(57)【要約】  本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）ならびにそれらを含む組成物および反応混合物を作製する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、
ａ）免疫エフェクター細胞を含む凍結インプットサンプルを用意し、
ｂ）前記凍結インプットサンプルを融解させて、融解サンプルを生成し、
ｃ）前記融解サンプルに対して水簸を行い、免疫エフェクター細胞を収集することによって、ＣＡＲの発現に好適である免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを生成すること
を含む方法。
【請求項２】
前記凍結インプットサンプルが血漿アフェレーシスサンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｄ）流動条件下でＣＤ１９＋細胞を枯渇させること、
ｅ）イオジキサノールを含む媒体、例えば、６０％イオジキサノール水溶液、例えばＯｐｔｉｐｒｅｐ媒体であって／あるか、フィコールより高い密度（例えば、１.０７７ｇ／ｍｌより高い、例えば約１.３２ｇ／ｍｌ）を有する媒体を使用して、密度遠心分離を実施すること、
ｆ）デキストロースおよび／または塩化ナトリウムを含む緩衝液、例えばＤ５媒体（５％デキストロースおよび０.４５％塩化ナトリウム）を用いる洗浄工程、例えば、ＣＳ５（ＣｅｌｌＳａｖｅｒ５＋）装置を使用して行われる洗浄工程を（例えば、前記融解サンプルに対して）実施すること、ならびに
ｇ）流動条件下でＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択を実施すること
の１、２、３または全てをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記融解サンプルの粘度を、例えば、前記融解サンプルに等張液、例えばＰＢＳを添加することにより、調整する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記水簸が約３０〜８２ｍＬ／分もしくは５０〜８０ｍＬ／分の流量を使用して行われおよび／または収集容量が、各画分について約２５０〜１２５０ｍＬもしくは３００〜１０００ｍＬであり、例えば、
前記水簸が、約３０、４０、５０、６０、７０、７２、もしくは８２ｍＬ／分、例えば、約７０または７２ｍＬ／分の流量を使用して行われ、
前記水簸が、約２５０、４００、５００、９００、もしくは９７５ｍＬ、例えば、約４００もしくは９７５ｍＬの収集容量を使用して行われおよび／または
前記水簸が、約２４００ｒｐｍで行われる、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記インプットサンプルが
少なくとも１０％、１５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３５％もしくは４０％単球、
６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％もしくは２０％未満Ｔ細胞および／または
少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％Ｂ細胞
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記アウトプットサンプルが
２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％もしくは０.１％未満単球、
少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％Ｔ細胞、
２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％もしくは０.１％未満Ｂ細胞、
少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.７％もしくは９９.９％ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞および／または
少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.７％もしくは９９.９％ＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％Ｔ細胞のＴ細胞収量回収率を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＣＡＲをコードする核酸と前記アウトプットサンプルを接触させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＡＲをコードする核酸と前記アウトプットサンプルを接触させた後、前記アウトプットサンプルが、
少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％ＣＡＲ＋ＣＤ４＋セントラルメモリー細胞、
少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％もしくは５０％ＣＡＲ＋細胞および／または
少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％ＣＡＲ＋ＣＤ８＋セントラルメモリー細胞
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＡＲをコードする核酸と前記アウトプットサンプルを接触させた後、前記アウトプットサンプルが
形質導入された細胞１個あたり１、０.９、０.８、０.７、０.６、０.５、０.４、０.３、０.２もしくは０.１ｐｇ未満ＩＦＮ−ガンマを産生するおよび／または
少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５もしくは３０の細胞毒性レベル（例えば、ＥＣ５０ｒｅｃ）を有する、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、
ａ）免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルを用意し、
ｂ）イオジキサノールを含む媒体、例えば、６０％イオジキサノール水溶液、例えばＯｐｔｉｐｒｅｐ媒体であって／であるか、フィコールより高い密度（例えば、１.０７７ｇ／ｍｌより高い、例えば約１.３２ｇ／ｍｌ）を有する媒体を使用して、密度遠心分離を実施することによって、ＣＡＲの発現に好適である免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを生成すること
を含む方法。
【請求項１３】
ｃ）流動条件下でＣＤ１９＋細胞を枯渇させること、
ｄ）融解インプットサンプルであってもよい前記インプットサンプルに対する水簸、
ｅ）デキストロースおよび／または塩化ナトリウムを含む緩衝液、例えば、Ｄ５媒体（５％デキストロースおよび０.４５％塩化ナトリウム）を用いる洗浄工程、例えば、ＣＳ５（ＣｅｌｌＳａｖｅｒ５＋）装置を使用して行われる洗浄工程を（例えば、密度遠心分離の前に）実施することおよび
ｆ）流動条件下でＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択を実施すること
の１、２、３または全てを実施することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
グリコールを含む溶液、例えばフィコール溶液を使用すること；またはデキストロースおよび／もしくは塩化ナトリウムを含む緩衝液、例えばＤ５媒体を用いる洗浄工程、例えば、ＣＳ５装置を使用して行われる洗浄工程を実施すること；または陽性選択工程を実施することの１以上を含まない、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記密度遠心分離が細胞分離デバイス、例えば、Ｓｅｐａｘ２デバイスを使用して行われる、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記インプットサンプルが
６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％もしくは１５％未満Ｔ細胞、
少なくとも１０％、１５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％もしくは７０％単球および／または
少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％もしくは８０％Ｂ細胞
を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記アウトプットサンプルが
少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％Ｔ細胞、
５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％もしくは０.１％未満単球および／または
２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％,０.２％、０.１％、０.０５％もしくは０.０１％未満Ｂ細胞
を含む、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％Ｔ細胞のＴ細胞収量回収率を有する、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、
ａ）免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルを用意し、
ｂ）流動条件下で、例えば、フロースルーデバイスを使用して、前記インプットサンプルからＣＤ１９＋細胞を除去することによって、ＣＡＲの発現に好適である免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを生成すること
を含む方法。
【請求項２０】
ｃ）融解インプットサンプルであってもよい前記インプットサンプルに対する水簸、
ｄ）イオジキサノールを含む媒体、例えば、６０％イオジキサノール水溶液、例えばＯｐｔｉｐｒｅｐ媒体であって／あるか、フィコールより高い密度（例えば、１.０７７ｇ／ｍｌより高い、例えば約１.３２ｇ／ｍｌ）を有する媒体を使用する密度遠心分離工程、
ｅ）緩衝液デキストロースおよび／または塩化ナトリウム、例えばＤ５媒体（５％デキストロースおよび０.４５％塩化ナトリウム）を用いる洗浄工程、例えば、ＣＳ５（ＣｅｌｌＳａｖｅｒ５＋）装置を使用して行われる洗浄工程を（例えば、ＣＤ１９＋細胞を除去する前におよび／または前記インプットサンプルを融解させた後に）実施することおよび
ｆ）流動条件下でのＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択
の１、２、３または全てを実施することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
水簸を実施することも密度遠心分離を実施することも含まない、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＤ１９＋細胞がＢ細胞、例えばリンパ芽球を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記インプットサンプルが
少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％もしくは５０％ＣＤ１９＋細胞、
少なくとも１０％、１５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３５％もしくは４０％単球および／または
６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％もしくは２０％未満Ｔ細胞
を含む、請求項１９〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記アウトプットサンプルが
２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％,０.２％、０.１％、０.０５％もしくは０.０１％未満ＣＤ１９＋細胞、
前記インプットサンプルと比較して百分率５０％、４５％、４０％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、２％、２％または１％未満のＣＤ１９＋細胞、
２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％もしくは０.１％未満単球、
少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％Ｔ細胞および／または
２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％,０.２％、０.１％、０.０５％もしくは０.０１％未満Ｂ細胞
を含む、請求項１９〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＣＤ１９＋細胞が、磁気分離により除去される、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記磁気分離が、
磁性もしくは常磁性メンバーとＣＤ１９結合メンバーとを含む分離試薬と、前記細胞を接触させること、
フローサイトメトリーおよび／または
磁性細胞分離デバイス、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣｓデバイスの使用
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＣＤ１９＋細胞が、ＦＡＣＳにより除去される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％Ｔ細胞のＴ細胞収量回収率を有する、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記インプットサンプル（例えば、洗浄後の前記インプットサンプル）が、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％Ｂ細胞を含む、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、
ａ）免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルを用意し、
ｂ）流動条件下で前記インプットサンプルからＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞を陽性選択することによって、ＣＡＲの発現に好適である免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを生成すること
を含む方法。
【請求項３１】
ｃ）ＣＤ１９＋細胞を例えば流動条件下で枯渇させること、
ｄ）融解インプットサンプルであってもよい前記インプットサンプルに対する水簸、
ｅ）イオジキサノールを含む媒体、例えば、６０％イオジキサノール水溶液、例えばＯｐｔｉｐｒｅｐ媒体であって／であるか、フィコールより高い密度（例えば、１.０７７ｇ／ｍｌより高い、例えば約１.３２ｇ／ｍｌ）を有する媒体を使用する密度遠心分離工程、
ｆ）緩衝液デキストロースおよび／または塩化ナトリウム、例えば、Ｄ５媒体（５％デキストロースおよび０.４５％塩化ナトリウム）を用いる洗浄工程、例えば、ＣＳ５（ＣｅｌｌＳａｖｅｒ５＋）装置を使用して行われる洗浄工程を（例えば、ＣＤ１９＋細胞を除去する前におよび／または前記インプットサンプルを融解させた後に）実施すること
の１、２、３または全てを実施することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
陽性選択を行う前に水簸、洗浄工程（適宜）および密度遠心分離（例えば、フィコールもしくはＯｐｔｉＰｒｅｐＯ媒体を使用する）を実施することおよび／または
陽性選択を行う前に洗浄工程（適宜）および密度遠心分離（例えば、フィコールもしくはＯｐｔｉＰｒｅｐ媒体を使用する）を実施すること
をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
水簸を実施することを含まない、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
デキストロースおよび／または塩化ナトリウム、例えば、Ｄ５  １／２  ＮＳを含む緩衝液を用いて、例えばＣＳ５＋装置を使用して、洗浄を実施することを含む、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞の前記陽性選択が磁性または常磁性メンバーとＣＤ３および／またはＣＤ２８結合メンバーとを含む分離試薬と前記インプットサンプルを接触させることを含む、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
ＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞の前記陽性選択が前記インプットサンプルを分離試薬とともに約１０〜９０分、約１０〜６０分、約１０〜４５分、約１２〜９０分、約１２〜６０分、約１２〜４５分、約１５〜９０分、約１５〜６０分、約１５〜４５分、例えば、約３０分または約２０分間インキュベートすることを含む、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記分離試薬が抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体にカップリングされている（例えば、共有結合的にまたは非共有結合的にカップリングされている）ビーズを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記アウトプットサンプルが
少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１５％または２０％Ｔ細胞、
２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％または０.１％未満単球、
少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％Ｔ細胞、例えばＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞
を含む、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
磁気デバイス、例えば、Ｄｙｎａｍａｇ  ＣＴＳ、もしくは磁気要素の他の装置を用いて行われるおよび／または約３：１の磁気分離メンバー（例えば、ビーズ）のＴ細胞に対する比を使用する、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞の前記陽性選択が約６分、５分、６分、３分、２分もしくは１分未満または約５０秒、４０秒、３０秒、２０秒、１０秒、５秒、４秒、３秒、２秒または１秒未満の分離または滞留時間を含む、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記免疫エフェクター細胞と磁気分離メンバーとを含む流体を、磁気分離が行われる密閉系、例えば、チャンバまたはバッグの中で流動させることを含み、適宜、前記流動させることが、前記メンバー（免疫エフェクター細胞と結合していてもよい）の磁気分離が生じるような速度で行われる、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
少なくとも１つの細胞懸濁モジュールと、
少なくとも１つのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールと、
少なくとも１つの非磁気アウトプットモジュールと、
少なくとも１つの磁気アウトプットモジュールと、
適宜、前記磁気分離／脱ビーズ化モジュールの外部の少なくとも１つの磁性構成要素であって、磁力および／または磁場勾配を生じさせる磁性構成要素と、
適宜、少なくとも１つの緩衝モジュールと
を含むデバイスを使用して行われる、請求項３０〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記磁気分離／脱ビーズ化モジュールが
壁により規定されており、ｘ方向、ｙ方向およびｚ方向を有するチャンバと、
前記チャンバの、例えば、前記ｘ方向の、前記ｙ方向のまたは前記ｚ方向の、両端に配置された入口および出口と、
前記チャンバの壁に隣接または近接しており、前記チャンバ内の前記入口と前記出口の間にゼロ勾配線を確立するように配置されている、少なくとも２つの磁石と
を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記インプットサンプルが
細胞約１×１０７個／ｍｌ、
少なくとも約５％、１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％Ｂ細胞、例えばＣＤ４５＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞および／または
少なくとも約５％、１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％Ｂ細胞、例えばＣＤ４５−ＣＤ１９＋Ｂ細胞
を含む、請求項３０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記アウトプットサンプルが
約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満Ｂ細胞、例えば、ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞、
約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満Ｂ細胞、例えば、ＣＤ４５−ＣＤ１９＋Ｂ細胞
を含む、請求項３０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記インプットサンプルが
少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％単球、
少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％腫瘍細胞、例えば、リンパ芽球および／または
６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％もしくは２０％未満免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞
を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記アウトプットサンプルが
２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％もしくは０.１％未満単球、
２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％もしくは０.１％未満腫瘍細胞、
少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.８％もしくは９９.９％免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞、
前記インプットサンプルと比較して百分率５０％、４５％、４０％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、２％、２％もしくは１％未満の単球、
前記インプットサンプルと比較して百分率５０％、４５％、４０％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、２％、２％もしくは１％未満の腫瘍細胞および／または
前記インプットサンプルと比較して百分率少なくとも５０％、４５％、４０％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、２％、２％もしくは１％の免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞
を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ＣＡＲをコードする核酸を前記アウトプットサンプル中の前記免疫エフェクター細胞の１以上に、例えば形質導入によって導入することをさらに含み、適宜、前記ＣＡＲが、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、一次シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激シグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達ドメインとを含み、ならびに適宜、前記形質導入が、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％の形質導入効率をもたらす、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記形質導入効率をアッセイする工程、ならびに／またはデキストロースおよび／もしくは塩化ナトリウムを含む緩衝液、例えばＤ５媒体を用いて、例えばＣＳ５＋装置を使用して、前記インプットサンプルに対する洗浄工程を実施することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記免疫エフェクター細胞がヒト免疫エフェクター細胞である、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記アウトプットサンプルがＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記インプットサンプルが、これらに限定されないが、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を包含する、１種または複数の急性白血病；これらに限定されないが、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を包含する、１種または複数の慢性白血病；これらに限定されないが、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性のリンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞の新生物、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、前白血病状態、非定型的および／または非典型的ながん、悪性腫瘍、前がん状態もしくは増殖性疾患を包含する、追加の血液がんもしくは血液学的状態、ならびにそれらのあらゆる組合せからなる群から選択されるがんを有する患者からのものである、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記アウトプットサンプル中の細胞上の１以上の細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２５もしくはＣＤ１４をアッセイする工程、ならびに／または
免疫エフェクター細胞を、例えば、形質導入前に、例えば、ＣＤ３および／もしくはＣＤ２８に結合する試薬、例えば、ＣＤ３および／もしくはＣＤ２８抗体にカップリングされている基質（例えばビーズ）と接触させることにより刺激する工程
をさらに含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、
ｉ）免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプル、例えば、凍結インプットサンプルまたは新鮮なインプットサンプルを用意し、
ii）適宜、前記インプットサンプルが凍結インプットサンプルである場合、前記凍結インプットサンプルを融解させて融解サンプルを生成し、
iii）１.融解インプットサンプルであってもよい前記インプットサンプルに対して水簸を実施することまたは
２. イオジキサノールを含む媒体、例えば、６０％イオジキサノール水溶液、例えばＯｐｔｉｐｒｅｐ媒体であって／であるか、フィコールより高い密度（例えば、１.０７７ｇ／ｍｌより高い、例えば約１.３２ｇ／ｍｌ）を有する媒体を使用して、密度遠心分離工程を実施すること
を含む濃縮工程を実施し、
iv）選択が、陽性選択、例えばＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択または陰性選択、例えばＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋、もしくはＣＤ１４＋細胞の陰性選択である、選択工程を実施すること
を含み、それによって、ＣＡＲの発現に好適である免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを生成する方法。
【請求項５５】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、
ａ）免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプル、例えば、凍結インプットサンプルまたは新鮮なインプットサンプルを用意し、
ｂ）水簸または密度遠心分離（例えば、フィコールもしくはＯｐｔｉｐｒｅｐ媒体を使用する）を実施することを含む濃縮工程を実施し、
ｃ）選択が、陽性選択、例えばＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択または陰性選択、例えばＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋もしくはＣＤ１４＋細胞の陰性選択である、選択工程を、例えばフロースルーデバイスを使用することにより、流動条件下で実施すること
を含み、それによって、ＣＡＲの発現に好適である免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを生成する方法。
【請求項５６】
デキストロースおよび／または塩化ナトリウムを含有する緩衝液、例えば、Ｄ５媒体（５％デキストロースおよび０.４５％塩化ナトリウム）を用いる洗浄工程、例えば、ＣＳ５（ＣｅｌｌＳａｖｅｒ５＋）装置を使用して行われる洗浄工程を実施すること；
免疫エフェクター細胞の増殖を刺激する、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤、ならびに／またはＴ細胞の表面の共刺激分子を刺激するリガンド、例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて、前記アウトプットサンプルを刺激すること；および／または
ＣＡＲをコードする核酸を、例えば、形質導入、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより、導入すること
をさらに含む、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法を使用して得られる、反応混合物。
【請求項５８】
少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％Ｔ細胞と、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満単球とを含む反応混合物であって、前記反応混合物中の細胞の総数が合計１００％であり、適宜、前記Ｔ細胞の１以上がＣＡＲを発現する、反応混合物。
【請求項５９】
合計少なくとも１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、もしくは５×１０８個の細胞、
１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％もしくは１％未満Ｂ細胞および／または
１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％もしくは１％未満がん細胞、例えばリンパ芽球
を含む、請求項５８に記載の反応混合物。
【請求項６０】
ＣＡＲをコードする核酸、例えば、Ｔ細胞内またはＴ細胞外に存在する核酸をさらに含む、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１５年１２月２８日付けで出願された米国特許出願第６２／２７１６９５号および２０１６年１２月７日付けで出願された米国特許出願第６２／４３１２０４号に基づく優先権を主張するものであり、これらの内容は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出した配列表を含み、この配列表は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。２０１６年１２月２７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、N2067-7100WO_SL.txtという名であり、サイズは２５７,８０８バイトである。
【０００３】
本発明は、一般に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）ならびにそれらを含む組成物を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
自己Ｔ細胞を用いる、特に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が形質導入されたＴ細胞を用いる養子細胞移入（ＡＣＴ）療法は、いくつかの血液がんの治験で有望性が証明されている。
【０００５】
遺伝子改変された自己Ｔ細胞の製造は、現在は、患者由来の物質（例えば、白血球アフェレーシスから得たもの）を用いて出発し、その物質からＣＡＲを発現する加工された治療用Ｔ細胞を得る、複雑なプロセスである。患者の白血球アフェレーシス物質の細胞成分のばらつきは高レベルであり得る。この出発物質は、患者によっておよび１つの病状の中で細胞組成が大きく異なり得る。細胞夾雑物は、顆粒球、単球、赤血球、循環芽球細胞および血小板を包含し得る。自己細胞療法製品製造プロセスは、出発物質の細胞の内容物にさらに影響を与えることになる、患者のそれぞれに異なる処置歴、疾患の状態などにも対処しなければならない（Burger et al. 2014、Kaiser et al. 2015、Ramos et al. 2009）。さらに、出発物質からのそのような夾雑物は、製造プロセス、最終製品の品質および製品の治療効果に悪影響を及ぼし得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ＣＡＲ発現細胞療法製品のより一貫した生産であって、その結果、製造プロセスが簡素化され、製品品質が向上され、製品の治療効果が最大化される生産をもたらす方法およびプロセスの需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）ならびにそれらを含む組成物を作製する方法に関する。
【０００８】
したがって、一態様において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製または濃縮する方法であって、水簸を実施することを包含する方法を特徴とする。方法は、免疫エフェクター細胞を含む凍結インプットサンプルを用意し、凍結インプットサンプルを融解させて、融解サンプルを生成し、融解サンプルに対して水簸を行い、免疫エフェクター細胞を収集することを包含し、それによって、ＣＡＲの発現に好適である免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを生成する。
【０００９】
一実施形態において、凍結インプットサンプルは、血漿アフェレーシスサンプルある。
【００１０】
一実施形態において、方法は、
ｉ）流動条件下でＣＤ１９＋細胞を枯渇させること、
ii）イオジキサノールを含む媒体、例えば、６０％イオジキサノール水溶液（例えば、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ媒体）であって／であるか、フィコールより高い密度（例えば、１.０７７ｇ／ｍｌより高い、例えば約１.３２ｇ／ｍｌ）を有する媒体を使用して、密度遠心分離を実施すること、
iii）デキストロースおよび／または塩化ナトリウムを含有する緩衝液、例えば、Ｄ５  １／２  ＮＳ媒体（５％デキストロースおよび０.４５％塩化ナトリウム）を用いる洗浄工程、例えば、細胞処理デバイス、例えば細胞洗浄デバイスまたは密度勾配遠心分離用デバイス、例えばＣＳ５（ＣｅｌｌＳａｖｅｒ５＋）装置を使用して行われる洗浄工程を（例えば、融解サンプルに対して）実施すること、ならびに
iv）流動条件下でＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択を実施すること
の１、２、３または全てをさらに含む。
【００１１】
一実施形態において、方法は、融解サンプルの粘度を、例えば、融解サンプルに等張液、例えばＰＢＳを添加することにより、調整する工程をさらに含む。
【００１２】
一実施形態において、水簸は、約３０〜８２ｍＬ／分もしくは５０〜８０ｍＬ／分の流量を使用して行われおよび／または収集容量は、各画分について約２５０〜１２５０ｍＬもしくは３００〜１０００ｍＬである。一実施形態において、水簸は、約３０ｍＬ／分、４０ｍＬ／分、５０ｍＬ／分、６０ｍＬ／分、７０ｍＬ／分、７２ｍＬ／分または８２ｍＬ／分、例えば、約７０または７２ｍＬ／分の流量を使用して行われる。一実施形態において、水簸は、約３０〜４０ｍＬ／分、４０〜５０ｍＬ／分、５０〜６０ｍＬ／分、６０〜７０ｍＬ／分、７０〜７２ｍＬ／分、７０〜８２ｍＬ／分、７２〜８２ｍＬ／分の流量を使用して行われる。一実施形態において、水簸は、約２５０ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、９００ｍＬまたは９７５ｍＬ、例えば、約４００または９７５ｍＬの収集容量を使用して行われる。一実施形態において、水簸は、約２５０〜４００ｍＬ、４００〜５００ｍＬ、５００〜９００ｍＬ、９００〜１０００ｍＬまたは１０００〜１２５９ｍＬの収集容量を使用して行われる。一実施形態において、水簸は、約２４００ｒｐｍで行われる。一実施形態において、水簸は、約２０００〜２８００ｒｐｍ、２２００〜２６００ｒｐｍまたは２３００〜２５００ｒｐｍで行われる。
【００１３】
一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３５％または４０％単球を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％または２０％未満Ｔ細胞を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％Ｂ細胞を含む。
【００１４】
一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％または０.１％未満単球を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％Ｔ細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％または０.１％未満Ｂ細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.７％または９９.９％ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.７％または９９.９％ＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞を含む。
【００１５】
一実施形態において、方法は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％Ｔ細胞のＴ細胞収量回収率をもたらす。
【００１６】
一実施形態では、アウトプットサンプルを、ＣＡＲをコードする核酸と接触させる。一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸をアウトプットサンプルと接触させた後、アウトプットサンプルは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％ＣＡＲ＋細胞を含む。そのような実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％ＣＡＲ＋ＣＤ４＋セントラルメモリー細胞を含む。そのような実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％ＣＡＲ＋ＣＤ８＋セントラルメモリー細胞を含む。
【００１７】
一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸とアウトプットサンプルを接触させた後、アウトプットサンプルは、ＣＡＲ発現細胞、例えば、形質導入された細胞１個あたり１、０.９、０.８、０.７、０.６、０.５、０.４、０.３、０.２または０.１ｐｇ未満ＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）を産生する。ＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）放出アッセイは、本明細書で、例えば、実施例で記載される。一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸とアウトプットサンプルを接触させた後、アウトプットサンプルは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５または３０の細胞毒性レベル（例えば、ＥＣ５０ｒｅｃ）を有する。細胞毒性アッセイは、本明細書で、例えば、実施例で記載される。
【００１８】
別の態様において、本開示は、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製または濃縮する方法であって、密度勾配遠心分離（本明細書では密度遠心分離とも称される）を実施することを包含する方法を特徴とする。方法は、免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルを用意し、イオジキサノールを含む媒体、例えば、６０％イオジキサノール水溶液、例えばＯｐｔｉｐｒｅｐ媒体であって／であるか、フィコールより高い密度（例えば、１.０７７ｇ／ｍｌより高い、例えば約１.３２ｇ／ｍｌ）を有する媒体を使用して、密度遠心分離を実施することを包含し、それによって、ＣＡＲの発現に好適である免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを生成する。
【００１９】
一実施形態において、ここに記載する密度勾配遠心分離方法は、
ｉ）流動条件下でＣＤ１９＋細胞を枯渇させること、
ii）融解インプットサンプルであってもよいインプットサンプルに対する水簸を実施すること、
iii）デキストロースおよび／または塩化ナトリウムを含有する緩衝液、例えば、Ｄ５  １／２  ＮＳ媒体（５％デキストロースおよび０.４５％塩化ナトリウム）を用いる洗浄工程、例えば、ＣＳ５（ＣｅｌｌＳａｖｅｒ５＋）装置を使用して行われる洗浄工程を（例えば、密度遠心分離の前に）実施することおよび流動条件下でのＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択を実施すること
の１、２、３または全てを実施することをさらに含む。
【００２０】
一実施形態において、ここに記載する密度勾配遠心分離方法は、グリコールを含む溶液、例えばフィコール溶液の使用；またはデキストロースおよび／もしくは塩化ナトリウムを含む緩衝液、例えば、Ｄ５  １／２  ＮＳ媒体を用いる洗浄工程、例えば、ＣＳ５装置を使用して行われる洗浄工程を実施すること；または陽性選択工程を実施すること、の１以上を含まない。
【００２１】
一実施形態において、密度遠心分離は、細胞分離デバイス、例えば、Ｓｅｐａｘ２デバイスを使用して行われる。
【００２２】
一実施形態において、インプットサンプルは、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％または１５％未満Ｔ細胞を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％単球を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％Ｂ細胞を含む。
【００２３】
一実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％Ｔ細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％または０.１％未満単球を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％、０.１％、０.０５％または０.０１％未満Ｂ細胞を含む。
【００２４】
一実施形態において、ここに記載する密度勾配遠心分離方法は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％Ｔ細胞のＴ細胞収量回収率をもたらす。
【００２５】
別の態様において、本開示は、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、がん関連抗原発現細胞、例えば、ＣＤ１９発現（ＣＤ１９＋）細胞を除去するための陰性選択工程を包含する方法を特徴とする。方法は、免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルを用意し、流動条件下で、例えば、フロースルーデバイス、例えば、ここに記載する細胞処理システムを使用して、インプットサンプルからＣＤ１９＋細胞を除去することを包含し、それによって、ＣＡＲの発現に好適である免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを生成する。一実施形態において、ＣＤ１９＋細胞は、Ｂ細胞を含む。一実施形態において、ＣＤ１９＋細胞は、リンパ芽球を含む。
【００２６】
一実施形態において、ここに記載する陰性選択方法は、
ｉ）融解インプットサンプルであってもよいインプットサンプルに対する水簸を実施すること、
ii）イオジキサノールを含む媒体、例えば、６０％イオジキサノール水溶液（例えば、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ媒体）であって／であるか、フィコールより高い密度（例えば、１.０７７ｇ／ｍｌより高い、例えば約１.３２ｇ／ｍｌ）を有する媒体を使用する密度遠心分離工程を実施すること、
iii）デキストロースおよび／または塩化ナトリウムを含有する緩衝液、例えば、Ｄ５  １／２  ＮＳ媒体（５％デキストロースおよび０.４５％塩化ナトリウム）を用いる洗浄工程、例えば、ＣＳ５（ＣｅｌｌＳａｖｅｒ５＋）装置を使用して行われる洗浄工程を（例えば、ＣＤ１９＋細胞を除去する前におよび／またはインプットサンプルを融解させた後に）実施することおよび
iv）流動条件下でのＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択を実施すること
の１、２、３または全てを実施することをさらに含む。
【００２７】
一実施形態において、ここに記載する陰性選択方法は、水簸を実施することも密度遠心分離を実施することも含まない。
【００２８】
一実施形態において、ＣＤ１９＋細胞は、インプットサンプルから磁気分離によって除去される。一実施形態において、細胞を分離試薬と接触させることを含む磁気分離。一実施形態において、分離試薬は、磁性または常磁性メンバーとＣＤ１９結合メンバーとを含む。一実施形態において、磁気分離は、フローサイトメトリーまたはＦＡＣＳを含む。一実施形態において、ＣＤ１９＋細胞は、ＦＡＣＳにより除去される。一実施形態において、磁気分離は、磁気細胞分離デバイス、例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣｓデバイスの使用を含む。一実施形態において、ＣＤ１９＋細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＣｓデバイスにより除去される。一実施形態において、ＣＤ１９＋細胞は、ここに記載するようなフロースルーデバイス、例えば、ここに記載するような細胞処理システムにより除去される。
【００２９】
一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％ＣＤ１９＋細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％、０.１％、０.０５％または０.０１％未満ＣＤ１９＋細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、インプットサンプルと比較して百分率５０％、４５％、４０％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、２％、２％または１％未満のＣＤ１９＋細胞を含む。
【００３０】
一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３５％または４０％単球を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％または２０％未満Ｔ細胞を含む。一実施形態において、インプットサンプル（例えば、洗浄後のインプットサンプル）は、少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％または８０％Ｂ細胞を含む。
【００３１】
一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％または０.１％未満単球を含む。一部の実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％Ｔ細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％、０.１％、０.０５％または０.０１％未満Ｂ細胞を含む。
【００３２】
一実施形態において、ここに記載する陰性選択方法は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％Ｔ細胞のＴ細胞収量回収率をもたらす。
【００３３】
別の態様において、本開示は、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、陽性選択を含む方法を特徴とする。方法は、免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルを用意し、流動条件下でインプットサンプルからＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞を陽性選択することを包含し、それによってＣＡＲの発現に好適である免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを生成し、例えば、前記陽性選択は、流動条件下で行われる。
【００３４】
一実施形態において、ここに記載する陽性選択方法は、
ｉ）ＣＤ１９＋細胞を、例えば流動条件下で枯渇させること；融解インプットサンプルであってもよいインプットサンプルに対する水簸を実施すること；
ii）イオジキサノールを含む媒体、例えば、６０％イオジキサノール水溶液（例えば、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ媒体）であって／であるか、フィコールより高い密度（例えば、１.０７７ｇ／ｍｌより高い、例えば約１.３２ｇ／ｍｌ）を有する媒体を使用して、密度遠心分離を実施すること；および
iii）デキストロースおよび／または塩化ナトリウムを含む緩衝液、例えば、Ｄ５  １／２  ＮＳ媒体（５％デキストロースおよび０.４５％塩化ナトリウム）を用いる洗浄工程、例えば、ＣＳ５（ＣｅｌｌＳａｖｅｒ５＋）装置を使用して行われる洗浄工程を（例えば、ＣＤ１９＋細胞を除去する前におよび／またはインプットサンプルを融解させた後に）実施すること
の１、２、３または全てを実施することをさらに含む。
【００３５】
一実施形態において、ここに記載する陽性選択方法は、インプットサンプルに対して（例えば、該インプットサンプルが融解インプットサンプルである場合）水簸を実施することをさらに含む。適宜、水簸は、ＣＤ１９＋細胞を枯渇させること（例えば、上記（ｉ）で記載の通り）、密度遠心分離を実施すること（例えば、上記（ii）で記載の通り）および洗浄工程を実施すること（上記（iii）で記載の通り）の１以上（例えば、１つ、２つまたは全て）とともに行われる。
【００３６】
一実施形態において、ここに記載する陽性選択方法は、陽性選択を行う前に水簸、洗浄工程（適宜）および密度遠心分離（例えば、フィコールまたはＯｐｔｉＰｒｅｐ媒体を使用する）を実施することをさらに含む。一実施形態において、ここに記載する陽性選択方法は、陽性選択を行う前に洗浄工程（適宜）および密度遠心分離（例えば、フィコールまたはＯｐｔｉＰｒｅｐ媒体を使用する）を実施することをさらに含む。一実施形態において、ここに記載する陰性選択方法は、水簸を実施することを含まない。一実施形態において、ここに記載する陽性選択方法は、デキストロースおよび／または塩化ナトリウムを含む緩衝液、例えば、Ｄ５  １／２  ＮＳ緩衝液を用いて、例えばＣＳ５＋装置を使用して、洗浄を実施することをさらに含む。
【００３７】
一実施形態において、陽性選択は、磁性または常磁性メンバーとＣＤ３および／またはＣＤ２８結合メンバーとを含む分離試薬と、インプットサンプルを接触させることを含む。一実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択は、インプットサンプルを分離試薬とともに約１０〜９０分、約１０〜６０分、約１０〜４５分、約１２〜９０分、約１２〜６０分、約１２〜４５分、約１５〜９０分、約１５〜６０分、約１５〜４５分、例えば、約３０分または約２０分間インキュベートすることを含む。一実施形態において、分離試薬は、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体にカップリングされている（例えば、共有結合的にまたは非共有結合的にカップリングされている）ビーズを含む。一実施形態において、陽性選択は、約３：１の磁気分離メンバー（例えばビーズ）のＴ細胞に対する比を使用する。
【００３８】
一実施形態において、陽性選択は、免疫エフェクター細胞と磁気分離メンバーとを含む流体を磁気分離が行われる密閉系、例えば、チャンバまたはバッグの中で、流動させることを含む。一実施形態において、流動させることは、メンバー（免疫エフェクター細胞と結合していてもよい）の磁気分離が生じるような速度で行われる。一実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択は、約６分、５分、６分、３分、２分もしくは１分未満または約５０秒、４０秒、３０秒、２０秒、１０秒、５秒、４秒、３秒、２秒もしくは１秒未満の分離または滞留時間を含む。
【００３９】
一実施形態において、陽性選択は、磁気デバイス、例えば、Ｄｙｎａｍａｇ  ＣＴＳ、ここに記載するような磁気要素を含むフロースルーデバイスまたは磁気要素の他の装置を用いて行われる。
【００４０】
一実施形態において、陽性選択は、少なくとも１つの細胞懸濁モジュールと；少なくとも１つのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化（debeading）モジュールと；少なくとも１つの非磁気アウトプットモジュールと；少なくとも１つの磁気アウトプットモジュールと；適宜、磁気分離／脱ビーズ化モジュールの外部の少なくとも１つの磁性構成要素であって、磁力および／または磁場勾配を生じさせる磁性構成要素と；適宜、少なくとも１つの緩衝モジュールとを備えているデバイスを使用して行われる。一実施形態において、デバイスは、磁気分離／脱ビーズ化モジュールの外部の少なくとも１つの磁性構成要素であって、磁力および／または磁場勾配を生じさせる磁性構成要素をさらに含む。一実施形態において、デバイスは、少なくとも１つの緩衝モジュールをさらに含む。一実施形態において、磁気分離／脱ビーズ化モジュールは、壁により規定されており、ｘ方向、ｙ方向およびｚ方向を有するチャンバと；前記チャンバの、例えば前記ｘ方向、前記ｙ方向または前記ｚ方向の、両端に配置された入口および出口と；前記チャンバの壁に隣接または近接しており、前記チャンバ内の前記入口と前記出口の間にゼロ勾配線を確立するように配置されている、少なくとも２つの磁石とを含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞はチャンバを通って流れ、その場合、チャンバ内の各々の位置は磁石から２ｃｍ以内である。
【００４１】
一実施形態において、陽性選択方法は、デキストロースおよび／または塩化ナトリウムを含む溶液、例えば、Ｄ５  １／２  ＮＳ媒体（５％デキストロースおよび０.４５％塩化ナトリウム）であって、適宜、周囲温度、例えば約２０〜２５℃である溶液と、免疫エフェクター細胞を接触させることを含む（例えば、工程ａ）とｂ）の間に）。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、例えば工程ａ）とｂ）中、可撓性容器、例えばバッグ内に存在する。一実施形態において、方法は、断熱材、例えば、紙を含む複数の層、例えばペーパータオルまたはワイプの上にバッグを配置することを含む（例えば、工程ａ）とｂ）の間、例えば、免疫エフェクター細胞を生理食塩水と接触させた後）。ある実施形態において、方法は、細胞を約３７℃で約１０分間インキュベートすることを含む（例えば、工程ｂ）の後）。ある実施形態において、方法は、細胞を約３６〜３８℃、３５〜３９℃または３４〜４０℃で例えば約１０分間、インキュベートすることを含む（例えば、工程ｂ）の後）。ある実施形態において、インキュベーション工程は、約８〜１２分間、５〜１５分間または５〜２０分間続く。ある実施形態において、インキュベーションは、Ｐｌａｓｍａｔｈｅｒｍデバイスにおいて行われる。
【００４２】
陽性選択方法のある実施形態において、免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルは、少なくとも２０％単球を含む。ある実施形態において、免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％単球を含む。
【００４３】
一実施形態において、陽性選択方法は、
ａ）血液悪性疾患を有する患者からの免疫エフェクター細胞を含む凍結インプットサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）であって、＞２０％リンパ芽球を含んでいてもよいサンプルを融解させること、
ｂ）免疫エフェクター細胞を、例えば周囲温度、例えば２０〜２５℃で、「改変培地」（ＭＭ）と呼ばれる洗浄溶液、例えば、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）で洗浄すること、
ｃ）磁性または常磁性メンバーとＣＤ３および／またはＣＤ２８結合メンバーとを含む分離試薬と、インプットサンプルを接触させること、
ｄ）回転器を用いてインプットサンプルおよび分離試薬を例えば２〜６ｒｐｍで、例えば４ｒｐｍで回転させること（ここでの回転は、例えば、１０〜３０分、例えば２０分間続く）および
ｅ）分離試薬に結合する細胞を濃縮するために、例えば、３０秒〜２分間、例えば１分間、陽性選択を実施すること
の１以上（例えば、２つ、３つ、４つもしくは全て）を、例えば列挙されている順序で含む。
【００４４】
一実施形態において、陽性選択方法は、
ａ）血液悪性疾患を有する患者からの免疫エフェクター細胞を含む凍結インプットサンプル（例えば、白血球アフェレーシスサンプル）であって、＞２０％単球を含んでいてもよいサンプルを融解させること、
ｂ）免疫エフェクター細胞を、例えば周囲温度、例えば２０〜２５℃で、洗浄溶液、例えば、約５％デキストロースおよび０.４５％塩化ナトリウムを含む洗浄溶液、例えばＤ５  １／２ＮＳで洗浄すること、
ｃ）細胞を含む可撓性容器を、断熱材、例えば、紙を含む複数の層、例えば、ペーパータオルまたはワイプの上に配置すること、
ｄ）磁性または常磁性メンバーとＣＤ３および／またはＣＤ２８結合メンバーとを含む分離試薬と、インプットサンプルを接触させること、
ｅ）インプットサンプルおよび分離試薬を、例えば３７℃で、例えば、５〜１５分、例えば１０分間、インキュベートすること、
ｆ）回転器を用いてインプットサンプルおよび分離試薬を例えば２〜６ｒｐｍで、例えば４ｒｐｍで回転させること（ここでの回転は、例えば、１０〜３０分、例えば２０分間続く）および
ｇ）分離試薬に結合する細胞を濃縮するために、例えば、３０秒〜２分間、例えば１分間、陽性選択を実施すること
の１以上（例えば、２、３、４、５、６または全て）を、例えば列挙されている順序で含む。
【００４５】
ある実施形態において、サンプル、例えばインプットサンプルは、血液悪性疾患、例えば、ここに記載する血液悪性疾患、例えばＡＬＬまたはＤＬＢＣＬを有する患者からのものである。
【００４６】
一実施形態において、インプットサンプルは、有核細胞約１×１０５個／ｍｌ、有核細胞２×１０５個／ｍｌ、有核細胞５×１０５個／ｍｌ、有核細胞７×１０５個／ｍｌ、有核細胞１×１０６個／ｍｌ、有核細胞２×１０６個／ｍｌ、有核細胞５×１０６個／ｍｌ、有核細胞７×１０６個／ｍｌ、有核細胞１×１０７個／ｍｌ、有核細胞２×１０７個／ｍｌ、有核細胞５×１０７個／ｍｌ、有核細胞７×１０７個／ｍｌ、有核細胞１×１０７個／ｍｌ、有核細胞２×１０８個／ｍｌ、有核細胞５×１０８個／ｍｌおよび有核細胞７×１０８個／ｍｌを含む。一実施形態において、インプットサンプルは、Ｔ細胞約１〜１.５×１０７個を含む。
【００４７】
一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％単球を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％腫瘍細胞、例えばリンパ芽球を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％または２０％未満免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも約５％、１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％Ｂ細胞、例えばＣＤ４５＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞を含む。一実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも約５％、１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％Ｂ細胞、例えばＣＤ４５−ＣＤ１９＋Ｂ細胞を含む。
【００４８】
一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％または０.１％未満単球を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％または０.１％未満腫瘍細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.８％または９９.９％免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％Ｔ細胞、例えばＣＤ３＋ＣＤ４５＋Ｔ細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満Ｂ細胞、例えば、ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋Ｂ細胞を含む。一実施形態において、アウトプットサンプルは、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満Ｂ細胞、例えば、ＣＤ４５−ＣＤ１９＋Ｂ細胞を含む。ある実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％または２０％Ｔ細胞を含有する。
【００４９】
別の態様において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、
ｉ）免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプル、例えば、凍結インプットサンプルまたは新鮮なインプットサンプルを用意し、適宜、インプットサンプルが凍結インプットサンプルである場合、凍結インプットサンプルを融解させて融解サンプルを生成し、
ii）融解インプットサンプルであってもよいインプットサンプルに対して水簸を実施することまたはイオジキサノールを含む媒体、例えば、６０％イオジキサノール水溶液、例えばＯｐｔｉｐｒｅｐ媒体であって／であるか、フィコールより高い密度（例えば、１.０７７ｇ／ｍｌより高い、例えば約１.３２ｇ／ｍｌ）を有する媒体を使用して、密度遠心分離工程を実施することを含む濃縮工程を実施し、
iii）選択が、陽性選択、例えばＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択または陰性選択、例えばＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋もしくはＣＤ１４＋細胞の陰性選択である、選択工程を実施すること
を包含し、それによって、ＣＡＲの発現に好適である免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを生成する方法を特徴とする。
【００５０】
別の態様において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、
ｉ）免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプル、例えば、凍結インプットサンプルまたは新鮮なインプットサンプルを用意し、
ii）適宜、インプットサンプルが凍結インプットサンプルである場合、凍結インプットサンプルを融解させて融解サンプルを生成し、
iii）１）融解インプットサンプルであってもよいインプットサンプルに対して水簸を実施することまたは
２）イオジキサノールを含む媒体、例えば、６０％イオジキサノール水溶液、例えばＯｐｔｉｐｒｅｐ媒体であって／あるか、フィコールより高い密度（例えば、１.０７７ｇ／ｍｌより高い、例えば約１.３２ｇ／ｍｌ）を有する媒体を使用して、密度遠心分離工程を実施すること
を含む濃縮工程を実施し、
iv）選択が、陽性選択、例えばＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択または陰性選択、例えばＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋もしくはＣＤ１４＋細胞の陰性選択である、選択工程を実施すること
を含み、それによって、ＣＡＲの発現に好適である免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを生成する方法を特徴とする。
【００５１】
別の態様において、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を作製する方法であって、
ｉ）免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプル、例えば、凍結インプットサンプルまたは新鮮なインプットサンプルを用意し、
ii）水簸または密度遠心分離（例えば、フィコールもしくはＯｐｔｉｐｒｅｐ媒体を使用する）を実施することを含む濃縮工程を実施し、
iii）選択が、陽性選択、例えばＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択または陰性選択、例えばＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋もしくはＣＤ１４＋細胞の陰性選択である、選択工程を実施すること
を包含し、それによって、ＣＡＲの発現に好適である免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを生成する方法を特徴とする。一実施形態において、選択工程は、流動条件下で、例えば、フロースルーデバイスを使用することにより、行われる。
【００５２】
ここに記載する方法または組成物いずれかについてのさらなる特徴または実施形態は、以下の１以上を包含する。
【００５３】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態のいずれかにおけるインプットサンプルは、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含む、対象からの生体サンプルである。ある実施形態において、インプットサンプルは、血液サンプル、例えば、全血サンプルである。ある実施形態において、インプットサンプルは、アフェレーシスサンプル、例えば、白血球アフェレーシスサンプルである。一実施形態において、インプットサンプルは、対象から得た新鮮なサンプルであって、対象から得てから１日、２日、５日または７日以内に、ここに記載する方法のいずれかを使用して処理される新鮮なサンプルである。一実施形態において、インプットサンプルは、例えば、−２０℃でもしくは液体窒素で凍結されたまたは毎分１℃の速度で−８０℃に冷凍され、液体窒素貯蔵タンクの気相に保存されている、凍結または凍結保存サンプルである。
【００５４】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％単球（および適宜、４０％、７０％または９５％以下単球）を含む。ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、インプットサンプルは、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％腫瘍細胞、例えばリンパ芽球（および適宜、５０％または９５％以下単球）を含む。ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、インプットサンプルは、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％または２０％未満免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞（および適宜、２０％を超えるＴ細胞）を含む。
【００５５】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％または０.１％未満単球（および適宜、１％または０.１％を超える単球）を含む。ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、アウトプットサンプルは、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、２％、２％、１％、０.５％、０.２％または０.１％未満腫瘍細胞（および適宜、１％または０.１％を超える腫瘍細胞）を含む。ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、アウトプットサンプルは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９.５％、９９.８％または９９.９％免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞（および適宜、６０％または９５％以下Ｔ細胞）を含む。
【００５６】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、アウトプットサンプルは、インプットサンプルと比較して百分率５０％、４５％、４０％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、２％、２％または１％未満の単球を含む。ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、アウトプットサンプルは、インプットサンプルと比較して百分率５０％、４５％、４０％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、２％、２％または１％未満の腫瘍細胞を含む。ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、アウトプットサンプルは、インプットサンプルと比較して百分率少なくとも５０％、４５％、４０％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、２％、２％または１％の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を含む。
【００５７】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、方法は、ＣＡＲをコードする核酸をアウトプットサンプル中の免疫エフェクター細胞の１以上に、例えば形質導入によって、導入することをさらに含む。ＣＡＲをコードする核酸を導入する他の方法は、ここに記載する。
【００５８】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、ＣＡＲは、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、例えば一次シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。
【００５９】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、方法は、形質導入効率をアッセイする工程をさらに含む。ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、形質導入は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％の形質導入効率をもたらす。
【００６０】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、方法は、デキストロースおよび／または塩化ナトリウムを含む緩衝液、例えばＤ５媒体を用いて、例えばＣＳ５＋装置を使用して、インプットサンプルに対する洗浄工程を実施することをさらに含む。
【００６１】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ヒト免疫エフェクター細胞である。
【００６２】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、アウトプットサンプルは、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、アウトプットサンプルは、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。
【００６３】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、インプットサンプルは、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原、例えばＣＤ１９に関連する疾患を有する患者からのものであり、前記疾患は、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患または脊髄形成異常、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態などの前がん状態から選択されるか、あるいはここに記載する腫瘍抗原の発現に関連する非がん関連の徴候である。一実施形態において、疾患は、ここに記載するがん、例えば、ここに記載する標的に関連するとここに記載するがんである。一実施形態において、血液がんは、白血病である。一実施形態において、がんは、これらに限定されないがＢ細胞急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を包含する１種または複数の急性白血病；これらに限定されないが慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を包含する１種または複数の慢性白血病；これらに限定されないが、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性のリンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞の新生物、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ならびに「前白血病状態」を包含する追加の血液がんまたは血液学的状態からなる群より選択され、これらは、骨髄の血液細胞の無効な産生（または異形成）を併せ持つ血液学的な状態の多様な集合体であり、ここに記載する腫瘍抗原の発現に関連する疾患としては、これらに限定されないが、ここに記載する腫瘍抗原を発現する非定型的および／または非典型的ながん、悪性腫瘍、前がん状態または増殖性疾患、ならびにそれらのあらゆる組合せが挙げられる。別の実施形態において、ここに記載する腫瘍抗原に関連する疾患は、固形腫瘍、例えば、ここに記載する固形腫瘍、例えば、前立腺、結腸直腸、膵臓、子宮頸、胃、卵巣、頭部または肺がんである。
【００６４】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、インプットサンプルは、これらに限定されないが、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を包含する、１種または複数の急性白血病；これらに限定されないが、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を包含する、１種または複数の慢性白血病；これらに限定されないが、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリーセル白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性のリンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞の新生物、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、前白血病状態、非定型的および／または非典型的ながん、悪性腫瘍、前がん状態もしくは増殖性疾患を包含する、追加の血液がんもしくは血液学的状態、ならびにそれらのあらゆる組合せからなる群から選択されるがんを有する患者からのものである。
【００６５】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、インプットサンプルは、ＡＬＬを有する患者からのものである。
【００６６】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、方法は、アウトプットサンプル中の細胞上の１以上の細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２５またはＣＤ１４をアッセイする工程をさらに含む。
【００６７】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、方法は、免疫エフェクター細胞の増殖を刺激する、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤、ならびに／またはＴ細胞の表面の共刺激分子を刺激するリガンド、例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を用いて、アウトプットサンプルを刺激することをさらに含む。
【００６８】
ここに記載する方法のいずれかについての実施形態において、方法は、ＣＡＲをコードする核酸を、例えば形質導入、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションにより、導入することをさらに含む。
【００６９】
別の態様において、本開示は、本明細書で開示される方法、例えば、上で開示した方法によって生成される反応混合物を特徴とする。
【００７０】
別の態様において、本開示は、少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％Ｔ細胞と、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満単球とを含む反応混合物であって、前記反応混合物中の細胞の総数が合計１００％である、反応混合物を特徴とする。一実施形態において、反応混合物は、合計少なくとも１×１０６個、２×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、２×１０７個、５×１０７個、１×１０８個、２×１０８個または５×１０８個の細胞を含む。一実施形態において、反応混合物は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満Ｂ細胞を含む。一実施形態において、反応混合物は、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満がん細胞、例えばリンパ芽球を含む。
【００７１】
ここに記載する反応混合物のいずれかにおいて、Ｔ細胞の１以上は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲを発現する。
【００７２】
ここに記載する反応混合物のいずれかにおいて、反応混合物は、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、Ｔ細胞内またはＴ細胞外に配置されている核酸をさらに含む。
【００７３】
以下で好適な方法および材料を記載するが、本発明の実施または試験において、本明細書で記載したものに類似したまたは同等な方法および材料を使用することができる。本明細書の中で言及される全ての公報、特許出願、特許および他の参考文献（例えば、配列データベース参照番号）は、参照によりそれら全体が組み入れられる。例えば、本明細書において、例えば本明細書のいずれかの表の中で参照される全てのＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉｇｅｎｅおよびＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により組み入れられる。特に他の明記がない限り、本明細書に明記される配列受託番号は、本明細書におけるあらゆる表中のものを含めて、２０１５年１２月２８日現在のデータベースエントリーを指す。１つの遺伝子またはタンパク質について複数の配列受託番号が参照用に記載されている場合、それらの配列変異体の全てが包含される。
【００７４】
加えて、材料、方法および実施例は単なる例示にすぎず、限定することを意図しない。見出し、小見出しまたは番号付けもしくは文字で分類された要素、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）などは、単に読解しやすくするために示されたにすぎない。この文書における見出しまたは番号付けもしくは文字で分類された要素の使用は、工程または要素をアルファベット順に実行することまたは工程または要素が必ずしも互いに不連続であることを必要としない。本発明の他の特色、目的および利点は、記載および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであると予想される。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１Ａ】図１Ａは、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールを伴う細胞処理システムの模式図である。
【００７６】
【図１Ｂ】図１Ｂは、並列に複数のフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールを伴う細胞処理システムの模式図である。
【００７７】
【図１Ｃ】図１Ｃは、直列に複数のフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールを伴う細胞処理システムの模式図である。
【００７８】
【図１Ｄ】図１Ｄは、リターンループを伴う細胞処理システムの模式図である。
【００７９】
【図１Ｅ】図１Ｅは、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールに別々に接続されている細胞懸濁モジュールと緩衝モジュールとを伴う細胞処理システムの模式図である。
【００８０】
【図１Ｆ】図１Ｆは、回転膜脱ビーズ化モジュールを備えている細胞処理システムの模式図である。
【００８１】
【図１Ｇ】図１Ｇは、複数のフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールと複数の回転膜脱ビーズ化モジュールとを備えている細胞処理システムの模式図である。
【００８２】
【図１Ｈ】図１Ｈは、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールを伴う細胞処理システムの別の模式図である。
【００８３】
【図２Ａ】図２Ａは、ｘ配向の磁石構成でのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの横断面模式図である。
【００８４】
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの半透明３次元模式図である。
【００８５】
【図３】図３は、膜およびサブ膜流体注入ポートを有するフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの側面縦断面模式図である。
【００８６】
【図４Ａ】図４Ａは、ゼロ勾配構成でのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの横断面模式図である。
【００８７】
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの半透明３次元模式図である。
【００８８】
【図４Ｃ】図４Ｃは、ゼロ勾配フィルターを作出するためのゼロ勾配構成でのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの上面縦断面模式図である。
【００８９】
【図４Ｄ】図４Ｄは、ゼロ勾配フィルターを作出するための複数のゼロ勾配構成でのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの上面縦断面模式図である。
【００９０】
【図５Ａ】図５Ａは、回転膜脱ビーズ化モジュールの縦断面模式図である。
【００９１】
【図５Ｂ】図５Ｂは、第１の磁石構成を有する回転膜脱ビーズ化モジュールの横断面模式図である。
【００９２】
【図５Ｃ】図５Ｃは、第２の磁石構成を有する回転膜脱ビーズ化モジュールの横断面模式図である。
【００９３】
【図６】図６は、細胞に対する流体力および磁力の図である。
【００９４】
【図７】図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、磁気分離中の細胞が存在する図２Ｂのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの図である。
【００９５】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、磁気脱ビーズ化中の細胞が存在する図２Ｂのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの図である。
【００９６】
【図９】図９は、図２Ａおよび２Ｂのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールを使用する脱ビーズ化の結果と、従来のストップフローモジュールを使用する脱ビーズ化の結果とを比較するグラフである（ボックスは４分位値および中央値を表す）。
【００９７】
【図１０Ａ】図１０Ａは、モジュール入口付近（左）およびモジュール出口付近（右）に常磁性粒子結合細胞が存在するフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの上面縦ｘ−ｙ断面模式図である。
【００９８】
【図１０Ｂ】図１０は、モジュール入口付近（左）およびモジュール出口付近（右）に常磁性粒子結合細胞が存在するフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの側面縦断面模式図である。
【００９９】
【図１１】図１１は、常磁性粒子結合細胞および非結合細胞の磁気分離中の図４Ａのものに類似しているフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの図である。
【０１００】
【図１２】図１２は、常磁性粒子結合細胞および非結合細胞の磁気分離中の細胞が存在する図４Ｃのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの図である。
【０１０１】
【図１３】図１３は、脱ビーズ化された非結合細胞からの常磁性粒子の磁気分離中の細胞が存在する図４Ｃのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの図である。
【０１０２】
【図１４】図１４は、脱ビーズ化中の細胞が存在する図５の回転膜脱ビーズ化モジュールの図である。
【０１０３】
【図１５】図１５Ａおよび図１５Ｂは、Ｓｅｐａｘ  ＳｍａｒｔＷａｓｈおよび改変培地（図１５Ａ）またはＤ５１／２ＮＳ水溶液（図１５Ｂ）への再懸濁後の細胞を示す写真である。
【０１０４】
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、異なる洗浄プロトコール後の細胞回収率を比較するグラフである。図１６Ａは、ＣＳ５＋洗浄手順およびＳｅｐａｘ  ＳｍａｒｔＷａｓｈ手順後の細胞回収率の比較を示すものであり、ここでの両方の手順は、Ｄ５１／２ＮＳ水溶液中で行った。図１６Ｂは、Ｄ５１／２ＮＳ水溶液中の細胞と比較した改変培地中の細胞についてのＣＳ５洗浄後および２時間インキュベーション後の細胞回収率の比較を示す。
【０１０５】
【図１７】図１７は、新規ＯｐｔｉＰｒｅｐプロセスと比較したプロセスＢにおける工程の比較を示す図である。
【０１０６】
【図１８】図１８は、Ｓｅｐａｘ  ２  ＮｅａｔＣｅｌｌバッグおよび配管キットの仕組みを示す概略図である。
【０１０７】
【図１９】図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄおよび１９Ｅは、プロセスＢにより生成された生成物（フィコール生成物を使用する密度勾配遠心分離）または新規ＯｐｒｉＰｒｅｘ利用Ｓｅｐａｘ法により生成された生成物（ＯｐｔｉＰｒｅｐ生成物）の表現型比較を示すグラフである。図１９Ａは、Ｔ細胞収率を示す。図１９Ｂは、Ｂ細胞収率を示す。図１９Ｃは、単球収率を示す。図１９Ｄは、最終生成物の表現型ごとの相対比較を示す。図１９Ｅは、最終生成物の表現型ごとの絶対比較を示す。
【０１０８】
【図２０】図２０は、最適化陽性選択（ＦＡＳＴ）用の滅菌バッグキットを示す概略図である。
【０１０９】
【図２１】図２１は、最適化陽性選択（ＦＡＳＴ）用の改良された蓋を示す概略図である。
【０１１０】
【図２２】図２２は、今までの臨床ロットの生細胞数を示すグラフである。黒線は、プロセスＢによって処理したロットを示す。色付きの線は、ＦＡＳＴ法によって処理したロットを示す。
【０１１１】
【図２３】図２３Ａ、２３Ｂおよび２３Ｃは、実施例５の実験１についての詳細を示す。図２３Ａは、結果の模式的全体像および概要である。図２３Ｂは、実験アーム１についての一連のＦＡＳＴ前および後濃縮プロットである。図２３Ｃは、実験アーム２についての一連のＦＡＳＴ前および後濃縮プロットである。
【０１１２】
【図２４】図２４Ａ、２４Ｂおよび２４Ｃは、実施例５の実験２についての詳細を示す。図２４Ａは、結果の図式的外観および概要である。図２４Ｂは、実験アーム１についての一連のＦＡＳＴ前および後濃縮プロットである。図２４Ｃは、実験アーム２についての一連のＦＡＳＴ前および後濃縮プロットである。
【０１１３】
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、実施例５の実験３についての詳細を示す。図２５Ａは、結果の図式的外観および概要である。図２５Ｂは、一連のＦＡＳＴ前および後濃縮プロットである。
【０１１４】
【図２６】図２６Ａおよび２６Ｂは、ＣＤ１９陰性選択の実行からの結果を示す表である。図２６Ａは、健常ドナーおよびＡＬＬ患者からのアフェレーシスサンプルにおけるＣＤ１９＋細胞枯渇の実行可能性を示す。図２６Ｂは、異なる濃縮プロトコール（ＴＲ１４９、ＴＲ１５０およびＴＲ１５１）実行前および後の異なる細胞型、Ｔ細胞、単球およびＣＤ１９  Ｂ細胞の分布を示す。
【０１１５】
【図２７】図２７は、プロセスＢについての工程を示す概略図である。「ＡＰＨサンプル」は、新鮮であってもよくまたは凍結されていてもよい、インプットアフェレーシスサンプルを表す。「ＣＳ５」は、例えば、ＣＳ５＋装置などの細胞洗浄または細胞処理システムを使用する、洗浄工程を表す。「Ｓｅｐａｘ」は、フィコールを使用する密度勾配分離を表す。「陽性選択」は、例えばＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用する、Ｄｙｎａｂｅａｄｓベースの「静的」分離を表す。
【０１１６】
【図２８】図２８は、現行の「静的」磁気分離（左）および「動的」磁気分離、例えば流動条件下でのもの（右）を示す概略図である。「選択」（中央）の概略図は、その標的分子と会合している磁気分離剤の分離であって、標的分子が磁気要素に誘引されることによって望ましくない分子から標的分子が分離される分離を示す。
【０１１７】
【図２９】図２９Ａ、２９Ｂおよび２９Ｃは、ＣＤ１９（図２９Ａ）、ＰＭＡ（図２９Ｂ）およびメソセリン（図２９Ｃ）での刺激後のＩＦＮγ放出アッセイの結果を示す。試験した免疫エフェクター細胞サンプルは、Ｘ軸に沿って列挙されている異なるプロトコールを使用して調製した。
【０１１８】
【図３０】図３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃは、細胞毒性アッセイの結果を示す。図３０Ａおよび３０Ｂは、Ｘ軸に沿って列挙されている異なるプロトコールを使用して調製した各免疫エフェクターサンプルについての比溶解の百分率を示す。図３０Ｃは、図３０Ａおよび３０Ｂから得られた細胞毒性結果をＥＣ５０単位の逆数として示す。
【０１１９】
【図３１】は、非フロースルー脱ビーズ化プロセスおよびフロースルー脱ビーズ化プロセスについての回収収率の、インプット細胞数の関数としてのグラフである。
【０１２０】
【図３２】は、非フロースルー脱ビーズ化プロセスおよびフロースルー脱ビーズ化プロセスについての回収収率の、インプット細胞数の関数としての、ビン分割されたグラフ（binned graph）である。
【発明を実施するための形態】
【０１２１】
定義
特に断らない限り、本明細書において使用される全ての専門用語や科学用語は、本発明が関連する当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１２２】
用語「１つの（a）」および「１つの（an）」は、文法上の目的語である物品が１つであるかまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つの）であることを指す。一例として、「要素（an element）」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。
【０１２３】
用語「約」は、量、持続時間、などなどの測定可能な値を指す場合、規定された値から、±２０％の変動またはいくつかの場合において±１０％の変動またはいくつかの場合において±５％の変動またはいくつかの場合において±１％の変動またはいくつかの場合において±０.１％の変動を包含することを意味しており、これはなぜなら、このような変動は開示された方法を行うのに適切であるためである。
【０１２４】
用語「キメラ抗原受容体」またはその代わりに「ＣＡＲ」は、免疫エフェクター細胞中にあるとき、標的細胞、典型的にはがん細胞への特異性および細胞内シグナルの生成をその細胞にもたらすポリペプチドのセット、最も簡単な実施形態では典型的には２つのポリペプチドのセットを指す。一部の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、下記で定義されるような刺激分子および／または共刺激分子由来の機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞質内シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称される）とを少なくとも含む。一部の実施形態において、ポリペプチドのセットは、同じポリペプチド鎖中にある（例えば、キメラ融合タンパク質を含む）。一部の実施形態において、ポリペプチドのセットは、互いに連続しておらず、例えば、異なるポリペプチド鎖中にある。一部の実施形態において、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在下でポリペプチドを互いにカップリングすることができ、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインにカップリングすることができる、二量体化スイッチを包含する。一実施形態において、ＣＡＲの刺激分子は、Ｔ細胞受容体複合体と会合しているゼータ鎖である。一態様において、細胞質内のシグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達ドメイン）を含む。一実施形態において、細胞質内シグナル伝達ドメインは、以下で定義されるような少なくとも１つの共刺激分子の１以上の機能的なシグナル伝達ドメインをさらに含む。一実施形態において、共刺激分子は、ここに記載する共刺激分子、例えば、４−１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＩＣＯＳおよび／またはＣＤ２８である。一実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、刺激分子の機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激分子の機能的なシグナル伝達ドメインおよび刺激分子の機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１以上の共刺激分子の２つの機能的なシグナル伝達ドメインおよび刺激分子由来の機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１以上の共刺激分子の少なくとも２つの機能的なシグナル伝達ドメインおよび刺激分子の機能的なシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ融合タンパク質を含む。一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）に任意のリーダー配列を含む。一実施形態において、ＣＡＲは、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端におけるリーダー配列をさらに含み、ここでリーダー配列は、細胞内プロセシングおよび細胞膜へのＣＡＲの局在化の間に、抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）から切断されてもよい。
【０１２５】
ここに記載するものなどの、特異的腫瘍抗原Ｘを標的とする抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖまたはＴＣＲ）を含むＣＡＲは、ＸＣＡＲとも称される。例えば、ＣＤ１９を標的とする抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、ＣＤ１９ＣＡＲと称される。
【０１２６】
用語「シグナル伝達ドメイン」は、第２メッセンジャーを生成したりまたはこのようなメッセンジャーに応答してエフェクターとして機能化したりすることにより規定のシグナル伝達経路を介して細胞活性を調節するために、細胞内の情報を伝えることによって作用するタンパク質の機能的な部分を指す。
【０１２７】
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、抗原と特異的に結合する免疫グロブリン分子由来のタンパク質またはポリペプチド配列を指す。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナルの、複数もしくは単一の鎖のまたはインタクト免疫グロブリンであってもよく、自然源由来でもよいしまたは組換え源由来でもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であってもよい。
【０１２８】
用語「抗体フラグメント」は、抗原のエピトープと（例えば、結合、立体障害、安定化／不安定化、空間分布によって）特異的に相互作用する能力を保持する、抗体の少なくとも一部を指す。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ抗体フラグメント、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；線形抗体；単一ドメイン抗体、例えばｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）；ラクダ化ＶＨＨドメイン；ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントなどの抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体；および抗体の単離されたＣＤＲまたは他のエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。抗原結合フラグメントはまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖに取り込まれていてもよい（例えば、Hollinger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136, 2005を参照）。抗原結合フラグメントは、フィブロネクチンIII型（Ｆｎ３）などのポリペプチドをベースとした足場にグラフトすることもできる（フィブロネクチンポリペプチドのミニボディを記載している米国特許第６,７０３,１９９号を参照）。
【０１２９】
用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントと重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体フラグメントとを含む融合タンパク質であって、軽鎖および重鎖可変領域が、例えば合成リンカー、例えば短いフレキシブルなポリペプチドリンカーを介して連続的に連結されており、単一鎖のポリペプチドとして発現することができ、さらにｓｃＦｖが、その元となったインタクト抗体の特異性を保持している、上記融合タンパク質を指す。特段の規定がなければ、ｓｃＦｖは、本明細書で使用される場合、ＶＬおよびＶＨ可変領域をいずれの順番で有していてもよく、例えばポリペプチドのＮ末端およびＣ末端の終端に関して、ｓｃＦｖは、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含んでいてもよいしまたはＶＨ−リンカー−ＶＬを含んでいてもよい。
【０１３０】
抗体またはその抗体フラグメントを含むＣＡＲの一部は、抗原結合ドメインが、例えば単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）およびヒト化抗体を含む、連続するポリペプチド鎖の一部として発現される、様々な形態で存在し得る（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。一実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる実施形態において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、用語「結合ドメイン」または「抗体分子」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質、例えば免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントを指す。用語「結合ドメイン」または「抗体分子」は、抗体および抗体フラグメントを包含する。ある実施形態において、抗体分子は、多重特異性抗体分子であり、例えば、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、前記複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列の第一の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第一のエピトープへの結合特異性を有し、前記複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列の第二の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第二のエピトープへの結合特異性を有する。一実施形態において、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する第一の免疫グロブリンの可変ドメイン配列および第二のエピトープに結合特異性を有する第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列を特徴とする。用語「抗体重鎖」は、それらの天然に存在するコンフォメーションの抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち大きい方を指し、通常これが抗体が属するクラスを決定する。
【０１３２】
抗体またはそれらの抗体フラグメントを含む本発明のＣＡＲの一部は、様々な形態で存在していてもよく、その場合、抗原結合ドメインは、例えば、単一ドメイン抗体フラグメント（ｓｄＡｂ）、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、二重特異性抗体などの連続的ポリペプチド鎖の一部として発現される（Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426）。一態様において、本発明のＣＡＲ組成物の抗原結合ドメインは、抗体フラグメントを含む。さらなる態様において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖを含む抗体フラグメントを含む。
【０１３３】
用語「抗体重鎖」は、それらの天然に存在するコンフォメーションの抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち大きい方を指し、通常これが抗体が属するクラスを決定する。
【０１３４】
用語「抗体軽鎖」は、それらの天然に存在するコンフォメーションの抗体分子中に存在する２つのタイプのポリペプチド鎖のうち小さい方を指す。カッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【０１３５】
用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、本明細書で使用される場合、抗原特異性と結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸配列を指す。例えば、一般的に、各重鎖可変領域中に３つのＣＤＲ（例えば、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）および各軽鎖可変領域中に３つのＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）がある。所与のＣＤＲの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）によって記載されたものまたはそれらの組合せなどの多数の周知のスキームのいずれかを使用して決定することができる。Ｋａｂａｔ番号付けスキームによれば、一部の実施形態において、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）におけるＣＤＲのアミノ酸残基は、３１〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）におけるＣＤＲのアミノ酸残基は、２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームによれば、一部の実施形態において、ＶＨにおけるＣＤＲのアミノ酸は、２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５２〜５６（ＨＣＤＲ２）および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と番号付けされ、ＶＬにおけるＣＤＲのアミノ酸残基は、２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と番号付けされる。ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの組合せでは、一部の実施形態において、ＣＤＲは、ＫａｂａｔのＣＤＲ、ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲまたはその両方の一部であるアミノ酸残基に相当する。例えば、一部の実施形態において、ＣＤＲは、ＶＨ、例えば哺乳動物のＶＨ、例えばヒトＶＨにおいて、アミノ酸残基２６〜３５（ＨＣＤＲ１）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）；ならびにＶＬ、例えば哺乳動物のＶＬ、例えばヒトＶＬにおいて、アミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）に相当する。
【０１３６】
用語「組換え抗体」は、例えばバクテリオファージまたは酵母発現系によって発現される抗体などの、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を指す。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子（このＤＮＡ分子は抗体タンパク質を発現する）または抗体を指定するアミノ酸配列の合成によって生成された抗体も意味すると解釈されるものとし、この場合、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当分野で利用可能であり周知の組換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られたものである。
【０１３７】
用語「抗原」または「Ａｇ」は、免疫反応を惹起する分子を指す。この免疫反応は、抗体産生または特異的な免疫担当細胞の活性化のいずれかまたはその両方を含み得る。当業者であれば、実質的に全てのタンパク質またはペプチドを包含するあらゆる高分子が抗原として役立つ可能性があることを理解する。さらに抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡ由来であってもよい。当業者であれば、免疫反応を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、結果的に本明細書において抗原という用語が使用される場合と同様の「抗原」をコードすることを理解する。さらに当業者であれば、抗原は、必ずしも遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされるわけではないことを理解する。本発明は、これらに限定されないが、１つより多くの遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用を包含すること、さらに望ましい免疫反応を惹起するポリペプチドがコードされるように、これらのヌクレオチド配列は様々な組合せで配置されることが容易に理解される。さらに当業者であれば、抗原は、必ずしも「遺伝子」によってコードされていなくてもよいことを理解する。抗原は、生成されるか合成されてもよくまたは生体サンプル由来であってもよくまたはポリペプチド以外にも高分子であってもよいことが容易に理解される。このような生体サンプルとしては、これらに限定されないが、組織サンプル、腫瘍サンプル、細胞または他の生物学的成分を含む流体を挙げることができる。
【０１３８】
用語「自己」は、後でそれが再導入されることになる個体と同じ個体由来のあらゆる材料を指す。
【０１３９】
用語「同種異系」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物由来のあらゆる材料を指す。２以上の個体は、１以上の遺伝子座における遺伝子が同一ではない場合、互いに同種異系といわれる。いくつかの態様において、同じ種の個体からの同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分な程度、遺伝学的に異なっていてもよい。
【０１４０】
用語「異種」は、異なる種の動物由来のあらゆる材料を指す。
【０１４１】
用語「がん」は、異常な細胞の制御不能な成長を特徴とする疾患を指す。がん細胞は、局所的にまたは血流およびリンパ系を介して体の他の部分に蔓延する可能性がある。様々ながんの例が本明細書で記載されており、これらに限定されないが、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、皮膚がん、膵臓がん、結腸直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がんなどが挙げられる。用語「腫瘍」および「がん」は、本明細書において同義的に使用され、例えば、どちらの用語も、固体および液性、例えば、びまん性または循環性の腫瘍を包含する。用語「がん」または「腫瘍」は、本明細書で使用される場合、前がん性の、同様に悪性のがんおよび腫瘍を包含する。
【０１４２】
「由来の」は、この用語が本明細書で使用される場合、第一の分子と第二の分子との関係を示す。これは一般的に、第一の分子と第二の分子との構造的な類似性を指し、第二の分子由来の第一の分子におけるプロセスまたは源の限定を意味したりまたは包含したりしない。例えば、ＣＤ３ゼータ分子由来の細胞内シグナル伝達ドメインのケースにおいて、細胞内シグナル伝達ドメインは、必要な機能、すなわち、適切な条件下でシグナルを生成する能力を有するのに十分なＣＤ３ゼータ構造を保持する。これは、細胞内シグナル伝達ドメインを生産する特定のプロセスへの限定を意味したりまたは包含したりすることはなく、例えば、細胞内シグナル伝達ドメインを提供するために、ＣＤ３ゼータ配列から開始して不要な配列を欠失させたりまたは突然変異を付与したりして、細胞内シグナル伝達ドメインを得なければならないことを意味しない。
【０１４３】
成句「ここに記載するような腫瘍抗原の発現に関連する疾患」は、例えば、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患または脊髄形成異常、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態などの前がん状態を包含する、ここに記載するような腫瘍抗原の発現に関連する疾患またはここに記載するような腫瘍抗原を発現する細胞に関連する状態；あるいはここに記載するような腫瘍抗原を発現する細胞に関連する非がん関連の徴候を包含するが、これらに限定されない。一実施形態において、ここに記載するような腫瘍抗原の発現に関連するがんは、血液がんである。一実施形態において、ここに記載するような腫瘍抗原の発現に関連するがんは、固形がんである。さらに、ここに記載するような腫瘍抗原の発現に関連する疾患は、これらに限定されないが、例えば、ここに記載するような腫瘍抗原の発現に関連する非定型的および／または非典型的ながん、悪性腫瘍、前がん状態または増殖性疾患を包含する。ここに記載するような腫瘍抗原の発現に関連する非がん関連の徴候は、これらに限定されないが、例えば、自己免疫疾患（例えば、狼瘡）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息）および移植を包含する。一部の実施形態において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するかまたはいずれかの時点で発現していた。ある実施形態において、腫瘍抗原発現細胞は、腫瘍抗原タンパク質（例えば、野生型または突然変異型）を産生するが、その腫瘍抗原タンパク質は、正常レベルで存在することもありまたは低下したレベルで存在することもある。ある実施形態において、腫瘍抗原発現細胞は、ある時点で検出可能なレベルの腫瘍抗原タンパク質を産生したが、その後、実質的に検出可能な腫瘍抗原タンパク質を産生しなかった。
【０１４４】
成句「ＣＤ１９の発現に関連する疾患」は、例えば、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患または脊髄形成異常、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態などの前がん状態を包含する、ＣＤ１９の発現に関連する疾患またはＣＤ１９を発現する細胞に関連する状態；あるいはＣＤ１９を発現する細胞に関連する非がん関連の徴候を包含するが、これらに限定されない。一態様において、ＣＤ１９の発現に関連するがんは、血液がんである。一態様において、血液がんは、白血病またはリンパ腫である。一態様において、ＣＤ１９発現に関連するがんは、例えば、これらに限定されないが、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）などの１以上の急性白血病；これらに限定されないが、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などの１種または複数の慢性白血病などのがんおよび悪性腫瘍を包含するが、これらに限定されない。ＣＤ１９の発現に関連する追加のがんまたは血液学的状態は、これらに限定されないが、例えば、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、小細胞型または大細胞型濾胞性リンパ腫、悪性のリンパ増殖性状態、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、脊髄形成異常および骨髄異形成症候群、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様樹状細胞の新生物、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、骨髄増殖性新生物；組織球性障害（例えば、マスト細胞障害または芽球性形質細胞様樹状細胞の新生物）；マスト細胞障害、例えば、全身性肥満細胞症またはマスト細胞白血病；Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、形質細胞性骨髄腫および骨髄の血液細胞の無効な産生（または異形成）を併せ持つ血液学的な状態の多様な集合体である「前白血病状態」、などを含む。さらに、ＣＤ１９発現の発現に関連する疾患としては、例えば、ＣＤ１９の発現に関連する非定型的および／または非典型的ながん、悪性腫瘍、前がん状態または増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。ＣＤ１９の発現に関連する非がん関連の徴候としては、例えば、自己免疫疾患（例えば、狼瘡）、炎症性障害（アレルギーおよび喘息）および移植が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、腫瘍抗原を発現する細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するかまたはいずれかの時点で発現していた。ある実施形態において、腫瘍抗原を発現する細胞は、腫瘍抗原タンパク質（例えば、野生型または突然変異）を産生し、その腫瘍抗原タンパク質が正常なレベルで存在することもありまたは低下したレベルで存在することもある。ある実施形態において、腫瘍抗原を発現する細胞は、ある時点で検出可能なレベルの腫瘍抗原タンパク質を産生したが、その後は実質的に検出可能な腫瘍抗原タンパク質を産生しなかった。他の実施形態において、疾患は、ＣＤ１９陰性のがん、例えば、ＣＤ１９陰性再発がんである。一部の実施形態において、腫瘍抗原（例えばＣＤ１９）発現細胞は、腫瘍抗原をコードするｍＲＮＡを発現するかまたはいずれかの時点で発現していた。ある実施形態において、腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１９）発現細胞は、腫瘍抗原タンパク質（例えば、野生型または突然変異型）を産生するが、その腫瘍抗原タンパク質は、正常レベルで存在することもありまたは低下したレベルで存在することもある。ある実施形態において、腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１９）発現細胞は、ある時点で検出可能なレベルの腫瘍抗原タンパク質を産生したが、その後、実質的に検出可能な腫瘍抗原タンパク質を産生しなかった。
【０１４５】
成句「Ｂ細胞抗原の発現に関連する疾患」は、例えば、がんもしくは悪性腫瘍などの増殖性疾患または脊髄形成異常、骨髄異形成症候群もしくは前白血病状態などの前がん状態を包含する、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２もしくはＲＯＲ１の１つもしくは複数の発現に関連する疾患またはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２もしくはＲＯＲ１の１つもしくは複数を発現するか、もしくはいずれかの時点で発現していた、細胞に関連する状態；あるいはＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２もしくはＲＯＲ１の１つもしくは複数を発現する細胞に関連する非がん関連の徴候を包含するが、これらに限定されない。誤解を避けるために言えば、Ｂ細胞抗原の発現に関連する疾患は、例えば、抗原発現が、例えばＢ細胞抗原を標的とする分子、例えばＣＡＲを標的とするＢ細胞での処置のため、下方調節されているために、現時点ではＢ細胞抗原を発現しないが、ある時点でこの抗原を発現していた細胞に関連する状態を包含し得る。成句「Ｂ細胞抗原の発現に関連する疾患」は、ここに記載するような、ＣＤ１９の発現に関連する疾患を包含する。実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、Ｂ細胞抗原に関連する疾患を処置するために使用される。実施形態において、本明細書における方法により産生されるＣＡＲは、Ｂ細胞抗原を標的とする抗原結合ドメインを含む。
【０１４６】
用語「再発」は、本明細書で使用される場合、例えば、治療、例えばがん治療に伴う以前の処置後の、初期応答（例えば、完全応答または部分応答）期間後の疾患（例えば、がん）の再出現を指す。初期応答期間は、がん細胞のレベルが、ある特定の閾値未満、例えば、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％未満に低下することを含み得る。再出現は、がん細胞のレベルが、ある特定の閾値より高く、例えば、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％より高く上昇することを含み得る。例えば、例えばＢ−ＡＬＬの状況において、再出現は、例えば、完全応答後の血液、骨髄（＞５％）またはいずれかの髄外部位における芽球の再出現を含み得る。この文脈での完全応答は、＜５％ＢＭ芽球を含み得る。より一般的には、ある実施形態において、応答（例えば、完全応答または部分応答）は、検出可能なＭＲＤの非存在（最小の残留疾患）を含み得る。ある実施形態において、初期応答期間は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日もしくは６日、少なくとも１週間、２週間、３もしくは４週間、少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、６カ月、８カ月、１０カ月もしくは１２カ月または少なくとも１年、２年、３年、４年もしくは５年続く。
【０１４７】
「難治性」は、本明細書で使用される場合、疾患、例えば処置に応答しないがんを指す。実施形態において、難治性がんは、処置の前または開始時に、処置に対して耐性である可能性がある。他の実施形態において、難治性がんは、処置中に耐性になる可能性がある。難治性がんはまた、耐性がんとも呼ばれる。
【０１４８】
用語「保存的配列改変」は、そのアミノ酸配列を含有する抗体または抗体フラグメントの結合特徴に有意に影響を与えたりまたは変更したりしないアミノ酸改変を指す。このような保存的改変としては、アミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。改変は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発などの当分野で公知の標準的な技術によって本発明の抗体または抗体フラグメントに導入することができる。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。したがって、ここに記載するＣＡＲ内の１以上のアミノ酸残基が、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置き換えられていてもよく、変更されたＣＡＲは、ここに記載する機能アッセイを使用してテストすることができる。
【０１４９】
用語「刺激」は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体またはＣＡＲ）とその同起源のリガンド（またはＣＡＲの場合は腫瘍抗原）との結合により誘導される一次応答を指し、それによって、これらに限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達またはＣＡＲの適切なＮＫ受容体もしくはシグナル伝達ドメインを介したシグナル伝達などの、シグナル伝達事象が媒介される。刺激は、ある特定の分子の変更された発現を媒介することもある。
【０１５０】
用語「刺激分子」は、免疫細胞シグナル伝達経路の少なくとも一部の態様に関して、刺激の形で免疫細胞の活性化を調節する細胞質内シグナル伝達配列をもたらす免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞）によって発現される分子を指す。一態様において、シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドを提示したＭＨＣ分子との結合によって始動する一次シグナルであり、それにより、これらに限定されないが、増殖、活性化、分化、などなどのＴ細胞応答の媒介が起こる。刺激の形態で作用する一次細胞質内シグナル伝達配列（また、「一次シグナル伝達ドメイン」とも称される）は、シグナル伝達モチーフを含有していてもよく、これは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られている。本発明において特定の用途を有する細胞質内シグナル伝達配列を含有するＩＴＡＭの例としては、これらに限定されないが、ＣＤ３ゼータ、共通ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃガンマＲＩＩａ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲ１ｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものが挙げられる。本発明の特定のＣＡＲにおいて、本発明のいずれか１以上のＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内シグナル伝達配列、例えばＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達配列を含む。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号９（突然変異ＣＤ３ゼータ）として提供される配列であるかまたは非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価の残基である。本発明の特定のＣＡＲにおいて、ＣＤ３−ゼータの一次シグナル伝達配列は、配列番号１０（野生型ヒトＣＤ３ゼータ）で提供される配列であるかまたは非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価の残基である。
【０１５１】
用語「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、その表面上に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）と複合体化した外来抗原を提示するアクセサリー細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞、など）などの免疫系細胞を指す。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこれらの複合体を認識する可能性がある。ＡＰＣは抗原をプロセシングし、それらをＴ細胞に提示させる。
【０１５２】
「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、この用語が本明細書において使用される場合、分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを含有する細胞、例えばＣＡＲＴ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成することができる。例えばＣＡＲＴ細胞における、免疫エフェクター機能の例としては、細胞溶解活性およびヘルパー活性、例えばサイトカイン分泌などが挙げられる。実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特殊化した機能を実行させる、タンパク質の部分である。細胞内シグナル伝達ドメイン全体が採用される場合もあるが、多くの場合において鎖全体を使用することは必ずしも必要ではない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分が使用される限りにおいて、このようなトランケートされた部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達しさえすればインタクト鎖の代わりに使用することができる。したがって細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆるトランケートされた部分を包含することを意味する。
【０１５３】
ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。典型的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとしては、一次刺激または抗原依存性刺激に関与する分子由来のものが挙げられる。ある実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含んでいてもよい。典型的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとしては、共刺激シグナルまたは抗原非依存性刺激に関与する分子由来のものが挙げられる。例えば、ＣＡＲＴの場合において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体の細胞質内配列を含んでいてもよいし、共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、補助受容体または共刺激分子からの細胞質内配列を含んでいてもよい。
【０１５４】
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして公知のシグナル伝達モチーフを含んでいてもよい。ＩＴＡＭを含有する一次細胞質内シグナル伝達配列の例としては、これらに限定されないが、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」）、ＦｃεＲＩおよびＣＤ６６ｄ、ＣＤ３２、ＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２由来のものが挙げられる。
【０１５５】
用語「ゼータ」またはその代わりに「ゼータ鎖」、「ＣＤ３−ゼータ」もしくは「ＴＣＲ−ゼータ」は、ＧｅｎＢａｎ受託番号ＢＡＧ３６６６４.１として提供されるタンパク質または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価の残基と定義され、「ゼータ刺激ドメイン」またはその代わりに「ＣＤ３−ゼータ刺激ドメイン」もしくは「ＴＣＲ−ゼータ刺激ドメイン」は、Ｔ細胞の活性化に必要な最初のシグナルを機能的に伝えるのに十分な、ゼータ鎖の細胞質内ドメインからのアミノ酸残基と定義される。一態様において、ゼータの細胞質内ドメインは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＡＧ３６６６４.１の残基５２から１６４またはそれらの機能的なオーソログである非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価の残基を含む。一態様において、「ゼータ刺激ドメイン」または「ＣＤ３−ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号９として提供される配列である。一態様において、「ゼータ刺激ドメイン」または「ＣＤ３−ゼータ刺激ドメイン」は、配列番号１０として提供される配列である。
【０１５６】
用語「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合することにより、これらに限定されないが増殖などのＴ細胞による共刺激応答を媒介する、Ｔ細胞上の同起源の結合パートナーを指す。共刺激分子は、効率的な免疫反応に必要な、抗原受容体以外の細胞表面分子またはそれらのリガンドである。共刺激分子としては、これらに限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが挙げられる。
【０１５７】
共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞内の部分全体、もしくはそれが得られた分子の天然型細胞内シグナル伝達ドメインの全体またはそれらの機能的なフラグメントを含んでいてもよい。
【０１５８】
細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体もしくは天然型細胞内シグナル伝達ドメイン全体またはそれらの機能的なフラグメントを含んでいてもよい。
【０１５９】
用語「４−１ＢＢ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８.２として提供される配列アミノ酸配列を有するＴＮＦＲスーパーファミリーの一員または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価の残基を指し、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ６２４７８.２のアミノ酸残基２１４〜２５５または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価の残基と定義される。一態様において、「４−１ＢＢ共刺激ドメイン」は、配列番号７として提供される配列または非ヒト種、例えばマウス、げっ歯類、サル、類人猿などからの等価の残基である。
【０１６０】
「免疫エフェクター細胞」は、この用語が本明細書において使用される場合、免疫応答、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、肥満細胞、ならびに骨髄系由来の食細胞が挙げられる。
【０１６１】
「免疫エフェクター機能または免疫エフェクター応答」は、この用語が本明細書において使用される場合、例えば、免疫エフェクター細胞の、標的細胞の免疫攻撃を増強または促進する機能または応答を指す。例えば、免疫エフェクター機能または応答は、標的細胞の成長または増殖の殺滅または阻害を促進するＴまたはＮＫ細胞の特性を指す。Ｔ細胞のケースにおいて、一次刺激および副刺激が、免疫エフェクター機能または応答の例である。
【０１６２】
用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊化した機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはサイトカイン分泌などのヘルパー活性であり得る。
【０１６３】
用語「枯渇」または「枯渇させる（こと）」は、本明細書で同義的に使用される場合、プロセス、例えば、選択工程、例えば陰性選択が行われた後のサンプル中の細胞、タンパク質または高分子のレベルまたは量の減少または低下を指す。枯渇は、細胞、タンパク質または高分子の完全な枯渇であってもよくまたは部分的枯渇であってもよい。ある実施形態において、枯渇は、プロセスが行われる前のサンプル中の細胞、タンパク質または高分子のレベルまたは量と比較して、細胞、タンパク質または高分子のレベルまたは量の少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％減少または低下である。
【０１６４】
用語「コードする」は、ヌクレオチド（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の規定の配列またはアミノ酸の規定の配列のいずれかを有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として役立つ、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異的配列の固有の特性およびそれにより生じる生物学的な特性を指す。したがって、細胞または他の生物系中で、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳によりタンパク質が産生される場合、その遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡは、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に示されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖はどちらも、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の生成物をコードすると称することができる。
【０１６５】
特に他の規定がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重型であるヌクレオチド配列や同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列全てを包含する。また、タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という成句は、いくつかの場合においてそのタンパク質をコードするヌクレオチド配列がイントロンを含有し得る程度にイントロンを包含していてもよい。
【０１６６】
用語「内因性」は、生物、細胞、組織または系由来の材料またはそれらの内部で産生されたあらゆる材料を指す。
【０１６７】
用語「外因性」は、生物、細胞、組織または系の外部から導入された材料またはそれらの外部で産生されたあらゆる材料を指す。
【０１６８】
用語「発現」は、プロモーターによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。
【０１６９】
用語「導入ベクター」は、単離された核酸を含み、細胞内部に単離された核酸を送達するのに使用できるものの組成物を指す。多数のベクターが当分野で公知であり、これらに限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスなどが挙げられる。したがって、用語「導入ベクター」は、自律複製型プラスミドまたはウイルスを包含する。この用語はまた、例えばポリリジン化合物、リポソーム、などなどの、細胞への核酸のトランスファーを容易にする非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに包含するとも解釈されるものとする。ウイルス導入ベクターの例としては、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、などが挙げられる。
【０１７０】
用語「発現ベクター」は、発現しようとするヌクレオチド配列に機能するように連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって供給されてもよいしまたはインビトロでの発現系中に供給されてもよい。発現ベクターは、当分野で公知のあらゆるものを包含し、例えば、組換えポリヌクレオチドを取り込んでいる、コスミド、プラスミド（例えば、裸の状態のまたはリポソーム中に含有された）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。
【０１７１】
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属の１つを指す。レンチウイルスは、レトロウイルスのなかでも非分裂細胞に感染することができるという点で独特であり、これらは、宿主細胞のＤＮＡに相当な量の遺伝情報を送達することができることから、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶおよびＦＩＶが、レンチウイルスの全ての例である。
【０１７２】
用語「レンチウイルスベクター」は、レンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターを指し、特に、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)で示されるような自己不活性化レンチウイルスベクターが挙げられる。診療施設で使用される可能性があるレンチウイルスベクターの他の例としては、これらに限定されないが、例えば、Oxford BioMedica製のＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（登録商標）遺伝子送達技術、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ製のＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクター系などが挙げられる。非臨床タイプのレンチウイルスベクターも利用可能であり、当分野で公知であると予想される。
【０１７３】
用語「相同」または「同一性」は、２つの高分子間の、例えば２つの核酸分子間の、例えば２つのＤＮＡ分子もしくは２つのＲＮＡ分子間のまたは２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニットの位置が同じモノマーのサブユニットで占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子それぞれにおける位置がアデニンで占められている場合、それらは、その位置において相同または同一である。２つの配列間の相同性は、マッチした位置または相同な位置の数の一次関数であり、例えば、２つの配列中の位置の半分（例えば、ポリマーの長さが１０個のサブユニット中の５個の位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば、１０個のうち９個）がマッチしているかまたは相同である場合、２つの配列は９０％相同である。
【０１７４】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化された」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント［例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列］である。大抵の場合、ヒト化抗体およびそれらの抗体フラグメントは、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、望ましい特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基で置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエントの抗体または抗体フラグメント）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体／抗体フラグメントは、レシピエント抗体でも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列でも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの改変は、抗体または抗体フラグメントの性能をさらに洗練させて最適化する可能性がある。一般的に、ヒト化抗体またはそれらの抗体フラグメントは、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に相当し、ＦＲ領域の全部のまたはかなりの部分がヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含むと予想される。ヒト化抗体または抗体フラグメントはまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでいてもよい。さらなる詳細に関しては、Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Reichmann et al., Nature, 332: 323-329, 1988; Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596, 1992を参照されたい。
【０１７５】
「完全にヒト」は、分子全体がヒト由来であるかまたは抗体もしくは免疫グロブリンのヒト形態に同一なアミノ酸配列からなる場合の、免疫グロブリン、例えば抗体または抗体フラグメントを指す。
【０１７６】
用語「単離された」は、天然状態から変更されたまたは天然状態から除去されたことを意味する。例えば、生存動物中に自然に存在する核酸またはペプチドは「単離されていない」が、同じ核酸またはペプチドでもその天然状態において共存する材料から部分的または完全に分離されていれば、「単離されている」。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在していてもよいしまたは例えば宿主細胞などの非天然の環境中に存在していてもよい。
【０１７７】
本発明の内容では、以下に示す通常存在する核酸塩基の略語が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」は、シトシンを指し、「Ｇ」は、グアノシンを指し、「Ｔ」は、チミジンを指し、「Ｕ」は、ウリジンを指す。
【０１７８】
用語「機能するように連結した」または「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列とが機能的に連結されて、結果として後者の発現をもたらすことを指す。例えば、第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的な関係で配置される場合、第一の核酸配列は第二の核酸配列と機能するように連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に機能するように連結している。機能するように連結したＤＮＡ配列は、互いに連続していてもよく、例えば２つのタンパク質のコード領域を合体させることが必要な場合、同じリーディングフレーム内にあってもよい。
【０１７９】
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ.ｃ.）、静脈内（ｉ.ｖ.）、筋肉内（ｉ.ｍ.）もしくは胸骨内、腫瘍内注射または点滴技術を包含する。
【０１８０】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）またはそのＤＮＡまたはＲＮＡの組合せおよび一本鎖または二本鎖いずれかの形態のそれらのポリマーを指す。用語「核酸」は、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを包含する。一実施形態において、核酸分子は、合成（例えば、化学的に合成された）核酸分子または組換え核酸分子である。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の方式で代謝される天然ヌクレオチドの類似体または誘導体を含有する核酸を包含する。特に断らない限り、特定の核酸配列はまた、それらの保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドンの置換）、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰおよび相補配列、加えて明確に提示された配列も事実上包含する。具体的に言えば、縮重コドンの置換は、１以上の選択された（または全ての）コドンの第三の位置が混成の塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成される可能性がある［Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)］。
【０１８１】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、同義的に使用され、ペプチド結合により共有結合で連結されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有していなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合で合体した２以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を包含する。この用語は、本明細書で使用される場合、当分野では一般的に例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖と、当分野では一般的に多くのタイプが存在するタンパク質と称されるそれより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」としては、例えば、なかでも生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、改変されたポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が挙げられる。ポリペプチドとしては、天然ペプチド、組換えペプチドまたはそれらの組合せが挙げられる。
【０１８２】
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるのに必要な、細胞の合成機構によって認識されるＤＮＡ配列または導入された合成機構を指す。
【０１８３】
用語「プロモーター／調節配列」は、プロモーター／調節配列に機能するように連結した遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。いくつかの場合において、この配列はコアプロモーター配列であってもよく、他の例において、この配列はまた、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列および他の調節因子を包含していてもよい。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な方式で遺伝子産物を発現するプロモーター／調節配列であってもよい。
【０１８４】
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは遺伝子産物を指定するポリヌクレオチドと機能するように連結している場合、細胞のほとんどまたは全ての生理学的条件下において細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１８５】
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたは遺伝子産物を指定するポリヌクレオチドと機能するように連結している場合、実質的にプロモーターに対応する誘導物質が細胞中に存在するときだけ、細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１８６】
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするかまたは遺伝子によって指定されたポリヌクレオチドと機能するように連結されている場合、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織タイプの細胞であるときだけ、細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列を指す。
【０１８７】
用語「がん関連抗原」または「腫瘍抗原」は、全体的にまたはフラグメントとして（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）のいずれかで、正常細胞と比較してがん細胞の表面で優先的に発現され、がん細胞への医薬物質の優先的な標的化に有用である、分子（典型的にはタンパク質、炭水化物または脂質）を同義的に指す。一部の実施形態において、腫瘍抗原は、正常細胞とがん細胞の両方によって発現されるマーカー、例えば系統マーカー、例えば、Ｂ細胞上のＣＤ１９である。ある特定の態様において、本発明の腫瘍抗原は、原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がんおよび腺癌、例えば乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がんなどを包含するがこれらに限定されない、がんに由来する。一部の実施形態において、がん関連抗原は、正常細胞と比較してがん細胞において過剰発現される、例えば、正常細胞と比較して、１倍の発現、２倍の過剰発現、３倍の過剰発現またはそれ以上である細胞表面分子である。一部の実施態様において、がん関連抗原は、がん細胞において不適切に合成される細胞表面分子、例えば、正常細胞で発現された分子と比較して欠失、付加または突然変異を含有する分子である。一部の実施形態において、がん関連抗原は、全体がまたはフラグメント（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として、排他的にがん細胞の細胞表面で発現され、正常細胞の表面では合成も発現もされない。一部の実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＭＨＣによって提示されるペプチドに結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体または抗体フラグメント）を含むＣＡＲを包含する。通常、内因性タンパク質由来のペプチドは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子のポケットを満たし、ＣＤ８＋Ｔリンパ球上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって認識される。ＭＨＣクラスＩ複合体は、全ての有核細胞によって構成的に発現される。がんにおいて、ウイルス特異的および／または腫瘍特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体は、免疫療法のための細胞表面標的の特有なクラスの代表である。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ１またはＨＬＡ−Ａ２の状況においてウイルスまたは腫瘍抗原由来のペプチドを標的とするＴＣＲ様抗体が、記載されている［例えば、Sastry et al., J Virol.2011 85(5):1935-1942；Sergeeva et al., Bood, 2011 117(16):4262-4272；Verma et al., J Immunol 2010 184(4):2156-2165；Willemsen et al., Gene Ther 2001 8(21):1601-1608；Dao et al., Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33；Tassev et al., Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100を参照されたい］。例えば、ＴＣＲ様抗体は、ヒトｓｃＦｖファージ提示型ライブラリーなどのライブラリーをスクリーニングすることにより同定することができる。
【０１８８】
用語「フレキシブルなポリペプチドリンカー」または「リンカー」は、ｓｃＦｖの状況で使用される場合、可変重鎖領域と可変軽鎖領域を一緒に連結するために、単独でまたは組み合わせて使用されるグリシンおよび／またはセリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーを指す。一実施形態において、フレキシブルなポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（配列番号１５）を含み、式中ｎは、１に等しいかまたは１より大きい正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９およびｎ＝１０である。一実施形態において、フレキシブルなポリペプチドリンカーとしては、これらに限定されないが、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号２７）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号２８）が挙げられる。別の実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）の複数の反復を包含する（配列番号２９）。参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１２／１３８４７５号で記載されているリンカーも本発明の範囲内に包含される。
【０１８９】
５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡｍ７Ｇキャップともいう）は、本明細書で使用される場合、転写開始直後に真核性メッセンジャーＲＮＡの「前部」または５’末端に付加された改変されたグアニンヌクレオチドである。５’キャップは、最初に転写されるヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮアーゼからの保護にとって極めて重要である。キャップの付加は転写とカップリングされ、それぞれ他方に影響を与えるようにともに転写されることによって実行される。転写開始直後、合成されているｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと会合したキャップを合成する複合体に結合される。この酵素的な複合体は、ｍＲＮＡのキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は、多段階の生化学反応として進行する。キャッピング成分を改変して、その安定性または翻訳効率などのｍＲＮＡの機能性を調節してもよい。
【０１９０】
「インビトロで転写されたＲＮＡ」は、本明細書で使用される場合、インビトロで合成されたＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを指す。一般的に、インビトロで転写されたＲＮＡは、インビトロの転写ベクターから生成される。インビトロの転写ベクターは、インビトロで転写されたＲＮＡを生成するのに使用される鋳型を含む。
【０１９１】
本明細書で使用される場合、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに付着した一連のアデノシンである。一過性発現のためのコンストラクトの一部の実施形態において、ポリＡは、５０から５０００個の間（配列番号３０）であり、例えば６４個より多く、例えば１００個より多く、例えば３００または４００個より多い。ポリ（Ａ）配列を化学的または酵素的に改変して、局在化、安定性または翻訳効率などのｍＲＮＡの機能性を調節してもよい。
【０１９２】
「ポリアデニル化」は、本明細書で使用される場合、ポリアデニリル成分またはその改変された変異体をメッセンジャーＲＮＡ分子に共有結合で連結させることを指す。真核生物において、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、３’末端でポリアデニル化されている。３’ポリ（Ａ）テールは、酵素のポリアデニル酸ポリメラーゼの作用を介してプレ−ｍＲＮＡに付加されたアデニンヌクレオチドの長い配列（しばしば数百にもなる）である。より高次の真核生物において、ポリ（Ａ）テールは、特異的配列であるポリアデニル化シグナルを含有する転写物上に付加される。ポリ（Ａ）テールとそれに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護するのに役立つ。またポリアデニル化は、転写終結、細胞核外へのｍＲＮＡ輸送および翻訳にとっても重要である。ポリアデニル化は、ＲＮＡへのＤＮＡ転写直後に細胞核で起こるが、それに加えて後に細胞質内でも起こる可能性がある。転写が終結した後、ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと会合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用を介して切断される。切断部位は通常、切断部位付近における塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在を特徴とする。ｍＲＮＡが切断された後、切断部位において遊離の３’末端にアデノシン残基が付加される。
【０１９３】
「一過性」は、本明細書で使用される場合、数時間、数日または数週間にわたり統合されていない導入遺伝子が発現されることを指し、ここで発現期間は、宿主細胞中でゲノムに統合されているかまたは安定なプラスミドレプリコン内に含有されている場合の遺伝子の発現期間より短い。
【０１９４】
アフェレーシスは、全血が個体から除去され、選ばれた成分に分離され、残分が循環に戻るプロセスである。一般に、血液成分の分離方法には、遠心力利用のものと遠心力を利用しないもの、２種がある。白血球アフェレーシスは、患者の白血球の能動的選択および除去をもたらす。
【０１９５】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、１種または複数の治療（例えば、１種または複数の治療剤、例えば本発明のＣＡＲ）の投与の結果として生じる、増殖性障害の進行、重症度および／もしくは期間の低減もしくは改善または増殖性障害の１種もしくは複数の症状（例えば、１種もしくは複数の認識可能な症状）の改善を指す。特定の実施形態において、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、患者により必ずしも認識され得るとは限らない、腫瘍の成長などの、増殖性障害の少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーターの改善を指す。他の実施形態では、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、例えば認識可能な症状の安定化により物理的に、例えば物理的パラメーターの安定化により生理的にまたは両方により、増殖性障害の進行を抑制することを指す。他の実施形態において、用語「処置する」、「処置」および「処置すること」は、腫瘍サイズまたはがん細胞数の低減または安定化を指す。
【０１９６】
用語「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナル伝達において役割を果たす様々なシグナル伝達分子間の生化学的な関係を指す。成句「細胞表面受容体」は、シグナルを受けて細胞膜を通過してシグナルを伝えることができる分子および分子複合体を包含する。
【０１９７】
用語「対象」は、免疫反応を惹起させることができる生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を包含することが意図される。
【０１９８】
用語「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。また実質的に精製された細胞は、通常その天然に存在する状況で共存する他の細胞型から分離された細胞も指す。いくつかの場合において、実質的に精製された細胞の集団は、細胞の同種の集団を指す。他の例において、この用語は単に、それらの天然の状態において自然に共存する細胞から分離された細胞を指す。いくつかの態様において、このような細胞は、インビトロで培養される。他の態様において、このような細胞は、インビトロで培養されない。
【０１９９】
本発明の内容において、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、特定の過剰増殖性障害に共通する抗原を指す。ある特定の実施形態において、腫瘍抗原は、原発性または転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝臓がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がんおよび腺癌、例えば乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がんなどを包含するがこれらに限定されない、がんに由来する。
【０２００】
用語「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」は、宿主細胞に外因性核酸を移入または導入させるプロセスを指す。「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」された細胞は、外因性核酸でトランスフェクトされた、形質転換したまたは形質導入された細胞である。細胞は、対象の初代細胞およびその後代を包含する。
【０２０１】
用語「特異的に結合する」は、サンプル中に存在する同起源の結合パートナータンパク質を認識してそれと結合する抗体またはリガンドを指すが、これらの抗体またはリガンドは、サンプル中の他の分子を実質的に認識したりまたはそれと結合したりしない。
【０２０２】
範囲：本開示全体にわたり、本発明の様々な態様は、範囲の様式で示される場合がある。範囲の様式での記載は、単に利便性および簡潔さのためであり、本発明の範囲における柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるものとする。したがって、範囲の記載は、全ての可能性のある部分範囲、加えてその範囲内の個々の数値を具体的に開示しているとみなされるものとする。例えば、１から６などの範囲の記載は、例えば１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６などの具体的に開示された部分範囲、加えてその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、２.７、３、４、５、５.３および６を有するとみなされると予想される。別の例として、９５〜９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する何かを包含し、さらに、９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％および９８〜９９％の同一性などの部分範囲を包含する。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０２０３】
記載
ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲを用いて加工することができる免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）、ならびにそのような細胞を含む反応混合物および組成物を製造する方法が、本明細書において提供される。本明細書において提供される方法は、ＣＡＲの発現に好適な細胞の収率および品質、例えば純度を向上させる。理論に縛られることは望まないが、ＣＡＲを発現するように操作することができる細胞の収率および品質向上は、ＣＡＲをコードする核酸の導入効率を向上させ、結果として得られるＣＡＲ発現細胞の拡大を改善すると考えられる。したがって、ここに記載する方法および組成物は、対象の疾患の処置に使用するための改善されたＣＡＲ発現細胞生成物を提供する。
【０２０４】
一態様において、本開示は、望ましくない物質、非標的細胞またはＣＡＲの発現またはＣＡＲ発現細胞の治療効果に悪影響を及ぼし得る細胞を、除去する方法を特徴とする。例えば、本明細書において特徴づけられる方法は、次のもののいずれかの１以上を除去するまたは枯渇させるために使用することができる：単球、顆粒球、赤血球、血小板、Ｂ細胞、がん細胞、例えばリンパ芽球、凍結保護物質（凍結サンプルからのもの）、ヘモグロビンまたは細胞残屑。例えば、本明細書において特徴づけられる方法は、次のもののいずれかの１以上を濃縮するまたはその数を増加させるために使用することができる：Ｔ細胞（ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、樹状細胞。単独でのまたはここに記載する方法の各々または全てとの任意の組合せでの、ここに記載する各方法の実施により、ＣＡＲを発現するように操作するのに好適な改善された出発物質が得られる。
【０２０５】
新鮮なアフェレーシス物質は、ＣＡＲを発現させるのに好適な細胞の製造によく使用される。凍結された、例えば凍結保存された、アフェレーシス物質の使用には、輸送が容易であることによって、ＣＡＲ発現細胞生成物製造施設への患者位置の近接に関わる一切の制限が除去され、ＣＡＲ発現細胞製造プロセスの産業化が可能になり、治療用製品のそれを必要とする患者へのより高い入手可能性が可能になるという利点がある。ＣＡＲ発現細胞を製造するために現在使用されている方法は、新鮮なアフェレーシス物質の処理のために最適化されたものであり、それらの方法を使用して、凍結アフェレーシスサンプルからＣＡＲ発現に好適な細胞について同様の品質または収率を得ることはできない。対照的に、ここに記載する方法を使用して、凍結、例えば凍結保存、アフェレーシスサンプルからＣＡＲ発現に好適な細胞を処理および製造することができる。出発物質が凍結されている、例えば凍結保存されている実施形態において、ここに記載する方法は、凍結細胞を放置して、例えば、融解プロセスを加速させるためのオペレーターまたはデバイスによる干渉なしに、融解させる融解工程または凍結細胞を、例えば、融解デバイス、例えばＰｌａｓｍａＴｈｅｒｍの使用により、融解プロセスを加速させるデバイスまたはプロセスに付す融解工程を、適宜、包含する。そのような実施形態において、融解物質は、周囲環境と同じ温度、例えば、部屋の環境温度と同じ温度を有するかまたは融解物質が添加される、融解物質の洗浄に用いられる、もしくは融解物質とともにインキュベートされる緩衝液のものと同じ温度を有する。ここに記載する方法は、凍結または融解インプットサンプル、例えば、凍結または融解アフェレーシスサンプルからＣＡＲを発現させるように加工することができる免疫エフェクター細胞の集団の生成または濃縮に特に有用である。
【０２０６】
本明細書で称されるプロセスＢは、現在使用されている、ＣＡＲを発現させるように加工することができる免疫エフェクター細胞を濃縮するための標準プロトコールである。プロセスＢは、フィコールを用いる密度勾配精製およびＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用する陽性選択を実施することを含み、この場合のインプットサンプルは、新鮮なアフェレーシス物質である。ここに記載する方法は、ＣＡＲを発現させるのに好適な所望の免疫エフェクター細胞についてのより高度の濃縮、向上した品質および収率をもたらす。
【０２０７】
別の態様において、本開示は、ＣＡＲを発現するように操作された、例えばここに記載する製造方法のいずれかによって作製された、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）であって、抗腫瘍特性を示す加工された免疫エフェクター細胞を特徴とする。一実施形態において、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例示的な抗原は、ここに記載するがん関連抗原（すなわち、腫瘍抗原）である。一態様において、細胞はＣＡＲで形質転換され、ＣＡＲは細胞表面上に発現される。いくつかの実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、ＣＡＲをコードするウイルスベクターで形質導入される。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかのこのような実施形態において、細胞は、ＣＡＲを安定して発現することができる。別の実施形態において、細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）は、ＣＡＲをコードする、核酸、例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡでトランスフェクトされる。いくつかのこのような実施形態において、細胞は、ＣＡＲを一過性発現することができる。
【０２０８】
さらに、本開示は、ＣＡＲ発現細胞組成物および数ある疾患の中でもここに記載するような腫瘍抗原を発現する細胞または組織に関わるがんまたは任意の悪性腫瘍もしくは自己免疫疾患を処置するための医薬品または方法におけるＣＡＲ発現細胞組成物の使用を提供する。
【０２０９】
水簸
一態様において、ここに記載する方法は、望ましくない細胞、例えば単球および芽球を除去することによってＣＡＲ発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞の濃縮向上をもたらす、水簸方法を特徴とする。一実施形態において、ここに記載する水簸方法は、以前に凍結されていたサンプル、例えば融解サンプルからの、ＣＡＲ発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞の濃縮に最適化されている。一実施形態において、ここに記載する水簸方法は、当技術分野において公知の水簸プロトコールから収集された細胞の調製物と比較して向上した純度を有する細胞の調製物を提供する。
【０２１０】
製造ロジティクス（遠隔サンプル収集、出荷、保管および生産ユニットスケジューリング）を助長するために、細胞原料は、典型的に、凍結保存された全血またはアフェレーシス物質であり、これらは製造開始前に融解させる必要がある。しかし、以前に凍結されていた融解物質からの細胞の密度およびサイズは、新鮮な物質のものとは全く異なる。しかるが故に、ＣＡＲ発現を操作するための細胞の単離によく使用される標準水簸プロトコールは、凍結保存され、融解された全血またはアフェレーシス物質から単球、顆粒球または任意のより大きいサイズの細胞を除去できないことが多い。この状況は、後続のＣＡＲＴ製造工程の結果に悪影響を与え、その結果、収率不良、製品品質の懸念および仕様からはずれるプロセスのずれが生じる。水簸は、単球を除去することができるが、芽球細胞の除去には効果がない。芽球細胞はＴリンパ球と同様の密度およびサイズを有するからである。
【０２１１】
ある実施形態において、ここに記載する水簸方法は、ある特定の等張溶液（例えば、ＰＢＳ）を用いる希釈による出発サンプル、例えば細胞サンプル、例えば融解細胞サンプルの最適粘度の使用および流量と水簸デバイスにより収集される各画分についての収集容量との最適組合せの使用を包含する。改良水簸プログラムの一例は、実施例１で記載される。
【０２１２】
単球からのリンパ球、例えば、Ｔ細胞の分離のための例示的な水簸設定範囲を表４に提供する。例示的な水簸プログラムの流量、遠心分離および容量についての設定も表４の「Ｅｘ.」と示されている列に提供する。
【表１】
2019500874.tif 000002
【０２１３】
一実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上の画分が水簸工程から収集される。一実施形態では、５画分が水簸工程から収集される。５画分が収集されるある実施形態において、第３の画分（Ｆ３）もしくは第４の画分（Ｆ４）または第３の画分と第４の画分の組合せは、所望のリンパ球集団を含有し、単球、顆粒球および他の非リンパ球細胞の量をほとんど有さない。一実施形態において、各画分は、異なる流量を使用して収集される。一実施形態において、各画分についての流量は、前の画分の収集に使用された流量から増加される。一実施形態において、画分の１以上は、異なる収集容量を使用して収集される。
【０２１４】
一実施形態において、水簸は、約２０〜９０ｍＬ／分、約３０〜９０ｍＬ／分、約４０〜９０ｍＬ／分、約５０〜９０ｍＬ／分、約６０〜９０ｍＬ／分、約７０〜９０ｍＬ／分、約４０〜８５ｍＬ／分、約５０〜８２ｍＬ／分、約６０〜８２ｍＬ／分、約７０〜８２ｍＬ／分、約５０〜８０ｍＬ／分、約６０〜８０ｍＬ／分、約７０〜８０ｍＬ／分の流量を使用して行われる。一実施形態において、水簸は、約３０〜８２ｍＬ／分または約５０〜８０ｍＬ／分の流量を使用して行われる。一実施形態において、水簸は、約３０、４０、５０、６０、７０、７２、８０または８２ｍＬ／分の流量を使用して行われる。一実施形態において、水簸は、約７０ｍＬ／分または７２ｍＬ／分の流量を使用して行われる。
【０２１５】
一実施形態において、所望のリンパ球集団を含有し、単球、顆粒球、他の非リンパ球細胞および他の望ましくない成分の量をほとんど有さない、１以上の画分についての流量は、約２０〜９０ｍＬ／分、約３０〜９０ｍＬ／分、約４０〜９０ｍＬ／分、約５０〜９０ｍＬ／分、約６０〜９０ｍＬ／分、約７０〜９０ｍＬ／分、約４０〜８５ｍＬ／分、約５０〜８２ｍＬ／分、約６０〜８２ｍＬ／分、約７０〜８２ｍＬ／分、約５０〜８０ｍＬ／分、約６０〜８０ｍＬ／分、約７０〜８０ｍＬ／分である。一実施形態において、所望のリンパ球集団を含有する１以上の画分についての流量は、約５０〜８２ｍＬ／分、約５０〜８０ｍＬ／分、約６０〜８２ｍＬ／分、約６０〜８０ｍＬ／分、約７０〜８２ｍＬ／分、約７０〜８０ｍＬ／分、約７０〜７５ｍＬ／分、約７０〜７２ｍＬ／分である。一実施形態において、所望のリンパ球集団を含有する１以上の画分についての流量は、約７０ｍＬ／分または７２ｍＬ／分である。
【０２１６】
一実施形態において、水簸は、約２５０〜１２５０ｍＬ、約２５０〜１０００ｍＬ、約３００〜１０００ｍＬ、約４００〜１０００ｍＬ、約５００〜１０００ｍＬ、約６００〜１０００ｍＬ、約７００〜１０００ｍＬ、約８００〜１０００ｍＬ、約９００〜１０００ｍＬ、約２５０〜９７５ｍＬ、約３００〜９７５ｍＬ、約４００〜９７５ｍＬ、約５００〜９７５ｍＬ、約６００〜９７５ｍＬ、約７００〜９７５ｍＬ、約８００〜９７５ｍＬ、約３００〜９００ｍＬ、約３００〜８００ｍＬ、約３００〜７００ｍＬ、約３００〜６００ｍＬ、約３００〜５００ｍＬまたは約３００〜４００ｍＬの収集容量を使用して行われる。一実施形態において、水簸は、約２５０、４００、５００、９００または９７５ｍＬの収集容量を使用して行われる。一実施形態において、水簸は、約４００ｍＬまたは約９７５ｍＬの収集容量を使用して行われる。
【０２１７】
一実施形態において、所望のリンパ球集団を含有し、単球、顆粒球、他の非リンパ球細胞および他の望ましくない成分の量をほとんど有さない、１以上の画分についての収集容量は、約２５０〜１２５０ｍＬ、約２５０〜１０００ｍＬ、約３００〜１０００ｍＬ、約４００〜１０００ｍＬ、約５００〜１０００ｍＬ、約６００〜１０００ｍＬ、約７００〜１０００ｍＬ、約８００〜１０００ｍＬ、約９００〜１０００ｍＬ、約２５０〜９７５ｍＬ、約３００〜９７５ｍＬ、約４００〜９７５ｍＬ、約５００〜９７５ｍＬ、約６００〜９７５ｍＬ、約７００〜９７５ｍＬ、約８００〜９７５ｍＬ、約３００〜９００ｍＬ、約３００〜８００ｍＬ、約３００〜７００ｍＬ、約３００〜６００ｍＬ、約３００〜５００ｍＬまたは約３００〜４００ｍＬである。一実施形態において、所望のリンパ球集団を含有する１以上の画分についての収集容量は、約２５０ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、９００ｍＬまたは９７５ｍＬである。一実施形態において、所望のリンパ球集団を含有する１以上の画分についての収集容量は、約４００ｍＬまたは約９７５ｍＬである。
【０２１８】
一実施形態において、ここに記載する水簸方法は、水簸デバイスにより行われる。例えば、水簸デバイスは、Ｃａｒｉｄｉａｎ  ＢＣＴ  Ｅｌｕｔｒａ（商標）細胞分離システム（Ｔｅｒｕｍｏ  ＢＣＴ  Ｍｏｄｅｌ  ７１８００）である。Ｃａｒｉｄｉａｎ  ＢＣＴ  Ｅｌｕｔｒａ（商標）細胞分離システム（Ｔｅｒｕｍｏ  ＢＣＴ  Ｍｏｄｅｌ  ７１８００）は、連続向流水簸技術を利用して、主としてサイズに、副次的に比重に基づいて細胞分離を行うクローズドシステムである。分離チャンバへの媒体の流れによって発生する相反する力および遠心力によって生じる沈降速度に起因して、細胞は、分離チャンバ内でサイズおよび密度ごとに整列し、そのチャンバ内で自動的に収集バッグに吸い上げられる。専用Ｅｌｕｔｒａ設定は、異なる画分中の顆粒球と組み合わされたリンパ球および単球の分布が可能になるように設計される。Ｅｌｕｔｒａは、製造業者の指示に従って操作することができる。
【０２１９】
密度勾配遠心分離
養子細胞療法製品の製造は、末梢血アフェレーシスの出発物質中に存在する血液細胞および血液成分の複雑な混合物から分けて、所望の細胞、例えば免疫エフェクター細胞を処理する必要がある。末梢血由来のリンパ球サンプルは、フィコール溶液による密度勾配遠心分離を使用して単離に成功している。しかし、フィコールは、臨床使用に適格でないので、治療用の細胞の単離に好ましい試薬ではない。加えて、フィコールは、細胞にとって毒性の可能性があるグリコールを含有する。さらに、凍結保存後の融解アフェレーシス産物のフィコール密度勾配遠心分離は、例えば本明細書の実施例で記載されるような、最適以下のＴ細胞生成物をもたらす。例えば、非Ｔ細胞、特に、望ましくないＢ細胞、芽球細胞および単球の相対的増加を伴う、最終生成物中のＴ細胞の損失が、フィコール溶液による密度勾配遠心分離によって単離された細胞調製物において観察された。
【０２２０】
理論に縛られることは望まないが、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞は、凍結保存中に脱水して新鮮な細胞より高濃度になると考えられる。理論に縛られることは望まないが、免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞はまた、他の血液細胞より長い間、より高濃度のままであり、それゆえ、フィコール密度勾配分離中に他の細胞と比較して容易に失われると考えられる。したがって、理論に縛られることは望まないが、フィコールより高い密度を有する媒体は、フィコールまたはフィコールと同じ密度、例えば１.０７７ｇ／ｍＬを有する他の媒体と比較して、所望の免疫エフェクター細胞の単離向上をもたらすと考えられる。
【０２２１】
一実施形態において、ここに記載する密度勾配遠心分離方法は、イオジキサノールを含む密度勾配媒体の使用を包含する。一実施形態において、密度勾配媒体は、約６０％イオジキサノール水溶液を含む。
【０２２２】
一実施形態において、ここに記載する密度勾配遠心分離方法は、フィコールより高い密度を有する密度勾配媒体の使用を包含する。一実施形態において、ここに記載する密度勾配遠心分離方法は、１.０７７ｇ／ｍＬより高い、例えば、１.０７７ｇ／ｍＬより高い、１.１ｇ／ｍＬより高い、１.１５ｇ／ｍＬより高い、１.２ｇ／ｍＬより高い、１.２５ｇ／ｍＬより高い、１.３ｇ／ｍＬより高い、１.３１ｇ／ｍＬより高い密度を有する密度勾配媒体の使用を包含する。一実施形態において、密度勾配媒体は、約１.３２ｇ／ｍＬの密度を有する。
【０２２３】
一実施形態において、ここに記載する密度勾配遠心分離方法は、イオジキサノールを含む媒体、例えば約６０％イオジキサノール水溶液であって、フィコールより高い、例えば、１.０７７ｇ／ｍＬより高い密度、例えば１.３２ｇ／ｍＬを有する密度勾配媒体の使用を包含する。一実施形態において、ここに記載する密度勾配遠心分離方法は、密度勾配媒体ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）（Ｓｉｇｍａ）の使用を包含する。ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）は、１.３２０±０.００１ｇ／ｍｌの密度を有する、既製品の、無菌の、エンドトキシン試験済みの６０％（ｗ／ｖ）イオジキサノール溶液である。対照的に、フィコール密度勾配溶液は、１.０７７ｇ／ｍｌの密度しか有さない。フィコールに勝るＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）のもう１つの利点は、ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）がＧＭＰグレードで入手でき、したがって、治療目的使用に適格である点である。
【０２２４】
理論に縛られることは望まないが、例えば融解アフェレーシス物質を用いる、ＯｐｔｉＰｒｅｐ密度勾配遠心分離工程の利用は、望ましくないＢ細胞および単球を保持する可能性が低いと考えられ、それゆえ、後続の活性化および形質導入工程に望ましい標的免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞の収集をさらに向上させると考えられる。したがって、理論に縛られることは望まないが、フィコールと比較して高いＯｐｔｉＰｒｅｐ密度は、所望の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の精製および回収率向上と、そうしなければＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞、生成物製造結果の一貫した成功に干渉し得る望ましくない非Ｔ細胞型の同時除去とを、両方とも可能にすると考えられる。
【０２２５】
一実施形態において、密度勾配遠心分離は、細胞分離デバイスを使用して行われる。細胞分離デバイスの例としては、Ｓｅｐａｘ２（Ｂｉｏｓａｆｅ）が挙げられる。洗浄工程、例えば、ここに記載するような改善された洗浄工程が、例えば、密度勾配遠心分離工程の前または後に行われる実施形態では、密度勾配遠心分離工程で使用するのと同じデバイスを使用して洗浄工程を実施することができる。
【０２２６】
選択による濃縮
ＣＡＲ発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞の濃縮を向上させるために特定の細胞を選択する方法が本明細書において提供される。一実施形態において、選択は、陽性選択、例えば、所望の免疫エフェクター細胞の選択を含む。別の実施形態において、選択は、陰性選択、例えば、望ましくない細胞の選択、例えば、望ましくない細胞の除去を含む。実施形態において、ここに記載する陽性または陰性選択方法は、流動条件下で、例えば、フロースルーデバイス、例えば、ここに記載するフロースルーデバイスを使用することによって行われる。
【０２２７】
例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８  ＣＴＳ（商標）を使用する、現行の選択方法、例えば陽性選択を、濃縮用にさらに最適化することができる。第１に、選択中に使用されるＤｙｎａｂｅａｄｓの量は、ＣＤ４５＋／３＋細胞、例えば、密度勾配遠心分離、例えばＳｅｐａｘフィコール、後のサンプル中に存在するＣＤ４５＋／３＋細胞の百分率に通常は基づかず、むしろ、元の患者由来物質中に存在する細胞、例えばＣＤ４５＋／３＋細胞の百分率に基づく。密度勾配遠心分離工程、例えば、Ｓｅｐａｘフィコール分離手順により引き起こされる組成の有意な変化を考えると、この予測は、通常は、Ｔ細胞百分率の低下および単球含有率の上昇という結果になる。第２に、２時間のインキュベーション時間は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）の非標的細胞（すなわち、非ＣＤ３および／または非ＣＤ２８細胞）への非特異的結合と、エンドサイトーシスによる非標的細胞（例えば、単球）によるビーズ取り込み、両方の機会をサンプル（ample）に与え、この問題により陽性選択産物のＴ細胞収率および純度が損なわれ得る。最後に、選択に使用される磁気装置および操作は、最適以下であり得る。現在、磁気分離は、大容量の流体（２００ｍｌ）中で行われ、そしてまたその結果、磁気標識細胞と磁石面間の距離が大きくなる。これは、分離に利用可能な磁力を制限し、したがって、分離感度を低下させ、より長い分離時間を必要とする。加えて、磁気分離は、現在は、陰性画分の除去の前に５分間、磁石面の上にサンプルを置いて、静的に行われている。そのような長い分離時間は、細胞にとって有害であり、その手順の間に「パイルアップ」効果に起因して細胞の生存能に悪影響を与えることが多く、非標的細胞がビーズに結合するかまたはビーズを内在化するさらなる機会を与える。
【０２２８】
現行の選択方法とは大いに異なって、ここに記載する選択方法は、現行の「静的」分離手順とは対照的に、「動的に」、例えば流動条件下で、行われる分離を包含する。ある実施形態では、流動条件下での分離は、磁気分離試薬、例えば、標的抗原に選択的に結合する磁性ビーズ、インプットサンプルおよび磁石を含み、この場合、磁気分離試薬およびインプットサンプルが磁石の上を通過する、例えば、流れる。ある特定の実施形態において、磁気分離試薬およびインプットサンプルは、磁石の上を継続的に通過する、例えば流れる。理論に縛られるものではないが、この動的技術は、インキュベーション時間（すなわち、サンプルと分離試薬の接触）および分離時間の短縮を可能にし、したがって、標的細胞に対する悪影響を最小にすること、ならびに非標的集団による非特異的結合および／またはビーズ取り込みの尤度を有意に低下させること可能にする。加えて、ここに記載する選択方法は、選択試薬（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ３／ＣＤ２８  ＣＴＳ（商標））の変更または選択に使用される試薬の量（３対１のビーズ対Ｔ細胞比）の変更を一切必要としない。
【０２２９】
ある実施形態において、ここに記載するような流動条件下での分離または選択は、フロースルー抗体ベース選択技術（Flow-through Antibody-based Selection Technique）（ＦＡＳＴ）プロトコールを含む。表１２は、現行の選択技術とＦＡＳＴプロトコール間で異なるパラメーターの大要を示す。
【表２】
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【０２３０】
一実施形態において、ここに記載する選択方法は、分離試薬およびインプットサンプルの現行標準プロトコールより短いインキュベーション時間、その後の磁気分離を含む。一実施形態において、インキュベーション時間は、２時間未満、例えば、１１０分未満、１００分未満、９０分未満、８０分未満、７０分未満、６０分未満、５０分未満、４０分未満、３０分未満、２５分未満、２０分未満、１５分未満、１０分未満または５分未満である。一実施形態において、インキュベーションは、穏やかに回転させながら行われる。
【０２３１】
ここに記載する選択方法のための例示的なキットは、図２０に示されている。一実施形態において、キットは、追加のサンプル／緩衝液バッグにスパイクによりまたは無菌溶接によって結合することができる、３つのバッグのアセンブリーからなる。加えて、図２１に示されている改良ＤｙｎａＭａｇ蓋は、分離に用いられ、分離中の最大容量を低容量、例えば、１００ｍＬ未満、９０ｍＬ未満、８０ｍＬ未満、７０ｍＬ未満、６０ｍＬ未満、５０ｍＬ未満、４０ｍｌ未満、例えば約５０ｍｌに制限する。理論に縛られることは望まないが、分離中に使用される低容量は、分離手順中に作用する磁力を最適化し、分離時間を最小にすると考えられる。改良ＤｙｎａＭａｇ蓋は、ビーズ：細胞コンジュゲートが磁石から離される最大距離も制限し、陽性選択中に経験する磁力を標準化する。
【０２３２】
一実施形態において、ここに記載するキットのバッグの１以上は、三角形のバッグである。一実施形態において、選択バッグは、三角形のバッグであり、該選択バッグの両端にポートがあるので、「フロースルー」モードで磁気分離を可能にする。そのような実施形態では、細胞を磁気要素（例えば、ＤｙｎａＭａｇなどの磁性板）上に継続的に流すことができ、かくて、磁気標識粒子のリアルタイム分離を可能にすることができるが、非標識細胞は、磁場により誘引されず、流出することになる。このフロースルー構成のため、このシステムは自動化に特に適している。この改良分離バッグには、追加のポートに対応するために図２１の改良蓋が必要である。
【０２３３】
一実施形態において、選択バッグは、三角形のバッグではない。選択バッグが三角形のバッグでない実施形態において、インキュベーション時間は、２時間未満、例えば、１１０分未満、１００分未満、９０分未満、８０分未満、７０分未満、６０分未満、５０分未満、４０分未満、３０分未満、２５分未満、２０分未満、１５分未満、１０分未満または５分未満である。
【０２３４】
陽性選択
実施形態において、ここに記載する陽性選択方法は、所望の免疫エフェクター細胞を選択すること、例えば濃縮することを含む。一実施形態において、ここに記載する陰性選択方法は、ＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞を選択することを含む。他の実施形態において、ここに記載する陰性選択方法は、次の１以上を選択することを含む：ＣＤ３＋細胞、ＣＤ２８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞またはＣＤ４５＋細胞。
【０２３５】
ここに記載する選択方法において使用される分離試薬は、磁性または常磁性メンバーおよび抗原結合メンバーを含む。一実施形態において、分離試薬は、ビーズ、例えば、抗原結合メンバーとカップリング（例えば、共有結合的にまたは非共有結合的に）している磁性または常磁性特性を有するビーズを含む。一実施形態において、抗原結合メンバーは、抗体またはその抗体フラグメントである。一実施形態において、ＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択に使用される分離試薬は、ＣＤ３および／またはＣＤ２８結合メンバー、例えば、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体または抗体フラグメントとカップリング（例えば、共有結合的にまたは非共有結合的に）しているビーズを含む。
【０２３６】
陰性選択
望ましくない細胞、例えば単球、顆粒球、赤血球、血小板およびＢ細胞のインプットサンプルを陰性選択するかまたは枯渇させることによって、所望の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を有する、結果として得られるアウトプットサンプルを濃縮する、陰性選択方法も本明細書において提供される。ある実施形態において、ここに記載する陰性選択方法は、流動条件下で、例えば、フロースルーデバイス、例えば、ここに記載するフロースルーデバイスを使用して行われる。
【０２３７】
一実施形態において、ここに記載する陰性選択方法は、単球、顆粒球、赤血球、血小板、Ｂ細胞またはがん細胞、例えばリンパ芽球の１以上を陰性選択することを含む。
【０２３８】
単球、顆粒球、赤血球、血小板またはＢ細胞の１以上の枯渇または除去が所望される実施形態において、次の１以上を発現する細胞を選択する陰性選択得方法：ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ１４または単球、顆粒球、赤血球、血小板もしくはＢ細胞により発現される他の表面マーカーもしくはタンパク質。
【０２３９】
対象が血液がんを有する実施形態では、がん細胞がアフェレーシスサンプル中に存在することがあり、がん細胞の除去が所望されることがある。一実施形態において、ここに記載する陰性選択方法は、ＣＤ１９＋細胞、例えば、リンパ芽球を陰性選択することを含む。別の実施形態において、ここに記載する陰性選択方法は、次の１以上を発現するがん細胞を陰性選択することを含む：ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＬＬ−１、ＢＣＭＡ、ＲＯＲ１またはＦＬＴ３。
【０２４０】
ここに記載する選択方法において使用される分離試薬は、磁性または常磁性メンバーおよび抗原結合メンバーを含む。一実施形態において、分離試薬は、ビーズ、例えば、抗原結合メンバーとカップリング（例えば、共有結合的にまたは非共有結合的に）している磁性または常磁性特性を有するビーズを含む。一実施形態において、抗原結合メンバーは、抗体またはその抗体フラグメントである。一実施形態において、ＣＤ１９＋細胞の陰性選択に使用される分離試薬は、ＣＤ１９結合メンバー、例えば、抗ＣＤ１９抗体または抗体フラグメントとカップリング（例えば、共有結合的にまたは非共有結合的に）しているビーズを含む。一実施形態において、ＣＤ１４＋細胞の陰性選択に使用される分離試薬は、ＣＤ１４結合メンバー、例えば、抗ＣＤ１４抗体または抗体フラグメントとカップリング（例えば、共有結合的にまたは非共有結合的に）しているビーズを含む。一実施形態において、ＣＤ２５＋細胞の陰性選択に使用される分離試薬は、ＣＤ２５結合メンバー、例えば、抗ＣＤ２５抗体または抗体フラグメントとカップリング（例えば、共有結合的にまたは非共有結合的に）しているビーズを含む。
【０２４１】
例示的なフロースルーデバイス
ここに記載するように、選択方法を流動条件下で、例えば、細胞処理システムとも称されるフロースルーデバイスを使用することによって行って、細胞の調製物をＣＡＲ発現に好適な所望の免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞についてさらに濃縮することができる。流動条件下でのそのような選択方法の使用のための例示的なフロースルーデバイスがこのセクションで記載される。
【０２４２】
一実施形態において、細胞処理システムは、少なくとも１つの細胞懸濁モジュールと；少なくとも１つの緩衝モジュールと；少なくとも１つのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールと；少なくとも１つの非磁気アウトプットモジュールと；少なくとも１つの磁気アウトプットモジュールとを備えている。
【０２４３】
このシステムの一部の変形形態において、該変形形態は、少なくとも１つのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの上流に戻る少なくとも１つのリターンループ；並列の少なくとも２つのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール；直列の少なくとも２つのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール；少なくとも１つの追加のモジュールまたはそれらの任意の組合せを備えることができる。少なくとも１つの追加のモジュールは、少なくとも１つの回転膜脱ビーズ化モジュール；並行の少なくとも２つの回転膜脱ビーズ化モジュール；または直列の少なくとも２つの回転膜脱ビーズ化モジュールを包含し得る。回転膜脱ビーズ化モジュールのいずれが、円筒形側壁に隣接または近接している少なくとも１つの磁石を備えていてもよい。
【０２４４】
より特異的な変形形態において、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールは、壁により規定されており、ｘ方向、ｙ方向およびｚ方向を有するチャンバと；前記チャンバの前記ｙ方向の両端に配置された入口および出口と；前記チャンバの壁に隣接または近接しており、前記チャンバ内の前記入口と前記出口の間にゼロ勾配線を確立するように配置されている、少なくとも２つの磁石とを備えている。
【０２４５】
独立型であってもよくまたは第１のより特異的な変形形態と組み合わせられていてもよい、別のより特異的な変形形態において、回転膜脱ビーズ化モジュールは、円筒形側壁により部分的に規定されている脱ビーズ化チャンバと；内部があり、前記円筒形側壁と同軸方向に配向されている、多孔質回転膜と；サンプル入口と；前記回転膜の内部に接続されている廃棄物アウトプットモジュールと；前記脱ビーズ化チャンバに接続されている細胞アウトプットモジュールとを備えている。
【０２４６】
別の実施形態において、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールは、壁により規定されており、ｘ方向、ｙ方向およびｚ方向を有するチャンバと；前記チャンバの前記ｙ方向の両端に配置された入口および出口と；前記チャンバの壁に隣接または近接しており、前記チャンバ内の前記入口と前記出口の間にゼロ勾配線を確立するように配置されている、少なくとも２つの磁石とを備えている。
【０２４７】
このモジュールの一部の変形形態において、該変形形態は、少なくとも２つの入口および少なくとも２つの出口；チャンバの壁に隣接または近接しており、チャンバ内の前記入口と前記出口の間に少なくとも２本のゼロ勾配線を確立するように配置されている、少なくとも３つの磁石；チャンバのｚ方向の両端に２列に配置された少なくとも４つの磁石；チャンバのｚ方向の両側に２列に配置されており、ｘ−ｙ平面においてチャンバのｚ方向の１つの入口付近から反対端の１つの出口付近まで交差配向されている、少なくとも４つの磁石；チャンバの壁に隣接しているサブ膜注入ポートであって、前記チャンバの壁が、少なくとも２つの磁石および前記サブ膜に隣接している膜にも隣接している、サブ膜注入ポート；またはそれらの任意の組合せを備えることができる。
【０２４８】
別の実施形態において、回転膜脱ビーズ化モジュールは、円筒形側壁により部分的に規定されている脱ビーズ化チャンバと；内部があり、前記円筒形側壁と同軸方向に配向されている、多孔質回転膜と；サンプル入口と；回転膜の内部に接続されている廃棄物アウトプットモジュールと；脱ビーズ化チャンバに接続されている細胞アウトプットモジュールと；円筒形側壁に隣接または近接している少なくとも１つの磁石とを備えている。
【０２４９】
このモジュールの一部の変形形態において、該変形形態は、試薬モジュールを備えていること、脱ビーズ化される粒子の径より大きく、脱ビーズ化される細胞の径より小さい細孔経を有することまたは両方であることが可能である。
【０２５０】
さらに別の実施形態において、フロースルー細胞処理方法は、常磁性粒子結合細胞を含む細胞懸濁液をフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールに流して、非結合細胞生成物を生じさせることを包含する。常磁性粒子結合細胞は、流動工程を通してフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの中を移動し続ける。フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールは、壁によって規定されている流動チャンバであって、細胞懸濁液が流動する流動チャンバと、少なくとも１つの壁に隣接または近接して配置された少なくとも２つの磁石とを備えている。
【０２５１】
この方法の一部の変形形態では、細胞懸濁液をフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールに層状に流すか；細胞懸濁液が非結合細胞さらに含み、該細胞懸濁液をフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールに流すことで、常磁性粒子結合細胞と非結合細胞を分離するか；細胞懸濁液が遊離常磁性粒子をさらに含み、該細胞懸濁液をフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールに流すことで、遊離常磁性粒子と非結合細胞またはそれらの任意の組合せを分離する。
【０２５２】
ここに記載する方法は、分離された非結合細胞を、リターンループを使用して２回もしくはそれに続く回数、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールに流すこと；分離された常磁性粒子結合細胞を、リターンループを使用して２回もしくはそれに続く回数、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールに流すこと；２回目以降の間にフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール内で常磁性粒子結合細胞を脱ビーズ化して、常磁性粒子および脱ビーズ化済み非結合細胞を生じさせること；生じた常磁性粒子および脱ビーズ化済み非結合細胞を３回以上、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールに流して、常磁性粒子と脱ビーズ化済み非結合細胞を分離すること；またはそれらの任意の組合せも包含し得る。
【０２５３】
全ての他のものと組み合わせることができる別の変形形態において、磁石は、流れの方向と交差する１本のゼロ勾配線を確立するように配向され、したがって、常磁性粒子結合細胞は、ゼロ勾配線に専ら一方向に引っ張られるが、磁石からの他の２方向の磁力による影響を受けない。
【０２５４】
全ての他のものと組み合わせることができる別の変形形態において、チャンバは、任意の常磁性粒子がフローチャンバに入る磁性入口と、非磁性入口と、非磁性入口に対向する磁性出口と、磁性入口に対向する非磁性出口とをさらに備えており、この場合、ゼロ勾配線が、全ての常磁性粒子およびあらゆる常磁性粒子結合細胞を磁性出口に向かわせる。
【０２５５】
細胞懸濁液は、非結合細胞をさらに含むことがあり、非磁性入口は、磁性入口より大きいこともあるが、非磁性出口は、磁性出口より大きいので、非磁性入口から流れる流体は、非磁性出口へと横断し、その結果、一切の非結合細胞の磁性出口への流入が防止される。
【０２５６】
あるいは、細胞懸濁液は、非結合細胞をさらに含むことがあり、非磁性入口と磁性入口は、実質的に同じサイズであってもよくまたは非磁性出口と磁性出口は、実質的に同じサイズであってもよくまたは両方であってもよく、前記入口に入る流体のそれぞれの流量、前記出口から退出する流体のそれぞれの流量または両方を、非磁性入口から流れる流体が非磁性出口へと横断し、その結果、一切の非結合細胞の磁性出口への流入が防止されるように調整することができる。
【０２５７】
全ての他のものと組み合わせることができる別の変形形態において、方法は、常磁性粒子結合細胞を回転膜脱ビーズ化モジュールに流して非結合細胞生成物を生じさせることを含む。回転膜脱ビーズ化モジュールは、常磁性粒子結合細胞が流動する円筒形脱ビーズ化チャンバであって、円筒形側壁により一部分規定されており、同軸回転膜を含有するチャンバと；円筒形脱ビーズ化チャンバ内で少なくとも１本のゼロ勾配線を確立するように円筒形側壁に隣接または近接して配置された少なくとも１つの磁石とを備えることができる。
【０２５８】
本開示は、細胞懸濁液中、常磁性粒子の存在下での常磁性粒子結合細胞または非結合細胞のフロースルー分離、脱ビーズ化、常磁性粒子分離またはそれらの任意の組合せのためのシステムおよび方法に関する。システムおよび方法は、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール、回転膜脱ビーズ化モジュールまたは両方を使用する。ここに記載するシステムおよび方法は、任意の細胞型から常磁性粒子を除去するために使用ことができるが、細胞療法において使用されることになる細胞からの常磁性粒子の除去への使用に特によく適している。加えて、脱ビーズ化は、通常は陽性選択方法中にしか行われないので、本記載のいくつかの部分は、常磁性粒子結合細胞の陽性選択に焦点を当てているが、システムおよび方法を陰性選択にも使用することができる。陰性選択に使用される場合、通常は一切の脱ビーズ化モジュールおよび工程が削除されることになる。
【０２５９】
分離および脱ビーズ化システムおよびモジュール
図１Ａは、細胞懸濁液中の常磁性粒子結合細胞のフロースルー分離、脱ビーズ化、常磁性粒子分離またはそれらの任意の組合せのための細胞処理システム２の模式図である。システム２は、細胞懸濁モジュール４と、緩衝モジュール６と、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８と、非磁気アウトプットモジュール１０と、磁気アウトプットモジュール１２とを備えている。システム２は、適宜、少なくとも１つの追加のモジュール１６、少なくとも１つのリターンループ１４または両方を備えることもできる。
【０２６０】
システム２は、チューブもしくはホースなどの流体導管、コネクタ、弁、スイッチ、クランプ、溶接部、ハウジング、モータ、ポンプ、他の機械的機構、回路、監視デバイスおよび制御デバイスをさらに備えることができる。システム２は、フロースルー分離プロセス、フロースルー脱ビーズ化プロセス、フロースルー常磁性粒子分離プロセスまたはこれらの任意の組合せを行うためにシステム２またはその任意の構成要素を制御するようにプログラムされたコンピュータをさらに備えることができる。
【０２６１】
システム２は、静的構成を有することもありまたは適応可能な構成を有することもある。１つの適応可能な構成は、モジュールの交換または追加のモジュールの挿入を可能にすることができる。別の適応可能な構成は、変更できないモジュールセットを有することもあるが、モジュールの少なくとも１つに対する流体経路指定の変更を可能にすることができる。他の適応可能な構成は、モジュールの交換および追加と流体経路指定の変更の両方を可能にすることができる。システム２の構成要素は、適応可能な構成を容易にすることができる。例えば、システム２におけるプログラムされたコンピュータは、どのモジュールが存在するかに関する情報を検出もしくは使用することができまたは流体経路指定を制御することができる。加えて、システム２は、同じ位置での異なるモジュールの除去または挿入を可能にする付属のコネクタ、バルブ、クランプまたはスイッチを備えている、ハウジングまたは流体導管を有することができる。モジュールまたは他の構成要素は、それらの存在または非存在を自動的に検出することを可能にするための、バーコードまたは無線周波数認識装置（ＲＦＩＤ）チップなどの識別要素を含むことができる。モジュールまたは他の構成要素は、適正製造基準および他の安全規定の順守を確実なものにすることができる１以上の指示要素も含むことができる。例えば、温度感受性指示要素は、モジュールもしくは他の構成要素が加熱滅菌されたことまたはその完全性もしくは有効性を損なう可能性がある温度にさらされていないことを示すことができる。指示要素は、使用されているモジュールまたは他の構成要素を明確に特定することもできる。指示要素をシステム２によって自動的に検出することもでき、これは、人為的ミスを最小にするのに役立つ。
【０２６２】
特定のプロセスに必要ないシステム２の構成要素は、なくてもよく、接続されていなくてもよくまたは閉鎖されていてもよい。例えば、別々の非磁気アウトプットジュール１０および磁気アウトプットモジュール１２ではなく、図１Ｈに示されているような単一のアウトプットモジュールが存在することもある。加えて、図１Ｈでも開示されるように、システム２の構成要素は、弁、クランプ、溶接部、スイッチおよびコネクタの構成に依存して、図１Ａに示されているようなものとは異なる経路および接続を有する流体導管を有することができる。
【０２６３】
細胞懸濁モジュール４は、懸濁流体に懸濁している分離または脱ビーズ化されることになる細胞を収容している。細胞が分離されることになる場合には、通常、細胞懸濁液は、常磁性粒子結合細胞と非結合細胞の両方を含有する。常磁性粒子結合細胞は、所望の細胞であることがあり、その場合、常磁性粒子結合細胞に対する陽性選択がシステム２内で行われることになりまたは常磁性粒子結合細胞が望ましくないこともあり、その場合、常磁性粒子結合細胞に対する陰性選択が行われることになる。
【０２６４】
細胞が脱ビーズ化されることになる場合または常磁性粒子が細胞から分離されることになる場合には、常磁性粒子結合細胞が所望の細胞である。システム２または別のシステムを使用して、これらの細胞を望ましくない細胞から事前に分離してもよい。望ましくない細胞の存在が問題にならない場合または分離すべき望ましくない細胞がない場合、脱ビーズ化されることになる細胞を事前に分離プロセスに付さなくてもよい。
【０２６５】
細胞は、血液などの生物サンプルからまたは細胞培養から、直接得ることができる。
【０２６６】
懸濁流体は、分離、脱ビーズ化または粒子除去プロセス全体を通して細胞の生存能を支持することができる任意の流体であり得る。例えば、懸濁流体は、培養培地であってもよく、ＤＭＳＯ含有流体などの凍結剤であってもよく、設定もしくは制御されたｐＨを有する別の流体であってもよくまたは栄養素を有する別の流体であってもよい。懸濁流体はまた、緩衝液であってもよく、この緩衝液は、緩衝モジュール６内の緩衝液と同じであってもよくまたは異なってもよい。懸濁流体は、緩衝液とは異なる粘度を有してもよい。懸濁流体はまた、細胞がシステム２に入る際の非常に高密度であり得る媒体、例えば、高密度フィコールとは異なる粘度を有してもよい。
【０２６７】
緩衝モジュール６内の緩衝液は、懸濁流体と併せることができ、さらにその懸濁流体が細胞の生存能を支持し続けることを可能にする、任意の流体であり得る。例えば、緩衝液は、設定または制御されたｐＨを有することもある。緩衝液は、１以上の細胞適合性の塩を含むこともある。緩衝液は、緩衝モジュール６内に別途供給されるが、緩衝液が細胞懸濁液と混ざってしまうと懸濁流体の一部とみなされる。
【０２６８】
懸濁流体または緩衝液は、抗菌剤を含有することもあるが、細胞が後に患者に提供されることになる場合、システム２が、回転膜脱ビーズ化モジュールもしくは別のモジュールなどによってこれらの抗菌剤を除去する場合を除いてまたは抗菌剤が後に追加のプロセス、モジュールもしくはシステムにより除去される場合を除いて、通常は抗菌剤を含有しないであろう。
【０２６９】
常磁性粒子は、金属または金属合金などの、任意の常磁性および／または着磁性材料から形成され得る。典型的に、常磁性材料は、細胞とってもしくは後に細胞を投与される患者にとって有毒でなくまたは毒性を回避するためにコーティングされている。常磁性材料は、高い飽和磁束（magnetic saturation flux）（ｍｓ）を達成するために選択され得る。一般に、どの常磁性材料が好適であるのかは、システム２内で使用される磁石および磁石を使用するモジュールの構成による影響を受ける。これらの要素は、常磁性材料を磁気飽和に至らせることに影響を与えるからである。
【０２７０】
常磁性粒子を、結合剤、例えば、成長剤、受容体もしくはリガンド、抗原、抗体またはその任意の結合フラグメントもしくはキメラ変異体、例えばキメラ抗原受容体リガンドで、コーティングすることができる。結合剤は、いくつかの場合において、可逆的であることがあり、それによって常磁性粒子の自発的または特定の化学薬品を使用する切り離しが可能になる。結合剤は、光切断性リンカーを含むこともあり、その場合、システム２は、リンカーの光切断および細胞と常磁性粒子の分離を可能にするための光源、特に高出力光源をモジュールとしてまたは別のモジュールの一部として備えることができる。いくつかの場合において、コーティングは、細胞と相互作用することができる。他の場合において、コーティングは、除去されることになる、細胞懸濁液の少なくとも１つの望ましくない成分と、相互作用することができる。この望ましくない成分は、活性であることもありまたは不活性であることもあり、以前に細胞または細胞懸濁流体に対して有用な機能を果たしていたものであることもある。例示的な望ましくない成分としては、抗体、増殖因子、他のタンパク質およびポリマーが挙げられる。
【０２７１】
一部の細胞懸濁液には、異なる結合剤を有する粒子または異なる磁性材料から形成された粒子などの、異なるタイプの常磁性粒子が存在することができ、それによって結合剤の複雑な分離または反復除去が可能になる。任意の結合剤でコーティングされていてもよい追加の非常磁性粒子を、細胞に結合させることもできる。
【０２７２】
常磁性でない他の粒子が細胞懸濁液内に存在することもあり、それらの粒子が、常磁性粒子をコーティングするために使用される任意のものでコーティングされていることもある。
【０２７３】
モジュールは、細胞保存用バッグなどの任意の生物学的に適合性の材料から形成することができまたはそのような材料で裏打ちすることができる。細胞懸濁液または緩衝液と接触するシステム２の流体導管および任意の他の構成要素もまた、任意の生物学的に適合性の材料から形成することができまたはそのような材料で裏打ちすることができる。
【０２７４】
細胞懸濁液または緩衝液と接触するシステム２の構成要素を、細胞懸濁液との接触前に滅菌することができる。
【０２７５】
システム２の構成要素は、使い捨てのものであってもよい。細胞懸濁液と接触する構成要素は、特に、汚染および無菌性の懸念を回避するために使い捨てのものであるだろう。
【０２７６】
図２Ａは、ｘ配向の磁石構成のフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８の横断面模式図であり、その一方で、図２Ｂは、同じ構成の同じ磁気分離モジュール８の半透明３次元模式図である。フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８は、壁５２によって規定されているフローチャンバ５０を備えている。外部の双極子磁石５４が、磁力線５６を生じさせる。磁石５４は、可動プラットフォーム６０上に収納されている。フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８は、入口６２および出口６４をさらに備えており、それらに通して、細胞懸濁液をモジュール８にｙ方向に流すことができる。
【０２７７】
図２Ａおよび図２Ｂは、１列の磁石５４が描かれているが、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８は、図４Ａに示されているように２列以上を有してもよく、１列に２つより多くの磁石を有してもよい。加えて、磁石５４は、常設位置にあってもよく、その場合、分離／脱ビーズ化モジュール８は、可動プラットフォーム６０を欠いていてもよくまたは可動フローチャンバ５０を有してもよい。さらに、磁石５４は、ｘ配向の構成で示されているが、ｙ配向またはｘ−ｙ交差配向を含めて、ｘ−ｙ平面において任意の角度であることができる。
【０２７８】
入口６２および出口６４は、チャンバ５０を通る細胞懸濁液の層流を確立するのに十分な任意の構成を有することができる。入口の幾何形状、出口の幾何形状および流量全てが、チャンバ５０を通る細胞懸濁液の流れに影響を与える。いくつかの場合において、乱流が許容されることもある。
【０２７９】
壁５２は、剛性構造であってもよくまたは可撓性であってもよい。例えば、壁５２は、細胞保存用バッグまたは他の同様の構成要素の壁であってもよい。壁５２が可撓性である場合、チャンバ５０のｚ方向の寸法は、チャンバ５０を通る細胞懸濁液の流量に依存して変動し得る。
【０２８０】
チャンバ５０のｚ方向の寸法は、５μｍ〜１００μｍの間、５μｍ〜５００μｍの間、もしくは５μｍ〜１０００μｍの間、５μｍ〜１ｃｍの間または一般に１００μｍ、５００μｍ、１０００μｍもしくは１ｃｍ以下であり得る。ｘ、ｙおよびｚ方向の両方の寸法を制限して、チャンバ５０を通って細胞または常磁性粒子を移動させるのに十分に高い流体力を達成することができる。
【０２８１】
磁石５４は、高い磁場強度を有することもある。例えば、磁石５４は、コバルトなどの別の金属と混ぜて合金にされた、ネオジムまたはサマリウムなどの希土類金属を含有し得る。磁石５４は、描かれているような双極子磁石であってもよくまたは四重極（quadrapole）磁石などの他のタイプの磁石であってもよい。磁石５４は、調整可能な磁場強度を有することもある。例えば、磁石５４は、電磁石であってもよい。磁石５４を、チャンバ５０の同じ側にある磁石の磁気引力を最大にするように配置してもよく、チャンバ５０の反対側にある磁石の磁力反発を最大にするように配置してもよくまたはその両方であってもよい。図２Ａには特定の磁石構成が描かれているが、達成すべき効果に依存して、磁石の極性が逆である構成を使用してもよくまたは一致している構成を使用してもよい。
【０２８２】
図３は、サブ膜流体注入ポート７２および磁石５４の上に位置する膜７０を有するフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８の側面縦断面模式図である。緩衝モジュール６または別の流体モジュールからの流体を流体注入ポート７２経由で導入して、膜７０付近に位置する細胞の脱ビーズ化を助長することができる。
【０２８３】
可動プラットフォーム６０は、ｚ方向に移動可能であり得、したがって、図２Ａおよび図２Ｂに示されているようにチャンバ５０に隣接する位置からまたはチャンバ５０に近接する位置（図示せず）から、チャンバ５０から離れた位置（図７Ｃに示されている通り）への、ｚ方向の磁石５４の移動が可能である。例えば、チャンバ５０から離れた位置は、最も近い壁５２から少なくとも１ｃｍであり得る。この離れた位置は、磁石５４がそれらの磁界によりチャンバ５０内のいずれかの常磁性粒子に実質的な影響を与えることを防止するのに十分なものである。磁気絶縁材を磁石５４とチャンバ５０の間に挿入すれば、この位置距離は、実質的により短くなり得る。磁石５４が調整可能な磁場強度を有する場合、磁石５４を移動させるのではなく、より低い磁場強度または磁場強度ゼロに単に調整して、チャンバ５０内の任意の常磁性粒子に対する一切の実質的影響を回避することができる。
【０２８４】
詳細には、ゼロ勾配構成を使用する場合、モジュール８は、図４Ａおよび図４Ｂに描かれているように、上の列の磁石５４および下の列の磁石５４を有し得る。可動プラットフォーム６０は、ｘ−ｙ平面において回転可能であってもよくまたは磁石５４がｘ−ｙ交差配向構成、例えば、図４Ｃのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８の上面縦断面模式図に描かれている構成になるように、磁石５４を永久配向させてもよい。ゼロ勾配構成での使用のために、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８は、２つの入口６２、非磁性入口６２ａおよび磁性入口６２ｂ、ならびに２つの出口６４、磁性出口６４ａおよび非磁性出口６４ｂ、を有し得る。この場合、モジュール８が使用されているときに、ｘ−ｙ交差配向方向のゼロ勾配線５８がゼロ勾配フィルターを形成する。図４Ｄに図示されているように、追加の磁石５４を含めることで、同じモジュール８内に２つのゼロ勾配線５８ａおよび５８ｂをもたらすことができ、それにより異なる出口６４ａおよび６４ｂへの異なる常磁性粒子の分離が可能になるかまたはバックアップフィルターが得られる。
【０２８５】
ゼロ勾配線５８は、図２Ａおよび図２Ｂに描かれているように、磁石５４が隣接しているのではなく互いから十分に離隔されている場合、ｘ方向の寸法を有するゼロ勾配帯になり得る。
【０２８６】
フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールとともに使用するための磁石は、細胞懸濁液が流動するチャンバの外部に位置してもよくまたはチャンバの内部に位置してもよい。磁石が内部にある場合、磁石を生体適合性材料でコーティングしてもよい。特に、磁石が内部にある場合、磁石は、使い捨てのものである。
【０２８７】
図１Ｂは、並列に複数のフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８ａ、８ｂおよび８ｃを備えている細胞処理システム２の模式図である。３つのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８しか図示されていないが、前記複数は、２より多くの任意の数であり得る。フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８が並列に存在する場合、それらのモジュールは、通常は、同じタイプかつ同じ構成のものであることになり、したがって、各モジュールにより同じ機能が果たされる。並列フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８は、追加のモジュールと組み合わされたとき、迅速な細胞懸濁液の処理または流体容量管理に特に有用であり得る。加えて、モジュールを全て同時に使用する必要があるので、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８を並列に配置することは、流体流の制御に自由度を与える。
【０２８８】
図１Ｃは、直列に複数のフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８ａ、８ｂおよび８ｃを備えている細胞処理システム２の模式図である。３つのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８しか図示されていないが、前記複数は、２より多くの任意の数であり得る。フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８が直列に存在する場合、それらのモジュールは、各モジュールにより同じ機能が果たされるように同じタイプおよび構成のものであってもよいが、通常は、各モジュールにより異なる機能が果たされるように、異なるタイプおよび構成のものであることになる。例えば、モジュール８ａは、常磁性粒子結合細胞と非結合細胞を分離することができ、モジュール８ｂは、常磁性粒子結合細胞を脱ビーズ化することができ、モジュール８ｃは、より大きい磁場勾配下で常磁性粒子結合細胞を脱ビーズ化することができる。
【０２８９】
図１Ｄは、リターンループ１４によって常磁性粒子結合細胞が戻ってフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８を通るように方向付けられる、細胞処理システム２の模式図である。そのようなシステムを使用して、リターンループ１４のない同様のシステムと比較して、常磁性粒子結合細胞と非結合細胞のより良好な分離または非結合細胞と常磁性粒子のより良好な脱ビーズ化もしくは分離を達成することができる。流体を弁またはスイッチによってリターンループ１４にまたは磁気アウトプットモジュール１２に向かわせることができる。
【０２９０】
図１Ｅは、細胞懸濁モジュール４および緩衝モジュール６がフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８に別々に接続されている細胞処理システム２の模式図である。そのようなシステムは、図５に示され、図５に関して記載されるように、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８がｘ−ｙ交差配向構成で２つの入口６２および２つの出口６４ならびに磁石５４を有する場合、特に有用であり得る。
【０２９１】
図１Ｆは、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８の下流に位置する回転膜脱ビーズ化モジュール１８を伴う細胞処理システム２の模式図である。回転膜脱ビーズ化モジュール１８は、廃棄物アウトプットモジュール２０および細胞アウトプットモジュール２２に接続されている。このシステム２では、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８が常磁性粒子結合細胞と非結合細胞を分離し、その一方で、回転膜脱ビーズ化モジュール１８が全ての脱ビーズ化を行うかまたはフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８が脱ビーズ化も行うことがある。化学薬品などの試薬が回転膜脱ビーズ化モジュール１８内の懸濁流体に添加される場合、試薬モジュール２４が適宜存在し得る。図１Ｆには１つの回転膜脱ビーズ化モジュール１８が示されているが、システム２は、複数のモジュール１８を直列または並列に備えることができる。モジュール１８が直列に存在する場合、化学薬品を最後のモジュール１８にのみ添加して、細胞の化学薬品への曝露を最小にすることができる。
【０２９２】
試薬モジュール２４内の試薬は、粒子と細胞間の結合を弱める任意の化学薬品であり得る。粒子は、常磁性粒子であってもよくまたは非常磁性粒子であってもよい。
【０２９３】
図５Ａは、回転膜脱ビーズ化モジュール１８の縦断面模式図である。このモジュール１８は、サンプル入口８０を備えており、このサンプル入口８０によって、円筒形側壁８４により部分的に規定されており、同軸方向に配向されている円筒形回転膜８６を収容している、円筒形脱ビーズ化チャンバ８２への、細胞懸濁液の流入が可能になる。壁８４は、その外部に磁石８８が一列に並べられている。脱ビーズ化チャンバ１８は、回転膜８６を通過した流体を廃棄物アウトプットモジュール２０経由で退出させるが、残りの流体および細胞は、細胞アウトプットモジュール２２経由で退出する。回転膜８６は、細胞の平均直径より小さい、しかし脱ビーズ化によって除去されることになるいずれの非常磁性粒子より大きい、平均細孔経を有する。この平均細孔経はまた、除去されることになるいずれの常磁性粒子より大きいものであることができ、これは、主要な粒子除去方法としてまたは磁気除去のバックアップとして、回転膜によるこれらの常磁性粒子の除去を可能にする。
【０２９４】
磁石８８は、図５Ｂに示されているように壁８４を実質的に包囲していてもよくまたは図５Ｃに示されているように壁８４に沿って間隔を空けて配置されていてもよい。磁石８８を可動プラットフォームに載置して、図５Ａ〜図５Ｃに示されているように壁８８に隣接したまたは壁８８に近接した位置（図示せず）から、壁８４から離れた位置への、磁石８８の移動を可能にすることができる。例えば、前記離れた位置は、壁８４から少なくとも１ｃｍであり得る。離れた位置へのこの移動は、磁石８８がそれらの磁界によりチャンバ８２内の任意の常磁性粒子に対して実質的な影響を与えるのを防止する。磁気絶縁材を磁石８８とチャンバ８２の間に挿入すれば、この位置距離（position distant）は、磁気絶縁材が存在しなかった場合より短くなり得る。磁石８８が調整可能な磁場強度を有する場合、磁石８８を移動させるのではなく、より低い磁場強度または磁場強度ゼロに単に調整して、チャンバ８２内の任意の常磁性粒子に対する実質的影響を回避することができる。
【０２９５】
複数の磁石８８が図５に示されているが、単一の磁石８８しか有さないことも可能である。
【０２９６】
磁石８８は、高い磁場強度を有することもある。例えば、磁石８８は、コバルトなどの別の金属と混ぜて合金にされた、ネオジムまたはサマリウムなどの希土類金属を含有し得る。磁石８８は、双極子磁石、四重極磁石または任意の他のタイプの磁石であってもよい。磁石８８は、調整可能な磁界強度を有することもあり、例えば、電磁石であってもよい。磁気引力を最大にするために、例えば巻かれた構成で、磁石８８を配置してもよい。
【０２９７】
回転膜モジュールとともに使用するための磁石は、細胞懸濁液が流動するチャンバの外部に位置してもよくまたはチャンバの内部に位置してもよい。磁石が内部にある場合、磁石を生体適合性材料でコーティングしてもよい。特に、磁石が内部にある場合、磁石は、使い捨てのものであるだろう。
【０２９８】
本明細書で開示されるモジュールにおける使用に好適な例示的回転膜としては、ＬＯＶＯ（登録商標）細胞処理システム（Fresenius Kabi, Fenwal, Lake Zurich, IL）に使用されている４μｍトラックエッチングポリカーボネート回転膜およびＩＳＯＬＥＸ（登録商標）磁気細胞分離システム（Baxter, Deerfield, IL）に使用されている回転膜が挙げられる。
【０２９９】
図２〜４に記載のフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８または図５に記載の磁気回転膜脱ビーズ化モジュール１８を包含する、図１Ａ〜図１Ｆの要素は、細胞処理システム２において、行われることになる具体的な細胞処理に依存して、互いに組み合わせることができる。これらの要素を描かれているように組み合わせてもよくまたは他の妥当な変形形態で組み合わせてもよい。例えば、脱ビーズ化に使用されるときのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８内の懸濁流体に化学薬品を添加するために、試薬モジュール２４を図１Ａにそれ以外は描かれているシステムに含めてもよい。適切な流体容量および流量を特にモジュール８および１８内で確保するために、モジュール（追加の緩衝モジュールまたはアウトプットモジュールを包含する）を配置してもよく、使用してもよい。
【０３００】
複数のモジュールおよびループを併せ持つ１つの例示的な細胞処理システム２が図１Ｇに示されている。このシステムは、第１のフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８ａに接続されている、細胞懸濁モジュール４および緩衝モジュール６ａを備えており、前記第１のフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８ａは、非磁気アウトプットモジュール１０ａおよび磁気アウトプットモジュール１２ａを有する。磁気アウトプットモジュール１２ａは、第２の直列フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８ｂに接続されており、この第２の直列フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８ｂは、緩衝モジュール６ｂにも接続されており、非磁気アウトプットモジュール１０ｂと、磁気アウトプットモジュール１２と、リターンループ１４ａとを有する。リターンループ１４ａは、戻ってモジュール８ｂにつながっている。磁気アウトプットモジュール１２ｂは第１の回転膜脱ビーズ化モジュール１８ａにつながっており、この第１の回転膜脱ビーズ化モジュール１８ａは、廃棄物アウトプットモジュール２０ａおよび細胞アウトプットモジュール２２ａを有する。細胞アウトプットモジュール２２ａは、第２の直列回転膜脱ビーズ化モジュール１８ｂにつながっており、この第２の直列回転膜脱ビーズ化モジュール１８ｂはまた、廃棄物アウトプットモジュール２０ｂ、リターンループ１４ｂおよび細胞アウトプットモジュール２２ｂばかりでなく、試薬モジュール２４にも接続されている。リターンループ１４ｂは、戻って第２の直列フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８ｂにつながっている。
【０３０１】
特有の流体導管を備えている様々な追加のモジュールを有する別の例示的細胞処理システム２が図１Ｈに示されている。細胞懸濁モジュール４と、空であってもよくまたは緩衝液を収容していてもよい、サテライトモジュール３０とが、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８に接続されている。フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８は、別途、緩衝モジュール６および貯蔵モジュール２６に接続されている。貯留モジュール２６は、回収モジュール２８にさらに接続されている。多くの接続が、スパイクチューブ３２を使用して行われている。このシステムは、様々な流体導管に沿って、ローラクランプ３４、溶接部３６、スライドクランプ３８およびピンチクランプ４０をさらに含む。
【０３０２】
細胞処理システム２は、磁気カラム、他の物理的分離モジュール、細胞洗浄モジュール、細胞高濃度化モジュールおよび培地交換モジュールなどの、様々な追加のモジュール１６を含むことができる。
【０３０３】
細胞分離および脱ビーズ化方法
システム２は、フロースループロセスにおいて常磁性粒子結合細胞と非結合細胞の分離、磁性粒子結合細胞の脱ビーズ化、常磁性粒子と非結合細胞の分離またはこれらの任意の組合せに使用することができる。フロースループロセスにおいて、全ての細胞は、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８内にある間、動き続ける。モジュール８を通過して、壁５２に沿って停止する常磁性粒子結合細胞は、存在しないか、０.０１％以下であるか、０.０５％以下であるか、１％以下である。
【０３０４】
フロースルー磁気分離／脱ビーズ化プロセス
図１Ａのシステムを使用するフロースループロセスでは、緩衝モジュール６からの緩衝液を該モジュール８経由で非磁性出力モジュール１０もしくは磁気アウトプットモジュール１２または別のアウトプットもしくは追加のモジュール１６へ流すことによって、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８を、適宜、プライミングすることができる。常磁性粒子結合細胞を含有する細胞懸濁液が、モジュール８に流される。
【０３０５】
システム２が分離のために構成されている場合、細胞懸濁液は、非磁気アウトプットモジュール１０に向かわされる。緩衝６からの緩衝液がモジュール８経由で磁気アウトプットモジュール１２へと流れる間に常磁性粒子を誘引しないように、モジュール８を周期的に構成することができる。細胞のより良好な分離および磁性または非磁性細胞生成物の高い純度を確実なものにするために、細胞懸濁液をループ１４によってモジュール８の２回目以降の通過に向かわせることができる。常磁性粒子結合細胞を、追加の構成要素１６、例えば、脱ビーズ化用に構成されたフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８にまたは回転膜脱ビーズ化モジュール１８に、向かわせることができる。
【０３０６】
システム２が脱ビーズ化用に構成されている場合、モジュール８を通って流れた後、細胞懸濁液は、非磁気アウトプットモジュール１０に向かわされる。あるいは、細胞懸濁液を、非磁気アウトプットモジュール１０に向かわせる前に、ループ１４によってモジュール８の２回目以降の通過に向かわせることができる。
【０３０７】
フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８を使用するプロセスは、少なくとも１つの常磁性粒子１０２が結合している常磁性粒子結合細胞１００の各々に流体（剪断または牽引）力１０４をかける。各細胞１００には、図６に示されているように磁力１０６もかかる。常磁性粒子１０２が常磁性粒子結合細胞１００と結合した状態を維持するように流体力１０４と磁力１０６を併用することができ、それによって非結合細胞からの細胞１００の分離が可能になる。常磁性粒子１０２を常磁性粒子結合細胞から切り離させるように流体力１０４と磁力１０６を併用することもでき、それによって細胞１００の脱ビーズ化が可能になる。拡散および重力などの二次的な力も常磁性粒子１０２に対して作用するが、脱ビーズ化に対するそれらの影響は、通常は流体力および磁力よりはるかに小さく、モジュールを通る適切な流量を計算するときに無視されることが多い。
【０３０８】
システム２は、一般に、可能な限り迅速に、所望の細胞がもはやモジュールの通過の対象にならないように構成することができ、それによって細胞の損傷が低減される。例えば、脱ビーズ化構成では、磁気アウトプットモジュール１２のみが、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８へのリターンループを含むことができ、それによって、より分離困難な形で（recalcitrantly）結合している常磁性粒子を有する細胞より少ない回数の、より容易に脱ビーズ化された細胞によるモジュール８の通過が可能になる。
【０３０９】
フロースルーモジュール８は、層流のものであってもよくまたは乱流のものであってもよい。磁力１０６は、常磁性粒子１０２の飽和磁束（ｍｓ）による影響を受ける。磁力１０６は、常磁性粒子１０２がさらされる磁場５６の強度による影響も受け、その磁場の強度は、磁石５４の強度はもちろん、チャンバ５０のｚ方向の深さおよびそのチャンバ内の細胞１００の位置による影響も受ける。磁力１０６は、常磁性粒子１０２がチャンバ５０を通って移動するときにさらされる磁場勾配による影響をさらに受け、その磁場勾配は、磁石５４の強度および配置はもちろん、磁石５４に対する常磁性粒子１０２の位置による影響も受ける。
【０３１０】
加えて、流体力は、流体の流速による影響を受け、この流速は、通常はチャンバの中心部で最も速く、壁でゼロになる。これは、壁に付着した細胞が、それらの常磁性粒子から切り離されるのに十分な流体力を受けることができないことおよび壁に沿っている細胞が主として静止した状態であり得、下流の細胞を流体力から遮蔽し得ることを意味する。これは、所望の細胞の損失をもたらすが、細胞懸濁液をチャンバ５０に継続的に流すことによって回避される。この損失は、細胞が磁力によって静止した状態にされないフロースルーアプローチによって回避することができる。流体の流速がチャンバ全体にわたって均一であるプラグフローモジュールなどの、壁での速度がゼロまたはほぼゼロにならないモジュールによっても、この損失を回避することができる。
【０３１１】
フロースルー分離プロセス
フロースルー分離プロセスは、図２Ａおよび図２Ｂに示されているような構成のフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８を使用して行うことができる。流量は、流体力１０４および磁力１０６によって常磁性粒子１０２が細胞１００に結合した状態を維持することができるような流量である。流量は、細胞１００が流体力によって溶解されないような流量でもある。
【０３１２】
図７Ａは、常磁性粒子結合細胞１００および非結合細胞１１０がチャンバ５０に入ったばかりのときの図２Ｂのモジュール８を示す。図７Ｂでは、細胞１００は停止してしまったが、非結合細胞１１０は元の速度で進み続けている。図７Ｃでは、磁石が遠ざかってしまい、細胞１００は、移動し続けているが、非結合細胞１１０は、チャンバ５０から退出してしまった。
【０３１３】
磁石５４がチャンバ５０に隣接または近接しているときにチャンバ５０から退出する懸濁流体は、非磁気アウトプットモジュール１０に入る。周期的に、細胞懸濁液モジュール４からの細胞懸濁液流は停止され、緩衝液は緩衝モジュール６からチャンバ５０に流入し、その間に磁石５４はチャンバ５０から遠ざかって、常磁性粒子結合細胞１００を緩衝液により磁気アウトプットモジュール１２内に押し流させる。
【０３１４】
このフロースルー分離プロセスは、特に細胞によるモジュール８の複数回の通過を可能にするために繰り返された場合、細胞懸濁液から、それが非磁気アウトプットモジュール１０に入る前に、常磁性粒子結合細胞１００の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％を除去することができる。細胞がモジュール８を一度だけ通過する単回通過プロセスの方が、効率は低い。例えば、単回通過プロセスの場合、モジュール８は、細胞懸濁液から、それが非磁気アウトプットモジュール１０に入る前に、常磁性粒子結合細胞１００の少なくとも２５％または少なくとも５０％を除去することができる。非磁気または磁気アウトプットのいずれかによるフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８の単回または複数回の通過により、結果として、１％以下の非結合細胞１１０を有し、フロースルー分離プロセス前に細胞懸濁液中で見出される常磁性粒子結合細胞１００の少なくとも９９％を含有する、常磁性粒子結合細胞生成物；１％以下の常磁性粒子結合細胞１００を有し、フロースループロセス前に細胞懸濁液中で見出される非結合細胞１１０の少なくとも９９％を含有する、非結合細胞生成物；または両方を得ることができる。
【０３１５】
フロースルー脱ビーズ化プロセス
フロースルー脱ビーズ化プロセスは、図２Ａおよび図２Ｂに示されているような構成のフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８を使用して行うこともできる。流量は、流体力１０４および磁力１０６によって、細胞懸濁液中の細胞の平均で少なくとも１つの常磁性粒子１０２が、細胞１００がチャンバ５０を通過している間に、細胞１００から切り離されるような流量である。流量は、細胞が流体力によって溶解されないような流量でもある。
【０３１６】
図８Ａは、常磁性粒子結合細胞１００ａおよび１００ｂがチャンバ５０に入ったばかりのときの図２Ｂのモジュール８を示す。細胞１００ａは、１つの常磁性粒子１０２を有し、その一方、細胞１００ｂは、２つの常磁性粒子１０２を有する。図８Ｂでは、１つの常磁性粒子１０２がそれぞれ、細胞１００ａと細胞１００ｂの両方から切り離されて、壁５２で静止しているが、細胞１００ａおよび１００ｂは、チャンバ５０を通過し続けている。細胞１００ａは、もう常磁性粒子１０２一切を有していないが、細胞１００ｂは、１つの常磁性粒子１０２を保持している。この第２の常磁性粒子１０２を除去するために、細胞１００ｂにもう１度モジュール８を通過させてもよい。あるいは、細胞１００ａはチャンバ５０から退出するが、細胞１００ｂは、図７における常磁性粒子結合細胞と同様に、チャンバ５０内に留まるように、モジュール８を構成してもよい。
【０３１７】
このフロースルー脱ビーズ化プロセスは、常磁性粒子の少なくとも９９％を細胞から除去することができる。
【０３１８】
磁気アウトプットモジュール１２からの再循環ループ１４を含むシステム２を使用して、ＣＬＴ０１１９  Ｔ細胞を脱ビーズ化したとき、磁気アウトプットにおける細胞を緩衝モジュール６からの緩衝液に再懸濁させ、もう１度モジュール８を通過させ、その後、さらに３回目の通過を行った。このプロセスの結果と従来のストップフロープロセスの結果の比較が図９に提供されている。図９は、最終生成物中の細胞の数の、脱ビーズ化システムに入った細胞の数に対する比である、エンド・ツー・エンド収率（end-to-end yield）を提示するものである。
【０３１９】
図３に示されているフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８を使用して、図２Ａおよび図２Ｂに示されているようなモジュール８と同様に細胞を脱ビーズ化することができる。ポート７２経由で導入された流体は、膜７０からの細胞１００の離脱に十分な力を細胞１００に供給する。懸濁流体の速度が膜７０付近でゼロに近づいたため、これらの細胞は、他の方法では分離も脱ビーズ化もされない可能性があり、失われる可能性もあった。
【０３２０】
このフロースルー脱ビーズ化プロセスは、常磁性粒子の少なくとも９９％を細胞から除去することもできる。
【０３２１】
フロースルーゼロ勾配フィルタープロセス
フロースルー分離プロセスは、図４Ａおよび図４Ｂに示されているような構成のフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８を使用して行うことができる。流量は、流体力１０４および磁力１０６によって常磁性粒子１０２が細胞１００に結合した状態を維持することができるような流量である。流量は、細胞１００がチャンバ５０内で停止せず、流体力によって溶解もされないような流量でもある。様々な構成が図１０〜図１３に示されているが、これらの構成を、異なるゼロ勾配フィルタープロセスとともに使用するために、例えば、入口６２および出口６４の数および比例サイズを調整するために、変更することができる。例えば、異なるサイズの入口６２および出口６４を有することによって達成されるのと同じ効果を、通常はポンプによって制御される異なる流量を同じサイズの入口および出口経由で供給することによって達成することもできる。
【０３２２】
図１０は、常磁性粒子結合細胞１００がゼロ勾配構成でいかにしてモジュール８を通って流れるかについての基本的な記載を提示する。図１０Ａに図示されているように、モジュール８に入った後の細胞１００（左図）は、モジュール８からほぼ退出する時点（右図）まで、ｘ方向にゼロ勾配線５８の方に引っ張られる。図１０Ａおよび図１０Ｂに図示されているように、細胞１００は、モジュール８に入るとき（左図）または出口に接近したとき（右図）でさえ、ｙ方向またはｚ方向の磁力作用を受けない。
【０３２３】
図１１は、図４Ａに示されているように配向された磁石５４を有するゼロ勾配モジュール８を示す。このモジュールには、流体が入口６２経由で入る。磁性粒子１０２を伴う細胞１００は、ゼロ勾配線５８をたどり、磁性出口６４ｂに向かわされる。非結合細胞１１０は、ゼロ勾配線５８による影響を受けず、非磁性出口６４ａおよび６４ｃへと流れる。この構成では、いくつかの非結合細胞１１０も磁性出口６４ｂに入ることになる。
【０３２４】
図１２は、図４Ｃのモジュール８を通って移動する細胞を示す。常磁性粒子１０２を伴う細胞１００は、ゼロ勾配線５８をたどり、磁性出口６４ｂに向かわされる。非結合細胞１１０は、ゼロ勾配線５８による影響を受けず、非磁性出口６４ｂへと流れる。したがって、ゼロ勾配線５８は、磁気フィルターとして作用する一方で、全ての細胞が、いずれの壁５２の方にも押されることなく、チャンバ５０を通って移動し続けることを可能にする。図示されているように、非磁性入口６２ａは、磁性入口６２ｂより大きく、非磁性出口６４ｂは、磁性出口６４ａより大きい。モジュール８内の流体流が層流である場合、非磁性入口６２ａからの流体は、非磁性出口６４ｂへと横断し、その結果、一切の非結合細胞１１０の磁性出口６４ａへの進入が防止される。乱流を用いてこの方法を使用することもできるが、磁性出口６４ａへの非結合細胞の損失のため、効率は低くなる。
【０３２５】
このフロースルー分離プロセスは、細胞懸濁液から、それが非磁気アウトプットモジュール１０に入る前に、常磁性粒子結合細胞１００の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％を除去することができる。非磁気アウトプットまたは磁気アウトプットのいずれかによるフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８の複数回の通過により、結果として、１％以下の非結合細胞１１を有し、フロースルー分離プロセス前に細胞懸濁液中で見出される常磁性粒子結合細胞１００の少なくとも９９％を含有する、常磁性粒子結合細胞生成物；１％以下の常磁性粒子結合細胞１００を有し、フロースループロセス前に細胞懸濁液中で見出される非結合細胞１１０の少なくとも９９％を含有する、非結合細胞生成物；または両方を得ることができる。
【０３２６】
フロースルーゼロ勾配常磁性粒子選択プロセス
フロースルー常磁性粒子分離プロセスは、図４Ｃに示されているような構成のフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８を使用して行うこともできる。図１３は、モジュール８を通って移動する、脱ビーズ化された非結合細胞１１０および常磁性粒子１０２を示す。細胞１１０は、例えば、回転膜脱ビーズ化モジュール１８、非回転膜脱ビーズ化モジュールまたは脱ビーズ化構成の同じもしくは別個のモジュール８によって、事前に脱ビーズ化されたものである。あるいは、細胞１１０は、すでに常磁性粒子１０２の存在下にあってもよいが、常磁性粒子１０２と結合していなくてもよい。常磁性粒子１０２は、ゼロ勾配線５８をたどり、磁性出口６４ａに向かわされる。脱ビーズ化された非結合細胞１１０は、ゼロ勾配線５８による影響を受けず、非磁性出口６４ｂへと流れる。したがって、ゼロ勾配線５８は、磁気フィルターとして作用する一方で、細胞１１０が、いずれの壁５２の方にも押されることなく、チャンバ５０を通って移動し続けることを可能にする。
【０３２７】
このフロースルー常磁性粒子分離プロセスは、細胞懸濁液からビーズの少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％を除去することができる。
【０３２８】
このプロセスは、常磁性粒子を除去するとともに、細胞懸濁液の望ましくない成分も除去することができる。
【０３２９】
細胞分離プロセスおよび粒子分離プロセスは、上では別々に記載されているが、両方を同じモジュールまたはシステム内で同時に行うこともできる。例えば、分離モジュールは、通常は、常磁性粒子結合細胞と遊離常磁性粒子の両方を細胞懸濁液から除去することになる。
【０３３０】
回転膜脱ビーズ化プロセス
図１Ｆのシステム２を使用するフロースループロセスでは、分離された常磁性粒子結合細胞１００は、サンプル入口８０経由で図１４に示されているような回転膜モジュール１８に向かわされる。脱ビーズ化チャンバ８２において、回転膜８６は、細胞懸濁液中で再循環テイラークエット流を発生させ、入口８０から出口２０および２２へのチャンバ８２を通る流れによって発生する流体力に加えて、このテイラークエット流が流体力を生じさせる。結果として、常磁性粒子１０２は、なお流体力および磁力を受けるが、これらの力の関係およびこれらの力がどのように脱ビーズ化を生じさせるのかをモデル化するのは困難である。しかし、流体力は、少なくとも回転膜８０のサイズおよび回転速度、チャンバ８２を通る細胞懸濁液の流量、ならびに懸濁流体の粘度による影響を受ける。磁力は、常磁性粒子１０２の性質、磁石８８の性質およびモジュール１８の設計、特に、細胞１００と磁石８８間の距離による影響を受ける。流体力は、通常は、細胞を溶解するほど高くない。テイラークエット流は、細胞を壁８４および回転膜８６から離しておよびそれらと接触しないように保持するのに十分なものである。
【０３３１】
細胞１００から除去される常磁性粒子１０２は、壁８４へと泳動され、詳細には壁８４に沿ってゼロ勾配線またはゼロ勾配帯へと泳動される。一切の非常磁性粒子１２０もまた、流体力だけで細胞１００から除去される。非常磁性粒子１２０は、回転膜８６内の細孔を通過し、その後、廃棄物出口モジュール２０経由でチャンバ８２から退出する。任意の試薬チャンバ２４から添加される一切の化学薬品１２２もまた、回転膜８６内の細孔を通過し、廃棄物出口モジュール２０経由でチャンバ８２から退出する。これにより、化学薬品１２０への細胞１００の曝露が制限される。脱ビーズ化された非結合細胞１１０は、細胞出口モジュール２２経由でチャンバ８２から退出する。
【０３３２】
例えば、チャンバ８２を通る細胞懸濁液流を停止させること、磁石８８を壁８４から離れた位置に移動させること、次いで緩衝液をチャンバ８２に流すことによって、常磁性粒子１０２を壁８４から周期的に除去することができる。
【０３３３】
一部の常磁性粒子１０２は、回転膜８０を通過して除去されることもある。磁石８８がない場合またはチャンバ８２から十分に離れている場合、全ての常磁性粒子の除去を回転膜８０によって果たすことができる。
【０３３４】
このフロースルー脱ビーズ化プロセスは、細胞からの常磁性粒子の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９９％の除去、細胞からの全ての非常磁性粒子の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％の除去または両方を実施することもできる。
【０３３５】
回転膜を使用して、常磁性粒子１０２を非結合細胞１０２から分離することもできる。
【０３３６】
回転膜８６は、細胞懸濁液中の全ての細胞を排除するのに十分な小ささの細孔経を有することができる。
【０３３７】
回転膜モジュール１８を使用して、望ましくない成分を細胞懸濁液から除去することもできる。これらの成分は、回転膜８８によって単に濾過されることもありまたは常磁性粒子１０２、非常磁性粒子１２０、もしくは両方のコーティングと相互作用し、それらの粒子とともに除去されることもある。脱ビーズ化および望ましくない成分の除去を別々に行ってもよくまたは同時に行ってもよい。
【０３３８】
他の脱ビーズ化および常時性粒子分離プロセス
システム２は、モジュール設計になっているため、他の脱ビーズ化および常磁性粒子分離プロセスとの互換性もある。適切な追加のモジュール１６を挿入するだけでよい。例えば、磁性カラムを含むカラムおよび物理的分離方法は、細胞を脱ビーズ化するために使用されることが多く、それらを追加のモジュール１６として含めることができる。
【０３３９】
他の組込みプロセス
システム２は、そのモジュール設計のため、他の組込みプロセスとの互換性がある。これらのプロセスは、少なくとも１つの追加のモジュール１６において行うことができる。例えば、モジュールを使用して細胞を洗浄することができる。モジュールを使用して、細胞を高濃度化することもできる。モジュールを使用して、細胞が位置する培地を交換することができる。１つのモジュールをこれらの工程の１つより多くに使用することができる。
【０３４０】
複数モジュールのフロースループロセス
図１Ｇに示されているようなシステム２を複数モジュールのフロースループロセスにおいて使用することができる。適宜、緩衝剤モジュール６ａからの緩衝剤を、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８ａに、ならびに適宜、モジュール８ｂ、１８ａおよび１８ｂの１以上にも流すことができる。所望の常磁性粒子および非常磁性粒子結合細胞と望ましくない非結合細胞とを含有する細胞懸濁液がモジュール８ａに流され、このモジュール８ａは、分離のために図４に示されているように構成されているが、あるいは、このモジュール８ａを分離のために図２Ａおよび図２Ｂに示されているように構成することもできる。非結合細胞は、廃棄物として非磁気アウトプットモジュール１０ａに向かわされる。常磁性粒子結合細胞は、磁気アウトプットモジュール１２ａ経由でフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール８ｂに向かわされる。モジュール８ｂは、脱ビーズ化のために図２Ａおよび図２Ｂに示されているように構成されている。常磁性粒子結合細胞は、廃棄物として磁気アウトプットモジュール１２ｂに入る前に、少なくとも１回、リターンループ１４ａに流される。脱ビーズ化された非結合細胞は、非磁気アウトプットモジュール１０ｂ経由で回転膜脱ビーズ化モジュール１８ａへ送られる。一切の残存常磁性粒子および非常磁性粒子は除去され、非常磁性粒子は、廃棄物アウトプットモジュール２０ａに流入し、その一方、非結合常磁性粒子は、モジュール１８内に留まり、非結合細胞および常磁性粒子、非常磁性粒子または両方を伴う細胞は、細胞アウトプットモジュール２２ａに流入する。細胞アウトプットモジュール２２ａは、第２の回転膜モジュール１８ｂにつながっている。細胞からの常磁性粒子もしくは非常磁性粒子のいずれかまたは両方の除去を助長することができる化学薬品が、試薬モジュール２４から添加される。非常磁性粒子および化学薬品は、廃棄物モジュール２０ｂに流入する。常磁性粒子は、モジュール１８内に留まる。非結合細胞および常磁性粒子、非常磁性粒子のいずれかまたは両方を伴う細胞は、フロースループロセスの最終細胞生成物として細胞アウトプットモジュール２２ｂへ送られる前に、少なくとも１回、リターンループ１４ｂに流入する。
【０３４１】
臨床応用
本明細書におけるプロセスの全ては、臨床適正製造基準（clinical good manufacturing practice）（ｃＧＭＰ）の基準に従って行うことができる。
【０３４２】
これらのプロセスは、特に、製造プロセス開始時の出発原料（特に細胞）の収集中、ならびに細胞療法用の細胞の選択または拡大のための製造プロセス中の、細胞精製、濃縮、回収、洗浄、高濃度化にまたは細胞培地の交換に使用することができる。
【０３４３】
細胞は、任意の複数の細胞を包含し得る。細胞は、同じ細胞型のものであってもよくまたは混合細胞型のものであってもよい。加えて、細胞は、細胞療法のための、自己ドナーまたは単一の同種異系ドナーなどの、１ドナーからのものであり得る。細胞は、例えば、白血球アフェレーシスまたはアフェレーシスによって患者から得ることができる。細胞は、Ｔ細胞を包含することができ、例えば、５０％より多くのＴ細胞、６０％より多くのＴ細胞、７０％より多くのＴ細胞、８０％より多くのＴ細胞または９０％より多くのＴ細胞を有する集団を包含し得る。
【０３４４】
選択プロセスは、培養および拡大前の細胞の選択に特に有用であり得る。例えば、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８でコーティングされた常磁性粒子を使用して、拡大のためのまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もしくは他のタンパク質をコードする核酸の導入のための、Ｔ細胞を選択することができる。そのようなプロセスは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の処置のためのＣＴＬ０１９  Ｔ細胞を産生させるために使用される。
【０３４５】
本明細書で開示される脱ビーズ化プロセスおよびモジュールは、細胞療法用の細胞の製造に、例えば、培養および拡大の前または後の細胞の精製に、特に有用であり得る。例えば、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた常磁性粒子を使用して、Ｔ細胞、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または他のタンパク質をコードする核酸の導入により、ＣＡＲがＴ細胞によって発現されるように修飾されているまたは修飾されることになるＴ細胞を、選択的に拡大させることができる。そのようなＴ細胞の製造中に、脱ビーズ化プロセスまたはモジュールを使用して、Ｔ細胞を常磁性粒子から分離することができる。そのような脱ビーズ化プロセスまたはモジュールは、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療のためのＣＴＬ０１９  Ｔ細胞を産生させるために使用される。
【０３４６】
ここで開示される１つのそのようなプロセスにおいて、細胞、例えばＴ細胞は、アフェレーシス（例えば、白血球アフェレーシス）によってドナー（例えば、自己キメラ抗原受容体Ｔ細胞生成物を用いて治療されることになる患者）から収集される。次いで、収集された細胞を、例えば水簸工程により、適宜精製することができる。次いで、常磁性粒子、例えば、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコーティングされた常磁性粒子を細胞集団に添加して、Ｔ細胞を拡大させることができる。このプロセスは、１以上の所望のタンパク質、例えばＣＡＲ、例えばＣＤ１９を標的とするＣＡＲをコードする核酸が、細胞内へ導入される、形質導入工程も包含し得る。核酸をレンチウイルスベクターで導入してもよい。次いで、細胞、例えば、レンチウイルスによって形質導入された細胞は、数日間、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日以上の間、例えば、好適な培地の存在下で、拡大させることができる。拡大後、本明細書で開示される脱ビーズ化プロセス／モジュールを使用して、所望のＴ細胞を常磁性粒子から分離することができる。このプロセスは、本開示のプロセスによる１以上の脱ビーズ化工程を包含することができる。次いで、脱ビーズ化された細胞を患者への投与のために製剤化することができる。ＣＡＲ  Ｔ細胞およびそれらの製造の例は、例えば、ＷＯ２０１２／０７９０００号にさらに記載されており、この特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本開示のシステムおよび方法は、ＷＯ２０１２／０７９０００号に記載されているまたはそれに関連する任意の細胞分離／精製／脱ビーズ化プロセスに使用することができる。
【０３４７】
本明細書におけるシステムおよび方法は、従来のシステムおよび方法と比較して、廃棄する所望の細胞がより少ないこと、生じさせる細胞損傷がより少ないこと、ならびに化学薬品へのより少ない曝露でまたは曝露なしで磁性および任意の非常磁性粒子を細胞からより確実に除去することにより、他の細胞療法製品にも同様に役立ち得る。
【０３４８】
本開示の単なる例示的な実施形態を上記で具体的に記載したが、本開示の趣旨および所期の範囲から逸脱することなく、これらの例の変更形態および変形形態が可能であることは理解されるであろう。例えば、磁気モジュールおよびそれらを含むシステムは、記載したものに加えて、様々な構成で配置および使用することができる。加えて、システムおよび方法は、本明細書で具体的に記載されない追加の構成要素および工程を包含し得る。例えば、方法は、気泡を除去して細胞懸濁液または緩衝液の移動に対する抵抗を低下させるために最初に流体を構成要素に導入する、プライミングを包含し得る。さらに、実施形態は、ここに記載する方法とともに使用するための、ここに記載するシステムの一部分しか包含しないこともある。例えば、実施形態は、細胞を分離または脱ビーズ化して細胞生成物を産生することができる完全なシステムを形成するための使い捨てでない機器内で使用可能な使い捨てモジュール、ホースなどに関することもある。
【０３４９】
ここに記載するフロースルーデバイスまたは細胞処理システムの様々な態様の実施形態は、以下の番号付きの項のいずれかで定義することができる。
【０３５０】
１. 少なくとも１つの細胞懸濁モジュールと、
少なくとも１つの緩衝モジュールと、
少なくとも１つのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールと、
少なくとも１つの非磁気アウトプットモジュールと、
少なくとも１つの磁気アウトプットモジュールと
を含む細胞処理システム。
【０３５１】
２. 少なくとも１つのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールの上流に戻る少なくとも１つのリターンループをさらに含む、第１項に記載の細胞処理システム。
【０３５２】
３. 少なくとも２つのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールを並列に含む、第１項に記載の細胞処理システム。
【０３５３】
４. 少なくとも２つのフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールを直列に含む、第１項に記載の細胞処理システム。
【０３５４】
５. 少なくとも１つの追加のモジュールをさらに含む、第１項に記載の細胞処理システム。
【０３５５】
６. 前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの回転膜脱ビーズ化モジュールを含む、第５項に記載の細胞処理システム。
【０３５６】
７. 少なくとも２つの回転膜脱ビーズ化モジュールを並列に含む、第６項に記載の細胞処理システム。
【０３５７】
８. 少なくとも２つの回転膜脱ビーズ化モジュールを直列に含む、第６項に記載の細胞処理システム。
【０３５８】
９. 前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの物理的分離モジュールを含む、第５項に記載の細胞処理システム。
【０３５９】
１０. 前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの磁性カラムモジュールを含む、第９項に記載の細胞処理システム。
【０３６０】
１１. 前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの培地交換モジュールを含む、第５項に記載の細胞処理システム。
【０３６１】
１２. 前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの細胞高濃度化モジュールを含む、第５項に記載の細胞処理システム。
【０３６２】
１３. 前記少なくとも１つの追加のモジュールが、少なくとも１つの細胞洗浄モジュールを含む、第５項に記載の細胞処理システム。
【０３６３】
１４. 前記フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールが、
壁により規定されており、ｘ方向、ｙ方向およびｚ方向を有するチャンバと、
前記チャンバの前記ｙ方向の両端に配置されている入口および出口と、
前記チャンバの壁に隣接または近接しており、前記チャンバ内の前記入口と前記出口の間にゼロ勾配線を確立するように配置されている、少なくとも２つの磁石と
を含む、第１項に記載の細胞処理システム。
【０３６４】
１５. 前記回転膜脱ビーズ化モジュールが、
円筒形側壁により部分的に規定されている脱ビーズ化チャンバと、
内部があり、前記円筒形側壁と同軸方向に配向されている、多孔質回転膜と、
サンプル入口と、
前記回転膜の内部に接続されている廃棄物アウトプットモジュールと、
前記脱ビーズ化チャンバに接続されている細胞アウトプットモジュールと
を含む、第６項に記載の細胞処理システム。
【０３６５】
１６. 前記回転膜脱ビーズ化モジュールが、円筒形側壁に隣接または近接している少なくとも１つの磁石をさらに含む、第１５項に記載の細胞処理システム。
【０３６６】
１７. 壁により規定されており、ｘ方向、ｙ方向およびｚ方向を有するチャンバと、
前記チャンバの前記ｙ方向の両端に配置された入口および出口と、
前記チャンバの壁に隣接または近接しており、前記チャンバ内の前記入口と前記出口の間にゼロ勾配線を確立するように配置されている、少なくとも２つの磁石と
を含む、フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール。
【０３６７】
１８. 少なくとも２つの入口および少なくとも２つの出口を含む、第１７項に記載のモジュール。
【０３６８】
１９. 前記チャンバの壁に隣接または近接しており、前記チャンバ内の前記入口と前記出口の間に少なくとも２本のゼロ勾配線を確立するように配置されている、少なくとも３つの磁石をさらに含む、第１７項に記載のモジュール。
【０３６９】
２０. 前記チャンバのｚ方向の両端に２列に配置されている少なくとも４つの磁石をさらに含む、第１７項に記載のモジュール。
【０３７０】
２１. 前記チャンバのｚ方向の両側に２列に配置されており、ｘ−ｙ平面において前記チャンバのｚ方向の１つの入口付近から反対端の１つの出口付近まで交差配向されている、少なくとも４つの磁石をさらに含む、第１８項に記載のモジュール。
【０３７１】
２２. 少なくとも２つの磁石にも隣接している前記チャンバの壁に隣接しているサブ膜注入ポートと；
前記サブ膜に隣接している膜と
をさらに含む、第１７項に記載のモジュール。
【０３７２】
２３. 円筒形側壁により部分的に規定されている脱ビーズ化チャンバと、
内部があり、前記円筒形側壁と同軸方向に配向されている、多孔質回転膜と、
サンプル入口と、
前記回転膜の内部に接続されている廃棄物アウトプットモジュールと、
前記脱ビーズ化チャンバに接続されている細胞アウトプットモジュールと、
前記円筒形側壁に隣接または近接している少なくとも１つの磁石と
を含む、回転膜脱ビーズ化モジュール。
【０３７３】
２４. 試薬モジュールをさらに含む、第２３項に記載の回転膜脱ビーズ化モジュール。
【０３７４】
２５. 前記多孔質回転膜が、脱ビーズ化されることになる粒子の径より大きく、かつ脱ビーズ化されることになる細胞の径より小さい、細孔経を有する、第２３項に記載の回転膜脱ビーズ化モジュール。
【０３７５】
２６. フロースルー細胞処理の方法であって、
常磁性粒子結合細胞を含む細胞懸濁液をフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールに流して、非結合細胞生成物を生じさせることを含み、
前記常磁性粒子結合細胞が、流動工程によりフロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール内を移動し続け、
前記フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールが、
壁によって規定されている流動チャンバであって、前記細胞懸濁液が流動する流動チャンバと、
少なくとも１つの壁に隣接または近接して配置されている少なくとも２つの磁石と
を含む、方法。
【０３７６】
２７. 前記細胞懸濁液が、前記フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールに層状に流される、第２６項に記載の方法。
【０３７７】
２８. 前記細胞懸濁液が、非結合細胞をさらに含み、前記フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールに前記細胞懸濁液を流すことにより、前記常磁性粒子結合細胞と前記非結合細胞が分離される、第２６項に記載の方法。
【０３７８】
２９. 前記細胞懸濁液が、遊離常磁性粒子をさらに含み、前記フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールに前記細胞懸濁液を流すことにより、前記遊離常磁性粒子と前記非結合細胞が分離される、第２８項に記載の方法。
【０３７９】
３０. 分離された非結合細胞を、リターンループを使用して２回もしくはそれに続く回数、前記フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールに流すことをさらに含む、第２８項に記載の方法。
【０３８０】
３１. 分離された常磁性粒子結合細胞を、リターンループを使用して２回もしくはそれに続く回数、前記フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールに流すことをさらに含む、第２８項に記載の方法。
【０３８１】
３２. ２回目以降の間に前記フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュール内で前記常磁性粒子結合細胞を脱ビーズ化して、常磁性粒子と脱ビーズ化された非結合細胞とを生じさせることをさらに含む、第３１項に記載の方法。
【０３８２】
３３. 生じた常磁性粒子および脱ビーズ化済み非結合細胞を３回以上、前記フロースルー磁気分離／脱ビーズ化モジュールに流して、前記常磁性粒子と前記脱ビーズ化済み非結合細胞を分離することをさらに含む、第３２項に記載の方法。
【０３８３】
３４. 前記磁石が、流れの方向と交差する１本のゼロ勾配線を確立するように配向されており、したがって、常磁性粒子結合細胞が、前記ゼロ勾配線に専ら一方向に引っ張られるが、前記２つの磁石の他の２方向の磁力による影響を受けない、第２６項に記載の方法。
【０３８４】
３５. 前記チャンバが、
任意の常磁性粒子がフローチャンバに入る磁性入口と、
非磁性入口と、
前記非磁性入口に対向する磁性出口と、
前記磁性入口に対向する非磁性出口と
をさらに含み、
前記ゼロ勾配線が、全ての常磁性粒子およびあらゆる結合細胞を前記磁性出口に向かわせる、第２６項に記載の方法。
【０３８５】
３６. 前記細胞懸濁液が、非結合細胞をさらに含み、非磁性入口が、前記磁性入口より大きく、前記非磁性出口が、磁性出口より大きく、前記非磁性入口から流れる流体が、前記非磁性出口へ横断し、その結果、一切の非結合細胞の前記磁性出口への流入が防止される、第３５項に記載の方法。
【０３８６】
３７. 前記細胞懸濁液が、非結合細胞をさらに含み、前記非磁性入口と磁性入口が、実質的に同じサイズであるかまたは前記非磁性出口と磁性出口が、実質的に同じサイズであるかまたは両方であり、前記入口に入る流体のそれぞれの流量、前記出口から退出する流体のそれぞれの流量または両方が、前記非磁性入口から流れる流体が前記非磁性出口へ横断し、その結果、一切の非結合細胞の磁性出口への流入が防止されるように調整される、第３５項に記載の方法。
【０３８７】
３８. 前記常磁性粒子結合細胞を回転膜脱ビーズ化モジュールに流して、非結合細胞生成物を生じさせることをさらに含み、
前記回転膜脱ビーズ化モジュールが
前記常磁性粒子結合細胞が流動する円筒形脱ビーズ化チャンバであって、円筒形側壁によって一部分規定されており、同軸回転膜を含有するチャンバと、
前記円筒形脱ビーズ化チャンバ内で少なくとも１本のゼロ勾配線を確立するように前記円筒形側壁に隣接または近接して配置されている少なくとも１つの磁石と
を含む、第２６項に記載の方法。
【０３８８】
３９. 前記常磁性粒子結合細胞を磁性カラムモジュールに流して、非結合生成物を生じさせることをさらに含む、第２６項に記載の方法。
【０３８９】
４０. 前記常磁性粒子結合細胞または前記非結合細胞生成物を細胞洗浄モジュールに流すことをさらに含む、第２６項に記載の方法。
【０３９０】
４１. 前記常磁性粒子結合細胞または前記非結合細胞生成物を培地交換モジュールに流すことをさらに含む、第２６項に記載の方法。
【０３９１】
４２. 前記常磁性粒子結合細胞または前記非結合細胞生成物を細胞高濃度化モジュールに流すことをさらに含む、第２６項に記載の方法。
【０３９２】
４３. 細胞療法用組成物を製造する方法であって、
細胞集団を、該細胞集団内の１以上の細胞型の拡大を支援する１以上の薬剤でコーティングされた常磁性粒子と接触させることと、
核酸を前記細胞集団内の細胞に導入し、
前記細胞集団内の細胞を拡大させることと、
第２６項〜４２項のいずれかに記載の方法に従ってまたは第１〜１６項のいずれかに記載のシステムもしくは第１７〜２５項のいずれかに記載のモジュールを使用して、前記細胞集団を脱ビーズ化し、
前記細胞集団を細胞療法用に製剤化すること
を含む方法。
【０３９３】
４４. １以上の細胞型の拡大を支援する前記１以上の薬剤が、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合フラグメント、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合フラグメントおよびそれらの組合せを含む、第４３項に記載の方法。
【０３９４】
４５. 前記核酸が、レンチウイルスまたはｍＲＮＡ形質導入によって導入される、第４３〜４４項のいずれかに記載の方法。
【０３９５】
４６. 前記細胞療法が、キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法である、第４３〜４５項のいずれかに記載の方法。
【０３９６】
４７. 前記細胞療法が、抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法である、第４６項に記載の方法。
【０３９７】
改善された洗浄工程
アフェレーシス、例えば白血球アフェレーシス産物の細胞組成は、患者によって大きく異なる。顆粒球（例えば、好中球）の百分率が高い白血球アフェレーシス産物は、プロセスＢを使用するＣＡＲ  Ｔ細胞製造中の細胞凝集増加の事例との相関関係が証明されている。理論に縛られることは望まないが、そのような不可逆的凝集は、入手可能な細胞数を低減させ、濃縮プロセス（例えば、陽性選択）への干渉により細胞収量に対して悪影響を与え、その結果、細胞数および純度が全般的に低下することになると考えられる。加えて、理論に縛られることは望まないが、細胞純度および収率の低下は、後続のプロセスの性能（例えば、形質導入効率および拡大）、ならびに最終生成物である細胞の数および品質に対して直接影響を与える。この正味の結果は、処理サイクル終了時に仕様を満たすことができる製造品の能力を低下させる。したがって、理論に縛られることは望まないが、凝集の防止は、細胞損失を低減させ、Ｔ細胞純度を向上させることができ、これにより、後続の処理工程のためのより良好な品質および量の出発物質を生成することができ、結果として全般的に改善された治療用製品を得ることができると考えられる。
【０３９８】
当分野における現行の製造プロセス、例えばプロセスＢでは、患者細胞の白血球アフェレーシス物質がＰｌａｓｍａｔｈｅｒｍ（Ｇｅｎｅｓｉｓ）で融解され、ＣｅｌｌＳａｖｅｒ  ５＋装置（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ）を使用して洗浄され、そしてその後、「改変培地」と呼ばれる、Ｘ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）に基づく細胞拡大培地に再懸濁されるかまたは後続のフィコールによるリンパ球選択のためにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝等張生理食塩水に再懸濁される。改変培地は、実施例２で提供されるプロトコールに従って調製される。しかし、実施例２で記載されるように、融解細胞の改変培地またはＰＢＳ溶液いずれかへの移入は、細胞を凝集させ得る。
【０３９９】
したがって、凝集を防止するための改善された細胞洗浄方法であって、後続の製造工程、例えば、例えば抗ＣＤ３／ＣＤ２８  ＣＴＳ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）での、刺激による、陽性選択に適合する方法も本明細書において提供される。加えて、ここに記載する改善された洗浄工程は、細胞内の残骸、遊離ヘモグロビンおよび凍結保護物質を除去するために、容量低減を達成するために、ならびに後続の密度勾配分離を可能にするために、例えば融解細胞に対して行われる。ある実施形態において、洗浄工程は、改変培地またはＰＢＳ溶液に対して代替細胞再懸濁緩衝液を用いて行われる。ある実施形態において、洗浄工程は、デキストロースおよび／または塩化ナトリウムを含む緩衝液を用いて行われる。ある実施形態において、緩衝液は、約５％および約０.４５％塩化ナトリウム、例えば、Ｄ５  １／２  ＮＳ媒体を含む。ある実施形態において、緩衝液は、例えば、少なくとも３０分、４５分、１時間、１.５時間、２時間、２.５時間、３時間、３.５時間、４時間、４.５時間、５時間、５.５時間または６時間、細胞懸濁液を安定させ、凝集を防止する。
【０４００】
一実施形態において、ここに記載する改善された洗浄抗体は、デバイス、例えば、細胞分離デバイス、例えば、密度勾配遠心分離に使用されるのと同じデバイスを使用して行われる。例えば、改善された洗浄工程は、Ｓｅｐａｘ  ２  ＲＭデバイス（Ｂｉｏｓａｆｅ）を使用して行われる。
【０４０１】
ある実施形態において、本明細書で開示される洗浄工程は、新鮮なアフェレーシスサンプルまたは以前に凍結された、例えば融解された、アフェレーシスサンプルに使用することができる。実施形態において、本明細書で開示される洗浄工程は、ここに記載する水簸、密度勾配遠心分離または選択方法のいずれかの前または後に使用することができる。別の実施形態において、本明細書で開示される洗浄工程は、密度勾配遠心分離工程、例えば、ＯｐｔｉＰｒｅｐ媒体を使用する密度勾配遠心分離の後に行われる。
【０４０２】
改善された製造プロセス
当分野において現在使用されている方法よりさらに多くＣＡＲを発現させるのに好適な免疫エフェクター細胞の品質および収率を向上させる方法が本明細書において提供される。一実施形態において、上記セクションで記載された水簸、密度勾配遠心分離、流動条件下での陽性および陰性選択、ならびに改善された洗浄工程を、互いに任意の組合せでまたは当分野において現在使用されているもしくはここに記載するさらなる方法との任意の組合せで使用して、ＣＡＲを発現させるのに好適である所望の免疫エフェクター細胞を単離または濃縮することができる。
【０４０３】
一般に、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞の集団を生成または濃縮する方法は、インプットサンプルを用意すること、濃縮工程を実施することおよび選択工程を実施することを含み、それによって、ＣＡＲの発現に好適である免疫エフェクター細胞を含むアウトプットサンプルを生成する。ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の集団を産生する方法は、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞の集団を生成または濃縮する方法を含み、例えば細胞を増殖または存続するように刺激する、刺激工程をさらに含み、ＣＡＲをコードする核酸の導入をさらに含む。刺激およびＣＡＲの導入／発現に関するさらなる開示は、後続のセクションでさらに記載される。
【０４０４】
一実施形態において、インプットサンプルは、対象から得られる新鮮なサンプル、例えば、新鮮なアフェレーシス、白血球アフェレーシスまたは全血サンプルである。別の実施形態において、インプットサンプルは、凍結サンプルある。インプットサンプルが凍結サンプル、例えば、凍結または凍結保存されたアフェレーシス、白血球アフェレーシスまたは全血サンプルである実施形態において、方法は、凍結サンプルを融解させることまたは融解サンプルを用意することを含む。凍結サンプル、例えば凍結保存サンプルは、受動的または能動的手段により融解させることができる。受動的手段による融解は、サンプルを融解させること、例えば周囲環境の温度に至らせること、例えば、室温に至らせることまたはサンプルが移入もしくは混合される緩衝液もしくは溶液の温度に至らせることを包含する。能動的手段による融解は、受動的手段により融解させる場合より速くサンプルを融解する、例えばサンプルを周囲環境の温度にする、デバイスの使用を包含する。
【０４０５】
一実施形態において、濃縮工程は、水簸または密度勾配遠心分離を実施することを含む。水簸は、当分野で公知の水簸条件を使用してまたは凍結されているもしくは以前に凍結されていたサンプルの水簸についてここに記載する改善された設定を使用して、行うことができる。密度勾配遠心分離は、フィコールを使用してまたはイオジキサノールを含む媒体、例えば、約６０％イオジキサノール水溶液、例えばＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）を使用して行うことができる。
【０４０６】
ここに記載する方法のいずれにおいても、選択工程は、陽性選択工程および／または陰性選択工程を実施することを含む。陽性選択工程は、例えば、分離剤、例えば、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体にカップリングされているビーズを静的条件下または流動条件下のいずれかで使用して、例えば、ａを使用して、ＣＤ３＋／ＣＤ２８＋細胞を選択することを含むことができる。陰性選択工程は、例えば、分離剤、例えば、抗ＣＤ１９抗体とカップリングしているビーズを使用して、ＣＤ１９＋Ｂ細胞またはＣＤ１９＋リンパ芽球を陰性選択することを含むことができる。
【０４０７】
ここに記載する方法のいずれにおいても、洗浄工程は、サンプル収集後に、サンプルの融解後に、濃縮工程前に、濃縮工程後に、選択工程前に、もしくは選択工程後にまたはそれらの任意の組合せで行うことができる。
【０４０８】
水簸、密度勾配遠心分離、陽性もしくは陰性選択、例えば、流動条件下でのものまたは改善された洗浄工程の１以上を包含する、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞の集団を生成または濃縮する例示的な方法が、本明細書においてさらに記載される。
【０４０９】
一実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞の集団を生成または濃縮する方法は、免疫エフェクター細胞を含む凍結インプットサンプルを用意し；凍結インプットサンプルを融解させて、融解サンプルを生成し；インプットサンプルに対して水簸を実施することを含み、前記インプットサンプルが融解インプットサンプルであってもよい、濃縮工程を実施し；選択が、陽性選択、例えばＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択または陰性選択、例えばＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋もしくはＣＤ１４＋細胞の陰性選択である、選択工程を実施することを包含する。
【０４１０】
別の実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞の集団を生成または濃縮する方法は、免疫エフェクター細胞を含む新鮮または凍結インプットサンプルを用意し；適宜、インプットサンプルが凍結インプットサンプルである場合、凍結インプットサンプルを融解させて、融解サンプルを生成し；イオジキサノールを含む媒体、例えば、６０％イオジキサノール水溶液、例えばＯｐｔｉＰｒｅｐ媒体であって／であるか、フィコールより高い密度（例えば、１.０７７ｇ／ｍｌより高い、例えば約１.３２ｇ／ｍｌ）を有する媒体を使用して、密度遠心分離工程を実施することを含む濃縮工程を実施し；選択が、陽性選択、例えばＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞の陽性選択または陰性選択、例えばＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋もしくはＣＤ１４＋細胞の陰性選択である、選択工程を実施することを包含する。
【０４１１】
別の実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞の集団を生成または濃縮する方法は、免疫エフェクター細胞を含む新鮮または凍結インプットサンプルを用意し；水簸または密度遠心分離（例えば、フィコールもしくはＯｐｔｉｐｒｅｐ媒体を使用する）を実施することを含む濃縮工程を実施し；流動条件下で、例えばＣＤ３／ＣＤ２８＋細胞の、陽性選択工程を実施することを包含する。
【０４１２】
別の実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作することができる免疫エフェクター細胞の集団を生成または濃縮する方法は、免疫エフェクター細胞を含む新鮮または凍結インプットサンプルを用意し；水簸または密度遠心分離（例えば、フィコールもしくはＯｐｔｉｐｒｅｐ媒体を使用する）を実施することを含む濃縮工程を実施し；流動条件下で、例えばＣＤ１９＋、ＣＤ２５＋またはＣＤ１４＋細胞の、陰性選択工程を実施することを包含する。
【０４１３】
ここに記載する方法のいずれにおいても、洗浄工程は、サンプル収集後に、サンプルの融解後に、濃縮工程前に、濃縮工程後に、選択工程前に、もしくは選択工程後にまたはそれらの任意の組合せで行うことができる。
【０４１４】
所望の免疫エフェクター細胞の濃縮を最適化し、製造の成功および製品品質を保証するために、ここに記載する方法におけるインプットサンプルのまたは１工程以上の後の特性の範囲または閾値を特定し、次の工程を示すまたは決定する管理限界を決定することができる。実施形態において、管理限界は、インプットサンプルが採取される対象のがんの型に依存して異なり得る。例として、ＡＬＬまたはＤＬＢＣＬを有する対象から採取されたインプットサンプル中の単球の存在についての管理限界は、次の通りである：単球が、インプットサンプル、例えば、白血球アフェレーシス全血液細胞の＞２０％である場合、最適な方法は、流動条件下での水簸および／もしくはＣＤ３／ＣＤ２８陽性選択を含み；または単球、インプットサンプルの＜２０％である場合、インプットサンプルは洗浄され、最適な方法は、含まれる芽球数に基づいて決定される。別の例において、ＡＬＬまたはＤＬＢＣＬを有する対象から採取されたインプットサンプル中の芽球細胞の存在についての管理限界は、次の通りである：芽球細胞が、入来白血球アフェレーシスＷＢＣの≧２０％である場合、水簸（単球、顆粒球および細胞残屑を除去するための）および／もしくは改変ＣＤ１９陰性選択（芽球を除去するための）または芽球を枯渇させるための他の技術を行うべきであり；または芽球細胞が、入来白血球アフェレーシスの＜２０％である場合、白血球アフェレーシス物質は、洗浄され、プロセスは、含まれる単球数に基づいて決定される。
【０４１５】
ＣＡＲを発現させるのに好適な免疫エフェクター細胞の濃縮後、一実施形態では、免疫エフェクター細胞は、当分野で公知のまたはここに記載する、例えば、「免疫エフェクター細胞の活性化および拡大」と題するセクションで記載されるような方法のいずれかを使用して、例えば増殖するように、刺激される。
【０４１６】
ＣＡＲを発現させるのに好適な免疫エフェクター細胞の濃縮後、ならびに適宜、ここに記載する刺激および／または拡大の後、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を、免疫エフェクター細胞に導入することができる。核酸、例えばＣＡＲをコードする核酸を導入する方法は、当分野周知であり、本明細書で記載され、例えば、「ＣＡＲをコードする核酸コンストラクト」、「ＲＮＡトランスフェクション」および「非ウイルス性送達方法」と題するセクションで記載される通りである。
【０４１７】
免疫エフェクター細胞源
このセクションは、所望の免疫エフェクター細胞を含むインプットサンプルを得るための、所望の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を単離および処理するための、ならびに望ましくない物質、例えば望ましくない細胞を除去するための、追加の方法または工程を提供する。このセクションで記載される追加の方法または工程を、上記セクションで記載された水簸、密度勾配遠心分離、流動条件下での選択または改善された洗浄工程のいずれと組み合わせて使用してもよい。
【０４１８】
細胞源、例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞源を対象から得ることができる。対象の例としては、ヒト、サル、チンパンジー、イヌ、ネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸膜滲出、脾臓組織および腫瘍などの多数の源から得ることができる。
【０４１９】
本開示のある特定の態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、当業者に公知の任意の数の技術およびここに記載する方法のいずれかを、それらの工程の任意の組合せで使用して、対象から収集された血液のユニットから得ることができる。一態様において、個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞などのリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核の白血球、赤血球および血小板を含有する。一態様において、アフェレーシスによって収集された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、それに続く処理工程のために細胞を適切な緩衝液または培地中に適宜、置くことができる。一実施形態において、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。別の実施形態において、洗浄溶液はカルシウムを含まず、マグネシウムを含んでいなくもよくまたは２価カチオンの全てとはいかないまでもその多くを含んでいなくてもよい。別の実施形態において、細胞は、ここに記載する改善された洗浄工程を使用して洗浄される。
【０４２０】
カルシウムの非存在下における初期の活性化工程により、活性化を増大させることができる。当業者であれば容易に認識するものと予想されるが、洗浄工程は、当分野で公知の方法によって、例えば半自動の「流水式」遠心分離機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞処理装置、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅまたはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を製造業者の説明書に従って使用することによって達成されてもよい。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えばＣａ非含有、Ｍｇ非含有ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａなどまたは他の緩衝液含有または非含有食塩水に再懸濁されもよい。あるいは、アフェレーシスサンプルの望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地に直接再懸濁させてもよい。
【０４２１】
一態様において、所望の免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、赤血球を溶解することおよび単球を枯渇させることによって、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によってまたは向流遠心水簸によって、末梢血リンパ球から単離される。
【０４２２】
ここに記載する方法は、例えば陰性選択技術、例えばここに記載する陰性選択技術を使用する、免疫エフェクター細胞の特定の部分集団、例えば、調節性Ｔ細胞枯渇集団、ＣＤ２５＋細胞枯渇集団であるＴ細胞の選択を包含していてもよい。一部の実施形態において、調節性Ｔ細胞枯渇集団は、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満のＣＤ２５＋細胞を含有する。
【０４２３】
一実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ２５抗体、もしくはそれらのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、例えばＩＬ−２を使用して集団から除去される。一実施形態において、抗ＣＤ２５抗体、もしくはそれらのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドは、基質、例えばビーズにコンジュゲートされているかまたは別の方法で基質、例えばビーズ上にコーティングされている。一実施形態において、抗ＣＤ２５抗体またはそれらのフラグメントは、ここに記載する基質にコンジュゲートされている。
【０４２４】
一実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ（商標）からのＣＤ２５枯渇試薬を使用して、集団から除去される。一実施形態において、ＣＤ２５枯渇試薬に対する細胞の比率は、２０μＬに対して細胞１×１０７個または１５μＬに対して細胞１×１０７個または１０μＬに対して細胞１×１０７個または５μＬに対して細胞１×１０７個または２.５μＬに対して細胞１×１０７個または１.２５μＬに対して細胞１×１０７個である。一実施形態において、例えば調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋枯渇の場合、細胞５億個／ｍｌより多くが使用される。さらなる態様において、細胞６億個、７億個、８億個または９億個／ｍｌの細胞濃度が使用される。
【０４２５】
一実施形態において、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、約６×１０９個のＣＤ２５＋Ｔ細胞を包含する。他の態様において、枯渇させる免疫エフェクター細胞の集団は、約１×１０９から１×１０１０個およびその間のあらゆる整数値のＣＤ２５＋Ｔ細胞を包含する。一実施形態において、結果得られた調節性Ｔ細胞枯渇集団は、２×１０９個またはそれ未満の調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞（例えば、１×１０９、５×１０８、１×１０８、５×１０７、１×１０７個またはそれ未満のＣＤ２５＋細胞）を有する。
【０４２６】
一実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞は、ＣｌｉｎｉＭＡＣシステムを例えばチュービング１６２−０１などの枯渇チュービングセットとともに使用して、集団から除去される。一実施形態において、ＣｌｉｎｉＭＡＣシステムは、例えばＤＥＰＬＥＴＩＯＮ２.１などの枯渇設定で実行される。
【０４２７】
特定の理論に縛られることは望まないが、アフェレーシスの前の対象においてまたはＣＡＲを発現する細胞生成物の製造中に、免疫細胞の負の調節因子のレベルを減少させること（例えば、不要な免疫細胞、例えばＴＲＥＧ細胞の数を減少させること）は、対象の再発リスクを有意に低減させることができる。例えば、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させる方法は、当分野で公知である。ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、これらに限定されないが、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体（ここに記載する抗ＧＩＴＲ抗体）、ＣＤ２５枯渇、ｍＴＯＲ阻害剤およびそれらの組合せが挙げられる。
【０４２８】
一部の実施形態において、製造方法は、ＣＡＲを発現する細胞の製造前に、ＴＲＥＧ細胞の数を低減させること（例えば、枯渇させること）を含む。例えば、製造方法は、例えば、ＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）生成物の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させるために、サンプル、例えばアフェレーシスサンプルを、抗ＧＩＴＲ抗体および／もしくは抗ＣＤ２５抗体（もしくはそれらのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド）と接触させることを含む。
【０４２９】
特定の理論に縛られることは望まないが、対象においてアフェレーシスの前にまたはＣＡＲを発現する細胞生成物の製造中に免疫細胞の負の調節因子のレベルを減少させること（例えば、不要な免疫細胞、例えばＴＲＥＧ細胞の数を減少させること）は、対象の再発リスクを低減させることができる。ある実施形態において、対象は、ＣＡＲを発現する細胞生成物の製造のために細胞を収集する前に、ＴＲＥＧ細胞を低減させる１以上の療法で前処置され、それによって対象がＣＡＲを発現する細胞の処置に戻るリスクを低減させる。ある実施形態において、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、これらに限定されないが、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇の１以上またはそれらの組合せを対象に投与することが挙げられる。ある実施形態において、ＴＲＥＧ細胞を減少させる方法としては、これらに限定されないが、シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇、ｍＴＯＲ阻害剤の１以上またはそれらの組合せを対象に投与することが挙げられる。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５−枯渇の１以上またはそれらの組合せの投与は、ＣＡＲを発現する細胞生成物の注入の前に、その間にまたはその後に行うことができる。シクロホスファミド、抗ＧＩＴＲ抗体、ＣＤ２５枯渇、ｍＴＯＲ阻害剤の１以上またはそれらの組合せの投与は、ＣＡＲを発現する細胞生成物の注入の前に、その間にまたはその後に行うことができる。
【０４３０】
一部の実施形態において、製造方法は、ＣＡＲを発現する細胞の製造前に、ＴＲＥＧ細胞の数を低減すること（例えば、を枯渇させること）を含む。例えば、製造方法は、例えば、ＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）生成物の製造前にＴＲＥＧ細胞を枯渇させるために、サンプル、例えばアフェレーシスサンプルを、抗ＧＩＴＲ抗体および／もしくは抗ＣＤ２５抗体（もしくはそれらのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド）と接触させることを含む。
【０４３１】
一実施形態において、対象は、ＣＡＲを発現する細胞生成物の製造のために細胞を収集する前に、シクロホスファミドで前処置され、それによって対象がＣＡＲを発現する細胞の処置（例えば、ＣＴＬ０１９処置）に戻るリスクを低減させる。一実施形態において、対象は、ＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）生成物の製造のために細胞を収集する前に、抗ＧＩＴＲ抗体で前処置され、それによって対象がＣＡＲを発現する細胞の処置に戻るリスクを低減させる。
【０４３２】
ある実施形態において、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）製造プロセスは、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）生成物（例えば、ＣＴＬ０１９生成物）の製造の前に、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させるように変更される。ある実施形態では、ＣＡＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）生成物（例えば、ＣＴＬ０１９生成物）の製造の前に、ＴＲＥＧ細胞を枯渇させるためにＣＤ２５枯渇が使用される。
【０４３３】
一実施形態において、除去される細胞の集団は、調節性Ｔ細胞または腫瘍細胞ではなく、別の様式でＣＡＲＴ細胞、例えばＣＤ１４、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ１５または免疫抑制細胞によって発現される可能性がある他のマーカーを発現する細胞の拡張および／または機能に負の影響を与える細胞である。一実施形態において、このような細胞は、調節性Ｔ細胞および／もしくは腫瘍細胞と同時にまたは前記枯渇の後にまたは別の順番で除去されることが想定される。
【０４３４】
ここに記載する方法は、１つより多くの選択工程、例えば１つより多くの枯渇工程を包含していてもよい。陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、例えば、陰性選択された細胞に独特な表面マーカーに向けられた抗体の組合せを用いて達成することができる。１つの方法は、陰性選択された細胞上に提示される細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する負磁気免疫接着またはフローサイトメトリーによるセルソーティングおよび／もしくは選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＤ８に対する抗体を包含していてもよい。
【０４３５】
ここに記載する方法は、集団から、腫瘍抗原、例えばＣＤ２５を含まない腫瘍抗原、例えばＣＤ１９、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ２０、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂを発現する細胞を除去することにより、ＣＡＲ、例えばここに記載するＣＡＲの発現に好適な、調節性Ｔ細胞枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇および腫瘍抗原枯渇細胞の集団を提供することをさらに包含していてもよい。一実施形態において、腫瘍抗原を発現する細胞は、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそれらのフラグメントおよび抗腫瘍抗原抗体またはそれらのフラグメントは、同じ基質、例えば細胞を除去するのに使用できるビーズに付着することができまたは抗ＣＤ２５抗体もしくはそれらのフラグメントまたは抗腫瘍抗原抗体もしくはそれらのフラグメントは、別々のビーズに付着することができ、それらの混合物は、細胞を除去するのに使用することができる。他の実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞の除去および腫瘍抗原を発現する細胞の除去は、逐次的であり、例えばどちらの順番でも行うことができる。
【０４３６】
また、集団から、チェックポイント阻害剤、例えばここに記載するチェックポイント阻害剤を発現する細胞、例えばＰＤ１＋細胞、ＬＡＧ３＋細胞およびＴＩＭ３＋細胞の１種または複数を除去することによって、調節性Ｔ細胞枯渇、例えばＣＤ２５＋枯渇細胞およびチェックポイント阻害剤枯渇細胞、例えばＰＤ１＋、ＬＡＧ３＋および／またはＴＩＭ３＋枯渇細胞の集団を提供することを包含する方法も提供される。例示的なチェックポイント阻害剤としては、例えばここに記載するように、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦ（例えばＴＧＦベータ）が挙げられる。一実施形態において、チェックポイント阻害剤を発現する細胞は、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞と同時に除去される。例えば、抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを同じビーズに付着させることができ、これを使用して細胞を除去することができまたは抗ＣＤ２５抗体またはそのフラグメントおよび抗チェックポイント阻害剤抗体またはそのフラグメントを別々のビーズに付着させることができ、その混合物を使用して細胞を除去することができる。他の実施形態において、調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋細胞の除去およびチェックポイント阻害剤を発現する細胞の除去は、逐次的であり、例えばどちらの順番でも行うことができる。
【０４３７】
ここに記載する方法は、陽性選択工程を包含し得る。例えば、所望のＴ細胞の陽性選択に十分な期間にわたり、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）がコンジュゲートしたビーズ、例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔとインキュベートすることによって、Ｔ細胞を単離することができる。一実施形態において、期間は、約３０分である。さらなる態様において、期間は、３０分から３６時間の範囲またはそれより長くおよびその間の全ての整数値である。さらなる実施形態において、期間は、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間または６時間である。さらに別の実施形態において、期間は、１０〜２４時間、例えば２４時間である。腫瘍組織または免疫不全個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する場合のように、他の細胞型と比較してＴ細胞がわずかしかないあらゆる状況においてＴ細胞を単離するためには、より長いインキュベート時間が使用される可能性がある。さらに、より長いインキュベート時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕獲効率を増加させることができる。したがって、時間を単に短くしたりまたは長くしたりすることによって、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させることができおよび／またはＴ細胞に対するビーズの比率（本明細書でさらに記載されるように）を増加または減少させることによって、培養開始時またはプロセス中の他の時点で、Ｔ細胞の部分集団を可否に応じて優先的に選択することができる。加えて、ビーズまたは他の表面に対する抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比率を増加または減少させることによって、培養開始時または他の所望の時点で、Ｔ細胞の部分集団を可否に応じて優先的に選択することができる。
【０４３８】
一実施形態において、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、グランザイムＢおよびパーフォリンの１種または複数または他の適切な分子、例えば他のサイトカインを発現するＴ細胞集団を選択する場合がある。細胞発現に関してスクリーニングする方法は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１２６７１２号で記載されている方法によって決定することができる。
【０４３９】
陽性または陰性選択によって細胞の所望の集団を単離するために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度は様々であってもよい。所定の態様において、細胞およびビーズの接触を最大にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合される容量を有意に減少させる（例えば、細胞濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、一態様において、細胞１００億個／ｍｌ、９０億個／ｍｌ、８０億個／ｍｌ、７０億個／ｍｌ、６０億個／ｍｌまたは５０億個／ｍｌの濃度が使用される。一態様において、細胞１０億個／ｍｌの濃度が使用される。さらなる態様において、１ｍｌあたり、細胞７５００万個以上、８０００万個以上、８５００万個以上、９０００万個以上、９５００万個以上または１億個の細胞濃度が使用される。さらなる態様において、１ｍｌあたり細胞１億２５００万または１億５０００万個の濃度が使用できる。
【０４４０】
高濃度の使用は、細胞収量、細胞の活性化および細胞拡大の増加をもたらすことができる。さらに、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの対象の標的抗原の発現が弱い可能性がある細胞または多くの腫瘍細胞が存在するサンプル（例えば、白血病の血液、腫瘍組織など）からの細胞のより効率的な捕獲を可能にする。このような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、取得が望ましいと予想される。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常のＣＤ２８発現が比較的弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０４４１】
関連する態様において、より低い細胞の濃度を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を相当に希釈することによって、粒子と細胞との相互作用を最小化する。それにより、粒子に結合させるために、大量の所望の抗原を発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高レベルのＣＤ２８を発現するが、薄い濃度でＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕捉される。一態様において、使用される細胞の濃度は、５×１０６／ｍｌである。他の態様において、使用される濃度は、約１×１０５／ｍｌから１×１０６／ｍｌまでおよびその間のあらゆる整数値であってもよい。
【０４４２】
他の態様において、細胞は、回転器で、様々な長さの時間にわたり、様々な速度、２〜１０℃または室温のいずれかでインキュベートすることができる。
【０４４３】
一実施形態において、前記集団の複数の免疫エフェクター細胞は、ジアシルグリセロールキナーゼ（diaglycerol kinase）（ＤＧＫ）を発現しない、例えば、ＤＧＫ欠損である。一実施形態において、前記集団の複数の免疫エフェクター細胞は、イカロスを発現しない、例えば、イカロス欠損である。一実施形態において、前記集団の複数の免疫エフェクター細胞は、ＤＧＫおよびイカロスを発現しない、例えば、ＤＧＫとイカロス両方の欠損である。
【０４４４】
刺激のためのＴ細胞を洗浄工程後に凍結してもよい。理論に縛られるつもりはないが、凍結工程とそれに続く融解工程は、細胞集団中の顆粒球とある程度の単球を除去することによってより均一な生成物をもたらす。血漿と血小板を除去する洗浄工程の後、細胞を凍結溶液に懸濁してもよい。多くの凍結のための溶液およびパラメーターが当分野で公知であり、この状況において有用であると予想されるが、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳまたは１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンならびに７.５％ＤＭＳＯを含有する培養培地または３１.２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１.２５％デキストロース５％、０.４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７.５％ＤＭＳＯを含有する培養培地または例えばヘスパンおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含有する他の好適な細胞凍結媒体を使用し、次いで細胞を１度／分の速度で−８０℃に凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相中で保存することを含む。他の制御冷凍方法を使用してもよいし、同様に−２０℃で即座にまたは液体窒素中で非制御冷凍してもよい。
【０４４５】
所定の態様において、凍結保存した細胞を融解させて、本明細書で記載したようにして洗浄し、本発明の方法を使用して活性化する前に室温で１時間そのまま置く。
【０４４６】
また、本発明の状況では、本明細書で記載したようにして拡大させた細胞が必要になるかもしれないときの前の期間に、対象から血液サンプルまたはアフェレーシス産物を収集することも考慮される。そのようなものとして、拡大させようとする細胞の源を必要なあらゆる時点で収集することができ、さらに、ここに記載するものなどの免疫エフェクター細胞治療によって利益を得ると予想される多数の疾患または状態のための免疫エフェクター細胞治療で後に使用するために、Ｔ細胞などの所望の細胞を単離して凍結してもよい。一態様において、血液サンプルまたはアフェレーシスは、全般的に健康な対象から採取される。所定の態様において、血液サンプルまたはアフェレーシスは、疾患を発症させる危険性があるが、まだ疾患を発症させていない、全般的に健康な対象から採取され、さらに、後の使用のために対象の細胞を単離して凍結してもよい。所定の態様において、Ｔ細胞は、後の時点で拡大、凍結および使用されてもよい。所定の態様において、本明細書で記載したような特定の疾患の診断の直後に、ただしいかなる処置の前に、サンプルが患者から収集される。さらなる態様において、これらに限定されないが、ナタリズマブ、エファリズマブなどの薬剤、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸塩およびＦＫ５０６、抗体または他の免疫除去剤（immunoablative agents）、例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、マイコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８および放射線照射での処置などの多数の関連する処置様式の前に、細胞が、対象からの血液サンプルまたはアフェレーシスから単離される。
【０４４７】
本発明のさらなる態様において、対象に機能的なＴ細胞を残す処置の後に、患者から直接Ｔ細胞を得る。これに関して、所定のがん処置の後、特定には、免疫系にダメージを与える薬物での処置の後、患者が通常処置から回復すると予想される期間中の処置の直後に、得られたＴ細胞の品質が、エクスビボで拡大するそれらの能力に関して最適であるかまたは向上している可能性があることが観察されている。同様に、ここに記載する方法を使用したエクスビボでの操作の後、これらの細胞は、生着およびインビボでの拡大の強化にとって好ましい状況にある可能性がある。したがって、本発明の内容において、この回収期間中に、Ｔ細胞、樹状細胞または造血細胞系の他の細胞を包含する血液細胞を収集することが考慮される。さらに、所定の態様において、動員（例えば、ＧＭ−ＣＳＦを用いた動員）およびコンディショニングレジメンを使用して、特に療法後の規定の時間帯中に、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生および／または拡大にとって好都合な対象における状態を作り出すことができる。例示的な細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞および他の免疫系細胞が挙げられる。
【０４４８】
一実施形態において、ＣＡＲ分子、例えば、ここに記載するＣＡＲ分子を発現する免疫エフェクター細胞は、免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤を受けた対象から得られる。一実施形態において、対象におけるまたは対象から回収された、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞のレベルまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞の比率、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞が少なくとも一時的に増加した状態になるように、十分な時間の後または十分な免疫を増強する低い用量のｍＴＯＲ阻害剤投与の後に、ＣＡＲを発現するように操作される免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団が回収される。
【０４４９】
他の実施形態において、ＣＡＲを発現するように操作されているかまたは加工されると予想される免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の集団は、ＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞の数を増加させるまたはＰＤ１陰性免疫エフェクター細胞の比率、例えばＴ細胞／ＰＤ１陽性免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞を増加させる量のｍＴＯＲ阻害剤との接触によって、エクスビボで処置され得る。
【０４５０】
適用方法は、５％またはそれ未満、例えば２％のヒトＡＢ血清を含む培養培地条件を利用でき、公知の培養培地条件および組成、例えばSmith et al., “Ex vivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novel Xeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement” Clinical & Translational Immunology (2015) 4, e31; doi:10.1038/cti.2014.31で記載されるものを採用できることが認識されている。
【０４５１】
一実施形態において、本出願の方法は、無血清培地を含む培養培地条件を用いることができる。一実施形態において、無血清培地は、ＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）、Ｉｍｍｕｎｏｃｕｌｔ  ＸＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣｅｌｌＧｒｏ（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）、ＴｅｘＭａｃｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、Ｓｔｅｍｌｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ）、Ｘｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ）、ＰｒｉｍｅＸＶ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはＳｔｅｍＸＶivｏ（ＲａｎｄＤ  ｓｙｓｔｅｍｓ）である。無血清培地に、ＬｉｆｅＴｅｃｈからのＩＣＳＲ（免疫細胞血清代替物）などの代用血清を補充してもよい。代用血清（例えば、ＩＣＳＲ）のレベルは、例えば５％以下、例えば、約１％、２％、３％、４％または５％であり得る。
【０４５２】
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、ジアシルグリセロールキナーゼ（diaglycerol kinase）（ＤＧＫ）欠損である。ＤＧＫ欠損細胞は、ＤＧＫのＲＮＡまたはタンパク質を発現しない細胞を包含するかまたは低減または阻害されたＤＧＫ活性を有する。ＤＧＫ欠損細胞は、遺伝学的アプローチによって、例えば、ＤＧＫ発現を低減または予防するためにＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを投与することによって生成することができる。あるいは、ＤＧＫ欠損細胞は、ここに記載するＤＧＫ阻害剤での処置によって生成することができる。
【０４５３】
一実施形態において、Ｔ細胞集団は、イカロス欠損である。イカロス欠損細胞は、イカロスのＲＮＡまたはタンパク質を発現しない細胞を包含するかまたは低減または阻害されたイカロス活性を有する。イカロス欠損細胞は、遺伝学的アプローチによって、例えば、イカロス発現を低減または予防するためにＲＮＡ干渉剤、例えばｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを投与することによって生成することができる。あるいは、イカロス欠損細胞は、イカロス阻害剤、例えばレナリドミドでの処置によって生成することができる。
【０４５４】
実施形態において、Ｔ細胞集団は、ＤＧＫ欠損およびイカロス欠損であり、例えば、ＤＧＫおよびイカロスを発現しないかまたは低減もしくは阻害されたＤＧＫおよびイカロス活性を有する。このようなＤＧＫおよびイカロス欠損細胞は、ここに記載する方法のいずれかによって生成することができる。
【０４５５】
一実施形態において、ＮＫ細胞は、対象から得られる。別の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞株、例えばＮＫ−９２細胞株（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ）である。
【０４５６】
同種異系ＣＡＲを発現する細胞
ここに記載する実施形態において、免疫エフェクター細胞は、同種異系の免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞であってもよい。例えば、細胞は、同種異系のＴ細胞、例えば、機能的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および／またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、例えばＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIの発現が欠失した同種異系のＴ細胞であってもよい。
【０４５７】
機能的なＴＣＲが欠失したＴ細胞は、例えば、その表面上にいかなる機能的なＴＣＲも発現しないように加工されていてもよいし、機能的なＴＣＲを含む１以上のサブユニットを発現しないように加工されていてもよいし［例えば、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＴＣＲガンマ、ＴＣＲデルタ、ＴＣＲイプシロンおよび／またはＴＣＲゼータを発現しない（またはその低減された発現を示す）ように加工される］またはその表面上に非常にわずかな機能的なＴＣＲしか生産しないように加工されていてもよい。あるいは、Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲのサブユニットの１以上の突然変異またはトランケートされた形態の発現によって、実質的に機能が損なわれたＴＣＲを発現することができる。用語「実質的に機能が損なわれたＴＣＲ」は、このＴＣＲが、宿主において有害な免疫反応を惹起しないと予想されることを意味する。
【０４５８】
ここに記載するＴ細胞は、例えば、その表面上に機能的なＨＬＡを発現しないように加工されていてもよい。例えば、ここに記載するＴ細胞は、ＨＬＡ、例えばＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIの細胞表面での発現が下方調節されるように加工されていてもよい。一部の実施形態において、ＨＬＡの下方調節は、ベータ−２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を低減したりまたはなくしたりすることによって達成され得る。
【０４５９】
一部の実施形態において、Ｔ細胞は、機能的なＴＣＲおよび機能的なＨＬＡ、例えばＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスIIを欠失していてもよい。
【０４６０】
機能的なＴＣＲおよび／またはＨＬＡの発現が欠失した改変Ｔ細胞は、ＴＣＲまたはＨＬＡの１以上のサブユニットのノックアウトまたはノックダウンなどのあらゆる好適な手段により得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）転写活性化剤様のエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用した、ＴＣＲおよび／またはＨＬＡのノックダウンを包含していてもよい。
【０４６１】
一部の実施形態において、同種異系の細胞は、例えばここに記載するいずれかの方法によって阻害分子を発現しないかまたは低いレベルで発現する細胞であってもよい。例えば、細胞は、阻害分子を発現しないかまたは低いレベルで発現する細胞、例えば、ＣＡＲを発現する細胞の免疫エフェクター応答を展開する能力を減少させることができる細胞であってもよい。阻害分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦ（例えばＴＧＦベータ）が挙げられる。阻害分子の阻害、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害による阻害は、ＣＡＲを発現する細胞の性能を最適化することができる。実施形態において、阻害核酸、例えば、ここに記載する阻害核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化剤様のエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が使用できる。
【０４６２】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ
いくつかの実施形態において、ＴＣＲの発現および／またはＨＬＡの発現は、細胞、例えばＴ細胞におけるＴＣＲおよび／またはＨＬＡおよび／またはここに記載する阻害分子［例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦベータ］をコードする核酸を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを使用して阻害することができる。
【０４６３】
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡのための発現系、ならびに典型的なｓｈＲＮＡは、例えば、参照によりその全体が組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落６４９および６５０において記載されている。
【０４６４】
ＴＣＲまたはＨＬＡを阻害するＣＲＩＳＰＲ
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」または「ＴＣＲおよび／もしくはＨＬＡに対するＣＲＩＳＰＲ」または「ＴＣＲおよび／もしくはＨＬＡを阻害するＣＲＩＳＰＲ」とは、クラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピートのセットまたはリピートのこのようなセットを含む系を指す。本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ」とは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を指す。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」系とは、ＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓに由来する系であって、細胞、例えばＴ細胞におけるＴＣＲ遺伝子および／もしくはＨＬＡ遺伝子、ならびに／またはここに記載する阻害分子［例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦベータ］をサイレンシングするかまたは突然変異させるのに使用し得る系を指す。
【０４６５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびその使用は、例えば、参照によりその全体が組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落６５１〜６５８において記載されている。
【０４６６】
ＴＣＲおよび／またはＨＬＡを阻害するＴＡＬＥＮ
「ＴＡＬＥＮ」または「ＨＬＡおよび／もしくはＴＣＲに対するＴＡＬＥＮ」または「ＨＬＡおよび／もしくはＴＣＲを阻害するＴＡＬＥＮ」とは、細胞、例えばＴ細胞におけるＨＬＡ遺伝子および／もしくはＴＣＲ遺伝子、ならびに／またはここに記載する阻害分子［例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦベータ］を編集するのに使用し得る人工ヌクレアーゼである、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼを指す。
【０４６７】
ＴＡＬＥＮおよびそれらの使用は、例えば、参照によりその全体が組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落６５９〜６６５において記載されている。
【０４６８】
ＨＬＡおよび／またはＴＣＲを阻害するジンクフィンガーヌクレアーゼ
「ＺＦＮ」または「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＨＬＡおよび／もしくはＴＣＲに対するＺＦＮ」または「ＨＬＡおよび／もしくはＴＣＲを阻害するＺＦＮ」とは、細胞、例えばＴ細胞におけるＨＬＡ遺伝子および／もしくはＴＣＲ遺伝子、ならびに／またはここに記載する阻害分子［例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（例えば、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦベータ］を編集するのに使用し得る人工ヌクレアーゼである、ジンクフィンガーヌクレアーゼを指す。
【０４６９】
ＺＦＮおよびそれらの使用は、例えば、参照によりその全体が組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落６６６〜６７１において記載されている。
【０４７０】
テロメラーゼの発現
テロメアは、体細胞持続性に極めて重要な役割を果たし、テロメアの長さは、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）によって維持される。ＣＬＬ細胞内のテロメアの長さは、非常に短い可能性があり（Roth et al., “Significantly shorter telomeres in T-cells of patients with ZAP-70+/CD38 chronic lymphocytic leukaemia” British Journal of Haematology, 143, 383-386., August 28 2008）、製造されたＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ１９細胞内ではよりいっそう短い可能性があり、その結果、患者への養子移入後にテロメアが伸長する可能性は制限される。テロメラーゼ発現は、ＣＡＲ発現細胞を複製疲弊から救うことができる。
【０４７１】
いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、いくつかの実施形態において、患者における治療的Ｔ細胞の持続性は、Ｔ細胞におけるテロメアの短縮に起因して短期間であり、したがって、テロメラーゼ遺伝子のトランスフェクションは、Ｔ細胞のテロメアを長くし、患者におけるＴ細胞の持続性を改善する可能性がある。Carl June, “Adoptive T cell therapy for cancer in the clinic”, Journal of Clinical Investigation, 117:1466-1476 (2007)を参照されたい。したがって、ある実施形態において、免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞は、テロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒性サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴを異所的に発現する。いくつかの態様において、本開示は、ＣＡＲ発現細胞を作製する方法であって、細胞を、テロメラーゼサブユニット、例えば、テロメラーゼの触媒性サブユニット、例えば、ＴＥＲＴ、例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸と接触させることを含む方法を提示する。細胞は、ＣＡＲをコードするコンストラクトと接触させる前に、核酸と接触させることもでき、これと並列して接触させることもでき、この後で接触させることもできる。
【０４７２】
テロメラーゼ発現は、安定していることもあり（例えば、核酸が細胞のゲノムに組み込まれていることもあり）または一過性であることもある（例えば、核酸は組み込まれず、発現が一定期間後、例えば数日後に低下する）。安定的発現は、テロメラーゼサブユニットおよび選択マーカーをコードするＤＮＡを用いて細胞にトランスフェクトまたは形質導入し、安定な組込体を選択することによって、達成することができる。これとは別にまたは組合せて、安定的発現は、例えばＣｒｅ／ＬｏｘまたはＦＬＰ／ＦＲＴ系を使用する、部位特異的組換えにより達成することができる。
【０４７３】
一過性発現は、核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを用いるトランスフェクションまたは形質導入を含み得る。一部の実施形態では、一過性ｍＲＮＡトランスフェクションより、ＴＥＲＴを用いる安定的トランスフェクションに随伴することがある遺伝的不安定性が回避される。外因性テロメラーゼ活性の一過性発現は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる国際出願ＷＯ２０１４／１３０９０９号において記載されている。実施形態において、テロメラーゼサブユニットのｍＲＮＡベースのトランスフェクションは、Moderna Therapeuticsによって商品化されたメッセンジャーＲＮＡ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（商標）プラットフォームに従って行われる。例えば、その方法は、米国特許８７１０２００号、同第８８２２６６３号、同第８６８００６９号、同第８７５４０６２号、同第８６６４１９４号または同第８６８００６９号において記載されている方法であってもよい。
【０４７４】
ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  ＡＡＣ５１７２４.１のアミノ酸配列［Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795］であって：
MPRAPRCRAVRSLLRSHYREVLPLATFVRRLGPQGWRLVQRGDP
AAFRALVAQCLVCVPWDARPPPAAPSFRQVSCLKELVARVLQRLCERGAKNVLAFGFA
LLDGARGGPPEAFTTSVRSYLPNTVTDALRGSGAWGLLLRRVGDDVLVHLLARCALFV
LVAPSCAYQVCGPPLYQLGAATQARPPPHASGPRRRLGCERAWNHSVREAGVPLGLPA
PGARRRGGSASRSLPLPKRPRRGAAPEPERTPVGQGSWAHPGRTRGPSDRGFCVVSPA
RPAEEATSLEGALSGTRHSHPSVGRQHHAGPPSTSRPPRPWDTPCPPVYAETKHFLYS
SGDKEQLRPSFLLSSLRPSLTGARRLVETIFLGSRPWMPGTPRRLPRLPQRYWQMRPL
FLELLGNHAQCPYGVLLKTHCPLRAAVTPAAGVCAREKPQGSVAAPEEEDTDPRRLVQ
LLRQHSSPWQVYGFVRACLRRLVPPGLWGSRHNERRFLRNTKKFISLGKHAKLSLQEL
TWKMSVRGCAWLRRSPGVGCVPAAEHRLREEILAKFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTET
TFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLKRVQLRELSEAEVRQHREARPALLTSRLRFI
PKPDGLRPIVNMDYVVGARTFRREKRAERLTSRVKALFSVLNYERARRPGLLGASVLG
LDDIHRAWRTFVLRVRAQDPPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKPQNTYC
VRRYAVVQKAAHGHVRKAFKSHVSTLTDLQPYMRQFVAHLQETSPLRDAVVIEQSSSL
NEASSGLFDVFLRFMCHHAVRIRGKSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAG
IRRDGLLLRLVDDFLLVTPHLTHAKTFLRTLVRGVPEYGCVVNLRKTVVNFPVEDEAL
GGTAFVQMPAHGLFPWCGLLLDTRTLEVQSDYSSYARTSIRASLTFNRGFKAGRNMRR
KLFGVLRLKCHSLFLDLQVNSLQTVCTNIYKILLLQAYRFHACVLQLPFHQQVWKNPT
FFLRVISDTASLCYSILKAKNAGMSLGAKGAAGPLPSEAVQWLCHQAFLLKLTRHRVT
YVPLLGSLRTAQTQLSRKLPGTTLTALEAAANPALPSDFKTILD
（配列番号１０８）
のアミノ酸配列を有する。
【０４７５】
ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１０８の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する。ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、配列番号１０８の配列を有する。ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端またはこれらの両方において、欠失（例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない）を含む。ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、Ｎ末端、Ｃ末端またはこれらの両方において、トランスジェニックのアミノ酸配列（例えば、５、１０、１５、２０または３０アミノ酸を超えない）を含む。
【０４７６】
ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０１８１６７の核酸配列（Meyerson et al., “hEST2, the Putative Human Telomerase Catalytic Subunit Gene, Is Up-Regulated in Tumor Cells and during Immortalization” Cell Volume 90, Issue 4, 22 August 1997, Pages 785-795）：
1 caggcagcgt ggtcctgctg cgcacgtggg aagccctggc cccggccacc cccgcgatgc
61 cgcgcgctcc ccgctgccga gccgtgcgct ccctgctgcg cagccactac cgcgaggtgc
121 tgccgctggc cacgttcgtg cggcgcctgg ggccccaggg ctggcggctg gtgcagcgcg
181 gggacccggc ggctttccgc gcgctggtgg cccagtgcct ggtgtgcgtg ccctgggacg
241 cacggccgcc ccccgccgcc ccctccttcc gccaggtgtc ctgcctgaag gagctggtgg
301 cccgagtgct gcagaggctg tgcgagcgcg gcgcgaagaa cgtgctggcc ttcggcttcg
361 cgctgctgga cggggcccgc gggggccccc ccgaggcctt caccaccagc gtgcgcagct
421 acctgcccaa cacggtgacc gacgcactgc gggggagcgg ggcgtggggg ctgctgttgc
481 gccgcgtggg cgacgacgtg ctggttcacc tgctggcacg ctgcgcgctc tttgtgctgg
541 tggctcccag ctgcgcctac caggtgtgcg ggccgccgct gtaccagctc ggcgctgcca
601 ctcaggcccg gcccccgcca cacgctagtg gaccccgaag gcgtctggga tgcgaacggg
661 cctggaacca tagcgtcagg gaggccgggg tccccctggg cctgccagcc ccgggtgcga
721 ggaggcgcgg gggcagtgcc agccgaagtc tgccgttgcc caagaggccc aggcgtggcg
781 ctgcccctga gccggagcgg acgcccgttg ggcaggggtc ctgggcccac ccgggcagga
841 cgcgtggacc gagtgaccgt ggtttctgtg tggtgtcacc tgccagaccc gccgaagaag
901 ccacctcttt ggagggtgcg ctctctggca cgcgccactc ccacccatcc gtgggccgcc
961 agcaccacgc gggcccccca tccacatcgc ggccaccacg tccctgggac acgccttgtc
1021 ccccggtgta cgccgagacc aagcacttcc tctactcctc aggcgacaag gagcagctgc
1081 ggccctcctt cctactcagc tctctgaggc ccagcctgac tggcgctcgg aggctcgtgg
1141 agaccatctt tctgggttcc aggccctgga tgccagggac tccccgcagg ttgccccgcc
1201 tgccccagcg ctactggcaa atgcggcccc tgtttctgga gctgcttggg aaccacgcgc
1261 agtgccccta cggggtgctc ctcaagacgc actgcccgct gcgagctgcg gtcaccccag
1321 cagccggtgt ctgtgcccgg gagaagcccc agggctctgt ggcggccccc gaggaggagg
1381 acacagaccc ccgtcgcctg gtgcagctgc tccgccagca cagcagcccc tggcaggtgt
1441 acggcttcgt gcgggcctgc ctgcgccggc tggtgccccc aggcctctgg ggctccaggc
1501 acaacgaacg ccgcttcctc aggaacacca agaagttcat ctccctgggg aagcatgcca
1561 agctctcgct gcaggagctg acgtggaaga tgagcgtgcg gggctgcgct tggctgcgca
1621 ggagcccagg ggttggctgt gttccggccg cagagcaccg tctgcgtgag gagatcctgg
1681 ccaagttcct gcactggctg atgagtgtgt acgtcgtcga gctgctcagg tctttctttt
1741 atgtcacgga gaccacgttt caaaagaaca ggctcttttt ctaccggaag agtgtctgga
1801 gcaagttgca aagcattgga atcagacagc acttgaagag ggtgcagctg cgggagctgt
1861 cggaagcaga ggtcaggcag catcgggaag ccaggcccgc cctgctgacg tccagactcc
1921 gcttcatccc caagcctgac gggctgcggc cgattgtgaa catggactac gtcgtgggag
1981 ccagaacgtt ccgcagagaa aagagggccg agcgtctcac ctcgagggtg aaggcactgt
2041 tcagcgtgct caactacgag cgggcgcggc gccccggcct cctgggcgcc tctgtgctgg
2101 gcctggacga tatccacagg gcctggcgca ccttcgtgct gcgtgtgcgg gcccaggacc
2161 cgccgcctga gctgtacttt gtcaaggtgg atgtgacggg cgcgtacgac accatccccc
2221 aggacaggct cacggaggtc atcgccagca tcatcaaacc ccagaacacg tactgcgtgc
2281 gtcggtatgc cgtggtccag aaggccgccc atgggcacgt ccgcaaggcc ttcaagagcc
2341 acgtctctac cttgacagac ctccagccgt acatgcgaca gttcgtggct cacctgcagg
2401 agaccagccc gctgagggat gccgtcgtca tcgagcagag ctcctccctg aatgaggcca
2461 gcagtggcct cttcgacgtc ttcctacgct tcatgtgcca ccacgccgtg cgcatcaggg
2521 gcaagtccta cgtccagtgc caggggatcc cgcagggctc catcctctcc acgctgctct
2581 gcagcctgtg ctacggcgac atggagaaca agctgtttgc ggggattcgg cgggacgggc
2641 tgctcctgcg tttggtggat gatttcttgt tggtgacacc tcacctcacc cacgcgaaaa
2701 ccttcctcag gaccctggtc cgaggtgtcc ctgagtatgg ctgcgtggtg aacttgcgga
2761 agacagtggt gaacttccct gtagaagacg aggccctggg tggcacggct tttgttcaga
2821 tgccggccca cggcctattc ccctggtgcg gcctgctgct ggatacccgg accctggagg
2881 tgcagagcga ctactccagc tatgcccgga cctccatcag agccagtctc accttcaacc
2941 gcggcttcaa ggctgggagg aacatgcgtc gcaaactctt tggggtcttg cggctgaagt
3001 gtcacagcct gtttctggat ttgcaggtga acagcctcca gacggtgtgc accaacatct
3061 acaagatcct cctgctgcag gcgtacaggt ttcacgcatg tgtgctgcag ctcccatttc
3121 atcagcaagt ttggaagaac cccacatttt tcctgcgcgt catctctgac acggcctccc
3181 tctgctactc catcctgaaa gccaagaacg cagggatgtc gctgggggcc aagggcgccg
3241 ccggccctct gccctccgag gccgtgcagt ggctgtgcca ccaagcattc ctgctcaagc
3301 tgactcgaca ccgtgtcacc tacgtgccac tcctggggtc actcaggaca gcccagacgc
3361 agctgagtcg gaagctcccg gggacgacgc tgactgccct ggaggccgca gccaacccgg
3421 cactgccctc agacttcaag accatcctgg actgatggcc acccgcccac agccaggccg
3481 agagcagaca ccagcagccc tgtcacgccg ggctctacgt cccagggagg gaggggcggc
3541 ccacacccag gcccgcaccg ctgggagtct gaggcctgag tgagtgtttg gccgaggcct
3601 gcatgtccgg ctgaaggctg agtgtccggc tgaggcctga gcgagtgtcc agccaagggc
3661 tgagtgtcca gcacacctgc cgtcttcact tccccacagg ctggcgctcg gctccacccc
3721 agggccagct tttcctcacc aggagcccgg cttccactcc ccacatagga atagtccatc
3781 cccagattcg ccattgttca cccctcgccc tgccctcctt tgccttccac ccccaccatc
3841 caggtggaga ccctgagaag gaccctggga gctctgggaa tttggagtga ccaaaggtgt
3901 gccctgtaca caggcgagga ccctgcacct ggatgggggt ccctgtgggt caaattgggg
3961 ggaggtgctg tgggagtaaa atactgaata tatgagtttt tcagttttga aaaaaaaaaa
4021 aaaaaaa（配列番号２３）
によりコードされる。
【０４７７】
ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、配列番号２３の配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一な配列を有する核酸によりコードされる。ある実施形態において、ｈＴＥＲＴは、配列番号２３の核酸によりコードされる。
【０４７８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明は、免疫エフェクター細胞をがんに指向させる１以上のＣＡＲを含有するように加工された免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を提供する。この指向は、がん関連抗原に対して特異的であるＣＡＲ上の抗原結合ドメインによって達成される。ここに記載するＣＡＲの標的にされ得る２クラスのがん関連抗原（腫瘍抗原）がある：（１）がん細胞の表面で発現されるがん関連抗原；および（２）それ自体は細胞内にあるがん関連抗原だが、そのような抗原のフラグメント（ペプチド）がＭＨＣ（主要組織適合複合体）によりがん細胞の表面に提示される、がん関連抗原。
【０４７９】
したがって、免疫エフェクター細胞、例えば、ここに記載する方法により得られる免疫エフェクター細胞を、以下のがん関連抗原（腫瘍抗原）の１つを標的とするＣＡＲを含有するように加工することができる：ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ−１、ＣＬＬ−１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖIII、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ  Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ−１３Ｒａ２、メソセリン、ＩＬ−１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ−ベータ、ＰＲＳＳ２１、ＳＳＥＡ−４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ−アセチル−ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、レグマイン、ＨＰＶ  Ｅ６,Ｅ７、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ  Ａ１、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ  ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３突然変異体、プロステイン、サバイビンおよびテロメラーゼ、ＰＣＴＡ−１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ突然変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥＲＧ  （ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ−１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ならびにｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２。
【０４８０】
二重特異性ＣＡＲ
一実施形態において、多重特異性抗体分子は、二重特異性抗体分子である。二重特異性抗体は、２つ以下の抗原に特異性を有する。二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する第一の免疫グロブリンの可変ドメイン配列および第二のエピトープに結合特異性を有する第二の免疫グロブリンの可変ドメイン配列を特徴とする。一実施形態において、第一および第二のエピトープは、同じ抗原、例えば、同じタンパク質（または多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態において、第一および第二のエピトープは、重複している。一実施形態において、第一および第二のエピトープは、重複していない。一実施形態において、第一および第二のエピトープは、異なる抗原、例えば、異なるタンパク質（または異なる多量体タンパク質のサブユニット）上にある。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列、ならびに第二のエピトープに結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を含む。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する半抗体および第二のエピトープに結合特異性を有する半抗体を含む。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有する半抗体またはそれらのフラグメントおよび第二のエピトープに結合特異性を有する半抗体またはそれらのフラグメントを含む。一実施形態において、二重特異性抗体分子は、第一のエピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそれらのフラグメントおよび第二のエピトープに結合特異性を有するｓｃＦｖまたはそれらのフラグメントを含む。
【０４８１】
ある特定の実施形態において、抗体分子は、多重特異性（例えば、二重特異性または三重特異性）抗体分子である。二重特異性またはヘテロ二量体抗体分子を生成するためのプロトコールおよび二重特異性抗体分子の様々な配置は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願されたＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落４５５〜４５８において記載されている。
【０４８２】
一態様において、二重特異性抗体分子は、ＣＤ１９に対する結合特異性を有する、例えばここに記載するｓｃＦｖを含むかまたはここに記載するｓｃＦｖからの軽鎖ＣＤＲおよび／もしくは重鎖ＣＤＲを含む、第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列、例えばｓｃＦｖと、異なる抗原上の第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列とを特徴とする。
【０４８３】
キメラＴＣＲ
一態様において、本発明の抗体および抗体フラグメント（例えば、ＣＤ１９抗体およびフラグメント）をＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）鎖、例えば、ＴＣＲアルファまたはＴＣＲベータ鎖の１以上の定常ドメインにグラフト化して、キメラＴＣＲを作り出すことができる。理論に縛られることはないが、キメラＴＣＲは、抗原結合直後にＴＣＲ複合体を介してシグナル伝達すると考えられる。例えば、本明細書で開示されるｓｃＦｖは、ＴＣＲ鎖、例えば、ＴＣＲアルファ鎖および／またはＴＣＲベータ鎖の、定常ドメイン、例えば細胞外定常ドメインの少なくとも一部、膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインにグラフト化されてもよい。別の例として、抗体フラグメント、例えばここに記載するＶＬドメインは、ＴＣＲアルファ鎖の定常ドメインにグラフト化されてもよいし、抗体フラグメント、例えばここに記載するＶＨドメインは、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインにグラフト化されてもよい（または別に、ＶＬドメインは、ＴＣＲベータ鎖の定常ドメインにグラフト化されてもよいし、ＶＨドメインは、ＴＣＲアルファ鎖にグラフト化されてもよい）。別の例として、抗体または抗体フラグメントのＣＤＲをＴＣＲアルファおよび／またはベータ鎖にグラフト化して、キメラＴＣＲを作り出してもよい。例えば、本明細書で開示されるＬＣＤＲをＴＣＲアルファ鎖の可変ドメインにグラフト化してもよいし、本明細書で開示されるＨＣＤＲをＴＣＲベータ鎖の可変ドメインにグラフト化してもよくまたは逆もまた同様である。このようなキメラＴＣＲは、例えば当分野で公知の方法によって産生され得る（例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 2000; 7: 1369-1377；Zhang T et al, Cancer Gene Ther 2004; 11: 487-496；Aggen et al, Gene Ther. 2012 Apr; 19(4):365-74）。
【０４８４】
非抗体足場
実施形態において、抗原結合ドメインは、非抗体足場、例えば、フィブロネクチン、アンキリン、ドメイン抗体、リポカリン、小モジュラー免疫薬、マキシボディ（maxybody）、プロテインＡまたはアフィリンを含む。非抗体足場は、細胞上の標的抗原と結合する能力を有する。実施形態において、抗原結合ドメインは、細胞上で発現される天然に存在するタンパク質のポリペプチドまたはそのフラグメントである。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、非抗体足場を含む。結果として得られるポリペプチドが、標的細胞上の標的抗原と特異的に結合する少なくとも１つの結合領域を含むのであれば、多種多様な非抗体足場を利用することができる。
【０４８５】
非抗体足場としては、フィブロネクチン（Novartis, MA）、アンキリン（Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland）、ドメイン抗体（Domantis, Ltd., Cambridge, MAおよびAblynx nv, Zwijnaarde, Belgium）、リポカリン（Pieris Proteolab AG, Freising, Germany）、小モジュラー免疫薬（Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA）、マキシボディ（Avidia, Inc., Mountain View, CA）、プロテインＡ（Affibody AG, Sweden）およびアフィリン（ガンマ−クリスタリンまたはユビキチン）（Scil Proteins GmbH, Halle, Germany）が挙げられる。
【０４８６】
ある実施形態において、抗原結合ドメインは、標的細胞の表面のカウンターリガンドに結合する分子の細胞外ドメインまたはそのカウンターリガンド結合フラグメントを含む。
【０４８７】
免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする配列を含む組換えＤＮＡコンストラクトを含むことができ、ここでのＣＡＲは、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原と特異的に結合する抗原結合ドメイン（例えば、抗体または抗体フラグメント、ＴＣＲまたはＴＣＲフラグメント）および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメイン、例えばゼータ鎖を含み得る。他の箇所で記載されるように、ここに記載する方法は、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を用いて細胞、例えば、調節性Ｔ細胞枯渇集団からの細胞に形質導入することを包含し得る。
【０４８８】
特定の態様において、ＣＡＲは、ｓｃＦｖドメインを含み、この場合、ｓｃＦｖの前に、配列番号１で提供されるもののような任意のリーダー配列、それに続いて、配列番号２または配列番号３６または配列番号３８で提供されるもののような任意のヒンジ配列、配列番号６で提供されるもののような膜貫通領域、配列番号７または配列番号１６を包含する細胞内シグナル伝達ドメインおよび配列番号９または配列番号１０を包含するＣＤ３ゼータ配列が存在していてもよく、例えば、前記ドメインは連続しており、同じリーディングフレーム内にあって、単一の融合タンパク質を形成する。
【０４８９】
一態様において、例示的なＣＡＲコンストラクトは、任意のリーダー配列（例えば、ここに記載するリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン）、ヒンジ（例えば、ここに記載するヒンジ領域）、膜貫通ドメイン（例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン）および細胞内刺激ドメイン（例えば、ここに記載する細胞内刺激ドメイン）を含む。一態様において、例示的なＣＡＲコンストラクトは、任意のリーダー配列（例えば、ここに記載するリーダー配列）、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、ここに記載する抗原結合ドメイン）、ヒンジ（例えば、ここに記載するヒンジ領域）、膜貫通ドメイン（例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン）、細胞内共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、ここに記載する共刺激シグナル伝達ドメイン）および／または細胞内一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン）を含む。
【０４９０】
例示的なリーダー配列は、配列番号１として提供される。例示的なヒンジ／スペーサー配列は、配列番号２または配列番号３６または配列番号３８として提供される。例示的な膜貫通ドメイン配列は、配列番号６として提供される。４−１ＢＢタンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインの例示的な配列は、配列番号７として提供される。ＣＤ２７の細胞内シグナル伝達ドメインの例示的な配列は、配列番号１６として提供される。典型的なＣＤ３ゼータドメイン配列は、配列番号９または配列番号１０として提供される。
【０４９１】
一態様において、免疫エフェクター細胞は、ＣＡＲをコードする核酸分子を含む組換え核酸コンストラクトを包含し、ここでの核酸分子は、抗原結合ドメインをコードする核酸配列を含み、該配列は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列と連続しておりそれと同じリーディングフレーム内にある。ＣＡＲにおいて使用することができる典型的な細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、などの１以上の細胞内シグナル伝達ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ、ＣＤ２８、４−１ＢＢなどのあらゆる組合せを含んでいてもよい。
【０４９２】
所望の分子をコードする核酸配列は、当分野で公知の組換え方法を使用して得ることができ、例えば核酸分子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすること、核酸分子を包含することがわかっているベクターからその核酸分子を抽出することまたはその遺伝子を含有する細胞および組織から標準的な技術を使用して直接単離することなどによって得ることができる。あるいは、対象の核酸は、クローニングされるのではなく合成的に産生されてもよい。
【０４９３】
例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターコンストラクトを使用して、ＣＡＲをコードする核酸を免疫エフェクター細胞に導入することができる。
【０４９４】
例えば、細胞に直接トランスフェクトすることができるＲＮＡコンストラクトを使用して、ＣＡＲをコードする核酸を免疫エフェクター細胞に導入することもできる。トランスフェクションで使用するためのｍＲＮＡを生成するための方法は、３’および５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）（例えば、ここに記載する３’および／または５’ＵＴＲ）、５’キャップ（例えば、ここに記載する５’キャップ）ならびに／または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）（例えば、ここに記載するＩＲＥＳ）、発現されることになる核酸、ならびにポリＡテールを含有する、典型的に長さが５０〜２０００塩基のコンストラクト（例えば、実施例で記載されるもの、例えば、配列番号３５）を産生するために、特別に設計されたプライマーを用いる鋳型のインビトロ転写（ＩＶＴ）、それに続くポリＡ付加を含む。このようにして産生されたＲＮＡは、異なる種類の細胞に効率的にトランスフェクトすることができる。一実施形態において、鋳型は、ＣＡＲに関する配列を包含する。ある実施形態において、ＲＮＡ  ＣＡＲベクターは、エレクトロポレーションによって細胞、例えば、Ｔ細胞に形質導入される。
【０４９５】
抗原結合ドメイン
一態様において、複数の免疫エフェクター細胞、例えば、調節性Ｔ細胞枯渇集団は、他に抗原結合ドメインと称される標的特異性の結合要素を含むＣＡＲをコードする核酸を含む。結合要素の選択は、標的細胞の表面を特徴づけるリガンドのタイプおよび数に依存する。例えば、抗原結合ドメインは、特定の病状に関連する標的細胞上の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選ぶことができる。したがって、ここに記載するＣＡＲにおける抗原結合ドメインのリガンドとして作用することができる細胞表面マーカーの例としては、ウイルス、細菌および寄生虫感染症、自己免疫疾患およびがん細胞に関連するものが挙げられる。
【０４９６】
一態様において、抗原結合ドメインを含むＣＡＲの部分は、腫瘍抗原、例えば、ここに記載する腫瘍抗原を標的とする抗原結合ドメインを含む。
【０４９７】
抗原結合ドメインは、これらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびこれらの機能的なフラグメント［これらに限定されないが、単一ドメイン抗体、例えば、ラクダ科動物由来のナノボディの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および可変ドメイン（ＶＨＨ）を包含する］を包含する抗体、ならびに組換えフィブロネクチンドメイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはそのフラグメント、例えば単鎖ＴＣＲ、などなどの、抗原結合ドメインとして機能することが当分野で公知の代替足場と結合する、あらゆるドメインであり得る。いくつかの場合において、抗原結合ドメインにとって、ＣＡＲが最終的に使用されると予想される同じ種由来であることは有益である。例えば、ヒトに使用する場合、ＣＡＲの抗原結合ドメインにとって、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインにヒトまたはヒト化残基を含むことは有益であり得る。
【０４９８】
ある実施形態において、抗原結合ドメインは、抗ＣＤ１９抗体またはそのフラグメント、例えばｓｃＦｖを含む。例えば、抗原結合ドメインは、表１に列挙する可変重鎖および可変軽鎖を含む。可変重鎖と可変軽鎖を合体させるリンカー配列は、例えば、ここに記載するリンカー配列の何れであってもよくまたは代替的に、GSTSGSGKPGSGEGSTKG（配列番号１０４）であってもよい。
【０４９９】
【表３】
2019500874.tif 000004
【０５００】
【表４】
2019500874.tif 000005
【０５０１】
【表５】
2019500874.tif 000006
【０５０２】
任意のＣＤ１９  ＣＡＲ、例えば、任意の公知ＣＡＲのＣＤ１９抗原結合ドメインを、本開示に従って使用することができる。例えば、ＬＧ−７４０；米国特許第８,３９９,６４５号；米国特許第７,４４６,１９０号；Xu et al., Leuk Lymphoma.2013 54(2):255-260(2012)；Cruz et al., Blood 122(17):2965-2973 (2013)；Brentjens et al., Blood, 118(18):4817-4828 (2011)；Kochenderfer et al., Blood 116(20):4099-102 (2010)；Kochenderfer et al., Blood 122 (25):4129-39(2013)；および16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther (ASGCT) (May 15-18, Salt Lake City) 2013, Abst 10で記載されるＣＤ１９  ＣＡＲである。
【０５０３】
ＣＡＲ発現細胞を使用して標的化することができる例示的な標的抗原としては、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４／１３０６３５号、ＷＯ２０１４／１３０６５７号およびＷＯ２０１５／０９０２３０号において記載されているような、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖIII、メソセリンが中でも挙げられるが、これらに限定されない。
【０５０４】
一実施形態において、ＣＤ１９と特異的に結合するＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＵＳＡＮ名ＴＩＳＡＧＥＮＬＥＣＬＥＵＣＥＬ−Ｔを有する。ＣＴＬ０１９は、Ｔ細胞の遺伝子改変によって作製され、この改変は、ＥＦ−１アルファプロモーターの制御下のＣＴＬ０１９導入遺伝子を含有する自己不活性化、複製欠損レンチウイルス（ＬＶ）ベクターでの形質導入による安定的挿入によって媒介される。ＣＴＬ０１９は、パーセント導入遺伝子陽性Ｔ細胞に基づいて対象に送達される導入遺伝子陽性Ｔ細胞と導入遺伝子陰性Ｔ細胞の混合物であってもよい。
【０５０５】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ヒトＣＤ１９と特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４／１５３２７０号の表３による、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメイン（例えば、ヒト化抗原結合ドメイン）を包含し得る。
【０５０６】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１２３と特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４／１３０６３５号の表１〜２による、ＣＡＲ分子（例えば、ＣＡＲ１〜ＣＡＲ８のいずれか）または抗原結合ドメインを包含し得る。
【０５０７】
ある実施形態において、ＣＡＲ分子は、ここに記載するＣＤ１２３  ＣＡＲ、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２号Ａ１または同第２０１６／００６８６０１号Ａ１において記載されているＣＤ１２３  ＣＡＲを含み、これらの特許文献は両方とも参照により本明細書に組み入れられる。実施形態において、ＣＤ１２３  ＣＡＲは、アミノ酸を含みまたは米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２号Ａ１または同第２０１６／００６８６０１号Ａ１に示されているヌクレオチド配列を有し、これらの特許文献は両方とも参照により本明細書に組み入れられる。
【０５０８】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＥＧＦＲｖIIIと特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４／１３０６５７号の表２または配列番号１１による、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインを包含し得る。
【０５０９】
ある実施形態において、ＣＡＲ分子は、ここに記載するＥＧＦＲｖIII  ＣＡＲ分子、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５号Ａ１において記載されているＥＧＦＲｖIII  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＥＧＦＲｖIII  ＣＡＲは、アミノ酸を含みまたは参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５号Ａ１に示されているヌクレオチド配列を有する。
【０５１０】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、メソセリンと特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１５／０９０２３０号の表２〜３による、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインを包含し得る。
【０５１１】
ある実施形態において、ＣＡＲ分子は、ここに記載するメソセリンＣＡＲ、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１５／０９０２３０号において記載されているメソセリンＣＡＲを含む。実施形態において、メソセリンＣＡＲは、アミノ酸を含みまたは参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１５／０９０２３０号に示されているヌクレオチド配列を有する。
【０５１２】
一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ここに記載するＢＣＭＡ  ＣＡＲ分子、例えば、米国特許出願公開第２０１６／００４６７２４号Ａ１において記載されているＢＣＭＡ  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、アミノ酸を含みまたは参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１６／００４６７２４号Ａ１に示されているヌクレオチド配列を有する。
【０５１３】
ある実施形態において、ＣＡＲ分子は、ここに記載するＣＬＬ１  ＣＡＲ、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１号Ａ１において記載されているＣＬＬ１  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＣＬＬ１  ＣＡＲは、アミノ酸を含みまたは参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１号Ａ１に示されているヌクレオチド配列を有する。
【０５１４】
ある実施形態において、ＣＡＲ分子は、ここに記載するＣＤ３３  ＣＡＲ、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２号Ａ１において記載されているＣＤ３３  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＣＤ３３  ＣＡＲは、アミノ酸を含みまたは参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２号Ａ１に示されているヌクレオチド配列を有する。
【０５１５】
ここに記載する任意の方法または組成物に従って、実施形態において、ＣＡＲ分子は、ここに記載するＣＤ１２３  ＣＡＲ、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２号Ａ１または同第２０１６／００６８６０１号Ａ１において記載されているＣＤ１２３  ＣＡＲを含み、これらの特許文献は両方とも参照により本明細書に組み入れられる。実施形態において、ＣＤ１２３  ＣＡＲは、アミノ酸を含みまたは米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２号Ａ１または同第２０１６／００６８６０１号Ａ１に示されているヌクレオチド配列を有し、これらの特許文献は両方とも参照により本明細書に組み入れられる。他の実施形態において、ＣＡＲ分子は、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ分子、例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２８３１７８号Ａ１において記載されているＣＤ１９  ＣＡＲ分子、例えばＣＴＬ０１９を含む。実施形態において、ＣＤ１９  ＣＡＲは、アミノ酸を含みまたは参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１５／０２８３１７８号Ａ１に示されているヌクレオチド配列を有する。一実施形態において、ＣＡＲ分子は、ここに記載するＢＣＭＡ  ＣＡＲ分子、例えば、米国特許出願公開第２０１６／００４６７２４号Ａ１において記載されているＢＣＭＡ  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＢＣＭＡ  ＣＡＲは、アミノ酸を含みまたは参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１６／００４６７２４号Ａ１に示されているヌクレオチド配列を有する。ある実施形態において、ＣＡＲ分子は、ここに記載するＣＬＬ１  ＣＡＲ、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１号Ａ１において記載されているＣＬＬ１  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＣＬＬ１  ＣＡＲは、アミノ酸を含みまたは参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１号Ａ１に示されているヌクレオチド配列を有する。ある実施形態において、ＣＡＲ分子は、ここに記載するＣＤ３３  ＣＡＲ、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２号Ａ１において記載されているＣＤ３３  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＣＤ３３  ＣＡＲは、アミノ酸を含みまたは参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２号Ａ１に示されているヌクレオチド配列を有する。ある実施形態において、ＣＡＲ分子は、ここに記載するＥＧＦＲｖIII  ＣＡＲ分子、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５号Ａ１において記載されているＥＧＦＲｖIII  ＣＡＲを含む。実施形態において、ＥＧＦＲｖIII  ＣＡＲは、アミノ酸を含みまたは参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５号Ａ１に示されているヌクレオチド配列を有する。ある実施形態において、ＣＡＲ分子は、ここに記載するメソセリンＣＡＲ、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１５／０９０２３０号において記載されているメソセリンＣＡＲを含む。実施形態において、メソセリンＣＡＲは、アミノ酸を含みまたは参照により本明細書に組み入れられるＷＯ第２０１５／０９０２３０号に示されているヌクレオチド配列を有する。
【０５１６】
例示的なＣＤ１９  ＣＡＲとしては、本明細書で、例えば、本明細書における１つもしくは複数の表で記載されるＣＤ１９  ＣＡＲまたはXu et al. Blood 123.24(2014):3750-9、Kochenderfer et al. Blood 122.25(2013):4129-39、Cruz et al. Blood 122.17(2013):2965-73、ＮＣＴ００５８６３９１、ＮＣＴ０１０８７２９４、ＮＣＴ０２４５６３５０、ＮＣＴ００８４０８５３、ＮＣＴ０２６５９９４３、ＮＣＴ０２６５０９９９、ＮＣＴ０２６４０２０９、ＮＣＴ０１７４７４８６、ＮＣＴ０２５４６７３９、ＮＣＴ０２６５６１４７、ＮＣＴ０２７７２１９８、ＮＣＴ００７０９０３３、ＮＣＴ０２０８１９３７、ＮＣＴ００９２４３２６、ＮＣＴ０２７３５０８３、ＮＣＴ０２７９４２４６、ＮＣＴ０２７４６９５２、ＮＣＴ０１５９３６９６、ＮＣＴ０２１３４２６２、ＮＣＴ０１８５３６３１、ＮＣＴ０２４４３８３１、ＮＣＴ０２２７７５２２、ＮＣＴ０２３４８２１６、ＮＣＴ０２６１４０６６、ＮＣＴ０２０３０８３４、ＮＣＴ０２６２４２５８、ＮＣＴ０２６２５４８０、ＮＣＴ０２０３０８４７、ＮＣＴ０２６４４６５５、ＮＣＴ０２３４９６９８、ＮＣＴ０２８１３８３７、ＮＣＴ０２０５０３４７、ＮＣＴ０１６８３２７９、ＮＣＴ０２５２９８１３、ＮＣＴ０２５３７９７７、ＮＣＴ０２７９９５５０、ＮＣＴ０２６７２５０１、ＮＣＴ０２８１９５８３、ＮＣＴ０２０２８４５５、ＮＣＴ０１８４０５６６、ＮＣＴ０１３１８３１７、ＮＣＴ０１８６４８８９、ＮＣＴ０２７０６４０５、ＮＣＴ０１４７５０５８、ＮＣＴ０１４３０３９０、ＮＣＴ０２１４６９２４、ＮＣＴ０２０５１２５７、ＮＣＴ０２４３１９８８、ＮＣＴ０１８１５７４９、ＮＣＴ０２１５３５８０、ＮＣＴ０１８６５６１７、ＮＣＴ０２２０８３６２、ＮＣＴ０２６８５６７０、ＮＣＴ０２５３５３６４、ＮＣＴ０２６３１０４４、ＮＣＴ０２７２８８８２、ＮＣＴ０２７３５２９１、ＮＣＴ０１８６０９３７、ＮＣＴ０２８２２３２６、ＮＣＴ０２７３７０８５、ＮＣＴ０２４６５９８３、ＮＣＴ０２１３２６２４、ＮＣＴ０２７８２３５１、ＮＣＴ０１４９３４５３、ＮＣＴ０２６５２９１０、ＮＣＴ０２２４７６０９、ＮＣＴ０１０２９３６６、ＮＣＴ０１６２６４９５、ＮＣＴ０２７２１４０７、ＮＣＴ０１０４４０６９、ＮＣＴ００４２２３８３、ＮＣＴ０１６８０９９１、ＮＣＴ０２７９４９６１またはＮＣＴ０２４５６２０７において記載されている抗ＣＤ１９  ＣＡＲが挙げられ、前記参考文献は、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０５１７】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、ここに記載する抗体（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、ＷＯ２０１５／１４２６７５号、米国特許出願公開第２０１５／０２８３１７８号Ａ１、米国特許出願公開第２０１６／００４６７２４号Ａ１、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２号Ａ１、米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１号Ａ１、米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１号Ａ１、米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２号Ａ１、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５号Ａ１、もしくはＷＯ２０１５／０９０２３０号において記載されている抗体）からの１、２、３（例えば、全３）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３ならびに／または本明細書に記載の抗体（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、ＷＯ２０１５／１４２６７５号、米国特許出願公開第２０１５／０２８３１７８号Ａ１、米国特許出願公開第２０１６／００４６７２４号Ａ１、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２号Ａ１、米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１号Ａ１、米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１号Ａ１、米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２号Ａ１、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５号Ａ１、もしくはＷＯ２０１５／０９０２３０号において記載されている抗体）からの１、２、３（例えば、全３）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙した抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。
【０５１８】
実施形態において、抗原結合ドメインは、参照により本明細書に組み入れられる、ＷＯ２０１５／１４２６７５号、米国特許出願公開第２０１５／０２８３１７８号Ａ１、米国特許出願公開第２０１６／００４６７２４号Ａ１、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２号Ａ１、米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１号Ａ１、米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１号Ａ１、米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２号Ａ１、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２７５号Ａ１またはＷＯ２０１５／０９０２３０号において記載されている抗原結合ドメインである。
【０５１９】
実施形態において、抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡを標的とし、米国特許出願公開第２０１６／００４６７２４号Ａ１において記載されている。
【０５２０】
実施形態において、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９を標的とし、米国特許出願公開第２０１５／０２８３１７８号Ａ１において記載されている。
【０５２１】
実施形態において、抗原結合ドメインは、ＣＤ１２３を標的とし、米国特許出願公開第２０１４／０３２２２１２号Ａ１、米国特許出願公開第２０１６／００６８６０１号Ａ１において記載されている。
【０５２２】
実施形態において、抗原結合ドメインは、ＣＬＬ１を標的とし、米国特許出願公開第２０１６／００５１６５１号Ａ１において記載されている。
【０５２３】
実施形態において、抗原結合ドメインは、ＣＤ３３を標的とし、米国特許出願公開第２０１６／００９６８９２号Ａ１において記載されている。
【０５２４】
ＣＡＲ発現細胞を使用して標的化することができる例示的な標的抗原としては、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４／１５３２７０号、ＷＯ２０１４／１３０６３５号、ＷＯ２０１６／０２８８９６号、ＷＯ２０１４／１３０６５７号、ＷＯ２０１６／０１４５７６号、ＷＯ２０１５／０９０２３０号、ＷＯ２０１６／０１４５６５号、ＷＯ２０１６／０１４５３５号およびＷＯ２０１６／０２５８８０号において記載されているような、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖIII、ＣＤ３３、メソセリン、ＢＣＭＡおよびＧＦＲ  ＡＬＰＨＡ−４が中でも挙げられるが、これらに限定されない。
【０５２５】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ヒト化ＣＤ１９と特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４／１５３２７０号の表３による、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメイン（例えば、ヒト化抗原結合ドメイン）を包含し得る。ＣＤ１９  ＣＡＲ分子および抗原結合ドメイン（例えば、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによれば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲおよび１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）をコードするアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１４／１５３２７０号において指定されている。
【０５２６】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１２３と特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４／１３０６３５号の表１〜２による、ＣＡＲ分子（例えば、ＣＡＲ１〜ＣＡＲ８のいずれか）または抗原結合ドメインを包含し得る。ＣＤ１２３  ＣＡＲ分子および抗原結合ドメイン（例えば、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによれば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲおよび１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）をコードするアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１４／１３０６３５号において指定されている。
【０５２７】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ１２３と特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１６／０２８８９６号の表２、６および９による、ＣＡＲ分子（例えば、ＣＡＲ１２３−１〜ＣＡＲ１２３−４およびｈｚＣＡＲ１２３−１〜ｈｚＣＡＲ１２３−３２のいずれか）または抗原結合ドメインを包含し得る。ＣＤ１２３  ＣＡＲ分子および抗原結合ドメイン（例えば、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによれば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲおよび１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）をコードするアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１６／０２８８９６号において指定されている。
【０５２８】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＥＧＦＲｖIIIと特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４／１３０６５７号の表２または配列番号１１による、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインを包含し得る。ＥＧＦＲｖIII  ＣＡＲ分子および抗原結合ドメイン（例えば、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによれば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲおよび１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）をコードするアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１４／１３０６５７号において指定されている。
【０５２９】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＤ３３と特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１６／０１４５７６号の表２または９による、ＣＡＲ分子（例えば、ＣＡＲ３３−１〜ＣＡＲ−３３−９のいずれか）または抗原結合ドメインを包含し得る。ＣＤ３３  ＣＡＲ分子および抗原結合ドメイン（例えば、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによれば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲおよび１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）をコードするアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１６／０１４５７６号において指定されている。
【０５３０】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、メソセリンと特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１５／０９０２３０号の表２〜３による、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインを包含し得る。メソセリンＣＡＲ分子および抗原結合ドメイン（例えば、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによれば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲおよび１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）をコードするアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１５／０９０２３０号において指定されている。
【０５３１】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＢＣＭＡと特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１６／０１４５６５号の表１または１６、配列番号２７１または配列番号２７３による、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインを包含し得る。ＢＣＭＡ  ＣＡＲ分子および抗原結合ドメイン（例えば、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによれば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲおよび１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）をコードするアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１６／０１４５６５号において指定されている。
【０５３２】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＬＬ−１と特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１６／０１４５３５号の表２による、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインを包含し得る。ＣＬＬ−１  ＣＡＲ分子および抗原結合ドメイン（例えば、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによれば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲおよび１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）をコードするアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１６／０１４５３５号において指定されている。
【０５３３】
他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＧＦＲ  ＡＬＰＨＡ−４と特異的に結合することができ、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１６／０２５８８０号の表２による、ＣＡＲ分子または抗原結合ドメインを包含し得る。ＧＦＲ  ＡＬＰＨＡ−４  ＣＡＲ分子および抗原結合ドメイン（例えば、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａによれば、１つ、２つ、３つのＶＨ  ＣＤＲおよび１つ、２つ、３つのＶＬ  ＣＤＲを含む）をコードするアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＷＯ２０１６／０２５８８０号において指定されている。
【０５３４】
一実施形態において、ここに記載するＣＡＲ分子のいずれか（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖIII、ＣＤ３３、メソセリン、ＢＣＭＡおよびＧＦＲ  ＡＬＰＨＡ−４のいずれか）の抗原結合ドメインは、上に列挙した抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３、ならびに／または上に列挙した抗原結合ドメインからの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙または記載した抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。
【０５３５】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙した抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３、ならびに／または上に列挙した抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙または記載した抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。
【０５３６】
一部の実施形態において、腫瘍抗原は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号において記載されている腫瘍抗原である。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、以下の１以上から選ばれる：ＣＤ１９；ＣＤ１２３；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ１７１；ＣＳ−１（ＣＤ２サブセット１、ＣＲＡＣＣ、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３１９および１９Ａ２４とも称される）；Ｃ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１またはＣＬＥＣＬ１）；ＣＤ３３；上皮増殖因子受容体変異型III（ＥＧＦＲｖIII）；ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）；ガングリオシドＧＤ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２−８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ）；ＴＮＦ受容体ファミリーメンバーＢ細胞成熟（ＢＣＭＡ）；Ｔｎ抗原（（Ｔｎ  Ａｇ）または（ＧａｌＮＡｃα−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ））；前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）；Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ３）；腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）；ＣＤ３８；ＣＤ４４ｖ６；がん胎児抗原（ＣＥＡ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６）；ＫＩＴ（ＣＤ１１７）；インターロイキン−１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ−１３Ｒａ２またはＣＤ２１３Ａ２）；メソセリン；インターロイキン１１受容体アルファ（ＩＬ−１１Ｒａ）；前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）；プロテアーゼセリン２１（ＴｅｓｔｉｓｉｎまたはＰＲＳＳ２１）；血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）；ルイス（Ｙ）抗原；ＣＤ２４；血小板由来増殖因子受容体ベータ（ＰＤＧＦＲ−ベータ）；ステージ特異的胎児抗原４（ＳＳＥＡ−４）；ＣＤ２０；葉酸受容体アルファ；受容体型チロシンプロテインキナーゼＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）；細胞表面関連ムチン１（ＭＵＣ１）；上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）；プロスターゼ；前立腺性酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）；伸長因子２突然変異型（ＥＬＦ２Ｍ）；エフリンＢ２；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−Ｉ受容体）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）；プロテアソーム（プロソーム、マクロパイン）サブユニット、ベータ型、９（ＬＭＰ２）；糖タンパク質１００（ｇｐ１００）；切断点クラスター領域（ＢＣＲ）およびエーベルソンマウス白血病ウイルス性癌遺伝子ホモログ１（Ａｂｌ）とからなる癌遺伝子融合タンパク質（ｂｃｒ−ａｂｌ）；チロシナーゼ；エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）；フコシルＧＭ１；シアリルルイス接着分子（ｓＬｅ）；ガングリオシドＧＭ３（ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ）；トランスグルタミナーゼ５（ＴＧＳ５）；高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷＭＡＡ）；ｏ−アセチル−ＧＤ２ガングリオシド（ＯＡｃＧＤ２）；葉酸受容体ベータ；腫瘍内皮マーカー１（ＴＥＭ１／ＣＤ２４８）；腫瘍内皮マーカー７関連（ＴＥＭ７Ｒ）；クローディン６（ＣＬＤＮ６）；甲状腺刺激ホルモン受容体（ＴＳＨＲ）；Ｇタンパク質共役型受容体クラスＣグループ５、メンバーＤ��ＧＰＲＣ５Ｄ）；Ｘ染色体オープンリーディングフレーム６１（ＣＸＯＲＦ６１）；ＣＤ９７；ＣＤ１７９ａ；未分化型リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）；ポリシアル酸；胎盤特異的１（ＰＬＡＣ１）；ｇｌｏｂｏＨグリコセラミドの六糖部分（ＧｌｏｂｏＨ）；乳腺分化抗原（ＮＹ−ＢＲ−１）；ウロプラキン２（ＵＰＫ２）；Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体１（ＨＡＶＣＲ１）；アドレナリン受容体ベータ３（ＡＤＲＢ３）；パネキシン３（ＰＡＮＸ３）；Ｇタンパク質共役型受容体２０（ＧＰＲ２０）；リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ  ９（ＬＹ６Ｋ）；嗅覚受容体５１Ｅ２（ＯＲ５１Ｅ２）；ＴＣＲガンマ代替リーディングフレームタンパク質（TCR Gamma Alternate Reading Frame Protein）（ＴＡＲＰ）；ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）；がん／精巣抗原１（ＮＹ−ＥＳＯ−１）；がん／精巣抗原２（ＬＡＧＥ−１ａ）；黒色腫関連抗原１（ＭＡＧＥ−Ａ１）；染色体１２ｐに位置するＥＴＳ転座変異型遺伝子６（ＥＴＶ６−ＡＭＬ）；精子タンパク質１７（ＳＰＡ１７）；Ｘ抗原ファミリー、メンバー１Ａ（ＸＡＧＥ１）；アンジオポエチン結合細胞表面受容体２（Ｔｉｅ  ２）；黒色腫がん精巣抗原１（ＭＡＤ−ＣＴ−１）；黒色腫がん精巣抗原２（ＭＡＤ−ＣＴ−２）；Ｆｏｓ関連抗原１；腫瘍タンパク質ｐ５３（ｐ５３）；ｐ５３突然変異体；プロステイン；サバイビン；テロメラーゼ；前立腺癌腫瘍抗原１（ＰＣＴＡ−１またはガレクチン８）、Ｔ細胞により認識される黒色腫抗原１（ＭｅｌａｎＡまたはＭＡＲＴ１）；ラット肉腫（Ｒａｓ）突然変異体；ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）；肉腫転座切断点；黒色腫由来アポトーシス阻害剤（ＭＬ−ＩＡＰ）；ＥＲＧ（膜貫通型プロテーゼ、セリン２（ＴＭＰＲＳＳ２）ＥＴＳ融合遺伝子）；Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（ＮＡ１７）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−３（ＰＡＸ３）；アンドロゲン受容体；サイクリンＢ１；ｖ−ｍｙｃトリ骨髄球症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ（ＭＹＣＮ）；ＲａｓホモログファミリーメンバーＣ（ＲｈｏＣ）；チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）；チトクロムＰ４５０  １Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）；ＣＣＣＴＣ結合因子（ジンクフィンガータンパク質）様（ＢＯＲＩＳまたはBrother of the Regulator of Imprinted Sites）、Ｔ細胞により認識される扁平上皮癌抗原３（ＳＡＲＴ３）；ペアードボックスタンパク質Ｐａｘ−５（ＰＡＸ５）；プロアクロシン結合タンパク質ｓｐ３２（ＯＹ−ＴＥＳ１）；リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（ＬＣＫ）；Ａキナーゼアンカータンパク質４（ＡＫＡＰ−４）；滑膜肉腫、Ｘ染色体切断点２（ＳＳＸ２）；終末糖化産物受容体（ＲＡＧＥ−１）；腎臓ユビキタス（renal ubiquitous）１（ＲＵ１）；腎臓ユビキタス２（ＲＵ２）；レグマイン；ヒトパピローマウイルスＥ６（ＨＰＶ  Ｅ６）；ヒトパピローマウイルスＥ７（ＨＰＶ  Ｅ７）；腸カルボキシルエステラーゼ；熱ショックタンパク質７０−２変異型（ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２）；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ７２；白血球関連免疫グロブリン様受容体１（ＬＡＩＲ１）；ＩｇＡ受容体のＦｃフラグメント（ＦＣＡＲまたはＣＤ８９）；白血球関連免疫グロブリン様受容体サブファミリ���Ａメンバー２（ＬＩＬＲＡ２）；ＣＤ３００分子様ファミリーメンバーｆ（ＣＤ３００ＬＦ）；Ｃ型レクチンドメインファミリー１２メンバーＡ（ＣＬＥＣ１２Ａ）；骨髄間質細胞抗原２（ＢＳＴ２）；ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２（ＥＭＲ２）；リンパ球抗原７５（ＬＹ７５）；グリピカン３（ＧＰＣ３）；Ｆｃ受容体様５（ＦＣＲＬ５）；ならびに免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド１（ＩＧＬＬ１）。
【０５３７】
一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙した抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の重鎖ＣＤＲ、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２およびＨＣ  ＣＤＲ３、ならびに／または上に列挙した抗体からの１つ、２つ、３つ（例えば、３つ全て）の軽鎖ＣＤＲ、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３を含む。一実施形態において、抗原結合ドメインは、上に列挙または記載した抗体の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を含む。
【０５３８】
一態様において、抗腫瘍抗原結合ドメインは、フラグメント、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。一態様において、ここに記載する結合ドメインとしての抗がん関連抗原は、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２または二重機能性（例えば、二重特異的）ハイブリッド抗体（例えば、Lanzavecchia et al., Eur.J. Immunol. 17, 105 (1987)）である。一態様において、本発明の抗体およびそれらのフラグメントは、野生型のまたは増強された親和性でここに記載するがん関連抗原タンパク質に結合する。
【０５３９】
いくつかの場合において、ｓｃＦｖは、当分野で公知の方法に従って調製できる［例えば、Bird et al., (1988) Science 242:423-426およびHuston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照］。ｓｃＦｖ分子は、フレキシブルなポリペプチドリンカーを使用してＶＨおよびＶＬ領域を一緒に連結することによって産生することができる。ｓｃＦｖ分子は、長さおよび／またはアミノ酸組成が最適化されたリンカー（例えば、Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー）を含む。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域がどのようにフォールディングして相互作用するかに大きく影響を与える可能性がある。実際、短いポリペプチドリンカーが採用される場合（例えば、５〜１０アミノ酸の間）、鎖内のフォールディングが予防される。鎖間のフォールディングは、２つの可変領域を一緒に架橋して機能的なエピトープ結合部位を形成するのにも必要である。リンカーの方向およびサイズの例に関しては、例えば、参照により本明細書に組み入れられるHollinger et al. 1993 Proc Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448、米国特許出願公開第２００５／０１００５４３号、２００５／０１７５６０６号、２００７／００１４７９４号およびＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０２０２５８号およびＷＯ２００７／０２４７１５号を参照されたい。
【０５４０】
ｓｃＦｖは、そのＶＬとＶＨ領域との間に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０アミノ酸残基またはそれより多くのアミノ酸残基のリンカーを含んでいてもよい。リンカー配列は、あらゆる天然に存在するアミノ酸を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、リンカー配列は、アミノ酸であるグリシンおよびセリンを含む。別の実施形態において、リンカー配列は、一連のグリシンおよびセリン反復を含み、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、ここで式中ｎは、１以上の正の整数である（配列番号２５）。一実施形態において、リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号２７）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号２８）であってもよい。リンカーの長さを変化させることで、活性を保持したりまたは強化したりすることが可能であり、それにより活性研究において優れた効能がもたらされる。
【０５４１】
別の態様において、抗原結合ドメインは、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」）またはそのフラグメント、例えば単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴＣＲ）である。そのようなＴＣＲを作製する方法は、当分野で公知である。例えば、Willemsen RA et al, Gene Therapy 7: 1369-1377 (2000)；Zhang T et al, Cancer Gene Ther 11: 487-496 (2004)；Aggen et al, Gene Ther.19(4):365-74 (2012)を参照されたい（参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。例えば、リンカー（例えば、可動性ペプチド）により連結されているＴ細胞クローンからのＶαおよびＶβ遺伝子を含有するｓｃＴＣＲを加工することができる。このアプローチは、それ自体が細胞内にあるがん関連標的だが、そのような抗原（ペプチド）のフラグメントがＭＨＣによりがん細胞の表面に提示される、がん関連標的に対して、非常に有用である。
【０５４２】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインに関して、様々な実施形態において、ＣＡＲの細胞外ドメインに付着した膜貫通ドメインが含まれるように、ＣＡＲを設計することができる。膜貫通ドメインは、膜貫通領域に隣接する１以上の追加のアミノ酸、例えば、膜貫通が誘導されたタンパク質の細胞外領域と会合する１以上のアミノ酸（例えば、細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５のアミノ酸）および／または膜貫通タンパク質が誘導されたタンパク質の細胞内領域に会合した１以上の追加のアミノ酸（例えば、細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０から最大１５のアミノ酸）を包含していてもよい。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの他のドメインの１つと会合しているものである。いくつかの場合において、膜貫通ドメインが同一または異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインと結合しないように、例えば、受容体複合体の他の一員との相互作用が最小化されるように、膜貫通ドメインを選択してもよいしまたはアミノ酸置換によって改変してもよい。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲを発現する細胞表面上で別のＣＡＲとホモ二量体化することができる。異なる態様において、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、同じＣＡＲＴに存在する天然型の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小化するように改変または置換されていてもよい。
【０５４３】
膜貫通ドメインは、天然源から得てもよいしまたは組換え源から得てもよい。源が天然である場合、そのドメインは、あらゆる膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来するものであってもよい。一態様において、膜貫通ドメインは、ＣＡＲが標的に結合したときはいつでも細胞内ドメインにシグナル伝達することができる。本発明において特定の用途を有する膜貫通ドメインは、少なくとも、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータまたはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域を包含していてもよい。一部の実施形態において、膜貫通ドメインは、少なくとも膜貫通領域、例えば、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２ＣまたはＣＤ１９と特異的に結合するリガンドを包含していてもよい。
【０５４４】
いくつかの場合において、膜貫通ドメインは、ヒンジ、例えばヒトタンパク質由来のヒンジを介して、ＣＡＲの細胞外領域、例えばＣＡＲの抗原結合ドメインに付着していてもよい。例えば、一実施形態において、ヒンジは、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）ヒンジ、例えばＩｇＧ４ヒンジまたはＣＤ８ａヒンジであってもよい。一実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、配列番号２のアミノ酸配列を含む（例えば、からなる）。一態様において、膜貫通ドメインは、配列番号６の膜貫通ドメインを含む（例えば、からなる）。
【０５４５】
一態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＧ４ヒンジを含む。例えば、一実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM（配列番号３６）のヒンジを含む。一部の実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG（配列番号３７）のヌクレオチド配列によってコードされたヒンジを含む。
【０５４６】
一態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＩｇＤヒンジを含む。例えば、一実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、アミノ酸配列RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH（配列番号３８）のヒンジを含む。一部の実施形態において、ヒンジまたはスペーサーは、AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCAGGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT（配列番号１０３）のヌクレオチド配列によってコードされたヒンジを含む。
【０５４７】
一態様において、膜貫通ドメインは組換えであってもよく、その場合、膜貫通ドメインは、主としてロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むと予想される。一態様において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの三つ組は、組換え膜貫通ドメインのそれぞれの末端で見出すことができる。
【０５４８】
ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質内領域との間で、長さが２から１０アミノ酸の間の短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーが連結を形成していてもよい。グリシン−セリンの二つ組が特に好適なリンカーを付与する。例えば、一態様において、リンカーは、GGGGSGGGGS（配列番号５）のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、リンカーは、GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC（配列番号８）のヌクレオチド配列によってコードされる。
【０５４９】
一態様において、ヒンジまたはスペーサーは、ＫＩＲ２ＤＳ２ヒンジを含む。
【０５５０】
細胞質内ドメイン
ＣＡＲの細胞質内ドメインまたは領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを包含する。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般的に、ＣＡＲが導入されている免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つの活性化に関与する。
【０５５１】
ここに記載するＣＡＲで使用するための細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、抗原受容体と接触した後にシグナル伝達を開始させるように協同して作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および補助受容体の細胞質内配列、加えて同じ機能的な能力を有するこれらの配列およびあらゆる組換え配列のあらゆる誘導体または変異体が挙げられる。
【０５５２】
ＴＣＲ単独により生成されたシグナルは、Ｔ細胞を完全に活性化させるには不十分であり、さらに二次的および／または共刺激シグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞の活性化は、細胞質内シグナル伝達配列の２つの別個のクラス：ＴＣＲを介した抗原依存性の一次活性化を開始させるクラス（一次細胞内シグナル伝達ドメイン）および抗原非依存性の方式で作用して二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するクラス（二次細胞質内ドメイン、例えば共刺激ドメイン）によって媒介されるということができる。
【０５５３】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激による方式または阻害による方式のいずれかでＴＣＲ複合体の一次的な活性化を調節する。刺激による方式で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有していてもよい。
【０５５４】
本発明において特に有用なＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（「ＩＣＯＳ」としても公知）ＦｃεＲＩ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２およびＣＤ６６ｄの上記ドメインが挙げられる。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３−ゼータ、例えば、ここに記載するＣＤ３−ゼータ配列の一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０５５５】
一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭドメイン、例えば、天然ＩＴＡＭドメインと比較して活性が変更された（例えば、増加または減少した）、突然変異したＩＴＡＭドメインを含む。一実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、改変されたＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化および／またはトランケートされたＩＴＡＭを含有する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つまたはそれより多くのＩＴＡＭモチーフを含む。
【０５５６】
共刺激シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインそれ自身を含んでいてもよいしまたは本発明のＣＡＲの状況において有用な他のあらゆる所望の細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせることができる。例えば、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖の部分および共刺激シグナル伝達ドメインを含んでいてもよい。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。一実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、細胞内ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＩＣＯＳのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。
【０５５７】
共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子であり得る。このような分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ならびに同種のものが挙げられる。例えば、ＣＤ２７の共刺激は、インビトロにおけるヒトＣＡＲＴ細胞の拡大、エフェクター機能および生存を強化し、インビボにおけるヒトＴ細胞の持続性および抗腫瘍活性を増大させることが実証されている［Song et al. Blood. 2012; 119(3):696-706］。このような共刺激分子のさらなる例としては、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２ＣおよびＰＡＧ／Ｃｂｐが挙げられる。
【０５５８】
ＣＡＲの細胞質内部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムな順番または特定の順番で互いに連結されていてもよい。例えば長さが２から１０アミノ酸の間（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸）の短いオリゴリンカーまたはポリペプチドリンカーが、細胞内シグナル伝達配列間の連結を形成していてもよい。一実施形態において、好適なリンカーとして、グリシン−セリンの二つ組を使用することができる。一実施形態において、好適なリンカーとして、単一のアミノ酸、例えばアラニン、グリシンを使用することができる。
【０５５９】
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２以上、例えば、２、３、４、５またはそれより多くの共刺激シグナル伝達ドメインが含まれるように設計される。ある実施形態において、２以上、例えば、２、３、４、５またはそれより多くの共刺激シグナル伝達ドメインは、リンカー分子、例えばここに記載するリンカー分子によって隔てられる。一実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、リンカー分子は、グリシン残基である。いくつかの実施形態において、リンカーは、アラニン残基である。
【０５６０】
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２８のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインは、配列番号７のシグナル伝達ドメインである。一態様において、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインは、配列番号９のシグナル伝達ドメインである。
【０５６１】
一態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ２７のシグナル伝達ドメインを含むように設計される。一態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP（配列番号１６）のアミノ酸配列を含む。一態様において、ＣＤ２７のシグナル伝達ドメインは、AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC（配列番号１４）の核酸配列によってコードされる。
【０５６２】
一態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、第二のＣＡＲ、例えば、例えば同じ標的または異なる標的（例えば、ここに記載するがん関連抗原以外の標的またはここに記載する異なるがん関連抗原、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＬＬ−１、ＣＤ３４、ＦＬＴ３、もしくは葉酸受容体ベータ）に対する異なる抗原結合ドメインを包含する第二のＣＡＲをさらに含むことができる。一実施形態において、第二のＣＡＲは、がん関連抗原と同じがん細胞型上で発現される標的に対する抗原結合ドメインを包含する。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、第一の抗原を標的する第一のＣＡＲであって、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが一次シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲと、第二の異なる抗原を標的とする第二のＣＡＲであって、一次シグナル伝達ドメインを有するが共刺激シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲとを含む。理論に縛られることは望まないが、第一のＣＡＲへの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７またはＯＸ−４０の配置および第二のＣＡＲへの一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータの配置は、両方の標的が発現される細胞に対するＣＡＲ活性を制限し得る。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載する標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを包含する第一のがん関連抗原ＣＡＲと、異なる標的抗原（例えば、第一の標的抗原と同じがん細胞型のものの上で発現される抗原）を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲとを含む。別の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載する標的抗原に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲと、第一の標的抗原以外の抗原（例えば、第一の標的抗原と同じがん細胞型上で発現される抗原）を標的とし、抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲとを含む。
【０５６３】
別の態様において、本開示は、ＣＡＲ発現細胞、例えばＣＡＲＴ細胞、の集団を特徴とする。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、異なるＣＡＲを発現する細胞の混合物を含む。
【０５６４】
例えば、一実施形態において、ＣＡＲＴ細胞の集団は、ここに記載するがん関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第一の細胞および異なる抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する異なるがん関連抗原に対する抗原結合ドメイン、例えば、第一の細胞によって発現されるＣＡＲの抗原結合ドメインによって結合されるがん関連抗原とは異なるここに記載するがん関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。
【０５６５】
別の例として、ＣＡＲ発現細胞の集団は、ここに記載するがん関連抗原に対する抗原結合ドメインを包含するＣＡＲを発現する第一の細胞およびここに記載するようながん関連抗原以外の標的に対する抗原結合ドメインを包含するＣＡＲを発現する第二の細胞を包含し得る。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の集団は、例えば、一次細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲ発現細胞および二次シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲ発現細胞を包含する。
【０５６６】
別の態様において、本開示は、集団中の少なくとも１種の細胞が、ここに記載するがん関連抗原に対する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを発現し、第二の細胞が、別の薬剤、例えばＣＡＲを発現する細胞の活性を増強する薬剤を発現する、細胞の集団を特徴とする。例えば、一実施形態において、薬剤は、阻害分子を阻害する薬剤であってもよい。阻害分子、例えばＰＤ−１は、一部の実施形態において、免疫エフェクター応答を開始するＣＡＲ発現細胞の能力を低下させることができる。阻害分子の例としては、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦ（例えば、ＴＧＦベータ）が挙げられる。一実施形態において、阻害分子を阻害する薬剤は、第一のポリペプチド、例えば阻害分子を含み、このようなポリペプチドは、細胞に正のシグナルを提供する第二のポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと会合している。一実施形態において、薬剤は、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／もしくはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４およびＴＧＦベータなどの阻害分子の第一のポリペプチドまたはこれらのいずれかのフラグメント、ならびにここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインである［例えば、共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＯＸ４０またはＣＤ２８、例えば、本明細書で記載されているようなもの）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む］第二のポリペプチドを含む。一実施形態において、薬剤は、ＰＤ−１の第一のポリペプチドまたはそのフラグメントおよびここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ここに記載するＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび／またはここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）の第二のポリペプチドを含む。
【０５６７】
抗ＣＤ１９結合ドメインの配列は、本明細書の表１に提供されている。表１に記載の抗原結合ドメインのいずれかを、下に提供する１以上の追加のＣＡＲ成分とともに使用して、完全ＣＡＲコンストラクトを生成することができる。
【０５６８】
・リーダー（アミノ酸配列）（配列番号１）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
・リーダー（核酸配列）（配列番号１２）
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCC
・リーダー（核酸配列２）（配列番号１２７）
ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC
・リーダー（核酸配列３）（配列番号１２８）
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG
【０５６９】
・ＣＤ８ヒンジ（アミノ酸配列）（配列番号２）
ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ
・ＣＤ８ヒンジ（核酸配列）（配列番号１３）
ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT
・ＣＤ８ヒンジ（核酸配列２）（配列番号１２９）
ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGAT
【０５７０】
・ＣＤ８膜貫通（アミノ酸配列）（配列番号６）
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ
・膜貫通（核酸配列）（配列番号１７）
ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC
・膜貫通（核酸配列２）（配列番号１３０）
ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT
【０５７１】
・４−１ＢＢ細胞内ドメイン（アミノ酸配列）（配列番号７）
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
・４−１ＢＢ細胞内ドメイン（核酸配列）（配列番号１８）
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
・４−１ＢＢ細胞内ドメイン（核酸配列２）（配列番号１３１）
AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG
【０５７２】
・ＣＤ３ゼータドメイン（アミノ酸配列）（配列番号９）
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
・ＣＤ３ゼータ（核酸配列）（配列番号２０）
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC
・ＣＤ３ゼータ（核酸配列２）（配列番号１３２）
CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGG
・ＣＤ３ゼータドメイン（アミノ酸配列；ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００７３４.３）（配列番号１０）
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
・ＣＤ３ゼータ（核酸配列；ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００７３４.３）（配列番号２１）
agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
【０５７３】
ＩｇＧ４ヒンジ（アミノ酸配列）（配列番号３６）
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM
【０５７４】
ＩｇＧ４ヒンジ（核酸配列）（配列番号３７）
GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG
【０５７５】
ＥＦ１アルファプロモーター
CGTGAGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGA（配列番号１１）
【０５７６】
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号２５）
GGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号２６）：この配列は、１〜６個の「Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ」反復ユニットを包含し得る。
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号２７）
GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号２８）
GGGGSGGGGS GGGGS
Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号２９）
GGGS
【０５７７】
ポリＡ（配列番号３０）：Ａ５０００
ポリＡ（配列番号３１）：Ａ１００
ポリＴ（配列番号３２）：Ｔ５０００
ポリＡ（配列番号３３）：Ａ５０００
ポリＡ（配列番号３４）：Ａ４００
ポリＡ（配列番号３５）”Ａ２０００
【０５７８】
・Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（配列番号１５）：この配列は、１〜１０個の「Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ」反復ユニットを包含し得る。
GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
【０５７９】
ここに記載する方法において使用することができる例示的なＣＤ１９  ＣＡＲコンストラクトを表３に示す：
【０５８０】
【表６】
2019500874.tif 000007
【表７】
2019500874.tif 000008
【０５８１】
【表８】
2019500874.tif 000009
【表９】
2019500874.tif 000010
【０５８２】
【表１０】
2019500874.tif 000011
【表１１】
2019500874.tif 000012
【０５８３】
【表１２】
2019500874.tif 000013
【表１３】
2019500874.tif 000014
【０５８４】
【表１４】
2019500874.tif 000015
【表１５】
2019500874.tif 000016
【０５８５】
【表１６】
2019500874.tif 000017
【表１７】
2019500874.tif 000018
【０５８６】
【表１８】
2019500874.tif 000019
【表１９】
2019500874.tif 000020
【０５８７】
【表２０】
2019500874.tif 000021
【表２１】
2019500874.tif 000022
【０５８８】
【表２２】
2019500874.tif 000023
【表２３】
2019500874.tif 000024
【０５８９】
【表２４】
2019500874.tif 000025
【表２５】
2019500874.tif 000026
【０５９０】
【表２６】
2019500874.tif 000027
【０５９１】
一部の実施形態において、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームまたはこれらの組合せに従って定義される。
【０５９２】
ｓｃＦｖドメインのヒト化ＣＤＲ配列の配列を、重鎖可変ドメインについて表３Ａに、軽鎖可変ドメインについて表３Ｂに示す。「ＩＤ」は、各ＣＤＲのそれぞれの配列番号を意味する。
【０５９３】
【表２７】
2019500874.tif 000028
【０５９４】
【表２８】
2019500874.tif 000029
【０５９５】
ＣＡＲと他の分子または薬剤の共発現
第二のＣＡＲの共発現
一態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、第二のＣＡＲ、例を挙げると、例えば同じ標的（例えば、ＣＤ１９）または異なる標的（例えば、ＣＤ１９以外の標的、例えばここに記載する標的）に対する、異なる抗原結合ドメインを包含する第二のＣＡＲをさらに含んでいてもよい。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、第一の抗原を標的する第一のＣＡＲであって、共刺激シグナル伝達ドメインを有するが一次シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲと、第二の異なる抗原を標的とする第二のＣＡＲであって、一次シグナル伝達ドメインを有するが共刺激シグナル伝達ドメインを有さない細胞内シグナル伝達ドメインを含有する第二のＣＡＲとを含む。第一のＣＡＲへの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０、もしくはＩＣＯＳの配置および第二のＣＡＲへの一次シグナル伝達ドメイン、例えばＣＤ３ゼータの配置は、両方の標的が発現される細胞に対するＣＡＲ活性を制限し得る。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激ドメインを包含する第一のＣＡＲと、別の抗原を標的とし、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲとを含む。別の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび一次シグナル伝達ドメインを包含する第一のＣＡＲと、別の抗原を標的とし、抗原に対する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインを包含する第二のＣＡＲとを含む。
【０５９６】
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載するＸＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲを含む。一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲおよび阻害性ＣＡＲを含む。一実施形態において、阻害性ＣＡＲは、がん細胞ではなく正常細胞、例えば、Ｘも発現する正常細胞上で見出すことができる抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。一実施形態において、阻害性ＣＡＲは、阻害分子の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む。例えば、阻害性ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンおよびＴＧＦ（例えばＴＧＦベータ）の細胞内ドメインであってもよい。
【０５９７】
一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞が２種以上の異なるＣＡＲを含む場合、異なるＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようになっていてもよい。例えば、第一および第二のＣＡＲを発現する細胞は、例えばフラグメント、例えばｓｃＦｖとして、第二のＣＡＲの抗原結合ドメインとの会合を形成しない第一のＣＡＲの抗原結合ドメインを有していてもよく、例えば、第二のＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＶＨＨである。
【０５９８】
一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である分子を包含する単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子を含む。例としては、重鎖可変ドメイン、天然に軽鎖を欠く結合分子、通常の４鎖抗体に由来する単一ドメイン、抗体に由来するもの以外の加工されたドメインおよび単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。ＳＤＡＢ分子は、当該技術の単一ドメイン分子のいずれかであってもよくまたは任意の将来の単一ドメイン分子であってもよい。ＳＤＡＢ分子は、これらに限定されるものではないがマウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、魚、サメ、ヤギ、ウサギおよびウシを包含する、いずれの種に由来してもよい。この用語は、ラクダ科およびサメ以外の種の、天然に存在する単一ドメイン抗体分子も包含する。
【０５９９】
一態様において、ＳＤＡＢ分子は、例えば、サメの血清において発見された新規抗原受容体（ＮＡＲ）として公知の免疫グロブリンアイソタイプに由来するものなどの、魚に見られる免疫グロブリンの可変領域に由来し得る。ＮＡＲの可変領域に由来する単一ドメイン分子（「ＩｇＮＡＲ」）を生成する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１号およびStreltsov (2005) Protein Sci.14:2901-2909において記載されている。
【０６００】
別の態様によれば、ＳＤＡＢ分子は、軽鎖を欠く重鎖として公知の、天然に存在する単一ドメイン抗原結合分子である。そのような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４０４６７８号およびHamers-Casterman, C. et al.(1993) Nature 363:446-448において開示されている。明確にするために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子に由来するこの可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの通常のＶＨと区別するために、本明細書ではＶＨＨまたはナノボディと称される。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科の種から、例えばラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカおよびグアナコにおいて得ることができる。ラクダ科以外の他の種が、天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生することもあり、そのようなＶＨＨは、本発明の範囲内である。
【０６０１】
ＳＤＡＢ分子は、組換え、ＣＤＲグラフト化された、ヒト化された、ラクダ化された、脱免疫化されたおよび／またはインビトロで産生された（例えば、ファージディスプレイにより選択された）ものであり得る。
【０６０２】
抗原結合ドメインを含む複数のキメラ膜包埋受容体を有する細胞であって、該受容体の抗原結合ドメイン間で相互作用する細胞は、例えば、抗原結合ドメインの１以上のその同種抗原への結合能力を阻害するため、望ましくないものであり得ることも発見した。したがって、そのような相互作用を最小にする抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体を有する細胞が本明細書において開示される。そのような相互作用を最小にする抗原結合ドメインを含む第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体をコードする核酸、ならびにそのような細胞および核酸を作製および使用する方法も、本明細書において開示される。ある実施形態において、第一および第二の天然に存在しないキメラ膜包埋受容体の一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科動物、サメもしくはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列に由来する単一ＶＨドメインを含む。
【０６０３】
一部の実施形態において、本明細書における組成物は、第一および第二のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインが可変軽鎖ドメインおよび可変重鎖ドメインを含まない、第一および第二のＣＡＲを含む。一部の実施形態において、第一および第二のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、他方は、ｓｃＦｖでない。一部の実施形態において、第一および第二のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科動物、サメもしくはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列に由来する単一ＶＨドメインを含む。一部の実施形態において、第一および第二のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ナノボディを含む。一部の実施形態において、第一および第二のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ラクダ科動物ＶＨＨドメインを含む。
【０６０４】
一部の実施形態において、第一および第二のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、単一ＶＨドメイン、例えば、ラクダ科動物、サメもしくはヤツメウナギ単一ＶＨドメインまたはヒトもしくはマウス配列に由来する単一ＶＨドメインを含む。一部の実施形態において、第一および第二のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、ナノボディを含む。一部の実施形態において、第一および第二のＣＡＲの一方の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖを含み、他方は、ラクダ科動物ＶＨＨドメインを含む。
【０６０５】
一部の実施形態において、細胞の表面に存在する場合、第１のＣＡＲの抗原結合ドメインのその同種抗原への結合は、第２のＣＡＲの存在により実質的に低減されない。一部の実施形態において、第二のＣＡＲ存在下での第一のＣＡＲの抗原結合ドメインのその同種抗原への結合は、第二のＣＡＲ非存在下での第一のＣＡＲの抗原結合ドメインのその同種抗原への結合の少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。
【０６０６】
一部の実施形態において、細胞の表面に存在する場合、第一および第二のＣＡＲの抗原結合ドメインは、互いの会合が、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインであった場合より少ない。一部の実施形態において、第一および第二のＣＡＲの抗原結合ドメインは、互いの会合が、両方がｓｃＦｖ抗原結合ドメインにあった場合より少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より少なく、例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％少ない。
【０６０７】
ＣＡＲ活性を増強する薬剤の共発現
別の態様において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、別の薬剤、例えば、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強するまたは適合度を向上させる薬剤をさらに発現することができる。
【０６０８】
例えば、一実施形態において、薬剤は、Ｔ細胞機能をモジュレートまたは調節する、例えば阻害する分子を阻害する薬剤であってもよい。一部の実施形態において、Ｔ細胞機能をモジュレートまたは調節する分子は、阻害分子である。いくつかの実施形態において、阻害分子、例えばＰＤ１は、免疫エフェクター応答を仕掛けるＣＡＲ発現細胞の能力を減少させることができる。阻害分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンまたはＴＧＦベータが挙げられる。
【０６０９】
実施形態では、薬剤、例えば、阻害核酸、例えばｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡまたは例えば、阻害タンパク質もしくは系、例えばクラスター化規則的間隔短鎖回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、もしくはジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、例えばここに記載するようなものを使用して、ＣＡＲ発現細胞におけるＴ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば阻害する分子の発現を阻害することができる。ある実施形態において、薬剤は、ｓｈＲＮＡ、例えばここに記載するｓｈＲＮＡである。ある実施形態において、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば阻害する薬剤は、ＣＡＲ発現細胞内で阻害される。例えば、Ｔ細胞の機能をモジュレートまたは調節する、例えば阻害する分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子は、ＣＡＲの構成要素、例えば構成要素の全て、をコードする核酸に連結される。
【０６１０】
一実施形態において、阻害分子を阻害する薬剤は、第一のポリペプチド、例えば阻害分子を含み、このようなポリペプチドは、細胞に正のシグナルを提供する第二のポリペプチド、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインと会合している。一実施形態において、薬剤は、例えば、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４またはＣＤ２７０）、ＫＩＲ、Ａ２ａＲ、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＧＡＬ９、アデノシンまたはＴＧＦベータまたはこれらのいずれかのフラグメント（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部）などの阻害分子の第一のポリペプチド、ならびにここに記載する細胞内シグナル伝達ドメインである［例えば、共刺激ドメイン（例えば、ここに記載するような４１ＢＢ、ＣＤ２７またはＣＤ２８）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ここに記載するＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む］第二のポリペプチドを含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも包含するＣＤ２８受容体ファミリーの阻害性の一員である。ＰＤ−１は、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞で発現される（Agata et al. 1996 Int. Immunol 8:765-75）。ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に対する２つのリガンドは、ＰＤ１に結合したときのＴ細胞の活性化を下方調節することが示されている（Freeman et a. 2000 J Exp Med 192:1027-34；Latchman et al.2001 Nat Immunol 2:261-8； Carter et al.2002 Eur J Immunol 32:634-43）。ＰＤ−Ｌ１は、ヒトがんにおいて豊富である（Dong et al. 2003 J Mol Med 81:281-7；Blank et al. 2005 Cancer Immunol. Immunother 54:307-314；Konishi et al. 2004 Clin Cancer Res 10:5094）。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ−Ｌ１との局所的な相互作用を阻害することによって、回復させることができる。
【０６１１】
一実施形態において、薬剤は、阻害分子、例えばプログラム死１（ＰＤ１：Programmed Death 1）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、４１ＢＢおよびＣＤ３ゼータなどの膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに融合させることができる（また本明細書では、ＰＤ１ＣＡＲとも称される）。一実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲは、ここに記載するＸＣＡＲと組み合わせて使用される場合、Ｔ細胞の持続性を向上させる。一実施形態において、ＣＡＲは、配列番号１０５において下線で示されたＰＤ１の細胞外ドメインを含むＰＤ１  ＣＡＲである。一実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。
Malpvtalllplalllhaarppgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号１０５）。
【０６１２】
一実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲは、以下に示されるアミノ酸配列（配列番号１０６）を含む。
pgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvtttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr（配列番号１０６）。
【０６１３】
一実施形態において、薬剤は、ＰＤ１  ＣＡＲ、例えばここに記載するＰＤ１  ＣＡＲをコードする核酸配列を含む。一実施形態において、ＰＤ１  ＣＡＲに関する核酸配列は、以下に示され、ＰＤ１  ＥＣＤは、以下の配列番号１０７において下線で示される。
atggccctccctgtcactgccctgcttctccccctcgcactcctgctccacgccgctagaccacccggatggtttctggactctccggatcgcccgtggaatcccccaaccttctcaccggcactcttggttgtgactgagggcgataatgcgaccttcacgtgctcgttctccaacacctccgaatcattcgtgctgaactggtaccgcatgagcccgtcaaaccagaccgacaagctcgccgcgtttccggaagatcggtcgcaaccgggacaggattgtcggttccgcgtgactcaactgccgaatggcagagacttccacatgagcgtggtccgcgctaggcgaaacgactccgggacctacctgtgcggagccatctcgctggcgcctaaggcccaaatcaaagagagcttgagggccgaactgagagtgaccgagcgcagagctgaggtgccaactgcacatccatccccatcgcctcggcctgcggggcagtttcagaccctggtcacgaccactccggcgccgcgcccaccgactccggccccaactatcgcgagccagcccctgtcgctgaggccggaagcatgccgccctgccgccggaggtgctgtgcatacccggggattggacttcgcatgcgacatctacatttgggctcctctcgccggaacttgtggcgtgctccttctgtccctggtcatcaccctgtactgcaagcggggtcggaaaaagcttctgtacattttcaagcagcccttcatgaggcccgtgcaaaccacccaggaggaggacggttgctcctgccggttccccgaagaggaagaaggaggttgcgagctgcgcgtgaagttctcccggagcgccgacgcccccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgaactgaacctgggacggcgggaagagtacgatgtgctggacaagcggcgcggccgggaccccgaaatgggcgggaagcctagaagaaagaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgaaattgggatgaagggagagcggcggaggggaaaggggcacgacggcctgtaccaaggactgtccaccgccaccaaggacacatacgatgccctgcacatgcaggcccttccccctcgc（配列番号１０７）。
【０６１４】
別の例では、一実施形態において、ＣＡＲ発現細胞の活性を増強する薬剤は、共刺激分子または共刺激分子リガンドであってもよい。共刺激分子の例としては、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体、ならびにＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）が挙げられる。このような共刺激分子のさらなる例としては、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、例えばここに記載するようなものが挙げられる。共刺激分子リガンドの例としては、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬおよびＩＬＧＨＴが挙げられる。実施形態において、共刺激分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激分子ドメインとは異なる共刺激分子のリガンドである。実施形態において、共刺激分子リガンドは、ＣＡＲの共刺激分子ドメインと同じである、共刺激分子のリガンドである。ある実施形態において、共刺激分子リガンドは、４−１ＢＢＬである。ある実施形態において、共刺激リガンドは、ＣＤ８０またはＣＤ８６である。ある実施形態において、共刺激分子リガンドは、ＣＤ７０である。実施形態において、ここに記載するＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞は、１以上の追加の共刺激分子または共刺激分子リガンドを発現するようにさらに加工され得る。
【０６１５】
ＣＡＲとケモカイン受容体の共発現
実施形態において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞、例えばＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞は、ケモカイン受容体分子をさらに含む。Ｔ細胞におけるケモカイン受容体ＣＣＲ２ｂまたはＣＸＣＲ２のトランスジェニック発現は、黒色腫および神経芽細胞腫を包含するＣＣＬ２分泌またはＣＸＣＬ１分泌固形腫瘍へのトラフィッキングを増進する［Craddock et al., J Immunother.2010 Oct；33(8):780-8およびKershaw et al., Hum Gene Ther.2002 Nov 1；13(16):1971-80］。したがって、理論に縛られることは望まないが、腫瘍、例えば固形腫瘍によって分泌されるケモカインを認識するＣＡＲ発現細胞において発現されるケモカイン受容体は、ＣＡＲ発現細胞の腫瘍へのホーミングを向上させ、ＣＡＲ発現細胞の腫瘍への浸潤を助長し、ＣＡＲ発現細胞の抗腫瘍効能を増強すると考えられる。ケモカイン受容体分子は、天然に存在するケモカイン受容体もしくは組換えケモカイン受容体またはそれらのケモカイン結合フラグメントを含んでいてもよい。ここに記載するＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔｘ）における発現に好適なケモカイン受容体分子としては、ＣＸＣケモカイン受容体（例えば、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６もしくはＣＸＣＲ７）、ＣＣケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０もしくはＣＣＲ１１）、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体（例えば、ＣＸ３ＣＲ１）、ＸＣケモカイン受容体（例えば、ＸＣＲ１）またはそれらのケモカイン結合フラグメントが挙げられる。一実施形態において、ここに記載するＣＡＲとともに発現されるケモカイン受容体分子は、腫瘍によって分泌されるケモカインに基づいて選択される。一実施形態において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞は、ＣＣＲ２ｂ受容体またはＣＸＣＲ２受容体をさらに含む、例えば発現する。ある実施形態において、ここに記載するＣＡＲおよびケモカイン受容体分子は、同じベクター上にあるかまたは２つの異なるベクター上にある。ここに記載するＣＡＲおよびケモカイン受容体分子が、同じベクター上にある実施形態において、前記ＣＡＲおよびケモカイン受容体分子は、各々が２つの異なるプロモーターの制御下にあるかまたは同じプロモーターの制御下にある。
【０６１６】
ＣＡＲをコードする核酸コンストラクト
本発明はまた、ここに記載する１以上のＣＡＲコンストラクトをコードする核酸分子を包含する、例えばここに記載する方法により作成された、免疫エフェクター細胞も提供する。一態様において、核酸分子は、メッセンジャーＲＮＡの転写物として提供される。一態様において、核酸分子は、ＤＮＡコンストラクトとして提供される。
【０６１７】
ここに記載する核酸分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子またはそれらの組合せであり得る。一実施形態において、核酸分子は、ここに記載するようなＣＡＲポリペプチドをコードするｍＲＮＡである。他の実施形態において、核酸分子は、上述の核酸分子のいずれかを包含するベクターである。
【０６１８】
一態様において、本発明のＣＡＲの抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、その配列が哺乳動物細胞での発現にコドン最適化された核酸分子によってコードされている。一態様において、本発明のＣＡＲコンストラクト全体は、その配列全体のコドンが哺乳動物細胞での発現に最適化された核酸分子によってコードされている。コドンの最適化は、コードＤＮＡ中の同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）の出現頻度が異なる種で偏っているという発見を指す。このようなコドンの縮重は、同一なポリペプチドを様々なヌクレオチド配列でコードすることを可能にする。様々なコドン最適化方法が当分野で公知であり、例えば、少なくとも米国特許第５,７８６,４６４号および６,１１４,１４８号で開示された方法が挙げられる。
【０６１９】
したがって、一態様において、免疫エフェクター細胞、例えば、ここに記載する方法により作製された免疫エフェクター細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子であって、前記ＣＡＲが、ここに記載する腫瘍抗原と結合する抗原結合ドメインを含む、核酸分子と、膜貫通ドメイン（例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン）と、刺激ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン）、例えば、共刺激ドメイン（例えば、ここに記載する共刺激シグナル伝達ドメイン）および／または一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ここに記載する一次シグナル伝達ドメイン、例えばここに記載するゼータ鎖）とを包含する。
【０６２０】
本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子、例えば、ここに記載する核酸分子が挿入されるベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来ベクターは、導入遺伝子の長期にわたり安定な統合および娘細胞中でのその増殖を可能にすることから、長期にわたる遺伝子移入を達成するためのツールとして好適である。レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞に形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルス由来のベクターに勝る追加の利点を有する。またレンチウイルスベクターは、低い免疫原性という追加の利点も有する。またレトロウイルスベクターは、例えば、ガンマレトロウイルスベクターであってもよい。ガンマレトロウイルスベクターは、例えば、プロモーター、パッケージングシグナル（Ψ）、プライマー結合部位（ＰＢＳ）、１以上の（例えば、２つの）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）および目的の導入遺伝子、例えば、ＣＡＲをコードする遺伝子を包含していてもよい。ガンマレトロウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖなどのウイルスの構造遺伝子（gens）を欠失していてもよい。例示的なガンマレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、脾フォーカス形成ウイルス（ＳＦＦＶ）および骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）およびそれら由来のベクターが挙げられる。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Tobias Maetzig et al., “Gammaretroviral Vectors: Biology, Technology and Application” Viruses. 2011 Jun; 3(6): 677-713で記載されている。
【０６２１】
別の実施形態において、所望のＣＡＲをコードする核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸の発現は、スリーピングビューティー、ｃｒｉｓｐｒ、ＣＡＳ９およびジンクフィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを使用して達成することができる。以下の、参照により本明細書に組み入れられるJune et al. 2009 Nature Reviews Immunology 9.10: 704-716を参照されたい。
【０６２２】
簡単にまとめると、ＣＡＲをコードする天然または合成核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドまたはそれらの一部をコードする核酸をプロモーターに機能するように連結して、そのコンストラクトを発現ベクターに取り入れることによって達成される。ベクターは、真核生物の複製および統合に好適であってもよい。典型的なクローニングベクターは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびに所望の核酸配列の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。
【０６２３】
核酸は、多数のタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、これらに限定されないが、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドなどのベクターにクローニングすることができる。特に興味深いベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター（probe generation vector）および配列決定ベクターが挙げられる。
【０６２４】
さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に供給されてもよい。ウイルスベクター技術は当分野周知であり、例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NYや他のウイルス学および分子生物学マニュアルで記載されている。ベクターとして有用なウイルスとしては、これらに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびレンチウイルスが挙げられる。一般的に、好適なベクターは、少なくとも１種の生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位および１以上の選択マーカーを含有する（例えば、ＷＯ０１／９６５８４号；ＷＯ０１／２９０５８号；および米国特許第６,３２６,１９３号）。
【０６２５】
哺乳動物細胞への遺伝子移入のための多数のウイルスベース系が開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系に便利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子を、当分野で公知の技術を使用してベクターに挿入し、レトロウイルス粒子中にパッケージ化してもよい。次いで組換えウイルスを単離して、インビボまたはエクスビボのいずれかで対象の細胞に送達してもよい。多数のレトロウイルス系が当分野で公知である。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが当分野で公知である。一実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。
【０６２６】
追加のプロモーター要素、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。これらは、典型的には開始部位上流の領域３０〜１１０ｂｐに配置されるが、多数のプロモーターが開始部位の下流に同様に機能的な要素を含有することが示されている。要素が互いに逆転または移動したときにプロモーターの機能が保存されるように、プロモーター要素間の間隔はフレキシブルであることが多い。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーター要素間の間隔は、活性が衰退し始める手前の５０ｂｐの間隔まで大きくすることができる。個々の要素は、転写を活性化するために、プロモーターに応じて協調的または独立的のいずれかによって機能する可能性があることが考えられる。典型的なプロモーターとしては、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。
【０６２７】
哺乳動物のＴ細胞においてＣＡＲをコードする核酸分子を発現することができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然型のＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素による送達に関与する延長因子−１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物の発現プラスミドにおいて広く使用されおり、レンチウイルスベクターにクローニングした核酸分子からのＣＡＲ発現の駆動において有効であることが示されてきた。例えば、Milone et al., Mol. Ther. 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。一態様において、ＥＦ１ａプロモーターは、実施例で提供される配列を含む。
【０６２８】
プロモーターの別の例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに機能するように連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することができる強い構成的プロモーター配列である。しかしながら他の構成的プロモーター配列も使用が可能であり、このような構成的プロモーター配列としては、これらに限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、加えてヒト遺伝子プロモーター、例えば、これらに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、延長因子−１αプロモーター、ヘモグロビンプロモーターおよびクレアチンキナーゼプロモーターなどが挙げられる。さらに本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されないものとする。誘導性プロモーターも、本発明の一部として意図される。誘導性プロモーターの使用は、分子スイッチを提供し、このような分子スイッチは、分子スイッチが機能するように連結したポリヌクレオチド配列の発現が望ましい場合に、そのポリヌクレオチド配列の発現を開始させまたは発現が望ましくない場合に、その発現を停止させることができる。誘導性プロモーターの例としては、これらに限定されないが、メタロチオネインプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターおよびテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。
【０６２９】
プロモーターの別の例は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである。実施形態において、トランケートされたＰＧＫプロモーター（例えば、野生型ＰＧＫプロモーター配列と比較した場合、１以上の、例えば、１、２、５、１０、１００、２００、３００または４００個のヌクレオチド欠失を有するＰＧＫプロモーター）が望ましい場合がある。
【０６３０】
例示的なＰＧＫプロモーターのヌクレオチド配列を以下に示す。
ＷＴ  ＰＧＫプロモーター：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCGCGGCGACGCAAAGGGCCTTGGTGCGGGTCTCGTCGGCGCAGGGACGCGTTTGGGTCCCGACGGAACCTTTTCCGCGTTGGGGTTGGGGCACCATAAGCT
（配列番号１０９）
【０６３１】
例示的なトランケートされたＰＧＫプロモーター：
ＰＧＫ１００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTG
（配列番号１１０）
【０６３２】
ＰＧＫ２００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACG
（配列番号１１１）
【０６３３】
ＰＧＫ３００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCG
（配列番号１１２）
【０６３４】
ＰＧＫ４００：
ACCCCTCTCTCCAGCCACTAAGCCAGTTGCTCCCTCGGCTGACGGCTGCACGCGAGGCCTCCGAACGTCTTACGCCTTGTGGCGCGCCCGTCCTTGTCCCGGGTGTGATGGCGGGGTGTGGGGCGGAGGGCGTGGCGGGGAAGGGCCGGCGACGAGAGCCGCGCGGGACGACTCGTCGGCGATAACCGGTGTCGGGTAGCGCCAGCCGCGCGACGGTAACGAGGGACCGCGACAGGCAGACGCTCCCATGATCACTCTGCACGCCGAAGGCAAATAGTGCAGGCCGTGCGGCGCTTGGCGTTCCTTGGAAGGGCTGAATCCCCGCCTCGTCCTTCGCAGCGGCCCCCCGGGTGTTCCCATCGCCGCTTCTAGGCCCACTGCGACGCTTGCCTGCACTTCTTACACGCTCTGGGTCCCAGCCG
（配列番号１１３）
【０６３５】
ベクターはまた、例えば、分泌を容易にするためのシグナル配列、ポリアデニル化シグナルおよび転写ターミネーター（例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子からの）、エピソームの複製および原核生物における複製を可能にする要素（例えばＳＶ４０オリジンおよびＣｏｌＥ１または当分野において公知の他のもの）ならびに／または選択を可能にする要素（例えば、アンピシリン耐性遺伝子および／またはゼオシンマーカー）を包含していてもよい。
【０６３６】
ＣＡＲポリペプチドまたはそれらの一部の発現を検討するために、細胞に導入しようとする発現ベクターはまた、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させたようとする細胞の集団から発現する細胞を同定および選択しやすくするために、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれかまたはその両方を含有していてもよい。他の態様において、選択マーカーは、ＤＮＡの別の断片に搭載させてコトランスフェクション手法で使用されてもよい。選択マーカーおよびレポーター遺伝子はどちらも、宿主細胞で発現できるように適切な調節配列を端部に有していてもよい。有用な選択マーカーとしては、例えば、ｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子などが挙げられる。
【０６３７】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされる可能性がある細胞を同定するために、さらには調節配列の機能性を評価するために使用することができる。一般的に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在しないかまたはそれらによって発現されない遺伝子であり、さらに、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性によって証明されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエントの細胞に導入された後の好適な時間にアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子または緑色蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができる（例えば、Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82）。好適な発現系は周知であり、公知の技術を使用して調製してもよいしまたは商業的に入手してもよい。一般的に、レポーター遺伝子の最大レベルの発現を示す最小の５’フランキング領域を有するコンストラクトは、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結されて、プロモーターによって駆動された転写を調整する能力に関して薬剤を評価するために使用することができる。
【０６３８】
実施形態において、ベクターは、ＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えばＣＤ１９  ＣＡＲおよび第二のＣＡＲ、例えば、阻害性ＣＡＲまたはＣＤ１９以外の抗原と特異的に結合するＣＡＲをコードする、２以上の核酸配列を含んでいてもよい。このような実施形態において、ＣＡＲをコードする２以上の核酸配列は、同じフレーム中で単一のポリペプチド鎖として単一の核酸分子によってコードされる。この態様において、２以上のＣＡＲは、例えば、１以上のペプチド切断部位（例えば、自動切断部位または細胞内プロテアーゼの基質）によって分離していてもよい。ペプチド切断部位の例としては、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２ＡあるいはＦ２Ａ部位が挙げられる。
【０６３９】
遺伝子を細胞に導入して発現させる方法は当分野で公知である。発現ベクターの場合において、ベクターは、あらゆる方法、例えば当分野で公知の方法によって宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的な手段によって宿主細胞に移入させることができる。
【０６４０】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する物理的な方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、などが挙げられる。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を産生する方法は当分野周知である。例えば、Sambrook et al., 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, volumes 1-4, Cold Spring Harbor Press, NYを参照されたい。宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する好適な方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０６４１】
宿主細胞に対象のポリヌクレオチドを導入する生物学的な方法としては、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用されている方法になりつつある。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純疱疹ウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス、ならびに同種のもの由来のものであってもよい。例えば、米国特許第５,３５０,６７４号および５,５８５,３６２号を参照されたい。
【０６４２】
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段としては、例えば高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームなどの脂質ベースの系が挙げられる。インビトロおよびインビボでの送達媒体として使用するための典型的なコロイド系は、リポソーム（例えば人工膜小胞）である。最先端の核酸の標的化送達の他の方法が利用可能であり、例えば、標的化ナノ粒子を用いたポリヌクレオチドの送達または他の好適なサブミクロンサイズの送達システムなどが挙げられる。
【０６４３】
非ウイルス送達システムが利用されるケースにおいて、典型的な送達媒体は、リポソームである。脂質調合物の使用は、宿主細胞への核酸の導入（インビトロ、エクスビボまたはインビボ）を意図している。別の態様において、核酸は、脂質と会合していてもよい。脂質に会合した核酸は、リポソームの水性の内部に封入されていてもよいし、リポソームの脂質二重層内に点在させてもよいし、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方と会合する連結分子を介してリポソームに付着していてもよいし、リポソーム中に閉じ込められていてもよいし、リポソームと複合体化していてもよいし、脂質を含有する溶液中に分散されていてもよいし、脂質と混合されてもよいし、脂質と組み合わされていてもよいし、脂質中の懸濁液として含有されてもよいし、ミセルとともに含有されるかもしくはミセルと複合体化していてもよいしまたはそれ以外の方法で脂質と会合していてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクターが会合した組成物は、溶液中におけるいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、上記組成物は、二重層構造で、ミセルとしてまたは「崩壊した」構造で存在していてもよい。また上記組成物は、単に溶液中に点在した状態であってもよく、サイズまたは形状が均一でない凝集体を形成する可能性もある。脂質は、天然に存在する可能性がある脂肪性の物質であるかまたは合成脂質である。例えば、脂質としては、細胞質中で自然に発生する脂肪の小滴、加えて長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、ならびにアルデヒドなどを含有する化合物のクラスが挙げられる。
【０６４４】
使用に好適な脂質は、商業的な供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Sigma, St.Louis, MOから得ることができ、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、K&K Laboratories（Plainview, NY）から得ることができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃalbiochem-Behringから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc.(Birmingham, AL）から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約−２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールより容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用される。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成された様々な単層および多層の脂質小胞（lipid vehicles）を包括する一般名称である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部の水性媒体とを有する小胞構造を有することを特徴とすることができる。多重膜リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過量の水溶液中に懸濁されると自発的に形成される。脂質成分は、閉じた構造が形成される前に自己再構成を経て、水を閉じ込め、脂質二重層の間に溶質を溶解させる（Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10）。しかしながら、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物も包括される。例えば、脂質は、ミセル構造であると推定することができまたは単に脂質分子の不均一な凝集体として存在する可能性もある。また、リポフェクトアミン−核酸複合体も考慮される。
【０６４５】
宿主細胞に外因性核酸を導入するのに使用される方法またはそれとは別に細胞を本発明の阻害剤に晒す方法にかかわらず、宿主細胞中の組換え核酸配列の存在を確認するために様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイとしては、例えば、当業者周知の「分子生物学的な」アッセイ、例えばサザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ；「生化学的な」アッセイ、例えば、免疫学的な手段（ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）によるまたは本発明の範囲内に含まれる薬剤を同定するためのここに記載するアッセイによる、特定のペプチドの存在または非存在の検出などが挙げられる。
【０６４６】
ナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）ＣＡＲ
一実施形態において、ここに記載するＣＡＲ分子は、ナチュラルキラー細胞受容体（ＮＫＲ）の１以上の構成要素を含み、それによってＮＫＲ−ＣＡＲを形成する。ＮＫＲの構成要素は、以下のナチュラルキラー細胞受容体：キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２／Ｌ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＤＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１／Ｓ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＰ１およびＫＩＲ３ＤＰ１；天然細胞毒性（cyotoxicity）受容体（ＮＣＲ）、例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６；免疫細胞受容体のシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリー、例えば、ＣＤ４８、ＣＤ２２９、２Ｂ４、ＣＤ８４、ＮＴＢ−Ａ、ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥおよびＣＤ２Ｆ−１０；Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、例えば、ＣＤ１６およびＣＤ６４；ならびにＬｙ４９受容体、例えば、ＬＹ４９Ａ、ＬＹ４９Ｃのいずれかからの、膜貫通ドメイン、ヒンジドメインまたは細胞質内ドメインであり得る。ここに記載するＮＫＲ−ＣＡＲ分子は、アダプター分子または細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＤＡＰ１２と相互作用する可能性がある。ＮＫＲ構成要素を含むＣＡＲ分子の例示的な配置および配列は、その内容が参照により本明細書に組み入れられる国際公報ＷＯ２０１４／１４５２５２号で記載されている。
【０６４７】
スプリットＣＡＲ
一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、スプリットＣＡＲを使用する。スプリットＣＡＲアプローチは、公報ＷＯ２０１４／０５５４４２号およびＷＯ２０１４／０５５６５７号においてより詳細に記載されている。簡単に言えば、スプリットＣＡＲシステムは、第一の抗原結合ドメインと共刺激ドメイン（例えば、４１ＢＢ）とを有する第一のＣＡＲを発現する細胞を含み、この細胞は、第二の抗原結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ゼータ）とを有する第二のＣＡＲも発現する。細胞が第一の抗原と遭遇すると、共刺激ドメインが活性化され、細胞は増殖する。細胞が第二の抗原と遭遇すると、細胞内シグナル伝達ドメインが活性化され、細胞を殺滅する活性が開始する。したがって、ＣＡＲ発現細胞は、両方の抗原の存在下でのみ完全に活性化される。
【０６４８】
キメラ抗原受容体を調節するための戦略
一部の実施形態において、ＣＡＲ活性を制御することができる調節可能なＣＡＲ（ＲＣＡＲ）は、ＣＡＲ療法の安全性および効能を最適化するのに望ましい。ＣＡＲ活性を調節することができる多くの方法がある。例えば二量体化ドメインに融合したカスパーゼを使用した誘導性アポトーシス（例えば、Di Stasa et al., N Engl. J. Med. 2011 Nov. 3;365(18):1673-1683を参照）は、例えば本発明のＣＡＲ療法における安全性スイッチとして使用できる。一実施形態において、本発明のＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、ヒトカスパーゼ（例えば、カスパーゼ９）または改変バージョンをヒトＦＫＢタンパク質の改変形に融合させることで条件付き二量体化を可能にするアポトーシス誘導性スイッチをさらに含む。ラパログ（例えば、ＡＰ  １９０３、ＡＰ２０１８７）などの小分子の存在下で、誘導性カスパーゼ（例えば、カスパーゼ９）は活性化され、本発明のＣＡＲを発現する細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）の急速なアポトーシスおよび死滅をもたらす。カスパーゼベースのアポトーシス誘導性スイッチ（またはこのようなスイッチの１つもしくは複数の態様）の例は、例えば、米国特許出願公開第２００４０４００４７号、同第２０１１０２８６９８０号、同第２０１４０２５５３６０号、ＷＯ１９９７０３１８９９号、ＷＯ２０１４１５１９６０号、ＷＯ２０１４１６４３４８号、ＷＯ２０１４１９７６３８号、ＷＯ２０１４１９７６３８号において記載されており、これらの特許文献の全てが参照により本明細書に組み入れられる。
【０６４９】
別の例において、ＣＡＲを発現する細胞はまた、二量体化剤［例えば、rimiducid（ＡＰ１９０３（Bellicum Pharmaceuticals）またはＡＰ２０１８７（Ａｒｉａｄ）とも呼ばれる］投与の際にカスパーゼ−９の活性化および細胞のアポトーシスを引き起こす誘導性カスパーゼ−９（ｉカスパーゼ−９）分子も発現することができる。ｉカスパーゼ−９分子は、ＣＩＤの存在下で二量体化を媒介する二量体化（ＣＩＤ）結合ドメインの化学的な誘導物質を含有する。これは、ＣＡＲを発現する細胞の誘導性で選択的な枯渇を引き起こす。いくつかの場合において、ｉカスパーゼ−９分子は、ＣＡＲをコードするベクターとは別の核酸分子によってコードされる。いくつかの場合において、ｉカスパーゼ−９分子は、ＣＡＲをコードするベクターと同じ核酸分子によってコードされる。ｉカスパーゼ−９は、ＣＡＲを発現する細胞のあらゆる毒性を回避するための安全性スイッチを提供することができる。例えば、Song et al. Cancer Gene Ther. 2008; 15(10):667-75;臨床試験識別番号NCT02107963;およびDi Stasi et al. N. Engl. J. Med. 2011; 365:1673-83を参照されたい。
【０６５０】
本発明のＣＡＲ療法を調節するための別の戦略としては、例えば、ＣＡＲを発現する細胞を欠失させることによって、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導することによって、ＣＡＲ活性を非活性化したりまたは止めたりする小分子または抗体を利用することが挙げられる。例えば、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞もまた、細胞死、例えばＡＤＣＣまたは補体誘導性の細胞死を誘導することが可能な分子によって認識される抗原を発現する可能性がある。例えば、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞はまた、抗体または抗体フラグメントによって標的化される可能性がある受容体を発現する可能性もある。このような受容体の例としては、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ３／４β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７およびＥＧＦＲ、ならびにそれらのトランケートされたバージョン（例えば、１以上の細胞外のエピトープを保存するが細胞質内ドメイン内の１以上の領域が欠失したバージョン）が挙げられる。
【０６５１】
例えば、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞はまた、シグナル伝達能力を欠失しているが、ＡＤＣＣ、例えばセツキシマブ［ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）］を誘導することが可能な分子によって認識されるエピトープを保持するトランケートされた上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を発現してもよく、それにより、セツキシマブの投与が、ＡＤＣＣとその後のＣＡＲを発現する細胞の枯渇を誘導するようになる（例えば、ＷＯ２０１１／０５６８９４号およびJonnalagadda et al., Gene Ther. 2013; 20(8)853-860を参照）。別の戦略としては、リツキシマブと結合し、その結果として例えばＡＤＣＣによるＣＡＲを発現する細胞の選択的な枯渇を引き起こす、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞中でＣＤ３２およびＣＤ２０抗原の両方からの標的エピトープを組み合わせた高度に圧縮されたマーカー／自殺遺伝子を発現することが挙げられる（例えば、Philip et al., Blood. 2014; 124(8)1277-1287を参照）。ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を枯渇させるための他の方法としては、例えばＡＤＣＣを誘導することによる破壊のために、成熟リンパ球、例えばＣＡＲを発現する細胞と選択的に結合してそれを標的とする、モノクローナル抗ＣＤ５２抗体であるＣＡＭＰＡＴＨの投与が挙げられる。他の実施形態において、ＣＡＲリガンド、例えば抗イディオタイプ抗体を使用して、ＣＡＲを発現する細胞を選択的に標的化することができる。一部の実施形態において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えばＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を引き起こすことによって、ＣＡＲを発現する細胞の数を低減させることができる。他の実施形態において、ＣＡＲリガンド、例えば抗イディオタイプ抗体を、細胞の死滅を誘導する薬剤、例えば毒素とカップリングさせることによって、ＣＡＲを発現する細胞の数を低減させることができる。あるいは、ＣＡＲ分子それ自身を、後述するように、活性を調節することができるように、例えば開始させたり止めたりすることができるように設計することができる。
【０６５２】
他の実施形態において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞は、Ｔ細胞枯渇剤によって認識される標的タンパク質を発現することもできる。一実施形態において、標的タンパク質はＣＤ２０であり、Ｔ細胞枯渇剤は、抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブである。このような実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、ＣＡＲを発現する細胞を低減または排除すること、例えばＣＡＲ誘導毒性を減弱することが望ましくなったら、投与される。他の実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、本明細書の実施例で記載されるような抗ＣＤ５２抗体、例えばアレムツズマブである。
【０６５３】
他の実施形態において、ＲＣＡＲは、ポリペプチドのセット、最も簡単な実施形態において、典型的には、２つのポリペプチドのセットを含み、別々のポリペプチドまたはメンバーに、ここに記載する標準的なＣＡＲの構成要素、例えば抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインが分配されている。一部の実施形態において、ポリペプチドのセットは、二量体化分子の存在下でポリペプチドを互いにカップリングすることができ、例えば抗原結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインにカップリングすることができる、二量体化スイッチを包含する。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、例えば参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１４１２７２６１号において記載されているもののような二量体化スイッチを利用する。このような調節可能なＣＡＲのさらなる記載および例示的な配置は、本明細書において提供され、例えば、その全体が参照により組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際公報ＷＯ２０１５／０９０２２９号の段落５２７〜５５１において提供されている。一部の実施形態において、ＲＣＡＲは、スイッチドメイン、例えば、配列番号１１４に記載のＦＫＢＰスイッチドメインを含むかまたはＦＲＢと結合する能力を有する、例えば配列番号１１５に記載の、ＦＫＢＰのフラグメントを含む。一部の実施形態において、ＲＣＡＲは、例えば配列番号１１６に記載のＦＲＢ配列または例えば配列番号１１７〜１２２のいずれかに記載の突然変異ＦＲＢ配列を含む、スイッチドメインを含む。
D V P D Y A S L G G P S S P K K K R K V S R G V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S Y（配列番号１１４）
V Q V E T I S P G D G R T F P K R G Q T C V V H Y T G M L E D G K K F D S S R D R N K P F K F M L G K Q E V I R G W E E G V A Q M S V G Q R A K L T I S P D Y A Y G A T G H P G I I P P H A T L V F D V E L L K L E T S（配列番号１１５）
ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK（配列番号１１６）
【０６５４】
【表２９】
2019500874.tif 000030
【０６５５】
ＲＮＡトランスフェクション
本明細書において、インビトロで転写されたＲＮＡ  ＣＡＲを産生する方法が開示される。ＲＮＡ  ＣＡＲおよびそれを使用する方法は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落５５３〜５７０において記載されている。
【０６５６】
免疫エフェクター細胞は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされたＣＡＲを包含し得る。一態様において、ここに記載するＣＡＲをコードするｍＲＮＡは、ＣＡＲ発現細胞の産生のために、例えばここに記載する方法により作製された、免疫エフェクター細胞に導入される。
【０６５７】
一実施形態において、インビトロで転写されたＲＮＡ  ＣＡＲは、一過性トランスフェクションの形態として細胞に導入することができる。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で生成した鋳型を使用したインビトロでの転写によって産生される。あらゆる源からの対象のＤＮＡを、インビトロでの適切なプライマーおよびＲＮＡポリメラーゼを使用したｍＲＮＡ合成のための鋳型に直接ＰＣＲで変換させることができる。ＤＮＡ源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列または他のあらゆる適切なＤＮＡ源であってもよい。インビトロでの転写に望ましい鋳型（temple）は、ここに記載するＣＡＲである。例えば、ＲＮＡ  ＣＡＲのための鋳型は、ここに記載する腫瘍関連抗原に対する抗体の単鎖可変ドメインを含む細胞外領域と、ヒンジ領域（例えば、ここに記載するヒンジ領域）と、膜貫通ドメイン（例えば、ここに記載する膜貫通ドメイン、例えばＣＤ８ａの膜貫通ドメイン）と、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ここに記載する細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３−ゼータのシグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインを包含する、細胞質内領域とを含む。
【０６５８】
一実施形態において、ＰＣＲに使用しようとするＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含有する。ＤＮＡは、生物のゲノムからの天然に存在するＤＮＡ配列由来であってもよい。一実施形態において、核酸は、５’および／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部または全部を包含していてもよい。核酸は、エキソンおよびイントロンを包含していてもよい。一実施形態において、ＰＣＲに使用しようとするＤＮＡは、ヒト核酸配列である。別の実施形態において、ＰＣＲに使用しようとするＤＮＡは、５’および３’ＵＴＲを包含するヒト核酸配列である。あるいはＤＮＡは、天然に存在する生物では通常発現されない人工ＤＮＡ配列であってもよい。典型的な人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するために一緒にライゲートされる遺伝子の一部を含有する配列である。一緒にライゲートされるＤＮＡの一部は、単一の生物由来であってもよいしまたは１種より多くの生物由来であってもよい。
【０６５９】
ＰＣＲは、トランスフェクションに使用されるｍＲＮＡのインビトロでの転写のための鋳型を生成するために使用される。ＰＣＲを行う方法は当分野周知である。ＰＣＲで使用するためのプライマーは、ＰＣＲのための鋳型として使用しようとするＤＮＡの領域に実質的に相補的な領域を有するように設計される。「実質的に相補的」は、本明細書で使用される場合、プライマー配列中の塩基の大部分または全部が相補的であるかまたは１つもしくは複数の塩基が非相補的であるかもしくはミスマッチであるヌクレオチド配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用されるアニーリング条件下で、意図したＤＮＡ標的にアニールしたりまたは意図したＤＮＡ標的とハイブリダイズしたりすることが可能である。プライマーは、ＤＮＡ鋳型のいずれかの部分に実質的に相補的になるように設計することができる。例えば、プライマーは、５’および３’ＵＴＲを包含する、細胞中で正常に転写される核酸（オープンリーディングフレーム）の一部が増幅されるように設計することができる。プライマーは、対象の特定のドメインをコードする核酸の一部が増幅されるように設計することもできる。一実施形態において、プライマーは、５’および３’ＵＴＲの全部または一部を包含するヒトｃＤＮＡのコード領域が増幅されるように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当分野周知の合成方法によって生成することができる。「フォワードプライマー」は、増幅されるべきＤＮＡ配列の上流にあるＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに実質的である相補的なヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「上流」は、コード鎖を基準にして、増幅しようとするＤＮＡ配列の５位を指すものとして本明細書では使用される。「リバースプライマー」は、増幅されるべきＤＮＡ配列の下流にある二本鎖ＤＮＡ鋳型に実質的に相補的であるヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「下流」は、コード鎖を基準にして、増幅しようとするＤＮＡ配列の３’位を指すものとして本明細書では使用される。
【０６６０】
本明細書で開示される方法において、ＰＣＲに有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。試薬およびポリメラーゼは、多数の供給元から市販されている。
【０６６１】
安定性および／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用が可能である。ＲＮＡは、実施形態において、５’および３’ＵＴＲを有する。一実施形態において、５’ＵＴＲは、長さが１から３０００ヌクレオチドの間である。コード領域に付加しようとする５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、これらに限定されないが、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲのためのプライマーを設計することなど様々な方法によって変更することができる。このアプローチを使用すれば、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を達成するのに必要な５’および３’ＵＴＲの長さを改変することができる。
【０６６２】
５’および３’ＵＴＲは、対象の核酸にとって、天然に存在する内因性５’および３’ＵＴＲであってもよい。あるいは、フォワードおよびリバースプライマーにＵＴＲ配列を取り入れることによってまたは鋳型の他のあらゆる改変によって、対象の核酸にとって内因性ではないＵＴＲ配列を付加してもよい。対象の核酸にとって内因性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を改変するのに有用な可能性がある。例えば、３’ＵＴＲ配列中のＡＵリッチ要素は、ｍＲＮＡの安定性を減少させる可能性があることが知られている。それゆえに、当分野周知のＵＴＲの特性に基づき転写されたＲＮＡの安定性を増加させるには、３’ＵＴＲを選択または設計することができる。
【０６６３】
一実施形態において、５’ＵＴＲは、内因性核酸のコザック配列を含有していてもよい。あるいは、対象の核酸にとって内因性ではない５’ＵＴＲを上述したようにＰＣＲによって付加しようとする場合、５’ＵＴＲ配列を付加することによってコンセンサスコザック配列の設計を改めてもよい。コザック配列は一部のＲＮＡ転写物の翻訳効率を増加させることができるが、効率的な翻訳を可能にするために全てのＲＮＡに必要であるとは考えられていない。多くのｍＲＮＡにとってのコザック配列の必要条件は当分野で公知である。他の実施形態において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡのゲノムが細胞中で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲであってもよい。他の実施形態において、様々なヌクレオチド類似体は、３’または５’ＵＴＲにおいて、エキソヌクレアーゼによるｍＲＮＡの分解を妨害するのに使用できる。
【０６６４】
遺伝子クローニングを必要とすることなくＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの合成を可能にするためには、転写プロモーターは、転写しようとする配列の上流でＤＮＡ鋳型に付着すると予想される。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの５’末端に付加される場合、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターは、転写しようとするオープンリーディングフレームの上流でＰＣＲ産物に取り入れられるようになる。一実施形態において、プロモーターは、本明細書の他所で記載したように、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、これらに限定されないが、Ｔ３およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられる。Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当分野で公知である。
【０６６５】
ある実施形態において、ｍＲＮＡは、５’末端上のキャップと３’ポリ（Ａ）テールの両方を有しており、これらがリボソーム結合、翻訳開始および細胞中でのｍＲＮＡの安定性を決定する。環状ＤＮＡ鋳型、例えばプラスミドＤＮＡにおいて、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞での発現には好適ではない長いコンカテマー様の生成物を産生する。３’ＵＴＲの末端で直線化したプラスミドＤＮＡの転写は、正常なサイズのｍＲＮＡをもたらすが、これは転写後にポリアデニル化されたとしても真核性のトランスフェクションにおいて有効ではない。
【０６６６】
直鎖状ＤＮＡ鋳型において、ファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の最後の塩基を過ぎても転写物の３’末端を伸長することができる［（Schenborn and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985)；Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003)］。
【０６６７】
ポリＡ／ＴストレッチをＤＮＡ鋳型に統合する従来の方法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡに統合されたポリＡ／Ｔ配列は、プラスミドを不安定化する可能性があり、これが、なぜ細菌細胞から得られたプラスミドのＤＮＡ鋳型に、欠失や他の異常が高度に混入していることが多いのかの理由である。そのため、クローニング手法は面倒で時間がかかるだけでなく、信頼できないものになっている。これが、クローニングを用いずにポリＡ／Ｔ３’ストレッチを有するＤＮＡ鋳型の構築が可能になる方法が極めて望ましい理由である。
【０６６８】
転写のＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、ポリＴテール、例えば１００Ｔテール（配列番号１２３）［サイズは、５０〜５０００Ｔであり得る（配列番号３２）］を含有するリバースプライマーを使用することによってＰＣＲ中に産生してもよいしまたはこれらに限定されないがＤＮＡライゲーションまたはインビトロでの組換えを包含する他のいずれかの方法によってＰＣＲ後に産生してもよい。またポリ（Ａ）テールは、ＲＮＡに安定性ももたらし、それらの分解を少なくする。一般的に、ポリ（Ａ）テールの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正の相関がある。一実施形態において、ポリ（Ａ）テールは、１００から５０００アデノシンの間である（例えば、配列番号３３）。
【０６６９】
ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、Ｅ.コリのポリＡポリメラーゼ（Ｅ−ＰＡＰ）などのポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して、インビトロでの転写の後にさらに伸長させることができる。一実施形態において、ポリ（Ａ）テールの長さを１００ヌクレオチドから、３００〜４００ヌクレオチド（配列番号３４）に増加させることにより、ＲＮＡの翻訳効率の約２倍の増加が得られる。加えて、３’末端への異なる化学基の付着は、ｍＲＮＡの安定性を増加させることができる。このような付着は、改変された／人工ヌクレオチド、アプタマーおよび他の化合物を含有していてもよい。例えば、ＡＴＰ類似体は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してポリ（Ａ）テールに取り入れられてもよい。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性をさらに増加させることができる。
【０６７０】
また５’キャップは、ＲＮＡ分子に安定性ももたらす。ある実施形態において、本明細書で開示された方法によって産生されたＲＮＡは、５’キャップを包含する。５’キャップは、当分野で公知の技術やここに記載する技術を使用してもたらされる［Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001)；Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001)；Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)］。
【０６７１】
本明細書で開示された方法によって産生されたＲＮＡはまた、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列を含有していてもよい。ＩＲＥＳ配列は、あらゆるウイルス配列、染色体配列または人工的に設計された配列であってもよく、これは、キャップ非依存性のｍＲＮＡへのリボソーム結合を開始させて翻訳開始を容易にするものである。細胞のエレクトロポレーションに好適なあらゆる溶質、すなわち糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤および界面活性剤などの細胞の透過性および生存能力を助長する因子を含有し得る溶質が包含されていてもよい。
【０６７２】
ＲＮＡは、多数の異なる方法、例えば市販の方法のいずれかを使用して標的細胞に導入することができ、このような方法としては、これらに限定されないが、エレクトロポレーション［Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)］、［ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ）（Harvard Instruments, Boston, Mass.］またはジーンパルサーＩＩ（BioRad、Denver、Colo.）、マルチポレーター（Eppendort, Hamburg Germany）、リポフェクションを使用したカチオン性リポソーム介在トランスフェクション、ポリマーのカプセル封入、ペプチド介在トランスフェクションまたは遺伝子銃粒子送達系、例えば「ジーンガン」［例えば、Nishikawa, et al. Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001)を参照］が挙げられる。
【０６７３】
非ウイルスの送達方法
いくつかの態様において、非ウイルス方法は、細胞または組織または対象にここに記載するＣＡＲをコードする核酸を送達するのに使用することができる。
【０６７４】
一部の実施形態において、非ウイルス方法としては、トランスポゾン（転移因子とも呼ばれる）の使用が挙げられる。一部の実施形態において、トランスポゾンは、ゲノム中の位置にそれ自身を挿入することができるＤＮＡの断片、例えば、自己増殖してそのコピーをゲノムに挿入することができるＤＮＡの断片またはより長い核酸からプライシングしてゲノム中の別の場所に挿入することができるＤＮＡの断片である。例えば、トランスポゾンは、転移のための遺伝子の端にある逆方向反復配列で構成されるＤＮＡ配列を含む。
【０６７５】
トランスポゾンを使用する核酸送達の例示的な方法としては、スリーピングビューティートランスポゾンシステム（ＳＢＴＳ）およびｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンシステムが挙げられる。例えば、全てが参照により本明細書に組み入れられる、Aronovich et al. Hum. Mol. Genet. 20.R1(2011):R14-20; Singh et al. Cancer Res. 15(2008):2961-2971; Huang et al. Mol. Ther. 16(2008):580-589; Grabundzija et al. Mol. Ther. 18(2010):1200-1209; Kebriaei et al. Blood. 122.21(2013):166; Williams. Molecular Therapy 16.9(2008):1515-16; Bell et al. Nat. Protoc. 2.12(2007):3153-65;およびDing et al. Cell. 122.3(2005):473-83を参照されたい。
【０６７６】
ＳＢＴＳは、２つの構成要素：１）導入遺伝子を含有するトランスポゾンおよび２）トランスポゼース酵素源を包含する。トランスポゼースは、担体プラスミド（または他のドナーＤＮＡ）から標的ＤＮＡ、例えば宿主細胞染色体／ゲノムにトランスポゾンを転移させることができる。例えば、トランスポゼースは、担体プラスミド／ドナーＤＮＡに結合し、プラスミドからトランスポゾン（導入遺伝子を包含する）を切り出して、それを宿主細胞のゲノムに挿入する。例えばAronovich et al.前記を参照されたい。
【０６７７】
例示的なトランスポゾンとしては、ｐＴ２ベースのトランスポゾンが挙げられる。例えば、全てが参照により本明細書に組み入れられる、Grabundzija et al. Nucleic Acids Res. 41.3(2013):1829-47;およびSingh et al. Cancer Res. 68.8(2008): 2961-2971を参照されたい。例示的なトランスポゼースとしては、Ｔｃ１／マリナー型トランスポゼース、例えばＳＢ１０トランスポゼースまたはＳＢ１１トランスポゼース（例えばサイトメガロウイルスプロモーターから発現させることができる過剰活性化トランスポゼース）が挙げられる。例えば、全てが参照により本明細書に組み入れられるAronovich et al.；Kebriaei et al.；およびGrabundzija et al.を参照されたい。
【０６７８】
ＳＢＴＳの使用は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸の効率的な統合および発現を許容する。例えばＳＢＴＳなどのトランスポゾンシステムを使用してここに記載するＣＡＲを安定して発現する細胞、例えばＴ細胞またはＮＫ細胞を生成する方法が本明細書で示される。
【０６７９】
ここに記載する方法によれば、一部の実施形態において、ＳＢＴＳ構成要素を含有する１以上の核酸、例えばプラスミドが、細胞（例えば、ＴまたはＮＫ細胞）に送達される。例えば、核酸は、核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ）送達の標準的な方法、例えばここに記載する方法、例えば、エレクトロポレーション、トランスフェクションまたはリポフェクションによって送達される。一部の実施形態において、核酸は、導入遺伝子、例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸を含むトランスポゾンを含有する。一部の実施形態において、核酸は、導入遺伝子（例えば、ここに記載するＣＡＲをコードする核酸）に加えてトランスポゼース酵素をコードする核酸配列を含むトランスポゾンを含有する。他の実施形態において、２つの核酸を含むシステムが提供され、例えば、二重プラスミドシステム、例えば、第一のプラスミドが導入遺伝子を含むトランスポゾンを含有し、第二のプラスミドがトランスポゼース酵素をコードする核酸配列を含有するシステムが提供される。例えば、第一および第二の核酸は、宿主細胞にともに送達される。
【０６８０】
一部の実施形態において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞、例えば、ＴまたはＮＫ細胞は、ＳＢＴＳを使用した遺伝子挿入と、ヌクレアーゼ（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムまたは加工されたメガヌクレアーゼを再加工したホーミングエンドヌクレアーゼ）を使用した遺伝学的編集との組合せを使用することによって生成される。
【０６８１】
一部の実施形態において、送達の非ウイルス方法の使用は、細胞、例えばＴまたはＮＫ細胞の再プログラミングおよび細胞の対象への直接注入を許容する。非ウイルスベクターの利点としては、これらに限定されないが、患者集団を満たすのに必要となる十分な量を生産するのが容易かつ比較的低コストであること、貯蔵中の安定性および免疫原性の欠如が挙げられる。
【０６８２】
製造／産生方法
一部の実施形態において、本明細書で開示される方法は、細胞（例えば、ここに記載するような免疫エフェクター細胞）での処置後にＴ細胞枯渇剤を投与することによってＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）を低減させること（例えば、枯渇させること）をさらに含む。このようなＴ細胞枯渇剤は、ＣＡＲ発現細胞（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ発現細胞）を有効に枯渇させて毒性を減弱するために使用することができる。一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞を、本明細書における方法に従って製造し、例えば、本明細書における方法に従ってアッセイを（例えば、トランスフェクションまたは形質導入の前または後に）行った。
【０６８３】
一部の実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、ここに記載する細胞、例えば免疫エフェクター細胞集団の投与の１週間、２週間、３週間、４週間または５週間後に投与される。
【０６８４】
一実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、例えば、抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または補体誘導性の細胞死を誘導することによって、ＣＡＲ発現細胞を枯渇させる薬剤である。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞はまた、細胞死、例えばＡＤＣＣまたは補体誘導性の細胞死を誘導することが可能な分子によって認識される抗原（例えば、標的抗原）を発現する可能性がある。例えば、ここに記載するＣＡＲ発現細胞はまた、抗体または抗体フラグメントによって標的化される可能性がある標的タンパク質（例えば、受容体）を発現する可能性もある。このような標的タンパク質の例としては、これらに限定されないが、ＥｐＣＡＭ、ＶＥＧＦＲ、インテグリン（例えば、インテグリンανβ３、α４、αΙ３／４β３、α４β７、α５β１、ανβ３、αν）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＰＤＧＦ受容体、インターフェロン受容体、葉酸受容体、ＧＰＮＭＢ、ＩＣＡＭ−１、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ１、ＴＡＧ−７２、ＩＬ−６受容体、５Ｔ４、ＧＤ２、ＧＤ３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ／ＬＦＡ−１、ＣＤ１５、ＣＤ１８／ＩＴＧＢ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３／ｌｇＥ受容体、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７／ベイシジン、ＣＤ１５２／ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５４／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＣＤ３１９／ＳＬＡＭＦ７およびＥＧＦＲ、ならびにそれらのトランケートされたバージョン（例えば、１以上の細胞外のエピトープを保存するが細胞質内ドメイン内の１以上の領域が欠失したバージョン）が挙げられる。
【０６８５】
一部の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲおよび標的タンパク質を共発現し、例えば、標的タンパク質を自然に発現しまたは標的タンパク質を発現するように操作される。例えば、細胞、例えば免疫エフェクター細胞集団は、ＣＡＲ核酸（例えば、ここに記載するようなＣＡＲ核酸）および標的タンパク質をコードする核酸を含む核酸（例えば、ベクター）を包含し得る。
【０６８６】
一実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、ＣＤ５２阻害剤、例えば、抗ＣＤ５２抗体分子、例えばアレムツズマブである。
【０６８７】
他の実施形態において、細胞、例えば免疫エフェクター細胞集団は、ここに記載するようなＣＡＲ分子（例えば、ＣＤ１９ＣＡＲ）およびＴ細胞枯渇剤によって認識される標的タンパク質を発現する。一実施形態において、標的タンパク質は、ＣＤ２０である。標的タンパク質がＣＤ２０である実施形態において、Ｔ細胞枯渇剤は、抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブである。
【０６８８】
上述の方法のさらなる実施形態において、方法は、細胞、例えば造血幹細胞または骨髄を、哺乳動物に移植することをさらに含む。
【０６８９】
別の態様において、本発明は、細胞移植の前に哺乳動物をコンディショニングする方法を特徴とする。方法は、ＣＡＲ核酸またはポリペプチド、例えばＣＤ１９  ＣＡＲ核酸またはポリペプチド、を含む細胞の有効量を哺乳動物に投与することを包含する。一部の実施形態において、細胞移植は、幹細胞移植、例えば造血幹細胞移植または骨髄移植である。他の実施形態において、細胞移植前の対象のコンディショニングは、対象における標的を発現する細胞、例えば、ＣＤ１９を発現する正常細胞またはＣＤ１９を発現するがん細胞の数を低減させることを含む。
【０６９０】
免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞）の活性化および拡大
ここに記載する方法によって生成または濃縮されたＴ細胞などの免疫エフェクター細胞は、一般的に、例えば米国特許第６,３５２,６９４号；６,５３４,０５５号：６,９０５,６８０号：６,６９２,９６４号：５,８５８,３５８号：６,８８７,４６６号：６,９０５,６８１号：７,１４４,５７５号：７,０６７,３１８号：７,１７２,８６９号：７,２３２,５６６号：７,１７５,８４３号：５,８８３,２２３号：６,９０５,８７４号：６,７９７,５１４号：６,８６７,０４１号：および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号で記載されているような方法を使用して活性化させて拡大させてもよい。
【０６９１】
一般に、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤と、Ｔ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドとを付着させた表面と接触させることによって、免疫エフェクター細胞集団、例えば調節性Ｔ細胞枯渇細胞を拡大させることができる。特定には、本明細書で記載したようにして、例えば、表面上に固定された抗ＣＤ３抗体もしくはそれらの抗原結合フラグメントまたは抗ＣＤ２抗体と接触させることによってまたはカルシウムイオノフォアとともにプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、Ｔ細胞集団を刺激してもよい。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、Ｔ細胞の集団を抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させてもよい。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するため、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用することができる。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９.３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Diaclone, Besancon, France）が挙げられ、これらは、一般的に当分野で知られている他の方法と同様にして使用することができる［Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998；Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999；Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999］。
【０６９２】
所定の態様において、Ｔ細胞に関する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、様々なプロトコールによって供給することができる。例えば、各シグナルを供給する薬剤は、溶解した状態かまたは表面にカップリングされていてもよい。表面にカップリングされる場合、薬剤は、同じ表面にカップリングされてもよいし（すなわち、「シス」形態）または別の表面に（すなわち、「トランス」形態）カップリングされてもよい。あるいは、１種の薬剤が表面にカップリングされ、他の薬剤が溶解した状態であってもよい。一態様において、共刺激シグナルを供給する薬剤が細胞表面に結合しており、一次活性化シグナルを供給する薬剤が、溶解した状態かまたは表面にカップリングされていてもよい。所定の態様において、両方の薬剤が溶解した状態であってもよい。一態様において、薬剤は、可溶性の形態であってもよく、次いで、Ｆｃ受容体を発現する細胞などの表面にまたは薬剤に結合すると予想される抗体もしくは他の結合剤に架橋されていてもよい。これに関して、例えば、本発明においてＴ細胞を活性化して拡大させることに使用することが意図された人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に関する米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号および２００６００３４８１０号を参照されたい。
【０６９３】
一態様において、２種の薬剤が、同じビーズ上、すなわち「シス」または別のビーズ上、すなわち「トランス」のいずれかでビーズ上に固定される。一例として、一次活性化シグナルを供給する薬剤は、抗ＣＤ３抗体またはそれらの抗原結合フラグメントであり、共刺激シグナルを供給する薬剤は、抗ＣＤ２８抗体またはそれらの抗原結合フラグメントであり、どちらの薬剤も、等しい分子の量で同じビーズにともに固定される。一態様において、ＣＤ４＋Ｔ細胞の拡大およびＴ細胞成長のために、ビーズに結合した１：１の比率の各抗体が使用される。本発明の所定の態様において、１：１の比率を使用して観察された拡大と比較してＴ細胞拡大の増加が観察されるような、ビーズに結合した抗ＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比率が使用される。特定の一態様において、１：１の比率を使用して観察された拡大と比較して、約１から約３倍の増加が観察される。一態様において、ビーズに結合したＣＤ３：ＣＤ２８抗体の比率は、１００：１から１：１００の範囲およびその間の全ての整数値である。一態様において、抗ＣＤ３抗体より多くの抗ＣＤ２８抗体が、粒子に結合しており、すなわちＣＤ３：ＣＤ２８の比率は１未満である。所定の態様において、ビーズに結合した抗ＣＤ２８抗体と抗ＣＤ３抗体との比率は、２：１より大きい。特定の一態様において、１：１００のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。一態様において、１：７５のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。さらなる態様において、１：５０のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。一態様において、１：３０のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。一態様において、１：１０のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。一態様において、１：３のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。さらなる態様において、３：１のＣＤ３：ＣＤ２８の比率のビーズに結合した抗体が使用される。
【０６９４】
Ｔ細胞または他の標的細胞を刺激するために、１：５００から５００：１までおよびその間のあらゆる整数値の粒子と細胞との比率を使用することができる。当業者であれば容易に認識できるように、粒子と細胞との比率は、標的細胞に対する粒度によって決まる可能性がある。例えば、小さいサイズのビーズは、わずかな数の細胞としか結合できないが、より大きいビーズは多くと結合できる。所定の態様において、細胞と粒子との比率は、１：１００から１００：１の範囲およびその間のあらゆる整数値であり、さらなる態様において、この比率は、１：９から９：１およびその間のあらゆる整数値を含み、Ｔ細胞を刺激するのにも使用することができる。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８がカップリングされた粒子とＴ細胞との、Ｔ細胞の刺激をもたらす比率は上述したように様々なであってよいが、所定の好ましい値としては、１：１００、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１および１５：１が挙げられ、１つの好ましい比率は、粒子とＴ細胞とが少なくとも１：１である。一態様において、１：１またはそれ未満の粒子と細胞との比率が使用される。特定の一態様において、好ましい粒子：細胞の比率は、１：５である。さらなる態様において、粒子と細胞との比率は、刺激の日に応じて変更することができる。例えば、一態様において、粒子と細胞との比率は、１日目では１：１から１０：１であり、その後、毎日または１日おきに最大１０日まで細胞に追加の粒子が添加され、最終的には１：１から１：１０の比率である（添加した日の細胞数に基づく）。特定の一態様において、粒子と細胞との比率は、刺激の１日目には１：１であり、刺激の３日目および５日目には１：５に調整される。一態様において、粒子は、毎日または１日おきに添加して、１日目に最終的な１：１の比率にし、刺激の３日目および５日目に１：５にする。一態様において、粒子と細胞との比率は、刺激の１日目には２：１であり、刺激の３日目および５日目には１：１０に調整される。一態様において、粒子は、毎日または１日おきに添加して、１日目に最終的な１：１の比率にし、刺激の３日目および５日目に１：１０にする。当業者であれば、様々な他の比率が本発明で使用するのに適している可能性があることを認識するものと予想される。特定には、比率は、粒度ならびに細胞のサイズおよびタイプに応じて様々であると予想される。一態様において、使用のための最も典型的な比率は、１日目に１：１、２：１および３：１の付近である。
【０６９５】
さらなる態様において、Ｔ細胞などの細胞は、薬剤でコーティングされたビーズと組み合わされ、その後ビーズおよび細胞を分離して、次いで細胞を培養する。別の態様において、培養の前に薬剤でコーティングしたビーズと細胞とを分離せずに、一緒に培養する。さらなる態様において、まず磁力などの力の適用によってビーズおよび細胞を濃縮し、その結果として細胞表面マーカーのライゲーションを増加させることにより、細胞の刺激を誘導する。
【０６９６】
一例として、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が付着している常磁性ビーズ（３×２８個のビーズ）をＴ細胞に接触させることによって、細胞表面タンパク質をライゲートさせることができる。一態様において、細胞（例えば、１０４から１０９個のＴ細胞）およびビーズ［例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ常磁性ビーズを１：１の比率で］を、緩衝液、例えばＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムなどの２価カチオンを含まない）中で組み合わせる。ここでも、あらゆる細胞濃度が使用できることは、当業者であれば容易に認識することができる。例えば、標的細胞は、サンプル中で極めて希少であってもよいし、サンプルのわずか０.０１％しか含んでいなくてもよいしまたはサンプル全体（すなわち、１００％）が対象の標的細胞を構成していてもよい。したがって、あらゆる細胞数が本発明の内容に含まれる。所定の態様において、細胞と粒子とが最大限に接触するように、粒子および細胞が一緒に混合されている容量を有意に減少させること（すなわち、細胞の濃度を増加させること）が望ましい場合がある。例えば、一態様において、細胞約２０億個／ｍｌの濃度が使用される。一態様において、１ｍｌあたり１億個より多くの細胞が使用される。さらなる態様において、１ｍｌあたり細胞１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万または５０００万個の細胞の濃度が使用される。さらなる態様において、１ｍｌあたり細胞７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万または１億個の細胞の濃度が使用される。例えば、一態様において、１ｍｌあたりの細胞約１００億個、１ｍｌあたりの細胞９０億個、１ｍｌあたりの細胞８０億個、１ｍｌあたりの細胞７０億個、１ｍｌあたりの細胞６０億個、１ｍｌあたりの細胞５０億個または１ｍｌあたりの細胞２０億個の濃度を使用する。一態様において、１ｍｌあたりの細胞１億個超を使用する。さらに、高い細胞濃度の使用は、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの対象の標的抗原の発現が弱い可能性がある細胞のより効率的な捕獲を可能にする。所定の態様において、このような細胞集団は治療的価値を有する可能性があり、取得が望ましいと予想される。例えば、高濃度の細胞の使用は、通常のＣＤ２８発現が比較的弱いＣＤ８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
【０６９７】
一実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸、例えば、ここに記載するＣＡＲ、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲで形質導入した細胞を、例えば、ここに記載する方法により拡大する。一実施形態において、細胞を、培養物中で、数時間（例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、１８時間、２１時間）〜約１４日間（例えば、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間または１４日間）にわたり拡大させる。一実施形態において、細胞を、４〜９日間にわたり拡大させる。一実施形態において、細胞を、８日以下、例えば、７日間、６日間または５日間にわたり拡大させる。一実施形態において、細胞を、培養物中で、５日間にわたり拡大させると、結果として得られる細胞は、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞より強力である。効力は、例えば、種々のＴ細胞機能、例えば、増殖、標的細胞の殺滅、サイトカインの産生、活性化、遊走またはこれらの組合せにより規定することができる。一実施形態において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞であって、５日間にわたり拡大させたＣＤ１９  ＣＡＲ細胞は、抗原刺激時に、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞と比較して、細胞倍加の少なくとも１、２、３または４倍の増加を示す。一実施形態において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞を、培養物中で、５日間にわたり拡大させると、結果として得られる細胞は、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞と比較して、高度な炎症促進性サイトカインの産生、例えば、ＩＦＮ−γレベルおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルを呈示する。一実施形態において、細胞、例えば、ここに記載するＣＤ１９  ＣＡＲ細胞であって、５日間にわたり拡大させたＣＡＲ細胞は、培養物中の同じ培養条件下において９日間にわたり拡大させた同じ細胞と比較して、炎症促進性サイトカインの産生、例えば、ＩＦＮ−γレベルおよび／またはＧＭ−ＣＳＦレベルの、ｐｇ／ｍｌ単位で、少なくとも１、２、３、４、５、１０倍またはこれを超える増加を示す。
【０６９８】
またＴ細胞の培養時間が６０日間またはそれより長くなるように、数サイクルの刺激が望ましい場合がある。Ｔ細胞培養に適切な条件としては、血清（例えば、ウシ胎児またはヒト血清）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβおよびＴＮＦ−αなどの増殖および生存能力に必要な因子または当分野で公知の細胞成長に関する他のあらゆる添加剤を含有していてもよい適切な培地［例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０または、Ｘ−ｖｉｖｏ  １５、（Ｌｏｎｚａ）］が挙げられる。細胞成長に関する他の添加剤としては、これらに限定されないが、界面活性剤、プラスマネート、ならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられる。培地としては、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよびビタミンが添加され、無血清であるかまたは適切な量の血清（または血漿）または規定された一連のホルモンおよび／またはＴ細胞の成長および拡大に十分な量のサイトカインが補充されたかのいずれかの、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−ｖｉｖｏ  １５およびＸ−ｖｉｖｏ  ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを挙げることができる。抗生物質、例えばペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的培養の場合のみに包含され、対象に注入しようとする細胞の培養の場合は包含されない。標的細胞は、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気および５％ＣＯ２）などの成長を支持するのに必要な条件下で維持される。
【０６９９】
一実施形態において、細胞を、１以上のインターロイキンを含む、適切な培地（例えば、ここに記載する培地）中で拡大させ、これにより、１４日間の拡大期間にわたり、例えば、フローサイトメトリーなど、ここに記載する方法により測定される通り、細胞の、少なくとも２００倍（例えば、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍）の増加を結果としてもたらす。一実施形態において、細胞を、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−７（例えば、ＩＬ−１５およびＩＬ−７）の存在下において拡大させる。
【０７００】
実施形態において、ここに記載する方法、例えば、ＣＡＲ発現細胞製造方法は、例えば、抗ＣＤ２５抗体もしくはそのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンド、ＩＬ−２を使用して、細胞集団から調節性Ｔ細胞、例えばＣＤ２５＋Ｔ細胞を除去することを含む。細胞集団から調節性Ｔ細胞、例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞を除去する方法は、ここに記載する。実施形態において、方法、例えば製造方法は、細胞集団（例えば、ＣＤ２５＋Ｔ細胞などの調節性Ｔ細胞が枯渇された細胞集団または抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメント、もしくはＣＤ２５結合リガンドと以前に接触したことがある細胞集団）をＩＬ−１５および／またはＩＬ−７と接触させることをさらに含む。例えば、細胞集団（例えば、抗ＣＤ２５抗体、そのフラグメントまたはＣＤ２５結合リガンドと以前に接触したことがある細胞集団）をＩＬ−１５および／またはＩＬ−７の存在下において拡大させる。
【０７０１】
いくつかの実施形態において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、例えば、エクスビボにおいて、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）ポリペプチド、インターロイキン１５受容体アルファ（ＩＬ−１５Ｒａ）ポリペプチドまたはＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチド、例えば、ｈｅｔＩＬ−１５の両方の組合せを含む組成物と接触させる。実施形態において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、例えば、エクスビボにおいて、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。実施形態において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、例えば、エクスビボにおいて、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方の組合せを含む組成物と接触させる。実施形態において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲ発現細胞の製造時に、例えば、エクスビボにおいて、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。
【０７０２】
一実施形態において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボにおける拡大時に、ｈｅｔＩＬ−１５を含む組成物と接触させる。ある実施形態において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボにおける拡大時に、ＩＬ−１５ポリペプチドを含む組成物と接触させる。ある実施形態において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、エクスビボにおける拡大時に、ＩＬ−１５ポリペプチドおよびＩＬ−１５Ｒａポリペプチドの両方を含む組成物と接触させる。一実施形態において、接触させることは、リンパ球亜集団、例えば、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の生存および増殖を結果としてもたらす。
【０７０３】
様々な刺激時間に晒されたＴ細胞は、異なる特徴を示す可能性がある。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスで得られた末梢血単核細胞産物は、細胞毒性またはサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より大きいヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。エクスビボでのＣＤ３およびＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞拡大は、約８〜９日目の前には主としてＴＨ細胞からなるＴ細胞集団を産生するが、約８〜９日目の後、Ｔ細胞の集団は、よりいっそう多くのＴＣ細胞集団を含む。したがって、処置目的に応じて、主としてＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利な場合がある。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的なサブセットが単離された場合、このようなサブセットは、このサブセットをより高度に拡大させるのに有益な場合がある。
【０７０４】
さらに、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーに加えて、細胞拡大プロセスの経過中、他の表現型マーカーが有意に、ただし大部分は再生可能に変化する。したがって、このような再現性は、活性化されたＴ細胞産物を特定の目的に合わせる能力を可能にする。
【０７０５】
ここに記載するＣＡＲが構築されたら、これらに限定されないが、抗原刺激後にＴ細胞を拡大させて再刺激の非存在下でＴ細胞の拡大を維持する能力および適切なインビトロおよび動物モデルにおける抗癌活性などの分子の活性を評価するために、様々なアッセイを使用することができる。本発明のＣＡＲの作用を評価するためのアッセイは、以下でさらに詳細に記載される。
【０７０６】
初代Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落６９５において記載されているように、単量体および二量体の存在を検出するために使用することができる。
【０７０７】
インビトロにおける抗原刺激後のＣＡＲ＋Ｔ細胞拡大は、フローサイトメトリーによって測定することができる。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、αＣＤ３／αＣＤ２８  ａＡＰＣで刺激し、続いて分析しようとするプロモーターの制御下でＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターを移入させる。典型的なプロモーターとしては、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子、ＥＦ−１α、ユビキチンＣまたはホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。培養から６日目に、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットにおいてＧＦＰ蛍光をフローサイトメトリーによって評価する。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)を参照されたい。あるいは、０日目に、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、αＣＤ３／αＣＤ２８でコーティングされた磁気ビーズで刺激し、１日目に、２Ａリボゾームスキッピング配列（ribosomal skipping sequence）を使用してｅＧＦＰとともにＣＡＲを発現するバイシストロン性のレンチウイルスベクターを使用して、ＣＡＲで形質導入する。培養物は、洗浄の後、ここに記載するようながん関連抗原＋Ｋ５６２細胞（ここに記載するようながん関連抗原を発現するＫ５６２）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）または抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の存在下でｈＣＤ３２および４−１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ＢＢＬ−３／２８）のいずれかで再刺激する。１日おきに外因性ＩＬ−２を１００ＩＵ／ｍｌで培養に添加する。ＧＦＰ＋Ｔ細胞は、ビーズベースの計数を使用するフローサイトメトリーによって数えられる。例えば、Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464(2009)を参照されたい。
【０７０８】
再刺激の非存在下において持続されるＣＡＲ＋Ｔ細胞拡大もまた、測定することができる。例えば、［Milone et al., Molecular Therapy 17(8): 1453-1464 (2009)］を参照されたい。略述すると、０日目における、αＣＤ３／αＣＤ２８でコーティングされた磁気ビーズによる刺激および１日目における、表示のＣＡＲの形質導入に続き、Coulter Multisizer III粒子カウンター、Nexcelom Cellometer VisionまたはMillipore Scepterを使用して、培養の８日目に、平均Ｔ細胞容量（ｆｌ）を測定する。
【０７０９】
ＣＡＲ発現細胞活性を測定するために、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落６９８において記載されているように、動物モデルもまた使用することができる。
【０７１０】
用量依存的ＣＡＲ処置応答は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落６９９において記載されているように、評価することができる。
【０７１１】
細胞増殖およびサイトカイン産生の評価は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落７００において記載されているように、すでに記載されている。
【０７１２】
細胞毒性は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落７０１において記載されているように、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって評価することができる。
【０７１３】
例えば、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析装置（ＲＴＣＡ）を使用して、接着細胞の電気インピーダンスの変化を測定することによって細胞毒性を評価することもできる。一部の実施形態において、細胞毒性は、複数の時点で測定される。
【０７１４】
腫瘍を有する動物モデルにおけるＣＡＲの特異的なトラフィッキングおよび増殖を評価するために、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落７０２において記載されているように、イメージング技術を使用することができる。
【０７１５】
また、本明細書における実施例のセクションで記載されているアッセイはもちろん当分野で公知のアッセイも包含する他のアッセイも、ここに記載するＣＡＲを評価するために使用することができる。
【０７１６】
ここに開示する方法とは別にまたはそれと組み合わせて、ＣＡＲ発現細胞の検出および／または定量化［例えば、インビトロまたはインビボ（例えば、臨床モニタリング）］；免疫細胞の拡大および／もしくは活性化；ならびに／またはＣＡＲリガンドの使用を伴う、ＣＡＲ特異的選択の１以上のための方法および組成物も開示される。例示的な一実施形態において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ分子に結合する抗体、例えば、ＣＡＲの細胞外抗原結合ドメインに結合する抗体（例えば、抗原結合ドメインに結合する抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体；または細胞外結合ドメインの定常領域に結合する抗体）である。他の実施形態において、ＣＡＲリガンドは、ＣＡＲ抗原分子（例えば、ここに記載するＣＡＲ抗原分子）である。
【０７１７】
一態様において、ＣＡＲ発現細胞を検出および／または定量化するための方法が開示される。例えば、ＣＡＲリガンドを使用して、インビトロまたはインビボにおいて、ＣＡＲ発現細胞を検出および／または定量化する（例えば、患者におけるＣＡＲ発現細胞または患者への投与の臨床モニタリングを行う）ことができる。方法は、
ＣＡＲリガンド（適宜、標識されたＣＡＲリガンド、例えば、タグ、ビーズ、放射性標識または蛍光標識を含むＣＡＲリガンド）を用意し；
ＣＡＲ発現細胞を得ること（例えば、製造用サンプルまたは臨床サンプルなど、ＣＡＲ発現細胞を含有するサンプルを得ること）と；
結合が生じる条件下において、ＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲリガンドと接触させ、これにより、存在するＣＡＲ発現細胞のレベル（例えば、量）を検出すること
を含む。ＣＡＲ発現細胞の、ＣＡＲリガンドとの結合は、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡなど、標準的な技術を使用して検出することができる。
【０７１８】
別の態様において、細胞（例えば、免疫エフェクター細胞）を拡大および／または活性化させる方法が開示される。方法は、
ＣＡＲ発現細胞（例えば、第一のＣＡＲ発現細胞またはＣＡＲを一過性に発現する細胞）を用意し；
前記ＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲリガンド、例えば、ここに記載するＣＡＲリガンドと、免疫細胞の拡大および／または増殖が生じる条件下において接触させ、これにより、活性化および／または拡大させた細胞集団をもたらすことと
を含む。
【０７１９】
ある特定の実施形態において、ＣＡＲリガンドは、基質において存在する（例えば、基質、例えば、天然では存在しない基質に固定化するかまたは接合させる）。いくつかの実施形態において、基質は、非細胞性基質である。非細胞性基質は、例えば、プレート（例えば、マイクロ滴定プレート）、膜（例えば、ニトロセルロース膜）、マトリックス、チップまたはビーズから選択される固体支持体であり得る。実施形態において、ＣＡＲリガンドは、基質（例えば、基質表面上）に存在する。ＣＡＲリガンドは、基質に固定化することもでき、接合させることもでき、共有結合的または非共有結合的に会合させる（例えば、架橋する）こともできる。一実施形態において、ＣＡＲリガンドは、ビーズに接合させる（例えば、共有結合的に接合させる）ことができる。前述の実施形態において、免疫細胞集団は、インビトロまたはエクスビボにおいて拡大させることができる。方法はさらに、例えば、ここに記載する方法のいずれかを使用して、ＣＡＲ分子のリガンドの存在下において、免疫細胞の集団を培養することを含み得る。
【０７２０】
他の実施形態において、細胞を拡大および／または活性化させる方法は、第二の刺激分子、例えば、ＣＤ２８の添加をさらに含む。例えば、ＣＡＲリガンドおよび第二の刺激分子を、基質、例えば、１以上のビーズに固定化し、これにより、細胞の拡大および／または活性化を増加させることができる。
【０７２１】
さらに別の態様において、ＣＡＲ発現細胞について選択または濃縮する方法が提供される。方法は、ＣＡＲ発現細胞を、ここに記載するＣＡＲリガンドと接触させることと；ＣＡＲリガンドの結合に基づき、細胞を選択することを含む。
【０７２２】
さらに他の実施形態において、ＣＡＲ発現細胞を枯渇、低減、かつ／または死滅させるための方法が提供される。方法は、ＣＡＲ発現細胞を、ここに記載するＣＡＲリガンドと接触させることと；ＣＡＲリガンドの結合に基づき、細胞を標的とし、これにより、ＣＡＲ発現細胞の数を低減し、かつ／またはこれらを死滅させることとを含む。一実施形態において、ＣＡＲリガンドを、毒性薬剤（例えば、毒素または細胞除去薬）にカップリングさせることができる。別の実施形態において、抗イディオタイプ抗体は、エフェクター細胞活性、例えば、ＡＤＣＣまたはＡＤＣ活性を引き起こし得る。
【０７２３】
本明細書で開示された方法において使用し得る例示的な抗ＣＡＲ抗体は、例えば、その内容が参照により組み入れられる、ＷＯ２０１４／１９０２７３号およびJena et al., “Chimeric Antigen Receptor (CAR)-Specific Monoclonal Antibody to Detect CD19-Specific T cells in Clinical Trials”, PLOS March 2013 8:3 e57838において記載されている。
【０７２４】
いくつかの態様および実施形態において、本明細書における組成物および方法を、例えば、その内容が参照によりそれらの全体において本明細書に組み入れられる、２０１５年７月３１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４３２１９号において記載されている通り、Ｔ細胞の特異的なサブセットについて最適化する。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の最適化されたサブセットは、対照Ｔ細胞、例えば、同じコンストラクトを発現する、異なるタイプのＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋ＴまたはＣＤ４＋Ｔ）と比較して、持続性の増強を提示する。
【０７２５】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ここに記載するＣＡＲであって、ＣＤ４＋Ｔ細胞に適する細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞について最適化された細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞における持続性の増強をもたらす細胞内シグナル伝達ドメイン）、例えば、ＩＣＯＳドメインを含むＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ここに記載するＣＡＲであって、ＣＤ８＋Ｔ細胞に適する細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞について最適化された細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞における持続性の増強をもたらす細胞内シグナル伝達ドメイン）、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメインまたはＩＣＯＳドメイン以外の、別の共刺激ドメインを含むＣＡＲを含む。いくつかの実施形態において、ここに記載するＣＡＲは、ここに記載する抗原結合ドメイン、例えば、ＣＡＲは、抗原結合ドメインを含む。
【０７２６】
ある態様において、本明細書では、対象、例えば、がんを有する対象を処置する方法が記載される。方法は、前記対象に、
１）ＣＡＲ（ＣＡＲＣＤ４＋）を含むＣＤ４＋Ｔ細胞であって、
抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメインと；
膜貫通ドメインと；
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第一の共刺激ドメイン、例えば、ＩＣＯＳドメインと
を含むＣＤ４＋Ｔ細胞；および
２）ＣＡＲ（ＣＡＲＣＤ８＋）を含むＣＤ８＋Ｔ細胞であって、
抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメインと；
膜貫通ドメインと；
細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、第二の共刺激ドメイン、例えば、４−１ＢＢドメイン、ＣＤ２８ドメインまたはＩＣＯＳドメイン以外の、別の共刺激ドメインと
を含み、
ＣＡＲＣＤ４＋とＣＡＲＣＤ８＋とが互いに異なる、
ＣＤ８＋Ｔ細胞
の有効量を投与することを含む。
【０７２７】
方法はさらに、
３）ＣＡＲ（第二のＣＡＲＣＤ８＋）を含む、第二のＣＤ８＋  Ｔ細胞であって、
抗原結合ドメイン、例えば、ここに記載する抗原結合ドメインと；
膜貫通ドメインと；
細胞内シグナル伝達ドメインと
を含み、第二のＣＡＲＣＤ８＋が、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＡＲＣＤ８＋において存在しない共刺激シグナル伝達ドメインを含み、適宜、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメインを含まない、第二のＣＤ８＋Ｔ細胞
を投与することを含んでもよい。
【０７２８】
バイオポリマーの送達法
いくつかの実施形態において、本明細書で開示された、１以上のＣＡＲ発現細胞を、対象に、バイオポリマー足場、例えば、バイオポリマーインプラントを介して、投与または送達することができる。バイオポリマー足場は、ここに記載するＣＡＲ発現細胞の送達、拡大および／または分散を支援または増強し得る。バイオポリマー足場は、天然に存在する場合もあり、合成の場合もある、生体適合性ポリマー（例えば、炎症応答または免疫応答を実質的に誘導しない）および／または生体分解性ポリマーを含む。典型的なバイオポリマーは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる２０１５年３月１３日に出願された国際出願ＷＯ２０１５／１４２６７５号の段落１００４〜１００６において記載されている。
【０７２９】
医薬組成物および処置
一部の態様において、本開示は、患者を処置する方法であって、ここに記載するように産生されたＣＡＲ発現細胞を、適宜、１種または複数の他の治療と組み合わせて、投与することを含む方法を提供する。一部の態様において、本開示は、患者を処置する方法であって、ここに記載するようなＣＡＲ発現細胞を含む反応混合物を、適宜、１種または複数の他の治療と組み合わせて、投与することを含む方法を提供する。一部の態様において、本開示は、ここに記載するようなＣＡＲ発現細胞を含む反応混合物を配送するまたは受け取る方法を提供する。一部の態様において、本開示は、患者を処置する方法であって、ここに記載するように産生されたＣＡＲ発現細胞を受け取ることおよびさらに、前記ＣＡＲ発現細胞を、適宜、１種または複数の他の治療と組み合わせて、患者に投与することを含む方法を提供する。一部の態様において、本開示は、患者を処置する方法であって、ここに記載するようにＣＡＲ発現細胞を産生させることおよびさらに、前記ＣＡＲ発現細胞を、適宜、１種または複数の他の療法と組み合わせて、患者投与することを含む方法を提供する。他の治療は、例えば、化学療法などのがん治療であってもよい。
【０７３０】
ある実施形態において、ここに記載するＣＡＲを発現する細胞を、対象に、Ｔｒｅｇ細胞集団を減少させる分子と組み合わせて投与する。Ｔｒｅｇ細胞の数を減少させる（例えば、枯渇させる）方法は、当分野で公知であり、例えば、ＣＤ２５の枯渇、シクロホスファミドの投与、ＧＩＴＲ機能をモジュレートすることを含む。理論に縛られるつもりはないが、アフェレーシスの前またはここに記載するＣＡＲ発現細胞の投与の前に、対象におけるＴｒｅｇ細胞の数を低減することは、腫瘍微小環境における望ましくない免疫細胞（例えば、Ｔｒｅｇ）の数を低減し、対象の再発の危険性を低減すると考えられる。
【０７３１】
一実施形態において、ここに記載する治療、例えばＣＡＲを発現する細胞を、対象に、ＧＩＴＲアゴニストおよび／または調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を枯渇させるＧＩＴＲ抗体などの、ＧＩＴＲを標的とする分子および／またはＧＩＴＲ機能をモジュレートする分子と組み合わせて投与する。実施形態において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象に、シクロホスファミドと組み合わせて投与する。一実施形態において、ＧＩＴＲ結合分子および／またはＧＩＴＲ機能をモジュレートする分子（例えば、ＧＩＴＲアゴニストおよび／またはＴｒｅｇを枯渇させるＧＩＴＲ抗体）を、ＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストは、細胞のアフェレーシスの前に投与することができる。実施形態において、シクロホスファミドを、対象に、ＣＡＲ発現細胞の投与（例えば、注入もしくは再注入）の前または細胞のアフェレーシスの前に投与する。実施形態において、シクロホスファミドおよび抗ＧＩＴＲ抗体を、対象に、ＣＡＲ発現細胞の投与（例えば、注入もしくは再注入）の前または細胞のアフェレーシスの前に投与する。一実施形態において、対象は、がん（例えば、固形がんまたはＡＬＬもしくはＣＬＬなどの血液がん）を有する。一実施形態において、対象は、ＣＬＬを有する。実施形態において、対象は、ＡＬＬを有する。実施形態において、対象は、固形がん、例えば、ここに記載する固形がんを有する。典型的なＧＩＴＲアゴニストとしては、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、２価抗ＧＩＴＲ抗体）、例えば、米国特許第６,１１１,０９０号、欧州特許第０９０５０５号Ｂ１、米国特許第８,５８６,０２３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００３１１８号および２０１１／０９０７５４号で記載されているＧＩＴＲ融合タンパク質または例えば米国特許第７,０２５,９６２号、欧州特許第１９４７１８３号Ｂ１、米国特許第７,８１２,１３５号、米国特許第８,３８８,９６７号、米国特許第８,５９１,８８６号、欧州特許ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８６８３、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３９９５４号号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許第７,６１８,６３２号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０５１７２６号で記載されている抗ＧＩＴＲ抗体が挙げられる。
【０７３２】
一実施形態において、ここに記載するＣＡＲ発現細胞を、対象に、ＧＩＴＲアゴニスト、例えばここに記載するＧＩＴＲアゴニストと組み合わせて投与する。一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストをＣＡＲ発現細胞の前に投与する。例えば、一実施形態において、ＧＩＴＲアゴニストは、細胞のアフェレーシスの前に投与することができる。一実施形態において、対象は、ＣＬＬを有する。
【０７３３】
ここに記載する方法は、ＣＡＲ発現細胞を医薬組成物に製剤化することをさらに含むことができる。医薬組成物は、ここに記載するようなＣＡＲ発現細胞、例えば複数のＣＡＲ発現細胞を、１以上の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含むことができる。このような組成物は、緩衝液、例えば中性緩衝食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など；炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含んでいてもよい。組成物は、例えば静脈内投与用に製剤化されることができる。
【０７３４】
一実施形態において、医薬組成物は、例えば、内毒素、マイコプラスマ、複製能を有するレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、残留した抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコーティングされたビーズ、マウス抗体、プールされたヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地の成分、ベクターのパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌からなる群より選択される汚染物質を実質的に含まず、例えば、それらのレベルが検出可能ではない。一実施形態において、細菌は、アルカリゲネス・フェカーリス（Alcaligenes faecalis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenza）、ナイセリア・メニンギティディス（Neisseria meningitides）、シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumonia）およびストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ａ群からなる群より選択される少なくとも１つである。
【０７３５】
「免疫学的有効量」、「抗癌有効量」、「癌阻害有効量」または「治療量」が提示される場合、投与しようとする組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍のサイズ、感染または転移の程度および状態の個体差を医師が検討することによって決定することができる。ここに記載する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を含む医薬組成物を、範囲内の全ての整数値を含めて、細胞１０４〜１０９個／ｋｇ体重の投薬量、いくつかの場合において細胞１０５〜１０６個／ｋｇ体重の投薬量で投与してもよいということが一般に言える。Ｔ細胞組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与してもよい。細胞は、免疫療法で一般的によく知られている注入技術を使用することによって投与してもよい（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med.319:1676, 1988を参照されたい）。
【０７３６】
一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞）の用量は、細胞約１×１０６、１.１×１０６、２×１０６、３.６×１０６、５×１０６、１×１０７、１.８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８または５×１０８個／ｋｇを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞）の用量は、細胞少なくとも約１×１０６、１.１×１０６、２×１０６、３.６×１０６、５×１０６、１×１０７、１.８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８または５×１０８個／ｋｇを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞）の用量は、細胞約１×１０６、１.１×１０６、２×１０６、３.６×１０６、５×１０６、１×１０７、１.８×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８または５×１０８個／ｋｇ以下を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞）の用量は、細胞約１.１×１０６〜１.８×１０７個／ｋｇを含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞）の用量は、細胞約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９または５×１０９個を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ細胞）の用量は、細胞少なくとも約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９または５×１０９個を含む。一部の実施形態において、ＣＡＲ細胞（例えばＣＤ１９  ＣＡＲ細胞）の用量は、細胞約１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、５×１０８、１×１０９、２×１０９または５×１０９個以下を含む。
【０７３７】
ある特定の態様において、活性化された免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞）を対象に投与し、その後続いて血液（またはアフェレーシスを行った）を再び採取し、それからの免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞）を本発明に従って活性化し、これらの活性化され拡大した免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞）を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスを数週間ごとに複数回実行してもよい。ある特定の態様において、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採取された血液から、免疫エフェクター細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞）を活性化することができる。ある特定の態様において、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃまたは１００ｃｃの採取された血液から、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を活性化する。
【０７３８】
本組成物の投与は、あらゆる便利な方式で実行することができる。ここに記載する組成物は、動脈経由、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節経由（intranodally）、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ.ｖ.）注射でまたは腹腔内で、患者に、例えば皮内または皮下注射によって投与する。免疫エフェクター細胞組成物（Ｔ細胞、ＮＫ細胞）を、腫瘍、リンパ節または感染部位に直接注射してもよい。
【実施例】
【０７３９】
以下の実施例を参照しながら本発明をさらに詳細に記載する。これらの実施例は単に例示のために示されたものであり、特に他の規定がない限り限定を意図していない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると決して解釈されず、本明細書で示された教示の結果として明らかになるありとあらゆるバリエーションを包含すると解釈されるものとする。
【０７４０】
実施例１：製造成功および製品品質と相関する出発アフェレーシス物質の特質の同定
単球は、ＣＡＲＴ製造および最終製品品質に悪影響を及ぼす細胞亜型として同定されている。単球は、阻害因子の源であること；抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズに非特異的に結合すること／それを包み込むこと；およびウイルス遺伝子ベクターのシンクとしての役割を果たすことにより遺伝子形質導入効率を低下させることによって、Ｔ細胞活性化および形質導入に悪影響を及ぼし得る（Powell et al. 2009）。単独または芽球細胞の存在下いずれかでの、融解後の患者白血球アフェレーシス物質中の単球の存在は、累積集団倍加数（ｃＰＤＬ）を、有意な単球の存在のないバッチ（＜２０％ＷＢＣ）に関する平均５.５から平均ｃＰＤＬ２. ７（単球＞２０％ＷＢＣ）に低減させた。ｃＰＤＬ＜４.５で一切のバッチを、所定の用量（形質導入Ｔ細胞数）の達成不可能、形質導入効率低下（＜２％）および／または測定可能な効力なし（＜５ｘバックグラウンド）を理由に、「最適以下」と分類した。製造バッチの有意な割合（３３％）が製造の課題を提示した。
【０７４１】
多量の単球またはＢ細胞芽球を含有する融解ロイコパックサンプルを現行の標準ＣＡＲＴ細胞製造プロトコール（プロセスＢ）に付したときの不良な結果のいくつかの例を下に示す。総白血球播種数は固定されているので、単球またはＣＤ１９＋Ｂ細胞芽球の百分率が相対的に高い患者ロットの直接的な結果は、０日目に播種することができるＴ細胞数が少なくなることを意味する。
【０７４２】
加えて、後にビーズ刺激し、レンチウイルスにより形質導入し、数日にわたって培養中で拡大させるサンプル中の単球またはＢ細胞芽球のそのような高い百分率は、Ｔ細胞活性化および拡大の可能性を損なわせるように働く。非Ｔ細胞はアポトーシスおよび細胞死を被るので、細胞培養培地は、細胞残屑によって損なわれ、被毒し、健常Ｔ細胞の選択的拡大を支持する能力が低下する可能性が高い。
【０７４３】
下の表５に示す結果は、高レベルの単球およびＢ細胞を含有する融解アフェレーシス物質を現行の標準ＣＡＲ  Ｔ細胞製造プロトコール（プロセスＢ）に付したときに生じる問題および課題を明示する。例えば、ロイコパックサンプル患者Ｆ１は、融解後に４７.１％のＣＤ１４＋単球を含有した。このサンプルは、最適以下の細胞増殖を経験し、１１日目の回収時に規格外（ＯＯＳ）であった。
【０７４４】
【表３０】
2019500874.tif 000031
【０７４５】
ロイコパックサンプル患者Ｐ１は、５５.５％の芽球細胞（ＣＤ１９＋白血病細胞）で出発し、最適以下の細胞増殖およびＴ細胞回収率を示した。このＰ１は、臨床使用の現行投与要件に不合格になるだろう。
【０７４６】
実施例２：水簸方法の比較
改良水簸プログラムの例として下の表６に列挙する水簸設定はリンパ球を単球から分離することができることを立証した。簡単に言うと、凍結アフェレーシス物質を融解させ、ＰＢＳで希釈し、次いで、全ての必要水簸媒体と接続されている水簸デバイスに接続した。システムをプライミングし、その後、細胞をチャンバに導入する。その間に、水簸媒体もチャンバに導入して、向流を生じさせ、細胞型分離を達成する。典型的に、画分３（Ｆ３）または画分３と画分４の組合せ（Ｆ３＋Ｆ４）は、標的リンパ球集団を含有し、単球、顆粒球および他の非リンパ球細胞の量をほとんど有さない。
【０７４７】
【表３１】
2019500874.tif 000032
【０７４８】
現行の標準フィコールプロセス（プロセスＢ）と改良水簸プログラム（Ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）との、多量の単球を含有するアフェレーシス物質を処理するそれぞれの能力についての、直接比較を行った。融解後、５名の異なる正常ドナーからのロイコパックサンプルを２分割し、一方のアームは、標準法（プロセスＢ）を使用して処理し、他方は、改良水簸を用いて処理した。得られた結果を表７に示す。
【０７４９】
【表３２】
2019500874.tif 000033
【０７５０】
上の表７に示した結果は、後続の製造工程を開始する前の０日目の細胞サンプルから単球の除去に関する新規Ｅｌｕｔｒａプロセスの有効性を明確に示す。例えば、ドナー４８４１は、融解アフェレーシスサンプル中に２４％単球を含有することが判明した。サンプルの半分を標準（プロセスＢ）プロトコールで処理した後、０日目の細胞は、４４％単球を含有した。このような多量の非Ｔ細胞は、製造プロセス終了時に回収される細胞におけるＴ細胞の収率に悪影響を与えた（回収細胞の３８％しかＴ細胞でなかった）。対照的に、本発明の開示で記載されるような改良Ｅｌｕｔｒａプロセスを使用して製造したサンプルの半分は、０日目に２％しか単球による「夾雑」を示さず、製造時終了時のＴ細胞収率および回収率の大きな向上を示した（回収した細胞の９１％がＴ細胞であった）。この分離効率は、下の表８から分かるように、高いパーセントの単球を含有することが判っているびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）患者の白血球アフェレーシス物質の処理においても実証された。
【０７５１】
【表３３】
2019500874.tif 000034
【０７５２】
実施例３：改良洗浄工程は細胞を低減させ、安定させ、凝集を低減させる
現行の製造プロセスＢでは、患者細胞の白血球アフェレーシス物質をＰｌａｓｍａｔｈｅｒｍ（Ｇｅｎｅｓｉｓ）で融解し、ＣｅｌｌＳａｖｅｒ  ５＋装置（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ）を使用して洗浄し、そしてその後、「改変培地」（ＭＭ）と呼ばれるＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）に基づく細胞拡大培地に再懸濁させるかまたは後続のフィコールによるリンパ球選択のためにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝等張生理食塩水に再懸濁させる。改変培地は、下の表９に提供する成分に従って調製する。
【０７５３】
【表３４】
2019500874.tif 000035
【０７５４】
融解細胞の改変培地またはＰＢＳ溶液いずれかへの移入は、細胞を凝集させ得る。この凝集を軽減するために、代替細胞再懸濁緩衝液を調査した。５％デキストロースおよび０.４５％塩化ナトリウムを有する水溶液（本明細書では同義的にデキストロース／ＮａＣｌ、「Ｄ５」またはＤ５  １／２  ＮＳと称される）は、細胞懸濁を安定させ、凝集を防止することが判明した。Ｄ５に懸濁させた細胞は、室温で少なくとも２時間保持したとき、安定しており、凝集しない。Ｄ５溶液も、抗ＣＤ３／ＣＤ２８  ＣＴＳ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Thermo Fisheｒ）での刺激によるＴ細胞の陽性選択を含む後続の製造工程に適合する。
【０７５５】
細胞内の残骸、遊離ヘモグロビンおよび凍結保護物質を除去するために、容量低減を達成するために、ならびに後続のフィコール密度勾配分離を可能にするために、Ｓｅｐａｘ  ２  ＲＭデバイス（Ｂｉｏｓａｆｅ）を使用して融解ロイコパック細胞を洗浄した。単球による夾雑を低減させ、さらに細胞凝集も防止するために、変性培地ではなくＤ５培地を使用してＳｅｐａｘ  ２  ＳｍａｒｔＷａｓｈプロトコールを行った。図１５Ａおよび１５Ｂは、変性培地中で２時間後の細胞の大量の凝集を実証する写真（図１５Ａ）、その一方で、Ｄ５溶液中で同じ時間長にわたって保持した細胞が凝集をほとんどまたは全く示さないことを実証する写真（図１５Ｂ）を示す。
【０７５６】
Ｄ５水溶液中でのＳｅｐａｘ  ＳｍａｒｔＷａｓｈを含む改良プロセスを行う方法のさらなる技術的詳細を提供する。オペレーターは、バイオセーフティーキャビネット（ＢＳＣ）の中でＳｅｐａｘ単回使用細胞処理キットを開封し、その使い捨てキットに融解白血球アフェレーシス細胞バッグおよび培地バッグを取り付ける。キットをＳｅｐａｘ  ２デバイスにインストールし、ＳｍａｒｔＷａｓｈ手順と１１５ｍＬのアウトプット容量を選択する。ＳｍａｒｔＷａｓｈ遠心分離手順は、細胞をペレット化し、次いで、Ｄ５溶液を用いてそれらを再懸濁させて１１５ｍＬの最終容量にする。
【０７５７】
Ｄ５溶液を使用する改良製造プロセスの順を追った詳細を下に与える。
工程１. ロイコパックを融解させ、５％デキストロースおよび０.４５％塩化ナトリウムの水溶液と混合する（ロイコパック１容量に対して溶液７〜１０容量）。
工程２. 細胞を３０分間、周囲温度で放置して平衡させる。
工程３. ＳｍａｒｔＷａｓｈプログラムを使用するＤ５溶液でのＳｅｐａｘ  ２細胞洗浄を用いて、凍結媒体および残屑を除去する。
工程４. 細胞をＤ５水溶液に再懸濁させる。
工程５. 変性培地を使用するのではなくＤ５水溶液中でＴ細胞の陽性選択を行う。
工程６. Ｄ５溶液中での陽性選択が完了したら、陰性画分（非Ｔ細胞）を除去し、陽性画分（Ｔ細胞）を後続の細胞拡大工程のために変性培地に再懸濁させる。
【０７５８】
ＣＡＲ  Ｔ細胞製造用の融解アフェレーシス細胞を調製するためのＤ５水溶液を使用するこの修正プロトコールは、Ｓｅｐａｘデバイスで直接行うことができ、細胞を洗浄するためのＣｅｌｌＳａｖｅｒ  ５  Ｐｌｕｓ（ＣＳ５＋）装置（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ）の使用を不必要にすることができる。図１６Ａにおいて下に提示する結果は、Ｓｅｐａｘ  ＳｍａｒｔＷａｓｈ手順が、ＣＳ５＋ｗａｓｈと比較して、より良好な細胞収率をもたらすことを実証する。
【０７５９】
上記のとおり、Ｄ５（５％デキストロースおよび０.４５％塩化ナトリウム）水溶液の使用は、特に、高い百分率の顆粒球（例えば、好中球）が存在する場合、融解アフェレーシス細胞物質の望ましくない凝集を防止するように働く。上の図１６Ａにおいて提示した結果は、Ｄ５水溶液を使用して両方のプロトコールを行ったときでさえ、ＣＳ５＋  ｗａｓｈに対するＳｅｐａｘ  ＳｍａｒｔＷａｓｈプロトコールの優位性を示す。
【０７６０】
下の図１６Ｂは、Ｄ５水溶液の使用が、Ｄ５ではなく変性培地を使用したときに見られるほぼ５０％細胞損失と比較して、ＣＳ５＋細胞洗浄および２時間の周囲温度インキュベーションの結果として生じる細胞損失を防止することを実証する。
【０７６１】
実施例４：密度勾配遠心分離の比較
この実施例では、凍結保存し、その後、融解正常ドナーアフェレーシス物質を使用する５種の直接比較実験を比較して、ＯｐｔｉＰｒｅｐ密度勾配媒体精製を含む簡易プロセスが、技術的進歩を表すかどうかを判定した。オペレーターは、Ｓｅｐａｘ  ２  ＮｅａｔＣｅｌｌプロコールを実行し、プロトコールにフィコールが必要である場合、その代わりにＯｐｔｉＰｒｅｐを代用した。図１８は、Ｓｅｐａｘ  ２  ＮｅａｔＣｅｌｌ単回使用使い捨て配管キット（Biosafe CS900.2）を細胞および培地バッグとともに構成するする方法に関する概略図を示す。
【０７６２】
Ｐｌａｓｍａｔｈｅｒｍ融解後、各々の正常ドナー由来ロイコパックサンプルの二分の一をプロセスＢプロトコール（ＣＳ５＋ｗａｓｈ、Ｓｅｐａｘ  ２容量低減およびフィコール勾配精製）に従って処理した。各々の融解ロイコパックサンプルの残りの半分は、本発明者らが開発したＯｐｔｉＰｒｅｐ利用Ｓｅｐａｘ法を使用して処理した。２つの異なる方法により精製した細胞物質を、次いで、ＣＡＲ  Ｔ細胞製造プロセスにおける同じ後続工程（抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ刺激、ＬＶ形質導入、ベクター洗浄除去および細胞拡大）に、別々に付した。細胞生成物を９日目に回収し、細胞表面マーカー特異的抗体（抗ＣＤ３、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ１４）を使用するフローサイトメトリーに付して相対細胞表現型およびサブセット組成を定量した。添付／挿入Ｅｘｃｅｌファイル「Ｓｅｐａｘ  ｗｉｔｈ  ＯｐｔｉＰｒｅｐ  Ｄａｔａ  Ｔａｂｌｅ」は、これらの分析の完全なデータファイルを収載するものであり、結果全般を下の表１０に要約する。
【０７６３】
【表３５】
2019500874.tif 000036
【０７６４】
これらの分析の結果は、新規ＯｐｔｉＰｒｅｐ利用Ｓｅｐａｘ法によって調製した生成物が、有意に多いＣＤ３＋Ｔ細胞絶対数（８.２５×１０ｅ８対２.２９×１０ｅ８）、向上したＣＤ＋細胞収率（４６％対１５％）、より少ないＣＤ１９＋Ｂ細胞（１０％対４１％）およびより少ないＣＤ１４＋単球（１６％対３４％）を有することを示す。加えて、ＯｐｔｉＰｒｅｐ利用Ｓｅｐａｘ法によって生成した最終生成物は、プロセスＢによって調製した生成物中に存在するＣＤ３＋Ｔ細胞量（３０.８５％）の二倍を超えるＣＤ３＋Ｔ細胞量（６６.０２％）を含有する。これらのデータを図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄおよび１９Ｅにグラフで提示する。
【０７６５】
実施例５：陽性選択方法の比較
３種の実験を行って、現行の陽性選択プロトコールであるプロセスＢとＦＡＳＴの使用を比較した。これらの実験の結果は、生成物Ｔ細胞純度がインプット組成物に関係なく９０％より高い、最適化ＦＡＳＴプロトコールによる確実なＴ細胞濃縮を示す。これらの結果は、単球、Ｂ細胞および芽球（Ｎａｌｍ６）細胞を包含する非Ｔ細胞集団のＦＡＳＴアプローチによる非常に効率的な枯渇も指摘する。
【０７６６】
芽球百分率が２０％を超えるサンプルについては患者に使用するためにＦＡＳＴ陽性選択を不測の事態に対するプロトコール（contingency protocol）として実行した。今までに、ＦＡＳＴを使用して３ロットを処理した。３ロット全てが拡大して用量を満たすことに成功し、それらの増殖曲線は、プロセスＢロットのものと同等であるかまたはそれより優れていた。図２２は、臨床ＦＡＳＴロットの増殖曲線（白色）のグラフ概観を、プロセスＢのもの（黒色）と比較して提供するものである。顕著なこととして、ＦＡＳＴロットは、プロセスＢと比較して、０日目と３日目の間の細胞損失の低減とともに、同等のまたは優れた拡大を提供した。全ての臨床ＦＡＳＴロットは、出発物質中に＞７０％芽球を有した。
【０７６７】
実験１：
実験１の詳細：現行の陽性選択プロセスに換えてのＦＡＳＴ陽性選択の使用を、先ず、実験ＦＡＳＴ００６で試験した。この実験は、ＣＳ５＋ｗａｓｈ工程を共有する２つの実験アームからなった（図２３Ａ）。実験アーム１は、ＣＳ５＋ｗａｓｈを使用したプロセスＢ、続いてＳｅｐａｘ  ２−フィコール濃縮をたどったが、陽性選択の代わりにＦＡＳＴを代用した。実験アーム２は、Ｓｅｐａｘ  ２−フィコール濃縮を割愛し、直接ＦＡＳＴ陽性選択を行う、別のアプローチを試験した。図２３Ａの概略図の最上部分に示されているように、実験アーム１には、アーム２（総細胞１×１０ｅ９個）に比べて３倍の総細胞（総細胞３×１０ｅ９個）を割り当てた。
【０７６８】
実験１の結果：実験アーム１と２の両方において、最適化ＦＡＳＴ陽性選択は、最終生成物Ｔ細胞の高い純度（アーム１において９４％、アーム２において９０％）と、全非Ｔ細胞集団の高度な枯渇をもたらした。実験アーム１（図２３Ｂ）において、Ｓｅｐａｘ  ２−フィコール後に回収したＣＤ４５＋／ＣＤ３＋Ｔ細胞の百分率は４１％に低下した（元のドナー物質における５１％から）が、Ｔ細胞純度（９４％）は、ＦＡＳＴ陽性選択後に再び確立された。実験アーム２（図２３Ｃ）は、三分の一のインプット細胞数にもかかわらず、最終生成物において最大数のＴ細胞（おおよそ３倍を超えるＴ細胞）と、９０％の最終純度をもたらした。
【０７６９】
実験１の概要：この実験は、現行の陽性選択様式の代わりに改良ＦＡＳＴプロトコールを代用することを正当化する概念実証結果を達成した。ＦＡＳＴプロトコール後の最終Ｔ細胞純度は、両方の実験アームにおいて９０％以上であった。Ｓｅｐａｘ  ２−フィコール濃縮工程を省略する選択肢を同定したが、それをさらに検証する必要がある。
【０７７０】
実験２：
実験２の詳細：この実験では、現行の陽性選択プロセスに換えてのＦＡＳＴ陽性選択の使用を、高い百分率の単球を含有するドナーアフェレーシスを用いて反復した。この実験は、２つの実験アームからなった（概略図の最上部参照）。実験アーム１は、ＣＳ５＋ｗａｓｈを使用したプロセスＢ、続いてＳｅｐａｘ  ２−フィコール濃縮をたどったが、陽性選択の代わりにＦＡＳＴを代用した。実験アーム２は、ＣＳ５  ｗａｓｈ工程の直後にＦＡＳＴ陽性選択を行う別のアプローチを試験した。凍結ロイコパック（ＬＫＰＫ）の四分の一を各アームに使用した。
【０７７１】
実験２の結果：実験アーム１と実験アーム２の両方において、最適化ＦＡＳＴ陽性選択は、最終生成物Ｔ細胞の高い純度（アーム１において９５％、アーム２において９２％）と、全ての非Ｔ細胞集団の確実な高度の枯渇をもたらした。実験アーム１（図２４Ａの左側）において、Ｓｅｐａｘ  ２−フィコール工程後のＣＤ４５＋／ＣＤ３＋Ｔ細胞の百分率は、元のドナー物質中の５６％から３８％へと低下し、単球の百分率は２８％であった一方で、Ｂ細胞は、全サンプルの１８％を構成した。ＦＡＳＴ選択後、ほぼ全ての単球およびＢ細胞が除去され、これにより９５％の最終Ｔ細胞純度が達成された（図２４Ｂ）。実験アーム２（図２４Ａの右側）では、ＣＳ５＋ｗａｓｈ後のものを、ＦＡＳＴを使用して直接精製し、これにより、９２％の最終Ｔ細胞純度を有する、事実上完全に単球が枯渇した最終生成物を得た。また、この実験において、Ｓｅｐａｘ  ２−フィコール濃縮を割愛する改良プロトコールの実行により、最終生成物中の最高Ｔ細胞数を得た。この実験段階からの細胞を培養に戻し、それらに形質導入した。ウェーブエクスパンション（wave expansion）後、１０日目に細胞を回収した。
【０７７２】
実験２の概要：現行の陽性選択プロトコールの代用としてのＦＡＳＴ陽性選択の使用を反復した。ＣＳ５＋ｗａｓｈ後に使用しようと、Ｓｅｐａｘ  ２−フィコール後に使用しようと、この最適化プロトコールは、サンプル中に存在するほぼ全ての単球を除去する非Ｔ細胞集団の高度な除去を達成し、Ｔ細胞純度が高い中間生成物をもたらした。形質導入を包含する、培養中のＦＡＳＴ分離細胞の性能を分析し、報告することになる。
【０７７３】
実験３：
実験３の詳細：この実験では、水簸後のサンプルをさらに精製するためのＦＡＳＴ陽性選択の使用を、高単球ドナーで分析した。加えて、腫瘍を有する患者のアフェレーシスサンプルを処理したときに観察されることが多い高Ｂ細胞芽球状態を、水簸後サンプルにＮａｌｍ６細胞（ＣＤ４５−／ＣＤ１９＋）をスパイクとして添加することによって刺激した。
【０７７４】
実験３の結果：図２５Ａに示されているように、２０％Ｔ細胞および４３％単球を含有する正常ドナーアフェレーシス物質を水簸して、サンプル中の単球の百分率を２６％に低下させ、Ｔ細胞百分率を３２％に濃縮した。この時点で、Ｔ細胞および単球と同等のＮａｌｍ６細胞数をスパイクとして添加し、その結果、２９％Ｔ細胞、２０％単球および２４％芽球（Ｎａｌｍ６）を含有するサンプルを得た。この故意に混ぜ物をしたサンプルに対するＦＡＳＴ陽性選択を使用する処理によって、９５％の最終Ｔ細胞純度を有する、ほぼ全ての単球およびＮａｌｍ６細胞が枯渇した最終生成物を得た。
【０７７５】
実験３の概要：ＦＡＳＴ陽性選択を水簸後に実行し、この実験において、ＦＡＳＴ陽性選択が単球と芽球（Ｎａｌｍ６）細胞の両方の高度で確実な枯渇を可能にすることを証明した。この異なるサンプルに対してＦＡＳＴ選択を行った後の最終Ｔ細胞純度は、２９％の水簸後Ｔ細胞純度から出発して、９５％となった。
【０７７６】
結論
ＦＡＳＴ陽性選択を一連の実験において提示し、ＦＡＳＴ陽性選択が様々なインプットサンプル物質にわたって確実なＴ細胞濃縮をもたらすことを証明した。この方法を、１Ｅ８〜２Ｅ９細胞の範囲の総細胞数、２０％〜５０％のインプットＴ細胞純度、２％〜３０％のインプット単球百分率および２％〜１００％のインプット芽球＼Ｎａｌｍ６分率を用いて試験した。今までに試験した全てのケースで、ＦＡＳＴは、９０％以上のＴ細胞純度を有する最終生成物をもたらした。Ｓｅｐａｘフィコール濃縮工程を外してＦＡＳＴ陽性選択をＣＳ５の直後に遂行する代替戦略であって、高純度の生成物と最終生成物中の最高Ｔ細胞数の両方をもたらす可能性を示す代替戦略の概要も述べた。
【０７７７】
実施例６：陰性選択によるＣＤ１９＋Ｂ細胞枯渇
アフェレーシスサンプルからのＣＤ１９枯渇の実行可能性を試験した。健常ドナーおよびＡＬＬを有する患者からのアフェレーシスサンプルを使用した。アフェレーシスサンプルを洗浄し、次いで、ＣｌｉｎｉＭＡＣｓを使用してＣＤ１９陰性選択を行った。ＣＤ１９枯渇からの結果を図２６Ａに示す。これらの結果は、ＣｌｉｎｉＭＡＣｓを使用するＣＤ１９枯渇が、健常ドナーアフェレーシスからＢ細胞を除去することができると判明したことを示す。さらに、ＣｌｉｎｉＭＡＣｓを使用するＣＤ１９枯渇は、アフェレーシスサンプルが非常に高い％の芽球を有する、ＡＬＬ患者アフェレーシスから、Ｂ細胞を除去することができた。具体的には、ＡＬＬ患者アフェレーシスサンプル中のＢ細胞が７７％から＜０.１％へと大幅に低減された。
【０７７８】
次に、ＣＤ１９枯渇工程を包含するプロトコールを使用するＴ細胞濃縮の効能を試験した。ＣＤ１９枯渇陰性選択工程を包含する濃縮プロトコールを、陰性選択工程を包含しないがその代わりに陽性選択工程を包含する濃縮プロトコールと比較した。ＴＲ１４９と名付けたプロトコールは、洗浄工程と、フィコールおよびＳｅｐａｘ２デバイスを使用する密度勾配遠心分離と、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用する陽性選択工程とを含み、別名プロセスＢである。ＴＲ１５０と名付けたプロトコールは、水簸と、洗浄工程と、ＣｌｉｎｉＭＡＣｓを使用するＣＤ１９枯渇工程（例えば、陰性選択）とを含む。ＴＲ１５１と名付けたプロトコールは、水簸と、洗浄工程と、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用する陽性選択工程とを含む。
【０７７９】
アフェレーシスにおける例えば濃縮プロトコール前のＴ細胞、Ｂ細胞および単球、ならびに濃縮プロトコールの結果として得たサンプル中のＴ細胞、Ｂ細胞および単球（本明細書では「播種細胞」とも称される）の百分率を、図２６Ｂに示す。
【０７８０】
ＣｌｉｎｉＭＡＣｓを使用する陰性選択によるＣＤ１９枯渇（ＴＲ１５０）は、播種細胞中のＢ細胞を（アフェレーシスサンプル中の１７.７％から）０％に削減した。アフェレーシスサンプルからのＢ細胞の枯渇は、Ｂ細胞枯渇工程を包含しない他のプロトコールと比較して、Ｔ細胞濃縮の向上をもたらした（例えば、ＴＲ１４９およびＴＲ１５１についての播種細胞中２０〜３０％Ｔ細胞と比較して、ＴＲ１５０についての播種細胞中８０％Ｔ細胞）。加えて、以前の研究からの結果と一致して、水簸工程（例えば、ＴＲ１５０およびＴＲ１５１におけるもの）は、良好なＴ細胞回収率をなお保持しながら、単球の百分率をアフェレーシスサンプル中１５％から播種細胞中＜１.５％に低下させた。
【０７８１】
結論として、これらの結果は、ＣＤ１９枯渇がＢ細胞の百分率を、濃縮プロトコールを用いた後、＜１％に低下させることができ、高いＴ細胞収率（＞８０％）にさせたことを実証する。
【０７８２】
実施例７：効力アッセイ
異なる濃縮プロトコール後の濃縮されたＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞の効力を評価するために２種のアッセイを使用して、異なる濃縮条件が、異なるＣＡＲ指向効力を有する免疫エフェクター細胞をもたらすかどうかを判定した。２名の異なるドナーからのアフェレーシスを表１１に示すような異なる濃縮プロトコールに付した。次いで、ＣＤ１９  ＣＡＲを発現させるように、それらの細胞を刺激し、それらの細胞に形質導入した。
【表３６】
2019500874.tif 000037
【０７８３】
ＩＦＮガンマ放出アッセイ
細胞を、標的細胞としてのＣＤ１９発現細胞（ＣＤ１９発現Ｋ５６２細胞）、陰性対照としてのメソセリン発現細胞（メソセリン発現Ｋ５６２細胞）または陽性対照としてのＰＭＡの存在下で共培養する。２４時間後、共培養物から上清を回収し、ＩＦＮγレベルをＥＬＩＳＡにより定量した。ＩＦＮγ放出をｐｇ／形質導入細胞として定量して、形質導入効率のばらつきを補正した。
【０７８４】
結果は、ＣＤ１９刺激が、図２９Ａに示されているようにＩＦＮγ放出をもたらしたことを示し、ここで、ＩＦＮγ放出レベルは、標準プロトコール、例えばプロセスＢ、を使用して細胞を濃縮したときに観察されたＩＦＮγ放出の範囲内であった。予想通り、全てのサンプルは、ＰＭＡ刺激後、ＰＭＡに応答してＩＦＮγを放出した（図２９Ｂ）。最高ＩＦＮγレベルは、水簸に起因して形質導入細胞から生じた。サンプルは、メソセリン刺激後に応答およびＩＦＮγ放出をほとんど示さなかった（図２９Ｃ）。
【０７８５】
細胞毒性アッセイ
ルシフェラーゼ発現ＣＤ１９細胞（ＮＡＬＭ６、標的細胞）とＣＡＲ発現細胞（エフェクター細胞）を、１：１０,０００〜１０：１の範囲の様々なエフェクター細胞：標的細胞比で共培養することにより、表１１に記載の濃縮条件から生じるＣＡＲ発現細胞の細胞毒性を試験した。２４時間後、発光（相対発光量、ＲＬＵ）をプレートリーダーで測定した。比溶解（ＳｐＬｙ）を、１００−（サンプルＲＬＵ／最大ＲＬＵ）×１００として計算した。播種したエフェクター細胞：標的細胞比を、％ＣＡＲ＋細胞（フローサイトメトリーにより測定）を使用してＣＴＬエフェクター細胞：標的細胞比に計算し直して、形質導入率のばらつきを補正した。
【０７８６】
図３０Ａおよび３０Ｂに示されているように、全てのサンプルが完全なＳ字型死滅曲線に至った。これは、特異的殺滅が達成されたことを実証する。殺滅効力が増した細胞は、グラフのより左側にある曲線を有する。細胞毒性アッセイからの結果をＥＣ５０の逆数値としても報告した。ＥＣ５０は、ＣＴＬ  Ｅ：Ｔおよび％比溶解についての曲線の４変数ロジスティックフィットから計算した。グラフの赤色の点線は、３０名の健常ドナーについての中央値レベルを表す。図３０Ｃに示されているように、全てのサンプルが、中央値レベル付近またはそれより上の良好なＥＣ５０ｒｅｃを有した。最高ＥＣ５０ｒｅｃは、水簸したサンプルからのものであった。
【０７８７】
実施例８：フロースルーデバイス
下記の実施例は、単に開示を目的として提供するものであり、本発明全体を包含することを意図したものではない。この実施例の態様は、ここに記載する本発明の他の態様と組み合わせることができる。
【０７８８】
この実施例では、Ｔ細胞を９日間にわたって培養で拡大させ、その後、回収し、先行手順による非フロースルー脱ビーズ化プロセスまたは本開示によるフロースルー脱ビーズ化プロセスを使用して脱ビーズ化した。サンプルは、有核生細胞おおよそ１ｅ８個〜有核生細胞おおよそ３ｅ１０個を有した。常磁性粒子の有核生細胞に対する比は、おおよそ３：１〜１：３の間であり、総有核生細胞数が低いサンプルほど、高い常磁性粒子対有核生細胞比を示した。常磁性粒子対細胞比は、細胞回収率における有意な要因であった。より高い常磁性粒子対有核生細胞比は、有核生細胞が常磁性粒子と結合し、常磁性粒子除去プロセス中に失われる機会を増加させた。
【０７８９】
非フロースルー脱ビーズ化プロセスでは、サンプルを、１リットル血小板バッグ（Terumo Medical Corp., Somerset, NJ）に収集し、平台型磁性板（ＤＹＮＡＭＡＧ（商標）ＣＴＳ（商標）、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）上に、０度で５分間、続いて３０度の傾きで１分間、静置した。次に、非磁性画分を含有するバッグ内の液体をバッグから分流させて、最終生成物を形成した。磁性画分は、廃棄物としてバッグ内に残留した。
【０７９０】
フロースルー脱ビーズ化プロセスでは、平台型磁性板（ＤＹＮＡＭＡＧ（商標）ＣＴＳ（商標）、Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）の上に配置したＣＳＤ４００Ｙ９  ＣＲＹＯＳＴＯＲＥ（商標）Ｃｏｎｉｃａｌ  Ｂａｇ（OriGen Biomedical, Austin, TX）にサンプルを継続的に流した。バッグを通って磁石の上を継続的に流すことにより、サンプルを動的に脱ビーズ化し、常磁性粒子は、バッグを通って移動するにつれて、生存有核細胞から取り去られた。バッグを通過した後しばらくたった液体から、最終生成物を形成した。磁性画分は、廃棄物としてバッグ内に残留した。磁性画分内に捕捉された生存有核細胞はほとんどなかった。これは、常磁性粒子に結合した生存有核細胞が磁石に誘引されて廃棄物中に失われた非フロースルー脱ビーズ化プロセスとは対照的である。
【０７９１】
３８回の非フロースルー脱ビーズ化プロセスの実行および３６回のフロースルー脱ビーズ化プロセスの実行のメタデータ分析は、フロースルー脱ビーズ化プロセスを使用したときに生存有核細胞の回収率の有意な増加を示した。図３１. 生存有核細胞回収率の増加は、サンプル中のより少ない細胞数（例えば、総生存有核細胞１.６ｅ９未満）で、特に有意であった。そのような総生存有核細胞数で、フロースルー脱ビーズ化プロセスは、非フロースルー脱ビーズ化プロセスについてのわずか３４％の平均回収率と比較して、７６％の平均回収率を示した。図３２.サンプル中により多数の細胞があっても、回収率の１０〜２０％増大が見られた
【０７９２】
この回収率の差は、フロースルー脱ビーズ化プロセスが、生存有核細胞が回収前に最初は常磁性粒子に結合していた場合でもそれらの生存有核細胞が失われないように、生存有核細胞から常磁性粒子を動的に除去することができることに起因する。
【０７９３】
実施例９：陽性選択方法
血液悪性疾患を有する患者から収集した白血球アフェレーシスを用いてＦＡＳＴ陽性選択を実施することができる。患者サンプルは、＞２０％リンパ芽球を含んでいてもよい。細胞は、この手順の少なくとも一部の間は、可撓性容器、例えば細胞バッグ、例えば長方形Ｏｒｉｇｅｎ  ＣＳ２５０バッグの中に存在し得る。先ず、白血球アフェレーシスサンプルが凍結されている場合、融解工程を行う。次いで、例えばＣｅｌｌＳａｖｅｒ５＋デバイスを、例えば、周囲温度、例えば２０〜２５℃で使用して、細胞を洗浄することができる。洗浄溶液は、５％ＨＡＢＳ（ヒトＡＢ血清）ＭＭ、例えば、Ｘ−ＶＩＶＯ１５を含み得る。次いで、磁性または常磁性ビーズとＣＤ３およびＣＤ２８結合抗体とを含む分離試薬と、細胞を接触させることができる。次いで、回転器を用いて細胞を例えば２〜６ｒｐｍで、例えば４ｒｐｍで回転させることができ、この回転は、例えば１０〜３０分、例えば２０分間続き得る。回転中、細胞は、周囲温度、例えば２０〜２５℃の間であり得る。次いで、例えば３０秒〜２分間、例えば１分間、陽性選択を行って、分離試薬に結合する細胞を濃縮することができる。
【０７９４】
実施例１０：陽性選択方法
血液悪性疾患を有する患者から収集した白血球アフェレーシスを用いてＦＡＳＴ陽性選択を実施することができる。細胞は、この手順の少なくとも一部の間は、可撓性容器、例えば細胞バッグ、例えば長方形Ｏｒｉｇｅｎ  ＣＳ２５０バッグの中に存在し得る。先ず、白血球アフェレーシスサンプルが凍結されている場合、融解工程を行う。次いで、例えばＣｅｌｌＳａｖｅｒ５＋デバイスを、例えば、周囲温度、例えば２０〜２５℃で使用して、細胞を洗浄することができる。洗浄溶液は、５％デキストロース、０.４５％塩化ナトリウムを含み得る（例えば、Ｄ５  １／２ＮＳ）。洗浄工程と後続の工程の間に保留時間がある場合、断熱材、例えば、紙を含む複数の層、例えばペーパータオルまたはワイプの上に細胞バッグを配置することができる。次いで、磁性または常磁性ビーズとＣＤ３およびＣＤ２８結合抗体とを含む分離試薬と、細胞を接触させることができる。次いで、細胞を、例えば３７℃で、例えば５〜１５分、例えば１０分間、インキュベートすることができる。次いで、回転器を用いて細胞を例えば２〜６ｒｐｍで、例えば４ｒｐｍで回転させることができ、この回転は、例えば１０〜３０分、例えば２０分間続き得る。断熱材を細胞用の可撓性容器と回転器の細胞プレートの片側との間に配置してもよい。回転中、細胞は、周囲温度より高温、例えば２０〜３７℃の間であり得る。次いで、例えば３０秒〜２分間、例えば１分間、陽性選択を行って、分離試薬に結合する細胞を濃縮することができる。
【０７９５】
均等物
本明細書において引用されたありとあらゆる特許、特許出願および出版物の開示は、それによってそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。本発明を具体的な態様を参照しながら開示してきたが、本発明の他の態様およびバリエーションが、本発明の真の本質および範囲から逸脱することなく当業者によって考え出され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、このような態様および等価なバリエーションの全てを包含するものと解釈されることが意図される。
【図１Ａ】
2019500874.tif 000038
【図１Ｂ】
2019500874.tif 000039
【図１Ｃ】
2019500874.tif 000040
【図１Ｄ】
2019500874.tif 000041
【図１Ｅ】
2019500874.tif 000042
【図１Ｆ】
2019500874.tif 000043
【図１Ｇ】
2019500874.tif 000044
【図１Ｈ】
2019500874.tif 000045
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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