(57)【要約】本発明は、核酸又はタンパク質のリアルタイム検出においてプライマーおよびプローブとして使用されるＸ−Ｙ−Ｚの構造を両末端又は内部に結合した検出可能なマーカーを有する又は一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）、及び前記プロマーを用いて標的核酸を増幅させた後、切断された断片を定量的に測定する工程を含む核酸及びタンパク質のリアルタイム検出方法に関する。本発明に係る核酸又又はタンパク質の検出方法は、従来の検出方法に比べて少量のオリゴを使用し、かつ、実時間同定の別の位置のプローブが不要なので、コストの削減及び簡単な分析方法で核酸又はタンパク質をリアルタイムで検出可能である。また、この方法はプロマーのＹ部位を切断した後、増幅工程でＹ部位の突然変異の同定を可能にし、プロマーと結合した蛍光物質の数を超える核酸又はタンパク質を多重検出できるので、予後診断及び様々な疾患の診断に有用である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸又はタンパク質のリアルタイム検出のためのプライマーおよびプローブとして使用される一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）であって、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有し、一本鎖核酸の両末端又は内部に１つ又はそれ以上の検出可能なマーカーが付されており、リアルタイム検出を目的とする標的核酸又は標的タンパク質の特定の部位に結合して複合体を形成し、特定の酵素によるＹ部位の切断時に、Ｘ部位は標的核酸又はタンパク質との複合体を維持しながらプライマーとして機能し、ＹおよびＺは、前記標的核酸又は標的タンパク質の特定の部位から分離されることを特徴とし、前記Ｘ、ＹおよびＺのいずれかがＤＮＡであるときに他の２つのうちの１つ以上はＲＮＡであることを特徴とし、
前記Ｘ、ＹおよびＺは、塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、
前記Ｘ、ＹおよびＺがのいずれかがＤＮＡであるときに他の２つのうちの１つ以上はＲＮＡであることを特徴とする、一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項２】
前記Ｘは、１〜６０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、
前記Ｙは、１〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、
前記Ｚは、０〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、
前記Ｚが０であるとき、Ｙは３〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、
前記Ｚが１であるとき、Ｙは２〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡからなることを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項３】
前記Ｘ、ＹおよびＺは、順次ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ、又はＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＲＮＡからなることを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項４】
前記検出可能なマーカーは、一本鎖核酸に共有結合又は非共有結合によって結合する蛍光物質、又は蛍光物質と消光物質とからなる蛍光ペアであることを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項５】
前記一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）のＸ、ＹおよびＺは、非特異的な切断を防ぐために、全体的にメチル化されるか、又は部分的にメチル化されるように合成されたことを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項６】
前記一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）のＸは１０〜３０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、Ｙは１〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、前記Ｚは２〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項７】
前記酵素は、Ｙ部位がＤＮＡであるとき、ＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮＡ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ）、具体的には、ＤＮａｓｅ  I、ＤＮａｓｅ  II、Ｓ１核酸加水分解酵素、核酸加水分解酵素Ｐ１、ＡＰエンドヌクレアーゼ、又はＵｖｒＡＢＳＣ核酸加水分解酵素を使用し、Ｘ部位がＲＮＡであるとき、ＲＮＡ加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＮａｓｅ）、具体的には、ＲＮａｓｅ  II、ＲＮａｓｅ  III、ＲＮａｓｅ  IV、ＲＮａｓｅ  Ｈ、又はＲＮａｓｅ  Ｔ２を使用することを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項８】
前記一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）は、ｉ）核酸のうちＲＮＡからｃＤＮＡを合成するためのＲＴプライマー；ｉｉ）核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）から合成されたｃＤＮＡを増幅するためのフォワードフォワードプライマー；ｉｉｉ）核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）から合成されたｃＤＮＡを増幅するためのリバースプライマー；ｉｖ）核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）
から合成されたｃＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマー；又はｖ）検出しようとする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質をリアルタイムで確認するためのプローブとして使用されることを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項９】
請求項１乃至８のうちいずれか１項に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）と、前記一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）のＹ部位を切断できる酵素と、からなることを特徴とする、核酸検出用キット。
【請求項１０】
前記酵素は、一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）のＸ部位がＤＮＡであるとき、ＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮＡ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ）、具体的には、ＤＮａｓｅ  I、ＤＮａｓｅ  II、Ｓ１核酸加水分解酵素、核酸加水分解酵素Ｐ１、ＡＰエンドヌクレアーゼ、又はＵｖｒＡＢＳＣ核酸加水分解酵素を使用し、Ｘ部位がＲＮＡであるとき、ＲＮＡ加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＮａｓｅ）、具体的には、ＲＮａｓｅ  II、ＲＮａｓｅ  III、ＲＮａｓｅ  IV、ＲＮａｓｅ  Ｈ、又はＲＮａｓｅ  Ｔ２を使用することを特徴とする、請求項９に記載の核酸検出用キット。
【請求項１１】
前記キットは、ＤＮＡの増幅反応に必要な試薬をさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載の核酸検出用キット。
【請求項１２】
ａ）試料からＲＮＡを抽出する工程と；
ｂ）前記ａ）工程で抽出したＲＮＡに、別のＲＴプライマー、又は請求項１乃至８のうちいずれか１項に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を混合してｃＤＮＡを合成する工程と；
ｃ）前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡに、ｉ）請求項１０乃至１２のうちいずれか１項に記載のキットであって、そのキットに含まれている一本鎖核酸が、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列を有するフォワードプライマーおよびプローブであることを特徴とするキット、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列を有するリバースプライマー、ｉｉ）請求項１０乃至１２のうちいずれか１項に記載のキットであって、そのキットに含まれている一本鎖核酸が、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能なリバースプライマーおよびプローブであることを特徴とするキット、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列を有するフォワードプライマー、および／又はｉｉｉ）請求項１０乃至１２のうちいずれか１項に記載のキットであって、そのキットに含まれている一本鎖核酸が、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能なフォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブであることを特徴とするキット、を混合して伸長反応によりｃＤＮＡを増幅させる工程と；
ｄ）前記ｃ）工程により切断された一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）断片の量を測定する工程と；を含むことを特徴とする、ＲＮＡのリアルタイム検出方法。
【請求項１３】
前記ｃ）工程は、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡと結合した一本鎖核酸が、キットに含まれている酵素による一本鎖核酸のＹ部位の切断時に、ＹおよびＺ部位が分離され、Ｘ部位がプライマーとして機能して増幅されることを特徴とする、請求項１２に記載のＲＮＡのリアルタイム検出方法。
【請求項１４】
ａ）試料からＤＮＡを抽出する工程と；
ｂ）前記ａ）工程で抽出したＤＮＡに、ｉ）請求項１０乃至１２のうちいずれか１項に記載のキットであって、そのキットに含まれている一本鎖核酸が、前記ｂ）工程で合成されたＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列を有するフォワードプライマ
ーおよびプローブであることを特徴とするキット、前記ｂ）工程で合成されたＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列を有するリバースプライマー、ｉｉ）請求項１０乃至１２のうちいずれか１項に記載のキットであって、そのキットに含まれている一本鎖核酸が、前記ａ）工程で抽出したＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能なリバースプライマーおよびプローブであることを特徴とするキット、前記ａ）工程で抽出したＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列を有するフォワードプライマー、および／又はｉｉｉ）請求項１０乃至１２のうちいずれか１項に記載のキットであって、そのキットに含まれている一本鎖核酸が、前記ａ）工程で抽出したＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能なフォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブであることを特徴とするキット、を混合して伸長反応によりＤＮＡを増幅させる工程と；
ｃ）前記ｂ）工程により切断された一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）断片の量を測定する工程と；を含むことを特徴とする、ＤＮＡのリアルタイム検出方法。
【請求項１５】
前記ｂ）工程は、前記ａ）工程で抽出したＤＮＡと結合した一本鎖核酸が、キットに含まれている酵素による一本鎖核酸のＹ部位の切断時にＹおよびＺ部位が分離され、Ｘ部位がプライマーとして機能して増幅されることを特徴とする、請求項１４に記載のＤＮＡのリアルタイム検出方法。
【請求項１６】
ａ）請求項１乃至８項のうちいずれか１項に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）と相補的な塩基配列を有する核酸が結合した抗体を調製する工程と；
ｂ）検出対象のタンパク質を含む試料と前記ａ）工程で調製した抗体とを結合させて、タンパク質−抗体複合体を形成させる工程と；
ｃ）前記ｂ）工程の複合体に、請求項１０乃至１２のうちいずれか１項に記載のキットをハイブリダイズさせて、タンパク質−抗体−一本鎖核酸複合体を形成させる工程と；
ｄ）前記ｃ）工程により切断された一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）断片の量を測定する工程と；を含むことを特徴とする、試料内のタンパク質のリアルタイム検出方法。
【請求項１７】
前記ｄ）工程は、前記ａ）工程で調製した抗体と結合した一本鎖核酸が、キットに含まれている酵素による一本鎖核酸のＹ部位の切断時にＹおよびＺ部位が分離され、Ｘ部位がプライマーとして機能して増幅されることをを特徴とする、請求項１６に記載の試料内のタンパク質のリアルタイム検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイムで核酸またはタンパク質を検出するためにプライマーおよびプローブとして同時に使用できる一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）、及び前記一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を用いた核酸又はタンパク質のリアルタイム検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸又はタンパク質のリアルタイム検出方法としては、当業界に公知のように、マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒａｙ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＲＴ−ＰＣＲ；Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ｑＲＴ−ＰＣＲ）検査法、ＮＡＳＢＡ、ＲＣＡ、ＴＤＭＡなどの等温増幅方法が広く使用されている。
【０００３】
このような核酸又はタンパク質の検出方法は、リアルタイム検出のためにフォワード／リバースプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）とＳＹＢＲなどのＩｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ  ｔｙｐｅのｄｓＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ、又はｐｒｏｂｅ  ｔｙｐｅのＴａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、ＭＧＢ  ｐｒｏｂｅ、ＣａｔａＣｌｅａｖｅ  ｐｒｏｂｅなどを必要とする。このような検出方法は、幾つかの限界を有する。例えば、ｍｉＲＮＡのような長さが短い核酸分析のためにｃＤＮＡを合成する過程において、ループＲＴプライマー（ｌｏｏｐ  ＲＴ  ｐｒｉｍｅｒ）又はポリＡ（ｐｏｌｙ  Ａ）を形成し、ポリＡの後に追加のオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）拡張を必要とする。この場合、ｍｉＲＮＡのように長さが短い核酸分析で複雑なプロセスが必要となり、追加コストの増加及び長い検出時間が必要となる。また、従来の方法では、検出される１つのｍｉＲＮＡに対して１つの蛍光物質のみが標識可能であり、現在、蛍光物質の検出に使用される機器では、１回に同時分析が可能な蛍光チャンネル数が通常４〜７種類に制限されているので、８個以上のｍｉＲＮＡを分析するためには２回以上の同じ作業を繰り返し行わなければならないという短所がある。
【０００４】
従来の方法により制限される他の例を挙げると、標的核酸の分析のために増幅するオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の長さは、フォワード／リバースプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）およびプローブ（ｐｒｏｂｅ）の長さを考慮した上、少なくとも６０〜７０ｂｐ以上の長さを必要とする。この場合、少なくとも３か所の特異的配列（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が求められる。
【０００５】
また他の例を挙げると、標的核酸の分析のために増幅するオリゴ（ｏｌｉｇｏ）の長さは、フォワード／リバースプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）およびプローブ（ｐｒｏｂｅ）の長さを考慮した上、少なくとも６０〜７０ｂｐ以上の長さを必要とする。この場合、少なくとも３箇所の特異的配列（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が必要となる。
【０００６】
また他の例を挙げると、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）のような単一部位のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の変異を測定するためには、終点遺伝子型決定法（ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）のためのＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）などのような技術を用いてプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）又はプローブ（ｐｒｏｂｅ）の特定の変異位置の結合力を高める必要があり、このため、プライマーおよびプローブの作製が困難となり、多くの時間及び費用がかかる。
【０００７】
一方、米国登録特許第５，７６３，１８１号には、核酸又はタンパク質のリアルタイム検出方法が開示されている。ＣａｔａＣｌｅａｖｅ技法は、プローブの切断がポリメラーゼ活性を持たない二次酵素によって行われる点で、ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅとは異なる。ＣａｔａＣｌｅａｖｅプローブは、例えば、制限酵素又はＲＮａｓｅのようなエンドヌクレアーゼの標的分子内に配列を有する。一具体例において、ＣａｔａＣｌｅａｖｅプローブは、プローブの５’末端および３’末端がＤＮＡからなり、切断部位はＲＮＡからなるキメラ構造を有する。プローブのＤＮＡ配列部分は、両末端又は内部が、ＦＲＥＴ対で標識される。ＰＣＲ反応は、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ配列部分を特異的に切断することができるＲＮａｓｅ  Ｈ酵素を含む。切断後、全てのプローブは、反応温度で標的アンプリコンから解離され、反応溶液中に分散される。供与体及び受容体が分離することにより、ＦＲＥＴは、ＴａｑＭａｎプローブと同様の方法で反転され、供与体放出をモニタリングすることができる。切断及び解離は、追加のＣａｔａＣｌｅａｖｅプローブ結合のための部位を再生させる。このように、単一のアンプリコンを使用して、プライマーがＣａｔａＣｌｅａｖｅプローブ結合部位を介して伸長するまで、単一のアンプリコンを標的として、プローブ切断を数回繰り返すことができる。
【０００８】
しかし、前記米国登録特許に開示されているＣａｔａＣｌｅａｖｅ  ｐｒｏｂｅを利用したリアルタイム検出方法は、いくつかの問題点を有している。
【０００９】
第一に、検出過程においてＣａｔａＣｌｅａｖｅ  ｐｒｏｂｅの繰り返し切断が原因でバックグラウンドの蛍光値が持続的に増加する。このため、Ｃｔ値を正確に測定することが困難となり、これを補完するための別途の作業が必要となる。
【００１０】
第二に、ＣａｔａＣｌｅａｖｅ  ｐｒｏｂｅが作用するためには、少なくとも６０〜７０ｂｐ以上の増幅区間が必要である。
【００１１】
第三に、ＣａｔａＣｌｅａｖｅ  ｐｒｏｂｅを用いたＳＮＰ分析は難しい。つまり、ＣａｔａＣｌｅａｖｅ  ｐｒｏｂｅの場合、従来のＥｎｄｐｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇに適用しにくく、点突然変異点に直接ハイブリダイズさせて確認する方法は、精度が落ちる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国登録特許第５，７６３，１８１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明は、上記問題を解決し、従来技術の限界を克服するためのものであり、本発明の一つの目的は、核酸又はタンパク質のリアルタイム検出のためにプライマーおよびプローブとして使用される一本鎖核酸を提供することである。
【００１４】
本発明の他の一つの目的は、前記一本鎖核酸を用いたＲＮＡのリアルタイム検出方法を提供することである。
【００１５】
本発明のまた他の一つの目的は、前記一本鎖核酸を用いたＤＮＡのリアルタイム検出方法を提供することである。
【００１６】
本発明のまた他の一つの目的は、前記一本鎖核酸を用いたタンパク質のリアルタイム検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の一様態によれば、本発明は、核酸又はタンパク質のリアルタイム検出のためにプライマーおよびプローブとして使用される一本鎖核酸を提供する。
【００１８】
そこで、本発明者らは、定量、再現性および分離度に優れ、何よりも増幅長が短く、及び時間を必要とする核酸又はタンパク質のリアルタイム検出方法を開発するために研究を進め、Ｘ１−Ｙ−Ｚ２の構造を有し、核酸又はタンパク質の検出過程でプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）およびプローブ（ｐｒｏｂｅ）として同時に使用可能な一本鎖核酸を開発し、前記一本鎖核酸を用いた場合、核酸の増幅過程又はタンパク質とのハイブリダイゼーション過程で切断された一本鎖核酸断片の量を測定することにより、所望の核酸又はタンパク質を正確かつ迅速に検出できることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１９】
本発明において、前記一本鎖核酸は、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有し、一本鎖核酸の両末端又は内部に１つ又はそれ以上の検出可能なマーカーが付されていることを特徴とする。このとき、付される検出可能なマーカーの位置は、特定の部位に限定されず、特定の酵素によるＹ部位の切断時に検出可能なマーカーが分離される位置であればどこでも可能である。
【００２０】
また、前記一本鎖核酸は、リアルタイム検出を目的とする標的核酸又は標的タンパク質の特定の部位に結合して複合体を形成し、特定の酵素によるＹ部位の切断時に、ＹおよびＺ部位は、標的核酸又は標的タンパク質の特定の部位から分離されるが、Ｘ部位は分離されず、複合体を維持し、増幅するためのプライマーとして使用されることを特徴とする。
【００２１】
本発明において、前記記一本鎖核酸は「プロマー（ｐｒｏｍｅｒ）」と称され、以下では、特に言及のない限り、一本鎖核酸と言えばプロマー（ｐｒｏｍｅｒ）として、プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）およびプローブ（ｐｒｏｂｅ）として同時に使用可能な一本鎖核酸を意味する。
【００２２】
本発明の一本鎖核酸は、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有し、Ｘ、ＹおよびＺの各々は、様々な数のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を有することができる。
【００２３】
例えば、ここで、前記Ｘは、１〜６０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは２〜３０個、さらにより好ましくは３〜３０個、さらにより好ましくは４〜３０個、さらにより好ましくは５〜３０個、さらにより好ましくは６〜３０個、さらにより好ましくは７〜３０個、さらにより好ましくは８〜３０個、さらにより好ましくは１０〜３０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡである。Ｘが６０個を超えた塩基配列を有する場合、核酸又はタンパク質のリアルタイム検出時に非特異的反応が生じる可能性がある。
【００２４】
例えば、前記Ｙは、１〜１０個、好ましくは１〜９個、より好ましくは１〜８個、さらにより好ましくは１〜７個、さらにより好ましくは１〜６個、さらにより好ましくは１〜５個、さらにより好ましくは１〜４個、さらにより好ましくは１〜３個、さらにより好ましくは１〜２個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡである。また、前記Ｙは、Ｚが０個の塩基からなるとき、少なくとも３個以上、好ましくは３〜１０個、より好ましくは３〜９個、さらにより好ましくは３〜８個、さらにより好ましくは３〜７個、さらにより好ましくは３〜６個、さらにより好ましくは３〜５個、さらにより好ましくは３〜４個の塩基配列で構成される。また、前記Ｙは、Ｚが１個の塩基からなるとき、少なくとも２個以上、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜９個、さらにより好ましくは２〜８個、さらにより好ましくは２〜７個、さらにより好ましくは２〜６個、さらにより好ましくは２〜５個、さらにより好ましくは２〜４個、さらにより好ましくは２〜３個の塩基配列で構成される。Ｙを構成する塩基配列が前記範囲を外れた場合には、核酸又はタンパク質のリアルタイム検出時に、非特異的反応が発生して感度が低下する可能性がある。
【００２５】
例えば、前記Ｚは、０〜１０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは２〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡである。Ｚを構成する塩基配列が前記範囲を外れた場合には、Ｙが切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）された後、標的核酸又はタンパク質に結合されたＺが標的核酸又は標的タンパク質から離脱せずにそのまま結合されているため、核酸又はタンパク質を検出することができないという問題がある。
【００２６】
この際、前記Ｘ、ＹおよびＺのうちのいずれかがＤＮＡであるときに他の２つのうちの１つ以上はＲＮＡである。好ましくは、前記Ｘ、ＹおよびＺは、順番にＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ、又はＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡである。
【００２７】
一具体例によれば、ＸがＤＮＡであるとき、ＹおよびＺのいずれか一方はＲＮＡ、例えば、ＹはＲＮＡであり、ＺはＤＮＡであるか、又は、ＹはＤＮＡであり、ＺはＲＮＡである。ここで、前記ＤＮＡおよびＲＮＡは、０個以上であることができることができ、前記Ｘ、ＹおよびＺで定義される個数のＤＮＡおよびＲＮＡを有する。
【００２８】
他の具体例によれば、ＸがＲＮＡであるとき、ＹおよびＺのいずれか一方はＲＮＡ、例えば、ＹはＲＮＡであり、ＺはＤＮＡであるか、又は、ＹはＤＮＡであり、ＺはＲＮＡである。ここで、前記ＤＮＡおよびＲＮＡは、０個以上であることができ、前記Ｘ、ＹおよびＺで定義される個数のＤＮＡおよびＲＮＡを有する。
【００２９】
また他の具体例をによれば、Ｚが０であるとき、ＸおよびＹのいずれか一方はＤＮＡであり、他方はＲＮＡである。ここで、前記ＤＮＡおよびＲＮＡは１個以上であり、前記ＸおよびＹで定義される個数のＤＮＡおよびＲＮＡを有する。
【００３０】
また、前記Ｘ、ＹおよびＺは、非特異的な切断を防ぐために、全体的にメチル化されるか、又は部分的にメチル化されるように合成されたものであってもよい。
【００３１】
本発明において、前記核酸は、試料からリアルタイムで検出しようとするＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
【００３２】
本発明において、前記検出可能なマーカーとしては、一本鎖核酸に共有結合又は非共有結合によって結合する蛍光物質、又は蛍光物質および消光物質からなる蛍光ペアを用いることができる。
【００３３】
前記蛍光物質は、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ５３２、Ａｌｅｘａ  ５４６、Ａｌｅｘａ  ５６８、Ａｌｅｘａ  ５９４、Ａｌｅｘａ  ６６０、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＴＡＭＲＡ、  ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏｒ  Ｘ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ＯＲＮＡｇｅ  ｇｒｅｅｎ  ４８８Ｘ、ＯＲＮＡｇｅ  ｇｒｅｅｎ  ５１４Ｘ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｏｙｓｔｅｒ  ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ  ６４５、Ｂｏｄｉｐｙ  ６３０／６５０、Ｂｏｄｉｐｙ
６５０／６６５、Ｃａｌｆｌｕｏｒ  ＯＲＮＡｇｅ  ５４６、Ｃａｌｆｌｕｏｒ  ｒｅｄ  ６１０、  Ｑｕａｓａｒ  ６７０およいビオチンからなる群より選ばれるいずれか１つであることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。また、前記消光物質は、例えば、ＤＤＱ−１、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐａｓｅ、６−ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、ｌｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ−Ｓｐ、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−２およびＭＧＢＮＦＱからなる群より選ばれるいずれか１つであることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００３４】
本発明で検出可能なマーカーとして蛍光ペアを用いる場合、蛍光物質および消光物質の位置は、Ｘ又はＺであってもよく、Ｙ部位であってもよく、これらのうちいずれか１箇所に限定されるものではない。例えば、蛍光物質はＸに位置し、消光物質はＹ又はＺに位置してもよい。
【００３５】
本発明の一本鎖核酸は、核酸又はタンパク質を検出するにあたり、ｉ）核酸のうちＲＮＡからｃＤＮＡを合成するためのＲＴプライマー；ｉｉ）ＤＮＡ又はＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマー；ｉｉｉ）ＤＮＡ又はＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを増幅するためのリバースプライマー；ｉｖ）ＤＮＡ又はＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマー；又はｖ）検出しようとする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質をリアルタイムで確認するためのプローブ；として使用できる。
【００３６】
本発明の具体的な様態によれば、本発明の一本鎖核酸は、ｉ）ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡなどのｓｍａｌｌ  ＲＮＡを含む）からｃＤＮＡを合成するためのＲＴプライマーおよびプローブ；ｉｉ）合成されたｃＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマーおよびプローブ；ｉｉｉ）合成されたｃＤＮＡを増幅するためのリバースプライマーおよびプローブ；又はｉｖ）合成されたｃＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブ；として使用できる。
【００３７】
特に、本発明の一本鎖核酸を、ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡなどのｓｍａｌｌ  ＲＮＡを含む）からｃＤＮＡを合成および増幅するためのＲＴプライマー；フォワードプライマーおよびプローブ；又はリバースプライマーおよびプローブ；として使用する場合、ｃＤＮＡ合成時にＲＴプライマーをループ状に形成する過程や、ポリＡを形成する過程が不要であり、検出しようとするＲＮＡとハイブリダイズしてｃＤＮＡを合成し、標的ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡなどのｓｍａｌｌ  ＲＮＡを含む）を増幅およびリアルタイム検出することができる。
【００３８】
本発明の他の具体的な様態によれば、本発明の一本鎖核酸は、試料から特定のＤＮＡを検出するための、ｉ）フォワードプライマーおよびプローブ；ｉｉ）リバースプライマーおよびプローブ；又はｉｉｉ）フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブ；として使用できる。
【００３９】
これらの一連の具体的な態様によれば、本発明の一本鎖核酸では、一本鎖核酸の部位を切断する酵素により一本鎖核酸の部位が切断された後、ＹおよびＺ部位は分離され、Ｘ部位は、標的核酸と複合体を維持しながらプライマーとして使用されて核酸を合成および増幅することができ、一本鎖核酸の部位を切断する酵素により一本鎖核酸のＹ部分のみが切断されるため、従来のＤＮＡポリメラーゼ（重合酵素）によって分解されるプローブに比べて、標的核酸又はタンパク質をより正確に検出することができる。
【００４０】
特に、本発明の一本鎖核酸においてＹ又はＺの３’末端に蛍光物質又は消光物質が結合されている場合、一本鎖核酸のＹ部位が切断されない限り、標的核酸又は標的タンパク質の特定の核酸がポリメラーゼによって増幅されることを防ぐことができるので、点突然変異（ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）、挿入変異（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）、欠失変異（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）などの突然変異のような変異を正確に検出することができる。
【００４１】
したがって、本発明の一本鎖核酸を、核酸又はタンパク質の検出に使用する場合、従来技術に比べて、追加の別の過程（例えば、ＲＴプライマーをループ状に形成、ポリＡを形成するなど）、および分析時間およびコストを削減することができ、従来の方法に比べて、標的核酸又はタンパク質をより正確に特異的に検出することができるので、核酸又はタンパク質をリアルタイムで検出するためのキットとして用いることができる。
【００４２】
本発明の一本鎖核酸を、核酸又はタンパク質の検出のためのキットとして用いる場合、前記キットは、本発明の一本鎖核酸の他に、一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素をさらに含むことが望ましい。
【００４３】
本発明において、前記一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素は、一本鎖核酸のＹ部位を特異的に切断できるものであればいかなるものであってもよい。例えば、部位がＤＮＡである場合は、ＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮＡ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ）、具体的には、ＤＮａｓｅ  I、ＤＮａｓｅ  II、Ｓ１核酸加水分解酵素、核酸加水分解酵素Ｐ１、ＡＰエンドヌクレアーゼ、又はＵｖｒＡＢＳＣ核酸加水分解酵素などを使用することが好ましく、Ｙ部位がＲＮＡである場合は、ＲＮＡ加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＮａｓｅ）、具体的には、ＲＮａｓｅ  II、ＲＮａｓｅ  III、ＲＮａｓｅ  IV、ＲＮａｓｅ  Ｈ、又はＲＮａｓｅ  Ｔ２等を使用することが好ましい。
【００４４】
本発明の一本鎖核酸を、核酸又はタンパク質の検出のためのキットとして使用する場合、前記キットは、本発明の一本鎖核酸と一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素との他に、ＤＮＡの増幅反応に必要な試薬をさらに含むことができる。
【００４５】
前記増幅反応に必要な試薬としては、例えば、適量のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｕｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｐｆｕ）から得られた熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼ助因子（Ｍｇ２＋）、緩衝液、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）および水（Ｈ２Ｏ）を挙げられる。また、前記緩衝液としては、適量のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）、Ｔｗｅｅｎ２０、ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、ＰＥＧ  ６０００、ホルムアミドおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
本発明の他の様態によれば、本発明は、本発明の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を用いたＲＮＡのリアルタイム検出方法を提供する。
【００４７】
上記方法は、下記の工程を含むことを特徴とする。：
ａ）試料からＲＮＡを抽出する工程；ｂ）前記ａ）工程で抽出したＲＮＡに別のＲＴプライマー又は本発明の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を混合してｃＤＮＡを合成する工程；ｃ）前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡに、本発明の一本鎖核酸を含むキット、および／又は前記ｃＤＮＡと相補的な塩基配列を有するフォワードプライマー又はリバースプライマーを混合して伸長反応によりｃＤＮＡを増幅させる工程；およびｄ）前記ｃ）工程により切断された一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）断片の量を測定する工程。
【００４８】
本発明に係るＲＮＡのリアルタイム検出方法を各工程に応じて具体的に説明すると、次の通りである。
【００４９】
ａ）試料からＲＮＡを抽出する工程である。
【００５０】
本発明において、前記試料は、生物学的試料、生物学的試料から分離されたＲＮＡ、又はこれらの断片であることができる。具体的には、前記試料は、血液、唾液、尿、糞便、組織、細胞および生検標本からなる群より選ばれるいずれか１つ以上、保存された生物学
的試料から分離されたＲＮＡ、又はこれらの断片であることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００５１】
前記保存された生物学的試料は、当業界に公知の通常の保存方法に基づいて１週間以上、１年以上、例えば、１年乃至１０年間保存、冷凍保存、又はホルマリンで固定された組織を常温で保存した組織から由来したものであることができる。
【００５２】
本発明において、試料からのＲＮＡの抽出には、当業界に公知の様々な方法を用いることができ、例えば、トリゾール（ｔｒｉｚｏｌ）又はトリトンＸ−１００等を用いることができる。
【００５３】
ｂ）ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する工程である。
【００５４】
具体的には、本発明のｂ）工程は、前記ａ）工程で抽出したＲＮＡに別のＲＴプライマーを混合してｃＤＮＡを合成する工程である。
【００５５】
本発明において、前記ＲＴプライマーは、標的ＲＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な５〜３０個、好ましくは１０〜３０個の塩基配列で構成された核酸である。このとき、ＲＴプライマーは、当業界に公知のＲＴプライマー又は本発明の一本鎖核酸であることができる。
【００５６】
本発明において、ＲＴプライマーとして本発明の一本鎖核酸を用いる場合、前記一本鎖核酸は、標的核酸の一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列からなることを特徴とする。
【００５７】
本発明において、前記ｃＤＮＡの合成は、当業界に公知の様々な方法を用いて行うことができ、例えば、試料から得られたＲＮＡを鋳型として逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼによって行われてもよい。また、前述した一本鎖核酸をＲＴプライマーとして用いない場合、ｐｏｌｙＡ  ｔａｉｌ、ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ、ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒを用いてｃＤＮＡを合成した場合にも一本鎖核酸を用いたＲＮＡの分析が可能である。
【００５８】
ｃ）ｃＤＮＡを増幅する工程である。
【００５９】
具体的には、本発明のｃ）工程は、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡに、本発明の一本鎖核酸を含むキット、および／又は前記ｃＤＮＡと相補的な塩基配列を有するフォワードプライマー又はリバースプライマーを混合して、伸長反応によりｃＤＮＡを増幅させる工程である。
【００６０】
前記一本鎖核酸を含むキットは、本発明の一本鎖核酸と、前記一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素とからなることをいう。
【００６１】
前記一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素は、一本鎖核酸のＸ部位を特異的に切断できるものであればいかなるものであってもよい。例えば、Ｘ部位がＤＮＡである場合は、ＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮＡ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ）、具体的には、ＤＮａｓｅ
I、ＤＮａｓｅ  II、Ｓ１核酸加水分解酵素、核酸加水分解酵素Ｐ１、ＡＰエンドヌクレアーゼ、又はＵｖｒＡＢＳＣ核酸加水分解酵素などを使用することが好ましく、Ｘ部位がＲＮＡである場合は、ＲＮＡ加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＮａｓｅ）、具体的には、ＲＮａｓｅ  II、ＲＮａｓｅ  III、ＲＮａｓｅ  IV、ＲＮａｓｅ  Ｈ、又はＲＮａｓｅ  Ｔ２などを使用することが好ましい。
【００６２】
本発明において、前記一本鎖核酸は、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列からなるものであり、ｃＤＮＡを増幅するための、ｉ）フォワードプライマーおよびプローブ、ｉｉ）リバースプライマーおよびプローブ、又はｉｉｉ）フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブとして使用されることを特徴とする。また、本発明の前記一本鎖核酸は、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有し、一本鎖核酸の両末端又は内部に１つ又はそれ以上の検出可能なマーカーが結合され、特定の酵素によるＹ部位の切断時に、ＹおよびＺが分離され、Ｘがプライマーとして機能する。
【００６３】
前記検出可能なマーカーとしては、一本鎖核酸に共有結合又は非共有結合によって結合する蛍光物質、又は蛍光物質および消光物質からなる蛍光ペアを用いることができる。
【００６４】
前記蛍光物質は、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ５３２、Ａｌｅｘａ  ５４６、Ａｌｅｘａ  ５６８、Ａｌｅｘａ  ５９４、Ａｌｅｘａ  ６６０、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＴＡＭＲＡ、  ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏｒ  Ｘ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ＯＲＮＡｇｅ  ｇｒｅｅｎ  ４８８Ｘ、ＯＲＮＡｇｅ  ｇｒｅｅｎ  ５１４Ｘ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｏｙｓｔｅｒ  ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ  ６４５、Ｂｏｄｉｐｙ  ６３０／６５０、Ｂｏｄｉｐｙ
６５０／６６５、Ｃａｌｆｌｕｏｒ  ＯＲＮＡｇｅ  ５４６、Ｃａｌｆｌｕｏｒ  ｒｅｄ  ６１０、  Ｑｕａｓａｒ  ６７０およいビオチンからなる群より選ばれるいずれか１つであることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。また、前記消光物質は、例えば、ＤＤＱ−１、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐａｓｅ、６−ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、ｌｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ−Ｓｐ、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−２およびＭＧＢＮＦＱからなる群より選ばれるいずれか１つであることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００６５】
一具体例によれば、本発明の一本鎖核酸を、フォワードプライマーおよびプローブ、又はリバースプライマーおよびプローブとして用いる場合、前記一本鎖核酸は、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基序列からなることを特徴とする。
【００６６】
他の具体例によれば、本発明の一本鎖核酸を、フォワードプライマーおよびプローブ、又はリバースプライマーおよびプローブとして使用する場合、前記一本鎖核酸の他に、別のリバースプライマー又はフォワードプライマーが使用できる。この時、前記別のリバースプライマー又はフォワードプライマーは、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡと相補的結合が可能であり、５〜３０個、好ましくは１０〜３０個の塩基配列で構成されたＤＮＡである。ここで、前記リバースプライマーは、前記ｂ）工程のＲＴプライマーと同じものであってもよい。
【００６７】
また他の具体例によれば、本発明の一本鎖核酸を、フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブとして使用する場合、前記リバースプライマーとして使用される一本鎖核酸は、前記ｂ）工程の一本鎖核酸と同じものであってもよく、一本鎖核酸の両末端又は内部に付された検出可能なマーカーは、前記ｂ）工程の一本鎖核酸と同一又は異なるものであってもよい。
【００６８】
本発明において、ｃＤＮＡの増幅は、Ａ）フォワードプライマーおよびプローブ、又はリバースプライマーおよびプローブとして使用される本発明の一本鎖核酸と、当業界で汎用されるフォワードプライマー又はリバースプライマーとによりアニーリングされるか、Ｂ）フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブとして使用される本発明の一本鎖核酸によりアニーリングされ、使用される酵素の活性を実質的に抑制しない等温
温度で行われることが望ましい。ここで、前記等温とは、熱循環（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ）がないことを意味するものであり、必ずしも物理的に同じ温度を意味するものではない。
【００６９】
一具体例によれば、本発明において増幅反応が行われる等温温度は、４０〜８０℃、好ましくは５５〜７５℃、より好ましくは６０〜７５℃であることができる。
【００７０】
本発明において、前記ｃＤＮＡの増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および核酸配列ベース増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）からなる群より選ばれるいずれか１つの方法により行われるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００７１】
本発明において、前記ｃＤＮＡの増幅反応は、本発明の一本鎖核酸を含むキットの他に、増幅に必要な試薬、例えば、適量のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｕｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｐｆｕ）から得られた熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼ助因子（Ｍｇ２＋）、緩衝液、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）および水（ｄＨ２Ｏ）を含むことができる。前記緩衝液としては、適量のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）、Ｔｗｅｅｎ２０、ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、ＰＥＧ  ６０００、ホルムアミドおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などがさらに使用できるが、これらに限定されない。
【００７２】
ｄ）一本鎖核酸の部位を切断できる酵素によって切断された一本鎖核酸断片の量を測定する工程である。
【００７３】
本発明において、一本鎖核酸断片の量の測定は、様々な検出方法を用いて行うことができる。具体的には、本発明により分離された一本鎖核酸断片の量の測定は、リアルタイム又は反応が終了した後に行うことが好ましく、蛍光光度の変化又は化学発光の測定により行うことができる。
【００７４】
前記蛍光光度の変化又は化学発光の測定装置としては、当業界に公知の蛍光マーカーの検出が可能な装置であればいかなる装置でも使用可能であり、例えば、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｍａｃｈｉｎｅ、ＴＲＩＡＤマルチモード検出器（ＴＲＩＡＤ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ蛍光（Ｗａｌｌａｃ／Ｖｉｃｔｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）又はパーキンエルマー社のＬＢ５０Ｂルミネセンス分光計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＢ５０Ｂ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）などが使用できるが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明により切断された一本鎖核酸断片の量の測定および検出方法は、一本鎖核酸又は反応液に流入した標識又は検出可能なマーカーの種類に応じて変わることができる。
【００７６】
例えば、Ｘ末端に蛍光供与体が付着し、Ｚ末端にクエンチャーが付着した一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）が標的核酸とハイブリダイズし、Ｙ部位を切断できる酵素によってＹおよびＺ部位が分離される前には、Ｘ末端に付着した蛍光供与体の蛍光が、Ｚ末端に付着した
クエンチャーによって大幅に減少した状態を維持する。しかし、Ｙ部位を切断できる酵素によってＸ部位は分離されず、ＹおよびＺ部位のみが標的核酸から分離されて反応溶液中に分散されると、Ｘ末端に付着した蛍光供与体の蛍光が、Ｚ末端に付着したクエンチャーの影響を受けなくなるため増加することになる。このとき、Ｘ末端に付着した蛍光供与体の蛍光放出が増加し、これにより前述した機器を用いて標的核酸をリアルタイムで検出することができる。
【００７７】
具体例によれば、小型ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ）と相補的な結合を示すＲＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した後、本発明に基づき、ｃＤＮＡと相補的な結合を示し、ＦＡＭが付着した一本鎖核酸をフォワードプライマー又はリバースプライマーとして用いてｃＤＮＡを増幅した結果、従来の、検出可能なマーカーが付されていないフォワードプライマーを用いて増幅されたｃＤＮＡとは異なり、ｃＤＮＡが増幅される過程中に増幅曲線が示されたことを確認した。
【００７８】
本発明のまた他の様態によれば、本発明は、本発明の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を用いたＤＮＡのリアルタイム検出方法を提供する。
【００７９】
上記方法は、下記の工程を含むことを特徴とする。：
ａ）試料からＤＮＡを抽出する工程；ｂ）前記ａ）工程で抽出したＤＮＡに、本発明の一本鎖核酸を含むキット、および／又は前記ＤＮＡと相補的な塩基配列を有するフォワードプライマー又はリバースプライマーを混合して、伸長反応によりＤＮＡを増幅させる工程；およびｃ）前記ｂ）工程により切断された一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）断片の量を測定する工程。
【００８０】
本発明に係るＤＮＡのリアルタイム検出方法を各工程に応じて説明すると、次の通りである。
【００８１】
ａ）試料からＤＮＡを抽出する工程である。
【００８２】
本発明において、前記試料は、生物学的試料、生物学的試料から分離されたＤＮＡ、又はこれらの断片であることができる。具体的には、前記試料は、血液、唾液、尿、糞便、組織、細胞および生検標本からなる群より選ばれるいずれか１つ以上、保存された生物学的試料から分離されたＤＮＡ、又はこれらの断片であることができるが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
前記保存された生物学的試料は、当業界に公知の通常の保存方法に基づいて１年以上、例えば、１年乃至１０年間保存、冷凍保存、又はホルマリンで固定された組織を常温で保存した組織から由来したものであることができる。
【００８４】
本発明において、試料からのＤＮＡの抽出には、当業界に公知の様々な方法を用いることができ、例えば、クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）又はエタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）等を用いることができる。
【００８５】
ｂ）ＤＮＡを増幅する工程である。
【００８６】
具体的には、本発明のｂ）工程は、前記ａ）工程で得られたＤＮＡに、本発明の一本鎖核酸を含むキット、および／又は前記ＤＮＡと相補的な塩基配列を有するフォワードプライマー又はリバースプライマーを混合して、伸長反応によりＤＮＡを増幅させる工程である。
【００８７】
本発明において、前記一本鎖核酸を含むキットは、本発明の一本鎖核酸と、前記一本鎖核酸のＸ部位を切断できる酵素とからなることをいう。
【００８８】
本発明において、前記一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素は、一本鎖核酸のＹ部位を特異的に切断できるものであればいかなるものであってもよい。例えば、Ｙ部位がＤＮＡである場合は、ＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮＡ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ）、具体的には、ＤＮａｓｅ  I、ＤＮａｓｅ  II、Ｓ１核酸加水分解酵素、核酸加水分解酵素Ｐ１、ＡＰ内部加水分解酵素、又はＵｖｒＡＢＳＣ核酸加水分解酵素などを使用することが好ましく、Ｙ部位がＲＮＡである場合は、ＲＮＡ加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＮａｓｅ）、具体的には、ＲＮａｓｅ  II、ＲＮａｓｅ  III、ＲＮａｓｅ  IV、ＲＮａｓｅ  Ｈ、又はＲＮａｓｅ  Ｔ２などを使用することが好ましい。
【００８９】
前述したように、前記一本鎖核酸は、前記ａ）工程で得られたＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列からなるものであり、ＤＮＡを増幅するための、ｉ）フォワードプライマーおよびプローブ、ｉｉ）リバースプライマーおよびブグローブ、又はｉｉｉ）フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブとして使用されることを特徴とする。また、本発明の前記一本鎖核酸は、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有し、一本鎖核酸の両末端又は内部に１つ又はそれ以上の検出可能なマーカーが結合され、特定の酵素によるＹ部位の切断時に、ＹおよびＺが分離され、Ｘが分離されずにプライマーとして機能する。このような一本鎖核酸の構造は上述した通りである。
【００９０】
前記検出可能なマーカーとしては、一本鎖核酸に共有結合又は非共有結合によって結合する蛍光物質、又は蛍光物質および消光物質からなる蛍光ペアを用いることができる。
【００９１】
前記蛍光物質は、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ５３２、Ａｌｅｘａ  ５４６、Ａｌｅｘａ  ５６８、Ａｌｅｘａ  ５９４、Ａｌｅｘａ  ６６０、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＴＡＭＲＡ、  ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏｒ  Ｘ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ＯＲＮＡｇｅ  ｇｒｅｅｎ  ４８８Ｘ、ＯＲＮＡｇｅ  ｇｒｅｅｎ  ５１４Ｘ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｏｙｓｔｅｒ  ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ  ６４５、Ｂｏｄｉｐｙ  ６３０／６５０、Ｂｏｄｉｐｙ
６５０／６６５、Ｃａｌｆｌｕｏｒ  ＯＲＮＡｇｅ  ５４６、Ｃａｌｆｌｕｏｒ  ｒｅｄ  ６１０、  Ｑｕａｓａｒ  ６７０およいビオチンからなる群より選ばれるいずれか１つであることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。また、前記消光物質は、例えば、ＤＤＱ−１、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐａｓｅ、６−ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、ｌｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ−Ｓｐ、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−２およびＭＧＢＮＦＱからなる群より選ばれるいずれか１つであることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００９２】
一具体例によれば、本発明の一本鎖核酸を、フォワードプライマーおよびプローブ、又はリバースプライマーおよびプローブとして用いる場合、前記一本鎖核酸は、前記ａ）工程で抽出されたＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基序列からなることを特徴とする。
【００９３】
他の具体例によれば、本発明の一本鎖核酸を、フォワードプライマーおよびプローブ、又はリバースプライマーおよびプローブとして使用する場合、前記一本鎖核酸の他に、別のリバースプライマー又はフォワードプライマーが使用される。この時、前記別のリバースプライマー又はフォワードプライマーは、前記ａ）工程で抽出されたＤＮＡと相補的結合が可能であり、５〜３０個、好ましくは１０〜３０個の塩基配列で構成されたＤＮＡである。
【００９４】
また他の具体例によれば、本発明の一本鎖核酸を、フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブとして用いる場合、前記一本鎖核酸は、前記ａ）工程で抽出されたＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列からなり、前記一本鎖核酸の他に、別のリバースプライマー又はフォワードプライマーが必要とされない。
【００９５】
本発明において、ＤＮＡの増幅は、Ａ）フォワードプライマーおよびプローブ、又はリバースプライマーおよびプローブとして使用される本発明の一本鎖核酸と、当業界で汎用されるフォワードプライマー又はリバースプライマーとによりアニーリングされるか、Ｂ）正方向プライマー、リバースプライマーおよびプローブとして使用される本発明の一本鎖核酸によりアニーリングされ、使用される酵素の活性を実質的に抑制しない等温温度で行われることが望ましい。ここで、前記等温とは、熱循環（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｉｎｇ）がないということを意味するものであり、必ずしも物理的に同じ温度を意味するものではない。
【００９６】
一具体例によれば、本発明においてＤＮＡ増幅反応が行われる等温温度は、４０〜８０℃、好ましくは５５〜７５℃、より好ましくは６０〜７５℃であることができる。
【００９７】
本発明において、前記ＤＮＡの増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）および核酸配列ベース増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）からなる群より選ばれるいずれか１つの方法により行われるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００９８】
本発明において、前記ＤＮＡの増幅反応は、本発明の一本鎖核酸を含むキットの他に、増幅に必要な試薬、例えば、適量のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｕｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ又はＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓ（Ｐｆｕ）から得られた熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼ助因子（Ｍｇ２＋）、緩衝液、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）および水（ｄＨ２Ｏ）を含むことができる。前記緩衝液としては、適量のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）、Ｔｗｅｅｎ２０、ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、ＰＥＧ  ６０００、ホルムアミドおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などがさらに使用できるが、これらに限定されない。
【００９９】
ｃ）一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素によって切断された一本鎖核酸断片の量を測定する工程である。
【０１００】
本発明において、一本鎖核酸断片の量の測定は、様々な検出方法を用いて行うことができる。具体的には、本発明により分離された一本鎖核酸断片の量の測定は、リアルタイム又は反応が終了した後に行うことが好ましく、蛍光光度の変化又は化学発光の測定により行うことができる。
【０１０１】
前記蛍光光度の変化又は化学発光の測定装置としては、当業界に公知の蛍光マーカーの検出が可能な装置であればいかなる装置でも使用可能であり、例えば、ＴＲＩＡＤマルチモード検出器（ＴＲＩＡＤ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ蛍光（Ｗａｌｌａｃ／Ｖｉｃｔｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）又はパー
キンエルマー社のＬＢ５０Ｂルミネセンス分光計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＢ５０Ｂ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）などが使用できるが、これらに限定されない。
【０１０２】
本発明により切断された一本鎖核酸断片の量を測定および検出方法は、一本鎖核酸又は反応液に流入した標識又は検出可能なマーカーの種類に応じて変わることができる。
【０１０３】
例えば、Ｘ末端に蛍光供与体が付着し、Ｚ末端にクエンチャーが付着した一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）が標的核酸とハイブリダイズし、Ｙ部位を切断できる酵素によってＹおよびＺ部位が分離される前には、Ｘ末端に付着した蛍光供与体の蛍光が、Ｚ末端に付着したクエンチャーによって大幅に減少した状態を維持する。しかし、Ｙ部位を切断できる酵素によってＸ部位は分離されず、ＹおよびＺ部位のみが標的核酸から分離されて反応溶液中に分散されると、Ｘ末端に付着した蛍光供与体の蛍光が、Ｚ末端に付着したクエンチャーの影響を受けなくなるため増加することになる。このとき、Ｘ末端に付着した蛍光供与体の蛍光放出が増加し、これにより前述した機器を用いて標的核酸をリアルタイムで検出することができる。
【０１０４】
本発明による一本鎖核酸を用いた核酸の検出方法は、従来の方法に比べて次のような改善効果を提供する。
【０１０５】
１．従来の方法では、フォワードおよびリバースプライマーおよびプローブをそれぞれ調製し使用して核酸をリアルタイムで検出した。しかし、本発明では、１つのフォワード又はリバースの一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）および１つのフォワード又はリバースのプライマーを調製して核酸をリアルタイムで検出するか、フォワードおよびリバース一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を調製して核酸をリアルタイムで検出する。したがって、本発明は、従来方法よりも少ないオリゴ（ｏｌｉｇｏ）を使用するので、コスト削減および簡単な分析方法を提供することができる。特に、従来のＣａｔａＣｌｅａｖｅプローブは、専らプローブとして使用されるだけ、プライマーとして使用されていないが、本発明の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）は、プライマーおよびプローブの両方として同時に使用される（図１参照）。
【０１０６】
２．従来の方法では、実時間同定のための別の位置のプローブ（ｐｒｏｂｅ）が必要となり、少なくとも６０〜７０ｂｐの増幅区間を必要とするが、本発明は、プライマーおよびプローブとして同時に作用可能であるため、別の位置のプローブが不要であり、より短い増幅区間だけでよい。例えば、従来技術の分析方法では、少なくとも６０ｂｐ〜７０ｂｐの増幅区間を必要とするが、本発明による一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を使用する場合には、４０ｂｐ以上の増幅区間を必要とする。そこで、本発明によれば、ｍｉＲＮＡのような小型核酸分析過程において追加のオリゴ伸長が不要であるため、より迅速かつ簡単な検出方法を提供することができる。特に、従来のＣａｔａＣｌｅａｖｅプローブでは、切断酵素による切断部位の切断後に、切断部位の前後部位が両方とも標的核酸およびタンパク質から分離される。しかし、本発明の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）では、Ｙ部位の切断後、Ｘ部位は標的核酸と複合体を維持し、ＹおよびＺ部位のみが標的核酸から分離されて、プライマーおよびプローブとして同時に使用可能である。
【０１０７】
３．本発明の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）では、Ｙ部位の切断後、増幅する工程によってＹ部位の突然変異を容易に判別することができるため、その後の核酸増幅反応によって突然変異を確認することができる。すなわち、本発明の一本鎖核酸では、Ｙ部位と標的核酸の突然変異部位とをハイブリダイズさせた場合、Ｙ部位が変異部位と正確に相補的な結合をした場合にのみＹが切断され、次いで増幅反応が行われるため、突然変異が発生したかどうかを明確に確認することができる。具体的には、本発明の一本鎖核酸では、Ｙ部位
と標的核酸の突然変異部位とをハイブリダイズさせても、Ｙ部位が相補的な結合をしない限りはＹ部位が切断されないため、増幅反応が起こらず、これは標的核酸に測定しようとする突然変異が存在しないことを意味する。これに対して、本発明の一本鎖核酸では、Ｙ部位を標的核酸の突然変異が発生する部位の非突然変異部位とハイブリダイズさせても、Ｙ部位が相補的な結合をしない限りはＹ部位が切断されないため、増幅反応が起こらず、これは標的核酸に突然変異が存在することを意味する。
【０１０８】
４．従来の方法のうちＣａｔａｃｌｅａｖｅプローブでは、図１８のように、繰り返しの切断によってバックグラウンド蛍光強度が持続的に増加する傾向にあるので、Ｃｔ値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ  ｖａｌｕｅ）の正確な測定が難しくなり、Ｃｔ値を測定するための別途の作業を必要とするが、本発明では、Ｃｔ値を測定するための別途の作業を不要にし、正確な測定が可能である。
【０１０９】
５．従来のＣａｔａｃｌｅａｖｅ  ＰｒｏｂｅやＴａｑｍａｎ  ｐｒｏｂｅなどのＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｂｅの場合、１回の増幅で増幅量に相当する正確な蛍光マーカーが生成されない。例えば、ＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅやＭＧＢ  ｐｒｏｂｅの場合、ハイブリダイズしたプローブがオリゴヌクレオチドの合成過程において切断される必要があるが、切断されずにそのまま離隔する場合が発生する。また、Ｃａｔａｃｌｅａｖｅ  Ｐｒｏｂｅの場合は、ハイブリダイゼーションおよび切断が繰り返されるので、実際の標的核酸の増幅量よりも多くの蛍光マーカーを生成させる。しかし、本発明では、一本鎖核酸（Ｐｒｏｍｅｒ）と標的核酸とのハイブリダイゼーション後にＹ部位が切断され、１つの蛍光マーカーが生成され、次いで、オリゴヌクレオチドの合成が行われ、この場合、蛍光マーカーの数は標的核酸の増幅に伴って増える。
【０１１０】
６．本発明の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）をフォワードおよびリバースプライマーとして用いることで、より一層改善された多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）検出方法を提供する。従来の周知の多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）検出によれば、使用される蛍光物質の種類数に応じてその数だけ検出可能であるが、本発明によれば、前記一本鎖核酸（ｐｒｏｅｍｒ）に同一か又は異なる蛍光物質が付着することで、より多くの核酸を検出することができる。例えば、通常、２つの蛍光物質を使用時には５種、３つの蛍光物質を使用時には９種、４つの蛍光物質を使用時には１４種の核酸を、それぞれ多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）検出することが可能である。
【０１１１】
本発明のまた他の様態によれば、本発明は、前記一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を用いたタンパク質のリアルタイム検出方法を提供する。
【０１１２】
上記方法は、下記の工程を含むことを特徴とする。：
ａ）本発明の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）と相補的な塩基配列を有する核酸が付着した抗体を調製する工程；ｂ）検出対象のタンパク質を含む試料と前記ａ）工程で調製した抗体とを結合させて、タンパク質−抗体複合体を形成させる工程；ｃ）前記ｂ）工程で形成されたタンパク質−抗体複合体に本発明の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を含むキットをハイブリダイズさせて、タンパク質−抗体−一本鎖核酸複合体を形成させる工程；およびｄ）前記ｃ）工程により切断された一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）断片の量を測定する工程。
【０１１３】
本発明に係るタンパク質のリアルタイム検出方法を各工程に応じて説明すると、次の通りである。
【０１１４】
ａ）本発明の一本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する核酸が付着した抗体を調製する工程である。
【０１１５】
本発明において、本発明の一本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する核酸は、本発明の一本鎖核酸の塩基配列を鋳型として、当業界で通常使用される増幅反応により合成されたものである。
【０１１６】
前述したように、本発明の一本鎖核酸では、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有し、一本鎖核酸の両末端又は内部に１つ又はそれ以上の検出可能なマーカーが付されており、特定の酵素による部位の切断時に、ＹおよびＺは分離され、Ｘは分離されずにプライマーとして機能する。このような一本鎖核酸の構造は、上述した通りである。
【０１１７】
前記検出可能なマーカーとしては、一本鎖核酸に共有結合又は非共有結合によって結合する蛍光物質、又は蛍光物質および消光物質からなる蛍光ペアを用いることができる。
【０１１８】
前記蛍光物質は、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ５３２、Ａｌｅｘａ  ５４６、Ａｌｅｘａ  ５６８、Ａｌｅｘａ  ５９４、Ａｌｅｘａ  ６６０、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＴＡＭＲＡ、  ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏｒ  Ｘ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ＯＲＮＡｇｅ  ｇｒｅｅｎ  ４８８Ｘ、ＯＲＮＡｇｅ  ｇｒｅｅｎ  ５１４Ｘ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｏｙｓｔｅｒ  ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ  ６４５、Ｂｏｄｉｐｙ  ６３０／６５０、Ｂｏｄｉｐｙ
６５０／６６５、Ｃａｌｆｌｕｏｒ  ＯＲＮＡｇｅ  ５４６、Ｃａｌｆｌｕｏｒ  ｒｅｄ  ６１０、  Ｑｕａｓａｒ  ６７０およいビオチンからなる群より選ばれるいずれか１つであることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。また、前記消光物質は、例えば、ＤＤＱ−１、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐａｓｅ、６−ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、ｌｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ−Ｓｐ、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−２およびＭＧＢＮＦＱからなる群より選ばれるいずれか１つであることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【０１１９】
本発明において、前記抗体は、抗体のＦｃ部位に、本発明の一本鎖核酸と相補的な配列を有する核酸がリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）により連結されてなる構造を有する。ここで、前記リンカーは、典型的には１〜１０個の塩基配列で構成されたＤＮＡである。
【０１２０】
本発明において、本発明の一本鎖核酸と相補的な配列を有する核酸と抗体とを連結させる方法としては、通常２つの方法が挙げられる。第１の方法によれば、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（Ｓｕｌｆｏ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｌ）Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ）、ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−Ｐｙｒｉｄｙｌｔｈｉｏ）Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ；ＳＰＤＰ）、Ｎ−スクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−［３’−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ；ＮＨＳ−Ｉｃ−ＳＰＤＰ）、又はスルホスクシンイミジル−６−［３’−（２−ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏ  Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−［３’−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ］ｈｅｘａｎｏａｔｅ；Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｉｃ−ＳＰＤＰ）などからなる群より選ばれるいずれか１つの試薬を使用して、５’末端がチオール（ｔｈｉｏｌ）化されたＤＮＡを抗体の遊離アミノ基に連結する。前記試薬は、それらの間隔を隔てるスペーサー（ｓｐａｃｅｒ）の長さおよび水への溶解度程度が異なる。もし必要であれば、追加の操作のためにＤＮＡを放出させるチオール化（ｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ）試薬により連結部位を切断することができる。
【０１２１】
第２の方法によれば、４量体（ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ）のタンパク質であるストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）によって抗体−ＤＮＡ間の連結部位を提供することにより、前記タンパク質は、ビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）とほぼ不可逆的な結合を形成する。抗体の遊離アミノ基は、ビオチン−ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ｂｉｏｔｉｎ−ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）と反応してビオチン標識化される。ＤＮＡのビオチン化は、５’−ビオチンホスホロアミダイト（５’−ｂｉｏｔｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）の使用、又は５’末端のアミノ基標識化の後に、ビオチン−ｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて行われてもよい。ＤＮＡ、ストレプトアビジンおよび抗体の複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）は、１モル当量の抗体をＤＮＡ−ストレプトアビジン複合体に添加して調製することができる。
【０１２２】
前述した方法に基づいて、本発明の一本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する核酸が結合された抗体を、４℃で１時間反応させた後、抗体−核酸複合体をスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００ゲル濾過カラムで精製し、抗体−核酸複合体を得ることができる。
【０１２３】
本発明に基づいて調製された抗体は、標的タンパク質のみを特異的に認識するとともに、本発明の一本鎖核酸がハイブリダイズする可能性があるので、所望のタンパク質をリアルタイムで検出するのに容易に使用することができる。
【０１２４】
ｂ）タンパク質−抗体複合体を形成させる工程である。
【０１２５】
具体的には、本発明のｂ）工程は、検出対象のタンパク質を含む試料と前記ａ）工程で調製した抗体とを結合させてタンパク質−抗体複合体を形成させる工程である。
【０１２６】
本発明において、前記試料は、検出対象のタンパク質を含む生物学的試料であることができる。具体的には、前記試料は、血液、唾液、尿、糞便、組織、細胞および生検標本からなる群より選ばれるいずれか１つ以上、又は検出対象のタンパク質を含む、保存された生物学的試料であることができるが、これらに限定されるものではない。
【０１２７】
前記保存された生物学的試料は、当業界に公知の通常の保存方法に基づいて１年以上、例えば、１年乃至１０年間保存、冷凍保存、又はホルマリンで固定された組織を常温で保存した組織から由来したものであることができる。
【０１２８】
本発明において、タンパク質と抗体との結合は、検出対象のタンパク質を含む試料と前記ａ）工程で調製した抗体とを混合して行うことができる。
【０１２９】
ｃ）タンパク質−抗体−一本鎖核酸複合体を形成させる工程である。
【０１３０】
具体的には、本発明のｃ）工程は、前記ｂ）工程で形成されたタンパク質−抗体複合体に、本発明の一本鎖核酸を含むキットをハイブリダイズさせて、タンパク質−抗体−一本鎖核酸複合体を形成させる工程である。
【０１３１】
本発明において、前記一本鎖核酸を含むキットは、本発明の一本鎖核酸と、前記一本鎖核酸の部位Ｙ遺伝子座を切断できる酵素とからなることをいう。
【０１３２】
本発明において、前記一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素は、一本鎖核酸のＹ部位を特異的に切断できるものであればいかなるものであってもよい。例えば、Ｙ部位がＤＮＡである場合は、ＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮＡ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ）、具体的
には、ＤＮａｓｅ  I、ＤＮａｓｅ  III、Ｓ１核酸加水分解酵素、核酸加水分解酵素Ｐ１、ＡＰエンドヌクレアーゼ、又はＵｖｒＡＢＳＣ核酸加水分解酵素などを使用することが好ましく、Ｙ部位がＲＮＡである場合は、ＲＮＡ加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＮａｓｅ）、具体的には、ＲＮａｓｅ  II、ＲＮａｓｅ  III、ＲＮａｓｅ  IV、ＲＮａｓｅ  Ｈ、又はＲＮａｓｅ  Ｔ２等を使用することが好ましい。
【０１３３】
本発明において、タンパク質−抗体複合体と、本発明の一本鎖核酸を含むキットとのハイブリダイゼーションは、タンパク質−抗体複合体に本発明の一本鎖核酸を含むキットを混合して行うことができる。
【０１３４】
ｄ）一本鎖核酸のＹ部位を切断できる酵素によって切断された一本鎖核酸断片の量を測定してタンパク質を検出する工程である。
【０１３５】
本発明において、一本鎖核酸断片の量の測定は、様々な検出方法を用いて行うことができる。具体的には、本発明により切断された一本鎖核酸断片の量の測定は、リアルタイム又は反応が終了した後に行うことが好ましく、蛍光光度の変化又は化学発光の測定により行うことができる。
【０１３６】
前記蛍光光度の変化なたは化学発光の測定装置としては、当業界に公知の蛍光マーカーの検出が可能な装置であればいかなる装置でも使用可能であり、例えば、ＴＲＩＡＤマルチモード検出器（ＴＲＩＡＤ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）、Ｗａｌｌａｃ
Ｖｉｃｔｏｒ蛍光（Ｗａｌｌａｃ／Ｖｉｃｔｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）又はパーキンエルマー社のＬＢ５０Ｂルミネセンス分光計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＢ５０Ｂ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）などが使用できるが、これらに限定されない。
【０１３７】
本発明により切断された一本鎖核酸断片の量の測定および検出方法は、一本鎖核酸又は反応液に流入した標識又は検出可能なマーカーの種類に応じて変わることができる。
【０１３８】
例えば、Ｘ末端に蛍光供与体が付着し、Ｚ末端にクエンチャーが付着した一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）が、標的タンパク質と複合体を形成した抗体とハイブリダイズし、Ｙ部位を切断できる酵素によってＹおよびＺ部位が分離される前には、Ｘ末端に付着した蛍光供与体の蛍光が、Ｚ末端に付着したクエンチャーによって大幅に減少した状態を維持する。しかし、Ｙ部位を切断できる酵素によってＸ部位は分離されず、ＹおよびＺ部位のみが抗体から分離されて反応溶液中に分散されると、Ｘ末端に付着した蛍光供与体の蛍光が、Ｚ末端に付着したクエンチャーの影響を受けなくなるため増加することになる。このとき、Ｘ末端に付着した蛍光供与体の蛍光放出が増加し、これにより前述した機器を用いて標的核酸をリアルタイムで検出することができる。
【０１３９】
一例を挙げると、前記検出可能なマーカーとしては、一本鎖核酸に共有結合又は非共有結合によって結合する蛍光物質、又は蛍光物質および消光物質からなる蛍光ペアを用いることができる。
【０１４０】
前記蛍光物質は、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｂｏｄｉｐｙ、Ａｌｅｘａ  ４８８、Ａｌｅｘａ  ５３２、Ａｌｅｘａ  ５４６、Ａｌｅｘａ  ５６８、Ａｌｅｘａ  ５９４、Ａｌｅｘａ  ６６０、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ＴＡＭＲＡ、  ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｆｌｕｏｒ  Ｘ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ、ＯＲＮＡｇｅ  ｇｒｅｅｎ  ４８８Ｘ、ＯＲＮＡｇｅ  ｇｒｅｅｎ  ５１４Ｘ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｏｙｓｔｅｒ  ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ  ６４５、Ｂｏｄｉｐｙ  ６３０／６５０、Ｂｏｄｉｐｙ
６５０／６６５、Ｃａｌｆｌｕｏｒ  ＯＲＮＡｇｅ  ５４６、Ｃａｌｆｌｕｏｒ  ｒｅ
ｄ  ６１０、  Ｑｕａｓａｒ  ６７０およいビオチンからなる群より選ばれるいずれか１つであることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。また、前記消光物質は、例えば、ＤＤＱ−１、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐａｓｅ、６−ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、ｌｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ−Ｓｐ、ＱＳＹ−７、ＱＳＹ−２およびＭＧＢＮＦＱからなる群より選ばれるいずれか１つであることができるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【０１４１】
本発明に係るタンパク質の検出方法は、本発明の一本鎖核酸と相補的な配列を有する核酸が結合された抗体と本発明の一本鎖核酸とを使用することにより、所望のタンパク質を検出するに際して、検出速度および精度を向上させることができるという利点がある。すなわち、上述のように、本発明の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）は、短い増幅区間および高い特異性のために、タンパク質−抗体複合体に結合した一本鎖核酸のより迅速かつ正確な検出を提供する。
【発明の効果】
【０１４２】
前述したように、本発明の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を用いた核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質の検出方法では、従来の検出方法に比べてより少ないオリゴ（ｏｌｉｇｏ）を使用し、かつ、実時間同定のための別の位置のプローブ（ｐｒｏｂｅ）が不要であるので、コストの削減および簡単な分析方法を提供することでき、この方法を用いて所望の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質をリアルタイムで検出することができる。
【０１４３】
また、一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）のＹ部位を切断した後、増幅する工程によってＹ部位の突然変異を確認することができる。
【０１４４】
一本鎖核酸に付着する蛍光物質の数よりも多くの核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質を多重検出することができる。
【０１４５】
したがって、本発明の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）及びこれを用いた核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質の検出方法は、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＥＧＦＲなどで発生する様々な点突然変異を区別することができ、様々な疾患の診断および予後診断に有用に使用することができ、点突然変異で発生する抗生剤耐性菌などの各種細菌およびウイルスをより容易に検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４６】
【図１】本発明に係る一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）による標的核酸の検出過程を示す図である。
【図２】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号２および７のプライマーを用いて、ＳＷ６２０ヒト細胞株およびＰＢＭＣ（Ａ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）におけるＣＫ−１８遺伝子の発現有無をポリメラーゼ連鎖反応により確認した図である。
【図３】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号３および８のプライマーを用いて、ＳＷ６２０ヒト細胞株およびＰＢＭＣにおけるＣＫ−１９遺伝子の発現有無をポリメラーゼ連鎖反応により確認した図である。
【図４】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号６および９のプライマーを用いて、ＳＷ６２０ヒト細胞株およびＰＢＭＣにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現有無をポリメラーゼ連鎖反応により確認した図である。
【図５】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号１のプロマーおよび配列番号２のリバースプライマーを用いて、ＳＷ６２０ヒト細胞株およびＰＢＭＣにおけるＣＫ−１８遺伝子の発現有無をポリメラーゼ連鎖反応により確認した図である。
【図６】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号３のフォワードプライマーおよび配列番号４のプロマーを用いて、ＳＷ６２０ヒト細胞株およびＰＢＭＣにおけるＣＫ−１９遺伝子の発現有無をポリメラーゼ連鎖反応により確認した図である。
【図７】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号５のプロマーおよび配列番号６のリバースプライマーを用いて、ＳＷ６２０ヒト細胞株およびＰＢＭＣにおけるＧＡＰＤＨ遺伝子の発現有無をポリメラーゼ連鎖反応により確認した図である。
【図８】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号１１のプロマーおよび配列番号１２のリバースプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応によりＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｄ突然変異の有無を確認した図である。
【図９】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号１０のプロマーおよび配列番号１２のリバースプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応的によりＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｖ突然変異の有無を確認した図である。
【図１０】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号１０のプロマーおよび配列番号１２のリバースプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応的によりＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｄ突然変異の有無を確認した図である。
【図１１】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号１４のプロマーおよび配列番号１９のリバースプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応後にＯＰＮ１ＭＷ遺伝子のＴ５２９Ｃ位置突然変異の有無を確認した図である。
【図１２】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号１４および１５のプロマーおよび配列番号１９のリバースプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応後にＯＰＮ１ＭＷ遺伝子のＴ５２９Ｃ位置突然変異の有無を確認した図である。
【図１３】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号１４および１６のプロマーおよび配列番号１９のリバースプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応後にＯＰＮ１ＭＷ遺伝子のＴ５２９Ｃ位置突然変異の有無を確認した図である。
【図１４】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号１４および１７のプロマーおよび配列番号１９のリバースプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応後にＯＰＮ１ＭＷ遺伝子のＴ５２９Ｃ位置突然変異の有無を確認した図である。
【図１５】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号１４および１８のプロマーおよび配列番号１９のリバースプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応後にＯＰＮ１ＭＷ遺伝子のＴ５２９Ｃ位置突然変異の有無を確認した図である。
【図１６】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号２０および２１のプロマーおよび配列番号１２のリバースプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応後にＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｄ位置突然変異の有無を確認した図である。
【図１７】本発明の一実施例に基づいて調製された配列番号２２および２３のプロマーおよび配列番号１２のリバースプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応後にＫＲＡＳ遺伝子のＧ１２Ｖ位置突然変異の有無を確認した図である。
【図１８】従来の技術によるＣａｔａＣｌｅａｖｅ  ｐｒｏｂｅを用いて、サルモネラセット３３（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｓｅｔ３３）の増幅有無を確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１４７】
以下、実施例等を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例等は、専ら本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に応じて本発明の範囲がこれらの実施例等によって制限されないということは、当業界において通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【０１４８】
実施例１：本発明に係るプロマーを用いたリアルタイム核酸分析
ＣＫ−１８（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−１８）、ＣＫ−１９（ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ−１９）、およびＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の遺伝子発現を測定するために、本発明に係るプロマー（ｐｒｏｍｅｒ）およびプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を、表１に示すようにＩＤＴ（Ｉｎ
ｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）に依頼して調製した（表１参照）。ここで、プロマー（ｐｒｏｍｅｒ）の場合は、５’末端にはＦＡＭ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）を、３’末端には３ＩＡＢｋＦＧをそれぞれ付着させ、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）との区別のために、配列の前に添え字「ｒ」で表示した。比較群として、ＳＹＢＲ  ｍｅｔｈｏｄに用いるプライマーをＩＤＴに依頼して、表２のように調製した。
【０１４９】
【表１】
2019512214.tif 000003
【０１５０】
【表２】
2019512214.tif 000004
【０１５１】
前記表１および表２で調製したプロマーおよびプライマーがそれぞれ１０μＭおよび１μｌ存在下で、ヒトの血液から採取したＳＷ６２０およびＰＢＭＣのＲＮＡを、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＲＴ−ＰＣＲ）により合成したそれぞれのｃＤＮＡ  １０ｎｇ、１０ｍ  ｕｎｉｔの耐熱性ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＡｐｔａＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ製）４μｌを、チューブに入れ、３次蒸留水で全体積（ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）が２０μｌになるまで調整し、その後、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行った。このとき、ＰＣＲ反応条件によれば、９５℃で５分間、６２〜６３℃で６０秒間、９５℃で１０秒間行い、ＳＹＢＲ法では４０ｃｙｃｌｅ、本発明に係るｐｒｏｍｅｒの場合では４５ｃｙｃｌｅ行った。その結果を図２〜図７に示した。
【０１５２】
その結果から、ＳＹＢＲ法を用いてＣＫ−１８、ＣＫ−１９およびＧＡＰＤＨの発現有無を測定した場合では、ＧＡＰＤＨを除いたＣＫ−１８およびＣＫ−１９の場合、ｎｅｇ
ａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌにおいて非特異的増幅曲線が得られ、ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌにおいても非特異的増幅が発生することが確認できた（図２〜４参照）。これに対して、本発明に係るプロマー（ｐｒｏｍｅｒ）を使用した場合では、ＧＡＰＤＨはもとよりＣＫ−１８およびＣＫ−１９の場合にも、非特異的増幅反応のような問題が発生しないことが確認された。したがって、本発明の実施例１に係るプロマー（ｐｒｏｍｅｒ）を用いる方法では、従来のＳＹＢＲ法に比べて、非特異的反応なしに遺伝子発現および分析に用いることができることが確認された。
【０１５３】
実施例２：本発明に係るプロマーを用いた突然変異の測定
本発明に係る一本鎖核酸プロマーを用いてＫＲＡＳ  ｇｅｎｅのＧ１２ＤおよびＧ１２Ｖ突然変異（ｍｕｔａｎｔ）の有無を測定した。具体的には、ＩＤＴに依頼して、本発明に係るプロマー（ｐｒｏｍｅｒ）およびｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒを下記表３に示すように調製し、プロマー（ｐｒｏｍｅｒ）の場合は、５’末端にはＦＡＭ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）を、３’末端には３ＩＡＢｋＦＧをそれぞれ付着させ、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）との区別のために、配列の前に添え字「ｒ」で表示した。
【０１５４】
【表３】
2019512214.tif 000005
【０１５５】
また、ＫＲＡＳ  ｇｅｎｅを測定するために、ＳＷ６２０（ＢｉｏＳａｍｐｌｅ：ＳＡＭＮ０５２９２４３０）およびＬＳ１７４Ｔ細胞株（ＢｉｏＳａｍｐｌｅ：ＳＡＭＮ０３７０１６８６）からｔｏｔａｌ  ＤＮＡを得た。ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅのｇｅｎｅは健常者の血液から同じ方法によりｔｏｔａｌ  ＤＮＡを得た。ここで、ＳＷ６２０はＧ１２Ｖ  ｍｕｔａｎｔ  ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅとして、ＬＳ１７４ＴはＧ１２Ｄ  ｍｕｔａｎｔ  ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅとしてそれぞれ知られている。
【０１５６】
その後、前記調製した配列番号１１のプロマー及び配列番号１２のプライマー各々１０μＭ濃度で１μｌずつ用意し、１０ｍ  ｕｎｉｔの耐熱性ＲＮａｓｅ  Ｈ、およびＡｐｔａＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ製）４μｌ、ＳＷ６２０から抽出した全ＤＮＡ４０ｎｇに、ＬＳ１７４Ｔから抽出した全ＤＮＡ４ｐｇ、４０ｐｇ、４００ｐｇ、および４ｎｇをそれぞれ添加した後、３次蒸留水で総体積（ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）が２０μｌになるように調整し、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、ＬＳ１７４Ｔ  ｍｕｔａｎｔとして知られているＧ１２Ｄ  ｍｕｔａｎｔを測定した。このとき、反応条件は、９５℃で５分、６２〜６３℃で６０秒、９５℃で１０秒とした。その結果を図８に示した。
【０１５７】
また、上記条件と同様であるが、配列番号１０のプロマー及び配列番号１２のプライマーの存在下で、ＳＷ６２０から抽出したｔｏｔａｌ  ＤＮＡにＬＳ１７４Ｔから抽出した全ＤＮＡを添加する代わりに、ＬＳ１７４Ｔから抽出したｔｏｔａｌ  ＤＮＡ４０ｎｇにＳＷ６２０から抽出したｔｏｔａｌ  ＤＮＡ４ｐｇ、４０ｐｇ  ４００ｐｇ、４ｎｇを添加して、ＳＷ６２０  ｍｕｔａｎｔとして知られているＧ１２Ｖ  ｍｕｔａｎｔを測定した。その結果を図９に示した。
【０１５８】
また、上記条件と同様であるが、配列番号１０のプロマー及び配列番号１２のプライマーの存在下で、ＳＷ６２０から抽出したｔｏｔａｌ  ＤＮＡにＬＳ１７４Ｔから抽出した全ＤＮＡを添加する代わりに、健常者からのｔｏｔａｌ  ＤＮＡ４０ｎｇにＬＳ１７４Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅから抽出したｔｏｔａｌ  ＤＮＡ４０ｐｇを添加し、ＬＳ１７４Ｔ  ｍｕｔａｎｔとして知られているＧ１２Ｄ  ｍｕｔａｎｔを測定した。その結果を図１０に示した。
【０１５９】
その結果から、本発明に係るプロマーを使用した場合、優れた感度および特異性により突然変異の有無を測定できることが確認できた。
【０１６０】
言い換えれば、従来の点突然変異を測定する方法として汎用されているＥｎｄｐｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇの場合は、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ反応によって突然変異の有無のみを判別することができ、その種類および割合を分析するためには、ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅを確認する過程を必要とした。しかし、本発明に係る一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を用いる場合は、上記のように、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲ反応のみで突然変異の種類および割合をも分析できることが確認された。また、従来の方法では、最大１〜０．１％程度の突然変異を確認できるが、本発明では、０．０１％の突然変異を分析することができる。
【０１６１】
実施例３：本発明に係るプロマーの最適の大きさを決定
Ｘ染色体の長腕（Ｘｑ２８）に位置しているＯＰＮ１ＭＷ遺伝子（Ｔｈｅ  ｍｅｄｉｕｍ−ｗａｖｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｏｐｓｉｎ−１  ｇｅｎｅ）は、色弱、色盲と関連した遺伝子であって、ヌクレオチドの４箇所の位置で突然変異が起こり、これにより赤緑色弱が発生したと言われている。その突然変異の位置はＣ２８２Ａ、Ｔ５２９Ｃ、Ｔ６０７Ｃ、Ｇ９８９Ａである。
【０１６２】
そこで、本発明者は、本発明に係るプロマー（ｐｒｏｍｅｒ）の長さによる突然変異検出の有無を確認するために、ＯＰＮ１ＭＷ  Ｔ５２９Ｃ突然変異遺伝子の２４１〜１０３０番目のヌクレオチド（配列番号１３のＤＮＡ配列参照）が挿入されたプラスミドを調製した後、１０ｆＭ、１ｆＭ、１００ａＭ、１０ａＭの濃度に希釈し、次いで、１μｌずつ取り、表４に示すようにＩＤＴに依頼して調製された５種のプロマーおよびｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒを用いて検出した。ここで調製された５種のプロマーの場合は、５’末端にはＦＡＭ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）を、３’末端には３ＩＡＢｋＦＧをそれぞれ付着させ、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）は、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）との区別のために、配列の前に添え字「ｒ」で表示した。その結果として、配列番号１４のプロマーを用いた場合の結果（図１１参照）と、配列番号１３のプロマーおよび配列番号１５、１６、１７および１８のそれぞれのプロマーを用いて比較した結果（図１２〜１５参照）とを、図１１乃至図１５に示した。
【０１６３】
【表４】
2019512214.tif 000006
【０１６４】
図１１乃至図１５に示すように、本発明に係るプロマー（ｐｒｏｍｅｒ）のＸ−Ｙ−Ｚ構造において、Ｘ部位の塩基が９個からなる場合は、Ｙ部位の切断後にＸ部位も鋳型から分離されてプライマーとして機能せずに専らプローブとしてのみ機能し（図１２参照）、また、Ｘ部位の塩基が３１個からなる場合は、非特異的増幅反応が観察された（図１３参照）。さらに、Ｚ部位の塩基が２個又は１０個である場合は、Ｙ部位の切断後に、Ｚ部位だけが鋳型から分離され、Ｘ分位は分離されずに、増幅反応が正常に行われた（図１１及び１４参照）。しかしながら、Ｚの部位の塩基が１７個である場合は、Ｙ部位の切断後に、Ｚ部位が鋳型から分離されないため、増幅反応が正常に行われなかった（図１５参照）。このように、本発明に係るプロマーでは、ＸおよびＺの部位において特定の範囲の塩基数で構成される場合には特異的反応が行われることが確認できた。
【０１６５】
また、前記実施例２の実験と同じ方法であるが、本発明に係るプロマーを下記表５に示すように、Ｙ部位ではＲＮＡが１個存在するように調製し、Ｚ部位ではＤＮＡが１個又は２個となるように合成してＫＲＡＳ遺伝子の突然変異の有無を確認した。
【０１６６】
具体的には、配列番号２０のプロマー及び配列番号１２のプライマー各々１０μＭおよび１μｌ、又は配列番号２１のプロマー及び配列番号１２のプライマー各々１０μＭ及び１μｌ、１０ｍ  ｕｎｉｔの耐熱性ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＡｐｔａＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ製）４μｌ、ＬＳ１７４Ｔから抽出した全ＤＮＡ１２０ｐｇおよび１．２ｎｇをそれぞれ添加した後、３次蒸留水で総体積（ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）が２０μｌになるように調整し、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を、９５℃で５分間、６２〜６３℃で６０秒間、９５℃で１０秒間の条件で行い、ＬＳ１７４Ｔ  ｍｕｔａｎｔとして知られているＧ１２Ｄ  ｍｕｔａｎｔを測定した。その結果を図１６に示した。
【０１６７】
また、配列番号２２のプロマー及び配列番号１２のプライマー各々１０μＭ及び１μｌ、配列番号２３のプロマー及び配列番号１２のプライマー各々１０μＭ及び１μｌ、１０ｍ  ｕｎｉｔの耐熱性ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＡｐｔａＴａｑ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ製）４μｌ、ＳＷ６２０から抽出した全ＤＡＮ１２０ｐｇおよび１．２ｎｇをそれぞれ添加した後、３次蒸留水で全体積（ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）が２０μｌになるように調整し、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応を、９５℃で５分間、６２〜６３℃で６０秒間、９５℃で１０秒間行い、ＳＷ６２０  ｍｕｔａｎｔとして知られているＧ１２Ｖ  ｍｕｔａｎｔを測定した。その結果を図１７に示した。
【０１６８】
【表５】
2019512214.tif 000007
【０１６９】
図１６および１７に示すように、切断されるＹ部位からＺ部位の間隔が最小２ｂｐを維する場合に、本発明に係るプロマーによる増幅反応が円滑に行われることが確認された。
【図１】
2019512214.tif 000008
【図２】
2019512214.tif 000009
【図３】
2019512214.tif 000010
【図４】
2019512214.tif 000011
【図５】
2019512214.tif 000012
【図６】
2019512214.tif 000013
【図７】
2019512214.tif 000014
【図８】
2019512214.tif 000015
【図９】
2019512214.tif 000016
【図１０】
2019512214.tif 000017
【図１１】
2019512214.tif 000018
【図１２】
2019512214.tif 000019
【図１３】
2019512214.tif 000020
【図１４】
2019512214.tif 000021
【図１５】
2019512214.tif 000022
【図１６】
2019512214.tif 000023
【図１７】
2019512214.tif 000024
【図１８】
2019512214.tif 000025
【配列表】
2019512214000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月25日(2018.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸又はタンパク質のリアルタイム検出のためのプライマーおよびプローブとして使用される一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）であって、Ｘ−Ｙ−Ｚの構造を有し、一本鎖核酸の両末端又は内部に１つ又はそれ以上の検出可能なマーカーが付されており、リアルタイム検出を目的とする標的核酸又は標的タンパク質の特定の部位に結合して複合体を形成し、特定の酵素によるＹ部位の切断時に、Ｘ部位は標的核酸又はタンパク質との複合体を維持しながらプライマーとして機能し、ＹおよびＺは、前記標的核酸又は標的タンパク質の特定の部位から分離されることを特徴とし、前記Ｘ、ＹおよびＺのいずれかがＤＮＡであるときに他の２つのうちの１つ以上はＲＮＡであることを特徴とし、
前記Ｘ、ＹおよびＺは、塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、
前記Ｘ、ＹおよびＺがのいずれかがＤＮＡであるときに他の２つのうちの１つ以上はＲＮＡであることを特徴とする、一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項２】
前記Ｘは、１〜６０個のヌクレオチドからなる塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、
前記Ｙは、１〜１０個のヌクレオチドからなる塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、
前記Ｚは、０〜１０個のヌクレオチドからなる塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、
前記Ｚが０であるとき、Ｙは３〜１０個のヌクレオチドからなる塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、
前記Ｚが１であるとき、Ｙは２〜１０個のヌクレオチドからなる塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡからなることを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項３】
前記Ｘ、ＹおよびＺは、順次ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ、又はＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＲＮＡからなることを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項４】
前記検出可能なマーカーは、一本鎖核酸に共有結合又は非共有結合によって結合する蛍
光物質、又は蛍光物質と消光物質とからなる蛍光ペアであることを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項５】
前記一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）のＸ、ＹおよびＺは、非特異的な切断を防ぐために、全体的にメチル化されるか、又は部分的にメチル化されるように合成されたことを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項６】
前記一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）のＸは１０〜３０個のヌクレオチドからなる塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、Ｙは１〜１０個のヌクレオチドからなる塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであり、前記Ｚは２〜１０個のヌクレオチドからなる塩基配列で構成されたＤＮＡ又はＲＮＡであることを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項７】
前記酵素は、Ｙ部位がＤＮＡであるとき、ＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮＡ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ）、具体的には、ＤＮａｓｅ  I、ＤＮａｓｅ  II、Ｓ１核酸加水分解酵素、核酸加水分解酵素Ｐ１、ＡＰエンドヌクレアーゼ、又はＵｖｒＡＢＳＣ核酸加水分解酵素を使用し、Ｘ部位がＲＮＡであるとき、ＲＮＡ加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＮａｓｅ）、具体的には、ＲＮａｓｅ  II、ＲＮａｓｅ  III、ＲＮａｓｅ  IV、ＲＮａｓｅ  Ｈ、又はＲＮａｓｅ  Ｔ２を使用することを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項８】
前記一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）は、ｉ）核酸のうちＲＮＡからｃＤＮＡを合成するためのＲＴプライマー；ｉｉ）核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）から合成されたｃＤＮＡを増幅するためのフォワードフォワードプライマー；ｉｉｉ）核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）から合成されたｃＤＮＡを増幅するためのリバースプライマー；ｉｖ）核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）から合成されたｃＤＮＡを増幅するためのフォワードプライマーおよびリバースプライマー；又はｖ）検出しようとする核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又はタンパク質をリアルタイムで確認するためのプローブとして使用されることを特徴とする、請求項１に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）。
【請求項９】
請求項１乃至８のうちいずれか１項に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）と、前記一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）のＹ部位を切断できる酵素と、からなることを特徴とする、核酸検出用キット。
【請求項１０】
前記酵素は、一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）のＸ部位がＤＮＡであるとき、ＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮＡ  ｎｕｃｌｅａｓｅ、ＤＮａｓｅ）、具体的には、ＤＮａｓｅ  I、ＤＮａｓｅ  II、Ｓ１核酸加水分解酵素、核酸加水分解酵素Ｐ１、ＡＰエンドヌクレアーゼ、又はＵｖｒＡＢＳＣ核酸加水分解酵素を使用し、Ｘ部位がＲＮＡであるとき、ＲＮＡ加水分解酵素（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ、ＲＮａｓｅ）、具体的には、ＲＮａｓｅ  II、ＲＮａｓｅ  III、ＲＮａｓｅ  IV、ＲＮａｓｅ  Ｈ、又はＲＮａｓｅ  Ｔ２を使用することを特徴とする、請求項９に記載の核酸検出用キット。
【請求項１１】
前記キットは、ＤＮＡの増幅反応に必要な試薬をさらに含むことを特徴とする、請求項９に記載の核酸検出用キット。
【請求項１２】
ａ）試料からＲＮＡを抽出する工程と；
ｂ）前記ａ）工程で抽出したＲＮＡに、別のＲＴプライマー、又は請求項１乃至８のうちいずれか１項に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）を混合してｃＤＮＡを合成する工程と；
ｃ）前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡに、ｉ）請求項１０乃至１２のうちいずれか１
項に記載のキットであって、そのキットに含まれている一本鎖核酸が、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列を有するフォワードプライマーおよびプローブであることを特徴とするキット、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列を有するリバースプライマー、ｉｉ）請求項１０乃至１２のうちいずれか１項に記載のキットであって、そのキットに含まれている一本鎖核酸が、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能なリバースプライマーおよびプローブであることを特徴とするキット、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列を有するフォワードプライマー、および／又はｉｉｉ）請求項１０乃至１２のうちいずれか１項に記載のキットであって、そのキットに含まれている一本鎖核酸が、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能なフォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブであることを特徴とするキット、を混合して伸長反応によりｃＤＮＡを増幅させる工程と；
ｄ）前記ｃ）工程により切断された一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）断片の量を測定する工程と；を含むことを特徴とする、ＲＮＡのリアルタイム検出方法。
【請求項１３】
前記ｃ）工程は、前記ｂ）工程で合成されたｃＤＮＡと結合した一本鎖核酸が、キットに含まれている酵素による一本鎖核酸のＹ部位の切断時に、ＹおよびＺ部位が分離され、Ｘ部位がプライマーとして機能して増幅されることを特徴とする、請求項１２に記載のＲＮＡのリアルタイム検出方法。
【請求項１４】
ａ）試料からＤＮＡを抽出する工程と；
ｂ）前記ａ）工程で抽出したＤＮＡに、ｉ）請求項１０乃至１２のうちいずれか１項に記載のキットであって、そのキットに含まれている一本鎖核酸が、前記ｂ）工程で合成されたＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列を有するフォワードプライマーおよびプローブであることを特徴とするキット、前記ｂ）工程で合成されたＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列を有するリバースプライマー、ｉｉ）請求項１０乃至１２のうちいずれか１項に記載のキットであって、そのキットに含まれている一本鎖核酸が、前記ａ）工程で抽出したＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能なリバースプライマーおよびプローブであることを特徴とするキット、前記ａ）工程で抽出したＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能な塩基配列を有するフォワードプライマー、および／又はｉｉｉ）請求項１０乃至１２のうちいずれか１項に記載のキットであって、そのキットに含まれている一本鎖核酸が、前記ａ）工程で抽出したＤＮＡの一部の塩基配列と相補的結合が可能なフォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブであることを特徴とするキット、を混合して伸長反応によりＤＮＡを増幅させる工程と；
ｃ）前記ｂ）工程により切断された一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）断片の量を測定する工程と；を含むことを特徴とする、ＤＮＡのリアルタイム検出方法。
【請求項１５】
前記ｂ）工程は、前記ａ）工程で抽出したＤＮＡと結合した一本鎖核酸が、キットに含まれている酵素による一本鎖核酸のＹ部位の切断時にＹおよびＺ部位が分離され、Ｘ部位がプライマーとして機能して増幅されることを特徴とする、請求項１４に記載のＤＮＡのリアルタイム検出方法。
【請求項１６】
ａ）請求項１乃至８項のうちいずれか１項に記載の一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）と相補的な塩基配列を有する核酸が結合した抗体を調製する工程と；
ｂ）検出対象のタンパク質を含む試料と前記ａ）工程で調製した抗体とを結合させて、タンパク質−抗体複合体を形成させる工程と；
ｃ）前記ｂ）工程の複合体に、請求項１０乃至１２のうちいずれか１項に記載のキットをハイブリダイズさせて、タンパク質−抗体−一本鎖核酸複合体を形成させる工程と；
ｄ）前記ｃ）工程により切断された一本鎖核酸（ｐｒｏｍｅｒ）断片の量を測定する工
程と；を含むことを特徴とする、試料内のタンパク質のリアルタイム検出方法。
【請求項１７】
前記ｄ）工程は、前記ａ）工程で調製した抗体と結合した一本鎖核酸が、キットに含まれている酵素による一本鎖核酸のＹ部位の切断時にＹおよびＺ部位が分離され、Ｘ部位がプライマーとして機能して増幅されることを特徴とする、請求項１６に記載の試料内のタンパク質のリアルタイム検出方法。
【国際調査報告】
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