(57)【要約】  本発明は、全般的には、アルファウイルスレプリコンとT7プロモーターとを利用する遺伝子発現系に関する。本系は、目的の遺伝子を宿主細胞のゲノム中に組込むことなく、タンパク質を細胞の細胞質中で発現することができる。本発明は人工多能性細胞の製造ならびに病原体および癌に対するワクチンのような、広範な用途を有する。【選択図】図１
2019500025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）バクテリオファージプロモーター、該バクテリオファージプロモーターに機能的に連結されたアルファウイルスレプリコン、第1キャッピング配列、サブゲノムプロモーター、第2キャッピング配列および目的の遺伝子を含むベクター、ならびに
（b）アルファウイルスベクターと共に細胞内に同時送達される、アルファウイルスレプリコンを転写する外因性RNAポリメラーゼ
を含む遺伝子発現系であって、目的の遺伝子が細胞の細胞質中で発現される、遺伝子発現系。
【請求項２】
アルファウイルスレプリコンがアルファウイルスに由来し、該アルファウイルスが、シンドビスウイルス（SIN）、セムリキ森林ウイルス（SFV）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（VEE）からなる群から選択される、請求項1記載の遺伝子発現系。
【請求項３】
アルファウイルスレプリコンが非細胞変性性である、請求項1記載の遺伝子発現系。
【請求項４】
アルファウイルスレプリコンがnsp2サブユニット内に1以上の突然変異を有する、請求項3記載の遺伝子発現系。
【請求項５】
バクテリオファージプロモーターが、T7、T3およびSP6プロモーターからなる群から選択される、請求項1記載の遺伝子発現系。
【請求項６】
第1および第2キャッピング配列の両方が、脳心筋炎ウイルスに由来する配列内リボソーム進入部位配列である、請求項1記載の遺伝子発現系。
【請求項７】
目的の遺伝子が抗原をコードしている、請求項1記載の遺伝子発現系。
【請求項８】
抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原および癌抗原からなる群から選択される、請求項7記載の遺伝子発現系。
【請求項９】
サブゲノムプロモーターがアルファウイルスに由来する、請求項1記載の遺伝子発現系。
【請求項１０】
バクテリオファージプロモーターがT7プロモーターであり、外因性RNAポリメラーゼがT7 RNAポリメラーゼである、請求項1記載の遺伝子発現系。
【請求項１１】
バクテリオファージプロモーター、該バクテリオファージプロモーターに機能的に連結されたアルファウイルスレプリコン、第1キャッピング配列、サブゲノムプロモーター、第2キャッピング配列および目的の遺伝子を含む、ベクター。
【請求項１２】
バクテリオファージプロモーターがT7プロモーターである、請求項11記載のベクター。
【請求項１３】
第1および第2キャッピング配列の両方が、脳心筋炎ウイルスに由来する配列内リボソーム進入部位配列である、請求項11記載のベクター。
【請求項１４】
目的の遺伝子が抗原をコードしている、請求項11記載のベクター。
【請求項１５】
抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原および癌抗原からなる群から選択される、請求項14記載のベクター。
【請求項１６】
抗原がインフルエンザ赤血球凝集素（HA）である、請求項15記載のベクター。
【請求項１７】
（a）1以上の哺乳類由来リプログラミング因子をコードする配列を含むベクターと、該アルファウイルスベクターと共に同時送達される外因性RNAポリメラーゼとを含む遺伝子発現系を哺乳類体細胞内に導入し、
（b）多能性および自己再生を維持するための条件下、線維芽細胞フィーダー層または細胞外マトリックス上、サイトカインの存在下で形質導入した体細胞を培養すること
を含む、人工多能性幹細胞の製造方法。
【請求項１８】
該配列がリプログラミング因子Oct4、Sox3/4、Klf4およびc-Mycをコードしており、その4つのリプログラミング因子が同時に発現される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
多能性幹細胞の樹立効率を改善するための物質の存在下で行う、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
多能性幹細胞の樹立効率を改善するための物質が、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）インヒビター、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（G9a）インヒビターおよびDNAメチラーゼ（Dnmt）インヒビターからなる群から選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
請求項1記載の遺伝子発現系を含むワクチンであって、目的の遺伝子が抗原をコードしている、ワクチン。
【請求項２２】
抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原および癌抗原からなる群から選択される、請求項21記載のワクチン。
【請求項２３】
抗原がインフルエンザ赤血球凝集素（HA）である、請求項22記載のワクチン。
【請求項２４】
（a）請求項1記載の遺伝子発現系を対象中に送達し、ここで、目的の遺伝子が抗原をコードしており、
（b）対象における該抗原に対する免疫応答を対象において誘導すること
を含む、対象において免疫応答を惹起するための方法。
【請求項２５】
請求項1記載の遺伝子発現系をトランスフェクトした樹状細胞を含む治療用組成物であって、目的の遺伝子が、該樹状細胞の表面上に提示されることができる抗原をコードしており、該治療用組成物が対象において免疫応答を生成できる、治療用組成物。
【請求項２６】
抗原が腫瘍抗原である、請求項25記載の治療用組成物。
【請求項２７】
腫瘍抗原が、チロシナーゼ、チロシン関連タンパク質1（TRP-1）およびチロシン関連タンパク質2（TRP-2）からなる群から選択される1以上のタンパク質である、請求項26記載の治療用組成物。
【請求項２８】
癌の治療を要する患者に請求項25記載の治療用組成物を投与することを含む、癌の治療方法。
【請求項２９】
癌がメラノーマであり、抗原がチロシナーゼである、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
癌がメラノーマであり、抗原がチロシン関連タンパク質1（TRP-1）である、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
癌がメラノーマであり、抗原がチロシン関連タンパク質2（TRP-2）である、請求項28記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、2015年11月18日付け出願の米国仮特許出願第62/256,788号（その開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。
【０００２】
背景
アルファウイルスは、トガウイルス科に属する、エンベロープ構造を有する一本鎖RNAウイルスである。アルファウイルスに基づくベクターはワクチン開発の魅力的な候補である。なぜなら、それは哺乳類細胞において高レベルの組換えタンパク質を発現し、動物モデルにおいて腫瘍細胞または致死量のウイルスでのチャレンジに対する中和抗体および防御を誘導しうるからである。Lundstromら, Gene Ther. Mol. Biol. 3:15-23 (1999)。アルファウイルスベクターは、通常、RNAレプリコンに基づいており、該RNAレプリコンにおいては、ウイルス構造遺伝子が欠失し、異種遺伝子により置換されている。アルファウイルスレプリコンは、その5'末端にウイルスレプリカーゼをコードしているORFを含み、それは、真核細胞中にそのRNAがトランスフェクトされると翻訳される。Casalesら, Virology 376:242-251 (2008)を参照されたい。これらのベクターは、シンドビスウイルス（SIN）、セムリキ森林ウイルス（SFV）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（VEE）を含む種々のウイルスから開発されている。Xiongら, Science 243:1188-1191 (1989)、Liljestromら, Biotechnology 9:1356-1361 (1991)、Pushkoら, Virology 239:389-401 (1997)およびCasalesら, Virology 376:242-251 (2008)を参照されたい。しかし、アルファウイルスに基づくベクターに関連した重大な問題は、未改変アルファウイルスベクターが、未だ完全には理解されていないメカニズムにより、ほとんどの哺乳類細胞において細胞変性性であることである。しかし、これらのベクターを非細胞変性性にすることができる、アルファウイルスレプリカーゼにおける幾つかの突然変異が見出されており、これらの突然変異のほとんどはRNAレプリカーゼのnsp2サブユニットにおいて検出されている。Froloveら, J. Virol. 73:3854-3865 (1999)、Perriら, J. Virol. 74:9802-9807 (2000)、Lundstromら, Expert Rev. Vaccines 2:447-459 (2003)およびPetrakovaら, J. Virol. 79:7597-7608（2005）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
裸RNA、組換えウイルス粒子および層状DNAベクターを含む幾つかのタイプのアルファウイルスベクター系が作製されている。裸RNAは、分解により遺伝子産物の変動をもたらす低い安定性の問題を有する。組換えウイルス粒子は、非相同組換えにより複製能の高いウイルス粒子を生成するリスクを有する。層状DNA/RNAベクターは、CMVプロモーターからの外来遺伝子発現をもたらすDNAベクターの送達から構成されるが、使用されるプロモーターのタイプゆえに発現のためにはDNAが核内に進入する必要があり、DNAが宿主染色体中に挿入されうるため、トランスフェクション効率が低下しうる。したがって、アルファウイルスベクターに基づく効率的な遺伝子発現系が尚も必要とされている。本発明はこの必要性を満足させるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概括
１つの態様においては、本発明は細胞質中の遺伝子発現のための真核細胞における遺伝子発現系を提供する。幾つかの実施形態においては、該遺伝子発現系は、以下の成分、すなわち、バクテリオファージプロモーター、バクテリオファージプロモーターに機能的に連結されたアルファウイルスレプリコン、第1キャッピング配列、サブゲノムプロモーター、第2キャッピング配列および目的の遺伝子を有するベクターを含む。該遺伝子発現系はまた、該ベクターと共に細胞中に同時送達される外因性RNAポリメラーゼを含み、これは、バクテリオファージプロモーターを認識することによりアルファウイルスレプリコンを転写する。
【０００５】
幾つかの実施形態においては、アルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス（SIN）、セムリキ森林ウイルス（SFV）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（VEE）からなる群から選択されるアルファウイルスに由来する。好ましい実施形態においては、アルファウイルスレプリコンは非細胞変性性であり、この場合、アルファウイルスレプリコンはnsp2サブユニット内に1以上の突然変異を含有する。
【０００６】
幾つかの実施形態においては、バクテリオファージプロモーターは、T7、T3およびSP6プロモーターからなる群から選択される。幾つかの他の実施形態においては、第1および第2キャッピング配列の両方が、脳心筋炎ウイルスに由来する配列内リボソーム進入部位配列である。幾つかの実施形態においては、目的の遺伝子は抗原をコードしており、該抗原はウイルス抗原、細菌抗原または癌抗原でありうる。幾つかの実施形態においては、サブゲノムプロモーターはアルファウイルスに由来する。好ましい実施形態においては、バクテリオファージプロモーターはT7プロモーターであり、外因性RNAポリメラーゼはT7ポリメラーゼである。
【０００７】
もう1つの態様においては、本発明は、バクテリオファージプロモーター、バクテリオファージプロモーターに機能的に連結されたアルファウイルスレプリコン、第1キャッピング配列、サブゲノムプロモーター、第2キャッピング配列および目的の遺伝子を含むベクターを提供する。幾つかの実施形態においては、バクテリオファージプロモーターはT7プロモーターである。幾つかの実施形態においては、第1および第2キャッピング配列の両方が、脳心筋炎ウイルスに由来する配列内リボソーム進入部位配列である。幾つかの実施形態においては、目的の遺伝子は抗原をコードしており、これはウイルス抗原、細菌抗原または癌抗原でありうる。
【０００８】
もう1つの態様においては、本発明は、（a）1以上の哺乳類由来リプログラミング因子をコードする配列を含むベクターと、該ベクターと共に同時送達される外因性RNAポリメラーゼとを含む遺伝子発現系を哺乳類体細胞中に導入し、（b）多能性および自己再生を維持するための条件下、線維芽細胞フィーダー層または細胞外マトリックス上、サイトカインの存在下で、形質導入した体細胞を培養することを含む、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell）の製造方法を提供する。幾つかの実施形態においては、該リプログラミング因子は、Oct3/4、Sox2、Klf4およびc-Mycからなる群から選択される。好ましい実施形態においては、リプログラミング因子Oct4、Sox2、Klf4およびc-Mycの組合せが発現される。幾つかの他の実施形態においては、該方法は、多能性幹細胞の樹立効率を改善するための物質の存在下で行われる。幾つかの実施形態においては、樹立効率を改善するための物質はヒストンデアセチラーゼ（HDAC）インヒビター、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（G9a）インヒビターまたはDNAメチラーゼ（Dnmt）インヒビターである。
【０００９】
もう1つの態様においては、本発明は、該遺伝子発現系を含むワクチンを提供し、ここで、目的の遺伝子は抗原をコードしており、該抗原はウイルス抗原、細菌抗原および癌抗原でありうる。好ましい実施形態においては、該ワクチンはインフルエンザ赤血球凝集素を含み、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を惹起することができる。
【００１０】
もう1つの態様においては、本発明は、目的の遺伝子が抗原をコードしている該遺伝子発現系を対象中に送達し、対象における抗原に対する免疫応答を対象において誘導することを含む、対象における抗原に対する免疫応答を惹起するための方法を提供する。本発明は、本明細書に開示されている組成物および方法の予防的使用および治療的使用の両方を想定している。
【００１１】
もう1つの態様においては、本発明は、該遺伝子発現系によりトランスフェクトされた樹状細胞を含む治療用組成物を提供し、ここで、目的の遺伝子は、該樹状細胞の表面上で提示されることができる抗原をコードしており、該治療用組成物は、T細胞を活性化して免疫応答を生じることができる。幾つかの実施形態においては、該抗原は腫瘍抗原である。好ましい実施形態においては、該腫瘍抗原は、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP-1）およびチロシナーゼ関連タンパク質2（TRP-2）からなる群から選択されるメラノーマ抗原である。
【００１２】
更にもう1つの態様においては、本発明は、癌の治療を要する患者に該治療用組成物を投与することを含む、癌の治療方法を提供する。好ましい実施形態においては、治療される癌はメラノーマである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1は本発明のアルファウイルスベクターを示す。アルファウイルスレプリカーゼ遺伝子はT7プロモーター下にクローニングされている。目的の遺伝子はレプリカーゼ領域の後かつSFVサブゲノムプロモーターの制御下に挿入される。ベクター中には2コピーのIREs配列が存在し、一方はT7プロモーターとレプリカーゼとの間に挿入されており、他方はSFVサブゲノムプロモーターと目的の遺伝子との間に挿入されている。目的の遺伝子の後にポリAおよびT7ターミネーター配列が配置されている。目的の遺伝子とT7ターミネーター配列との間に追加的な選択マーカー、例えばGFPおよびハイグロマイシンが挿入されうる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
詳細な説明
定義
本出願の全体にわたって以下の用語を用いる。特に示されていない限り、これらの用語は以下のとおりに定義される。
【００１５】
「ポリヌクレオチド」は核酸重合体である。「ポリヌクレオチド」は二本鎖配列および一本鎖配列の両方を含むことが可能であり、天然由来のDNA配列および合成DNA配列を含みうる。この語はまた、DNAおよびRNAの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列を包含し、天然配列に対する欠失、付加および置換（一般には本質的に保存的であるもの）のような改変を含む。
【００１６】
「ポリペプチド」および「タンパク質」なる語はアミノ酸残基の重合体を意味し、産物の最小長には限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などがこの定義に含まれる。全長タンパク質およびその断片の両方がこの定義に含まれる。これらの語はまた、天然配列に対する欠失、付加および置換（一般には本質的に保存的であるもの）のような改変を含む。
【００１７】
「抗原」なる語は、免疫学的応答を刺激できる1以上のエピトープを含有する分子を意味する。通常、エピトープは、約3〜15個、一般に約5〜15個のアミノ酸を含む。所与のタンパク質のエピトープは、当技術分野で周知の幾つものエピトープマッピング技術を用いて特定できる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris編, 1996) Humana Press, Totowa, N.J.を参照されたい。例えば、タンパク質分子の一部分に対応する多数のペプチドを固体支持体上で同時に合成し、該ペプチドを該支持体に結合させたまま該ペプチドを抗体と反応させることにより、直鎖状エピトープを決定することが可能である。そのような技術は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第4,708,871号; Geysenら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002(1984); Geysenら, Molec. Immunol. 23:709-715 (1986)（それらの全ては全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。同様に、立体エピトープは、例えばX線結晶学的方法および2次元核磁気共鳴のようなアミノ酸の空間的コンホメーションの決定により容易に特定される。例えば、Epitope Mapping Protocols（前掲）を参照されたい。
【００１８】
本発明の目的においては、抗原は、幾つかの公知のウイルス、細菌、寄生生物および真菌のいずれか、ならびに種々の腫瘍のいずれかに由来するものでありうる。更に、本発明の目的においては、「抗原」は、免疫学的応答を惹起する能力が維持されている限り、例えば、その天然配列に対する欠失、付加および置換（一般には本質的に保存的であるもの）のような改変を含めた、タンパク質を指す。これらの改変は部位特異的突然変異誘発によるもののように意図的なものであってもよく、あるいは、抗原を産生する宿主の突然変異によるもののように偶発的なものであってもよい。
【００１９】
「免疫学的応答」または「免疫応答」は、目的の組成物中に存在する分子に対する体液性および／または細胞性免疫応答の、対象における発生である。本発明の目的においては、「体液性免疫応答」は、抗体分子により媒介される免疫応答を指し、「細胞性免疫応答」は、Tリンパ球および／または他の白血球により媒介されるものである。したがって、本明細書中で用いる免疫学的応答は、細胞傷害性T細胞の産生および／またはヘルパーT細胞の産生もしくは活性化を刺激するものでありうる。そのような応答は、当技術分野で周知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを用いて決定されうる。
【００２０】
本明細書中で用いる「アルファウイルス」なる語は、その全てがトガウイルス科のメンバーであるウイルスの属を意味する。公知アルファウイルスには、東部ウマ脳炎ウイルス（EEE）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（VEE）、エバーグレイズウイルス、ムカンボウイルス、ピクスナウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス（WEE）、シンドビスウイルス、南アフリカアルボウイルス86（S.A.AR86）、セムリキ森林ウイルス、ミドルバーグ（Middleburg）ウイルス、チクングニアウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、バーマ森林ウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ウナウイルス、アウラウイルス、ワタロアウイルス、ババンキウイルス、キジラガッハ（Kyzylagach）ウイルス、ハイランズ（Highlands）Jウイルス、フォートモーガン（Fort Morgan）ウイルス、ヌドゥムウイルスおよびバギークリーク（Buggy Creek）ウイルスが含まれる。
【００２１】
本明細書中で用いる「アルファウイルスRNAレプリコン」または「アルファウイルスレプリコン」なる語は、非構造タンパク質遺伝子を発現するアルファウイルスRNA分子であって、それ自身の複製（増幅）を指令することが可能であり、5'および3'アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルス非構造タンパク質のコード配列ならびにポリアデノシントラクトを含むようなRNA分子を指して用いられる。それはまた、調節カセット、および該調節カセットから発現される目的の異種核酸を含有しうる。それはまた、1つであって全てではないアルファウイルス構造タンパク質を発現するように操作されうる。
【００２２】
本明細書中で用いる「ベクター」は、目的の遺伝物質の特異的選択および指向性導入を可能にする、遺伝子操作された、環状の、通常は二本鎖の核酸分子を指す。そのようなベクターは哺乳類発現ベクター、細菌プラスミド、バクテリオファージベクター、酵母エピソームベクター、人工染色体ベクターまたはウイルスベクターである。
【００２３】
本明細書中で互換的に用いる「3'末端」または「3'ヒドロキシル末端」なる語は、核酸分子の糖環における第3炭素のヒドロキシル基における末端を指し、テールエンドとしても知られる。本明細書中で互換的に用いる「5'末端」または「5'リン酸末端」なる語は、末端のデオキシリボースまたはリボースの糖環における第5炭素にリン酸基を有するDNAまたはRNA鎖の末端を称する。
【００２４】
本明細書中で互換的に用いる「宿主細胞」または「宿主」なる語は、本発明の単離された核酸分子またはベクターを含有する生物を意味する。そのような宿主細胞は哺乳類細胞、植物、細菌、昆虫細胞または線虫でありうる。好ましくは、宿主は真核細胞であり、より好ましくは、該宿主は哺乳類細胞である。
【００２５】
本明細書中で用いる「プロモーター」なる語は、転写を開始させるためにRNAポリメラーゼおよび他のタンパク質（トランス作用性転写因子）の認識および結合に関与するポリヌクレオチド分子を指す。
【００２６】
「機能的に連結された」なる語は、調節配列、例えばプロモーターが遺伝子の発現を制御することを意味する。
【００２７】
「バクテリオファージプロモーター」なる語は、バクテリオファージに由来するポリヌクレオチド分子であって、転写を開始させるためにRNAポリメラーゼおよび他のタンパク質（トランス作用性転写因子）の認識および結合に関与する分子を意味する。好ましい実施形態においては、バクテリオファージプロモーターはSP6、T7およびT3プロモーターである。
【００２８】
本明細書中で用いる「サブゲノムプロモーター」なる語は、RNA分子中および構造遺伝子の5'末端にあるそのような配列であって、該RNA分子を鋳型として用いてメッセンジャーRNA合成を指令する配列を指す。サブゲノムプロモーターは、RNAを鋳型として用いて遺伝子の発現を駆動するのに必要である。サブゲノムプロモーターは、ウイルスRNAレプリカーゼでありうるRNA依存性RNAポリメラーゼにより認識される。該プロモーター自体は、2以上の起源（天然物または合成物）に由来するセグメントの複合体でありうる。好ましい実施形態はセムリキ森林ウイルス由来のサブゲノムプロモーターである。
【００２９】
「キャッピング配列」なる語は、mRNA分子の5'末端に見出されるキャップ構造を形成できる配列を指し、一般的に、異常な5'-5'三リン酸結合を介してmRNAに連結されたグアノシンヌクレオチドからなる。好ましい実施形態においては、キャッピング配列はIRES配列である。
【００３０】
本明細書中で用いる「IRES」なる語は配列内リボソーム進入部位を意味する。IRES配列は、脊椎動物および無脊椎動物細胞に感染するウイルスからの多数の転写産物ならびに脊椎動物および無脊椎動物遺伝子からの転写産物において見出されている。本発明における使用に適したIRESエレメントの例には以下のものが含まれる：ピコルナウイルス由来のウイルス性IRESエレメント、例えばポリオウイルス（PV）、脳心筋炎ウイルス（EMCV）、口蹄疫ウイルス（FMDV）由来のウイルス性IRESエレメント、例えばC型肝炎ウイルス（HCV）のようなフラビウイルス由来のウイルス性IRESエレメント、例えばブタコレラウイルス（classical swine fever virus, CSFV）のようなペスチウイルス由来のウイルス性IRESエレメント、例えばマウス白血病ウイルス（MLV）のようなレトロウイルス由来のウイルス性IRESエレメント、例えばサル免疫不全ウイルス（SIV）のようなレンチウイルス由来のウイルス性IRESエレメント；あるいは、細胞性mRNA IRESエレメント、例えば、翻訳開始因子、例えばeIF4GまたはDAP5に由来するもの、転写因子、例えばc-Myc（YangおよびSarnow, Nucleic Acids Research 25:2800-2807(1997)）またはNF-κB抑制因子（NRF）に由来するもの、増殖因子、例えば血管内皮増殖因子（VEGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF-2）、血小板由来増殖因子B（PDGF B）に由来するもの、ホメオティック遺伝子、例えばアンテナペディアに由来するもの、生存（survival）タンパク質、例えばX連鎖アポトーシスインヒビター（XIAP）またはApaf-1、またはシャペロン、例えば免疫グロブリン重鎖結合タンパク質BiP（Martinez-Salasら, Journal of General Virology 82:973-984 (2001)）に由来するもの。好ましい実施形態においては、IRES配列は脳心筋炎ウイルス（EMCV, ATCCアクセッション番号NC001479）に由来する。
【００３１】
本発明の内容における「外因性」なる語は、遺伝子または酵素が天然の宿主生物には通常は存在しないことを意味する。本発明の内容における「外因性RNAポリメラーゼ」なる語は、RNAポリメラーゼが天然の宿主生物には通常は存在しないことを意味する。外因性RNAポリメラーゼは当技術分野で周知の方法を用いて細胞に送達されうることを当業者は認識するであろう。好ましい実施形態においては、外因性RNAポリメラーゼはベクターに予め結合しているか、あるいはベクターと共に細胞中に送達される。
【００３２】
「樹状細胞」なる語は、その特有の樹状形態および複数の薄膜突起ならびにその高密度のクラスII MHC分子により特徴づけられる抗原提示細胞を指して本明細書中で用いられる。樹状細胞には、皮膚のランゲルハンス細胞、輸入リンパ管の「ベール細胞」、濾胞性樹状細胞、脾臓の樹状細胞およびリンパ器官の指状嵌入細胞が含まれる。樹状細胞は皮膚、脾臓、骨髄、リンパ節、他のリンパ器官および末梢血臍帯血から得られうる。好ましくは、樹状細胞は、本発明における使用のために血液または骨髄から得られる。
【００３３】
アルファウイルスベクター
1つの態様においては、本発明は、目的の遺伝子を動物またはヒト細胞において発現させるためのアルファウイルスベクターを提供する。該アルファウイルスベクターにおいては、アルファウイルスレプリコンはプロモーター配列の制御下に配置され、これはアルファウイルスレプリコンの転写を開始させ、ついでアルファウイルスレプリコンはサブゲノムプロモーターを認識し、サブゲノムプロモーターに機能的に連結された目的の遺伝子の転写を開始させる。本発明はアルファウイルスレプリコンの高レベルな一過性異種遺伝子発現を利用する。これはワクチン開発においてそれを魅力的なものとするものである。
【００３４】
幾つかの実施形態においては、本発明のアルファウイルスベクターは以下の成分を以下の5'から3’方向へ含む：バクテリオファージプロモーター、第1キャッピング配列、アルファウイルスレプリコンをコードする配列、サブゲノムプロモーター、第2キャッピング配列、目的の遺伝子、転写ターミネーターおよびポリA配列。転写が5'末端から開始し、アルファウイルスレプリコンをコードする配列、目的の遺伝子を経て進行し、3'末端で終結するように、これらの成分は機能的に連結されている。また、本発明で使用されるアルファウイルスベクターは更に、目的の遺伝子の挿入を容易にする複数の制限酵素認識部位を有するマルチクローニングサイトの配列、IRES（配列内リボソーム進入部位）の配列などを含有していてもよい。
【００３５】
前記ベクターの製造における使用に適した野生型アルファウイルスをコードする配列は、本明細書に提供されている開示に基づいて天然源から、または寄託機関（例えば、American Type Culture Collection, Rockville, Maryland）から容易に得られる。
【００３６】
適切なアルファウイルスの代表例には以下のものが含まれる：アウラウイルス（ATCC VR-368）、べバルウイルス（ATCC VR-600, ATCC VR-1240）、カバッソウ（Cabassou）（スベオアルマジロ属）ウイルス（ATCC VR-922）、チクングニアウイルス（ATCC VR-64, ATCC VR-1241）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ATCC VR-65, ATCC VR-1242）、フォートモーガン（Fort Morgan）ウイルス（ATCC VR-924）、ゲタウイルス（ATCC VR-369, ATCC VR-1243）、キジラガッハ（Kyzylagach）ウイルス（ATCC VR-927）、マヤロウイルス（ATCC VR-66, ATCC VR-1277）、ミドルバーグ（Middleburg）ウイルス（ATCC VR-370）、ムカンボウイルス（ATCC VR-580, ATCC VR-1244）、ヌドゥムウイルス（ATCC VR-371）、ピクスナウイルス（ATCC VR-372, ATCC VR-1245）、ロスリバーウイルス（ATCC VR-373, ATCC VR-1246）、セムリキ森林ウイルス（ATCC VR-67, ATCC VR-1247）、シンドビスウイルス（ATCC VR-68, ATCC VR-1248; 後記のCMCC #4640も参照されたい）、トナテ（Tonate）ウイルス（ATCC VR-925）、トリニチ（Triniti）ウイルス（ATCC VR-469）、ウナウイルス（ATCC VR-374）、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス（ATCC VR-69, ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR-532）、西部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252）、ワタロアウイルス（ATCC VR-926）およびY-62-33ウイルス（ATCC VR-375）。
【００３７】
アルファウイルス細胞変性ベクターは、例えばインビトロでのタンパク質の製造および特徴づけ、ワクチン接種ならびに癌遺伝子治療研究のような種々の用途において有用である。しかし、例えばIPS誘導のように長期間の遺伝子発現が必要とされる場合には、細胞変性ベクターは使用できない。幾つかの実施形態においては、本発明におけるアルファウイルスレプリコンは、アルファウイルスレプリコンを非細胞変性性にする1以上の突然変異を含有しうる。突然変異は1以上のヌクレオチドのヌクレオチド欠失、付加または置換であってよく、あるいは、適切な野生型アルファウイルスと比較して突然変異を含有する生ウイルスの細胞変性効果の喪失をもたらす再編成またはキメラ構築を含む突然変異であってよい。そのような突然変異は、アルファウイルス非構造タンパク質であるnsp1〜nsp4サブユニットに存在しうる。幾つかの好ましい実施形態においては、突然変異はアルファウイルスnsp-2に存在する。nsp-2における例示的な突然変異としては、以下に限定するものではないが、以下の任意の1以上におけるアミノ酸の欠失または置換が挙げられる：nsp2アミノ酸1位、nsp2アミノ酸10位、nsp2アミノ酸469位、nsp2アミノ酸472位；nsp2アミノ酸694位；nsp2アミノ酸713位；nsp2アミノ酸718位；nsp2アミノ酸721位。幾つかの実施形態においては、非細胞変性アルファウイルスレプリコンはnsp2に突然変異P718Tを有する。幾つかの実施形態においては、非細胞変性アルファウイルスレプリコンはnsp2に突然変異R649Hを有する。幾つかの実施形態においては、非細胞変性アルファウイルスレプリコンはnsp2に突然変異P718TおよびR649Hの両方を有する。非細胞変性アルファウイルスレプリコンをコードする配列および非細胞変性アルファウイルスレプリコンの製造方法は当技術分野で公知であり、例えば、Belliら, US2003/0170871; Frolovaら, J. Virol., 76:11254-11264 (2002); Perriら, J. Virol., 74:9802-9807 (2000); Lundstromら, Expert Rev. Vaccines 2:447-459 (2003); Lundstromら, Cell Biol., 115:83-91 (2001); Petrakovaら, J. Virol., 79:7597-7608 (2005); Casalesら, Virology, 376(1):242-251 (2008)（これらの参考文献の全ては全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００３８】
幾つかの実施形態においては、アルファウイルスベクターのバクテリオファージプロモーターは、T7、T3またはSP6プロモーターからなる群から選択される。好ましい実施形態においては、バクテリオファージプロモーターはT7プロモーターである。もう1つの好ましい実施形態においては、転写ターミネーターはT7ターミネーターである。T7プロモーターおよびターミネーターの配列は当技術分野で公知である。Reimら, US 5122457を参照されたい。
【００３９】
幾つかの実施形態においては、第1および第2キャッピング配列は配列内リボソーム進入部位（IRES）の配列である。本発明における使用に適したIRESエレメントの例には以下のものが含まれる：ピコルナウイルス由来のウイルス性IRESエレメント、例えばポリオウイルス（PV）、脳心筋炎ウイルス（EMCV）、口蹄疫ウイルス（FMDV）由来のウイルス性IRESエレメント、例えばC型肝炎ウイルス（HCV）のようなフラビウイルス由来のウイルス性IRESエレメント、例えばブタコレラウイルス（classical swine fever virus, CSFV）のようなペスチウイルス由来のウイルス性IRESエレメント、例えばマウス白血病ウイルス（MLV）のようなレトロウイルス由来のウイルス性IRESエレメント、例えばサル免疫不全ウイルス（SIV）のようなレンチウイルス由来のウイルス性IRESエレメント；あるいは、細胞性mRNA IRESエレメント、例えば、翻訳開始因子、例えばeIF4GまたはDAP5に由来するもの、転写因子、例えばc-Myc（YangおよびSarnow, Nucleic Acids Research 25:2800-2807(1997)）またはNF-κB抑制因子（NRF）に由来するもの、増殖因子、例えば血管内皮増殖因子（VEGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF-2）、血小板由来増殖因子B（PDGF B）に由来するもの、ホメオティック遺伝子、例えばアンテナペディアに由来するもの、生存（survival）タンパク質、例えばX連鎖アポトーシスインヒビター（XIAP）またはApaf-1、またはシャペロン、例えば免疫グロブリン重鎖結合タンパク質BiP（Martinez-Salasら, Journal of General Virology 82:973-984 (2001)に概説されている）に由来するもの。好ましい実施形態においては、第1および第2キャッピング配列は脳心筋炎ウイルス（EMCV, ATCCアクセッション番号NC001479）からのIRESの配列である。
【００４０】
前記アルファウイルスベクターを構築するための一般的方法は、Sambrook, J.ら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Ausubel, F.M.ら, Short protocols in Molecular Biology: A Compendium Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1999)に記載されている。
【００４１】
外因性RNAポリメラーゼの同時送達
もう1つの態様においては、本発明は、アルファウイルスベクターと、該アルファウイルスベクターに予め結合しており細胞内に同時送達される外因性RNAポリメラーゼとを含む遺伝子発現系を提供する。該遺伝子発現系のユニークな特徴は、遺伝子発現の開始が、宿主細胞内に進入する前に外因性RNAポリメラーゼが該ベクターに結合していることに依存することである。ベクターに予め結合したRNAポリメラーゼの複合体は、細胞内への進入中に解離することなく安定である。RNAポリメラーゼおよび結合ベクターが細胞の細胞質に進入すると、予め結合したRNAポリメラーゼにより、ベクター中のバクテリオファージプロモーターを介して、転写が直ちに開始される。バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼは核局在化シグナルを含有せず、細胞質内にとどまるため、目的の遺伝子の発現は細胞質内でのみ生じ、核内の宿主細胞ゲノム内への組込みを要しないように、該遺伝子発現系は設計されている。Dunnら, Gene 68, 259-266 (1988)を参照されたい。好ましい実施形態においては、外因性RNAポリメラーゼはT7 RNAポリメラーゼであり、その配列は当技術分野で公知である。 Reimら, 米国特許第5122457号を参照されたい。
【００４２】
本発明の遺伝子発現系は、他のアルファウイルスベースの発現方法と比較して幾つかの利点をもたらす。第1に、それは転写開始のためにDNAが細胞核内に進入することを要しないため、遺伝子発現が迅速である。その作用部位が細胞質に位置することは、発癌遺伝子のような休眠遺伝子の隣接部位における宿主ゲノム中へのその組込みと、それによる該休眠遺伝子の活性化の可能性を低減するという安全性上の特徴をもたらす。更に、レトロウイルスベクターとは異なり、たとえDNAの組込みが生じたとしても、使用される外因性プロモーターは真核生物転写タンパク質によっては活性化されないであろう。RNAポリメラーゼは細胞の細胞質中で合成され、それは核移行シグナルを欠いているため、その同族（コグネイト）プロモーターへの結合のために核に接近することはできないであろう。この遺伝子発現系は種々の用途を有する。例えば、それは、特異的抗体の生成のために動物の免疫化に使用される大量のタンパク質の迅速な産生に有用である。これに関して、本発明は、抗原特異的宿主免疫応答を惹起する遺伝子産物の一過性発現のために、細胞および組織中に外因性遺伝子をインビボで導入するために使用されうる。遺伝子発現の短期的性質は、抗原に対する宿主のインビボ免疫化のためのビヒクルとしてのその使用にとって理想的でありうる。
【００４３】
幹細胞療法
1つの態様においては、本発明は、哺乳類体細胞をリプログラミングすることによる、人工多能性幹細胞の製造方法を提供する。本発明の遺伝子発現系はアルファウイルスレプリコンの高いトランスフェクション効率を利用するため、それは体細胞の効率的なトランスフェクションをもたらして人工多能性幹細胞を産生する。本明細書中で用いる「人工多能性幹細胞」または「iPS細胞」なる語は、いわゆる胚性幹（ES）細胞ではないが、ES細胞の特性に類似した特性を有する、多能性を有する人工的に産生された細胞を指す。iPS細胞はマウス体細胞およびヒト体細胞から樹立されている。TakahashiおよびYamanakaら, Cell 126: 663-676 (2006); Takahashiら, Cell 13 1 : 861-872 (2007); Yuら, Science 318: 1917-1920 (2007); Nakagawaら, Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008)を参照されたい。iPS細胞は例えば以下の特徴を有する：それは、動物の体を構成する種々の細胞に分化することができ（すなわち、多能性）；核型をも保持しつつ半永久的な増殖を維持することができ；およびES細胞により一般的に発現される遺伝子の群も同様に発現される。したがって、iPS細胞は、分化した体細胞とは明らかに異なる特性を有する、体細胞のリプログラミングにより人工的に誘導された細胞である。
【００４４】
幾つかの実施形態においては、該遺伝子発現系は、1以上のiPS細胞リプログラミング因子を発現させるために使用されうる。幾つかの実施形態においては、該遺伝子発現系は、1以上の突然変異をnsp2に有する非細胞変性アルファウイルスレプリコンを含むベクターを含む。nsp-2における例示的な突然変異には、以下に限定するものではないが、以下の任意の1以上におけるアミノ酸の欠失または置換が含まれる：nsp2アミノ酸1位、nsp2アミノ酸10位、nsp2アミノ酸469位、nsp2アミノ酸472位；nsp2アミノ酸694位；nsp2アミノ酸713位；nsp2アミノ酸718位；nsp2アミノ酸721位。幾つかの実施形態においては、非細胞変性アルファウイルスレプリコンはnsp2に突然変異P718Tを有する。幾つかの実施形態においては、非細胞変性アルファウイルスレプリコンはnsp2に突然変異R649Hを有する。幾つかの実施形態においては、非細胞変性アルファウイルスレプリコンはnsp2に突然変異P718TおよびR649Hの両方を有する。幾つかの実施形態においては、nsp2における突然変異はP718TおよびR649Hである。
【００４５】
本明細書中で用いる「リプログラミング」なる語は、分化細胞を未分化細胞、特に多能性細胞へと誘導し変換する方法または手段を指す。本発明においては、iPS細胞への体細胞のリプログラミングは、生殖系列細胞、例えば卵子（または卵）、卵母細胞およびES細胞に非依存的に生じうる。本明細書中で用いるリプログラミング因子には、タンパク質、核酸またはそれらの組合せが含まれる。現在までに報告されているリプログラミング因子の例には、Oct3/4、Sox2およびKlf4；Oct3/4、Klf4、およびc-Myc；Oct3/4、Sox2、Klf4およびc-Myc；Oct3/4およびSox2；Oct3/4、Sox2およびNanog；Oct3/4、Sox2およびLin28；ならびにOct3/4およびKlf4が含まれる。前記のリプログラミング因子の配列はGenBank（NCBI, U.S.A.）へのアクセスによっても入手可能である。US 2011/0250692を参照されたい。
【００４６】
前記のリプログラミング因子Oct3/4、NanogおよびLin28のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、それぞれ、GenBank（NCBI, U.S.A.）へのアクセスにより入手可能である。Oct3/4に関しては、例えば、ヒトOct3/4、マウスOct3/4およびラットOct3/4の配列は、それぞれ、NM 203289またはNM 002701、NM 013633およびNM OO 1009178として登録されている。Nanogに関しては、例えば、ヒトNanog、マウスNanogおよびラットNanogの配列が、それぞれ、NM 024865、NM 028016およびNM OO 00117878として登録されている。
【００４７】
Lin28に関しては、例えば、ヒトLin28、マウスLin28およびラットLin28の配列が、それぞれ、NM 024674、NM 145833およびNM OO1 109269として登録されている。Lin28に類似する因子として、同じLinファミリーに属するLin28bが公知である。したがって、Lin28に加えて、またはLin28の代わりに、Lin28bが使用されうる。Lin28bに関しては、例えば、ヒトLin28bおよびマウスLin28bの配列が、それぞれ、NM OO 1004317およびNM 001031772として登録されている。
【００４８】
好ましい実施形態では、本発明における体細胞からiPS細胞を誘導するためのリプログラミング因子はリプログラミング因子Oct3/4、Sox 2、Klf4およびc-Mycの組合せである。もう1つの好ましい実施形態においては、前記のリプログラミング因子の組合せは同時に発現されうる。
【００４９】
前記因子以外のリプログラミング因子の例には、以下に限定するものではないが、以下のものから選択される1以上のリプログラミング因子（または一群のリプログラミング因子）が含まれる：ECAT1、およびECAT2（ESG1とも称される）、ECAT3（Fbxl5とも称される）、ECAT5（Erasとも称される）、ECAT7、ECAT8およびECAT9（Gdf3とも称される）、ECAT10（Sox15とも称される）、ECAT15-1（Dppa4とも称される）、ECAT 15-2（Dppa2とも称される）、Fth1 17、Sall4およびRex1（Zfp42とも称される）、Utfl、TellおよびStella（Dppa3とも称される）、β-カテニン（Ctnnblとも称される）、Stat3、Grb2、c-Myc、Soxl、Sox3、N-Myc、L-Myc、Klfl、Klf2、Klf4およびKlf5（国際公開WO2007/069666）、ならびにFoxD3、ZNF206、Mybl2およびOtx2（国際公開WO2008/118820）。前記のリプログラミング因子の配列もGenBank（NCBI, U.S.A.）へのアクセスにより入手可能である。US 2011/0250692を参照されたい。
【００５０】
各リプログラミング因子の由来する哺乳動物の種類は限定されず、任意の哺乳動物が使用されうる。好ましい哺乳動物の例には、霊長類（例えば、ヒト、サルおよびチンパンジー）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモットおよびハムスター）、有蹄類（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギおよびブタ）およびペット動物（例えば、イヌおよびネコ）が挙げられる。一般に、特定の哺乳動物に由来する体細胞をリプログラミングする場合には、同じ哺乳動物に由来するリプログラミング因子が好ましくは使用される。例えば、iPS細胞をヒト由来の体細胞から誘導する場合、ヒト由来のリプログラミング因子が使用される。
【００５１】
好ましい実施形態においては、1以上のリプログラミング因子をコードするヌクレオチド配列群がアルファウイルスベクター中に、好ましくは、サブゲノム配列とT7ターミネーター配列との間にクローニングされうる。アルファウイルスベクターは選択マーカーを更に含みうる。選択マーカーの例には、薬物耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子およびピューロマイシン耐性遺伝子）、レポーター遺伝子（例えば、GFP（緑色蛍光タンパク質）、GUS（β-グルクロニダーゼ）およびFLAG）、および陰性選択マーカー（例えば、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子およびジフテリア毒素（DT）遺伝子）が含まれる。
【００５２】
好ましい実施形態においては、複数のリプログラミング因子を、発現が可能となるように直列に連結し、それにより、それらを含有するカセットを得る。このカセットはベクター中に、好ましくは、サブゲノムプロモーターとターミネーター配列との間に組込まれる。リプログラミング因子の間にリンカー配列が配置されうる。2以上のリプログラミング因子（または遺伝子）の連結のためには、口蹄疫ウイルス由来2A配列（PLoS 0NE3, e2532, 2008, Stem Cells 25, 1707, 2007）、IRES配列（米国特許第4,937,190号）のような、ポリシストロニック発現を可能にする任意の配列が使用されうる。
【００５３】
幾つかの実施形態においては、iPS細胞の樹立を更に改善または促進するために、追加的な物質が加えられうる。そのような物質には、以下に限定するものではないが、サイトカイン、例えば塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および幹細胞因子（SCF）が含まれうる。更に、該物質には、低分子量化合物、例えばヒストンデアセチラーゼ（FIDAC）インヒビター、例えばバルプロ酸（VPA）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（G9a）インヒビター、例えばBIX-01294（BIX）、およびDNAメチラーゼ（Dnmt）インヒビター、例えば5'-アザシチジンが含まれる。Huangfuら, Nat. Biotechnol., 26 (7): 795-797 (2008); Shiら, Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008); Kubicekら, Mol. Cell 25: 473-481 (2007); Shiら, Cell Stem Cell, 3: 568-574 (2008)を参照されたい。また、p53インヒビター、例えば、p53またはUTF1に対するshRNAまたはsiRNAが細胞内に導入されうる。Yangら, Cell Stem Cell, 3: 475-479 (2008)を参照されたい。更に、シグナル伝達、Wntシグナルの活性化、マイトジェン活性化プロテインキナーゼおよびグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3シグナル伝達の抑制に関して、ES細胞特異的miRNAもiPS細胞の樹立の効率を改善しうる。Marsonら, Cell Stem Cell, 3: 32-135, (2008)、Silvaら, PLoS Biology, 6, pp2237-2247 (2008)、およびJudsonら, Nat. Biotechnol. 27:459-461 (2009)を参照されたい。
【００５４】
本明細書中で用いる体細胞には、以下に限定するものではないが、胎児体細胞、新生児体細胞および成熟体細胞、初代培養細胞、継代細胞ならびに樹立細胞系のうち任意のものが含まれる。体細胞の例には、組織幹細胞および組織前駆細胞が更に含まれる。体細胞の具体例には、以下に限定するものではないが、（1）組織幹細胞（体細胞幹細胞）、例えば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞および歯髄幹細胞、（2）組織前駆細胞、ならびに（3）分化細胞、例えばリンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、線維芽細胞（例えば、皮膚細胞）、毛包細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵臓細胞（例えば、膵外分泌細胞）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および皮膚細胞が含まれる。
【００５５】
体細胞を得るための起源として適している哺乳動物個体は、以下に限定するものではないが、好ましくは、得られたiPS細胞が再生医療に使用された場合に拒絶反応が生じないという観点から、患者自身、または同一もしくは実質的に同一のHLA型を有する他者である。本明細書中で用いる、HLA型に関する「実質的に同一」なる語は、体細胞に由来するiPS細胞の分化を誘導することにより産生される細胞が患者に移植された場合に、移植細胞が生存可能である程度に、ドナーとレシピエントとの間でHLA型が一致すること［例えば、主要HLA（例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3つの遺伝子座）が同一である場合］を意味する。これは後記において同様に適用される。iPS細胞を投与も移植もしない場合、例えば、患者における薬物感受性または副作用の存在または非存在を評価するのにスクリーニングするために細胞源としてiPS細胞を使用する場合には、患者自身、または薬物感受性もしくは副作用と相関する同一遺伝子多型を有する他者から体細胞を得ることが望ましい。
【００５６】
適切に選択された物質、例えば血清（例えば、10% FBS）、抗生物質（例えば、ペニシリンおよび／またはストレプトマイシン）、ピルビン酸Na、グルタミン、非必須アミノ酸およびL-デキストロースを補充した基本培地、例えばDMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）、MEM（最小必須培地）、α-MEM（最小必須培地アルファ改変）、Ham's F12、RPMI1640またはそれらの混合物中、約37℃の温度で、5% CO2の存在下、体細胞を培養することができる。培養手法は当業者に公知であり、例えば、US 2010/0250692を参照されたい。
【００５７】
リプログラミング因子をコードする核酸を、哺乳動物由来の培養した体細胞内に導入するための方法には、通常の方法、例えばエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、ウイルス感染法、リポフェクション法およびリポソーム法が含まれる。
【００５８】
iPS細胞の誘導のためには、培養体細胞を動物細胞培養用の適当な培地中で前記のリプログラミング因子と接触させ、該リプログラミング因子を該体細胞内に導入し、それにより、該細胞を形質転換または形質導入（トランスダクション）する。培養培地の例には、以下に限定するものではないが、10〜15% FBSを含有するDMEM、DMEM/F12またはDME培地［該培地は更に、所望により、LIF（白血病抑制因子）、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸、β-メルカプトエタノールなどを含有していてもよい］、bFGFまたはSCFを含有するES細胞培養用培地、例えばマウスES細胞培養用培地（例えば、TX-WES(商標)、COSMO BIO）、あるいは霊長類ES細胞培養用培地（例えば、ReproCELL(商標)、COSMO BIO）が含まれる。培養手法は当業者に公知であり、例えば、US 2010/0250692を参照されたい。
【００５９】
多能性（または3つの胚葉の形成）は、例えば、奇形腫形成、および奇形腫組織内の3つの胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の各組織（または細胞）の特定に基づいて確認されうる。特に、マウスiPS細胞の場合には、細胞をヌードマウスに皮下注射し、あるいはヒトiPS細胞の場合には、細胞をScidマウスの精巣中に注射し、ついで腫瘍形成を確認する。多能性は、腫瘍組織が例えば軟骨組織（または細胞）、神経管組織（または細胞）、筋肉組織（または細胞）、脂肪組織（または細胞）、腸様組織（または細胞）などから構成されるという結果により確認されうる。更に、多能性は、このようにして生じた奇形腫が神経管組織（外胚葉）、軟骨組織（中胚葉）、腸様組織（内胚葉）を含有することを示す組織学的染色によっても確認されうる。
【００６０】
iPS細胞は、種々の分化細胞、前駆細胞および組織を形成するように誘導されうる。特に、アクチビンA/BMP4（骨形成タンパク質4）またはVEGF（血管内皮増殖因子）のような因子の存在下、神経細胞および心筋細胞のような種々の分化細胞がiPS細胞から誘導されうる。得られた分化細胞は、該細胞を患者（例えば、欠損組織を有する患者）に移植することにより患者を治療するための再生医療として使用されうる。
【００６１】
ウイルスおよび他の病原体に対するワクチン
1つの態様においては、本発明はワクチンの送達方法を提供する。幾つかの実施形態においては、本発明の遺伝子発現系は、種々の病原体からの免疫原性タンパク質をコードしうる標的遺伝子の発現を可能にする。幾つかの実施形態においては、病原体はウイルスである。例えば、免疫原性タンパク質は、ウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV）、サイトメガロウイルス（CMV）、ブタコレラウイルスCSFV、デング熱、エボラ、B型肝炎、C型肝炎、ヘンドラウイルス（HeV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV-1）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、単純ヘルペスウイルス（HSV-1）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（IBDV）、インフルエンザ、伝染性サケ貧血ウイルス（ISAV）、日本脳炎ウイルス（JEV）、ラッサ、跳躍病ウイルス（LIV）、マールブルグウイルス（MBGV）、麻疹、マレー渓谷脳炎ウイルス（MVE）、ニパウイルス（NiV）、ノーウォーク様ウイルス（NLV）、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、リフトバレー熱ウイルス（RVFV）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoV）、ソウルウイルス（SEOV）、サル-ヒト免疫不全ウイルス（SHIV）、スーダンウイルス（SUDV）、ワクシニアに由来しうる。代表的な免疫原性タンパク質またはペプチドを表1に示す。
【００６２】
【表１】
2019500025.tif 000003
【００６３】
幾つかの実施形態においては、免疫原性タンパク質またはペプチドは非ウイルス病原体に由来しうる。例えば、免疫原性タンパク質は、B. anthracis（B.アンスラシス；炭疽菌）、B. abortus（B.アボルツス）、C. Botulinum（C.ボツリヌム）、マラリア、M. tuberculosis（M.ツベルクローシス；結核菌）、P. falciparum（P.ファルシパルム）、プリオン、スタフィロコッカス属（ブドウ球菌）に由来しうる。例示的な免疫原性タンパク質を表2に示す。
【００６４】
【表２】
2019500025.tif 000004
【００６５】
抗原に対する能動的免疫応答が惹起される限り、当技術分野で公知の任意の適切なワクチンおよびワクチン接種方法（すなわち、免疫化）が本発明の実施において使用されうる。
【００６６】
好ましい実施形態においては、ワクチン方法は裸DNAワクチンである。DNAワクチン接種は、抗原をコードするポリヌクレオチドをインビボで投与して、標的細胞中で抗原の産生を誘導することを含む。DNAワクチンの導入は正常細胞の主要組織適合複合体（HMC）と共にトランスフェクト細胞の細胞表面上に抗原を提示させる。更に、トランスフェクト細胞により発現された抗原はまた、抗原提示細胞により拾い上げられて、全身性体液性抗体応答を誘発しうる。
【００６７】
幾つかの実施形態においては、該遺伝子発現系はワクチン組成物中に配合されることが可能であり、該ワクチン組成物はアジュバントを更に含みうる。本明細書中で用いる「アジュバント」は、対象に有害な影響を与えることなく対象における免疫応答を増強、改善またはさもなければ調節（モジュレーション）するためにポリペプチドまたは核酸ワクチンと組み合わせることができる任意の免疫調節物質でありうる物質を示す。例えば、本発明のアジュバントは、以下に限定するものではないが、免疫刺激性サイトカイン（GM/CSF、インターロイキン2、インターロイキン12、インターフェロンガンマ、インターロイキン4、腫瘍壊死因子アルファ、インターロイキン1、造血因子flt3L、CD40L、B7.1共刺激分子およびB7.2共刺激分子を包含するが、これらに限定されるものではない）でありうる。適切なアジュバントは水中油、サポニン、アルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）、リン酸アルミニウムまたはアルガンムリン（algannmulin）をも包含するが、カルシウム、鉄または亜鉛の塩であってもよく、あるいはカチオンもしくはアニオン誘導体化多糖またはポリホスファゼンまたはアシル化糖もしくはアシル化チロシンの不溶性懸濁液であってもよい。ワクチンはまた、医薬上許容される賦形剤と共に製剤化されうる。そのような賦形剤は当技術分野でよく知られており、典型的には、生理学的に許容され、不活性であり、または本発明の組成物のワクチン特性を増強するものであるべきである。具体例には、無菌生理食塩水のような液体ビヒクルが含まれる。賦形剤を使用する場合、それはワクチンの製剤化における任意の時点で加えられることが可能であり、あるいはそれは完全なワクチン組成物と混合されうる。
【００６８】
幾つかの実施形態においては、投与されるワクチンは1用量あたりDNA約1〜5μgの量であることが可能であり、治療される対象、所望の免疫応答を生じる対象の免疫系の能力および望まれる保護の度合に左右される。投与されるべきワクチンの正確な量は実施者の判断によるものであってもよく、各対象および抗原に特有でありうる。
【００６９】
ワクチンは単回投与スケジュール、または好ましくは、複数回投与スケジュール［この場合、初期ワクチン接種過程は、別々の1〜10回の投与と、その後の、免疫応答を維持および／または増強するのに必要なそれに続く時間間隔での他の投与、例えば、2回目の投与に関しては1〜4ヶ月の時点での他の投与、そして必要に応じて数ヶ月後の後続の投与を行いうる］で投与されうる。適切な免疫化スケジュールの例には、（i）0、1ヶ月および6ヶ月、（ii）0、7日および1ヶ月、（iii）0および1ヶ月、（iv）0および6ヶ月が含まれ、あるいは、防御免疫を付与する又は疾患症状を軽減する又は疾患の重症度を低減すると考えられる所望の免疫応答を惹起するのに十分な他のスケジュールが含まれる。
【００７０】
好ましくは、ワクチン製剤化用のDNAを凍結または凍結乾燥して乾燥粉末を形成する。製剤化において溶液を使用する場合には、該溶液のための乾燥成分を予め混合し、予め測定し、バイアルまたは密封薬袋のような容器に入れることが可能である。
【００７１】
ワクチンは複数の投与経路用に製剤化されうる。特に好ましい経路には、筋肉内、経皮、皮下もしくは皮内注射、エアロゾル、経口またはこれらの経路の組合せが含まれ、１回でまたは複数の単位投与量で投与されうる。ワクチンの投与は周知であり、最終的には、個々の製剤および主治医の判断による。
【００７２】
癌ワクチン
本発明の1つの態様は、癌抗原をコードする遺伝子または抗癌遺伝子を含むアルファウイルスベクターを、癌に罹患している哺乳動物に投与することによる、癌の治療方法を提供する。幾つかの実施形態においては、治療される癌は、以下に限定するものではないが、脳腫瘍、子宮頸癌、結腸癌、内皮癌、悪性腫瘍（例えば、神経芽細胞腫、膠芽腫、神経膠腫、髄芽細胞腫、星状細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫および髄膜腫）、腎臓癌、メラノーマ、転移性癌、前立腺癌、乳癌、膀胱癌、膵臓癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌および非小細胞肺癌）でありうる。
【００７３】
幾つかの実施形態においては、癌抗原は、癌に対する免疫応答を惹起しうるタンパク質またはペプチドである。例えば、そのようなタンパク質またはペプチドには、以下に限定するものではないが、メラノソーム抗原（例えば、メラニン細胞組織特異的タンパク質、gp100、MART-1およびチロシナーゼ）、癌マーカー（例えば、HER2-neu、CEAおよびPSA）が含まれる。これらの癌抗原の配列は当業者に公知であり、例えば、それらはRosenbergら, Immunity, 10: 281-287 (1999)に記載されている。例示的な癌抗原を表3に示す。
【００７４】
【表３】
2019500025.tif 000005
【００７５】
幾つかの実施形態においては、抗癌遺伝子は自殺遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、腫瘍遺伝子アンタゴニスト遺伝子、腫瘍サプレッサーエフェクター遺伝子、アンチセンスオリゴヌクレオチドコード配列、リボザイムコード配列でありうる。好ましい実施形態においては、そのような抗腫瘍遺伝子はアポトーシス誘導遺伝子である。代表的な抗癌遺伝子を表4に示す。
【００７６】
【表４】
2019500025.tif 000006
【００７７】
幾つかの実施形態においては、本発明の遺伝子発現系は、当業者に公知の適切な方法により、および前記のとおりに、対象における癌の検出の前または後で患者に投与されうる。また、本発明に従い投与される場合、人工癌細胞抗原は未改変癌細胞に対する能動的および防御的免疫応答を誘導できるはずである。
【００７８】
該遺伝子発現系を含むワクチンは多様な投与経路用に製剤化されうる。特に好ましい経路には、筋肉内、経皮、皮下もしくは皮内注射、エアロゾル、経口またはこれらの経路の組合せが含まれ、１回でまたは複数の単位投与量で投与されうる。ワクチンの投与は周知であり、最終的には、個々の製剤および主治医の判断による。ワクチンは更に、当業者に公知の及び前記のとおりのアジュバントまたは賦形剤を含みうる。
【００７９】
樹状細胞ワクチン
もう1つの態様においては、本発明は、強力な抗腫瘍免疫応答を生じさせるための免疫細胞刺激、例えば樹状細胞刺激のための方法を提供する。幾つかの実施形態においては、本発明は、目的の抗原に対する免疫応答を惹起するように抗原が樹状細胞の表面に提示されるように、抗原を樹状細胞にトランスフェクトするための方法を提供する。
【００８０】
幾つかの実施形態においては、本発明による樹状細胞刺激において使用する抗原は、以下に限定するものではないが、以下のものを包含する腫瘍抗原である：メラノーマ腫瘍抗原（Kawakamiら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515-3519 (1994); Kawakamiら, J. Exp. Med., 180:347-352 (1994); Kawakamiら, Cancer Res. 54:3124-3126 (1994)）、例えばMART-1（Coulieら, J. Exp. Med. 180:35-42 (1991)）、gp100（Wickら, J. Cutan. Pathol. 4:201-207 (1988)）およびMAGE抗原、MAGE-1、MAGE-2およびMAGE-3（Van der Bruggenら, Science, 254:1643-1647 (1991)）; CEA、TRP-1、P-15およびチロシナーゼ（Brichardら, J. Exp. Med. 178:489 (1993)）; HER-2/neu遺伝子産物（米国特許第4,968,603号）; エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、p53腫瘍抑制タンパク質（Levine, Ann. Rev. Biochem. 62:623 (1993)）; ムチン抗原（Taylor-Papdimitriou, 国際公開WO90/05142）; テロメラーゼ; 核マトリックスタンパク質; 前立腺酸性ホスファターゼ; 乳頭腫ウイルス抗原; ならびに以下の癌に関連する抗原：メラノーマ、転移癌、腺癌、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、結腸癌、非ホジキンリンパ種、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌など（例えば、Rosenberg, Ann. Rev. Med. 47:481-91 (1996)）。
【００８１】
好ましい実施形態においては、本発明の樹状細胞ワクチンにおいて使用される腫瘍抗原はチロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP-1）またはチロシナーゼ関連タンパク質2（TRP-2）である。チロシナーゼ、TRP-1およびTRP-2はチロシナーゼ関連遺伝子ファミリーのメンバーである。
【００８２】
本発明の1つの態様は、樹状細胞における、チロシナーゼ、TRP-1遺伝子、TRP-2遺伝子またはその変異体によりコードされる癌ペプチドの遺伝子発現に関する。チロシナーゼ遺伝子、TRP-1抗原、TRP-2抗原、それらの断片は、単独で、または1以上の共免疫刺激分子と組み合わせて使用されうる。1つの態様においては、本発明は、樹状細胞においてチロシナーゼ遺伝子、TRP-1抗原、TRP-2抗原を発現させることによりメラノーマ（黒色腫）の予防および治療の両方を行うことを想定している。
【００８３】
幾つかの実施形態においては、1以上の選択された抗原が樹状細胞の表面上に有効量で提示されるように、前記の腫瘍抗原を発現する遺伝子発現系をエクスビボ（ex vivo）で樹状細胞内に挿入する。「有効量」は、提示が、樹状細胞が免疫応答を引き起こすことを可能にするのに十分であることを意味する。核酸操作のための技術は周知である。そのような技術、例えば制限酵素などを適用するのに有用な試薬は当技術分野で広く知られており、多数の販売元から商業的に入手可能である。
【００８４】
該アルファウイルスベクターはまた、選択されたクラスIおよびクラスII MHC分子、共刺激および他の免疫調節分子、ABCトランスポータータンパク質、例えばTAP1およびTAP2タンパク質、をコードするポリヌクレオチド配列を含有しうる。したがって、ポリヌクレオチド配列の種々の組合せが本発明のアルファウイルスベクター中に挿入されうる。該アルファウイルスベクターは更に、ベクターを含有する樹状細胞の選択を可能にする少なくとも1つの陽性マーカーを含有しうる。
【００８５】
好ましい実施形態において、治療される患者から樹状細胞を得る。樹状細胞は、免疫療法のために、インビトロまたはインビボのいずれかで、患者のT細胞を活性化するために使用される。
【００８６】
もう1つの実施形態においては、健康な個体から樹状細胞を得る。前記のように、例えば個体の末梢血単核細胞（PBMC）上の、関連HLA抗原（クラスIおよびIIの両方、例えばHLA-A、B、CおよびDR）を特定し、HLA抗原に関して患者と一致する樹状細胞を単離し、増殖させる。例えば、ある場合には、放射線および／または化学療法剤で治療された末期癌患者は十分または有効な樹状細胞を提供できない。したがって、健康なHLA適合個体、例えば兄弟姉妹から樹状細胞を得て、前記の方法のいずれかを用いて増殖させることができる。
【００８７】
樹状細胞を単離するための方法は当業者に公知である。例えば、非リンパ組織、例えば皮膚の表皮（ランゲルハンス細胞）、およびリンパ組織、例えば脾臓、骨髄、リンパ節および胸腺、ならびに血液（血液樹状細胞）、例えば末梢血および臍帯血、およびリンパ（ベール細胞）を含めた循環系を包含する、樹状細胞が存在する任意の組織から、樹状細胞が得られうる。例えば、器官培養に置かれたマウスまたはヒト皮膚の外植片は、該外植片を取り巻く培地への樹状細胞の選択的遊走を可能にする。Larsenら, J. Exp. Med. 172:1483-1493 (1990)、およびRichtersら, J. Invest. Dermatol. (1994)を参照されたい。
【００８８】
最近の研究は、ヒト末梢血由来のものを含め、ヒト樹状細胞の単離および増殖のための方法を記載している。Macatoniaら, Immunol. 74: 399-406 (1991); O'Dohertyら, J. Exp. Med. 178: 1067-1078 (1993); およびMarkowiczら, J. Clin. Invest. 85: 955-961(1990); Romaniら, J. Exp. Med. 180: 83-93 (1994); Sallustoら, J. Exp. Med. 179: 1109-1118 (1994); Berhardら, J. Exp. Med. 55: 1099-1104 (1995)を参照されたい。骨髄および臍帯血から得られたCD34+ 前駆細胞ならびに末梢血由来の単核細胞から樹状細胞（ランゲルハンス細胞を含む）を誘導するための技術も開示されている。Van Tendelooら, Gene Ther. 5: 700-707 (1998)を参照されたい。
【００８９】
樹状細胞を処理して成熟または活性化を誘導してもよく、これは例えば、好ましくは特定の増殖または刺激因子の存在下で培養することにより、行われうる。後記実施例においては、GM-CSFと共に培養することにより、樹状細胞を改変する。樹状細胞の製造に関連した追加的な技術は、例えば米国特許第5,788,963号、第5,962,318号および第5,851,756号（それらの開示を参照により本明細書に組み入れることとする）において見出されうる。
【００９０】
樹状細胞をポリヌクレオチドでトランスフェクトするための方法は当業者に公知である。例えば、トランスフェクションが生じるのに十分な時間および温度で、溶液中でポリヌクレオチドと共にインキュベートすることにより、樹状細胞をトランスフェクトすることが可能である。幾つかの実施形態においては、樹状細胞およびポリヌクレオチドを加湿CO2インキュベーター内で37℃で24時間インキュベートする。樹状細胞中へのトランスフェクションの後の目的のポリヌクレオチドの発現はイムノアッセイまたは生物学的アッセイにより確認されうる。例えば、細胞中の導入ポリヌクレオチドの発現は、当技術分野でよく知られたアッセイ、例えばFACS（蛍光活性化細胞選別）またはELISA（酵素結合イムノソルベントアッセイ）を用いて、目的の抗原に特異的な標識抗体の、細胞への結合を検出することにより、あるいは単に（例えば、β-galで）染色し、細胞数を決定することにより確認されうる。T細胞の活性化は種々の公知方法により検出可能であり、例えば、T細胞の増殖、標的細胞の殺傷およびある調節因子（例えば、リンホカイン）の分泌、ある免疫調節分子のmRNAの発現またはこれらの組合せにおける変化を測定することにより検出可能である。
【００９１】
幾つかの実施形態においては、患者から単離された樹状細胞を培養し、インビトロでトランスフェクトし、患者に戻し投与して、T細胞活性化を含む免疫応答を刺激する。したがって、樹状細胞がワクチンおよび／または免疫療法剤を構成する。一例として、抗原を提示する樹状細胞を、例えば約106〜108細胞の用量で、静脈内注入により投与する。患者の免疫応答はモニター可能である。注入は、患者の免疫応答に基づいて所望の間隔で繰返されうる。
【００９２】
以下に、本発明を実施するための特定の実施形態の例を示す。これらの実施例は専ら例示目的で記載されているに過ぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【００９３】
実施例1：アルファウイルス発現ベクターの構築
ベクターの構築
発現ベクターpT7/ NSP1-4/HygEGFPの構築のために、インフュージョン（in-fusion）クローニングキットを使用して、種々の断片をベクターpTNT中にクローニングした。簡潔に説明すると、まず、pTNTをSmaIで切断し、ゲル精製した。IRES、NSP1-4、HygEGFPの断片をプラスミドpCITE-2a、pSmart2aおよびpHygEGFP由来のフュージョン（phusion）酵素を使用してPCR増幅した。PCR増幅に使用するプライマーを、Clontechのオンラインツールを使用して設計した。該プライマーは、ベクターまたは隣接断片のいずれかとの15bpの重複を含有する。精製されたベクターおよび断片を一緒に混合し、インフュージョン（infusion）酵素混合物と共に50℃で15分間、共インキュベートした。得られた反応物を形質転換に使用した。
【００９４】
PCR増幅用のプライマー配列：
1. 5'キャップ非依存的インビボ発現用の第1のIRES断片のためのプライマー：
TNT-IRES FWプライマー(F1 FW): CTCTAGAGTCGACCCgttattttccaccatattgcc 
IRES-NSP RVプライマー(F1 RV): TCACACATCCGCCATaaaggaaaaccacgtcccc
2. NSP1-4用のプライマー：
NSP FWプライマー(F2 FW): ATGGCGGATGTGTGACATA
NSP-IRES RVプライマー(F2 RV): AAATAACATTTAAATcgtagaggtgtataacagg
3. 配列内リボソーム進入部位として使用され、それにより標的遺伝子およびHygEGFPを共にサブゲノムプロモーター下で発現させることができる、第2のIRES断片用のプライマー:
IRES FWプライマー(F3 FW): ATTTAAATgttattttccaccatattgccgtcttttggc
IRES-Hyg RVプライマー(F3 RV): TTCAGGCTTTTTCAtaaaggaaaaccacgtcccc
4. HygEGFP用のプライマー：
Hyg FWプライマー(F4 FW): ATGAAAAAGCCTGAACTCAC
Hyg-TNT RVプライマー(F4 RV): TTTTTGCGGCCGCCCcttgtacagctcgtccatg
注：プライマー配列における大文字は重複配列を示す。
【００９５】
効率的遺伝子発現のための、DNAに予め結合したT7 RNAポリメラーゼ
ベクターpT7/NSP1-4/HygEGFPを、バッファー溶液、例えば生理食塩水、PBSまたはDMEM中、T7 RNAポリメラーゼと複合体形成させる。該溶液をマウスの尾、肝臓、脚筋、脳脊髄液または静脈内に注射する。一定時間の後、動物を犠死させ、特定の組織の一部を摘出することにより、遺伝子発現を評価する。遺伝子発現レベルを示すためのマーカーとして、EGFPを使用する。対照として該ベクターのみを含有する溶液を使用して、同じ操作を行う。
【００９６】
該ベクターおよび予め結合したT7 RNAポリメラーゼを含有する溶液を注射したマウスからのサンプルは、EGFPの高レベル発現ゆえに、高レベルの蛍光強度を示すと思われる。また、EGFPの発現は長期間、例えば少なくとも1週間にわたって検出可能であると予想される。一方、対照サンプルは、EGFP発現がないため、蛍光を示さないと思われる。
【００９７】
実施例3：遺伝子発現系を使用したヒトiPS細胞の樹立
リプログラミング因子Klf4、Oct3/4、Sox2およびc-Mycをコードする4つのヒト遺伝子をベクター中にクローニングし、予め結合したRNAポリメラーゼと共に細胞内に導入する。感染後の第7日に、細胞を収集し、ついでフィーダー細胞上に、例えば、5×105細胞/100mmディッシュで再播種する。フィーダー細胞として、細胞分裂を停止させるためにマイトマイシンCで処理されたSNL細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）を使用する。感染後の第10日から、霊長類ES細胞培養用培地（ReproCeLL, Japan）に組換えヒトbFGF（WAKO, Japan）を加えることにより調製された培地中で細胞を培養する。トランスフェクションは、マーカー遺伝子を使用することによって更に確認される。
【００９８】
クローンをScidマウスの精巣内に挿入して、その多能性を調べる。具体的には、ヒトiPS細胞クローンを、組換えヒトbFGFおよびRhoキナーゼインヒビターY-27632を含有する霊長類ES細胞培養用培地（ReproCeLL, COSMO BIO, Japan）中で培養する。1時間後、細胞をコラーゲンIVで処理し、そして収集する。ついで細胞を遠心分離し、回収し、Y-27632を含有するDMEM/F12に懸濁させる。コンフルエントな細胞（100mmディッシュ）をScidマウスの精巣内に注射する。2〜3ヶ月後、腫瘍を断片に切断し、ついで4% ホルムアルデヒドを含有するPBSバッファーで固定する。パラフィン包埋組織をスライスし、ついでヘマトキシリン-エオシンで染色する。腫瘍は複数のタイプの細胞から構成され、多様な胚葉、例えば、神経管組織、軟骨組織および腸様上皮構造への分化を示すと期待される。このように、iPS細胞の多能性が観察されると期待される。
【００９９】
実施例4：インビトロでのインフルエンザウイルスワクチン活性
インフルエンザウイルス抗原血球凝集素（HA）をコードするDNAをベクターpT7/NSP1-4/Hygベクター中にクローニングする。インフルエンザウイルス遺伝子は当業者によって同様に作製されうる。
【０１００】
インフルエンザ抗原特異的免疫応答の刺激を実証するために、T7 RNAポリメラーゼに予め結合したインフルエンザ抗原HAを有するベクターを含有する溶液を使用して、市販サブユニットFLUワクチン抗原と並行して、BALB/cマウスを免疫化する。該溶液を筋肉内に2回投与し、各免疫化後に標準的なELISAアッセイによりHA特異的血清抗体応答を決定する。ELISAアッセイの一例は以下のとおりである： 2.5μg/mlの一価サブユニットインフルエンザワクチン調製物を含有するPBS溶液または該ベクターおよび予め結合したT7 RNAポリメラーゼを含有する溶液で平底プレートを4℃で一晩コーティングする。ついでプレートを、0.05% Tween-20（PBS-T）を補充したPBS（pH7.2）で3回洗浄する。洗浄後、PBS-T中の5% (w/v)粉乳を使用して、ウェルを37℃で1時間、非特異的結合に対してブロッキングする。サンプル血清をPBS-T中、1:50から開始する3倍連続希釈に付す。希釈血清と共に37℃で90分間インキュベートした後、プレートをPBS-Tで3回リンスする。
【０１０１】
PBS-T中に希釈されたアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIg、IgG1またはIgG2aと共に、プレートを更に37℃で1時間インキュベートする。PBS-Tで十分に洗浄した後、100μlの色素原-基質溶液、ジエタノールアミン中のパラニトロフェニルホスファート1mg/mlを各ウェルに加える。ついで、20分後、SpectraMax（登録商標）（Molecular Devices, CA）を使用して、405nmでプレートを読み取る。力価の計算のために、PBS対照の平均の光学密度（OD）値にそれらの標準偏差の3倍を加えたものとして、カットオフ値を定める。ついで、サンプルがカットオフ値のODを生じる希釈度として、抗体価を計算する。該ベクターおよび予め結合したT7 RNAポリメラーゼを含有するサンプルは、試験された両方の用量において非常に強力であり、該市販サブユニットインフルエンザワクチンより高い免疫原性を示すと期待される。
【０１０２】
実施例5：インビボでのインフルエンザウイルスワクチン活性
T7 RNAポリメラーゼに予め結合しておりインフルエンザ抗原HAを発現するベクターでチャレンジされた動物モデルにおいて、インフルエンザウイルスからの防御を試験する。Balb/cマウスを各群マウス10匹の2つの群に分ける。T7 RNAポリメラーゼに予め結合した、インフルエンザ抗原HAを発現するベクターを含有する溶液、または商業的に入手可能なサブユニットインフルエンザワクチンのいずれかを、各群のマウスをチャレンジするために使用する。マウスを3週間間隔で2回免疫化する。2回目の免疫化の2週間後、上気道への鼻腔内投与により、生インフルエンザウイルスでマウスをチャレンジする。
【０１０３】
チャレンジの日から2週間にわたって、死亡率に関して動物をモニターする。予め結合したT7 RNAポリメラーゼと共に上記ベクターを含有する溶液を注射したマウスは、商業的に入手可能なサブユニットワクチンで免疫化されたマウスと比較して、鼻腔内インフルエンザチャレンジからの、より高い度合の防御を示すことが期待される。
【０１０４】
実施例6：PAPを発現する遺伝子発現系でのラットの免疫化はT細胞免疫応答を惹起する
チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP-1）またはチロシナーゼ関連タンパク質2（TRP-2）をコードする配列を有するDNAをベクター中にクローニングし、目的の遺伝子の発現をインビトロ発現アッセイ、例えばELISA、により確認する。樹状細胞は当技術分野で公知の適切な方法に従い調製されうる。例証のための一例をここに含める。末梢血を静脈穿刺によりボランティアドナーから得、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1：2に希釈する。末梢血単核細胞（PBMC）をリンパ球分離培地（ICN Biomedicals, Aurora, OH）に対する遠心分離により単離し、PBSで2回洗浄し、無血清AIM-V培地（Invitrogen, Carlsbad, CA）に再懸濁させる。6ウェル組織培養プレート中で107 PBMC/ウェルを2時間培養することにより、単球を富化させる。非接着性PBMCを取り出し、90% ウシ胎仔血清/10% DMSO中で凍結保存する。
【０１０５】
チロシナーゼ、TRP-1またはTRP-2をコードするベクターを使用して、樹状細胞をトランスフェクトする。トランスフェクトした樹状細胞が特異的CD4およびCD8 T細胞を活性化する能力を試験する。トランスフェクトした樹状細胞は強力なT細胞活性化を示すと期待される。
【０１０６】
マウス骨髄DC培養およびトランスフェクション
C57BL/6マウスの脛骨および大腿骨を、氷冷PBSで、幅70μmのカットオフ細胞ストレーナを通して洗い流した。RBCを塩化アンモニウムTrisバッファーで37℃で3分間、細胞溶解した。細胞を1400rpmで5分間遠心分離し、該細胞をDC培地（5% FCS、1×非必須アミノ酸、2mM Lグルタミン、500nM 2-ME、100U/mlペニシリン/ストレプトマイシン、20μg/mlゲンタマイシンを補充したRPMI）、150U/ml GM-CSFおよび75U/ml IL-4中に懸濁させた。3×106個の細胞を、5mlのDC培地を含有する6ウェルプレート中に入れて、6日間培養した。第7日に、非接着細胞を採取し（未成熟な第7日のDC）、洗浄し、リポフェクタミンまたはヌクレオフェクションを用いてプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、10ng/mL 腫瘍壊死因子α（TNF-α）を補充したDC培地に懸濁させ、2〜3日間培養して更に成熟させた。
【０１０７】
マウスにおけるCTL初回免疫(priming)
ナイーブC57BL/6マウスを、200μlのPBS中、5×105個のトランスフェクトDC/マウスで14日間隔で2回、静脈内(i.v.)で免疫化した。最終免疫化の12〜14日後に脾細胞を採取し、塩化アンモニウムTrisバッファーでRBCを枯渇させた。10% FCS、1mMピルビン酸ナトリウム、100IU/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシンおよび5×10-5M β-メルカプトエタノール（ウェル当たり）を含有する5mlのイスコブ（Iscove）改変ダルベッコ培地中、IFN-γで前処理され7500radで照射された5×105個の刺激性B16/F0細胞と共に、脾細胞（107個）を6ウェル組織培養プレート内で培養した。細胞を37℃、5% CO2で5日間培養した。第5日に、CTLアッセイにおける使用の前に、Histopaque 1083勾配でエフェクター脾細胞を集めた。
【０１０８】
インビトロ細胞傷害性アッセイ（CD8）
標的細胞（5〜10×106個のB16 F0）をユーロピウムで4℃で20分間標識した。ユーロピウム標識標的（104個）および種々のE：Tのエフェクター細胞の連続希釈物を200μlの完全RPMI 1640中でインキュベートした。プレートを500gで3分間遠心分離し、37℃で4時間インキュベートした。50μlの上清を回収し、ユーロピウム放出を時間分解蛍光により測定した。以下の式を用いて細胞傷害比活性を決定した。
比放出％= (実験放出 − 自然放出)／(総放出 − 自然放出)
【０１０９】
標的細胞の自然放出は全アッセイにおいて界面活性剤による総放出の25%未満であった。
比較のために、非トランスフェクトDCで初回免疫したマウスからの脾細胞を使用した。
【０１１０】
CD4+ T細胞精製およびIL-2/IL-4産生に関するバイオアッセイ
CD4+ T細胞の精製のために、ナイロンウール富化脾臓T細胞を、B細胞（B220）およびCD8+ T細胞（2.43）に対するモノクローナル抗体(MAb)と補体とを含有する腹水と共に37℃で90分間インキュベートすることにより更に処理し、ついで3回洗浄した。フローサイトメトリーによる表現型分析を用いて、単離されたCD4+ T細胞の純度を分析した。
【０１１１】
精製されたCD4+ T細胞を、照射（3,000rad）されたトランスフェクトDCまたは非トランスフェクトDC細胞により、20:1のT細胞/DC細胞比で、インビトロで24時間刺激し、インキュベーションの終了時に上清を集めた。非特異的サイトカイン放出を制限するために、CD4+ T細胞をFBS不含培地中で精製し、APC細胞を無血清培地中または2% マウス血清の存在下で調製した。FBS不含AIM-V培地中でサイトカインの誘導を行った。CTLL細胞系の増殖を支持する能力によりIL-2/IL-4活性を決定した。IL-2およびIL-4の両方がCTLL細胞の増殖を支持するため、上清中のサイトカイン活性は区別されず、したがってIL-2/IL-4と命名された。あるいは、IL-2およびIL-4の量はELISAにより測定することができる。
【０１１２】
配列表
配列番号1：プラスミドpT7/NSP1-4/HygEGFPの配列
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配列番号2：ポリAおよびT7ターミネーター
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配列番号3：T7プロモーター
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配列番号4：IRES配列
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配列番号5：アルファウイルスRNAレプリカーゼnsp 1〜4
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配列番号6：SFVからのサブゲノムプロモーター配列
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配列番号7：ハイグロマイシン/EGFP融合遺伝子
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配列番号8：非細胞変性プラスミドpT7/NSP1-4/HygEGFPの配列（8734位および8940位における下線付き文字は、それぞれ、突然変異P718TおよびR649Hに対する突然変異ヌクレオチドを示す）
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2019500025.tif 000029
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