(57)【要約】  本発明は、生体適合性ナノ粒子及びその使用に関するもので、より詳細には、多糖、その誘導体及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれたいずれか一つ以上の物質の水溶液に電子ビームを照射して、分子間架橋結合又は分子内架橋結合を誘導して形成された生体適合性ナノ粒子及びその薬剤伝達体、造影剤、診断剤、腸癒着防止剤又は疾病の予防及び治療の使用に関する発明である。  本発明の生体適合性ナノ粒子は、有機溶媒又は架橋剤の混入による人体内の毒性問題が発生する心配が全くなく、その製造工程の中で、別の精製工程が不要なため、短時間の電子ビーム照射だけで大量生産が可能であり、生産性の面でも極めて優れている。また、本発明のナノ粒子は、薬剤伝達体、薬学的組成物、造影剤組成物、腸癒着防止剤等、多方面で活用きるという点で極めて有用である。
2019507730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖、その誘導体及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれたいずれか一つ以上の分子間架橋結合又は分子内架橋結合だけで形成されたことを特徴とする生体適合性ナノ粒子。
【請求項２】
前記生体適合性ナノ粒子は、多糖又はその誘導体の分子間架橋結合又は分子内架橋結合だけで形成されたことを特徴とする請求項1記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記生体適合性ナノ粒子は、多糖又はその誘導体がポリエチレングリコールと分子間架橋結合によって形成されたことを特徴とする請求項1記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記多糖は、キトサン、ゼラチン、コラーゲン、マンナン、デキストラン硫酸、α-シクロデキストリン、β-シクロデキストリン、γ-シクロデキストリン、フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、イヌリン、ヒアルロン酸、アルギン酸、グリコーゲン、アミロース、カルボキシメチルデキストラン、ベータグルカン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、フコイダン及びコンドロイチンからなる群から選ばれた一つ以上であることを特徴とする請求項1記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記ナノ粒子は、（a)水に多糖、その誘導体及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれたいずれか一つ以上の物質を添加して溶液を製造する段階；及び(b)前記（a)段階で生成された溶液に電子ビームを照射して、前記の物質を架橋結合させる段階を含む方法によって製造されたことを特徴とする請求項1記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記方法は、架橋剤及び有機溶媒を使用しないことを特徴とする請求項5記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記電子ビームの強度は、5乃至250kGyの照射量で照射されることを特徴とする請求項3記載のナノ粒子。
【請求項８】
請求項1乃至請求項7のいずれか一つの項のナノ粒子に核酸、タンパク質、多糖類及び薬剤からなる群から選ばれたいずれか一つ以上が結合されたことを特徴とする薬剤伝達体。
【請求項９】
前記薬剤は、抗生剤、抗癌剤、鎮痛剤、消炎剤、鎮咳剤、去痰剤、鎮静剤、筋肉弛緩剤、癲癇治療剤、潰瘍治療剤、抗うつ剤、抗アレルギー剤、強心剤、抗不整脈剤、血管拡張剤、降圧利尿剤、糖尿病治療薬、凝固防止剤、止血剤、抗結節剤、ホルモン剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれた一つ以上であることを特徴とする請求項8記載の薬剤伝達体。
【請求項１０】
前記薬剤伝達体に放射性同位元素、有機蛍光物質、無機物質の量子ドット、磁気共鳴画像造影剤、コンピュータ断層撮影造影剤、陽電子断層撮影造影剤、超音波造影剤及び蛍光造影剤からなる群から選ばれた一つ以上の標識物質が標識されていることを特徴とする請求項8記載の薬剤伝達体。
【請求項１１】
請求項8の薬剤伝達体を有効成分として含む薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項1乃至請求項7のいずれか一つの項のナノ粒子に放射性同位元素、有機蛍光物質、無機物質の量子ドット、磁気共鳴画像造影剤、コンピュータ断層撮影造影剤、陽電子断層撮影造影剤、超音波造影剤及び蛍光造影剤からなる群から選ばれた一つ以上の標識物質を標識したナノ粒子及び薬学的に許容される担体又は添加剤を含む造影剤組成物。
【請求項１３】
（a)水に多糖、その誘導体及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれたいずれか一つ以上の物質を添加して溶液を製造する段階;及び（b)前記（a)段階で生成された溶液に電子ビームを照射して、前記物質を架橋結合させる段階を含む、生体適合性ナノ粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2016年1月20日に出願された大韓民国特許出願第10-2016-0007104号に基づく優先権を主張し、前記明細書全体は参照により本出願に援用する。
【０００２】
本発明は、生体適合性ナノ粒子及びその使用に関するもので、より詳細には、多糖(polysaccharide)、その誘導体及びポリエチレングリコール(polyethylene glycol、PEG)からなる群から選ばれたいずれか一つ以上の物質の水溶液に電子ビームを照射して、分子間架橋結合(inter-molecular cross-linking)又は分子内架橋結合(intra-molecular cross-linking)を誘導して形成された、生体適合性ナノ粒子及びその薬剤伝達体、造影剤、診断剤、腸癒着防止剤又は疾病の予防及び治療使用に関する発明である。
【背景技術】
【０００３】
極めて小さく、一定の大きさを維持する粒子を迅速かつ効率的に製造する技術は、多くの産業分野で求められている。一定の大きさを維持する小さな粒子は、多くの長所を有していて、その中でも特に、流動性が良く、粒子間の相互作用において偏差が殆どないという点は、産業的に極めて有用な長所となる。例えば、医薬産業において、治療剤粒子の大きさは、分解速度、生物学的能力、剤形(formulation)等において極めて重要な要素となるので、治療剤粒子間の相互作用において偏差が少なくなるほど、治療剤の全体的な安定性は良くなる。
【０００４】
医薬品において、治療剤の粒子の大きさをナノ粒子にすると、次のような長所がある。まず、経口投与の際、腸内での吸収率が小さい薬剤において、粒子の大きさが大きい場合よりも多く吸収されることができ、結果的に治療剤の生物学的効率を増加させることができる。また、経口投与のみが可能であった薬剤を、吸込み型で患者に投与可能になるように、治療剤剤形の形態を多様にすることができる。また、治療剤の放出速度は、徐放性治療剤の剤形において極めて重要な要素であるところ、治療粒子の大きさをナノ粒子にすると、その大きさが相対的に均一になることにより、治療剤の放出速度が予測可能となり、より効果的な治療剤を製造することができるようになる。
【０００５】
前記の通り、均一なナノ粒子は多様な長所を有するため、活性物質をナノ粒子として製造するための多様な試みが今まで続いてきた。例えば、Takashi Hirokawaらは、特許文献１で塩化ナトリウムとポリオール化合物を活性物質と混合して、粉砕媒体無しで湿式ミリング工程を行うことにより、ナノ単位の活性物質を得る工程を提示した。これらの工程では大量の塩化ナトリウム及びポリオール化合物を使用するため、得られたナノ粒子を医薬品として使用するためには、塩化ナトリウム及びポリオール化合物を除去する工程が必須的に遂行されなければならないという問題がある。特許文献２では、難溶性医薬品に2.5倍以上の低分子の糖又は糖アルコールを混合して、これを乾式粉砕して、難溶性医薬品の微細粒子を製造する方法について記述している。しかし、この方法では、大量の糖を使用するため、実際の医薬品に適用するためには、粉砕された混合物を水に分散した後、濾過して糖を除去して、これを再乾燥しなければならないと言う問題点がある。特許文献３は、活性物質を有機溶媒に溶かし、これを界面活性剤が溶けている水溶液に噴射することにより微粒子を製造する方法を開示している。
【０００６】
また、治療用タンパク質や薬剤を生体内に伝達するために使用される殆どのナノ粒子は、有機溶媒を使用するエマルジョン蒸発（emulsion evaporation）法を通じて製造されるので、製造から乾燥までの製造工程が複雑で時間がかかり、有機溶媒の使用に伴うコストも増加し、また、有機溶媒の使用に伴って生体内に問題を引き起こす可能性がある（非特許文献１〜３)。
【０００７】
一方、水和ゲル(hydrogel)は、高分子が架橋結合された3次元網状構造(polymeric network)の高分子物質であって、外部から流体を吸収する膨潤特性を有する。従って、生体組織のように水分や生体液を多量に含有することができ、他の合成物質よりも柔らかく、生体適合性が優れているので、医療及び製薬分野で広く研究されてきた。このような水和ゲルは、一般的に高分子物質に架橋剤及び／又は硬化剤等の化学物質を添加して架橋する方法で製造されてきた。しかしながら、前記架橋反応に使用される架橋剤及び／又は硬化剤自体が生体に有害であるため、このような架橋剤及び／又は硬化剤を使用して製造された水和ゲルが生体に使用される場合に、有害な作用を引き起こす可能性がある。特に、このような水和ゲルは、医療及び製薬用材料、例えば、創傷被覆材(wound dressing)、薬剤送達キャリア(drug delivery carrier)、コンタクトレンズ、軟骨、腸癒着防止剤等の使用に適さない。
【０００８】
また、架橋剤及び／又は硬化剤が使用される場合には、水和ゲル製造後に水和ゲル内の残留架橋剤及び／又は硬化剤を回収しなければならないので、製造工程が複雑になるだけでなく、コストが上昇する問題がある。そこで、架橋剤及び／又は硬化剤を使用せずに、ナノメートルサイズの高分子由来のハイドロゲルを製造するための努力が続けられており、このような努力の成果により、合成高分子(synthetic polymer)に放射線を照射することにより、ナノメートルサイズのハイドロゲルを製造した成果が報告されている。
【０００９】
しかし、合成高分子由来のナノハイドロゲルは、生体適合性(biocompatibility)及び生分解性(biodegradable)の面で医薬学的用途に活用されるには適していないので、架橋剤、硬化剤、有機溶媒等を使用せず、多糖又はオリゴ糖の分子内又は分子間架橋結合のみによって形成されたナノ粒子の開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００８／１２６７９７号
【特許文献２】米国特許第５２０２１２９号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００４／００６７２５１号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】TG Park, et al., Biomacromolecules 8（2007）650-656
【非特許文献２】TG Park, et al., Biomacromolecules 7（2006）1864-1870
【非特許文献３】DT Birnbaum, et al., J. Control. Rel.65（2000）375-387
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
そこで、本発明者らは、多糖、その誘導体又はポリエチレングリコールの他には、如何なる人工的な架橋剤又は有機溶媒も使用せず、ただ電子ビームのみを用いてナノ粒子を製造することにより、多糖、この誘導体及びPEGからなる群から選ばれたいずれか一つ以上の、分子間又は分子内結合のみからなる、純粋な生体適合性ナノ粒子を製造できることを発見して、本発明を完成した。
【００１３】
従って、本発明の目的は、多糖、その誘導体及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれたいずれか一つ以上の、分子間架橋結合又は分子内架橋結合だけで形成されたことを特徴とする、生体適合性ナノ粒子を提供することである。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記生体適合性ナノ粒子に核酸、タンパク質、多糖類及び薬剤からなる群から選ばれたいずれか一つ以上が結合されたことを特徴とする、薬剤伝達体を提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記薬剤伝達体を有効成分として含む、薬学的組成物を提供することである。
【００１６】
本発明の他の目的は、前記ナノ粒子に放射性同位元素、有機蛍光物質、無機物質である量子ドット（Quantum dots）、磁気共鳴画像(MRI)造影剤、コンピュータ断層撮影(CT)造影剤、陽電子断層撮影(PET)造影剤、超音波造影剤及び蛍光造影剤からなる群から選ばれた一つ以上の標識物質を標識したナノ粒子及び薬学的に許容される担体又は添加剤を含む、造影剤組成物を提供することである。
【００１７】
本発明の他の目的は（a)水に多糖、その誘導体、ポリエチレングリコールからなる群から選ばれたいずれか一つ以上の物質を添加して溶液を製造する段階；（b)前記（a)段階で生成された溶液に電子ビームを照射して、前記物質を架橋結合させる段階を含む、生体適合性ナノ粒子の製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
［技術的解決方法］
前記本発明の目的を達成するために、本発明は多糖、その誘導体及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれたいずれか一つ以上の分子間架橋結合又は分子内架橋結合だけで形成されたことを特徴とする、生体適合性ナノ粒子を提供する。
【００１９】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記生体適合性ナノ粒子に核酸、タンパク質、多糖類及び薬剤からなる群から選ばれたいずれか一つ以上が封入されたことを特徴とする薬剤伝達体を提供する。
【００２０】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記薬剤伝達体を有効成分として含む薬学的組成物を提供する。
【００２１】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、前記ナノ粒子の放射性同位元素、有機蛍光物質、無機物質である量子ドット、磁気共鳴画像造影剤、コンピュータ断層撮影造影剤、陽電子断層撮影造影剤、超音波造影剤及び蛍光造影剤からなる群から選ばれた一つ以上の標識物質を標識したナノ粒子及び薬学的に許容される担体又は添加剤を含む造影剤組成物を提供する。
【００２２】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は（a)水に多糖、その誘導体、ポリエチレングリコールからなる群から選ばれたいずれか一つ以上の物質を添加して溶液を製造する段階；及び（b)前記（a)段階で生成された溶液に電子ビームを照射して、前記の物質を架橋結合させる段階を含む、生体適合性ナノ粒子の製造方法を提供する。
【００２３】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００２４】
本発明は、多糖、その誘導体及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれたいずれか一つ以上の、分子間架橋結合又は分子内架橋結合だけで形成されたことを特徴とする生体適合性ナノ粒子を提供する。
【００２５】
本発明で前記ナノ粒子とは、大きさが数十乃至数百ナノメートル(nm、10億分の1メートルである物質)の粒子を意味する。好ましくは、本発明において、前記ナノ粒子は、粒子の大きさが1乃至700nmであることを特徴とすることができるが、これに限定されるものではなく、ナノ粒子の形状は特に制限されないが、好ましくは球状であってもよい。また、本発明において前記ナノ粒子とは、ナノゲル又はナノハイドロゲルも含まれている概念で、以下のナノ粒子、ナノゲル又はナノハイドロゲルは、全て本発明に係るナノ粒子を意味するものとして使用される。
【００２６】
高分子材料だけでなく、全ての医療用材料は、生体適合性を必要とし、これらの生体適合性は二つの点で意味を区別することができる。広い意味の生体適合性は、目的とする機能と、生体に対する安全性を兼ね備えたことを意味し、狭義の生体適合性は、生体に対する生物学的安全性、すなわち毒性がなく、滅菌可能であることを意味する。従って、本発明では、前記生体適合性ナノ粒子とは、生体で目的とする機能を発揮し、材料自体の毒性がなく滅菌可能なナノ粒子と言える。
【００２７】
一方、本発明で生体適合性ナノ粒子の原料となる多糖又はその誘導体は、それらの化学構造内に存在する多機能性官能基により、薬剤等の担体(carrier)として活用価値が極めて高いだけでなく、生体適合性及び生分解性等のような物理化学的特性により、合成高分子よりも医薬分野における活用可能性がより優れている。(Materials Science and Engineering C68 (2016) 964-981)
【００２８】
本発明において、前記多糖とは、単糖類が3つ以上グリコシド結合を介して連続鎖（chain）を作っている大きな分子を意味する。本発明の前記多糖には、単糖類が少量縮合しているオリゴ糖も含まれる。多糖類はその構造内に反応性が非常に良いヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基等が存在するため、他の化合物と反応させて誘導体を容易に製作することができ、本発明の誘導体は、多糖類に存在するこれらの官能基にアルキル、アルケニル、カルボキシメチル、ヒドロキシアルキル、アセチル等が結合した誘導体を含むもので、その種類は特に制限されない。
【００２９】
本発明では、前記多糖は基本的には、水に溶解される水溶性を示すことができ、不溶性であっても誘導体化、例えば、ヒドロキシアルキル化やアルキル化、カルボキシアルキル化等により水溶性化されたものであってもよい。本発明で前記多糖は、キトサン（Chitosan）、ゼラチン、コラーゲン、マンナン（Mannan）、デキストラン硫酸、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン（β-cyclodextrin）、γ−シクロデキストリン、フルクトオリゴ糖（Fructo-oligosaccharide）、イソマルトオリゴ糖（isomalto-oligosaccharide）、イヌリン（inulin）、ヒアルロン酸（Hyaluronic acid）、アルギン酸（alginate）、グリコーゲン、アミロース、カルボキシメチルデキストラン（CM-dextran）、ベータグルカン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、フコイダン（Fucoidan）又はコンドロイチンであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００３０】
すなわち、本発明において、前記生体適合性ナノ粒子は、多糖又はその誘導体の分子間架橋結合又は分子内架橋結合のみで形成されるので、ナノ粒子の製造工程中に混入する可能性のある外部物質が全く含まれていないので、体内で容易に分解され、体内蓄積による副作用及び毒性に対する懸念が全くないという長所を有する。
【００３１】
一方、高分子を利用してナノ粒子又はナノゲルを製造する方法には、高分子の架橋結合を誘導するために架橋剤が利用されることが一般的である。架橋剤を利用した高分子の架橋結合を誘導する方法の場合、架橋剤が高分子間又は高分子内の結合を媒介するので、架橋剤がナノ粒子内部に混入されることがあり、架橋剤の濃度が高く活性状態で反応物に残る、又は反応後に残っている未反応物が存在してナノ粒子の製造工程中に精製工程を経る必要があるという問題点が起こり得る。また、ナノ粒子内に残存する架橋剤は、体内に投与された後、多様な副作用を引き起こす可能性がある。しかし、本発明者は、特定の条件で多糖に電子ビームを照射することにより分子間又は分子内架橋結合が誘導されて、ナノメートルサイズのハイドロゲルが形成されることを確認した。分子内部に架橋剤や金属陽イオンのような外部物質が含まれておらず、ただ多糖自体の結合によってのみ形成されたナノ粒子は、従来報告されたことの無いもので、本発明者が本発明を通じて最初に公開するものである。
【００３２】
本発明の前記生体適合性ナノ粒子は、多糖自体の分子間又は分子内架橋結合によってのみ形成されるため、従来の方法に基づいて製造されたナノ粒子が有する前記問題点が無い。さらに、本発明のナノ粒子を製造する工程で一切の有機溶媒が使用されず、水溶液の状態で電子ビームを照射することにより製造が可能であるため、製造工程で発生する可能性のある汚染や複雑な工程が要求されず、産業的にも極めて活用度が大きい。
【００３３】
本発明の一実施例によると、本発明者は、ヒアルロン酸、マンナン、β−シクロデキストリン、アルギン酸塩、フルクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、フコイダン、キトサン又はカルボキシメチルデキストラン水溶液に電子ビームを照射することにより、ナノメートルサイズの粒子を製造した。
【００３４】
本発明の他の一実施例によると、カルボキシメチルデキストラン又はポリエチレングリコール水溶液に電子ビームを照射して、ナノ粒子が形成されることを確認し、また、カルボキシメチルデキストランとポリエチレングリコールの混合水溶液に電子ビームを照射した場合も、目的とするナノ粒子がよく形成されることを確認した。
【００３５】
すなわち、本発明の生体適合性ナノ粒子は、1種以上の多糖とポリエチレングリコールの複合ナノ粒子であってもよい。本発明のポリエチレングリコールは、ナノ粒子表面の親水性を増加させ、人体内の免疫機能に因る速やかな分解を防止して、血中滞留時間を向上させるために導入された高分子物質である。このようにポリエチレングリコールに改質することをペグ化（pegylation）と称する。前記ペグ化工程を通じて、肝臓での蓄積が減少して血中滞留時間が増加した高分子ナノ粒子を製造することができる。つまり、ナノ粒子の表面にポリエチレングリコールを導入することにより、粒子の親水性が増加され、病原菌、老廃物及び外部流入物質を捕食して消化する人体内の大食細胞(macrophage)等を含む、免疫機能からの認識を防止するいわゆるステルス効果（stealth effect）を通じて体内での速やかな分解を防止することができ、ナノ粒子の血中滞留時間を増加させることができる。本発明者は、独立してペグ化を進めなくとも、多糖とポリエチレングリコールの混合水溶液に電子ビームを照射することにより、多糖の分子とポリエチレングリコールの分子が分子間架橋結合を形成してナノ粒子が生成されることを確認した。このとき、使用されるポリエチレングリコールは、好ましくは100乃至150000の分子量を有し、線形又は樹状等の多様な構造を有することができる。
【００３６】
以上のように、本発明の前記生体適合性ナノ粒子は、好ましくは以下のようなものであってもよい：
（i）多糖又はその誘導体の分子間又は分子内架橋結合のみからなるナノ粒子、
（ii）多糖又はその誘導体がポリエチレングリコールと分子間架橋結合を形成して生成されたナノ粒子。
【００３７】
本発明で前記ナノ粒子は、次のような方法により製造されることを特徴とすることができる：
（a)水に多糖、その誘導体及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれたいずれか一つ以上の物質を添加して溶液を製造する段階;及び（b)前記（a)段階で生成された溶液に電子ビームを照射して、前記物質を架橋結合させる段階。
【００３８】
（a)水に多糖、その誘導体及びポリエチレングリコールからなる群から選ばれたいずれか一つ以上の物質を添加して溶液を製造する段階;
治療用タンパク質や薬剤を生体内に伝達するために使用される殆どのナノ粒子は、有機溶媒を使用する乳剤蒸発法を介して製造されるので、製造から乾燥時までの製造工程が複雑で時間がかかり、有機溶媒の使用に伴うコストも増加し、また、有機溶媒の使用に伴う生体内問題を引き起こす可能性がある（TG Park、et al.、Biomacromolecules 8（2007）650-656; TG Park、et al.、Biomacromolecules 7（2006）1864-1870; DT Birnbaum、et al.、J. Control. Rel. 65（2000）375-387)。
【００３９】
しかし、本発明のナノ粒子を製造する工程では、有機溶媒が全く使用されず、溶媒として水のみを使用するので、有機溶媒の残留による多様な副作用が発生する恐れがないばかりでなく、有機溶媒を除去するために経なければならない精製工程が含まれないので、ナノ粒子の合成工程を単純化し、製造効率を向上させることができる長所がある。
【００４０】
本発明の多糖又はその誘導体の分子量は特に制限されないが、好ましくは5kDa乃至3000kDaであってもよい。
【００４１】
本発明のナノ粒子を製造するために使用される多糖又はその誘導体水溶液の濃度は、0.1％(w/v)乃至15％(w/v)であってもよい。本発明の一実施例によると、ナノ粒子が形成される具体的な水溶液の濃度は、多糖類の種類によって、全て同じではなかったが、0.1乃至15％(w/v)の範囲内でナノ粒子が形成されることがわかった。
【００４２】
多糖水溶液の濃度が0.1％未満の場合には、分子間架橋結合の形成が容易ではないため、ナノ粒子が形成されず、生成されたナノ粒子の大きさが均一ではない問題が発生することがあり、15％を超える場合には、分子間の結合が過度に発生し、バルクゲル(bulkgel)が形成されてナノ粒子を製造することができないという問題が発生することがあり、高分子水溶液を製造する際に熱を加えながら溶かさなければならない煩わしさがあるという点で好ましくない。
【００４３】
より好ましくは、本発明において前記多糖類水溶液の濃度は、0.1乃至10％であってもよい。
【００４４】
より好ましくは、
（1)ヒアルロン酸の場合、0.5乃至7％、最も好ましくは1乃至5％;
（2)マンナンの場合、0.5乃至7％、最も好ましくは0.5乃至3％;
（3)β-シクロデキストリンの場合、0.5乃至3％、最も好ましくは1乃至3％;
（4)アルギン酸塩の場合、0.5乃至10％、最も好ましくは0.5乃至7％;
（5)フルクトオリゴ糖の場合、0.5乃至10％、最も好ましくは0.5乃至3％;
（6)イソマルトオリゴ糖の場合、3乃至10％、最も好ましくは3乃至7％;
（7)キトサンの場合、0.1乃至3％、最も好ましくは0.3乃至1％;
（8)フコイダンの場合、0.5乃至3％;及び
（9)カルボキシメチルデキストランの場合、3 乃至10％、最も好ましくは5乃至10％であってもよい。
【００４５】
（b)前記（a)段階で生成された溶液に電子ビームを照射して、前記物質を架橋結合させる段階。
【００４６】
上述した通り、本発明では、生体適合性ナノ粒子を製造するために架橋剤等の開始剤を一切使用せず、多糖又はその誘導体の分子間又は分子内架橋結合を誘導するために、電子ビームを利用する。
【００４７】
電子ビームを利用して架橋結合を誘導する方法は、他の一般的な化学添加物による反応と比べて、有害な触媒等の必要がないきれいな方法であると同時に、短時間で処理が可能なため、エネルギー消費が少なく、製造工程を簡略化することができる等の長所がある。
【００４８】
高分子物質に電子ビームのような放射線を照射すると、高分子物質内に存在する共有結合が切断されて非共有電子対を含有したラジカルが形成され、これらのラジカルは、非規則的に相互作用をするようになる。分子内共有結合の切断及び再結合の相対的な速度に応じて架橋結合が形成されることもあり、又は高分子物質が低分子量分画に分解されることもある。電子ビームの照射が高分子物質に及ぼす影響は、高分子物質の構造によって決定される。
【００４９】
具体的には、Radoslaw A. Wachらによると(Carbohydrate Polymers 112 (2014) 412-415)、放射線を照射して高分子物質の架橋結合を誘導する放射線法の場合、合成高分子にはよく適用される反面、多糖類に放射線を照射した場合は、分子の切断を誘導して分子量が減少した物質が生成されるだけで架橋結合が形成されないという問題がある。これらの問題を克服し、放射線法を利用して多糖類を架橋結合させるためには、アルキンガス又は四塩化炭素のように、架橋結合反応を促進させる添加剤を利用する方法が考案された事があり（Journal of Polymer Science Part A：Polymer Chemistry、42、3897-3909. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B、265、37-43）、又は溶液のpHを調節して架橋結合を誘導する方法が試みられている(Carbohydrate Polymers 112 (2014) 412-415)。しかし、従来報告された方法に基づいて多糖類の架橋結合を誘導しても、ナノメートルサイズの粒子が生成された例は見られない。
【００５０】
一方、多糖、又はその誘導体に電子ビームを照射して誘導される架橋結合の程度は、電子ビーム照射時の実験条件によって変化するようになる。つまり、電子ビームが照射された多糖類水溶液の濃度、温度、電子ビームの照射量等の条件によって、粒子の大きさ、均一度等が変化するようになる。
【００５１】
本発明において、前記照射される電子ビームのエネルギー強度は5乃至250kGyであってもよく、好ましくは10乃至250kGyであってもよいが、これに限定されるものではない。照射される電子ビームのエネルギー強度は、多糖類水溶液の濃度、多糖の種類等を考慮して、製造するナノ粒子の大きさによって、当業者が適切に調節して選択することができる。
【００５２】
より好ましくは、
（1)ヒアルロン酸の場合、30乃至230kGy;
（2)マンナンの場合、30乃至230kGy：
（3)β-シクロデキストリンの場合、10乃至100kGy、最も好ましくは30乃至70kGy
（4)アルギン酸塩の場合、10乃至230kGy
（5)フルクトオリゴ糖の場合、10乃至230kGy最も好ましくは150乃至230kGy;
（6)イソマルトオリゴ糖の場合、10乃至230kGy、最も好ましくは30乃至70kGy;
（7)フコイダンの場合、100乃至230kGy、最も好ましくは150乃至230kGy;
（8)キトサンの場合、10乃至230kGy、最も好ましくは150乃至230kGy;及び
（7)カルボキシメチル-デキストランの場合、100乃至230kGy、最も好ましくは150乃至230kGyであってもよい。
【００５３】
本発明で、前記電子ビームが照射される時間は1秒乃至2時間であってもよい。本発明のナノ粒子を製造するための電子ビーム照射装置で線形電子ビーム加速器を使用して一定の速度で移動するコンベア上の多糖類水溶液にビーム電流及び照射時間を調節する形式で電子ビーム照射条件が変わるように調節して5kGy、10kGy、50kGy、100kGy、200kGy線量で電子ビームを照射した。電子ビームを照射する時間とビーム電流は、サンプルの濃度、照射される電子ビームのエネルギー強度等を考慮して、製造しようとするナノ粒子の大きさにより当業者が適切に調節して選択することができる。
【００５４】
本発明は、また、前記（b)段階の後で（c)核酸、タンパク質、多糖類、放射性物質及び薬剤からなる群から選ばれたいずれか一つ以上を前記（b)段階の生体適合性高分子ナノ粒子が含まれた溶液に添加した後、攪拌する段階をさらに含むことを特徴とするナノ粒子を製造することができる。
【００５５】
前記方法により製造されたナノ粒子は、その内部に核酸、タンパク質、多糖類、放射性物質又は薬剤が封入されて薬剤伝達体又は造影剤としての効果が発揮できる。
【００５６】
従って、本発明は、前記ナノ粒子の核酸、タンパク質、多糖類、放射性物質、及び薬剤からなる群から選ばれたいずれか一つ以上が封入されたことを特徴とする薬剤伝達体を提供する。
【００５７】
薬剤を体内に正確に伝達するための最も理想的な方法の一つは、患部等の特定の部位に薬剤を直接伝達することである。薬剤を伝達するための目標箇所は体内にある肺、心臓、腎臓、肝臓等の臓器であってもよく、筋肉、骨、軟骨等の組織であってもよく、癌細胞等の特定の細胞の単位であってもよい。疾病がある箇所にのみ薬剤を伝達すると、投与した薬剤の効率を高めることができるだけでなく、疾病のない他の部位に薬剤が伝達されることを防止することができ、副作用を減らすことができる長所がある。このような長所により、薬剤伝達体の研究は材料の分野で活発な研究が行われている。特にナノ技術が発展するに伴い、その研究はより活発化されている。
【００５８】
本発明で、「薬物伝達体」とは、長期間にわたる薬剤の持続性放出だけでなく、予測性及び再生性の概念を含む薬剤伝達体を意味する。従って、本発明において、前記薬剤伝達体に搭載された薬剤は、予定された部位で予定された時間にかけて一定して再生させることができる速度で放出することができる。このような調節型薬剤伝達体は、生体的利用率が低かったり、薬剤の吸収性が極めて大きく体外に過度に早めに消失されたりする場合に薬剤の放出速度を調節することにより、薬剤の血中濃度を長時間治療領域に保持させることができる長所がある。このような製剤の薬剤放出調節メカニズムは、拡散、溶解、浸透圧又はイオン交換が使用され、殆どの場合、これらの方法が複合して使用される。
【００５９】
本発明の生体適合性ナノ粒子は、人体内で毒性が少なく、水溶解性が優れているため、薬剤を目的とする部位まで効果的に伝達することができ、多様な製剤学的技術と接合されて薬剤の放出速度を調節する徐放性薬剤伝達体として活用することもできる。また、本発明のナノ粒子に特定の抗原を認識する抗体又は特定受容体にリガンドとして作用するペプチド等を融合することにより、標的指向的薬剤伝達体としても活用することができる。
【００６０】
本発明のナノ粒子に封入可能な物質の種類は特に制限されず、好ましくは、核酸、タンパク質、多糖類又は薬剤であってもよい。
【００６１】
本発明で前記薬剤は、抗生剤、抗がん剤、鎮痛剤、消炎剤、鎮咳剤、去痰剤、鎮静剤、筋肉弛緩剤、癲癇治療剤、潰瘍治療剤、抗うつ剤、抗アレルギー剤、強心剤、抗不整脈剤、血管拡張剤、降圧利尿剤、糖尿病治療剤、凝固防止剤、止血剤、抗結節剤、ホルモン剤、及びこれらの組み合わせからなる群から選ばれたいずれか一つ以上であってもよいが、これらに制限されるものではない。
【００６２】
また、本発明の前記薬剤伝達体は、放射性同位元素、有機蛍光物質、無機物質の量子ドット、磁気共鳴画像造影剤、コンピュータ断層撮影造影剤、陽電子断層撮影造影剤、超音波造影剤、蛍光造影剤等のような診断マーカーが追加して接合されていることもある。従って、ナノ粒子に封入されている薬剤と追加して接合されている診断マーカーがその効果を発揮して、疾病の治療及び診断を同時に行うことができる。
【００６３】
本発明の一実施例によると、カルボキシメチルデキストランナノ粒子に、抗癌剤として広く使用されているドキソルビシンを結合させた結果、封入効率が約79％に達するほどの優れた薬剤搭載率を示した。本発明の他の一実施例によると、ポリエチレングリコール及びカルボキシメチルデキストランの混合ナノ粒子にドキソルビシンを結合させた結果、その封入効率が約72％と極めて優れていることを確認して、本発明のナノ粒子が薬剤伝達体として極めて有用に使用できることを確認した。
【００６４】
本発明はまた、前記薬剤伝達体を有効成分として含む薬学的組成物を提供する。
【００６５】
前記薬学的組成物の治療のための使用は、ナノ粒子に封入される薬剤の種類により選択的に適用が可能である。すなわち、本発明の薬学的組成物は、生体適合性高分子の内部に封入される薬剤の種類によって、細菌感染の予防及び治療用組成物、癌の予防及び治療用組成物、痛症の予防及び治療用組成物、炎症性疾患の予防及び治療用組成物、癲癇性疾患の予防及び治療用組成物、潰瘍の予防及び治療用組成物、うつ病の予防及び治療用組成物、アレルギー性疾患の予防及び治療用組成物、不整脈の予防及び治療用組成物、高血圧の予防及び治療用組成物、糖尿病の予防及び治療用組成物又は心臓病の予防及び治療用組成物等に活用が可能である。
【００６６】
本発明の一実施例によると、ドキソルビシンが結合されたポリエチレングリコール及びカルボキシメチルデキストラン混合ナノ粒子を有効成分として含む薬学的組成物を投与した動物モデルにおいて、遊離ドキソルビシン（free doxorubicin）を投与した動物群と比べて、腫瘍の成長がより阻害されることを確認した。すなわち、本発明に係る薬剤伝達体を有効成分として含む薬学的組成物の場合、薬剤が体内で容易に分解されて排泄されることを防止する効果、又は薬剤を目的とする部位に徐放する効果を示し、遊離型薬剤と比べて、より優れた薬理活性を示し得るものと判断される。
【００６７】
本発明の薬学的組成物は、薬剤を封入している薬物伝達体の他に、薬学的に許容可能な添加剤をさらに含むことができ、薬剤学的に許容可能な添加剤には、デンプン、ゼラチン化デンプン、微結晶セルロース、乳糖、ポビドン、コロイド状二酸化ケイ素、リン酸水素カルシウム、ラクトース、マンニトール、飴、アラビアゴム、アルファ化澱粉、トウモロコシ澱粉、粉末セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、オパドライ、澱粉グリコール酸ナトリウム、カルナバ蝋、合成ケイ酸アルミニウム、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、ステアリン酸カルシウム、白糖、デキストロース、ソルビトール、及びタルク等が使用できる。本発明に係る薬剤学的に許容可能な添加剤は、前記組成物に対して0.1乃至90重量部で含まれることが好ましいが、これに制限されるものではない。
【００６８】
また、本発明の組成物は、実際の臨床投与時に経口及び非経口の多様な剤形で投与できるが、製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤等の希釈剤又は賦形剤を使用して調剤することができる。
【００６９】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれて、これらの固形製剤は生体適合性高分子ナノ粒子に薬剤が封入された薬剤伝達体に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース又はゼラチン等を混ぜて調製することができる。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウムタルクのような潤滑剤も使用することができる。経口のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤及びシロップ剤等が該当するが、広く使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれる。
【００７０】
非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤にはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステル等が使用される。坐剤の基剤には、ウイテプゾール(witepsol)、マクロゴール、ツイーン（tween)61、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等が使用できる。
【００７１】
一方、注射剤には溶解剤、等張化剤、懸濁化剤、乳化剤、安定化剤、防腐剤等のような従来の添加剤が含まれる。
【００７２】
本発明の薬学的組成物の人体に対する投与量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態、及び疾患の程度によって異なる場合があり、一般的には0.01-100mg/kg/dayであり、好ましくは0.1-20mg/kg/dayであって、さらに好ましくは5-10mg/kg/dayであってもよい。また、医師又は薬剤師の判断に基づいて、一定の間隔で分割投与することもできる。
【００７３】
本発明は、また、生体適合性ナノ粒子に放射性同位元素、有機蛍光物質、無機物質である量子ドット、磁気共鳴画像造影剤、コンピュータ断層撮影造影剤、陽電子断層撮影造影剤、超音波造影剤及び蛍光造影剤からなる群から選ばれた一つ以上の標識物質を標識したナノ粒子及び薬学的に許容される担体又は添加剤を含む造影剤組成物を提供する。
【００７４】
本発明のナノ粒子には、画像診断に使用できる多様な標識物質が付着してもよく、これを利用して造影剤組成物として活用することができる。
【００７５】
本発明で生体適合性ナノ物質に結合できる標識物質としては、放射性同位元素、有機蛍光物質、無機物質の量子ドット、磁気共鳴画像造影剤、コンピュータ断層撮影造影剤、陽電子断層撮影造影剤、超音波造影剤又は蛍光造影剤等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
放射性同位元素を利用した方法において、放射性標識物質(Radioactive isotope)には、単一光子放出コンピュータ断層撮影用核種の99mTc、123I、111In、67Ga、177Lu、201Tl、117mSn、125Iと、陽電子断層撮影用核種の11C、13N、15O、18F、38K、62Cu、64Cu、68Ga、82Rb、124I、89Zrと、治療のための核種の131I、166Ho、188Re、67Cu、89Sr、90Y、225Ac、213Bi、211Atを使用できるが、これらに制限されるものではない。放射性同位元素は、化学的性質がほぼ似ている非放射性の同位体と任意の置換が可能であり、放出エネルギーが比較的大きいため、少量の検出も可能な長所があるので、長い間使用されてきた。
【００７７】
放射性同位元素に対する代案として広く使用されるのは有機蛍光物質(Organic fluorescent dyes)である。蛍光物質は、特定の波長によって活性になると、固有の波長を有する光を発光することになる。特に、検索法が小型化されることによって、放射性物質も検出限界を示し、検索に長い時間が要求される。これに比べて蛍光物質の場合、適切な条件で分子当たり数千個の光子を放出することができ、単一分子水準の検出までも理論的には可能である。本発明では、生体適合性高分子ナノ物質に封入又は結合できる有機蛍光物質の種類は、当業界で使用されているか、又は今後使用する物質を全て含む概念として理解される。
【００７８】
また、半導体ナノ物質である量子ドットは、CdSe、CdS、ZnS、ZnSe等で構成されており、大きさ及び種類によって、それぞれ異なる色の光を発光する。有機蛍光物質に比べて広い活性波長を有し、狭い発光波長を示すので、他の色を発光する種類の数が、有機蛍光物質よりも多い。従って、最近になって、有機蛍光物質の短所を克服するための方法として量子ドットが多く使用されている。本発明で生体適合性高分子ナノ粒子に封入又は結合することができる量子ドットは、当業界で現在使用されているか、又は今後使用する物質を全て含む概念として理解される。
【００７９】
前記磁気共鳴画像造影剤としては、具体的には、ガドリニウム（Gd）、マンガン（Mn）、鉄（Fe）、銅（Cu）及びクロム（Cr）を含む遷移金属イオン;ガドペンテト酸ジメグルミン（Gd-DTPA)、ガドテル酸メグルミン（Gd-DOTA)を含む前記遷移金属イオンの疎水性錯化合物;パーフルオロカーボン（perfluorocarbon)、パーフルオロプロパン（perfluoropropane)を含むフッ素含有化合物;酸化鉄系、マンガン系、銅系及びクロム系ナノ粒子;前記ナノ粒子の表面を疎水性物質で修飾した化合物等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００８０】
前記コンピュータ断層撮影造影剤としては、具体的には、ヨウ化ケシ種子油由来のヨウ化疎水性物質;ビスマス（Bi）、金（Au）及び銀（Ag）を含む金属元素で構成されたナノ粒子等が使用されるが、これに限定されるものではない。
【００８１】
前記単一光子放出コンピュータ断層撮影造影剤としては、99mTc、123I、111In、67Ga、177Lu、201Tl、117mSn、125Iを含む放射性同位元素、前記放射性同位元素の疎水性錯化合物等が使用できるが、これに限定されるものではない。
【００８２】
前記陽電子断層撮影造影剤としては、11C、13N、15O、18F、38K、62Cu、64Cu、68Ga、82Rb、124I、89Zrを含む放射性同位元素、前記放射性同位元素の疎水性錯化合物等が使用できるが、これに限定されるものではない。
【００８３】
治療の目的のためには、131I、166Ho、188Re、67Cu、89Sr、90Y、225Ac、213Bi、211Atを含む放射性同位元素、前記放射性同位元素の疎水性錯化合物等を使用することができるが、これに限定されるものではない。
【００８４】
前記超音波造影剤としては、具体的には、パーフルオロプロパン（perfluoropropan)、パーフルオロヘキサン（perfluorohexane)、六フッ化硫黄（sulfur hexafluoride)、パーフルオロペンタン（perfluoropentane）、デカフルオロブタン（decafluorobutane）等が使用できるが、これに限定されるものではない。
【００８５】
また、前記蛍光造影剤としては、具体的には、フルオロセイン（fluorescein)、ローダミン（rhodamine)、ナイルレッド（Nile Red）、Cy-3及びCy-5を含む低分子蛍光物質;前記低分子蛍光物質を共有結合で導入した疎水性物質;5nm乃至20nmサイズのCdSe、CdS、及びCdTeからなる群から選ばれる無機物発光半導体でなされており、ZnSで形成された異種接合体が外部を囲んでいる量子ドット;前記量子ドットの表面を疎水性物質で修飾した形態の物質等が使用できるが、これに限定されるものではない。
【００８６】
本発明に係る造影剤組成物に使用される担体は、医薬分野で通常使用される担体及びビークルを含み、具体的にはイオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン)、緩衝物質(例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、カリウムソルビン酸塩、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物)、水、塩又は電解質(例えば、プロタミン硫酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、及び亜鉛塩)、コロイド性シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系基質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアリレート、ワックス、ポリエチレングリコール又は羊毛等を含むが、これらに限定されない。本発明の造影剤組成物は、また、前記成分の他に潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、又は保存剤等をさらに含むことができる。
【００８７】
本発明に係る造影剤組成物は、非経口投与のための水溶性溶液で製造することができる。好ましくはハンス溶液(Hank’s solution)、リンゲル溶液(Ringer’s solution)又は物理的に緩衝された塩水のような緩衝溶液を使用することができる。水性注射(injection)用懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、又はデキストランのように懸濁液の粘度を増加させることができる基質を添加することができる。
【００８８】
本発明の造影剤組成物の他の好ましい形態は、水性又は油性懸濁液の滅菌注射用製剤の形態であってもよい。これらの懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤(例えば、ツイーン80)及び懸濁化剤を使用して、本分野に公知された技術に基づいて製剤化することができる。滅菌注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射溶液又は懸濁液(例えば、1,3-ブタンジオール中の溶液)であってもよい。使用することができるビークル及び溶媒としては、マンニトール、水、リンゲル溶液、及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。また、滅菌非揮発性油が一般的に溶媒又は懸濁化媒質として使用される。これらの目的のために、合成モノ又はジグリセリドを含んで刺激性の少ない非揮発性油は、そのいずれも使用することができる。
【００８９】
本発明の造影剤組成物は、クエン酸、クエン酸ナトリウム等のその他の一般的にpH調整剤に使用する物質及び／又はアスファルタム、アセスルファムカリウム、ドッキングシロップ、サッカリンナトリウム、サッカリンカルシウム、砂糖等のその他に一般的に甘味料に使用する物質及び／又はケイ素樹脂等、その他の一般的に消泡剤として使用する物質及び／又はアルコール類、フェノール類、有機酸及びその塩類、有機水銀化合物、パラベン類等、その他の一般的に保存剤として使用される物質及び／又はパイナップルの香り、イチゴの香り、オレンジの香り、レモンの香り、チョコレートの香り、コーラの香り、ブドウの香り、松の香り等のその他の一般的に着香剤に使用される物質の中から選ばれた1種以上の添加剤をさらに含有することができる。
【発明の効果】
【００９０】
［有利な効果］
本発明の生体適合性ナノ粒子は、電子ビームを通じて多糖又はその誘導体分子間又は分子内架橋結合を誘導することにより製造されるので、有機溶媒又は架橋剤の混入による人体における毒性の問題が発生する心配が全くなく、その製造工程の中で、別の精製工程が不要な短時間の電子ビーム照射だけで大量生産が可能なため、生産性の面でも極めて優れている。また、本発明のナノ粒子は、薬剤伝達体、薬学的組成物、造影剤組成物又は腸癒着防止剤等、多方面で活用することができる点で極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図1は、カルボキシメチルデキストラン水溶液に電子ビームを照射してナノ粒子を製造する方法に関する模式図である。
【図２】図2は、10％濃度のカルボキシメチルデキストラン水溶液に200kGyの電子ビームを照射したときに生成されたナノ粒子に対するDLS及びTEM写真を示す図である。
【図３】図3は、多様な濃度のカルボキシメチルデキストラン水溶液に電子ビームを照射した後、ナノ粒子生成の有無を、DLSを介して確認した結果である。
【図４】図4は、多様な条件でヒアルロン酸水溶液に電子ビームを照射したときのナノ粒子生成の有無を、DLSを介して確認した結果である。
【図５】図5は、多様な条件でマンナン水溶液に電子ビームを照射したときのナノ粒子の生成の有無を、DLSを介して確認した結果である。
【図６】図6は、多様な条件でβ-シクロデキストリン水溶液に電子ビームを照射したときのナノ粒子の生成の有無を、DLSを介して確認した結果である。
【図７】図7は、多様な条件でアルギン酸水溶液に電子ビームを照射したときのナノ粒子の生成の有無を、DLSを介して確認した結果である。
【図８】図8は、他の条件でフルクトオリゴ糖水溶液に電子ビームを照射したときのナノ粒子の生成の有無を、DLSを介して確認した結果である。
【図９】図9は、多様な条件でイソマルトオリゴ糖水溶液に電子ビームを照射したときのナノ粒子の生成の有無を、DLSを介して確認した結果である。
【図１０】図10は、多様な条件でフコイダン水溶液に電子ビームを照射したときのナノ粒子の生成の有無を、DLSを介して確認した結果である。
【図１１】図11は、多様な条件でキトサン水溶液に電子ビームを照射したときのナノ粒子の生成の有無を、DLSを介して確認した結果である。
【図１２】図12は、カルボキシメチルデキストランナノ粒子の濃縮に伴う遠心分離後、チューブの底に残っている水の量の差を比較することにより、ハイドロゲルの特性があることを確認した図である。
【図１３】図13は、ポリエチレングリコールとカルボキシメチルデキストラン混合ナノ粒子を、電子ビームを利用して製造する工程を示した模式図である。
【図１４】図14は、多様なエネルギー強度の電子ビームを照射したときのPEGナノ粒子の形成の有無及び、粒子サイズを確認した図である。
【図１５】図15は、10％カルボキシデキストラン及び1％ポリエチレングリコールの混合水溶液に電子ビームを照射して形成されたナノ粒子に対するDLSの結果である。
【図１６】図16は、ポリエチレングリコール及びカルボキシメチルデキストラン混合ナノ粒子の1H-NMRの結果を示した図である。
【図１７】図17は、ポリエチレングリコール及びカルボキシメチルデキストラン混合ナノ粒子の13C-NMRの結果を示した図である。
【図１８】図18は、カルボキシメチルデキストランナノ粒子のキレートがコンジュゲートされた構造を示した図である。
【図１９】図19は、キレートがコンジュゲーションされたカルボキシメチルデキストランナノ粒子に対するCu-64標識TLCの結果を示した図である。
【図２０】図20は、Cu-64標識されたカルボキシメチルデキストランナノ粒子に対するTLCの結果を示した図である。
【図２１】図21は、Bolton-Hunter試薬を使用したカルボキシメチルデキストランナノ粒子の放射性ヨウ素標識工程を示した模式図である。
【図２２】図22は、I-131で標識されたカルボキシメチルデキストランナノ粒子に対する反応及び精製後のRadio-TLCの結果を示した図である。
【図２３】図23はドキソルビシンに対する検量線及び遠心分離を介して確認したドキソルビシンが結合されたカルボキシメチルデキストランナノ粒子を観察した図である。
【図２４】図24は、ドキソルビシンが結合されたカルボキシメチルデキストランナノ粒子（CM-DNP）及びドキソルビシンが結合されたポリエチレングリコールとカルボキシメチル-デキストラン混合ナノ粒子(PEG-DNP)のドキソルビシン放出速度を確認した結果である。
【図２５】図25は、ドキソルビシンが結合されたナノ粒子のin vivo抗腫瘍活性を評価した結果である（PBSを処理するBlankのグループ、遊離ドキソルビシンを処理するグループ（free DOX）、ドキソルビシンが結合されたPEG-DNP(DOX@PEG-DNP)を処理するグループ。）
【図２６】図26は、ドキソルビシンが結合されたナノ粒子のin vivo抗腫瘍活性を評価した動物モデルから、各薬剤の投与による動物の体重変化を観察した図である（PBSを処理するBlankのグループ、遊離ドキソルビシンを処理するグループ（free DOX）、ドキソルビシンが結合されたPEG-DNP（DOX@PEG-DNP）を処理するグループ。）
【発明を実施するための形態】
【００９２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００９３】
但し、下記の実施例は、本発明を例示するのみであり、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【００９４】
＜実施例１＞
電子ビーム加速器を用いた電子ビーム照射条件及び準備
電子ビームを照射する溶液について、多様な条件の電子ビーム線量を調査して実験を進めた。実験には、線形電子ビーム加速器を使用し、一定の速度で移動するコンベア上のサンプルにビーム電流及び照射時間を調節する形式で電子ビームを照射することにより、5kGy、10kGy、50kGy、100kGy、200kGy線量で電子ビームを照射した。電子ビームを照射する時間と照射量は電子ビーム照射時の温度条件、サンプルの濃度、照射される電子ビームのエネルギー強度等を考慮して、製造しようとするナノ粒子の大きさに応じて、当業者が適切に調節して選択することができる。
【００９５】
＜実施例２＞
電子ビーム照射によるナノ粒子の製造
＜2−1＞カルボキシメチルデキストラン溶液及び電子ビーム照射条件
カルボキシメチル-デキストランを使用してナノ粒子を合成する実験を進めて、直流型電子ビーム加速器を使用して調査サンプルに電子ビームを照射するが、ビーム電流及び照射時間を調節する形式で電子ビーム照射条件が異なるようにした。
【００９６】
より具体的には、カルボキシメチルデキストラン(分子量10kDa)を水に溶解して0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％(w/v)の濃度になるように溶液を製造し、製造されたカルボキシメチルデキストラン溶液に電子ビーム照射エネルギー量を5kGy、10kGy、50kGy、100kGy、200kGyに変えながら、常温で実験を行った。前記製造されたカルボキシメチルデキストラン溶液には、有機溶媒、架橋剤、無機物等、いかなる添加物も加えなかった。
【００９７】
＜2−2＞電子ビーム照射によるカルボキシメチルデキストランナノ粒子の製造
多様な濃度と多様な電子ビーム線量条件で実験を進め、製造されたナノゲルの粒子サイズをDLS(Dynamic light scattering)で確認した結果、10％の濃度のカルボキシメチルデキストラン溶液に200kGyの電子ビームを照射したときにのみ10nm程度の均一な大きさのナノ粒子が合成されるのを確認することができた(図2)。
【００９８】
20％の濃度に200kGyの電子ビームを照射したときは、DLS測定時に複数のピークを示す結果が得られ、他の条件では十分な測定結果得られていないことからナノ粒子がうまく形成されないことが確認された(図3)。
【００９９】
＜2−3＞電子ビーム照射による多糖類又はオリゴ糖類由来のナノ粒子の製造
前記カルボキシメチルデキストランナノ粒子以外に、他の多糖類又はオリゴ糖類を利用してナノ粒子を製造した。
【０１００】
前記実施例2-1での方法と同じ方法で実験を進めるが、カルボキシメチルデキストランの代わりに、多様な多糖類又はオリゴ糖類を水に溶解した後、電子ビームを照射して、ナノ粒子が形成されるか否かを確認した。
【０１０１】
（1)ヒアルロン酸（Hyaluronic acid）(10kDa)に対する結果
1％、5％、10％(w/v%)濃度のヒアルロン酸溶液に、10kGy、50kGy、200kGyの電子ビームを照射して実験を行った。
【０１０２】
その結果、図4に示した通り、1％、50kGyの条件で380nm、5％、200kGyの条件で108nmの粒子サイズを有するナノゲルが形成されることを確認できた。残りの条件では、粒子の大きさが極めて大きいか、又は複数個のピークが現れ、均一な粒子サイズのナノゲルが形成されないことを確認できた。
【０１０３】
（2)マンナン（Mannan）（0.7kDa）に対する結果
1％、5％、10％(w/v%)濃度のマンナン溶液に、10kGy、50kGy、200kGyの電子ビームを照射して、実験を行った。
【０１０４】
その結果、図5に示した通り、1％、50kGyの条件で162nm、1％、200kGyの条件で305nmの粒子サイズを有するナノゲルが形成されることを確認できた。残りの条件では、粒子の大きさが極めて大きいか又は複数個のピークが表れ、均一な粒子の大きさのナノゲルが形成されないことを確認した。
【０１０５】
（3)β−シクロデキストリン（β-cyclodextrin）（1.1kDa）に対する結果
0.1％、1％、5％(w/v%)濃度のβ-シクロデキストリン溶液に、10kGy、50kGy、200kGyの電子ビームを照射して実験を行った。
【０１０６】
その結果、図6に示した通り、1％、50kGyの条件で486nmの粒子の大きさを有するナノゲルが形成されることを確認できた。残りの条件では複数個のピークが現れ均一な粒子の大きさのナノゲルが形成されないことを確認できた。
【０１０７】
（4)アルギン酸塩（Alginate）（33kDa）に対する結果
1％、5％、10％(w/v%)濃度のアルギン酸塩溶液に、10kGy、50kGy、200kGyの電子ビームを照射して実験を行った。
【０１０８】
その結果、図7に示した通り、1％、10kGyの条件で283nm、1％、50kGyの条件で354nm、5％、1％、200kGyの条件で283nm、5％、10kGyの条件で302nm、5％、200kGyの条件で602nm、10％、10kGyの条件で540nmの粒子の大きさを有するナノゲルが形成されることを確認できた。
【０１０９】
（5)フルクトオリゴ糖（Fructo-oligosaccharides）の結果
1％、5％、10％、20％、30％、40％(w/v%)濃度のフルクトオリゴ糖溶液で、10kGy、50kGy、200kGyの電子ビームを照射して実験を行った。
その結果、図8に示した通り、1％、200kGyの条件で501nmの粒子の大きさを有するナノゲルが形成されることを確認した。一方、10％、10kGY条件及び10％、200kGY条件でも、粒子の大きさが均一ではなかったが、ナノ粒子が形成されることを確認した。それ以外の条件では粒子の大きさが極めて大きいか、又は複数個のピークが現れ、ナノ粒子が正常に生成されなかった。
【０１１０】
（6)イソマルトオリゴ糖（Isomalto-oligosaccharides）に対する結果
1％、5％、10％、20％、30％、40％(w/v%)濃度のイソマルトオリゴ糖溶液で、10kGy、50kGy、200kGyの電子ビームを照射して、実験を行った。
その結果、図9に示した通り、5％で50kGyの条件で542nmの粒子の大きさを有するナノゲルが形成されることを確認した。一方、5％、10kGy条件及び10％、200kGy条件でも、粒子の大きさが均一ではなかったが、ナノ粒子が形成されることを確認した。それ以外の条件では粒子の大きさが極めて大きいか、又は複数個のピークが現れ、ナノ粒子が正常に生成されなかった。
【０１１１】
（7)フコイダン（Fucoidan）に対する結果
0.5％、1％、5％(w/v%)濃度のフコイダン溶液で、10kGy、50kGy、200kGyの電子ビームを照射して、実験を行った。
【０１１２】
その結果、図10に示した通り、1％、200kGyの条件で100nmの粒子の大きさを有するナノゲルが形成されることを確認した。それ以外の条件では複数個のピークが現れ、均一な粒子の大きさのナノゲルが形成されないことを確認した。
【０１１３】
（8)キトサン（Chitosan）（5kDa）に対する結果
0.5％、1％、5％(w/v%)濃度のキトサン溶液で、10kGy、50kGy、200kGyの電子ビームを照射して、実験を行った。
【０１１４】
その結果、図11に示した通り、0.5％、200kGyの条件で172nmの粒子の大きさを有するナノゲルが形成されることを確認した。一方、0.1％、50kGy条件、0.1％、100kGy条件、0.5％、10kGy条件、1％、10kGy条件及び1％、200kGy条件でも、粒子の大きさが均一ではなかったが、ナノ粒子が形成されることを確認した。それ以外の条件では粒子の大きさが極めて大きいか又は複数個のピークが現れ、ナノ粒子が正常的に生成されなかった。
【０１１５】
＜実施例３＞
カルボキシメチルデキストランナノ粒子(CM-DNP)の物性評価-ゲル(gel)の特性
電子ビームを照射した試料は、3.5kDa-6kDaサイズの透析メンブレンチューブを使用して、５日間、１日に２回ずつ、NaClが含まれた水を交換しながら透析を行い、粒子の大きさに変化が発生するか否かをDSLで確認したが、透析工程中には粒子の大きさに変化がないことを確認した。以降、サンプルを凍結乾燥して照射された電子ビームによる架橋形成を通じて作られたナノ粒子収率を計算したところ、43％程度の収率を示し、合計8.2gのナノ粒子を得ることができた。
【０１１６】
前記実施例により製造されたナノ粒子を使用して、このようなナノ粒子がゲルの特徴を示すか否かを確認する実験を行った。CM-DNP 0mg、100mg、200mg、300mgをそれぞれ400 uLの水に溶かした後、3kDaの膜を有する遠心濾過器(YM-3 filter)を使用して、13000rpmで30分間の遠心分離を３回繰り返して行い、CM-DNPの濃縮に伴う水の膨潤(Swelling)の程度がどのような差を示すかを確認した。その結果、CM-DNPの濃縮により、遠心分離工程後にチューブの底に落ちる水の量に差が生じ、CM-DNPの濃度が高い程、その水の量が少ないことを確認できた。このような結果を通じて、合成されたCM-DNPのナノ粒子がゲルの特徴を有していることを確認した(図12)。
【０１１７】
＜実施例４＞
電子ビームを通じたポリエチレングリコール(PEG)が混合されたカルボキシメチルデキストランナノ粒子(CM-DNP)の合成
デキストラン以外に、既に臨床で使用されている有機分子を一緒に添加して、有機分子がデキストランナノ粒子形成及び物性に及ぼす影響を研究することを計画して、添加する有機分子として、既に臨床で広く使用されるPEGを使用して研究を進めた(図13)。
【０１１８】
＜4-1＞電子ビーム照射によるポリエチレングリコールナノ粒子の生成
まず、PEG自体で、電子ビーム照射時に架橋形成を起こすか否かを確認するための実験を進め、PEGの濃度を変えて、複数のエネルギー強度で電子ビームを照射する実験を行った。実験には、6kDaのPEGを使用し、水に溶解して1％、5％、10％(w/v)濃度の溶液を調製し、電子ビームのエネルギーの強度は10kGy、30kGy、50kGy、100kGy、200kGyで照射した。エネルギーの強度が増加して30kGy以上になると、サンプルの色が濁り、バルクゲル(bulkgel)が作られる傾向を確認することができ、PEGの濃度が低いとき、より大きいナノゲルが作られる傾向性を確認できた(図14)。
【０１１９】
＜4-2＞電子ビーム照射によるPEG及びカルボキシメチル-デキストラン混合物のナノ粒子生成
PEG溶液に電子ビームを照射する際に架橋を形成する事実を直接確認することができ、PEGとカルボキシメチルデキストランを一緒に混合して電子ビームを照射し、架橋がよく形成されたか、また、カルボキシメチルデキストランだけを利用して製作したナノ粒子とは異なる大きさ及び物性を有するナノ粒子が作られるかを確認する実験を行った。
【０１２０】
互いに異なる濃度のデキストランとPEGを調製して10kGy、50kGy、200kGyで電子ビームを照射した後、そのサンプルの大きさを、DLSを利用して測定する方法でナノ粒子の形成の有無を確認した。
【０１２１】
他の条件とは異なり、10％のカルボキシメチルデキストランと1％のPEGを使用して電子ビームを照射した場合にのみ、ナノゲルが生成されることを確認した(結果図示せず)。他の条件では、バルクゲルが形成された。DLSでサンプルの大きさを測定した結果、10kGyでは63nm、50kGyでは50nm、200kGyでは9nmであり、照射されたエネルギーの大きさが増加するほど、ナノ粒子の大きさが小さくなる傾向が確認できた(図15)。
【０１２２】
＜4-3＞PEG及びカルボキシメチルデキストラン混合ナノ粒子(PEG-DNP)の収率
前記の通り、1％のPEGを10％のカルボキシメチルデキストランと一緒に混合して、10、50、200kGyのエネルギー強度において電子ビームを照射した場合にも、ナノ粒子がよく作られる結果を得た。その後、どの程度の収率でナノ粒子が形成されたかを確認するために、サンプルを3.5kDa-5kDaサイズの透析メンブレンチューブを使用して、5日間、一日に2回ずつNaClが含まれた水を交換しながら透析を進め、その後、それぞれのサンプルを凍結乾燥して、照射された電子ビームによる架橋形成を介して作られたナノ粒子の収率を計算した結果、各エネルギー条件でのサンプルは全て24〜36％程度の収率を示した。
【０１２３】
その内、9〜10nmの大きさを有するナノ粒子が生成された200kGy電子ビーム照射条件で、より多くのカルボキシメチルデキストランナノ粒子(PEG-DNP)を合成する実験を進め、大量に進行することにより、再現性良く10nm程度の大きさを示し、各段階で失われる量が減り、以前よりも高い52％程度の収率を示し、合計2gのナノ粒子を得ることができた。
【０１２４】
＜4-4＞PEG-DNPの構造解析
電子ビーム照射によるPEG及びCM-DNP混合ナノ粒子の製造が、電子ビーム照射によるPEGだけの架橋によるナノ粒子の形成の結果でであるかを確認するために(つまり、生成されたナノ粒子がPEGとカルボキシメチルデキストランの分子間架橋結合によって形成されたかどうかを確認するために)、前記実施例4-3で得られたCM-DNPに対するNMR分析を行うことにより、作られたナノ粒子にPEGとデキストランが全て存在するか、そしてPEG又はデキストランに対するピークは確認できないかを確認する実験を行った。
【０１２５】
1H-NMRを利用した分析を進めるために、サンプルをD2Oに溶かして分析を進めた結果、PEGのピークと共に、デキストランのピークも確認することができ、これを通じて、形成されたナノ粒子は、PEGとデキストランが一緒に架橋を形成することにより形成されたことを確認した(図16)。
【０１２６】
13C-NMRを利用した分析の結果からも同様に、PEGのピークと共にデキストランのピークも確認することができ、これを通じて形成されたナノ粒子は、PEGとデキストランが共に架橋を形成することにより形成されたことを再確認することができた(図17)。
【０１２７】
＜実施例５＞
カルボキシメチルデキストランナノ粒子のキレートコンジュゲーション及びCu-64放射性標識
合成したCM-DNPを使用して多様なキレートをコンジュゲーションさせて、Cu-64で放射性標識する実験を行った。ナノ粒子にCu-64を利用した標識実験を進めるために、まず、ナノ粒子にキレートをコンジュゲーションさせ、DOTA-Bn-p-NH2、DOTA-GA-NH2、TE2A-NH2の3つのキレートを使用して行った。
【０１２８】
CM-DNP(100mg)を、まず丸底フラスコに入れて、DMSO(5mL)を入れて溶かした後、CDI(carbodiimidazole、10mg)を入れて窒素条件下（N2 atmosphere）、40℃で2時間攪拌させて反応を行った。反応後、TLCを使用して(C18、CH2Cl2:MeOH=10:1)、適切な固相及び移動相条件で反応していないCDIが残っているか否かを確認して、CDIが全て反応した場合には3つのキレートをそれぞれ入れた後、60℃で16時間反応させた。以後精製のために透析を進め、それ以降のそれぞれのサンプルを凍結乾燥して、約35〜45mg量のキレートがコンジュゲーションされたデキストランナノ粒子を得ることができた(図18)。
【０１２９】
前記のようにキレートがコンジュゲーションされたナノ粒子のCu-64を使用して、放射性標識がよく行われるかを確認した。
【０１３０】
100μLの0.1M NH4OAc(pH 6.8)に三つのキレートがコンジュゲーションされたカルボキシメチルキストランナノ粒子10μLを入れた後、Cu-64を入れながら、60℃で1時間反応させた。固相にはITLCを、移動相には50mM EDTAを使用して、Cu-64がどれほど良く標識されたかその結果を確認したとき、DOTA-Bn-p-NH2がコンジュゲーションされたデキストランナノ粒子の場合には25％、DOTA-GA-NH2がコンジュゲーションされたデキストランナノ粒子の場合には47％、TE2A-NH2がコンジュゲーションされたデキストランナノ粒子の場合には27％が標識されることを確認した(図19)。
【０１３１】
次に、10kDaの多孔性膜を有する遠心濾過器(YM-10 filter)を使用して遠心分離を5回繰り返して行い、標識されていない遊離（Free）Cu-64を除去して、標識されたナノ粒子のみを分離する精製工程を進行し、その後、TLCによって、分離されたナノ粒子は、遊離Cu-64が全て除去されたことが確認できた(図20)。
【０１３２】
＜実施例６＞
放射性ヨウ素を利用したカルボキシメチルデキストランナノ粒子の標識
放射性核種標識を通じたCM-DNP基盤核医学映像造影剤の開発は、Cu-64以外に放射性ヨウ素を利用しても進行しており、放射線ヨウ素標識法として広く活用されている補欠分子族(prosthetic group)であるBolton-Hunter試薬を使用して行い、放射性ヨウ素では、半減期が8日と長く、価格も比較的安いI-131を購入して実験を行った(図21)。
【０１３３】
10nmの大きさを有するCM-DNPを使用して標識実験を行い、Bolton-Hunter試薬(1.1μg/μL in DMSO)をI-131とChloramine-T(10μg/μL in D.W)と一緒に1分間反応させた後、ピロ亜硫酸ナトリウムを使用して反応を停止した後、Sep-PAK C18を使用して、水とエタノールで標識されたBolton-Hunter試薬を分離し、分離されたBolton-Hunter試薬とカルボキシメチルデキストランナノ粒子を、0.1 M Na2B4O7(pH 9.2)を使用して、30分間コンジュゲーションを行った後、PD-10カラムを利用して、標識されたナノ粒子を分離した(図22)。
【０１３４】
反応後とPD-10 columnを利用した精製工程後に標識収率の結果をRadio-TLCを使用して確認し、標識収率は43％でありPD-10カラムを通じて遊離I-131を除去して標識されたナノ粒子だけをよく分離することができた。
【０１３５】
＜実施例７＞
ドキソルビシンが結合されたカルボキシメチルデキストラン基盤のナノ粒子の合成
＜7-1＞ナノ粒子へのドキソルビシンの結合
デキストランナノ粒子の抗癌剤として広く使用されているドキソルビシン(doxorubicin)を結合させる実験を行った。まず、CM-DNPを使用して実験を進め、10nmサイズのCM-DNP 15mgを3mLの蒸留水（D.W.）に溶解した後、NaOHを使用してpHを8に合わせ、ドキソルビシン(1mg/mL)を入れて光を遮断し、常温で一日攪拌させる方法で反応を行った。反応後、16000×gで90分間遠心分離を行うと、ドキソルビシンが結合されたデキストランナノ粒子は、底に沈殿を形成するようになり、上澄み液と沈殿を分離した(図23)。
【０１３６】
分離した上澄み液は、吸収スペクトルを測定し、ナノ粒子に結合されなかったドキソルビシンの量を確認することができ、ドキソルビシンに対して吸収極大を示す481nmの波長で吸光度を測定し、その値を予め用意しておいた481nmの波長でのドキソルビシンに対する検量線に代入して、上澄み液に残っているドキソルビシンの量を確認した。反応に使用したドキソルビシンの量と上澄み液に残っているドキソルビシンの量を、下記の公式に代入して、CM-DNPにドキソルビシンがどれ程結合されたかを確認した結果、LE(Loading efficiency)(%)が78.9％であることを確認した。
【０１３７】
PEG-DNPの場合も前記と同じ方法でドキソルビシンを結合させる実験を進めてみたが、LE(%)が56.1％で、より低いことを確認した。そこで、ドキソルビシンのLE(%)を増加させる条件を調べる実験を進めて、1mg/mLのドキソルビシンとの反応に使用するPEG-DNPの量を3mg/mLから0.5mg/mLに減らして反応した場合、LE(%)が72.7％に増加することを確認した。この時、反応する時間を45分に減らしても、LE(%)には大きな差がないことを確認し、反応時間も短縮することができた。
【０１３８】
＜7-2＞ドキソルビシンが結合されたナノ粒子での薬剤の放出速度
ドキソルビシンが結合されたカルボキシメチルデキストランナノ粒子(CM-DNP)とPEG及びカルボキシメチルデキストランの混合ナノ粒子(PEG-DNP)を使用して薬剤が放出される速度はどうであるかを確認する流出実験を行った。10mgの同じ量のナノ粒子を使用して、pHが7.4のPBSでドキソルビシンが放出される速度を確認するために、複数の時点に合わせてサンプルを得て遠心分離を行い、上澄み液に存在するドキソルビシンの量を確認することにより、ナノ粒子から放出されたドキソルビシンの量を確認した。その結果、6日間にわたって、CM-DNPの場合には9.16％でドキソルビシンが抜け出て、PEG-DNPの場合には18.4％でナノ粒子に結合されたドキソルビシンが、かなり徐々に連続的に抜け出ることを確認することができた(図24)。
【０１３９】
＜7-3＞ドキソルビシンが結合されたPEG-DNPの腫瘍成長阻害効果
ドキソルビシンが結合されたデキストラン基盤のナノ粒子が、腫瘍の成長を阻害することができる治療剤として使用できるのか、その能力を比較確認する実験を行った。実験に使用された腫瘍モデルには、大腸癌マウスの腫瘍モデル(CT26 tumor model)を使用し、5x106個の細胞を、マウスの脇腹に注射した後、10日後に腫瘍が発生することを確認した後、実験に使用した。PBSを処理するブランク（Blank）グループ、遊離ドキソルビシンを処理するグループ(free DOX)、ドキソルビシンが結合されたPEG-DNPを処理するグループ(DOX@PEG-DNP)に区分した後、実験を始めた。各グループに該当するマウスの数は3匹であり、それぞれの投与物質を二日間隔で、計3回、静脈注射を通じてマウスの腫瘍モデルに処理し、この時、遊離ドキソルビシンを処理するグループ、ドキソルビシンが結合されたPEG-DNP(DOX@PEG-DNP)グループに処理されるドキソルビシンの量は200μgであった。
【０１４０】
33日間にわたって腫瘍モデルでの腫瘍の大きさ及びマウスの重量を確認し、その結果を確認及び比較したとき、DOX@PEG-DNPを処理したグループで最も腫瘍の成長が阻害され、腫瘍の大きさが3000mm3以下に、他の二つのグループに比べて確かに小さいことが確認できた。遊離ドキソルビシンを処理したグループの場合には、3匹のうち1匹のみにおいて腫瘍の成長速度が阻害されず、PBSを処理したブランクグループと類似した腫瘍の成長速度を示すことが確認でき、その腫瘍モデルを除いた残りの2匹の腫瘍モデルの場合には、確かにPBSを処理したブランクグループよりは腫瘍の成長速度が阻害されたこと確認できた。腫瘍モデルの重量の場合には、遊離ドキソルビシンやDOX@PEG-DNPを処理しても急激に体重が減少しないことを確認することができ、時間が経つにつれ、各グループ間で体重に少し差が発生はしたものの、これは、各グループでの腫瘍の大きさの差により発生したものと考えられる。これらの結果を通じて、DOX@PEG-DNPが確かに、遊離ドキソルビシンと比較して、腫瘍モデルに大きな毒性を示さずに、腫瘍の成長を阻害できることが確認できた(図25及び図26)。
【産業上の利用可能性】
【０１４１】
本発明の生体適合性ナノ粒子は、電子ビームを通じて多糖又はその誘導体分子間又は分子内架橋結合を誘導することによって製造されるので、有機溶媒又は架橋剤の混入による人体内の毒性の問題が発生する恐れが全くなく、その製造工程の中で、別の精製工程が不要な短い時間の電子ビーム照射だけで大量生産が可能で、生産性の面でも極めて優れている。また、本発明のナノ粒子は、薬剤伝達体、薬学的組成物又は造影剤組成物、腸癒着防止剤等、多方面で活用できる点で極めて有用で、産業上の利用可能性が極めて高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
2019507730.tif 000029
2019507730.tif 000030
2019507730.tif 000031
2019507730.tif 000032
2019507730.tif 000033
2019507730.tif 000034