(57)【要約】本開示は、ＤＵＸ４の発現を制御するための方法および組成物に関する。いくつかの側面において、本開示により記載される方法は、異常なＤＵＸ４発現（例えば、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー）に関連する疾患を処置するために有用である。
2019534298.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィーを有する対象を処置するための方法であって、対象にＤＵＸ４遺伝子発現のエピジェネティックな修飾因子の有効量を投与することを含み、ここで、前記エピジェネティックな修飾因子が、対象の筋細胞においてＤＵＸ４遺伝子発現を低下させる、前記方法。
【請求項２】
エピジェネティックな修飾因子が、対象の筋細胞においてＺＳＣＡＮ４遺伝子発現を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＵＸ４遺伝子発現のエピジェネティックな修飾因子が、対象の筋細胞においてＴＲＩＭ４３またはＺＳＣＡＮ４を阻害しない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＤＵＸ４遺伝子発現のエピジェネティックな修飾因子が、１つ以上の筋原性制御遺伝子を阻害しない、請求項１または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１つ以上の筋原性制御遺伝子が、ミオゲニン（ＭｙｏＧ）、ｍｙｏＤ、およびミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
エピジェネティックな修飾因子が、ＪＱ１、またはＪＱ１のアナログではない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子が、デメチラーゼ酵素の阻害剤である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
デメチラーゼが、リジン特異的デメチラーゼである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
リジン特異的デメチラーゼが、ＫＤＭ４Ａ、ＫＤＭ４Ｂ、ＫＤＭ４Ｃ、ＫＤＭ４Ｄ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＭ６Ｂ、およびＰＨＦ２からなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
リジン特異的デメチラーゼが、ＫＤＭＣ４Ｃであり、エピジェネティックな修飾因子が、ＫＤＭ４Ｃを特異的に阻害する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
エピジェネティックな修飾因子が、ブロモドメイン含有タンパク質（ＢＲＤ）の阻害剤である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＢＲＤタンパク質が、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤＴ、ＡＳＨ１Ｌ、ＢＲＰＦ１、ＢＲＰＦ３、ＢＰＴＦ、ＢＡＺ１Ａ、ＢＡＺ１Ｂ、またはＢＡＺ２Ａである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＢＲＤタンパク質が、ＢＲＤ２であり、エピジェネティックな修飾因子が、ＢＲＤ２を特異的に阻害する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＢＲＤタンパク質が、ＢＡＺ１Ａであり、エピジェネティックな修飾因子が、ＢＡＺ１Ａを特異的に阻害する、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
エピジェネティックな修飾因子が、クロマチンリモデリングタンパク質の阻害剤である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
クロマチンリモデリングタンパク質が、ＳＭＡＲＣＡ５またはＳＭＡＲＣＢ１である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
クロマチンリモデリングタンパク質が、ＳＭＡＲＣＡ５であり、エピジェネティックな修飾因子が、ＳＭＡＲＣＡ５を特異的に阻害する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子が、メチルトランスフェラーゼ酵素の阻害剤である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
メチルトランスフェラーゼが、ＣＡＲＭ１、ＤＯＴ１Ｌ、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｅ、ＰＲＭＴ１、ＳＥＴＤ１Ａ、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＭＹＤ３、またはＡＳＨ１Ｌである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
メチルトランスフェラーゼが、ＡＳＨ１Ｌであり、エピジェネティックな修飾因子が、ＡＳＨ１Ｌを特異的に阻害する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子が、核酸、ポリペプチド、または小分子である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子が、核酸である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
核酸が、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群より選択される干渉性核酸である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子が、表１において列記される干渉性核酸である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子が、ポリペプチドである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチドが、抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子が、小分子である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
筋細胞が、最終分化した筋細胞である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
有効量が、対象の筋細胞にex vivoで投与される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
転写活性ＤＵＸ４遺伝子の存在に基づいて、ＦＳＨＤを有する対象が同定される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
筋細胞が、エピジェネティックな修飾因子の有効量の投与の前に、染色体４ｑ３５においてエピジェネティックに調節不全となったＤ４Ｚ４アレイを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
エピジェネティックに調節不全となったＤ４Ｚ４アレイが、１１個より少ない反復単位を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
投与の前および／または後に、対象のＤＵＸ４発現レベルを評価することをさらに含み、ここで、ＤＵＸ４発現レベルの変化が、処置の有効性を示す、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
ＤＵＸ４遺伝子発現のエピジェネティックな修飾因子を同定するための方法であって、以下：
（ｉ）ＤＵＸ４の発現により特徴づけられる細胞を、ＤＵＸ４の推定のクロマチンモディファイアーの発現または活性を修飾するための候補の剤と接触させること；
（ｉｉ）細胞におけるＤＵＸ４の発現レベルを検出すること；ならびに、
（ｉｉｉ）候補の剤との接触の後でＤＵＸ４の発現レベルが対照細胞と比較して低下した場合に、候補の剤を、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子として同定すること
を含む、前記方法。
【請求項３５】
ＤＵＸ４がＤＵＸ４全長（ＤＵＸ４−ｆｌ）である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
細胞が、筋細胞、任意に最終分化した筋細胞である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
細胞が、ＦＳＨＤを有するか、またはこれを有することが疑われる対象から得られる、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
細胞が、染色体４ｑ３５において、エピジェネティックに調節不全となったＤ４Ｚ４アレイを含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
Ｄ４Ｚ４アレイが、１１個より少ない反復単位を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
候補の剤が、化合物ライブラリーから選択される、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ライブラリーが、デメチラーゼ阻害剤を含むか、またはこれからなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
デメチラーゼ阻害剤が、リジン特異的デメチラーゼ阻害剤である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ライブラリーが、ブロモドメイン阻害剤を含むか、またはこれからなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
ライブラリーが、クロマチンリモデリングタンパク質の阻害剤を含むか、またはこれからなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
ライブラリーが、メチルトランスフェラーゼ阻害剤を含むか、またはこれからなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
候補の剤が、核酸、ポリペプチド、または小分子である、請求項３４〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
候補の剤が、核酸である、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
核酸が、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群より選択される干渉性核酸である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
候補の剤が、ポリペプチドである、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
ポリペプチドが、抗体である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
候補の剤が、小分子である、請求項３４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
検出が、ハイブリダイゼーションベースのアッセイ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）またはＦＡＣＳにより行われる、請求項３４〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
細胞においてＤＵＸ４の発現を阻害するための方法であって、細胞を、組み換え遺伝子編集複合体の有効量と接触させることを含み、ここで、遺伝子編集複合体は、細胞において、リジン特異的デメチラーゼ、ＢＲＤタンパク質、メチルトランスフェラーゼ、またはクロマチンリモデリングタンパク質の発現を阻害する、前記方法。
【請求項５４】
組み換え遺伝子編集複合体が、Ｃａｓタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはメガヌクレアーゼを含む、請求項５３に記載の方法
【請求項５５】
Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、またはそのバリアントである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
Ｃａｓタンパク質が、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質である、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
Ｃａｓタンパク質が、配列番号３１において記載される配列を含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
組み換え遺伝子編集複合体が、転写抑制因子ドメインをさらに含む、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
転写抑制因子ドメインが、ＫＲＡＢドメインである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
遺伝子編集複合体が、配列番号２９において記載される配列を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
組み換え遺伝子編集複合体は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、任意に一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をさらに含む、請求項５５〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、リジン特異的デメチラーゼ、ＢＲＤタンパク質、メチルトランスフェラーゼ、またはクロマチンリモデリングタンパク質をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
リジン特異的デメチラーゼが、ＫＤＭ４Ｃである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ＢＲＤタンパク質が、ＢＲＤ２である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
ＢＲＤタンパク質が、ＢＡＺ１Ａである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
メチルトランスフェラーゼが、ＡＳＨ１Ｌである、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
クロマチンリモデリングタンパク質が、ＳＭＡＲＣＡ５である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
組み換え遺伝子編集複合体が、ウイルスベクター、任意にレンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにより細胞に送達される、請求項５３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
細胞が、筋細胞、任意に最終分化した筋細胞である、請求項５３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
以下：
（ｉ）組み換え遺伝子編集タンパク質；および
（ｉｉ）リジン特異的デメチラーゼ、ＢＲＤタンパク質、メチルトランスフェラーゼ、またはクロマチンリモデリングタンパク質をコードする標的遺伝子に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ここで、細胞における標的遺伝子へのガイド鎖の結合が、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子発現の阻害をもたらす、
を含む、組み換え遺伝子編集複合体。
【請求項７１】
組み換え遺伝子編集タンパク質が、Ｃａｓタンパク質、任意にＣａｓ９タンパク質、Ｃｆｐ１タンパク質、またはそのバリアントを含む、請求項７０に記載の組み換え遺伝子編集複合体。
【請求項７２】
Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質または不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質であり、任意にここで、ｄＣａｓ９タンパク質が、配列番号２９において記載される配列を含む、請求項７１に記載の組み換え遺伝子編集複合体。
【請求項７３】
組み換え遺伝子編集複合体が、転写抑制因子ドメインをさらに含む、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載の組み換え遺伝子編集複合体。
【請求項７４】
転写抑制因子ドメインが、ＫＲＡＢドメインである、請求項７３に記載の組み換え遺伝子編集複合体。
【請求項７５】
リジン特異的デメチラーゼが、ＫＤＭ４Ｃである、請求項７０〜７４のいずれか一項に記載の組み換え遺伝子編集複合体。
【請求項７６】
ＢＲＤタンパク質が、ＢＲＤ２またはＢＡＺ１Ａである、請求項７０〜７４のいずれか一項に記載の組み換え遺伝子編集複合体。
【請求項７７】
メチルトランスフェラーゼが、ＡＳＨ１Ｌである、請求項７０〜７４のいずれか一項に記載の組み換え遺伝子編集複合体。
【請求項７８】
クロマチンリモデリングタンパク質が、ＳＭＡＲＣＡ５である、請求項７０〜７４のいずれか一項に記載の組み換え遺伝子編集複合体。
【請求項７９】
ガイド鎖が、配列番号２０〜２７から選択される配列を含むか、またはこれからなる、請求項７０〜７８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８０】
請求項７０〜７９のいずれか一項に記載の組み換え遺伝子編集複合体、およびウイルスベクター、任意にレンチウイルスベクターまたは組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含む、組成物。
【請求項８１】
薬学的に受入可能な賦形剤を含む、請求項８０に記載の組成物。
【請求項８２】
それを必要とする対象において顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を処置するための方法であって、対象に、請求項７０〜７９のいずれか一項に記載の組み換え遺伝子編集複合体または請求項８０または８１に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項８３】
組み換え遺伝子編集複合体が、ウイルスベクター、任意にレンチウイルスベクターまたは組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターにより、対象に投与される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
対象が、哺乳動物、任意にヒトである、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８５】
投与が、注射、任意に筋肉内注射または静脈内注射によるものである、請求項８２〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
組み換え遺伝子編集複合体が、対象の筋細胞、任意に対象の最終分化した筋細胞、筋幹細胞、筋サテライト細胞、または筋芽細胞に投与される、請求項８２〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、２０１６年１１月７日に出願された米国仮出願番号62/418,694、表題「IDENTIFICATION OF THERAPEUTIC TARGETS FOR FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY」、および２０１７年４月２７日に出願された米国仮出願番号62/490,783、表題「IDENTIFICATION OF THERAPEUTIC TARGETS FOR FACIOSCAPULOHUMERAL MUSCULAR DYSTROPHY」の出願日の利益を主張し、これらの内容は、その全体において参考として援用される。
【０００２】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所により付与されたAR062587下における政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）は、染色体４ｑ３５におけるエピジェネティックに調節不全となったＤ４Ｚ４アレイからのＤＵＸ４遺伝子の異常発現により引き起こされる。この遺伝子は、健康な個体においては、一般に発現しないか、非常に低いレベルにおいて発現する。ＦＳＨＤ患者においては、ＤＵＸ４遺伝子は、骨格筋において、高いレベルで異常発現する。この異常発現が、最終的に、筋肉の病変、萎縮、および臨床的な脱力をもたらす。開発されているほとんどの治療は、ＤＵＸ４のｍＲＮＡまたはタンパク質を標的とする。
【０００４】
ＤＵＸ４のタンパク質のｍＲＮＡを標的とするいくつかの治療剤が、ＦＳＨＤの処置のために研究されてきた。しかし、有効なヒト用の処置は、なお必要とされている。今日まで、ＦＳＨＤのための特異的治療は存在せず、現在の処置は、行動症状を改善するためのみに向けられている。したがって、ＦＳＨＤを処置するための新規の組成物および方法の開発について、一般的な必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
概要
いくつかの側面において、本開示は、ＤＵＸ４の異常な発現に関連する疾患（例えば、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、ＦＳＨＤ）の処置のために有用な組成物および方法に関する。いくつかの態様において、本明細書において開示されるエピジェネティックな修飾因子は、ＤＵＸ４の異常な発現をエピジェネティックに制御（例えば阻害）するため有用である。いくつかの態様において、ＤＵＸ４の異常な発現により特徴づけられる疾患（例えばＦＳＨＤ）を有する対象における、エピジェネティックな修飾因子（例えば選択的阻害剤）によるＤＵＸ４発現の低下は、病原性ＤＵＸ４−ＦＬタンパク質の発現の低下をもたらし、それにより、疾患の総体症状を軽減するか、疾患の症状を逆転させることが期待される。いくつかの態様において、エピジェネティックな修飾因子は、対象においてＺＳＣＡＮ４遺伝子発現を低下させる。
【０００６】
本開示の側面は、エピジェネティックな修飾因子（例えば選択的阻害剤）によるＤＵＸ４遺伝子発現の阻害が、ＤＵＸ４遺伝子発現の低下および／またはＤＵＸ４タンパク質（例えば、ＤＵＸ４−ＦＬ）のタンパク質産生の低下をもたらすという発見に関する。例えば、特定のブロモドメイン含有タンパク質（例えば、ＢＲＤ２、ＢＡＺ１Ａなど）、ヒストンデメチラーゼ（例えばＫＤＭ４Ｃ）、特定のメチルトランスフェラーゼ（例えばＡＳＨ１Ｌ）、およびクロマチンリモデリングタンパク質（例えば、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＭＡＲＣＢ１など）をコードする遺伝子の選択的阻害は、ＤＵＸ４遺伝子発現の低下（例えば、ＤＵＸ４遺伝子のエピジェネティックサイレンシング）をもたらす。したがって、いくつかの態様において、ＤＵＸ４遺伝子の選択的なエピジェネティックな修飾因子は、病原性ＤＵＸ４−ＦＬタンパク質の産生を低下させ、ＦＳＨＤを処置するために有用である。
【０００７】
本開示のいくつかの側面において、それを必要とする対象において顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を処置するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、対象にＤＵＸ４遺伝子発現のエピジェネティックな修飾因子の治療有効量を投与することを含む。いくつかの態様において、エピジェネティックな修飾因子は、対象の筋細胞、筋前駆細胞、または筋幹細胞において、ＤＵＸ４発現を低下させる。
【０００８】
いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、ＤＵＸ４とハイブリダイズする干渉性核酸ではない。
いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、デメチラーゼ酵素の阻害剤である。いくつかの態様において、デメチラーゼは、リジン特異的デメチラーゼである。いくつかの態様において、リジン特異的デメチラーゼは、ＫＤＭ４Ａ、ＫＤＭ４Ｂ、ＫＤＭ４Ｃ、ＫＤＭ４Ｄ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＭ６Ｂ、およびＰＨＦ２からなる群より選択される。いくつかの態様において、リジン特異的デメチラーゼは、ＫＤＭＣ４ＣおよびＫＤＭ４Ｃを特異的に阻害するエピジェネティックな修飾因子である。
【０００９】
いくつかの態様において、エピジェネティックな修飾因子は、ブロモドメイン含有タンパク質（ＢＲＤ）の阻害剤である。いくつかの態様において、ＢＲＤタンパク質は、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤＴ、ＡＳＨ１Ｌ、ＢＲＰＦ１、ＢＲＰＦ３、ＢＰＴＦ、ＢＡＺ１Ａ、ＢＡＺ１Ｂ、またはＢＡＺ２Ａである。いくつかの態様において、ＢＲＤタンパク質は、ＢＲＤ２であり、エピジェネティックな修飾因子は、ＢＲＤ２を特異的に阻害する。いくつかの態様において、ＢＲＤタンパク質は、ＢＡＺ１Ａであり、エピジェネティックな修飾因子は、ＢＡＺ１Ａを特異的に阻害する。
【００１０】
いくつかの態様において、エピジェネティックな修飾因子は、クロマチンリモデリングタンパク質の阻害剤である。いくつかの態様において、クロマチンリモデリングタンパク質は、ＳＭＡＲＣＡ５またはＳＭＡＲＣＢ１である。
いくつかの態様において、クロマチンリモデリングに関与するタンパク質は、ＳＭＡＲＣＡ５であり、エピジェネティックな修飾因子は、ＳＭＡＲＣＡ５を特異的に阻害する。
【００１１】
いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、メチルトランスフェラーゼ酵素の阻害剤である。いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼは、ＣＡＲＭ１、ＤＯＴ１Ｌ、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｅ、ＰＲＭＴ１、ＳＥＴＤ１Ａ、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＭＹＤ３、またはＡＳＨ１Ｌである。いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼは、ＡＳＨ１Ｌであり、エピジェネティックな修飾因子は、ＡＳＨ１Ｌを特異的に阻害する。
いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、核酸、ポリペプチド、または小分子である。
【００１２】
いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、核酸である。いくつかの態様において、核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群より選択される干渉性核酸である。いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、表１において列記される配列を有する干渉性核酸である。
いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、ポリペプチドである。いくつかの態様において、ポリペプチドは、抗体である。
【００１３】
いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、小分子である。本開示の側面は、部分的に、筋分化を改変することによりＤＵＸ４発現を改変する小分子（例えばＪＱ１）は、いくつかの態様においては、ＦＳＨＤの処置のための実行可能な候補ではない、という発見に関する。したがって、いくつかの態様において、小分子は、対象の細胞における１つ以上の筋原性制御遺伝子を改変するかまたはこれを実質的に改変することなく、ＤＵＸ４発現を阻害する。いくつかの態様において、１つ以上の筋原性制御遺伝子は、ミオゲニン（Ｍｙｏｇ）、ＭｙｏＤ、およびミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）からなる群より選択される。いくつかの態様において、小分子は、対象の細胞において、筋分化（myodifferentiation）を阻害しない。いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、ＪＱ１、またはＪＱ１のアナログではない。
【００１４】
いくつかの態様において、筋細胞は、分化した筋細胞、任意に最終分化した筋細胞である。いくつかの態様において、有効量は、対象の筋細胞にex vivoで投与される。
いくつかの態様において、筋細胞は、染色体４ｑ３５において、エピジェネティックに調節不全となったＤ４Ｚ４アレイを含む。いくつかの態様において、エピジェネティックに調節不全となったＤ４Ｚ４アレイは、１１個より少ない反復単位を含む。
【００１５】
いくつかの態様において、方法は、投与の前および／または後に、対象のＤＵＸ４発現レベルを評価することをさらに含み、ここで、ＤＵＸ４発現レベルの変化が、処置の有効性を示す。
いくつかの側面において、本開示は、ＤＵＸ４遺伝子発現のエピジェネティックな修飾因子を同定するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、以下を含む：（ｉ）ＤＵＸ４の発現により特徴づけられる細胞を、ＤＵＸ４の推定のクロマチンモディファイアーの発現または活性を修飾するための候補の剤と接触させること；（ｉｉ）細胞におけるＤＵＸ４の発現レベルを検出すること；ならびに、（ｉｉｉ）候補の剤との接触の後でＤＵＸ４の発現レベルが対照細胞と比較して低下した場合に、候補の剤を、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子として同定すること。
【００１６】
いくつかの態様において、細胞および／または対照細胞は、最終分化した筋細胞などの筋細胞である。いくつかの態様において、細胞は、エピジェネティックに調節不全となったＤ４Ｚ４アレイを含む。いくつかの態様において、対応する対照細胞は、エピジェネティックに調節不全となったＤ４Ｚ４アレイを含まない。
いくつかの態様において、候補の剤は、化合物ライブラリーから選択される。いくつかの態様において、ライブラリーは、デメチラーゼ阻害剤を含むか、またはこれからなる。いくつかの態様において、デメチラーゼ阻害剤は、リジン特異的デメチラーゼ阻害剤である。いくつかの態様において、ライブラリーは、ブロモドメイン阻害剤を含むか、またはこれからなる。いくつかの態様において、ライブラリーは、クロマチンリモデリングタンパク質の阻害剤（例えばＳＭＡＲＣＡ５阻害剤など）を含むか、またはこれからなる。いくつかの態様において、ライブラリーは、メチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えばＡＳＨ１Ｌ阻害剤）を含むか、またはこれからなる。
【００１７】
いくつかの態様において、候補の剤は、核酸、ポリペプチド、または小分子である。
いくつかの態様において、候補の剤は、核酸である。いくつかの態様において、核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）からなる群より選択される干渉性核酸である。
【００１８】
いくつかの態様において、候補の剤は、ポリペプチドである。いくつかの態様において、ポリペプチドは、抗体である。
いくつかの態様において、候補の剤は、小分子である。
いくつかの態様において、ＤＵＸ４の発現レベルは、ハイブリダイゼーションベースのアッセイ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリー、定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）またはＦＡＣＳを用いて検出される。
【００１９】
本開示の側面は、ＤＵＸ４遺伝子発現の低下を引き起こすために有用な遺伝子編集複合体および／または分子の開発に関する。したがって、いくつかの側面において、本開示は、細胞においてＤＵＸ４遺伝子発現を阻害するための方法を提供し、該方法は、細胞を、組み換え遺伝子編集複合体の有効量と接触させることを含み、ここで、当該遺伝子編集複合体が、当該細胞において、リジン特異的デメチラーゼ、ＢＲＤタンパク質、メチルトランスフェラーゼ、または別のクロマチンリモデリングタンパク質の発現の低下を引き起こす。
【００２０】
いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集複合体は、ＤＵＸ４とハイブリダイズまたは直接的に結合しない。
いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集複合体は、Ｃａｓタンパク質、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはヌクレアーゼ（例えばメガヌクレアーゼ）を含む。
【００２１】
いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質、またはそのバリアントである。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質は、不活性型（dead）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質、例えば配列番号３１において記載される配列を含むｄＣａｓ９タンパク質などである。
いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集複合体は、転写抑制因子ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、転写抑制因子ドメインは、ＫＲＡＢドメインである。いくつかの態様において、遺伝子編集複合体は、配列番号２９において記載される配列を含む。
【００２２】
いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集複合体は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、任意に一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をさらに含む。いくつかの態様において、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、リジン特異的デメチラーゼ、ＢＲＤタンパク質、メチルトランスフェラーゼ、またはクロマチンリモデリングに関与するタンパク質をコードする遺伝子に特異的にハイブリダイズする。いくつかの態様において、リジン特異的デメチラーゼは、ＫＤＭ４Ｃである。いくつかの態様において、ＢＲＤタンパク質は、ＢＲＤ２である。いくつかの態様において、ＢＲＤタンパク質は、ＢＡＺ１Ａである。いくつかの態様において、クロマチンリモデリングタンパク質は、ＳＭＡＲＣＡ５である。いくつかの態様において、メチルトランスフェラーゼは、ＡＳＨ１Ｌである。
【００２３】
いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集複合体は、例えばレンチウイルスベクターまたは組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターにより、細胞に送達される。
いくつかの態様において、細胞は、筋細胞、任意に最終分化した筋細胞である。
【００２４】
いくつかの側面において、本開示は、（ｉ）組み換え遺伝子編集タンパク質；および、（ｉｉ）リジン特異的デメチラーゼ、ＢＲＤタンパク質、メチルトランスフェラーゼ、またはクロマチンリモデリングに関与するタンパク質に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組み換え遺伝子編集複合体を含む組成物を提供し、ここで、細胞における標的遺伝子へのガイド鎖の結合は、細胞におけるＤＵＸ４遺伝子発現の阻害をもたらす。
いくつかの側面において、本開示は、本明細書において記載されるような組み換え遺伝子編集複合体を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、本開示により記載されるような遺伝子編集複合体をコードするウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターまたはｒＡＡＶベクター）を含む。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に受入可能な賦形剤をさらに含む。
【００２５】
いくつかの側面において、本開示は、それを必要とする対象において顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を処置するための方法を提供し、該方法は、本開示により記載されるような治療組み換え遺伝子編集複合体の有効量または本開示により記載されるような組成物を、対象に投与することを含む。
いくつかの態様において、対象は、哺乳動物、任意にヒトである。
【００２６】
いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集複合体は、注射、任意に筋肉内注射または静脈内注射により、対象に投与される。
いくつかの態様において、組み換え遺伝子編集複合体は、対象の筋細胞、任意に対象の最終分化した筋細胞、筋幹細胞、筋サテライト細胞、または筋芽細胞に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、Ｄｕｘ４（ＤＵＸ４−ｆｌ）、他の筋原性因子（ミオゲニン、ＭｙｏＤ、ＭｙＨＣ）、ＦＳＨＤ領域遺伝子１（ＦＲＧ１）、ユートロフィン（ＵＴＲＮ）、および１８Ｓの発現に対する、ブロモドメイン含有タンパク質（ＢＲＤ）ファミリーメンバーＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、およびＢＲＤＴのｓｈＲＮＡノックダウンの効果を示す。各々のＢＲＤ遺伝子を、２つの異なるレンチウイルスにより発現されるｓｈＲＮＡによりノックダウンした。
【００２８】
【図２】図２は、メチラーゼファミリーメンバーコアクチベーター結合型アルギニンメチルトランスフェラーゼ１（ＣＡＲＭ１）およびリジンメチルトランスフェラーゼ２Ａ（ＫＭＴ２Ａ）、およびリジンデメチラーゼ４Ａ（ＫＤＭ４Ａ）、リジンデメチラーゼ４Ｂ（ＫＤＭ４Ｂ）、リジンデメチラーゼ４Ｃ（ＫＤＭ４Ｃ）、およびリジンデメチラーゼ４Ｄ（ＫＤＭ４Ｄ）の、Ｄｕｘ４（ＤＵＸ４−ｆｌ）、他の筋原性因子（ミオゲニン、ＭｙｏＤ、ＭｙＨＣ）、ＦＳＨＤ領域遺伝子１（ＦＲＧ１）、ユートロフィン（ＵＴＲＮ）、および１８Ｓの発現に対する、ｓｈＲＮＡノックダウンの効果を示す。各々の遺伝子を、２つの異なるレンチウイルスにより発現されるｓｈＲＮＡによりノックダウンした。
【００２９】
【図３】図３は、Ｄｕｘ４（ＤＵＸ４−ｆｌ）、他の筋原性因子（ミオゲニン、ＭｙｏＤ、ＭｙＨＣ）、ＦＳＨＤ領域遺伝子１（ＦＲＧ１）、ユートロフィン（ＵＴＲＮ）、および１８Ｓの発現に対する、ジンクフィンガードメイン隣接ブロモドメイン（Bromodomain Adjacent To Zinc Finger Domain）１Ｂ（ＢＡＺ１Ｂ）、ジンクフィンガードメイン隣接ブロモドメイン１Ａ（ＢＡＺ１Ａ）、ジンクフィンガードメイン隣接ブロモドメイン２Ａ（ＢＡＺ２Ａ）、ＳＷＩ／ＳＮＦ関連マトリックス結合型アクチン依存性クロマチン制御因子（SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator of chromatin）サブファミリーＢメンバー１（ＳＭＡＲＣＢ１）、ＳＷＩ／ＳＮＦ関連マトリックス結合型アクチン依存性クロマチン制御因子サブファミリーＡメンバー５（ＳＭＡＲＣＡ５）、ＢＲＣＡ１関連タンパク質１（ＢＡＰ１）、およびＡＳＨ１様タンパク質（ＡＳＨ１Ｌ）のｓｈＲＮＡノックダウンの効果を示す。各々の遺伝子を、２つの異なるレンチウイルスにより発現されるｓｈＲＮＡによりノックダウンした。
【００３０】
【図４Ａ−Ｂ】図４Ａ〜４Ｅは、候補標的遺伝子のｓｈＲＮＡノックダウンを示す。図４Ａは、３つの異なるｓｈＲＮＡを用いたＡＳＨ１Ｌのノックダウンを示す。図４Ｂは、２つの異なるｓｈＲＮＡを用いたＢＲＤ２のノックダウンを示す。
【図４Ｃ−Ｄ】図４Ａ〜４Ｅは、候補標的遺伝子のｓｈＲＮＡノックダウンを示す。図４Ｃは、３つの異なるｓｈＲＮＡを用いたＫＤＭ４Ｃのノックダウンを示す。図４Ｄは、２つの異なるｓｈＲＮＡを用いたＳＭＡＲＣＡ５のノックダウンを示す。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｅは、候補標的遺伝子のｓｈＲＮＡノックダウンを示す。図４Ｅは、２つの異なるｓｈＲＮＡを用いたＢＡＺ１Ａのノックダウンを示す。
【００３１】
【図５】図５は、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９／ＫＲＡＢ転写修飾の図による説明を示す。
【００３２】
【図６】図６は、１７ＡＢｉｃ細胞におけるＫＤＭ４ＣのレンチウイルスベースのｄＣａｓ９−ＫＲＡＢノックダウンについての代表的なデータを示す。ＫＤＭ４Ｃ、ＤＵＸ４−ｆｌ（Ｄ４−ｆｌ）、ＦＲＧ１、ＭｙｏＧ、ＭｙＨＣ、１８ＳおよびＭｙｏＤの相対的遺伝子発現を示す。２つの異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いた実験からのデータを示す。
【００３３】
【図７】図７は、１７ＡＢｉｃ細胞におけるＡＳＨ１ＬのレンチウイルスベースのｄＣａｓ９−ＫＲＡＢノックダウンについての代表的なデータを示す。ＡＳＨ１Ｌ、ＤＵＸ４−ｆｌ（Ｄ４−ｆｌ）、ＦＲＧ１、ＭｙｏＧ、ＭｙＨＣ、１８ＳおよびＭｙｏＤの相対的遺伝子発現を示す。シングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いた実験からのデータを示す。
【００３４】
【図８】図８は、１７ＡＢｉｃ細胞におけるＳＭＡＲＣＡ５のレンチウイルスベースのｄＣａｓ９−ＫＲＡＢノックダウンについての代表的なデータを示す。ＳＭＡＲＣＡ５、ＤＵＸ４−ｆｌ（Ｄ４−ｆｌ）、ＦＲＧ１、ＭｙｏＧ、ＭｙＨＣ、１８ＳおよびＭｙｏＤの相対的遺伝子発現を示す。２つの異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いた実験からのデータを示す。
【００３５】
【図９】図９は、１７ＡＢｉｃ細胞におけるＢＡＺ１ＡのレンチウイルスベースのｄＣａｓ９−ＫＲＡＢノックダウンについての代表的なデータを示す。ＢＡＺ１Ａ、ＤＵＸ４−ｆｌ（Ｄ４−ｆｌ）、ＦＲＧ１、ＭｙｏＧ、ＭｙＨＣ、１８ＳおよびＭｙｏＤの相対的遺伝子発現を示す。２つの異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いた実験からのデータを示す。
【００３６】
【図１０】図１０は、１７ＡＢｉｃ細胞におけるＢＲＤ２のレンチウイルスベースのｄＣａｓ９−ＫＲＡＢノックダウンについての代表的なデータを示す。ＢＲＤ２、ＤＵＸ４−ｆｌ（Ｄ４−ｆｌ）、ＦＲＧ１、ＭｙｏＧ、ＭｙＨＣ、１８ＳおよびＭｙｏＤの相対的遺伝子発現を示す。シングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いた実験からのデータを示す。
【００３７】
【図１１Ａ−Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｆは、エピジェネティックな制御因子のｓｈＲＮＡノックダウンが、ＦＳＨＤ筋細胞においてＤＵＸ４−ｆｌの発現を低下させることを示す。分化したＦＳＨＤ筋細胞に、２回の連続したラウンドにおいて、ＡＳＨ１Ｌ（図１１Ａ）、ＢＡＺ１Ａ（図１１Ｂ）、ＢＲＤ２（図１１Ｃ）、ＫＤＭ４Ｃ（図１１Ｄ）、ＳＭＡＲＣＡ５（図１１Ｅ）、またはスクランブル（scramble）した対照に対するｓｈＲＮＡを感染させた。４日後、ｑＲＴ−ＰＣＲによる全長ＤＵＸ４アイソフォーム（ＤＵＸ４−ｆｌ）、ミオゲニン（Ｍｙｏｇ）、ＭｙｏＤ、ミオシン重鎖１（ＭｙＨＣ）、ＦＲＧ１、ユートロフィン（Ｕｔｒ）、および１８Ｓ遺伝子発現の分析のために、細胞を収集した。図１１Ｆは、ＡＳＨ１Ｌ（１６１６９）、ＢＲＤ２（６３０８）、ＫＤＭ４Ｃ（２２０５８）、またはＳＭＡＲＣＡ５（１３２１４）に対するｓｈＲＮＡが、いくつかのＦＳＨＤコホート（０５Ａｂｉｃ、１８Ａｂｉｃ、および１７Ａｂｉｃ）にわたりＤＵＸ４−ｆｌ発現を低下させることを示す。全てのパネルにおいて、モックまたは対照感染細胞についての相対的ｍＲＮＡ発現を、１に設定する。データを、技術的複製の平均値＋ＳＤ値としてプロットする。
【図１１Ｃ−Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｆは、エピジェネティックな制御因子のｓｈＲＮＡノックダウンが、ＦＳＨＤ筋細胞においてＤＵＸ４−ｆｌの発現を低下させることを示す。分化したＦＳＨＤ筋細胞に、２回の連続したラウンドにおいて、ＡＳＨ１Ｌ（図１１Ａ）、ＢＡＺ１Ａ（図１１Ｂ）、ＢＲＤ２（図１１Ｃ）、ＫＤＭ４Ｃ（図１１Ｄ）、ＳＭＡＲＣＡ５（図１１Ｅ）、またはスクランブル（scramble）した対照に対するｓｈＲＮＡを感染させた。４日後、ｑＲＴ−ＰＣＲによる全長ＤＵＸ４アイソフォーム（ＤＵＸ４−ｆｌ）、ミオゲニン（Ｍｙｏｇ）、ＭｙｏＤ、ミオシン重鎖１（ＭｙＨＣ）、ＦＲＧ１、ユートロフィン（Ｕｔｒ）、および１８Ｓ遺伝子発現の分析のために、細胞を収集した。図１１Ｆは、ＡＳＨ１Ｌ（１６１６９）、ＢＲＤ２（６３０８）、ＫＤＭ４Ｃ（２２０５８）、またはＳＭＡＲＣＡ５（１３２１４）に対するｓｈＲＮＡが、いくつかのＦＳＨＤコホート（０５Ａｂｉｃ、１８Ａｂｉｃ、および１７Ａｂｉｃ）にわたりＤＵＸ４−ｆｌ発現を低下させることを示す。全てのパネルにおいて、モックまたは対照感染細胞についての相対的ｍＲＮＡ発現を、１に設定する。データを、技術的複製の平均値＋ＳＤ値としてプロットする。
【図１１Ｅ−Ｆ】図１１Ａ〜１１Ｆは、エピジェネティックな制御因子のｓｈＲＮＡノックダウンが、ＦＳＨＤ筋細胞においてＤＵＸ４−ｆｌの発現を低下させることを示す。分化したＦＳＨＤ筋細胞に、２回の連続したラウンドにおいて、ＡＳＨ１Ｌ（図１１Ａ）、ＢＡＺ１Ａ（図１１Ｂ）、ＢＲＤ２（図１１Ｃ）、ＫＤＭ４Ｃ（図１１Ｄ）、ＳＭＡＲＣＡ５（図１１Ｅ）、またはスクランブル（scramble）した対照に対するｓｈＲＮＡを感染させた。４日後、ｑＲＴ−ＰＣＲによる全長ＤＵＸ４アイソフォーム（ＤＵＸ４−ｆｌ）、ミオゲニン（Ｍｙｏｇ）、ＭｙｏＤ、ミオシン重鎖１（ＭｙＨＣ）、ＦＲＧ１、ユートロフィン（Ｕｔｒ）、および１８Ｓ遺伝子発現の分析のために、細胞を収集した。図１１Ｆは、ＡＳＨ１Ｌ（１６１６９）、ＢＲＤ２（６３０８）、ＫＤＭ４Ｃ（２２０５８）、またはＳＭＡＲＣＡ５（１３２１４）に対するｓｈＲＮＡが、いくつかのＦＳＨＤコホート（０５Ａｂｉｃ、１８Ａｂｉｃ、および１７Ａｂｉｃ）にわたりＤＵＸ４−ｆｌ発現を低下させることを示す。全てのパネルにおいて、モックまたは対照感染細胞についての相対的ｍＲＮＡ発現を、１に設定する。データを、技術的複製の平均値＋ＳＤ値としてプロットする。
【００３８】
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｄは、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢによるエピジェネティックな制御因子の転写抑制が、ＦＳＨＤ筋細胞においてＤＵＸ４−ｆｌの発現を低下させることを示す。分化したＦＳＨＤ筋細胞を、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢまたはＢＡＺ１Ａ（図１２Ａ）、ＢＲＤ２（図１２Ｂ）、ＫＤＭ４Ｃ（図１２Ｃ）もしくはＳＭＡＲＣＡ５（図１２Ｄ）を標的とする個々のｓｇＲＮＡ（各々の標的遺伝子について、ｇ１−２）のいずれかを発現するレンチウイルス上清の組み合わせによる、４回の連続的な共感染に供した。ｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の分析のために、約７２時間後に細胞を収集した（図１１Ａ〜１１Ｆにおけるものと同様に）。データを、３回の独立した実験の平均値＋ＳＤ値としてプロットし、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢのみを感染させた細胞についての相対的ｍＲＮＡ発現を、１に設定する。
【図１２Ｃ−Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｄは、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢによるエピジェネティックな制御因子の転写抑制が、ＦＳＨＤ筋細胞においてＤＵＸ４−ｆｌの発現を低下させることを示す。分化したＦＳＨＤ筋細胞を、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢまたはＢＡＺ１Ａ（図１２Ａ）、ＢＲＤ２（図１２Ｂ）、ＫＤＭ４Ｃ（図１２Ｃ）もしくはＳＭＡＲＣＡ５（図１２Ｄ）を標的とする個々のｓｇＲＮＡ（各々の標的遺伝子について、ｇ１−２）のいずれかを発現するレンチウイルス上清の組み合わせによる、４回の連続的な共感染に供した。ｑＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の分析のために、約７２時間後に細胞を収集した（図１１Ａ〜１１Ｆにおけるものと同様に）。データを、３回の独立した実験の平均値＋ＳＤ値としてプロットし、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢのみを感染させた細胞についての相対的ｍＲＮＡ発現を、１に設定する。
【００３９】
【図１３Ａ−Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｄは、候補制御因子のノックダウンが、Ｄ４Ｚ４マクロサテライトにおいてクロマチン抑制を増大させることを示す。分化したＦＳＨＤ筋細胞に、２回の連続したラウンドにおいて、ＡＳＨ１Ｌ（図１３Ａ）、ＢＲＤ２（図１３Ｂ）、ＫＤＭ４Ｃ（図１３Ｃ）、ＳＭＡＲＣＡ５（図１３Ｄ）、ＧＦＰ対照、またはスクランブルした対照に対するｓｈＲＮＡを感染させた。４日後、細胞をＣｈＩＰ分析のために収集した。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３またはＨ３に対して特異的な抗体を用いて、クロマチンを免疫沈降させ、染色体４のＤ４Ｚ４アレイ（4-spec D4Z4）、ミオゲニンプロモーター（Myog prom）、Ｄ４Ｚ４に近い領域（5’flank）、および染色体４上の４ｐアレイに対するプライマーを用いたｑＰＣＲにより分析した。データを、α−ヒストンＨ３に対して正規化したαＨ３Ｋ９ｍｅ３による標的領域のエンリッチメントの倍率として提示し、ＧＦＰ ｓｈＲＮＡ感染細胞についてのエンリッチメントを、１に設定する。データを、２回の独立した実験の平均値＋ＳＤ値としてプロットする。
【図１３Ｃ−Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｄは、候補制御因子のノックダウンが、Ｄ４Ｚ４マクロサテライトにおいてクロマチン抑制を増大させることを示す。分化したＦＳＨＤ筋細胞に、２回の連続したラウンドにおいて、ＡＳＨ１Ｌ（図１３Ａ）、ＢＲＤ２（図１３Ｂ）、ＫＤＭ４Ｃ（図１３Ｃ）、ＳＭＡＲＣＡ５（図１３Ｄ）、ＧＦＰ対照、またはスクランブルした対照に対するｓｈＲＮＡを感染させた。４日後、細胞をＣｈＩＰ分析のために収集した。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３またはＨ３に対して特異的な抗体を用いて、クロマチンを免疫沈降させ、染色体４のＤ４Ｚ４アレイ（4-spec D4Z4）、ミオゲニンプロモーター（Myog prom）、Ｄ４Ｚ４に近い領域（5’flank）、および染色体４上の４ｐアレイに対するプライマーを用いたｑＰＣＲにより分析した。データを、α−ヒストンＨ３に対して正規化したαＨ３Ｋ９ｍｅ３による標的領域のエンリッチメントの倍率として提示し、ＧＦＰ ｓｈＲＮＡ感染細胞についてのエンリッチメントを、１に設定する。データを、２回の独立した実験の平均値＋ＳＤ値としてプロットする。
【００４０】
【図１４Ａ−Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｄは、候補制御因子のノックダウンが、Ｄ４Ｚ４マクロサテライトにおいてクロマチン抑制を増大させることを示す。分化したＦＳＨＤ筋細胞に、２回の連続したラウンドにおいて、ＢＲＤ２（図１４Ａ）、ＡＳＨ１Ｌ（図１４Ｂ）、ＳＭＡＲＣＡ５（図１４Ｃ）、ＫＤＭ４Ｃ（図１４Ｄ）、ＧＦＰ対照、またはスクランブルした対照に対するｓｈＲＮＡを感染させた。４日後、細胞をＣｈＩＰ分析のために収集した。Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３に対して特異的な抗体を用いて、クロマチンを免疫沈降させ、染色体４のＤ４Ｚ４アレイ（4-spec D4Z4）、ミオゲニンプロモーター（Myog prom）、Ｄ４Ｚ４に近い領域（5’flank）、および染色体４上の４ｐアレイに対するプライマーを用いたｑＰＣＲにより分析した。データを、α−ヒストンＨ３に対して正規化したαＨ３Ｋ９ｍｅ３による標的領域のエンリッチメントの倍率として提示し、ＧＦＰ ｓｈＲＮＡ感染細胞についてのエンリッチメントを、１に設定する。
【図１４Ｃ−Ｄ】図１４Ａ〜１４Ｄは、候補制御因子のノックダウンが、Ｄ４Ｚ４マクロサテライトにおいてクロマチン抑制を増大させることを示す。分化したＦＳＨＤ筋細胞に、２回の連続したラウンドにおいて、ＢＲＤ２（図１４Ａ）、ＡＳＨ１Ｌ（図１４Ｂ）、ＳＭＡＲＣＡ５（図１４Ｃ）、ＫＤＭ４Ｃ（図１４Ｄ）、ＧＦＰ対照、またはスクランブルした対照に対するｓｈＲＮＡを感染させた。４日後、細胞をＣｈＩＰ分析のために収集した。Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３に対して特異的な抗体を用いて、クロマチンを免疫沈降させ、染色体４のＤ４Ｚ４アレイ（4-spec D4Z4）、ミオゲニンプロモーター（Myog prom）、Ｄ４Ｚ４に近い領域（5’flank）、および染色体４上の４ｐアレイに対するプライマーを用いたｑＰＣＲにより分析した。データを、α−ヒストンＨ３に対して正規化したαＨ３Ｋ９ｍｅ３による標的領域のエンリッチメントの倍率として提示し、ＧＦＰ ｓｈＲＮＡ感染細胞についてのエンリッチメントを、１に設定する。
【００４１】
【図１５】図１５は、ＦＳＨＤ１罹患（Ａ）およびＦＳＨＤ無症候（Ｂ）患者から単離された初代筋芽細胞の、小分子のみ、または、Ｄ４Ｚ４のエピジェネティック状態に影響を及ぼす組み合わせによる処置が、ＤＵＸ４発現に影響を及ぼすことを示す。
【００４２】
【図１６】図１６は、ＤＵＸ４のＪＱ１制御が、間接的であり、いくつかの重要な筋原性制御遺伝子であるミオゲニン（Ｍｙｏｇ）、ｍｙｏＤ、ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）、およびミオスタチン（Ｍｙｏｓｔ）の発現を阻害することにより達成されることを示す。
【００４３】
【図１７】図１７は、ＦＳＨＤおよび健康なヒト骨格筋筋芽細胞（ＨＳＭＭ）の両方において、筋原性遺伝子であるミオゲニン（Ｍｙｏｇ）、ｍｙｏＤ、ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）が、ＪＱ１により誤制御されることを示す。
【００４４】
【図１８】図１８は、ＤＵＸ−４アンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下または不在下における、ＦＳＨＤの骨格筋の筋管におけるＺＳＣＡＮ４発現についての代表的なデータを示す。ＤＵＸ−４およびＺＳＣＡＮ４の相対的遺伝子発現を示す。
【００４５】
【図１９】図１９は、ＳＭＡＲＣＡ５およびＫＤＭ４Ｃのアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下または不在下における、ＦＳＨＤの骨格筋の筋管におけるＺＳＣＡＮ４発現についての代表的なデータを示す。ＳＭＡＲＣＡ５、ＫＤＭ４ＣおよびＺＳＣＡＮ４の相対的遺伝子発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
詳細な説明
いくつかの側面において、本開示は、ＤＵＸ４の異常な発現に関連する疾患（例えば、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、ＦＳＨＤ）の処置のために有用な方法および組成物に関する。本開示は、部分的に、特定のエピジェネティックな修飾因子（例えば、ＫＤＭ４Ｃ、ＡＳＨ１Ｌ、ＳＭＡＲＣＡ５、ＢＡＺ１Ａ、ＢＲＤ２などの阻害剤）を用いてＤＵＸ４遺伝子発現を抑制することにより、ＦＳＨＤに関連する病原性のｍＲＮＡアイソフォームであるＤＵＸ４−ｆｌタンパク質の産生の低下がもたらされるという、驚くべき発見に基づく。いくつかの態様において、本開示により記載される方法および組成物は、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）媒介型ノックダウン、遺伝子編集分子媒介型ノックダウン、または小分子阻害剤を通して、ＤＵＸ４の特定の制御因子（例えば、クロマチンモディファイアー）を標的とすることにより、ＤＵＸ４遺伝子発現を阻害する。いくつかの態様において、エピジェネティックな修飾因子は、対象においてＺＳＣＡＮ４遺伝子発現を低下させる。
【００４７】
本開示の側面は、部分的に、ＤＵＸ４遺伝子発現の特定の阻害剤（例えば、特定の間接的阻害剤）（例えば、ＪＱ１、またはＪＱ１のアナログ）が、例えば筋分化の動力学を改変することにより、および／またはミオゲニン（Ｍｙｏｇ）、ＭｙｏＤ、ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）、およびミオスタチン（Ｍｙｏｓｔ）などの筋原性制御因子の異常な発現を引き起こすことにより、筋形成または細胞の筋分化を阻害するという発見に基づく。したがって、いくつかの態様において、本開示により記載されるようなＤＵＸ４発現のエピジェネティックな修飾因子は、筋原性制御遺伝子（例えば、Ｍｙｏｇ、ＭｙｏＤ、ＭｙＨＣ、Ｍｙｏｓｔなど）を阻害しない。いくつかの態様において、ＤＵＸ４遺伝子発現のエピジェネティックな修飾因子は、ＪＱ１、またはＪＱ１のアナログではない。
【００４８】
したがって、いくつかの側面において、本開示は、それを必要とする対象において顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を処置するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、対象にＤＵＸ４遺伝子発現のエピジェネティックな修飾因子の治療有効量を投与することを含み、ここで、エピジェネティックな修飾因子は、対象の筋細胞においてＤＵＸ４発現を低下させる。
【００４９】
顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）
本明細書において用いられる場合、用語「顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー」または「ＦＳＨＤ」とは、骨格筋の量および／または機能の進行的喪失を伴う筋ジストロフィーを指し、ここで、顔面、肩甲（shoulder blades）および上腕の筋肉は、最も影響を受けるものである。ＦＳＨＤは、ＤＵＸ４の異常な発現を伴う。ある態様において、ＦＳＨＤは、ＤＵＸ４遺伝子の転写活性化からもたらされる。いくつかの態様において、ＤＵＸ４遺伝子の活性化は、ＤＵＸ４遺伝子の機能（例えば、病原性ＤＵＸ４−ｆｌの産生）の有害な獲得をもたらし、進行性の骨格筋脱力（例えば、顔面筋脱力、肩の脱力など）、聴覚の喪失、異常な心臓のリズム、二頭筋、三頭筋、三角筋および前腕の筋肉の不均等な衰弱、腹筋および／または下肢の筋肉の強度の喪失、下垂足を含む広範な症状を引き起こす。いくつかの態様において、ＦＳＨＤにより、対象は換気補助を必要とするようになるか、または車いすにより制限されるようになる。
【００５０】
一般に、ＦＳＨＤは、ヒトゲノムの染色体４上のサブテロメア領域４ｑ３５におけるＤ４Ｚ４反復配列の短縮に関連する。一般に、ＦＳＨＤを有さない対象の染色体４は、１１〜１５０個の反復単位を有するＤ４Ｚ４反復領域を含み、これは、選択的にスプライシングされた３’が短縮されたＤＵＸ４トランスクリプト（ＤＵＸ４−ｓ）の産生をもたらす。いくつかの態様において、短縮したＤ４Ｚ４反復配列（例えば、１１個以下の反復単位）を有する対象のＤＵＸ４遺伝子は、反復配列により媒介される抑制の喪失に起因して転写的に活性化され、これは、病原性の全長ＤＵＸ４（ＤＵＸ４−ｆｌ）のｍＲＮＡおよびタンパク質の産生をもたらす。
【００５１】
いくつかの側面において、本発明は、特定のＤＵＸ４のクロマチンモディファイアー（例えば、ＫＤＭ４Ｃ、ＡＳＨ１Ｌ、ＳＭＡＲＣＡ５、ＢＡＺ１Ａ、ＢＲＤ２など）の阻害が、対象において（例えば、対象の細胞において）ＤＵＸ４（例えばＤＵＸ４−ｆｌ）発現を低下させるという発見に関する。本明細書において用いられる場合、用語「低下したＤＵＸ４発現」とは、適切な対照と比較した、対象の細胞におけるＤＵＸ４のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質のレベルの低下を指す。いくつかの態様において、低下したＤＵＸ４発現は、転写的に活性な（例えば、発現されたかまたは転写された）状態から、転写活性が低下した状態、例えば転写的に不活性な（例えばサイレンシングされた）状態への、ＤＵＸ４遺伝子の状態の変化に関連する。例えば、いくつかの態様において、転写的に活性な（例えば発現された）ＤＵＸ４遺伝子を有する対象（例えば対象における細胞）は、ＤＵＸ４−ｆｌを産生する；例えばＤＵＸ４のクロマチンモディファイアーの阻害剤の投与による、対象（例えば、対象における細胞）におけるＤＵＸ４発現のノックダウン（例えばサイレンシング）は、対象において低下した（または阻害された）ＤＵＸ４−ｆｌの発現および産生をもたらす。
【００５２】
いくつかの態様において、ＤＵＸ４発現の低下は、ＤＵＸ４のクロマチンモディファイアーの阻害剤による処置の前の試料中のＤＵＸ４（例えば、ＤＵＸ４−ｆｌ）の発現レベルと比較した、ＤＵＸ４のクロマチンモディファイアーの阻害剤による処置の後の試料（例えば、細胞または対象）中のＤＵＸ４の発現レベルとして測定することができる。一般に、ＤＵＸ４（例えばＤＵＸ４−ｆｌ）の発現レベルは、当該分野において公知の任意の好適な方法により、例えば、ハイブリダイゼーションベースのアッセイ（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット）、タンパク質ベースの方法（例えば、ウェスタンブロット）、分光学的方法（例えば、質量分析）、および細胞ベースの方法（例えば、フローサイトメトリー、蛍光励起セルソーティング（ＦＡＣＳ））により、測定することができる。
【００５３】
ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子
本明細書において用いられる場合、用語「エピジェネティックな修飾因子」とは、例えば、その遺伝子のクロマチンの状態に影響を及ぼすこと（例えば、転写を阻害する凝縮したクロマチン状態または転写を増強する弛緩したクロマチン状態を促進すること）により、遺伝子（例えばＤＵＸ４）の転写活性を改変する剤を指す。いくつかの態様において、エピジェネティックな修飾因子は、細胞、例えば筋細胞に送達された場合に、活性なＤＵＸ４遺伝子に接触して、細胞におけるＤＵＸ４の転写を低下させる剤である。いくつかの態様において、エピジェネティックな修飾因子は、ＤＵＸ４遺伝子発現を直接的に修飾する。いくつかの態様において、エピジェネティックな修飾因子は、ＤＵＸ４遺伝子発現を間接的に修飾する（例えば、ＤＵＸ４遺伝子座またはＤ４Ｚ４反復配列アレイに直接的には結合しないか、またはＤＵＸ４遺伝子発現の直接的なクロマチンモディファイアーの発現または活性を制御する）。例えば、いくつかの態様において、エピジェネティックな修飾因子は、ＤＵＸ４遺伝子発現の正の制御因子（例えば、ＤＵＸ４遺伝子座におけるオープンなクロマチン状態を促進するクロマチンモディファイアー）を標的とするＲＮＡｉ分子または小分子阻害剤であり、それにより、負のＤＵＸ４遺伝子発現のエピジェネティックな修飾因子として機能する。
【００５４】
本開示の側面は、例えばＲＮＡｉまたは小分子阻害剤を用いてＤＵＸ４遺伝子発現の特定の制御因子（例えば、ＫＤＭ４Ｃ、ＢＲＤ２、ＢＡＺ１Ａ、ＡＳＨ１Ｌ、ＳＭＡＲＣＡ５などのクロマチンモディファイアー）を阻害することは、ＤＵＸ４遺伝子発現の阻害をもたらし、したがって、異常なＤＵＸ４発現により特徴づけられる疾患または状態（例えばＦＳＨＤ）の処置のために有用であり得るという発見に関する。
【００５５】
細胞のクロマチンの状態（例えば、ヒストンおよび非ヒストンタンパク質によるＤＮＡのパッケージング）は、遺伝子発現に対して顕著な影響を有する。いくつかの態様において、本開示は、ノックダウンされた場合に細胞（例えば、最終分化した筋細胞などの筋細胞）においてＤＵＸ４遺伝子の発現を低下させるクロマチンモディファイアー（例えば、クロマチンリモデリングタンパク質およびこれをコードする遺伝子）に関する。いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、クロマチンモディファイアーを標的とする。本明細書において用いられる場合、用語「クロマチンモディファイアー」とは、ＤＮＡを修飾する（例えば、メチル化により）かまたはヒストンタンパク質を転写後に修飾して（例えばリン酸化、アセチル化、メチル化、またはユビキチン化により）、クロマチン構造の改変をもたらし、それにより遺伝子発現の修飾をもたらす剤（例えば、酵素または転写因子）を指す。クロマチンモディファイアーの例として、これらに限定されないが、ヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンデメチラーゼ酵素）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、特定のブロモドメイン含有タンパク質、キナーゼ（例えば、ヒストンをリン酸化するキナーゼ）、およびアクチン依存性のクロマチンの制御因子が挙げられる。いくつかの態様において、クロマチン構造リモデリング複合体（ＲＳＣ）中に１つ以上のクロマチンリモデリングタンパク質が存在する。したがって、いくつかの態様において、ＤＵＸ４のクロマチンモディファイアーは、ＲＳＣの構成成分（例えば、その中に存在するタンパク質）である。
【００５６】
本明細書において用いられる場合、用語「ヒストンデメチラーゼ」とは、ヒストンタンパク質からのメチル基の除去を触媒する酵素を指す。いくつかの態様において、ヒストンデメチラーゼ酵素は、以下のドメインのうちの１つ以上を含む：Ｓｗｉ３、ＲｓｃおよびMoira（ＳＷＩＲＭ１）ドメイン、十文字ＮまたはＣ末端（ＪｍｊＮまたはＪｍｊＣ）ドメイン、ＰＨＤフィンガードメイン、ジンクフィンガードメイン、アミンオキシダーゼドメイン、およびTudorドメイン。例えば、いくつかの態様において、ヒストンデアセチラーゼは、少なくとも１つのTudorドメインおよび２つのＪｍｊドメイン（例えば、１つのＪｍｊＮドメインおよび１つのＪｍｊＣドメイン）を含む。いくつかの態様において、ヒストンデメチラーゼは、リジン特異的ヒストンデメチラーゼである。リジン特異的ヒストンデメチラーゼの非限定的な例として、ＫＤＭ４Ａ、ＫＤＭ４Ｂ、ＫＤＭ４Ｃ、ＫＤＭ４Ｄ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＭ６Ｂ、およびＰＨＦ２が挙げられる。いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、ヒストンデメチラーゼ阻害剤である。
【００５７】
本明細書において用いられる場合、用語「ブロモドメイン含有タンパク質」とは、モノアセチル化されたリジン残基を認識するブロモドメインを有するタンパク質を指す。一般に、ブロモドメイン含有（ＢＲＤ）タンパク質は、アセチル化されたヒストンに結合し、いくつかの態様において、クロマチンリモデリングを媒介する。いくつかの態様において、ＢＲＤタンパク質は、少なくとも１つのブロモドメイン（例えば、１、２、３、４、５、またはそれより多くのブロモドメイン）および１つの末端外（ＥＴ）ドメインを含む。ＢＲＤタンパク質の非限定的な例として、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ、ＢＲＰＦ１、ＢＲＰＦ３、ＢＰＴＦ、ＢＡＺ１Ａ、ＢＡＺ１Ｂ、およびＢＡＺ２Ａが挙げられる。いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、ＢＲＤタンパク質阻害剤である。
【００５８】
本明細書において用いられる場合、用語「アクチン依存性のクロマチンの制御因子」とは、タンパク質は、ＳＷＩ／ＳＮＦ関連マトリックス結合型アクチン依存性クロマチン制御因子のファミリーのメンバーを指す。一般に、ＳＷＩ／ＳＮＦタンパク質ファミリーのメンバーは、ヘリカーゼドメインおよびＡＴＰａｓｅドメインを含み、クロマチン構造を改変することにより特定の遺伝子の転写を制御するように機能する。いくつかの態様において、アクチン依存性のクロマチンの制御因子は、１つ以上のＳｗｉ３、Ａｄａ２、Ｎ−Ｃｏｒ、およびＴＦＩＩＩＢ（ＳＡＮＴ）ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、１つ以上のアクチン依存性のクロマチンの制御因子は、クロマチンリモデリングおよびスプライシング因子（ＲＳＦ）複合体中に存在する。アクチン依存性のクロマチンの制御因子の非限定的な例として、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＣ１、ＳＭＡＲＣＣ２、ＳＭＡＲＣＤ１、ＳＭＡＲＣＤ２、およびＳＭＡＲＣＤ３が挙げられる。いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、アクチン依存性のクロマチンの制御因子阻害剤である。
【００５９】
本明細書において用いられる場合、用語「ヒストンメチルトランスフェラーゼ」とは、ヒストンタンパク質少なくとも１つのメチル基（例えば、１、２、３、またはそれより多くのメチル基）のリジンおよび／またはアルギニン残基への移動を触媒する酵素を指す。一般に、ヒストンメチルトランスフェラーゼ酵素は、リジン特異的またはアルギニン特異的メチルトランスフェラーゼのいずれかとして特徴づけられる。
【００６０】
いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、リジン特異的メチルトランスフェラーゼの阻害剤である。リジン特異的メチルトランスフェラーゼの２つのファミリー：ＳＥＴドメイン含有メチルトランスフェラーゼおよび非ＳＥＴドメイン含有メチルトランスフェラーゼが存在する。リジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼの例として、これらに限定されないが、ＡＳＨ１Ｌ、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＨＭＴ１、ＥＨＭＴ２、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、ＭＬＬ、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＭＬＬ４、ＭＬＬ５、ＮＳＤ１、ＰＲＤＭ１、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｅ、ＳＥＴ、ＳＥＴＢＰ１、ＳＥＴＤ１Ａ、ＳＥＴＤ２、ＳＥＴＤ３、ＳＥＴＤ４、ＳＥＴＤ５、ＳＥＴＤ６、ＳＥＴＤ７、ＳＥＴＤ９、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＭＹＤ１、ＳＭＹＤ２、ＳＭＹＤ３、ＳＭＹＤ４、ＳＭＹＤ５、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＵＶ４２０Ｈ１、およびＳＵＶ４２０Ｈ２が挙げられる。いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、リジン特異的メチルトランスフェラーゼ阻害剤である。
【００６１】
いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、アルギニン特異的メチルトランスフェラーゼの阻害剤である。アルギニン特異的メチルトランスフェラーゼは、ＰＲＭＴとも称され、一般に、２つの群に分類される。ＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ３、ＣＡＲＭ１、ＰＲＭＴ４およびＲｍｔ１／Ｈｍｔ１を含むＰＲＭＴの１つの群は、モノメチルアルギニンおよび不斉性のジメチルアルギニン残基を生成する。ＪＢＰ１およびＰＲＭＴ５を含むＰＲＭＴの第２の群は、モノメチルまたは不斉性のジメチルアルギニン残基を生成する。いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、アルギニン特異的メチルトランスフェラーゼ阻害剤である。
【００６２】
いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、キナーゼ（例えば、セリン−スレオニンキナーゼ、例えばＮＥＫ６）、デアセチラーゼ酵素（例えば、ヒストンデアセチラーゼ、例えばＨＤＡＣ１）、スプライシング因子タンパク質（例えば、スプライシング因子３ｂタンパク質複合体のメンバー、例えばＳＦ３Ｂ１）、ポリメラーゼ（例えば、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＰＡＲＰ３など）、リガーゼ（例えば、ＵＦＬ１）、ヒドラーゼ（例えば、ＢＡＰ１）、ペプチダーゼ（例えば、ユビキチン特異的ペプチダーゼ、例えばＵＳＰ３、ＵＳＰ７、ＵＳＰ１６、ＵＳＰ２１、もしくはＵＳＰ２２）、またはプロテアーゼ（例えば、ヒストンデユビキチナーゼ、例えばＭＹＳＭ１）の阻害剤である。いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、前述のタンパク質のうちのいずれか１つの阻害剤（例えば、キナーゼ阻害剤、デアセチラーゼ酵素阻害剤、スプライシング因子タンパク質阻害剤、ポリメラーゼ阻害剤、リガーゼ阻害剤、ヒドラーゼ阻害剤、ペプチダーゼ阻害剤、またはプロテアーゼ阻害剤）である。
【００６３】
本発明の側面は、特定のクロマチンモディファイアーの阻害が、ＤＵＸ４遺伝子発現の低下および／またはＤＵＸ４タンパク質（例えば、ＤＵＸ４−ｆｌ）タンパク質産生の低下をもたらすという発見に関する。本明細書において用いられる場合、用語「阻害剤」とは、標的分子または遺伝子の活性または発現を低下させる（例えば妨げる）任意の剤（例えば、ＤＵＸ４のクロマチンモディファイアー）を指す。阻害剤は、核酸（例えば、干渉ＲＮＡ）、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド（例えば、抗体）、小分子、または前述のものの任意の組み合わせであってよい。
【００６４】
本開示の側面は、部分的に、ＤＵＸ４遺伝子発現の特定の阻害剤（例えば、特定の間接的阻害剤）が、筋形成または細胞の筋分化を阻害し、したがって、ＦＳＨＤの処置のために好適であり得るという発見に基づく。例えば、いくつかの態様において、小分子ＪＱ１は、ＤＵＸ４遺伝子発現のみならず、ＴＲＩＭ４３およびＺＳＣＡＮ４の発現をも阻害し、筋分化の動力学を改変する。ＪＱ１は、ブロモドメインタンパク質のＢＥＴファミリーの選択的阻害剤である。ＪＱ１のアナログはまた、例えばSyeda et al. (2015) Tetrahedron Letters 56(23):3454-3457により記載されるとおり、当該分野において公知である。したがって、いくつかの態様において、本開示により記載されるようなＤＵＸ４遺伝子発現のエピジェネティックな修飾因子は、筋形成または細胞の筋分化を阻害しない。いくつかの態様において、ＤＵＸ４遺伝子発現のエピジェネティックな修飾因子は、ＪＱ１またはＪＱ１のアナログではない。
【００６５】
特定の間接的ＤＵＸ４遺伝子発現の阻害剤（例えば、ＪＱ１）はまた、ミオゲニン（Ｍｙｏｇ）、ＭｙｏＤ、ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）、およびミオスタチン（Ｍｙｏｓｔ）などの筋原性制御因子の異常な発現を引き起こすことが観察されている。したがって、いくつかの態様において、本開示により記載されるようなＤＵＸ４発現のエピジェネティックな修飾因子は、筋原性制御遺伝子（例えば、Ｍｙｏｇ、ＭｙｏＤ、ＭｙＨＣ、Ｍｙｏｓｔなど）を阻害しない。いくつかの態様において、筋原性制御遺伝子の阻害とは、ＤＵＸ４遺伝子発現の阻害剤により処置されていない細胞における遺伝子の発現と比較した、ＤＵＸ４遺伝子発現の阻害剤により処置された細胞における遺伝子の発現の低下である。いくつかの態様において、遺伝子の発現の低下とは、ＤＵＸ４発現の阻害剤により処置されていない細胞における遺伝子の発現よりも、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％少ないことである。
【００６６】
いくつかの態様において、ＤＵＸ４遺伝子発現のエピジェネティックな修飾因子は、選択的阻害剤である。本明細書において用いられる場合、「選択的に阻害する」と言われる「選択的阻害剤」または阻害剤とは、特定のクラスの標的分子の活性または発現を、当該クラスの他の分子と比較して、優先的に阻害する阻害剤を指す。いくつかの態様において、特定のクラスの標的分子の選択的阻害剤は、標的分子に対して、当該クラスの１つ以上の他のメンバーに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
選択的阻害剤は、メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼもしくはヒストンメチルトランスフェラーゼ、例えばリジン特異的メチルトランスフェラーゼもしくはアルギニン特異的メチルトランスフェラーゼ）、ＢＲＤタンパク質、ヒストンデメチラーゼ、またはアクチン依存性のクロマチンの制御因子（例えば、クロマチン構造リモデリング複合体（ＲＳＣ）の構成成分）の阻害剤である。
【００６７】
いくつかの態様において、選択的阻害剤は、ヒストンデメチラーゼを選択的に阻害する。いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンデメチラーゼであるＫＤＭ４Ｃの選択的阻害剤は、ＫＤＭ４Ｃに対して、１つ以上の他のヒストンデメチラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンデメチラーゼであるＫＤＭ４Ａの選択的阻害剤は、ＫＤＭ４Ａに対して、１つ以上の他のヒストンデメチラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【００６８】
いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンデメチラーゼであるＫＤＭ４Ｂの選択的阻害剤は、ＫＤＭ４Ｂに対して、１つ以上の他のヒストンデメチラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンデメチラーゼであるＫＤＭ４Ｄの選択的阻害剤は、ＫＤＭ４Ｄに対して、１つ以上の他のヒストンデメチラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【００６９】
いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンデメチラーゼであるＫＤＭ６Ａの選択的阻害剤は、ＫＤＭ６Ａに対して、１つ以上の他のヒストンデメチラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンデメチラーゼであるＫＤＭ６Ｂの選択的阻害剤は、ＫＤＭ６Ｂに対して、１つ以上の他のヒストンデメチラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【００７０】
いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンデメチラーゼであるＰＨＦ２の選択的阻害剤は、ＰＨＦ２に対して、１つ以上の他のヒストンデメチラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
いくつかの態様において、選択的阻害剤は、ヒストンメチルトランスフェラーゼを選択的に阻害する。いくつかの態様において、アルギニン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼであるＣＡＲＭ１の選択的阻害剤は、ＣＡＲＭ１に対して、１つ以上のリジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【００７１】
いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼであるＡＳＨ１Ｌの選択的阻害剤は、ＡＳＨ１Ｌに対して、１つ以上のリジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼであるＤＯＴ１Ｌの選択的阻害剤は、ＤＯＴ１Ｌに対して、１つ以上のリジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【００７２】
いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼであるＫＭＴ２Ａの選択的阻害剤は、ＫＭＴ２Ａに対して、１つ以上のリジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼであるＫＭＴ２Ｃの選択的阻害剤は、ＫＭＴ２Ｃに対して、１つ以上のリジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【００７３】
いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼであるＫＭＴ２Ｅの選択的阻害剤は、ＫＭＴ２Ｅに対して、１つ以上のリジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼであるＰＲＭＴ１の選択的阻害剤は、ＰＲＭＴ１に対して、１つ以上のリジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【００７４】
いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼであるＳＥＴＤ１Ａの選択的阻害剤は、ＳＥＴＤ１Ａに対して、１つ以上のリジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼであるＳＥＴＤ１Ｂの選択的阻害剤は、ＳＥＴＤ１Ｂに対して、１つ以上のリジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【００７５】
いくつかの態様において、リジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼであるＳＭＹＤ３の選択的阻害剤は、ＳＭＹＤ３に対して、１つ以上のリジン特異的ヒストンメチルトランスフェラーゼに対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
いくつかの態様において、選択的阻害剤は、ＢＲＤタンパク質を選択的に阻害する。いくつかの態様において、ＢＲＤ２の選択的阻害剤は、ＢＲＤ２に対して、１つ以上のＢＲＤタンパク質に対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【００７６】
いくつかの態様において、ＢＲＤ３の選択的阻害剤は、ＢＲＤ３に対して、１つ以上のＢＲＤタンパク質に対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
いくつかの態様において、ＢＲＤＴの選択的阻害剤は、ＢＲＤＴに対して、１つ以上のＢＲＤタンパク質に対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【００７７】
いくつかの態様において、ＢＲＰＦ１の選択的阻害剤は、ＢＲＰＦ１に対して、１つ以上のＢＲＤタンパク質に対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
いくつかの態様において、ＢＲＰＦ３の選択的阻害剤は、ＢＲＰＦ３に対して、１つ以上のＢＲＤタンパク質に対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【００７８】
いくつかの態様において、ＢＲＰＴＦの選択的阻害剤は、ＢＲＰＴＦに対して、１つ以上のＢＲＤタンパク質に対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
いくつかの態様において、ＢＡＺ１Ａの選択的阻害剤は、ＢＡＺ１Ａに対して、１つ以上のＢＲＤタンパク質に対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【００７９】
いくつかの態様において、ＢＡＺ１Ｂの選択的阻害剤は、ＢＡＺ１Ｂに対して、１つ以上のＢＲＤタンパク質に対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
いくつかの態様において、ＢＡＺ２Ａの選択的阻害剤は、ＢＡＺ２Ａに対して、１つ以上のＢＲＤタンパク質に対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【００８０】
いくつかの態様において、選択的阻害剤は、アクチン依存性のクロマチンの制御因子（例えば、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＭＡＲＣＢ１）を選択的に阻害する。いくつかの態様において、ＳＭＡＲＣＡ５の選択的阻害剤は、ＳＭＡＲＣＡ５に対して、１つ以上のアクチン依存性のクロマチンの制御因子に対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。いくつかの態様において、ＳＭＡＲＣＢ１の選択的阻害剤は、ＳＭＡＲＣＢ１に対して、１つ以上のアクチン依存性のクロマチンの制御因子に対するＩＣ５０よりも、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも８倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍低い最大半量阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。
【００８１】
いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、干渉ＲＮＡである。干渉ＲＮＡの例として、これらに限定されないが、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が挙げられる。阻害性オリゴヌクレオチドは、遺伝子の発現、転写および／または翻訳を妨害し得る。一般に、阻害性オリゴヌクレオチドは、相補性の領域を介して標的ポリヌクレオチドに結合する。例えば、阻害性オリゴヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドへの結合は、ＲＮＡｉ経路により媒介される標的ポリヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどの場合）の分解を引き起こし得るか、転写の機構（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を遮断し得る。阻害性オリゴヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡからなる群より選択される。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、修飾された核酸である。
【００８２】
用語「ヌクレオチドアナログ」または「改変されたヌクレオチド」または「修飾されたヌクレオチド」とは、天然に存在しないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む、標準的でないヌクレオチドを指す。いくつかの態様において、ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチドの特定の化学的特性を改変するが、ヌクレオチドアナログがその意図される機能を行う能力を保持するために、任意の位置において修飾される。誘導体化され得るヌクレオチドの位置の例として、５位、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン、５−プロピンウリジン、５−プロペニルウリジンなど；６位、例えば、６−（２−アミノ）プロピルウリジン；アデノシンおよび／またはグアノシンについては８位、例えば、８−ブロモグアノシン、８−クロログアノシン、８−フルオログアノシンなどが挙げられる。ヌクレオチドアナログはまた、デアザヌクレオチド、例えば、７−デアザ−アデノシン；Ｏ−およびＮ−修飾された（例えばアルキル化された、例えばＮ６−メチルアデノシン、または当該分野において他に公知であるように）ヌクレオチド；ならびに他のヘテロ環が修飾されたヌクレオチドアナログ、例えばHerdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310において記載されるものを含む。
【００８３】
ヌクレオチドアナログはまた、ヌクレオチドの糖部分に対する修飾を含んでもよい。例えば、２’ＯＨ−基を、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、ＣＯＯＲ、またはＯＲから選択される基により置き換えてもよく、ここで、Ｒは、置換されたまたは未置換のＣ１−Ｃ６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールなどである。他の可能な修飾として、米国特許第5,858,988号および同第6,291,438号において記載されるものが挙げられる。しばしばアクセス不能な（inaccessible）ＲＮＡとしても言及されるロックド核酸（ＬＮＡ）は、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素と４’炭素とを連結する余分の架橋により修飾される。
【００８４】
ヌクレオチドのリン酸基もまた、リン酸基の酸素のうちの１つ以上を硫黄で置換することにより（例えばホスホロチオエート）、または、例えば、Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2):117-21、Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5):333-45、Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5): 317-25、Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11(2):77-85、および米国特許第5,684,143号において記載されるような、ヌクレオチドがその意図される機能を行うことを可能にする他の置換を行うことにより、修飾される。上で言及される修飾のうちの特定のもの（例えばリン酸基修飾）は、好ましくは、例えば前記アナログを含むポリヌクレオチドのin vivoまたはin vitroでの加水分解の速度を低下させる。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、修飾された阻害性オリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、修飾された阻害性オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート骨格、および／または２’−ＯＭｅ修飾を含む。以下の表１は、ＤＵＸ４発現の修飾因子である干渉ＲＮＡの例を提供する。
【００８５】
表１  ＤＵＸ４発現を修飾するための干渉ＲＮＡの例
【表１】
2019534298.tif 000003
【００８６】
遺伝子編集分子
本開示の側面は、いくつかの態様において、遺伝子編集複合体（例えば、遺伝子編集分子）は、ＤＵＸ４遺伝子発現を阻害するためのエピジェネティックな修飾因子として有用であるという発見に関する。したがって、いくつかの側面において、本開示は、細胞においてＤＵＸ４遺伝子発現を阻害するための方法を提供し、該方法は、細胞を、組み換え遺伝子編集複合体の有効量と接触させることを含み、ここで、遺伝子編集複合体が、細胞においてリジン特異的デメチラーゼ、ＢＲＤタンパク質、メチルトランスフェラーゼ、またはクロマチンリモデリングタンパク質の発現を阻害する。
【００８７】
本明細書において用いられる場合、「遺伝子編集複合体」とは、例えば標的ＤＮＡにおいて二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすことにより、ゲノム配列（例えば遺伝子配列）を加えるか、破壊するかまたはこれを変更するために、あるいは、標的ＤＮＡ配列の転写を阻害する（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系または類似の系の１つ以上の構成成分を用いて）ために設計された、生物学的に活性な分子（例えば、タンパク質、１つ以上のタンパク質、核酸、１つ以上の核酸、または前述のものの任意の組み合わせ）を指す。遺伝子編集複合体の例として、これらに限定されないが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、改変メガヌクレアーゼの再設計ホーミングエンドヌクレアーゼ（engineered meganuclease re-engineered homing endonuclease）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、およびメガヌクレアーゼ（例えば、メガヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩ）が挙げられる。いくつかの態様において、遺伝子編集複合体は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に関連するタンパク質または分子（例えば構成成分）を含み、これは、限定されないが、Ｃａｓ９、Ｃａｓ６、ｄＣａｓ９、Ｃｐｆ１、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、およびこれらのバリアントを含む。
【００８８】
本明細書において用いられる場合、用語「エンドヌクレアーゼ」および「ヌクレアーゼ」とは、ポリヌクレオチド鎖中のホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。ヌクレアーゼは、天然に存在するものであっても、遺伝子操作されたものであってもよい。遺伝子操作されたヌクレアーゼは、ゲノム編集のために特に有用であり、一般に、４つのファミリーに分類される：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ（例えば、改変メガヌクレアーゼ）およびＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓヌクレアーゼ）。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、ＺＦＮである。いくつかの態様において、ＺＦＮは、ＦｏｋＩ切断ドメインを含む。いくつかの態様において、ＺＦＮは、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２折りたたみ基（fold group）を含む。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮである。いくつかの態様において、ＴＡＬＥＮは、ＦｏｋＩ切断ドメインを含む。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼの例として、これらに限定されないが、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、およびこれらの組み合わせ（例えば、Ｅ−ＤｒｅＩ、ＤｍｏＣｒｅ）が挙げられる。
【００８９】
用語「ＣＲＩＳＰＲ」とは、「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）」を指し、これは、塩基配列の短い反復配列を含むＤＮＡ遺伝子座である。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、外来遺伝子材料に対する耐性を付与する、原核生物の獲得免疫系の一部を形成する。各々のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座には、ウイルスゲノム材料に由来する「スペーサーＤＮＡ」の短いセグメントが隣接する。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系において、スペーサーＤＮＡは、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にハイブリダイズして、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセッシングされ、その後、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓヌクレアーゼ）に結合して、外来ＤＮＡを認識して分解する複合体を形成する。ある態様において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓヌクレアーゼ）である。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの例として、これらに限定されないが、Ｃａｓ９、ｄＣａｓ９、Ｃａｓ６、Ｃｐｆ１、およびこれらのバリアントが挙げられる。いくつかの態様において、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、細菌Streptococcus pyogenes（例えば、ＳｐＣａｓ９）またはStaphylococcus aureus（例えば、ＳａＣａｓ９、例えば配列番号２８）に由来する。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を失うように修飾される（例えば遺伝子操作される）。例えば、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質は、標的遺伝子座に結合するが、前記遺伝子座を切断しない。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９タンパク質は、配列番号３１において記載される配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質またはそのバリアントは、例えばRan et al. (2015) Nature. 520(7546)；186-91において記載されるような、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターのパッケージング能力を超えない。例えば、いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、約４．６ｋｂ未満の長さである。
【００９０】
本開示の側面は、ＣＲＩＳＰＲ干渉などのＣＲＩＳＰＲにより媒介される転写の制御の、ＤＵＸ４発現の低下（例えばサイレンシング）のための使用に関する。例えば、いくつかの態様において、触媒的に不活性型のＣａｓ９タンパク質（例えば、不活性型Ｃａｓ９、「ｄＣａｓ９」）は、Qi et al. (2013) Cell. 152(5)；1173-1183およびGilbert et al. (2013) Cell. 154(2)；442-451において記載されるように、転写制御因子ドメインに融合（例えば共有結合）して、標的遺伝子（例えば、ＤＵＸ４遺伝子発現の制御因子、例えばＫＤＭ４Ｃ、ＡＳＨ１Ｌ、ＢＲＤ２、ＢＡＺ１Ａ、ＳＭＡＲＣＡ５などのクロマチンモディファイアー）の発現を修飾する（例えば阻害する）。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、配列番号３１において記載される配列を含む。いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まないが、ｄＣａｓ９（または別の触媒的に不活性型のＣａｓタンパク質）は、いくつかの態様においては、標的配列への転写機構（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ複合体）の結合を立体的に妨害することにより、転写抑制を媒介する。
【００９１】
いくつかの態様において、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓタンパク質（例えばｄＣａｓ９）は、転写制御因子ドメインに融合する。本明細書において用いられる場合、「転写制御因子ドメイン」とは、転写活性の改変（例えば、転写活性化または転写抑制）をもたらすクロマチン分子の構造または化学的変化を触媒する、タンパク質ドメインである。いくつかの態様において、転写制御因子ドメインは、転写抑制因子ドメインである。いくつかの態様において、抑制性ドメインは、Kruppel関連ボックスドメイン（ＫＲＡＢドメイン）を含む。ＫＲＡＢドメインの非限定的な例として、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢドメイン、ＫＯＸ８ ＫＲＡＢドメイン、ＺＮＦ４３ ＫＲＡＢドメイン、およびＺＮＦ１８４ ＫＲＡＢドメインが挙げられる。いくつかの態様において、ＫＲＡＢドメインは、ＫＯＸ１ ＫＲＡＢドメインである。いくつかの態様において、遺伝子編集タンパク質は、配列番号２９または配列番号３０において記載される配列を含む。抑制性ドメインのさらなる非限定的な例として、Chromo Shadow（ＣＳ）ドメイン（例えば、ＨＰ１αのＣＳドメイン）およびＷＲＰＷドメイン（例えば、Ｈｅｓ１のＷＲＰＷドメイン）が挙げられる。
【００９２】
いくつかの態様において、転写制御因子ドメインは、転写活性化因子ドメインである。いくつかの態様において、転写活性化因子ドメインは、ＶＰ１６などの単純ヘルペスウイルスの転写活性化ドメイン、またはそのバリアントを含む。一般に、例えばBeerli et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(25)；14628-33により記載されるように、転写因子は、複数の活性化ドメインを含み得る。したがって、いくつかの態様において、転写活性化因子ドメインは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の活性化ドメインを含む。いくつかの態様において、転写活性化因子ドメインは、ＶＰ６４、ＶＰ９６、またはＶＰ１６０である。
【００９３】
いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質は、転写制御因子ドメインに融合せず、ヌクレアーゼ活性（例えばＤＮＡ切断）を介して遺伝子発現を修飾する（例えば阻害する）ことができる。一般に、Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡによりターゲティングされた部位においてＤＮＡを切断し、次いで、不正確かつしばしばターゲティングされた配列を破壊する小さな挿入または欠失（ＩｎＤｅｌ）をもたらす非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復されるか、あるいは、特異的な位置におけるゲノム中への変更されたかまたは新たなＤＮＡ配列の挿入を可能にする相同組み換えＤＮＡ修復（homology directed DNA repair）により修復される。いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まないが、Ｃａｓタンパク質によるＤＮＡ切断およびその後の修復は、遺伝子発現に有害に作用（例えば阻害）し得る標的ＤＮＡ配列中に修飾を導入する。したがって、いくつかの側面において、本開示は、機能的ヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡを含む遺伝子編集複合体であって、ＤＵＸ４遺伝子発現の制御因子（例えば、ＫＤＭ４Ｃ、ＡＳＨ１Ｌ、ＢＡＺ１Ａ、ＢＲＤ２、ＳＭＡＲＣＡ５など）をコードする遺伝子にハイブリダイズするか、および／またはこれと相補的であり、当該因子の発現を阻害することができ、それにより、対象（例えば対象の細胞）においてＤＵＸ４の発現を阻害することができるものを指す。
【００９４】
ゲノム編集の目的のために、ＣＲＩＳＰＲ系は、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはただの（ｇＲＮＡ）中に組み合わせるために修飾されていてもよい。本明細書において用いられる場合、用語「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、および「ｓｇＲＮＡ」とは、細胞における標的配列に対して相補的であり、Ｃａｓヌクレアーゼと結合し、それにより、Ｃａｓヌクレアーゼを標的配列に方向づけるポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）は、１〜３０ヌクレオチド長の範囲である。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）は、５〜２５ヌクレオチド長の範囲である。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）は、１０〜２２ヌクレオチド長の範囲である。いくつかの態様において、ｇＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）は、１４〜２４ヌクレオチド長の範囲である。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）は、同じベクターから発現される。いくつかの態様において、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ（例えばｓｇＲＮＡ）は、別々のベクター（例えば、２つ以上のベクター）から発現される。いかなる特定の理論によっても拘束されることは望まないが、ガイドＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）は、標的配列にハイブリダイズして（例えばワトソン・クリック塩基対形成により特異的に結合して）、それにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質を標的配列に方向づける。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、ＤＵＸ４のクロマチンモディファイアーをコードする遺伝子（例えば核酸配列）にハイブリダイズする（例えばターゲティングする）。いくつかの態様において、ガイド鎖は、ヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンデメチラーゼ酵素）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ブロモドメイン含有タンパク質、キナーゼ（例えば、ヒストンタンパク質をリン酸化するキナーゼ）、またはアクチン依存性クロマチン制御因子をコードする遺伝子にハイブリダイズする。
【００９５】
いくつかの態様において、ガイド鎖は、ヒストンデメチラーゼをコードする遺伝子（例えば核酸配列）にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイド鎖は、リジン特異的ヒストンデメチラーゼ、例えばＫＤＭ４Ａ、ＫＤＭ４Ｂ、ＫＤＭ４Ｃ、ＫＤＭ４Ｄ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＭ６Ｂ、またはＰＨＦ２にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイド鎖は、配列番号１２（
【数１】
2019534298.tif 000004
；ＰＡＭを太字とした）または配列番号１３（
【数２】
2019534298.tif 000005
；ＰＡＭを太字とした）により記載される配列を含む。
【００９６】
いくつかの態様において、ガイド鎖は、ＢＲＤタンパク質、例えばＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、ＢＲＤＴ、ＢＲＰＦ１、ＢＲＰＦ３、ＢＰＴＦ、ＢＡＺ１Ａ、ＢＡＺ１Ｂ、またはＢＡＺ２Ａをコードする遺伝子（例えば核酸配列）にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイド鎖は、配列番号１４（
【数３】
2019534298.tif 000006
；ＰＡＭを太字とした）により記載される配列を含む。いくつかの態様において、ガイド鎖は、配列番号１５（
【数４】
2019534298.tif 000007
；ＰＡＭを太字とした）または配列番号１６（
【数５】
2019534298.tif 000008
；ＰＡＭを太字とした）により記載される配列を含む。
【００９７】
いくつかの態様において、ガイド鎖は、アクチン依存性のクロマチンの制御因子、例えばＳＭＡＲＣＡ５、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＣ１、ＳＭＡＲＣＣ２、ＳＭＡＲＣＤ１、ＳＭＡＲＣＤ２、またはＳＭＡＲＣＤ３をコードする遺伝子（例えば核酸配列）にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイド鎖は、配列番号１７（
【数６】
2019534298.tif 000009
；ＰＡＭを太字とした）または配列番号１８（
【数７】
2019534298.tif 000010
；ＰＡＭを太字とした）により記載される配列を含む。
【００９８】
いくつかの態様において、ガイド鎖は、リジン特異的メチルトランスフェラーゼ、例えばＡＳＨ１Ｌ、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＨＭＴ１、ＥＨＭＴ２、ＥＺＨ１、ＥＺＨ２、ＭＬＬ、ＭＬＬ２、ＭＬＬ３、ＭＬＬ４、ＭＬＬ５、ＮＳＤ１、ＰＲＤＭ１、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｃ、ＫＭＴ２Ｅ、ＳＥＴ、ＳＥＴＢＰ１、ＳＥＴＤ１Ａ、ＳＥＴＤ２、ＳＥＴＤ３、ＳＥＴＤ４、ＳＥＴＤ５、ＳＥＴＤ６、ＳＥＴＤ７、ＳＥＴＤ９、ＳＥＴＤ１Ｂ、ＳＭＹＤ１、ＳＭＹＤ２、ＳＭＹＤ３、ＳＭＹＤ４、ＳＭＹＤ５、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＳＵＶ４２０Ｈ１、またはＳＵＶ４２０Ｈ２をコードする遺伝子（例えば核酸配列）にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ガイド鎖は、配列番号１９（
【数８】
2019534298.tif 000011
；ＰＡＭを太字とした）により記載される配列を含む。
【００９９】
いくつかの態様において、ガイド鎖は、アルギニン特異的メチルトランスフェラーゼ、例えばＰＲＭＴ１、ＰＲＭＴ３、ＣＡＲＭ１、ＰＲＭＴ４、Ｒｍｔ１／Ｈｍｔ１、ＪＢＰ１、またはＰＲＭＴ５をコードする遺伝子（例えば核酸配列）にハイブリダイズする。
いくつかの態様において、いくつかの態様において、ガイド鎖は、キナーゼ（例えば、セリン−スレオニンキナーゼ、例えばＮＥＫ６）、デアセチラーゼ酵素（例えば、ヒストンデアセチラーゼ、例えばＨＤＡＣ１）、スプライシング因子タンパク質（例えば、スプライシング因子３ｂタンパク質複合体のメンバー、例えばＳＦ３Ｂ１）、ポリメラーゼ（例えば、ＰＡＲＰ１、ＰＡＲＰ２、ＰＡＲＰ３など）、リガーゼ（例えば、ＵＦＬ１）、ヒドラーゼ（例えば、ＢＡＰ１）、ペプチダーゼ（例えば、ユビキチン特異的ペプチダーゼ、例えばＵＳＰ３、ＵＳＰ７、ＵＳＰ１６、ＵＳＰ２１、もしくはＵＳＰ２２）、またはプロテアーゼ（例えば、ヒストンデユビキチナーゼ、例えばＭＹＳＭ１）をコードする遺伝子（例えば核酸配列）にハイブリダイズする。
【０１００】
処置の方法
いくつかの側面において、本開示は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）を有する対象を処置するための方法を提供する。例えば、ＤＵＸ４遺伝子の転写活性化は、対象においてＦＳＨＤをもたらし得る。本明細書において用いられる場合、「対象」は、「それを必要とする対象」と交換可能であり、これらはいずれも、ＦＳＨＤを有する対象、またはかかる障害を発症するリスクが、集団全般と比較して増大している対象を指す。例えば、いくつかの態様において、対象は、染色体４ｑ３５において１１以下の反復単位を含むＤ４Ｚアレイを有するが、ＦＳＨＤの徴候および症状を示さない。それを必要とする対象は、転写活性ＤＵＸ４遺伝子を有する対象（例えば、ＤＵＸ４−ｆｌタンパク質を発現する対象であってもよい。対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ネコ、イヌ、または他の哺乳動物であってもよい。
【０１０１】
本明細書において用いられる場合、用語「処置」、「処置すること」、および「治療」とは、治療的処置および予防的（prophylactic）または防止的（preventative）処置を指す。用語は、さらに、既知の症状、例えばＦＳＨＤに関連する症状を寛解させること、さらなる症状を防止すること、症状の根底にある原因を寛解または防止すること、症状の原因を防止または逆転させることを含む。したがって、用語は、ＦＳＨＤを有するか、またはかかる障害を発症する可能性を有する対象に、有益な結果が与えられることを意味する。さらに、用語「処置」は、疾患、疾患の症状、または疾患への素因を、治癒させる（cure）か、治癒させる（heal）か、軽減するか、緩和するか、改変するか、治療するか、寛解させるか、改善するか、またはこれに影響を与えることを目的として、疾患、疾患の症状、または疾患への素因を有し得る対象、または対象から単離された組織もしくは細胞株への、剤（例えば、治療剤または治療用組成物）の適用または投与として定義される。
【０１０２】
治療剤あたは治療用組成物は、特定の疾患（例えばＦＳＨＤ）の症状を防止および／または軽減する薬学的に受入可能な形態において、化合物を含んでもよい。例えば、治療用組成物は、ＦＳＨＤの症状を防止および／または軽減する医薬組成物であってもよい。本発明の治療用組成物は、任意の好適な形態において提供されるであろうことが、企図される。治療用組成物の形態は、本明細書において記載されるような投与の様式を含む、多数の要因に依存するであろう。治療用組成物は、本明細書において記載されるような他の成分の中で、希釈剤、アジュバントおよび賦形剤を含んでもよい。
【０１０３】
いくつかの側面において、本開示は、細胞において転写活性ＤＵＸ４遺伝子を阻害する（例えばサイレンシングする）ための方法を提供し、該方法は、細胞を、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子の有効量と接触させることを含み、ここで、エピジェネティックな修飾因子は、細胞においてＤＵＸ４発現を低下させる。いくつかの態様において、細胞は、in vitroまたはex vivoのものである。
【０１０４】
本明細書において用いられる場合、「ex vivoで修飾された細胞」とは、対象から取り除かれて、遺伝子的に修飾され（例えば、外来核酸により遺伝子導入または形質導入されたか、または遺伝子的に再プログラムされ）、培養されるかまたは増殖させられ（expand）、および任意に、対象（例えば、同じ対象または異なる対象のいずれか）に戻された細胞（例えば、哺乳動物細胞）を指す。一般に、ex vivoで修飾された細胞は、自家細胞治療または同種細胞治療のために有用である。例えば、細胞を、特定の遺伝子異常に関連する疾患（例えばＦＳＨＤ）を有する対象から取り除き、遺伝子異常を修正する（例えば、ＤＵＸ４の発現を低下させる）遺伝子編集複合体で遺伝子導入し、対象中に再導入する。別の非限定的な例において、細胞を、対象から取り除き、遺伝子的に再プログラムし（例えば、筋細胞に分化させるか、分化転換させ）、増殖させ、対象に再導入する。
【０１０５】
ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子の有効量と接触させられる細胞は、転写活性ＤＵＸ４遺伝子を有する任意の細胞であってよい。例えば、細胞は、筋細胞（例えば、筋芽細胞、最終分化した筋細胞、筋サテライト細胞、または筋幹細胞）であってよい。
転写活性ＤＵＸ４遺伝子を有する細胞はまた、ＤＵＸ４遺伝子の染色体４ｑ３５におけるＤ４Ｚ４反復配列アレイの短縮を含んでもよい。アレイ中の反復単位の数は、変化し得る。いくつかの態様において、短縮中の反復単位の数は、１１以下（例えば、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、または０）個の反復単位である。
【０１０６】
医薬組成物
いくつかの側面において、本開示は、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子を含む、医薬組成物に関する。いくつかの態様において、組成物は、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子および薬学的に受入可能なキャリアを含む。本明細書において用いられる場合、用語「薬学的に受入可能なキャリア」は、医薬の投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性な物質のためのかかる媒質および剤の使用は、当該分野において周知である。任意の慣用的な媒質または剤が活性化合物と不適合である場合を除き、組成物におけるそれらの使用が企図される。補足的な活性化合物もまた、組成物中に組み込むことができる。医薬組成物は、以下に記載されるように調製することができる。活性成分は、任意の慣用的な薬学的に受入可能なキャリアまたは賦形剤と混合または配合することができる。組成物は、無菌であってもよい。
【０１０７】
典型的には、医薬組成物は、剤（例えば、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子）の有効量を送達するために処方される。一般的に、活性剤の「有効量」とは、所望される生物学的応答（例えば転写抑制、例えば活性なＤＵＸ４遺伝子のサイレンシングまたは阻害）を引き起こすために十分な量を指す。剤の有効量は、所望される生物学的エンドポイント、化合物の薬物動態学、処置されている疾患（例えばＦＳＨＤ）、投与の様式、および患者などの要因に依存して、変化し得る。
【０１０８】
組成物は、その投与が、レシピエント患者により耐容され得る場合に、「薬学的に受入可能なキャリア」であると言われる。無菌のリン酸緩衝化食塩水は、薬学的に受入可能なキャリアの一例である。他の好適なキャリアは、当該分野において周知である。例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES、第１８版（１９９０年）を参照。
【０１０９】
当業者は、投与の任意の様式、慣用的に使用され、活性剤に関して不活性なビヒクルまたはキャリアを、本開示の医薬組成物を調製および投与するために利用することができることを、理解するであろう。かかる方法、ビヒクルおよびキャリアの説明は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第４版（１９７０年）において記載されるものであり、この開示は、本明細書において参考として援用される。本開示の原理に触れた当業者は、好適かつ適切なビヒクル、賦形剤およびキャリアを決定することにおいて、または活性成分をそれらと配合して本開示の医薬組成物を形成させることにおいて、何らの困難も経験しないであろう。
【０１１０】
化合物（例えば、アンチセンス核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）、遺伝子編集複合体、または小分子ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子）の有効量は、治療有効量としてもまた言及され、細胞において、またはかかる修飾を必要とする個体において、遺伝子の活性化（例えば、転写活性化）または増大した発現に関連する、少なくとも１つの有害効果を寛解させるために十分な量である。いくつかの態様において、有効量は、細胞において、またはＤＵＸ４阻害を必要とする個体において、ＤＵＸ４遺伝子を阻害する（例えば転写的に抑制する）ために、十分な量である。医薬組成物中に含められるべき治療有効量は、各々の場合において、いくつかの要因、例えば、処置されるべき患者の型、サイズおよび条件、意図される投与の様式、患者が意図される投与形態を取り入れる能力などに依存する。一般に、活性剤の量は、約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、および好ましくは約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇを提供するように、各々の投与形態中に含まれる。当業者は、経験的に適切な治療有効量を決定することができるであろう。
【０１１１】
本明細書において提供される教示と組み合わせて、多様な活性化合物の中から選択すること、および強度、相対的なバイオアベイラビリティー、患者の体重、有害な副作用の重篤度、および選択される投与の様式などの要因を比較することにより、実質的な毒性を引き起こさず、しかし特定の対象を処置するために完全に有効である有効な予防的または治療的処置レジメンを計画することができる。任意の特定の適用のための有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与されている特定の治療剤、対象のサイズ、または疾患もしくは状態の重篤度などの要因に依存して変化し得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、特定の核酸および／または他の治療剤の有効量を、経験的に決定することができる。
【０１１２】
いくつかの場合において、本開示の化合物は、コロイド状分散系中で調製される。コロイド状分散系は、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む、脂質ベースの系を含む。いくつかの態様において、本開示のコロイド状の系は、リポソームである。リポソームは、送達ベクターとしてin vivoまたはin vitroで有用な人工の膜管である。０．２〜４．０μｍの範囲のサイズの大単層小胞（large unilamellar vesicle：ＬＵＶ）は、大きな巨大分子を封入することができることが示されている。RNA、DNAおよび完全なビリオンを、水性の内部に封入して、生物学的に活性な形態において細胞に送達することができる。Fraley et al. (1981) Trends Biochem Sci 6:77。
【０１１３】
リポソームは、リポソームを、モノクローナル抗体、糖、糖脂質またはタンパク質などの特異的リガンドにカップリングさせることにより、特定の組織に対してターゲティングすることができる。リポソームを、例えば平滑筋細胞に対してターゲティングするために有用であり得るリガンドとして、限定されないが、平滑筋細胞に特異的な受容体と相互作用する完全な分子または分子のフラグメント、およびがん細胞の細胞表面マーカーと相互作用する、抗体などの分子が挙げられる。かかるリガンドは、当業者に周知の結合アッセイにより、容易に同定することができる。さらに他の態様において、リポソームは、それを、当該分野において公知の抗体とカップリングすることにより、組織に対してターゲティングすることができる。
【０１１４】
遺伝子導入のための脂質処方物は、QIAGENから、例えば、EFFECTENE（商標）（非リポソーム性の脂質、および特別なＤＮＡ縮合増強剤）およびSUPERFECT（商標）（新規の活性型デンドリマー技術）として、市販されている。
リポソームは、Gibco BRLから、例えば、LIPOFECTIN（商標）およびLIPOFECTACE（商標）として市販されており、これらは、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）などのカチオン性脂質からなる。リポソームを作製するための方法は、当該分野において周知であり、多くの刊行物において記載されている。リポソームはまた、Gregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3:235-241により概説されている。
【０１１５】
特定のＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル硫酸塩（ＤＯＴＡＰ）を含む特定のカチオン性脂質は、本開示のＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子（例えば、干渉ＲＮＡ）と組み合わせた場合に、有利となり得る。
【０１１６】
本開示のいくつかの側面において、圧縮剤の使用もまた、望ましい場合がある。圧縮剤はまた、単独で、または生物学的もしくは化学的／物理的ベクターと組み合わせて使用してもよい。「圧縮剤」とは、本明細書において用いられる場合、ヒストンなどの、核酸に対する負の電荷を中和して、それにより核酸の微細な顆粒への圧縮を可能にする剤を指す。核酸の圧縮は、標的細胞による核酸にの取り込みを促進する。圧縮剤は、例えばＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子を、細胞によってより効率的に取り込まれる形態において送達するために単独で、または上記のキャリアのうちの１つ以上と組み合わせて用いることができる。
【０１１７】
ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子の取り込みを促進するために用いられる他の例示的な組成物として、リン酸カルシウムおよび他の細胞内輸送の化学メディエーター、マイクロインジェクション組成物、エレクトロポレーションおよび相同組み換え組成物（例えば、核酸を、標的細胞の染色体中の予め選択された位置に組み込むためのもの）が挙げられる。
【０１１８】
化合物は、単独で（例えば食塩水または緩衝液中で）、または当該分野において公知の任意の送達ビヒクルを用いて、投与することができる。例えば、以下の送達ビヒクルが記載されている：コクリエート；エマルソーム（Emulsome）；ＩＳＣＯＭ；リポソーム；生細菌ベクター（例えば、Salmonella、Escherichia coli、Bacillus Calmette-Guerin、Shigella、Lactobacillus)；生ウイルスベクター（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、単純ヘルペス、レンチウイルス）；マイクロスフェア；核酸ワクチン；ポリマー（例えば、カルボキシメチルセルロース、キトサン）；ポリマー環；プロテアソーム；フッ化ナトリウム；トランスジェニック植物；ビロソーム；およびウイルス様粒子。いくつかの態様において、本開示により記載されるＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子は、レンチウイルスベクターにより送達される。
【０１１９】
本開示の処方物は、薬学的に受入可能な溶液中で投与され、これは、慣用的に、薬学的に受入可能な濃度の塩、緩衝化剤、保存剤、適合性のキャリア、アジュバントおよび任意に他の治療成分を含んでもよい。
【０１２０】
用語薬学的に受入可能なキャリアとは、ヒトまたは他の脊椎動物への投与のために好適な、１つ以上の適合性の固体または液体の充填剤、希釈剤または封入用物質を意味する。キャリアという用語は、適用を容易にするために活性成分を組み合わせる、天然または合成の有機または無機の成分を意味する。医薬組成物の構成成分はまた、本開示の化合物と、互いに、所望される薬学的な効率を実質的に損なう相互作用が存在しない様式において、混合することができる。
【０１２１】
糖衣錠のコアは、好適なコーティングを備える。この目的のために、濃縮された糖溶液を用い、これは、任意に、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含んでもよい。活性化合物の用量の異なる組み合わせの同定のため、またはこれらを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠のコーティングに、染料または色素を添加してもよい。
【０１２２】
本明細書において記載される処方物に加えて、化合物はまた、デポー製剤として処方してもよい。かかる長期作用型処方物は、好適なポリマー性または疎水性の材料により（例えば、受入可能な油脂中のエマルジョンとして）、またはイオン交換樹脂により、または難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として、処方することができる。
医薬組成物はまた、好適な固相またはゲル相のキャリアまたは賦形剤を含んでもよい。かかるキャリアまたは賦形剤の例として、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、多様な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられる。
【０１２３】
好適な液体または固体の医薬製剤形態は、例えば、吸入のための水溶液または食塩水溶液、マイクロカプセル化、コクリエート化、顕微鏡用金粒子上に被覆したもの、リポソーム中に含まれるもの、噴霧化したもの、エアロゾル、皮膚中への移植のためのペレット、または皮膚中に引っ掻くための鋭い物体上で乾燥させたものである。医薬組成物はまた、顆粒、粉末、錠剤、コーティングされた錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、滴下剤、または活性化合物の長期放出を有する製剤を含み、これらの製剤中に、賦形剤および添加物および／または助剤、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、潤滑剤、香味剤、甘味剤または可溶化剤は、上記のように習慣的に用いられる。医薬組成物は、多様な薬物送達系における使用のために好適である。薬物送達のための方法の簡単な概説については、本明細書において参考として援用されるLanger R (1990) Science 249:1527-1533を参照。
【０１２４】
化合物は、それ自体（ニート）で、または薬学的に受入可能な塩の形態において投与することができる。医薬において用いられる場合、塩は、薬学的に受入可能であるべきであるが、薬学的に受入不可能な塩もまた、その薬学的に受入可能な塩を調製するために便利に用いることができる。かかる塩として、これらに限定されないが、以下の酸から調製されるものが挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸。また、かかる塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、例えばカルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩として、調製することができる。
【０１２５】
好適な緩衝化剤は、酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；酢酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が挙げられる。好適な保存剤として、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【０１２６】
組成物は、単位投与形態において、便利に提示することができ、製薬の分野において周知の方法のうちのいずれかにより、調製することができる。全ての方法は、化合物を、１つ以上の補助成分を構成するキャリアと組み合わせるステップを含む。一般的に、組成物は、化合物を、液体のキャリア、微細に分割された固体のキャリア、またはその両方と、均一にかつ緊密に組み合わせて、次いで必要な場合には、製品を成形することにより、調製される。液体の用量の単位は、バイアルまたはアンプルである。固体の用量の単位は、錠剤、カプセルおよび坐剤である。
【０１２７】
投与の様式
本開示の医薬組成物は、好ましくは、化合物または混合物を、錠剤、カプセルもしくは丸剤として経口で、または非経口で、静脈内で、皮内で、筋肉内で、もしくは皮下で、もしくは経皮で、投与可能にするために好適な、薬学的に受入可能なキャリアまたは賦形剤を含む。
【０１２８】
いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子の治療有効量は、標的組織または標的細胞に送達される。いくつかの態様において、ＤＵＸ４（例えば、ＤＵＸ４−ｆｌ）は、ＦＳＨＤを有する対象の筋細胞において発現される。したがって、いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子の有効量は、対象の筋細胞に送達される。いくつかの態様において、筋細胞は、最終分化した筋細胞である。分化した筋細胞の例として、筋細胞および筋管が挙げられる。
【０１２９】
ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子および／または他の化合物を含む医薬組成物は、医薬を投与するための任意の好適な経路により投与することができる。多様な投与経路が利用可能である。選択される特定の様式は、無論、選択される特定の剤、処置されている特定の状態、および治療効力のために必要とされる投与量に依存するであろう。本開示の方法は、一般的に言って、医学的に受入可能な任意の投与の様式を用いて実施することができ、これは、臨床的に受け入れることができない有害効果を引き起こさない任意の様式を意味する。多様な投与の様式が、本明細書において議論される。治療における使用のために、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子の有効量および／または他の治療剤は、所望される表面、例えば全身、筋肉内などに剤を送達する任意の様式により、対象に投与することができる。
【０１３０】
本開示の医薬組成物を投与することは、当業者に公知の任意の手段により達成することができる。投与の経路として、これらに限定されないが、経口、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻内、舌下、気管内、吸入、皮下、眼、膣、および直腸が挙げられる。全身経路は、経口および非経口を含む。いくつかの型のデバイスは、吸入による投与のために定期的に用いられる。これらの型のデバイスは、定量噴霧式吸入器（ＭＤＩ）、吸気感応型ＭＤＩ、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、ＭＤＩと組み合わせたスペーサー／保持チャンバー、およびネブライザーを含む。
【０１３１】
経口投与のために、化合物は、活性化合物を、当該分野において周知の薬学的に受入可能なキャリアと組み合わせることにより、容易に処方することができる。かかるキャリアは、本開示の化合物を、処置されるべき対象による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することを可能にする。経口での使用のための医薬製剤は、固体の賦形剤として得ることができ、任意に、必要な場合には好適な助剤を添加した後で、生じた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、錠剤または糖衣錠のコアを得る。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、馬鈴薯デンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース製剤、および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの充填剤である。所望される場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を添加してもよい。任意に、経口処方物はまた、内部の酸条件を中和するための食塩水または緩衝液中で処方してもよく、いかなるキャリアも用いずに投与してもよい。
【０１３２】
経口で用いることができる医薬製剤は、ゼラチン製のプッシュ・フィット式カプセル、ならびに軟性のゼラチンおよび可塑化剤（グリセロールまたはソルビトールなど）からできた密封カプセルを含む。プッシュ・フィット式カプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはたるくもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意に安定化剤との混合物中に、活性成分を含んでもよい。軟性のカプセル中で、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中で溶解または懸濁してもよい。加えて、安定化剤を添加してもよい。経口投与のために処方されたマイクロスフェアもまた、用いることができる。かかるマイクロスフェアは、当該分野においてよく定義されている。経口投与のための全ての処方物は、かかる投与のために好適な投与量であるべきである。
【０１３３】
頬側投与のために、組成物は、慣用的な様式において処方された錠剤またはロゼンジの形態をとってもよい。
吸入による投与のために、本開示による使用のための化合物は、好適な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適な気体を使用する、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーの体裁の形態において、便利に送達することができる。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量された量を送達するための値を提供することにより、決定することができる。吸入器または注入器（insufflator）における使用のための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含めて処方することができる。
【０１３４】
化合物は、それらを全身に送達することが望ましい場合、注射による、例えばボーラス注射または持続注入による、非経口投与のために処方してもよい。注射のための処方物は、単位投与形態において、例えば、アンプルにおいて、または複数用量容器において、保存剤を添加して、提示してもよい。組成物は、油性または水性のビヒクル中の、懸濁液、溶液または乳液などの形態をとってもよく、懸濁剤、安定化剤、および／または分散剤などの処方剤を含んでもよい。
【０１３５】
非経口投与のための医薬処方物は、水溶性の形態における活性化合物の水溶液を含む。したがって、活性化合物の懸濁液は、適切な油性の注射用懸濁液として調製してもよい。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとして、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成の脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。水性の注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストリンなどの、懸濁液の粘性を増大させる物質を含んでもよい。任意に、懸濁液はまた、化合物の可溶性を増大させて、高濃度の溶液の調製を可能にする、好適な安定化剤を含んでもよい。
【０１３６】
あるいは、活性化合物は、好適なビヒクル、例えば無菌のパイロジェンフリー水により、使用の前に再構成するために、粉末形態であってもよい。
化合物はまた、例えばカカオバターまたは他のトリグリセリドなどの慣用的な坐剤用基剤を含む、坐剤または停留浣腸などの直腸または膣用組成物において処方してもよい。
【０１３７】
他の送達系は、時間放出、遅延放出または持続放出送達系を含んでもよい。かかる系は、化合物の繰り返し投与を回避することができ、対象および医師に対する利便性を増大することができる。多くの型の放出送達系が利用可能であり、当業者に公知である。それらは、ポリ（ラクチドグリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ無水物などのポリマーベースの系を含む。薬物を含む前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第5,075,109号において記載される。送達系はまた、非ポリマー系：すなわち、コレステロール、コレステロールエステルなどのステロール、および、モノ、ジおよびトリグリセリドなどの脂肪酸または中性脂肪を含む脂質；ハイドロゲル放出系；サイラスティック系；ペプチドベースの系；ワックスコーティング；慣用的な結合剤および賦形剤を用いて圧縮成形された錠剤；部分的に融合したインプラント；などを含む。具体例として、これらに限定されないが、（ａ）本開示の剤がマトリックス内の形態において含まれる浸食性の系、例えば、米国特許第4,452,775号、同第4,675,189号および同第5,736,152号において記載されるもの、ならびに（ｂ）活性な構成成分がポリマーから制御された速度において浸透する拡散性の系、例えば、米国特許第3,854,480号、同第5,133,974号および同第5,407,686号において記載されるものが挙げられる。加えて、ポンプベースのハードウェア送達系を用いてもよく、そのうちのいくつかは、移植のために適切である。
【０１３８】
いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチド（例えば干渉ＲＮＡ）は、阻害剤オリゴヌクレオチドを発現するように操作された発現ベクターを介して、細胞に送達することができる。発現ベクターは、所望される配列を、制御配列に作動的に連結されてＲＮＡトランスクリプトとして発現されることができるように、例えば制限酵素切断およびライゲーションにより、挿入することができるものである。発現ベクターは、典型的には、タンパク質のための、または阻害性オリゴヌクレオチドのためのコード配列であるインサート、例えばｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを含む。ベクターは、当該ベクターにより形質転換または遺伝子導入されているか、またはそうされていない細胞の同定における使用のために好適な、１つ以上のマーカー配列をさらに含んでもよい。マーカーとして、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性のいずれかを増大または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、その活性が標準的なアッセイまたは蛍光タンパク質などにより検出可能である酵素をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１３９】
本明細書において用いられる場合、コード配列（例えば、タンパク質コード配列、ｍｉＲＮＡ配列、ｓｈＲＮＡ配列）と制御配列とは、それらが、コード配列の発現または転写を、制御配列の影響または制御下におくように、共有結合により連結される場合に、「作動的に」連結していると言われる。コード配列が、機能的タンパク質に翻訳されることが望ましい場合、２つのＤＮＡ配列は、５’制御配列中のプロモーターの誘導が、コード配列の転写をもたらす場合、および、２つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が、（１）フレーム−シフト変異の導入をもたらさない、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を指揮する能力を妨げない、または（３）対応するＲＮＡトランスクリプトがタンパク質に翻訳される能力を妨げない場合に、作動的に連結していると言われる。したがって、生じたトランスクリプトが所望されるタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得るように、プロモーター領域がそのＤＮＡ配列の転写をもたらすことができる場合に、プロモーター領域はコード配列に作動的に連結される。コード配列が、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡをコードし得ることが、理解されるであろう。
【０１４０】
遺伝子発現のために必要とされる制御配列の正確な性質は、種または細胞型の間で変化し得るが、一般的に、必要である場合には、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列などを含むべきである。かかる５’非転写制御配列は、作動的に連結された遺伝子の転写の制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むであろう。制御配列はまた、所望される場合、エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を含んでもよい。本開示のベクターは、任意に、５’リーダーまたはシグナル配列を含んでもよい。
【０１４１】
いくつかの態様において、核酸分子の送達のためのウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび弱毒化ポックスウイルスを含むポックスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルス、ならびにＴｙウイルス様粒子からなる群より選択される。外来核酸を送達するために用いられてきたウイルスおよびウイルス様粒子の例として、以下が挙げられる：複製欠損アデノウイルス、修飾されたレトロウイルス、非複製性レトロウイルス、複製欠損セムリキ森林ウイルス、カナリアポックスウイルスおよび高度に弱毒化されたワクシニアウイルス誘導体、非伴複製ワクシニアウイルス、伴複製ワクシニアウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、レンチウイルスベクターおよびＴｙウイルス様粒子。
【０１４２】
特定の適用のために有用な別のウイルスは、アデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、広範な細胞型および種に感染することができ、複製欠損になるように操作され得る。それはさらに、熱および脂質溶媒安定性、造血細胞を含む多様な系統の細胞における高い形質導入頻度、および重複感染の阻害の欠失により複数の一連の形質導入を可能にすることなどの利点を有する。アデノ随伴ウイルスは、
部位特異的な様式においてヒト細胞ＤＮＡ中に組み込み、それにより、挿入変異の可能性および挿入遺伝子の発現の変異性を最小化することができる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の不在下における１００回を超える継代にわたる組織培養において継続し、このことは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みが、比較的安定なイベントであることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外での様式においても機能し得る。
【０１４３】
一般的に、他の有用なウイルスベクターは、必須でない遺伝子が目的の遺伝子で置き換えられている非細胞傷害性の真核生物ウイルスに基づく。非細胞傷害性のウイルスとして、その生活環が、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写と、その後の宿主細胞のＤＮＡ中へのプロウイルス性組み込みを含む、特定のレトロウイルスが挙げられる。一般的に、レトロウイルスは、複製欠損である（例えば、所望されるトランスクリプトの合成を指揮することはできるが、感染性粒子を産生することはできない）。かかる遺伝子改変されたレトロウイルス発現ベクターは、in vivoでの遺伝子の高効率での形質移入のために、一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコル（外来遺伝子材料のプラスミド中への組み込み、プラスミドによるパッケージング細胞株の遺伝子導入、パッケージング細胞株による組み換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の回収、およびウイルス粒子による標的細胞の感染を含む）は、Kriegler, M.、「Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual」、W.H. Freeman Co.、New York（１９９０年）およびMurry, E.J.編、「Methods in Molecular Biology」、第7巻、Humana Press, Inc.、Clifton、New Jersey（１９９１年）において提供される。いくつかの態様において、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子（例えば、干渉ＲＮＡまたは遺伝子編集複合体）は、レンチウイルスベクターにより、細胞（例えば、対象の細胞）に送達される。
【０１４４】
本開示の核酸分子を細胞中に導入するために、核酸分子が宿主においてin vitroで導入されるのかin vivoで導入されるのかに依存して、多様な技術を使用することができる。かかる技術として、核酸分子−リン酸カルシウム沈殿物の遺伝子導入、ＤＥＡＥに関連する核酸分子の遺伝子導入、目的の核酸分子を含む前述のウイルスによる遺伝子導入または感染、リポソーム媒介型遺伝子導入などが挙げられる。他の例として、以下が挙げられる：Sigma-AldrichによるN-TER（商標）ナノ粒子遺伝子導入系、Polyplus Transfectionによる昆虫細胞のためのFectoFly（商標）遺伝子導入試薬、Polysciences, Inc.によるポリエチレンイミン「Max」、Cosmo Bio Co., Ltd.によるユニークな非ウイルス性遺伝子導入ツール、InvitrogenによるLipofectamine（商標）LTX遺伝子導入試薬、StratageneによるSatisFection（商標）遺伝子導入試薬、InvitrogenによるLipofectamine（商標）遺伝子導入試薬、Roche Applied ScienceによるFuGENE（登録商標）HD遺伝子導入試薬、Polyplus TransfectionによるＧＭＰ準拠in vivo-jetPEI（商標）遺伝子導入試薬、およびNovagenによるInsect GeneJuice（登録商標）遺伝子導入試薬。
【０１４５】
スクリーニング方法
いくつかの側面において、本開示は、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子として機能にする剤を同定する方法に関する。したがって、いくつかの態様において、本開示は、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子を同定するための方法を提供し、該方法は、ＤＵＸ４（例えばＤＵＸ４−ｆｌ）の発現により特徴づけられる細胞を、ＤＵＸ４の推定のクロマチンモディファイアーの発現または活性を修飾するための候補の剤と接触させること；細胞におけるＤＵＸ４の発現レベルを検出すること；ならびに、候補の剤との接触の後でＤＵＸ４の発現レベルが対照細胞と比較して低下した場合に、候補の剤を、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子として同定することを含む。例示的な候補の剤として、これらに限定されないが、小分子、抗体、抗体コンジュゲート、ペプチド、タンパク質、アンチセンス分子（例えば、干渉ＲＮＡ）または他の核酸が挙げられる。いくつかの態様において、本開示により記載される方法は、新たなＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子を同定するために、候補化合物の大きなライブラリー（例えば、化合物ライブラリー）をスクリーニングするために有用である。いくつかの態様において、化合物ライブラリーは、特定の標的核酸（例えば核酸配列）または特定のタンパク質標的、例えばヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンデメチラーゼ酵素）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ブロモドメイン含有タンパク質、キナーゼ（例えば、ヒストンタンパク質をリン酸化するキナーゼ）、またはアクチン依存性のクロマチンの制御因子に対して特異的な、候補の剤からなる。いくつかの態様において、候補の剤は、ヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンデメチラーゼ酵素）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ブロモドメイン含有タンパク質、キナーゼ（例えば、ヒストンタンパク質をリン酸化するキナーゼ）、またはアクチン依存性のクロマチンの制御因子の阻害剤である。
【０１４６】
当業者は、活性化されたＤＵＸ４遺伝子を有する細胞を候補化合物と接触させるためのいくつかの方法を認識する。例えば、自動液体操作システムが、一般に、ハイスループット薬物スクリーニングのために利用される。自動液体操作システムは、ロボットアームにより制御される液体分配容器のアレイを利用して、固定された容積の液体をアッセイプレートのウェルに分配する。一般に、アレイは、９６、３８４または１５３６個の液体分配チップを含む。自動液体操作システムの非限定的な例として、デジタルディスペンサー（例えば、HP D300 Digital Dispenser）およびピンニング機（例えば、MULTI-BLOT（商標）Replicator System、CyBio、Perkin Elmer Janus）が挙げられる。自動化されていない方法もまた、本開示により企図され、これらに限定されないが、手動のデジタルリピートマルチチャネルピペットが挙げられる。
【０１４７】
いくつかの態様において、本開示により記載されるスクリーニング方法は、ハイスループットモードにおいて行われる。いくつかの態様において、ハイスループットスクリーニングは、マルチウェル細胞培養プレート中で行われる。いくつかの態様において、マルチウェルプレートは、プラスチックまたはガラスである。いくつかの態様において、マルチウェルプレートは、６、２４、９６、３８４または１５３６ウェルのアレイを含む。しかし、当業者は、マルチウェルプレートは、複数の６、２４、９６、３８４または１５３６のウェルの数を有するマルチウェルプレートなどの多様な他の受入可能な形状に構築することができることを理解する。例えば、いくつかの態様において、マルチウェルプレートは、３０７２ウェルのアレイを含む（これは複数の１５３６である）。
【０１４８】
細胞におけるＤＵＸ４の発現レベルは、当該分野において公知の任意の好適な手段により測定することができる。例えば、細胞におけるＤＵＸ４の発現レベルは、ハイブリダイゼーションベースの方法により測定することができる。ハイブリダイゼーションベースのアッセイの例として、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット、およびサザンブロットが挙げられる。いくつかの態様において、細胞におけるＤＵＸ４（例えばＤＵＸ４−ｆｌ）の発現レベルは、タンパク質ベースの方法により測定される。タンパク質ベースのアッセイの例として、これらに限定されないが、ウェスタンブロット、ブラッドフォードアッセイ、ローリータンパク質アッセイ、および分光学的方法（例えば、質量分析、高圧液体クロマトグラフィーなど）が挙げられる。いくつかの態様において、細胞におけるＤＵＸ４（例えばＤＵＸ４−ｆｌ）の発現レベルは、細胞ベースの方法により決定される。細胞ベースのアッセイの例として、フローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）が挙げられる。いくつかの態様において、細胞は、ＤＵＸ４阻害が耐性遺伝子の発現に作動的に連結され、それにより、ＤＵＸ４の阻害（例えば転写抑制）が、選択培地の存在下において細胞の増殖および選択を可能にするように、修飾される。細胞におけるＤＵＸ４の発現レベルを定量するさらなる方法は、当業者には容易に明らかとなるであろう。
【０１４９】
候補化合物は、候補化合物の存在下におけるＤＵＸ４の量が、候補化合物の不在下における量よりも少ない（例えば、これと比較して低下している）場合に、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子として同定することができる。ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子の存在下において発現されるＤＵＸ４の量は、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子の不在下において発現されるＤＵＸ４の量よりも、約１％〜約１００％少ない、約５％〜約５０％少ない（例えば、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％少ない）、約１０％〜約４０％少ない、または約２０％〜約３０％少ない範囲であってよい。いくつかの態様において、ＤＵＸ４は、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子の存在下においては発現されず（例えば、転写的に不活性であるか、またはサイレンシングされている）、ＤＵＸ４のエピジェネティックな修飾因子の不在下において発現される（例えば、転写的に活性である）。
【０１５０】
例
例１
この例は、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）の処置のために、ＤＵＸ４の転写の異常な増大を支配する制御機構をターゲティングすることを記載する。正常な対象（例えば、ＦＳＨＤを有さない対象）において、ＤＵＸ４発現は、通常オフである。ここでは、ＦＳＨＤを有する対象の筋肉においてＤＵＸ４をオンにする制御因子の同定を記載する。かかる制御因子は、いくつかの態様において、ＦＳＨＤを処置するための小分子治療のための標的である。
【０１５１】
ＤＵＸ４発現に関与する遺伝子（例えば、ＦＳＨＤ筋細胞においてこれらの遺伝子の発現が低下している場合、ＤＵＸ４発現もまた減少する）を同定するためのスクリーニングを行った。簡単に述べると、ＦＳＨＤを有する対象に由来する初代分化筋細胞を、候補遺伝子を標的とするｓｈＲＮＡで処置し、病原性ＤＵＸ４−ｆｌのｍＲＮＡの発現レベルを定量した。ＤＵＸ４ノックダウンの間接的効果を評価するために、他の筋原性制御因子（例えば、ミオゲニン、ＭｙｏＤ、ＭｙＨＤ）および他の標的（例えば、ＦＲＧ１、ＵＴＲＮ、および１８Ｓ）の発現レベルもまた定量した。試料スクリーニングプロトコルを、以下に示す：
例のスクリーニングプロトコル
１．低継代初代ＦＳＨＤ筋芽細胞を増殖させる。
２．６ウェルプレート中に播種する。
３．細胞をコンフルーエンシーに達させ、分化させる（約４８時間）。
４．細胞にレンチウイルスｓｈＲＮＡコンストラクトを感染させ、２４時間にわたりインキュベートする。
５．細胞にレンチウイルスｓｈＲＮＡコンストラクトを再感染させる。
６．第２の感染の４日後に細胞を収集する。
７．ＲＮＡを細胞から抽出して、ＤＵＸ４−ｆｌおよび他の目的の遺伝子の発現レベルについてアッセイする。
【０１５２】
候補遺伝子の非限定的な例を提供するリストを、表２において提供する。合計で３９個の表２からの候補遺伝子をスクリーニングした；各々の候補遺伝子に、また表２において示される２〜３種の異なるｓｈＲＮＡを感染させた。ＤＵＸ４、ミオゲニン、ＭｙｏＤ、ＭｙＨＣ、ＦＲＧ１、ＵＴＲＮ、および１８Ｓについての相対的遺伝子発現を、表３において示す。
表２
【表２】
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【０１５３】
表３
【表３】
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【０１５４】
図１は、Ｄｕｘ４（ＤＵＸ４−ｆｌ）、他の筋原性因子（ミオゲニン、ＭｙｏＤ、ＭｙＨＣ）、ＦＲＧ１、ＵＴＲＮ、および１８Ｓの発現に対するＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、およびＢＲＤＴのｓｈＲＮＡノックダウンの効果を示す。データは、２つの異なるｓｈＲＮＡによるＢＲＤ２のノックダウンは、ＤＵＸ４−ｆｌ発現を低下させることを示す。しかし、ＢＲＤ４のノックダウンは、ＤＵＸ４発現に対してほとんど効果を有さない。
【０１５５】
図２は、Ｄｕｘ４（ＤＵＸ４−ｆｌ）、およびさらなる目的の遺伝子のパネル（ミオゲニン、ＭｙｏＤ、ＭｙＨＣ、ＦＲＧ１、ＵＴＲＮ、および１８Ｓ）の発現に対する、ＣＡＲＭ１、ＫＭＴ２Ａ、およびＫＤＭ４Ａ−４ＤのｓｈＲＮＡノックダウンの効果を示す。データは、２つの異なるｓｈＲＮＡによるＣＡＲＭ１のノックダウンが、各々、ＤＵＸ４−ｆｌ発現の低下をもたらすことを示す。ＣＡＲＭ１を標的とする第３のｓｈＲＮＡは、ＤＵＸ４−ｆｌ発現の低下をもたらさなかった。３つの異なるｓｈＲＮＡを用いたＫＤＭ４Ｃのノックダウンは、ＤＵＸ４−ｆｌ発現の低下をもたらした。
【０１５６】
図３は、Ｄｕｘ４（ＤＵＸ４−ｆｌ）、他の筋原性因子（ミオゲニン、ＭｙｏＤ、ＭｙＨＣ）、ＦＳＨＤ領域遺伝子１（ＦＲＧ１）、ユートロフィン（ＵＴＲＮ）、および１８Ｓの発現に対する、ジンクフィンガードメイン隣接ブロモドメイン１Ｂ（ＢＡＺ１Ｂ）、ジンクフィンガードメイン隣接ブロモドメイン１Ａ（ＢＡＺ１Ａ）、ジンクフィンガードメイン隣接ブロモドメイン２Ａ（ＢＡＺ２Ａ）、ＳＷＩ／ＳＮＦ関連マトリックス結合型アクチン依存性クロマチン制御因子サブファミリーＢメンバー１（ＳＭＡＲＣＢ１）、ＳＷＩ／ＳＮＦ関連マトリックス結合型アクチン依存性クロマチン制御因子サブファミリーＡメンバー５（ＳＭＡＲＣＡ５）、ＢＲＣＡ１関連タンパク質１（ＢＡＰ１）、およびＡＳＨ１様タンパク質（ＡＳＨ１Ｌ）の、ｓｈＲＮＡノックダウンの効果を示す。各々の遺伝子を、２つの異なるレンチウイルスにより発現されるｓｈＲＮＡによりノックダウンした。
【０１５７】
図４は、上記のスクリーニングから、以下の基準に適合する５つの候補遺伝子（ＳＭＡＲＣＡ５、ＢＲＤ２、ＫＤＭ４Ｃ、ＡＳＨ１Ｌ、およびＢＡＺ１Ａ）が同定されたことを示す：１）候補遺伝子が別々の経路において機能し、各々の遺伝子のノックダウンが、個別にＤＵＸ４発現を減少させる；２）これらの候補遺伝子各々を標的とする複数のｓｈＲＮＡが、類似のＤＵＸ４発現のノックダウンを生じる（例えば、起こり得るオフターゲット効果を最小化するために）；３）これらの候補遺伝子のターゲティングは、細胞の形態学または筋肉特異的遺伝子の発現に有害な影響を及ぼさなかった；ならびに、４）候補遺伝子によりコードされるタンパク質が、小分子ドラッガブル（druggable）ドメインを含む。
【０１５８】
したがって、いくつかの態様において、小分子を用いる、これらの候補遺伝子（または上記のスクリーニング方法により同定される別の候補遺伝子）のうちの任意の１つまたは組み合わせの阻害またはノックダウンは、ＤＵＸ４の転写を阻害するかまたは低下させ、Ｄ４Ｚ４反復配列アレイにおいて、抑制性のクロマチン環境を誘導することができる。
【０１５９】
発明者の知識の及ぶ限りにおいて、このスクリーニングにおいて同定される遺伝子は、先には認識されていないＤＵＸ４発現の制御因子であり、ＦＳＨＤのための治療標的である。加えて、この例において記載されるスクリーニングは、他のスクリーニングにおいては存在しない可能性が高いいくつかの重要な実験的側面を組み入れる：１）ＦＳＨＤ患者からの初代筋細胞の使用；２）最終分化した筋細胞（患者の筋肉におけるもののような）においてスクリーニングを行うこと；３）レポーターまたは下流の標的ではなく、病原性のＤＵＸ４アイソフォーム（ＤＵＸ４−ｆｌ）のｍＲＮＡのレベルを直接的にアッセイすること；４）筋原性遺伝子に影響を及ぼす候補を排除すること；ならびに、５）Ｄ４Ｚ４反復配列アレイクロマチンを非病原性状態に戻すこと（これは、いくつかの態様において、同定された候補遺伝子を標的とする治療をより安定かつ長期的なものにする）。
【０１６０】
例２
この例は、遺伝子編集複合体を用いたＤＵＸ４クロマチンモディファイアーの阻害によるＤＵＸ４発現の修飾を記載する。簡単に述べると、ＤＵＸ４発現のクロマチンモディファイアー（例えば、ＫＤＭ４Ｃ、ＡＳＨ１Ｌ、ＳＭＡＲＣＡ５、ＢＡＺ１Ａ、ＢＲＤ２）を標的とするシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いて、ＫＲＡＢ抑制因子に融合したｄＣａｓ９を含む遺伝子編集分子を用いたＤＵＸ４の転写の修飾を指揮した。図５は、この例において記載されるＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓ９／ＫＲＡＢ転写修飾系の図説である。
【０１６１】
ＦＳＨＤ患者に由来する筋原性細胞である１７ＡＢｉｃ細胞において、ノックダウンを行った。各々の候補遺伝子について、６〜８種のｓｇＲＮＡを試験した。表４は、ＤＵＸ４のクロマチンモディファイアーを標的とするガイドＲＮＡの例を記載する。
表４：ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
【表４】
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*ｓｇＲＮＡは、各々遺伝子のプロモーターまたはエクソン１を標的とする。
**ｓｇＲＮＡは、ＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９の両方により認識される二重ＰＡＭに隣接する配列を標的とする。
***スコアおよび特異性は、sgRNA Designer scores（CRISPR Design Tool；http://crispr.mit.edu）である。
【０１６２】
各々の候補遺伝子、ＤＵＸ４−ｆｌ（Ｄ４−ｆｌ）、ＦＲＧ１、ＭｙｏＧ、ＭｙＨＣ、１８ＳおよびＭｙｏＤについての相対的発現レベルを定量した。一般に、遺伝子特異的ノックダウンのレベルは、当該分野において報告されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介型ノックダウン（例えば。Radzisheuskaya et al. (2016) Nucleic Acids Research 1；doi: 10.1093/nar/gkw583により記載されるもの）と一致した。
【０１６３】
図６は、１７ＡＢｉｃ細胞におけるＫＤＭ４ＣのレンチウイルスベースのｄＣａｓ９−ＫＲＡＢノックダウンについての代表的なデータを示す。２つの異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いた実験からのデータを示す。各々のガイド鎖は、ＤＵＸ４−ｆｌ（Ｄ４−ｆｌ）の減少を媒介した。ＫＤＭ４Ｃの発現レベルは、ノックダウンの後で約８０％であり、このことは、ＤＵＸ４の発現が、ＫＤＭ４Ｃの発現レベルの変化に対して非常に感受性であることを示している。
図７は、１７ＡＢｉｃ細胞におけるＡＳＨ１ＬのレンチウイルスベースのｄＣａｓ９−ＫＲＡＢノックダウンについての代表的なデータを示す。シングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いた実験からのデータを示す。ＡＳＨ１Ｌのノックダウン（約２０％）は、ＤＵＸ４−ｆｌの発現の減少をもたらした。ＭｙｏＧおよびＭｙｏＤの発現レベルは、顕著には変化しなかった。
【０１６４】
図８は、１７ＡＢｉｃ細胞におけるＳＭＡＲＣＡ５のレンチウイルスベースのｄＣａｓ９−ＫＲＡＢノックダウンについての代表的なデータを示す。２つの異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いた実験からのデータを示す。各々のガイド鎖は、ＤＵＸ４−ｆｌ（Ｄ４−ｆｌ）の減少を媒介した。ＳＭＡＲＣＡ５の発現レベルは、ノックダウンの後で約７５％であり、このことは、ＤＵＸ４の発現が、ＳＭＡＲＣＡ５の発現レベルの変化に対して非常に感受性であることを示している。ＭｙｏＧおよびＭｙｏＤの発現レベルは、顕著には変化しなかった。
図９は、１７ＡＢｉｃ細胞におけるＢＡＺ１ＡのレンチウイルスベースのｄＣａｓ９−ＫＲＡＢノックダウンについての代表的なデータを示す。２つの異なるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いた実験からのデータを示す。各々のガイド鎖は、ＤＵＸ４−ｆｌ（Ｄ４−ｆｌ）の減少を媒介し、これは、ＢＡＺ１Ａの発現レベルの低下と相関する。ＢＡＺ１Ａのノックダウンは、試験された任意の遺伝子のうちで、ＤＵＸ４の発現レベルの最大の減少をもたらした。
【０１６５】
図１０は、１７ＡＢｉｃ細胞におけるＢＲＤ２のレンチウイルスベースのｄＣａｓ９−ＫＲＡＢノックダウンについての代表的なデータを示す。シングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いた実験からのデータを示す。ＤＵＸ４の発現レベルの減少を観察した。
まとめると、遺伝子編集複合体を用いたＫＤＭ４Ｃ、ＡＳＨ１Ｌ、ＳＭＡＲＣＡ５、ＢＡＺ１Ａ、ＢＲＤ２のノックダウンは、ＤＵＸ４のクロマチンモディファイアーを阻害することによりＤＵＸ４発現レベルを低下させることに関して、例１において記載されるＲＮＡｉの結果を確認する。
【０１６６】
例３
プラスミドおよび抗体。
pHAGE EF1-dCas9-KRAB（Addgene plasmid＃50919）およびpLKO.1-puro U6 sgRNA BfuAI stufferレンチウイルスプラスミドを入手した。この例において使用されるＣｈＩＰ−グレードの抗体、α−Ｈ３Ｋ９ｍｅ３（ab8898）およびα−ヒストンＨ３（ab1791）は、市販のソースから購入した。
【０１６７】
ｓｇＲＮＡの設計およびプラスミド構築。
公共で利用可能なｓｇＲＮＡ設計ツールを用いて、ヒトＢＡＺ１Ａ、ＢＲＤ２、ＫＤＭ４ＣおよびＳＭＡＲＣＡ５（表４）のプロモーター／エクソン１領域を標的とする候補一本鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を同定した。本研究の範囲を超えて実験の適応性を構築するために、ＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９の両方により認識可能な二重のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する配列を標的とするｓｇＲＮＡに優先順位を付けた。予測されるオフターゲットマッチを、CRISPR Design Tool（http://crispr.mit.edu）を用いて決定した。各々の標的遺伝子について６〜８種のｓｇＲＮＡを、個々に、pLKO.1-puro U6 sgRNA BfuAI stufferプラスミド中のＢｆｕＡＩ部位中にクローニングして、配列を検証した。
【０１６８】
細胞培養、一過性遺伝子導入、およびレンチウイルス感染。
無関係なＦＳＨＤ１患者（０５Ａｂｉｃ、１７Ａｂｉｃおよび１８Ａｂｉｃ）の二頭筋に由来する筋原性培養を、２０％ＦＢＳ（Hyclone）、０．５％ニワトリ胚抽出物、１％抗生物質＆抗真菌薬、および１．２ｍＭのＣａＣｌ２を添加したハムＦ−１０培地中で増殖させた。２９３Ｔパッケージング細胞を、
ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋０．１％ペニシリン−ストレプトアビジン中で増殖させた。ｓｈＲＮＡノックダウン実験のために、２９３Ｔ細胞に、レンチウイルスパッケージングプラスミド（pCMV-dR8.91）、エンベローププラスミド（VSV-G）、およびSIGMA MISSION ｓｈＲＮＡ発現プラスミドで遺伝子導入した。レンチウイルス上清を収集し、定量分割し、−８０℃で冷凍した。ＦＳＨＤ１骨格筋芽細胞を、コラーゲンコートされた６ウェルプレート（遺伝子発現分析のために）または１０−ｃｍプレート（ＣｈＩＰのために）中に播種し、コンフルーエンシーまで増殖させ、次いで、増殖培地中で約４８時間にわたり自己分化させた。細胞を、２ラウンドの感染に供した。簡単に述べると、レンチウイルス上清＋８μｇ／ｍｌのポリブレンを培養に添加して、プレートを１５分間にわたり３７℃でインキュベートし、次いで、パラフィルムでラップして、その後３０分間にわたり１１００ｇで遠心分離した（３２℃）。遠心分離の後で、ウイルス上清を、増殖培地で置き換えた。細胞を、増殖培地中で維持し、最後のラウンドの感染の４日後に収集した。ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ感染について、２９３Ｔ細胞に、TransIT-LT1遺伝子導入試薬を用いて、レンチウイルスパッケージングプラスミド（pCMV-dR8.91）、エンベローププラスミド（VSV-G）、およびｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ発現プラスミド（＃50919）またはｓｇＲＮＡ発現プラスミドのいずれかで遺伝子導入した。レンチウイルス上清を遺伝子導入後７２〜１０８時間、１１時間の間隔で収集した。ＦＳＨＤ１骨格筋芽細胞を、コラーゲンコートされた６ウェルプレート中に播種し、約８０％のコンフルーエンシーまで増殖させ、次いで、２日間にわたり４回の連続感染に供した。細胞を、増殖培地中で約８時間にわたり回復させ、その後、次のラウンドの感染を行った。最後の感染の後に、これらの自己分化した培養を、増殖培地中で７２時間にわたり維持し、その後、収集した。
【０１６９】
定量逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。
TRIzol（Invitrogen）を用いて全ＲＮＡを抽出し、カラム上でのDNase I消化の後で、RNeasy Miniキット（Qiagen）を用いて精製した。Superscript III逆転写酵素（Invitrogen）を用いるｃＤＮＡ合成のために全ＲＮＡ（２μｇ）を用い、ｑＰＣＲ分析のために２００ｎｇのｃＤＮＡを用いた。オリゴヌクレオチドプライマー配列を、表５において提供する。
表５
【表５】
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*この位置におけるＧは、染色体１０（Ｔ）と比較して、染色体４（Ｇ）に特異的である。
【０１７０】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）。
レンチウイルスに感染した１７Ａｂｉｃ分化筋細胞により、Fast ChIP法（Nelson）をいくつかの改変により用いて、ＣｈＩＰアッセイを行った。細胞を、ＤＭＥＭ中の１％ホルムアルデヒド中で１０分間にわたり固定し、１０回ダウンス（dounce）し、その後超音波処理した。細胞を、Branson Sonifier 450（VWR Scientific）において６５％の出力で、１２ラウンドにわたり１５秒間のパルスで超音波処理し、ＤＮＡを約２００〜８００ｂｐのラダーに剪断し、アガロースゲル電気泳動により、剪断の効率を検証した。クロマチンを、２μｇの特異的抗体を用いて免疫沈降させた。９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間を４０サイクルにわたり、ＳＹＢＲグリーン定量ＰＣＲアッセイを行った。ＰＣＲ生成物を、１．５％アガロースゲル上で分析し、生成物の正確なサイズおよびプライマーアニーリングの特異性を検証した。オリゴヌクレオチドプライマー配列を、表５において提供する。
【０１７１】
ＦＳＨＤ筋細胞において複数のエピジェネティックな経路がＤＵＸ４−ｆｌの発現を制御する。
ＤＵＸ４をコードするＤ４Ｚ４マクロサテライトアレイは、成体の体細胞においては、通常、強力なエピジェネティック抑制下にある。一般に、ＦＳＨＤ患者は、この抑制の喪失を示し、４ｑのＤ４Ｚ４アレイにおけるＤＮＡの低メチル化、ならびに４ｑおよび１０ｑの両方におけるＤ４Ｚ４アレイにおけるクロマチンの弛緩（抑制性Ｈ３Ｋ９ｍｅ３マーク、ＨＰ１γおよびコヒーシンのエンリッチメントの低下）を示す。３６個のＤＵＸ４−ｆｌの候補アクチベーターを、潜在的な薬物標的として調べた（表３）。これらの候補は、転写制御因子、クロマチンリモデラ―（remodeler）、およびヒストン修飾酵素を含む。最初のスクリーニングのために、ＦＳＨＤ１患者（０５Ａｂｉｃ）からの、最終分化した場合に一貫して相対的に高いレベルのＤＵＸ４−ｆｌを発現する骨格筋細胞を用いた。レンチウイルスによりコードされるｓｈＲＮＡを用いて、各々の候補を、最終分化した培養中でノックダウンし、次いで、４日後に細胞を収集し、ＤＵＸ４−ｆｌおよび他の遺伝子の発現について評価した。
【０１７２】
データは、これらの候補のうちの多くが、ＤＵＸ４−ｆｌの発現を制御することにおいて役割を果たすと考えられることを示す。例えば、ポリコーム媒介型遺伝子サイレンシングを相殺するショウジョウバエのトライソラクス群タンパク質の哺乳動物の相同体であるＡＳＨ１Ｌは、ＦＳＨＤにおいてＤＵＸ４発現を活性化することができるヒストンメチルトランスフェラーゼである。いくつかの態様において、ＡＳＨ１Ｌは、DBE-T lncRNAによりＤ４Ｚ４アレイの近傍に動員され、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ２のエンリッチメントおよびＦＳＨＤ遺伝子座の抑制解除をもたらす。３種の異なるｓｈＲＮＡによるＡＳＨ１Ｌのノックダウンが、ＤＵＸ４−ｆｌ発現を約７０〜８０％低下させることが観察された（図１１Ａ）。同様に、エピジェネティックリーダーＢＲＤ２（図１１Ｃ）、リジン特異的ヒストンデメチラーゼＫＤＭ４Ｃ（図１１Ｄ）、およびクロマチンリモデリング因子であるＢＡＺ１ＡおよびＳＭＡＲＣＡ５のノックダウンは、ＤＵＸ４−ｆｌのレベルを実質的に低下させた（図１１Ｂおよび１１Ｅ）。重要なことに、これらのノックダウンは、重要な筋転写因子であるＭｙｏＤおよびミオゲニン、または筋肉の構造タンパク質であるミオシン重鎖１の発現に対して、最少の効果を有した（図１１Ａ〜１１Ｅ）。Ｄ４Ｚ４アレイの近傍に存在するＦＳＨＤ候補遺伝子であるＦＲＧ１の発現はまた、相対的に不変であった（図１１Ａ〜１１Ｅ）。ユートロフィンの発現の低下もまた、ＦＳＨＤ筋細胞におけるＢＲＤ２のノックダウンの後で観察された（図１１Ｃ）。
【０１７３】
これらのデータは、ＦＳＨＤにおいてＤＵＸ４−ｆｌの発現を制御する特定のエピジェネティック経路が、分化した筋細胞に対して主要な有害効果を伴うことなく修飾され得ることを示す。ＦＳＨＤ患者コホートにわたって候補を確認するために、２つの他の無関係なＦＳＨＤ１患者（１８Ａｂｉｃおよび１７Ａｂｉｃ）あらの筋細胞において、ＡＳＨ１Ｌ、ＢＲＤ２、ＫＤＭ４ＣおよびＳＭＡＲＣＡ５のｓｈＲＮＡノックダウンを試験し、類似の結果を得た。ｓｈＲＮＡがＤＵＸ４−ｆｌの発現を低下させることができなかった場合にについての原因である可能性が高いウイルスのプレップにおける差異にもかかわらず、各々の標的についての少なくとも１つのｓｈＲＮＡは、３つ全ての患者コホートにおいて、筋細胞におけるＤＵＸ４−ｆｌのレベルを実質的に低下させた（図１１Ｆ）。
【０１７４】
ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢによる候補制御因子の転写の抑制は、ＦＳＨＤ筋細胞におけるＤＵＸ４−ｆｌ発現を低下させる。
少なくとも２種のｓｈＲＮＡによる８種の候補のノックダウン（例えば、１候補あたり２種のｓｈＲＮＡ）は、＞７０％のＤＵＸ４−ｆｌの発現の低下をもたらし、他の試験された遺伝子に対しては効果は最小限であった。候補のうちの５つ、ＡＳＨ１Ｌ、ＢＡＺ１Ａ、ＢＲＤ２、ＫＤＭ４Ｃ、およびＳＭＡＲＣＡ５を、第２の遺伝子サイレンシングモダリティーによる調査のために選択した。適切なｓｇＲＮＡによりガイドされ、転写エフェクター（ＫＲＡＢ、ＬＳＤ１、ＶＰ６４、ｐ３００）に融合した酵素的に不活性なｄＣａｓ９は、哺乳動物細胞における内在標的遺伝子発現を修飾することができる。活性な遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の近傍の領域に動員された場合（例えば、−５０〜＋２５０塩基対）、ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢは、有効な転写抑制因子となり得る。したがって、各々の候補について、プロモーターまたはエクソン１を標的とする６〜８種のｓｇＲＮＡを設計した。ｓｇＲＮＡおよびｄＣａｓ９−ＫＲＡＢを、４回の連続した遠心分離による共感染を用いて、１７Ａｂｉｃ筋細胞中に形質導入した。７２時間後に細胞を収集し、遺伝子発現の変化についてアッセイした。
【０１７５】
ＡＳＨ１Ｌを標的とする試験されたｓｇＲＮＡのうちのいずれも、この候補遺伝子の発現に対して一貫して影響を及ぼさなかった。ＢＲＤ２を標的とする１つの機能的ｓｇＲＮＡ（図１２Ｂ）、ならびにＢＡＺ１Ａ（図１２Ａ）、ＫＤＭ４Ｃ（図１２Ｃ）、およびＳＭＡＲＣＡ５（図１２Ｄ）についての２つの独立した機能的ｓｇＲＮＡを同定した。しかし、ｓｈＲＮＡノックダウンを用いた場合と同様に、標的遺伝子発現のわずかな低下ですら、ＤＵＸ４−ｆｌのレベルを実質的に（約３０〜６０％）低下させるために十分であることが証明された（図１２Ａ〜１２Ｄ）。対照的に、他の遺伝子（ＦＲＧ１、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ミオシン重鎖１、および１８Ｓ）の発現レベルは、候補制御因子の低下によって著しくは影響を受けなかった（図１２Ａ〜１２Ｄ）。ＤＵＸ４−ｆｌは、両方の抑制の方法（ｓｈＲＮＡノックダウンおよびＣＲＩＳＰＲ阻害）により実質的に低下することが試験された唯一の遺伝子であった。
【０１７６】
候補制御因子のノックダウンは、Ｄ４Ｚ４マクロサテライトにおいてクロマチン抑制を増大する。
病原性遺伝子座におけるクロマチンの変化を調べた。ＤＵＸ４は、４ｑおよび１０ｑの両方のアレルにおいて、全てのＤ４Ｚ４反復単位において存在するが、これらのアレルのうちの３つにおけるクロマチンは、既に圧縮されたヘテロクロマチン状態にある。したがって、短縮したアレルにおける抑制を評価する試みは、他の３つのアレルの存在により弱められ得る。分析から１０ｑアレルを取り除くために、ＤＵＸ４のエクソン２中の染色体４に特異的な配列多型・対・染色体１０に特異的な配列多型を、プライマーを設計する場合に、計算に入れた。
【０１７７】
１７Ａｂｉｃ ＦＳＨＤ筋細胞において、ＡＳＨ１Ｌ（図１３Ａ）、ＢＲＤ２（図１３Ｂ）、ＫＤＭ４Ｃ（図１３Ｃ）、またはＳＭＡＲＣＡ５（図１３Ｄ）のいずれかのｓｈＲＮＡノックダウンの後で、いくつかのヒストン修飾について、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を行った。試験した全てのＦＳＨＤコホートにわたる各々の標的遺伝子の強力な一貫したノックダウンを提供するｓｈＲＮＡを、評価した。プロモーターＨ３Ｋ４ｍｅ３マーク、活性なＨ３Ｋ２７ａｃマーク、および抑制性Ｈ３Ｋ９ｍｅ３マークの相対的占有率を、染色体４のＤＵＸ４エクソン１／イントロン１、Ｄ４Ｚ４アレイ、ヘテロクロマチンの４ｐマクロサテライトアレイ、および活性なミオゲニンプロモーターに近い領域において調べた。各々のエピジェネティック標的のノックダウンは、Ｄ４Ｚ４遺伝子座におけるＨ３Ｋ４ｍｅ３またはＨ３Ｋ２７ａｃのレベルに対して検出可能な効果を有さなかったが、抑制性Ｈ３Ｋ９ｍｅ３マークのレベルは増大した（図１３Ａ〜１３Ｄ）。エンリッチメントのレベルは、約４０％〜２倍であり、ヘテロクロマチンの４ｑ反復配列のバックグラウンドの中でも、遠位の抑制解除された病原性反復配列における抑制の増大を示す。このことに関して、患者１７Ａは、短縮した４Ａ１６１アレルにおいて約５個の反復単位、および短縮していない４Ａ〜Ｌ１６１アレルにおいて約２６個の反復単位を有する。
【０１７８】
ＢＲＤ２、ＫＤＭ４Ｃ、またはＳＭＡＲＣＡ５がノックダウンされた細胞において、増強された抑制は、概ね、Ｄ４Ｚ４マクロサテライトに対して特異的であると考えられる。なぜならば、他の試験した領域におけるＨ３Ｋ９ｍｅ３レベルは、対照ｓｈＲＮＡを用いて観察されたものよりも高くはならなかったからである（図１３Ａ〜１３Ｄ）。このことは、これらのＤＵＸ４制御因子のノックダウンが、ミオゲニンを含む他の遺伝子に対して、非常にわずかな効果しか有しないことを示す。
【０１７９】
４特異的Ｄ４Ｚ４（例えば、Ｒプライマーの３’末端における染色体４に特異的な多型・対・染色体１０に特異的な多型）、Ｄ４Ｚ４の５’隣接配列（flank）（アレイの上流）、ミオゲニンプロモーター（活性な筋特異的遺伝子プロモーター）、および４ｐアレイ（ｃｈ４上の別のヘテロクロマチンアレイ）におけるＨ３Ｋ３６ｍｅ３の相対的占有率もまた、ＢＲＤ２（図１４Ａ）、ＡＳＨ１Ｌ（図１４Ｂ）、ＳＭＡＲＣＡ５（図１４Ｃ）、およびＫＤＭ４Ｃ（図１４Ｄ）のノックダウンの後で評価した。データは、ＢＲＤ２およびＫＤＭＣ４ノックダウン細胞における４特異的Ｄ４Ｚ４における著しいエンリッチメントを示す（図１４Ａおよび１４Ｄ）。ミオゲニンプロモーターにおけるエンリッチメントは、空ベクター対照と比較して有意ではなく、ヘテロクロマチン４ｐアレイにおいては、エンリッチメントはほとんど〜全く存在しなかった。
【０１８０】
まとめると、この例において記載されるデータは、複数のクロマチン制御因子の独立したノックダウンが、Ｄ４Ｚ４におけるクロマチン抑制、およびＦＳＨＤ筋細胞におけるＤＵＸ４−ｆｌ発現の実質的な減少をもたらすこと、ならびに、特定のエピジェネティック経路の適度な阻害により、ＤＵＸ４−ｆｌのレベルを実質的に低下させることができることを示し、このことは、ＦＳＨＤのための新規の薬物標的としてのそれらの潜在能力を実証している。
【０１８１】
例４
この例は、エピジェネティックな因子を標的とする小分子が、ＤＵＸ４の発現を修飾することができることを示す。トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）は、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤であり、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５’ＡＤＣ）は、ＤＮＡメチル化阻害剤であり、カエトシン（chaetocin：ＣＨ）は、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤である。ＦＳＨＤ１を罹患する患者（例えば、コホート２８Ａ、２９Ａ、３０Ａ、および１５Ａ）ならびにＦＳＨＤ無症候の患者（例えば、コホート２８Ｂ、２９Ｂ、３０Ｂ、および１５Ｂ）から単離した初代筋芽細胞の、Ｄ４Ｚ４反復配列のエピジェネティック状態に影響を及ぼす小分子のみ、または組み合わせにおける処置は、ＤＵＸ４の発現に影響を及ぼす（図１５）。
【０１８２】
筋分化を改変することによりＤＵＸ４の発現に影響を及ぼす小分子は、間接的に作用しており、ＦＳＨＤのための実行可能な候補ではない。
ＪＱ１は、初代ＦＳＨＤ筋細胞（０９Ａｂｉｃ）においてＤＵＸ４の発現および下流の遺伝子ＴＲＩＭ４３およびＺＳＣＡＮ４を阻害すると考えられる小分子エピジェネティック薬である。しかし、処置の時間経過は、ＤＵＸ４のＪＱ１制御は間接的であり、いくつかの重要な筋原性制御遺伝子であるミオゲニン（Ｍｙｏｇ）、ｍｙｏＤ、ミオシン重鎖（ＭｙＨＣ）、およびミオスタチン（Ｍｙｏｓｔ）の発現を阻害することにより達成されることを示す（図１６）。ＤＵＸ４の発現は、筋分化の間に誘導され、このプロセスを遮断することまたは遅延させることは、ＪＱ１を用いる場合、ＤＵＸ４の発現を見かけ上阻害するが、このとき、実際には、それはあくまで筋原性分化の動力学を改変させているのである。重要なことに、これらの遺伝子は、ＦＳＨＤおよび健康なヒト骨格筋筋芽細胞（ＨＳＭＭ）の両方において、ＪＱ１により誤制御される（図１７）。したがって、ＪＱ１は、非特異的小分子の例であり、ＦＳＨＤ治療薬としての使用のためには適切ではない。
【０１８３】
例５
この例は、ＤＵＸ−４、ＳＭＡＲＣＡ５、およびＫＤＭ４ＣのノックダウンによるＺＳＣＡＮ４の発現の修飾を記載する。ＺＳＣＡＮ４は、テロメア維持および胚性幹細胞の多能性の制御において役割を果たす。簡単に述べると、ＦＳＨＤの骨格筋の筋管を、ＤＵＸ−４、ＳＭＡＲＣＡ５、またはＫＤＭ４Ｃを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置し、示された遺伝子の相対的発現を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて決定した。
以下の材料を、例５において用いた。含まれた細胞：FTCE-00016-01（不死化ＦＳＤＨ筋芽細胞株、６．３反復配列）、同質遺伝子系統Ａ４対照、健康な正常な、およびC12 FSHDの筋芽細胞。
【０１８４】
含まれた培地構成成分および組織培養材料：骨格筋増殖培地（PromoCell、C-23160）に１５％ＦＢＳ（Hyclone、SH30071）およびPen／Strep（Gibco、15140148）を添加したもの。骨格筋細胞分化培地（PromoCell、C-23061）に、２０％のKnockOut血清置換物（Gibco、10828010）およびPen／Strepを添加したもの（分化培地）。EmbryoMax 0.1%ゼラチン溶液（EMDmillipore ES-006-B）。ＰＢＳ（Gibco、10010023）組織培養物処理された９６ウェルマイクロプレート（Corning、CLS3595）、ＴＣ処理されたマルチウェル細胞培養プレート（Falcon、353046）。
【０１８５】
リアルタイムＰＣＲ試薬は、以下を含んだ：溶解バッファー−Roche Realtime Ready溶解バッファー１９．５ｕＬ（２０ｕＬのために）（Roche、07248431001）、DNAse I（Ambion, AM2222）０．２５ｕＬ、Protector RNase阻害剤（Roche、3335402001）０．２５ｕＬ、RNeasy Microキット（Qiagen、74004）、Taqman Preamp Master Mix（ThermoFisher Scientific、4391128）、Taqman Multiplex Master Mix（ThermoFisher Scientific、4484262）、ZSCAN4 Taqmanアッセイ（ThermoFisher Scientific、Hs00537549_m1、FAM-MGB）、MYOG Taqmanアッセイ（ThermoFisher Scientific、Hs01072232_m1、JUN-QSY）、RPLP0 Taqmanアッセイ（ThermoFisher Scientific、Hs99999902_m1）、LEUTX Taqmanアッセイ（ThermoFisher Scientific、Hs00418470_m1）。
アンチセンスオリゴヌクレオチド配列を、表５において示す。
表６
【表６】
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【０１８６】
図１１は、ＦＳＨＤの骨格筋の筋管におけるＺＳＣＡＮ４の発現が、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたＤＵＸ−４のノックダウンにより低下したことを示す。ＤＭＳＯ処置されたＦＳＨＤの骨格筋の筋管、および野生型の筋管を、対照として用いた。
図１２は、ＦＳＨＤの骨格筋の筋管におけるＺＳＣＡＮ４の発現が、ＳＭＡＲＣＡ５およびＫＤＭ４Ｃのノックダウンにより低下したことを示す。ターゲティングされていないアンチセンスオリゴヌクレオチドを、対照として用いた。
まとめると、これらの結果は、ＤＵＸ−４、ＳＭＡＲＣＡ５、またはＫＤＭ４Ｃの阻害またはノックダウンが、ＺＳＣＡＮ４の発現を低下させることができることを示した。
【０１８７】
配列
ＳａＣａｓ９タンパク質（配列番号２０）
【数９】
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【０１８８】
Ｓａ−ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ（配列番号２１）
【数１０】
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【０１８９】
Ｓｐ−ｄＣａｓ９−ＫＲＡＢ（配列番号２２）
【数１１】
2019534298.tif 000023
【０１９０】
Ｓａ−ｄＣａｓ９（配列番号２３）
【数１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｂ】
2019534298.tif 000028
【図４Ｃ−Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
2019534298.tif 000037
【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１１Ｅ−Ｆ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１２Ｃ−Ｄ】
2019534298.tif 000041
【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１３Ｃ−Ｄ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１４Ｃ−Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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