(57)【要約】  本発明は、生物工学の分野、特に、ヒトＩＬ−２及び由来ムテインをコードする遺伝子において、異なる宿主の生物学的機能に影響せずに分泌レベルの増大をもたらす、単一の突然変異を導入することに基づく方法に関する。特に、これら突然変異は、ヒトＩＬ−２の一次配列中の３５位に位置するアミノ酸の非保存的変化に基づき、好ましくは、置換はＫ３５Ｅ、Ｋ３５Ｄ及びＫ３５Ｑである。本発明の別の目的は、本発明に記述される方法を使用して組換えヒトＩＬ−２及び由来ムテインの両方を得るために使用される発現系である。上述の方法は、研究室並びに産業規模両方で組換えヒトＩＬ−２及び由来ムテインの生産効率を改善するのに有用である。本方法を使用して得られるタンパク質は、治療目的及び養子移入療法用Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に使用され得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えヒトＩＬ−２及びそれ由来のムテインの分泌レベルを生物学的機能に影響せずに増大させる方法であって、その配列における単一の突然変異の導入を特徴とする方法。
【請求項２】
前記分泌レベルが、元の組換えヒトＩＬ−２及びそれ由来ムテインと比較して少なくとも３倍高い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記由来ムテインが、ヒトＩＬ−２に関して９０％超の同一性を有する、請求項１及び２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
導入された前記突然変異が、非保存的である、請求項１及び２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記非保存的突然変異が、一次配列の３５位に導入される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記３５位における突然変異が、
−  Ｋ３５Ｅ、
−  Ｋ３５Ｄ及び
−  Ｋ３５Ｑ
を含む群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組換えヒトＩＬ−２及びそれ由来のムテインが、
−  繊維状ファージのカプシドタンパク質、
−  アルブミン
−  抗体のＦｃ領域、
−  完全抗体、及び
−  その可変ドメインを含む抗体断片
を含む群から選択されるタンパク質のいずれかに融合される、請求項５及び６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
宿主が、
−  大腸菌（ｅ．ｃｏｌｉ）、
−  哺乳動物細胞、及び
−  酵母
を含む群から選択される、請求項５から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項８の方法により得られるタンパク質。
【請求項１０】
配列番号１、
配列番号２、
配列番号３、
配列番号４、
配列番号５、
配列番号６、
配列番号７、
配列番号８、
配列番号９、
配列番号１０、
配列番号１１、
配列番号１２、
配列番号１３、
配列番号１４、
配列番号１５、
配列番号１６、
配列番号１７、及び
配列番号１８
を含む群から選択される、請求項５から８までのいずれか一項に記載の方法によって得られるタンパク質。
【請求項１１】
研究室又は産業規模での、請求項８に記載の方法の使用。
【請求項１２】
治療目的である、請求項９又は１０により得られるタンパク質の使用。
【請求項１３】
養子移植療法用Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させるための、請求項９又は１０に記載の使用。
【請求項１４】
正常又は腫瘍の細胞及び／又は組織の生理状態を改変するための、請求項５から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記改変された細胞が、ＮＫ細胞、Ｔ又はＢリンパ球である、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学の分野に関する。特にインターロイキン−２（ＩＬ−２）分子及びそれに由来する免疫調節性ムテインのファミリーの分泌レベルの増大をそれらの生物学的機能に影響せずに導く、それらの分子の遺伝子に変異を導入する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−２は、当初、Ｔ細胞の増殖因子として記述され（Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ａ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．５１：３３７〜３５７頁、１９８０年）、免疫応答内において二重の機能を有する調節因子としてその後明らかになり（Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：４５３〜４７９頁、２００８年；Ｈｏｙｅｒ  Ｋ．Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２２６：１９〜２８頁、２００８年）、免疫系のエフェクター機能を促進する又は負に調節する能力を呈する。その主要な役割は、ＩＬ−２受容体のα鎖を高レベルで構成的に発現する調節性Ｔ細胞の刺激による免疫寛容の維持に関係すると現在考えられている（Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．及びＢａｙｅｒ，Ａ．Ｌ．、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：６６５〜６７４頁、２００４年）。β及びγサブユニットは、免疫系のエフェクター細胞において構成的に存在する中程度の親和性の二量体受容体を形成するが、高レベルのα鎖の構成的存在は、調節性Ｔ細胞に、この細胞集団によるサイトカインの優先的使用を可能にする高親和性三量体受容体を付与する（Ｍａｌｅｋ，Ｔ．Ｒ．及びＣａｓｔｒｏ，Ｉ．、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．３３：１５３〜１６５頁、２０１０年）。
【０００３】
ＩＬ−２の機能的二分性は、免疫系に対して反対の治療効果をもたらし、異なるシナリオにおいて所望の意味に免疫応答を調節するために活用されてきた。その免疫増強能力を使用して、抗腫瘍応答を刺激した（Ｋｌａｐｐｅｒ，Ｊ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ．１１３：２９３〜３０１頁、２００８年）。他方、調節性Ｔ細胞を優先的に刺激するＩＬ−２の能力は、エフェクターＴ細胞を刺激する又は毒性効果をもたらすには十分でない低用量を適用することによって自己免疫性障害（Ｈａｒｔｅｍａｎｎ，Ａ．ら、Ｌａｎｃｅｔ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１：２９５〜３０５頁、２０１３年）、及び炎症（Ｓａａｄｏｕｎ，Ｄ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：２０６７〜２０７７頁、２０１１年）、及び移植片対宿主病（Ｋｏｒｅｔｈ，Ａ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：２０５５〜２０６６頁、２０１１年）の調節に活用されてきた。
【０００４】
種々の結合インターフェースに突然変異を導入することによる受容体のサブユニットとＩＬ−２との相互作用の分離が、種々の免疫調節特性を有するムテインを得る方法として提案された。指向性突然変異誘発によるα鎖とのインターフェースの選択的攪乱により、調節性Ｔ細胞を刺激する能力が減少したが、β／γ二量体受容体を保有するエフェクター細胞に対するアゴニスト作用を保持し続ける非αと称する分子を得ることが可能になった（Ｃａｒｍｅｎａｔｅ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０：６２３０〜６２３８頁、２０１３年；米国特許第９，２０６，２４３号Ｂ２）。この分子は、マウスにおいて強い抗腫瘍効果を有する。他方、β及び／又はγサブユニットとのＩＬ−２インターフェースの突然変異誘発による破壊は、異なる細胞集団の刺激を選択的に調節するＩＬ−２受容体アンタゴニストを生成し得る（Ｓｈａｎａｆｅｌｔ，Ａ．Ｂ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１１９７〜１２０２頁、２０００年；ＷＯ２０１１／０６３７７０）。この型の分子の例は、米国特許第８，７５９，４８６号Ｂ２に記述されているムテインＭ１及びＭ２である。
【０００５】
相互作用能力を喪失したムテインに加えて、受容体の１つ又は別のサブユニットに対する結合能力の増大によりスーパーアゴニスト特性を有するＩＬ−２の突然変異バリアントについても記述されている。βサブユニットに対する親和性の増大は、エフェクター細胞を強力に刺激し、強い抗腫瘍効果を有する分子の産生をもたらす（Ｌｅｖｉｎ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．４８４：５２９〜５３３頁、２０１２年）。他方、受容体のαサブユニットに対するＩＬ−２の親和性の増大は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞の増殖応答を刺激する優れた能力を有する他のスーパーアゴニストバリアントを生じた（ＷＯ２００５／００７１２１）。
【０００６】
上に記述したＩＬ−２由来ムテインは、酵母細胞の表面に提示されるＩＬ−２の合理的な設計、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏスクリーニング及び指向性進化法によって得られた。繊維状ファージ上で生物学的に活性なＩＬ−２の提示が達成された（Ｂｕｃｈｌｉ，Ｐ．Ｊ．ら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３３９：７９〜８４頁、１９９７年；Ｖｉｓｐｏ，Ｎ．Ｓ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３：１８５〜１９３頁、１９９７年）が、この技術的基盤は、改変された特性を有するサイトカインの新たなバリアントの選択に今のところ活用されていない。ＩＬ−２及びそれ由来ムテインの免疫調節性特性のみならず、その治療的活用に必須の要素は、それを充分な量で得ることができるシステムの開発である。特に、研究室規模、産業規模で、又は正常及び／若しくは腫瘍の細胞若しくは組織のトランスフェクション若しくは形質導入による。
【０００７】
ＩＬ−２及び他の関連分子の組換え産生の主たる経路は、封入体を形成する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞質における発現、その後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ復元手順であった（Ｄｅｖｏｓ，Ｒ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：４３０７〜４３２３頁、１９８３年；Ｗｅｉｒ，Ｍ．Ｐ．及びＳｐａｒｋｓ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２４５：８５〜９１頁、１９８７年）。この戦略についてはその実用性が既に実証されているにもかかわらず、最初から、天然のＩＬ−２に非常によく似た正しくフォールドされた分子の取得に至る他の発現系の探究が、続けられてきた。これら発現系のいくつかにおいてＩＬ−２の分泌は、ＩＬ−２が凝集する傾向により限定されてきた（Ｈａｌｆｍａｎｎ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：２４６５〜２４７３頁、１９９３年；Ｃｈａ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．２４：２２５〜２３３頁、２００５年）。
【０００８】
驚くべきことに、本発明の発明者らは、これまでに記載されていない又はヒトＩＬ−２の結晶構造の分析から予測できず、その導入が、種々のタイプの細胞における、特定の免疫調節特性を有する組換えヒトＩＬ−２及びそれ由来の複数のムテインを分泌する能力を増大させる、いくつかの突然変異を見いだした。この発見は、生産的規模でのこれら突然変異の使用に関する基礎を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
一実施形態において、本発明は、異なる宿主においてその生物学的機能に影響せずに組換えヒトＩＬ−２分泌レベルを増大させる方法に関する。前記方法は、ヒトＩＬ−２及びそれ由来の他のポリペプチドをコードする遺伝子における独自の突然変異の導入に基づき、そのポリペプチドには、それだけには限らないが、アンタゴニスト、スーパーアゴニスト又は選択的アゴニストとして作用するように設計されたヒトＩＬ−２由来のムテインが含まれる。本発明の方法が使用される場合、前記タンパク質の分泌レベルの増大は、突然変異がない相対物と比較して少なくとも３倍高い。本発明において、由来ムテインとは、ヒトＩＬ−２と９０％より高い同一性を有するもののことを指す。
【００１０】
本発明の方法は、タンパク質一次配列の３５位（元の配列においてＬｙｓ）にあるアミノ酸の非保存的変化、好ましくはＫ３５Ｅ、Ｋ３５Ｄ及びＫ３５Ｑ置換をもたらす突然変異に関する。
【００１１】
特に、本発明は、配列番号１〜１８を含む群から選択される、ここで記述した方法によって得られるタンパク質に関する。
【００１２】
また、本発明の対象は、ＩＬ−２又はそれ由来の他の免疫調節性ポリペプチド及び追加のタンパク質配列により形成される融合タンパク質の合成をコードする、他のヌクレオチド配列に融合された上記の突然変異遺伝子を含む遺伝子の構築物である。追加のタンパク質配列には、それだけには限らないが、繊維状ファージのカプシドタンパク質、アルブミン、抗体のＦｃ領域、全抗体又はその可変ドメインを含む抗体断片がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
特定の実施形態において、上記分子を得るために使用される宿主には、それだけには限らないが、とりわけ大腸菌、酵母、及びＨＥＫ−２９３、ＣＨＯ、ＮＳＯなどの哺乳動物細胞がある。本発明の方法は、研究室並びに産業規模の両方でＩＬ−２及びそれ由来の他のポリペプチドを産生する効率を改善するのに有用である。本発明の方法により得られるタンパク質は、治療目的に使用され得る。別の実施形態において、本発明の目的は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ並びにｉｎ  ｖｉｖｏ両方において、ヒトＩＬ−２及び／又はそれ由来の免疫調節性ムテインのファミリー（単独又は他のタンパク質に融合されている）の発現によって正常若しくは腫瘍性細胞及び／若しくは組織の生理状態を改変することである。例、養子移植療法のためのＴリンパ球、Ｂリンパ球若しくはＮＫ細胞の形質導入；又は腫瘍組織の直接形質導入／トランスフェクション。本発明の方法は、これら文脈において目的の分子の分泌を高めるのに有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、種々の宿主においてその生物学的機能に影響せずに組換えヒトＩＬ−２分泌のレベルを増大させる方法に関する。前記方法は、ヒトＩＬ−２及びそれ由来の他のポリペプチドをコードする遺伝子における独自の突然変異の導入に基づき、そのポリペプチドには、それだけには限らないが、アンタゴニスト、スーパーアゴニスト又は選択的アゴニストとして作用するように設計されたヒトＩＬ−２由来のムテインが含まれる。
【００１５】
ヒトＩＬ−２由来のタンパク質が繊維状ファージ上に提示される、能力を増大させる突然変異の同定。
繊維状ファージ上の提示レベルを増大させる独自の突然変異を有するヒトＩＬ−２由来のポリペプチドの選択は、繊維状ファージ上に提示された１０８個超の分子のライブラリーから行うことができる。前記ポリペプチドに対応する遺伝子は、ファージミド型発現ベクターに挿入され（繊維状ファージカプシドタンパク質をコードする遺伝子の１つに融合される）、表面にタンパク質バリアントを提示するウイルス粒子の産生に使用され得る。開始ライブラリーは、配列の全体におよぶ又は一組の予め定義された位置における異なる程度の多様性を含み得る。これら位置における元の残基のそれぞれは、２０種のアミノ酸の混合物又は選択された残基のサブセットによって置き換え得る。多様性は、ランダム又は部位特異的突然変異誘発によって達成され得る。
【００１６】
ヒトＩＬ−２の提示レベルを増大したファージの選択は、固体表面に固定されたセレクター分子と接触させてライブラリー由来ファージ混合物をインキュベーションし、洗浄により結合していないファージを除去し、タンパク質相互作用と干渉する条件下で結合しているファージを溶出することに基づき得る。セレクター分子として、組換えＩＬ−２受容体サブユニットのうち１つ又はＩＬ−２若しくは遺伝的にそれに融合されたペプチドに対して作られたモノクローナル抗体が、使用され得る。いくつかの連続した選択のサイクルが、類似の条件下で行われ得る。選択したファージミドに挿入されたＤＮＡ配列の分析から、より多量の置換が同定され、ファージ上での提示能力の増大に潜在的に関わる規則性が明らかになり得る。
【００１７】
ＩＬ−２の突然変異バリアントの提示のレベルは、異なるＩＬ−２突然変異バリアントと天然の参照とを区別なく認識する固定化された捕捉分子に対するＥＬＩＳＡなどの結合アッセイによって評価できる。この型のアッセイの捕捉分子として、ＩＬ−２バリアントに遺伝的に融合されたｃ−ｍｙｃペプチドなどのマーカーペプチド配列に対する抗体が好ましく、そのマーカーペプチド配列は、ファージミドベクターｐＣＳＭに基づく発現系において全ての外来タンパク質に融合される。ＩＬ−２由来ムテインファミリーに対する上述のスクリーニングにおいて同定される突然変異の効果の生成は、ヒトＩＬ−２について記述されている異なる突然変異バリアントの配列に前記変化を導入し、その導入がＩＬ−２受容体の異なるサブユニットとの相互作用に選択的に影響を及ぼすことを目的とするその配列全体におよぶ多様な性質の様々な数の置換を含み、その結果生じる免疫調節性機能の改変によって実証することができる。これら改変されたムテインの全ては、ファージミドベクターにそのコード遺伝子を挿入することにより繊維状ファージ上に提示される。繊維状ファージ上の各ムテイン提示レベルの評価は、ＩＬ−２について記述される通りＥＬＩＳＡにより実行され得る。本発明の一部として同定される変化の導入に伴うファージディスプレイの増大の大きさを算出する参照として、元のムテインが、いかなる追加の変化及びファージ上の提示も含まずに使用される。別法として、本発明の方法は、酵母又は哺乳動物細胞における提示など組合せ生物学の他の基盤を活用して、細胞膜上の提示のレベルの増大を伴うＩＬ−２のバリアント及び／又はそれ由来ムテインを選択することにより実行される可能性がある。上記の選択過程から、回帰性非保存的突然変異が３５位で明らかになり得る（特にＫ３５Ｅ、Ｋ３５Ｄ及びＫ３５Ｑ）。
【００１８】
ヒトＩＬ−２及びそれに由来するムテインの可溶性タンパク質としての分泌レベル並びに封入体からの復元を増大させるための同定された突然変異の使用
ヒトＩＬ−２及びそれ由来ムテインの繊維状ファージにおける提示を増大させる一群の突然変異を同定した後、酵母又は哺乳動物細胞用の可溶性発現ベクターにクローニングされた対応するコード遺伝子にその突然変異を導入することにより、可溶性タンパク質の分泌に対するこれら同じ変化の効果を実証することができる。前記変化を含まない元の相対物との比較において、前記発現ベクターを含有する宿主細胞によって上清に分泌されるタンパク質の濃度を評価することにより、本発明の方法が使用する突然変異の導入に伴う、ＩＬ−２及びそれ由来ムテインの分泌の増大を実証することが可能になる。
【００１９】
別法として、ヒトＩＬ−２及びそれ由来ムテインの産生の増大は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける、正常及び／又は腫瘍の細胞及び／又は組織のトランスフェクション及び／又は形質導入から検証すべきである。
【００２０】
本発明の方法を使用する上記研究は、ＩＬ−２及びそれ由来ムテイン単独で又はアルブミン、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域、全抗体若しくはその可変領域に基づく抗体断片など追加のポリペプチド配列に融合させて実行できる。
【００２１】
本発明に記述される突然変異を使用して、大腸菌の細胞質中に封入体として得られるヒトＩＬ−２及びそれ由来ムテインのｉｎ  ｖｉｔｒｏ復元の過程を改善することもできる。復元の効率の増大は、突然変異がないバリアントとの比較によりタンパク質質量当たりの特定の生物活性を測定することによって評価できる。
【００２２】
ＩＬ−２の生物学的機能と、受容体サブユニットとのその相互作用の選択的調節との、使用した突然変異の適合性の実証。
本発明の方法により改変されたＩＬ−２バリアントの生物活性の評価は、Ｔリンパ球部分集団、ＮＫ細胞及び増殖をＩＬ−２に依存するリンパ起源の細胞系などの異なる細胞型の増殖、分化及び活性化を誘導する能力の保存を証明するように向けられたｉｎ  ｖｉｔｒｏ並びにｉｎ  ｖｉｖｏ技術を網羅することができる。三量体受容体を発現しているＴリンパ球の増殖に対する天然のＩＬ−２の効果は、アラマーブルー減少の比色技術を使用するＣＴＬＬ−２細胞系増殖のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ又はフローサイトメトリーによって決定され得る。ＣＤ４＋Ｔリンパ球の調節性Ｔリンパ球への分化に対する天然ＩＬ−２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＫ細胞を増殖させ、活性化するこの分子の能力は、フローサイトメトリーにより決定される。
【００２３】
本発明の方法に使用される突然変異と、ＩＬ−２とその受容体との相互作用の選択的調節との適合性は、ＩＬ−２受容体のサブユニットのいずれかに対する結合能力を増減させるように予め設計及び／又は選択した前記変化をムテインのフレームワークへ導入することによって証明できる。結合特性の所望の変化が起こったことは、受容体サブユニットのそれぞれをコーティングしたマイクロタイタープレート上でのＥＬＩＳＡ実験で直接決定することにより実証できる。異なるムテインの免疫調節活性及び／又は抗腫瘍活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで特徴付けするために使用される以前に記載のアッセイを、追加の検証ツールとして使用できる。非αムテイン（Ｃａｒｍｅｎａｔｅ，Ｔ．ｙ  ｏｔｒｏｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０：６２３０〜６２３８頁、２０１３年）の場合、それが、天然のＩＬ−２と同じ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖を刺激する能力を維持することが検証できる。受容体のβサブユニットに対する結合能力が増大し、スーパーアゴニスト活性を有するムテイン（スーパーβムテイン）の場合、それが、天然のＩＬ−２より高い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＫ細胞増殖を刺激する能力を維持することが検証できる。両方の場合において、増殖は、フローサイトメトリーによって決定され得る。ｉｎ  ｖｉｖｏでの集団の増殖に対する差異的効果は、ブロモデオキシウリジン組み込み実験によって決定され得る。両方のムテインが、ＭＢ１６Ｆ０黒色腫系を使用する実験的転移モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで天然のＩＬ−２より大きな抗腫瘍効果を誘導することが実証され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】突然変異ＩＬ−２のファージディスプレイレベルのＥＬＩＳＡ評価を示す図である。全てのファージ調製物は、１０１３個ウイルス粒子／ｍＬの等しい濃度に調整された。
【図２】ＩＬ−２又はそれ由来ムテインとヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインによって形成される融合タンパク質の分泌レベルのＥＬＩＳＡ評価を示す図である。
【図２ａ】細胞を、ポリエチレンイミン並びに突然変異Ｋ３５Ｅを含む及び含まないＩＬ−２を含有する融合タンパク質をコードする遺伝子構築物でトランスフェクトした。
【図２ｂ】細胞を、ポリエチレンイミン並びに追加の突然変異Ｋ３５Ｅを含む及び含まない非αＩＬ−２（ＮＡ）を含有する融合タンパク質をコードする遺伝子構築物でトランスフェクトした。
【図２ｃ】細胞を、ポリエチレンイミン並びにＫ３５Ｅを含む及び含まないスーパーβＩＬ−２（ＳＢ）を含有する融合タンパク質をコードする遺伝子構築物でトランスフェクトした。
【図２ｄ】細胞を、ポリエチレンイミン並びにＫ３５Ｅを含む及び含まない非γＭ１  ＩＬ−２（ＮＧ  Ｍ１）を含有する融合タンパク質をコードする遺伝子構築物でトランスフェクトした。
【図２ｅ】細胞を、ポリエチレンイミン並びにＫ３５Ｅを含む及び含まない非γＭ２  ＩＬ−２（ＮＧ  Ｍ２）を含有する融合タンパク質をコードする遺伝子構築物でトランスフェクトした。
【図３】Ｋ３５Ｅバリアントにおける天然のＩＬ−２の分子間相互作用の保存を示す図である（ＥＬＩＳＡ）。
【図４】ＣＴＬＬ−２増殖アッセイを使用した、置換Ｋ３５Ｅを有するＩＬ−２生物活性の保存を示す図である。
【図５】ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＬ−２依存性細胞集団を増殖させるＩＬ−２  Ｋ３５Ｅの能力を示す図である。        図５ａは、ＩＬ−２  Ｋ３５Ｅバリアント及びＰＢＳで注射されたマウスの脾臓の写真である。        図５ｂは、脾臓中のＣＤ３＋ＣＤ８＋メモリ表現型（ＣＤ４４ｈｉ）細胞集団のフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図６】ＩＬ−２由来ムテインについて既に記述されているＩＬ−２受容体αサブユニットに対する結合能力の喪失と置換Ｋ３５Ｅとの適合性を示す図である（ＥＬＩＳＡ）。        図６ａは、マイクロタイタープレートをヒトαサブユニットでコーティングした図である。        図６ｂは、マイクロタイタープレートをマウスαサブユニットでコーティングした図である。
【図７】ＩＬ−２由来ムテインについて既に記述されているＩＬ−２受容体βサブユニットに対する結合能力の増大と置換Ｋ３５Ｅとの適合性を示す図である（ＥＬＩＳＡ）。
【実施例】
【００２５】
（例１）
機能的突然変異ヒトＩＬ−２を提示する繊維状ファージの選択及び特徴付け。
ヒトＩＬ−２のいくつかの位置を標的とした穏やかなランダム化ライブラリーを構築した。選択した位置には、αサブユニット受容体インターフェースに寄与する側鎖がある残基を有する位置が含まれていた（Ｋ３５、Ｒ３８、Ｔ４１、Ｆ４２、Ｋ４３、Ｆ４４、Ｙ４５、Ｅ６１、Ｅ６２、Ｋ６４、Ｐ６５、Ｅ６８、Ｖ６９、Ｎ７１、Ｌ７２、Ｑ７４及びＹ１０７）。選択した領域全てに中程度の多様性を導入するために、ヒトＩＬ−２を、標的とした各位置において８５％が元のヌクレオチドを保ち、それに加えて１５％が残り３種のヌクレオチドの等モル混合物の突然変異誘発性オリゴヌクレオチドをスパイクするＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発により多様化した。従って得られた１０９個クローンのライブラリーは、インターフェースの各位置で２０種のアミノ酸を全体として含有していたが、ライブラリー内の各分子は少数の置換しか有しておらず、新たなポリペプチドの探索が、開始分子により近い機能的配列空間に制限された。ライブラリーファージは、確立された手順を使用してポリエチレングリコールによる沈殿によって精製された（Ｍａｒｋｓ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１〜５９７頁、１９９１年）。精製したウイルス粒子を、組換えαＩＬ−２受容体サブユニット（Ｒ＆Ｄ）でコーティングした免疫管（Ｎｕｎｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）上でインキュベートして、ファージへの提示能により機能的突然変異ＩＬ−２バリアントを単離した。２つの独立したパニング手順を、ヒト及びマウスＩＬ−２受容体サブユニットに対して実行した。結合していないファージを洗浄した後、結合しているファージを塩基性トリエチルアミン溶液を添加することにより溶出した。ＴＧ１細菌を選択したファージで感染させ、そのファージを、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを使用して増幅し、新たな選択回転の出発材料として使用した。４回のファージ選択回転を実行した。選択したファージミド（３及び４回選択回転由来）中の挿入物の配列決定から、得られた突然変異バリアントにおける類似性が明らかになった。元の非突然変異ＩＬ−２遺伝子が優性である（元のライブラリーにおいて高く表れる）にもかかわらず、置換Ｋ３５Ｅ、Ｋ３５Ｄ及びＫ３５Ｑを有し、繊維状ファージにおける機能的ＩＬ−２の提示において３５位の非保存的変化の影響を示すバリアントが少しの割合存在した。Ｋ３５Ｅは、最も高頻度の置換であった。ＩＬ−２／受容体複合体の結晶構造（ＰＤＢコード３Ｂ５Ｉ及び２ＥＲＪ）の分析は、αサブユニットとのインターフェースの極性周辺領域におけるイオン性相互作用への元のＫ３５残基の関与を示すので、この発見は驚きであった。従って、セレクター分子との相互作用を保つ非保存的置換（事例中２例では荷電反転）の能力は、予想外であった。
【００２６】
（例２）
３５位に非保存的変化を有するヒトＩＬ−２の分泌及びファージディスプレイの増大。
ライブラリーから選択した異なるＩＬ−２バリアントが大腸菌ペリプラズムに分泌され、ファージ上に提示される能力を比較した。天然のＩＬ−２を参照分子として使用した。Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発によりＫ３５Ｒ含有バリアント（３５位に保存的変化）も構築して、追加の対照として使用した。ファージミドベクターｐＣＳＭにそのコード遺伝子を挿入し（Ｍ１３遺伝子３に融合させた）、その後得られた遺伝子構築物で形質転換したＴＧ１細菌からファージを産生することによって全てのタンパク質を得た（Ｒｏｊａｓ，Ｇ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．２１８：１０５〜１１３頁、２０１３年）。各バリアントのファージディスプレイのレベルを、９Ｅ１０モノクローナル抗体でコーティングしたマイクロタイタープレート上でＥＬＩＳＡによって評価した。結合しているファージを、セイヨウワサビペルオキシダーゼとカップリングした抗Ｍ１３抗体で検出した。置換Ｋ３５Ｅ、Ｋ３５Ｄ及びＫ３５Ｑが、元の分子と比較してヒトＩＬ−２の提示の増大をもたらすことが示された（図１）。この増大の大きさは、電荷反転変化のＫ３５Ｅ及びＫ３５Ｄについて１０倍であり、Ｋ３５Ｑについて７倍であった。他方、保存的変化Ｋ３５Ｒは、ＩＬ−２の提示能を改変しなかった（図１）。Ｋ３５Ｅを、更なる研究のために選択した。
【００２７】
（例３）
分泌及びファージディスプレイに対するＫ３５Ｅ置換の効果は、ＩＬ−２突然変異バリアントのパネルにまでおよぶ。
Ｋ３５Ｅを、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発によってヒトＩＬ−２のいくつかの突然変異バリアントの遺伝子に（ファージディスプレイ形式で）導入した。パネルは、異なる免疫調節性機能を実行するために既に記述されている４つのムテイン：エフェクターＴ細胞に対して選択的アゴニスト機能を有する１つの非αムテイン（Ｃａｒｍｅｎａｔｅ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０：６２３０〜６２３８頁、２０１３年；米国特許第９，２０６，２４３号Ｂ２）、γＩＬ−２受容体サブユニット（非γ）に対する結合能力を失った１つのアンタゴニストムテイン（米国特許第８，７５９，４８６号Ｂ２）、及びβ（スーパーβ）又はα（スーパーα）ＩＬ−２受容体サブユニットのいずれかに対する結合能力が増強された２つのスーパーアゴニストムテイン（Ｌｅｖｉｎ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．４８４：５２９〜５３３頁、２０１２年；ＷＯ２００５／００７１２１）を含んだ。これらタンパク質のそれぞれを提示するファージを作製し、精製し（Ｋ３５Ｅを含まない元の分子と一緒に）、外来タンパク質の提示レベルを、９Ｅ１０モノクローナル抗体をコーティングしたマイクロタイタープレート上でＥＬＩＳＡによって評価した。天然のＩＬ−２を提示しているファージ調製物を参照として使用して（その中に１００任意単位／ｍＬの存在を仮定する）標準曲線を構築し、それにより各バリアントについて相対的提示レベルを算出した。表１は、Ｋ３５Ｅの導入に伴う各ムテインの提示レベルの増大を示す。
【表１】
2019535269.tif 000003
【００２８】
（例４）
置換Ｋ３５は、ＩＬ−２及びそれ由来ムテインに基づく融合タンパク質のヒト宿主細胞による分泌を増強する。
ｐＣＭＸ発現ベクターの文脈において、遺伝子構築物を、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域遺伝子にヒトＩＬ−２及びそれ由来ムテインの遺伝子を融合するように設計した。突然変異Ｋ３５Ｅを有する同等の構築物の追加のパネルも調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（懸濁液中で増殖するように適応している）を、ポリエチレンイミンと適切に混合した上記遺伝子構築物のそれぞれでトランスフェクトした。トランスフェクション容積は、５０ｍＬであった。トランスフェクトした細胞からの上清を、培養６日後に採取した。組換えＩＬ−２由来タンパク質の存在を、ＩＬ−２．２モノクローナル抗体（全てのムテインに存在する直鎖状エピトープに対して作られている）でコーティングしたマイクロタイタープレート上でＥＬＩＳＡによって評価した。捕捉された融合タンパク質を、セイヨウワサビペルオキシダーゼとカップリングされた抗ヒトＦｃ抗体で検出した。上清中の融合タンパク質のレベルは、その元の相対物と比較して置換Ｋ３５Ｅを含有する分子について高かった（図２ａ〜図２ｅ）。そのような組換えタンパク質を、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。表２は、精製後の収量を示す。
【表２】
2019535269.tif 000004
【００２９】
（例５）
Ｋ３５Ｅ置換は、天然のＩＬ−２の分子間相互作用と適合する。
ヒトＦｃ融合ホモ二量体形式の組換え突然変異ＩＬ−２（Ｋ３５Ｅ）の結合能力を、天然のＩＬ−２と相互作用することが公知の異なる分子でコーティングしたマイクロタイタープレート上でＥＬＩＳＡによって評価した。コーティング分子のパネルは、ＩＬ−２上の異なるエピトープ、及びＩＬ−２受容体αサブユニット（ヒト又はマウス起源）を認識する４つのモノクローナル抗体を含んだ。捕捉された融合タンパク質を、セイヨウワサビペルオキシダーゼとカップリングされた抗ヒトＦｃ抗体で検出した。同じ発現系において作製した非突然変異ＩＬ−２を含む類似の融合ホモ二量体を、対照として使用した。抗体及び受容体両方に対する突然変異ホモ二量体の結合は、Ｋ３５Ｅの存在の影響を受けなかった、逆にそれは反対の効果をもたらした。全てのコーティング分子に対する突然変異バリアントの反応性は、その非突然変異組換え対応物より高く（図３）、このことは、Ｋ３５Ｅバリアントの抗原性及び機能性が、類似の条件下で得られる非突然変異組換えタンパク質より大きな程度で、天然のＩＬ−２のそうした特性を再現することを示す。
【００３０】
（例６）
Ｆｃ融合ＩＬ−２  Ｋ３５Ｅは、ＣＴＬＬ−２細胞の増殖を刺激する能力を維持している。
Ｆｃ融合ホモ二量体形式（懸濁液中でトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から精製した）における突然変異ＩＬ−２（Ｋ３５Ｅ）の、ＣＴＬＬ−２増殖を誘導する能力を評価した。組換えヒトＩＬ−２を対照として使用した。細胞を、異なる濃度の両タンパク質の存在下で増殖させ、増殖を比色アラマーブルー減少アッセイによって測定した（図４）。比活性度を、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して最大半量増殖をもたらした分子の用量からあらゆる場合において算出した。Ｆｃ融合突然変異ＩＬ−２（Ｋ３５Ｅを含む）の比活性度は、４×１０６ＩＵ／ｍｇであり、参照組換えＩＬ−２（２．３×１０６ＩＵ／ｍｇ）のそれと同程度であった。この結果は、Ｋ３５Ｅの存在におけるＩＬ−２生物活性の保存を示した。
【００３１】
（例７）
Ｆｃ融合ＩＬ−２  Ｋ３５Ｅは、ｉｎ  ｖｉｖｏでメモリ表現型ＣＤ８Ｔ細胞の増殖を刺激する能力を有する。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１日用量の５倍である４×１０４ＩＵのＦｃ融合突然変異ＩＬ−２（Ｋ３５Ｅ）を５日間連続投与して、ＩＬ−２依存細胞集団のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖を刺激するこのタンパク質の能力を研究した。動物を処置後に屠殺し、その脾臓を観察した。加えて、メモリ表現型（ＣＤ４４ｈｉ）を有するＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の集団のサイズを、フローサイトメトリーにより決定した。実験の対照は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で注射したマウスの一群であった。脾臓の肥大（図５ａ）及びその中のメモリ表現型ＣＤ８Ｔ細胞の割合の倍化（図５ｂ）によって判断される通り、組換えＦｃ融合ＩＬ−２（Ｋ３５Ｅ）は、メモリＣＤ８Ｔ細胞集団に対して予想される効果を有した。
【００３２】
（例８）
置換Ｋ３５Ｅは、選択的アゴニストの特性を決定するＩＬ−２受容体αサブユニットに対する結合能力の喪失と適合する。
これまでに記述されているヒトＩＬ−２及び非αムテイン両方の結合特性を比較した（Ｃａｒｍｅｎａｔｅ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０：６２３０〜６２３８頁、２０１３年；米国特許第９，２０６，２４３号）。非αムテインは、ヘテロ二量体β／γ受容体を有するエフェクター細胞に対する作用に影響せずに調節性Ｔ細胞に対する刺激潜在性を減少させることを意図してＩＬ−２受容体αサブユニットに結合する能力の喪失をもたらす置換Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ及びＥ６２Ａを含有する。両方の組換えタンパク質は、追加のＫ３５Ｅ突然変異を有し、ヒト免疫グロブリンのＦｃドメインを含有する融合タンパク質として作製された。マイクロタイタープレートを、ヒト（ａ）及びマウス（ｂ）起源の組換えＩＬ−２受容体αサブユニットでコーティングした。捕捉された融合タンパク質を、セイヨウワサビペルオキシダーゼとカップリングされた抗ヒトＦｃ抗体で検出した。Ｋ３５Ｅの導入により、元の相対物より発現レベルが高く（図２ｂ）、置換Ｋ３５Ｅも有する非突然変異ＩＬ−２と比較してヒト及びマウスα鎖結合が激しく減少した新たな非α分子を得た（図６）。これらの結果は、ＩＬ−２の相互作用及び免疫調節性機能の選択的な調節とＫ３５Ｅの適合性の最初の証拠を与えた。
【００３３】
（例９）
置換Ｋ３５Ｅは、スーパーアゴニストバリアントに対して既に記述されているＩＬ−２受容体βサブユニット結合能力の増大と適合する。
ＩＬ−２及び突然変異Ｌ８０Ｆ、Ｒ８１Ｄ、Ｌ８５Ｖ、Ｉ８６Ｖ及びＩ９２Ｆを含有するスーパーβムテイン（両方とも追加の突然変異Ｋ３５Ｅがあり、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに融合されている）の結合能力を、ＩＬ−２受容体βサブユニットでコーティングしたプレート上でＥＬＩＳＡによって評価した。捕捉された融合タンパク質を、セイヨウワサビペルオキシダーゼとカップリングされた抗ヒトＦｃ抗体で検出した。Ｋ３５Ｅの導入により、元のスーパーβムテインと比較して発現レベルがより高く（図２ｃ）、スーパーアゴニスト機能の基礎であるβサブユニット結合能力が増強された（図７）新たな分子を得た。この結果は、受容体サブユニットとそれらとの相互作用及び免疫調節性機能に改変がある新たなＩＬ−２由来分子の設計とＫ３５Ｅ置換との適合性の証拠を拡大した。
【配列表フリーテキスト】
【００３４】
配列番号１：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号２：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号３：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号４：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号５：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号６：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号８：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号９：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号１０：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号１１：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号１２：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号１３：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号１４：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号１５：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号１６：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号１７：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
配列番号１８：＜２２３＞組換えＤＮＡ技術による
【図１】
2019535269.tif 000005
【図２ａ】
2019535269.tif 000006
【図２ｂ】
2019535269.tif 000007
【図２ｃ】
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【図２ｄ】
2019535269.tif 000009
【図２ｅ】
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【図３】
2019535269.tif 000011
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019535269.tif 000015
【配列表】
2019535269000001.app
【国際調査報告】
2019535269.tif 000016
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