(57)【要約】  本発明は、メタクリル酸メチルの生産のための方法に関する。本発明の方法は、ａ）発酵培地中で微生物を、前述の微生物がＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを生産する条件下において提供するステップと；ｂ）発酵培地と接触する、発酵培地中よりも高濃度でＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを含む有機相を提供するステップと；ｃ）発酵培地との接触から前述のＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを含有する有機相を取り出すステップと；ｄ）任意選択により有機相からの分離後に、取り出したＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対してメタノールでエステル交換を行い、メタクリル酸メチルを生産させるステップとを含む。
2019535327.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）の生産のための方法であって、
ａ）発酵培地中で微生物を、前記微生物がＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを生産する条件下において提供するステップと；
ｂ）前記発酵培地と接触する、前記発酵培地中よりも高濃度でＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを含む有機相を提供するステップと；
ｃ）前記発酵培地との接触から、前記Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを含有する有機相を取り出すステップと；
ｄ）任意選択により前記有機相からの分離後に、前記取り出したＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸をメタノールでエステル交換反応して、メタクリル酸メチルを生成させるステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記メタクリル酸エステルが、Ｃ３〜Ｃ１２アルキル、ヒドロキシアルキル、アルケニル、アルキルアリールまたはアルケニルアリールメタクリル酸エステルから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メタクリル酸エステルが、メタクリル酸ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソペンチル、ヘキシル、シクロへキシル、ヘプチル、オクチル、２−エチルヘキシル、デシル、ドデシル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、イソボルニル、アリルまたはシンナミル、より好ましくは、メタクリル酸イソプロピルまたはｎ−ブチルから選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）またはシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）を含む、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が、野生型よりも多くのＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを生産するように遺伝学的に修飾される、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が、イソブチリル−ＣｏＡをメタクリリル−ＣｏＡに変換し得る１つ以上の酵素を発現する、請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記微生物が、一般に、適切なＣ３〜Ｃ１２、より一般的にはＣ３〜Ｃ８アルコールの存在下で、メタクリリル−ＣｏＡをＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに、より一般的にはＣ３〜Ｃ８メタクリル酸エステルに変換し得る１つ以上の酵素を発現する、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物が、オキシダーゼ、デヒドロゲナーゼまたはオキシドレダクターゼ酵素およびアルコールアシルトランスフェラーゼ酵素を発現する、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記オキシダーゼがアシルＣｏＡオキシダーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記オキシダーゼが、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）からのＡＣＸ４である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物が、２−ケトイソ吉草酸をイソブチリル−ＣｏＡに変換し得る１つ以上の酵素を発現する、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素が、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ酵素複合体またはオキシドレダクターゼ酵素を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ酵素複合体が、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）由来の分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＢＣＫＤ、Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｕｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のＢＣＫＤ、Ａ．タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＢＣＫＤ、ストレプトミセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のＢＣＫＤまたはサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）由来のＢＣＫＤを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップｄ）の前記エステル交換が、メタノールおよび触媒の存在下で行われる、請求項１〜１３の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記触媒が塩基性触媒である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記触媒が、金属酸化物、水酸化物、炭酸塩、酢酸塩（エタン酸塩）、シュウ酸塩、アルコキシド、炭酸水素塩、上記のうち１つの四級アンモニウム化合物、アルキルまたはフェニルアミン、ジアザビシクロウンデセンおよびジアザビシクロノナンから選択される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記触媒が、次のうち１つ以上：ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｂａ（ＯＨ）２、ＣｓＯＨ、Ｓｒ（ＯＨ）２、ＲｂＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、Ｌｉ２ＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、Ｒｂ２ＣＯ３、Ｃｓ２ＣＯ３、ＭｇＣＯ３、ＣａＣＯ３、ＳｒＣＯ３、ＢａＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３、ＬｉＨＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＫＨＣＯ３、ＲｂＨＣＯ３、ＣｓＨＣＯ３、Ｍｇ（ＨＣＯ３）２、Ｃａ（ＨＣＯ３）２、Ｓｒ（ＨＣＯ３）２、Ｂａ（ＨＣＯ３）２、ＮＨ４ＨＣＯ３、Ｌｉ２Ｏ、Ｎａ２Ｏ、Ｋ２Ｏ、Ｒｂ２Ｏ、Ｃｓ２Ｏ、ＭｇＯ、ＣａＯ、ＳｒＯ、ＢａＯ、Ｌｉ（ＯＲ１）、Ｎａ（ＯＲ１）、Ｋ（ＯＲ１）、Ｒｂ（ＯＲ１）、Ｃｓ（ＯＲ１）、Ｍｇ（ＯＲ１）２、Ｃａ（ＯＲ１）２、Ｓｒ（ＯＲ１）２、Ｂａ（ＯＲ１）２、ＮＨ４（ＯＲ１）（式中、Ｒ１は、何らかのＣ１〜Ｃ６の分岐、非分岐または環式アルキル基であり、これらは任意選択により１つ以上の官能基で置換される）；ＮＨ４（Ｒ２ＣＯ２）、Ｌｉ（Ｒ２ＣＯ２）、Ｎａ（Ｒ２ＣＯ２）、Ｋ（Ｒ２ＣＯ２）、Ｒｂ（Ｒ２ＣＯ２）、Ｃｓ（Ｒ２ＣＯ２）、Ｍｇ（Ｒ２ＣＯ２）２、Ｃａ（Ｒ２ＣＯ２）２、Ｓｒ（Ｒ２ＣＯ２）２またはＢａ（Ｒ２ＣＯ２）２（式中、Ｒ２ＣＯ２は酢酸塩である）；（ＮＨ４）２（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｌｉ２（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｎａ２（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｋ２（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｒｂ２（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｃｓ２（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｍｇ（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｃａ（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｓｒ（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｂａ（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、（ＮＨ４）２（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）（式中、ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２はシュウ酸塩である）；メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシルアミン、シクロヘキシルアミン、アニリン；Ｒ４ＮＯＨ（式中、Ｒは、メチル、エチル  プロピル、ブチルである）；ジアザビシクロウンデセンおよびジアザビシクロノナンから選択される、請求項１４〜１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記触媒が、第Ｉ族または第ＩＩ族金属塩から選択される、請求項１４〜１７の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記触媒が、第Ｉ族または第ＩＩ族金属酸化物、水酸化物、炭酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、アルコキシドおよび炭酸水素塩から選択される、請求項１４〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記触媒が第Ｉ族金属塩である、請求項１４〜１９の何れか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記触媒が第Ｉ族メトキシドである、請求項１４〜２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記触媒が均一系触媒である、請求項１４〜２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記触媒が、ナトリウムメトキシド、リチウムメトキシド、カリウムメトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カリウムおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１４〜２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ステップｄ）の前記エステル交換が、前記触媒に対するｍｏｌ％水が５０％以下、例えば４０％、３０％、３５％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％などの条件で行われる、請求項１〜２３の何れか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記有機相を乾燥させるステップが、任意選択により蒸留によって、ステップｄ）の前記エステル交換の前に行われる、請求項１〜２４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ステップｄ）の前記エステル交換が、水の非存在下で行われる、請求項１〜２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記発酵培地中でのＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルのタイターがおよそ２２０ｍｇ／Ｌである、請求項１〜２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ステップｂ）で提供される前記有機相が、前記微生物により生産される前記Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルによって提供される、請求項１〜２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ステップｂ）で提供される前記有機相が、前記発酵培地と接触する外部の有機溶媒を含む、請求項１〜２８の何れか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記有機溶媒が生体適合性である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記有機溶媒が３．０以上のｌｏｇＰｏ／ｗ値を有する、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記溶媒が、トリブチリン、イソプロピルベンゼン、ｎ−プロピルベンゼン、シクロヘプタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロオクタン、イソオクタン、１，４−ジイソプロピルベンゼン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン、ドデカンおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２９〜３１の何れか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記有機相中の前記Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを精製することをさらに含む、請求項１〜３２の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタクリル酸メチルの生産のための方法に関する。特に、本発明は、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを生成させるために発酵を介してメタクリル酸メチルを生産させるための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）は、化学工業において重要な単量体である。ＭＭＡの主要な使用は、様々な利用のためのプラスチックの生産におけるものであるが；ＭＭＡは、整形外科で使用するための骨セメントにおいても使用され得る。最も顕著な重合適用は、光学的透明度が高いプラスチックを製造するためのポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）の鋳造、成形または押出である。ＰＭＭＡの世界的な消費量は、年間およそ２１０万トンと推定される。
【０００３】
ＭＭＡは現在、専ら化学的手段により生産されており、ＭＭＡの生産のための現在の方法には、アセトンシアノヒドリン（ＡＣＨ）経路および様々なＣ２〜Ｃ４前駆体から出発する他の経路が含まれる。ＭＭＡ生産のための最も良好な方法の１つは、「アルファ方法」であり、これによって、ホルムアルデヒドとの無水反応によりエステル、プロピオン酸メチルからＭＭＡを得る。アルファ方法において、エチレンのカルボニル化によりプロピオン酸メチルが生産される。このエチレン原料は化石燃料由来である。アルファ方法には、ＭＭＡの生産で一般的に使用される他の方法と比較して多くの長所がある。これらの長所としては、危険な化学物質の使用の減少、生成物の選択制が格段に高いこと、原油由来の原料への依存の減少が挙げられる。しかし、原料の価格設定はガソリンのコストと関連する。したがって、これらの欠点を克服するＭＭＡの生産のための代替的な方法を開発することが望ましい。
【０００４】
化学合成によらず発酵を介して高価な化学物質を生産するために微生物を使用し得る。このような微生物の組み換えＤＮＡ技術および合成代謝工学によって、特定の化学物質の生産に対する代謝経路の再構築が可能になった。近年、アクリレート類の生物学的生産に対するいくつかの持続可能な経路が開発されている。これらの方法は、一般的に、微生物発酵を介した再生可能原料からのアクリレート類の生産に焦点を当てている。しかし、発酵中のこれらの生成物の蓄積は、一般に生体触媒にとって毒性があり、細胞増殖を阻害し、および／または、その結果、細胞死が起こる。特に、高級アルキルメタクリレート類（例えばメタクリル酸ブチル（ＢＭＡ）など）は、ＭＭＡなどの低級メタクリル酸アルキルよりも生体触媒に対してさらにより強い毒性を示す。この観点において、およびＭＭＡを生産するための現在の化学的方法に付随するある種の短所の観点において、ＭＭＡの生産に対する生物学的または部分生物学的方法の改善の提供は有利である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、上述の問題の１つ以上を取り除くかまたは軽減すること、ＭＭＡの生産のための方法を改善すること、および／またはＭＭＡの生産のための生物学的または部分生物学的方法を改善することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＭＭＡの生産のための方法に関し、これは、部分的に、発明者らによる研究に基づいており、この発明者らの研究によって、驚くべきことに、高級メタクリレート類が微生物に対して示す固有の毒性にもかかわらず、高級メタクリル酸エステルを生産する発酵を介してＭＭＡを効率的に生産することが可能であることが示された。驚くべきことに、本発明の方法が、ＭＭＡの直接的な生産と比較して、高級エステルに対する反応速度を向上させることも分かった。
【０００７】
本発明の第１の態様において、メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）の生産のための方法が提供される。本方法は、
ａ）発酵培地中で微生物を、その微生物がＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを生産する条件下において提供し；
ｂ）発酵培地と接触する、発酵培地中よりも高い濃度でＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを含む有機相を提供し；
ｃ）発酵培地との接触からＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを含有する有機相を取り出し；
ｄ）メタクリル酸メチルを生成させるために、任意選択により有機相からの分離後に、取り出したＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対してメタノールを用いてエステル交換を行うステップを含む。
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル
本発明の第１の態様において、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルは、発酵培地中で微生物により生産される。
【０００８】
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルという用語は、一般に、それらの構造異性体を含め、Ｃ３〜Ｃ１２アルキル、ヒドロキシアルキル、アルケニル、アルキルアリールまたはアルケニルアリール基を含むメタクリレート類を意味する。Ｃ３〜Ｃ１２基は、環式、非環式または部分環式、直鎖状または分岐状、脂肪族、芳香族または部分芳香族／脂肪族であり得る。好ましくは、本発明のＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルは、例えば、メタクリル酸ｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソペンチル、ヘキシル、シクロへキシル、２−エチルヘキシル、デシル、ドデシル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、イソボルニル、アリルまたはシンナミルを含み得る。
【０００９】
好ましくは、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルは、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸アルキル、より好ましくは、Ｃ３〜Ｃ８メタクリル酸アルキル、例えばｎ−プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｎ−ブチル、イソペンチル、ヘキシル、シクロへキシル、ヘプチル、オクチル、２−エチルヘキシル、デシルまたはメタクリル酸ドデシルである。
【００１０】
好ましくは、メタクリル酸ヒドロキシアルキルは、メタクリル酸ヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピルである。
実施形態において、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルは、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸アルケニルアリール、例えばメタクリル酸シンナミルである。
【００１１】
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸アルキルは、より好ましくは、例えばその構造異性体を含め、Ｃ３〜Ｃ６メタクリル酸アルキル、例えばメタクリル酸プロピル、ブチルまたはヘキシルである。より好ましくは、Ｃ３〜Ｃ６メタクリル酸アルキルは、メタクリル酸プロピルまたはブチル、特にメタクリル酸イソプロピルまたはｎ−ブチルである。
微生物
本発明の微生物は、天然の野生型または非天然の組み換え微生物、例えば、細菌、古細菌、酵母、真菌類、藻類または発酵方法に適用可能な様々な他の微生物の何れかから選択され得る。
【００１２】
本発明の実施形態において、微生物は細菌である。適切な細菌の例としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、パンテア（Ｐａｎｔｏｅａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、モーガネラ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）属などのプロテオバクテリアに属する腸内細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属するいわゆるコリネ型細菌およびアリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ヒドロゲノバクター（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ）、メタノコッカス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシネバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アクソリゾビウム（Ａｘｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バルトネラ（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ボルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カリマトバクテリウム（Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミドフィラ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コキシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ）、エーリキア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ガルドネレラ（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ（Ｋｅｌｂｓｉｅｌｌａ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、モラキセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ペプトストレプトコッカス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ロシャリメア（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ）、ロチア（Ｒｏｔｈｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ステノトロホモナス（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネア（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、ボルバキア（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属に属する細菌などが挙げられる。
【００１３】
代表的な細菌としては、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、アナエロビオスピリルム・スクシニシプロデュセンス（Ａｎａｅｒｏｂｉｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、アクチノバチルス・スクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、マンヘイミア・スクシニシプロデュセンス（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）、ジモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ストレプトミセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ヒドロゲノバクター・サーモフィルス（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｂａｃｔｅｒ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、メタノコッカス・ジャンナシイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）から選択される種が挙げられる。
【００１４】
好ましくは、細菌は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属である。好ましくは、細菌は、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）またはシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）である。
【００１５】
代表的な酵母または真菌としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｔｐｏｃｏｃｃｕｓ）属に属するものなどが挙げられる。代表的な酵母または真菌種としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）から選択されるものなどが挙げられる。
【００１６】
本発明の実施形態において、微生物は、野生型よりも多くのＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを生産させるために遺伝学的に修飾され得る。
野生型微生物と比較してＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの生産を促進することは、当技術分野で公知の様々な遺伝子工学的技術の使用により既存の細胞代謝プロセス、核酸および／またはタンパク質に対して修飾を行うことを含み得る。Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの生産を促進することはまた、微生物中で１つ以上の異種遺伝子を発現するように微生物を修飾することも含み得る。これらは、炭素ベースの原料からのＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対する所望の経路の酵素をコードする遺伝子を含み得るか、またはこのような経路において直接的または間接的の何れかで酵素の機能および発現を促すために作用する他の補助的遺伝子を含み得る。
【００１７】
したがって、本発明の微生物は、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの生産を促進するために修飾され得る。
微生物は、同じ基質および／または中間体に対して競合することによりＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性を低下させるかまたは排除する修飾を含み得る。あるいは、またはさらに、本発明の方法で使用される微生物は、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを生産する経路においてＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを代謝するか、または中間体を代謝する酵素の活性を低下させるかまたは排除する修飾を含み得る。
【００１８】
あるいは、またはさらに、本発明の方法で使用される微生物は、中間体を除去する他の細胞機能に関与するタンパク質の活性を低下させるかまたは排除する修飾を含み得る。このような他の細胞機能の例としては、（例えば酵母における）空胞貯蔵または代謝産物を貯蔵可能な他の細胞内ボディ（例えば細菌マイクロコンパートメント）などの貯蔵機構、細菌ペリプラズムまたは代謝産物を輸出可能な膜貫通ポンプまたはポリンなどの輸送機序が挙げられ得る。
【００１９】
あるいは、またはさらに、本発明の方法で使用される微生物は、
（ｉ）Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル生産経路から物質をする；および／または
（ｉｉ）Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを代謝する、
細胞機能に加わる酵素またはタンパク質の活性を低下させるかまたは排除する修飾を含み得る。
【００２０】
あるいは、またはさらに、本発明の方法で使用される微生物は、結果的に微生物が発酵条件、反応条件または本発明の方法中に遭遇する他のストレスに対してより耐性となる修飾を含み得る。
【００２１】
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの生産を促進することは、野生型微生物と比較してより多くのＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを生産するように適応させられる微生物を選択することを含み得る。本発明の文脈において、「適応させる」という用語は、微生物に関して使用される場合、遺伝学的に修飾されたかもしくは改変された生物、または例えばＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの生産を天然に促進する１つ以上の酵素を発現するということに基づいて選択された生物の突然変異体株を意味する。このような修飾は、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの生産を促進し得る上述の修飾の何れかを含み得る。
【００２２】
上述の酵素またはタンパク質の活性を低下させるかまたは排除するために、従来のランダムまたは部位特異的突然変異誘発または遺伝子改変技術によって、酵素もしくはタンパク質の細胞内活性を低下させるかまたは排除するための突然変異を上述の酵素またはタンパク質の遺伝子に導入し得る。突然変異誘発の例としては、例えばＸ線または紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの突然変異原での処理、それぞれハイフィデリティまたはエラープローンポリメラーゼ連鎖反応による、インビトロ部位特異的またはランダム突然変異誘発などが挙げられ得る。突然変異が導入される遺伝子上の部位は、酵素もしくはタンパク質をコードするコード領域またはプロモーターなどの発現調節領域にあり得る。遺伝子改変技術の例としては、遺伝子組み換え、形質導入、細胞融合および遺伝子ノックアウトが挙げられ得る。
【００２３】
目的とする酵素またはタンパク質の細胞内活性の低下および排除および低下度は、候補株から得られる細胞抽出物またはその精製分画中の酵素またはタンパク質活性を測定し、野生型株と比較することによって、または細胞全体による標的産物の形成を測定することによって、確認し得る。
【００２４】
好ましくは、１つ以上の微生物は、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル、好ましくはＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸アルキルの生産を触媒するために必要な１つ以上の酵素を発現する。好ましくは、１つ以上の微生物内で、適切なステップおよび何らかのさらなる酵素性ステップがインビボで行われる。
【００２５】
１つ以上の微生物は、天然に１つ以上の酵素を発現し得るか、または１つ以上の酵素を発現させるために遺伝子改変され得るか、または野生型もしくは遺伝子改変酵素の両方の組み合わせを発現し得る。このような遺伝子改変生物は、組み換え生物として記載され得る。
【００２６】
１つ以上の微生物は、内因的にまたは異種性に１つ以上の酵素を発現し得るか、または内因性および異種酵素の組み合わせを発現し得る。
本発明の文脈において、「組み換え生物」という用語は、人工的に構築され、生物に挿入されている遺伝子材料を含む、遺伝子修飾されているかまたは改変されている生物を意味する。遺伝子材料は、さらに遺伝子修飾されてもよいかまたはされなくてもよい、内因性または異種核酸を含み得る。
【００２７】
本発明の文脈において、「内因性」という用語は、生物の同じ種由来であることを意味する。
本発明の文脈において、「異種」という用語は、異なる種の生物由来であることを意味する。
【００２８】
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル、好ましくはＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸アルキルを生産させるために修飾されるように微生物内で発現され得る１つ以上の遺伝子は、次の酵素の何れかをコードするものを含む。
【００２９】
実施形態において、微生物は、イソブチリル−ＣｏＡをメタクリリル−ＣｏＡに変換し得る１つ以上の酵素、例えばオキシダーゼ、デヒドロゲナーゼまたはオキシドレダクターゼを発現し得る。
【００３０】
オキシダーゼは、ＥＣ番号ＥＣ１．３．ｘ．ｘ下、ＣＨ−ＣＨ結合上で作用するオキシダーゼ、より好ましくは、ＥＣ番号ＥＣ１．３．３．ｘ下、電子受容体として酸素を使用してＣＨ−ＣＨ結合上で作用するオキシダーゼであり得る。さらにより好ましくは、オキシダーゼは、適切にはＥＣ番号ＥＣ１．３．３．６下のアシル−ＣｏＡオキシダーゼである。より好ましくは、アシル−ＣｏＡオキシダーゼは、次の酵素の何れか：アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡＣＸ４、アルスロバクター・ニコチアナエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）由来の短鎖アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、ビグナ・ラジアタ（Ｖｉｇｎａ  ｒａｄｉａｔａ）由来のペルオキシソームアシル−ＣｏＡオキシダーゼ、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種由来のアシル−ＣｏＡオキシダーゼおよびカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）由来のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ４から選択される。最も好ましくは、アシル−ＣｏＡオキシダーゼは、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡＣＸ４である。
【００３１】
オキシドレダクターゼは、ＥＣ群番号１．Ｘ．Ｘ．Ｘの下のオキシドレダクターゼであり得る。好ましくは、オキシドレダクターゼは、適切にはＥＣ群１．３．Ｘ．Ｘ下の、電子供与体のＣＨ−ＣＨ基上で作用するオキシドレダクターゼである。より好ましくは、供与体のＣＨ−ＣＨ基上で作用するオキシドレダクターゼは、ＦＡＤ依存性オキシドレダクターゼであり、さらにより好ましくは、オキシドレダクターゼは、ＥＣ群１．３．８．Ｘ下のＣｏＡデヒドロゲナーゼである。より好ましくはさらに、オキシドレダクターゼは、適切にはＥＣ群１．３．８．１下の短鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、適切にはＥＣ群１．３．８．４下のイソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、適切にはＥＣ群１．３．８．５下の２−メチル−分岐鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼまたは適切にはＥＣ群１．３．８．−下のアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、例えばイソブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼなどである。最も好ましくは、オキシドレダクターゼは、次の酵素：シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）由来の短／分岐鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のイソブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のイソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの何れかから選択される。
【００３２】
ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素は、一般的にユビキノンの還元と基質の酸化をカップリングさせるための付随する電子伝達系を必要とし、これがその後再生される。このような電子伝達系は、電子移動フラボタンパク質（ＥＴＦ）および電子移動フラボタンパク質ユビキノンオキシドレダクターゼ（ＥＴＦＱＯ）からなる。ＥＴＦは、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素およびＥＴＦＱＯの両方と適合性でなければならない。したがって、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼが使用される実施形態において、次の再生系の１つが好ましくは使用される：
・イソブチリル−ＣｏＡに対して活性がある内因性ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびその付随する電子伝達系を発現する宿主微生物、例えばシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）の場合など；
・異種ＣｏＡデヒドロゲナーゼと同じ生物からの電子伝達系のタンパク質を付随して異種ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素を発現する宿主微生物。例えば、全て、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（または別の宿主生物）で発現される、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来の、またはアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＣｏＡデヒドロゲナーゼおよび電子伝達系構成成分；または
・同様に異なる微生物由来の電子伝達系構成成分を付随する、異種ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素を発現する宿主微生物、それによりこれらの構成成分は互いに、およびＣｏＡデヒドロゲナーゼと適合性である。例えば、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）由来のＣｏＡデヒドロゲナーゼは、サス・スクロファ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）の電子移動フラボタンパク質と適合性であり、これはまた、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来の電子移動フラボタンパク質ユビキノンオキシドレダクターゼと適合性である。あるいは、Ａ．タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）のＥＴＦ−ユビキノンオキシドレダクターゼがＲ．スファエロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）のＥＴＦ−ユビキノンオキシドレダクターゼと良好な配列相同性を有するので、Ａ．タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）のイソバレリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼおよびＥＴＦは、イソブチリル−ＣｏＡの酸化のために、Ｒ．スファエロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来のＥＴＦ−ユビキノンオキシドレダクターゼとともに機能的な系を形成し得る。最後に、パラコッカス・デニトリフィカンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）由来のＥＴＦおよびＥＴＦ−ユビキノンオキシドレダクターゼは、Ｐ．デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＥＴＦがヒトおよびブタＥＴＦと類似性があるので、Ｈ．サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）のものまたは異なる生物由来の相同体など、別の起源由来のイソブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼと適合性であると予測される。
【００３３】
実施形態において、微生物は、例えばアルコールアシルトランスフェラーゼなど、メタクリリル−ＣｏＡをＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに変換し得る１つ以上の酵素を発現し得る。
【００３４】
好ましくは、アルコールアシルトランスフェラーゼは、アルコール、より好ましくはＣ３〜Ｃ１２アルコール、最も好ましくはＣ３〜Ｃ８アルコールの存在下で、またより好ましくはプロパノールまたはブタノール、例えばｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノールまたはオクタノールなどの存在下で作用する。最も好ましくは、アルコールアシルトランスフェラーゼは、イソプロパノールまたはｎ−ブタノールの存在下で作用する。
【００３５】
本明細書中でアルコールという用語は、ヒドロキシル基（−ＯＨ基）を有し、メタクリレート類とともにエステル基を形成可能である種を意味する。
好ましくは、アルコールアシルトランスフェラーゼは、植物起源由来であり、より好ましくはこの植物は、ジンギベラレス（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｌｅｓ）、ロサレス（Ｒｏｓａｌｅｓ）、エリカレス（Ｅｒｉｃａｌｅｓ）、ククルビタレス（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｌｅｓ）、ブラシカレス（Ｂｒａｓｓｉｃａｌｅｓ）およびラウラレス（Ｌａｕｒａｌｅｓ）からなる群から選択される何れかの目に属し；さらにより好ましくは、この植物は、ムサセアエ（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、ロサセアエ（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、エリカセアエ（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）、アクチニジアセアエ（Ａｃｔｉｎｉｄｉａｃｅａｅ）、ククルビタセアエ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、カリカセアエ（Ｃａｒｉｃａｃｅａｅ）およびラウラセアエ（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）からなる群から選択される何れかの科に属し；さらにより好ましくは、この植物は、ムサ（Ｍｕｓａ）、フラガリア（Ｆｒａｇａｒｉａ）、マルス（Ｍａｌｕｓ）、プルヌス（Ｐｒｕｎｕｓ）、ピルス（Ｐｙｒｕｓ）、ワクシニウム（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）、アクチニジア（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）、ククミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、カリカ（Ｃａｒｉｃａ）およびペルセア（Ｐｅｒｓｅａ）からなる群から選択される何れかの属に属し；さらにより好ましくは、この植物は、バナナ、イチゴ、リンゴ、プルヌス・ムメ（Ｐｒｕｎｕｓ  ｍｕｍｅ）、ピルス・コミュニス（Ｐｙｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ブルーベリー、キウイ、メロン、パパイヤおよびアボカドからなる群から選択される何れか１つである。最も好ましくは、アルコールアシルトランスフェラーゼは、リンゴ、メロンまたはトマト起源などの果実起源由来、適切にはリンゴ起源である。
【００３６】
本発明の実施形態において、微生物は、イソブチリルＣｏＡをＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに変換するためのオキシダーゼおよびアルコールアシルトランスフェラーゼを発現し得る。適切なオキシダーゼおよびアルコールアシルトランスフェラーゼは上記で概説している。オキシダーゼがアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡＣＸ４であれば特に好ましい。
【００３７】
実施形態において、微生物は、２−ケトイソ吉草酸をイソブチリル−ＣｏＡに変換し得る１つ以上の酵素を発現し得る。実施形態において、１つ以上の酵素は、アルファサブユニット構成成分、リポアミドアシルトランスフェラーゼ構成成分およびリポアミドデヒドロゲナーゼ構成成分からなる、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ酵素複合体などの酵素複合体であり得る。最も好ましくは、デヒドロゲナーゼは、次の酵素：Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）由来の分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ（ＢＣＫＤ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＢＣＫＤ、Ｐ．エルギノーサ（Ｐ．ａｅｕｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のＢＣＫＤ、Ａ．タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＢＣＫＤ、ストレプトミセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）由来のＢＣＫＤおよびサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＢＣＫＤの何れかから選択される。
【００３８】
あるいは、２−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡへの変換は、適切にはＥＣ群１．Ｘ．Ｘ．Ｘ下のオキシドレダクターゼ酵素、好ましくは適切にはＥＣ群１．２．Ｘ．Ｘ下の供与体のアルデヒドまたはオキソ基上で作用するオキシドレダクターゼ、より好ましくは、適切にはＥＣ群１．２．７．Ｘ下の、電子受容体としての鉄−イオウタンパク質を使用して供与体のアルデヒドまたはオキソ基上で作用するオキシドレダクターゼ酵素、最も好ましくは、アルファ、ベータ、ガンマおよびデルタサブユニットからなるテトラマーである、適切にはＥＣ群番号１．２．７．７下の２−ケトイソ吉草酸フェレドキシンレダクターゼ（ケトバリンフェレドキシンオキシドレダクターゼとしても知られる）により触媒され得る。このような酵素の例は、ピロコッカス・フリオシス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｉｓ）由来の２−ケトイソ吉草酸フェレドキシンレダクターゼ；ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）種由来の２−ケトイソ吉草酸フェレドキシンレダクターゼ；サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種由来の２−ケトイソ吉草酸フェレドキシンレダクターゼ；サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の２−ケトイソ吉草酸フェレドキシンレダクターゼ；サーモコッカス・プロフンドゥス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）由来の２−ケトイソ吉草酸フェレドキシンレダクターゼおよびメタノバクテリウム・サーモオートトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）由来の２−ケトイソ吉草酸フェレドキシンレダクターゼである。
【００３９】
あるいは、微生物は、イソ酪酸をイソブチリル−ＣｏＡに変換し得る１つ以上の酵素、例えばリガーゼ、を発現し得る。リガーゼは適切にはＥＣ群番号６．Ｘ．Ｘ．Ｘ下であり、好ましくはＥＣ群６．２．Ｘ．Ｘ下の炭素−イオウ結合形成リガーゼ、より好ましくはＥＣ群６．２．１．Ｘ下の酸−チオール形成リガーゼ、より好ましくは、適切にはＥＣ群６．２．１．１下の、ＧＤＰ形成、ＡＤＰ形成またはＡＭＰ形成リガーゼ、例えばＡＭＰ形成酢酸−ＣｏＡリガーゼなど、適切にはＥＣ群６．２．１．２下の酪酸−ＣｏＡリガーゼ、適切にはＥＣ群６．２．１．１０下のカルボン酸−ＣｏＡリガーゼ、適切にはＥＣ群６．２．１．１３下のＡＤＰ形成酢酸−ＣｏＡリガーゼ、適切にはＥＣ群６．２．１．１７下のプロピオン酸−ＣｏＡリガーゼまたはＥＣ群６．２．１．−の酸−チオールリガーゼである。最も好ましくは、リガーゼは、次の酵素：シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）由来のＡｃｓＡ、パエシロミセス・バリオティ（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ  ｖａｒｉｏｔｉ）由来のブチリル−ＣｏＡシンテターゼ、ウシ心臓ミトコンドリア由来のブチリル−ＣｏＡシンテターゼの何れかから選択される。
【００４０】
あるいは、微生物は、イソ酪酸エステルをイソブチリル−ＣｏＡに変換し得る１つ以上の酵素を発現し得る。例えばイソ酪酸エステルは、キナーゼ酵素によりイソブチリル−ホスフェートに変換され得、イソブチリル−ホスフェートは、トランスフェラーゼ酵素によりイソブチリル−ＣｏＡに変換され得る。
【００４１】
好ましくは、イソ酪酸エステルは、適切にはＥＣ群番号ＥＣ２．Ｘ．Ｘ．Ｘ下、好ましくはＥＣ２．７．Ｘ．Ｘ下、より好ましくはＥＣ群番号ＥＣ２．７．２．Ｘ下のキナーゼ酵素により、最も好ましくは、適切にはＥＣ群２．７．２．１下の酢酸キナーゼ、ＥＣ２．７．２．６下のギ酸キナーゼ、ＥＣ２．７．２．７下の酪酸キナーゼ、ＥＣ２．７．２．１４下の分岐鎖脂肪酸キナーゼまたはＥＣ２．７．２．１５下のプロピオン酸キナーゼにより、イソブチリル−ホスフェートに変換される。最も好ましくは、キナーゼは、次の酵素：スピロヘータ（Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅ）ＭＡ−２由来の分岐鎖脂肪酸キナーゼ、Ｃ．ブチリクム（Ｃ．ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）由来の酪酸キナーゼの何れかから選択される。
【００４２】
好ましくは、イソブチリル−ホスフェートは、ＥＣ群番号２．Ｘ．Ｘ．Ｘ下のトランスフェラーゼ酵素の作用により、より好ましくはＥＣ群番号２．３．Ｘ．Ｘ下のアシルトランスフェラーゼの作用により、さらにより好ましくはＥＣ群番号２．３．１．Ｘ下のアミノ−アシル基以外の基を移動させるアシルトランスフェラーゼの作用により、イソブチリル−ＣｏＡに変換される。さらにより好ましくは、それぞれＥＣ群番号２．３．１．８および２．３．１．１９下の、リン酸アセチルトランスフェラーゼまたはリン酸ブチリルトランスフェラーゼである。より好ましくは、トランスフェラーゼは、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ８２４由来のリン酸ブチリルトランスフェラーゼまたはバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）およびクロストリジウム・クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来のリン酸アセチルトランスフェラーゼである。これらの酵素の他の供給源としては、他の嫌気的細菌、特にクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、例えばクロストリジウム・パステウリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）またはクロストリジウム・ベイジェリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）などが挙げられる。
【００４３】
微生物は、イソ酪酸をイソブチリル−ＣｏＡに変換し得る１つ以上の酵素、例えばシンテターゼ酵素、好ましくはイソブチリル−ＣｏＡシンテターゼ、最も好ましくはＰ．クロラフィス（Ｐ．ｃｈｌｏｒａｐｈｉｓ）Ｂ２３由来のイソブチリル−ＣｏＡシンテターゼ（ＡｃｓＡ）を発現し得る。
【００４４】
任意選択により、微生物は、上記酵素の何らかの組み合わせを発現し得る。
本発明による、タンパク質、特に微生物において発現される酵素をコードする遺伝子に対する核酸の供給源としては、例えば、コードされる遺伝子産物が参照反応を触媒可能である何れかの種が挙げられ得る。このような種は、古細菌および真正細菌を含む細菌および、酵母、植物、昆虫、動物を含む真核生物および、ヒトを含む哺乳動物を含むが限定されない、原核および真核生物の両方を含む。このような供給源に対する代表的な種としては、例えばエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、プロピオニバクテリウム・フレデンレイシイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、メチロバクテリウム・エクストルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）、エルシニア・フレデリクセニイ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）、ラツス・ノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、アシネトバクター・カルコアセチカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ）、アシネトバクター・バイリイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）種、クロストリジウム・クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、シュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、オリクトラグス・クニクルス（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ユーバクテリウム・バルケリ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂａｒｋｅｒｉ）、バクテロイデス・カピロサス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｃａｐｉｌｌｏｓｕｓ）、アネロトランカス・コリホミニス（Ａｎａｅｒｏｔｒｕｎｃｕｓ  ｃｏｌｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ナトラナエロビウス・サーモフィルス（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、サス・スクロファ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）、バチルス・スブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、ストレプトミセス・コエリコロル（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、メチリビウム・ペトロレイフィルム（Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ  ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ）、ストレプトミセス・シンナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトミセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、アーケオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、ハロアルクラ・マリスモルツイ（Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ  ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ）、ピロバクルム・アエロフィルム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クロストリジウム・コクレアリウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｏｃｈｌｅａｒｉｕｍ）、クロストリジウム・テタノモルフム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、シトロバクター・アマロナチクス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）、マス・マスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ボス・タウルス（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、モーガネラ・モーガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）、クロストリジウム・パステウリアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、キサントバクター・アウトトロフィクス（Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、クロストリジウム・プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、メガスファエラ・エルスデニイ（Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ  ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、スルホロブス・トコダイイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）、メタロスファエラ・セデュラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ）、クロロフレクサス・アウランチアクス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、クロストリジウム・サッカロペルブチルアセトニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ）、アシダミノコックス・フェルメンタンス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）ならびに本明細書中で開示されるかまたは対応する遺伝子に対する供給源生物として利用可能な他の代表的な種が挙げられる。
【００４５】
非天然のＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル生産微生物においてタンパク質の発現を構築し、試験するための方法は、例えば当技術分野で周知の組み換え技術および検出方法によって行われ得る。このような方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９９９）に記載されていることが分かり得る。
【００４６】
接合、エレクトロポレーション、化学的形質転換、形質導入、遺伝子移入および超音波形質転換を含むが限定されない当技術分野で周知の技術を使用して、その形成においてＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルまたは中間体の生産に対する経路に関与する外来核酸配列を微生物細胞へと安定に、または一過性に導入し得る。
【００４７】
形質転換方法の例としては、ＤＮＡの透過性を向上させるようにレシピエント微生物細胞を塩化カルシウムで処理し、増殖期にある細胞からコンピーテント細胞を調製し、続いてＤＮＡにより形質転換することが挙げられ得る。あるいは、ＤＮＡ−レシピエント細胞を、組み換えＤＮＡを容易に取り込み得るプロトプラストまたはスフェロプラストにして、続いて組み換えＤＮＡを細胞に導入する方法も使用し得、これはバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、放線菌および酵母に適用可能であることが知られている。さらに微生物の形質転換はエレクトロポレーションによっても行い得る。このような方法は当技術分野で周知である。
【００４８】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）または他の原核微生物細胞における外因性発現について、真核核酸の遺伝子またはｃＤＮＡにおけるいくつかの核酸配列は、Ｎ末端ミトコンドリアのまたは他の標的化シグナルなどの標的化シグナルをコードし得、これは、必要に応じて原核微生物細胞への形質転換前に除去され得る。例えば、ミトコンドリアのリーダー配列の除去は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現増加につながった（Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４３２９−４３３８（２００５））。酵母または他の真核微生物細胞における外因性発現について、リーダー配列を付加することなくサイトゾルにおいて遺伝子が発現され得るか、またはミトコンドリアもしくは他の細胞小器官に対して標的化され得るか、または標的細胞小器官に適切なミトコンドリア標的化もしくは分泌シグナルなどの適切な標的化配列の付加によって分泌に対して標的化され得る。したがって、所望の特性を付与するために、標的化配列を除去するかまたは含むようにするための核酸配列への適切な修飾を外来核酸配列に組み込み得ることが理解される。さらに、微生物内でのタンパク質発現の最適化を達成するために、当技術分野で周知の技術により、遺伝子に対してコドン最適化を行い得る。
【００４９】
発現ベクターは、微生物中で機能的な発現調節配列に操作可能に連結される、本明細書中で例示されるような１つ以上の生合成経路酵素をコードする核酸を含むように構築され得る。本発明の微生物中での使用に適用可能な発現ベクターとしては、例えば、ベクターおよび宿主染色体への安定的な組み込みのための操作可能な選択配列またはマーカーを含む、プラスミド、コスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソームおよび人工染色体が挙げられる。
【００５０】
さらに、発現ベクターは、１つ以上の選択可能マーカー遺伝子および適切な発現調節配列を含み得る。選択可能マーカー遺伝子もまたそれに含まれ得、例えば、抗生物質もしくは毒物に対する耐性を提供する、栄養要求性欠損を補完する、または培地中にない必須の栄養分を供給する。発現調節配列は、当技術分野で周知である、構成的、誘導性または抑制性プロモーター、転写エンハンサー、転写終結因子、翻訳シグナルなどを含み得る。２つ以上の外来性コード核酸配列を同時発現させようとする場合、例えば単一の発現ベクターに、または個別の発現ベクターにおいて、両方の核酸配列を挿入し得る。単一のベクター発現について、誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターなど、コード核酸を１つの共通の発現調節配列に操作可能に連結させ得るか、または異なる発現調節配列に連結させ得る。いくつかの実施形態において、本ベクターは、複数の遺伝子またはオペロンの同時発現のために２つ以上のプロモーターを有し得る。いくつかの実施形態において、本遺伝子／オペロンは、１つ以上の対応するプロモーターを用いて１つ以上の異なるベクター上で発現され得る。
【００５１】
形質転換のために使用されるベクターは、微生物の細胞において自律的に複製可能なベクターであり得る。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの腸内細菌科の細菌における自律的に再現可能なベクターの例としては、プラスミドベクターｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ＲＳＦ１０１０、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＳＴＶ２８、ｐＳＴＶ２９、ｐＥＴ２０ｂ（＋）、ｐＥＴ２８ｂ（＋）（ｐＥＴベクターはＮｏｖａｇｅｎより入手可能）、ｐＬｙｓＳ、（ｐＨＳＧおよびｐＳＴＶベクターはＴａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．より入手可能）、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８（ｐＭＷベクターはＮｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より入手可能）など、およびそれらの誘導体が挙げられ得る。さらに、コリネ型細菌に対するベクターは、ｐＡＭ３３０（特開５８−６７６９９号公報）、ｐＨＭ１５１９（特開５８−７７８９５号公報）、ｐＳＦＫ６（特開２０００−２６２２８８号公報）、ｐＶＫ７（米国特許出願公開第２００３−０１７５９１２Ａ号明細書）、ｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１、ｐＡＪ１８４４（特開５８−１９２９００号公報）、ｐＣＧ１（特開第５７−１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（特開５８−３５１９７号明細書）、ｐＣＧ４、ｐＣＧ１１（特開５７−１８３７９９号公報）、ｐＨＫ４（特開平５−７４９１号公報）などが挙げられ得る。さらに、酵母のためのベクターとしては、酵母プラスミド、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）に対するｐＤ９０２またはｐＤ９０５、またはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対するｐＤ１２０１、ｐＤ１２０４、ｐＤ１２０５、ｐＤ１２０７、ｐＤ１２１１、ｐＤ１２１４  ｐＤ１２１５、ｐＤ１２１７、ｐＤ１２１８、ｐＤ１２２１、ｐＤ１２２４、ｐＤ１２２５、ｐＤ１２２７、ｐＤ１２３１、ｐＤ１２３４、ｐＤ１２３５、ｐＤ１２３７などが挙げられ得る。遺伝子はまた、周知の方法を使用して宿主染色体にも組み込まれ得る（例えばＤａｔｅｎｓｋｏおよびＷａｎｎｅｒ（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：６６４０−６６４５））。
【００５２】
酵素の活性の促進は、ゲノムＤＮＡまたはプラスミド上のプロモーターなどの標的遺伝子の発現制御配列を適切な強度を有するプロモーターで置き換えることによって、標的遺伝子の発現を促進することを含み得る。例えば、ｔｈｒプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｐＬプロモーター、ｔａｃプロモーターなどは、頻繁に使用されるプロモーターとして知られる。細菌などの微生物における高発現活性を有するプロモーターの例としては、伸長因子Ｔｕ（ＥＦ−Ｔｕ）遺伝子のプロモーター、ｔｕｆ、コシャペロニンＧｒｏＥＳ／ＥＬ、チオレドキシンレダクターゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のプロモーターなどが挙げられ得る（国際公開第２００６／０２８０６３号パンフレット、欧州特許第１６９７５２５号明細書）。強力なプロモーターおよびプロモーターの強度を評価するための方法の例は当技術分野で周知である。
【００５３】
さらに、国際公開第２０００／１８９３５号パンフレットで開示されるように、プロモーターが適切な強度を有するように、遺伝子のプロモーター領域においていくつかのヌクレオチドを置換することも可能である。例えば、温度感受性プラスミドを使用して、遺伝子置換の場合と同じように、発現制御配列の置換が行われ得る。エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはパントエア・アナナチス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）に対して使用され得る温度感受性複製起点を有するベクターの例としては、例えば国際公開第１９９９／０３９８８号パンフレットに記載のプラスミドｐＭＡＮ９９７、その誘導体などが挙げられ得る。さらに、発現制御配列の置換は、λ−ファージのＲｅｄレコンビナーゼを使用する「Ｒｅｄ−ドリブン（Ｒｅｄ−ｄｒｉｖｅｎ）組み込み」と呼ばれる方法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ，Ｋ．Ａ．およびＷａｎｎｅｒ，Ｂ．Ｌ．２０００，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：６６４０−６６４５）、Ｒｅｄ−ドリブン（Ｒｅｄ−ｄｒｉｖｅｎ）組み込み方法およびλ−ファージエクサイシブ（ｅｘｃｉｓｉｖｅ）系を組み合わせた方法（Ｃｈｏ，Ｅ．Ｈ．ら、２００２．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８４：５２００−５２０３）（国際公開第２００５／０１０１７５号パンフレット）など、直鎖状ＤＮＡを使用する方法によっても行われ得る。発現制御配列の修飾は、遺伝子コピー数を増加させることと組み合わせ得る。
【００５４】
さらに、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）と開始コドンとの間のスペーサー、および特に開始コドンのすぐ上流の配列、におけるいくつかのヌクレオチドの置換は、ｍＲＮＡの翻訳可能性に著しく影響を及ぼすことが知られている。これらの配列を修飾することによって翻訳を促進し得る。
【００５５】
標的遺伝子が上述のプラスミドまたは染色体に導入される場合、使用される微生物中で機能するプロモーターが選択される限り、遺伝子の発現に対してあらゆるプロモーターが使用され得る。プロモーターは、遺伝子のネイティブプロモーターまたは修飾されたプロモーターであり得る。遺伝子の発現はまた、選択される微生物において強力に機能するプロモーターを適切に選択することによっても、またはコンセンサス配列に近いプロモーターの−３５および−１０領域に近付けることによっても調節され得る。
【００５６】
代謝または合成経路に関与する外来核酸配列の形質転換、形質導入、接合または染色体挿入は、当技術分野で周知の方法を使用して確認され得る。このような方法としては、例えば、プラスミドまたは染色体ＤＮＡの抽出とそれに続く特異的な標的配列のポリメラーゼ連鎖増幅または制限マッピング、ノーザンブロットもしくはｍＲＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅などのさらなる核酸分析またはポリアクリルアミドゲル電気泳動または酵素活性測定または遺伝子産物の発現に対する免疫ブロッティング、または導入された核酸配列もしくはその対応する遺伝子産物の発現を試験するための他の適切な分析方法が挙げられる。所望の遺伝子産物を生産するのに十分な量で外来核酸が発現されることが当業者により理解され、当技術分野で周知の方法を使用して十分な発現を得るために発現レベルが最適化され得ることがさらに理解される。
【００５７】
注目すべきは、本発明の微生物において発現され得る酵素をコードする１つ以上の遺伝子がまた、この酵素の変異体、例えばポリペプチド配列において１つまたはいくつかのアミノ酸の置換、欠失、挿入または付加を含む変異体酵素、をコードする遺伝子も含み、このポリペプチドは未修飾酵素の活性を保持する。このような変異体酵素としては、未修飾酵素と比較した場合に酵素活性が低下している変異体酵素およびアロステリック調節が改変された酵素も挙げられる。
【００５８】
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル生産能および／またはその中間体を付与するかまたは促進するためのさらなる方法は、下方制御剤／阻害剤に対する耐性を付与すること、上方制御剤／活性化剤に対する感受性を付与すること、または他の化合物による酵素のアロステリック活性化の必要性の軽減を含み得る。
溶媒抽出
本発明の方法において、発酵培地と接触する有機相が提供され、この有機相は、発酵培地中よりも高濃度でＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル、好ましくはＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸アルキルを含む。
【００５９】
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル、例えばメタクリル酸ブチルなどの生産は、溶解度限界に到達するので、高濃度での発酵培地からの相分離という長所をもたらす。したがって、発酵培地中のＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルのタイターが十分に高い場合、さらなる抽出溶媒を必要とし得ず、次にエステルがそれ自身の有機相を形成する。
【００６０】
好ましくは、発酵培地中のＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルのタイターは、少なくとも５ｍｇ／Ｌである。例えば、５、１５、２５、３５、４５、５５、６５、７５、８５、９５、１０５、１１５、１２５、１３５、１４５、１５５ｍｇ／Ｌである。より好ましくは、タイターは１６０ｍｇ／Ｌ、１８０ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌ、２２０ｍｇ／Ｌまたは２４０ｍｇ／Ｌよりも大きい。
【００６１】
好ましい実施形態において、発酵培地中のＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルのタイターは発酵培地に対する溶解度限界であり、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルが分離して、それと接触する有機相を形成するようになる。
【００６２】
Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルがメタクリル酸ブチルである実施形態において、発酵培地中のメタクリル酸ブチルのタイターは、少なくとも１２０、１３０、１４０、１５０または２００ｍｇ／Ｌであることが特に好ましい。さらにより好ましいのは、発酵培地中での溶解度限界、およそ２２０ｍｇ／Ｌでのメタクリル酸ブチルのタイターである。このような濃度では、さらなる抽出溶媒が必要でなくなり得る。
【００６３】
したがって、本発明の実施形態において、ステップｂ）で提供される有機相は、微生物により生産されるＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルによって提供され得る。あるいは、実施形態において、ステップｂ）で提供される有機相は、発酵の前、その最中またはその後の何れかにおいて発酵培地（例えばこれに添加して）と接触する外部の有機溶媒を含み得る。例えば、有機溶媒は、発酵の前、その最中またはその後の何れかにおいて、層（例えば発酵培地の上の層）として発酵培地に添加し得る。外部有機溶媒は、好ましくは、それとの接触中に、発酵培地からＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを抽出するのに有効であり、一般的にはそれにより、前記のＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを含む。
【００６４】
外部有機溶媒を発酵培地と接触させる実施形態において、有機相は、好ましくは、培地の総体積（すなわち発酵培地および有機相の総体積）の５０％未満を構成する。より好ましくは、この状況において、有機相は、培地の総体積の４０％、３０％または２０％未満を構成する。
【００６５】
ステップｂ）で提供される有機相が、実質的に微生物により生産されるＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルにより提供される実施形態において、有機相は、培地の総体積（すなわち発酵培地および有機相の総体積）の２０％未満を構成する。より好ましくは、この状況において、有機相は、培地の総体積の１０％または５％未満を構成する。
【００６６】
実施形態において、有機溶媒は生体適合性であり、すなわち微生物にとってあまり毒性が高くない。
実施形態において、有機溶媒のｌｏｇＰｏ／ｗ値は、３．０以上である。より好ましくは有機溶媒のｌｏｇＰｏ／ｗ値は、３．６、３．７、３．８、３．９または４．０以上である。ｌｏｇＰｏ／ｗは、１−オクタノールおよび水の標準１：１混合物の間の特定の溶媒の分配係数の対数として定義される。発明者らは、ｌｏｇＰｏ／ｗ値の上昇に従い、得られる微生物毒性が低下することを示した。特に好ましい溶媒は、Ｃ３以上の１つ以上の置換基、特に直鎖状または分岐状であり得るアルキル置換基で置換される、Ｃ７以上の直鎖状または分岐状、環式アルカンおよび芳香族化合物、特にベンゼン、であり得る、Ｃ６以上の高級アルカンである。
【００６７】
実施形態において、有機溶媒は、トリブチリン、イソプロピルベンゼン、ｎ−プロピルベンゼン、シクロヘプタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロオクタン、イソオクタン、１，４−ジイソプロピルベンゼン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカンまたはドデカンおよびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００６８】
有機溶媒は、イオン性の液体でもあり得る。このような実施形態において、有機溶媒は、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムビス（２−エチルヘキシル）ホスフェート、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムジシアナミド、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムビス（トリフルオロメタン）スルホンイミド、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムアセスルファム、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムサッカリネート、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムサリチレート、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムトリフルオロメタンスルホネート、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムビス（２，４，４−トリメチルペンチル）ホスフィネート、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムジシアナミド、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムオクタノエート、トリヘキシル（テトラデシル）ホスホニウムシクロメート、トリブチル（オクチル）ホスホニウムビス（トリフルオロメタン）スルホンイミド、トリブチル（オクチル）ホスホニウムサリチレート、トリブチル（オクチル）ホスホニウムトリフルオロメタンスルホネート、トリブチル（オクチル）ホスホニウムアセスルファム、トリブチル（オクチル）ホスホニウムサッカリネート、トリブチル（オクチル）ホスホニウムビス（トリフルオロメタン）スルホンイミド、トリブチル（メチル）アンモニウムビス（トリフルオロメタン）スルホンイミドまたはテトラオクチルアンモニウムアセスルファムまたはそれらの混合物からなる群から選択される。
【００６９】
本発明において、本方法には、発酵培地との接触から有機相を取り除くことが含まれる。当業者により認められようが、「有機相を取り出す」という句は、必ずしも有機相全体が取り出されることを示さない。ステップｃ）で有機相全体（または有機相の殆ど）が取り出され得るものの、どの時点においても、有機相の一部のみが取り出され得ることが認められよう。連続方法において、有機相は、発酵培地中でのエステル生産と釣り合った状態で、連続的に取り出され得る。
【００７０】
実施形態において、本発明の方法のステップｃ）における有機相の取り出しは、連続的であり得、すなわち方法全体を通じて行われ得る。あるいは、有機相の取り出しは、断続的、すなわち方法中の定められた時点で行われ得る。
【００７１】
本発明の実施形態において、本方法は、例えば蒸留により有機相中のＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを精製すること（例えば有機相の取り出し）をさらに含み得る。
エステル交換反応
本発明は、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対してエステル交換反応を行い、メタクリル酸メチルを生成させることを含む。
【００７２】
本発明のステップｄ）のエステル交換反応は、メタノールおよび触媒の存在下で行われる。
実施形態において、エステル交換は触媒の存在下で行われる。何らかの適切な触媒、例えば酸もしくは塩基触媒または生体触媒、例えばリパーゼなどの酵素などを利用し得る。
【００７３】
触媒は均一系または不均一系触媒であり得る。一実施形態において、触媒は、液体反応相中で溶解され得る。しかし、触媒は、反応相が通過し得る固体支持体上に懸垂され得る。この状況において、反応相は、好ましくは液体、より好ましくは液相中で維持される。好ましくは、触媒は均一系である。
【００７４】
当業者により認められようが、均一系触媒は、反応物と同じ相の触媒であり、一方で不均一系触媒は、反応物とは異なる相の触媒である。
好ましくは、触媒は塩基性塩触媒である。好ましくは、塩基性触媒は、金属酸化物、水酸化物、炭酸塩、酢酸塩（エタン酸塩）、アルコキシド、炭酸水素塩または分解可能なジもしくはトリカルボン酸の塩、または上記のうち１つの四級アンモニウム化合物；より好ましくは第Ｉ族または第ＩＩ族金属酸化物、水酸化物、炭酸塩、酢酸塩、アルコキシド、炭酸水素塩またはジもしくはトリカルボン酸の塩またはメタクリル酸を含む。塩基性触媒は１つ以上のアミンも含み得る。最も好ましくは、触媒は第Ｉ族または第ＩＩ族金属水酸化物またはアルコキシドである。
【００７５】
好ましくは、触媒は次のうち１つ以上：ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｂａ（ＯＨ）２、ＣｓＯＨ、Ｓｒ（ＯＨ）２、ＲｂＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、Ｌｉ２ＣＯ３、Ｎａ２ＣＯ３、Ｋ２ＣＯ３、Ｒｂ２ＣＯ３、Ｃｓ２ＣＯ３、ＭｇＣＯ３、ＣａＣＯ３、ＳｒＣＯ３、ＢａＣＯ３、（ＮＨ４）２ＣＯ３、ＬｉＨＣＯ３、ＮａＨＣＯ３、ＫＨＣＯ３、ＲｂＨＣＯ３、ＣｓＨＣＯ３、Ｍｇ（ＨＣＯ３）２、Ｃａ（ＨＣＯ３）２、Ｓｒ（ＨＣＯ３）２、Ｂａ（ＨＣＯ３）２、ＮＨ４ＨＣＯ３、Ｌｉ２Ｏ、Ｎａ２Ｏ、Ｋ２Ｏ、Ｒｂ２Ｏ、Ｃｓ２Ｏ、ＭｇＯ、ＣａＯ、ＳｒＯ、ＢａＯ、Ｌｉ（ＯＲ１）、Ｎａ（ＯＲ１）、Ｋ（ＯＲ１）、Ｒｂ（ＯＲ１）、Ｃｓ（ＯＲ１）、Ｍｇ（ＯＲ１）２、Ｃａ（ＯＲ１）２、Ｓｒ（ＯＲ１）２、Ｂａ（ＯＲ１）２、ＮＨ４（ＯＲ１）（式中、Ｒ１は、Ｃ１〜Ｃ６分岐状、非分岐状または環式アルキル基であり、任意選択により１つ以上の官能基で置換される）；ＮＨ４（Ｒ２ＣＯ２）、Ｌｉ（Ｒ２ＣＯ２）、Ｎａ（Ｒ２ＣＯ２）、Ｋ（Ｒ２ＣＯ２）、Ｒｂ（Ｒ２ＣＯ２）、Ｃｓ（Ｒ２ＣＯ２）、Ｍｇ（Ｒ２ＣＯ２）２、Ｃａ（Ｒ２ＣＯ２）２、Ｓｒ（Ｒ２ＣＯ２）２またはＢａ（Ｒ２ＣＯ２）２（式中、Ｒ２ＣＯ２は酢酸基（ａｃｅｔａｔｅ）である）；（ＮＨ４）２（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｌｉ２（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｎａ２（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｋ２（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｒｂ２（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｃｓ２（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｍｇ（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｃａ（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｓｒ（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、Ｂａ（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）、（ＮＨ４）２（ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２）（式中、ＣＯ２Ｒ３ＣＯ２はシュウ酸基（ｏｘａｌａｔｅ）である）；メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシルアミン、シクロヘキシルアミン、アニリン；Ｒ４ＮＯＨ（式中、Ｒは、メチル、エチル  プロピル、ブチルである）；ジアザビシクロウンデセンおよびジアザビシクロノナンから選択される。
【００７６】
より好ましくは、触媒は、次のうち１つ以上：−ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、Ｍｇ（ＯＨ）２、Ｃａ（ＯＨ）２、Ｂａ（ＯＨ）２、ＣｓＯＨ、Ｓｒ（ＯＨ）２、ＲｂＯＨ、ＮＨ４ＯＨ、Ｌｉ（ＯＲ１）、Ｎａ（ＯＲ１）、Ｋ（ＯＲ１）、Ｒｂ（ＯＲ１）、Ｃｓ（ＯＲ１）、Ｍｇ（ＯＲ１）２、Ｃａ（ＯＲ１）２、Ｓｒ（ＯＲ１）２、Ｂａ（ＯＲ１）２、ＮＨ４（ＯＲ１）（式中、Ｒ１は、何れかのＣ１〜Ｃ６分岐状、非分岐状または環式アルキル基であり、任意選択により１つ以上の官能基で置換される）；ジアザビシクロウンデセンおよびジアザビシクロノナンから選択される。
【００７７】
最も好ましくは、触媒は、次のうち１つ以上：−ＬｉＯＨ、ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＲｂＯＨ、ＣｓＯＨ、Ｌｉ（ＯＲ１）、Ｎａ（ＯＲ１）、Ｋ（ＯＲ１）、Ｒｂ（ＯＲ１）、Ｃｓ（ＯＲ１）（式中、Ｒ１はメチル基である）；ジアザビシクロウンデセンおよびジアザビシクロノナンから選択される。
【００７８】
好ましい触媒としては、第Ｉ族および第ＩＩ族塩基性金属塩、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウム、フランシウム、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウムまたはラジウム塩が挙げられる。特に好ましいのは、リチウム、ナトリウム、カリウム、ルビジウム、セシウムまたはフランシウム（すなわち第Ｉ族金属）塩である。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態において、触媒は、第Ｉ族メトキシドまたは水酸化物、例えばナトリウムメトキシド、リチウムメトキシド、カリウムメトキシド、水酸化ナトリウム、水酸化リチウムまたは水酸化カリウムを含む。
【００８０】
特に好ましい実施形態において、触媒は、第Ｉ族または第ＩＩ族メトキシド、好ましくは第Ｉ族メトキシドである。第Ｉ族メトキシド、特にリチウムメトキシドは、他の触媒ほど急速に不活性化されないので、特に有利であることが発明者らにより示され、したがって、（バッチ反応に加えて）連続方法で使用され得る。
【００８１】
実施形態において、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルは本発明のステップｃ）で取り出される有機相に存在し、本発明は、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルに対してエステル交換を行うことを含む。ステップｄ）のエステル交換反応は、ステップｃ）の有機相の取り出しと同時に行ってもよいし、またはステップｃ）の有機相の取り出し後に行ってもよい。
【００８２】
実施形態において、エステル交換反応は、触媒に対するｍｏｌ％水が５００％、４００％、３００％、２００％または１００％以下である条件下で行われる。好ましくは、触媒に対するｍｏｌ％水は、９０％、８０％、７０％または６０％以下である。より好ましくは、触媒に対するｍｏｌ％水は、５０％、４０％、３０％、３５％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％または１％以下である。好ましくは、エステル交換反応は水の非存在下で行われる。
【００８３】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、エステル交換反応中に存在する水が減少すると、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル、特にメタクリル酸ブチルのメタクリル酸メチルへの変換が増加することを示した。したがって、本発明の好ましい実施形態において、（例えば水性の発酵培地の形態で）エステル交換反応中に存在する水を減少させるために、ステップｄ）のエステル交換反応前に有機相のさらなる精製（または乾燥）を行う。
【００８４】
したがって、実施形態において、本方法は、任意選択によりステップｄ）のエステル交換反応前に、有機相を精製する（または乾燥させる）ステップを含む。任意選択により、精製または乾燥は蒸留により達成される。
【００８５】
本発明の実施形態において、本方法は、ｅ）エステル交換反応が行われる培地からＭＭＡを精製することをさらに含む。このような精製は例えば蒸留により達成され得る。
発酵および発酵培地
本発明において、微生物がＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを生産する条件下で、発酵培地中で微生物が提供される。
【００８６】
実施形態において、本発明は、前記の発酵培地中で微生物を培養することを含む。培養することまたは培養は、適切に、微生物がエネルギーを引き出し、増殖し得る炭素に基づく原料を必要とする。したがって、好ましくは、微生物は炭素に基づく原料において培養される。
【００８７】
発酵培地は、微生物を取り囲む周囲の培地であり得る。好ましくは、炭素に基づく原料は培地中に存在し、任意選択により培地中で溶解されるか、または懸濁されるか、培地に通気されるか、および／または培地と混合される。したがって、好ましくは、本培地は、何らかの緩衝物および塩とともに、微生物および炭素に基づく原料を含む。
【００８８】
発酵培地は、微生物のニーズに適切な、何らかの市販の培地であり得る。発酵培地は適切には、炭素に基づく原料および窒素供給源ならびに微生物の増殖および／またはＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの形成に必要なさらなる化合物を含有する。
【００８９】
当技術分野で公知の適切な炭素に基づく原料の例としては、グルコース、マルトース、マルトデキストリン、スクロース、加水分解デンプン、デンプン、リグニン、芳香族化合物、合成ガスまたはその構成成分、メタン、エタン、プロパン、ブタン、モラセスおよび油が挙げられる。好ましくは、炭素に基づく原料はバイオマス由来である。混合物も使用され得、ならびに廃棄物、例えば都市廃棄物、食品加工、林業または農業からの食品廃棄物およびリグノセルロース系廃棄物なども使用し得る。
【００９０】
当技術分野で公知の適切な窒素供給源の例としては、ダイズミール、コーンスティープリカー、酵母エキス、アンモニア、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、窒素ガスまたは他の窒素供給源が挙げられる。
【００９１】
微生物増殖のために必要とされ得る（および、したがって発酵培地中に存在し得る）さらなる化合物の例としては、抗生物質、抗真菌剤、抗酸化剤、緩衝剤、リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム塩、微量元素および／またはビタミンが挙げられる。
【００９２】
微生物の様々なクラス間で、すなわち真菌、酵母および細菌の間で変動し得る量で、リン酸塩、硫酸塩または微量元素のような、微生物の増殖のために、および／またはＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの生産のために必要とされるさらなる化合物が添加され得る。さらに、添加しようとするさらなる化合物の量は、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを形成させるために使用される経路が何であるかによって決定され得る。
【００９３】
培地に添加しようとする炭素に基づく原料および窒素供給源の量は、微生物のニーズおよび／または微生物の培養の長さに依存して変動し得る。培養培地中の炭素に基づく原料と窒素供給源との比はかなり変動し得る。
【００９４】
一般的には、形成されるバイオマスの量は使用される炭素に基づく原料の量および何らかのフィーディングレジメ中に課される栄養制限により主に決定されるので、微生物の増殖に必要な各発酵培地構成成分の量は、栄養分に対して増殖収率を測定することによって決定され、培養プロセス中で使用される炭素に基づく原料の量に関してさらに評価される。
【００９５】
炭素に基づく原料がバイオマス由来である実施形態において、バイオマスは、好ましくは大量の炭水化物を含む。特に好ましいのは、Ｃ５またはＣ６糖の供給源である炭水化物、炭素に基づくガスまたは芳香族化合物、好ましくはＣ５もしくはＣ６糖、より好ましくはグルコース、例えばデンプン、リグニン、セルロース、グリコーゲン、アラビノキシラン、キチンまたはペクチンなどであるが限定されない。
【００９６】
あるいは、バイオマスは、大量の脂肪を含み得、特に好ましいのは、グリセロールおよび脂肪酸、具体的にはトリグリセリドの供給源である脂肪または油である。適切なトリグリセリドとしては、植物または動物性供給源から容易に入手可能な何らかの油または脂肪が挙げられる。このような油および脂肪の例としては、パーム油、亜麻仁油、ナタネ油、ラード、バター、ニシン油、ヤシ油、植物油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ダイズ油、オリーブ油、カカオバター、ギー、脂身などが挙げられる。
【００９７】
バイオマスは、１つ以上の異なるバイオマス供給源から構成され得る。適切なバイオマス供給源の例としては、原木、エネルギー作物、農業残渣、食品廃棄物、都市廃棄物および工業廃棄物または副産物が挙げられる。
【００９８】
原木バイオマス供給源としては、木片、樹皮、枝くず、丸太、おがくず、木材ペレットまたはブリケットが挙げられ得るが限定されない。
エネルギー作物バイオマス供給源としては、短期輪作雑木林または森林、ススキなどの非木材草本、ヘンプスイッチグラス、アシまたはライムギ、砂糖などの農作物、デンプンまたは油作物または微細藻類または大型藻類および海藻などの水生植物が挙げられ得るが限定されない。
【００９９】
農業残渣としては、外皮、麦藁、トウモロコシ茎葉、小麦粉、子実、家禽敷料、肥料、スラリー、合成ガスまたは貯蔵牧草が挙げられ得るが限定されない。
食品廃棄物としては、果皮／皮、殻、殻皮、芯、種／核果、動物または魚の食用に適さない部分、絞り汁からのパルプおよび石油抽出物、醸造由来の大麦絞り粕またはホップ、一般家庭の台所の廃棄物、ラードまたは油または脂肪が挙げられ得るが限定されない。
【０１００】
工業廃棄物としては、ペレットを含む未処理材木、処理済み材木、シェールガス、ＭＤＦ／ＯＳＤを含む木質複合材、合板、紙パルプ／破砕物／廃棄物、繊維／糸／廃液を含む織物または下水スラッジが挙げられ得るが限定されない。
【０１０１】
微生物は、バッチ、反復バッチ、流加、反復流加または連続培養プロセスとして培養し得る。
培養プロセスは、好ましくは工業的規模で行われる。工業的規模のプロセスは、≧０．０１ｍ３、好ましくは≧０．１ｍ３、好ましくは≧０．５ｍ３、好ましくは≧５ｍ３、好ましくは≧１０ｍ３、より好ましくは≧２５ｍ３、より好ましくは≧５０ｍ３、より好ましくは≧１００ｍ３、最も好ましくは≧２００ｍ３である体積規模の１つ以上の発酵槽中での培養プロセスを包含すると理解される。
【０１０２】
実施形態において、培養はバイオリアクター中で行われる。バイオリアクターは、一般に、微生物が工業的に培養される容器を意味すると理解される。バイオリアクターは、あらゆるサイズ、数および形態であり得、栄養素、増殖のためのさらなる化合物、新鮮培地、炭素に基づく原料、空気、窒素、酸素または二酸化炭素などであるが限定されないガスの添加物を提供するための注入口を含み得る。バイオリアクターは、発酵培地からＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを回収するために培養培地の体積を取り出すための出口も含み得る。バイオリアクターは、培養物の試料採取のための出口も有し得る。
【０１０３】
バイオリアクターは、一般に、例えば培養物を通じた、撹拌、振動、振盪、転倒撹拌、ガス通気などにより発酵培地を混合させるように設定され得る。あるいは、一部の連続培養は混合を必要とせず、例えばマイクロリアクター系は栓流系を使用する。バイオリアクターは一般的であり、当技術分野で周知であり、例は「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ａｕｔｈｏｒｓ：Ｗｕｌｆ  ＣｒｕｅｇａｒおよびＡＮｎｅｌｉｓｅ  Ｃｒｕｅｇｅｒ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ訳、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ」などの標準的な教科書で見出され得る。
【０１０４】
記載され、例示される実施形態は、実例とみなすべきであり、限定的な性質のものではなく、好ましい実施形態のみが示され、記載されているものであり、特許請求の範囲で定められるような本発明の範囲内に入る変更および改変は全て、保護されることが望まれると理解される。
【０１０５】
本記載中での「好ましい」、「好ましくは」、「好まれる」または「より好まれる」などの語の使用がそのように記載される特性が所望され得ることを示唆する一方で、これはそれでもなお必要とされるものではなく、このような特性を欠く実施形態が、添付の特許請求の範囲で定められるような本発明の範囲内であるとして企図され得ることを理解されたい。特許請求の範囲に関連して、「ａ」、「ａｎ」または「少なくとも１つ」などの語が特性の前に置かれるために使用される場合、請求項において具体的にそうでないと述べられない限り、唯一のこのような特性に請求項を限定するものではないものとする。
【０１０６】
ここで、次のものを示す次の図面を参照して本発明をさらに記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＣＸ４タンパク質の発現のためのプラスミド  ｐＭＭＡ１２１の構造。
【図２】組み換えＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から生産されたアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＣＸ４タンパク質を用いたイソブチリル−ＣｏＡからのメタクリリル−ＣｏＡの生産。
【図３】アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＣＸ４タンパク質を含有する組み換えＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図４】組み換えＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における、リンゴＡＡＴ（ＭｐＡＡＴ１）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡＣＸ４およびシュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡ０１株由来のｂｋｄＡ１、ｂｋｄＡ２、ｂｋｄＢおよびＩｐｄＶ：ＢＣＫＡＤ複合遺伝子の発現のためのプラスミドｐＷＡ００８、ｐＭＭＡ１３３およびｐＭＭＡ１３４の構造。
【図５】プラスミドｐＭＭＡ１３４を発現する組み換えＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）生産の培養物の試料のＨＰＬＣ分析による、２−ケトイソ吉草酸エステル（２−ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）およびブタノールからのメタクリル酸ブチルの生産。■、２−ケトイソ吉草酸エステル（２−ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）（２−ＯＩＶ）；▲、イソ酪酸（ＩＢＡ）；◆、メタクリル酸ブチル（ＢＭＡ）；およびｘ、メタクリル酸（ＭＡＡ）。
【図６】触媒としてナトリウムメトキシドを用いた、反応温度に対する、ｎ−ＢＭＡからＭＭＡへの変換。
【図７】触媒として水酸化リチウムを用いた、反応温度に対する、ｎ−ＢＭＡからＭＭＡへの変換。
【図８】触媒として水酸化リチウムを用いた、反応温度での時間に対する、ｎ−ＢＭＡからＭＭＡへの変換。
【図９】リチウムメトキシドにより触媒される反応中の時間に伴うｎＢＭＡからＭＭＡへの変換の変化。
【図１０】ＬｉＯＨおよびＬｉＯＭｅにより触媒される初期エステル交換反応後のメタノールおよびｎＢＭＡのさらなる添加時のｎＢＭＡのエステル交換反応についての時間に対するＭＭＡへの変換のプロット。
【図１１】水含量を漸増させた、ｎＢＭＡのエステル交換についての時間に対するＭＭＡへの変換のプロット。
【発明を実施するための形態】
【０１０８】
発明者らは、ＭＭＡが微生物を使用することによってどのように効率的に生産され得るかを決定するために詳細な試験を行った。特に、詳細な実験ではあるが、発明者らは、発酵によりＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルが生産されるステップを介してＭＭＡが生産され得る方法を開発した。発明者らは、驚くべきことに、このような方法を実行不可能にすると以前は考えられた微生物に対するこのようなＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの毒性にもかかわらず、このような方法を開発することができた。
一般的な材料および方法
培養物増殖および維持
微生物
エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）およびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を１６％グリセロール保存溶液中、−８０℃で保存した。実験用培養物を寒天プレート上で準備した。
ルリア・ベルターニ（ＬＢ）および寒天調製
ＬＢ培地に言及するときはいつも、ルリア・ベルターニ高塩濃度培地（Ｍｅｌｆｏｒｄ）（２５ｇ／Ｌ）を使用した。カゼイン消化物からのペプトン（１０ｇ）、酵母エキス（５ｇ）および塩化ナトリウム（１０ｇ）を１Ｌ水中で溶解させることによってＬＢ培地を調製した。１２６℃、１５分間オートクレーブにかけることによってこの混合物を滅菌し、次いで室温まで冷ました。液体ＬＢ培地は、室温で最長１週間、密封滅菌デュラン瓶中で保存した。ＬＢ高塩濃度培地（２５ｇ／Ｌ）および寒天（２０ｇ／Ｌ）を使用して、ＬＢ寒天プレートを調製した。オートクレーブにかけ、５０℃水浴中で冷ました後、無菌的技術を使用して滅菌ペトリ皿に注ぐことによって、ＬＢおよび寒天混合物を滅菌した。４℃で最長２週間にわたりプレートを保存した。
酵母エキス−ペプトン−デキストロース（ＹＥＰＤ）および寒天調製
蒸留水（１Ｌ）中で酵母エキス（３ｇ）、麦芽エキス（３ｇ）、ダイズ由来ペプトン（５ｇ）およびグルコース（１０ｇ）を溶解させることによって、酵母エキス−ペプトン−デキストロース（ＹＥＰＤ）培地および寒天プレートを調製した。寒天プレートを調製する場合は、寒天（１５ｇ）を添加した。混合物を１２６℃で１５分間オートクレーブにかけ、次いで６０℃に冷ました後、無菌的技術を使用してプレートを滅菌ペトリ皿に流し込んだ。４℃で最長２週間にわたりプレートを保存した。室温で最長１週間にわたり液体ＹＥＰＤ培地を保存した。
ＭＳＸブロス調製
最少塩（ＭＳＸ）培地を３つの部分で調製した；ＭＳＡ、ＭＳＢおよびＶｉｓｈｎｉａｃ微量元素。ＥＤＴＡ二ナトリウム塩（５０ｇ）を水（８００ｍＬ）と合わせ、ＫＯＨペレット（１回で２〜３粒）を添加することにより溶解させることによって、Ｖｉｓｈｎｉａｃ微量元素溶液（１Ｌ）を調製した。次に化学物質を次の順序で添加した；ＺｎＳＯ４（２．２ｇ）、ＣａＣｌ２（５．５４ｇ）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（５．０６ｇ）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（５ｇ）、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ（１．１ｇ）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（１．５７ｇ）およびＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（１．６１ｇ）。ＫＯＨ（１Ｍ）を使用して溶液をｐＨ６に調整し、次いで水を使用して１Ｌにした。溶液を４℃で最長６か月間保存した。水（６６０ｍＬ）中でＫＨ２ＰＯ４（６ｇ）およびＶｉｓｈｎｉａｃ微量元素（２ｍＬ）を溶解させることによってＭＳＡを調製した。ＫＯＨ（１Ｍ）を使用して溶液をｐＨ７に調整した。次いで、溶液を水で７６０ｍＬにした。水（２００ｍＬ）中でＮＨ４Ｃｌ（３ｇ）およびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．４ｇ）を溶解させることによって、ＭＳＢを調製した。水（１００ｍＬ）中でＤ−グルコース（１２．５ｇ）を溶解させることによって、グルコース（１２．５％）の保存溶液も調製した。１２６℃で個別に１５分間にわたり、ＭＳＡ、ＭＳＢおよびグルコース（４０ｍＬ）をオートクレーブにかけ、次に、冷めたら無菌的に合わせて、最終的な溶液のｐＨが６．８となった。この溶液を室温で最長１週間にわたり保存した。
液体培地中での微生物の培養
全般
４本の使い捨て接種用ループを用いて、グリセロール保存溶液から、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を滅菌寒天プレート上に画線した。接種したプレートをＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対してそれぞれ３７℃または３０℃にてインキュベーターに一晩入れた。無菌技術を使用して、適量の滅菌ＬＢ、ＹＥＰＤまたはＭＳＸ培地（１００ｍＬフラスコ中２５ｍＬの培地および２５０ｍＬフラスコ中５０ｍＬの培地）を滅菌エーレンマイヤーフラスコに添加し、ポリウレタンフォーム栓を嵌め込み、アルミホイルで覆った。寒天プレートから接種するために、使い捨て接種用ループを用いて、よく単離された単一コロニーをプレートから取り出した。適切な培地を含有する予めオートクレーブ処理したフラスコにコロニーを移した。フラスコストッパーを取り換え、個々の微生物に対して３０または３７℃、２００ｒｐｍでオービタルインキュベーターにおいてフラスコを温置した。ＯＤ６００値が≒０．８に達したら、滅菌ピペットを使用して接種物のアリコートを一晩培養物から取り出し、予めオートクレーブ処理したフラスコに移した。培養のこのステップで必要とされるフラスコのタイプおよび体積は各試験に特異的であり、この章の各関連セクションで述べる。この方法は、この論文全体を通じて行われる増殖および毒性試験のための全ての培養物を最初に接種するために使用した。
【０１０９】
ｌｎＮｔ／Ｎ０＝μｔという式（式中、Ｎｔは、時間ｔ（ｈ）での任意光散乱単位であり、μは増殖速度（ｈ−１）である）を使用して、指数増殖期において培養物の特異的な増殖速度を計算した。増殖速度は、増殖培地のタイプに依存して、および異なる試験間でも、僅かに変動し、したがって、全ての増殖試験結果は、特定の試験に並行した対照実験の％値として表す。
増殖阻害試験−振盪フラスコ培養物
メタクリル酸エステルの揮発性およびプラスチックウェルプレートを分解する能力ゆえに、滅菌４０ｍＬテフロン（登録商標）密封ガラスバイアル中でメタクリル酸エステル毒性試験を行った。無菌的技術を使用して、各バイアルに対して、ＬＢまたはＭＳＸ培地の適切な培地をＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して添加し、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対してＹＥＰＤを添加した。次いで培地にＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の一晩培養物（１００μＬ）を接種した。次に、対照試験としてこれらの構成成分のみを含有するバイアルを１本だけ残し、残りの３本のバイアルに所望のメタクリル酸エステルを添加した。メタクリル酸エステルあたり４本のバイアルを、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対してそれぞれ３０または３７℃、２５０ｒｐｍに設定したオービタルインキュベーターに移した。最初に３０分ごとに水媒体相を試料採取し、細胞が指数増殖期に入ったら１０分ごとに試料採取し、定常期に達したら再び３０分ごとに試料採取して、増殖曲線を作成した。滅菌ガラスシリンジおよび針を使用してテフロン（登録商標）密封フタを通じて試料を採取し、適切な検出範囲に試料を希釈して、ＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計を使用してＯＤ６００の値を記録した。
【０１１０】
【表１】
2019535327.tif 000003
【０１１１】
【表２】
2019535327.tif 000004
【０１１２】
分析方法
バイオマス濃度
ポリスチレンキュベット（１０ｍｍ経路長）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３分光光度計で６００ｎｍにて光学密度（ＯＤ）測定を行った。分析しようとする試料（１ｍＬ）をキュベットに移し、ＯＤを測定した。読み取り値が０〜０．８の範囲外であった場合、指定範囲内にそれらが入るまで試料をｄＨ２Ｏ中で１０倍希釈した。
ガスクロマトグラフィー
次の操作条件下でガスクロマトグラフィーを使用して、ＢＭＡ／ＭＭＡ抽出実験からの試料を分析した：
【０１１３】
【表３】
2019535327.tif 000005
【０１１４】
次の操作条件下でガスクロマトグラフィーを使用して、エステル交換実験からの試料を分析した：
【０１１５】
【表４】
2019535327.tif 000006
【実施例】
【０１１６】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対する高級メタクリル酸エステルの毒性
発明者らは、微生物、特にＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＧ１６５５およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＤＳＭ７０４４９に対するＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルの毒性を調べた。
【０１１７】
特に、メタクリル酸エステルの様々な濃度の存在下で、それぞれＬＢおよびＹＥＰＤ培地中でＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＳＭ７０４４９を増殖させることによって、メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）、メタクリル酸イソプロピル（ｉＰＭＡ）およびメタクリル酸ブチル（ＢＭＡ）の相対的毒性を調べた。
【０１１８】
最終バイオマス濃度を７２時間後に記録し、各エステルに対する阻害濃度（ＩＣ５０）を計算するために使用した。これは、エステル非存在下での増殖と比較して、最大光学密度（ＭａｘＯＤ６００）を半分にするエステルの濃度である（表１参照）。
【０１１９】
【表５】
2019535327.tif 000007
【０１２０】
細胞をＭＳＸ培地中で増殖させた場合のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対するＭＭＡ、ｉＰＭＡおよびＢＭＡの毒性も調べた。最終バイオマス濃度を使用して、各エステルに対する阻害濃度（ＩＣ５０）を計算した（表２参照）。
【０１２１】
【表６】
2019535327.tif 000008
【０１２２】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の両方に対して、試験した全エステルが毒性であった（表１および２）。しかし、より短鎖のメタクリル酸エステルと比較して、ＢＭＡ存在下で顕著な毒性上昇が示され、微生物に対して呈される毒性ゆえに、このエステルを生産させるための発酵の使用が困難になる。
組み換えエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）による２−ケトイソ吉草酸エステル（２−ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）からのメタクリル酸ブチルの生産
次いで、発明者らは、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル、例えばメタクリル酸ブチルがＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの微生物により生産され得るか否かを判定するための実験を行った。
【０１２３】
アラバドプシス・タリアナ（Ａｒａｂａｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のＡＣＸ４遺伝子をＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対してコドン最適化し、合成し、ｐＥＴ１６ｂ（Ｓｓｅ）ベクターにクローニングした。この遺伝子をＮｈｅ１／Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化し、Ｘｂａ１／Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化したｐＥＴ１６ｂ（Ｓｓｅ）においてライゲーションした。得られたプラスミド、ｐＭＭＡ１２１（図１参照）をＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、組み換えＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭＭＡ１２１）を次のように培養した。
【０１２４】
アンピシリン（０．１ｍｇ／ｍＬ）を補充したＬＢ培地において、ＢＬ（ＤＥ３／）ｐＥＴ１６ｂ（ベクター対照）またはＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭＭＡ１２１を接種し、試験管中で３７℃にて一晩増殖させた。一晩培養物のアリコートをフラスコ中の１００ｍＬの同じ培地に移し、３７℃で２〜３時間振盪した。ＩＰＴＧ（最終１ｍＭ）をフラスコに添加し、２０℃で一晩振盪しながら培養物を温置した。
【０１２５】
遠心分離により細胞を回収し、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で懸濁し、次いで超音波により破砕した。破砕されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を上清およびペレット分画へと遠心分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ＡＣＯ（アシル−ＣｏＡオキシダーゼ）活性（図２参照）について、およびＡＣＸ４タンパク質に対する発現（図３参照）について、ベクター対照およびｐＭＭＡ１２１含有細胞の両方を分析した。
【０１２６】
図２は、緩衝液中のＩＢＡ−ＣｏＡのみの存在、未改変プラスミドｐＥＴ１６ｂのみを含む細胞を含有する試料中のＩＢＡ−ＣｏＡおよび少量のＣｏＡの存在および、プラスミドｐＭＭＡ１２１を含む細胞を含有する試料中の、ＭＡＡ−ＣｏＡ、はるかに少ないＩＢＡ−ＣｏＡおよび未知化合物の存在を示す。したがって、メタクリリルＣｏＡの生産により示されるＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭＭＡ１２１の上清分画中で高ＡＣＯ活性が検出され、これにより、図３のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出される４０ｋＤａタンパク質がＡＣＸ４タンパク質であることが示される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、レーン１−ＢＬ２１／ｐＥＴ１６ｂ（ベクター）ＳＦ（可溶性分画）；レーン２−ＢＬ２１／ｐＭＭＡ１２１  ＳＦ；レーン３−ＢＬ２１／ｐＥＴ１６ｂ  ＩＦ（不溶性分画）；レーン４−ＢＬ２１／ｐＭＭＡ１２１  ＩＦ；およびレーン５−分子量マーカーを示す。４０ｋＤａ前後で、バンド（黒い囲みにより強調）が観察されたのはＢＬ２１／ｐＭＭＡ１２１レーンのみであり、ＢＬ２１／ｐＥＴ１６ｂ（ベクター）レーンでは観察されなかった。
【０１２７】
次のようにシュードモナス・エルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡ０１株からＢＣＫＡＤ複合遺伝子をクローニングした。ＢＣＫＡＤ複合遺伝子をコードする遺伝子オペロン全体を含有するＤＮＡ断片は、鋳型としてゲノムＤＮＡを使用して、プライマーＢＣＫＡＤ．ＦおよびＢＣＫＡＤ．Ｒを用いたＰＣＲにより得た。得られた断片を制限酵素ＢｓｐＨＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉで消化し、Ｎｃｏ１／Ｓｓｅ８３８７Ｉ（ｐＥＴ１６ｂのＢａｍＨ部位をＳｓｅ８３８７Ｉ部位に変換した）の間でベクターｐＥＴ１６ｂ（Ｓｓｅ）に挿入した。得られたプラスミドをｐＷＡ００８と名付けた（図４参照）。
【０１２８】
リンゴＡＡＴおよびＡ．タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＡＣＸ４を発現させるためのプラスミドを次のように構築した。鋳型としてそれぞれコドン最適化ＡＡＴ遺伝子またはｐＭＭＡ１２１を含有するプラスミドを使用して、プライマーＡＡＴ．ＦおよびＡＡＴ．ＲまたはＡＣＸ４．ＦおよびＡＣＸ４．Ｒを用いて、ＰＣＴによって、ＡＡＴまたはＡＣＸ４遺伝子を含有するＤＮＡ断片を増幅させた。ｐＥＴ（Ｓｓｅ）ベクターを制限酵素ＮｃｏＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉで消化し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）を使用することによって、ＡＡＴ遺伝子を含有するＤＮＡ断片と連結させた。得られたプラスミド、ｐＡＡＴ２１２を制限酵素ＳｐｅＩで消化し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットを使用することによってＡＣＸ４遺伝子を含有するＤＮＡ断片と連結させた。得られたプラスミド、ｐＭＭＡ１３３は、Ｔ７プロモーター調節とともにＡＡＴおよびＡＣＸ４遺伝子を含有した（図４参照）。
【０１２９】
次のようにＢＣＫＡＤ、ＡＡＴおよびＡＣＸ４を発現するプラスミドを構築した。プラスミドｐＭＭＡ１３３を制限酵素ＳｐｅＩおよびＳｓｅ８３８７７Ｉで消化し、直線化したＤＮＡ断片を得た。プラスミドｐＷＡ００８を制限酵素ＸｂａＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉで消化し、ＢＣＫＡＤ複合遺伝子を含有する５．０ｋｂ断片を単離した。ＤＮＡライゲーションキット「Ｍｉｇｈｔｙ  Ｍｉｘ」（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．製造）を使用して両断片をライゲーションした。メタクリル酸ブチル生産実験のために、得られたプラスミドｐＭＭＡ１３４（図４）をＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。
【０１３０】
基本的にＡＣＸ４の発現に関して上で記載したものと同じように、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＭＭＡ１３４を培養した。遠心分離により細胞を回収し、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、同じ緩衝液中で懸濁して、細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を使用することによって、４０ｍＭ  ２−ケトイソ吉草酸エステル（２−ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）（２−オキソイソ吉草酸エステル（２−ｏｘｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ））、６０ｍＭブタノール、０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）および細胞（ＯＤ６５０＝１２．５）を含有した各バイアル中で約１ｍＬの休止細胞反応溶液を調製した。３０℃、１８０ｒｐｍで３〜４４時間、反応を行い、１ｍＬアセトニトリルをバイアルに添加し、反応を停止させるためによく混合した。シリンジフィルターＤＩＳＭＩＣ／孔径０．４５ミクロン（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製造）を使用したろ過後、ＯＤＳカラム上でＨＰＬＣによって分析を行った。ＨＰＬＣ条件は次のとおりであった：装置：Ｗａｔｅｒｓ２６９５、カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＵＧ１２０、２．０ｍｍｌ．Ｃ．ｘ２５０ｍｍ、移動相：０．１％リン酸／６５％メタノール、流量：０．２５ｍＬ／ｍｉｎ、稼働時間：１２分、カラム温度：３５℃および検出：ＵＢ２１０ｎｍ。
【０１３１】
図５は、発酵の時間経過にわたる次の化学物質の濃度を示す：■、２−ケトイソ吉草酸エステル（２−ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）（２−ＯＩＶ）；▲、イソ酪酸（ＩＢＡ）；◆、メタクリル酸ブチル（ＢＭＡ）；およびｘ、メタクリル酸（ＭＡＡ）。２−ケトイソ吉草酸エステル（２−ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）（２−オキソイソ吉草酸エステル（２−ｏｘｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ））の原料の濃度が下落するとともに、その経路における中間体、イソ酪酸の生産が増加し、最終エステル生成物メタクリル酸ブチルの生産も増加する。
【０１３２】
この実施例から、グルコースから直接生産される生化学的中間体２−ケトイソ吉草酸エステル（２−ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）（２−オキソイソ吉草酸エステル（２−ｏｘｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ））および一般的な工業原料である試薬ブタノールからのＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル、特にメタクリル酸ブチルの実現可能なインビボ生産が明らかになる。ブタノールとの反応によって、２−ケトイソ吉草酸エステル（２−ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）をイソブチリルＣｏＡに変換するためにＢＣＫＡＤオペロン、イソブチリルＣｏＡをメタクリリルＣｏＡに変換するためにＡＣＸ４およびメタクリリルＣｏＡをメタクリル酸ブチルに変換するためにＡＡＴを発現する組み換えＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を培養することによって、工業的に適用可能なレベルでメタクリル酸ブチルの生産が明らかになる。
有機溶媒へのＢＭＡの抽出
組み換えエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）による２−ケトイソ吉草酸エステル（２−ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）からのメタクリル酸ブチルの生産を明らかにした上記試験後、発明者らは、発酵培地からのＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル、例えばＢＭＡの抽出を調べるために重要な実験を行った。
【０１３３】
簡潔に述べると、上記の実施例で使用したものと同様の変異体Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を含有する５個の振盪フラスコ培養物を増殖させ、これにより、組み換えエスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）による２−ケトイソ吉草酸エステル（２−ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ）からのメタクリル酸ブチルの生産が明らかになった。各フラスコからバイオマスを回収し、個別の生体内変換を行わせた。ガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出器（ＧＣ−ＦＩＤ）によって、溶媒抽出後のドデカン中のＢＭＡおよびＭＭＡレベルを定量した。
【０１３４】
１Ｌのバッフル付き振盪フラスコ中で、２００μｇ／ｍＬアンピシリンを含有する２００ｍＬのＬＢ培地の出発培養物を１６．３３時間増殖させた。３００ｍＬ新鮮ＬＢ培地を含有する５本の１Ｌバッフル付き振盪フラスコへと、培養物をＯＤ６０００．２までバック希釈（ｂａｃｋ  ｄｉｌｕｔｅｄ）し、３０℃にて２５０ｒｐｍで２３．３５時間増殖させた。次に、５０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間の遠心分離によってバイオマスを回収した。各細胞ペレットを１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．７）で洗浄し、遠心分離ステップを反復した。ＯＤ６００が２５に達するまで、必要な体積の生体内変換液中でバイオマスを再懸濁した。
【０１３５】
５ｘ２５０ｍＬ密封ショット瓶中、３０℃および１８０ｒｐｍで２４時間、生体内変換反応を行った。各生体内変換のための条件を以下の表３で示す。
【０１３６】
【表７】
2019535327.tif 000009
【０１３７】
５時間および２４時間の時点でＧＣ−ＦＩＤ分析用に試料を採取した。各時点で、５ｍＬの試料を取り出し、１５ｍＬファルコンチューブに移した。ドデカン（１ｍＬ）に加えて、アセトニトリル（５ｍＬ）を添加した。混合物を＞８００ｒｐｍで１０分間激しく振盪し、その後、３９００ｒｐｍおよび２０℃で２０分間遠心分離した。有機相および水相の両方から５００μＬの試料を採取し、０．４５μｍフィルターを通じてろ過し、注入前に圧着フタ付きのガスクロマトグラフィーバイアルに入れた。
【０１３８】
既知濃度でＢＭＡおよびＭＭＡの容積測定保存溶液を調製することによって得た外部標準較正培養物を使用することによって、生体内変換試料中のＢＭＡおよびＭＭＡレベルの定量を達成した。
【０１３９】
抽出実験の結果を以下の表４で示す：
【０１４０】
【表８】
2019535327.tif 000010
【０１４１】
発明者らは、ドデカンへのＢＭＡの抽出効率が、ＭＭＡと比較して一貫してより高いことを明らかにした。例えば、生体内変換２および３の比較から、ＭＭＡと比較してＢＭＡの抽出効率が２．７ｘ高いことが示され、生体内変換４および５の比較から、ＭＭＡと比較して、ＢＭＡの抽出効率が３．３ｘ高いことが示された。全試料にわたり、ドデカンへのＢＭＡ抽出の平均量は３５．６％前後であり、それに対してＭＭＡでは１０．５％であった。
エステル交換反応によるＢＭＡからのＭＭＡ生産
本発明の方法において、発酵を介して得られたＢＭＡに対してエステル交換反応を行い、ＭＭＡを生成させた。発明者らは、高い反応変換および選択性で動作し得る有効なエステル交換反応プロセスがどのように開発され得るかを決定するために実験を行った。
【０１４２】
エステル交換反応は、反応を推進するために触媒を用いることが多い。このような触媒は、例えば酸性触媒、塩基性触媒または生体触媒であり得る。より高分子量のメタクリル酸エステルへのＭＭＡのエステル交換反応を推進するために、多くの均一系および不均一系触媒が使用されてきた。しかし、逆の反応は調べられていない。
【０１４３】
ｎ−ＢＭＡ、メタノールおよび一連の触媒を使用し、多くのエステル交換反応実験を行った。
窒素の不活性雰囲気下にて、三つ口シュレンクフラスコ中でエステル交換反応実験を行った。反応溶液に熱電対を与えることによって、反応温度を決定した。一般に、いくつかの反応試料を反応中に採取した。しかし、最終的実験試料が、反応が起こらなかったことを示した場合、より早期の試料は分析しなかった。
【０１４４】
チタンブトキシド、ジルコニウムブトキシド、ジルコニウムアセチルアセトナート、不均一性アルキル金属錯体（シリカ担持セシウム）、Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ１５−Ｈ（スルホン酸官能化ポリスチレン樹脂）を使用したＢＭＡからＭＭＡへの変換レベルは低かった（０〜２０％）。しかし、ナトリウムメトキシド、リチウムメトキシドおよび水酸化リチウムを使用した変換レベルは、以下で概略を述べるように非常により高かった。
メタノールおよびナトリウムメトキシドを用いたｎ−ＢＭＡのエステル交換反応
ｎ−ＢＭＡ（１ｍｏｌ、１４２．２０ｇ）、ＭｅＯＨ（１ｍｏｌ、３２．０４ｇ）、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（０．１ｇ）およびＮａＯＭｅ（１．０１ｇ、１８．７ｍｍｏｌ）を窒素下で三つ口２５０ｍＬシュレンクフラスコに添加した。フラスコの１つの口を栓で塞ぎ、１つの口をシリコンバンジ（ｂｕｎｇｅ）で塞ぎ、これを使用して熱電対を反応溶液に入れ、３番目の口をコンデンサーに連結した。温度を最初におよそ２０℃で１時間維持し、次いで、８８．２℃の還流温度に到達するまで、毎時およそ１０℃ずつ上昇させた。各温度点で試料を採取し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。
【０１４５】
触媒としてナトリウムメトキシドを使用した結果、ｎ−ＢＭＡからＭＭＡへの良好な変換が起こった（５０％前後；図６）。
メタノールおよび水酸化リチウムを用いたｎ−ＢＭＡのエステル交換
ｎ−ＢＭＡ（１ｍｏｌ、１４２．２０ｇ）、ＭｅＯＨ（１ｍｏｌ、３２．０４ｇ）、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（０．１ｇ）およびＬｉＯＨ（１．０１ｇ、４２ｍｍｏｌ）を窒素下で三つ口２５０ｍＬシュレンクフラスコに添加した。フラスコの１つの口を栓で塞ぎ、１つの口をシリコン栓で塞ぎ、これを使用して熱電対を反応溶液に入れ、３番目の口をコンデンサーに連結した。温度を最初におよそ２０℃で１時間維持し、次いで、８８．２℃の還流温度に到達するまで、毎時およそ１０℃ずつ上昇させた。各温度点で試料を採取し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。
【０１４６】
触媒として水酸化リチウムを使用してｎ−ＢＭＡからＭＭＡへの良好な変換が達成された（５〜６０％；図７）。
次に、反応物の還流温度での反応速度を決定するために、（触媒として水酸化リチウムを使用して）反復実験を行った。
【０１４７】
密封シュレンクフラスコ中で撹拌することにより、水酸化リチウム（０．５１ｇ、２１ｍｍｏｌ）をメタノール（３２．４３ｇ、１ｍｏｌ）中で溶解させた。ｎ−ＢＭＡ（１４２．１８ｇ、１ｍｏｌ）および４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（０．１ｇ）を窒素下で三つ口２５０ｍＬシュレンクフラスコに添加し、この混合物を８８．２℃に加熱し、１つの口を栓で塞ぎ、１つに栓をし、その他をコンデンサーに連結した。還流温度に到達し、温度が安定したら、シリンジによって触媒（水酸化リチウム）およびＭｅＯＨ溶液を反応フラスコに添加した。最初の１０分間は２分ごとに試料を採取し、１時間にわたり５分ごとに採取した。次に、ガスクロマトグラフィーにより試料を分析した。図８で示されるように、４分間加熱後、ｎ−ＢＭＡおよびＭＭＡの平衡比に到達した。
メタノールおよびリチウムメトキシドを用いたｎ−ＢＭＡのエステル交換
密封フラスコ中で撹拌することにより、リチウムメトキシド（０．７９ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）をメタノール（３２．０４ｇ、１．００ｍｏｌ）中で溶解させた。ｎＢＭＡ（１４２．２０ｇ、１．００ｍｏｌ）および４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（０．１０ｇ）の溶液を窒素雰囲気（９１℃）下で加熱した。温度が安定したら、触媒およびメタノール溶液を添加し、還流温度に到達した（８８℃）。最初の１０分間は２分ごとに試料を採取し、１時間にわたり３０分ごとに採取した。シリカを通じてこれらの試料をろ過し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。
【０１４８】
５３±３％のｎＢＭＡからＭＭＡへの変換が４分後に達成された（図９）。
ｎＢＭＡからＭＭＡへのエステル交換に対する触媒としてのＬｉＯＨおよびＬｉＯＭｅの比較
２種類のリチウム触媒、水酸化リチウムおよびリチウムメトキシドの非活性化度も調べた。これは触媒寿命を調べることであった。
【０１４９】
ＬｉＯＨおよびＬｉＯＭｅ触媒を使用してメタノールでのｎＢＭＡのエステル交換反応を行うことによってこれを調べた。還流温度で１時間後、さらなるモル数のｎＢＭＡおよびモル数のメタノールを反応に添加し、ＭＭＡへの変換を時間で監視した（ｔｉｍｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ）。
【０１５０】
ｎＢＭＡ（１４２．２０ｇ、１．００ｍｏｌ）、メタノール（３２．０４ｇ、１．００ｍｏｌ）および４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（０．１０ｇ）の溶液を触媒で処理し、窒素雰囲気下で還流温度（８７℃）まで加熱した。還流温度で１時間後、さらなるｎＢＭＡ（１４２．２０ｇ、１．００ｍｏｌ）およびメタノール（３２．０４ｇ、１．００ｍｏｌ）を反応溶液に添加した。最初の１０分間は２分ごとに試料を採取し、１時間にわたり３０分ごとに採取した。シリカを通じてこれらの試料をろ過し、ガスクロマトグラフィーにより分析した。ＬｉＯＨ（０．５０ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）およびＬｉＯＭｅ（０．７９ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）触媒を利用した。
【０１５１】
さらなるｎＢＭＡおよびメタノールをＬｉＯＨにより触媒されるエステル交換反応溶液に添加したところ、ＭＭＡへの変換のさらなる増加は観察されなかった。これは、触媒全てが、最初のエステル交換反応で形成された水により非活性化されたので、新鮮な反応物を添加したときにさらなる反応が起こり得なかったことを示す（図１０）。しかし、ＬｉＯＭｅ触媒エステル交換反応溶液を用いて、より多くの反応物を添加した場合、平衡に到達するまでＭＭＡへの変換が増加した（図１０）。
【０１５２】
このデータから、触媒としてのＬｉＯＨの使用は、反応を維持するために経時的に新鮮なＬｉＯＨの添加を必要とすることが示される。しかし、ＬｉＯＭｅはあまり頻繁に添加する必要がなく、したがって連続反応により適したものであり得る。ＬｉＯＨの不活性化は、ＬｉＯＨからＬｉＭＭＡへの変換ゆえであると思われ；ＬｉＯＭｅは、インシトゥで水を形成するためにメタノールと反応せず、したがってあまり急速に非活性化されない。
エステル交換反応における水量増加の効果
本発明の方法において、発酵反応は水性環境で行われ、したがって生産されるＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルは水で飽和される。しかし驚くべきことに、水はエステル交換反応に影響を及ぼす。
【０１５３】
メタノールによるｎＢＭＡエステル交換反応への漸増量の水の添加に関して、エステル交換反応での水の存在の結果を以下で示す。この反応は、還流温度で行い、ＭＭＡへの変換を経時的に監視した。水の％は全て、ＬｉＯＨのモル数に対する水のモル数として決定した（表５）。
【０１５４】
【表９】
2019535327.tif 000011
【０１５５】
密封フラスコ中で撹拌することにより、メタノール（３２．０４ｇ、１．００ｍｏｌ）および水（０．１３ｇ、７１．８ｍｍｏｌ）中で水酸化リチウム（０．５０ｇ、２０．９ｍｍｏｌ）を溶解させた。ｎＢＭＡおよび４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（０．１０ｇ）の溶液を窒素雰囲気下で９０℃に加熱した。温度が安定化したとき、ＬｉＯＨ、メタノールおよび水の溶液を添加し、８６℃の還流温度を観察した。最初の１０分間は２分ごと、次いで３０分および６０分後に試料を採取した。シリカゲルを通じてこれらの試料をろ過し、その後、ガスクロマトグラフィーにより分析した。０．５３ｇおよび２．０１ｇの水の質量でこの方法を反復した。
【０１５６】
この結果から、反応中の水が増加すると、ｎＢＭＡからＭＭＡへの変換が減少することが明らかである（図１１）。これらの結果から、Ｃ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルからＭＭＡへの変換が水の存在下で行われ得るにもかかわらず、水の存在が限定されると、変換を改善するために有利であることが示される。したがって、エステル交換反応の開始前に水性環境から本発明のＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステルを取り出すことは有利であり得る。
生体内変換
異なるアルコールを使用して生体内変換を比較するために、メタクリル酸エステル生産のために修飾されたＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の新しい株において生体内変換実験を行った。
【０１５７】
バッフル付き振盪フラスコにおいてＬＢ−Ｍｉｌｌｅｒ（Ｍｅｒｃｋ）＋アンピシリン（２００μｇ／ｍＬ）中で一晩、３０℃および２５０ｒｐｍで細胞を増殖させた。
得られた培養物を遠心分離し、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）を用いて５０のＯＤになるようにペレットを再懸濁した。この再懸濁培養物のアリコート（１５ｍＬ）を２５０ｍＬショット瓶に入れ、１５ｍＬの８０ｍＭ  ＫＩＶ（ケトイソ吉草酸エステル（ｋｅｔｏｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ））保存溶液を添加した。これにより、全体的なＯＤが２５になり、３０ｍＬ体積中で４０ｍＭ  ＫＩＶおよび０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液の最終濃度となった。５ｍＭの最終濃度まで各アルコールを適切に（ｎｅａｔ）添加した。ショット瓶中で３０℃および２５０ｒｐｍにて生体内変換温置を行った。
【０１５８】
ＧＣ−ＭＳ分析のために３．５時間温置後に試料を採取して、メタクリル酸アルキルエステルレベルを決定した。
生体内変換ブロスの０．５ｍＬ試料を採取し、０．５ｍＬヘプタンを添加し、５分間にわたり混合物を連続的にボルテックス処理することによって、試料採取を行った。次いで、微量遠心分離（１４，８００ｒｐｍ、５分）によって相を分離した。得られたヘプタン抽出物の０．２ｍＬ試料を採取し、ＧＣバイアル（０．２５ｍＬバイアルインサート含有）に入れ、圧着した。次に、Ａｇｉｌｅｎｔ  ５９７３質量選択検出器（シングル四重極）とともにＡｇｉｌｅｎｔ  ６８９０  ｓｅｒｉｅｓ  ＧＣを使用して、試料に対してＧＣ−ＭＳを行った。ヘリウム担体ガスを用い、ＺＢ−ＷＡＸＰｌｕｓ  ３０ｍカラム、内径２５０μｍおよび膜厚０．２５μｍを使用して、分析物を分離した。具体的なＧＣの詳細は表６で与え、結果は表７で示す。
【０１５９】
【表１０】
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【０１６０】
【表１１】
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【０１６１】
結論
これらの研究は、触媒として第Ｉ族および第ＩＩ族塩基性金属塩を使用して、特定の高い効率でＭＭＡを生産させるためにＣ３〜Ｃ１２メタクリル酸エステル（特にｎ−ＢＭＡ）がエステル交換され得ること、および水がない結果、より高い変換効率が得られることが示される。さらに、より高いエステルの生産がメタクリル酸メチルの場合よりも速い速度で進むことが示された。
【０１６２】
このような特性および／またはステップの少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除き、（あらゆる添付される特許請求の範囲、要約および図面を含む）本願で開示される特性の全ておよび／またはそのように開示されるあらゆる方法のステップの全てを、あらゆる組み合わせで組み合わせ得る。
【０１６３】
別段明らかに述べられない限り、（あらゆる添付される特許請求の範囲、要約および図面を含む）本願で開示される各特性は、同じ、同等または同様の目的に役立つ代替的な特性で置き換え得る。したがって、別段明らかに述べられない限り、開示される各特性は、包括的な一連の同等または同様の特性の単なる一例である。
【０１６４】
本発明は、前述の実施形態の詳細に限定されない。本発明は、（あらゆる添付される特許請求の範囲、要約および図面を含む）本願で開示される特性の、何らかの新規のものまたは何らかの新規の組み合わせに、またはそのように開示されるあらゆる方法のステップの、あらゆる新規のもの、またはあらゆる新規の組み合わせに拡大される。
【０１６５】
さらに、添付の特許請求の範囲で定められるような本発明の範囲から逸脱することなく、上記方法に対する多くの改変がなされ得ることが認められよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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