(57)【要約】本発明は、被験体の癌を処置する方法、寛解にある被験体の癌の再発を予防または遅らせる方法、癌からの寛解を延長する方法、生存を増加させる方法、および癌の症状を低減または緩和する方法を提供し、これらの方法は、ａ）ヒスタミン二塩酸塩およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）／プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与する工程、またはｂ）ヒスタミン受容体アゴニストと共に、活性酸素種（ＲＯＳ）を随意に減少させる薬剤を投与する工程を含む。本発明はさらに、細胞傷害性Ｔ細胞の再分布、ＮＫ細胞の頻度、または他の生化学的な変化に基づいて癌治療の有効性を予測する方法、ならびに癌の再発を防ぐための関連方法、および癌からの寛解を延長するための関連方法を提供する。関連するキットおよび組成物がさらに提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発癌または転移癌を有する被験体の腫瘍量を減らす方法であって：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与する工程であって、それにより前記被験体の腫瘍量を減らす、工程を含む方法。
【請求項２】
活動的な癌を有する被験体の、転移性腫瘍の拡散リスクを減らす方法であって：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与する工程であって、それにより前記被験体における転移性腫瘍の拡散リスクを減らす、工程を含む方法。
【請求項３】
被験体における癌の再出現、再発または転移の拡大を防ぐ、または遅らせる方法であって：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与する工程であって、それによって前記被験体における前記癌の再出現、再発または転移の拡大を防ぐ、または遅らせる、工程を含む方法。
【請求項４】
被験体の癌の再発を防ぐ方法であって：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与する工程であって、それによって前記被験体における前記癌の再発を防ぐ、工程を含む方法。
【請求項５】
前記癌からの寛解にある被験体の癌の再発を遅らせる方法であって：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与する工程であって、それによって前記癌からの寛解にある前記被験体における癌の再発を防ぐ、工程を含む方法。
【請求項６】
被験体の癌からの寛解を延長する方法であって：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与する工程であって、それによって前記被験体における前記癌からの寛解を延長する、工程を含む方法。
【請求項７】
癌からの寛解にある被験体の生存を増加させる方法であって：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与する工程であって、それによって前記被験体の生存を増加させる、工程を含む方法。
【請求項８】
癌からの寛解にある被験体の生存期間を延長する方法であって：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与する工程であって、それによって前記被験体の生存期間を延長する、工程を含む方法。
【請求項９】
被験体における悪性腫瘍増殖を減らす方法であって：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与する工程であって、それによって前記被験体における悪性腫瘍の増殖を減らす、工程を含む方法。
【請求項１０】
癌からの寛解にある被験体の癌症状を低減または緩和する方法であって：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与する工程であって、それによって前記被験体における前記癌症状を低減または緩和する、工程を含む方法。
【請求項１１】
前記ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１阻害剤は抗体である、請求項１−１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ＢＭＳ  ９３６５５９、およびＭＰＤＬ３２８ＯＡから成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒスタミン受容体アゴニストはヒスタミン二塩酸塩である、請求項５−１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒスタミン受容体アゴニストは、Ｎ−メチル−ヒスタミンまたは４−メチル−ヒスタミンである、請求項５−１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
治療上有効な量の、追加の免疫増強薬を投与する工程をさらに含む、請求項１−１４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
前記追加の免疫増強薬はインターロイキン２（ＩＬ−２）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
癌ワクチンを投与する工程をさらに含む、請求項１−１６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
被験体における癌からの寛解を延長するためのキットであって、ａ）治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤、および前記キットの使用に関する使用説明書を含むキット。
【請求項１９】
前記ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１阻害剤は抗体である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ＢＭＳ  ９３６５５９、およびＭＰＤＬ３２８ＯＡから成る群から選択される、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記ヒスタミン受容体アゴニストはヒスタミン二塩酸塩である、請求項１８−２０のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２２】
前記ヒスタミン受容体アゴニストは、Ｎ−メチル−ヒスタミン、または４−メチル−ヒスタミンである、請求項１８−２０のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２３】
免疫増強薬をさらに含む、請求項１８−２２のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２４】
前記免疫増強薬はインターロイキン２（ＩＬ−２）である、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
被験体の癌治療の有効性を予測する方法であって、該方法は：
ａ．前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；
ｂ．前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；
ｃ．前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；および
ｄ）前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプル内の、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞表現型の頻度を測定する工程を含み、
前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにＴエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）の頻度の減少、およびＴエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の頻度の増加があるような、細胞傷害性Ｔ細胞の再分布がある場合、前記癌治療は被験体において有効であると予測され、および、
前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルに細胞傷害性Ｔ細胞の再分布がない場合、前記の癌治療は前記被験体において有効ではないと予測され、
前記工程ａからｄによって前記被験体における前記癌治療の効果を予測する、方法。
【請求項２６】
前記癌からの寛解にある被験体の癌の再発を防ぐ方法であって、該方法は：
ａ．前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；
ｂ．前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；
ｃ．前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；
ｄ．前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプル内の、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞表現型の頻度を測定する工程、および
ｅ．前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにＴエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）の頻度の減少、およびＴエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の頻度の増加があるような、細胞傷害性Ｔ細胞の再分布がある場合、前記被験体に前記処置の追加のサイクルを施す工程を含み、
前記工程ａからｅによって前記被験体における前記癌の再発を防ぐ、方法。
【請求項２７】
被験体の癌からの寛解を延長する方法であって、該方法は：
ａ．前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；
ｂ．前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；
ｃ．前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；
ｄ．前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプル内の、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞表現型の頻度を測定する工程、および
ｅ．前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにＴエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）の頻度の減少、およびＴエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の頻度の増加があるような、細胞傷害性Ｔ細胞の再分布がある場合、前記被験体に前記処置の追加のサイクルを施す工程、を含み、
前記ａからｅの工程によって前記被験体における前記癌からの緩解を延長する、方法。
【請求項２８】
前記癌は白血病である、請求項１−８、１０−１７および２５−２７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
前記白血病は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌は胸腺腫である、請求項１−８、１０−１７および２５−２７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
前記被験体は前記癌から完全寛解（ＣＲ）にある、請求項５−８、１０−１７および２５−３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
前記癌治療は前記被験体へのサイトカインの投与を含む、請求項２５−３１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３３】
前記サイトカインはインターロイキンである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記インターロイキンはＩＬ−２を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記インターロイキンはＩＬ−１２またはＩＬ−１５を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記インターロイキンは低用量で投与される、請求項３３−３５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３７】
前記ＩＬ−２は、１日２回、１６，４００Ｕ／ｋｇの用量で投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記サイトカインはインターフェロンを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記インターフェロンはインターフェロンαを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記インターフェロンはインターフェロンβを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記インターフェロンはインターフェロンγを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記サイトカインは造血成長因子を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
前記造血成長因子は、エリトロポイエチン、ＩＬ−１１、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記癌治療は前記被験体へのヒスタミン受容体アゴニストの投与を含む、請求項２５−４３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４５】
前記ヒスタミン受容体アゴニストはヒスタミン二塩酸塩である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ヒスタミン受容体アゴニストは、Ｎ−メチル−ヒスタミンまたは４−メチル−ヒスタミンである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
ヒスタミン二塩酸塩は、１日２回、０．５ｍｇ投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記癌治療は、ヒスタミン二塩酸塩およびインターロイキン２（ＩＬ−２）の投与を含む、請求項２５−４７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項４９】
寛解にある前記被験体は、再発防止のための免疫療法を受けている、請求項２５−４８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５０】
前記癌治療は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤の投与を含む、請求項２５−４９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５１】
前記処置のサイクルは、前記処置の第１のサイクルである、請求項２５−５０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５２】
前記処置のサイクルは、前記処置の第３のサイクルである、請求項２５−５０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５３】
前記サイクルは、３週間の処置のサイクルである、請求項２５−５２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５４】
前記血液サンプルは末梢血サンプルである、請求項２５−５３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５５】
前記処置のサイクル、または提案された処置は皮下に施される、請求項２６−５４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５６】
完全寛解（ＣＲ）にある、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する被験体のＡＭＬの再発を防ぐ方法であって、該方法は：
ａ．前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；
ｂ．前記被験体にヒスタミン二塩酸塩およびインターロイキン２（ＩＬ−２）の第１サイクルを投与する工程；
ｃ．処置の前記第１サイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；
ｄ．前記血液サンプル内のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞表現型の頻度を測定する工程；および
ｅ．Ｔエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）の頻度の減少、およびＴエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の頻度の増加があるような、前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルに細胞傷害性Ｔ細胞の再分布がある場合、前記被験体にヒスタミン二塩酸塩およびＩＬ−２の追加のサイクルを投与する工程を含み、
前記工程ａからｅによって前記被験体におけるＡＭＬの再発を防ぐ、方法。
【請求項５７】
被験体における癌治療の有効性を予測するためのキットであって、治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、免疫増強薬、ＣＤ８＋細胞傷害性表現型を測定する手段、および前記キットの使用に関する使用説明書を含むキット。
【請求項５８】
前記ヒスタミン受容体アゴニストはヒスタミン二塩酸塩である、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
前記ヒスタミン受容体アゴニストは、Ｎ−メチル−ヒスタミンまたは４−メチル−ヒスタミンである、請求項５７に記載のキット。
【請求項６０】
前記免疫増強薬はサイトカインである、請求項５７−５９のいずれか１つに記載のキット。
【請求項６１】
前記サイトカインはインターロイキンである、請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
前記インターロイキンはＩＬ−２を含む、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
前記インターロイキンはＩＬ−１２またはＩＬ−１５を含む、請求項６１に記載のキット。
【請求項６４】
前記ＣＤ８＋細胞傷害性表現型を測定する手段は、ＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＩＦＮ−γに対する抗体を含む、請求項５７−６３のいずれか１つに記載のキット。
【請求項６５】
前記ＣＤ８＋細胞傷害性表現型を測定する手段は、ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＨＩＴ３ａ）、ＣＤ４−ＡＰＣ−Ｈ７（ＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ４−Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｖ４５０（ＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８−ＡＰＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ８／ＳＫ１）、ＣＤ８−Ｑｄｏｔ７０５（３Ｂ５）、ＣＤ１６−Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｖ４５０（３Ｇ８）、ＣＤ２５−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（Ｍ−Ａ２５１）、ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ（ＨＩ１００）、ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ（ＵＣＨＬ１）、ＣＤ５６−ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ７１０（ＣＭＳＳＢ）、ＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ７（ＮＣＡＭ１６．２）、ＣＤ６９−ＰＥ−Ｃｙ７（ＦＮ５０）、ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ（Ｌ２４３）、ＣＣＲ７−ＰＥ−Ｃｙ７（Ｇ０４３Ｈ７）、ＣＤ３−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（Ｓ４．１）、ＣＤ１４−Ｑｄｏｔ６５５（ＴｕＫ４）、およびストレプトアビジン−Ｑｄｏｔ６０５、ＩＦＮ−γ−ＰＥ−Ｃｙ７、またはそれらの組み合わせを含む、請求項５７−６３のいずれか１つに記載のキット。
【請求項６６】
血液サンプルを採取するための１つ以上の容器をさらに含む、請求項５７−６５のいずれか１つに記載のキット。
【請求項６７】
治療上有効な量の、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤をさらに含む、請求項５７−６６のいずれか１つに記載のキット。
【請求項６８】
前記ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤は抗体である、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
前記抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ＢＭＳ  ９３６５５９、およびＭＰＤＬ３２８ＯＡから成る群から選択される、請求項６８に記載のキット。
【請求項７０】
被験体の癌治療の有効性を予測する方法であって、該方法は：
ａ．前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；
ｂ．前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；
ｃ．前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；および
ｄ．前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプル内のＮＫ細胞の頻度を測定する工程、を含み、
前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにＮＫ細胞の頻度の増加がある場合、前記癌治療は前記被験体において効果的であると予測され、および、
前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにＮＫ細胞の頻度の増加がない場合、前記癌治療は前記被験体において効果的ではないと予測され、
前記工程ａからｄによって前記被験体における前記癌治療の有効性を予測する、方法。
【請求項７１】
前記癌は急性骨髄性白血病である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＮＫ細胞は、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ＮＬ細胞、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞、またはその両方である、請求項７０または７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＮＫ細胞のレベルは、ＮＫ細胞に関連するバイオマーカーの検知を通じて測定される、請求項７０−７２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７４】
前記ＮＫ細胞に関連するバイオマーカーはＮＫｐ３０である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＮＫ細胞に関連するバイオマーカーはＮＫｐ４６である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
被験体の癌治療の有効性を予測する方法であって、該方法は：
ａ．前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；
ｂ．前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；
ｃ．前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；および
ｄ．前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプル内のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程、を含み、
前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにバイオマーカーの発現レベルの増加がある場合、前記癌治療は前記被験体において効果的であると予測され、および、
前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにバイオマーカーの発現レベルの増加がない場合、前記癌治療は前記被験体において効果的ではないと予測され、
前記工程ａからｄによって前記被験体における前記癌治療の有効性を予測する、方法。
【請求項７７】
前記バイオマーカーは白血球細胞表面受容体である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記バイオマーカーは単球細胞表面受容体である、請求項７６または７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記バイオマーカーはヒスタミン２型受容体（Ｈ２Ｒ）である、請求項７６−７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
被験体の癌治療の有効性を予測する方法であって、該方法は：
ａ．前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；
ｂ．前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；
ｃ．前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；および
ｄ．前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプル内のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程、を含み、
前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにバイオマーカーの発現レベルの低下がある場合、前記癌治療は前記被験体において効果的であると予測され、および、
前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにバイオマーカーの発現レベルの低下がない場合、前記癌治療は前記被験体において効果的ではないと予測され、
前記工程ａからｄによって前記被験体における前記癌治療の有効性を予測する、方法。
【請求項８１】
前記バイオマーカーは白血球細胞表面受容体である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記バイオマーカーはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ａである、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記バイオマーカーはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ｂである、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項８４】
前記バイオマーカーはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ｃである、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項８５】
被験体の癌を処置する方法であって：活性酸素種（ＲＯＳ）を減少させる治療上有効な量の薬剤を前記被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項８６】
前記薬剤は細胞外のＲＯＳを減少させる、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記薬剤はＲＯＳ形成の阻害剤である、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記薬剤は細胞外のＲＯＳの消去剤である、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項８９】
ヒスタミン受容体アゴニストを投与する工程をさらに含む、請求項８５−８８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９０】
前記ヒスタミン受容体アゴニストはヒスタミン二塩酸塩である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記ヒスタミン受容体アゴニストは、Ｎ−メチル−ヒスタミンまたは４−メチル−ヒスタミンである、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記癌治療は、ヒスタミン二塩酸塩およびインターロイキン２（ＩＬ−２）の投与を含む、請求項７０−９１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９３】
前記癌は白血病である、請求項７０−９２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９４】
前記白血病は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である、請求項９３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験体の癌を処置する方法、寛解にある被験体における癌の再発を予防または遅らせる方法、癌からの寛解を延長する方法、生存を増加させる方法、および癌の症状を低減または緩和する方法を提供し、これらの方法は、ａ）ヒスタミン二塩酸塩、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）／プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与する工程、またはｂ）ヒスタミン受容体アゴニストと共に、活性酸素種（ＲＯＳ）を随意に減少させる薬剤を投与する工程、を含む。本発明はさらに、細胞傷害性Ｔ細胞の再分布、ＮＫ細胞の頻度、または他の生化学的な変化に基づいた癌治療の有効性を予測する方法、および癌の再発を防ぎ、かつ癌からの寛解を延長するための関連方法を提供する。関連するキットおよび組成物がさらに提供される。
【背景技術】
【０００２】
ヒスタミン二塩酸塩は生体アミンヒスタミンに由来する。それは、免疫活性化サイトカインに対する応答を含む、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の機能を阻害する活性酸素種の生成を阻害する。サイトカインインターロイキン（ＩＬ）−２およびヒスタミン二塩酸塩の同時投与は、ＩＬ−２によるＴ細胞とＮＫ細胞の活性化を助け、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の癌細胞を含む癌細胞の破壊をもたらす。
【０００３】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）と診断された患者は、白血病細胞の微視的な消失および正常な再現造血（完全寛解、ＣＲ）に達することを目的とした導入化学療法を受ける。寛解後のフェーズには、検出不可能な白血病細胞を根絶する目的での地固め療法が含まれる。しかしながら、ＣＲにおける再発は一般的であり、特に高齢の患者（＞６０歳）においてはよくあることであり、成人のＡＭＬ患者の少数のみが長期の白血病なしの生存（ＬＦＳ）を達成する理由を有意に説明する。ＡＭＬ再発後の長期生存の可能性は乏しい。したがって、ＣＲにおけるＡＭＬの再発および他の癌を防ぐ方法が非常に求められる。
【０００４】
加えて、研究者は、腫瘍細胞が免疫系により認識され得るが、それにもかかわらず抗腫瘍反応を制限または遮断する阻害機構によって免疫系が休止したままであり得るために、癌治療が頻繁に、最良に効果的でないことに気づいている。例えば、負の調節性Ｔ細胞表面分子は、その活性を弱めるように活性化Ｔ細胞でアップレギュレートされ、結果として腫瘍細胞を死滅させる効果が弱くなることが発見された。これらの阻害分子は、Ｔ細胞共刺激分子ＣＤ２８への相同性ゆえに、負の共刺激分子と名付けられた。免疫チェックポイントタンパク質とも呼ばれるこれらのタンパク質は、初期活性化シグナルの減衰、正の共刺激に対する競合、および抗原提示細胞の直接阻害を含む多数の経路において機能する。
【０００５】
ある免疫チェックポイントタンパク質ＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１）は、ＣＤ２７９（表面抗原分類２７９）としても知られ、免疫活性化と免疫寛容との間のバランスの調節に関係する単球、活性化Ｔ細胞、およびＢ細胞に発現する。ＰＤ−１の主な役割はおそらく、感染に対する炎症反応中に末梢のＴ細胞の活性を制限し、および自己免疫を制限することである。ＰＤ−１リガンドＢ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１およびＢ７−ＤＣ／ＰＤ−Ｌ２は、様々な炎症誘導性サイトカインに反応してアップレギュレートされ、および炎症を起こした組織内の活性化Ｔ細胞においてＰＤ−１に結合することができ、それによって免疫反応を制限する。
【０００６】
ＰＤ−１リガンドは、肺、卵巣および結腸の細胞腫、および黒色腫などの、多くのヒト腫瘍に、正常レベルよりも高いレベルで発現し、それは腫瘍浸潤リンパ球においてＰＤ−１に結合することにより局所の抗腫瘍Ｔ細胞応答を阻害する。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用の阻害は、インビトロでのＴ細胞応答を増強し、および前臨床の抗腫瘍活性を媒介することができる。
【０００７】
ＰＤ−１などの免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）の使用は、より良い癌免疫療法に対する有望な手法の代表であると思われる。しかしながら、ワクチンを含む免疫活性化の他の手段との、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害剤の併用は、免疫療法の望ましい改善を大してもたらさなかった。
【０００８】
したがって、ＩＣＩでの処置に基づく、特にＰＤ−１経路阻害剤に基づく治療のための、安全かつ効果的な方法が必要であり、腫瘍、癌および／または感染症の治療に特に必要とされる。
【発明の概要】
【０００９】
一実施形態では、本発明は、原発癌または転移癌を有する被験体の腫瘍量を減少させる方法を提供し、該方法は：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記被験体の腫瘍量を減少させる工程を含む。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、活動的な癌を有する被験体における転移性腫瘍の拡散リスクを減らす方法を提供し、該方法は：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記被験体の転移性腫瘍のリスクを減らす工程を含む。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌の再出現、再発または転移の拡大を防ぐ、または遅らせる方法を提供し、該方法は：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記被験体における前記癌の再出現、再発または転移の拡大を防ぐ、または遅らせる工程を含む。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、前記癌からの寛解にある被験体における癌の再発を防ぐ方法を提供し、該方法は：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記癌からの寛解にある前記被験体における癌の再発を防ぐ工程を含む。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、前記癌からの寛解にある被験体における癌の再発を遅らせる方法を提供し、該方法は：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記癌からの寛解にある前記被験体における癌の再発を遅らせる工程を含む。
【００１４】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌からの寛解を延長する方法を提供し、該方法は：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記被験体における前記癌からの寛解を延長する工程を含む。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、癌からの寛解にある被験体における生存を増加させる方法を提供し、該方法は：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記被験体の生存を増加させる工程を含む。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、癌からの寛解にある被験体の生存期間を延長する方法を提供し、該方法は：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記被験体の生存期間を延長する工程を含む。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、被験体における悪性腫瘍の増殖を減らす方法を提供し、該方法は：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記被験体における悪性腫瘍の増殖を減らす工程を含む。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、癌からの寛解にある被験体の癌の症状を低減または緩和する方法を提供し、該方法は：前記被験体に、治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記被験体における前記癌症状を低減または緩和する工程を含む。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌からの寛解を延長するためのキットを提供し、該キットは：ａ）治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤、および前記キットの使用に関する使用説明書を含む。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌治療の有効性を予測する方法を提供し、該方法は：ａ）前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；ｂ）前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；ｃ）前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；およびｄ）前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプル内の、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞表現型の頻度を測定する工程を含み、ここで前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにＴエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）の頻度の減少、およびＴエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の頻度の増加があるような、細胞傷害性Ｔ細胞の再分布がある場合、前記癌治療は被験体において有効であると予測され、および、前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルに細胞傷害性Ｔ細胞の再分布がない場合、前記癌治療は前記被験体において有効ではないと予測され、それによって前記被験体における前記癌治療の効果が予測される。
【００２１】
別の実施形態では、本発明は、前記癌からの寛解にある被験体における癌の再発を防ぐ方法を提供し、該方法は：ａ）前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；ｂ）前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；ｃ）前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；ｄ）前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプル内の、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞表現型の頻度を測定する工程、およびｅ）前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにＴエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）の頻度の減少、およびＴエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の頻度の増加があるような、細胞傷害性Ｔ細胞の再分布がある場合、前記被験体に前記処置の追加のサイクルを施す工程を含み、それによって前記被験体における前記癌の再発を防ぐ。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌からの寛解を延長する方法を提供し、該方法は：ａ）前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；ｂ）前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；ｃ）前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；ｄ）前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプル内の、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞表現型の頻度を測定する工程、およびｅ）前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにＴエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）の頻度の減少、およびＴエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の頻度の増加があるような、細胞傷害性Ｔ細胞の再分布がある場合、前記被験体に前記処置の追加のサイクルを施す工程を含み、それによって前記被験体における前記癌からの寛解を延長する。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、化学療法後の完全寛解（ＣＲ）にある、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する被験体におけるＡＭＬの再発を防ぐ方法を提供し、該方法は：ａ）前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；ｂ）前記被験体にヒスタミン二塩酸塩およびインターロイキン２（ＩＬ−２）の第１サイクルを投与する工程；ｃ）前記第１サイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；ｄ）前記血液サンプル内のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞表現型の分布を測定する工程；およびｅ）Ｔエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）の頻度の減少、およびＴエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の頻度の増加があるような、前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルに細胞傷害性Ｔ細胞の再分布がある場合、前記被験体にヒスタミン二塩酸塩およびＩＬ−２の追加のサイクルを投与する工程を含み、それによって前記被験体におけるＡＭＬの再発を防ぐ。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌治療の有効性を予測するためのキットを提供し、該キットは、ヒスタミン受容体アゴニスト、免疫増強薬、ＣＤ８＋細胞傷害性の表現型を測定する手段、および前記キットの使用に関する使用説明書を含む。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌治療の有効性を予測する方法を提供し、該方法は：（ａ）前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；（ｂ）前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；（ｃ）前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；および（ｄ）前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプル内のＮＫ細胞の頻度を測定する工程を含み、ここで前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにＮＫ細胞の頻度に増加がある場合、前記癌治療は前記被験体において効果的であると予測され、および、前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにＮＫ細胞の頻度の増加がない場合、前記癌治療は前記被験体において効果的ではないと予測され、それによって前記被験体における前記癌治療の有効性が予測される。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌治療の有効性を予測する方法を提供し、該方法は：（ａ）前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；（ｂ）前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；（ｃ）前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；および（ｄ）前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプルにおけるバイオマーカーの発現レベルを測定する工程を含み、前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにバイオマーカーの発現レベルの増加がある場合、前記癌治療は前記被験体において効果的であると予測され、および前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにバイオマーカーの発現レベルの増加がない場合、前記癌治療は前記被験体において効果的ではないと予測され、それによって前記被験体における前記癌治療の有効性が予測される。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌治療の有効性を予測する方法を提供し、該方法は：（ａ）前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；（ｂ）前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；（ｃ）前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；および（ｄ）前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプルにおけるバイオマーカーの発現レベルを測定する工程を含み、ここで前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにバイオマーカーの発現レベルの低下がある場合、前記癌治療は前記被験体において効果的であると予測され、および、前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにバイオマーカーの発現レベルの低下がない場合、前記癌治療は前記被験体において効果的ではないと予測され、それによって前記被験体における前記癌治療の有効性が予測される。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、被験体の癌を処置する方法を提供し、該方法は：前記被験体に治療上有効な量の、活性酸素種（ＲＯＳ）を低下させる薬剤を投与する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
本発明と見なされる主題が特に指摘され、本明細書の結論部分で明確に請求される。しかしながら、本発明は、その目的、特徴および利点と共に、実施の構成および方法の両方に関して、添付の図と共に読む時に、以下の詳細な説明を参照することによって最もよく理解され得る。
【図１】４つの処置グループにおける各被験体の個々の腫瘍サイズ。腫瘍増殖中の８、１１および１３日目の、対照（ｎ＝２９）、ヒスタミン（ｎ＝２９）、α−ＰＤ１／ＰＤＬ１（ｎ＝８）、およびヒスタミン＋α−ＰＤ１／ＰＤＬ１（ｎ＝８）処置群の各被験体における腫瘍サイズが示される。腫瘍サイズは対照の％として示され、１００％は腫瘍接種後２週間における対照腫瘍の平均サイズであった。
【図２】４つの処置群における平均腫瘍サイズ。腫瘍増殖中の８、１１および１３日目の、対照（ｎ＝２９）、ヒスタミン（ｎ＝２９）、α−ＰＤ１／ＰＤＬ１（ｎ＝８）、およびヒスタミン＋α−ＰＤ１／ＰＤＬ１（ｎ＝８）の処置群における平均腫瘍サイズの平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）が示される。群は二元配置分散分析を使用して統計的に比較された。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。示される全てのｐ値は両側ｐ値である。腫瘍サイズは対照の％として示され、１００％は腫瘍接種後２週間における対照腫瘍の平均サイズであった。
【図３】４つの処置群における腫瘍サイズ。４つの処置群における腫瘍サイズは、腫瘍測定のそれぞれの時点ごとに箱ひげ図で示される。箱は、水平線によって示された中間値の腫瘍サイズを有する、腫瘍サイズの第２５および第７５四分位を示す。ひげは、腫瘍サイズの最大値および最小値を示す。Ｐ値はスチューデントのｔ検定を使用して算出された。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。示される全てのｐ値は両側ｐ値である。腫瘍サイズは対照の％として示され、１００％は腫瘍接種後２週間における対照腫瘍の平均サイズであった。
【図４】Ｒｅ：Ｍｉｓｓｉｏｎ第ＩＶ相試験の概観。第１の完全寛解（ＣＲ）にある適格なＡＭＬ患者は、１８ヶ月間、３週間サイクルのＨＤＣ／ＩＬ−２を１０回受けた。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、サイクル１およびサイクル３の前後に採取された血液から単離した。患者は最後の処置サイクルを完了した後、６ヶ月間フォローアップされた。
【図５】分析された患者。試験に含まれた患者の数、および成功裡に分析されたサンプルの数を示すフローチャート。
【図６Ａ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法中の、再発のないおよび再発を有するＡＭＬ患者におけるＣＤ８＋サブセットの分布。ＨＤＣ／ＩＬ−２処置の第１および第３サイクルの前（サイクル１、１日目、Ｃ１Ｄ１）、および後（Ｃ１Ｄ２１）における、ＣＤ８＋Ｔ細胞の血球数測定。
【図６Ｂ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法中の、再発のないおよび再発を有するＡＭＬ患者におけるＣＤ８＋サブセットの分布。ＣＤ８＋Ｔ細胞区画内の、ナイーブ細胞（ＴＮ；ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）、中央メモリー細胞（ＴＣＭ；ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ；ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７−）、およびエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ；ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−）を判定するためのゲーティング法。
【図６Ｃ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法中の、再発のないおよび再発を有するＡＭＬ患者におけるＣＤ８＋サブセットの分布。免疫療法の第１サイクルの開始（Ｃ１Ｄ１）および末日（Ｃ１Ｄ２１）における、再発のない（ｎ＝１８）および再発を有する（ｎ＝２６）患者の、ＣＤ８＋部分母集団ＴＮ細胞の頻度。統計的分析をスチューデントの対応のあるｔ検定によって行なった。
【図６Ｄ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法中の、再発のないおよび再発を有するＡＭＬ患者におけるＣＤ８＋サブセットの分布。免疫療法の第１サイクルの開始（Ｃ１Ｄ１）および末日（Ｃ１Ｄ２１）における、再発のない（ｎ＝１８）および再発を有する（ｎ＝２６）患者の、ＣＤ８＋部分母集団ＴＣＭ細胞の頻度。統計的分析をスチューデントの対応のあるｔ検定によって行なった。
【図６Ｅ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法中の、再発のないおよび再発を有するＡＭＬ患者におけるＣＤ８＋サブセットの分布。免疫療法の第１サイクルの開始（Ｃ１Ｄ１）および末日（Ｃ１Ｄ２１）における、再発のない（ｎ＝１８）および再発を有する（ｎ＝２６）患者の、ＣＤ８＋部分母集団ＴＥＭ細胞の頻度。統計的分析をスチューデントの対応のあるｔ検定によって行なった。
【図６Ｆ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法中の、再発のないおよび再発を有するＡＭＬ患者におけるＣＤ８＋サブセットの分布。免疫療法の第１サイクルの開始（Ｃ１Ｄ１）および末日（Ｃ１Ｄ２１）における、再発のない（ｎ＝１８）および再発を有する（ｎ＝２６）患者の、ＣＤ８＋部分母集団Ｔｅｆｆ（Ｆ）細胞の頻度。統計的分析をスチューデントの対応のあるｔ検定によって行なった。
【図７Ａ】免疫療法の開始時の、ＬＦＳに対するＣＤ８＋サブセットの影響。ＨＤＣ／ＩＬ−２の第１の処置サイクル前に採取された血液サンプル中のＴＮ  ＣＤ８＋Ｔ細胞の中間パーセンテージに基づいて、患者を二分した。ＬＦＳをログランク検定で分析した。
【図７Ｂ】免疫療法の開始時の、ＬＦＳに対するＣＤ８＋サブセットの影響。ＨＤＣ／ＩＬ−２の第１の処置サイクル前に採取された血液サンプル中のＴＣＭ ＣＤ８＋Ｔ細胞の中間パーセンテージに基づいて、患者を二分した。ＬＦＳをログランク検定で分析した。
【図７Ｃ】免疫療法の開始時の、ＬＦＳに対するＣＤ８＋サブセットの影響。ＨＤＣ／ＩＬ−２の第１の処置サイクル前に採取された血液サンプル中のＴＥＭ ＣＤ８＋Ｔ細胞の中間パーセンテージに基づいて、患者を二分した。ＬＦＳをログランク検定で分析した。
【図７Ｄ】免疫療法の開始時の、ＬＦＳに対するＣＤ８＋サブセットの影響。ＨＤＣ／ＩＬ−２の第１の処置サイクル前に採取された血液サンプル中のＴｅｆｆ ＣＤ８＋Ｔ細胞の中間パーセンテージに基づいて、患者を二分した。ＬＦＳをログランク検定で分析した。
【図８Ａ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている患者の臨床結果に対する、ＣＤ８＋サブセットの変化させた分布の影響。全ての患者を、第１の処置サイクル中のＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。患者は、第１の処置サイクル中のＴＥＭ細胞の減少（％）およびＴｅｆｆ細胞の同時誘導（％）の発生によって、遷移に対し陽性であると見なされた。
【図８Ｂ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている患者の臨床結果に対する、ＣＤ８＋サブセットの変化させた分布の影響。全ての患者を、第１の処置サイクル中のＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。患者は、第１の処置サイクル中のＴＥＭ細胞の減少（％）およびＴｅｆｆ細胞の同時誘導（％）の発生によって、遷移に対し陽性であると見なされた。
【図８Ｃ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている患者の臨床結果に対する、ＣＤ８＋サブセットの変化させた分布の影響。全ての患者を、第１の処置サイクル中のＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。患者は、第１の処置サイクル中のＴＥＭ細胞の減少（％）およびＴｅｆｆ細胞の同時誘導（％）の発生によって、遷移に対し陽性であると見なされた。
【図８Ｄ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている患者の臨床結果に対する、ＣＤ８＋サブセットの変化させた分布の影響。全ての患者を、第１の処置サイクル中のＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。患者は、第１の処置サイクル中のＴＥＭ細胞の減少（％）およびＴｅｆｆ細胞の同時誘導（％）の発生によって、遷移に対し陽性であると見なされた。
【図８Ｅ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている患者の臨床結果に対する、ＣＤ８＋サブセットの変化させた分布の影響。全ての患者を、ＴＥＭからＴｅｆｆ細胞への遷移（ｔｒａｎｓ）または無遷移に基づいて二分し、およびＬＦＳとＯＳをログランク検定によって分析した。患者は、第１の処置サイクル中のＴＥＭ細胞の減少（％）およびＴｅｆｆ細胞の同時誘導（％）の発生によって、遷移に対し陽性であると見なされた。
【図８Ｆ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている患者の臨床結果に対する、ＣＤ８＋サブセットの変化させた分布の影響。＞６０歳の患者を、第１の処置サイクル中のＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。患者は、第１の処置サイクル中のＴＥＭ細胞の減少（％）およびＴｅｆｆ細胞の同時誘導（％）の発生によって、遷移に対し陽性であると見なされた。
【図８Ｇ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている患者の臨床結果に対する、ＣＤ８＋サブセットの変化させた分布の影響。＞６０歳の患者を、第１の処置サイクル中のＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。患者は、第１の処置サイクル中のＴＥＭ細胞の減少（％）およびＴｅｆｆ細胞の同時誘導（％）の発生によって、遷移に対し陽性であると見なされた。
【図８Ｈ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている患者の臨床結果に対する、ＣＤ８＋サブセットの変化させた分布の影響。＞６０歳の患者を、第１の処置サイクル中のＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。患者は、第１の処置サイクル中のＴＥＭ細胞の減少（％）およびＴｅｆｆ細胞の同時誘導（％）の発生によって、遷移に対し陽性であると見なされた。
【図８Ｉ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている患者の臨床結果に対する、ＣＤ８＋サブセットの変化させた分布の影響。＞６０歳の患者を、第１の処置サイクル中のＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。患者は、第１の処置サイクル中のＴＥＭ細胞の減少（％）およびＴｅｆｆ細胞の同時誘導（％）の発生によって、遷移に対し陽性であると見なされた。
【図８Ｊ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている患者の臨床結果に対する、ＣＤ８＋サブセットの変化させた分布の影響。＞６０歳の患者を、ＴＥＭからＴｅｆｆ細胞への遷移（ｔｒａｎｓ）または無遷移に基づいて二分し、およびＬＦＳとＯＳをログランク検定によって分析した。患者は、第１の処置サイクル中のＴＥＭ細胞の減少（％）およびＴｅｆｆ細胞の同時誘導（％）の発生によって、遷移に対し陽性であると見なされた。
【図９】免疫療法中のＴＥＭ細胞とＴｅｆｆ細胞の分布における変化の負の相関。ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた第１の処置サイクル中の、ＣＤ８＋ＴＥＭ（Ｙ軸）およびＴｅｆｆ（Ｘ軸）の頻度における変化は、相関していた。再発のない患者は赤い点で示され、他方で再発している患者は黒い点で示される。
【図１０Ａ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている若年の患者、および高齢の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分布。ＨＤＣ／ＩＬ−２免疫療法の前（サイクル１、１日目；Ｃ１Ｄ１）または後（Ｃ１Ｄ２１）の、＜６０歳の患者（ｎ＝１７）、および＞６０歳の患者（ｎ＝２７）における、ＣＤ８＋部分母集団ＴＮ細胞の頻度。統計的分析をスチューデントの対応のあるｔ検定によって行なった。
【図１０Ｂ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている若年の患者、および高齢の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分布。ＨＤＣ／ＩＬ−２免疫療法の前（サイクル１、１日目；Ｃ１Ｄ１）または後（Ｃ１Ｄ２１）の、＜６０歳の患者（ｎ＝１７）、および＞６０歳の患者（ｎ＝２７）における、ＣＤ８＋部分母集団ＴＣＭ細胞の頻度。統計的分析をスチューデントの対応のあるｔ検定によって行なった。
【図１０Ｃ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている若年の患者、および高齢の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分布。ＨＤＣ／ＩＬ−２免疫療法の前（サイクル１、１日目；Ｃ１Ｄ１）または後（Ｃ１Ｄ２１）の、＜６０歳の患者（ｎ＝１７）、および＞６０歳の患者（ｎ＝２７）における、ＣＤ８＋部分母集団ＴＥＭ細胞の頻度。統計的分析をスチューデントの対応のあるｔ検定によって行なった。
【図１０Ｄ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている若年の患者、および高齢の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分布。ＨＤＣ／ＩＬ−２免疫療法の前（サイクル１、１日目；Ｃ１Ｄ１）または後（Ｃ１Ｄ２１）の、＜６０歳の患者（ｎ＝１７）、および＞６０歳の患者（ｎ＝２７）における、ＣＤ８＋部分母集団Ｔｅｆｆの細胞の頻度。統計的分析をスチューデントの対応のあるｔ検定によって行なった。
【図１０Ｅ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている若年の患者、および高齢の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分布。＜６０歳の患者を、第１の処置サイクル中の、異なるＣＤ８＋サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。
【図１０Ｆ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている若年の患者、および高齢の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分布。＜６０歳の患者を、第１の処置サイクル中の、異なるＣＤ８＋サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。
【図１０Ｇ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている若年の患者、および高齢の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分布。＜６０歳の患者を、第１の処置サイクル中の、異なるＣＤ８＋サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。
【図１０Ｈ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている若年の患者、および高齢の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分布。＜６０歳の患者を、第１の処置サイクル中の、異なるＣＤ８＋サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。
【図１０Ｉ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている若年の患者、および高齢の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分布。＜６０歳の患者を、第１の処置サイクル中の、異なるＣＤ８＋サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。
【図１０Ｊ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている若年の患者、および高齢の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分布。＜６０歳の患者を、第１の処置サイクル中の、異なるＣＤ８＋サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。
【図１０Ｋ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている若年の患者、および高齢の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分布。＜６０歳の患者を、第１の処置サイクル中の、異なるＣＤ８＋サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。
【図１０Ｌ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている若年の患者、および高齢の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分布。＜６０歳の患者を、第１の処置サイクル中の、異なるＣＤ８＋サブセットの頻度の誘導または減少に基づいて二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳおよびＯＳを分析した。
【図１０Ｍ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている若年の患者、および高齢の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分布。＜６０歳の患者を、ＴＥＭからＴｅｆｆ細胞への遷移または無遷移に基づいて二分し、およびＬＦＳとＯＳをログランク検定によって分析した。
【図１０Ｎ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている若年の患者、および高齢の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞集団の分布。＜６０歳の患者を、ＴＥＭからＴｅｆｆ細胞への遷移または無遷移に基づいて二分し、およびＬＦＳとＯＳをログランク検定によって分析した。
【図１１Ａ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法中の、ＣＤ８＋Ｔ細胞における活性化マーカーの発現。ＣＤ３＋ＣＤ８＋集団におけるＣＤ２５＋細胞の頻度（サイクル１、１日目；Ｃ１Ｄ１  ｎ＝６２；Ｃ１Ｄ２１  ｎ＝６３）。統計的分析をスチューデントの対応のあるｔ検定によって行なった。
【図１１Ｂ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法中の、ＣＤ８＋Ｔ細胞における活性化マーカーの発現。ＣＤ３＋ＣＤ８＋集団におけるＣＤ６９＋細胞の頻度（サイクル１、１日目；Ｃ１Ｄ１  ｎ＝６２；Ｃ１Ｄ２１  ｎ＝６３）。統計的分析をスチューデントの対応のあるｔ検定によって行なった。
【図１１Ｃ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法中の、ＣＤ８＋Ｔ細胞における活性化マーカーの発現。ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨＬＡ−ＤＲの中間蛍光強度（ＭＦＩ）（ｎ＝４４）。統計的分析をスチューデントの対応のあるｔ検定によって行なった。サイクル１中のＨＬＡ−ＤＲ強度の減少は、ノンパラメトリック分析において統計的に有意なままであった（ウィルコクソンの符号順位検定、Ｐ＝０．０００３）。
【図１１Ｄ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法中の、ＣＤ８＋Ｔ細胞における活性化マーカーの発現。免疫療法の第１サイクルの開始時（Ｃ１Ｄ２１）または末日（Ｃ１Ｄ１）に採取された血液サンプルを、ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激し、続いてＩＦＮ−γの細胞内染色を行った。箱ひげ図は、第１の処置サイクル前後のＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を示す（Ｃ１Ｄ１  ｎ＝５８；Ｃ１Ｄ２１  ｎ＝６３）。統計的分析をスチューデントの対応のあるｔ検定によって行なった。
【図１２Ａ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている患者における、ＨＬＡ−ＤＲ発現および白血病に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のＬＦＳに対する影響。患者を、治療の開始時（Ｃ１Ｄ１；ｎ＝４４）、または第１の処置サイクル後（Ｃ１Ｄ２１；ｎ＝４７）における、ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞での中間値のＨＬＡ−ＤＲ発現によって二分した。ＬＦＳとＯＳをログランク検定で分析した。
【図１２Ｂ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている患者における、ＨＬＡ−ＤＲ発現および白血病に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のＬＦＳに対する影響。ＨＤＣ／ＩＬ−２処置を受けている患者からの血液サンプルを、白血病細胞関連抗原からのペプチドのプール（ＡＭＬ−ペプチド）、またはＣＭＶ、ＥＢＶおよびインフルエンザウイルスからのペプチドのプール（ＣＥＦ−ペプチド）、またはペプチド無し（負の対照）で刺激した。ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって判定した。代表的なドットプロットが、刺激なしのサンプル、およびＡＭＬ−ペプチドまたはＣＥＦ−ペプチドで刺激されたサンプルにおけるＩＦＮ−γ生成を示す。
【図１２Ｃ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を受けている患者における、ＨＬＡ−ＤＲ発現および白血病に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のＬＦＳに対する影響。ＨＤＣ／ＩＬ−２処置を受けている患者からの血液サンプルを、白血病細胞関連抗原からのペプチドのプール（ＡＭＬ−ペプチド）、またはＣＭＶ、ＥＢＶおよびインフルエンザウイルスからのペプチドのプール（ＣＥＦ−ペプチド）、またはペプチド無し（負の対照）で刺激した。ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーによって判定した。ＡＭＬ特異的、またはＣＥＦ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の有無に基づいて患者を二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳを分析した。抗原特異性Ｔ細胞の分析の最終時点（Ｃ３Ｄ２１；１０５日）前に起こる事象を伴わない患者のみを、後の分析において考慮した。
【図１３】ＴＥＭからＴｅｆｆ細胞への遷移およびＮＫ細胞ＮＫｐ４６発現の、臨床結果に対する影響。第１の処置サイクル中にＴＥＭ細胞の減少（％）およびＴｅｆｆ細胞の同時誘導（％）を示す場合に、患者を遷移陽性と見なし、および免疫療法の第１サイクル後（Ｃ１Ｄ２１）に、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞がＮＫｐ４６の中間値レベルを超えて発現した場合、ＮＫｐ４６ｈｉｇｈと見なした。データは、ＴＥＭ−Ｔｅｆｆ遷移およびＮＫｐ４６ｈｉｇｈ（両方）、遷移のみ、ＮＫｐ４６ｈｉｇｈのみ、ＴＥＭ−Ｔｅｆｆ無遷移および低いＮＫｐ４６発現（両方）を伴う患者のＬＦＳとＯＳを示す（傾向に関するログランク検定によって分析）。
【図１４Ａ】６０歳未満および６０歳を超える患者におけるＮＫ細胞の誘導と活性化。箱ひげ図は、＜６０歳の患者（若年、白；ＮＫ細胞数、ｎ＝１７、ＮＣＲ発現、ｎ＝２１）、および＞６０歳の患者（高齢、灰色；ＮＫ細胞数、ｎ＝３０、ＮＣＲ発現、ｎ＝３５）における、ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた第１の２１日間の処置サイクルの前（Ｃ１Ｄ２１）および後（Ｃ１Ｄ１）の、ＣＤ１６＋またはＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞における血液内のＣＤ１６＋ＮＫ細胞の数を示す。ＮＫ細胞数の誘導およびＮＣＲ発現を、スチューデントの対応のあるｔ検定を使用して分析した。
【図１４Ｂ】６０歳未満および６０歳を超える患者におけるＮＫ細胞の誘導と活性化。箱ひげ図は、＜６０歳の患者（若年、白；ＮＫ細胞数、ｎ＝１７、ＮＣＲ発現、ｎ＝２１）、および＞６０歳の患者（高齢、灰色；ＮＫ細胞数、ｎ＝３０、ＮＣＲ発現、ｎ＝３５）における、ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた第１の２１日間の処置サイクルの前（Ｃ１Ｄ２１）および後（Ｃ１Ｄ１）の、ＣＤ１６＋またはＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞におけるＮＫｐ３０の中間蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ＮＫ細胞数の誘導およびＮＣＲ発現を、スチューデントの対応のあるｔ検定を使用して分析した。
【図１４Ｃ】６０歳未満および６０歳を超える患者におけるＮＫ細胞の誘導と活性化。箱ひげ図は、＜６０歳の患者（若年、白；ＮＫ細胞数、ｎ＝１７、ＮＣＲ発現、ｎ＝２１）、および＞６０歳の患者（高齢、灰色；ＮＫ細胞数、ｎ＝３０、ＮＣＲ発現、ｎ＝３５）における、ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた第１の２１日間の処置サイクルの前（Ｃ１Ｄ２１）および後（Ｃ１Ｄ１）の、ＣＤ１６＋またはＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞におけるＮＫｐ４６の中間蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ＮＫ細胞数の誘導およびＮＣＲ発現を、スチューデントの対応のあるｔ検定を使用して分析した。
【図１４Ｄ】６０歳未満および６０歳を超える患者におけるＮＫ細胞の誘導と活性化。箱ひげ図は、＜６０歳の患者（若年、白；ＮＫ細胞数、ｎ＝１７、ＮＣＲ発現、ｎ＝２１）、および＞６０歳の患者（高齢、灰色；ＮＫ細胞数、ｎ＝３０、ＮＣＲ発現、ｎ＝３５）における、ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた第１の２１日間の処置サイクルの前（Ｃ１Ｄ２１）および後（Ｃ１Ｄ１）の、ＣＤ１６＋またはＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞における血液内のＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞の数を示す。ＮＫ細胞数の誘導およびＮＣＲ発現を、スチューデントの対応のあるｔ検定を使用して分析した。
【図１４Ｅ】６０歳未満および６０歳を超える患者におけるＮＫ細胞の誘導と活性化。箱ひげ図は、＜６０歳の患者（若年、白；ＮＫ細胞数、ｎ＝１７、ＮＣＲ発現、ｎ＝２１）、および＞６０歳の患者（高齢、灰色；ＮＫ細胞数、ｎ＝３０、ＮＣＲ発現、ｎ＝３５）における、ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた第１の２１日間の処置サイクルの前（Ｃ１Ｄ２１）および後（Ｃ１Ｄ１）の、ＣＤ１６＋またはＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞におけるＮＫｐ３０の中間蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ＮＫ細胞数の誘導およびＮＣＲ発現を、スチューデントの対応のあるｔ検定を使用して分析した。
【図１４Ｆ】６０歳未満および６０歳を超える患者におけるＮＫ細胞の誘導と活性化。箱ひげ図は、＜６０歳の患者（若年、白；ＮＫ細胞数、ｎ＝１７、ＮＣＲ発現、ｎ＝２１）、および＞６０歳の患者（高齢、灰色；ＮＫ細胞数、ｎ＝３０、ＮＣＲ発現、ｎ＝３５）における、ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた第１の２１日間の処置サイクルの前（Ｃ１Ｄ２１）および後（Ｃ１Ｄ１）の、ＣＤ１６＋またはＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞におけるＮＫｐ４６の中間蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ＮＫ細胞数の誘導およびＮＣＲ発現を、スチューデントの対応のあるｔ検定を使用して分析した。ＮＫ細胞数の誘導およびＮＣＲ発現を、スチューデントの対応のあるｔ検定を使用して分析した。
【図１５Ａ】高齢のＡＭＬ患者における、白血病なしの生存（ＬＦＳ）および全生存（ＯＳ）に対するＮＫ細胞ＮＣＲ発現の影響。高齢の患者（＞６０）に関するＬＦＳおよびＯＳが示され、第１のＨＤＣ／ＩＬ−２処置サイクル前のＣＤ１６＋ＮＫ細胞上でのＮＫｐ３０発現の中央値以上（赤）または以下（黒色）に基づいて二分されている。
【図１５Ｂ】高齢のＡＭＬ患者における、白血病なしの生存（ＬＦＳ）および全生存（ＯＳ）に対するＮＫ細胞ＮＣＲ発現の影響。高齢の患者（＞６０）に関するＬＦＳおよびＯＳが示され、第１のＨＤＣ／ＩＬ−２処置サイクル前のＣＤ１６＋ＮＫ細胞上でのＮＫｐ４６発現の中間値以上（赤）または以下（黒色）に基づいて二分されている。
【図１５Ｃ】高齢のＡＭＬ患者における、白血病なしの生存（ＬＦＳ）および全生存（ＯＳ）に対するＮＫ細胞ＮＣＲ発現の影響。高齢の患者（＞６０）に関するＬＦＳおよびＯＳが示され、第１のＨＤＣ／ＩＬ−２処置サイクル後のＣＤ１６＋ＮＫ細胞上でのＮＫｐ３０の発現の中間値以上（赤）または以下（黒色）に基づいて二分されている。
【図１５Ｄ】高齢のＡＭＬ患者における、白血病なしの生存（ＬＦＳ）および全生存（ＯＳ）に対するＮＫ細胞ＮＣＲ発現の影響。高齢の患者（＞６０）に関するＬＦＳおよびＯＳが示され、第１のＨＤＣ／ＩＬ−２処置サイクル後の、ＣＤ１６＋ＮＫ細胞上でのＮＫｐ４６発現の中間値以上（赤）または以下（黒色）に基づいて二分されている。
【図１６Ａ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法は、白血球数を増加させ、血液単球レベルを低下させる。ＨＤＣ／ＩＬ−２による免疫療法のサイクル１（Ｃ１）および３（Ｃ３）の前（１日目；Ｄ１）および後（２１日目；Ｄ２１）の、白血球の末梢血球数を示す。スチューデントの対応のあるｔ検定を、時点間の違いを分析するために用いた。
【図１６Ｂ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法は、白血球数を増加させ、血液単球レベルを低下させる。ＨＤＣ／ＩＬ−２による免疫療法のサイクル１（Ｃ１）および３（Ｃ３）の前（１日目；Ｄ１）および後（２１日目；Ｄ２１）の、好酸球の末梢血球数を示す。スチューデントの対応のあるｔ検定を、時点間の違いを分析するために用いた。
【図１６Ｃ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法は、白血球数を増加させ、血液単球レベルを低下させる。ＨＤＣ／ＩＬ−２による免疫療法のサイクル１（Ｃ１）および３（Ｃ３）の前（１日目；Ｄ１）および後（２１日目；Ｄ２１）の、好中球の末梢血球数を示す。スチューデントの対応のあるｔ検定を、時点間の違いを分析するために用いた。
【図１６Ｄ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法は、白血球数を増加させ、血液単球レベルを低下させる。ＨＤＣ／ＩＬ−２による免疫療法のサイクル１（Ｃ１）および３（Ｃ３）の前（１日目；Ｄ１）および後（２１日目；Ｄ２１）の、単球の末梢血球数を示す。スチューデントの対応のあるｔ検定を、時点間の違いを分析するために用いた。
【図１６Ｅ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法は、白血球数を増加させ、血液単球レベルを低下させる。サイクル１中の単球減少の中間値に基づいて患者を二分し、続いてログランク検定によりＬＦＳおよびＯＳを分析した。
【図１６Ｆ】ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法は、白血球数を増加させ、血液単球レベルを低下させる。サイクル１中の単球減少の中間値に基づいて患者を二分し、続いてログランク検定によりＬＦＳおよびＯＳを分析した。
【図１７Ａ】ＬＦＳとＯＳへのヒスタミンＨ２Ｒ発現の影響。スチューデントの対応のあるｔ検定によって分析された、ＨＤＣ／ＩＬ−２のサイクル中のＣＤ１４＋＋単球のＨ２Ｒ発現を示す。
【図１７Ｂ】ＬＦＳとＯＳへのヒスタミンＨ２Ｒ発現の影響。スチューデントの対応のあるｔ検定によって分析された、ＨＤＣ／ＩＬ−２のサイクル中のＣＤ１６＋単球のＨ２Ｒ発現を示す。
【図１７Ｃ】ＬＦＳとＯＳへのヒスタミンＨ２Ｒ発現の影響。免疫療法のサイクル１の２１日目（Ｃ１Ｄ２１）における、ＣＤ１４＋＋単球の中間値Ｈ２Ｒ発現（ＭＦＩ）に基づいて患者を二分し、続いてログランク検定によりＬＦＳおよびＯＳを分析した。
【図１７Ｄ】ＬＦＳとＯＳへのヒスタミンＨ２Ｒ発現の影響。免疫療法のサイクル１の２１日目（Ｃ１Ｄ２１）における、ＣＤ１６＋単球の中間値Ｈ２Ｒ発現（ＭＦＩ）に基づいて患者を二分し、続いてログランク検定によりＬＦＳおよびＯＳを分析した。
【図１７Ｅ】ＬＦＳとＯＳへのヒスタミンＨ２Ｒ発現の影響。免疫療法のサイクル１の２１日目（Ｃ１Ｄ２１）における、ＣＤ１４＋＋単球の中間値Ｈ２Ｒ発現（ＭＦＩ）に基づいて患者を二分し、続いてログランク検定によりＬＦＳおよびＯＳを分析した。
【図１７Ｆ】ＬＦＳとＯＳへのヒスタミンＨ２Ｒ発現の影響。免疫療法のサイクル１の２１日目（Ｃ１Ｄ２１）における、ＣＤ１６＋単球の中間値Ｈ２Ｒ発現（ＭＦＩ）に基づいて患者を二分し、続いてログランク検定によりＬＦＳおよびＯＳを分析した。
【図１８Ａ】ＨＤＣ／ＩＬ−２免疫療法中の骨髄表面マーカーの再分布。サイクル１および３の１日目と２１日目における、ＣＤ１４＋単球上でのＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０およびＣＤ８６の発現（ＭＦＩ）を示す。時間点間の違いを分析するためにスチューデントの対応のあるｔ検定を用いた。
【図１８Ｂ】ＨＤＣ／ＩＬ−２免疫療法中の骨髄表面マーカーの再分布。ＣＤ１６＋単球に関する対応する発現データを示す。時間点間の違いを分析するためにスチューデントの対応のあるｔ検定を用いた。
【図１８Ｃ】ＨＤＣ／ＩＬ−２免疫療法中の骨髄表面マーカーの再分布。ＣＤ１ｃ＋ＤＣｓに関する対応する発現データを示す。時間点間の違いを分析するためにスチューデントの対応のあるｔ検定を用いた。
【図１８Ｄ】ＨＤＣ／ＩＬ−２免疫療法中の骨髄表面マーカーの再分布。ＣＤ１４１＋ＤＣｓに関する、対応する発現データを示す。時間点間の違いを分析するためにスチューデントの対応のあるｔ検定を用いた。
【図１９Ａ】骨髄性細胞におけるＨＬＡ−ＡＢＣ発現は、ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた処置中のＬＦＳを予測する。ＣＤ１４＋単球の骨髄性細胞のサブセットに関し、示された時間点におけるＨＬＡ−ＡＢＣ発現を示す。スチューデントの対応のあるｔ検定を、時間点間の違いを分析するために用いた。
【図１９Ｂ】骨髄性細胞におけるＨＬＡ−ＡＢＣ発現は、ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた処置中のＬＦＳを予測する。ＣＤ１６＋単球の骨髄性細胞のサブセットに関し、示された時間点におけるＨＬＡ−ＡＢＣ発現を示す。スチューデントの対応のあるｔ検定を、時間点間の違いを分析するために用いた。
【図１９Ｃ】骨髄性細胞におけるＨＬＡ−ＡＢＣ発現は、ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた処置中のＬＦＳを予測する。ＣＤ１ｃ＋ＤＣｓの骨髄性細胞のサブセットに関し、示された時間点におけるＨＬＡ−ＡＢＣ発現を示す。スチューデントの対応のあるｔ検定を、時間点間の違いを分析するために用いた。
【図１９Ｄ】骨髄性細胞におけるＨＬＡ−ＡＢＣ発現は、ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた処置中のＬＦＳを予測する。ＣＤ１４１＋ＤＣｓの骨髄性細胞のサブセットに関し、示された時間点におけるＨＬＡ−ＡＢＣ発現を示す。スチューデントの対応のあるｔ検定を、時間点間の違いを分析するために用いた。
【図１９Ｅ】骨髄性細胞におけるＨＬＡ−ＡＢＣ発現は、ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた処置中のＬＦＳを予測する。サイクル１の１日目（Ｃ１Ｄ１）における、ＣＤ１４＋単球の中間値ＨＬＡ−ＡＢＣ発現に基づいて患者を二分し、続いてログランク検定によってＬＦＳを分析した。
【図１９Ｆ】骨髄性細胞におけるＨＬＡ−ＡＢＣ発現は、ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた処置中のＬＦＳを予測する。サイクル１の１日目（Ｃ１Ｄ１）における、ＣＤ１４＋単球の中間値ＨＬＡ−ＡＢＣ発現に基づいて患者を二分し、続いてログランク検定によってＯＳを分析した。
【図２０Ａ】免疫療法の開始時または免疫療法中のＴＥＭからＴｅｆｆへの遷移において、高ＣＤ８＋ＴＥＭ数を有する、または有さない患者の結果に対する、単球ＨＬＡ−ＡＢＣ発現の影響。サイクル１の１日目（Ｃ１Ｄ１）において、高い血液ＣＤ８＋ＴＥＭ細胞数を有する患者を、Ｃ１Ｄ１におけるＣＤ１４＋単球上の中間値ＨＬＡ−ＡＢＣ発現に基づいて二分し、続いてログランク検定によりＬＦＳを分析した。
【図２０Ｂ】免疫療法の開始時または免疫療法中のＴＥＭからＴｅｆｆへの遷移において、高ＣＤ８＋ＴＥＭ数を有する、または有さない患者の結果に対する、単球ＨＬＡ−ＡＢＣ発現の影響。サイクル１の１日目（Ｃ１Ｄ１）において、低い血液ＣＤ８＋ＴＥＭ細胞数を有する患者を、Ｃ１Ｄ１におけるＣＤ１４＋単球上の中間値ＨＬＡ−ＡＢＣ発現に基づいて二分し、続いてログランク検定によりＬＦＳを分析した。
【図２０Ｃ】免疫療法の開始時または免疫療法中のＴＥＭからＴｅｆｆへの遷移において、高ＣＤ８＋ＴＥＭ数を有する、または有さない患者の結果に対する、単球ＨＬＡ−ＡＢＣ発現の影響。サイクル１の１日目（Ｃ１Ｄ１）において、低い血液ＣＤ８＋ＴＥＭ細胞数を有する患者を、Ｃ１Ｄ１におけるＣＤ１４＋単球上の中間値ＨＬＡ−ＡＢＣ発現に基づいて二分し、続いてログランク検定によりＯＳを分析した。
【図２０Ｄ】免疫療法の開始時または免疫療法中のＴＥＭからＴｅｆｆへの遷移において、高ＣＤ８＋ＴＥＭ数を有する、または有さない患者の結果に対する、単球ＨＬＡ−ＡＢＣ発現の影響。免疫療法のサイクル１中に、ＣＤ８＋ＴＥＭからＴｅｆｆ細胞への遷移を達成した、またはしなかった患者に関する、対応する結果を示す。
【図２０Ｅ】免疫療法の開始時または免疫療法中のＴＥＭからＴｅｆｆへの遷移において、高ＣＤ８＋ＴＥＭ数を有する、または有さない患者の結果に対する、単球ＨＬＡ−ＡＢＣ発現の影響。免疫療法のサイクル１中に、ＣＤ８＋ＴＥＭからＴｅｆｆ細胞への遷移を達成した、またはしなかった患者に関する、対応する結果を示す。
【図２０Ｆ】免疫療法の開始時または免疫療法中のＴＥＭからＴｅｆｆへの遷移において、高ＣＤ８＋ＴＥＭ数を有する、または有さない患者の結果に対する、単球ＨＬＡ−ＡＢＣ発現の影響。免疫療法のサイクル１中に、ＣＤ８＋ＴＥＭからＴｅｆｆ細胞への遷移を達成した、またはしなかった患者に関する、対応する結果を示す。
【図２１Ａ】ＣＭＭＬ患者は、免疫抑制特性を有する白血病細胞を宿す。末梢血中のＣＭＭＬ単核細胞に対する代表的なゲーティング法を示す。緑の集団は成熟した白血病ＣＤ１４＋細胞を含み、他方で未成熟のＣＤ３４＋芽細胞は青色で描かれる。
【図２１Ｂ】ＣＭＭＬ患者は、免疫抑制特性を有する白血病細胞を宿す。ＣＭＭＬ患者（ｎ＝１１）および健康な対照（ｎ＝１０）からの末梢血中のＣＤ１４＋およびＣＤ３４＋細胞における、ｇｐ９１ｐｈｏｘおよびＨ２Ｒのフローサイトメトリー分析。
【図２１Ｃ】ＣＭＭＬ患者は、免疫抑制特性を有する白血病細胞を宿す。ＨＤＣ（５０μＭ）、ラニチジン（１０μＭ）、およびＡＨ２０２３９９ＡＡ（１０μＭ）による阻害の有無に応じた、ＦＡＣＳ選別されたＣＤ１４＋ＣＭＭＬ細胞からの代表的なＲＯＳ測定を示す。
【図２１Ｄ】ＣＭＭＬ患者は、免疫抑制特性を有する白血病細胞を宿す。ＮＯＸ−２阻害剤ＨＤＣを使用した１１の組み合わせ実験を示す（１００μＭ、ｐ＜０．００１）。対応のあるウィルコクソンの符号付順位検定を使用した分析。
【図２２Ａ】ＲＯＳを産生するＣＭＭＬ細胞はＮＫ細胞機能を損なう。ＮＫ細胞（左）とＣＤ１４＋ＣＭＭＬ細胞（右）間の相互作用を描く共焦点の顕微鏡写真図を示す。青変病は核のＤＡＰＩ染色を表し、および緑色の染料は膜結合型のｇｐ９１ｐｈｏｘに結合している。
【図２２Ｂ】ＲＯＳを産生するＣＭＭＬ細胞はＮＫ細胞機能を損なう。抗ＣＤ３３抗体リンツズマブ（１μｇ／ｍｌ）およびＨＤＣ（１００μＭ）の有無に応じた、ＩＬ−２刺激されたＮＫ細胞（ｎ＝９）によるＣＤ１４＋ＣＭＭＬ細胞に対する脱顆粒。データを、ボンフェローニの補正とスチューデントの対応のあるｔ検定を使用して分析した。
【図２２Ｃ】ＲＯＳを産生するＣＭＭＬ細胞はＮＫ細胞機能を損なう。１６：１から１：１の範囲の比率で、ＣＭＭＬ細胞を用いて一晩インキュベーションした後のＮＫ細胞死（ｎ＝６）を示す。図に示されるのは、各ドナーごとに、少なくとも５０％のアポトーシスＮＫ細胞を伴う最初のＮＫ：ＣＭＭＬ比率からのアポトーシスＮＫ細胞の度合である。示された時、ＮＯＸ２阻害剤ＨＤＣ（１００μＭ）、ＰＡＲＰ−１阻害剤ＰＪ３４（０．５μＭ）、ＮＯＸ２阻害剤ＤＰＩ（３μＭ）またはカタラーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）が、一晩のインキュベーション中に存在した。ＣＭＭＬ誘導ＮＫ細胞アポトーシスに対する阻害剤の効果を、一元配置分散分析により分析し、続いてボンフェローニの多重比較検定によって分析した。
【図２３Ａ】ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＭＭＬセル誘導ＲＯＳ媒介細胞死に感受性がある。阻害剤ＨＤＣ（１００μＭ）、ＰＡＲＰ−１阻害剤ＰＪ３４（０．５μＭ）、ＮＯＸ２阻害剤ＤＰＩ（３μＭ）、またはカタラーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）の有無における、１：１比率でのＣＭＭＬ細胞を用いた一晩のインキュベーション後のＣＤ８＋Ｔ細胞アポトーシス（ｎ＝４）を示す。一元配置分散分析、続いてボンフェローニの多重比較検定によって分析した。
【図２３Ｂ】ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＭＭＬセル誘導ＲＯＳ媒介細胞死に感受性がある。示されたＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを選別し、および１：１比率で、ＮＯＸ２阻害剤ＤＰＩ（３μＭ、ｎ＝３）の有無において、ＣＭＭＬ細胞を用いて一晩インキュベートした。ＴＮ細胞をＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋、ＴＣＭをＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋、ＴＥＭをＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７、およびＴｅｆｆをＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−と定義した。一元配置分散分析、続いてボンフェローニの多重比較検定によって分析した。
【図２４Ａ】ＣＭＭＬ患者における活性化ＮＫ細胞受容体の発現。受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ−１、および２Ｂ４の中間値蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。ＣＭＭＬ患者（ｎ＝１０）を、ＰＢＭＣ内のＣＤ３４＋芽細胞が２％より多い（ｎ＝５）またはより少ない（ｎ＝５）に分け、および年齢の一致している対称（Ｈ．Ｄ；ｎ＝１０）と比較した。データをスチューデントのｔ検定によって分析した。
【図２４Ｂ】ＣＭＭＬ患者における活性化ＮＫ細胞受容体の発現。パネルＡに対応する受容体に対して陽性のＮＫ細胞のパーセンテージを示す。ＣＭＭＬ患者（ｎ＝１０）を、ＰＢＭＣ内のＣＤ３４＋芽細胞が２％より多い（ｎ＝５）またはより少ない（ｎ＝５）に分け、および年齢の一致している対称（Ｈ．Ｄ；ｎ＝１０）と比較した。データをスチューデントのｔ検定によって分析した。
【図２５】活性化受容体の、ＲＯＳ媒介下方調節。（Ａ）健康なドナーからのＮＫ細胞および単球を、ＰＡＲＰ−１阻害剤ＰＪ３４（０．５μＭ）の有無において、一晩、共インキュベートした。受容体ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、ＤＮＡＭ−１およびＣＤ１６に関する中間値の蛍光強度（ＭＦＩ）が表示される。データをスチューデントのｔ検定によって分析した。
【００３０】
単純かつ明確に例示するために、図に示される要素は必ずしも正確な縮図ではないことが理解されよう。例えば、要素のいくつかの寸法は、明確にするために他の要素に比して誇張されている場合もある。さらに、適切であると考えられた場合、対応するまたは類似の要素を示すために、参照番号は図の間で重複している場合もある。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下の詳細な記載では、本発明を完全に理解するために、数々の特定の詳細が明らかにされる。しかしながら、本発明がこれらの特定の詳細なしで実行され得ることが当業者によって理解されるだろう。他の場合、周知の方法、手続きおよび構成要素は、本発明を不明瞭にしないように詳細に記載されてはいない。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌を処置する方法を提供し、該方法は：前記被験体に別の治療薬と共に治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニストを投与し、それによって前記被験体の前記癌を治療する工程を含む。一実施形態では、治療薬はプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）阻害剤である。別の実施形態では、治療薬はプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）阻害剤である。
【００３３】
一実施形態では、本発明は、原発癌または転移癌を有する被験体の腫瘍量を減少させる方法を提供し、該方法は、前記被験体に治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記被験体の腫瘍量を減少させる工程を含む。
【００３４】
別の実施形態では、本発明は、活動的な癌を有する被験体における転移性腫瘍の拡散リスクを減らす方法を提供し、該方法は。前記被験体に治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記被験体における転移癌拡大のリスクを減らす工程を含む。
【００３５】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌の再出現、再発または転移の拡大を防ぐまたは遅らせる方法を提供し、該方法は、前記被験体に治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記被験体における前記癌の再出現、再発または転移の拡大を防ぐ、または遅らせる工程を含む。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、前記癌からの寛解にある被験体における癌の再発を防ぐ方法を提供し、該方法は、前記被験体に治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記癌からの寛解にある前記被験体における癌の再発を防ぐ工程を含む。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、前記癌からの寛解にある被験体における癌の再発を遅らせる方法を提供し、該方法は、前記被験体に治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記癌からの寛解にある前記被験体における癌の再発を遅らせる工程を含む。
【００３８】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌からの寛解を延長する方法を提供し、該方法は、前記被験体に治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記被験体における前記癌からの寛解を延長する工程を含む。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、癌からの寛解にある被験体の生存を増加させる方法を提供し、該方法は、前記被験体に治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記被験体の生存を増加させる工程を含む。
【００４０】
別の実施形態では、本発明は、癌からの寛解にある被験体の生存期間を延長する方法を提供し、該方法は、前記被験体に治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記被験体の生存期間を延長する工程を含む。
【００４１】
別の実施形態では、本発明は、被験体における悪性腫瘍の増殖を減らす方法を提供し、該方法は、前記被験体に治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤を投与し、それによって前記被験体における悪性腫瘍の増殖を減らす工程を含む。
【００４２】
別の実施形態では、本発明は、癌からの寛解にある被験体の癌の症状を低減または緩和する方法を提供し、該方法は、前記被験体に治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）を投与し、それによって前記被験体における前記癌の症状を低減または緩和する工程を含む。
【００４３】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌からの寛解を延長するためのキットを提供し、該キットは、ａ）治療上有効な量のヒスタミン受容体アゴニスト、およびプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）またはプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）の阻害剤、および前記キットの使用に関する使用説明書を含む。
【００４４】
＜ＰＤ−１阻害剤＞
一実施形態では、本発明の癌治療は、本明細書に記載されるような１つ以上の治療薬と併用したＰＤ−１の阻害剤の投与を含む。一実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は抗体である。一実施形態では、抗体はアンタゴニスト抗体または核酸コードされた抗体（細胞内抗体）である。別の実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＰＤ−１に結合することができるがＰＤ−１シグナルを防ぐことができるアミノ酸配列を含むタンパク質（またはそのようなアミノ酸配列をコードする核酸）（例えば、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２のフラグメントの融合タンパク質、および免疫グロブリンのＦｃ部分）、リガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の結合のための膜結合型ＰＤ−１と競合する可溶性タンパク質（または可溶性タンパク質をコードする核酸）；またはＰＤ−１経路シグナルを阻害することができる小分子阻害剤である。
【００４５】
一実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、抗ＰＤ１抗体ニボルマブ（ＭＤＸ−１  １０６／ＢＭＳ−９３６５５８／ＯＮＯ−４５３８）（Ｂｒａｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２８（１９）：３１  ６７−７５；ＰＭＩＤ：２０５１  ６４４６）；またはピジリズマブ（ＣＴ−０１  １）（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １４（１０）：３０４４−５１；ＰＭＩＤ：１８４８３３７０）；およびＭＫ−３４７５（ＳＣＨ  ９００４７５）である。別の実施形態では、抗ＰＤ１抗体はペムブロリズマブである。
【００４６】
別の実施形態では、ＰＤ−１経路阻害剤は、ＰＤ−１リガンドに向けられる抗体（または抗体をコードする核酸）であり、一実施形態では、ＰＤ−１またはＰＤ−２リガンドの細胞外領域に特異的に結合する抗体である。一実施形態では、抗体はリガンド上のＰＤ−１またはＰＤ−２結合部位の近くに結合し、およびそれに対して破壊的である。
【００４７】
＜ＰＤ−Ｌ１阻害剤＞
一実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＤＸ−１  １０５／ＢＭＳ−９３６５５９（Ｂｒａｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３６６（２６）：２４５５−６５；ＰＭＩＤ：２２６５８１２８）；ＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ７４４６またはＭＥＤＩ４７３６である。別の実施形態では、ＰＤ−１経路阻害剤は、ＰＤ−１に結合することができるが、ＰＤ−１経路シグナルを防ぐことができるアミノ酸配列を含むタンパク質、またはそのようなアミノ酸配列をコードする核酸である。一実施形態では、ＰＤ−１経路阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２リガンドのフラグメントの融合タンパク質である。一実施形態では、ＰＤ−１経路阻害剤は、ＰＤ−１および免疫グロブリンのＦｃ部分に結合することができる、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２、またはそれらのフラグメントの細胞外の領域を含む融合タンパク質である。そのような融合タンパク質の一例は、ＡＭＰ−２２４に代表される（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｆｃ  ｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｌｇＧ２ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｍｋｒｔｉｃｈｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８９（５）：２３３８−４７；ＰＭＩＤ：２２８３７４８３）。
【００４８】
＜ヒスタミン＞
一実施形態では、ヒスタミンは本発明の方法および組成物に使用される。別の実施形態では、ヒスタミン受容体アゴニストは本発明の方法および組成物に使用される。一実施形態では、本発明のヒスタミンはヒスタミン二塩酸塩である。別の実施形態では、本発明のヒスタミンはＮ−メチル−ヒスタミンである。別の実施形態では、本発明のヒスタミンは４−メチル−ヒスタミンである。別の実施形態では、本発明のヒスタミンは他のヒスタミンＨ２−受容体アゴニストを含む。
【００４９】
ヒスタミン二塩酸塩は市販で入手可能であり、およびヒスタミン二塩酸塩とヒスタミンの他の形態を作る方法は、当技術分野において既知である（例えば米国特許第６，５２８，６５４、これは参照により本明細書に組み込まれる）。
投与方法
【００５０】
一実施形態では、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤およびヒスタミンの投与は、同時または時期をずらして、同じ投与部位または異なる投与部位に行ってもよい。
【００５１】
別の実施形態では、本明細書に記載される治療または予防のための薬剤または化合物はいずれも同時に投与してもよい。別の実施形態では、それらを互いに異なる時期に投与してもよい。一実施形態では、それらを互いに対して数分以内に投与してもよい。別の実施形態では、それらを互いに対して数時間以内に投与してもよい。別の実施形態では、それらを互いに対して１時間以内に投与してもよい。別の実施形態では、それらを互いに対して２時間以内に投与してもよい。別の実施形態では、それらを互いに対して５時間以内に投与してもよい。別の実施形態では、それらを互いに対して１２時間以内に投与してもよい。別の実施形態では、それらを互いに対して２４時間以内に投与してもよい。
【００５２】
一実施形態では、本明細書に記載される治療または予防のための薬剤または化合物はいずれも同じ投与部位に投与してもよい。別の実施形態では、それらを異なる投与部位に投与してもよい。
【００５３】
＜免疫増強薬＞
別の実施形態では、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤およびヒスタミンを投与する本発明の方法は、さらに追加の免疫増強薬を投与する工程を含む。一実施形態では、追加の免疫増強薬はインターロイキン２（ＩＬ−２）である。ＩＬ−２の投与は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤およびヒスタミンのように、同時または時期をずらして、同じ投与部位または異なる投与部位に行ってもよい。
【００５４】
別の実施形態では、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤およびヒスタミンは、ＬＡＧ−３の阻害剤、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）の阻害剤、シプロイセルＴ、または他のワクチン注射、またはそれらの組み合わせによる併用処置として投与される。別の実施形態では、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤およびヒスタミンは、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ２７、抗４−１ＢＢ、またはそれらの組み合わせを用いた併用処置として施される。別の実施形態では、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤およびヒスタミンは、他の免疫賦活剤を用いた併用処置として投与される。一実施形態では、免疫増強薬は、ＩＦＮ、ＩＬ−２１、および抗キラー免疫グロブリン様受容体［ＫＩＲ］、またはそれらの組み合わせである。
【００５５】
別の実施形態では、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１阻害剤およびヒスタミンの投与に加えて、癌ワクチンが本発明の方法において投与される。一実施形態では、ワクチンはＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）である。別の実施形態では、ワクチンはＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）である。別の実施形態では、ワクチンはシプロイセルＴである。
【００５６】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌からの寛解を延長するためのキットを提供し、該キットは：ａ）ヒスタミン二塩酸塩およびＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤、ならびに前記キットの使用に関する使用説明書を含む。
【００５７】
一実施形態では、ヒスタミンは免疫増強薬である。一実施形態では、キットは、ヒスタミン二塩酸塩に加えて追加の免疫増強薬を含む。一実施形態では、追加の免疫増強薬はＩＬ−２である。別の実施形態では、キットは、ヒスタミン二塩酸塩およびＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤に加えて、上記に記載のものを含む追加の処置を含む。
【００５８】
＜癌治療の有効性の予測＞
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌治療の有効性を予測するための方法を提供する。
【００５９】
一実施形態では、バイオマーカーは被験体における癌治療の有効性を予測するために使用される。一実施形態では、バイオマーカーはＨ２Ｒである。別の実施形態では、バイオマーカーはＮＫｐ３０である。別の実施形態では、バイオマーカーはＮＫｐ４６である。
【００６０】
別の実施形態では、バイオマーカーはＨＬＡ−ＤＲ（Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ）、ＣＤ８６、ＣＤ４０、またはそれらの組み合わせである。別の実施形態では、バイオマーカーはＨＬＡ−ＡＢＣの低い発現である。別の実施形態では、血液単球数の減少は白血病なしの生存を予測する。
【００６１】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌治療の有効性を予測する方法を提供し、該方法は：（ａ）前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；（ｂ）前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；（ｃ）前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；および（ｄ）前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプル内のＮＫ細胞の頻度を測定する工程、を含み、ここで前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにＮＫ細胞の頻度の増加がある場合、前記癌治療は前記被験体において効果的であると予測され、および、前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにＮＫ細胞の頻度の増加がない場合、前記癌治療は前記被験体において効果的ではないと予測され、それによって前記被験体における前記癌治療の有効性が予測される。
【００６２】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌治療の有効性を予測する方法を提供し、該方法は：（ａ）前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；（ｂ）前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；（ｃ）前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；および（ｄ）前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプル内のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程を含み、ここで前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにバイオマーカーの発現レベルの増加がある場合、前記癌治療は前記被験体において効果的であると予測され、および、前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにバイオマーカーの発現レベルの増加がない場合、前記癌治療は前記被験体において効果的ではないと予測され、それによって前記被験体における前記癌治療の有効性が予測される。
【００６３】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌治療の有効性を予測する方法を提供し、該方法は：（ａ）前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；（ｂ）前記癌に処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；（ｃ）前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；および（ｄ）前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプル内のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程を含み、ここで前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにバイオマーカーの発現レベルの低下がある場合、前記癌治療は前記被験体において効果的であると予測され、および、前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにバイオマーカーの発現レベルの低下がない場合、前記癌治療は前記被験体において効果的ではないと予測され、それによって前記被験体における前記癌治療の有効性が予測される。
【００６４】
一実施形態では、本明細書に記載される癌治療の有効性を予測する方法は、前記癌からの寛解にある被験体の癌の再発を予防する方法、被験体における癌からの寛解を延長する方法、化学療法後の完全寛解（ＣＲ）にあるＡＭＬを有する被験体における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の再発を予防する方法、またはそれらの併用、と合わせて使用されてもよく、前記方法は：ａ）前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；ｂ）前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；ｃ）前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；ｄ）被験体の癌治療の有効性を予測する方法において使用される、前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプル内のバイオマーカーの測定、およびｅ）本明細書に記載される癌治療の有効性を予測する方法において、前記バイオマーカーが前記第１の血液サンプルから前記第２の血液サンプルへと変化していたならば、前記処置の追加のサイクルを前記被験体に施す工程を含む。
【００６５】
＜細胞傷害性Ｔ細胞の再分布＞
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌治療の有効性を予測する方法を提供し、該方法は：ａ）前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；ｂ）前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；ｃ）前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；およびｄ）前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプルにおけるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞表現型の頻度を測定する工程を含み、ここで前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにＴエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）の頻度の減少、およびＴエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の頻度の増加があるような、細胞傷害性Ｔ細胞の再分布がある場合、前記癌治療は被験体において有効であると予測され、および、前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルに細胞傷害性Ｔ細胞の再分布がない場合、前記癌治療は前記被験体において有効ではないと予測され、それによって前記被験体における前記癌治療の効果が予測される。
【００６６】
別の実施形態では、本発明は、前記癌からの寛解にある被験体における癌の再発を防ぐ方法を提供し、該方法は：ａ）前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；ｂ）前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；ｃ）前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；ｄ）前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプルにおけるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞表現型の頻度を測定する工程、およびｅ）前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにＴエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）の頻度の減少、およびＴエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の頻度の増加があるような、細胞傷害性Ｔ細胞の再分布がある場合、前記被験体に前記処置の追加のサイクルを施す工程を含み、それによって前記被験体における前記癌の再発を防ぐ。
【００６７】
別の実施形態では、本発明は、被験体における癌からの寛解を延長する方法を提供し、該方法は：ａ）前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；ｂ）前記癌に対する処置のサイクル、または提案された処置を前記被験体に施す工程；ｃ）前記処置のサイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；ｄ）前記第１の血液サンプルおよび前記第２の血液サンプルにおけるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞表現型の頻度を測定する工程、およびｅ）前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルにＴエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）の頻度の減少、およびＴエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の頻度の増加があるような、細胞傷害性Ｔ細胞の再分布がある場合、前記被験体に前記処置の追加のサイクルを施す工程を含み、それによって前記被験体における前記癌からの寛解を延長する。
【００６８】
別の実施形態において、本発明は、完全寛解（ＣＲ）にある急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する被験体におけるＡＭＬの再発を防ぐ方法を提供し、該方法は：ａ）前記被験体から第１の血液サンプルを得る工程；ｂ）前記被験体にヒスタミン二塩酸塩およびインターロイキン２（ＩＬ−２）の第１サイクルを投与する工程；ｃ）前記第１サイクルの完了後に、前記被験体から第２の血液サンプルを得る工程；ｄ）前記血液サンプル内のＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞表現型の頻度を測定する工程；およびｅ）Ｔエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）の頻度の減少、およびＴエフェクター細胞（Ｔｅｆｆ）の頻度の増加があるような、前記第１の血液サンプルと比較して前記第２の血液サンプルに細胞傷害性Ｔ細胞の再分布がある場合、前記被験体にヒスタミン二塩酸塩およびＩＬ−２の追加のサイクルを投与する工程を含み、それによって前記被験体におけるＡＭＬの再発を防ぐ。
【００６９】
＜活性酸素種（ＲＯＳ）＞
別の実施形態では、本発明は、被験体の癌を処置する方法を提供し、該方法は：治療上有効な量の、活性酸素種（ＲＯＳ）を低下させる薬剤を投与する工程を含む。一実施形態では、該方法は、治療上有効な量の、細胞外のＲＯＳを低下させる薬剤を投与する工程を含む。
【００７０】
一実施形態では、薬剤はＲＯＳ形成の阻害剤である。別の実施形態において、薬剤は細胞外ＲＯＳの消去剤である。
【００７１】
一実施形態では、該方法はさらに、ヒスタミン受容体アゴニストを投与する工程を含む。一実施形態では、癌は白血病である。一実施形態では、白血病は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である。
【００７２】
＜癌＞
一実施形態では、本明細書に記載される癌を治療する方法は、寛解にある被験体における癌の再発を予防または遅らせる方法、癌からの寛解を延長する方法、生存を増加させる方法、癌の症状を低減または緩和する方法、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、本明細書に記載される癌を処置する方法は、原発癌または転移癌を有する被験体の腫瘍量を減少させる方法、活動的な癌を有する被験体における転移性腫瘍の拡散リスクを減らす方法、被験体における癌の再出現、再発または転移の拡大を予防または遅らせる方法、被験体における癌の再発生を防ぐ方法、前記癌からの寛解にある被検体における癌の再発を遅らせる方法、被験体の癌からの寛解を延長する方法、癌からの寛解にある被験体の生存を増加させる方法、癌からの寛解にある被験体の生存期間を延長する方法、被験体の悪性腫瘍増殖を減らす方法、癌からの寛解にある被験体の癌の症状を低減または緩和する方法、またはそれらの組合せを含む。
【００７３】
一実施形態では、本発明の方法によって処置される被験体は、癌または腫瘍を有するか、または患っている。別の実施形態では、本発明の方法によって処置される被験体は、癌または腫瘍からの寛解にある。別の実施形態では、被験体は完全寛解（ＣＲ）にある。一実施形態では、ＣＲは白血病からのＣＲである。完全寛解を評価するする方法は、当技術において周知である。
【００７４】
別の実施形態において、本発明の方法によって処置された被験体は、固形腫瘍またはリンパ腫を有し、および初期の癌治療に対する「奏効」を示した。別の実施形態において、本発明の方法によって処置された被験体は、固形腫瘍またはリンパ腫を有し、および初期の癌治療に対して「完全寛解」を示した。
【００７５】
一実施形態では、癌または腫瘍を有する被験体は、癌に対する免疫システムの反応を増大させることを意図した治療を含む、外科手術、化学療法、放射線治療、標的治療、またはそれらの組み合わせにより処置されている。別の実施形態では、癌または腫瘍を有する被験体は、ヒスタミンおよびＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤で処置されている。
【００７６】
一実施形態では、本発明の方法における被験体は、癌を有する、または過去に癌を有していた。別の実施形態では、被験体は腫瘍を有する、または過去に腫瘍を有していた。別の実施形態では、被験体は腫瘍疾患を有する。別の実施形態では、被験体は悪性腫瘍を有する。別の実施形態では、被験体は、前癌性の疾病または前悪性の疾病を有する、または過去に有していた。
【００７７】
一実施形態では、癌は白血病である。一実施形態では、白血病は急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。別の実施形態では、白血病は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。別の実施形態では、白血病は慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）である。別の実施形態では、白血病は急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）である。別の実施形態では、白血病は慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である。別の実施形態では、白血病はヘアリー細胞白血病である。
【００７８】
一実施形態では、腫瘍は固形腫瘍である。一実施形態では、固形腫瘍は、結腸癌、前立腺癌、乳癌、肺癌、皮膚癌、肝臓癌、骨癌、卵巣癌、膵臓癌、脳癌、頭頸部癌、または他の固形腫瘍である。
【００７９】
一実施形態では、癌または腫瘍は、乳房、前立腺、肺、結腸、胃、膵臓、卵巣または脳にある。別の実施形態では、癌は造血癌、神経芽腫または悪性神経膠腫である。
【００８０】
別の実施形態では、癌は以下の１つ以上から選択される：副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌−皮膚癌（非黒色腫性）を参照、胆管癌、膀胱癌、骨癌、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、骨肉腫および悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、星細胞腫、脳腫瘍および脊髄腫瘍の治療の概要、脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣腫、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫−非ホジキンリンパ腫を参照、カルチノイド、胃カルチノイド、原発不明癌腫、心臓腫瘍、中枢神経系、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、胚芽腫、胚細胞腫瘍、リンパ腫、原発性リンパ腫、子宮頸癌、胆管癌、脊索腫、慢性脊髄増殖性腫瘍、結腸癌、大腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫−菌状息肉腫およびセザリー症候群を参照、非浸潤性乳癌（ＤＣＩＳ）、胚芽腫、中枢神経系、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫、ファロピウス管癌、骨の線維性組織球腫、悪性、および骨肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、睾丸胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫−脳腫瘍脳幹を参照、頭頸部癌、心臓腫瘍、肝細胞性（肝臓）癌、組織球症、ランゲルハンス細胞、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、島細胞腫、膵臓神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓、腎細胞、ウィルムス腫瘍および他の小児腎腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞、口唇癌および口腔癌、肝臓癌（原発性）、肺癌、非小細胞性リンパ腫、小細胞性リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫−非ホジキンリンパ腫を参照、皮膚Ｔ細胞リンパ腫−菌状息肉腫およびセザリー症候群を参照、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、中枢神経系原発性（ＣＮＳ）リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症−非ホジキンリンパ腫を参照、男性の乳癌、骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫、眼内（ブドウ膜）黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、悪性原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、ＮＵＴ遺伝子を含む中線管癌腫（Ｍｉｄｌｉｎｅ  Ｔｒａｃｔ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、口腔癌、多発性内分泌腺腫症、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／脊髄増殖性腫瘍、骨髄腫、多発性脊髄増殖性腫瘍、慢性副鼻腔癌および鼻腔癌、鼻咽腔癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、口腔癌、口唇癌および口腔咽頭癌、骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫、上皮性卵巣癌、胚細胞腫瘍、低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵神経内分泌腫瘍（島細胞腫）、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔癌および鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、クロム親和細胞腫、下垂体腫瘍、形質細��腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、妊娠および乳癌、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、腎盂と尿管の移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫（骨癌）、横紋筋肉腫、軟部組織肉腫、子宮肉腫、血管腫瘍、セザリー症候群、皮膚癌、黒色腫、メルケル細胞癌、非黒色腫性の小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、有棘細胞癌−皮膚癌（非黒色腫性）を参照、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、胃癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫−菌状息肉腫およびセザリー症候群を参照、精巣癌、喉頭癌、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、腎盂と尿管の移行上皮癌、原発癌、尿管と腎盂の移行細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮内膜癌、子宮肉腫、膣癌、血管腫瘍、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症−非ホジキンリンパ腫を参照、およびウィルムス腫瘍。
【００８１】
一実施形態では、前癌性の疾病は、日光角化症、バレット食道、萎縮性胃炎、非浸潤性乳管癌、先天性角化異常症、鉄欠乏性嚥下困難、扁平苔癬、口腔粘膜下線維症、日光弾力線維症、子宮頸部異形成、白板症、紅板症、またはそれらの組み合わせである。一実施形態では、前癌性の疾病は異形成または良性の新生物である。一実施形態では、前癌性の疾病は、前立腺上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、増殖性炎症性萎縮（ＰＩＡ）、異型小腺房増殖（ＡＳＡＰ）、扁平上皮内病変（ＳＩＬ）、子宮内膜異型増殖症、卵巣上皮性形成異常、胸の石灰化、ＭＧＵＳ（ｍｏｎｏ  ｇａｍｍｏｐａｔｈｙ  ｏｆ  ｕｎｋｎｏｗｎ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、上皮内小葉癌（ＬＣＩＳ）膣上皮内腫瘍、またはＶＡＩＮ外陰硬化性苔癬および扁平苔癬、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、バレット食道、またはそれらの組み合わせである。
【００８２】
一実施形態では、本発明の方法に記載される癌治療を寛解期の被験体に与える。一実施形態では、被験体は造血癌からの寛解にある。一実施形態では、導入療法を受けた被験体にそれを与える。一実施形態では、導入補助化学療法はシタラビンとダウノルビシンの併用を含む。一実施形態では、地固め療法を完了した被験体にそれを与える。一実施形態では、地固め療法はシタラビンとダウノルビシンの併用を含む。別の実施形態では、地固めフェーズは、２〜４クールの高用量シタラビンの投与を含み、時にはアントラサイクリンが追加される（一実施形態ではダウノルビシン、または別の実施形態ではイダルビシン）。別の実施形態では、地固めフェーズは、アントラサイクリンの追加無しの、高用量シタラビン投与を含む。別の実施形態では、地固めフェーズは同種または自己由来の移植を含む。別の実施形態では、被験体は地固めフェーズの完了後に同種または自己由来の移植を受ける。
【００８３】
一実施形態では、癌治療は免疫学的処置または免疫療法である。一実施形態では、該処置は被験体の癌に対する免疫反応を強化する。別の実施形態では、該処置は被験体の癌に対する免疫反応を誘導する。一実施形態では、該処置は、被験体へのサイトカインの投与を含む。一実施形態では、サイトカインは免疫増強薬である。
【００８４】
＜サイトカイン＞
一実施形態では、サイトカインはインターロイキンである。一実施形態では、インターロイキンはＩＬ−２である。別の実施形態では、インターロイキンはＩＬ−１２である。別の実施形態では、インターロイキンはＩＬ−１５である。一実施形態では、インターロイキンは低用量で投与される。
【００８５】
一実施形態では、ＩＬ−２は、１日２回、１６，４００Ｕ／ｋｇの用量で投与される。
【００８６】
別の実施形態では、サイトカインはインターフェロンである。一実施形態では、インターフェロンはインターフェロンαである。別の実施形態では、インターフェロンはインターフェロンβである。別の実施形態では、インターフェロンはインターフェロンγである。
【００８７】
別の実施形態では、サイトカインは造血成長因子である。一実施形態では、造血成長因子は：エリトロポイエチン、ＩＬ−１１、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、またはそれらの組み合わせから成る群から選択される。
【００８８】
一実施形態では、本発明の方法は、抗ＣＴＬＡ−４を投与する工程を含み、および本発明の組成物は抗ＣＴＬＡ−４を含む。一実施形態では、ＣＤ１５２（表面抗原分類１５２）としても知られるＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ−４（細胞傷害性リンパ球関連タンパク質４）は、免疫チェックポイントとして機能して免疫系をダウンレギュレートするタンパク質受容体である。一実施形態では、癌治療の有効性を向上させるために、抗ＣＴＬＡ−４を被験体に投与する。
【００８９】
一実施形態では、寛解にある被験体または癌を有する被験体に行われた地固め療法は、被験体へのヒスタミン受容体アゴニストの投与を含む。一実施形態では、ヒスタミンは免疫増強薬である。一実施形態では、ヒスタミンはヒスタミン二塩酸塩である。
【００９０】
一実施形態では、０．５ｍｇのヒスタミン二塩酸塩を投与する。
【００９１】
一実施形態では、ＩＬ−２、ヒスタミン、およびＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤を含む、本明細書に記載される治療薬を、１日１回投与する。別の実施形態では、治療薬を１日２回、被験体に投与する。別の実施形態では、治療薬を１日３回、被験体に投与する。別の実施形態では、治療薬を１日４回、被験体に投与する。別の実施形態では、治療薬を１週間に１回、被験体に投与する。別の実施形態では、治療薬を１週間に２回、被験体に投与する。別の実施形態では、治療薬を１週間に３回、被験体に投与する。別の実施形態では、治療薬を１週間に４回、被験体に投与する。別の実施形態では、治療薬を２週間に１回、被験体に投与する。
【００９２】
一実施形態では、癌治療はヒスタミン二塩酸塩およびインターロイキン２（ＩＬ−２）を投与する工程を含む。一実施形態では、以下の実施例３に記載されるように、１日２回、０．５ｍｇ投与されたヒスタミン二塩酸塩、および１日２回、１６，４００  Ｕで投与されたＩＬ−２は、以下の実施例４に記載されるようにＩＬ−２およびヒスタミンを用いた第１回または第３回の処置が、Ｔエフェクターメモリー細胞の頻度の減少および付随するＴエフェクター細胞の増加が存在する細胞傷害性Ｔ細胞の再分布を誘導した時、ＡＭＬからの寛解にある患者の再発防止に非常に効果的であった。
【００９３】
一実施形態では、図４に記載されるように、本明細書の方法に記載の癌治療は、地固め後の治療、または維持療法である。
【００９４】
一実施形態では、本発明の方法のいくつかは、一連の地固め後の治療の前後に被験体から取り出された第１および第２のサンプルにおいて実行される。一実施形態では、地固め後の治療の完了前後にサンプルを採取する。別の実施形態では、第１回の地固め後の治療の前後にサンプルを採取する。別の実施形態では、第３回の地固め後の治療の前後にサンプルを採取する。別の実施形態では、第１回および第３回の地固め後の治療の前後にサンプルを採取する。別の実施形態では、第１回から第４回までの地固め後の治療の前後にサンプルを採取する。別の実施形態では、第２回の地固め後の治療の前後にサンプルを採取する。別の実施形態では、第４回の地固め後の治療の前後にサンプルを採取する。別の実施形態では、第１回の地固め後の治療の前、および第３回の地固め後の治療の後にサンプルを採取する。別の実施形態では、第１回の地固め後の治療の前、および第２回の地固め後の治療の後にサンプルを採取する。別の実施形態では、第１回の地固め後の治療の前、および第４回の地固め後の治療の後にサンプルを採取する。
【００９５】
一実施形態では、実施例３に記載されるように各処置サイクルは３週間続く。別の実施形態では、各処置サイクルは１−５週間続く。別の実施形態では、各処置サイクルは１週間続く。別の実施形態では、各処置サイクルは２週間続く。別の実施形態では、各処置サイクルは４週間続く。
【００９６】
一実施形態では、以下の実施例３に記載されるように、地固め後の治療は１０のサイクルを含む。別の実施形態では、地固め療法は１−５のサイクルを含む。別の実施形態では、地固め療法は５−１０のサイクルを含む。別の実施形態では、地固め療法は１０−１５のサイクルを含む。別の実施形態では、地固め療法は５のサイクルを含む。別の実施形態では、地固め療法は１５のサイクルを含む。別の実施形態では、地固め療法は７のサイクルを含む。別の実施形態では、地固め療法は１２のサイクルを含む。別の実施形態では、地固め療法は３のサイクルを含む。
【００９７】
一実施形態では、被験体からのサンプルは組織サンプルである。別の実施形態では、被験体からのサンプルは血液サンプルである。一実施形態では、血液サンプルは末梢血サンプルである。別の実施形態では、被験体からのサンプルは脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルである。別の実施形態では、被験体からのサンプルは尿サンプルである。別の実施形態では、被験体からのサンプルは糞便サンプルである。
【００９８】
＜キット＞
別の実施形態において、本発明は、被験体における癌治療の有効性を予測するためのキットを提供し、該キットは、治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、免疫増強薬、ＣＤ８＋細胞傷害性表現型を測定する手段、および前記キットの使用に関する使用説明書を含む。
【００９９】
別の実施形態において、本発明は、前記癌からの寛解にある被験体における癌の再発を予防するためのキットを提供し、該キットは、治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、免疫増強薬、ＣＤ８＋細胞傷害性表現型を測定する手段、および前記キットの使用に関する使用説明書を含む。
【０１００】
別の実施形態において、本発明は、被験体における癌からの寛解を延長するためのキットを提供し、該キットは、治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、免疫増強薬、ＣＤ８＋細胞傷害性表現型を測定する手段、および前記キットの使用に関する使用説明書を含む。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明は、化学療法後に完全寛解（ＣＲ）にある、ＡＭＬを有する被験体における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の再発を防ぐためのキットを提供し、該キットは、ヒスタミン二塩酸塩、免疫増強薬、ＣＤ８＋細胞傷害性の表現型を測定する手段、および前記キットの使用に関する使用説明書を含む。
【０１０２】
別の実施形態において、本発明は、被験体における癌治療の有効性を予測するためのキットを提供し、該キットは、治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、免疫増強薬、本明細書に記載のバイオマーカーを測定する手段、および前記キットの使用に関する使用説明書を含む。
【０１０３】
別の実施形態において、本発明は、前記癌からの寛解にある被験体における癌の再発を予防するためのキットを提供し、該キットは、治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、免疫増強薬、本明細書に記載のバイオマーカーを測定する手段、および前記キットの使用に関する使用説明書を含む。
【０１０４】
別の実施形態において、本発明は、被験体における癌からの寛解を延長するためのキットを提供し、該キットは、治療上有効な量のヒスタミン二塩酸塩、免疫増強薬、本明細書に記載のバイオマーカーを測定する手段、および前記キットの使用に関する使用説明書を含む。
【０１０５】
別の実施形態では、本発明は、化学療法後に完全寛解（ＣＲ）にある、ＡＭＬを有する被験体における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の再発を防ぐためのキットを提供し、該キットは、ヒスタミン二塩酸塩、免疫増強薬、本明細書に記載のバイオマーカーを測定する手段、および前記キットの使用に関する使用説明書を含む。
【０１０６】
一実施形態では、本発明の癌治療は癌の再発を予防する。別の実施形態では、本発明の癌治療は癌の再発生を予防する。別の実施形態では、本発明の癌治療は癌の再発を遅らせる。別の実施形態では、本発明の癌治療は癌の再発生を遅らせる。別の実施形態では、本発明の癌治療は癌からの寛解を延長する。別の実施形態では、本発明の癌治療は、癌を有する被験体の生存を増加させる。別の実施形態では、本発明の癌治療は、癌を有する被験体の生存期間を延長する。別の実施形態では、本発明の癌治療は被験体の癌を処置する。別の実施形態では、本発明の癌治療は被験体の癌の症状を低減する。別の実施形態では、本発明の癌治療は被験体の癌の症状を緩和する。別の実施形態では、本発明の癌治療は、癌のない寛解を延長する。別の実施形態では、本発明の癌治療は、被験体の悪性腫瘍のサイズを減少させる。別の実施形態では、本発明の癌治療は、原発癌または転移癌を有する患者の腫瘍量を減少させる。別の実施形態では、本発明の癌治療は、活動的な癌を有する被験体における転移性腫瘍の拡散リスクを減らす。別の実施形態では、本発明の癌治療は、癌の負荷を減らすための外科手術、化学療法、または他の処置を受けた患者における癌の再出現、再発または転移の拡大を防ぐ、または遅らせる。
【０１０７】
一実施形態では、寛解は造血癌からの寛解を含む。一実施形態では、造血癌からの寛解は、正常な造血の再出現と共に、被験体に（骨髄、血液または他の器官に）微視的な癌細胞がない場合であり、一実施形態では導入補助化学療法後に上記の状態にある場合である。
【０１０８】
一実施形態では、癌の寛解は、癌の徴候および症状の減少または消失である。一実施形態では、寛解は部分的な部分寛解であり、一実施形態では、癌の徴候および症状の全てではないにしてもそのいくつかが消えた場合である。別の実施形態では、寛解は完全寛解であり、一実施形態では、癌は依然として体内に存在しているかもしれないが、癌の全ての徴候および症状が消えた状態である。
【０１０９】
一実施形態では、被験体は、外科手術、化学療法または腫瘍量を低減する他の方法を含む導入療法後に寛解期に入る。
【０１１０】
一実施形態では、「処置」は、治療的な処置、および予防的処置または再発防止処置の両方を指し、その目的は、上記に記載のような標的とされた病理状態または障害を予防すること、または低減することである。したがって一実施形態では、本発明の方法は、被験体が化学療法または外科手術または他の処置後に癌からの寛解にある間、被験体に投与する工程を含む。別の実施形態では、本発明の方法は、癌を再発した被験体に投与する工程を含む。別の実施形態では、本発明の方法は活動的な癌を有する被験体に投与する工程を含む。
【０１１１】
したがって一実施形態では、処置は、疾患、障害または疾病に関連する症状に直接影響を与えること、またはそれの治療、抑制、予防、阻害、その発生率を低下させること、その重症度の低減、その発症を遅らせること、そのような症状の低減、またはそれらの組み合わせを含み得る。したがって一実施形態では、「処置」はとりわけ進行を遅らせること、寛解の促進、寛解の誘導、寛解を増加させること、回復を早めること、代替的な治療の有効性を増大させること、またはそれに対する抵抗を低下させること、またはそれらの組合せを指す。別の実施形態では、処置は、被験体における癌の再発の病因を減らすこと、その症状の改善、その続発症状の改善、または再発への潜伏期の延長を指す。一実施形態では、「予防」はとりわけ、症状の発症を遅らせること、疾患の再発の予防、再発症状の数または頻度を減らすこと、徴候的な発症と発症の間の潜伏期を増やすこと、またはそれらの組み合わせを指す。一実施形態では、「抑制」または「阻害」はとりわけ、症状の重症度の低減、急性発症の重症度の低減、症状の数を減らすこと、疾患関連の症状の発生率を減らすこと、症状の潜伏期を減らすこと、症状の改善、続発症状の低減、二次感染を減らすこと、患者の生存期間の延長、またはそれらの組み合わせを指す。
【０１１２】
一実施形態では、本発明の方法は被験体の症状を緩和する。一実施形態では、症状は原発性であり、他方で別の実施形態においては、症状は続発性である。一実施形態では、「原発性」は癌に直接起因する症状を指し、他方で一実施形態では、「続発性」は原発性の要因に由来する症状、またはその結果として生じた症状を指す。一実施形態では、本発明の方法は、癌に関連する原発症状または続発症状、または続発性の合併症を処置する。
【０１１３】
別の実施形態では、「症状」は、筋肉の単攣縮、痙攣、硬直；腕または脚に影響する筋力低下；早口で不明瞭な話し方、または鼻声；噛む、または呑み込むのが困難；一般的な脱力、萎縮、またはそれらの組み合わせを含む癌の発現で有り得る。
【０１１４】
本発明の方法のいずれかによれば、一実施形態において被験体はヒトである。別の実施形態では、被験体はヒト以外の霊長類である。別の実施形態では、被験体はネズミ科であり、一実施形態ではマウスであり、および別の実施形態ではラットである。別の実施形態では、被験体はイヌ、ネコ科の動物、ウシ、ウマ、ウサギ（ｌａｐｒｉｎｅ）、またはブタである。別の実施形態では、被験体は哺乳類である。別の実施形態では、被験体は、癌または腫瘍に侵されやすい有機体である。
【０１１５】
＜治療組成物および投与の方法＞
一実施形態では、本発明の方法は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤、ヒスタミン二塩酸塩、およびＩＬ−２、および薬学的に許容可能な担体を含む、本明細書に記載の治療薬を含む医薬組成物を投与する工程を含む。
【０１１６】
「医薬組成物」は、一実施形態では、薬学的に許容可能な担体または希釈剤と共に、治療上有効な量の有効成分、すなわちＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤、ヒスタミン二塩酸塩、またはＩＬ−２を指す。「治療上有効な量」は、一実施形態では、所与の疾病に対して治療効果を提供する量、および投与レジメンを指す。
【０１１７】
治療薬を含む医薬組成物は、一実施形態では、非経口的に、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、静脈内に、皮膚内に、腹腔内に、心室内に、頭蓋内に、膣内に、または腫瘍内になどの、当業者に既知の任意の方法で被験体に投与することができる。一実施形態では、治療薬は皮下に投与される。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物に記載されるように、医薬組成物は経口で投与され、したがって経口投与に適した形態、すなわち固形または液状製剤で調剤される。適切な固形の経口製剤は、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、ペレットなどを含む。適切な液体の経口製剤は、液剤、懸濁剤、分散液、乳剤、油脂などを含む。本発明の別の実施形態では、有効成分はカプセルで調剤される。この実施形態によれば、本発明の組成物は、活性化合物および不活性な担体または希釈剤に加えて、固いゲル化カプセル含む。
【０１１９】
別の実施形態では、医薬組成物は、液体製剤の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。適切な液体製剤は液剤、懸濁剤、分散液、乳剤、油脂などを含む。別の実施形態では、医薬組成物は静脈内に投与され、したがって静脈内投与に適した形態で調剤される。別の実施形態では、医薬組成物は動脈内に投与され、したがって動脈内投与に適した形態で調剤される。別の実施形態では、医薬組成物は筋肉内に投与され、したがって筋肉内投与に適した形態で調剤される。
【０１２０】
別の実施形態では、医薬組成物は、体表面に局所的に投与され、したがって局所投与に適した形態で調剤される。適切な局所用製剤には、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、点滴剤などが含まれる。局所投与のために、治療薬は、医薬担体の有無に関わらず、生理的に許容可能な希釈剤中の液剤、懸濁剤または乳剤として調製され、および投与される。
【０１２１】
別の実施形態では、本明細書で提供される医薬組成物は、徐放性の組成物、すなわち治療薬が投与後一定期間にわたって放出される組成物である。徐放性または持効性の組成物は、脂肪好性のデポー剤（例えば脂肪酸、ワックス、油脂）での製剤を含む。別の実施形態では、組成物は即時放出性の組成物、つまり全ての治療薬が投与直後に放出される組成物である。
【０１２２】
上記の添加物、添加剤、製剤、および投与方法の各々は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２３】
本明細書において引用された特許、特許出願、および自然科学に関する出版物は、参照によってそれらの全体が本書に組み込まれる。
【０１２４】
以下の例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために示される。しかしながら、本発明の広い範囲を制限するように解釈されるべきものでは決してない。
【実施例】
【０１２５】
＜実施例１＞
＜抗ＰＤ−１／抗ＰＤＬ−１およびヒスタミンの併用−方法＞
ＥＬ−４胸腺腫細胞株（提供：Ｄｒ．Ｉｎｇｏ  Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｏｔｔｏ−ｖｏｎ−Ｇｕｅｒｉｃｋｅ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍａｇｄｅｂｕｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を、Ｍａｒｔｎｅｒ，Ａ．ｅｔａｌに記載のように、１０％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および２ｍＭのＬ−グルタミンを追加したＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）で培養した（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  １９４，ｎｏ．１０，ｐｐ．５０１４−５０２１）。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６−８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙから購入）に、１．７５−２ｘ１０５のＥＬ−４腫瘍細胞を皮下接種させ、および細胞接種の１日前に開始した週３回の腹腔内注射によって、食塩水（対照）または食塩水で希釈した１．５ｍｇのヒスタミン二塩酸塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎから購入）で処置した。プログラム細胞死−１受容体に対する２４０μｇの抗体（抗マウスＰＤ１、クローンＲＭＰ１−１４、α−ＰＤ１と呼ぶ）、およびプログラム死−リガンド１に対する２４０μｇの抗体（抗マウスＰＤ−Ｌ１、クローン１０Ｆ．９Ｇ２、α−ＰＤＬ１と呼ぶ）（双方ともＢｉｏＸｃｅｌｌ，Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ，ＵＳＡから購入し、それぞれのカタログＮｏ．はＢＥ０１４６とＢＥ０１０１）を、腫瘍接種の３日、６日、および１０日後に腹腔内注射により投与した。腫瘍を、２−３日ごとに手動で測定した。腫瘍サイズを長さ×幅で算出した。腫瘍接種の２週間後、対照腫瘍がおよそ１．５ｃｍ２のサイズに達した時に、マウスを犠牲にした。
【０１２６】
＜実施例２＞
＜抗ＰＤ−１／抗ＰＤＬ１およびヒスタミンの併用−結果＞
従来の研究（Ｍａｒｔｎｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ  １９４，ｎｏ．１０，ｐｐ．５０１４−５０２１）と一致し、ＥＬ−４を有するマウスのヒスタミンを用いた処置は、有意に腫瘍成長率を減少させた（図１−３）。α−ＰＤ１−＋α−ＰＤＬ１−阻害抗体は、結果として腫瘍成長の比較可能な減少をもたらした。ヒスタミンおよび抗ＰＤ１／抗ＰＤＬ１の併用は、各処置（ヒスタミンまたはα−ＰＤ１／α−ＰＤＬ１）のみの場合よりも、ＥＬ−４腫瘍成長の低減を増加させた。図１−３では、腫瘍サイズを対照の％として示し、１００％は実験の終了時（すなわち腫瘍接種の２週間後）における対照腫瘍の平均サイズであった。
【０１２７】
＜実施例３＞
＜免疫療法中の細胞障害性Ｔ細胞サブセットの動態は、急性骨髄性白血病における結果を予測する＞
＜物質と方法＞
＜患者、研究デザインおよび目的＞
この単一群の多施設のフェーズＩＶ試験（Ｒｅ：Ｍｉｓｓｉｏｎ，  ＮＣＴ０１３４７９９６，  ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ  ａｔ  ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）は、第１のＣＲにおいてＡＭＬを有する８４人の患者（１８−７９歳）を登録した。図４に模式的に概説されるように、患者は、１８カ月の間、または、再発または死亡するまでに、低用量ＩＬ−２と組み合わせてヒスタミン二塩酸塩（ＨＤＣ；Ｃｅｐｌｅｎｅ）の２１日間のサイクルを１０回連続して受けた。
【０１２８】
合計１８ヶ月間、または、患者が再発、死亡、有害事象のために治療の中止、同意の撤回、またはフォローアップに影響を受けなくなるまで、治療は続けられた。サイクル１〜３は、３週間の治療および３週間の治療を受けていない期間（ｏｆｆ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）からなり、サイクル４〜１０では、治療を受けていない期間が６週間に延長された。各サイクルにおいて、治療群の患者は、１日２回の皮下の０．５ｍｇでのＨＤＣ（Ｍａｘｉｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびヒト組換えＩＬ−２（アルデスロイキン；  １６００Ｕ／ｋｇ皮下、１日２回；  Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を受けた。１８か月の処置（ＨＤＣ／ＩＬ−２群）の後に、患者はみな免疫療法が終わってからさらに少なくとも６か月間追跡された。
【０１２９】
用量、投与経路、排除基準などは、以前の第ＩＩＩ相試験で記載されたものと同一であった［Ｂｌｏｏｄ．２００６；１０８（１）：８８−９６，ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ  ｈｅｒｅｉｎ  ｂｙ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ］。Ｒｅ：Ｍｉｓｓｉｏｎ試験における主要なエンドポイントは、処置サイクル前後にＴ細胞およびＮＫ細胞の表現型をモニタリングすることによる、ＨＤＣ／ＩＬ−２の量的および質的な薬力学的効果の評価を含んでいた。プロトコルには、これらの目的を支持するために収集されたすべてのデータは、登録時の患者の年齢（６０歳未満および６０歳超）に応じて集団全体として、かつサブグループごとに分析される、と示された。Ｔ細胞の生物学対臨床結果（ＬＦＳとＯＳ）の本明細書に報告された態様は事後に行なわれた。患者の特徴は表１に示される。
【０１３０】
【表１−１】
2019506454.tif 000003
【０１３１】
【表１−２】
2019506454.tif 000004
【０１３２】
前の導入療法および地固め治療についてのより詳細な説明は他の所で見つけることができる。
【０１３３】
＜末梢血のサンプル採取とフローサイトメトリー＞
末梢血を、第１および第３の処置サイクルの前後、すなわちサイクル１の１日目（Ｃ１Ｄ１）、サイクル１の２１日目（Ｃ１Ｄ２１）、サイクル３の１日目（Ｃ３Ｄ１）、サイクル３の２１日目（Ｃ３Ｄ２１）、で収集した。ＰＢＭＣを局所で単離し凍結保存し、フローサイトメトリーの使用によって分析のために（Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎの）中央検査室へドライアイスにのせて配送した。これらの分析のために、冷凍ＰＢＭＣサンプルを１０％ＦＣＳで補充したイスコフ培地中で急速に解凍した。続いて、細胞をイスコフ培地中で洗浄し、その後ＰＢＳ中で洗浄した。細胞をＰＢＳ中で４℃で３０分間インキュベートすることによりＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ固定可能黄色染色剤（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  ｆｉｘａｂｌｅ  ｙｅｌｌｏｗ  ｓｔａｉｎ）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）でまず染色し、続いて０．５％ＢＳＡおよび０．１％ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中またはブリリアント染色緩衝液（ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｓｔａｉｎ  ｂｕｆｆｅｒ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）中で４℃で３０分間表面マーカーを染色した。以下の抗ヒトモノクローナル抗体が表現型を決定するために使用された：ＣＤ３−ＦＩＴＣ（ＨＩＴ３ａ）、ＣＤ４−ＡＰＣ−Ｈ７（ＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ４−Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｖ４５０（ＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８−ＡＰＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＲＰＡ−Ｔ８／ＳＫ１）、ＣＤ８−Ｑｄｏｔ７０５  （３Ｂ５）、ＣＤ１６−Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｖ４５０（３Ｇ８）、ＣＤ２５−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（Ｍ−Ａ２５１）、ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ（ＨＩ１００）、ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ（ＵＣＨＬ１）、ＣＤ５６−ＰｅｒＣＰ−ｅＦｌｕｏｒ７１０（ＣＭＳＳＢ）、ＣＤ５６−ＰＥ−Ｃｙ７（ＮＣＡＭ１６．２）、ＣＤ６９−ＰＥ−Ｃｙ７（ＦＮ５０）、ＨＬＡ−ＤＲ−ＦＩＴＣ（Ｌ２４３）（すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）。Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡからのＣＣＲ７−ＰＥ−Ｃｙ７（Ｇ０４３Ｈ７）。ＣＤ３−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（Ｓ４．１）、ＣＤ１４−Ｑｄｏｔ６５５（ＴｕＫ４）およびｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｑｄｏｔ６０５（すべてＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）。ＩＦＮ−γ−ＰＥ−Ｃｙ７（Ｂ２７；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の細胞内染色を、製造業者の指示に従い、ＦｏｘＰ３固定化／透過処理キット（ＦｏｘＰ３  ｆｉｘａｔｉｏｎ／ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、表面染色および固定化および透過処理を行った後に実行した。
【０１３４】
染色されたサンプルを、４レーザーＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  ＳＯＲＰフローサイトメーター（４０５、４８８、５３２および６４０ｎｍ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアのバージョン７．６．５以降、（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）、またはＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアのバージョン６以降（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、データを分析した。生存率が２５％未満のサンプルは除外した。
【０１３５】
血液サンプルは８４人の患者のうちの８１人の患者から利用可能だった。全血の微分計数（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ）を局所で行い、血液ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を計算するために利用した。全ての利用可能なサンプルを、Ｔ細胞内容物および発現活性化マーカー（ＣＤ２５およびＣＤ６９ならびにＰＭＡに応答するＩＦＮ−γ産生を含む）について分析した。所定の基準（実験失敗、細胞が少ない、細胞生存率が劣悪）によれば分析が失敗であった場合、第２のサンプルを再分析のために解凍した。また、第２の試みもデータ生成に失敗した場合、これらのサンプルを分析から除外した。実験の第２のセットでは、利用可能なサンプルを、Ｔ細胞サブセットおよびＨＬＡ−ＤＲ発現の分布について分析した。上記の予め定義された基準に従って、すべての分析に成功したサンプルがこのレポートに含まれている。分析に含まれ、または分析から除外された患者のフローチャートが図５に示される。
【０１３６】
＜ＰＭＡ／イオノマイシンまたはペプチド刺激後のＩＦＮ−γ産生＞
ＨＤＣ／ＩＬ−２免疫療法の第１および第３の処置サイクルの前後に採取した解凍したサンプルを、ウェル当たり１×１０６細胞の９６ウェルプレートの１０％ＦＣＳを補充したイスコフ培地に播種した。細胞は３７度で一晩安置された。翌日、２μｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と０．２μｇ／ｍｌのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）での５時間のインキュベーション、または、ＡＭＬ−ペプチド（白血病関連タンパク質ＷＴ１、ＰＲＡＭＥ、サバイビンおよびｈＴＥＲＴをカバーする重複するペプチド；  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、または、対照として、ＣＥＦ−ペプチド（ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびインフルエンザウイルス由来の配列を有するＭＨＣクラスＩに特異的な３２のペプチド；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）のプールでの６時間のインキュベーション、のいずれかからなる刺激の前に、温かい培地で細胞を洗浄した。
【０１３７】
各ペプチドの最終濃度は０．６ｎｍｏｌだった。それぞれ２μｇ／ｍｌの共刺激分子抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗ＣＤ４９ｄ（９Ｆ１０；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、バックグラウンドシグナルを判定する役目をした、陰性の対照サンプルと同様に、ペプチド刺激があるウェルに加えた。すべての刺激について、Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、製造業者のプロトコルに従って刺激の最後の４時間の間に加えた。サンプルを、上記のように固定し、透過処理し、ＩＦＮ−γで細胞内染色する前に、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ固定可能黄色染色剤および表面マーカーで染色した。ＩＦＮ−γ−産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の発生頻度（陰性対照試料によって判定されたバックグラウンドを差し引いた後）が、いずれかの時点（Ｃ１Ｄ１、Ｃ１Ｄ２１、Ｃ３Ｄ１、Ｃ３Ｄ２１）で０．０５％を超える場合、患者はＡＭＬ−またはＣＥＦ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を保持していると考えられた。選択バイアスを回避するために、これらの分析では、最後の時点（Ｃ３Ｄ２１；１０５日）前に起こった事象（再発）のない患者のみが考慮された。
【０１３８】
＜統計＞
統計的な分析の計画に従って、ＣＤ８＋Ｔ細胞表現型の単一比較のために対応のあるｔ検定を使用した。結果に対するＣＤ８＋サブセットまたはマーカーの動態の影響を判定するために、サンプルを、単一の時点についての中間値によって、または、別段の記載がない限り第１の処置サイクル中の誘導／減少によって、二分した。細胞機能対結果の分析は、試験の終了日（２０１４年１０月１３日）、すなわちすべての患者が少なくとも２４ヶ月間（１８ヶ月の治療および６ヶ月の追加のフォローアップ）追跡された時点で利用可能な、ＨＤＣ／ＩＬ−２による免疫療法の開始から任意の原因による再発または死亡までの日数として定義されるＬＦＳ、および、死亡までに対応する時間として定義されるＯＳについてのデータに基づく。再発は、骨髄における少なくとも５％の芽細胞または骨髄外白血病の存在として定義された。ＬＦＳおよびＯＳへのＴ細胞表現型の影響はログランク検定を使用して分析された。
【０１３９】
ＬＦＳおよびＯＳに対する、年齢の影響、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ＬｅｕｋｅｍｉａＮｅｔの推奨に従ったリスク群の分類［Ｂｌｏｏｄ．２０１０；１１５（３）：４５３−４７４］、ＣＲを達成するために必要とされる導入コースの数（１または＞１）、および地固めコースの数（０−２または＞２）を、Ｃｏｘ単変量回帰モデルを用いて評価した。Ｃｏｘ多変量回帰解析では、０．１未満のｐ値（年齢および導入サイクル数）を有する予後因子が潜在的な交絡因子として含まれていた（表２）。
【０１４０】
【表２−１】
2019506454.tif 000005
【０１４１】
【表２−２】
2019506454.tif 000006
【０１４２】
示されたＰ値はすべて両側Ｐ値である。この試験はヘルシンキ宣言の原則に従って行われた。この試験は各参加機関の倫理委員会によって承認され、患者はすべて登録の前に書面によるインフォームドコンセントを行った。
【０１４３】
＜実施例４＞
＜免疫療法中の細胞障害性Ｔ細胞サブセットの動態は、急性骨髄性白血病における結果を予測する−結果＞
図４に概説されているように、最初のＣＲのＡＭＬ患者は、地固め後のフェーズでＨＤＣ／ＩＬ−２の連続３週間の１０回のサイクルを受けた。第１のおよび第３の免疫療法のサイクルの前後に収集された末梢血を、ＣＤ８＋Ｔ細胞内容物および表現型について分析した。処置サイクル中、ＨＤＣ／ＩＬ−２は、血中のＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を変化させなかった（図６Ａ）。また、治療前または治療後のＣＤ８＋Ｔ細胞数（中間値の上または下）は、再発リスクに影響しなかった（データは示さず）。
【０１４４】
第１の処置サイクルの前後にＣＤ８＋ＴＮ、ＴＣＭ、ＴＥＭおよびＴｅｆｆの分布を比較すると、非再発性の患者はＴｅｆｆ細胞の導入とともにＴＥＭ細胞の画分の明確な減少を示した（図６）。治療の開始時では、ＴＥＭ細胞のパーセンテージが高い（中間値を超える）患者は、わずかに高いＬＦＳの可能性を示したが、一方で、ＴＮ、ＴＣＭ、またはＴｅｆｆ細胞の割合が（中間値につき）高いか低い患者では、再発リスクの有意差は見られなかった（図７）。サイクル１の間にＴＥＭ細胞の出現頻度の減少またはＴｅｆｆ細胞の導入を経験した患者は、ＬＦＳおよび／またはＯＳの有意な改善を示した（表２に示す多変量解析の結果を示す図８Ｃ−Ｄ）。また、第１の処置サイクル中のナイーブＴ細胞の出現頻度の導入は、ＬＦＳおよびＯＳを有意に予測した（図８Ａ、表２）。ＴＣＭ細胞の分布は、免疫療法（図８Ｄ）の間は一見不変であり、再発リスクに影響しなかった（図８Ｂ）。Ｔ細胞サブセットの分布は、処置サイクル３の間は有意に変化しなかった（データは示さず）。
【０１４５】
ＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原による刺激が、ＴＮ→ＴＣＭ→ＴＥＭ→Ｔｅｆｆ細胞の分化を促進するために提案されてきた［Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１３；２５（５）：５５６−５６３；Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１５；３３（７）：９１４−９２３］。したがって、ＨＤＣ／ＩＬ−２の第１の処置サイクル中にＴＥＭ細胞からＴｅｆｆ細胞が導入されると推測した。確かに、サイクル１の間にＴｅｆｆの導入とＴＥＭの減少との間に相関性が見られた（図９）。４４人の分析可能な患者のうち１８人（４１％）が、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞の付随する増加を伴うＣＤ８＋ＴＥＭ細胞の減少として定義される、メモリーＴ細胞からエフェクターＴ細胞への遷移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を示した。これらの患者は改善されたＬＦＳ（ＨＲ  ０．１９およびＰ＜０．００１）およびＯＳ（ＨＲ  ０．１３およびＰ＝０．００２；図８Ｅ、表２）を示した。
【０１４６】
＜高齢の患者のＴ細胞表現型＞
試験プロトコルは、登録時の患者の年齢（６０歳超および６０歳未満）に従ってサブグループごとの結果の分析を特定した。免疫療法の開始時におけるＣＤ８＋Ｔ細胞数またはＣＤ８＋ＴＮ／ＴＣＭ／ＴＥＭ／Ｔｅｆｆ細胞の分布は、年齢群間で有意に異ならなかった（図１０Ａ−Ｄ）。第１のサイクル中に、ＨＤＣ／ＩＬ−２での処置は、高齢患者においてのみＴｅｆｆ細胞の出現頻度の有意な増加を導入した（図１０Ｄ）。ＴＮおよびＴｅｆｆ細胞の変化した分布、ＴＥＭ細胞の出現頻度の減少、および、結果に対するＴＥＭ細胞のＴＥＭ細胞への明らかな遷移の影響は、高齢の患者に顕著であった。このように、免疫療法に導入されるＣＤ８＋Ｔ細胞分化のこれらの態様のすべては、この年齢群（図８Ｆ−Ｊ）においてＬＦＳおよび／またはＯＳを予告し、予後因子の補正後に有意に予測的なままであった（表２）。サイクル１におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットの動態は、若年の患者においてはＬＦＳまたはＯＳを有意に予測しなかった（図１０Ｅ−Ｎ）。
【０１４７】
＜Ｔ細胞活性化の追加のマーカー＞
Ｔ細胞表現型の分布に加え、細胞傷害性Ｔ細胞活性化マーカーに対する免疫療法の影響を分析した。活性化されたＴ細胞のマーカーとしてよく使用される、ＣＤ６９とＣＤ２５の発現レベルは、ＨＤＣ／ＩＬ−２処置に影響されず（図１１Ａ−Ｂ）、これらのマーカーの発現レベルは臨床の結果に影響を及ぼさなかった（データは示されていない）。これに対して、ＨＬＡ−ＤＲの発現は処置の第１のサイクル中に低減した（図１１Ｃ）。ＨＬＡ−ＤＲは、主にメモリー集団によって発現され、その減少はＴＣＭおよびＴＥＭ細胞では有意であったが、ＴＮまたはＴｅｆｆ細胞では有意ではなかった（データは示されていない）。第１のＨＤＣ／ＩＬ−２処置サイクルの終了時のＣＤ８＋Ｔ細胞上のＨＬＡ−ＤＲの低発現は、良好な臨床結果を僅かに予測した（ＯＳについての単変量Ｃｏｘ回帰分析はＰ＝０．０４であったが、ＯＳの多変量Ｃｏｘ回帰分析は  Ｐ＝０．１２だった；図１２Ａ）。
【０１４８】
＜白血病特異的Ｔ細胞の存在はＣＲの維持を予測する＞
次に、免疫療法の前後でＩＦＮ−γをエクスビボで産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の能力を判定した。ＰＭＡ／イオノマイシンで刺激した後に患者のＣＤ８＋Ｔ細胞がＩＦＮ−γを産生する能力は、第１の処置サイクルの前後で同様であり（図１１Ｄ）、臨床結果には影響しなかった（示さず）。白血病抗原と特異的に反応したＣＤ８＋Ｔ細胞を患者が有していたかどうかを判定するために、既知の白血病関連抗原（ＷＴ１、サバイビン、ＰＲＡＭＥおよびｈＴＥＲＴ）を表すペプチドプールによってＰＢＭＣを刺激し、続いてＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞を定量した。ＰＢＭＣ由来の健康なドナーＣＤ８＋Ｔ細胞は、白血病由来のペプチドに応答して、バックグラウンドレベルより高いＩＦＮ−γを産生しなかった（データを示さず）。分析された２０人の患者のうち３人は、免疫療法の開始時にこれらの抗原のいずれかに対して抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を示した（Ｃ１Ｄ１）。これらの患者のうちの２人は遅い再発（６００日より後）を経験した。免疫療法（Ｃ１Ｄ２１、ｎ＝２、Ｃ３Ｄ１、ｎ＝４、または、Ｃ３Ｄ２１、ｎ＝１）中に７人の患者が白血病反応性Ｔ細胞を得た。カプラン−マイアー分析によって、白血病特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在はＬＦＳを予測した（Ｐ＝０．０１）が、一方、ウイルスコントロールペプチド（ＣＭＶ、ＥＢＶおよびインフルエンザ；ＣＥＦ）に応答する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在は予測しなかった（Ｐ＝０．５；図１２Ｂ−Ｃ）。
【０１４９】
この試験の結果は、免疫療法中の血中の細胞傷害性Ｔ細胞表現型の分布の変化が、ＣＲにおける非移植ＡＭＬ患者の予後に関連することを初めて示した。主要な所見は、Ｔ細胞免疫のこれらの態様が、再発および死亡のリスクが高い高齢患者の再発リスクおよび生存率を決定する、ということであった。メモリーＴ細胞からエフェクターＴ細胞への遷移を評価することは、Ｔ細胞に基づく癌免疫療法において広く有用であり得る。若年の患者におけるＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの動態と結果との間に有意な相関がない理由は知られていないが、この年齢群における低い再発率および分析に利用可能なサンプル数が少ないことに関連している可能性がある。
【０１５０】
ＨＤＣ／ＩＬ−２免疫療法の第１のサイクル中に、ＡＭＬ患者の血中のＴＥＭ細胞からＴｅｆｆ細胞への遷移という所見を説明する正確なメカニズムは決定されていない。しかしながら、ＩＬ−２はＣＤ８＋Ｔ細胞のメモリーおよびエフェクター細胞集団への発達を促進することが報告されており、したがって、ＨＤＣ／ＩＬ−２レジメンのＩＬ−２成分が、観察されたメモリーＴ細胞からエフェクターＴ細胞への遷移にとって重要であることが考えられる。また、メモリー細胞からエフェクター細胞への遷移は、ＴＥＭ細胞が抗原暴露の後にＴｅｆｆ細胞に分化するという見解と両立する。免疫療法中のＴ細胞サブセットの溢出を含む代替の説明が可能であるが、ＨＤＣ／ＩＬ−２による免疫療法がエフェクターＴ細胞の発生を促進すると仮定し、これはＴＥＭからＴＥＦへの遷移を経験した患者の臨床結果の強力な予測を説明することができる。覚えておくべきことに、他のものは、ＡＭＬ特異的Ｔ細胞がＴｅｆｆ細胞表現型を有することを示している。免疫療法中の機能的なＴ細胞免疫の発達のさらなる支持においては、白血病のペプチドと反応したＣＤ８＋Ｔ細胞の検出可能なレベルが、治療の過程で７／２０の患者に認められた。共通のウイルス抗原と反応するＣＤ８＋Ｔ細胞ではなく、白血病特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在が、ＬＦＳを有意に予測した。これらの結果は、ＡＭＬにおける免疫反応性白血病関連抗原の役割に関するこれまでの所見と一致し、白血病クローンのサーベイランスのための細胞傷害性Ｔ細胞の役割に対する支持を与える。
【０１５１】
ＨＬＡ−ＤＲはＴ細胞活性化マーカーと考えられるが、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＨＬＡ−ＤＲの発現の増加はまた、癌、慢性ウイルス感染および老化におけるＴ細胞の抑制および枯渇に関連している。免疫療法中のＴＣＭとＴＥＭ細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ発現の減少、および、発現が減少した患者の好ましい臨床結果の傾向は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のメモリー集団が免疫療法中に改善されたエフェクター機能にシフトし得ることを示唆する。
【０１５２】
ＨＤＣ／ＩＬ−２は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＩＬ−２成分）の集団を拡大および活性化し、同時に、これらの抗白血病エフェクター細胞を骨髄細胞由来の活性酸素種（ＨＤＣ成分）による不活性化から保護するためのＡＭＬ免疫療法用に開発されている。Ｒｅ：Ｍｉｓｓｉｏｎ試験の以前の結果は、ＨＤＣ／ＩＬ−２での処置は、血液中のＮＫ細胞数の増加とともに、異常細胞のＮＫ細胞認識に重要な受容体を活性化する天然の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）の発現を誘発した、ということを示した。Ｒｅ：Ｍｉｓｓｉｏｎ試験の結果は、ＮＣＲ発現およびＮＫ細胞数のサイクル内での増加は、ＬＦＳおよびＯＳを弱く予測しただけということを示唆しているが、一方、本明細書に提示された結果は、第１の処置サイクル中のＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの分布の変化が予後にとって重要であることを示唆している。免疫療法後の細胞傷害性ＣＤ１６＋ＮＫ細胞での高いＮＫｐ４６発現とともに第１の処置サイクル中のＴＥＭ細胞からＴＥＦ細胞への遷移を有する患者は、有意に再発から保護された一方、ＴＥＭ細胞からＴＥＦ細胞への遷移またはＮＫｐ４６高発現だけを有する患者は、部分的にしか防止されなかった（図１３）、ということが観察された。これらのデータは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞のエフェクター機能が免疫療法中に同時に発達し、両方の細胞のサブセットが再発防止に貢献しうるという仮説を支持する。
【０１５３】
＜実施例５＞
＜天然の細胞障害性受容体のＮＫ細胞発現は、寛解維持のための免疫療法を受ける高齢のＡＭＬ患者における再発リスクを判定しうる＞
診断では、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者のおよそ７０％は６０歳超である。高齢の患者が高い割合で化学療法後に完全寛解（ＣＲ）が達成される一方で、化学療法後のフェーズでは白血病の再発は一般的であり、高齢の患者の５年生存率が１０−１５％の範囲である理由を有意に説明する。ヒスタミン二塩酸塩および低用量インターロイキン−２（ＨＤＣ／ＩＬ−２）を用いた免疫療法は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の抗白血病機能を向上させ、残留白血病を軽減または根絶することを目的とする。第ＩＩＩ相試験では、ＨＤＣ／ＩＬ−２での処置はＣＲにおけるＡＭＬ患者の再発を予防すると示された。
【０１５４】
ＮＫ細胞機能のいくつかの態様は、ＡＭＬの予後と関連していることが報告されているが、高齢の患者におけるＮＫ細胞生物学の態様の系統的な分析は実施されていない。ヒトＮＫ細胞は２つの主な表現型を含む：細胞傷害性ＣＤ１６＋／５６＋ＮＫ細胞（ここではＣＤ１６＋ＮＫ細胞と呼ばれる）は、健康な被験者において血液ＮＫ細胞の９０−９５％を構成するが、しかし、弱い細胞傷害性ＣＤ１６−／５６ｂｒｉｇｈｔ細胞（ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞）はＣＤ１６＋ＮＫ細胞の前駆体と見なされる。ＮＫ細胞傷害性は、活性化および阻害性のＮＫ細胞受容体およびそれらの同族リガンドにより悪性標的細胞上で調節される。主な活性化受容体は天然の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ；ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０およびＮＫｐ４４）およびＮＫＧ２Ｄを含む。我々は、以前、寛解維持のためにＨＤＣ／ＩＬ−２を使用して、第ＩＶ相試験に参加したＡＭＬ患者のＮＫ細胞生物学の態様の中間報告を公表した。ここでは、我々は、高齢のＡＭＬ患者（６０歳超）のサブグループに焦点をおいて、この試験の最終的な結果を報告する。
【０１５５】
別記されるように、第１のＣＲのＡＭＬ患者は、１８か月の間ＨＤＣ／ＩＬ−２の３週間の１０回のサイクルを受けた。血液サンプルは、ＮＫ細胞の絶対数およびＮＣＲのＮＫ細胞発現の分析のために第１のサイクル前後に収集された。前の中間報告では、ＨＤＣ／ＩＬ−２による処置が、処置サイクル中にＮＫｐ３０とＮＫｐ４６のＮＫ細胞発現が増加したとともに、血中のＮＫ細胞数を増大させたことを示した。我々はまず、若年の患者（＜６０歳）、および、高齢の患者（＞６０歳）のＮＫ細胞およびＮＣＲの導入の程度をそれぞれ比較した。処置の開始時のＮＫ細胞数およびＮＣＲ発現は、高齢の患者（Ｐ＝０．０４５、マン−ホイットニー検定）においてＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ＋細胞対ＣＤ１６＋の比がより低かったことを除いて、これらの年齢群間で差はなく、これは健康な被験者における以前の所見と一致している。処置サイクル中の血中のＣＤ１６＋およびＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＮＫ細胞の蓄積（図１４Ａ、１４Ｄ）、または、ＮＫｐ３０とＮＫｐ４６の受容体のＮＫ細胞発現の誘導（図１４Ｂ−１４Ｃ、１４Ｅ−１４Ｆ）に関して、若年の患者および高齢の患者には差がなかった。
【０１５６】
ＮＫ細胞数またはＮＫ細胞ＮＣＲ発現強度の（中間値につき）高い値または低い値ごとに若年の患者および高齢の患者を二分することにより、結果に対するＮＫ細胞関連マーカーの効果を判定し、続いて無白血球生存（ＬＦＳ）および全生存（ＯＳ）の分析をすることを目的とした。ＮＫ細胞数は、若年の患者または高齢の患者の結果を有意には予測せず、ＮＫ細胞のＮＣＲ発現は若年の患者の結果を予測しなかった（ＬＦＳではＰ＞０．５、図示せず）。治療の開始時（サイクル１の１日目；Ｃ１Ｄ１）にＣＤ１６＋ＮＫ細胞上でＮＫｐ３０の中間値より高い発現を有する高齢の患者は、ＮＫｐ４６についての傾向と同様に、ＬＦＳおよびＯＳの改善を示した（図１５Ａおよび１５Ｃ）。第１の処置サイクル後（サイクル１の２１日目；Ｃ１Ｄ２１）のＣＤ１６＋ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６の高い発現は、ＮＫｐ３０についての傾向と同様に、ＬＦＳおよびＯＳと正の相関であった（図１５Ｂおよび１５Ｄ）。第１の処置サイクル中のＮＫ細胞数の誘導またはＮＣＲの誘導のレベル（つまりＣ１Ｄ２１レベルからＣ１Ｄ１レベルを引いたレベル（示されない））と、結果との間では有意な相関は見られなかった。年齢、リスク群の分類、ＣＲを達成するのに必要な導入コースの数、および地固めコースの数を補正した多変量解析では、Ｃ１Ｄ１でのＮＫｐ３０発現およびＣ１Ｄ２１でのＮＫｐ４６発現が、高齢の患者のＬＦＳおよび／またはＯＳを独立して予測した（表３）。ＣＲの１人の患者は敗血症で死亡したが、他のすべての死亡では再発が先行し、これは高齢のＡＭＬ患者群においても地固め後のフェーズでの生存に対する再発の影響を示す。
【０１５７】
若年の患者のＮＣＲ発現と結果との間に相関がない理由は知られていないが、この年齢群における再発および死亡率が低いことに加えて、研究における若年患者数が少ないことに関連している可能性がある（データは示されていない）。ＮＫ細胞機能は、その後にＮＫ細胞の細胞傷害性の活性化が続く、標的細胞上のＮＣＲとそれらのリガンドとの間の相互作用に依存する。ＮＣＲのリガンドが有害なＡＭＬ細胞によって頻繁に発現する一方、新しく診断されたＡＭＬ患者のＮＫ細胞はより低い密度のＮＣＲを発現することがあり、これは、ＮＫ細胞の抗白血病効率ならびに生存率および化学療法後にＣＲを達成する可能性に影響する。この結果は、ＡＭＬの化学療法後のフェーズにおける再発を予防する際にＮＣＲについての役割を指摘し、これらの以前の所見を拡大する。これらの結果を確認し、未治療の患者または他の免疫療法を受けている患者においてもＮＫ細胞のＮＣＲ発現が再発の予告となるかどうかを確立するために、さらなる研究が必要である。
【０１５８】
【表３】
2019506454.tif 000007
【０１５９】
単変量および多変量Ｃｏｘ回帰分析を利用して、６０歳を超える患者のＬＦＳおよびＯＳに対するサイクル１の１日目（Ｃ１Ｄ１）のＮＫｐ３０またはサイクル１の１日目（Ｃ１Ｄ２１）のＮＫｐ４６の発現レベルの中間値の上下の影響を判定した。多変量解析では、年齢、リスクグループの分類、ＣＲを達成するために必要な導入コースの数、および、地固めコースの数についてハザード比を補正した。
【０１６０】
＜物質と方法＞
＜患者＞
この単一群の多施設の第ＩＶ相試験（Ｒｅ：Ｍｉｓｓｉｏｎ，ＮＣＴ０１３４７９９６，ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ  ａｔ  ｗｗｗ  ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）は、１８か月の間、または、再発または死亡までに、ＨＤＣ／ＩＬ−２の２１日間の１０サイクルを受けた、第１のＣＲにおいてＡＭＬを有する８４人の患者（１８−７９歳）を登録した。主要なエンドポイントは、第１の処置サイクル前後に、ＮＫ細胞の表現型およびその機能をモニタリングすることによる、ＨＤＣ／ＩＬ−２の量的および質的な薬力学的効果の評価を含んでいた。プロトコルには、これらの目的を支持するために収集されたデータは、登録時の患者の年齢（６０歳未満および６０歳超）に応じて集団全体として、かつサブグループごとに、定義された集団について分析される、と示された。ＮＫ細胞数およびＮＣＲの発現対結果の分析は事後に行なわれた。高齢の患者（６０歳超、中間値６７．２、６０−７９の範囲）の登録時の特徴は、表４にて説明される。患者の特徴、導入療法および地固め療法、除外基準、処置および投薬の詳細は、前の中間報告（実施例４）で見られる。
【０１６１】
＜末梢血のサンプル採取およびフローサイトメトリー＞
末梢血を、処置サイクル１の前後、すなわちサイクル１の１日目（Ｃ１Ｄ１）、サイクル１の２１日目（Ｃ１Ｄ２１）、で収集し、ＰＢＭＣを局所で単離し凍結保存し、フローサイトメトリー分析のために（Ｓａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎの）中央検査室へドライアイスにのせて配送した。ＰＢＭＣサンプルを蛍光色素結合抗体および生存マーカーで染色し、他所（実施例４）で詳細に説明したように、４レーザーＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  ＳＯＲＰ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて分析した。
【０１６２】
サンプルは、３７人の若年の患者のうち３２人と、４７人の高齢の患者のうち４５人から入手可能であった。入手可能なサンプルはすべて分析された。所定の基準（実験失敗、細胞が少ない、細胞生存率が劣悪）によれば分析が失敗であった場合、第２のサンプルを再分析のために解凍した。Ｃ１Ｄ１サンプルの１８ケース、およびＣ１Ｄ２１サンプルの１２ケースでもまた、第２の試みはデータの生成に失敗し、これらのサンプルは分析から除外された。全血の微分計数（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ）を局所で行い、血液ＮＫ細胞の絶対数を計算するために利用した。微分計数は４人の若年の患者と５人の高齢の患者にはなかった。
【０１６３】
【表４】
2019506454.tif 000008
【０１６４】
＜統計＞
統計的な計画に従って、対応のあるｔテストをＮＫ細胞表現型の単一の比較に使用した。ＮＫ細胞マーカー対結果の分析は、試験の終了日（２０１４年１０月１３日）、すなわち、すべての患者が少なくとも２４ヶ月間（１８ヶ月の治療および６ヶ月の追加のフォローアップ）追跡された時点で利用可能な、ＨＤＣ／ＩＬ−２による免疫療法の開始から任意の原因による再発または死亡までの日数として定義されるＬＦＳ、および、ＯＳについてのデータに基づく。再発は、骨髄における少なくとも５％の芽細胞または骨髄外白血病の発生として定義された。ＬＦＳは、ＨＤＣ／ＩＬ−２での処置の最初の日から任意の原因による再発または死亡までの時間として定義された。ＯＳは、原因にかかわらず死亡までの対応する時間として定義された。ログランク検定を用いてＬＦＳおよびＯＳを分析した。ＬＦＳおよび／またはＯＳを有意に予測したパラメータを、単変量および多変量のＣｏｘ回帰分析によってさらに分析した。多変量解析では、年齢、リスク群の分類、ＣＲを達成するために必要な導入コースの数（１または＞１）、および、地固めコースの数（０−２または＞２；表１）について、ハザード比を修正した。示されたＰ値はすべて２面がある。患者はＥｕｒｏｐｅａｎ  ＬｅｕｋｅｍｉａＮｅｔによる推奨にしたがってリスク分類された。この試みは各参加機関の倫理委員会によって承認され、患者はすべて登録の前に書面によるインフォームドコンセントを行った。
【０１６５】
＜実施例６＞
＜急性骨髄性白血病における再発予防免疫療法中の骨髄細胞集団の動態＞
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者において、未成熟な骨髄性細胞は、急速に血液と骨髄に蓄積する。化学療法後に大多数のＡＭＬ患者が白血病細胞の消失（完全寛解、ＣＲ）を達成するにもかかわらず、ほとんどの成人患者は長期生存の見通しが悪い白血病の再発を経験する。Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化するサイトカインＩＬ−２（ＨＤＣ／ＩＬ−２）と併用したヒスタミン二塩酸塩（ＨＤＣ）による免疫療法は、現在、ＥＵ内およびイスラエル内で、地固め後のフェーズにおける再発防止のために使用されている。このレジメンの承認は、ＨＤＣ／ＩＬ−２を受ける患者における再発リスクの有意な低減を示す第ＩＩＩ相試験結果に基づいており、ＩＬ−２単独またはＨＤＣ／ＩＬ−２によって達成される再発予防を比較するメタアナリシスは、ＨＤＣ成分の臨床効果を支持する。
【０１６６】
ＮＯＸ２は、骨髄細胞の活性酸素種（ＲＯＳ）生成ＮＡＤＰＨオキシダーゼである。ＨＤＣは、成熟骨髄細胞上のヒスタミンＨ２受容体（Ｈ２Ｒ）を標的にして、ＮＯＸ２依存性ＲＯＳ形成を抑制する。ＮＯＸ２由来のＲＯＳの阻害は、隣接する抗白血病エフェクター細胞をＲＯＳ誘導不活性化から保護することが見出されており、これはＡＭＬにおけるＨＤＣの再発予防特性と関連する機構として提示されている。加えて、従来の研究は骨髄細胞の分化促進剤としてＨＤＣを示唆している。このように、Ｙａｎｇらはヒスタミン形成酵素の遺伝的破壊によりヒスタミンが欠乏したマウスは、化学的に導入される癌に対する感受性の増加とともに、骨髄細胞分化の障害を示す、と報告した。ＨＤＣはまた、単球由来樹状細胞（ＤＣ）上のＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの発現を増強し、ＮＯＸ２依存的な方法で骨髄細胞上のＣＤ１１ｂの発現を増強することも示された。
【０１６７】
これらの従来の所見により、ＨＤＣ／ＩＬ−２を用いた免疫療法中に血中の骨髄細胞集団の動態を評価する（８７）ことが駆り立てられた。骨髄細胞のサブセットおよびそれらの成熟マーカーの発現がＨＤＣに基づく免疫療法中に調節され、血中の骨髄細胞の動態がＡＭＬにおける臨床結果と関連し得ることを報告する。
【０１６８】
＜患者、物質、及び方法＞
患者、研究デザイン、及び目的。第１のＣＲにおける８４人の成人のＡＭＬ患者（１８−７９歳）を、Ｒｅ：Ｍｉｓｓｉｏｎ試験（ＮＣＴ０１３４７９９６、ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖにて登録）に登録した。詳細な患者の特徴は、前述の刊行物において説明されている。Ｒｅ：Ｍｉｓｓｉｏｎ試験は、全ての患者が１８か月間、又は再発或いは死亡まで、ＨＤＣ及び少量のＩＬ−２の１０回連続の２１日のサイクルを受ける、単群の多施設の第ＩＶ相研究（ｓｉｎｇｌｅ−ａｒｍｅｄ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｐｈａｓｅ  ＩＶ  ｓｔｕｄｙ）であった。レジメンは以前の第ＩＩＩ相試験で利用されたものと同一であった。患者は、地固めの完了後４６日の中間で登録され、免疫療法の開始後少なくとも２４か月にわたりフォローアップを受けた。３人の患者が同意を撤回し、分析には含まれなかった。追加の１４人の患者は、時期尚早に研究を中止し、最後の捕捉されたフォローアップ日に打ち切られた。骨髄中の少なくとも５％の芽球細胞又は髄外の白血病として、再発を定義した。主要な試験エンドポイントは、処置サイクル中の、末梢血におけるＴ細胞及びＮＫ細胞の集団に対するＨＤＣ／ＩＬ−２の量的且つ質的な効果を含んでいた。骨髄性の集団に対する効果、及びそれらの臨床結果（無白血病生存、ＬＦＳ、及び全生存、ＯＳ）に対する影響の分析を、事後に行なった。研究は、ヘルシンキ宣言に概説される原理に従って行なわれ、且つ関与する機関それぞれの倫理委員会により承認された。全ての患者が、登録前に書面による同意を提供した。
【０１６９】
ＰＢＭＣの単離、染色、及びフローサイトメトリー。末梢血を、第１及び第３のＨＤＣ／ＩＬ−２処置サイクルの前後に集めた。ＰＢＭＣを単離し、局所で凍結保存し、２つの骨髄パネルによる分析のためにヨーテボリ大学のＴＩＭＭ研究所へとドライアイスの上に乗せて搬送した。２つの骨髄パネルのうち、一方は１１８の骨髄細胞による活性化マーカーの発現を判定するためのものであり、他方は単球上のＨ２Ｒの発現レベルを判定するためのものである。解凍後、活性化パネル用に意図される凍結保存されたサンプルを、ヒトＦＣブロック（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ））において予めインキュベートした。Ｈ２Ｒパネル用に意図されるサンプルを、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤの固定可能な黄色染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）により染色した。その後、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔの染色緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（活性化パネル）において、又は、０．５％のＢＳＡ及び０．１％のＥＤＴＡを含むＰＢＳ（Ｈ２Ｒパネル）において、表面マーカー抗体のカクテルを用いて４℃で３０分間、サンプルをインキュベートした。以下の抗ヒトモノクローナル抗体を利用した：ＣＤ３−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（ＨＩＴ３Ａ）、ＣＤ１９−ＰｅｒＣＰＣｙ５．５（ＳＪ２５Ｃ１）、ＣＤ１６−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ６０５（３Ｇ８）、ＨＬＡ−ＤＲ−ＡＰＣＨ７（Ｇ４６−６）、ＣＤ１４−ＰＥＣｙ７（ＭφＰ９）、ＣＤ１４１−ＡＰＣ（１Ａ４）、ＨＬＡ−ＡＢＣ−ＦＩＴＣ（Ｇ４６−２、６）、ＣＤ４０−ＰＥ（５Ｃ３）、ＣＤ８６−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ７１１（ＦＵＮ１）、ＣＤ１１ｂ−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（ＩＣＲＦ４４）、ＣＤ３３−ＰＥＣｙ７（Ｐ６７．６）（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来）、ＣＤ５６−ＰｅｒＣＰ  ｅｆｌｏｕｒ  ７１０（ＣＭＳＳＢ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＣＤ１ｃ−Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（Ｌ１６１）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、抗ヒスタミンＨ２受容体（多クローン性ウサギＩｇＧ）（ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ヤギ抗ウサギ−ＡＰＣ及びＣＤ１４−Ｑｄｏｔ６５５又はＣＤ１４−Ｐａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ（共にクローンＴｕｅＫ４）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０１７０】
４−レーザーＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  ＳＯＲＰのフローサイトメーター（４０５、４８８、５３２、及び６４０ｎｍ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の上でサンプルを分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアのバージョン７．６．５、又はそれ以降のもの（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を使用して、データ分析を行った。血液サンプルは、８４人の患者のうちの８１人の患者から入手可能であった。上記の骨髄パネルを使用して、骨髄細胞の表現型分析をＰＢＭＣ上で行った。Ｈ２Ｒパネルを使用して４９人の患者を分析し、活性化マーカーパネルを使用して５９のサンプルを分析した。これらの患者を、生存可能な状態の冷凍されたＰＢＭＣの利用可能性に基づいて選択した。全血上で関与するセンターによって微分計数を行い、これは研究の継続を承諾した８１人の患者に利用可能なものであった。微分係数１４３を使用して（Ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｏｕｎｔｓ  ｗｅｒｅ  ｕｓｅ  １４３  ｄ）、血液中の骨髄集団（好酸球、好中球、及び単球）の絶対数を判定した。
【０１７１】
統計分析。統計的な研究計画において明示されるように、免疫療法前後での血球数の比較及び骨髄細胞上での成熟マーカーの発現を、対応のあるスチューデントｔ検定によりプリズム６を使用して行った。対応のあるスチューデントｔ検定を使用して報告された全ての有意性は、ウィルコクソン符号順位和検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｍａｔｃｈｅｄ  ｐａｉｒｓ  ｔｅｓｔ）によっても有意なままであった。試験の閉鎖日（２０１４年１０月１３日）でのＬＦＳ及びＯＳに対するこれら免疫パラメータの影響を、ログランク検定を使用して判定した。ログランク検定によりＬＦＳ又はＯＳを有意に予測したパラメータを、ＳＰＳＳ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２４のソフトウェアを使用したＣｏｘの単変量及び多変量の回帰分析によって、更に分析した。多変量分析において、蛍光強度などの連続的なパラメータを、中間より上又は下の発現に基づいて公称値に変換した。単変量Ｃｏｘ分析を利用して、ＬＦＳ及びＯＳに対する、年齢、リスクの群（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ＬｅｕｋｅｍｉａＮｅｔ（１４）による推奨に従い分類）、ＣＲの達成に必要な導入コースの数（１又は＞１）、及び地固めコースの数（０−２又は＞２）の影響を判定した。ＬＦＳ（導入サイクルの年齢及び数）のための、０．１より下のＰ値を持つ予後因子を、多変量Ｃｏｘ分析において潜在的な交絡因子として含めた。
【０１７２】
結果
ＨＤＣ／ＩＬ−２での免疫療法は、血液中の好酸球数を増大させる。第１のＣＲにおいてＡＭＬを持つ８４人の成人患者が、Ｒｅ：Ｍｉｓｓｉｏｎ試験に参加した。患者は、地固め後のフェーズにおいてＨＤＣ／ＩＬ−２での免疫療法を、１０回連続の３週間のサイクルで受けた。処置サイクル１と３の前後に末梢血を集め、微分計数により白血球集団の含有量を分析した。加えて、血液から単離されたＰＢＭＣを、単球及びＤＣの集団の含有量、並びにそれらの活性化マーカーの発現のために、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１７３】
処置サイクル中に、サイクル間で標準化された白血球の総数の著しい増加が見られた（図１６Ａ）。白血球の導入は主に好酸球によって寄与され、その数は典型的に、処置サイクル中に１０倍増大した（図１６Ｂ）。好酸球数は処置サイクル間に減ったが、サイクル３の開始時の好酸球数はサイクル１の開始前のほぼ２倍もの多さのままであった（図１６Ｂ）。処置サイクルの前の好酸球数、処置サイクルの後の好酸球数、或いは処置サイクル中の好酸球の導入も、ＬＦＳ又はＯＳに関する臨床結果に対し有意に影響を及ぼさなかった（データは示さず）。
【０１７４】
ＨＤＣ／ＩＬ−２での処置は、血液中の単球数を減らす。ＨＤＣ／ＩＬ−２治療中の好酸球数の増加とは対照的に、単球及び好中球の数は、第１の処置サイクル中に減少した（図１６Ｃ−Ｄ）。サイクル３中では単球又は好中球の数は更に減少した。免疫療法の開始時のレベルと比較して、単球数はサイクル３において減少したままであった（図１６Ｄ）。
【０１７５】
免疫療法１９３の前又は後の血液中の好中球数は、臨床結果に影響を与えなかった（データは示さず）。しかし、患者を、第１の処置サイクル中の単球数の減少が高いもの又は低いもの／無いものへと、中間で二分した時、ＬＦＳで強固な単球の減少が有意に予測され（図１６Ｅ）、ＯＳでは同様の傾向が見られた（図１６Ｆ）。ＬＦＳに対する単球減少の影響は、単変量回帰分析では有意なままであったが、多変量回帰分析ではそうでなかった（表５）。
【０１７６】
表５．ＬＦＳとＯＳに対する、単球数の減少、Ｈ２Ｒの単球発現、及びＨＬＡ−ＡＢＣの単球発現の影響の、単変量及び多変量のＣｏｘ回帰分析
【０１７７】
【表５】
2019506454.tif 000009
【０１７８】
Ｈ２Ｒの単球発現は、ＨＤＣベースの免疫療法を受ける患者における再発リスク及び生存を予測する。血液中の主な２つの単球集団である、ＣＤ１４＋＋ＣＤ１６−（ＣＤ１４＋＋）細胞及びＣＤ１４＋ＣＤ１６＋（ＣＤ１６＋）細胞は、ＨＤＣ／ＩＬ−２での処置中に同じくらいの程度まで減少した（データは示さず）。初期の研究は、骨髄細胞の分化の促進に加えて、インビトロでのＮＯＸ２由来のＲＯＳ形成を阻害するために、ＨＤＣがヒスタミン２型受容体（Ｈ２Ｒ）をライゲートすることを示している。ＣＤ１４＋＋及びＣＤ１６＋の単球の上でのＨ２Ｒの発現を、免疫療法中に評価し、臨床結果に関連づけた。図１７Ａ−Ｂに示されるように、Ｈ２Ｒの発現は、処置サイクル中及び処置サイクル間にはＣＤ１４＋＋単球上で、並びに、第１のＨＤＣ／ＩＬ−２処置サイクル中にはＣＤ１６＋単球上で有意に増強した。第１の処置サイクル後のＣＤ１４＋＋又はＣＤ１６＋の単球上での高度のＨ２Ｒ発現は、ＬＦＳとＯＳの兆候を強く示した（図１７Ｃ−Ｆ）。高度の単球Ｈ２Ｒ発現の有用な影響に関する同様の傾向を、免疫療法の開始時に観察した（データは示さず）。ＬＦＳとＯＳに対する単球Ｈ２Ｒ発現の影響は、多変量分析では有意なままであった（表５）。
【０１７９】
ＨＤＣ／ＩＬ−２での処置は、単球及びＤＣ上での活性化マーカーの発現を増大させる。骨髄由来の細胞に対するＨＤＣ／ＩＬ−２処置の効果を更に明らかにするために、活性化マーカーＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、及びＣＤ８６の発現を、処置サイクル１及び３の前後に判定した。結果は、処置サイクル中にＣＤ１４＋＋及びＣＤ１６＋の両単球上でのこれら活性化マーカーの発現の増加を示した（図１８Ａ−Ｂ）。ＣＤ１４＋＋単球については、ＨＬＡ−ＤＲ発現の有意な増加を、サイクル３中に観察し、及びＣＤ４０発現の有意な増加を両方の処置サイクル中に観察した（図１８Ａ）。ＣＤ１６＋単球については、全ての分析された活性化マーカーは、ＨＤＣ／ＩＬ−２処置サイクルの少なくとも１つの間に著しく増大した（図１８Ｂ）。
【０１８０】
血液中の２つの主なＤＣの集団は、ＣＤ１ｃ＋及びＣＤ１４１＋ＤＣの表現型をそれぞれ運ぶ。単球と同様に、ＤＣの数は、ＨＤＣ／ＩＬ−２免疫療法中に減少した（データは示さず）。ＤＣ関連の活性化マーカーの発現に関して、ＣＤ１ｃ＋ＤＣ集団とＣＤ１４１＋ＤＣ集団との間に差異があった。ＣＤ４０の発現は、ＣＤ１ｃ＋ＤＣの上でのみ、ＨＤＣ／ＩＬ−２での処置中に増大したが、ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８６の発現は、ＣＤ１４１＋ＤＣの上でのみ誘導された（図１８Ｃ−Ｄ）。ＨＬＡ−ＤＲ及びＣＤ８６の発現は、対照的に、ＨＤＣ／ＩＬ−２処置中にＣＤ１ｃ＋ＤＣの上で僅かに減少した（図１８Ｃ）。有意な相関性は、臨床結果と単球又はＤＣ上でのＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、又はＣＤ８６の発現との間には観察されなかった（データは示さず）。
【０１８１】
骨髄細胞上での低度のＨＬＡ−ＡＢＣ発現は、血液中の細胞障害性Ｔ細胞の変更された分配を伴う患者における好ましい臨床結果を告げる。ＨＤＣ／ＩＬ−２での処置は、分析された全ての単球とＤＣの集団上での処置サイクル中のＨＬＡ−ＡＢＣの発現の増強を一貫して伴っていた（図１９Ａ−Ｄ）。免疫療法の開始時のＣＤ１４＋＋単球上でのＨＬＡ−ＡＢＣの高度の発現は予後不良を予告し（図１９Ｅ−Ｆ）、これは多変量分析において有意なままであった（表１）。ＣＤ１４＋＋単球上での高度のＨＬＡ−ＡＢＣ発現を伴う患者の短いＬＦＳに関する同様の傾向が、第１のＨＤＣ／ＩＬ−２処置サイクル（Ｐ＝０．１５、ｎ＝６２、ログランク検定）の後に観察された。ＣＤ１６＋単球、ＣＤ１ｃ＋ＤＣ、及びＣＤ１４１＋ＤＣ上でのＨＬＡ−ＡＢＣの発現を、ＣＤ１４＋＋単球のＨＬＡ−ＡＢＣ発現に高度に関連づけた（データは示さず）。これら骨髄性集団上でのＨＬＡ−ＡＢＣの高度の処置前の発現も、乏しい臨床的結果を予測した（データは示さず）。
【０１８２】
残りの骨髄性の悪性細胞の上でのＨＬＡ−ＡＢＣ発現が、単球及びＤＣの上でのＨＬＡ−ＡＢＣ発現と同様な場合があることを、推測した。悪性細胞上での高度のＨＬＡ−ＡＢＣ発現はしたがって、悪性細胞を認識且つ破壊するために細胞障害性Ｔ細胞との相互作用を促進するだけでなく、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）との相互作用によってＮＫ細胞の細胞傷害性の活性化を妨害する。Ｒｅ：Ｍｉｓｓｉｏｎ試験からの以前の報告において、免疫療法の開始時に血液中に高頻度のＣＤ８＋エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ；ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７−）を持つ患者、又は第１のＨＤＣ／ＩＬ−２処置サイクル中にＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞（ＴＥｆｆ；ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−）へのＣＤ８＋ＴＥＭ細胞の遷移を受ける患者が、ＬＦＳ及びＯＳの改善を示したことを、観察した。これらの要因は、減少した再発リスクと関連する機能的なＴ細胞免疫を示し得る。治療の開始時に中間頻度より上のＣＤ８＋ＴＥＭ細胞を持つ患者の中で、ＣＤ１４＋＋単球Ｃ１Ｄ１の上でのＨＬＡ−ＡＢＣの発現は再発リスクに影響を与えなかった（図２０Ａ）。対照的に、低度の単球ＨＬＡ−ＡＢＣ発現の好ましい影響は、免疫療法の開始時にＣＤ８＋ＴＥＭ細胞をほとんど持たない患者において明らかになった（ｐｒｏｎｏｕｎｃｅｄ）（図２０Ｂ−Ｃ、表１）。同様に、ＴＥＭからＴＥｆｆへの遷移が観察された患者は、単球上での低度のＨＬＡ−ＡＢＣ発現の明らかな利益を示さなかったが（図２０Ｄ）、遷移陰性の患者は、Ｃ１Ｄ２１で低度の単球ＨＬＡ−ＡＢＣ発現を持つことから有意に利益を得た（図２０Ｅ−Ｆ、表５）。
【０１８３】
＜考察＞
ＡＭＬの化学療法後のフェーズにおける白血病の再発は、残りの悪性細胞の拡大から結果として生じると仮定され、地固め後の免疫療法の目標は、これらの残りの細胞を根絶することである。細胞障害性Ｔ細胞とＮＫ細胞は、白血病細胞の監視のための主なエフェクター集団であると考えられるが、骨髄性免疫細胞の適切な機能化がこのようなリンパ球の活性に重要である。ＨＤＣ／ＩＬ−２の併用免疫療法において、ＩＬ−２成分の提唱された機能は、細胞障害性リンパ球を活性化することである一方で、ＨＤＣ成分は、免疫抑制性ＲＯＳの産生の阻害、及び骨髄細胞の成熟の促進によって骨髄誘導性の免疫抑制を標的とする。
【０１８４】
ＨＤＣ／ＩＬ−２での処置サイクル中に観察された明白な好酸球増加症は、恐らくＩＬ−５及びＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−２により誘導された産生の結果としてＩＬ−２での単独療法が好酸球増加症を引き起こすと示されている、以前のＡＭＬ試験に従っている。従って、ＨＤＣ／ＩＬ−２での処置中に観察された好酸球の導入は、恐らくＩＬ−２成分に起因する。著しいことに、我々の研究に使用されるＩＬ−２の用量は、大半の以前の研究におけるよりも少なく、好酸球増加症のレベルに対するＨＤＣ成分による寄与は、形式的に除外することができない。再発リスク又は生存に関する好酸球数と臨床結果との間に相関性が無いことが観察された。
【０１８５】
好酸球増加症に加えて、ＩＬ−２の投与は、ＡＭＬ患者における好中球減少症を引き起こすと報告された。我々の研究において、ＨＤＣと併用した低用量のＩＬ−２の使用により、血中好中球の軽度且つ一時的な減少を、第１の処置サイクル中に観察した。単球数の同様の及びより明白な減少を、ＨＤＣ／ＩＬ−２の第１のサイクル中に観察した。好中球数ではなく単球数が、処置サイクル３の開始時に低いレベルのままであって。表現型分析により、ＣＤ１４＋＋及びＣＤ１６＋の両単球の血球数がＨＤＣ／ＩＬ−２治療中に減少することが明らかになった。以前のＡＭＬ試験からの単球数に対するＨＤＣ又はＩＬ−２の効果に関する情報が乏しい一方、転移性腎細胞癌（ＲＣＣ）を患う患者における臨床試験の結果により、ＩＬ−２は血液中の単球数を少なくするのではなくＩＬ−２を増大させることが示された。興味深いことに、ＤｏｎｓｋｏｖらによるＲＣＣ試験において、ＩＬ−２レジメンへのＨＤＣの追加は、単球増多症を防いだ。未熟骨髄細胞の阻害剤としてのＨＤＣを更に支持して、マウスにおけるヒスタミン合成の遺伝子欠損は、未熟骨髄細胞の明白な堆積に関連付けられる。したがって、ＨＤＣ／ＩＬ−２  ＨＤＣ成分はＡＭＬ試験において単球数の減少の観察に寄与したと仮定される。面白いことに、好中球及び単球と同様に、ＣＤ１ｃ＋及びＣＤ１４１＋ＤＣの数も、試験中の免疫療法中に減少した。ＨＤＣの投与が癌を患うマウスにおけるＤＣの数を増やすと以前に示されているため、このことは予期されなかった。しかし、上述のＲＣＣ試験の１つにおいて、ＩＬ−２処置は血液ＤＣ数を減らすことが分かった。従って、単球の減少とは対照的に、ＤＣの数の減少はＩＬ−２に起因し得ることが推測される。しかし、ＣＲにおけるＡＭＬ患者は近年、強化化学療法を受けており、白血球数の観察された変動は、少なくとも部分的に、骨髄機能の回復中に生じる事象を反映し得ることに、注意されたい。
【０１８６】
癌の様々な形態において、不適当に活性化された単球及び好中球は免疫抑制に関連付けられ、血液及び他の組織中のそれらの存在は頻繁に、生存に関する予後不良を告げている。ＲＣＣにおいて、ＩＬ−２処置の前後の少ない単球及び／又は好中球の数、又はＩＬ−２治療中の単球数の減少は、好ましい臨床結果を予測すると示されている。現在の研究において、第１のＨＤＣ／ＩＬ−２処置サイクル中の単球数の強固な減少は、ＬＦＳに関連付けられ、それにより、血液中の単球の存在が免疫療法の効力を弱め得るという考えが支持されている。
【０１８７】
骨髄細胞に対するＨＤＣの提唱された効果は、ＮＯＸ２依存性ＲＯＳ形成の阻害及び骨髄細胞成熟の促進を含む。これら効果は厳密に、骨髄細胞上で発現されたＨ２Ｒのライゲーションを介して媒介される。Ｒｅ：Ｍｉｓｓｉｏｎ試験において、ＨＤＣ／ＩＬ−２治療中、具体的には第１の処置サイクル中に、ＣＤ１４＋＋単球の他にＣＤ１６＋単球の上でもＨ２Ｒの発現が強く増強されたことが観察された。Ｃ１Ｄ２１での高度の単球Ｈ２Ｒ発現は、潜在的な交絡因子を考慮に入れる多変量分析において有意なままである、改善されたＬＦＳ及びＯＳを予告した。また、免疫療法の開始時に高密度のＨ２Ｒを持つ患者の好ましい生存への傾向が観察された。Ｈ２Ｒの高度の発現密度は、おそらくＨＤＣ処置に対する骨髄細胞の反応性を増強し、ＨＤＣ／ＩＬ−２での免疫療法の有効性のバイオマーカーと見なされ得る。更なる研究が、免疫療法を受けない患者におけるＨ２Ｒ発現の潜在的効果を含む、ＡＭＬの臨床経過に関する骨髄細胞Ｈ２Ｒの発現の重要性を判定するために是認される。
【０１８８】
Ｈ２Ｒに加えて、成熟の他の様々なマーカーの発現は、処置サイクル中に単球とＤＣの集団上で有意に増大し、このことは免疫療法がインビトロだけでなくインビボでヒト細胞の骨髄の成熟を引き起こすことを示している。しかし、予想外にも、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、又はＣＤ８６の高度の骨髄細胞発現はＬＦＳに影響を及ぼさず、一方でＨＬＡ−ＡＢＣの高度の発現は再発のリスクの増強に関連付けられた。ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８６、及びＣＤ４０の単球発現は、免疫療法の第１のサイクル前後での単球ＨＬＡ−ＡＢＣの発現に強く相関した（データは示さず）。同様の相関性を、ＨＤＣ／ＩＬ−２での処置の前後でのＨＬＡ−ＤＲ及びＨＬＡ−ＡＢＣのＤＣ発現に見出した。したがって、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、又はＣＤ８６の発現の正の影響の欠如は、負の予後のマーカーＨＬＡ−ＡＢＣとのこれら成熟マーカーの相関性に関連し得ることが、推測される。
【０１８９】
数連の証拠は、ＮＫ細胞とＴ細胞の機能がＡＭＬの好ましい臨床結果に重要であることを示唆している。ＨＤＣ／ＩＬ−２の免疫療法中に、天然の細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）のＮＫ細胞数及びＮＫ細胞発現を含む、ＮＫ細胞関連のパラメータは、地固め後のフェーズにおいて再発及び死亡を有意に予測することが、以前に報告されている。加えて、治療の開始時の多数のＣＤ８＋ＴＥＭ細胞、ＴＥＭ細胞からＴＥｆｆ細胞へのＣＤ８＋Ｔ細胞遷移、及びＡＭＬ由来の抗原に反応的なＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を含む、機能的な細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞に関係するパラメータは、好ましい臨床結果の兆候を示す。以前の結果はまた、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞がＡＭＬの再発の予防において独立したエフェクターアーム（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ａｒｍｓ）を構成し得ることを示唆している。
【０１９０】
現在の研究において、骨髄細胞上のＨＬＡ−ＡＢＣの高度の発現は予後不良に関連付けられ、したがって考慮され得るバイオマーカーの場合がある。単球上のＨＬＡ−ＡＢＣ発現と他の全ての分析された骨髄細胞集団との間の強固な相関性は、単球ＨＬＡ−ＡＢＣの発現が残りの白血病性芽球上でのＨＬＡ発現も反映し得ることを示唆している。白血病性芽球上で発現されたＨＬＡ−ＡＢＣは、ＮＫ細胞により発現されたＫＩＲのライゲーションを介してＮＫ細胞の細胞傷害性を阻害し得る。興味深いことに、ＬＦＳ上での低度のＨＬＡ−ＡＢＣ発現の好ましい影響は、外見上、ＣＤ８＋Ｔ細胞の好ましくない分布、即ち、低頻度のＣＤ８＋ＴＥＭ細胞及びＴＥＭからＴＥｆｆの遷移の欠如を示す患者に制限されていた。Ｔ細胞分布が好ましくない患者は、白血病細胞のＮＫ細胞で媒介された監視に依存することもあり、これは故に、この群の患者における低度のＨＬＡ−ＡＢＣ発現の好ましい臨床的な影響に対し考えられる説明を提供する。このような推定の予備的な性質は強調されなければならず、詳細な研究が、骨髄細胞ＨＬＡ−ＡＢＣの発現とＡＭＬにおけるＮＫ細胞及びＴ細胞の抗白血病機能との間の起こり得る相互作用に対して是認される。
【０１９１】
骨髄細胞集団の表現型及び動力学は、ＡＭＬにおける再発リスクに関連し得ること、及び、骨髄細胞機能の態様を標的とするための戦略は再発を防ぐことを目的とする免疫療法の有効性を改善し得ることが、結論付けられた。
【０１９２】
＜実施例７＞
＜慢性骨髄単球性白血病におけるＮＯＸ２依存性の免疫抑制＞
慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）は、処置の選択肢が少なく且つ予後が憂鬱なものである、骨髄増殖性且つ骨髄異形成の腫瘍である。ＣＭＭＬにおけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び他の抗白血病リンパ球の役割の大部分が未知である。骨髄細胞ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（ＮＯＸ２）により形成された免疫抑制性の活性酸素種（ＲＯＳ）に焦点を当てることで、ＣＭＭＬにおける免疫回避の機構に対する見識をもたらすことを目的とした。初代ヒトＣＭＭＬ細胞の支配的な集団は、共培養されたＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔエフェクターメモリー細胞、及びＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞における大規模なＰＡＲＰ  １−依存性の細胞死を次々に誘発した、膜結合型のＮＯＸ２及び放出されたＲＯＳを発現することが分かった。ＲＯＳ形成の阻害剤及び細胞外ＲＯＳの消去剤は、ＣＭＭＬ細胞で誘導されたリンパ球死を防ぎ、抗体が被覆された初代ＣＭＭＬ細胞へのＮＫ細胞の脱顆粒を容易にした。ＣＭＭＬ患者において、血液中の未熟な細胞の数（ＣＤ３４）の上昇は、様々なＮＫ細胞を活性化する受容体の発現の減少に関連付けられた。ＣＭＭＬ細胞は、免疫回避の標的化可能な機構として細胞外のＲＯＳを利用し得ることが提唱される。
【０１９３】
ＣＭＭＬを患う患者は、血液と骨髄における芽球細胞の存在と共に、血液中の単球数の上昇（＞１ｘ１０９／Ｌ）を提示した。ＣＭＭＬは典型的に、骨髄増殖及び骨髄異形成の兆候と共にゆっくりと進行する。診断後の中間の生存は＜２年であり、長期間の生存者はほとんどおらず、このことは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）への高リスクの遷移によって部分的に説明される。ＣＭＭＬ患者の大部分は＞６０歳であり、且つ同種骨髄移植には不適当であり、これは唯一の潜在的に治療的な処置のままである。
【０１９４】
活性酸素種（ＲＯＳ）は、微生物に対する防御戦略として様々な型の骨髄細胞によって産生される。しかし、単球と顆粒球のＮＡＤＰＨオキシダーゼ／ＮＯＸ２（ＮＯＸ２）によって形成されたＲＯＳも、免疫調節における役割を割り与えられてきた。故に、ＮＯＸ２を介してＲＯＳを生成するための骨髄細胞の完全な能力は、報告によると、自己反応性Ｔ細胞の活性を弱めるのに重要である。癌において、ＮＯＸ２由来のＲＯＳの細胞外放出は、抗腫瘍性のリンパ球、具体的にはＮＫナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＴ細胞のサブセットの有意な機能不全に関連付けられる。ＮＯＸ２媒介性のＲＯＳ形成の阻害剤であるヒスタミン二塩酸塩（ＨＤＣ）は、ＡＭＬの化学療法後のフェーズにおける再発防止のために、ＮＫ細胞及びＴ細胞を活性化するサイトカインインターロイキン２（ＩＬ−２）と組み合わせて使用される。第ＩＩＩ相試験の結果の事後解析は、患者が機能的なＮＯＸ２及びヒスタミン２型受容体（Ｈ２Ｒ）を共発現させる白血病細胞を持つ、ＨＤＣ／ＩＬ−２の臨床適用が単球分化のＡＭＬを患う患者の中で明らかにされることを示唆した。
【０１９５】
この研究のために、（１）初代ヒトＣＭＭＬ細胞上のＮＯＸ２及びＨ２Ｒの発現を判定し、（２）ＣＭＭＬ細胞の潜在的な免疫抑制特性を評価し、（３）ＣＭＭＬ患者からの循環するＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットの表現型を判定した。結果は、ＮＯＸ２由来のＲＯＳがＣＭＭにおいて白血病関連の免疫抑制の標的化可能な機構を構成し得ることを示唆している。
【０１９６】
患者及び健康な給血者。スウェーデンのヴェストラ・イェータランド県とスコーネ県にある病院で確認されるＣＭＭＬを患う患者の血液サンプルを、書面でのインフォームドコンセントを得た後に採取した。患者は、２００８年のＷＨＯの分類に従うＣＭＭＬの基準を満たしていた。１２人の患者のうち、１０人（８３％）にはＣＭＭＬ−１（血液中の前単球を含む＜５％の芽細胞、又は骨髄中の＜１０％の芽細胞として定義される）があったが、残り２人（１７％）にはＣＭＭＬ−２があった。１０人の患者は男性であり、２人は女性であった（５２−８８歳、中間で７０歳）。ＣＭＭＬ患者において循環する単球の絶対数は、９人の患者から利用可能であり、４．５ｘ１０９／Ｌから２９．６ｘ１０９／Ｌまで及び、中間は１０．０ｘ１０９／Ｌであった。健康な給血者のＬｅｕｋｏｐａｃｋｓ（バフィーコート）は、スウェーデンのＳａｈｌｇｒｅｎｓｋａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＨｏｓｐｉｔａｌとＫｕｎｇａｌｖ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの輸血センターから得られた。患者のＮＫ細胞のイムノフェノタイピングのために、年齢の一致した個体の対照サンプルを使用した（５０−８２歳、中間６５．５歳）。
【０１９７】
細胞の単離。患者及び健康なドナーから、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を記載される通りに単離した。簡潔に、血液サンプル又はバフィーコート白血球を、密度勾配遠心分離、続いてデキストラン沈降にさらした。健康なドナーのＮＫ細胞、ＣＤ８＋細胞、及び単球を、ＭＡＣＳ  ＮＫ細胞単離キット、ＣＤ８＋単離キット、及びＭＡＣＳ単球単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，  Ｓｗｅｄｅｎ）をそれぞれ使用した免疫磁気単離により獲得した。主要な白血病性芽球及び単球を、ＦＡＣＳにより患者のＰＢＭＣから単離した。芽細胞をＣＤ１４−ＣＤ３４＋として定義し、単球をＣＤ１４＋ＣＤ３３＋として定義した。
【０１９８】
ＲＯＳの産生。初代ＣＭＭＬ細胞の細胞外ＲＯＳ産生を、記載されるようにイソルミノールを増強した化学発光により測定した。簡潔に、２ｘ１０５の細胞を、イソルミノール（１０μｇ／ｍｌ）及びワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；４Ｕ／ｍｌ）の存在下で９６ウェルのプレートに加えて、ＮＯＸ２誘発因子であるＮ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＦ；０．１μＭ）により刺激した。光の放射を、ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａのプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して記録した。
【０１９９】
リンパ球の死滅。単離したリンパ球のサブセットを、５％のＣＯ２において３７℃で、ＮＯＸ２阻害剤又は他の抗酸化化合物を用いる又は用いないＣＭＭＬ患者の初代白血病単球と共に、一晩共培養した。リンパ球の死滅を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）の固定可能な死細胞染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での染色後のフローサイトメトリーによって評価した。受容体発現アッセイにおいて、精製されたＮＫ細胞を、ＰＡＲＰ−１阻害剤ＰＪ３４（０．５μＭ）の存在下又は不在下で単球と共に一晩共培養した。以下の抗体を、受容体発現の評価のために使用した：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏｔｅｃのＮＫｐ４６−ＰＥ（クローン：９Ｅ２）及びＤＮＡＭ−１−ＰＥ−Ｃｙ７（クローン：ＤＸ１１）。ＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎのＮＫｐ８０−ＡＰＣ（クローン：４Ａ４．Ｄ１０）及びＣＤ１６−ＢＶ６０５（クローン：３Ｇ８）。
【０２００】
ＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットを染色し、３種類のレーザーを用いるＦＡＣＳＡＲＩＡ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で選別した。Ｔ細胞集団を識別するために以下の抗体を使用した：Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣＤ３−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（クローン：Ｓ４．１）。全てＢＤ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎのＣＤ８−ＡＰＣ−Ｈ７（クローン：ＳＫ１）、ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ（クローン：ＨＩ１００）、ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ（クローン：ＵＣＨＬ１）、及びＣＣＲ７−ＰＥ−Ｃｙ７（クローン：Ｇ０４３Ｈ７）。ＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットを更に以下のように定義した：ＣＤ４５ＲＡ  ＣＣＲ７＋としてナイーブＴ細胞（ＴＮ）、ＣＤ４５ＲＯＣＣＲ７＋としてＴ中央メモリー細胞（Ｔ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ）（ＴＣＭ）、ＣＤ４５ＲＯＣＣＲ７−としてＴエフェクター記憶細胞（ＴＥＭ）、及びＣＤ４５ＲＡＣＣＲ７−としてＴエフェクター細胞（ＴＥｆｆ）。
【０２０１】
ＮＫ細胞の脱顆粒及びＡＤＣＣのアッセイ。患者由来の悪性単球に対するＮＫ細胞の脱顆粒及び細胞傷害性を、ヒト化抗ＣＤ３３抗体であるリンツズマブ（Ａｂｂｖｉｅ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用する実験において評価した。健康なドナーのＮＫ細胞を単球と共に共同インキュベートし、３７℃及び５％のＣＯ２で４時間、抗−ＣＤ１０７ａ−ＰＥ−Ｃｙ７抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び抗酸化化合物の存在下で、ＣｅｌｌＴｒａｃｅの紫色染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識した。その後、細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）の固定可能な死細胞染色（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、フローサイトメトリーによって単球及びＮＫ細胞の脱顆粒の溶解について評価した。培養実験、細胞傷害性アッセイ、及び共焦点顕微鏡のために、１０％のヒトＡＢ＋血清で補足されたイスコフ改変ダルベッコ最少必須培地（ＩＤＭＥＭ）を使用した。
【０２０２】
共焦点顕微鏡。ＣＭＭＬ患者の主要な白血病性単球を、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓの抗フラボシトクロムｂ５５８（ｇｐ９１ｐｈｏｘ）（クローン７Ｄ５、ＦＩＴＣ）で染色し、続いて、リンツズマブ（１μｇ／ｍｌ）の存在下で健康なＮＫ細胞を用いて１：２の比率で４５分間、共焦点スライド上でインキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ中で広範囲に洗浄し、ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄの褐色防止封入剤（ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  ａｎｔｉｆａｄｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でマウントした。Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ７００共焦点顕微鏡を使用して顕微鏡写真を得て、ＺｅｉｓｓのＺＥＮ  Ｂｌｕｅソフトウェアを使用して分析した。
【０２０３】
化合物。以下の化合物を使用した：ヒスタミン二塩酸塩（ＨＤＣ；１００μＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｈ２Ｒ受容体アンタゴニストラニチジン（Ｇｌａｘｏ，Ｍｏｌｎｄａｌ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ＡＨ２０２３９９ＡＡ（ラニチジンに対する化学対照、Ｇｌａｘｏ）、カタラーゼ（２００Ｕ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、インターロイキン２（ＩＬ−２；５００Ｕ／ｍｌ；Ｃｈｉｒｏｎ）、ＮＯＸ２阻害剤ジフェニレンヨードニウムクロリド（ＤＰＩ；３μＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びＰＡＲＰ−１阻害剤ＰＪ３４（０．５μＭ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【０２０４】
フローサイトメトリーによるイムノフェノタイピング。細胞培養の前後の活性化受容体のＮＫ細胞発現を、１０人のＣＭＭＬ患者及び１０人の健康な年齢の一致した対照におけるフローサイトメトリーによって測定した。これら試験において、細胞を、９６ウェルのプレート中で３日間、ＩＬ−２（５００ｕ／ｍｌ）が存在する２００μｌにおいて１つのウェルにつき１ｘ１０６細胞の濃度で培養した。その後、細胞を１日目と３日目に染色し、４種類のレーザーを用いるＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  ＳＯＲＰのフローサイトメーターを使用して分析した。ＮＫ細胞をＣＤ３−／ＣＤ５６＋細胞として定義した。この分析は、ＮＫ細胞の活性化又は成熟に関連する以下の受容体を含んでいた：全てＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＢｉｏｔｅｃのＮＫｐ３０−ＰＥ（クローン：ＡＦ２９−４Ｄ１２）、ＮＫｐ８０−ＡＰＣ（クローン：４Ａ４．Ｄ１０）及びＤＮＡＭ−１−ＰＥ−Ｃｙ７（クローン：ＤＸ１１）、ＮＫｐ４６−ＰＥ（クローン：９Ｅ２）、ＮＫＧ２Ｄ−ＰＥ−Ｃｙ７（クローン：１Ｄ１１）、ＬＦＡ−１ｂ−ＡＰＣ（クローン：６．７）、ＣＤ５７−ＦＩＴＣ（クローン：ＨＮＫ−１）はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎのものであった。２Ｂ４−ＦＩＴＣはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓのものであり、ＮＫＧ２Ｃ−Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ（クローン：ＭＭ０４８８−９Ｒ１７）はＮｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓのものであった。
【０２０５】
ＣＭＭＬ患者の単球及び芽細胞を、全てＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎの抗ＣＤ３３（クローンＰ６７．６、ＰＥ−Ｃｙ７）、抗ＣＤ３４（クローン８Ｇ１２、ＰＥ）、抗ＣＤ５６（クローンＮＣＡＭ１６、ＰＥ−Ｃｙ７、ＡＰＣ）、抗ＣＤ１４（クローンＭΦＰ９、ＡＰＣ−Ｃｙ７）、抗ＣＤ１５（クローンＨＩ９８、ＡＰＣ）から成るパネルを使用して分析した。抗フラボシトクロムｂ５５８（ｇｐ９１ｐｈｏｘ）（クローン７Ｄ５、ＦＩＴＣ）。抗ヒスタミンＨ２受容体（多クローン性ウサギＩｇＧ）はＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）のものであり、ヤギ抗ウサギ二次抗体（ＰＥ−Ｃｙ５．５）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのものであった。
【０２０６】
統計分析及び倫理規定。一元配置分散分析、その後のボンフェローニの事後試験を多重比較のために使用し、対応のあるｔ検定を単一の比較のために使用した。Ｐ値＜０．０５を有意であると考慮した。図において、アスタリスクは以下のように使用される：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。全ての示されたＰ値は全て両側性である。研究はゴセンバーグの倫理審査委員会により承認されており、全ての実験はヘルシンキ宣言に従って行なわれた。
【０２０７】
＜結果＞
単球性のＣＭＭＬ細胞は機能的なＮＯＸ２及びヒスタミンＨ２受容体を発現する。免疫抑制性のＲＯＳは、慢性骨髄性白血病における悪性顆粒球によって、及びＡＭＬにおける悪性単球細胞によって産生されるが、初代ＣＭＭＬ細胞の潜在的なＲＯＳを形成する能力は未知のままであった。初期実験において、細胞の膜結合型のＮＯＸ２特異的サブユニットｇｐ９１ｐｈｏｘの中央蛍光強度（ＭＦＩ）によって反映されるように、ＮＯＸ２の発現と併せたヒトＣＭＭＬ細胞からのＲＯＳの産生を分析した。ＣＭＭＬ患者の末梢血における単球性のＣＤ１４＋集団は、健康なドナーのＣＤ１４＋単球が発現したように、同様のレベルのｇｐ９１ｐｈｏｘを発現した（図２１Ａ及びＢ）。ｇｐ９１ｐｈｏｘに対し陽性であるＣＤ１４＋単球の分画は、全てのＣＭＭＬ患者について９９％の過剰であった（データは示さず）。
【０２０８】
Ｈ２−受容体（Ｈ２Ｒ）を介したシグナル伝達は、ＲＯＳ形成のヒスタミンで誘発される阻害を変換することが示されている。初代単球性ＣＭＭＬ細胞は例外なく高レベルのＨ２Ｒを発現し、このことは、ＮＯＸ２活性がＨＤＣによって標的とされ得ることを示唆している（図２１Ａ及びＢ）。大多数のＣＭＭＬ細胞がＣＤ３３ＣＤ１４＋である一方、ＣＤ３４＋芽細胞のより小さな集団は大半の患者の血液中で検出された。より成熟した単球性のＣＭＭＬ細胞とは対照的に、ＣＤ３４芽球細胞は、低レベルのｇｐ９１ｐｈｏｘ、及び中程度のレベルのＨ２Ｒを発現した（図２１Ａ及びＢ）。ｇｐ９１ｐｈｏｘの発現が機能的なＮＯＸ２を反映したかどうかを判断するために、患者のＣＤ１４＋細胞を、ｆＭＬＦ、即ちヒト骨髄細胞においてＲＯＳ形成を引き起こす細菌起源のホルミル化トリペプチドでの刺激後のＲＯＳ産生の分析が後続するＦＡＣＳによって選別した。選別された単球性のＣＭＭＬ細胞は高レベルのＲＯＳを生成することが分かり、ＨＤＣの添加はＲＯＳ産生を有意に抑えた（図２１Ｃ及びＤ）。ＨＤＣのＲＯＳ阻害作用は、順に、ラニチジン、即ち特異的Ｈ２Ｒアンタゴニストによって拮抗されたが、ラニチジンの化学対照、即ちＡＨ２０２３９９ＡＡによっては拮抗されず、そこでは、チオエーテル基がエーテルによって置き換えられ、それによりＨ２Ｒ＞５０倍でその親和性を減らしている（図２１Ｃ）。これらの効果は、Ｈ２Ｒを標的とすることによってＨＤＣがＣＭＭＬ細胞におけるＮＯＸ２媒介性のＲＯＳ産生を抑えることを示唆している。
【０２０９】
ＮＯＸ２の阻害は、抗体が被覆された初代ＣＭＭＬ細胞の方へとＮＫ細胞脱顆粒及びＡＤＣＣを促進する。健康な及び悪性の骨髄細胞は以前に、ＲＯＳ［１６］の産生によってＮＫ細胞の抗腫瘍機能を損なうと示されている。共培養実験において、相互に作用する初代ＣＤ１４＋ＣＭＭＬ細胞及びＮＫ細胞の共焦点顕微鏡写真を得た。ＣＤ１４＋ＣＭＭＬ細胞とＮＫ細胞との相互作用を分析する時に、細胞と、ＮＫ細胞の方への膜結合型ＮＯＸ２の極性化との間に、異なるシナプスを観察した（図２２Ａ）。単球性のＣＭＭＬ細胞が高レベルのＲＯＳを産生する能力と共に免疫学的シナプスの付近でＮＯＸ２を発現したという発見により、ＣＭＭＬ細胞が免疫媒介性の死滅を逃れる機構がＲＯＳ産生によって構築され得るかどうかについての研究が駆り立てられた。この目的のために、ＮＫ細胞とＣＭＭＬ細胞との相互作用を増強するための結合抗体（ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）としてのリンツズマブ（抗ＣＤ３３）の存在下又は不在下で、ＩＬ−２で刺激されたＮＫ細胞が初代ＣＤ１４＋ＣＭＭＬ細胞に応じて脱顆粒を行う能力を試験した。ＮＫ細胞だけが、初代ＣＭＭＬ細胞に対する脱顆粒をほとんど表示しなかった。リンツズマブの添加はＮＫ細胞応答を有意に増大させ（ｐ＜０．０１、ｎ＝９）、ＮＯＸ２阻害剤ＨＤＣの添加は初代白血病細胞に対する脱顆粒応答を増強させた（ｐ＜０．０１、ｎ＝９；図２２Ｂ）。
【０２１０】
ＣＤ１４＋ＣＭＭＬ細胞は、リンパ球におけるＰＡＲＰ  １依存性の細胞死を誘導する。一晩の共培養実験において、初代ＣＤ１４＋ＣＭＭＬ細胞は、健康なＮＫ細胞（ｐ＜０．００１、ｎ＝６、図２２Ｃ）及びＣＤ８＋Ｔ細胞（ｐ＜０．００１、ｎ＝４、図２３Ａ）において有意な細胞死を引き起こした。ＣＭＭＬで誘導されたリンパ球のアポトーシスは、ＮＯＸ２阻害剤ＨＤＣ及びＤＰＩ、並びに、Ｈ２Ｏ２を分解することにより細胞外のＲＯＳを除去するカタラーゼによって妨げられた。リンパ球も、ＰＡＲＰ−１の阻害剤であるＰＪ３４によってＣＭＭＬ細胞誘導性の細胞死から救い出され、故にこのことは、ＣＭＭＬ細胞により形成されたＲＯＳが、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞において、パータナトスとしても知られるＰＡＲＰ  １依存性の細胞死を引き起こすことを示唆している（図２２Ｃ及び２３Ａ）。
【０２１１】
ＣＭＭＬ細胞は、成熟したＴ細胞サブセットに対して優先的に抑制作用がある。以前に、ＣＤ８＋Ｔエフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ）の存在が、地固め後のフェーズにおける再発防止のためにＨＤＣ／ＩＬ−２での免疫療法を受けるＡＭＬ患者の好ましい予後に関連付けられることが、示されている。ＣＭＭＬ細胞が特定のＴ細胞サブセットを特異的に阻害するかどうかを判定するために、ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット（ＴＮ、ＴＣＭ、ＴＥＭ、及びＴＥｆｆ）をＦＡＣＳで選別し、初代単球性ＣＭＭＬ細胞でこれらの部分母集団を一晩培養した。血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの分布は、ＣＭＭＬ患者、及び年齢が一致した健康な対照被験体において同様であった（データは示さず）。ＣＭＭＬ細胞は、より成熟したＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット、即ちＴＥＭ及びＴＥｆｆ細胞における細胞死を顕著に誘導し、一方でＴＮ細胞は、ＣＭＭＬ細胞誘導性のアポトーシスに対する耐性が大きかった（図２３Ｂ）。ＮＯＸ２阻害剤ＤＰＩがＣＭＭＬ細胞誘導性の細胞死から全てのＴ細胞サブセットを効率的に救い出したため、Ｔ細胞サブセットの細胞死の差はＲＯＳ感度の差によって顕著に説明された。
【０２１２】
ＣＭＭＬ患者のＮＫ細胞における受容体発現の欠損。ＮＫ細胞の機能は、ＮＫ細胞表面上で発現された抑制性受容体を活性化することにより調節される。初期の研究は、ＡＭＬ及びＭＤＳを含む骨髄性の悪性腫瘍におけるＮＫ細胞受容体を活性化する発現減少が生存に関する予後不良を告げることを示している。また、ＭＤＳの進行は以前に、活性化ＮＫ細胞受容体の下方調節（ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）に関連付けられていた。
【０２１３】
末梢のＣＤ１４−ＣＤ３４＋芽球細胞のパーセンテージに関して患者を分析すると、年齢が一致した健康な対照と比較して、より高い比率の循環ＣＤ３４＋芽細胞（ＰＢＭＣの＞２％）を持つ患者の群は、かなり低い強度の活性化ＮＫ細胞受容体ＮＫｐ３０、ＮＫｐ８０、及び２Ｂ４を示すことが分かった（図２４Ａ）。加えて、血液中のＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０、ＤＮＡＭ１、及び２Ｂ４を発現する循環ＮＫ細胞の頻度は、健康な対照よりもＣＭＭＬ患者において低い（図２４Ｂ）。また、７２時間、ＩＬ−２の存在下又は不在下で患者又は健康なドナーのＰＢＭＣを培養し、ＮＫ細胞受容体の発現を判定した。ＩＬ−２刺激は患者由来のＮＫ細胞におけるＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、及びＤＮＡＭ１の発現を有意に増強したことを観察した（データは示さず）。
【０２１４】
初期の研究は、ＲＯＳを産生する単球がインビトロでの活性化ＮＫ細胞受容体の発現を下方調節することを示している。しかし、活性化受容体の観察された下方調節が、ＮＫ細胞による受容体発現の直接的なＲＯＳで誘導された減少ではなく、ＮＫ細胞アポトーシスの開始に関係する第２の事象を反映するかどうかは、未知のままであった。それ故、ＰＡＲＰ−１阻害剤ＰＪ３４の存在下で健康なドナーからのＲＯＳを産生する単球性細胞に、ＮＫ細胞をさらし、これは、ＲＯＳへの曝露にもかかわらずＮＫ細胞の生存度を支持している。図２５Ａに示されるように、ＰＪ３４の存在下で単球由来のＲＯＳにさらされたＮＫ細胞は、ＮＫｐ８０及びＤＮＡＭ−１に関して同様の傾向でＮＫｐ４６及びＣＤ１６を有意にダウンレギュレートした。ＮＫ細胞がＲＯＳを産生する細胞の不在下でＰＪ３４にさらされた時、ＮＫ細胞受容体発現のダウンレギュレーションは観察されなかった（データは示さず）。
【０２１５】
＜考察＞
ＮＫ細胞と骨髄細胞は、免疫応答を開始するために双方向のクロストークに従事し、ＮＫ細胞は、骨髄細胞のサブセットを死滅させることによって免疫応答を形成し、調節し、及び終了させると提唱されている。ＮＫ細胞はまた、様々な悪性骨髄細胞に対して細胞傷害性を及ぼす。ＮＫ細胞機能の欠損は、骨髄性白血病において疾患の経過に影響を与えると提唱されている。例えば、血液中の少ないＮＫ細胞数は、慢性骨髄性白血病患者におけるチロシンキナーゼ阻害剤の中止後の白血病の再発に関連し、貧しいＮＫ細胞機能及び活性化ＮＣＲの発現の欠損は、ＡＭＬを患う患者における陰気な予後を告げる。
【０２１６】
骨髄性の悪性腫瘍におけるＮＫ細胞欠損の基礎を成す機構に関する詳細が定義されているままである一方、骨髄細胞からの細胞外ＲＯＳのＮＯＸ２依存性の形成は、免疫抑制の貢献的な経路として提唱されている。この研究における主な発見は、ＣＭＭＬ患者が機能的なＮＯＸ２を発現する単球性の白血病細胞を持つこと、及び、白血病細胞からのＮＯＸ２由来のＲＯＳの放出が、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、意図された（ｐｕｒｐｏｒｔｅｄ）抗白血病の機能を持つリンパ球において機能不全及び細胞死を引き起こしたことであった。また、ＣＭＭＬ細胞により産生されたＮＯＸ２由来のＲＯＳを標的とするための戦略が、ＮＫ細胞及びＣＤ８＋リンパ球のサブセットの生存度を維持し、ＮＫ細胞の抗白血病の機能を支持したことも示されている。これらの戦略は、ＮＯＸ２機能を阻害するためにＨ２ＲをライゲートするＨＤＣと共に、細胞外のＲＯＳ（カタラーゼ）の劣化及びＮＯＸ２（ＤＰＩ）の特異的阻害を含んでいた。
【０２１７】
比較的わずかな研究が、疾患の経過にわたりＣＭＭＬの免疫生物学又は抗白血病リンパ球の役割に対処してきた。４１人のＭＤＳ患者（６人はＣＭＭＬを患う）のコホートにおいて、Ｃａｒｌｓｔｅｎ及びその同僚は、表示された骨髄サンプルに由来するＮＫ細胞が、年齢が一致した健康な対照と比較して細胞傷害性の減少を示したことを観察した。これらの著者はまた、患者由来のＮＫ細胞における活性化受容体（ＤＮＡＭ−１及びＮＫＧ２Ｄ）の表面発現の減少を実証し、このことは骨髄芽球数の上昇と関連した。これらの以前の研究がＣＭＭＬにおけるＮＫ細胞区画の別個の分析を可能にしなかった一方で、結果は、ＣＭＭＬ患者、特に血液中のＣＤ１４−ＣＤ３４＋芽細胞の数が多い患者のＮＫ細胞による様々な活性化受容体の発現減少の発見に適合可能である。以前の研究に従って、単球性の細胞によって産生されたＲＯＳは活性化ＮＫ細胞受容体のダウンレギュレーションを誘導することが観察された。ＰＡＲＰ−１阻害剤ＰＪ３４を使用する実験は、ＲＯＳが細胞死の無い状態でもＮＫ細胞受容体のダウンレギュレーションを引き起こすことを示唆しており、故に、初期のアポトーシスに関連した細胞的事象ではなくＲＯＳが活性化ＮＫ細胞受容体の発現を減らすことを支持している。結果はまた、ＮＫ細胞受容体の欠損がサイトカイン活性化によって少なくとも部分的に可逆的であることを示唆しており（データは示さず）、ＣＭＭＬ患者のＮＫ細胞上でのＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、及びＤＮＡＭ−１の発現は、ＩＬ−２によって健康な年齢が一致したドナーのものに匹敵するＭＦＩレベルに戻された。
【０２１８】
ＣＭＭＬにおける細胞障害性Ｔ細胞の役割は詳細に特徴付けられていない。同種幹細胞移植（ａｌｌｏ−ＳＣＴ）は、悪性細胞を除去する際にＴ細胞免疫が恐らく役割を果たすことを示唆している、ＣＭＭＬにおける唯一の潜在的に回復的な処置である。この意見は更に、ａｌｌｏ−ＳＣＴの後に再発が生じたＣＭＭＬ患者においてＣＤ３＋Ｔ細胞を使用するドナーリンパ球輸注療法（ＤＬＩ）の臨床的有効度によって支持される。現在の研究において、初代ＣＭＭＬ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞区画、特に白血病細胞のクリアランスを媒介すると仮定される非ナイーブ細胞において有意なＲＯＳ依存性のアポトーシスを引き起こしたことが観察された。これらの発見は、ＣＤ８＋ＴＥＭが低レベルの外因性ＲＯＳによって誘導された細胞死に対し非常に敏感であることを示している初期の報告に適合可能である。ＣＭＭＬ細胞由来のＲＯＳに対するＴ細胞サブセットの分差感度を説明する機構は、更に定義されなければならない。また、更なる研究が、Ｔ細胞へのＣＭＭＬ細胞誘導性の免疫抑制が疾患の経過に影響を与えるかどうか、及び、白血病細胞によるＲＯＳ形成が、ＣＭＭＬにおけるａｌｌｏ−ＳＣＴの、報告によると制限のある利益に起因し得るかどうかを明らかにするために、必要とされる。
【０２１９】
ＮＯＸ２阻害剤ＨＤＣは、化学療法の完了後に少量のＩＬ−２と共に使用した時にＡＭＬの再発を防ぐと示されている。第ＩＩＩ相試験結果の事後分析は、Ｆｒｅｎｃｈ−Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｂｒｉｔｉｓｈ（ＦＡＢ）分類に従い、ＡＭＬのクラス４及び５を患う患者においてＨＤＣ／ＩＬ−２の臨床的有効度が公表されることを示唆した。ＡＭＬのこれら亜型は、Ｈ２Ｒと共にＲＯＳを産生且つ放出する能力を持つ機能的なＮＯＸ２を運ぶ単球分化を伴う、白血病の集団を含んでいる。これらの発見は、単球性のＡＭＬ細胞によるＲＯＳ産生が白血病誘起性の免疫回避の機構として役立ち得るという仮説に対する背景を形成した。現在の研究の結果は、同様の免疫抑制性の機構がＣＭＭＬにおいて手近にあるかもしれないことを示唆している。
【０２２０】
要するに、結果は、初代ヒトＣＭＭＬ細胞が、白血病細胞のＮＫ細胞及びＴ細胞に依存するクリアランスに影響を与え得る免疫抑制性のＲＯＳを産生することを示唆している。細胞外のＲＯＳを標的とする戦略は、ＣＭＭＬにおける抗白血病の細胞性免疫の改善において価値があり得ることが、提唱される。
【０２２１】
本発明の特定の特徴が本明細書で例示且つ記載されてきたが、多くの改変、置換、変更、及び同等物が、当業者により想到される。それ故、添付された請求項は、本発明の真の趣旨の中にあるものとしてこのような改変及び変更を全て包含するように意図されることを、理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
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【図１０Ｌ】
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【図１０Ｍ】
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【図１０Ｎ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２０Ｆ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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