＩＴ）（０．３×１０６個の細胞／マウス）で移植した。移植の５日後、ＩＣＶおよびＩＴ移植マウスに、ｍＣｈｅｒｒｙをコードするＬＶを形質導入したＣＤ４５．１ドナーからの全ＢＭ細胞を与えた（図１０Ａ）。マウスは、移植して４５日目に犠牲にした。ＨＳＰＣ（ＣＤ４５．２  ＧＦＰ＋）の高いおよび同等な生着が、ＩＶおよびＩＴ移植マウスのＢＭにおいて観察された一方、ＩＣＶ移植マウスのＢＭでは、ＣＤ４５．２  ＧＦＰ＋細胞はまったく（または、非常に低くしか）観察されなかった（図１０Ｂ、左のグラフ）。ＩＣＶ移植マウスは、ｍＣｈｅｒｒｙ＋  ＣＤ４５．１  ＢＭ移植細胞の良好なＢＭ生着を示した一方、ＩＴ移植マウスでは、同じ細胞は、恐らく０日目に移植したＣＤ４５．２  ＧＦＰ＋  ＨＳＰＣとの競合のために、ほとんど生着しないことを示した。すべての群の脳骨髄コンパートメントにおいて生着したＣＤ４５．２  ＧＦＰ＋  ＨＳＰＣを解析し（図１０Ｂの中央のグラフ）、ＩＣＶ＋ＩＶ注入マウスは、他の群と比べて、最高のドナーキメラ現象を示した。ＩＶ移植細胞のｍＣｈｅｒｒｙ＋  ＣＤ４５．１細胞子孫が、ＩＣＶ移植マウスにおいて観察された。すべての群の脊髄骨髄コンパートメントにおいて生着したドナー（ＧＦＰ＋ｍＣｈｅｒｒｙ）細胞を解析し（図１０Ｂの右側グラフ）、ＩＣＶ＋ＩＶ注入マウスは、他の群と比べて、最低のＧＦＰキメラ現象を示した。ＩＴのマウスと比べて、ＩＣＶ移植マウスでは、ｍＣｈｅｒｒｙ＋  ＣＤ４５．１  ＢＭ移植細胞の割合の増加が観察された。全体として、これらのデータにより、脳内および移植レシピエントの脊髄の両方において、骨髄細胞の再構成を達成するために、ＨＳＰＣに関するさらなる投与経路として、ＩＴを使用することができることが示される。ＩＣＶおよびＩＶのみの送達（deliveyr）はまた、ドナーによる顕著な脊髄キメラ現象に関連している。ドナー細胞を移植したＩＴはまた、末梢血液および骨髄に専ら観察され、このことは、ＩＴは、移植に際しＣＮＳにおいて保持されないことを示している。したがって、この移植手順は、特に、ＣＮＳと全身性障害の両方を有するそのような疾患の場合に、考慮することができる。
【０１６６】
（実施例１２）
早期造血幹細胞／前駆細胞に由来する、移植後脳骨髄細胞
ＨＳＰＣ内のｃ−ｋｉｔ＋、Ｓｃａ−１＋、Ｌｉｎ−（ＫＳＬ）画分は、ＩＶ移植に際しマウスの脳における、ＴＡμおよびμを生じさせることができる一方、ｃ−ｋｉｔおよびＳｃａ−１（Ｎｏｔ−ＫＳＬ）に対する二重陽性ではないＬｉｎ−前駆細胞は、そうではない（Capotondoら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０９巻、１５０１８〜１５０２３頁（２０１２年））。この知見は、骨髄脳細胞代謝回転への移植細胞の差次的寄与の可能性を評価するため、ＩＶ（図１１Ｄ）およびＩＣＶ（図１１Ｅ）経路の両方を使用して、個々の動物における、差次的に標識したＫＳＬおよびｎｏｔ−ＫＳＬ細胞を共移植することによる厳密な競合状況でさらに調べた（図１１Ａ、１１Ｄおよび１１Ｅ）。ＫＳＬ細胞は、ｎｏｔ−ＫＳＬをＩＶ注入した場合、ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋骨髄脳細胞；ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂｈｉｇｈμ細胞；ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋／ｌｏｗ一過性増幅μ−ＴＡμ細胞；ＣＤ４５ｈｉｇｈＣＤ１１ｂｈｉｇｈ  ＣＮＳ関連マクロファージ、ＣＮＳｍａｃとして特定される、様々な脳骨髄細胞集団（図１１Ｄ）にほとんど独占的に寄与した（Capotondoら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０９巻、１５０１８〜１５０２３頁（２０１２年））。ＫＳＬおよびｎｏｔ−ＫＳＬ細胞は、ＩＣＶ注入した場合、代わりに、脳骨髄細胞再構成に同程度に寄与した（図１１Ｅ）。脳骨髄細胞の生着に寄与するよう、ＳＬＡＭマーカーであるＣＤ１５０およびＣＤ４８の差次的発現により、ＫＳＬコンパートメント内で特定された、差次的に標識した部分集団の能力に取り組んだ（図１１Ａ、１１Ｂ）。競合的ＩＶ移植に際し、ＣＤ４８−／ＣＤ１５０＋長期間ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）およびＣＤ４８−／ＣＤ１５０−多能性前駆体（ＭＰＰ）に比べ、他の注入集団よりも、脳骨髄コンパートメントを再構成する能力が最高となることを示した（図１１Ｆ）。対照的に、より強くコミットしたＣＤ４８＋ＣＤ１５０−細胞もまた、マウス移植ＩＣＶの脳骨髄集団の再構成に寄与した（図１１Ｇ）。移植マウスの造血再構成は、図１１Ｃに示されている。ＩＶおよびＩＣＶ移植マウスからの脳の凍結スライスに関する組織学により、これらの結果が確認された（図１１Ｈおよび１１Ｉ）。これまでの知見に一致して、これらの状況においても、ドナー由来細胞は、薄いプロセスが細胞本体から出ている分岐形態を示し、骨髄マーカーＩｂａ−１およびＣＤ１１ｂを発現した（図１１Ｈおよび１１Ｉ）。
【０１６７】
これらの知見を解釈するため、ＨＳＣの動員およびＢＭへのホーミングに関与することが周知のＣＸＣＲ４受容体の発現（Darら、Experimental  hematology  ３４巻、９６７〜９７５頁（２００６年）；Rettigら、Leukemia  ２６巻、３４〜５３頁（２０１２年）；Sugiyamaら、Immunity  ２５巻、９７７〜９８８頁（２００６年））を、ＫＳＬ、ｎｏｔ−ＫＳＬ細胞および上記の４つのＫＳＬ部分集団に関して解析した（移植時の形質導入の終わりに細胞を解析した）。興味深いことに、ＩＶ注入状況における、ミクログリア様細胞の再構成可能性、すなわちＫＳＬ、ＬＴ−ＨＳＣおよびＭＰＰにおいて濃縮した細胞は、ｎｏｔ−ＫＳＬおよびＨＰＣ−１およびＨＰＣ−２と比べて、一層高いレベルでＣＸＣＲ４を発現した（図１１Ｊ）。理論によって拘泥されることを意図するものではないが、この知見は、高いレベルの細胞でＣＸＣＲ４を発現する細胞は、ＩＶ注入時の脳への早期動員に有利となり得、したがって、脳骨髄細胞のキメラ現象に寄与する能力に有利となり得る。これは、異なるシグナルが重要となり得る場合、ＩＣＶ送達に適用することはできない。
【０１６８】
正真正銘のＨＳＣが、競合がない場合に、ＩＣＶ移植に際し新しいミクログリア様細胞を発生することができるかどうかを一層厳密に評価するため、ＬＴ−ＨＳＣを、代替マーカー、およびＦｇｄ５−Ｚｓｇｒｅｅｎ動物におけるＦｇｄ５発現の機能的シグネチャにより単離した（Gazitら、J  Exp  Med  ２１１巻、１３１５〜１３３１頁（２０１４年））。実際に、Ｆｇｄ５緑色リポータ株は、ＨＳＣ活性に非常に富む細胞を確実に単離することを可能にする。５００の正真正銘のＨＳＣは、Ｚｓｇｒｅｅｎ＋、系統−、ｃ−ｋｉｔ＋、Ｓｃａ１＋、Ｆｌｋｔ−２−、ＣＤ３４−細胞としてＣＤ４５．２  Ｆｇｄ５−Ｚｓｇｒｅｅｎドナーから単離し、未操作全骨髄ＣＤ４５．１支持体と共に、ブスルファン前処理または致死照射ＣＤ４５．１レシピエントマウスに、ＩＶまたはＩＣＶ移植した（図１２Ａ）。ＩＶ細胞送達により、強固な造血ドナーキメラ現象に至った一方、ＩＣＶ注入細胞は、末梢血液において造血作用に寄与しなかった。興味深いことに、ＩＣＶ移植動物は、末梢血液キメラ現象を示さなかったが、ドナー由来ＣＤ４５．２＋細胞は、両方の移植状況で、脳内で特定された（図１２ＢおよびＣ）。脳骨髄細胞の再構成は、上記の通り、ブスルファン−アブレーションしたレシピエントよりもむしろ、照射したレシピエントでは、それほど有効ではないことが確認された（Capotondoら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０９巻、１５０１８〜１５０２３頁（２０１２年））。ドナー由来細胞は、ＣＤ４５およびＣＤ１１ｂを発現し、ＴＡμ細胞コンパートメントの大部分に存在した（図１２Ｄおよび１２Ｅ）。
【０１６９】
これらのデータにより、ＩＣＶまたはＩＶによる移植に際し、脳中で、正真正銘のＨＳＣがミクログリア様子孫を発生させたことが実証される。しかし、このプロセスは、早期前駆体がやはりＩＣＶ投与された場合、かなり一層有効であった。
【０１７０】
関連マーカーによるμ再構成可能性を可能にするＨＳＣ内の細胞をさらに特定するため、ミクログリアおよび骨髄系統造血細胞上に高度に発現する新規ＣＸ３Ｃケモカインフラクタルカインに対する特異的受容体である、７回膜貫通受容体ＣＸ３ＣＲ１の制御下で、ＧＦＰリポータ遺伝子を発現する、ＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰリポータマウスを使用した。特に、低いが検出可能なレベルのＣＸ３ＣＲ１発現が、ＨＳＣプール内のミクログリア再構成可能性を有する細胞を特定することができるかどうかを評価した。この目標のため、ＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰ異型接合マウスの骨髄およびＨＳＰＣのプールを特徴付けて、ＨＳＰＣのプールの画分がＣＸ３ＣＲ１を発現したが、実際の発現は、正真正銘のＬＴ−ＨＳＣ内で検出することができないことが確認された（図１３Ａ）。Ｌｉｎ−ＨＳＰＣコンパートメント内のＧＦＰ＋および高い細胞を分類し、これらの細胞を、支持体として正常な（ＣＸＣＲ１−ＧＦＰではない）ドナーからの未操作全骨髄と共にブスルファン処置レシピエントに移植した。ＧＦＰ＋子孫細胞は、移植後１．５か月において、再増殖したマウスの骨髄および脳において検出することができなかった（図１３Ｂ）。むしろ、ＧＦＰ発現μ細胞は、ＣＸ３ＣＲ１−ＧＦＰマウスからの未分類の全骨髄を移植した対照マウスの脳において特定することができた（図１３Ｂ）。これらのデータは、μ前駆体の骨髄等価体は、ＬＴ−ＨＳＣに保持され、ＣＸ３Ｃｒ１を発現しないことを示している。
【０１７１】
標識ＣＤ３４＋細胞および部分画分を、免疫不全ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスに移植することにより、ヒト状況において追加の実験を行った。特に、差次的に標識したＣＤ３４＋ＣＤ３８＋（文献に基づいて前駆体として定義）およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−（長期幹細胞活性に富む）で分類した細胞の共移植を行った（図１４Ａ）。興味深いことに、ヒトにおいて、幹細胞活性に非常に富むＣＤ３８−細胞の画分しか、移植マウスの脳における標識骨髄ヒト細胞の外観に関連しなかった（図１４Ｂ）。この状況において、マウス状況において行ったことと同様に、本発明者らは、前に進めて、ＣＤ３８およびＣＤ９０発現によるＨＳＰＣ画分をさらに解剖した。ＣＤ３８−ＣＤ９０＋ＨＳＣ（ＧＦＰで標識）、ＣＤ３８−ＣＤ９０−ＭＰＰ（ｍＯ２をコードするＬＶを形質導入）およびＣＤ３８＋ＣＤ９０−およびＣＤ３８＋ＣＤ９０＋へとコミットした前駆細胞（それぞれ、Ｃｈｅｒｒｙおよびタグ−ＢＦＰ  ＬＶにより標識化）を単離し、標識した（様々なリポータ遺伝子を有するＬＶによる）（図１４Ｃ）。興味深いことに、マウス状況に観察されたものと一致して、幹細胞可能性の高まった集団は、ミクログリア関連細胞によるヒト脳細胞のキメラ現象に寄与する能力を一層高く有することが確認された（図１４Ｄ）。
【０１７２】
（実施例１３）
調節された治療的遺伝子発現のためのミクログリアの分子工学操作。
本明細書において記載した革新的なプロトコルの文脈における、ＩＶまたはＩＣＶのどちらか一方で移植した細胞の分子工学操作は、治療的遺伝子発現の効力、安全性および特異性／調節という正確な要件に対処するために必要である。このことに関する限り、持続的ではあるが調節された導入遺伝子発現が必要となることがある特定の状況に適用することができる、組み込み用ベクターによる遺伝子移入および標的化された遺伝子付加に基づいて、２つの異なる戦略が開発されている。
【０１７３】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）またはアルツハイマー病（ＡＤ）、および神経変性ＳＤなどの成人期の神経変性疾患は、ミクログリア活性化により持続される神経炎症応答の高まりによって特徴付けられ、病理学的事象の過程における活性化ミクログリアにより上方調節された分子の１つは、他のものおよび本発明者らによる、ポジトロン断層法向けの選択的トランスロケータタンパク質（ＴＳＰＯ）放射リガンドを使用して示されている通り、１８ｋＤａのＴＳＰＯである（Visigalliら  Neurobiol  Dis  ３４巻、５１〜６２頁（２００９年）；Turnerら  Neurobiol  Dis  １５巻、６０１〜６０９頁（２００４年））。ミクログリア細胞は、ＴＳＰＯシグナルの増加を担う主要な細胞タイプである。したがって、ＴＳＰＯは、脳において、ミクログリア関連神経炎症をモニタリングするための有用かつ感受性の高いマーカーであり、そのプロモーター配列は、組織損傷および炎症に応答する新規に操作されたミクログリアによってマーカーまたは治療用タンパク質生成に対する最適調節配列として使用することができた。神経変性疾患およびニューロＬＳＤにおける適用可能性を含めた、脳への治療分子の調節された送達のためのＨＳＣ誘導による、ＴＳＰＯを標的とする、脳ミクログリアの工学的操作を可能にする革新的手段を開発している。特に、脳ミクログリアは、局所神経変性および上で詳述した先進的移植プロトコルを使用する神経炎症に応答して、細胞活性化に目的の遺伝子を発現するよう操作されている「センサー」細胞により、罹患した脳において再構成される（この状況はまた、μ前駆体に向かわせる前処理レジメンの使用に適合可能となる）。
【０１７４】
この目標のため、導入遺伝子発現を推進するためのＴＳＰＯプロモーター配列を使用する。これは、ＨＳＣ形質導入に使用されることになる先進的世代のＬＶの文脈におけるマーカーまたは治療的遺伝子の手前に、証拠に基づいた選択されたＴＳＰＯプロモーター配列（Wangら、Cell  Tissue  Res  ３５０巻、２６１〜２７５頁（２０１２年））を含めること、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ技術を使用する標的化された遺伝子付加によってそのプロモーターを活用するＴＳＰＯ遺伝子の第１のイントロン／エクソンの手前／その内部に治療的遺伝子を挿入することにより達成することができ、様々な戦略が試験されている。ＴＳＰＯノックアウトマウスは、この後者の戦略の実現可能性に関する証明となる（Banatiら  Nat  Commun  ５巻、５４５２頁（２０１４年））。第３世代のＬＶの文脈におけるマーカー遺伝子としてのＧＦＰの手前に挿入された（図１６Ｂ）選択されたＴＳＰＯプロモーター配列（Wangら、Cell  Tissue  Res  ３５０巻、２６１〜２７５頁（２０１２年））（図１６Ａ）は、ナイーブ配列により予期されるように、ミクログリア細胞内（ミクログリア細胞系ＢＶ２内）の持続的な導入遺伝子発現を推進することが確認されており、細菌のＬＰＳによる刺激に応答する（図１６Ｃおよび１６Ｄ）。形質導入されたおよび／または編集された細胞は、次に、先進的プロトコルにより、レシピエントマウスにおける脳骨髄細胞を専ら再構成するために使用される。
【０１７５】
１つの作業仮説は、神経が炎症して変性した環境での細胞の活性化時に、神経炎症応答の正確な分子モニタリングを可能にする、および／または治療的活性および疾患の表現型の改善への寄与をもたらす遺伝子を発現する、脳骨髄細胞およびミクログリアの集団が、ＴＳＰＯ遺伝子座において遺伝的に修飾／編集されたＨＳＣの移植に際し発生するということである。開発中の手段を特徴付けるためのリポータ遺伝子は、ＡＬＳマウスモデル（ＳＯＤ１．Ｇ９３Ａマウス）（Pevianiら、CNS  Neurol  Disord  Drug  Targets  ９巻、４９１〜５０３頁（２０１０年））およびグロボイド細胞白質ジストロフィー（ＧＬＤ）の動物モデル（Visigalliら  Neurobiol  Dis  ３４巻、５１〜６２頁（２００９年））などの、ミクログリア活性化およびＴＳＰＯ上方調節により特徴付けられる動物モデルにおいて検証されている。この手段は、その機能性について確認され、治療作用に対するその可能性は、利用可能な動物モデルにおいて検証されている。
【０１７６】
（実施例１４）
ブスルファン毒性およびＦｇｄ５リポータマウスのγＨ２ＡＸマーカーの使用によるミクログリア前駆体の同定。
これまでの検討により、ｉ）脳に位置しており、ブスルファンに基づく前処理の投与時にアブレーションされ易い機能的に規定されたミクログリアプレカーサー集団であって、内因性ＣＮＳ常在性ミクログリア前駆体（μＰ）と同時に発生し得る、ミクログリアプレカーサー集団の存在の証拠を提供する。リン酸化ヒストン２ＡＸ（γＨ２ＡＸ）は、脳内のブスルファンによって標的とされる細胞を追跡する高感度な特異的バイオマーカーである。したがって、機能的な脳常在性μＰは、ブスルファン、およびこれらの細胞内のその細胞毒性の薬理学マーカーであるγＨ２ＡＸを利用することにより特定することができる。γＨ２ＡＸを、ブスルファン細胞毒性のバイオマーカーとして検討した。特に、γＨ２ＡＸの存在、分布および細胞局在化を、全身性ブスルファン前処理により処置したマウスからの脳のスライスに対するフローサイトメトリー（ＦＣ）および免疫蛍光法（ＩＦ）により検討した。ＦＣは、最後のブスルファン用量から１日目および５日目における、ブスルファン処置対対照の未処置動物において、特に生存ＣＤ４５＋細胞内で、γＨ２ＡＸシグナルが向上することを示した（図１５Ｂ）。同時に、ブスルファン処置後の早期アポトーシスはまた、特に、ＣＤ１１ｂ＋およびｃ−ｋｉｔ＋細胞において、ＣＤ４５＋脳細胞内でのアネキシンＶ染色により検出される（図１５Ａ）。ＩＦによって、γＨ２ＡＸは、主に海馬に位置する、ほとんど存在しないニューロン細胞中に見出される一部のγＨ２ＡＸ＋病巣を除いて、対照マウスではほとんど検出されず（図１６Ｃ、上の写真）、生理学的ニューロン活性とＨ２ＡＸリン酸化との間の相関が、以前に示されている。対照的に、ブスルファン処置マウスでは、γＨ２ＡＸ＋シグナルは、側脳室、脳室下（ＳＶＺ）および吻側移動流（ＲＭＳ）をライニングする細胞の核において向上した（図１５Ｃ、下部の写真）。γＨ２ＡＸ＋病巣は、ニューロン（図１５Ｃ挿入図）とグリア細胞、すなわちミクログリアと星状細胞（図１５Ｃの挿入図）の両方で局在化していた。まとめると、これらのデータは、ＣＮＳ幹細胞のニッチ領域を含めた脳の十分に規定された領域に局在化するニューロン細胞と非ニューロン細胞の両方が、ブスルファンに対して感受性が高いことを示している。したがって、これらの結果は、ミクログリア前駆細胞を特定する可能性を有する。同様の実験が、ブスルファン感受性細胞を一層良好に追跡するため、Ｆｇｄ５またはＣｘ３Ｃｒ１などの造血幹細胞およびミクログリア特異的遺伝子のマーカーのプロモーターにより発現されるリポータ遺伝子を発現するマウスにおいて行われている。
【０１７７】
（実施例１５）
標的送達のためにナノ担体を使用する、ミクログリア前駆体を標的とする選択的脳前処理。
ブスルファンの全身性投与は、ドナー由来細胞を有する脳ミクログリアの効率的な代謝回転を発展させるのに役立つ。類似しているが、ＣＮＳに限定されるレジメンにより、骨髄アブレーションによる全身性前処理の副作用から、ＣＮＳに限定される疾患（例えば、ＩＮＣＬ、ＰＤ、ＡＬＳなど）を有する患者が保護される。予備検討では、マウス中の側脳室内に埋め込まれたカニューレにより、ブスルファンの脳内投与の可能性を調べた。臨床的グレードのブスルファン製剤を含めた、ブスルファンの様々な薬物製剤を試験した。しかし、ＩＣＶ投与は、全身性薬物投与によって達成されるものに匹敵するブスルファンレベルへの脳常在性μＰの曝露を保証することはできず、移植したＨＳＰＣ生着を有利にすることもできなかった（データは図示せず）。広範囲の神経毒性および局所炎症にむしろ関連した。したがって、ナノ粒子を使用する標的薬物送達戦略を実施した。理論によって拘泥されることを意図するものではないが、ナノ粒子は、機能的に規定されたμＰにアブレーション薬物を効率よくかつ選択的に送達することを可能とする可能性を有することができる。
【０１７８】
最近、ポリマーナノ粒子（ＮＰ）は、化学治療剤を含めた、薬物の薬理学的プロファイルを改善する有望な手段として大きな関心を寄せている。ＮＰは、材料組成、表面機能化および分解速度の調節が可能であり、ｉ）ＮＰを含まない同一薬物と比べて、ＮＰと共に製剤化された薬物の副作用のリスクを低減する、細胞を標的とする高い選択性；ｉｉ）多重薬物送達、ｉｉｉ）経時的な制御薬物放出を可能にする。ＮＰは、人工または天然ポリマーから作製され、１０〜４００ｎｍの間のサイズを有する。キトサン、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（アルキル−シアノアクリレート）（ＰＡＣＡ）、ポリ−乳酸（ＰＬＡ）またはポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）などの様々な生分解性ポリマーをコアマトリックスとして使用することができる。ポリ（エチレン−グリコール）（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーによる表面機能化は、生体適合性、水溶解度およびＮＰ安定性を改善するために使用される。ＮＰの表面特性により、細胞を標的とすることによる取り込みの選択性が決定付けられ、こうして、生物学的流体中の生体内分布および半減期に影響を及ぼす。一方、ＮＰコアの物理化学特性が、薬物ロード能および薬物放出プロファイルを担う。抗体を含めた標的部分を含むＮＰ表面の機能化により、血液−脳関門（ＢＢＢ）において、またはＣＮＳ生体内分布もしくは標的細胞特異性の増強を得るための特異的細胞タイプ上に発現する受容体または輸送体への優先的な結合が決定され得る。親油性の改変、ナノ粒子コアの構造および組成により、物質の生分解時間を調節すると、薬物ロードおよび放出プロファイルを最適化することが可能となる。
【０１７９】
生分解性および生体適合性ナノ担体（ＰＣＬ  ＮＰに基づく）の新規な薬物送達（図１７Ａ）は、脊髄損傷マウスモデルにおける、実質内柔組織投与後のミクログリア／マクロファージを選択的に標的とするよう検証された。マウスにおけるＩＣＶ投与後のこのようなミクログリア標的ＮＰの生体内分布を検証し、様々なＣＮＳ領域におけるミクログリア／マクロファージによる効率的な取り込みおよび広範な分布を確認した（図１７Ａ〜１７Ｉ）。注入されたマウス脳に関する細胞蛍光分析により、ＮＰは、特に、ＢＢＢの貫通を有利にするためのマンニトールと一緒にＩＣＶを注入した場合、ＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞（図１７Ｃ）および増殖性Ｅｄｕ＋細胞による取り込みが優先（図１７Ｄ）して、ＣＤ４５＋脳細胞によって効率よく取り込まれた（図１７Ｂ）。これらのミクログリアを標的とするＮＰは、ＮＰ安定性を確保し、分解速度を調節し、経時的な薬物放出をモジュレートする低分子量ＰＥＧ鎖を含めた、ＦＤＡにより承認を受けている生分解性物質に基づいた。興味深いことに、免疫蛍光共焦点解析により、これらの知見が確認され、ＮＰは、脳内、およびブスルファン投与後の強度の強いγＨ２ＡＸ陽性シグナルの領域の脳ミクログリア再構成に至るプロセスの間の、移植直後のドナー由来のＨＳＰＣにより真っ先にコロニー形成されるＳＶＺおよびＲＭＳなどの、脳領域に集中することが示された。こうして、代表的な領域が、恐らくμＰに富む（図１７Ｇ）。留意すべきことに、ＮＰを含有するローダミン＋Ｉｂａ＋骨髄細胞は、犠牲および染色の前に、ｋｉ６７陽性シグナル（図１６Ｇ）とＥｄｕ投与の両方によって示唆（uggested）されるように、やはり増殖性であった（図１７Ｈ）。Ｅｄｕ＋ローダミン＋細胞は、造血骨髄マーカーに対してやはり陽性であり、分岐したミクログリア様細胞と円形のミクログリア様細胞の両方の形状を示した。重要なことに（improtantly）、ローダミン＋Ｉｂａ１＋細胞はまた、早期／幹細胞マーカーネスチンを時に発現した（図１７Ｈ、右側の写真）。ローダミンシグナルのＮＰを注入した脳中での存在および分布は、興味深いことに、Ｅｄｕシグナルの分布と一致しており、ＮＰは、ミクログリア前駆体特徴を有する細胞を含み得る、増殖細胞中に優先的に起こっている（図１７Ｉ）ことを示唆する。
【０１８０】
次に、ポリ−（２−ヒドロキシ−エチルメタクリレート）主鎖（ここでは、ＢＫ−５１０と呼ばれる）に共有結合によりグラフトした薬物（「ＳＰ」および「ＱＭＳ」と呼ばれる）と適合させるために選択される、２つの異なる化学部分を活用することによる、ブスルファンおよびエトポシドによるロードを可能にするため、デノボ化学合成による新規なＮＰの最適化を行った。これにより、生物学的に適切な量の薬物のＮＰ中への封入を達成することが可能となった（すなわち、２１０．７±５．３〜２５７．６±７．２μｇ／ｍｌの範囲のブスルファンの場合）。化学治療薬（ブスルファンまたはエトポシドなど）をロードしたこのようなナノ粒子の製剤は、凍結乾燥物質から始めるＮＰの形成を可能にする、いわゆる「自己集合」手法を導入することによりさらに改善された（図１８）。これにより、ナノ粒子材料は、効力および異なるバッチ間の一貫性を喪失することなく、スケールアップ合成、凍結乾燥医薬製品の長期保管に好適なものとなる。
【０１８１】
ブスルファン関連遺伝毒性の信頼性の高い薬力学マーカーとしてγＨ２ＡＸを使用することにより、γＨ２ＡＸ＋細胞数の増加が、ブスルファンをロードしたＮＰへのｉｎ  ｖｉｖｏでの曝露後の免役蛍光法およびフローサイトメトリー解析によって強調された（図１９Ａおよび１９Ｂ）。これは、ＢＶ２ミクログリア様細胞系に対して行われた細胞生存アッセイによってさらに確認され、７２時間のインキュベート後のＢＵロードＮＰの特異的細胞毒性を強調し、ＮＰへのＢＵの封入は、薬物効力を損なわなかったことを示している。マウスの側脳室におけるブスルファンをロードした（ＮＰ−ＢＵＳ）または空のＮＰは、ＮＰ−ＢＵＳへの曝露時に、脳ミクログリア（ＣＤ４５＋／ＣＤ１１ｂ＋）細胞中のγＨ２ＡＸシグナルの顕著な増大を誘発した（図１９Ｃ）。
【０１８２】
有効な脳の前処理レジメンの開発を促進するため、ＮＰロードは、予備的な支持結果を示した、エトポシドおよびロムスチンなどの他の薬物により最適化した（図１９Ｄ〜１９Ｅ）。細胞増殖アッセイを、ＢＶ２細胞ミクログリア様細胞系に対して行った。エトポシドは、２７５ｕｇ／ｍｌとなる見かけの薬物濃度において、様々なＮＰ製剤（事前集合させた１００ｎｍのＰＣＬ  ＮＰ；自己集合１００ｎｍ  ＮＰまたは自己集合５０ｎｍ  ＮＰ）にロードした。エトポシドをロードしたＮＰ、または非封入薬物を細胞培養培地に加え、次に、細胞の生存率を、薬物投与の４８時間および７２時間後に、３７℃でＣｅｌｌＴｉｔｅｒ細胞増殖ＭＴＳアッセイによって測定した。様々な薬物濃度を試験した（１．６、６．２５および２５ｕｇ／ｍｌ）。対照として、空のＮＰ（薬物を含まない）を試験した。この場合、媒体中の最終ＮＰ濃度は、ＮＰ中に封入されたエトポシドを２５ｕｇ／ｍｌ投与するために使用した濃度に一致させた。図２０Ｄ〜２０Ｅにおいて観察され得るように、３つのＮＰ製剤のすべてが、エトポシドの送達の有効性は等しく、したがって、細胞死を決定付ける。短期間のインキュベートの間（自己集合１００ｎｍ  ＮＰ、４８時間の時間点）、空のＮＰは、毒性でもなく（事前集合した１００ｎｍ  ＰＣＬ  ＮＰ、および自己集合５０ｎｍ  ＮＰ）、または毒性が軽度でもない。しかし、空のＮＰの場合の細胞の生存率は、エトポシドをロードしたＮＰの１を常に超え、このことはエトポシドをロードしたＮＰに関して観察された効果は、ＮＰ自体というよりもむしろ、薬物の放出によることを示唆している。興味深いことに、１．６ｕｇ／ｍｌの最終薬物濃度で試験したエトポシドをロードしたＮＰの場合に観察された効果は、封入されていない薬物の場合に観察されるものよりも顕著である。この差異は、７２時間のインキュベート時間時にさらに一層顕著であり、このことは、ＮＰ中のエトポシドを封入するとその効力が増強され、既に非常に低濃度の薬物の細胞毒性の改善が決定付けられる。
【０１８３】
これらのＮＰ製剤は、ｉ）単回用量のブスルファンを２５ｍｇ／ｋｇ、またはｉｉ）脳において、ミクログリア前駆体の増殖を誘発する、および／もしくはＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋細胞を拡張することが示されているＣＳＦ  １Ｒ阻害剤（Elmoreら、Neuron.  ８２巻（２号）：３８０〜３９７頁（２０１４年））の１０日間の経口投与により事前処置した野生型の成体動物の脳にＩＣＶ注入した（図１９Ａ、１９Ｃ、１９Ｄ）。ＮＰ注入の５日後に、動物を、脳ミクログリア前駆体のアブレーションの場合の参照として、ブスルファン標準処置（２５ｍｇ／ｋｇの４回用量）を使用する、ミクログリア細胞および／またはその前駆体のエトポシド媒介性死滅の発生について分析した。興味深いことに、エトポシドをロードしたＮＰは、標準のアブレーションによるブスルファン処置時に観察されたものと一致した、ＣＤ４５＋ｃ−ｋｉｔ＋およびＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋細胞内でアポトーシスを誘発した（フローサイトメトリーにおいて、アネキシンＶ陽性染色による）（図１９Ｂおよび１９Ｅ）。
【０１８４】
全体として、ここで試験したＮＰ製剤は、選択的な脳の前処理に必要なミクログリア前駆体へのアブレーション薬物の標的送達を達成した。
【０１８５】
（実施例１３）
造血幹細胞および前駆細胞からの転写により依存可能な新規ミクログリアを発生させるための新規な移植モダリティ
多角的手法を使用して、ＨＣＴ後のドナーによる正真正銘の脳骨髄細胞の代謝回転を改善するため、新規戦略を特定し、この現象は、出生後の脳骨髄細胞の生理学的成熟を繰り返すことができるプロセスにより、転写により依存可能な新しいミクログリアの強固かつ迅速な生着をもたらすことができる。
【０１８６】
第１に、ブスルファン処置したキメラマウスの脳から（form）回収した、新規に形成した骨髄細胞（μおよびＴＡμ細胞として特定）に転写によるプロファイリング解析を適用した。この解析により、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂおよびドナー細胞のマーカーの発現に対して分類したドナー由来の脳骨髄細胞の遺伝子発現パターンは、様々な発育年齢におけるナイーブマウスの内因性ミクログリア細胞のそれと非常に近いことが明らかになった。新しく形成した細胞は、Ｔｍｅｍ１１９、Ｔｇｆｂｒ１、Ｐ２ｒｙ１３、Ｏｌｆｍｌ３、Ｍｅｒｔｋなどの典型的なミクログリアマーカーを発現したことが留意される。興味深いことに、これらの細胞は、マクロファージと比べて、完全に分離した形でてクラスター形成し、移植後に再構成した脳細胞は、骨髄常在性または循環性骨髄細胞とは転写により区別され、内因性脳骨髄集団とかなり類似していることが確認された（Gosselinら、Cell  １５９巻、１３２７〜１３４０頁（２０１４年））。Bennettおよび共同研究者（Bennettら  Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １１３巻、Ｅ１７３８〜１７４６頁（２０１６年））は、全骨髄移植に由来する成体のＣＮＳにおける細胞は、ミクログリアと他の骨髄細胞とを区別することができるマーカーとして、上記の著者らにより検討されたＴｍｅｍ１１９を発現しないことを示した。ドナー由来脳骨髄細胞における、強固なＴｍｅｍ１１９発現を示すデータと明らかに矛盾するこれらの知見は、様々な実験条件の使用に基づいて解釈することができる。実際に、精製ＨＳＰＣの代わりに全骨髄細胞の使用は、脳の子孫に関する限り、移植手順の転帰に影響を及ぼし得る。実際に、これらのデータは、後者の脳の子孫が、新しいミクログリアを生じさせる能力に富むことを示している。さらに、マウスの前処理のためのブスルファンの上部への強力な照射を使用すると、ブスルファン単独に基づいたレジメンによってむしろ影響を受けない、ＢＢＢ透過性に影響を及ぼすことによって、循環している骨髄細胞の動員を誘発することができた（Capotondoら  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  １０９巻、１５０１８〜１５０２３頁（２０１２年））。
【０１８７】
フローサイトメトリーと連携した遺伝子発現プロファイリングにより、ＨＣＴマウスから単離したμおよびＴＡμを示す以前のデータが、それぞれ、成体の未処置動物に由来するミクログリア細胞、およびＰ１０マウスに由来する未成熟ミクログリアとの類似性を示すことがやはり確認された。特に、生物学的プロセスおよび機能経路解析により、移植マウスおよびＰ１０動物に由来するＴＡμ集団の遺伝子パターンが、神経の発達過程、細胞の構成成分の組織化および細胞周期／分化に一層関連することが示され、それらは、最近に記載されている通り、脳のリモデリングの間に、恐らくある役割を果たす、未成熟ミクログリア集団であることを示唆している（Matcovitch-Natanら  Science  ３５３巻、ａａｄ８６７０頁（２０１６年））。それとは別に、移植動物および成体対照マウスに由来するμ集団は、免疫応答、細胞伝達および食菌作用に関連する遺伝子中で富み、これらの細胞は、成熟ミクログリアにより大部分、構成されていることを示している。したがって、これらのデータは、ＨＣＴ後のミクログリア再構成は、移植後、短期間のドナー由来要素に通常、豊富な中間ＴＡμ集団から、移植後の長期間で、ドナー要素に次第に一層豊富になるμ段階までの移行により起こるという仮説を支持し得る。この現象により、ｐ１０において特定された未成熟細胞から、成体対照動物から単離されたミクログリア細胞までの移行に沿って、出生後ミクログリアの発達が思い起こされ得る。この仮説の支持に際して、ミクログリア分化（Matcovitch-Natanら  Science  ３５３巻、ａａｄ８６７０頁（２０１６年））に関連する選択遺伝子の発現をデータセットで検討し、ＨＳＰＣ由来細胞は、ＨＣＴ時に、段階的な成熟プログラムに従うことが確認された。しかし、ＭＡＦＢとして、成体ミクログリアの発達期に関与する転写因子を解析することにより（Matcovitch-Natanら  Science  ３５３巻、ａａｄ８６７０頁（２０１６年））、Ｐ１０マウスと比べて、ＨＣＴマウスから回収したＴＡμ細胞中にこの遺伝子が一層高く発現することが観察された。理論によって拘泥されることを意図するものではないが、成体の前処理マウスにおけるＨＳＣＰ移植に際し発生する新しく形成されたＴＡμミクログリア細胞は、Ｐ１０細胞と比べて、成熟段階へとより強くコミットしている。遺伝子発現のデータセットおよびこの移行中の関連変化の深い検討は、ミクログリア再構成をさらに改善するために使用することができる、ミクログリアの発達および維持に関与する重要因子の特定の一助となり得る。
【０１８８】
ドナーによるミクログリア細胞の再構成の過程を検討した。興味深いことに、移植に際しミクログリアを再構成する能力をほとんど保持している細胞画分は、ＨＳＰＣ内の非常に早期の幹細胞コンパートメントにおいて特定した。特に、異なって標識されているＨＳＰＣ部分集団の競合的移植に際し、ＫＳＬ細胞、およびその内部のＬＴ−ＨＳＣおよびＭＰＰは、造血システムを再構成するだけではなく、脳内の広範なミクログリオーシスも引き起こす可能性が最も高いことを示した。これらのデータは、移植後の脳中の新規なミクログリア源として挙動する能力を有する細胞は、マウスにおける造血幹細胞の活性に大部分富む画分内に維持されることを示唆している。興味深いことに、この能力は、細胞表面上のＣＸＣｒ４発現のレベルと関連する。理論によって拘泥されることを意図するものではないが、このことは、骨髄のニッチに向かうＨＳＰＣのホーミングだけではなく、脳に向かうＨＳＰＣのホーミングにおけるＳＤＦ１−ＣＸＣｒ４シグナル伝達の役割を示す。ヒト化ＮＳＧマウスにおける、ヒトＨＳＰＣのミクログリオーシスへの寄与を、脳へのヒト生着を有利にするため、マウス状況において、このモデルに適用したブスルファンに基づく前処理レジメンを適合させることによって、やはり調べた。この戦略によって、異なる供給源（臍帯血、骨髄および末梢血液）から精製したヒトＣＤ３４＋細胞は、レシピエントマウス脳において、ミクログリアを連想させる細胞を生じることが実証された。興味深いことに、マウス細胞の場合に観察される通り、大部分の未成熟造血コンパートメント（ＣＤ３８−およびＣＤ３８−ＣＤ９０＋／−細胞）は、脳ヒトミクログリオーシスに一層大きな程度で寄与した。これらの証拠は、早期ＨＳＰＣ／ＨＳＣからのミクログリアの発生のモダリティを調べるさらなる検討へと繋がり得るが、また、未操作生成物よりもむしろ幹細胞の活性に富む細胞調製物の使用を支持することにより、ＬＳＤおよび関連疾患における移植臨床行為への移行に関して重要な示唆を有することもできた。さらに、これらの観察は、標準臍帯血／アフェレティックな／骨髄外殖片調製物中に存在するものと比べると、早期造血細胞において豊富なグラフトを受ける、神経変性貯蔵症を有する患者において、ＨＳＣ遺伝子治療法試験で観察される大きな効力の説明に寄与することができた。
【０１８９】
再増殖した移植レシピエントにおいて、ミクログリアおよび末梢造血細胞のクローン独立性に関するこれまでの観察に基づくと（Capotondoら  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.  １０９巻、１５０１８〜１５０２３頁（２０１２年））、移植プロトコルに挑戦し、ＨＳＰＣは、適切なレシピエントマウスの前処理後の、脳室内空間に直接、注入した。興味深いことに、ＩＣＶでのＨＳＰＣ移植に際し、ミクログリア再構成は、ブスルファン処置マウス、および照射マウスではより低い程度で、どちらにおいても観察され得、造血組織中のドナー細胞生着は、ミクログリアの置き換えに必要ではないことが確認された。むしろ、脳中で播種したＨＳＰＣは、局所生着、増殖および分化によって、新しい正真正銘のミクログリアを発生することができた。重要なことに、この移植経路は、ＩＶ移植に際し実現された置き換えと比べて、骨髄脳コンパートメントの、特に成熟μ細胞プールの一層迅速な再構成と関連した。ＩＶ移植により得られた知見とは異なり、局部注入すると、コミットしたＨＳＰＣ画分も、長期ミクログリオーシスに関わった。これらの知見は、様々に解釈することができた。第１に、脳の微小環境は、より強くコミットした高い細胞の生着に有利となり得る条件を作り出すことができた。この仮説を支持して、脳環境は、その生着を恐らくは有利にする、移植後早期の典型的なミクログリアマーカー（ＣＤ１１５およびＣＸ３ＣＲ１）の発現を誘発させることにより移植細胞の運命に影響を及ぼした。さらに、ＩＣＶ注入時に、ＣＸＣＲ４−ＳＤＦ−１シグナル伝達経路から独立した、他のもの（ＨＰＣ−２）の中で、定量的により多く表される細胞に利点がもたらされ、局部的なグラフト化および拡張に有利となり得ると推測される。最後に、静脈内に移植した場合、より強くコミットした細胞は、上で議論されているＣＸＣＲ４解析によりＬＴ−ＨＳＣおよびＭＰＰと比べて、脳に移動する能力は潜在的により低いために不利となり得た。とはいえ、ＩＣＶ細胞の注入時に、移植細胞は、様々なシグナル伝達経路に応答することができることを排除することができなかった。この点で、遺伝子発現解析として、さらなる検討により、ＩＶ注入と比べて、ＩＣＶ移植に際し実現されるミクログリア再構成の基礎をなす機構をよりよく評価するための貴重な指標がもたらされる。重要なことに、ＩＣＶ送達による脳骨髄細胞再構成へのＨＳＰＣの寄与はまた、ヒト化状況で、ＮＳＧマウスにおけるヒトＨＳＰＣの移植において確認された。これらの適切な臨床的知見を現在の遺伝子および細胞に基づく移植プロトコルへと移行させるために、ＩＣＶによるＨＳＰＣの移植の可能性を組み合わせることが提唱され、これは、標準移植状況と比べて、より迅速かつ高いミクログリア再構成をもたらし、ＩＶ移植に優る利点が実現される。この戦略は、重症なＣＮＳ障害および病理の迅速な進行を特徴とするそのような疾患における、治療法の臨床的利益に関わる必要性に取り組むことができた。明らかに、この手法は、細胞投与の様々な経路に従い、移植の、および移植されることになる細胞サブセットのタイミングの深い評価を必要とする。
【０１９０】
まとめると、本データは、ＨＳＰＣ移植に際し、ミクログリア特徴を有する細胞の再構成が起こるという強力な証拠を提示する。これらの細胞の発生は、中間段階から一層成熟した細胞への成熟、すなわち、出生後のミクログリア発達に非常に類似したプロセスによって起こる。このプロセスは、脳において早期ＨＳＰＣの存在に依存しており、脳への循環に起因する成熟細胞の浸潤とは無関係である。実際に、ミクログリアの置き換えは、ＨＳＰＣの直接的な脳注入時に得られて、さらに増強され得、重症かつ迅速な進行を伴うＣＮＳ障害の処置に対する革新的な移植手法の開発を支援する証拠を生み出す。
【０１９１】
本明細書に記載されている結果は、以下の物質および方法を使用して得た。
【０１９２】
マウスの検討
Ｃ５７ＢＬ６／ＪおよびＣ５７ＢＬ／６−Ｌｙ５．１マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒによって提供を受けた。ＮＯＤ．Ｃｇ−ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊＩ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ実験室によって購入された。Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−およびＲａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２＋／＋マウスは、Ｓａｎ  Ｒａｆｆａｅｌｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物施設で生成した（Meneghiniら、Stem  Cells  Transl  Med、（２０１６年））。Ｆｇｄ５ＺｓＧｒ・ＺｓＧｒ／＋（Ｆｇｄ５−ＺｓＧｒｅｅｎ）（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ストック番号０２７７８８）は、親切なことに、Ｄｅｒｒｉｃｋ  Ｊ．Ｒｏｓｓｉ'ｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｂｏｓｔｏｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ'ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌによって提供を受けた（Gazitら、J  Exp  Med  ２１１巻、１３１５〜１３３１頁（２０１４年））。
【０１９３】
手順はすべて、Ｆｏｎｄａｚｉｏｎｅ  Ｓａｎ  Ｒａｆｆａｅｌｅ  ｄｅｌ  Ｍｏｎｔｅ  Ｔａｂｏｒ（ＩＡＣＵＣ５７３）の動物実験委員会により承認を受け、イタリアの法律に基づき、Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌ  ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓに連絡をした。
【０１９４】
マウス造血細胞の単離、形質導入および移植
若い成体マウス（５〜８週）をＣＯ２で殺傷し、大腿骨および脛骨を洗い流して、ＢＭを得た。マウスＨＳＰＣを精製し、ＬＶを形質導入し、記載の通り尾部静脈に注入することにより移植した（Capotondoら、Proc  Natl  Acad  Sci  USA  １０９巻、１５０１８〜１５０２３頁（２０１２年））。
【０１９５】
ＨＳＰＣは、製造業者の指示書に従い、ａｕｔｏＭＡＣＳ（商標）分離器による磁気分離を含むＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎキットを使用して、系統−（Ｌｉｎ−）選択により精製した。系統陰性選択後に残ったほとんどないＬｉｎ＋細胞（５〜１０％）を排除するため、この画分のうちのＫＳＬ（ｃ−ｋｉｔ＋ｓｃａ−１＋）、ＣＤ１５０＋／−ＣＤ４８＋／−細胞単離を行う際、Ｌｉｎ−細胞をビオチン−抗体カクテル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｌｉｎｅａｇｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎキット）／ストレプトアビジンＰｅ−Ｃｙ５（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。次に、ＫＳＬ画分の単離に関すると、細胞は、ラットのＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ７８０抗マウスＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびラットのＰｅ−ｃｙ７抗マウスＬｙ−６Ａ／Ｅ  Ｓｃａ−１（Ｓｃａ−１）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅ）により染色した。ＣＤ１５０＋／−ＣＤ４８＋／−細胞選択の場合、ハムスターＰＥ抗マウスＣＤ４８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびラットＡＰＣ抗マウスＣＤ１５０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を加えた。細胞染色の終わりに、選択したマーカーの発現に従い、細胞をセルソータＭＯＦＬＯ  ＸＤＰ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により単離した。リポータによるゲーティング戦略を図２Ｆに示す。単離したＬｉｎ−、ＫＳＬまたはＣＤ１５０＋／−ＣＤ４８＋／−ＫＳＬ細胞は、記載の通り、感染多重度（ＭＯＩ）１００で１６時間、様々なレンチウイルスベクター（ＬＶ）を使用して形質導入した（Biffiら、J.  Clin.  Invest.  １１６巻、３０７０〜３０８２頁（２００６年））。特に、以下のＬＶを使用した：
Ｌｉｎ−、ＫＳＬおよびＣＤ１５０＋ＣＤ４８−  ＫＳＬ細胞の場合、ｐＣＣＬｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ｈｕｍａｎＰＧＫ．ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ．Ｗｐｒｅ（ＧＦＰ−ＬＶ）（Dullら、J.  Virol  ７２巻、８４６３〜８４７１頁（１９９８年））；
ｎｏｔ−ＫＳＬ細胞およびＣＤ１５０−ＣＤ４８−ＫＳＬ細胞の場合、ｐＣＣＬｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ｈｕｍａｎＰＧＫ．ＤｅｌｅｔｅｄＮｅｒｖｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＲｅｃｅｐｔｏｒ．Ｗｐｒｅ（ΔＮＧＦＲ−ＬＶ）（Dullら、J.  Virol  ７２巻、８４６３〜８４７１頁（１９９８年））；
ＣＤ１５０−ＣＤ４８＋ＫＳＬ細胞の場合、ｐＣＣＬｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ｈｕｍａｎＰＧＫ．ｍＣｈｅｒｒｙＰｒｏｔｅｉｎ．Ｗｐｒｅ（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＬＶ）（Biffiら、Science  ３４１巻、１２３３１５８頁（２０１３年））；ＣＤ１５０＋ＣＤ４８＋ＫＳＬ細胞の場合、ｐＣＣＬｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ｈｕｍａｎＰＧＫ．Ｔａｇ−ＢｌｕｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ．Ｗｐｒｅ（Ｔａｇ−ＢＦＰ−ＬＶ）。サイトフローメトリック解析によって導入遺伝子発現を評価するため、形質導入細胞の画分は、記載の通り、１０日間、培養した（Biffiら、J.  Clin.  Invest.  １１６巻、３０７０〜３０８２頁（２００６年））。形質導入細胞は、様々な実験状況に従い、様々な濃度で、照射（２×４００ｃＧｙ）または４回目のブスルファンの用量（２５ｍｇ／ｋｇ×４日間）の２４時間後に、７／８週齢の前処理済みＣ５７ＢＬ６／Ｊ雌マウスに尾部静脈から注入した。
【０１９６】
静脈内（ＩＶ）移植
Ｌｉｎ−細胞：１０６個の細胞／マウス；ＫＳＬ：０．３×１０５個の細胞／マウス；Ｎｏｔ  ＫＳＬ：５×１０５個の細胞／マウス；ＨＰＣ１≒０，１２×１０４個の細胞／マウス；ＬＴ−ＨＳＣ≒０，５５×１０４個の細胞／マウス；ＨＰＣ２≒１，８×１０４個の細胞／マウス；ＭＰＰ≒０，５５×１０４個の細胞／マウス。ＫＳＬ細胞を移植して５日後に、マウスに、支持体としてＣＤ４５．１  Ｃ５７マウスに由来する全骨髄（ＴＢＭ）細胞を５×１０５個、投与した。マウスは滅菌条件に維持した。
【０１９７】
脳室内（ＩＣＶ）移植
Ｌｉｎ−細胞：０．３×１０６個の細胞／マウス；ＫＳＬ：０．３×１０５個の細胞／マウス；  Ｎｏｔ  ＫＳＬ：３×１０５個の細胞／マウス；ＨＰＣ１≒０，１２×１０４個の細胞／マウス；ＬＴ−ＨＳＣ≒０．５５×１０４個の細胞／マウス；ＨＰＣ２≒１，８×１０４個の細胞／マウス；ＭＰＰ≒０，５５×１０４個の細胞／マウス。移植して５日後に、マウスに、支持体としてＣＤ４５．１  Ｃ５７マウスに由来する全骨髄（ＴＢＭ）細胞を５×１０５個、投与した。
【０１９８】
Ｆｇｄ５  ＨＳＣの単離の場合、８週のＦｇｄ５ＺｓＧｒ・ＺｓＧｒ／＋ＣＤ４５．２マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙストック番号０２７７８８）をドナーとして使用した。製造業者の指示書に従い、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）マイクロビーズ（ＣＤ１１７マイクロビーズ、マウス−Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ｃ−ｋｉｔ＋細胞の濃縮を行った。次に、以下の抗体：系統マーカーＴｅｒ１１９、Ｍａｃ−１（ｍ１／７０）、Ｇｒ−１（８Ｃ５）、ＣＤ３（１７Ａ２）、ＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＣＤ８（５３−６．７）、Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）およびＩＬ７Ｒａ（Ａ７Ｒ３４）；ＣＤ３４（ＲＡＭ３４）、Ｆｌｋ２（Ａ２Ｆ１０）、ｃ−ｋｉｔ（２Ｂ８）、Ｓｃａ１（Ｄ７）、ＣＤ４５．２（１０４）（すべて、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄまたはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製）の組合せ物を使用して、ＰＢＳ  ２ｍＭのＥＤＴＡ、２％ＦＢＳ中、４℃で、ｃ−ｋｉｔが豊富な細胞を染色した。染色後、細胞を洗浄して、ＰＢＳ  ２ｍＭのＥＤＴＡ、２％ＦＢＳ（ＰＩ（０．０５μｇ／μＬ）を含む）に再懸濁し、氷上に維持した。細胞を分類するためにＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ）を使用した。
【０１９９】
分類した細胞は、ＩＶ（５００）またはＩＣＶ（５００）移植した。移植して５日後に、マウスに支持体としてＣＤ４５．１  Ｃ５７マウスに由来する１．０×１０６個のＴＢＭを投与した。細胞移植のレシピエントは、ブスルファン（Ｓｉｇｍａ）２５〜２７ｍｇ／ｋｇにより前処理した２か月齢の雌ＣＤ４５．２  Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスとし、ｉ．ｐ．または致死放射線量（２×５００ｃＧｙ）で投与した。ＩＶ移植の場合、細胞は尾部静脈に注入した。ＩＣＶ移植は、麻酔（ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ））時に手術によって行った。剃毛して消毒したマウスの頭部を定位固定フレーム中、耳棒で固定し、皮膚を縦方向に開いた。ブレグマが可視化され、座標を記録した。ブレグマから、注入座標（１ｍｍ側部、０．５ｍｍ前部）を調節した後、０．７ｍｍの直径のドリルヘッドを用いて、視覚制御下で頭蓋骨を取り囲んだ。細胞懸濁液５μｌを、頭蓋骨から２ｍｍの遠位部から脳に、１０μｌ  Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを挿入して注入した。創傷を閉じた後、動物に単回用量のアチパメゾール（１μｌ／ｇ）を摂取させて、滅菌条件で維持した。
【０２００】
前処理および移植後、予防用の抗生物質（硫酸ゲンタマイシン、８０ｍｇ／２５０ｍＬ）を、飲料水により、２週間、投与した。株および実験状況に応じて、マウスは、移植後（spo-transplant）、１．５、３、４および６か月に犠牲にして、ドナー細胞の生着について、末梢血液／ＢＭおよび脳を解析した。
【０２０１】
ヒトＣＤ３４＋細胞の単離、形質導入および移植
ヒト臍帯血（ＣＢ）由来のＣＤ３４＋細胞は、Ｌｏｎｚａ（２Ｃ−１０１）から購入した。解凍時に、ｈＩＬ−３［６０ｎｇ／μＬ］、ｈＴＰＯ［１００ｎｇ／μＬ］、ｈＳＣＦ［３００ｎｇ／μＬ］、ｈＦｌｔ３−Ｌ［３００ｎｇ／μＬ］（それらはすべてＰｅｐｒｏｔｅｃｈ製、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を補給した、ＣｅｌｌＧｒｏ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で、２４時間、細胞を事前刺激し、記載の通り、ＭＯＩ１００で、１ラウンドのＬＶ曝露によって、実験室グレードのＬＶをコードする、ＧＦＰ−（Dullら、J  Virol  ７２巻、８４６３〜８４７１頁（１９９８年））またはＡＲＳＡ（Sessaら、Lancet  ３８８巻、４７６〜４８７頁（２０１６年））を形質導入した（Biffiら、Science  ３４１巻、１２３３１５８頁（２０１３年））。ゲーティング戦略は、図３Ｍ、３Ｎおよび３Ｏに示されている。単離後、細胞は、以前に記載されている通りに事前刺激し、様々なＬＶにより形質導入した。特に、以下のＬＶ：
ＭＰＢ  ＣＤ３８−およびＣＤ３８−ＣＤ９０−細胞の場合、ｐＣＣＬｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ｈｕｍａｎＰＧＫ．ｍＯｒａｎｇｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ．Ｗｐｒｅ（Ｏｒａｎｇｅ−ＬＶ）；ＭＰＢ  ＣＤ３８ｍｉｄおよびＣＤ３８＋Ｃｄ９０−細胞の場合、ｐＣＣＬｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ｈｕｍａｎＰＧＫ．ｍＣｈｅｒｒｙＰｒｏｔｅｉｎ．Ｗｐｒｅ（ｍＣｈｅｒｒｙ−ＬＶ）；
ＭＰＢ  ＣＤ３８ｉｎｔ細胞の場合、ｐＣＣＬｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ｈｕｍａｎＰＧＫ．ＣｙａｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ．Ｗｐｒｅ（Ｃｙａｎ−ＬＶ）；ＭＰＢ  ＣＤ３８ｈｉｇｈ、ＣＤ３８−ＣＤ９０＋細胞およびＢＭ  ＣＤ３８−細胞の場合、ｐＣＣＬｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ｈｕｍａｎＰＧＫ．ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ．Ｗｐｒｅ（ＧＦＰ−ＬＶ）；ＭＰＢ  ＣＤ３８＋ＣＤ９０＋細胞およびＢＭ  ＣＤ３８＋細胞の場合、ｐＣＣＬｓｉｎ．ｃＰＰＴ．ｈｕｍａｎＰＧＫ．Ｔａｇ−ＢｌｕｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ．Ｗｐｒｅ（Ｔａｇ−ＢＦＰ−ＬＶ）を使用した。サイトフローメトリック解析によって導入遺伝子発現を評価するため、形質導入細胞の画分を、記載の通り、１０日間、培養した（Ｂｉｆｆｉ、２０１３年）。形質導入後、細胞を洗浄して、７〜９週齢の致死未満の照射（２００ｃＧｙ）、または骨髄アブレーションしたブスルファン処置（４日間、１６．２５ｍｇ／ｋｇ／日）した雌ＮＳＧマウスの尾部静脈に注入した。その生理学的割合に従い、様々に分類した細胞の混合物からなる、５×１０５個のｈＣＤ３４＋細胞または５×１０５個のｈＣＤ３４＋細胞を移植した。ＮＳＧマウスをブスルファンで事前処置した場合、雄のＮＳＧマウスからの４×１０６個のＴＢＭを支持体として移植した。ＮＳＧマウスにおけるｈＣＤ３４＋細胞のＩＣＶ移植を、Ｃ５７マウスにマウスのＨＳＰＣをＩＣＶ移植する場合に記載されている通りに実施した。１２週間後に、マウスを犠牲にして、ヒト造血細胞生着についてＢＭおよび脳を解析した。
【０２０２】
出生後の２日目に、Ｒａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−を、全身体照射３００＋２５０ＲＡＤの致死未満用量で前処理した。側頭静脈注入（２．５×１０５個の細胞／マウス）またはＩＣＶ（ガラス製キャピラリーにより側頭室内に）により、マウスにＩＶで形質導入細胞を投与した（Neriら、Stem  Cells  ２９巻、１５５９〜１５７１頁（２０１１年））（０．７５×１０５個の細胞／マウス）。移植して５週間後にマウスを犠牲にして、４−メチルウンベリフェリル−サルフェート基質を使用することによる細胞蛍光分析およびＡＲＳＡ活性によって、ＢＭと脳のヒト造血細胞の生着を解析した（Martinoら、J  Biotechnol  １１７巻、２４３〜２５１頁（２００５年））。
【０２０３】
細胞蛍光分析および組織学のためのマウス組織の収集および処理
マウスは、大腿骨をクランプした後、１５分間、冷ＰＢＳを用いて、広範囲な心臓内潅流による深い麻酔下で安楽死させた。次に、臓器を採集して、異なる処理をした。記載の通り、クランプした大腿骨から骨髄（ＢＭ）細胞を採集した（Biffiら、J.  Clin.  Invest.  １１６巻、３０７０〜３０８２頁（２００６年））。脳を除去して、２つの脳半球に異なる処理をした。免疫蛍光解析の場合、脳半球の１つを４％  ＰＦＡ中で２４時間、固定化し、ＯＣＴ化合物に埋包して、スクロースグラジエント（１０〜３０％）の平衡後に−８０℃で保管した。細胞蛍光解析に関すると、もう一方の脳半球からの細胞の凝集を機械的に解除し、２０ｍｌのＧＫＮ／ＢＳＡ緩衝液（８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．４ｇ／Ｌ  ＫＣｌ、１．４２ｇ／Ｌ  ＮａＨ２Ｐ０４、０．９３ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰ０４、２ｇ／Ｌ  Ｄ＋グルコース、ｐＨ７．４＋０．００２％  ＢＳＡ）中で単一細胞懸濁液を得た。
【０２０４】
ＮＳＧおよびＲａｇ−／−γ−鎖−／−Ａｓ２−／−移植マウスの脳内における、ｈＣＤ３４＋由来細胞の生着である、Ｆｇｄ５＋細胞生着の分析の場合、骨髄細胞の濃縮は、脳組織の酵素（１９ｍｇのパパイン、１０ｍｇのシステイン、２，５ｍｇのＤＮアーゼ）による消化後に、３０％パーコールグラジエント（Nikodemovaら、J  Neuroinflammation  ９巻、１４７頁（２０１２年））を使用して行った。
【０２０５】
フローサイトメトリー解析
ＢＭおよび脳からの細胞は、ブロッキング用溶液（ＰＢＳ  ５％ＦＢＳ、１％ＢＳＡ）に再懸濁してフローサイトメトリーにより解析し、以下の特異的抗体を用いて、１５分間、４℃で標識した：ラットＰＥ抗マウスＣＤ４５（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）１：１００；ラットＡＰＣ抗マウスＣＤ４５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１：１５０；ラットＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ５１０抗マウスＣＤ４５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）１：１５０；ラットＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ抗マウスＣＤ４５．２（Ｂｉｏ  Ｌｅｇｅｎｄ）１：１００；マウスＰＥ抗マウスＣＤ４５．１（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１：１００；ラットＡＰＣ抗マウスＣＤ１１ｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１：１００；マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７抗ヒトＣＤ２７１（ＮＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）１：３０；ラットＡＰＣ７８０抗マウスＣＤ１１ｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１：１００；ラットＡＰＣ７８０抗マウスＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１：１００；ラットＰＥ−Ｃｙ７抗マウスＬｙ−６Ａ／Ｅ  Ｓｃａ−１（Ｓｃａ−１）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅ）１：１５０；ハムスターＰＥ抗マウスＣＤ４８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）１：１００；ラットＡＰＣ抗マウスＣＤ１５０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）１：７５；ラットＰＥ抗マウスＣＤ２０２ｂ（Ｔｉｅ２）（ｅＢｉｏｓｃｅｎｃｅ）１：１５０；ラットＰＥ抗マウスＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅ）１：１５０；ラットＰＥ抗マウスＣＤ３４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１：１５０；ラットＰＥ−Ｃｙ７抗マウスＣＤ９３（ＡＡ４．１）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１：１５０；ラットビオチン抗マウスＣＤ１１５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１：１５０；ヤギＡＰＣ抗マウスＣＸ３ＣＲ１（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）１：７５；ＡＰＣストレプトアビジン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）１：５００；ラットＡＰＣ−Ｃｙ７抗マウスＢ２２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１：１００；ハムスターＡＰＣ−Ｃｙ７抗マウスＣＤ３ｅ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）１：１００；マウスＡＰＣ−Ｃｙ７抗ヒトＣＤ４５（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）；ラットＰＥ−ｃｙ７抗ヒトＣＸ３ＣＲ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）５：１００。死滅細胞を排除するため、本発明者らは、死滅細胞を排除するため、膜非透過性色素である７−ＡＡＤ（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をいずれか使用して、解析前に細胞に加えた。ＢＭおよび脳細胞を、ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって解析した。
【０２０６】
免疫蛍光解析
脳は、１５μｍ片で、低温保持装置上で矢状平面に連続的に切り出した。組織スライドは、ＰＢＳにより２回、洗浄し、空気乾燥して、０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ、２％  ＢＳＡ、１０％  ＮＧＳ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により２時間、ブロッキングした。次に、以下の通り、４℃で、ＰＢＳ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ、２％  ＢＳＡ、１０％  ＮＧＳ中で希釈した一次抗体を用いて、一晩、インキュベートした：ラットＡＰＣ抗ＣＤ１１ｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）１：５０；ウサギ抗Ｉｂａ１（Ｗａｋｏ）１：１００；ニワトリ抗ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ）１：２５０；ウサギ抗ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１：１００；マウスＰＥ抗ヒトＣＤ２７１（ＮＧＦ受容体）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）１：５０；ウサギ抗ｃｈｅｒｒｙ（Ａｂｃａｍ）１：１００。二次抗体ヤギＩｇＧ抗ニワトリＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、ヤギＩｇＧ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、５４６または６３３、ヤギＩｇＧ抗ラットＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６または６３３、ヤギＩｇＧ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、一次抗体の染色に使用したものと同じブロッキング用溶液中、１：５００に希釈し、室温で２時間、薄片と共にインキュベートした。核を、ＰＢＳ中、１：１０００のＴＯ−ＰＲＯ  ＩＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、またはＰＢＳ中、ＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ）１：３０によって染色した。スライス片をＰＢＳ中で洗浄し、空気乾燥して、Ｆｌｕｏｒｓａｆｅ試薬（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でマウントした。試料は、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ａｎｄ  Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ２；Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｒａｄｉａｎｃｅ  ２１００；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（λ励起＝４８８、５８６、６６０）を用いて解析した。蛍光シグナルは、Ｌａｓｅｒｓｈａｒｐ２０００ソフトウェアによって処理した。画像は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ８．０ソフトウェアにインポートし、自動化レベル補正を使用して処理した。脳薄片の再構築の場合、本発明者らは、画像の取得に蛍光顕微鏡Ｄｅｌｔａ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｉｘ７０を使用し、次に、この画像をＳｏｆｔ  Ｗｏｒｋ３．５．０ソフトウェアによって処理した。次に、画像をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ  ８．０ソフトウェアにインポートし、再構築した。
【０２０７】
ＲＮＡ抽出、およびリアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析
成体またはＰ１０ナイーブ対照および移植マウスから以前に分類した以下の集団から、遺伝子発現解析のための全ＲＮＡを単離した：ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂおよびＧＦＰ（ＨＣＴ−マウスのみ）の発現により分類した全ＣＤ４５＋ＣＤ１１ｂ＋、μおよびＴＡμ；ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、Ｌｙ６ＣおよびＧＦＰ（のみＨＣＴ−マウス）の発現により分類したマクロファージ。ＲＮＡ量は、ＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ（登録商標）ＲＮＡシステムおよびＱｕａｎｔｕｓ（商標）蛍光光度計（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して決定した。ｃＤＮＡを生成して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＶＩＬＯマスター混合物（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の使用により精製したｍＲＮＡを１ｎｇから１００ｎｇまで始めた。次に、Ｃｕｓｔｏｍ  Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ＰｒｅＡｍｐ  Ｐｏｏｌｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ｃＤＮＡを予備増幅した。ｃＤＮＡ生成および事前増幅のための熱サイクルは、製造業者の指示書に従い、Ｔ１００サーマルサイクラー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）で行った。遺伝子発現解析は、カスタム設計のＴａｑＭａｎをベースとするマイクロ流体カード遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行い、選択した１６個の遺伝子（１３個の標的、２個の内因性ハウスキーピングおよび１個の内部対照）の発現を測定した。リアルタイムＰＣＲは、以下の熱サイクル条件：５０℃、２分間で１サイクル、９５℃で１０分間で１サイクル、９５℃で１５秒間で４０サイクル、および６０℃で１分間を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）ＶｉｉＡ（商標）７リアルタイムＰＣＲシステム上で標準モードで実施した。（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＶｉｉＡ（商標）７ソフトウェアｖ１．２．２を使用して、未加工データを抽出した。各遺伝子の閾値サイクル（ＣＴ）と参照遺伝子の閾値サイクル（ＣＴ）（ＨＰＲＴおよび１８Ｓ  ＣＴの平均値）との間の差異（ｄＣＴ）を使用して、遺伝子発現を決定した。ＩＣＶ対ＩＶ移植マウスにおける選択したミクログリア遺伝子の発現の倍率変化を、２−ｄｄＣＴ方法（Livakら、Methods  ２５巻、４０２〜４０８頁（２００１年））により算出し、この場合、ｄｄＣＴは、μおよびＴＡμ細胞に一致した、ＩＣＶ移植マウスから回収した各試料のｄＣＴとＩＶ移植マウスから回収した試料のｄＣＴ平均値との間の差異を表す。
【０２０８】
ＲＮＡ配列決定および解析
ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｃｒｏキット（Ｑｉａｇｅｎ）使用して、分類した骨髄脳集団に由来するＲＮＡを抽出した。特に、本発明者らは、以下から様々な骨髄脳部分集団を分類することにより回収した：ＧＦＰ  ＨＳＰＣ移植から３か月時点の、Ｐ１０（ｎ＝４、二連）（ＴＡμ細胞）、５か月齢Ｃ５７ｂｌ６／ｊ（ｎ＝３）マウス（μ細胞）およびＢＵ処置マウス（ｎ＝３；本発明者らは、ＦＡＣＳにより解析した他の試料からのその多様性により、ＴＡμの１つの試料を分析から除外した）（μおよびＴＡμ細胞）。分類前に、マウスは、大腿骨をクランプした後、冷ＰＢＳを用いて心臓内潅流による深い麻酔下で安楽死させた。脳を採集して、既に記載した通り、処理した。ＲＮＡを採集して、−８０℃で保管した。少量の一定分量を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ６０００Ｐｉｃｏキットを使用して抽出したＲＮＡの量を確認した。
【０２０９】
ＲＮＡ配列決定は、ＩＧＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｕｄｉｎｅ）により行った。手短に言えば、全ＲＮＡ（開始量＝試料あたり１００ｎｇ）からのｃＤＮＡの増幅をＯｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２（Ｎｕｇｅｎ）を使用して行い、次に、画分化し、ＮｕＧＥＮ'ｓ  Ｏｖａｔｉｏｎ  Ｕｌｔｒａｌｏｗライブラリシステムを使用して、配列決定ライブラリにライゲーションした。バーコードを付けた後に、ＲＮＡライブラリをプールして変性し、８ｐＭの最終濃度に希釈した。クラスター形成は、フローセルｖ．３を使用して、ｃＢｏｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）（シングルエンド）上で行った。ＳＢＳ（合成による配列決定）は、５０サイクルに設定したＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に関するＴｒｕＳｅｑ  ＳＲプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って行い、各試料について、平均で３０×１０６個のクラスターを得た。未加工の配列（ｆａｓｔｑ）を、ＦａｓｔＱＣソフトウェアを使用して、良好な品質スコアとなるようフィルターにかけた。得られた配列は、ＳＴＡＲアライナー（ＳＴＡＲ＿２．３．０ｅ＿ｒ２９１）を使用して、マウスのゲノム（ｍｍ１０リリース）にアラインした（Dobinら、Bioinformatics  ２９巻、１５〜２１頁（２０１３年））。唯一独自にマッピングされた読み取り値を使用して、Ｐｙｔｈｏｎ  ｓｃｒｉｐｔ  「ＨＴＳｅｑ−ｃｏｕｎｔ」（モデルタイプ−ｕｎｉｏｎ、http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/）により、報告されているＥｎｓｅｍｂｌ  ｇｅｎｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ（ｖ７２）を使用して遺伝子数を見積もった（Andersら、Bioinformatics  ３１巻、１６６〜１６９頁（２０１５年））。遺伝子数をマッピングした後、データをどこかに記載されている、「Ｍ値の加重トリミング平均値（weighted  trimmed  mean  of  M-values）」を使用して正規化した（Robinsonら、Genome  Biol  １１巻、Ｒ２５頁（２０１０年））。正規化後、差次的遺伝子発現は、Ｒの「ｌｉｍｍａ」パッケージを使用して行った（Ritchieら、Nucleic  Acids  Res  ４３巻、ｅ４７頁（２０１５年））。
【０２１０】
ＲＮＡ配列決定に関する統計解析
主要な構成要素の解析（ＰＣＡ）。ＰＣＡは、ｌｉｍｍａのｖｏｏｍ関数によって生成させたｌｏｇ２正規化発現値に対して、ＲのｍｉｘＯｍｉｃｓライブラリ（Kim-Anh  Le  Cao、Florian  Rohart、Ignacio  Gonzalez、Sebastien  Dejean、ならびに主要貢献者：Benoit  Gautier、Francois  Bartolo、貢献者：Pierre  Monget、Jeff  Coquery、FangZou  YaoおよびBenoit  Liquet（２０１６年）mixOmics:  Omics  Data  Integration  Project.  R  package  version  6.0.0.  https://CRAN.R-  project.org/package=mixOmics）を使用して行った（Le  Caoら、Bioinformatics  ２５巻、２８５５〜２８５６頁（２００９年））。
【０２１１】
階層的クラスタリング。階層的クラスタリングは、ｌｉｍｍａのｖｏｏｍ関数によって生成させたｌｏｇ２正規化発現値に対して、同一名称を有するＲライブラリのｐｈｅａｔｍａｐ関数（「ユークリッド距離」および「コンプリート」法）を使用して行った。
【０２１２】
ボックスプロット。ｑＰＣＲデータのボックスプロットは、−ｄＣＴ（参照としてＧａｐｄｈ）に対するＲを使用して生成し、データのｌｏｇ２スケールを維持した。アスタリスク（＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．０１、＊＊＊ｐ値＜０．００１）は、ＡＮＯＶＡ−テューキーの事後検定を表す。
【０２１３】
ＧｏｓｓｅｌｉｎらにおけるＲＮＡ−Ｓｅｑデータの解析（Gosselin,D.ら、Cell  １５９巻、１３２７〜１３４０頁（２０１４年））。多様な起源の対照ミクログリアおよびマクロファージからの未加工発現データを、ＳＲＡアーカイブ（ＳＲＲ１６３４６７５、ＳＲＲ１６３４６７６、ＳＲＲ１６３４６７７、ＳＲＲ１６３４６７８、ＳＲＲ１６３４７０８、ＳＲＲ１６３４７０９、ＳＲＲ１６３４７１０、ＳＲＲ１６３４７１１、ＳＲＲ１６３４７１２、ＳＲＲ１６３４７２１）からのＧＥＯデータセットＧＳＥ６２８２６からダウンロードし、未加工配列を含むｆａｓｔｑファイルを得た。Ｇｏｓｓｅｌｉｎのマクロファージおよびミクログリアからの読み取り値は、本明細書に記載されているμおよびＴＡμ細胞からの読み取り値と一緒に処理し、μおよびＴＡμ集団の発現と、Ｇｏｓｓｅｌｉｎらの検討における成体ミクログリアとマクロファージの両方を比較するため、ＰＣＡおよびヒートマップを生成した（Gosselinら、Cell  １５９巻、１３２７〜１３４０頁（２０１４年））。
【０２１４】
ベン図。ベン図は、Ｖｅｎｎｙオンラインツール（Oliveros,J.C.（２００７〜２０１５年）Venny.  An  interactive  tool  for  comparing  lists  with  Venn's  diagrams.  http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）を使用して作製した。
【０２１５】
機能的濃縮。細胞集団間の差異に関する経路を評価するため、ＧＳＥＡの予備ランク付け解析を行った。ｌｉｍｍａにより推定したｌｏｇ２倍率変化のリストを、デフォルトパラメータ（ｇｓｅａ２−２．２．３．ｊａｒ）による、ｇｓｅａ予備ランク付けコマンドラインツール（ｐｒｅ−ｒｅａｎｋｅｄ  ｃｏｍｍａｎｄ  ｌｉｎｅ  ｔｏｏｌ）を用いて予備ランク付けリストとして使用した。ｅｎｓｅｍｂｌ−ｍａｒｔ相同性マップを使用してヒトｅｎｔｒｅｚ  ｉｄをマウス遺伝子記号に翻訳した後、遺伝子オントロジー生物学的プロセス（ｃ５．ｇｏ．ｂｐ）をｇｍｔファイルとして使用した。μ．ＢＵＴＸおよびＴＡμ．ＢＵＴＸ細胞に相関して見出された重要な分類数がより多いために、濃縮のための標準ＦＤＲのカットオフを０．０５〜０．００１に向上させた。ＧＯＳｅｍＳｉｍの意味類似性マトリックスは、ＧＯＳｅｍＳｉｍ  Ｒパッケージ（１．２４．１）を使用して計算した（Yuら、Bioinformatics  ２６巻、９７６〜９７８頁（２０１０年））。類似性のマトリックスは、Ｒのｐｈｅａｔｍａｐ（クラスター形成のため「ユークリッド」距離および「コンプリート」法を用いる）を使用して、クラスター形成したＧＯのヒートマップとして示した。
【０２１６】
受託番号コード。遺伝子発現オムニバス：ＲＮＡ−Ｓｅｑデータは、受託番号コードＧＳＥ８７７９９で入手可能であり、Ｇｏｓｓｅｌｉｎらに再解析されたデータは、受託番号コードＧＳＥ６２８２６で入手可能である（Gosselin,D.ら、Cell  １５９巻、１３２７〜１３４０頁（２０１４年））。
【０２１７】
ナノ粒子（ＮＰ）生合成および投与
材料：具体的に明記した場合を除いて、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ、９７％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ε−カプロラクトン（ＣＬ、９７％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、２−エチルヘキサン酸スズ（ＩＩ）塩（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２、約９５％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ９５０、Ｍｎ９５０Ｄａ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、３−スルホプロピルメタクリレートカリウム塩（ＳＰＭＡＫ、９８％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、４−シアノ−４−（フェニルカルボノチオイルチオ）−ペンタン酸（ＣＰＡ、＞９７％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、４−４’アゾビス（シアノ吉草酸）（ＡＣＶＡ、９８％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、過硫酸カリウム（ＫＰＳ；＞９９％純度、ＡＣＳ  ｒｅａｇｅｎｔ）、ローダミンＢ（ＲｈＢ、Ｓｂ感度＜０．１μｇ  ｍＬ−１、Ｃａｒｌｏ  Ｅｒｂａ  ｒｅａｇｅｎｔｓ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ；９９％純度、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、４−（ジメチルアミノ）−ピリジン（ＤＭＡＰ；＞９９％純度、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）は、受領したまま使用した。ポリ（エチレングリコール）メチルエーテルメタクリレート（ＰＥＧＭＡ２０００、Ｍｎ２０００Ｄａ、Ｈ２Ｏ中５０重量％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）は、ＤＣＭにより抽出し、減圧下で乾燥した。使用される溶媒はすべて、分析グレードの純度であり、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【０２１８】
ＰＣＬをベースとするマクロモノマー（ＨＥＭＡ−ＣＬｎ）およびＨＥＭＡ−ＲｈＢ合成および特徴付け。ポリε−カプロラクトンをベースとするマクロモノマーは、これまでのプロトコルに従い、開始剤としてＨＥＭＡ、触媒としてＳｔ（Ｏｃｔ）２を用いて、バルク中、ＣＬの開環重合（ＲＯＰ）により生成した。触媒に対する開始剤の比は、２００までの一定を維持する一方、開始剤に対するモノマーのモル比は、それぞれ、３（ＨＥＭＡ−ＣＬ３）および５（ＨＥＭＡ−ＣＬ５）のカプロラクトン単位を有するマクロモノマーを得るため、３〜５に設定した。ＨＥＭＡ−ＣＬ５の場合、ＨＥＭＡ４．５ｇおよびＳｔ（Ｏｃｔ）２  ７１ｍｇを１０ｍｌのバイアル中、室温で、完全に溶解するまで混合した。カプロラクトン２０ｇおよびＮａ２ＳＯ４  ８２．６ｍｇをセプタムで密封したフラスコ中で混合し、温度を制御した油浴中で撹拌下、１３０℃に置いた。次に、ＨＥＭＡおよびＳｔ（Ｏｃｔ）２混合物をフラスコに加え、この反応物を３時間、反応させた。冷却後、マクロモノマーを１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｂｒｕｋｅｒ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により特徴付けた。ローダミンＢに基づく蛍光モノマーは、ＤＣＣおよびＤＭＡＰの存在下、ＨＥＭＡによりＲｈＢをシュテークリヒエステル化により合成し、文献に報告されているプロトコルに従い特徴付けした。
【０２１９】
ブロックコポリマー合成および特徴付け−自己集合ＮＰ。２つのＰＣＬに基づくブロックコポリマーは、２つの後続するＲＡＦＴ溶液の重合により合成した。第１の工程では、ＰＥＧ化されたマクロＲＡＦＴ剤（５ＰＥＧＭＡ２０００）を、ＣＰＡに対するモノマーおよびＣＰＡに対するＡＣＶＡのモル比を５に等しくして、ＰＥＧＭＡ２０００のＲＡＦＴ重合により合成した。手短に言えば、１４．８ｇのＰＥＧＭＡ２０００、４２５ｍｇのＣＰＡおよび８５ｍｇのＡＣＶＡを７５ｍｌのエタノールに溶解し、セプタムで密封したフラスコに注ぎ入れた。３０分間、窒素をパージした後、撹拌下、温度を制御した油浴中、この混合物を６５℃まで加熱した。２４時間後に、他の８５ｍｇのＡＣＶＡを２．５ｍｌのエタノールに溶解し、シリンジを用いて反応器に注入した。この反応物をさらに２４時間後に停止し、この混合物を窒素下で乾燥した。最終マクロＲＡＦＴ剤を３回、ジエチルエーテルにより洗浄し、未反応ＰＥＧＭＡ２０００を除去した。第２の工程では、それぞれ、中性および負に帯電したポリマー界面活性剤を生成するため、ＳＰＭＡＫを添加して、および添加しないで、２つの異なるブロックコポリマーを合成した。中性のものである、５１０と称するもの（ＰＥＧＭＡ２０００単位の数の場合、５であり、ＨＥＭＡ−ＣＬ５繰り返し単位の数の場合、１０である）である場合、それぞれ、ＲＡＦＴ剤に対するモノマーのモル比、およびＲＡＦＴ剤に対する開始剤のモル比を１０および３に等しくして、ＨＥＭＡ−ＣＬ５のＲＡＦＴ溶液重合を実施した。５．８ｇの５ＰＥＧＭＡ２０００、４ｇのＨＥＭＡ−ＣＬ５、５４ｍｇのＡＣＶＡおよび１３．８ｍｇのＨＥＭＡ−Ｒｈを、５０ｍｌのエタノールに溶解し、丸底フラスコに注ぎ入れた。３０分間、窒素をパージした後、この混合物を６５℃まで加熱し、撹拌下で２４時間、反応させた。最終ポリマーを窒素下で乾燥し、ジエチルエーテルにより３回、洗浄した。負に帯電したブロックコポリマー（５１０−ＳＰ）の生成の場合、同量の開始剤、マクロ−ＲＡＦＴ剤、ＨＥＭＡ−Ｒｈおよび５ＰＥＧＭＡ２０００を、酢酸緩衝液／エタノール（２０／８０重量％）混合物３９ｇに、０．２８ｇのＳＰＭＡＫと共に溶解した。５１０と同じ反応条件および精製プロトコルを適用した。各工程の転化、ＭＷおよび分散度（Ｄ）は、Ｊａｓｃｏ（シリーズ）装置を備えたＧＰＣによって決定した。試料は、４ｍｇ  ｍＬ−１の濃度でＴＨＦに溶解し、注入前に、０．４５μｍの細孔−サイズフィルターシリンジによりろ過した。分離は、３５℃、０．５ｍＬ分−１の流速で、３本のＳｕｐｅｒｃｈｒｏｍ  ＰＬｇｅｌ  ５μｍカラム（６００×７．５ｍｍ、０．５〜１０００ｋＤａの範囲を測定）により行った。Ｍｎ、ＧＰＣおよび分散度（Ｄ）は、示差屈折率（ＲＩ）データから直接較正することにより決定し、ポリ（スチレン）標準品（５８０〜３，２５０，０００ｇ／ｍｏｌ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に対して相対とした。変換は、以下：
ＸＧＰＣ＝Ａｐｏｌ／Ａｐｏｌ＋Ａｍｏｎ
に従い、ポリマー（Ａｐｏｌ）およびモノマー（Ａｍｏｎ）のＲＩシグナル曲線下面積により推定した。
【０２２０】
ブロックコポリマー５１０ＳＰの場合、特徴付けは、ＧＰＣの溶離液に不溶性であるので、１Ｈ−ＮＭＲにより行った。１Ｈ−ＮＭＲ分析を行うため、１０ｍｇの５１０ＳＰを、０．７ｍｇのＤＭＳＯ−ｄ６に溶解した。
【０２２１】
５１０および５１０ＳＰのナノ沈殿によるＮＰ生成−自己集合ＮＰ。２つの蛍光ブロックコポリマーを使用して、自己集合によりＰＢＳにＮＰを直接、生成させた。６０ｍｇのポリマー界面活性剤（例えば、５１０）を０．３ｇのＤＭＳＯに溶解し、次に、３ｍｌのＰＢＳを事前にロードした５ｍｌシリンジにより吸引した。吸入および排出を３サイクル行った後、この混合物を０．２μｍのＰＥＳ細孔−サイズのフィルターシリンジ（Ｍｉｌｌｅｘ）によりろ過した。ＮＰ  ＤｎおよびＰＤＩを動的レーザー光散乱解析（ＤＬＬＳ、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により決定した。
【０２２２】
ＮＰは、エマルション重合によって生成した。第１世代のＮＰ。ＰＥＧ化されているＰＣＬをベースとするＮＰは、既に記載したＨＥＭＡ−ＣＬ３のモノマーを不足させたセミバッチエマルション重合（ＭＳＳＥＰ）により合成した。手短に言えば、０．４ｇのＰＥＧＭＡ９５０を、３つ口丸底フラスコ中、４５ｍｌの脱イオン水に溶解し、８０℃に加熱した。窒素／真空のサイクルを３回行った後、２．１ｇのＨＥＭＡ−ＣＬ３を２．１ｍｇのＨＥＭＡ−Ｒｈと混合し、２ｍＬ  ｈ−１の供給速度で反応器に加えた。０．０２ｇのＫＰＳを２．５ｍＬの脱イオン水に溶解し、親油性モノマーの供給の開始にシリンジにより注入した。３時間後、この反応を停止し、最終ラテックスをＤＬＬＳにより特徴付けた。
【０２２３】
統計解析：
統計学的検定は、すべて両側とした。ＲＮＡ−Ｓｅｑの結果以外の比較に関すると、スチューデントのｔ検定を２つの群の比較に使用した。２つを超える群を含む比較に関すると、テューキーの事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡを使用した。差異は、Ｐ＜１．５（＊０）の値で統計学的に有意と見なした。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーを含む図のすべてにおいて、グラフは、平均値±ＳＤを図示している。
【０２２４】
他の実施形態
上述から、変形および修飾を、本明細書に記載されている本発明に行い、本発明を様々な利用および条件に適合することができることが明らかであろう。このような実施形態はまた、以下の特許請求の範囲内にある。
【０２２５】
本明細書における変数のいかなる定義における要素をリストしたものの列挙は、列挙した要素の任意の単一要素または組合せ（または、部分組合せ）として、そのような変数の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、任意の単一実施形態として、または任意の他の実施形態もしくはその一部と組み合わせて、そのような実施形態を含む。
【０２２６】
本明細書において明記されている、特許、刊行物および受託番号はすべて、あたかも個々の独立した特許、刊行物および受託番号のそれぞれが、具体的かつ個々に、参照により組み込まれて示されているかのごとく、同じ程度に参照により本明細書に組み込まれている。
【図１Ａ】
2019534898.tif 000008
【図１ＢＣＤ】
2019534898.tif 000009
【図１Ｅ】
2019534898.tif 000010
【図１Ｆ】
2019534898.tif 000011
【図１Ｇ】
2019534898.tif 000012
【図１Ｈ】
2019534898.tif 000013
【図２】
2019534898.tif 000014
【図３Ａ】
2019534898.tif 000015
【図３Ｂ】
2019534898.tif 000016
【図３ＣＤ】
2019534898.tif 000017
【図３Ｅ】
2019534898.tif 000018
【図３Ｆ】
2019534898.tif 000019
【図３ＧＨ】
2019534898.tif 000020
【図３Ｉ】
2019534898.tif 000021
【図３Ｊ】
2019534898.tif 000022
【図４Ａ】
2019534898.tif 000023
【図４Ｂ】
2019534898.tif 000024
【図４Ｃ】
2019534898.tif 000025
【図４Ｄ】
2019534898.tif 000026
【図４Ｅ】
2019534898.tif 000027
【図５Ａ−１】
2019534898.tif 000028
【図５Ａ−２】
2019534898.tif 000029
【図５Ａ−３】
2019534898.tif 000030
【図５Ｂ】
2019534898.tif 000031
【図５Ｃ−１】
2019534898.tif 000032
【図５Ｃ−２】
2019534898.tif 000033
【図５Ｃ−３】
2019534898.tif 000034
【図５Ｄ−１】
2019534898.tif 000035
【図５Ｄ−２】
2019534898.tif 000036
【図５Ｄ−３】
2019534898.tif 000037
【図５ＥＦ】
2019534898.tif 000038
【図６】
2019534898.tif 000039
【図７】
2019534898.tif 000040
【図８】
2019534898.tif 000041
【図９】
2019534898.tif 000042
【図１０】
2019534898.tif 000043
【図１１Ａ】
2019534898.tif 000044
【図１１Ｂ】
2019534898.tif 000045
【図１１Ｃ】
2019534898.tif 000046
【図１１ＤＥＦＧ】
2019534898.tif 000047
【図１１ＨＩ】
2019534898.tif 000048
【図１１Ｊ】
2019534898.tif 000049
【図１２Ａ】
2019534898.tif 000050
【図１２ＢＣＤＥ】
2019534898.tif 000051
【図１３Ａ】
2019534898.tif 000052
【図１３Ｂ−１】
2019534898.tif 000053
【図１３Ｂ−２】
2019534898.tif 000054
【図１４】
2019534898.tif 000055
【図１５Ａ】
2019534898.tif 000056
【図１５Ｂ】
2019534898.tif 000057
【図１５Ｃ】
2019534898.tif 000058
【図１６Ａ−１】
2019534898.tif 000059
【図１６Ａ−２】
2019534898.tif 000060
【図１６ＢＣ】
2019534898.tif 000061
【図１６Ｄ】
2019534898.tif 000062
【図１７Ａ】
2019534898.tif 000063
【図１７ＢＣＤ】
2019534898.tif 000064
【図１７ＥＦ】
2019534898.tif 000065
【図１７ＧＨＩ】
2019534898.tif 000066
【図１８】
2019534898.tif 000067
【図１９】
2019534898.tif 000068
【図２０ＡＢ】
2019534898.tif 000069
【図２０ＣＤＥ】
2019534898.tif 000070
【配列表】
2019534898000001.app
【国際調査報告】
2019534898.tif 000071
2019534898.tif 000072
2019534898.tif 000073