(57)【要約】  腸管外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する組成物および方法が記載される。特に、多くの環境ストレスに耐えることができる緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のエキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原多糖を含有する多価ワクチンが記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；
ｂ．３％（ｗ／ｖ）〜８％（ｗ／ｖ）のソルビトール；
ｃ．５〜１５ｍＭのメチオニン；
ｄ．５〜２０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）；ならびに
ｅ．０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤
を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
前記ソルビトールの濃度は５％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記メチオニンの濃度は１０ｍＭである、請求項１または２に記載の免疫原性組成物である。
【請求項４】
前記リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液の濃度は１０ｍＭであり、かつ前記リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液のｐＨは７．０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、好ましくは、前記界面活性剤はＦ−６８、ＰＳ２０およびＰＳ８０からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記界面活性剤はＰＳ８０であり、好ましくは、前記ＰＳ８０の濃度は０．０２％（ｗ／ｖ）である、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
ａ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；
ｂ．５％（ｗ／ｖ）のソルビトール；
ｃ．１０ｍＭのメチオニン；
ｄ．１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）；
ｅ．０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０；ならびに
ｆ．水
からなる免疫原性組成物。
【請求項８】
ａ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；
ｂ．３％（ｗ／ｖ）〜１２％（ｗ／ｖ）のスクロース；
ｃ．０．１〜１．５ｍＭのＥＤＴＡ；
ｄ．５〜２０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）；ならびに
ｅ．０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤
を含む免疫原性組成物。
【請求項９】
前記スクロースの濃度は８％（ｗ／ｖ）である、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記ＥＤＴＡの濃度は１ｍＭである、請求項８または９の記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液の濃度は１０ｍＭであり、かつ前記リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液のｐＨは７．０である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、好ましくは、前記界面活性剤はＦ−６８、ＰＳ２０およびＰＳ８０からなる群から選択される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記界面活性剤はＰＳ８０であり、好ましくは、前記ＰＳ８０の濃度は０．０２％（ｗ／ｖ）である、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
ａ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；
ｂ．８％（ｗ／ｖ）のスクロース；
ｃ．１ｍＭのＥＤＴＡ；
ｄ．１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）；
ｅ．０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０；ならびに
ｆ．水
からなる免疫原性組成物。
【請求項１５】
２〜８℃の温度で保存した場合に、少なくとも６ヶ月間、好ましくは少なくとも１２ヶ月間、より好ましくは少なくとも１８ヶ月間安定である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記各Ｏ抗原多糖の濃度は約１〜２００μｇ／ｍＬ、例えば約２〜１００μｇ／ｍＬ、例えば約８〜４８μｇ／ｍＬであり、好ましくは、前記多糖：担体タンパク質比は、各Ｏ抗原多糖について、約１：１０〜約１：２、好ましくは約１：５〜約１：２である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
ＥＰＡ担体タンパク質に共有結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原を含む液体免疫原性組成物を安定に保持する方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物を、２〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間保存することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管外病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）に対する免疫応答を誘導する組成物に関する。特に、本発明の実施形態は、多くの環境ストレスに耐えることができる、担体タンパク質に共有結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）多糖抗原の複合体を含有する多価ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）は、ヒトにおいて最も一般的なグラム陰性病原体であり、胃腸管外で様々な感染を引き起こし得、これは、多様で重篤な疾患に繋がり、かなりの罹患率および死亡率をもたらし得る。ＥｘＰＥＣ株における多剤耐性の増加は治療の障害になり、ＥｘＰＥＣ感染に関連する、入院および死亡の数の増加、ならびに医療費の増加に繋がる。
【０００３】
したがって、ＥｘＰＥＣに対するワクチンが緊急に必要とされている。表面リポ多糖の成分であるＯ−抗原は有望なワクチン標的として確認されており、現在開発中の複合糖質ワクチンにおける抗原として使用されている（例えば、Ｐｏｏｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｗａｃｋｅｒ，２０１６，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．２１３：６−１３を参照）。
【０００４】
現在開発中のＥｘＰＥＣに対する複合糖質ワクチンは、それぞれ緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のエキソプロテインＡ（ＥＰＡ）などの担体タンパク質に結合した、ＥｘＰＥＣの異なる血清型のＯ−グリカンを含む（例えば、国際公開第２０１５／１２４７６９号パンフレットおよび国際公開第２０１７／０３５１８１号パンフレットを参照）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型のＯ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２およびＯ６ＡのＯ−グリカンを含むこのようなワクチンは、例えば、進行中の第２相試験の段階にある（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ．識別名：ＮＣＴ０２５４６９６０）。
【０００５】
本発明者らは、既存のＥｘＰＥＣワクチン製剤（２５ｍＭトリス  ｐＨ７．４、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ）は２〜８℃での短期保存および使用中の安定性では許容できるが、凍結／融解および撹拌ストレスには強くないことを見出した。偶発的な凍結、偶発的な加熱、および撹拌（例えば、保存または輸送中）は、ＥｘＰＥＣ製剤の製品の完全性に有害な影響を及ぼす。ＥｘＰＥＣに対する複合糖質ワクチンなどの、大集団での使用が意図される医薬品では、低温でバルクで凍結でき、融解後、使用前は約２〜８℃で保存できる製剤を有することが有益である（すなわち、原薬は大規模かつ長期保存のために凍結されるが、使用状況にある薬物製品は約２〜８℃で保存されるため、少なくとも１回の凍結−融解サイクルが不可避である）。さらに、製剤は、製品（例えば、複合糖質）が異なる体裁（例えば、袋、瓶、バイアル、プレフィルドシリンジ、および／または適用可能なデバイス）で保存され得るように、異なる材料と混合可能であることもまた好ましい。
【０００６】
多くの環境ストレス（例えば、凍結／融解、撹拌、高温、光暴露、金属酸化体暴露など）に耐えることができ、組成物のより長期の安定性およびより長い貯蔵寿命をもたらし、好ましくは多くの加工（例えば、容器）材料に適合する、ＥｘＰＥＣに対するワクチンの製剤が、当該技術分野で必要とされている。環境ストレスに起因する分解経路はいずれも、生物活性を低下させ、また潜在的に製剤成分の副生物または誘導体を形成し得、したがって、ＥｘＰＥＣワクチンの毒性の増加および／または免疫原性の変化をもたらし得る。したがって、様々な条件での安定性を保証する複合糖質ワクチンのための強固な製剤を見出す、個々の状況に合った方法が求められる。複合糖質ワクチンを化学的、物理的、および生物学的に安定に保つために、緩衝液の種類、ｐＨ、および特定の賦形剤を選択し、特に組み合わせ、その後、慎重に最適化する必要がある。変動し得る因子の全てを考慮すると、ＥｘＰＥＣに対する複合糖質ワクチンの最適な製剤化条件を見出すことには課題が多く、良好な製剤の組成は直観的に予測不可能である。
【０００７】
したがって、当該技術分野において、ワクチン組成物が多くの環境ストレスに耐えることができ、より良好な安定性およびより長い貯蔵寿命を有することを確実にする、ＥｘＰＥＣに対する複合糖質ワクチンの製剤が要望されている。本発明の目的は、このような製剤を提供することである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
凍結／融解、撹拌ストレス、熱ストレス、および金属誘発酸化ストレスに対する安定化効果が改善されたワクチン組成物を提供する、ＥｘＰＥＣに対する複合糖質ワクチンのための２つの新しい製剤が提供され、これらの製剤はさらに種々の加工（例えば、容器）材料にも適合する。これらの改善された製剤は、薬物製品および原薬の両方で、保存または輸送中に利用することができる。そうした保存または輸送中は、（偶発的な）凍結または激しい撹拌が起こり得、これは、製品の完全性、したがって有効性に有害な影響を及ぼし得る。さらに、これらの新規な製剤は、熱ストレスに対する安定性が改善された複合糖質ＥｘＰＥＣワクチンを提供し、したがって、広範囲の温度および条件下での薬物製品および原薬の保存、取扱いおよび輸送に関して広範な商業的用途を有することができる。
【０００９】
本明細書においては、少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（ここで、この少なくとも１つのＯ抗原多糖は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソプロテインＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；３％（ｗ／ｖ）〜８％（ｗ／ｖ）のソルビトール；５〜１５ｍＭのメチオニン；５〜２０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）；および０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤を含む組成物が提供される。好ましい実施形態では、ソルビトールの濃度は４％（ｗ／ｖ）〜６％（ｗ／ｖ）である。好ましい実施形態では、メチオニンの濃度は８〜１２ｍＭである。好ましい実施形態では、リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液の濃度は８〜１５ｍＭである。好ましくは、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は独立して緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；４％（ｗ／ｖ）〜６％（ｗ／ｖ）のソルビトール；８〜１２ｍＭのメチオニン；８〜１５ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）；ならびに０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤を含む多価免疫原性組成物である。
【００１０】
本明細書においては、また、少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（ここで、この少なくとも１つのＯ抗原多糖は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソプロテインＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；３％（ｗ／ｖ）〜１２％（ｗ／ｖ）のスクロース；０．１〜１．５ｍＭのＥＤＴＡ；５〜２０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）；および０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤を含む組成物が提供される。好ましい実施形態では、スクロースの濃度は３％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）である。好ましい実施形態では、リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液の濃度は８〜１５ｍＭである。好ましくは、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各抗原多糖は独立して緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；３％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）のスクロース；０．１〜１．５ｍＭのＥＤＴＡ；８〜１５ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）；ならびに０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤を含む多価免疫原性組成物である。
【００１１】
特定の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２、およびＯ６Ａ抗原多糖は、１：１：１：１または２：１：１：１の重量比である。
【００１２】
特定の実施形態では、ソルビトールの濃度は５％（ｗ／ｖ）である。
【００１３】
特定の実施形態では、スクロースの濃度は８％（ｗ／ｖ）である。
【００１４】
特定の実施形態では、メチオニンの濃度は１０ｍＭである。
【００１５】
特定の実施形態では、ＥＤＴＡの濃度は１ｍＭである。
【００１６】
特定の実施形態では、リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液の濃度は１０ｍＭであり、リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液のｐＨは７．０である。
【００１７】
特定の実施形態では、界面活性剤の濃度は０．０２％（ｗ／ｖ）である。好ましい実施形態では、界面活性剤は、親水性頭部（ＯＨ基）および長い疎水性尾部（炭素鎖、炭素鎖中に少なくとも約１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１３０またはそれ以上の炭素を含み得る）から構成される。好ましい実施形態では、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。特定の実施形態では、界面活性剤は、Ｆ−６８、ＰＳ２０、ＰＳ４０、ＰＳ６０およびＰＳ８０からなる群から選択される。特定の実施形態では、界面活性剤はＰＳ８０である。
【００１８】
特定の実施形態では、実質的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；５％（ｗ／ｖ）のソルビトール；１０ｍＭのメチオニン；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；５％（ｗ／ｖ）のソルビトール；１０ｍＭのメチオニン；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。
【００１９】
特定の実施形態では、実質的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖、および１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；５％（ｗ／ｖ）のソルビトール；１０ｍＭのメチオニン；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖、および１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；５％（ｗ／ｖ）のソルビトール；１０ｍＭのメチオニン；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。
【００２０】
特定の実施形態では、実質的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；８％（ｗ／ｖ）のスクロース；１ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；８％（ｗ／ｖ）のスクロース；１ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。
【００２１】
特定の実施形態では、実質的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖、および１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；８％（ｗ／ｖ）のスクロース；１ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖、および１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；８％（ｗ／ｖ）のスクロース；１ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。
【００２２】
また、本明細書においては、本明細書に開示の組成物を調製する方法が提供される。特定の実施形態では、本発明による液体製剤が生成されるように、ＥＰＡ担体に共有結合した少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原、水、緩衝溶液用の塩（すなわち、リン酸（二）水素ナトリウムおよびリン酸（二）水素カリウム［すなわち、Ｎａ２ＨＰＯ４およびＫＨ２ＰＯ４またはＮａＨ２ＰＯ４およびＫ２ＨＰＯ４］）、浸透圧調節剤（すなわち、ソルビトールまたはスクロース）、抗酸化剤（すなわち、浸透圧調節剤がソルビトールである場合はメチオニン；浸透圧調節剤がスクロースである場合はＥＤＴＡ）、および界面活性剤（例えば、ＰＳ８０）を容器に添加し、ｐＨを所望のｐＨ（すなわち、６．５〜７．５、例えば、７．０）に調節し、かつこれらの成分を混合することを含む、組成物の調製方法が提供される。好ましい実施形態では、組成物の調製方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；水；リン酸カリウム；リン酸ナトリウム；ソルビトール；メチオニン；およびＰＳ８０を、リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液の最終濃度が５〜２０ｍＭ（例えば、１０ｍＭ）で、ｐＨが６．５〜７．５（例えば、７．０）、ソルビトールの最終濃度が３〜８％（ｗ／ｖ）（例えば、５％（ｗ／ｖ））、メチオニンの最終濃度が５〜１５ｍＭ（例えば、１０ｍＭ）、およびＰＳ８０の最終濃度が０．０１〜０．０８％（ｗ／ｖ）（例えば０．０２％（ｗ／ｖ））となるように、容器に添加し、ｐＨを６．５〜７．５（例えば、７．０）に調節し、かつ各成分を混合することを含む。別の好ましい実施形態では、組成物の調製方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；水；リン酸カリウム；リン酸ナトリウム；スクロース；ＥＤＴＡ；およびＰＳ８０を、スクロースの最終濃度が３〜１２％（ｗ／ｖ）（例えば、８％（ｗ／ｖ））、ＥＤＴＡの最終濃度が０．１〜１．５ｍＭ（例えば、１ｍＭ）、リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液の最終濃度が５〜２０ｍＭ（例えば、１０ｍＭ）で、ｐＨが６．５〜７．５（例えば、７．０）、およびＰＳ８０が０．０１〜０．０８％（ｗ／ｖ）（例えば０．０２％（ｗ／ｖ））となるように、容器に添加し、各成分を混合し、かつｐＨを６．５〜７．５（例えば、７．０）に調節することを含む。
【００２３】
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、液体組成物として提供される。液体組成物とは、組成物が２〜８℃で液体形態であり、好ましくは２〜８℃で保存されることを意味する。
【００２４】
特定の実施形態では、組成物は、２〜８℃、２５℃または４０℃で保存することができ、かつ安定である。好ましい実施形態では、組成物は、２〜８℃で保存され、かつ安定である。特定の実施形態では、組成物は、２〜８℃で、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６ヶ月またはそれ以上の間安定である。特定の実施形態では、組成物は、２５℃で、少なくとも約１、２、３、４、５、６ヶ月またはそれ以上の間安定である。特定の実施形態では、組成物は、４０℃で、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週またはそれ以上の間安定である。
【００２５】
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、凍結製剤として提供される。凍結製剤とは、組成物が約−１８℃以下、例えば、約−２０℃、−４０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、もしくはそれらの間の任意の温度、またはそれより低い温度で保存されるとき、固体形態であることを意味する。特定の実施形態では、組成物は、組成物中に存在する浸透圧調節剤に応じて−４０℃または−６０℃で保存することができ、かつ安定である。特定の実施形態では、組成物は、−７０℃で保存することができ、かつ安定である。特定の実施形態では、組成物は、スクロースを含み、−４０℃で、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８ヶ月またはそれ以上の間安定である。特定の実施形態では、組成物は、ソルビトールを含み、−６０℃で、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８ヶ月またはそれ以上の間安定である。特定の実施形態では、組成物は、ソルビトールまたはスクロースを含み、−７０℃で、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年またはそれ以上の間安定である。
【００２６】
好ましい実施形態では、本発明の組成物は塩化ナトリウムを含まない。
【００２７】
特定の実施形態では、組成物中の各Ｏ抗原多糖の濃度は、約１〜２００μｇ／ｍＬ、例えば、約２〜１００μｇ／ｍＬ、例えば、約４〜５０μｇ／ｍＬである。その特定の実施形態では、多糖：担体タンパク質の比は、組成物中の各Ｏ抗原多糖で、約１：１０〜約１：２、例えば、約１：５〜１：２である。
【００２８】
上述の概要、および下記の本願の好ましい実施形態の詳細な説明は、添付した図面と共に読む場合により良く理解されるであろう。本発明が図面に示す明確な実施形態に限定されないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｃは、ソルビトールではなく、ＰＳ２０、ＰＳ８０、およびＦ６８が、試験条件下でＥｘＰＥＣ複合糖質の凍結／融解誘発凝集を抑制することができたことを示す：ＰＳ２０、ＰＳ８０、Ｆ６８およびソルビトールをＥｘＰＥＣ複合糖質製剤に添加し、凍結／融解誘発ストレスに供し、図１Ａは、サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）クロマトグラムの積分スキームを示し；図１Ｂは、凍結／融解の前後の実験結果を示すＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示し；図１Ｃは、全ピーク積分におけるプレピーク１の百分率値をプロットしたグラフを示す。
【図１−２】（上記の通り。）
【図１−３】（上記の通り。）
【図２】図２は、１２週の長期間にわたって４０℃に置いた場合の、製剤２６および２８のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーのプレピーク１の割合を、旧ＥｘＰＥＣ複合糖質製剤と直接比較したグラフを示す。直立（↑）および逆さ（↓）の両バイアル方向を調べ、熱ストレス（４０℃）を受けた場合、製剤２６および２８は、旧ＥｘＰＥＣ複合糖質製剤よりも安定性が増加することを実証した。
【図３】図３は、３つの異なる濃度のタングステン抽出物（ＨＷ、ＭＷ、ＬＷ）に曝露し、４０℃で４週間保存した場合の、旧ＥｘＰＥＣ複合糖質製剤と比較した、製剤２６および２８のプレピーク１の傾向を示すグラフを示す。
【図４】図４は、ＰＥＴＧおよびＰＣプラスチック材料と接触させて、旧製剤と比較した、製剤２６および２６の撹拌ストレス（Ｔ０は対照、すなわち撹拌ストレスなしである）の前後の実験結果を示すＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
背景技術において、また本明細書全体を通して、様々な刊行物、論文および特許が引用または記載されており、これらの参考文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれている文献、行為、材料、装置、物品などの議論は、本発明に関する文脈を提供することを目的とする。そのような議論は、これらの内容のいずれかまたは全てが、開示されている、または特許請求されているあらゆる発明に関する先行技術の一部を形成することを認めるものではない。
【００３１】
別途定義されていない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が関係する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。そうでなければ、本明細書で使用する、ある特定の用語は、本明細書で規定されている意味を有する。
【００３２】
本明細書で使用する場合、および添付した特許請求の範囲においては、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別途文脈が明白に規定していない限り、複数の言及を含むことに留意しなければならない。
【００３３】
特に明記しない限り、本明細書に記載される濃度または濃度範囲などの数値は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、数値は、通常、列挙された値の±１０％を含む。例えば、濃度１ｍｇ／ｍＬは、０．９ｍｇ／ｍＬ〜１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は、０．９％（ｗ／ｖ）〜１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用する場合、数値範囲の使用は、全ての可能な部分的範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含み、文脈に明らかに別段の指示がない限り、そのような範囲内の整数および値の分数を含む。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｓ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「〜を含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、もしくは「〜を含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、またはそれらの任意の他の変形は、記載された整数または整数群を包含することを意味するものと理解されるが、任意の他の整数または整数群の排除を意味するものではなく、非排他的またはオープンエンドであることが意図されている。例えば、構成要素一覧を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は必ずしもそれらの構成要素のみに限定されるものではなく、明示的に列挙されていない、またはそのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置が本来具備している他の構成要素を含むことができる。さらに、明確に反対のことを述べない限り、「または」は包括的「または」を意味し、排他的「または」を意味しない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つによって満たされる。Ａが真であり（または、存在し）かつＢが偽である（または、存在しない）、Ａが偽であり（または、存在しない）かつＢが真である（または、存在する）、ならびにＡおよびＢの両方が真である（または、存在する）。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」という用語、または「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」もしくは「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」などのその変形は、本明細書および特許請求の範囲を通して使用されるとき、記載された整数または整数群を全て包含するが、その特定の方法、構造、または組成物にさらなる整数または整数群を加えることはできないことを意味する。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という用語、または「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」もしくは「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」などのその変形は、本明細書および特許請求の範囲を通して使用されるとき、記載された整数または整数群を全て包含し、かつ、その特定の方法、構造、または組成物の基本の、または新規の特性を実質的に変化させないものであれば、記載された整数または整数群を任意選択的に包含することを意味する。
【００３７】
また、本明細書で好ましい発明の構成要素の寸法または特性に言及するときに使用される「約」、「略」、「一般に」、「実質的に」などの用語は、当業者には理解されているであろうように、記載された寸法／特性が厳密な境界またはパラメータではなく、機能的に同じかまたは類似している、そこからのわずかな変形は排除しないことを示すことは理解されたい。少なくとも、そのような数値パラメータを含む言及は、当該技術分野で受容されている数学的および工業的原理（例えば、四捨五入、測定その他の系統的誤差、製造上の公差など）を使用して、最下位桁を変化させない変動を含むであろう。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「Ｏ多糖」、「Ｏ抗原（Ｏ−ａｎｔｉｇｅｎ）」、「Ｏ抗原（Ｏ  ａｎｔｉｇｅｎ）」、「Ｏ抗原多糖」、「Ｏ多糖抗原」、および略語「ＯＰＳ」という用語は全て、グラム陰性菌のＯ抗原を指し、これは、リポ多糖（ＬＰＳ）の成分であり、グラム陰性菌の各血清型または血清（亜）型に特異的である。Ｏ抗原は、通常、２〜７個の糖残基の繰り返し単位（ＲＵ）を含む。本明細書で使用する場合、ＲＵは、生物学的繰り返し単位（ＢＲＵ）と一致する。ＢＲＵは、インビボで合成されるＯ抗原のＲＵを表す。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「複合体」および「複合糖質」という用語は全て、担体タンパク質（例えば、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のエキソトキシンＡ（ＥＰＡ））に共有結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原を含む複合生成物を指す。複合体は、宿主細胞内で調製された複合生成物である生体複合体であり得、宿主細胞機構がＯ抗原および担体タンパク質を産生し、Ｏ抗原を担体タンパク質に、例えばＮ結合を介して連結する。複合体はまた、他の手段によって、例えばタンパク質および糖抗原の化学結合によって調製することができる。
【００４０】
本発明の実施形態における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抗原には、Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ、およびＯ２５Ｂが含まれ、これらは国際公開第ＷＯ２０１５／１２４７６９号パンフレットおよび国際公開第２０１７／０３５１８１号パンフレットに記載されている。これらの各参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、特定のＯ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａおよび／またはＯ２５Ｂ抗原に加えて、他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原もまた使用することができ、それには、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２１、Ｏ２５、Ｏ７３、Ｏ７５およびＯ１５３血清型またはそれらの血清亜型由来のＯ抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「原薬」は、個々の複合糖質（ＥＰＡ担体タンパク質に共有結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖、例えば、ＥＰＡに共有結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ  Ｏ抗原）のバルク製品を指し、それは対象に最終的に投与される製品より高い濃度にある。原薬は、複合糖質を精製するための下流のプロセスの完了後に製造することができる。原薬は、例えば、本発明の製剤緩衝液中に、例えばマイナス７０℃などの凍結状態で、より濃縮された形態で保存することができる。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「薬物製品」は、対象へ投与する最終形態での複合糖質の製剤をいう。薬物製品は、全ての複合糖質（多価ワクチンの場合、ＥＰＡ担体タンパク質に結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖、例えば４価ワクチンの場合、ＥＰＡ担体タンパク質にそれぞれ個別に結合したＯ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２およびＯ６Ａ、また場合により、ワクチンの価数が増加したなら、ＥＰＡ担体タンパク質に結合したより多くの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原）を含有する。薬物製品は、一般に、それぞれの複合糖質の原薬を混合し、必要に応じて、ワクチンの標的用量が生成されるように、製剤緩衝液で希釈することにより調製することができる。本発明による製剤における薬物製品は、２〜８℃で保存することができ、その温度で少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６ヶ月またはそれ以上の間安定した状態を保つ。
【００４３】
用語「約」は、数字と共に使用される場合、言及された数の±１、±５または±１０％内の任意の数を指す。
【００４４】
Ｏ抗原がタンパク質担体に共有結合している場合、Ｏ抗原の有効量または用量は、複合体中のＯ抗原多糖部分のみに基づいて計算される。
【００４５】
ＥｘＰＥＣまたはＥｘＰＥＣ感染に関連する疾患には、尿路感染、手術部位感染、菌血症、腹部または骨盤感染、肺炎、院内肺炎、骨髄炎、蜂巣炎、腎盂腎炎、創傷感染、髄膜炎、新生児髄膜炎、腹膜炎、胆管炎、軟部組織感染、化膿性筋炎、敗血症性関節炎、および敗血症が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
本明細書で使用する場合、対象への２つ以上の治療の投与の文脈における「組み合わせて」という用語は、２つ以上の治療の使用を指す。用語「組み合わせて」の使用は、治療が対象に投与される順序を制限しない。例えば、第１の治療（例えば、本明細書に記載の組成物）は、対象に対する第２の治療（例えば、本明細書に記載の組成物、または別の治療（例えば、抗生物質による処置））の投与の前、同時、または後に投与され得る。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、動物、好ましくは哺乳動物を指し、非霊長類（例えば、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット、またはマウス）および霊長類（例えば、サル、チンパンジー、またはヒト）を含み得る。特定の実施形態では、対象は非ヒト動物である。別の実施形態では、対象はヒトである。「対象」および「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。本発明による組成物は対象への投与に適しており、組成物に含まれるＥｘＰＥＣ  Ｏ抗原に対する免疫応答を生成するために使用することができる。
【００４８】
本明細書で使用する場合、抗原または組成物に対する「免疫学的応答」または「免疫応答」は、対象における、抗原、または組成物中に存在する抗原に対する体液性および／または細胞性免疫応答の発生を指す。
【００４９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖組成物
１つの一般的な態様では、本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）臨床分離株の中で主に見出されるＯ抗原血清型を含む多価ワクチンに関し、このワクチンはその中に含まれるＯ抗原血清型を有するＥｘＰＥＣによって引き起こされる疾患を予防する能動免疫を提供するために使用することができる。一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原を含む組成物に関する。特定の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖を含み得る。他の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ、Ｏ２、および／またはＯ６Ａ抗原多糖を含む。好ましい実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ、およびＯ２５Ｂ抗原多糖を含むが、これらは国際公開第ＷＯ２０１５／１２４７６９号パンフレットおよび国際公開第２０１７／０３５１８１号パンフレットに記載されている。これらの各参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、組成物中に、他の、またはさらなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖が含まれる。このような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖には、限定されないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ６、Ｏ７、Ｏ８、Ｏ１５、Ｏ１６、Ｏ１８、Ｏ２１、Ｏ２５、Ｏ７３、Ｏ７５およびＯ１５３の血清（亜）型由来のＯ抗原が含まれ得る。多くの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型に対する免疫防御を提供するために、組成物は、必要に応じて、２つ以上のさらなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のさらなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原を含み得る。
【００５０】
特定の実施形態では、組成物および方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原、および１つ以上のさらなる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原に関連し得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原の例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２およびＯ６Ａ抗原が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ血清型に特異的なＯ抗原を指す。一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原は、次式Ｏ２５Ｂ’で示される構造を含む。
【化１】
2019535678.tif 000002
ここで、式Ｏ２５Ｂ’中のｎは、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０、２５〜３０、５〜２５、１０〜２５、１５〜２５、２０〜２５、１０〜２０または１５〜２０の整数である。本発明の一実施形態では、式Ｏ２５Ｂ’中のｎは１０〜２０の整数である。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ血清型に特異的なＯ抗原を指す。一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原は、次式Ｏ１Ａ’で示される構造を含む。
【化２】
2019535678.tif 000003
ここで、式Ｏ１Ａ’中のｎは、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０、２５〜３０、５〜２５、１０〜２５、１５〜２５、２０〜２５、１０〜２０または１５〜２０の整数である。本発明の一実施形態では、式Ｏ１Ａ’中のｎは７〜１５の整数である。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２血清型に特異的なＯ抗原を指す。一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原は、次式Ｏ２’で示される構造を含む。
【化３】
2019535678.tif 000004
ここで、式Ｏ２’中のｎは、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０、２５〜３０、５〜２５、１０〜２５、１５〜２５、２０〜２５、１０〜２０または１５〜２０の整数である。一実施形態では、式Ｏ２’中のｎは８〜１６の整数である。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６血清型に特異的なＯ抗原を指す。一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６抗原は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａである。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ｋ２抗原」または「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ｇｌｃ抗原」とも呼ばれる「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原」は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ血清型に特異的なＯ抗原を指す。一実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原は、次式Ｏ６Ａ’で示される構造を含む。
【化４】
2019535678.tif 000005
ここで、β１，２結合はまたβ２結合とも称され、式Ｏ６Ａ’中のｎは、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１０〜３０、１５〜３０、２０〜３０、２５〜３０、５〜２５、１０〜２５、１５〜２５、２０〜２５、１０〜２０または１５〜２０の整数である。一実施形態では、式Ｏ６Ａ’中のｎは８〜１８の整数である。
【００５６】
本発明の組成物中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖は担体タンパク質に共有結合されており（「複合化され（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」とも称される）、本発明の担体タンパク質は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のエキソトキシンＡ、好ましくはその解毒された変異体である（ＥＰＡ；例えば、Ｉｈｓｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｉｅｓ  ９，６１；国際公開第２０１５／１２４７６９号パンフレットを参照されたい）。担体タンパク質とＯ抗原多糖との組み合わせは、複合糖質と呼ばれる。一般に、本組成物中の各大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型由来のＯ抗原は、別々の担体タンパク質に共有結合している。すなわち、組成物が４つのＯ抗原多糖を含む場合、これらの各々はＥＰＡ担体タンパク質に別々にかつ独立して結合しており、したがって、組成物は４つの異なる複合糖質を含む。複合糖質を作製する１つの方法は生体複合化によるものであり、この場合、宿主細胞機構がＯ抗原および担体タンパク質を産生し、Ｏ抗原を担体タンパク質に、例えば、Ｎ結合を介して連結する（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原Ｏ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２およびＯ６Ａ多糖とＥＰＡ担体タンパク質の生体複合体の調製については国際公開第２０１５／１２４７６９号パンフレットを参照されたい）。ＥＰＡについては、種々の解毒されたタンパク質変異体が文献に記載されており、担体タンパク質として用いることができる。解毒（または非毒性）ＥＰＡとは、ＡＤＰリボース化活性を欠く任意の緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡを指す。野生型ＥＰＡのリボース化活性はＥＰＡの約４００位のアミノ酸から約６１３位のアミノ酸の間に位置しており、例えば、野生型ＥＰＡから５５３位のアミノ酸グルタミン酸を欠失させるか、または野生型ＥＰＡの４２６位のヒスチジンをチロシンで置換することにより、ＥＰＡ分子は解毒される。当業者に知られているように、野生型ＥＰＡの４００位〜６１３位のアミノ酸内の他のアミノ酸を、例えば、アミノ酸残基の欠失、付加、または置換によって改変して、ＡＤＰリボース化活性およびそれに伴う毒性を除くことができる。本発明の好ましい実施形態では、ＥＰＡ担体タンパク質は解毒変異体である。特定の非限定的で、かつ例示的な実施形態では、ＥＰＡ担体タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列（解毒ＥＰＡの実施形態である）、あるいは配列番号１に対して少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するか、または配列番号１に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個のアミノ酸が相異しているアミノ酸配列であって、これらのうちのいくつかは、場合により、さらに１、２、３、４、５、６、７、８、もしくはそれ以上の、組み換え技術によって導入された、以下に記載するようなグリコシル化コンセンサス配列を含むアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、グリコシル化部位の導入は、グリコシル化コンセンサス配列（例えば、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）（こ��で、Ｘは、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸であり得る）；または好ましくはＡｓｐ（Ｇｌｕ）−Ｘ−Ａｓｎ−Ｚ−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）（ここで、ＸおよびＺはＰｒｏ（配列番号２）を除く任意の天然アミノ酸から独立して選択される）（例えば、国際公開第２００６／１１９９８７号パンフレットおよび国際公開第２０１５／１２４７６９号パンフレットを参照されたい））をＥＰＡタンパク質の一次構造の任意の場所へ挿入することによって達成される。好ましい実施形態では、ＥＰＡ担体タンパク質は、アミノ酸配列Ａｓｐ（Ｇｌｕ）−Ｘ−Ａｓｎ−Ｚ−Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）（ここで、ＸおよびＺは、Ｐｒｏ（配列番号２）を除く任意の天然アミノ酸から独立して選択される）を有する１つ以上の組み換え技術によって導入されたＮ結合型グリコシル化コンセンサス部位を含む。特定の実施形態では、ＥＰＡ担体タンパク質は、そのような導入コンセンサス配列を１、２、３、４、５、６、７、８またはそれ以上含む。他の実施形態では、ＥＰＡは、例えば、複合糖質が古典的な結合化学によって調製される場合、そのような導入Ｎ結合型グリコシル化コンセンサス部位を含まない（例えば、米国特許第５，３７０，８７２号明細書；Ｃｒｙｚ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５８：３７３−３７７を参照されたい）。
【００５７】
特定の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原は、約１：２０〜２０：１、好ましくは１：１０〜１０：１、例えば１：１０〜３：１の多糖対タンパク質の重量／重量比で担体タンパク質に共有結合されている。生体複合体の特定の非限定的な実施形態では、多糖／タンパク質比は、Ｏ抗原血清型に応じて、各生体複合体で、約０．１〜０．５（すなわち、多糖：タンパク質は、約１：１０〜１：２、例えば、約１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、またはその間の任意の値）である。
【００５８】
特定の非限定的実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖は、組成物中に、各抗原多糖について、約１〜２００μｇ／ｍＬ、例えば、約２〜１００μｇ／ｍＬ、例えば、約４〜５０μｇ／ｍＬ、例えば、約４〜４８μｇ／ｍＬ、例えば、約８〜４８μｇ／ｍＬ、例えば、約４〜３２μｇ／ｍＬ、例えば、約８〜３２μｇ／ｍＬ、例えば、８、１６、２０もしくは３２μｇ／ｍＬ、またはその間の任意の値の濃度で存在する。少なくとも２つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖の組成物においては、各Ｏ抗原多糖は、組成物中のＯ抗原多糖の各組み合わせについて、１：１〜１：２、またはその間の任意の値の重量比で存在することが好ましい。
【００５９】
特定の非限定的な実施形態では、Ｏ抗原多糖は、約４〜１０００μｇ／ｍＬ、例えば、約１０〜５００μｇ／ｍＬ、例えば、約２０〜２５０μｇ／ｍＬ、例えば、約２４〜１２０μｇ／ｍＬの総Ｏ抗原多糖濃度で組成物中に存在する。
【００６０】
特定の非限定的な実施形態では、組成物中のＥＰＡ担体タンパク質の総濃度は、例えば、約４０〜２０００μｇ／ｍＬ、例えば、約１００〜１５００μｇ／ｍＬ、例えば、約２００〜１２００μｇ／ｍＬ、例えば、約２５０〜６００μｇ／ｍＬであり得る。
【００６１】
特定の実施形態では、組成物は、Ｏ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２およびＯ６Ａ抗原多糖を１：１：１：１の重量比で含む（ここで、Ｏ抗原多糖は各々、ＥＰＡ担体タンパク質に共有結合している）。別の実施形態では、組成物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２およびＯ６Ａ抗原多糖を２：１：１：１の重量比で含む（ここで、Ｏ抗原多糖は各々、ＥＰＡ担体タンパク質に共有結合している）。このような実施形態の各々において、Ｏ２５Ｂ抗原多糖は、非限定的な例として、約８、１６、または３２μｇ／ｍＬの濃度で存在し得る。
【００６２】
本明細書に記載される組成物は、ＥｘＰＥＣによる対象（例えば、ヒト対象）の感染の処置および予防に有用である。特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ＥＰＡ担体タンパク質に共有結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖を含むことに加えて、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される」は動物、より特にはヒトにおける使用のために、連邦もしくは州政府の規制当局によって承認されているか、または米国薬局方もしくは他の一般的に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、本明細書中で薬学的に許容される担体に関連して使用される場合、医薬組成物が共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。本発明の組成物中の水は、注射用水であることが好ましい。
【００６３】
本明細書で提供される組成物は、界面活性剤を含む。本明細書において使用される界面活性剤は、両親媒性の有機化合物であり、疎水性基（それらの尾部）および親水性基（それらの頭部）の両方を含むことを意味する。好ましい実施形態では、界面活性剤は、親水性頭部（ＯＨ基を含む）および長い疎水性尾部（その中に少なくとも約１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１３０またはそれ以上の炭素を含み得る炭素鎖）から構成される。本明細書による好ましい界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。本発明の組成物に好適な界面活性剤の例には、ポリソルベート２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート４０（ＰＳ４０）、ポリソルベート６０（ＰＳ６０）、ポリソルベート８０（ＰＳ８０）、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８（Ｆ−６８）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、界面活性剤はＰＳ８０である。特定の実施形態では、組成物中の界面活性剤は、０．０１％（重量／体積（ｗ／ｖ））〜０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で提供される。特定の実施形態では、組成物中の界面活性剤は、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％、０．１５％、０．１６％、０．１７％、０．１８％、０．１９％、０．２％、またはそれらの間の任意の値の濃度で提供される。Ｆ−６８が界面活性剤である実施形態では、濃度は約０．０５％〜約０．２％であることが好ましい。ＰＳ２０、ＰＳ４０、ＰＳ６０またはＰＳ８０が界面活性剤である実施形態では、濃度は、約０．０１％〜約０．０８％、例えば、約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、またはその間の任意の値であることが好ましい。
【００６４】
本明細書において提供される組成物は、特定のｐＨを有する緩衝液を含む。本発明によれば、組成物はリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液を含む。このような緩衝液の濃度範囲は、例えば、約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約８ｍＭ〜約１５ｍＭ、約８ｍＭ〜約１３ｍＭ、約９ｍＭ〜約１１ｍＭであり得る。特定の実施形態では、緩衝液は、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、またはそれらの間の任意の値の濃度で提供される。特定の実施形態では、緩衝液の濃度は、約８ｍＭ〜約１５ｍＭである。好ましい実施形態では、組成物は、緩衝液を１０ｍＭの濃度で含む。このような緩衝液のｐＨ範囲は、例えば、ｐＨ約６．５〜ｐＨ約７．５、ｐＨ約６．６〜ｐＨ約７．４、ｐＨ約６．７〜ｐＨ約７．３、ｐＨ約６．８〜ｐＨ約７．２、ｐＨ約６．９〜ｐＨ約７．１であり得る。特定の実施形態では、ｐＨは、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、またはそれらの間の任意の値であり得る。好ましい実施形態では、緩衝液のｐＨは７．０である。好ましい実施形態では、組成物は、ｐＨ７．０のリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液を１０ｍＭの濃度で含む。
【００６５】
リン酸カリウム／ナトリウム緩衝溶液は、例えば、Ｋ２ＨＰＯ４（二塩基性）またはＫＨ２ＰＯ４（一塩基性）由来のカリウムと、Ｎａ２ＨＰＯ４（二塩基性）またはＮａＨ２ＰＯ４（一塩基性）由来のナトリウムとを含み得る。特定の実施形態では、リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液は、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）およびリン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）を含む。特定の実施形態では、リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液は、リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）およびリン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）を含む。一塩基性リン酸塩種と二塩基性リン酸塩種（［Ｈ２ＰＯ４］−／［ＨＰＯ４］２−）とのモル比は、対イオンにかかわらず、５．１３〜０．５２の範囲である。
【００６６】
本明細書で提供される組成物は、浸透圧調節剤（「安定剤」と呼ばれることもある）をさらに含むことができる。本発明の組成物に使用される浸透圧調節剤は、本明細書で定義されるように、他の賦形剤に応じて、スクロースまたはソルビトールである。特定の実施形態では、組成物はスクロースを含む。特定の実施形態では、組成物は、スクロースを、約３％（ｗ／ｖ）〜約１２％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）〜約１１％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）、約５％（ｗ／ｖ）〜約９％（ｗ／ｖ）、約６％（ｗ／ｖ）〜約９％（ｗ／ｖ）の濃度で含む。特定の実施形態では、スクロースは、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、またはそれらの間の任意の値の濃度で提供される。好ましい実施形態では、組成物は、スクロースを約３％〜約１０％の濃度で含む。好ましい実施形態では、組成物は、スクロースを８％の濃度で含む。他の好ましい実施形態では、組成物はソルビトールを含む。好ましい実施形態では、組成物は、ソルビトールを、約３％（ｗ／ｖ）〜約８％（ｗ／ｖ）、約３％（ｗ／ｖ）〜約７％（ｗ／ｖ）、約４％（ｗ／ｖ）〜約６％（ｗ／ｖ）の濃度で含む。好ましい実施形態では、組成物は、ソルビトールを約４％（ｗ／ｖ）〜約６％（ｗ／ｖ）の濃度で含む。特定の実施形態では、ソルビトールは、３％、４％、５％、６％、７％、８％、またはそれらの間の任意の値の濃度で提供される。好ましい実施形態では、組成物は、ソルビトールを５％の濃度で含む。
【００６７】
本明細書で提供される組成物は、抗酸化剤をさらに含む。本発明の組成物において使用される抗酸化剤は、本明細書に記載されるように、他の賦形剤に応じて、ＥＤＴＡまたはメチオニンである。特定の実施形態では、組成物はＥＤＴＡを含む。特定の実施形態では、組成物は、ＥＤＴＡを、約０．１ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約０．２ｍＭ〜約１．４ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約１．３ｍＭ、約０．７ｍＭ〜約１．２ｍＭ、約０．８ｍＭ〜約１．２ｍＭ、約０．９ｍＭ〜約１．１ｍＭの濃度で含む。特定の実施形態では、ＥＤＴＡは、０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、またはそれらの間の任意の値の濃度で提供される。好ましい実施形態では、組成物は、ＥＤＴＡを１．０ｍＭの濃度で含む。ＥＤＴＡを含む本発明の組成物はまた、スクロースを含む。他の実施形態では、組成物はメチオニンを含む。特定の実施形態では、組成物は、メチオニンを、約５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約６ｍＭ〜約１４ｍＭ、約７ｍＭ〜約１３ｍＭ、約８ｍＭ〜約１２ｍＭ、約９ｍＭ〜約１１ｍＭの濃度で含む。好ましい実施形態では、組成物は、メチオニンを約８ｍＭ〜約１２ｍＭの濃度で含む。特定の実施形態では、メチオニンは、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、またはそれらの間の任意の値の濃度で提供される。好ましい実施形態では、組成物は、メチオニンを１０ｍＭの濃度で含む。メチオニンを含む本発明の組成物はまた、ソルビトールを含む。
【００６８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；５％（ｗ／ｖ）のソルビトール；１０ｍＭのメチオニン；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０を含む組成物が提供される。  
【００６９】
また、実質的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；５％（ｗ／ｖ）のソルビトール；１０ｍＭのメチオニン；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；５％（ｗ／ｖ）のソルビトール；１０ｍＭのメチオニン；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖、および１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；５％（ｗ／ｖ）のソルビトール；１０ｍＭのメチオニン；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０を含む組成物が提供される。また、実質的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖、および１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；５％（ｗ／ｖ）のソルビトール；１０ｍＭのメチオニン；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖、および１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；５％（ｗ／ｖ）のソルビトール；１０ｍＭのメチオニン；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）��ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。
【００７０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；８％（ｗ／ｖ）のスクロース；１ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０を含む組成物が提供される。また、実質的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；８％（ｗ／ｖ）のスクロース；１ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；８％（ｗ／ｖ）のスクロース；１ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖、および１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；８％（ｗ／ｖ）のスクロース；１ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０を含む組成物が提供される。また、実質的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖、および１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；８％（ｗ／ｖ）のスクロース；１ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。また、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、大腸��（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖、および１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；８％（ｗ／ｖ）のスクロース；１ｍＭのＥＤＴＡ；１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに０．０２％のＰＳ８０からなる組成物が提供される。
【００７１】
本明細書に記載の組成物は場合により、水銀誘導体チメロサール、フェノキシエタノール、またはパラベンなどの防腐剤をさらに含むことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、０．００１％〜０．０１％のチメロサールを含む。他の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、防腐剤を含まない。
【００７２】
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物（例えば、免疫原性組成物）はアジュバントを含むか、またはアジュバントと組み合わせて投与される。本明細書に記載の組成物と組み合せて投与されるアジュバントは、前記組成物の投与前、投与と同時に、または投与後に投与することができる。いくつかの実施形態では、用語「アジュバント」は、本明細書中に記載される組成物と一緒に、またはその一部として投与される場合、生体複合体に対する免疫応答を増加、増強、および／または増大させるが、アジュバント化合物が単独で投与される場合、生体複合体に対する免疫応答を生成しない化合物を指す。アジュバントは、例えば、リンパ球動員、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激などのいくつかの機構によって、免疫応答を増強し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、生体複合体および賦形剤を除いてアジュバントを含まず、かつ／または生体複合体および賦形剤を除いてアジュバントを組み合わせて投与されない（生体複合体または賦形剤がいくつかの固有のアジュバント特性を含む場合、これらは無視され、これらの実施形態では、追加の外部アジュバントは添加されない）。
【００７３】
アジュバントの具体例には、アルミニウム塩（ミョウバン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、および硫酸アルミニウム）、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）（英国特許第２２２０２１１号明細書を参照されたい）、ＭＦ５９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＳ０３（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＡＳ０４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、イミダゾピリジン化合物（国際公開第２００７／１０９８１２号パンフレットを参照されたい）、イミダゾキノキサリン化合物（国際公開第２００７／１０９８１３号パンフレットを参照されたい）、およびサポニン、例えばＱＳ２１（Ｋｅｎｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ  ＆  Ｎｅｗｍａｎ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９５）；米国特許第５，０５７，５４０号明細書を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。他のアジュバントは、水中油型エマルション（例えば、スクアレンまたは落花生油）であり、任意選択によりモノホスホリルリピドＡなどの免疫刺激剤と組み合わせられる（Ｓｔｏｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６，８６−９１を参照されたい）。他のアジュバントは、ＣｐＧ（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ  Ｔｏｄａｙ、Ｎｏｖ．１５、１９９８）である。
【００７４】
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、対象への意図した投与経路に好適であるように製剤化される。例えば、本明細書に記載の組成物は、例えば、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、経口投与、鼻腔内投与、皮内投与、経皮投与、結腸直腸投与、腹腔内投与、気管内投与、局所投与、直腸または肺投与に好適であるように製剤化することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、筋肉内注射による投与に有用である。他の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、皮内投与することができる。他の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、皮膚を通して送達することができる。
【００７５】
別の態様では、また、本明細書に詳細に記載の４つの複合体（すなわち、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２、またはＯ６Ａに由来するＯ抗原を示す）のうちの少なくとも１つを含む原薬組成物が本明細書において提供される。４つの複合体のうちの１つのみまたはサブセットを含むこのような組成物は、例えば、最終的な薬物製品に配合する前の原薬として、バルク抗原の保存に有用であり得、そして、４つの複合体を全て含む薬物製品組成物について記載される有用な安定特性を共有し得る。
【００７６】
方法／使用
本発明の組成物は、例えば、それを必要としている対象へＥｘＰＥＣに対する免疫応答を誘導する方法に使用することができる。免疫応答は、それを必要としている対象におけるＥｘＰＥＣに関連する疾患を予防または治療するのに有効であることが好ましい。方法は、本発明による組成物を対象に投与することを含む。
【００７７】
特定の実施形態では、本明細書において提供される組成物は、容器に保存することができる。好適な容器には、袋、バイアル、注射器、瓶、および試験管が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、注射器によって孔を開けることができる栓を有するバイアルは、本明細書に記載の組成物のいずれかを含む。本明細書で提供される容器は、ガラス（例えば、ホウケイ酸ガラス）、金属、またはプラスチック（例えば、ポリカーボネート）などの様々な材料から形成することができる。特定の実施形態では、容器は、例えば、タイプＩホウケイ酸ガラスからなるバイアルである。他の実施形態では、容器は、ルアーロックまたはステーキド・ニードルを備えたガラス注射器である。他の実施形態では、容器はプラスチック材料、例えば、ポリカーボネート（ＰＣ）またはポリエチレンテレフタレートグリコール（ＰＥＴＧ）からなるバイアルまたは注射器であり、この材料は、例えば、本発明による原薬と適合性があることが示された。バイアルは、任意選択により、例えば、フルオロポリマー膜（例えば、Ｆｌｕｒｏｔｅｃ［エチレンテトラフオロエチレン（ＥＦＴＥ）］またはＴｅｆｌｏｎ［フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）］）でコーティングされた（クロロ／ブロモ）ブチルゴムからなるゴム栓を含んでもよい。他の材料および容器の種類もまた使用することができ、本発明の製剤との適合性は、本開示に基づき、当業者によって決定され得る。
【００７８】
特定の実施形態では、原薬は、ポリカーボネート製の容器、例えば瓶に保存される。特定の実施形態では、原薬は、ポリエチレンテレフタレートグリコール製の容器、例えば瓶に保存される。特定の実施形態では、原薬は、ガラス製の容器、例えばバイアルに保存される。
【００７９】
本明細書で提供される製剤は、組成物中の複合糖質の安定性を改善する。安定であるとは、組成物が保存時にその物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を保持することを一般に意味する。組成物は、保存時に、その物理的および化学的安定性ならびにその生物学的活性を実質的に保持することが好ましい。物理的安定性、化学的安定性、および生物学的活性は、本明細書中に開示される方法および当該技術分野で知られた方法を利用して、当業者によって決定され得る。本発明では、本明細書中の実施例に記載されるように、時点ゼロと比較して、サイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣプレピーク（複合糖質の凝集を示す）の変化が５％以下の場合、組成物は「安定である」とみなされる（そして、対応する製剤は「安定化する」とみなされる）。例えば、既存のＥｘＰＥＣワクチン組成物（２５ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ中）は、４０℃で８週間で５％を超えるプレピークの増加を示し、したがってこの温度で８週間で安定ではないが、本発明の組成物は４０℃で１２週間後のプレピークの増加は５％未満を示し、したがってこの温度で少なくとも１２週間安定である。本発明の組成物は、２〜８℃で少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６ヶ月またはそれ以上の間、ガラス容器中で安定である。本発明の組成物はまた、２５℃で少なくとも７日間、プラスチック容器中で安定であり、これは、これらの条件下でのＥｘＰＥＣ複合糖質生成物の加工を可能にする。
【００８０】
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、液体組成物として提供される。液体組成物とは、組成物が２〜８℃で液体形態であり、好ましくは２〜８℃で保存されることを意味する。場合により、液体組成物は、例えば、熱ストレス条件下での加速安定性試験のために、２５℃または４０℃で保存される。
【００８１】
特定の実施形態では、組成物は、２〜８℃、２５℃または４０℃で保存することができ、かつ安定である。好ましい実施形態では、組成物は、２〜８℃で保存され、かつ安定である。特定の実施形態では、組成物は、２〜８℃で、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６ヶ月またはそれ以上の間安定である。特定の実施形態では、組成物は、２５℃で、少なくとも約１、２、３、４、５、６ヶ月またはそれ以上の間安定である。特定の実施形態では、組成物は、４０℃で、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週またはそれ以上の間安定である。
【００８２】
特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、凍結組成物として提供される。凍結組成物とは、組成物が約−１８℃以下、例えば、約−２０℃、−４０℃、−６０℃、−７０℃、−８０℃、もしくはそれらの間の任意の温度、またはそれより低い温度で保存されるとき、固体形態であることを意味する。特定の実施形態では、組成物は、組成物中に存在する浸透圧調節剤に応じて−４０℃または−６０℃で保存することができ、かつ安定である。特定の実施形態では、組成物は、−７０℃で保存することができ、かつ安定である。特定の実施形態では、組成物は、スクロースを含み、−４０℃で、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８ヶ月またはそれ以上の間安定である。特定の実施形態では、組成物は、ソルビトールを含み、−６０℃で、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８ヶ月またはそれ以上の間安定である。特定の実施形態では、組成物は、ソルビトールまたはスクロースを含み、−７０℃で、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年またはそれ以上の間安定である。本発明の組成物は、前述の旧組成物製剤よりも安定であるように設計される。組成物の安定性は、本明細書に記載される方法および当該技術分野で知られた方法によって決定され得る。これらの方法を利用して、本発明の組成物は、所与の温度で所与の時間、その同じ時間および同じ温度で旧製剤の組成物と比較して、より安定であろう。
【００８３】
また、本明細書においては、本明細書に開示の組成物を調製する方法が提供される。特定の実施形態では、本発明による液体製剤が生成されるように、ＥＰＡ担体に共有結合した少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原、水、緩衝溶液用の塩（すなわち、リン酸（二）水素ナトリウムおよびリン酸（二）水素カリウム［すなわち、Ｎａ２ＨＰＯ４およびＫＨ２ＰＯ４またはＮａＨ２ＰＯ４およびＫ２ＨＰＯ４］）、浸透圧調節剤（すなわち、ソルビトールまたはスクロース）、抗酸化剤（すなわち、浸透圧調節剤がソルビトールである場合はメチオニン；浸透圧調節剤がスクロースである場合はＥＤＴＡ）、および界面活性剤（例えば、ＰＳ８０）を容器に添加する工程、ｐＨを所望のｐＨ（すなわち、６．５〜７．５、例えば、７．０）に調節する工程、ならびに、これらの成分を混合する工程を含む、組成物を調製する方法が提供される。好ましい実施形態では、組成物を調製する方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；水；リン酸カリウム；リン酸ナトリウム；ソルビトール；メチオニン；およびＰＳ８０を、リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液の最終濃度が１０ｍＭで、ｐＨが７．０、ソルビトールの最終濃度が５％（ｗ／ｖ）、メチオニンの最終濃度が１０ｍＭ、およびＰＳ８０の最終濃度が０．０２％（ｗ／ｖ）となるように、容器に添加し、ｐＨを７．０に調節し、かつ各成分を混合することを含む。本発明による製剤を調製する１つの非限定的で例示的な方法は、以下の通りであり、約３．５リットルの水に、３．３６９６ｇのＫＨ２ＰＯ４（Ｍｗ＝１３６．０９ｇ／ｍｏｌ）、２．１６３５ｇのＮａ２ＨＰＯ４（Ｍｗ＝１４１．９６ｇ／ｍｏｌ）、２００ｇのソルビトール、５．９６８４ｇのメチオニン（Ｍｗ＝１４９．２１ｇ／ｍｏｌ）、８ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＳ８０ストックが加えられ、その結果、ｐＨが約６．７３となり、その後、約５００μＬの１０Ｎ  ＮａＯＨで目標ｐＨ＝７．０に調節され、水で容量が４リットルに調節される。ソルビトールおよびメチオニンの代わりにスクロースおよびＥＤＴＡを含む製剤は、同様の方法で調製することができ、これは一般的な知識および本明細書中に提供される情報を有する当業者に明らかである。本発明による組成物を調製する１つの可能な方法は、例えば、接線流濾過、濾過、透析、サイズ排除クロマトグラフィーなどを使用する緩衝液交換によって、例えば、ＥｘＰＥＣ複合糖質の精製工程の間または後に、上記のように調製された製剤を、ＥｘＰＥＣ複合糖質が存在する緩衝液に交換する方法である。このような緩衝液交換工程は、本明細書で提供される情報を使用して、当業者にはルーチン的である。
【００８４】
本発明の下記の実施例により、本発明の性質をさらに説明する。下記の実施例は本発明を限定せず、本発明の範囲は添付した特許請求の範囲によって決定されるものであることを理解しなければならない。
【００８５】
実施形態
実施形態１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖の１つ以上、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２およびＯ６Ａ抗原多糖の４つ全て（ここで、各抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；３％（ｗ／ｖ）〜８％（ｗ／ｖ）（好ましくは、４％（ｗ／ｖ）〜６％（ｗ／ｖ））のソルビトール；５〜１５ｍＭ（好ましくは、８〜１２ｍＭ）のメチオニン；５〜２０ｍＭ（好ましくは８〜１５ｍＭ）のリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）；ならびに０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．２％（ｗ／ｖ）界面活性剤を含む免疫原性組成物である。
【００８６】
実施形態２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２、およびＯ６Ａ抗原多糖が１：１：１：１または２：１：１：１の重量比である、実施形態１の免疫原性組成物である。
【００８７】
実施形態３は、ソルビトールの濃度が５％（ｗ／ｖ）である、実施形態１または２の免疫原性組成物である。
【００８８】
実施形態４は、メチオニンの濃度が１０ｍＭである、実施形態１〜３のいずれかの免疫原性組成物である。
【００８９】
実施形態５は、リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液の濃度が１０ｍＭであり、リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液のｐＨが７．０である、実施形態１〜４のいずれかの免疫原性組成物である。
【００９０】
実施形態６は、界面活性剤が親水性頭部および疎水性尾部を含み、好ましくは、界面活性剤がＦ−６８、ＰＳ２０およびＰＳ８０からなる群から選択される、実施形態１〜５のいずれかの免疫原性組成物である。
【００９１】
実施形態７は、界面活性剤がＰＳ８０である、実施形態６の免疫原性組成物である。
【００９２】
実施形態８は、界面活性剤の濃度が０．０２％（ｗ／ｖ）である、実施形態７の免疫原性組成物である。
【００９３】
実施形態９は、
ａ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；
ｂ．５％（ｗ／ｖ）のソルビトール；
ｃ．１０ｍＭのメチオニン；
ｄ．６．１９ｍＭのＫＨ２ＰＯ４および３．８１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに
ｅ．０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０
を含む免疫原性組成物である。
【００９４】
実施形態１０は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖の１つ以上、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２およびＯ６Ａ抗原多糖の４つ全て（ここで、各抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；３％（ｗ／ｖ）〜１２％（ｗ／ｖ）（好ましくは、３％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ））のスクロース；０．１〜１．５ｍＭのＥＤＴＡ；５〜２０ｍＭ（好ましくは８〜１５ｍＭ）のリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）；ならびに０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．２％（ｗ／ｖ）界面活性剤を含む免疫原性組成物である。
【００９５】
実施形態１１は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２、およびＯ６Ａ抗原多糖が１：１：１：１または２：１：１：１の重量比である、実施形態１０の免疫原性組成物である。
【００９６】
実施形態１２は、スクロースの濃度が８％（ｗ／ｖ）である、実施形態１０または１１の免疫原性組成物である。
【００９７】
実施形態１３は、ＥＤＴＡの濃度が１ｍＭである、実施形態１０〜１２のいずれかの免疫原性組成物である。
【００９８】
実施形態１４は、リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液の濃度が１０ｍＭであり、リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液のｐＨが７．０である、実施形態１０〜１３のいずれかの免疫原性組成物である。
【００９９】
実施形態１５は、界面活性剤が親水性頭部および疎水性尾部を含み、好ましくは、界面活性剤がＦ−６８、ＰＳ２０およびＰＳ８０からなる群から選択される、実施形態１０〜１４のいずれかの免疫原性組成物である。
【０１００】
実施形態１６は、界面活性剤がＰＳ８０である、実施形態１５の免疫原性組成物である。
【０１０１】
実施形態１７は、界面活性剤の濃度が０．０２％（ｗ／ｖ）である、実施形態１６の免疫原性組成物である。
【０１０２】
実施形態１８は、
ａ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；
ｂ．８％（ｗ／ｖ）のスクロース；
ｃ．１ｍＭのＥＤＴＡ；
ｄ．１０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム（例えば、６．１９ｍＭのＫＨ２ＰＯ４および３．８１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４）緩衝液（ｐＨ７．０）；ならびに
ｅ．０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０
を含む免疫原性組成物である。
【０１０３】
実施形態１９は、各Ｏ抗原多糖の濃度が、約１〜２００μｇ／ｍＬ、好ましくは、１〜１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは、２〜５０μｇ／ｍＬ、例えば、約４μｇ／ｍＬ〜３２μｇ／ｍＬである、実施形態１〜１８のいずれか１つの免疫原性組成物である。
【０１０４】
実施形態２０は、各Ｏ抗原多糖について、多糖：担体タンパク質（重量：重量）比が、約１：１０〜約１：２、例えば、約１：５〜約１：２である、実施形態１〜１９のいずれか１つの免疫原性組成物である。
【０１０５】
実施形態２１は、注射または点滴による投与に好適な液体形態である、実施形態１〜２０のいずれか１つの免疫原性組成物である。
【０１０６】
実施形態２２は、それを必要としている対象に免疫応答を誘導するための実施形態１〜２１のいずれか１つの免疫原性組成物である。
【０１０７】
実施形態２３は、それを必要としている対象に免疫応答を誘導する薬剤を製造するための実施形態１〜２１のいずれか１つの免疫原性組成物である。
【０１０８】
実施形態２４は、ガラス容器に入った実施形態１〜２１のいずれか１つによる組成物である。
【０１０９】
実施形態２５は、ポリカーボネート容器に入った実施形態１〜２１のいずれか１つによる組成物である。
【０１１０】
実施形態２６は、ポリエチレンテレフタレートグリコール容器に入った実施形態１〜２１のいずれか１つによる組成物である。
【０１１１】
実施形態２７は、バイアルに入った実施形態１〜２１のいずれか１つによる組成物である。
【０１１２】
実施形態２８は、注射器に入った実施形態１〜２１のいずれか１つによる組成物である。
【０１１３】
実施形態２９は、２〜８℃の温度で保存された場合に、少なくとも６ヶ月間、好ましくは少なくとも１２ヶ月間、より好ましくは少なくとも１８ヶ月間、より好ましくは少なくとも２４ヶ月間、より好ましくは少なくとも２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６ヶ月、またはそれ以上の間、安定である、実施形態１〜２１または２４〜２８のいずれか１つによる組成物である。
【０１１４】
実施形態３０は、ＥＰＡ担体タンパク質に共有結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原を含む液体免疫原性組成物を安定に保持する方法であって、実施形態１〜２１または２４〜２９のいずれか１つによる組成物を、２〜８℃の温度で、少なくとも６ヶ月間、好ましくは少なくとも１２ヶ月間、より好ましくは少なくとも１８ヶ月間、より好ましくは少なくとも２４ヶ月間、より好ましくは少なくとも２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６ヶ月、またはそれ以上の間、保存することを含む方法である。
【実施例】
【０１１５】
実施例１：界面活性剤の添加は、ＥｘＰＥＣ複合糖質の凍結／融解誘導凝集を抑制する。
どのような組み合わせの賦形剤を、それぞれ独立して、別個の緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のエキソトキシンＡ（ＥＰＡ）に共有結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ、Ｏ１Ａ、Ｏ２、Ｏ６Ａ抗原多糖（すなわち、合計４つの別個の複合糖質）（以下、ＥｘＰＥＣ複合糖質と呼ぶ）に添加して、凍結／融解、撹拌、熱誘発ストレス、および金属誘発酸化ストレスに対する安定化を助けることができるかを決定するために、異なる賦形剤を、最初のＥｘＰＥＣ複合糖質製剤（ＥｘＰＥＣ複合糖質、２５ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ）（以下、「旧」ＥｘＰＥＣ複合糖質と呼ぶ。これは、ＥｘＰＥＣ複合糖質の第２相臨床試験、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  識別名：ＮＣＴ０２５４６９６０において現在使用されている製剤である）に添加し、得られた製剤の安定化の増加を、適切な方法によって試験した。
【０１１６】
旧製剤（本明細書中で「対照」とも呼ばれることがある）において、ＥｘＰＥＣ複合体は、凍結／融解誘導ストレスに供されると凝集した。ＥｘＰＥＣ複合糖質の凝集は、サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）プロファイル（例えば、図１Ａおよび１Ｂを参照）においてプレピークとして見ることができ、そこでは、プレピーク１は、ストレスに曝されたときの不安定性の指標である。
【０１１７】
最初に、抗凍結剤（例えば、ソルビトール）をＥｘＰＥＣ複合糖質製剤に添加し、その後の製剤を試験して、凍結／融解誘発ストレスに曝されたときに安定性が増加するか否かを決定した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣで測定されているように（図１Ｂ）、ソルビトールの添加は、凍結／融解誘発凝集からＥｘＰＥＣ複合糖質を保護しないことがわかった。
【０１１８】
しかしながら、驚くべきことに、界面活性剤（例えば、Ｆ−６８（ポロクサマー１８８、もしくはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８としても知られる）、ＰＳ２０またはＰＳ８０）のＥｘＰＥＣ複合糖質製剤への添加は、凍結／融解誘発ストレスに曝されたときのＥｘＰＥＣ複合糖質の安定性を増加させた。特に、界面活性剤は、凍結／融解誘発ストレスに曝露されたときのＥｘＰＥＣ複合糖質の凝集を抑制した。ＥｘＰＥＣ複合糖質への０．０１％  ＰＳ−８０、０．０１％  ＰＳ２０、または０．１％  Ｆ−６８（すべてｗ／ｖ）の添加により、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで測定されているように（図１Ｂおよび図１Ｃ）、凍結／融解誘発凝集が抑制された。試験した各界面活性剤（全て非イオン性界面活性剤）が、親水性頭部（ＯＨ基を含む）および長い疎水性尾部（その中に少なくとも約１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１２０、１３０またはそれ以上の炭素を含み得る炭素鎖）から構成された。理論に束縛されることを望むものではないが、これらの物理的特性が、試験された界面活性剤がＥｘＰＥＣ複合糖質の凍結／融解誘発凝集を抑制することを可能にしたと考えられる。さらなる開発において、ＰＳ８０を凍結／融解誘発凝集を防ぐための賦形剤として使用した。なぜなら、この特定の界面活性剤が、ＥｘＰＥＣ複合糖質の後期開発の容易な実施に関連するさらなる利点を有するからである。
【０１１９】
実施例２：製剤の緩衝液、ｐＨ値、および浸透圧調節剤の評価。
界面活性剤がＥｘＰＥＣ複合糖質の凍結／融解誘発凝集を抑制できることを実証した後、製剤に好適な緩衝液、ｐＨ、および浸透圧調節剤を調べた。追跡実験において、浸透圧調節剤としてのＮａＣｌ（１５０ｍＭ）または５％（ｗ／ｖ）のソルビトールの存在下、および全てがＰＳ８０（０．０１％（ｗ／ｖ）を含有する、異なる緩衝液−ｐＨの組み合わせをカバーするいくつかの製剤を調べた。旧製剤（２５ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ）を対象として使用した。多くの濃度のＥｘＰＥＣ複合糖質（例えば、各多糖について１６または８μｇ／ｍＬ）を試験したが、試験した製剤の安定化に、濃度差の影響は観察されなかった（データは示さず）。
【０１２０】
凍結／融解、撹拌、露光、および様々な温度（例えば、２〜８℃、２５℃、および４０℃）での熱ストレスを含むいくつかのストレスを、これらの製剤に加えた（表１）。
【０１２１】
【表１】
2019535678.tif 000006
【０１２２】
【表２】
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【０１２３】
表２に記載のアナリティクスパッケージを利用して、ｐＨ７のヒスチジンまたはｐＨ７のリン酸カリウムを含有する製剤が、他の緩衝液−ｐＨの組み合わせと比較してより安定であることが実証された（データは示さず）。また、極端なｐＨ値（すなわち、ｐＨ５．０およびｐＨ８．０）では、ＥｘＰＥＣ複合糖質の凝集がより多く見られるようである。さらに、浸透圧調節剤としてソルビトールを含有する製剤は、浸透圧調節剤としてＮａＣｌを含有する製剤よりも予想外に安定化していることが観察された。実際、ＮａＣｌを含有する製剤は、４０℃での保存中の凝集に対してＥｘＰＥＣ複合糖質を安定化することができないことが観察された。ソルビトールを浸透圧調節剤として使用した場合、ＥｘＰＥＣ複合糖質の凝集は起こらず、ソルビトールが驚くべき安定化効果を有することを実証した。さらに、ｐＨ極値（すなわち、ｐＨ５．０およびｐＨ８．０）での凝集は、ソルビトール含有製剤において、ＮａＣｌ含有製剤と比べて減少する。これは、ソルビトールが製剤をより強固にし、製造中にｐＨ差が生じたとしても、ＥｘＰＥＣ複合糖質の安定化効果を提供することができることを示している。
【０１２４】
実施例３：製剤の安定性に対する評価。
ＥｘＰＥＣ複合糖質の安定性に関して最良の候補製剤を特定するために、さらなる製剤を設計した。緩衝液およびｐＨについては、ヒスチジンをｐＨ６．５および７．０で評価し、純粋なリン酸カリウムの代わりに、リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４）をｐＨ６．５および７．０で評価した。カリウムとナトリウムの組み合わせは、最初の結果に基づいて選択され、凍結／融解時の局所ｐＨ緩衝能をより良くカバーする。緩衝系の調製においては、ナトリウムよりもカリウムが優勢である（例えば、ｐＨ＝７．０の１０ｍＭリン酸緩衝液では、６．１９ｍＭのＫＨ２ＰＯ４および３．８１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を使用した）。浸透圧調節剤として、スクロース（８％（ｗ／ｖ））およびソルビトール（５％（ｗ／ｖ））を評価した。さらに、抗酸化剤のＥＤＴＡ（１ｍＭ）またはメチオニン（１０ｍＭ）を評価した。また、ＮａＣｌの非存在またはソルビトールの存在が、実施例２で観察された保護効果をもたらすか否かを、これらの組み合わせを含む製剤（それぞれ半分の濃度を、これらの成分を実施例２のように個々に使用した場合と比較）を含めることによって試験した。製剤は全て、ＰＳ８０を０．０２％（ｗ／ｖ）の濃度で含有した。
【０１２５】
異なる製剤を、実施例２に記載したのと同じストレス条件下に置いた。安定性データの組み合わせに基づいて、選択工程を実施し、各製剤の性能を評価し、以下の基準に基づいて除外した：（ａ）各温度の３つの時点のうち少なくとも２つで、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラム上にさらなるポストピークが見られた；（ｂ）各温度の３つの時点のうち少なくとも２つで、ＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラム上にプレピーク１が見られた／増加した；（ｃ）ストレス（例えば、撹拌、凍結／融解、光暴露）を受けた後のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラム上にさらなるポストピークが見られた；および（ｄ）ストレス（例えば、撹拌、凍結／融解、光暴露）を受けた後のＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラム上にプレピーク１が見られた／増加した。本明細書中で製剤２６および２８と名付けた２つの特定の製剤が、試験した各ストレス条件に耐えるＥｘＰＥＣ複合糖質を提供し得ることがわかった。
【０１２６】
製剤２６は、１０ｍＭのリン酸Ｎａ／Ｋ緩衝液（ｐＨ７．０）、５％（ｗ／ｖ）のソルビトール、１０ｍＭのメチオニン、０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ−８０、およびＥｘＰＥＣ複合糖質を含んだ。
【０１２７】
製剤２８は、１０ｍＭのリン酸Ｎａ／Ｋ緩衝液（ｐＨ７．０）、８％のスクロース、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のＰＳ−８０、およびＥｘＰＥＣ複合糖質を含んだ。
【０１２８】
驚くべきことに、（ｉ）ソルビトールとメチオニン、または（ｉｉ）スクロースとＥＤＴＡを含む製剤が、（ａ）ソルビトールとＥＤＴＡを組み合わせた製剤、（ｂ）スクロースとメチオニンを組み合わせた製剤、および（ｃ）抗酸化剤を含まない製剤より性能が優れていることから、浸透圧調節剤および抗酸化剤の特定の組み合わせは関連性があった。また、驚くべきことに、ＥｘＰＥＣ複合糖質製剤は、塩化ナトリウムを含まないことが好ましいことがわかった。製剤２６および２８は、範囲内で変化させることができるが、ＥｘＰＥＣ糖質を安定化することが依然として期待されている。表３は、製剤２６および２８のｐＨおよび賦形剤濃度の適用可能な範囲を提供する。
【０１２９】
【表３】
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【０１３０】
旧ＥｘＰＥＣ複合糖質製剤（ＥｘＰＥＣ複合糖質、２５ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ）と直接比較するために、製剤２６および２８を確認試験でさらに試験した。直立および逆さの両バイアル方向を試験して、最終容器の栓との接触の影響を評価した。製剤２６および２８は、提案された濃度でいかなる安全性の懸念も引き起こさず、認可されたワクチンにおいて使用され、かつ／または非経口投与用に認可された賦形剤として挙げられている賦形剤から構成される。製剤２６および２８でのこれらの賦形剤の組み合わせと、緩衝溶液のｐＨ値は、旧ＥｘＰＥＣ複合糖質製剤と比較して、ＥｘＰＥＣ複合糖質の安定化効果の改善に寄与する。製剤２６および２８に対するこれらの賦形剤の提案された組み合わせは、２〜８℃および２５℃での保存時に予想される安定性傾向（データは示さず）に従いながら、凍結／融解および熱ストレス時にＥｘＰＥＣ複合体ワクチンの原薬（ＤＳ）および薬物製品（ＤＰ）を保存することを実証した（例えば、図２）。ＤＰについて試験した多糖濃度は、各株２０μｇ／ｍＬ（合計８０μｇ／ｍＬ）であり、タンパク質濃度は合計３００μｇ／ｍＬであった。血清型Ｏ２５Ｂ（すなわち、ＥＰＡ担体タンパク質に共有結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖を含有する）のＤＳでは、試験した多糖濃度は２００μｇ／ｍＬであり、試験したタンパク質濃度は８３０μｇ／ｍＬであった。このような組成物は経時的に安定であった。これまでのところ、製剤２６および２８中の薬物製品は、２〜８℃で少なくとも６ヵ月間、２５℃で少なくとも６ヵ月間安定性を示しており、安定性試験は継続している。
【０１３１】
実施例４：金属誘発酸化ストレスに対する製剤の評価。
製剤２６および２８を、金属誘発生成物酸化のモデルとして、タングステンの存在下でのＥｘＰＥＣ複合糖質に対するそれらの安定化効果をさらに評価した。タングステン残渣は、通常、タングステンピンを用いたチップ形成プロセスの結果である、ガラスプレフィルドシリンジ（ＰＦＳ）のチップに存在する。ＰＦＳ中のタングステン残渣の堆積は製造プロセスに依存し、ＰＦＳ製造業者間で２５０〜１２５０ナノグラム／バレルの範囲で変化し得る。タングステンは、ＰＦＳにおけるタンパク質凝集と関連している（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉ．９８（１２）：４６９５−７１０（２００９）；Ｓｅｉｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．２９：１４５４−６７（２０１２））。したがって、酸化ストレスおよびＥｘＰＥＣ複合糖質の凝集傾向をモニターしながら、異なる濃度のタングステンに曝露したときの製剤２６および２８ならびに旧製剤の安定性を調べた。この評価では、現在市販されているＰＦＳ中に存在するタングステン残渣の全てのレベルをカバーする３つのレベルのタングステン（高（ＨＷ）、中（ＭＷ）、および低（ＬＷ））を調べた。製剤に適用したストレス条件を表４に要約する。
【０１３２】
【表４】
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【０１３３】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析（安定性を示すプレピーク１）によって実証されているように、製剤２６および２８は、経時的にＥｘＰＥＣ複合糖質の凝集体の量が最も少ないことが示された。最高レベルのタングステンに暴露した場合でも、４週のプレピークレベルは、Ｔ−０での１．０％と比較して、３．１％に達したに過ぎなかった（１週当たり平均０．５％の増加、図３）。
【０１３４】
したがって、本発明は、ＥｘＰＥＣ複合糖質ワクチンのための２つの異なる改良された液体製剤を提供する。第１の、最も好ましい組成物は、ＥｘＰＥＣ複合糖質、ソルビトール、メチオニン、リン酸Ｋ／Ｎａ緩衝液（ｐＨ７）および界面活性剤を含む。第２の好ましい組成物は、ＥｘＰＥＣ複合糖質、スクロース、ＥＤＴＡ、リン酸Ｋ／Ｎａ緩衝液（ｐＨ７）および界面活性剤を含む。これらの組成物は、２〜８℃での保存時、ＥｘＰＥＣ複合糖質ワクチンは、本発明の新規製剤において、より良好な安定性プロファイルを示し、安定性を示すアッセイ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣ）で示されるように、凝集および分解産物の形成が抑制されるという、以前に記載された組成物を超える利点を有する。本発明の新規な両製剤の凍結／融解、熱（４０℃）、および金属誘発酸化ストレスに対する安定化効果は、前述の分析手法で分析すると、より一層明白である。これらの特徴は、ＥｘＰＥＣ複合糖質ワクチンのＤＳおよびＤＰの両方で、多くの保存および輸送オプションを可能にする。さらに、金属誘発酸化ストレスに耐えることに関し改善された特性もまた、代替の一次包装システム（例えば、プレフィルドシリンジおよび／または適用可能なデバイス）におけるＥｘＰＥＣワクチンの長期保存に適用することができるであろう。
【０１３５】
実施例５：プラスチック材料との適合性に対する製剤の評価。
ポリカーボネート（ＰＣ）およびポリエチレンテレフタレートグリコール（ＰＥＴＧ）などの様々なプラスチック材料と接触させたＥｘＰＥＣ複合糖質原薬（Ｏ２５Ｂ複合体、多糖の試験濃度２２７〜２４２μｇ／ｍＬおよびタンパク質の試験濃度９５２〜１０４８μｇ／ｍＬ）に対する製剤２６および２８の安定化効果をさらに評価した。プラスチック材料は、例えば、プラスチック材料を照射によって滅菌した場合に、タンパク質分解に関係している。ＰＥＴＧおよびＰＣ容器中、過酷な撹拌ストレス（室温で２００ｒｐｍで２４時間）下で、製剤の安定性を試験した。旧製剤は、ＰＥＴＧ容器中、これらの条件下で完全な分解を示した。対照的に、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析が示しているように（図４を参照、不安定性の指標としてプレピーク１を使用）、製剤２６および２８は、試験したＰＥＴＧおよびＰＣ容器において同じ条件下で安定なままであった。さらに、２５℃でＰＣおよびＰＥＴＧ容器に７日間保存したこれらの製剤中の原薬の安定性が観察された（データは示さず）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月8日(2018.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（ここで、前記少なくとも１つのＯ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；
ｂ．３％（ｗ／ｖ）〜８％（ｗ／ｖ）のソルビトール；
ｃ．５〜１５ｍＭのメチオニン；
ｄ．５〜２０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）；ならびに
ｅ．０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤
を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記ソルビトールの濃度は５％（ｗ／ｖ）である、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記メチオニンの濃度は１０ｍＭである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液の濃度は１０ｍＭであり、かつ前記リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液のｐＨは７．０である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、好ましくは、前記界面活性剤はＦ−６８、ＰＳ２０およびＰＳ８０からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記界面活性剤はＰＳ８０であり、好ましくは、前記ＰＳ８０の濃度は０．０２％（ｗ／ｖ）である、請求項６に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
ａ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；
ｂ．５％（ｗ／ｖ）のソルビトール；
ｃ．１０ｍＭのメチオニン；
ｄ．１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）；
ｅ．０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０；ならびに
ｆ．水
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
ａ．少なくとも１つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原多糖（ここで、前記少なくとも１つのＯ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；
ｂ．３％（ｗ／ｖ）〜１２％（ｗ／ｖ）のスクロース；
ｃ．０．１〜１．５ｍＭのＥＤＴＡ；
ｄ．５〜２０ｍＭのリン酸カリウム／ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５〜７．５）；ならびに
ｅ．０．０１％（ｗ／ｖ）〜０．２％（ｗ／ｖ）の界面活性剤
を含む免疫原性組成物。
【請求項１０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）を含む、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記スクロースの濃度は８％（ｗ／ｖ）である、請求項９または１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記ＥＤＴＡの濃度は１ｍＭである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液の濃度は１０ｍＭであり、かつ前記リン酸カリウム／ナトリウム緩衝液のｐＨは７．０である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、好ましくは、前記界面活性剤はＦ−６８、ＰＳ２０およびＰＳ８０からなる群から選択される、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記界面活性剤はＰＳ８０であり、好ましくは、前記ＰＳ８０の濃度は０．０２％（ｗ／ｖ）である、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
ａ．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２５Ｂ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１Ａ抗原多糖、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ２抗原多糖、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ６Ａ抗原多糖（ここで、各Ｏ抗原多糖は緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ（ＥＰＡ）担体タンパク質に共有結合している）；
ｂ．８％（ｗ／ｖ）のスクロース；
ｃ．１ｍＭのＥＤＴＡ；
ｄ．１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．０）；
ｅ．０．０２％（ｗ／ｖ）のＰＳ８０；ならびに
ｆ．水
を含む、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
２〜８℃の温度で保存した場合に、少なくとも６ヶ月間、好ましくは少なくとも１２ヶ月間、より好ましくは少なくとも１８ヶ月間安定である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
前記各Ｏ抗原多糖の濃度は１〜２００μｇ／ｍＬ、例えば約２〜１００μｇ／ｍＬ、例えば約８〜４８μｇ／ｍＬであり、好ましくは、前記多糖：担体タンパク質比は、各Ｏ抗原多糖について、１：１０〜１：２、好ましくは１：５〜１：２である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
４〜１０００μｇ／ｍＬ、例えば１０〜５００μｇ／ｍＬ、例えば２０〜２５０μｇ／ｍＬ、例えば２４〜１２０μｇ／ｍＬの全Ｏ抗原多糖濃度、および４０〜２０００μｇ／ｍＬ、例えば１００〜１５００μｇ／ｍＬ、例えば２００〜１２００μｇ／ｍＬ、例えば２５０〜６００μｇ／ｍＬの全ＥＰＡ担体タンパク質濃度を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
ＥＰＡ担体タンパク質に共有結合した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ抗原を含む液体免疫原性組成物を安定に保持する方法であって、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物を、２〜８℃の温度で少なくとも６ヶ月間保存することを含む方法。
【国際調査報告】
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