(57)【要約】  本明細書に記載されているのは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合ドメインおよび癌細胞に対してｄｓＲＮＡを標的化するための癌細胞標的ドメインを含む組換えキメラタンパク質である。記載されたキメラタンパク質の使用方法もまた、本明細書に提供される。【選択図】図２Ａ
2019534037.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合ドメインと、
前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する標的結合部分と、を含む、キメラ組換えタンパク質。
【請求項２】
前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインと前記標的結合部分との間にスペーサーペプチドをさらに含む、請求項１に記載のキメラ組換えタンパク質。
【請求項３】
前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインが、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ結合モチーフ（ｄｓＲＢＭ）を含む、請求項１または２に記載のキメラ組換えタンパク質。
【請求項４】
前記少なくとも１つのｄｓＲＢＭが、ｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、ＴＲＢＰ、ＰＡＣＴ、Ｓｔａｕｆｅｎ、ＮＦＡＲ１、ＮＦＡＲ２、ＳＰＮＲ、ＲＨＡ、およびＮＲＥＢＰのｄｓＲＢＭから選択される、請求項３に記載のキメラ組換えタンパク質。
【請求項５】
前記少なくとも１つのｄｓＲＢＭが、配列番号１８として示されるヒトＰＫＲのアミノ酸１〜１９７と少なくとも７０％同一であるポリペプチド配列を含む、請求項３に記載のキメラ組換えタンパク質。
【請求項６】
前記標的結合部分が、ポリペプチド、抗体、抗体断片、または抗体模倣物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ組換えタンパク質。
【請求項７】
前記スペーサーペプチドが、プロテアーゼ認識配列を含むオリゴペプチド、正に荷電したアミノ酸のホモオリゴペプチド、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載のキメラ組換えタンパク質。
【請求項８】
前記スペーサーペプチドが、アルギニンのホモオリゴペプチドである、請求項７に記載のキメラ組換えタンパク質。
【請求項９】
前記二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合ドメインが、配列番号１８に記載のヒトＰＫＲの少なくとも１つのｄｓＲＮＡ結合ドメインであるか、またはその機能的バリアントであり、
前記スペーサーペプチドが、配列番号５に記載のＡＲＧ９、またはその機能的バリアントであり、
前記標的結合部分が、配列番号２０に記載の単鎖抗ＰＳＭＡ抗体、またはその機能的バリアントである、請求項２〜８のいずれか一項に記載のキメラ組換えタンパク質。
【請求項１０】
配列番号３に記載の配列と少なくとも７０％同一であるポリペプチドを含む、請求項９に記載のキメラ組換えタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキメラ組換えタンパク質と、ｄｓＲＮＡと、を含む複合体。
【請求項１２】
前記ｄｓＲＮＡが、ポリイノシン酸鎖とポリシチジル酸鎖（ポリＩＣ）とを含む、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸。
【請求項１４】
前記核酸配列が、細菌または植物宿主細胞における発現のために最適化されている、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
前立腺癌の治療または腫瘍血管新生の発現の阻害に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のキメラ組換えタンパク質、または請求項１１もしくは１２に記載の複合体。
【請求項１６】
それを必要とする対象に治療有効量の請求項１１または１２に記載の複合体を投与し、それによって前記癌を治療するか、または前記腫瘍血管新生の発現を阻害することを含む、前立腺癌の治療または腫瘍血管新生の発現の阻害を行うための方法。
【請求項１７】
前記複合体が全身または局所に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象に治療有効量の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を投与することをさらに含む、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
２０１６年９月４日に出願された米国仮特許出願第６２／３８３，４６６号に対して利益が主張されており、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
技術分野
【０００２】
本明細書で提供されるのは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合ドメイン、および癌細胞に対してｄｓＲＮＡを標的化するための癌細胞標的ドメインを含む組換えキメラタンパク質である。記載されたキメラタンパク質の使用方法もまた、本明細書に提供される。
【背景技術】
【０００３】
前立腺癌は、一般に、世界で２番目に診断される癌であり、米国男性の間で毎年診断される新たな癌の症例の２５％以上を占めている（１）。転移性前立腺癌の場合、患者は、主に、アンドロゲン除去療法（ＡＤＴ）で治療される。
【０００４】
この治療法では、一般に、短期の寛解を達成するが、患者は典型的には、去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）を発症する。これらの患者は、既存の治療法にほとんど反応せず、約３年の生存期間中央値を示すことから、ＣＲＰＣ患者に対する新規治療法には大きな需要がある（１−３）。
【０００５】
現在のほとんどの標的癌療法では、腫瘍の進行を遅延させてはいるが、この進行を妨げることはめったにない。腫瘍細胞はゲノム的に不安定であるため、腫瘍細胞が治療を逃れ、かつ、耐性を発現し得る突然変異および遺伝的変化を最終的に獲得する。標的化剤によって誘発される死滅速度が非常に遅いため、腫瘍にとっては、治療によって加えられる一定の圧力に順応するのに十分な時間となる。さらに、腫瘍は不均質であり、いくつかの異なる亜集団を有する。標的療法は、通常、これらの亜集団の一部のみを標的としており、それ以外を標的としないことから、腫瘍全体を根絶することは期待できない。
【０００６】
転移性ＣＲＰＣは、典型的には、標的療法に利用することができる独特の細胞表面分子、すなわち前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を提示する。ＰＳＭＡは、全てのグリーソンスコアにおいて最大１０００倍のレベルで過剰発現し（４）、また、過剰発現は腫瘍の進行とともに増加する（５，６）。この疾患はその不均質性にもかかわらず、完全にＰＳＭＡが陰性である原発腫瘍または転移はまれである（７）。上記の知見は、ＰＳＭＡが非常に有望な治療標的であるという概念を裏付けるものではあるが、ＰＳＭＡを標的とした治療法は、現在、臨床用途に承認されていない。しかし、臨床試験中の薬剤はほとんどない（８−１１）。
【０００７】
したがって、ＣＰＲＣに関する標的療法が引き続き必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本明細書に記載されるのは、癌細胞へのｄｓＲＮＡの標的化、すなわちｄｓＲＮＡをＰＳＭＡ過剰発現細胞に送達できるキメラタンパク質分子を生成することに対する改良されたアプローチである。
【０００９】
本開示は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合ドメインおよび前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する標的結合部分を含むキメラ組換えタンパク質およびそのコード核酸を提供する。
【００１０】
記載されたキメラ組換えタンパク質およびｄｓＲＮＡを含む複合体がさらに記載されている。また、前立腺癌の治療または腫瘍新生血管の発達の阻害における記載された複合体の使用、およびそれを必要とする対象に治療有効量の記載された複合体を投与することを含む、対応する前立腺癌の治療方法または腫瘍新生血管の阻害方法である。
【００１１】
上記および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面を参照して進められる以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】ＧＦＰ−ＳＣＰは、ＰＳＭＡ過剰発現細胞に結合し、選択的に内在化している。図１Ａ：ＧＦＰ−ＳＣＰを示す略図である。
【図１Ｂ】図１Ｂ：ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、およびＭＣＦ７細胞を２５ｎＭ  ＧＦＰ−ＳＣＰと５時間インキュベートした。細胞を固定し、抗ＧＦＰ抗体（Ｃｙ３）および４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールで染色し、レーザー走査共焦点顕微鏡によって観察した。
【図１Ｃ】図１Ｃ：ＬＮＣａＰ細胞およびＭＣＦ７細胞をＧＦＰ−ＳＣＰとインキュベートした後、フローサイトメトリー分析に供した。
【図１Ｄ】図１Ｄ：上のパネル：ＬＮＣａＰ細胞は、２００ｎＭのＧＦＰ−ＳＣＰを添加して０〜７２分後にレーザー共焦点イメージングによって監視した。細胞の外側に印を付けるために、ＧＦＰ−ＳＣＰを添加する直前に、スルホローダミンＢを培地に添加した。下のパネルは、ＩｍａｇｅＪを用いて測定した、細胞内のＧＦＰ蛍光を示す。
【図２Ａ】ｄｓＲＢ−ＳＣＰの設計、発現および精製。図２Ａ：ｄｓＲＢ−ＳＣＰを示す略図である。
【図２Ｂ】図２Ｂ：ｄｓＲＢ−ＳＣＰの発現および精製：Ｌ：清澄化ライセート、Ｍ：分子量マーカー、Ｅ１：ＩＭＡＣ後溶出液（ニッケルセファロースカラム）、Ｅ２：ＩＥＸから溶出した精製ｄｓＲＢ−ＳＣＰ（イオン交換カラム）。破線は、ゲルの写真がどこでカットされ、再編成されたかを示すものである。
【図２Ｃ】図２Ｃ：ｄｓＲＮＡへのｄｓＲＢ−ＳＣＰの結合：ｄｓＲＢ−ＳＣＰ（０．５〜３μｇ）を５００ｂｐ長のｄｓＲＮＡとプレインキュベートし、２％アガロースゲル上で電気泳動させた。Ｍ：１００ｂｐのＤＮＡ分子量マーカー。
【図３Ａ】ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣは、ＰＳＭＡ過剰発現細胞のアポトーシスを選択的に誘導する。図３Ａ：細胞を三連で播種し、一晩増殖させ、指示のとおり１００時間処理した。生存度は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて定量化した。
【図３Ｂ】図３Ｂ：生存細胞は、永久に停止させた状態のままとした。細胞を三連で播種し、一晩増殖させ、指示のとおり処理した。培地を交換し、生存度は、１００／１７２／３４４時間後に、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを用いて定量化した（対照細胞は、完全なコンフルエントに達したために、２．５倍加を超えて増殖できなかった）。
【図３Ｃ】図３Ｃ：ＬＮＣａＰ細胞をｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣまたはポリＩＣ単独で指示された時間処理し、溶解し、全長および切断されたカスパーゼ−３およびＰＡＲＰを検出するためにウエスタンブロット分析に供した。
【図４Ａ】ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣは、炎症誘発性サイトカインの分泌およびＰＢＭＣの動員をもたらす。図４Ａおよび図４Ｂ：ＬＮＣａＰ細胞を４８時間指示どおりに処理し、その後培地を回収し、ＩＰ−１０およびＲＡＮＴＥＳサイトカインをＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。
【図４Ｂ】ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣは、炎症誘発性サイトカインの分泌およびＰＢＭＣの動員をもたらす。図４Ａおよび図４Ｂ：ＬＮＣａＰ細胞を４８時間指示どおりに処理し、その後培地を回収し、ＩＰ−１０およびＲＡＮＴＥＳサイトカインをＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。
【図４Ｃ】図４Ｃ：ＬＮＣａＰ細胞は、４時間、指示のとおり処理し、ＩＦＮ−β転写をｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。
【図４Ｄ】図４Ｄ：ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣは、ＰＢＭＣの走化性を誘導する。ＬＮＣａＰ細胞を増殖させ、指示どおりに処理した。処理の４８時間後、細胞培地をトランスウェル走化性プレートの下部チャンバに移した。ＰＢＭＣを上部チャンバに添加し、プレートを３．５時間インキュベートした。その後、培地を下部チャンバから回収し、下部チャンバに遊走したリンパ球をＦＡＣＳにより定量化した。
【図５Ａ】ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣは、直接的な、ＰＢＭＣを介したバイスタンダー効果を誘発する。図５Ａ：ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を指示どおりに処理した。２４時間後、ＰＢＭＣを試験ウェルに添加し（黒い棒線）、培地を対照ウェルに添加した（灰色の棒線）。ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の生存は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。
【図５Ｂ】図５Ｂ：ＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰ＋ＬＮＣａＰ：ＬＮＣａＰ細胞は、指示のとおりに処理した。２４時間後、ＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を培養液に添加した。６時間後、ＰＢＭＣ（黒い棒線）または培地（斜線の棒線）を培養液に加えた。ＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰ：ＬＮＣａＰ増殖培地は、指示のとおりに処理した。２４時間後、ＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を添加し、６時間後にＰＢＭＣ（黒い棒線）または培地（斜線の棒線）のいずれかを添加した。ＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の生存は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。Ｔ検定では、高い有意性を示している（＊＊＊Ｐ≦０．００１）。
【図６Ａ】ＰＢＭＣと一緒にｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ処理することで、ＬＮＣａＰスフェロイドの破壊をもたらす。図６Ａ：Ｒ＝３００〜４００μｍのスフェロイドを以下のように処理した：（ａ）未処理、（ｂ）４００ｎＭ  ｄｓＲＢ−ＳＣＰ、（ｃ）２．５μｇ／ｍｌポリＩＣ、（ｄ）４００ｎＭ  ｄｓＲＢ−ＳＣＰ＋２．５μｇ／ｍｌポリＩＣ。１、２、４、および５日目にスフェロイドを４回処理した後、さらに１０日間培養した。指示された時間にレーザー走査共焦点顕微鏡によりスフェロイド像を取得した。処理ごとに１つの代表的なスフェロイドを示している。処理したスフェロイドからの細胞の顕著な脱落に留意のこと（赤い矢印）。１５日目に、スフェロイドをカルセインＡＭ（生細胞；緑色）およびヨウ化プロピジウム（死細胞；赤色）で標識した。ＩｍａｇｅＪを用いて測定されたスフェロイドの最大面積をグラフに示す（平均および標準偏差）。
【図６Ｂ】図６Ｂ：上のパネル：指示どおりに処理されたＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰスフェロイド。２４時間後、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ  ＢＭＱＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識した８ｘ１０４個のＰＢＭＣをスフェロイドに加えた。下のパネル：細胞を含まないＰＢＭＣ培地をスフェロイドに添加した。両方のパネルにおいて、スフェロイドを、処理開始から０時間、７２時間、９６時間、１６８時間後にレーザー走査共焦点顕微鏡により取得した。生細胞は、それらのＧＦＰ蛍光によって検出された。死細胞を強調するために、ＰＩを下のパネルのスフェロイドに加えた。死滅したＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞と死滅ＰＢＭＣを区別する方法がないので、上のパネルのＰＩ染色は示されていない。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書と共に提供される核酸および／またはアミノ酸配列は、米国特許法施行規則第１．８２２条に定義されているように、ヌクレオチド塩基については標準文字略号、およびアミノ酸については３文字コードを用いて示す。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は表示された鎖を参照することにより含まれると理解される。配列表は、参照により本明細書に組み入れられる、２０１６年１２月１２日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイル（ファイル名ＳｅｑＬｉｓｔ＿３１５２＿１＿２．ｔｘｔ、約２１ＫＢ）として提出する。配列表：
配列番号１は、ＧＦＰ−ＳＣＰタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ＧＦＰ−ＳＣＰタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号３は、ｄｓＲＢ−ＳＣＰタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４は、ｄｓＲＢ−ＳＣＰタンパク質をコードする核酸配列である。
配列番号５は、Ａｒｇ９リンカーペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号６および７は、ＩＦＮ−β定量化のためのフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号８および９は、ＧＡＰＤＨ定量化のためのフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーである。
配列番号１０は、ＳＣＰ−Ｎプライマーの核酸配列である。
配列番号１１は、ＳＣＰ−Ｃプライマーの核酸配列である。
配列番号１２は、ＧＦＰ−Ｎプライマーの核酸配列である。
配列番号１３は、ＧＦＰ−Ｃプライマーの核酸配列である。
配列番号１４は、ｄｓＲＢ−Ｎプライマーの核酸配列である。
配列番号１５は、ｄｓＲＢ−Ｃプライマーの核酸配列である。
配列番号１６は、９ＡＲＧ１プライマーの核酸配列である。
配列番号１７は、９ＡＲＧ２プライマーの核酸配列である。
配列番号１８は、ＰＫＲ  ｄｓＲＮＡのアミノ酸配列である。
配列番号１９は、ＰＫＲ  ｄｓＲＮＡの核酸配列である。
配列番号２０は、ＳｃＦｖＪ５９１のアミノ酸配列である。
配列番号２１は、ＳｃＦｖＪ５９１の核酸配列である。
【００１４】
Ｉ．      用語
【００１５】
特に明記しない限り、本明細書で使用される技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないと示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、文脈が明らかにそうでないと示さない限り、単語「または」は、「および」を含むことを意図している。さらに、核酸またはポリペプチドについて与えられた全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）または分子量の値（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ｖａｌｕｅｓ）は近似値であり、説明のために提供されていることを理解されたい。本明細書に記載のものと類似のまたは同等の方法および材料は、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。用語「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」を意味する。略語「ｅ．ｇ．（例えば）」はラテン語の例示に由来し、本明細書では非限定的な例を示すために使用される。したがって、略語「ｅ．ｇ．（例えば）」は、用語「ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ（例えば）」と同義語である。
【００１６】
矛盾がある場合には、用語の説明を含む本明細書が優先するものとする。さらに、全ての材料、方法、および実施例は例示的であり、限定的であることを意図するものではない。
【００１７】
投与：選択された経路による対象への組成物の導入。活性化合物または組成物の投与は、当業者に公知の任意の経路によるものであり得る。投与は、局所であるか、または全身あってもよい。局所投与の例としては、局所的投与、皮下投与、筋肉内投与、髄腔内投与が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、局所投与には、例えば、特定の臓器について、血管内投与を動脈供給に向けることによるなど、典型的には、全身投与に通常使用される投与経路を含む。したがって、特定の実施形態では、このような投与が特定の臓器に供給する血管系を標的とする場合、局所投与は動脈内投与および静脈内投与を含む。局所投与はまた、持続可能な治療効果のために長期間にわたって活性剤および化合物を放出する血管ステントまたは他のリザーバーなどの移植可能なデバイスまたは構築物へ活性化合物および剤を組み込むことを含む。
【００１８】
全身投与には、循環系を介して全身にわたって活性化合物または組成物を広く分布するように設計された任意の投与経路を含む。したがって、全身投与としては、動脈内投与および静脈内投与が挙げられるが、これらに限定されない。全身投与としては、このような投与が循環系による全身への吸収および分布を目的とする場合、これらに限定されないが、局所的投与、皮下投与、筋肉内投与、または吸入による投与が挙げられる。
【００１９】
抗体：ＰＳＭＡなどの抗原のエピトープを特異的に認識して結合する、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンド。抗体は、重鎖および軽鎖から構成され、それらのそれぞれは、可変重（ＶＨ）鎖領域および可変軽（ＶＬ）鎖領域と呼ばれる可変領域を有する。同時に、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、抗体によって認識される抗原に結合することを担っている。本明細書中で使用されるとき、「抗体」は、無処置の免疫グロブリン、ならびにそれらのバリアント、および当該分野で周知のそれらの部分、例えば、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）などが挙げられる。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）などの組換え形態も含む。
【００２０】
キメラ：２つ以上の供給源由来の核酸配列、アミノ酸配列、またはタンパク質（例えば、２つ以上の異なる種由来のアミノ酸配列）を含む核酸配列、アミノ酸配列、またはタンパク質。一般に、キメラ配列は、遺伝子工学の結果である。
【００２１】
発現制御配列：機能的に連結されている異種核酸配列の発現、例えば本明細書に記載のキメラ組換えタンパク質をコードする核酸の発現を調節する核酸配列。発現制御配列が、核酸配列の転写、および、必要に応じて翻訳を制御および調節する場合、発現制御配列は核酸配列に機能的に連結されている。したがって、発現制御配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子の前の開始コドン（ＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするためのその遺伝子の正確なリーディングフレームの維持、および終止コドンを含んでもよい。
【００２２】
ポリペプチドの機能的断片およびバリアント：親ポリペプチドの１つ以上の機能を維持する断片およびバリアントを含む。ポリペプチドをコードする遺伝子またはｃＤＮＡは、野生型または親ポリペプチドに対して６０％〜９９％の配列同一性のバリアントなど、１つ以上のポリペプチドの機能を実質的に変えることなく、かなり変異させ得ることを認識されたい。第一に、遺伝コードは縮重していることが公知であり、したがって異なるコドンが同じアミノ酸をコードする。第二に、たとえアミノ酸置換基が導入されても、突然変異は保存的であり得、かつタンパク質の本質的な機能に重大な影響を及ぼすことがないことがある。第三に、ポリペプチド鎖の一部は、その機能の全てを損なうことなく、または機能を消失させることなく欠失させることができる。第四に、ポリペプチド鎖において、挿入または付加は、その機能を損なうことなくまたは機能が消失することなく、例えばエピトープタグを付加することにより、行うことができる。機能的断片およびバリアントは、様々な長さのものであってもよい。例えば、いくつかの断片は、少なくとも１０、２５、５０、７５、１００、または２００のアミノ酸残基を有する。機能的に類似しているアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換の一覧は、当業者に周知である。以下の６つのグループは、互いに対する保存的置換と見なされるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００２３】
リンカー：２つの核酸分子間または２つのペプチド間など、２つの分子間のスペーサーとして働く１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸。
【００２４】
模倣物：模倣物は、生物学的に活性な分子など、別の分子の活性を模倣する分子である。生物学的に活性な分子は、化合物の生物学的活性を模倣する化学構造を含んでもよい。
【００２５】
作動可能に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に置かれるとき、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は隣接しており、必要であれば、同じリーディングフレーム内で２つのタンパク質コード領域を接合している。
【００２６】
薬学的に許容される担体：本開示に有用な薬学的に許容される担体は、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，第１５版（１９７５年）には、本明細書に開示されている化合物の医薬的送達に適した組成物および製剤について記載している。
【００２７】
一般に、担体の性質は、採用されている特定の投与方式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容される流体をビヒクルとして含む注射用流体を含む。生物学的に中性である担体に加えて、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤およびｐＨ緩衝剤など少量の無毒性補助物質、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含んでもよい。
【００２８】
配列同一性：２つの核酸配列、または２つのアミノ酸配列間の類似性は、配列間の類似性によって表わされ、そうでなければ配列同一性と称される。配列同一性は、多くの場合、同一性パーセント（または類似性もしくは相同性）に関して測定される。パーセンテージが高いほど、２つの配列は類似性が高い。
【００２９】
対象：脊椎動物などの生きた多細胞生物、ヒトおよび非ヒトの哺乳動物の両方を含むカテゴリー。
【００３０】
治療有効量：治療される対象において、所望の効果を達成するのに十分な化合物の量。有効量の化合物は、治療過程の間に、単回投与で、または数回の投与で、例えば毎日投与してもよい。しかし、有効量は、適用される化合物、治療される対象、苦痛の重症度および種類、ならびに化合物の投与様式に依存するものである。
ＩＩ．      いくつかの実施形態の概要
【００３１】
本明細書に記載しているのは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合ドメイン、および前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合する標的結合部分を含むキメラ組換えタンパク質である。
【００３２】
特定の実施形態では、キメラ組換えタンパク質は、ｄｓＲＮＡ結合ドメインと標的結合部分との間にスペーサーペプチドをさらに含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、キメラ組換えタンパク質のｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ｄｓＲＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）、ＴＲＢＰ、ＰＡＣＴ、Ｓｔａｕｆｅｎ、ＮＦＡＲ１、ＮＦＡＲ２、ＳＰＮＲ、ＲＨＡ、またはＮＲＥＢＰのｄｓＲＢＭなどの少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡ結合モチーフ（ｄｓＲＢＭ）を含む。一例では、少なくとも１つのｄｓＲＢＭは、配列番号１８として記載されているヒトＰＫＲのアミノ酸１〜１９７と少なくとも７０％同一であるポリペプチド配列を含む。
【００３４】
キメラ組換えタンパク質の特定の実施形態では、標的結合部分は、ポリペプチド、抗体、抗体断片、または抗体模倣物である。
【００３５】
キメラ組換えタンパク質の他の特定の実施形態では、スペーサーペプチドは、プロテアーゼ認識配列を含むオリゴペプチド、正に荷電したアミノ酸のホモオリゴペプチド、およびこれらの組み合わせから選択される。一例では、スペーサーペプチドは、アルギニンのホモオリゴペプチドである。
【００３６】
記載したキメラ組換えタンパク質の特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合ドメインは、配列番号１８に記載のヒトＰＫＲの少なくとも１つのｄｓＲＮＡ結合ドメイン、またはその機能的バリアントであり、スペーサーペプチドは、配列番号５に記載のＡＲＧ９、またはその機能的バリアントであり、また標的結合部分は、配列番号２０に記載の単鎖抗ＰＳＭＡ抗体、またはその機能的バリアントである。
【００３７】
別の特定の実施形態では、キメラ組換えタンパク質は、配列番号３と記載された配列と少なくとも７０％同一であるポリペプチドを含む。
【００３８】
ポリイノシン酸鎖およびポリシチジル酸鎖を含むｄｓＤＮＡ（ポリＩＣ）などの、記載されたキメラ組換えタンパク質およびｄｓＲＮＡを含む複合体も本明細書に記載される。
【００３９】
特定の実施形態では、記載された複合体は、それを必要とする対象に治療有効量の記載された複合体を投与し、それによって癌を治療するかまたは腫瘍新生血管系の成長を阻害することを含む、前立腺癌のための治療方法または腫瘍血管新生の阻害方法など、前立腺癌の治療または腫瘍新生血管の発達の阻害に使用される。
【００４０】
記載された方法のいくつかの実施形態では、複合体は全身投与または局所投与される。他の実施形態では、方法は、治療有効量の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を対象に投与することをさらに含む。
【００４１】
本明細書にさらに記載されるのは、記載されたキメラ組換えタンパク質のいずれかをコードする核酸である。
【００４２】
特定の実施形態では、記載された核酸配列は、細菌または植物宿主細胞における発現のために最適化されている。
ＩＩＩ．ＰＳＭＡ発現細胞に対してｄｓＲＮＡを標的化するためのキメラポリペプチド
【００４３】
本明細書に記載されるのは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）を発現する細胞に対してｄｓＲＮＡを標的化するために使用され得るキメラ組換えポリペプチドである。記載されたキメラ組換えポリペプチドは、少なくともｄｓＲＮＡ結合ドメインおよびＰＳＭＡを特異的に標的とするドメイン（本明細書では部分とも呼ばれる）を含む。特定の実施形態では、記載されたポリペプチドはまた、ｄｓＲＮＡ結合ドメインと標的結合ドメインとの間にリンカーを含む。キメラ組換えポリペプチドの機能的バリアントもまた記載されている。
【００４４】
ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、当業者が利用可能な方法を用いて、ペプチド配列中で容易に同定され得る。記載された組換えタンパク質のうちの任意の１つのｄｓＲＮＡ結合ドメインは、アルファ−ベータ−ベータ−ベータ−アルファ−フォールドなどの１つ以上の二本鎖ＲＮＡ結合モチーフ（ｄｓＲＢＭ）を含んでもよい。
【００４５】
特定の実施形態では、１つ以上のｄｓＲＢＭは、ｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、ＴＲＢＰ、ＰＡＣＴ、Ｓｔａｕｆｅｎ、ＮＦＡＲ１、ＮＦＡＲ２、ＳＰＮＲ、ＲＨＡ、またはＮＲＥＢＰのｄｓＲＢＭから選択される。特に、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、任意により柔軟なリンカーによって接続された、ＰＫＲの２つのｄｓＲＢＭを含んでもよい。
【００４６】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、本明細書中に配列番号１８として記載されているアミノ酸配列と約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の配列同一性を共有するポリペプチドなど、ヒトｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）のｄｓＲＮＡ結合ドメイン、またはその機能的バリアントである。
【００４７】
特定の実施形態では、本明細書に記載の組換えタンパク質のうちのいずれか１つの標的結合部分は、（ｉ）細胞表面受容体に対するリガンド、（ｉｉ）ヒト化抗体などの抗体、ヒト抗体、抗体の機能的断片、ナノボディなどの単一ドメイン抗体、組換え抗体、および一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、または（ｉｉｉ）アフィボディ分子などの抗体模倣物、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、クニッツドメインペプチド、およびモノ抗体が挙げられる。
【００４８】
特定の実施形態では、標的結合部分は、ＤＵＰＡまたはその類似体などの前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）リガンド、抗ＰＳＭＡ  ｓｃＦｖ、またはヒト化もしくはヒト抗ＰＳＭＡ抗体などの抗ＰＳＭＡ抗体（例えば全長抗体Ｊ５９１）、または抗ＰＳＭＡアフィボディである。
【００４９】
特定の実施形態では、ＰＳＭＡ標的化部分は、配列番号１９として本明細書に記載のアミノ酸配列と約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の配列同一性を共有するポリペプチドなど、ＰＳＭＡに対する一本鎖抗体、ＳｃＦｖＪ５９１、またはその機能的バリアントである。
【００５０】
記載されたスペーサーペプチドは、ポリペプチドキメラの２つの機能ドメインを接続するための当技術分野において公知の任意のオリゴペプチドであってもよい。特定の実施形態では、スペーサーペプチド（リンカー）は、プロテアーゼ認識配列を含むオリゴペプチド、またはアルギニンなどの（生理的ｐＨで）正に荷電したアミノ酸のホモオリゴペプチドを含む。
【００５１】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインと標的結合部分との間のリンカー（スペーサーペプチド）は、配列番号５として本明細書に記載のアミノ酸配列と約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の配列同一性を共有するポリペプチドなど、ＡＲＧ９ペプチド、またはその機能的バリアントである。
【００５２】
特定の実施形態では、キメラ組換えポリペプチドは、配列番号３として本明細書に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または配列番号４と約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の配列同一性を共有するペプチドなど、その機能的バリアントである。
【００５３】
他の実施形態では、記載された配列からの変異は、当業者がポリペプチドの形状または電荷を大きく変えないと考える保存的置換であってもよい。記載されたポリペプチドはまた、示されたものと１００％の配列同一性を共有するが、天然のまたは天然に産生された配列とは翻訳後修飾が異なるポリペプチドを含む。
【００５４】
特定の実施形態では、記載された組換えポリペプチドは、個別の生体分子として提供される。他の実施形態では、記載されたポリペプチドは、独立して折り畳まれた構造ドメイン、または環境にアクセス可能な機能ドメインなどの、より大きなポリペプチドのドメインである。
【００５５】
本明細書にさらに記載されるのは、記載された組換えタンパク質およびｄｓＲＮＡのうちのいずれか１つを含む複合体である。特定の実施形態では、複合体のｄｓＲＮＡはＰＫＲ活性化ｄｓＲＮＡ、例えばポリイノシン酸鎖およびポリシチジル酸鎖（ポリＩＣ）を含むｄｓＲＮＡである。特定の実施形態では、ポリＩＣは各鎖に少なくとも２２個のリボヌクレオチド、例えば各鎖に８５〜３００個のリボヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、複合体のｄｓＲＮＡは、これに限定するものではないが、Ｂｃｌ−ｘ１、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｓｔａｔ３、Ｐｋｂ／Ａｋｔなどの発癌性タンパク質に対して向けられた少なくとも１つのｓｉＲＮＡ配列を含む。
【００５６】
特定の実施形態では、記載された複合体は、上記のような薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の成分である。
【００５７】
記載されたキメラ組換えポリペプチドをコードする核酸、例えば配列番号４として本明細書に記載の核酸などもまた本明細書に提供される。
【００５８】
記載された核酸の配列は、遺伝暗号の縮重のために、コードされたポリペプチドにはいかなる変化もないが、本明細書に配列番号４として記載の配列とは著しく異なる可能性があることが理解されよう。記載されたポリペプチドにおける他のおよび／または追加の突然変異、例えば保存的アミノ酸突然変異もまた、明らかな差異なく含まれ得る。したがって、いくつかの実施形態では、記載された核酸は、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％の配列同一性など、配列番号４と６０％〜１００％の配列同一性を共有する。特定の例では、核酸配列は、細菌細胞または植物細胞などの特定の生物における天然のコドンの偏りをもたらすために調整される。このような調整は、当技術分野において公知であり、見出すことができる（１２）。
【００５９】
特定の実施形態において、記載された核酸配列は、当該分野において標準的であるように、ＤＮＡクローニングおよび／または発現プラスミド内に含まれる。記載されたキメラポリペプチドをコードする核酸のうちの１つ以上を発現させるために任意の標準的な発現プラスミドを使用することができることが理解されよう。このようなプラスミドには、複製の起点、選択配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子などであるがこれに限定されない）、および記載された核酸に作動可能に連結された発現制御配列を最小限含む。特定の実施形態では、発現プラスミドは、記載された核酸とインフレームでコードされている翻訳後配列（例えば、ポリペプチドプロセシングおよびエクスポートを指示するためのシグナル配列）を含む。特定の実施形態では、発現制御配列は、細菌または植物宿主において最適化された発現制御に関して、当技術分野において公知のものである。
【００６０】
細菌発現プラスミドの特定の非限定的な例としては、ＩＰＴＧ誘導性プラスミド、アラビノース誘導性プラスミドなどが挙げられる。発現誘導の他の非限定的な例としては、光誘導、温度誘導、栄養素誘導、および自己誘導、植物および哺乳動物特異的ＤＮＡ発現プラスミドが挙げられる。特注の発現プラスミドは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）およびＤＮＡ  ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）などの供給業者から市販されている。
【００６１】
特定の実施形態では、記載されたポリペプチドは、即時放出用に配合することができ、それにより周囲の環境に直ちに接近可能であり、それにより対象への投与時に、かつ投与量が対象によって代謝されるまで有効量の活性剤（複数可）を提供する。
【００６２】
さらに別の実施形態では、記載されたポリペプチドは、徐放製剤またはシステムに配合することができる。このような製剤において、治療剤は、１〜７２時間、２４〜４８時間、１６〜３６時間、１２〜２４時間、およびその間の任意の時間長など、１、２、３、４またはそれ以上の日数など、長期間にわたって提供される。特定の実施形態では、徐放製剤は投与時すぐに利用可能になり、有効量の治療用組成物を提供し、長期間にわたって有効量で利用可能なままである。他の実施形態では、徐放製剤は対象内で直ちに利用できるものではなく、利用可能になるのみであり、活性化合物（複数可）が周囲環境に放出されるように製剤が代謝または分解された後に治療有効量の活性化合物（複数可）を提供する。
【００６３】
一実施形態では、ポンプを使用してもよい。別の実施形態では、徐放製剤は、インプラント、ゲル、カプセルなど当該分野で一般的に使用されるポリマー材料を含む。
【００６４】
治療用調製物は、患者に適切な投与をもたらすように、好適な量の担体と共に、治療有効量の、好ましくは精製された形態の少なくとも１つの活性成分を含む。製剤は、投与様式に適合するものとする。
ＩＶ．ＰＳＭＡ関連疾患の治療方法
【００６５】
ＰＳＭＡの発現は、癌性細胞、特に前立腺癌および腫瘍関連血管新生に関連している（１３）。さらなる態様では、本開示は、ＰＳＭＡの発現によって特徴付けられる癌の治療ための方法であって、それを必要とする対象に本明細書に記載の複合体または医薬組成物のうちのいずれか１つを投与することによる方法を提供する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、記載された複合体は、治療中の癌の治療のために他の医薬剤と組み合わせて対象に投与される。例えば、癌治療の特定の例において、記載されたものの投与は、外科手術、細胞療法、化学療法および／または放射線療法と組み合わせることができる。記載されたポリペプチドと組み合わせた１つ以上の療法は、記載されたポリペプチドと順番に（前もしくは後に）、または同時に対象に投与することができる。適用可能であれば、特定の実施形態において、活性成分の組み合わせが、単一または複数の製剤で、また単一または複数の投与経路によって対象に投与され得る。特定の実施形態では、治療方法は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の逐次投与または同時投与を含む。
【００６７】
記載された方法において使用するための、有効とされる各治療剤の量は、治療される癌の性質、ならびにその障害または状態の段階に依存することとなる。治療有効量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。製剤中に使用される正確な用量も投与経路に依存するものとし、医療関係者の判断および各患者の状況に従って決定されるものとする。任意の特定の対象については、具体的な用量レベルおよび投与頻度は変動してもよく、具体的な化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与様式および投与時間、排泄速度、薬剤の組み合わせ、および治療を受けている宿主の状態の重症度など、様々な要因に依存する。
【００６８】
本開示の治療用化合物および組成物は、治療期間全体を通して、漸増用量レジメンまたは負荷用量レジメン（例えば、負荷用量は、維持用量の約２〜５倍である）において、ほぼ同じ用量で投与することができる。いくつかの実施形態では、用量は、治療されている対象の状態、疾患または状態の重症度、治療に対する明らかな反応、および／または当業者によって判断される他の要因に基づいて、治療の過程において変動する。いくつかの実施形態では、薬物による長期治療が企図される。
【００６９】
以下の実施例は、ある特定の特徴および／または実施形態を例解するために提供されている。これらの実施例は、本開示を記載された特定の特徴または実施形態に限定するものと解釈されるべきではない。
実施例
実施例１：方法
ＧＦＰ−ＳＣＰおよびｄｓＲＢ−ＳＣＰのクローニング
【００７０】
プラスミドｐＧＦＰ−ＳＣＰ（Ａｒｇ９を介してＰＳＭＡに対する一本鎖抗体ＳｃＦｖＪ５９１に連結したＧＦＰ（５６ｋＤａ）をコードする）およびｐｓＲＢ−ＳＣＰ（Ａｒｇ９を介してＳｃＦｖＪ５９１に連結したヒトＰＫＲのｄｓＲＢ（４８ｋＤａ）をコードする）（図１Ａ）は、以下のとおり構築した。
【００７１】
ＳＣＰ（ＰＳＭＡに対する一本鎖抗体、ＳｃＦｖＪ５９１）を、プライマーＳＣＰ−ＮおよびＳＣＰ−Ｃを使用して、プラスミドＳＦＧ−Ｐｚ１（１４）からＰＣＲによって増幅した。ＧＦＰは、プライマーＧＦＰ−ＮおよびＧＦＰ−Ｃを用いて、プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲによって増幅した。ｄｓＲＢは、プライマーｄｓＲＢ−ＮおよびｄｓＲＢ−Ｃを用いてプラスミドＤＲＢＭ−ＤＴ−ＥＧＦ（１５）からＰＣＲによって増幅した。Ａｒｇ９リンカー（ＧＳＲＲＲＲＲＲＲＲＧＲＫＡ；配列番号５）を調製するために、オリゴヌクレオチド９ＡＲＧ１をその相補的オリゴヌクレオチド９ＡＲＧ２にアニールした。使用したオリゴヌクレオチドを表１に列挙する。ＧＦＰ−ＳＣＰは、細菌発現ベクターｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中で段階的に構築された：ＧＦＰは、プラスミドｐＥＴ２８ａのＨｉｓ６タグの後、ＮｄｅＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位との間にクローニングし、ＳＣＰは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｈｏＩ部位との間にクローニングし、Ａｒｇ９リンカーは、融合体Ｈｉｓ６−ＧＦＰ−Ａｒｇ９−ＳＣＰを得るために、ＢａｍＨ１部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入した（図１Ａ）。ｄｓＲＢ−ＳＣＰの構築のために、制限部位ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いてＧＦＰ断片をｄｓＲＢ配列と置換して、融合体Ｈｉｓ６−ｄｓＲＢ−Ａｒｇ９−ＳＣＰを得た（図２Ａ）。予想される配列は、Ｔｈｅ  Ｈｅｂｒｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＪｅｒｕｓａｌｅｍのＴｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにて確認した（補足）。
2019534037.tif 000003
ＧＦＰ−ＳＣＰおよびｄｓＲＢ−ＳＣＰの発現
【００７２】
キメラタンパク質を、レアコドン用のｔＲＮＡをコードするプラスミドｐＲＡＲＥで形質転換した大腸菌ＢＬ２１ｔｒｘＢ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）中で発現させた。細菌は、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、３０μｇ／ｍｌカナマイシン、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１％グルコースおよび５％ＮＰＳ緩衝液（１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４、１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４）を補充した２ＸＹＴ培地中、３７℃で増殖させた。培養液のＯＤ６００が約０．３に達したとき、０．１％グリセロールおよび０．１ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸を加え、培養液を４２℃に移して大腸菌シャペロンの発現を誘導し、タンパク質の溶解度を高めた。ＯＤ６００が約０．９に達したとき、培養液を氷上で冷却し、１４℃に移した。１０分の調整期間の後、０．５ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧを添加し、続いて２４時間インキュベートした。細菌を採取し、ペレットを精製するまで−８０℃で保存した。
ＧＦＰ−ＳＣＰおよびｄｓＲＢ−ＳＣＰの精製
【００７３】
ＧＦＰ−ＳＣＰ：１．２Ｌの大腸菌ＢＬ２１ｔｒｘＢ（ＤＥ３、ｐＲＡＲＥ、ｐＧＦＰ−ＳＣＰ）から得られたペレットを、プロテアーゼ阻害剤カクテル、３ｍｇ／ｍｌリゾチームおよびＤＮａｓｅを補充した６０ｍｌの結合緩衝液（緩衝液Ａ、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭ  イミダゾール）中、氷上で解凍し、ＬＶ１マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して溶解した。抽出物を３０分間の遠心分離（１５，０００ｘｇ、４℃）により清澄化し、８ｍｌのニッケルセファロースＦＦ  ＩＭＡＣカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に添加し、１０カラム容量（ＣＶ）の結合緩衝液、続いて６ＣＶの５％緩衝液Ｂ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１Ｍイミダゾール）、６ＣＶの１０％緩衝液Ｂおよび１ＣＶの１５％緩衝液Ｂで洗浄した。タンパク質を６０％緩衝液Ｂで溶出した。キメラを含む分画（合計８ｍｌ）を、ＧＦ緩衝液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール）で予め平衡化した５００ｍｌセファクリルＳ−２００ゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に添加した。０．５ＣＶ後に溶出した画分をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ−２０（ＭＷＣＯ：３００００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して濃縮し、３５０ｍｌ  スーパーデックス−７５に添加した。０．５ＣＶ後に溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色した。高度に精製されたキメラを含む分画をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ−２０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて濃縮し、アリコートに分けて−８０℃で保存した。
【００７４】
ｄｓＲＢ−ＳＣＰ：６Ｌの大腸菌ＢＬ２１ｔｒｘＢ（ＤＥ３、ｐＲＡＲＥ、ｐｄｓＲＢ−ＳＣＰ）から得られたペレットを、プロテアーゼ阻害剤、リゾチームおよびＤＮａｓｅを補充した３００ｍｌの結合緩衝液Ａ中で解凍し、上記のように溶解および清澄化した。結合した宿主核酸を放出させるために、清澄化溶解物を８Ｍ尿素と１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）で混合した。混合物を４℃で１．５時間インキュベートし、次いで緩衝液Ｃ（０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および４Ｍ尿素を補充した緩衝液Ａ）で予め平衡化した６０ｍｌのニッケルセファロースＦＦカラムに添加し、１２．４ＣＶの緩衝液Ｃで洗浄した。タンパク質を再度折り畳むために、緩衝液Ｃから緩衝液Ｄ（０．５％Ｔｗｅｅｎ８０を補充した緩衝液Ａ）への、１０ＣＶ、０．８ｍｌ／分のゆっくりした直線勾配を適用した。カラムを３ＣＶの１０％緩衝液Ｅおよび３ＣＶの２５％緩衝液Ｅ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５００ｍＭイミダゾール、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０）で洗浄し、タンパク質を１００％緩衝液Ｅで溶出した。キメラを含む分画をプールして、希釈緩衝液（３０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ、１０％グリセロール、０．５％Ｔｗｅｅｎ）で１：１に希釈した。希釈したタンパク質を３０分間の遠心分離（１５，０００ｘｇ、４℃）によって清澄化し、６６ｍｌのＦｒａｃｔｏ−ｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３  ＩＥＸカラム（Ｍｅｒｃｋ）に添加した。緩衝液Ｆ（３０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．００１％Ｔｗｅｅｎ）および２５％、２７％、３０％、３７％および３８％緩衝液Ｇ（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．３、２Ｍ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、０．００１％Ｔｗｅｅｎ  ８０）の手動段階勾配（７ＣＶ）を適用した。溶出画分のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色した。精製キメラを含む画分をプールし、濃縮し、上記のように−８０℃で貯蔵した。
細胞株
【００７５】
ＬＮＣａＰ細胞を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。ＶＣａＰ細胞は、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で培養した。ＰＣ３およびＤＵ１４５細胞を、１％非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４および１％ＭＥＭビタミン混合物を補充したＭＥＭ（最小必須培地）中で培養した。ＭＣＦ７細胞は、ＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。全ての組織培養培地に、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｌ）、および１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を補充した。全ての細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入し、試験を行い、マイコプラズマ非含有であることが示された。
【００７６】
ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰおよびＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰは、以前に記載されたように（１６）、融合遺伝子ルシフェラーゼ−ＧＦＰ（Ｌｕｃ／ＧＦＰ）をコードするレンチウイルスベクターを使用して生成された。ＰＢＭＣを、標準的なフィコール密度勾配遠心分離によって新鮮なヒト末梢血から単離した（１７）。全ての細胞を、加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２で３７℃でインキュベートした。細胞培養試薬は全て、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｂｅｔ  Ｈａ’ｅｍｅｋ、およびＩｓｒａｅｌから購入した。
フローサイトメトリー
【００７７】
細胞を１ウェルあたり１ｘ１０５細胞の密度で１２ウェルプレートに播種し、４０時間増殖させ、ＧＦＰ−ＳＣＰと共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、１ｍｌの冷ＰＢＳに再懸濁し、４８８ｎｍレーザーを備えたＢＤ  ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）を使用してフローサイトメトリー分析に供した。各処理につき１０，０００個の細胞を取得した。細胞を生細胞のみを含むようにゲーティングを行い、ＧＦＰレベルについて亜集団を分析した。全てのデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
免疫細胞化学
【００７８】
ＬＮＣａＰ、ＰＣ３およびＭＣＦ７細胞を４８時間増殖させ、２５ｎＭ  ＧＦＰ−ＳＣＰと共に３７℃で５時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、透過処理し、ヤギ抗ＧＦＰ抗体（１：１０００、Ａｂｃａｍ  ａｂ５４５０）で染色し、その後ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８コンジュゲート結合抗ヤギ二次抗体（１：３００，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートした。４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いてＤＮＡを染色した。染色したサンプルを共焦点顕微鏡（ＦＬＵＯＶＩＥＷ  ＦＶ−１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）により観察した。
生細胞の画像化
【００７９】
ＧＦＰ−ＳＣＰの局在化は、タイムラプス共焦点顕微鏡（ＦＬＵＯＶＩＥＷ  ＦＶ−１０００，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）を使用して、生きているＬＮＣａＰ細胞において観察された。ＬＮＣａＰ細胞を、８ウェルμスライド（Ｉｂｉｄｉ、カタログ番号８０８２６）中で４８時間増殖させた。培地交換後、２００ｎＭ  ＧＦＰ−ＳＣＰをチャンバに直接添加し、細胞を直ちに観察し、その後の画像を７２分間６分ごとに撮影した。画像は、ＦＬＵＯＶＩＥＷ  Ｖｉｅｗｅｒソフトウェア（Ｖｅｒ．４．２）を用いて解析した。
ｄｓＲＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
【００８０】
ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＮＡｉ  Ｋｉｔ（ＡＭ１６２６）のコントロールテンプレートから転写された５００ｂｐ長のｄｓＲＮＡをＬａｂｅｌ  ＩＴ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ）を用いて標識した。１μｇの標識ｄｓＲＮＡを漸増量の精製ｄｓＲＢ−ＳＣＰ（０．５〜３μｇ）と共に３０分間インキュベートし、その混合物を２％アガロースゲル上で電気泳動させた。ゲルは、臭化エチジウムで染色することによって可視化した。
ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ複合体の調製
【００８１】
全ての実験に使用したポリＩＣは、低分子量（ＬＭＷ）ポリＩＣ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）であった。全ての実験について、ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ、ポリＩＣ単独、またはｄｓＲＢ−ＳＣＰ単独を、本文中に示されている濃度で結合緩衝液（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール）中で調製し、細胞に添加する前に、室温で４５分間プレインキュベートした。
生存アッセイ
【００８２】
ＬＮＣａＰ、ＶＣａＰ、ＰＣ３、およびＭＣＦ７細胞を９６ウェルプレートに三連（５０００細胞／ウェル）で播種し、一晩増殖させた。ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ、ポリＩＣ単独またはｄｓＲＢ−ＳＣＰを細胞に加え、次いでさらに１００時間インキュベートした。生存は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。
【００８３】
レスキュー実験のために、ＬＮＣａＰ細胞を、ポリ−リジンで予めコーティングした３枚の９６ウェルプレートに播種した（５０００細胞／ウェル）。各プレートについて、処理を三連のウェルで繰り返し、細胞を一晩増殖させた。次いで細胞をｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ、ポリＩＣ単独またはｄｓＲＢ−ＳＣＰ単独で処理した。最初のプレートは、１００時間後の生存についてアッセイした。２番目のプレートの培地は、１００時間後に交換し、生存を１７２時間後にアッセイした。３番目のプレートの培地は、１００時間後に交換し、１７２時間後に再び交換し、生存を３４４時間後にアッセイした。
免疫ブロット
【００８４】
ＬＮＣａＰ細胞を６ウェルプレートに播種し（１ｘ１０６細胞／ウェル）、一晩増殖させ、示された濃度において、ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣまたはポリＩＣ単独で処理した。７時間、１６時間または２４時間後、細胞を沸騰しているＬａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液（１０％グリセロール、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、３％ＳＤＳ、および５％２−メルカプトエタノール）で溶解し、次いで溶解物をウエスタンブロット分析に供した（１８）。ＰＡＲＰおよびカスパーゼ３の切断は、抗ＰＡＲＰ（カタログ番号９５４２５）、抗カスパーゼ３（カタログ番号９６６２５）および抗切断カスパーゼ３（カタログ番号９６６１５）（全てＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製）を用いて監視した。各レーンに適用されたタンパク質の量を標準化するための内部標準として、ブロットを抗−ＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ｓｃ−２５７７８）と共にインキュベートした。
ＥＬＩＳＡによる分泌ケモカイン（ＩＰ−１０およびＲＡＮＴＥＳ）の検出
【００８５】
ＬＮＣａＰ細胞を９６ウェルプレートに三連で播種し、一晩増殖させた（１０，０００細胞／ウェル）。次いで細胞を示された濃度でｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣまたはポリＩＣ単独で処理した。４８時間後、培地を回収し、ＩＰ−１０およびＲＡＮＴＥＳの濃度を市販のＥＬＩＳＡキット（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を用いて測定した。
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成および定量的リアルタイムＰＣＲ
【００８６】
ＬＮＣａＰ細胞を２４ウェルプレートに播種し（５００，０００細胞／ウェル）、一晩増殖させた。次いで、細胞を示された濃度で、ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ、ポリＩＣ単独またはｄｓＲＢ−ＳＣＰ単独で４時間処理した。細胞を溶解し、ＥＺ−１０  ＤＮＡ  Ａｗａｙ  ＲＮＡ−Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ  Ｂａｓｉｃ）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成した。定量的リアルタイムＰＣＲを用いてＩＦＮ−β遺伝子発現レベルを比較し、ΔΔＣＴ法を用いてＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。ＩＦＮ−βの定量化に使用したプライマーは、フォワード：５’ＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣ  ３‘（配列番号６）、およびリバース：５‘ＧＣＴＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡＧＣＴＧＴＡＧＴＧ３‘（配列番号７）であった。ＧＡＰＤＨ定量化のためのプライマーは、フォワード：５’ＧＡＧＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＣＡＧＡＣ３’（配列番号８）およびリバース：５’ＣＴＴＣＴＣＡＴＧＧＴＴＣＡＣＡＣＣＣ３’（配列番号９）であった。
ＰＢＭＣの走化性
【００８７】
ＬＮＣａＰ細胞を、ポリ−リジン（２５０，０００細胞／ウェル）でプレコートした２４ウェルプレートに播種し、一晩増殖させた。その後、培地を低血清培地（０．１５％ＦＢＳ）に交換し、細胞を示された濃度においてｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣで処理した。４８時間後、馴化培地を細胞から回収し、２４ウェルのＴｒａｎｓｗｅｌｌ  ｓｙｓｔｅｍ（微孔性ポリカーボネート膜（０．５μｍ）Ｃｏｒｎｉｎｇ；Ｃｏｓｔａｒ）の底のウェルに入れた。低血清培地（０．１５％ＦＢＳ）中の新たに単離されたＰＢＭＣ（１ｘ１０６）を上部チャンバに添加した。３．５時間後、下部チャンバからの培地を回収し、遊走細胞をリンパ球上の散乱ゲートによりＦＡＣＳ分析により定量した。
共培養システムにおけるバイスタンダー効果の分析
【００８８】
他の細胞と共培養した単一細胞株の生存度を測定するために、ルシフェラーゼを発現させた細胞（ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰまたはＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰのいずれか）を作製した。
【００８９】
ＰＢＭＣと共培養したＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を用いて免疫細胞を介したバイスタンダー効果を分析した：ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を、ポリ−リジンでプレコートした９６ウェルプレートに三連で播種し（１０，０００細胞／ウェル）、一晩増殖させた。次いで、細胞を示された濃度のｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ、ポリＩＣ単独またはｄｓＲＢ−ＳＣＰ単独で処理した。２４時間後、新たに単離されたＰＢＭＣを培養液に添加した（１ｘ１０５／ウェル）。４８時間後、ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の生存を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性に基づいて測定した。
【００９０】
直接的、かつ免疫細胞を介したバイスタンダー効果の組み合わせを、ＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰおよびＰＢＭＣと共培養したＬＮＣａＰ細胞を用いて分析した：ＬＮＣａＰ細胞を、ポリ−リジンでプレコーティングした９６ウェルプレートに三連で播種し（６，０００細胞／ウェル）、一晩増殖させ、ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ、ポリＩＣ単独、またはｄｓＲＢ−ＳＣＰ単独で処理した。１６時間後、ＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞（４，０００細胞／ウェル）を培養液に添加した。処理から２４時間後、新たに単離されたＰＢＭＣ（１ｘ１０５個／ウェル）を培養液に添加した。４８時間後、ＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の生存を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ルシフェラーゼ活性に基づいて測定した。
腫瘍スフェロイドモデル
【００９１】
寒天コーティングプレートを用いて腫瘍スフェロイドを作製した。９６ウェルプレートを、参考文献（１９）に従って、５０μｌ／ウェル寒天（ＲＰＭＩに溶解した１．５％（ｗｔ／ｖｏｌ））でコーティングした。ＬＮＣａＰまたはＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を播種し（２０００細胞／ウェル）、インキュベートした。９７時間後、Ｒ＝３００〜４００μｍの単一の球状スフェロイドが各ウェルに形成された。
【００９２】
ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣで処理した後のＬＮＣａＰスフェロイドを測定するために、非常に薄く均一なポリＨＥＭＡ（１２０ｍｇ／ｍｌを９５％エタノールに溶解）層でプレコートした９６ウェルプレート（１スフェロイド／ウェル）に個々にスフェロイドを移した。スフェロイドを移すために、最初に各スフェロイドをその２００μｌの培地と共に９６Ｕウェルプレート（Ｕ字型ウェルを有する）中に吊上げた。プレートを２２０ｇで１０分間遠心分離し、培地を８０μｌの新鮮な培地と交換した。次に、スフェロイドをその８０μｌの培地と共にポリＨＥＭＡコーティングプレートに移した。ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ、ポリＩＣ単独、またはｄｓＲＢ−ＳＣＰ単独を示された濃度で加えた。処理は、５日間続けた。１、２、４、および５日目に、各ウェルの培地の半分を除去し、適切な処理を含む新鮮な培地と交換した。１５日目に、スフェロイドをカルセインＡＭ（１：１０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｃ３０９９）および０．５μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムで染色した。共焦点顕微鏡を用いてスフェロイドを監視し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてサイズを測定した。
【００９３】
腫瘍スフェロイドに対する免疫細胞を介したバイスタンダー効果を分析するために、指示された濃度で、ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ、ポリＩＣ単独またはｄｓＲＢ−ＳＣＰ単独で、ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰスフェロイドを寒天プレート上で、直接１回処理した。２４時間後、１μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ  ＢＭＱＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造元のプロトコルに従って使用して、新鮮なＰＢＭＣの標識を行った。８ｘ１０４個のＰＢＭＣをスフェロイド培養液に添加した。共培養は、共焦点顕微鏡を用いて監視した。
実施例２：ＰＳＭＡを標的とするキメラタンパク質の構築およびアッセイ
ＳｃＦｖＪ５９１は、ＰＳＭＡ過剰発現前立腺癌細胞を選択的に標的とし、そのカーゴを細胞内に効率的に送達する。
【００９４】
最初に、一本鎖抗体ＳｃＦｖＪ５９１をキメラタンパク質の一部としてホーミングリガンドとして使用できるかどうかを試験した。エンドソームエスケープ配列を含むリンカーを介して、ＰＳＭＡに対する一本鎖抗体ＳｃＦｖＪ５９１に融合した追跡マーカーとしてＧＦＰをコードするｐＧＦＰ−Ａｒｇ９−ＳｃＦｖＪ５９１を生成した（図１Ａ）。５６ｋＤａ組換えタンパク質、ＧＦＰ−ＳＣＰ（ＧＦＰ−Ａｒｇ９−ＳｃＦｖＪ５９１）を大腸菌中で発現させ、アフィニティ精製、およびそれに続く２段階のゲル濾過を含む３段階精製プロセスで精製した（方法を参照されたい）。
【００９５】
共焦点顕微鏡を使用してＧＦＰ−ＳＣＰの選択性の試験を行った。ＰＳＭＡを過剰発現しているＬＮＣａＰ細胞と共にキメラタンパク質をインキュベートし、５時間後に結合を分析した。ＰＳＭＡを発現していないＰＣ３およびＭＣＦ７細胞は、陰性対照とした。共焦点画像では、ＧＦＰ−ＳＣＰがＬＮＣａＰ細胞に結合し、選択的に内在化することが実証されたが、ＰＣ３またはＭＣＦ７細胞では結合は見られなかった（図１Ｂ）。次に、フローサイトメトリーを使用して、ＧＦＰ−ＳＣＰの取り込みをＬＮＣａＰおよびＭＣＦ７細胞と比較した。２つの期間（３０分、６０分）にわたって、２つの用量のＧＦＰ−ＳＣＰ（２００ｎＭ、４００ｎＭ）を使用した。ＧＦＰ−ＳＣＰの蓄積は、得られた蛍光シフトによって測定した。予想通り、観察された蛍光レベルは、ＧＦＰ−ＳＣＰの濃度およびインキュベーション期間と相関していた（図１Ｃ）。これらの結果は、時間依存的および用量依存的なＧＦＰ−ＳＣＰの内在化を示唆している。対照的に、ＰＳＭＡを欠くＭＣＦ７細胞では、ＧＦＰ−ＳＣＰのいかなる蓄積も観察されなかった（図１Ｃ）。ＧＦＰ−ＳＣＰの局在を監視するために、ＬＮＣａＰ細胞をＧＦＰ−ＳＣＰとインキュベートし、それらを生細胞共焦点顕微鏡を用いて観察した。初期には、ＧＦＰ−ＳＣＰの蛍光は細胞表面に限定されており、自由拡散は観察されなかった（図１Ｄ）。数分後、小さな細胞内点状構造の出現によって示されるように、ＧＦＰ−ＳＣＰはエンドサイトーシスを介して細胞に侵入した（図１Ｄ）。時間の経過と共に、これらの構造の数は増加した。さらに、細胞内拡散粉末状蛍光の増加が観察され（図１Ｄ）、これは、ＧＦＰがエンドソームから脱出してサイトゾルに拡散したことを示している。細胞内部でのＧＦＰの蓄積は、結合後の最初の４０分で直線的に増加した（図１Ｄ）。
ＰＳＭＡ過剰発現前立腺癌細胞にポリＩＣを選択的に運搬して内在化することができるキメラタンパク質の設計、発現および精製
【００９６】
ＧＦＰ−ＳＣＰキメラの構造に基づいて、ポリＩＣをＰＳＭＡ過剰発現細胞に特異的に送達するキメラタンパク質を設計した。ＧＦＰ部分をＰＫＲのｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）で置換した（図２Ａ）。キメラ４８ｋＤａタンパク質、ｄｓＲＢ−ＳＣＰ（ｄｓＲＢ−９Ａｒｇ−ＳｃＦｖＪ５９１）を大腸菌中で発現させ、実施例１に記載されているように、アンフォールディングおよびリフォールディング工程（図２Ｂ）を用いて精製した。精製タンパク質のｄｓＲＮＡへの結合を評価した。ｄｓＲＢ−ＳＣＰを規定の長さ（５００ｂｐ）のｄｓＲＮＡとインキュベートし、混合物をアガロースゲルで電気泳動させた（図２Ｃ）。裸のｄｓＲＮＡ対照は、ゲル中の予想された位置で泳動させた（図２Ｃ）。ｄｓＲＢ−ＳＣＰとインキュベートしたｄｓＲＮＡの電気泳動は、用量依存的様式で遅れ（図２Ｃ）、キメラタンパク質がｄｓＲＮＡに結合したことが確認された。
ポリＩＣと複合体を形成したｄｓＲＢ−ＳＣＰは、アポトーシスを誘導することによってＰＳＭＡ過剰発現細胞を選択的に死滅させる。
【００９７】
本発明者らは、４つの細胞株（すなわちＰＳＭＡを過剰発現しているＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ、ならびにＰＳＭＡを発現していないＭＣＦ７およびＰＣ３）を用いて、ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ複合体の死滅効果を評価した。ｄｓＲＢ−ＳＣＰは、ポリＩＣをＰＳＭＡ過剰発現細胞（ＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ）に選択的に送達し、細胞を最大８０％まで死滅させた（図３Ａ）。ＰＳＭＡを発現していない細胞（ＭＣＦ７およびＰＣ３）は、処理によって死滅することはなかった（図３Ａ）。キメラを洗い流してから２５０時間後（処理後３５０時間）に再増殖は観察されなかったので、残りの２０％のＬＮＣａＰ細胞は永久的に停止したと見なした（図３Ｂ）。ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣは、カスパーゼ−３およびＰＡＲＰの切断によって示されるように、アポトーシス経路を活性化することによって細胞死を誘導した（図３Ｃ）。ポリＩＣのみで処理した細胞では、カスパーゼ−３またはＰＡＲＰの切断はいずれも検出されなかった（図３Ｃ）。
ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ処理が、サイトカインの分泌および免疫細胞の走化性を誘導する。
【００９８】
細胞内にｄｓＲＮＡが存在することで、抗増殖性およびプロアポトーシス性のサイトカインおよびケモカインの産生が活性化する（２０）。ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣが同様の効果を引き起こすことができるかを判断するために、細胞内の３つの主要サイトカインの産生を分析した：ＩＰ−１０およびＲＡＮＴＥＳは、双方とも免疫細胞およびＩＦＮ−βの化学誘引に関与しており、免疫細胞の分化において重要な役割を担う（２１）。ＥＬＩＳＡによって測定されるように、培地へのＩＰ−１０およびＲＡＮＴＥＳの分泌は、以前に報告されたとおり、ポリＩＣ単独によって部分的に誘導された（２２）。ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣにより処理することで、ＩＰ−１０およびＲＡＮＴＥＳの分泌をさらに２倍増加させた（図４Ａ〜Ｂ）。ＩＦＮ−βの発現は、ポリＩＣまたはｄｓＲＢ−ＳＣＰ単独による影響を受けなかったが、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されるように、ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣによる処理は、非常に強いＩＦＮ−β発現の誘導をもたらした（図４Ｃ）。
【００９９】
分泌されたサイトカインが免疫細胞を引き付けるかどうかを調べるために、ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ処理したＬＮＣａＰ細胞からの培地が、新たに単離されたＰＢＭＣの走化性を誘導するかどうかを調べた。図４Ｄは、未処理細胞由来の培地と比較して、より多い数のＰＢＭＣがｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣで処理した細胞から馴化培地に向かって移動したことを示している。
ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣによるバイスタンダー効果
【０１００】
次に、動員された免疫細胞が免疫細胞を介したバイスタンダー効果を引き起こすことができるかどうかを試験した。ルシフェラーゼを安定に発現するＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞を低用量のｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣで処理した後、ＰＢＭＣと共インキュベートした。ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の生存の尺度としてルシフェラーゼ活性を用いた。結果は、ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の根絶を示した（図５Ａ）。対照的に、ＰＢＭＣの非存在下では、ルシフェラーゼレベルはほとんど影響を受けなかった。これらの結果は、ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣが強力な免疫細胞を介したバイスタンダー効果を誘発していることを示唆している。
【０１０１】
ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣも直接的バイスタンダー効果を誘発するかどうかを評価するために、ＬＮＣａＰ細胞を、ＰＳＭＡを発現していないＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞と共インキュベートした。ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ処理は、結果として、最大６０％のＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の死滅をもたらした（図５Ｂ）。ＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞は、ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣによって標的化されることはないので（図５Ｂ）、これらの細胞の死は、ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ標的化ＬＮＣａＰ細胞によって誘導される直接バイスタンダー効果の結果であると推測する。この共培養系へヒトＰＢＭＣを添加することが、ＰＣ３−Ｌｕｃ／ＧＦＰ細胞の死滅率の有意な上昇となり（図５Ｂ）、これらの条件下において、免疫細胞を介したバイスタンダー効果がさらに関与していることを示している。
ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣが、腫瘍スフェロイドを破壊する。
【０１０２】
次に、３Ｄ腫瘍スフェロイドモデルにおけるｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣの有効性を評価した。インビトロ３Ｄモデルは、ヒト腫瘍の構造によく似ており（２３）、抗癌剤に対する高い耐性を特徴とする（２４）。ＬＮＣａＰスフェロイドが生成され、３００〜４００μｍの直径に達し得る。次にスフェロイドをポリＨＥＭＡプレートに移し、５日間かけてｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ（４００ｎＭ  ｄｓＲＢ−ＳＣＰ、２．５μｇ／ｍｌポリＩＣ）で繰り返し処理した。５日目までに、ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣで処理したスフェロイドは収縮し始め、死細胞を脱落したが、未処理スフェロイドはサイズが増大した（図６Ａ）。１５日目に、スフェロイドをカルセインＡＭおよびヨウ化プロピジウムで染色して、生存度を監視した（図６Ａ）。ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣ処理スフェロイドは、著しい構造的損傷を示しており、多数の死細胞を含んでいた（図６Ａ）。対照的に、未処理スフェロイド、およびポリＩＣ単独またはｄｓＲＢ−ＳＣＰ単独で処理されたスフェロイドは、表面の細胞が生きていて、コアにある細胞が壊死している典型的な無傷の構造を維持していた（１１）。
【０１０３】
インビボ条件をより厳密に模倣し、スフェロイドに対する免疫細胞を介したバイスタンダー効果を試験するために、処理済みのスフェロイドにＰＢＭＣを加えた。ＬＮＣａＰ−Ｌｕｃ／ＧＦＰスフェロイドをｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣで１回処理し、２４時間後に新たに単離したＰＢＭＣを培養液に添加した。最も低用量のｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣであっても、スフェロイドの分解は、処理開始後７２時間またはＰＢＭＣ添加後４８時間ですでに明らかであった（図６Ｂ）。より高用量では、処理開始後９６時間で完全なスフェロイドの破壊が観察された。さらに７２時間後、死細胞のみが明らかになり、ＧＦＰ蛍光は見られなかった（図６Ｂ）。対照として、ＰＢＭＣの非存在下で同じ処理を行った。エンドポイント（１６８時間）では、処理することにより、結果的に、目に見える細胞死およびスフェロイドの分解をもたらした（図６Ｂ下パネル）が、ＰＢＭＣの存在下で観察されたレベルと比較すると、その効果は弱かった。したがって、ｄｓＲＢ−ＳＣＰ／ポリＩＣは、スフェロイドに対して強力な効果を有し、かつこの効果は、免疫細胞の添加によって大いに拡大される。
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
１．  Ｌｕｏ，  Ｊ．，  Ｂｅｅｒ，  Ｔ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒａｆｆ，  Ｊ．  Ｎ．  （２０１６）    Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｏｎｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  （Ｗｉｌｌｉｓｔｏｎ  Ｐａｒｋ）  ３０，  ３３６−３４４，  
２．  Ａｔｔａｒｄ，  Ｇ．，  Ｓａｒｋｅｒ，  Ｄ．，  Ｒｅｉｄ，  Ａ．，  Ｍｏｌｉｆｅ，  Ｒ．，  Ｐａｒｋｅｒ，  Ｃ．，  ａｎｄ  ｄｅ  Ｂｏｎｏ，  Ｊ．  Ｓ．  （２００６）    Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ９５，  ７６７−７７４，    １０．１０３８／ｓｊ．ｂｊｃ．６６０３２２３
３．  Ｊａｖｉｄａｎ，  Ｊ．，  Ｄｅｉｔｃｈ，  Ａ．  Ｄ．，  Ｓｈｉ，  Ｘ．  Ｂ．，  ａｎｄ  ｄｅ  Ｖｅｒｅ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｒ．  Ｗ．  （２００５）    Ｔｈｅ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ２３，  ５２０−５２８，    １０．１０８０／０７３５７９００５００２０２７２１
４．  Ａｋｈｔａｒ，  Ｎ．  Ｈ．，  Ｐａｉｌ，  Ｏ．，  Ｓａｒａｎ，  Ａ．，  Ｔｙｒｅｌｌ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｔａｇａｗａ，  Ｓ．  Ｔ．  （２０１２）    Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｕｒｏｌｏｇｙ  ２０１２，  ９７３８２０，    １０．１１５５／２０１２／９７３８２０
５．  Ｓｗｅａｔ，  Ｓ．  Ｄ．，  Ｐａｃｅｌｌｉ，  Ａ．，  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｇ．  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｂｏｓｔｗｉｃｋ，  Ｄ．  Ｇ．  （１９９８）    Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｇｒｅａｔｅｓｔ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ，Ｕｒｏｌｏｇｙ  ５２，  ６３７−６４０，  
６．  Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｇ．  Ｌ．，  Ｊｒ．，  Ｇｒｏｂ，  Ｂ．  Ｍ．，  Ｈａｌｅｙ，  Ｃ．，  Ｇｒｏｓｓｍａｎ，  Ｋ．，  Ｎｅｗｈａｌｌ，  Ｋ．，  Ｐｅｔｒｙｌａｋ，  Ｄ．，  Ｔｒｏｙｅｒ，  Ｊ．，  Ｋｏｎｃｈｕｂａ，  Ａ．，  Ｓｃｈｅｌｌｈａｍｍｅｒ，  Ｐ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｍｏｒｉａｒｔｙ，  Ｒ．  （１９９６）    Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｆｔｅｒ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｕｒｏｌｏｇｙ  ４８，  ３２６−３３４，  
７．  Ｍａｎｎｗｅｉｌｅｒ，  Ｓ．，  Ａｍｅｒｓｄｏｒｆｅｒ，  Ｐ．，  Ｔｒａｊａｎｏｓｋｉ，  Ｓ．，  Ｔｅｒｒｅｔｔ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｋｉｎｇ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｍｅｈｅｓ，  Ｇ．  （２００９）    Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＰＳＭＡ）  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ＰＯＲ  １５，  １６７−１７２，    １０．１００７／ｓ１２２５３−００８−９１０４−２
８．  Ｔａｇａｗａ，  Ｓ．  Ｔ．，  Ｍｉｌｏｗｓｋｙ，  Ｍ．  Ｉ．，  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｍ．，  Ｖａｌｌａｂｈａｊｏｓｕｌａ，  Ｓ．，  Ｃｈｒｉｓｔｏｓ，  Ｐ．，  Ａｋｈｔａｒ，  Ｎ．  Ｈ．，  Ｏｓｂｏｒｎｅ，  Ｊ．，  Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｌａｒｓｏｎ，  Ｓ．，  Ｔａｓｋａｒ，  Ｎ．  Ｐ．，  Ｓｃｈｅｒ，  Ｈ．  Ｉ．，  Ｂａｎｄｅｒ，  Ｎ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｎａｎｕｓ，  Ｄ．  Ｍ．  （２０１３）    Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｌｕｔｅｔｉｕｍ−１７７−ｌａｂｅｌｅｄ  ａｎｔｉ−ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｊ５９１  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９，  ５１８２−５１９１，    １０．１１５８／１０７８−０４３２．ＣＣＲ−１３−０２３１
９．  Ｇａｌｓｋｙ，  Ｍ．  Ｄ．，  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｍ．，  Ｍｏｏｒｅ−Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｓ．，  Ｋｅｌｌｙ，  Ｗ．  Ｋ．，  Ｓｌｏｖｉｎ，  Ｓ．  Ｆ．，  ＤｅＬａＣｒｕｚ，  Ａ．，  Ｌｅｅ，  Ｙ．，  Ｗｅｂｂ，  Ｉ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒ，  Ｈ．  Ｉ．  （２００８）    Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ＭＬＮ２７０４  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２６，  ２１４７−２１５４，    １０．１２００／ＪＣＯ．２００７．１５．０５３２
１０．      ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ，  Ｐ．  Ｊ．，  Ｓｔｒｉｃｋｅｒ，  Ｐ．，  Ｈｒｕｂｙ，  Ｇ．，  Ｋｎｅｅｂｏｎｅ，  Ａ．，  Ｔｉｎｇ，  Ｆ．，  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｂ．，  Ｎｇｕｙｅｎ，  Ｑ．，  Ｈｏ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｅｍｍｅｔｔ，  Ｌ．  （２０１６）    （６８）  Ｇａ−ＰＳＭＡ  ｈａｓ  ａ  ｈｉｇｈ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｕｔｓｉｄｅ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｆｏｓｓａ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｂｅｉｎｇ  ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ  ｆｏｒ  ｓａｌｖａｇｅ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ＢＪＵ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  １１７，  ７３２−７３９，    １０．１１１１／ｂｊｕ．１３３９７
１１．      Ｐｈｕｎｇ，  Ｙ．  Ｔ．，  Ｂａｒｂｏｎｅ，  Ｄ．，  Ｂｒｏａｄｄｕｓ，  Ｖ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｈｏ，  Ｍ．  （２０１１）    Ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ２，  ５０７−５１４，  
１２．      Ｐｕｉｇｂｏ，  Ｐ．，  Ｇｕｚｍａｎ，  Ｅ．，  Ｒｏｍｅｕ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ−Ｖａｌｌｖｅ，  Ｓ．  （２００７）    ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ：  ａ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３５，  Ｗ１２６−１３１，    １０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｍ２１９
１３．      Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ，  Ａ．  Ｋ．，  Ａｎｉｌｋｕｍａｒ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，  Ｊ．  Ｊ．  （２００５）    Ｉｓ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ？
，Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．  Ｃｅｌｌ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２８８，  Ｃ９７５−９８１，    １０．１１５２／ａｊｐｃｅｌｌ．００５０６．２００４
１４．      Ｇｏｎｇ，  Ｍ．  Ｃ．，  Ｌａｔｏｕｃｈｅ，  Ｊ．  Ｂ．，  Ｋｒａｕｓｅ，  Ａ．，  Ｈｅｓｔｏｎ，  Ｗ．  Ｄ．，  Ｂａｎｄｅｒ，  Ｎ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｓａｄｅｌａｉｎ，  Ｍ．  （１９９９）    Ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｌｙｓｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  １，  １２３−１２７，  
１５．      Ｅｄｉｎｇｅｒ，  Ｎ．，  Ｌｅｂｅｎｄｉｋｅｒ，  Ｍ．，  Ｋｌｅｉｎ，  Ｓ．，  Ｚｉｇｌｅｒ，  Ｍ．，  Ｌａｎｇｕｔ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，  Ａ．  （２０１６）    Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｏｌｙＩＣ  ｔｏ  ＥＧＦＲ  ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｓＲＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ｔｏ  ＥＧＦ，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  １１，  ｅ０１６２３２１，    １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１６２３２１
１６．      Ｚｉｇｌｅｒ，  Ｍ．，  Ｓｈｉｒ，  Ａ．，  Ｊｏｕｂｒａｎ，  Ｓ．，  Ｓａｇａｌｏｖ，  Ａ．，  Ｋｌｅｉｎ，  Ｓ．，  Ｅｄｉｎｇｅｒ，  Ｎ．，  Ｌａｕ，  Ｊ．，  Ｙｕ，  Ｓ．  Ｆ．，  Ｍｉｚｒａｊｉ，  Ｇ．，  Ｇｌｏｂｅｒｓｏｎ  Ｌｅｖｉｎ，  Ａ．，  Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，  Ｍ．  Ｘ．，  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，  Ａ．  （２０１６）    ＨＥＲ２−Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｅ／Ｐｏｌｙｃｙｔｏｓｉｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ    １０．１１５８／２３２６−６０６６．ＣＩＲ−１５−０２０３
１７．      Ｓｈｉｒ，  Ａ．，  Ｏｇｒｉｓ，  Ｍ．，  Ｒｏｅｄｌ，  Ｗ．，  Ｗａｇｎｅｒ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，  Ａ．  （２０１１）    ＥＧＦＲ−ｈｏｍｉｎｇ  ｄｓＲＮＡ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｃａｎｃｅｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ＥＧＦＲ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７，  １０３３−１０４３，    １０．１１５８／１０７８−０４３２．ＣＣＲ−１０−１１４０
１８．      Ｍｉｚｒａｃｈｙ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｓ．，  Ｃｏｈｅｎ，  Ｎ．，  Ｋｌｅｉｎ，  Ｓ．，  Ｋｒａｖｃｈｅｎｋｏ−Ｂａｌａｓｈａ，  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，  Ａ．  （２０１１）    Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃ−Ｓｒｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８６，  １５２６８−１５２７７，    １０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１０．２１１８１３
１９．      Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，  Ｊ．，  Ｓｅｉｄｅｌ，  Ｃ．，  Ｅｂｎｅｒ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｋｕｎｚ−Ｓｃｈｕｇｈａｒｔ，  Ｌ．  Ａ．  （２００９）    Ｓｐｈｅｒｏｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｄｒｕｇ  ｓｃｒｅｅｎ：  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ４，  ３０９−３２４，    １０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００８．２２６
２０．      Ｄｅｒ，  Ｓ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｌａｕ，  Ａ．  Ｓ．  （１９９５）    Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ−ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ＰＫＲ  ｉｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９２，  ８８４１−８８４５，  
２１．      Ｋｕｍａｒ，  Ａ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｙｕ，  Ｆ．  Ｓ．  （２００６）    Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ａｇｏｎｉｓｔ  ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１７，  １１−２１，    １０．１１１１／ｊ．１３６５−２５６７．２００５．０２２５８．ｘ
２２．      Ｇａｌｌｉ，  Ｒ．，  Ｓｔａｒａｃｅ，  Ｄ．，  Ｂｕｓａ，  Ｒ．，  Ａｎｇｅｌｉｎｉ，  Ｄ．  Ｆ．，  Ｐａｏｎｅ，  Ａ．，  Ｄｅ  Ｃｅｓａｒｉｓ，  Ｐ．，  Ｆｉｌｉｐｐｉｎｉ，  Ａ．，  Ｓｅｔｔｅ，  Ｃ．，  Ｂａｔｔｉｓｔｉｎｉ，  Ｌ．，  Ｚｉｐａｒｏ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｒｉｃｃｉｏｌｉ，  Ａ．  （２０１０）    ＴＬＲ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８４，  ６６５８−６６６９，    １０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．０９０２４０１
２３．      Ｋｉｍ，  Ｊ．  Ｂ．  （２００５）    Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １５，  ３６５−３７７，    １０．１０１６／ｊ．ｓｅｍｃａｎｃｅｒ．２００５．０５．００２
２４．      Ｔａｋａｇｉ，  Ａ．，  Ｗａｔａｎａｂｅ，  Ｍ．，  Ｉｓｈｉｉ，  Ｙ．，  Ｍｏｒｉｔａ，  Ｊ．，  Ｈｉｒｏｋａｗａ，  Ｙ．，  Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ，  Ｔ．  （２００７）    Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐｈｅｒｏｉｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｔｉｓｓｕｅ−ｌｉｋｅ  ｆｅａｔｕｒｅｓ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７，  ４５−５３，  
【０１０４】
開示された発明の原理が適用され得る多くの可能な実施形態を考慮すると、例解された実施形態は本発明の好ましい例にすぎず、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。むしろ、本発明の範囲は、特許請求の範囲によって規定される。したがって、これらの請求の範囲と趣旨の範囲内における全てが私たちの発明であることを主張する。
【図１Ａ】
2019534037.tif 000004
【図１Ｂ】
2019534037.tif 000005
【図１Ｃ】
2019534037.tif 000006
【図１Ｄ】
2019534037.tif 000007
【図２Ａ】
2019534037.tif 000008
【図２Ｂ】
2019534037.tif 000009
【図２Ｃ】
2019534037.tif 000010
【図３Ａ】
2019534037.tif 000011
【図３Ｂ】
2019534037.tif 000012
【図３Ｃ】
2019534037.tif 000013
【図４Ａ】
2019534037.tif 000014
【図４Ｂ】
2019534037.tif 000015
【図４Ｃ】
2019534037.tif 000016
【図４Ｄ】
2019534037.tif 000017
【図５Ａ】
2019534037.tif 000018
【図５Ｂ】
2019534037.tif 000019
【図６Ａ】
2019534037.tif 000020
【図６Ｂ】
2019534037.tif 000021
【配列表】
2019534037000001.app
【国際調査報告】
2019534037.tif 000022
2019534037.tif 000023
2019534037.tif 000024