(57)【要約】  本明細書において、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体が提供される。提供されたＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントをコード可能な関連するポリヌクレオチド、提供された抗体又は抗原結合フラグメントを発現する細胞、並びに関連するベクター及び検出可能に標識された抗体又は抗原結合フラグメントも記載される。加えて、提供された抗体を使用する方法が記載される。例えば、提供された抗体を使用して、がんに対する対象の免疫応答を高めることができる。
2019512230.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｃ．配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｅ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｆ．配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｇ．配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｈ．配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｉ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｊ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｋ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｌ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｍ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｎ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｏ．配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、又は
ｐ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３
を含む、前記単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号３９〜５４、６３、及び６４からなる群から選択される重鎖領域を含む、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号５５〜５８からなる群から選択される軽鎖領域を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号３９〜５４、６３、及び６４からなる群から選択される重鎖領域と、配列番号５５〜５８からなる群から選択される軽鎖領域とを含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
ａ．前記重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号３９を含み、
ｂ．前記重鎖領域が、配列番号５６を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４０を含み、
ｃ．前記重鎖領域が、配列番号５７を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４１を含み、
ｄ．前記重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４２を含み、
ｅ．前記重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４３を含み、
ｆ．前記重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４４を含み、
ｇ．前記重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４５を含み、
ｈ．前記重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４６を含み、
ｉ．前記重鎖領域が、配列番号５８を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４７を含み、
ｊ．前記重鎖領域が、配列番号５８を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４８を含み、
ｋ．前記重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４９を含み、
ｌ．前記重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号５０を含み、
ｍ．前記重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号５１を含み、
ｎ．前記重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号５２を含み、
ｏ．前記重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号５３を含み、
ｐ．前記重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号５４を含み、
ｑ．前記重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号６３を含み、又は
ｒ．前記重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号６４を含む、
請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、ＧＩＴＲ（配列番号６２、
アミノ酸残基：
ｃ．４０〜４５、及び
ｄ．７５〜７９と相互作用することによってヒトＧＩＴＲに特異的に結合する、
請求項５に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５９のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する、請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、実施例９に記載される実験計画を使用して表面プラズモン共鳴により測定された場合、少なくとも３０ｎＭの結合親和性で、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導する、請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体又は抗原結合フラグメントは、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導する、請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト抗体又は抗原結合フラグメントである、請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ２フラグメント、又は一本鎖抗体である、請求項１に記載の抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記抗体又は抗原結合フラグメントは、組み換え体である、請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプのものである、請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲに特異的に結合する、請求項１のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
請求項１のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２０】
抗体又は抗原結合フラグメントを生成するためのプロセスであって、
前記抗体又は抗原結合フラグメントの発現を可能にする条件下で、請求項１９に定義される前記宿主細胞を培養することと、前記抗体又は抗原結合分子を前記培養物から回収することとを含む、プロセス。
【請求項２１】
がん又は他の腫瘍状態の症状を緩和する方法であって、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを、それを必要とする対象に、前記対象の前記がん又は他の腫瘍状態の前記症状を緩和するのに充分な量で投与することを含む、前記方法。
【請求項２２】
前記対象がヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ａ．化学療法を施すこと、
ｂ．放射線療法を施すこと、又は
ｃ．１つ又は２つ以上の追加の治療剤を投与すること、
のうちの１つ又は２つ以上を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記追加の治療剤が、免疫刺激剤である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫刺激剤が、ＰＤ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＣＤ１２２抗体、ＣＤ４０抗体、ＯＸ４０抗体、及びＣＤ８  Ａｇ特異的ＯＶＡペプチドワクチンからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、医薬的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント及びそのパッケージを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１６年３月８日に出願された米国仮出願番号第６２／３０５，２７０号、及び２０１６年１０月１２日に出願された米国仮出願番号第６２／４０７，１０６号の利益を主張するものである。前述の出願の全内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（配列表）
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出済みの配列表を含み、その配列表の全体を参照により本明細書に援用するものである。当該ＡＳＣＩＩのコピーは、２０１７年２月２１日に作成され、ファイル名はＪＢＩ５０８２ＵＳＮＰ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、そのサイズは９２，２３１バイトである。
【０００３】
（発明の分野）
本明細書に提供される開示は、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）に特異的に結合するモノクローナル抗体と、記載される抗体を生成及び使用する方法とに関する。
【背景技術】
【０００４】
ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーである、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ；同様にＡＩＴＲ、ＴＮＦＲＳＦ１８、又はＣＤ３５７）は、先天免疫及び適応免疫系内の多くの成分中で発現し、獲得免疫及び先天免疫の両方を刺激する（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）ＰＮＡＳ  ９４：６２１６〜６２２１、Ｈａｎａｂｕｃｈｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｂｌｏｏｄ  １０７：３６１７〜３６２３、Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ  Ｇ  ＆  Ｒｉｃｃａｒｄｉ  Ｃ（２００５）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：１０１６〜１０２２、Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７：１１６５〜１１６９）。当該タンパク質は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状（dendritic、ＤＣ）細胞、及びナチュラルキラー（Natural Killer、ＮＫ）細胞を含むいくつかの細胞及び組織において発現し、主に抗原提示細胞（Antigen Presenting Cell、ＡＰＣ）上に発現する当該タンパク質のリガンドであるＧＩＴＲ−Ｌによって、内皮細胞上及び同様に腫瘍細胞内で活性化される。
【０００５】
ＧＩＴＲ−ＧＩＴＲＬ系は、自己免疫応答／炎症応答の発生に関与し、感染及び腫瘍に対する応答を増強する。例えば、ＧＩＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質で動物を処置すると自己免疫疾患／炎症疾患が改善するが、ＧＩＴＲ誘因は、ウイルス感染、細菌感染、及び寄生中感染を処置する際、並びに腫瘍に対する免疫応答を促進させる際に有効である（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １６５：２０８９〜９９）。これらの効果は、エフェクターＴ細胞の共活性化、制御性ＴＮＫ細胞及び樹状細胞の機能の調節、マクロファージの活性化、並びに溢出過程の制御を含むいくつかの同時的な機構によるものである。ＧＩＴＲの膜発現は、Ｔ細胞活性化後に増加する（Ｈａｎａｂｕｃｈｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，（２００６）上記、Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ  Ｇ  ＆  Ｒｉｃｃａｒｄｉ  Ｃ上記）。膜発現の誘因は、エフェクターＴリンパ球を共活性化する（ＭｃＨｕｇｈ  ＲＳ  ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：３１１〜３２３、Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：１３５〜１４２、Ｒｏｎｃｈｅｔｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３４：６１３〜６２２、Ｔｏｎｅ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，（２００３）ＰＮＡＳ  １００：１５０５９〜１５０６４）。ＧＩＴＲ活性化は、腫瘍及びウイルス感染に対する抵抗性を増加させ、自己免疫過程／炎症過程に関与し、白血球溢出を制御する（Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ  Ｇ  ＆  Ｒｉｃｃａｒｄｉ  Ｃ（２００５）上記、Ｃｕｚｚｏｃｒｅａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ７６：９３３〜９４０、Ｓｈｅｖａｃｈ  ＥＭ  ＆  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ＧＬ（２００６）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：６１３〜６１８、Ｃｕｚｚｏｃｒｅａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，（２００６）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７７：６３１〜６４１、Ｃｕｚｚｏｃｒｅａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，（２００７）ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２１：１１７〜１２９）。
【０００６】
ヒトＧＩＴＲは、極めて低レベルの抹消（非活性化）Ｔ細胞内で発現する。Ｔ細胞活性化後、ＧＩＴＲは、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞の両方で数日間にわたって強く発現上昇し（Ｋｗｏｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ，（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：６０５６〜６０６１、Ｇｕｒｎｅｙ  ＡＬ  ｅｔ  ａｌ，（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ９：２１５〜２１８、Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）上記、Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，（２００２）上記、Ｊｉ  ＨＢ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）上記、Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｂｌｏｏｄ  １００：３５０〜３５２、Ｌｉ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ，（２００３）Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  ２１：８３〜９２）、ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ８＋細胞よりも高いＧＩＴＲ発現を有する（Ｋｏｂｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，（２００８）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３８（１０）：２６７８〜８８、Ｂｉａｎｃｈｉｎｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ，（２０１１）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４１（８）：２２６９〜７８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
免疫応答を調節する際にヒトＧＩＴＲが果たす役割は、ヒトＧＩＴＲががんなどの疾患に対する抗体に基づいた療法のための好適な標的であり得ることを示すことである。ＧＩＴＲに対する抗体が（例えば、国際公開第２００６１０５０２号、国際公開第２０１１０２８６８３号、国際公開第２０１５０３１６６７号、国際公開第２０１５０３５３６３７号、国際公開第２０１５１８７８３５号、国際公開第２０１５１８４０９９号、米国特許第９２５５１５１号、及び米国特許第９２５５１５２号の中に）記載されているが、がんなどの疾患に対するＧＩＴＲ活性を調節するための新規な薬剤及び方法が継続的に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書において、ＧＩＴＲに特異的に結合する、抗体及びその抗原結合フラグメントが提供される。また、提供されたＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントをコード可能な関連するポリヌクレオチド、提供された抗体及び抗原結合フラグメントを発現している細胞及び関連するベクター、並びに検出可能に標識された抗体及び抗原結合フラグメントもまた記載されている。加えて、提供された抗体及び抗原結合フラグメントを使用する方法が記載されている。例えば、ＧＩＴＲが免疫応答を調節する際に果たす役割を考慮すると、ＧＩＴＲ特異的抗体は、免疫応答を改変することが望ましい各種のＧＩＴＲ関連疾患又は障害の処置における有用性を有する。例えば、ＧＩＴＲ特異的抗体を各種のがんの治療など、各種の免疫療法の用途で使用することができる。
【０００９】
ＧＩＴＲ特異的抗体
本明細書において、ＧＩＴＲに特異的な単離された抗体及び抗原結合フラグメントが記載されている。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、ヒトＧＩＴＲに結合する。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲに結合する。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号５９で定義されるように、ＧＩＴＲ細胞外ドメイン（extracellular domain、ＥＣＤ）からの１つ又は２つ以上の残基を含むエピトープに結合する。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の結合親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。
【００１０】
表１に、本明細書に記載された一部のＧＩＴＲ特異的抗体の例の概要を提供する。
【００１１】
【表１】
2019512230.tif 000003
【００１２】
一部の実施形態では、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖と、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖とを含む、ＧＩＴＲ特異的抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。
【００１３】
ＩｇＧクラスは、ヒトにおいて、４つのアイソタイプ：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に分割される。これらのアイソタイプは、Ｆｃ領域のアミノ酸配列において９５％超の相同性を共有するが、ヒンジ領域のアミノ酸組成及び構造において主な差異を示す。Ｆｃ領域は、エフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を媒介する。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰにおいて、抗体のＦｃ領域は、免疫エフェクター細胞、例えば、ナチュラルキラー及びマクロファージの表面上のＦｃ受容体（Fc receptors、ＦｃｇＲ）に結合し、標的細胞の溶解又は貪食をもたらす。ＣＤＣにおいて、抗体は、標的細胞を、細胞表面における補体カスケードをトリガーすることにより殺傷する。本明細書に記載された抗体は、ＩｇＧアイソタイプのいずれかとの組み合わせで、可変ドメインの記載された特徴を有する抗体を含む。同ＩｇＧアイソタイプは、Ｆｃ配列が異なるエフェクター機能をもたらすために改変されている改変版を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、抗体は、上記表１で表わされた抗体のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、記載された抗体は、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance、ＳＰＲ）により測定された場合、３０ｎＭ以下の解離定数で、ＧＩＴＲに結合可能である。一部の実施形態では、記載された抗体は、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導可能である。一部の実施形態では、記載された抗体は、６７ｎｇ／ｍＬ以下のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導可能である。
【００１５】
記載されたＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントに加えて、記載された抗体及び抗原結合フラグメントをコード可能なポリヌクレオチド配列もまた提供される。記載されたポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供される。同様に、本明細書で提供されたＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントを発現している細胞が提供される。また、開示されたベクターを発現可能な細胞も記載される。これらの細胞は、哺乳類細胞（例えば、２９３Ｆ細胞、ＣＨＯ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ７細胞）、酵母細胞、植物細胞、又は細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）でもよい。記載された抗体又は抗原結合フラグメントを生成するためのプロセスもまた提供される。
【００１６】
ＧＩＴＲ特異的抗体を使用する方法
記載されたＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントを使用する方法もまた開示されている。本節に検討されている方法で使用する特定の抗体には、表１に抗体に対して記載された一連のＣＤＲを有するものが含まれる。例えば、免疫応答においてＧＩＴＲが果たす重要な役割は、所望の腫瘍抗原又は病原性抗原（例えば、ウイルス及び他の病原性生物）に対する免疫応答を誘導すること又は向上させることを含む免疫療法のための魅力的な標的となることである。このように、ＧＩＴＲ特異的抗体は、各種のがん及び感染疾患の治療における有用性を有する。
【００１７】
上記のように、ＧＩＴＲ活性化は、共活性化信号をＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞に送り、制御性Ｔ細胞による免疫応答の抑制を防止する。これにより、一実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体を投与して、制御性Ｔ細胞によるエフェクターＴ細胞活性の抑制を阻害する。このような阻害は、例えば、Ｔ細胞増殖、既知の活性化マーカーの発現、又はサイトカイン分泌をモニタすることを含む、当該技術分野において既知の各種の方法によってアッセイされ得る。別の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体を対象に投与して、制御性Ｔ細胞のレベル、例えば、腫瘍の制御性Ｔ細胞のレベルを減少させる。更に別の実施形態では、エフェクターＴ細胞の活性は、本明細書で提供されたＧＩＴＲ特異的抗体を投与することによって誘導されるか又は向上する。これらの方法の各々についての特定のアッセイが実施例において提供される。
【００１８】
ＧＩＴＲ特異的抗体キット
開示されたＧＩＴＲ特異的抗体又はその抗原結合フラグメントを含むキットが本明細書において記載されている。記載されたキットを使用して、本明細書で提供されたＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントを使用する方法、又は当業者に既知の他の方法を行うことができる。一部の実施形態では、記載されたキットは、本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントと、生体サンプル中のＧＩＴＲの存在を検出する際に使用するための試薬と、を含んでもよい。したがって、記載されたキットは、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合フラグメントのうち１つ又は２つ以上と、使用していないときに抗体又はフラグメントを収容するための容器と、抗体又はフラグメントを使用するための指示書と、本明細書に記載されたとおり、固体支持体に固定された抗体若しくはフラグメント及び／又は検出可能に標識された形態の抗体若しくはフラグメントを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】従来のスクリーンパネルから抗ヒトＧＩＴＲのｍＡｂによって呈されるアゴニスト活性。示されたデータは、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子のみ（Ｌｕｃ）、又はＧＩＴＲ発現ベクター及びＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方（ＧＩＴＲ−Ｌｕｃ）のいずれかでトランスフェクトされた後に、示された試薬で処理された細胞からのＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ信号である。ＰＢＳ処理で見出される信号よりも大きな信号を生成する抗体をアゴニストとして予備的に分類した。
【図１Ｂ】従来のスクリーンパネルから抗ヒトＧＩＴＲのｍＡｂによって呈されるアゴニスト活性。示されたデータは、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子のみ（Ｌｕｃ）、又はＧＩＴＲ発現ベクター及びＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方（ＧＩＴＲ−Ｌｕｃ）のいずれかでトランスフェクトされた後に、示された試薬で処理された細胞からのＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ信号である。ＰＢＳ処理で見出される信号よりも大きな信号を生成する抗体をアゴニストとして予備的に分類した。
【図１Ｃ】従来のスクリーンパネルから抗ヒトＧＩＴＲのｍＡｂによって呈されるアゴニスト活性。示されたデータは、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子のみ（Ｌｕｃ）、又はＧＩＴＲ発現ベクター及びＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方（ＧＩＴＲ−Ｌｕｃ）のいずれかでトランスフェクトされた後に、示された試薬で処理された細胞からのＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ信号である。ＰＢＳ処理で見出される信号よりも大きな信号を生成する抗体をアゴニストとして予備的に分類した。
【図２Ａ】次世代型配列決定パネルから抗ＧＩＴＲのｍＡｂによって呈されるアゴニスト活性。示されるデータは、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子のみ、又はＧＩＴＲ発現ベクター及びＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方のいずれかでトランスフェクトされた後に、示された試薬で処理された細胞からのＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ信号である。
【図２Ｂ】次世代型配列決定パネルから抗ＧＩＴＲのｍＡｂによって呈されるアゴニスト活性。示されるデータは、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子のみ、又はＧＩＴＲ発現ベクター及びＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方のいずれかでトランスフェクトされた後に、示された試薬で処理された細胞からのＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ信号である。
【図２Ｃ】次世代型配列決定パネルから抗ＧＩＴＲのｍＡｂによって呈されるアゴニスト活性。示されるデータは、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子のみ、又はＧＩＴＲ発現ベクター及びＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方のいずれかでトランスフェクトされた後に、示された試薬で処理された細胞からのＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ信号である。
【図２Ｄ】次世代型配列決定パネルから抗ＧＩＴＲのｍＡｂによって呈されるアゴニスト活性。示されるデータは、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子のみ、又はＧＩＴＲ発現ベクター及びＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方のいずれかでトランスフェクトされた後に、示された試薬で処理された細胞からのＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ信号である。
【図２Ｅ】次世代型配列決定パネルから抗ＧＩＴＲのｍＡｂによって呈されるアゴニスト活性。示されるデータは、ＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子のみ、又はＧＩＴＲ発現ベクター及びＮＦ−κＢルシフェラーゼレポーター遺伝子の両方のいずれかでトランスフェクトされた後に、示された試薬で処理された細胞からのＣｅｌｌ−Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ信号である。
【図３Ａ】ＮＦ−κＢ活性に対する抗ＧＩＴＲ抗体ライゲーションの効果。示された結果は、ＧＩＴＲで安定してトランスフェクトされたＨＥＫ青色ＮＦ−κＢ細胞中のＮＦ−κＢ活性化の尺度としてのＳＥＡＰ活性を表す。２５ｎｇ／ｍＬの可溶性ＧＩＴＲリガンドの非存在下（３Ａ、３Ｂ）又は存在下（３Ｃ、３Ｄ）で、様々な濃度の抗ＧＩＴＲ抗体で細胞を処理した。培地及びＣＮＴＯ３９３０は、無抗体及びアイソタイプ抗体対照として使用した。
【図３Ｂ】ＮＦ−κＢ活性に対する抗ＧＩＴＲ抗体ライゲーションの効果。示された結果は、ＧＩＴＲで安定してトランスフェクトされたＨＥＫ青色ＮＦ−κＢ細胞中のＮＦ−κＢ活性化の尺度としてのＳＥＡＰ活性を表す。２５ｎｇ／ｍＬの可溶性ＧＩＴＲリガンドの非存在下（３Ａ、３Ｂ）又は存在下（３Ｃ、３Ｄ）で、様々な濃度の抗ＧＩＴＲ抗体で細胞を処理した。培地及びＣＮＴＯ３９３０は、無抗体及びアイソタイプ抗体対照として使用した。
【図３Ｃ】ＮＦ−κＢ活性に対する抗ＧＩＴＲ抗体ライゲーションの効果。示された結果は、ＧＩＴＲで安定してトランスフェクトされたＨＥＫ青色ＮＦ−κＢ細胞中のＮＦ−κＢ活性化の尺度としてのＳＥＡＰ活性を表す。２５ｎｇ／ｍＬの可溶性ＧＩＴＲリガンドの非存在下（３Ａ、３Ｂ）又は存在下（３Ｃ、３Ｄ）で、様々な濃度の抗ＧＩＴＲ抗体で細胞を処理した。培地及びＣＮＴＯ３９３０は、無抗体及びアイソタイプ抗体対照として使用した。
【図３Ｄ】ＮＦ−κＢ活性に対する抗ＧＩＴＲ抗体ライゲーションの効果。示された結果は、ＧＩＴＲで安定してトランスフェクトされたＨＥＫ青色ＮＦ−κＢ細胞中のＮＦ−κＢ活性化の尺度としてのＳＥＡＰ活性を表す。２５ｎｇ／ｍＬの可溶性ＧＩＴＲリガンドの非存在下（３Ａ、３Ｂ）又は存在下（３Ｃ、３Ｄ）で、様々な濃度の抗ＧＩＴＲ抗体で細胞を処理した。培地及びＣＮＴＯ３９３０は、無抗体及びアイソタイプ抗体対照として使用した。
【図４Ａ】ＣＭＶ及びＴＴに対するメモリーＴ細胞応答への抗ＧＩＴＲ抗体の効果。抗ＧＩＴＲ抗体の非存在下若しくは存在下で、ＣＮＴＯ３９３０アイソタイプ対照抗体の非存在下若しくは存在下で、又は抗体なしで、血清反応性ＰＢＭＣをＣＭＶ及びＴＴ抗原でパルスした。上清を回収し、ＩＦＮγの存在について測定した。
【図４Ｂ】ＣＭＶ及びＴＴに対するメモリーＴ細胞応答への抗ＧＩＴＲ抗体の効果。抗ＧＩＴＲ抗体の非存在下若しくは存在下で、ＣＮＴＯ３９３０アイソタイプ対照抗体の非存在下若しくは存在下で、又は抗体なしで、血清反応性ＰＢＭＣをＣＭＶ及びＴＴ抗原でパルスした。上清を回収し、ＩＦＮγの存在について測定した。
【図５Ａ】同系ＭＣ３８結腸癌腫モデルにおけるサロゲート抗ＧＩＴＲ（ＤＴＡ−１）の単剤抗腫瘍活性。腫瘍体積が１００ｍｍ３に達した時点で開始する黒矢じり（群当たりｎ＝１０）によって示される日に、ＤＴＡ−１又はアイソタイプラットＩｇＧ２ｂを２００ｕｇ／マウスで動物に投与した。ＤＴＡ−１処理は、５／１０の動物で完全な腫瘍退縮をもたらした。
【図５Ｂ】同系ＭＣ３８結腸癌腫モデルにおけるサロゲート抗ＧＩＴＲ（ＤＴＡ−１）の単剤抗腫瘍活性。腫瘍体積が１００ｍｍ３に達した時点で開始する黒矢じり（群当たりｎ＝１０）によって示される日に、ＤＴＡ−１又はアイソタイプラットＩｇＧ２ｂを２００ｕｇ／マウスで動物に投与した。ＤＴＡ−１処理は、５／１０の動物で完全な腫瘍退縮をもたらした。
【図６Ａ】サロゲート抗ＧＩＴＲ抗体（ＤＴＡ−１）と抗ＰＤ−１抗体（ＲＭＰ１〜１４）との組み合わせは、同系ＭＣ３８結腸癌腫モデルにおける相乗的抗腫瘍活性をもたらす。腫瘍体積が２００ｍｍ３に達した時点で開始する黒矢じり（群当たりｎ＝１０）によって示される日に、アイソタイプラットＩｇＧ２ｂ（６Ａ）、ＤＴＡ−１（６Ｂ）、又はＤＴＡ−１＋ＲＭＰ１〜１４（６Ｃ）を１００ｕｇ／抗体／マウスで動物に投与した。併用治療は、５／１０の動物で腫瘍退縮をもたらした。
【図６Ｂ】サロゲート抗ＧＩＴＲ抗体（ＤＴＡ−１）と抗ＰＤ−１抗体（ＲＭＰ１〜１４）との組み合わせは、同系ＭＣ３８結腸癌腫モデルにおける相乗的抗腫瘍活性をもたらす。腫瘍体積が２００ｍｍ３に達した時点で開始する黒矢じり（群当たりｎ＝１０）によって示される日に、アイソタイプラットＩｇＧ２ｂ（６Ａ）、ＤＴＡ−１（６Ｂ）、又はＤＴＡ−１＋ＲＭＰ１〜１４（６Ｃ）を１００ｕｇ／抗体／マウスで動物に投与した。併用治療は、５／１０の動物で腫瘍退縮をもたらした。
【図６Ｃ】サロゲート抗ＧＩＴＲ抗体（ＤＴＡ−１）と抗ＰＤ−１抗体（ＲＭＰ１〜１４）との組み合わせは、同系ＭＣ３８結腸癌腫モデルにおける相乗的抗腫瘍活性をもたらす。腫瘍体積が２００ｍｍ３に達した時点で開始する黒矢じり（群当たりｎ＝１０）によって示される日に、アイソタイプラットＩｇＧ２ｂ（６Ａ）、ＤＴＡ−１（６Ｂ）、又はＤＴＡ−１＋ＲＭＰ１〜１４（６Ｃ）を１００ｕｇ／抗体／マウスで動物に投与した。併用治療は、５／１０の動物で腫瘍退縮をもたらした。
【図７Ａ】サロゲート抗ＧＩＴＲ抗体（ＤＴＡ−１）と抗ＣＴＬＡ−４抗体（９Ｄ９）との組み合わせは、同系ＭＣ３８結腸癌腫モデルにおける相乗的抗腫瘍活性をもたらす。腫瘍体積が２００ｍｍ３に達した時点で開始する黒矢じり（群当たりｎ＝１０）によって示される日に、アイソタイプラットＩｇＧ２ｂ（７Ａ）、ＤＴＡ−１（７Ｂ）、又はＤＴＡ−１＋９Ｄ９（７Ｃ）を１００ｕｇ／抗体／マウスで動物に投与した。併用治療は、３／１０の動物で腫瘍退縮をもたらした。
【図７Ｂ】サロゲート抗ＧＩＴＲ抗体（ＤＴＡ−１）と抗ＣＴＬＡ−４抗体（９Ｄ９）との組み合わせは、同系ＭＣ３８結腸癌腫モデルにおける相乗的抗腫瘍活性をもたらす。腫瘍体積が２００ｍｍ３に達した時点で開始する黒矢じり（群当たりｎ＝１０）によって示される日に、アイソタイプラットＩｇＧ２ｂ（７Ａ）、ＤＴＡ−１（７Ｂ）、又はＤＴＡ−１＋９Ｄ９（７Ｃ）を１００ｕｇ／抗体／マウスで動物に投与した。併用治療は、３／１０の動物で腫瘍退縮をもたらした。
【図７Ｃ】サロゲート抗ＧＩＴＲ抗体（ＤＴＡ−１）と抗ＣＴＬＡ−４抗体（９Ｄ９）との組み合わせは、同系ＭＣ３８結腸癌腫モデルにおける相乗的抗腫瘍活性をもたらす。腫瘍体積が２００ｍｍ３に達した時点で開始する黒矢じり（群当たりｎ＝１０）によって示される日に、アイソタイプラットＩｇＧ２ｂ（７Ａ）、ＤＴＡ−１（７Ｂ）、又はＤＴＡ−１＋９Ｄ９（７Ｃ）を１００ｕｇ／抗体／マウスで動物に投与した。併用治療は、３／１０の動物で腫瘍退縮をもたらした。
【図８Ａ】サロゲート抗ＧＩＴＲ抗体（ＤＴＡ−１）と抗ＯＸ−４０抗体（ＯＸ−８６）との組み合わせは、同系ＭＣ３８結腸癌腫モデルにおけるＯＸ−８６単独よりも良好である。腫瘍体積が２００ｍｍ３に達した時点で開始する黒矢じり（群当たりｎ＝１０）によって示される日に、アイソタイプラットＩｇＧ２ｂ（８Ａ）又はＤＴＡ−１（８Ｂ）の３回の注入を１００ｕｇ／抗体／マウスで動物に投与した。ＤＴＡ−１（ｄ１）の後のＯＸ−８６（ｄ５、ｄ９、図７Ｄ）の順序は、アイソタイプＡｂの後のＯＸ−８６（７Ｃ）よりも良好であった。
【図８Ｂ】サロゲート抗ＧＩＴＲ抗体（ＤＴＡ−１）と抗ＯＸ−４０抗体（ＯＸ−８６）との組み合わせは、同系ＭＣ３８結腸癌腫モデルにおけるＯＸ−８６単独よりも良好である。腫瘍体積が２００ｍｍ３に達した時点で開始する黒矢じり（群当たりｎ＝１０）によって示される日に、アイソタイプラットＩｇＧ２ｂ（８Ａ）又はＤＴＡ−１（８Ｂ）の３回の注入を１００ｕｇ／抗体／マウスで動物に投与した。ＤＴＡ−１（ｄ１）の後のＯＸ−８６（ｄ５、ｄ９、図７Ｄ）の順序は、アイソタイプＡｂの後のＯＸ−８６（７Ｃ）よりも良好であった。
【図８Ｃ】サロゲート抗ＧＩＴＲ抗体（ＤＴＡ−１）と抗ＯＸ−４０抗体（ＯＸ−８６）との組み合わせは、同系ＭＣ３８結腸癌腫モデルにおけるＯＸ−８６単独よりも良好である。腫瘍体積が２００ｍｍ３に達した時点で開始する黒矢じり（群当たりｎ＝１０）によって示される日に、アイソタイプラットＩｇＧ２ｂ（８Ａ）又はＤＴＡ−１（８Ｂ）の３回の注入を１００ｕｇ／抗体／マウスで動物に投与した。ＤＴＡ−１（ｄ１）の後のＯＸ−８６（ｄ５、ｄ９、図７Ｄ）の順序は、アイソタイプＡｂの後のＯＸ−８６（７Ｃ）よりも良好であった。
【図８Ｄ】サロゲート抗ＧＩＴＲ抗体（ＤＴＡ−１）と抗ＯＸ−４０抗体（ＯＸ−８６）との組み合わせは、同系ＭＣ３８結腸癌腫モデルにおけるＯＸ−８６単独よりも良好である。腫瘍体積が２００ｍｍ３に達した時点で開始する黒矢じり（群当たりｎ＝１０）によって示される日に、アイソタイプラットＩｇＧ２ｂ（８Ａ）又はＤＴＡ−１（８Ｂ）の３回の注入を１００ｕｇ／抗体／マウスで動物に投与した。ＤＴＡ−１（ｄ１）の後のＯＸ−８６（ｄ５、ｄ９、図７Ｄ）の順序は、アイソタイプＡｂの後のＯＸ−８６（７Ｃ）よりも良好であった。
【図９Ａ】ワクチン接種による抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１療法の組み合わせは、Ａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の膨張、機能、及び分化を促進する。ナイーブ型のＢ６非腫瘍保有マウス（ｎ＝５／群）を、単独療法又は併用療法（０、３、及び６日目に２００μｇの抗ＧＩＴＲ又は対照ラットＩｇＧ、並びに３、６、９、及び１２日目に２００μｇの抗ＰＤ−１）と共に、ＯＶＡ２５７〜２６４ペプチド（０日目）でいったん免疫化した。所望の免疫応答を７日目（ｄ７）及び１４日目（ｄ１４）に血液及び／又は脾臓中でモニタした。Ａ．ＯＶＡ２５７〜２６４特異的ペプチドで刺激したマウスの脾臓からのＩＦＮγ分泌Ｔ細胞のＥＬＩＳｐｏｔ分析（ｄ７）。Ｂ．カラムグラフは、一重陽性、二重陽性、及び三重陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の多官能性サブ集団が、エフェクターサイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−２を脾臓内でＯＶＡ２５７〜２６４刺激に対して放出していることを示す（ｄ７）。Ｃ．細胞溶解表現型のプロファイル（ｄ７）。Ｄ．ｄ７の末梢血中のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞。Ｄに示される５匹のマウスを表すドットプロット。Ｅ．ｄ１４の末梢血中のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞。Ｅ及びＦ．免疫化後のｄ１４の処置されたマウスの血液中のＯＶＡ四量体特異的ＣＤ８＋メモリーＴ細胞の分化。上記の実験の各々を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーはＳＥＭを示す。ＥＭ：エフェクターメモリー、ＣＭ：中央メモリー。
【図９Ｂ】ワクチン接種による抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１療法の組み合わせは、Ａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の膨張、機能、及び分化を促進する。ナイーブ型のＢ６非腫瘍保有マウス（ｎ＝５／群）を、単独療法又は併用療法（０、３、及び６日目に２００μｇの抗ＧＩＴＲ又は対照ラットＩｇＧ、並びに３、６、９、及び１２日目に２００μｇの抗ＰＤ−１）と共に、ＯＶＡ２５７〜２６４ペプチド（０日目）でいったん免疫化した。所望の免疫応答を７日目（ｄ７）及び１４日目（ｄ１４）に血液及び／又は脾臓中でモニタした。Ａ．ＯＶＡ２５７〜２６４特異的ペプチドで刺激したマウスの脾臓からのＩＦＮγ分泌Ｔ細胞のＥＬＩＳｐｏｔ分析（ｄ７）。Ｂ．カラムグラフは、一重陽性、二重陽性、及び三重陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の多官能性サブ集団が、エフェクターサイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−２を脾臓内でＯＶＡ２５７〜２６４刺激に対して放出していることを示す（ｄ７）。Ｃ．細胞溶解表現型のプロファイル（ｄ７）。Ｄ．ｄ７の末梢血中のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞。Ｄに示される５匹のマウスを表すドットプロット。Ｅ．ｄ１４の末梢血中のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞。Ｅ及びＦ．免疫化後のｄ１４の処置されたマウスの血液中のＯＶＡ四量体特異的ＣＤ８＋メモリーＴ細胞の分化。上記の実験の各々を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーはＳＥＭを示す。ＥＭ：エフェクターメモリー、ＣＭ：中央メモリー。
【図９Ｃ】ワクチン接種による抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１療法の組み合わせは、Ａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の膨張、機能、及び分化を促進する。ナイーブ型のＢ６非腫瘍保有マウス（ｎ＝５／群）を、単独療法又は併用療法（０、３、及び６日目に２００μｇの抗ＧＩＴＲ又は対照ラットＩｇＧ、並びに３、６、９、及び１２日目に２００μｇの抗ＰＤ−１）と共に、ＯＶＡ２５７〜２６４ペプチド（０日目）でいったん免疫化した。所望の免疫応答を７日目（ｄ７）及び１４日目（ｄ１４）に血液及び／又は脾臓中でモニタした。Ａ．ＯＶＡ２５７〜２６４特異的ペプチドで刺激したマウスの脾臓からのＩＦＮγ分泌Ｔ細胞のＥＬＩＳｐｏｔ分析（ｄ７）。Ｂ．カラムグラフは、一重陽性、二重陽性、及び三重陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の多官能性サブ集団が、エフェクターサイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−２を脾臓内でＯＶＡ２５７〜２６４刺激に対して放出していることを示す（ｄ７）。Ｃ．細胞溶解表現型のプロファイル（ｄ７）。Ｄ．ｄ７の末梢血中のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞。Ｄに示される５匹のマウスを表すドットプロット。Ｅ．ｄ１４の末梢血中のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞。Ｅ及びＦ．免疫化後のｄ１４の処置されたマウスの血液中のＯＶＡ四量体特異的ＣＤ８＋メモリーＴ細胞の分化。上記の実験の各々を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーはＳＥＭを示す。ＥＭ：エフェクターメモリー、ＣＭ：中央メモリー。
【図９Ｄ】ワクチン接種による抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１療法の組み合わせは、Ａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の膨張、機能、及び分化を促進する。ナイーブ型のＢ６非腫瘍保有マウス（ｎ＝５／群）を、単独療法又は併用療法（０、３、及び６日目に２００μｇの抗ＧＩＴＲ又は対照ラットＩｇＧ、並びに３、６、９、及び１２日目に２００μｇの抗ＰＤ−１）と共に、ＯＶＡ２５７〜２６４ペプチド（０日目）でいったん免疫化した。所望の免疫応答を７日目（ｄ７）及び１４日目（ｄ１４）に血液及び／又は脾臓中でモニタした。Ａ．ＯＶＡ２５７〜２６４特異的ペプチドで刺激したマウスの脾臓からのＩＦＮγ分泌Ｔ細胞のＥＬＩＳｐｏｔ分析（ｄ７）。Ｂ．カラムグラフは、一重陽性、二重陽性、及び三重陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の多官能性サブ集団が、エフェクターサイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−２を脾臓内でＯＶＡ２５７〜２６４刺激に対して放出していることを示す（ｄ７）。Ｃ．細胞溶解表現型のプロファイル（ｄ７）。Ｄ．ｄ７の末梢血中のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞。Ｄに示される５匹のマウスを表すドットプロット。Ｅ．ｄ１４の末梢血中のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞。Ｅ及びＦ．免疫化後のｄ１４の処置されたマウスの血液中のＯＶＡ四量体特異的ＣＤ８＋メモリーＴ細胞の分化。上記の実験の各々を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーはＳＥＭを示す。ＥＭ：エフェクターメモリー、ＣＭ：中央メモリー。
【図９Ｅ】ワクチン接種による抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１療法の組み合わせは、Ａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の膨張、機能、及び分化を促進する。ナイーブ型のＢ６非腫瘍保有マウス（ｎ＝５／群）を、単独療法又は併用療法（０、３、及び６日目に２００μｇの抗ＧＩＴＲ又は対照ラットＩｇＧ、並びに３、６、９、及び１２日目に２００μｇの抗ＰＤ−１）と共に、ＯＶＡ２５７〜２６４ペプチド（０日目）でいったん免疫化した。所望の免疫応答を７日目（ｄ７）及び１４日目（ｄ１４）に血液及び／又は脾臓中でモニタした。Ａ．ＯＶＡ２５７〜２６４特異的ペプチドで刺激したマウスの脾臓からのＩＦＮγ分泌Ｔ細胞のＥＬＩＳｐｏｔ分析（ｄ７）。Ｂ．カラムグラフは、一重陽性、二重陽性、及び三重陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の多官能性サブ集団が、エフェクターサイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−２を脾臓内でＯＶＡ２５７〜２６４刺激に対して放出していることを示す（ｄ７）。Ｃ．細胞溶解表現型のプロファイル（ｄ７）。Ｄ．ｄ７の末梢血中のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞。Ｄに示される５匹のマウスを表すドットプロット。Ｅ．ｄ１４の末梢血中のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞。Ｅ及びＦ．免疫化後のｄ１４の処置されたマウスの血液中のＯＶＡ四量体特異的ＣＤ８＋メモリーＴ細胞の分化。上記の実験の各々を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーはＳＥＭを示す。ＥＭ：エフェクターメモリー、ＣＭ：中央メモリー。
【図９Ｆ】ワクチン接種による抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１療法の組み合わせは、Ａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の膨張、機能、及び分化を促進する。ナイーブ型のＢ６非腫瘍保有マウス（ｎ＝５／群）を、単独療法又は併用療法（０、３、及び６日目に２００μｇの抗ＧＩＴＲ又は対照ラットＩｇＧ、並びに３、６、９、及び１２日目に２００μｇの抗ＰＤ−１）と共に、ＯＶＡ２５７〜２６４ペプチド（０日目）でいったん免疫化した。所望の免疫応答を７日目（ｄ７）及び１４日目（ｄ１４）に血液及び／又は脾臓中でモニタした。Ａ．ＯＶＡ２５７〜２６４特異的ペプチドで刺激したマウスの脾臓からのＩＦＮγ分泌Ｔ細胞のＥＬＩＳｐｏｔ分析（ｄ７）。Ｂ．カラムグラフは、一重陽性、二重陽性、及び三重陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の多官能性サブ集団が、エフェクターサイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−２を脾臓内でＯＶＡ２５７〜２６４刺激に対して放出していることを示す（ｄ７）。Ｃ．細胞溶解表現型のプロファイル（ｄ７）。Ｄ．ｄ７の末梢血中のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞。Ｄに示される５匹のマウスを表すドットプロット。Ｅ．ｄ１４の末梢血中のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞。Ｅ及びＦ．免疫化後のｄ１４の処置されたマウスの血液中のＯＶＡ四量体特異的ＣＤ８＋メモリーＴ細胞の分化。上記の実験の各々を少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーはＳＥＭを示す。ＥＭ：エフェクターメモリー、ＣＭ：中央メモリー。
【図１０Ａ】ワクチン接種によるインビトロ併用療法は、マウスのＢ１６−ＯＶＡ腫瘍拒絶を増進する。Ａ．Ｂ１６−ＯＶＡ定着腫瘍（約３０〜４０ｍｍ３）を示される処理で治療した。Ｂ．個々の腫瘍応答、群腫瘍測定値（平均値＋／−ＳＥＭ、Ｃ）、及び生存率（Ｄ）を経時的にモニタした。グラフは、研究された動物の群当たりの平均腫瘍体積を表し、チャートは、腫瘍なし／総数の数を示す。グラフは、３つの独立した実験のうちの１つの代表的な結果である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１０Ｂ】ワクチン接種によるインビトロ併用療法は、マウスのＢ１６−ＯＶＡ腫瘍拒絶を増進する。Ａ．Ｂ１６−ＯＶＡ定着腫瘍（約３０〜４０ｍｍ３）を示される処理で治療した。Ｂ．個々の腫瘍応答、群腫瘍測定値（平均値＋／−ＳＥＭ、Ｃ）、及び生存率（Ｄ）を経時的にモニタした。グラフは、研究された動物の群当たりの平均腫瘍体積を表し、チャートは、腫瘍なし／総数の数を示す。グラフは、３つの独立した実験のうちの１つの代表的な結果である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１０Ｃ】ワクチン接種によるインビトロ併用療法は、マウスのＢ１６−ＯＶＡ腫瘍拒絶を増進する。Ａ．Ｂ１６−ＯＶＡ定着腫瘍（約３０〜４０ｍｍ３）を示される処理で治療した。Ｂ．個々の腫瘍応答、群腫瘍測定値（平均値＋／−ＳＥＭ、Ｃ）、及び生存率（Ｄ）を経時的にモニタした。グラフは、研究された動物の群当たりの平均腫瘍体積を表し、チャートは、腫瘍なし／総数の数を示す。グラフは、３つの独立した実験のうちの１つの代表的な結果である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１０Ｄ】ワクチン接種によるインビトロ併用療法は、マウスのＢ１６−ＯＶＡ腫瘍拒絶を増進する。Ａ．Ｂ１６−ＯＶＡ定着腫瘍（約３０〜４０ｍｍ３）を示される処理で治療した。Ｂ．個々の腫瘍応答、群腫瘍測定値（平均値＋／−ＳＥＭ、Ｃ）、及び生存率（Ｄ）を経時的にモニタした。グラフは、研究された動物の群当たりの平均腫瘍体積を表し、チャートは、腫瘍なし／総数の数を示す。グラフは、３つの独立した実験のうちの１つの代表的な結果である。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１１Ａ】ＣＤ８＋ＴＩＬのワクチン誘導抗原特異的応答の頻度及び機能を向上させるように相乗作用が与えられたＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法。ＯＶＡ２５７〜２６４制限（ＣＤ８）ペプチド刺激（Ａ−Ｂ）後の、又は腫瘍移植後１２〜１５日目のＰＭＡ／ＩＯＮ刺激（Ｄ）によって、ＣＤ８＋ＴＩＬＳ中のＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＮＦγ／ＴＮＦα、及びＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγに関する細胞内サイトカイン染色の要約データを示す。Ｃ．バーグラフは、腫瘍中の総ＣＤ４５＋細胞のＨ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ制限ＯＶＡ四量体特異的ＣＤ８＋ＴＩＬのパーセンテージを示す。実験を少なくとも２回繰り返して同様の結果を得た。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーは、ｎ＝４〜５／群のＳＥＭを示す。
【図１１Ｂ】ＣＤ８＋ＴＩＬのワクチン誘導抗原特異的応答の頻度及び機能を向上させるように相乗作用が与えられたＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法。ＯＶＡ２５７〜２６４制限（ＣＤ８）ペプチド刺激（Ａ−Ｂ）後の、又は腫瘍移植後１２〜１５日目のＰＭＡ／ＩＯＮ刺激（Ｄ）によって、ＣＤ８＋ＴＩＬＳ中のＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＮＦγ／ＴＮＦα、及びＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγに関する細胞内サイトカイン染色の要約データを示す。Ｃ．バーグラフは、腫瘍中の総ＣＤ４５＋細胞のＨ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ制限ＯＶＡ四量体特異的ＣＤ８＋ＴＩＬのパーセンテージを示す。実験を少なくとも２回繰り返して同様の結果を得た。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーは、ｎ＝４〜５／群のＳＥＭを示す。
【図１１Ｃ】ＣＤ８＋ＴＩＬのワクチン誘導抗原特異的応答の頻度及び機能を向上させるように相乗作用が与えられたＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法。ＯＶＡ２５７〜２６４制限（ＣＤ８）ペプチド刺激（Ａ−Ｂ）後の、又は腫瘍移植後１２〜１５日目のＰＭＡ／ＩＯＮ刺激（Ｄ）によって、ＣＤ８＋ＴＩＬＳ中のＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＮＦγ／ＴＮＦα、及びＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγに関する細胞内サイトカイン染色の要約データを示す。Ｃ．バーグラフは、腫瘍中の総ＣＤ４５＋細胞のＨ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ制限ＯＶＡ四量体特異的ＣＤ８＋ＴＩＬのパーセンテージを示す。実験を少なくとも２回繰り返して同様の結果を得た。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーは、ｎ＝４〜５／群のＳＥＭを示す。
【図１１Ｄ】ＣＤ８＋ＴＩＬのワクチン誘導抗原特異的応答の頻度及び機能を向上させるように相乗作用が与えられたＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法。ＯＶＡ２５７〜２６４制限（ＣＤ８）ペプチド刺激（Ａ−Ｂ）後の、又は腫瘍移植後１２〜１５日目のＰＭＡ／ＩＯＮ刺激（Ｄ）によって、ＣＤ８＋ＴＩＬＳ中のＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＮＦγ／ＴＮＦα、及びＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγに関する細胞内サイトカイン染色の要約データを示す。Ｃ．バーグラフは、腫瘍中の総ＣＤ４５＋細胞のＨ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ制限ＯＶＡ四量体特異的ＣＤ８＋ＴＩＬのパーセンテージを示す。実験を少なくとも２回繰り返して同様の結果を得た。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーは、ｎ＝４〜５／群のＳＥＭを示す。
【図１２Ａ】併用療法はＣＤ８＋  Ｔ細胞浸潤を促進し、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍中のＴｒｅｇの頻度を低下させる。Ａ．図９Ｂ〜図９Ｄの非腫瘍保有マウスの脾臓から評価したＴｒｅｇのパーセンテージ。（図１０のように）Ｖａｘ、抗ＧＩＴＲ、及び／又はＰＤ−１の組み合わせで処置したＢ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスのコホート。Ｂ．腫瘍移植後１５日目の合計のＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとしてのＣＤ８＋ＴＩＬ。Ｃ及びＤ．代表的なフロードットプロット及び要約データは、腫瘍移植後１５日目処置されたマウスの腫瘍中のＣＤ４５＋ＴＩＬのＴｒｅｇのパーセンテージ、及びＴｒｅｇに対するＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の割合を示す。統計解析をＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１と比較する。結果は、群当たり４〜５匹のマウスによる２〜３つの独立した実験を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図１２Ｂ】併用療法はＣＤ８＋  Ｔ細胞浸潤を促進し、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍中のＴｒｅｇの頻度を低下させる。Ａ．図９Ｂ〜図９Ｄの非腫瘍保有マウスの脾臓から評価したＴｒｅｇのパーセンテージ。（図１０のように）Ｖａｘ、抗ＧＩＴＲ、及び／又はＰＤ−１の組み合わせで処置したＢ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスのコホート。Ｂ．腫瘍移植後１５日目の合計のＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとしてのＣＤ８＋ＴＩＬ。Ｃ及びＤ．代表的なフロードットプロット及び要約データは、腫瘍移植後１５日目処置されたマウスの腫瘍中のＣＤ４５＋ＴＩＬのＴｒｅｇのパーセンテージ、及びＴｒｅｇに対するＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の割合を示す。統計解析をＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１と比較する。結果は、群当たり４〜５匹のマウスによる２〜３つの独立した実験を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図１２Ｃ】併用療法はＣＤ８＋  Ｔ細胞浸潤を促進し、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍中のＴｒｅｇの頻度を低下させる。Ａ．図９Ｂ〜図９Ｄの非腫瘍保有マウスの脾臓から評価したＴｒｅｇのパーセンテージ。（図１０のように）Ｖａｘ、抗ＧＩＴＲ、及び／又はＰＤ−１の組み合わせで処置したＢ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスのコホート。Ｂ．腫瘍移植後１５日目の合計のＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとしてのＣＤ８＋ＴＩＬ。Ｃ及びＤ．代表的なフロードットプロット及び要約データは、腫瘍移植後１５日目処置されたマウスの腫瘍中のＣＤ４５＋ＴＩＬのＴｒｅｇのパーセンテージ、及びＴｒｅｇに対するＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の割合を示す。統計解析をＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１と比較する。結果は、群当たり４〜５匹のマウスによる２〜３つの独立した実験を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図１２Ｄ】併用療法はＣＤ８＋  Ｔ細胞浸潤を促進し、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍中のＴｒｅｇの頻度を低下させる。Ａ．図９Ｂ〜図９Ｄの非腫瘍保有マウスの脾臓から評価したＴｒｅｇのパーセンテージ。（図１０のように）Ｖａｘ、抗ＧＩＴＲ、及び／又はＰＤ−１の組み合わせで処置したＢ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスのコホート。Ｂ．腫瘍移植後１５日目の合計のＣＤ４５＋細胞のパーセンテージとしてのＣＤ８＋ＴＩＬ。Ｃ及びＤ．代表的なフロードットプロット及び要約データは、腫瘍移植後１５日目処置されたマウスの腫瘍中のＣＤ４５＋ＴＩＬのＴｒｅｇのパーセンテージ、及びＴｒｅｇに対するＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の割合を示す。統計解析をＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１と比較する。結果は、群当たり４〜５匹のマウスによる２〜３つの独立した実験を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図１３Ａ】Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の有効性は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に依存し、治療は長期記憶を誘導する。Ａ．療法上の枯渇試験（therapeutic depletion study）の投薬スケジュール。Ｂ６マウス（ｎ＝１０／群）に皮下投与で４×１０５のＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞を注入し、腫瘍直径が約４０ｍｍ３に達したときに、その腫瘍細胞を、７、８、９、１１、１４、１７日目に２００μｇ各／マウスのｍＡｂの投与によって、ＣＤ８細胞、ＣＤ４細胞、又はＮＫ細胞を枯渇させた。８日目は、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１又はＩｇＧによる治療を開始した日である。腫瘍移植後、ワクチンを８日目に、抗ＧＩＴＲを８及び１４日目に、抗ＰＤ−１を１０、１３、１６、及び１９日目に投与した。Ｂ．腫瘍体積を週に２回モニタした（平均値＋／−ＳＥＭ）。Ｃ及びＤ．初代腫瘍拒絶の６ケ月後、併用治療後の腫瘍のないマウス（群当たりｎ＝６〜９）に、同じ脇腹においてＢ１６−ＯＶＡ（２×１０５；Ｃ）又はＢ１６．Ｆ１０（１．５×１０５；Ｄ）細胞で再チャレンジした。年齢適合マウスを再チャレンジで使用した。結果は、２〜３つの独立した実験を代表するものである。
【図１３Ｂ】Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の有効性は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に依存し、治療は長期記憶を誘導する。Ａ．療法上の枯渇試験（therapeutic depletion study）の投薬スケジュール。Ｂ６マウス（ｎ＝１０／群）に皮下投与で４×１０５のＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞を注入し、腫瘍直径が約４０ｍｍ３に達したときに、その腫瘍細胞を、７、８、９、１１、１４、１７日目に２００μｇ各／マウスのｍＡｂの投与によって、ＣＤ８細胞、ＣＤ４細胞、又はＮＫ細胞を枯渇させた。８日目は、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１又はＩｇＧによる治療を開始した日である。腫瘍移植後、ワクチンを８日目に、抗ＧＩＴＲを８及び１４日目に、抗ＰＤ−１を１０、１３、１６、及び１９日目に投与した。Ｂ．腫瘍体積を週に２回モニタした（平均値＋／−ＳＥＭ）。Ｃ及びＤ．初代腫瘍拒絶の６ケ月後、併用治療後の腫瘍のないマウス（群当たりｎ＝６〜９）に、同じ脇腹においてＢ１６−ＯＶＡ（２×１０５；Ｃ）又はＢ１６．Ｆ１０（１．５×１０５；Ｄ）細胞で再チャレンジした。年齢適合マウスを再チャレンジで使用した。結果は、２〜３つの独立した実験を代表するものである。
【図１３Ｃ】Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の有効性は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に依存し、治療は長期記憶を誘導する。Ａ．療法上の枯渇試験（therapeutic depletion study）の投薬スケジュール。Ｂ６マウス（ｎ＝１０／群）に皮下投与で４×１０５のＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞を注入し、腫瘍直径が約４０ｍｍ３に達したときに、その腫瘍細胞を、７、８、９、１１、１４、１７日目に２００μｇ各／マウスのｍＡｂの投与によって、ＣＤ８細胞、ＣＤ４細胞、又はＮＫ細胞を枯渇させた。８日目は、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１又はＩｇＧによる治療を開始した日である。腫瘍移植後、ワクチンを８日目に、抗ＧＩＴＲを８及び１４日目に、抗ＰＤ−１を１０、１３、１６、及び１９日目に投与した。Ｂ．腫瘍体積を週に２回モニタした（平均値＋／−ＳＥＭ）。Ｃ及びＤ．初代腫瘍拒絶の６ケ月後、併用治療後の腫瘍のないマウス（群当たりｎ＝６〜９）に、同じ脇腹においてＢ１６−ＯＶＡ（２×１０５；Ｃ）又はＢ１６．Ｆ１０（１．５×１０５；Ｄ）細胞で再チャレンジした。年齢適合マウスを再チャレンジで使用した。結果は、２〜３つの独立した実験を代表するものである。
【図１３Ｄ】Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の有効性は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞に依存し、治療は長期記憶を誘導する。Ａ．療法上の枯渇試験（therapeutic depletion study）の投薬スケジュール。Ｂ６マウス（ｎ＝１０／群）に皮下投与で４×１０５のＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞を注入し、腫瘍直径が約４０ｍｍ３に達したときに、その腫瘍細胞を、７、８、９、１１、１４、１７日目に２００μｇ各／マウスのｍＡｂの投与によって、ＣＤ８細胞、ＣＤ４細胞、又はＮＫ細胞を枯渇させた。８日目は、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１又はＩｇＧによる治療を開始した日である。腫瘍移植後、ワクチンを８日目に、抗ＧＩＴＲを８及び１４日目に、抗ＰＤ−１を１０、１３、１６、及び１９日目に投与した。Ｂ．腫瘍体積を週に２回モニタした（平均値＋／−ＳＥＭ）。Ｃ及びＤ．初代腫瘍拒絶の６ケ月後、併用治療後の腫瘍のないマウス（群当たりｎ＝６〜９）に、同じ脇腹においてＢ１６−ＯＶＡ（２×１０５；Ｃ）又はＢ１６．Ｆ１０（１．５×１０５；Ｄ）細胞で再チャレンジした。年齢適合マウスを再チャレンジで使用した。結果は、２〜３つの独立した実験を代表するものである。
【図１４Ａ】Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の併用療法は、腫瘍特異的ＣＤ８＋  ＴＩＬを増やし、ＫＬＲＧ１＋エフェクターメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞によって媒介される腫瘍クリアランスを誘導する。Ａ．代表的なスキャッタプロットグラフは、腫瘍植え付け（４〜５匹のマウス／群）後１５日目のＨ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ制限ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ、（Ｂ）ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋  ＴＩＬのパーセンテージ、及び（Ｃ）四量体結合ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋  ＴＩＬのパーセンテージを示す。Ｄ．Ｂ６マウス（群当たり１０）に皮下投与で４×１０５のＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞を注入し、腫瘍直径が約５０ｍｍ３に達した８日目に、療法を図１３のように開始した。２００μｇのａＫＬＲＧ１  ｍＡｂを、７、８、９、１１、１４、１７、２０日目に投与した。８日目は治療を開始した日である。腫瘍の体積及び生存率を週に２回モニタした。全般的なグラフは、少なくとも２つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１４Ｂ】Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の併用療法は、腫瘍特異的ＣＤ８＋  ＴＩＬを増やし、ＫＬＲＧ１＋エフェクターメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞によって媒介される腫瘍クリアランスを誘導する。Ａ．代表的なスキャッタプロットグラフは、腫瘍植え付け（４〜５匹のマウス／群）後１５日目のＨ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ制限ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ、（Ｂ）ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋  ＴＩＬのパーセンテージ、及び（Ｃ）四量体結合ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋  ＴＩＬのパーセンテージを示す。Ｄ．Ｂ６マウス（群当たり１０）に皮下投与で４×１０５のＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞を注入し、腫瘍直径が約５０ｍｍ３に達した８日目に、療法を図１３のように開始した。２００μｇのａＫＬＲＧ１  ｍＡｂを、７、８、９、１１、１４、１７、２０日目に投与した。８日目は治療を開始した日である。腫瘍の体積及び生存率を週に２回モニタした。全般的なグラフは、少なくとも２つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１４Ｃ】Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の併用療法は、腫瘍特異的ＣＤ８＋  ＴＩＬを増やし、ＫＬＲＧ１＋エフェクターメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞によって媒介される腫瘍クリアランスを誘導する。Ａ．代表的なスキャッタプロットグラフは、腫瘍植え付け（４〜５匹のマウス／群）後１５日目のＨ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ制限ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ、（Ｂ）ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋  ＴＩＬのパーセンテージ、及び（Ｃ）四量体結合ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋  ＴＩＬのパーセンテージを示す。Ｄ．Ｂ６マウス（群当たり１０）に皮下投与で４×１０５のＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞を注入し、腫瘍直径が約５０ｍｍ３に達した８日目に、療法を図１３のように開始した。２００μｇのａＫＬＲＧ１  ｍＡｂを、７、８、９、１１、１４、１７、２０日目に投与した。８日目は治療を開始した日である。腫瘍の体積及び生存率を週に２回モニタした。全般的なグラフは、少なくとも２つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１４Ｄ】Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の併用療法は、腫瘍特異的ＣＤ８＋  ＴＩＬを増やし、ＫＬＲＧ１＋エフェクターメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞によって媒介される腫瘍クリアランスを誘導する。Ａ．代表的なスキャッタプロットグラフは、腫瘍植え付け（４〜５匹のマウス／群）後１５日目のＨ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ制限ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ、（Ｂ）ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋  ＴＩＬのパーセンテージ、及び（Ｃ）四量体結合ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋  ＴＩＬのパーセンテージを示す。Ｄ．Ｂ６マウス（群当たり１０）に皮下投与で４×１０５のＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞を注入し、腫瘍直径が約５０ｍｍ３に達した８日目に、療法を図１３のように開始した。２００μｇのａＫＬＲＧ１  ｍＡｂを、７、８、９、１１、１４、１７、２０日目に投与した。８日目は治療を開始した日である。腫瘍の体積及び生存率を週に２回モニタした。全般的なグラフは、少なくとも２つの独立した実験の平均＋／−ＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図１５Ａ】二重抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の組み合わせをＴＲＰ２ベースのペプチドワクチンと相乗作用させて、定着Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍の退縮を誘導する。Ｂ６マウス（群当たり１０）に皮下投与で４×１０５のＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞を注入し、腫瘍が約５０ｍｍ３に達したときに治療を開始した。Ａ．Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける単独療法又は抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法（若しくは適合したアイソタイプのＩｇＧ）でのＴＲＰ２ペプチドワクチン接種のスケジュールの概略図。Ｂ．腫瘍増殖を、群（平均値＋／−ＳＥＭ）内及び個体において経時的にモニタした。実験を少なくとも２回実施して、同様の結果を得た。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１５Ｂ】二重抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の組み合わせをＴＲＰ２ベースのペプチドワクチンと相乗作用させて、定着Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍の退縮を誘導する。Ｂ６マウス（群当たり１０）に皮下投与で４×１０５のＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞を注入し、腫瘍が約５０ｍｍ３に達したときに治療を開始した。Ａ．Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍保有マウスにおける単独療法又は抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法（若しくは適合したアイソタイプのＩｇＧ）でのＴＲＰ２ペプチドワクチン接種のスケジュールの概略図。Ｂ．腫瘍増殖を、群（平均値＋／−ＳＥＭ）内及び個体において経時的にモニタした。実験を少なくとも２回実施して、同様の結果を得た。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１６】Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の併用療法によるＣＤ２５＋細胞の枯渇は、腫瘍効果を無効にしないか又は向上させない。図５Ａに示されるように、併用治療及び２００μｇの抗ＣＤ２５の投薬を与えた。腫瘍体積を週に２回モニタした（平均値＋／−ＳＥＭをプロットした）。結果は、群当たり１０匹のマウスを用いた２つの独立した実験を表す。
【図１７Ａ】抗ＫＬＲＧ１抗体は、ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋標的集団を枯渇させる。Ａ及びＢ．図９のように、ナイーブ型の腫瘍のないマウスにＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の組み合わせ及でアイソタイプを投薬した。抗ＫＬＲＧ１で処理されたマウスに、ワクチン接種後２、４、及び６日目に１００μｇの抗ＫＬＲＧ１  ｍＡｂを投与した。ワクチン接種後７日目にマウスを屠殺し、ＣＤ８、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ４４の発現を評価するために、血液及び脾臓の両方からリンパ球を採取した。Ａ．抗ＫＬＲＧ−１抗体で処理した後の脾臓中のＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ。Ｂ．血液及び脾臓中のＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋のパーセンテージ、並びに（Ｃ）血液及び脾臓中のＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋ＣＤ４４＋及びＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋細胞（それぞれ左パネル及び右パネル）の頻度及び／又は総細胞数のコンパイルされたデータ、を示す代表的なフロープロット。結果は、群当たり５匹のマウスを用いた２つの独立した実験を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図１７Ｂ】抗ＫＬＲＧ１抗体は、ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋標的集団を枯渇させる。Ａ及びＢ．図９のように、ナイーブ型の腫瘍のないマウスにＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の組み合わせ及でアイソタイプを投薬した。抗ＫＬＲＧ１で処理されたマウスに、ワクチン接種後２、４、及び６日目に１００μｇの抗ＫＬＲＧ１  ｍＡｂを投与した。ワクチン接種後７日目にマウスを屠殺し、ＣＤ８、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ４４の発現を評価するために、血液及び脾臓の両方からリンパ球を採取した。Ａ．抗ＫＬＲＧ−１抗体で処理した後の脾臓中のＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ。Ｂ．血液及び脾臓中のＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋のパーセンテージ、並びに（Ｃ）血液及び脾臓中のＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋ＣＤ４４＋及びＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋細胞（それぞれ左パネル及び右パネル）の頻度及び／又は総細胞数のコンパイルされたデータ、を示す代表的なフロープロット。結果は、群当たり５匹のマウスを用いた２つの独立した実験を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図１７Ｃ】抗ＫＬＲＧ１抗体は、ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋標的集団を枯渇させる。Ａ及びＢ．図９のように、ナイーブ型の腫瘍のないマウスにＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の組み合わせ及でアイソタイプを投薬した。抗ＫＬＲＧ１で処理されたマウスに、ワクチン接種後２、４、及び６日目に１００μｇの抗ＫＬＲＧ１  ｍＡｂを投与した。ワクチン接種後７日目にマウスを屠殺し、ＣＤ８、ＫＬＲＧ１、及びＣＤ４４の発現を評価するために、血液及び脾臓の両方からリンパ球を採取した。Ａ．抗ＫＬＲＧ−１抗体で処理した後の脾臓中のＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージ。Ｂ．血液及び脾臓中のＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋のパーセンテージ、並びに（Ｃ）血液及び脾臓中のＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋ＣＤ４４＋及びＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋細胞（それぞれ左パネル及び右パネル）の頻度及び／又は総細胞数のコンパイルされたデータ、を示す代表的なフロープロット。結果は、群当たり５匹のマウスを用いた２つの独立した実験を表す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図１８Ａ】Ｂ１６−ＯＶＡ細胞（４００，０００）の移植後、移植後第７日目の抗ＣＤ１２２  ｍＡｂ  ５Ｈ４（２〜３日の間隔で５回投与）による治療、又はペプチドワクチン複合体（１回投薬）若しくは示されるような組み合わせによる治療のいずれかによるマウス（群当たりｎ＝１０）の腫瘍増殖（図１２Ａ）及び生存率（図１２Ｂ）を示す。
【図１８Ｂ】Ｂ１６−ＯＶＡ細胞（４００，０００）の移植後、移植後第７日目の抗ＣＤ１２２  ｍＡｂ  ５Ｈ４（２〜３日の間隔で５回投与）による治療、又はペプチドワクチン複合体（１回投薬）若しくは示されるような組み合わせによる治療のいずれかによるマウス（群当たりｎ＝１０）の腫瘍増殖（図１２Ａ）及び生存率（図１２Ｂ）を示す。
【図１９Ａ】Ｂ１６−ＯＶＡ移植（４００，０００細胞）後１６日目に採取したＴＩＬの頻度、Ｇ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ−）（図１３Ａ）、ＯＶＡ２５７〜２６４ペプチドによるエクスビボ刺激時の腫瘍浸潤ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋サイトカイン分泌ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１３Ｂ）、Ｈ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ  ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ＴＩＬ（図１３Ｃ）、及び腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ４４＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋）（図１３Ｄ）のパーセンテージを示す。ａＣＤ１２２：抗ＣＤ１２２モノクローナル抗体。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１９Ｂ】Ｂ１６−ＯＶＡ移植（４００，０００細胞）後１６日目に採取したＴＩＬの頻度、Ｇ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ−）（図１３Ａ）、ＯＶＡ２５７〜２６４ペプチドによるエクスビボ刺激時の腫瘍浸潤ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋サイトカイン分泌ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１３Ｂ）、Ｈ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ  ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ＴＩＬ（図１３Ｃ）、及び腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ４４＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋）（図１３Ｄ）のパーセンテージを示す。ａＣＤ１２２：抗ＣＤ１２２モノクローナル抗体。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１９Ｃ】Ｂ１６−ＯＶＡ移植（４００，０００細胞）後１６日目に採取したＴＩＬの頻度、Ｇ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ−）（図１３Ａ）、ＯＶＡ２５７〜２６４ペプチドによるエクスビボ刺激時の腫瘍浸潤ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋サイトカイン分泌ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１３Ｂ）、Ｈ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ  ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ＴＩＬ（図１３Ｃ）、及び腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ４４＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋）（図１３Ｄ）のパーセンテージを示す。ａＣＤ１２２：抗ＣＤ１２２モノクローナル抗体。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図１９Ｄ】Ｂ１６−ＯＶＡ移植（４００，０００細胞）後１６日目に採取したＴＩＬの頻度、Ｇ−ＭＤＳＣ（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋Ｌｙ６Ｃ−）（図１３Ａ）、ＯＶＡ２５７〜２６４ペプチドによるエクスビボ刺激時の腫瘍浸潤ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋サイトカイン分泌ＣＤ８＋  Ｔ細胞（図１３Ｂ）、Ｈ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ  ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ＴＩＬ（図１３Ｃ）、及び腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ４４＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５＋）（図１３Ｄ）のパーセンテージを示す。ａＣＤ１２２：抗ＣＤ１２２モノクローナル抗体。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２０Ａ】抗ＣＤ１２２療法は、非腫瘍保有マウスの末梢におけるワクチン誘導抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を向上させることを示す（Ｈ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ制限ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（図３１Ａ）のパーセンテージ；非腫瘍保有マウスの血液中の抗ＣＤ１２２処理後のＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞集団のパーセンテージ（図３１Ｂ）、腫瘍保有マウスの腫瘍中の療法処理後のＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞集団のパーセンテージ（図３１Ｃ））。ＣＤ１２２：抗ＣＤ１２２モノクローナル抗体；Ｖａｘ：ワクチン。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図２０Ｂ】抗ＣＤ１２２療法は、非腫瘍保有マウスの末梢におけるワクチン誘導抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を向上させることを示す（Ｈ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ制限ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（図３１Ａ）のパーセンテージ；非腫瘍保有マウスの血液中の抗ＣＤ１２２処理後のＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞集団のパーセンテージ（図３１Ｂ）、腫瘍保有マウスの腫瘍中の療法処理後のＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞集団のパーセンテージ（図３１Ｃ））。ＣＤ１２２：抗ＣＤ１２２モノクローナル抗体；Ｖａｘ：ワクチン。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図２０Ｃ】抗ＣＤ１２２療法は、非腫瘍保有マウスの末梢におけるワクチン誘導抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を向上させることを示す（Ｈ２−Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ制限ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（図３１Ａ）のパーセンテージ；非腫瘍保有マウスの血液中の抗ＣＤ１２２処理後のＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞集団のパーセンテージ（図３１Ｂ）、腫瘍保有マウスの腫瘍中の療法処理後のＣＤ８＋ＣＤ１２２＋Ｔ細胞集団のパーセンテージ（図３１Ｃ））。ＣＤ１２２：抗ＣＤ１２２モノクローナル抗体；Ｖａｘ：ワクチン。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。エラーバーはＳＥＭを示す。
【図２１Ａ】Ｂ１６−ＯＶＡ細胞（４００，０００）を移植した後、ペプチドワクチン接種（３回投薬）と組み合わせて抗ＣＤ１２２で処理したマウスの生存率を示す（図３２Ａ）。腫瘍なしで生存した図３２Ａのワクチン／抗ＣＤ１２２で処理したマウスを、Ｂ１６−ｏｖａ細胞再チャレンジした。グラフは、第２の腫瘍チャレンジを拒絶するマウスのパーセンテージを示す（図３２Ｂ）。
【図２１Ｂ】Ｂ１６−ＯＶＡ細胞（４００，０００）を移植した後、ペプチドワクチン接種（３回投薬）と組み合わせて抗ＣＤ１２２で処理したマウスの生存率を示す（図３２Ａ）。腫瘍なしで生存した図３２Ａのワクチン／抗ＣＤ１２２で処理したマウスを、Ｂ１６−ｏｖａ細胞再チャレンジした。グラフは、第２の腫瘍チャレンジを拒絶するマウスのパーセンテージを示す（図３２Ｂ）。
【図２２Ａ】Ｂ１６−ＯＶＡ細胞（４００，０００）の移植後に、移植後４日目に、示されるように抗ＣＤ１２２若しくは抗ＧＩＴＲのいずれか、又は抗ＣＤ１２２と抗ＧＩＴＲとの組み合わせによる治療を受けたナイーブ型マウス（群当たりｎ＝１０）の腫瘍の増殖及び生存率を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２２Ｂ】Ｂ１６−ＯＶＡ細胞（４００，０００）の移植後に、移植後４日目に、示されるように抗ＣＤ１２２若しくは抗ＧＩＴＲのいずれか、又は抗ＣＤ１２２と抗ＧＩＴＲとの組み合わせによる治療を受けたナイーブ型マウス（群当たりｎ＝１０）の腫瘍の増殖及び生存率を示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２３】ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦの存在下又は非存在下のＧＩＴＲ−ＣＥＤの各セグメントの重水素化レベルの差異。各ブロックは、マッピングされ得るペプチド、並びに６０、６００、３，６００、及び１４，４００秒における対照に対する交換の程度を表す。グレー：重水素保護なし、ダークグレー：ｍＡｂ結合時の強い保護、ライトグレー：ｍＡｂ結合時の中程度の保護。
【図２４】黒で強調されたＴＲＧＢ１９１エピトープを有するＧＩＴＲ  ＥＣＤモノマーの空間充填モデル。
【図２５Ａ】初代静止及び活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞に対するＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦのＡＤＣＣ活性。静止中のＣＤ４＋（Ａ、左パネル）及び静止中のＣＤ８＋  Ｔ細胞（Ｂ、左パネル）、又は活性化ＣＤ４＋（Ａ、右パネル）及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（Ｂ、右パネル）に対するＡＤＣＣ活性について、ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦ及びＣＮＴＯ３９３０（アイソタイプ対照抗体）を評価した。特異的溶解のパーセンテージを平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。Ｅ：Ｔ比を凡例に示す。Ｎ＝３つの実験的複製、データポイント当たりｎ＝１２。［Ａｂ］＝抗体濃度。
【図２５Ｂ】初代静止及び活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞に対するＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦのＡＤＣＣ活性。静止中のＣＤ４＋（Ａ、左パネル）及び静止中のＣＤ８＋  Ｔ細胞（Ｂ、左パネル）、又は活性化ＣＤ４＋（Ａ、右パネル）及びＣＤ８＋  Ｔ細胞（Ｂ、右パネル）に対するＡＤＣＣ活性について、ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦ及びＣＮＴＯ３９３０（アイソタイプ対照抗体）を評価した。特異的溶解のパーセンテージを平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。Ｅ：Ｔ比を凡例に示す。Ｎ＝３つの実験的複製、データポイント当たりｎ＝１２。［Ａｂ］＝抗体濃度。
【図２６】ＪＪＮ−３細胞株に対するＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦのＡＤＣＣ活性。ＪＪＮ−３標的細胞及びＮＫ−９２  １５８Ｖ／Ｖエフェクター細胞を使用して、ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦ及びＣＮＴＯ３９３０（アイソタイプ対照抗体）をＡＤＣＣ活性について評価した。特異的溶解のパーセンテージを平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。Ｎ＝６つの実験的複製、データポイント当たりｎ＝１２〜２４。［Ａｂ］＝抗体濃度。
【図２７】ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦ及びＣＮＴＯ３９３０アイソタイプ対照抗体を、ＮＫ−９２  １５８Ｖ／Ｖエフェクター細胞を使用して、標的細胞としてのＪＪＮ−３標的細胞及びインビトロ分化Ｔｒｅｇに対するＡＤＣＣ活性について試験した。特異的溶解のパーセンテージを平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。Ｎ＝３つの実験的複製、データポイント当たりｎ＝１２。［Ａｂ］＝抗体濃度、ＥＣ５０＝半数最大効果濃度、Ｂｍａｘ＝最大溶解。
【図２８Ａ】高親和性ＦｃγＲＩＩＩＡ多型性及び低親和性ＦｃγＲＩＩＩＡ多型性を有するエフェクター細胞を使用したＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦのＡＤＣＣ活性。ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦ及びＣＮＴＯ３９３０を、（Ａ）１５８Ｖ／Ｖ高親和性変異体又は（Ｂ）１５８Ｆ／Ｆ低親和性変異体を発現するＮＫ−９２エフェクター細胞を使用して、ＪＪＮ−３標的細胞に対するＡＤＣＣ活性について試験した。特異的溶解のパーセンテージを平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。Ｎ＝３つの実験的複製、データポイント当たりｎ＝１２。［Ａｂ］＝抗体濃度、ＥＣ５０＝半数最大効果濃度、Ｂｍａｘ＝最大溶解。
【図２８Ｂ】高親和性ＦｃγＲＩＩＩＡ多型性及び低親和性ＦｃγＲＩＩＩＡ多型性を有するエフェクター細胞を使用したＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦのＡＤＣＣ活性。ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦ及びＣＮＴＯ３９３０を、（Ａ）１５８Ｖ／Ｖ高親和性変異体又は（Ｂ）１５８Ｆ／Ｆ低親和性変異体を発現するＮＫ−９２エフェクター細胞を使用して、ＪＪＮ−３標的細胞に対するＡＤＣＣ活性について試験した。特異的溶解のパーセンテージを平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示す。Ｎ＝３つの実験的複製、データポイント当たりｎ＝１２。［Ａｂ］＝抗体濃度、ＥＣ５０＝半数最大効果濃度、Ｂｍａｘ＝最大溶解。
【図２９】ＤＴＡ−１＋ＦＧＫ４．５処理は、１００ｍｍ３の腫瘍体積で開始するＭＣ３８モデルにおいてより完全な腫瘍退縮をもたらす。
【図３０】ＤＴＡ−１＋ＦＧＫ４．５処理は、２３０ｍｍ３の腫瘍体積で開始するＭＣ３８モデルにおいてより完全な腫瘍退縮をもたらす。
【図３１】ＤＴＡ−１＋ＯＸ８６処理は、１００ｍｍ３の腫瘍体積で開始するＭＣ３８モデルにおいてより完全な腫瘍退縮をもたらす。
【図３２】ＤＴＡ−１＋ＲＭＰ１〜１４処理は、１００ｍｍ３の腫瘍体積で開始するＭＣ３８モデルにおいてより完全な腫瘍退縮をもたらす。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
本明細書及び特許請求の範囲を通して本明細書の諸態様に関する様々な用語が使用される。別途記載のない限り、そのような用語には、当該技術分野におけるそれらの通常の意味が与えられるものとする。その他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と一致する様式で解釈されるものとする。
【００２１】
本明細書及び添付の「特許請求の範囲」において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「細胞（a cell）」という言及には、２つ以上の細胞の組み合わせ、及びこれに類するものなどが含まれる。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、測定値、例えば、量、持続時間等に言及する場合の「約」という用語は、指定された値から最大±１０％の偏差を包含することを意味する。同様に、このような偏差は、開示された方法を行うのに適している。別途記載のない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される成分、分子量、反応条件等の特性の量を表わす全ての数字は、全ての事例において「約」という用語により修飾されていると理解されたい。したがって、そうではないと示されない限り、下記明細書及び添付の特許請求の範囲で説明された数値パラメータは、本発明により得ようとする所望の特性に応じて変動する場合がある近似値である。最低でも、特許請求の範囲の範囲に対して均等論の適用を制限することを試みてはならず、各数値パラメータは、報告された有効桁の数字を考慮し、通常の四捨五入の手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
【００２３】
本発明の広い範囲を説明する数値範囲及びパラメータは近似値であるが、特定の実施例に記載された数値は、可能な限り正確に報告される。ただし、任意の数値は、各試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じる一定の誤差を本質的に含有する。
【００２４】
「単離された」とは、生物学的成分（例えば、核酸、ペプチド、又はタンパク質）が、これらの成分が本来存在する生物の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体及び染色体外ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにタンパク質から、実質的に分離され、同他の成分とは別に生成され、又は同他の成分から離して精製されていることを意味する。このため、「単離」されている核酸、ペプチド、及びタンパク質は、標準的な精製法により精製された核酸及びタンパク質を含む。「単離された」核酸、ペプチド、及びタンパク質は、組成物の一部であることができ、このような組成物が核酸、ペプチド、又はタンパク質の本来の環境の一部ではない場合であっても単離されている。また、この用語は、宿主細胞中での組み換え発現により調製された核酸、ペプチド、及びタンパク質、並びに化学合成された核酸も包含する。本明細書で使用されるとき、「単離された」抗体又は抗原結合フラグメントは、種々の抗原特異性を有する他の抗体又は抗原結合フラグメントを実質的に含まない抗体又は抗原結合フラグメントを意味することを意図している（例えば、ＧＩＴＲに特異的に結合する単離された抗体は、ＧＩＴＲ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ただし、ＧＩＴＲのエピトープ、アイソフォーム、又は変異体に特異的に結合する単離された抗体は、例えば、他の種に由来する他の関連する抗原（例えば、ＧＩＴＲ種間ホモログ）に対する交差反応性を有してもよい。
【００２５】
本明細書で使用されるとき、「グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質」及び「ＧＩＴＲ」という用語は、具体的には、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ２４１２２９、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００４１８６．１及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｑ９Ｙ５Ｕ５に記載されているような、ヒトＧＩＴＲタンパク質を含む（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，６０５６〜６０６１も参照されたい）。ＧＩＴＲはまた、科学文献においてＡＩＴＲ、ＣＤ３５７、ＴＮＦＲＳＦ１８、及びＧＩＴＲ−Ｄとしても知られている。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、「ＧＩＴＲリガンド」、「ＧＩＴＲＬ」、及び「ＧＩＴＲ−Ｌ」という用語は、「グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲ関連タンパク質リガンド」を意味する。ＧＩＴＲＬは、別様に、活性化誘導ＴＮＦ関連リガンド（ＡＩＴＲＬ）及び腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＳＦ１８）として知られている。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１２５３０３は、例示的なヒトＧＩＴＲＬ核酸配列を提供する。ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＮＰ  ００５０８３及びＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＮＧ２は、例示的なヒトＧＩＴＲＬアミノ酸配列を提供する。特定の実施形態では、ＧＩＴＲＬは、配列番号６５のヒトＧＩＴＲＬである。
【００２７】
「抗体」は、特に断らない限り、免疫グロブリンの全てのアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＹ）を指し、種々の単量体、多量体、及びキメラ型を含む。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、及び抗体様ポリペプチド、例えば、キメラ抗体及びヒト化抗体が、「抗体」という用語に具体的に包含される。
【００２８】
「抗原結合フラグメント」は、特定の抗原に対して結合親和性を示し得る任意のタンパク質性構造体である。抗原結合フラグメントは、任意の既知の手法、例えば、酵素開裂、ペプチド合成、及び組み換え手法により提供されたものを含む。一部の抗原結合フラグメントは、親抗体分子の抗原結合特異性を保持しているインタクトな抗体の一部から構成される。例えば、抗原結合フラグメントは、特定の抗原に結合することが既知である抗体の、少なくとも１つの可変領域（重鎖若しくは軽鎖の可変領域のいずれか一方）、又は１つ若しくは２つ以上のＣＤＲを含んでもよい。適切な抗原結合フラグメントの例には、ディアボディ及び一本鎖分子、並びにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆａｂｃ、及びＦｖ分子、一本鎖（Ｓｃ）抗体、個々の抗体軽鎖、個々の抗体重鎖、抗体鎖若しくはＣＤＲと他のタンパク質との間でのキメラ融合体、タンパク質スキャフォールド、重鎖単量体若しくは二量体、軽鎖単量体若しくは二量体、１本の重鎖と１本の軽鎖とからなる二量体、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント、国際公開第２００７０５９７８２号に記載された一価抗体、ヒンジ領域においてジスルフィド結合により連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、Ｖ．ｓｕｂ．Ｈ及びＣ．ｓｕｂ．Ｈ１ドメインから本質的になるＦｄフラグメント、抗体の１つのアームのＶＬ及びＶＨドメインから本質的になるＦｖフラグメント、ＶＨドメインから本質的になり、ドメイン抗体とも呼ばれる（Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ；Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３  Ｎｏｖ．；２１（１１）：４８４〜９０）ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４〜５４６（１９８９））、ラクダ科動物抗体フラグメントつまりナノボディ（Ｒｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００５  Ｊａｎ．；５（１）：１１１〜２４）、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）等が挙げられるが、これらに限定されない。全ての抗体アイソタイプが、抗原結合フラグメントを生成するのに使用されてもよい。加えて、抗原結合フラグメントは、対象となる所与の抗原に対する親和性を付与する方向にポリペプチドセグメントをうまく包含させ得る、非抗体タンパク質性フレームワーク、例えば、タンパク質スキャフォールドを含んでもよい。抗原結合フラグメントは、組み換え的に生成されてもよく、又はインタクトな抗体の酵素的若しくは化学的開裂により生成されてもよい。「抗体又はその抗原結合フラグメント」という表現は、所与の抗原結合フラグメントが、この表現内で参照された抗体の１つ又は２つ以上のアミノ酸セグメントを組み込んでいることを示すために使用されてもよい。
【００２９】
「ＣＤＲ」及びその複数形「ＣＤＲｓ」という用語は、相補性決定領域（ＣＤＲ）であって、そのうちの３つが軽鎖可変領域（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）の結合特性を構成し、３つが重鎖可変領域（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）の結合特性を構成する、相補性決定領域（ＣＤＲ）を意味する。ＣＤＲは、抗体分子の機能的活性に寄与し、スキャフォールド領域又はフレームワーク領域を含むアミノ酸配列によって分離される。正確な定義上のＣＤＲの境界及び長さは、異なる分類及び番号付けシステムに依存する。したがって、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、接触定義、又は任意の他の境界定義によって参照され得る。境界が異なるにもかかわらず、これらのシステムの各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成するものにおいてある程度のオーバーラップを有する。したがって、これらのシステムによるＣＤＲの定義は、隣接するフレームワーク領域についての長さ及び境界領域の点で異なることがある。例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  ｅｄ．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１〜３２４２（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）、及びＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｃｏｎｔａｃｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２（１９９６））を参照されたい。これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３０】
典型的には、ＣＤＲは、カノニカル構造として分類され得るループ構造を形成する。「カノニカル構造」という用語は、抗原結合（ＣＤＲ）ループによって採用される主鎖立体配座を意味する。比較構造の研究から、６つの抗原結合ループのうちの５つが利用可能な立体配座の限られたレパートリーしか有さないことが見出された。各カノニカル構造は、ポリペプチド主鎖のねじれ角によって特徴付けられ得る。したがって、抗体間の対応するループは、ループのほとんどの部分において高いアミノ酸配列の変異性にもかかわらず、非常に類似した三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ，」Ｉ  ３４２：８７７（１９８９）；Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｉｎ  Ｌｏｏｐｓ  ｏｆ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００（１９９６）。これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。更に、採用されたループ構造とその周囲のアミノ酸配列との間には関係がある。特定のカノニカルクラスの立体配座は、ループの長さと、ループ内の重要な位置並びに保存されたフレームワーク（すなわち、ループの外側）内にあるアミノ酸残基とによって決定される。したがって、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて、特定のカノニカルクラスへの割り当てを行うことができる。
【００３１】
「ポリペプチド」という用語は、「タンパク質」という用語と互換的に使用され、その最も広い意味において、２つ又はそれ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、又はペプチド模倣体の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されていてもよい。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結されてもよい。本明細書で使用されるとき、「アミノ酸」という用語は、グリシン並びにＤ及びＬ光学異性体の両方と、アミノ酸類似体と、ペプチド模倣体とを含む、天然及び／若しくは非天然アミノ酸又は合成アミノ酸のいずれかを指す。３つ又はそれ以上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短い場合、一般にオリゴペプチドと称される。ペプチド鎖が長い場合、ペプチドは、一般にポリペプチド又はタンパク質と称される。抗体又は抗体フラグメントの文脈において使用されるとき、「特異的に結合（Specifically binds）」若しくは「特異的に結合（binds specifically）」又はそれらの派生語は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによりコードされたドメインを介して、分子の混合集団を含有するサンプル中の他の分子に優先的に結合することなく、対象となるタンパク質の１つ又は２つ以上のエピトープに結合することを表わす。典型的には、抗体は、表面プラズモン共鳴アッセイ又は細胞結合アッセイにより測定された場合、約１×１０−８Ｍ未満のＫｄで、同じ性質の抗原に結合する。「［抗原］特異的」抗体（例えば、ＧＩＴＲ特異的抗体）等の表現は、列挙された抗体が列挙された抗原に特異的に結合することを伝達することを意味する。
【００３２】
「ポリヌクレオチド」は、同義的に「核酸分子」、「ヌクレオチド」、又は「核酸」と呼ばれ、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡでもよい、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指す。「ポリヌクレオチド」には、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖及び二本鎖の領域の混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖、又はより典型的には、二本鎖、又は一本鎖及び二本鎖の領域の混合物でもよい）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語、ポリヌクレオチドには、１つ以上の修飾塩基を含有するＤＮＡ又はＲＮＡ、及び安定性若しくは他の理由により修飾された主鎖を有するＤＮＡ又はＲＮＡも含まれる。「修飾」塩基は、例えば、トリチル化塩基及び異常な塩基、例えば、イノシンを含む。各種の修飾が、ＤＮＡ及びＲＮＡになされてもよい。したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に認められるポリヌクレオチドの化学的、酵素的又は代謝的に修飾された形態、並びにウイルス及び細胞のＤＮＡ及びＲＮＡの特徴を有する化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、比較的短い核酸鎖（多くの場合、オリゴヌクレオチドと呼ばれる）も包含する。
【００３３】
「ベクター」とは、セグメントの複製又は発現をもたらすように、別の核酸セグメントを操作的に挿入可能な、レプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、又はウイルスのことである。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」という用語は、例えば、初代細胞、培養中の細胞、又は細胞株からの細胞のいずれのタイプの細胞であり得る。特定の実施形態では、「宿主細胞」という用語は、核酸分子でトランスフェクトされた細胞、及びそのような細胞の子孫又は潜在的子孫を指す。このような細胞の子孫は、核酸分子でトランスフェクトされた親細胞とは、例えば、宿主細胞ゲノムへの核酸分子の後続の生成又は集積において生じ得る変異又は環境影響により、同一ではないことがある。「発現」及び「生成」という用語は、本明細書において同義的に使用され、遺伝子産物の生合成を意味する。これらの用語は、遺伝子のＲＮＡへの転写を包含する。また、これらの用語は、ＲＮＡの１つ又は２つ以上のポリぺプチドへの翻訳を包含し、全ての天然の転写後及び翻訳後修飾を更に包含する。抗体又はその抗原結合フラグメントの発現又は生成は、細胞の細胞質内、又は細胞外環境、例えば、細胞培養の増殖培地内でもよい。「実質的に同じ」の意味は、この用語が使用される文脈に応じて異なる場合がある。天然の配列バリエーションが重鎖及び軽鎖並びにこれらをコードする遺伝子中におそらく存在するために、いくらかのレベルのバリエーションが本明細書に記載されたアミノ酸配列又は抗体若しくは抗原結合フラグメントをコードする遺伝子内に見出されると予測されるであろう。ただし、固有の結合特性（例えば、特異性及び親和性）にはほとんど影響しないか、又は影響しない。このような予測は、部分的には、遺伝暗号の縮重及び保存的アミノ酸配列バリエーションの進化的成功による。同バリエーションは、コードされたタンパク質の性質を認識できるほどには改変させない。したがって、核酸配列の文脈において、「実質的に同じ」は、２つ以上の配列間での少なくとも６５％の同一性を意味する。好ましくは、この用語は、２つ以上の配列間での少なくとも７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも７５％の同一性、より好ましくは、少なくとも８０％の同一性、より好ましくは、少なくとも８５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９１％の同一性、より好ましくは、少なくとも９２％の同一性、より好ましくは、少なくとも９３％の同一性、より好ましくは、少なくとも９４％の同一性、より好ましくは、少なくとも９５％の同一性、より好ましくは、少なくとも９６％の同一性、より好ましくは、少なくとも９７％の同一性、より好ましくは、少なくとも９８％の同一性、及びより好ましくは、少なくとも９９％以上の同一性を意味する。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップ数及び各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、相同性の割合（％）＝同一位置数／位置の総数×１００）。同考慮は、２つの配列の最適なアライメントを導くのに必要である。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の同一性パーセントは、例えば、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ  ４，１１〜１７（１９８８）のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。同アルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれ���おり、ＰＡＭ１２０重み付け残基テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用する。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４４〜４５３（１９７０）のアルゴリズムを使用して決定されてもよい。
【００３５】
タンパク質の機能に実質的な影響を有することなく、タンパク質のアミノ酸配列内に生じ得るバリエーションの度合いは、核酸配列のバリエーションの度合いより非常に小さい。これは、同じ縮重原理がアミノ酸配列には適用しないためである。したがって、抗体又は抗原結合フラグメントの文脈において、「実質的に同じ」は、記載された抗体又は抗原結合フラグメントに対して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する抗体又は抗原結合フラグメントを意味する。他の実施形態は、本明細書に記載された抗体及び抗原結合フラグメントと顕著な同一性を共有しないが、１つ又は２つ以上のＣＤＲ又は結合性を付与するのに必要とされる他の配列を組み込む、フレームワーク、スキャフォールド、又は他の非結合領域を有し、本明細書に記載されたこのような配列に対して、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する、ＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントを含む。
【００３６】
「結合親和性」は、概して、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総和の強さを指す。別途記載のない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体及び抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性を、概して、解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）及び平衡会合定数（ＫＡ）を含むが、これらに限定されない、当該技術分野において既知のいくつかの方法で測定及び／又は発現され得る。ＫＤはｋｏｆｆ／ｋｏｎの商から計算されるが、ＫＡはｋｏｎ／ｋｏｆｆの商から計算される。ｋｏｎは、例えば、抗原に対する抗体の会合速度定数を意味し、ｋｏｆｆは、例えば、抗原に対する抗体の解離を意味する。Ｋｏｎ及びｋｏｆｆは、表面プラズモン共鳴などの当業者に既知の手法によって決定され得る。
【００３７】
「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を意味し、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウサギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類を意味する。記載された方法の多くの実施形態において、対象はヒトである。
【００３８】
ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメント
本明細書において、ＧＩＴＲに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントが記載されている。抗体分子の全体的な構造は、抗原結合ドメインを含む。同ドメインは、重鎖及び軽鎖並びにＦｃドメインを含み、補体固定及び結合抗体受容体を含む各種の機能を果たす。
【００３９】
記載されたＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、全てのアイソタイプである、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、並びに４本鎖免疫グロブリン構造の合成多量体を含む。記載された抗体又は抗原結合フラグメントはまた、雌鳥又はシチメンチョウの血清及び雌鳥又はシチメンチョウの卵黄中に一般的に見出されるＩｇＹアイソタイプも含む。
【００４０】
ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、任意の種から組み換え手法により得ることができる。例えば、抗体又は抗原結合フラグメントは、マウス、ラット、ヤギ、ウマ、ブタ、ウシ、ニワトリ、ウサギ、ラクダ、ロバ、ヒト、又はそれらのキメラ版でもよい。ヒトへの投与において使用するために、非ヒト由来の抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト患者への投与時に、より低い抗原性となるように、遺伝的に又は構造的に改変されてもよい。
【００４１】
一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントはキメラである。本明細書で使用されるとき、「キメラ」という用語は、非ヒト哺乳類、げっ歯類、又は爬虫類の抗体アミノ酸配列に由来する少なくとも１つの可変ドメインの少なくともいくらかの部分を有する抗体又はその抗原結合フラグメントを指すが、抗体又はその抗原結合フラグメントの残り部分はヒトに由来する。
【００４２】
一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最少配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、その免疫グロブリン鎖、又はフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体の他の抗原結合部分配列）でもよい。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が所望の特異性、親和性、及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、又はウサギからの残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一般的には、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むこととなる。同可変ドメイン中、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、全て又は実質的に全てのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域である。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのＦｃのうち少なくとも一部を含んでもよい。
【００４３】
本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントは、各種の形態で存在し得るが、表１に示された抗体ＣＤＲのうち１つ又は２つ以上を含むこととなる。
【００４４】
本明細書において、ＧＩＴＲに特異的に結合する単離された抗体及び抗原結合フラグメントが記載されている。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトＩｇＧ又はその誘導体である。本明細書で例示されたＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトであるが、例示された抗体又は抗原結合フラグメントは、キメラ化されてもよい。
【００４５】
一部の実施形態では、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む重鎖と、表１に記載された抗体のうちいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む軽鎖と、を含む、ＧＩＴＲ特異的抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。
【００４６】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１２を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３９と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５５と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築体への包含に適している。
【００４７】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１３を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２９を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４０と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５６と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築物への包含に適している。
【００４８】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号１を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１４を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３０を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３７を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４１と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５７と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築物への包含に適している。
【００４９】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１５を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４２と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５５と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築物への包含に適している。
【００５０】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４３と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５５と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築体への包含に適している。
【００５１】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号８を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１７を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４４と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５５と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築体への包含に適している。
【００５２】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号９を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１８を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４５と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５５と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築体への包含に適している。
【００５３】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１９を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４６と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５５と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築体への包含に適している。
【００５４】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２０を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３１を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３４を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３８を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４７と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５８と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築体への包含に適している。
【００５５】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号３１を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３４を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３８を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４８と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５８と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築体への包含に適している。
【００５６】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２２を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号４９と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５５と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築体への包含に適している。
【００５７】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２３を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号５０と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５５と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築体への包含に適している。
【００５８】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２４を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号５１と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５５と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築体への包含に適している。
【００５９】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２５を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。
【００６０】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号５２と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５５と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築体への包含に適している。
【００６１】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２７を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２６を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号５３と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５５と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築体への包含に適している。
【００６２】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２１を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号５４と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５５と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築体への包含に適している。
【００６３】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号７を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号１６を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号６３と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５５と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築体への包含に適している。
【００６４】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号２７を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号５を含む重鎖ＣＤＲ２、配列番号２６を含む重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒトフレームワーク配列を含んでもよい。このＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、３０ｎＭ未満の親和性でＧＩＴＲに結合し得、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導し得、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導し得る。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、配列番号６４と実質的に同じか又は同一の重鎖と、配列番号５５と実質的に同じか又は同一の軽鎖とを含む。この段落において検討された抗体の重鎖及び軽鎖は、１つのアームが抗ＧＩＴＲアームである二重特異性構築体への包含に適している。
【００６５】
ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体又は抗原結合フラグメントをコードする単離されたポリヌクレオチドもまた開示される。本明細書で提供された可変ドメインセグメントをコード可能な単離されたポリヌクレオチドは、抗体又は抗原結合フラグメントを生成する同一の又は異なるベクターに含まれてもよい。
【００６６】
組み換え抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドもまた、本開示の範囲内である。一部の実施形態では、記載されたポリヌクレオチド（及びこのポリヌクレオチドがコードするペプチド）は、リーダー配列を含む。当技術分野において既知の任意のリーダー配列を利用することができる。リーダー配列には、制限部位又は翻訳開始部位を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００６７】
本明細書に記載されたＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、記載されたＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントの生物学的特性（例えば、結合親和性又は免疫エフェクター活性）を保持している、１つ又は複数のアミノ酸置換、欠失、又は付加を有する変異体を含む。これらの変異体としては、（ａ）１つ又は２つ以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的アミノ酸により置換されている変異体、（ｂ）１つ又は２つ以上のアミノ酸がポリペプチドに付加され、又は同ポリペプチドから欠失されている変異体、（ｃ）１つ又は２つ以上のアミノ酸が置換基を含む変異体、及び（ｄ）ポリペプチドが別のペプチド又はポリペプチド、例えば、融合パートナー、タンパク質タグ、又は他の化学部分と融合した変異体、を挙げることができる。これらは、ポリペプチドに有用な特性、例えば、抗体に対するエピトープ、ポリヒスチジン配列、ビオチン部分等を付与してもよい。本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントは、保存的又は非保存的位置のいずれかにおいてある種からのアミノ酸残基が別の種における対応する残基に置換されている変異体を含んでもよい。他の実施形態では、非保存的位置におけるアミノ酸残基は、保存的又は非保存的残基により置換される。これらの変異体を得るための手法は、遺伝的（欠失、変異等）、化学的、及び酵素的手法を含めて、当業者に既知である。
【００６８】
本明細書に記載されたＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、複数の抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを具現化することができる。一部の実施形態では、抗体アイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプ、好ましくは、ＩｇＧ１アイソタイプである。抗体又はその抗原結合フラグメントの特異性は、ＣＤＲのアミノ酸配列及び配置により主に決定される。したがって、あるアイソタイプのＣＤＲは、抗原特異性を変化させることなく、別のアイソタイプに変更することができる。あるいは、抗原特異性を変化させることなく、ハイブリドーマに、ある抗体アイソタイプを別のものにスイッチさせる技術（アイソタイプスイッチング）が確立されてきた。したがって、このような抗体アイソタイプは、記載された抗体又は抗原結合フラグメントの範囲内にある。
【００６９】
本明細書に記載されたＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、約３０ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）を含む、ＧＩＴＲに対する結合親和性を有する。記載されたＧＩＴＲ特異的抗体、又は抗原結合フラグメントの親和性は、表面プラズモン共鳴又はＥＬＩＳＡベースの方法など、当技術分野において既知の各種の方法によって決定されることができる。ＳＰＲにより親和性を測定するためのアッセイは、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００機器を使用して行われるアッセイを含む。この場合、このアッセイは、室温（例えば、２５℃又は２５℃付近）で行われる。ＧＩＴＲに結合可能な抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅセンサチップ上に、抗Ｆｃ抗体（例えば、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異的抗体、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｒｏｄ＃  １０９−００５−０９８）により、７５ＲＵ付近のレベルで捕捉され、続けて、４０μＬ／分の流量において、会合及び解離データが収集される。
【００７０】
本明細書に記載されたポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供される。ベクターは、発現ベクターであり得る。このため、対象となるポリペプチドをコードする配列を含有する組み換え発現ベクターは、本開示の範囲内であると想到される。発現ベクターは、１つ又は２つ以上の追加配列を含有してもよい。同追加配列には、例えば、制御配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）、選択マーカー、及びポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。広い各種の宿主細胞を形質転換するためのベクターは周知であり、プラスミド、ファージミド、コスミド、バキュロウイルス、バクミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、並びに、他の細菌、酵母、及びウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
本説明の範囲内にある組み換え発現ベクターは、適切な調節エレメントに操作可能に連結することができる少なくとも１つの組み換えタンパク質をコードする、合成的、遺伝的、又はｃＤＮＡ由来の核酸フラグメントを含む。このような調節エレメントには、転写プロモータ、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終了を制御する配列を挙げることができる。発現ベクター、特に、哺乳類の発現ベクターはまた、１つ又は２つ以上の非転写エレメント、例えば、複製の起点、発現される遺伝子に連結された適切なプロモータ及びエンハンサー、他の５’又は３’フランキング非転写配列、５’又は３’非翻訳配列（例えば、必須リボソーム結合部位）、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、又は転写終了配列を含んでもよい。宿主において複製する能力を付与する複製の起点もまた包含されてもよい。
【００７２】
脊椎動物細胞を形質転換するのに使用される発現ベクター中の転写及び翻訳コントロール配列は、ウイルスソースにより提供することができる。例示的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，３  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２８０（１９８３）に記載されたように構築されてもよい。
【００７３】
一部の実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメントのコード配列は、強力な構成的プロモータ、例えば、下記遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ベータアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン等のためのプロモータの制御下に置かれる。加えて、多くのウイルスプロモータが、真核細胞中で構成的に機能し、記載された実施形態での使用に適している。このようなウイルスプロモータには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモータ、ＳＶ４０の初期及び後期プロモータ、マウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、モロニー白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、及び他のレトロウイルスの長端末反復配列（ＬＴＲ）、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモータが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＧＩＴＲ特異的抗体又はその抗原結合フラグメントのコード配列は、誘引性プロモータ、例えば、メタロチオネインプロモータ、テトラサイクリン誘引性プロモータ、ドキシサイクリン誘引性プロモータ、１つ又は２つ以上のインターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）、例えば、プロテインキナーゼＲ２’，５’−オリゴアデニレート合成酵素、ＭＸ遺伝子、ＡＤＡＲ１等を含有するプロモータの制御下に置かれる。
【００７４】
本明細書に記載されたベクターは、１つ又は２つ以上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有してもよい。ＩＲＥＳ配列の融合ベクター内への包含は、一部のタンパク質の発現を向上させるのに有益であり得る。一部の実施形態では、ベクター系は、１つ又は２つ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含むこととなる。同部位は、前述の核酸配列のうちいずれかの上流又は下流にあってもよい。ベクターのコンポーネントは、近接して連結されてもよく、又は遺伝子産物を発現させるのに最適な間隔を提供するように（すなわち、ＯＲＦ間に「スペーサ」ヌクレオチドを導入することにより）配置されてもよく、若しくは別の方法で位置付けられてもよい。調節エレメント、例えば、ＩＲＥＳモチーフはまた、発現に最適な間隔を提供するように配置されてもよい。
【００７５】
ベクターは、当技術分野において既知の選択マーカーを含んでもよい。選択マーカーには、陽性及び陰性選択マーカー、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子（例えば、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子、テトラサイクリン抵抗性遺伝子、ペニシリン抵抗性遺伝子）、グルタミン酸合成酵素遺伝子、ガンシクロビル選択用のＨＳＶ−ＴＫ、ＨＳＶ−ＴＫ誘導体、又は６−メチルプリン選択用の細菌のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（Ｇａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，７  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１７３８〜１７４３（２０００））が挙げられる。選択マーカーをコードする核酸配列又はクローニング部位は、対象となるポリペプチドをコードする核酸配列又はクローニング部位の上流又は下流にあってもよい。
【００７６】
本明細書に記載されたベクターを使用して、記載された抗体又は抗原結合フラグメントをコードする遺伝子で、種々の細胞を形質転換することができる。例えば、ベクターを使用して、ＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントの生成細胞を生じさせることができる。このため、別の態様は、ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント、例えば、本明細書に記載され、例示された抗体又は抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含むベクターで形質転換された宿主細胞を特徴とする。
【００７７】
外来性遺伝子を細胞内に導入するための数多くの手法が、当技術分野において既知であり、本明細書に記載され、例示された種々の実施形態に従って、記載された方法を行う目的で組み換え細胞を構築するのに使用することができる。使用される手法により、異種遺伝子配列を宿主細胞に安定して導入すべきであり、その結果、異種遺伝子配列は、細胞の子孫により遺伝され、発現されることができ、レシピエント細胞の必須の成育及び生理学的機能が損なわれない。使用することができる手法としては、染色体導入法（例えば、細胞融合、染色体媒介性遺伝子導入、マイクロ細胞媒介性遺伝子導入）、物理的方法（例えば、トランスフェクション、スフェロプラスト融合、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム担体）、ウイルスベクター導入（例えば、組み換えＤＮＡウイルス、組み換えＲＮＡウイルス）等が挙げられる（Ｃｌｉｎｅ，２９  Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６９〜９２（１９８５）に記載）が、これらに限定されない。哺乳類細胞による細菌プロトプラストのリン酸カルシウム沈殿及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘因融合を使用しても、細胞を形質転換することができる。
【００７８】
本明細書に記載されたＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントの発現に使用するのに適した細胞は、好ましくは、真核細胞、より好ましくは、植物、げっ歯類、又はヒト起源の細胞である。これらの細胞には、とりわけ、例えば、ＮＳＯ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ｐｅｒＣ．６、Ｔｋ−ｔｓ１３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ−７、Ｔ９８Ｇ、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＮＳ１、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞、及びＢＨＫ細胞株等が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、抗体の発現は、ハイブリドーマ細胞を使用して達成されてもよい。ハイブリドーマを生成するための方法は、当技術分野において十分確立されている。
【００７９】
本明細書に記載された発現ベクターにより形質転換された細胞は、本明細書に記載された抗体又は抗原結合フラグメントの組み換え発現について選択され、又はスクリーニングされてもよい。組み換え陽性細胞は、タンパク質改変又は変化させた翻訳後修飾により、所望の表現型、例えば、高レベルの発現、向上した増殖特性、又は所望の生化学的特性を有するタンパク質を生成する能力を示すサブクローンについて、増殖され、スクリーニングされる。これらの表現型は、所与のサブクローンの本来の特性又は変異により得る。変異は、化学薬品、ＵＶ波長光、照射、ウイルス、挿入変異、ＤＮＡミスマッチ修復の阻害、又はこのような方法の組み合わせにより得られる。
【００８０】
処置のためにＧＩＴＲ特異的抗体を使用する方法
本明細書において、治療に使用するための、ＧＩＴＲ特異的抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。特に、これらの抗体又は抗原結合フラグメントは、がんを処置するのに有用であり得る。したがって、本発明は、本明細書に記載されたとおりの抗体、例えば、ＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントを投与することを含むがんを処置する方法を提供する。ＧＩＴＲ生物学の２つの態様は、それらを様々ながんの処置の潜在的な標的としている。まずは、上記で詳しく記載したように、ＧＩＴＲ活性化が免疫系を活性化することである。更に、ＧＩＴＲ発現エフェクターＴ細胞及び制御性Ｔ細胞は、複数の腫瘍タイプに浸潤するが、非造血細胞上にＧＩＴＲの発現はほとんど又は全く存在しない。この分布プロファイルは、ＧＩＴＲ発現細胞が腫瘍に集中し得ることを意味する。この活性化及び分布の組み合わせは、総じて、ＧＩＴＲの標的化を各種のがんの処置ための魅力的なアプローチにしている。抗原結合タンパク質を使用して、固形腫瘍並びに白血病を含む血液がんの両方を処置することができる。
【００８１】
これらの方法において使用する抗体には、本明細書に前述したもの、例えば、表１及びこれらの抗体の更なる検討において列記された特徴、例えば、ＣＤＲ又は可変ドメイン配列を有するＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントが含まれる。
【００８２】
本明細書に記載された一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体の免疫エフェクター特性は、当業者に既知の手法によるＦｃ改変によって改変され得る。例えば、Ｆｃエフェクター機能、例えば、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介性貪食（ＡＤＣＰ）、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）のダウンレギュレーション等が、これらの活性を担うＦｃ中の残基を改変することにより提供され、かつ／又は制御され得る。
【００８３】
「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」又は「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現している非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上に結合した抗体を認識し、続けて、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。
【００８４】
ＡＤＣＣを誘導するモノクローナル抗体の能力は、そのオリゴ糖成分を操作することにより向上され得る。ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３は、Ａｓｎ２９７においてＮ−グリコシル化される。ここで、グリカンの大部分は、周知の二分岐Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１、Ｇ１Ｆ、Ｇ２、又はＧ２Ｆの形態にある。遺伝子操作されていないＣＨＯ細胞により生成される抗体は、典型的には、少なくとも約８５％のグリカンフコース含量を有する。Ｆｃ領域に付着した二分岐の複雑なタイプのオリゴ糖からのコアフコースの除去により、改善されたＦｃ．ガンマ．ＲＩＩＩａ結合を介して、抗原結合性又はＣＤＣ活性を変化させることなく、抗体のＡＤＣＣが向上される。このようなｍＡｂは、二分岐の複雑なタイプのＦｃオリゴ糖を有する、比較的高い脱フコシル化抗体の成功した発現をもたらすことが報告された種々の方法、例えば、培養浸透圧の制御（Ｋｏｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６４：２４９〜６５，２０１２）、宿主細胞株としての変異体ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３の適用（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３〜２６７４０，２００２）、宿主細胞株としての変異体ＣＨＯ株ＥＢ６６の適用（Ｏｌｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ；２（４），２０１０、Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ、ＰＭＩＤ：２０５６２５８２）、宿主細胞株としてのラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０の適用（Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６〜３４７３，２００３）、アルファ．１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）遺伝子に対して特異的な低分子干渉ＲＮＡの導入（Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８８：９０１〜９０８，２００４）、又はベータ−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩとゴルジアルファ−マンノシダーゼＩＩとの共発現又は強力なアルファ−マンノシダーゼＩ阻害剤であるキフネンシン（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：５０３２〜５０３６；２００６、Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９３：８５１〜８６１，２００６；Ｘｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９９：６５２〜６５，２００８）を使用して達成され得る。
【００８５】
本明細書において記載された一部の実施形態では、ＧＩＴＲ抗体により引き出されたＡＤＣＣはまた、抗体Ｆｃ中の特定の置換によって向上され得る。例示的な置換は、例えば、米国特許第６，７３７，０５６号に記載されたように、アミノ酸位置２５６、２９０、２９８、３１２、３５６、３３０、３３３、３３４、３６０、３７８、又は４３０（ＥＵインデックスに従った残基番号付け）における置換である。
【００８６】
薬学的組成物及び投与
本明細書で提供された医薬組成物は、ａ）有効量の本発明のＧＩＴＲ特異的抗体又は抗体フラグメントと、ｂ）不活性でも又は生理学的に活性でもよい医薬的に許容され得る担体と、を含む。好ましい実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体は、本明細書に記載されるＧＩＴＲ特異的抗体又はその抗原結合フラグメントである。本明細書で使用されるとき、「医薬的に許容され得る担体」という用語は、生理学的に適合性である、任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、及び抗真菌剤等を含む。適切な担体、希釈剤、及び／又は賦形剤の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等のうち１種又は２種以上、並びにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。多くの場合には、等張性剤、例えば、糖、ポリアルコール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。特に、適切な担体の関連する例には、（１）ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ約７．４、約１ｍｇ／ｍＬ〜２５ｍｇ／ｍＬヒト血清アルブミンを含有又は非含有、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ｗ／ｖ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ））、及び（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロース、が挙げられ、抗酸化剤、例えば、トリプタミン、及び安定化剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）をも含有してもよい。
【００８７】
本明細書における組成物はまた、処置される特定の疾患にとって必要な場合には、更なる治療剤を含有してもよい。好ましくは、ＧＩＴＲ特異的抗体又は抗体フラグメントと補助的な活性化合物とは、互いに有害な影響を及ぼさない補完的な活性を有する。好ましい実施形態では、更なる治療剤は、シタラビン、アントラサイクリン、ヒスタミン二塩酸塩、又はインターロイキン２である。好ましい実施形態では、更なる治療剤は、化学療法剤である。
【００８８】
本発明の組成物は、各種の形態でもよい。これらには、例えば、液体、半固体、及び固体の剤形が挙げられるが、好ましい形態は、意図された投与方式及び治療用途により決まる。典型的に好ましい組成物は、注射可能な溶液又は注入可能な溶液の形態である。好ましい投与方式は、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下）である。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、静脈内に、ボーラスとして又は一定期間にわたる連続的な注入により投与される。別の好ましい実施形態では、本組成物は、局所及び全身性の治療効果を発揮するために、筋肉内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、腫瘍内、腫瘍周囲、病巣内、又は病巣周囲の経路により投与される。
【００８９】
非経口投与用の無菌組成物が、本発明の抗体、抗体フラグメント、又は抗体コンジュゲートを、必要とされる量で適切な溶媒に包含させ、続けて、マイクロフィルター法により滅菌することにより調製され得る。溶媒又は賦形剤として、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、並びにこれらの組み合わせを使用することができる。多くの場合には、等張性剤、例えば、糖、ポリアルコール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。これらの組成物はまた、補助剤、特に、湿潤剤、等張化剤、乳化剤、分散剤、及び安定化剤を含有してもよい。非経口投与用の無菌組成物はまた、使用時に滅菌水又は任意の他の注射可能な菌媒体中に溶解されてもよい、無菌の固体組成物の形態に調製されてもよい。
【００９０】
ＧＩＴＲ特異的抗体又は抗体フラグメントはまた、経口投与されてもよい。経口投与用の固体組成物として、錠剤、丸剤、粉末剤（ゼラチンカプセル剤、サッシェ剤）、又は顆粒剤が使用されてもよい。これらの組成物において、本発明による活性成分は、１つ又は２つ以上の不活性な希釈剤、例えば、デンプン、セルロース、スクロース、ラクトース、又はシリカと、アルゴン流下において混合される。これらの組成物はまた、希釈剤以外の物質、例えば、１つ又は２つ以上の潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム又はタルク、着色剤、コーティング（糖衣錠）、あるいはグレーズを含んでもよい。
【００９１】
経口投与用の液体組成物として、不活性な希釈剤、例えば、水、エタノール、グリセロール、植物油、又はパラフィンオイルを含有する、医薬的に許容され得る液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、及びエリキシル剤が使用されてもよい。これらの組成物は、希釈剤以外の物質、例えば、湿潤剤、甘味料、増粘剤、着香剤、又は安定化製品を含んでもよい。
【００９２】
用量は、所望の効果、治療の期間、及び使用される投与経路により決まる。用量は、一般的には、成人１日あたりに経口で５ｍｇ〜１０００ｍｇであり、単位用量は、活性物質１ｍｇ〜２５０ｍｇの範囲である。一般的には、医師は、適切な用量を、処置される対象の年齢、体重、及び同対象に固有の任意の他の要因に応じて決定する。
【００９３】
また、本明細書において、Ｔｒｅｇ細胞を必要とする患者にＡＤＣＣ活性を有するＧＩＴＲ特異的抗体を投与することによってＴｒｅｇ細胞を殺傷するための方法であって、免疫細胞を補充してＧＩＴＲ発現Ｔｒｅｇ細胞を殺傷することができる、方法が提供される。本発明のＧＩＴＲ特異的抗体又は抗体フラグメントのいずれかは、治療的に使用されてもよい。好ましい実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体は、本明細書に記載されるＧＩＴＲ特異的抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００９４】
好ましい実施形態では、本発明のＧＩＴＲ特異的抗体又は抗体フラグメントは、哺乳類における過剰増殖性障害を処置するために使用される。より好ましい実施形態では、本発明のＧＩＴＲ特異的抗体又は抗体フラグメントを含有する、上記で開示された医薬組成物のうち１つは、哺乳類における過剰増殖性障害を処置するために使用される。一実施形態において、この障害は、がんである。各種の異なるがん性腫瘍が、ＧＩＴＲ陽性免疫細胞を含有することが実証されている。したがって、これらの腫瘍は特に魅力的な標的である。このような腫瘍としては、例えば、黒色腫（ステージＩＩＩ及びステージＩＶの悪性黒色腫を含む）、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（non-small cell lung cancer、ＮＳＣＬＣ）、頭頸部がん、前立腺がん、腎細胞がん、及び大腸直腸がんが挙げられる。好ましい実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体は、本明細書に記載されるＧＩＴＲ特異的抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【００９５】
抗原結合タンパク質で処置され得る他のがんとしては、乳房、前立腺、子宮内膜、膀胱、腎臓、食道、精巣、卵巣、膀胱、扁平上皮細胞がん（例えば、頭部及び頸部の扁平上皮細胞がん（squamous cell carcinoma of the head and neck、ＳＣＣＨＮ）、ブドウ膜黒色腫、濾胞性リンパ腫、子宮頸部、脳、膵臓、肝臓、リンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫、胃がん、並びに星細胞系のがん（astrocyctic cancer）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
前述のがんのいずれかを処置する際、提供される処置方法を利用して、更なる腫瘍増殖を阻害し、腫瘍退縮を誘導し、無増悪生存期間を増加させ、並びに／又は腫瘍を有する個体における全生存期間を延長することができる。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体はまた、転移の発症を遅延又は防止し得る。各種の方法を使用して、処置の進行をモニタすることができる。例えば、阻害は、腫瘍サイズの減少及び／又は腫瘍内の代謝活性の低下をもたらし得る。これらのパラメータの両方は、例えば、ＭＲＩ又はＰＥＴスキャンによって測定され得る。阻害はまた、腫瘍内の壊死のレベル、腫瘍細胞死、及び血管分布のレベルを確認する生検によってモニタされ得る。転移の程度は、既知の方法を使用してモニタされ得る。したがって、本発明の医薬組成物は、黒色腫、肺、頭部及び頸部、腎細胞、大腸直腸、乳房、前立腺、子宮内膜、膀胱、腎臓、食道、精巣、卵巣、扁平上皮細胞がん（例えば、頭部及び頸部の扁平上皮細胞がん（squamous cell carcinoma of the head and neck、ＳＣＣＨＮ）、ブドウ膜黒色腫、濾胞性リンパ腫、子宮頸部、脳、膵臓、肝臓、リンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫、胃、並びに星細胞（astrocyctic）が含まれるが、これらに限定されない、各種のがんの処置又は転移の防止に有用である。
【００９７】
同様に、本明細書において、選択された細胞集団の増殖を阻害するための方法であって、ＧＩＴＲ発現免疫細胞を、有効量の本発明のＧＩＴＲ特異的抗体又は抗体フラグメントと、単独で、又は他の治療剤との組み合わせにおいてかのいずれか一方で、接触させることを含む、方法が更に提供される。好ましい実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体は、本明細書に記載されるＧＩＴＲ特異的抗体又はその抗原結合フラグメントである。好ましい実施形態では、更なる治療剤は免疫療法、すなわち、免疫応答を誘導又は向上させる免疫刺激剤である。このような薬剤としては、例えば、１）樹状細胞の活性化剤、２）ワクチンアジュバント、３）Ｔ細胞刺激剤、４）免疫チェックポイント阻害剤、並びに５）抑制細胞、サイトカイン、及び／又は酵素の阻害剤が挙げられ得る。
【００９８】
一実施形態では、免疫刺激剤は、がんワクチンである。がん関連抗原からなるがんワクチンに加えて、ＧＩＴＲ特異的抗体との組み合わせで有用なワクチンとしては、限定はされないが、ＧＭ−ＣＳＦ  ＤＮＡ及び細胞ベースのワクチン、樹状細胞ワクチン、組み換えウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）ワクチン、並びに熱ショックタンパク質（heat shock protein、ＨＳＰ）ワクチンが挙げられる。有用なワクチンとしては、黒色腫細胞から形成されたものなどの腫瘍ワクチンも挙げられ、自家又は同種であってもよい。ワクチンは、例えば、ペプチド、ＤＮＡ、又は細胞由来であってもよい。一実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体は、ＣＤ８／ＣＤ４  Ａｇ特異的ペプチドワクチンとの組み合わせで投与される。
【００９９】
臨床的な使用について、治療的に有効な量のＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントがそれを必要とする対象に投与される。例えば、ＧＩＴＲ特異的抗体及びその抗原結合フラグメントは、ＧＩＴＲ陽性免疫細胞を含有するがん性腫瘍の処置において有用であり得る。好ましい実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体は、本明細書に記載されるＧＩＴＲ特異的抗体又はその抗原結合フラグメントである。一部の実施形態では、対象は、哺乳類、好ましくは、ヒトである。一部の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、無菌試験済みの溶液として投与される。
【０１００】
処置及び使用の上記方法における投与計画は、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節される。例えば、単一ボーラスを投与してもよく、いくつかの分離用量を、時間をかけて投与してもよく、又は用量を治療状況の緊急性によって示されるように、比例して減少又は増加させてよい。非経口組成物は、投与しやすくしかつ用量を均一にするために、投与単位の形態に製剤化されてもよい。
【０１０１】
ＧＩＴＲ特異的抗体及びフラグメントの効率的な投与及び投与計画は、処置される疾患又は状態により決まり、当業者により決定されてもよい。本発明の化合物の治療的に有効な量の例示的で非限定的な範囲は、約０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１〜５ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１〜２ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．００１、約０．０１、約０．１、約１、又は約１０ｍｇ／ｋｇである。
【０１０２】
当技術分野において通常の技能を有する医師又は獣医師は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、医薬組成物中で用いるＧＩＴＲ特異的抗体又はフラグメントの用量を、所望の治療効果を達成するのに必要されるレベルよりも少ないレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることができる。一般的には、本発明のＧＩＴＲ特異的抗体の適切な１日用量は、治療効果を生じさせるのに有効な最も少ない用量である化合物量である。投与は、例えば、非経口、例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下でもよい。一実施形態において、ＧＩＴＲ特異的抗体又はフラグメントは、ｍｇ／ｍ２で算出された１週用量で注入により投与されてもよい。このような用量は、例えば、下記：用量（ｍｇ／ｋｇ）×７０に従って、上記で提供されたｍｇ／ｋｇ用量に基づくことができる。このような投与は、例えば、１〜８回、例えば、３〜５回繰り返されてもよい。投与は、２〜２４時間、例えば、２〜１２時間の期間にわたる連続的な注入により行われてもよい。一実施形態において、ＧＩＴＲ特異的抗体又はフラグメントは、毒性の副作用を減少させるために、長期間、例えば、２４時間超にわたるゆっくりとした連続的な注入により投与されてもよい。
【０１０３】
一実施形態において、ＧＩＴＲ特異的抗体又はフラグメントは、１週間に１回で与えられる場合、最大８回、例えば、４〜６回の固定用量として算出された１週用量で投与されてもよい。このような計画は、例えば、６ケ月又は１２ケ月後に、必要に応じて１回又は２回以上繰り返されてもよい。このような固定用量は、例えば、上記で提供されたｍｇ／ｋｇ用量に基づくことができる。ここで、体重は、７０ｋｇと仮定する。用量は、例えば、生体サンプルを採取し、本発明のＧＩＴＲ特異的抗体のＧＩＴＲ抗原結合領域を標的にする抗イディオタイプ抗体を使用することによって、本発明のＧＩＴＲ特異的抗体の投与時の血中量を測定することにより、決定又は調節されてもよい。
【０１０４】
一実施形態において、ＧＩＴＲ特異的抗体又はフラグメントは、例えば、６ケ月又はそれ以上の期間にわたり週一回等の維持療法により投与されてもよい。
【０１０５】
ＧＩＴＲ特異的抗体又はフラグメントはまた、がんの進行リスクを低下させ、がんの進行におけるイベントの発生の開始を遅延させ、かつ／又はがんが緩解した際の再発リスクを低下させるために、予防的に投与されてもよい。
【０１０６】
本明細書に記載されたＧＩＴＲ特異的抗体及びそのフラグメントはまた、併用療法において投与されてもよい、すなわち、処置される疾患又は状態に関連する他の治療剤と組み合わせられてもよい。したがって、一実施形態において、抗体含有医薬は、１種又は２種以上の他の治療剤、例えば、化学療法剤と組み合わせるためのものである。一部の実施形態では、他の治療剤としては、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、及びクロラムブシル）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、及びセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ））；Ｔｅｍｏｄａｌ（商標）（テモゾラミド）、エチレンイミン／メチルメラミン（例えば、トリエチレンメラミン（thriethylenemelamine）（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホルアミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレトアミン）；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）；トリアジン（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ））；葉酸類似体（例えば、メトトレキサート及びトリメトレキサート）、ピリミジン類似体（例えば、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ，シタラビン）、５−アザシチジン、２、２’−ジフルオロデオキシシチジン）、プリン類似体（例えば、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルマイシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、リン酸フルダラビン、及び２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ））を含む代謝拮抗剤；抗有糸分裂薬（例えば、パクリタキセル）、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチン、及びビノレルビン含む）、タキソテレ、エストラムスチン、及びリン酸エストラムスチンを含む天然物；ピポドフィロトキシン（pipodophylotoxins）（例えば、エトポシド及びテニポシド）；抗生物質（例えば、アクチモマイシンＤ（actimomycin D）、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシンＣ、及びアクチノマイシン；酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）；生体応答修飾剤（例えば、インターフェロン−アルファ、ＩＬ−２、Ｇ  ＣＳＦ、及びＧＭ  ＣＳＦ）；プラチナ配位複合体（例えば、シスプラチン及びカルボプラチン）、アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）、置換尿素（例えば、ヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン派生物（Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）及びプロカルバジン含む）、副腎皮質抑制剤（例えば、ミトタン（ｏ，ｐ−ＤＤＤ））、及びアミノグルテチミドを含む雑薬剤（miscellaneous agent）；副腎皮質ステロイドアンタゴニスト（例えば、プレドニゾン及び等価物）、デキサメタゾン、並びにアミノグルテチミドを含むホルモン及びアンタゴニスト；Ｇｅｍｚａｒ（商標）（ゲムシタビン）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、及び酢酸メゲストロール）；エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロ��ル及びエチニルエストラジオール等価物）；抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）；アンドロゲン（プロピオン酸テストステロン及びフルオキシメステロン／等価物含む）；抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモンの類似体、及びロイプロリド）；並びに非ステロイド的抗アンドロゲン（例えば、フルタミド）を含む、アルキル化剤を含む抗腫瘍剤が挙げられるが、これらに限定されない。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、脱メチル化剤（例えば、Ｖｉｄａｚａ）、及び転写抑制解除（ＡＴＲＡ）療法を含むが、これらに限定されない、エピジェネティック機構を標的とする療法も、ＧＩＴＲ抗体と組み合わせることができる。
【０１０７】
化学療法剤の追加の特異的例としては、タキソール、タキセン（taxenes）（例えば、ドセタキセル及びＴａｘｏｔｅｒｅ）、変性パクリタキセル（例えば、Ａｂｒａｘａｎｅ及びＯｐａｘｉｏ）ドキソルビシン、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｓｕｔｅｎｔ、Ｎｅｘａｖａｒ、及び他の多種キナーゼ阻害剤、シスプラチン及びカルボプラチン、エトポシド、ゲムシタビン、並びにビンブラスチンが挙げられる。ＭＡＰＫ経路阻害剤（例えば、ＥＲＫ、ＪＮＫ、及びｐ３８の阻害剤）、ＰＩ３キナーゼ／ＡＫＴ阻害剤、並びにＰｉｍ阻害剤を含むが、これらに限定されない他のキナーゼの特異的阻害剤をＧＩＴＲ抗体と組み合わせて使用することもできる。他の阻害剤としては、Ｈｓｐ９０阻害剤、プロテアソーム阻害剤（例えば、Ｖｅｌｃａｄｅ）、及びＴｒｉｓｅｎｏｘなどの複数の作用機序の阻害剤が挙げられる。
【０１０８】
このような組み合わせ投与は、同時、任意の順序において、別々又は連続的でもよい。同時投与では、薬剤は、必要に応じて、１つの組成物又は別々の組成物として投与されてもよい。
【０１０９】
一実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体又はそのフラグメントは、別の免疫調節剤との組み合わせで投与され、免疫調節剤は、例えば、ＣＤ４０リガンド及び抗ＣＤ４０アゴニスト抗体などの樹状細胞活性化剤と、抗原提示のエンハンサー、Ｔ細胞指向性のエンハンサー、ＴＧＦ−β（トランスホーミング増殖因子ベータ）などの腫瘍関連免疫抑制因子の阻害剤、及びＩＬ−１０からなる群から選択され得る。
【０１１０】
いくつかの方法は、ＧＩＴＲ特異的抗体又はそのフラグメントをワクチンアジュバントと共に投与することを含む。このようなアジュバントとしては、例えば、ＩＬ−１２と種々のＴｏｌｌ様受容体（Toll Like Receptor、ＴＬＲ）アゴニストとが挙げられ、ＴＬＲアゴニストには、ＣｐＧ（ＴＬＲ９アゴニスト）、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ−ＴＬＲ４アゴニスト）、ポリＩ：Ｃ又はポリＩＣＬＣ（ＴＬＲ３アゴニスト）、並びにレシキモド及び８５２Ａ（ＴＬＲ７／８アゴニスト）が含まれる。
【０１１１】
他の治療的アプローチでは、ＧＩＴＲ特異的抗体は、ＩＬ−１５及び／若しくはＩＬ−１７、又はこれらの分子の活性化剤などのＴ細胞増殖因子との組み合わせで投与される。関連する方法では、Ｔ細胞刺激剤がＧＩＴＲ抗体と組み合わせられる。このような刺激剤としては、アゴニスト抗４−１ＢＢ抗体などの４−１ＢＢのアゴニスト、及び４−１ＢＢＬが挙げられる。
【０１１２】
一実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体又はそのフラグメントは、Ｔ細胞チェックポイント阻害剤、例えば、免疫系に阻害シグナルを送る分子と共に投与される。このような薬剤の例としては、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）及びＭＫ−３４７５（Ｍｅｒｃｋ）としても知られるペンブロリズマブ、ピジリズマブ（Ｃｕｒｅｔｅｃｈ）、ＡＭＰ−２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）を含む抗ＰＤ−１抗体、並びにＭＰＤＬ３２８０Ａ（Ｒｏｃｈｅ）、ＭＤＸ−１１０５（Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＭＥＤＩ−４７３６（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、及びＭＳＢ−００１０７１８Ｃ（Ｍｅｒｃｋ）を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体などのＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）の阻害剤が挙げられる。他のチェックポイント阻害剤としては、抗ＣＴＬＡ−４抗体などのＣＴＬＡ−４のアンタゴニストが挙げられる。例示的な抗ＣＴＬＡ４抗体は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂより市販されているＹｅｒｖｏｙ（登録商標）（イピリムマブ）である。他の例示的なＣＴＬＡ−４抗体としては、トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）、チシリムマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、及びＡＭＧＰ−２２４（Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）が挙げられる。
【０１１３】
更に他の方法では、ＧＩＴＲ特異的抗体又はそのフラグメントは、免疫抑制効果を有する酵素の阻害剤との組み合わせで投与される。一例は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼの小分子阻害剤である１−メチルトリプトファン（1-methyl tryptophan、１ＭＴ）である。
【０１１４】
ＧＩＴＲ特異的抗体又はそのフラグメントはまた、ＡｍｇｅｎによるＴ−ＶＥＣ（腫瘍溶解性免疫療法薬）との組み合わせで使用され得る。
【０１１５】
特定の実施形態では、ＧＩＴＲ特異的抗体又はそのフラグメントは、二重特異性抗体との組み合わせで投与される。二重特異性抗体は、宿主の免疫系、特に、Ｔ細胞の細胞毒性活性をがん細胞に対して指向させ得る。
【０１１６】
ＧＩＴＲ特異的抗体又はそのフラグメントはまた、各種の標的治療との組み合わせで投与され得る。標的治療の例としては、治療用抗体の使用が挙げられるが、これに限定されない。例示的な抗体としては、細胞表面タンパク質Ｈｅｒ２、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ３３、ムチン様糖タンパク質、及び腫瘍細胞、ＯＸ４０、ＰＤ−１、ＣＤ１２２、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ−４上に存在する表皮増殖因子受容体（epidermal growth factor receptor、ＥＧＦＲ）に結合し、任意選択的に、これらのタンパク質を発現する腫瘍細胞に対して細胞増殖抑制効果及び／又は細胞毒性効果を誘導するものが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な抗体はまた、乳がん及び他の形態のがんを処置するために使用され得るＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（トラスツズマブ）、並びに非ホジキンスリンパ腫及び他の形態のがんの処置に使用され得るＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（リツキシマブ）、ＺＥＶＡＬＩＮ（商標）（イブリツモマブチウキセタン）、及びＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（商標）（エプラツズマブ）が挙げられる。特定の例示的な抗体としてはまた、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標））、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（ＩＭＣ−Ｃ２２５）；ＢＥＸＸＡＲ（商標）（ヨード１３１トシツモマブ）；ＫＤＲ（キナーゼドメイン受容体）阻害剤；抗ＶＥＧＦ抗体及びアンタゴニスト（例えば、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）及びＶＥＧＡＦ−ＴＲＡＰ）；抗ＶＥＧＦ受容体抗体及び抗原結合領域；抗Ａｎｇ−１及びＡｎｇ−２抗体並びに抗原結合領域；Ｔｉｅ−２に対する抗体並びに他のＡｎｇ−１及びＡｎｇ−２受容体；Ｔｉｅ−２リガンド；Ｔｉｅ−２キナーゼ阻害剤に対する抗体；Ｈｉｆ−１ａの阻害剤、並びにＣａｍｐａｔｈ（商標）（アレムツズマブ）が挙げられる。特定の実施形態では、がん治療剤は、ＴＮＦ関連ポリペプチドＴＲＡＩＬを含むが、これに限定されない、腫瘍細胞において選択的にアポトーシスを誘導するポリペプチドである。
【０１１７】
一実施形態では、本明細書に提供されるＧＩＴＲ特異的抗体又はそのフラグメントは、血管新生を減少させる１つ又は２つ以上の抗血管新生剤との組み合わせで使用される。特定のこれらの薬剤としては、ＩＬ−８アンタゴニスト；Ｃａｍｐａｔｈ、Ｂ−ＦＧＦ；ＦＧＦアンタゴニスト；Ｔｅｋアンタゴニスト（Ｃｅｒｒｅｔｔｉら、米国特許出願公開第２００３／０１６２７１２号；Ｃｅｒｒｅｔｔｉら、米国特許第６，４１３，９３２号、及びＣｅｒｒｅｔｔｉら、米国特許第６，５２１，４２４号）；抗ＴＷＥＡＫ剤（抗体及び抗原結合領域を含むが、これらに限られない）；可溶性ＴＷＥＡＫ受容体アンタゴニスト（Ｗｉｌｅｙ、米国特許第６，７２７，２２５号）；インテグリンのリガンドへの結合をアンタゴナイズするためのＡＤＡＭディスインテグリンドメイン（Ｆａｎｓｌｏｗら、米国特許出願公開第２００２／００４２３６８号）；抗ｅｐｈ受容体及び抗ｅｐｈｒｉｎ抗体；抗原結合領域又はアンタゴニスト（米国特許第５，９８１，２４５号；同第５，７２８，８１３号；同第５，９６９，１１０号；同第６，５９６，８５２号；同第６，２３２，４４７号；同第６，０５７，１２４号）；Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）又はＶＥＧＦ−ＴＲＡＰ（商標）などの抗ＶＥＧＦ剤（例えば、抗体若しくはＶＥＧＦに特異的に結合する抗原結合領域、又は可溶性ＶＥＧＦ受容体若しくはそのリガンド結合領域）及び抗ＶＥＧＦ受容体剤（例えば、抗体又はそれに特異的に結合する抗原結合領域）、パニツムマブ、ＩＲＥＳＳＡ（商標）（ゲフィチニブ）、ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）（エルロチニブ）などのＥＧＦＲ阻害剤（例えば、抗体又はそれに特異的に結合する抗原結合領域）、抗Ａｎｇ−１剤及び抗Ａｎｇ−２剤（例えば、抗体又はそれ若しくはそれらの受容体、例えば、Ｔｉｅ−２／ＴＥＫに特異的に結合する抗原結合領域）、並びに抗Ｔｉｅ−２キナーゼ阻害剤（例えば、抗体、又は肝細胞増殖因子（hepatocyte growth factor、ＨＧＦ（散乱因子としても知られる））のアンタゴニストなどの増殖因子に特異的に結合し、当該因子の活性を阻害する抗原結合領域）、及び抗体又はその受容体「ｃ−ｍｅｔ」（例えば、リロツムマブ及びＡＭＧ  ３３７、Ａｍｇｅｎ）に特異的に結合する抗原結合領域）；抗ＰＤＧＦ−ＢＢアンタゴニスト；ＰＤＧＦ−ＢＢリガンドに対する抗体及び抗原結合領域；並びにＰＤＧＦＲキナーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
ＧＩＴＲ特異的抗体又はそのフラグメントとの組み合わせで使用され得る他の抗血管新生剤としては、ＭＭＰ−２（マトリックスメタロプロテアーゼ２）阻害剤、ＭＭＰ−９（マトリックスメタロプロテアーゼ９）阻害剤、及びＣＯＸ−ＩＩ（シクロオキシゲナーゼのＩＩ）阻害剤などの薬剤が挙げられる。有用なＣＯＸ−ＩＩ阻害剤の例としては、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（商標）（セレコキシブ）、バルデコキシブ、及びロフェコキシブが挙げられる。
【０１１９】
本明細書に提供されるＧＩＴＲ特異的抗体又はそのフラグメントはまた、増殖因子阻害剤との組み合わせで使用され得る。このような薬剤の例としては、ＥＧＦ−Ｒ抗体（例えば、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ（登録商標）））、ＥＧＦ抗体、及びＥＧＦ−Ｒ阻害剤である分子などのなどのＥＧＦ−Ｒ（表皮増殖因子受容体）応答を阻害することができる薬剤；ＶＥＧＦ受容体及びＶＥＧＦを阻害することができる分子などのＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）阻害剤；並びにｅｒｂＢ２受容体に結合する有機分子又は抗体、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）などのｅｒｂＢ２受容体阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。ＥＧＦ−Ｒ阻害剤は、例えば、米国特許第５，７４７，４９８号、国際公開第９８／１４４５１号、国際公開第９５／１９９７０号、及び国際公開第９８／０２４３４号に記載されている。
【０１２０】
一部の処置用途では、特に、骨が悪影響を受けるようにがんが骨に転移している場合、ＧＩＴＲ特異的抗体又はそのフラグメントを、更なる骨喪失を阻害するか又は喪失された骨を復元するのを助ける治療剤と共に投与するのが有用であり得る。したがって、ＧＩＴＲ特異的抗体又はそのフラグメントは、治療的に有効な量の骨増殖促進（同化）剤又は骨吸収抑制剤と共に投与されることができ、骨増殖促進（同化）剤又は骨吸収抑制剤としては、ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−１２で指定された骨形成因子；トランスフォーミング増殖因子β及びＴＧＦ−βファミリーメンバー；線維芽細胞増殖因子ＦＧＦ−１〜ＦＧＦ−１０；インターロイキン１阻害剤（ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１に対する抗体、及びＩＬ−１受容体に対する抗体を含む）；ＴＮＦα阻害剤（エタネルセプト、アダリムマブ、及びインフリキシマブを含む）；ＲＡＮＫリガンド阻害剤（可溶性ＲＡＮＫ、オステオプロテゲリン、及びデノスマブ（ＸＧＥＶＡ（登録商標））などのＲＡＮＫ又はＲＡＮＫリガンドに特異的に結合するアンタゴニスト抗体を含む）、Ｄｋｋ−１阻害剤（例えば、抗Ｄｋｋ−１抗体）、パラサイロイドホルモン、Ｅシリーズのプロスタグランジン、ビスホスホネート、並びにフッ化物及びカルシウムなどの骨強化ミネラルが挙げられるが、これらに限定されない。ＧＩＴＲ抗体及びその機能的フラグメントとの組み合わせで使用され得る同化剤としては、パラサイロイドホルモン及びインスリン様増殖因子（insulin-like growth factor、ＩＧＦ）が挙げられ、後者の薬剤は、好ましくは、ＩＧＦ結合タンパク質と複合化される。このような併用治療に好適なＩＬ−１受容体アンタゴニストは、国際公開第８９／１１５４０号に記載されており、好適な可溶性ＴＮＦ受容体１は、国際公開第９８／０１５５５号に記載されている。例示的なＲＡＮＫリガンドアンタゴニストは、例えば、国際公開第０３／０８６２８９号、国際公開第０３／００２７１３号、米国特許第６，７４０，５１１号、及び同第６，４７９，６３５号に開示されている。
【０１２１】
一実施形態では、がんを処置するための方法は、本明細書に記載されたＧＩＴＲ特異的抗体の治療的に有効な量の投与と、それを必要とする対象に放射線治療を行うこととを含む。放射線治療としては、患者に対する放射線療法又は放射性医薬の関連する投与を含んでもよい。放射線源は、処置される患者の外側又は内側のいずれか一方であってもよい（放射線治療は、例えば、外照射療法（ＥＢＲＴ）又は小線源治療（ＢＴ）の形態でもよい）。このような方法を実施するのに使用することができる放射性元素には、例えば、ラジウム、セシウム−１３７、イリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、金−１９８、コバルト−５７、銅−６７、テクネチウム−９９、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、及びインジウム−１１１が挙げられる。
【０１２２】
ＧＩＴＲを検出する方法
本明細書において、サンプルを、本明細書に記載された抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることにより、生体サンプル中のＧＩＴＲを検出するための方法が提供される。本明細書に記載されたように、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織会合していない細胞（すなわち、遊離細胞）、組織（例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微小針吸引を含む生検）、組織学的調製物等から得ることができる。一部の実施形態では、記載された方法は、サンプルを、本明細書に記載されたＧＩＴＲ特異的抗体又はその抗原結合フラグメントのいずれかと接触させることにより、生体サンプル中のＧＩＴＲを検出することを含む。
【０１２３】
一部の実施形態では、サンプルを、本明細書に記載されたＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントの２つ以上と接触させてもよい。例えば、サンプルを、第１のＧＩＴＲ特異的抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させ、次いで、第２のＧＩＴＲ特異的抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させてもよく、この場合、第１の抗体又は抗原結合フラグメントと第２の抗体又は抗原結合フラグメントとは、同じ抗体又は抗原結合フラグメントではない。一部の実施形態では、第１の抗体又はその抗原結合フラグメントは、サンプルと接触させる前に、表面、例えば、マルチウェルプレート、チップ、又は類似する基材に固定されてもよい。他の実施形態では、第１の抗体又はその抗原結合フラグメントは、サンプルと接触させる前に、何にも固定されず又は付着されなくてもよい。
【０１２４】
記載されたＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、検出可能に標識されてもよい。一部の実施形態では、標識された抗体及び抗原結合フラグメントは、本明細書に記載された方法によるＧＩＴＲの検出を容易にし得る。多くのこのような標識が、当業者に容易に既知である。例えば、適切な標識には、放射線標識、蛍光標識、エピトープタグ、ビオチン、発色団標識、ＥＣＬ標識、又は酵素が挙げられるが、これらに限定されると考えられるべきではない。より具体的には、記載された標識には、ルテニウム、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ、１１１Ｉｎ−ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びベータガラクトシダーゼ、ポリヒスチジン（ＨＩＳタグ）、アクリジン染料、シアニン染料、フルオロン染料、オキサジン染料、フェナントリジン染料、ローダミン染料、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（登録商標）染料などが挙げられる。
【０１２５】
記載されたＧＩＴＲ特異的抗体及び抗原結合フラグメントは、生体サンプル中のＧＩＴＲを検出するための各種のアッセイに使用されてもよい。一部の適切なアッセイには、ウェスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴、免疫蛍光測定法、免疫沈澱法、平衡透析法、免疫拡散法、電気化学発光（ＥＣＬ）イムノアッセイ、免疫組織化学法、蛍光発色細胞選別（ＦＡＣＳ）又はＥＬＩＳＡアッセイが挙げられるが、これらに限定されると考えられるべきではない。
【０１２６】
ＧＩＴＲを検出するためのキット
本明細書において、生体サンプル中のＧＩＴＲを検出するためのキットが提供される。これらのキットは、本明細書に記載されたＧＩＴＲ特異的抗体又はその抗原結合フラグメントのうち１つ又は２つ以上と、このキットを使用するための指示書とを含む。
【０１２７】
提供されたＧＩＴＲ特異的抗体又は抗原結合フラグメントは、溶液の中に存在してもよく、凍結乾燥されていてもよく、基材、キャリア、又はプレートに固着されていてもよく、又は検出可能に標識化されていてもよい。
【０１２８】
記載されたキットはまた、本明細書に記載された方法を行うのに有用な更なる構成要素を含んでもよい。例として、キットは、対象からサンプルを得るための手段、対照若しくは参照サンプル、例えば、ゆっくり進行するがんを有する対象及び／又はがんを有さない対象からのサンプル、１つ若しくはそれ以上のサンプル区画、及び／又は本発明の方法の実施について説明する指示材料、並びに組織特異的な対照若しくは基準物質を含んでもよい。
【０１２９】
ＧＩＴＲのレベルを決定するための手段は、例えば、ＧＩＴＲのレベルを決定するためのアッセイで使用するためのバッファ又は他の試薬を更に含み得る。指示書は、例えば、アッセイを行うための印刷された指示書及び／又はＧＩＴＲの発現レベルを評価するための指示書であり得る。
【０１３０】
記載されたキットはまた、対象からサンプルを単離するための手段を含んでもよい。これらの手段は、対象から流体又は組織を得るのに使用され得る機器又は試薬のうち１つ又は２つ以上の品目を含み得る。対象からサンプルを得るための手段はまた、血液サンプルから血液成分、例えば、血清を単離するための手段を含んでもよい。好ましくは、キットは、ヒト対象で使用するために設計されている。
【０１３１】
記載された主題の例示的な実施形態
本明細書に記載された主題をより適切かつ詳細に説明するために、本節では、提示された主題の例示的な実施形態を列挙して提供する。
【０１３２】
列挙した実施形態：
実施形態
１．ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
ａ．配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｂ．配列番号２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２９のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｃ．配列番号１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号３０のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３３のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｄ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｅ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｆ．配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｇ．配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｈ．配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｉ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２０のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｊ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号３１のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｋ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｌ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｍ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｎ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、
ｏ．配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３、又は
ｐ．配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３２のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む、単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
２．配列番号３９〜５４、６３、及び６４からなる群から選択される重鎖領域を含む、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する単離された抗体又はその抗原結合フラグメント。
３．抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号５５〜５８からなる群から選択される軽鎖領域を含む、実施形態２に記載の抗体。
４．抗体又はその抗原結合フラグメントが、配列番号３９〜５４、６３、及び６４からなる群から選択される重鎖領域と、配列番号５５〜５８からなる群から選択される軽鎖領域とを含む、実施形態２に記載の抗体。
５．
ａ．重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号３９を含み、
ｂ．重鎖領域が、配列番号５６を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４０を含み、
ｃ．重鎖領域が、配列番号５７を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４１を含み、
ｄ．重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４２を含み、
ｅ．重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４３を含み、
ｆ．重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４４を含み、
ｇ．重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４５を含み、
ｈ．重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４６を含み、
ｉ．重鎖領域が、配列番号５８を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４７を含み、
ｊ．重鎖領域が、配列番号５８を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４８を含み、
ｋ．重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号４９を含み、
ｌ．重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号５０を含み、
ｍ．重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号５１を含み、
ｎ．重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号５２を含み、
ｏ．重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号５３を含み、
ｐ．重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号５４を含み、
ｑ．重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号６３を含み、又は
ｒ．重鎖領域が、配列番号５５を含む軽鎖領域と対形成した配列番号６４を含む、実施形態４に記載の抗体。
６．抗体が、ＧＩＴＲ（配列番号６２、
アミノ酸残基：
ａ．４０〜４５、及び
ｂ．７５〜７９と相互作用することによってヒトＧＩＴＲに特異的に結合する、実施形態５に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
７．抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５９のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する、実施形態１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
８．抗体又はその抗原結合フラグメントは、実施例９に記載される実験計画を使用して表面プラズモン共鳴により測定された場合、少なくとも３０ｎＭの結合親和性で、ヒトＧＩＴＲに特異的に結合する、実施形態１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
９．抗体又は抗原結合フラグメントは、ＮＦ−κＢルシフェラーゼ遺伝子アッセイ中のルシフェラーゼ発現の増加を誘導する、実施形態１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
１０．抗体又は抗原結合フラグメントは、約６７ｎｇ／ｍＬ未満のＥＣ５０でＡＤＣＣをインビトロで誘導する、実施形態１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
１１．抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト抗体又は抗原結合フラグメントである、実施形態１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
１２．抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ２フラグメント、又は一本鎖抗体である、実施形態１に記載の抗原結合フラグメント。
１３．抗体又は抗原結合フラグメントは、組み換え体である、実施形態１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
１４．抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプのものである、実施形態１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
１５．ＩｇＧ１アイソタイプである、実施形態１に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
１６．抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒトＧＩＴＲ及びカニクイザルＧＩＴＲに特異的に結合する、実施形態１のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
１７．実施形態１のいずれか１つに記載の抗体又は抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド。
１８．実施形態１７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
１９．実施形態１８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
２０．抗体又は抗原結合フラグメントを生成するためのプロセスであって、
抗体又は抗原結合フラグメントの発現を可能にする条件下で、実施形態１９に定義される宿主細胞を培養することと、抗体又は抗原結合分子を培養物から回収することとを含む、プロセス。
２１．がん又は他の腫瘍状態の症状を緩和する方法であって、実施形態１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを、それを必要とする対象に、対象のがん又は他の腫瘍状態の症状を緩和するのに充分な量で投与することを含む、方法。
２２．対象がヒトである、実施形態２１に記載の方法。
２３．
ａ．化学療法を施すこと、
ｂ．放射線療法を施すこと、又は
ｃ．１つ又は２つ以上の追加の治療剤を投与すること、
のうちの１つ又は２つ以上を更に含む、請求項２１に記載の方法。
２４．追加の治療剤が、免疫刺激剤である、実施形態２３に記載の方法。
２５．免疫刺激剤が、ＰＤ−１抗体、ＣＴＬＡ−４抗体、ＣＤ１２２抗体、ＣＤ４０抗体、ＯＸ４０抗体、及びＣＤ８  Ａｇ特異的ＯＶＡペプチドワクチンからなる群から選択される、実施形態２４に記載の方法。
２６．実施形態１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、医薬的に許容され得る担体とを含む、医薬組成物。
２７．実施形態１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント及びそのパッケージを含む、キット。
【実施例】
【０１３３】
下記実施例は、先の開示を補い、本明細書に記載された主題のより良好な理解を提供するために提供される。これらの実施例は、記載された主題を限定すると解釈されるべきでない。本明細書に記載された実施例及び実施形態は例示のみを目的とするものであり、それらを考慮した種々の改変又は変更は、当業者に明らかであり、また、本発明の真の範囲内に含まれ、かつ本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【０１３４】
実施例１：材料
ＧＩＴＲ  ＥＣＤ分子：
ｈＧＩＴＲ（配列番号５９）のアミノ酸２６〜１６１に対応する組み換え体ヒト（ｈ）ＧＩＴＲ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号６８９−ＧＲ）。タンパク質をファージパンニング研究のためにビオチン化した。このタンパク質をまた、結合性及び親和性の測定にも使用した。
【０１３５】
ＧＩＴＲ細胞株
ＧＩＴＲは、抗ＧＩＴＲ抗体反応性確認のため、ファージ及び次世代配列決定パネルを試験するため、並びにｃｙｎｏ−ＧＩＴＲに対するＧＩＴＲ  ｍＡｂ該当点の交差反応性をチェックするためのトランスフェクション又はレンチウイルス形質導入によってＨＥＫ２９３Ｆ細胞中に発現された。
【０１３６】
トランスフェクトされた細胞は、以下のＧＩＴＲ配列を提示した。
ヒトＧＩＴＲ（配列番号６０）
ＱＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴＤＡＲＣＣＲＶＨＴＴＲＣＣＲＤＹＰＧＥＥＣＣＳＥＷＤＣＭＣＶＱＰＥＦＨＣＧＤＰＣＣＴＴＣＲＨＨＰＣＰＰＧＱＧＶＱＳＱＧＫＦＳＦＧＦＱＣＩＤＣＡＳＧＴＦＳＧＧＨＥＧＨＣＫＰＷＴＤＣＴＱＦＧＦＬＴＶＦＰＧＮＫＴＨＮＡＶＣＶＰＧＳＰＰＡＥＰＬＧＷＬＴＶＶＬＬＡＶＡＡＣＶＬＬＬＴＳＡＱＬＧＬＨＩＷＱＬＲＳＱＣＭＷＰＲＥＴＱＬＬＬＥＶＰＰＳＴＥＤＡＲＳＣＱＦＰＥＥＥＲＧＥＲＳＡＥＥＫＧＲＬＧＤＬＷＶ
Ｃｙｎｏ  ＧＩＴＲ（配列番号６１）
ＱＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＫＤＡＲＣＣＲＶＨＰＴＲＣＣＲＤＹＱＳＥＥＣＣＳＥＷＤＣＶＣＶＱＰＥＦＨＣＧＮＰＣＣＴＴＣＱＨＨＰＣＰＳＧＱＧＶＱＰＱＧＫＦＳＦＧＦＲＣＶＤＣＡＬＧＴＦＳＲＧＨＤＧＨＣＫＰＷＴＤＣＴＱＦＧＦＬＴＶＦＰＧＮＫＴＨＮＡＶＣＶＰＧＳＰＰＡＥＰＰＧＷＬＴＩＶＬＬＡＶＡＡＣＶＬＬＬＴＳＡＱＬＧＬＨＩＷＱＬＧＳＱＰＴＧＰＲＥＴＱＬＬＬＥＶＰＰＳＴＥＤＡＳＳＣＱＦＰＥＥＥＲＧＥＲＬＡＥＥＫＧＲＬＧＤＬＷＶ
【０１３７】
レンチウイルスで形質導入された細胞は、以下のＧＩＴＲ配列を提示した。
ヒトＧＩＴＲ（配列番号６２）
ＭＡＱＨＧＡＭＧＡＦＲＡＬＣＧＬＡＬＬＣＡＬＳＬＧＱＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＴＤＡＲＣＣＲＶＨＴＲＣＣＲＤＹＰＧＥＥＣＣＳＥＷＤＣＭＣＶＱＰＥＦＨＣＧＤＰＣＣＴＴＣＲＨＨＰＣＰＰＧＱＧＶＱＳＱＧＫＦＳＦＧＦＱＣＩＤＣＡＳＧＴＦＳＧＧＨＥＧＨＣＫＰＷＴＤＣＴＱＦＧＦＬＴＶＦＰＧＮＫＴＨＮＡＶＣＶＰＧＳＰＰＡＥＰＬＧＷＬＴＶＶＬＬＡＶＡＡＣＶＬＬＬＴＳＡＱＬＧＬＨＩＷＱＬＲＳＱＣＭＷＰＲＥＴＱＬＬＬＥＶＰＰＳＴＥＤＡＲＳＣＱＦＰＥＥＥＲＧＥＲＳＡＥＥＫＧＲＬＧＤＬＷＶ
Ｃｙｎｏ  ＧＩＴＲ（配列番号６１）
ＱＲＰＴＧＧＰＧＣＧＰＧＲＬＬＬＧＴＧＫＤＡＲＣＣＲＶＨＰＴＲＣＣＲＤＹＱＳＥＥＣＣＳＥＷＤＣＶＣＶＱＰＥＦＨＣＧＮＰＣＣＴＴＣＱＨＨＰＣＰＳＧＱＧＶＱＰＱＧＫＦＳＦＧＦＲＣＶＤＣＡＬＧＴＦＳＲＧＨＤＧＨＣＫＰＷＴＤＣＴＱＦＧＦＬＴＶＦＰＧＮＫＴＨＮＡＶＣＶＰＧＳＰＰＡＥＰＰＧＷＬＴＩＶＬＬＡＶＡＡＣＶＬＬＬＴＳＡＱＬＧＬＨＩＷＱＬＧＳＱＰＴＧＰＲＥＴＱＬＬＬＥＶＰＰＳＴＥＤＡＳＳＣＱＦＰＥＥＥＲＧＥＲＬＡＥＥＫＧＲＬＧＤＬＷＶ
【０１３８】
ＨＥＫ  ２９３Ｆ細胞の一過性発現を、細胞を１ｅ６細胞／ｍＬの密度でＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３培地（Ｇｉｂｃｏ＃１２３３８）に入れ、１２５ｍＬ容通気式キャップ振盪フラスコ中で３０ｍＬの量にして、トランスフェクションの２４時間前に１３０ＲＰＭで振盪することによって実施した。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍａｘ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１６４４７）を用いてトランスフェクションを行った。１回３０ｍＬのトランスフェクションについて、ある管で、３７．５μｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｍａｘ試薬を１ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ＃３１９８５）で希釈した。別の管で３７．５μｇのＤＮＡ（３００ナノグラムの標的及び３７．２μｇの非関連担体プラスミド）を１ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭに混入した。次いで、２本の管を合わせて混合し、バイオセーフティキャビネット内で１分間インキュベートしてから、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞のフラスコに混合物を直接添加した。増殖の４８時間後、細胞は示されたアッセイ中で使用する準備ができていた。
【０１３９】
Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａにより生成された完全長のＧＩＴＲを提示するレンチウイルス粒子（ヒトＧＩＴＲについてはＧｅｎｅｃｏｐｏｅｉａカタログ＃ＬＰＰ−Ｕ０２０２−ＬＶ１０５−２００−Ｓ、ｃｙｎｏ  ＧＩＴＲについてはＧｅｎｏｃｏｐｏｅｉａカタログ＃ＬＰＰ−Ｕ０２０２−ＬＶ１０５−２００−Ｓ）を、製造業者のプロトコルを使用して細胞中に形質導入した。形質導入された細胞を安定したプラスミドの組み込みのために選択し、次いで、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＦＡＣＳ  Ｊａｚｚ細胞ソーターを使用して単一細胞選別した。ＧＩＴＲ表面発現を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＦＡＢ６８９Ｐ抗ｈｕＧＩＴＲ抗体を用いたフローサイトメトリー染色によって定量化し、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６で分析した。
【０１４０】
実施例２：ファージディスプレイ技術を使用したＧＩＴＲ抗体の発見
ＶκＶＬＫ３−２０、ＶＬＫ４−１、ＶＬＫ３−１１、及びＶＬＫ１−３９軽鎖ライブラリと対形成したＶＨ１−６９、３−２３、及び５−５１重鎖ライブラリからなる、新規なｐＩＸ  Ｆａｂライブラリ（Ｓｈｉ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２０１０．３９７（２）：ｐ．３８５〜３９６。国際公開第２００９／０８５４６２号）を、Ｒｏｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３７６：１１８２〜１２００，２００８及びＳｔｅｉｄｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６：１３５〜１４４，２００８に記載されるものと同様の選択プロセスにおいて、１００ｎＭ（ラウンド１〜３）又は１０ｎＭ（ラウンド４）の濃度で、ビオチン化したヒトＧＩＴＲ−ＥＣＤ  Ｆｃ融合に対してパンニングした。
【０１４１】
ｐＩＸ遺伝子を、４回目のラウンドのパニング後に、ファージミドＤＮＡから切除して、可溶性ｈｉｓタグ付きＦａｂコード領域を生成した。ＦａｂをＥ．ｃｏｌｉで発現させ、ＧＩＴＲへの結合についてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。簡潔に、９６ウェルのＮｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ  ＃４３７１１１）を、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍＬのストレプトアビジン（Ｐｒｏｍｅｇａ）又はヒツジ抗ヒトＦｄ（結合部位＃ＰＣ０７５）のいずれかで、４℃にて一晩かけてコーティングした。ディープウェル培養プレートにおいて、Ｆａｂ発現ベクターを含有する細菌培養物を１ｍＬの２ｘＹＴ（カルベニシリン（Ｃａｒｂｅｎｅｃｉｌｌｉｎ））中で濁る（ＯＤ６００≒０．６）まで増殖させた。次いで、Ｆａｂ発現を、濃度１ｍＭにＩＰＴＧの付加により誘導した。培養物を、３０℃で一晩増殖させ、次いで、翌日遠心分離により分類した。ストレプトアビジンコートプレートをＴＢＳ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ  ＃７９０３９−１０ＰＡＫ）で３回洗浄し、ビオチン化したＧＩＴＲ−Ｆｃを５μｇ／ｍＬで充填し、室温で３０分間保持した。Ｂｉｏｍｅｋ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ  Ｒｏｂｏｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、抗ＦｄコートＭａｘｉｓｏｒｐプレート及びストレプトアビジンコートプレートの両方を、ＴＢＳ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ  ＃７９０３９−１０ＰＡＫ）で３回洗浄し、ウェル当たり２００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．５％）＋脱脂粉乳（３％）で、室温において１時間ブロックした。この工程及び後続の全ての工程において、プレートを、ＴＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ  ＃７９０３９−１０ＰＡＫ）で３回洗浄した。各ウェルに、５０μＬのＦａｂ上清を入れ、続けて、室温において１時間インキュベートした。洗浄後、５０μＬのヤギ抗ヒトカッパ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を０．３％のミルクを含むＴＢＳＴ中、１：５０００希釈で加え、プレートを室温において１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、５０ｕＬの化学発光基質ＰｏＤ（Ｒｏｃｈｅ  ＃１２１−５８２９５００００１）を、製造業者の指示書に従って加えた。次いで、プレートを、発光について、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）プレートリーダーにおいて読み取った。ｆａｂ発現ＥＬＩＳＡ及びＧＩＴＲ結合ＥＬＩＳＡの両方において陽性であったクローンをＤＮＡ配列決定のために選択した。このファージパンニングプロセスによって、合計５０個の固有のＦａｂ配列を発見した。固有の重鎖Ｖ領域をヒトＩｇＧ１＿Ｇ１ｍ（１７，１）発現ベクターにクローニングし、固有の軽鎖をヒトカッパ発現ベクターにクローニングし、得られた抗体を再びＥＬＩＳＡで結合活性について試験した。
【０１４２】
実施例３：ファージディスプレイ技術を介して得られるＧＩＴＲ抗体の初期特性化
ヒトＧＩＴＲ結合アッセイ
遺伝子操作を受けた細胞へのＧＩＴＲ抗体の結合を、ＦＡＣＳを使用して評価した。スクリーニングアッセイの目標は、ｈＧＩＴＲを発現する細胞に結合する抗体を特定することであった。
【０１４３】
簡潔に、ウェル当たり３００，０００個の細胞を９６−ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ  ｃａｔ＃６５１２６１）に蒔き、細胞をペレット状にした。細胞を１００μＬのＦＡＣＳ染色バッファ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｓｔａｉｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＳＡ）ｃａｔ  ＃５５４６５７）で洗浄し、５０μＬのＦＡＣＳ染色バッファとウェル当たり２０μＬの未精製抗体上清との混合物と共に４℃で３０分間インキュベートし、２００μＬのＦＡＣＳ染色バッファで１回洗浄した。検出については、ＦＡＣＳ染色バッファ中ｍＬ当たり２μｇで、ウェル当たり５０μＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ｃａｔ  ＃Ａ１１０１３）と共に４℃で３０分間のインキュベーションに供した。細胞をウェル当たり２００μＬのＦＡＣＳ染色バッファで１回洗浄し、ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳ染色バッファ中で再懸濁し、次いで、ウェル当たり２００μＬのＦＡＣＳ染色バッファを含有するＦＡＣＳ管に移した。次いで、ＦＡＣＳ分析を行った。アッセイを、データ整合性のために繰り返し、トップバインダーを、更なる開発のために選択した。
【０１４４】
ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ遺伝子アッセイ
ＧＩＴＲ抗体のアゴニスト活性を評価するために、ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ遺伝子アッセイを使用してパネルをスクリーニングした。簡潔に、ＨＥＫ２９３細胞を、ヒトＧＩＴＲ発現プラスミドと一緒にＮＦ−κＢプロモータの制御下でルシフェラーゼ遺伝子をコードするレポータープラスミドで一過的にトランスフェクトした。細胞をトランスフェクションから回収し、３７℃で４時間ヒトＧＩＴＲを発現させ、その時点でアッセイを実施することができた。アッセイが意図したとおりに作用したことを確認するために、組み換えヒトＧＩＴＲリガンド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ６９８７−ＧＬ／ＣＦ）をｍＬ当たり２．５マイクログラムの最終濃度で陽性対照ウェルに添加した。試験を受ける抗ＧＩＴＲ抗体をｍＬ当たり５マイクログラムの最終濃度で実験ウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。成功したＧＩＴＲシグナリングは、ＮＦ−ｋＢ経路の後に、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃａｔ  ＃Ｅ２５５０）によって示されるようにＳｔｅａｄｙ  Ｇｌｏを添加し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で得られた発光を測定することによって検出され得るルシフェラーゼ発現を活性化することが期待された。
【０１４５】
ＰＢＳのみによる処置と比較して、１５個の抗体がルシフェラーゼ発現の増加を誘導した（図１）。ＰＢＳのみによる処置と比較してルシフェラーゼ発現の増加を生み出した抗体は、アゴニストとして予め分類したが、残りの抗体はアンタゴニストであってもよいし、シグナリングに影響を与えることなく簡便にＧＩＴＲに結合していてもよい。
【０１４６】
実施例４：次世代配列決定によるＧＩＴＲ抗体の発見
第１セットの抗ＧＩＴＲ抗体の発見に続いて、ファージ選択の最終ラウンドの結果からのＤＮＡサンプルを、Ｒｏｃｈｅ  ４５４配列決定プラットフォームを使用した重鎖Ｖ領域の次世代配列決定のためにＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓに提供した。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓからの未加工のデータをＩＭＧＴで初期分析に供し、次いで、専売のＪａｎｓｓｅｎソフトウェアプログラム３ＤＸを使用して内部でより綿密に調査した。発見された抗体の数及び品質を増加させる方法として、ファージ選択の結果をより広範囲に調査するために次世代配列決定を使用するアイデアが開発されている（Ｒａｖｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６０（２０１３）ｐｇ  ９９〜１１０）。
【０１４７】
ＩＭＧＴによって提供された配列を、品質が悪いサンプル又は終止コドンを含むサンプルについてフィルタリングし、次いで、残りの配列を重鎖ＣＤＲ３によって選別した。ＣＤＲ３が抗原の結合エネルギーの大部分を駆動することが予想され、ファージライブラリの多様性の大部分が重鎖ＣＤＲ３に位置するため、このアプローチを選択した。システイン、メチオリン、又は高度に疎水性の配列の発生及び欠失の両方の頻度に基づいて、ヒトＩｇＧ１＿Ｇ１ｍ（１７）ベクターへのＤＮＡ合成及びクローニングのために８７個のＶ領域を選択した。
【０１４８】
合成後、推定上の抗ＧＩＴＲ重鎖を先に記載されたＧＩＴＲへの結合について試験した。これらの重鎖Ｖ領域のための適切な軽鎖パートナーについての情報が次世代配列決定データセットには含まれていないため、重鎖を、ファージライブラリＶｋ３−２０、Ｖｋ４−１、Ｖｋ３−１１、及びＶｋ１−３９において見出される４つの軽鎖殖細胞遺伝子の各々で共トランスフェクトした。これらの４つの標準トランスフェクションからの未精製抗体上清を、組み換えヒトＧＩＴＲ  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質に結合する能力についてＥＬＩＳＡで試験した。このアッセイからのトップバインダーを、更なる開発のために選択した。
【０１４９】
実施例５：次世代配列決定を通じて得られたｇｉｔｒ抗体の初期特性化
次世代配列決定データセットからの抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂがＥＬＩＳＡでＧＩＴＲ  ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質に結合することが示された後、サブセットを、実施例３に記載される細胞表面ＧＩＴＲへの結合について試験した。実施例３に記載されるＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ遺伝子アッセイを使用して、陽性バインダーをアゴニスト活性について試験した。ｍＬ当たり４０マイクログラムでは、天然リガンドによる処置で観察されたバックグラウンドを超える増加の少なくとも２０％に等しいルシフェラーゼ発現の増加を誘導した抗体は、アゴニスト活性を有すると考えられた（図２）。
【０１５０】
実施例６：ｃｙｎｏ交差反応性
ファージディスプレイ及び次世代配列決定の両方からの精製された抗体を、フローサイトメトリーを使用してカニクイザルＧＩＴＲへの結合について試験した。一過的にトランスフェクトされた細胞を、０．１ｍｇ／ｍＬの試験抗体と共に２〜８℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧと共に２〜８℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔフローサイトメトリーで分析した。陽性バインダーとして特定された抗体は、空のベクターでトランスフェクトされた細胞の平均蛍光強度と比較して、ヒトＧＩＴＲ又はｃｙｎｏ  ＧＩＴＲでトランスフェクトされた細胞の平均蛍光強度において１．５〜２個の対数シフトを示した。結合結果を表２にまとめた。
【０１５１】
表２．ヒトＧＩＴＲ又はカニクイザルＧＩＴＲで一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ｆ細胞への抗ＧＩＴＲ抗体の結合。ｃｙｎｏ  ＧＩＴＲ細胞への結合を示した抗体のみがこの表に示されており、試験されたがｃｙｎｏ  ＧＩＴＲへの結合を実証しなかった抗体は示されていないことに留意されたい。抗体には強くシフトした結合曲線については＋＋を、結合時の中程度のシフトについては＋を割り当てた。
【０１５２】
【表２】
2019512230.tif 000004
【０１５３】
したがって、合計で、表３に全て示される１６個のＧＩＴＲ抗体のパネルが、ヒトＧＩＴＲ及びｃｙｎｏ  ＧＩＴＲに結合することが見出された。
【０１５４】
【表３】
2019512230.tif 000005
【０１５５】
１６個のＧＩＴＲ  ｍＡｂのＶＨ及びＶＬを以下の表４に示す。
【０１５６】
【表４−１】
2019512230.tif 000006
【０１５７】
【表４−２】
2019512230.tif 000007
【０１５８】
【表４−３】
2019512230.tif 000008
【０１５９】
【表４−４】
2019512230.tif 000009
【０１６０】
【表４−５】
2019512230.tif 000010
【０１６１】
【表４−６】
2019512230.tif 000011
【０１６２】
【表４−７】
2019512230.tif 000012
【０１６３】
【表４−８】
2019512230.tif 000013
【０１６４】
実施例７：機能性細胞殺傷アッセイにおけるＧＩＴＲ抗体の評価
ヒトＧＩＴＲ及びｃｙｎｏ  ＧＩＴＲの両方に結合した抗体を、ＡＤＣＣアッセイ及びＣＤＣアッセイにおける活性について試験した。比較のために、これらのアッセイにｈｕＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を含めた。高い親和性のＦｃγＲＩＩＩａ  １７６Ｖ／Ｖ多型性を発現するように遺伝子修飾されたＮＫ−９２細胞によって行われる細胞殺傷を調べるためにＡＤＣＣアッセイを使用した。ヒトＧＩＴＲを内因的に発現するＨｕＴ１０２細胞、プールされたＨＴ１０８０−ｈｕＧＩＴＲ安定トランスフェクション、及びヒトＧＩＴＲ又はｃｙｎｏ  ＧＩＴＲのいずれかで一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の３つのタイプの標的細胞を使用した。ＡＤＣＣアッセイを行うために、標的細胞をカルセインＡＭで標識し、洗浄し、アッセイ培地内に再懸濁し、Ｖ底９６ウェルプレートに５０，０００個の細胞／５０マイクロリットル／ウェルで播種した。抗ｈＧＩＴＲ又は対照抗体を各種の濃度（１００マイクロリットル／ウェル）でウェルに添加した。ＮＫ−９２  １７６Ｖエフェクター細胞を洗浄し、アッセイ培地内に再懸濁し、標的細胞及び抗体と共に５０，０００個の細胞／５０マイクロリットル／ウェル又は１００，０００個の細胞／５０マイクロリットル／ウェルで播種した。培地単独（バックグラウンドシグナル）、標的細胞単独（自発的溶解シグナル）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（最大溶解シグナル）で最終的に処置されるであろう細胞、及び１マイクログラム／ｍＬの最終濃度のアイソタイプ対照抗体を、対照として含めた。３７℃で１時間インキュベーションした後、２０マイクロリットルの２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加を通じて、最大シグナルウェル中に完全な細胞溶解を誘導し、プレートを遠心分離した。１００マイクロリットルの上清を除去し、クリア底ブラックプレートに添加した。蛍光強度（ＦＩ）単位は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ５を使用して測定した。全てのウェルから培地単独で観察された平均ＦＩを差し引いた後、特異的溶解率を計算した。特異的溶解率を決定する式は、（サンプル−自然溶解）／（最大溶解−自然溶解）×１００であった。半数最大効果濃度（ＥＣ５０）の分析をプリズム内の抗体ごとに行った。
【０１６５】
表５は、試験した異なる細胞株中のＧＩＴＲ抗体の活性を示す。
【０１６６】
【表５】
2019512230.tif 000014
＾ＴＲＧＢ２３はＴＲＧＢ２５であり、ＴＲＧＢ２５はＴＲＧＢ１９である。
【０１６７】
実施例８．二重遺伝子構築及び低フコース分子の生成
細胞株開発のための調製時に、ＴＲＧＢ２５、ＴＲＧＢ１５３、ＴＲＧＢ１５９、及びＴＲＧＢ１６０について二重遺伝子構築を開始した。このプロセスの間、ＴＲＧＢ２５の重鎖は、好ましいヒトアロタイプＩｇＧ１＿Ｇ１ｍ（１７）ではなく、ヒトアロタイプＩｇＧ１＿Ｇ１ｍ（１７，１）内であったことが発見された。ＴＲＧＢ２５からの重鎖Ｖ領域を二重遺伝子構築中にヒトＩｇＧ１＿Ｇ１ｍ（１７）アロタイプのフレームワークに切り換え、それによって新しいタンパク質ＴＲＧＢ１９０を作り出した。この時点で、ＴＲＧＢ１６０が重鎖のアミノ末端にフレームワーク変異を有したことにも着目した。二重遺伝子の構築中、ＴＲＧＢ１６０重鎖のアミノ末端残基をＱからＥに切り換え、それによって新しいタンパク質ＴＲＧＢ１９１を作り出した。加えて、ＴＲＧＢ１９１の低フコースバージョン、すなわち、ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦを生成することを決定した。表６は、この修飾された抗ＧＩＴＲ抗体の配列を概説する。
【０１６８】
【表６】
2019512230.tif 000015
【０１６９】
実施例９：ＳＰＲによる親和性測定
組み換えヒトＧＩＴＲ  ＥＣＤに対するＧＩＴＲ抗体の親和性は、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６タンパク質相互作用アレイシステム（ＢｉｏＲａｄ）を使用して表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance、ＳＰＲ）によって測定した。
【０１７０】
ＧＩＴＲ  ＥＣＤの会合及び解離の速度を各変異体について測定した。アミンカップリング化学についての製造業者の指示書を使用して、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）をＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）の表面に共有結合させることにより、バイオセンサ表面を調製した。約８８００  ＲＵ（応答単位）のヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｐｒｏｄ  ＃  １０９−００５−０９８）を固定した。固定されたＲＵはまた、他の抗体を捕捉するのに加えられたヤギ抗マウスＦｃ抗体も含んだが、ここで報告したものに含めなかった。１：１で混合したため、これらの固定されたＲＵの約５０％は、ヤギ抗ヒトＦｃであると予測される。結合動力学実験を、ランニングバッファ（ＰＢＳ  ｐＨ７．４、０．００５％  Ｐ２０、３ｍＭ  ＥＤＴＡ）中において２５℃で行った。４倍（１：３）系列希釈のヒトＧＩＴＲ  ＥＣＤ又はＣｙｎｏ  ＧＩＴＲ  ＥＣＤを、１００ｎＭで開始して、ランニングバッファにおいて調製した。平均３００ＲＵのｍＡｂ（１７４〜６００）を、センサチップの各チャネルにおいて捕捉した。捕捉された候補を含有していない参照スポット（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）−修飾表面）を、参照表面として使用した。ｍＡｂの捕捉を、４０μＬ／分での抗原の３分の注入（会合段階）により行い、続けて、１０分のバッファフロー（解離段階）を行った。チップ表面を、１００μＬ／分での、０．８５％リン酸の注入により再生した。機器のソフトウェアにおいてデータを処理した。分析物の注入についてのレファレンスを引いた曲線からバッファ注入によって作成した曲線を減じることによって、レファレンスデータのダブルレファレンスサブトラクションを実施した。グループフィットを有する１：１ラングミュア結合モデルを使用して、データの動力学分析を行った。各ｍＡｂについての結果を、ｋｏｎ又はｏｎ速度、ｋｏｆｆ又はｏｆｆ速度、及びＫＤ（平衡解離定数）の形式で報告した（表７）。
【０１７１】
【表７】
2019512230.tif 000016
【０１７２】
結果は、少数の抗体が、ヒトＧＩＴＲ  ＥＣＤへの結合の５倍以内の親和性で、ｃｙｎｏ  ＧＩＴＲ  ＥＣＤに結合する目標を満たしたことを示した。この結果は、抗体の大部分が、ヒトＧＩＴＲタンパク質を発現する細胞に対して示されたものをほんのわずか下回る効力で、ｃｙｎｏ  ＧＩＴＲを発現する細胞を殺傷した、実施例７において論じられる細胞殺傷データと矛盾するようであった。昆虫細胞内で過剰発現した短縮されたＧＩＴＲ細胞外ドメインが適切に折り畳まれていない可能性があり、細胞殺傷と親和性分析実験との間に不一致が生じたという可能性がある。更に、ヒト細胞内で発現した完全長のＧＩＴＲが適切に折り畳まれた可能性が高く、ＧＩＴＲ発現細胞に対する結合親和性の測定が、観察された細胞殺傷活性と整合する可能性が高いであろうという可能性がある。これらの可能性を試験するために、ヒトＧＩＴＲ又はｃｙｎｏ  ＧＩＴＲのいずれかを発現する細胞に対するこれらの抗体の親和性を評価するべきである。
【０１７３】
実施例１０：ＭＳＤによる親和性測定
ＭＳＤ−細胞親和性技術（MSD-Cell Affinity Technology、ＭＳＤ−ＣＡＴ）を使用して、ヒトＧＩＴＲ及びｃｙｎｏ  ＧＩＴＲのトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞株との抗ＧＩＴＲ抗体の結合を評価するために、細胞ベースの親和性実験を実施した。ＭＳＤ−ＣＡＴは、ハイスループット方式において、インタクトな細胞を使用して親和性を決定するための標識フリー法として社内で開発された。発現したＧＩＴＲをいずれも備えない親ＨＥＫ２９３細胞株を陰性対照として使用した。
【０１７４】
この手法による相互作用の親和性を測定するために、固定された濃度の抗ＧＩＴＲ抗体（３００、６０、１２、２．４ｐＭ）及び様々な濃度のヒトＧＩＴＲ又はｃｙｎｏ  ＧＩＴＲ発現細胞（２．０×１０７〜１．０×１０３細胞／ｍＬ）を有する一連の溶液を調製し、４℃で１８時間プレートを回転させることによって平衡に到達させた。これらのサンプルは、０．０５％のアジド、１％のＢＳＡ、３ｍＭのＥＤＴＡでＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｄ＃  １０５６９−０４４）内において調製した。平衡化後、プレートを、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遊離したＧＩＴＲ  ｍＡｂを、上清において検出する。混合物中の遊離した抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂを、ＭＳＤリーダー機器を使用する電気化学発光法（electrochemiluminescence、ＥＣＬ）により検出した。検出のために、ＭＳＤ−ストレプトアビジンプレート（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｐｒｏｄ＃  Ｌ１１ＳＡ−１）を、５０μＬ／ウェルのアッセイバッファ中の０．１μｇ／ｍＬのビオチン化されたヒトＧＩＴＲ抗原でコーティングし、一晩（４℃で約１６時間）平衡化させた。平衡化の後、コーティング抗原を除去することなく、アッセイバッファを１５０μＬ／ウェルで添加することにより、プレートをブロックし、周囲温度において約１時間インキュベートし、洗浄バッファで３回洗浄した。遠心分離したプレートからの上清を、抗原コートプレート（５０μＬ／ウェル）に移し、６０分間インキュベートし、次いで、洗浄バッファで３回洗浄した。この後、５０μＬ／ウェルの０．７μｇ／ｍＬのルテニウム共役したＦ（ａｂ’）２ロバ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ；Ｐｒｏｄ＃  ７０９−００６−１４９）を添加し、１時間インキュベートした。１時間後、プレートを洗浄バッファで３回洗浄し、ウェル当たり１５０μＬのＭＳＤリードバッファ（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃａｔ＃  Ｒ９２ＴＣ−１；１：３のストックをｄ．Ｈ２Ｏに希釈することによって調製）を添加した。このプレートを、発光レベルについて、ＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００リーダーにおいて、直ちに読み取った。ＭＳＤにより検出されたＥＣＬシグナルを、混合物中の遊離抗体の割合に関して表した。データを分析して、Ｐｒｉｓｍソフトウェアに導入された（質量作用の法則から得られた）ユーザ定義等式を使用して、親和性を決定した。受容体濃度の関数としての遊離ｍＡｂ濃度を、結合親和性を決定するために、１：１の結合モデルを用いた非線形最小２乗分析に供する。表８は、試験した分子の全てについての細胞結合親和性を要約するものである。
【０１７５】
【表８】
2019512230.tif 000017
【０１７６】
ＴＲＧＢ２５、ＴＲＧＢ１９０、ＴＲＧＢ１６０、ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦ、及びＴＲＧＢ１５３について、細胞表面発現ＧＩＴＲの親和性をＭＳＤ−ＣＡＴによって測定した。第１の研究を予備的データと考慮し、１つのレプリカのみからなる４つの研究を実施した。より多くの反復を伴う更なる研究を実施した（研究２及び研究３）。研究２及び研究３は、ＴＲＧＢ１９０については、ｃｙｎｏ  ＧＩＴＲに対するｍＡｂ親和性がヒトＧＩＴＲに対してよりも１．５〜１．６倍弱いことを示している。研究２及び研究３はまた、ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦについては、ｃｙｎｏ  ＧＩＴＲに対するｍＡｂ親和性がヒトＧＩＴＲに対してよりも１．５〜３．２倍弱いことを示している。早期の研究からのＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦのデータを確認するために、後日、研究４を行った。研究４のデータは、ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦについては、ｃｙｎｏ  ＧＩＴＲに対するｍＡｂ親和性がヒトＧＩＴＲに対してよりも２．０倍弱いことを示している。
【０１７７】
実施例１１：ＮＦ−ｋＢを通じたＧＩＴＲシグナル及びシグナリングに対するＧＩＴＲＬ遮断薬の効果
抗原プライムされたＴリンパ球を、適応免疫を促進するように増やして存続させる必要がある。必要とされる増殖及び生存シグナルには、活性化Ｔ細胞中のＮＦ−κＢ経路が主に寄与している。ＮＦ−ｋＢ転写因子の周知の標的遺伝子であるインターフェロンガンマ（Interferon gamma、ＩＦＮγ）は、外来病原体に対する免疫のための重要なサイトカインであり、抗原特異的免疫が発現すると、Ｔｈ１  ＣＤ４及びＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球（cytotoxic T lymphocyte、ＣＴＬ）エフェクターＴ細胞によって生成される（Ｓｃｈｏｅｎｂｏｒｎ  ＪＲ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＣＢ．Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；９６：４１〜１０１）。
【０１７８】
ＧＩＴＲがメンバーである腫瘍壊死因子受容体（tumor necrosis factor receptor、ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバーは、Ｔ細胞に共刺激シグナルを提供し得る。これは、それらのそれぞれのリガンドに結合することによって、及びＮＦ−κＢ経路を通じてシグナルを伝達し得るＴＲＡＦ（ＴＮＦ受容体関連因子）として既知のアダプタタンパク質の漸増を介して開始される。加えて、共刺激シグナリングの強さは、三量体若しくは六量体の可溶性リガンドによって又は抗体が媒介した架橋を介して達成され得る受容体オリゴマー化に依存する。
【０１７９】
ＮＦ−κＢ活性に対する抗ＧＩＴＲ抗体ライゲーションの効果を検出するために、ＨＥＫ青色ＮＦ−κＢ系の修飾されたバージョン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を利用した。これらの細胞は、５つのＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の結合部位に融合した最小プロモータの制御下で、ＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリホスファターゼ（Secreted Embroyonic Alkaline Phosphatase））レポーター遺伝子を発現する。これらを、ヒトＧＩＴＲを発現するように安定にトランスフェクトした。本システムにおけるＧＩＴＲ受容体架橋は、上清中のＳＥＡＰ分泌によって検出され得るＮＦ−κＢ活性を駆動する。三量体可溶性ＧＩＴＲリガンドキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を陽性対照として使用した。
【０１８０】
「アゴニスト」試験のために、２５，０００個のＨＥＫ青色ＮＦ−κＢ−ＧＩＴＲ細胞を、連続１：２希釈の可溶性ＧＩＴＲＬ（１００ｎｇ／ｍＬで開始）又は抗ＧＩＴＲ抗体（１ｕｇ／ｍＬで開始）で、５倍過剰の架橋剤抗体の存在下（それぞれ抗ＨＡ若しくは抗Ｆｃ）、１６〜２０時間にわたって処置した。上清（４０ｕＬｓ）を除去し、１６０ｕＬｓのＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（商標）試薬と混合した。比色反応を、ＯＤ６５０ｎｍで分光光度計で読み取る前に、最大１時間、３７℃でインキュベートさせた。
【０１８１】
「アンタゴニスト」モードにおいて抗体を試験するために、細胞を、２５ｎｇ／ｍＬの一定濃度の可溶性ＧＩＴＲＬの存在下で、連続１：２希釈の抗ＧＩＴＲ抗体（２ｕｇ／ｍＬで開始）で処置した。アンタゴニストを、可溶性ＧＩＴＲＬの結合及びＮＦ−κＢ活性を５０％超ブロックした抗体として定義した。代表的なグラフが以下に提供され、実験変動性を説明するのに役立つ。
【０１８２】
アゴニストモードでは、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＨＥＫ青色ＮＦ−κＢ−ＧＩＴＲ細胞上でＧＩＴＲを架橋することができ、アイソタイプ対照抗体であるＣＮＴＯ３９３０（図３）と比較して、ＮＦ−κＢ活性における用量依存の増加を引き起こす。ｓＧＩＴＲＬの存在下で、いくつかの抗ＧＩＴＲ抗体は、ｓＧＩＴＲ依存性ＮＦ−κＢ活性化のレベルを低減するように観察されるが、他の抗体は、４００倍濃度で使用されても低減しない。ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦ、ＧＴＲＢ４５、及びＧＴＲＢ４９は、アッセイ変動性に帰し得る、ＧＩＴＲＬ：ＧＩＴＲ相互作用を３０％超ブロックするようには思えない。ＧＴＲＢ４５及びＧＴＲＢ４９は、ＧＩＴＲにも結合する非特性化された抗体である。
【０１８３】
実施例１２．ＧＩＴＲ抗体はＣＭＶ及びＴＴ抗原に対するメモリーＴ細胞応答を向上させ得る
免疫の特徴は、外来抗原に対するメモリーＴ細胞の生成であり、その結果、その後の曝露時に免疫応答をより迅速に開始することができる。
【０１８４】
サイトメガロウイルス（Cytomegalovirus、ＣＭＶ）は、ヘルペスウイルスであり、通常、健康な成人及び子供では無症候性である一般的な感染症である。４０歳に達するまでに５０〜８０％の成人がＣＭＶに感染していると推定されている。破傷風毒素（Tetanus toxin、ＴＴ）は、破傷風菌と呼ばれる生成される細菌である。米国の大部分の成人は、６歳までに５回、破傷風に対するワクチン接種を受け、その後１０年ごとに追加抗原刺激を受ける。
【０１８５】
血清陽性個体をその個体のそれぞれの抗原に曝露することにより、メモリーＴ細胞を再活性化してリコール応答を開始することができる。ＧＩＴＲ発現は、抗原提示細胞上でＴ細胞及びＧＩＴＲＬに対して上方調節されるように示された。アゴニストＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲを介したシグナリングによりＴ細胞活性化を強化し、抗原特異的免疫応答を更に向上させることができる。
【０１８６】
インターフェロンガンマ（Interferon gamma、ＩＦＮγ）は、外来病原体に対する免疫のための重要なサイトカインであり、抗原特異的免疫が発現すると、Ｔｈ１  ＣＤ４及びＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球（cytotoxic T lymphocyte、ＣＴＬ）エフェクターＴ細胞によって生成される（Ｓｃｈｏｅｎｂｏｒｎ  ＪＲ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＣＢ．Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；９６：４１〜１０１）。
【０１８７】
ここで、本発明者らは、ＩＦＮγ分泌によって測定された場合にこれらのＴ細胞活性化を向上させるその能力に関して独自の抗ＧＩＴＲ抗体を特性化するためのＣＭＶ及びＴＴリコールアッセイを開発した。簡潔に、ＣＭＶ及びＴＴの血清陽性ドナーから得た１５０，０００個のＰＢＭＣを、０．１ｕｇ／ｍＬのＣＭＶ抗原又はＴＴ抗原（全ＣＭＶ抗原、Ａｓｔａｒｔｅ  ＃１００４；ＴＴ抗原、Ａｓｔａｒｔｅ  ＃１００２）の存在下、５ｕｇ／ｍＬ〜１５６ｎｇ／ｍＬ（ｘ軸上で左から右）で開始する１：２希釈系列の試験抗体で予めコーティングされたウェル中でインキュベートした。上清を４〜６日後に採取し、ＩＦＮγレベルをＭＳＤによって定量化した。抗原のみの対照を使用してドナーの反応性を評価した。ＣＮＴＯ３９３０は抗体アイソタイプ対照であった。各抗体濃度を複製で実行した（ｎ＝６）。
【０１８８】
ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦは、ＩＦＮγ分泌によって測定された場合、ＣＭＶ依存性メモリーＴ細胞活性化を用量依存の様式で増大させ、［Ａｂ］＝５ｕｇ／ｍＬでピークに達する（図４Ａ）。ＴＴリコールアッセイにおいて、ピークＴ細胞共活性化を、［Ａｂ］＝６２５ｎｇ／ｍＬで観察した（図４Ｂ）。
【０１８９】
実施例１３．抗ＧＩＴＲ単剤免疫療法は頑丈な抗腫瘍免疫を誘導する
抗腫瘍免疫に対する抗ＧＩＴＲの有効性は、宿主が完全な免疫系を有する腫瘍モデルにおいてのみ研究することができる。このため、ＧＩＴＲマウス代理抗体ＤＴＡ−１を、Ｂａｌｂ／Ｃマウス又はＣ５７／ＢＬ６マウスの確立された同系結腸がんモデルＣＴ２６及びＭＣ３８においてそれぞれ研究した。
【０１９０】
マウスに、５×１０５のＣＴ２６又はＭＣ３８腫瘍細胞を右脇腹に皮下（subcutaneously、ｓｃ）移植した。腫瘍細胞移植後７日目に、マウスを、平均腫瘍サイズがそれぞれおよそ８５ｍｍ３又は１２０ｍｍ３の実験群に無作為化した。
【０１９１】
マウスに、ＤＴＡ−１（ＢｉｏＸｃｅｌｌ  ＃ＢＥ００６３）又はラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（クローンＬＴＦ−２、ＢｉｏＸｃｅｌｌ  ＃ＢＥ００９０）を、２００μｇ／動物ｑ３ｄ−ｑ４ｄで、７、１１、及び１４日目に合計３用量、腹腔内投与した（ｎ＝１０／群）。腫瘍の厚さ測定を研究の終わりまで週２回行った。腫瘍体積を、次式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ｌ×ｗ２／２）（式中、「ｌ」は厚さ測定により決定された腫瘍の長さを表し、「ｗ」は厚さ測定により決定された腫瘍の幅を表す）を使用して算出し、研究中、週２回モニタした。腫瘍増殖抑制率（％ＴＧＩ）を、処置群の平均腫瘍体積と対照群の平均腫瘍体積との間の差と定義し、％ＴＧＩ＝［（（ＴＶｃ−ＴＶｔ）／ＴＶｃ）×１００］（式中、ＴＶｃは、所与の対照群における平均腫瘍体積であり、ＴＶｔは、処置群における平均腫瘍体積である）を用いて算出した。ＮＣＩ基準によって定義されるように、≧６０％のＴＧＩは、生物学的に有意であると考慮される。
【０１９２】
ＭＣ３８モデルでは、統計学的に有意な腫瘍増殖阻害をＤＴＡ−１処置（アイソタイプ対照ｐ＜０．０００１に対して２１日目に８０％のＴＧＩ）により達成した。腫瘍退縮は早ければＤＴＡ−１処置後１４日目に、完全応答（complete response、ＣＲ）は２８日目までに５／１０の動物において観察された。ＣＲは耐久性があるように見え、最終処置用量後、最大３５日間、再増殖は観察されなかった。
【０１９３】
ＣＴ２６モデルでは、アイソタイプ処置対照動物（２７日目に＞６５％のＴＧＩ、ｐ＜０．０００１）と比較して、統計学的に有意な腫瘍増殖阻害をＤＴＡ−１処置により達成した。腫瘍退縮は群の半分（５／１０の動物）で早ければ１４日目に観測され、完全応答（ＣＲ）は３１日までに観測された（図５）。ＣＲは耐久性があるように見え、最終処置用量後、最大４２日間、再増殖は観察されなかった。
【０１９４】
実施例１４．免疫チェックポイント抗体及びＴ細胞アゴニスト抗体によるＡＮＴＩ−ＧＩＴＲ併用療法は抗腫瘍免疫を増大させる
ＭＣ３８同系結腸がんモデルを使用して、抗ＰＤ−１、抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント遮断薬、又は抗ＯＸ−４０抗体との組み合わせによる併用抗ＧＩＴＲ療法を評価した。
【０１９５】
マウスに、５×１０５のＭＣ３８腫瘍細胞を右脇腹に皮下（ｓｃ）移植した。腫瘍細胞移植後１４〜２１日目に、マウスを、平均腫瘍サイズがおよそ２００ｍｍ３の実験群に無作為化した。マウスに、代理抗ＧＩＴＲ（ＤＴＡ−１、ＢｉｏＸｃｅｌｌ  ＃ＢＥ００６３）、抗ＰＤ−１（ＲＭＰ１〜１４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ  ＃ＢＥ０１４６）、抗ＣＴＬＡ−４（９Ｄ９、ＢｉｏＸｃｅｌｌ  ＃ＢＰ０１６４）、抗ＯＸ４０（ＯＸ−８６、ＢｉｏＸｃｅｌｌ  ＃ＢＥ００３１）、又はラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照（ＬＴＦ−２、ＢｉｏＸｃｅｌｌ  ＃ＢＥ００９０）を、１００μｇ／動物ｑ４ｄで、無作為化後１、５、及び９日目に合計３用量、腹腔内投与した（ｎ＝１０／群）。腫瘍の厚さ測定を研究の終わりまで週２回行った。腫瘍体積を、次式：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ｌ×ｗ２／２）（式中、「ｌ」は厚さ測定により決定された腫瘍の長さを表し、「ｗ」は厚さ測定により決定された腫瘍の幅を表す）を使用して算出し、研究中、週２回モニタした。腫瘍増殖抑制率（％ＴＧＩ）を、処置群の平均腫瘍体積と対照群の平均腫瘍体積との間の差と定義し、％ＴＧＩ＝［（（ＴＶｃ−ＴＶｔ）／ＴＶｃ）×１００］（式中、ＴＶｃは、所与の対照群における平均腫瘍体積であり、ＴＶｔは、処置群における平均腫瘍体積である）を用いて算出した。ＮＣＩ基準によって定義されるように、≧６０％のＴＧＩは、生物学的に有意であると考慮される。
【０１９６】
腫瘍がより大きく、用量を２００μｇ／マウスから１００ｕｇ／マウスに低減したときに処置が開始されたにもかかわらず、アイソタイプ対照コホートと比較して、統計学的に有意な腫瘍増殖阻害を抗ＧＩＴＲ処置により達成した。抗ＧＩＴＲ＋抗ＰＤ−１併用群では、無作為化後２６日目までに５／１０の動物において腫瘍退縮が観察された（図６）。抗ＧＩＴＲ＋抗ＣＴＬＡ−４併用群では、腫瘍退縮が３／１０の動物において観測され、腫瘍進行の遅延が２／１０の動物において観測された（図７）。最後に、抗ＧＩＴＲ（ｄ１）＋抗ＯＸ４０（ｄ５、ｄ９）の組み合わせは、抗ＧＩＴＲ療法単独（ｄ１、ｄ５、ｄ９）及び抗ＯＸ４０単独（ｄ５、ｄ９）よりも良好であった（図８）。
【０１９７】
実施例１５．ワクチン接種による抗ＧＩＴＲ及び抗ＰＤ１療法の併用は、非腫瘍保有マウスにおいて、頑丈な抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、機能、及び分化を誘導する。
ＰＤ−１遮断薬とのＧＩＴＲを標的とした併用療法がワクチンセッティングにおいてＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増大させる機構を評価した。これに対処するために、非腫瘍保有マウスをＯＶＡ免疫優性ＣＴＬエピトープＯＶＡ２５７〜２６４ペプチドワクチン（以後、Ｖａｘと称する）で１回免疫化し、０、３、及び６日目に２００μｇの抗ＧＩＴＲで、並びに３、６、９、及び１２日目に２００μｇの抗ＰＤ−１で処置した。脾臓Ａｇ特異的ＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔ応答、多官能性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答のレベルの増加、及び細胞毒性活性を示すＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルの上昇によって証明されるように（それぞれ図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃ）、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の併用療法は、対照と比較してＣＤ８＋エフェクター機能を増大させた。三重療法は、他の処置及び対照群（図９Ｂ）と比較して、単一ＩＦＮγ、二重ＩＦＮγ／ＴＮＦα、及び三重ＩＦＮγ／ＴＮＦα／ＩＬ−２を発現する多官能性エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の著しく高い頻度を誘発した。Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１は、ＯＶＡ２６７〜２６４Ｈ−２Ｋｂ−ＳＩＩＮＦＥＫＬ四量体による直接染色により、７日目及び１４日目に末梢血におけるＯＶＡ四量体特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の頻度を著しく増幅し（図９Ｄ及び図９Ｅ）、標的特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のトラフィッキングが示唆された。Ｔｈ１炎症サイトカインを分泌するエフェクター細胞の高い頻度は、抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１のインビボ組み合わせがワクチン誘導Ａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を向上させ得ることを示す。
【０１９８】
ワクチンプライミングの１４日後にＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌの表面発現によって、併用療法がエフェクター対メモリー表現型に向かってＡｇ特異的ＣＤ８＋細胞分化を歪めた程度を決定した。中央メモリー（central memory、ＣＭ）の表現型プロファイルは、典型的には、ＣＤ４４＋及びＣＤ６２Ｌ＋であり、エフェクターメモリー（effector memory、ＥＭ）細胞は、ＣＤ４４＋及びＣＤ６２Ｌ−である。三重併用療法を受けたマウスの四量体ＯＶＡ特異的ＥＭ及びＣＭ  ＣＤ８＋Ｔ細胞集団において、他の群と比較して著しい増加が観察された（図９Ｅ）。更に、ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の優勢な集団は防御免疫（２５〜２７）の最適なエフェクターサブセットであり、おそらくがん免疫療法（２３、２８〜２９）の有効性と相関する重要なサブセットであることが強調されている。したがって、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＧであるメンバー１（ＫＬＲＧ１）の細胞表面発現を発現するＡｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の表現型を相関として特性化した。図９Ｆに示されるように、四量体特異的ＫＬＲＧ１＋エフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、対照群と比較して三重併用群において著しく高かった。全体として、これらの結果は、ワクチン接種と抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１との併用が、インビボで強力なＡｇ特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び機能を向上させ得ることを示している。
【０１９９】
実施例１６．ワクチン接種との併用療法は腫瘍保有マウスにおいて腫瘍退縮及び生存率の向上を誘導した。
非腫瘍保有セッティングにおける三重併用療法によって誘導されたＡｇ特異的エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増加を考慮すると、次の問題は、この組み合わせが、免疫原性の乏しいＢ１６−ＯＶＡ黒色腫モデルを使用して抗腫瘍応答を誘導できるかどうかであった。Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞をナイーブ型受容体Ｂ６マウス（ｎ＝１０／群）のコホートに移植した。移植の７日後、腫瘍が約３０〜４０ｍｍ３の平均サイズに達したときに、マウスを無作為化し、図１０Ａに概説される療法で処置した。ワクチンを伴わない抗体レジメンは、腫瘍を若干遅らせたが、おそらくＡｇ特異的Ｔ細胞の弱い誘導により、腫瘍クリアランスに至らなかった。同様に、Ｖａｘ単独も、抗ＧＩＴＲ又は抗ＰＤ−１  ｍＡｂとの併用も、１０〜２０％を超える生存率には至らなかった。しかしながら、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１で処置したマウスの腫瘍は、他の全ての群よりも著しく遅く増殖した（図１０Ｂ〜図１０Ｃ）。興味深いことに、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の併用療法は、他の併用療法又はワクチン単独よりも、およそ５０％のマウスにおいて腫瘍退縮及び生存率を著しく向上させた（図１０Ｃ〜図１０Ｄ）。総合すれば、データは、抗ＧＩＴＲ標的及び抗ＰＤ−１遮断薬の組み合わせは、ワクチンと相乗作用して全生存期間を向上させ得ることを示している。
【０２００】
実施例１７．Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用免疫療法はＡｇ特異的多官能性ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導し、腫瘍内のＴｒｅｇ集団を低減する。
併用療法の作用機序を理解するために、各種の免疫療法後の腫瘍から単離されたＣＤ８＋エフェクター及びＣＤ４＋ＴｒｅｇのＡｇ特異的表現型及び機能的応答を特性化した。抗腫瘍免疫における多機能エフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫の重要性（Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ  ＤＯ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１４；７４：１７８９〜８００、Ｓｌａｎｅｙ  ＣＹ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１４；７４：７１６８〜７１７４）を考慮して、エクスビボＯＶＡ２５７〜２６４  ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチド刺激に応答して、Ａｇ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団及びそのＩＦＮγ及びＴＮＦαの発現を腫瘍移植の１５日後に測定した（図１１Ａ）。Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法は、他の全ての群と比較して、腫瘍内のエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ及びＴ  ＮＦα生成を著しく増加させた（図１１Ａ）。更に、腫瘍内のＯＶＡ特異的ＩＦＮγ／ＴＮＦα二重陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞のより高い頻度によって示されるように、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１療法は、相乗効果を示した（図１１Ａ）。細胞溶解性ＣＤ８＋ＣＴＬが腫瘍に対する防御の点で重要な成分である（Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ  ＤＯ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２０１４；７４：１７８９〜８００、Ｓｌａｎｅｙ  ＣＹ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ２０１４；７４：７１６８〜７１７４）ことを考慮して、脱顆粒を受ける細胞の細胞溶解潜在能力を発現マーカーＣＤ１０７ａによって決定した。結果は、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１で処置した腫瘍保有マウスから単離したＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（tumor infiltrating lymphocyte、ＴＩＬ）が、対照と比較して、ＯＶＡ２５７〜２６４に対する溶解活性を有するＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が著しく高かったことを示し、これらのＴ細胞が腫瘍細胞を標的とする、より大きな潜在能力を有することを示唆している（図１１Ｂ）。三重併用はまた、腫瘍内にトラフィッキングされる四量体ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のより高い頻度を誘導した（図１１Ｃ）。更に、ＰＭＡ／ＩＯＮで刺激した場合、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及び／又は発現ＣＤ１０７ａを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度で同様の傾向が見られ、これは、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の組み合わせがより機能的なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を全体的に誘導したことを示している（図１１Ｄ）。ＰＭＡ／ＩＯＮで刺激したＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１処置ＴＩＬは、ＣＤ１０７ａ＋ＩＦＮγ＋を共発現する細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞のより高い頻度を有した。これは、細胞溶解活性の実質的な増加を、その著しい制御及び／又はマウス内の確立された腫瘍の退縮と関連付ける。
【０２０１】
抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂのうちの１つの機序が腫瘍中のＣＤ４＋  Ｔｒｅｇを低減させるものである（Ｃｏｈｅｎ  ＡＤ，ｅｔ  ａｌ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１０；５：ｅ１０４３６、Ｓｃｈａｅｒ  ＤＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１２；２４：２１７〜２２４、ｃｈａｅｒ  ＤＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１４：１５：２〜７）ことを考慮して、腫瘍内のこれらの細胞に対するＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用免疫療法の効果を評価した。しかしながら、腫瘍内のＴｒｅｇ集団を評価する前に、非腫瘍保有マウス内の１４日目の脾臓Ｔｒｅｇ集団を、図１０のスキームを使用して、但し、ナイーブ型保有マウスにおいてモニタした。他の免疫療法群と比較して、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１処置群においてＴｒｅｇの著しい減少が観察された（図１２Ａ）。このため、これらの結果に基づいて、三重併用療法は腫瘍内のＴｒｅｇの減少につながり得ることが予想された。腫瘍移植後１５日目のＴｒｅｇ集団をモニタすると、抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１免疫療法及びＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１免疫療法の両方が同様かつ劇的に腫瘍内の浸潤Ｔｒｅｇを減少させた（図１２Ｃ〜図１２Ｄ）。これは、両方のセッティングにおいて抗ＧＩＴＲ併用が腫瘍浸潤Ｔｒｅｇを減少させ得ることを示している。三重併用は全般的に、全ての処置群と比較して、腫瘍内のＴｒｅｇのより良好な低減を示した。ワクチン接種群の大部分におけるＴｒｅｇ集団の全般的な低減は、潜在的にＴＭＥにおける好ましいＴｈ１応答によるものであり、ＴＭＥを抑制性から炎症性にシフトさせた（Ｔａｔｓｕｍｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ２００２；１９６：６１９〜６２８、Ｆｒｉｄｍａｎ  ＷＨ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２；１２：２９８〜３０６）。抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ１を除く全ての免疫療法は、図９及び図１１Ａに示されるように、おそらくペプチドワクチンによって誘導されたＡｇ特異的ＣＴＬ応答の誘導のために、腫瘍内へのＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤を猛烈に増加させた（図１２Ｂ）。結果として、腫瘍内のＣＤ８／Ｔｒｅｇ比は明らかに増加し、三重併用療法は任意の他のＡｂ併用療法よりも統計的に優れており（図１２Ｄ）、これは、黒色腫モデルにおける治療有効性の相関として記載されている応答である（Ｑｕｅｚａｄａ  ＳＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００６；１１６：１９３５〜１９４５）。総じて、腫瘍反応性ＣＴＬ応答を向上させ、Ｔｒｅｇを低減し、腫瘍内のエフェクターＴ細胞とＴｒｅｇとの比をより高くさせるためのＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用の相乗効果は、腫瘍クリアランスをより媒介することができる、よりＡｇ特異的な炎症の微小環境を表し得る。
【０２０２】
実施例１８．Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法は、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介されるＢ１６−ＯＶＡ腫瘍拒絶を誘導し、長期記憶を誘発した。
腫瘍浸潤性ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法における免疫ペプチドに対する相乗的強化を示した。これは、強力なＣＴＬ応答の優れた誘導が併用療法の有効性にとって最も重要であることを示している。したがって、併用療法によって誘導される腫瘍拒絶に対するエフェクター集団の関連性を調査した。療法セッティングでは、図１３Ａに示されるように、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＮＫ細胞は、腫瘍保有マウスにおいて激減した。移植後２２日を過ぎて生存したマウスは存在しなかったため、ＣＤ８枯渇が、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１によって提供される有益な効果を完全に無効にしたことを結果は示している（図１３Ｂ）。対照的に、ＣＤ４細胞及びＮＫ細胞の枯渇は、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１療法の抗腫瘍活性に影響しなかった（図１３Ｂ）。これは、これらの細胞は観察された有効性において何の役割も果たしていないことを示している。全般的に、対照マウス、又は抗ＣＤ８単独及び抗ＮＫ１．１単独で処置したこれらのマウスからの腫瘍には統計的な差異はなかった。前回の研究（Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２０１４；１３４：１８８４〜９２）に従って、抗ＣＤ４単独で処置した群を用いて、腫瘍増殖の遅延及び観察された生存率の有意差（ｐ＝０．００３７；ＣＤ４枯渇対アイソタイプ）を観察した（図１３Ｂ）。しかしながら、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法でａＣＤ４（図１３Ｂ）又はａＣＤ２５（図１６）を投与することの追加の利点はなかった。これは、この組み合わせはヘルパーＴ細胞又は調節ＣＤ４＋  Ｔ細胞の枯渇とは無関係に作用し得ることを示唆している。全般的に、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、生存期間を延ばし、腫瘍拒絶を誘発する要因である主なエフェクター集団であることを結果は示している。
【０２０３】
がんに対するワクチン接種及び活性免疫療法の両方の最終目的は、その後のＡｇ曝露に対して迅速に対応し得る長期持続性メモリーＴ細胞の発生である。記憶応答を評価するために、再チャレンジ実験を、処置完了の６ケ月後に、腫瘍のない生存動物で再度行った。Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１処置により第１の腫瘍チャレンジから生存した全てのマウスは、６ケ月後の同じ腫瘍に対する第２の腫瘍チャレンジから生存した（図１３Ｃ）。これは、耐久性のある抗腫瘍免疫及び長期記憶応答の誘導を示している。加えて、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１による処置後に治癒したマウスを、ＯＶＡを発現しない親Ｂ１６．Ｆ１０腫瘍濃染で再チャレンジした場合、マウスの約８０％は腫瘍がないままで、再チャレンジの際に腫瘍を拒絶した（図１３Ｄ）。全般的に、これらのデータは、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法が長期記憶応答並びに腫瘍細胞によって発現される他の抗原に対するエピトープスプレディングを誘導し得ることを示唆している。
【０２０４】
実施例１９．Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の組み合わせは、腫瘍の制御及びクリアランスに重要な強力なＡｇ特異的腫瘍浸潤ＫＬＲＧ１＋エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞を誘発する
この分野における広範囲な研究では、ＣＴＬが腫瘍拒絶において主要な役割を果たし、腫瘍浸潤エフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞の数がしばしば予後良好と相関することが示されている（Ｂｌｏｈｍ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；３６：４６８〜４７７、Ｂｏｉｓｓｏｎｎａｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００７；２０４：３４５〜３５６、Ｓｔｅｅｒ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１０；２９：６３０１〜６３１３）。より最近では、ＫＬＲＧ１＋エフェクターメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞のサブセットが病原体及び腫瘍に対する治療有効性を予測し得るという仮説を支持するいくつかの研究が始まっている（Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ  ＤＯ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１５；１０：１６５３〜１６６２、Ｏｌｓｏｎ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１３；３８：１２５０〜６０、Ｃｕｓｈ  ＳＳ，Ｆｌａｎｏ  Ｅ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１１；１８６：４０５１〜８、Ｙｅ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１２；１８９：５２０６〜１１、ｖａｎ  Ｄｕｉｋｅｒｅｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１２；１８９：３３９７〜４０３、Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ  ＤＯ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１４；７４：１７８９〜８００、Ｓｌａｎｅｙ  ＣＹ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１４；７４：７１６８〜７１７４、Ｂｒｕｎｎｅｒ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２０１５；６１：１９５７〜６７）。図９Ｆの非腫瘍保有マウスの末梢血におけるＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増加は、これらの細胞が三重併用療法によって誘発された完全な腫瘍退縮の免疫相関であり得ることを示唆した（図１０）。したがって、腫瘍退縮が、ロバストな腫瘍浸潤ＫＬＲＧ１＋エフェクターメモリーＡｇ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を駆動させるその能力と関連付けられるかどうかを調査した。腫瘍移植の１２日後（治療開始の５日後、図１０Ａ）、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法では腫瘍内の四量体特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答が最も高く増加したことが示された（図１４Ａ）。次いで、発現マーカーＫＬＲＧ１に基づくエフェクターメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞サブセットを評価した。興味深いことに、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１療法は、他の全ての群と比較して、腫瘍浸潤ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋エフェクター細胞及びＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋細胞の頻度の約２倍の増加をもたらした（図１４Ｂ〜図１４Ｃ）。これは、Ａｇ特異的ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋エフェクター細胞が迅速なエフェクター機能を誘発するように腫瘍部位にトラフィッキングし得ることを暗示している。全般的に、本発明者らは、より高いＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の生成は、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法で見られる確立された腫瘍の退縮と相関していることを実証した。
【０２０５】
ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋サブセット集団の増殖がＶａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法におけるより良好な腫瘍増殖制御／退縮の確立を助ける１つの機序である場合、ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋ＣＤ４４＋エフェクターＴ細胞サブ集団の枯渇が腫瘍増殖制御の喪失につながるかどうかを決定することが重要であった。最初に、標的集団を枯渇させる抗ＫＬＲＧ１（ａＫＬＲＧ１）抗体の能力を決定した。これを調査するために、非腫瘍保有マウスの２つの群に、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法でワクチン接種し、１つの群をワクチン接種後の０、２、４、及び６日目に２００μｇの抗ＫＬＲＧ１  ｍＡｂ（２００μｇ）で処置し、療法開始後７日目に、血液及び脾臓由来のＣＤ８＋Ｔ細胞でＫＬＲＧ１の発現をモニタした（図１７）。抗ＫＬＲＧ１  ｍＡｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを低減させ（図１７Ａ）、標的ＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋ＣＤ４４＋集団を枯渇させることが観察された（図１７Ｂ〜図１７Ｃ）。Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１で処置した抗ＫＬＲＧ１マウスは、非処置ＫＬＲＧ１対照群と比較して、血液及び脾臓内のＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋ＣＤ４４＋及びＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋Ｔｅｔ＋集団の頻度及び／又は絶対総数の著しい減少をもたらした（図１７Ｂ〜図１７Ｃ）。次に、腫瘍保有マウスにおいてＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋ＣＤ４４＋細胞を枯渇させることによって、三重併用療法によって誘導された腫瘍拒絶を促進する際のＫＬＲＧ１＋ＣＤ８＋ＣＤ４４＋集団の寄与を評価した。結果は、ＫＬＲＧ１  Ａｂを枯渇したマウスがＫＬＲＧ１枯渇を伴わずに処置した組み合わせよりも速い腫瘍増殖を示したことにより、ＫＬＲＧ１枯渇が保護を著しく低減させたことを明らかにした（図１４Ｄ）。より顕著に、αＫＬＲＧ１枯渇を伴う併用療法は、もはや、ａＫＬＲＧ１処置を伴わない併用療法を超える腫瘍退縮及び長期生存率を確立しなかった（０％対４０％腫瘍拒絶）。総合すれば、これらの結果は、三重併用によって誘導されたＡｇ特異的ＫＬＲＧ１＋エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞の増加が、この黒色腫療法モデルにおける腫瘍の増殖制御、退縮、及び長期生存率を促進した機序であることを示唆している。したがって、このようなエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞のサブ集団の増殖は、将来のがん免疫療法戦略にとっての主要な利益であり得る。
【０２０６】
実施例２０．抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法は、自己抗原腫瘍関連抗原ワクチンと相乗作用して抗腫瘍効果を向上させる。
効果的ながん免疫療法を開発するための主要な課題は、自己抗原などの免疫原性の乏しい腫瘍関連抗原（tumor associated antigen、ＴＡＡ）に対する強い抗腫瘍応答を駆動させることである。図１３Ｄの結果は、Ｖａｘ／抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１処置の組み合わせが、ＯＶＡ以外に黒色種ＴＡＡへのエピトープスプレディングを誘導する可能性があることを示唆した。したがって、これは、抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１併用療法が自己腫瘍関連抗原をコードするワクチンの有効性を向上させ得るかどうかについての疑問を促した。黒色種腫瘍抗原チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ−２）は、それが最もよく研究された弱い免疫原性の黒色種腫瘍抗原のうちの１つであるため選択された。単剤ＴＲＰ２ワクチン接種は、Ｂ１６黒色種マウスモデルにおける予防的なセッティングにおいて効力のある抗腫瘍効果を有することが示されている（Ａｖｏｇａｄｒｉ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓ  ２０１４；２：４４８〜４５８、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ＳＲ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１３；１９１：３９５５〜３９６７）。しかしながら、この活性は著しく低減し、治療のセッティングにおいて腫瘍を制御することに限定されている。同様に、抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１抗体療法は単独では、その有効性が限定されている（図１０）。したがって、抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の併用療法を使用し、図１５Ａに示されるようにＴＲＰ２ペプチドワクチンでマウスを３回付随的に免疫化して、８日目の腫瘍（平均腫瘍直径約５０ｍｍ３）に対して厳重な治療的介入を適用した。確立された腫瘍の併用治療は、対照群（図１５Ｂ）と比較して、腫瘍増殖の著しい抑制を示した（図１５Ｂ）。これは、処置が自己抗原に対する耐性を破壊することができることを示唆している。より重要なことに、ＴＲＰ２／抗ＧＩＴＲ６／抗ＰＤ−１の三重併用療法は、マウスの約２０％で完全かつ耐久性の退縮をもたらしたが、単独療法は完全な退縮を誘発しなかった（図１５Ｂ）。この観察は、抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１が抗腫瘍免疫を増大させるようにペプチドワクチンと相乗作用し得ることを再確認している。全般的に、これらの研究は、抗ＧＩＴＲ／抗ＰＤ−１の併用が、自己及び非自己腫瘍抗原に対するワクチン誘導応答を両方増大させるための有用な免疫療法であり得るという概念を支持する。
【０２０７】
実施例２１．抗ＣＤ１２２処置は、腫瘍ワクチン及び抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂと相乗作用して、最適な治療効果を達成する。
単独療法としての抗ＣＤ１２２は腫瘍の進行を遅延させたが、試験した条件下では、７日目の腫瘍（平均腫瘍径約３０ｍｍ３）に対するより厳格な治療的介入では治癒的ではなかった（図１８Ａ〜図１８Ｂ）。したがって、腫瘍特異的免疫応答の大きさを向上させる試みでは、新腫瘍抗原としてＯＶＡ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を標的とするペプチドベースのがんワクチンを、抗ＣＤ１２２療法と組み合わせて使用した。抗ＣＤ１２２及びペプチドワクチンの単回用量を使用した７日目の確立された腫瘍の治療的介入は腫瘍増殖の著しい抑制を示し、約１０％の長期生存率につながったが、いずれかの単独療法はほとんど影響を及ぼさなかった（図１８Ａ〜図１８Ｂ）。ＴＩＬの分析は、抗ＣＤ１２２をワクチンと組み合わせた場合、各薬剤単独と比較してＧ−ＭＤＳＣの頻度が著しく低減したことを示した（図１９Ａ〜図１９Ｄ）。加えて、併用療法はまた、エフェクターＣＤ８＋ＴＩＬからの二重ＩＦＮγ／ＴＮＦαの生成を著しく増加させ、腫瘍内のＯＶＡ四量体特異的ＣＤ４４＋ＣＤ８＋メモリーＴ細胞を相乗的に増強させた（図１９Ａ〜図１９Ｄ）。ＯＶＡ四量体特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増加は、ワクチン及び抗ＣＤ１２２療法の組み合わせで処置した非腫瘍保有マウスの周辺にも認められた（図２０Ａ〜図２０Ｃ）。併用療法は、各薬剤単独に対するＣＤ４＋Ｔｒｅｇの割合を明らかに低減させた（図１９Ｄ）。これは、併用群において観察された全般的に改善された保護が、（１）Ａｇ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の増加、（２）Ｇ−ＭＤＳＣの減少、及び（３）腫瘍内のＣＤ４＋Ｔｒｅｇ集団の低減、に関連付けられたことを示唆している。これらの変化は、腫瘍拒絶のためのより支持的な環境をもたらし得る。
【０２０８】
７日目の確立された腫瘍を処置するために、プライムブーストワクチン接種戦略を７、１０、及び１４日目に適用した。これは、この治療のセッティングにおけるワクチン単回投与よりも大きい長期生存率（３０％）を示した（図２１Ａ）。ＣＤ８＋ＣＤ１２２＋  Ｔ細胞がメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞特性を有すると記載されていることを考慮して（Ｌｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１４；１１：３２６〜３１、Ｌｉｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１５；６：４９４）、そのような集団を標的とすることが、長期にわたるメモリーＴ細胞の生成に影響を及ぼす可能性があるかどうかを調査した。治療後８０日目のプライムブースト生存体の第２の腫瘍チャレンジは腫瘍増殖を示さなかった。これは、併用療法の間にＴ細胞記憶のレベルが発達及び維持されたことを示している（図２１Ｂ）。
【０２０９】
最後に、Ｖａｘ／抗ＣＤ１２２併用及び抗ＣＤ４／抗ＣＤ１２２併用の研究においてＴｒｅｇを低減させるという付加的な利益によって改善された有効性を考慮して、抗ＣＤ１２２単独が、腫瘍内のＣＤ４＋  Ｔｒｅｇの数を低減させることができる免疫療法である抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂと相乗作用し得るかどうかを決定した（Ｓｃｈａｅｒ  ＤＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１２；２４：２１７〜２２４）。抗ＣＤ１２２及び抗ＧＩＴＲ標的ｍＡｂの併用療法を使用した４日目の腫瘍に対する治療的介入は相乗作用を示した。これは、抗ＣＤ１２２単独療法と比較して、約４０％の長期生存率をもたらした腫瘍増殖の著しい抑制を示している（図２２Ａ〜図２２Ｂ）。これらの研究は更に、追加のがん免疫療法と組み合わせてＧＩＴＲ標的アプローチを設計するための段階をセットした。
【０２１０】
実施例２２．ｔｒｇｂ１９１結合エピトープのマッピング
ヒトＧＩＴＲ細胞外ドメインのＴＲＧＢ１９１についての結合エピトープを特定するために、溶液水素／重水素交換質量分析法（hydrogen/deuterium exchange-mass spectrometry、ＨＤＸ−ＭＳ）を行った。
【０２１１】
ペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化及びＬＣ  ＭＳ
ペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化のために、１３３μＬ対照バッファ（５０ｍＭリン酸、１００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４）中の３．２μｇのヒトＧＩＴＲを、１３５μＬの４Ｍ塩酸グアニジン、０．８５Ｍ  ＴＣＥＰバッファ（最終的なｐＨは２．５である）を添加し、混合物を３分間２５℃でインキュベートすることによって変性させた。その後、混合物をオンラインペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化に供し、結果として生じるペプチドを、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｈｙｂｒｉｄ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ）に連結したＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣで構成されるＵＰＬＣ−ＭＳシステムを使用して分析した。ペプチドを、ヒトＧＩＴＲを含有するサンプルについて２〜２８％の溶媒Ｂ（アセトニトリル中、０．２％のギ酸）から１９分の勾配で５０ｍｍ×１ｍｍのＣ８カラム上で分離した。溶媒Ａは、水中、０．２％のギ酸である。注入バルブ並びにペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩカラム及びそれらに関連する接続チューブは、１１℃に維持された冷却ボックスの内側にある。また、第２のスイッチングバルブ、Ｃ８カラム、及びそれらに関連するステンレス鋼の接続チューブは、０℃に維持された別の冷却循環ボックス内にある。ペプチド同定は、ヒトＧＩＴＲ配列に対するＭＳ／ＭＳデータをＭａｓｃｏｔで検索することを通じて行う。前駆体及び産生物イオンに対する質量許容差は、それぞれ１０ｐｐｍ及び０．０５Ｄａである。
【０２１２】
グリカン質量の同定
１０μｇのヒトＧＩＴＲを、１μＬのＰＮＧａｓｅ  Ｆと共に３７℃で一晩インキュベートすることによって脱グリコシル化した。次いで、サンプルをドライダウンさせ、グリカンを再構成し、６５℃で３時間、５μＬの４００ｍＭのプロカインアミド（酢酸：ＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）及び１Ｍのシアノ水素化ホウ素ナトリウムの３：７比で調製）と共にインキュベートした。過剰な標識試薬を除去するために、サンプルを９０％のＡＣＮ中、合計５００μＬの溶液に再構成した。ＨＩＬＩＣ−ＳＰＥプレートを、２００μＬの水及び２００μＬの９０％のＡＣＮで条件づけした後、サンプルをＨＩＬＩＣ−ＳＰＥプレートに充填し、２００μＬの９０％のＡＣＮで洗浄し、５０μＬの２０％のＡＣＮで溶出した。７５μＬのＡＣＮを、更なる分析の前に添加した。Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ及びＢｒｕｋｅｒ  ＭｉｃｒｏＴＯＦ  ＱＩＩからなるＵＰＬＣ−ＭＳを使用してグリカン質量を測定した。
【０２１３】
ＨＤＸ
８μＬのヒトＧＩＴＲ（３．２μｇ）又は８μＬのヒトＧＩＴＲ及びｍＡｂ混合物（３．２μｇ：２４μｇ）を、１２５μＬの重水素標識バッファ（ｐＤ７．４で、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム）と共に２５℃で０秒、６０秒、３００秒、１８００秒、７２００秒、及び１４４００秒間インキュベートした。１３５μＬの４Ｍ塩酸グアニジン、０．８５Ｍ  ＴＣＥＰバッファ（最終的なｐＨは２．５である）を添加することによって水素／重水素交換をクエンチした。その後、クエンチしたサンプルを、上記に記載されるようにオンカラムペプシン／プロテアーゼＸＩＩＩ消化及びＬＣ−ＭＳ分析に供した。質量スペクトルはＭＳのみのモードで記録した。
【０２１４】
未加工のＭＳデータを、Ｈ／Ｄ交換ＭＳデータの分析のためのソフトウェア、ＨＤＸ  ＷｏｒｋＢｅｎｃｈを使用して処理した（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１２，２３（９），１５１２〜１５２１）。重水素化ペプチドとその天然形態（ｔ０）との平均質量差を使用して、重水素レベルを算出した。
【０２１５】
結果
特定されたペプチドにおける重水素レベルを、ＬＣ−ＭＳでの質量シフトからモニタした。ネイティブヒトＧＩＴＲ−ＥＣＤは、配列番号６２の残基２８〜５０及び７０〜７９のｍＡｂ  ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦに結合すると重水素摂取において著しい低減を示す。したがって、ｍＡｂに結合する際に重水素摂取で著しい低減を有するこれらの領域は、図２３の濃いグレー又は薄いグレーで強調されるエピトープペプチドとして割り当てられる。
【０２１６】
エピトープをＧＩＴＲ構造にモデル化
ヒトＧＩＴＲ  ＥＣＤに結合するｍＡｂ  ＴＲＧＢ１９１のＨＤＸ−ＭＳ測定値は、結合エピトープが不連続であり、ＧＩＴＲの２つのペプチド領域内に位置することを示す。
領域１（配列番号６２の残基２８〜５０）
領域２（配列番号６２の残基７０〜７９）：
【０２１７】
ｍＡｂ  ＴＲＧＢ１９１の結合エピトープは、ＴＲＧＢ１５９  Ｆａｂと複合体化したＧＩＴＲ  ＥＣＤの結晶構造から得られたＧＩＴＲの３Ｄモデル上のＨＤＸデータをマッピングすることによって、更に精製した。この構造によれば、２つのペプチドの大部分は溶媒にアクセスできない。ペプチドの曝露部分は、空間内で近位であり、（図２４に強調された）配列番号６２の残基４０〜４５及び７５〜７９を含む。
【０２１８】
構造は次のように決定した。ＧＩＴＲ：ＴＲＧＢ１５９複合体は、Ｆａｂを２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５、２５０ｍＭのＮａＣｌ中、２５％モル過剰のＧＩＴＲ  ＥＣＤと混合することによって調製し、４℃で一晩インキュベートした。複合体の形成をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラムでモニタした。複合体の結晶化を、２０℃のシッティングドロップ（sitting drops）における蒸気拡散法によって実施した。Ｘ線分析に好適な結晶を、０．１ＭのＨＥＰＥＳバッファ、ｐＨ７．５中の１４％のＰＥＧ  ３３５０及び０．２Ｍのギ酸Ｎａから得た。Ｘ線データ収集のため、１つの結晶を、２４％グリセロールを添加した母液を含むクライオプロテクタント溶液中に数秒間浸漬し、液体窒素中でフラッシュ冷却した。Ｘ線回折データを、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ，ＩＬ）で、Ｍａｒ２２５検出器を使用して収集した。回折強度を２．８オングストローム分解能で検出し、プログラムＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ、Ｗ．（２０１０）．ＸＤＳ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６，１２５〜１３２．）で処理した。構造は、検索モデルとしてタンパク質データバンクの構造５Ｉ１６を使用して、プログラムＰｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．，Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｒ．Ｗ．，Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｓｔｏｒｏｎｉ，Ｌ．Ｃ．＆  Ｒｅａｄ，Ｒ．Ｊ．（２００７）．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．４０，６５８〜６７４）による分子置換によって解釈した。Ｆａｂが単位胞内に位置付けられたときに、ＧＩＴＲ分子をプログラムＣｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．，Ｌｏｈｋａｍｐ，Ｂ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｗ．Ｇ．＆  Ｃｏｗｔａｎ，Ｋ．（２０１０）．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６，４８６〜５０１）を使用して電子密度で手動で構築した。
【０２１９】
実施例２３．初代活性化Ｔ細胞及びＪＪＮ−３細胞株に対するＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦのＡＤＣＣ活性
ＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子（ｒｓ３９６９９１）の多型性は、１５８ＶアロタイプがヒトＩｇＧ１に対して高い親和性を示し、ＡＤＣＣが増加した位置１５８（Ｖ１５８Ｆ）のバリンからフェニルアラニンへのアミノ酸置換変化をもたらし、この多型性は、Ｖ１７６Ｆとして文献中に折々示されている（Ｗｕ  Ｊ，Ｅｄｂｅｒｇ  ＪＣ，Ｒｅｄｅｃｈａ  ＰＢ，Ｂａｎｓａｌ  Ｖ，Ｇｕｙｒｅ  ＰＭ，Ｃｏｌｅｍａｎ  Ｋ，Ｓａｌｍｏｎ  ＪＥ，Ｋｉｍｂｅｒｌｙ  ＲＰ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ；１９９７；１００（５）：１０５９〜７０）。Ｃａｒｔｒｏｎらは、ホモ接合型ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ遺伝子型は、作用機序が腫瘍細胞のＡＤＣＣを含む抗体であるリツキシマブに対する陽性臨床応答に関連する単一パラメータであることを確認した（Ｃａｒｔｒｏｎ  Ｇ，Ｄａｃｈｅｕｘ  Ｌ，Ｓａｌｌｅｓ  Ｇ，Ｓｏｌａｌ−Ｃｅｌｉｇｎｙ  Ｐ，Ｂａｒｄｏｓ  Ｐ，Ｃｏｌｏｍｂａｔ  Ｐ，Ｗａｔｉｅｒ  Ｈ．Ｂｌｏｏｄ；２００２；９９（３）：７５４〜８）。
【０２２０】
ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦは低フコース抗体として製造し、その後、同じｍＡｂの「通常の」フコシル化バージョン（fucosylated version、ＲＦＶ）と比較して、ＮＫ細胞に存在するＦｃ受容体であるＦｃγＲＩＩＩＡに対して約１０倍向上された親和性を有する（ＫＤは、それぞれ高親和性ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ変異体に対して約３７ｎＭ対約３７０ｎＭ、低親和性ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆ変異体に対して約１８０ｎＭ対１，７５０ｎＭであった）。
【０２２１】
ＦｃγＲＩＩＩＡに対する向上した親和性を有する抗体は、増加したＡＤＣＣ活性を有することが実証されている（Ｓｔｒｏｈｌ  Ｗ，Ｓｔｒｏｈｌ  Ｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  Ｄｒｉｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ａｒｅａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ．１ｓｔ  ｅｄ．Ｓａｗｓｔｏｎ：Ｗｏｏｄｈｅａｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；２０１２）。ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦのＡＤＣＣ活性を、様々なレベルのｈＧＩＴＲを発現するいくつかの標的細胞又は細胞株に対して評価した。例えば、休止末梢Ｔ細胞は、最小レベルのＧＩＴＲを発現するが、インビトロで活性化されると、ＧＩＴＲ発現は、これらの細胞上で上方調節される。ＪＪＮ−３細胞株は、内因性ｈＧＩＴＲを、ＨｕＴ１０２細胞と比較して、より生理学的レベルで発現するヒト形質細胞白血病株であり、活性化Ｔ細胞及びインビトロで分化したＴｒｅｇで見られるものにより類似している。
【０２２２】
ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦのＡＤＣＣ活性は、ＮＫ−９２  １５８Ｖ／Ｖエフェクター細胞を使用して、初代休止又は活性化Ｔ細胞（図２５参照）及びＪＪＮ−３細胞（図２６参照）に対する広範囲なＥ：Ｔ細胞比にわたって特性化した。
【０２２３】
ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦは、休止中の非活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２５Ａ、左パネル参照）及び非活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞（図２５Ｂ、左パネル参照）に対して最小のＡＤＣＣ活性を有した。ＧＩＴＲを発現する活性化初代Ｔ細胞において、ＪＮＪ−６４１６４７１１を、５：１の最高Ｅ：Ｔ比で１１ｎｇ／ｍＬ〜３２ｎｇ／ｍＬの範囲で変動するＥＣ５０値を有する高いＡＤＣＣ活性を誘発し、値はＥ：Ｔ比に依存して変化した（表９参照）。Ｂｍａｘ値もＥ：Ｔ細胞比に依存し、より多くのエフェクター細胞が系内に存在したとき、増加した。アイソタイプ対照抗体（ＣＮＴＯ３９３０）はＡＤＣＣを誘導しなかった。
【０２２４】
ＪＪＮ−３細胞は、ＨｕＴ１０２細胞よりも低いレベルのＧＩＴＲを発現することが既に特性化されており、レベルは数倍高かったが、活性化初代Ｔ細胞及びインビトロで生成されたＴｒｅｇにより匹敵する範囲内であった。ＪＪＮ−３細胞を広範囲のＥ：Ｔ比（図２６参照）にわたってＮＫ−９２  １５８Ｖ高親和性エフェクター細胞を使用して試験したとき、ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦは、活性化初代Ｔ細胞を用いたＡＤＣＣアッセイで得られたものと非常に類似したＢｍａｘ値で、５０ｎｇ／ｍＬ〜１３０ｎｇ／ｍＬに及ぶＡＤＣＣ活性を誘導した（表９参照）。アイソタイプ対照（ＣＮＴＯ３９３０）は影響を受けなかった。
【０２２５】
【表９】
2019512230.tif 000018
データなし、条件は、試験しなかった。ＣＮＴＯ３９３０アイソタイプ対照及び非活性化初代標的細胞データは、ソフトウェアが信頼できる曲線適合を生成できなかったため示されていない。Ｅ：ＮＫ−９２  １５８Ｖ／Ｖエフェクター細胞；Ｔ：標的細胞（ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、又はＪＪＮ−３細胞。
【０２２６】
実施例２４．インビトロで分化されたＴＲＥＧに対するＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦのＡＤＣＣ活性
最近発表された内部データは、ＧＩＴＲがマウス及びヒトの両方において腫瘍微小環境内に存在する腫瘍浸潤リンパ球で発現し、固形腫瘍内のＣＤ４＋  Ｔｒｅｇにおいて最高レベルの発現が観察されていることを示している。
【０２２７】
末梢ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋と定義される機能的に抑制的なＴｒｅｇになるように分化及び増殖させた。これらのＴｒｅｇは、活性化初代ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞と比較して、同様のレベルのＧＩＴＲを発現する。ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦは、ＪＪＮ−３細胞で観察された強度に匹敵する抗体依存性Ｔｒｅｇ細胞殺傷を誘導した（図２７参照）。アイソタイプ対照（ＣＮＴＯ３９３０）は影響を受けなかった。
【０２２８】
実施例２５．高親和性ＦｃγＲＩＩＩＡ多型性及び低親和性ＦｃγＲＩＩＩＡ多型性を有するエフェクター細胞を使用したＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦのＡＤＣＣ活性
ＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦは、同じｍＡｂのＲＦＶと比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ／Ｖ及びＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆ／Ｆの両方に対して約１０倍向上した親和性を有し、低親和性ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆ／Ｆ変異体に対するそのＫＤ値は約１８０ｎＭに等しかった。これは、高親和性変異体受容体（３７０ｎＭ）に対するＲＦＶの親和性の約２倍である。
【０２２９】
ＪＪＮ−３細胞に対するＴＲＧＢ１９１．ＣＬＦのＡＤＣＣ活性は、高親和性ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｖ／Ｖ又は低親和性ＦｃγＲＩＩＩＡ−１５８Ｆ／Ｆ変異体のいずれかを発現するＮＫ−９２エフェクター細胞を使用した場合に匹敵し、ＥＣ５０値は約２倍（それぞれ４０．０１ｎｇ／ｍＬ及び８７．４４ｎｇ／ｍＬ）で変動した（図２８参照）。
【０２３０】
実施例２６．抗ＣＤ４０、抗ＯＸ４０、又は抗ＰＤＬ−１との抗ＧＩＴＲの組み合わせはより良好な腫瘍増殖遅延をもたらす
より小さい腫瘍体積（約１００ｍｍ３）で開始したアイソタイプ対照抗体で処置した動物は、約１９日間の中央タイムトゥエンドポイント（median time-to-endpoint、ＭＴＥ）に達した。１日目に１０ｍｇ／ｋｇで単回投与されたＤＴＡ−１は２回の耐久性完全退縮（complete regression、ＣＲ）及び２９．３日間のＭＴＥ遅延をもたらした。ＦＧＫ４．５、１、５、及び９日目に２ｍｇ／ｋｇで投与された抗ＣＤ４０は、６回のＣＲ、及び測定可能な６０日間のＭＴＥ遅延をもたらした。ＦＧＫ４．５（ｑ４ｄｘ３）を伴う１日目の１０ｍｇ／ｋｇのＤＴＡ−１の単回注入との組み合わせは、１つの進行が見られる時点で４０日目まで８回のＣＲをもたらした（図２９）。
【０２３１】
より大きい腫瘍体積（約２３０ｍｍ３）で開始したアイソタイプ対照抗体で処置した動物は、約１０．５日間の中央タイムトゥエンドポイント（median time-to-endpoint、ＭＴＥ）に達した。１、５、及び９日目に１０ｍｇ／ｋｇで投与されたＦＧＫ４．５は、１回の完全応答（ＣＲ）、及び測定可能な３３日間のＭＴＥ遅延をもたらした。ＦＧＫ４．５（ｑ４ｄｘ３）を伴う１日目の１０ｍｇ／ｋｇのＤＴＡ−１の単回注入との組み合わせは、４回の耐久性ＣＲをもたらした（図３０）。
【０２３２】
ＤＴＡ−１（１０ｍｇ／ｋｇ、ｑ１、１日目）抗体とＯＸ８６（１日目に開始する抗ＯＸ４０、１０ｍｇ／ｋｇ、ｑ４ｄｘ３）抗体との同時併用も、より良好な抗腫瘍増殖応答をもたらし、ＤＴＡ−１を用いた２回のＣＲから、ＯＸ８６を加えたＤＴＡ−１の組み合わせを用いた５回のＣＲへと増加した。ＯＸ８６は、単剤として腫瘍の進行を阻害しなかった（図３１）。
【０２３３】
ＤＴＡ−１（１０ｍｇ／ｋｇ、ｑ１、１日目）とＲＭＰ１〜１４（抗ＰＤ−１、１０ｍｇ／ｋｇ、ｑ４ｄｘ３）との同時併用はまた、それを第１の薬剤の２日後に与えることによって治療のうちの１つを遅延させるよりも有効であった。抗ＰＤ−１の単剤は３回のＣＲをもたらし、抗ＧＩＴＲの単剤は２回のＣＲをもたらし、同時に与えられた抗−ＧＩＴＲ及び抗ＰＤ−１併用療法は８回のＣＲをもたらした。抗ＰＤ−１又は抗ＧＩＴＲがそれぞれ最初に連鎖投与される場合、この有効性は４回又は５回のＣＲに低減した（図３２）。
【０２３４】
【表１０−１】
2019512230.tif 000019
【０２３５】
【表１０−２】
2019512230.tif 000020
【０２３６】
【表１０−３】
2019512230.tif 000021
【０２３７】
【表１０−４】
2019512230.tif 000022
【０２３８】
【表１０−５】
2019512230.tif 000023
【０２３９】
【表１０−６】
2019512230.tif 000024
【０２４０】
【表１０−７】
2019512230.tif 000025
【０２４１】
【表１０−８】
2019512230.tif 000026
【０２４２】
【表１０−９】
2019512230.tif 000027
【図１Ａ】
2019512230.tif 000028
【図１Ｂ】
2019512230.tif 000029
【図１Ｃ】
2019512230.tif 000030
【図２Ａ】
2019512230.tif 000031
【図２Ｂ】
2019512230.tif 000032
【図２Ｃ】
2019512230.tif 000033
【図２Ｄ】
2019512230.tif 000034
【図２Ｅ】
2019512230.tif 000035
【図２Ｆ】
2019512230.tif 000036
【図３Ａ】
2019512230.tif 000037
【図３Ｂ】
2019512230.tif 000038
【図３Ｃ】
2019512230.tif 000039
【図３Ｄ】
2019512230.tif 000040
【図４Ａ】
2019512230.tif 000041
【図４Ｂ】
2019512230.tif 000042
【図５Ａ】
2019512230.tif 000043
【図５Ｂ】
2019512230.tif 000044
【図６Ａ】
2019512230.tif 000045
【図６Ｂ】
2019512230.tif 000046
【図６Ｃ】
2019512230.tif 000047
【図７Ａ】
2019512230.tif 000048
【図７Ｂ】
2019512230.tif 000049
【図７Ｃ】
2019512230.tif 000050
【図８Ａ】
2019512230.tif 000051
【図８Ｂ】
2019512230.tif 000052
【図８Ｃ】
2019512230.tif 000053
【図８Ｄ】
2019512230.tif 000054
【図９Ａ】
2019512230.tif 000055
【図９Ｂ】
2019512230.tif 000056
【図９Ｃ】
2019512230.tif 000057
【図９Ｄ】
2019512230.tif 000058
【図９Ｅ】
2019512230.tif 000059
【図９Ｆ】
2019512230.tif 000060
【図１０Ａ】
2019512230.tif 000061
【図１０Ｂ】
2019512230.tif 000062
【図１０Ｃ】
2019512230.tif 000063
【図１０Ｄ】
2019512230.tif 000064
【図１１Ａ】
2019512230.tif 000065
【図１１Ｂ】
2019512230.tif 000066
【図１１Ｃ】
2019512230.tif 000067
【図１１Ｄ】
2019512230.tif 000068
【図１２Ａ】
2019512230.tif 000069
【図１２Ｂ】
2019512230.tif 000070
【図１２Ｃ】
2019512230.tif 000071
【図１２Ｄ】
2019512230.tif 000072
【図１３Ａ】
2019512230.tif 000073
【図１３Ｂ】
2019512230.tif 000074
【図１３Ｃ】
2019512230.tif 000075
【図１３Ｄ】
2019512230.tif 000076
【図１４Ａ】
2019512230.tif 000077
【図１４Ｂ】
2019512230.tif 000078
【図１４Ｃ】
2019512230.tif 000079
【図１４Ｄ】
2019512230.tif 000080
【図１５Ａ】
2019512230.tif 000081
【図１５Ｂ】
2019512230.tif 000082
【図１６】
2019512230.tif 000083
【図１７Ａ】
2019512230.tif 000084
【図１７Ｂ】
2019512230.tif 000085
【図１７Ｃ】
2019512230.tif 000086
【図１８Ａ】
2019512230.tif 000087
【図１８Ｂ】
2019512230.tif 000088
【図１９Ａ】
2019512230.tif 000089
【図１９Ｂ】
2019512230.tif 000090
【図１９Ｃ】
2019512230.tif 000091
【図１９Ｄ】
2019512230.tif 000092
【図２０Ａ】
2019512230.tif 000093
【図２０Ｂ】
2019512230.tif 000094
【図２０Ｃ】
2019512230.tif 000095
【図２１Ａ】
2019512230.tif 000096
【図２１Ｂ】
2019512230.tif 000097
【図２２Ａ】
2019512230.tif 000098
【図２２Ｂ】
2019512230.tif 000099
【図２３】
2019512230.tif 000100
【図２４】
2019512230.tif 000101
【図２５Ａ】
2019512230.tif 000102
【図２５Ｂ】
2019512230.tif 000103
【図２６】
2019512230.tif 000104
【図２７】
2019512230.tif 000105
【図２８Ａ】
2019512230.tif 000106
【図２８Ｂ】
2019512230.tif 000107
【図２９】
2019512230.tif 000108
【図３０】
2019512230.tif 000109
【図３１】
2019512230.tif 000110
【図３２】
2019512230.tif 000111
【配列表】
2019512230000001.app
【国際調査報告】
2019512230.tif 000112
2019512230.tif 000113
2019512230.tif 000114
2019512230.tif 000115