(57)【要約】本発明は、さまざまな態様及び実施形態において、１つ以上のコラーゲンＩＶ由来生物模倣ペプチドを投与することによってＴｉｅ２関連血管透過性を処置するための方法、及び１つ以上のコラーゲンＩＶ由来生物模倣ペプチドを含む、Ｔｉｅ２関連血管透過性を処置するための組成物を含む。そのようなペプチドは、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）のＴｉｅ２アゴニスト活性を促進し、それにより、血管系及び／またはリンパ管を安定化させることができる。【選択図】図２Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者におけるＴｉｅ２関連血管またはリンパ管透過性に関係する状態を予防または処置するための方法であって、コラーゲンＩＶ由来生物模倣ペプチドを前記患者に有効な量で投与して、Ｔｉｅ２依存性の血管またはリンパ管透過性を低下させることを含む、前記方法。
【請求項２】
前記状態は、糖尿病黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、湿性加齢黄斑変性（湿性ＡＭＤ）、背景糖尿病性網膜症、がん、インフルエンザ、出血熱、または脳性マラリアである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記状態は、腫瘍増殖または転移である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記状態は、リンパ管機能不全を伴う炎症状態である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記状態は、がんに対する化学療法の前の血管透過性である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドは、腫瘍血管系を正常化するのに有効な量で投与され、それに化学療法の適用が続く、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記状態は、任意に、ＮＳＣＬＣもしくはＳＣＬＣである肺癌、肝癌、トリプルネガティブ乳癌、または膠芽腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記状態は、敗血症である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記状態は、毛細血管漏出症候群である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記状態は、肺の炎症状態であり、これは、任意に急性呼吸促迫症候群、慢性喘息、または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記状態は、血管浮腫である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記状態は、血管漏出症候群である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
配列番号１〜４のペプチドを含む組成物は、糖尿病黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、湿性加齢黄斑変性（湿性ＡＭＤ）、または背景糖尿病性網膜症を有する患者に、約１００μｇから約１０００μｇの用量の前記ペプチドの硝子体内注射によって、１ヶ月に１回を超えない注射の頻度で投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記注射の頻度は、およそ２ヶ月に１回を超えない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記注射の頻度は、およそ３ヶ月に１回を超えない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ペプチドは、ＶＥＧＦ遮断または阻害剤療法がうまくいかなかった後に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記状態は、ＶＥＧＦ遮断または阻害剤療法に対して抵抗性であるか、または部分的にしか反応しない、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドは、ＶＥＧＦ遮断または阻害剤療法がうまくいかなかった後に投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペプチドは、ＶＥＧＦ遮断または阻害剤療法に対する代替として投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペプチドは、ＶＥＧＦ遮断療法と組み合わせて投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチドは、配列番号１〜４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ペプチドは、コラーゲンＩＶのα５細線維、またはその生物模倣物から誘導される、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペプチドは、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号５）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＡＭＦ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号６）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＡＦ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号７）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＡ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号８）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦ（Ｎｌｅ）Ｆ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号９）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭ（４−ＣｌＰｈｅ）（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号１０）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦＳＮＩＮＮＶＳＮＦ（配列番号１１）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦＡＮＩＮＮＶＡＮＦ（配列番号１２）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号１３）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦＴＮＩＮＮＶＴＮＦ（配列番号１４）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦ（ＡｌｌｙＧｌｙ）ＮＩＮＮＶ（ＡｌｌｙＧｌｙ）ＮＦ（配列番号１５）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦＶＮＩＮＮＶＶＮＦ（配列番号１６）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦｄＡＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号１７）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＡＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号１８）、
ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号１９）、
ＬＲＲＦＳＴＡＰＦｄＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＦ（配列番号２０）、
ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＷ（配列番号２１）、
ｄＬＲＲｄＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＦ（配列番号２２）、
ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮｄＦ（配列番号２３）、または
ｄＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮｄＦ（配列番号２４）
である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ペプチドは、
Ｆ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）Ｎ（配列番号２５）、
ＦＴＮＩＮＮＶＴＮ（配列番号２６）、
ＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号２７）、
ＦＳＮＩＮＮＶＳＮＦ（配列番号２８）、
ＦＡＮＩＮＮＶＡＮＦ（配列番号２９）、
Ｆ（ＡｌｌｙＧｌｙ）ＮＩＮＮＶ（ＡｌｌｙＧｌｙ）ＮＦ（配列番号３０）、
ＦＶＮＩＮＮＶＶＮＦ（配列番号３１）、
ＦＩＤＩＮＤＶＩＮＦ（配列番号３２）、
ＦＩＤＩＮＤＶＩＮＷ（配列番号３３）、
ＦＴＤＩＮＤＶＴＮ（配列番号３４）、
Ａ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号３５）、または
（４−ＣｌＰｈｅ）（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号３６）
である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ペプチドは、ナノ粒子またはマイクロ粒子と結合させられるか、またはそれに充填される、請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ナノ粒子またはマイクロ粒子は、ＰＬＧＡ・ＰＥＧを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ペプチドまたはその粒子製剤であって、前記ペプチドは、配列番号１〜３６のいずれか１つのアミノ酸配列を有し、これは、任意に配列番号５から３６から選択される配列を有するペプチドである、前記ペプチドまたはその粒子製剤。
【請求項２８】
前記製剤は、１００μｇまたは約１０００μｇのペプチド薬剤を含む、請求項２７に記載のペプチドまたは粒子製剤。
【請求項２９】
前記製剤は、粒子へのカプセル化を伴わない、請求項２８に記載の製剤。
【請求項３０】
前記製剤は、１用量当たり約１ｍｇから約１０ｍｇを含む、請求項２７に記載のペプチドまたは粒子製剤。
【請求項３１】
前記製剤は、任意に遊離ペプチドを伴う、マイクロ粒子へのカプセル化を含む、請求項３０に記載のペプチドまたは粒子製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月４日に出願された米国仮特許出願第６２／４０３，７８６号の優先権を主張するものであり、その内容全体を参照によって本明細書に組み込んだものとする。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究のもとで行われた発明に対する権利の記載
本発明は、米国国立衛生研究所によるＲ０１ＣＡ１３８２６４及び１Ｒ２１ＥＹ０２６１４８のもと政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明の一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−ＷｅｂによりＡＳＣＩＩ形式で提出した配列表を含み、参照によりその全体を本明細書に組み込んだものとする。２０１７年１０月１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、ＡＳＸ−００２ＰＣ−ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔの名称で、サイズが１３，２０４バイトである。
【背景技術】
【０００４】
Ｔｉｅ２受容体チロシンキナーゼシグナル伝達経路、ならびにそのリガンド、アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）及びアンジオポエチン２（Ａｎｇ２）は、血管透過性を調節する。網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、湿性加齢黄斑変性（湿性ＡＭＤ）、及び背景糖尿病性網膜症（ＤＲ）、ならびに多くのその他の状態を有する患者を含む、黄斑浮腫を有する患者では血管透過性が損なわれている。Ｔｉｅ２は、特に炎症の間、リンパ管の完全性も調節することができる。
【０００５】
Ａｎｇ１はＴｉｅ２と結合し、リン酸化及び下流のシグナル伝達を刺激して、血管を安定化させる。Ａｎｇ２は、Ｔｉｅ２との結合に関してＡｎｇ１と競合して、Ｔｉｅ２のリン酸化を低減するため、内因性Ｔｉｅ２アンタゴニストとして働く。虚血性または低酸素性網膜は、高レベルのＡｎｇ２を産生し、ＶＥＧＦレベルと同様にＡｎｇ２レベルがＤＭＥ患者の眼で増加する。Ａｎｇ２は、ＶＥＧＦに対する網膜血管の反応性を増加させ、血管漏出及び新血管形成を促進する。
【０００６】
Ａｎｇ２は、特に、Ａｎｇ１レベルが低いときに、Ｔｉｅ２の弱いアゴニストとして働く場合もある。特に、外因性Ａｎｇ２は、内皮細胞（ＥＣ）におけるＴｉｅ２及び遊走促進性、生存促進性ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を活性化するが、外因性Ａｎｇ１よりも効力が低く、親和性が低い。ＥＣは、Ａｎｇ２を産生するが、Ａｎｇ１は産生しない。この内因性Ａｎｇ２は、Ｔｉｅ２、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ、及びＡｋｔ活性を維持し、ＥＣの生存、遊走、及び管形成を促進する。
【０００７】
Ｔｉｅ２活性化の回復は、黄斑浮腫、ＤＭＥ、及びその他の状態を含む、浮腫ならびに血管の完全性と関連する状態に恩恵をもたらすであろう。
【発明の概要】
【０００８】
さまざまな態様及び実施形態において、本発明は、１つ以上のコラーゲンＩＶ由来生物模倣ペプチドを投与することによってＴｉｅ２関連血管透過性を処置するための方法及び組成物を提供する。そのようなペプチドは、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）のＴｉｅ２アゴニスト活性を促進し、それにより、血管系及び／またはリンパ管を安定化させることができる。さまざまな実施形態において、生物模倣ペプチドは、黄斑浮腫、湿性ＡＭＤなどの状態の処置、及びとりわけ腫瘍増殖または転移の処置または予防のために送達することができる。いくつかの実施形態において、状態は、ＶＥＧＦ遮断療法またはキナーゼ阻害剤療法に対して抵抗性であるか、または部分的にだけ反応する。例えば、本生物模倣ペプチドは、ＶＥＧＦ遮断療法がうまくいかなかった後、すなわち、血管形成、リンパ管形成、及び／または浮腫の著しい減少が観察されなかった場合に投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本ペプチドは、ＶＥＧＦ遮断療法の代替としてか、またはＶＥＧＦ遮断療法と組み合わせて投与される。Ｔｉｅ２シグナル伝達を活性化することによって、本生物模倣ペプチドまたはペプチド薬剤は、ＶＥＧＦ遮断療法、またはＶＥＧＦ遮断療法単独では観察できない治療的恩恵をもたらす。
【０００９】
コラーゲンＩＶ由来生物模倣ペプチドは、ＩＶ型コラーゲンのα５細線維から誘導される。本ペプチドは、いくつかの実施形態において、α５β１及びαＶβ３インテグリンを標的とすることができ、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ）、及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を含む、複数の受容体を介したシグナル伝達を阻害することもできる。本明細書中で開示されているとおり、コラーゲンＩＶ由来生物模倣ペプチドは、アンジオポエチン２のＴｉｅ２アゴニスト活性をさらに促進し、それにより、血管系及び／またはリンパ管を安定化させる。
【００１０】
本生物模倣ペプチドまたはペプチド薬剤は、例えば、さまざまな薬学的に許容される担体を使用して、患部組織への局所送達のため、または全身送達のために製剤化されてもよい。いくつかの実施形態において、本ペプチドは、高分子ナノ粒子またはマイクロ粒子担体を用いて製剤化され、これは、１つ以上の分解可能な結合を有する材料を含んでもよい。本ペプチドは、粒子の表面に結合させてもよく、または持続放出のために粒子内にカプセル化されてもよい。いくつかの実施形態において、粒子は、生物模倣ペプチドと共有結合した可変サイズのポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）ポリエチレングリコール（ＰＬＧＡ・ＰＥＧ）ブロックコポリマーを含む。粒子は、表面特性の調整など循環特性、体内分布、分解速度を含む所望の薬力学的利点をもたらすよう設計されてもよい。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、Ｔｉｅ２関連状態の処置のために、カプセル化活性剤をさらに含む。例えば、粒子は、長時間作用型薬物デポーを提供するため、または生物模倣ペプチドもしくはペプチド薬剤の持続放出を提供するために、有効量の生物模倣ペプチドをカプセル化するマイクロ粒子であってもよい。
【００１２】
特定の態様において、本発明は、患者におけるＴｉｅ２関連血管透過性またはリンパ管の完全性が関係する状態を予防または処置するための方法を提供する。本方法は、コラーゲンＩＶ由来生物模倣ペプチド、またはその粒子製剤を、Ｔｉｅ２依存性の血管透過性またはリンパ管の完全性を低下させるのに有効な量で患者に投与することを含む。Ｔｉｅ２活性化の回復は、黄斑浮腫、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、及び急性または慢性炎症を特徴とする状態などその他の状態を含む浮腫または血管透過性と関連する状態に治療上の利益をもたらす。Ｔｉｅ２関連状態としては、とりわけ、糖尿病黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、湿性ＡＭＤ、背景糖尿病性網膜症、がん（腫瘍増殖または転移を低減する、遅くするまたは予防するためを含む）、インフルエンザ、出血熱、脳性マラリア、アルツハイマー病、急性呼吸促迫症候群、肺水腫、喘息、ＲＳウイルス、ＣＯＰＤ、ＳＡＲＳ、肺炎、敗血症が挙げられる。
【００１３】
本発明のその他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明から明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＡＸＴ１０７（図１ではＳＰ２０４３と特定される）が、Ａｎｇ２のアゴニスト活性を促進して、Ｔｉｅ２シグナル伝達経路を活性化させることを示す。
【図２】図２Ａは、Ｔｉｅ２ならびに下流エフェクターＳＴＡＴ３、Ａｋｔ、及びＥｒｋ１／２のリン酸化を示す、Ａｎｇ２及びＡＸＴ１０７で処理した微小血管内皮細胞（ＭＥＣ）ライセートのウエスタンブロットを示し、ローディングコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。図２Ｂは、ローディングコントロールに対して調節され、Ａｎｇ２単独の対照と比較して示される図２Ａに開示されたウエスタンブロットの濃度測定分析を示すグラフである。一元配置分散分析法；Ｎ＝３；Ａｎｇ２単独の対照に対して、それぞれ、＊、＊＊＊ｐ≦０．０５及び０．００１。
【図３】図３Ａは、ＰＢＳ中の０．１％  ＢＳＡ（左列）または２００ｎｇ／ｍｌ  Ａｎｇ２（右列）で１５分間、ＡＸＴ１０７の濃度を変化させて処理し、リン酸化Ｔｉｅ２（Ｙ９９２）（緑）及びＤＡＰＩ（青）を染色したＭＥＣ単層の免疫蛍光画像を示す。白い矢印は接合部のＴｉｅ２を示す。図３Ｂは、さまざまな増殖因子及び１００μＭのＡＸＴ１０７またはＤＭＳＯビヒクルで処理し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００可溶性プール及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性プールに分取したＭＥＣライセートのウエスタンブロットを含む。図３Ｃは、図３Ｂに開示されているウエスタンブロットの濃度測定分析を示すグラフである。それぞれの棒は、同じ増殖因子の対応するビヒクル対照に対するＡＸＴ１０７処理サンプルの変化率を表し、可溶性（左の棒）及び不溶性（右の棒）によって分けられている。図３Ｄは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００分取したライセートのウエスタンブロットの代表的な画像（ｎ＝３）であり、これを、Ｔｉｅ２に関して免疫沈降させ、リン酸化Ｔｉｅ２（上部）または合計Ｔｉｅ２（下部）に関してブロットした。
【図４】図４Ａ及び図４Ｃは、さまざまな増殖因子及び１００μＭのＡＸＴ１０７またはＤＭＳＯビヒクルで処理し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００可溶性プール及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性プールに分取し、インテグリンα５に対して免疫ブロットしたＭＥＣライセートのウエスタンブロットを示す。図４Ｂ及び図４Ｄは、それぞれ図４Ａ及び図４Ｃのバンドの濃度測定分析を示すグラフである。それぞれの棒は、同じ増殖因子の対応するビヒクル対照と比較したＡＸＴ１０７処理サンプルの変化率を表し、可溶性（左の棒）及び不溶性（右の棒）によって分けられている。図４Ｅは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００分取したライセートのウエスタンブロットを示し、このライセートは、インテグリンα５に対して免疫沈降させ、インテグリンα５に対して（上部）またはインテグリンβ１に対して（下部）ブロットした。図４Ｆは、ビヒクルまたは１００μＭのＡＸＴ１０７で処理したＭＥＣ単層におけるα５インテグリンとβ１インテグリンの間の相互作用を示すＤｕｏｌｉｎｋ（商標）アッセイの代表的な画像の顕微鏡写真を示す。図４Ｇは、任意の面積当たりの相互作用を量化するグラフである。図４Ｈ及び図４Ｉは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００分取したライセートのウエスタンブロットの代表的な画像（ｎ＝３）を示す。このライセートは、Ｔｉｅ２に対して免疫沈降し、α５インテグリンに対してブロットした。図４Ｈの細胞は、２００ｎｇ／ｍｌのＡｎｇ２で処理した。Ｎ＝３。図４Ｉの細胞は、増殖因子で処理しなかった。Ｎ＝３。
【図５】図５Ａは、さまざまな濃度のＡＸＴ１０７で２００ｎｇ／ｍｌのＡｎｇ２により３時間処理したＭＥＣ単層のＶＥ−カドヘリンの代表的なウエスタンブロットを示す。ローディングコントロールとしてＧＡＰＤＨが含まれる。図５Ｂは、２００ｎｇ／ｍｌのＡｎｇ２及びさまざまな濃度のＡＸＴ１０７で処理したＭＥＣ単層の免疫蛍光画像の顕微鏡写真を示し、これは、ＶＥ−カドヘリン（緑）、Ｆ−アクチン（赤）、及びＤＡＰＩ（青）を標的とする抗体で染色され、合成された領域が黄色で示されている。矢印は、ＶＥ−カドヘリン分布の遷移を示す代表的な領域を示す。図５Ｃは、細胞当たりのＦ−アクチン範囲の平均面積を量化するグラフである。一元配置分散分析法；Ｎ＝３；Ａｎｇ２単独の対照に対して、それぞれ、＊、＊＊ｐ≦０．０５及び０．０１。図５Ｄは、２００ｎｇ／ｍｌのＡｎｇ２及びさまざまな濃度のＡＸＴ１０７で処理し、ｐＭＬＣ２に対してブロットしたＭＥＣのライセートの代表的なウエスタンブロット画像を示し、ローディングコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いた。図５Ｅは、図５Ｄに示すデータの濃度測定分析を示すグラフである。一元配置分散分析法；Ｎ＝３；Ａｎｇ２単独の対照に対して、＊＊＊ｐ≦０．００１。図５Ｆは、実施例５に記載されている経内皮透過性アッセイの概略図である。図５Ｇは、示した増殖因子及びＡＸＴ１０７による処理後の半透性支持体に播いたＭＥＣ単層を超えたＦＩＴＣデキストラン（４０ｋＤａ）遊走の量化を示すグラフである。スチューデントの両側ｔ検定；Ｎ≧７；＊ｐ≦０．０５。
【図６】ＡＸＴ１０７が関係するＴｉｅ２の活性化のモデルを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
さまざまな態様及び実施形態において、本発明は、１つ以上のコラーゲンＩＶ由来生物模倣ペプチド（複数可）を投与することによってＴｉｅ２関連血管またはリンパ管透過性を処置するための方法及び組成物を提供する。そのようなペプチドは、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）のＴｉｅ２アゴニスト活性を促進し、それにより、血管系及び／またはリンパ管を安定化させることができる。
【００１６】
コラーゲンＩＶ由来生物模倣ペプチドは、ＩＶ型コラーゲンのα５細線維から誘導される。例となるペプチドは、アミノ酸配列ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＦ（配列番号１）、またはその誘導体を含む、それからなる、または基本的にそれからなる。このペプチドはα５β１及びαＶβ３インテグリンを標的とすることが可能で、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ）、及び上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を含む、複数の受容体を介したシグナル伝達を阻害する。本明細書中で開示されているとおり、コラーゲンＩＶ由来生物模倣ペプチドは、アンジオポエチン２のＴｉｅ２アゴニスト活性をさらに促進し、それにより、血管系及び／またはリンパ管を安定化させる。
【００１７】
コラーゲンＩＶ由来生物模倣ペプチドとしては、参照によりその全体を本明細書に組み込んだものとするＵＳ９，０５６，９２３に記載されているものが挙げられる。例えば、以下の開示によるペプチドとしては、アミノ酸配列ＬＲＲＦＳＴＸＰＸＸＸＸＮＩＮＮＶＸＮＦ（配列番号２）を含むペプチドが挙げられ、ここで、Ｘは、標準的なアミノ酸または遺伝子にコードされていないアミノ酸である。いくつかの実施形態において、位置７のＸはＭ、Ａ、またはＧであり；位置９のＸは、Ｆ、Ａ、Ｙ、またはＧであり；位置１０のＸは、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｄ−アラニン（ｄＡ）、またはノルロイシン（Ｎｌｅ）であり；位置１１のＸは、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｇ、または４−クロロフェニルアラニン（４−ＣｌＰｈｅ）であり；位置１２及び位置１８のＸは、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、またはアリルグリシン（ＡｌｌｙｌＧｌｙ）から独立して選択される。さまざまな実施形態において、本ペプチドは、約３０以下のアミノ酸、または約２５以下のアミノ酸、または約２４のアミノ酸、または約２３のアミノ酸、または約２２のアミノ酸、または約２１のアミノ酸、または約２０のアミノ酸を含む。さらに他の実施形態において、配列番号２の１、２、３、４、または５つのアミノ酸が除去される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本ペプチドは、アミノ酸配列ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＦ（配列番号３）、またはその誘導体を含む。配列番号３のペプチドは、ＡＸＴ１０７またはＳＰ２０４３とも言及される。配列番号３のペプチドの誘導体としては、配列番号３に対する１から５つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を有するペプチド（例えば、まとめて１、２、３、４、または５つのアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失）が挙げられるが、いくつかの実施形態では、位置１３及び１６のＡｓｐは保持される。いくつかの実施形態において、配列ＤＩＮＤＶは、誘導体に保持される。配列番号３におけるアミノ酸置換は、任意に、配列番号１の対応する位置のＸによって占められた位置であってもよい。すなわち、ペプチドは、配列番号４：ＬＲＲＦＳＴＸＰＸＸＸＸＤＩＮＤＶＸＮＦのアミノ酸配列を有してもよく、ここで、Ｘは、標準的なアミノ酸または遺伝子にコードされていないアミノ酸である。いくつかの実施形態において、位置７のＸはＭ、Ａ、またはＧであり；位置９のＸは、Ｆ、Ａ、Ｙ、またはＧであり；位置１０のＸは、Ｍ、Ａ、Ｇ、Ｄ−アラニン（ｄＡ）、またはノルロイシン（Ｎｌｅ）であり；位置１１のＸは、Ｆ、Ａ、Ｙ、Ｇ、または４−クロロフェニルアラニン（４−ＣｌＰｈｅ）であり；位置１２及び位置１８のＸは、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、Ｇ、Ｓ、Ａ、Ｖ、Ｔ、Ｉ、Ｌ、またはアリルグリシン（ＡｌｌｙｌＧｌｙ）から独立して選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１、２、３、または４のペプチドの任意の位置で行われ、これは、保存的または非保存的置換から独立して選択されてもよい。これらの実施形態またはその他の実施形態において、本ペプチドは、（まとめて）一方または両方の末端に付加された１から１０個のアミノ酸を含む。Ｎ及び／またはＣ末端は、任意に、本明細書においてさらに詳細に記載されるとおり、別の化学基（アミンまたはカルボキシ以外、例えば、アミドまたはチオール）によって占められていてもよく、これは、ＰＥＧまたはＰＬＧＡ・ＰＥＧコポリマーを含む他の部分の結合に有用な場合がある。
【００２０】
保存的置換は、例えば、関係するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解性、疎水性、親水性、及び／または両親媒性の性質の類似性に基づいて行われてもよい。２０の遺伝子にコードされたアミノ酸は、以下の６つの標準的なアミノ酸グループに分類することができる：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００２１】
本明細書中で使用される場合、「保存的置換」は、上で示した６つの標準的なアミノ酸グループの同じグループ内に列挙されている別のアミノ酸によるアミノ酸の交換と定義される。例えば、ＡｓｐのＧｌｕによる交換は、そのように改変されたポリペプチドに１つの負電荷を保持する。さらに、グリシン及びプロリンは、α−ヘリックスを妨害する能力に基づいて互いに置換されてもよい。上記６つのグループ内のいくつかの好ましい保存的置換は、以下のサブグループ内における交換である：（ｉ）Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅ；（ｉｉ）Ｓｅｒ及びＴｈｒ；（ｉｉｉ）Ａｓｎ及びＧｌｎ；（ｉｖ）Ｌｙｓ及びＡｒｇ；及び（ｖ）Ｔｙｒ及びＰｈｅ。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、「非保存的置換」は、上で示した６つの標準的なアミノ酸グループ（１）から（６）の異なるグループに列挙されている別のアミノ酸によるアミノ酸の交換と定義される。
【００２３】
さまざまな実施形態において、生物模倣ペプチドまたはペプチド薬剤は、約８から約３０のアミノ酸、または約１０から約２０のアミノ酸のペプチドであり、配列番号１または３の少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの連続したアミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、本ペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのＤ−アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、本ペプチドは、１から約５つ（例えば、１、２、または３）の遺伝子コードされていないアミノ酸を含み、これは、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、４−クロロフェニルアラニン（４−ＣｌＰｈｅ）、及びアリルグリシン（ＡｌｌｙｌＧｌｙ）から任意に選択される。
【００２４】
本開示による例となる生物模倣ペプチドとしては、以下のものが挙げられる：
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号５）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＡＭＦ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号６）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＡＦ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号７）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＡ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号８）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦ（Ｎｌｅ）Ｆ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号９）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭ（４−ＣｌＰｈｅ）（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号１０）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦＳＮＩＮＮＶＳＮＦ（配列番号１１）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦＡＮＩＮＮＶＡＮＦ（配列番号１２）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号１３）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦＴＮＩＮＮＶＴＮＦ（配列番号１４）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦ（ＡｌｌｙＧｌｙ）ＮＩＮＮＶ（ＡｌｌｙＧｌｙ）ＮＦ（配列番号１５）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＭＦＶＮＩＮＮＶＶＮＦ（配列番号１６）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦｄＡＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号１７）、
ＬＲＲＦＳＴＭＰＦＡＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号１８）、
ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号１９）、
ＬＲＲＦＳＴＡＰＦｄＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＦ（配列番号２０）、
ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＷ（配列番号２１）、
ｄＬＲＲｄＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮＦ（配列番号２２）、
ＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮｄＦ（配列番号２３）、
ｄＬＲＲＦＳＴＡＰＦＡＦＩＤＩＮＤＶＩＮｄＦ（配列番号２４）、
Ｆ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）Ｎ（配列番号２５）、
ＦＴＮＩＮＮＶＴＮ（配列番号２６）、
ＦＩＮＩＮＮＶＩＮＦ（配列番号２７）、
ＦＳＮＩＮＮＶＳＮＦ（配列番号２８）、
ＦＡＮＩＮＮＶＡＮＦ（配列番号２９）、
Ｆ（ＡｌｌｙＧｌｙ）ＮＩＮＮＶ（ＡｌｌｙＧｌｙ）ＮＦ（配列番号３０）、
ＦＶＮＩＮＮＶＶＮＦ（配列番号３１）、
ＦＩＤＩＮＤＶＩＮＦ（配列番号３２）、
ＦＩＤＩＮＤＶＩＮＷ（配列番号３３）、
ＦＴＤＩＮＤＶＴＮ（配列番号３４）、
Ａ（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号３５）、または
（４−ＣｌＰｈｅ）（Ａｂｕ）ＮＩＮＮＶ（Ａｂｕ）ＮＦ（配列番号３６）。
【００２５】
生物模倣ペプチドまたはペプチド薬剤は、固相合成などの周知の技術を使用して、化学合成及び精製することができる。参照によりその全体を本明細書に組み込んだものとするＵＳ９，０５１，３４９を参照。
【００２６】
ペプチドは、いくつかの実施形態において、薬学的に許容される塩の形態で提供されてもよく、または特定の組織への標的送達もしくは持続送達のために、その他の構成成分と複合体形成されるか、もしくは粒子にカプセル化されてもよい。
【００２７】
生物模倣ペプチドまたはペプチド薬剤は、いくつかの実施形態において、薬学的に許容される塩として製剤化される。薬学的に許容される塩は、一般に当業者によく知られており、例として、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベシル酸塩、安息香酸塩、炭酸水素塩、重酒石酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カルンシレート、炭酸塩、クエン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストル酸塩、エシル酸、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコールリルアルサニル酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、またはテオクル酸塩を挙げることができるが、それらに限定されない。その他の薬学的に許容される塩は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  ｅｄ．）  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）に見出すことができる。薬学的に許容される塩としては、例えば、酢酸塩、安息香酸塩、臭化物、炭酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、マレイン酸塩、メシル酸塩、ナプシル酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、リン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、または酒石酸塩が挙げられる。
【００２８】
生物模倣ペプチドまたはペプチド薬剤は、例えば、水、生理的食塩水、デキストロース溶液、ヒト血清アルブミン、リポソーム、ハイドロゲル、マイクロ粒子及びナノ粒子が挙げられるが、それらに限定されないさまざまな薬学的に許容される担体を使用して、局所送達または全身送達のために製剤化されてもよい。
【００２９】
いくつかの実施形態において、有効量の生物模倣ペプチドまたはペプチド薬剤は、１用量当たり約０．１から約５０ｍｇ、またはいくつかの実施形態において、１用量当たり約０．５から約２５ｍｇ、１用量当たり約１から約１０ｍｇ、もしくは１用量当たり約１から約５ｍｇ、もしくは１用量当たり約１から約３ｍｇの範囲内にあることになる。正確な投与量は、例えば、投与経路、化合物が投与される形態、ならびに処置される医学的状態及び／または患者により決まることになる。さまざまな実施形態において、本ペプチドは、１日、１週間、もしくは１ヶ月に１から３回（例えば、１日、１週間、もしくは１ヶ月に１回）投与されるか、またはいくつかの実施形態において、２ヶ月に１回を超えず、もしくは３ヶ月に１回を超えず、もしくは４ヶ月に１回を超えず投与される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、生物模倣ペプチドまたはペプチド薬剤は、例えば、糖尿病黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、湿性加齢黄斑変性（湿性ＡＭＤ）、または糖尿病網膜症の処置のために硝子体内注射によって投与される。生物模倣ペプチドまたはペプチド薬剤を含む組成物は、ＶＥＧＦ遮断療法またはキナーゼ阻害剤療法に抵抗性であるか、または部分的にだけ反応する状態の処置のために投与されてもよい。例えば、生物模倣ペプチドは、ＶＥＧＦ遮断療法がうまくいかなかった後に投与されてもよく、及び／または一次、第一選択療法（他の薬剤を用いない）として投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本ペプチドは、約１００μｇから約１０００μｇの用量、またはいくつかの実施形態において、約２００μｇから約８００μｇの用量、もしくは約４００から約８００μｇの用量で投与される。いくつかの実施形態において、本ペプチドの用量は、約２００μｇ、約４００μｇ、約５００μｇ、約６００μｇ、約８００μｇ、または約１ｍｇである。ペプチド用量は、１ヶ月に１回、２ヶ月に１回、または３ヶ月に１回、または４ヶ月に１回、または６ヶ月に１回投与されてもよい。裸のペプチドは硝子体内注射時にデポーを形成することができるため、粒子にした製剤を用いてか、または用いずに投薬の頻度を実質的に減少させることができる。マイクロ粒子を伴う製剤は、さらに少ない頻度の投薬につながることがあり、いくつかの実施形態において、製剤は、初期用量の活性剤、それに続く、数ヶ月にわたる持続放出をもたらすために遊離型及びカプセル化タンパク質の両方を含む。マイクロ粒子製剤の非存在下においてでも、およそ１ヶ月に１回、または２ヶ月に１回、または３ヶ月に１回の頻度の硝子体内注射が可能である。いくつかの実施形態において、本ペプチド製剤は、１ｍｇから約１０ｍｇの用量のペプチド薬剤、またはいくつかの実施形態において、約１ｍｇから５ｍｇの用量のペプチド、またはいくつかの実施形態において、１ｍｇから３ｍｇの用量のペプチド薬剤をカプセル化しているマイクロ粒子を含む。
【００３１】
生物模倣ペプチドは、全身及び局所または局部投与を含む、投与のさまざまな様式のために製剤化することができる。技術及び製剤は、一般にＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  ｅｄ．）  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）に見出すことができる。バイオアベイラビリティを促進するために、本開示の組成物は、ナノ粒子またはマイクロ粒子として送達されるか、あるいはポリエチレングリコール、または抗体Ｆｃドメインもしくはアルブミンアミノ酸配列との融合物などのその他のＰＫ促進複合物に結合させられてもよい。薬剤は、例えば、徐放または持続放出形態で送達されてもよい。製剤及び投与のための技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  ｅｄ．）  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）に見出すことができる。適した経路としては、経口、頬側、吸入エアロゾルによる、舌下、直腸、経皮、経膣、経粘膜、経鼻もしくは腸投与；筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接室内、静脈内、関節内、胸骨内、滑液嚢内、肝臓内、病巣内、腫瘍内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、もしくは眼内（例えば、硝子体内）注射を含む非経口送達、またはその他の送達様式を挙げることができる。
【００３２】
注射に関して、生物模倣ペプチドまたはペプチド薬剤は、製剤化され、ハンクス液、リンゲル液、または生理的食塩緩衝液などの生理学的に適合した緩衝液などの水溶液中で希釈されてもよい。
【００３３】
経粘膜投与に関して、透過させるバリアに適した浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は、当該技術分野において知られている。
【００３４】
本組成物は、当該技術分野において周知の薬学的に許容される担体を使用して、経口投与に適した投与量に容易に製剤化することができる。そのような担体は、生物模倣ペプチドまたはペプチド薬剤が、処置される対象（例えば、患者）が経口摂取するための錠剤、丸剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化されるのを可能にする。
【００３５】
経鼻または吸入送達に関して、生物模倣ペプチドまたはペプチド薬剤は、当業者に既知の方法によって製剤化されてもよく、例えば、以下に限定されないが、生理的食塩水、ベンジルアルコールなどの保存料、吸収促進剤、及びフッ化炭素などの可溶化する、希釈する、または分散させる物質の例を含んでもよい。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本ペプチドは、高分子ナノ粒子またはマイクロ粒子担体を用いて製剤化される。例えば、いくつかの実施形態において、マイクロ粒子またはナノ粒子は、エステル結合、ジスルフィド結合、アミド結合、無水物結合、及び酵素分解の影響を受けやすい結合などの１つ以上の分解可能な結合を有する材料を含む。特定の実施形態において、マイクロ粒子またはナノ粒子は、生分解性ポリマーまたはポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ベータ−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ−３−ヒドロキシブチレート（Ｐ３ＨＢ）及びポリ（ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ヒドロキシバレラート）からなる群から選択されるポリマーのブレンドを含む。いくつかの実施形態において、粒子は、ＰＬＧＡ及びＰＢＡＥのブレンドを含む。他の実施形態において、当該技術分野において使用されるポリスチレンなどの非分解性ポリマーは、上の分解性ポリマー（複数可）と混合されて、コポリマー系をもたらす。したがって、いくつかの実施形態において、非分解性ポリマーは、生分解性ポリマーと混合される。
【００３７】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＰＬＧＡ・ＰＥＧコポリマー及び複合生物模倣ペプチドを含むナノ粒子を提供する。複合ペプチドは、配列番号１〜３６のいずれか１つのペプチドが可能である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面に結合した付加的な薬物または標的化薬剤を含む。例えば、ナノ粒子は、ＰＬＧＡ・ＰＥＧ・Ｘ及びＰＬＧＡ・ＰＥＧ・Ｙポリマーから生成されてもよく、ここで、Ｘは生物模倣ペプチドであり、Ｙは別の薬物または標的化薬剤である。標的化薬剤は、組織選択的な標的化薬剤であってもよく、またはがん細胞を含む所望の細胞種に対して選択的であってもよい。ナノ粒子は、これらの実施形態において（複合ペプチド、及び任意に付加的な標的化薬剤を有する）、上記のとおり固形腫瘍を含むがんの処置、及び膠芽腫または（トリプルネガティブ乳癌を含む）乳癌を含むがんの処置に使用されてもよい。
【００３９】
さらにまたは代わりに、（代替的なインテグリン結合部分を含む）その他の標的結合薬剤が使用されてもよく、これらとしては、抗体及びその抗原結合部分が挙げられる。標的結合のためのさまざまな形式としては、シングルドメイン抗体、組み換え重鎖抗体（ＶＨＨ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、サメ重鎖抗体（ＶＮＡＲ）、微小タンパク質（システインノットタンパク質、ノッチン）、ＤＡＲＰｉｎ、テトラネクチン、アフィボディ；トランスボディ、アンチカリン、アドネクチン、アフィリン、ミクロボディ、ペプチドアプタマー、フィロマー、ストラドボディ、マキシボディ、エヴィボディ、フィノマー、アルマジロリピートタンパク質、クニッツドメイン、アヴィマー、アトリマー、プロボディ、イムノボディ、トリオマブ、トロイボディ、ペプボディ、ワクシボディ、ユニボディ、デュオボディ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ペプチド模倣分子、または合成分子、または内容全体を参照により本明細書に組み込んだものとする米国特許または特許公開ＵＳ７，４１７，１３０、ＵＳ２００４／１３２０９４、ＵＳ５，８３１，０１２、ＵＳ２００４／０２３３３４、ＵＳ７，２５０，２９７、ＵＳ６，８１８，４１８、ＵＳ２００４／２０９２４３、ＵＳ７，８３８，６２９、ＵＳ７，１８６，５２４、ＵＳ６，００４，７４６、ＵＳ５，４７５，０９６、ＵＳ２００４／１４６９３８、ＵＳ２００４／１５７２０９、ＵＳ６，９９４，９８２、ＵＳ６，７９４，１４４、ＵＳ２０１０／２３９６３３、ＵＳ７，８０３，９０７、ＵＳ２０１０／１１９４４６、及び／またはＵＳ７，１６６，６９７、に記載されているとおりのものが挙げられる。Ｓｔｏｒｚ  ＭＡｂｓ．  ２０１１  Ｍａｙ−Ｊｕｎ；３（３）：  ３１０−３１７も参照。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、配列番号１〜３６のいずれか１つのペプチド、もしくはその誘導体、または上記のとおりのその他の結合薬剤と共有結合した可変サイズのポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）ポリエチレングリコール（ＰＬＧＡ・ＰＥＧ）ブロックコポリマーから合成される。表面に所望の密度の標的化薬剤を有するナノ粒子を作り出すために、任意の比率の複合及び非複合ポリマーのミックスが使用されてもよい。いくつかの実施形態において、生物模倣ペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含む（ＡＸＴ１０７またはＳＰ２０４３と呼ばれる）。
【００４１】
いくつかの実施形態において、粒子と結合したペプチドは、配列番号１〜３６のアミノ酸配列、またはその誘導体を有する。ナノ粒子は、いくつかの実施形態では、ＰＬＧＡ・ＰＥＧ・ペプチド複合物から形成されるか、または他の実施形態においては、ペプチドが予め形成された粒子に結合させられる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、１ｎｍから１０００ｎｍの間の任意の整数値を含む、約１ｎｍから約１０００ｎｍの範囲の少なくとも１つの寸法を有する粒子を指す（約１、２、５、１０、２０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、及び１０００ｎｍならびにその間のすべての整数及び分数）。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、少なくとも１つの寸法、例えば、約５０から約１００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、約７０から１００ｎｍの直径を有する。
【００４３】
いくつかの実施形態において、粒子は、マイクロ粒子である。「マイクロ粒子」という用語は、少なくとも約１マイクロメートル（μｍ）の範囲の少なくとも１つの寸法を有する粒子を含む。「粒子」という用語は、本明細書中で使用される場合、ナノ粒子及びマイクロ粒子を含むことを意味する。
【００４４】
粒子は、循環特性、体内分布、及び分解速度を含む、所望の薬力学的利点をもたらすよう設計されてもよい。そのようなパラメータとしては、とりわけ、大きさ、表面電荷、ポリマー組成、リガンド結合化学、及びペプチド結合密度が挙げられる。例えば、いくつかの実施形態において、粒子は、ＰＬＧＡポリマーコア、及びＰＬＧＡ・ＰＥＧコポリマーのＰＥＧ部分によって形成された親水性シェルを有し、ＰＬＧＡ・ＰＥＧポリマーの一部は、ペプチドの末端接続を有する。親水性シェルは、ＰＬＧＡ・ＰＥＧ・ＭｅＯＨポリマーなどの官能基に対して不活性なエステル末端キャップＰＬＧＡ・ＰＥＧポリマーをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、非複合ポリマーの一部またはすべては、表面特性の微細な調整をもたらすために（カルボキシなどの）その他の末端基を有する。
【００４５】
本明細書に記載されているペプチドは、任意の利用可能な処理を使用して粒子と化学的に結合させることができる。ペプチド結合のための官能基としては、ＰＥＧ−ＣＯＯＨ、ＰＥＧ−ＮＨ２、ＰＥＧ−ＳＨが挙げられる。例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  ＢｌＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９６を参照。活性化官能基としては、アルキル及びアシハロゲン化物、アミン、スルフヒドリル、アルデヒド、不飽和結合、ヒドラジド、イソシアネート、イソチオシアナート、ケトン、及び化学的結合に対して活性化することが知られているその他の基が挙げられる。あるいは、ペプチドは、小分子カップリング試薬の使用により結合されてもよい。カップリング試薬の非限定例としては、カルボジイミド、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ビスクロロエチルアミン、グルタルアルデヒドなどの二機能性アルデヒド、無水物などが挙げられる。
【００４６】
例となる実施形態において、ナノ粒子は、（ＬＡ：ＧＡ比及び／またはＰＬＧＡポリマーの分子量を調整することによって）インビボにおける特定の生分解速度を調整することができるコア（ＰＬＧＡ）を有する。いくつかの実施形態において、ＰＬＧＡは、５／９５、１０／９０、１５／８５、２０／８０、２５／７５、３０／７０、３５／６５、４０／６０、４５／５５、５０／５０、５５／４５、６０／４０、６５／３５、７０／３０、７５／２５、８０／２０、８５／１５、９０／１０、または９５／５のＬ／Ｇの組成を含む、２０：１から１：２０のＬＡ：ＧＡ比に基づく。ＰＬＧＡは、エステル結合の加水分解によって分解する。ＰＬＧＡの分解に必要とされる時間は、モノマーの比に関連し、グリコリド単位の含有量が高い程、大部分がラクチド単位と比較して、分解に必要とされる時間が短い。さらに、エステルで末端キャップされたポリマーは、（遊離カルボン酸とは対照的に）より長い分解半減期を有する。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ＰＬＧＡポリマーは、可変粒子サイズをもたらすために、約２０Ｋ、約２５Ｋ、約３０Ｋ、約４０Ｋ、約５０Ｋ、約６０Ｋ、または約７０Ｋなどの約１０Ｋから約７０Ｋの範囲の分子量を有する。ポリマーのＰＥＧ部分は、一般に２Ｋから５Ｋの範囲である。さまざまな実施形態において、ＰＬＧＡ・ＰＥＧ・ペプチドと非複合ＰＬＧＡ・ＰＥＧの比は、約１：１５から約１５：１、または約１：１０から約１０：１、または約１：５から約５：１、または約１：２から約２：１などの約１：２０から約２０：１に及ぶ。いくつかの実施形態において、ＰＬＧＡ・ＰＥＧ・ペプチド及び非複合コポリマーの比は約１：１である。いくつかの実施形態において、ポリマーの少なくとも５０％は、複合ペプチドを有する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、約５０から約２００ｎｍの範囲内、または約５０から約１００ｎｍの範囲内のサイズ（平均直径）を有する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、約−５ｍＶから約−４０ｍＶ、いくつかの実施形態において、約−１０ｍＶから約−３０ｍＶ（例えば、約−２０、約−２５、または約−３０ｍＶ）の範囲内の脱イオン化水におけるゼータ電位を有する。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、流感、アルツハイマー病、出血熱、脳性マラリア、腫瘍増殖または転移、及び本明細書に記載されているその他のものを含む、微小血管またはリンパ管漏出を特徴とする状態などの本明細書中で開示されているＴｉｅ２関連状態の処置のための活性剤であり得るカプセル化活性剤をさらに含む。これらの実施形態において、ナノ粒子は、活性剤の持続放出をもたらす。例えば、いくつかの実施形態において、活性剤は、以下の１つ以上のものなどの化学療法剤である：アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエンエストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロナート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾトシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビン。
【００４９】
ナノ粒子は、いくつかの実施形態において実質的に球状であるが、ナノ粒子は、任意に非球状であってもよい。
【００５０】
材料がどのように生物系と相互作用するかに影響を及ぼす可能性があるさまざまな物理的及び化学的特性が存在する。マイクロ粒子及びナノ粒子ベースの材料の場合、粒子の材料の選択、サイズ分布、及び形状分布が粒子の活性に影響を及ぼすすべての重要なパラメータである。粒子のサイズ及び形状の両方が、粒子が体のさまざまな細胞と相互作用する方法に影響を及ぼす可能性があることは以前に示された。例えば、粒子の形状は、さまざまな細胞種がどれほど粒子を取り込むことができるかに影響を及ぼす場合があり、この場合、楕円粒子は、通常、球状粒子よりも細胞が取り込むのが難しい。したがって、粒子の形状を伸ばすと、免疫系細胞によるなどの粒子の望ましくない取り込みを低減することができ、それにより、体における粒子の半減期を延長する。粒子サイズも、粒子を取り込み、それと相互作用する細胞の能力に影響を及ぼす。したがって、粒子ベースの系の活性の最適化は、粒子のサイズ及び形状分布を調整することによって達成することができる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ナノ粒子の寸法及び／または粒子を伸ばすための処理は、参照によりその全体を本明細書に組み込んだものとするＷＯ２０１３／０８６５００に開示されている。
【００５２】
特定の実施形態において、三次元のマイクロ粒子またはナノ粒子は、長楕円体を含み、長楕円体が方程式ａ＞ｂ＝ｃによって示すことができるよう、ｘ軸に沿った寸法（ａ）は、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）よりも大きく、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）は、ｚ軸に沿った寸法（ｃ）と実質的に等しい。他の実施形態において、楕円体は、３軸楕円体であり、３軸楕円体が方程式ａ＞ｂ＞ｃによって示すことができるよう、ｘ軸に沿った寸法（ａ）は、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）よりも大きく、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）は、ｚ軸に沿った寸法（ｃ）よりも大きい。さらに別の実施形態において、楕円体は、扁平楕円体であり、扁平楕円体が方程式ａ＝ｂ＞ｃによって示すことができるよう、ｘ軸に沿った寸法（ａ）は、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）と等しく、ｙ軸に沿った寸法（ｂ）は、ｚ軸に沿った寸法（ｃ）よりも大きい。ただし、現在開示されている非対称性粒子は、ａ＝ｂ＝ｃの実施形態を含まない。
【００５３】
さらに別の実施形態において、マイクロ粒子またはナノ粒子は、約１．１から約５の範囲の縦横比を有する。他の実施形態において、縦横比は、約５から約１０の範囲を有する。いくつかの実施形態において、縦横比は、約１．５から約３．５の範囲を有する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、粒子は、（本明細書に記載されているペプチド、及び／または別の薬剤などの）薬物カーゴをカプセル化するマイクロ粒子である。これらの実施形態において、粒子は、その表面に結合したペプチドを含んでも、または含まなくてもよい。これらの実施形態において、粒子は、ペプチドの持続放出をもたらすために長時間作用型薬物デポーを提供することができる。例となる粒子形式としては、参照により本明細書に組み込んだものとするＷＯ２０１４／１９７８９２に記載されているものが挙げられる。いくつかの実施形態において、粒子は、ポリ（ベータ−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）を含まないため、ポリマーは、基本的にＰＬＧＡ・ＰＥＧブロックコポリマーからなる。これらの粒子は、例えば、黄斑変性（例えば、湿性もしくは乾性加齢黄斑変性）または糖尿病黄斑浮腫の処置として眼内注射に使用することができる。いくつかの実施形態において、カーゴは、所望の部位に送達される活性剤の組み合わせを可能にさせる。いくつかの実施形態において、ナノ粒子は、がんの処置のために投与される。これらの実施形態またはその他の実施形態において、粒子は、約１μｍから約２５０μｍの範囲などの１μｍから５００μｍの範囲のサイズ（平均直径）を有する。粒子は、持続性ペプチドまたは薬物放出の持続時間に応じて、およそ１日に１回からおよそ６ヶ月に１回、またはおよそ１週間に１回もしくはおよそ１ヶ月に１回注射されてもよい。
【００５５】
特定の態様において、本発明は、患者におけるＴｉｅ２関連血管透過性またはリンパ管の完全性が関係する状態を予防または処置するための方法を提供する。本方法は、コラーゲンＩＶ由来生物模倣ペプチド、またはそのナノ粒子製剤を、患者にＴｉｅ２依存性の血管またはリンパ管透過性を低下させるのに有効な量で投与することを含む。Ｔｉｅ２活性化の回復は、黄斑浮腫、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、及び急性または慢性炎症を特徴とする状態などその他の状態を含む浮腫または血管透過性と関連する状態に治療上の利益をもたらす。Ｔｉｅ２関連状態としては、とりわけ、糖尿病黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症、湿性ＡＭＤ、背景糖尿病性網膜症、がん（腫瘍増殖または転移を低減する、遅くするまたは予防するためを含む）、インフルエンザ、出血熱、脳性マラリア、アルツハイマー病、急性呼吸促迫症候群、肺水腫、喘息、ＲＳウイルス、ＳＡＲＳ、肺炎、敗血症が挙げられる。
【００５６】
さまざまな実施形態において、生物模倣ペプチドは、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）遮断または阻害剤療法に抵抗性であるか、または部分的にだけ反応する（黄斑浮腫、湿性ＡＭＤ、腫瘍増殖または転移を含む）状態に対して送達することができる。ＶＥＧＦを遮断する医薬品としては、アフリベルセプト、ベバシズマブ、ラニビズマブ、及びラムシルマブ、及び類似の薬剤が挙げられ、これらは、血管形成を遅くするか、または妨げるために投与される。ＶＥＧＦが関係する生物学的活性を標的とするその他の薬剤としては、パゾパニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、アキシチニブ、ポナチニブ、レンバチニブ、バンデタニブ、レゴラフェニブ、及びカボザンチニブなどのキナーゼ阻害剤が挙げられる。
【００５７】
アフリベルセプトは、（ＺＡＬＴＲＡＰ）として、湿性黄斑変性（ＥＹＬＥＡ）、及び転移性結腸直腸癌のための処置のためのバイオ医薬品である。アフリベルセプトは、ＶＥＧＦの阻害剤であり、ヒトＶＥＧＦ受容体１及び２の細胞外ドメインの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）結合部分からなる組み換え融合タンパク質であり、これは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ部分と融合している。アフリベルセプトは、循環しているＶＥＧＦと結合し、「ＶＥＧＦトラップ」のように働いて、血管内皮増殖因子サブタイプＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｂの活性を阻害するとともに、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）と結合し、それぞれ、脈絡毛細管または腫瘍における新しい血管の成長を阻害する。
【００５８】
ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）は、新しい血管の成長を遅くする薬物である血管形成阻害剤である。ベバシズマブは、ＶＥＧＦ−Ａを阻害することによって血管形成を妨げる組み換えヒト化モノクローナル抗体である。ベバシズマブは、結腸癌、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）、腎癌、卵巣癌、乳癌、及び膠芽腫を含む、特定の転移性がんを処置するために投与される。ベバシズマブはまた、ＡＭＤ及び糖尿病網膜症を含む、眼疾患の処置のためにも使用することができる。
【００５９】
ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ）は、モノクローナル抗体フラグメント（Ｆａｂ）であり、湿性ＡＭＤの処置のために投与される。薬物は、硝子体内に（眼の硝子体液に）およそ１ヶ月に１回注射される。ラニビズマブは、ベバシズマブと同様にＶＥＧＦ  Ａを阻害することによって血管形成を阻害するモノクローナル抗体である。
【００６０】
したがって、いくつかの実施形態において、ＶＥＧＦ阻害剤は、モノクローナル抗体もしくはその抗原結合部分を含むか、またはヒトＶＥＧＦ受容体１及び／または２の細胞外ドメインを含む。例えば、生物模倣ペプチドは、ＶＥＧＦ遮断療法がうまくいかなかった後、すなわち、血管形成、リンパ管形成、及び／または浮腫の低減が観察されなかった場合に投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本ペプチドは、ＶＥＧＦ遮断療法に対する代替として投与される。さらに別の実施形態において、本ペプチドは、ＶＥＧＦ遮断療法と組み合わせて、ＶＥＧＦ遮断治療計画と同時、その前、またはその後のいずれかで投与される。Ｔｉｅ２シグナル伝達を活性化することによって、生物模倣ペプチドまたはペプチド薬剤は、ＶＥＧＦ遮断療法、またはＶＥＧＦ遮断療法単独では観察されないであろう治療的恩恵をもたらす。
【００６１】
いくつかの実施形態において、患者は、黄斑浮腫を有する。黄斑浮腫は、眼の網膜黄斑（網膜の黄色い中心領域）上または下に体液及びタンパク質沈着が集中したときに生じ、網膜を厚く、膨張させる。黄斑浮腫の原因としては、慢性または非管理の糖尿病２型（例えば、糖尿病網膜症）が挙げられ、この場合、網膜の末梢血管を含む末梢血管が体液を網膜へ漏出する。その他の原因及び／または関連する障害としては、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、慢性ぶどう膜炎、アテローム動脈硬化症、高血圧及び緑内障が挙げられる。いくつかの実施形態において、患者は、網膜静脈閉塞症を有するか、またはそのリスクがあり、それは、虚血及び浮腫のために網膜に対する重度の損傷及び失明に至る場合がある。いくつかの実施形態において、患者は、ＶＥＧＦ遮断療法と組み合わせて、またはその代替としてペプチドまたはその粒子製剤の眼内注射を受ける。
【００６２】
いくつかの実施形態において、患者は、流感を有するか、またはそのリスクがある。インフルエンザ（「流感」）は、インフルエンザウイルスが原因となる感染性疾患である。症状としては、高熱、鼻水、咽喉痛、筋肉痛、頭痛、咳、及び疲労が挙げられる。こうした症状は、一般にウイルスへの曝露の２日後に始まる。感染は、ウイルスの存在に関して咽頭、痰、または鼻を検査することによって確認することができる。ノイラミニダーゼ阻害剤（例えば、とりわけ、オセルタミビル）などの抗ウイルス薬がインフルエンザを処置するために使用されてきたが、これらは、限られた恩恵しか示しておらず、恩恵を得るためには感染の初期（例えば、症状が現れたらすぐ）に使用されなければならない。インフルエンザを有するヒトのおよそ３３％は無症状である。インフルエンザの症状は、感染のおよそ１から２日後に非常に突然始まる場合がある。通常、最初の症状は悪寒または寒気であるが、発熱も感染初期に一般的である。抗ウイルス処置は、場合によって限られた恩恵をもたらすが、ウイルス抵抗性のリスクを冒すことであり、これは、特に強力なパンデミック株において問題になるであろう。
【００６３】
ウイルスの処置に対する魅力的な代替物は、宿主応答を処置することであり、これは、薬物に対する抵抗性を生じる可能性がはるかに低く、効力のより大きなウィンドウをもたらし、さらに進んだステージの病気の処置を可能にする。宿主による主な応答の１つは、肺の微小血管漏出及び肺損傷の原因となり、場合により呼吸器不全につながる炎症反応である。微小血管漏出を阻害する抗浮腫剤は、流感の症状を回復させることができるであろう。
【００６４】
いくつかの実施形態において、ペプチドまたはそれを含む医薬組成物は、流感症状の出現の前に最初に投与される。例えば、患者は、患者サンプル中のウイルスの存在を検出する検査室の検査を使用して流感を有すると診断されてもよく、または患者は、ウイルスに曝露された後に流感のリスクがある。曝露は、感染した個人及び／または徴候を示す個人との密接な接触によって判断することができる。
【００６５】
他の実施形態において、本ペプチドまたは医薬組成物は、最初の流感症状が現れた後に最初に投与される。いくつかの実施形態において、本ペプチドまたは医薬組成物は、最初の流感症状の出現後１から４日以内（１また２日など）に投与される。本発明のこの態様によると、本ペプチドは、インフルエンザウイルスに関連する肺の浮腫を低減し、それにより、症状及び／または状態の重症度を改善する。いくつかの実施形態において、病気の全体的な長さが１、２、３、４日以上短縮される、及び／または重症度及び不快感が実質的に低減される場合がある。
【００６６】
流感を有するか、またはそのリスクがある患者の処置に対して、本明細書に記載されているペプチドまたは医薬組成物は、１日に約１から約３回などの１日に約１から約５回投与されてもよい。いくつかの実施形態において、ペプチドは、例えば、粉末もしくは溶液エアロゾルによって局所的に肺に投与されるか、または他の実施形態においては、全身投与される。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本ペプチドは、別々の薬物製剤としてまたは配合剤製品としてのいずれかで、インフルエンザに対して有効な１つ以上の抗ウイルス剤とともに投与されるか、または、１つ以上の抗炎症剤とともに投与される。例となる抗ウイルス剤としては、Ｔａｍｉｆｌｕ（登録商標）（リン酸オセルタミビル）、Ｒｅｌｅｎｚａ（登録商標）（ザナミビル）、Ｒａｐｉｖａｂ（ペラミビル）、アマンタジン、及びリマンタジンが挙げられる。抗炎症剤としては、アスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン、及びナプロキセンなどのＮＳＡＩＤが挙げられる。
【００６８】
他の実施形態において、本ペプチドまたは医薬組成物は、アルツハイマー病の処置、またはその進行を遅くするために投与される。血液脳関門（ＢＢＢ）は、血液由来産物、病原体、及び細胞の脳への侵入を制限し、これは、正常なニューロンの働き及び情報処理に不可欠である。死後の組織分析により、アルツハイマー病にＢＢＢ損傷が示された。ただし、ＢＢＢ破綻の時期は、分からないままである。生きたヒトの脳の局所ＢＢＢの透過性を定量するための高空間時間分解能を有する高度ダイナミックコントラスト強調ＭＲＩは、アルツハイマー病の初期に冒される学習及び記憶に重要な領域である海馬に年齢依存性ＢＢＢ破綻を示した。これらのデータは、ＢＢＢ破綻が老齢のヒト脳における初期の事象であり、これは、海馬で始まり、認知障害に寄与する可能性もあることを示唆する。したがって、血液脳損傷及び結果として生じる透過性の増加を阻害する薬剤は、アルツハイマー病の進行を減速することができるであろう。本明細書に記載されているペプチドまたは組成物の投与は、いくつかの実施形態において、血液脳関門の完全性を維持して、それにより、アルツハイマー病の発症または進行を遅くするか、または予防する。
【００６９】
いくつかの実施形態において、患者は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（タクリン、リバスチグミン、ガランタミン及びドネペジル）またはメマンチンから選択されてもよい、アルツハイマー病の処置のための少なくとも１つの付加的な薬剤による処置を受けている。
【００７０】
アルツハイマー病、特に初期のステージの疾患の可能性のある症状を示している患者の処置に対して、本明細書に記載されているペプチドまたは医薬組成物は、疾患の発症または進行を遅くするために１日に約１から約３回などの１日に約１から約５回投与されてもよい。初期のステージの疾患は、学習及び記憶の機能障害の増加として観察される場合が多く、これが、最終的に確定診断につながる。一部では、言語、実行機能、認知（認知障害）、または運動の実行（運動失行）の困難が記憶の問題よりも顕著である。言語の問題は、語彙の減少及び語の流暢さの低下によって特徴づけられ、口頭及び文字言語の全般的な衰えに至る。
【００７１】
他の実施形態において、患者は、出血性ウイルスによって引き起こされる出血熱または出血症候群を有するか、またはそのリスクがある。これらのうち最も有名なのは、エボラウイルス及びマールブルグウイルスである。出血は、デング熱またはラッサ熱を有するヒトでも生じる。エボラでは、この出血性症候群は、疾患においてやや遅れて生じ、一般に死の２４から４８時間前に生じる。出血を伴う症例は、劇的な場合があり、鼻、口及び体のその他の穴から起こることもある。出血に至るメカニズムは、おおざっぱな概要としてわかっており、ウイルスが肝臓によって産生される凝固因子のアップレギュレーションを引き起こし、凝固因子の数の増加が凝血塊を微小血管中で形成させ、肝臓がウイルスによる攻撃下にあるため、肝臓によって産生される凝固因子の供給が枯渇し、活性化過剰の免疫系が血管に出血を開始させる炎症性タンパク質の産生を増加させ、凝固因子の利用不能は出血が止められないことを意味する。死亡の多くは出血を伴わなくても起こるが、出血を伴う患者は非常に高い死亡率を有する。症状が最初に出現した後に投与された薬剤は、そうでなければ進行して、出血性症候群を示すであろう患者の微小血管系からの出血を止めるか、または低減することができるであろう。
【００７２】
いくつかの実施形態において、患者は、エボラウイルスまたはマールブルグウイルスを有する。例えば、患者は、発熱及び出血のしやすさの増加、及び／または顔及び胸部の潮紅、小さな赤または紫色の斑点（点状出血）などの出血熱の初期の徴候を有する場合もある。出血熱のその他の徴候及び症状としては、倦怠感、筋肉痛、頭痛、嘔吐、及び下痢が挙げられる。いくつかの実施形態において、エボラウイルスまたはその他の出血熱ウイルスの存在が患者サンプル中に確認される。いくつかの実施形態において、患者は、静脈内リバビリンなどの少なくとも１つの抗ウイルス剤もしくは抗炎症薬または出血熱の処置のための薬剤による処置を受けている。出血熱を有するか、またはそのリスクがある患者の処置に対して、本明細書に記載されているペプチドまたは医薬組成物は、疾患の進行を遅くするために、１日に約１から約３回などの１日に約１から約５回投与されてもよい。
【００７３】
さらに別の実施形態において、患者は、脳性マラリア（ＣＭ）を有するか、またはそのリスクがある。ＣＭは、熱帯熱マラリアの最も致命的な合併症の１つであり、マラリア関連死の大きな割合を占める。世界保健機関（ＷＨＯ）は、無性生殖Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ寄生虫血の存在下において、脳症の他の原因がない状態で発作の終了後または低血糖に対する補正後、少なくとも１時間持続する昏睡（痛み刺激の場所を特定できない、またはＢｌａｎｔｙｒｅ昏睡スコア≦２）とＣＭを定義する。最大７５％のＣＭ関連死が、認識されてから２４時間以内に起こる。画像化、拡散、灌流、血管造影、分光測定などのマルチモダリティ核磁気共鳴技術は、血液脳関門破壊及び出血を含む血管損傷がＣＭで起こることを示した。これらの影響は、炎症過程のためだと考えられる。Ｐｅｎｅｔら（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２００５  Ａｕｇ  １０；２５（３２）：７３５２−８）は、ＣＭのマウスモデルを使用して、ＣＭでは大幅な浮腫形成ならびに脳血流の減少が生じ、高エネルギーリン酸の減少及び脳内乳酸の増加を伴う虚血性代謝プロフィールが同時に起こることを示した。彼らはまた、大幅な血行動態の異常に対する説得力のある証拠を提供する血管造影も使用した。重要なことに、彼らは、浮腫は脳動脈を圧迫することによって虚血をさらに悪化させ、その後、最終的に死因である血流の虚脱に至ることを発見した。これらの発見は、炎症性病変及び虚血性病変が同時に存在することを示し、実験的脳性マラリアの致死的転帰における浮腫の主な役割を立証している。脳の浮腫及び／または虚血を阻害する薬剤を、寄生虫を直接標的とする抗マラリア剤と組み合わせて使用して、こうした患者の処置を向上させることもできるであろう。いくつかの実施形態において、患者は、クロロキン、メフロキン、ドキシサイクリン、またはアトバコン及び塩酸プログアニル（マラロン）の組み合わせから選択される抗マラリア療法を受ける。
【００７４】
これらの実施形態において、本ペプチドは、脳性マラリアの患者における血液脳関門及び血管の完全性を維持する。脳性マラリアを有するか、またはそのリスクがある患者の処置に対して、本明細書に記載されているペプチドまたは医薬組成物は、疾患の進行を遅くするため及び／または死亡を防ぐために、１日に約１から約３回などの１日に約１から約５回投与されてもよい。
【００７５】
他の態様において、本発明は、化学療法のために腫瘍血管系を正常化すること、または腫瘍増殖もしくは転移を予防するか、もしくは遅くすることを含む、がんを処置するための方法を提供する。血管形成は、がんを処置するための薬物標的と広く考えられてきた。ＶＥＧＦ及びその受容体ＶＥＧＦＲ２は、血管形成の重要なメディエーターである。ヒトＶＥＧＦを捕捉する抗体であるベバシズマブ、ならびにＶＥＧＦＲ２を阻害するアフリベルセプト及びラニビズマブ、及び小分子チロシンキナーゼ阻害剤がさまざまな種類のがんに対する処置として投与されてきた。その周知の血管形成促進活性に加えて、樹状細胞の成熟を阻害することによってＶＥＧＦも免疫抑制因子として働く。新生血管系を引き寄せるため、及び成熟免疫細胞の数を減少させ、リンパ球内皮輸送を調節することによって免疫系を抑制するための両方のために、腫瘍がＶＥＧＦを産生すると考えられている。いくつかの実施形態において、がんは、アフリベルセプト、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ラムシルマブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、アキシチニブ、ポナチニブ、レンバチニブ、バンデタニブ、レゴラフェニブ、及びカボザンチニブを含む、そのような薬剤に対して（例えば、１つ以上のそのような薬剤による処置の後）非応答性である。
【００７６】
いくつかの実施形態において、がんは、生殖系腫瘍、中枢神経系の腫瘍、乳癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮癌、肺癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、星細胞腫、グリオーマ、膵癌、胃癌、肝癌、結腸癌、黒色腫（進行性黒色腫を含む）、腎癌、膀胱癌、食道癌、喉頭の癌、耳下腺の癌、胆道の癌、直腸癌、子宮内膜癌、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、神経芽腫、中皮腫、副腎皮質癌、上皮癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、胚細胞腫瘍、肝芽腫、肝細胞癌、リンパ腫、黒色腫、非横紋筋肉腫軟部組織肉腫、骨肉腫、末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、及びウィルムス腫瘍から選択される肉腫、癌腫、または固形腫瘍がんである。いくつかの実施形態において、がんは、非小細胞肺癌、黒色腫、前立腺癌、転移性腎細胞癌である。
【００７７】
いくつかの実施形態において、がんは、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、膠芽腫、または肝癌である。
【００７８】
さまざまな実施形態において、患者は、初期ステージのがん（例えば、ステージＩもしくはＩＩ）を有するか、または後期ステージ（ステージＩＩＩもしくはステージＩＶ）にある場合がある。ステージＩのがんは、体の一部分に局在している。ステージＩＩのがんは、局所的に進行しており、ステージＩＩＩのがんも同じである。がんがステージＩＩまたはステージＩＩＩと指定されるかは、がんの特定のタイプによって決まる場合がある。例えば、ステージＩＩは、横隔膜の片側のみのリンパ節が冒されていることを指す場合があるのに対して、ステージＩＩＩは、横隔膜の上及び下のリンパ節が冒されていることを指す。ステージＩＩ及びＩＩＩに対する特定の基準は、したがって、診断によって異なる。ステージＩＶのがんは、他の器官または体全体に転移したか、または広がっている場合が多い。本ペプチドまたはその粒子製剤は、ステージＩもしくはＩＩのがんの進行を防ぐため、またはステージＩＩＩもしくはステージＩＶのがんの進行を遅くするか、もしくはそのさらなる進行を阻害するために投与することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、がんは、切除不可能な肝癌などの切除不可能なものである。切除不可能ながんは、転移巣の数のため、または外科的に危険な区域であるため外科的に除去できない悪性腫瘍である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、状態は、がんに対する化学療法の前の血管透過性である。例えば、生物模倣ペプチドまたはペプチド薬剤の治療計画（例えば、１から１０用量）は、腫瘍血管系及び／または腫瘍微小環境を正常化するために、がん化学療法を受ける少なくとも１週間または少なくとも２週間前に投与されてもよい。例となる化学療法剤としては、とりわけ、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエンエストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロナート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾトシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンが挙げられる。いくつかの実施形態において、生物模倣ペプチドまたはペプチド薬剤は、いくつかの実施形態においては、腫瘍内を含む非経口投与によって投与される。
【００８１】
いくつかの実施形態において、患者は、リンパ管炎（リンパ管の炎症）及びリンパ浮腫（組織におけるリンパ液の長期的な貯留、これは、一部の外科手技の副作用の場合がある）を含む、リンパ管機能不全を伴う炎症状態を有する。リンパ系は、体の中で３つの主な機能を果たす：過剰な間質液及びタンパク質を体循環へ戻す排出；細胞性及び体液性メカニズムの両方による免疫応答の調節；及び腸からの脂質の吸収。リンパ系障害は、悪性腫瘍、先天的な形成異常、胸部及び腹部手術、外傷、ならびに感染症の後に見られる。手術の現場及び危機的な看護環境において多くのリンパ系障害に直面する。ペプチドの投与は、リンパ管の完全性を回復させるか、またはその継続する低下を防ぐのに役立つ場合がある。
【００８２】
いくつかの実施形態において、状態は、毛細血管漏出症候群である。全身性毛細血管漏出症候群は、体液及びタンパク質が毛細血管から漏出し、周辺組織に流れ込み、結果として危険なほど低い血圧になる状態である。発作が頻繁に数日間継続し、緊急の看護を必要とする。
【００８３】
いくつかの実施形態において、状態は、敗血症である。敗血症は、感染症に対する体の応答が自身の組織及び器官を傷つける場合に起こる命に関わる状態である。敗血症は、感染症によって誘発される免疫応答が原因である。感染症は、最も一般的には細菌性であるが、真菌、ウイルス、または寄生生物からの可能性もある。一次感染の一般的な場所としては、肺、脳、尿路、皮膚、及び腹部器官が挙げられる。敗血症は、通常、静脈内輸液及び抗生物質により処置される。疾患の重症度が部分的に転帰を決め、死亡のリスクが高い。ペプチドの投与は、血管の完全性を回復させるか、またはその継続する低下を防いで、状態を回復させるのに役立つ場合がある。
【００８４】
いくつかの実施形態において、状態は、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺傷害（ＡＬＩ）、慢性喘息、または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの急性または慢性肺炎症を伴う。そのような実施形態において、本ペプチド組成物は、吸入により局所投与されるか、または全身投与されてもよい。
【００８５】
急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）は、肺の広汎性炎症を特徴とし、外傷、肺炎及び敗血症などの病態によって誘発される場合もある。ＡＲＤＳは、肺における毛細血管による気体の交換に関与する微小な肺胞の体液充満をもたらす肺への急性傷害によって誘発された肺水腫の形態である。ＡＲＤＳでは、これらの変化が、心不全によるものではない。臨床症候群は、肺炎、好酸球性肺炎、特発性器質化肺炎、急性線維素性器質化肺炎、及びびまん性肺胞傷害（ＤＡＤ）を含む、病理所見と関連づけられる。これらのうち、最も一般的にＡＲＤＳと関連づけられる病態は、肺組織のびまん性炎症を特徴とするＤＡＤである。組織への傷害の誘発は、通常、結果として局所的な上皮及び内皮細胞によって分泌される化学シグナル及び他の炎症性メディエーターの初期放出をもたらす。敗血症が引き起こす炎症などの炎症は、内皮機能不全、毛細血管からの体液漏出及び肺からの体液の排水障害を引き起こす。この段階では高い吸入酸素濃度が必要になる場合が多く、免疫細胞における「呼吸性バースト」を促進する場合もある。第二段階では、内皮機能不全が、細胞及び炎症性滲出物を肺胞に侵入させる。この肺水腫は、肺胞毛細血管空間の厚さを増加させて、酸素が血液に到達するために拡散しなければならない距離を増加させ、これが、ガス交換を損ない、低酸素に至り、呼吸の労力を増加させ、最終的に気腔の線維症を引き起こす。
【００８６】
いくつかの実施形態において、患者は、非心臓性肺水腫を有し、これは、任意に喘息または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）と関連づけられる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、状態は、血管浮腫または蕁麻疹である。血管浮腫は、真皮、皮下組織、粘膜及び粘膜下組織の急速な腫脹である。蕁麻疹（ｈｉｖｅｓ）として一般的に知られる蕁麻疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）は、真皮上層に生じる。血管浮腫が急速に進行する場合、気道閉塞及び窒息が起こる可能性があるため、医学的緊急事態である。いくつかの実施形態において、ペプチドの投与は、症状の重症度を低減することができる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、患者は、血管漏出症候群を有し、これは、任意に免疫療法の副作用である。毛細血管漏出症候群は、毛細血管に沿って並ぶ内皮細胞が数日間、分離すると考えられる間の自己逆行エピソードを特徴とし、循環器系から間質腔へ体液を漏出させ、結果として危険な血圧低下（低血圧）、血液濃縮、及び低アルブミン血症を生じる。
【００８９】
本開示の特定の態様において、本発明は、粒子製剤を含む、製剤のペプチド組成物を提供する。本ペプチドは、配列番号５から３６から選択される配列を有する誘導ペプチドを含む配列番号１〜３６のいずれか１つのアミノ酸配列を有してもよい。いくつかの実施形態において、本製剤は、単位用量当たり１００μｇまたは約１０００μｇのペプチド薬剤を含み、これは、任意に粒子へのカプセル化を伴わない。いくつかの実施形態において、本製剤は、単位用量当たり約１ｍｇから約１０ｍｇ（またはいくつかの実施形態においては、１から５ｍｇもしくは１から３ｍｇ）を含み、これは、任意に遊離ペプチドを伴う粒子カプセル化を含んでもよい。カプセル化されたペプチド及び遊離ペプチドの両方を提供する製剤は、初期用量（例えば、１００μｇから約１０００μｇの範囲内）を提供すると同時に、カプセル化ペプチドは、数ヶ月（例えば、３から６ヶ月以上）にわたる持続放出を提供する。いくつかの実施形態において、本ペプチド薬剤は、配列番号１、２、３、または４の配列を有する。
【００９０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに別のことを規定していない限り複数の指示対象を含む。
【００９１】
文脈から具体的に指定されるか、または明白でない限り、本明細書中で使用される場合、「または」という用語は、包括的であると理解され、「または」及び「及び」の両方を含む。
【００９２】
文脈から具体的に指定されるか、またはそれから明白でない限り、本明細書中で使用される場合、「約」という用語は、当該技術分野において正常な許容範囲内、例えば、プラスまたはマイナス１０％以内と理解される。
【００９３】
本発明は、以下の非限定的実施例によりさらに記載される。
【実施例】
【００９４】
Ａｎｇ・Ｔｉｅシグナル伝達に対するインテグリンの制御的機能を、例となるインテグリン結合生物模倣ペプチドＡＸＴ１０７を使用して下の実施例に記載する。ＡＸＴ１０７は、ＩＶ型コラーゲンの配列から誘導された２０ｍｅｒのペプチドである。ＡＸＴ１０７は、インテグリンα５β１及びインテグリンαＶβ３と強固に結合し、少なくとも増殖因子受容体ＶＥＧＦＲ２、ｃＭｅｔ、ＰＤＧＦＲβ、及びＩＧＦ１Ｒの活性を妨害する（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２０１４；４：７１３９）。
【００９５】
本明細書に記載されるとおり、ＡＸＴ１０７は、Ａｎｇ２及びＴｉｅ２を含む新規のメカニズムによって血管漏出を阻害することが分かった。ＡＸＴ１０７は、Ａｎｇ２のアゴニスト活性を強力に促進して、内皮細胞におけるＴｉｅ２、Ａｋｔ及びＳｔａｔ３のリン酸化の増加に至り、血管系の内皮細胞間のバリアを強化する。ＡＸＴ１０７は、ＩＧＦ１Ｒとβ１インテグリンの間の相互作用を妨害し、インビトロにおけるＶＥＧＦＲ２の分解を増大し、インビボにおける新生血管系の成長及び透過性を抑制する。
【００９６】
以下の実施例は、例となるインテグリン結合生物模倣ペプチドによる処置が、通常、Ａｎｇ２のインビトロ及びインビボの両方におけるＴｉｅ２に対する弱いアゴニスト活性を増強し、具体的にはＥＣ生存及びバリア機能と関連づけられる下流の標的を活性化することを示す。機構的に、ＡＸＴ１０７処置は、α５インテグリン及びβ１インテグリンを解離させて、結果としてＴｉｅ２の移動及びＥＣ・ＥＣ接合部におけるその活性化ならびにＦ−アクチン及びＶＥ−カドヘリンの再構築による単層の透過性の低下を生じる。
【００９７】
実施例１：ＡＸＴ１０７はＡｎｇ２のアゴニスト活性を強力に促進する
Ｔｉｅ２受容体チロシンキナーゼシグナル伝達経路ならびにそのリガンド、アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）及びアンジオポエチン２（Ａｎｇ２）は、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、湿性加齢黄斑変性（湿性ＡＭＤ）、及び背景糖尿病性網膜症（ＤＲ）を有する患者を含む、黄斑浮腫を有する患者において損なわれている血管透過性を調節する。Ａｎｇ１は、Ｔｉｅ２と結合し、リン酸化及び下流のシグナル伝達を刺激して、血管を安定化させる（１、２）。Ａｎｇ２は、Ｔｉｅ２との結合に関してＡｎｇ１と競合して、Ｔｉｅ２のリン酸化を低減するため、内因性Ｔｉｅ２アンタゴニストとして働く（３）。虚血性または低酸素性網膜は、高レベルのＡｎｇ２を産生し（４）、ＶＥＧＦレベルと同様にＡｎｇ２レベルがＤＭＥ患者の眼で増加する（５）。Ａｎｇ２は、ＶＥＧＦに対する網膜血管の反応性を増加させ、血管漏出及び新血管形成を促進する（６〜９）。これらの結果は、Ｔｉｅ２活性化の回復が黄斑浮腫、ＤＭＥ、及びその他を含む浮腫と関連づけられる状態に恩恵を与えることができるであろうことを示唆する。
【００９８】
Ｔｉｅ２は、特に炎症の間、リンパ管の完全性も調節することができる。特に、Ｔｉｅ２のリン酸化を増大させる分子は、場合によっては、炎症の間のリンパ管機能不全を処置するために使用することができるであろう（１０）。
【００９９】
他のデータは、特に、Ａｎｇ１レベルが低い場合に、Ａｎｇ２もＴｉｅ２の弱いアゴニストとして働くことを示唆する（１１）。外因性Ａｎｇ２は、内皮細胞（ＥＣ）においてＴｉｅ２及び遊走促進性、生存促進性ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を活性化するが、外因性Ａｎｇ１よりも効力が低く、親和性が低い。ＥＣは、Ａｎｇ２を産生するが、Ａｎｇ１は産生しない。この内因性Ａｎｇ２は、Ｔｉｅ２、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ、及びＡｋｔ活性を維持し、ＥＣの生存、遊走、及び管形成を促進する。
【０１００】
ＡＸＴ１０７は、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、及びＩＧＦ１を含む、複数の血管新生促進経路からのシグナル伝達を阻害するインテグリン結合抗血管新生生物模倣ペプチドであり、これは、コラーゲンＩＶ由来生物模倣ペプチドのクラスを表す。これらの経路の阻害は新血管形成を阻害し、ＶＥＧＦ経路の阻害は特に血管漏出を阻害する。本明細書に記載されるとおり、ＡＸＴ１０７は、Ａｎｇ２及びＴｉｅ２を含む新規のメカニズムによって血管漏出を阻害することが分かった。通常、ＤＭＥを有する患者ではＶＥＧＦレベル及びＡｎｇ２レベルの両方が増加しており、それらが協調的に新血管形成及び血管透過性を促進する。図１に示されるとおり、ＡＸＴ１０７（図面ではＳＰ２０４３と特定される）は、Ａｎｇ２のアゴニスト活性を強力に促進して、内皮細胞におけるＴｉｅ２、Ａｋｔ及びＳｔａｔ３のリン酸化の増加につながり、血管系の内皮細胞間のバリアを強化する。
【０１０１】
ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）のコンフルエントな単層を、ＥＢＭ−２を用いて一晩血清不足にした。０、１０、３２、及び１００μＭの濃度のＡＸＴ１０７による９０分間の処理後に、その細胞を１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウムで１５分間処理した。次に、その細胞を２００ｎｇ／ｍＬのアンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）で１５分間処理した。細胞溶解後に、そのライセートをｐＴｉｅ２（Ｙ９９２）、ｐＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）、及びｐＡｋｔ（Ｓ４７３）に対して免疫ブロットした。
【０１０２】
この結果は、ＡＸＴ１０７及びこのクラスの他のペプチドが、ＶＥＧＦ及び他の血管新生促進増殖因子を同時に阻害することによって、ならびにアゴニストとしてのＡｎｇ２の効力を増加させることによりＴｉｅ２のリン酸化を促進することによって、ＤＭＥ及び黄斑浮腫の他の形態を有する患者における血管漏出を抑制できるであろうことを示唆する。これは、がん、インフルエンザ、出血熱、脳性マラリア及びＴｉｅ２シグナル伝達の活性が増大することが浮腫の主な要因であるその他のものなどの、血管透過性が重要な可能性のある他の疾患にも当てはまる。
【０１０３】
参考文献
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１０．  Ｋａｊｉｙａ，  Ｋ．  Ｋｉｄｏｙａ，  Ｈ．，  Ｓａｗａｎｅ，  Ｍ．，  Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ−Ｏｋａｚａｋｉ，  Ｙ．，  Ｙａｍａｎｉｓｈｉ，  Ｈ．，    Ｆｕｒｕｓｅ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｔａｋａｋｕｒａ，  Ｎ．  Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｂｙ  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−１／  Ｔｉｅ２  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  ２０１２，  １８０：１２７３−１２８２；ＤＯＩ：  １０．１０１６／ｊ．ａｊｐａｔｈ．２０１１．１１．００８
１１．  Ｙｕａｎ，  ＨＴ，  Ｋｈａｎｋｉｎ，  ＥＶ，  Ｋａｒｕｎｍａｎｃｈｉ，  ＳＡ，  Ｐａｒｉｋｈ，  ＳＭ．  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ２  Ｉｓ  ａ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ａｇｏｎｉｓｔ／Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  Ｔｉｅ２  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９  Ａｐｒ；２９（８）：２０１１−２２．  ｄｏｉ：  １０．１１２８／ＭＣＢ．０１４７２−０８．  Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｆｅｂ  １７．
【０１０４】
実施例２：ＡＸＴ１０７はＡｎｇ２によるＴｉｅ２の活性化を増強する
この実施例では、Ａｎｇ・Ｔｉｅシグナル伝達に対するインテグリンの制御的機能を、例となるインテグリン結合生物模倣ペプチド、ＡＸＴ１０７を使用して調査した。
【０１０５】
Ｔｉｅ２シグナル伝達に対するインテグリン阻害剤ＡＸＴ１０７の効果を調査するために、フィブロネクチンコーティングシャーレ上の微小血管内皮細胞（ＭＥＣ）のコンフルエントな単層をさまざまな濃度のＡＸＴ１０７で処理した後に、Ｔｉｅ２リガンドであるＡｎｇ１またはＡｎｇ２への曝露を行った。Ａｎｇ１単独は、Ｔｉｅ２のリン酸化を引き起こした（データは示していない）が、Ａｎｇ２は、単独ではわずかな効果しか示さなかった（図２Ａ及び図２Ｂ）。
【０１０６】
驚くべきことに、ＡＸＴ１０７処理はＡｎｇ１活性には著しい影響を与えなかったが（データは示していない）、ＡＸＴ１０７及びＡｎｇ２と組み合わせて処理した細胞でＴｉｅ２リン酸化の顕著な用量依存的な増加が観察された（図２Ａの最初の行、及び図２Ｂ上部左のグラフ）。下流の生存促進性エフェクター、ＳＴＡＴ３及びＡｋｔのリン酸化も、Ａｎｇ２及びＡＸＴ１０７処理により増加した（図２Ａの２番目及び３番目の行、ならびに図２Ｂ上部右及び下部左のグラフ）。しかしながら、増殖関連因子Ｅｒｋ１／２のリン酸化は、すべての試験条件において一定のままであった（図２Ａの第４の行及び図２Ｂ下部右のグラフ）。あらゆる場合に関して、Ｔｉｅ２及び下流の標的の合計タンパク質レベルは変わらないままであり（データは示していない）、いずれのリガンドの非存在下においてもペプチド単独によってリン酸化は引き起こされなかった。
【０１０７】
ＡＸＴ１０７によるインテグリン阻害は、受容体リン酸化ならびに多くのＲＴＫに関する下流シグナル、例えば、ＶＥＧＦＲ２、ｃ−Ｍｅｔ、ＩＧＦ１Ｒ、及びＰＤＧＦＲβを著しく低減し、受容体分解の増加により合計受容体レベルを低下させた（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１４；４：７１３９）。対照的に、ＡＸＴ１０７は、明らかにインビトロ及びインビボの両方においてＡｎｇ２によるＴｉｅ２の活性化を増強し、Ｔｉｅ２の合計レベルには影響を与えない。これは、他のＲＴＫにより起こるのと同様にはＴｉｅ２に関する受容体の分解の増加が起こらないことを示唆している。
【０１０８】
これらのデータは、例となるインテグリン結合生物模倣ペプチドによる処理が、通常、Ｔｉｅ２に対するＡｎｇ２の弱いアゴニスト活性を増強するか、またはＡｎｇ２をＴｉｅ２アンタゴニストからアゴニストに変えることを示す。したがって、ＡＸＴ１０７は、特に内皮細胞（ＥＣ）生存及びバリア機能と関連づけられる下流の標的を活性化する。
【０１０９】
実施例３：ＡＸＴ１０７が関係するＴｉｅ２細胞分布の変化が受容体活性化に影響を与える
ＡＸＴ１０７はＡｎｇ２が関係するＡｋｔ及びＳＴＡＴ３のリン酸化を増強するがＥＲＫ１／２リン酸化は増強しないという発見は、ＡＸＴ１０７が、特に、細胞・細胞外基質（ＥＣＭ）界面にあるＴｉｅ２分子ではなく接合部のＴｉｅ２を活性化することを示唆している。したがって、続く実験は、ＥＣ・ＥＣＭ界面ではなくＭＥＣ単層の細胞間接合部におけるＡＸＴ１０７の効果を、免疫蛍光顕微鏡法を使用して評価する。
【０１１０】
ＡＸＴ１０７は、培地に添加されたときにペプチド複合体に自己集合することが分かった。この挙動は、マウスの眼において観察されたデポーと同様である（データは示していない）。Ａｎｇ２単独で処理したサンプルでは（図３Ａ最上部の行）、リン酸化Ｔｉｅ２は主として細胞表面にわたって弱い点状の分布として見つかった。Ａｎｇ２及びＡＸＴ１０７で処理したサンプルは、増加した全体的な蛍光強度及び細胞間接合部に沿ってＡＸＴ１０７ペプチド複合体と共存する大きなクラスターとなった再分布したリン酸化Ｔｉｅ２を有した（図３Ａの下部３行）。細胞のない領域または二次抗体単独で処理したウェルではペプチド複合体に対する緑色の蛍光シグナルが観察されなかったため、リン酸化Ｔｉｅ２のこれらの大きなクラスターは、ＡＸＴ１０７ペプチド複合体と試験抗体の間の非特異的な相互作用の結果ではなさそうである（データは示していない）。以前の報告は、Ｔｉｅ２のＡｎｇ２の活性化におけるクラスター形成の重要性を強調しており、Ａｎｇ２によるＴｉｅ２リン酸化ならびに血管安定性及び不活発の下流エフェクターの活性化の増強を説明することもできる。
【０１１１】
ＥＣ・ＥＣ接合部のＴｉｅ２は、アクチンが豊富な複合体を形成する。これは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ベースの溶解緩衝液には不溶性だが、細胞の表面に分布しているときは可溶性である。したがって、ＭＥＣ単層を、ＡＸＴ１０７、Ａｎｇ１、及びＡｎｇ２のさまざまな組み合わせで処理し、細胞ライセートをＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００ベースの溶解緩衝液に対する溶解性によって分取した。ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達がＴｉｅ２の活性を阻むことが多いため、ＶＥＧＦ１６５を含む実験も行った。それぞれの実験において、１００μＭのＡＸＴ１０７を使用した。その理由は、ＡＸＴ１０７のそれより低い濃度と比較して明白な結果をもたらすためである。
【０１１２】
免疫蛍光アッセイの観察結果と一致して（図３Ａに示されるとおり）、ＡＸＴ１０７で処理したライセートの不溶性画分でＴｉｅ２の量の増加が見つかった。量の増加は特定の増殖因子の処理とは無関係であった（図３Ｂ及び３Ｃ）。最近、接合部のＴｉｅ２の活性化に必須であることが示された共受容体であるＴｉｅ１に関しても同様の結果が得られた（データは示していない）（Ｋｏｒｈｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２０１６；１２６（９）：３４９５−３５１０）。
【０１１３】
次に、Ｔｉｅ２の不溶性画分への移動がＡｎｇ２によるＴｉｅ２の活性化に重要か否かを判断するための実験を行った。Ｔｉｅ２を、ＡＸＴ１０７とともに、またはそれを伴わずにＡｎｇ２に曝露した分取ＭＥＣライセートから免疫沈降させた後、リン酸化Ｔｉｅ２に対して免疫ブロットした。興味深いことに、リン酸化は、ペプチド処理したサンプルの不溶性画分でのみ観察された（図３Ｄ）。
【０１１４】
これらのデータは、ＡＸＴ１０７ペプチドによる処理がＥＣ・ＥＣ接合部へのＴｉｅ２の移動及びＴｉｅ２の活性化をもたらすことを示す。
【０１１５】
実施例４：ＡＸＴ１０７は、α５インテグリンサブユニットとβ１インテグリンサブユニットの間の相互作用を妨害する
α５β１インテグリンヘテロダイマー及びαＶβ３インテグリンヘテロダイマーは、ＡＸＴ１０７の一次標的である。Ｔｉｅ２を調節するためのインテグリンが関係するメカニズムの可能性を調査するために、α５インテグリンサブユニットに対して免疫ブロットした分取ＭＥＣライセートは、ＡＸＴ１０７で処理したサンプルにおいて、α５インテグリンサブユニットの部分が不溶性画分に移動したことを明らかにし（図４Ａ及び４Ｂ）、この結果は、Ｔｉｅ２（図３Ｄ）及びＴｉｅ１（データは示していない）の両方に関して観察されたものと同様である。
【０１１６】
驚くべきことに、β１インテグリンサブユニットは、長い曝露時間及び高い抗体濃度の使用にもかかわらず、不溶性画分中には全く観察されなかった（図４Ｃから４Ｅ）。これは、ＡＸＴ１０７による処理がインテグリンヘテロダイマー中のα５インテグリンサブユニットとβ１インテグリンサブユニットの間の相互作用を妨害することを示唆する。β１インテグリンがα５インテグリンサブユニットとヘテロダイマーを形成する既知の唯一のβサブユニットであるため、ここでは不溶性画分中で観察されたα５サブユニットは、α５β１以外のヘテロダイマーインテグリンペアから生じたとは考えられない。不運にも、高いバックグラウンドが免疫蛍光法によるα５インテグリン単独の視覚化を妨害した。ＡＸＴ１０７がインテグリンヘテロダイマーを解離させるという予想外の発見を考慮して、この発見をいくつかの独立したアッセイにおいて確認した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００分取したライセート中のα５インテグリンの免疫沈降は、α５インテグリンがＡＸＴ１０７処理後の不溶性画分中で観察できたが、β１との相互作用は可溶性画分でのみ見つかった（データは示していない）ことを明らかにした。したがって、Ｔｉｅ２とヘテロダイマーを形成したα５β１インテグリンの間の相互作用がＴｉｅ２をＥＣ・ＥＣＭ界面に保持するようである。これは、Ｔｉｅ２がα５サブユニットの非存在下ではβ１インテグリンと相互作用しないという報告と一致している（Ｃａｓｃｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００５；１７０（６）：９９３−１００４）。これらのインテグリンヘテロダイマーの破壊がＥＣ・ＥＣ接合部における大きなクラスターとしてのＴｉｅ２含有複合体の形成を可能にさせる。
【０１１７】
さらに、α５サブユニットとβ１サブユニットの間の相互作用の変化を、Ｄｕｏｌｉｎｋ（商標）技術を使用してさらに調査した。この技術は、α５インテグリンサブユニットとβ１インテグリンサブユニットの間の個々の相互作用を蛍光顕微鏡法により明確な斑点として視覚化することができる。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００分取調査の結果と一致して（図４Ａから４Ｅ）、α５インテグリンサブユニットとβ１インテグリンサブユニットの間の相互作用は、ビヒクル単独と比較してＡＸＴ１０７で処理した単層では著しく低減した（図４Ｆ及び図４Ｇ）。
【０１１８】
最後に、α５インテグリンサブユニットがβ１インテグリンとの解離の後にＴｉｅ２と複合体を形成したままであるか否かを判断した。図４Ｈ及び図４Ｉに示されるとおり、α５インテグリンは、Ｔｉｅ２の免疫沈降後のペプチド処理された不溶性画分中で観察された。
【０１１９】
これらのデータは、ＡＸＴ１０７ペプチドによる処理がヘテロダイマーからα５インテグリンサブユニット及びβ１インテグリンサブユニットを解離させることを示す。
【０１２０】
興味深いことに、β１インテグリンのノックダウンがＡｋｔリン酸化を低減することが示され、これは、α５インテグリンノックダウンまたはペプチド処理の結果と対照的である。可能性のある説明として、β１がインテグリンのなかで最も無差別であり、そのタンパク質レベルの低下が、比較的特異的なα５インテグリンのノックダウンまたはインテグリンレベルは一定のままであるが、阻害された条件と比較して、Ｔｉｅ２依存性及びＴｉｅ２非依存性の両方の細胞活動により影響を与える可能性がある。まとめると、これらの発見は、Ｔｉｅ２の下流のシグナル伝達経路の選択的な活性化におけるインテグリンの重要性を強調する。
【０１２１】
実施例５：ＡＸＴ１０７による処理は、内皮細胞接合部を強化し、狭くする
ＡＸＴ１０７が、α５β１インテグリンにおけるサブユニット間の相互作用の破壊によりＴｉｅ２の活性化を増強することが証明されたため、この活性の機能的結果を判断するために以下の実験を行った。
【０１２２】
Ｔｉｅ２シグナル伝達は血管透過性の主な調節因子であり、この活性の異常が黄斑浮腫及び疾患進行の増加に寄与することが知られている。特に、Ｔｉｅ２は、近傍の細胞にあるＴｉｅ２受容体とのトランス相互作用の形成及び細胞間接合部に連続的に沿ったＶＥ−カドヘリン複合体の再構築により細胞間接合部を強化する。
【０１２３】
Ａｎｇ１によるＴｉｅ２活性化の以前の報告と一致して、ＶＥ−カドヘリンの合計レベルは、３時間のＡＸＴ１０７及びＡｎｇ２処理後も変わらないままであった（図５Ａ）。しかしながら、免疫蛍光画像化は、ＶＥ−カドヘリン接合部の構造の明白な変化を明らかにした。図５Ｂに示されるとおり、低い濃度では、ＶＥ−カドヘリンの分布が不連続で、見た目がギザギザであったが、ＡＸＴ１０７の濃度が高まるにつれ段々と滑らかになった。これらの接合部のギザギザは、細胞内のアクチンの構造に関連する。ＡＸＴ１０７処理がないと（図５Ｂ、左列）、放射状のアクチン線維は細胞を横切って並んでいたが、ＡＸＴ１０７の濃度が高まるにつれより皮層になった（図５Ｂの残りの列と比較；図５Ｃも参照）。放射状のアクチンは、細胞を引っ張って離す働きをして、透過性を増加させる一方で、接合部のアクチンは同様に引っ張ることはしないため、血管透過性を低下させる。
【０１２４】
Ｔｉｅ２のリン酸化は、Ｒａｐ１・ＧＴＰアーゼ経路を刺激して、アクチン再構成と関連づけられる下流のモータータンパク質ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ２）のリン酸化の低減につながることが知られている。図５Ｄに示されるとおり、ＭＬＣ２のリン酸化は、ＡＸＴ１０７及びＡｎｇ２による処理後に用量依存的な様式で低減される。
【０１２５】
ＡＸＴ１０７による内皮細胞接合部におけるＶＥ−カドヘリン、アクチン、及びＴｉｅ２の再構築は、ペプチドによる処理が細胞間相互作用を安定化させることを示唆する。これらの接合部の完全性はまた、細胞間の間隙の大きさを制御することによる単層の透過性の調節にも重要である。ＥＣ透過性に対するＡＸＴ１０７の効果を、パーミアブルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）支持体上に播いたＭＥＣ単層を超えるＦＩＴＣ標識デキストランの経内皮拡散によってさらに調査した。アッセイの概略図を図５Ｆに示す。
【０１２６】
図５Ｇに示されるとおり、Ａｎｇ２またはＡＸＴ１０７単独による処理は、単層を超えたＦＩＴＣデキストラン拡散に影響を与えた一方で、単独またはＡｎｇ２と組み合わせたＶＥＧＦ処理は、透過性を（著しくではないが）増加させるようであった。興味深いことに、１００μＭのＡＸＴ１０７とともにプレインキュベーションした単層への単独またはＶＥＧＦと組み合わせたＡｎｇ２の添加は、増殖因子単独で処理した細胞と比較した場合に、上部チャンバーへのＦＩＴＣデキストラン拡散の著しい低下を示した。ペプチドの存在下及び非存在下においてＶＥＧＦ中で処理した単層間で、同様であるが、顕著でない傾向も観察された。
【０１２７】
これらのデータは、ＡＸＴ１０７ペプチドによる処理がＦ−アクチン及びＶＥ−カドヘリンの再構築による単層の透過性の低下をもたらすことを示す。
【０１２８】
Ｔｉｅ２シグナル伝達の調節におけるインテグリン相互作用の重要性は、これに関して自然のメカニズムが存在して、生物内で起こる可能性があることを示唆する。軟骨オリゴマー基質タンパク質（ＣＯＭＰ）・Ａｎｇ１によるＥＣの処理は、Ｔｉｅ２の接合部への移動を引き起こすことが示され、これは、その処理が未知のメカニズムによるβ１インテグリンからのＴｉｅ２の解離を刺激する可能性もあることを示唆する。興味深いことに、Ａｎｇ１及びＡｎｇ２のＣ末端の差異がβ１インテグリンとの相互作用を変化させ、そのために、Ａｎｇ２によってのみβ１インテグリンを活性化できたことが分かった。
【０１２９】
理論に縛られることを望まないが、本明細書中で開示されているデータは、ＡＸＴ１０７が関係するＴｉｅ２の活性化に対するモデルを提供する。図６の上部に示されるとおり、ＡＸＴ１０７の非存在下において、（１）Ａｎｇ２は、ＥＣ・ＥＣＭ界面にあるインテグリンα５β１ヘテロダイマーと複合したＴｉｅ２を弱く活性化し、これが、（２）増殖シグナル（例えば、ＥＲＫ１／２）を優先的に活性化する。（３）活性のＭＬＣキナーゼ（ＭＬＣＫ）は、ＭＬＣ３を活性化し、細胞内の放射状のアクチンストレス線維の形成及びＥＣ・ＥＣ細胞接合部の張力につながる。しかしながら、図６下部のＡＸＴ１０７の存在下において、（４）α５インテグリンはβ１インテグリンから分離し、（５）Ｔｉｅ２とともにＥＣ・ＥＣ接合部へ遊走して、大きな複合体及び／または接合部にわたるトランス相互作用を形成する。（６）これらの複合体は、Ｔｉｅ２のリン酸化を増強し、（７）Ａｋｔ及びＳＴＡＴ３が関係する生存経路を活性化する。さらに、（８）ＭＬＣホスファターゼは、ＲＡＰ１またはＲＡＣ１経路により活性化され、これが、低下したＭＬＣ２活性、増加した皮層のアクチン、及び安定化した接合部につながる。
【０１３０】
実施例６：インビボにおいて、例となるインテグリン結合生物模倣物はＴｉｅ２リン酸化を増強する
インビボにおけるＴｉｅ２活性化に対するＡＸＴ１０７の効果を調査するために、未熟児網膜症（ＲＯＰ）マウスモデルを使用した。この系では、生後７日の子を７５％ Ｏ２中に５日間入れ、結果として高酸素から網膜毛細血管密度の低下及び子を正常酸素条件に戻したときの新血管形成の急速な誘導が生じる。ここでは、インビボにおけるペプチドの可能性を、眼血管系モデルを使用して実証した。硝子体内のＡｎｇ２のレベルの増加は、さまざまな網膜症の血管漏出及び黄斑浮腫に寄与する。
【０１３１】
以下の例となる方法及び材料を上の実施例に使用した。
細胞培養及び試薬
ヒト皮膚微小血管内皮細胞（Ｌｏｎｚａ）を、ＥＢＭ−２ＭＶ培地（Ｌｏｎｚａ）中で３７℃及び５％ ＣＯ２に維持し、２から７の間の継代数を使用した。該当する場合、細胞を、補助剤を用いないＥＢＭ−２培地（Ｌｏｎｚａ）において血清不足にした。ＦＩＴＣデキストラン透過性アッセイに関しては、自己蛍光を避けるためにフェノールレッドを含まない培地を使用した。ＡＸＴ１０７は、固体合成によりＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅで製造し、凍結乾燥し、１００％  ＤＭＳＯに溶解させた。希釈後、好ましくは、ＤＭＳＯ濃度は０．２５％を上回らないものとした。
【０１３２】
ウエスタンブロッティング
Ａｎｇ１／２シグナル伝達調査に対して、細胞培養シャーレ（直径１０ｃｍ）を、５μｇ／ｍｌのフィブロネクチン（ＦＮ１；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で３７℃において２時間コーティングした。その後、ＦＮ１溶液を吸引によって除去し、５×１０６の微小血管内皮細胞（ＭＥＣ；Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）をＥＧＭ−２ＭＶ培地（Ｌｏｎｚａ）中に播いて、３７℃で４８時間培養した。その細胞を、その後、無血清ＥＧＭ−２基本培地（Ｌｏｎｚａ）中で１６時間血清不足にした。ＡＸＴ１０７（示したとおり０〜１００μＭ）を、その後、各培養物に添加し、３７℃で７５分間インキュベーションした。その培養物を、その後、１ｍＭのバナジン酸ナトリウム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）で１５分間処理して、リン酸化Ｔｉｅ２シグナルを増大させ、続いて、２００ｎｇ／ｍｌのアンジオポエチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）でさらに１５分間刺激を行った。その細胞を、その後、氷に移し、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含む氷のように冷たいダルベッコのリン酸緩衝生理的食塩水（ｄＰＢＳ）で２回洗浄し、５００μｌの１×Ｂｌｕｅ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）にこすり取ることによって回収した。ライセートサンプルを、その後、超音波処理し、煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。以下の一次抗体：Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  −  リン酸化Ｔｉｅ２（Ｙ９９２）（カタログ＃：４２２１）、Ｔｉｅ２（カタログ＃：７４０３）、リン酸化Ｓｔａｔ３（Ｙ７０５）（カタログ＃：４１１３）、Ｓｔａｔ３（カタログ＃：４９０４）、リン酸化Ａｋｔ（Ｓ４７３）（カタログ＃：４０５８）、Ａｋｔ（カタログ＃：９２７２）、リン酸化ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）（カタログ＃：４３７０）、ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（カタログ＃：４６９５）；ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  −  β１インテグリン（カタログ＃：６１０４６７）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  −  α５インテグリン（カタログ＃：ＡＢ１９２８）を使用してウエスタンブロットによって特異的なタンパク質を特定し、ＨＲＰ複合ヤギ抗ウサギ及びヒツジ抗マウス二次抗体（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出した。
【０１３３】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００分取
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００可溶性画分及び不溶性画分の単離を以前に示された手順に対して改変を使用して行った（例えば、Ｌａｍｐｕｇｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９５；１２９（１）：２０３−２１７を参照）。ＦＮ１コーティングされた６つのウェルプレートに２．５×１０６の細胞を播き、上記のとおり４８時間培養した。その培養物を、その後、ＥＢＭ−２培地中で９０分間血清不足にし、１００μＭのＡＸＴ１０７またはＤＭＳＯビヒクルで処理し、１ｍＭのバナジン酸ナトリウムで１５分間処理した。その細胞を、その後、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡ、４００ｎｇ／ｍｌのＡｎｇ２、またはＰＢＳのいずれかで１５分間刺激した。そのプレートを、その後、氷に移し、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含む冷えたｄＰＢＳで２回及びＥＢＭ−２培地で２回洗浄した。その後、培地を除去し、その細胞を、氷上で、２００μｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００抽出緩衝液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；２ｍＭ  ＣａＣｌ２；１％  ＮＰ−４０；１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｃ−１００；及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃：５８７１））中において、４℃で時折撹拌しながら３０分間インキュベーションした。抽出緩衝液を、穏やかに回収し、１２，０００×ｇで５分間遠心分離した。その上清を、その後、１２５μｌの３×Ｂｌｕｅ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｄｙｅと混合し、煮沸し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００可溶性画分として−２０℃で保存した。残りの不溶性画分を、洗浄緩衝液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ））で２回洗浄し、上記のとおり、こすり取り、続いて遠心分離し、煮沸することにより３７５μｌの１×Ｂｌｕｅ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｄｙｅに回収した。このライセートを、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００不溶性画分として−２０℃で保存した。サンプルを、上記のとおりのウエスタンブロットによって分析した。
【０１３４】
プルダウン変形に関して、不溶性画分を、代わりに、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及び５ｍＭのＥＤＴＡで処理したＲＩＰＡ緩衝液（Ｓｉｇｍａ）に回収した。ライセートを、短時間超音波処理し、回転混合しながら抗Ｔｉｅ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ＃：４２２４）または抗α５インテグリン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；カタログ＃：ＡＢ１９２８）とともに１時間インキュベーションした。その後、２０μｌのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａｇａｒｏｓｅ  Ａ／Ｇ  Ｂｅａｄ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を添加し、サンプルをさらに１時間インキュベーションした。ビーズを、１，５００×ｇ及び４℃で遠心分離によって回収し、ＰＢＳで４回洗浄し、ＳＤＳベースのＢｌｕｅ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｄｙｅ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に再懸濁させ、煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。
【０１３５】
免疫蛍光法
ハーフウェルサイズのガラスボトム９６ウェルプレートを、１０μｇ／ｍｌのＦＮ１により３７℃で２時間コーティングした。ＦＮ１溶液を、その後、吸引によって除去し、プレートに４×１０３のＭＥＣをＥＧＭ−２ＭＶ培地中に播いた。２４時間後、細胞を、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含むｄＰＢＳで１回洗浄して、死んだ細胞を除去し、細胞をさらに２４時間増殖させた。３時間の継続時間の処理に関して（すなわち、ＶＥ−カドヘリン）、細胞をＣａ２＋及びＭｇ２＋を含むｄＰＢＳで２回洗浄し、ＥＢＭ−２中で９０分間血清不足にした。その後、培地を除去し、細胞を、２００ｎｇ／ｍｌのＡｎｇ２またはＰＢＳを含む１００μｌのＥＢＭ−２培地でＡＸＴ１０７またはＤＭＳＯの濃度を変化させて３時間処理した。１５分処理したサンプルに関して（すなわち、リン酸化Ｔｉｅ２）、細胞を、ＥＢＭ−２培地中で１６５分間血清不足にし、ＥＢＭ−２中でＡＸＴ１０７またはＤＭＳＯの濃度を変化させて９０分間インキュベーションし、最後に、ペプチドを加えた２００ｎｇ／ｍｌのＡｎｇ２またはＰＢＳで１５分間刺激して、同じ濃度を保持した。これらの時間は、両方の処理手順が同時に完了するよう選択した。細胞を、その後、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含む冷えたｄＰＢＳで２回洗浄し、１０％中性緩衝ホルマリン中で、１５分間固定した。その後、ホルマリン溶液を除去し、ウェルをＣａ２＋及びＭｇ２＋を含むｄＰＢＳ中で３回洗浄した。その細胞を、その後、ブロッキング緩衝液中でブロッキングした（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含むｄＰＢＳ中の５％通常ヤギ血清；０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）及び抗体希釈緩衝液（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含むｄＰＢＳ中の１％  ＢＳＡ；０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中で１：１５０に希釈されたリン酸化Ｔｉｅ２（Ｙ９９２）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ＃：ＡＦ２７２０）またはＶＥ−カドヘリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；カタログ＃：２５００）に対する一次抗体で１６時間染色した。ウェルを、その後、ｄＰＢＳで３回洗浄し、抗体希釈緩衝液中で１：３００に希釈されたＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８複合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；カタログ＃：４４１２）とともに１時間インキュベーションした。その後、ウェルを２回洗浄し、ＰＢＳ中で１：２０に希釈されたＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ５５５複合ファロイジン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；カタログ＃：８９５３）で２０分間染色した。細胞を、その後、ｄＰＢＳ中で再度２回洗浄し、ＤＡＰＩで２０分間染色し、画像化のために溶液をｄＰＢＳと交換した。細胞を、ＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ  ８５５システム及びＡｔｔｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して画像化した。
【０１３６】
Ｄｕｏｌｉｎｋタンパク質相互作用分析
免疫蛍光実験に関する上記のとおり、ガラスボトム９６ウェルプレートを、ＦＮ１でコーティングし、ＭＥＣを播いた。４８時間の増殖後、細胞を、３時間血清不足にし、１００μＭのＡＸＴ１０７またはＤＭＳＯビヒクルで９０分間処理し、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含むｄＰＢＳで２回洗浄し、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定した。細胞を、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含むｄＰＢＳ中の５％通常ヤギ血清；０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００において１時間ブロッキングし、１％  ＢＳＡ及び０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を伴うＣａ２＋及びＭｇ２＋を含むＰＢＳ中のウサギ抗α５インテグリン及びマウス抗β１インテグリン抗体とともに４℃で一晩インキュベーションした。相互作用箇所を、製造業者の説明書に従ってＤＵＯＬＩＮＫグリーン検出試薬を使用して顕出させ、ＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ  ８５５システムを使用して検出した。
【０１３７】
ＦＩＴＣ  ｔｒａｎｓｗｅｌｌ透過性アッセイ
Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、２４ウェルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、７．５μｇ／ｃｍ２のＦＮ１で３７℃において２時間コーティングし、吸引し、その後、室温で３０分間乾燥した。その後、１００μｌのＥＢＭ−２培地（フェノールレッドを含まない）中の７．５×１０４のＭＥＣをウェルに播き、室温で３０分間沈降させた。その後、１ｍｌのＥＧＭ−２培地を、下部チャンバー及びさらに２００μｌを上部チャンバーに添加した。プレートを、３７℃で２４時間インキュベーションした後、培地を吸引し、さらに７．５×１０４のＭＥＣを各ウェルに上記のとおりに播いた。３７℃で４８時間後、培地を両チャンバーから吸引し、細胞を、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含むｄＰＢＳ中で２回、ＥＢＭ−２培地（フェノールレッドを含まない）で１回洗浄し、両チャンバーに利用したＥＢＭ−２培地中において３７℃で２時間血清不足にした。このインキュベーションの後、１００μＭのＡＸＴ１０７または同等量のＤＭＳＯビヒクルを添加し、さらに９０分間インキュベーションした。上部チャンバーにおいて、細胞を、その後、２００ｎｇ／ｍｌのＡｎｇ２、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦＡ、その両方、またはＰＢＳ対照で処理し、下部チャンバーにおいて、細胞を、その後、２５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣデキストラン（４０ｋＤａ  ＭＷ）で処理した。ＡＸＴ１０７も両チャンバーに添加して、１００μＭの濃度を維持する。３時間後、１０μｌを各ウェルの上部チャンバーから除去し、クリアボトム９６ウェルプレートにおいて９０μｌの水と混合した。各サンプルに対する蛍光値を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒプレートリーダーを使用して算出した。
【０１３８】
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Ｂｅｎｅｓｔ  ＡＶ，  Ｋｒｕｓｅ  Ｋ，  Ｓａｖａｎｔ  Ｓ，  Ｔｈｏｍａｓ  Ｍ，  Ｌａｉｂ  ＡＭ，  Ｌｏｏｓ  ＥＫ，  Ｆｉｅｄｌｅｒ  Ｕ  ａｎｄ  Ａｕｇｕｓｔｉｎ  ＨＧ．  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅａｋａｇｅ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１３；８（８）：ｅ７０４５９．
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Ｄａｌｙ  Ｃ，  Ｐａｓｎｉｋｏｗｓｋｉ  Ｅ，  Ｂｕｒｏｖａ  Ｅ，  Ｗｏｎｇ  Ｖ，  Ａｌｄｒｉｃｈ  ＴＨ，  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ｊ，  Ｉｏｆｆｅ  Ｅ，  Ｄａｌｙ  ＴＪ，  Ｆａｎｄｌ  ＪＰ，  Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  Ｎ，  ＭｃＤｏｎａｌｄ  ＤＭ，  Ｔｈｕｒｓｔｏｎ  Ｇ，  Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ  ＧＤ  ａｎｄ  Ｒｕｄｇｅ  ＪＳ．  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａｎ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｓｔｒｅｓｓｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００６；１０３（４２）：１５４９１−１５４９６．
Ｙｕａｎ  ＨＴ，  Ｋｈａｎｋｉｎ  ＥＶ，  Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉ  ＳＡ  ａｎｄ  Ｐａｒｉｋｈ  ＳＭ．  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ２  ｉｓ  ａ  ｐａｒｔｉａｌ  ａｇｏｎｉｓｔ／ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  Ｔｉｅ２  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００９；２９（８）：２０１１−２０２２．
Ｋｏｒｈｏｎｅｎ  ＥＡ，  Ｌａｍｐｉｎｅｎ  Ａ，  Ｇｉｒｉ  Ｈ，  Ａｎｉｓｉｍｏｖ  Ａ，  Ｋｉｍ  Ｍ，  Ａｌｌｅｎ  Ｂ，  Ｆａｎｇ  Ｓ，  Ｄ’Ａｍｉｃｏ  Ｇ，  Ｓｉｐｉｌａ  ＴＪ，  Ｌｏｈｅｌａ  Ｍ，  Ｓｔｒａｎｄｉｎ  Ｔ，  Ｖａｈｅｒｉ  Ａ，  Ｙｌａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ  Ｓ，  Ｋｏｈ  ＧＹ，  ＭｃＤｏｎａｌｄ  ＤＭ，  Ａｌｉｔａｌｏ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｅ１  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２０１６；１２６（９）：３４９５−３５１０．
Ｓｈｅｎ  Ｊ，  Ｆｒｙｅ  Ｍ，  Ｌｅｅ  ＢＬ，  Ｒｅｉｎａｒｄｙ  ＪＬ，  ＭｃＣｌｕｎｇ  ＪＭ，  Ｄｉｎｇ  Ｋ，  Ｋｏｊｉｍａ  Ｍ，  Ｘｉａ  Ｈ，  Ｓｅｉｄｅｌ  Ｃ，  Ｌｉｍａ  ｅ  Ｓｉｌｖａ  Ｒ，  Ｄｏｎｇ  Ａ，  Ｈａｃｋｅｔｔ  ＳＦ，  Ｗａｎｇ  Ｊ，  Ｈｏｗａｒｄ  ＢＷ，  Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ  Ｄ，  Ｋｏｎｔｏｓ  ＣＤ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＶＥ−ＰＴＰ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＴＩＥ２  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ  ｔｈｅ  ｏｃｕｌａｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２０１４；１２４（１０）：４５６４−４５７６．
Ｓｉｎｇｈ  Ｈ，  Ｍｉｌｎｅｒ  ＣＳ，  Ａｇｕｉｌａｒ  Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ＭＭ，  Ｐａｔｅｌ  Ｎ  ａｎｄ  Ｂｒｉｎｄｌｅ  ＮＰ．  Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｔｉｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．  ２００９；２１（８）：１３４６−１３５０．
Ｃａｓｃｏｎｅ  Ｉ，  Ｎａｐｉｏｎｅ  Ｌ，  Ｍａｎｉｅｒｏ  Ｆ，  Ｓｅｒｉｎｉ  Ｇ  ａｎｄ  Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ  Ｆ．  Ｓｔａｂｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｌｐｈａ５ｂｅｔａ１  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  Ｔｉｅ２  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ａｎｇ−１．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００５；１７０（６）：９９３−１００４．
Ｌｅｅ  Ｅ，  Ｌｅｅ  ＳＪ，  Ｋｏｓｋｉｍａｋｉ  ＪＥ，  Ｈａｎ  Ｚ，  Ｐａｎｄｅｙ  ＮＢ  ａｎｄ  Ｐｏｐｅｌ  ＡＳ．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ａ  ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２０１４；４：７１３９．
Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ  ＥＤ  ａｎｄ  Ｐｏｐｅｌ  ＡＳ．  Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００８；１０５（３７）：１３７７５−１３７８０．
Ｃｈｅｎ  ＴＴ，  Ｌｕｑｕｅ  Ａ，  Ｌｅｅ  Ｓ，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＳＭ，  Ｓｅｇｕｒａ  Ｔ  ａｎｄ  Ｉｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅ  ＭＬ．  Ａｎｃｈｏｒａｇｅ  ｏｆ  ＶＥＧＦ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｏｎｖｅｙｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１０；１８８（４）：５９５−６０９．
Ｓｏｌｄｉ  Ｒ，  Ｍｉｔｏｌａ  Ｓ，  Ｓｔｒａｓｌｙ  Ｍ，  Ｄｅｆｉｌｉｐｐｉ  Ｐ，  Ｔａｒｏｎｅ  Ｇ  ａｎｄ  Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ  Ｆ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｌｐｈａｖｂｅｔａ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２．  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９９９；１８（４）：８８２−８９２．
Ｖｅｅｖｅｒｓ−Ｌｏｗｅ  Ｊ，  Ｂａｌｌ  ＳＧ，  Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈ  Ａ  ａｎｄ  Ｋｉｅｌｔｙ  ＣＭ．  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｌｐｈａ５ｂｅｔａ１−ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＤＧＦＲ−ｂｅｔａ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  ２０１１；１２４（Ｐｔ  ８）：１２８８−１３００．
Ｒａｈｍａｎ  Ｓ，  Ｐａｔｅｌ  Ｙ，  Ｍｕｒｒａｙ  Ｊ，  Ｐａｔｅｌ  ＫＶ，  Ｓｕｍａｔｈｉｐａｌａ  Ｒ，  Ｓｏｂｅｌ  Ｍ  ａｎｄ  Ｗｉｊｅｌａｔｈ  ＥＳ．  Ｎｏｖｅｌ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｎ  ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ａｎｄ  ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ａ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｍｅｔ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  ＢＭＣ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００５；６（１）：８．
Ｂａｒｏｎ  Ｖ  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｍ．  Ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２０００；２７５（５０）：３９３１８−３９３２３．
Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ  ＰＡ，  Ｋｈａｎａｎｉ  Ａ，  Ｓｉｎｇｅｒ  Ｍ，  Ｐａｔｅｌ  Ｓ，  Ｂｏｙｅｒ  Ｄ，  Ｄｕｇｅｌ  Ｐ，  Ｋｈｅｒａｎｉ  Ｓ，  Ｗｉｔｈｅｒｓ  Ｂ，  Ｇａｍｂｉｎｏ  Ｌ，  Ｐｅｔｅｒｓ  Ｋ，  Ｂｒｉｇｅｌｌ  Ｍ  ａｎｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ｔ−Ｓ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｂｅｎｅｆｉｔ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｍａｃｕｌａｒ  Ｅｄｅｍａ  ｆｒｏｍ  ＡＫＢ−９７７８  Ｔｉｅ２  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ．  ２０１６；１２３（８）：１７２２−１７３０．
Ｏｒｆａｎｏｓ  ＳＥ，  Ｋｏｔａｎｉｄｏｕ  Ａ，  Ｇｌｙｎｏｓ  Ｃ，  Ａｔｈａｎａｓｉｏｕ  Ｃ，  Ｔｓｉｇｋｏｓ  Ｓ，  Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｕ  Ｉ，  Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｕ  Ｃ，  Ｚａｋｙｎｔｈｉｎｏｓ  Ｓ，  Ａｒｍａｇａｎｉｄｉｓ  Ａ，  Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｒｏｕｓｓｏｓ  Ｃ．  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｓｅｐｓｉｓ：  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ．  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ２００７；３５（１）：１９９−２０６．
Ｚｉｅｇｌｅｒ  Ｔ，  Ｈｏｒｓｔｋｏｔｔｅ  Ｊ，  Ｓｃｈｗａｂ  Ｃ，  Ｐｆｅｔｓｃｈ  Ｖ，  Ｗｅｉｎｍａｎｎ  Ｋ，  Ｄｉｅｔｚｅｌ  Ｓ，  Ｒｏｈｗｅｄｄｅｒ  Ｉ，  Ｈｉｎｋｅｌ  Ｒ，  Ｇｒｏｓｓ  Ｌ，  Ｌｅｅ  Ｓ，  Ｈｕ  Ｊ，  Ｓｏｅｈｎｌｅｉｎ  Ｏ，  Ｆｒａｎｚ  ＷＭ，  Ｓｐｅｒａｎｄｉｏ  Ｍ，  Ｐｏｈｌ  Ｕ，  Ｔｈｏｍａｓ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ２  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｓｅｐｓｉｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２０１３．
Ｈａｎ  Ｓ，  Ｌｅｅ  ＳＪ，  Ｋｉｍ  ＫＥ，  Ｌｅｅ  ＨＳ，  Ｏｈ  Ｎ，  Ｐａｒｋ  Ｉ，  Ｋｏ  Ｅ，  Ｏｈ  ＳＪ，  Ｌｅｅ  ＹＳ，  Ｋｉｍ  Ｄ，  Ｌｅｅ  Ｓ，  Ｌｅｅ  ＤＨ，  Ｌｅｅ  ＫＨ，  Ｃｈａｅ  ＳＹ，  Ｌｅｅ  ＪＨ，  Ｋｉｍ  ＳＪ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ  ｂｙ  ＴＩＥ２  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．  ２０１６；８（３３５）：３３５ｒａ３５５．
Ｌａｍｐｕｇｎａｎｉ  ＭＧ，  Ｃｏｒａｄａ  Ｍ，  Ｃａｖｅｄａ  Ｌ，  Ｂｒｅｖｉａｒｉｏ  Ｆ，  Ａｙａｌｏｎ  Ｏ，  Ｇｅｉｇｅｒ  Ｂ  ａｎｄ  Ｄｅｊａｎａ  Ｅ．  Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｏ  ｃｅｌｌ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ：  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｋｏｇｌｏｂｉｎ，  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ，  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−ｃａｔｅｎｉｎ  ｗｉｔｈ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃａｄｈｅｒｉｎ（ＶＥ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９５；１２９（１）：２０３−２１７．
【図１】
2019535651.tif 000003
【図２】
2019535651.tif 000004
【図３−１】
2019535651.tif 000005
【図３−２】
2019535651.tif 000006
【図４−１】
2019535651.tif 000007
【図４−２】
2019535651.tif 000008
【図５−１】
2019535651.tif 000009
【図５−２】
2019535651.tif 000010
【図６】
2019535651.tif 000011
【配列表】
2019535651000001.app
【国際調査報告】
2019535651.tif 000012
2019535651.tif 000013
2019535651.tif 000014