(57)【要約】【課題】マイクロ流体組立体内のチャンバに閉じ込められた微小物体によって生成される検体の数量を正確に特定することができる撮像システム又は方法が必要とされる。【解決手段】  アッセイの結果を検出する方法、システム及びキットが本明細書に記載される。特に、本開示の方法、システム及びデバイスは、リポーター分子及び対象の検体の拡散率間の差に依拠して、マイクロ流体デバイス内の検体の量を定量化する。検体は、生物学的微小物体の分泌産物であり得る。【選択図】図４Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定するシステムであって、
画像取得ユニットであって、
マイクロ流体デバイスを固定可能なマイクロ流体デバイスホルダであって、前記マイクロ流体デバイスが、フロー領域及び前記フロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含み、前記複数の隔離ペンのそれぞれが、１つ又は複数の生物学的微小物体を保持することができる、マイクロ流体デバイスホルダ、及び
前記マイクロ流体デバイスの前記複数の隔離ペン及び前記フロー領域の１つ又は複数のアッセイ画像を取得するように構成される撮像要素
を含む画像取得ユニットと、
前記画像取得ユニットに通信可能に接続される画像処理ユニットであって、
捕捉された各アッセイ画像を受信し、且つ前記アッセイ画像に示される各隔離ペンの対象エリアを定義するように構成される対象エリア決定エンジンであって、前記対象エリアが、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、前記隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ前記隔離ペンと前記フロー領域との間で拡散軸に沿って延在する前記隔離ペン内のエリアに対応する画像エリアを含む、対象エリア決定エンジン、及び
各隔離ペンの前記対象エリア内の前記画像エリアの少なくとも一部を分析して、各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定するように構成されるスコア付けエンジン
を含む画像処理ユニットと、
を含むシステム。
【請求項２】
背景ノイズに起因し、且つ／又はアッセイ画像捕捉中に導入される画像歪みについて、各隔離ペンの前記対象エリアの少なくとも前記画像エリアを正規化するように構成される較正エンジンを更に含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記撮像要素が、１つ又は複数の対応する背景画像及び１つ又は複数の対応する信号基準画像を捕捉するように更に構成される、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記較正エンジンが、前記対応する背景画像を前記アッセイ画像から減算することにより、画像歪みについて各隔離ペンの前記対象エリアの少なくとも前記画像エリアを正規化するように構成され、及び／又は前記較正エンジンが、前記対応する信号基準画像において捕捉された画像取得歪みを考慮することにより、画像歪みについて各隔離ペンの前記対象エリアの少なくとも前記画像エリアを正規化するように構成される、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記スコア付けエンジンが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの少なくとも一部を分析して、各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定するように構成される、請求項２〜４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項６】
前記スコア付けエンジンが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの一部にわたる光強度値に線形回帰分析を適用して、各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定するように構成される、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記スコア付けエンジンが、各隔離ペンの前記正規化対象エリアの一部にわたる光強度値を積分して、各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定するように構成される、請求項５に記載のシステム。
【請求項８】
前記画像取得ユニット及び前記画像処理ユニットが、別個に向けられる、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記画像取得ユニット及び前記画像処理ユニットが、単一のユニットに統合される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記対象エリア及び／又は前記対象エリアの前記画像エリアが、前記画像処理ユニットによって自動的に定義される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記マイクロ流体デバイスが、前記生物学的微小物体によって生成される検体に結合し、且つ検出可能な標識を含む結合剤のフローを受け取るように構成され、前記スコア付けエンジンが、前記アッセイ画像から特定されるように、前記結合剤の前記検出可能な標識によって発せられる光の量に基づいて、各隔離ペン内の検体の数量を特定するように構成される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定する方法であって、
フロー領域及び前記フロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含むマイクロ流体デバイスの撮像データを受信することであって、前記撮像データが、検体アッセイ画像と、背景ノイズ画像及び信号基準画像の一方又は両方とを含む、受信することと、
各隔離ペンの対象エリアを定義することであって、前記対象エリアが、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、前記隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ前記隔離ペンと前記フロー領域との間で拡散軸に沿って延在する前記隔離ペン内の画像エリアを含む、定義することと、
各隔離ペンの前記対象エリアの前記画像エリアの少なくとも一部を分析することにより、各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することと、
を含む方法。
【請求項１３】
前記撮像データが、前記生物学的微小物体によって生成される前記検体に結合するリポーター分子から発せられる光から特定される発光データを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記背景ノイズ画像において捕捉された背景ノイズを減算することにより、前記検体アッセイ画像内の前記隔離ペンのそれぞれの前記対象エリアの少なくとも前記画像エリアを正規化し、且つ／又は前記信号基準画像において捕捉された画像取得歪みを考慮することにより、前記検体アッセイ画像内の前記隔離ペンのそれぞれの前記対象エリアの少なくとも前記画像エリアを正規化することを更に含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの少なくとも一部を分析することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの少なくとも一部にわたる発光データに線形回帰分析を適用することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの少なくとも一部にわたる発光データを積分することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記検体が、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１９】
生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定する画像処理方法をコンピュータに実行させるプログラムが記憶される非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記方法が、
フロー領域及び前記フロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含むマイクロ流体デバイスの撮像データを受信することであって、前記撮像データが、検体アッセイ画像と、背景ノイズ画像及び信号基準画像の一方又は両方とを含む、受信することと、
各隔離ペンの対象エリアを定義することであって、前記対象エリアが、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、前記隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ前記隔離ペンと前記フロー領域との間で拡散軸に沿って延在する前記隔離ペン内の画像エリアを含む、定義することと、
各隔離ペンの前記対象エリアの前記画像エリアの少なくとも一部を分析することにより、各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することとと、
を含む、非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項２０】
前記撮像データが、前記生物学的微小物体によって生成される前記検体に結合するリポーター分子から発せられる光から特定される発光データを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記背景ノイズ画像において捕捉された背景ノイズを減算することにより、前記検体アッセイ画像内の前記隔離ペンのそれぞれの前記対象エリアの少なくとも前記画像エリアを正規化し、且つ／又は前記信号基準画像において捕捉された画像取得歪みを考慮することにより、前記検体アッセイ画像内の前記隔離ペンのそれぞれの前記対象エリアの少なくとも前記画像エリアを正規化することを更に含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの少なくとも一部を分析することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの少なくとも一部からの発光データに線形回帰分析を適用することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
各隔離ペン内の前記検体の数量を示すスコアを決定することが、各隔離ペンの前記対象エリアの前記正規化画像エリアの少なくとも一部にわたる発光データを積分することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記検体が、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２６】
生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団による検体の分泌のレベルを評価する方法であって、
前記生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することであって、前記マイクロ流体デバイスが、フロー領域を有するエンクロージャを含み、前記隔離ペンは、前記フロー領域に流体的に接続され、前記隔離ペンは、第１の流体媒体を含む、導入することと、
前記生物学的微小物体又はそれから生成される前記生物学的微小物体の集団に、前記隔離ペン内の前記第１の流体媒体内に前記検体を分泌させることと、
第２の流体媒体を前記フロー領域に導入することであって、前記第２の流体媒体が、複数のリポーター分子を含み、各リポーター分子が、
前記分泌検体に結合するように構成される結合成分、及び
検出可能な標識
を含む、導入することと、
前記複数のリポーター分子の一部を前記隔離ペン内に拡散させ、且つそこに分泌された前記検体に結合させ、それにより、複数のリポーター分子：分泌検体（ＲＭＳＡ）複合体を生成することと、
前記マイクロ流体デバイス内の対象エリア内に位置するリポーター分子を検出することであって、前記対象エリアが、前記隔離ペンの少なくとも一部を含む、検出することとと、
を含む方法。
【請求項２７】
前記隔離ペンは、分離領域及び前記分離領域を前記フロー領域に流体的に接続する接続領域を有し、前記分離領域及び前記接続領域は、前記分離領域内の流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみ前記フロー領域内の流体媒体の成分と交換されるように構成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記隔離ペン内の前記生物学的微小物体を増殖させて、生物学的微小物体のクローン集団にすることを更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
培養媒体で前記フロー領域を灌流させることを更に含み、前記灌流が、前記生物学的微小物体を前記隔離ペンに導入した後且つ前記第２の流体媒体を前記フロー領域に導入する前に行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記培養媒体が、可溶性フィーダ細胞成分、定義された溶解酸素成分、定義されたｐＨ成分、排出成長媒体成分及び／又は可溶性刺激成分の１つ又は複数を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２の流体媒体を前記フロー領域に導入することが、第１の時間期間にわたり、前記フロー領域を通して前記第２の流体媒体を流すことを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の時間期間が、約３０分から約６０分である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第３の流体媒体を前記フロー領域に導入することであって、前記第３の流体媒体が、リポーター分子を含まない、導入することと、
非結合リポーター分子の少なくとも一部を前記隔離ペンから拡散させることと
を更に含み、
前記対象エリア内の前記リポーター分子を検出することが、前記隔離ペンから拡散した非結合リポーター分子の量が、前記隔離ペンから拡散したＲＭＳＡ複合体の量の少なくとも２倍だけ大きいように選択された時間において行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記第３の流体媒体を前記フロー領域に導入することが、第２の時間期間にわたり、前記フロー領域を通して前記第３の流体媒体を流すことを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２の時間期間が、非結合リポーター分子及びＲＭＳＡ複合体の拡散プロファイルのモデリングに基づいて選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第２の時間期間が、約２０分から約５０分である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象エリアが、前記隔離ペン内から前記フロー領域への拡散軸に沿って整列された前記隔離ペンの少なくとも一部を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象エリア内に位置する前記リポーター分子を検出することが、前記対象エリアから到来する検出可能な信号の強度を測定することを含み、前記検出可能な信号の少なくとも幾つかが、前記対象エリア内に位置するリポーター分子の前記検出可能な標識から発せられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象エリア内に位置する前記リポーター分子を検出することが、前記検出可能な信号の前記測定された強度から背景信号の強度を減算することにより、背景減算信号強度を特定することを更に含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記生物学的微小物体を前記隔離ペンに導入する前の時間において、前記対象エリア内の背景信号の強度を測定することを更に含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記検出可能な信号の前記測定された強度又は前記背景減算信号強度が、前記隔離ペン内で観測された細胞数について正規化される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記検体の前記分泌のレベルを定量化することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４３】
前記隔離ペンの分泌スコアを提供することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４４】
前記分泌スコアが、請求項１２に記載の方法に従って決定される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記分泌検体が、前記リポーター分子の分子量の少なくとも２倍の大きさの分子量を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項４６】
前記分泌検体が、前記リポーター分子の分子量の少なくとも４倍だけ大きい分子量を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項４７】
前記分泌検体が、前記リポーター分子の分子量の少なくとも１０倍だけ大きい分子量を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項４８】
前記リポーター分子の前記結合成分が、少なくとも１つのアミノ酸及び／又は少なくとも１つ核酸を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４９】
前記リポーター分子の前記結合成分が、ペプチド又はタンパク質を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記リポーター分子の前記結合成分が、配列番号１から１０のいずれか１つの配列を有するペプチドを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記リポーター分子の前記結合成分が、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ又はタンパク質Ａ若しくはタンパク質ＧのＩｇＧ結合断片を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記リポーター分子の前記結合成分が、アプタマーを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項５３】
前記検出可能な標識が、可視標識、発光標識、リン光標識又は蛍光標識を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項５４】
前記検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項２６に記載の方法。
【請求項５５】
前記生物学的微小物体によって分泌される前記検体が、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項５６】
前記生物学的微小物体によって分泌される前記検体が、抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項５７】
前記生物学的微小物体によって分泌される前記検体が、抗体以外のタンパク質である、請求項２６に記載の方法。
【請求項５８】
前記マイクロ流体デバイスが、複数の隔離ペンを含み、生物学的微小物体が、前記複数のうちの少なくとも２つの隔離ペンに導入され、前記方法の残りは、前記少なくとも２つの隔離ペンのそれぞれに対して実行される、請求項２６に記載の方法。
【請求項５９】
前記複数のうちの前記少なくとも２つの隔離ペンの隔離ペンの分泌のレベルを比較することを更に含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記複数の隔離ペンのうちの２つ以上の隔離ペンの分泌スコアを比較することを更に含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記少なくとも２つの隔離ペンのうちの１つ又は複数を選択することと、
前記選択された隔離ペンのそれぞれから１つ又は複数の生物学的微小物体を搬出することと
を更に含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記選択された隔離ペンのそれぞれからの前記１つ又は複数の生物学的微小物体が、前記マイクロ流体デバイスから更に搬出される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記選択された隔離ペンが、個々に搬出される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
クローン株成長の方法であって、
個々の生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスの複数の隔離ペンのそれぞれに導入することであって、前記マイクロ流体デバイスが、フロー領域を有するエンクロージャを更に含み、前記複数のうちの前記隔離ペンのそれぞれが、前記フロー領域に流体的に接続され、且つ第１の流体媒体を含む、導入することと、
各生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体のクローン集団に、前記対応する隔離ペンに含まれる前記第１の流体媒体に検体を分泌させることと、
第２の流体媒体を前記フロー領域に導入することであって、前記第２の流体媒体が、複数のリポーター分子を含み、各リポーター分子が、
前記分泌検体に結合するように構成される結合成分、及び
検出可能な標識
を含む、導入することと、
前記複数のリポーター分子の一部を前記複数のうちの各隔離ペンに拡散させ、且つそこで分泌された前記検体の少なくとも一部に結合させ、それにより、前記複数の隔離ペンのそれぞれにおいて複数のリポーター分子：分泌検体（ＲＭＳＡ）複合体を生成することと、
前記複数のうちの各隔離ペンについて、対応する対象エリアから発せられる信号の強度を検出することであって、前記対象エリアは、前記対応する隔離ペンの少なくとも一部を含み、前記対象エリアから発せられる前記信号の少なくとも一部が、前記対象エリア内に位置するリポーター分子の前記検出可能な標識から発せられる、検出することと、
前記複数のうちの各隔離ペンについて、前記対応する対象エリアから発せられた前記検出された信号強度に基づいてスコアを決定することと、
前記複数の隔離ペンから隔離ペンの組を選択することであって、前記組の各隔離ペンが、それに含まれる前記生物学的微小物体又はクローン集団がトップ検体生成者であることを示すスコアを有する、選択することと、
前記マイクロ流体デバイスから、前記選択された隔離ペンの組の各隔離ペン内に含まれる１つ又は複数の生物学的微小物体を搬出することと、
対応する反応容器内において、前記選択された隔離ペンの組の各隔離ペンからの前記搬出された１つ又は複数の生物学的微小物体を増殖させることと、
それぞれの対応する反応容器内で分泌された検体のレベルを特定し、それにより、各生物学的微小物体又はクローン集団の分泌のレベルを特定することとと、
を含む方法。
【請求項６５】
前記複数のうちの各隔離ペンが、分離領域及び前記分離領域を前記フロー領域に流体的に接続する接続領域を有し、前記分離領域及び前記接続領域が、前記分離領域内の流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみ前記フロー領域内の流体媒体の成分と交換されるように構成される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記複数のうちの幾つか又は全ての隔離ペン内の前記個々の生物学的微小物体を増殖させて、生物学的微小物体のクローン集団にすることを更に含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
培養媒体で前記フロー領域を灌流させることを更に含み、前記灌流が、前記個々の生物学的微小物体を前記複数の隔離ペンに導入した後且つ前記第２の流体媒体を前記フロー領域に導入する前に行われる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記培養媒体は、可溶性フィーダ細胞成分、定義された溶解酸素成分、定義されたｐＨ成分、排出成長媒体成分及び／又は可溶性刺激成分の１つ又は複数を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記第２の流体媒体を前記フロー領域に導入することが、第１の時間期間にわたり、前記フロー領域を通して前記第２の流体媒体を流すことを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記第１の時間期間が、約３０分から約６０分である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
第３の流体媒体を前記フロー領域に導入することであって、前記第３の流体媒体は、リポーター分子を含まない、導入することと、
非結合リポーター分子の少なくとも一部を前記隔離ペンから拡散させることと
を更に含み、
前記複数のうちの各隔離ペンの前記対応する対象エリアから発せられる前記信号の前記強度を検出することが、前記隔離ペンから拡散した非結合リポーター分子の量が、前記隔離ペンから拡散したＲＭＳＡ複合体の量の少なくとも２倍だけ大きいように選択される時間において行われる、請求項６４に記載の方法。
【請求項７２】
前記第３の流体媒体を前記フロー領域に導入することが、第２の時間期間にわたり、前記フロー領域を通して前記第３の流体媒体を流すことを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記第２の時間期間が、非結合リポーター分子及びＲＭＳＡ複合体の拡散プロファイルのモデリングに基づいて選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記第２の時間期間が、約２０分から約５０分である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記対象エリアが、前記隔離ペン内から前記フロー領域への拡散軸に沿って整列された前記隔離ペンの少なくとも一部を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７６】
前記複数のうちの各隔離ペンの前記対応する対象エリアから発せられた前記信号の強度を検出することが、前記検出可能信号の前記測定された強度から背景信号の強度を減算して、背景減算信号強度を特定することを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項７７】
前記生物学的微小物体を前記隔離ペンに導入する前の時間において、前記複数のうちの各隔離ペンの前記対応する対象エリア内の背景信号の強度を測定することを更に含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記検出可能な信号の前記測定された強度又は前記背景減算信号強度が、前記対応する隔離ペン内で観測された細胞数について正規化される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記複数の隔離ペンの前記スコアが、請求項１２に記載の方法に従って決定される、請求項６４に記載の方法。
【請求項８０】
前記分泌検体が、前記リポーター分子の分子量の少なくとも２倍の大きさの分子量を有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項８１】
前記分泌検体が、前記リポーター分子の分子量の少なくとも４倍だけ大きい分子量を有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項８２】
前記分泌検体が、前記リポーター分子の分子量の少なくとも１０倍だけ大きい分子量を有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項８３】
前記リポーター分子の前記結合成分が、少なくとも１つのアミノ酸及び／又は少なくとも１つ核酸を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項８４】
前記リポーター分子の前記結合成分が、ペプチド又はタンパク質を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記リポーター分子の前記結合成分が、配列番号１から１０のいずれか１つの配列を有するペプチドを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記リポーター分子の前記結合成分が、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ又はタンパク質Ａ若しくはタンパク質ＧのＩｇＧ結合断片を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
前記リポーター分子の前記結合成分が、アプタマーを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項８８】
前記検出可能な標識が、可視標識、発光標識、リン光標識又は蛍光標識を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項８９】
前記検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項６４に記載の方法。
【請求項９０】
前記生物学的微小物体によって分泌される前記検体が、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項９１】
前記生物学的微小物体によって分泌される前記検体が、抗体である、請求項６４に記載の方法。
【請求項９２】
前記生物学的微小物体によって分泌される前記検体が、抗体以外のタンパク質である、請求項６４に記載の方法。
【請求項９３】
前記反応容器が、ウェルプレート内のウェル、振とうフラスコ又はバイオリアクタである、請求項６４に記載の方法。
【請求項９４】
生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団によって分泌される検体のレベルを評価するキットであって、
フロー領域及び複数の隔離ペンを有するエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスであって、各隔離ペンは、フロー領域に流体的に接続され、前記フロー領域及び前記隔離ペンは、流体媒体を含むように構成される、マイクロ流体デバイスと、
検出可能な標識及び前記検体に結合するように構成される結合成分を含むリポーター分子と、
を含むキット。
【請求項９５】
前記複数のうちの各隔離ペンが、分離領域及び前記分離領域を前記フロー領域に流体的に接続する接続領域を有し、前記分離領域及び前記接続領域が、前記分離領域内の流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみ前記フロー領域内の流体媒体の成分と交換されるように構成される、請求項９４に記載のキット。
【請求項９６】
前記リポーター分子の前記結合成分が、少なくとも１つのアミノ酸及び／又は少なくとも１つ核酸を含む、請求項９４に記載のキット。
【請求項９７】
前記リポーター分子の前記結合成分が、ペプチド又はタンパク質を含む、請求項９６に記載のキット。
【請求項９８】
前記リポーター分子の前記結合成分が、配列番号１から１０のいずれか１つの配列を有するペプチドを含む、請求項９７に記載のキット。
【請求項９９】
前記リポーター分子の前記結合成分が、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ又はタンパク質Ａ若しくはタンパク質ＧのＩｇＧ結合断片を含む、請求項９７に記載のキット。
【請求項１００】
前記リポーター分子の前記結合成分が、アプタマーを含む、請求項９６に記載のキット。
【請求項１０１】
前記検出可能な標識が、可視標識、発光標識、リン光標識又は蛍光標識を含む、請求項９４に記載のキット。
【請求項１０２】
前記検出可能な標識が、蛍光標識である、請求項９４に記載のキット。
【請求項１０３】
流体媒体を更に含む、請求項９４に記載のキット。
【請求項１０４】
前記流体媒体が、前記生物学的微小物体又はそれから生成される前記生物学的微小物体の集団を維持するか、増殖させるか、又はそれに選択的圧力を提供するように構成される、請求項１０３に記載のキット。
【請求項１０５】
前記マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の表面を調整するように構成される試薬を更に含む、請求項９４に記載のキット。
【請求項１０６】
前記試薬が、前記マイクロ流体デバイスの前記１つ又は複数の表面を共有結合的に修飾するように構成される、請求項１０５に記載のキット。
【請求項１０７】
前記対象エリアが、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、前記隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ前記隔離ペンと前記フロー領域との間で拡散軸に沿って延在する前記隔離ペン内のエリアに対応する画像エリアを含む、請求項２６〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記対象エリアが、基本的に前記画像エリアからなる、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
自動化される、請求項２６〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
コンピュータに、生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定する方法を実行するようにシステムに指示させるプログラムが記憶される非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記方法が、請求項１０７に記載の方法である、非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項１１１】
前記システムが、請求項１に記載のシステムである、請求項１１０に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項１１２】
前記対象エリアが、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、前記隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ前記隔離ペンと前記フロー領域との間で拡散軸に沿って延在する前記隔離ペン内のエリアに対応する画像エリアを含む、請求項６４〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記対象エリアが、基本的に前記画像エリアからなる、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
自動化される、請求項６４〜９３又は１１２若しくは１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
コンピュータに、クローン株成長の方法の少なくとも一部を実行するようにシステムに指示させるプログラムが記憶される非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記方法が、請求項１１２に記載の方法であり、前記システムが、少なくとも、前記選択された隔離ペンの組の各隔離ペン内に含まれる前記１つ又は複数の生物学的微小物体を前記マイクロ流体デバイスから搬出するまでの且つそれを含む前記ステップを実行する、非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項１１６】
前記システムは、請求項１に記載のシステムである、請求項１１５に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１６年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３２３，５００号及び２０１６年７月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／３６４，５６８号の利益を主張する非仮出願であり、これらの開示のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
背景
本明細書に開示される実施形態は、概して、定義されたエリア内に閉じ込められた微小物体の数量パラメータ又は品質パラメータを光学的に測定するシステム、装置及び方法に関する。より詳細には、マイクロ流体組立体内のチャンバに閉じ込められた微小物体によって生成される検体の数量を正確に特定することができる撮像システム又は方法が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
概要
一態様では、生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定するシステムが提供される。本システムは、画像取得ユニットを含み得る。画像取得ユニットは、マイクロ流体デバイスを固定可能なマイクロ流体デバイスホルダを含み得、マイクロ流体デバイスは、フロー領域及びフロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含む。複数の隔離ペンのそれぞれは、１つ又は複数の生物学的微小物体を保持することができる。画像取得ユニットは、マイクロ流体デバイスの複数の隔離ペン及びフロー領域の１つ又は複数のアッセイ画像を取得するように構成される撮像要素を更に含み得る。本システムは、画像取得ユニットに通信可能に接続される画像処理ユニットを更に含み得る。画像処理ユニットは、捕捉された各アッセイ画像を受信し、且つアッセイ画像に示される各隔離ペンの対象エリアを定義するように構成される対象エリア決定エンジンを含み得る。対象エリアは、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ隔離ペンとフロー領域との間で拡散軸に沿って延在する隔離ペン内のエリアに対応する画像エリアを含み得る。画像処理ユニットは、各隔離ペンの対象エリア内の画像エリアの少なくとも一部を分析して、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定するように構成されるスコア付けエンジンを更に含み得る。
【０００４】
別の態様では、生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定する方法が提供される。本方法は、フロー領域及びフロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含むマイクロ流体デバイスの撮像データを受信するステップを含み得る。撮像データは、検体アッセイ画像と、背景ノイズ画像及び信号基準画像の一方又は両方とを含み得る。本方法は、各隔離ペンの対象エリアを定義することを更に含み得る。対象エリアは、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ隔離ペンとフロー領域との間で拡散軸に沿って延在する隔離ペン内の画像エリアを含み得る。本方法は、各隔離ペンの対象エリアの画像エリアの少なくとも一部を分析することにより、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することを更に含み得る。
【０００５】
別の態様では、生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定する画像処理方法をコンピュータに実行させるプログラムが記憶される非一時的コンピュータ可読媒体が提供される。方法は、フロー領域及びフロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含むマイクロ流体デバイスの撮像データを受信することを含み得る。撮像データは、検体アッセイ画像と、背景ノイズ画像及び信号基準画像の一方又は両方とを含み得る。方法は、各隔離ペンの対象エリアを定義することを更に含み得る。対象エリアは、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ隔離ペンとフロー領域との間で拡散軸に沿って延在する隔離ペン内の画像エリアを含み得る。方法は、各隔離ペンの対象エリアの画像エリアの少なくとも一部を分析することにより、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することを更に含み得る。
【０００６】
別の態様では、生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団による分泌のレベルを評価する方法が提供され、本方法は、生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することであって、マイクロ流体デバイスは、フロー領域を有するエンクロージャを含み、隔離ペンは、フロー領域に流体的に接続され、隔離ペンは、第１の流体媒体を含む、導入することと、生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団に、隔離ペン内の第１の流体媒体内に検体を分泌させることと、第２の流体媒体をフロー領域に導入することであって、第２の流体媒体は、複数のリポーター分子を含み、各リポーター分子は、分泌検体に結合するように構成される結合成分、及び検出可能な標識を含む、導入することと、複数のリポーター分子の一部を隔離ペン内に拡散させ、且つそこに分泌された検体に結合させ、それにより、複数のリポーター分子：分泌検体（ＲＭＳＡ）複合体を生成することと、マイクロ流体デバイス内の対象エリア内に位置するリポーター分子を検出することであって、対象エリアは、隔離ペンの少なくとも一部を含む、検出することとを含む。
【０００７】
別の態様では、クローン株成長の方法が提供され、本方法は、個々の生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスの複数の隔離ペンのそれぞれに導入することであって、マイクロ流体デバイスは、フロー領域を有するエンクロージャを更に含み、複数のうちの隔離ペンのそれぞれは、フロー領域に流体的に接続され、且つ第１の流体媒体を含む、導入することと、各生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体のクローン集団に、対応する隔離ペンに含まれる第１の流体媒体に検体を分泌させることと、第２の流体媒体をフロー領域に導入することであって、第２の流体媒体は、複数のリポーター分子を含み、各リポーター分子は、分泌検体に結合するように構成される結合成分、及び検出可能な標識を含む、導入することと、複数のリポーター分子の一部を複数のうちの各隔離ペンに拡散させ、且つそこで分泌された検体の少なくとも一部に結合させ、それにより、複数の隔離ペンのそれぞれにおいて複数のリポーター分子：分泌検体（ＲＭＳＡ）複合体を生成することと、複数のうちの各隔離ペンについて、対応する対象エリアから発せられる信号の強度を検出することであって、対象エリアは、対応する隔離ペンの少なくとも一部を含み、対象エリアから発せられる信号の少なくとも一部は、対象エリア内に位置するリポーター分子の検出可能な標識から発せられる、検出することと、複数のうちの各隔離ペンについて、対応する対象エリアから発せられた検出された信号強度に基づいてスコアを決定することと、複数の隔離ペンから隔離ペンの組を選択することであって、その組の各隔離ペンは、それに含まれる生物学的微小物体又はクローン集団がトップ検体生成者であることを示すスコアを有する、選択することと、マイクロ流体デバイスから、選択された隔離ペンの組の各隔離ペン内に含まれる１つ又は複数の生物学的微小物体を搬出することと、対応する反応容器内において、選択された隔離ペンの組の各隔離ペンからの搬出された１つ又は複数の生物学的微小物体を増殖させることと、それぞれの対応する反応容器内で分泌された検体のレベルを特定し、それにより、各生物学的微小物体又はクローン集団の分泌のレベルを特定することとを含む
【０００８】
更に別の態様では、生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団によって分泌される検体のレベルを評価するキットが提供され、本キットは、フロー領域及び複数の隔離ペンを有するエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスであって、各隔離ペンは、フロー領域に流体的に接続され、フロー領域及び隔離ペンは、流体媒体を含むように構成される、マイクロ流体デバイスと、検出可能な標識及び検体に結合するように構成される結合成分を含むリポーター分子とを含む。
【０００９】
図面の簡単な説明
本明細書に開示される原理及びその利点をより詳細に理解するために、ここで、添付図面と併せて解釈される以下の説明が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス及び関連する制御機器と併用されるシステムの例を示す。
【図１Ｂ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す。
【図１Ｃ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す。
【図２Ａ】本開示の幾つかの実施形態による隔離ペンを示す。
【図２Ｂ】本開示の幾つかの実施形態による隔離ペンを示す。
【図２Ｃ】本開示の幾つかの実施形態による詳細な隔離ペンを示す。
【図２Ｄ】本開示の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを示す。
【図２Ｅ】本開示の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを示す。
【図２Ｆ】本開示の幾つかの他の実施形態による隔離ペンを示す。
【図２Ｇ】本開示の実施形態によるマイクロ流体デバイスを示す。
【図２Ｈ】本開示の実施形態によるマイクロ流体デバイスの被覆面を示す。
【図３Ａ】本開示の幾つかの実施形態による、マイクロ流体デバイスと併用されるシステム及び関連する制御機器の具体例を示す。
【図３Ｂ】本開示の幾つかの実施形態による撮像デバイスを示す。
【図４Ａ】本開示の幾つかの実施形態によるアッセイの図表現である。
【図４Ｂ】本開示の幾つかの実施形態によるアッセイの図表現である。
【図４Ｃ】本開示の幾つかの実施形態によるアッセイの図表現である。
【図５Ａ】本開示の幾つかの他の実施形態によるアッセイの図表現である。
【図５Ｂ】本開示の幾つかの他の実施形態によるアッセイの図表現である。
【図５Ｃ】本開示の幾つかの他の実施形態によるアッセイの図表現である。
【図６】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスのチャンバ内の拡散特性の概略図である。
【図７Ａ】本開示の幾つかの実施形態による分子の計算された拡散率の図表現である。
【図７Ｂ】本開示の幾つかの実施形態による分子の計算された拡散率の図表現である。
【図８Ａ】本開示の幾つかの実施形態による分子の計算された拡散率及び実験的に確認された拡散率の図表現である。
【図８Ｂ】本開示の幾つかの実施形態による分子の計算された拡散率及び実験的に確認された拡散率の図表現である。
【図９Ａ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスのチャンバ内の拡散特性の図表現である。
【図９Ｂ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスのチャンバ内の拡散特性の図表現である。
【図１０Ａ】本開示の幾つかの他の実施形態によるマイクロ流体デバイスのチャンバ内の拡散特性の図表現である。
【図１０Ｂ】本開示の幾つかの他の実施形態によるマイクロ流体デバイスのチャンバ内の拡散特性の図表現である。
【図１１Ａ】本開示の幾つかの更に他の実施形態によるマイクロ流体デバイスのチャンバ内の拡散特性の図表現である。
【図１１Ｂ】本開示の幾つかの更に他の実施形態によるマイクロ流体デバイスのチャンバ内の拡散特性の図表現である。
【図１２Ａ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスのチャンバ内の拡散特性及び生物学的微小物体からの産物の分泌のレベルを評価する対象エリアの図表現及び写真表現である。
【図１２Ｂ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスのチャンバ内の拡散特性及び生物学的微小物体からの産物の分泌のレベルを評価する対象エリアの図表現及び写真表現である。
【図１２Ｃ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスのチャンバ内の拡散特性及び生物学的微小物体からの産物の分泌のレベルを評価する対象エリアの図表現及び写真表現である。
【図１３Ａ】本開示の幾つかの実施形態による正規化前後のマイクロ流体デバイスの写真画像を示す。
【図１３Ｂ】本開示の幾つかの実施形態による正規化前後のマイクロ流体デバイスの写真画像を示す。
【図１４Ａ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス内のアッセイ画像及びその対象エリアのアッセイデータの図表現及び写真表現である。
【図１４Ｂ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス内のアッセイ画像及びその対象エリアのアッセイデータの図表現及び写真表現である。
【図１４Ｃ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス内のアッセイ画像及びその対象エリアのアッセイデータの図表現及び写真表現である。
【図１５】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス内の複数のチャンバのメジアン強度値のオーバーレイの図表現である。
【図１６Ａ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス内に配置された生物学的微小物体の検体分泌物の図表現である。
【図１６Ｂ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイス内に配置された生物学的微小物体の検体分泌物の図表現である。
【図１７】本開示の幾つかの実施形態による隔離ペン内に存在する生物学的微小物体によって分泌された検体の量を定量化するために実行されるステップを示す。
【図１８】本開示の幾つかの実施形態による生物学的微小物体によって分泌された検体の量を表す絶対値又は相対値を計算するために実行される一連のステップを示す。
【図１９】本開示の幾つかの実施形態による細胞のクローン集団によって分泌された献体の量を表す絶対値又は相対値を評価するために実行されるステップを示す。
【図２０】本開示の幾つかの実施形態によって生成された滴定曲線の図表現である。
【図２１】本開示の幾つかの実施形態によるペン識別情報を含むマイクロ流体デバイスの一部の正規化アッセイ画像及びアッセイスコアの写真表現である。
【図２２】本開示の幾つかの実施形態による培養及びアッセイシーケンスの過程の写真表現及び図表現である。
【図２３Ａ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスの全てのチャンバのアッセイ値の図表現である。
【図２３Ｂ】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスの全てのチャンバのアッセイ値の図表現である。
【図２４】本開示の幾つかの実施形態によるマイクロ流体デバイスの選択されたチャンバ内のクローン集団のアッセイ値と、スケールアップされた各クローン集団でのアッセイ値との相関の図表現である。
【図２５】様々な実施形態によるコンピュータシステムを示すブロック図である。
【図２６】様々な実施形態による検体の数量を評価するシステムの概略図である。
【図２７】様々な実施形態による検体の数量を評価するシステムの概略図である。
【図２８】様々な実施形態によるマイクロ流体デバイスのチャンバの断面である。
【図２９】様々な実施形態による検体の数量を特定する方法を示す例示的なフローチャートである。
【図３０】様々な実施形態による検体の数量を特定する方法を示す例示的なフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
図が必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではなく、図中の物体が必ずしも互いに関連して一定の縮尺で描かれているわけでもないことを理解されたい。図は、本明細書に開示される装置、システム及び方法の様々な実施形態に明確性及び理解をもたらすことが意図された描写である。可能な場合には常に、図面全体を通して同じ参照番号が同じ又は同様の部分を指すのに使用される。更に、図面は、決して本教示の範囲を限定することが意図されないことを理解されたい。
【００１２】
詳細な説明
本明細書は、本発明の例示的な実施形態及び用途を記載する。しかし、本発明は、これらの例示的な実施形態及び用途又は例示的な実施形態及び用途が動作する様式若しくは本明細書に記載される様式に限定されない。更に、図は、簡易化された図又は部分図を示し得、図中の要素の寸法は、強調されることもあれば、又は他の方法で一定の比率でないことがある。加えて、「上」、「付着される」、「接続される」、「結合される」又は同様の用語が本明細書において使用される場合、ある要素（例えば、材料、層、基板等）は、ある要素が他の要素の直接上にあるか、直接付着されるか、直接接続されるか、若しくは直接結合されるか否かに関係なく、又はある要素と別の要素との間に１つ若しくは複数の介在要素があるか否かに関係なく、別の要素の「上」にあり、別の要素に「付着」されるか、「接続」されるか、又は「結合」され得る。また、文脈により別のことが示される場合を除き、方向（例えば、上方、下方、上部、下部、横、上、下、の下、の上、上部の、下部の、横、縦、「ｘ」、「ｙ」、「ｚ」等）は、提供される場合、相対的なものであり、単に例として例示及び考察を容易にするために提供され、限定として提供されるものではない。加えて、要素のリスト（例えば、要素ａ、ｂ、ｃ）が言及される場合、そのような言及は、リスト自体に列挙された要素のいずれか１つ、列挙された要素の全て未満の任意の組合せ及び／又は列挙された全ての要素の組合せを包含することが意図される。本明細書でのセクション分割は、検討を容易にすることのみを目的とし、考察されるいかなる要素の組合せも限定しない。
【００１３】
マイクロ流体特徴の寸法が幅又は面積を有するものとして説明される場合、寸法は、通常、ｘ軸次元及び／又はｙ軸次元に相対して説明され、ｘ軸及びｙ軸の両方は、マイクロ流体デバイスの基板及び／又はカバーに平行する平面内にある。マイクロ流体特徴の高さは、ｚ軸方向に相対して説明され得、ｚ軸は、マイクロ流体デバイスの基板及び／又はカバーに平行する平面に直交する。幾つかの場合、チャネル又は通路等のマイクロ流体特徴の断面積は、ｘ軸／ｚ軸、ｙ軸／ｚ軸又はｘ軸／ｙ軸面積に関連し得る。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「実質的に」は、意図される目的で十分に機能することを意味する。したがって、「実質的に」という用語は、当業者により予期されるが、全体性能にそれほど影響しない等の絶対的又は完全な状態、寸法、測定、結果等からの小さくわずかな変動を可能にする。数値又は数値として表現することができるパラメータ若しくは特徴に関して使用される場合、「実質的に」は、１０％以内を意味する。
【００１５】
「１つ」という用語は、２つ以上を意味する。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１以上であり得る。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「配置される」という用語は、その意味内に「位置する」を包含する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「マイクロ流体デバイス」又は「マイクロ流体装置」は、流体を保持するように構成された１つ又は複数の別個のマイクロ流体回路であって、各マイクロ流体回路は、領域、流路、チャネル、チャンバ及び／又はペンを含むがこれに限定されない流体的に相互接続される回路要素で構成される、１つ又は複数の別個のマイクロ流体回路と、流体（及び任意選択的に流体中に懸濁した微小物体）をマイクロ流体デバイス内及び／又は外に流すように構成される少なくとも１つのポートとを含むデバイスである。通常、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路は、マイクロ流体チャネルを含み得るフロー領域及び少なくとも１つのチャンバを含み、約１ｍＬ未満、例えば、約７５０μＬ未満、約５００μＬ未満、約２５０μＬ未満、約２００μＬ未満、約１５０μＬ未満、約１００μＬ未満、約７５μＬ未満、約５０μＬ未満、約２５μＬ未満、約２０μＬ未満、約１５μＬ未満、約１０μＬ未満、約９μＬ未満、約８μＬ未満、約７μＬ未満、約６μＬ未満、約５μＬ未満、約４μＬ未満、約３μＬ未満又は約２μＬ未満の容量の流体を保持する。特定の実施形態では、マイクロ流体回路は、約１μＬ〜約２μＬ、約１μＬ〜約３μＬ、約１μＬ〜約４μＬ、約１μＬ〜約５μＬ、約２μＬ〜約５μＬ、約２μＬ〜約８μＬ、約２μＬ〜約１０μＬ、約２μＬ〜約１２μＬ、約２μＬ〜約１５μＬ、約２μＬ〜約２０μＬ、約５μＬ〜約２０μＬ、約５μＬ〜約３０μＬ、約５μＬ〜約４０μＬ、約５μＬ〜約５０μＬ、約１０μＬ〜約５０μＬ、約１０μＬ〜約７５μＬ、約１０μＬ〜約１００μＬ、約２０μＬ〜約１００μＬ、約２０μＬ〜約１５０μＬ、約２０μＬ〜約２００μＬ、約５０μＬ〜約２００μＬ、約５０μＬ〜約２５０μＬ又は約５０μＬ〜約３００μＬを保持する。マイクロ流体回路は、マイクロ流体デバイスの第１のポート（例えば、流入口）と流体的に接続される第１の端部と、マイクロ流体デバイスの第２のポート（例えば、流出口）と流体的に接続される第２の端部とを有するように構成され得る。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「ナノ流体デバイス」又は「ナノ流体装置」は、約１マイクロリットル未満、例えば、約７５０ｎＬ未満、約５００ｎＬ未満、約２５０ｎＬ未満、約２００ｎＬ未満、約１５０ｎＬ未満、約１００ｎＬ未満、約７５ｎＬ未満、約５０ｎＬ未満、約２５ｎＬ未満、約２０ｎＬ未満、約１５ｎＬ未満、約１０ｎＬ未満、約９ｎＬ未満、約８ｎＬ未満、約７ｎＬ未満、約６ｎＬ未満、約５ｎＬ未満、約４ｎＬ未満、約３ｎＬ未満、約２ｎＬ未満、約１ｎＬ未満又はそれ未満の容量の流体を保持するように構成された少なくとも１つ回路要素を含むマイクロ流体回路を有するタイプのマイクロ流体デバイスである。ナノ流体デバイスは、複数の回路要素（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、１５００個、２０００個、２５００個、３０００個、３５００個、４０００個、４５００個、５０００個、６０００個、７０００個、８０００個、９０００個、１０，０００個又はこれを超える）を含み得る。特定の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ又は複数（例えば、全て）は、約２０ｎＬから２００ｎＬ、約１００ｐＬから１ｎＬ、約１００ｐＬから２ｎＬ、約１００ｐＬから５ｎＬ、約２５０ｐＬから２ｎＬ、約２５０ｐＬから５ｎＬ、約２５０ｐＬから１０ｎＬ、約５００ｐＬから５ｎＬ、約５００ｐＬから１０ｎＬ、約５００ｐＬから１５ｎＬ、約７５０ｐＬから１０ｎＬ、約７５０ｐＬから１５ｎＬ、約７５０ｐＬから２０ｎＬ、約１ｎＬから１０ｎＬ、約１ｎＬから１５ｎＬ、約１ｎＬから２０ｎＬ、約１ｎＬから２５ｎＬ又は約１ｎＬから５０ｎＬの容量の流体を保持するように構成される。他の実施形態では、少なくとも１つの回路要素の１つ又は複数（例えば、全て）は、約１００ｎＬから２００ｎＬ、約１００ｎＬから３００ｎＬ、約１００ｖから４００ｎＬ、約１００ｎＬから５００ｎＬ、約２００ｎＬから３００ｎＬ、約２００ｎＬから４００ｎＬ、約２００ｎＬから５００ｎＬ、約２００ｎＬから６００ｎＬ、約２００ｎＬから７００ｎＬ、約２５０ｎＬから４００ｎＬ、約２５０ｎＬから５００ｎＬ、約２５０ｎＬから６００ｎＬ又は約２５０ｎＬから７５０ｎＬの容量の流体を保持するように構成される。
【００２０】
マイクロ流体デバイス又はナノ流体デバイスは、本明細書では、「マイクロ流体チップ」若しくは「チップ」又は「ナノ流体チップ」若しくは「チップ」と呼ばれることもある。
【００２１】
「マイクロ流体チャネル」又は「フローチャネル」は、本明細書では、水平寸法及び垂直寸法の両方よりもはるかに長い長さを有するマイクロ流体デバイスのフロー領域を指す。例えば、フローチャネルは、水平寸法又は垂直寸法のいずれか一方の長さの少なくとも５倍、例えば、長さの少なくとも１０倍、長さの少なくとも２５倍、長さの少なくとも１００倍、長さの少なくとも２００倍、長さの少なくとも５００倍、長さの少なくとも１，０００倍、長さの少なくとも５，０００倍又はそれを超える長さであり得る。幾つかの実施形態では、フローチャネルの長さは、その間の任意の値を含めて約１０，０００μｍから約５００，０００μｍである。幾つかの実施形態では、水平寸法は、約１００μｍから約１０００μｍ（例えば、約１５０μｍから約５００μｍ）であり、垂直寸法は、約２５μｍから約２００μｍの範囲（例えば、約４０μｍから約１５０μｍ）である。なお、フローチャネルは、マイクロ流体デバイスにおいて様々な異なる空間構成を有し得、したがって、完全に線形の要素に限定されない。例えば、フローチャネルは、以下の構成を有する１つ又は複数のセクションであり得るか、又はそれを含み得る：曲線、湾曲、螺旋、傾斜、下降、フォーク形（例えば、複数の異なる流路）及びそれらの任意の組合せ。加えて、フローチャネルは、経路に沿って異なる断面積を有し、広がり及び収縮して所望の流体フローを内部に提供し得る。フローチャネルは、弁を含み得、弁は、マイクロ流体の分野で既知の任意のタイプのものであり得る。弁を含むマイクロ流体チャネルの例は、米国特許第６，４０８，８７８号及び同第９，２２７，２００号に開示されており、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「障害物」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイス内の２つの異なる領域又は回路要素間の標的微小物体の移動を部分的に（完全にではなく）妨げるのに十分に大きいバンプ又は同様のタイプの構造物を指す。２つの異なる領域／回路要素は、例えば、マイクロ流体隔離ペンの接続領域及び分離領域であり得る。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「狭窄」という用語は、一般に、マイクロ流体デバイスでの回路要素（又は２つの回路要素間の界面）の幅の狭まりを指す。狭窄は、例えば、隔離領域と本開示のマイクロ流体隔離ペンの接続領域との間の界面に配置することができる。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「透明」という用語は、可視光が透過する際、可視光を実質的に変更せずに透過させる材料を指す。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「微小物体」という用語は、一般に、本開示により分離及び／又は操作し得る任意の顕微鏡的物体を指す。微小物体の非限定的な例としては、微粒子；微小ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ、Luminex（商標）ビーズ等）；磁性ビーズ；微小ロッド；微小ワイヤ；量子ドット等の無生物微小物体、細胞；生物学的細胞小器官；ベシクル又は複合体；合成ベシクル；リポソーム（例えば、合成又は膜標本由来）；脂質ナノクラフト（lipid nanocraft）等の生物学的微小物体、又は無生物微小物体と生物学的微小物体との組合せ（例えば、細胞に付着した微小ビーズ、リポソームコーティング微小ビーズ、リポソームコーティング磁性ビーズ等）が挙げられる。ビーズは、蛍光標識、タンパク質、炭水化物、抗原、小分子シグナリング部分又はアッセイで使用可能な他の化学／生物種等の共有結合又は非共有結合した部分／分子を含み得る。脂質ナノクラフトは、例えば、Ritchieら著、(2009)“Reconstitution of Membrane Proteins in Phospholipid Bilayer Nanodiscs”, Methods Enzymol., 464:211-231において説明されている。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は「生体細胞」と同義で使用される。生体細胞の非限定的な例としては、真核細胞、植物細胞、哺乳類細胞、爬虫類細胞、鳥類細胞、魚類細胞等の動物細胞、原核細胞、細菌細胞、真菌細胞、原生細胞等、筋肉、軟骨組織、脂肪、皮膚、肝臓、肺、神経組織等の組織から解離された細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ等の免疫細胞、胚（例えば、接合子）、卵母細胞、卵子、精子細胞、ハイブリドーマ、培養細胞、細胞株からの細胞、がん細胞、感染細胞、トランスフェクト細胞及び／又は形質転換細胞、レポーター細胞等が挙げられる。哺乳類細胞は、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、霊長類等からの細胞であり得る。
【００２７】
生体細胞のコロニーは、生殖可能なコロニー内の生細胞の全てが単一の親細胞由来の娘細胞である場合、「クローン」である。特定の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、１０以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。他の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、１４以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。他の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、１７以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。他の実施形態では、クローンコロニー内の全ての娘細胞は、２０以下の細胞分裂での単一の親細胞からのものである。「クローン細胞」という用語は、同じクローンコロニーの細胞を指す。
【００２８】
本明細書で使用される場合、生体細胞の「コロニー」は、２つ以上の細胞（例えば、約２個から約２０個、約４個から約４０個、約６個から約６０個、約８個から約８０個、約１０個から約１００個、約２０個から約２００個、約４０個から約４００個、約６０個から約６００個、約８０個から約８００個、約１００個から約１０００個又は約１０００個を超える細胞）を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「細胞を維持する」という用語は、細胞を生存した状態に保ち、及び／又は増殖させるのに必要な状況を提供する流体成分及びガス成分の両方並びに任意選択的に表面を含む環境を提供することを指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞を指す場合、細胞数の増大を指す。
【００３１】
流体媒体の「成分」は、溶媒分子、イオン、小分子、抗生物質、ヌクレオチド及びヌクレオシド、核酸、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、炭水化物、脂質、脂肪酸、コレステロール、代謝産物等を含む、媒体に存在する任意の化学分子又は生物分子である。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「捕捉部分」は、微小物体の認識部位を提供する化学種、生物種、機能又はモチーフである。選択されたクラスの微小物体は、インサイチューで生成された捕捉部分を認識し得、インサイチューで生成された捕捉部分に結合するか、又は捕捉部分への親和性を有し得る。非限定的な例として、抗原、抗体及び細胞表面結合モチーフが挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「流動性ポリマー」は、流体媒体（例えば、プレポリマー溶液）内で溶解可能又は分散可能なポリマーモノマー又はマクロマーである。流動性ポリマーは、マイクロ流体フロー領域に流入し得、内部の流体媒体の他の成分と共に流れ得る。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「光開始ポリマー」は、光に露出されると共有結合的に架橋し、特定の共有結合を形成し、硬質化化学モチーフの周囲の位置化学を変更し、又は物理的状態を変更させるイオン対を形成し、それによりポリマー網目構造を形成可能なポリマー（又はポリマーの生成に使用することができる単量体分子）を指す。幾つかの場合、光開始ポリマーは、共有結合的に架橋し、特定の共有結合を形成し、硬質化化学モチーフの周囲の位置化学を変更し、又は物理的状態を変更させるイオン対を形成することが可能な１つ又は複数の化学部分に結合するポリマーセグメントを含み得る。幾つかの場合、光開始ポリマーは、ポリマー網目構造の形成を開始する（例えば、ポリマーの重合化を介して）ために、光活性化可能なラジカル開始剤を必要とし得る。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「抗体」は、免疫グロブリン（Ｉｇ）を指し、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方、霊長類化（例えば、ヒト化）抗体、ネズミ抗体、マウス−ヒト抗体、マウス−霊長類抗体並びにキメラ抗体を含み、完全な分子、その断片（ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ）’２断片等）、又は完全な分子及び／若しくは断片の多量体若しくは凝集体であり得、天然に存在するか、又は免疫処置、合成若しくは遺伝子操作等によって製造することができる。本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、抗原を結合する、抗体に由来するか又は抗体に関係する断片を指し、幾つかの実施形態では、例えば、ガラクトース残基の組み入れにより、クリアランス及び取り込みを容易にする構造上の特徴を示すように誘導体化され得る。これには、例えば、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）及びそれらの組合せが含まれる。
【００３６】
流体媒体を参照して本明細書で使用される場合、「拡散する」及び「拡散」は、濃度勾配を下がる流体媒体の成分の熱力学的移動を指す。
【００３７】
「媒体の流れ」という語句は、拡散以外の任意のメカニズムに主に起因する流体媒体のバルク移動を意味する。例えば、媒体の流れは、ポイント間の圧力差に起因する流体媒体のあるポイントから別のポイントへの移動を含み得る。そのようなフローは、液体の連続フロー、パルスフロー、周期的フロー、ランダムフロー、断続的フロー若しくは往復フロー又はそれらの任意の組合せを含み得る。ある流体媒体が別の流体媒体中に流れる場合、媒体の乱流及び混合が生じ得る。
【００３８】
「実質的に流れがない」という語句は、流体媒体内への又は流体媒体内の材料（例えば、対象となる検体）の成分の拡散率未満である、経時平均される流体媒体の流量を指す。そのような材料の成分の拡散率は、例えば、成分の温度、サイズ及び成分と流体媒体との相互作用の強さに依存し得る。
【００３９】
マイクロ流体デバイス内の異なる領域を参照して本明細書で使用される場合、「流体的に接続される」という語句は、異なる領域が流体媒体等の流体で実質的に充填されているとき、各領域内の流体が接続されて単一の流体を形成することを意味する。これは、異なる領域内の流体（又は流体媒体）の組成が必ずしも同一であることを意味しない。正確に言えば、マイクロ流体デバイスの流体的に接続される異なる領域内の流体は、溶質が各濃度勾配を下に移動し、及び／又は流体がマイクロ流体デバイスを通って流れるとき、流動的である異なる組成（例えば、タンパク質、炭水化物、イオン又は他の分子等の異なる濃度の溶質）を有し得る。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「流路」は、媒体の流れの軌道を定義し、媒体の流れの軌道を受ける１つ又は複数の流体的に接続される回路要素（例えば、チャネル、領域、チャンバ等）を指す。したがって、流路は、マイクロ流体デバイスの掃引領域の例である。他の回路要素（例えば、非掃引領域）は、流路における媒体の流れを受けることなく、流路を含む回路要素と流体的に接続し得る。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「微小物体の分離」は、マイクロ流体デバイス内の画定エリアに微小物体を閉じ込めることを意味する。
【００４２】
マイクロ流体（又はナノ流体）デバイスは、「掃引」領域及び「非掃引」領域を含み得る。本明細書で使用される場合、「掃引」領域は、流体がマイクロ流体回路を流れているときに媒体の流れを受ける、マイクロ流体回路の１つ又は複数の流体的に相互接続される回路要素で構成される。掃引領域の回路要素は、例えば、領域、チャネル及びチャンバの全て又は一部を含み得る。本明細書で使用される場合、「非掃引」領域は、流体がマイクロ流体回路を流れているときに流体流動を実質的に受けない、マイクロ流体回路の１つ又は複数の流体的に相互接続される回路要素で構成される。非掃引領域は、流体接続が、掃引領域と非掃引領域との間の拡散が可能であるが、実質的に媒体フローがないような構造を有する場合、掃引領域に流体的に接続することができる。したがって、マイクロ流体デバイスは、実質的に掃引領域と非掃引領域との間の拡散的な流体連通のみを可能にしながら、掃引領域内の媒体のフローから非掃引領域を実質的に分離するような構造を有し得る。例えば、マイクロ流体デバイスのフローチャネルは、掃引領域の例である一方、マイクロ流体デバイスの分離領域（以下に更に詳細に説明する）は、非掃引領域の例である。
【００４３】
そのようなマイクロ流体デバイスにおいて、特定の生物学的材料（例えば、抗体等のタンパク質）を生成する生物学的微小物体（例えば、生体細胞）の能力をアッセイすることができる。アッセイの特定の実施形態では、対象となる検体の生産についてアッセイする生物学的微小物体（例えば、細胞）を含む試料材料をマイクロ流体デバイスの掃引領域に装填することができる。生物学的微小物体（例えば、ヒト細胞等の哺乳類細胞）のそれぞれは、特定の特性に関して選択することができ、非掃引領域に配置することができる。次に、残りの試料材料を掃引領域から流出させ、アッセイ材料を掃引領域に流入させることができる。選択された生物学的微小物体は、非掃引領域にあるため、選択された生物学的微小物体は、残りの試料材料の流出又はアッセイ材料の流入による影響を実質的に受けない。選択された生物学的微小物体は、対象となる検体を生成することが可能であり得、検体は、非掃引領域から掃引領域中に拡散することができ、掃引領域において、対象となる検体は、アッセイ材料と反応して、それぞれを特定の非掃引領域に相関付けることができる、局所化された検出可能反応を生成することができる。検出された反応に関連する任意の非掃引領域を分析して、非掃引領域中の生物学的微小物体のうち、対象となる検体の十分な生産者物体がある場合、それがいずれかを特定することができる。
【００４４】
マイクロ流体デバイス及びそのようなデバイスを操作し観測するシステム
図１Ａは、生物学的微小物体の維持、分離、アッセイ又は培養に使用することができるマイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の例を示す。カバー１１０を一部切り欠き、マイクロ流体デバイス１００内の部分図を提供するマイクロ流体デバイス１００の斜視図を示す。マイクロ流体デバイス１００は、一般に、流路１０６を含むマイクロ流体回路１２０を含み、流路１０６を通って流体培地１８０が流れることができ、任意選択的に１つ又は複数の微小物体（図示せず）をマイクロ流体回路１２０内及び／又はマイクロ流体回路１２０を通して搬送する。１つのマイクロ流体回路１２０が図１Ａに示されているが、適するマイクロ流体デバイスは、複数（例えば、２又は３個）のそのようなマイクロ流体回路を含むことができる。それに関係なく、マイクロ流体デバイス１００はナノ流体デバイスであるように構成され得る。図１Ａに示されるように、マイクロ流体回路１２０は、複数のマイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０を含み得、ここで、各隔離ペンは、流路１０６に流体接続する１つ又は複数の開口部を有し得る。図１Ａのデバイスの幾つかの実施形態では、隔離ペンは、流路１０６と流通する１つのみの開口部を有し得る。更に以下で考察するように、マイクロ流体隔離ペンは、培地１８０が流路１０６を通って流れているときであっても、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスに微小物体を保持するように最適化された様々な特徴及び構造を含む。しかし、上記を参照する前に、マイクロ流体デバイス１００及びシステム１５０の概説を提供する。
【００４５】
図１Ａに概して示されるように、マイクロ流体回路１２０はエンクロージャ１０２により画定される。エンクロージャ１０２は異なる構成で物理的に構造化することができるが、図１Ａに示される例では、エンクロージャ１０２は、支持構造体１０４（例えば、基部）、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０を含むものとして示されている。支持構造体１０４、マイクロ流体回路構造１０８、及びカバー１１０は、互いに取り付けることができる。例えば、マイクロ流体回路構造１０８は、支持構造体１０４の内面１０９に配置することができ、カバー１１０は、マイクロ流体回路構造１０８を覆って配置することができる。支持構造体１０４及びカバー１１０と一緒に、マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の要素を画定することができる。
【００４６】
図１Ａに示されるように、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の下部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の上部にあり得る。代替的に、支持構造体１０４及びカバー１１０は、他の向きで構成され得る。例えば、支持構造体１０４は、マイクロ流体回路１２０の上部にあり得、カバー１１０はマイクロ流体回路１２０の下部にあり得る。それに関係なく、それぞれがエンクロージャ１０２内又は外への通路を含む１つ又は複数のポート１０７があり得る。通路の例としては、弁、ゲート、貫通孔等が挙げられる。示されるように、ポート１０７は、マイクロ流体回路構造１０８のギャップにより作られる貫通孔である。しかし、ポート１０７は、カバー１１０等のエンクロージャ１０２の他の構成要素に配置することができる。１つのみのポート１０７が図１Ａに示されているが、マイクロ流体回路１２０は２つ以上のポート１０７を有することができる。例えば、流体がマイクロ流体回路１２０に入るための流入口として機能する第１のポート１０７があり得、流体がマイクロ流体回路１２０を出るための流出口として機能する第２のポート１０７があり得る。ポート１０７が流入口として機能するか、それとも流出口として機能するかは、流体が流路１０６を通って流れる方向に依存し得る。
【００４７】
支持構造体１０４は、１つ又は複数の電極（図示せず）と、基板又は複数の相互接続された基板を含むことができる。例えば、支持構造体１０４は、１つ又は複数の半導体基板を含むことができ、各半導体基板は電極に電気的に接続される（例えば、半導体基板の全て又はサブセットは、１つの電極に電気的に接続することができる）。支持構造体１０４は、プリント回路基板組立体（「ＰＣＢＡ」）を更に含むことができる。例えば、半導体基板はＰＣＢＡ上に搭載することができる。
【００４８】
マイクロ流体回路構造１０８は、マイクロ流体回路１２０の回路要素を画定することができる。そのような回路要素は、マイクロ流体回路１２０に流体が充填される場合、流体的に相互接続することができる、フロー領域（１つ又は複数のフローチャネルを含み得る）、チャンバ、ペン、トラップ等の空間又は領域を含むことができる。図１Ａに示されるマイクロ流体回路１２０では、マイクロ流体回路１０８は、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６を含む。枠１１４は、マイクロ流体回路材料１１６を部分的又は完全に囲むことができる。枠１１４は、例えば、マイクロ流体回路材料１１６を実質的に囲む比較的剛性の構造であり得る。例えば、枠１１４は金属材料を含むことができる。
【００４９】
マイクロ流体回路材料１１６には、キャビティ等をパターニングして、マイクロ流体回路１２０の回路要素及び相互接続を画定することができる。マイクロ流体回路材料１１６は、ガス透過可能であり得る可撓性ポリマー（例えば、ゴム、プラスチック、エラストマー、シリコーン、ポリジメチルシロキサン（「ＰＤＭＳ」）等）等の可撓性材料を含むことができる。マイクロ流体回路材料１１６を構成することができる材料の他の例としては、成形ガラス、シリコーン（フォトパターニング可能シリコーン又は「ＰＰＳ」）等のエッチング可能材料、フォトレジスト（例えば、ＳＵ８）等が挙げられる。幾つかの実施形態では、そのような材料  −  したがって、マイクロ流体回路材料１１６  −  は、剛性及び／又はガスを実質的に不透過であり得る。それに関係なく、マイクロ流体回路材料１１６は、支持構造体１０４上及び枠１１４内部に配置することができる。
【００５０】
カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であり得る。代替的に、カバー１１０は、図１Ａに示されるように、構造的に別個の要素であり得る。カバー１１０は、枠１１４及び／又はマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は異なる材料を含むことができる。同様に、支持構造体１０４は、示されるように枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６とは別個の構造であってもよく、又は枠１１４若しくはマイクロ流体回路材料１１６の一体部分であってもよい。同様に、枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６は、図１Ａに示されるように別個の構造であってもよく、又は同じ構造の一体部分であってもよい。
【００５１】
幾つかの実施形態では、カバー１１０は剛性材料を含むことができる。剛性材料は、ガラス又は同様との特性を有する材料であり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は変形可能材料を含むことができる。変形可能材料は、ＰＤＭＳ等のポリマーであり得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、剛性材料及び変形可能材料の両方を含むことができる。例えば、カバー１１０の１つ又は複数の部分（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０上に位置する１つ又は複数の部分）は、カバー１１０の剛性材料と界面を接する変形可能材料を含むことができる。幾つかの実施形態では、カバー１１０は１つ又は複数の電極を更に含むことができる。１つ又は複数の電極は、ガラス又は同様の絶縁材料でコーティングし得る、インジウム−錫−酸化物（ＩＴＯ）等の導電性酸化物を含むことができる。代替的に、１つ又は複数の電極は、ポリマー（例えば、ＰＤＭＳ）等の変形可能ポリマーに埋め込まれた単層ナノチューブ、多層ナノチューブ、ナノワイヤ、導電性ナノ粒子のクラスタ、又はそれらの組合せ等の可撓性電極であり得る。マイクロ流体デバイスで使用することができる可撓性電極は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０３２５６６５号（Chiouら）に記載されており、この内容は参照により本明細書に援用される。幾つかの実施形態では、カバー１１０は、細胞の接着、生存、及び／又は成長を支持するように変更することができる（例えば、マイクロ流体回路１２０に向かって内側に面する表面の全て又は部分を調整することにより）。変更は、合成ポリマー又は天然ポリマーのコーティングを含み得る。幾つかの実施形態では、カバー１１０及び／又は支持構造体１０４は、光を透過することができる。カバー１１０は、ガス透過可能な少なくとも１つの材料（例えば、ＰＤＭＳ又はＰＰＳ）を含むこともできる。
【００５２】
図１Ａは、マイクロ流体デバイス１００等のマイクロ流体デバイスを動作させ制御するシステム１５０も示す。システム１５０は、電源１９２、撮像デバイス１９４（撮像モジュール１６４内に組み込まれ、デバイス１９４自体は図１Ａに示されていない）、及び傾斜デバイス１９０（傾斜モジュール１６６の部分であり、デバイス１９０は図１Ａに示されていない）を含む。
【００５３】
電源１９２は、電力をマイクロ流体デバイス１００及び／又は傾斜デバイス１９０に提供し、バイアス電圧又は電流を必要に応じて提供することができる。電源１９２は、例えば、１つ又は複数の交流（ＡＣ）及び／又は直流（ＤＣ）電圧源又は電流源を含むことができる。撮像デバイス１９４（以下で述べられる撮像モジュール１６４の一部）は、マイクロ流体回路１２０内部の画像を捕捉する、デジタルカメラ等のデバイスを含むことができる。幾つかの場合、撮像デバイス１９４は、高速フレームレート及び／又は高感度（例えば、低光用途用）を有する検出器を更に含む。撮像デバイス１９４は、刺激放射線及び／又は光線をマイクロ流体回路１２０内に向け、マイクロ流体回路１２０（又はマイクロ流体回路１２０内に含まれる微小物体）から反射されるか、又は発せられる放射線及び／又は光線を収集する機構を含むこともできる。発せられる光線は可視スペクトル内であり得、例えば、蛍光放射を含み得る。反射光線は、ＬＥＤ又は水銀灯（例えば、高圧水銀灯）若しくはキセノンアーク灯等の広域スペクトル灯から発せられた反射放射を含み得る。図３Ｂに関して考察するように、撮像デバイス１９４は顕微鏡（又は光学縦列）を更に含み得、これは接眼レンズを含んでもよく、又は含まなくてもよい。
【００５４】
システム１５０は、１つ又は複数の回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を回転させるように構成される傾斜デバイス１９０（以下で述べられる傾斜モジュール１６６の一部）を更に含む。幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、マイクロ流体デバイス１００（したがって、マイクロ流体回路１２０）を水平向き（すなわち、ｘ軸及びｙ軸に相対して０°）、垂直向き（すなわち、ｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°）、又はそれらの間の任意の向きで保持することができるように、少なくとも１つの軸の周りでマイクロ流体回路１２０を含むエンクロージャ１０２を支持及び／又は保持するように構成される。軸に相対するマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の向きは、本明細書では、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）の「傾斜」と呼ばれる。例えば、傾斜デバイス１９０は、ｘ軸に相対して０．１°、０．２°、０．３°、０．４°、０．５°、０．６°、０．７°、０．８°、０．９°、１°、２°、３°、４°、５°、１０°、１５°、２０°、２５°、３０°、３５°、４０°、４５°、５０°、５５°、６０°、６５°、７０°、７５°、８０°、９０°、又はそれらの間の任意の度数でマイクロ流体デバイス１００を傾斜させることができる。水平向き（したがって、ｘ軸及びｙ軸）は、重力により定義される垂直軸に垂直なものとして定義される。傾斜デバイスは、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸及び／又はｙ軸に相対して９０°よりも大きい任意の角度に傾斜させるか、又はマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）をｘ軸若しくはｙ軸に相対して１８０°に傾斜させて、マイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を真逆にすることもできる。同様に、幾つかの実施形態では、傾斜デバイス１９０は、流路１０６又はマイクロ流体回路１２０の何らかの他の部分により定義される回転軸の周りでマイクロ流体デバイス１００（及びマイクロ流体回路１２０）を傾斜させる。
【００５５】
幾つかの場合、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が１つ又は複数の隔離ペンの上方又は下方に位置するように、垂直向きに傾斜する。「上方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離ペンよりも高く位置する（すなわち、流路１０６の上方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも高い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。「下方」という用語は、本明細書で使用される場合、流路１０６が、重力により定義される垂直軸上で１つ又は複数の隔離ペンよりも下に位置する（すなわち、流路１０６の下方の隔離ペン内の物体が流路内の物体よりも低い重力位置エネルギーを有する）ことを示す。
【００５６】
幾つかの場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６と平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。更に、マイクロ流体デバイス１００は、流路１０６が、隔離ペンの真上又は真下に配置されずに、１つ又は複数の隔離ペンの上方又は下方に配置されるように、９０°未満の角度に傾斜することができる。他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に直交する軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。更に他の場合、傾斜デバイス１９０は、流路１０６に平行でもなく直交もしない軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる。
【００５７】
システム１５０は培地源１７８を更に含むことができる。培地源１７８（例えば、容器、リザーバ等）は、それぞれが異なる流体培地１８０を保持する複数のセクション又は容器を含むことができる。したがって、培地源１７８は、図１Ａに示されるように、マイクロ流体デバイス１００の外部にある、マイクロ流体デバイス１００とは別個のデバイスであり得る。代替的に、培地源１７８は、全体的又は部分的に、マイクロ流体デバイス１００のエンクロージャ１０２内部に配置することができる。例えば、培地源１７８は、マイクロ流体デバイス１００の部分であるリザーバを含むことができる。
【００５８】
図１Ａは、システム１５０の一部を構成し、マイクロ流体デバイス１００と併せて利用することができる制御及び監視機器１５２の例の簡易ブロック図表現も示す。示されるように、そのような制御及び監視機器１５２の例は、培地源１７８を制御する培地モジュール１６０と、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）及び／又は培地（例えば、培地の液滴）の移動及び／又は選択を制御する原動モジュール１６２と、画像（例えば、デジタル画像）を捕捉する撮像デバイス１９４（例えば、カメラ、顕微鏡、光源、又はそれらの任意の組合せ）を制御する撮像モジュール１６４と、傾斜デバイス１９０を制御する傾斜モジュール１６６とを含むマスタコントローラ１５４を含む。制御機器１５２は、マイクロ流体デバイス１００に関する他の機能を制御、監視、又は実行する他のモジュール１６８を含むこともできる。示されるように、機器１５２は、表示デバイス１７０及び入／出力デバイス１７２を更に含むことができる。
【００５９】
マスタコントローラ１５４は、制御モジュール１５６及びデジタルメモリ１５８を含むことができる。制御モジュール１５６は、例えば、メモリ１５８内に非一時的データ又は信号として記憶される機械実行可能命令（例えば、ソフトウェア、ファームウェア、ソースコード等）に従って動作するように構成されるデジタルプロセッサを含むことができる。代替的に又は追加として、制御モジュール１５６は、ハードワイヤードデジタル回路及び／又はアナログ回路を含むことができる。培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、同様に構成され得る。したがって、マイクロ流体デバイス１００又は任意の他のマイクロ流体装置に関して実行されるものとして本明細書で考察される機能、プロセス、行動、動作、又はプロセスのステップは、上述したように構成されるマスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８の任意の１つ又は複数により実行され得る。同様に、マスタコントローラ１５４、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び／又は他のモジュール１６８は、通信可能に結合されて、本明細書において考察される任意の機能、プロセス、行動、動作、又はステップで使用されるデータを送受信し得る。
【００６０】
培地モジュール１６０は培地源１７８を制御する。例えば、培地モジュール１６０は、培地源１７８を制御して、選択された流体培地１８０をエンクロージャ１０２に入れる（例えば、流入口１０７を介して）ことができる。培地モジュール１６０は、エンクロージャ１０２からの培地の取り出し（例えば、流出口（図示せず）を通して）を制御することもできる。したがって、１つ又は複数の培地を選択的にマイクロ流体回路１２０に入れ、マイクロ流体回路１２０から搬出することができる。培地モジュール１６０は、マイクロ流体回路１２０内部の流路１０６での流体培地１８０のフローを制御することもできる。例えば、幾つかの実施形態では、培地モジュール１６０は、傾斜モジュール１６６が傾斜デバイス１９０に所望の傾斜角までマイクロ流体デバイス１００を傾斜させる前に、流路１０６内及びエンクロージャ１０２を通る培地１８０のフローを停止させる。
【００６１】
原動モジュール１６２は、マイクロ流体回路１２０での微小物体（図示せず）の選択、捕捉、及び移動を制御するように構成され得る。図１Ｂ及び図１Ｃに関して後述するように、エンクロージャ１０２は、誘電泳動（ＤＥＰ）構成、光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成、及び／又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成（図１Ａに示されず）を含むことができ、原動モジュール１６２は、電極及び／又はトランジスタ（例えば、フォトトランジスタ）のアクティブ化を制御して、流路１０６及び／又は隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０で微小物体（図示せず）及び／又は培地の液滴（図示せず）を選択し移動させることができる。
【００６２】
撮像モジュール１６４は撮像デバイス１９４を制御することができる。例えば、撮像モジュール１６４は、撮像デバイス１９４から画像データを受信し、処理することができる。撮像デバイス１９４からの画像データは、撮像デバイス１９４により捕捉された任意のタイプの情報を含むことができる（例えば、微小物体、培地の液滴、蛍光標識等の標識の蓄積の有無等）。撮像デバイス１９４により捕捉された情報を使用して、撮像モジュール１６４は、物体（例えば、微小物体、培地の液滴）の位置及び／又はマイクロ流体デバイス１００内のそのような物体の移動速度を更に計算することができる。
【００６３】
傾斜モジュール１６６は、傾斜デバイス１９０の傾斜移動を制御することができる。代替的に又は追加として、傾斜モジュール１６６は、重力を介して１つ又は複数の隔離ペンへの微小物体の移送を最適化するように、傾斜率及びタイミングを制御することができる。傾斜モジュール１６６は、撮像モジュール１６４と通信可能に結合されて、マイクロ流体回路１２０での微小物体及び／又は培地の液滴の移動を記述するデータを受信する。このデータを使用して、傾斜モジュール１６６は、マイクロ流体回路１２０の傾斜を調整して、マイクロ流体回路１２０内で微小物体及び／又は培地の液滴が移動する率を調整し得る。傾斜モジュール１６６は、このデータを使用して、マイクロ流体回路１２０内での微小物体及び／又は培地の液滴の位置を繰り返し調整することもできる。
【００６４】
図１Ａに示される例では、マイクロ流体回路１２０は、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０を含むものとして示されている。各ペンは、チャネル１２２への開口部を含むが、ペンがペン内部の微小物体を流体培地１８０及び／又はチャネル１２２の流路１０６又は他のペン内の微小物体から実質的に分離することができるように、その他では閉じられている。隔離ペンの壁は、ベースの内面１０９からカバー１１０の内面まで延び、エンクロージャを提供する。マイクロ流体チャネル１２２へのペンの開口部は、フロー１０６がペン内に向けられないように、フロー１０６に対して傾斜して向けられる。フローは、ペンの開口部の平面に対して接線方向にあり得るか又は直交し得る。幾つかの場合、ペン１２４、１２６、１２８、１３０は、１つ又は複数の微小物体をマイクロ流体回路１２０内に物理的に囲い入れるように構成される。本開示による隔離ペンは、以下に詳細に考察し示すように、ＤＥＰ、ＯＥＴ、ＯＥＷ、流体フロー、及び／又は重力との併用に最適化された様々な形状、表面、及び特徴を含むことができる。
【００６５】
マイクロ流体回路１２０は、任意の数のマイクロ流体隔離ペンを含み得る。５つの隔離ペンが示されているが、マイクロ流体回路１２０は、より少数又はより多数の隔離ペンを有し得る。示されるように、マイクロ流体回路１２０のマイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、及び１３０は、生物学的微小物体の維持、分離、アッセイ又は培養するに当たり有用な１つ又は複数の利点を提供し得る異なる特徴及び形状をそれぞれ含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、複数の同一のマイクロ流体隔離ペンを含む。
【００６６】
図１Ａに示される実施形態では、１つのチャネル１２２及び流路１０６が示される。しかし、他の実施形態は、それぞれが流路１０６を含むように構成される複数のチャネル１２２を含み得る。マイクロ流体回路１２０は、流路１０６及び流体培地１８０と流体連通する流入弁又はポート１０７を更に含み、それにより、流体培地１８０は、流入口１０７を介してチャネル１２２にアクセスすることができる。幾つかの場合、流路１０６は１つの経路を含む。幾つかの場合、１つの経路はジグザグパターンで配置され、それにより、流路１０６は、交互になった方向で２回以上にわたってマイクロ流体デバイス１００にわたり移動する。
【００６７】
幾つかの場合、マイクロ流体回路１２０は、複数の平行チャネル１２２及び流路１０６を含み、各流路１０６内の流体培地１８０は同じ方向に流れる。幾つかの場合、各流路１０６内の流体培地は、順方向又は逆方向の少なくとも一方で流れる。幾つかの場合、複数の隔離ペンは、隔離ペンが標的微小物体と並列に配置されることができるように構成される（例えば、チャネル１２２に相対して）。
【００６８】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体回路１２０は、１つ又は複数の微小物体トラップ１３２を更に含む。トラップ１３２は、一般に、チャネル１２２の境界を形成する壁に形成され、マイクロ流体隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０の１つ又は複数の開口部の逆に位置し得る。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から１つの微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの実施形態では、トラップ１３２は、流路１０６から複数の微小物体を受け取り、又は捕捉するように構成される。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の容積に概ね等しい容積を含む。
【００６９】
トラップ１３２は、標的微小物体のトラップ１３２へのフローを支援するように構成される開口部を更に含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、１つの標的微小物体の寸法に概ね等しい高さ及び幅を有する開口部を含み、それにより、より大きい微小物体が微小物体トラップに入らないようにされる。トラップ１３２は、トラップ１３２内への標的微小物体の保持を支援するように構成される他の特徴を更に含み得る。幾つかの場合、トラップ１３２は、微小流体隔離ペンの開口部と位置合わせされ、微小流体隔離ペンの開口部に関してチャネル１２２の逆側に配置され、それにより、マイクロ流体チャネル１２２に平行な軸の周りでマイクロ流体デバイス１００を傾斜されると、捕捉された微小物体は、微小物体を隔離ペンの開口部に落とす軌道でトラップ１３２を出る。幾つかの場合、トラップ１３２は、標的微小物体よりも小さく、トラップ１３２を通るフローを促進し、それによりトラップ１３２内への微小物体の捕捉確率を増大させるサイド通路１３４を含む。
【００７０】
幾つかの実施形態では、誘電泳動（ＤＥＰ）力は、１つ又は複数の電極（図示せず）を介して流体培地１８０にわたり適用されて（例えば、流路及び／又は隔離ペンにおいて）、内部に配置された微小物体の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、マイクロ流体回路１２０の１つ又は複数の部分に適用されて、１つの微小物体を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、隔離ペン（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の微小物体が隔離ペンから変位しないようにする。更に、幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力を使用して、本開示の形態により前に収集された微小物体を隔離ペンから選択的に取り出す。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力は、光電子ピンセット（ＯＥＴ）力を含む。
【００７１】
他の実施形態では、光電子ウェッティング（ＯＥＷ）力が、１つ又は複数の電極（図示せず）を介してマイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）での１つ又は複数の位置（例えば、流路及び／又は隔離ペンの画定に役立つ位置）に適用されて、マイクロ流体回路１２０に配置された液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力は支持構造体１０４（及び／又はカバー１１０）の１つ又は複数の位置に適用されて、１つの液滴を流路１０６から所望のマイクロ流体隔離ペンに輸送する。幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、隔離ペン（例えば、隔離ペン１２４、１２６、１２８、又は１３０）内の液滴が隔離ペンから変位しないようにする。更に、幾つかの実施形態では、ＯＥＷ力を使用して、本開示の形態により前に収集された液滴を隔離ペンから選択的に取り出す。
【００７２】
幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、フロー及び／又は重力等の他の力と組み合わせられて、マイクロ流体回路１２０内の微小物体及び／又は液滴の操作、輸送、分離、及びソートを行う。例えば、エンクロージャ１０２は傾斜して（例えば、傾斜デバイス１９０により）、流路１０６及び流路１０６内に配置された微小物体をマイクロ流体隔離ペンの上に位置決めすることができ、重力は、微小物体及び／又は液滴をペン内に輸送することができる。幾つかの実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の前に適用することができる。他の実施形態では、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力の後に適用することができる。更に他の場合、ＤＥＰ力及び／又はＯＥＷ力は、他の力と同時に又は他の力と交互に適用することができる。
【００７３】
図１Ｂ、図１Ｃ及び図２Ａ〜図２Ｈは、本開示の形態に使用することができるマイクロ流体デバイスの様々な実施形態を示す。図１Ｂは、マイクロ流体デバイス２００が光学作動動電学的デバイスとして構成される実施形態を示す。光電子ピンセット（ＯＥＴ）構成を有するデバイス及び光電子ウェッティング（ＯＥＷ）構成を有するデバイスを含め、様々な光学作動動電学的デバイスが当技術分野で既知である。適するＯＥＴ構成の例は、以下の米国特許文献に示されており、各文献は全体的に参照により本明細書に援用される：米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）；及び米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）。ＯＥＷ構成の例は、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）及び米国特許出願公開第２０１２／００２４７０８号（Chiouら）に示されており、これらは両方とも全体的に参照により本明細書に援用される。光学作動動電的デバイスの更に別の例は、ＯＥＴ／ＯＥＷ結合構成を含み、その例は、米国特許出願公開第２０１５０３０６５９８号（Khandrosら）及び同第２０１５０３０６５９９号（Khandrosら）並びにそれらの対応するＰＣＴ公報である国際公開第２０１５／１６４８４６号及び国際公開第２０１５／１６４８４７号に示されており、これらは全て全体的に参照により本明細書に援用される。
【００７４】
生物学的微小物体を配置し、培養し、及び／又は監視することができる隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号（出願番号１４／０６０，１１７、２０１３年１０月２２日出願）、米国特許出願公開第２０１５／０１５１２９８号（出願番号１４／５２０，５６８、２０１４年１０月２２日出願）、及び米国特許出願公開第２０１５／０１６５４３６号（出願番号１４／５２１，４４７、２０１４年１０月２２日出願）に記載されており、これらはそれぞれ全体的に参照により援用される。米国特許出願公開第１４／５２０，５６８号及び同第１４／５２１，４４７号は、マイクロ流体デバイスで培養された細胞の分泌物を分析する例示的な方法についても記載している。上記の各出願は、光電子ツイーザ（ＯＥＴ）等の誘電泳動（ＤＥＰ）力を生成するように構成されるか、又は光電子ウェッティング（ＯＥＷ）を提供するように構成されるマイクロ流体デバイスを更に記載している。例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１１６８８１号の図２に示される光電子ツイーザデバイスは、本開示の実施形態で利用して、個々の生物学的微小物体又は生物学的微小物体のグループを選択し移動させることができるデバイスの例である。
【００７５】
原動マイクロ流体デバイス構成
上述したように、システムの制御及び監視機器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体回路において微小物体又は液滴等の物体を選択し移動させる原動モジュールを含むことができる。マイクロ流体デバイスは、移動される物体のタイプ及び他の考慮事項に応じて様々な原動構成を有することができる。例えば、誘電泳動（ＤＥＰ）構成を利用して、マイクロ流体回路において微小物体を選択し移動させることができる。したがって、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の微小物体に対してＤＥＰ力を選択的に誘導し、それにより個々の微小物体又は微小物体群の選択、捕捉、及び／又は移動を行うＤＥＰ構成を含むことができる。代替的に、マイクロ流体デバイス１００の支持構造体１０４及び／又はカバー１１０は、マイクロ流体回路１２０内の流体培地１８０内の液滴に対して電子ウェッティング（ＥＷ）力を選択的に誘導し、それにより個々の液滴又は液滴群の選択、捕捉、及び／又は移動を行う電子ウェッティング（ＥＷ）構成を含むことができる。
【００７６】
ＤＥＰ構成を含むマイクロ流体デバイス２００の一例を図２１Ｂ及び図１Ｃに示す。簡潔にするために、図１Ｂ及び図１Ｃは、領域／チャンバ２０２を有するマイクロ流体デバイス２００のエンクロージャ１０２の部分の側面断面図及び上面断面図をそれぞれ示すが、領域／チャンバ２０２が、成長チャンバ、隔離ペン、フロー領域、又はフローチャネル等のより詳細な構造を有する流体回路要素の部分であり得ることを理解されたい。更に、マイクロ流体デバイス２００は他の流体回路要素を含み得る。例えば、マイクロ流体デバイス２００は、マイクロ流体デバイス１００に関して本明細書に記載される等の複数の成長チャンバ、或いは隔離ペン及び／又は１つ若しくは複数のフロー領域又はフローチャネルを含むことができる。ＤＥＰ構成は、マイクロ流体デバイス２００の任意のそのような流体回路要素に組み込み得るか、又はその部分を選択し得る。上記又は下記の任意のマイクロ流体デバイス構成要素及びシステム構成要素がマイクロ流体デバイス２００内に組みこまれ得、及び／又はマイクロ流体デバイス２００と組み合わせて使用し得ることを更に理解されたい。例えば、培地モジュール１６０、原動モジュール１６２、撮像モジュール１６４、傾斜モジュール１６６、及び他のモジュール１６８の１つ又は複数を含む上述した制御及び監視機器１５２を含むシステム１５０は、マイクロ流体デバイス２００と併用し得る。
【００７７】
図１Ｂにおいて見られるように、マイクロ流体デバイス２００は、下部電極２０４及び下部電極２０４に重なる電極活性化基板２０６を有する支持構造体１０４と、上部電極２１０を有するカバー１１０とを含み、上部電極２１０は下部電極２０４から離間される。上部電極２１０及び電極活性化基板２０６は、領域／チャンバ２０２の両面を画定する。したがって、領域／チャンバ２０２に含まれる培地１８０は、上部電極２１０と電極活性化基板２０６との間に抵抗接続を提供する。下部電極２０４と上部電極２１０との間に接続され、領域／チャンバ２０２でのＤＥＰ力の生成のために必要に応じて電極間にバイアス電圧を生成するように構成される電源２１２も示されている。電源２１２は、例えば、交流（ＡＣ）電源であり得る。
【００７８】
特定の実施形態では、図１Ｂ及び図１Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２００は、光学作動ＤＥＰ構成を有することができる。したがって、原動モジュール１６２により制御し得る光源２１６からの光２１８の変更パターンは、電極活性化基板２０６の内面２０８の領域２１４においてＤＥＰ電極の変更パターンを選択的に活性化又は非活性化することができる。（以下ではＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの領域２１４を「ＤＥＰ電極領域」と呼ぶ）。図１Ｃに示されるように、電極活性化基板２０６の内面２０８に向けられる光パターン２１８は、正方形等のパターンで、選択されたＤＥＰ電極領域２１４ａ（白色で示される）を照明することができる。照明されないＤＥＰ電極領域２１４（斜線が付される）を以下では「暗」ＤＥＰ電極領域２１４と呼ぶ。ＤＥＰ電極活性化基板２０６を通る相対電気インピーダンス（すなわち、下部電極２０４から、フロー領域１０６において培地１８０と界面を接する電極活性化基板２０６の内面２０８まで）は、各暗ＤＥＰ電極領域２１４での領域／チャンバ２０２において培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対電気インピーダンスよりも大きい。しかし、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４ａでの領域／チャンバ２０２での培地１８０を通る相対インピーダンス未満である電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスの低減を示す。
【００７９】
電源２１２が活性化されている場合、上記のＤＥＰ構成は、照明ＤＥＰ電極領域２１４ａと隣接する暗ＤＥＰ電極領域２１４との間に流体培地１８０内で電場勾配を生じさせ、次に、電場勾配は、流体培地１８０内の付近の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥する局所ＤＥＰ力を生成する。したがって、流体培地１８０内の微小物体を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光源２１６からマイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８を変更することにより、領域／チャンバ２０２の内面２０８での多くの異なるそのようなＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。ＤＥＰ力が付近の微小物体を引き寄せるか、それとも排斥するかは、電源２１２の周波数並びに培地１８０及び／又は微小物体（図示せず）の誘電特性等のパラメータに依存し得る。
【００８０】
図１Ｃに示される照明ＤＥＰ電極領域２１４ａの正方形パターン２２０は単なる例である。マイクロ流体デバイス２００に投射される光パターン２１８により、任意のパターンのＤＥＰ電極領域２１４を照明する（それにより活性化する）ことができ、照明／活性化されるＤＥＰ電極領域２１４のパターンは、光パターン２１８を変更又は移動させることにより繰り返し変更することができる。
【００８１】
幾つかの実施形態では、電極活性化基板２０６は、光伝導性材料を含むか、又は光導電性材料からなることができる。そのような実施形態では、電極活性化基板２０６の内面２０８は、特徴を有さないことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ−Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％〜４０％の水素を含むことができる（水素原子の数／水素及びケイ素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ〜約２．０μｍを有することができる。そのような実施形態では、ＤＥＰ電極領域２１４は、光パターン２１８により、電極活性化基板２０６の内面２０８上の任意の場所に任意のパターンで作成することができる。したがって、ＤＥＰ電極領域２１４の数及びパターンは、固定される必要がなく、光パターン２１８に対応することができる。上述したような光伝導層を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に援用される。
【００８２】
他の実施形態では、電極活性化基板２０６は、半導体分野で既知等の半導体集積回路を形成する複数のドープ層、絶縁層（又は領域）、及び導電層を含む基板を含むことができる。例えば、電極活性化基板２０６は、例えば、横型バイポーラフォトトランジスタを含む複数のフォトトランジスタを含むことができ、各フォトトランジスタはＤＥＰ電極領域２１４に対応する。代替的に、電極活性化基板２０６は、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができ、そのような各電極はＤＥＰ電極領域２１４に対応する。電極活性化基板２０６は、パターンになったそのようなフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等、行列に配置された実質的に正方形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する実質的に六角形のフォトトランジスタ又はフォトトランジスタ制御される電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、電気回路素子は、電極活性化基板２０６の内面２０８におけるＤＥＰ電極領域２１４と下部電極２１０との間に電気接続を形成することができ、それらの電気接続（すなわち、フォトトランジスタ又は電極）は、光パターン２１８により選択的に活性化又は非活性化することができる。活性化されない場合、各電気接続は、電極活性化基板２０６を通る（すなわち、下部電極２０４から、領域／チャンバ２０２内の培地１８０と界面を接する電極活性化電極２０６の内面２０８まで）相対インピーダンスが、対応するＤＥＰ電極領域２１４における培地１８０を通る（すなわち、電極活性化基板２０６の内面２０８からカバー１１０の上部電極２１０まで）相対インピーダンスよりも大きいような高いインピーダンスを有することができる。しかし、光パターン２１８内の光により活性化される場合、電極活性化基板２０６を通る相対インピーダンスは、各照明ＤＥＰ電極領域２１４での培地１８０を通る相対インピーダンス未満であり、それにより、上述したように、対応するＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化する。したがって、培地１８０内の微小物体（図示せず）を引き寄せるか、又は排斥するＤＥＰ電極は、光パターン２１８により決まるように、領域／チャンバ２０２での電極活性化基板２０６の内面２０８での多くの異なるＤＥＰ電極領域２１４において選択的に活性化及び非活性化することができる。
【００８３】
フォトトランジスタを含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許第７，９５６，３３９号（Ohtaら）に記載されており（例えば、図２１及び図２２に示されるデバイス３００並びにその説明を参照されたい）、この内容全体は参照により本明細書に援用される。フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を含む電極活性化基板を有するマイクロ流体デバイスの例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）に記載されており（例えば、図面全体を通して示されるデバイス２００、４００、５００、６００、及び９００並びにその説明を参照されたい）、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
【００８４】
ＤＥＰ構成のマイクロ流体デバイスの幾つかの実施形態では、上部電極２１０はエンクロージャ１０２の第１の壁（又はカバー１１０）の一部であり、電極活性化基板２０６及び下部電極２０４は、エンクロージャ１０２の第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部である。領域／チャンバ２０２は、第１の壁と第２の壁との間にあり得る。他の実施形態では、電極２１０は第２の壁（又は支持構造体１０４）の一部であり、電極活性化基板２０６及び／又は電極２１０の一方又は両方は、第１の壁（又はカバー１１０）の一部である。更に、光源２１６は代替的に、下からエンクロージャ１０２を照明するのに使用することができる。
【００８５】
ＤＥＰ構成を有する図１Ｂ及び図１Ｃのマイクロ流体デバイス２００を用いて、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をマイクロ流体デバイス２００に投射して、微小物体を囲み捕捉するパターン（例えば、正方形パターン２２０）で電極活性化基板２０６の内面２０８のＤＥＰ電極領域２１４ａでの第１の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、領域／チャンバ２０２での培地１８０内の微小物体（図示せず）を選択することができる。次に、原動モジュール１６２は、光パターン２１８をマイクロ流体デバイス２００に相対して移動させて、ＤＥＰ電極領域２１４での第２の組の１つ又は複数のＤＥＰ電極を活性化することにより、インサイチューで生成され捕捉された微小物体を移動させることができる。代替的に、マイクロ流体デバイス２００を光パターン２１８に相対して移動させることができる。
【００８６】
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、電極活性化基板２０６の内面２０８でのＤＥＰ電極の光活性化に依存しないＤＥＰ構成を有することができる。例えば、電極活性化基板２０６は、少なくとも１つの電極を含む表面（例えば、カバー１１０）とは逆に位置する、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）を選択的に開閉して、ＤＥＰ電極領域２１４でのＤＥＰ電極を活性化又は非活性化し得、それにより、活性化されたＤＥＰ電極の近傍での領域／チャンバ２０２内の微小物体（図示せず）に対する正味ＤＥＰ力を生成する。電源２１２の周波数及び培地（図示せず）及び／又は領域／チャンバ２０２内の微小物体の誘電特性等の特徴に応じて、ＤＥＰ力は、付近の微小物体を引き寄せるか、又は排斥することができる。ＤＥＰ電極の組（例えば、正方形パターン２２０を形成するＤＥＰ電極領域２１４の組における）を選択的に活性化又は非活性化することにより、領域／チャンバ２０２における１つ又は複数の微小物体を捕捉し、領域／チャンバ２０２内で移動させることができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御し、したがって、ＤＥＰ電極の個々の電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲の特定の微小物体（図示せず）を選択、捕捉、及び移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むＤＥＰ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第６，２９４，０６３号（Beckerら）及び同第６，９４２，７７６号（Medoro）に記載されており、これらの内容全体は参照により本明細書に援用される。
【００８７】
更なる別例として、マイクロ流体デバイス２００は電子ウェッティング（ＥＷ）構成を有することができ、ＥＷ構成は、ＤＥＰ構成の代わりであってもよく、又はＤＥＰ構成を有する部分とは別個のマイクロ流体デバイス２００の部分に配置されてもよい。ＥＷ構成は、光電子ウェッティング構成又は誘電体上の電子ウェッティング（ＥＷＯＤ）構成であり得、これらは両方とも当技術分野で既知である。幾つかのＥＷ構成では、支持構造体１０４は、以下に記載するように、誘電層（図示せず）と下部電極２０４との間に挟まれた電極活性化基板２０６を有する。誘電層は、疎水性材料を含むことができ、及び／又は疎水性材料でコーティングすることができる。ＥＷ構成を有するマイクロ流体デバイス２００の場合、支持構造体１０４の内面２０８は、誘電層の内面又はその疎水性コーティングである。
【００８８】
誘電層（図示せず）は、１つ又は複数の酸化物層を含むことができ、厚さ約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍ（例えば、約１２５ｎｍ〜約１７５ｎｍ）を有することができる。特定の実施形態では、誘電層は、金属酸化物（例えば、酸化アルミニウム又は酸化ハフニウム）等の酸化物の層を含むことができる。特定の実施形態では、誘電層は、酸化ケイ素又は窒化物等の金属酸化物以外の誘電材料を含むことができる。厳密な組成及び厚さに関係なく、誘電層は約１０ｋオーム〜約５０ｋオームのインピーダンスを有することができる。
【００８９】
幾つかの実施形態では、領域／チャンバ２０２に向かって内側に面した誘電層の表面は、疎水性材料でコーティングされる。疎水性材料は、例えば、フッ素化炭素分子を含むことができる。フッ素化炭素分子の例としては、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、TEFLON（登録商標）又はポリ（２，３−ジフルオロメチレニル−ペルフルオロテトラヒドロフラン）（例えば、CYTOP（商標））などのパーフルオロポリマーが挙げられる。疎水性材料を構成する分子は、誘電層の表面に共有結合され得る。例えば、疎水性材料の分子は、シロキサン基、ホスホン酸基、又はチオール基等のリンカーにより、誘電層の表面に共有結合され得る。したがって、幾つかの実施形態では、疎水性材料は、アルキル末端シロキサン、アルキル末端ホスホン酸、又はアルキル末端チオールを含むことができる。アルキル基は長鎖炭化水素（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１６個、１８個、２０個、２２個、若しくはそれを超える個数の炭素の鎖を有する）であり得る。代替的に、フッ素化（又はパーフルオロ化）炭素鎖をアルキル基の代わりに使用することができる。したがって、例えば、疎水性材料は、フルオロアルキル末端シロキサン、フルオロアルキル末端ホスホン酸、又はフルオロアルキル末端チオールを含むことができる。幾つかの実施形態では、疎水性コーティングは約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの厚さを有する。他の実施形態では、疎水性コーティングは厚さ１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５〜３．０ｎｍ）を有する。
【００９０】
幾つかの実施形態では、電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイス２００のカバー１１０も同様に疎水性材料（図示せず）でコーティングされる。疎水性材料は、支持構造体１０４の誘電層のコーティングに使用されるものと同じ疎水性材料であり得、疎水性コーティングは、支持構造体１０４の誘電層の疎水性コーティングの厚さと略同じである厚さを有することができる。更に、カバー１１０は、支持構造体１０４の様式で、誘電層と上部電極２１０との間に挟まれた電極活性化基板２０６を含むことができる。電極活性化基板２０６及びカバー１１０の誘電層は、電極活性化基板２０６及び支持構造体１０４の誘電層と同じ組成及び／又は寸法を有することができる。したがって、マイクロ流体デバイス２００は２つの電子ウェッティング表面を有することができる。
【００９１】
幾つかの実施形態では、電子活性化基板２０６は、上述した光伝導性材料等の光伝導性材料を含むことができる。したがって、特定の実施形態では、電極活性化基板２０６は、水素化非晶質シリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）の層を含むか、又はａ−Ｓｉ：Ｈの層からなることができる。ａ−Ｓｉ：Ｈは、例えば、約８％〜４０％の水素を含むことができる（水素原子の総数及びケイ素原子の総数／水素原子の総数に１００を掛けたものとして計算）。ａ−Ｓｉ：Ｈの層は厚さ約５００ｎｍ〜約２．０μｍを有することができる。代替的に、電子活性化基板２０６は、上述したように、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極（例えば、導電性金属電極）を含むことができる。光電子ウェッティング構成を有するマイクロ流体デバイスは当技術分野で既知であり、及び／又は当技術分野で既知の電極活性化基板を用いて構築することができる。例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）には、ａ−Ｓｉ：Ｈ等の光伝導性材料を有する光電子ウェッティング構成が開示されており、一方、上記で引用した米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）には、フォトトランジスタスイッチにより制御される電極を有する電極活性化基板が開示されている。
【００９２】
したがって、マイクロ流体デバイス２００は光電子ウェッティング構成を有することができ、光パターン２１８を使用して、電極活性化基板２０６での光応答性ＥＷ領域又は光応答性ＥＷ電極を活性化することができる。電極活性化基板２０６のそのような活性化されたＥＷ領域又はＥＷ電極は、支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、重なった誘電層の内面又はその疎水性コーティング）において電子ウェッティング力を生成することができる。電子活性化基板２０６に入射する光パターン２１８を変更する（又は光源２１６に相対してマイクロ流体デバイス２００を移動させる）ことにより、支持構造体１０４の内面２０８に接触する液滴（例えば、水性培地、水溶液又は水性溶媒を含む）は、領域／チャンバ２０２内に存在する不混和流体（例えば、油媒体）を通って移動することができる。
【００９３】
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２００は、ＥＷＯＤ構成を有することができ、電極活性化基板２０６は、活性化のために光に依存しない、選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を含むことができる。したがって、電極活性化基板２０６は、パターンになったそのような電子ウェッティング（ＥＷ）電極を含むことができる。パターンは、例えば、図２Ｂに示される等の行列に配置された略正方形のＥＷ電極のアレイであり得る。代替的に、パターンは、六角形格子を形成する略六角形のＥＷ電極のアレイであり得る。パターンに関係なく、ＥＷ電極は、電気スイッチ（例えば、半導体基板のトランジスタスイッチ）により選択的に活性化（又は非活性化）することができる。電極活性化基板２０６でのＥＷ電極を選択的に活性化及び非活性化することにより、重なった誘電層の内面２０８又はその疎水性コーティングに接触する液滴（図示せず）は、領域／チャンバ２０２内で移動することができる。図１Ａの原動モジュール１６２は、そのようなスイッチを制御することができ、したがって、個々のＥＷ電極を活性化及び非活性化して、領域／チャンバ２０２の周囲で特定の液滴を選択し移動させることができる。選択的にアドレス指定可能且つエネルギー付与可能な電極を有するＥＷＯＤ構成を有するマイクロ流体デバイスは、当技術分野で既知であり、例えば、米国特許第８，６８５，３４４号（Sundarsanら）に記載されており、この内容全体は参照により本明細書に援用される。
【００９４】
マイクロ流体デバイス２００の構成に関係なく、電源２１２を使用して、マイクロ流体デバイス２００の電気回路に給電する電位（例えば、ＡＣ電源電位）を提供することができる。電源２１２は、図１で参照される電源１９２と同じ又は電源１９２の構成要素であり得る。電源２１２は、上部電極２１０及び下部電極２０４にＡＣ電圧及び／又は電流を提供するように構成され得る。ＡＣ電圧の場合、電源２１２は、上述したように、領域／チャンバ２０２内の個々の微小物体（図示せず）を捕捉して移動させ、及び／又はこれらも上述したように、領域／チャンバ２０２内の支持構造体１０４の内面２０８（すなわち、誘電層及び／又は誘電層上の疎水性コーティング）のウェッティング特性を変更するのに十分に強い正味ＤＥＰ力（又は電子ウェッティング力）を生成するのに十分な周波数範囲及び平均又はピーク電力（例えば、電圧又は電流）を提供することができる。そのような周波数範囲及び平均又はピーク電力範囲は、当技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，９５８，１３２号（Chiouら）、米国特許第ＲＥ４４，７１１号（Wuら）（元々は米国特許第７，６１２，３５５号として発行された）、並びに米国特許出願公開第２０１４／０１２４３７０号（Shortら）、同第２０１５／０３０６５９８号（Khandrosら）、及び同第２０１５／０３０６５９９号（Khandrosら）を参照されたい。
【００９５】
隔離ペン。
一般的な隔離ペン２２４、２２６、及び２２８の非限定的な例は、図２Ａ〜図２Ｃに示されるマイクロ流体デバイス２３０内に示されている。各隔離ペン２２４、２２６、及び２２８は、分離領域２４０と、分離領域２４０をチャネル１２２に流体接続する接続領域２３６とを画定する分離構造体２３２を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２への基端開口部２３４及び分離領域２４０への先端開口部２３８を含むことができる。接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２から隔離ペン２２４、２２６、２２８内に流れる流体培地（図示せず）のフローの最大侵入深さが分離領域２４０内に及ばないように構成され得る。したがって、接続領域２３６に起因して、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０内に配置された微小物体（図示せず）又は他の材料（図示せず）は、チャネル１２２内の培地１８０のフローから分離され、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフローにより実質的に影響されないことができる。
【００９６】
図２Ａ〜図２Ｃの隔離ペン２２４、２２６、及び２２８は、マイクロ流体チャネル１２２に対して直接開く単一の開口部をそれぞれ有する。隔離ペンの開口部は、マイクロ流体チャネル１２２から横に開く。電極活性化基板２０６がマイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、及び２２８の両方の下にある。隔離ペンのフロアを形成する、隔離ペンのエンクロージャ内の電極活性化基板２０６の上面は、マイクロ流体デバイスのフローチャネル（又はそれぞれフロー領域）のフロアを形成する、マイクロ流体チャネル１２２（又はチャネルが存在しない場合、フロー領域）内の電極活性化基板２０６の上面と同じ高さ又は略同じ高さに配置される。電極活性化基板２０６は、特徴を有さなくてもよく、又は約３μｍ未満、約２．５μｍ未満、約２μｍ未満、約１．５μｍ未満、約１μｍ未満、約０．９μｍ未満、約０．５μｍ未満、約０．４μｍ未満、約０．２μｍ未満、約０．１μｍ未満、又はそれを下回って最高隆起部から最低陥没部まで変化する不規則又はパターン化表面を有してもよい。マイクロ流体チャネル１２２（又はフロー領域）及び隔離ペンの両方にわたる基板の上面の隆起の変動は、隔離ペンの壁の高さ又はマイクロ流体デバイスの壁の高さの約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．９％未満、約０．８％未満、約０．５％未満、約０．３％未満、又は約０．１％未満であり得る。マイクロ流体デバイス２００について詳細に説明したが、これは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイス１００、２３０、２５０、２８０、２９０、３００、４００、５００、９００、１０００、１１００、１２００にも当てはまる。
【００９７】
したがって、マイクロ流体チャネル１２２は掃引領域の例であり得、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は非掃引領域の例であり得る。述べたように、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８は、１つ又は複数の流体培地１８０を含むように構成され得る。図２Ａ〜図２Ｂに示される例では、ポート２２２はマイクロ流体チャネル１２２に接続され、流体培地１８０がマイクロ流体デバイス２３０内に導入又は外に取り出せるようにすることができる。流体培地１８０を導入する前に、マイクロ流体デバイスは、二酸化炭素ガス等のガスでプライミングし得る。マイクロ流体デバイス２３０が流体培地１８０を含むと、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は選択的に生成及び停止させることができる。例えば、示されるように、ポート２２２はマイクロ流体チャネル１２２の異なる位置（例えば、両端部）に配置することができ、流入口として機能するあるポート２２２から流出口として機能する別のポート２２２への培地のフロー２４２を生成することができる。
【００９８】
図２Ｃは、本開示による隔離ペン２２４の例の詳細図を示す。微小物体２４６の例も示されている。
【００９９】
既知のように、隔離ペン２２４の基端開口部２３４を越えたマイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、隔離ペン２２４内及び／又は外への培地１８０の２次フロー２４４を生じさせることができる。隔離ペン２２４の分離領域２４０内の微小物体２４６を２次フロー２４４から分離するために、隔離ペン２２４の接続領域２３６の長さＬｃｏｎ（すなわち、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで）は、接続領域２３６への２次フロー２４４の侵入深さＤｐよりも大きい値であるはずである。２次フロー２４４の侵入深さＤｐは、マイクロ流体チャネル１２２内を流れる流体培地１８０の速度並びにマイクロ流体チャネル１２２及びマイクロ流体チャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４の構成に関連する様々なパラメータに依存する。所与のマイクロ流体デバイスでは、マイクロ流体チャネル１２２及び開口部２３４の構成は固定され、一方、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度は可変である。したがって、隔離ペン２２４毎に、２次フロー２４４の侵入深さＤｐが接続領域２３６の長さＬｃｏｎを超えないことを保証するチャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の最高速度Ｖｍａｘを識別することができる。マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の流量が最大速度Ｖｍａｘを超えない限り、結果として生成される、マイクロ流体チャネル１２２及び接続領域２３６への２次フロー２４４を制限することができ、分離領域２４０に入らないようにすることができる。したがって、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２は、微小物体２４６を分離領域２４０外に引き込まない。むしろ、分離領域２４０内に配置された微小物体２４６は、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２に関係なく、分離領域２４０内に留まる。
【０１００】
更に、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２の流量がＶｍａｘを超えない限り、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２は、様々な粒子（例えば、微粒子及び／又はナノ粒子）をマイクロ流体チャネル１２２から隔離ペン２２４の分離領域２４０内に移動させない。したがって、接続領域２３６の長さＬｃｏｎを２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐよりも大きくすることで、ある隔離ペン２２４の、マイクロ流体チャネル１２２又は別の隔離ペン（例えば、図２Ｄの隔離ペン２２６、２２８）からの様々な粒子による汚染を回避することができる。
【０１０１】
マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の接続領域２３６は、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２により影響を及ぼすことができるため、マイクロ流体チャネル１２２及び接続領域２３６は、マイクロ流体デバイス２３０の掃引（又はフロー）領域と見なすことができる。他方、隔離ペン２２４、２２６、２２８の分離領域２４０は、非掃引（又は非フロー）領域と見なすことができる。例えば、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の流体培地１８０中の成分（図示せず）は、実質的に、マイクロ流体チャネル１２２から接続領域２３６を通り分離領域２４０内の第２の流体培地２４８への第１の培地１８０の成分の拡散によってのみ、分離領域２４０内の第２の流体培地２４８と混合することができる。同様に、分離領域２４０内の第２の培地２４８の成分（図示せず）は、実質的に、分離領域２４０から接続領域２３６を通り、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の培地１８０への第２の培地２４８の成分の拡散によってのみ、マイクロ流体チャネル１２２内の第１の培地１８０と混合することができる。幾つかの実施形態では、拡散による隔離ペンの分離領域とフロー領域との間での流体媒体交換の程度は、流体交換の約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％よりも高い割合である。第１の培地１８０は、第２の培地２４８と同じ培地であってもよく、又は異なる培地であってもよい。更に、第１の培地１８０及び第２の培地２４８は、同じ培地として開始され、異なるようになることができる（例えば、分離領域２４０内の１つ又は複数の細胞により又はマイクロ流体チャネル１２２を通って流れる培地１８０を変更することにより、第２の培地２４８を調整することを通して）。
【０１０２】
マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２により生じる２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐは、上述したように、幾つかのパラメータに依存し得る。そのようなパラメータの例としては、マイクロ流体チャネル１２２の形状（例えば、チャネルは、培地を接続領域２３６に向けることができ、接続領域２３６から培地を逸らすことができ、又はマイクロ流体チャネル１２２への接続領域２３６の基端開口部２３４に実質的に直交する方向に培地を向けることができる）、基端開口部２３４でのマイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈ（又は断面積）及び基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２の速度Ｖ、第１の培地１８０及び／又は第２の培地２４８の粘度等が挙げられる。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の寸法は、マイクロ流体チャネル１２２内の流体培地１８０のフロー２４２のベクトルに対して以下のように向けることができる：マイクロ流体チャネル幅Ｗｃｈ（又はマイクロ流体チャネル１２２の断面積）は、培地１８０のフロー２４２に略直交することができ、開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎ（又は断面積）は、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略平行であり得、及び／又は接続領域の長さＬｃｏｎは、マイクロ流体チャネル１２２内の培地１８０のフロー２４２に略直交することができる。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル１２２及び隔離ペン２２４、２２６、２２８の相対位置は、互いに対して他の向きであり得る。
【０１０４】
図２Ｃに示されるように、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４から先端開口部２３８まで均一であり得る。したがって、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の値であり得る。代替的に、先端開口部２３８での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きい値であり得る。
【０１０５】
図２Ｃに示されるように、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での基端領域２３６の幅Ｗｃｏｎと略同じであり得る。したがって、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎについて本明細書において識別された任意の値であり得る。代替的に、先端開口部２３８での分離領域２４０の幅は、基端開口部２３４での接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎよりも大きくてもよく、又は小さくてもよい。更に、先端開口部２３８は基端開口部２３４よりも小さくてよく、接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎは、基端開口部２３４と先端開口部２３８との間で狭め得る。例えば、接続領域２３６は、様々な異なるジオメトリ（例えば、接続領域を面取りする、接続領域に勾配を付ける）を使用して基端開口部と先端開口部との間で狭め得る。更に、接続領域２３６の任意の部分又はサブ部分を狭め得る（例えば、基端開口部２３４に隣接する接続領域の部分）。
【０１０６】
図２Ｄ〜図２Ｆは、図１Ａの各マイクロ流体デバイス１００、回路１３２、及びチャネル１３４の変形形態であるマイクロ流体回路２６２及びフローチャネル２６４を含むマイクロ流体デバイス２５０の別の例示的な実施形態を示す。マイクロ流体デバイス２５０は、上述した隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８の追加の変形形態である複数の隔離ペン２６６も有する。特に、図２Ｄ〜図２Ｆに示されるデバイス２５０の隔離ペン２６６をデバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０、３００、４００、５００、９００、１０００、１１００、１２００での上述した隔離ペン１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、又は２２８のいずれかで置換可能なことを理解されたい。同様に、マイクロ流体デバイス２５０は、マイクロ流体デバイス１００の別の変形形態であり、上述したマイクロ流体デバイス１００、２００、２３０、２８０、２９０、３００、４００、５００、９００、１０００、１１００、１２００と同じ又は異なるＤＥＰ構成及び本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体システム構成要素を有することもできる。
【０１０７】
図２Ｄ〜図２Ｆのマイクロ流体デバイス２５０は、支持構造体（図２Ｄ〜図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００の支持構造体１０４と同じ又は概して同様であり得る）、マイクロ流体回路構造２５６、及びカバー（図２Ｆ〜図２Ｆでは見えないが、図１Ａに示されるデバイス１００のカバー１２２と同じ又は概して同様であり得る）を含む。マイクロ流体回路構造２５６は枠２５２及びマイクロ流体回路材料２６０を含み、これらは図１Ａに示されるデバイス１００の枠１１４及びマイクロ流体回路材料１１６と同じ又は概して同様であり得る。図２Ｄに示されるように、マイクロ流体回路材料２６０により画定されるマイクロ流体回路２６２は複数のチャネル２６４（２つが示されるが、より多くのチャネルがあり得る）を含むことができ、チャネル２６４に複数の隔離ペン２６６が流体接続される。
【０１０８】
各隔離ペン２６６は、分離構造２７２、分離構造２７２内の分離領域２７０、及び接続領域２６８を含むことができる。マイクロ流体チャネル２６４の基端開口部２７４から分離構造２７２での先端開口部２７６まで、接続領域２６８はマイクロ流体チャネル２６４を分離領域２７０に流体接続する。一般に、図２Ｂ及び図２Ｃの上記考察によれば、チャネル２６４内の第１の流体培地２５４のフロー２７８は、マイクロ流体チャネル２６４から隔離ペン２６６の各接続領域２６８内及び／又は外への第１の培地２５４の２次フロー２８２をもたらすことができる。
【０１０９】
図２Ｅに示されるように、各隔離ペン２６６の接続領域２６８は、一般に、チャネル２６４の基端開口部２７４と分離構造２７２の先端開口部２７６との間に延びるエリアを含む。接続領域２６８の長さＬｃｏｎは、２次フロー２８２の最大侵入深さＤｐよりも大きい値であり得、その場合、２次フロー２８２は、分離領域２７０に向かってリダイレクトされずに接続領域２６８内に延びる（図２Ｄに示されるように）。代替的に、図２Ｆに示されるように、接続領域２６８は、最大侵入深さＤｐよりも小さい長さＬｃｏｎを有することができ、その場合、２次フロー２８２は、接続領域２６８を通って延び、分離領域２７０に向かってリダイレクトされる。この後者の状況では、接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２との和は最大侵入深さＤｐよりも大きく、したがって、２次フロー２８２は分離領域２７０内に延びない。接続領域２６８の長さＬｃｏｎが侵入深さＤｐよりも大きいか否か又は接続領域２６８の長さＬｃ１及びＬｃ２の和が侵入深さＤｐよりも大きいか否かに関係なく、最大速度Ｖｍａｘを超えないチャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８は、侵入深さＤｐを有する２次フローをもたらし、隔離ペン２６６の分離領域２７０内の微小物体（示されていないが、図２Ｃに示される微小物体２４６と同じ又は概して同様であり得る）は、チャネル２６４内の第１の培地２５４のフロー２７８により分離領域２７０外に引き出されない。チャネル２６４内のフロー２７８は、様々な材料（図示せず）もチャネル２６４から隔離ペン２６６の分離領域２７０内に引き込まない。したがって、マイクロ流体チャネル２６４内の第１の培地２５４内の成分をマイクロ流体チャネル２６４から隔離ペン２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内に移動させることができる唯一の機構は、拡散である。同様に、隔離ペン２６６の分離領域２７０内の第２の培地２５８内の成分を分離領域２７０からマイクロ流体チャネル２６４内の第１の培地２５４内に移動させることができる唯一の機構も拡散である。第１の培地２５４は、第２の培地２５８と同じ培地であり得、又は第１の培地２５４は、第２の培地２５８と異なる培地であり得る。代替的に、第１の培地２５４及び第２の培地２５８は、同じ培地から始まり、例えば、分離領域２７０内の１つ又は複数の細胞により又はマイクロ流体チャネル２６４を通って流れる培地を変更することにより、第２の培地を調整することを通して異なるようになることができる。
【０１１０】
図２Ｅに示されるように、マイクロ流体チャネル２６４内のマイクロ流体チャネル２６４の幅Ｗｃｈ（すなわち、図２Ｄにおいて矢印２７８で示されるマイクロ流体チャネルを通る流体培地フローの方向を横断してとられる）は、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１に略直交することができ、したがって、先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２に略平行であり得る。しかし、基端開口部２７４の幅ｃｏｎ１及び先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２は、互いに略直交する必要はない。例えば、基端開口部２７４の幅Ｗｃｏｎ１が向けられる軸（図示せず）と、先端開口部２７６の幅Ｗｃｏｎ２が向けられる別の軸との間の角度は、直交以外であり得、したがって、９０°以外であり得る。代替的に向けられる角度の例としては、約３０°から約９０°、約４５°から約９０°、約６０°から約９０°等を含む。
【０１１１】
隔離ペンの様々な実施形態（例えば、１２４、１２６、１２８、１３０、２２４、２２６、２２８、又は２６６）では、分離領域（例えば、２４０又は２７０）は、複数の微小物体を含むように構成される。他の実施形態では、分離領域は、１つのみ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は同様の相対的に少数の微小物体を含むように構成され得る。したがって、分離領域の容積は、例えば、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも６×１０６立方μｍ、又はこれを超える大きさであり得る。
【０１１２】
隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の幅Ｗｃｈは、約５０μｍ〜約１０００μｍ、約５０μｍ〜約５００μｍ、約５０μｍ〜約４００μｍ、約５０μｍ〜約３００μｍ、約５０μｍ〜約２５０μｍ、約５０μｍ〜約２００μｍ、約５０μｍ〜約１５０μｍ、約５０μｍ〜約１００μｍ、約７０μｍ〜約５００μｍ、約７０μｍ〜約４００μｍ、約７０μｍ〜約３００μｍ、約７０μｍ〜約２５０μｍ、約７０μｍ〜約２００μｍ、約７０μｍ〜約１５０μｍ、約９０μｍ〜約４００μｍ、約９０μｍ〜約３００μｍ、約９０μｍ〜約２５０μｍ、約９０μｍ〜約２００μｍ、約９０μｍ〜約１５０μｍ、約１００μｍ〜約３００μｍ、約１００μｍ〜約２５０μｍ、約１００μｍ〜約２００μｍ、約１００μｍ〜約１５０μｍ又は約１００μｍ〜約１２０μｍであり得る。幾つかの他の実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の幅Ｗｃｈは、約２００μｍ〜約８００μｍ、約２００μｍ〜約７００μｍ、約２００μｍ〜約６００μｍであり得る。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈは、上記の列挙した任意の終点内の任意の幅であり得る。更に、マイクロ流体チャネル１２２の幅Ｗｃｈは、隔離ペンの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域においてこれらの任意の幅であるように選択することができる。
【０１１３】
幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約３０μｍから約２００μｍ又は約５０μｍから約１５０μｍを有する。幾つかの実施形態では、隔離ペンは、約１×１０４平方μｍ〜約３×１０６平方μｍ、約２×１０４平方μｍ〜約２×１０６平方μｍ、約４×１０４平方μｍ〜約１×１０６平方μｍ、約２×１０４平方μｍ〜約５×１０５平方μｍ、約２×１０４平方μｍ〜約１×１０５平方μｍ又は約２×１０５平方μｍ〜約２×１０６平方μｍの断面積を有する。
【０１１４】
隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、以下の任意の高さ内であり得る：約２０μｍ〜約１００μｍ、約２０μｍ〜約９０μｍ、約２０μｍ〜約８０μｍ、約２０μｍ〜約７０μｍ、約２０μｍ〜約６０μｍ、約２０μｍ〜約５０μｍ、約３０μｍ〜約１００μｍ、約３０μｍ〜約９０μｍ、約３０μｍ〜約８０μｍ、約３０μｍ〜約７０μｍ、約３０μｍ〜約６０μｍ、約３０μｍ〜約５０μｍ、約４０μｍ〜約１００μｍ、約４０μｍ〜約９０μｍ、約４０μｍ〜約８０μｍ、約４０μｍ〜約７０μｍ、約４０μｍ〜約６０μｍ又は約４０μｍ〜約５０μｍ。上記は単なる例であり、マイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の高さＨｃｈは、上記の列挙した任意の終点内の高さであり得る。マイクロ流体チャネル１２２の高さＨｃｈは、隔離ペンの基端開口部以外のマイクロ流体チャネルの領域においてこれらの任意の高さであるように選択することができる。
【０１１５】
隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の断面積は、約５００平方μｍ〜約５０，０００平方μｍ、約５００平方μｍ〜約４０，０００平方μｍ、約５００平方μｍ〜約３０，０００平方μｍ、約５００平方μｍ〜約２５，０００平方μｍ、約５００平方μｍ〜約２０，０００平方μｍ、約５００平方μｍ〜約１５，０００平方μｍ、約５００平方μｍ〜約１０，０００平方μｍ、約５００平方μｍ〜約７，５００平方μｍ、約５００平方μｍ〜約５，０００平方μｍ、約１，０００平方μｍ〜約２５，０００平方μｍ、約１，０００平方μｍ〜約２０，０００平方μｍ、約１，０００平方μｍ〜約１５，０００平方μｍ、約１，０００平方μｍ〜約１０，０００平方μｍ、約１，０００平方μｍ〜約７，５００平方μｍ、約１，０００平方μｍ〜約５，０００平方μｍ、約２，０００平方μｍ〜約２０，０００平方μｍ、約２，０００平方μｍ〜約１５，０００平方μｍ、約２，０００平方μｍ〜約１０，０００平方μｍ、約２，０００平方μｍ〜約７，５００平方μｍ、約２，０００平方μｍ〜約６，０００平方μｍ、約３，０００平方μｍ〜約２０，０００平方μｍ、約３，０００平方μｍ〜約１５，０００平方μｍ、約３，０００平方μｍ〜約１０，０００平方μｍ、約，３，０００平方μｍ〜約７，５００平方μｍ又は約３，０００平方μｍから約６，０００平方μｍであり得る。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）におけるマイクロ流体チャネル（例えば、１２２）の断面積は、上記の列挙した任意の終点内の面積であり得る。
【０１１６】
隔離ペンの様々な実施形態では、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、約１μｍ〜約６００μｍ、約５μｍ〜約５５０μｍ、約１０μｍ〜約５００μｍ、約１５μｍ〜約４００μｍ、約２０μｍ〜約３００μｍ、約２０μｍ〜約５００μｍ、約４０μｍ〜約４００μｍ、約６０μｍ〜約３００μｍ、約８０μｍ〜約２００μｍ又は約１００μｍ〜約１５０μｍであり得る。上記は単なる例であり、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎは、上記の列挙した任意の終点内の長さであり得る。
【０１１７】
隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、約２０μｍ〜約５００μｍ、約２０μｍ〜約４００μｍ、約２０μｍ〜約３００μｍ、約２０μｍ〜約２００μｍ、約２０μｍ〜約１５０μｍ、約２０μｍ〜約１００μｍ、約２０μｍ〜約８０μｍ、約２０μｍ〜約６０μｍ、約３０μｍ〜約４００μｍ、約３０μｍ〜約３００μｍ、約３０μｍ〜約２００μｍ、約３０μｍ〜約１５０μｍ、約３０μｍ〜約１００μｍ、約３０μｍ〜約８０μｍ、約３０μｍ〜約６０μｍ、約４０μｍ〜約３００μｍ、約４０μｍ〜約２００μｍ、約４０μｍ〜約１５０μｍ、約４０μｍ〜約１００μｍ、約４０μｍ〜約８０μｍ、約４０μｍ〜約６０μｍ、約５０μｍ〜約２５０μｍ、約５０μｍ〜約２００μｍ、約５０μｍ〜約１５０μｍ、約５０μｍ〜約１００μｍ、約５０μｍ〜約８０μｍ、約６０μｍ〜約２００μｍ、約６０μｍ〜約１５０μｍ、約６０μｍ〜約１００μｍ、約６０μｍ〜約８０μｍ、約７０μｍ〜約１５０μｍ、約７０μｍ〜約１００μｍ又は約８０μｍ〜約１００μｍであり得る。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、上記の例と異なることができる（例えば、上記の列挙した任意の終点内の任意の値）。
【０１１８】
隔離ペンの様々な実施形態では、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、少なくとも、隔離ペンが意図される微小物体（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、卵又は胚であり得る生体細胞）の最大寸法と同じ大きさであり得る。上記は単なる例であり、基端開口部（例えば、２３４）における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎは、上記の例と異なることができる（例えば、上記の列挙した任意の終点内の任意の値）。
【０１１９】
隔離ペンの様々な実施形態では、接続領域の基端開口部における幅Ｗｐｒは、少なくとも、隔離ペンが意図される微小物体（例えば、細胞等の生物学的微小物体）の最大寸法と同じ大きさであり得る。例えば、幅Ｗｐｒは、約５０μｍ、約６０μｍ、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍであり得、又は約５０μｍ〜約３００μｍ、約５０μｍ〜約２００μｍ、約５０μｍ〜約１００μｍ、約７５μｍ〜約１５０μｍ、約７５μｍ〜約１００μｍ又は約２００μｍ〜約３００μｍであり得る。
【０１２０】
隔離ペンの様々な実施形態では、接続領域（例えば、２３６）の長さＬｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域（例えば、２３６）の幅Ｗｃｏｎとの比率は、以下の任意の比率以上であり得る：０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０又はそれを超える値。上記は単なる例であり、接続領域２３６の長さＬｃｏｎと基端開口部２３４における接続領域２３６の幅Ｗｃｏｎとの比率は、上記の例と異なり得る。
【０１２１】
マイクロ流体デバイス１００、２００、２３、２５０、２８０、２９０、３００、４００、５００、９００、１０００、１１００、１２００の様々な実施形態では、Ｖｍａｘは、約０．２ｍＬ／秒、約０．５ｍＬ／秒、約０．７ｍＬ／秒、約１．０ｍＬ／秒、約１．３ｍＬ／秒、約１．５ｍＬ／秒、約２．０ｍＬ／秒、約２．５ｍＬ／秒、約３．０ｍＬ／秒、約３．５ｍＬ／秒、約４．０ｍＬ／秒、約４．５ｍＬ／秒、約５．０ｍＬ／秒、約５．５ｍＬ／秒、約６．０ｍＬ／秒、約６．７ｍＬ／秒、約７．０ｍＬ／秒、約７．５ｍＬ／秒、約８．０ｍＬ／秒、約８．５ｍＬ／秒、約９．０ｍＬ／秒、約１０ｍＬ／秒、約１１ｍＬ／秒、約１２ｍＬ／秒、約１３ｍＬ／秒、約１４ｍＬ／秒又は約１５ｍＬ／秒に設定することができる。
【０１２２】
隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、隔離ペンの分離領域（例えば、２４０）の容積は、例えば、少なくとも５×１０５立方μｍ、少なくとも８×１０５立方μｍ、少なくとも１×１０６立方μｍ、少なくとも２×１０６立方μｍ、少なくとも４×１０６立方μｍ、少なくとも６×１０６立方μｍ、少なくとも８×１０６立方μｍ、少なくとも１×１０７立方μｍ、少なくとも５×１０７立方μｍ、少なくとも１×１０８立方μｍ、少なくとも５×１０８立方μｍ、少なくとも８×１０８立方μｍ又はそれを超え得る。隔離ペンを有するマイクロ流体デバイスの様々な実施形態では、隔離ペンの容積は、約５×１０５立方μｍ、約６×１０５立方μｍ、約８×１０５立方μｍ、約１×１０６立方μｍ、約２×１０６立方μｍ、約４×１０６立方μｍ、約８×１０６立方μｍ、約１×１０７立方μｍ、約３×１０７立方μｍ、約５×１０７立方μｍ、約８×１０７立方μｍ又はそれを超え得る。幾つかの他の実施形態では、隔離ペンの容積は、約１ｎＬから約５０ｎＬ、約２ｎＬから約２５ｎＬ、約２ｎＬから約２０ｎＬ、約２ｎＬから約１５ｎＬ又は約２ｎＬから約１０ｎＬであり得る。
【０１２３】
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、本明細書で考察された任意の実施形態におけるように構成された隔離ペンを有し、マイクロ流体デバイスは、約５個から約１０個、約１０個から約５０個、約１００個から約５００個、約２００個から約１０００個、約５００個から約１５００個、約１０００個から約２０００個、約１０００個から約３５００個、約３０００個から約７０００個、約５０００個から約１０，０００個、約９，０００個から約１５，０００個又は約１２，０００個から約２０，０００個の隔離ペンを有する。隔離ペンは、全て同じサイズである必要はなく、様々な構成（例えば、異なる幅、隔離ペン内の異なる特徴等）を含み得る。
【０１２４】
様々な実施形態では、隔離ペン４２４、４２６、４２８、５２４、５２６、５２８、６２４、９２４、１０２４、１１２４、１１２６、１４２４、１４２６は、本明細書に記載される任意の特徴、寸法又は構成要素を任意の組合せで有し得る。
【０１２５】
図２Ｇは、一実施形態によるマイクロ流体デバイス２８０を示す。図２Ｇに示されたマイクロ流体デバイス２８０は、マイクロ流体デバイス１００の定型化された図である。実際には、マイクロ流体デバイス２８０及びその構成回路要素（例えば、チャネル１２２及び隔離ペン１２８）は本明細書で考察された寸法を有する。図２Ｇに示されるマイクロ流体回路１２０は、２つのポート１０７、４つの別個のチャネル１２２、及び４つの別個の流路１０６を有する。マイクロ流体デバイス２８０は、各チャネル１２２に通じる複数の隔離ペンを更に含む。図２Ｇに示されるマイクロ流体デバイスでは、隔離ペンは、図２Ｃに示されるペンと同様のジオメトリを有し、したがって、接続領域及び分離領域の両方を有する。したがって、マイクロ流体回路１２０は、掃引領域（例えば、チャネル１２２及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐ内の接続領域２３６の部分）及び非掃引領域（例えば、分離領域２４０及び２次フロー２４４の最大侵入深さＤｐ内にない接続領域２３６の部分）の両方を含む。
【０１２６】
図３Ａ〜図３Ｂは、本開示によるマイクロ流体デバイス（例えば、１００、２００、２３０、２５０、２８０、２９０、３００、４００、５００、９００、１０００、１１００、１２００）を動作させるため及び観測のために使用することができるシステム１５０の様々な実施形態を示す。図３Ａに示されるように、システム１５０は、マイクロ流体デバイス１００（図示せず）又は本明細書に記載される任意の他のマイクロ流体デバイスを保持するように構成された構造体（「ネスト」）３００を含むことができる。ネスト３００は、マイクロ流体デバイス３２０（例えば、光学的に作動される動電学的デバイス１００）と界面を接することができ、電源１９２からマイクロ流体デバイス３２０への電気接続を提供することができるソケット３０２を含むことができる。ネスト３００は、一体型電気信号生成サブシステム３０４を更に含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されているとき、バイアス電圧がマイクロ流体デバイス３２０内の電極の対にわたり印加されるように、バイアス電圧をソケット３０２に供給するように構成され得る。したがって、電気信号生成サブシステム３０４は電源１９２の部分であり得る。バイアス電圧をマイクロ流体デバイス３２０に印加する能力は、マイクロ流体デバイス３２０がソケット３０２により保持されている場合には常にバイアス電圧が印加されることを意味しない。むしろ、大半の場合、バイアス電圧は、断続的に、例えば、マイクロ流体デバイス３２０内での電気泳動又は電子ウェッティング等の動電力の生成を促進するために必要な場合にのみ印加される。
【０１２７】
図３Ａに示されるように、ネスト３００は、プリント回路基板組立体（ＰＣＢＡ）３２２を含むことができる。電気信号生成サブシステム３０４は、ＰＣＢＡ３２２に搭載され、ＰＣＢＡ３２２に電気的に集積することができる。例示的な支持体は、同様にＰＣＢＡ３２２に搭載されるソケット３０２も含む。
【０１２８】
通常、電気信号生成サブシステム３０４は波形生成器（図示せず）を含む。電気信号生成サブシステム３０４は、波形生成器から受信される波形を増幅するように構成されたオシロスコープ（図示せず）及び／又は波形増幅回路（図示せず）を更に含むことができる。オシロスコープは、存在する場合、ソケット３０２により保持されるマイクロ流体デバイス３２０に供給される波形を測定するように構成され得る。特定の実施形態では、オシロスコープは、マイクロ流体デバイス３２０の基端位置（及び波形生成器の先端位置）において波形を測定し、それにより、デバイスに実際に印加されている波形を測定するに当たりより大きい精度を保証する。オシロスコープ測定から得られるデータは、例えば、フィードバックとして波形生成器に提供され得、波形生成器は、そのようなフィードバックに基づいて出力を調整するように構成され得る。適する結合された波形生成器及びオシロスコープの例は、Red Pitaya（商標）である。
【０１２９】
特定の実施形態では、ネスト３００は、電気信号生成サブシステム３０４の検知及び／又は制御に使用される、マイクロプロセッサ等のコントローラ３０８を更に含む。適するマイクロプロセッサの例としては、Arduino Nano（商標）等のArduino（商標）マイクロプロセッサが挙げられる。コントローラ３０８を使用して機能及び分析を実行し、又は外部マスタコントローラ１５４（図１Ａに示される）と通信して機能及び分析を実行し得る。図３Ａに示される実施形態では、コントローラ３０８は、インタフェース３１０（例えば、プラグ又はコネクタ）を通してマスタコントローラ１５４と通信する。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、ネスト３００は、Red Pitaya（商標）波形生成器／オシロスコープユニット（「Red Pitayaユニット」）を含む電気信号生成サブシステム３０４と、Red Pitayaユニットにより生成された波形を増幅し、増幅電圧をマイクロ流体デバイス１００に渡す波形増幅回路とを含むことができる。幾つかの実施形態では、Red Pitayaユニットは、マイクロ流体デバイス３２０での増幅電圧を測定し、次に、マイクロ流体デバイス３２０での測定電圧が所望の値であるように、必要に応じてそれ自体の出力電圧を調整するように構成される。幾つかの実施形態では、波形増幅回路は、ＰＣＢＡ３２２に搭載されるＤＣ−ＤＣコンバータの対により生成される＋６．５Ｖ〜−６．５Ｖ電源を有することができ、その結果、マイクロ流体デバイス１００において１３Ｖｐｐまでの信号が生成される。
【０１３１】
図３Ａに示されるように、支持構造体３００（例えば、ネスト）は、熱制御サブシステム３０６を更に含むことができる。熱制御サブシステム３０６は、支持構造体３００により保持されるマイクロ流体デバイス３２０の温度を調整するように構成され得る。例えば、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイス（図示せず）及び冷却ユニット（図示せず）を含むことができる。ペルチェ熱電デバイスは、マイクロ流体デバイス３２０の少なくとも１つの表面と界面を接するように構成された第１の表面を有することができる。冷却ユニットは、例えば、液冷アルミニウムブロック等の冷却ブロック（図示せず）であり得る。ペルチェ熱電デバイスの第２の表面（例えば、第１の表面とは逆の表面）は、そのような冷却ブロックの表面と界面を接するように構成され得る。冷却ブロックは、冷却ブロックを通して冷却流体を循環させるように構成された流体路３１４に接続することができる。図３Ａに示される実施形態では、支持構造体３００は、流入口３１６及び流出口３１８を含む、外部リザーバ（図示せず）から冷却された流体を受け取り、冷却された流体を流体路３１４に導入し、冷却ブロックを通し、次に、冷却された流体を外部リザーバに戻す。幾つかの実施形態では、ペルチェ熱電デバイス、冷却ユニット、及び／又は流体路３１４は、支持構造体３００のケース３１２に搭載することができる。幾つかの実施形態では、熱制御サブシステム３０６は、ペルチェ熱電デバイスの温度を調整して、マイクロ流体デバイス３２０の標的温度を達成するように構成される。ペルチェ熱電デバイスの温度調整は、例えば、Pololu（商標）熱電電源（Pololu Robotics and Electronics Corp.）等の熱電電源により達成することができる。熱制御サブシステム３０６は、アナログ回路により提供される温度値等のフィードバック回路を含むことができる。代替的に、フィードバック回路はデジタル回路により提供され得る。
【０１３２】
幾つかの実施形態では、ネスト３００は、抵抗（例えば、抵抗１ｋオーム＋／−０．１％、温度係数＋／−０．０２ｐｐｍ／Ｃ０）及びＮＴＣサーミスタ（例えば、公称抵抗１ｋオーム＋／−０．０１％を有する）を含むアナログ分圧回路（図示せず）であるフィードバック回路を有する熱制御サブシステム３０６を含むことができる。幾つかの場合、熱制御サブシステム３０６は、フィードバック回路からの電圧を測定し、次に、計算された温度値をオンボードＰＩＤ制御ループアルゴリズムへの入力として使用する。ＰＩＤ制御ループアルゴリズムからの出力は、例えば、Pololu（商標）モーター駆動デバイス（図示せず）上の方向信号及びパルス幅変調信号ピンの両方を駆動して熱電電源を作動させることができ、それにより、ペルチェ熱電デバイスを制御する。
【０１３３】
ネスト３００はシリアルポート３５０を含むことができ、シリアルポート３２４により、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、インタフェース３１０（図示せず）を介して外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。加えて、コントローラ３０８のマイクロプロセッサは、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６と通信することができる（例えば、Plinkツール（図示せず）を介して）。したがって、コントローラ３０８、インタフェース３１０、及びシリアルポート３２４の組合せを介して、電気信号生成サブシステム３０４及び熱制御サブシステム３０６は、外部マスタコントローラ１５４と通信することができる。このようにして、マスタコントローラ１５４は、特に、出力電圧調整のためにスケーリング計算を実行することにより電気信号生成サブシステム３０４を支援することができる。外部マスタコントローラ１５４に結合された表示デバイス１７０を介して提供されるグラフィカルユーザインタフェース（ＧＵＩ）（図示せず）は、熱制御サブシステム３０６及び電気信号生成サブシステム３０４からそれぞれ得られる温度データ及び波形データをプロットするように構成され得る。代替的に又は追加として、ＧＵＩは、コントローラ３０８、熱制御サブシステム３０６、及び電気信号生成サブシステム３０４への更新を可能にすることができる。
【０１３４】
上述したように、システム１５０は撮像デバイス１９４を含むことができる。幾つかの実施形態では、撮像デバイス１９４は光変調サブシステム３３０（図３Ｂ参照）を含む。光変調サブシステム３３０は、デジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）又はマイクロシャッタアレイシステム（ＭＳＡ）を含むことができ、これらのいずれかは、光源３３２から光を受け取り、受け取った光のサブセットを顕微鏡３５０の光学縦列に送るように構成され得る。代替的に、光変調サブシステム３３０は、有機発行ダイオードディスプレイ（ＯＬＥＤ）、液晶オンシリコン（ＬＣＯＳ）デバイス、強誘電性液晶オンシリコンデバイス（ＦＬＣＯＳ）、又は透過型液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のそれ自体の光を生成する（したがって、光源３３２の必要性をなくす）デバイスを含むことができる。光変調サブシステム３３０は、例えば、プロジェクタであり得る。したがって、光変調サブシステム３３０は、構造化光及び非構造化光の両方を発することが可能であり得る。特定の実施形態では、システム１５０の撮像モジュール１６４及び／又は原動モジュール１６２は、光変調サブシステム３３０を制御することができる。
【０１３５】
特定の実施形態では、撮像デバイス１９４は顕微鏡３５０を更に含む。そのような実施形態では、ネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０に搭載されるように個々に構成され得る。顕微鏡３５０は、例えば、標準の研究等級の光学顕微鏡又は蛍光顕微鏡であるように構成され得る。したがって、ネスト３００は、顕微鏡３５０のステージ３４４に搭載するように構成され得、及び／又は光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０のポートに搭載されるように構成され得る。他の実施形態では、本明細書に記載されるネスト３００及び光変調サブシステム３３０は、顕微鏡３５０の一体構成要素であり得る。
【０１３６】
特定の実施形態では、顕微鏡３５０は１つ又は複数の検出器３４８を更に含むことができる。幾つかの実施形態では、検出器３４８は撮像モジュール１６４により制御される。検出器３４８は、接眼レンズ、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ（例えば、デジタルカメラ）、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。少なくとも２つの検出器３４８が存在する場合、１つの検出器は、例えば、高速フレームレートカメラであり得、一方、他の検出器は高感度カメラであり得る。更に、顕微鏡３５０は、マイクロ流体デバイス３２０から反射された光及び／又は発せられた光を受け取り、反射光及び／又は放射光の少なくとも部分を１つ又は複数の検出器３４８に結像するように構成された光学縦列を含むことができる。顕微鏡の光学縦列は、各検出器での最終倍率が異なることができるように、異なる検出器で異なるチューブレンズ（図示せず）を含むこともできる。
【０１３７】
特定の実施形態では、撮像デバイス１９４は、少なくとも２つの光源を使用するように構成される。例えば、第１の光源３３２は、構造光の生成（例えば、光変調サブシステム３３０を介して）に使用することができ、第２の光源３３４は、非構造光の提供に使用することができる。第１の光源３３２は、光学作動エレクトロキネシス及び／又は蛍光励起の構造光を生成することができ、第２の光源３３４は、明視野照明の提供に使用することができる。これらの実施形態では、原動モジュール１６４を使用して、第１の光源３３２を制御することができ、撮像モジュール１６４を使用して、第２の光源３３４を制御することができる。顕微鏡３５０の光学列は、（１）構造光を光変調サブシステム３３０から受信し、デバイスがネスト３００により保持されているとき、構造光を光学作動エレクトロキネシスデバイス等のマイクロ流体デバイス内の少なくとも第１の領域に集束させ、（２）マイクロ流体デバイスから反射光及び／又は放射光を受け取り、そのような反射光及び／又は放射光の少なくとも一部を検出器３４８に集束させるように構成することができる。光学列は、非構造光を第２の光源から受け取り、デバイスがネスト３００により保持されているとき、非構造光をマイクロ流体デバイスの少なくとも第２の領域に集束させるように更に構成することができる。特定の実施形態では、マイクロ流体デバイスの第１及び第２の領域は、重複する領域であり得る。例えば、第１の領域は、第２の領域のサブセットであり得る。他の実施形態では、第２の光源３３４は、追加又は代替として、レーザを含み得、レーザは、任意の適する波長の光を有し得る。図３Ｂに示される光学システムの表現は、概略表現にすぎず、光学システムは、追加のフィルタ、ノッチフィルタ、レンズ等を含み得る。第２の光源３３４が明視野及び／又は蛍光励起用の１つ又は複数の光源及びレーザ照明を含む場合、光源の物理的配置は、図３Ｂに示される配置から異なり得、レーザ照明は、光学システムの任意の適する物理的位置に導入し得る。光源３３４及び光源３３２／光変調サブシステム３３０の概略位置も同様に交換することが可能である。
【０１３８】
図３Ｂでは、光を光変調サブシステム３３０に供給している第１の光源３３２が示されており、光変調サブシステム３３０は構造化光をシステム３５５（図示せず）の顕微鏡３５０の光学縦列に提供する。ビームスプリッタ３３６を介して非構造化光を光学縦列に提供している第２の光源３３４が示される。光変調サブシステム３３０からの構造化光及びに示されるように、第２の光源３３４からの非構造化光は、ビームスプリッタ３３６から光学縦列を通って一緒に移動して、第２のビームスプリッタ（又は光変調サブシステム３３０によって提供される光に応じて、ダイクロイックフィルタ３３８）に到達し、ここで、光は反射し、対物レンズ３３６を通して試料面３４２まで下がる。次に、試料面３４２からの反射光及び／又は放射光は再び対物レンズ３４０を通って移動し、ビームスプリッタ及び／又はダイクロイックフィルタ３３８を通り、ダイクロイックフィルタ３４６に到達する。ダイクロイックフィルタ３４６に達する光の一部のみが透過され、検出器３４８に到達する。
【０１３９】
幾つかの実施形態では、第２の光源３３４は青色光を発する。適切なダイクロイックフィルタ３４６を用いて、試料面３４２から反射された青色光は、ダイクロイックフィルタ３４６を透過し、検出器３４８に到達することが可能である。これとは対照的に、光変調サブシステム３３０から来る構造化光は、試料面３４２で反射されるが、ダイクロイックフィルタ３４６を透過しない。この例では、ダイクロイックフィルタ３４６は、４９５ｎｍよりも長い波長を有する可視光を濾波して除外する。光変調サブシステム３３０からの光のそのような濾波は、光変調サブシステムから発せられる光が４９５ｎｍよりも短いいかなる波長も含まない場合にのみ完了する（示されるように）。実際には、光変調サブシステム３３０から来る光が４９５ｎｍよりも短い波長（例えば、青色波長）を含む場合、光変調サブシステムからの光の幾らかがフィルタ３４６を透過して検出器３４８に到達する。そのような実施形態では、フィルタ３４６は、第１の光源３３２から検出器３４８に到達する光の量と第２の光源３３４から検出器３４８に到達する光の量とのバランスを変更する役割を果たす。これは、第１の光源３３２が第２の光源３３４よりもはるかに強力な場合、有益であり得る。他の実施形態では、第２の光源３３４は、赤色光を発することができ、ダイクロイックフィルタ３４６は、赤色光以外の可視光（例えば、６５０ｎｍよりも短い波長を有する可視光）を濾波して除外することができる。
【０１４０】
被覆溶液及び被覆剤。
理論による限定を意図せずに、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成及び／又はＥＷ構成マイクロ流体デバイス）内での生物学的微小物体（例えば、生体細胞）の維持は、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つ又は複数の内面が、マイクロ流体デバイスと内部に維持される生物学的微小物体との間の主な界面を提供する有機分子及び／又は親水性分子の層を提示するように調整又は被覆される場合に促進し得る（すなわち、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイス内で生存率の増大、より大きい増殖、及び／又はより大きい可搬性を示す）。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの内面の１つ又は複数（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイスの電極活性化基板の内面、マイクロ流体のカバー、及び／又は回路材料の表面）は、有機分子及び／又は親水性分子の所望の層を生成するように、被覆溶液及び／又は被覆剤により処理又は修飾し得る。
【０１４１】
被覆は、生物学的微小物体を導入する前又は後に塗布してもよく、又は生物学的微小物体と同時に導入してもよい。幾つかの実施形態では、生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の被覆剤を含む流体媒体中に搬入し得る。他の実施形態では、マイクロ流体デバイス（例えば、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス）の内面は、生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスに導入する前に、被覆剤を含む被覆溶液を用いて処理又は「プライミング」される。
【０１４２】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの表面は、生物学的微小物体の維持及び／又は増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供する（例えば、後述するような調整面を提供する）被覆剤を含む。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの略全ての内面は被覆材料を含む。被覆された内面は、フロー領域（例えば、チャネル）の表面、チャンバの表面、隔離ペンの表面、又はそれらの組合わせを含み得る。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも１つの内面を有する。他の実施形態では、複数のフロー領域又はチャネルのそれぞれは、被覆材料で被覆された少なくとも１つの内面を有する。幾つかの実施形態では、複数の隔離ペンのそれぞれ及び複数のチャネルのそれぞれの少なくとも１つの内面は、被覆材料で被覆される。
【０１４３】
被覆剤／溶液。
限定ではなく、血清又は血清因子、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリマー、洗剤、酵素、及びそれらの任意の組合わせを含む任意の従来の被覆剤／被覆溶液を使用することができる。
【０１４４】
ポリマーベースの被覆材料。
少なくとも１つの内面は、ポリマーを含む被覆材料を含み得る。ポリマーは、少なくとも１つの表面に共有結合又は非共有結合し得る（又は非特異的に付着し得る）。ポリマーは、ブロックポリマー（及びコポリマー）、星型ポリマー（星型コポリマー）、並びにグラフト又は櫛形ポリマー（グラフトコポリマー）に見られる等の多種多様な構造モチーフを有し得、これらは全て本明細書に開示される方法に適し得る。
【０１４５】
ポリマーは、アルキレンエーテル部分を含むポリマーを含み得る。広範囲のアルキレンエーテル含有ポリマーが、本明細書に記載されるマイクロ流体デバイスでの使用に適し得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの非限定的で例示的な一クラスは、ポリマー鎖内で異なる比率及び異なる場所にあるポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）サブユニット及びポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）サブユニットのブロックを含む両親媒性非イオンブロックコポリマーである。Pluronic（登録商標）ポリマー（ＢＡＳＦ）は、このタイプのブロックコポリマーであり、生細胞と接触する場合の使用に適することが当技術分野で既知である。ポリマーは、平均分子質量ＭＷで、約２０００Ｄａ〜約２０ＫＤａの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、ＰＥＯ−ＰＰＯブロックコポリマーは、約１０よりも大きい（例えば、１２〜１８）の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）を有することができる。被覆された表面をもたらすのに有用な特定のPluronic（登録商標）ポリマーは、Pluronic（登録商標）Ｌ４４、Ｌ６４、Ｐ８５、及びＦ１２７（Ｆ１２７ＮＦを含む）を含む。別のクラスのアルキレンエーテル含有ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  ＭＷ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、ＭＷ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは約１０００Ｄａ、５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、又は２０，０００ＤａのＭＷを有し得る。
【０１４６】
他の実施形態では、被覆材料は、カルボン酸部分を含むポリマーを含み得る。カルボン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリ乳酸（ＰＬＡ）である。他の実施形態では、被覆材料は、ポリマー骨格の末端又はポリマー骨格からのペンダントのいずれかにリン酸部分を含むポリマーを含み得る。更に他の実施形態では、被覆材料は、スルホン酸部分を含むポリマーを含み得る。スルホン酸サブユニットは、アルキル、アルケニル、又は芳香族部分含有サブユニットであり得る。非限定的な一例はポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳＡ）又はポリアネトールスルホン酸である。更なる実施形態では、被覆材料はアミン部分を含むポリマーを含み得る。ポリアミノポリマーは、天然ポリアミンポリマー又は合成ポリアミンポリマーを含み得る。天然ポリアミンの例としては、スペルミン、スペルミジン、及びプトレッシンが挙げられる。
【０１４７】
他の実施形態では、被覆材料は、糖類部分を含むポリマーを含み得る。非限定的な例では、キサンタンガム又はデキストラン等のポリサッカリドが、マイクロ流体デバイスにおける細胞の突き刺しを低減又は阻止し得る材料を形成するのに適し得る。例えば、約３ｋＤａのサイズを有するデキストランポリマーを使用して、マイクロ流体デバイス内の表面に被覆材料を提供し得る。
【０１４８】
他の実施形態では、被覆材料は、リボヌクレオチド部分又はデオキシリボヌクレオチド部分を有し、高分子電解質表面を提供し得る、ヌクレオチド部分、すなわち、核酸を含むポリマーを含み得る。核酸は、天然ヌクレオチド部分のみを含んでもよく、又は限定ではなく、７−デアザアデニン、ペントース、メチルホスホン酸、又はホスホロチオエート部分等の核酸塩基、リボース、リン酸塩部分類似物を含む非天然ヌクレオチド部分を含んでもよい。
【０１４９】
更に他の実施形態では、被覆材料は、アミノ酸部分を含むポリマーを含み得る。アミノ酸部分を含むポリマーは、天然アミノ酸含有ポリマー又は非天然アミノ酸含有ポリマーを含み得、これらのいずれかはペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を含み得る。非限定的な一例では、被覆剤として、タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）並びに／或いはアルブミン及び／又は１つ又は複数の他の同様のタンパク質を含む血清（又は複数の異なる血清の組合わせ）であり得る。血清は、限定ではなく、ウシ胎仔血清、ヒツジ血清、ヤギ血清、ウマ血清等を含む任意の好都合のソースからのものであり得る。特定の実施形態では、被覆溶液中のＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約１ｍｇ／ｍＬから約１００ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。特定の実施形態では、被覆溶液中の血清は、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又はそれを超えるか、若しくはそれらの間の任意の値を含め、約２０％（ｖ／ｖ）〜約５０％ｖ／ｖの濃度で存在し得る。幾つかの実施形態では、ＢＳＡは、５ｍｇ／ｍＬで被覆溶液中に被覆剤として存在し得、一方、他の実施形態では、ＢＳＡは、７０ｍｇ／ｍＬで被覆溶液中に被覆剤として存在し得る。特定の実施形態では、血清は、３０％で被覆溶液中に被覆剤として存在する。幾つかの実施形態では、フォスター細胞成長への細胞の付着を最適化するために、細胞外基質（ＥＣＭ）タンパク質を被覆材料内に提供し得る。被覆材料に包含し得る細胞基質タンパク質としては、限定ではなく、コラーゲン、エラスチン、ＲＧＤ含有ペプチド（例えば、フィブロネクチン）、又はラミニンを挙げることができる。更に他の実施形態では、成長因子、サイトカイン、ホルモン、又は他の細胞シグナリング種をマイクロ流体デバイスの被覆材料内に提供し得る。
【０１５０】
幾つかの実施形態では、被覆材料は、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、又はアミノ酸部分の２つ以上を含むポリマーを含み得る。他の実施形態では、ポリマーの調整された表面は、被覆材料に独立して又は同時に組み込み得る、アルキレンオキシド部分、カルボン酸部分、スルホン酸部分、リン酸塩部分、サッカリド部分、ヌクレオチド部分、及び／又はアミノ酸部分をそれぞれ有する２つ以上のポリマーの混合物を含み得る。
【０１５１】
共有結合される被覆材料。
幾つかの実施形態では、少なくとも１つの内面は、マイクロ流体デバイス内の生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供して、そのような細胞に調整面を提供する共有結合分子を含む。
【０１５２】
共有結合分子は結合基を含み、結合基は、後述するように、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の表面に共有結合する。結合基は、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分にも共有結合する。
【０１５３】
幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される共有結合部分は、アルキル又はフルオロアルキル（ペルフルオロアルキルを含む）部分；モノ又はポリサッカリド（デキストランを含み得るが、これに限定されない）；アルコール（プロパルギルアルコールを含むが、これに限定されない）；ポリビニルアルコールを含むが、これに限定されないポリアルコール；ポリエチレングリコールを含み得るが、これに限定されないアルキレンエーテル；高分子電解質（ポリアクリル酸又はポリビニルホスホン酸を含むが、これに限定されない）；アミノ基（アルキル化アミン、モルホルニル又はピペラジニル等であるが、これらに限定されない非芳香族化された窒素環原子を含むヒドロキシアルキル化されたアミノ基、グアニジニウム基、及びヘテロ環基等であるが、これらに限定されないその誘導体）；プロピオル酸（カルボン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないカルボン酸；エチニルホスホン酸（ホスホン酸塩アニオン表面を提供し得る）を含むが、これに限定されないホスホン酸；スルホン酸アニオン；カルボキシベタイン；スルホベタイン；スルファミン酸；又はアミノ酸を含み得る。
【０１５４】
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される共有結合部分は、アルキル部分、フルオロアルキル部分（ペルフルオロアルキル部分を含むが、これに限定されない）等の置換アルキル部分、アミノ酸部分、アルコール部分、アミノ部分、カルボン酸部分、ホスホン酸部分、スルホン酸部分、スルファミン酸部分、又はサッカリド部分等の非ポリマー部分を含み得る。代替的には、共有結合部分は、上述した任意の部分であり得るポリマー部分を含み得る。
【０１５５】
幾つかの実施形態では、共有結合部分は、線状鎖（例えば、少なくとも１０個の炭素又は少なくとも１４、１６、１８、２０、２２、若しくはそれを超える個数の炭素の線状鎖）を形成する炭素原子を含むことができ、且つ直鎖アルキル部分であり得る。幾つかの実施形態では、アルキル基は置換アルキル基を含み得る（例えば、アルキル基の炭素の幾つかはフッ素化又はパーフルオロ化することができる）。幾つかの実施形態では、アルキル基は、非置換アルキル基を含み得る第２のセグメントに結合される、ペルフルオロアルキル基を含み得る第１のセグメントを含み得る。第１及び第２のセグメントは、直接又は間接的（例えば、エーテル結合により）に結合され得、ここで、アルキル基の第１のセグメントは、結合基の先端部に配置し得、アルキル基の第２のセグメントは、結合基の基端部に配置し得る。
【０１５６】
他の実施形態では、共有結合部分は、２つ以上の種類のアミノ酸を含み得る少なくとも１つのアミノ酸を含み得る。したがって、共有結合部分は、ペプチド又はタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、共有結合部分は、双性イオン性表面を提供して、細胞成長、生存、可搬性、又はそれらの任意の組合せを支持し得るアミノ酸を含み得る。
【０１５７】
他の実施形態では、共有結合部分は、少なくとも１つのアルキレンオキシド部分を含み得、上述した任意のアルキレンオキシドポリマーを含み得る。アルキレンエーテル含有ポリマーの有用な１クラスは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  Ｍｗ＜１００，０００Ｄａ）又は代替的にはポリエチレンオキシド（ＰＥＯ、Ｍｗ＞１００，０００）である。幾つかの実施形態では、ＰＥＧは約１０００Ｄａ、約５０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、又は約２０，０００ＤａのＭｗを有し得る。
【０１５８】
共有結合部分は１つ又は複数のサッカリドを含み得る。共有結合サッカリドはモノ、ジ、又はポリサッカリドであり得る。共有結合サッカリドは、表面に付着するような結合又は加工を可能にする反応ペア部分を導入するように修飾し得る。例示的な反応ペア部分は、アルデヒド、アルキン、又はハロ部分を含み得る。ポリサッカリドは、ランダムに修飾し得、各サッカリドモノマーが修飾されてもよく、又はポリサッカリド内のサッカリドモノマーの一部のみが、表面に直接若しくは間接的に結合され得る反応ペア部分を提供するように修飾される。一例は、直鎖リンカーを介して表面に間接的に結合され得るデキストランポリサッカリドを含み得る。
【０１５９】
共有結合部分は１つ又は複数のアミノ基を含み得る。アミノ基は、置換アミン部分、グアニジン部分、窒素含有ヘテロ環部分又はヘテロアリール部分であり得る。アミノ含有部分は、マイクロ流体デバイス内及び任意選択的に隔離ペン及び／又はフロー領域（例えば、チャネル）内の環境のｐＨ変更を可能にする構造を有し得る。
【０１６０】
調整面を提供する被覆材料は、一種のみの共有結合部分を含んでもよく、又は２つ以上の異なる種類の共有結合部分を含んでもよい。例えば、フルオロアルキル調整面（ペルフルオロアルキルを含む）は、全て同じ、例えば、表面への同じ結合基及び共有結合、同じ全体長、及びフルオロアルキル部分を含む同数のフルオロメチレン単位を有する複数の共有結合部分を有し得る。代替的には、被覆材料は、表面に付着する２種類以上の共有結合部分を有し得る。例えば、被覆材料は、指定された数のメチレン又はフルオロメチレン単位を有する共有結合アルキル又はフルオロアルキル部分を有する分子を含み得、被覆面においてより嵩張った部分を提示する能力をお提供し得る、より多数のメチレン又はフルオロメチレン単位を有するアルキル又はフルオロアルキル鎖に共有結合した荷電部分を有する更なる組の分子を更に含み得る。この場合、異なる、立体的に要求が余り厳しくない末端及びより少数の骨格原子を有する第１の組の分子は、基板表面全体を官能化し、それにより基板自体を構成するケイ素／酸化ケイ素、酸化ハフニウム、又はアルミナへの望ましくない付着又は接触を回避するのに役立つことができる。別の例では、共有結合部分は、表面上でランダムに交流電荷を提示する両性イオン表面を提供し得る。
【０１６１】
調整面特性。
調整された表面の組成以外で、疎水性材料の物理的厚さ等の他の要因がＤＥＰ力に影響し得る。調整された表面が基板に形成される様式（例えば、蒸着、液相堆積、スピンコーティング、フラッディング、及び静電コーティング）等の様々な要因が調整された表面の物理的厚さを変更し得る。幾つかの実施形態では、調整面は、約１ｎｍから約１０ｎｍ、約１ｎｍから約７ｎｍ、約１ｎｍから約５ｎｍ、又はそれらの間の任意の個々の値の厚さを有する。他の実施形態では、共有結合部分により形成される調整面は、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍの厚さを有し得る。様々な実施形態では、本明細書において記載されるように準備される調整面は、１０ｎｍ未満の厚さを有する。幾つかの実施形態では、調整面の共有結合部分は、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、ＤＥＰ構成基板表面）に共有結合した場合、単層を形成し得、１０ｎｍ未満（例えば、５ｎｍ未満又は約１．５ｎｍ〜３．０ｎｍ）の厚さを有し得る。これらの値は、例えば、約３０ｎｍの厚さを典型的には有する、スピンコーティングで用意された表面の厚さとは対照的である。幾つかの実施形態では、調整面は、ＤＥＰ構成マイクロ流体デバイス内での動作に適宜機能的であるために、完全に形成された単層を必要としない。
【０１６２】
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの調整面を提供する被覆材料は、所望の電気特性を提供し得る。理論による限定を意図せずに、特定の被覆材料が被覆された表面の堅牢性に影響する一因子は、本質的に電荷捕獲である。異なる被覆材料は電子を捕獲し得、これは被覆材料の破壊に繋がる恐れがある。被覆材料の欠陥は、電荷捕獲を増大させ、被覆材料の更なる破壊に繋がる恐れがある。同様に、異なる被覆材料は異なる絶縁耐力（すなわち、絶縁破壊が生じる最小印加電場）を有し、これは電荷捕獲に影響を有し得る。特定の実施形態では、被覆材料は、その電荷捕獲量を低減又は制限する全体構造（例えば、高密度単層構造）を有することができる。
【０１６３】
調整された表面は、その電気特性に加えて、生体分子との併用に有利な特性を有することもできる。例えば、フッ化（又はパーフルオロ化）炭素鎖を含む調整された表面は、表面ファウリング量を低減するに当たり、アルキル末端鎖と比較して利点を提供し得る。表面ファウリングは、本明細書で使用される場合、タンパク質及びその老廃物、核酸及び各老廃物等のバイオ材料の永久的又は半永久的な堆積を含み得る、マイクロ流体デバイスの表面への無差別材料堆積量を指す。
【０１６４】
単一又は複数パートの調整面。
共有結合被覆材料は、後述するように、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を既に含む分子の反応により形成し得る。代替的には、共有結合被覆材料は、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分を、それ自体が表面に共有結合した表面修飾リガンドに結合することにより、２部シーケンスで形成し得る。
【０１６５】
共有結合された被覆材料を準備する方法。
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの表面（例えば、隔離ペン及び／又はフロー領域の少なくとも１つの表面を含む）に共有結合した被覆材料は、式１又は式２の構造を有する。被覆材料は、表面に１ステップで導入される場合、式１の構造を有し、一方、被覆材料は、複数ステッププロセッサで導入される場合、式２の構造を有する。
【化１】
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【０１６６】
被覆材料は、ＤＥＰ構成又はＥＷ構成基板の表面の酸化物に供給結合し得る。ＤＥＰ又はＥＷ構成基板は、ケイ素、酸化ケイ素、アルミナ、又は酸化ハフニウムを含み得る。酸化物は、基板の元の化学構造の一部として存在してもよく、又は後述するように導入し得る。
【０１６７】
被覆材料は、結合基（「ＬＧ」）を介して酸化物に結合し得、ＬＧは、シロキサン基又はホスホン酸基と酸化物との反応から形成されるシロキシ又はホスホネートエステル基であり得る。マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、本明細書に記載される任意の部分であり得る。結合基ＬＧは、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に直接又は間接的に接続し得る。結合基ＬＧがその部分に直接接続される場合、任意選択的なリンカーＬは存在せず、ｎは０である。結合基ＬＧが部分に間接的に接続される場合、リンカーＬが存在し、ｎは１である。リンカーＬは、線状部の骨格が、当技術分野で既知の化学結合制約を受けるケイ素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、硫黄原子、及び／又はリン原子の任意の組合せから選択される１から２００個の非水素原子を含み得る線状部を有し得る。それは、エーテル基、アミノ基、カルボニル基、アミド基、及び／又はリン酸基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、又はヘテロ環基から選択され得る１つ又は複数の部分の任意の組合せで中断され得る。幾つかの実施形態では、リンカーＬの骨格は１０〜２０個の炭素を含み得る。他の実施形態では、リンカーＬの骨格は約５原子〜約２００原子、約１０原子〜約８０原子、約１０原子〜約５０原子、又は約１０原子〜約４０原子を含み得る。幾つかの実施形態では、骨格原子は全て炭素原子である。
【０１６８】
幾つかの実施形態では、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分は、複数ステッププロセスで基板の表面に追加し得、上で示された式２の構造を有する。この部分は、上述した任意の部分であり得る。
【０１６９】
幾つかの実施形態では、結合基ＣＧは、反応部分Ｒｘとペアとなる反応部分Ｒｐｘ（すなわち、反応部分Ｒｘと反応するように構成される部分）との反応の結果生成される基を表す。例えば、典型的な１つの結合基ＣＧはカルボキサミジル（carboxamidyl）基を含み得、これは、アミノ基と、活性化エステル、酸クロリド等のカルボン酸の誘導体との反応の結果である。他のＣＧは、トリアゾリレン（triazolylene）基、カルボキサミジル（carboxamidyl）、チオアミジル、オキシム、メルカプチル（mercaptyl）、二硫化物、エーテル、又はアルケニル基、又は反応部分とペアとなる各反応部分との反応時に形成し得る任意の他の適する基を含み得、結合基ＣＧは、リンカーＬの第２の端部（すなわち、マイクロ流体デバイスにおける生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分に近い端部）に配置し得、これは上述した要素の任意の組合せを含み得る。幾つかの他の実施形態では、結合基ＣＧは、リンカーＬの骨格を中断し得る。結合基ＣＧは、トリアゾリレン（triazolylene）である場合、クリック結合反応からの結果である産物であり得、更に置換し得る（例えば、ジベンゾシクロオクチル溶融トリアゾリレン（triazolylene）基）。
【０１７０】
幾つかの実施形態では、被覆材料（又は表面修飾リガンド）は、化学蒸着を使用してマイクロ流体デバイスの内面に堆積する。蒸着プロセスは任意選択的に、例えば、溶媒浴への露出、超音波処理、又はそれらの組合せにより、カバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板（例えば、ＤＥＰ構成基板の電極活性化基板２０６の内面２０８又はＥＷ構成基板の支持構造体１０４の誘電層）を予めクリーニングすることにより改善することができる。代替又は追加として、そのような事前クリーニングは、カバー１１０、マイクロ流体回路材料１１６、及び／又は基板を酸素プラズマクリーナにおいて処理することを含むことができ、酸素プラズマクリーナは、様々な不純物を除去することができ、それと同時に酸化表面（例えば、表面における酸化物、本明細書に記載されるように共有結合的に修飾し得る）を導入することができる。代替的には、塩酸と過酸化水素との混合物又は硫酸と過酸化水素との混合物（例えば、硫酸と過酸化水素との比率が約３：１から約７：１であり得るピラニア溶液）等の液相処理を酸素プラズマクリーナの代わりに使用することもできる。
【０１７１】
幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス２００が組み立てられて、マイクロ流体回路１２０を画定するエンクロージャ１０２を形成した後、蒸着を使用して、マイクロ流体デバイス２００の内面を被覆し得る。理論による限定を意図せずに、そのような被覆材料を完全に組み立てられたマイクロ流体回路１２０に堆積させることは、マイクロ流体回路材料１１６と電極活性化基板２０６の誘電層及び／又はカバー１１０との結合の弱化により生じる剥離を回避するに当たり有利であり得る。２ステッププロセスが利用される実施形態では、表面修飾リガンドは、上述したように蒸着を介して導入し得、続けて、生物学的微小物体の維持／増殖に適した有機分子及び／又は親水性分子の層を提供するように構成される部分が導入される。続く反応は、表面修飾マイクロ流体デバイスを溶液中の適する結合試薬に露出させることにより実行し得る。
【０１７２】
図２Ｈは、調整面を提供する例示的な共有結合被覆材料を有するマイクロ流体デバイス２９０の断面図を示す。示されるように、被覆材料２９８（概略的に示される）は、ＤＥＰ基板であり得る基板２８６の内面２９４と、マイクロ流体デバイス２９０のカバー２８８の内面２９２と、の両方に共有結合した高密度分子の単層を含むことができる。被覆材料２９８は、幾つかの実施形態では、上述したように、マイクロ流体デバイス２９０内の回路要素及び／又は構造の画定に使用されるマイクロ流体回路材料（図示せず）の表面を含む、マイクロ流体デバイス２９０のエンクロージャ２８４に近くエンクロージャ２８４に向かって内側に面する略全ての内面２９４、２９２に配置することができる。代替の実施形態では、被覆材料２９８は、マイクロ流体デバイス２９０の内面の１つのみ又は幾つかに配置することができる。
【０１７３】
図２Ｈに示される実施形態では、被覆材料２９８は、オルガノシロキサン分子の単層を含むことができ、各分子は、シロキシリンカー２９６を介してマイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４に共有結合する。上記の被覆材料２９８のいずれかを使用することができ（例えば、アルキル末端、フルオロアルキル末端部分、ＰＥＧ末端部分、デキストラン末端部分、又はオルガノシロキサン部分に正電荷又は負電荷を含む末端部分）、末端部分は、エンクロージャに面する末端に配置される（すなわち、内面２９２、２９４に結合されず、エンクロージャ２８４に近い被覆材料２９８の単層の部分）。
【０１７４】
他の実施形態では、マイクロ流体デバイス２９０の内面２９２、２９４の被覆に使用される被覆材料２９８はアニオン部分、カチオン部分、両性イオン部分、又はそれらの任意の組合せを含むことができる。理論による限定を意図せずに、カチオン部分、アニオン部分、及び／又は両性イオン部分をマイクロ流体回路１２０のエンクロージャ２８４の内面に提示することにより、被覆材料２９８は、その結果生成される水和の水が、生物学的微小物体を非生物学的分子（例えば、基板のケイ素及び／又は酸化ケイ素）との相互作用から分離する層（又は「シールド」）として機能するような、強力な水との水素結合を形成することができる。加えて、被覆材料２９８が被覆剤と併用される実施形態では、被覆材料２９８のアニオン、カチオン、又は両性イオンは、エンクロージャ２８４内の媒体１８０（例えば、被覆溶液）中に存在する非共有結合被覆剤（例えば、溶液中のタンパク質）の荷電部分とイオン結合を形成することができる。
【０１７５】
更に他の実施形態では、被覆材料は、エンクロージャに面した末端において親水性被覆剤を含み得るか、又は提示するように化学的に修飾し得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、ＰＥＧ等のアルキレンエーテル含有ポリマーを含み得る。幾つかの実施形態では、被覆材料は、デキストラン等のポリサッカリドを含み得る。上述した荷電部分（例えば、アニオン部分、カチオン部分、及び両性イオン部分）のように、親水性被覆剤は、その結果生成される水和の水が、生物学的微小物体を非生物学的分子（例えば、基板のケイ素及び／又は酸化ケイ素）との相互作用から分離する層（又は「シールド」）として機能するような、強力な水との水素結合を形成することができる。
【０１７６】
適切な被覆処理及び修飾の更なる詳細については、２０１６年４月２２日に出願された米国特許出願公開第１５／１３５，７０７号において見出し得、この特許出願は全体的に参照により本明細書に援用される。
【０１７７】
マイクロ流体デバイスの隔離ペン内の細胞の生存性を維持する追加のシステム構成要素。
細胞集団の成長及び／又は増殖を促進するために、システムの追加の構成要素により、機能的な細胞の維持を促す環境状況を提供し得る。例えば、そのような追加の構成要素は、栄養素、細胞成長シグナリング種、ｐＨ調整、ガス交換、温度制御、及び細胞からの老廃物の除去を提供することができる。
【０１７８】
生物学的微小物体によって分泌された検体のアッセイ。
幾つかの実施形態では、本開示は、隔離ペン内に存在する生体分子を定量化する方法、システム及びデバイスを提供する。幾つかの実施形態では、生体分子は、生体細胞の分泌検体又は分泌検体を生成可能な任意の他の生物学的微小有機物である。
【０１７９】
生物学的生産業界では、深刻な一問題は、現在利用可能な機器及びワークフローを利用した場合の所望のレベルの生産及び生育習性を有するクローン集団の識別における費用、時間及び困難性である。例えば、新しい抗体生産ラインの開発は、数ヶ月の仕事及び数百万ドルを人員、機器及び材料に費やすことがある。本明細書に記載されるように、個々の創始細胞の播種後３日、４日、５日、６日又は７日等の増殖中の集団のかなり初期に、マイクロ流体デバイス内の見込のあるクローンをスクリーニング及び識別する能力は、多くの場合、時間的及びコスト的に大きい利点であり得る。ナノ流体環境、特に本明細書に記載されるような隔離ペンに基づくものが、互いからのクローン手段の典型的な分離を提供し、マイクロ流体デバイス内に位置する他のクローン集団からの汚染なしで、個々の各クローン集団からアッセイ結果を得る能力が可能になることが本出願人により発見された。クローン増殖の初期段階で実行される場合でも、本明細書に記載される方法を使用して分泌検体の相対量又は絶対量を特定するアッセイは、より典型的な増殖のマイクロスケール規模（例えば、振とうフラスコ等）で所望の分泌検体の生産に相関付けられ得ることも発見されている。更に、そのような初期段階で個々のクローンをスクリーニングする能力により、成長率及び／又はよりロバストな生産（例えば、代謝老廃物又は栄養物の枯渇等の培養環境内の材料レベルにより高い耐性を有する高生産性クローン）という特定の要件を満たす所望のクローンの識別も可能である。
【０１８０】
本出願人により発見された別の利点は、本明細書に記載されるナノ流体チャンバ（例えば、隔離ペン）により、極めて小量で数千までの個々の創始細胞の同時成長／アッセイを同時に行うことができるため、過度のリソースを使用せずに、クローン集団の潜在的な創始細胞としての複数の細胞のより完全な増殖を行い得ることである。
【０１８１】
更に、本明細書に記載されるナノ流体環境では、繰り返されるアッセイからのフィードバックを用いて、細胞に対する特定の条件の影響を調べることができる。例えば、細胞の分泌産物（本明細書の方法では検体）の大規模生産により密に関連する培養培地等の条件及び材料を使用して、更に調べるのに最も適したクローンを発見し且つ特徴付け得る。別の例では、Ｂ細胞抗体刺激の多様な刺激プロトコールをより再現可能なように調べることができ、あるプロトコールよりも優れた別のプロトコールの利点をより同等に評価するためにアッセイし得る。
【０１８２】
拡散プロファイルを使用した検出及び定量化。
本明細書に記載されるように、生物学的微小物体の分泌検体量は、分泌検体に結合するリポーター分子を使用して定量化し得る。リポーター分子は、定量化される分泌検体に結合する結合成分と、リポーター分子量の検出に使用される信号成分とを含む。リポーター分子は、結合状態（例えば、分泌検体の１つ又は複数の分子に結合されている）よりも非結合状態（例えば、分泌検体に結合されていない）で高い拡散率を有する。幾つかの実施形態では、非結合リポーター分子と結合リポーター分子との拡散率との間の違いは、リポーター分子が結合する分泌検体分子のサイズの関数である。幾つかの実施形態では、リポーター分子は、拡散率を低くする配座で分泌検体に結合し得る。例えば、リポーター分子は、分泌検体が凝集する配座で、部分的にその配座に起因してゆっくりと拡散する分泌検体の複数のコピーと結合し得る。本明細書に記載される方法は、リポーター分子（非結合）と結合リポーター分子：検体複合体（ＲＭＳＡ）との間の拡散率の差を利用して分泌検体量を定量化する。
【０１８３】
マイクロ流体チャネル内のフロー状況下での拡散アッセイ。
図４Ａ〜図４Ｃは、本開示の幾つかの実施形態によるアッセイを示す。図４Ａでは、検出可能な標識をそれぞれ有するリポーター分子４１２は、フロー２４２内のある濃度のリポーター分子４１２を含む流体をマイクロ流体デバイス４００のチャネル１２２に流すことにより、マイクロ流体チャネル１２２に導入される。隔離ペン４２４、４２６、４２８は、それぞれ生体検体４１０を分泌する様々な数の細胞４０２、４０４、４０６を含むマイクロ流体チャネル１２２に流体的に接続される。各隔離ペン４２４、４２６、４２８は、接続領域４３６及び分離領域４４０を含む（単に明確にするために、隔離ペン４２４は、そのように標識された唯一のペンである）。接続領域４３６及び分離領域４４０は、上述した特性を有し、チャネル１２２に導入された材料の接触を制限する（例えば、分離領域４４０内において、チャネル１２２内に流入した材料は、分離領域への直接フローではなく、拡散によってのみ分離領域に入り得る）。図４Ａに示される時点では、分泌検体４１０の分子は、細胞の近くにある。
【０１８４】
図４Ｂは、後の時点での図４Ａと同様のマイクロ流体デバイスの同じ領域を示す。リポーター分子４１２は、リポーター分子４１２の濃度がチャネル１２２と隔離ペン４２４、４２６、４２８の内部との間で平衡するように、チャネル１２２及び隔離ペン４２４、４２６、４２８内に迅速に拡散することができる。図４Ｂに示されるように、リポーター分子４１２は、隔離ペン４２４、４２６、４２８内で略均一である定常状態に達している。リポーター分子４１２を含む媒体のフロー２４２は、リポーター分子４１２を含まない媒体のフロー２４２で置換され、チャネル１２２は、有意量のリポーター分子を含まない。
【０１８５】
各隔離ペン４２４、４２６、４２８内のリポーター分子４１２が分泌検体４１０の分子に接触する際、リポーター分子４１２は、検体４１０に結合することができ、リポーター分子：検体複合体４１４を形成し、分泌検体４１０の数量に関連する局所検出可能な信号を提供する。フロー２４２が続くにつれて、リポーター分子は、隔離ペンから拡散し、チャネル１２２に入り、マイクロ流体デバイスから搬出される。しかし、図４Ｂに示されるように、リポーター分子：検体複合体４１０の拡散は、分子量（及び有効サイズ）がより大きいことに起因して、非結合リポーター分子４１２よりも遅く、差別的に隔離ペン４２４、４２６、４２８から迅速に拡散しない。
【０１８６】
図４Ｃは、分泌検体４１０及びリポーター分子：検体複合体４１４が分泌検体４１０のソース（例えば、細胞４０２、４０４、４０６）からチャネル１２２に拡散している更に後の時点での図４Ａ及び図４Ｂと同様のマイクロ流体デバイスの同じ領域を示す。フロー２４２は、チャネル１２２内で継続し、それにより、リポーター分子：検体複合体４１０よりも迅速にリポーター分子４１２を各隔離ペン４２４、４２６、４２８から拡散させる。
【０１８７】
分泌検体分子４１０は、リポーター分子４１２よりも大きい分子量（及び溶液中の関連する有効サイズ）を有し得るため、リポーター分子：検体複合体は、より低速で拡散する。分泌検体が抗体であり、リポーター分子がペプチド又はアプタマーである実施形態では、分子量の差が大きい。いずれの場合でも、結合したリポーター分子：検体複合体４１４の重量（及びしたがってサイズ）は、非結合リポーター分子４１２よりも大きく、したがって、リポーター分子：検体複合体４１４は、非結合リポーター分子４１２よりもゆっくりと拡散し、非結合リポーター分子４１２により提供される均一信号と比較して示差的な拡散プロファイル及び関連する検出可能信号を提供する。更に、生物学的微小物体５０２、５０４、５０６は、検体４１０を引き続き分泌し、なお隔離ペン５２４、５２６、５２８内に配置されているリポーター分子４１２と結合するより多くの標的を提供する。隔離ペンから拡散しているか又は既に拡散した非結合リポーター分子の割合が閾値を超える時点を選択することができ、各隔離ペン４２４、４２６、４２８内の実質的に又は支配的にリポーター分子：検体複合体４１４のみから検出可能な信号を撮像することができる。幾つかの実施形態では、隔離ペンから拡散した非結合リポーター分子４１２の量が約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は上記の値の２つにより定義される任意の範囲であるとき、アッセイ画像が取得される。代替又は追加として、幾つかの実施形態では、隔離ペンから拡散した非結合リポーター分子４１２の量が、隔離ペンから拡散した結合リポーター分子：検体複合体４１４の量の約１．２５倍、約１．５倍、約２．０倍、約２．５倍、約３．０倍、約３．５倍、約４．０倍、約４．５倍、約５．０倍、約７．５倍、約１０倍、約２５倍、約５０倍又は約１００倍であるとき、アッセイ画像が取得される。
【０１８８】
アッセイ画像で取得される検出可能な信号は、ペン内の生物学的微小物体の数に比例し得る。隔離ペン４２４は、６個の生物学的微小物体を含むものとして示され、隔離ペン４２６は、４個の生物学的微小物体を含むものとして示され、隔離ペン４２８は、２個の生物学的微小物体を含むものとして示され、幾つかの実施形態では、各隔離ペンからのアッセイ信号は、それらの細胞数に比例し得る。幾つかの実施形態では、検体を分泌は、アッセイ信号取得時間での細胞周期状態に依存し得、複数の隔離ペンのそれぞれからの信号は、各隔離ペン内の細胞数に実質的に比例しないことがあり得る。更に、図４Ｃに示されるように、細胞４０２、４０４、４０６の全てが検体４１０を分泌している間、異なる集団の細胞（例えば、異なるクローン）が様々な率で生体検体４１０を分泌することがある。したがって、産出される検体４１０の量（その結果として、リポーター分子：検体複合体４１４から検出される拡散プロファイル信号の強度）は、各ペンに存在する細胞４０２、４０４、４０６の数について正規化された場合でも、ペンごとに同じでないことがある。この時間期間中に１つ又は複数のアッセイ画像を取得し得、アッセイ画像を使用して、撮像された隔離ペン４２４、４２６、４２８内の分泌検体４１０の量を特徴付け得る。産出される分泌検体４１０の量の相対数量又は絶対数量に到達するために実行される分析の説明が以下に続く。
【０１８９】
マイクロ流体チャネル内の非フロー状況下での拡散アッセイ。
図５Ａ〜図５Ｃは、本開示の一実施形態によるアッセイを示す。図５Ａでは、検出可能な標識をそれぞれ有するリポーター分子４１２が、ある濃度のリポーター分子４１２を含む流体をチャネル１２２に流すことにより、マイクロ流体デバイス５００のマイクロ流体チャネル１２２に導入される。図５Ａは、生物検体４１０を分泌している様々な数の細胞５０２、５０４、５０６を含むマイクロ流体チャネル１２２に流体的に接続される隔離ペン５２４、５２６、５２８も示す。各隔離ペン５２４、５２６、５２８は、接続領域５３６及び分離領域５４０を含む（単に明確にするために、隔離ペン５２４は、標識された唯一のペンである）。接続領域５３６及び分離領域５４０は、上述した特性を有し、チャネル１２２に導入された材料の接触を制限する（例えば、分離領域５４０内において、チャネル１２２内に流入した材料は、分離領域への直接フローではなく、拡散によってのみ分離領域に入り得る）。図５Ａに示される時点では、分泌検体４１０の分子は、細胞の近くにある。
【０１９０】
図５Ｂは、後の時点での図５Ａと同様のマイクロ流体デバイスの同じ領域を示す。リポーター分子４１２は、リポーター分子４１２の濃度がチャネル１２２と隔離ペン５２４、５２６、５２８の内部との間で平衡するように、チャネル１２２及び隔離ペン５２４、５２６、５２８内に迅速に拡散することができる。図５Ｂに示されるように、リポーター分子４１２は、非結合リポーター分子４１２の濃度が隔離ペン５２４、５２６、５２８及びチャネル１２２で実質的に均一であり得るような定常濃度平衡に達している。リポーター分子４１２の濃度が隔離ペン５２４、５２６、５２８内と平衡するとき、チャネル内のフローは停止される。リポーター分子４１２が分泌検体４１０の分子に接触する際、リポーター分子４１２は、検体４１０に結合することができ、リポーター分子：検体複合体４１４を形成し、分泌検体４１０の数量に関連する局所検出可能信号を提供する。
【０１９１】
図５Ｃは、分泌検体４１０及びリポーター分子：検体複合体４１４が分泌検体４１０のソース（例えば、細胞５０２、５０４、５０６）からチャネル１２２に拡散している更に後の時点での図５Ａ及び図５Ｂと同様のマイクロ流体デバイスの同じ領域を示す。この時点でチャネル１２２内にフローはない。
【０１９２】
上記と同様に、分泌検体分子４１０は、リポーター分子４１２よりも大きい分子量（及び溶液中の関連する有効サイズ）を有し得る。したがって、リポーター分子：検体複合体４１４は、非結合リポーター分子４１２よりも低速で拡散し、非結合リポーター分子４１２により提供される均一信号と比較して示差的な拡散プロファイル及び関連する検出可能信号を提供する。更に、生物学的微小物体５０２、５０４、５０６は、検体４１０を引き続き分泌し、なお隔離ペン５２４、５２６、５２８内に配置されているリポーター分子４１２と結合するより多くの標的を提供する。
【０１９３】
拡散プロファイル及び／又は関連する信号は、ペン内の生物学的微小物体の数に比例し得る。隔離ペン５２４は、６個の生物学的微小物体を含むものとして示され、隔離ペン５２６は、４個の生物学的微小物体を含むものとして示され、隔離ペン５２８は、２個の生物学的微小物体を含むものとして示される。しかし、幾つかの他の実施形態では、各隔離ペン５２４、５２６、５２８内の細胞５０２、５０４、５０６は、概ね同じ率で検体４１０を分泌し得、その結果、リポーター分子：検体複合体４１４から検出される信号の強度は、各隔離ペン内に存在する細胞５０２、５０４、５０６の数に比例し得る。しかし、検体の分泌は、アッセイ信号取得時間での細胞周期状態に依存し得る。更に、図５Ｃに示されるように、細胞５０２、５０４、５０６の全てが検体を分泌している間、異なる集団の細胞（例えば、異なるクローン）が様々な率で生体検体４１０を分泌することがある。したがって、産出される検体４１０の量（その結果として、リポーター分子：検体複合体４１４から検出される拡散プロファイル信号の強度）は、各ペンに存在する細胞５０２、５０４、５０６の数について正規化された場合でも、ペンごとに同じでないことがあり得る。この時間期間中に１つ又は複数のアッセイ画像を取得し得、アッセイ画像を使用して、撮像された隔離ペン５２４、５２６、５２８内の分泌検体４１０の量を特徴付け得る。産出される分泌検体４１０の量の相対数量又は絶対数量に到達するために実行される分析の説明が以下に続く。
【０１９４】
分泌検体。
生物学的微小物体によって分泌される検体は、タンパク質、サッカリド、核酸、３Ｋｄ未満の分子量を有する有機分子、小胞、ウィルス及びそれらの任意の組合せであり得る。分泌検体は、天然発現検体（例えば、ネイティブ発現）であり得、又は遺伝子操作された検体（例えば、遺伝子挿入、遺伝子欠失、変更等から生じる産物）であり得る。核酸である分泌検体は、リボ核酸又はデオキシリボ核酸であり得、天然又は非天然ヌクレオチドを含み得る。ウィルスである分泌検体は、ウィルス粒子、ベクター又はフェーズであり得る。サッカリドである分泌検体は、モノ、ジ又はポリサッカリドであり得る。サッカリドの非限定的な例としては、グルコース、トレハロース、マンノース、アラビノース、フルクトース、リボース、キサンタン又はキトサンを挙げ得る。分泌小有機分子は、限定ではなく、バイオ燃料、オイル、ポリマー又はマクロライド系抗生材料等の薬剤を含み得る。タンパク質である分泌検体は、抗体又は抗体の断片であり得る。タンパク質である分泌検体は、アルブミン、グロブリン（例えば、アルファ２−マクログロブリン、ガンマグロブリン、ベータ２−マイクログロブリン、ハプトグロブリン）、補体タンパク質（例えば、補体成分３又は４）、トランスフェリン、プロトロンビン、アルファ１抗トリプシン等の血中タンパク質；インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、成長ホルモン、成長因子（例えば、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、エリスロポエチン、ＩＧＦ、ＴＮＦ）、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、レプチン等のホルモン；絹又は細胞外基質タンパク質（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、ビトロネクチン、テネイシン、バーシカン、骨シアロタンパク質）等の線維性タンパク質；メタロプロテアーゼ（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ））又は他のタイプのプロテアーゼ（例えば、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ）、アミラーゼ、セルラーゼ、カタラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素；細菌性、酵母又は原生動物タンパク質；植物タンパク質；カプシド又はエンベロープタンパク質等のｏ又はａウィルスタンパク質であり得る。タンパク質である分泌検体は、抗体、抗体の断片、酵素（限定ではなく、タンパク質分解酵素を含む）、例えば、アルブミン等の遺伝子操作（通常、細胞内タンパク質）タンパク質及び／又は蚕絹又は蜘蛛の糸）を含むがこれに限定されない構造タンパク質であり得る。このリストは限定ではなく、分泌されるように遺伝子操作し得る任意のタンパク質を方法により評価し得る。分泌検体は、抗体薬物複合体であり得る。プロテイン、サッカリド、核酸、３Ｋｄ未満の分子量を有する有機分子及び／又はウィルスの組合せを有し得る分泌検体の非限定的な例としては、プロテオグリカン又は糖タンパク質を挙げることができる。
【０１９５】
リポーター分子及びその特性。
リポーター分子は、分泌検体に結合するように設計された結合成分を含み得ると共に、検出可能な標識を含み得る。結合成分は、分泌検体に結合するように構成された任意の適する結合相手であり得る。結合成分は、タンパク質、ペプチド、核酸又は３Ｋｄ未満の分子量を有する小有機分子であり得る。例えば、結合成分は、別の核酸配列に特異的に結合する核酸配列又はタンパク質に特異的に結合するペプチド（例えば、特定の抗体を認識するエピトープ）であり得る。幾つかの実施形態では、結合成分は、生物学的微小物体の分泌検体の群に非特異的に結合することができる。例えば、結合成分は、ＩｇＧドメインに特異的に結合するペプチド又は核酸配列の群に存在する領域に結合する核酸であり得る。幾つかの実施形態では、リポーター分子は、分泌検体の２つ以上のコピー又は分泌検体の群の２つ以上のメンバに結合する２つ以上の結合成分を含む多価であり得る。考察を容易にするために、本明細書で使用される分泌検体という用語は、特定の分泌検体分子又は分泌検体の群のいずれかを指すことができる。したがって、ＲＭＳＡ複合体の化学量論は、様々であり得る。例えば、分泌検体の１コピーに結語するリポーター分子は、１：１化学量論を有するＲＭＳＡ複合体を有し得る。代替的に、ＲＭＳＡ複合体は、２：１、３：１、４：１、２：２、４：２又は他の化学量論のリポーター分子：分泌検体を有し得る。分子量に依存するリポーター分子：検体複合体の拡散特定により定義されるような見掛けの「サイズ」が、非結合リポーター分子とＲＭＳＡ複合体との間で示差的な拡散を観測するのに十分にリポーター分子自体よりも「大きい」という規定の下、リポーター分子は、任意の適する分子量を有し得る。リポーター分子は、分泌検体の分子量の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又は同じ分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、リポーター分子の分子量は、分泌検体の分子量の約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満である。ＲＭＳＡ複合体の分子量は、リポーター分子の分子量の少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍又はそれらの間の任意の倍数だけ大きい値であり得る。ＲＭＳＡ複合体の分子量は、非結合リポーター分子の分子量の２倍、４倍又は５０倍であり得る。
【０１９６】
分泌検体の１クラス：抗体のリポーター分子
抗体への結合に適するリポーター分子は、ＩｇＧの領域に結合するように構成されたタンパク質、ペプチド及びアプタマーが挙げられる。抗体を検出するためにリポーター分子内で使用されるのに適する結合成分の非限定的なリストを表１に示す。
【０１９７】
【表１】
2019514007.tif 000004
【０１９８】
ＣＰＤ１〜１４のいずれも、本明細書に記載されるアッセイに使用することができる。上記の列挙されたＣＰＤの幾つかは、ＩｇＧのＦｃ領域に結合することが既知の小ペプチドである（ＣＰＤ４及びＣＰＤ７〜１４については、DeLano WL, el al. (2000), Science 287: 1279-1283及び米国特許第７６０８６８１Ｂ２号を参照されたく、それぞれの開示は、その全体が本明細書に援用される）。
【０１９９】
ＣＰＤ３は、Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒの構造を有する。
【０２００】
ＣＰＤ４は、Ａｓｐ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｔｒｐ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｒｐ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒの構造を有する。
【０２０１】
ＣＰＤ７は、Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０の構造を有し、ここで、Ｘａａ１は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ２は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ３は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ４は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ５は、Ｃｙｓ又はＳｅｒであり；Ｘａａ６は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ７は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ８は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ９は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ１０は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ１１は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ１６は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ１７は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ１８は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ１９は、任意のアミノ酸又は欠損であり；及びＸａａ２０は、任意のアミノ酸又は欠損である。
【０２０２】
ＣＰＤ８は、Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０の構造を有し、ここで、Ｘａａ１は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ２は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ３は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ４は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ５は、Ｃｙｓ又はＳｅｒであり；Ｘａａ６は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ７は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ８は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ９は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ１６は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ１７は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ１８は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ１９は、任意のアミノ酸又は欠損であり；及びＸａａ２０は、任意のアミノ酸又は欠損である。
【０２０３】
ＣＰＤ９は、Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０の構造を有し、ここで、Ｘａａ１は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ２は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ３は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ４は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ５は、Ｃｙｓ又はＳｅｒであり；Ｘａａ６は、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり；Ｘａａ７は、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり；Ｘａａ８は、Ｈｉｓ又はＴｒｐであり；Ｘａａ９は、Ｌｅｕ又はＭｅｔであり；Ｘａａ１６は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ１７は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ１８は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ１９は、任意のアミノ酸又は欠損であり；及びＸａａ２０は、任意のアミノ酸又は欠損である。
【０２０４】
ＣＰＤ１０は、Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８−Ｘａａ１９−Ｘａａ２０の構造を有し、ここで、Ｘａａ１は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ２は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ３は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ４は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ又はＡｓｐであり；Ｘａａ５は、Ｃｙｓ又はＳｅｒであり；Ｘａａ６は、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり；Ｘａａ７は、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり；Ｘａａ８は、Ｈｉｓ又はＴｒｐであり；Ｘａａ９は、Ｌｅｕ又はＭｅｔであり；Ｘａａ１６は、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌであり；Ｘａａ１７は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ１８は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ１９は、任意のアミノ酸又は欠損であり；及びＸａａ２０は、任意のアミノ酸又は欠損である。
【０２０５】
ＣＰＤ１１は、Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｘａａ８−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１３の構造を有し、ここで、Ｘａａ１は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ２は、Ｃｙｓ又はＳｅｒであり；Ｘａａ３は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ４は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ５は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ６は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ７は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ８は、任意のアミノ酸であり；及びＸａａ１３は、任意のアミノ酸又は欠損である。
【０２０６】
ＣＰＤ１２は、Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１３の構造を有し、ここで、Ｘａａ１は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ２は、Ｃｙｓ又はＳｅｒであり；Ｘａａ３は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ４は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ５は、任意のアミノ酸であり；Ｘａａ６は、任意のアミノ酸であり；及びＸａａ１３は、任意のアミノ酸又は欠損である。
【０２０７】
ＣＰＤ１３は、Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１３の構造を有し、ここで、Ｘａａ１は、任意のアミノ酸又は欠損であり；Ｘａａ２は、Ｃｙｓ又はＳｅｒであり；Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり；Ｘａａ４は、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり；Ｘａａ５は、Ｈｉｓ又はＴｒｐであり；Ｘａａ６は、Ｌｅｕ又はＭｅｔであり；及びＸａａ１３は、任意のアミノ酸又は欠損である。
【０２０８】
ＣＰＤ１４は、Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ｃｙｓ−Ｘａａ１３の構造を有し、ここで、Ｘａａ１は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ又はＡｓｐであり；Ｘａａ２は、Ｃｙｓ又はＳｅｒであり；Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒであり；Ｘａａ４は、Ｔｒｐ又はＴｙｒであり；Ｘａａ５は、Ｈｉｓ又はＴｒｐであり；Ｘａａ６は、Ｌｅｕ又はＭｅｔであり；及びＸａａ１３は、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ又はＶａｌである。
【０２０９】
結合成分は、ＩｇＧに高い親和性（例えば、表１のＣＰＤ１及びＣＰＤ２について既知のようなナノモル）を有する材料に限定されない。幾つかの実施形態では、約１００ミリモル又は約１マイクロモルよりも大きい親和性を有する結合成分は、抗体を検出するのにこの拡散ベースのアッセイに問題なく使用され得る。
【０２１０】
他のタイプの分泌検体では、リポーター分子の異なるタイプの結合成分を使用し得る。例えば、不可逆プロテアーゼ阻害剤を使用して、セリン又はシステインプロテアーゼのフルオロメチルケトン阻害剤等のタンパク質分解酵素を検出し得る。サッカリド又はマクロライド抗体等の遺伝子操作された検体へのアプタマーが使用可能である。抗体又はその断片を使用して、アルブミン、構造タンパク質又はマクロライド抗体を検出し得る。当技術分野で既知である、分泌検体への任意の適する結合成分を使用し得る。
【０２１１】
検出可能な標識。
リポーター分子は、可視、発光、リン光又は蛍光で検出可能な標識も含み得る。幾つかの実施形態では、検出可能な標識は、蛍光標識であり得る。限定ではなく、フルオレセイン、ローダミン、シアニン、フェナントレン又は任意の他のクラスの蛍光顔料標識を含め、任意の適する蛍光標識を使用し得る。有用な蛍光顔料標識の幾つかの例としては、フルオレセイン（リポーター分子の結合成分の標識するチオイソシアネート活性種として利用可能）Alexa Fluor（登録商標）５９４（（ＡＦ５９４、ThermoFisher Scientific、カタログ番号Ａ２０００４（ＮＨＳエステル））ＭＷ８１９．８、Ｅｘ／Ｅｍ５９０／６１７ｎｍ）又はHiLyte Fluor（商標）５５５（AnaSpec Inc.、カタログ番号ＡＳ−８１２５０）ＭＷ８６９、Ｅｘ／Ｅｍ５５０／５６６ｎｍ（Ｃｙ３フィルタ）が挙げられる。幾つかの実施形態では、アプタマー又は捕獲オリゴヌクレオチド等のリポーター分子は、ＦＲＥＴ標識オリゴヌクレオチドを含み得、これは、限定ではなく、分子ビーコン、デュアルハイブリダイゼーションプローブ、Scorpion（登録商標）プローブ又はEclipse（登録商標）プローブを含み得る。ＦＲＥＴ標識オリゴヌクレオチドプローブ又はプローブ対は、ハイブリダイゼーションイベントが発生するまで蛍光しない蛍光標識を含み得る。幾つかの実施形態では、検出可能な標識は、リポーター分子の結合成分に直接又は間接的に共有結合する。幾つかの他の実施形態では、捕獲オリゴヌクレオチドは、リポーター分子の結合成分であり得、内因性又は外因性のいずれかの蛍光顔料は、捕獲オリゴヌクレオチドが検体、例えばインターカレーター性顔料に結合するまで、リポーター分子の検出可能な標識が検出不可能であり得るような検出可能な標識であり得る。幾つかの実施形態では、リポーター分子の検出可能な標識は、ＲＭＳＡ複合体が形成された後まで検出可能でないことがあり得、なぜなら、検出可能な信号は、結合前に存在しなかった新しい波長にシフトするためである。幾つかの実施形態では、リポーター分子の結合成分に共有結合したインターカレーター性顔料等である。他の実施形態では、検出可能な標識は、同位体であり得る。
【０２１２】
更に他の実施形態では、検出可能な標識及び結合成分は、単一部分、例えば、検出可能な信号（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の自己検出可能タンパク質又はＧＦＰと均等なＲＮＡである「Spinach」等のリボ核酸アプタマー）を提供するタンパク質又は核酸である。Spinachは、蛍光検出可能標識として３，５−ジフルオロ−４−ヒドロキシベンジリデンイミダゾリノン（ＤＦＨＢＩ）を組み込む。
【０２１３】
拡散モデリング
本明細書に記載される方法は、隔離ペンの分離領域からフロー領域（例えば、マイクロ流体チャネル）への分泌検体の示差的な拡散に関連するモデル及び感想を利用する。生物学的微小物体の分泌検体の挙動をモデリングするに当たり、ＣＯＭＳＯＬ（登録商標）、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）並びに／又は様々な数値モデリング及びコンピュータ支援設計ツールを含むがこれに限定されない幾つかのソフトウェアプログラムを利用し得る。
【０２１４】
図６は、チャネル１２２への隔離ペン６２４の開口部から遠いポイントにおいて、隔離領域６４０内の隔離ペン６２４のベースに配置された１つの生体細胞（６０２）を有する１タイプの隔離ペンのモデルを示す。拡散の線６１０は、分離領域６４０から接続領域６３６を経てチャネル１２２への細胞６０２の分泌検体の拡散の軌跡を示す。接続領域を通しての拡散材料通路として、高濃度拡散線及びチャネル１２２へのフロー線形性を見ることができる。拡散率は、分泌検体の拡散係数により定義され、以下のようにモデリングすることができる。
【０２１５】
特定の分泌検体の拡散係数Ｄは、
Ｄ＝（１／ｆ）ｋＴ  （式１）
として定義され、式中、ｆは、摩擦係数であり、ｋは、ボルツマン定数であり、Ｔは、絶対温度である。摩擦係数ｆは、分泌検体が拡散している溶媒の粘度（η）並びに分泌検体のサイズ及び形状に依存する。球形を有する分泌検体が最小化された摩擦係数を有するが、抗体又は定義された構造制約を有する他のタンパク質等の非対称形状を有する分泌検体のｆは大きくなる。更に、分泌検体が、分泌検体に関連する水素結合又は水和水等の溶媒との相互作用を有する場合にも、摩擦係数は大きくなる。幾つかの一般的な拡散係数を表２に示す。
【０２１６】
【表２】
2019514007.tif 000005
【０２１７】
分泌検体の拡散は、以下の式：
＜ｘ２＞＝ｑｉＤｔ  （式２）
により表すことができ、式中、＜ｘ２＞は、平均二乗変位であり、ｘは、時間ｔにわたる、選択された移動開始点からの平均距離である。ｑｉの値は、拡散が１次元、２次元又は３次元で評価されているかに依存する。
【０２１８】
これらの式を用いて、リポーター分子が、定義された構成の隔離ペン内外に拡散する時間及びＲＭＳＡ複合体の時間をモデリングすることができ、これは、約１５０ｋＤａの範囲内の分子量を有する抗体分泌検体について図７Ａ及び図７Ｂに示されている。図７Ｂでは、曲線７１２は、分子量約２．５ｋＤａのＣＰＤ３のような小ペプチドの挙動をモデリングし、ここで、小ペプチドは、２５分〜３０分以内に、チャネルから隔離ペン４２４、５２４、６２４等（図４Ａ〜図４Ｃ、図５、図６のそれぞれ）のように構成された隔離ペン内に拡散し平衡することが可能なように計算される。これとは対照的に、曲線７１４は、分子量約４５ｋＤａを有するはるかに大きいＣＰＤ１の挙動をモデリングする。このより大きい分子は、溶媒と相互作用するより多くの機会を呈し、約４５分〜約５０分で平衡に達しない。
【０２１９】
図７Ｂでは、４２４、６２４のように構成された隔離ペンからの拡散の場合の４つの異なる種の挙動が示される。このグラフでは、曲線７１６は、小ペプチドＣＰＤ３の場合での隔離ペン４２４、５２４、６２４等のように構成された隔離ペンからの計算された拡散率を示す。小ペプチドＣＰＤ３は、約２５分までに隔離ペンから実質的になくなる。これとは対照的に、ＣＰＤ３が分泌検体ＩｇＧ（ＭＳ  １５０ｋＤａ）に結合する場合、曲線７２２（三角形）は、ＣＰＤ３を含むＲＭＳＡ複合体の計算された拡散挙動を示し、ここでは、６０分後に小量のＲＭＳＡ複合体が残っている。曲線７１８（菱形）は、ＣＰＤ１（タンパク質Ａ、４５ｋＤａタンパク質）の計算された拡散挙動を示し、したがって、これは、実質的に完全に拡散してなくなるのに５０分を超える時間を要する。このタンパク質が分泌抗体（ＭＷ  １５０ｋＤａ）と複合体を形成する場合、曲線７２４（破線セグメント）は、ＣＰＤ３：ＩｇＧ複合体と同様に遅い拡散率を示し、６０分後に複合体が依然として残っていることを示す。
【０２２０】
図８Ａは、リポーター分子の２つの異なる結合成分のそれぞれでのリポーター分子とＲＭＳＡ複合体との差の計算を示す。曲線８２６は、ＲＭＳＡ複合体から生じる最大信号及び非結合リポーター分子に起因した最小信号を観測するための、ＣＰＤ３：ＣＰＤ３／ＩｇＧ対での隔離ペン内の最大濃度差に向けたアッセイ時間最適化を示し、時間最適化は、マイクロ流体デバイスからいかなる拡散材料も搬出する、マイクロ流体チャネル内の媒体フローを回復させて約１５分であるように見える。曲線８２６は、ＣＰＤ１の拡散曲線を示し、隔離ペン内の、非結合ＣＤＰ−１とＣＰＤ１を含有するＲＭＳＡ複合体との間の濃度差を示し、最大差が後の時点、約２５分後又はそれよりも後に出ることを示す。図８Ｂは、非結合ＣＰＤ１の内部拡散（上のグラフ）及び外部拡散（下のグラフ）の実験時間を示し、計算された値間に妥当な相関を示す。これらの組のモデリング及び実行された実験は、特定の隔離ペン内の検体分泌のレベルを評価するために、実質的にリポーター分子：分泌検体複合体から検出可能な信号を観測するのに最適化された時点を見つけることが可能であることを示す。
【０２２１】
拡散軸に沿った領域の選択。
図９Ａ及び図９Ｂ並びに図１０Ａ及び図１０Ｂは、アッセイ画像から定量測定（相対又は絶対のいずれか）を抽出する領域を特定するのに使用されるモデリング実験を示す。図９Ａ及び図９Ｂでは、拡散フロー及びＲＭＳＡ複合体から生成された蛍光信号強度のモデリングを実行して、隔離ペン４２４、５２４、６２４と同様のマイクロ流体デバイス９００の隔離ペン９２４内の生体細胞９０２、９０４、９０６の位置の影響を考慮した。影響は、チャネル１２２への隔離ペン９２４の開口部から離れた隔離ペンのベース（０μｍ）から約２５μｍにある細胞９０２の位置を使用してモデリングされ、細胞９０４は、隔離ペン９２４のベースから約１００μｍの距離でモデリングされ、細胞９０６は、隔離ペン９２４のベースから約１８０μｍの距離でモデリングされた（図９Ａ及び図９Ｂの横軸を参照されたい）。各細胞は、モデリングを簡単にするために、線９５２で示された隔離ペンの開口部に向かう拡散軌道の中心軸に沿ってあるようにモデリングされる。これらの各位置は、隔離ペンの分離領域９４０内にあり、且つ隔離ペンの接続領域９３６から離れており、したがって、分離領域９４０内で細胞９０２、９０４、９０６から検出される信号強度がチャネル１２２内のフロー２４２からのフローの影響を受けないことを保証する。図９Ａのｙ軸は、リポーター分子の正規化濃度を表す（又は等しくＲＭＳＡ複合体、この実験は、検出される蛍光強度のみに依拠するため）。図９Ａに示されるように、蛍光信号の強度（モデリングは、９０２、９０４、９０６が全て同じ率で分泌検体を産出しているという制約を含む）は、細胞９０２で最高であり、なぜなら、隔離ペン９２４のベースに近い位置に起因して、９０４、９０６よりも高い単一方向性で拡散しているためである。細胞９０４、９０６は、標識されたＲＭＳＡ複合体を全方向に拡散させるより大きい容量を有する。このモデルにより特定されるのは、標識された種の濃度（例えば、ＲＭＳＡ複合体）変化に起因して、信号強度が蛍光信号強度変化の影響を最も受けやすく、且つ細胞９０２、９０４、９０６の厳密な位置の影響を最も受けにくい領域を識別し得ることであり、それは、図９Ａ及び図９Ｂの両方に示されるように、隔離ペン９２４とチャネル１２２との間の拡散軸に沿って存在する領域９４４である。細胞位置の影響をあまり受けない領域９４４は、隔離ペン９２４内の生物学的微小物体の分泌検体の相対量又は絶対量の評価に使用される対象エリア（ＡＯＩ）の少なくとも一部である。幾つかの実施形態では、ＡＯＩは、隔離ペン９２４及び／又はチャネル１２２の追加の部分を含み得る。
【０２２２】
細胞の大きい集団に最適化された隔離ペン。
図１０Ａ及び図１０Ｂは、構成の異なる隔離ペン１０２４での図９Ａ及び図９Ｂに示されるのと同様に構築されたモデリング実験を示す。マイクロ流体デバイス１０００の隔離ペン１０２４（隔離ペン２２４、２２６、２２８と同様）内の生体細胞１００２、１００４、１００６の位置の影響が示される。影響は、チャネル１２２への隔離ペン１０２４の開口部から離れた隔離ペンのベース（０μｍ）から約２５μｍにある細胞１００２の位置を使用してモデリングされ、細胞１００４は、隔離ペン１０２４のベースから約１００μｍの距離でモデリングされ、細胞１００６は、隔離ペン１０２４のベースから約１８０μｍの距離でモデリングされた（図１０Ａ及び図１０Ｂの横軸を参照されたい）。各細胞は、モデリングを簡単にするために、線１０５２で示された隔離ペンの開口部に向かう拡散軌道の中心軸に沿ってあるようにモデリングされる。これらの各位置は、隔離ペンの分離領域１０４０内にあり、且つ隔離ペンの接続領域１０３６から離れており、したがって、分離領域１０４０内で細胞１００２、１００４、１００６から検出される信号強度がチャネル１２２内のフロー２４２からのフローの影響を受けないことを保証する。図１０Ａのｙ軸は、リポーター分子の正規化濃度を表し（又は等しくＲＭＳＡ複合体、この実験は、検出される蛍光強度のみに依拠するため）、示される濃度の考察は、図９Ａについて上述したものと同様である。このモデルにより特定されるのは、標識された種の濃度（例えば、ＲＭＳＡ複合体）変化に起因して、信号強度が蛍光信号強度変化の影響を最も受けやすく、且つ細胞１００２、１００４、１００６の厳密な位置の影響を最も受けにくい領域を識別し得ることであり、それは、図１０Ａ及び図１０Ｂの両方に示されるように、隔離ペン１０２４とチャネル１２２との間の拡散軸に沿って存在する領域１０４４である。細胞位置の影響をあまり受けない領域１０４４は、隔離ペン１０２４内の生物学的微小物体の分泌検体の相対量又は絶対量の評価に使用されるＡＯＩの少なくとも一部である。幾つかの実施形態では、ＡＯＩは、隔離ペン１０２４とチャネルとの間の拡散軸に沿って位置する隔離ペン１０２４及び／又はチャネル１２２の追加の部分を含み得る。
【０２２３】
幾つかの実施形態では、隔離ペンの幾何学的形状は、分泌検体の最適な拡散プロファイルを提供するように変更し得る。図１１Ａは、最適な拡散プロファイルを提供するように設計されたチャネル１２２及び隔離ペン１１２４、１１２６を含むマイクロ流体デバイス１１００の一部を示す。特に、隔離ペン１１２４、１１２６は、多数の生物学的微小物体１１０２を収容することができる分離領域を有し、細胞１１０２の分泌検体の数量（相対又は絶対）を評価するに当たり使用されるより大きい信号強度を提供するに当たり有用であり得る。
【０２２４】
幾つかの実施形態では、隔離ペン１１２４の分離領域１１４０は、０．１ｎＬから１００ｎＬの範囲の容積を収容し得る。特定の実施形態では、図１１Ｂに示されるように、分離領域１１４０は、６ｎＬの容積を保持し得る。隔離ペン１１２４、１１２６は、１００個、２００個、３００個、４００個又は５００個という多数の微小物体を収容することができる。幾つかの実施形態では、隔離ペンは、最大で３００個〜４００個の微小物体を収容し得る。
【０２２５】
隔離ペン１１２４、１１２６は、それぞれ分離領域１１４０内の生物学的微小物体１１０２を接続領域１１３６から分離し、分泌検体がソース（例えば、検体を分泌する生物学的微小物体１１０２の１つ）から離れて拡散するのに十分な距離をもたらすように構成された接続領域１１３６を有する。この分離は、生物学的微小物体１１０２（例えば、自由に拡散していない）になお関連付けられたＲＭＳＡ複合体からの局所信号の、予期される拡散軌道１１３０の線に沿った拡散軌道との干渉又は重複を低減する。この重複をなくすことにより、ＡＯＩの少なくとも一部又はＡＯＩ全体から生成される濃度値は、拡散する際の結合リポーター分子からの信号を表す。幾つかの実施形態では、接続領域１１３６は、分離領域１１４０に対する接続領域１１３６の制約により分離領域１１４０から分離される。幾つかの実施形態では、接続領域１１３６は、１０μｍ〜３０μｍの範囲の幅及び４０μｍ〜２００μｍの範囲の長さを有する。特定の実施形態では、接続領域１１３６は、２０μｍの幅であり、１００μｍから２００μｍの範囲の長さである。
【０２２６】
図１１Ｂは、隔離ペン１１２４内から接続領域１１３６を通してチャネル１２２に出る生物学的微小物体１１０２の分泌検体の力線１１２０及び濃度勾配線１１０を示す。接続領域１１３６の部分は、ＡＯＩの少なくとも一部として選択され得、細胞位置の影響をあまり受けず、且つアッセイ画像で観測される強度変動の影響もあまり受けない領域の部分であり得る。
【０２２７】
対象エリア（ＡＯＩ）の評価。
図１２Ａは、生物学的微小物体からの分泌検体の相対量又は絶対量を特定するためにデータが抽出されるＡＯＩの概略表現を示す。ＡＯＩ１２５０は、分離領域１２４０内の領域、接続領域１２３６（マイクロ流体デバイス１２００内の隔離ペン１２２４の）内の領域及びチャネル１２２の一部を包含するように選択され、これらは、全て隔離ペン１２２４からチャネル１２２への拡散軸に沿って整列する。この実施形態では、フロー２４２は、マイクロ流体チャネル１２２内に存在し、ＡＯＩ内に組み込まれるチャネルの部分内の任意の検出可能信号を低減する。隔離ペン内の、ＡＯＩが終了するポイントの選択は、検体を分泌し、検出可能な信号が発せられる生物学的物体１２０２との重複を回避するように行われる。図１２Ａに示されるように、拡散線１２１０は、接続領域１２３６に向けられ、接続領域１２３６に入る際、拡散軸と整列するようになる。接続勾配線１２２０も同様に示される。
【０２２８】
図１２Ｂは、マイクロ流体デバイス１２００内の位置を示す、「３２７」という識別番号１２６０を有する隔離ペン１２２４のアッセイ画像を示す写真である。識別番号は、明視野と蛍光画像位置との相関付けを支援すると共に、ユーザが、選択された隔離ペンから細胞を選択し、操作し、搬出するのを支援する。図１２Ｂの隔離ペン１２２４は、分離領域（標識されていない）内に存在する１つの生物学的微小物体１２０２を有する。アッセイ画像は、生物学的微小物体１２０２から発せられる、隔離ペン内の蛍光信号の幅広い量を明確に示す。ＡＯＩ１２５０は、写真で重ねられて示され、拡散軸に沿って整列し、拡散器銅線１２５２に沿ってセンタリングされる。ＡＯＩは、２０ピクセル幅であり、これは、接続領域１２６（図１２Ｂにおいて標識されていない）の幅に応じて選択され、２０のサブ領域に分割される。ＡＯＩは、各サブ領域に対して他のピクセルサイズを有し得、サブ領域の数は、約１個から約５０個まで様々であり得る。ＡＯＩのサブ領域１２５４は、ＡＯＩの全てのサブ領域のチャネル１２２から最も離れて位置するサブ領域であるが、生物学的微小物体１２０２と重複しないように選択される。ＡＯＩの第２の端部におけるサブ領域は、サブ領域１２５８であり、チャネル１２２内に位置する。重要なことに、サブ領域１２５６の群は、図９Ａ及び図９Ｂ並びに図１０Ａ及び図１０Ｂの細胞位置集中領域９４４、１０４４であり、それから検出された蛍光を使用して、隔離ペン内の生物学的微小物体の分泌検体の相対量又は絶対量を評価する。
【０２２９】
図１２Ｃは、ＡＯＩにおいて検出された蛍光の図表現を示し、図１２Ｃにおいて、横軸の値は、生物学的微小物体１２０２に最も近いＡＯＩの端部におけるサブ領域であるサブ領域１（図１２Ｂのサブ領域１２５４に対応する）及びチャネル１２２内のＡＯＩの最も近い端部における、図１２Ｂのサブ領域１２５８に対応するサブ領域２０を表す。ＡＯＩ内の検出された蛍光量は、分泌検体量に比例する。様々な数学的演算を使用して、分泌検体の相対量又は絶対量についての情報を抽出し得、様々な数学的演算について以下のセクションにおいて詳細に考察する。
【０２３０】
アッセイ画像の正規化
アッセイ画像を処理して、分泌検体の相対量又は絶対量を評価することができるようになる前に生のアッセイ画像を正規化し得る。図１３Ａは、光源、光変調サブシステム（例えば、ＤＭＤ）、画像捕捉デバイス（例えば、カメラ）等のシステム構成要素の変動及び非線形性等のエラーを示す生のアッセイ画像を示す。
【０２３１】
フロー状況下で行われるアッセイの方法Ａ。
一実施形態では、生のアッセイ画像は、暗基準画像及び信号基準画像両方の補正を生のアッセイ画像における各ピクセルから以下の式に従って減算することにより正規化し得る。
【数１】
2019514007.tif 000006
【０２３２】
暗基準画像は、いかなる媒体もデバイスに流す前に、マイクロ流体デバイスを撮像することにより取得し得る。自己蛍光エラー及び他のシステムエラーは、各ピクセルで暗基準値を減算することにより補正することができる。信号基準画像は、ロールオフ、退色又はカメラエラーについて補正され得、流れているリポーター分子又はリポーター分子若しくは蛍光標識の平衡濃度に達するマイクロ流体デバイス全体にわたるリポーター分子のみにより取得される。生のアッセイ画像内の各ピクセルは、このように補正され得、それから定量化目的で蛍光データを抽出する。正規化されたアッセイ画像を図１３Ｂに示す。
【０２３３】
非フロー状況下で行われるアッセイの幾つかの実施形態の方法Ｂ。
正規化の最初のステップとして、上述したように、暗基準画像が、結合リポーター分子及び非結合リポーター分子が存在するマイクロ流体デバイスの画像から減算されて、「暗基準減算画像」を生成した。
【０２３４】
２番目のステップとして、結合リポーター分子及び非結合リポーター分子が存在しない図１３Ａの生のアッセイ画像の部分（すなわちマイクロ流体デバイス内の隔離ペン及びチャネルを画定する壁）を自己蛍光減算画像から除去又は「マスキング」して、「マスク済み暗基準減算画像」を生成する。当業者に理解されるように、このステップは、自己蛍光の減算前に実行することもできる。
【０２３５】
図１３Ａの正規化画像を生成する３番目のステップとして、マスク済み自己蛍光減算画像内の全てのピクセルに基づいて計算された大域的平均強度により、マスク済み自己蛍光減算画像内の各ピクセルの強度値で除算する。大域的平均強度で各ピクセルの強度値を除算することにより、各ピクセルの利得補正係数を含む画像又は同様のデータ構造（例えば、マトリックス）（「利得補正画像」）が画像の各ピクセルで生成される。利得補正画像を生成する他の方法も当業者に周知である。
【０２３６】
図１３Ａに示される正規化画像を生成する４番目のステップとして、利得補正画像は、平滑化アルゴリズムを受けて、ランダムノイズを低減し得る。このステップは、方法の幾つかの実施形態で利用されないことがある。特に、利得補正画像は、各ピクセルの局所平均を生成するに当たり画像のマスキングされた部分を占める９ピクセル×９ピクセルボックスフィルタを使用するボックスフィルタ平滑化アルゴリズムを受けた。当業者が理解することができるように、平均フィルタリング、ガウスフィルタリング、勾配加重フィルタリング、シーケンス統計フィルタリング、ロバスト平滑化フィルタリング、クリミンス（Crimmins）ノイズ除去フィルタリング、エッジ保存フィルタリング及び自己適応メジアンフィルタリング等の他の平滑化アルゴリズムも使用可能である。
【０２３７】
図１３Ｂに示される正規化写真を生成する５番目のステップとして、平滑化利得補正画像を自己蛍光減算画像で乗算して正規化画像を生成し得る。
【０２３８】
これらの方法は、同じ又は異なる順序で上記のステップ及び方法のいずれかを組み合わせ得る。
【０２３９】
非フロー状況下で行われるアッセイの幾つかの実施形態の方法Ｃ。
結合ＲＭＳＡ複合体よりも高い拡散率に起因して、チャネル内の実質的に均一濃度の非結合リポーター分子に応じて、画像を正規化する別の方法を使用し得る。チャネルの輝度を使用して画像を正規化し、上述したエラーを補正し得る。
【０２４０】
したがって、代替の実施形態では、ペンの基端におけるチャネル内の輝度を使用して図１３Ｂの正規化画像を取得して、マイクロ流体デバイスの領域のビューにわたる輝度量の任意のばらつきを補正することができる。この正規化方法は、チャネルが存在するいかなる検体（又はいかなるＲＭＳＡ複合体）も有すると予期されないことに依拠し、したがって、検体が存在しないマイクロ流体デバイスの任意のエリアを使用して実行することができる。
【０２４１】
最初のステップとして、チャネル強度に基づいて正規化するために、内部にいかなる検体も存在が予期されないチャネルＲの領域が各隔離ペンで識別される。幾つかの実施形態では、この領域Ｒは、ペンの上のチャネルのエリアに対応する予め定義される領域Ｒであり得る。他の実施形態では、各隔離ペンの領域Ｒは、他の情報に基づいて識別するか又は画像に基づいて計算することができる。
【０２４２】
チャネルＲの各領域について、輝度値ＢＲが領域内のピクセルに基づいて計算される。輝度値を計算する前、輝度値の計算に使用される画像は、上述したように、減算、マスキング又は他の処理を行い得る。幾つかの実施形態では、ＢＲは、領域Ｒ内のピクセルの平均輝度値である。
【０２４３】
各領域Ｒの平均輝度値ＢＲを計算した後、ペン及びチャネルの画像を一連のエリアＡに分割し得、各エリアＡは、各領域Ｒを包含する。このエリアは、領域ＲがエリアＡの中心にあるように計算し得る。特定の実施形態では、エリアＡは、各領域Ｒの質量中心のボロノイ図又はドロネー三角形分割を生成することにより計算し得る。他の実施形態では、各領域Ｒは、各エリアＡの質量中心である必要はなく、マイクロ流体デバイスをセグメント化する予め定義されたエリアに基づいて計算することができる。各エリアＡについて、利得補正係数は、エリアＡに関連する領域Ｒの輝度値ＢＲで最高輝度領域ＢＲｍａｘに計算された最大輝度値を除算することに基づいて計算される。利得補正係数を使用して利得補正画像を生成し得、この画像を別の画像（例えば、自己蛍光減算画像）と乗算して、正規化画像を生成することができる。利得補正係数画像は、正規化に使用する前に上述したように平滑化することもできる。
【０２４４】
アッセイ信号の定量化。
幾つかの実施形態では、ＲＭＰＣの拡散プロファイルを使用して、隔離ペン内に存在するＲＭＰＣ量を定量化し得る。拡散プロファイルは、ソースからチャネルに拡散する際のＲＭＰＣの濃度を表す一連の値（「濃度値」）を提供する。
【０２４５】
ＡＯＩの識別後、他の変換を適用し得る。例えば、外れ値及び／又は異常ピクセルの破棄、他の形態の大域／局所的正規化、空間変換及びピクセルの空間の変換（例えば、多次元空間から二次元空間への又はこの逆への）により、各線内のピクセルを処理し得る。
【０２４６】
実施形態に応じて、強度値を異なるように使用して濃度値を計算し得る。幾つかの実施形態では、ＡＯＩは、固定点でサンプリングされて、固定点での強度値に対応する濃度値の組を生成し得る。幾つかの実施形態では、ＡＯＩは、一連のセグメントでセグメント化し得、各セグメントのメジアン又は平均強度を計算し得る。実施形態及び必要とされる分解能の程度に基づいて、計算される濃度値の数は、わずか１でもあり得、及び拡散軌道を表す線内のピクセルの数ほど多数でもあり得る。
【０２４７】
実施形態に応じて、濃度値を異なるように結合して、存在する結合リポーター分子からの信号量（及びしたがって分泌検体量）を定量化し得る。幾つかの実施形態では、濃度値をプロットして、濃度値が拡散プロファイルと一致した特性を示すか否かを評価し得る。実施形態に応じて、幾つかのアルゴリズムを使用して、線を濃度値にフィッティングし、線に関連する傾き及びエラー等の線の特性を計算し得る。適する線フィッティングアルゴリズムとしては、最小二乗、多項式フィッティング、曲線フィッティング及び相補誤差関数（ｅｒｆｃ）フィッティングが挙げられる。他のアルゴリズムも当技術分野で知られている。蛍光強度値を変換して濃度値を取得する方法について、より詳細に以下に説明する。
【０２４８】
図１４Ａは、識別番号「１１０７」を有する１つの隔離ペン１４２４のアッセイ画像（写真）であり、予期される拡散軌道の線１４５２が示されている。ＡＯＩ１４５０は、アッセイ画像に射影され、この例では、幅約１２ピクセルを有し、線により定義される軸に沿って２０の等しいセグメント（セグメントは図示されず）にセグメント化された。２０の等しいセグメントのそれぞれのメジアン強度を計算し、図１４Ｂのグラフにおいて濃度値としてプロットした。グラフの横軸には、セグメント番号１〜２０がソース（すなわち分泌検体を分泌している細胞）からの距離に従って付番され、低い番号を有するセグメント番号は、チャネルから最も離れた隔離ペンの領域内の細胞に最も近いＡＯＩのセグメントを表す。
【０２４９】
図１４Ｂは、前の段落及び以下の他のセクションにおいて考察される方法に従って生成された隔離ペンの組の濃度値を表す一連の曲線を示す。図１４Ｂに示される一連の曲線を生成するために、各隔離ペンに生成された濃度値は、隔離ペン内の細胞数に基づいて正規化されなかった。しかし、代替の実施形態では、濃度値及びその結果生成される曲線は、各隔離ペン内の細胞数に基づいて正規化し得る。図１４Ｂに示されるように、各ペンの曲線（濃度値の）の傾きを使用して、各隔離ペン内に存在する分泌検体の相対量を評価し得る。換言すれば、傾きは、隔離ペンをランク付けし、互いに相対して並べることができるようなスコアとして使用し得、「傾き」及び「スコア」は、本明細書における幾つかの実施形態では、同義で使用し得る。幾つかの場合、スコアは、分泌スコアと呼ばれることもある。より詳細には、分泌検体が、隔離ペンに存在する生物学的微小物体（例えば、細胞）により産出される場合、傾きを使用して、分泌検体（例えば、抗体を分泌する細胞の相対能力）を産出する、各隔離ペン内の細胞の相対能力を評価し得る。後述するように、分泌検体の相対量又は絶対量は、隔離ペン内の細胞の位置が集中し、且つ観測された蛍光強度のばらつきの影響を最も受けやすいＡＯＩのサブ領域（例えば、図１２Ｂの領域１２５６、図１０Ａ及び図１０Ｂの１０４４並びに図９Ａ及び図９Ｂの９４４）内の全てのポイントの合算を含め、様々な方法を使用して計算し得る。
【０２５０】
加えて、曲線の形状を評価して、各ペンの濃度値が予期されるパラメータに一致するか否か、又は系統的なエラーを示すか否かを評価し得る。例えば、図１４Ｂにおいて「ペン１４９７」と標識された曲線の形状は、他の隔離ペンで観測された曲線の形状に対応しない一方、「ペン１１０７」と標識された曲線の形状は、予期された拡散プロファイルに対応する。図１４Ａに示されるように、ペン１１０７は、隔離ペンからチャネルまでリポーター分子の可視の勾配を有し、それにより、予期された拡散プロファイルに対応した曲線になる。図１４Ｃに示されるように、識別番号ペン１４９７を有する隔離ペン１４２６は、予期される拡散軌道の線１４５２及びＡＯＩ１４５０を有する。しかし、隔離ペン１４２６は、気泡を含むチャネルの近くにあり、気泡のメニスカス１４０１は、白色楕円として画像に現れる。気泡の存在により、図１４Ｂに示されるペン１４９７の曲線は変形する。様々な実施形態では、線形回帰を適用し得るセグメント化ＡＯＩの領域は、セグメント（サブ領域）９〜１３であるように選択し得、上述したように、接続領域の部分を包含し、蛍光強度のばらつきの影響を最も受けやすく、且つ隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくいものとして識別されている。
【０２５１】
図１５は、マイクロ流体デバイス内の複数の隔離ペンから得られる、本明細書に記載される任意の方法を介して導出された強度値（及びしたがって濃度値）を表す複数の曲線のオーバーレイを示す。グラフの縦軸にプロットされた各曲線内の各点の強度値は、オーバーレイを容易にするために正規化されている。横軸に沿った値は、ゼロに等しい「ｙ」の値で開始され、各ＡＯＩのｙ次元での最初のピクセルを表す（且つ図９Ａ及び図９Ｂ、図１０Ａ及び図１０Ｂ、図１２Ａ及び図１２ｂ並びに図１４Ａ及び図１４Ｃに示されるＡＯＩと同様に、マイクロ流体デバイスのチャネル内且つ隔離ペンの外部に物理的に位置する。「２００」と標識された横軸に沿った点は、複数の隔離ペンの各ＡＯＩ内の最後のピクセルに対応し、検体を分泌している細胞及びしたがってＲＭＰＣからの検出可能な信号が発せられるソースに最も近いＡＯＩの境界である。隔離ペン内の細胞の位置の影響を最も受けにくく、且つ蛍光強度のばらつきの影響を最も受けやすいＡＯＩの部分１５４４から得られた濃度値は、示されるように、約９０から約１３０の間のｙ値に関連する曲線の部分に示されている。この領域に線形を課し、その傾きを抽出する数学的演算がデータの状態を密に表すことを見て取ることができる。
【０２５２】
それぞれが別個の隔離ペンに配置された１つの細胞から導出された数千のクローン集団を含むナノ流体デバイスにわたりアッセイを実行することにより、各クローン集団の定量化を提供することができる。図１６Ａ及び図１６Ｂに示されるように、希な高生産クローンを発見する能力が強化される。細胞のランダム分泌プールからの力価の分布がポアソン統計により良好に記述されると仮定される場合、力価分布は、ガンマ分布に合うはずである。図１６Ａでは、（スコアから得られ、複数の各隔離ペンに存在する細胞数について正規化され、任意の単位（Ａ．Ｕ．）で表された力価の棒グラフ分布に重ねられた曲線は、良好な一致を示す。クローン集団の大半は、５０Ａ．Ｕ．未満から１００Ａ．Ｕ．未満の検体を表し、２５０Ａ．Ｕ．以上の高範囲には非常に少数の個々の力価がある。同じデータは、ここで、成長率に対して（横軸に沿った）相対的な特定の生産性をプロットして示される。グラフに重ねられた曲線は、一定力価の線を示し、ここでも、クローンの大半が、成長が速いクローンであるか又は遅いクローンであるかに関係なく、１００Ａ．Ｕ．未満において検体を発現し、細胞株の発展に求められる望ましい高生産クローンでないことを示す。領域１６７０、１６８０及び１６９０内で識別される少数のクローンは、希な高生産クローンである。しかし、これらのクローンは、元々播種された１つの細胞から生じた最高生産クローンではない。これらの細胞がウェルプレート又は振とうフラスコ等のより大きい成長環境の一環として他の細胞と混合された場合、これらの希な高生産クローンは、より高速に成長し、生産性のより低いクローンの異常増殖を受ける可能性が最も高い。増殖させる単一の細胞セットをランダムに選択しようとする場合、これらのクローンを識別しようとすることは、播種確率を有するために必要な細胞数を成長させるために、リソースの大量の入力を用いた大量のサンプリング努力が必要である。本明細書に提供されるシステムでは、力価（又はスコア）は、全てのクローン集団で取得し得、生産性の高いクローンの物理的位置は既知である（以下の図２１を参照されたい）。更に、選択されたクローンのみを選択し、更なる増殖／サブクローニングのために物理的に移動させ得、選択及び移動が個々に実行されて、他の細胞集団による汚染を回避し得る。元々播種された細胞から生じた全てのクローンをスクリーニングする機会は、所望の検体を分泌する細胞をスクリーニングし選択するプロセスの大きい改善を提供する。
【０２５３】
方法。
生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団の検体の分泌のレベルを評価する方法が提供され、この方法は、生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することであって、マイクロ流体デバイスは、フロー領域を有するエンクロージャを含み、隔離ペンは、フロー領域に流体的に接続され、隔離ペンは、第１の流体媒体を含む、導入することと、生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団に、隔離ペン内の第１の流体媒体内に検体を分泌させることと、第２の流体媒体をフロー領域に導入することであって、第２の流体媒体は、複数のリポーター分子を含み、各リポーター分子は、分泌検体に結合するように構成される結合成分、及び検出可能な標識を含む、導入することと、複数のリポーター分子の一部を隔離ペン内に拡散させ、且つそこに分泌された検体に結合させ、それにより、複数のリポーター分子：分泌検体（ＲＭＳＡ）複合体を生成することと、マイクロ流体デバイス内の対象エリア内に位置するリポーター分子を検出することであって、対象エリアは、隔離ペンの少なくとも一部を含む、検出することとを含む。
【０２５４】
幾つかの実施形態では、フロー領域も第１の流体媒体を含み得る。他の実施形態では、フロー領域は、第１の流体媒体と異なる流体媒体を含み得る。
【０２５５】
幾つかの実施形態では、リポーター分子は、分泌検体と結合し得、それにより、化学量論１：１、２：１、３：１、４：１、２：２、４：２等のリポーター分子：分泌検体のＲＭＳＡ複合体を有するＲＭＳＡ複合体を形成する。
【０２５６】
検体の分泌のレベルを評価する方法の様々な実施形態では、リポーター分子を検出することは、非結合リポーター分子を検出することと、ＲＭＳＡ複合体の一部であるリポーター分子を検出することとを含み得る。
【０２５７】
様々な実施形態では、隔離ペンは、分離領域及び分離領域をフロー領域に流体的に接続する接続領域を有し、分離領域及び接続領域は、分離領域内の流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみフロー領域内の流体媒体の成分と交換されるように構成される。
【０２５８】
検体の分泌のレベルを評価する方法の様々な実施形態では、方法は、隔離ペン内の生物学的微小物体を増殖させて、生物学的微小物体のクローン集団にすることを更に含む。
【０２５９】
様々な実施形態では、方法は、培養媒体でフロー領域を灌流させることを更に含み得、灌流は、生物学的微小物体を隔離ペンに導入した後且つ第２の流体媒体をフロー領域に導入する前に行われる。幾つかの実施形態では、培養媒体は、第１の媒体と同じであり得る。
【０２６０】
様々な実施形態では、培養媒体は、可溶性フィーダ細胞成分、定義された溶解酸素成分、定義されたｐＨ成分、排出成長媒体成分及び／又は可溶性刺激成分の１つ又は複数を含み得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス内で培養されている細胞の生存性は、マイクロ流体デバイス内での細胞培養を刺激又は他の方法でサポートする補助生体分子を提供するフィーダ細胞の上清培養媒体の一部を含むことにより改善し得る。フィーダ細胞自体は、マイクロ流体デバイス内に存在しなくてもよく、標準反応容器内で培養し得る。フィーダ細胞の存在により調整された培養媒体の一部の収穫及びマイクロ流体デバイスへの輸送を実行し得る。他の実施形態では、溶解酸素量を測定し、必要に応じて変更し得、これは、培養ウェルプレート、振とうフラスコ等でのそのような調整と比較して、本明細書に記載されるマイクロ流体環境内の容易なプロセスであり得る。幾つかの他の実施形態では、マイクロ流体環境内の培養媒体のｐＨを監視して変更し得、ここでも、標準的に使用されるプラスチック製品よりも容易なプロセスである。
【０２６１】
更に他の実施形態では、消費された成長媒体をマイクロ流体環境に追加し得、これは、マイクロ流体環境内のいずれのクローンがなおより容易に分泌検体を生成し得るか、又はウェルプレート、振とうフラスコ及びバイオリアクタを含み得る様々なタイプの反応容器のスケールアップ環境の近似に使用し得るかを分析する選択機構として機能することができる。更に他の実施形態では、マイクロ流体環境内の細胞を刺激して、刺激成分の導入前よりも高速で検体を生成するか、又は異なる検体を生成し得る抗体（ＣＤ２８を含むがこれに限定されない）、サイトカイン、成長因子等の可溶性刺激成分である。他の実施形態では、細胞が互いに及びペンに付着するのを防ぐように構成された１つ又は複数の化合物及び／又は試薬を培養媒体に追加し得る。
【０２６２】
幾つかの実施形態では、培養媒体へのこれらの追加の１つ又は複数は、隔離ペン内の細胞の１つ又は複数に選択的圧力を与え得る。
【０２６３】
様々な実施形態では、第２の流体媒体をフロー領域に導入することは、第１の時間期間にわたり、フロー領域を通して第２の流体媒体を流すことを含む。幾つかの実施形態では、第１の時間期間は、非結合リポーター分子の拡散プロファイルのモデリングに基づき得る。幾つかの実施形態では、第１の時間期間は、約３０分から約６０分であり得る。
【０２６４】
方法は、第３の流体媒体をフロー領域に導入することであって、第３の流体媒体は、リポーター分子を含まない、導入することと、非結合リポーター分子の少なくとも一部を隔離ペンから拡散させることとを更に含み得、対象エリア内のリポーター分子を検出することは、隔離ペンから拡散した非結合リポーター分子の量が、隔離ペンから拡散したＲＭＳＡ複合体の量の少なくとも２倍だけ大きいように選択された時間において行われる。検出することは、非結合リポーター分子を検出することと、ＲＭＳＡ複合体の一部であるリポーター分子を検出することとを含み得る。様々な実施形態では、第３の流体媒体をフロー領域に導入することは、第２の時間期間にわたり、フロー領域を通して第３の流体媒体を流すことを含み得る。幾つかの実施形態では、第２の時間期間は、非結合リポーター分子及びＲＭＳＡ複合体の拡散プロファイルのモデリングに基づいて選択され得る。
【０２６５】
様々な実施形態では、対象エリアは、隔離ペン内からフロー領域への拡散軸に沿って整列された隔離ペンの少なくとも一部を含み得る。様々な実施形態では、対象エリア内に位置するリポーター分子を検出することは、対象エリアから到来する検出可能な信号の強度を測定することを含み得、検出可能な信号の少なくとも幾つかは、対象エリア内に位置するリポーター分子の検出可能な標識から発せられる。幾つかの実施形態では、検出可能な信号の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれを超えるものは、対象エリア内に位置するリポーター分子の検出可能な標識から発せられる。幾つかの実施形態では、対象エリア内に位置するリポーター分子を検出することは、検出可能な信号の測定された強度から背景信号の強度を減算することにより、背景減算信号強度を特定することを更に含み得る。背景信号は、リポーター分子が検出されるたびに測定しなくてもよい。幾つかの実施形態では、背景信号は、既知／標準の状況（例えば、チップタイプ、チップ内の隔離ペンの位置、検出可能な標識のタイプ、第１の流体媒体の成分）に基づいて予め決定し得る。
【０２６６】
方法は、生物学的微小物体を隔離ペンに導入する前の時間において、対象エリア内の背景信号の強度を測定することを更に含み得る。様々な実施形態では、検出可能な信号の測定された強度又は背景減算信号強度は、隔離ペン内で観測された細胞数について正規化され得る。
【０２６７】
様々な実施形態では、方法は、検体の分泌のレベルを定量化することを更に含み得る。産出物の分泌のレベルを定量化することは、いずれも視野内のビネットについて正規化し得る検出可能な信号の測定強度又は背景減算信号強度等の任意の幾つかの測定に基づき得る。方法は、隔離ペンの分泌スコアを提供することを更に含み得る。分泌スコアは、検出及び／又は正規化された蛍光信号を処理する方法を記載する以下のセクションにおける任意の方法により特定し得る。
【０２６８】
様々な実施形態では、分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも２倍の大きさの分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも４倍だけ大きい分子量を有し得る。他の実施形態では、分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも１０倍だけ大きい分子量を有し得る。
【０２６９】
様々な実施形態では、リポーター分子の結合成分は、少なくとも１つのアミノ酸及び／又は少なくとも１つ核酸を含み得る。幾つかの実施形態では、リポーター分子の結合成分は、ペプチド又はタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、リポーター分子の結合成分は、配列番号１から１０のいずれか１つの配列を有するペプチドを含み得る。幾つかの他の実施形態では、リポーター分子の結合成分は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ又はタンパク質Ａ若しくはタンパク質ＧのＩｇＧ結合断片を含む。様々な実施形態では、リポーター分子の結合成分は、アプタマーを含み得る。
【０２７０】
様々な実施形態では、検出可能な標識は、可視標識、発光標識、リン光標識又は蛍光標識を含み得る。幾つかの実施形態では、検出可能な標識は、蛍光標識であり得る。
【０２７１】
様々な実施形態では、生物学的微小物体によって分泌される検体は、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含み得る。幾つかの実施形態では、生物学的微小物体によって分泌される検体は、抗体であり得る。他の実施形態では、生物学的微小物体によって分泌される検体は、抗体以外のタンパク質であり得る。
【０２７２】
様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスは、複数の隔離ペンを含み得、配置するステップは、生物学的微小物体を複数の隔離ペンの少なくとも一部内に配置することを含み得る。様々な実施形態では、方法は、複数の隔離ペンのうちの隔離ペンのサブセットの各隔離ペンの分泌のレベルを比較するステップを更に含み得る。方法は、複数の隔離ペンのうちの２つ以上の隔離ペンのスコアを比較するステップを更に含み得る。幾つかの実施形態では、方法は、分泌のレベルを定量化するステップを更に含み得る。様々な実施形態では、方法は、複数の隔離ペンのうちの１つ又は複数を選択するステップと、生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団を選択された１つ又は複数の隔離ペンから搬出するステップとを更に含み得る。様々な実施形態では、この方法は、その結果生成されたサブクローン集団を更に増殖させてアッセイすることにより、サブクローニング及びサブクローンの比較分析を可能にする。これは、選択されたクローン集団をマイクロ流体デバイス内の別の隔離ペンの組に移し、選択された集団の個々の各細胞を再び増殖させることにより達成し得る。他の実施形態では、方法は、選択された生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団をマイクロ流体デバイスから搬出するステップを更に含み得る。様々な実施形態では、隔離ペンからチャネルに又は隔離ペン及び／又はチャネルからマイクロ流体デバイスを出て搬出するステップは、選択された各隔離ペンで個々に実行し得る（例えば、選択された隔離ペンの組からの細胞は、一度に隔離ペン１つずつで一連の搬出ステップで搬出され得る）。幾つかの実施形態では、隔離ペン内に配置された細胞は、以前にアッセイされた隔離ペンからのものであり得、サブクローニング及びサブクローンの比較分析を可能にする。例えば、特定の抗体の絶対値又は相対値を使用して、高容量の特定の抗体を生成する細胞を選択し増殖させ得る。同様に、タンパク質（例えば、ＩｇＧ領域を有する抗体）の群の絶対値又は相対値を使用して、高容量の抗体を生成する細胞を選択し増殖させ得る。幾つかの実施形態では、分泌検体量を表す相対値又は絶対値に関連する隔離ペンからの全ての細胞が選択され、同じ隔離ペン内又はチップの他の包含エリアで増殖する。他の実施形態では、分泌検体量を表す相対値又は絶対値に関連する同じ隔離ペンからの細胞の１つ又は複数が選択され、異なる隔離ペン内で増殖する。幾つかの実施形態では、相対値又は絶対値を生成する上記のステップは、増殖した細胞に対して繰り返し実行し得る（１回、２回、３回、４回又はそれを超える回数）。
【０２７３】
別の実施形態では、この方法の適用により、繰り返されるアッセイからのフィードバックを用いて、細胞への特定の状況の影響を調べることができる。例えば、分泌検体の大規模集団により密に関連する状況及び材料を使用して、更に調べるのに最も適するクローンを発見し且つ特徴付け得る。別の例では、Ｂ細胞抗体刺激への多様な刺激プロトコールをより高い再現性で調べ得、他のプロトコールよりも優れたあるプロトコールの利点をより同等に評価するためにアッセイし得る。
【０２７４】
ここで、図１７を参照すると、図１７は、本開示の幾つかの実施形態による隔離ペン内に存在する分泌検体量を定量化するために実行される機能を示す。
【０２７５】
枠１７０２において、分泌検体を生成する生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイス内の１つ又は複数の隔離ペン内に維持される。例えば、生物学的微小物体は、隔離ペン内で培養され得、又は光学的に作動し得る、重力及び／又は誘電泳動力を含む様々な手段を使用して隔離ペンに装填され得る。各ペンは、単一の生物学的微小物体又は複数の生物学的微小物体を含み得る。複数の生物学的微小物体は、単一の生物学的微小物体から生成される生物学的微小物体のクローン集団（例えば、細胞のクローン集団）であり得、又は生物学的微小物体の異種集団であり得る。
【０２７６】
枠１７０４において、信号成分及び分泌検体に結合する結合成分を有するリポーター分子がチャネル又は隔離ペンに提供される。例えば、リポーター分子は、チャネルに流入して、チャネルへの隔離ペン開口部内に拡散し得る。リポーター分子をチャネルに提供する他の手段を使用することもできる。
【０２７７】
枠１７０６において、リポーター分子は、非結合状態で定常状態濃度平衡に達するまでマイクロ流体デバイス内（例えば、チャネル及び隔離ペン内）に拡散する。リポーター分子の分子量に応じて、定常状態濃度平衡を達成するのに必要な時間量は様々であり得る。
【０２７８】
枠１７０８において、リポーター分子は、隔離ペンに存在する分泌検体に結合する。幾つかの実施形態では、チャネル内でフローが再開され、非結合リポーター分子を隔離ペン外に拡散させる。
【０２７９】
枠１７１０において、非結合リポーター分子及びＲＭＳＡ複合体を含む隔離ペン及びチャネルの画像が生成される。リポーター分子の信号成分に応じて、マイクロ流体デバイスを特定の光に露出させる（例えば、蛍光体又は特定の周波数の光に露出させる）か、又は追加の試薬を導入して信号成分を可視化する必要があり得る。
【０２８０】
枠１７１２において、隔離ペン及びチャネルの画像が分析されて、隔離ペンに存在する分泌検体の量を計算する。
【０２８１】
ここで、図１８を参照すると、図１８は、本開示の幾つかの実施形態による分泌検体量を表す絶対値又は相対値を計算するために実行される機能を示す。
【０２８２】
枠１８０２において、チャネル及び隔離ペンを含むマイクロ流体デバイスの画像が正規化されて、系統的エラーを補正する。上述したように、系統的エラーの補正のために様々な異なる正規化アルゴリズムが使用可能である。幾つかの実施形態では、利得補正係数を使用して画像を正規化する。幾つかの実施形態では、隔離ペンに隣接するチャネルに存在する蛍光信号の量を使用して画像を正規化する。幾つかの実施形態では、自己蛍光画像は、正規化中、マイクロ流体デバイスの画像から減算される。
【０２８３】
枠１８０４において、ペン内の分泌検体のソース（例えば、ペン内の細胞）から、ペンに近いチャネルへの予期される拡散軌道の軸を表す線が識別される。予期される拡散軌道の軸に沿って整列したＡＯＩが識別され、隔離ペン内からチャネル内に延在する。ＡＯＩの少なくとも一部は、信号強度の影響を最も受けやすく、同時に隔離ペン内の細胞位置の影響を受けにくい領域を含む。上述したように、ＡＯＩ及び信号の影響を最も受けやすい／細胞位置の影響を受けにくい各領域は、隔離ペンの幾何学的形状、ペン内の分泌検体のソースの位置、分泌検体の分子量及びチャネル内のフローの存在（又は不在）を含むがこれらに限定されない幾つかの異なるパラメータを計算的にモデリングすることにより特定し得る。
【０２８４】
枠１８０６において、細胞位置の影響を受けにくく、且つ信号変動の影響を最も受けやすいＡＯＩの少なくとも一部を含むＡＯＩに基づいて１つ又は複数の濃度値が生成される。実施形態によれば、濃度値は、ＡＯＩ内のピクセルのサンプリング又はピクセル群へのＡＯＩのセグメント化に基づいて計算され得る。
【０２８５】
枠１８０８において、１つ又は複数の濃度値を使用して、各隔離ペンに存在する分泌検体量を表す相対値又は絶対値を計算する。上述したように、所与の隔離ペンに計算された１つ又は複数の濃度値は、各隔離ペンに存在する生物学的微小物体（例えば、細胞）の数に基づいて正規化し得る。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の濃度値を使用して、分泌検体のソースからチャネルへの拡散プロファイルを表す曲線又は他の複合値を生成し得る。これらの実施形態では、濃度値（又は他の複合値）の曲線にフィッティングされた線の傾きは、隔離ペンに関連する分泌スコアを評価し得、他の隔離ペンに対する各隔離ペンに存在する分泌検体量（すなわち分泌検体の相対値）の評価に使用し得る。
【０２８６】
別の態様では、クローン株成長の方法が提供され、方法は、生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスの複数の隔離ペンのそれぞれに導入することであって、マイクロ流体デバイスは、フロー領域を有するエンクロージャを更に含み、複数のうちの隔離ペンのそれぞれは、フロー領域に流体的に接続され、且つ第１の流体媒体を含む、導入することと、各生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体のクローン集団に、対応する隔離ペンに含まれる第１の流体媒体に検体を分泌させることと、第２の流体媒体をフロー領域に導入することであって、第２の流体媒体は、複数のリポーター分子を含み、各リポーター分子は、分泌検体に結合するように構成される結合成分、及び検出可能な標識を含む、導入することと、複数のリポーター分子の一部を複数のうちの各隔離ペンに拡散させ、且つそこで分泌された検体の少なくとも一部に結合させ、それにより、複数の隔離ペンのそれぞれにおいて複数のリポーター分子：分泌検体（ＲＭＳＡ）複合体を生成することと、複数のうちの各隔離ペンについて、対応する対象エリアから発せられる信号の強度を検出することであって、対象エリアは、対応する隔離ペンの少なくとも一部を含み、対象エリアから発せられる信号の少なくとも一部は、対象エリア内に位置するリポーター分子の検出可能な標識から発せられる、検出することと、複数のうちの各隔離ペンについて、対応する対象エリアから発せられた検出された信号強度に基づいてスコアを決定することと、複数の隔離ペンから隔離ペンの組を選択することであって、その組の各隔離ペンは、それに含まれる生物学的微小物体又はクローン集団がトップ検体生成者であることを示すスコアを有する、選択することと、マイクロ流体デバイスから、選択された隔離ペンの組の各隔離ペン内に含まれる１つ又は複数の生物学的微小物体を搬出することと、対応する反応容器内において、選択された隔離ペンの組の各隔離ペンから搬出された１つ又は複数の生物学的微小物体を増殖させることと、それぞれの対応する反応容器内で分泌された検体のレベルを特定し、それにより、各生物学的微小物体又はクローン集団の分泌のレベルを特定することとを含む。トップ検体生成者は、生成者の上位５０％の１つであり得る。幾つかの実施形態では、トップ検体生成者は、上位５５％、上位６０％、上位６５％、上位７０％、上位７５％、上位８０％、上位８５％、上位９０％、上位９２％、上位９４％、上位９５％、上位９６％、上位９７％、上位９８％、上位９９％又はそれを超える生産クローンの中の率で検体を生成する。代替的に、トップ生成者は、閾値量よりも大きい検体を生成することができる。
【０２８７】
様々な実施形態では、スコアは、対応する対象エリアから発せられた信号の強度であり得、又は対応する対象エリアから発せられた信号の強度に基づいて計算され得る。
【０２８８】
複数のうちの各隔離ペンは、分離領域及び分離領域をフロー領域に流体的に接続する接続領域を有し得、分離領域及び接続領域は、分離領域内の流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみフロー領域内の流体媒体の成分と交換されるように構成され得る。
【０２８９】
様々な実施形態では、方法は、複数のうちの幾つか又は全ての隔離ペン内の個々の生物学的微小物体を増殖させて、生物学的微小物体のクローン集団にすることを更に含む。様々な実施形態では、方法は、培養媒体でフロー領域を灌流させることを更に含み、灌流は、個々の生物学的微小物体を複数の隔離ペンに導入した後且つ第２の流体媒体をフロー領域に導入する前に行われる。培養媒体は、第１の媒体と同じであり得る。灌流は、連続して又は断続的に実行され得る。
【０２９０】
幾つかの実施形態では、培養媒体は、可溶性フィーダ細胞成分、定義された溶解酸素成分、定義されたｐＨ成分、排出成長媒体成分及び／又は可溶性刺激成分の１つ又は複数を含み得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイス内で培養されている細胞の生存性は、マイクロ流体デバイス内での細胞培養を刺激又は他の方法でサポートする補助生体分子を提供するフィーダ細胞の上清培養媒体の一部を含むことにより改善し得る。フィーダ細胞自体は、マイクロ流体デバイス内に存在しなくてもよく、標準反応容器内で培養し得る。フィーダ細胞の存在により調整された培養媒体の一部の収穫及びマイクロ流体デバイスへの輸送を実行し得る。他の実施形態では、溶解酸素量を測定し、必要に応じて変更し得、これは、培養ウェルプレート、振とうフラスコ等でのそのような調整と比較して、本明細書に記載されるマイクロ流体環境内の容易なプロセスであり得る。幾つかの他の実施形態では、マイクロ流体環境内の培養媒体のｐＨを監視して変更し得、ここでも、標準的に使用されるプラスチック製品よりも容易なプロセスである。
【０２９１】
更に他の実施形態では、消費された成長媒体をマイクロ流体環境に追加し得、これは、マイクロ流体環境内のいずれのクローンがなおより容易に分泌検体を生成し得るか、又はウェルプレート、振とうフラスコ及びバイオリアクタを含み得る様々なタイプの反応容器のスケールアップ環境の近似に使用し得るかを分析する選択機構として機能することができる。更に他の実施形態では、マイクロ流体環境内の細胞を刺激して、刺激成分の導入前よりも高速で検体を生成するか、又は異なる検体を生成し得る抗体（ＣＤ２８を含むがこれに限定されない）、サイトカイン、成長因子等の可溶性刺激成分である。他の実施形態では、細胞が互いに及びペンに付着するのを防ぐように構成された１つ又は複数の化合物及び／又は試薬を培養媒体に追加し得る。
【０２９２】
方法の様々な実施形態では、第２の流体媒体をフロー領域に導入することは、第１の時間期間にわたり、フロー領域を通して第２の流体媒体を流すことを含み得る。第１の時間期間は、非結合リポーター分子の拡散プロファイルのモデリングに基づいて選択され得る。幾つかの実施形態では、第１の時間期間は、約３０分から約６０分であり得る。
【０２９３】
様々な実施形態では、方法は、第３の流体媒体をフロー領域に導入することであって、第３の流体媒体は、リポーター分子を含まない、導入することと、非結合リポーター分子の少なくとも一部を隔離ペンから拡散させることとを更に含み、複数のうちの各隔離ペンの対応する対象エリアから発せられる信号の強度を検出することは、隔離ペンから拡散した非結合リポーター分子の量が、隔離ペンから拡散したＲＭＳＡ複合体の量の少なくとも２倍だけ大きいように選択される時間において行われる。幾つかの実施形態では、第３の流体媒体をフロー領域に導入することは、第２の時間期間にわたり、フロー領域を通して第３の流体媒体を流すことを含み得る。幾つかの実施形態では、第２の時間期間は、非結合リポーター分子及びＲＭＳＡ複合体の拡散プロファイルのモデリングに基づいて選択され得る。幾つかの実施形態では、第２の時間期間は、約２０分から約５０分であり得る。
【０２９４】
方法の様々な実施形態では、対象エリアは、隔離ペン内からフロー領域への拡散軸に沿って整列された隔離ペンの少なくとも一部を含み得る。
【０２９５】
方法の様々な実施形態では、複数のうちの各隔離ペンの対応する対象エリアから発せられた信号の強度を検出することは、検出可能信号の測定された強度から背景信号の強度を減算して、背景減算信号強度を特定することを含み得る。背景信号は、リポーター分子が検出されるたびに測定しなくてもよい。幾つかの実施形態では、背景信号は、既知／標準の状況（例えば、チップタイプ、チップ内の隔離ペンの位置、検出可能な標識のタイプ、第１の流体媒体の成分）に基づいて予め決定し得る。
【０２９６】
様々な実施形態では、方法は、生物学的微小物体を隔離ペンに導入する前の時間において、複数のうちの各隔離ペンの対応する対象エリア内の背景信号の強度を測定することを更に含み得る。幾つかの実施形態では、検出可能な信号の測定された強度又は背景減算信号強度は、対応する隔離ペン内で観測された細胞数について正規化され得る。
【０２９７】
様々な実施形態では、複数の隔離ペンのスコアは、検出及び／又は正規化された蛍光信号を処理する方法を記載する以下のセクションにおける任意の方法により特定される。
【０２９８】
様々な実施形態では、分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも２倍の大きさの分子量を有し得る。幾つかの実施形態では、分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも４倍だけ大きい分子量を有し得る。他の実施形態では、分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも１０倍だけ大きい分子量を有し得る。
【０２９９】
様々な実施形態では、リポーター分子の結合成分は、少なくとも１つのアミノ酸及び／又は少なくとも１つ核酸を含み得る。幾つかの実施形態では、リポーター分子の結合成分は、ペプチド又はタンパク質を含み得る。幾つかの実施形態では、リポーター分子の結合成分は、配列番号１から１０のいずれか１つの配列を有するペプチドを含み得る。幾つかの他の実施形態では、リポーター分子の結合成分は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ又はタンパク質Ａ若しくはタンパク質ＧのＩｇＧ結合断片を含み得る。様々な実施形態では、リポーター分子の結合成分は、アプタマーを含み得る。
【０３００】
様々な実施形態では、検出可能な標識は、可視標識、発光標識、リン光標識又は蛍光標識を含み得る。幾つかの実施形態では、検出可能な標識は、蛍光標識であり得る。
【０３０１】
様々な実施形態では、生物学的微小物体によって分泌される検体は、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含み得る。幾つかの実施形態では、生物学的微小物体によって分泌される検体は、抗体であり得る。他の実施形態では、生物学的微小物体によって分泌される検体は、抗体以外のタンパク質であり得る。
【０３０２】
様々な実施形態では、反応容器は、ウェルプレート内のウェル、振とうフラスコ又はバイオリアクタであり得る。反応容器は、約２０μＬ超、約１００μＬ超、約１ｍＬ超、約１０ｍＬ超、約１００ｍＬ超、約１Ｌ超又はそれを超える容積を有し得る。バイオリアクタは、以下の特徴の１つ又は複数を有し得る：Ｏ２及びＣＯ２の独立制御を用いたｐＨ及び溶解酸素（ＤＯ）の閉ループ制御、２０Ｌ、５０Ｌ、５０ガロン（約１８９Ｌ）、２００ガロン（約７５７Ｌ）又はそれを超える容積を有し得る分泌検体の大量生産に使用されるリアクタの環境をより密に近似し得る、リアクタ準備、播種、塩基添加及びサンプリングの自動液体処理。バイオリアクタは、１０ｍＬ又は１５ｍＬ（例えば、ambr15（商標）（TAP Biosystems）バイオリアクタ）等の比較的小量を有し得る。バイオリアクタは、統合生存性分析機能を有し得る。
【０３０３】
図１９は、本開示の幾つかの実施形態による細胞のクローン集団内の分泌検体量を表す絶対値又は相対値を評価するために実行される機能を示す。
【０３０４】
枠１９０２において、単一の細胞が増殖に選択される。上述したように、細胞は、アッセイの結果に基づいて選択され得、又は細胞は、表現型及び／又はモルフォロジ等の他の特徴性に基づいて選択され得る。
【０３０５】
枠１９０４において、単一の細胞は、増殖されて細胞のクローン集団になる。幾つかの実施形態では、細胞のクローン集団の態様は、細胞が急速に増殖するにつれて分析し得る。例えば、増殖率、細胞のモルフォロジ及び細胞の付着を分析して、細胞の全体的な健康及び／又は生存性を評価し得る。
【０３０６】
枠１９０６において、細胞のクローン集団によって生成された分泌検体の絶対値又は相対値が評価される。幾つかの実施形態では、絶対値又は相対値は、図１２Ａ〜図１２Ｃ及び図１５に関して上述したように評価し得る。幾つかの実施形態では、絶対値又は相対値は、米国特許出願公開第１４／９６４，０２５号に記載される等の他の方法を使用して評価し得、この特許出願は、参照により本明細書に援用される。
【０３０７】
枠１９０８において、細胞のクローン集団によって生成された分泌検体の絶対値又は相対値に基づいて、細胞のクローン集団からの細胞の１つ又は複数を選択し得る。幾つかの実施形態では、１つ又は複数の細胞は、上述したように、細胞増殖中、観測される細胞のクローン集団の態様に基づいて選択し得る。幾つかの実施形態では、選択された細胞は、分析又は更なる増殖（例えば、分泌検体を生成するための細胞株としての増殖）のために搬出し得る。上述したように、幾つかの実施形態では、単一の細胞を増殖し、分泌検体の生成のためにクローン集散を分析するプロセスを繰り返して、第２の分泌検体の絶対量若しくは相対量を評価し、又は単一の細胞が枠１９０６において定量化された分泌検体を安定して生成するか否かを評価し得る。
【０３０８】
分泌検体濃度の絶対値：滴定曲線
幾つかの実施形態では、拡散の理論モデルを使用して、ペンの１つ内の生物学的微小物体の分泌検体の１つ又は複数の濃度値及び／又は既知の数量に基づいて絶対値を生成し得る。実施形態に応じて、異なる拡散理論モデルを使用して、１つ又は複数の濃度値に基づいて検体の絶対値を計算し得る。実施形態に応じて、理論モデルは、様々な現象をモデリングし、様々な仮定を評価し得る。
【０３０９】
幾つかの実施形態では、滴定曲線を使用して生物学的微小物体の分泌検体の絶対値を生成し得る。これらの場合、様々な既知の量の検体をマイクロ流体デバイスに導入して使用し、既知の量の検体を表す絶対値を生成し得る。既知の量の検体を表す絶対値を使用して、部分的に、絶対値と様々な既知の量の検体との線形関係を示す滴定曲線を生成し得る。幾つかの実施形態では、滴定曲線が、様々なシステムパラメータを所与として、検体の正確な定量化の上限及び下限（すなわち線形関係を有する絶対値を生成する検体の最高量及び最低量）を示す「ダイナミックレンジ」を含むように、既知の量の検体に対応する幾つかの絶対値を生成し得る。
【０３１０】
実施形態に応じて、予期される拡散プロファイルを模写する様々な方法を使用して、隔離ペン内のソースにおいて生成される（例えば、隔離ペン内の細胞により）検体と同じように、既知の濃度の検体を生成できるようにし得る。幾つかの実施形態では、様々な既知の濃度の対象検体がリポーター分子と共に培養される。大半の実施形態では、リポーター分子の濃度は、検体の全てのコピーと結合するために必要なリポーター分子量を超える。幾つかの実施形態では、リポーター分子の濃度は、検体の全てのコピーと結合するために必要な量の概ね５倍〜２００倍である。しかし、この範囲は、検体へのリポーター分子の結合親和性に基づいて様々であり得る。例えば、リポーター分子が検体への強い結合親和性を有する実施形態では、リポーター分子の濃度は、検体の全てのコピーと結合するために必要な量の２倍〜２００場合の範囲であり得る。ＦＩＴＣ標識ＣＰＤ４（表１）がＩｇＧとの結合に使用される特定の実施形態では、ＦＩＴＣ標識ＣＰＤ４の濃度は、ＩｇＧの全てのコピーと結合するために必要な量の５倍〜１００倍の範囲であり得る。方法は、ＣＰＤ４の使用に限定されず、拡散アッセイ自体に適する任意のリポーター分子を使用し得る。例えば、蛍光標識されたＣＰＤ１、ＣＰＤ２、ＣＰＤ３、ＣＰＤ５、ＣＰＤ６（表１）を使用して滴定曲線を生成し得、蛍光体は、Alexa Fluor（登録商標）５９４又はHiLyte Fluor（商標）５５５等の任意の適宜選択された蛍光体であり得る。
【０３１１】
幾つかの実施形態では、予期される拡散プロファイルは、非結合リポーター分子及び結合リポーター分子：検体複合体が隔離ペンに入るのに十分な時間にわたり、非結合リポーター分子及びリポーター分子：検体複合体をマイクロ流体デバイスの隔離ペン及びチャネルに提供する（すなわちマイクロ流体デバイス全体を通して非結合リポーター分子及び結合リポーター分子を灌流させる）ことによって生成され得る。ＲＭＳＡ複合体及び非結合リポーター分子がマイクロ流体デバイス全体を通して灌流した後、チャネルに別の媒体のフローを提供し得、それにより、ＲＭＳＡ複合体及び非結合リポーター分子をチャネル及び隔離ペンの掃引領域からなくす（すなわちフラッシュする）。ＲＭＳＡ複合体及び非結合リポーター分子は、次に隔離ペンからチャネルに拡散する。しかし、上述したように、非結合リポーター分子は、ＲＭＳＡ複合体よりも高い拡散率を有する。したがって、非結合リポーター分子は、ＲＭＳＡ複合体よりもはるかに早くマイクロ流体デバイスを通して平衡に達する（すなわちチャネル及び隔離ペンにおいて同じ濃度を有する）。この差により、図１２Ａ〜図１２Ｃ及び図１５に関して上述し、具体的なデータ操作に関して後述するように、ＡＯＩ（対象エリア）のサブ領域のメジアン強度値に基づいて濃度値を定量化することができる。
【０３１２】
図２０は、特定の実施形態によって生成された滴定曲線を示す。特に、図２０は、既知の量のＩｇＧ（ｘ軸にμｇ／ｍＬ単位で示される）に対応する一連の絶対値（ｙ軸に「オンチップアッセイ力価スコア」と標識される）を示す。特に、図２０に示される滴定曲線の生成に使用されたＩｇＧの既知の量は、０．００１５２６μｇ／ｍＬ、０．００３０５２μｇ／ｍＬ、０．００６１０４μｇ／ｍＬ、０．０１２２０７μｇ／ｍＬ、０．０２４４１４μｇ／ｍＬ、０．０４８８２８μｇ／ｍＬ、０．０９７６５６μｇ／ｍＬ、０．１９５３１３μｇ／ｍＬ、０．３９０６２５μｇ／ｍＬ、０．７８１２５μｇ／ｍＬ、１．５６２５μｇ／ｍＬ、３．１２５μｇ／ｍＬ、６．２５μｇ／ｍＬ、１２．５μｇ／ｍＬであった。
【０３１３】
図２０に示される既知の量のＩｇＧ（標識アッセイスコア）を表す絶対値を生成するために、ＦＩＴＣ標識ＣＰＤ４を含む溶液中で既知の量のＩｇＧを培養した。ＩｇＧの全てのコピーの結合及び検出を保証するために、ＩｇＧの全てのコピーを結合するのに必要な量の６倍の量のＦＩＴＣ標識ＣＰＤ４を溶液中に含めた。次に、マイクロ流体デバイスを４５分間にわたって溶液で灌流し、次に１０μＬ／秒の速度で細胞株媒体（ThermoFisher CD CHO媒体）でチャネルをフラッシュした。チャネルをフラッシュした後、ＦＩＴＣ標識ＣＰＤ４及びＩｇＧを１０分間にわたって隔離ペンからチャネルに拡散させた。次に、マイクロ流体デバイスを撮像し、マイクロ流体デバイスを使用して、後述するように、マイクロ流体デバイス内の各隔離ペンのアッセイスコアを生成した。このプロセスは、まず最高量のＩｇＧ（すなわち１２．５μｇ／ｍＬ）で実行され、より低量のＩｇＧをその都度使用して連続して繰り返した。
【０３１４】
マイクロ流体デバイスを撮像した後、マイクロ流体デバイス内の各隔離ペンで生成された個々の絶対値の平均をとることにより、各既知量のＩｇＧのアッセイスコアを計算した。図１２〜図１５に関して上述したように、隔離ペンに生成された濃度値の傾きをとることにより、個々の各絶対値を生成した。特に、選択されたＡＯＩに基づいて生成された濃度値に基づいて各隔離ペンの傾きを計算した。濃度値を生成する前、図１３Ａ及び図１３Ｂに関して上述したように、画像を正規化し、利得補正係数を受けた。各隔離ペンの傾きを計算した後、マイクロ流体デバイス内の全ての隔離ペンの全ての傾きの平均をアッセイスコアとして使用した。
【０３１５】
生成されると、図２０に示される等の滴定曲線を使用して、未知の数量の分泌検体の絶対値を生成し得る。図２０に示されるように、滴定曲線中のアッセイスコアを任意の線フィッティングアルゴリズムを用いてフィッティングして、検体（すなわちＩｇＧ）の絶対値（すなわちアッセイスコア）と既知の量との関係を定義する傾きの式を生成し得る。次に、傾きの式を使用して、実験条件下で観測されたアッセイスコアを所与として、実験条件下で存在する検体（すなわち未知の量の検体を生成している細胞）の量を表す絶対値を生成することができる。図２０に示される滴定曲線を生成するために、Tableauソフトウェアを使用して、アッセイスコアの標準偏差に基づく９５％信頼区間を使用した対数フィッティングモデルを生成した。
【０３１６】
図２０に示されるように、既知の量のＩｇＧのアッセイスコアは、約１μｇ／ｍＬにおいて始まる線形関係を示す。すなわち、アッセイスコアは、ＩｇＧの増量に応答して比例する増大を示す。１μｇ／ｍＬ未満の濃度では、線形関係は観測されない。したがって、図２０に示される滴定曲線は、約１μｇ／ｍＬにおいて正確な定量化の下限を有するダイナミックレンジを示す。図２０に示される滴定曲線は、上限を示さず、なぜなら、最高量のＩｇＧに対応するアッセイスコアが、既知の量のＩｇＧと線形関係を示すアッセイスコアの範囲内にあるためである。
【０３１７】
図２０に示される曲線に示されるように、実験条件下（すなわちＩｇＧを分泌する隔離ペン内の細胞）で通常観測されるアッセイスコアは、滴定曲線においてグレーで標識されると共に、「典型的なアッセイ力価範囲」と標識される。実験条件下で観測されるアッセイスコアは、既知の量のＩｇＧと線形関係を示すアッセイスコアの範囲内にあるため、図２０で生成される傾きを使用して、通常、実験条件下で生成されるＩｇＧの量を計算することができる。
【０３１８】
キット。
生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団によって分泌される検体のレベルを評価するキットが提供され得、キットは、フロー領域及び隔離ペンを有するエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスであって、隔離ペンは、フロー領域に流体的に接続され、フロー領域及び隔離ペンは、流体媒体を含むように構成される、マイクロ流体デバイスと、検出可能な標識及び検体に結合するように構成される結合成分を含むリポーター分子とを含む。
【０３１９】
キットの様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスの隔離ペンは、分離領域及び分離領域をフロー領域に流体的に接続する接続領域を有し得、分離領域及び接続領域は、流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみフロー領域と隔離ペンの分離領域との間で交換されるように構成される。様々な実施形態では、マイクロ流体デバイスのエンクロージャは、ベースを含み得、ベースにフロー領域及び隔離ペンが配置される。幾つかの実施形態では、エンクロージャのベースは、誘電泳動構成を有する基板を含み得る。誘電泳動構成は、光学的に作動し得る。様々な実施形態では、フロー領域は、チャネルであり得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意の隔離ペンのように構成され得る複数の隔離ペンを含み得る。幾つかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの内面は、共有結合的に修飾された表面を含む。様々な実施形態では、キットのマイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意のマイクロ流体デバイスのように構成され得、任意の構成要素、寸法及び／又は多様なマイクロ流体回路要素を任意の組合せで有し得る。
【０３２０】
キットの様々な実施形態では、リポーター分子の結合成分は、少なくとも１つのアミノ酸及び／又は少なくとも１つ核酸を含み得る。幾つかの実施形態では、リポーター分子の結合成分は、ペプチド又はタンパク質を含み得る。様々な実施形態では、ペプチド又はタンパク質結合成分は、ヒト又はマウスのＩｇＧに結合するペプチド又はタンパク質であり得る。幾つかの実施形態では、リポーター分子の結合成分は、ＣＰＤ１、ＣＰＤ２、ＣＰＤ３、ＣＰＤ４、ＣＰＤ７、ＣＰＤ８、ＣＰＤ９、ＣＰＤ１０、ＣＰＤ１１、ＣＰＤ１２、ＣＰＤ１３又はＣＰＤ１４（表１を参照されたい）のいずれかであり得る。幾つかの実施形態では、リポーター分子の結合成分は、ＣＰＤ１、ＣＰＤ２、ＣＰＤ３又はＣＰＤ４（表１を参照されたい）であり得る。幾つかの実施形態では、ヒト又はマウスのＩｇＧに結合するタンパク質結合成分は、ＣＰＤ１又はＣＰＤ２（表１を参照されたい）であり得る。他の実施形態では、リポーター分子の結合成分は、アプタマーを含む。様々な実施形態では、アプタマーは、ＣＰＤ５又はＣＰＤ６（表１を参照されたい）であり得る。幾つかの実施形態では、リポーター分子の結合成分は、ＩｇＧのＦｃに結合する。
【０３２１】
キットの様々な実施形態では、リポーター分子の検出可能な標識は、可視標識、発光標識、リン光標識又は蛍光標識である。幾つかの実施形態では、検出可能な標識は、蛍光標識である。蛍光標識は、ローダミン、フルオレセイン又はシアニン蛍光顔料であり得る。
【０３２２】
キットの様々な実施形態では、キットは、流体媒体も含み得る。流体媒体は、生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団を維持するか、増殖させるか、又はそれに選択的圧力を提供するように構成され得る。
【０３２３】
キットの様々な実施形態では、キットは、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の表面を調整するように構成される試薬も含み得る。幾つかの実施形態では、試薬は、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の表面を共有結合的に修飾するように構成され得る。
【０３２４】
コンピュータ実施システム。
図２５は、本教示の実施形態を実施し得るコンピュータシステム３１００を示すブロック図である。本教示の様々な実施形態では、コンピュータシステム３１００は、情報を通信するバス３１０２又は他の通信機構と、バス３１０２と結合されて情報を処理するプロセッサ３１０４とを含み得る。様々な実施形態では、コンピュータシステム３１００は、メモリ３１０６も含み得、メモリは、バス３１０２に結合されて、プロセッサ３１０４により実行する命令を決定するランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）又は他の動的記憶装置であり得る。メモリ３１０６は、命令の実行中、プロセッサ３１０４により実行される一時変数又は他の中間情報を記憶するのに使用することもできる。様々な実施形態では、コンピュータシステム３１００は、バス３１０２に結合され、プロセッサ３１０４の静的情報及び命令を記憶する読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）３１０８又は他の静的記憶装置を更に含み得る。情報及び命令を記憶するために、磁気ディスク又は光ディスク等の記憶装置３１１０を提供し、バス３１０２に結合することができる。
【０３２５】
様々な実施形態では、コンピュータシステム３１００は、バス３１０２を介して陰極線管（ＣＲＴ）又は液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）等のディスプレイ３１１２に結合して、情報をコンピュータユーザに表示することができる。英数字キー及び他のキーを含む入力デバイス３１１４をバス３１０２に結合して、情報及びコマンド選択をプロセッサ３１０４に通信することができる。別のタイプのユーザ入力デバイスは、指示情報及びコマンド選択をプロセッサ３１０４に通信し、且つディスプレイ３１１２上でのカーソルの動きを制御する、マウス、トラックボール又はカーソル方向キー等のカーソル制御機構３１１６である。この入力デバイス３１１４は、通常、２つの軸である第１の軸（すなわちｘ）及び第２の軸（すなわちｙ）において自由度２を有し、デバイスが平面において位置を指定できるようにする。しかし、３次元（ｘ、ｙ及びｚ）カーソル移動が可能な入力デバイス３１１４も本明細書において意図されることを理解されたい。
【０３２６】
本教示の特定の実装形態によれば、結果は、プロセッサ３１０４がメモリ３１０６に含まれる１つ又は複数の命令の１つ又は複数のシーケンスを実行することに応答して、コンピュータシステム３１００により提供することができる。そのような命令は、別のコンピュータ可読媒体又は記憶装置３１１０等のコンピュータ可読記憶媒体からメモリ３１０６に読み込むことができる。メモリ３１０６に含まれる命令シーケンスの実行は、プロセッサ３１０４に本明細書に記載されるプロセスを実行させることができる。代替的に、ハードワイヤード回路をソフトウェア命令の代わりに又は組み合わせて使用して本教示を実施することができる。したがって、本教示の実装形態は、ハードウェア回路とソフトウェアとのいかなる特定の組合せにも限定されない。
【０３２７】
「コンピュータ可読媒体」（例えば、データストア、データ記憶装置等）又は「コンピュータ可読記憶媒体」という用語は、本明細書で使用される場合、実行のために命令をプロセッサ３１０４に提供することに参加する任意の媒体を指す。そのような媒体は、限定ではなく、不揮発性媒体、揮発性媒体及び伝送媒体を含む多くの形態をとることができる。不揮発性媒体の例としては、記憶装置３１１０等の光ディスク、固体状態ディスク、磁気ディスクを挙げることができる。揮発性媒体の例としては、限定ではなく、メモリ３１０６等のダイナミックメモリを挙げることができる。伝送媒体の例としては、限定ではなく、バス３１０２を構成するワイヤを含め、同軸ケーブル、銅線及び光ファイバを挙げることができる。
【０３２８】
一般的な形態のコンピュータ可読媒体は、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ若しくは任意の他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、フラッシュＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップ若しくはカートリッジ又はコンピュータが読み取り可能な任意の他の有形媒体を含む。
【０３２９】
コンピュータ可読媒体に加えて、命令又はデータは、通信装置又はシステムに含まれる伝送媒体上を信号として提供されて、実行のために１つ又は複数の命令のシーケンスをコンピュータシステム３１００のプロセッサ３１０４に提供することができる。例えば、通信装置は、命令及びデータを示す信号を有する送受信機を含み得る。命令及びデータは、１つ又は複数のプロセッサに本明細書における開示で概説される機能を実施させるように構成される。データ通信伝送接続の代表的な例としては、限定ではなく、電話モデム接続、広域ネットワーク（ＷＡＮ）、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、赤外線データ接続、ＮＦＣ接続等を挙げることができる。
【０３３０】
本明細書に記載される方法論、フローチャート、図及び添付される本開示は、コンピュータシステム３１００をスタンドアロンデバイスとして使用して又はクラウド計算ネットワーク等の共有コンピュータ処理リソースの分散ネットワークで実施し得ることを理解されたい。
【０３３１】
検体定量化システム。
様々な実施形態によれば、微小物体によって生成される検体の数量を特定するシステム及び方法が開示される。検体は、例えば、微小物体からの分泌物を含み得、微小物体は、生物学的微小物体であり得る。検体は、例えば、タンパク質、サッカリド、核酸、抗体、抗原、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含み得る。検体の数量は、後述するように相対数量であり得る。
【０３３２】
図２６は、様々な実施形態による微小物体によって生成される検体の数量を特定するシステムの概略図である。本明細書に記載されるように、システム３２００は、画像取得ユニット３２０２、画像処理ユニット３２０４、及びデータを出力し、関連する入力デバイス（図示せず）を介してユーザ入力を受信するディスプレイ３２１２を含み得る。
【０３３３】
画像処理ユニット３２０２（上記の図１に示された撮像モジュール１６４等であるがこれに限定されない）は、マイクロ流体デバイスホルダ３２１４（上記の図１及び図３Ｂに示された支持構造１０４及び３００等であるがこれらに限定されない）並びに撮像要素３２１６（上記の参照した撮像デバイス１９４等であるがこれに限定されない）を含み得る。
【０３３４】
マイクロ流体デバイスホルダ３２１４は、マイクロ流体デバイスを固定するような向きを有し、そのように設計することができる。マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される任意の様々な例（上記の図１Ｂ、図１Ｃ、図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｄ、図２Ｇ、図２Ｈ、図３Ａ、図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ａ〜図５Ｃ、図９Ｂ、図１０Ｂ、図１１Ａ、図１１Ｂ、図１２Ａ及び図１２Ｂに示されるマイクロ流体デバイス２００、２３０、２５０、２８０、２９０、３２０、４００、５００、９００、１０００、１１００及び１２００等であるがこれらに限定されない）を含み得る。代替的に、ホルダ３２１４は、マイクロ流体デバイスと統合することができる。マイクロ流体デバイスは、フロー領域及び１つ又は複数のチャンバを有することができ、チャンバは、フロー領域に流体的に接続され、各チャンバは、１つ又は複数の微小物体を保持することができる。上述したように、チャンバは、例えば、隔離ペンであり得る。チャンバが、使用される特定の用途に求められるように、任意の形状、サイズ又は向きのものであり得ることを理解されたい。上述したように、フロー領域は、単一のマイクロ流体チャネル又は複数のマイクロ流体フローチャネル（上記の図１Ａ及び図２Ａ〜図２Ｃに示されるチャネル１２２並びに上記の図２Ｄ〜図２Ｆに示されるフローチャネル２６４等であるがこれらに限定されない）であり得、単一の流路又は複数の流路を提供する（上記の図１Ａ及び図２Ｂに示される流路１０６並びに上記の図２Ｃ、図２Ｄ、図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ａ、図９Ｂ、図１０Ｂ、図１２Ａに示される媒体のフロー２４２及び２７８等であるがこれらに限定されない）。フロー領域は、１つ又は複数のチャンバと流体連通し得る。代替的に、フロー領域は、例えば、弁等の可逆的クロージャを介して１つ又は複数のチャンバと流体連通し得る。フロー領域は、上述したように、流入口を介して材料のフローを受け取るように構成することができる。材料のフローは、例えば、微小物体、結合剤若しくは試薬又は材料を含む媒体のフローを含み得る。マイクロ流体デバイスは、流路を通してチャンバ内で結合剤（例えば、リポーター分子等）のフローを受け取るように更に構成することができる。結合剤は、検体に結合すると、結合剤の検出可能な標識によって発せられる光等の電磁放射線（例えば、蛍光、ＵＶ等）を発し得る。検体は、例えば、微小物体からの分泌物を含み得、微小物体は、生物学的微小物体であり得る。検体は、例えば、タンパク質、サッカリド、核酸、抗体、抗原、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含み得る。
【０３３５】
撮像要素２１６は、マイクロ流体デバイスの複数のチャンバ及びフロー領域の１つ又は複数のアッセイ画像３２２２（図２７を参照されたい）を捕捉するように構成することができる。撮像要素３２１６は、分析され、詳細に後述するように１つ又は複数のアッセイ画像３２２２と併せて実施される、対応する１つ又は複数の背景画像３２１８（図２７を参照されたい）を捕捉するように更に構成することができる。
【０３３６】
背景画像３２１８は、いかなる異物（例えば、微小物体、結合剤又は他の試薬等）もマイクロ流体デバイスに導入する前に撮像要素３２１６により撮影することができる。そうするに当たり、背景画像３２１８は、デバイス内、特に更に後述する対象エリアにおける任意の背景ノイズを捕捉する。背景ノイズは、例えば、アーチファクト又は機器セットアップ及び撮像パラメータ  −  例えば、励起源からの光、カメラノイズ及び周辺光  −  に起因し得る。背景ノイズは、例えば、試料、容器、撮像媒体の自己蛍光又は特定の標的に結合しなかった蛍光体から生じる蛍光により付与された背景蛍光にも起因し得る。背景画像にいずれの画像エリアが含まれるかは、その画像がシステムでどのように前に出て実施されるかに依存する。例えば、詳細に後述するように、使用される較正方法に応じて、異なる背景画像エリアが望ましいことがある。
【０３３７】
信号基準画像３２２０は、結合剤が、対象エリア（「ＡＯＩ」）において結合剤濃度が平衡するようなレベルまでチャンバに導入された後、撮像要素３２１６により撮影することができる。そうするに当たり、信号基準画像３２２０は、デバイスの画像取得歪みを捕捉する。そのような歪みは、例えば、マイクロ流体要素又は撮像要素の設計に起因し得る。画像歪みのタイプとしては、例えば、画像エッジ効果、射影歪み、樽形歪み、ピンクッション形歪み、口ひげ歪み及び色収差を挙げることができる。信号基準画像エリアは、ＡＯＩ、チャンバ近くのフロー領域及び関連するＡＯＩ並びに両方の画像を含み得る。いずれの画像エリアが信号基準画像に含まれるかは、その画像がシステムでどのように前に出て実施されるかに依存する。例えば、以下に更に詳細に提供されるように、システムにより実施される較正方法に応じて、異なる信号基準画像を利用し得る。
【０３３８】
図２６のシステム３２００の画像処理ユニット３２０４は、画像取得ユニット３２０２に通信可能に接続することができる。様々な実施形態では、画像処理ユニット３２０４は、対象エリア決定エンジン３２０６及びスコア付けエンジン３２１０を含み得る。画像処理ユニット３２０４の一部として示される（及び本明細書に記載される）各構成要素（例えば、エンジン、モジュール等）は、ハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア又はそれらの任意の組合せとして実施可能であることを理解されたい。
【０３３９】
様々な実施形態では、画像処理ユニット３２０４は、画像取得ユニット３２０２との統合機器システム組立体として実施することができる。すなわち、画像処理ユニット３２０４及び画像取得ユニット３２０２は、同じ筐体組立体内に収容することができ、従来のデバイス／構成要素接続手段（例えば、シリアルバス、光ケーブル、電気ケーブル等）を介して通信することができる。
【０３４０】
様々な実施形態では、画像処理ユニット３２０４は、光学、シリアルポートネットワーク又はモデム接続を介して画像取得ユニット３２０２に通信可能に接続されるスタンドアロン計算デバイス（上記の図２５に示されるように）として実施することができる。例えば、画像処理ユニットは、画像取得ユニット３２０２により取得した撮像データ分析の画像処理ユニット３２０４に送信できるようにするＬＡＮ接続又はＷＡＮ接続を介して接続することができる。
【０３４１】
様々な実施形態では、画像処理ユニット３２０４の機能は、ＷＡＮ（又は均等な）接続を介して通信可能に接続される共有コンピュータ処理リソースの分散ネットワークで実施することができる。例えば、画像処理ユニット３２０４の機能は、AMAZON WEB SERVICES（商標）等のクラウド処理サービスで１つ又は複数の計算ノードにおいて実施されるように分割することができる。
【０３４２】
対象エリア決定エンジン３２０６は、捕捉されたアッセイ画像を撮像要素３２１６から受信し、アッセイ画像に示された各チャンバのＡＯＩを定義するように設計及び構成することができる。対象エリア決定エンジン３２０６は、ＡＯＩ内において、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすいチャンバ内の画像エリアを含むことにより、適切なＡＯＩを定義するようにプログラムすることができる。例えば、これは、撮像要素３２１６により、発光等の電磁放射線（例えば、蛍光、ＵＶ等）の最小の変動を測定することができるチャンバ内のエリアである。更に、画像エリアは、検体変動が測定されるとき、チャンバ内の微小物体の位置の影響を最も受けにくい画像エリアを含み得る。例えば、これは、発光等の電磁放射線（例えば、蛍光、ＵＶ等）の測定感度がチャンバ内の微小物体の存在による影響を受ける程度が最も低いチャンバ内のエリアである。ＡＯＩは、各チャンバと、各チャンバと流体連通するフロー領域との間の拡散軸３３０２（図２８を参照されたい）に沿って延在するように更に定義することができる。
【０３４３】
図２８に示される例示的な実施形態では、拡散軸３３０２は、マイクロ流体デバイス及び対応するチャンバについての空間情報を使用して決定することができる。その空間情報は、システム３２００に含まれるＣＡＤモデル、関連するソフトウェア又は別個のソフトウェアパッケージから導出して、定義された非整列ＡＯＩ３２２４を生成することができる。撮像要素及びマイクロ流体デバイスの較正アルゴリズムは、次に画像データをこのＣＡＤモデルにマッピングして、適切な拡散軸３３０２を取得することができる。このマッピングに基づく空間補正変換３２２６を対象エリア決定エンジン３２０６に適用して、整列ＡＯＩ３２２８の組を生成することができる。ＡＯＩは、対象エリア決定エンジン３２０６から自動的に決定することもでき、又はディスプレイ３２１２へのユーザ入力を介して手動で決定することもできる。
【０３４４】
図２６のシステム３２００のスコア付けエンジン３２１０は、各チャンバの対象エリア内の画像エリアの少なくとも一部を分析して、各チャンバ内の検体の数量を示すスコアを決定するように設計及び構成することができる。更に、スコアは、スコア付けエンジン３２１０により他のスコアと比較して、検体の相対量又は相対濃度を示すことができる無次元値であり得るため、特定されたスコアは、ユーザのために濃度の単位に変換することができる。
【０３４５】
スコアを決定するために、スコア付けエンジン３２１０は、様々なモデルを使用することができる。後述するような幾つかのモデルは、例えば、各チャンバ、フロー領域等内の検体に結合する結合剤（例えば、リポーター分子等）の量を定量化する蛍光データを利用するものであり得る。検体は、例えば、チャンバ内の微小物体からの分泌物を含み得、微小物体は、生物学的微小物体であり得る。スコア付けエンジン３２１０は、特にＡＯＩにわたる結合リポーター分子データ（例えば、蛍光値等）を使用して各チャンバのスコアを決定することができ、スコアは、そのチャンバ内の検体の数量を示す。スコア付けモデルの非限定的な例としては、各チャンバのＡＯＩの画像エリアの一部にわたり線形回帰分析を発光データ（例えば、蛍光値又は何らかの他のタイプの検出可能な信号）に適用すること、シグモイドモデルをＡＯＩに適用すること、対象となる検体を発している生物学的微小物体の位置に対して不変のＡＯＩの平均強度を使用すること、又は各チャンバのＡＯＩの画像エリアの一部にわたる発光データ（例えば、蛍光値又は何らかの他のタイプの検出可能な信号）を積分することが挙げられる。
【０３４６】
シグモイドモデリングは、例えば、シグモイド又は対数の曲線、方程式及び細部によりＡＯＩ内の拡散勾配を近似する。例えば、成長率、漸近線間の差及び変曲点位置等のパラメータの組合せを使用した定量化モデルが必要な正確性及び／又は精密性をもたらし得る。モデルのパラメータは、例えば、使用されるシグモイド曲線の厳密な形態に応じて、非線形回帰又は曲線回帰により推定することができる。一般的なモデルパラメータ推定技法としては、例えば、リーベンベルグ−マルクワルト、シンプレックス及びシミュレートアニーリングが挙げられる。ヒューリスティック技法を使用してパラメータを初期化し、非線形回帰等の反復フィッティング技法中の収束の保証を更に支援することができる。例えば、上下漸近線は、ＡＯＩの両極端におけるサブ領域の平均により大まかに推定することができる。
【０３４７】
代替的に、図２７の実施形態に示されるように、上記のスコア付けモデルをＡＯＩにわたり適用する前、スコア付けエンジン３２１０は、整列したＡＯＩ３２２８を拡散軸３３０２（図２８を参照されたい）に沿って別個のセグメント３２３０に分割することができる。図４は、フロー領域３３０８、チャンバ３３０６、拡散軸３３０２、複数のセグメント３３０４及び微小物体３３１０を含むマイクロ流体デバイスの一部の例を示す。セグメント３３０４の数は、必要とされるスコア付けモデルの実行の必要性に応じて様々であり得る。セグメント３３０４の数は、例えば、２０であり得る。セグメント３３０４では、スコア付けエンジン３２１０は、メジアン値３２３２を計算することができ、この値は、例えば、各チャンバ３３０６、フロー領域３３０８又は両方内の検体に結合した結合剤（例えば、リポーター分子等）の量を示す蛍光値等の電磁放射線値であり得る。検体は、例えば、微小物体３３１０からの分泌物を含み得、微小物体は、生物学的微小物体であり得る。スコア付けエンジン３２１０は、次に、パラメータの組に基づき、サブセクション定量化プロセス３２３４を介してセグメント３３０４のサブセットを決定することができる。
【０３４８】
スコア付けエンジン３２１０は、スコア付けエンジン３２１０に符号化されるか、又はリモートに提供される（例えば、無線、リモートソフトウェアプログラム、ユーザ入力）命令の組を使用して、サブセクション定量化プロセス３２３４を介してセグメント３３０４のサブセットを決定することができる。命令の組は、例えば、微小物体タイプ、チャンバ内の微小物体カウント、セグメントカウント、サブセクションカウント及びサブセクション位置の様々な組合せを使用して行われた、例えば、前の数値シミュレーションに基づくことができる。このデータを使用して、対象となる微小物体を様々な数値シミュレーションに関連付けて、対象となる生物学的微小物体の分析に適切なセグメントのサブセットを決定する命令を符号化することができる。
【０３４９】
セグメント３３０４のサブセットは、上記のチャンバ３３０６のスコアの特定に必要な合計セグメントカウント内の任意のセグメント群を含み得る。例えば、提供されたパラメータ又は命令の組に基づいて、スコア付けエンジン３２１０は、特定のチャンバのスコア特定に使用されるビンのサブセットとして、ビン９〜１３を識別することができる。上述したようなスコア付けモデルを適用して、スコア付けエンジン３２１０は、上記のチャンバの分泌スコア３２３６等のスコアを決定することができる。
【０３５０】
代替的に、画像処理ユニット３２０４は、図２６の実施形態及び図２７の実施形態に示されるように、較正エンジン３２０８を更に含み得る。較正エンジン３２０８は、マイクロ流体デバイスから及びアッセイ画像捕捉中の背景ノイズによって生じる画像歪みについて、各チャンバのＡＯＩ正規化プロセス３２３８を適用するように設計及び構成することができる。次に、その結果生成された較正画像ＡＯＩは、スコア付けエンジン３２１０によりスコア付けすることができる。上述したように、背景ノイズは、例えば、アーチファクト又は機器セットアップ及び撮像パラメータ  −  例えば、励起源からの光、カメラノイズ及び周辺光  −  に起因し得る。背景ノイズは、例えば、試料、容器、撮像媒体の自己蛍光又は特定の標的に結合しなかった蛍光体から生じる蛍光により付与された背景蛍光にも起因し得る。アッセイ画像捕捉中の画像歪みは、例えば、マイクロ流体デバイス設計又は撮像デバイス設計に起因し得る。画像歪みのタイプとしては、例えば、画像エッジ効果、プロジェクタ非均一性、カメラビネット、射影歪み、樽形歪み、ピンクッション形歪み、口ひげ歪み及び色収差を挙げることができる。
【０３５１】
較正エンジン３２０８は、アッセイ画像捕捉前のマイクロ流体デバイスからの画像歪み及び／又はアッセイ画像捕捉中に導入される画像歪みについて、各チャンバのＡＯＩ又は各チャンバのＡＯＩの少なくとも画像エリアを正規化するように設計及び構成することができる。較正エンジン３２０８は、背景画像をアッセイ画像及び／又は信号基準画像から減算し、信号基準画像において捕捉された画像取得歪みを考慮することによりこれを達成することができる。
【０３５２】
特徴抽出及び異常な検出について画像を正規化する様々なモデルが存在する。実施形態では、統計学的推論を介したデータ除外は、ＡＯＩの正規化前に異常値を除去することができる。非常に低い強度又は非常に高い強度を有し得る異物等の異常値は、全てのＡＯＩデータの分布内の所与のデータ点のｚ値を計算する等の基本的な統計的変換を用いて検出することができる。
【０３５３】
実施形態では、統計学的推論を介したデータ除外は、ＡＯＩを正規化する前に異常値を除外することができる。理想的な拡散プロファイルは、一般に、拡散軸に直交する任意の線に沿って一定の値を有するため、異物等の異常値がＡＯＩ内に存在するか否かを統計的に推論し、それらのデータ点をモデリングから除外することが可能である。ＡＯＩ内の各データ点は、ｚ値に変換することができ、ｚ値は、不規則変動に起因して発生する確率を示す。例えば、Ｉが所与の点での強度値であるＡＯＩを所与として、μは、平均強度値であり、σは、標準偏差であり、ｙは、拡散方向を示し、ｘは、それに直交し、所与の点におけるｚ値は、式（１）を介して計算することができる。
【数２】
2019514007.tif 000007
【０３５４】
上記の式によって生成されるｚ値を使用して、所与の閾値よりも大きいｚ値を有するデータを除外することができる。このプロセスを繰り返して、異なるサイズ及び強度の異常値を繰り返し除去することができる。
【０３５５】
実施形態では、区分モデリングは、ＡＯＩを正規化する前に異常値を除去することができる。拡散プロファイルは、理想的には、拡散軸に直交する任意の方向に沿って一定の値を有するという原理に基づいて、ＡＯＩのＮ列にわたり独立して分析モデルを当てはめることができる。理想的なシステムでは、これらのモデルは、全て同じパラメータ推定をもたらす。実際には、これらのモデルは、正規分布する。しかし、位置合わせずれ又は異物の存在等の異常値の場合、パラメータ推定値の分布に追加のモダリティがある。ＡＯＩ列データへのモデルの相関等の情報を全パラメータ推定値の分布内の所与のパラメータの大きさの傾向と組み合わせることにより、いずれのモデルが異常な結果を反映しているか、したがって更なる分析から除外すべきかを特定し得る。これは、対象のデータを適宜正規化するために、上述したｚ値技法と組み合わせて使用し得る。
【０３５６】
実施形態では、式（２）に従って、背景画像「ａ」及び信号基準画像「ｃ」データを使用して、点ｘ，ｙにおけるアッセイ画像の正規化値（ＩＣｏｒｒｅｃｔｅｄ）を生成捕捉することができる。
【数３】
2019514007.tif 000008
【０３５７】
実施形態では、Ｇスコアを生成して、ＡＯＩ内の全てのデータ点を正規化する。背景画像「ａ」及び信号基準画像「ｃ」を捕捉した後、補正係数「Ｇ」を式（３）に従って計算することができる。
【数４】
2019514007.tif 000009
【０３５８】
次に、補正係数Ｇは、以下のように適用して、ＡＯＩのスコア付けについて式（４）に従ってアッセイ画像（ＩＣｏｒｒｅｃｔｅｄ）の正規価値を特定することができる。
（４）（ＩＣｏｒｒｅｃｔｅｄ）（ｘ，ｙ）＝Ｇ（ｘ，ｙ）（ＩＯｒｉｇｉｎａｌ（ｘ，ｙ）−ａ（ｘ，ｙ））
【０３５９】
アッセイ画像の正規価値を使用して、スコア付けエンジン３２１０は、各チャンバの正規化された対象エリアの一部を分析して、各チャンバ内の検体の数量を示すスコアを決定するように更に設計及び構成することができる。詳細に上述したように、スコア付けモデルの例としては、各チャンバの正規化対象エリアの一部に線形回帰分析を適用すること、又は各チャンバの正規化対象エリアの一部にわたる蛍光値（又は何らかの他のタイプの検出可能な信号）を積分することが挙げられる。
【０３６０】
代替的に、ＡＯＩの信号基準画像及び背景画像を使用するのではなく、較正エンジン３２０８は、チャンバの近くのフロー領域、関連するＡＯＩ及び生物学的微小物体を含まないマイクロ流体デバイスの他のエリアの信号基準画像及び／又は背景画像を使用して較正する上記の実施形態を適用し得る。これらの「非ＡＯＩ」画像は、アッセイ画像データと併せて使用して、上記で詳述したようにアッセイ画像データを正規化することができる。
【０３６１】
様々な実施形態によれば、画像取得ユニット３２０２及び画像処理ユニット３２０４は、１つの物理ユニットに統合することができる。代替的に、画像取得ユニット３２０２及び画像処理ユニット３２０４は、別個に向けられ、ユニットがなお通信可能に接続されて、情報を交換するように独立ユニットで提供することができる。
【０３６２】
上述した画像処理ユニット３２０４の各構成要素は、ハードウェアであり得、又は部分的若しくは全体的にソフトウェアモジュールであり得る。
【０３６３】
図２９は、微小物体によって生成される検体の数量を予測し特定する方法を示す例示的なフローチャートである。本明細書に示されるように、ステップ３４１０は、図２６のシステム３２００の画像取得ユニット３２０２の対象エリアエンジン３２０６により利用することができる例示的なワークフローを詳述する。ステップ３４１０において、対象エリアエンジン３２０６は、フロー領域に流体的に接続されるフロー領域及び複数のチャンバを含むマイクロ流体デバイスの撮像データを受信し、撮像データは、背景ノイズ画像、信号基準画像及び検体アッセイ画像を含む。背景画像は、いかなる異物（例えば、微小物体、結合剤又は他の試薬）もマイクロ流体デバイスに導入される前に撮像要素３２１６により撮影することができる。そうするに当たり、背景画像は、システム３２００及びデバイスのエリアの画像捕捉に関連する任意の背景ノイズを捕捉する。背景ノイズの例については上述した。信号基準画像は、結合剤が、結合剤濃度がデバイスにおいて平衡するようなレベルまでチャンバに導入された後、撮像要素３２１６により撮影することができる。そうするに当たり、信号基準画像は、システム３２００及びデバイスのエリアの関連する画像捕捉に関連する画像取得歪みを捕捉する。
【０３６４】
受信される撮像データは、例えば、１つ又は複数のチャンバ、フロー領域又は両方において検体に結合した結合剤（例えば、リポーター分子等）から発せられた蛍光から特定される蛍光データを含み得る。検体は、例えば、微小物体からの分泌物を含み得、微小物体は、生物学的微小物体であり得る。生物学的微小物体からの分泌物は、例えば、タンパク質、サッカリド、核酸、３Ｋｄ未満の分子量を有する有機分子又はウィルスを含み得る。上述したように、チャンバは、例えば、隔離ペンであり得る。
【０３６５】
本明細書に示されるように、ステップ３４２０及び３４３０は、図２６のシステム３２００の画像処理ユニット３２０４のスコア付けエンジン３２１０により利用することができる例示的なワークフローを詳述する。ステップ３４２０において、画像処理ユニット３２０４は、各チャンバの対象エリア（「ＡＯＩ」）を定義することができる。ＡＯＩは、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすいチャンバ内の画像エリアを含み得る。ＡＯＩは、検体変動が測定されるとき、チャンバ内の微小物体の位置の影響を最も受けにくい画像エリアを更に含み得、更に、画像エリアは、チャンバとフロー領域との間で拡散軸に沿って延在し得る。
【０３６６】
ステップ３４３０において、スコア付けエンジン３２１０は、各チャンバの一部を分析することにより、各チャンバ内の検体の数量を示すスコアを決定することができる。チャンバごとにスコアを決定するために、スコア付けエンジン３２１０は、上述したように、様々なモデルを使用することができる。幾つかのモデルは、例えば、検体に結合する結合剤（例えば、リポーター分子等）の量を定量化する蛍光データを利用するものであり得る。検体は、例えば、チャンバ内の微小物体からの分泌物を含み得、微小物体は、生物学的微小物体であり得る。スコア付けエンジン３２１０は、特にＡＯＩにわたる結合リポーター分子データ（又は蛍光値）を使用して、各チャンバ内の検体の数量を示すそのチャンバのスコアを決定することができる。スコア付けモデルの非限定的な例としては、各チャンバの正規化された対象エリアの一部に線形回帰分析を適用すること、又は各チャンバの正規化された対象エリアの一部にわたる蛍光値（又は何らかの他のタイプの検出可能な信号）を積分することが挙げられる。
【０３６７】
図３０は、撮像データを適用して、検体アッセイ画像において各チャンバの正規化ＡＯＩを取得することができる較正方法を示す。本明細書に記載されるように、ステップ３５１０〜３５３０は、図２６の画像処理ユニット３２０４の較正エンジン３２０８により利用することができる較正方法の例示的なワークフローを詳述する。
【０３６８】
ステップ３５１０において、較正エンジン３２０８は、画像取得ユニット３２０２から撮像データを受信することができ、撮像データは、背景画像、信号基準画像及び検体アッセイ画像の撮像データを含み得る。上述したように、撮像データは、マイクロ流体デバイスのチャンバごとの対象エリアからの蛍光値の形態であり得る。撮像される蛍光は、背景ノイズ（背景画像用）、対象エリアを充填する結合剤（信号基準画像用、又は例えばチャンバ内に存在する生物学的微小物体からの分泌物を含み得る検体に結合する結合剤（例えば、リポーター分子等）による放射から発せられたものであり得る。
【０３６９】
ステップ３５２０において、較正エンジン３２０８は、信号基準画像及び検体アッセイ画像値から背景画像値を減算することができる。そうするに当たり、システムに既に存在する任意の背景ノイズは、信号基準画像及び検体アッセイ画像値から除去されて、もはやノイズの影響を受けない両画像の背景補正値を取得する。
【０３７０】
ステップ３５３０において、較正エンジン３２０８は、信号基準画像及び検体アッセイ画像値の背景補正値を比較して、信号基準画像を通して識別される、上述した画像取得歪みを考慮することにより、検体アッセイ画像値を更に補正することができる。比較は、特にＡＯＩ内の正規化検体アッセイ画像値を生成する。正規化値を特定する関連する公式及び計算の例は、上記に提供されている。
【０３７１】
正規化データを使用して、スコア付けエンジン３２１０は、各チャンバのここでは正規化されたＡＯＩの一部を分析することにより、各チャンバ内の検体の数量を示すスコアを決定することができる。
【０３７２】
本明細書に記載される方法論は、用途に応じて様々な手段により実施し得る。例えば、これらの方法論は、ハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア又はそれらの任意の組合せで実施し得る。ハードウェア実施の場合、処理ユニットは、１つ又は複数の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、デジタル信号処理デバイス（ＤＳＰＤ）、プログラマブル論理デバイス（ＰＬＤ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、プロセッサ、コントローラ、マイクロコントローラ、マイクロプロセッサ、電子デバイス、本明細書に記載される機能を実行するように設計された他の電子ユニット又はそれらの組合せ内で実施し得る。
【０３７３】
様々な実施形態では、本教示の方法は、Ｃ、Ｃ＋＋等の従来のプログラミング言語で記述されたファームウェア、及び／又はソフトウェアプログラム、及びアプリケーションとして実施し得る。ファームウェア及び／又はソフトウェアで実施される場合、本明細書に記載される実施形態は、コンピュータに上記の方法を実行させるプログラムが記憶された非一時的コンピュータ可読媒体で実施することができる。本明細書に記載される様々なエンジンが図１のコンピュータシステム３１００等のコンピュータシステムで提供され得、それにより、プロセッサ３１０４は、メモリ構成要素３１０６／３１０８のいずれか１つ又は組合せにより提供される命令及び入力デバイス３１１４を介して提供されるユーザ入力を受けて、これらのエンジンにより提供される分析及び特定を実行することを理解されたい。
【０３７４】
本教示は、様々な実施形態と併せて説明されているが、本教示がそのような実施形態に限定されることは意図されない。逆に、本教示は、当業者に理解されるように、様々な代替形態、変更形態及び均等物を包含する。
【０３７５】
更に、様々な実施形態を説明するに当たり、本明細書は、特定の順序のステップとして方法及び／又はプロセスを提示している場合がある。しかし、方法又はプロセスが、本明細書に記載される特定の順序のステップに依拠しない限り、方法又はプロセスは、記載される特定の順序のステップに限定されるべきではない。当業者が理解するように、他の順序のステップも可能であり得る。したがって、本明細書に記載される特定の順序のステップは、特許請求の範囲への限定として解釈されるべきではない。加えて、方法及び／又はプロセスに向けられた請求項は、記述された順序でのステップの実行に限定されるべきではなく、順序が可変であり、それでもなお様々な実施形態の趣旨及び範囲内に留まることを当業者は容易に理解することができる。
【０３７６】
本明細書に記載される実施形態は、ハンドヘルドデバイス、マイクロプロセッサシステム、マクロプロセッサベース又はプログラマブル消費者電子機器、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ等を含む他のコンピュータシステム構成で実施することもできる。実施形態は、タスクが、ネットワークを通してリンクされたリモート処理デバイスにより実行される分散計算環境で実施することもできる。
【０３７７】
本明細書に記載される実施形態は、コンピュータシステムに記憶されるデータが関わる様々なコンピュータ実施動作を利用し得ることを理解されたい。これらの動作は、物理的数量の物理的操作を必要とするものである。必ずしも必要ではないが、通常、これらの数量は、記憶、転送、結合、比較及び他の方法での操作が可能な電気信号又は磁気信号の形態をとる。更に、実行される操作は、多くの場合、生成、識別、特定又は比較等の用語で呼称される。
【０３７８】
本明細書に記載される実施形態の一部をなす任意の動作は、有用な機械動作である。本明細書に記載される実施形態は、これらの動作を実行するデバイス又は装置にも関する。本明細書に記載されるシステム及び方法は、必要とされる目的に向けて特に構築することができ、又はコンピュータに記憶されるコンピュータプログラムにより選択的にアクティブ化若しくは構成される汎用コンピュータであり得る。特に、様々な汎用機械は、本明細書の教示に従って記述されたコンピュータプログラムと併用され得、又は必要とされる動作を実行するより専用の装置を構築することがより好都合であり得る。
【０３７９】
特定の実施形態は、コンピュータ可読媒体のコンピュータ可読コードとして実施することもできる。コンピュータ可読媒体は、後にコンピュータシステムによる読み取りが可能な任意のデータ記憶装置である。コンピュータ可読媒体の例としては、ハードドライブ、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、磁気テープ及び他の光学メモリ、フラッシュメモリ及び非光学データ記憶装置が挙げられる。コンピュータ可読媒体は、ネットワーク結合コンピュータシステムに分散することもでき、それにより、コンピュータ可読コードは、分散して記憶され実行される。
【０３８０】
実験
システム及びデバイス：Berkeley Lights, Inc.製であり、これもBerkeley Lights, Inc.製の光学機器により制御されるナノ流体デバイスであるOptoSelect（商標）デバイスを利用した。この機器は、温度コントローラに結合されたチップの搭載ステージ、ポンプ及び流体媒体調整構成要素並びにカメラ及びチップ内のフォトトランジスタのアクティブ化に適した構造光源を含む光学列を含む。OptoSelectデバイスは、フォトトランジスタアクティブ化ＯＥＴ力を提供するOptoElectroPositioning（ＯＥＰ（商標））が構成された基板を含む。チップは、複数のマイクロ流体チャネルも含み、各チャネルは、流体的に接続される複数のNanoPen（商標）チャンバ（又は隔離ペン）をそれぞれ有した。各隔離ペンの容積は、約１×１０６立方μｍである。
【０３８１】
生体細胞：ヒト抗体を発現するように遺伝子操作されたＣＨＯ細胞を使用した。細胞の数及び生存性をカウントし、細胞をOptoSelectデバイスに装填するために細胞密度を５×１０５／ｍＬに調整した。
【０３８２】
デバイスプライミング：OptoSelectデバイスに１００％二酸化炭素２５０μＬを１２μＬ／秒のレートで流し、次にPluronic（登録商標）Ｆ２７（Life Technologies（登録商標）カタログ番号Ｐ６８６６）を含む０．１％ＰＢＳ  ２５０μＬを１２μＬ／秒で流し、最後に１２μＬ／秒でＰＢＳ  ２５０μＬを流した。培養媒体の導入が続く。
【０３８３】
媒体：市販の無タンパク質及び無血清媒体であり、化学的に定義された媒体であるＣＤ  ＣＨＯ媒体（ThermoFisher Scientificカタログ番号１０７４３０２９）を使用した。
【０３８４】
培養中の媒体灌流：以下の２つの方法のいずれかに従ってOptoSelectデバイスに媒体を灌流させた。
１．  ０．０１μＬ／秒で２時間灌流し、２μＬ／秒で６４秒間灌流し且つ繰り返す。
２．  ０．０２μＬ／秒で１００秒間灌流し、フローを５００秒間停止し、２μＬ／秒で６４秒間灌流し且つ繰り返す。
【０３８５】
例１：ペプチドリポーター分子を使用して抗体の相対生産を評価する
リポーター分子：HiLyte Fluor（商標）５５５ＮＨＳエステル（AnaSpec Inc.カタログ番号ＡＳ−８１２５１、８６９ｄａ（遊離酸のＭＷ）、Ｅｘ／Ｅｍ５５０／５６６ｎｍ（Ｃｙ３フィルタ））でＮ末端標識された、分子量２．４Ｋｄを有するＩｇＧ結合ペプチド。
【０３８６】
暗基準画像収集：細胞の導入前、最初に媒体及びリポーター分子が存在しない状態でOptoSelectデバイスを撮像して、背景を除去し、各NanoPenチャンバの画像を正規化する本明細書に記載のプロセスで使用される暗基準画像を取得した。
【０３８７】
信号基準画像収集：蛍光化合物が拡散し、NanoPenチャンバとマイクロ流体チャネルとの間で拡散平衡を達成するまで、１μｇ／ｍＬの濃度でＮ末端標識されたHiLyte Fluor（商標）５５５  ＩｇＧ結合ペプチド（リポーター分子）を含む培養媒体を０．００５μＬ／秒で４５分間にわたりOptoSelectデバイスに流した。NanoPenチャンバとマイクロ流体チャネルとの間で拡散平衡を達成したとき、信号基準画像を取得した。次に、リポーター分子を有さない培養媒体を用いて０．０３μＬ／秒でOptoSelectデバイスを２５分間フラッシュした。このフラッシュ期間は、リポーター分子がNanoPenチャンバから実質的に完全に拡散し、NanoPenチャンバ内に残留したリポーター分子がゼロであるか又はごくわずかな量であることを保証した。信号基準画像は、代替的に、等モル濃度で蛍光顔料自体を流すことにより取得し得、蛍光標識されたリポーター分子を利用する必要がない。
【０３８８】
マイクロ流体デバイスへの分泌細胞の導入：ＣＨＯ細胞をOptoSelectデバイスに導入し、デバイスのＯＥＰ技術の誘電泳動力を使用してNanopenチャンバに選択的に配置した。細胞は、１つのNanopenチャンバにつき１つの細胞として配置された。培養媒体を上記と同様に６日間にわたり灌流させた。毎日、明視野画像を撮影して、各NanoPenチャンバ内の細胞増殖を記録した。最初のアッセイ前の６日間の培養期間の選択は、生体細胞及び分泌検体の特定の要件に応じて変更し得る。長期間の培養期間のそれぞれの日でアッセイする（明視野画像を含み得る）ことが望ましいこともあり、又は培養期間中、選択された日に１つ若しくは複数のアッセイを実行することができる。
【０３８９】
アッセイ信号収集：アッセイの初期ステップとして、明視野画像を取得して、各NanoPenチャンバ内の細胞の数及び位置を相関付けた。明視野画像の収集後、１μｇ／ｍＬの濃度の蛍光リポーター分子をマイクロ流体チャネルに０．０５μＬ／秒で、リポーター分子が各NanoPenチャンバ内に完全に拡散するのに十分な時間を提供する４５分間にわたり流した。リポーター分子をNanoPenチャンバに導入した後、上記の特定された拡散率に基づいて、蛍光リポーター分子を含む培養媒体のフローを２５分間の期間にわたり０．０３μＬ／秒で再開した。蛍光画像を取得した。必要に応じて、特定の細胞及び／又はそれからの分泌検体に適すると判断された追加の培養／増殖期間にわたり、アッセイを繰り返し得る。
【０３９０】
検体の相対生産の特定
幅約２０ピクセル及び長さ約２００ピクセルのエリアを包含した、NanoPenチャンバ内からの拡散軸に沿った対象エリア（ＡＯＩ）を各NanoPenチャンバ内で識別し、ＡＯＩの下端部（第１）は、細胞が配置されない、マイクロ流体チャネル内への開口部から遠いNanoPenチャンバのベースから選択された距離にある分離領域内にあるように選択された。ＡＯＩの長さの第２（上端部）は、マイクロ流体チャネル自体内にあるように選択され、ＡＯＩ内及びチャネル内にあるピクセルが実質的に信号を有さないことを保証した。ＡＯＩの幅は、NanoPenチャンバの分離領域からOptoSelectデバイスのチャネルへの予期される拡散の軌道に沿ってセンタリングされる。本明細書に記載されるように、ＡＯＩは２０のサブ領域（ビン）に細分され、各サブ領域は、幅２０ピクセル及び予期される拡散軌道に沿って長さ１０ピクセルを有する。
【０３９１】
暗基準画像及び信号基準画像を使用して、本明細書に記載されるように、蛍光アッセイ画像を正規化／較正して、システムエラー及び視野の不完全な照明に起因した信号画像のロールオフを低減した。ＡＯＩ内の各ピクセルは、
【数５】
2019514007.tif 000010
として処理された。
【０３９２】
サブ領域内の各ピクセルの信号強度を合算することにより、２０のサブ領域のそれぞれのメジアン強度を特定した。各サブ領域の正規化メジアン強度値のプロットした結果生成された曲線の表現を図１２Ｂに示し、図１２Ｂでは、ｘ軸は、サブ領域１から２０を列挙する。サブ領域１は、チャネルから最も離れたＡＯＩのサブ領域であり、サブ領域２０は、チャネルに最も入ったＡＯＩのサブ領域である。サブ領域９〜１３（図１２Ｂの領域１１５６）の正規化メジアン強度値をプロットした曲線の部分に対して線形回帰を実行した。上述したように、これらのサブ領域は、観測された信号強度が、NanoPenチャンバの分離領域の下部（チャネルから最も遠い）内の生体細胞の位置の影響を受けにくかった。この動作から得られた傾きの値を任意の単位（Ａ．Ｕ．）のスコアとして使用した。傾き（スコア）が大きいほど、そのNanoPenチャンバ内の細胞による検体の分泌が高いことを示した。
【０３９３】
図２１に示されるように、可視の各NanoPenチャンバの識別番号及びスコアが示され（上の数字は、そのNanoPenチャンバの識別番号であり、下の数字は、そのNanoPenチャンバのスコアである）、観測された信号強度と明らかに相関する。それぞれ低いスコア１０．０１及び８．６７を有するNanoPenチャンバ５６３及び９４１は、検体を生成する少なくとも１つの債オブを有したが、これらのNanoPenチャンバのそれぞれから拡散したリポーター分子：抗体複合体は小量であった。それぞれスコア１３．１５及び１７．２６を有するNanoPenチャンバ５６３及び９４９は、中範囲のスコアを示した。最後に、それぞれスコア２５．２６、２９．９９及び２７．９５を有するNanoPenチャンバ５６０、５６６及び９４２は、より多量の抗体検体を生成した。ここに示されるスコアは、存在する細胞数について補正されなかった。しかし、その計算は、ここに示されるスコアに対して行い得る。生のスコア又は細胞カウント補正スコアのいずれも、高生産細胞株を成長させる取り組みの過程においていずれのNanoPenチャンバを更に調べるかの判断を支援するために、NanoPenチャンバをより容易にランク付けるために使用し得る。曲線下面積又は各NanoPenチャンバ内の分泌検体の生成レベルを定量化する本明細書に記載される他の方法等、NanoPenチャンバ内からチャネルへの濃度率変化を計算する他の方法を利用することもできる。
【０３９４】
相対生産性の測定：図２２Ａ及び図２２Ｂに示されるように、NanoPenチャンバごとの細胞数についてスコアを補正し得る。この実験では、細胞タイプ、媒体、リポーター分子、培養前画像取得、培養条件及びアッセイ条件は、上記と同じであった。図２２Ａは、図２１の上の行における画像に示されるように、０日目、３日目、４日目、５日目、６日目に取得された１つのNanoPenチャンバ２１２４を示す。更に、上述したアッセイを３日目、４日目、５日目、６日目のそれぞれで実行し、同じ１つのNanoPenチャンバ２１２４の３日目、４日目、５日目及び６日目のそれぞれの蛍光画像は、その日の対応する明視野画像の下に並べて示した。明視野画像を使用して、存在する細胞数をカウントし、これは、自動プロセスで実行し得、クローン集団が増殖するにつれて、選択されたNanoPenチャンバについて０日目（細胞１個）、３日目（細胞８個）、４日目（細胞２５個）、５日目（細胞６５個）、６日目（細胞１２３個）を示した。上述したように取得されたアッセイスコア（負の傾きを表す）も同様に安定して増大した：３日目（１９５Ａ．Ｕ．）、４日目（５６６Ａ．Ｕ．）、５日目（１４３１Ａ．Ｕ．）、６日目（２８４２）。したがって、３日目では、NanoPenチャンバ内の８個の細胞は、スコア１９５（Ａ．Ｕ．）を生成した。４日目では、同じNanoPenチャンバは、ここで、２５個の細胞を有し、スコア５６６（Ａ．Ｕ．）を生成した。５日目では、同じNanoPenチャンバは、６５個の細胞を有し、スコア１４３１（Ａ．Ｕ．）を生成した。最後に、６日目では、同じNanoPenチャンバは、１２３個の細胞を有し、スコア２８４３（Ａ．Ｕ．）を生成した。図２２Ｂのグラフは、NanoPenチャンバ内の細胞培養の開始からの日数単位のアッセイ時点（ｘ軸）に対してプロットされたアッセイスコア（ｙ軸）を示す。絶対スコアをその時点で存在する細胞数で除算して、チャンバ内の細胞数に正規化されたスコアを提供した。これは、細胞ごとに２２．６から２４．１Ａ．Ｕ．の範囲内に留まる、選択されたNanoPenチャンバ内の細胞の生産性（ｒＱｐ）の正規化された尺度をもたらした。
【０３９５】
例２．マクロスケールの生産及び細胞株成長を用いた抗体生産のインサイチュースコア付けの補正
システム及びデバイス：上記と同様。
細胞：実験１と同様のＣＨＯ細胞。
媒体：実験１と同様。
リポーター分子：実験１と同様。
【０３９６】
培養を６日間実行し、分子量２．４Ｋｄを有する、HiLyte Fluor（商標）５５５標識のＩｇＧ結合ペプチドを使用した拡散ベースのアッセイを実験１と同様に実行した。本明細書に定義されるように、ＡＯＩ内で観測された信号の強度に基づいてスコアを割り当てる分析を実行した。OptoSelectデバイス内の各NanoPenチャンバのスコアを評価した。図２２Ａ及び図２２Ｂ、OptoSelectデバイス内の各NanoPenチャンバをプロットし、ここで、横軸は、チップ上で得られた力価（「スコア」又はこの場合、細胞位置の影響を受けにくいサブ領域（ＡＯＩ全体のサブ領域１〜２０のうちのサブ領域９〜１３）に沿ったメジアン強度値の傾き）である。各NanoPenチャンバは、グラフ（図２３Ａ）のｙ軸にプロットされ、アッセイの時点において各NanoPenチャンバ内でカウントされた細胞の数を表す（明視野画像から取得される）。第１の選択は、検体分泌の低（８００Ａ．Ｕ．未満遮断）スコア、検体分泌の中レベルスコア（８００Ａ．Ｕ．未満から約１４００Ａ．Ｕ．）及び検体分泌の高スコア（約１４００Ａ．Ｕ．から約２４００Ａ．Ｕ．）を有するNanoPenチャンバの３つの群を選択することにより行われた。これらの選択された群のそれぞれ内に、多数、中間数及び少数の細胞を有するNanoPenチャンバがあった。
【０３９７】
図２３Ｂに示されるように、更なる選択が含められて、高速成長を有するNanoPenチャンバ、中間の細胞倍化率を示すチャンバを選択し、第３の群は、低速でのみ細胞数が増殖するものとして選択された。これらの各群において、高レベル、中レベル及び低レベルの検体生産の代表があった（図２３の横軸全体にわたるスコア範囲）。成長／分泌プロファイルの９つ全てのサブタイプの１つ内の個々のNanoPenチャンバの選択がなされ、選択されたペン（別個のクローン集団をそれぞれ保持する）をまずウェルプレートに個々に搬出した。ＩｇＧへのＥＬＩＳＡアッセイを介して力価を取得した。クローン集団を含む低、中及び高分泌ウェルの更なる選択が１２５ｍＬ振とうフラスコに導入され、更にスケールアップした。
【０３９８】
ＩｇＧへのＥＬＩＳＡアッセイを介して、スケールアップ１２５ｍＬ振とうフラスコ内のクローン集団をアッセイした。選択されたクローンは、図２４に示され、図２４では、各１２５ｍＬ振とうフラスコの力価がｙ軸に表され、細胞の起点となった各NanoPenチャンバのオンチップ力価（上述したアッセイで得られたＡ．Ｕ．単位のスコア）がｘ軸に示されている。第１の群２４０５は、低オンチップ力価（スコア）を有するNanoPenチャンバ内の細胞に由来した。群２４０５は、１２５ｍＬ振とうフラスコにスケーリングされると、いかなる高生産クローンも含まなかった。第２の群２４１５は、中間範囲のオンチップ力価（スコア）を有するNanoPenチャンバ内の細胞に由来し、１２５振とうフラスコからの中間範囲のＥＬＩＳＡ力価値を示した。最後の群２４２５は、高い力価値を有し、全て１３９．１μｇ／ｍＬのプール平均よりも高く、これも、高いオンチップ力価（Ａ．Ｕ．単位のスコア）を有するNanoPenチャンバからの細胞に相関する。したがって、中から高のオンチップ力価（スコア又は特定の実施形態では傾き）を有するNanoPenチャンバ内の細胞について、マクロスケール集団で得られた力価レベルに良好な相関があることが実証された。したがって、本明細書に記載されるようにOptoSelectデバイス内で実行されたアッセイは、細胞株成長により多数の高生産クローンをより高速で識別する、意味のある手法をもたらした。更に、図１６Ｂに関して上述したように、各クローン集団を個々にスクリーニングする能力は、他の非生産性クローン集団ほど迅速に成長しない可能性がある生産性クローンを識別する能力を提供する。
【０３９９】
例３．アプタマーを使用した抗体の相対生産の評価
システム及びデバイス：上記と同様。
細胞：実験１と同様のＣＨＯ細胞。
媒体：実験１と同様。
リポーター分子：ヒト免疫グロブリンＧのアプタマー（Apta-Index（商標）、Ａｐｔ  ８、ＩＤ＃４４、２３−ｍｅｒ、ＭＷ．７．４Ｋｄ、Ｆｃ領域への親和性、Aptagen L.L.C.配列：５’−ｒＧｐ−ｒＧｐ−ｒＡｐ−ｒＧｐ−ｒＧｐ−ｆＵｐ−ｆＣｐ−ｆＣｐ−ｒＧｐ−ｒＡｐ−ｒＡｐ−ｒＡｐ−ｒＧｐ−ｒＧｐ−ｒＡｐ−ｆＣｐ−ｆＵｐ−ｆＣｐ−ｆＣｐ−３’。配列表記中、接頭辞ｒ−は、リボヌクレオチドを示し、接頭辞ｆ−は、２−フルオロヌクレオチドを示し、接尾辞−ｐは、リン酸塩を示し、Ｇ、Ａ、Ｃ、Ｕは、標準ヌクレオチド略称である。Alexa Fluor（登録商標）５９４（ＡＦ５９４、ThermoFisher Scientific、カタログ番号Ａ２０００４（ＮＨＳエステル））ＭＷ８１９．８、Ｅｘ／Ｅｍ５９０／６１７ｎｍ）で標識された。
【０４００】
蛍光化合物が拡散し、NanoPenチャンバとマイクロ流体チャネルとの間で拡散平衡を達成するまで、Alexa Fluor（登録商標）５９４又はAlexa Fluor（登録商標）５９４標識アプタマーを２μｇ／ｍＬの濃度で含む培養媒体を４５分間にわたりOptoSelectデバイスに流した。信号基準画像を取得する。次に、リポーター分子を有さない培養媒体を用いて０．０３μＬ／秒でOptoSelectデバイスを３０分間フラッシュした。このフラッシュ期間は、リポーター分子がNanoPenチャンバから実質的に完全に拡散することを保証する。
【０４０１】
ＣＨＯ細胞をOptoSelectデバイスに導入し、デバイスのＯＥＰ技術の誘電泳動力を使用してNanopenチャンバに選択的に配置した。細胞は、１つのNanopenチャンバにつき１つの細胞として配置される。６日の期間にわたり、上記のように培養媒体を灌流させる。毎日、明視野画像を撮影して、各NanoPenチャンバ内の細胞増殖を記録した。実験の３日目、４日目、５日目及び６日目のそれぞれの日で、抗体生産を検出するアッセイを実行する。
【０４０２】
アッセイ信号収集：明視野画像を取得して、各NanoPenチャンバ内の細胞の数及び位置を相関付ける。明視野画像の収集後、２μｇ／ｍＬの濃度の蛍光リポーター分子であるアプタマーAlexaFluor５９４をマイクロ流体チャネルに、リポーター分子が各NanoPenチャンバ内に完全に拡散するのに十分な時間を提供する５０分間にわたり流した。リポーター分子をNanoPenチャンバに導入した後、約７Ｋｄの分子での拡散率に基づいて、リポーター分子を含まない培養媒体のフローを３０分間の期間にわたり０．０３μＬ／秒で再開する。蛍光画像を取得する。
【０４０３】
実験１において上述したように配置された幅約２０ピクセル及び長さ約２００ピクセルのエリアを包含した、NanoPenチャンバ内の拡散軸に沿った対象エリア（ＡＯＩ）が各NanoPenチャンバ内で識別される。ＡＯＩの幅は、NanoPenチャンバの分離領域からOptoSelectデバイスのチャネルへの予期される拡散の軌道に沿ってセンタリングされる。ＡＯＩは、２０のサブ領域（ビン又はセグメント）に細分され、各サブ領域は、幅２０ピクセル及び予期される拡散軌道に沿って長さ１０ピクセルを有する。暗基準画像及び信号基準画像を使用して、本明細書に記載されるように、蛍光アッセイ画像を正規化／較正して、システムエラー及び視野の不完全な照明に起因した信号画像のロールオフを低減する。
【０４０４】
サブ領域内の各ピクセルの信号強度を合算することにより、２０のサブ領域のそれぞれのメジアン強度を特定する。各サブ領域の正規化メジアン強度値の曲線が生成され、サブ領域９〜１３の正規化メジアン強度値をプロットした曲線の部分に対して線形回帰を実行する。この動作から得られた傾きの値を任意の単位（Ａ．Ｕ．）のスコアとして使用する。OptoSelectデバイスの合計で３５００個のNanoPenチャンバのうちの選択された数の個々のNanoPenチャンバが、２００Ａ．Ｕ．〜２５０Ａ．Ｕ．よりも大きいスコアを有し、増殖及び更なる成長のための搬出に選択されることが予期される。
【０４０５】
本開示の特定の実施形態及び用途について本明細書に説明したが、これらの実施形態及び用途は、単なる例示であり、多くの変形形態が可能である。
【０４０６】
選択された実施形態の列挙
実施形態１
生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定するシステムであって、画像取得ユニットであって、マイクロ流体デバイスを固定可能なマイクロ流体デバイスホルダであって、マイクロ流体デバイスは、フロー領域及びフロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含み、複数の隔離ペンのそれぞれは、１つ又は複数の生物学的微小物体を保持することができる、マイクロ流体デバイスホルダ、及びマイクロ流体デバイスの複数の隔離ペン及びフロー領域の１つ又は複数のアッセイ画像を取得するように構成される撮像要素を含む画像取得ユニットと、画像取得ユニットに通信可能に接続される画像処理ユニットであって、捕捉された各アッセイ画像を受信し、且つアッセイ画像に示される各隔離ペンの対象エリアを定義するように構成される対象エリア決定エンジンであって、対象エリアは、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ隔離ペンとフロー領域との間で拡散軸に沿って延在する隔離ペン内のエリアに対応する画像エリアを含む、対象エリア決定エンジン、及び各隔離ペンの対象エリア内の画像エリアの少なくとも一部を分析して、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定するように構成されるスコア付けエンジンを含む画像処理ユニットとを含むシステム。
【０４０７】
実施形態２
背景ノイズに起因し、且つ／又はアッセイ画像捕捉中に導入される画像歪みについて、各隔離ペンの対象エリアの少なくとも画像エリアを正規化するように構成される較正エンジンを更に含む、実施形態１に記載のシステム。
【０４０８】
実施形態３
撮像要素は、１つ又は複数の対応する背景画像及び１つ又は複数の対応する信号基準画像を捕捉するように更に構成される、実施形態１又は２に記載のシステム。
【０４０９】
実施形態４
較正エンジンは、対応する背景ノイズをアッセイ画像から減算することにより、画像歪みについて各隔離ペンの対象エリアの少なくとも画像エリアを正規化するように構成され、及び／又は較正エンジンは、対応する信号基準画像において捕捉された画像取得歪みを考慮することにより、画像歪みについて各隔離ペンの対象エリアの少なくとも画像エリアを正規化するように構成される、実施形態３に記載のシステム。
【０４１０】
実施形態５
スコア付けエンジンは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部を分析して、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定するように構成される、実施形態２〜４のいずれかに記載のシステム。
【０４１１】
実施形態６
スコア付けエンジンは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部にわたる光強度値に線形回帰分析を適用して、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定するように構成される、実施形態５に記載のシステム。
【０４１２】
実施形態７
スコア付けエンジンは、各隔離ペンの正規化対象エリアの一部にわたる光強度値を積分して、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定するように構成される、実施形態５に記載のシステム。
【０４１３】
実施形態８
画像取得ユニット及び画像処理ユニットは、別個に向けられる、実施形態１〜７のいずれかに記載のシステム。
【０４１４】
実施形態９
画像取得ユニット及び画像処理ユニットは、単一のユニットに統合される、実施形態１〜７のいずれかに記載のシステム。
【０４１５】
実施形態１０
対象エリア及び／又は対象エリアの画像エリアは、画像処理ユニットによって自動的に定義される、実施形態１〜９のいずれかに記載のシステム。
【０４１６】
実施形態１１
マイクロ流体デバイスは、生物学的微小物体によって生成される検体に結合し、且つ検出可能な標識を含む結合剤のフローを受け取るように構成され、スコア付けエンジンは、アッセイ画像から特定されるように、結合剤の検出可能な標識によって発せられる光の量に基づいて、各隔離ペン内の検体の数量を特定するように構成される、実施形態１〜１０のいずれかに記載のシステム。
【０４１７】
実施形態１２
生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定する方法であって、フロー領域及びフロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含むマイクロ流体デバイスの撮像データを受信することであって、撮像データは、検体アッセイ画像と、背景ノイズ画像及び信号基準画像の一方又は両方とを含む、受信することと、各隔離ペンの対象エリアを定義することであって、対象エリアは、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ隔離ペンとフロー領域との間で拡散軸に沿って延在する隔離ペン内の画像エリアを含む、定義することと、各隔離ペンの対象エリアの画像エリアの少なくとも一部を分析することにより、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することとを含む方法。
【０４１８】
実施形態１３
撮像データは、生物学的微小物体によって生成される検体に結合するリポーター分子から発せられる光から特定される発光データを含む、実施形態１２に記載の方法。
【０４１９】
実施形態１４
背景ノイズ画像において捕捉された背景ノイズを減算することにより、検体アッセイ画像内の隔離ペンのそれぞれの対象エリアの少なくとも画像エリアを正規化し、且つ／又は信号基準画像において捕捉された画像取得歪みを考慮することにより、検体アッセイ画像内の隔離ペンのそれぞれの対象エリアの少なくとも画像エリアを正規化することを更に含む、実施形態１２又は１３に記載の方法。
【０４２０】
実施形態１５
各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部を分析することを更に含む、実施形態１４に記載の方法。
【０４２１】
実施形態１６
各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部にわたる発光データに線形回帰分析を適用することを更に含む、実施形態１４に記載の方法。
【０４２２】
実施形態１７
各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部にわたる発光データを積分することを更に含む、実施形態１４に記載の方法。
【０４２３】
実施形態１８
検体は、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、実施形態１２〜１７のいずれかに記載の方法。
【０４２４】
実施形態１９
生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定する画像処理方法をコンピュータに実行させるプログラムが記憶される非一時的コンピュータ可読媒体であって、方法は、フロー領域及びフロー領域に流体的に接続される複数の隔離ペンを含むマイクロ流体デバイスの撮像データを受信することであって、撮像データは、検体アッセイ画像と、背景ノイズ画像及び信号基準画像の一方又は両方とを含む、受信することと、各隔離ペンの対象エリアを定義することであって、対象エリアは、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ隔離ペンとフロー領域との間で拡散軸に沿って延在する隔離ペン内の画像エリアを含む、定義することと、各隔離ペンの対象エリアの画像エリアの少なくとも一部を分析することにより、各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することとを含む、非一時的コンピュータ可読媒体。
【０４２５】
実施形態２０
撮像データは、生物学的微小物体によって生成される検体に結合するリポーター分子から発せられる光から特定される発光データを含む、実施形態１９に記載の方法。
【０４２６】
実施形態２１
背景ノイズ画像において捕捉された背景ノイズを減算することにより、検体アッセイ画像内の隔離ペンのそれぞれの対象エリアの少なくとも画像エリアを正規化し、且つ／又は信号基準画像において捕捉された画像取得歪みを考慮することにより、検体アッセイ画像内の隔離ペンのそれぞれの対象エリアの少なくとも画像エリアを正規化することを更に含む、実施形態１９又は２０に記載の方法。
【０４２７】
実施形態２２
各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部を分析することを更に含む、実施形態２１に記載の方法。
【０４２８】
実施形態２３
各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部からの発光データに線形回帰分析を適用することを更に含む、実施形態２１に記載の方法。
【０４２９】
実施形態２４
各隔離ペン内の検体の数量を示すスコアを決定することは、各隔離ペンの対象エリアの正規化画像エリアの少なくとも一部にわたる発光データを積分することを更に含む、実施形態２１に記載の方法。
【０４３０】
実施形態２５
検体は、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、実施形態１９〜２４のいずれかに記載の方法。
【０４３１】
実施形態２６
生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団による検体の分泌のレベルを評価する方法であって、生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスの隔離ペンに導入することであって、マイクロ流体デバイスは、フロー領域を有するエンクロージャを含み、隔離ペンは、フロー領域に流体的に接続され、隔離ペンは、第１の流体媒体を含む、導入することと、生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団に、隔離ペン内の第１の流体媒体内に検体を分泌させることと、第２の流体媒体をフロー領域に導入することであって、第２の流体媒体は、複数のリポーター分子を含み、各リポーター分子は、分泌検体に結合するように構成される結合成分、及び検出可能な標識を含む、導入することと、複数のリポーター分子の一部を隔離ペン内に拡散させ、且つそこに分泌された検体に結合させ、それにより、複数のリポーター分子：分泌検体（ＲＭＳＡ）複合体を生成することと、マイクロ流体デバイス内の対象エリア内に位置するリポーター分子を検出することであって、対象エリアは、隔離ペンの少なくとも一部を含む、検出することとを含む方法。
【０４３２】
実施形態２７
隔離ペンは、分離領域及び分離領域をフロー領域に流体的に接続する接続領域を有し、分離領域及び接続領域は、分離領域内の流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみフロー領域内の流体媒体の成分と交換されるように構成される、実施形態２６に記載の方法。
【０４３３】
実施形態２８
隔離ペン内の生物学的微小物体を増殖させて、生物学的微小物体のクローン集団にすることを更に含む、実施形態２７に記載の方法。
【０４３４】
実施形態２９
培養媒体でフロー領域を灌流させることを更に含み、灌流は、生物学的微小物体を隔離ペンに導入した後且つ第２の流体媒体をフロー領域に導入する前に行われる、実施形態２８に記載の方法。
【０４３５】
実施形態３０
培養媒体は、可溶性フィーダ細胞成分、定義された溶解酸素成分、定義されたｐＨ成分、排出成長媒体成分及び／又は可溶性刺激成分の１つ又は複数を含む、実施形態２９に記載の方法。
【０４３６】
実施形態３１
第２の流体媒体をフロー領域に導入することは、第１の時間期間にわたり、フロー領域を通して第２の流体媒体を流すことを含む、実施形態２６〜３０のいずれかに記載の方法。
【０４３７】
実施形態３２
第１の時間期間は、約３０分から約６０分である、実施形態３１に記載の方法。
【０４３８】
実施形態３３
第３の流体媒体をフロー領域に導入することであって、第３の流体媒体は、リポーター分子を含まない、導入することと、非結合リポーター分子の少なくとも一部を隔離ペンから拡散させることとを更に含み、対象エリア内のリポーター分子を検出することは、隔離ペンから拡散した非結合リポーター分子の量が、隔離ペンから拡散したＲＭＳＡ複合体の量の少なくとも２倍だけ大きいように選択された時間において行われる、実施形態２６〜３２のいずれかに記載の方法。
【０４３９】
実施形態３４
第３の流体媒体をフロー領域に導入することは、第２の時間期間にわたり、フロー領域を通して第３の流体媒体を流すことを含む、実施形態３３に記載の方法。
【０４４０】
実施形態３５
第２の時間期間は、非結合リポーター分子及びＲＭＳＡ複合体の拡散プロファイルのモデリングに基づいて選択される、実施形態３４に記載の方法。
【０４４１】
実施形態３６
第２の時間期間は、約２０分から約５０分である、実施形態３４に記載の方法。
【０４４２】
実施形態３７
対象エリアは、隔離ペン内からフロー領域への拡散軸に沿って整列された隔離ペンの少なくとも一部を含む、実施形態２６〜３６のいずれかに記載の方法。
【０４４３】
実施形態３８
対象エリア内に位置するリポーター分子を検出することは、対象エリアから到来する検出可能な信号の強度を測定することを含み、検出可能な信号の少なくとも幾つかは、対象エリア内に位置するリポーター分子の検出可能な標識から発せられる、実施形態２６〜３７のいずれかに記載の方法。
【０４４４】
実施形態３９
対象エリア内に位置するリポーター分子を検出することは、検出可能な信号の測定された強度から背景信号の強度を減算することにより、背景減算信号強度を特定することを更に含む、実施形態３８に記載の方法。
【０４４５】
実施形態４０
生物学的微小物体を隔離ペンに導入する前の時間において、対象エリア内の背景信号の強度を測定することを更に含む、実施形態３９に記載の方法。
【０４４６】
実施形態４１
検出可能な信号の測定された強度又は背景減算信号強度は、隔離ペン内で観測された細胞数について正規化される、実施形態３８〜４０のいずれかに記載の方法。
【０４４７】
実施形態４２
検体の分泌のレベルを定量化することを更に含む、実施形態２６〜４１のいずれかに記載の方法。
【０４４８】
実施形態４３
隔離ペンの分泌スコアを提供することを更に含む、実施形態２６〜４２のいずれかに記載の方法。
【０４４９】
実施形態４４
分泌スコアは、請求項１２〜１８のいずれかに記載の方法に従って決定される、実施形態４３に記載の方法。
【０４５０】
実施形態４５
分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも２倍の大きさの分子量を有する、実施形態２６〜４４のいずれかに記載の方法。
【０４５１】
実施形態４６
分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも４倍だけ大きい分子量を有する、実施形態２６〜４４のいずれかに記載の方法。
【０４５２】
実施形態４７
分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも１０倍だけ大きい分子量を有する、実施形態２６〜４４のいずれかに記載の方法。
【０４５３】
実施形態４８
リポーター分子の結合成分は、少なくとも１つのアミノ酸及び／又は少なくとも１つ核酸を含む、実施形態２６〜４７のいずれかに記載の方法。
【０４５４】
実施形態４９
リポーター分子の結合成分は、ペプチド又はタンパク質を含む、実施形態４８に記載の方法。
【０４５５】
実施形態５０
リポーター分子の結合成分は、配列番号１から１０のいずれか１つの配列を有するペプチドを含む、実施形態４９に記載の方法。
【０４５６】
実施形態５１
リポーター分子の結合成分は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ又はタンパク質Ａ若しくはタンパク質ＧのＩｇＧ結合断片を含む、実施形態４９に記載の方法。
【０４５７】
実施形態５２
リポーター分子の結合成分は、アプタマーを含む、実施形態２６〜５１のいずれかに記載の方法。
【０４５８】
実施形態５３
検出可能な標識は、可視標識、発光標識、リン光標識又は蛍光標識を含む、実施形態２６〜５２のいずれかに記載の方法。
【０４５９】
実施形態５４
検出可能な標識は、蛍光標識である、実施形態２６〜５２のいずれかに記載の方法。
【０４６０】
実施形態５５
生物学的微小物体によって分泌される検体は、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、実施形態２６〜５４のいずれかに記載の方法。
【０４６１】
実施形態５６
生物学的微小物体によって分泌される検体は、抗体である、実施形態２６〜５５のいずれかに記載の方法。
【０４６２】
実施形態５７
生物学的微小物体によって分泌される検体は、抗体以外のタンパク質である、実施形態２６〜５５のいずれかに記載の方法。
【０４６３】
実施形態５８
マイクロ流体デバイスは、複数の隔離ペンを含み、生物学的微小物体は、複数のうちの少なくとも２つの隔離ペンに導入され、方法の残りは、少なくとも２つの隔離ペンのそれぞれに対して実行される、実施形態２６〜５７のいずれかに記載の方法。
【０４６４】
実施形態５９１
複数のうちの少なくとも２つの隔離ペンの隔離ペンの分泌のレベルを比較することを更に含む、実施形態５８に記載の方法。
【０４６５】
実施形態６０
複数の隔離ペンのうちの２つ以上の隔離ペンの分泌スコアを比較することを更に含む、実施形態５８に記載の方法。
【０４６６】
実施形態６１
少なくとも２つの隔離ペンのうちの１つ又は複数を選択することと、選択された隔離ペンのそれぞれから１つ又は複数の生物学的微小物体を搬出することとを更に含む、実施形態５８〜６０のいずれかに記載の方法。
【０４６７】
実施形態６２
選択された隔離ペンのそれぞれからの１つ又は複数の生物学的微小物体は、マイクロ流体デバイスから更に搬出される、実施形態６１に記載の方法。
【０４６８】
実施形態６３
選択された隔離ペンは、個々に搬出される、実施形態６１又は６２に記載の方法。
【０４６９】
実施形態６４
クローン株成長の方法であって、個々の生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスの複数の隔離ペンのそれぞれに導入することであって、マイクロ流体デバイスは、フロー領域を有するエンクロージャを更に含み、複数のうちの隔離ペンのそれぞれは、フロー領域に流体的に接続され、且つ第１の流体媒体を含む、導入することと、各生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体のクローン集団に、対応する隔離ペンに含まれる第１の流体媒体に検体を分泌させることと、第２の流体媒体をフロー領域に導入することであって、第２の流体媒体は、複数のリポーター分子を含み、各リポーター分子は、分泌検体に結合するように構成される結合成分、及び検出可能な標識を含む、導入することと、複数のリポーター分子の一部を複数のうちの各隔離ペンに拡散させ、且つそこで分泌された検体の少なくとも一部に結合させ、それにより、複数の隔離ペンのそれぞれにおいて複数のリポーター分子：分泌検体（ＲＭＳＡ）複合体を生成することと、複数のうちの各隔離ペンについて、対応する対象エリアから発せられる信号の強度を検出することであって、対象エリアは、対応する隔離ペンの少なくとも一部を含み、対象エリアから発せられる信号の少なくとも一部は、対象エリア内に位置するリポーター分子の検出可能な標識から発せられる、検出することと、複数のうちの各隔離ペンについて、対応する対象エリアから発せられた検出された信号強度に基づいてスコアを決定することと、複数の隔離ペンから隔離ペンの組を選択することであって、その組の各隔離ペンは、それに含まれる生物学的微小物体又はクローン集団がトップ検体生成者であることを示すスコアを有する、選択することと、マイクロ流体デバイスから、選択された隔離ペンの組の各隔離ペン内に含まれる１つ又は複数の生物学的微小物体を搬出することと、対応する反応容器内において、選択された隔離ペンの組の各隔離ペンからの搬出された１つ又は複数の生物学的微小物体を増殖させることと、それぞれの対応する反応容器内で分泌された検体のレベルを特定し、それにより、各生物学的微小物体又はクローン集団の分泌のレベルを特定することとを含む方法。
【０４７０】
実施形態６５
複数のうちの各隔離ペンは、分離領域及び分離領域をフロー領域に流体的に接続する接続領域を有し、分離領域及び接続領域は、分離領域内の流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみフロー領域内の流体媒体の成分と交換されるように構成される、実施形態６４に記載の方法。
【０４７１】
実施形態６６
複数のうちの幾つか又は全ての隔離ペン内の個々の生物学的微小物体を増殖させて、生物学的微小物体のクローン集団にすることを更に含む、実施形態６５に記載の方法。
【０４７２】
実施形態６７
培養媒体でフロー領域を灌流させることを更に含み、灌流は、個々の生物学的微小物体を複数の隔離ペンに導入した後且つ第２の流体媒体をフロー領域に導入する前に行われる、実施形態６６に記載の方法。
【０４７３】
実施形態６８
培養媒体は、可溶性フィーダ細胞成分、定義された溶解酸素成分、定義されたｐＨ成分、排出成長媒体成分及び／又は可溶性刺激成分の１つ又は複数を含む、実施形態６７に記載の方法。
【０４７４】
実施形態６９
第２の流体媒体をフロー領域に導入することは、第１の時間期間にわたり、フロー領域を通して第２の流体媒体を流すことを含む、実施形態６４〜６８のいずれかに記載の方法。
【０４７５】
実施形態７０
第１の時間期間は、約３０分から約６０分である、実施形態６９に記載の方法。
【０４７６】
実施形態７１
第３の流体媒体をフロー領域に導入することであって、第３の流体媒体は、リポーター分子を含まない、導入することと、非結合リポーター分子の少なくとも一部を隔離ペンから拡散させることとを更に含み、複数のうちの各隔離ペンの対応する対象エリアから発せられる信号の強度を検出することは、隔離ペンから拡散した非結合リポーター分子の量が、隔離ペンから拡散したＲＭＳＡ複合体の量の少なくとも２倍だけ大きいように選択される時間において行われる、実施形態６４〜７０のいずれかに記載の方法。
【０４７７】
実施形態７２
第３の流体媒体をフロー領域に導入することは、第２の時間期間にわたり、フロー領域を通して第３の流体媒体を流すことを含む、実施形態７１に記載の方法。
【０４７８】
実施形態７３
第２の時間期間は、非結合リポーター分子及びＲＭＳＡ複合体の拡散プロファイルのモデリングに基づいて選択される、実施形態７２に記載の方法。
【０４７９】
実施形態７４
第２の時間期間は、約２０分から約５０分である、実施形態７３に記載の方法。
【０４８０】
実施形態７５
対象エリアは、隔離ペン内からフロー領域への拡散軸に沿って整列された隔離ペンの少なくとも一部を含む、実施形態６４〜７４のいずれかに記載の方法。
【０４８１】
実施形態７６
複数のうちの各隔離ペンの対応する対象エリアから発せられた信号の強度を検出することは、検出可能信号の測定された強度から背景信号の強度を減算して、背景減算信号強度を特定することを含む、実施形態６４〜７５のいずれかに記載の方法。
【０４８２】
実施形態７７
生物学的微小物体を隔離ペンに導入する前の時間において、複数のうちの各隔離ペンの対応する対象エリア内の背景信号の強度を測定することを更に含む、実施形態７６に記載の方法。
【０４８３】
実施形態７８
検出可能な信号の測定された強度又は背景減算信号強度は、対応する隔離ペン内で観測された細胞数について正規化される、実施形態７６又は７７に記載の方法。
【０４８４】
実施形態７９
複数の隔離ペンのスコアは、請求項１２〜１８のいずれかに記載の方法に従って決定される、実施形態６４に記載の方法。
【０４８５】
実施形態８０
分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも２倍の大きさの分子量を有する、実施形態６４〜７９のいずれかに記載の方法。
【０４８６】
実施形態８１
分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも４倍だけ大きい分子量を有する、実施形態６４〜７９のいずれかに記載の方法。
【０４８７】
実施形態８２
分泌検体は、リポーター分子の分子量の少なくとも１０倍だけ大きい分子量を有する、実施形態６４〜７９のいずれかに記載の方法。
【０４８８】
実施形態８３
リポーター分子の結合成分は、少なくとも１つのアミノ酸及び／又は少なくとも１つ核酸を含む、実施形態６４〜８２のいずれかに記載の方法。
【０４８９】
実施形態８４
リポーター分子の結合成分は、ペプチド又はタンパク質を含む、実施形態８３に記載の方法。
【０４９０】
実施形態８５
リポーター分子の結合成分は、配列番号１から１０のいずれか１つの配列を有するペプチドを含む、実施形態８４に記載の方法。
【０４９１】
実施形態８６
リポーター分子の結合成分は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ又はタンパク質Ａ若しくはタンパク質ＧのＩｇＧ結合断片を含む、実施形態８４に記載の方法。
【０４９２】
実施形態８７
リポーター分子の結合成分は、アプタマーを含む、実施形態６４〜８６のいずれかに記載の方法。
【０４９３】
実施形態８８
検出可能な標識は、可視標識、発光標識、リン光標識又は蛍光標識を含む、実施形態６４〜８７のいずれかに記載の方法。
【０４９４】
実施形態８９
検出可能な標識は、蛍光標識である、実施形態６４〜８７のいずれかに記載の方法。
【０４９５】
実施形態９０
生物学的微小物体によって分泌される検体は、タンパク質、サッカリド、核酸、タンパク質、サッカリド若しくは核酸以外の有機分子、小胞又はウィルスを含む、実施形態６４〜８９のいずれかに記載の方法。
【０４９６】
実施形態９１
生物学的微小物体によって分泌される検体は、抗体である、実施形態６４〜９０のいずれかに記載の方法。
【０４９７】
実施形態９２
生物学的微小物体によって分泌される検体は、抗体以外のタンパク質である、実施形態６４〜９０のいずれかに記載の方法。
【０４９８】
実施形態９３
反応容器は、ウェルプレート内のウェル、振とうフラスコ又はバイオリアクタである、実施形態６４〜９２のいずれかに記載の方法。
【０４９９】
実施形態９４
生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団によって分泌される検体のレベルを評価するキットであって、フロー領域及び複数の隔離ペンを有するエンクロージャを含むマイクロ流体デバイスであって、各隔離ペンは、フロー領域に流体的に接続され、フロー領域及び隔離ペンは、流体媒体を含むように構成される、マイクロ流体デバイスと、検出可能な標識及び検体に結合するように構成される結合成分を含むリポーター分子とを含むキット。
【０５００】
実施形態９５
複数のうちの各隔離ペンは、分離領域及び分離領域をフロー領域に流体的に接続する接続領域を有し、分離領域及び接続領域は、分離領域内の流体媒体の成分が、実質的に拡散によってのみフロー領域内の流体媒体の成分と交換されるように構成される、実施形態９４に記載のキット。
【０５０１】
実施形態９６
リポーター分子の結合成分は、少なくとも１つのアミノ酸及び／又は少なくとも１つ核酸を含む、実施形態９４又は９５に記載のキット。
【０５０２】
実施形態９７
リポーター分子の結合成分は、ペプチド又はタンパク質を含む、実施形態９６に記載のキット。
【０５０３】
実施形態９８
リポーター分子の結合成分は、配列番号１から１０のいずれか１つの配列を有するペプチドを含む、実施形態９７に記載のキット。
【０５０４】
実施形態９９
リポーター分子の結合成分は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ又はタンパク質Ａ若しくはタンパク質ＧのＩｇＧ結合断片を含む、実施形態９７に記載のキット。
【０５０５】
実施形態１００
リポーター分子の結合成分は、アプタマーを含む、実施形態９６に記載のキット。
【０５０６】
実施形態１０１
検出可能な標識は、可視標識、発光標識、リン光標識又は蛍光標識を含む、実施形態９４〜１００のいずれかに記載のキット。
【０５０７】
実施形態１０２
検出可能な標識は、蛍光標識である、実施形態９４〜１００のいずれかに記載のキット。
【０５０８】
実施形態１０３
流体媒体を更に含む、実施形態９４〜１０２のいずれかに記載のキット。
【０５０９】
実施形態１０４
流体媒体は、生物学的微小物体又はそれから生成される生物学的微小物体の集団を維持するか、増殖させるか、又はそれに選択的圧力を提供するように構成される、実施形態１０３に記載のキット。
【０５１０】
実施形態１０５
マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の表面を調整するように構成される試薬を更に含む、実施形態９４〜１０４のいずれかに記載のキット。
【０５１１】
実施形態１０６
試薬は、マイクロ流体デバイスの１つ又は複数の表面を共有結合的に修飾するように構成される、実施形態１０５に記載のキット。
【０５１２】
実施形態１０７
対象エリアは、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ隔離ペンとフロー領域との間で拡散軸に沿って延在する隔離ペン内のエリアに対応する画像エリアを含む、実施形態２６〜６３のいずれかに記載の方法。
【０５１３】
実施形態１０８
対象エリアは、基本的に画像エリアからなる、実施形態１０７に記載の方法。
【０５１４】
実施形態１０９
自動化される、実施形態２６〜６３、１０７又は１０８のいずれかに記載の方法。
【０５１５】
実施形態１１０
コンピュータに、生物学的微小物体によって生成される検体の数量を特定する方法を実行するようにシステムに指示させるプログラムが記憶される非一時的コンピュータ可読媒体であって、方法は、実施形態２６〜６３、１０７又は１０８のいずれかに記載の方法である、非一時的コンピュータ可読媒体。
【０５１６】
実施形態１１１
システムは、実施形態１〜１１に記載のシステムである、実施形態１１０に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【０５１７】
実施形態１１２
対象エリアは、検体濃度変動の測定について影響を最も受けやすく、検体変動が測定されるとき、隔離ペン内の生物学的微小物体の位置の影響を最も受けにくく、且つ隔離ペンとフロー領域との間で拡散軸に沿って延在する隔離ペン内のエリアに対応する画像エリアを含む、実施形態６４〜９３のいずれかに記載の方法。
【０５１８】
実施形態１１３
対象エリアは、基本的に画像エリアからなる、実施形態１１２に記載の方法。
【０５１９】
実施形態１１４
自動化される、実施形態６４〜９３、１１２又は１１３のいずれかに記載の方法。
【０５２０】
実施形態１１５
コンピュータに、クローン株成長の方法の少なくとも一部を実行するようにシステムに指示させるプログラムが記憶される非一時的コンピュータ可読媒体であって、方法は、実施形態６４〜９３、１１２又は１１３のいずれかに記載の方法であり、システムは、少なくとも、選択された隔離ペンの組の各隔離ペン内に含まれる１つ又は複数の生物学的微小物体をマイクロ流体デバイスから搬出するまでの且つそれを含むステップを実行する、非一時的コンピュータ可読媒体。
【０５２１】
実施形態１１６
システムは、実施形態１〜１１のいずれかに記載のシステムである、実施形態１１５に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【図１Ａ】
2019514007.tif 000011
【図１Ｂ】
2019514007.tif 000012
【図１Ｃ】
2019514007.tif 000013
【図２Ａ】
2019514007.tif 000014
【図２Ｂ】
2019514007.tif 000015
【図２Ｃ】
2019514007.tif 000016
【図２Ｄ】
2019514007.tif 000017
【図２Ｅ】
2019514007.tif 000018
【図２Ｆ】
2019514007.tif 000019
【図２Ｇ】
2019514007.tif 000020
【図２Ｈ】
2019514007.tif 000021
【図３Ａ】
2019514007.tif 000022
【図３Ｂ】
2019514007.tif 000023
【図４Ａ−４Ｂ】
2019514007.tif 000024
【図４Ｃ】
2019514007.tif 000025
【図５Ａ−５Ｃ】
2019514007.tif 000026
【図６】
2019514007.tif 000027
【図７Ａ】
2019514007.tif 000028
【図７Ｂ】
2019514007.tif 000029
【図８Ａ】
2019514007.tif 000030
【図８Ｂ】
2019514007.tif 000031
【図９Ａ】
2019514007.tif 000032
【図９Ｂ】
2019514007.tif 000033
【図１０Ａ】
2019514007.tif 000034
【図１０Ｂ】
2019514007.tif 000035
【図１１Ａ】
2019514007.tif 000036
【図１１Ｂ】
2019514007.tif 000037
【図１２Ａ】
2019514007.tif 000038
【図１２Ｂ】
2019514007.tif 000039
【図１２Ｃ】
2019514007.tif 000040
【図１３Ａ】
2019514007.tif 000041
【図１３Ｂ】
2019514007.tif 000042
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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