(57)【要約】  α−アミラーゼバリアントであって、親α−アミラーゼのアミノ酸配列中の少なくとも１個のアミノ酸残基を変異または欠失させることによって得られ、親α−アミラーゼのα−１，４−グリコシド結合加水分解能を保持しており、親α−アミラーゼと９５％以上のアミノ酸配列相同性を有していることを特徴とするα−アミラーゼバリアントが提供される。本発明によって提供される一連のα−アミラーゼバリアントは、ｐＨ５．０の酸性条件および１００℃以上の高温条件で比較的高い触媒活性を示す。
2019506186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α−アミラーゼバリアントであって、親α−アミラーゼのアミノ酸配列中の少なくとも１個のアミノ酸残基を変異または欠失させることによって得られ、親α−アミラーゼのα−１，４−グリコシド結合加水分解能を保持しており、親α−アミラーゼと９５％以上のアミノ酸配列相同性を有していることを特徴とするα−アミラーゼバリアント。
【請求項２】
前記親α−アミラーゼが、バチルス・サブチリス（枯草菌）、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｇ．ステアロサーモフィルスおよびバチルス・セレウスからなる群から選択される１種の細菌のα−アミラーゼである、請求項１に記載のα−アミラーゼバリアント。
【請求項３】
前記親α−アミラーゼが、Ｂ．リケニフォルミスまたはＧ．ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼであり、好ましくはＧ．ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼである、請求項２に記載のα−アミラーゼバリアント。
【請求項４】
Ｇ．ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼをコードする完全長遺伝子配列が配列番号１で示され、これに対応するアミノ酸配列が配列番号２で示される、請求項３に記載のα−アミラーゼバリアント。
【請求項５】
（１）Ｇ．ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのＮ末端から１番目〜５番目のアミノ酸残基を欠失させて、ＶＮまたはＡＮＬＮで置換すること；
（２）Ｇ．ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのＣ末端から２７〜３２個のアミノ酸残基を欠失させること；ならびに
（３）Ｇ．ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのＮ末端から１８０番目および１８１番目のアミノ酸残基を欠失させること
のいずれか１つまたはこれらの任意の組み合わせによって得られる、請求項４に記載のα−アミラーゼバリアント。
【請求項６】
Ｃ末端に３個のアミノ酸残基ＦＡＮが付加されている、請求項５に記載のα−アミラーゼバリアント。
【請求項７】
前記α−アミラーゼバリアントのアミノ酸配列が、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択される、請求項５または６に記載のα−アミラーゼバリアント。
【請求項８】
前記α−アミラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列が、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１からなる群から選択される、請求項７に記載のα−アミラーゼバリアント。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列が、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１からなる群から選択される、請求項９に記載の遺伝子。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のα−アミラーゼバリアントを発現させるための発現ベクターであって、請求項８に記載のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項１２】
天然または合成のプロモーター配列、天然または合成のリボソーム結合部位、天然または合成のターミネーター配列、および請求項８に記載のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子を主として含む発現カセットを含む、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のα−アミラーゼバリアントを発現させるための組換え細胞であって、請求項９に記載のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子を１つ以上含む組換え細胞。
【請求項１４】
前記組換え細胞を得るための宿主細胞が、バチルス株、好ましくは遺伝子組換えによりいくつかの内因性タンパク質を失活させたＢ．リケニフォルミスまたはその他のバチルス株から選択される、請求項１３に記載の組換え細胞。
【請求項１５】
前記組換え細胞を得るための宿主細胞が、遺伝子組換えによりAprEおよび／またはNprEを失活させたＢ．リケニフォルミスから選択される、請求項１４に記載の組換え細胞。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のα−アミラーゼバリアントを製造する方法であって、前記α−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子配列を含む組換え細胞を、前記α−アミラーゼバリアントの発現に適した条件下で培養し、該組換え細胞またはその培養上清から前記α−アミラーゼバリアントを得ることを含む方法。
【請求項１７】
多糖類のα−１，４−グリコシド結合の加水分解における、請求項１〜６のいずれか一項に記載のα−アミラーゼバリアントの使用。
【請求項１８】
前記α−アミラーゼバリアントが、高温および／または低ｐＨの条件下における多糖類のα−１，４−グリコシド結合の加水分解において使用され、該高温が好ましくは８０℃〜１１０℃であり、より好ましくは１００℃〜１１０℃であり、低ｐＨが好ましくは５．０〜５．５である、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は酵素工学分野に関し、特にα−アミラーゼバリアントおよびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
産業分野におけるデンプンの加水分解は、主にα−アミラーゼを使用して開始される。微生物由来のα−アミラーゼと別の種類の酵素（たとえばプルラナーゼ、グルコアミラーゼやグルコースイソメラーゼなど）を併用することによって、デンプンの巨大分子を効率よく分解することができ、このようにして製造された低分子多糖類や単糖類は、食品製造、穀物加工、ビール製造およびアルコール製造の様々な用途において非常に重要である。α−アミラーゼは糖化・加水分解酵素に属し、主な構造的特徴として（α／β）８バレルの折りたたみ構造を有しており、通常１０個以下の単糖モノマーからなる特有のデンプン基質結合部位を含んでいる。しかしながら、デンプンの巨大分子を切断するためには、いくつかの種類のアミラーゼの結合部位が共同で機能してデンプンと複数箇所で結合を形成する必要がある。
【０００３】
α−アミラーゼは、デンプン基質のα−１，４−グリコシド結合を効率よく切断し、デンプン基質の分子量および粘度を速やかに低下させることができる。これによって得られる生成物は主として様々な長さのデキストリンである。様々な種類のα−アミラーゼが存在し、これらのα−アミラーゼを産業利用する際の条件は、所望の生成物の特徴に大きく左右される。
【０００４】
α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）は、デンプンや他の多糖類のα−１，４−グリコシド結合を効率よく加水分解する。デンプンの加水分解において酵素の効率を上げ、生産コストを下げることが要求されていることから、様々な応用分野においてデンプンを効率よく液化することができるα−アミラーゼを探索することが、学術分野や産業分野での研究領域の一つとして重要視されるようになった。現在、酵素工学技術を使用した酵素種の改良は、主に耐熱性、酸・塩基耐性および液化作用の改善に焦点を当てて行われている。
【０００５】
植物や微生物に見出される様々なα−アミラーゼ、主にＢ．リケニフォルミス（B. licheniformis）のα−アミラーゼ、Ｂ．アミロリクエファシエンス（B. amyloliquefaciens）のα−アミラーゼ、Ｇ．ステアロサーモフィルス（G. stearothermophilus）のα−アミラーゼなどに商品価値があることがわかっており、特にＢ．リケニフォルミスのα−アミラーゼをテンプレートとしたバリアントは最も数が多く、最も広く使用されている。
【０００６】
本発明では、工業生産におけるニーズを満たすことを目的として、Ｇ．ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼをテンプレートとして使用して一連のα−アミラーゼバリアントを構築し、α−アミラーゼの利用効率を向上させることに成功した。特に、本発明のα−アミラーゼバリアントによる液化効率は、ｐＨが低く、添加量が少ない場合でも、代表的な市販品とほぼ同等である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、液化効率の向上を可能とし、工業生産におけるニーズに応えることができる、Ｇ．ステアロサーモフィルス由来の一連のα−アミラーゼバリアントを提供することを目的とする。特に、本発明のα−アミラーゼバリアントの酵素活性およびその他の特性は、１００℃以上の温度およびｐＨ５．０の条件下において代表的な市販品とほぼ同等である。
【０００８】
また、本発明は、α−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、本発明は、α−アミラーゼバリアントの製造方法およびその使用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は以下の技術的解決策によって達成することができる。
α−アミラーゼバリアントであって、親α−アミラーゼのアミノ酸配列中の少なくとも１個のアミノ酸残基を変異または欠失させることによって得られ、親α−アミラーゼのα−１，４−グリコシド結合加水分解能を保持しており、親α−アミラーゼと９５％以上のアミノ酸配列相同性を有していることを特徴とするα−アミラーゼバリアント。
【００１１】
前記親α−アミラーゼは、天然のα−アミラーゼすなわち細菌性α−アミラーゼであることが好ましく、バチルス・サブチリス（枯草菌）、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｇ．ステアロサーモフィルスおよびバチルス・セレウスからなる群から選択される１種の細菌のα−アミラーゼであることがより好ましく、Ｂ．リケニフォルミスまたはＧ．ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼであることがさらに好ましく、Ｇ．ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼであることが最も好ましい。
【００１２】
Ｇ．ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼをコードする完全長遺伝子配列は配列番号１で示され、これに対応するアミノ酸配列は配列番号２で示される。
【００１３】
前記α−アミラーゼバリアントは、
（１）Ｇ．ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのＮ末端から１番目〜５番目のアミノ酸残基を欠失させて、ＶＮまたはＡＮＬＮで置換すること；
（２）Ｇ．ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのＣ末端から２７〜３２個のアミノ酸残基を欠失させること、たとえば、Ｃ末端から１番目〜２７番目のアミノ酸残基を欠失させること、Ｃ末端から１番目〜２９番目のアミノ酸残基を欠失させること、またはＣ末端から１番目〜３２番目のアミノ酸残基を欠失させること；ならびに
（３）Ｇ．ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのＮ末端から１８０番目および１８１番目のアミノ酸残基を欠失させること
のいずれか１つまたはこれらの任意の組み合わせによって得られることが好ましい。
【００１４】
前記α−アミラーゼバリアントは、前記３種の改変のいずれか１つまたは前記３種の改変の任意の組み合わせに加えて、Ｃ末端に３個のアミノ酸残基ＦＡＮが付加されていることがさらに好ましい。
【００１５】
前記α−アミラーゼバリアントのアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択されることがさらに好ましい。
【００１６】
前記α−アミラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１からなる群から選択される。
【００１７】
本発明のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子が提供される。前記遺伝子は、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１からなる群から選択されることが好ましい。
【００１８】
請求項８に記載のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子を含む、本発明のα−アミラーゼバリアントを発現させるための発現ベクターが提供される。前記発現ベクターは、天然または合成のプロモーター配列、天然または合成のリボソーム結合部位、天然または合成のターミネーター配列、および本発明のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子配列を主として含む発現カセットを含む。
【００１９】
本発明のα−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子を１つ以上含む、本発明のα−アミラーゼバリアントを発現させるための組換え細胞が提供される。前記組換え細胞を得るための宿主細胞は、バチルス株から選択されることが好ましく、遺伝子組換えによりいくつかの内因性タンパク質を失活させたＢ．リケニフォルミスまたはその他のバチルス株から選択されることがさらに好ましく、遺伝子組換えによりAprEおよび／またはNprEを失活させたＢ．リケニフォルミスから選択されることが最も好ましい。
【００２０】
本発明のα−アミラーゼバリアントを製造する方法であって、前記α−アミラーゼバリアントをコードする遺伝子配列を含む組換え細胞を、前記α−アミラーゼバリアントの発現に適した条件下で培養すること、および該組換え細胞またはその培養上清から前記α−アミラーゼバリアントを得ることを含む方法が提供される。
【００２１】
さらに、多糖類のα−１，４−グリコシド結合の加水分解における、好ましくは高温および／または低ｐＨの条件下における多糖類のα−１，４−グリコシド結合の加水分解における、本発明のα−アミラーゼバリアントの使用が提供される。前記高温は８０℃〜１１０℃であることが好ましく、１００℃〜１１０℃であることがより好ましく、前記低ｐＨは５．０〜５．５であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によって提供される一連のα−アミラーゼバリアントは、ｐＨ５．０の酸性条件および１００℃以上の高温条件で高い触媒活性を示す。これらのα−アミラーゼバリアントの耐酸性および熱安定性はデンプンの液化に適している。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】pYF-tsDEベクターを示す。このベクターは温度感受性因子（３０℃で複製活性を示す）およびエリスロマイシン耐性決定遺伝子（ErmC）を含んでおり、大腸菌に導入した場合、３００μｇ／ｍＬのエリスロマイシンに耐性を示し、Ｂ．リケニフォルミスに導入した場合、５μｇ／ｍＬのエリスロマイシンに耐性を示す。本発明のα−アミラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞をエリスロマイシンで選別した。
【図２】本発明のpYF-tsDEベクターを得ることが可能な、pUC57-KS-ermベクターの概略図である。
【図３】pYF-tsINT-amyベクターの概略図である。
【図４】タンパク質の綿状沈殿および粘性を示す。
【図５】様々な濃度のデンプンスラリーを使用した液化実験の結果を示すグラフである。
【図６】α−アミラーゼバリアントの耐酸性実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
特に記載がない限り、本明細書で使用されている技術用語および科学用語はいずれも、当業者によって一般的に理解される意味を有すると見なされる。本願において、特定の用語の意味は本明細書に記載されている通りである。本明細書および添付の請求項において、単数形の「a」、「an」および「the」は、明確な記載がない限り、複数のものを含むことに留意されたい。
【００２５】
本発明において「α−アミラーゼ」は、多糖類のα−１，４−グリコシド結合を加水分解することができる酵素を指す。たとえば、α−アミラーゼは、デンプンを加水分解してデキストリンを生成することができる。
【００２６】
本発明において「親α−アミラーゼ」は天然のα−アミラーゼを指す。この天然のα−アミラーゼは細菌性α−アミラーゼであり、細菌性α−アミラーゼの由来細菌として、バチルス・サブチリス（枯草菌）、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．アミロリクエファシエンス、Ｇ．ステアロサーモフィルスおよびバチルス・セレウスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明の好ましい一実施形態によれば、天然のα−アミラーゼは、バチルス株、特にＢ．リケニフォルミスおよびＧ．ステアロサーモフィルスに由来するものである。Ｇ．ステアロサーモフィルスのα−アミラーゼをコードする完全長配列は配列番号１で示され、これに対応するアミノ酸配列は配列番号２で示される。
【００２８】
本発明において「α−アミラーゼバリアント」は、親α−アミラーゼのアミノ酸配列中の１個または複数個のアミノ酸残基を変異または欠失させることによって得られる非天然のα−アミラーゼであり、親α−アミラーゼのα−１，４−グリコシド結合加水分解能を保持しているものを指す。
【００２９】
本発明において「液化」は、通常、糖質を低分子多糖類に分解するプロセスを指す。α−アミラーゼまたはα−アミラーゼバリアントを添加する場合、「液化」は特に糖質のα−１，４−グリコシド結合を加水分解することを指す。
【００３０】
本発明において「α−１，４−グリコシド結合」は、一方のグルコースのＣ１と他方のグルコースのＣ４とを連結する結合、すなわち、α−１，４−グリコシド結合を指す。
【００３１】
本発明は、親α−アミラーゼの配列を改変することによって得られる「α−アミラーゼバリアント」に関する。親α−アミラーゼは天然のα−アミラーゼであり、特に細菌由来の天然のα−アミラーゼである。本発明の一実施形態によれば、α−アミラーゼバリアントは、親α−アミラーゼのアミノ酸配列中の１個または複数個のアミノ酸残基を変異または欠失させることによって得られる。
【００３２】
本発明は一連のα−アミラーゼバリアントを含む。本発明の一実施形態によれば、一連のα−アミラーゼバリアントの各アミノ酸配列は少なくとも９５％の相同性を有し、さらには９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相同性を有する。
【００３３】
本発明において、α−アミラーゼバリアントは、たとえば、以下のいずれか１つの改変によって得られるが、これらに限定されない。
（１）Ｇ．ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのＮ末端から１番目〜５番目のアミノ酸残基を欠失させてＶＮで置換し、Ｃ末端から１番目〜２７番目のアミノ酸残基を欠失させる。これによって得られるアミノ酸配列を配列番号４に示す。
（２）Ｇ．ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのＮ末端から１番目〜５番目のアミノ酸残基を欠失させてＡＮＬＮで置換し、Ｎ末端から１８０番目および１８１番目のアミノ酸残基を欠失させ、Ｃ末端から１番目〜２７番目のアミノ酸残基を欠失させる。これによって得られるアミノ酸配列を配列番号６に示す。
（３）Ｇ．ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのＮ末端から１番目〜５番目のアミノ酸残基を欠失させてＡＮＬＮで置換し、Ｎ末端から１８０番目および１８１番目のアミノ酸残基を欠失させ、Ｃ末端から１番目〜２９番目のアミノ酸残基を欠失させる。これによって得られるアミノ酸配列を配列番号８に示す。
（４）Ｇ．ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのＮ末端から１番目〜５番目のアミノ酸残基を欠失させてＡＮＬＮで置換し、Ｎ末端から１８０番目および１８１番目のアミノ酸残基を欠失させ、Ｃ末端から１番目〜３２番目のアミノ酸残基を欠失させる。これによって得られるアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
（５）Ｇ．ステアロサーモフィルスの親α−アミラーゼのＮ末端から１番目〜５番目のアミノ酸残基を欠失させてＡＮＬＮで置換し、Ｎ末端から１８０番目および１８１番目のアミノ酸残基を欠失させ、Ｃ末端から１番目〜２７番目のアミノ酸残基を欠失させ、Ｃ末端に３個のアミノ酸残基ＦＡＮを付加する。これによって得られるアミノ酸配列を配列番号１２に示す。
【００３４】
本発明のα−アミラーゼバリアントのアミノ酸配列は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２からなる群から選択される。
【００３５】
本発明のα−アミラーゼバリアントは、α−１，４−グリコシド結合を加水分解する能力が保持されている。さらに、本発明のα−アミラーゼの性能は、工業生産で要求される条件、たとえば、液化効率の向上、酸性ｐＨまたは高温下での安定した触媒活性などを満たすものである。
【００３６】
本発明の一実施形態によれば、本発明のα−アミラーゼバリアントは、ｐＨ５．０の酸性条件または１００℃以上の温度（特に１００℃〜１１０℃）で安定した触媒活性を示す。デンプン産業において実施される液化プロセスは低ｐＨおよび高温の条件下で行われることが多いことから、本発明のα−アミラーゼバリアントが有するこのような改良された特性は、デンプン産業における液化反応により適したものである。
【００３７】
本発明のα−アミラーゼバリアントはいずれも液化反応に使用することができる。好ましい一実施形態において、本発明のα−アミラーゼバリアントは、親α−アミラーゼ、特にＧ．ステアロサーモフィルス由来の親α−アミラーゼから作製される。特に好ましい一実施形態において、本発明のα−アミラーゼバリアントのアミノ酸配列は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２のいずれかで示される。
【００３８】
本発明によれば、α−１，４−グリコシド結合を含む糖質であればどのようなものであっても液化反応に使用することができる。１つ以上のα−１，４−グリコシド結合を含む糖質としては、デンプン、アミロペクチン、アミロースおよびデキストランが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
アミロペクチンなどの糖質の多くは、α−１，６−グリコシド結合およびα−１，４−グリコシド結合を含んでいる。「α−１，４−グリコシド結合」は、一方のグルコースのＣ１と他方のグルコースのＣ４とを連結する結合、すなわち、α−１，４−グリコシド結合を指す。したがって、糖化プロセスにおいて、α−１，６−グリコシド結合を加水分解することができるプルラナーゼを、本発明のα−アミラーゼバリアントと組み合わせて使用することができる。α−１，４−グリコシド結合を加水分解することができる酵素としては、α−アミラーゼが挙げられるが、これに限定されない。本発明の好ましい一実施形態において、α−１，４−グリコシド結合の加水分解を触媒する酵素はα−アミラーゼである。
【００４０】
したがって、本発明の一実施形態によれば、糖化反応に対する触媒性能を向上させて糖化反応の効率を上昇させる方法では、プルラナーゼと組み合わせて使用する。本発明において「プルラナーゼ」は、α−１，６−グリコシド結合を加水分解することができる加水分解酵素を指す。
【００４１】
デンプンの糖化において、本発明のα−アミラーゼとプルラナーゼとを併用することによって、グルコースおよびマルトースの純度を上げることができる。さらに、糖化反応においてこの複合酵素を使用することによって、基質濃度を効果的に低下させることができ、転化効率を効果的に上昇させることができ、酸性ｐＨまたは高温下においてさらに高い触媒活性を発揮させることができ、デンプンを加水分解するための工業条件により合致させることができる。
【００４２】
本発明は、工業生産に適した任意の温度条件およびｐＨ条件において、α−アミラーゼバリアントを使用してα−１，４−グリコシド結合を加水分解して糖化を行う方法を提供する。本発明によれば、液化反応は、８０℃〜１１０℃の高温域、たとえば、８０℃、９０℃、１００℃、１０５℃、１１０℃などで実施することができる。糖化反応は、ｐＨ５．０〜ｐＨ５．５の酸性ｐＨ条件、たとえば、ｐＨ５．０、ｐＨ５．１、ｐＨ５．２、ｐＨ５．３、ｐＨ５．４、ｐＨ５．５などで実施することができる。
【００４３】
本発明の一実施形態によれば、酸性ｐＨおよび１００℃以上の温度の条件下においてα−アミラーゼバリアントによって触媒される液化反応の触媒活性は安定である。
【００４４】
別の一態様において、本発明の発現ベクターは、α−アミラーゼバリアントをコードする合成ヌクレオチド配列を含み、組換え宿主細胞はこの発現ベクターを含む。本発明の発現ベクターは、様々なα−アミラーゼバリアントをコードする一連の合成ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。本発明の発現ベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。たとえば、本発明の発現ベクターは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９および配列番号１１で示される合成ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００４５】
本発明の発現ベクターは、天然または合成のプロモーター配列、天然または合成のリボソーム結合部位および天然または合成のターミネーター配列を含むことが好ましい。これらの遺伝因子と合成α−アミラーゼバリアントのコード配列から発現カセットが構成され、この発現カセットとベクターバックボーンから発現ベクターが構成される。たとえば、本発明の発現ベクターは、遺伝因子として、プロモーター配列、合成リボソーム結合部位、本発明のα−アミラーゼバリアントをコードする合成ヌクレオチド配列およびターミネーター配列を含む発現カセットを含む。シグナル配列は、α−アミラーゼバリアントの分泌を誘導することができる配列であり、本発明の発現ベクターまたは発現カセットへのシグナル配列の導入、特に開始コドンの上流へのシグナル配列の導入は、α−アミラーゼバリアントの分泌においてさらに有利である。
【００４６】
本発明の好ましい一実施形態によれば、本発明の発現ベクターは、細菌において適切に発現され、特にバチルス株、より好ましくはＢ．リケニフォルミスにおいて適切に発現される。特に好ましい一実施形態において、本発明の発現ベクターは、バチルス属のゲノム、特にＢ．リケニフォルミスのゲノムに組み込むことができる。宿主細胞の染色体にポリヌクレオチド配列を組み込むために使用することができる発現ベクターおよびこのような発現ベクターの構築方法は、現在の生物学分野においてよく知られている一般的な技術である。
【００４７】
本発明の一実施形態によれば、本発明の組換え宿主細胞は、遺伝子組換えにより、α−アミラーゼバリアントをコードする１つ以上の核酸配列が導入されていてもよい。遺伝子組換えを利用した、本発明のα−アミラーゼバリアントをコードする１つ以上の合成核酸配列の宿主細胞への導入は、どのような技術を使用して行ってもよく、たとえば染色体組み込みを利用してもよい。温度感受性因子および耐性選択マーカーを含むベクターを使用して、組み込み工程を行うことができる。ベクターは、Campbell機構を介してゲノムの特定領域に組み込まれ、組換え株は耐性スクリーニングによって得られる。組換え株の耐性スクリーニングマーカーは、この後の培養工程において相同組換えによって除去される。
【００４８】
本発明の一実施形態によれば、本発明の組換え宿主細胞は、遺伝子組換えによっていくつかの内因性タンパク質が失活している。失活させることができる内因性タンパク質としては、菌体外プロテアーゼが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの内因性タンパク質は、α−アミラーゼバリアント発現遺伝子を含む核酸配列で形質転換された組換え宿主細胞を得る前またはその後に失活させる。より好適な方法では、α−アミラーゼバリアント発現遺伝子を含むベクターを導入する前に、宿主細菌において菌体外分泌プロテアーゼを失活させる。
【００４９】
最初に、Ｂ．リケニフォルミスを遺伝子組換えして、いくつかの菌体外分泌プロテアーゼ遺伝子を失活させる。具体的には、いくつかの菌体外プロテアーゼ、たとえばサブチリシン（AprE）やグルタミン酸特異的プロテアーゼ（Blase）などを、Ｂ．リケニフォルミス株において失活させることができる。このような遺伝子組換えを行うことによって、Ｂ．リケニフォルミス株を、α−アミラーゼバリアントの発現および分泌により適したものとすることができる。
【００５０】
本発明は、α−アミラーゼバリアントの製造方法を提供する。本発明の一実施形態によれば、前記方法は、α−アミラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む組換え宿主細胞を、前記α−アミラーゼバリアントの発現に適した条件下で培養すること、および該組換え宿主細胞またはその上清から前記α−アミラーゼバリアントを得ることを含む。
【００５１】
本発明の組換え宿主細胞はいずれもα−アミラーゼバリアントを産生することができる。本発明の組換え宿主細胞は、α−アミラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を少なくとも１コピー含む。α−アミラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列は、好適な条件下でα−アミラーゼバリアントを発現することができる。組換え宿主細胞から分泌されたα−アミラーゼバリアントは、該組換え細胞またはその上清から回収することができる。回収方法としては、濾過、遠心分離などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
本発明の一実施形態によれば、遺伝子組換えＢ．リケニフォルミスを使用した発酵によってα−アミラーゼバリアントを大量生産することができる。目的のα−アミラーゼバリアントをコードするヌクレオチド配列を、遺伝子操作によりＢ．リケニフォルミスに導入する。より好ましくは、本発明のＢ．リケニフォルミスは、遺伝子組換えによって、耐性スクリーニング遺伝子が除去されており、よって、環境に優しく、製造されるα−アミラーゼバリアントは、食品産業での使用により適したものである。
【００５３】
以下の本発明の実施例は本発明の本質をさらに詳しく説明するものである。ただし、以下の実施例は本発明をなんら限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求項によって定義される。
【実施例】
【００５４】
実施例１：pYF-tsDEプラスミドの構築
pYF-tsDE（図１）は、大腸菌／Ｂ．リケニフォルミスの熱感受性シャトルプラスミドである。このプラスミドは温度感受性複製起点（３０℃において活性を示す）およびエリスロマイシン耐性遺伝子（ErmC）を含んでおり、大腸菌では３００μｇ／ｍｌのエリスロマイシンに耐性を示し、Ｂ．リケニフォルミスでは５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンに耐性を示す。このプラスミドの複製起点を３７℃で失活させ、プラスミドを宿主ゲノムの所定の部位に組み込み、ErmCでスクリーニングした。
【００５５】
pYF-tsDEプラスミドは以下のようにして構築した。まず、pUC57-KS-ermプラスミド（Genscript社に委託して合成したもの、配列は中国特許第１０４０７３４５８Ａ号の図２に示す）をBglIIで消化し、消化した断片を回収し、３．８ｋｂｐの断片を精製し、Ｔ４リガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ）でセルフライゲートさせ、クローニングしてpYF-tsDEプラスミドを得た。このプラスミドを大腸菌TOP10に導入して形質転換体を増殖させ、以下のすべての遺伝子操作においてバックボーンとして使用した。
【００５６】
実施例２：プロテアーゼ欠損Ｂ．リケニフォルミス株の構築
組換え酵素を産生する宿主細胞としての遺伝子組換え株は文献で報告されている（Widner et al., Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 25, 204-212, 2000）。このような組換え宿主細胞は、通常、酵素を発現するための標的配列をコードする１つ以上の核酸構造を含む。本発明では、Ｂ．リケニフォルミスを、遺伝子組換えレシピエント細菌として使用する。現在、バチルス属の形質転換は、十分に確立された方法を使用して実施することができ、このような方法として、たとえば、コンピテントセル形質転換法、電気的形質転換法およびプロトプラスト形質転換法が挙げられる（Young et al., J Bacteriology, 81, 823-829, 1961; Shigekawa et al., Biotechniques, 6, 742-751, 1988; Chang et al., Molecular General Genetics, 168, 111-115, 1979）。
【００５７】
本発明において、α−アミラーゼバリアントを発現させるための単一の発現カセットは、天然または合成のプロモーター配列、バチルス属からスクリーニングされたシグナルペプチド配列、合成リボソーム結合部位、Ｇ．ステアロサーモフィルス由来のα−アミラーゼバリアントのコード遺伝子および転写ターミネーターを含むものであった。このような設計にすることにより、宿主菌株における遺伝子発現量およびα−アミラーゼバリアントの分泌量の大幅な増加が期待される。Ｂ．リケニフォルミス細胞のゲノム上の特定部位におけるα−アミラーゼバリアントのコード遺伝子への置換は、プラスミドを介した１回交叉型相同組換えによって行った。
【００５８】
Ｂ．リケニフォルミスにおいて、菌体外プロテアーゼの活性は異種酵素の分泌に悪影響を与える。サブチリシン（AprE）とグルタミン酸特異的プロテアーゼ（Blase）の２種の主要な菌体外プロテアーゼが同定されている。Ｂ．リケニフォルミスにおいて見られる菌体外プロテアーゼ活性の大部分は、これらの２種のプロテアーゼに由来するものである。
【００５９】
本発明では、完全な構造のα−アミラーゼバリアント遺伝子を得るため、前記２種の遺伝子を失活させ、Campbell様機構による１回交叉型連続組換えを採用した。具体的な手順を以下に示す。
【００６０】
２．１  BglIIによるpYF-tsDEの消化およびCIP処理によるセルフライゲーションの抑制
２．２  遺伝子ノックアウト
（１）前記各遺伝子を欠失した断片を得るため、Ｂ．リケニフォルミス（CICC 22794、China Center of Industrial Culture Collectionから購入したもの）のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用してＰＣＲを行い、欠失させる遺伝子の両末端から約５００ｂｐの相同配列をそれぞれ増幅した。Ｂ．リケニフォルミスの単クローンは、あらかじめ９８℃で５分間変性させることによって、ＰＣＲ反応のゲノムＤＮＡテンプレートとしてそのまま使用することができた。
【００６１】
ＰＣＲ反応用のプライマーは、Genscript社で合成したものを使用した。プライマー配列を以下に示す。
Apr遺伝子の上流配列を増幅するためのプライマー：
lichApr_F1  TTATTGAGCGGCAGCTTCGACATTGATCAGACCTT
lichApr_R1  CCTTACGGCATTCCTCTCAACAGCGGATCTTCAG
Apr遺伝子の下流配列を増幅するためのプライマー：
lichApr_F2  CCTGAAGATCCGCTGTTGAGAGGAATGCCGTAAGG
lichApr_R2  ATGATGAGGAAAAAGAGTTTTTGGCTTGGGATGCTGAC
Blase遺伝子の上流配列を増幅するためのプライマー：
blalich_F1  TTATTGTGCGCTGTTTTTCCAGTTGGTCAAATTGTCG
blalich_cR1  CGGACAAGGGTCACCAACGGGACAACTGTTACCATC
Blase遺伝子の下流配列を増幅するためのプライマー：
blalich_cF2  GATGGTAACAGTTGTCCCGTTGGTGACCCTTGTCC
blalich_R2  CGGCGTTGGTTAGTAAAAAGAGTGTTAAACGAGGTTTGAT
【００６２】
ＰＣＲ増幅系の反応容量は５０μｌであった。反応操作を以下に示す。
（１）単クローン性Ｂ．リケニフォルミス１４５８０を９８℃で８分間あらかじめ変性
（２）９６℃、１５秒
（３）５８℃、１５秒
（４）７２℃、３０秒
工程２〜４を２５〜３０回繰り返した。
（５）７２℃、２分間で最終伸長
【００６３】
０．８％アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ産物を検出し、Axygenキットを使用して精製した。
【００６４】
２．３  約４００〜５００ｂｐの内部配列が欠失した標的遺伝子のオーバーラップ伸長ＰＣＲ法による増幅
内部欠失遺伝子断片はオーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＳＯＥ）法を使用して得た。具体的な手順を以下に示す。
（１）２．２節で得た各遺伝子の上流ＰＣＲ断片および下流ＰＣＲ断片を回収し精製した。
（２）各目的遺伝子の上流相同断片および下流相同断片を１：１のモル比でテンプレートとして使用し、プライマーXX-CZ-F1およびXX-CZ-R2（「XX」にはAprまたはBlaseが入る）を使用してＰＣＲ増幅を行い、内部断片が欠失したAprE遺伝子またはBlase遺伝子を得た。
【００６５】
Clone-EZ Cloning Kit（Genscript社から入手）を使用して、BglIIで線状化したpYF-tsDEベクターに各断片を再度組み込んだ。このようにして得られた各組換えプラスミドを、pYF-tsDE-AprおよびpYF-tsDE-Blaseと名付けた。これらの組換えプラスミドは温度感受性プラスミドであり、各組換えプラスミドに含まれているApr遺伝子またはBlase遺伝子は、それぞれ元の遺伝子から約４００〜５００ｂｐの内部配列が欠失されている。
【００６６】
別のアレルを相同組換えによって置換することもできる。具体的な方法は中国特許第１０２１２４１１２Ａ号に記載されており、当技術分野で公知のその他の相同組換え法を使用することもできる。
【００６７】
２．４  プラスミドによる形質転換
ノックアウトプラスミドによってＢ．リケニフォルミスのコンピテントセルを形質転換する方法および実験において使用したスクリーニング法を以下に示す。
（１）熱感受性プラスミドpYF-tsDE-AprまたはpYF-tsDE-Blaseを使用して、Ｂ．リケニフォルミス（CICC 22794、China Center of Industrial Culture Collectionから購入したもの）のコンピテントセルを形質転換した。
（２）ＬＢ培地（１Ｌ当たり、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇおよび塩化ナトリウム１０ｇを含む）において３０℃で培養を行い、エリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）耐性に基づいて陽性クローン株を選別した。
（２）陽性クローン株を３７℃の条件に移してインキュベーションを行い、温度感受性プラスミドを宿主ゲノムに融合させた。所定の位置で遺伝子の置換が起こるように、いくつかのクローンを選択し、２×ＹＴ培地に接種して２４時間培養し、次いで継代培養を１回行った。全工程を通して４〜５回（通常５〜７日間）の継代培養を行った。
（３）エリスロマイシン感受性バチルスを選別し、ＰＣＲにより同定を行った。これと同時に、１％スキムミルク含有ＬＢ平板培地を用いることにより、加水分解に伴う透明環の観察も行うことができる。ノックアウト株であれば、加水分解に伴い形成される透明環が有意に小さくなるはずである。
【００６８】
同定に使用したＰＣＲプライマー：
AprE：Apr-seqF1/Apr-seqR3
Blase：Blase-seqF1/Blase-seqR3
Apr-seqF1：GCCAGGTTGAAGCGGTCTATTCAT
Apr-seqR3：TACGGCCATCCGACCATAATGGAAC
Blase-seqF1：GAAGAGCCGGTCACAATTGC
Blase-seqR3：GGCCGTTAGATGTGACAGCC
【００６９】
実施例３：α−アミラーゼバリアント株の構築および組み込み
３．１  アミラーゼ発現カセットの構築
組み込みプラスミドは、前記のpYF-tsDEプラスミドと同様の方法で構築した。ゲノム上の所定のAmyE部位に発現カセットを組み込むため、ゲノム上のAmyE部位の上流と下流にある約８００ｂｐの相同領域をそれぞれ作製し、α−アミラーゼバリアント発現カセットの両末端にライゲートした。これと同時に、α−アミラーゼバリアント遺伝子の発現制御に必要な、完全に天然由来の細菌染色体ＤＮＡ断片と機能的合成配列とを複数連結した。
【００７０】
代表的なアミラーゼ発現カセットは以下の要素を含んでいた。すなわち、代表的なα−アミラーゼバリアント発現カセットは、天然または合成のプロモーター配列（配列番号１３）、合成リボソーム結合部位（aaaggagg）、Ｇ．ステアロサーモフィルス由来のα−アミラーゼバリアントのコード遺伝子（配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１）および合成ターミネーター配列（配列番号１４）を含むものであった。また、発現させる酵素の分泌効率を向上させるため、バチルス・サブチリス（枯草菌）からスクリーニングされた強力な天然のシグナル配列（配列番号１５）を、α−アミラーゼバリアントのコード遺伝子のプロモーターの上流に挿入した。構築したα−アミラーゼバリアント発現カセットを、Clone-EZ Cloning Kit（Genscript）を使用して、線状化pYF-tsDEのBglII部位に挿入した。このようにして得られた温度感受性の組み込みプラスミドをpYF-tsINT-amyと名付けた（図３）。前記配列の合成はGenscript社で行い、各配列を直列に順次連結してα−アミラーゼ酵素発現カセットを得た。このカセット中のシグナルペプチド配列はバチルス・サブチリス（枯草菌）からスクリーニングされたものであり、α−アミラーゼの分泌を効果的に増加させることができる。
【００７１】
３．２  プラスミドによる形質転換
BglIIで線状化したpYF-tsDEプラスミドを環化するための遺伝子組換え技術（Genscript社によって提供された組換えキット）を使用して、α−アミラーゼ発現カセットの全体（amyE遺伝子の上流および下流の相同部分を含む）を環化した。このようにして構築した熱感受性プラスミドをpYF-tsINT-amyと名付けた。AprEプロテアーゼ遺伝子およびBlaseプロテアーゼ遺伝子を欠失させたバチルス・リケニフォルミス（CICC 22794、China Center of Industrial Culture Collectionから購入したもの）を、このプラスミドで形質転換することによって、耐性マーカーを持たないα−アミラーゼバリアント発現カセットでAmyE部位を置換した。Ｂ．リケニフォルミスの染色体にα−アミラーゼバリアントのコード遺伝子が組み込まれた細菌株を、前述の方法と同様にして青色デンプン平板培地に播種したところ、透明環が形成された。さらにＰＣＲでは、このレシピエント細菌のAmyE部位に前記発現カセットが組み込まれていることが確認できた。
【００７２】
α−アミラーゼバリアントを産生する遺伝子組換えＢ．リケニフォルミス株を−８０℃で保存した。
【００７３】
実施例４：振盪フラスコ発酵によるα−アミラーゼバリアントの製造
活性化した単クローン細菌（α−アミラーゼバリアント発現カセットを含む）を、２０ｍｌの培地（マルトースシロップ４．０％、ペプトン２．０％、酵母粉末０．１％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．６％および対応する抗生物質を含む）に接種し、対数増殖期まで培養した。培養液１．２ｍｌを、３０ｍｌの培地（マルトースシロップ１２．０％、ペプトン１．０％、酵母粉末１％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％およびＭｎＣｌ２ ０．００３％を含む）に接種し、１２０ｒｐｍのレシプロシェーカー上で３日間培養した。２４時間後、４８時間後および７２時間後に試料を採取し、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。上清を保存し、SDS-PAGEで分析した。α−アミラーゼバリアントの分子量は約５３ｋＤであった。
【００７４】
実施例６に記載の方法でα−アミラーゼバリアントの活性を測定した。
【００７５】
実施例５：α−アミラーゼバリアントのステップ供給発酵プロセス
実施例３で得た後−８０℃で凍結保存した遺伝子組換えＢ．リケニフォルミス株を寒天斜面培地に塗抹し、３７℃で一晩培養した。寒天斜面培地の組成は、ペプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ １％および寒天粉末２％であった。
【００７６】
新鮮なクローンをいくつか選択し、５０ｍｌの培地を入れた播種用振盪フラスコ中において３７℃で１６時間培養した。播種用振盪フラスコ中の組成は、マルトースシロップ４．０％、ペプトン２．０％、酵母エキス０．１％およびＫＨ２ＰＯ４ ０．６％であった。１６時間後、播種された培養液すべてを、４Ｌの培地を入れた７Ｌのステンレス鋼製の発酵槽に移し、攪拌速度３５０ｒｐｍおよび通気速度６５０Ｌ／ｈで発酵を１２時間行った。発酵槽中の組成は、麦芽シロップ６．０％、ペプトン１．０％、酵母エキス１％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％およびＭｎＣｌ２ ０．００３％であった。その後、５％リン酸で発酵ｐＨを約５．７±０．２に調整した。マルトースシロップ４８％、ペプトン６％および酵母エキス８％からなる仕込み液を、最初の１８時間は１Ｌ／１８時間の速度で発酵槽に連続供給し、次の１１０時間は０．５Ｌ／１８時間の速度で連続供給した。発酵プロセスの継続時間は合計で１４０〜１５０時間であった。発酵槽中の培地をすべて回収し、４℃、１０１０ｋｒｐｍで３０分間遠心分離した。遠心分離後に得られた上清を使用してα−アミラーゼバリアントの酵素活性を分析した。
【００７７】
実施例６：アミラーゼ活性アッセイ
アミラーゼ活性は、Bestzymeアミラーゼ単位（ＢＡＵ）を用いて評価した。「１ＢＡＵ」とは、ｐＨ６．０および７０℃の条件で１ｍｇの可溶性デンプンを１分間で液化するのに必要な酵素の量と定義される。
【００７８】
簡潔に述べると、酵素活性を以下のようにして測定した。２０ｇ／Ｌの可溶性デンプン溶液２０ｍｌをリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）５ｍｌと混合し、７０℃で８分間あらかじめ加熱した後、希釈した酵素溶液１．０ｍｌを加え、正確に５分間反応を行った。０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液０．５ｍｌおよび希ヨウ素溶液５ｍｌをあらかじめ加えた試験管に反応溶液１ｍｌを加え、よく振盪した。０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸溶液０．５ｍｌおよび希ヨウ素溶液５ｍｌをブランクとして使用し、波長６６０ｎｍにおける吸光度を速やかに測定し、吸光度をプロットしたグラフから測定試料の酵素活性を求めた。
【００７９】
実施例７：アミラーゼの使用
以下の結果はいずれも、配列番号８のα−アミラーゼバリアント配列を使用して得られたものである。
【００８０】
特に記載がない限り、以下の通りである。
１ＢＡＵ：アミラーゼ活性は、Bestzymeアミラーゼ単位（ＢＡＵ）を用いて評価した。「１ＢＡＵ」とは、ｐＨ６．０および７０℃の条件で１ｍｇの可溶性デンプンを１分間で液化するのに必要な酵素の量と定義される。
ｔＤＳ：乾燥物１トン当たりを示す。
【００８１】
Ｂ．リケニフォルミス細胞で発現させて単離したアミラーゼを、最初の試験として、トウモロコシデンプンを使用した液化試験に供した。試験条件は、１８ボーメ度（°Ｂｅ）、十分な混合、塩酸でｐＨ５．２に調整するものとした。１００℃、１０５℃、１０８℃、１１０℃または１１５℃の注入温度で０．２２ｋｇ／ｔＤＳのアミラーゼを加え、５〜８分間維持後フラッシュし、その後９５℃で１２０分間維持した。液化後、ＤＥ（デキストロース当量）の測定およびヨウ素試験を行った。タンパク質の綿状沈殿が生じ、粘性があることが観察された。表１および図４に結果を示す。
【００８２】
【表１】
2019506186.tif 000003
【００８３】
様々な注入温度で実験を行った結果、以下のことが示された。１００℃では液化が過剰に進みすぎた。１０５℃での液化は適切なレベルであり、タンパク質の綿状沈殿も良好であった。１０８℃および１１０℃での液化でも良好な結果が得られ、タンパク質の綿状沈殿も正常レベルであり、α−アミラーゼバリアントが良好な耐熱性を有することが示された。これに対して、１１５℃での液化では良好な結果は得られず、α−アミラーゼバリアントが１１５℃という高温に耐えられないことが示された。
【００８４】
次に、様々な濃度のデンプンスラリーを使用した液化実験を行い、高濃度の基質に対するアミラーゼの耐性を試験した。液化条件は前記と同様とし、注入温度は１０８℃とした。表２および図５に結果を示す。
【００８５】
【表２】
2019506186.tif 000004
【００８６】
表２に示したように、様々な濃度のデンプンスラリーを使用したところ、デンプンスラリーの濃度が２２°Ｂｅという高い濃度であっても、α−アミラーゼバリアントを使用して正常レベルの液化を行うことができた。このことから、本発明のα−アミラーゼバリアントは濃厚なスラリーの液化に使用することができ、したがって、工場コストの効果的な削減が可能であることが示された。
【００８７】
次に、アミラーゼバリアントの耐酸性を測定するため、酵素の添加量を様々に変えて液化を行った。液化反応条件は前記と同様とし、ｐＨは５．０とし、酵素の添加量を０．０５ｋｇ／ｔＤＳ、０．１ｋｇ／ｔＤＳ、０．１５ｋｇ／ｔＤＳ、０．２ｋｇ／ｔＤＳ、０．２２ｋｇ／ｔＤＳ、０．２５ｋｇ／ｔＤＳまたは０．３ｋｇ／ｔＤＳとした。表３および図６に結果を示す。
【００８８】
【表３】
2019506186.tif 000005
【００８９】
表３に示したように、低いｐＨ条件下において０．１５〜０．３ｋｇ／ｔＤＳのα−アミラーゼバリアントを添加した場合であっても、α−アミラーゼバリアントを使用して正常レベルの液化を行うことができた。このことから、本発明のα−アミラーゼバリアントは低いｐＨに高い耐性を示すことが明らかとなった。また、０．１５ｋｇ／ｔＤＳという少量のα−アミラーゼバリアントを加えた条件でも、本発明のα−アミラーゼバリアントを使用して正常レベルの液化を行うことができたことから、工場において使用される酵素のコストを効果的に削減できることが示された。
【００９０】
さらに、α−アミラーゼバリアントの糖化作用を試験し、Liquozyme Supra（Novozymes社から購入）で液化した液化溶液と比較した。試験条件は、乾燥物（ＤＳ）３２％、十分な混合、塩酸でｐＨ４．３に調整するものとした。本発明のα−アミラーゼバリアントとグルコアミラーゼとを組み合わせた複合酵素０．４５ｋｇ／ｔＤＳを加え、反応量を２００ｍｌとして６０℃で２４時間および４８時間反応を行った。孔径０．２２μｍの膜で試料を濾過し、１００℃で失活させて、ＨＰＬＣ分析を行った。表４に結果を示す。
【００９１】
【表４】
2019506186.tif 000006
【００９２】
表４に示したように、α−アミラーゼバリアントによって得られた液化溶液と、Liquozyme Supraによって得られた液化溶液とを比較したところ、これらの酵素が同等の糖化作用を有することが示された。このことから、本発明のα−アミラーゼバリアントをデンプン糖産業に使用できることがわかった。
【００９３】
α−アミラーゼはアルコール産業においても重要な用途があることから、アルコールの製造における前記α−アミラーゼバリアントの液化作用を試験した。コーンフラワー（４０メッシュ）と水を１：２．５の比率で仕込み、塩酸でｐＨを５．８に調整し、０．１４５ｋｇ／ｔＤＳのα−アミラーゼバリアントを加えた。得られた溶液を９５℃で１２０分間かけて液化させた。反応終了後、試料のＤＥおよび粘度を測定した。これと同時に、Liquzoyme SC（Novozymesから入手可能）との比較試験も行った。結果を表５に示す。
【００９４】
【表５】
2019506186.tif 000007
【００９５】
表５に示したように、α−アミラーゼバリアントはLiquzoyme SCと同等の使用効果を発揮することができたことから、本発明のα−アミラーゼバリアントをコーンアルコール産業に使用できることが示された。
【００９６】
したがって、本発明における実験結果によれば、本発明の一連のα−アミラーゼバリアントは優れた耐熱性およびｐＨ耐性を示し、高濃度のデンプンスラリーを液化することができたことから、デンプン糖産業およびアルコール産業に適用することができると考えられる。
【００９７】
本発明の実施例は、本発明の教示や当技術分野の技術手段と不可分なものである。したがって、本発明は開示された特定の実施例に限定されず、添付の請求項に詳細に記載されているように、本発明の要旨および範囲内のさらなる変更も可能である。
【図１】
2019506186.tif 000008
【図２】
2019506186.tif 000009
【図３】
2019506186.tif 000010
【図４】
2019506186.tif 000011
【図５】
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【図６】
2019506186.tif 000013
【配列表】
2019506186000001.app
【国際調査報告】
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