(57)【要約】本開示は、化生（例えば、バレット食道）および／または新生物がん（例えば、食道がん）において差次的にメチル化されているゲノム遺伝子座（例えば、ビメンチンおよび／またはＳｑＢＥ１８）を同定するための方法を提供する。メチル化されたゲノム遺伝子座の同定には、例えば、疾患リスクを特徴付ける、治療に対する応答性を予測する、対象を非観血的に診断する、ならびに胃腸管化生および／または新生物を有すると判定された対象を処置することを含む、数多くの用途がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が食道新生物または化生を有するかどうかを診断する方法であって、
対象から試料を得るステップと、
前記試料から得たビメンチン核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって、前記ビメンチン核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中の前記シトシンの少なくとも８０％がメチル化されている場合、前記ビメンチン核酸配列またはその部分はメチル化リードとみなされる、ステップと、
前記試料中に存在するメチル化リードの数を測定するステップであって、
前記試料中の前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記試料由来の前記ビメンチン核酸配列が亜硫酸水素塩で処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記亜硫酸水素塩で変換された核酸配列の配列が次世代配列決定により判定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
メチル化シトシンのレベルが、前記対象から得られた前記ビメンチン核酸配列の増幅された部分において判定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
増幅プライマー間で前記増幅された部分が、天然の亜硫酸水素塩で処理されていないビメンチンゲノム配列に存在する１０のＣｐＧジヌクレオチドに対応するかまたはそれに由来する１０のジヌクレオチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ビメンチン核酸配列の前記部分を増幅するために使用される前記プライマーが配列番号１６２０９および１６２１０を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
増幅された部分が配列番号１６２０７および／または１６２０８のヌクレオチド配列を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料中の前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１．０５％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記試料中の前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも３％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料中の前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも５％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象が食道新生物または化生を有すると判定された場合、前記対象に寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
食道新生物または化生を有する対象を処置する方法であって、前記対象由来の試料において、ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１％は、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも８０％がメチル化されていることが先に判定されており、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップを含む方法。
【請求項１３】
前記治療剤が、プロトンポンプ阻害剤、ヒスタミンＨ２受容体遮断剤、逆流防止薬物、胃腸管の中を食物をもっと迅速に移動させる薬物、カルボプラチンおよびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））（放射線と組み合わせてもよい）；シスプラチンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（放射線と組み合わせることが多い）；ＥＣＦ：エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標））、シスプラチンおよび５−ＦＵ（特に、胃食道接合部腫瘍用に）；ＤＣＦ：ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、シスプラチン、および５−ＦＵ；カペシタビンと一緒のシスプラチン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））；オキサリプラチンおよび５−ＦＵまたはカペシタビン；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、ブレオマイシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、トポテカン、およびイリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、トラスツズマブ、ならびに／またはラムシルマブである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記外科手術が内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）、食道切除術、および／または逆流防止手術である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記１０のＣｐＧが、亜硫酸水素塩で処理された後に配列番号１６２１１および１６２１２に含まれるＣｐＧに対応する、請求項５に記載の方法。
【請求項１６】
対象が食道新生物または化生を有するかどうかを診断する方法であって、
擦過（例えば、細胞擦過）によって対象から試料を得るステップと、
前記試料から得たＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中の前記シトシンの少なくとも７０％または少なくとも７５％がメチル化されている場合、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分はメチル化リードとみなされる、ステップと、
前記試料中に存在するメチル化リードの数を測定するステップであって、
前記試料中の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも３％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定されるステップと
を含む方法。
【請求項１７】
前記試料由来の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列が亜硫酸水素塩で処理される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記亜硫酸水素塩で変換された核酸配列の配列が次世代配列決定により判定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
メチル化シトシンのレベルが、前記対象から得られた前記ＳｑＢＥ１８核酸配列の増幅された部分において判定される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記増幅された部分が、天然の亜硫酸水素塩で処理されていないＳｑＢＥ１８ゲノム配列に存在する２１のＣｐＧジヌクレオチドに対応するかまたはそれに由来する２１のジヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料中の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも３．１１％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が食道新生物または化生を有すると判定された場合、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップをさらに含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
食道新生物または化生を有する対象を処置する方法であって、前記対象由来の擦過（例えば、細胞擦過）試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも３％は、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも７０％または少なくとも７５％がメチル化されていることが先に判定されており、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップを含む方法。
【請求項２４】
前記治療剤が、プロトンポンプ阻害剤、ヒスタミンＨ２受容体遮断剤、逆流防止薬物、胃腸管の中を食物をもっと迅速に移動させる薬物、カルボプラチンおよびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））（放射線と組み合わせてもよい）；シスプラチンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（放射線と組み合わせることが多い）；ＥＣＦ：エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標））、シスプラチンおよび５−ＦＵ（特に、胃食道接合部腫瘍用に）；ＤＣＦ：ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、シスプラチン、および５−ＦＵ；カペシタビンと一緒のシスプラチン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））；オキサリプラチンおよび５−ＦＵまたはカペシタビン；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、ブレオマイシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、トポテカン、およびイリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、トラスツズマブ、ならびに／またはラムシルマブである、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記外科手術が内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）、食道切除術、および／または逆流防止手術である、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
対象が食道新生物または化生を有するかどうかを診断する方法であって、
バルーンによって対象から試料を得るステップと、
前記試料から得たＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中の前記シトシンの少なくとも７０％または少なくとも７５％がメチル化されている場合、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分はメチル化リードとみなされる、ステップと、
前記試料中に存在するメチル化リードの数を測定するステップであって、
前記試料中の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも０．１％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、ステップと
を含む方法。
【請求項２７】
前記試料由来の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列が亜硫酸水素塩で処理される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記亜硫酸水素塩で変換された核酸配列の配列が次世代配列決定により判定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
メチル化シトシンのレベルが、前記対象から得られた前記ＳｑＢＥ１８核酸配列の増幅された部分において判定される、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記増幅された部分が、天然の亜硫酸水素塩で処理されていないＳｑＢＥ１８ゲノム配列に存在する２１のＣｐＧジヌクレオチドに対応するかまたはそれに由来する２１のジヌクレオチドを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料中の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも０．７６％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料中の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも１％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が食道新生物または化生を有すると判定された場合、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップをさらに含む、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
食道新生物または化生を有する対象を処置する方法であって、前記対象由来のバルーン試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも１％は、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも７０％がメチル化されていることが先に判定されており、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップを含む方法。
【請求項３５】
前記治療剤が、プロトンポンプ阻害剤、ヒスタミンＨ２受容体遮断剤、逆流防止薬物、胃腸管の中を食物をもっと迅速に移動させる薬物、カルボプラチンおよびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））（放射線と組み合わせてもよい）；シスプラチンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（放射線と組み合わせることが多い）；ＥＣＦ：エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標））、シスプラチンおよび５−ＦＵ（特に、胃食道接合部腫瘍用に）；ＤＣＦ：ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、シスプラチン、および５−ＦＵ；カペシタビンと一緒のシスプラチン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））；オキサリプラチンおよび５−ＦＵまたはカペシタビン；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、ブレオマイシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、トポテカン、およびイリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、トラスツズマブ、ならびに／またはラムシルマブである、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記外科手術が内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）、食道切除術、および／または逆流防止手術である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３７】
対象が食道新生物または化生を有するかどうかを診断する方法であって、
擦過（例えば、細胞擦過）によって対象から試料を得るステップと、
前記試料から得たビメンチン核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって、前記ビメンチン核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中の前記シトシンの少なくとも８０％がメチル化されている場合、前記ビメンチン核酸配列またはその部分はビメンチンメチル化リードとみなされる、ステップと、
前記試料から得たＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中の前記シトシンの少なくとも７０％または７５％がメチル化されている場合、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分はＳｑＢＥ１８メチル化リードとみなされる、ステップと、
前記試料中に存在するメチル化リードの数を測定するステップであって、
前記試料中の前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１％がビメンチンメチル化リードである場合、および前記試料中の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも３％がＳｑＢＥ１８メチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、ステップと
を含む方法。
【請求項３８】
前記試料由来の前記ビメンチンおよびＳｑＢＥ１８核酸配列が亜硫酸水素塩で処理される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記亜硫酸水素塩で変換された核酸配列の配列が次世代配列決定により判定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
メチル化シトシンのレベルが、前記対象から得られた前記ビメンチン核酸配列の増幅された部分で、および前記ＳｑＢＥ１８核酸配列の増幅された部分で判定される、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＳｑＢＥ１８核酸配列の前記増幅された部分が、前記天然の亜硫酸水素塩で処理されていないＳｑＢＥ１８ゲノム配列に存在する２１のＣｐＧジヌクレオチドに対応するかまたはそれに由来する２１のジヌクレオチドを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ビメンチン核酸配列の前記増幅された部分が、前記天然の亜硫酸水素塩で処理されていないビメンチンゲノム配列に存在する１０のＣｐＧジヌクレオチドに対応するかまたはそれに由来する１０のジヌクレオチドを含む、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記試料中の前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１％がビメンチンメチル化リードである場合、前記試料中の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも３．１１％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象が食道新生物または化生を有すると判定された場合、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップをさらに含む、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
食道新生物または化生を有する対象を処置する方法であって、前記対象由来の擦過（例えば、細胞擦過）試料中のビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１％は、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも８０％がメチル化されていることが先に判定されており、前記対象由来の擦過（例えば、細胞擦過）試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも３％は、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも７５％がメチル化されていることが先に判定されており、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップを含む方法。
【請求項４６】
前記治療剤が、プロトンポンプ阻害剤、ヒスタミンＨ２受容体遮断剤、逆流防止薬物、胃腸管の中を食物をもっと迅速に移動させる薬物、カルボプラチンおよびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））（放射線と組み合わせてもよい）；シスプラチンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（放射線と組み合わせることが多い）；ＥＣＦ：エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標））、シスプラチンおよび５−ＦＵ（特に、胃食道接合部腫瘍用に）；ＤＣＦ：ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、シスプラチン、および５−ＦＵ；カペシタビンと一緒のシスプラチン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））；オキサリプラチンおよび５−ＦＵまたはカペシタビン；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、ブレオマイシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、トポテカン、およびイリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、トラスツズマブ、ならびに／またはラムシルマブである、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記外科手術が内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）、食道切除術、および／または逆流防止手術である、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４８】
対象が食道新生物または化生を有するかどうかを診断する方法であって、
バルーンによって対象から試料を得るステップと、
前記試料から得たビメンチン核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって、前記ビメンチン核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中の前記シトシンの少なくとも８０％がメチル化されている場合、前記ビメンチン核酸配列またはその部分はビメンチンメチル化リードとみなされる、ステップと、
前記試料から得たＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中の前記シトシンの少なくとも７０％または少なくとも７５％がメチル化されている場合、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分はＳｑＢＥ１８メチル化リードとみなされる、ステップと、
前記試料中に存在するメチル化リードの数を測定するステップであって、
前記試料中の前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも０．９５％がビメンチンメチル化リードである場合、および前記試料中の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも０．１％がＳｑＢＥ１８メチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、ステップと
を含む方法。
【請求項４９】
前記試料由来の前記ビメンチンおよびＳｑＢＥ１８核酸配列が亜硫酸水素塩で処理される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記亜硫酸水素塩で変換された核酸配列の配列が次世代配列決定により判定される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
メチル化シトシンのレベルが、前記対象から得られた前記ビメンチン核酸配列の増幅された部分で、および前記ＳｑＢＥ１８核酸配列の増幅された部分で判定される、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記増幅された部分が、天然の亜硫酸水素塩で処理されていないＳｑＢＥ１８ゲノム配列に存在する２１のＣｐＧジヌクレオチドに対応するかまたはそれに由来する２１のジヌクレオチドを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ビメンチン核酸配列の前記増幅された部分が、前記天然の亜硫酸水素塩で処理されていないビメンチンゲノム配列に存在する１０のＣｐＧジヌクレオチドに対応するかまたはそれに由来する１０のジヌクレオチドを含む、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記試料中の、前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１％、および前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも０．７６％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記試料中の、前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１％、および前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも１％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が食道新生物または化生を有すると判定された場合、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップをさらに含む、請求項４８〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
食道新生物または化生を有する対象を処置する方法であって、前記対象由来のバルーン試料において、ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも１％は、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも７０％または少なくとも７５％がメチル化されていることが先に判定されており、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップを含む方法。
【請求項５８】
前記治療剤が、プロトンポンプ阻害剤、ヒスタミンＨ２受容体遮断剤、逆流防止薬物、胃腸管の中を食物をもっと迅速に移動させる薬物、カルボプラチンおよびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））（放射線と組み合わせてもよい）；シスプラチンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（放射線と組み合わせることが多い）；ＥＣＦ：エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標））、シスプラチンおよび５−ＦＵ（特に、胃食道接合部腫瘍用に）；ＤＣＦ：ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、シスプラチン、および５−ＦＵ；カペシタビンと一緒のシスプラチン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））；オキサリプラチンおよび５−ＦＵまたはカペシタビン；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、ブレオマイシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、トポテカン、およびイリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、トラスツズマブ、ならびに／またはラムシルマブである、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記外科手術が内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）、食道切除術、および／または逆流防止手術である、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＳｑＢＥ１８核酸配列の前記部分を増幅させるために使用されるプライマーが配列番号８３８８および／または８４０２を含む、請求項１６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記増幅された部分が配列番号８３１８、８３６０、８３３２および／または８３７４のヌクレオチド配列を含む、請求項１６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記増幅された部分が配列番号８３３２および／または８３７４のヌクレオチド配列を含む、請求項１６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記対象が食道新生物または化生を有するという判定が追加の診断アッセイにより確かめられる、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記追加の診断アッセイが内視鏡アッセイである、請求項６３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年７月６日に出願された米国仮出願番号第６２／３５８，７０１号に基づく優先権を主張している。前述の出願の開示は、その全体が参考として本明細書によって援用される。
【０００２】
資金
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により与えられたＵＯ１ＣＡ１５２７５６；Ｕ５４ＣＡ１６３０６０；およびＰ５０ＣＡ１５０９６４の下での政府支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されており、その全体がこれにより参照により組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年７月５日に作成され、１８４８４９３＿０００２＿０９８＿ＷＯ１＿ＳＬ．ＴＸＴと名付けられており、サイズは１４，２４７，７３５バイトである。
【背景技術】
【０００４】
背景
２０１０年には１５，０００を超える食道がんの新たな症例が診断され、このがん単独によるほぼ同数の死者が出た。他のがんの場合と同様に、この率は、改良された診断法により減らすことが可能である。食道がんを検出する方法は存在するが、その方法は理想的なものではない。一般に、内視鏡検査、細胞の単離（例えば、液体試料からのもしくは組織試料からの細胞／組織の収集を介して）および／または撮像技術の組合せを使用して、がん性細胞および腫瘍を同定する。上部消化管内視鏡検査は、通常胃腸科医により実施され、食道のならびに胃および十二指腸の新生物を検出することが可能であるが、この検査は不快であり費用の掛かる手技である。バリウム食道造影検査などの他の検出手技も利用可能であるが、偽陽性、偽陰性、ならびに費用および不快感の問題を伴う。
【０００５】
食道新生物／がんを検出または処置するための既存の方法には不都合があるため、食道新生物／がん診断および治療のための新しい方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
開示の要旨
ある特定の態様では、本開示は、ＣｐＧジヌクレオチド内のシトシンが正常なヒト組織と比べて食道新生物では差次的にメチル化されている特定のヒトゲノムＤＮＡ領域（本明細書では情報価値のある遺伝子座またはパッチとも呼ばれる）の発見に一部基づいている。
【０００７】
本開示の第一の態様は、対象が食道新生物または化生を有するかどうかを診断する方法であって、対象から試料を得るステップと、前記試料から得たビメンチン核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって、前記ビメンチン核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中の前記シトシンの少なくとも８０％がメチル化されている場合、前記ビメンチン核酸配列またはその部分はメチル化リードとみなされる、ステップと、前記試料中に存在するメチル化リードの数を測定するステップであって、前記試料中の前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、ステップとを含む方法を提供する。
【０００８】
一部の実施形態では、前記試料由来の前記ビメンチン核酸配列が亜硫酸水素塩で処理される。必要に応じて、前記亜硫酸水素塩で変換された核酸配列の配列が次世代配列決定により判定される。一部の実施形態では、メチル化シトシンのレベルが、前記対象から得られた前記ビメンチン核酸配列の増幅された部分において判定される。必要に応じて、増幅プライマー間で、前記増幅された部分が、天然の亜硫酸水素塩で処理されていないビメンチンゲノム配列に存在する１０のＣｐＧジヌクレオチドに対応するかまたはそれに由来する１０のジヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記ビメンチン核酸配列の前記部分を増幅するために使用される前記プライマーが配列番号１６２０９および１６２１０を含む。必要に応じて、増幅された部分が配列番号１６２０７および／または１６２０８のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、１０のＣｐＧが、亜硫酸水素塩で処理した後、配列番号１６２１１および１６２１２に含まれるＣｐＧに対応する。
【０００９】
一部の実施形態では、前記試料中の前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１．０５％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される。必要に応じて、前記試料中の前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも３％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される。一部の実施形態では、前記試料中の前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも５％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される。
【００１０】
一部の実施形態では、前記対象が食道新生物または化生を有すると判定された場合、前記対象に寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施す。
【００１１】
本開示の第二の態様は、食道新生物または化生を有する対象を処置する方法であって、前記対象由来の試料において、ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１％は、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも８０％がメチル化されていることが先に判定されており、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップを含む方法を提供する。
【００１２】
一部の実施形態では、前記治療剤が、プロトンポンプ阻害剤、ヒスタミンＨ２受容体遮断剤、逆流防止薬物、胃腸管の中を食物をもっと迅速に移動させる薬物、カルボプラチンおよびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））（放射線と組み合わせてもよい）；シスプラチンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（放射線と組み合わせることが多い）；ＥＣＦ：エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標））、シスプラチンおよび５−ＦＵ（特に、胃食道接合部腫瘍用に）；ＤＣＦ：ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、シスプラチン、および５−ＦＵ；カペシタビンと一緒のシスプラチン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））；オキサリプラチンおよび５−ＦＵまたはカペシタビン；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、ブレオマイシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、トポテカン、およびイリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、トラスツズマブ、ならびに／またはラムシルマブである。必要に応じて、前記外科手術が内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）、食道切除術、および／または逆流防止手術である。
【００１３】
一部の実施形態では、本開示は、対象が食道新生物または化生を有するかどうかを診断する方法であって、擦過（例えば、細胞擦過）によって対象から試料を得るステップと、前記試料から得たＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中の前記シトシンの少なくとも７０％または少なくとも７５％がメチル化されている場合、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分はメチル化リードとみなされる、ステップと、前記試料中に存在するメチル化リードの数を測定するステップであって、前記試料中の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも３％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定されるステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、前記試料由来の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列が亜硫酸水素塩で処理される。一部の実施形態では、前記亜硫酸水素塩で変換された核酸配列の配列が次世代配列決定により判定される。一部の実施形態では、メチル化シトシンのレベルが、前記対象から得られた前記ＳｑＢＥ１８核酸配列の増幅された部分において判定される。一部の実施形態では、前記増幅された部分が、天然の亜硫酸水素塩で処理されていないＳｑＢＥ１８ゲノム配列に存在する２１のＣｐＧジヌクレオチドに対応するかまたはそれに由来する２１のジヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記試料中の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも３．１１％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される。一部の実施形態では、前記対象が食道新生物または化生を有すると判定された場合、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップをさらに含む。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示は、食道新生物または化生を有する対象を処置する方法であって、前記対象由来の擦過（例えば、細胞擦過）試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも３％は、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも７０％または少なくとも７５％がメチル化されていることが先に判定されており、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、前記治療剤が、プロトンポンプ阻害剤、ヒスタミンＨ２受容体遮断剤、逆流防止薬物、胃腸管の中を食物をもっと迅速に移動させる薬物、カルボプラチンおよびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））（放射線と組み合わせてもよい）；シスプラチンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（放射線と組み合わせることが多い）；ＥＣＦ：エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標））、シスプラチンおよび５−ＦＵ（特に、胃食道接合部腫瘍用に）；ＤＣＦ：ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、シスプラチン、および５−ＦＵ；カペシタビンと一緒のシスプラチン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））；オキサリプラチンおよび５−ＦＵまたはカペシタビン；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、ブレオマイシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、トポテカン、およびイリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、トラスツズマブ、ならびに／またはラムシルマブである。一部の実施形態では、前記外科手術が内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）、食道切除術、および／または逆流防止手術である。一部の実施形態では、本開示は、対象が食道新生物または化生を有するかどうかを診断する方法であって、バルーンによって対象から試料を得るステップと、前記試料から得たＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中の前記シトシンの少なくとも７０％または少なくとも７５％がメチル化されている場合、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分はメチル化リードとみなされる、ステップと、前記試料中に存在するメチル化リードの数を測定するステップであって、前記試料中の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも０．１％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、ステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、前記試料由来の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列が亜硫酸水素塩で処理される。一部の実施形態では、前記亜硫酸水素塩で変換された核酸配列の配列が次世代配列決定により判定される。一部の実施形態では、メチル化シトシンのレベルが、前記対象から得られた前記ＳｑＢＥ１８核酸配列の増幅された部分において判定される。一部の実施形態では、前記増幅された部分が、天然の亜硫酸水素塩で処理されていないＳｑＢＥ１８ゲノム配列に存在する２１のＣｐＧジヌクレオチドに対応するかまたはそれに由来する２１のジヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記試料中の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも０．７６％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される。一部の実施形態では、前記試料中の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも１％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される。一部の実施形態では、前記対象が食道新生物または化生を有すると判定された場合、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップをさらに含む。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示は、食道新生物または化生を有する対象を処置する方法であって、前記対象由来のバルーン試料において、ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも１％は、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも７０％がメチル化されていることが先に判定されており、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、前記治療剤が、プロトンポンプ阻害剤、ヒスタミンＨ２受容体遮断剤、逆流防止薬物、胃腸管の中を食物をもっと迅速に移動させる薬物、カルボプラチンおよびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））（放射線と組み合わせてもよい）；シスプラチンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（放射線と組み合わせることが多い）；ＥＣＦ：エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標））、シスプラチンおよび５−ＦＵ（特に、胃食道接合部腫瘍用に）；ＤＣＦ：ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、シスプラチン、および５−ＦＵ；カペシタビンと一緒のシスプラチン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））；オキサリプラチンおよび５−ＦＵまたはカペシタビン；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、ブレオマイシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、トポテカン、およびイリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、トラスツズマブ、ならびに／またはラムシルマブである。一部の実施形態では、前記外科手術が内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）、食道切除術、および／または逆流防止手術である。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は、対象が食道新生物または化生を有するかどうかを診断する方法であって、擦過（例えば、細胞擦過）によって対象から試料を得るステップと、前記試料から得たビメンチン核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって、前記ビメンチン核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中の前記シトシンの少なくとも８０％がメチル化されている場合、前記ビメンチン核酸配列またはその部分はビメンチンメチル化リードとみなされる、ステップと、前記試料から得たＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中の前記シトシンの少なくとも７０％または７５％がメチル化されている場合、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分はＳｑＢＥ１８メチル化リードとみなされる、ステップと、前記試料中に存在するメチル化リードの数を測定するステップであって、前記試料中の前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１％がビメンチンメチル化リードである場合、および前記試料中の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも３％がＳｑＢＥ１８メチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、ステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、前記試料由来の前記ビメンチンおよびＳｑＢＥ１８核酸配列が亜硫酸水素塩で処理される。一部の実施形態では、前記亜硫酸水素塩で変換された核酸配列の配列が次世代配列決定により判定される。一部の実施形態では、メチル化シトシンのレベルが、前記対象から得られた前記ビメンチン核酸配列の増幅された部分で、および前記ＳｑＢＥ１８核酸配列の増幅された部分で判定される。一部の実施形態では、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列の前記増幅された部分が、天然の亜硫酸水素塩で処理されていないＳｑＢＥ１８ゲノム配列に存在する２１のＣｐＧジヌクレオチドに対応するかまたはそれに由来する２１のジヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記ビメンチン核酸配列の前記増幅された部分が、前記天然の亜硫酸水素塩で処理されていないビメンチンゲノム配列に存在する１０のＣｐＧジヌクレオチドに対応するかまたはそれに由来する１０のジヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記試料中の、前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１％がビメンチンメチル化リードである場合であって、ここで前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも３．１１％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される。一部の実施形態では、前記対象が食道新生物または化生を有すると判定された場合、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップをさらに含む。
【００１７】
一部の実施形態では、本開示は、食道新生物または化生を有する対象を処置する方法であって、前記対象由来の擦過（例えば、細胞擦過）試料中のビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１％は、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも８０％がメチル化されていることが先に判定されており、前記対象由来の擦過（例えば、細胞擦過）試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも３％は、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも７５％がメチル化されていることが先に判定されており、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、前記治療剤が、プロトンポンプ阻害剤、ヒスタミンＨ２受容体遮断剤、逆流防止薬物、胃腸管の中を食物をもっと迅速に移動させる薬物、カルボプラチンおよびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））（放射線と組み合わせてもよい）；シスプラチンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（放射線と組み合わせることが多い）；ＥＣＦ：エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標））、シスプラチンおよび５−ＦＵ（特に、胃食道接合部腫瘍用に）；ＤＣＦ：ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、シスプラチン、および５−ＦＵ；カペシタビンと一緒のシスプラチン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））；オキサリプラチンおよび５−ＦＵまたはカペシタビン；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、ブレオマイシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、トポテカン、およびイリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、トラスツズマブ、ならびに／またはラムシルマブである。一部の実施形態では、前記外科手術が内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）、食道切除術、および／または逆流防止手術である。一部の実施形態では、対象が食道新生物または化生を有するかどうかを診断する方法であって、バルーンによって対象から試料を得るステップと、前記試料から得たビメンチン核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって、前記ビメンチン核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中の前記シトシンの少なくとも８０％がメチル化されている場合、前記ビメンチン核酸配列またはその部分はビメンチンメチル化リードとみなされる、ステップと、前記試料から得たＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分におけるＣｐＧジヌクレオチド中の前記シトシンの少なくとも７０％または少なくとも７５％がメチル化されている場合、前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分はＳｑＢＥ１８メチル化リードとみなされる、ステップと、前記試料中に存在するメチル化リードの数を測定するステップであって、前記試料中の前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも０．９５％がビメンチンメチル化リードである場合、および前記試料中の前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも０．１％がＳｑＢＥ１８メチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される、ステップとを含む方法。一部の実施形態では、前記試料由来の前記ビメンチンおよびＳｑＢＥ１８核酸配列が亜硫酸水素塩で処理される。一部の実施形態では、前記亜硫酸水素塩で変換された核酸配列の配列が次世代配列決定により判定される。一部の実施形態では、メチル化シトシンのレベルが、前記対象から得られた前記ビメンチン核酸配列の増幅された部分で、および前記ＳｑＢＥ１８核酸配列の増幅された部分で判定される。一部の実施形態では、前記増幅された部分が、天然の亜硫酸水素塩で処理されていないＳｑＢＥ１８ゲノム配列に存在する２１のＣｐＧジヌクレオチドに対応するかまたはそれに由来する２１のジヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記ビメンチン核酸配列の前記増幅された部分が、前記天然の亜硫酸水素塩で処理されていないビメンチンゲノム配列に存在する１０のＣｐＧジヌクレオチドに対応するかまたはそれに由来する１０のジヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、前記試料中の、前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１％、および前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも０．７６％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される。一部の実施形態では、前記試料中の、前記ビメンチン核酸配列またはその部分の少なくとも１％、および前記ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも１％がメチル化リードである場合、前記対象は食道新生物または化生を有すると判定される。一部の実施形態では、前記対象が食道新生物または化生を有すると判定された場合、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップをさらに含む。
【００１８】
一部の実施形態では、本開示は、食道新生物または化生を有する対象を処置する方法であって、前記対象由来のバルーン試料において、ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその部分の少なくとも１％は、ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも７０％または少なくとも７５％がメチル化されていることが先に判定されており、前記対象に、寒冷療法、光線力学的療法（ＰＤＴ）；ラジオ波焼灼療法（ＲＦＡ）；レーザー焼灼術；アルゴンプラズマ凝固法（ＡＰＣ）；電気凝固法（高周波電気療法）；食道ステント、外科手術、および／または治療剤を施すステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、前記治療剤が、プロトンポンプ阻害剤、ヒスタミンＨ２受容体遮断剤、逆流防止薬物、胃腸管の中を食物をもっと迅速に移動させる薬物、カルボプラチンおよびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））（放射線と組み合わせてもよい）；シスプラチンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（放射線と組み合わせることが多い）；ＥＣＦ：エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標））、シスプラチンおよび５−ＦＵ（特に、胃食道接合部腫瘍用に）；ＤＣＦ：ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、シスプラチン、および５−ＦＵ；カペシタビンと一緒のシスプラチン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））；オキサリプラチンおよび５−ＦＵまたはカペシタビン；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、ブレオマイシン、マイトマイシン、メトトレキサート、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、トポテカン、およびイリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、トラスツズマブ、ならびに／またはラムシルマブである。一部の実施形態では、前記外科手術が内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）、食道切除術、および／または逆流防止手術である。
【００１９】
一部の実施形態では、本明細書中に開示される方法のいずれかにおいて前記ＳｑＢｅ１８核酸配列の前記部分を増幅させるために使用されるプライマーが配列番号８３８８および／または８４０２を含む。一部の実施形態では、前記増幅された部分が配列番号８３１８、８３６０、８３３２および／または８３７４のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、前記増幅された部分が配列番号８３３２および／または８３７４のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、前記対象が食道新生物または化生を有するという判定が追加の診断アッセイにより確かめられる。一部の実施形態では、前記追加の診断アッセイが内視鏡アッセイである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｄは、正常な外観のＧＥ接合部のまたは内視鏡で可視化したＢＥまたはＥＡＣの食道細胞擦過物におけるメチル化ビメンチン（ＶＩＭ）およびＳｑＢＥ１８測定の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。図１Ａは、６１例の対照および１０８症例のトレーニングセットにおけるＳｑＢＥ１８のための次世代亜硫酸水素塩配列決定アッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。図１Ｂは、５９例の対照および１０７症例のトレーニングセットにおける次世代亜硫酸水素塩配列決定ＶＩＭアッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。図１Ｃは、２８例の対照および１１５症例の検証セットにおけるＳｑＢＥ１８のための次世代亜硫酸水素塩配列決定アッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。図１Ｄは、２７例の対照および１１７症例の検証セットにおける次世代亜硫酸水素塩配列決定ＶＩＭアッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。曲線下面積（ＡＵＣ）、ならびに最適なカットポイントでのアッセイの感度および特異性を、図１Ａ〜１Ｄの各々のために掲載する。トレーニングおよび検証セットにおける各マーカーのための症例および対照の数は、各マーカーのために８０を超える読み取り数の深度で配列決定した試料数を反映する。（中央リード深度はＳｑＢＥ１８では３，８０９であり、ＶＩＭでは１０，０２１であった）。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｄは、正常な外観のＧＥ接合部のまたは内視鏡で可視化したＢＥまたはＥＡＣの食道細胞擦過物におけるメチル化ビメンチン（ＶＩＭ）およびＳｑＢＥ１８測定の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。図１Ａは、６１例の対照および１０８症例のトレーニングセットにおけるＳｑＢＥ１８のための次世代亜硫酸水素塩配列決定アッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。図１Ｂは、５９例の対照および１０７症例のトレーニングセットにおける次世代亜硫酸水素塩配列決定ＶＩＭアッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。図１Ｃは、２８例の対照および１１５症例の検証セットにおけるＳｑＢＥ１８のための次世代亜硫酸水素塩配列決定アッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。図１Ｄは、２７例の対照および１１７症例の検証セットにおける次世代亜硫酸水素塩配列決定ＶＩＭアッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。曲線下面積（ＡＵＣ）、ならびに最適なカットポイントでのアッセイの感度および特異性を、図１Ａ〜１Ｄの各々のために掲載する。トレーニングおよび検証セットにおける各マーカーのための症例および対照の数は、各マーカーのために８０を超える読み取り数の深度で配列決定した試料数を反映する。（中央リード深度はＳｑＢＥ１８では３，８０９であり、ＶＩＭでは１０，０２１であった）。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｄは、正常な外観のＧＥ接合部のまたは内視鏡で可視化したＢＥまたはＥＡＣの食道細胞擦過物におけるメチル化ビメンチン（ＶＩＭ）およびＳｑＢＥ１８測定の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。図１Ａは、６１例の対照および１０８症例のトレーニングセットにおけるＳｑＢＥ１８のための次世代亜硫酸水素塩配列決定アッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。図１Ｂは、５９例の対照および１０７症例のトレーニングセットにおける次世代亜硫酸水素塩配列決定ＶＩＭアッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。図１Ｃは、２８例の対照および１１５症例の検証セットにおけるＳｑＢＥ１８のための次世代亜硫酸水素塩配列決定アッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。図１Ｄは、２７例の対照および１１７症例の検証セットにおける次世代亜硫酸水素塩配列決定ＶＩＭアッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。曲線下面積（ＡＵＣ）、ならびに最適なカットポイントでのアッセイの感度および特異性を、図１Ａ〜１Ｄの各々のために掲載する。トレーニングおよび検証セットにおける各マーカーのための症例および対照の数は、各マーカーのために８０を超える読み取り数の深度で配列決定した試料数を反映する。（中央リード深度はＳｑＢＥ１８では３，８０９であり、ＶＩＭでは１０，０２１であった）。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｄは、正常な外観のＧＥ接合部のまたは内視鏡で可視化したＢＥまたはＥＡＣの食道細胞擦過物におけるメチル化ビメンチン（ＶＩＭ）およびＳｑＢＥ１８測定の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。図１Ａは、６１例の対照および１０８症例のトレーニングセットにおけるＳｑＢＥ１８のための次世代亜硫酸水素塩配列決定アッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。図１Ｂは、５９例の対照および１０７症例のトレーニングセットにおける次世代亜硫酸水素塩配列決定ＶＩＭアッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。図１Ｃは、２８例の対照および１１５症例の検証セットにおけるＳｑＢＥ１８のための次世代亜硫酸水素塩配列決定アッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。図１Ｄは、２７例の対照および１１７症例の検証セットにおける次世代亜硫酸水素塩配列決定ＶＩＭアッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。曲線下面積（ＡＵＣ）、ならびに最適なカットポイントでのアッセイの感度および特異性を、図１Ａ〜１Ｄの各々のために掲載する。トレーニングおよび検証セットにおける各マーカーのための症例および対照の数は、各マーカーのために８０を超える読み取り数の深度で配列決定した試料数を反映する。（中央リード深度はＳｑＢＥ１８では３，８０９であり、ＶＩＭでは１０，０２１であった）。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、パーセントメチル化のためにＲＯＣカットオフを使用した、陽性のための異なる数のＣｐＧカットオフでのＶＩＭおよびＳｑＢＥ１８の成績を示す。図２Ａは、ＶＩＭの感度および特異性の曲線を示す。８＋ＣｐＧカットオフ（青色ボックス）は、対照のための特異性および症例のための感度の合計を最大にする。図２Ｂは、ＳｑＢＥ１８の感度および特異性の曲線を示す。１５＋、１６＋および１７＋ＣｐＧカットオフは、ＳｑＢＥ１８に対して同一の最大の感度＋特異性の合計を提供する。１６＋ＣｐＧ（青色ボックス）は、この範囲の中央として選択された。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、パーセントメチル化のためにＲＯＣカットオフを使用した、陽性のための異なる数のＣｐＧカットオフでのＶＩＭおよびＳｑＢＥ１８の成績を示す。図２Ａは、ＶＩＭの感度および特異性の曲線を示す。８＋ＣｐＧカットオフ（青色ボックス）は、対照のための特異性および症例のための感度の合計を最大にする。図２Ｂは、ＳｑＢＥ１８の感度および特異性の曲線を示す。１５＋、１６＋および１７＋ＣｐＧカットオフは、ＳｑＢＥ１８に対して同一の最大の感度＋特異性の合計を提供する。１６＋ＣｐＧ（青色ボックス）は、この範囲の中央として選択された。
【図３】図３は、擦過物のトレーニングセットにおけるＶＩＭおよびＳｑＢＥ１８の成績を示す表である。胃食道接合部（ＧＥＪ）の特異度対照＝無影響の対照（ＧＥＲＤ、びらん性食道炎（ＥＥ）の個体、または内視鏡検査の間に病状が検出されなかった個体（「他」））；ＳＳＢＥ＝短セグメントのバレット食道（１〜３ｃｍ））；ＬＳＢＥ＝バレット食道（３ｃｍまたはそれよりも長い）；ＬＧＤ＝軽度の形成異常のバレット食道；ＨＧＤ＝重度の形成異常のバレット食道；がん＝ＥＡＣ（食道腺癌）およびＪＣＡ（食道接合部がん）を含む。
【図４】図４は、擦過物の検証セットにおけるＶＩＭおよびＳｑＢＥ１８の成績を示す表である。胃食道接合部（ＧＥＪ）の特異性対照＝無影響の対照（ＧＥＲＤ、びらん性食道炎（ＥＥ）の個体、または内視鏡検査の間に病状が検出されなかった個体（「他」））；ＳＳＢＥ＝短セグメントのバレット食道（１〜３ｃｍ））；ＬＳＢＥ＝バレット食道（３ｃｍまたはそれよりも長い）；ＬＧＤ＝軽度の形成異常のバレット食道；ＨＧＤ＝重度の形成異常のバレット食道；がん＝ＥＡＣ（食道腺癌）およびＪＣＡ（食道接合部がん）を含む。
【図５】図５は、擦過物の組合せセットにおけるＶＩＭおよびＳｑＢＥ１８の成績を示す表である。この表は、擦過物のトレーニングおよび検証セットの組合せからの全ての試料を含む。胃食道接合部（ＧＥＪ）の特異性対照＝無影響の対照（ＧＥＲＤ、びらん性食道炎（ＥＥ）の個体、または内視鏡検査の間に病状が検出されなかった個体（「他」））；ＳＳＢＥ＝短セグメントのバレット食道（１〜３ｃｍ））；ＬＳＢＥ＝バレット食道（３ｃｍまたはそれよりも長い）；ＬＧＤ＝軽度の形成異常のバレット食道；ＨＧＤ＝重度の形成異常のバレット食道；がん＝ＥＡＣ（食道腺癌）およびＪＣＡ（食道接合部がん）を含む。
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、遠位食道の食道バルーンサンプリングでアッセイしたメチル化ＶＩＭの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。図６Ａは、３８例の対照および５０症例のトレーニングセットにおけるＶＩＭのための次世代亜硫酸水素塩配列決定アッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。図６Ｂは、３８例の対照および５０症例のトレーニングセットにおける次世代亜硫酸水素塩配列決定ＳｑＢＥ１８アッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。曲線下面積（ＡＵＣ）、ならびに最適なカットポイントでのアッセイの感度および特異性を、各グラフのために掲載する。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、遠位食道の食道バルーンサンプリングでアッセイしたメチル化ＶＩＭの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。図６Ａは、３８例の対照および５０症例のトレーニングセットにおけるＶＩＭのための次世代亜硫酸水素塩配列決定アッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。図６Ｂは、３８例の対照および５０症例のトレーニングセットにおける次世代亜硫酸水素塩配列決定ＳｑＢＥ１８アッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。曲線下面積（ＡＵＣ）、ならびに最適なカットポイントでのアッセイの感度および特異性を、各グラフのために掲載する。
【図７】図７は、食道バルーン試料におけるＶＩＭおよびＳｑＢＥ１８の成績を示す表である。胃食道接合部（ＧＥＪ）の特異性対照＝無影響の対照（ＧＥＲＤ、びらん性食道炎（ＥＥ）の個体、または内視鏡検査の間に病状が検出されなかった個体（「他」））；ＳＳＢＥ＝短セグメントのバレット食道（１〜３ｃｍ））；ＬＳＢＥ＝バレット食道（３ｃｍまたはそれよりも長い）；ＬＧＤ＝軽度の形成異常のバレット食道；ＨＧＤ＝重度の形成異常のバレット食道；がん＝ＥＡＣ（食道腺癌）およびＪＣＡ（食道接合部がん）を含む。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
便宜上、明細書、実施例、および添付されている特許請求の範囲で用いられるある特定の用語がここに集められている。他に定義されていなければ、本明細書で使用される専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２２】
本明細書に記載されている方法および材料に類似するかまたは等価である方法および材料を本発明の実行または試験において使用することが可能であるが、適切な方法および材料は下に記載されている。材料、方法および実施例は説明的なものにすぎず、限定的であることを意図していない。本明細書で言及される公報、特許および他の文書はすべて参照によりその全体が組み込まれる。
【００２３】
本明細書に記載されている本発明のそれぞれの実施形態は、単独でとってもよく、本発明の１つまたは複数の他の実施形態と組み合わせてとってもよい。
【００２４】
本明細書全体を通じて、単語「含む（comprise）」または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」などの変形は、述べられている整数または整数の群を含むが、他のいかなる整数または整数の群も排除しないことを意味すると理解される。
【００２５】
冠詞「１つの（a）」および「１つの（an）」は、本明細書では、冠詞の文法的目的語の１つまたは１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「１つの要素（an  element）」とは１つの要素または１つよりも多い要素を意味する。
【００２６】
用語「アデノーマ」は、本明細書では、上皮組織の任意の前がん性新生物または良性腫瘍、例えば、胃腸管、膵臓、および／または膀胱の前がん性新生物を記述するために使用される。
【００２７】
本明細書の用語「血液由来画分」とは、全血の成分（単数または複数）を指す。全血は液体部分（すなわち、血漿）および固体部分（すなわち、血液細胞）を含む。血液の液体および固体部分はそれぞれ複数の成分、例えば、血漿中の異なるタンパク質または固体部分中の異なる細胞型で構成されている。これらの成分の１つまたはこれらの成分のいずれかの混合物は、そのような画分が全血で見出される１つまたは複数の成分を失っている限り、血液由来画分である。
【００２８】
用語「食道」は、口腔の背部から、縦隔の後部を下に通過して横隔膜を通って胃にまでまたがる消化器系の上部を包含することが意図されている。
【００２９】
用語「食道がん」は、本明細書では、食道の任意のがん性新生物を指すために使用される。
【００３０】
本明細書で使用される「バレット食道」とは、食道の下部の細胞の異常な変化（化生）を指す。バレットは食道での腸上皮化生の所見により特徴付けられる。
【００３１】
食道の「擦過物」は、本明細書で言及されるように、当技術分野で公知のあらゆる手段を使用して得ることができる。一部の実施形態では、擦過物は、食道を、ブラシ、細胞ブラシ、スポンジ、バルーン、または食道と接触して食道試料を得るあらゆるその他のデバイスもしくは物質と接触させることにより得られる。
【００３２】
「細胞」、「宿主細胞」または「組換え宿主細胞」は、本明細書では互換的に使用される用語である。このような用語は、特定の対象細胞に加えて、そのような細胞の後代または生じ得る後代も指すと理解される。突然変異または環境の影響のためにある特定の改変が次の世代で起こることがあるので、そのような後代は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、それでも本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
【００３３】
用語「化合物」、「試験化合物」、「薬剤」、および「分子」は、本明細書では互換的に使用され、ペプチド、核酸、炭水化物、小有機分子、天然産物抽出ライブラリー、および任意の他の分子（化学物質、金属、および有機金属化合物を含むがこれらに限定されない）を含むがこれらに限定されないことが意図されている。
【００３４】
本明細書の用語「化合物変換ＤＮＡ」は、ＤＮＡ中の非メチル化Ｃ塩基を異なるヌクレオチド塩基に変換する化学化合物で処理されているまたはこれと反応させているＤＮＡを指す。例えば、１つのそのような化合物は亜硫酸水素ナトリウムであり、これは非メチル化ＣをＵに変換する。変換感受性シトシンを含有するＤＮＡが亜硫酸水素ナトリウムで処理される場合、化合物変換ＤＮＡはＣに代わってＵを含有することになる。亜硫酸水素ナトリウムで処理されるＤＮＡがメチルシトシンのみを含有する場合、化合物変換ＤＮＡはメチルシトシンに代わってウラシルを含有することはない。
【００３５】
本明細書で使用される用語「脱メチル化剤」とは、薬剤で処理するとメチル化により発現停止されていた標的遺伝子の活性および／または遺伝子発現を回復させる薬剤を指す。そのような薬剤の例は、５−アザシチジンおよび５−アザ−２’−デオキシシチジンを限定せずに含む。
【００３６】
用語「検出」は、本明細書では、生体試料中のマーカー、またはマーカーの変化（例えば、マーカーのメチル化状態の変化などの）を観察する任意のプロセスを指すために使用され、マーカーまたはマーカーの変化が実際に検出されるかどうかは関係がない。言い換えると、たとえマーカーが存在しないまたは感度のレベルより下であると判定されようとも、マーカーまたはマーカーの変化について試料を探索する行為が「検出」である。検出は定量的、半定量的または非定量的観察でもよい。
【００３７】
用語「差次的にメチル化されたヌクレオチド配列」とは、がん組織または細胞株ではメチル化されているが正常組織または細胞株ではメチル化されていないことが分かっているゲノム遺伝子座の領域を指す。
【００３８】
本明細書で使用される用語「新生物」とは、組織の異常な成長を指す。本明細書で使用される場合、用語「新生物」はがん性および非がん性腫瘍、ならびにバレット食道（本明細書では化生と呼ばれる場合もある）および異形成のあるバレット食道を指すために使用してもよい。一部の実施形態では、異形成のあるバレット食道は高悪性度の異形成のあるバレット食道である。一部の実施形態では、異形成のあるバレット食道は低悪性度の異形成のあるバレット食道である。一部の実施形態では、新生物はがん（例えば、食道腺癌）である。
【００３９】
「胃腸新生物」とは、上部および下部胃腸管の新生物を指す。当技術分野で一般に理解されるように、上部胃腸管は食道、胃、および十二指腸を含み、下部胃腸管は小腸の残りの部分および大腸のすべてを含む。
【００４０】
用語「健康な」、「正常な」、および「非新生物の」は、本明細書では互換的に使用されて、新生物などの疾患状態を欠く（少なくとも検出限界まで）対象または特定の細胞もしくは組織を指す。
【００４１】
「相同性」または「同一性」または「類似性」とは、２つのペプチド間のまたは２つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性および同一性はそれぞれ、比較を目的に整列させてもよいそれぞれの配列での位置を比較することにより判定することが可能である。比較される配列中の等価の位置が同じ塩基またはアミノ酸により占められている場合、分子はその位置で同一であり、等価な部位が同じまたは類似するアミノ酸残基（例えば、立体的および／または電子的性質が類似している）により占められる場合、分子はその位置で相同である（類似している）と呼ぶことが可能である。相同性／類似性または同一性の百分率としての表現とは、比較される配列により共有される位置での同一のまたは類似するアミノ酸の数の関数を指す。「関係のない」または「非相同性」である配列は、一部の実施形態では、本発明の配列と４０％未満の同一性、特定の実施形態では、２５％未満の同一性を共有する。２つの配列を比較する際に、残基（アミノ酸または核酸）が存在しないことまたは余分な残基が存在することも同一性および相同性／類似性を減らす。
【００４２】
用語「相同性」は、類似する機能またはモチーフを有する遺伝子またはタンパク質を同定するために使用される配列類似性の数学的基礎の比較を記述する。本発明の核酸およびタンパク質配列は、公表されているデータベースに対して検索を実施して、例えば、他のファミリーのメンバー、関連する配列または相同体を同定するための「クエリー配列」として使用してもよい。そのような検索は、Altschulら、（１９９０年）J  Mol.  Biol.２１５巻：４０３〜１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することが可能である。本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施することが可能である。本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施することが可能である。比較目的でギャップドアライメントを得るため、Altschulら、（１９９７年）Nucleic  Acids  Res.２５巻（１７号）：３３８９〜３４０２頁に記載される通りにギャップドＢＬＡＳＴを利用することが可能である。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することが可能である。www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照されたい。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「同一性」は、配列マッチングを最大にするように、すなわち、ギャップおよび挿入を考慮に入れて配列を整列させた場合、２つまたはそれよりも多い配列において対応する位置での同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の百分率を意味する。同一性は、（Computational  Molecular  Biology、Lesk,  A.  M.編、Oxford  University  Press、New  York、１９８８年；Biocomputing:  Informatics  and  Genome  Projects、Smith,  D.  W.編、Academic  Press、New  York、１９９３年；Computer  Analysis  of  Sequence  Data、第Ｉ部、Griffin,  A.  M.、およびGriffin,  H.  G.編、Humana  Press、New  Jersey、１９９４年；Sequence  Analysis  in  Molecular  Biology、von  Heinje,  G.、Academic  Press、１９８７年；ならびにSequence  Analysis  Primer、Gribskov,  M.およびDevereux,  J.編、M  Stockton  Press、New  York、１９９１年；ならびにCarillo,  H.、およびLipman,  D.、SIAM  J.  Applied  Math.、４８巻：１０７３頁、１９８８年）に記載される方法を含むがこれらに限定されない公知の方法により容易に計算することが可能である。同一性を判定する方法は、試験されている配列間に最大の合致を与えるように設計されている。さらに、同一性を判定する方法は、公に利用可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性を判定するコンピュータプログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux,  J.ら、Nucleic  Acids  Research  １２巻（１号）：３８７頁（１９８４年））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Altschul,  S.  F.ら、J.  Molec.  Biol.  ２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）およびAltschulら、Nuc.  Acids  Res.２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９９７年））を含むがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴ  ＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の出典から公に利用可能である（BLAST  Manual、Altschul,  S.ら、NCBI  NLM  NIH  Bethesda、Md.２０８９４；Altschul,  S.ら、J.  Mol.  Biol.  ２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年））。周知のスミスウォターマンアルゴリズムを使用して同一性を判定してもよい。
【００４４】
用語「含む（including）」は、語句「含むが限定されない」を意味するように本明細書では使用され、この語句と互換的に使用される。
【００４５】
ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に関して本明細書で使用される用語「単離された」とは、天然には存在しない形態の分子を指す。さらに、「単離された核酸」は、断片として天然には存在しておらず、天然の状態で見出されないと予想される核酸断片を含むことが意図されている。
【００４６】
本明細書の用語「メチル化特異的ＰＣＲ」（「ＭＳＰ」）とは、化合物変換鋳型配列の増幅が実施されるポリメラーゼ連鎖反応を指す。２セットのプライマーがＭＳＰにおいて使用するために設計される。それぞれのセットのプライマーはフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む。１セットのプライマーは、メチル化特異的プライマーと呼ばれ（下参照）、ＤＮＡ内のＣｐＧジヌクレオチドのＣ塩基がメチル化されていれば化合物変換鋳型配列を増幅させることになる。別のセットのプライマーは、非メチル化特異的プライマーまたは非メチル化配列のためのプライマーなどと呼ばれ（下参照）、ＤＮＡ内のＣｐＧジヌクレオチドのＣ塩基がメチル化されていなければ化合物変換鋳型配列を増幅させることになる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および、必要に応じて、リボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを指す。この用語は、等価物として、ヌクレオチドアナログから作られるＲＮＡまたはＤＮＡのアナログ、ならびに記載されている実施形態に適用可能である場合は、一本鎖（センスまたはアンチセンスなどの）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むとも理解されるべきである。
【００４８】
２つのＤＮＡ領域間の関係を記述する場合の「作動可能に連結している」とは、２つのＤＮＡ領域が互いに機能的に関係していることを意味するだけである。例えば、プロモーターまたは他の転写調節配列は、それがコード配列の転写を制御している場合にはコード配列に作動可能に連結している。
【００４９】
用語「または」は、本明細書では、文脈が他の方法で明白に示していなければ、用語「および／または」を意味するように使用され、この用語と互換的に使用される。
【００５０】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用される。
【００５１】
「試料」は、分子マーカーもしくは、例えば、メチル化状態などの分子マーカーの変化の検出のために得たもしくは調製した任意の材料、または分子マーカーもしくは分子マーカーの変化の検出を目的に検出試薬もしくは検出デバイスと接触させる任意の材料を含む。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「試料を得ること」は、アッセイを受ける対象から試料を直接回収すること、または保存され後になってアッセイを受ける対象から試料を直接回収することを含む。代わりに、試料は第２当事者を介して得てもよい。すなわち、試料は、その試料を回収した、または他の方法でその試料を得た別の個人から、例えば、発送を介して得てもよい。
【００５３】
「対象」とは、目的の任意の生物、一般的には、マウスなどの哺乳動物対象、特定の実施形態では、ヒト対象である。
【００５４】
本明細書で使用される場合、用語「特異的にハイブリダイズする」とは、一部の実施形態では、本発明の核酸プローブ／プライマーが、標的遺伝子以外の細胞内核酸（例えば、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡ）への１５％未満、１０％未満、または５％未満のバックグランドハイブリダイゼーションを有するように、標的配列の少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０もしくは１００連続するヌクレオチド、またはそれと相補的な配列、またはその天然に存在する突然変異体にハイブリダイズする能力を指す。種々のハイブリダイゼーション条件を使用して特定のハイブリダイゼーションを検出してもよく、厳密性は主にハイブリダイゼーションアッセイの洗浄段階により判定される。一般に、高温および低塩分濃度は高厳密性を与え、低温および高塩分濃度は低厳密性を与える。低厳密性ハイブリダイゼーションは、例えば、５０℃、約２．０×ＳＳＣでの洗浄により達成され、高厳密性は５０℃、約０．２×ＳＳＣで達成される。厳密性についてのさらなる説明は下で提供される。
【００５５】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な配列同一性」とは、２つのペプチド配列が、例えば、デフォルトギャップを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列される場合、少なくとも９０パーセント配列同一性、一部の実施形態では、少なくとも９５パーセント配列同一性、または少なくとも９９パーセント配列同一性またはそれよりも多くを共有することを意味する。一部の実施形態では、同一ではない残基位置が保存的アミノ酸置換により異なる。例えば、電荷または極性などの類似する化学的特性を有するアミノ酸の置換はタンパク質の特性に影響を及ぼす可能性はない。例は、アスパラギンの代わりのグルタミンまたはアスパラギン酸の代わりのグルタミン酸を含む。
【００５６】
本明細書で使用される「情報価値のある遺伝子座」とは、健康な対照対象由来の試料中の対応する核酸配列のメチル化パターンと比べた場合、バレット食道および／または食道新生物を有する対象由来の試料（例えば、食道組織試料）中の変化した（例えば、増加した）メチル化を有することがある本明細書で開示される核酸配列のいずれかを指す。情報価値のある遺伝子座の例はビメンチンである。
【００５７】
本明細書で使用される用語「Ｕｐ３」とは、配列番号１２５６３、１２５８１、１２５９９、１２６１７の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ３配列とは、配列番号１２５６９、１２５８７、１２６０５、もしくは１２６２３の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ３配列とは、配列番号１２５７５、１２５９３、１２６１１、もしくは１２６２９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ３配列は、配列番号１２６３５および／もしくは１２６４１の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００５８】
本明細書で使用される用語「Ｕｐ１０」とは、配列番号１２５６４、１２５８２、１２６００もしくは１２６１８の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ１０配列とは、配列番号１２５７０、１２５８８、１２６０６、もしくは１２６２４の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ１０配列とは、配列番号１２５７６、１２５９４、１２６１２、もしくは１２６３０の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ１０配列は、配列番号１２６３６および／もしくは１２６４２の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００５９】
本明細書で使用される用語「Ｕｐ１５−１」とは、配列番号１２５６５、１２５８３、１２６０１、もしくは１２６１９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ１５−１配列とは、配列番号１２５７１、１２５８９、１２６０７、もしくは１２６２５の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ１５−１配列とは、配列番号１２５７７、１２５９５、１２６１３、もしくは１２６３１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ１５−１配列は、配列番号１２６３７および／もしくは１２６４３の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００６０】
本明細書で使用される用語「Ｕｐ１５−２」とは、配列番号１２５６５、１２５８３、１２６４７、もしくは１２６５６の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ１５−２配列とは、配列番号１２５７１、１２５８９、１２６５０、もしくは１２６５９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ１５−２配列とは、配列番号１２５７７、１２５９５、１２６５３、もしくは１２６６２の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ１５−２配列は、配列番号１２６６５および／もしくは１２６６８の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００６１】
本明細書で使用される用語「Ｕｐ２０−１」とは、配列番号１２５６６、１２５８４、１２６０２、もしくは１２６２０の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ２０−１配列とは、配列番号１２５７２、１２５９０、１２６０８、もしくは１２６２６の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ２０−１配列とは、配列番号１２５７８、１２５９６、１２６１４、もしくは１２６３２の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ２０−１配列は、配列番号１２６３８および／もしくは１２６４４の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００６２】
本明細書で使用される用語「Ｕｐ２０−２」とは、配列番号１２５６６、１２５８４、１２６４８もしくは１２６５７の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ２０−２配列とは、配列番号１２５７２、１２５９０、１２６５１、もしくは１２６６０の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ２０−２配列とは、配列番号１２５７８、１２５９６、１２６５４、もしくは１２６６３の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ２０−２配列は、配列番号１２６６６および／もしくは１２６６９の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００６３】
本明細書で使用される用語「Ｕｐ２７」とは、配列番号１２５６７、１２５８５、１２６０３もしくは１２６２１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ２７配列とは、配列番号１２５７３、１２５９１、１２６０９、もしくは１２６２７の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ２７配列とは、配列番号１２５７９、１２５９７、１２６１５、もしくは１２６３３の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ２７配列は、配列番号１２６３９および／もしくは１２６４５の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００６４】
本明細書で使用される用語「Ｕｐ３５−１」とは、配列番号１２５６８、１２５８６、１２６０４もしくは１２６２２の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ３５−１配列とは、配列番号１２５７４、１２５９２、１２６１０、もしくは１２６２８の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ３５−１配列とは、配列番号１２５８０、１２５９８、１２６１６、もしくは１２６３４の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ３５−１配列は、配列番号１２６４０および／もしくは１２６４６の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００６５】
本明細書で使用される用語「Ｕｐ３５−２」とは、配列番号１２５６８、１２５８６、１２６４９もしくは１２６５８の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ３５−２配列とは、配列番号１２５７４、１２５９２、１２６５２、もしくは１２６６１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ３５−２配列とは、配列番号１２５８０、１２５９８、１２６５５、もしくは１２６６４の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、Ｕｐ３５−２配列は、配列番号１２６６７および／もしくは１２６７０の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００６６】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ２」とは、配列番号８２０９、８２５１、８２９３もしくは８３３５の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ２配列とは、配列番号８２２３、８２６５、８３０７、もしくは８３４９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ２配列とは、配列番号８２３７、８２７９、８３２１、もしくは８３６３の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ２配列は、配列番号８３７７および／もしくは８３９１の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００６７】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ５」とは、配列番号８２１０、８２５２、８２９４もしくは８３３６の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ５配列とは、配列番号８２２４、８２６６、８３０８、もしくは８３５０の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ５配列とは、配列番号８２３８、８２８０、８３２２、もしくは８３６４の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ５配列は、配列番号８３７８および／もしくは８３９２の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００６８】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ７」とは、配列番号８２１１、８２５３、８２９５もしくは８３３７の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ７配列とは、配列番号８２２５、８２６７、８３０９、もしくは８３５１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ７配列とは、配列番号８２３９、８２８１、８３２３、もしくは８３６５の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ７配列は、配列番号８３７９および／もしくは８３９３の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００６９】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ９」とは、配列番号８２１２、８２５４、８２９６もしくは８３３８の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ９配列とは、配列番号８２２６、８２６８、８３１０、もしくは８３５２の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ９配列とは、配列番号８２４０、８２８２、８３２４、もしくは８３６６の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ９配列は、配列番号８３８０および／もしくは８３９４の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００７０】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ１０」とは、配列番号８２１３、８２５５、８２９７もしくは８３３９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１０配列とは、配列番号８２２７、８２６９、８３１１、もしくは８３５３の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１０配列とは、配列番号８２４１、８２８３、８３２５、もしくは８３６７の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１０配列は、配列番号８３８１および／もしくは８３９５の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００７１】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ１１−１」とは、配列番号８２１４、８２５６、８２９８もしくは８３４０の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１１−１配列とは、配列番号８２２８、８２７０、８３１２、もしくは８３５４の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１１−１配列とは、配列番号８２４２、８２８４、８３２６、もしくは８３６８の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１１−１配列は、配列番号８３８２および／もしくは８３９６の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００７２】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ１１−２」とは、配列番号８２１４、８２５６、８４０５もしくは８４２０の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１１−２配列とは、配列番号８２２８、８２７０、８４１０、もしくは８４２５の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１１−２配列とは、配列番号８２４２、８２８４、８４１５、もしくは８４３０の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１１−２配列は、配列番号８４３５および／もしくは８４４０の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００７３】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ１３」とは、配列番号８２１５、８２５７、８２９９もしくは８３４１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１３配列とは、配列番号８２２９、８２７１、８３１３、もしくは８３５５の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１３配列とは、配列番号８２４３、８２８５、８３２７、もしくは８３６９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１３配列は、配列番号８３８３および／もしくは８３９７の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００７４】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ１４−２」とは、配列番号８２１６、８２５８、８４０６もしくは８４２１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１４−２配列とは、配列番号８２３０、８２７２、８４１１、もしくは８４２６の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１４−２配列とは、配列番号８２４４、８２８６、８４１６、もしくは８４３１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１４−２配列は、配列番号８４３６および／もしくは８４４１の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００７５】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ１５」とは、配列番号８２１７、８２５９、８３０１もしくは８３４３の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１５配列とは、配列番号８２３１、８２７３、８３１５、もしくは８３５７の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１５配列とは、配列番号８２４５、８２８７、８３２９、もしくは８３７１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１５配列は、配列番号８３８５および／もしくは８３９９の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００７６】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ１６−１」とは、配列番号８２１８、８２６０、８３０２もしくは８３４４の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１６−１配列とは、配列番号８２３２、８２７４、８３１６、もしくは８３５８の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１６−１配列とは、配列番号８２４６、８２８８、８３３０、もしくは８３７２の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１６−１配列は、配列番号８３８６および／もしくは８４００の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００７７】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ１６−２」とは、配列番号８２１８、８２６０、８４０７もしくは８４２２の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１６−２配列とは、配列番号８２３２、８２７４、８４１２、もしくは８４２７の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１６−２配列とは、配列番号８２４６、８２８８、８４１７、もしくは８４３２の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１６−２配列は、配列番号８４３７および／もしくは８４４２の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００７８】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ１７−１」とは、配列番号８２１９、８２６１、８３０３もしくは８３４５の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１７−１配列とは、配列番号８２３３、８２７５、８３１７、もしくは８３５９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１７−１配列とは、配列番号８２４７、８２８９、８３３１、もしくは８３７３の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１７−１配列は、配列番号８３８７および／もしくは８４０１の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００７９】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ１８」とは、配列番号８２２０、８２６２、８３０４もしくは８３４６の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１８配列とは、配列番号８２３４、８２７６、８３１８、もしくは８３６０の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１８配列とは、配列番号８２４８、８２９０、８３３２、もしくは８３７４の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ１８配列は、配列番号８３８８および／もしくは８４０２の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００８０】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ２２−１」とは、配列番号８２２１、８２６３、８３０５もしくは８３４７の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ２２−１配列とは、配列番号８２３５、８２７７、８３１９、もしくは８３６１の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ２２−１配列とは、配列番号８２４９、８２９１、８３３３、もしくは８３７５の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ２２−１配列は、配列番号８３８９および／もしくは８４０３の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００８１】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ２２−２」とは、配列番号８２２１、８２６３、８４０９もしくは８４２４の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ２２−２配列とは、配列番号８２３５、８２７７、８４１４、もしくは８４２９の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ２２−２配列とは、配列番号８２４９、８２９１、８４１９、もしくは８４３４の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ２２−２配列は、配列番号８４３９および／もしくは８４４４の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００８２】
本明細書で使用される用語「ＳｑＢＥ２３」とは、配列番号８２２２、８２６４、８３０６もしくは８３４８の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ２３配列とは、配列番号８２３６、８２７８、８３２０、もしくは８３６２の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ２３配列とは、配列番号８２５０、８２９２、８３３４、もしくは８３７６の配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むメチル化ヌクレオチド配列の亜硫酸水素塩で変換された産物を指す。一部の実施形態では、ＳｑＢＥ２３配列は、配列番号８３９０および／もしくは８４０４の配列またはその断片もしくは逆相補体を含むプライマーを使用して増幅してもよい。
【００８３】
一部の例では、本明細書で開示されるヌクレオチド配列のいずれも、１つまたは複数の「Ｙ」位置を含有する。メチル化されているまたはメチル化されていない場合があり、したがって、Ｔに亜硫酸水素塩で変換されている（メチル化されていない場合）またはＣのままである（メチル化されている場合）場合があるシトシン残基が、「Ｙ」で指定される。一部の実施形態では、親ヌクレオチド配列は、配列が亜硫酸水素塩変換に続いてすべてのＹ位置にＴを含む場合、完全に非メチル化される。一部の実施形態では、親ヌクレオチド配列は、配列が亜硫酸水素塩変換に続いてすべてのＹ位置にＣを含む場合、完全にメチル化される。一部の実施形態では、親ヌクレオチド配列は、配列が亜硫酸水素塩変換に続いて配列のＹ位置に少なくとも１つのＣおよびＹ位置に少なくとも１つのＴを含む場合、部分的にメチル化される。一部の実施形態では、本明細書で開示される亜硫酸水素塩で変換された配列はＹ位置に少なくとも１つのＣおよびＹ位置に少なくとも１つのＴを含む、すなわち、親配列は部分的にメチル化される。
【００８４】
ＩＩ．概要
本開示は、特定のゲノム遺伝子座（例えば、ビメンチンおよび／またはＳｑＢＥ１８）の差次的メチル化は上部胃腸管、例えば、食道の新生物または化生を示すことができるという認識に少なくとも一部基づいている。本所見は、これらのゲノム遺伝子座でのメチル化が上部胃腸管での新生物の有用なバイオマーカーになる可能性があることを実証している。本所見は、ＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の状態と組み合わせて使用されるこれらの遺伝子座でのメチル化の状態は、上部胃腸管での新生物の高度に感度がよく特異的なバイオマーカーになる可能性があることをさらに実証している。
【００８５】
一般に、新生物は、染色体不安定性、マイクロサテライト不安定性、およびＣｐＧアイランドメチル化形質（ＣＩＭＰ）と呼ばれる少なくとも３つの異なる経路のうちの１つを通じて発症する可能性がある。一部の重複はあるが、これらの経路は幾分異なる生物学的挙動を呈する傾向がある。腫瘍発症の経路、関与する標的遺伝子、および遺伝子不安定性の根底にある機構を理解することにより、異なるタイプの新生物を検出し処置する戦略を実行することが可能である。
【００８６】
本開示は、ある特定の標的遺伝子が、その標的遺伝子の５’隣接またはプロモーター領域でのＣｐＧアイランドの差次的メチル化により発現停止または不活化されることがあるという認識に少なくとも一部基づいている。ＣｐＧアイランドはＤＮＡ配列中のシトシン−グアノシン残基のクラスターであり、この残基は、本発明者らのゲノム中の約半分の遺伝子の５’隣接領域またはプロモーター領域で顕著に表される。特に、本出願は、特定のゲノム遺伝子座の差次的メチル化が食道新生物を含むがこれに限定されない上部胃腸管の新生物を示す可能性があるという認識に少なくとも一部基づいている。
【００８７】
さらに、本開示は、ＴＰ５３での体細胞突然変異（例えば、本明細書で開示される体細胞ＴＰ５３突然変異のいずれか）は、本明細書で開示されるある特定の情報価値のある遺伝子座のメチル化と組み合わせると、食道新生物（例えば、食道腺癌）を含む新生物の有用なインジケーターとして役立つことがあるという認識に少なくとも一部基づいている。ある特定の実施形態では、ＴＰ５３体細胞突然変異は本明細書で開示されるＴＰ５３突然変異のいずれかである。ある特定の実施形態では、ＴＰ５３体細胞突然変異は、当技術分野で公知の任意の非同義体細胞突然変異である。ある特定の実施形態では、ＴＰ５３体細胞突然変異は、配列番号１６２０５のアミノ酸残基７２、１０５、１０８、１１０、１１３、１２４、１２７、１３２、１４４、１５２、１６３、１７５、１８３、１９４、２１３、２１４、２１８、２３２、２３４、２４８、２６５、２７３、２７８、３０６、３３７、３４７、または６３９に対応するいずれか１つまたは複数のアミノ酸残基でのいずれか１つまたは複数の突然変異である。ある特定の実施形態では、ＴＰ５３体細胞突然変異は、配列番号１６２０５のＬｅｕ１９４Ａｒｇ、Ｇｌｙ１０５Ａｓｐ、Ａｒｇ２７３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１６３Ｈｉｓ、Ｉｌｅ２３２Ｔｈｒ、Ａｒｇ２１３Ｔｅｒ、Ａｒｇ２７３Ｈｉｓ、Ａｒｇ２４８Ｇｌｎ、Ａｒｇ１７５Ｈｉｓ、Ａｒｇ１１０ｄｅｌｉｎｓＧｌｎＳｅｒ、Ｓｅｒ１８３Ｔｅｒ、Ａｒｇ２４８Ｇｌｎ、Ａｒｇ３３７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１３２Ａｒｇ、Ｌｅｕ２６５ＴｈｒｆｓＴｅｒ７、Ａｒｇ３０６Ｔｅｒ、Ｃｙｓ１２４ＴｒｐｆｓＴｅｒ２５、Ｐｒｏ７２Ａｒｇ、Ｖａｌ２１８Ｇｌｕ、Ｈｉｓ２１４Ｌｅｕ、Ｇｌｎ１４４Ｔｅｒ、Ｐｈｅ１１３Ｓｅｒ、Ｔｙｒ２３４Ｈｉｓ、Ｓｅｒ１２７Ｐｈｅ、Ｐｒｏ２７８Ａｌａ、Ａｌａ３４７Ｔｈｒ、およびＰｒｏ１５２Ｌｅｕからなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の突然変異である。ある特定の実施形態では、ＴＰ５３突然変異は、配列番号１６２０６のヌクレオチド位置１０８、２１５、３１４、３３８、３８０、３９５、４３０、４５５、４８７、５２４、５４８、５８１、６３７、６３９、６４１、６５３、６９５、７００、７４３、８１８、８３２、９１６、１０１０、または１０３９に対応するいずれか１つまたは複数のヌクレオチド位置でのいずれか１つまたは複数の突然変異である。
【００８８】
配列番号１６２０５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５３７．３に対応する）の配列は以下の通りである。
MEEPQSDPSVEPPLSQETFSDLWKLLPENNVLSPLPSQAMDDLMLSPDDIEQWFTEDPGPDEAPRMPEAAPPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKGEPHHELPPGSTKRALPNNTSSSPQPKKKPLDGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQAGKEPGGSRAHSSHLKSKKGQSTSRHKKLMFKTEGPDSD
【００８９】
配列番号１６２０６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５４６．５に対応する）の配列は以下の通りである。
GATGGGATTGGGGTTTTCCCCTCCCATGTGCTCAAGACTGGCGCTAAAAGTTTTGAGCTTCTCAAAAGTCTAGAGCCACCGTCCAGGGAGCAGGTAGCTGCTGGGCTCCGGGGACACTTTGCGTTCGGGCTGGGAGCGTGCTTTCCACGACGGTGACACGCTTCCCTGGATTGGCAGCCAGACTGCCTTCCGGGTCACTGCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCCTAGCGTCGAGCCCCCTCTGAGTCAGGAAACATTTTCAGACCTATGGAAACTACTTCCTGAAAACAACGTTCTGTCCCCCTTGCCGTCCCAAGCAATGGATGATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAACAATGGTTCACTGAAGACCCAGGTCCAGATGAAGCTCCCAGAATGCCAGAGGCTGCTCCCCCCGTGGCCCCTGCACCAGCAGCTCCTACACCGGCGGCCCCTGCACCAGCCCCCTCCTGGCCCCTGTCATCTTCTGTCCCTTCCCAGAAAACCTACCAGGGCAGCTACGGTTTCCGTCTGGGCTTCTTGCATTCTGGGACAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTACTCCCCTGCCCTCAACAAGATGTTTTGCCAACTGGCCAAGACCTGCCCTGTGCAGCTGTGGGTTGATTCCACACCCCCGCCCGGCACCCGCGTCCGCGCCATGGCCATCTACAAGCAGTCACAGCACATGACGGAGGTTGTGAGGCGCTGCCCCCACCATGAGCGCTGCTCAGATAGCGATGGTCTGGCCCCTCCTCAGCATCTTATCCGAGTGGAAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATTTGGATGACAGAAACACTTTTCGACATAGTGTGGTGGTGCCCTATGAGCCGCCTGAGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTACAACTACATGTGTAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCGTGTTTGTGCCTGTCCTGGGAGAGACCGGCGCACAGAGGAAGAGAATCTCCGCAAGAAAGGGGAGCCTCACCACGAGCTGCCCCCAGGGAGCACTAAGCGAGCACTGCCCAACAACACCAGCTCCTCTCCCCAGCCAAAGAAGAAACCACTGGATGGAGAATATTTCACCCTTCAGATCCGTGGGCGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCGAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAACTCAAGGATGCCCAGGCTGGGAAGGAGCCAGGGGGGAGCAGGGCTCACTCCAGCCACCTGAAGTCCAAAAAGGGTCAGTCTACCTCCCGCCATAAAAAACTCATGTTCAAGACAGAAGGGCCTGACTCAGACTGACATTCTCCACTTCTTGTTCCCCACTGACAGCCTCCCACCCCCATCTCTCCCTCCCCTGCCATTTTGGGTTTTGGGTCTTTGAACCCTTGCTTGCAATAGGTGTGCGTCAGAAGCACCCAGGACTTCCATTTGCTTTGTCCCGGGGCTCCACTGAACAAGTTGGCCTGCACTGGTGTTTTGTTGTGGGGAGGAGGATGGGGAGTAGGACATACCAGCTTAGATTTTAAGGTTTTTACTGTGAGGGATGTTTGGGAGATGTAAGAAATGTTCTTGCAGTTAAGGGTTAGTTTACAATCAGCCACATTCTAGGTAGGGGCCCACTTCACCGTACTAACCAGGGAAGCTGTCCCTCACTGTTGAATTTTCTCTAACTTCAAGGCCCATATCTGTGAAATGCTGGCATTTGCACCTACCTCACAGAGTGCATTGTGAGGGTTAATGAAATAATGTACATCTGGCCTTGAAACCACCTTTTATTACATGGGGTCTAGAACTTGACCCCCTTGAGGGTGCTTGTTCCCTCTCCCTGTTGGTCGGTGGGTTGGTAGTTTCTACAGTTGGGCAGCTGGTTAGGTAGAGGGAGTTGTCAAGTCTCTGCTGGCCCAGCCAAACCCTGTCTGACAACCTCTTGGTGAACCTTAGTACCTAAAAGGAAATCTCACCCCATCCCACACCCTGGAGGATTTCATCTCTTGTATATGATGATCTGGATCCACCAAGACTTGTTTTATGCTCAGGGTCAATTTCTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTCTTTGAGACTGGGTCTCGCTTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGGAGTGGCGTGATCTTGGCTTACTGCAGCCTTTGCCTCCCCGGCTCGAGCAGTCCTGCCTCAGCCTCCGGAGTAGCTGGGACCACAGGTTCATGCCACCATGGCCAGCCAACTTTTGCATGTTTTGTAGAGATGGGGTCTCACAGTGTTGCCCAGGCTGGTCTCAAACTCCTGGGCTCAGGCGATCCACCTGTCTCAGCCTCCCAGAGTGCTGGGATTACAATTGTGAGCCACCACGTCCAGCTGGAAGGGTCAACATCTTTTACATTCTGCAAGCACATCTGCATTTTCACCCCACCCTTCCCCTCCTTCTCCCTTTTTATATCCCATTTTTATATCGATCTCTTATTTTACAATAAAACTTTGCTGCCACCTGTGTGTCTGAGGGGTG.
【００９０】
食道腺癌（ＥＡＣ）はここ数十年間にわたり発生率が着実に増加している。８５％の死亡率で、このがんはアメリカ人口中固形腫瘍によるがん死亡のもっとも急速に増加している原因である。したがって、ＥＡＣおよびバレット食道（ＢＥ）のその前駆病変の早期検出のためのスクリーニングアプローチの開発にかなりの関心がもたれてきた。しかし、ＥＡＣの大部分は患者において先の症状なしで発症し、ＢＥを有することが分かっている個体の縦断的スクリーニングと組み合わせた、胃食道逆流症の持続性の症状がある個体の内視鏡検査の現在のアプローチは、したがって、ＥＡＣによる死亡を低減するのに著しい影響を及ぼしてはいない。
【００９１】
上記の通り、適切な治療介入と連結させた胃腸新生物（例えば、上部胃腸管の新生物）の早期検出は患者の生存率を高めるのに重要である。特異性および／もしくは感度の欠如（例えば、バリウム飲み込み）または医療資源（例えば、上部消化管内視鏡検査もしくはＣＴスキャン）の高額費用および高度利用を含む、種々の理由で、食道新生物についてスクリーニングするための現在のシステムは不十分である。食道新生物を検出するための代わりのシステムは広範囲な他の臨床状況でも同様に有用になると考えられる。例えば、食道新生物を検出することにより、新生物の切除（内視鏡的切除または外科的切除を介して）、新生物の焼灼、化学療法、または放射線療法を含むがこれらに限定されない治療を受ける患者を選択することができる。さらなる例として、食道がんのために外科および／または薬物療法を受けたことがある患者は再発を経験する場合がある。そのような患者が上部胃腸管の反復性のまたは再発した新生物を有するかどうかを判定するための代わりのシステムがあれば有利となるであろう。さらなる例として、代わりの診断システムは、そのような新生物を有することが分かっている患者において上部胃腸管の新生物の増加、減少または持続をモニタリングすることを促進すると考えられる。化学療法を受けている患者はこの療法の有効性を評価するためにモニタリングしてもよい。
【００９２】
ＩＩＩ．疾患バイオマーカーとしての情報価値のある遺伝子座のメチル化
本開示は、その変化したＤＮＡメチル化が食道新生物ならびに／またはバレット食道（ＢＥ）および／もしくは食道腺癌（ＥＡＣ）を含む化生の存在を示すゲノム遺伝子座の同定に少なくとも一部関する。一部の実施形態では、バレット食道は異形成に関連している。一部の実施形態では、異形成は高悪性度異形成である。一部の実施形態では、異形成は低悪性度異形成である。一部の実施形態では、本明細書で開示される情報価値のある遺伝子座のメチル化パターンは本明細書に記載されている対象から採取される試料において判定され、これを使用して、バレット食道を有する対象と高悪性度異形成および／もしくは低悪性度異形成ならびに／または食道腺癌を有する対象を区別することができる。情報価値のある遺伝子座の例は本明細書に提供されている。
【００９３】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは逆相補体のいずれでも１つまたは複数の「Ｙ」残基を含有してよい。メチル化されているまたはメチル化されていない場合があり、したがって、Ｔに亜硫酸水素塩で変換された（メチル化されていない場合）またはＣのままである（メチル化されている場合）シトシン残基は「Ｙ」で指定される。一部の実施形態では、本明細書で開示される配列（またはその断片もしくは逆相補体）のいずれかにおけるＹ残基の１つまたは複数はメチル化Ｃを指定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される配列（またはその断片もしくは逆相補体）のいずれかにおけるＹ残基の１つまたは複数は非メチル化Ｃを指定する。一部の実施形態では、本明細書で開示される配列（またはその断片もしくは逆相補体）のいずれかにおけるＹ残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０はメチル化Ｃ残基に対応する。一部の実施形態では、本明細書で開示される配列（またはその断片もしくは逆相補体）のいずれかにおけるＹ残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０は非メチル化Ｃ残基に対応する。一部の実施形態では、本明細書で開示される配列（またはその断片もしくは逆相補体）のいずれかにおけるＹ残基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％はメチル化Ｃ残基に対応する。一部の実施形態では、本明細書で開示される配列（またはその断片もしくは逆相補体）のいずれかにおけるＹ残基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％は非メチル化Ｃ残基に対応する。一部の実施形態では、本明細書で開示される配列（またはその断片もしくは逆相補体）のいずれかは亜硫酸水素塩で変換されている。一部の実施形態では、本明細書で開示される亜硫酸水素塩で変換された配列（またはその断片もしくは逆相補体）のいずれかにおけるＹ残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０はＣに対応する。一部の実施形態では、本明細書で開示される亜硫酸水素塩で変換された配列（またはその断片もしくは逆相補体）のいずれかにおけるＹ残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０はＴに対応する。一部の実施形態では、本明細書で開示される亜硫酸水素塩で変換された配列（またはその断片もしくは逆相補体）のいずれかにおけるＹ残基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％はＣ残基に対応する。一部の実施形態では、本明細書で開示される亜硫酸水素塩で変換された配列（またはその断片もしくは逆相補体）のいずれかにおけるＹ残基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％はＴ残基に対応する。
【００９４】
一部の実施形態では、対象における情報価値のある遺伝子座は、その遺伝子座が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％メチル化されている場合、対象が食道で化生（例えば、バレット食道）または新生物（例えば、高悪性度もしくは低悪性度異形成などの異形成のあるバレット食道）（例えば、食道腺癌などの食道がん）を発症する傾向があるおよび／または発症しているかどうかを判定する目的で、「メチル化されている」とみなされる。一部の実施形態では、対象由来のＤＮＡ試料は亜硫酸水素塩で処理され、得られた亜硫酸水素塩配列は「Ｙ」ヌクレオチドを含む本明細書で開示されるヌクレオチド配列のいずれかに対応する。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換された配列のＹ残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０がＣを有する場合、対象が食道で化生（例えば、バレット食道）または新生物（例えば、高悪性度または低悪性度異形成などの異形成のあるバレット食道）（例えば、食道腺癌などの食道がん）を発症する傾向があるおよび／または発症しているかどうかを判定する目的で、その配列は「メチル化されている」とみなされる。一部の実施形態では、対象由来のＤＮＡ試料は亜硫酸水素塩で処理され、得られた亜硫酸水素塩配列は「Ｙ」ヌクレオチドを含む本明細書で開示されるヌクレオチド配列のいずれかに対応する。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換された配列のＹ残基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％がＣを有する場合、対象が食道で化生（例えば、バレット食道）または新生物（例えば、高悪性度または低悪性度異形成などの異形成のあるバレット食道）（例えば、食道腺癌などの食道がん）を発症する傾向があるおよび／または発症しているかどうかを判定する目的で、その配列は「メチル化されている」とみなされる。本開示は、対象（例えば、ヒト）が食道に化生（例えば、バレット食道）または新生物（例えば、高悪性度または低悪性度異形成などの異形成のあるバレット食道）（例えば、食道腺癌などの食道がん）を有するかまたはそれを発症する傾向があるかどうかを評価するために使用してもよい情報価値のある遺伝子座を提供する。一部の実施形態では、本明細書で定義される１つまたは複数の情報価値のある遺伝子座は、対象が化生（例えば、バレット食道）を有するかまたはそれを発症する可能性があるかどうかを判定するために使用してもよい。一部の実施形態では、本明細書で定義される１つまたは複数の情報価値のある遺伝子座は、対象が新生物（例えば、高悪性度異形成のあるバレット食道、または食道腺癌などの食道がん）を有するかまたはそれを発症する可能性があるかどうかを判定するために使用してもよい。一部の実施形態では、本明細書で定義される１つまたは複数の情報価値のある遺伝子座は、対象が食道に化生（例えば、バレット食道）を有するかまたは食道新生物（例えば、高悪性度異形成のあるバレット食道、もしくは食道腺癌などの食道がん）を有するかどうかを区別するために使用してもよい。
【００９５】
一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、配列番号１〜４２８、２５６９〜２９９６、５１３７〜５５３１、７５０７〜７５３２、７６６３〜７６６８、７８１９〜７８４２、７９６３〜７９７６、８０４７〜８０６０、８１３１〜８１４３、８２０９〜８２２２、８２９３〜８３０６、８４０５〜８４０９、８４４７〜８６３２、９５６３〜９７４８、１０６７９〜１０８２５、１１５６１〜１１６１１、１１８６７〜１１９１７、１２１７３〜１２２１９、１２４５５〜１２４６０、１２４９１〜１２４９６、１２５２７〜１２５３２、１２５６３〜１２５６８、１２５９９〜１２６０４、１２６４７〜１２６４９、１２６７１〜１２９０７、１４０９３〜１４３２９、１５５１５〜１５５３７、１５６５３〜１５６９２、１５８９３〜１５９３２、１６１３３〜１６１３７、１６１６３〜１６１６５、１６１８１〜１６１８３、もしくは１６１９９、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するプラス鎖ＤＮＡ配列のいずれか１つまたは複数に関連している配列を含む。特定の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、配列番号７９６３〜７９７６、８０４７〜８０６０、８１３１〜８１４３、１２４５５〜１２４６０、１２４９１〜１２４９６、１２５２７〜１２５３２、１６１６３〜１６１６５、１６１８１〜１６１８３、もしくは１６１９９またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するプラス鎖ＤＮＡ配列のいずれか１つまたは複数に関連している配列を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、健康な対照対象から採取した同じ試料タイプと比べた場合、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連している。一部の実施形態では、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号１〜４２８、２５６９〜２９９６、５１３７〜５５３１、７５０７〜７５３２、７６６３〜７６６８、７８１９〜７８４２、７９６３〜７９７６、８０４７〜８０６０、８１３１〜８１４３、８２０９〜８２２２、８２９３〜８３０６、もしくは８４０５〜８４０９、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するプラス鎖ＤＮＡ配列のいずれか１つまたは複数に関連している配列を含む。特定の実施形態では、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号７９６３〜７９７６、８０４７〜８０６０、もしくは８１３１〜８１４３、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するプラス鎖ＤＮＡ配列のいずれか１つまたは複数に関連している配列を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、異形成のないバレット食道を有する対象から採取した同じタイプの試料と比べた場合、食道腺癌試料および／または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレットでの増加したメチル化に関連している。一部の実施形態では、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号８４４７〜８６３２、９５６３〜９７４８、１０６７９〜１０８２５、１１５６１〜１１６１１、１１８６７〜１１９１７、１２１７３〜１２２１９、１２４５５〜１２４６０、１２４９１〜１２４９６、もしくは１２５２７〜１２５３２、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のいずれか１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、低悪性度異形成のあるバレットでの増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号１２４５５〜１２４６０、１２４９１〜１２４９６、もしくは１２５２７〜１２５３２、またはその断片もしくは相補体のいずれかに少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のいずれか１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、食道腺癌試料または高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号１２４５５〜１２４６０、１２４９１〜１２４９６、もしくは１２５２７〜１２５３２、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のいずれか１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、バレット食道を有する対象から採取した同じタイプの試料と比べた場合、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連している。一部の実施形態では、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号１２６７１〜１２９０８、１４０９３〜１４３２９、１５５１５〜１５５３７、１５６５３〜１５６９２、１５８９３〜１５９３２、１６１３３〜１６１３７、１６１６３〜１６１６５、１６１８１〜１６１８３、もしくは１６１９９、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のいずれか１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号１６１６３〜１６１６５、１６１８１〜１６１８３、もしくは１６１９９、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のいずれか１つまたは複数を含む。
【００９６】
一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座または情報価値のある遺伝子座のアンプリコンは、亜硫酸水素塩などの薬剤で処理される。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は亜硫酸水素塩で処理されている配列を含む。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるプラスＤＮＡ鎖のいずれかの亜硫酸水素塩対照配列を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるプラスＤＮＡ鎖のいずれかの亜硫酸水素塩で処理された非メチル化配列を提供する。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換されたプラス鎖対照ＤＮＡ配列は、配列番号８５７〜１２８４、３４２５〜３８５２、５９２７〜６３２１、７５５９〜７５８４、７７１５〜７７４０、７８６７〜７８９０、７９９１〜８００４、８０７５〜８０８８、８１５７〜８１６９、８２２３〜８２３６、８３０７〜８３２０、８４１０〜８４１４、８８１９〜９００４、９９３５〜１０１２０、１０９７３〜１１１１９、１１６６３〜１１７１３、１１９６９〜１２０１９、１２２６７〜１２３１３、１２４６７〜１２４７２、１２５０３〜１２５０８、もしくは１２５３９〜１２５４４、１２５６９〜１２５７４、１２６０５〜１２６１０、１２６５０〜１２６５２，またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するいずれか１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換されたプラス鎖対照ＤＮＡ配列は、配列番号７９９１〜８００４、８０７５〜８０８８、８１５７〜８１６９、８２２３〜８２３６、８３０７〜８３２０、８４１０〜８４１４、１２４６７〜１２４７２、１２５０３〜１２５０８、もしくは１２５３９〜１２５４４、１２５６９〜１２５７４、１２６０５〜１２６１０、１２６５０〜１２６５２またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するいずれか１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、健康な対照対象から採取した同じ試料タイプと比べた場合、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連している。一部の実施形態では、本開示は、健康な対照対象から採取した同じ試料タイプと比べた場合、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連しているプラスＤＮＡ鎖のいずれかの亜硫酸水素塩で処理された非メチル化配列を提供する。一部の実施形態では、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連しているプラスＤＮＡ鎖のいずれかの亜硫酸水素塩で変換された配列は、配列番号８５７〜１２８４、３４２５〜３８５２、５９２７〜６３２１、７５５９〜７５８４、７７１５〜７７４０、７８６７〜７８９０、７９９１〜８００４、８０７５〜８０８８、８１５７〜８１６９、８２２３〜８２３６、８３０７〜８３２０、もしくは８４１０〜８４１４、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択される。特定の実施形態では、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連しているプラスＤＮＡ鎖のいずれかの亜硫酸水素塩で変換された配列は、配列番号７９９１〜８００４、８０７５〜８０８８、８１５７〜８１６９、８２２３〜８２３６、８３０７〜８３２０、もしくは８４１０〜８４１４、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化プラス鎖ＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、本開示は、異形成のないバレット食道を有する対象から採取した同じタイプの試料と比べた場合、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連しているプラスＤＮＡ鎖のいずれかの亜硫酸水素塩で処理された非メチル化配列を提供する。一部の実施形態では、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連しているプラスＤＮＡ鎖のいずれかの亜硫酸水素塩で変換された配列は、配列番号８８１９〜９００４、９９３５〜１０１２０、１０９７３〜１１１１９、１１６６３〜１１７１３、１１９６９〜１２０１９、１２２６７〜１２３１３、１２４６７〜１２４７２、１２５０３〜１２５０８、１２５３９〜１２５４４、１２５６９〜１２５７４、１２６０５〜１２６１０、もしくは１２６５０〜１２６５２、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化プラス鎖ＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連しているプラスＤＮＡ鎖のいずれかの亜硫酸水素塩で変換された配列は、配列番号１２４６７〜１２４７２、１２５０３〜１２５０８、１２５３９〜１２５４４、１２５６９〜１２５７４、１２６０５〜１２６１０、もしくは１２６５０〜１２６５２、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のいずれか１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、バレット食道を有する対象から採取した同じタイプの試料と比べた場合、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連している。一部の実施形態では、本開示は、バレット食道を有する対象から採取した同じタイプの試料と比べた場合、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連しているプラスＤＮＡ鎖のメチル化対照配列を提供する。一部の実施形態では、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連しているプラスＤＮＡ鎖のいずれかのメチル化対照配列は、配列番号１３１４５〜１３３８１、１４５６７〜１４８０３、１５５６１〜１５５８３、１５７３３〜１５７７２、１５９７３〜１６０１２、１６１４３〜１６１４７、１６１６９〜１６１７１、１６１８７〜１６１８９もしくは１６２０１、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化プラス鎖ＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連しているプラスＤＮＡ鎖のいずれかのメチル化対照配列は、配列番号１６１６９〜１６１７１、１６１８７〜１６１８９もしくは１６２０１、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化プラス鎖ＤＮＡ配列を含む。
【００９７】
一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座または情報価値のある遺伝子座のアンプリコンは、亜硫酸水素塩などの薬剤で処理される。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は亜硫酸水素塩で処理されている配列を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、亜硫酸水素塩で処理されているメチル化核酸配列を含む。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化プラス鎖ＤＮＡ配列は、配列番号１２８５〜１７１２、３８５３〜４２８０、６３２２〜６７１６、７５８５〜７６１０、７７４１〜７７６６、７８９１〜７９１４、８００５〜８０１８、８０８９〜８１０２、８１７０〜８１８２、８２３７〜８２５０、８３２１〜８３３４、８４１５〜８４１９、９００５〜９１９０、１０１２１〜１０３０６、１１１２０〜１１２６６、１１７１４〜１１７６４、１２０２０〜１２０７０、１２３１４〜１２３６０、１２４７３〜１２４７８、１２５０９〜１２５１４もしくは１２５４５〜１２５５０、１２５７５〜１２５８０、１２６１１〜１２６１６、１２６５３〜１２６５５、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する。特定の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化プラス鎖ＤＮＡ配列は、配列番号８００５〜８０１８、８０８９〜８１０２、８１７０〜８１８２、１２４７３〜１２４７８、１２５０９〜１２５１４もしくは１２５４５〜１２５５０、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、健康な対照対象から採取した同じ試料タイプと比べた場合、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連している。一部の実施形態では、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号１２８５〜１７１２、３８５３〜４２８０、６３２２〜６７１６、７５８５〜７６１０、７７４１〜７７６６、７８９１〜７９１４、８００５〜８０１８、８０８９〜８１０２、８１７０〜８１８２、８２３７〜８２５０、８３２１〜８３３４、もしくは８４１５〜８４１９、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化プラス鎖ＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号８００５〜８０１８、８０８９〜８１０２、８１７０〜８１８２、８２３７〜８２５０、８３２１〜８３３４、もしくは８４１５〜８４１９、またはその断片もしくは相補体に対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化プラス鎖ＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、異形成のないバレット食道を有する対象から採取した同じタイプの試料と比べた場合、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連している。一部の実施形態では、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号９００５〜９１９０、１０１２１〜１０３０６、１１１２０〜１１２６６、１１７１４〜１１７６４、１２０２０〜１２０７０、１２３１４〜１２３６０、１２４７３〜１２４７８、１２５０９〜１２５１４、１２５４５〜１２５５０、１２５７５〜１２５８０、１２６１１〜１２６１６、もしくは１２６５３〜１２６５５、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化プラス鎖ＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号１２４７３〜１２４７８、１２５０９〜１２５１４、１２５４５〜１２５５０、１２５７５〜１２５８０、１２６１１〜１２６１６、もしくは１２６５３〜１２６５５、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、バレット食道を有する対象から採取した同じタイプの試料と比べた場合、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連している。一部の実施形態では、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号１３３８２〜１３６１８、１４８０４〜１５０４０、１５５８４〜１５６０６、１５７７３〜１５８１２、１６０１３〜１６０５２、１６１４８〜１６１５２、１６１７２〜１６１７４、１６１９０〜１６１９２または１６２０２に対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化プラス鎖ＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号１６１７２〜１６１７４、１６１９０〜１６１９２もしくは１６２０２、またはその断片もしくは相補体に対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のいずれか１つまたは複数を含む。
【００９８】
一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、配列番号４２９〜８５６、２９９７〜３４２４、５５３２〜５９２６、７５３３〜７５５８、７６８９〜７７１４、７８４３〜７８６６、７９７７〜７９９０、８０６１〜８０７４、８１４４〜８１５６、８２５１〜８２６４、８３３５〜８３４８、８４２０〜８４２４、８６３３〜８８１８、９７４９〜９９３４、１０８２６〜１０９７２、１１６１２〜１１６６２、１１９１８〜１１９６８、１２２２０〜１２２６６、１２４６１〜１２４６６、１２４９７〜１２５０２、１２５３３〜１２５３８、１２５８１〜１２５８６、１２６１７〜１２６２２、１２６５６〜１２６５８、１２９０９〜１３１４４、１４３３０〜１４５６６、１５５３８〜１５５６０、１５６９３〜１５７３２、１５９３３〜１５９７２、１６１３８〜１６１４２、１６１６６〜１６１６８、１６１８４〜１６１８６、もしくは１６２００、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するマイナス鎖ＤＮＡ配列のいずれかに関連している配列を含む。特定の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、配列番号７９７７〜７９９０、８０６１〜８０７４、８１４４〜８１５６、８２５１〜８２６４、８３３５〜８３４８、８４２０〜８４２４、１２４６１〜１２４６６、１２４９７〜１２５０２、１２５３３〜１２５３８、１２５８１〜１２５８６、１２６１７〜１２６２２、１２６５６〜１２６５８、１６１６６〜１６１６８、１６１８４〜１６１８６もしくは１６２００、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するマイナス鎖ＤＮＡ配列のいずれかに関連している配列を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、健康な対照対象から採取した同じ試料タイプと比べた場合、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連している。一部の実施形態では、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号４２９〜８５６、２９９７〜３４２４、５５３２〜５９２６、７５３３〜７５５８、７６８９〜７７１４、７８４３〜７８６６、７９７７〜７９９０、８０６１〜８０７４、８１４４〜８１５６、８２５１〜８２６４、８３３５〜８３４８、８４２０〜８４２４、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するマイナス鎖ＤＮＡ配列のいずれか１つまたは複数に関連している配列を含む。特定の実施形態では、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号８２５１〜８２６４、８３３５〜８３４８、８４２０〜８４２４、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するプラス鎖ＤＮＡ配列のいずれか１つまたは複数に関連している配列を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、異形成のないバレット食道を有する対象から採取した同じタイプの試料と比べた場合、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連している。一部の実施形態では、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号８６３３〜８８１８、９７４９〜９９３４、１０８２６〜１０９７２、１１６１２〜１１６６２、１１９１８〜１１９６８、１２２２０〜１２２６６、１２４６１〜１２４６６、１２４９７〜１２５０２、１２５３３〜１２５３８、１２５８１〜１２５８６、１２６１７〜１２６２２、もしくは１２６５６〜１２６５８、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号１２４６１〜１２４６６、１２４９７〜１２５０２、１２５３３〜１２５３８、１２５８１〜１２５８６、１２６１７〜１２６２２、もしくは１２６５６〜１２６５８、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、バレット食道を有する対象から採取した同じタイプの試料と比べた場合、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連している。一部の実施形態では、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号１２９０９〜１３１４４、１４３３０〜１４５６６、１５５３８〜１５５６０、１５６９３〜１５７３２、１５９３３〜１５９７２、１６１３８〜１６１４２、１６１６６〜１６１６８、１６１８４〜１６１８６もしくは１６２００、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号１６１６６〜１６１６８、１６１８４〜１６１８６、もしくは１６２００、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数を含む。
【００９９】
一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座または情報価値のある遺伝子座のアンプリコンは、亜硫酸水素塩などの薬剤で処理される。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は亜硫酸水素塩で処理されている配列を含む。一部の実施形態では、一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるマイナスＤＮＡ鎖のいずれかの亜硫酸水素塩対照配列を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるマイナスＤＮＡ鎖のいずれかの亜硫酸水素塩で処理された配列を提供する。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換されたマイナス鎖対照ＤＮＡ配列は、配列番号１７１３〜２１４０、４２８１〜４７０８、６７１７〜７１１１、７６１１〜７６３６、７７６７〜７７９２、７９１５〜７９３８、８０１９〜８０３２、８１０３〜８１１６、８１８３〜８１９５、８２６５〜８２７８、８３４９〜８３６２、８４２５〜８４２９、９１９１〜９３７６、１０３０７〜１０４９２、１１２６７〜１１４１３、１１７６５〜１１８１５、１２０７１〜１２１２１、１２３６１〜１２４０７、１２４７９〜１２４８４、１２５１５〜１２５２０、１２５５１〜１２５５６、１２５８７〜１２５９２、１２６２３〜１２６２８、もしくは１２６５９〜１２６６１、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のいずれか１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換されたマイナス鎖対照ＤＮＡ配列は、配列番号８０１９〜８０３２、８１０３〜８１１６、８１８３〜８１９５、１２４７９〜１２４８４、１２５１５〜１２５２０、もしくは１２５５１〜１２５５６、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のいずれか１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、健康な対照対象から採取した同じ試料タイプと比べた場合、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連している。一部の実施形態では、本開示は、健康な対照対象から採取した同じ試料タイプと比べた場合、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連しているマイナスＤＮＡ鎖のいずれかの亜硫酸水素塩で処理された配列を提供する。
一部の実施形態では、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連しているマイナスＤＮＡ鎖のいずれかの配列は、配列番号１７１３〜２１４０、４２８１〜４７０８、６７１７〜７１１１、７６１１〜７６３６、７７６７〜７７９２、７９１５〜７９３８、８０１９〜８０３２、８１０３〜８１１６、８１８３〜８１９５、８２６５〜８２７８、８３４９〜８３６２、もしくは８４２５〜８４２９、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択される。特定の実施形態では、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連しているマイナスＤＮＡ鎖のいずれかの配列は、配列番号８０１９〜８０３２、８１０３〜８１１６、８１８３〜８１９５、８２６５〜８２７８、８３４９〜８３６２、もしくは８４２５〜８４２９、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化マイナス鎖ＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、本開示は、異形成のないバレット食道を有する対象から採取した同じタイプの試料と比べた場合、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連しているマイナスＤＮＡ鎖のいずれかの亜硫酸水素塩で処理された配列を提供する。一部の実施形態では、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連しているマイナスＤＮＡ鎖のいずれかの配列は、配列番号９１９１〜９３７６、１０３０７〜１０４９２、１１２６７〜１１４１３、１１７６５〜１１８１５、１２０７１〜１２１２１、１２３６１〜１２４０７、１２４７９〜１２４８４、１２５１５〜１２５２０、もしくは１２５５１〜１２５５６、１２５８７〜１２５９２、１２６２３〜１２６２８、もしくは１２６５９〜１２６６１、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化マイナス鎖ＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連しているマイナスＤＮＡ鎖のいずれかの非メチル化配列は、配列番号１２４７９〜１２４８４、１２５１５〜１２５２０、１２５５１〜１２５５６、１２５８７〜１２５９２、１２６２３〜１２６２８、もしくは１２６５９〜１２６６１、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のいずれか１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、バレット食道を有する対象から採取した同じタイプの試料と比べた場合、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連している。一部の実施形態では、本開示は、バレット食道を有する対象から採取した同じタイプの試料と比べた場合、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連しているマイナスＤＮＡ鎖のメチル化対照配列を提供する。一部の実施形態では、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連しているマイナスＤＮＡ鎖のいずれかのメチル化対照配列は、配列番号１３６１９〜１３８５５、１５０４１〜１５２７７、１５６０７〜１５６２９、１５８１３〜１５８５２、１６０５３〜１６０９２、１６１５３〜１６１５７、１６１７５〜１６１７７、１６１９２〜１６１９５、もしくは１６２０３、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化プラス鎖ＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連しているマイナスＤＮＡ鎖のいずれかのメチル化対照配列は、配列番号１６１７５〜１６１７７、１６１９２〜１６１９５もしくは１６２０３、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化マイナス鎖ＤＮＡ配列を含む。
【０１００】
一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座または情報価値のある遺伝子座のアンプリコンは、亜硫酸水素塩などの薬剤で処理される。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は亜硫酸水素塩で処理されている配列を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、亜硫酸水素塩で処理されているメチル化核酸配列を含む。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化マイナス鎖ＤＮＡ配列は、配列番号２１４１〜２５６８、４７０９〜５１３６、７１１２〜７５０６、７６３７〜７６６２、７７９３〜７８１８、７９３９〜７９６２、８０３３〜８０４６、８１１７〜８１３０、８１９６〜８２０８、８２７９〜８２９２、８３６３〜８３７６、８４３０〜８４３４、９３７７〜９５６２、１０４９３〜１０６７８、１１４１４〜１１５６０、１１８１６〜１１８６６、１２１２２〜１２１７２、１２４０８〜１２４５４、１２４８５〜１２４９０、１２５２１〜１２５２６、１２５５７〜１２５６２、１２５９３〜１２５９８、１２２６９〜１２６３４、もしくは１２６６２〜１２６６４、またはその断片もしくは相補体に対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化マイナス鎖ＤＮＡ配列は、配列番号８０３３〜８０４６、８１１７〜８１３０、８１９６〜８２０８、８２７９〜８２９２、８３６３〜８３７６、８４３０〜８４３４、１２４８５〜１２４９０、１２５２１〜１２５２６、１２５５７〜１２５６２、１２５９３〜１２５９８、１２２６９〜１２６３４、もしくは１２６６２〜１２６６４、またはその断片もしくは相補体に対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の配列を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、健康な対照対象から採取した同じ試料タイプと比べた場合、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連している。一部の実施形態では、バレット食道と食道腺癌試料の両方での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号２１４１〜２５６８、４７０９〜５１３６、７１１２〜７５０６、７６３７〜７６６２、７７９３〜７８１８、７９３９〜７９６２、８０３３〜８０４６、８１１７〜８１３０、８１９６〜８２０８、８２７９〜８２９２、８３６３〜８３７６、もしくは８４３０〜８４３４、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化マイナス鎖ＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号８０３３〜８０４６、８１１７〜８１３０、８１９６〜８２０８、８２７９〜８２９２、８３６３〜８３７６、もしくは８４３０〜８４３４、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化マイナス鎖ＤＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、異形成のないバレット食道を有する対象から採取した同じタイプの試料と比べた場合、食道腺癌試料または高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連している。一部の実施形態では、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号９３７７〜９５６２、１０４９３〜１０６７８、１１４１４〜１１５６０、１１８１６〜１１８６６、１２１２２〜１２１７２、１２４０８〜１２４５４、１２４８５〜１２４９０、１２５２１〜１２５２６、１２５５７〜１２５６２、１２５９３〜１２５９８、１２２６９〜１２６３４、もしくは１２６６２〜１２６６４、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化マイナス鎖ＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、食道腺癌試料または低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット試料での増加したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号１２４８５〜１２４９０、１２５２１〜１２５２６、１２５５７〜１２５６２、１２５９３〜１２５９８、１２２６９〜１２６３４、もしくは１２６６２〜１２６６４、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のうちのいずれか１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、情報価値のある遺伝子座は、バレット食道を有する対象から採取した同じタイプの試料と比べた場合、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連している。一部の実施形態では、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号１３８５６〜１４０９２、１５２７８〜１５５１４、１５６３０〜１５６５２、１５８５３〜１５８９２、１６０９３〜１６１３２、１６１５８〜１６１６２、１６１７８〜１６１８０、１６１９６〜１６１９８、もしくは１６２０４、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換されたメチル化マイナス鎖ＤＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、食道腺癌試料での減少したメチル化に関連している情報価値のある遺伝子座は、配列番号１６１７８〜１６１８０、１６１９６〜１６１９８、もしくは１６２０４、またはその断片もしくは相補体に対して少なくとも８０％、８５％、８７％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列のいずれか１つまたは複数を含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、本開示は、以下の：Ｕｐ３、Ｕｐ１０、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ１５−２、Ｕｐ２０−１、Ｕｐ２０−２、Ｕｐ２０−２、Ｕｐ２７、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、ＳｑＢＥ２、ＳｑＢＥ５、ＳｑＢＥ７、ＳｑＢＥ９、ＳｑＢＥ１０、ＳｑＢＥ１１−１、ＳｑＢＥ１１−２、ＳｑＢＥ１３、ＳｑＢＥ１４−２、ＳｑＢＥ１５、ＳｑＢＥ１６−１、ＳｑＢＥ１６−２、ＳｑＢＥ１７−１、ＳｑＢＥ１８、ＳｑＢＥ２２−１、ＳｑＢＥ２２−２またはＳｑＢＥ２３のいずれか１つの亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を提供する。特定の実施形態では、配列は、以下の：Ｕｐ３、Ｕｐ１０、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ１５−２、Ｕｐ２０−１、Ｕｐ２０−２、Ｕｐ２０−２、Ｕｐ２７、Ｕｐ３５−１、またはＵｐ３５−２のいずれか１つの亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、配列は、以下の：ＳｑＢＥ２、ＳｑＢＥ５、ＳｑＢＥ７、ＳｑＢＥ９、ＳｑＢＥ１０、ＳｑＢＥ１１−１、ＳｑＢＥ１１−２、ＳｑＢＥ１３、ＳｑＢＥ１４−２、ＳｑＢＥ１５、ＳｑＢＥ１６−１、ＳｑＢＥ１６−２、ＳｑＢＥ１７−１、ＳｑＢＥ１８、ＳｑＢＥ２２−１、ＳｑＢＥ２２−２またはＳｑＢＥ２３のいずれか１つの亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、本開示は本明細書で開示される配列のいずれかのパネルを提供する。一部の実施形態では、パネルは、配列の以下の組合せ：ａ）Ｕｐ３、Ｕｐ１０、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ１５−２、Ｕｐ２０−１、Ｕｐ２０−２、Ｕｐ２７、Ｕｐ３５−１、およびＵｐ３５−２；ｂ）Ｕｐ３、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ１５−２、Ｕｐ２０−１、Ｕｐ２７、およびＵｐ３５−１；ｃ）Ｕｐ１０、Ｕｐ３、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ１５−２、Ｕｐ２０−１、Ｕｐ２７、およびＵｐ３５−１；ｄ）Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ１５−２、Ｕｐ２０−１、Ｕｐ２７およびＵｐ３５−１；ｅ）Ｕｐ１５−１およびＵｐ３５−１；ｆ）Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、およびＵｐ１０；ｇ）Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１およびＵｐ２０−１；ｈ）Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ１０、およびＵｐ１５−２；ｉ）Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ１０、およびＵｐ２７；ｊ）Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ１５−２、およびＵｐ２０−１；ｋ）Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ１５−２およびＵｐ２７；ｌ）Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ２０−１、およびＵｐ２７；ｍ）Ｕｐ３およびＵｐ３５−１；ｎ）Ｕｐ３およびＵｐ３５−２；ｏ）Ｕｐ３およびＵｐ１０；ｐ）Ｕｐ３およびＵｐ２７；ｑ）Ｕｐ３５−１およびＵｐ３５−２；ｒ）Ｕｐ３５−１およびＵｐ２７；ｓ）Ｕｐ３５−２およびＵｐ１０；ｔ）Ｕｐ１０およびＵｐ２７；ｕ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−１およびＵｐ３５−２；ｖ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−１およびＵｐ１０；ｗ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−１、およびＵｐ２７；ｘ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−２およびＵｐ１０；ｙ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−２、およびＵｐ２７；ｚ）Ｕｐ３、Ｕｐ１０、およびＵｐ２７；ａａ）Ｕｐ３５−１、Ｕｐ１０、およびＵｐ２７；ａｂ）Ｕｐ３５−２、Ｕｐ１０、およびＵｐ２７；ａｃ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２およびＵｐ１０；ａｄ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２およびＵｐ２７；ａｅ）Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ１０およびＵｐ２７；ａｆ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ１０およびＵｐ２７；ａｇ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ１０およびＵｐ２７；ａｈ）Ｕｐ３、Ｕｐ１０、Ｕｐ２７、Ｕｐ３５−１、およびＵｐ３５−２；ａｉ）Ｕｐ３５−１およびＵｐ１０、ａｊ）Ｕｐ３５−１およびＵｐ２７；ａｋ）Ｕｐ３５−２およびＵｐ１０；ａｌ）Ｕｐ３５−２およびＵｐ２７；ａｍ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−１およびＵｐ３５−２；ａｎ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−１、およびＵｐ１０；ａｏ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−１、およびＵｐ２７；ａｐ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−２およびＵｐ１０；ａｑ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−２およびＵｐ２７；ａｒ）Ｕｐ３、Ｕｐ１０およびＵｐ２７；ａｔ）Ｕｐ３５−１、Ｕｐ１０、およびＵｐ２７；ａｕ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、およびＵｐ１０；ａｖ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２およびＵｐ２７；ａｗ）Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ１０およびＵｐ２７；ａｘ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ１０およびＵｐ２７；ａｙ）Ｕｐ３、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ１０およびＵｐ２７；ａｚ）Ｕｐ３、Ｕｐ１０、Ｕｐ２７、Ｕｐ３５−１、およびＵｐ３５−２；ｂａ）ＳｑＢＥ５およびＳｑＢＥ７；ｂｂ）ＳｑＢＥ５およびＳｑＢＥ１６；ｂｃ）ＳｑＢＥ５およびＳｑＢＥ１７；ｂｄ）ＳｑＢＥ５およびＳｑＢＥ１８；ｂｅ）ＳｑＢＥ７およびＳｑＢＥ１６；ｂｆ）ＳｑＢＥ７およびＳｑＢＥ１７；ＳｑＢＥ７およびＳｑＢＥ１７；ｂｇ）ＳｑＢＥ７およびＳｑＢＥ１８；ｂｈ）ＳｑＢＥ１６およびＳｑＢＥ１７ならびにｂｉ）ＳｑＢＥ１６およびＳｑＢＥ１８のいずれかを含む。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるパネルのいずれかでの配列のメチル化状態を検出する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示されるパネルのいずれかでの配列のメチル化状態を検出する方法を提供し、ｐ５３の突然変異状態を検出することをさらに含む。特定の実施形態では、本開示は、ａ）Ｕｐ−３およびＵｐ３５−２の配列を含むパネルのメチル化状態を検出し、ｂ）ＴＰ５３の突然変異状態をさらに検出する方法を提供する。
【０１０３】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書で開示される遺伝子座のいずれかのメチル化状態を検出する方法を提供し、ビメンチンのメチル化状態を検出することをさらに含む。一部の実施形態では、ビメンチンメチル化は、Liら（Li  Mら、（２００９年）Sensitive  digital  quantification  of  DNA  methylation  in  clinical  samples.  Nat  Biotechnol  ２７巻（９号）：８５８〜８６３頁）に記載される様式と一致する様式で検出される。一部の実施形態では、ビメンチンメチル化パターンは、配列番号１６２０７または１６２０８に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列で判定される。一部の実施形態では、メチル化パターンは、以下の核酸配列組合せ：ａ）ビメンチンおよびＳＱＢＥ５；ｂ）ビメンチンおよびＳＱＢＥ７、ｃ）ビメンチンおよびＳＱＢＥ１６、ｄ）ビメンチンおよびＳＱＢＥ１７またはｅ）ビメンチンおよびＳＱＢＥ１８のいずれかで判定される。
【０１０４】
特定の実施形態では、本開示は、以下の配列：８２０９〜８２２２、８２５１〜８２６４、８２９３〜８３０６、８３３５〜８３４８、８４０５〜８４０９、８４２０〜８４２４、１２５６３〜１２５６８、１２５８１〜１２５８６、１２５９９〜１２６０４、１２６１７〜１２６２２、１２６４７〜１２６４９もしくは１２６５６〜１２６５８、またはその断片および／もしくは逆相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列を提供する。特定の実施形態では、本開示は、以下の配列：１２５６３〜１２５６８、１２５８１〜１２５８６、１２５９９〜１２６０４、１２６１７〜１２６２２、１２６４７〜１２６４９もしくは１２６５６〜１２６５８、またはその断片および／もしくは逆相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列を提供する。特定の実施形態では、本開示は、以下の配列：８２０９〜８２２２、８２５１〜８２６４、８２９３〜８３０６、８３３５〜８３４８、８４０５〜８４０９、もしくは８４２０〜８４２４、またはその断片および／もしくは逆相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含むヌクレオチド配列を提供する。
【０１０５】
一部の実施形態では、本開示は、以下の配列：配列番号８３０７〜８３１３、８３１５〜８３２７、８３２９〜８３３４、８３４９〜８３５５、８３５７〜８３６９、８３７１〜８３７６、８４１１、８４１２、８４１４、８４１６、８４１７、８４１９、８４２６、８４２７、８４２９、８４３１、８４３２、８４３４、１２６０５〜１２６１６、１２６２３〜１２６３４、１２６５０〜１２６５５、もしくは１２６５９〜１２６６４、またはその断片および／もしくは逆相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、配列は、以下の配列：配列番号８３０７〜８３１３、８３１５〜８３２７、８３２９〜８３３４、８３４９〜８３５５、８３５７〜８３６９、８３７１〜８３７６、８４１１、８４１２、８４１４、８４１６、８４１７、８４１９、８４２６、８４２７、８４２９、８４３１、または８４３２、８４３４のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、配列は、以下の配列：配列番号１２６０５〜１２６１６、１２６２３〜１２６３４、１２６５０〜１２６５５、または１２６５９〜１２６６４のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む。
【０１０６】
一部の実施形態では、本開示は、以下の配列：配列番号８２２３〜８２５０、８２６５〜８２９２、１２５６９〜１２５８０、もしくは１２５８７〜１２５９８、またはその断片および／もしくは逆相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、配列は、以下の配列：配列番号８２２３〜８２５０または８２６５〜８２９２のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、配列は、以下の配列：配列番号１２５６９〜１２５８０または１２５８７〜１２５９８のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、本明細書で開示される方法のいずれかにおいて使用するための試料は対象から採取される組織試料である。一部の実施形態では、試料は食道由来の組織試料である。一部の実施形態では、試料は生検または擦過物である。一部の実施形態では、試料は食道の生検または擦過物である。一部の実施形態では、試料は体液である。一部の実施形態では、体液は血液、血清、唾液、つば、便、尿または食道洗液である。
【０１０８】
本開示は、個体から生体試料を得て、その試料中での本明細書で開示される配列のいずれかの少なくとも１つにおけるＤＮＡメチル化の存在を判定することによりバレット食道、異形成のあるバレット食道（例えば、低悪性度もしくは高悪性度異形成のあるバレット食道）の、または食道腺癌の存在を判定するために、診断手順を受ける個体を選択する方法を想定している。一部の実施形態では、本開示は、食道新生物のモニタリングのための対象を選択する方法であって、本明細書で開示される配列のいずれかの少なくとも１つにおけるＤＮＡメチル化の存在が対象由来の試料中で検出される方法を提供する。一部の実施形態では、検出は、ＤＮＡ配列決定、次世代配列決定、メチル化特異的ＰＣＲ、蛍光発生的ハイブリダイゼーションプローブと組み合わせたメチル化特異的ＰＣＲ、リアルタイムメチル化特異的ＰＣＲ、またはアレイへのハイブリダイゼーションのいずれか１つまたは複数により達成される。一部の実施形態では、試料中での検出は、対象が食道新生物（例えば、食道がん）への進行のリスクが高いことを示している。一部の実施形態では、対象は内視鏡検査によりモニタリングされる。一部の実施形態では、本明細書で開示される配列のいずれかの少なくとも１つのＤＮＡメチル化が検出される対象由来の試料は、対象が特定の処置を施されるべきであることを示している。一部の実施形態では、処置は食道新生物の内視鏡的除去術もしくは焼灼、および／または食道腺癌の外科手術、放射線、もしくは化学療法処置からなる群から選択される。一部の実施形態では、配列は、以下の配列：配列番号１〜８５６、２５６９〜３４２４、５１３７〜５９２６；７５０７〜７５５８、７６６３〜７７１４、７８１９〜７８６６、７９６３〜７９９０、８０４７〜８０７４、８１３１〜８１５６、８２０９〜８２２２、８２５１〜８２６４、８２９３〜８３０６、８３３５〜８３４８、８４０５〜８４０９、および８４２０〜８４２４、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の配列である。
【０１０９】
本開示は、個体から生体試料を得て、その試料中での本明細書で開示される配列のいずれかの少なくとも１つにおけるＤＮＡメチル化の存在を判定することにより低悪性度異形成のあるバレット食道、高悪性度異形成のあるバレット食道、または食道腺癌の存在を判定するために、診断手順を受ける個体を選択する方法も想定している。一部の実施形態では、配列は、以下の配列：配列番号８４４７〜８８１８、９５６３〜９９３４、１０６７９〜１０９７２、１１５６１〜１１６６２、１１８６７〜１１９６８、１２１７３〜１２２６６、１２４５５〜１２４６６、１２４９１〜１２５０２、１２５２７〜１２５３８、１２５６３〜１２５６８、１２５８１〜１２５８６、１２５９９〜１２６０４、１２６１７〜１２６２２、１２６４７〜１２６４９、もしくは１２６５６〜１２６５８、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の配列である。本開示は、方法が試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の状態を判定するステップをさらに含んでもよいことをさらに想定している。例えば、試料中の染色体遺伝子座、例えば、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、およびＵｐ１０のメチル化の状態を判定するステップと、試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の存在または非存在を判定するステップとを含む方法が想定されている。
【０１１０】
本開示は、方法が試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の状態を判定するステップをさらに含んでもよいことをさらに想定している。例えば、試料中の染色体遺伝子座、例えば、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、およびＵｐ１０のメチル化の状態を判定するステップと、試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の存在または非存在を判定するステップとを含む方法が想定されている。ある特定の実施形態では、方法は必要に応じて、ＴＰ５３での体細胞突然変異の存在または非存在を検出するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＴＰ５３体細胞突然変異は、本明細書に記載されるように、配列番号１６２０５のアミノ酸残基７２、１０５、１０８、１１０、１１３、１２４、１２７、１３２、１４４、１５２、１６３、１７５、１８３、１９４、２１３、２１４、２１８、２３２、２３４、２４８、２６５、２７３、２７８、３０６、３３７、３４７、または６３９に対応するいずれか１つまたは複数のアミノ酸残基でのいずれか１つまたは複数の突然変異である。ある特定の実施形態では、ＴＰ５３体細胞突然変異は、当技術分野で公知の任意の非同義体細胞突然変異である。ある特定の実施形態では、ＴＰ５３体細胞突然変異は、配列番号１６２０５のＬｅｕ１９４Ａｒｇ、Ｇｌｙ１０５Ａｓｐ、Ａｒｇ２７３Ｈｉｓ、Ｔｙｒ１６３Ｈｉｓ、Ｉｌｅ２３２Ｔｈｒ、Ａｒｇ２１３Ｔｅｒ、Ａｒｇ２７３Ｈｉｓ、Ａｒｇ２４８Ｇｌｎ、Ａｒｇ１７５Ｈｉｓ、Ａｒｇ１１０ｄｅｌｉｎｓＧｌｎＳｅｒ、Ｓｅｒ１８３Ｔｅｒ、Ａｒｇ２４８Ｇｌｎ、Ａｒｇ３３７Ｌｅｕ、Ｌｙｓ１３２Ａｒｇ、Ｌｅｕ２６５ＴｈｒｆｓＴｅｒ７、Ａｒｇ３０６Ｔｅｒ、Ｃｙｓ１２４ＴｒｐｆｓＴｅｒ２５、Ｐｒｏ７２Ａｒｇ、Ｖａｌ２１８Ｇｌｕ、Ｈｉｓ２１４Ｌｅｕ、Ｇｌｎ１４４Ｔｅｒ、Ｐｈｅ１１３Ｓｅｒ、Ｔｙｒ２３４Ｈｉｓ、Ｓｅｒ１２７Ｐｈｅ、Ｐｒｏ２７８Ａｌａ、Ａｌａ３４７Ｔｈｒ、およびＰｒｏ１５２Ｌｅｕからなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の突然変異である。ある特定の実施形態では、ＴＰ５３突然変異は、配列番号１６２０６のヌクレオチド位置１０８、２１５、３１４、３３８、３８０、３９５、４３０、４５５、４８７、５２４、５４８、５８１、６３７、６３９、６４１、６５３、６９５、７００、７４３、８１８、８３２、９１６、１０１０、または１０３９に対応するいずれか１つまたは複数のヌクレオチド位置でのいずれか１つまたは複数の非同義体細胞突然変異である。
【０１１１】
本開示は、個体から生体試料を得て、その試料中での本明細書で開示される配列のいずれかの少なくとも１つにおけるＤＮＡメチル化の存在を判定することによりバレット食道、低悪性度異形成のあるバレット食道、高悪性度異形成のあるバレット食道について、または食道腺癌について処置を受ける個体を選択する方法も想定している。一部の実施形態では、配列は、以下の配列：配列番号１〜８５６、２５６９〜３４２４、５１３７〜５９２６；７５０７〜７５５８、７６６３〜７７１４、７８１９〜７８６６、７９６３〜７９９０、８０４７〜８０７４、８１３１〜８１５６、８２０９〜８２２２、８２５１〜８２６４、８２９３〜８３０６、８３３５〜８３４８、８４０５〜８４０９、もしくは８４２０〜８４２４，またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の配列である。一部の実施形態では、本開示は、方法が試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の状態を判定するステップをさらに含んでもよいことをさらに想定している。例えば、試料中の染色体遺伝子座、例えば、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、およびＵｐ１０のメチル化の状態を判定するステップと、試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の存在または非存在を判定するステップとを含む方法が想定されている。
【０１１２】
本開示は、個体から生体試料を得て、その試料中での本明細書で開示される配列のいずれかの少なくとも１つにおけるＤＮＡメチル化の存在を判定することによりバレット食道、低悪性度異形成のあるバレット食道、高悪性度異形成のあるバレット食道について、または食道腺癌について処置を受ける個体を選択する方法も想定している。一部の実施形態では、配列は、以下の配列：配列番号８４４７〜８８１８、９５６３〜９９３４、１０６７９〜１０９７２、１１５６１〜１１６６２、１１８６７〜１１９６８、１２１７３〜１２２６６、１２４５５〜１２４６６、１２４９１〜１２５０２、１２５２７〜１２５３８、１２５６３〜１２５６８、１２５８１〜１２５８６、１２５９９〜１２６０４、１２６１７〜１２６２２、１２６４７〜１２６４９、もしくは１２６５６〜１２６５８，またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の配列である。本開示は、方法が試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の状態を判定するステップをさらに含んでもよいことをさらに想定している。例えば、試料中の染色体遺伝子座、例えば、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、およびＵｐ１０のメチル化の状態を判定するステップと、試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の存在または非存在を判定するステップとを含む方法が想定されている。本開示は、個体から生体試料を得て、その試料中での本明細書で開示される配列のいずれかの少なくとも１つにおけるＤＮＡメチル化の存在を判定することにより、低悪性度異形成のあるバレット食道、高悪性度異形成のあるバレット食道の、または食道腺癌の発症について強化された監視を受ける個体を選択する方法も想定している。一部の実施形態では、配列は、以下の配列：配列番号８４４７〜８８１８、９５６３〜９９３４、１０６７９〜１０９７２、１１５６１〜１１６６２、１１８６７〜１１９６８、１２１７３〜１２２６６、１２４５５〜１２４６６、１２４９１〜１２５０２、１２５２７〜１２５３８、１２５６３〜１２５６８、１２５８１〜１２５８６、１２５９９〜１２６０４、１２６１７〜１２６２２、１２６４７〜１２６４９、もしくは１２６５６〜１２６５８，またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の配列である。本開示は、方法が試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の状態を判定するステップをさらに含んでもよいことをさらに想定している。例えば、試料中の染色体遺伝子座、例えば、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、およびＵｐ１０のメチル化の状態を判定するステップと、試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の存在または非存在を判定するステップとを含む方法が想定されている。本開示は、食道がんを有する個体から生体試料を得て、本明細書で開示される配列のいずれかの少なくとも１つにおいてメチル化の存在を判定することにより、治療に対する食道がんを有する個体の応答を判定する方法も想定している。一部の実施形態では、配列は、以下の配列：配列番号１〜８５６、２５６９〜３４２４、５１３７〜５９２６；７５０７〜７５５８、７６６３〜７７１４、７８１９〜７８６６、７９６３〜７９９０、８０４７〜８０７４、８１３１〜８１５６、８２０９〜８２２２、８２５１〜８２６４、８２９３〜８３０６、８３３５〜８３４８、８４０５〜８４０９、もしくは８４２０〜８４２４、８４４７〜８８１８、９５６３〜９９３４、１０６７９〜１０９７２；配列番号１１５６１〜１１６６２、１１８６７〜１１９６８、１２１７３〜１２２６６；配列番号１２４５５〜１２４６６、１２４９１〜１２５０２、１２５２７〜１２５３８、１２５６３〜１２５６８、１２５８１〜１２５８６、１２５９９〜１２６０４、１２６１７〜１２６２２、１２６４７〜１２６４９、および１２６５６〜１２６５８、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の配列である。一部のインプリメンテーションにおいて、経時的なメチル化のレベルの増加は、疾患進行および治療の変更（既存の治療の投与レジメンを修正すること、または新しい治療薬（単数または複数）を単独でもしくは既存の治療と組み合わせて投与することなど）の必要性を示しており、経時的なメチル化のレベルの増加がないことまたは経時的なメチル化のレベルの減少は治療の変更が必要ないことを示している。本開示は、方法が試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の状態を判定するステップをさらに含んでもよいことをさらに想定している。例えば、試料中の染色体遺伝子座、例えば、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、およびＵｐ１０のメチル化の状態を判定するステップと、試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の存在または非存在を判定するステップとを含む方法が想定されている。
【０１１３】
本開示は、個体から生体試料を得て、その試料中での本明細書で開示される配列のいずれかの少なくとも１つにおけるＤＮＡメチル化の存在を判定することにより、ＥＡＣおよび／またはＢＥ由来の低／高悪性度異形成を区別する方法も想定している。一部の実施形態では、配列は、以下の配列：配列番号８４４７〜８８１８、９５６３〜９９３４、１０６７９〜１０９７２；配列番号１１５６１〜１１６６２、１１８６７〜１１９６８、１２１７３〜１２２６６；配列番号１２４５５〜１２４６６、１２４９１〜１２５０２、１２５２７〜１２５３８、１２５６３〜１２５６８、１２５８１〜１２５８６、１２５９９〜１２６０４、１２６１７〜１２６２２、１２６４７〜１２６４９、および１２６５６〜１２６５８、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の配列である。本開示は、方法が試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の状態を判定するステップをさらに含んでもよいことをさらに想定している。例えば、試料中の染色体遺伝子座、例えば、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、およびＵｐ１０のメチル化の状態を判定するステップと、試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の存在または非存在を判定するステップとを含む方法が想定されている。ある特定の実施形態では、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、およびＵｐ１０でメチル化がないこと、ならびにＴＰ５３には体細胞突然変異がないことは非形質異常バレット食道を示している可能性がある。ある特定の実施形態では、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、およびＵｐ１０のいずれか１つにメチル化があること、またはＴＰ５３には体細胞突然変異があることは、食道腺癌または高悪性度異形成のあるバレットを示している可能性がある。
【０１１４】
本開示は、個体から生体試料を得て、その試料中での本明細書で開示される配列のいずれかの少なくとも１つにおけるＤＮＡメチル化の存在を判定することにより、ＥＡＣおよび／またはＢＥ由来の低／高悪性度異形成を区別する方法も想定している。一部の実施形態では、配列は、以下の配列：配列番号８４４７〜８８１８、９５６３〜９９３４、１０６７９〜１０９７２；配列番号１１５６１〜１１６６２、１１８６７〜１１９６８、１２１７３〜１２２６６；配列番号１２４５５〜１２４６６、１２４９１〜１２５０２、１２５２７〜１２５３８、１２５６３〜１２５６８、１２５８１〜１２５８６、１２５９９〜１２６０４、１２６１７〜１２６２２、１２６４７〜１２６４９、および１２６５６〜１２６５８，またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択されるいずれか１つまたは複数の配列である。本開示は、方法が試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の状態を判定するステップをさらに含んでもよいことをさらに想定している。例えば、試料中の染色体遺伝子座、例えば、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、およびＵｐ１０のメチル化の状態を判定するステップと、試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の存在または非存在を判定するステップとを含む方法が想定されている。ある特定の実施形態では、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、およびＵｐ１０でメチル化がないこと、ならびにＴＰ５３には体細胞突然変異がないことは非形質異常バレット食道を示している可能性がある。ある特定の実施形態では、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、およびＵｐ１０のいずれか１つにメチル化があること、またはＴＰ５３には体細胞突然変異があることは、食道腺癌を示している可能性がある。
【０１１５】
本開示は、食道新生物の進行（または後退）を経時的にモニタリングする方法も想定している。方法は、最初のときのおよび後になってからの対象由来の試料中の以下の配列：配列番号１〜８５６、２５６９〜３４２４、５１３７〜５９２６；７５０７〜７５５８、７６６３〜７７１４、７８１９〜７８６６、７９６３〜７９９０、８０４７〜８０７４、８１３１〜８１５６、８２０９〜８２２２、８２５１〜８２６４、８２９３〜８３０６、８３３５〜８３４８、８４０５〜８４０９、および８４２０〜８４２４、８４４７〜８８１８、９５６３〜９９３４、１０６７９〜１０９７２；配列番号１１５６１〜１１６６２、１１８６７〜１１９６８、１２１７３〜１２２６６；配列番号１２４５５〜１２４６６、１２４９１〜１２５０２、１２５２７〜１２５３８、１２５６３〜１２５６８、１２５８１〜１２５８６、１２５９９〜１２６０４、１２６１７〜１２６２２、１２６４７〜１２６４９、および１２６５６〜１２６５８、またはその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択される１つまたは複数のヌクレオチド配列のメチル化状態を検出するステップを含む。ある特定の実施形態では、新生物後退は、後になって採取したヌクレオチド配列にメチル化がなく、最初に採取したヌクレオチド配列にメチル化があることによって示すことができる。ある特定の実施形態では、新生物進行は、後になって採取したヌクレオチド配列にメチル化があり、最初に採取したヌクレオチド配列にメチル化がないことによって示すことができる。本開示は、方法が試料中のＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）の状態を判定するステップをさらに含んでもよいことをさらに想定している。一部の実施形態では、新生物後退は、最初の試料中でメチル化された染色体遺伝子座、例えば、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、および／もしくはＵｐ１０のメチル化があること、またはＴＰ５３での体細胞突然変異があること、ならびに後の試料中でメチル化された染色体遺伝子座がないこと、例えば、非メチル化Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、およびＵｐ１０、およびＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）がないことにより示すことができる。一部の実施形態では、新生物進行は、最初の試料中で非メチル化染色体遺伝子座、例えば、非メチル化Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、およびＵｐ１０があること、およびＴＰ５３での体細胞突然変異（単数または複数）がないこと、ならびに後の試料中でメチル化された染色体遺伝子座、例えば、メチル化されたＵｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７、および／もしくはＵｐ１０があること、またはＴＰ５３での体細胞突然変異があることにより示すことができる。
【０１１６】
本開示は、配列番号１〜８４４４および８４４７〜１６２０４、またはその断片もしくは相補体のいずれか１つまたは複数のヌクレオチド配列に高厳密条件下でハイブリダイズする配列も提供する。上で論じたように、当業者であれば、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切な厳密性条件は変動させることが可能であることを容易に理解する。当業者であれば、ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切な厳密性条件は変動させることが可能であることを容易に理解する。例えば、約４５℃、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でハイブリダイゼーションを実施し、続いて５０℃で２．０×ＳＳＣの洗浄を行うことができる。例えば、洗浄ステップでの塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低厳密性から５０℃で約０．２×ＳＳＣの高厳密性まで選択することが可能である。さらに、洗浄ステップでの温度は、約２２℃の室温での低厳密性条件から、約６５℃での高厳密性条件まで増やすことが可能である。温度と塩分の両方を変化させてもよく、または温度もしくは塩濃度を一定に保っておいて、もう一方の変数を変化させてもよい。一実施形態では、本開示は、室温で６×ＳＳＣの低厳密性条件下でハイブリダイズして、続いて室温で２×ＳＳＣで洗浄する核酸を提供する。
【０１１７】
他の実施形態では、本開示は、配列番号１〜８４４４および８４４７〜１６２０４、またはその断片のいずれか１つまたは複数のヌクレオチド配列のメチル化形態も提供し、配列中に存在するＣｐＧアイランドのシトシン塩基がメチル化されている。言い換えると、配列番号１〜８４４４もしくは８４４７〜１６２０４、またはその断片もしくは相補体のいずれか１つまたは複数の収載されているヌクレオチド配列は、メチル化状態（例えば、新生物に見られる）であってもよくまたは非メチル化状態（例えば、正常細胞に見られる）であってもよい。さらなる実施形態では、本開示のヌクレオチド配列は単離され得る、組換え体であり得る、および／または異種ヌクレオチド配列と融合させることが可能である、またはＤＮＡライブラリー中にあることが可能である。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、本開示は、亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列、例えば、本明細書で開示される配列のいずれかから選択される亜硫酸水素塩で変換された配列を提供する。一部の実施形態では、配列は、以下の配列：配列番号８５７〜２５６８、３４２５〜５１３６、５９２７〜７５０６、７５５９〜７６６２、７７１５〜７８１８、７８６７〜７９６２、７９９１〜８０４６、８０７５〜８１３０、８１５７〜８２０８、８２２３〜８２５０、８２６５〜８２９２、８３０７〜８３３４、８３４９〜８３７６、８４１０〜８４１９、８４２５〜８４３４，および／またはその断片、および／またはその逆相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択される。さらに他の実施形態では、本開示は、以下の配列：配列番号８８１９〜９５６２、９９３５〜１０６７８、１０９７３〜１１５６０；１１６６３〜１１８６６、１１９６９〜１２１７２、１２２６７〜１２４５４；１２４６７〜１２４９０、１２５０３〜１２５２６、１２５３９〜１２５６２、１２５６９〜１２５８０、１２５８７〜１２５９８、１２６０５〜１２６１６、１２６２３〜１２６３４、１２６５０〜１２６５５、および１２６５９〜１２６６４，および／またはその断片、および／またはその逆相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択される亜硫酸水素塩で変換された配列を提供する。さらに他の実施形態では、本開示は、以下の配列：配列番号１３１４５〜１４０９２、１４５６７〜１５５１４、１５５６１〜１５６５２；１５７３３〜１５８９２、１５９７３〜１６１３２、１６１４３〜１６１６２；１６１６９〜１６１８０、１６１８７〜１６１９８、および１６２０１〜１６２０４、および／またはその断片、および／またはその逆相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択される亜硫酸水素塩で変換された配列を提供する。
【０１１９】
本明細書で開示されるヌクレオチド配列のいずれかの断片／部分は、そのヌクレオチド配列のメチル化状態を判定しうる限り、いかなる長さでもよい。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は少なくとも１０、１５、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１５００、１７００、または２０００ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は少なくとも１０〜２０００、１０〜１０００、１０〜５００、１０〜２００、１０〜１５０、１０〜１００、５０〜２０００、５０〜１０００、５０〜５００、５０〜２００、５０〜１５０、５０〜１００、８０〜２０００、８０〜１０００、８０〜５００、８０〜１５０、８０〜１００、１００〜２０００、１００〜１０００、１００〜５００、１００〜２００、または１００〜１５０ヌクレオチド長である。
【０１２０】
そのような亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列は、例えば、ＭＳＰ反応によりまたは直接配列決定（例えば、次世代配列決定）によりメチル化状態を検出するために使用することが可能である。これらの亜硫酸水素塩で変換された配列は、亜硫酸水素塩変換に続いてメチル化または非メチル化ヌクレオチド配列を特異的に検出するＭＳＰ反応用のプライマーを設計するためにも有用である。さらに他の実施形態では、本開示の亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列は、配列番号１〜８４４４および８４４７〜１６２０４、またはその断片もしくは相補体のいずれか１つまたは複数の任意のヌクレオチド配列に高厳密性条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列も含む。
【０１２１】
さらなる態様では、本出願はそのような亜硫酸水素塩で変換されたヌクレオチド配列を作成するための方法を提供し、例えば、本出願は、非メチル化シトシン塩基がウラシルなどの異なるヌクレオチド塩基に変換されるように、ヌクレオチド配列を亜硫酸水素塩剤で処理するための方法を提供する。
【０１２２】
さらに他の態様では、本出願は、配列番号１〜８４４４および８４４７〜１６２０４のいずれか１つまたは複数の核酸配列内の領域を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドプライマーの対をＨｐａＩＩアッセイなどの検出アッセイにおいて使用することが可能である。ある特定の態様では、ＭＳＰ反応において使用されるプライマーはメチル化および非メチル化ＤＮＡを特異的に区別することが可能である。
【０１２３】
本開示のプライマーは、増幅核酸の特定の開始をもたらすように十分な長さおよび適切な配列を有する。本開示のプライマーは、増幅される核酸配列のそれぞれの鎖に「実質的に」相補的であるように設計される。一部の実施形態では、プライマーは、配列番号８３７７〜８４０４、８４３５〜８４４６、１２６３５〜１２６４６、および１２６６５〜１２６７０のいずれかに対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列からなる群から選択される。一部の実施形態では、プライマーは、配列番号８３７７〜８４０４、８４３５〜８４４６、１２６３５〜１２６４６、および１２６６５〜１２６７０のプライマー配列のいずれかの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５連続するヌクレオチドを含む。例示的なプライマーは、配列番号８３７７〜８４０４、８４３５〜８４４６、１２６３５〜１２６４６、および１２６６５〜１２６７０、またはその断片のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する任意の配列の配列を含むが、配列番号１〜８４４４および８４４７〜１６２０４のいずれか１つまたは複数の亜硫酸水素塩で変換された配列とハイブリダイズするいかなるプライマーも、記載されている通りに、本開示の範囲内に含まれ、メチル化核酸を検出するための本開示の方法において有用であると理解される。同様に、配列番号１〜８４４４および８４４７〜１６２０４、またはその断片もしくは相補体の配列のいずれかの情報価値のある遺伝子座の差次的にメチル化された領域内でメチル化感受性制限部位（単数または複数）を増幅するのに役立つと考えられるいかなるプライマーも、記載されている通りに、本開示の範囲内に含まれ、核メチル化核酸を検出するための本開示の方法において有用であると理解される。
【０１２４】
本開示のオリゴヌクレオチドプライマーは、従来のリン酸トリエステルおよびリン酸ジエステル法またはその自動化された実施形態などの任意の適切な方法を使用することにより調製してもよい。１つのそのような自動化された実施形態では、ジエチルホスホラミダイトは出発材料として使用され、Beaucageら、（Tetrahedron  Letters、２２巻：１８５９〜１８６２頁、１９８１年）により記載される通りに合成してもよい。改質固形支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する１つの方法は米国特許第４，４５８，０６６号に記載されている。
【０１２５】
ＩＶ．アッセイおよび薬物スクリーニング方法論
ある特定の態様では、本出願は、本明細書に開示される、情報を提供する遺伝子座、またはその亜硫酸水素塩で変換されたメチル化もしくは非メチル化配列のいずれかを使用したアッセイおよび方法を提供する。一部の実施形態では、情報を提供する遺伝子座は、配列番号１〜４２８、２５６９〜２９９６、５１３７〜５５３１、７５０７〜７５３２、７６６３〜７６６８、７８１９〜７８４２、７９６３〜７９７６、８０４７〜８０６０、８１３１〜８１４３、８２０９〜８２２２、８２９３〜８３０６、８４０５〜８４０９、８４４７〜８６３２、９５６３〜９７４８、１０６７９〜１０８２５、１１５６１〜１１６１１、１１８６７〜１１９１７、１２１７３〜１２２１９、１２４５５〜１２４６０、１２４９１〜１２４９６、１２５２７〜１２５３２、１２５６３〜１２５６８、１２５９９〜１２６０４、１２６４７〜１２６４９、１２６７１〜１２９０８、１４０９３〜１４３２９、１５５１５〜１５５３７、１５６５３〜１５６９２、１５８９３〜１５９３２、１６１３３〜１６１３７、１６１６３〜１６１６５、１６１８１〜１６１８３、１６１９９、４２９〜８５６、２９９７〜３４２４、５５３２〜５９２６、７５３３〜７５５８、７６８９〜７７１４、７８４３〜７８６６、７９７７〜７９９０、８０６１〜８０７４、８１４４〜８１５６、８２５１〜８２６４、８３３５〜８３４８、８４２０〜８４２４、８６３３〜８８１８、９７４９〜９９３４、１０８２６〜１０９７２、１１６１２〜１１６６２、１１９１８〜１１９６８、１２２２０〜１２２６６、１２４６１〜１２４６６、１２４９７〜１２５０２、１２５３３〜１２５３８、１２５８１〜１２５８６、１２６１７〜１２６２２、１２６５６〜１２６５８、１２９０９〜１３１４４、１４３３０〜１４５６６、１５５３８〜１５５６０、１５６９３〜１５７３２、１５９３３〜１５９７２、１６１３８〜１６１４２、１６１６６〜１６１６８、１６１８４〜１６１８６  ｏｒ  １６２００の配列、または任意のその断片もしくは相補体のいずれかに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、情報を提供する遺伝子座は、健康な細胞と化生細胞（例えば、バレット食道細胞）を識別する分子マーカーとして使用される。一部の実施形態では、情報を提供する遺伝子座は、健康な細胞と新生物細胞（例えば、がん細胞）を識別する分子マーカーとして使用される。特定の実施形態では、情報を提供する遺伝子座は、健康な細胞と食道腺癌細胞を識別する分子マーカーとして使用される。一部の実施形態では、情報を提供する遺伝子座は、バレット食道細胞とがん細胞を識別する分子マーカーとして使用される。一部の実施形態では、情報を提供する遺伝子座は、バレット食道細胞と食道腺癌細胞を識別する分子マーカーとして使用される。例えば、一実施形態では、本出願は、配列番号８４４７〜８８１８、９５６３〜９９３４、１０６７９〜１０９７２、１１５６１〜１１６６２、１１８６７〜１１９６８、１２１７３〜１２２６６、１２４５５〜１２４６６、１２４９１〜１２５０２、１２５２７〜１��５３８、１２５６３〜１２５６８、１２５８１〜１２５８６、１２５９９〜１２６０４、１２６１７〜１２６２２、１２６４７〜１２６４９または１２６５６〜１２６５８、または任意のその断片もしくは相補体のいずれか１つもしくは複数に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む情報を提供する遺伝子座のいずれかを、健康な細胞と新生物細胞を識別するマーカーとして使用する方法およびアッセイを提供する。他の実施形態では、本出願は、配列番号１〜８５６、２５６９〜３４２４、５１３７〜５９２６、７５０７〜７５５８、７６６３〜７７１４、７８１９〜７８６６、７９６３〜７９９０、８０４７〜８０４７、８１３１〜８１５６、８２０９〜８２２２、８２５１〜８２６４、８２９３〜８３０６、８３３５〜８３４８、８４０５〜８４０９、８４２０〜８４２４、８４４７〜８８１８、９５６３〜９９３４、１０６７９〜１０９７２、１１５６１〜１１６６２、１１８６７〜１１９６８、１２１７３〜１２２６６、１２４５５〜１２４６６、１２４９１〜１２５０２、１２５２７〜１２５３８、１２５６３〜１２５６８、１２５８１〜１２５８６、１２５９９〜１２６０４、１２６１７〜１２６２２、１２６４７〜１２６４９、１２６５６〜１２６５８、１２６７１〜１３１４４、１４０９３〜１４５６６、１５５１５〜１５５６０、１５６５３〜１５７３２、１５８９３〜１５９７２、１６１３５〜１６１４２、１６１６３〜１６１６８、１６１８１〜１６１８６および／もしくは１６１９９〜１６２００、または任意のその断片もしくは相補体のいずれか１つもしくは複数に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む情報を提供する遺伝子座を、健康な細胞と上部胃腸管の新生物に由来する細胞を識別するマーカーとして使用する方法およびアッセイを提供する。一態様では、本発明の分子マーカーは、情報を提供する遺伝子座の差別的にメチル化された配列である。ある特定の態様では、本出願は、配列番号１〜８５６、２５６９〜３４２４、５１３７〜５９２６、７５０７〜７５５８、７６６３〜７７１４、７８１９〜７８６６、７９６３〜７９９０、８０４７〜８０４７、８１３１〜８１５６、８２０９〜８２２２、８２５１〜８２６４、８２９３〜８３０６、８３３５〜８３４８、８４０５〜８４０９、８４２０〜８４２４、８４４７〜８８１８、９５６３〜９９３４、１０６７９〜１０９７２、１１５６１〜１１６６２、１１８６７〜１１９６８、１２１７３〜１２２６６、１２４５５〜１２４６６、１２４９１〜１２５０２、１２５２７〜１２５３８、１２５６３〜１２５６８、１２５８１〜１２５８６、１２５９９〜１２６０４、１２６１７〜１２６２２、１２６４７〜１２６４９、１２６５６〜１２６５８、１２６７１〜１３１４４、１４０９３〜１４５６６、１５５１５〜１５５６０、１５６５３〜１５７３２、１５８９３〜１５９７２、１６１３５〜１６１４２、１６１６３〜１６１６８、１６１８１〜１６１８６および／もしくは１��１９９〜１６２００、または任意のその断片もしくは相補体のいずれか１つもしくは複数に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む情報を提供する遺伝子座を、健康な細胞とがん細胞を識別する分子マーカーとして、ＴＰ５３における体細胞突然変異（単数または複数）の状態と組み合わせて使用するアッセイおよび方法を提供する。例えば、一実施形態では、本出願は、配列番号１〜８５６、２５６９〜３４２４、５１３７〜５９２６、７５０７〜７５５８、７６６３〜７７１４、７８１９〜７８６６、７９６３〜７９９０、８０４７〜８０４７、８１３１〜８１５６、８２０９〜８２２２、８２５１〜８２６４、８２９３〜８３０６、８３３５〜８３４８、８４０５〜８４０９、８４２０〜８４２４、８４４７〜８８１８、９５６３〜９９３４、１０６７９〜１０９７２、１１５６１〜１１６６２、１１８６７〜１１９６８、１２１７３〜１２２６６、１２４５５〜１２４６６、１２４９１〜１２５０２、１２５２７〜１２５３８、１２５６３〜１２５６８、１２５８１〜１２５８６、１２５９９〜１２６０４、１２６１７〜１２６２２、１２６４７〜１２６４９、１２６５６〜１２６５８、１２６７１〜１３１４４、１４０９３〜１４５６６、１５５１５〜１５５６０、１５６５３〜１５７３２、１５８９３〜１５９７２、１６１３５〜１６１４２、１６１６３〜１６１６８、１６１８１〜１６１８６および／もしくは１６１９９〜１６２００、または任意のその断片もしくは相補体のいずれか１つもしくは複数に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する配列を含む情報を提供する遺伝子座、ならびにＴＰ５３における体細胞突然変異（単数または複数）の状態を、健康な細胞と新生物細胞（例えば、がん／食道腺癌細胞）を識別する分子マーカーとして使用する方法およびアッセイを提供する。他の実施形態では、本出願は、本明細書に開示される情報を提供する遺伝子座（例えば、染色体遺伝子座Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２、Ｕｐ３、Ｕｐ２７およびＵｐ１０）およびＴＰ５３における体細胞突然変異（単数または複数）の状態を、健康な細胞と上部胃腸管の新生物に由来する細胞を識別するマーカーとして使用する方法およびアッセイを提供する。一態様では、本発明の分子マーカーは、情報を提供する遺伝子座の差別的にメチル化された配列である。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、本出願は、差別的にメチル化されたヌクレオチド配列（例えば、ビメンチンおよび／またはＳｑＢＥ１８）を検出するためのアッセイを提供する。したがって、差別的にメチル化されたヌクレオチド配列は、そのメチル化状態においては、本明細書に記載される様々な方法、および本出願の教示を考慮すれば当業者の視野の中に十分ある方法を使用した検出のための標的の役割をすることができる。
【０１２７】
ある特定の態様では、メチル化ヌクレオチド配列（例えば、ビメンチンおよび／またはＳｑＢＥ１８）を検出するためのそのような方法は、メチル化Ｃ（すなわち、５ｍＣ）ではなく非メチル化Ｃを異なるヌクレオチド塩基に変換する化合物によるゲノムＤＮＡの処理に基づく。１つのそのような化合物は、５ｍＣではなくＣをＵに変換する亜硫酸水素ナトリウム（本明細書では単に「亜硫酸水素塩」とも呼ばれる）である。ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理のための方法が、当技術分野で公知である（Hermanら、１９９６年、Proc  Natl  Acad  Sci  USA、９３巻：９８２１〜６頁；HermanおよびBaylin、１９９８年、Current  Protocols  in  Human  Genetics、N.  E.  A.  Dracopoli編、John  Wiley  &  Sons、２巻：１０．６．１〜１０．６．１０；米国特許第５，７８６，１４６号）。例示すると、非メチル化Ｃヌクレオチドを含有するＤＮＡ分子を亜硫酸水素ナトリウムで処理して化合物変換ＤＮＡになるとき、そのＤＮＡの配列が変化する（ＣからＵ）。変換されたヌクレオチド配列におけるＵの検出は、非メチル化Ｃを示す。
【０１２８】
化合物変換ヌクレオチド配列に存在する異なるヌクレオチド塩基（例えば、Ｕ）は、様々な方法でその後検出することができる。特定の実施形態では、本発明は、「メチル化感受性ＰＣＲ」（ＭＳＰ）を使用して化合物変換ＤＮＡ配列中のＵを検出する方法を提供する（例えば、Hermanら、１９９６年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９３巻：９８２１〜９８２６頁；米国特許第６，２６５，１７１号；米国特許第６，０１７，７０４号；米国特許第６，２００，７５６号を参照）。ＭＳＰでは、ＤＮＡの中のＣｐＧジヌクレオチドにおけるＣ塩基がメチル化されるならば、１セットのプライマー（すなわち、フォワードおよびリバースプライマーを含む）が化合物変換鋳型配列を増幅する。このプライマーセットは、「メチル化特異的プライマー」と呼ばれる。５’隣接配列の中のＣｐＧジヌクレオチドにおけるＣ塩基がメチル化されないならば、別のプライマーセットが化合物変換鋳型配列を増幅する。このプライマーセットは、「非メチル化特異的プライマー」と呼ばれる。
【０１２９】
ＭＳＰでは、反応は、対象の試料からの化合物変換ＤＮＡを使用する。メチル化ＤＮＡのためのアッセイでは、メチル化特異的プライマーが使用される。ＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチドの中のＣがメチル化される場合には、ポリメラーゼの存在下でメチル化特異的プライマーが化合物変換鋳型配列を増幅し、ＭＳＰ生成物が生成される。ＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチドの中のＣがメチル化されない場合には、ポリメラーゼの存在下でメチル化特異的プライマーは化合物変換鋳型配列を増幅せず、ＭＳＰ生成物は生成されない。一部の実施形態では、本明細書に開示される亜硫酸水素塩で変換されたメチル化配列のいずれも、特定の適応症のためのマーカーとして使用される。
【０１３０】
非メチル化ＤＮＡの検出のために対照反応を実行することも、しばしば有益である。反応は、対象の試料からの化合物変換ＤＮＡを使用し、非メチル化特異的プライマーが使用される。ＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチドの中のＣがメチル化されない場合には、ポリメラーゼの存在下で非メチル化特異的プライマーが化合物変換鋳型配列を増幅し、ＭＳＰ生成物が生成される。ＤＮＡの標的配列のＣｐＧジヌクレオチドの中のＣがメチル化される場合には、ポリメラーゼの存在下で非メチル化特異的プライマーは化合物変換鋳型配列を増幅せず、ＭＳＰ生成物は生成されない。生体試料は、メチル化特異的プライマーによるシグナルを生成する新生物細胞と、非メチル化特異的プライマーによるシグナルを生成する正常な細胞性エレメントの両方の混合物をしばしば含有することに留意する。非メチル化特異的シグナルは対照反応としてしばしば有用であるが、この場合、メチル化特異的プライマーを使用した反応に由来する陽性シグナルによって示される通りに新生物の不在を暗示していない。一部の実施形態では、本明細書に開示される亜硫酸水素塩で変換された非メチル化配列のいずれも、対照として使用される。一部の実施形態では、非メチル化対照配列は、あらゆる「Ｙ」位置が「Ｔ」である、配列番号８５７〜１２８４、３４２５〜３８５２、５９２７〜６３２１、７５５９〜７５８４、７７１５〜７７４０、７８６７〜７８９０、７９９１〜８００４、８０７５〜８０８８、８１５７〜８１６９、８２２３〜８２３６、８３０７〜８３２０、８４１０〜８４１４、８８１９〜９００４、９９３５〜１０１２０、１０９７３〜１１１１９、１１６６３〜１１７１３、１１９６９〜１２０１９、１２２６７〜１２３１３、１２４６７〜１２４７２、１２５０３〜１２５０８、もしくは１２５３９〜１２５４４、１２５６９〜１２５７４、１２６０５〜１２６１０、１２６５０〜１２６５２，１７１３〜２１４０、４２８１〜４７０８、６７１７〜７１１１、７６１１〜７６３６、７７６７〜７７９２、７９１５〜７９３８、８０１９〜８０３２、８１０３〜８１１６、８１８３〜８１９５、８２６５〜８２７８、８３４９〜８３６２、８４２５〜８４２９、９１９１〜９３７６、１０３０７〜１０４９２、１１２６７〜１１４１３、１１７６５〜１１８１５、１２０７１〜１２１２１、１２３６１〜１２４０７、１２４７９〜１２４８４、１２５１５〜１２５２０、１２５５１〜１２５５６、１２５８７〜１２５９２、１２６２３〜１２６２８、もしくは１２６５９〜１２６６１の亜硫酸水素塩で変換された配列のいずれかである。
【０１３１】
ＭＳＰ反応のためのプライマーは、化合物変換鋳型配列に由来する。本明細書において、「由来する」は、プライマーの配列が、ＭＳＰ反応においてプライマーが化合物変換鋳型配列を増幅するように選択されることを意味する。各プライマーは、長さが少なくとも８ヌクレオチドである一本鎖ＤＮＡ断片を含む。一部の実施形態では、プライマーは長さが５０ヌクレオチド未満であり、または、一部の実施形態では、長さが１５から３５ヌクレオチドである。化合物変換鋳型配列は、亜硫酸水素ナトリウムで処理される二本鎖ＤＮＡのワトソン鎖またはクリック鎖であってよいので、プライマー配列はワトソンまたはクリックの化合物変換鋳型配列のいずれがＭＳＰにおいて増幅させるために選択されるかに依存する。ワトソンまたはクリック鎖のいずれかを、増幅させるために選択することができる。
【０１３２】
化合物変換鋳型配列、したがってＭＳＰ反応の生成物は、一部の実施形態では、長さが２０から３０００ヌクレオチドの間である。他の実施形態では、ＭＳＰ反応の生成物は、長さが５０から１０００ヌクレオチドの間である。他の実施形態では、ＭＳＰ反応の生成物は、長さが５０から５００ヌクレオチドの間である。他の実施形態では、ＭＳＰ反応の生成物は、長さが８０から１５０ヌクレオチドの間である。一部の実施形態では、ＭＳＰ反応の生成物は、長さが少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０または２５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、メチル化特異的プライマーは、非メチル化特異的プライマーによって生成されたＭＳＰ生成物と異なる長さのＭＳＰ生成物をもたらす。
【０１３３】
ＭＳＰ生成物が反応アッセイにおいて生成されたかどうか判定するために、様々な方法を使用することができる。ＭＳＰ生成物が反応において生成されたかどうか判定する１つの方法は、アガロースゲル電気泳動によって反応の一部を分析することである。例えば、０．６から２．０％のアガロースの水平アガロースゲルを作製し、ＭＳＰ反応混合物の一部を、アガロースゲルを通して電気泳動にかける。電気泳動の後、アガロースゲルを臭化エチジウムで染色する。紫外線で照射の間にゲルを眺めるとき、ＭＳＰ生成物は可視的である。標準化サイズのマーカーとの比較によって、ＭＳＰ生成物が正しい予想サイズであるかどうか判定される。
【０１３４】
生成物がＭＳＰ反応において作製されるかどうか判定するために、他の方法を使用することができる。１つのそのような方法は、「リアルタイムＰＣＲ」と呼ばれる。リアルタイムＰＣＲは、蛍光計（すなわち、蛍光を測定する機器）を組み込むサーマルサイクラー（すなわち、ＰＣＲ反応が起こるために必要な温度変化を提供する機器）を利用する。リアルタイムＰＣＲ反応混合物は、生成物へのその組込みを数量化することができ、その数量化が鋳型におけるその配列のコピー数を示す試薬も含有する。１つのそのような試薬は、二本鎖ＤＮＡに優先的に結合し、その蛍光が二本鎖ＤＮＡの結合によって大いに強化される、ＳＹＢＲグリーンＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）と呼ばれる蛍光色素である。ＰＣＲ反応をＳＹＢＲグリーンＩの存在下で実行するとき、結果として生じるＤＮＡ生成物はＳＹＢＲグリーンＩおよび蛍光に結合する。蛍光が検出され、蛍光計で数量化される。そのような技術は、ＰＣＲ反応における生成物の量の数量化のために特に有益である。さらに、ＰＣＲ反応からの生成物は、ＴａｑＭａｎプローブおよび分子ビーコンを含む生成物にハイブリダイズする様々なプローブを用いて、「リアルタイムＰＣＲ」において定量化することができる。定量化は絶対ベースであってよいか、または構成的にメチル化されたＤＮＡ標準に相対的であってよいか、または非メチル化ＤＮＡ標準に相対的であってもよい。１つの場合には、メチル化由来生成物対非メチル化由来生成物の比を構築することができる。
【０１３５】
本開示によるＤＮＡのメチル化を検出するための方法はＭＳＰに限定されず、ＤＮＡメチル化を検出するための任意のアッセイを包含することができる。ＤＮＡのメチル化を検出する別の例示的方法は、「メチル化感受性」制限エンドヌクレアーゼを使用することによる。そのような方法は、対象から単離されたゲノムＤＮＡをメチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼで処理し、制限エンドヌクレアーゼ処理ＤＮＡを次にＰＣＲ反応における鋳型として使用することを含む。本明細書では、認識配列の中のＣ塩基がメチル化されていないならば、メチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡの中の特異的配列を認識し、切断する。制限エンドヌクレアーゼの認識配列の中のＣ塩基がメチル化されているならば、ＤＮＡは切断されない。そのようなメチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼの例には、ＨｐａＩＩ、ＳｍａＩ、ＳａｃＩＩ、ＥａｇＩ、ＢｓｔＵＩおよびＢｓｓＨＩＩが限定されずに含まれる。この技術では、メチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼのための認識配列は、鋳型ＤＮＡの中の、ＰＣＲ反応のために使用されるフォワードおよびリバースプライマーの間に位置する。メチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼ認識配列の中のＣ塩基がメチル化されていない場合には、エンドヌクレアーゼはＤＮＡ鋳型を切断し、ＤＮＡがＰＣＲ反応において鋳型として使用されるときにＰＣＲ生成物は形成されない。メチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼ認識配列の中のＣ塩基がメチル化される場合には、エンドヌクレアーゼはＤＮＡ鋳型を切断せず、ＤＮＡがＰＣＲ反応において鋳型として使用されるときにＰＣＲ生成物が形成される。したがって、Ｃ塩基のメチル化は、ＰＣＲ生成物の不在または存在によって判定することができる（Kaneら、１９９７年、Cancer  Res、５７巻：８０８〜１１頁）。この技術において、亜硫酸水素ナトリウムは使用されない。
【０１３６】
ＤＮＡのメチル化を検出するさらに別の例示的方法は、改変ＭＳＰと呼ばれ、この方法は、化合物変換鋳型配列がＣｐＧジヌクレオチドまたはＵｐＧジヌクレオチドを含有するかどうかによって、ＭＳＰ反応の生成物が制限エンドヌクレアーゼによる消化に感受性であるように設計され、選択されるプライマーを利用する。
【０１３７】
ＤＮＡのメチル化を検出するためのさらに他の方法には、ＭＳ−ＳｎｕＰＥ方法が含まれる。この方法は、化合物変換鋳型がＣｐＧジヌクレオチドまたはＵｐＧジヌクレオチドを含有するかどうかによって使用されるプライマーが生成物を生成する、プライマー伸長反応における鋳型として化合物変換ＤＮＡを使用する（例えば、Gonzalgoら、１９９７年、Nucleic  Acids  Res.、２５巻：２５２９〜３１頁を参照）。
【０１３８】
ＤＮＡのメチル化を検出する別の例示的な方法は、ＣＯＢＲＡ（すなわち、組み合わせた亜硫酸水素塩制限分析）と呼ばれる。この方法はＤＮＡメチル化検出のために日常的に使用され、当技術分野で周知である（例えば、Xiongら、１９９７年、Nucleic  Acids  Res、２５巻：２５３２〜４頁を参照）。この技術では、認識配列の中のＣ塩基がメチル化されているならば、メチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡの中の特異的配列を認識し、切断する。制限エンドヌクレアーゼの認識配列の中のＣ塩基がメチル化されていないならば、ＤＮＡは切断されない。一部の実施形態では、本方法はメチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼを利用する。
【０１３９】
ＤＮＡのメチル化を検出する別の例示的な方法は、メチル化鋳型に由来する配列にハイブリダイズするプローブを含むアレイへの、化合物変換ＤＮＡのハイブリダイゼーションを必要とする。
【０１４０】
ＤＮＡのメチル化を検出する別の例示的な方法は、メチル化ＤＮＡに結合する抗体またはメチル化ＤＮＡに結合する他のタンパク質によるメチル化ＤＮＡの沈殿、および、次に、沈殿中のＤＮＡ配列の検出を含む。ＤＮＡの検出は、ＰＣＲに基づく方法によって、アレイへのハイブリダイゼーションによって、または当業者に公知である他の方法によって実行することができる。
【０１４１】
メチル化ＤＮＡを検出する別の例示的な方法は、メチル化および非メチル化鋳型に由来する変換されたＤＮＡを増幅するメチル化に無関係なＰＣＲプライマーを使用した、亜硫酸水素塩で変換されたＤＮＡの標的領域の増幅を含む亜硫酸水素塩配列決定である。メチル化に無関係なプライマーは、メチル化に無関係でありかつ亜硫酸水素塩に特異的であるように、すなわち亜硫酸水素塩で変換された標的ＤＮＡだけを増幅し、非変換標的配列を増幅しないように、しばしば設計される。一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡは、次に、元の鋳型の中の各シトシン塩基を、メチル化の存在（シトシンの保持）またはメチル化の不在（チミジンへの変換）について各ＤＮＡ配列リードの中で評価することを可能にする次世代配列決定方法によって特徴付けることができる。チミジンに変換されることに対してシトシンがシトシンとして保存されるＤＮＡリードのパーセントによって、元の鋳型における各シトシン塩基のメチル化のパーセントを次に計算することができる。同様に、個々のＤＮＡリードにおいて領域をメチル化または非メチル化として評価するための規則を判定し（すなわち、領域を「メチル化された」に分類する領域中のメチル化のためのカットオフを判定し）、次に、その領域がメチル化されたことが認められるＤＮＡリードのパーセントを判定することによって、目的領域にわたるメチル化のパーセントを評価することができる。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、本開示は、化合物変換鋳型配列がＣｐＧジヌクレオチドまたはＵｐＧジヌクレオチドを含有するかを判定するために、ＭＳＰ反応からもたらされる生成物を直接的に配列決定することを含む方法を提供する。ＰＣＲ生成物を直接的に配列決定することなどの分子生物学技術は、当技術分野で周知である。
【０１４３】
一部の実施形態では、ＤＮＡのメチル化は、全ＤＮＡの百分率として測定することができる。高レベルのメチル化は、１〜１００％のメチル化、例えば、１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のメチル化であってよい。低レベルのメチル化は、０％〜０．９９％のメチル化、例えば、０％、０．１％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％であってよい。少なくとも一部の正常組織、例えば、正常な食道試料は、いかなる検出可能なメチル化も有しないかもしれない。
【０１４４】
当業者は、本開示が、本明細書に開示される情報を提供する遺伝子座のいずれか１つが、例えば腫瘍抑制遺伝子として機能することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むことができるとの認識に、一部基づくことを認める。したがって、本出願は、細胞試料中のそのようなポリペプチドを検出するための方法をさらに提供する。一部の実施形態では、本開示は、患者が疾患状態を有するかまたは有しないかを判定するためにそのようなポリペプチドをアッセイすることによる検出方法を提供する。さらに、そのような疾患状態は、そのようなポリペプチドの低下したレベルによって特徴付けることができる。ある特定の実施形態では、本開示は、そのようなポリペプチドを検出することによって患者ががんを有する可能性があるかまたはないかを判定するための方法を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、患者が再発を起こしているかどうかを判定するための、または患者のがんが処置に応答しているかどうかを判定するための方法を提供する。
【０１４５】
必要に応じて、そのような方法は、試料中のタンパク質の定量的測定を得ることを含む。この明細書を考慮すると、当業者は、タンパク質の存在を検出し、必要に応じて定量化するために用いることができる広範囲の技術を認識する。一部の実施形態では、タンパク質は抗体で検出される。多くの実施形態では、抗体に基づく検出アッセイは、対応するエピトープを有するタンパク質に抗体が結合する機会を有するように、試料および抗体を接触させることを含む。多くの実施形態では、抗体に基づく検出アッセイは、抗体−エピトープ複合体の存在を検出し、それによって対応するエピトープを有するタンパク質の存在の検出を達成するための系も一般的に含む。抗体は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、ウエスタンブロットを含む、様々な検出技術において使用することができる。タンパク質を同定するための抗体非依存性技術を用いることもできる。例えば、質量分析は、特に液体クロマトグラフィーと一緒に、試料中の多数のタンパク質の検出および数量化を許す。タンパク質を同定するために二次元ゲル電気泳動を使用することもでき、質量分析または他の検出技術、例えばＮ末端タンパク質配列決定と併用することができる。目的のタンパク質のための特異的結合を有するＲＮＡアプタマーを生成して、検出試薬として使用することもできる。試料は、用いる検出系と一貫している方法で一般的に調製するべきである。例えば、タンパク質検出系において使用される試料は、プロテアーゼの不在下で一般的に調製するべきである。同様に、核酸検出系において使用される試料は、ヌクレアーゼの不在下で一般的に調製するべきである。多くの場合には、抗体に基づく検出系で使用するための試料は、実質的な調製ステップに付されない。例えば、唾液および血液がそうであるように、尿を直接的に使用することができるが、ある特定の実施形態では、血液は、血漿および血清などの分画に分離される。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、試料中の、ｍＲＮＡなどの情報を提供する遺伝子座によって発現される核酸の存在を検出することを含む。必要に応じて、本方法は、試料中の情報を提供する遺伝子座によって発現される核酸の定量的測定を得ることを含む。この明細書を考慮すると、当業者は、核酸の存在を検出し、必要に応じて定量化するために用いることができる広範囲の技術を認識する。核酸検出系は、試料の精製された核酸分画を調製し、その試料を直接検出アッセイまたは増幅工程とそれに続く検出アッセイに付すことを一般的に含む。増幅は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素（ＲＴ）および共役ＲＴ−ＰＣＲによって達成することができる。核酸の検出は、目的の核酸にハイブリダイズするプローブによって精製された核酸分画を探索することによって一般的に達成され、多くの場合には、検出は増幅を同様に含む。ノーザンブロット、ドットブロット、マイクロアレイ、定量的ＰＣＲおよび定量的ＲＴ−ＰＣＲの全ては、試料中の核酸を検出するための周知の方法である。
【０１４７】
ある特定の実施形態では、本開示は、情報を提供する遺伝子座核酸と特異的に結合する核酸プローブを提供する。そのようなプローブは、例えば、蛍光性部分、放射性核種、酵素または親和性タグ、例えばビオチン部分で標識されてもよい。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）系は、プローブが溶液中に遊離しているときに蛍光性シグナルがクエンチされ、プローブがより大きな核酸に組み込まれるときに明るいような方法で標識される核酸プローブを用いる。
【０１４８】
がんを検出および／または診断するために、情報を提供する遺伝子座に向けられるモノクローナル抗体を使用した免疫シンチグラフィを使用することができる。例えば、９９テクネチウム、１１１インジウム、１２５ヨウ素で標識された情報を提供する遺伝子座に対するモノクローナル抗体を、そのような画像化のために効果的に使用することができる。当業者に明らかであるように、投与される放射性同位体の量は放射性同位体に依存する。当業者は、活性部分として使用される所与の放射性核種の比活性およびエネルギーに基づいて、投与される画像化剤の量を容易に製剤化することができる。一般的に、画像化剤の１用量につき０．１〜１００ミリキューリー、１〜１０ミリキューリーまたはしばしば２〜５ミリキューリーが投与される。したがって、放射性部分にコンジュゲートされる標的化部分を含む画像化剤として有益な本発明による組成物は、０．１〜１００ミリキューリー、一部の実施形態では１〜１０ミリキューリー、一部の実施形態では２〜５ミリキューリー、一部の実施形態では１〜５ミリキューリーを含む。
【０１４９】
当業者に明らかになるように、ＴＰ５３が体細胞突然変異を含むかどうか判定するために、様々な方法を使用することができる。一部の実施形態では、ＴＰ５３遺伝子またはタンパク質配列が判定され、判定された配列における野生型配列と比較したいかなる変化も検出される。一部の実施形態では、ＴＰ５３遺伝子配列は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、サザンブロットおよび／またはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって判定される。ＴＰ５３が体細胞突然変異を含むかどうか判定する別の方法は、抗体に基づく検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫組織化学および／またはウエスタンブロット）の使用を含むことができる。一部の実施形態では、抗体に基づく検出アッセイは、それが野生型ＴＰ５３タンパク質に結合するよりもタイトな親和性で突然変異体ＴＰ５３タンパク質に結合する抗体を利用する。当業者は、その全ては参照により本明細書に完全に組み込まれている、米国特許第５８４３６５４号、米国特許第５６２０８４８号、欧州特許第０３９０３２３号および米国特許第５５２７６７６号の開示に基づいて、ＴＰ５３における体細胞突然変異を判定する方法も容易に認める。
【０１５０】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される情報を提供する遺伝子座、またはその断片もしくは相補体のいずれかのメチル化状態を検出するのに有益なデバイスを提供する。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される情報を提供する遺伝子座、またはその断片もしくは相補体のメチル化状態を検出するのに有益な構成要素を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、対象から食道試料を収集するための嚥下可能なバルーンを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に完全に組み込まれる、ＷＯ２０１５／０８９４２２に開示される嚥下可能なバルーンデバイスのいずれかを含む。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される情報を提供する遺伝子座のいずれかを増幅するためのプライマー、および本明細書に開示される方法のいずれかを実行するための説明書を含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは亜硫酸水素塩をさらに含む。一部の実施形態では、キットは、対象から試料を収集するのに好適な物体をさらに含む（例えば、ブラシおよびまたはバルーン）。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される治療剤のいずれか、および本明細書に開示される治療方法のいずれかを実行するための説明書を含むキットを提供する。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示される情報を提供する遺伝子座に位置する配列によってコードされるポリペプチドの腫瘍サプレッサー機能を強化する試験化合物を同定するための、薬物スクリーニングアッセイを提供する。一態様では、本アッセイは、本明細書に開示される情報を提供する遺伝子座に位置する配列によってコードされるポリペプチドの発現レベルを強化する試験化合物を検出する。別の態様では、本アッセイは、ＤＮＡのメチル化を阻害する試験化合物を検出する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される情報を提供する遺伝子座に位置する配列によってコードされるポリペプチドの安定性または機能に干渉するそれらの能力に基づいて試験化合物を検出する、薬物スクリーニングアッセイを生成することができる。
【０１５２】
様々なアッセイフォーマットを使用することができるが、本開示に照らして、本明細書に明示的に記載されないものが、それにもかかわらず当技術分野の通常の技術の範囲内にあると考えられる。アッセイフォーマットは、そのような状態をタンパク質発現レベル、ヌクレオチド配列のメチル化状態、腫瘍抑制活性で近似させることができ、多くの異なる形態で生成することができる。多くの実施形態では、本開示は、無細胞系を含むアッセイおよびインタクトな細胞を利用する細胞に基づくアッセイを提供する。
【０１５３】
試験される化合物は、例えば、細菌、酵母もしくは他の生物体によって生成すること（例えば、天然の生成物）、化学的に生成すること（例えば、小分子、ペプチド様物質を含む）、または組換えで生成することができる。化合物の有効性は、様々な濃度の試験化合物を使用して得られるデータから用量反応曲線を生成することによって、評価することができる。さらに、比較のためのベースラインを提供するために、対照アッセイを実行することもできる。対照アッセイでは、複合体の形成は、試験化合物の不在下で定量化される。
【０１５４】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムでは、所与の期間で調査をする化合物の数を最大にするために、ハイスループットアッセイが望ましい。精製もしくは半精製されたタンパク質または溶解物で開発することができるような、無細胞系で実行される本発明のアッセイは、試験化合物によって媒介される分子標的の変化の急速な発生および比較的容易な検出を可能にするようにそれらを生成することができる点で、「一次」スクリーニングとしてしばしば好ましい。さらに、試験化合物の細胞毒性および／または生物学的利用能の作用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系では一般的に無視することができ、本アッセイは、代わりに、他のタンパク質との結合親和性の変更または分子標的の酵素特性における変化において明らかになり得るように、分子標的に及ぼす薬物の作用に主に重点を置く。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、これらのアッセイから同定される試験化合物は、がんを治療する治療方法において使用することができる。
【０１５６】
本出願のさらに別の態様は、本明細書に開示される情報を提供する遺伝子座のいずれか１つの中に位置する遺伝子を発現するか、または、動物の組織もしくは細胞型の少なくとも１つにおいて破壊されたそのようなゲノム遺伝子（単数または複数）の１つまたは複数を有していた、トランスジェニックのヒト以外の動物を提供する。
【０１５７】
別の態様では、本出願は、本明細書に開示される情報を提供する遺伝子座のいずれか１つの中に位置する遺伝子の誤発現された対立遺伝子を有する、がんのための動物モデルを提供する。そのようなマウスモデルは、本明細書に開示される情報を提供する遺伝子座のいずれか１つの中に位置する遺伝子の誤発現から生じる障害を研究するために次に使用することができる。
【０１５８】
導入遺伝子の発現を可能にする遺伝学的技術は、当業者に公知であるｉｎ  ｖｉｖｏ部位特異的遺伝子操作を通して調節することができる。例えば、標的配列の遺伝子組換えを触媒するリコンビナーゼの調節された発現を可能にする遺伝系が利用可能である。本明細書で用いるように、語句「標的配列」は、リコンビナーゼによって遺伝子組換えされるヌクレオチド配列を指す。標的配列は、リコンビナーゼ認識配列が隣接し、リコンビナーゼ活性を発現する細胞において一般的に切除または反転される。リコンビナーゼ触媒組換え事象は、標的配列の組換えがポリペプチドの発現の活性化または抑圧をもたらすように設計することができる。例えば、組換え遺伝子の発現に干渉する標的配列の切除は、その遺伝子の発現を活性化するように設計することができる。タンパク質の発現に対するこの干渉は、プロモータエレメントまたは内部終止コドンからの遺伝子の空間的分離などの、様々な機構から生じることができる。さらに、その遺伝子のコード配列にリコンビナーゼ認識配列が隣接し、プロモータエレメントに関して３’から５’の配向で細胞の中に最初にトランスフェクトされる、導入遺伝子を作製することができる。このような例では、標的配列の反転は、コード配列の５’末端を、プロモータエレメントに関してプロモータ作動転写活性化を可能にする配向に置くことによって対象遺伝子を再設定する。
【０１５９】
例示的実施形態では、ｉｎ  ｖｉｖｏ部位特異的遺伝子組換え系を生成するために、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（Laksoら、（１９９２年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA８９巻：６２３２〜６２３６頁；Orbanら、（１９９２年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA８９巻：６８６１〜６８６５頁）またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼ系（O'Gormanら、（１９９１年）Science２５１巻：１３５１〜１３５５頁；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１５６９４）を使用することができる。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ配列の間に位置する介在標的配列の部位特異的組換えを触媒する。ｌｏｘＰ配列は、Ｃｒｅリコンビナーゼが結合し、Ｃｒｅリコンビナーゼ媒介遺伝子組換えのために必要である、３４塩基対のヌクレオチド反復配列である。ｌｏｘＰ配列の配向は、Ｃｒｅリコンビナーゼが存在するときに介在標的配列が切除されるかまたは反転されるかを判定する（Abremskiら、（１９８４年）J.  Biol.  Chem.２５９巻：１５０９〜１５１４頁）；ｌｏｘＰ配列がダイレクトリピートとして配向されるときに標的配列の切除を触媒し、ｌｏｘＰ配列が逆位反復として配向されるときに標的配列の反転を触媒する。
【０１６０】
Ｖ．対象および試料
ある特定の態様では、本発明は、上部胃腸管のがん、異形成または新生物（例えば、食道がん）を有することが疑われるかまたは有する対象に関する。この代わりに、対象はルーチンのスクリーニングを受けていてもよく、そのような異形成または新生物を有することが必ずしも疑われていなくてもよい。一部の実施形態では、対象はヒト対象であり、新生物は食道などの上部胃腸管の新生物である。一部の実施形態では、対象はヒト対象であり、異形成はバレット食道である。
【０１６１】
例えば上部または下部胃腸管の異形成または新生物を有することが知られていない対象からの試料中の上記のバイオマーカーのアッセイは、対象におけるそのような異形成または新生物の診断を助けることができる。実例を示すと、ＭＳＰによってヌクレオチド配列のメチル化状態を検出することは、例えば上部または下部胃腸管の新生物を検出するための感度および／または特異性を向上させるために、単独で、または、ＴＰ５３の体細胞突然変異状態の検出もしくは他の様々なアッセイと組み合わせて使用することができる。一部の実施形態では、そのような検出は、処置が有効である可能性がより高いように、がんの発達の初期の段階で行われる。
【０１６２】
一部の実施形態では、対象における情報価値のある遺伝子座は、その遺伝子座が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％メチル化されている場合、対象が食道で化生（例えば、バレット食道）または新生物（例えば、高悪性度もしくは低悪性度異形成などの異形成のあるバレット食道）（例えば、食道腺癌などの食道がん）を発症する傾向があるおよび／または発症しているかどうかを判定する目的で、「メチル化されている」とみなされる。一部の実施形態では、対象由来のＤＮＡ試料は亜硫酸水素塩で処理され、得られた亜硫酸水素塩配列は「Ｙ」ヌクレオチドを含む本明細書で開示されるヌクレオチド配列のいずれかに対応する。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換された配列のＹ残基の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０がＣを有する場合、対象が食道で化生（例えば、バレット食道）または新生物（例えば、高悪性度もしくは低悪性度異形成などの異形成のあるバレット食道）（例えば、食道腺癌などの食道がん）を発症する傾向があるおよび／または発症しているかどうかを判定する目的で、その配列は「メチル化されている」とみなされる。一部の実施形態では、対象由来のＤＮＡ試料は亜硫酸水素塩で処理され、得られた亜硫酸水素塩配列は「Ｙ」ヌクレオチドを含む本明細書で開示されるヌクレオチド配列のいずれかに対応する。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換された配列のＹ残基の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％がＣを有する場合、対象が食道で化生（例えば、バレット食道）または新生物（例えば、高悪性度もしくは低悪性度異形成などの異形成のあるバレット食道）（例えば、食道腺癌などの食道がん）を発症する傾向があるおよび／または発症しているかどうかを判定する目的で、その配列は「メチル化されている」とみなされる。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換された配列中のある特定の数の「Ｙ」ヌクレオチドがシトシンである場合は、対象は、食道で異形成（例えば、バレット食道）または新生物（例えば、高いグレードまたは低いグレードの形成異常などの形成異常を有するバレット食道）（例えば、食道腺癌などの食道がん）を起こしやすいと判定され、および／または起こしている。一部の実施形態では、ある特定の数は、亜硫酸水素塩で変換された配列の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のＹ残基である。一部の実施形態では、ある特定の数は、亜硫酸水素塩で変換された配列のＹ残基の最低１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％である。ある特定の実施形態では、対象からの試料からのＤＮＡ分子のある特定の百分率が本明細書に規定されるように「メチル化」されていると判定される場合は、対象は、食道で異形成（例えば、バレット食道）または新生物（例えば、食道腺癌などの食道がん）（例えば、高いグレードまたは低いグレードの形成異常などの形成異常を有するバレット食道）を起こしやすいと判定され、および／または起こしている。一部の実施形態では、ＤＮＡ分子のある特定の百分率は、試料からのＤＮＡ分子の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％が「メチル化」されていると判定される。一部の実施形態では、メチル化ＤＮＡ分子の百分率は、次世代配列決定を使用して判定される。ＤＮＡメチル化およびＤＮＡ分子の百分率の例示的なカットオフは、本明細書で提供される実施例のセクションに見出すことができる。
【０１６３】
特定の実施形態では、ビメンチン配列またはその一部の中のＣｐＧシトシンの少なくとも７０％、７５％、８０％、９０％または１００％がメチル化されている場合は、ビメンチン配列は「メチル化されている」または「メチル化リード」とみなされる。一部の実施形態では、ビメンチン配列（例えば、配列番号１６２０７および／または１６２０８の配列、またはその一部、例えば配列番号１６２０９および／または１６２１０の配列）の一部における「Ｙ」ヌクレオチドの少なくとも８、９または１０個がＣを有するならば、ビメンチン配列は「メチル化されている」または「リード」とみなされる。一部の実施形態では、ビメンチン核酸配列の一部を増幅するために使用されるプライマーは、配列番号１６２０９および／または１６２１０のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、対象からの試料中のビメンチン核酸配列の少なくとも０．５％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％がメチル化されている、またはリードとみなされるならば、対象は食道異形成および／または新生物を有すると判定される。特定の実施形態では、対象からの試料中のビメンチン核酸配列の少なくとも１％（例えば、少なくとも１．０５％）がメチル化されている、またはリードとみなされるならば、対象は食道異形成および／または新生物を有すると判定される。
【０１６４】
特定の実施形態では、ＳｑＢＥ１８配列（例えば、配列番号８２２０、８２６２、８３０４または８３４６の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一性のヌクレオチド配列）またはその一部の中のＣｐＧシトシンの少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、９０％または１００％がメチル化されているならば、ＳｑＢＥ１８配列は「メチル化されている」または「メチル化リード」とみなされる。一部の実施形態では、対象からの試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列の少なくとも０．５％、０．８％、０．９％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％または９％がメチル化されている、またはリードとみなされるならば、対象は食道異形成および／または新生物を有すると判定される。特定の実施形態では、対象からの擦過試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列の少なくとも２％、２．５％または３％（例えば、少なくとも３．１１％）がメチル化されている、またはリードとみなされるならば、対象は食道異形成および／または新生物を有すると判定される。特定の実施形態では、対象からのバルーン試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列の少なくとも１％がメチル化されている、またはリードとみなされるならば、対象は食道異形成および／または新生物を有すると判定される。
【０１６５】
一部の実施形態では、本開示は、対象が食道新生物または異形成を有するかどうか診断する方法であって、対象から試料を得るステップと；試料から得たビメンチン核酸配列またはその一部におけるＣｐＧジヌクレオチドの中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって；ビメンチン核酸配列またはその一部におけるＣｐＧジヌクレオチドの中のシトシンの少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％または好ましくは少なくとも８０％がメチル化されているならば、ビメンチン核酸配列またはその一部はリードとみなされるステップと；試料中に存在するリードの数を測定するステップであって；試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも１％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定されるステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、試料からのビメンチン核酸配列は、亜硫酸水素塩で処理される。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換された核酸配列の配列は、次世代配列決定によって判定される。一部の実施形態では、メチル化シトシンのレベルは、対象から得た亜硫酸水素塩で変換されたビメンチン核酸配列の増幅された部分において判定される。一部の実施形態では、増幅された部分は１０個のＣｐＧを含む。一部の実施形態では、ビメンチン核酸配列の一部を増幅するために使用されるプライマーは、配列番号１６２０９および１６２１０を含む。一部の実施形態では、増幅された部分は、配列番号１６２０７および／または１６２０８のヌクレオチド配列を含み、増幅プライマーの間の領域は、配列番号１６２０９および／または１６２０１０のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から５％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から３％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から１．５％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも０．９５％から１．１６％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも１．０２％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも３％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも５％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料が擦過から得られる場合、および試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から１．５％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料が擦過から得られる場合、および試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも１．０５％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料がバルーンから得られる場合、および試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から１．５％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料がバルーンから得られる場合、および試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも０．９５％から１．１６％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料がバルーンから得られる場合、および試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも１％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、対象が食道新生物または異形成を有すると判定されるならば、対象に、寒冷療法、光力学療法（ＰＤＴ）；高周波アブレーション（ＲＦＡ）；レーザーアブレーション；アルゴンプラズマ凝固（ＡＰＣ）；電気凝固（電気高周波療法）；食道ステント、手術および／または治療剤のいずれかを投与することができる。
【０１６６】
一部の実施形態では、本開示は、対象が食道新生物または異形成を有するかどうか診断する方法であって、対象から試料を得るステップと；試料から得たＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部におけるＣｐＧジヌクレオチドの中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって；ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部におけるＣｐＧジヌクレオチドの中のシトシンの少なくとも６５％、少なくとも７０％、もしくは少なくとも７５％（例えば、少なくとも７１％または少なくとも７６％）がメチル化されているならば、ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部はリードとみなされるステップと；試料中に存在するリードの数を測定するステップであって；試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、または少なくとも３％（例えば、少なくとも３．１１％）がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定されるステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、試料からのＳｑＢＥ１８核酸配列は、亜硫酸水素塩で処理される。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換された核酸配列の配列は、次世代配列決定によって判定される。一部の実施形態では、メチル化シトシンのレベルは、対象から得た亜硫酸水素塩で変換されたＳｑＢＥ１８核酸配列の増幅された部分において判定される。一部の実施形態では、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から５％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から３．５％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも１％から３．１１％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも０．７６％から１．０６％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも３．１１％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも０．１％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも１％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料が擦過から得られる場合、および試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも２％から３．１１％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料が擦過から得られる場合、および試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも３．１１％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料がバルーンから得られる場合、および試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から１．５％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料がバルーンから得られる場合、および試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも０．７６％から１．０６％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料がバルーンから得られる場合、および試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも１％がリードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、対象が食道新生物または異形成を有すると判定されるならば、対象に、寒冷療法、光力学療法（ＰＤＴ）；高周波アブレーション（ＲＦＡ）；レーザーアブレーション；アルゴンプラズマ凝固（ＡＰＣ）；電気凝固（電気高周波療法）；食道ステント、手術および／または治療剤のいずれかを投与することができる。
【０１６７】
一部の実施形態では、本開示は、対象が食道新生物または異形成を有するかどうか診断する方法であって、対象から試料を得るステップと；試料から得たビメンチン核酸配列およびＳｑＢＥ１８核酸配列、またはその一部におけるＣｐＧジヌクレオチドの中のメチル化シトシンの量を測定するステップであって；ビメンチン核酸配列またはその一部におけるＣｐＧジヌクレオチドの中のシトシンの少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％または好ましくは少なくとも８０％がメチル化されているならば、ビメンチン核酸配列またはその一部はＶＩＭ（ビメンチン）のリードとみなされ；ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部におけるＣｐＧジヌクレオチドの中のシトシンの少なくとも６５％、少なくとも７０％または少なくとも７５％（例えば、少なくとも７１％または少なくとも７６％）がメチル化されているならば、ＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部はＳｑＢＥ１８のリードとみなされる、ステップと；試料中に存在するＶＩＭおよびＳｑＢＥ１８リードの数を測定するステップであって；試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも１％がＶＩＭリードであるならば、および、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％または少なくとも３％（例えば、最低３．１１％）がＳｑＢＥ１８リードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定されるステップとを含む方法を提供する。一部の実施形態では、試料からのビメンチンまたはＳｑＢＥ１８核酸配列は、亜硫酸水素塩で処理される。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換された核酸配列の配列は、次世代配列決定によって判定される。一部の実施形態では、メチル化シトシンのレベルは、対象から得た亜硫酸水素塩で変換されたビメンチンまたはＳｑＢＥ１８核酸配列の増幅された部分において判定される。一部の実施形態では、増幅されたビメンチン部分は１０個のＣｐＧを含む。一部の実施形態では、増幅されたＳｑＢＥ１８部分は２１個のＣｐＧを含む。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換されたビメンチン核酸配列の一部を増幅するために使用されるプライマーは、配列番号１６２０９および１６２１０を含む。一部の実施形態では、増幅された部分は、配列番号１６２０７および／または１６２０８のヌクレオチド配列を含み、増幅プライマーの間の領域は、配列番号１６２０９および／または１６２１０のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、亜硫酸水素塩で変換されたＳｑＢＥ１８核酸配列の一部を増幅するために使用されるプライマーは、配列番号８３８８および８４０２を含む。一部の実施形態では、増幅された部分は、配列番号８３１８および／または８３６０のヌクレオチド配列、あるいはその断片および／または逆相補体を含む。一部の実施形態では、増幅された部分は、配列番号８３３２および／または８３７４のヌクレオチド配列、あるいは、完全メチル化親鋳型から生成することができる、その断片および／または逆相補体を含む。一部の実施形態では、試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から５％がＶＩＭリードであるならば、および、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から５％がＳｑＢＥ１８リードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から３％がＶＩＭリードであるならば、および、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から３．５％がＳｑＢＥ１８リードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から１．５％がＶＩＭリードであるならば、および、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも１％から３．１１％がＳｑＢＥ１８リードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも１％がＶＩＭリードであるならば、および、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも１％がＳｑＢＥ１８リードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも１．０５％がＶＩＭリードであるならば、および、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも３．１１％がＳｑＢＥ１８リードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料が擦過から得られる場合、および試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から１．５％がＶＩＭリードであるならば、および、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも２％から３．１１％がＳｑＢＥ１８リードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料が擦過から得られる場合、および試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも１．０５％がＶＩＭリードであるならば、および、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも３．１１％がＳｑＢＥ１８リードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料がバルーンを使用して得られる場合、および試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から１．５％がＶＩＭリードであるならば、および、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも０．５％から１．５％がＳｑＢＥ１８リードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料がバルーンを使用して得られる場合、および試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも０．９５％から１．１６％がリードであるならば、および、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも０．７６％から１．０６％がＳｑＢＥ１８リードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、試料がバルーンから得られる場合、および、試料中のビメンチン核酸配列またはその一部の少なくとも１％がリードであるならば、および、試料中のＳｑＢＥ１８核酸配列またはその一部の少なくとも１％がＳｑＢＥ１８リードであるならば、対象は食道新生物または異形成を有すると判定される。一部の実施形態では、対象が食道新生物または異形成を有すると判定されるならば、対象に、寒冷療法、光力学療法（ＰＤＴ）；高周波アブレーション（ＲＦＡ）；レーザーアブレーション；アルゴンプラズマ凝固（ＡＰＣ）；電気凝固（電気高周波療法）；食道ステント、手術および／または治療剤のいずれかを投与することができる。
【０１６８】
診断に加えて、例えば上部胃腸管の異形成または新生物を有することが知られていない対象からの試料中のマーカーのアッセイは、対象にとって予後診断であることができる（すなわち、疾患の可能な経過を示す）。実例を示すと、上部胃腸管の異形成または新生物を起こす素因を有する対象は、メチル化ヌクレオチド配列を有する可能性がある。対象からの試料中のメチル化された情報を提供する遺伝子座（例えば、ビメンチンおよび／またはＳｑＢＥ１８）のアッセイは、単独で、またはＴＰ５３における体細胞突然変異（単数または複数）のためのアッセイと組み合わせて、例えば対象の上部胃腸管の新生物または異形成に対して特に有効である特定の療法または複数の療法を選択するために、または有効でない可能性がある療法を除外するために使用することもできる。
【０１６９】
がんを有するかまたは有していたことが知られている対象からの試料におけるメチル化された情報を提供する遺伝子座（例えば、ビメンチンおよび／またはＳｑＢＥ１８）のアッセイも、有益である。例えば、本方法は、ある特定の対象のために療法が有効であるかどうかを同定するために使用することができる。療法の前および後に同じ対象から１つまたは複数の試料をとり、単独で、またはＴＰ５３における体細胞突然変異（単数または複数）のためのアッセイと組み合わせて、情報を提供する遺伝子座マーカーのいずれか１つまたは複数についてアッセイする。療法の前にとられた試料において情報を提供する遺伝子座がメチル化されており、療法の後に不在である（または、より低いレベルである）との知見は、療法が有効で、変更する必要がないことを示している可能性がある。療法の前にとられた試料および療法の後にとられた試料において情報を提供する遺伝子座がメチル化されている場合には、対象においてがんが低減される可能性を増加させるために療法を変更することが望ましいかもしれない。したがって、本方法は、療法への患者の応答を判定するために使用されるより侵襲性の手法を実行する必要性を不要にすることができる。
【０１７０】
進行がん患者では、療法の後にがんは頻繁に再発する。この場合および他の場合には、本発明のアッセイは、本明細書に開示される情報を提供する遺伝子座に位置する遺伝子のサイレンシングに関連したがんの状態を経時的にモニタリングするのに有益である。がんが進行している対象では、第１の試料をとるときに一部または全ての試料においてＤＮＡメチル化がなく、その後、第２の試料をとるときに１つまたは複数の試料において出現することがある。がんが退行している対象では、第１の試料をとるときにＤＮＡメチル化が１つまたはいくつかの試料に存在し、その後、第２の試料をとるときにこれらの試料の一部または全部において存在しないことがある。
【０１７１】
本明細書に記載される方法で使用するための試料は、事実上目的の任意の生体材料、例えば対象からとられる細胞の集合であってよい。例えば、試料は、対象からの体液試料、対象からの組織試料、対象からの固体もしくは半固体の試料、対象に由来する材料の一次細胞培養もしくは組織培養、細胞系からの細胞、または細胞もしくは組織培養からの培地もしくは他の細胞外材料、または異種移植（第２の対象、例えば免疫不全マウスにおいて培養された、第１の対象、例えばヒトからのがんの試料を意味する）であってよい。本明細書で用いる用語「試料」は、対象から直接的に得られる生体材料（一次試料と記載されることがある）、ならびに一次試料の任意の操作された形態または部分を包含するものである。試料は、生体材料を外因性液体と接触させ、接触させた生体材料の一部分を含有する洗浄液の生成をもたらすことによって得ることもできる。さらに、用語「試料」は、それが１つまたは複数の添加剤、例えば保存剤、キレーター、抗凝固因子等と混合された後の一次試料を包含するものである。一部の実施形態では、試料は、細胞擦過および／またはバルーンによって得られる。一部の実施形態では、試料は、対象の胃食道接合部から得られる。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、体液試料は血液試料である。この場合には、用語「試料」は、患者から直接的に得られる血液だけでなく、血液の分画、例えば血漿、血清、細胞分画（例えば、血小板、赤血球およびリンパ球）、タンパク質調製物、核酸調製物等も包含するものである。一部の実施形態では、体液は、胃に由来することができ、例えば、胃分泌、酸逆流または嘔吐であってよい。他の実施形態では、体液は、膵臓または膀胱によって分泌される液であってよい。他の実施形態では、体液は、唾液、唾または食道洗液であってよい。ある特定の実施形態では、組織試料は、胃腸管の粘膜からとられる生検である。他の実施形態では、組織試料は、例えば対象の食道からの擦過物である。
【０１７３】
一部の実施形態では対象はヒト対象であるが、本明細書に開示される分子マーカー、特に他の動物からのそれらの相同体は、他の動物において同様の有用性があると予想される。ある特定の実施形態では、生体材料の別個の部分を得ることなく、生物体において本明細書に記載されるバイオマーカー（例えば、ＤＮＡメチル化またはタンパク質発現レベル）を直接的に検出することが可能であるかもしれない。このような場合には、用語「試料」は、検出工程に含まれる試薬またはデバイスと接触させた生体材料の部分を包含するものである。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、鋳型として使用されるＤＮＡは、体液試料から得られる。体液の例は、血液、唾液、唾または食道洗液である。他の体液を使用することもできる。それらは対象から容易に得ることができ、複数の疾患についてスクリーニングするために使用することができるので、血液または血液由来の分画は特に有益である。血液由来の分画は、血液、血清、血漿または他の分画を含むことができる。例えば、細胞分画は、５ｍｌの全血を室温および重力の８００倍で１０分の間遠心分離することにより、「バフィーコート」（すなわち、白血球強化血液部分）として調製することができる。赤血球は最も急速に沈殿し、遠心管の中に一番下の分画として存在する。バフィーコートは、赤血球の上に薄いクリーム状の白色の層として存在する。血液の血漿部分は、バフィーコートの上の層を形成する。血液からの分画は、様々な他の方法で単離することもできる。１つの方法は、細胞の特定のサイズまたは密度について強化するために遠心分離で使用した勾配から１つまたは複数の分画をとることによる。
【０１７５】
一部の実施形態では、ＤＮＡは試料から単離される。そのような試料からのＤＮＡの単離の手順は、当業者に周知である。一般的に、そのようなＤＮＡ単離手順は、例えば、試料中に存在する任意の細胞の洗浄剤を使用した溶解を含む。細胞溶解の後、タンパク質は、一般的に様々なプロテアーゼを使用してＤＮＡから取り出される。ＲＮＡは、ＲＮアーゼを使用して取り出される。ＤＮＡは、次に一般的にフェノールで抽出され、アルコール中で沈殿させられ、水溶液に溶解される。
【０１７６】
ＶＩ．治療方法。
【０１７７】
一部の実施形態では、本開示は、食道（例えば、バレット食道）における異形成の存在を示す、本明細書に開示されるメチル化された情報を提供する遺伝子座（例えば、ビメンチンおよび／またはＳｑＢＥ１８）のいずれか１つまたは複数を対象が有するかどうか判定する方法を提供し、ここで、対象が食道（例えば、バレット食道）に異形成を有すると判定されるならば、対象は、食道（例えば、バレット食道）の異形成を処置する薬剤で処置される。一部の実施形態では、本開示は、食道（例えば、バレット食道）に異形成を有すると判定される対象を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、食道（例えば、バレット食道）の異形成の処置は、以下の化合物のいずれか１つまたは複数の投与を包含する：オメプラゾール（Ｐｒｉｌｏｓｅｃ、Ｚｅｇｅｒｉｄ）、ランソプラゾール（Ｐｒｅｖａｃｉｄ）、パントプラゾール（Ｐｒｏｔｏｎｉｘ）、ラベプラゾール（ＡｃｉｐＨｅｘ）、エゾメプラゾール（Ｎｅｘｉｕｍ）、デクスランソプラゾール（Ｄｅｘｉｌａｎｔ）などのプロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）。シメチジン（Ｔａｇａｍｅｔ）、ラニチジン（Ｚａｎｔａｃ）、ファモチジン（Ｐｅｐｃｉｄ）およびニザチジン（Ａｘｉｄ）などのヒスタミンＨ２受容体遮断剤。Ｔｕｍ、Ｒｏｌａｉｄまたは他の即効性の逆流医薬品。胃腸管を通して食物をより速やかに動かすのを助ける運動促進剤または薬物は、単独で、または酸阻害と組み合わせて魅力的な代替物を提供する。一部の実施形態では、食道（例えば、バレット食道）の異形成の処置は、内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）；光力学療法（ＰＤＴ）；高周波アブレーション（ＲＦＡ）；アルゴンプラズマ凝固（ＡＰＣ）；寒冷療法および／または手術（例えば食道切除、逆流防止手術）である。
【０１７８】
一部の実施形態では、本開示は、食道新生物（例えば、食道がん）を示す、本明細書に開示されるメチル化された情報を提供する遺伝子座のいずれか１つまたは複数を対象が有するかどうか判定する方法を提供し、ここで、対象が食道新生物（例えば、食道がん）を有すると判定されるならば、対象は、食道新生物（例えば、食道がん）を処置する薬剤で処置される。一部の実施形態では、本開示は、食道新生物（例えば、食道がん）を示す、本明細書に開示されるメチル化された情報を提供する遺伝子座のいずれか１つまたは複数を、本明細書に開示されるＴＰ５３体細胞突然変異のいずれかと一緒に対象が有するかどうか判定する方法を提供し、ここで、対象が食道新生物（例えば、食道がん）を有すると判定されるならば、対象は、食道新生物（例えば、食道がん）を処置する薬剤で処置される。一部の実施形態では、本開示は、食道新生物（例えば、食道がん）を有すると判定された対象を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、食道新生物は、低いグレードの形成異常を有するバレット食道、高いグレードの形成異常（ＨＧＤ）を有するバレット食道、および／または食道腺癌（ＥＡＣ）である。一部の実施形態では、食道新生物（例えば、食道がん）の処置は、手術（例えば食道切除）、放射線療法、化学放射線療法および／または化学療法を包含する。一部の実施形態では、食道新生物（例えば、食道がん）の処置は、１つまたは複数の化学療法剤、例えば以下からなる群から選択される任意の１つまたは複数の治療剤を投与することを包含する：カルボプラチンおよびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））（放射線と組み合わせることができる）；シスプラチンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（しばしば放射線と組み合わされる）；ＥＣＦ：エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（登録商標））、シスプラチンおよび５−ＦＵ（特に胃食道接合部腫瘍のために）；ＤＣＦ：ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、シスプラチンおよび５−ＦＵ；カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））とシスプラチン；オキサリプラチンおよび５−ＦＵまたはカペシタビンのいずれか；ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、ブレオマイシン、マイトマイシン、メトトレキセート、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、トポテカンおよびイリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））。一部の実施形態では、それらの細胞の表面にＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する一部の食道がんでは、化学療法を標的化薬物トラスツズマブに加えて使用することができる。それらが進行しているとき、胃食道（ＧＥ）接合部から始まるがんを処置するために、ラムシルマブを使用することができる。一部の実施形態では、処置は、内視鏡処置、例えば内視鏡的粘膜切除術（ＥＭＲ）と、続くプロトンポンプ阻害剤、光力学療法（ＰＤＴ）；高周波アブレーション（ＲＦＡ）；レーザーアブレーション；アルゴンプラズマ凝固（ＡＰＣ）；電気凝固（電気高周波療法）；または食道ステントによる処置を包含する。
【０１７９】
用語「処置」、「処置する」、「緩和」などは、所望の薬理学的および／または生理的作用を得ることを一般的に意味するために本明細書で使用され、処置する状態の１つまたは複数の症状を向上、緩和させ、および／またはその重症度を低下させることを指すために使用することもできる。この作用は、疾患、状態もしくはその症状の開始もしくは再発を完全にもしくは部分的に遅らせる点で予防的であってよく、ならびに／または、疾患もしくは状態および／もしくはその疾患もしくは状態に起因する有害作用のための部分的もしくは完全な治癒の点で治療的であってよい。本明細書で用いる「処置」は、哺乳動物、特にヒトの疾患または状態の任意の処置を包含し、以下を含む：（ａ）疾患または状態の素因を有する可能性があるが、それを有するとまだ診断されていない対象において疾患または状態が起こることを阻止すること；（ｂ）疾患または状態を阻害すること（例えば、その発達を抑えること）；または（ｃ）疾患または状態を軽減すること（例えば、疾患または状態の退行を引き起こすこと、１つまたは複数の症状の改善を提供すること）。
【０１８０】
対象において異形成（例えば、バレット食道）および／または新生物（例えば、食道がん）を処置することは、異形成（例えば、バレット食道）および／または新生物（例えば、食道がん）に関連した１つまたは複数の症状を向上させる（対象の状態を向上させる）、緩和する、その進行または発症を遅延させるか遅らせる、その重症度を低下させることを指す。例えば、異形成または新生物を処置することは、以下のいずれか１つまたは複数を含む：異形成／新生物細胞の成長、増殖および／または生存を低減すること、異形成／新生物細胞を死滅させること（例えば、壊死、アポトーシスまたは自己貪食によって）、異形成／新生物のサイズを減少させること、異形成／新生物のサイズの増加速度を低下させること、異形成／新生物のサイズの増加を止めること、嚥下能力を向上させること、内出血を減少させること、嘔吐の出現率を低下させること、疲労を低減すること、転移の数を減少させること、疼痛を減少させること、生存を増加すること、および無進行生存を増加すること。
【実施例】
【０１８１】
本発明をここで一般的に説明したが、さらに以下の実施例を参照してより容易に理解される。しかしながらこのような実施例は、本発明のある特定の態様および実施形態を単に例示するために記載され、本発明を限定するものではない。
【０１８２】
（実施例１）
食道がん情報を提供する遺伝子座の同定
【０１８３】
メチル化された情報を提供する遺伝子座は、正常な扁平上皮食道およびマッチさせた食道腺癌の２３対の生検のディスカバリーセット、ならびに８つのバレット食道組織の生検、ならびに８つのバレット食道組織の擦過物において、リデューストリプリゼンテーションバイサルファイトシーケンシング（ＲＲＢＳ：ｒｅｄｕｃｅｄ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）の技術を使用して最初に同定された（１つのＢＥ擦過物の例はマッチさせた生検も有する）。
【０１８４】
ディスカバリーデータは、ＲＲＢＳデータセットにおける各個々のＣｐＧ残基について最初に分析した。個々のＣｐＧは、それらが情報を提供する扁平上皮試料の全部においてＤＮＡ配列リードの１０％未満でメチル化を示し、その場合、少なくとも４つの扁平上皮試料が情報を提供し、情報を提供する試料は、ＣｐＧを包含する２０個と同等またはそれよりも多いリードを有したならば、および、情報を提供するＥＡＣ試料のうちの８個またはそれよりも多くが、ほとんどのメチル化された正常な扁平上皮試料のメチル化レベルより少なくとも２０百分率ポイント高いレベルのパーセントメチル化を実証したならば、ＥＡＣにおいてメチル化されているとみなされた。ＣｐＧは、それらが全ての情報を提供する扁平上皮試料のＤＮＡ配列リードの１０％未満でメチル化を示し、その場合、情報を提供する試料は、ＣｐＧを包含する２０個と同等またはそれよりも多いリードを有したならば、および、情報を提供するＢＥ試料のうちの３個またはそれよりも多くが、ほとんどのメチル化された正常な扁平上皮試料のメチル化レベルより少なくとも２０百分率ポイント高いレベルのパーセントメチル化を実証したならば、バレット食道でメチル化されていると同様に規定された。ＥＡＣおよびＢＥの両方におけるメチル化のための基準を満たすＣｐＧは、ＥＡＣおよびＢＥの両方でメチル化されていると規定された。そのようなメチル化ＣｐＧは、次にお互いから２００ｂｐ以内にあったメチル化ＣｐＧを一緒に集めることによって、パッチに凝集した。パッチは、上記の基準を満たす１つからいかなる数までのＣｐＧからなることができる。
【０１８５】
上の基準によってＥＡＣおよびＢＥの両方においてメチル化されたと規定される４２８個のゲノムパッチに割り当てられた名称を記録したが、これらの遺伝子座の配列は配列番号１〜８５６に対応する。上記の基準によってメチル化されたと規定されるゲノムパッチのゲノム座標も、記録した。それぞれのゲノム（＋）および（−）鎖の上のこれらのパッチのゲノム配列を判定して、記録した。（小文字の配列がより低い複雑性のＤＮＡ配列であるＵＣＳＣブラウザーのそれらに従って、大文字および小文字の名称を使用した）。これらの対応するパッチの亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、（＋）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列）を判定して、記録した（それぞれの（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号８５７〜１２８１および１７１３〜２１４０の配列を参照する）。メチル化されてもメチル化されなくてもよい、したがってＴに亜硫酸水素塩で変換されるか（非メチル化の場合）またはＣのままであってもよい（メチル化の場合）Ｃ残基は、Ｙ（この場合、ＹはＣまたはＴを表す）で指定され、ここで、亜硫酸水素塩で変換された後、Ｙ指定塩基のＣとしての実際の維持は、その塩基でのメチル化として評価された。したがって、これらの配列は、０、１または１つより多いＹがＴに変換される全ての配列の全ての組合せの群を表す。（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。（＋）鎖および（−）鎖に対応する、対応するパッチの完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、あらゆる亜硫酸水素塩で変換された配列における全てのＹ塩基がＣとして保持される）を判定し、記録した（対応するパッチのそれぞれ（＋）および（−）鎖の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号１２８５〜１７１２および２１４１〜２５６８の配列を参照する）。亜硫酸水素塩で変換されたメチル化（＋）鎖および（−）鎖配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。
【０１８６】
増幅プライマーの設計に適合するように、またはさらなる推定上のメチル化塩基を含むように、パッチは、いずれかの側で１００塩基対拡張した。これらの拡張されたパッチの配列は配列番号２５６９〜３４２４に対応し、それらのゲノム座標も記録した。それぞれのゲノム（＋）および（−）鎖の上のこれらの拡張されたパッチのゲノム配列を判定して、記録した。（小文字の配列がより低い複雑性のＤＮＡ配列であるＵＣＳＣブラウザーのそれらに従って、大文字および小文字の名称を使用した）。これらの対応する拡張されたパッチの亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、（＋）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列）を判定して、記録した（それぞれの（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号３４２５〜３８５２および４２８１〜４７０８の配列を参照する）。メチル化されてもメチル化されなくてもよい、したがってＴに亜硫酸水素塩で変換されるか（非メチル化の場合）またはＣのままであってもよい（メチル化の場合）Ｃ残基は、Ｙ（この場合、ＹはＣまたはＴを表す）で指定され、ここで、亜硫酸水素塩で変換された後、Ｙ指定塩基のＣとしての実際の維持は、その塩基でのメチル化として評価された。したがって、これらの配列は、０、１または１つより多いＹがＴに変換される全ての配列の全ての組合せの群を表す。（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。（＋）鎖および（−）鎖に対応する、対応する拡張されたパッチの完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、あらゆる亜硫酸水素塩で変換された配列における全てのＹ塩基がＣとして保持される）を判定し、記録した（対応する拡張されたパッチのそれぞれ（＋）および（−）鎖の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号３８５３〜４２８０および４７８９〜５１３６の配列を参照する）。亜硫酸水素塩で変換されたメチル化（＋）鎖および（−）鎖配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。
【０１８７】
パッチと協調的にメチル化されているさらなるＣｐＧを含有することができるパッチに重なっているＣｐＧ島も、規定された。これらのＣｐＧ島の配列は、配列番号５１３７〜５９２６に対応する。ＣｐＧ島のゲノム座標も、記録した。それぞれのゲノム（＋）および（−）鎖の上のこれらの拡張されたパッチのゲノム配列を判定して、記録した。（小文字の配列がより低い複雑性のＤＮＡ配列であるＵＣＳＣブラウザーのそれらに従って、大文字および小文字の名称を使用した）。これらの対応するＣｐＧ島の亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、（＋）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列）を判定して、記録した（それぞれの（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号５９２７〜６３２１および６７１７〜７１１１の配列を参照する）。メチル化されてもメチル化されなくてもよい、したがってＴに亜硫酸水素塩で変換されるか（非メチル化の場合）またはＣのままであってもよい（メチル化の場合）Ｃ残基は、Ｙ（この場合、ＹはＣまたはＴを表す）で指定され、ここで、亜硫酸水素塩で変換された後、Ｙ指定塩基のＣとしての実際の維持は、その塩基でのメチル化として評価された。したがって、これらの配列は、０、１または１つより多いＹがＴに変換される全ての配列の全ての組合せの群を表す。（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。（＋）鎖および（−）鎖に対応する、対応するＣｐＧ島の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、あらゆる亜硫酸水素塩で変換された配列における全てのＹ塩基がＣとして保持される）を判定し、記録した（対応するＣｐＧ島のそれぞれ（＋）および（−）鎖の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号６３２２〜６７１６および７１１２〜７５０６の配列を参照する）。亜硫酸水素塩で変換されたメチル化（＋）鎖および（−）鎖配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。
【０１８８】
好ましいパッチを包含するだろうＰＣＲアンプリコンの設計のために、好ましい領域を提供した目的領域（ＲＯＩ）が規定された。ＲＯＩのゲノム座標も、記録した。目的領域の（＋）鎖の配列は配列番号８２０９〜８２２２に対応し、目的領域の（−）鎖の配列は配列番号８２５１〜８２６１に対応する。（小文字の配列がより低い複雑性のＤＮＡ配列であるＵＣＳＣブラウザーのそれらに従って、大文字および小文字の名称を使用した）。これらの対応する目的領域の亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、（＋）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列）を判定し、記録した（それぞれの（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号８２２３〜８２３６および８２６５〜８２７８の配列を参照する）。メチル化されてもメチル化されなくてもよい、したがってＴに亜硫酸水素塩で変換されるか（非メチル化の場合）またはＣのままであってもよい（メチル化の場合）Ｃ残基は、Ｙ（この場合、ＹはＣまたはＴを表す）で指定され、ここで、亜硫酸水素塩で変換された後、Ｙ指定塩基のＣとしての実際の維持は、その塩基でのメチル化として評価された。したがって、これらの配列は、０、１または１つより多いＹがＴに変換される全ての配列の全ての組合せの群を表す。（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。（＋）鎖および（−）鎖に対応する、目的領域の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、あらゆる亜硫酸水素塩で変換された配列における全てのＹ塩基がＣとして保持される）を判定し、記録した（対応する目的領域のそれぞれ（＋）および（−）鎖の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号８２３７〜８２５０および８２７９〜８２９２の配列を参照する）。亜硫酸水素塩で変換されたメチル化（＋）鎖および（−）鎖配列の逆相補体は、当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。
【０１８９】
特異的ＰＣＲアンプリコンを、目的領域（ＲＯＩ）の中で規定した。アンプリコンのゲノム座標を記録した。アンプリコンの（＋）鎖の配列は配列番号８２９３〜８３０６および８４０５〜８４０９に対応し、アンプリコンの（−）鎖の配列は配列番号８３３５〜８３４８および８４２０〜８４２４に対応する。（小文字の配列がより低い複雑性のＤＮＡ配列であるＵＣＳＣブラウザーのそれらに従って、大文字および小文字の名称を使用した）。これらのアンプリコンの亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、（＋）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列）を判定し、記録した（（＋）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号８３０７〜８３２０および８４１０〜８４１４の配列を参照し、（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号８３４９〜８３６２および８４２５〜８４２９の配列を参照する）。メチル化されてもメチル化されなくてもよい、したがってＴに亜硫酸水素塩で変換されるか（非メチル化の場合）またはＣのままであってもよい（メチル化の場合）Ｃ残基は、Ｙ（この場合、ＹはＣまたはＴを表す）で指定され、ここで、亜硫酸水素塩で変換された後、Ｙ指定塩基のＣとしての実際の維持は、その塩基でのメチル化として評価された。したがって、これらの配列は、０、１または１つより多いＹがＴに変換される全ての配列の全ての組合せの群を表す。（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。（＋）鎖および（−）鎖に対応する、アンプリコンの完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、あらゆる亜硫酸水素塩で変換された配列における全てのＹ塩基がＣとして保持される）を判定し、記録した（（＋）鎖の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号８３２１〜８３３４および８４１５〜８４１９の配列を参照し、（−）鎖の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号８３６３〜８３７６および８４３０〜８４３４の配列を参照する）。亜硫酸水素塩で変換されたメチル化（＋）鎖および（−）鎖配列の逆相補体は、当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。アンプリコンの増幅で使用されるＰＣＲプライマーの配列は、配列番号８３７７〜８４０４および８４３５〜８４４４として提供される。
【０１９０】
亜硫酸水素塩特異的であるがメチル化非依存性増幅プライマーを使用して増幅された候補遺伝子座の亜硫酸水素塩配列決定を使用して、候補遺伝子座の確証分析を次に実行した。これは、既知のより高いグレードの病変のない個体からの２３個のＥＡＣ、８つのＨＧＤ、１５個の非形成異常ＢＥからの生検の新しい試料セットを用いた。さらに、ＨＧＤに隣接したＢＥの５症例から、およびＥＡＣに隣接したＢＥの１１症例から生検を得た。これらは、非形成異常ＢＥの分析に含まれなかった。さらに、３３個の正常な扁平上皮粘膜試料から生検を得た。
【０１９１】
表１は、強力な性能特性を有し、上で議論された研究において同定された、選択された遺伝子座のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列決定分析を使用した確証試料セットにおける成績を記載する。表１で、カラムＣ〜Ｓは、選択されたアンプリコンの成績を開示する。各アンプリコンにわたる各ＤＮＡ配列リードのために、増幅プライマーの間でメチル化されたＣｐＧの数を数え、リードは、アンプリコンの上のメチル化ＣｐＧの要求された数のためのカットオフを使用して、メチル化または非メチル化に分類した。表１、第３列は、アンプリコンの各々のための増幅プライマーの間のＣｐＧの数を掲載する。表１、第４列は、そのリードをメチル化とみなすために個々のリードでメチル化される必要があるＣｐＧの数を掲載する（例えば、ＳｑＢＥ２の場合、プライマーの間に１６個のＣｐＧ残基があり、それをメチル化と評価するためにリードの上で１４＋（＞＝１４を意味する）のＣｐＧがメチル化されなければならない。表１、第６、７および８列は、それが全てのＤＮＡリードの１０％（０．１）を超えてメチル化を実証したならば試料が検出された基準を使用して、食道腺癌（ＥＡＣ）（第６列）、高グレードの形成異常（ＨＧＤ）（第７列）および非形成異常バレット食道（非形成異常ＢＥ）（第８列）を検出するための感度を記録する。表１、第９列は、それが全てのＤＮＡリードの１０％（０．１）を超えてメチル化を実証したならば試料が検出された基準を再び使用して、正常な扁平上皮粘膜を検出しないための、各アンプリコンの特異性を記録する。表１、第１１列は、それが全てのＤＮＡリードの１％（０．０１）を超えてメチル化を実証したならば試料が検出された基準を今度は使用して、正常な扁平上皮粘膜を検出しないための、各アンプリコンの特異性を記録する。比較として、表１、Ｂ欄は、Liら（Li  Mら（２００９年）Sensitive  digital  quantification  of  DNA  methylation  in  clinical  samples.  Nat  Biotechnol、２７巻（９号）：８５８〜８６３頁）に開示されるプライマーを使用して増幅したビメンチン（ＶＩＭ）遺伝子座におけるメチル化を検出するための同じデータを提供する。これらのプライマーは、配列番号８４４５〜８４４６に対応する。これらのプライマーを使用して増幅されるアンプリコンは、親の（−）鎖に由来し、以下の通りである：
【０１９２】
ビメンチンアンプリコン（−）鎖（配列番号１６２０８）：
GtTGtttAGGtTGTAGGTGYGGGTGGAYGTAGTtAYGTAGtTtYGGtTGGAGtTYGGtYGGtTYGYGGTGttYGGGtYGtYGAAtATttTGYGGTAGGAGGAYGAG
配列番号１６２０８の逆相補体も、生成される。
【０１９３】
メチル化が分析される増幅プライマーの間に存在するこのアンプリコンの領域は、以下の通りである：
ビメンチンアンプリコン（−）鎖（配列番号１６２１２）：
GGAYGTAGTtAYGTAGtTtYGGtTGGAGtTYGGtYGGtTYGYGGTGttYGGGtYGtYGA
配列番号１６２１２の逆相補体も生成され、分析される。
【０１９４】
参考のために、ビメンチン（＋）鎖に由来した対応する亜硫酸水素塩で変換された領域の増幅に由来するだろう亜硫酸水素塩で変換された配列は、以下の通りになる。
【０１９５】
ビメンチンアンプリコン（＋）鎖（配列番号１６２０７）：
tTYGTttTttTAtYGtAGGATGTTYGGYGGttYGGGtAtYGYGAGtYGGtYGAGtTttAGtYGGAGtTAYGTGAtTAYGTttAttYGtAttTAtAGttTGGGtAGt
加えて、配列番号１６２０７の逆相補体も。
ビメンチン（−）鎖アンプリコンを増幅するために使用したプライマーの間に入る配列番号１６２１１の対応する部分は以下の通りである：
ビメンチンアンプリコン（＋）鎖（配列番号１６２１１）：
TYGGYGGttYGGGtAtYGYGAGtYGGtYGAGtTttAGtYGGAGtTAYGTGAtTAYGTtt
加えて、配列番号１６２１１の逆相補体も。
【０１９６】
アンプリコン（およびパッチ）は、個々に使用する必要はないが、食道新生物の検出のために、パネルに統合することができる。そのようなパネル、およびそれらの関連する成績統計の例は、パネル内のマーカーならびにマーカー組合せからもたらされる感度および特異性を提供する、表１、Ｔ欄からＡＧ欄に提供される（組合せの任意のメンバーが陽性であるならば組合せが陽性であるとき）。
【０１９７】
ＥＡＣ（１００％）、ＨＧＤ（８８％）およびＢＥ（１００％）の検出のための感度は、以下の示す組合せの間で同じである：全てのアンプリコン、１７アンプリコン、１５アンプリコン、４アンプリコン、３アンプリコンの４つの組合せのうちの３つ（Ｙ、Ｚ、ＡＡ欄）および２アンプリコンの１つの組合せ（ＡＦ欄）。リードの１０％がメチル化された検出カットオフにおいて正常な扁平上皮を検出しない特異性（９７％）は、以下の示す全ての組合せで同じである：１５アンプリコン、４アンプリコン、３アンプリコンまたは２アンプリコン。リードの１％がメチル化されたカットオフを使用して特異性が判定されるとき、最も高い感度を有するアンプリコンの間で、最も高い特異性は、表１、Ｚ欄の３アンプリコンの組合せによって実証された９４％であり、それに続くのは、４アンプリコン、３アンプリコンの２つの組合せおよび２アンプリコンの１つの組合せの示す組合せによって実証された９１％特異性である。
【表１Ａ】
2019522993.tif 000002
【０１９８】
【表１Ｂ】
2019522993.tif 000003
【０１９９】
上記の亜硫酸水素塩特異的であるがメチル化非依存性の増幅プライマーを使用して増幅された候補遺伝子座の亜硫酸水素塩配列決定を使用して、候補遺伝子座の確証分析をさらに実行した。これは、症候的な胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）を有するか有しないが、全てバレット食道（ＢＥ）を有しない５９名の対照対象から最初に得られた、内視鏡誘導下で細胞ブラシを使用して得られた食道擦過物の新しい試料セットを用いた。これらの対照は、正常な内視鏡所見またはびらん性食道炎の個人を含んだ。これらの対照では、擦過物は腺粘膜から試料を採取するために胃食道接合部から得られ、擦過物は扁平上皮食道粘膜からも得られた。擦過物は、食道の腺癌（ＥＡＣ）（Ｎ＝４６）または胃食道接合部の腺癌（ＪＣＡ）（Ｎ＝１４）のがんを有する６０人の個体およびＢＥを有する４７人の個体を含んだ１０７症例の食道病変からも得られた。ＢＥ症例のうち、１２症例は非形成異常のショートセグメントＢＥ（ＳＳＢＥ、＜３ｃｍ）を有し、１７症例は非形成異常のロングセグメントＢＥ（ＬＳＢＥ≧３ｃｍ）を有し、８症例は低いグレードの形成異常（ＬＧＤ）を有し、１０症例は高いグレードの形成異常（ＨＧＤ）を有した。
【０２００】
表１．５第、Ｂ〜Ｆ欄は、強力な性能特性を有し、次世代ＤＮＡ配列決定機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ機器）で実行された亜硫酸水素塩配列決定を使用して分析した食道擦過試料セットにおける上記の研究において同定された、選択された遺伝子座の個々のアンプリコンの成績を開示する。表１．５、第３列は、アンプリコンの各々のための増幅プライマーの間のＣｐＧの数を掲載する。表１．５、第４列は、プライマーの間にあるＣｐＧを包含する（および、プライマーの中のいくつかの非ＣｐＧ塩基を含むことができる）ゲノム区間のｈｇ１９における座標を提供する。表１．５、第５列は、そのリードをメチル化とみなすために個々のＤＮＡリードでメチル化される必要があったプライマーの間のＣｐＧの数を掲載する（例えば、ＶＩＭの場合、プライマーの間に１０個のＣｐＧ残基があり、そのリードをメチル化と評価するためにリードの上で８＋（＞＝８を意味する）のＣｐＧがメチル化される必要があった）。表１．５第６列は、試料がメチル化と評価され、したがって検出されるために必要とされた、亜硫酸水素塩配列決定によって同定されたメチル化リードの最小限のパーセント（カットオフ）を掲載する（例えばＶＩＭの場合、全リードの＞＝０．０１０２分画がメチル化される必要があった）。表１．５第７、８、９、１０および１１列は、それが第５列のカットオフ値より大きいメチル化を実証したならば試料が検出された基準を使用して、食道腺癌（ＥＡＣ）（第７列）、胃食道接合部の腺癌（ＪＣＡ）（第８列）、低いグレードの形成異常（ＬＧＤ）（第９列）、高いグレードの形成異常（ＨＧＤ）（第１０列）および非形成異常のバレット食道（非形成異常ＢＥ）（第１１列）を検出する、各アンプリコンの感度を記録する。表１．５第１２列は、正常な扁平上皮食道粘膜（正常なＳｑ）を検出しない各アンプリコンの特異性を記録し、第１３列は正常な胃食道接合部（ＧＥＪ）を検出しない各アンプリコンの特異性を記録する。
【０２０１】
表１．５、Ｂ欄は、Liら（Li  Mら（２００９年）Sensitive  digital  quantification  of  DNA  methylation  in  clinical  samples.  Nat  Biotechnol２７巻（９号）：８５８〜８６３頁）に開示されるプライマーを使用して増幅したビメンチン（ＶＩＭ）遺伝子座におけるメチル化を検出するためのデータを提供する。これらのプライマーは以下の通りである：
フォワードプライマー：ＣＴＣＲＴＣＣＴＣＣＴＡＣＣＲＣＡＡＡＡＴＡＴＴＣ（配列番号１６２０９）および
リバースプライマー：ＧＴＴＧＴＴＴＡＧＧＴＴＧＴＡＧＧＴＧＹＧＧＧ（配列番号１６２１０）
（これらの表記では、ＲはＡまたはＧ塩基を有することができる代替配列を表し、ＹはＣまたはＴ塩基を有することができる代替配列を表す）。
これらのプライマーを使用して増幅されるアンプリコンは、親の（−）鎖に由来し、以下の通りである：
ビメンチンアンプリコン（−）鎖（配列番号１６２０８）：
GtTGtttAGGtTGTAGGTGYGGGTGGAYGTAGTtAYGTAGtTtYGGtTGGAGtTYGGtYGGtTYGYGGTGttYGGGtYGtYGAAtATttTGYGGTAGGAGGAYGAG
配列番号１６２０８の逆相補体も生成される。
メチル化が分析される増幅プライマーの間に存在するこのアンプリコンの領域は、以下の通りである：
ビメンチンアンプリコン（−）鎖（配列番号１６２１２）：
GGAYGTAGTtAYGTAGtTtYGGtTGGAGtTYGGtYGGtTYGYGGTGttYGGGtYGtYGA
配列番号１６２１２の逆相補体も生成され、分析される。
参考のために、ビメンチン（＋）鎖に由来した対応する亜硫酸水素塩で変換された領域の増幅に由来するだろう亜硫酸水素塩で変換された配列は、以下の通りになる。
ビメンチンアンプリコン（＋）鎖（配列番号１６２０７）：
tTYGTttTttTAtYGtAGGATGTTYGGYGGttYGGGtAtYGYGAGtYGGtYGAGtTttAGtYGGAGtTAYGTGAtTAYGTttAttYGtAttTAtAGttTGGGtAGt
ならびに、配列番号１６２０７の逆相補体。
ビメンチン（−）鎖アンプリコンを増幅するために使用したプライマーの間にある配列番号１６２１１の対応する部分は、以下の通りである：
ビメンチンアンプリコン（＋）鎖（配列番号１６２１１）：
TYGGYGGttYGGGtAtYGYGAGtYGGtYGAGtTttAGtYGGAGtTAYGTGAtTAYGTtt
ならびに、配列番号１６２１１の逆相補体。
【０２０２】
各試料からのＤＮＡ配列決定リードは、Ｂｏｗｔｉｅ２を使用してヒト参照ゲノム（ｈｇ１８）の亜硫酸水素塩変換および非変換バージョンと整列させ、整列させたリードは、それらが８またはそれよりも多くの（ＶＩＭ亜硫酸水素塩−ｓｅｑ  ＰＣＲ断片のプライマーの間に存在する合計１０個のＣｐＧのうち）メチル化されたＣｐＧジヌクレオチドを有したならば、メチル化されたに分類した。これらの分析は、亜硫酸水素塩配列決定データの処理のために開発された、Ｂｉｓｍａｒｋソフトウェアによって促進された。
【０２０３】
メチル化ビメンチン対立遺伝子の頻度が１．０２％を超えたならば、すなわち、配列リードの１．０２％を超えてメチル化されていると分類されたならば（研究した全ての試料の受信者動作曲線の上の感度と特異性の合計を最大にしたカットオフ）、試料はＶＩＭについてメチル化されているとみなされた。０．５〜３．０％の範囲内の代わりのカットオフも、可能である。食道病変の検出におけるＶＩＭメチル化の成績は、第３〜１２列に示す。全体として、１．０２％メチル化のカットオフでは、ＶＩＭメチル化は、ＢＥまたは食道新生物の同定に関して９０．７％の感度を示し、正常な胃食道接合部の拒絶のために９３％の特異性を示した。ＶＩＭメチル化のためのカットオフが０〜１００％で変動し、感度が（１００−特異性）（受信者動作曲線）に対してプロットされるとき、ＶＩＭアッセイのための曲線下面積は０．９４９である。
【０２０４】
この同じ試料セットで、次世代亜硫酸水素塩配列決定および（リードをメチル化と評価するために＞＝８個のメチル化ＣｐＧが必要とされ、メチル化リードの＞１％が試料をメチル化され、検出されたと評価するカットオフを規定する）上の分析アルゴリズムによるＶＩＭメチル化のアッセイを、定量的なメチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）によるＶＩＭメチル化のアッセイの実行に対して比較した（Moinovaら、Cancer  Epidemiol  Biomarkers  Prev.２０１２年；２１巻（４号）：５９４〜６００頁に記載される）。亜硫酸水素塩配列決定方法は、より優れた感度およびより優れた特異性によって優位性を示した。特に、ｑＭＳＰアッセイのための受信者動作曲線下の面積は０．９２５であり、ｑＭＳＰによって測定した２．２％ＶＩＭメチル化の最適なカットオフでは（受信者動作曲線によって規定される）、アッセイ感度は８２．９％であって、アッセイ特異性は９１．３％であったが、それらの全ては表１．５に載せた次世代亜硫酸水素塩配列決定アッセイおよび分析アルゴリズムで得られた結果に劣っている。
【０２０５】
アンプリコンは個々に使用する必要はないが、食道新生物の検出のために、パネルに統合することができる。そのようなパネルおよびそれらの関連する性能統計の例は、パネル内のマーカーならびにマーカー組合せからもたらされる感度および特異性を規定する（組合せの任意のメンバーが陽性であるならばその組合せは陽性と評価されるとき）、表１．５、第Ｇ〜Ｌ欄に提供される。これらのマーカー組合せでは、パネルの各個々のメンバーは、第Ｂ〜Ｆ欄の第４および５列にそのマーカーのために個々に規定される条件を使用して分析される。ＶＩＭまたはＳｑＢＥ１８のアンプリコンにおけるメチル化のマーカー組合せは特に興味があるが、その理由は、これらの２つのマーカーの組合せが、正常な胃食道接合部への９１％の特異性を保存しながらも、食道腺癌の９６％、胃食道接合部の癌腫の９３％、高いグレードの形成異常の１００％、低いグレードの形成異常の１００％、および非形成異常のロングセグメントのバレット食道の９４％の検出を示すからである。
【表１−５】
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【０２０６】
ＶＩＭまたはＳｑＢＥ１８のアンプリコンにおけるメチル化のマーカー組合せは、外見が正常である胃食道接合部（ＧＥＪ）または内視鏡で可視化されたＢＥまたはＥＡＣの食道細胞擦過物においてさらに調査した。これらの実験において、上記の同じビメンチンアンプリコンを使用し、１０個のＣｐＧを含有していた。正常なＧＥＪ試料のためのビメンチン特異性は、試料が「非メチル化」と呼ばれるためにリードにおいてより多くのＣｐＧが非メチル化であるべきとの要件により増加する。反対に、ＢＥ／がんのためのビメンチン感度は、「メチル化」と呼ばれるためにリードにおいてより多くのＣｐＧが必要とされる要件により低下する。８＋ＣｐＧカットオフ（図２Ａの青色ボックス）は、対照のための特異性および症例のための感度の合計を最大にする。このように、１０のうちの任意の８つのＣｐＧがメチル化されていたならば、ＶＩＭリードはメチル化されているとみなされた。各試料のアウトプットは、各試料のリードの総数におけるメチル化リードの割合であった。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を生成するために、これらの値を次に使用した。食道擦過試料のトレーニングおよび検証セットをそれぞれ記載する、図１Ｂおよび１Ｄを参照。
【０２０７】
上の段落に記載される同じ試料で使用されたＳｑＢＥ１８アンプリコンは、２１個のＣｐＧを含有した。これらのアンプリコンは上記のように生成され、配列番号８３１８のヌクレオチド配列を有するアンプリコン配列を誘導するために配列番号８３８８および８４０２のヌクレオチド配列を有するＰＣＲプライマーによって亜硫酸水素塩で変換されたＤＮＡを増幅することによって得られた。正常なＧＥＪ試料のためのＳｑＢＥ１８特異性は、試料が「非メチル化」と呼ばれるためにリードにおいてより多くのＣｐＧが非メチル化であるべきとの要件により増加する。反対に、ＢＥ／がんのためのＳｑＢＥ１８感度は、「メチル化」と呼ばれるためにリードにおいてより多くのＣｐＧが必要とされる要件により低下する。１５＋、１６＋および１７＋ＣｐＧカットオフは、ＳｑＢＥ１８に対して同一の最大の感度＋特異性の合計を提供する。１６＋ＣｐＧ（図２Ｂの青色ボックス）は、この範囲の中央として選択された。このように、２１のうちの任意の１６個のＣｐＧがメチル化されていたならば、リードはＳｑＢＥ１８アンプリコンに関してメチル化されているとみなされた。各試料のアウトプットは、各試料のリードの総数におけるメチル化リードの割合であった。ＲＯＣ曲線を生成するために、これらの値を次に使用した。図１Ａおよび１Ｃを参照。
【０２０８】
メチル化の斑状の性質のために、正常な試料は少数のランダムなメチル化ＣｐＧを含有することができ、反対に、メチル化ＤＮＡは、多少の非メチル化ＣｐＧを含有することができた。異なるＣｐＧ島は異なるメチル化密度を有し、その結果、メチル化および非メチル化ＤＮＡを最適に区別するだろうカットオフを領域ごとに確立した。この研究では、ＶＩＭリードの１．０５％を超えてメチル化されていたならば、この試料はＶＩＭメチル化に関して「陽性」とみなされ、ＳｑＢＥ１８リードの３．１１％を超えてメチル化されていたならば、この試料はＶＩＭメチル化に関して「陽性」とみなされた。
【０２０９】
遠位性食道の細胞擦過物のトレーニングセットまたは検証セットからのＤＮＡ試料において、ビメンチンおよびＳｑＢＥ１８遺伝子のメチル化（ｍＶＩＭおよびｍＳｑＢＥ１８）をアッセイした。遠位性食道の擦過物のトレーニングおよび検証セットの両方は、以下に由来した：無影響の対照（ＧＥＲＤ、びらん性食道炎の個体、または内視鏡検査の間に病状が検出されなかった個体−各々ＧＥ接合部で擦過された）；ＳＳＢＥ（ショートセグメントのバレット食道（１〜３ｃｍ））；ＬＳＢＥ（バレット食道（３ｃｍまたはより長い）；ＬＧＤ（低いグレードの形成異常を有するバレット食道）；ＨＧＤ（高いグレードの形成異常を有するバレット食道）；がん−ＥＡＣ（食道腺癌）およびＪＣＡ（食道の接合部がん）を含む。トレーニングセットの場合は、亜硫酸水素塩配列決定によりｍＶＩＭメチル化対立遺伝子の頻度が＞１．０５％と測定され、ｍＳｑＢＥ１８メチル化対立遺伝子の頻度が＞３．１１％と測定されたときに、試料はメチル化と評価された（これらのアッセイの各々のために最適な成績をそれぞれ提供するＲＯＣカットポイントを表す）。検証セットの場合は、亜硫酸水素塩配列決定によりｍＶＩＭメチル化対立遺伝子の頻度が＞１．０５％と測定され、ｍＳｑＢＥ１８メチル化対立遺伝子の頻度が＞３．１１％と測定されたときに、試料はメチル化と評価された（これらのアッセイの各々のための擦過物のトレーニングセットからのＲＯＣカットポイントをそれぞれ表す）。２つのマーカーの組合せのために、２つの方法で計算を行った：
・１マーカーの失敗は削除される：ｍＶＩＭまたはｍＳｑＢＥ１８のいずれかの配列決定が失敗したならば、試料は分析から除外された
・１マーカーの失敗は許可される：１マーカーが失敗したならば、試料はなお分析に含まれ、１つの有効マーカーの成績に基づいて陽性または陰性と評価された。
トレーニングセット分析からのデータは図３に要約され、検証セット分析からのデータは図４に要約される。
【０２１０】
上の段落に記載された擦過物のトレーニングおよび検証セットからの全ての試料を組み合わせ、次に、亜硫酸水素塩配列決定によりｍＶＩＭメチル化対立遺伝子の頻度が＞１．０５％と測定され、ｍＳｑＢＥ１８メチル化対立遺伝子の頻度が＞３．１１％と測定されたときに、メチル化と評価した（これらのアッセイの各々のための擦過物のトレーニングセットからのＲＯＣカットポイントをそれぞれ表す）。２つのマーカーの組合せのために、以下の通りに計算を行った：
・対照−１マーカーの失敗は削除される：ｍＶＩＭまたはｍＳｑＢＥ１８のいずれかの配列決定が失敗したならば、試料は分析から除外された。これは、アッセイの特異性を強める。
・症例−１マーカーの失敗は許可される：１マーカーが失敗したならば、試料はなお分析に含まれ、１つの有効マーカーの成績に基づいて陽性または陰性と評価された。これは、アッセイの感度を強める。
対照の場合：１つのマーカーが失敗したならば、特異性を過大評価しないために試料は削除された。症例の場合：１つのマーカーが失敗し、他のマーカーが機能したならば、試料はなお数えられた。これらの分析の結果を、図５に提供する。
【０２１１】
遠位性食道の食道バルーンサンプリングをＶＩＭメチル化のためにアッセイし、ＲＯＣ曲線を得た。図６Ａは、３８例の対照および５０症例のトレーニングセットにおけるＶＩＭのための次世代亜硫酸水素塩配列決定アッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。上記の実験と同様に、使用したビメンチンアンプリコンは、１０個のＣｐＧを含有し、１０のうちの任意の８つのＣｐＧがメチル化されているならば（スライド３のデータの分析に基づく）、リードはメチル化されているとみなされた。各試料のアウトプットは、各試料のリードの総数におけるメチル化リードの割合であった。ＲＯＣ曲線を生成するために、これらの値を次に使用した。バルーンでのｍＶＩＭアッセイのための最適なＲＯＣカットポイントは０．９５％から１．１６％の間にあって、この範囲の中央の便利な数として１％を選択した。ＶＩＭバルーンのためのＭｅｄＣａｌｃによって選び出された実際のカットオフは、０．９５％であった。
【０２１２】
遠位性食道の食道バルーンサンプリングをＳｑＢＥ１８メチル化のためにもアッセイし、ＲＯＣ曲線を得た。図６Ｂは、３８例の対照および５０症例のトレーニングセットにおける次世代亜硫酸水素塩配列決定ＳｑＢＥ１８アッセイに基づくＲＯＣ曲線を示す。上記の実験と同様に、使用したＳｑＢＥ１８アンプリコンは、２１個のＣｐＧを含有し、２１のうちの任意の１６個のＣｐＧがメチル化されていたならば、リードはメチル化されているとみなされた。各試料のアウトプットは、各試料のリードの総数におけるメチル化リードの割合であった。ＲＯＣ曲線を生成するために、これらの値を次に使用した。バルーンでのＳｑＢＥ１８アッセイのための最適なＲＯＣカットポイントは、感度および特異性の合計の最大化に基づいて０．１％の間にあった。しかし、アッセイのより高い特異性を維持するためにより高いカットポイントを選択した。０．７６％から１．０６％の間の任意のカットポイントは、感度および特異性の同じ値を与えるだろう。この範囲の中央の便利な数として１％を選択した。ＳｑＢＥ１８バルーンのためのＭｅｄＣａｌｃによって選び出された実際のカットオフは、０．１％であった。しかし、特異性を最大にするためにカットオフとして１％を選択した。０．７６％から１．０６％の間の任意の数は、１％と同じように機能しただろう。＞０．１％ならば、感度：８４．０％、および特異性：９４．７％。
【０２１３】
以下からの遠位性食道の食道バルーンＤＮＡ試料において、ビメンチンおよびＳｑＢＥ１８遺伝子のメチル化（ｍＶＩＭおよびｍＳｑＢＥ１８）をアッセイした：無影響の対照（ＧＥＲＤ、びらん性食道炎の個体、または内視鏡検査の間に病状が検出されなかった個体）；ＳＳＢＥ（ショートセグメントのバレット食道（１ｃｍ〜３ｃｍ未満））；ＬＳＢＥ（バレット食道（３ｃｍまたはそれよりも長い）；ＬＧＤ（低いグレードの形成異常を有するバレット食道）；ＨＧＤ（高いグレードの形成異常を有するバレット食道）；がん−ＥＡＣ（食道腺癌）およびＪＣＡ（食道の接合部がん）を含む。前記２つの段落に記載されるバルーンＲＯＣ曲線に基づき、ｍＶＩＭおよびＳｑＢＥ１８メチル化対立遺伝子の頻度が＞１％と測定されたときに、試料はメチル化と評価された。これらの分析の結果を、図７に提供する。
【０２１４】
（実施例２）
食道新生物の進行を検出するための食道がんの情報を提供する遺伝子座の同定
ＥＡＣをＢＥから識別するために使用することができる遺伝子座を同定するために、ＲＲＢＳデータセットにおいて各個々のＣｐＧ残基についてディスカバリーデータも分析した。個々のＣｐＧは、情報を提供する全てのＢＥ試料のリードの１０％未満のメチル化をそれらが示し、少なくとも３つのＢＥ試料が情報を提供したならば、および、情報を提供する全ての正常な扁平上皮試料のリードの１０％未満のメチル化をそれらが示し、情報を提供する試料が、ＣｐＧを包含する２０個と同等またはそれよりも多いリードを有したならば、および、ＥＡＣ試料のうちの６個またはそれよりも多くが、ほとんどのメチル化されたＢＥ試料のメチル化レベルより少なくとも２０百分率ポイント高いレベルのパーセントメチル化を実証したならば、ＢＥに対してＥＡＣにおいてメチル化されているとみなされた。ＥＡＣ対ＢＥにおけるメチル化のための基準を満たすＣｐＧは、ＥＡＣ対ＢＥでメチル化されていると規定される。そのようなメチル化ＣｐＧは、メチル化ＣｐＧがお互いから２００ｂｐ以内にあった場合に、次にパッチに凝集させた。
【０２１５】
ディスカバリーセットにおいて、ＢＥに対してＥＡＣにおいてメチル化されていると規定された１８６個のゲノムパッチを同定した（配列番号８４４７〜８８１８を参照する）。上記の基準によってメチル化されたと規定されるゲノムパッチのゲノム座標も、記録した。それぞれのゲノム（＋）および（−）鎖の上のこれらのパッチのゲノム配列を判定して、記録した。（小文字の配列がより低い複雑性のＤＮＡ配列であるＵＣＳＣブラウザーのそれらに従って、大文字および小文字の名称を使用した）。これらの対応するパッチの亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、（＋）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列）を判定して、記録した（それぞれの（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号８８１９〜９００４および９１９１〜９３７６の配列を参照する）。メチル化されてもメチル化されなくてもよい、したがってＴに亜硫酸水素塩で変換されるか（非メチル化の場合）またはＣのままであってもよい（メチル化の場合）Ｃ残基は、Ｙ（この場合、ＹはＣまたはＴを表す）で指定され、ここで、亜硫酸水素塩で変換された後、Ｙ指定塩基のＣとしての実際の維持は、その塩基でのメチル化として評価された。したがって、これらの配列は、０、１または１つより多いＹがＴに変換される全ての配列の全ての組合せの群を表す。（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。（＋）鎖および（−）鎖に対応する、対応するパッチの完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、あらゆる亜硫酸水素塩で変換された配列における全てのＹ塩基がＣとして保持される）を判定し、記録した（対応するパッチのそれぞれ（＋）および（−）鎖の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号９００５〜９１９０および９３７７〜９５６２の配列を参照する）。亜硫酸水素塩で変換されたメチル化（＋）鎖および（−）鎖配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。
【０２１６】
増幅プライマーの設計に適合するように、またはさらなる推定上のメチル化塩基を含むように、パッチは、いずれかの側で１００塩基対拡張した。これらの拡張されたパッチの配列は配列番号９５６３〜９９３４に対応し、それらのゲノム座標も記録した。それぞれのゲノム（＋）および（−）鎖の上のこれらの拡張されたパッチのゲノム配列を判定して、記録した。（小文字の配列がより低い複雑性のＤＮＡ配列であるＵＣＳＣブラウザーのそれらに従って、大文字および小文字の名称を使用した）。これらの対応する拡張されたパッチの亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、（＋）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列）を判定して、記録した（それぞれの（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号９９３５〜１０１２０および１０３０７〜１０４９２の配列を参照する）。メチル化されてもメチル化されなくてもよい、したがってＴに亜硫酸水素塩で変換されるか（非メチル化の場合）またはＣのままであってもよい（メチル化の場合）Ｃ残基は、Ｙ（この場合、ＹはＣまたはＴを表す）で指定され、ここで、亜硫酸水素塩で変換された後、Ｙ指定塩基のＣとしての実際の維持は、その塩基でのメチル化として評価された。したがって、これらの配列は、０、１または１つより多いＹがＴに変換される全ての配列の全ての組合せの群を表す。（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。（＋）鎖および（−）鎖に対応する、対応する拡張されたパッチの完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、あらゆる亜硫酸水素塩で変換された配列における全てのＹ塩基がＣとして保持される）を判定し、記録した（対応する拡張されたパッチのそれぞれ（＋）および（−）鎖の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号１０１２１〜１０３０６および１０４９３〜１０６７８の配列を参照する）。亜硫酸水素塩で変換されたメチル化（＋）鎖および（−）鎖配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。
【０２１７】
パッチと協調的にメチル化されているさらなるＣｐＧを含有することができるパッチに重なっているＣｐＧ島も、規定された。これらのＣｐＧ島の配列は、配列番号１０６７９〜１０９７２に対応する。ＣｐＧ島のゲノム座標も、記録した。それぞれのゲノム（＋）および（−）鎖の上のこれらの拡張されたパッチのゲノム配列を判定して、記録した。（小文字の配列がより低い複雑性のＤＮＡ配列であるＵＣＳＣブラウザーのそれらに従って、大文字および小文字の名称を使用した）。これらの対応するＣｐＧ島の亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、（＋）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列）を判定して、記録した（それぞれの（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号１０９７３〜１１１１９および１１２６７〜１１４１３の配列を参照する）。メチル化されてもメチル化されなくてもよい、したがってＴに亜硫酸水素塩で変換されるか（非メチル化の場合）またはＣのままであってもよい（メチル化の場合）Ｃ残基は、Ｙ（この場合、ＹはＣまたはＴを表す）で指定され、ここで、亜硫酸水素塩で変換された後、Ｙ指定塩基のＣとしての実際の維持は、その塩基でのメチル化として評価された。したがって、これらの配列は、０、１または１つより多いＹがＴに変換される全ての配列の全ての組合せの群を表す。（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。（＋）鎖および（−）鎖に対応する、対応するＣｐＧ島の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、あらゆる亜硫酸水素塩で変換された配列における全てのＹ塩基がＣとして保持される）を判定し、記録した（対応するＣｐＧ島のそれぞれ（＋）および（−）鎖の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号１１１２０〜１１２６６および１１４１４〜１１２６６の配列を参照する）。亜硫酸水素塩で変換されたメチル化（＋）鎖および（−）鎖配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。
【０２１８】
好ましいパッチを包含するだろうＰＣＲアンプリコンの設計のために、好ましい領域を提供した目的領域（ＲＯＩ）が規定された。ＲＯＩのゲノム座標も、記録した。目的領域の（＋）鎖の配列は配列番号１２５６３〜１２５６８に対応し、目的領域の（−）鎖の配列は配列番号１２５８１〜１２５８６に対応する。（小文字の配列がより低い複雑性のＤＮＡ配列であるＵＣＳＣブラウザーのそれらに従って、大文字および小文字の名称を使用した）。これらの対応する目的領域の亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、（＋）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列）を判定し、記録した（それぞれの（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号１２５６９〜１２５７４および１２５８７〜１２５９２の配列を参照する）。メチル化されてもメチル化されなくてもよい、したがってＴに亜硫酸水素塩で変換されるか（非メチル化の場合）またはＣのままであってもよい（メチル化の場合）Ｃ残基は、Ｙ（この場合、ＹはＣまたはＴを表す）で指定され、ここで、亜硫酸水素塩で変換された後、Ｙ指定塩基のＣとしての実際の維持は、その塩基でのメチル化として評価された。したがって、これらの配列は、０、１または１つより多いＹがＴに変換される全ての配列の全ての組合せの群を表す。（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。（＋）鎖および（−）鎖に対応する、目的領域の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、あらゆる亜硫酸水素塩で変換された配列における全てのＹ塩基がＣとして保持される）を判定し、記録した（対応する目的領域のそれぞれ（＋）および（−）鎖の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号１２５７５〜１２５８０および１２５９３〜１２５９８の配列を参照する）。亜硫酸水素塩で変換されたメチル化（＋）鎖および（−）鎖配列の逆相補体は、当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。
【０２１９】
特異的ＰＣＲアンプリコンを、目的領域（ＲＯＩ）の中で規定した。アンプリコンのゲノム座標を記録した。アンプリコンの（＋）鎖の配列は配列番号１２５９９〜１２６０４および１２６４７〜１２６４９に対応し、アンプリコンの（−）鎖の配列は配列番号１２６１７〜１２６２２および１２６５６〜１２６５８に対応する。（小文字の配列がより低い複雑性のＤＮＡ配列であるＵＣＳＣブラウザーのそれらに従って、大文字および小文字の名称を使用した）。これらのアンプリコンの亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、（＋）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列）を判定し、記録した（（＋）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号１２６０５〜１２６１０および１２６５０〜１２６５２の配列を参照し、（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号１２６２３〜１２６２８および１２６５９〜１２６６１の配列を参照する）。メチル化されてもメチル化されなくてもよい、したがってＴに亜硫酸水素塩で変換されるか（非メチル化の場合）またはＣのままであってもよい（メチル化の場合）Ｃ残基は、Ｙ（この場合、ＹはＣまたはＴを表す）で指定され、ここで、亜硫酸水素塩で変換された後、Ｙ指定塩基のＣとしての実際の維持は、その塩基でのメチル化として評価された。したがって、これらの配列は、０、１または１つより多いＹがＴに変換される全ての配列の全ての組合せの群を表す。（＋）および（−）鎖の亜硫酸水素塩で変換された配列の逆相補体は当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。（＋）鎖および（−）鎖に対応する、アンプリコンの完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列（すなわち、あらゆる亜硫酸水素塩で変換された配列における全てのＹ塩基がＣとして保持される）を判定し、記録した（（＋）鎖の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号１２６１１〜１２６１６および１２６５３〜１２６５５の配列を参照し、（−）鎖の完全メチル化形態の亜硫酸水素塩で変換された配列のための配列番号１２６２９〜１２６３４および１２６６２〜１２６６４の配列を参照する）。亜硫酸水素塩で変換されたメチル化（＋）鎖および（−）鎖配列の逆相補体は、当業者にとって明らかであり、この開示においても暗示によって含まれる。アンプリコンの増幅で使用されるＰＣＲプライマーの配列は、配列番号１２６３５〜１２６４６および１２６６５〜１２６７０として提供される。
【０２２０】
亜硫酸水素塩特異的であるがメチル化非依存性増幅プライマーを使用して増幅された候補遺伝子座の亜硫酸水素塩配列決定を使用して、候補遺伝子座の確証分析を次に実行した。これは、既知のより高いグレードの病変のない個体からの２３個のＥＡＣ、８つのＨＧＤ、１５個の非形成異常ＢＥからの生検の新しい試料セットを用いた。さらに、ＨＧＤに隣接したＢＥの５症例から、およびＥＡＣに隣接したＢＥの１１症例から生検を得た。これらは、非形成異常ＢＥの分析に含まれない。さらに、３３個の正常な扁平上皮粘膜試料から生検を得た。
【０２２１】
表２は、ＢＥに対してＥＡＣにおいてメチル化されており、好ましいマーカー特性を有すると規定された、選択された遺伝子座からのアンプリコンの亜硫酸水素塩配列決定分析を使用した確証試料セットにおける成績を記載する。表２、第Ｂ〜Ｊ欄は、確証データセットにおけるアンプリコンの成績を開示する。このデータセットでは、メチル化は、アンプリコンを増幅するためのプライマーの間における全てのＣｐＧのメチル化の平均レベルとして計算された。各アンプリコンにわたる各リードのために、メチル化されたＣｐＧの数を数え、リードは、アンプリコンの上のメチル化ＣｐＧの要求された数のためのカットオフを使用して、メチル化または非メチル化に分類した。表２、第３列は、アンプリコンの各々のための増幅プライマーの間のＣｐＧの数を掲載する。表２、第４列は、そのリードをメチル化とみなすために個々のリードでメチル化される必要があるＣｐＧの数を掲載する（例えば、Ｕｐ３の場合、プライマーの間に３６個のＣｐＧ残基があり、それをメチル化と評価するためにリードの上で２５＋（＞＝２５を意味する）のＣｐＧがメチル化されなければならない）。表２、第６および７列は、それが全てのＤＮＡリードの１０％（０．１）を超えてメチル化を実証したならば試料が検出された基準を使用して、ＥＡＣ（第６列）およびＨＧＤ（第７列）を検出するための感度を記録する。表２、第８および９列は、それが全てのＤＮＡリードの１０％（０．１）を超えてメチル化を実証したならば試料が検出された基準を再び使用して、非形成異常ＢＥ（第８列）を検出しないための、および正常な扁平上皮粘膜（第９列）を検出しないための、各アンプリコンの特異性を記録する。表２、第１１および１２列は、それが全てのＤＮＡリードの１％（０．０１）を超えてメチル化を実証したならば試料が検出された基準を使用して、非形成異常ＢＥ（第１１列）を検出しないための、および正常な扁平上皮粘膜（第１２列）を検出しないための、各アンプリコンの特異性を記録する。アンプリコン（およびパッチ）は、個々に使用する必要はないが、食道新生物の検出のために、パネルに統合することができる。アンプリコンの選択されたパネルの成績統計は、パネルの感度および特異性を提供する表２第Ｋ〜Ｖ欄に提供する（組合せの任意のメンバーが陽性であるならば組合せが陽性であるとき）。
【表２Ａ】
2019522993.tif 000005
【表２Ｂ】
2019522993.tif 000006
【０２２２】
さらに、ＲＲＢＳディスカバリーデータは：ｉ）情報を提供するあらゆるＢＥにおいて少なくとも９０％メチル化を実証した少なくとも３つの情報を提供するＢＥであって；ここで、ｉｉ）情報を提供する正常な扁平上皮試料の５％以下が９０％未満のメチル化レベルを実証したＢＥを実証し；およびｉｉｉ）少なくとも６つの情報を提供するＥＡＣであって、これらの情報を提供するＥＡＣにおいて、メチル化のレベルは最少メチル化ＢＥのメチル化レベルより少なくとも２０百分率ポイント低かったＥＡＣを実証した、ＣｐＧ残基を同定するために分析された。これらの基準を満たしたＣｐＧは、ＥＡＣ対ＢＥにおいて非メチル化と規定される。そのような非メチル化ＣｐＧは、次に、お互いから２００ｂｐ以内にあった非メチル化ＣｐＧを一緒に集めることによって、パッチに凝集させた。非メチル化ＥＡＣパッチは、上記の基準を満たす１ＣｐＧからいかなる数までのＣｐＧからなることができる。
【０２２３】
（実施例３）
食道新生物の進行を検出するための食道がんの情報を提供する遺伝子座の同定
バレット食道の高グレード形成異常（ＨＧＤ）または食道腺癌（ＥＡＣ）へのバレット食道の進行を検出するためのマーカーのパネルの試験において、生検試料（確証生検試料セットと重なっていた）をさらに分析した。マーカーの３つのパネルを研究のために選択した。第１のマーカーパネルは、以下の４つのメチル化マーカー：Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ２７およびＵｐ１０の少なくとも１つを検出することからなった（対応するアンプリコンの亜硫酸水素塩配列決定分析を使用して、および表２Ａに規定される検出のための基準を使用して）。第２のパネルは、ＴＰ５３コード領域にわたったＰＣＲアンプリコンのセットを使用してゲノムＤＮＡからＴＰ５３を増幅し、次に、次世代ＤＮＡ配列決定を使用して、食道病変対マッチさせた正常な食道組織からのＴＰ５３配列を比較したアッセイにおいて、ＴＰ５３における体細胞性非同義突然変異について試験することからなった。１０％を超えるまたはそれと同等のＴＰ５３突然変異対立遺伝子の頻度が同定されたならば、試料は検出されたと分類された。第３のパネルは、Ｕｐ１５−１、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ２７およびＵｐ１０のいずれかにおけるメチル化の検出、またはＴＰ５３における突然変異の検出の組合せであった。
【０２２４】
表３は、表２の分析と異なるメチル化のためのカットオフ基準を使用した、第１の検証生検セットの異なる試料タイプの検出における、バイオマーカーの個々の成績を示す。対応するアンプリコン（Ｕｐ３、Ｕｐ１０、Ｕｐ２７、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２）の亜硫酸水素塩配列決定分析によって試験した５つの異なるメチル化ＤＮＡマーカーの異なる試料タイプの検出の成績を示す。表３は、この分析のためにそのリードをメチル化に分類するためにＤＮＡ配列リードでメチル化される必要があるＣｐＧの数を規定する。全てのＤＮＡ配列リードの１％を超えるかまたはそれと同等がメチル化に分類されるならば、または、全てのＤＮＡ配列リードの１０％を超えるかまたはそれと同等がメチル化に分類されるならば、試料がメチル化されているとみなされるときの結果を提供する。ＴＰ５３コード領域にわたったＰＣＲアンプリコンのセットを使用してゲノムＤＮＡからＴＰ５３を増幅し、次に、次世代ＤＮＡ配列決定を使用して、食道病変対マッチさせた正常な食道組織からのＴＰ５３配列を比較したアッセイにおける、非同義体細胞突然変異についての試験の、試料検出の成績も示す。ＴＰ５３リードの３％を超えるかそれと同等が突然変異体として評価されるならば、またはＴＰ５３リードの１０％を超えるかそれと同等が突然変異体として評価されるならば、試料がＴＰ５３突然変異体に分類されるときの、試料検出率（感度または特異性で表される）を示す。
【０２２５】
【表３】
2019522993.tif 000007
【０２２６】
表４は、表３に提供される実験における、異なる試料タイプの検出のためのメチル化ＤＮＡマーカー（Ｕｐ３、Ｕｐ１０、Ｕｐ２７、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２）の選択された組合せの成績を示す。マーカー組合せパネルの任意のメンバーが試料をメチル化と評価するならば、試料はメチル化と評価される。全てのＤＮＡ配列リードの１％を超えるかまたはそれと同等がメチル化に分類されるならば、または、全てのＤＮＡ配列リードの１０％を超えるかまたはそれと同等がメチル化に分類されるならば、個々のマーカーがメチル化されているとみなされるときの結果を提供する。
【０２２７】
【表４Ａ】
2019522993.tif 000008
【０２２８】
【表４Ｂ】
2019522993.tif 000009
【０２２９】
表３および表４に要約される試料は、ＴＰ５３における非同義の体細胞突然変異のためにさらに試験した。表５は、異なる試料タイプの検出のためのメチル化ＤＮＡマーカー（Ｕｐ３、Ｕｐ１０、Ｕｐ２７、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２）の選択された組合せに加えてＴＰ５３（ｐ５３）における突然変異の試験の成績を示す。マーカー組合せパネルの任意のメンバーが試料をメチル化と評価するならば、または、ＴＰ５３突然変異のための分析が試料をＴＰ５３突然変異体と評価するならば、試料は検出されたと評価される。ＤＮＡリードの１％を超えるかまたはそれと同等において任意のメチル化マーカーがメチル化として検出されるならば、または、ＤＮＡ配列リードの１０％を超えるかまたはそれと同等においてＴＰ５３が突然変異体として検出されるならば、試料は検出されたと評価されるマーカーパネルの成績を示す。ＤＮＡリードの１０％を超えるかまたはそれと同等において任意のメチル化マーカーがメチル化として検出されるならば、または、ＤＮＡ配列リードの１０％を超えるかまたはそれと同等においてＴＰ５３が突然変異体として検出されるならば、試料は検出されたと評価されるマーカーパネルの成績も示す。
【０２３０】
【表５Ａ】
2019522993.tif 000010
【０２３１】
【表５Ｂ】
2019522993.tif 000011
【０２３２】
食道の細胞擦過によっても得られた食道試料からも、ＤＮＡを抽出した。試料セットは、４９個の食道腺癌（ＥＡＣ）；胃食道接合部（ＪＣＡ）の１４個の癌腫；低いグレードの形成異常（ＬＧＤ）を有する８個のバレット食道；高いグレードの形成異常（ＨＧＤ）を有する９個のバレット食道；ショートセグメントのバレット食道（ＳＳＢＥ）の１３症例を含んだ、ＨＧＤまたはＥＡＣのない症例からの形成異常のないバレット食道の３３症例、別名非形成異常ＢＥからの擦過物を含んでいた。ＨＧＤなしの、ＥＡＣなしのバレット食道のない６２人の個体からの胃食道接合部（正常なＧＥＪ）の擦過物も含まれた。これは、胃食道逆流症を有する、好酸球性食道炎を有する、またはいかなる疾患もない個体を含んだ。上記の各個体からの正常な扁平上皮食道の１７６個の擦過物も含まれた。これらのＤＮＡ試料は、選択されたアンプリコンの亜硫酸水素塩配列決定によってメチル化のために分析し、ＴＰ５３における非同義の体細胞突然変異のためにも分析した。
【０２３３】
表６は、検証擦過物セットの異なる試料タイプの検出における、バイオマーカーの個々の成績を示す。選択されたアンプリコン（Ｕｐ３、Ｕｐ１０、Ｕｐ２７、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２）の亜硫酸水素塩配列決定によって分析した５つの異なるメチル化ＤＮＡマーカーの異なる試料タイプの検出の成績を示す。表は、そのリードをメチル化に分類するためにＤＮＡ配列リードでメチル化される必要があるＣｐＧの数を規定する。全てのＤＮＡ配列リードの１％を超えるかまたはそれと同等がメチル化に分類されるならば、または、全てのＤＮＡ配列リードの１０％を超えるかまたはそれと同等がメチル化に分類されるならば、試料がメチル化されているとみなされるときの結果を提供する。ＴＰ５３コード領域にわたったＰＣＲアンプリコンのセットを使用してゲノムＤＮＡからＴＰ５３を増幅し、次に、次世代ＤＮＡ配列決定を使用して、食道病変対マッチさせた正常な食道組織からのＴＰ５３配列を比較したアッセイにおける、体細胞突然変異についての試験の、試料検出の成績も示す。ＴＰ５３リードの３％を超えるかそれと同等が突然変異体として評価されるならば、または、ＴＰ５３リードの１０％を超えるかまたはそれと同等が突然変異体として評価されるならば、試料がＴＰ５３突然変異体に分類されるときの試料検出率（感度または特異性として表される）を示す。
【０２３４】
【表６Ａ】
2019522993.tif 000012
【０２３５】
【表６Ｂ】
2019522993.tif 000013
【０２３６】
表７は、表６に提供される食道擦過試料における、異なる試料タイプの検出のためのメチル化ＤＮＡマーカー（Ｕｐ３、Ｕｐ１０、Ｕｐ２７、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２）の選択された組合せの成績を示す。マーカー組合せパネルの任意のメンバーが試料をメチル化と評価するならば、試料はメチル化と評価される。全てのＤＮＡ配列リードの１％を超えるかまたはそれと同等がメチル化に分類されるならば、または、全てのＤＮＡ配列リードの１０％を超えるかまたはそれと同等がメチル化に分類されるならば、個々のマーカーがメチル化されているとみなされるときの結果を提供する。
【０２３７】
【表７Ａ】
2019522993.tif 000014
【０２３８】
【表７Ｂ】
2019522993.tif 000015
【０２３９】
表８は、表６および７に提供される食道擦過試料における、異なる試料タイプの検出のためのメチル化ＤＮＡマーカー（Ｕｐ３、Ｕｐ１０、Ｕｐ２７、Ｕｐ３５−１、Ｕｐ３５−２）の選択された組合せに加えてＴＰ５３（ｐ５３）における突然変異の試験の成績を示す。マーカー組合せパネルの任意のメンバーが試料をメチル化と評価するならば、または、ＴＰ５３突然変異のための分析が試料をＴＰ５３突然変異体と評価するならば、試料は検出されたと評価される。ＤＮＡリードの１％を超えるかそれと同等において任意のメチル化マーカーがメチル化として検出されるならば、または、ＤＮＡ配列リードの３％を超えるかそれと同等、もしくは１０％を超えるかそれと同等においてＴＰ５３が突然変異体として検出されるならば、試料は検出されたと評価されるマーカーパネルの成績を示す。ＤＮＡリードの１０％を超えるかそれと同等において任意のメチル化マーカーがメチル化として検出されるならば、または、ＤＮＡ配列リードの３％を超えるかそれと同等、もしくは１０％を超えるかそれと同等においてＴＰ５３が突然変異体として検出されるならば、試料は検出されたと評価されるマーカーパネルの成績も示す。形成異常のない全てのＢＥにおける９０％を超える特異性を有するマーカー組合せは、好ましい黄色である。ＥＡＣのために優れた感度をさらに示すマーカー組合せが、さらに好ましい。特に好ましいマーカー組合せは以下の通りである：Ｕｐ３５−２メチル化プラスＴＰ５３突然変異；Ｕｐ３５−２メチル化プラスＵｐ３メチル化プラスＴＰ５３突然変異；Ｕｐ１０メチル化プラスＵｐ３メチル化プラスＴＰ５３突然変異；Ｕｐ３５−２メチル化プラスＵｐ１０メチル化プラスＴＰ５３突然変異；Ｕｐ１０メチル化プラスＵｐ２７メチル化プラスＴＰ５３突然変異；Ｕｐ３５−２メチル化プラスＵｐ３メチル化プラスＵｐ１０メチル化プラスＴＰ５３突然変異。
【０２４０】
【表８Ａ】
2019522993.tif 000016
【０２４１】
【表８Ｂ】
2019522993.tif 000017
【０２４２】
（実施例４）
ホルマリン固定パラフィン包埋組織における食道がんの情報を提供する遺伝子座の分析
胃および食道のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料から抽出されたＤＮＡで、高いグレードの形成異常および食道腺癌を有するバレット以外の異なる診断カテゴリーを捕捉するさらなる研究を実行した。各試料からの亜硫酸水素塩で変換されたＤＮＡは、選択されたアンプリコンに対応している亜硫酸水素塩特異的メチル化に無関係なプライマーで増幅し、次に、アンプリコンを亜硫酸水素塩配列決定によって分析して、親のＤＮＡ鋳型の上でのメチル化状態を判定した。
【０２４３】
表９は、高いグレードの形成異常および食道腺癌を有するバレット以外の異なる診断カテゴリーを捕捉する、胃および食道のＦＦＰＥ組織試料における８つのメチル化ＤＮＡマーカーの並列比較を要約する。腸管異形成は、ＩＭと略す。表９は、そのリードをメチル化に分類するためにＤＮＡ配列リードで検出される必要があるメチル化シトシン塩基の数を各マーカーについて示す。ＤＮＡ配列リードの１％を超えるかまたはそれと同等がメチル化に分類されるならば、試料はメチル化として検出される。
【０２４４】
【表９Ａ】
2019522993.tif 000018
【０２４５】
【表９Ｂ】
2019522993.tif 000019
【０２４６】
表１０は、高いグレードの形成異常および食道腺癌を有するバレット以外の異なる診断カテゴリーを捕捉する、胃および食道のＦＦＰＥ組織試料における８つのメチル化ＤＮＡマーカーの並列比較を要約する。腸管異形成は、ＩＭと略す。表１０は、そのリードをメチル化に分類するためにＤＮＡ配列リードで検出される必要があるメチル化シトシン塩基の数を各マーカーについて示す。ＤＮＡ配列リードの１０％を超えるかまたはそれと同等がメチル化に分類されるならば、試料はメチル化として検出される。
【０２４７】
【表１０Ａ】
2019522993.tif 000020
【０２４８】
【表１０Ｂ】
2019522993.tif 000021
【０２４９】
表１１は、高いグレードの形成異常および食道腺癌を有するバレット以外の異なる診断カテゴリーを捕捉する、胃および食道のＦＦＰＥ組織試料におけるメチル化ＤＮＡマーカーの組合せを含む異なるパネルの成績を要約する。腸管異形成は、ＩＭと略す。表９および１０は、そのリードをメチル化に分類するためにＤＮＡ配列リードで検出される必要があるメチル化シトシン塩基の数を各マーカーについて示す。マーカーパネルの任意のメンバーに関してＤＮＡ配列リードの１％を超えるかまたはそれと同等がメチル化に分類されるならば、試料はメチル化として検出される。
【０２５０】
【表１１Ａ】
2019522993.tif 000022
【０２５１】
【表１１Ｂ】
2019522993.tif 000023
【０２５２】
表１２は、高いグレードの形成異常および食道腺癌を有するバレット以外の異なる診断カテゴリーを捕捉する、胃および食道のＦＦＰＥ組織試料におけるメチル化ＤＮＡマーカーの組合せを含む異なるパネルの成績を要約する。腸管異形成は、ＩＭと略す。表９および１０は、そのリードをメチル化に分類するためにＤＮＡ配列リードで検出される必要があるメチル化シトシン塩基の数を各マーカーについて示す。マーカーパネルの任意のメンバーに関してＤＮＡ配列リードの１０％を超えるかまたはそれと同等がメチル化に分類されるならば、試料はメチル化として検出される。
【０２５３】
【表１２Ａ】
2019522993.tif 000024
【０２５４】
【表１２Ｂ】
2019522993.tif 000025
【０２５５】
方法論
以下の方法を使用して、ＴＰ５３における体細胞突然変異を検出した。全てのコード配列およびスプライスジャンクションを包含するプライマー対の多重系を使用して、ＴＰ５３のエクソン２〜１１を増幅した。プライマーは、バーコード配列ならびにＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｉ５およびＩ７配列を最終ＰＣＲ生成物に導入した二次増幅のためにその後使用された、さらなる５’末端配列を含有した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ機器でＰＣＲ生成物を混合し、精製し、分析した。ＣＬＣＢｉｏソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ）およびＶａｒｉａｎｔＳｔｕｄｉｏソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、データ分析を実行した。
【図１Ａ】
2019522993.tif 000026
【図１Ｂ】
2019522993.tif 000027
【図１Ｃ】
2019522993.tif 000028
【図１Ｄ】
2019522993.tif 000029
【図２Ａ】
2019522993.tif 000030
【図２Ｂ】
2019522993.tif 000031
【図３】
2019522993.tif 000032
【図４】
2019522993.tif 000033
【図５】
2019522993.tif 000034
【図６Ａ】
2019522993.tif 000035
【図６Ｂ】
2019522993.tif 000036
【図７】
2019522993.tif 000037
【配列表】
2019522993000001.app
【国際調査報告】
2019522993.tif 000038
2019522993.tif 000039
2019522993.tif 000040
2019522993.tif 000041
2019522993.tif 000042
2019522993.tif 000043