(57)【要約】本発明は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検サンプル由来の微量ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の使用に概して有用である方法および組成物を提供し、特にこのような生検サンプルにおける多剤耐性のピロリ菌の識別に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の遺伝子における突然変異をサンプル内で検出するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
ａ）  １つまたは複数の突然変異を含有する遺伝子のそれぞれの領域を含むアンプリコンを産生するのに適切なＰＣＲプライマー対を識別する工程、
ｂ）  別のＰＣＲプライマー対によるアンプリコン生成を妨げる１つまたは複数のプライマーを含むＰＣＲプライマー対を、別個のＰＣＲプライマー対プールに分離する工程であって、前記別個のＰＣＲプライマー対プールの各々が、複数のＰＣＲプライマー対を含有する、工程
ｃ）  前記別個のＰＣＲプライマー対プールの各々および前記サンプルより単離された標的ＤＮＡから、アンプリコンを生成する工程、
ｄ）  前記別個のＰＣＲプライマー対プールの各々および前記標的ＤＮＡから産生される全てのアンプリコンを、サンプルアンプリコンプールへと組み合わせ、前記サンプルアンプリコンプール内で、前記アンプリコンに固有インデックス配列を付加してインデックス付きサンプルアンプリコンプールを生成し、任意で、異なるサンプル由来の１つまたは複数の差次的なインデックス付きサンプルアンプリコンプールと、前記インデックス付きサンプルアンプリコンプールとをさらに組み合わせ、すべてのインデックス付きサンプルアンプリコンを同時に配列決定する工程、および
ｅ）  対応する野生型遺伝子配列を参照することにより、サンプル由来の前記インデックス付き配列決定アンプリコン内の突然変異を識別する工程。
【請求項２】
前記サンプルが生検サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生検が胃生検である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルがホルマリン固定パラフィン包埋生検サンプルを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルがヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）（ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ））を含有する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の遺伝子が、ピロリ菌１６Ｓ ｒＲＮＡ、２３Ｓ ｒＲＮＡ、ｇｙｒＡ、ｒｐｏＢ、ｐｂｐ１、およびｒｄｘＡからなる群から選択される遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記識別された突然変異が、前記ピロリ菌２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＡ２１４２Ｇ、Ａ２１４３Ｇ、および／またはＡ２１４２Ｃの突然変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記識別された突然変異が、前記ピロリ菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＡ９２８Ｃ、ＡＧ９２６〜９２７ＧＴ、Ａ９２６Ｇ／Ａ９２８Ｃ、および／またはＡＧＡ９２６〜９２８ＴＴＣの突然変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記識別された突然変異が、ＤＮＡジャイレースサブユニットＡをコードする前記ピロリ菌ｇｙｒＡ遺伝子のＣ２６１Ａ、Ｃ２６１Ｇ、Ｇ２７１Ａ、および／またはＧ２７１Ｔの突然変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記識別された突然変異が、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのベータ／ベータ’サブユニットをコードする前記ピロリ菌ｒｐｏＢ遺伝子のコドン５２５〜５４５の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記識別された突然変異が、ペニシリン結合タンパク質１をコードする前記ピロリ菌ｐｂｐ１遺伝子におけるＣ１２４２ＡまたはＣ１２４２Ｇの突然変異である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記識別された突然変異が、前記ピロリ菌ｒｄｘＡ遺伝子内である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記識別された突然変異が、ｒｄｘＡによりコードされるピロリ菌の酸素非感受性（タイプＩ）ＮＡＰＤ（Ｐ）Ｈニトロレダクターゼの機能喪失を生じさせる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アンプリコンが、２３０塩基対を超えない長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記アンプリコンが、１３０塩基対を超える長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
別のＰＣＲプライマー対によるアンプリコン生成を妨げる１つまたは複数のプライマーを含む前記ＰＣＲプライマー対は、クロスペアプライマー二量体を形成することにより妨げる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
別のＰＣＲプライマー対によるアンプリコン生成を妨げる１つまたは複数のプライマーを含む前記ＰＣＲプライマー対は、クロスペアのトランケートされたアンプリコンを形成することにより妨げる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
薬剤耐性ピロリ菌の存在を患者由来サンプル内で検出するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
ａ）  前記患者由来サンプルから単離されたＤＮＡからアンプリコンを生成する工程であって、
ｂ）  ＰＣＲプライマー対プール１はプライマー配列番号１〜１０を含み、
ｃ）  ＰＣＲプライマー対プール２はプライマー配列番号１１〜２２を含み、
ｄ）  ＰＣＲプライマー対プール３はプライマー配列番号２３〜２８を含み、
ｅ）  ＰＣＲプライマー対プール４はプライマー配列番号２９〜３２を含み、
ｆ）  ＰＣＲプライマー対プール５はプライマー配列番号３３〜３８を含み、
ｇ）  ＰＣＲプライマー対プール６はプライマー配列番号３９〜４４を含む、工程、
ｈ）  工程ａ）でＰＣＲプライマー対プール１〜６から産生された全てのアンプリコンを、サンプルアンプリコンプールへと組み合わせ、前記サンプルアンプリコンプール内で前記アンプリコンに固有インデックス配列を付加してインデックス付きサンプルアンプリコンプールを生成し、任意で、異なる患者由来サンプルに由来する１つまたは複数の差次的なインデックス付きサンプルアンプリコンプールと、前記インデックス付きサンプルアンプリコンプールとをさらに組み合わせ、すべてのインデックス付きサンプルアンプリコンを同時に配列決定する工程、
ｉ）  配列番号４７〜５１に対する参照により、前記配列決定されたインデックス付きサンプルアンプリコン内の突然変異を識別する工程、および
ｊ）  工程ｃ）で識別される前記突然変異の存在または非存在により、前記患者由来プロファイルに存在するピロリ菌の前記薬剤耐性プロファイルを決定する工程。
【請求項１９】
ピロリ菌中のｒｄｘＡにおける突然変異の存在を患者由来サンプル内で検出するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
ａ）  前記患者由来サンプルから単離されたＤＮＡからアンプリコンを生成する工程であって、
ｉ）  ＰＣＲプライマー対プール１はプライマー配列番号２３〜２８を含み、
ｉｉ）  ＰＣＲプライマー対プール２はプライマー配列番号２９〜３２を含み、
ｉｉｉ）  ＰＣＲプライマー対プール３はプライマー配列番号３３〜３８を含み、
ｉｖ）  ＰＣＲプライマー対プール４はプライマー配列番号３９〜４４を含む、工程、
ｂ）  工程ａ）でＰＣＲプライマー対プール１〜４から産生された全てのアンプリコンを、サンプルアンプリコンプールへと組み合わせ、前記サンプルアンプリコンプール内で前記アンプリコンに固有インデックス配列を付加してインデックス付きサンプルアンプリコンプールを生成し、任意で、異なる患者由来サンプルに由来する１つまたは複数の差次的なインデックス付きサンプルアンプリコンプールと、前記インデックス付きサンプルアンプリコンプールとをさらに組み合わせ、すべてのインデックス付きサンプルアンプリコンを同時に配列決定する工程、
ｃ）  配列番号４７〜５１に対する参照により、前記配列決定されたインデックス付きサンプルアンプリコン内の突然変異を識別する工程、および
ｄ）  工程ｃ）で識別される前記突然変異の存在または非存在により、前記患者由来サンプルに存在するピロリ菌がｒｄｘＡ突然変異を有するかどうかを決定する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
記載された方法および組成物は、概して、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）生検試料由来の微量ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の使用に関する。特に、本方法および材料は、ヒト生検ＦＦＰＥ保存サンプル内の微量の細菌ＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅を促進する。より詳細には、該方法および組成物は、ヒト胃生検ＦＦＰＥサンプル中に存在する多剤耐性ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）（ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ））を特徴付けるのに適している。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ピロリ菌は、主に胃で見出される重要なヒト病原体である。ピロリ菌は、胃炎、消化性潰瘍および胃癌において重要な役割を果たす。ピロリ菌の薬剤耐性および多剤耐性株はますます一般的となり、ピロリ菌の治療のための最前線治療は、通常、プロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）、および２つのさらなる抗生物質、典型的にはクラリスロマイシンと、メトロニダゾールまたはアモキシシリンのいずれかとを同時に投与することを含む、三重の抗生物質療法を伴う。しかしながら、そのような治療は、それが標的とする臨床分離株がクラリスロマイシン耐性でない、あるいはメトロニダゾール、またはアモキシシリンのようなペニシリン様薬剤に耐性でない場合にのみ有効である。他の抗生物質を使用してもよいが、いずれの場合においても、効果的な治療処置を提供するために、患者を苦しめているピロリ菌株が、いずれかの特定の抗生物質に対する耐性を有する傾向があるかどうかを知ることが重要である。尿素呼気試験、迅速ウレアーゼ試験、および血清および糞便サンプルについての抗ピロリ菌抗体検査、ならびに広範囲の免疫組織学的染色方法を含む、ピロリ菌の存在を検出するためのいくつかの診断法が開発されている。大部分の場合、そのような方法は、培養分離株または最近得られた臨床サンプルの使用を必要とする。ピロリ菌の培養および抗生物質感受性試験は、成長および輸送の点でのピロリ菌の特定の要件のために、日常的なプラクティスでは一般的に行われていない。それは困難であり、常に成功するとは限らない。さらに、検出された任意のピロリ菌の薬剤耐性プロファイルを決定することを可能にする良い方法はない。検出された細菌の薬剤耐性プロファイルを同時に判定しながら、ピロリ菌を検出することができる堅牢で安価な方法は、既存の技術よりも大幅に改善されている。
【０００３】
歴史的に、生検組織、特に胃生検組織は、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプル（ＦＦＰＥ）の「ブロック」に保存されている。そのようなブロックは、特別な取り扱いまたは保管を必要とせず、臨床組織学研究室においてヒト生検材料を保存する一般的な方法を表す。ＦＦＰＥは、長期間に亘って、埋め込まれた組織の超構造的関係を保存し、サンプルは外因性汚染の影響を受けず、ＦＦＰＥは組織学的染色のための処理を容易にし、多くの抗体に基づく分析に適している。残念なことに、細胞物質の固定化を可能にするホルマリン固定（主に巨大分子中の窒素含有基の架橋による）は、ＦＦＰＥ生検サンプル中の特定の遺伝子配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などの多くの核酸法の有効性を低下させる。ＰＣＲ増幅に使用されるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、化学的に架橋されているかまたは多くの修飾された窒素塩基を含有するＤＮＡ配列を、横切ることも、正確に複製することもできない。
【０００４】
幸いにも、ほとんどのＦＦＰＥサンプルにおける架橋結合のレベルは、核酸分析を完全には排除しない。本明細書に記載の方法および組成物は、既存の方法よりも、そのような架橋およびその他の損傷を受けた、生検ＦＦＰＥサンプルに由来する微量ＤＮＡのＰＣＲ増幅の効果を改善する。典型的には、ＦＦＰＥ保存サンプルに由来するＤＮＡのＰＣＲ増幅は、生検に存在するヒトＤＮＡ配列の分析を標的としており、増幅され得る比較的多量の標的ＤＮＡが存在する。これは重要であり、ホルマリンによる化学的架橋がランダムに起こり、ＰＣＲ増幅反応内で任意の所与の標的ＤＮＡ配列の十分に高いコピー数を伴うので、所望の標的ＤＮＡ配列の複数のコピーのうち少なくとも１つまたはいくつかの組合せが増幅のために利用可能であり、したがってＰＣＲに基づく分析に適している可能性が高い。市販のキットは、イルミナのＴｒｕＳｅｑカスタムアンプリコンローインプットキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）などが、ＦＦＰＥ生検サンプルから回収されたヒトＤＮＡの直接分析に利用できる。しかしながら、ＦＦＰＥ保存組織内に低コピー数で存在する細菌性病原体のような、あまり豊富でないＤＮＡ配列に適用した場合、状況は非常に異なる。ＰＣＲ増幅の標的となるＤＮＡ配列が非常に低いコピー数である場合、標的ＤＮＡのあらゆるコピーを含む、架橋または付加体の可能性が大きな懸念事項である。ＰＣＲ増幅が成功する可能性を最大にするためには、ＰＣＲ増幅によって産生されるＤＮＡ断片（アンプリコン）のサイズを分析に必要な最小限に制限し、このような最小アンプリコンを産生する最も好ましいプライマー配列のみを使用し、可能な限り、標的ＤＮＡの単一アリコートから多くの診断用アンプリコンを産生することが必要である。
【０００５】
そのような小さいアンプリコンサイズに対する要件は、標的配列に沿ってプライマーを分配するための選択肢の数を制限し、かつ複数の密接に関連したプライミング部位を使用して、プライマー結合配列内で架橋結合によってまたは破壊的な付加体の存在によって単一の部位が損なわれないことを確実にすることを必要とする。ＤＮＡ配列は完全に異種ではないため、そして、最適なプライマー結合部位は、特にプライマー配列の３’末端でより高いＧＣ含量を好む傾向があるため、アンプリコンのセットを生成するための最良のプライマーは、所与の標的配列の狭い領域にクラスター化する傾向がある。各アンプリコンが、所望のプライマー対から特異的かつ専ら産生されることを確実にするためには、ＰＣＲ増幅プロセスの間に産生される、プライマー二量体またはアンプリコン鎖のクロスハイブリダイゼーションによる組換え増幅産物の形成を避けるために、通常、各アンプリコンは個々に産生されなければならない。実際には、これは複数のＰＣＲ反応間で標的ＤＮＡの希釈を必要とし、これは標的ＤＮＡの非効率的な使用であり、ＦＦＰＥ生検サンプルから回収できる微量の細菌ＤＮＡでは実用的ではない。ここで開示されるより効率的な方法は、ＰＣＲ増幅の間の、プライマー二量体形成または新たに生じたアンプリコン間のクロスハイブリダイゼーションのリスクが最小限になるように、ＰＣＲプライマー対を、相互に適合するプールに分離することを含む。この種の、プライマー対の分離的プーリング（分離的にプールすること）は、臨床検査室セッティングにおいて、ＰＣＲ増幅に基づく方法で分析される稀なＤＮＡ配列を含有するＦＦＰＥサンプルの効率的かつ自動化可能な取り扱いを可能にする。
【発明の概要】
【０００６】
一態様では、本発明は、ＦＦＰＥ保存組織中の薬剤耐性ピロリ菌の存在を特徴付けるためのＰＣＲ増幅プライマーのセットを提供する。既知の薬剤耐性ピロリ菌株に特徴的な別個の遺伝子のための２対のプライマー（各対において１つは順方向１つは逆方向）からなるプライマーを図２に列挙する。ここに提示されている遺伝子の例には、１６Ｓ ｒＲＮＡ（テトラサイクリン耐性に関連する）、２３Ｓ ｒＲＮＡ（クラリスロマイシン耐性に関連する）、ｐｂｐ１（ペニシリン抗生物質に対する耐性に関連する）、ｇｙｒＡ（フルオロキノン抗生物質に対する耐性に関連する）、ｒｐｏＢ（リファブチン耐性に関連する）およびｒｄｘＡ（メトロニダゾールに対する耐性に関連する）を含む。他の抗生物質に対する耐性に関与する他の遺伝子座が知られており、本明細書に記載されたものに含まれていてもよいし、代用されてもよいことを当業者であれば理解する。実際には、各標的遺伝子に対して２つのプライマー対を使用することにより、標的ＤＮＡ配列中に見られる任意の特定の障害（例えば、架橋または付加体）が両方のアンプリコンからのＰＣＲ増幅を阻害する機会が、最小限に抑えられる。その理由は、このような障害は、２つの異なるプライマー結合部位で起こる可能性が低く、標的（鋳型）ＤＮＡ内の標的遺伝子の全てのコピーを含むためである。しかしながら、細菌染色体の同じ領域を標的とし、異なるが重複する断片をなお産生する２対のプライマーの使用は、各プライマー対が産生するように設計された全長アンプリコンと一致しないハイブリッドアンプリコンの産生を避けるために、ＰＣＲ増幅反応を別々に実施することを必要とする。したがって、少なくとも２つのＰＣＲ増幅反応をプライマー対の各セットについて実施しなければならない。対照的に、異なる遺伝子を標的とし、相同配列をもたないアンプリコンを産生するＰＣＲプライマー対をプールすることができ、したがってＦＦＰＥ保存組織から増幅され得る標的細菌ＤＮＡの限られた量ができるだけ効率的に使用される。本発明は、アンプリコンの重複するセットを別個のプールに標的指向させるプライマー対の分離、および分離したプールで単一ＰＣＲ増幅反応を行って、所望のアンプリコンを生成することを教示する。ここに提示された一例では、ＦＦＰＥ胃生検サンプルから抽出されたＤＮＡを用いた、たった２つのＰＣＲ反応から、上に列挙した５種類の異なるタイプの薬剤耐性ピロリ菌遺伝子を診断するための１０種類ものアンプリコンを産生することができる。
【０００７】
本発明の一実施形態は、複数の遺伝子における突然変異を、サンプル内で検出するための方法であって、該方法は、以下の工程を含む：
ａ）１つまたは複数の突然変異を含有する遺伝子のそれぞれの領域を含むアンプリコンを産生するのに適切なＰＣＲプライマー対を識別する工程、
ｂ）別のＰＣＲプライマー対によるアンプリコン生成を妨げる１つまたは複数のプライマーを含むＰＣＲプライマー対を、別個のＰＣＲプライマー対プールに分離する工程であって、該別個のＰＣＲプライマー対プールの各々は、複数のＰＣＲプライマー対を含む、工程、
ｃ）該別個のＰＣＲプライマー対プールの各々および該サンプルより単離された標的ＤＮＡからアンプリコンを生成する工程、
ｄ）該別個のＰＣＲプライマー対プールの各々および該標的ＤＮＡから産生される全てのアンプリコンを、サンプルアンプリコンプールへと組み合わせ、該サンプルアンプリコンプール内で、該アンプリコンに固有インデックス配列を付加してインデックス付きサンプルアンプリコンプールを生成し、任意で、異なるサンプル由来の１つまたは複数の差次的なインデックス付きサンプルアンプリコンプールと、該インデックス付きサンプルアンプリコンプールとをさらに組み合わせ、すべてのインデックス付きサンプルアンプリコンを同時に配列決定する工程、および
ｅ）対応する野生型遺伝子配列決定を参照することにより、サンプル由来の該インデックス付き配列決定アンプリコン内の突然変異を識別する工程。
【０００８】
本発明の一実施形態では、該サンプルは生検サンプルであり、別の実施形態では、該生検は胃生検である。さらなる実施形態では、該生検サンプルはホルマリン固定パラフィン包埋生検サンプルを含む。別の実施形態では、該サンプルはヘリコバクター・ピロリ（ピロリ菌）を含有する。
【０００９】
別の実施形態では、該複数の遺伝子は、ピロリ菌１６Ｓ ｒＲＮＡ、２３Ｓ ｒＲＮＡ、ｇｙｒＡ、ｒｐｏＢ、ｐｂｐ１、およびｒｄｘＡからなる群から選択される遺伝子を含む。さらなる実施形態では、該識別された突然変異は、ピロリ菌２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＡ２１４２Ｇ、Ａ２１４３Ｇ、および／またはＡ２１４２Ｃの突然変異、ピロリ菌１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＡ９２８Ｃ、ＡＧ９２６〜９２７ＧＴ、Ａ９２６Ｇ／Ａ９２８Ｃ、および／またはＡＧＡ９２６〜９２８ＴＴＣの突然変異、ＤＮＡジャイレースサブユニットＡをコードするピロリ菌ｇｙｒＡ遺伝子のＣ２６１Ａ、Ｃ２６１Ｇ、Ｇ２７１Ａ、および／またはＧ２７１Ｔの突然変異、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのベータ／ベータ’サブユニットをコードするピロリ菌ｒｐｏＢ遺伝子のコドン５２５〜５４５の間の突然変異、ペニシリン結合タンパク質１をコードするピロリ菌ｐｂｐ１遺伝子におけるＣ１２４２ＡまたはＣ１２４２Ｇの突然変異、あるいはピロリ菌ｒｄｘＡ遺伝子内の突然変異である。別の実施形態では、該識別された突然変異は、ｒｄｘＡによりコードされる、ピロリ菌の酸素非感受性（タイプＩ）ＮＡＰＤ（Ｐ）Ｈニトロレダクターゼの機能喪失を生じさせる。
【００１０】
本発明の一実施形態では、該アンプリコンは、２３０塩基対を超えない長さである。別の実施形態では、該アンプリコンは、１３０塩基対を超える長さである。さらなる実施形態では、別のＰＣＲプライマー対によるアンプリコン生成を妨げる１つまたは複数のプライマーを含む該ＰＣＲプライマー対は、クロスペアのプライマー二量体を形成することにより、または、クロスペアのトランケートされたアンプリコンを形成することにより、妨げる。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、薬剤耐性ピロリ菌の存在を、患者由来サンプル内で検出するための方法に関し、該方法は、以下の工程を含む：
ａ）該患者由来サンプルから単離されたＤＮＡからアンプリコンを生成する工程であって、
ｉ）ＰＣＲプライマー対プール１はプライマー配列番号１〜１０を含み、
ｉｉ）ＰＣＲプライマー対プール２はプライマー配列番号１１〜２２を含み、
ｉｉｉ）ＰＣＲプライマー対プール３はプライマー配列番号２３〜２８を含み、
ｉｖ）ＰＣＲプライマー対プール４はプライマー配列番号２９〜３２を含み、
ｖ）ＰＣＲプライマー対プール５はプライマー配列番号３３〜３８を含み、
ｖｉ）ＰＣＲプライマー対プール６はプライマー配列番号３９〜４４を含む、工程、
ｂ）工程ａ）でＰＣＲプライマー対プール１〜６から産生された全てのアンプリコンを、サンプルアンプリコンプールへと組み合わせ、該サンプルアンプリコンプール内で該アンプリコンに固有インデックス配列を付加してインデックス付きサンプルアンプリコンプールを生成し、任意で、異なる患者由来サンプルに由来する１つまたは複数の差次的なインデックス付きサンプルアンプリコンプールと、該インデックス付きサンプルアンプリコンプールとをさらに組み合わせ、すべてのインデックス付きサンプルアンプリコンを同時に配列決定する工程、
ｃ）配列番号４７〜５１に対する参照により、該配列決定されたインデックス付きサンプルアンプリコン内の突然変異を識別する工程、および
ｄ）工程ｃ）で識別される突然変異の存在または非存在により、患者由来プロファイルに存在するピロリ菌の薬剤耐性プロファイルを決定する工程。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態は、薬剤耐性ピロリ菌の存在を、患者由来サンプル内で検出するための方法に関し、該方法は、以下の工程を含む：
ａ）該患者由来サンプルから単離されたＤＮＡからアンプリコンを生成する工程であって、
ｉ）ＰＣＲプライマー対プール１はプライマー配列番号２３〜２８を含み、
ｉｉ）ＰＣＲプライマー対プール２はプライマー配列番号２９〜３２を含み、
ｉｉｉ）ＰＣＲプライマー対プール３はプライマー配列番号３３〜３８を含み、
ｉｖ）ＰＣＲプライマー対プール４はプライマー配列番号３９〜４４を含む、工程、
ｂ）工程ａ）でＰＣＲプライマー対プール１〜４から産生された全てのアンプリコンを、サンプルアンプリコンプールへと組み合わせ、該サンプルアンプリコンプール内で該アンプリコンに固有インデックス配列を付加してインデックス付きサンプルアンプリコンプールを生成し、任意で、異なる患者由来サンプルに由来する１つまたは複数の差次的なインデックス付きサンプルアンプリコンプールと、該インデックス付きサンプルアンプリコンプールとをさらに組み合わせ、すべてのインデックス付きサンプルアンプリコンを同時に配列決定する工程、
ｃ）配列番号４７〜５１に対する参照により、該配列決定されたインデックス付きサンプルアンプリコン内の突然変異を識別する工程、および
ｄ）工程ｃ）で識別される突然変異の存在または非存在により、患者由来プロファイルに存在するピロリ菌の薬剤耐性プロファイルを決定する工程。
【００１３】
さらなる実施形態では、本明細書に記載の任意のアンプリコンプールは、末端プライマーの１つをプール内の単一のアンプリコンに対してフォワード配列決定プライマーとして使用し、他の末端プライマーをリバース配列決定プライマーとしてそのアンプリコンに使用して、古典的なサンガー配列決定法によって配列決定することができる。あるいは、アンプリコンプール内の各個々のアンプリコンについてのそれぞれの所望の反応に特異的な固有配列決定プライマーを同じ目的のために使用することができる。このようにして、各アンプリコンを、アンプリコンプールから直接配列決定することができる。アンプリコンプールは、同じＦＦＰＥで抽出した生検サンプル由来の他のアンプリコンプールと組み合わせることも、組み合わせないことも可能であり、組み合わせたアンプリコンは、次世代配列決定（ＮＧＳ）の準備のためにアダプターおよびインデックスタグを付加することによって配列決定するために調製した。単一のＦＦＰＥ生検サンプル由来のタグ付けされたアンプリコンプールは、異なるＦＦＰＥ生検サンプル由来の差次的にタグ付けされたアンプリコンプール、およびハイスループットマルチプレックス配列決定法により直接配列決定された組み合わせられたサンプルアンプリコンプールと、さらに組み合わせられてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ピロリ菌ｒｄｘＡ遺伝子を示し、記載されたアンプリコンの相対配置を図示する。
【図２−１】図２は、説明および実施例で開示された個々のプライマーの表である。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【図２−４】同上。
【図３】すべてのｒｄｘＡ特異的プライマーをプールすると不正確なサイズのアンプリコンを生成するが、本明細書に記載された分離されたプライマープールは正しいサイズのアンプリコンを生成することを示す電気泳動ゲルである。
【図４】２３Ｓ ｒＲＮＡ１９４−Ｆおよび１７０Ｒ−Ｆを用いて配列決定された、２３Ｓ ｒＲＮＡの（ＦＦＰＥサンプル、ＦＦＰＥ＿ＫおよびＬにおける）２３Ｓ ｒＲＮＡクラリスロマイシン配列のアラインメントにおける代表的な突然変異を識別する。赤いボックスは２３Ｓ ｒＲＮＡ上の突然変異遺伝子座を示す。
【図５】分離的プーリング、および識別された薬剤耐性ピロリ菌に特徴的な６つの異なる遺伝子のそれぞれに突然変異を有するプールされたアンプリコンのストラテジーを用いて、１６個のＦＦＰＥサンプルからの次世代配列決定（ＮＧＳ）データによって分析された１６個のＦＦＰＥサンプルの要約データ表である。ＮＧＳによって同定された全ての突然変異は、サンガー配列決定によって確認された。
【図６】分離的プーリング、および識別された薬剤耐性ピロリ菌に特徴的な６つの異なる遺伝子のそれぞれに突然変異を有するプールされたアンプリコンのストラテジーを用いて、２４個のＦＦＰＥサンプルからのＮＧＳデータによって分析された２４個のＦＦＰＥサンプルの要約データ表である。データ表は、ＮＧＳによって同定された遺伝子突然変異およびその突然変異頻度を列挙する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は、ＦＦＰＥ生検サンプル中に存在する微量ＤＮＡ配列を増幅するための方法および組成物を提供する。これらの方法および組成物は、ＦＦＰＥ胃生検サンプルからのピロリ菌の薬剤耐性および多剤耐性プロファイルの存在を決定し、それらを特徴付けるために有用である。
【００１６】
本明細書に記載の方法および組成物は、ＦＦＰＥ生検サンプル中に存在する微量の細菌ＤＮＡからアンプリコンを生成することに関する。そのようなＤＮＡは特に損傷を受けやすく、損傷したＤＮＡのＰＣＲ増幅は、所望の配列が標的ＤＮＡから増幅されることを確実にする特別な工程を必要とする。これらの工程は、増幅反応から回収される各アンプリコンの長さの最小化、標的ＤＮＡ配列内の最適なプライマー配列の決定、および互いに干渉を避けるための、重複するアンプリコンおよびプライマーの戦略的プーリングを含む。分離的プーリング、と呼ばれるプロセス。ＤＮＡ完全性が比較的高いと推定され得る典型的なＰＣＲ増幅スキームにおいては、プライマー選択は、鋳型ＤＮＡがＦＦＰＥ由来ＤＮＡの場合のように架橋または塩基の付加体の存在によって損傷されることが知られている場合ほどには限定されない。さらに、典型的な生検サンプル中に見出される細菌ＤＮＡの絶対量は、宿主生物のＤＮＡよりも数桁低い。これは、増幅の標的となる配列がサンプル中の全ＤＮＡのうちの少数であり、そのような珍しいＤＮＡ配列から１つまたは複数のアンプリコンを首尾よく増幅するためには、最適なプライマーおよび標的ＤＮＡの最も効率的な使用が可能であることが必要であることを意味する。さらに、商業的臨床検査室で一般的に有用であるためには、このような方法は確立された技術および試薬と互換性があり、確立された技術および試薬を可能な限り使用するべきである。
【００１７】
Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐ  ＤＳＰ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号６０４０４）を使用して、製造元の指示に従って、ＦＦＰＥ胃生検サンプルから全ＤＮＡを抽出した。簡単に説明すると、単一のＦＦＰＥ生検サンプルの５μｍの厚さの５つの切片を単一チューブに入れ、キシレンで脱パラフィンし、プロテアーゼＫを用いて６５℃で１時間処理して細胞を脱パラフィンしたサンプル中で溶解させ、細胞構造を脱架橋しかつプロテイナーゼＫを変性させるために９０℃でさらに１時間インキュベートした。脱パラフィンし溶解したサンプルを、製造業者の推奨手順に従ってＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８００４）に適用して室温に冷却する。ＭｉｎｉＥｌｕｔｅカラムを２回洗浄し、溶出緩衝液でカラムから回収したＦＦＰＥ生検サンプルからＤＮＡを回収する。回収したＤＮＡをＱｕｂｉｔ２．０蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量し、ＤＮＡ純度をＮａｎｏｄｒｏｐ装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。
【００１８】
各生検サンプルからの全ＤＮＡサンプル中のピロリ菌配列の存在を確認するために、ピロリ菌の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の特異的１２５塩基対断片の固有に高度に保存された領域のＰＣＲ増幅を、配列番号４５および４６のＰＣＲプライマーを用いて実施した。ＰＣＲ産物を精製し、配列決定し、ＢＬＡＳＴ分析によってピロリ菌に特異的であることを確認した［Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｇｉｓｈ，Ｗ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９０）"Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ．"Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０］。適切な増幅産物（アンプリコン）が存在しないことは、使用可能なピロリ菌ＤＮＡがサンプル中に存在しないことを示した。
【００１９】
回収されたＤＮＡの品質を決定するために、１２５塩基対のピロリ菌特異的ＰＣＲアンプリコンを産生したサンプルをさらに調査した。ＰＣＲ増幅および配列決定のためにピロリ菌を含有するＦＦＰＥ胃生検サンプルから抽出されたＤＮＡの適合性を決定するために、多重ＰＣＲ適格性アッセイを開発した。この適格性アッセイは、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするヒトＧＡＰＤＨ遺伝子を、１００、２００、３００、４００、および５００塩基対断片のアンプリコンラダーを産生することができるＰＣＲプライマーセットでＰＣＲ増幅することを含む。大きな断片サイズかつ比較的高い濃度である有意な損傷を有さないＦＦＰＥ  ＤＮＡは、アンプリコンラダーの５つ全ての「段（ｒｕｎｇ）」を生成し、一方、高度に損傷し、有意に断片化されたＤＮＡは、予想されるアンプリコンのいずれも産生しない。この方法で培った経験を生かして、ＦＦＰＥ胃生検サンプルから回収されたＤＮＡを、この試験がアンプリコンラダーの２〜５バンドを産生する場合は良い、１バンドのみを産生する場合は普通、全くバンドが観察されない場合は悪い、と評価している。多数のＦＦＰＥ抽出生検サンプルにわたって観察されたアンプリコンバンド数の全体的な頻度は、分析用アンプリコンのサイズを約２００塩基対以下に制限することにより、可能な限り連続した配列を生成することと、鋳型ＤＮＡにおけるＰＣＲ増幅を終了させる損傷を避けることとの間の最良のバランスが得られることが示される。
【００２０】
新たに調製または凍結したピロリ菌染色体ＤＮＡ（陽性対照として）およびＦＦＰＥ胃生検サンプルから抽出したサンプル（実験サンプル）の両方を用いたＰＣＲ増幅反応を、１ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、１０ｍＭのｄＮＴＰミックス入りの、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭのＫＣｌおよび２５ｍＭのＭｇＣｌ２緩衝液中で行った。
【００２１】
サンガー配列決定法によって分析されたサンプルについては、図１のＰＣＲプライマー（配列番号１〜４４）を、以下の熱サイクルパラメータで示されるように使用した：９５℃で１０分間の初期変性、次に９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒、を３５サイクル、次に７２℃で１０分間の最終伸長。各増幅反応から得られたアンプリコンを、ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎカラムを用いて製造元の指示に従って精製した。
【００２２】
精製したアンプリコンを、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３３７４５５）を用いて製造元のプロトコールに従ってサンガー配列決定のために処理した。ＰＣＲ配列決定反応は、以下の熱パラメータを用いて実施した：９５℃で１分間、次に９５℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、６０℃で１分間、を２５サイクル。プライマー伸長反応は、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＣｌｅａｎＳＥＱキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号Ａ２９１５１）を用いて製造元の指示に従って処理した。ＡＢＩ  ３５００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でサンプルをロードし分析した。３５００シリーズデータ収集ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて生の配列データを収集し、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ｖ  ５．４ソフトウェア（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を用いて参照配列に対してアセンブルし、整列させた。
【００２３】
ＮＧＳ配列決定を目的とするサンプルの場合、イルミナオーバーハングアダプター配列を、図２（配列番号１〜４４）に列挙された遺伝子座特異的プライマー配列に付加する。フォワードオーバーハング配列（遺伝子座特異的フォワードプライマー配列の５’側に付加）は
2019514438.tif 000003
であり、リバースオーバーハング配列（遺伝子座特異的リバースプライマー配列の５’側に付加）は
2019514438.tif 000004
である。最初のラウンドのＰＣＲ増幅熱サイクルパラメータは、９５℃で１１分間の初期変性、その後、９５℃で３０秒、５９℃で１分、７２℃で１分、を３５サイクル、次に７２℃で１０分間の最終伸長である。第２段階のＰＣＲ反応（マルチプレックスインデックスアダプターの追加を含む）は、熱サイクルパラメータ：９８℃で３０秒、９８℃で２０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で４５秒、を１７サイクル、７２℃で５分間の最終伸長を含んだ。次に、ライブラリーを製造元の指示に従ってＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰキット（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号Ａ６３８８０）で処理し、必要に応じて希釈して、２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で定量し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ配列決定装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）にロードした。データ解析は、ＮｅｘｔＧＥＮｅ  Ｖ  ２．４．１．１ソフトウェア（ＳｏｆｔＧｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて行った。
【００２４】
本発明は、本発明の理解を助けるために記載されている以下の実施例で説明されるが、以下の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００２５】
実施例１
複数の遺伝子座からの薬剤耐性を特徴付けるための、ＰＣＲプライマーおよびアンプリコンの分離的プーリング
本発明の一態様では、薬剤耐性の異なる形態をコードする複数の遺伝子座は、標的遺伝子座のそれぞれをカバーする診断用アンプリコンを生成するために使用されるＰＣＲプライマーを分離することによって同時に特徴付けることができる。ピロリ菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の位置９２６〜９２８にまたがる１６８塩基対のアンプリコン（１６Ｓ ｒＲＮＡ １６８）を産生するための、配列番号１および２を含むＰＣＲプライマー対。これらの位置の事実上のあらゆる突然変異は、低レベルのテトラサイクリン耐性を生じさせるが、三重変異ＡＧＡ９２６〜９２８ＴＴＣは、テトラサイクリン耐性の非常に高いレベルと関連する。配列番号１１および１２を含む第２のプライマー対は、ピロリ菌１６Ｓ ｒＲＮＡの９２６〜９２８位をも包含する１６２塩基対のアンプリコン（１６Ｓ ｒＲＮＡ １６２）を産生する。配列番号３および４を含む別のＰＣＲプライマー対は、ピロリ菌の２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の２１４２位および２１４３位にまたがる１９４塩基対のアンプリコン（２３Ｓ ｒＲＮＡ １９４）を産生する。これらの位置の突然変異、特にＡ２１４２Ｇ、Ａ２１４２ＣおよびＡ２１４３Ｇ突然変異は、クラリスロマイシン耐性と関連している。配列番号１３および１４を含む第２のプライマー対は、ピロリ菌２３ ＳｒＲＮＡの２１４２位および２１４３位にもまたがる１７０塩基対のアンプリコン（２３Ｓ ｒＲＮＡ １７０）を産生する。配列番号５および６を含む別のＰＣＲプライマー対は、ｇｙｒＡ遺伝子によってコードされるピロリ菌ジャイレースのＡサブユニットのアミノ酸位置８７〜９１をコードする領域にまたがる１９３塩基対アンプリコン（ｇｙｒＡ １９３）を産生する。Ａｓｎ８７のＬｙｓまたはＴｙｒへの突然変異およびＡｓｐ９１のＧｌｙ、ＡｓｎまたはＴｙｒへの突然変異は、個々にまたは一緒に、フルオロキノン抗生物質に耐性を生じることが知られている。配列番号１５および１６を含む、ピロリ菌ｇｙｒＡ遺伝子のこの領域にまたがる第２のＰＣＲプライマー対は、１３９塩基対のアンプリコン（ｇｙｒＡ １３９）を産生する。配列番号１７および１８を含む、同じ領域にまたがる第３のＰＣＲプライマー対は、１３７塩基対アンプリコン（ｇｙｒＡ １３７）を産生する。配列番号７および８を含む別のＰＣＲプライマー対は、ピロリ菌ｐｂｐ１遺伝子のアミノ酸位置４１４をコードする配列を包含する１５９塩基対アンプリコン（ｐｂｐＡ １５９）を産生する。ペニシリン結合タンパク質１の位置４１４に通常見出されるセリンのアルギニンへの突然変異は、アモキシシリンおよび他のペニシリン抗生物質に対する耐性を生じる。別のＰＣＲプライマー対、配列番号１９および２０は、ピロリ菌ペニシリン結合タンパク質１の位置４１４をコードする配列をも包含する１４０塩基対のアンプリコン（ｐｂｐＡ １４０）を産生する。配列番号９および１０を含む別のＰＣＲプライマー対は、ＲＮＡポリメラーゼのβ／β’サブユニットをコードするピロリ菌ｒｐｏＢ遺伝子のコドン５２５〜５４５を包含する２２８塩基対アンプリコンを産生する。この領域内のコドンのいずれかの突然変異は、リファブチンおよび他のリファマイシン様抗生物質に対する耐性を与えることができる。配列番号２１および２２を含むＰＣＲプライマー対はまた、１６７塩基対でありかつｒｐｏＢ内の重要なコドンを包含するアンプリコン（ｒｐｏＢ−Ｒ−１６７）を産生する。
【００２６】
薬剤耐性突然変異を潜在的にコードする特定の遺伝子領域を標的とするＰＣＲプライマーの各対は、異なる遺伝子を標的とする一つまたは複数の固有のプライマー対を含有する別個のＰＣＲプライマー対プールに分離される。したがって、各プールのＰＣＲ増幅は、各プール内の複数の遺伝子に特異的なアンプリコンを産生し、プライマー二量体またはオーバーラッピングアンプリコン配列内の相同的対形成によって引き起こされるクロスペアアンプリコントランケーションのようなＰＣＲ増幅アーティファクトの可能性を最小にする。図２に示すように、プール５ＧＦは、ＰＣＲプライマー対、１６Ｓ ｒＲＮＡ １６８、２３Ｓ ｒＲＮＡ １９４、ｇｙｒＡ １９３、ｐｂｐＡ １５９およびｒｐｏＢ ２２８を含む。ＦＦＰＥ由来のピロリ菌標的ＤＮＡをこれらのプライマー対で増幅すると、１５９、１６８、１９３、１９４、および２２８塩基対の５つの固有のアンプリコンが産生される。
【００２７】
アンプリコンプール５ＧＲ（図２）は、ＰＣＲプライマー対、１６Ｓ ｒＲＮＡ １６２Ｒ、２３Ｓ ｒＲＮＡ １７０Ｒ、ｇｙｒＡ １３９Ｒ、ｇｙｒＡ １３７Ｒ、ｐｂｐＡ １４０およびｒｐｏＢ−Ｒ−１６７を含む。ＦＦＰＥ由来のピロリ菌標的ＤＮＡをこれらのプライマー対で増幅すると、８個ものアンプリコンが産生される。これらのうち４つは、１４０、１６２、１６７および１７０塩基対（それぞれｐｂｐＡ特異的アンプリコン、１６Ｓ ｒＲＮＡ特異的アンプリコン、ｒｐｏＢ特異的アンプリコンおよび２３Ｓ ｒＲＮＡ特異的アンプリコンに対応）の固有のアンプリコンである。残りの４つのアンプリコンは、プール５ＧＲに存在する２対のｇｙｒＡ特異的ＰＣＲプライマー対について順に並んだものを表す。これらのプライマー対は、４つの可能なアンプリコンが２対のプライマーから産生され得るように、同じ方向に互いに部分的に重複する。プライマーの部分的な重複は、同じ鎖の向き（方向）を有するプライマーに限定されるので、プライマー二量体形成のリスクはなく、プライマー間の増幅された配列は同一であるため（増幅された配列の絶対的な長さを除いて）、アンプリコン間のクロスハイブリダイゼーションは新しい配列を生成しないであろう。したがって、２対の半固有プライマーをアンプリコンプール内に収容することができる。この場合、これらのプライマーは、１３１、１３７、１３９、および１４５塩基対の４つもの相同なアンプリコンを産生することができる。これらのアンプリコンの配列は、より長いアンプリコンに存在する、短いアンプリコンの末端から欠けている少数の塩基対を除いて、他のアンプリコンのそれぞれの配列と端から端まで同一である。
【００２８】
配列決定されたアンプリコンの各々を整列させることにより、薬剤耐性を付与する突然変異の同定が可能になる。図４は、２つの独立したＦＦＰＥ由来サンプル（「Ｅ」および「Ｋ」）において同定された、２３Ｓ ｒＲＮＡにおけるＡ２１４２Ｇ突然変異の例であり、これらのサンプルが由来する患者を苦しめているピロリ菌株の治療はクラリスロマイシンに反応しそうもないことを示す。一番上の配列は、ピロリ菌の既知のクラリスロマイシン耐性株であり、対照のすぐ下の２つの配列は、サンプル「Ｅ」からの独立したＰＣＲアンプリコンであり、最後の２つの配列は、サンプル「Ｆ」からの独立したアンプリコンである。
【００２９】
実施例２
遺伝子の全コード配列の調査に由来する薬剤耐性を特徴付けるための、ＰＣＲプライマーおよびアンプリコンの分離的プーリング
本発明の別の態様において、分離されたＰＣＲプライマープールは、遺伝子全体の有効なカバレッジを可能にする。メトロニダゾールに対する耐性は、細菌の酸素非感受性（Ｉ型）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈニトロレダクターゼをコードするピロリ菌ｒｄｘＡ遺伝子における任意の機能喪失的変異の結果として生じ得る。メトロニダゾールはこの酵素の作用によって活性化され、したがって、この酵素をコードするｒｄｘＡ遺伝子内のあらゆるフレームシフトまたは点突然変異は、メトロニダゾールに対する耐性を付与する可能性がある。先に記載された実施形態とは異なり、単一の短いアンプリコンは、ピロリ菌に遭遇するメトロニダゾール耐性の既知の突然変異スペクトルを包含することはできない。この問題に対処するために、各系列内のプライマーが一緒にｒｄｘＡ遺伝子の全コード領域をカバーする短いアンプリコンを産生するように、オーバーラッピングアンプリコンを産生する２系列のＰＣＲプライマー対を設計した。２つの系列の間のプライマーは固有の位置に位置するが、いくつかはｒｄｘＡ遺伝子のコード配列内にあり、他の系列の類似のプライマーと比較して一方向のわずか数塩基だけずらされている（前のパラグラフで説明したアンプリコンプール５ＧＲ内の部分的に重複するｇｙｒＡプライマーと同様の様式で）。このストラテジーは、標的ＤＮＡ中に存在する単一の架橋または付加体がアンプリコンの産生を完全にブロックする機会を減少させる。１系列のＰＣＲプライマーによって産生されたアンプリコン由来の配列は、プライマープールの全セットからｒｄｘＡ遺伝子の完全なカバレッジが確実に達成されるように、他の一連のＰＣＲプライマーから産生されたアンプリコンで組み立てることができる。各系列のプライマーは、各系列の２つのアンプリコンプールのうちの１つに配置され、重複してもよく、プライマー二量体を形成しやすいプライマーから産生される系列内のアンプリコンは別個のプールに分離される。ピロリ菌ｒｄｘＡ遺伝子の場合、５つの短いアンプリコンのうち１つの系列は集合的にｒｄｘＡコード配列全体に及ぶ。５’から３’へのこれらの５つのアンプリコンは、ｒｄｘＡ １８８アンプリコン（ＰＣＲプライマー対配列番号２３および２４から産生）、ｒｄｘＡ−５−２−１６３アンプリコン（ＰＣＲプライマー対配列番号２９および３０から産生）、ｒｄｘＡ １５６アンプリコン（ＰＣＲプライマー対配列番号２５および２６から産生）、ｒｄｘＡ １８２アンプリコン（ＰＣＲプライマー対配列番号３１および３２から産生）、およびｒｄｘＡ １７７アンプリコン（ＰＣＲプライマー対配列番号２７および２８から産生）を含む。この系列内では、アンプリコンｒｄｘＡ １８８、ｒｄｘＡ １５６およびｒｄｘＡ １７７を産生するＰＣＲプライマー対を、ｒｄｘＡ−Ｆ１と称する単一のプールに入れ、一方、アンプリコンｒｄｘＡ−５−２−１６３およびｒｄｘＡ １８２を産生するＰＣＲプライマー対は、ｒｄｘＡ−Ｆ２と呼ばれる異なるプールに組み合わされる（図２）。別の系列では、ピロリ菌ｒｄｘＡ遺伝子全体に６つの短いアンプリコンが使用されている。５’から３’に配列されたこれらのアンプリコンは、ｒｄｘＡ−Ｒ−１５０アンプリコン（ＰＣＲプライマー���配列番号３３および３４から産生）、ｒｄｘＡ−Ｒ−１８７アンプリコン（ＰＣＲプライマー対配列番号３９および４０から産生）、ｒｄｘＡ−Ｒ−１６４アンプリコン（ＰＣＲプライマー対配列番号３５および３６から産生）、ｒｄｘＡ−Ｒ０１７４アンプリコン（ＰＣＲプライマー対配列番号４１および４２から産生）、ｒｄｘＡ−Ｒ−１７１アンプリコン（配列番号３７および３８のＰＣＲプライマー対から産生）、およびｒｄｘＡ−Ｒ−１８９アンプリコン（ＰＣＲプライマー対配列番号４３および４４から産生）を含む。この系列内で、アンプリコンｒｄｘＡ−Ｒ−１５０、ｒｄｘＡ−Ｒ−１６４およびｒｄｘＡ−Ｒ−１７１を産生するＰＣＲプライマー対を、ｒｄｘＡ−Ｒ１と称される一方のプールと組み合わせ、アンプリコンｒｄｘＡ−Ｒ−１８７、ｒｄｘＡ−Ｒ−１７４、およびｒｄｘＡ−Ｒ−１８９を産生するＰＣＲプライマー対を、ｒｄｘＡ−Ｒ２と称される異なるプールと組み合わせる（図２）。これらのＰＣＲプライマープールは、ＦＦＰＥ生検サンプルから抽出されたピロリ菌ＤＮＡからそれらの同族アンプリコンを生成するために使用される。アンプリコンをどのように配列決定するかに応じて、各ＰＣＲ反応からのアンプリコンをさらに組み合わせて、各系列が単一のアンプリコンプールによって表されるようにすることができる。
【００３０】
図３に示すように、適切な分離的プーリングは正しい（予測された）アンプリコンを産生するが、単一のプールに存在するときの同じプライマーは、誤ったアンプリコンおよびプライマー二量体からなる一連のＰＣＲ産物を産生する。２つのＦＦＰＥサンプル、「ＦＦＰＥ＿Ｃ」および「ＦＦＰＥ＿Ｅ」は記載のように処理され、ｒｄｘＡ遺伝子の分析のための標的ＤＮＡとして供された。（一番左端のレーンをレーン１として数えて）レーン６は、二本鎖ＤＮＡサイズマーカー（Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｕｓｅ  １００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ、Ｂｉｏｔｉｕｍ、Ｉｎｃ．）である。サイズマーカーは、サンプル特異的にプールされた増幅産物の各側に隣接している。「ＲＤＸ−Ａｌｌ」と表示されたレーン１および７は、上記ｒｄｘＡ遺伝子全体にわたるアンプリコンのすべてのＰＣＲプライマーを含有するＰＣＲ増幅反応の結果である。「Ｆ１」と記されたレーン（レーン２およびレーン８）は、ｒｄｘＡ １８８、ｒｄｘＡ １５６およびｒｄｘＡ １７７アンプリコンプライムを含むｒｄｘＡ−Ｆ１プールに対応し、両方のサンプルレーンは、予想通り１５０〜２００塩基対のアンプリコンを含有する。「Ｆ２」と記されたレーン（レーン３および９）は、ｒｄｘＡ−５−２−１６３およびｒｄｘＡ １８２アンプリコンプライマーを含むｒｄｘＡ−Ｆ２プールに対応し、両方のサンプルレーンは正しいサイズのアンプリコンを含有する。約６０塩基対のマイナーな産物も存在するが、このアンプリコンは、正しいアンプリコンの配列決定を妨害せず、所望のアンプリコンのうちの１つの中でまたはその間での内部組換え産物を表す可能性が高いことに留意されたい。「Ｒ１」（レーン４および１０）と記されたレーンは、ｒｄｘＡ−Ｒ−１５０、ｒｄｘＡ−Ｒ−１６４およびｒｄｘＡ−Ｒ−１７１アンプリコンプライマーを含むｒｄｘＡ−Ｒ１プールに対応し、所望のアンプリコンは、ゲル上で１５０〜約１７０塩基対でクラスター化される。「Ｒ２」と記されたレーン（レーン５および１１）は、ｒｄｘＡ−Ｒ−１８７、ｒｄｘＡ−Ｒ−１７４およびｒｄｘＡ−Ｒ−１８９アンプリコンプライマーを含むｒｄｘＡ−Ｒ２プールに対応し、適切なサイズのアンプリコンを産生する。
【００３１】
図５は、単一のＮＧＳ分析に基づいて、ＦＦＰＥサンプル由来の複数の分離株における薬剤耐性および多剤耐性の存在およびパターンを決定する方法の性能を示す。この場合、実施例１に記載されるように分析された５つの別個の遺伝子ならびに実施例２に記載のように分析されたｒｄｘＡ遺伝子が、各患者由来のＦＦＰＥ生検サンプル中のピロリ菌の潜在的耐性プロファイルを６つの薬剤のそれぞれについて概説する単一の報告書にまとめられている。
【００３２】
図６はまた、実施例１および２に記載のＮＧＳ分析に基づいて、ＦＦＰＥサンプル由来の複数の分離株における薬剤耐性および多剤耐性の存在およびパターンを決定する方法の性能を示す。この表には、各サンプル中に見出される遺伝子突然変異ならびに各突然変異の頻度が列挙されている。結果は、ＮＧＳ分析が、突然変異を有さないＦＦＰＥサンプルと突然変異を有するものとを区別できることを示す。例えば、２４サンプルのうち、１０サンプル（４２％）には変異がなかった（番号５、６、８、９、１３、１７、および２１〜２４）。しかしながら、結果はまた、ＮＧＳ分析が、１つのＦＦＰＥサンプル内の単一および複数の突然変異の両方を検出できることも示している。例えば、１４個のサンプル（５８％）は、少なくとも１つの遺伝子突然変異（番号１〜４、７、１０〜１２、１４〜１６、および１８〜２０）を有していた。これらの１４個のサンプルのうち、１１個のサンプルは単一の遺伝子（番号２、４、７、１１〜１２、１４〜１６、１８、１９、および２０）に突然変異を有し、３個のサンプルは複数の遺伝子（番号１、３、および１０）に突然変異を有していた。
【００３３】
単一の遺伝子変異を有するサンプルのうち、５個のサンプルはｇｙｒＡ遺伝子の突然変異のみを有し（番号２、４、１５、１８、および１９）、２個のサンプルはｒｄｘＡ遺伝子の突然変異のみを有し（番号７および２０）、４個のサンプルは２３Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の突然変異のみを有していた（番号１１、１２、１４、および１６）。ｇｙｒＡ突然変異のみを有するサンプルのうち、サンプルの１つは、ｇｙｒＡ遺伝子に２つの突然変異を有していた（Ｎｏ．１９）。上記のように、ｇｙｒＡ遺伝子変異の存在は、フルオロキノン抗生物質耐性を示す。ｒｄｘＡ遺伝子突然変異のみを有するサンプルのうち、サンプルの１つはｒｄｘＡ遺伝子内に２つの突然変異を有していた（Ｎｏ．７）。上記のように、ｒｄｘＡ遺伝子突然変異の存在は、メトロニダゾールに対する耐性を示す。
【００３４】
複数の突然変異を有する３個のサンプルは、２３Ｓ ｒＲＮＡおよびｇｙｒＡの両方（番号１および３）、ならびにｇｙｒＡおよびｒｄｘＡの両方（番号１０）に突然変異を有していた。同時発生している２３Ｓ ｒＲＮＡおよびｇｙｒＡ突然変異は、クラリスロマイシンおよびフルオロキノン抗生物質耐性の両方を示し、一方、同時発生しているｇｙｒＡおよびｒｄｘＡ突然変異は、フルオロキノン抗生物質耐性およびメトロニダゾール耐性の両方を示す。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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