(57)【要約】  間質性膀胱炎の治療のためのヒドロゲル組成物が記載され、架橋ヒアルロナンヒドロゲルマトリックス全体に分散した架橋ヒアルロナン粒子を含み、ここでヒアルロナンは高分子量ヒアルロナンである。組成物はヒトへの直接膀胱点滴注入用に製剤化される。ヒアルロナン粒子は、ナノサイズのヒアルロナン粒子、又はナノサイズのヒアルロナン粒子の凝集体、又はそれらの混合物である。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において間質性膀胱炎を治療する方法において使用するためのヒドロゲル組成物であって、ヒドロゲルマトリックス中に分散及び懸濁された架橋高分子量ヒアルロナン粒子を含み、ヒトにおける直接膀胱点滴注入のために製剤化される、ヒドロゲル組成物。
【請求項２】
前記ヒドロゲル組成物が、直接膀胱点滴注入により前記ヒトに投与される、請求項１に記載の使用のための、請求項１に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項３】
前記ヒドロゲル組成物が、前記膀胱の尿路上皮層の修復／再生を促進するためのバリア効果を提供する、請求項１又は２に記載の使用のための、請求項１に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項４】
前記ヒドロゲル組成物が炎症性サイトカイン産生を抑制する、請求項１、２又は３に記載の使用のための、請求項１に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項５】
前記ヒドロゲル組成物が前記膀胱壁の透過性を低下させる、請求項１〜４のいずれかに記載の使用のための、請求項１に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項６】
前記ヒドロゲルマトリックスがヒアルロナンである、請求項１〜５に記載の使用のための、請求項１に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項７】
前記ヒドロゲルマトリックスが架橋高分子量ヒアルロナンである、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための、請求項４に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項８】
前記ＨＡ粒子がナノサイズの粒子、又はナノサイズのＨＡ粒子の凝集体、又はそれらの組み合わせである、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための、請求項１〜７のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項９】
ＨＡ粒子対ヒドロゲルマトリックスの重量比が約１：１０〜１０：１である、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための、請求項１〜８のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１０】
ＨＡ粒子対ヒドロゲルマトリックスの重量比が約１：２〜２：１である、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための、請求項１〜９に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１１】
前記ＨＡが架橋部分で化学的に架橋されている、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための、請求項１〜１０のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１２】
前記架橋部分が官能化エチレングリコールである、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための、請求項１〜１１のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１３】
前記官能化エチレングリコールがＰＥＧ-アミンである、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための、請求項１〜１２のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１４】
前記ＨＡがＥＤＣ／ＮＨＳ又は４-（４，６-ジメトキシ-１，３，５-トリアジン-２-イル））-４-メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）化学で架橋されている、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための、請求項１〜１３のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１５】
前記組成物が週に１回、４〜１２週間投与される、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための、請求項１〜１４のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１６】
前記組成物が８Ｆ又は１０Ｆカテーテルによって投与される、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための、請求項１〜１５のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１７】
架橋ヒアルロナンヒドロゲルマトリックス中に分散及び懸濁された架橋ヒアルロナン粒子を含むヒドロゲル組成物であって、前記ヒアルロナンは高分子量ヒアルロナンであり、前記ヒドロゲルはヒトへの直接膀胱点滴注入用に製剤化されている、ヒドロゲル組成物。
【請求項１８】
前記ＨＡ粒子が、ナノサイズの粒子、又はナノサイズのＨＡ粒子の凝集体、又はそれらの組み合わせである、請求項１７に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１９】
前記ナノサイズのＨＡ粒子が１００〜９００ｎｍの平均粒径を有する、請求項１８に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２０】
前記ナノサイズのＨＡ粒子が４００〜６００ｎｍの平均粒径を有する、請求項１８に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２１】
前記凝集体が５００ｎｍ〜１０ミクロンの平均寸法を有する、請求項１８、１９又は２０に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２２】
ＨＡ粒子対ＨＡヒドロゲルマトリックスの重量比が約１：１０〜１０：１である、請求項１７〜２１のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２３】
ＨＡ粒子対ＨＡヒドロゲルマトリックスの重量比が約１：４〜４：１である、請求項２２に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２４】
ＨＡ粒子対ＨＡヒドロゲルマトリックスの重量比が約１：２〜２：１である、請求項２２に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２５】
前記ＨＡが架橋部分で化学的に架橋されている、請求項１７〜２４のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２６】
前記架橋部分が官能化エチレングリコールである、請求項２５に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２７】
前記官能化エチレングリコールがＰＥＧ-アミンである、請求項２６に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２８】
前記ＨＡがＥＤＣ／ＮＨＳ又は４-（４，６-ジメトキシ-１，３，５-トリアジン-２-イル）-４-メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）化学で架橋されている、請求項２５〜２７のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２９】
架橋剤対ＨＡの前記比が１：１〜１：１０（重量）である、請求項１７〜２８のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項３０】
前記ＨＡ粒子の前記架橋部分が、前記ＨＡヒドロゲルマトリックスの前記架橋部分とは異なる、請求項２５〜２９のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項３１】
前記ヒアルロナン（ＨＡ）が正に帯電している、請求項１７〜３０のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項３２】
前記ＨＡがアミノプロピルイミダゾールで誘導体化されている、請求項３１に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項３３】
約０．１〜約１０％のＨＡ（重量％）を含む、請求項１７〜３２のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項３４】
約０．５％〜２％未満のＨＡ（重量％）を含む、請求項３３に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項３５】
架橋ヒアルロナンヒドロゲルマトリックス中に分散及び懸濁された架橋ヒアルロナン粒子を含むヒドロゲル組成物であって、前記ヒアルロナンは高分子量ヒアルロナンであり、官能化ＰＥＧ架橋剤で架橋されており、前記ヒドロゲルはヒトへの直接膀胱点滴注入用に製剤化されている、ヒドロゲル組成物。
【請求項３６】
前記ＨＡ粒子がナノサイズ粒子、又はナノサイズＨＡ粒子の凝集体、又はそれらの組み合わせである、架橋高分子量ヒアルロナン粒子。
【請求項３７】
前記ナノサイズＨＡ粒子が１００〜９００ｎｍの平均粒径を有する、請求項３６に記載の架橋高分子量ヒアルロナン粒子。
【請求項３８】
前記ナノサイズＨＡ粒子が４００〜６００ｎｍの平均粒径を有する、請求項３６に記載の架橋高分子量ヒアルロナン粒子。
【請求項３９】
前記凝集体が５００ｎｍ〜１０ミクロンの平均寸法を有する、請求項３６〜３８のいずれかに記載の架橋高分子量ヒアルロナン粒子。
【請求項４０】
前記ＨＡが架橋部分で化学的に架橋されている、請求項３６〜３９のいずれかに記載の架橋高分子量ヒアルロナン粒子。
【請求項４１】
前記架橋部分が官能化エチレングリコールである、請求項４０に記載の架橋高分子量ヒアルロナン粒子。
【請求項４２】
前記官能化エチレングリコールがＰＥＧ-アミンである、請求項４１に記載の架橋高分子量ヒアルロナン粒子。
【請求項４３】
前記ＨＡがＥＤＣ／ＮＨＳ又は４-（４，６-ジメトキシ-１，３，５-トリアジン-２-イル）-４-メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）化学で架橋されている、請求項４０〜４２のいずれかに記載の架橋高分子量ヒアルロナン粒子。
【請求項４４】
架橋剤対ＨＡの前記比が１：１〜１：１０（重量）である、請求項４０〜４３のいずれかに記載の架橋高分子量ヒアルロナン粒子。
【請求項４５】
前記ヒアルロナン（ＨＡ）が正に帯電している、請求項３６〜４４のいずれかに記載の架橋高分子量ヒアルロナン粒子。
【請求項４６】
前記ＨＡがアミノプロピルイミダゾールで誘導体化されている、請求項４５に記載の架橋高分子量ヒアルロナン粒子。
【請求項４７】
医薬として使用するための、請求項１７〜３５のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項４８】
哺乳動物における炎症性疾患又は障害を治療する方法において使用するための、請求項１７〜３５のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項４９】
前記組成物が、直接膀胱点滴注入によって前記膀胱に任意に投与される、哺乳動物の間質性膀胱炎の治療方法に使用するための、請求項１７〜３５のいずれかに記載のヒドロゲル組成物。
【請求項５０】
医薬として使用するための、請求項３６〜４６のいずれかに記載の架橋高分子量ヒアルロナン粒子。
【請求項５１】
哺乳動物の炎症性疾患又は障害を治療する方法に使用するための、請求項３６〜４６のいずれかに記載の架橋高分子量ヒアルロナン粒子。
【請求項５２】
前記組成物が、直接膀胱点滴注入によって前記膀胱に任意に投与される、哺乳動物の間質性膀胱炎の治療方法に使用するための、請求項３６〜４６のいずれかに記載の架橋高分子量ヒアルロナン粒子。
【請求項５３】
架橋ＨＡ粒子を提供する工程、架橋ＨＡヒドロゲルマトリックスを提供する工程、及び前記ＨＡ粒子を前記ＨＡヒドロゲルマトリックスに共架橋することなく、前記架橋ＨＡヒドロゲルマトリックス中に前記架橋ＨＡ粒子を分散及び懸濁させる工程を含む、ヒドロゲル組成物の製造方法。
【請求項５４】
前記ＨＡが高分子量ＨＡである、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記ＨＡが化学架橋剤で架橋されている、請求項５３又は５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＨＡが官能化エチレングリコールで架橋されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記官能化エチレングリコールがＰＥＧ-アミンである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記架橋が、ＥＤＣ／ＮＨＳ又は４-（４，６-ジメトキシ-１，３，５-トリアジン-２-イル）-４-メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）化学を含む、請求項５５〜５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
架橋剤対ＨＡの前記比が約１：１〜１：３である、請求項５５〜５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
前記ＨＡ分子に正味の正電荷を付与する部分で前記ＨＡを誘導体化する工程を含む、請求項５３〜５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記ＨＡ分子に正味の正電荷を付与する前記部分が、アミノプロピルイミダゾールである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
請求項５３〜６１のいずれかに記載の方法によって得られる、ヒドロゲル組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療適応症、特に間質性膀胱炎を治療するためのヒアルロナン組成物及びその使用に関する。ヒアルロナン組成物を製造する方法も考察する。
【背景技術】
【０００２】
間質性膀胱炎／疼痛性膀胱症候群（ＩＣ／ＰＢＳ）は、膀胱痛、頻尿、切迫感、夜間頻尿及び慢性骨盤痛を特徴とする慢性炎症性疾患で、患者の生活の質に深刻な影響を与える。ＩＣ患者の生活の質は、末期腎臓病又は重度の慢性関節リウマチと同様に見なされている。診療所における現在の目標基準である既存の膀胱内ヒアルロナン溶液注入療法の限界は、膀胱粘膜バリア機能を完全に回復させることができないことにある。２０１１年のＲＡＮＤ間質性膀胱炎疫学調査では、アメリカ合衆国の女性の２．７〜６．５％が間質性膀胱炎／膀胱痛症候群の診断と一致する尿路症状を有すると推定している。７つの主要市場で、約８３４０万人の女性が膀胱障害を患っていると推定されている。現在、膀胱障害に対して承認されているこれらの製品は、薬品がわずかに有効であることを示している臨床試験に基づいている。
【０００３】
膀胱障害の治療用に承認されている現在存在する製品は、薬がわずかに有効であることを示した臨床試験に基づいている。いくつかの現在の治療戦略は、本質的に単に症状管理であり、根本的な疾患の病状に対処するのに失敗している。イブプロフェン、ナプロキセン及び他の非ステロイド性抗炎症薬は疼痛症状を標的とする。アミトリプチリンやイミプラミンなどの三環系抗うつ薬は、膀胱の筋肉を弛緩させ、痛みを抑えることを目的としている。ジフェンヒドラミンなどの抗ヒスタミン薬は、膀胱細胞壁の肥満細胞活性化を標的とする。上記のすべてが臨床効果を欠く経口治療である。治療法の選択肢は弱く、ペントサンポリスルフェートナトリウム（Ｅｌｍｉｒｏｎ）とジメチルスルホキシド（Ｒｉｍｓｏ−５０）があり、どちらも現在特許が切れている。ＰＰＳは経口ＧＡＧ補充療法であり、試験は、ＰＰＳの恩恵を受けているＩＣ患者のわずか６．２％〜１８．７％という、患者に対する最低限の治療効果を示し、ジェネリックのＰＰＳはまだ入手できない。ジェネリックのジメチルスルホキシドは２００２年に発売され、それは限られた臨床的有効性及び臨床データの欠如を伴う点滴治療であり、２０００年の最新の試験では、ＩＣのサブタイプに対する限定された効果を示している。Ｇｅｐａｎ（登録商標）及びＵｒａｃｙｓｔ（登録商標）のコンドロイチン硫酸ベースの治療法は効果がなく、コンドロイチンベースの臨床試験では、２つの二重、盲検、多施設、無作為化、並行群試験でのプラセボと比較して効果がない。
【０００４】
ＵＳ２０１０／０２８４３５は、治療的及び美容的／皮膚科学的用途のための注射用ヒアルロナンヒドロゲルを開示している。ヒドロゲルは、ヒアルロナンゲルマトリックスと、連続相ゲルマトリックスに共架橋した比較的大きな（１〜２０ミクロン）架橋ヒアルロナン粒子とを含む。この組成物は、括約筋の体積を増加させるための薬剤としての泌尿器科／婦人科分野における使用のために提案されている。
【０００５】
ＥＰ２０１１８１６は、美容用途又は外科用途における組織充填剤としての使用のための、２つのゲル系を有するヒアルロナン組成物を記載している。ゲルは、連続ゲルマトリックスと共架橋したヒアルロナン粒子を含む。尿失禁の治療のために、ゲルを尿道周囲注射によって投与することができる。
【０００６】
ＵＳ２０１６／０３８６４３には、メタクリル化ＨＡゲルマトリックス中に低分子量ＨＡ粒子を含む組織置換用足場が記載されている。足場は、ＨＡゲルマトリックス中にＨＡ粒子を含む非架橋前駆体組成物として投与することができ、ここで前駆体組成物は光架橋によってインビボで活性化される。
【０００７】
ＷＯ２００９／０１８０７６は、皮膚充填剤として使用するための架橋高分子量ＨＡゲルを記載している。ゲルは架橋ＨＡの粒子を含み得る。架橋剤は、４アーム官能化ＰＥＧ部分のような多官能性架橋剤であり、これはゲルの力学的強度を増大させてそれを皮膚充填剤としての使用に適するようにすることが見出されている。これはゲルを直接膀胱点滴注入するのに不適当にすることになる。
【０００８】
本発明の目的は、上記の問題の少なくとも１つを克服することである。
発明の概要
【０００９】
本発明は、高分子量ヒアルロナン組成物を用いる間質性膀胱炎（ＩＣ）の点滴注入治療が、ゲルマトリックス全体に分散したヒアルロナン粒子、典型的には高分子量ヒアルロナンゲルマトリックスの形態で組成物を提供することによって改善できるという発見に基づく。ただし、アルギン酸塩などの他のゲルマトリックスを使用してもよい。出願人は、ヒアルロナン（ＨＡ）粒子が、尿路上皮細胞炎症の細胞モデルにおける一連の従来技術の組成物と比較して内因性ｓＧＡＧ発現を有意に増加させることを示し（図２）、ＨＡヒドロゲルマトリックス中のＨＡ粒子の供給は、尿路上皮細胞におけるｓＧＡＧ発現の有意なそして一貫した増加を、ある範囲の濃度にわたって提供することを示す（図５）。本出願人はまた、ＨＡ粒子で処理した尿路上皮組織外植片は、未処理及び硫酸プロタミン処理組織の両方と比較して、より大きい組織完全性及びより厚い尿路上皮を保持することを示した（図６）。本出願人はまた、ＨＡゲル中のＨＡ粒子で処理した尿路上皮組織外植片が、未処理及び硫酸プロタミン処理組織の両方と比較して膀胱透過性を減少させることを示した（図１１）。
【００１０】
概して、本発明は、間質性膀胱炎又は他の炎症状態もしくは疾患の治療に使用するためのヒアルロナン粒子、典型的にはナノサイズの粒子に関する。粒子は一般に、担体相内に分散した粒子を含む組成物の形態で提供される。担体相は、液体、半固体（すなわちゲル）、又は固体（すなわち固体インプラント又は足場）であり得る。好ましい一実施形態では、担体相はゲル又はヒドロゲルである。一実施形態では、ゲル又はヒドロゲルは架橋されている。一実施形態では、ヒドロゲルはヒアルロナンヒドロゲルである。一実施形態では、担体相は架橋ヒアルロナンヒドロゲルである。一実施形態では、組成物は直接膀胱点滴注入用に製剤化される。
【００１１】
従って、本発明の第１の態様によれば、ヒアルロナンヒドロゲルマトリックス全体に分散したヒアルロナン粒子を含む組成物が提供される。
【００１２】
一実施形態では、組成物は哺乳動物、特にヒトへの直接膀胱点滴注入用に製剤化される。従って、ヒドロゲル組成物は、カテーテルなどの適切な送達装置を使用して膀胱に送達するのに適しており、従って一般に流動性の液体である。他の実施形態では、組成物は液体よりも固体であり得、それは材料を他の療法に適したものにする。
【００１３】
一実施形態では、ヒアルロナン粒子は高分子量ヒアルロナンを含む。一実施形態では、ヒアルロナンヒドロゲルマトリックスは高分子量ヒアルロナンを含む。
【００１４】
一実施形態では、ＨＡ粒子はナノサイズの粒子であり、典型的には１００〜９００ｎｍの平均粒径を有する。一実施形態では、ＨＡ粒子は３００〜７００ｎｍの平均粒径を有する。一実施形態では、ＨＡ粒子は４００〜６００ｎｍの平均粒径を有する。一実施形態では、ＨＡ粒子はナノサイズのＨＡ粒子の凝集体であり、その凝集体は５００ｎｍから１０ミクロンの平均寸法を有することができる。
【００１５】
一実施形態では、ＨＡ粒子対ＨＡヒドロゲルマトリックスの重量比は、約１：９〜９：１である。一実施形態では、ＨＡ粒子対ＨＡヒドロゲルマトリックスの重量比は、約１：５〜５：１である。一実施形態では、ＨＡ粒子対ＨＡヒドロゲルマトリックスの重量比は、約１：４〜４：１である。一実施形態では、ＨＡ粒子対ＨＡヒドロゲルマトリックスの重量比は、約１：３〜３：１である。一実施形態では、ＨＡ粒子対ＨＡヒドロゲルマトリックスの重量比は、約１：２〜２：１である。一実施形態では、ＨＡ粒子対ＨＡヒドロゲルマトリックスの重量比は、約１：１である。一実施形態では、ＨＡ粒子はＨＡゲルに懸濁されている。
【００１６】
一実施形態では、ＨＡ粒子は架橋部分で架橋されている。一実施形態では、ＨＡヒドロゲルマトリックスは架橋部分で架橋されている。
【００１７】
一実施形態では、ＨＡ粒子の架橋部分は、ＨＡヒドロゲルマトリックスの架橋部分とは異なる。粒子及びヒドロゲルマトリックスにおける異なる架橋剤の使用は、調整されたＨＡ分解プロファイルを有する組成物を提供し、調整可能なＨＡヒドロゲル足場を提供するための異なる架橋剤の使用を可能にする。
【００１８】
一実施形態では、ＨＡは化学的に架橋されている。一実施形態では、架橋部分（剤）は官能化エチレングリコール、例えば官能化ＰＥＧ、例えばＰＥＧ−アミンである。一実施形態では、架橋開始は、ＥＤＣ／ＮＨＳ又は４-（４，６-ジメトキシ-１，３，５-トリアジン-２-イル）-４-メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）化学で行われる。他の架橋方法としては、熱架橋又は光架橋が挙げられる。一実施形態では、架橋剤対ＨＡの比は、１：１〜１：１０（重量）、典型的には１：１〜１：５、好ましくは約１：１〜１：３である。一実施形態では、架橋剤とＨＡの比は約１：２（重量）である。
【００１９】
一実施形態では、ヒアルロナン（ＨＡ）は正に帯電している。これは、ＨＡ分子に正味の正電荷を付与する部分（例えばカチオン）でＨＡを誘導体化することによって達成することができる。ＨＡを誘導体化するために使用することができる部分の例には、アミノプロピルイミダゾールが挙げられる。本明細書において、ＨＡという用語は、誘導体化ＨＡ及び非誘導体化ＨＡの両方を含む。正電荷ＨＡ、例えばカチオン化ＨＡの製造方法は、文献に記載されており、これには四級アンモニウム含有基を用いたカルボキシル及びヒドロキシル基の修飾が含まれる（ＵＳ２００９／０２８１０５６及びＵＳ２０１０／０１９７９０４）。
【００２０】
一実施形態では、組成物は治療有効量のＨＡを含む。一実施形態では、組成物は約０．１〜約１０％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態では、組成物は約０．５〜約５％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態では、組成物は約０．１〜約１％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態では、組成物は約１．０〜約１０％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態では、組成物は約０．５〜約２％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態では、組成物は約５．０〜約１０％のＨＡ（重量％）を含む。
【００２１】
本発明のさらなる態様によれば、担体相内に配置されたヒアルロナン粒子を含む組成物が提供される。
【００２２】
担体相は典型的には液体、例えば水性流体である。しかしながら、担体相は固相又は半固相、例えばゲル、ヒドロゲル又はポリマー担体又は医薬賦形剤から形成されたマトリックスの形態をとることもできる。担体相は、ヒアルロナン粒子を放出するように構成することができる。担体相は生分解性、例えば水溶性であり得る。担体相は生体適合性であり得る。担体相は少なくとも２つの担体相を含み、ヒアルロナン粒子を放出するように構成された各相は異なる放出速度である。組成物は、哺乳動物の体内で使用するためのインプラントであり得る。インプラントは、固体又は半固体（例えば、足場、ゲル、カプセル）であり得る。担体相（ゲル又はヒドロゲル担体相）に適したポリマーは、ＵＳ２０１６／０３８６４３（特に段落６１〜６３）に記載されている。
【００２３】
一実施形態では、組成物は哺乳動物、特にヒトへの直接膀胱点滴注入用に製剤化される。従って、組成物は、カテーテルなどの適切な送達装置を使用して膀胱に送達するのに適しており、従って一般に流動性の液体である（すなわち、尿道カテーテルを通して投与するのに十分な流動性）。他の実施形態では、組成物は液体よりも固体であり得、それは材料を他の療法に適したものにする。
【００２４】
一実施形態では、ヒアルロナン粒子は高分子量ヒアルロナンを含む。
【００２５】
一実施形態では、ＨＡ粒子はナノサイズの粒子であり、典型的には１００〜９００ｎｍの平均粒径を有する。一実施形態では、ＨＡ粒子は３００〜７００ｎｍの平均粒径を有する。一実施形態では、ＨＡ粒子は４００〜６００ｎｍの平均粒径を有する。一実施形態では、ＨＡ粒子はナノサイズのＨＡ粒子の凝集体であり、その凝集体は５００ｎｍから１０ミクロンの平均寸法を有することができる。
【００２６】
一実施形態では、ＨＡ粒子は架橋部分で架橋されている。
【００２７】
一実施形態では、ＨＡ粒子は化学的に架橋されている。一実施形態では、架橋部分（薬剤）は官能化エチレングリコール、例えば官能化ＰＥＧ、例えばＰＥＧ−アミンである。一実施形態では、架橋開始は、ＥＤＣ／ＮＨＳ又は４-（４，６-ジメトキシ-１，３，５-トリアジン-２-イル）-４-メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）化学で行われる。他の架橋方法は熱架橋を含む。一実施形態では、架橋剤対ＨＡの比は、１：１〜１：１０（重量）、典型的には１：１〜１：５、好ましくは約１：１〜１：３である。一実施形態では、架橋剤とＨＡの比は約１：２（重量）である。
【００２８】
一実施形態では、ヒアルロナン（ＨＡ）は正に帯電している。これは、ＨＡ分子に正味の正電荷を付与する部分（例えばカチオン）でＨＡを誘導体化することによって達成することができる。ＨＡを誘導体化するために使用することができる部分の例には、アミノプロピルイミダゾールが挙げられる。本明細書において、ＨＡという用語は、誘導体化ＨＡ及び非誘導体化ＨＡの両方を含む。正電荷ＨＡ、例えばカチオン化ＨＡの製造方法は、文献に記載されており、これには四級アンモニウム含有基を用いたカルボキシル及びヒドロキシル基の修飾が含まれる（ＵＳ２００９／０２８１０５６及びＵＳ２０１０／０１９７９０４）。
【００２９】
一実施形態では、組成物は治療有効量のＨＡを含む。一実施形態では、組成物は約０．１〜約１０％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態では、組成物は約０．５〜約５％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態では、組成物は約０．１〜約１％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態では、組成物は約１．０〜約１０％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態では、組成物は約０．５〜約２％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態では、組成物は約２〜約４％のＨＡ（重量％）を含む。一実施形態では、組成物は約５．０〜約１０％のＨＡ（重量％）を含む。
【００３０】
本発明のさらなる態様によれば、高分子量ヒアルロナンから形成され、ヒアルロナン粒子が任意に架橋されているヒアルロナン粒子が提供される。一実施形態では、ヒアルロナン粒子はナノサイズである。
【００３１】
一実施形態では、ナノサイズのヒアルロナン粒子は、３００〜７００ｎｍの平均寸法を有する。一実施形態では、ナノサイズのヒアルロナン粒子は、４００〜６００ｎｍの平均寸法を有する。
【００３２】
一実施形態では、ヒアルロナン粒子は化学的に架橋されているが、他の架橋方法も可能である（例えば熱的又は光活性化可能な架橋）。一実施形態では、ヒアルロナン粒子は、官能化エチレングリコール架橋剤、例えば官能化ＰＥＧ（すなわちＰＥＧ−アミン）で化学的に架橋されている。
【００３３】
一実施形態では、ヒアルロナン粒子は（例えばカチオン化によって）正に帯電するように修飾される。
【００３４】
別の態様では、本発明は医薬として使用するための本発明の組成物を提供する。別の態様では、本発明は、炎症性疾患又は障害、典型的には上皮組織の炎症性疾患又は障害を治療する方法において使用するための本発明の組成物を提供する。
【００３５】
別の態様では、本発明は、哺乳動物における炎症性膀胱又は尿路適応症の治療方法に使用するための本発明の組成物又は粒子を提供し、ここで組成物又は粒子は典型的には直接膀胱点滴注入によって膀胱に投与される。別の態様では、本発明は、ＧＡＧ層損傷を特徴とする適応症、例えば間質性膀胱炎、疼痛性膀胱症候群、化学膀胱炎、放射線療法誘発性膀胱炎、又は再発性尿路感染症又は猫の尿路疾患（ＦＬＵＴＤ）などの膀胱疾患の治療方法に使用するための本発明の組成物又は粒子を提供する。
【００３６】
一実施形態では、適応症は膀胱炎である。一実施形態では、適応症は間質性膀胱炎又は疼痛性膀胱症候群である。
【００３７】
別の態様では、本発明は、ＧＡＧ補充療法の方法において使用するための本発明の組成物又は粒子を提供する。
【００３８】
本発明の組成物の他の使用には、化粧品、皮膚科用、組織再生、組織工学用途及び使用が含まれる。
【００３９】
一実施形態では、治療方法は、治療期間中に定期的に組成物又は粒子を投与することを含む。投与頻度は、疾患の状態、患者の年齢、治療の有効性など、さまざまな要因によって異なる。一実施形態では、組成物又は粒子は週に１回投与される。一実施形態では、組成物又は粒子は週に１回又は週に２回投与される。一実施形態では、組成物又は粒子は、４〜１２週間にわたって週１回投与される。一実施形態では、組成物又は粒子は毎日投与される。一実施形態では、組成物又は粒子は月２回投与される。一実施形態では、組成物又は粒子は月１回投与される。一実施形態では、組成物又は粒子は治療期間中に１〜１０回投与される。一実施形態では、治療期間は１週間から６ヶ月の間である。
【００４０】
一実施形態では、本発明の組成物の単位用量（すなわち、１回の点滴注入治療に用いられる量）は、１０〜５００ｍｇの（任意に架橋された）ヒアルロナンを含む。一実施形態では、本発明の組成物の単位用量は、１０〜２００ｍｇの（任意に架橋された）ヒアルロナンを含む。一実施形態では、本発明の組成物の単位用量は、５０〜２００ｍｇの（任意に架橋された）ヒアルロナンを含む。一実施形態では、本発明の組成物の単位用量は、１００〜１５０ｍｇの（任意に架橋された）ヒアルロナンを含む。
【００４１】
本発明の組成物は追加の成分を含み得る。従って、ＨＡ粒子は１つ又は複数の追加の成分を含み得る。担体相（すなわちヒドロゲル）は、１つ又は複数の追加の成分を組み込んでもよい。ＨＡ粒子と担体相の両方が、独立して、１つ又は複数の追加の成分を組み込んでもよい。成分は、薬学的又は生物学的に活性な薬剤であり得る。成分は、細胞、細胞成分、多糖、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗原、抗体（モノクローナル又はポリクローナル）、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、ナノボディ又はＶＨＶフラグメントなどの単一ドメイン抗体）、抗体（又は抗体フラグメント）とタンパク質又はペプチドなどの結合相手とのコンジュゲート、核酸（遺伝子、遺伝子構築物、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸を含む）であり得る。成分は、増殖因子（すなわち、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ及びインターロイキン）などの細胞産物であり得る。成分は、薬物、例えば、非ステロイド系抗炎症薬（イブプロフェン、ケトプロフェン又はナプロキセンなど）、アスピリン、アセトアミノフェン、コデイン、ヒドロコドンなどの痛みを和らげる薬物、ステロイド系抗炎症薬、抗鬱剤、抗ヒスタミン薬などの抗炎症薬、又は鎮痛薬であり得る。細胞は自己由来、同種異系、異種であり得る。細胞は幹細胞であり得る。幹細胞は、サイドポピュレーション、胚性、胚種性、内皮性、造血性、筋芽細胞性、胎盤性、臍帯血性、脂肪細胞性及び間葉系幹細胞を含む群から選択され得る。細胞は、生物学的産物、例えば成長因子などの治療用生物学的産物を発現するように操作することができる。
【００４２】
一実施形態では、本発明の組成物は、約０．１〜１５、好ましくは約０．１〜１の貯蔵弾性率Ｇ’を有する。一実施形態では、本発明の組成物は、約０．２〜３５、好ましくは約０．２〜１．５の損失弾性率Ｇ’’を有する。一実施形態では、本発明の組成物は、約０．１〜６、好ましくは約０．１〜約０．２の複素粘度（Ｐａ．ｓ）を有する。
【００４３】
別の態様では、本発明は、架橋ＨＡ粒子を製造する工程、架橋ＨＡヒドロゲルマトリックスを製造する工程、及び架橋ＨＡヒドロゲルマトリックス中に架橋ＨＡ粒子を分散させる工程を含む、本発明の組成物を製造する方法を提供する。
【００４４】
一実施形態では、ＨＡは官能化エチレングリコール架橋剤、例えばＰＥＧ−アミンなどの官能化ＰＥＧ架橋剤で架橋されている。一実施形態では、この方法は、典型的にはＥＤＣ／ＮＨＳ又は４-（４，６-ジメトキシ-１，３，５-トリアジン-２-イル）-４-メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）化学で行われるステップ架橋開始を含む。
【００４５】
一実施形態では、架橋剤対ＨＡの比は、１：１〜１：１０（重量）、典型的には１：１〜１：５、好ましくは約１：１〜１：３である。一実施形態では、架橋剤とＨＡの比は約１：２（重量）である。
【００４６】
一実施形態では、この方法は、ＨＡ分子に正味の正電荷を付与する部分でＨＡを誘導体化する工程を含む。一実施形態では、誘導体化工程は架橋工程の前に行われる。
【００４７】
本発明はまた、本発明の方法によって得られる組成物に関する。
【００４８】
本発明の他の態様及び好ましい実施形態は、以下に示される他の特許請求の範囲において定義され説明される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の組成物の作用機序の概要。
【図２】ＨＡ粒子と他の３つの市販製品（Ｃｙｓｔｉｓｔａｔ、Ｈｙａｃｙｓｔ及びＩａｌｕｒｉｌ）との間の比較分析は、ＨＡ粒子で処理した細胞についてより高いｓＧＡＧ発現を明らかにした。
【図３】正電荷ヒアルロナン（ＨＡ）ＨＡを水に溶解し、アミノプロピルイミダゾールを天然の負に荷電したＨＡ溶液に添加することにより、正電荷ＨＡを作製した。ＤＳＣは、溶液中にＨＡ上で−１５ｍＶの電荷を示す。
【図４】ヒト尿路上皮細胞を硫酸プロタミンで１時間炎症させた後、３つの異なるＨＡ条件で２４時間処置した。ヒト患者における現在の治療を模倣するため、水中のＨＡ粒子、ＨＡ  ｇｅ、及びＨＡゲルとＨＡ粒子との１：１の比の組み合わせを用いた。使用した総ＨＡ濃度は、それに応じて２ｍｇ、１ｍｇ及び０．５ｍｇであった。（Ｐ＜０．０５）
【図５】ａ）ＨＡ粒子と他の３つの市販製品（Ｃｙｓｔｉｓｔａｔ（登録商標）、Ｈｙａｃｙｓｔ（登録商標）及びＩａｌｕｒｉｌ（登録商標））との間の比較分析は、ＨＡ粒子で処理した細胞についてより高いｓＧＡＧ発現を明らかにした。ｂ）ヒアルロナン合成のための遺伝子発現、定量的ＰＣＲを用いたＨＡＳ２もまた、未処理対照と比較して、２ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬの処理細胞において有意な増加（Ｐ＜０．０５）を示した。
【図６】ラットにおける前臨床試験の前にＩＣの治療条件を最適化するためにＩＣの生体外モデルを確立した。新鮮な膀胱をラットから解剖し、４つの小さい片に切断した。組織を引き伸ばし、アガロースゲル上に固定した。組織を正常組織と硫酸プロタミン侵襲を伴う組織に分けた。２日後、硫酸プロタミン群において、組織を１０ｍｇ／ｍｌの硫酸プロタミンで１時間炎症させた。処置のために、ＨＡ粒子を膀胱組織に導入し、２時間インキュベートした。未処置群では、硫酸プロタミンを除去し、血清を含まないＤＭＥＭ培地と交換した。２時間のインキュベーション後、ＨＡ粒子及びＤＭＥＭ培地（未処理）を除去し、１％血清を含む培地と交換し、インキュベーター内で３７℃、２０％Ｏ２及び５％ＣＯ２でさらに３日間培養した。３日後、組織を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィンブロックし、Ｈ＆Ｅで染色した。
【図７】尿路上皮細胞上のＨＡゲルの粘度の影響。Ａ）ｓＧＡＧの産生に対するＨＡゲルの粘度の影響。Ｂ）ＨＡゲルの粘度がＩＬ-８レベルに及ぼす影響。Ｃ）ＨＡゲルの粘度がＩＬ−６レベルに及ぼす影響。
【図８】動的振動振幅、異なるＨＡ濃度溶液の時間掃引曲線、貯蔵弾性率、Ｇ’（Ａ）、損失弾性率、Ｇ’’（Ｂ）、異なるＨＡ濃度溶液のＧ’、Ｇ”の比較（Ｃ）、凍結乾燥ヒアルロナン溶液（３ｍｇ／ｍｌ）のＳＥＭ画像（Ｄ）、レオロジー粘度曲線（Ｅ）、異なるＨＡ濃度溶液の複素粘度の比較。データは平均値±ＳＤ、一元配置分散分析、事後テューキー検定として表す。＊ｐ＜０．０５対１ｍｇ／ｍｌ；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１対１ｍｇ／ｍｌ
【図９】炎症性サイトカインに対する１ｍｇ／ｍｌのヒアルロナンの効果。（Ａ）２４時間にわたるＨＴＢ-２細胞から分泌されたＩＬ-６レベルに対する、１ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度での粒子対ゲルの異なる比率の比較。（Ｂ）２４時間にわたるＨＴＢ-２細胞から分泌されたＩＬ-８レベルに対する、１ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度での粒子対ゲルの異なる比率の異なる比率の比較。（Ｃ）２４時間にわたるＨＴＢ-２細胞から分泌されたＭＣＰ-１レベルに対する、１ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度での粒子対ゲルの異なる比率の異なる比率の比較。
【図１０】炎症性サイトカインに対する３ｍｇ／ｍｌのヒアルロナンの効果。（Ａ）２４時間にわたるＨＴＢ-２細胞から分泌されたＩＬ-６レベルに対する、３ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度での粒子対ゲルの異なる比率の比較。（Ｂ）２４時間にわたるＨＴＢ-２細胞から分泌されたＩＬ-８レベルに対する、３ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度での粒子対ゲルの異なる比率の比率の比較。（Ｃ）２４時間にわたるＨＴＢ-２細胞から分泌されたＭＣＰ-１レベルに対する、１ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度での粒子対ゲルの異なる比率の比較。
【図１１】膀胱透過性に対するＨＡ系におけるＨＡの効果。（Ａ）硫酸プロタミンで処理したＴ８４細胞における６時間にわたるＴＥＥＲレベルに対する、１ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度及びＣｙｓｔｉｓｔａｔ（登録商標）での粒子対ゲルの異なる比率の効果の比較。（Ｂ）硫酸プロタミン及びＴＮＦαで処理したＴ８４細胞における６時間にわたるＴＥＥＲレベルに対する、１ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度及びＣｙｓｔｉｓｔａｔ（登録商標）での粒子対ゲルの異なる比率の効果の比較。（Ｃ）硫酸プロタミンで処理したＴ８４細胞における６時間にわたるＰａｐｐに対する、３ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度での粒子対ゲルの異なる比率の効果の比較。（Ｄ）硫酸プロタミン及びＴＮＦαで処理したＴ８４細胞における６時間にわたるＰａｐｐに対する、３ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度での粒子対ゲルの異なる比率の効果の比較。（Ｅ）硫酸プロタミンで処理したＴ８４細胞における６時間にわたるＴＥＥＲレベルに対する、３ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度での粒子対ゲルの異なる比率の効果の比較。（Ｆ）硫酸プロタミン及びＴＮＦαで処理したＴ８４細胞における６時間にわたるＴＥＥＲレベルに対する、３ｍｇ／ｍｌの異なる３ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度及びＣｙｓｔｉｓｔａｔ（登録商標）での粒子対ゲルの異なる比率の効果の比較。
【図１２】図１：カップリング試薬として使用して架橋された粒子のためのＮＭＲ−Ｈ：（ａ）ＥＤＣ／ＮＨＳ、（ｂ）ＤＭＴＭＭ（４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）-４-メチルモルホリン）
【図１３】１５００ｒｐｍで遠心分離した後の３つの異なる反応条件下で得られた最終生成物のＮＭＲ-Ｈ。紫：対照反応、カップリング試薬は使用せず。赤：カップリング試薬としてＥＤＣを使用。緑：ＤＭＴＭＭをカップリング試薬として使用。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本明細書で言及された全ての刊行物、特許、特許出願及び他の参考文献は、それぞれ個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示され、その内容が完全に引用されているように、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００５１】
定義と一般的な好み
本明細書で使用される場合、そして他に具体的に示されない限り、以下の用語は、当該用語が当該技術分野において享受し得る任意のより広い（又はより狭い）意味に加えて以下の意味を有することを意図する。
【００５２】
文脈によって他に必要とされない限り、本明細書における単数形の使用は複数形を含むと解釈されるべきであり、逆もまた同様である。ある実体に関して使用される「１つの」という用語は、その実体の１つ又は複数を指すと解釈されるべきである。そのように、用語「１つの」（「ａ」又は「ａｎ」）、「１つ又は複数」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書では互換的に使用される。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又はその変形の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、任意の列挙された整数（例えば、特色、要素、特徴、特性、方法／プロセスの工程又は制限）又は整数のグループ（例えば、特色、要素、特徴、特性、方法／プロセスの工程又は制限）を包含するが、任意の他の整数又は整数のグループを排除するものではないことを示すと解釈されるべきである。従って、本明細書で使用されるとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、包括的又は無制限であり、追加の列挙されていない整数又は方法／プロセスの工程を除外しない。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「疾患」は、生理学的機能を損ない、特定の症状と関連する任意の異常な状態を定義するために使用される。この用語は、病因の性質にかかわらず生理学的機能が損なわれている（又は実際に疾患の病因学的根拠が確立されているかどうかにかかわらず）あらゆる障害、病気、異常、病理、病気、状態又は症候群を包含するために広く用いられる。それゆえ、それは感染、外傷、傷害、手術、放射線焼灼、中毒又は栄養欠乏から生じる状態を包含する。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、用語「治療」又は「治療すること」は、疾患の症状を治癒、改善又は軽減するか、又はその原因（例えば、ヒト尿路上皮細胞の炎症の減少）を取り除く（又はその影響を軽減する）介入（例えば、対象への薬剤の投与）を指す。この場合、この用語は「療法」という用語と同義に使用される。
【００５６】
さらに、「治療」又は「治療すること」という用語は、疾患の発症又は進行を防止又は遅延させるか、又は治療された集団内でのその発生率を低下させる（又は根絶する）介入（例えば、対象への薬剤の投与）を指す。この場合、治療という用語は、「予防」という用語と同義で使用される。
【００５７】
本明細書中で使用される場合、薬剤の有効量又は治療有効量は、妥当な利益／リスク比と釣り合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題もしくは合併症なしに対象に投与され得る量を定義するが、所望の効果、例えば、対象の状態の恒久的又は一時的な改善によって明らかにされる治療又は予防を提供するのに十分である。量は、個体の年齢及び一般的状態、投与方法及び他の要因に応じて、対象ごとに変わるであろう。従って、正確な有効量を特定することは不可能であるが、当業者は日常的な実験及び背景の一般的な知識を用いて、任意の個々の場合において、適切な「有効」量を決定することができるであろう。これに関連した治療結果は、症状の根絶又は軽減、痛み又は不快感の軽減、生存期間の延長、運動性の改善及び他の臨床的改善のマーカーを含む。治療結果は完治である必要はない。
【００５８】
上記で定義された治療及び有効量の文脈において、対象（文脈が許す場合には「個体」、「動物」、「患者」又は「哺乳動物」を含むと解釈されるべきである）という用語は、治療が指示されている任意の対象、特に哺乳動物対象を定義する。哺乳動物の対象には、ヒト、飼育動物、家畜、動物園の動物、スポーツ動物、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、ネズミ、ウマ、ウシ、乳牛などのペット動物、類人猿、サル、オランウータン、及びチンパンジーなどの霊長類、イヌやオオカミなどのイヌ科動物、ネコ、ライオン、トラなどのネコ科動物、ウマ、ロバ、シマウマなどのウマ類、乳牛、ブタ、ヒツジなどの食用動物、シカやキリンなどの有蹄類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類が含まれるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【００５９】
本明細書で使用されるとき、用語「ヒアルロナン」又は「ヒアルロン酸」又は「ＨＡ」は、ヒトの細胞外マトリックスの一部を形成し、反復二糖→４）−β−ｄ−ＧｌｃｐＡ−（１→３）-β-ｄ-ＧｌｃｐＮＡｃ-（１→からなる陰イオン性非硫酸化グリコサミノグリカンを指す。ヒアルロナンはヒアルロン酸の共役塩基であるが、２つの用語は同じ意味で使用されている。ヒアルロン酸の塩を使用する場合、塩はカルシウム塩又はカリウム塩などの塩を使用することができるが、一般にナトリウム塩である。ヒアルロン酸又はヒアルロナンは、細菌供給源を含む任意の供給源から得ることができる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉからのヒアルロン酸ナトリウム塩は、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈによって製品参照番号５３７４７-１Ｇ及び５３７４７-１０Ｇとして販売されている。ヒアルロン酸の微生物生産は、Ｌｉｕら（Ｍｉｃｒｏｂ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔ．２０１１年、１０：９９）に記載されている。この用語はまた、ＨＡの誘導体、例えばＵＳ２００９／０２８１０５６及びＵＳ２０１０／０１９７９０４に開示されているような、カチオン基で誘導体化されたＨＡ、及びＭｅｎａａら（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  Ｓ３：００１（２０１１））、Ｓｃｈａｎｔｅら（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ８５（２０１１））、ＥＰ０１３８５７２、ＥＰ０２１６４５３、ＥＰ１０９５０６４、ＥＰ０７０２６９９、ＥＰ０３４１７４５、ＥＰ１３１３７７２及びＥＰ１３３９７５３に開示されている誘導体などの他のタイプの官能化誘導体も含む。
【００６０】
本明細書で使用されるとき、用語「ヒアルロナンヒドロゲルマトリックス」は、水分散媒体中のヒアルロナンポリマーの三次元ネットワークを意味する。一実施形態では、ヒアルロナンポリマーは架橋されて三次元ネットワークを形成する。一実施形態では、マトリックスはホモポリマー、典型的にはＨＡホモポリマーで形成される。いずれの実施形態でも、（ＥＰ２０１１８１６の２ゲルシステムとは対照的に）マトリックスは単一ゲルシステムである。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、ヒアルロン酸に適用されるときの用語「高分子量」は、５００ＫＤａより大きい分子量を意味する。一実施形態では、高分子量は、６００ＫＤａを超える分子量を有する。一実施形態では、高分子量は７００ＫＤａを超える分子量を有する。一実施形態では、高分子量は８００ＫＤａを超える分子量を有する。一実施形態では、高分子量は９００ＫＤａを超える分子量を有する。一実施形態では、高分子量は１０００ＫＤａを超える分子量を有する。一実施形態では、高分子量は１１００ＫＤａを超える分子量を有する。一実施形態では、高分子量ヒアルロナンは、５００〜５０００ＫＤａの分子量を有する。一実施形態では、高分子量ヒアルロナンは、５００〜２０００ＫＤａの分子量を有する。一実施形態では、高分子量ヒアルロナンは、５００〜１５００ＫＤａの分子量を有する。一実施形態では、高分子量ヒアルロナンは、５００〜１０００ＫＤａの分子量を有する。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、ヒアルロン酸に適用される「架橋された」という用語は、ヒアルロン酸ポリマー鎖が架橋剤（部分）と共有結合的に架橋されて三次元ネットワークを形成することを意味する。架橋ＨＡヒドロゲルは、例えば、Ｋｅｎｎｅら（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、第９１巻、第１号（２０１１））、Ｓｅｇｕｒａら（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第２６巻、第４号（２００５））、Ｙｅｏｍら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ、第２１巻（２）２０１０）などの文献、ＵＳ８１２４１２０、及びＵＳ６０１３６７９に記載されている。用語「架橋剤」は、ＨＡと反応することができる２つ以上の官能基を含有する分子を意味する。架橋剤の例には、官能化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧ−アミン及びＰＥＧジグリシジルエーテル（ＥＸ８１０）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボイミド（ＥＤＣ）、ジビニルスルホン（ＤＶＳ）及びエチレングリコールジアクリレート及びジメタクリレート、メチレンビスアクリルアミド（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）の誘導体を含む官能化エチレングリコール架橋剤が含まれる。架橋剤の他の例は、ＷＯ２００９／０１８０７６に記載されている。一実施形態では、ＨＡ、例えばＨＡヒドロゲルは、生体内原位置で架橋されている。ヒドロゲル及び架橋剤は、投与前は別々に保たれ、投与中又は投与後に結合して架橋ＨＡを形成することができる。二重注入システムを用いてヒドロゲルを生体内原位置で架橋することができる。
【００６３】
本明細書では、ヒアルロナン粒子に適用される「ナノサイズ」という用語は、ナノメートル範囲の平均寸法を有することを意味する。例えば、ＨＡ粒子は、１〜１０００ｎｍ、典型的には１００〜９００ｎｍ、典型的には２００〜８００ｎｍ、好ましくは３００〜７００ｎｍ、より好ましくは４００〜６００ｎｍの平均サイズを有し得る。一実施形態では、ＨＡ粒子は５００±１００ｎｍの平均粒径を有する。粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（ナノ範囲）を用いて測定される。
【００６４】
本明細書で使用される場合、担体相中のＨＡ粒子（すなわち、架橋ＨＡヒドロゲル）に適用される「分散及び懸濁」という用語は、ＵＳ２０１０／０２８４３５に記載されているように、ゲルと共架橋するのとは対照的に、粒子がゲル内にカプセル化されることを意味する。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、用語「直接膀胱点滴注入用に製剤化された」は、膀胱点滴注入装置、例えばカテーテルを通して組成物をヒトの膀胱に点滴注入することを可能にするのに十分流動性であることを意味する。膀胱点滴注入組成物は当業者に周知であり、膀胱点滴注入のための本発明の組成物を製剤化することは当業者にとって日常的な事項である。膀胱点滴注入を行う方法は当業者に周知であり、以下の文献：ＵＳ５８８０１０８、ＵＳ５８８８９８６、ＵＳ５９９４３５７、ＵＳ２６６３５６２５に記載されている。一実施形態では、本発明の組成物は、８Ｆ又は１０Ｆカテーテルを用いる膀胱点滴注入用に製剤化される。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「薬学的又は生物学的に活性な薬剤」は、一般に、哺乳動物において薬学的又は生物学的効果を有する薬剤又は成分を指す。例としては、細胞、細胞成分、多糖、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、抗原、抗体（モノクローナル又はポリクローナル）、抗体フラグメント（例えば、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、ナノボディ又はＶＨＶフラグメントなどの単一ドメイン抗体）、抗体（又は抗体フラグメント）とタンパク質又はペプチドなどの結合相手とのコンジュゲート、核酸（遺伝子、遺伝子構築物、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸を含む）、成長因子（すなわち、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ-１、ＩＧＦ-２、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、ＴＧＦ-α、ＴＧＦ-β、ＴＮＦ-α、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ及びインターロイキン）などの細胞産物、薬物、例えば、非ステロイド系抗炎症薬（イブプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセンなど）、アスピリン、アセトアミノフェン、コデイン、ヒドロコドンなどの痛みを和らげる薬物、ステロイド系抗炎症薬、抗鬱剤、抗ヒスタミン薬などの抗炎症薬、又は鎮痛薬が挙げられる。細胞は自己由来、同種異系、異種であり得る。細胞は幹細胞であり得る。幹細胞は、サイドポピュレーション、胚性、胚種性、内皮性、造血性、筋芽細胞性、胎盤性、臍帯血性、脂肪細胞性及び間葉系幹細胞を含む群から選択され得る。細胞は、生物学的産物、例えば成長因子などの治療用生物学的産物を発現するように操作することができる。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、用語「炎症性障害」又は「炎症性疾患」とは、哺乳動物、特にヒトに影響を及ぼし、一般に１つ又は複数のサイトカインの発現調節異常によって特徴付けられる免疫媒介炎症状態を意味する。炎症性障害の例には、皮膚炎症性障害、関節の炎症性障害、椎骨及び／又は椎間板の炎症性障害、心血管系の炎症性障害、ある種の自己免疫疾患、肺及び気道の炎症性障害、腸の炎症性障害が含まれる。皮膚の炎症性障害の例には、皮膚炎、例えばアトピー性皮膚炎及び接触性皮膚炎、尋常性ざ瘡、及び乾癬が含まれる。関節の炎症性障害の例には、慢性関節リウマチが含まれる。椎間板の炎症性障害の例には、椎間板変性が含まれる。心血管系の炎症性障害の例には、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症及び重症下肢虚血がある。自己免疫疾患の例には、１型糖尿病、グレーブス病、ギランバレー病、ループス、乾癬性関節炎、潰瘍性大腸炎及びクローン病が含まれる。肺及び気道の炎症性障害の例には、喘息、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、気腫、及び急性呼吸窮迫症候群が含まれる。腸の炎症性障害の例には、大腸炎及び炎症性腸疾患が含まれる。他の炎症性障害には、癌、花粉症、歯周炎、アレルギー、過敏症、虚血、鬱病、全身性疾患、感染後炎症及び気管支炎が含まれる。本明細書において、用語「代謝障害」には、糖尿病前症、糖尿病、１型糖尿病、２型糖尿病、メタボリック・シンドローム、肥満、糖尿病性脂質異常症、高脂血症、高血圧、高トリグリセリド血症、高脂肪血症、高コレステロール血症、高インスリン血症、及びＭＯＤＹを含むと理解されるべきである。
【００６８】
間質性膀胱炎（ＩＣ）は、膀胱本来のＧＡＧバリア、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）バリア層の破壊を特徴とする慢性疾患であり、尿からの有害成分への透過性を増加させ、これは現在有効な治療に抵抗性がある。本発明の１つの組成物は、ＩＣなどの上皮バリア障害の治療のために損傷を受けたＧＡＧ層を修復するために膀胱内への注入用に製剤化されたヒアルロナン系ヒドロゲル中のヒアルロナン系粒子を含む。本発明の組成物は、ＩＣに対してより効果的な治療を提供し、そして非外科的カテーテル法により送達される装置として、現在市販されている療法と同じ方法で臨床医により使用されることになる。ヒアルロナンヒドロゲルは、ＧＡＧに富む送達システムとして作用し、細胞壁を結合し、ＧＡＧ層の修復を促進するためのバリア効果を形成する。ＨＡ粒子は、尿中溶質と膀胱壁との間の距離を長くする。本発明の組成物の調整された分解プロファイルは、膀胱内でのバイオアベイラビリティを高め、バリア機能及び滞留時間を長くし、それにより管腔内膜の修復／再生及び炎症性サイトカイン産生の抑制を促進し、従ってＩＣの根本的な病理学に対処する、ＩＣのための一次治療として作用することになる。間質性膀胱炎の治療における本発明の組成物の作用機序の概要を図１に提供する。
【００６９】
ＧＡＧ置換点滴注入療法は、失われた本来のＧＡＧ層を置き換えることによって壁を修復することを目的としている。それにもかかわらず、最適なレジメンはまだ定義されておらず、初期治療のために週に数回服用量を変え、維持治療をしながら、病院訪問を繰り返す必要がある。従って、ヒアルロナン粒子を含有するヒアルロナンゲルを含む本発明の治療は、既存の膀胱内ヒアルロナン溶液の点滴注入療法と比較して有意な有効性プロファイルを示すであろう。本発明の治療は、現行の高分子量ＨＡの治療と同様に結合するが、ＨＡ粒子の緩やかな劣化は、内因性ＧＡＧの産生も刺激しながら、膀胱内のＨＡの滞留時間、バリア機能及び生物学的利用能を増加させる。本発明の組成物は、膀胱と尿中溶質との間の分離距離を増大させ、活性化された膀胱壁に対する尿中溶質の影響を減少させ、そしてサイトカイン分泌を減少させる。さらに、正電荷ＨＡは、負に荷電した尿路上皮に対してより強い親和性を有し、従って滞留時間及びバリア機能が増大する。以下の表１に示すような本発明の治療は、ＩＣのための既存の治療的介入に比較して、向上した臨床的有効性プロファイルを示すであろう。
【００７０】
表１：本発明の組成物の競争上の利点 
【００７１】
【表１】
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【実施例】
【００７２】
本発明を特定の実施例を参照して説明する。これらは単なる例示であり説明の目的のためだけであって、主張された独占権又は記載された発明の範囲を決して限定することを意図しない。これらの実施例は、本発明を実施するために現在考えられている最良の形態を構成する。
【００７３】
実施例１：非架橋ＨＡヒドロゲル、架橋ＨＡヒドロゲルのプロトコール
材料仕様：
ヒアルロン酸：高分子量（ＨＭ  Ｗｔ）ヒアルロナンナトリウム１Ｍ  Ｄａ（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ＵＳＡ）。ＣＡＳ番号：９０６７−３２−７。
ＰＥＧ−アミン：Ｍｗ  ２０００  ＤａはＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡ（Ａｌｌｅｎ、ＴＸ）から購入した。ＣＡＳ番号：２５３２２-６８-３、純度＞９５％。
Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）ＣＡＳ番号２５９５２−５３−８、純度約１００％。
Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）：（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＵＳＡ）。ＣＡＳ番号６０６６−８２−６、純度９８％。
リン酸緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）ＣＡＳ番号Ｐ４４１７−５０ＴＡＢ（ｐＨを６．５に調整）
非架橋ゲルの製剤化又は配合手順：
１．蒸留水２００ｍｌに１錠を溶解することにより、リン酸緩衝生理食塩水を用意し、ｐＨを６．５に調整する（別に保存）。
２．≦２５℃でリン酸緩衝生理食塩水中に、ヒアルロン酸ナトリウム塩の必要量をゆっくりと加える（１ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ）。
３．≦２５℃で磁気撹拌機上で溶液を一晩攪拌する。ｐＨが６．５〜７．５の範囲内であるかどうか確認する。
４．さらなる使用のために、低温室条件（４℃）でヒドロゲルを保存する。
架橋ゲルの製剤化又は配合手順：
１．０．１  Ｍ  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中に９ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸ナトリウム塩をゆっくり加える。
２．上記溶液に、ＭＥＳ緩衝液中のＥＤＣ（４．５ｍｇ）及びＮＨＳ（２．７ｍｇ）を（ＨＡ繰り返し単位の各モノマーについて）加え、１５分間撹拌する。混合を続け、架橋のために、ＰＥＧアミンの必要量（ＨＡに対して１：１．３２比）を加え、反応物を≦２５℃で一晩撹拌した。
３．完了後、反応混合物を６０００〜８０００ＭＷの透析膜を用いて蒸留水に対して２４〜４８時間透析して、いかなる未反応の出発物質及び塩も除去した。
透析後、サンプルを凍結乾燥して、純粋な架橋ＨＡヒドロゲルを得た。凍結乾燥粉末をＰＢＳに再分散して同じ濃度のゲルを得る。
【００７４】
実施例２：ＨＡの架橋のためのプロトコル
材料仕様
ヒアルロン酸：高分子量（ＨＭｗｔ）ヒアルロン酸ナトリウム１．２×１０６  Ｄａ（Ｌｉｆｅｃｏｒｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ＵＳＡ）。ＣＡＳ番号：９０６７−３２−７。
ＰＥＧ−アミン：Ｍｗ  ２０００  ＤａはＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡ（Ａｌｌｅｎ、ＴＸ）から購入した。ＣＡＳ番号：２５３２２−６８−３、純度＞９５％
Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（Ｓｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＵＳＡ）ＣＡＳ番号２５９５２−５３−８、純度約１００％
Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）：（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＵＳＡ）。ＣＡＳ番号６０６６−８２−６、純度９８％
溶媒：蒸留水中の２０重量％の硫酸ナトリウム溶液及び０．１Ｍ  ＭＥＳ（２-（Ｎ-モルホリノ）エタンスルホン酸）緩衝液
ＨＡの架橋のための合成プロトコルの評価（ＥＤＣ／ＮＨＳ）
１．１０ｍｇ／ｍＬ濃度。ＨＡを０．１  Ｍ  ＭＥＳ緩衝液に室温で２時間溶解した
ａ．  ＭＥＳ緩衝液はＨＡの迅速な溶解を促進し、均質な溶液を得る
ｂ．  ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ約６）はＨＡのカルボキシル基のイオン化も促進する（ｐＫａ約３〜４）
２．２０重量％のＮａ２ＳＯ４の溶液、中性イオン塩を次に加えて、ＨＡのイオン化をさらに誘導した
３．この溶液に、ＥＤＣ（４６ｍｇ、０．２  Ｍ）溶液、及びＭＥＳ緩衝液中のＮＨＳ（２７ｍｇ、０．２  Ｍ）溶液を添加し、１５分間撹拌した
ａ．  ＭＥＳ緩衝液は、架橋効率及び収率を増加させると、文献に報告されている
４．ＰＥＧ（５ｍｇ、ＨＡに対して１：２比）を、次いで架橋のために加え、反応物を室温で一晩撹拌した
５．完了後、反応混合物を６０００〜８０００ＭＷの透析膜を用いて蒸留水に対して４８時間透析して、いかなる未反応の出発物質及び塩も４８時間除去した。
６．透析後、サンプルを凍結乾燥して、純粋な架橋ＨＡ粒子を得た
７．ゼータ電位とＳＥＭによる特徴づけ
ａ．  大きさの増加及びゼータ電位の減少が観察され、これは遊離カルボキシル基の数及び粒子の長さも減少させるので、架橋効率の増加に起因する。
８．ゼータ電位：−２４．８（平均）、２．１７（標準偏差）、−２１．６（最大）、−２７．３（最小）
ＨＡの架橋のための合成プロトコルの評価（ＤＭＴＭＭ）
１．１０ｍｇ／ｍＬ濃度。ＨＡを０．１  Ｍ  ＭＥＳ緩衝液に室温で２時間溶解した
ａ．ＭＥＳ緩衝液はＨＡの迅速な溶解を促進し、均質な溶液を得る
ｂ．ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ約６）はＨＡのカルボキシル基のイオン化も促進する（ｐＫａ約３〜４）
２．２０重量％のＮａ２ＳＯ４の溶液、中性イオン塩を次に加えて、ＨＡのイオン化をさらに誘導した
３．この溶液に、ＤＭＴＭＭの溶液を加える（７．３ｍｇ、ＨＡの繰り返し単位に対して１当量）
ａ．  ＭＥＳ緩衝液は、架橋効率及び収率を増加させると、文献に報告されている
４．ＰＥＧ（５ｍｇ、ＨＡに対して１：２比）を、次いで架橋のために加え、反応物を室温で一晩撹拌した
５．ＤＭＴＭＭ及びペグ−アミンを０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液に溶解して全容量を１ｍＬとし、最終反応容量を３ｍＬとした
６．反応物を８体積％飽和塩化ナトリウム（５ｍＬ）で濃縮した
７．生成物を９６％エタノール（１０ｍｌ）を用いて沈殿させた
８．反応物を３０分間攪拌して、完全な沈殿を可能にした
９．１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、生成物を収集した
１０．続いて数回の洗浄工程を行い、次いで生成物を濾過し、４８時間真空下に保った
１１．サンプルを、純度についてはＮＭＲによって、架橋の程度についてはＴＮＢＳＡによって、及び形態学的評価についてはＳＥＭによって特徴づけた。
架橋ＨＡ粒子をＨＡゲルと混合して、さらなる試験のためにＨＡ粒子をＨＡゲル又はヒドロゲル中にカプセル化する
【００７５】
実施例３
ヒト尿路上皮細胞ＨＴＢ４を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる基本培地中で増殖させた。全ての場合において、細胞を９０〜１００％コンフルエントになるまで増殖させ、処理前にリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）ですすぐことにより３回洗浄した。単層細胞を硫酸プロタミン（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて３０分間化学的に剥離してＧＡＧ層を除去した。剥離後、細胞をＰＢＳで３回すすぐことにより洗浄し、次いで処置群に割り当てた。処置群は、基礎培地（対照）、ＨＡ粒子（１ｍｇ／ｍｌ）、Ｃｙｓｔｉｓｔａｔ、Ｈｙａｃｙｓｔ及びＩａｌｕｒｉｌからの３つの市販品、ならびに処置対照なし（正常ＧＡＧ層又は硫酸プロタミンによる前処置なし）であった。細胞を１時間処理した後、ＰＢＳですすぎ、血清を含まないＤＭＥＭ培地と交換し、さらに２４時間インキュベートした。２４時間後、上清を集め、Ｂｌｙｓｃａｎ硫酸化グリコサミノグリカンアッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ．ｃｏ．ｕｋ）にかけて、分泌されたｓＧＡＧ産生を測定した。
ＨＡ粒子と他の３つの市販品（Ｃｙｓｔｉｓｔａｔ、Ｈｙａｃｙｓｔ及びＩａｌｕｒｉｌ）との間のｓＧＡＧ発現の比較分析は、正常細胞及び未処理細胞と比較してＨＡ粒子についてのｓＧＡＧ発現における有意な増加（Ｐ＜０．０５）を明らかにした（図２）。
【００７６】
実施例４
ＨＡを水に溶解し、アミノプロピルイミダゾールを天然の負に帯電したＨＡ溶液に添加することによって、正電荷ＨＡを作製し、次いでＥＤＣ／ＮＨＳ又は４-（４，６-ジメトキシ-１，３，５-トリアジン-２-イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）を溶液に加え、その後絶えず撹拌しながら２４〜４８時間溶液をインキュベートした。ポリマーを水に対して透析することによって精製し、凍結乾燥して粉末形態を得た。（図３）
【００７７】
実施例５
ＨＡ粒子の有効性を、ゲル形式のＨＡと比較して、及び粒子含有ＨＡゲルと比較して、ｓＧＡＧを増加させるその能力について試験した。ＨＴＢ４細胞を上記のように培養した。硫酸プロタミン（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて細胞を３０分間化学的に剥離して、ＧＡＧ層を除去した。剥離後、細胞をＰＢＳで３回すすぎ、次いで処置群に割り当てた。処置群は、基礎培地（対照）、３つの異なるＨＡ群；ＨＡ粒子のみ、ＨＡゲルのみ、及びそれぞれ０．５、１及び２ｍｇ／ｍｌの濃度の組み合わせ（ＨＡ粒子及びＨＡゲル）、ならびに処理対照なし（ＧＡＧ層は除去されなかった、又は硫酸プロタミンによる前処理なし）であった。
細胞を１時間処理した後、細胞をＰＢＳですすぎ、血清を含まないＤＭＥＭ培地と交換し、２４時間インキュベートした。２４時間後、上清を集め、Ｂｌｙｓｃａｎ硫酸化グリコサミノグリカンアッセイ（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ．ｃｏ．ｕｋ）にかけて、分泌されたｓＧＡＧ産生を測定した。
図４は、粒子がｓＧＡＧの細胞産生を増加させることを実証する。粒子単独では、無処理の細胞と比較して有意な効果を有する。しかしながら、ＨＡ粒子及びゲルの濃度は全て、ｓＧＡＧレベルの増加に対して劇的かつ一貫した効果を有する。
【００７８】
実施例６
市販の処理と比較したｓＧＡＧレベルを増加させるＨＡ粒子の能力を調べた。処理及び対照ＨＴＢ４細胞をトリプシン処理し、溶解し、そしてＲＮｅａｓｙミニキット（ＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＲＮＡを単離した。大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｍＲＮＡ（１５００ｎｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。  ｃＤＮＡ（７５ｎｇ）をマスターミックス試薬、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ）（Ｒｏｃｈｅ）中の各ＲＴ−ＰＣＲ反応に添加した。リアルタイムサイクラーは、ＳｔｅｐＯｎｅ  ｐｌｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施した。ＨＡＳ２遺伝子発現は、内因性対照であるＢアクチンに対して正規化された比較ＣＴ（ΔΔＣＴ）実験における変化倍数として計算された。分析はＳｔｅｐＯｎｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）ソフトウェアを用いて行った。図５Ａは、ＨＡ粒子が市販の処理と比較してｓＧＡＧレベルを劇的に改善することを示す。
図５Ｂは、ある範囲の濃度が、長鎖ＨＡの産生に重要な酵素であるＨＡＳ２遺伝子の産生を増加させることをｑＰＣＲを用いて実証する。図５の両方のグラフをまとめると、粒子が尿路上皮細胞におけるＨＡ及びｓＧＡＧのバイオアベイラビリティを増大させていることが実証される。
【００７９】
実施例７
２８０〜３００ｇの体重の３匹のメスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを安楽死させ、膀胱を摘出した。次いで、膀胱組織を水平に半分に切断し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回すすぎ、引き伸ばし、そして固体アガロース上に基底部側を下にして４つの角に固定し、そして尿路上皮を培地にさらした。次いで外植片を硫酸プロタミン１０ｍｇ／ｍｌに１時間さらし、次いでＰＢＳで洗浄し、次いで細胞培地又はＨＡ粒子で覆い、さらに３日間培養した。
３日後、収穫した膀胱を４％のパラホルムアルデヒドで一晩固定した。次いで組織をパラフィン包埋し、切片化し（５μｍ）そしてヘマトキシリン及びエオシンで染色した。組織外植片を取り出し、アガロース側底側を下にして安定化させ、尿路上皮を培地にさらした。
図６では、硫酸プロタミンにさらされていない組織（正常）、ＨＡ粒子にさらされた組織（ＨＡ粒子）、及び硫酸プロタミンに１時間さらされた組織（硫酸プロタミン）を示す。これは、硫酸プロタミンが尿路上皮組織をどのように分解したかを示す（青い矢印）。ＨＡ粒子で処理された組織は、正常組織及び硫酸プロタミン組織の両方と比較して、より厚い尿路上皮でより大きな組織完全性を保持していた（青い矢印）。
【００８０】
実施例８
ＨＡの粘度の役割を解明するために、粘度の変化が尿路上皮細胞に対する生物学的効果の変化と相関するかどうかを調べた。正常条件下で、ｓＧＡＧならびに尿路上皮細胞上のＩＬ-６及びＩＬ-８発現に対する１ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ及び１５ｍｇ／ｍｌのＨＡゲルの効果を調べた。ｓＧＡＧ分泌に対するＨＡゲルの粘度の影響を調べた（図７Ａ）。ＨＡゲルの粘度が増加してもｓＧＡＧ分泌が増加しないことを観察した。ＩＬ−８分泌に対するＨＡゲルの粘度の影響を調べた（図７Ｂ）。ＨＡゲルの粘度を増加させると、ＩＬ−８分泌が増加することを観察した。ＩＬ−６分泌に対するＨＡゲルの粘度の影響を調べた（図７Ｃ）。ＨＡゲルの粘度を増加させると、ＩＬ−６分泌が増加することを観察した。
【００８１】
実施例９
ヒアルロナン溶液のレオロジー測定は、直径６０  ｍｍの平行プレート形状を使用してＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｒｈｅｏｍｅｔｅｒで行い、この選択した形状は感度とサンプル容量のバランスをとるように選択した。ヒアルロナン溶液（１、３、９、１５ｍｇ／ｍｌ）をボルテックスした後、各サンプルを底部プレートに直接載せ、次いで上部プレートを５００μｍの測定ギャップまで下げた。測定パラメータは、振幅掃引及び周波数掃引によって予備実験において線形粘弾性領域内にあると決定された（図８）。貯蔵弾性率（Ｇ’）、損失弾性率（Ｇ’’）がプラトーに達するまで測定を続けた。弾性率（Ｇ’、Ｇ’’）及び複素粘度（η＊、Ｐａ．ｓ）は、振幅掃引（１ｈｚの周波数で０．１〜１０％のひずみ）及び時間掃引（１Ｐａストレスで、５分間の０．１Ｈｚ周波数）を用いて動的振動モードで３７℃で得た。
【００８２】
実施例１０
ＭＣＰ−１、ＩＬ−６及びＩＬ−８上のヒアルロナンゲル中のヒアルロナン粒子濃度の評価（図９）。ヒト尿路上皮細胞ＨＴＢ２を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる基本培地中でプラスチック上で増殖させた。細胞を８０〜９０％コンフルエントになるまで増殖させ、すべての実験の前にハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）ですすいで３回洗浄した。ＨＴＢ−２細胞をＨＢＳＳ及びトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて洗浄し、０．２５％を１０分間添加し、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次に細胞を分割し、１ウェルあたり５０，０００細胞で４８ウェルプレートに播種した。細胞を基礎培地中で２４時間増殖させた。実験は異なる条件で行われた。Ｈ２Ｏ２処理細胞：４８ウェルプレート中の細胞単層を化学的に剥離し、ヒアルロナン介入の適用前に１時間過酸化水素（基礎培地中１％のＨ２Ｏ２）を用いて炎症を起こさせた。４８ウェルプレート中の硫酸プロタミン（ＰＳ）処理細胞単層を、ＨＡ介入の前に硫酸プロタミン（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて１時間化学的に剥離した。４８ウェルプレート中のＴＮＦα処理細胞単層を、ＨＡ介入の前に１時間ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）を用いて炎症を起こさせた。基本条件：４８ウェルプレート培地中の細胞単層を基本培地と交換した。ＨＡ介入：細胞をＨＢＳＳで洗浄した。Ｃｙｓｔｉｓｔａｔ（登録商標）（０．８ｍｇ／ｍｌ）又は対照（基礎培地）又はＨＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ）をウェルに２時間添加し、次いでＨＢＳＳで洗浄し、そして基礎培地と２４時間交換した。細胞上清を除去し、−２０℃で保存した。
【００８３】
実施例１１
炎症性サイトカインに対する３ｍｇ／ｍｌのヒアルロナンの効果（図１０）（Ａ）２４時間にわたるＨＴＢ-２細胞から分泌されたＩＬ-６レベルに対する、３ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度での粒子対ゲルの異なる比率の比較。（Ｂ）２４時間にわたるＨＴＢ-２細胞から分泌されたＩＬ-８レベルに対する、３ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度での粒子対ゲルの異なる比率の比率の比較。（Ｃ）２４時間にわたるＨＴＢ-２細胞から分泌されたＭＣＰ-１レベルに対する、１ｍｇ／ｍｌのＨＡ濃度での粒子対ゲルの異なる比率の比較。
【００８４】
実施例１２
透過性試験：Ｔ８４単層を横切る経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）及びＦＩＴＣ-デキストラン（４ｋＤａ）フラックスを６時間にわたって測定し、ＦＩＴＣ-デキストラン（４ｋＤａ）の明らかな透過係数（Ｐａｐｐ）を計算した。これらの研究は、バリア効果をもたらし、膀胱壁の透過性を減少させるためのＨＡゲル中のＨＡ粒子の有効性を検証している（図１１）。
【００８５】
実施例１３
Ｎ-３-ジメチルアミノプロピル）-Ｎ’-エチルカルボジイミド；ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＥＤＣ／ＮＨＳ）は溶液のｐＨの変化に感受性はないので、その代わりに（４-（４，６-ジメトキシ-１，３，５-トリアジン-２-イル）-４-メチルモルホリン）（ＤＭＴＭＭ）を使用することによって架橋度を高めることができることが見出された（図１２）。ＤＭＴＭＭ（ｂ）を用いた場合の３．１５ｐｐｍにおけるより広いシグナルは、より高度の架橋を示唆する。
図１３に示すように、次のことが確認された。
・  ＤＭＴＭＭは、ＥＤＣ／ＮＨＳよりもポリマーを架橋するのにより効率的な試薬であった。
・  無架橋試薬を用いない対照反応は、精製後にＮＭＲスペクトルにおいてヒアルロン酸ナトリウムについてのピークのみを明らかにしたので、精製方法もより効率的であった。
【００８６】
等価物
前述の説明は、本発明の現在好ましい実施形態を詳述している。これらの説明を考慮すると、当業者にはその実施における多数の修正及び変形が想起されると予想される。それらの修正及び変形は、添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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