(57)【要約】  本発明は、子宮内膜がんの診断又は予後の方法を提供し、この方法は、女性生殖器から得る子宮吸引液試料中のＭＭＰ９の発現レベルを判定することを含む。本発明は更に、疾患の診断のためのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
女性生殖器から得られる子宮吸引液試料中のＭＭＰ９の発現レベルを判定することを含む、子宮内膜がんの診断又は予後判定の方法。
【請求項２】
以下のタンパク質：ＫＰＹＭ、ＥＮＯＡ、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、ＧＳＴＰ１、ＣＡＰＧ、ＣＡＤＨ１、ＨＳＰＢ１、ＰＤＩＡ１、ＬＤＨＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＡＳＰ３、ＦＡＢＰ５、ＴＰＩＳ、ＬＤＨＡ、ＣＴＮＢ１、ＣＨ１０、ＮＡＭＰＴ、及びＡＮＸＡ２の１以上の発現レベルを判定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＫＰＹＭ、ＥＮＯＡ、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、ＧＳＴＰ１、ＣＡＰＧ、ＣＡＤＨ１、ＨＳＰＢ１、ＰＤＩＡ１、ＬＤＨＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＡＳＰ３、ＦＡＢＰ５、ＴＰＩＳ、ＬＤＨＡ、ＣＴＮＢ１、ＣＨ１０、ＮＡＭＰＴ、及びＡＮＸＡ２からなる群から選択される１つのタンパク質の発現レベルを判定することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現レベルがタンパク質のレベルで判定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質の前記発現レベルが、前記タンパク質に結合することができる抗体又はその断片を用いて判定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体又はその断片ｏがキットの一部を形成する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
単離された前記試料が子宮体液である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
女性生殖器から得られる子宮吸引液試料において、子宮内膜がんを診断又は予後判定するための、インビトロマーカーとしてのＭＭＰ９の使用。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法において子宮内膜がんを診断又は予後判定するための、ＭＭＰ９の使用。
【請求項１０】
固体支持体と、ＫＰＹＭ、ＥＮＯＡ、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、ＧＳＴＰ１、ＣＡＰＧ、ＣＡＤＨ１、ＨＳＰＢ１、ＰＤＩＡ１、ＬＤＨＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＡＳＰ３、ＦＡＢＰ５、ＴＰＩＳ、ＬＤＨＡ、ＣＴＮＢ１、ＣＨ１０、ＮＡＭＰＴ、及びＡＮＸＡ２からなる群から選択される１以上のタンパク質並びにＭＭＰ９の発現レベルを検出するための手段と、を含む、キット。
【請求項１１】
ＫＰＹＭ、ＥＮＯＡ、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、ＧＳＴＰ１、ＣＡＰＧ、ＣＡＤＨ１、ＨＳＰＢ１、ＰＤＩＡ１、ＬＤＨＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＡＳＰ３、ＦＡＢＰ５、ＴＰＩＳ、ＬＤＨＡ、ＣＴＮＢ１、ＣＨ１０、ＮＡＭＰＴ、及びＡＮＸＡ２からなる群から選択される１つのタンパク質並びにＭＭＰ９の前記発現レベルを判定するための手段を更に含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記タンパク質の前記発現レベルを検出するための手段が抗体又はその断片である、請求項１０〜１１のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１６年５月４日に出願された欧州特許出願公開第１６１６８３２８．９号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、子宮内膜癌（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）の診断及び予後に関する。
【背景技術】
【０００３】
子宮内膜がん（ｃａｎｃｅｒ）（ＥＣ）は、女性生殖器で最も頻繁に認められる侵襲性の腫瘍であり、先進国においては女性で４番目に多いがんであり、２０１５年に米国では５４，８７０例という診断数を占め、１０，１７０例は死亡が推定されている。今日、ＥＣの症例の７０％は、腫瘍が子宮内膜内に依然局在化しており、全５年生存率９６％と関連している疾患の初期の段階で診断されている。しかし、ＥＣ患者の３０％は、５年生存率の大幅な低下に関連する疾患の進行期にのみ診断されている。それは、子宮筋層浸潤及び／又はリンパ節の罹患が既に存在する場合、６７％に低下し、遠隔転移の場合は１８％に低下する。従って、早期診断の改善は、ＥＣを適切に管理し、疾患に関連する死亡率を減少させるための主要な問題である。
【０００４】
ＥＣ患者の早期発見は、ＥＣと診断される女性の９３％に存在する異常な膣の出血のような症状の存在によって支持される。しかし、他の多くの良性の疾患が同様の症状を引き起こす。良性の子宮内膜病変の患者とＥＣの患者の識別は、骨盤検査及び経膣超音波検査からなる長々しい診断プロセスの後、子宮内膜生検の確認用の組織病理学的検査を行った後にのみ達成される。この処置で使用される好ましい生検は、子宮吸引物及び／又はｐｉｐｅｌｌｅによる生検と呼ばれており、子宮腔内からの子宮内膜液の低侵襲吸引によって得られる。現在のところ、子宮吸引物の診断処置は細胞の物質の存在に頼っているため、このプロセスは残念なことに診断不全を伴い、関連する不適当なサンプリング率がそれぞれ８％及び１５％である。これは、閉経後の女性では１２％及び２２％まで増加する。これらの症例では、子宮鏡により誘導される生検を行うことが必要である。この場合、この侵襲的な技法が子宮穿孔、出血、及び他の臓器に及ぼし得る害を含む合併症のリスクの増加をもたらす。
【０００５】
これまで、ＥＣ腫瘍組織及び正常な子宮内膜に関し数多くの研究がなされたにもかかわらず、プロテオームに基づく診断アッセイの開発は依然として困難であった。診療所でのこれらの研究によってもたらされた結果の転換の欠如は、以下の２つの決定要因が占めている：ｉ）ＥＣバイオマーカーを作り出すための生体流体の研究が欠如していることである。研究の大部分は、組織及び／又は血清若しくは血漿に基づくものであった。しかし、血漿又は血清のバイオマーカーの探索は、有効なバイオマーカーの濃度が低く、タンパク質存在量が広いダイナミックレンジに亘るために非常に困難である。また、ｉｉ）バイオマーカーパイプラインの発見段階と検証段階との間の橋渡しとしての検証研究が欠如していることである。バイオマーカーを発見する実験には、生物学的変動性や含まれる試料が少数であることに起因した誤った発見が伴う。
【０００６】
従って、努力がなされたにもかかわらず、高い感度及び特異度を備える初期の子宮内膜がんの診断を可能にするバイオマーカーの必要性が依然として存在している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、子宮体液試料が、高い感度及び特異度を備える子宮内膜がんの診断のための適切な試料となるいくつかの堅牢なマーカーを含むことを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以下に示されるように、本発明者らは、子宮内膜がんに罹患している患者の子宮体液試料において示差的に発現される２７個のタンパク質を初めて同定することができた。驚くべきことに、２７種類のタンパク質は全て非常に高い感度と特異度を示し（下記の表１参照）、偽陽性又は偽陰性の診断リスクを最小限に抑える。
【０００９】
これらの知見は、血液／血清又は組織生検の代わりに疾患の診断のための生体試料として子宮体液試料を使用する扉を開く。有用な診断バイオマーカーは、疾患に罹患している患者と良性の症例との間の識別について改善しなければならないだけでなく、経済的に有益で、臨床的なシナリオにおいて有利なものにするべきである。ＥＣのための診断用バイオマーカーの場合、侵襲的生検の数及び診断コストの減少は非常に重要な値である。従って、現在の診断プロセスで既に実施されている低侵襲性の処置で得られる子宮体液試料のような入手しやすい生体流体における、本発明の目的であるバイオマーカーの同定は、疾患の早期診断での著しい前進を意味する。
【００１０】
それ故に、本発明は、子宮内膜がんの早期診断における大きな進歩を意味する。
【００１１】
従って、第１の態様において、本発明は、子宮内膜癌の診断又は予後判定の方法を提供し、この方法は、女性生殖器から得る単離された液体試料におけるＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、及びＧＴＲ１からなる群から選択される１以上のタンパク質の発現レベルを判定することを含む。
【００１２】
本発明の第１の態様のバイオマーカーが、がんと個別に及び集合的に関連付けられ、共通して改変されるがんの分子的な過程、例えば特に細胞運動、細胞死、及び生存との強い関連性を維持しているという結論に至ったことは、注目に値する。
【００１３】
従って、第２の態様において、本発明は、女性生殖器から得る単離された液体における子宮内膜癌の診断又は予後判定のためのインビトロマーカーとして、ＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、又はＧＴＲ１を使用することを提供する。また、この態様は、対象における１以上の子宮内膜がんマーカーを検出するための方法として公式化することもでき、（ａ）女性生殖器から液体試料体液試料を得ること、（ｂ）ＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、及びＧＴＲ１から選択される少なくとも１つの子宮内膜がんマーカーの量を試料中で検出することを含む。
【００１４】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の方法における子宮内膜癌の診断又は予後判定のため、ＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、及びＧＴＲ１の発現レベルを判定するための手段の使用を提供する。
【００１５】
重要なことに、本発明の目的であるタンパク質バイオマーカーは、免疫化学又はＥＬＩＳＡのような簡単且つ低コストの方法、即ち病院で広く利用可能なプラットフォームによって評価することができる。その結果、これらのタンパク質バイオマーカーは、健康システムのコストを低減したルーチンの臨床診断キットとして容易に実施することができる。更に、本発明によって提供されるバイオマーカーに基づく診断キットの試験は、診断の現在のプロセスを改善し、子宮吸引物で疾患の有用な診断情報又は予後情報を提供することができるようにする。
【００１６】
従って、第４の態様では、本発明は、固体支持体と、ＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、及びＧＴＲ１からなる群から選択される２以上のタンパク質の発現レベルを検出するための手段と、を含むキットを提供する。
【００１７】
更なる態様において、本発明は、子宮内膜癌に罹患していることが疑われる対象を同定するための方法を提供し、方法は、
ａ）対象の女性生殖器から得る液体試料におけるＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、及びＧＴＲ１からなる群から選択される１以上のタンパク質の発現レベルをインビトロで判定すること、並びに
ｂ）ステップ（ａ）のレベルを基準対照レベルと比較することであって、ステップ（ａ）で判定されたレベルが基準対照レベルよりも高い場合、それは対象が子宮内膜癌に罹患している疑いがあることを示すこと、
を含む。
【００１８】
更なる態様において、本発明は、子宮内膜癌に罹患している疑いがある対象の医療レジメンを開始するかどうかを決定又は推奨する方法であって、
ａ）対象の女性生殖器から得る液体試料におけるＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、及びＧＴＲ１からなる群から選択される１以上のタンパク質の発現レベルをインビトロで判定するステップ、並びに
ｂ）試験試料のタンパク質レベルが基準対照レベルよりも高い場合、子宮内膜癌と診断するか、対象が子宮内膜癌に罹患している疑いがあるかどうかを判定するステップ、
を含み、
ｉ）対象が子宮内膜癌に罹患していると診断された場合又は子宮内膜癌に罹患した疑いがある場合、医療レジメンの開始が推奨され、
ｉｉ）患者が子宮内膜癌に罹患していないと診断された場合、医師による患者の検査結果を考慮して任意選択にフォローアップを行う
方法を提供する。
【００１９】
試験試料のマーカーレベルを判定することにより、当業者は、試料中で検出されたレベルが疾患の進展（即ち、重症度）を反映し得るので、推奨できる最も適切な療法であるものを更に確立することができる。
【００２０】
更に、対象が子宮内膜癌に罹患しているかその疑いがあるために医療レジメンを開始しなければならないと決定された場合、本発明のマーカーを使用してレジメンがどれほど効率的であるかをモニタすることができ、マーカーの正常なレベルへの（即ち、がんのない対照の対象のレベルまで）低下又は回復は、患者が医療レジメンに好都合に反応し、従って当該のレジメンが有効であるということを示すことができ、マーカーのレベルが有意には変化しないか増加する場合、これはレジメンが有効ではないことを示すことができる。最後に、マーカーのレベルは、再発を制御するための治療の終了後に測定することができる。
【００２１】
従って、更なる態様において、本発明は、子宮内膜癌と既に診断されている患者における医療レジメンの有効性を判定する方法であって、
（ａ）医療レジメンの投与に先立ち、対象の女性生殖器から得る液体試料におけるＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、及びＧＴＲ１からなる群から選択される１以上のタンパク質の発現レベルをインビトロで測定するステップ、
（ｂ）医療レジメンの投与を開始したら、対象の女性生殖器から得る液体試料における当該のマーカーのレベルをインビトロで測定するステップ、並びに
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定されたレベルがステップ（ａ）で測定されたレベルよりも低い場合には、医療レジメンが子宮内膜癌の治療に有効であることを示すように、ステップ（ａ）及び（ｂ）で測定されたレベルを比較するステップ
を含む方法、あるいは
（ｉ）医療レジメンの投与を開始させたら対象の女性生殖器から得る液体試料におけるＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、及びＧＴＲ１からなる群から選択される１以上のタンパク質の発現レベルをインビトロで測定するステップ、並びに
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で測定されたレベルをマーカーの基準対照レベルと比較するステップ、
を含み、
ステップ（ｉ）で測定されたレベルが基準対照レベルほど高くない場合、それは、医療レジメンが子宮内膜癌の治療に有効であることを示す方法を提供する。
【００２２】
本発明のこの方法を用いて、治療の転帰（個々の症例又は連鎖におけるこれらの介入の効果、有効性、安全性、実用性等を判定するために、疾患との闘いで使用される管理及び手順の結果を評価すべく行われる評価）を判定することができる。
【００２３】
本発明者らはまた、以下に示すように、驚くべきことに、ＭＭＰ−９が、健常の対照と比較して、子宮内膜がん対象から得た子宮吸引物試料（「ｐｉｐｅｌｌｅによる生検検」、又は子宮内膜生検に含まれる液としても知られている）において、顕著に高く発現したことを見出した。
【００２４】
従って、更なる態様において、本発明者らは、
【００２５】
１．単離された子宮吸引物試料におけるＭＭＰ９の発現レベルを判定することを含む、子宮内膜癌の診断又は予後判定の方法；
【００２６】
２．子宮吸引液試料の子宮内膜癌を診断又は予後判定するためのインビトロマーカーとしてのＭＭＰ−９の使用；
【００２７】
３．子宮内膜癌に罹患している疑いがある対象を同定するための方法であって、
ａ）子宮吸引液試料のＭＭＰ９の発現レベルをインビトロで判定すること、及び
ｂ）ステップ（ａ）のレベルを基準対照レベルと比較することであって、ステップ（ａ）で判定されたレベルが基準対照レベルよりも高い場合、それは対象が子宮内膜癌に罹患している疑いがあることを示すことを含む方法；
【００２８】
４．子宮内膜癌に罹患している疑いがある対象の医療レジメンを開始するかどうかを決定又は推奨する方法であって、
ａ）子宮吸引液試料におけるＭＭＰ９の発現レベルをインビトロで判定するステップ、及び
ｂ）試験試料のタンパク質レベルが基準対照レベルよりも高い場合、子宮内膜癌と診断するか、対象が子宮内膜癌に罹患している疑いがあるかどうかを判定するステップ
を含み、
ｉ）対象が子宮内膜癌に罹患していると診断された場合又は子宮内膜癌に罹患している疑いがある場合、医療レジメンの開始が推奨され、
ｉｉ）患者が子宮内膜癌に罹患していないと診断された場合、医師による患者の検査結果を考慮して任意選択にフォローアップを行う
方法；並びに
【００２９】
５．子宮内膜癌と既に診断されている患者における医療レジメンの有効性を判定する方法であって、
（ａ）医療レジメンの投与に先立ち対象の女性生殖器から単離された子宮吸引液試料におけるＭＭＰ９の発現レベルをインビトロで判定するステップ、
（ｂ）医療レジメンの投与を開始したら、対象の女性生殖器から得る単離された子宮吸引液試料における当該のマーカーのレベルをインビトロで測定するステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）で測定されたレベルがステップ（ａ）で測定されたレベルよりも低い場合には、医療レジメンが子宮内膜癌の治療に有効であることを示すように、ステップ（ａ）及び（ｂ）で測定されたレベルを比較するステップ
を含む方法、あるいは
（ｉ）医療レジメンの投与を開始させたら対象の女性生殖器から得る単離された子宮吸引液試料におけるＭＭＰ９の発現レベルをインビトロで判定するステップ、及び
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で測定されたレベルをマーカーの基準対照レベルと比較するステップ
を含み、
ステップ（ｉ）で測定されたレベルが基準対照レベルほど高くない場合、それは、医療レジメンが子宮内膜癌の治療に有効であることを示す方法
を、提供する。
【００３０】
最後の態様において、本発明は、標的捕捉モードで質量分析を行うことにより、子宮内膜がんの潜在可能性のあるタンパク質マーカーを検証するためのワークフローを提供する。潜在可能性のある子宮内膜がんタンパク質マーカーのリストから、各タンパク質の少なくとも１つの代理ペプチドを、質量分析による検出可能性の基準及びアミノ酸配列の一意性に従って選択した。炭素及び窒素の安定な重同位体で標識されたアミノ酸を含むこれらのペプチドの変形を合成した。女性生殖器から得た液をトリプシンで個別にタンパク質分解し、等量の安定同位体標識合成ペプチド混合物を補充した。ハイブリッド高分解能質量分析計でハイフン化された高速液体クロマトグラフィーにより試料が分析され、それは（ａ）規定されたクロマトグラフィーの分離条件下における溶出時間と関連する、検出されるべきペプチドイオンのリストを含む取得方法を生成すること、（ｂ）四重極型分析器によって、列挙されたペプチドイオンの溶出時間ウィンドウ中に繰り返し単離することによって、質量分析を行うこと、（ｃ）単離されたペプチドイオンの衝突誘発断片化を実施すること、及び（ｄ）その後のペプチド断片イオンを高分解能分析器で分析することによってなされる。各ペプチドについて、対象の断片イオンのシグナルを抽出して、統合することができるペプチドの溶出プロファイルを構築した。内在性ペプチドに起因する領域の正規化を、それぞれの安定同位体標識ペプチドの領域で行った。本方法は、スペクトルマッチングによってペプチドの同一性を確認するステップを含む。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本願において本明細書で使用される全ての用語は、別段の記載がない限り、当技術分野で知られている通常の意味で理解されるものとする。本願で使用される特定の用語の他のより具体的な定義は、以下に述べるものであり、他の明確に規定された定義がより広い定義を付与しない限り、明細書及び特許請求の範囲全体で均等に適用することを意図する。
【００３２】
本発明は、女性生殖器液の子宮内膜癌の診断又は予後判定のための新規なバイオマーカーを提供する。
【００３３】
「診断」という用語は当業者に公知である。本明細書で使用される場合、「診断」は、対象において特定の医学的状態の合併症又はリスクを認識すること、疾患又は状態の性質の判定をすること、あるいは１つの疾患又は状態を別のものと区別することとして理解される。これは、考えられる疾患又は障害を判定又は特定しようとするプロセス、及びそのプロセスにより到達する意見の両方を示す。診断処置という意味での診断は、治療及び予後に関して医学的に判断できるようにしている別個の異なるカテゴリーに、個人の状態を分類する試みとみなすことができる。その後、診断上の意見は、疾患又は他の状態の観点から説明されることが多い。しかし、診断は多くの形をとり得る。存在を検出し、疾患、病変、機能不全、又は不能状態を識別することがあり得る。それは、管理又は予後のためカテゴリーに帰属させる試みである場合もある。それは、連続体の異常の程度又は分類上の異常の種類のいずれかを示す場合もある。
【００３４】
本発明の第１の態様のインビトロな診断方法は、（ａ）無症候性対象、（ｂ）子宮内膜癌に罹患している疑いがあると既に特定されている対象、（ｃ）相補的な確定診断アッセイのときに子宮内膜癌と既に診断されている対象、又は（ｄ）疾患に罹患する危険性の高い対象の試料を用いて実施することができる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「予後・予後判定」は、疾患の起こり得る進行及び転帰の予測を示す。それは、新生物の類別（増加する退形成が新生物の攻撃性と相関するとき、新生物における細胞の分化のレベルを反復可能な言葉で表現しようとする試み）、新生物の病期分類（患者における新生物の程度を反復可能な形で表現しようとする試み）を含む。
【００３６】
「女性生殖器から得る液体試料」という用語は、女性生殖器の一部を形成する子宮器官により産生され、真空化吸引（即ち、「吸引試料」）等の吸引によって採取された液体を示す。本発明によれば、液体の吸引は、食塩水注入の前段階なしで行われる。即ち、「吸引物」という用語は、子宮を洗うことで生じる試料を包含しない。
【００３７】
本発明の第１の態様の方法の別の実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、方法は、（ａ）インビトロで、試験試料においてＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、及びＧＴＲ１からなる群から選択される１以上のタンパク質の発現レベルを測定すること、並びに（ｂ）検証されるタンパク質それぞれの発現レベルを基準の対照値と比較することを含む。本発明の第１の態様の方法の別の実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、方法は、（ａ）インビトロで、試験試料においてＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、及びＧＴＲ１からなる群から選択される１以上のタンパク質の発現レベルを測定すること、並びに（ｂ）検証されるタンパク質それぞれの発現レベルを基準の対照値と比較することを含み、タンパク質が過剰発現される場合、それは子宮内膜癌又は予後不良を示す。
【００３８】
本発明において、本発明の第１及び第２の態様の方法において言及している「基準対照レベル」という用語は、所与の分子マーカーの所定の値として理解されるべきであり、本件においては、第１の態様又は第２の態様及び特定の実施形態でいずれかのタンパク質が挙げられており、それは試料又は試料群中の当該の分子マーカーのレベルに由来している。発現レベルがタンパク質のレベルで判定される場合、「基準発現レベル」はタンパク質の量の所定の値であり、一方で発現レベルがｍＲＮＡのレベルで判定される場合、「基準発現レベル」はｍＲＮＡの量の所定の値である。試料は、疾患の存在、不在、段階、又は経過が先行して適切に進んでいる対象又は対象群から採取している。この値は、とりわけ疾患の段階、子宮内膜癌を発症するリスク、又はそれに罹患するリスクを判定するために、分析すべき状態が存在している対象と係る状態がない対象とを（即ち、子宮内膜がんを有している対象と子宮内膜がんではない対象とを）識別するための閾値として使用される。この基準対照レベルは、対象が医療レジメンを開始しなければならないかどうか、及びレジメンがどれほど有効であるかを判定するためにも有用である。「基準対照レベル」が得られる１人以上の対象としては、その状態が存在しない対象、その状態が存在する対象、又はその両方を挙げることができる。当業者は、一般知識を利用して、本発明の方法の各々に対する基準対照レベルを得るのにより適切な対象又は対象の群を選択することができる。選択された対象群から基準値を得る方法は、最新技術において周知である（Ｂｕｒｔｉｓ  Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｈａｐｔｅｒ１４，ｓｅｃｔｉｏｎ「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｖａｌｕｅｓ」）。特定の場合、「基準制御レベル」は、従来のＲＯＣ分析（受信者動作特性分析）によって定められるカットオフ値である。当業者が認識するように、最適なカットオフ値は、診断又は予後判定の方法の特定の用途、即ち、目的、診断又は予後の標的集団、特異度と感度の間のバランス等に従って定められる。
【００３９】
本発明の第１の態様の別の実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、本方法は、ＥＮＯＡ、ＫＰＹＭ、ＰＤＩＡ１、ＡＮＸＡ２、及びＦＡＢＰ５からなる群から選択される１以上のタンパク質の発現レベルを判定することを更に含む。
【００４０】
ＰＥＲＭは、ミエロペルオキシダーゼ又はＭＰＯとしても知られており、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ０５１６４、２０１４年２月１９日−ｖ４を有する。ＭＰＯは、細胞レベルでの炎症及び酸化ストレスにおいて重要な役割を果たす白血球によって放出されるタンパク質である。
【００４１】
カドヘリン−１又はＥ−カドヘリンとしても知られているＣＡＤＨ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ１２８３０、１９９３年７月１日−ｖ３を有する。このタンパク質は、細胞−細胞接着、上皮細胞の移動性及び増殖を調節する機構に関与している。有効な侵略的なサプレッサーの役割を担っている。
【００４２】
Ｋｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤１としても知られているＳＰＩＴ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｏ４３２７８、２００５年３月１５日−ｖ２を有する。このタンパク質は、ＨＧＦ活性化因子の阻害剤である。マトリプターゼの阻害剤としても作用する（ＳＴ１４）。
【００４３】
アルファ−エノラーゼとしても知られているＥＮＯＡは、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ０６７３３、２００７年１月２３日−ｖ２を有する。これは、解糖におけるその役割のみならず、増殖の制御や、低酸素耐性、アレルギー反応等の様々なプロセスにおいて役割を果たす多機能酵素である。また、白血球やニューロン等のいくつかの細胞型の細胞表面のプラスミノーゲンの受容体及び活性化因子として機能する能力に起因して、血管内及び細胞周囲の線維素溶解系で機能することができる。免疫グロブリンの産生を刺激する。
【００４４】
マトリックスメタロプロテイナーゼ−９としても知られているＭＭＰ９は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ１４７８０、２００９年１１月２４日−ｖ３を有する。このタンパク質は、細胞外マトリックスの局所的タンパク質分解及び白血球の移動において必須の役割を果たしている可能性がある。骨の破骨細胞再吸収において役割を果たしている可能性がある。ＫｉＳＳ１をＧｌｙ−｜−Ｌｅｕ結合で切断する。ＩＶ型及びＶ型コラーゲンを、大きなＣ末端の３／４断片及びそれより短いＮ末端の１／４断片に切断する。フィブロネクチンは分解するがラミニンやＰｚ−ペプチドは分解しない。
【００４５】
ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼとしても知られているＮＡＭＰＴは、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ４３４９０、１９９５年１１月１日−ｖ１を有する。この酵素は、哺乳動物ＮＡＤ生合成経路における律速性の構成要素であり、５−ホスホリボシル−１−ピロリン酸とのニコチンアミドの縮合を触媒して、ＮＡＤの生合成における中間体であるニコチンアミドモノヌクレオチドを生成する。
【００４６】
Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼＡ鎖としても知られているＬＤＨＡは、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ００３３８、２００７年１月２３日−ｖ２を有する。このタンパク質は、ピルビン酸から（Ｓ）−乳酸を合成するサブ経路のステップ１に関与している。
【００４７】
カスパーゼ−３としても知られているＣＡＳＰ３は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ４２５７４、２００５年１０月１１日−ｖ２を有する。これは、アポトーシスの遂行を司るカスパーゼの活性化カスケードに関与している。
【００４８】
ピルビン酸キナーゼＰＫＭとしても知られているＫＰＹＭは、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ１４６１８、２００７年１月２３日−ｖ４を有する。ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）からＡＤＰへのホスホリル基の転移を触媒し、ＡＴＰを生成し、腫瘍細胞のカスパーゼ非依存性細胞死において一般的な役割を果たす解糖酵素である。
【００４９】
ペルオキシレドキシン−１としても知られているＰＲＤＸ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｑ０６８３０、１９９４年６月１日−ｖ１を有する。それは、細胞のレドックスの調節に関与している。
【００５０】
オステオポンチンとしても知られているＯＳＴＰは、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ１０４５１、１９８９年７月１日−ｖ１を有する。これは、インターフェロン−ガンマ及びインターロイキン−１２の産生増強、並びにインターロイキン−１０の産生減少に関与しているサイトカインとして作用し、Ｉ型免疫を導く経路において必須である。
【００５１】
タンパク質ジスルフィド−イソメラーゼとしても知られているＰＤＩＡ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ０７２３７、１９９７年１１月１日−ｖ３を有する。それはジスルフィド結合の形成、破壊、及び再配列を触媒する。
【００５２】
マクロファージ遊走阻止因子としても知られているＭＩＦは、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ１４１７４、２００７年１月２３日−ｖ４を有する。それは、細菌性病原体に対する本来の免疫応答に関与している。
【００５３】
カテニンベータ−１としても知られているＣＴＮＢ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ３５２２２、１９９４年２月１日−ｖ１を有する。これは、中心体の凝集の負の調節因子として作用し、悪性の腎臓及び腸上皮細胞のアノイキスを阻止する。
【００５４】
ケラチン、ＩＩ型細胞骨格８としても知られているＫ２Ｃ８は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ０５７８７、２００７年１月２３日−ｖ７を有する。ＫＲＴ１９と一緒に、横紋筋のコスタメートルで収縮装置とジストロフィンを繋げるのに役立つ。
【００５５】
アネキシン−２としても知られているＡＮＸＡ２は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ０７３５５、２００７年１月２３日−ｖ２を有する。それは、カルシウムに対する親和性が陰イオン性リン脂質によって大きく増強されたカルシウム調節膜結合タンパク質である。それは、高親和性でカルシウムイオンに結合し、熱ストレス反応に関与している可能性がある。
【００５６】
マクロファージキャッピングタンパク質としても知られているＣＡＰＧは、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ４０１２１、２０１０年１１月３０日−ｖ２を有する。これは、アクチンフィラメントの有棘末端を可逆的にブロックするが、予め形成されたアクチンフィラメントを切断しないカルシウム感受性タンパク質である。マクロファージの機能において重要な役割を果たしている可能性がある。
【００５７】
脂肪酸結合タンパク質（表皮）としても知られているＦＡＢＰ５は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｑ０１４６９、２００７年１月２３日−ｖ３を有する。それは脂肪酸に対する高い特異度を示し、ケラチノサイトの分化に関与している可能性がある。
【００５８】
ムチン−１としても知られているＭＵＣ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ１５９４１、２０１０年５月１８日−ｖ３を有する。このアルファサブユニットは細胞接着特性を有する。これは、接着性及び接着防止性の両方のタンパク質として作用することができる。細菌及び酵素の攻撃に対して上皮細胞に保護層をもたらすことができる。
【００５９】
カルシフォシンとしても知られているＣＡＹＰ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｑ１３９３８、１９９７年１１月１日−ｖ１を有する。それは、細胞のシグナル伝達事象において役割を果たし得るカルシウム結合タンパク質である。
【００６０】
エキスポーチン−２としても知られているＸＰＯ２は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ５５０６０、２００５年３月２９日−ｖ３を有する。とりわけ、このタンパク質は、インポーチン−アルファ用の受容体を搬出したり、移入基質（カーゴ）後に核から細胞質へのインポーチンアルファの再搬出を仲介したり、活性ＧＴＰ結合型でインポーチン−アルファ及びＧＴＰａｓｅ  Ｒａｎと協同するよう結合したりするものとして開示されてきた。
【００６１】
好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリンとしても知られているＮＧＡＬは、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ８０１８８、１９９５年１１月１日−ｖ２を有する。これは、インターロイキン３（ＩＬ３）欠乏及び先天性免疫に起因するアポトーシスに関与している。
【００６２】
マンマグロビン−Ｂとしても知られているＳＧ２Ａ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｏ７５５５６、１９９８年１１月１日−ｖ１を有する。それは、アンドロゲン及び他のステロイドに結合し得る。
【００６３】
アネキシン−１としても知られているＡＮＸＡ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ０４０８３、２００７年１月２３日ｖ２を有する。とりわけ、先天性免疫応答において重要な役割を果たし、炎症過程を調節し、抗炎症活性を有し、炎症の解決及び創傷の治癒を促進するものとして開示されてきた。
【００６４】
熱ショックタンパク質ベータ−１としても知られているＨＳＰＢ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ０４７９２、２００１年９月２６日−ｖ２を有する。それはストレス抵抗性及びアクチン組織に関与している。
【００６５】
高分子免疫グロブリン受容体としても知られているＰＩＧＲは、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ０１８３３、２００７年６月２６日−ｖ４を有する。この受容体は、上皮細胞の基底外側面でポリマーＩｇＡ及びＩｇＭに結合する。
【００６６】
１０ｋＤａ熱ショックタンパク質、ミトコンドリアとしても知られているＣＨ１０は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ６１６０４、２００７年１月２３日−ｖ２を有する。これは、ＣＰＮ６０と共に、ミトコンドリアタンパク質の生合成に不可欠である。ＣＰＮ６０にＭｇ−ＡＴＰの存在下で結合し、後者のＡＴＰａｓｅ活性を抑制する。
【００６７】
ＣＤ４４抗原としても知られているＣＤ４４は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ１６０７０、２０１０年１０月５日−ｖ３を有する。ＨＡに対する親和性を介して、場合によってはオステオポンチン、コラーゲン、及びマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）等の他のリガンドに対する親和性によっても、細胞−細胞及び細胞−マトリックスの相互作用を媒介する。
【００６８】
クロライド細胞内チャネルタンパク質１としても知られているＣＬＩＣ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｏ００２９９、２００７年１月２３日−ｖ４を有する。それは膜に挿入され、塩化物イオンチャネルを形成する。チャネルの活性はｐＨに依存する。膜の挿入はレドックスの調節がなされているように思われ、酸化条件下でのみ起こり得る。細胞周期の調節に関与している。
【００６９】
トリオースリン酸イソメラーゼとしても知られているＴＰＩＳは、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ６０１７４、２０１１年１０月１９日−ｖ３を有する。このタンパク質は、炭水化物生合成の一部である経路の糖新生に関与している。
【００７０】
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼＰとしても知られているＧＳＴＰ１は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ０９２１１、２００７年１月２３日−ｖ２を有する。それは、神経変性を防止するためにｐ２５／ｐ３５転座を介して負のＣＤＫ５活性を調節する。
【００７１】
ＧＴＲ１はＵｎｉｐｒｏｔデータベース受託番号Ｐ１１１６６、２００６年１０月３日−ｖ２を有する。それは促進的なグルコース輸送体である。このアイソフォームは、構成的又は基礎的なグルコース取り込みを司る可能性がある。これは、非常に広い基質特異性を有する。ペントースとヘキソースの両方を含む広範囲のアルドースを輸送することができる。
【００７２】
本発明の第１の態様の方法の別の実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、方法は、（ａ）インビトロで、女性生殖器から得る単離された液体試料において、ＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、及びＧＴＲ１のタンパク質の第１の群から選択される１以上のタンパク質の発現レベル、並びにＥＮＯＡ、ＫＰＹＭ、ＰＤＩＡ１、ＡＮＸＡ２、及びＦＡＢＰ５からなる第２の群から選択される１以上のタンパク質の発現レベルを測定すること、並びに（ｂ）検証されるタンパク質それぞれの発現レベルを基準値と比較することを含み、タンパク質が過剰発現される場合、それは子宮内膜癌又は予後不良を示す。
【００７３】
本発明の第１の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、方法は、ＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、ＧＴＲ１、ＥＮＯＡ、ＫＰＹＭ、ＰＤＩＡ１、ＡＮＸＡ２、及びＦＡＢＰ５からなる群から選択される２つのタンパク質の発現レベルを判定することを含む。
【００７４】
本発明の第１の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、方法は、ＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、ＧＴＲ１、ＥＮＯＡ、ＫＰＹＭ、ＰＤＩＡ１、ＡＮＸＡ２、及びＦＡＢＰ５からなる群から選択される３つのタンパク質の発現レベルを判定することを含む。
【００７５】
本発明の第１の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、方法は、ＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、ＧＴＲ１、ＥＮＯＡ、ＫＰＹＭ、ＰＤＩＡ１、ＡＮＸＡ２、及びＦＡＢＰ５からなる群から選択される４つのタンパク質の発現レベルを判定することを含む。
【００７６】
本発明の第１の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、方法は、ＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、ＧＴＲ１、ＥＮＯＡ、ＫＰＹＭ、ＰＤＩＡ１、ＡＮＸＡ２、及びＦＡＢＰ５からなる群から選択される５つのタンパク質の発現レベルを判定することを含む。
【００７７】
本発明の第１の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、方法は、ＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、ＧＴＲ１、ＥＮＯＡ、ＫＰＹＭ、ＰＤＩＡ１、ＡＮＸＡ２、及びＦＡＢＰ５からなる群から選択される６つのタンパク質の発現レベルを判定することを含む。
【００７８】
本発明の第１の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、方法は、ＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、ＧＴＲ１、ＥＮＯＡ、ＫＰＹＭ、ＰＤＩＡ１、ＡＮＸＡ２、及びＦＡＢＰ５からなる群から選択される７つのタンパク質の発現レベルを判定することを含む。
【００７９】
本発明の第１の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、方法は、ＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、ＧＴＲ１、ＥＮＯＡ、ＫＰＹＭ、ＰＤＩＡ１、ＡＮＸＡ２、及びＦＡＢＰ５からなる群から選択される８つのタンパク質の発現レベルを判定することを含む。
【００８０】
本発明の第１の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、方法は、ＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、ＧＴＲ１、ＥＮＯＡ、ＫＰＹＭ、ＰＤＩＡ１、ＡＮＸＡ２、及びＦＡＢＰ５からなる群から選択される９つのタンパク質の発現レベルを判定することを含む。
【００８１】
本発明の第１の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、方法は、ＰＥＲＭ、ＯＳＴＰ、ＣＴＮＢ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、Ｋ２Ｃ８、ＣＡＰＧ、ＭＵＣ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、ＧＴＲ１、ＥＮＯＡ、ＫＰＹＭ、ＰＤＩＡ１、ＡＮＸＡ２、及びＦＡＢＰ５からなる群から選択される１０のタンパク質の発現レベルを判定することを含む。
【００８２】
本発明の第１の態様の別の実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、本方法は、以下のＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ、及びＣＡＤＨ１のマーカーの２以上の発現レベルを判定することを含む。
【００８３】
本発明の第１の態様の１つの実施形態では、上記又は下記で提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、本方法は、以下のマーカー群の１つの発現レベルを判定することを含む：ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ；ＭＭＰ９、ＰＥＲＭ；ＭＭＰ９、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ；ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ；ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ；ＬＤＨＡ、ＳＰＩＴ１；ＬＤＨＡ、ＮＡＭＰＴ；ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ；ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１；ＫＰＹＭ、ＮＡＭＰＴ；ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；及びＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ。
【００８４】
本発明の第１の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、本方法は、以下のマーカー群の１つの発現レベルを判定することを含む：ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ；ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１；ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＮＡＭＰＴ；ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；ＬＤＨＡ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；及びＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ。
【００８５】
本発明の第１の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、本方法は、以下のマーカー群の１つの発現レベルを判定することを含む：ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；及びＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ。
【００８６】
本発明の第１の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、本方法は、以下のマーカー群の１つの発現レベルを判定することを含む：ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；及びＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ。
【００８７】
本発明の第１の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、本方法は、ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ、及びＣＡＤＨ１の発現レベルを判定することを含む。
【００８８】
以下で伝えるように、ＭＭＰ９の発現レベルが子宮吸引物において判定される場合、正確な診断／予後の情報（約０．８９〜０．９０のＡＵＣ値）が達成される。
【００８９】
ＥＣバイオマーカーとしてのＭＭＰ９の堅牢性を改善する試みにおいて、本発明者らは、ＭＭＰ９検出を、以下のタンパク質ＫＰＹＭ、ＥＮＯＡ、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、ＧＳＴＰ１、ＣＡＰＧ、ＣＡＤＨ１、ＨＳＰＢ１、ＰＤＩＡ１、ＬＤＨＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＡＳＰ３、ＦＡＢＰ５、ＴＰＩＳ、ＬＤＨＡ、ＣＴＮＢ１、ＣＨ１０、ＮＡＭＰＴ、及びＡＮＸＡ２の１以上の検出と組み合わせたときに、感度の実質的な改善が達成され、約０．９６までのＡＵＣ値に到達したということを、驚くべきことに見出した。この知見は、ＭＭＰ９を他のタンパク質と組み合わせたとき、ＭＭＰ９単独で提供されるものと比較して、その組み合わせから生じるＡＵＣが影響を受けないか、悪化したため、驚くべきものであった。
【００９０】
従って、上記又は下記の本発明によって提供される方法及び使用のいずれかの一実施形態では、ＭＭＰ９、並びにＫＰＹＭ、ＥＮＯＡ、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、ＧＳＴＰ１、ＣＡＰＧ、ＣＡＤＨ１、ＨＳＰＢ１、ＰＤＩＡ１、ＬＤＨＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＡＳＰ３、ＦＡＢＰ５、ＴＰＩＳ、ＬＤＨＡ、ＣＴＮＢ１、ＣＨ１０、ＮＡＭＰＴ、及びＡＮＸＡ２からなる群から選択される１以上のタンパク質の量が判定される。
【００９１】
上記又は下記の本発明によって提供される方法及び使用のいずれかの別の実施形態では、ＫＰＹＭ、ＥＮＯＡ、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、ＧＳＴＰ１、ＣＡＰＧ、ＣＡＤＨ１、ＨＳＰＢ１、ＰＤＩＡ１、ＬＤＨＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＡＳＰ３、ＦＡＢＰ５、ＴＰＩＳ、ＬＤＨＡ、ＣＴＮＢ１、ＣＨ１０、ＮＡＭＰＴ、及びＡＮＸＡ２からなる群から選択される１つのタンパク質を伴うＭＭＰ９の量が判定される。
【００９２】
上記又は下記の本発明によって提供される方法及び使用のいずれかの別の実施形態では、ＫＰＹＭ、ＥＮＯＡ、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、ＧＳＴＰ１、ＣＡＰＧ、ＣＡＤＨ１、ＨＳＰＢ１、ＰＤＩＡ１、ＬＤＨＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＡＳＰ３、ＦＡＢＰ５、ＴＰＩＳ、ＬＤＨＡ、ＣＴＮＢ１、ＣＨ１０、ＮＡＭＰＴ、及びＡＮＸＡ２からなる群から選択される２つのタンパク質を伴うＭＭＰ９の量が判定される。
【００９３】
上記又は下記の本発明によって提供される方法のいずれかの別の実施形態では、ＫＰＹＭ、ＥＮＯＡ、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、ＧＳＴＰ１、ＣＡＰＧ、ＣＡＤＨ１、ＨＳＰＢ１、ＰＤＩＡ１、ＬＤＨＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＡＳＰ３、ＦＡＢＰ５、ＴＰＩＳ、ＬＤＨＡ、ＣＴＮＢ１、ＣＨ１０、ＮＡＭＰＴ、及びＡＮＸＡ２からなる群から選択される３つのタンパク質を伴うＭＭＰ９の量が判定される。
【００９４】
上記又は下記の本発明によって提供される方法のいずれかの別の実施形態では、ＫＰＹＭ、ＥＮＯＡ、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、ＧＳＴＰ１、ＣＡＰＧ、ＣＡＤＨ１、ＨＳＰＢ１、ＰＤＩＡ１、ＬＤＨＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＡＳＰ３、ＦＡＢＰ５、ＴＰＩＳ、ＬＤＨＡ、ＣＴＮＢ１、ＣＨ１０、ＮＡＭＰＴ、及びＡＮＸＡ２からなる群から選択される４つのタンパク質を伴うＭＭＰ９の量が判定される。
【００９５】
上記又は下記の本発明によって提供される方法のいずれかの別の実施形態では、ＫＰＹＭ、ＥＮＯＡ、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、ＧＳＴＰ１、ＣＡＰＧ、ＣＡＤＨ１、ＨＳＰＢ１、ＰＤＩＡ１、ＬＤＨＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＡＳＰ３、ＦＡＢＰ５、ＴＰＩＳ、ＬＤＨＡ、ＣＴＮＢ１、ＣＨ１０、ＮＡＭＰＴ、及びＡＮＸＡ２からなる群から選択される５つのタンパク質を伴うＭＭＰ９の量が判定される。
【００９６】
上記又は下記で提供される実施形態のいずれかにおいて、本発明の態様のいずれかについて、発現レベルはタンパク質レベルで判定される。この実施形態では、タンパク質マーカーは、ポリペプチド及びその誘導体の修飾された形態を含む、マーカーの天然配列ポリペプチド、アイソフォーム、キメラポリペプチド、全ての相同体、断片、及び前駆体を含むが、これに限定されない。
【００９７】
上記又は下記で提供される実施形態のいずれかにおいて、発現レベルは、免疫化学によって判定される。
【００９８】
本明細書で使用する場合、「免疫化学」という用語は、特異的に抗原に結合する抗体の原理を利用することによって、当該の抗原（通常はタンパク質及びペプチド、本件の場合は、単独又は組み合わせて上に列挙したタンパク質のいずれか）を試料において検出するための様々な技法を示す。抗体−抗原の相互作用を視覚化することは、いくつかの方法で達成することができる。最も一般的な例では、抗体が発色反応を触媒することができる酵素、例えばペルオキシダーゼに共役される。あるいは、抗体をフルオレセインやローダミン等のフルオロフォアにタグ付けすることもできる。免疫化学の技法は、直接的であっても間接的であってもよい。直接的な方法は、一段階染色法であり、抗原と直接反応する標識化させた抗体（例えば、ＦＩＴＣコンジュゲート抗血清）を含む。この技法は抗体を１つしか使用せず、そのため単純で迅速になされるが、間接的な方法等のシグナル増幅が少ないために感度が低く、間接的な方法ほど一般的には利用されていない。間接的な方法は、試料の標的抗原に結合する標識されていない一次抗体（第１の層）及び一次抗体と反応する標識された二次抗体（第２の層）に関与する。この方法は、二次抗体が蛍光又は酵素レポーターに共役されている場合、各一次抗体といくつかの二次抗体が結合していることに起因するシグナルの増幅のために、直接的な検出法よりも感度が高い。
【００９９】
二次抗体が、アビジン、ストレプトアビジン、又はニュートラアビジン酵素の複合体を動員することができるいくつかのビオチン分子に共役している場合、更なる増幅が達成できる。間接的な方法は、その感度が高いこと以外に、相対的に少数の標準共役（標識）二次抗体だけを生成する必要があるという利点も有する。直接的な方法では、対象の全ての抗原について各一次抗体を標識することが必要である。タグ化核酸プローブ（特定の標的核酸配列に特異的に結合するように設計されている）が後に、標識された抗体で検出され得る場合、免疫化学技術を用いて特定の核酸配列を検出することもできることを覚えておかねばならない。従って、タンパク質の検出は、標的タンパク質ＲＮＡの特定の配列に結合するように設計されたタグ化核酸を使用し、次いでタグに選択的に結合する標識抗体で当該のタグ化核酸を検出することによって行うことができる。
【０１００】
適切なイムノアッセイの処置には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノドットアッセイ、凝集アッセイ、抗体−抗原−抗体サンドイッチアッセイ、抗原−抗体−抗原サンドイッチアッセイ、免疫クロマトグラフィー、又は当業者に周知の他のイムノアッセイ形式が含まれる。
【０１０１】
一実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、タンパク質の発現レベルはイムノアッセイによって判定される。
【０１０２】
別の実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、タンパク質の発現レベルをＥＬＩＳＡによって判定する。
【０１０３】
あるいは、タンパク質の発現レベルは、生物発光、蛍光、化学発光、電気化学、又は質量分析によって判定することができる。
【０１０４】
別の実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、タンパク質の発現レベルは、標的タンパク質に結合することができる抗体又はその断片を用いて判定される。
【０１０５】
「標的タンパク質に結合することができる抗体又はその断片」という用語は、標的タンパク質に選択的に結合することができる任意の免疫グロブリン又はその断片として理解されるべきである。これには、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体が含まれる。「その断片」という用語は、標的タンパク質のエピトープに結合するのに適したサイズ及び立体配座を有する抗体の任意の部分を包含する。適切な断片には、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、及びＦｖが含まれる。「エピトープ」は、免疫系（Ｂ細胞、Ｔ細胞、又は抗体）によって認識される抗原の一部である。
【０１０６】
特異的検出に使用される抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。抗体の調製及び特徴付けについては最新技術の周知の手段がある。ポリクローナル抗体を生成するための方法は、先行技術において周知である。簡潔には、タンパク質について動物に免疫をもたせることによって、ポリクローナル抗体を調製し、その後、免疫を得た動物から血清を回収し、抗体を単離する。抗血清の産生のために広範囲の動物の種を使用することができる。典型的には、抗血清の産生に使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、又はヤギであり得る。
【０１０７】
更に、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、周知の技術を用いて調製することができる。典型的には、この処置は、疾患に関連するタンパク質について適切な動物に免疫をもたせることを含む。免疫をもたせる組成物は、抗体産生細胞を刺激するのに有効な量で投与することができる。モノクローナル抗体を調製するための方法は、一般に、ポリクローナル抗体の調製と同じラインに従って開始させる。免疫原は抗原として動物に注入される。抗原は、完全又は不完全フロイントアジュバント等のアジュバントと混合することができる。およそ２週間の間隔で、同じ抗原で免疫化を繰り返す。
【０１０８】
第３の態様の別の特定の実施形態において、本発明を実施する手段は、キットの一部を形成する。標的タンパク質を検出するための抗体又はその断片は、キットに含めることができる。キットは、抗体−タンパク質の相互作用を視覚化するための手段（添加剤、溶媒）を更に含むことができる。
【０１０９】
これらの抗体は、本発明の第５の態様における標的タンパク質の発現を判定するための「手段」として用いることができる。
【０１１０】
また、分析されるタンパク質（リストの２〜１０及び２、３、４、５、又は６つの特定のマーカーを含むタンパク質のセット）に関して、本発明の第１の態様において、上記で提供された全ての実施形態は、本発明の第３の態様の使用の特定の実施形態である。
【０１１１】
あるいは、発現レベルはｍＲＮＡレベルで判定される。
【０１１２】
一実施形態では、マーカーのそれぞれ１つのｍＲＮＡの量は、例えば、１つ以上のポリヌクレオチド子宮内膜がんマーカー又はそのようなポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって検出される。他の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、１つ以上のポリヌクレオチド子宮内膜がんマーカー又はそのようなポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用してハイブリダイゼーション技術を用いて検出される。
【０１１３】
ｍＲＮＡ検出を使用する場合、この方法は、単離されたｍＲＮＡを試薬と組み合わせて、当技術分野で周知の標準的な方法に従ってｃＤＮＡに変換し、変換されたｃＤＮＡを容器において（ｃＤＮＡ  ＰＣＲ反応試薬のような）増幅反応試薬で核酸プライマーの適切な混合物と共に処理し、容器の内容物を反応させて増幅産物を生成し、更に増幅産物を分析して、試料のポリヌクレオチド子宮内膜がんマーカーの１以上の存在を検出することによって実行できる。ｍＲＮＡについては、ノーザンブロット分析を用いて分析ステップを実施して、試料のポリヌクレオチド子宮内膜がんマーカーの存在を検出することができる。分析ステップは、増幅産物のポリヌクレオチド子宮内膜がんマーカーの存在を定量的に検出し、検出されたマーカーの量を、類似のプライマーを使用して得られる正常及び悪性の組織におけるこのようなマーカーの既知の有無に関する予想値のパネルと比較することによって、更に達成することができる。
【０１１４】
別の実施形態では、本発明は、（ａ）試料からｍＲＮＡを単離し、ｍＲＮＡを試薬と組み合わせてｃＤＮＡに変換すること、（ｂ）変換されたｃＤＮＡを、増幅反応試薬及びポリヌクレオチド子宮内膜がんマーカー、子宮内膜がんマーカーの１以上にハイブリダイズする核酸プライマーで処理して増幅産物を産生すること、（ｃ）タンパク質子宮内膜がんマーカーをコードして存在するｍＲＮＡの量を判定するための増幅産物を分析すること、並びに（ｄ）判定されたｍＲＮＡの量を、同様の方法を用いて得られた正常及び疾患組織（例えば、悪性組織）についての予想値のパネルに対して検出された量と比較することによってｍＲＮＡを検出する方法を提供する。
【０１１５】
本発明の特定の実施形態では、検出及び分析用のタンパク質子宮内膜がんマーカーのｍＲＮＡを増幅するために、ＲＴ−ＰＣＲを使用することができる。本発明の他の実施形態は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを用いてタンパク質子宮内膜がんマーカーのｍＲＮＡの量を定量的に判定する。本発明の更なる実施形態は、定量及び分析のためにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用する。
【０１１６】
第４の態様において、本発明はキットを提供する。
【０１１７】
本発明の第４の態様の一実施形態において、発現レベルを測定するための手段は、標的タンパク質に特異的に結合する抗体又はその断片である。
【０１１８】
キットに含まれる特異的抗体又はその断片の数は、検出されるタンパク質の数に依存する。これに関して、本発明の第１の態様の方法の先の実施形態は、子宮内膜癌の適切な診断を行うため又は予後のために判定されるいくつかのタンパク質セットを提供しており、これらのタンパク質セットは、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のタンパク質を含む。この情報から出発して、当業者は、各タンパク質の検出のために、既に述べたセットの１つを選択し、既に利用可能なものから、より適切な抗体又はその断片を選択することができる。適切な固体支持体での選択された抗体の取り込みは、日常的な方法を用いて実施することができる。
【０１１９】
第４の態様の１つの実施形態では、上記又は下記で提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、キットは、ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ、及びＣＡＤＨ１から選択される２以上のタンパク質の発現レベルを検出するための手段を含む。
【０１２０】
本発明の第４の態様の１つの実施形態では、上記又は下記で提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、キットは、以下のマーカー群の１つの発現レベルを判定するための手段を含む：ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ；ＭＭＰ９、ＰＥＲＭ；ＭＭＰ９、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＮＡＭＰＴ；ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ；ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ；ＬＤＨＡ、ＳＰＩＴ１；ＬＤＨＡ、ＮＡＭＰＴ；ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ；ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１；ＫＰＹＭ、ＮＡＭＰＴ；ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＧＳＴＰ１；ＭＭＰ９、ＨＳＰＢ１；及びＭＭＰ９、ＣＨ１０。
【０１２１】
本発明の第４の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、キットは、以下のマーカー群の１つの発現レベルを判定するための手段を含む：ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ；ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１；ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＮＡＭＰＴ；ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；ＬＤＨＡ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；及びＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ。
【０１２２】
本発明の第４の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、キットは、以下のマーカー群の１つの発現レベルを判定するための手段を含む：ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；及びＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ。
【０１２３】
本発明の第４の態様の１つの実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、キットは、以下のマーカー群の１つの発現レベルを判定するための手段を含む：ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；ＭＭＰ９、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ；及びＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ。
【０１２４】
第４の態様の別の実施形態では、上記又は下記に提供される実施形態のいずれかと任意選択に組み合わせて、キットは、ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＫＰＹＭ、ＰＥＲＭ、ＳＰＩＴ１、ＮＡＭＰＴ、及びＣＡＤＨ１の発現レベルを検出する手段を含む。
【０１２５】
上記で提供される本発明の第４の態様の実施形態のいずれかにおいて、キットは、任意選択に、ＥＮＯＡ、ＫＰＹＭ、ＰＤＩＡ１、ＡＮＸＡ２、及びＦＡＢＰ５から選択される１以上のタンパク質の発現レベルを検出するための手段を含むことができる。
【０１２６】
別の実施形態で、本発明は、固体支持体と、ＭＭＰ９並びにＫＰＹＭ、ＥＮＯＡ、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、ＧＳＴＰ１、ＣＡＰＧ、ＣＡＤＨ１、ＨＳＰＢ１、ＰＤＩＡ１、ＬＤＨＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＡＳＰ３、ＦＡＢＰ５、ＴＰＩＳ、ＬＤＨＡ、ＣＴＮＢ１、ＣＨ１０、ＮＡＭＰＴ、及びＡＮＸＡ２からなる群から選択される１以上のタンパク質の発現レベルを検出するための手段を含むキットを提供する。
【０１２７】
他の実施形態では、本発明は、ＭＭＰ９並びにＫＰＹＭ、ＥＮＯＡ、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、ＧＳＴＰ１、ＣＡＰＧ、ＣＡＤＨ１、ＨＳＰＢ１、ＰＤＩＡ１、ＬＤＨＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＡＳＰ３、ＦＡＢＰ５、ＴＰＩＳ、ＬＤＨＡ、ＣＴＮＢ１、ＣＨ１０、ＮＡＭＰＴ、及びＡＮＸＡ２からなる群から選択される１つのタンパク質の発現レベルを判定するための手段を含むキットを提供する。
【０１２８】
本発明の第４の態様の別の実施形態において、キットはＥＬＩＳＡキットである。この実施形態では、キットは、固体支持体と、上記で提供されたタンパク質の群のいずれかの発現レベルを判定するための手段とを含む。別の実施形態では、キットは、固体支持体、及び検出される標的タンパク質に特異的に結合する抗体又はその断片を含み、これらの抗体はシグナルを生成することができるレポーター分子と共役される。
【０１２９】
「固体支持体」は、ニトロセルロース膜、ガラス、又はポリマーを含む。最も一般的に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、ストリップ、チューブ、ビーズ、ディスク、若しくはマイクロプレート、又はイムノアッセイを実施するのに適した任意の他の表面の形態であり得る。
【０１３０】
本明細書において使用される場合、「レポーター分子」は、その化学的性質により、抗原結合抗体の検出を可能にする分析上同定可能なシグナルを提供する分子を意味する。検出は定性的でも定量的でもよい。このタイプのアッセイにおける最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォア、又は放射性核種含有分子（即ち、放射性同位体）のいずれかである。酵素イムノアッセイの場合、酵素は一般にグルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸塩を用いて第２の抗体に共役される。しかし、容易に認識されるように、当業者に容易に利用可能な様々な異なる結合技術が存在する。一般に使用される酵素としては、とりわけ西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びアルカリホスファターゼが挙げられる。特定の酵素と共に使用される基質は、一般に、対応する酵素による加水分解の際に検出可能な変色を生じるように選択される。例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムは、アルカリホスファターゼ共役体との使用に適している。ペルオキシダーゼ共役体については、１，２−フェニレンジアミン、５−アミノサリチル酸、３，３：５，５：テトラメチルベンジジン、又はトリジンが一般的に使用される。上記の発色基質ではなく蛍光産物を生じる蛍光発生基質を使用することも可能である。蛍光発生基質の例は、フルオレセイン及びローダミンである。特定の波長の光で照射することにより活性化されると、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子に励起状態を誘導し、その後光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色の光を放出する。免疫蛍光法及びＥＩＡ法はいずれも当技術分野において十分に確立されており、本方法にとって特に好ましい。しかし、他のレポーター分子、例えば放射性同位元素、化学発光、生物発光分子、並びに／又は色素及び他の発色物質も使用することができる。
【０１３１】
特定のレポーター分子共役抗体の選択は、大部分が、本発明の試験用キットの意図された使用及び使用者によって決定される。
【０１３２】
別の実施形態では、キットはマイクロアレイである。
【０１３３】
別の実施形態では、キットは、タンパク質子宮内膜がんマーカーをコードする遺伝子の規定された群を含むマイクロアレイである。子宮内膜疾患により発現が顕著に変化する２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のタンパク質を有するタンパク質の特定のセットについて上記で提供された全ての実施形態はまた、マイクロアレイの特定の実施形態である。
【０１３４】
本発明のインビトロの方法は、診断及び予後の情報を提供する。一実施形態では、本発明の方法は、（ｉ）診断又は予後の情報を収集するステップと、（ｉｉ）情報をデータキャリアで保存するステップと、を更に含む。
【０１３５】
本発明の意味において、「データキャリア」は、紙等の、子宮内膜癌の診断又は予後のための意味のある情報のデータを含む任意の手段として理解するべきである。キャリアはまた、予後のデータを移すことができる任意のエンティティ又はデバイスであってもよい。例えば、キャリアは、例えばＣＤ−ＲＯＭ又は半導体ＲＯＭなどの記憶媒体、あるいはフロッピーディスクやハードディスク等の磁気記録媒体を備えていてもよい。更に、キャリアは、電気信号又は光信号等の伝送可能なキャリアであってもよく、電気又は光ケーブルを介して、あるいは無線又は他の手段によって伝達されてもよい。予後のデータが、ケーブル又は他のデバイス若しくは手段によって直接伝達され得る信号に具体化される場合、そのキャリアは、そのようなケーブル又は他のデバイス若しくは手段によって構成され得る。他のキャリアは、ＵＳＢデバイス及びコンピュータアーカイブに関するものである。適切なデータキャリアの例は、紙、ＣＤ、ＵＳＢ、ＰＣ内のコンピュータアーカイブ、又は同じ情報を有する音声登録である。
【０１３６】
明細書及び特許請求の範囲を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語及びその単語の変形は、他の技術的特徴、添加物、構成要素、又はステップを排除することを意図しない。更に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語及びその変形は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語を包含する。本発明の更なる目的、利点、及び特徴は、説明を検討して当業者に明らかになるか、本発明を実施することにより習得されるであろう。以下の実施例は説明のために提供され、本発明を限定する意図はない。更に、本発明は、本明細書に記載の特定の好ましい実施形態のあらゆる可能な組み合わせを包含する。
【実施例】
【０１３７】
実施例１
【０１３８】
試薬
Ａｌｂｕｍｉｎ  ａｎｄ  ＩｇＧ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ＳｐｉｎＴｒａｐカラムを、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（カタログ番号２８−９４８０−２０）から購入した。Ｌｙｓ  ＣエンドプロテイナーゼＭＳグレードは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した（カタログ番号９００５１）。Ｗａｔｅｒｓから固相抽出カートリッジ、Ｓｅｐ  Ｐａｋ  ｔＣ１８、５０ｍｇを得た（カタログ番号ＷＡＴ０５４９６０）。全ての他の試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから得た。
【０１３９】
患者と試料の収集
２０１２年〜２０１５年にかけて、Ｖａｌｌ  ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ大学病院（スペイン、バルセロナ）で、本前向き試験に参加する合計３８人の患者（ＥＣに苛まれている２０人の女性と非ＥＣの対照１８人、即ちＥＣの症状を有するがＥＣと診断されなかった女性）が集められた。Ｖａｌｌ  ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ倫理委員会によって承認された同意説明文書に、全ての患者が署名した（承認番号：ＰＲ＿ＡＭＩ＿５０−２０１２）。
【０１４０】
手術前に臨床医の診療室又は手術室でＣｏｒｎｉｅｒ  Ｐｉｐｅｌｌｅ（Ｅｕｒｏｇｉｎｅ  Ｒｅｆ．０３０４０２００）を用いて吸引して子宮液の試料を収集し、１．５ｍｌのマイクロチューブに移した。リン酸緩衝液生理食塩水を１：１（ｖ／ｖ）の比で加え、２５００ｒｃｆで２０分間遠心分離して、可溶性画分（上清）を固体画分（ペレット）から分離した。分離した画分は、使用するまで−８０℃に保った。
【０１４１】
検証研究用の試料の調製
２０人のＥＣ患者及び１８人の非ＥＣ対照から得た子宮吸引物の上清を超音波処理して潜在性微小胞、タンパク質凝集体、及び／又は粘液を、５秒間に１００％の振幅で５サイクルで破壊した（Ｌａｂｓｏｎｉｃ  Ｍ）。次いで、製造者の指示に従ってＡｌｂｕｍｉｎ＆ＩｇＧ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｓｐｉｎ  Ｔｒａｐキットを使用して、アルブミン及び免疫グロブリンＧを５０μｌの上清試料から枯渇させた。全タンパク質濃度は、３回実施したＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定した。次いで３８試料の各々を２５μｇの２つのアリコートに分離して、全プロセスについて複製を生成したが、複製するには材料の量が不十分であった１つの試料を除いた。試料を重炭酸アンモニウムの５０ｍＭ溶液に希釈して１２０μｌの最終容量にし、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中に懸濁した１８５μｌの１０Ｍの尿素を添加することにより変性させ、２２℃で２０分間撹拌しながらインキュベートし、続いて超音波に浸して（Ｂｒａｎｓｏｎ５５１０）１０分間インキュベートした。次いで、試料を２００ｍＭジチオスレイトール７．８μｌで３７℃で６０分間還元し、２２℃で１２．２μｌの４００ｍＭヨードアセトアミドで暗所で３０分間アルキル化した。試料をＬｙｓ  Ｃ（プロテアーゼ／総タンパク質量比１／１５０；ｗ／ｗ）で３７℃で４時間消化した。その後、尿素の濃度を５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝液で１Ｍに希釈し、試料をトリプシン（プロテアーゼ／全タンパク質の量の比１／５０；ｗ／ｗ）で３７℃で一晩インキュベートした。トリプシンの活性を、１００μｌの溶液当たり１μｌの無水のギ酸の添加によりクエンチした。試料を重合成ペプチドの混合物でスパイクし、次いで固相抽出カートリッジ（Ｓｅｐ  Ｐａｋ  ｔＣ１８、５０ｍｇ、Ｗａｔｅｒｓ）に脱塩した。その後、溶離液を真空遠心分離機で蒸発乾固させ、次いでＬＣ−ＰＲＭ分析の前に０．１％ギ酸で再懸濁した。
【０１４２】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ  ＰＲＭの構成
ＬＣ  ＭＳのセットアップは、高圧バイナリグラジエント用に構成され、カラム切り替えモードで動作するＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ＲＳＬＣクロマトグラフィシステムからなる。移動相Ａは、水中の０．１％ギ酸からなり、相Ｂはアセトニトリル中の０．１％ギ酸に存し、装填相は水中の０．０５％トリフルオロ酢酸及び１％アセトニトリルに存した。２５０ｎｇの消化された各々の試料に相当するものを注入し、５μｌ／分でトラップカラム（７５μｍ×２ｃｍ、Ｃ１８  ＰｅｐＭａｐ１００、３μｍ）に装填し、分析カラム（７５μｍ×１５ｃｍ、Ｃ１８  ＰｅｐＭａｐ１００、２μｍ）に、３００ｎｌ／分で、４８分間で２％Ａ〜３５％Ｂで開始する線形勾配でさらに溶出した。ＭＳの分析は、ＰＲＭモードで操作されるハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計（Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ｐｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により行った。ＭＳサイクルは、７０，０００の分解能（２００ｍ／ｚ）で実行される完全ＭＳ１スキャンで開始され、２０の標準化された衝突エネルギーで、３５，０００の分解能（２００ｍ／ｚ）で獲得される、時間スケジュール化した標的化ＰＲＭスキャンが続いた。ＰＲＭ事象の四重極単離ウィンドウを１ｍ／ｚ単位に設定し、内因性ペプチド及び同位体標識ペプチドのそれぞれの対に関するスケジュールされた時間ウィンドウの持続時間を２分に設定した。
【０１４３】
統計分析
全ての分析は、ＳＰＳＳバージョン２０．０（ＩＢＭ、ＵＳＡ）及びＧｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ．６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＣＡ、米国）で行った。平均化された軽度／重度の面積比を複製の間で計算した。ピアソン相関係数を用いて、同じタンパク質のシグナチャのペプチド間の線形相関を計算した。Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖａ検定及びＳｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ検定によって評価された非正規分布のデータセットに起因して、腫瘍と対照試料との間のモニタされたペプチドの発現の比較を、ノンパラメトリックなＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定によって評価した。３を超える倍率変化を伴う０．０５を下回るＰ値が、統計的に有意であると考えられた。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を用いて、ＥＣ対非ＥＣ対照群の感度と特異度との間の関係を計算し、それによって各バイオマーカー候補の診断能力を評価した。
【０１４４】
結果
２０人のＥＣ患者と１８人の非ＥＣ対照との間の各バイオマーカー候補の発現を比較した。重要なことに、患者と対照の両方共、異常な膣の出血を患っている閉経後女性であり、ＥＣに罹患している患者の９３％がこれらの臨床的特徴を示していたが、その１５％のみが最終的にＥＣと診断されることになる。
【０１４５】
Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイに基づいて、アルブミン及びＩｇＧ枯渇後の全タンパク質濃度の２５０ｎｇを各試料に対して注入した。ＭＳ１スキャンの全イオンクロマトグラムの積分によって、試料間で注入された一定量のタンパク質が更に確認された。ＭＳデータのキュレーション後、ＭＳ２における９８個のモニタリングされたペプチドの相対レベル（軽／重比）を、腫瘍試料と対照試料との比較のためにＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定にかけた。３２のタンパク質に対応する５８のペプチドが、２群間でｐ値＜０．０５及び倍率変化１．５超で有意差を示した：ＰＥＲＭ、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＥＮＯＡ、ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＫＰＹＭ、ＰＲＤＸ１、ＯＳＴＰ、ＰＤＩＡ１、ＮＡＭＰＴ、ＭＩＦ、ＣＴＮＢ１、Ｋ２Ｃ８、ＡＮＸＡ２、ＣＡＰＧ、ＦＡＢＰ５、ＭＵＣ１、ＣＡＹＰ１、ＸＰＯ２、ＮＧＡＬ、ＳＧ２Ａ１、ＡＮＸＡ１、ＨＳＰＢ１、ＰＩＧＲ、ＣＨ１０、ＣＤ４４、ＣＬＩＣ１、ＴＰＩＳ、ＧＳＴＰ１、及びＧＴＲ１。これらのタンパク質は全て、対照試料と比較して、腫瘍試料で過剰発現していた。
【０１４６】
ＥＣ診断用のバイオマーカーとしてのそれらの有用性を更に評価するために、各バイオマーカーの感度及び特異度を判定するためのＲＯＣ分析を行った。興味深いことに、全てのタンパク質は、０．７１から０．９５の範囲の低侵襲性子宮吸引物でのＥＣの増加した可能性を規定するための優れた濃度曲線下面積（ＡＵＣ）値を達成した。１０種の最高の能力の個々のタンパク質は、全てが０．９より高いＡＵＣ値のＰＥＲＭ、ＣＡＤＨ１、ＳＰＩＴ１、ＥＮＯＡ、ＭＭＰ９、ＬＤＨＡ、ＣＡＳＰ３、ＫＰＹＭアイソフォームＭ１−Ｍ２、ＰＲＤＸ１、及びＯＳＴＰアイソフォームＡであった。
【０１４７】
【表１】
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【０１４８】
これらの結果により、これらのタンパク質が女性生殖器から得た単離された液体試料において非常に高い感度及び特異度を示すと結論づけられる。
【０１４９】
更に、これらのタンパク質とがんとの関連及び細胞内の位置に関するそれらの起源をよりよく理解するために、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）を使用する生物情報学の解析も実施した。予想されるように、データの統合は、これらのバイオマーカーに関連する主要な疾患としてがん、炎症性疾患、生命体の傷害及び異常、並びに生殖器系の疾患の同定をもたらした。これらのタンパク質に関わる分子機能と細胞機能の主要な５つには、細胞運動、細胞死と生存、細胞の発達、細胞の増殖、細胞間シグナル伝達と相互作用が含まれる。この全てが、がんにおいて変化する重要な過程である。これらのタンパク質は、主に細胞質、原形質膜、及び細胞外空間に見出され、それらが子宮内膜の上皮細胞及び炎症細胞の分泌から、又は近位組織における細胞の壊死から来ることを示す。これらの特徴は、女性生殖器に関連する近位体液中のＥＣを診断するためのバイオマーカーの使用を促進するために重要であった。
【０１５０】
実施例２
【０１５１】
いくつかのタンパク質の診断能力は、１１６人の女性から得た子宮吸引試料において、先に開示したような並列反応モニタリング取得法（ＬＣ−ＰＲＭ）を用いた質量分析検出による液体クロマトグラフィーによって評価した。
【０１５２】
子宮吸引物の処理には、特殊な装置を用いた吸引による収集、ＰＢＳ１×生理食塩水溶液を１：１（ｖ／ｖ）の比でチューブに吸引する希釈が含まれていた。次に、液体画分を細胞画分から分離するために、２，５００×ｇで２０分間の遠心分離を行った。子宮吸引物の上清を用いてタンパク質バイオマーカーを評価した。
【０１５３】
１１６人の女性のうち、６９人がＥＣと診断された。４９人の類内膜ＥＣ（ＥＥＣ）及び２０人の非類内膜の漿液性ＥＣ（ＳＥＣ）が含まれていた。残りの４７人の女性は非ＥＣ女性で、通常の子宮内膜症又は良性の疾患と診断された。
【０１５４】
有意なＥＣバイオマーカーを得るために、ＬＣ−ＰＲＭ研究（ＬＣ−ＰＲＭの構成は実施例１と同じである）で得られた軽／重面積比として測定された各マーカーの発現を、ノンパラメトリックであるマンホイットニーＵ検定を用いて、腫瘍団（ｎ＝６９）と非ＥＣ団（ｎ＝４７）とで比較した。０．０５未満の調整後のｐ値が統計的に有意であると考えられた。受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を用いて、バイオマーカーの特異度及び感度を評価し、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）を各タンパク質について評価した。結果を以下の表２に要約する。
【０１５５】
【表２】
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【０１５６】
より堅牢なバイオマーカーから、本発明者らは、ＭＭＰ９によって提供される診断情報の改善に関心を向けた。この目的のために、ロジスティック回帰モデルをデータに適合させて、タンパク質の異なる組み合わせの力を評価して、２つの臨床的カテゴリー（がん及び対照）の試料を分類した。これらの回帰モデルのそれぞれについてＲＯＣ曲線を生成した。群間の識別用の「最適な」カットオフ点でのＡＵＣ、感度、及び特異度が得られた。最適なカットオフは、アイデンティティ（対角線）までの距離を最大化する閾値に対応していた。最適性の基準は、最大（感度＋特異度）であった。ＡＵＣの９５％信頼区間（ＣＩ）をＤｅｌｏｎｇ法（２０）で計算した。感度及び特異度の値の９５％ＣＩは、Ｆａｗｃｅｔｔに記載されている平均化方法及びブートストラップ再サンプリングを用いて計算した（Ｆａｗｃｅｔｔ  Ｔ．，  「Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ＲＯＣ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎ  Ｌｅｔｔ．２００６，ｖ．２７，ｐａｇｅｓ８６１−８７４）。全てのＲＯＣ分析は、Ｒ  「ｐＲＯＣ」パッケージを用いて実施した（Ｒｏｂｉｎ  Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，“ｐＲＯＣ：ａｎ  ｏｐｅｎ−ｓｏｕｒｃｅ  ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  Ｒ  ａｎｄ  Ｓ＋ｔｏ  ａｎａｌｙｚｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｅ  ＲＯＣ  ｃｕｒｖｅｓ”，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１１，ｖ．１２，ｐａｇｅ７７）。各タンパク質パネルの堅牢性を評価するために、データセットの残りの試料に対して調整されたロジスティック回帰モデルを、データセットの各試料に適用することにより、「ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ」交差確認手順を実行し、それにより新しいＲＯＣ曲線を得て、その後通常のＲＯＣ分析を実行した。同様の方法で、診断したタンパク質パネルの識別能力は、初期のセット（コホート１：実施例２のコホート）に対して調整されたロジスティック回帰モデルを、独立した試料のセットの各試料（コホート２：実施例１のコホート）に適用することによって更に検証し、それにより新しいＲＯＣ曲線を得て、その後通常のＲＯＣ分析を実行した。
【０１５７】
従って、ＭＭＰ９バイオマーカーの値は、ＭＭＰ９と組み合わせたときにＭＭＰ９単独のＥＣバイオマーカー値に悪影響を及ぼす他のタンパク質とは対照的に、ＫＰＹＭ、ＥＮＯＡ、ＰＲＤＸ１、ＭＩＦ、ＧＳＴＰ１、ＣＡＰＧ、ＣＡＤＨ１、ＨＳＰＢ１、ＰＤＩＡ１、ＬＤＨＡ、ＣＬＩＣ１、ＣＡＳＰ３、ＦＡＢＰ５、ＴＰＩＳ、ＬＤＨＡ、ＣＴＮＢ１、ＣＨ１０、ＮＡＭＰＴ、及びＡＮＸＡ２と組み合わせて判定を実施したときに著しく改善したことが見出された。
【０１５８】
陽性の組み合わせの特定の例は、０．９６のＡＵＣ値を示すＭＭＰ９＋ＫＰＹＭの組み合わせである。個々のＡＵＣ値がそれぞれＭＭＰ９は０．８９、ＫＰＹＭは０．９０であり、組み合わせたときにＭＭＰ９のＡＵＣ値が増加しているため、この知見は意外であった。
【０１５９】
対照的に、ＭＭＰ９とＰＥＲＭとの組み合わせは、ＥＣの検出精度を改善しなかった。実施例１及び実施例２において、ＭＭＰ９について得られた個々のＡＵＣ値は０．９１及び０．８９であった。ＰＥＲＭのＡＵＣ値は０．９６及び０．８６であった。しかし、それらの組み合わせは、いかなるＡＵＣ値の改善をも報告しなかった。ＭＭＰ９とＰＥＲＭとの組み合わせは、０．８９のＡＵＣ値を有する。
【０１６０】
実施例３
【０１６１】
ＥＬＩＳＡ技法によるＭＭＰ９とＫＰＹＭの検出。製造者のプロトコールによる、ＥＬＩＳＡキット（それぞれ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ及びＵＳＣＮ  ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。ＭＭＰ９については、１０５の子宮吸引試料を、１：１０、１：１００、又は１：１０００の希釈物を用いて分析した。ＫＰＹＭについては、試料物質が不足していたために、１：２、１：４、又は１：１０の希釈物を用いて、３９の子宮吸引試料のみ分析することができた。全ての試料を２回測定し、平均値をｎｇ／ｍＬとして報告した。ＬＣ−ＰＲＭ及びＥＬＩＳＡアッセイの結果間の線形相関は、ピアソン相関係数を用いて計算した。ＥＬＩＳＡの結果により、質量分析で観察された結果と高度な相関があることが見出された。従って、ＭＭＰ９及びＫＰＹＭは、ＥＣを診断するための抗体ベースの技術において使用できる。
【国際調査報告】
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