(57)【要約】  本発明の対象は、発酵によるムコン酸の生物学的生成の収率および力価の改善である。ムコン酸経路に関与する１つまたは複数の酵素の活性の増加は、ムコン酸の生成の増加をもたらす。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
３，４ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ酵素をコードする少なくとも１つの外因性遺伝子と、前記外因性３，４ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ酵素の活性を増加させるタンパク質をコードする少なくとも１つの他の遺伝子とを含む、非芳香族炭素源からムコン酸を生成する遺伝子操作された微生物。
【請求項２】
７２時間以内に少なくとも６０ｇ／Ｌのムコン酸を生成する、請求項１に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項３】
細菌である、請求項１に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項４】
大腸菌である、請求項１に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項５】
３，４ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ酵素の活性の前記増加が、ｋｐｄＢ遺伝子またはその相同体によりコードされるＫｐｄＢタンパク質の発現によって達成され、前記ｋｐｄＢ遺伝子の前記相同体がＫｐｄＢタンパク質に対する少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項６】
３，４ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ酵素の活性の前記増加が、ＵｂｉＸ遺伝子またはその相同体によりコードされるＵｂｉＸタンパク質の発現によって達成され、前記ＵｂｉＸ遺伝子の前記相同体がＵｂｉＸタンパク質に対する少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項７】
漏れやすいシキミ酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子をさらに含み、前記漏れやすいシキミ酸デヒドロゲナーゼ酵素が、芳香族アミノ酸およびビタミンに対する原栄養性を付与するが、前記芳香族アミノ酸またはビタミンの有意な分泌をもたらすことがない、請求項１に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項８】
ａｒｏＺ、ｑａ−４、ａｓｂＦ、ａｒｏＹ、ｑｕｉＣおよびｃａｔＡＸからなる群から選択される１つまたは複数の外因性遺伝子をさらに含み、前記外因性遺伝子がムコン酸経路において機能的なタンパク質をコードする、請求項１に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項９】
ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ｔｋｔＡ、ｔａｌＢ、ｒｐｅ、およびｒｐｉからなる群から選択される１つまたは複数の外因性遺伝子をさらに含み、前記外因性遺伝子がシキミ酸経路において機能的なタンパク質をコードする、請求項１に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項１０】
ｔｙｒＲ遺伝子またはその相同体によってコードされる芳香族アミノ酸生合成の負の調節因子タンパク質の活性が実質的に低下する、または除去される、請求項１に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項１１】
フェニルアラニンによる阻害に対して実質的に耐性であるＤＡＨＰシンターゼ酵素をコードするａｒｏＧ＊遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子操作された生物。
【請求項１２】
ＤＡＨＰシンターゼ酵素をコードするａｒｏＧ＊遺伝子が、ａｒｏＧ＊２０−８９３、ａｒｏＧ＊２０−８９７、ａｒｏＧ＊２０−８９９、ａｒｏＧ＊２０−９０１、ａｒｏＧ＊１１１、ａｒｏＧ＊２１１、ａｒｏＧ＊２１２、ａｒｏＧ＊３１１、ａｒｏＧ＊３１２、ａｒｏＧ＊４１１、ａｒｏＧ＊４１２、およびａｒｏＧ＊５１１からなる群から選択される、請求項１１に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項１３】
ホスホエノールピルビン酸依存的ホスホトランスフェラーゼ系およびグルコース移入のためのＧａｌＰタンパク質に基づく系の活性が低下しており、機能的グルコース促進拡散タンパク質をコードする外因性遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の遺伝子操作された生物。
【請求項１４】
機能的グルコース促進拡散タンパク質がｇｌｆ遺伝子またはその相同体によりコードされるＧｌｆタンパク質である、請求項１３に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項１５】
グルコキナーゼをコードする外因性遺伝子をさらに含む、請求項１３に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項１６】
ピルビン酸カルボキシラーゼ酵素をコードする少なくとも１つの外因性遺伝子を含む、非芳香族炭素源からムコン酸を生成する遺伝子操作された微生物。
【請求項１７】
７２時間以内に少なくとも６０ｇ／Ｌのムコン酸を生成する、請求項１６に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項１８】
細菌である、請求項１６に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項１９】
大腸菌である、請求項１６に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項２０】
ピルビン酸カルボキシラーゼ酵素をコードする前記外因性遺伝子が、サッカロミセス・セレビジア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するｐｙｃ遺伝子またはその相同体によってコードされ、前記ｐｙｃ遺伝子の前記相同体がサッカロミセス・セレビジアのｐｙｃ遺伝子によってコードされるカルボキシラーゼ酵素に対する少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１６に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項２１】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性の低下または除去に対する突然変異をさらに含む、請求項１６に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項２２】
サッカロミセス・セレビジアに由来する外因性ｐｙｃ遺伝子が、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｐｃ遺伝子の遺伝子座に挿入されている、請求項１６に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項２３】
ａｒｏＺ、ｑａ−４、ａｓｂＦ、ａｒｏＹ、ｑｕｉＣおよびｃａｔＡＸまたはその相同体からなる群から選択される１つまたは複数の外因性遺伝子をさらに含み、前記外因性遺伝子がムコン酸経路において機能的なタンパク質をコードする、請求項１６に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項２４】
ａｒｏＢ、ａｒｏＤ、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、ａｒｏＨ、ｔｋｔＡ、ｔａｌＢ、ｒｐｅ、およびｒｐｉまたはその相同体からなる群から選択される１つまたは複数の外因性遺伝子をさらに含み、前記外因性遺伝子がシキミ酸経路において機能的なタンパク質をコードする、請求項１６に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項２５】
３，４ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ酵素またはその相同体をコードする少なくとも１つの外因性遺伝子と、前記外因性３，４ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ酵素の活性を増加させるタンパク質をコードする少なくとも１つの他の遺伝子とをさらに含む、請求項１６に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項２６】
３，４ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ酵素の活性の前記増加が、ｋｐｄＢ遺伝子またはその相同体によりコードされるＫｐｄＢタンパク質の発現によって達成され、ｋｐｄＢ遺伝子の前記相同体がＫｐｄＢタンパク質に対する少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードする、請求項２５に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項２７】
３，４ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ酵素の活性の前記増加が、ＵｂｉＸ遺伝子またはその相同体によりコードされるＵｂｉＸタンパク質の発現によって達成され、ＵｂｉＸ遺伝子の前記相同体がＵｂｉＸタンパク質に対する少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するタンパク質をコードする、請求項２５に記載の遺伝子操作された微生物。
【請求項２８】
ホスホエノールピルビン酸依存的ホスホトランスフェラーゼ系およびグルコース移入のためのＧａｌＰタンパク質に基づく系の活性が低下しており、機能的グルコース促進拡散タンパク質をコードする外因性遺伝子をさらに含む、請求項１６に記載の遺伝子操作された生物。
【請求項２９】
機能的グルコース促進拡散タンパク質が、ｇｌｆ遺伝子によりコードされるＧｌｆタンパク質である、請求項２８に記載の遺伝子操作された細菌。
【請求項３０】
グルコキナーゼをコードする外因性遺伝子をさらに含む、請求項２９に記載の遺伝子操作された細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１６年３月２日に出願された米国特許仮出願第６２／３０２，５５８号の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、中心的な芳香族生合成経路において遺伝子操作された生体触媒を用いて再生可能な化学原料を生成する分野にある。より詳細には、本発明は、遺伝的に改変された生体触媒を用いた再生可能な炭素資源からのムコン酸の生成を改善するためのプロセスを提供する。
【背景技術】
【０００３】
アジピン酸は、主要商品である化学物質であり、ナイロン６，６およびポリウレタンの生成において用いられる。アジピン酸は現在、石油化学原料から誘導されている。アジピン酸の現在の合成は、環境的に有害な硝酸を放出する（Xie et al,, 2014）。あるいは、アジピン酸を、化学的水素化によりムコン酸の３つの異性体（ｃｉｓ，ｃｉｓ；ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ；ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ異性体）のいずれかから作製することができる。微生物を用いる発酵、次いでアジピン酸を得るための水素化プロセスにより、再生可能な資源からムコン酸を生成することが望ましいが、それはアジピン酸へのそのような経路が伝統的な石油化学的経路よりも環境に優しいからである（Niu, Draths and Frost, 2002; Frost and Draths, 1997）。他の多くの化学物質を、限定されるものではないが、１，６ヘキサンジオール、３−ヘキセンジカルボン酸、１，６−ヘキサンジアミン、およびテレフタル酸などの、１つまたは複数のムコン酸異性体の化学的変換によって作製することができる。
【０００４】
国際特許出願公開ＷＯ２０１１／０１７５６０は、ムコン酸経路を有する生体触媒およびこれらの生体触媒を用いてムコン酸を生成するための方法を特許請求している。簡単に述べると、この公開特許出願は、ムコン酸を生成するための４つの異なる経路を開示する。ムコン酸生成のための第１の経路は、スクシニル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡから始まる。ムコン酸生成のための第２の経路は、ピルビン酸およびマロン酸セミアルデヒドから始まる。ムコン酸生成のための第３の経路は、ピルビン酸およびコハク酸セミアルデヒドから始まる。ムコン酸生成のための第４の経路は、リシンから始まる。この特許出願において提唱されたムコン酸生成のためのこれらの経路は全て、コンピュータモデリングに基づくものであり、そのような生体触媒を、ムコン酸のために商業的に許容される生産性および収率で作出することができるかどうかさえ、まだわかっていない。
【０００５】
遺伝子操作された大腸菌系を用いるｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を生成する発酵経路が科学文献(Niu et al., 2002; Frost and Draths, 1997)および特許文献（米国特許第５，４８７，９８７号；米国特許第５，６１６，４９６号；ＷＯ２０１１／０８５３１１Ａ１）に記載されている。しかしながら、ムコン酸生成のための先行技術によるプロセスは、高価な中間成分（芳香族アミノ酸およびビタミン）および化学誘導物質、ならびに工業生産にとって必要とされるものよりも低い収率などの有意な欠点に悩まされてきた。最近の米国特許出願公開第２０１５／００４４７５５号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、関連遺伝子の構成的発現を含むムコン酸生成のための生体触媒の改善、異種遺伝子および新規な「漏れやすい」ＡｒｏＥ酵素の改善を提供する。本発明は、米国特許出願公開第２０１５／００４４７５５号に記載されたムコン酸生体触媒のさらなる改善を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、限定されるものではないが、グルコース、スクロース、グリセロールおよびセルロース加水分解物を含む糖および炭水化物などの非芳香族炭素源から出発してｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を生成する遺伝子操作された微生物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施形態においては、芳香族アミノ酸生合成の負の調節因子の活性が遺伝子操作される。本発明の一態様においては、負の調節因子ＴｙｒＲの活性は、ＴｙｒＲタンパク質をコードするｔｙｒＲ遺伝子の発現を制御することによって実質的に低下する。本発明の別の態様においては、負の調節因子ＴｙｒＲの活性は、微生物の染色体ＤＮＡにおいてｔｙｒＲ遺伝子を欠失させるか、または不活化することによって完全に排除される。
【０００８】
本発明の別の実施形態においては、ある特定の代謝物による芳香族アミノ酸経路におけるある特定の酵素のフィードバック阻害が、遺伝子操作によって克服される。多くの野生型大腸菌株において、芳香族アミノ酸経路の開始時に機能するデオキシアラビノ−ヘプツロソネート７−リン酸シンターゼ（「ＤＡＨＰシンターゼ」）は、３つの異なる遺伝子、すなわち、ａｒｏＧ、ａｒｏＦおよびａｒｏＨによりコードされることが知られる３つの異なるアイソザイムとして生じる。これらの３つの遺伝子のそれぞれによりコードされるタンパク質は、芳香族アミノ酸経路の１つまたは複数の代謝物によるフィードバック阻害を受ける。本発明の一態様においては、野生型ａｒｏＧ遺伝子は、微生物細胞内の芳香族アミノ酸経路の１つまたは複数の代謝物によるフィードバック阻害に対して耐性であるＡｒｏＧタンパク質をコードする改変されたａｒｏＧ遺伝子により置きかえられる。そのようなフィードバック耐性型のＡｒｏＧタンパク質は、「ＡｒｏＧＦＢＲ」と呼ばれる。本発明の別の態様においては、野生型ａｒｏＦ遺伝子は、微生物細胞内の芳香族アミノ酸経路の１つまたは複数の代謝物によるフィードバック阻害に対して耐性であるＡｒｏＦタンパク質をコードするａｒｏＦ遺伝子によって置きかえられる（ＡｒｏＦＦＢＲ）。本発明のさらに別の態様においては、野生型ａｒｏＨ遺伝子は、微生物細胞内の芳香族アミノ酸経路の１つまたは複数の代謝物によるフィードバック阻害に対して耐性であるＡｒｏＨタンパク質をコードするａｒｏＨ遺伝子によって置きかえられる（ＡｒｏＨＦＢＲ）。本発明のさらに別の態様においては、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の商業生産のために選択される生体触媒は、ＤＡＨＰシンターゼのための１つより多いフィードバック耐性アイソザイムを有してもよい。
【０００９】
本発明の別の実施形態においては、微生物細胞内の中心的な芳香族生合成経路に関与する１つまたは複数の酵素の活性が増強される。本発明の一態様においては、芳香族経路および／またはムコン酸経路の動作に関与する１つまたは複数の酵素の活性の増強は、遺伝子操作によって達成される。本発明の好ましい態様においては、タンパク質ＡｒｏＦ、ＡｒｏＧ、ＡｒｏＨ、ＡｒｏＢ、ＴｋｔＡ、ＴａｌＢ、ＡｒｏＺ、ＱｕｔＣ、Ｑａ−４、ＡｓｂＦ、ＱｕｉＣ、ＡｒｏＹ、Ｒｐｅ、Ｒｐｉ、Ｐｐｓ、ＣａｔＡおよびＣａｔＸまたはその相同体もしくは類似体をコードする１つまたは複数の遺伝子の発現が増強され、前記タンパク質の活性の増加を誘導する。Ｒｐｅはリブロース−５−リン酸エピメラーゼであり、Ｒｐｉはリブロース−５−リン酸イソメラーゼであり、Ｐｐｓはホスホフェノールピルビン酸シンテターゼである(Neidhardt and Curtiss, 1996)。宿主株が酵母、例えば、サッカロミセス・セレビジア、または糸状菌、例えば、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）である場合、シキメート経路における反応を触媒するいくつかの酵素を、サッカロミセス・セレビジアの場合、ＡＲＯ１遺伝子によりコードされる、Ａｒｏ１ｐと呼ばれる１つの大きいタンパク質またはポリペプチド中で組み合わせることができる。Ａｒｏ１ｐはＡｒｏＢ、ＡｒｏＤ、ＡｒｏＥ、ＡｒｏＫ（またはＡｒｏＬ）およびＡｒｏＡの機能を組み合わせる。そのようなものとして、本発明の目的のために、Ａｒｏ１ｐ、およびＡＲＯ１、またはその一部を、代用物として、またはＡｒｏＢ、ＡｒｏＤ、ＡｒｏＥ、ＡｒｏＫおよび／もしくはＡｒｏＡに加えて用いることができる。
【００１０】
本発明のさらに別の実施形態においては、細菌細胞内でのエリスロース−４−リン酸を介する流動は、ペントースリン酸経路の動作における酵素を過剰発現させることによって増強される。本発明の一態様においては、トランスアルドラーゼ酵素、例えば、ｔａｌＢまたはｔａｌＡ遺伝子によりコードされるものの発現が、遺伝子改変により増強される。本発明の別の態様においては、トランスケトラーゼ酵素をコードする遺伝子、例えば、ｔｋｔＡ遺伝子の発現が遺伝子操作により増強される。本発明のさらに別の態様においては、リブロース−５−リン酸エピメラーゼとリブロース−５−リン酸イソメラーゼのいずれかまたは両方をコードする遺伝子の発現が遺伝子操作により増強される。
【００１１】
本発明の別の実施形態においては、芳香族アミノ酸経路の機能に必要なホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）のプールは、遺伝子操作によって増加する。本発明の一態様においては、ＰＥＰプールの使用に関する競合は、グルコース取込みのためのＰＥＰ非依存系によるグルコース取込みのためのＰＥＰ依存的ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）の排除および／または補完により減少する。本発明の別の態様においては、ＧａｌＰに基づく糖の取込み系が、微生物細胞内にＡＴＰを保存する目的で不活化される。本発明のさらに別の態様においては、ＰＴＳ系と、ＧａｌＰに基づく糖の取込み系との両方の機能が欠損した（ΔＰＴＳ／ΔｇａｌＰ）微生物細胞中で、糖の取込みは、Ｇｌｆ（グルコース拡散を容易にするタンパク質）をコードする外因性遺伝子、またはＧｌｆとＧｌｋ（グルコキナーゼ）タンパク質の両方をコードする外因性遺伝子を導入することにより達成される。本発明のさらに別の実施形態においては、ＰＥＰの利用可能性は、ｐｐｓなどのＰＥＰシンテターゼをコードする遺伝子の発現を増加させることにより増加する。
【００１２】
本発明のさらに別の実施形態においては、３，４−ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ（ＡｒｏＹ）の活性が増強される。この実施形態の一態様においては、ＡｒｏＹの発現は、遺伝子操作により増強される。本発明の別の態様においては、ＵｂｉＸ、ＫｐｄＢ、Ｅｌｗ、Ｋｏｘ、Ｌｐｌおよびその相同体を含む群から選択される、ＡｒｏＹの付属タンパク質として作用するタンパク質の発現が、３，４−ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ活性の増加をもたらす遺伝子操作により増加する。
【００１３】
本発明の別の実施形態においては、ＰＥＰ利用可能性は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）活性の減少または除去により増加する。本発明の一態様においては、ピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）活性は、増加する、および／または、特にＰｐｃ活性が除去される場合、Ｐｐｃ活性を置換する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】大腸菌における芳香族アミノ酸生合成のための経路。
【図２】大腸菌におけるムコン酸の生合成のための経路。
【図３】３−デオキシ−アラビノ−ヘプツロネート７−リン酸（ＤＨＡＰ）のムコン酸への変換における反応工程。
【図４】総ムコン酸および生化学的中間体のＨＰＬＣ分析に用いられる標準物を示すクロマトグラフ。
【図５】ムコン酸異性体のＨＰＬＣ分析に用いられる標準物を示すクロマトグラフ。
【図６】プラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰ、ｐＣＰ１４およびｐＣＰ５４を用いて形質転換された大腸菌株ＭＹＲ３４中でのＤＨＳの生成に関する力価。大腸菌のＭＹＲ３４株は、ａｒｏE遺伝子の欠失を有する。プラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰはＤＡＨＰシンターゼをコードするａｒｏＧ遺伝子を発現する。プラスミドｐＣＰ１４はＤＨＱシンターゼをコードするａｒｏＢ遺伝子を発現する。プラスミドｐＣＰ５４はａｒｏＢとａｒｏＧ遺伝子の両方を発現する。
【図７】プラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰおよびｐＣＰ５４を用いて形質転換された大腸菌株ＭＹＲ３４およびＭＹＲ１７０中でのＤＨＳの生成に関する力価。大腸菌のＭＹＲ３４株は、ａｒｏE遺伝子の欠失を有する。ＭＹＲ１７０株はａｒｏＥ遺伝子の欠失および宿主染色体ＤＮＡのａｃｋ遺伝子座に組込まれたＰ１５プロモーターの制御下にａｒｏＢ遺伝子の第２のコピーを有する。プラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰは、ＤＡＨＰシンターゼをコードするａｒｏＧ遺伝子を発現する。プラスミドｐＣＰ５４は、ａｒｏＢとａｒｏＧ遺伝子の両方を発現する。
【図８】プラスミドｐＭＧ３７のみ、またはｐＭＧ３７とｐＣＰ３２ＡＭＰプラスミドの両方を用いて形質転換された大腸菌株ＭＹＲ３４およびＭＹＲ１７０中でのｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の生成に関する力価。大腸菌のＭＹＲ３４株は、ａｒｏＥ遺伝子の欠失を有する。ＭＹＲ１７０株は、ａｒｏＥ遺伝子の欠失および宿主染色体ＤＮＡのａｃｋ遺伝子座に組込まれたＰ１５プロモーターの制御下に第２のコピーのａｒｏＢ遺伝子を有する。プラスミドｐＣＰ３１ＡＭＰは、ＤＨＡＰシンターゼをコードするａｒｏＧ遺伝子を発現する。プラスミドｐＭＧ３７は、ムコン酸経路において機能的なタンパク質をコードするａｒｏＺ、ａｒｏＹおよびｃａｔＡＸ遺伝子を発現する。
【図９】ａｒｏＧ遺伝子のみ（ｐＣＰ３２ＡＭＰ）またはａｒｏＧとｔｋｔＡ遺伝子を同時に発現するプラスミド（ｐＣＰ５０）を用いて形質転換された大腸菌のＭＹＲ１７０株中でのＤＨＳの生成に関する力価。ＭＹＲ１７０株は、ａｒｏＥ遺伝子の欠失および宿主染色体ＤＮＡのａｃｋ遺伝子座に組込まれたＰ１５プロモーターの制御下に第２のコピーのａｒｏＢ遺伝子を有する。
【図１０】プラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰおよびｐＣＰ５０を用いて形質転換された大腸菌のＭＹＲ３４およびＭＹＲ１７０株からのＤＨＳ収率。ＤＨＳ収率は、消費されたグルコース１グラムあたりの生成されたＤＨＳのグラム数として算出される。プラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰはａｒｏＧ遺伝子を発現するが、ｐＣＰ５０はａｒｏＧおよびｔｋｔＡを発現する。細菌株ＭＹＲ３４は、ａｒｏＥ遺伝子中に欠失を有する。大腸菌のＭＹＲ１７０株は、ＭＹＲ３４から誘導され、染色体ＤＮＡ上のａｃｋ遺伝子座に組込まれたさらなるａｒｏＢ遺伝子を有する。
【図１１】プラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰおよびｐＣＰ５０を用いて形質転換された大腸菌のＭＹＲ１７０およびＭＹＲ２６１株に由来するＤＨＳ力価。プラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰはａｒｏＧ遺伝子を発現するが、ｐＣＰ５０はａｒｏＢとｔｋｔＡ遺伝子を発現する。ＭＹＲ１７０株はａｒｏＥ遺伝子の欠失および宿主染色体ＤＮＡのａｃｋ遺伝子座に組込まれたＰ１５プロモーターの制御下に第２のコピーのａｒｏＢ遺伝子を有する。大腸菌のＭＹＲ２６１株は、大腸菌のＭＹＲ１７０株から誘導される。大腸菌のＭＹＲ２６１株は、染色体ＤＮＡのｐｏｘＢ遺伝子座に組込まれたその天然プロモーターと共に第２のコピーのｔｋｔＡ遺伝子を有する。
【図１２】シキミ酸生合成経路におけるＤＡＨＰシンターゼをコードするａｒｏＧを発現するプラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰおよびムコン酸経路において機能的なタンパク質をコードするａｒｏＺ、ａｒｏＹおよびｃａｔＡＸ遺伝子を発現するプラスミドｐＭＧ３７を用いて形質転換された大腸菌株ＭＹＲ１７０、ＭＹＲ２６１およびＭＹＲ３０５中でのムコン酸および酢酸の生成。ＭＹＲ１７０株は、ａｒｏＥ遺伝子における欠失および宿主染色体ＤＮＡ中のａｃｋ遺伝子座に挿入されたＰ１５プロモーターの制御下にさらなるコピーのａｒｏＢ遺伝子を有する。ＭＹＲ２６１およびＭＹＲ３０５は、ＭＹＲ１７０株の誘導体である。ＭＹＲ２６１は、宿主染色体ＤＮＡ上のｐｏｘＢ遺伝子座に組込まれたさらなるコピーのｔｋｔＡ遺伝子を有するが、ＭＹＲ３０５は宿主染色体ＤＮＡ上のｐｏｘＢ遺伝子座中に欠失を有する。
【図１３】大腸菌株ＭＹＲ３４により生成された内因性ＤＨＳからムコン酸への変換。大腸菌の株ＭＹＲ３４はシキメートデヒドロゲナーゼをコードするａｒｏＥ遺伝子中に欠失を有する。結果として、ＤＨＳが蓄積される。株ＭＹＲ３４がムコン酸経路において機能的なタンパク質をコードするａｒｏＺ、ａｒｏＹおよびｃａｔＡＸ遺伝子を発現するプラスミドを用いて形質転換される場合、ＤＨＳからムコン酸への変換が存在する。しかしながら、ＭＹＲ３４株を外因性遺伝子を含まない空のプラスミドベクター（ｐＣＬ１９２１）を用いて形質転換する場合、ＤＨＳからムコン酸への変換は起こらない。
【図１４】ＤＨＳをムコン酸経路に転換する能力に関するａｒｏＺ類似体の比較。３つの異なるａｒｏＺ類似体、すなわち、アシネトバクター種ＡＤＰ１に由来するｑｕｉＣ、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）に由来するａｓｂＦ、およびニューロスポラ・クラッサに由来するｑａ−４を、それぞれＰ１５およびラムダＰＲプロモーターからｃａｔＡＸおよびａｒｏＹ遺伝子も発現する低コピープラスミド中のＰ２６プロモーターの下にクローニングした。これらの３つの異なるプラスミドコンストラクトを、形質転換によってＭＹＲ３４中で発現させ、生成されたムコン酸の量を測定した。
【図１５】単一コピーのｃａｔＡＸ、ａｒｏＹおよびｑｕｉＣを、大腸菌のＭＹＲ１７０株中に染色体的に組込み（ΔａｒｏＥ、Δａｃｋ：：Ｐ１５−ａｒｏＢ）、ＭＹＲ３５２を得た（配列番号４１）。また、ＭＹＲ１７０を、ムコン酸経路の動作にとって必要な全ての遺伝子を担持する低コピープラスミドｐＭＧ３７を用いて形質転換し、ＭＹＲ２１９株を誘導した。ＭＹＲ３５２とＭＹＲ２１９は両方とも、ＹＥｐ２４（中コピーの空ベクター）またはｐＣＰ３２ＡＭＰ（中コピーのａｒｏＧ発現プラスミド）またはｐＣＰ５０（中コピーのａｒｏＧおよびｔｋｔＡ発現プラスミド）を用いて形質転換し、生成されたＰＣＡ、カテコールおよびムコン酸の量を、ＨＰＬＣ法を用いて定量した。
【図１６】ｃａｔＡＸの発現を増加させることによるＭＹＲ３５２中のカテコール蓄積の除去。ＭＹＲ３５２を、ａｒｏＹのみを発現するプラスミド（ｐＭＧ２７）またはｑｕｉＣのみを発現するプラスミド（ｐＭＧ３９）または３つのムコン酸経路遺伝子全て、すなわち、ｃａｔＡＸ、ａｒｏＹおよびｑｕｉＣを発現するプラスミド（ｐＭＧ３７）またはムコン酸経路中の２つの遺伝子のみ、すなわち、ｃａｔＡＸおよびａｒｏＹを発現するプラスミド（ｐＭＧ３３）を用いて形質転換した。ｃａｔＡＸのみの過剰発現で、カテコールの蓄積を防止するには十分であった。
【図１７】グルコースを移入するために異なる系を用いる株の増殖。ｐｔｓＨＩおよびｇａｌＰの欠失（ＭＹＲ３１）は、最少グルコース培地中での増殖の欠如をもたらすが、ｇｌｆおよびｇｌｋ遺伝子の導入（ＭＹＲ２１７）は増殖を戻す。対照株ＭＹＲ３４はΔａｒｏＥであるが、さもなければ野生型である。３つの芳香族アミノ酸および３つの芳香族ビタミンを培地に添加して、栄養要求株の増殖を可能にした。
【図１８】大腸菌のＭＹＲ３４およびＭＹＲ２１７株におけるＤＨＳ生成。ＤＨＳの生成をもたらすプラスミドを用いて形質転換された場合、グルコース移入のためにｇｌｆ−ｇｌｋを用いるＭＹＲ２１７は、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）を用いるＭＹＲ３４の形質転換体よりも高力価のＤＨＳを生成した。
【図１９】７リットルの発酵器中での大腸菌のＭＹＲ４２８株によるムコン酸の生成。ΔａｒｏＥ  ΔａｃｋＡ：：Ｐ１５−ａｒｏＢΔｐｏｘＢ：：ｔｋｔＡの遺伝子型を有する大腸菌のＭＹＲ２６１株を、プラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰおよびｐＭＧ３７を用いて形質転換して、大腸菌のＭＹＲ４２８株を作成した。
【図２０】ムコン酸ならびに２つのＭＹＲ９９３誘導体ＭＹＲ９９３ΔｕｂｉＸおよびＭＹＲ９９３ΔｕｂｉＤを生成するように遺伝子操作された大腸菌株ＭＹＲ９９３におけるムコン酸およびＰＣＡの生成。ＭＹＲ９９３ΔｕｂｉＸ大腸菌株は、ｕｂｉＸ遺伝子のコード領域を、カナマイシン耐性をコードするカセットで置きかえることによりＭＹＲ９９３株から誘導された。ＭＹＲ９９３ΔｕｂｉＤ大腸菌株は、同様に、ｕｂｉＤ遺伝子のコード領域を、カナマイシン耐性をコードするカセットで置きかえることによりＭＹＲ９９３株から誘導された。
【図２１】ＵｂｉＸの様々な相同体の相対的活性の測定。ＵｂｉＸ相同体の活性の測定を、２９０ｎｍでの吸光度（Ａ２９０）の低下により測定されるＰＣＡの脱カルボキシル化から実行した。５つの異なるＵｂｉＸ相同体、すなわち、ＫｐｄＢ、ＵｂｉＸ、Ｅｌｗ、ＫｏｋおよびＬｐｌを、この試験において用いた。
【図２２】低または高レベルのｋｐｄＢ遺伝子発現を有する大腸菌株におけるムコン酸およびＰＣＡの生成。外因性ｋｐｄＢ遺伝子を有さない大腸菌株ＭＹＲ１３０５を、親株として用いて、Ｐ２６プロモーターまたは大腸菌ｐｇｉプロモーターから発現されるｋｐｄＢ遺伝子を有する低コピープラスミドを用いて形質転換した。Ｐ２６プロモーターからの遺伝子発現は、相対的に低レベルにあると予想されるが、ｐｇｉプロモーターからの遺伝子発現は相対的に高レベルにあると予想される。
【図２３】大腸菌株ＭＹＲ１６７４およびその誘導体ＭＹＲ１７７２におけるムコン酸の生成。ＭＹＲ１７７２は、ｐｐｃのコード領域およびプロモーターを、ＰＲ−ｐｙｃ遺伝子で置きかえることによってＭＹＲ１６７４から誘導した。ＰＲは、コリファージラムダに由来する強力な右向きプロモーターの省略形である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
全ての特許、特許出願、刊行物、配列、および他の公開された材料は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１６】
本特許出願で用いられる語句「例えば」または「など」は、主題の１つより多い方法、手法、解決法、または組成物が手元にあることを示すことを意味し、与えられる例はその例に限定されることを意味しない。
【００１７】
用語「異種」とは、ある生物中に天然または自然には見出されないが、形質転換、交配、または形質導入などの遺伝子操作により生物中に導入することができる遺伝子またはタンパク質を指す。異種遺伝子を染色体に組込む（挿入する）か、またはプラスミド上に含有させることができる。用語「外因性」とは、形質転換、交配、形質導入、または突然変異誘発などの遺伝子操作により、活性を増加、減少、または排除するために、ある生物中に導入された、または変化した遺伝子またはタンパク質を指す。外因性遺伝子もしくはタンパク質は異種であってもよく、またはそれは宿主生物に対して自然であるが、１つもしくは複数の方法、例えば、染色体もしくはプラスミド中での突然変異、欠失、プロモーターの変化、ターミネーターの変化、複製、もしくは１つもしくは複数のさらなるコピーの挿入により変化した遺伝子もしくはタンパク質であってもよい。かくして、例えば、ａｒｏＢ遺伝子の第２のコピーが天然部位とは異なる染色体中の部位に挿入される場合、第２のコピーは外因性である。
【００１８】
本発明において用いられる用語「微生物」は、発酵プロセスによるｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の商業生産に用いることができる細菌、古細菌、酵母、藻類および糸状菌を含む。用語「遺伝子操作された微生物」とは、自然には存在しないが、本特許出願に記載される１つまたは他の遺伝子改変を用いて生成される微生物を指す。
【００１９】
命名については、遺伝子またはコード領域は通常、イタリック体の小文字を用いて、例えば、「ａｒｏＺ」と命名されるが、遺伝子によりコードされる酵素またはタンパク質は同じ文字を用いるが、最初の文字は大文字で、イタリック体を用いずに、例えば、「ＡｒｏＺ」と命名される。酵素またはタンパク質を、より説明的な名称により記載することもでき、例えば、ＡｒｏＺを３−デヒドロシキメートデヒドラターゼと記載することもできる。特定の触媒活性を有する酵素の一例をコードする遺伝子またはコード領域は、歴史的に異なる起源のため、または遺伝子が異なる種に由来するため、いくつかの異なる名称を有してもよい。例えば、バチルス・アントラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に由来する３−デヒドロシキメートデヒドラターゼをコードする遺伝子を、ａｒｏＺの代わりにａｓｂＦと命名し、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）に由来する同じ遺伝子をｑｕｔＣと命名し、ニューロスポラ・クラッサに由来する同じ遺伝子をｑａ−４と命名し、アシネトバクター・バイリイ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｙｌｙｉ）に由来する同じ遺伝子をｑｕｉＣと命名することができる。
【００２０】
「プラスミド」は、微生物の染色体（複数可）とは別の、染色体より実質的に小さく、染色体（複数可）から別々に複製する環状または線状ＤＮＡ分子を意味する。「プラスミド」は、細胞あたり約１コピーまたは細胞あたり１より多いコピーで存在してもよい。一般に、微生物細胞内でのプラスミドの維持には、抗生物質選択が必要であるが、栄養要求性の補完を用いることもできる。
【００２１】
細菌細胞の文脈で本発明において用いられる用語「染色体」または「染色体ＤＮＡ」は、プラスミドよりも実質的に大きく、抗生物質選択を必要としない環状ＤＮＡ分子である。
【００２２】
用語「発現カセット」または「カセット」は、コード領域がプロモーターにより発現され、酵素またはタンパク質がＤＮＡ配列を含む宿主細胞により生成されるような、少なくともプロモーターと酵素または他のタンパク質をコードする遺伝子または領域とを含む染色体またはプラスミドの一部であってもよいＤＮＡ配列を意味する。「発現カセット」は、コード領域がコード領域と天然には会合しないプロモーターから発現されるような、少なくとも部分的に合成されたものであるか、または遺伝子操作方法により構築されたものであってもよい。「発現カセット」は、コード領域と天然に会合するターミネーターであってもなくてもよい転写ターミネーターを含んでもよい。「発現カセット」は、１つより多いタンパク質のためのコード領域を有してもよく、その場合、それはオペロンまたは合成オペロンと呼ぶことができる。
【００２３】
遺伝子またはコード領域の「過剰発現」という用語は、その遺伝子またはコード領域によりコードされる酵素またはタンパク質が、同じか、または類似する増殖条件下で野生型の宿主微生物中に認められるレベルよりも高いレベルで宿主微生物中で生成されるのを引き起こすことを意味する。これを、例えば、１つまたは複数の下記方法：１）より強力なプロモーターを導入すること、２）翻訳開始コドンの約４〜１０塩基上流に位置する、５’−ＡＧＧＡＧＧのＤＮＡ配列などのより強力なリボソーム結合部位を導入すること、３）ターミネーターまたはより強力なターミネーターを導入すること、４）コード領域中の１つまたは複数の部位でのコドンの選択を改善すること、５）ｍＲＮＡ安定性を改善すること、および６）染色体中に複数コピーを導入するか、または多コピープラスミド上にカセットを配置することにより、遺伝子のコピー数を増加させることによって達成することができる。過剰発現される遺伝子から生成される酵素またはタンパク質は、「過剰生成」されると言われる。「過剰発現」される遺伝子または「過剰生成」されるタンパク質は、宿主微生物にとって天然であるものであってもよく、またはそれは異なる生物から宿主微生物中に遺伝子操作方法により移植されたものであってもよく、その場合、酵素またはタンパク質およびその酵素またはタンパク質をコードする遺伝子またはコード領域は「外来」または「異種」と呼ばれる。外来または異種遺伝子およびタンパク質は、操作されていない宿主生物中には存在しないため、それらは定義によれば、過剰発現および過剰生成される。
【００２４】
第１の遺伝子、ＤＮＡ配列、またはタンパク質の「相同体」という用語は、前記第１の遺伝子、ＤＮＡ配列またはタンパク質のものと類似する生物学的機能を実施し、デフォルトパラメータを用い、欠失および挿入を許容して、配列比較のためのＢＬＡＳＴコンピュータプログラム(Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997)により決定された場合、前記第１の遺伝子またはタンパク質との少なくとも２５％の配列同一性（タンパク質配列を比較するか、または遺伝子配列から誘導されるタンパク質配列を比較する場合）を有する第２の遺伝子、ＤＮＡ配列、またはタンパク質である。大腸菌ａｒｏＧ遺伝子の相同体の一例は、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）に由来するａｒｏＧ遺伝子である。
【００２５】
相同性によって距離的に非常に関連する２つの酵素またはタンパク質は、同じ生化学的機能を実行することができるが、互いに相対的に弱く相同であるに過ぎない。例えば、大腸菌Ｋ−１２（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＰ＿４１６１２９）に由来するＦｕｍＡフマラーゼは、その重複領域にわたってクロストリジウム・ボツリナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＧＡＥ０３９０９．１）に由来するフマラーゼと約２６．９％相同であり、その重複領域にわたってピロコッカス種（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＳＴ０４（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＫＦ２３１４６．１）に由来するフマラーゼベータサブユニットと約２５．１％相同である。別の例としては、両方ともＤＨＳをＰＣＡに変換するように機能するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ（クレブシエラ）ＡｒｏＺおよびニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）Ｑａ−４酵素は、２９．３％同一である。従って、代謝経路の遺伝子操作にとって、異種酵素またはタンパク質の重要な特徴は、その酵素またはタンパク質によって実行される機能または反応であって、起源生物または正確なアミノ酸配列ではないため、本発明者らは、例えば、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法を用いるＬａｓｅｒＧｅｎｅ  １２（ＤＮＡＳｔａｒ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）ＭｅｇＡｌｉｇｎ  プログラムを使用するアラインメントのためのデフォルトパラメータ（Ｋｔｕｐｌｅ＝２、Ｇａｐペナルティ＝４、およびＧａｐ長ペナルティ＝１２）を用いることにより示されるように、ギャップを許容して、そのアミノ酸配列の同一性が２５％以上の酵素またはタンパク質の任意の対を含むものとして、「相同」酵素もしくはタンパク質または「相同体」を定義する。
【００２６】
第１の遺伝子、ＤＮＡ配列、またはタンパク質の「類似体」という用語は、前記第１の遺伝子、ＤＮＡ配列、またはタンパク質のものと類似する生物学的機能を実施するが、欠失および挿入を許容して、配列比較のためのＢＬＡＳＴコンピュータプログラム(Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997)により決定された場合、前記第１の遺伝子、ＤＮＡ配列またはタンパク質との配列同一性が２５％未満（タンパク質配列を比較するか、または遺伝子配列から誘導されるタンパク質配列を比較する場合）である第２の遺伝子、ＤＮＡ配列、またはタンパク質である。クレブシエラ・ニューモニアのＡｒｏＺタンパク質の類似体の一例は、アスペルギルス・ニデュランスに由来するＱｕｔＣタンパク質であるが、これは両タンパク質が３−デヒドロシキメートデヒドラターゼ反応を触媒する酵素であるが、２つの酵素またはその対応する遺伝子の間には有意な配列相同性がないからである。当業界における博識な科学者であれば、特定の生物学的機能、例えば、ＤＡＨＰシンターゼまたは３−デヒドロシキメートデヒドラターゼを有する多くの酵素およびタンパク質を、相同体または類似体のいずれかとして、多くの異なる生物中に見出すことができ、そのようなファミリーの酵素またはタンパク質のメンバーが同じ機能を共有するが、それらは構造においてわずかに、または実質的に異なっていてもよく、多くの場合、同じファミリーの異なるメンバーを、遺伝子操作の現在の方法を用いて同じ生物学的機能を実施するために用いることができることを知っているであろう。かくして、例えば、ＡｒｏＺ酵素およびＱｕｔＣ酵素は同じ反応、ＤＨＳデヒドラターゼを触媒し、従って、いずれか１つは適切な状況においてｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の生成をもたらし、最終的にいずれかの１つを用いる選択を、類似する発酵条件下でより高力価のｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸をもたらすものを選択することによって行うことができる。
【００２７】
用語「非芳香族炭素源」または「非芳香族化合物」は、炭素および／またはエネルギーの源として本発明の微生物に供給するために用いることができる炭素含有化合物を意味し、その化合物はベンゼンと関連する６員環を含有しない。非芳香族炭素源の例としては、グルコース、キシロース、ラクトース、グリセロール、アセテート、アラビノース、ガラクトース、マンノース、マルトース、またはスクロースが挙げられる。「芳香族化合物」は、ベンゼンと関連する１つまたは複数の６員環を含有する化合物である。芳香族化合物の一例は、カテコール、または１，２−ジヒドロキシベンゼンである。非芳香族炭素源の源としてグルコースを用いてムコン酸を生成するために選択される微生物をさらに操作して、特許文献である米国特許第８，８７１，４８９号ならびに米国特許出願公開第２０１３／０３３７５１９Ａ１号および同第２０１４／０２３４９２３Ａ号に提供されたような遺伝子操作技術を用いて、グリセロール、スクロースおよびキシロースなどの、他の型の非芳香族炭素源を用いることができる。
【００２８】
用語「強力な構成的プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるＤＮＡ配列または遺伝子の、典型的には上流（従来の５’から３’方向に記載される場合、遺伝子の５’側）にあり、任意の好適なアッセイ手順により直接的または間接的に容易に検出されるレベルでＲＮＡポリメラーゼによる転写によって前記ＤＮＡ配列または遺伝子の発現を引き起こすＤＮＡ配列を意味する。好適なアッセイ手順の例としては、１）定量的逆転写酵素＋ＰＣＲ、２）コードされる酵素の酵素アッセイ、３）クマシーブルー染色タンパク質ゲル、または４）前記転写の結果として間接的に生成される代謝物の測定可能な生成、および転写のレベルを特異的に調節するタンパク質、代謝物、もしくは化学誘導因子の存在もしくは非存在に関係なく生じるそのような測定可能な転写が挙げられる。「強力な構成的プロモーター」ではないプロモーターの一例は、大腸菌のＰｌａｃプロモーターであり、これはそれがラクトースまたは誘導因子ＩＰＴＧの非存在下ではリプレッサーにより抑制されるからである。当業界で周知の方法を用いることにより、「強力な構成的プロモーター」を用いて天然のプロモーター（さもなければＤＮＡ配列または遺伝子から上流に天然に存在するプロモーター）を置きかえて、プラスミドまたは染色体中に配置することができ、天然プロモーターからのレベルよりも高いレベルでの所望のＤＮＡ配列または遺伝子の発現レベルを提供する発現カセットを得ることができる。強力な構成的プロモーターは、種または属にとって特異的であってもよいが、細菌に由来する強力な構成的プロモーターは遠縁の細菌中でも良好に機能し得ることが多い。例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するプロモーターまたは通常はバチルス・サブチリス上で増殖するファージは、大腸菌中でも良好に機能することができる。「強力な構成的プロモーター」は、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の先行技術による生成において用いられてきた、典型的には、所望のレベルの機能のために高価な化学物質または他の環境的変化を必要とする、Ｐｔａｃなどの誘導的プロモーターとは実質的に異なるものである(Niu et al., 2002)。強力な構成的プロモーターの例は、バチルス・サブチリスファージＳＰ０１に由来するＰ１５、Ｐ２６、およびコリファージラムダＰＲである。
【００２９】
「突然変異」は、ＤＮＡ配列を、関連する野生型配列と異なるものにする、ＤＮＡ配列の任意の変化である。「突然変異」は、単一塩基変化、欠失、挿入、置きかえ、フレームシフト、反転、重複、またはＤＮＡ配列の他の任意の型の変化を含んでもよい。通常、「突然変異」とは、機能に対する負の効果を有するか、または遺伝子もしくは遺伝子産物の活性を低下させる変化を指すが、本明細書における用語「突然変異」は、遺伝子または遺伝子産物の活性を増加させる変化を指してもよい。例えば、ａｒｏＧ遺伝子のフィードバック耐性突然変異は、フェニルアラニンなどの阻害剤の存在下でＡｒｏＧの活性を増加させる。あるプロモーターの、異なる、より強力なプロモーターによる置きかえもまた、遺伝子または遺伝子産物の活性を増加させることができる突然変異をもたらす。「ヌル突然変異」は、遺伝子の多くの、または全部の欠失などの突然変異であり、遺伝子の機能を効率的に除去する突然変異である。「突然変異体」は、１つまたは複数の突然変異を含む株または単離物である。
【００３０】
ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸（本明細書では単に「ムコン酸」と呼ばれる）の生物学的生成は、芳香族アミノ酸経路からの炭素の再指向に基づく。芳香族アミノ酸およびビタミンの天然の生成には、代謝物であるエリスロース−４−リン酸（Ｅ４Ｐ）およびホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）が必要である。芳香族アミノ酸合成における第１の関与工程は、３−デオキシ−アラビノ−ヘプツロネート７−リン酸（ＤＡＨＰ）シンターゼ酵素によって触媒される。大腸菌においては、この工程は、３つの異なるアイソザイム、ＡｒｏＧ、ＡｒｏＦ、またはＡｒｏＨによって実施され得る。これらの酵素はそれぞれ、リプレッサータンパク質ＴｙｒＲによって転写レベルで調節され、ならびにそれぞれ、経路の最終生成物であるフェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからの阻害によってタンパク質レベルで調節される。ムコン酸の生成は、芳香族アミノ酸経路の中間体であるデヒドロシキミ酸（ＤＨＳ）から進行し、３つの異種酵素であるデヒドロシキメートデヒドラターゼ（ＡｒｏＺ）、３，４−ジヒドロ安息香酸デカルボキシラーゼ（ＡｒｏＹ）、およびカテコール１，２−ジオキシゲナーゼ（ＣａｔＡ）の発現を必要とする。この経路は、図１および図２に示される。
【００３１】
「ムコン経路」または「ムコン酸経路」とは、ＤＨＳからＰＣＡ、カテコール、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸に向かう生化学経路を指し、「ムコン経路遺伝子」はムコン経路中の工程を触媒する酵素をコードするか、または前記酵素の１つ、例えば、ａｒｏＺ、ａｒｏＹ、ｃａｔＡ、ｃａｔＸ、およびｑｕｔＣ（図３）の活性を増強するように働く補助機能をコードする遺伝子である。ＤＨＳは３−デヒドロシキメートの省略形であり、ＰＣＡはプロトカテク酸の省略形である。「ムコンプラスミド」は、１つまたは複数のムコン経路遺伝子を含有するプラスミドである。
【００３２】
本発明において用いられる遺伝子操作は、図１に示されるような多くの微生物細胞中に存在する芳香族アミノ酸および芳香族ビタミン（またはビタミン様物質）生合成のための共通経路に集中している。図１に示す芳香族アミノ酸生合成のための共通経路は、「シキミ酸」もしくは「シキメート」経路、「コリスミ酸」もしくは「コリスメート」経路、または「中心芳香族」もしくは「中心芳香族生合成」経路と呼ぶことができる。
【００３３】
芳香族アミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンの生成のための微生物の遺伝子操作に関するかなりの量の公開された研究が存在する（米国特許第４，６８１，８５２号、米国特許第４，７５３，８８３号、米国特許第６，１８０，３７３号、欧州特許出願第８６３００７４８．０号）。芳香族アミノ酸の生成のための手法としては、様々な組合せのフィードバック耐性酵素（ＡｒｏＦ、ＡｒｏＧ、ＰｈｅＡ、ＴｙｒＡ）の使用、転写抑制の脱調節（ｔｙｒＲ−）、プロモーター強度の増大（Ｐｔａｃ、Ｐｌａｃ）および１つまたは複数の遺伝子のコピー数の増加（ｔｋｔＡ）が挙げられる。上記遺伝子改変の多くの特定の組合せを行って、ムコン酸生成にとって好適な生体触媒を得ることができる。
【００３４】
その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願公開ＷＯ２０１３／１１６２４４の開示によれば、遺伝子操作された微生物は、ムコン酸を生成するためにいかなる外因性プラスミドも含有する必要はないが、それらは所望の表現型を達成するのに必要なある特定の外因性または異種遺伝子を有する。本発明の好ましい実施形態においては、微生物中に導入される外因性遺伝子は、染色体ＤＮＡ中に安定的に組み込まれる。外因性遺伝子のこの染色体ＤＮＡへの組込みの結果として、外因性ＤＮＡを担持するプラスミドを維持するための抗生物質または他の選択方法の使用の必要性は、全体として除去される。さらに、グルコースなどの炭素源からｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸への経路の操作にとって必要な遺伝子を発現させるために、化学的誘導因子を必要としない強力なプロモーターが用いられる。
【００３５】
外因性コード配列を染色体ＤＮＡ中に組み込む場合、それを、その欠失がいかなる有害効果も引き起こさないと報告されている遺伝子座に組み込む。例えば、ｙｄｅＭとしても知られる、大腸菌細菌中の物理的位置００３９のコード領域は、リポタンパク質と注釈され、欠失に対する有害効果を有さないことが証明されている。同様に、ｎｌｐＡとしても知られる、大腸菌細菌中の物理的位置２１６０のコード領域は、ラジカルＳＡＭドメインタンパク質と注釈され、欠失に対する有害効果を有さないことが証明されている。本発明においては、ＰＲ−ｃａｔＡＸのコピーを、大腸菌細菌中の物理的位置００３９に挿入し、ＰＲ−ａｒｏＧＦＢＲのコピーを、大腸菌細菌中の物理的位置２１６０に挿入した。本明細書に記載の他の例においては、挿入は、望ましくない機能をコードする遺伝子、例えば、ｐｔｓＩ遺伝子またはｔｙｒＲ遺伝子などの、ノックアウトまたは欠失させることが有利である遺伝子中で行われる。
【００３６】
芳香族アミノ酸生合成経路は多くの微生物、特に大腸菌については周知である(Neidhart and Curtiss, 1996)。野生型細胞においては、前記経路はフィードバック阻害と転写の抑制との両方によって厳密に調節される。最初の関係する工程は、デオキシ−アラビノ−ヘプツロソネート７−リン酸（ＤＡＨＰ）シンターゼにより触媒され、ａｒｏＦ、ａｒｏＧ、およびａｒｏＨによりコードされる３つのアイソザイムが存在する。３つのアイソザイム、ＡｒｏＦ、ＡｒｏＧ、およびＡｒｏＨは、芳香族アミノ酸生合成経路の生成物、すなわち、それぞれ、チロシン、フェニルアラニン、およびトリプトファンによりフィードバック阻害される。ＡｒｏＦ、ＡｒｏＧ、およびＡｒｏＨのフィードバック耐性突然変異体が周知である(Hu et al., 2003; Lutke-Eversloh and Stephanopoulos, 2007)。本発明の一態様は、芳香族アミノ酸生合成経路の生成物によるフィードバック阻害に耐性であるＡｒｏＦ、ＡｒｏＧおよびＡｒｏＨ酵素タンパク質を発現させるためのａｒｏＦ、ａｒｏＧおよびａｒｏＨ遺伝子のフィードバック耐性対立遺伝子の使用を含む。フィードバック阻害に耐性であるＡｒｏＦ、ＡｒｏＧおよびＡｒｏＨ酵素タンパク質は、ＡｒｏＦＦＢＲ、ＡｒｏＧＦＢＲおよびＡｒｏＨＦＢＲと呼ばれる。
【００３７】
芳香族経路に関与するいくつかのオペロンの転写は、ｔｙｒＲ遺伝子によりコードされるリプレッサーまたはｔｒｐＲ遺伝子によりコードされるリプレッサーのいずれか、またはその両方によって調節される(Neidhardt and Curtiss, 1996)。ＴｙｒＲタンパク質が１つまたは複数の芳香族アミノ酸と結合した場合のＴｙｒＲタンパク質によるａｒｏＧおよびａｒｏＦの転写の負の調節が特に重要である。本発明の一態様は、宿主細菌株の染色体からこれらの遺伝子を排除することによる、ｔｙｒＲまたはｔｒｐＲ遺伝子による負の調節の除去を含む。
【００３８】
本発明は、ムコン酸生成にとって好適な生体触媒における遺伝子エレメントのある特定の組合せ、例えば、限定されるものではないが、過剰生成されるフィードバック耐性ＡｒｏＧ、過剰生成されるフィードバック耐性ＡｒｏＦ、過剰発現されるｔｋｔＡ、過剰発現されるｔａｌＡ、強力な構成的プロモーターからａｒｏＺ、ａｒｏＹおよびｃａｔＡＸ（またはその類似体もしくは相同体）を発現させるための染色体に組込まれるカセット、ならびに芳香族アミノ酸およびビタミンの原栄養性を付与するが、望ましくない芳香族化合物の有意な分泌をもたらさないＡｒｏＥ酵素をコードする遺伝子と本発明者らが定義する、漏れやすい（ｌｅａｋｙ）ａｒｏＥ対立遺伝子の様々な組合せを教示する。
【００３９】
本明細書で開示される株コンストラクションの全ての特定例は、野生型大腸菌Ｃ株（ＡＴＣＣ８７３９）または大腸菌Ｗ株（ＡＴＣＣ９６３７）に基づくものである。しかしながら、本明細書で開示される発現カセットまたは遺伝子エレメントの適切な類似体および相同体を、発酵プロセスによるムコン酸の商業生産のために用いることができる、任意の他の好適な大腸菌株ならびに他の種の細菌、古細菌、酵母、藻類、および糸状菌などの任意の他の好適な微生物中で集合させることができることが、この点で実現されるべきである。
【００４０】
大腸菌においては、グルコースからの芳香族アミノ酸生合成経路は、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の非酸化的分岐から始まる。非酸化的ペントースリン酸経路中の４つの重要な酵素は、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼおよびリブロース−５−リン酸イソメラーゼである。これらの酵素は、ヘキソースまたはペントース糖からのエリスロース４−リン酸（Ｅ４Ｐ）の形成を誘導する反応を触媒する。大腸菌におけるＥ４Ｐの利用性を増大させるために、トランスケトラーゼをコードするｔｋｔＡ遺伝子を過剰発現させることができる(Niu et al., 2002)。同様に、トランスアルドラーゼ遺伝子の過剰発現も、いくつかの環境においてはＥ４Ｐの利用性を増大させると予想される(Bongaerts et al., 2001)。本発明のさらに別の態様においては、トランスケトラーゼとトランスアルドラーゼ遺伝子との両方が、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ酵素の活性の増加をもたらす遺伝子操作によって増強される。本発明のさらに別の態様においては、ＰＰＰの非酸化的分岐を介する流動が、リブロース−５−リン酸エピメラーゼおよびリブロース−５−リン酸イソメラーゼを過剰生成することにより増加する。
【００４１】
第１の関連する工程および共通の芳香族アミノ酸経路における最も厳密に調節される反応は、ＤＡＨＰシンターゼ（ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、およびａｒｏＨによりコードされる）によりデオキシアラビノ−ヘプツロソネート７−リン酸（ＤＡＨＰ）を生成するためのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）とＥ４Ｐとの縮合である。大腸菌により消費されるＤ−グルコースは、一部はＰＰＰにより、一部は解糖により芳香族生合成にもたらされる。芳香族経路へのグルコースの流動は、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ）およびＤＡＨＰシンターゼのアイソザイム（ａｒｏＧ）が、コピー数を増加させることにより発現を増加させるプラスミドを用いる形質転換により増幅された場合に大きく増加する(Niu et al., 2002)。本発明の好ましい態様においては、外因性ａｒｏＧおよびｔｋｔＡ遺伝子は、トランスケトラーゼおよびＤＡＨＰシンターゼ酵素の活性の増幅のために染色体ＤＮＡ中に組込まれる。
【００４２】
本発明の別の実施形態においては、微生物細胞内でのＰＥＰを介する流動は、ＰＥＰの他の経路への流動を減少させることによりＤＡＨＰの合成に利用可能なＰＥＰを増加させることによって改善される。細菌細胞の多くの属は、１個のＰＥＰ分子が細菌外膜を通って輸送されるグルコース分子ごとに消費されるホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）を用いて細胞膜を通るグルコースの輸送においてＰＥＰを消費する。ＰＥＰ依存的ＰＴＳを非ＰＥＰ依存的（ＰＥＰ非依存的）グルコース取込み機構で置きかえるか、または補完することにより、微生物細胞内で芳香族アミノ酸生合成経路にとって利用可能なＰＥＰのプールサイズを増大させることができる。例えば、糖取込みのためのＰＴＳ系を、ＧａｌＰに基づく糖取込み系またはＧｌｆ／Ｇｌｋタンパク質に基づく糖輸送系により置きかえるか、または補完することができる(Chandran et al., 2003; Yi et al., 2003)。本発明の好ましい態様においては、微生物細胞内のＰＥＰプールを保存するために糖取込みのためのＰＴＳ系を欠失させることの他に、微生物細胞内のＡＴＰを保存するためにＧａｌＰに基づく糖取込み系も不活化される。ＰＴＳ系とＧａｌ−Ｐに基づく糖取込み系との両方の機能が欠損した微生物細胞（ΔＰＴＳ／ΔｇａｌＰ）においては、Ｇｌｆ（ｇｌｕｃｏｓｅ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｄ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）をコードする外因性遺伝子、またはＧｌｆ［グルコース促進拡散タンパク質］およびＧｌｋ（グルコキナーゼ）タンパク質の両方をコードする外因性遺伝子を導入することによって、糖取込みを達成することができる。本発明で用いられる用語「機能的グルコース促進拡散タンパク質」とは、任意のＧｌｆタンパク質ならびにＧｌｆと機能的に等価であり、促進拡散により糖を微生物細胞中に輸送するように機能する任意の他のタンパク質を指す。本発明の一態様においては、グルコース促進タンパク質Ｇｌｆをコードする遺伝子は、ΔＰＴＳ／ΔｇａｌＰである微生物細胞中に導入され、微生物細胞中に輸送されるグルコースは内因性グルコースキナーゼによってリン酸化される。本発明の別の態様においては、ＧｌｆとＧｌｋタンパク質の両方をコードする遺伝子は、ΔＰＴＳ／ΔｇａｌＰである微生物細胞中に導入される。本発明の好ましい態様においては、微生物細胞中に導入される外因性ｇｌｆおよびｇｌｋ遺伝子は、宿主染色体ＤＮＡ中に組込まれる。
【００４３】
本発明の別の実施形態においては、増殖およびエネルギーのための炭素源が糖新生を必要とする場合（例えば、炭素源がアセテートまたはスクシネートである場合）、細胞内に既に存在するカルボキシル化酵素、例えば、大腸菌においてはｐｃｋによりコードされるＰＥＰカルボキシキナーゼの活性を増加させるか、または外因性カルボキシル化酵素を導入することにより、ＰＥＰプールを増加させることができる。好ましい実施形態においては、カルボキシル化酵素をコードする導入された外因性遺伝子は、宿主染色体中に安定に組込まれる。カルボキシル化酵素をコードする遺伝子を、様々な微生物種から誘導することができる。カルボキシル化酵素をコードする遺伝子を遺伝子操作にさらにかけて、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸生成のための生体触媒内のカルボキシル化酵素の発現を有意に増強することができる。
【００４４】
ＰＥＰは、芳香族経路のための２つの主要な代謝物のうちの１つであり、Ｐｐｃ活性の減少または除去は、芳香族経路およびムコン酸生成のためにＰＥＰを保持する。Ｐｐｃは、ＴＣＡサイクル中の中間体であるオキサロ酢酸を形成するアナプレロティック反応を触媒する。Ｐｐｃ活性は、最少培地中の野生型大腸菌およびいくつかの他の生物にとって必須であるが、それは他のものには存在しない。Ｐｐｃを欠く酵母などのいくつかの生物は、オキサロ酢酸を補給するためにＰｙｃを用いる。Ｐｐｃ活性の低下またはその非存在を、ＰＥＰの代わりのピルビン酸からオキサロ酢酸への代替経路を提供し、ムコン酸生成ならびに中間体としてＰＥＰを必要とする芳香族化合物などの他の化合物の生成のためのＰＥＰの利用可能性の増加をもたらすことによって、Ｐｙｃ活性で補完することができる。本明細書に開示される少なくとも１つの例においては、ＰｙｃのＰｐｃへの置換は、ＰＥＰからＯＡＡへの流動を減少させ、次いで、中心芳香族経路のためにＰＥＰを保存することができる。
【００４５】
本発明のさらに別の実施形態においては、微生物細胞内のＰＥＰプールは、基質としてＰＥＰを用いるＰｙｋＡおよびＰｙｋＦなどのピルビン酸キナーゼ酵素の活性を低下または排除することにより増加する。
【００４６】
ＤＡＨＰについては、芳香族アミノ酸経路は、いくつかの中間体を介して、３つの芳香族アミノ酸、すなわち、Ｌ−チロシン（Ｌ−Ｔｙｒ）、Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｐｈｅ）、およびＬ−トリプトファン（Ｌ−Ｔｒｐ）の生合成のための分岐点であるコリスメート（ＣＨＡ）に向かって進行する。
【００４７】
共通芳香族アミノ酸経路の初期段階では、３−デヒドロキネート（ＤＨＱ）シンターゼ（ＡｒｏＢ）は、ＤＨＡＰからリン酸基を除去し、ＤＨＱの形成をもたらす。酵素ＤＨＱデヒドラターゼ（ＡｒｏＤ）は、ＤＨＱから水分子を除去し、３−デヒドロシキメート（ＤＨＳ）の形成をもたらし、次いで、シキメートデヒドロゲナーゼ（ＡｒｏＥ）によってシキメート（ＳＨＫ）に還元される。シキメートキナーゼＩ／ＩＩ（ＡｒｏＫ、ＡｒｏＬ）は、シキメートをシキメート３−リン酸（Ｓ３Ｐ）にリン酸化する。Ｓ３ＰとＰＥＰとの縮合が存在し、５エノールピルボイルシキメート３−リン酸（ＥＰＳＰ）の形成をもたらす。ＥＰＳＰの形成は、ＥＰＳＰシンターゼ（ＡｒｏＡ）によって媒介される。ＥＰＳＰに由来するリン酸基は、コリスメートシンターゼ（ＡｒｏＣ）により除去され、コリスメート（ＣＨＡ）の形成をもたらす。
【００４８】
図２に示されるように、芳香族アミノ酸経路を、ａｒｏＥ遺伝子中の突然変異のためシキメート（ＳＨＫ）への３−デヒドロシキメート（ＤＨＳ）の変換のレベルで遮断し、ＤＨＳの蓄積をもたらすことができる(Niu et al., 2002)。外因性ａｒｏＺ遺伝子の導入は、ＤＨＳをプロトカテクエート（ＰＣＡ）に変換するように機能する。ＰＣＡは続いてＡｒｏＹ酵素により媒介される脱カルボキシル化反応によりカテコールに変換される。カテコールは最終的に、ｃａｔＡ遺伝子産物の作用によりｃｉｓ−ｃｉｓ−ムコン酸（ｃｃＭｕＡ）に変換される。ｃｃＭｕＡをマレイルアセト酢酸イソメラーゼにより作用させて、ｔｒａｎｓ−ｔｒａｎｓムコン酸（ｔｔＭｕＡ）を得ることができる。ＤＨＳからｃｃＭｕＡおよび／またはｔｔＭｕＡへの生合成経路は、ムコン酸経路と呼ばれる。ＤＨＳのｃｃＭｕＡへの変換を担う３つの異なる遺伝子を、様々な微生物種から取得し、大腸菌などのムコン酸生成のために選択される微生物中に導入することができる。本発明の好ましい実施形態においては、ムコン酸経路に関与するタンパク質をコードする外因性遺伝子は宿主染色体ＤＮＡ中に組込まれる。
【００４９】
芳香族アミノ酸経路をｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の生成に向かわせる場合、ａｒｏＥ遺伝子の突然変異が重要である。ａｒｏＥ遺伝子を完全に不活化し、ムコン酸生成について記載された大腸菌のＷＮ１／ｐＷＮ２．２４８株と同様、芳香族アミノ酸の生合成の完全な遮断をもたらすことができる(Niu et al., 2002)。ＷＮ１／ｐＷＮ２．２４８大腸菌株および関連株に関する重要な欠点は、ａｒｏＥ遺伝子の完全な不活化のため、この株がフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンなどの芳香族酸、ならびに上記の芳香族ビタミンまたはビタミン様化合物について栄養要求性になっていることである。結果として、この株は、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の生成のためのその増殖の間に、これらの化合物（またはシキメートなどの共通の中間体）の外因的添加を必要とし、それによって、そのような株を用いるｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の商業生産の費用に実質的に加える。芳香族アミノ酸の外因性源へのこの依存性を克服するための新規手法は、ａｒｏＥ中に漏れやすい突然変異を有する株を使用することである。漏れやすいａｒｏＥ突然変異体は、有意な量のＤＨＳを蓄積させながらシキミ酸への炭素の限られた流動を可能にし、次いで、ＡｒｏＺ酵素の作用によるＰＣＡへの変換に利用可能である。かくして、漏れやすい突然変異型のａｒｏＥの使用は、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸への炭素の流動を依然として転換しながら外因性芳香族アミノ酸への依存性を排除する。
【００５０】
ＤＨＳのｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸への変換にとって必須のＡｒｏＺ、ＡｒｏＹおよびＣａｔＡタンパク質の合成をコードする遺伝子を、多くの微生物種のいずれか１つから誘導することができる。一実施形態においては、これらの外因性遺伝子は、開発される生体触媒の宿主染色体中に組込まれる。好ましい実施形態においては、生体触媒内でのこれらの外因性遺伝子の発現は、誘導因子を必要とすることなく構成的プロモーターにより誘導される。
【００５１】
酵素３−デヒドロシキメートデヒドラターゼ（ＡｒｏＺ；ＥＣ４．２．１．１１８）は、中間体プロトカテクエートの生合成にとって必要である。本明細書では、「ＡｒｏＺ」は、３−デヒドロシキメートデヒドラターゼ反応を触媒する任意の酵素を指す。先行技術においては、この酵素は、クレブシエラ・ニューモニア株Ａ１７０−４０（ＡＴＣＣ２５５９７）のａｒｏＺ遺伝子から発現される(Niu et al., 2002; Draths and Frost, 1995)。しかしながら、ＡｒｏＺの比活性は、０．１から２６１マイクロモル／ｍｉｎ／ｍｇまで生物間で広く変化し（Wheeler et al, 1996; Fox et al, 2008; Pfleger et al, 2008)、従って、クレブシエラ・ニューモニアよりも高い比活性を有する生物、例えば、アシネトバクター・バイリイ、現在ではエメリセラ・ニデュランス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）としても知られるアスペルギルス・ニデュランス(Wheeler et al, 1996)、またはニューロスポラ・クラッサ(Rutledge, 1984; Stroman et al, 1978)、またはポドスポラ・パウシセタ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ｐａｕｃｉｓｅｔａ）(Hansen et al, 2009)としても知られるポドスポラ・アンセリナ（Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ  ａｎｓｅｒｉｎａ）から、ａｓｂＦ(Fox et al, 2008; Pfleger et al, 2008)、ｑｕｔＣ(Wheeler et al, 1996)、ｑａ−４(Rutledge, 1984)、およびｑｕｉＣとしても知られるａｒｏＺ遺伝子を発現させることにより、有意な改善を得ることができる。
【００５２】
１つの特定の例として、３−デヒドロシキメートデヒドラターゼをコードするニューロスポラ・クラッサに由来するｑａ−４遺伝子のコード配列を、いくつかの周知の方法のいずれか、例えば、全遺伝子ＤＮＡ合成、ｃＤＮＡクローニング、またはゲノムＤＮＡクローニングとＰＣＲとの組合せまたは合成ＤＮＡリンカー合成により取得することができる。ｑａ−４遺伝子中にはイントロンが存在しないため、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲによってコード領域を取得することができる(Rutledge, 1984)。ｑａ−４酵素のタンパク質配列（配列番号４）および天然遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号５）は公知である。
【００５３】
あるいは、アスペルギルス・ニデュランスに由来する３−デヒドロシキメートデヒドラターゼのために発現カセットを構築することができる。アスペルギルス・ニデュランスに由来するＱｕｔＣ酵素のコード配列を、いくつかの周知の方法のいずれか、例えば、全遺伝子ＤＮＡ合成、ｃＤＮＡクローニング、またはゲノムＤＮＡクローニングとＰＣＲとの組合せもしくは合成ＤＮＡリンカー合成により取得することができる。ＱｕｔＣ（配列番号６）のタンパク質配列およびイントロンを含まない天然遺伝子のＤＮＡ配列は公知である（配列番号７；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ７７６６５．１）。ＤＮＡ合成、またはゲノムクローニングとＰＣＲの組合せによって発現カセットを取得して、ＱｕｔＣ酵素を大腸菌中で正確に生成させることができる。大腸菌中で強力な構成的プロモーターからＱｕｔＣのコード配列を発現させることにより、染色体中に組込まれた１または２コピーの遺伝子から十分な発現を得て、先行技術(Niu et al., 2002)に開示され、不安定性をもたらし得る多コピープラスミド上で２コピーより多い発現カセットを維持する必要性を除くことができる。一般に、上記の方法を用いて、所望の酵素をコードするＤＮＡ配列を取得した後、そのコード配列を用いて、大腸菌または別の適切な微生物宿主生物中で機能するように設計された発現カセットを構築することができる。
【００５４】
ＡｒｏＺの比活性を、先行技術(Niu et al., 2002)に由来するタンパク質配列を用いることにより、例えば、より強力なプロモーターおよび／またはリボソーム結合部位（ＲＢＳ）が、実施例４に記載されるようにコード領域の前に導入された、改善された発現カセットを構築することにより改善することもできる。
【００５５】
クレブシエラ・ニューモニア株Ａ１７０−４０に由来するＡｒｏＺ（３−デヒドロシキメートデヒドラターゼ）をコードするａｒｏＺ遺伝子を、先行技術に記載のように取得することができる。遺伝子および周囲のＤＮＡのＤＮＡ配列を、当業界で周知の方法によって決定することができる。ａｒｏＺなどの本発明の異種遺伝子を、天然ＤＮＡ配列を用いて発現カセット中で構成するか、またはそれを意図される宿主生物のためのコドン最適化された配列を用いて合成することができる。ａｒｏＺ遺伝子を、活性なａｒｏＺ遺伝子を含有する任意の他の微生物、例えば、クレブシエラ・ニューモニア株３４２、アシネトバクター種ＡＤＰ１（アシネトバクター・バイリイＡＤＰ１）、バチルス・チューリンゲンシス、エメリセラ・ニデュランス、エルウィニア・アミロボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、シュードモナス・プチダＷ６１９、ニューロスポラ・クラッサ、アスペルギルス・ニデュランスおよび多くの他のものから、記載のように(Draths and Frost, 1995)クローニングすることができる。
【００５６】
酵素プロトカテクエートデカルボキシラーゼ（ＡｒｏＹ；ＥＣ４．１．１．６３）は、中間体カテコールの生合成にとって必要である。本明細書では、「ＡｒｏＹ」は、プロトカテクエートデカルボキシラーゼ反応を触媒する任意の酵素を指す。先行技術においては、この酵素は、多コピープラスミド上のクレブシエラ・ニューモニア株Ａ１７０−４０（ＡＴＣＣ２５５９７）のａｒｏＹ遺伝子から発現される(Niu et al., 2002)。しかしながら、再度、宿主生物の染色体中に組込まれた１または２コピーの発現カセットから十分な酵素を生成させることにより、プロセスの改善を得ることができる。先行技術のクレブシエラ・ニューモニアのＡｒｏＹ酵素のものよりも高い比活性を有するＡｒｏＹ酵素を天然に生成する生物からａｒｏＹ遺伝子を取得することにより、または例えば、実施例４の下で強力な構成的プロモーターおよび／もしくは上記の強力なＲＢＳを用いる発現カセットを構築することによりクレブシエラ・ニューモニアのＡｒｏＹの発現レベルを増加させることにより、これを達成することができる。クレブシエラ・ニューモニア株Ａ１７０−４０に由来するＡｒｏＹのタンパク質配列を、配列番号８に与える。対応する遺伝子ａｒｏＹを上記のように(Draths and Frost, 1995)クローニングするか、またはタンパク質配列に基づいて、意図される宿主生物のための最適化されたコドンを用いてそれを合成することができる。
【００５７】
ａｒｏＹ遺伝子を、相同体または類似体を含む任意の他の微生物、例えば、クレブシエラ・ニューモニア株ＮＣＴＣ４１８（ＡＴＣＣ１５３８０）、クレブシエラ・ニューモニア３４２、およびアルクスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）(Sietmann et al, 2010)から得ることができる。クレブシエラ・ニューモニア３４２に由来するａｒｏＹ遺伝子および周囲のＤＮＡのＤＮＡ配列を、配列番号９に与える。
【００５８】
酵素カテコール１，２−ジオキシゲナーゼ（ＣａｔＡ；ＥＣ１．１３．１１．１）は、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸生合成の最後の工程にとって必要である。本明細書では、「ＣａｔＡ」は、カテコール１，２−ジオキシゲナーゼ反応を触媒する任意の酵素を指す。先行技術においては、この酵素は多コピープラスミド上のアシネトバクター・カルコアセチクス株ＡＤＰ１のｃａｔＡ遺伝子から発現される(Niu et al., 2002)。起源株であるアシネトバクター・カルコアセチクス株ＡＤＰ１は、外見上、アシネトバクター種ＡＤＰ１およびアシネトバクター・バイリイＡＤＰ１と改名された(Neidle and Ornston, 1986; Barbe et al, 2004; de Berardinis et al, 2008)。この先行技術の例においては、ｃａｔＡ遺伝子は、誘導因子としてラクトースまたはＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）のいずれかを必要とするＰｔａｃプロモーターから発現された。これらの化合物は商業的発酵における使用にとってはあまりにも高価であり、再度、高価な誘導因子の必要性を排除するため、および染色体中に発現カセットを組込むことによりより安定な株を作出するためには、プロセスにおける有意な改善が必要である。これを、強力な構成的プロモーター、強力なＲＢＳ、および／または他の実施例に上記されたようなより安定なｍＲＮＡを用いるｃａｔＡ遺伝子のための発現カセットを構築することにより達成することができる。
【００５９】
アシネトバクター・バイリイＡＤＰ１に由来するｃａｔＡ遺伝子および周囲の配列のＤＮＡ配列を、配列番号１０に与える。同株に由来するＣａｔＡのタンパク質配列を、配列番号１１に与える。好ましい実施形態においては、ｃａｔＡのための発現カセットは、ｃａｔＡ遺伝子の発現レベルを増加させるための、天然ではｃａｔＡから下流に存在する１つまたは２つのさらなるオープンリーディングフレームを含む(Schirmer and Hillen, 1998)。多くの他の生物がｃａｔＡ遺伝子の起源であってもよく、例えば、シュードモナス・アルビラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｒｖｉｌｌａ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）(Nakazawa et al, 1967; Kojima et al, 1967)、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種株２０６５(Iwagami et al, 2000)、クプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ  ｎｅｃａｔｏｒ）３３５Ｔ、および他の多くのもの(Perez-Pantoja et al, 2008)が挙げられる。
【００６０】
ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸に向かう炭素の流動を改善するためには、漏れやすいａｒｏＥ突然変異体を用いることによりＤＨＳからシキメート（ＳＨＫ）への炭素の流動を減少させることの他に、芳香族アミノ酸経路から分岐する特定の他の経路を遮断することが必要である。例えば、アシネトバクター属およびシュードモナス属のいくつかの細菌は、ＤＨＳを没食子酸に変換する酵素ｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（ｈｙｄｒｏｘｌａｓｅ）をコードするｐｏｂＡという名称の遺伝子を含む。ＰｏｂＡ相同体または類似体は大腸菌中には見出されていないが、ＤＨＳを生成するように操作された大腸菌の株は測定可能な量の没食子酸を分泌するため(Li and Frost, 1999)、そのような酵素が大腸菌中に存在する可能性がある。さらにＤＨＳから誘導されたＰＣＡを、ｐｏｂＡ遺伝子によりコードされたｐ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（ＰｏｂＡ）酵素の作用により没食子酸に変換することができる。次いで、かくして生成された没食子酸を、ピロガロールに変換することができる。ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の改善のために選択された生体触媒中での没食子酸およびピロガロールへの炭素流動を遮断するための１つの方法は、遺伝子操作を介するｐ−ヒドロ安息香酸ヒドロキシラーゼ（ＰｏｂＡ）タンパク質の活性を遮断するか、または減少させることである。同様に、ＤＨＳに対する前駆体であるＤＨＱに、ａｒｏＥによりコードされたシキメートデヒドロゲナーゼを作用させて、キナ酸（ｑｕｉｎｎｉｃ  ａｃｉｄ）の生成をもたらすこともできる。本発明のある実施形態においては、漏れやすいＡｒｏＥ突然変異体酵素を、ＤＨＱをキナ酸に変換するその無能力または能力の低下についてさらに選択またはスクリーニングする。
【００６１】
ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の代わりにｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を生成することにはいくつかの利点がある。ｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸は、テレフタル酸の生成のためのエチレンとのＤｉｅｌｓ  Ａｌｄｅｒ反応においてｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸よりも好ましい。遺伝子操作された芳香族経路を有する生体触媒は、化学的変換プロセスを用いて細胞の外部でｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸に変換することができるｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を生成する。他方、生体触媒中にマレイルアセト酢酸イソメラーゼまたは類似するイソメラーゼ酵素を導入することにより、細菌生体触媒内でｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸をｔｒａｎｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸に変換することができる。
【００６２】
一実施形態においては、本発明は、３，４−ジヒドロキシ安息香酸（プロトカテク酸またはＰＣＡ）のカテコールへの変換に関与するＡｒｏＹタンパク質の活性を増強するための遺伝的手法を提供する。ＡｒｏＹタンパク質の活性は、グルコースのムコン酸への生物学的変換における主な制限およびボトルネックとして同定された（Horwitz et al 2015；Weber et al 2012；Curran et al 2013；Sonoki et al 2014）。ＡｒｏＹは、多くの細菌間に広く存在し、様々な基質を用いる非酸化的デカルボキシラーゼのクラスに属する（Lupa et al 2005）。非酸化的デカルボキシラーゼをコードするこれらの遺伝子の多くは、Ｂ、Ｃ、およびＤ型遺伝子をコードする、３つの遺伝子オペロンに組織化される。「Ｃ」型遺伝子は、ＡｒｏＹのようなデカルボキシラーゼをコードし、ＢおよびＤ型遺伝子の特定の機能は未知であるが、それらはＣ型デカルボキシラーゼの完全な活性を実現するのに必要であることが示されることがある（Lupa et al 2005；Jimenez et al 2013；Lin et al 2015；Sonoki et al 2014）。Wever et al(2012)は、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）またはセジメンチバクター・ヒドロキシベンゾイクス（Ｓｅｄｉｍｅｎｔｉｂａｃｔｅｒ  ｈｙｄｒｏｂｅｎｚｏｉｃｕｓ）に由来するＢ、ＣおよびＤ遺伝子を、高コピー数酵母ベクターｐＲＳ４Ｋ−ＨＫＴ７中にクローニングし、外部的にＰＣＡを添加した培地中で発酵を実施して、これらの遺伝子クラスターに由来するＰＣＡデカルボキシラーゼ活性の存在を決定した；しかしながら、Ｃ遺伝子によりコードされるＰＣＡデカルボキシラーゼがこれらの遺伝子クラスター中のＢまたはＤ遺伝子に依存するかどうかを決定するための努力も為されていなかったし、Ｂ、ＣおよびＤ遺伝子を含むこれらの遺伝子クラスターの発現が、グルコースなどの非芳香族炭素源を用いてムコン酸生成を増強することができるかどうかを決定するためのいかなる試みも為されていなかった。
【００６３】
本明細書に開示される特定例において用いられるＡｒｏＹをコードする遺伝子は、クレブシエラ・ニューモニエに由来するが、このａｒｏＹ遺伝子の部分的遺伝子構造は、ＢまたはＤ型酵素のいずれかをコードする転写的に関連しない遺伝子を示す。以前の研究は、クレブシエラ・ニューモニエに由来する別のＢ型遺伝子であるｋｐｄＢ（４−ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼに由来するオペロンの一部）の含有が、リグニン関連芳香族化合物からムコン酸を生成する場合、ＡｒｏＹ活性を増加させることができることを示した（Sonoki et al 2014）。しかしながら、リグニンは、化学物質の複雑な混合物であり、ムコン酸などの純粋な生成物を生成するために費用が高い下流の精製プロセスを必要とする。Johnson et al(2016)は、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃｅａｅ）に由来するＡｒｏＹ（ＰＣＡデカルボキシラーゼ）を発現するシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）株中での、ＫｐｄＢに対する８９．３％の配列同一性を有するエンテロバクター・クロアカに由来するＥｃｄＢタンパク質の同時発現が、５４時間の発酵の終わりに、１．４４ｇ／Ｌ〜４．９２ｇ／Ｌの炭素源としてグルコースを用いるムコン酸生成を増加させるが、このシュードモナス・プチダに基づく系におけるムコン酸収率は依然として極端である（０．０７７ｍｏｌ／ｍｏｌ）ことがわかっており、かくして、このシュードモナス・プチダに基づく系を商業規模での適用にとって適さないものにすることを示した。従って、炭水化物および他の非芳香族化合物などの安価で、より純粋な、非芳香族炭素源からのムコン酸生成プロセスの改善が依然として必要である（上記参照）。最近の研究により、ＫｐｄＢの相同体であるＵｂｉＸが、プレニル化されたフラビンモノヌクレオチドコファクターを生成し、このコファクターがユビキノン形成におけるＵｂｉＤの脱カルボキシル化活性を支持することが示された（White et al 2015; Payne et al 2015）。ＵｂｉＸおよびその相同体の以前の特性評価は、４−ヒドロキシ−３−ポリプレニル安息香酸デカルボキシラーゼ、ヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ、サブユニットＢタンパク質、フェノール酸デカルボキシラーゼ、またはフェニルアクリル酸デカルボキシラーゼのいずれかとしてのタンパク質を指すが、これらのタンパク質は現在、より正確にはフラビンプレニルトランスフェラーゼと注釈されている。
【００６４】
ムコン酸の生成におけるさらなる制限は、前駆代謝物であるＰＥＰおよびＥ４Ｐの制限に帰するものであり得る。これらの代謝物の消費を除去する、または低下させる変化が、生成物形成を改善することが本発明において示された。例えば、ＰＥＰの利用可能性は、天然グルコース輸送、ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）を、代替系（ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）に由来するＧｌｆ−Ｇｌｋ）で置きかえることによって改善された。ＰＴＳの大腸菌による天然の使用は、グルコースの輸送およびリン酸化のためにＰＥＰの使用を必要とする。Ｇｌｆ−Ｇｌｋ系は、それぞれ、グルコースの輸送およびリン酸化のために、容易になった拡散因子およびグルコキナーゼ＋ＡＴＰを使用する。ＰＴＳの代わりのＧｌｆ−Ｇｌｋの使用は、いくつかの芳香族生成物の収率および力価を改善することが示された。ＰＥＰは、様々な生物学的反応のための基質である。ＰＴＳによるグルコース輸送に加えて、ＰＥＰはピルビン酸キナーゼのための基質でもあり、解糖において生成されるＡＴＰの半分を提供するＡＴＰおよびピルビン酸をもたらす。ピルビン酸キナーゼをコードする遺伝子（ｐｙｋＡまたはｐｙｋＦ）の不活化は、芳香族経路における生成物の収率を増加させることが証明されている（Escalante et al. 2010）。ＰＥＰはまた、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）によるオキサロ酢酸の生成のための基質でもある。大腸菌において、これは必須遺伝子であり（Baba et al. 2006）、ｐｐｃについて欠失した株は、最少培地上で増殖することができない。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを有さない生物は他にもあるが、例えば、サッカロミセス・セレビジアは、その代わりにピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）を用いてピルビン酸からオキサロ酢酸を補給する。大腸菌におけるピルビン酸カルボキシラーゼの添加は、コハク酸生成の改善についてだけでなく（Lin et al. 2004；Vemuri, Eiteman, and Altman 2002）、任意の芳香族生成物についても調査されている。
【００６５】
本出願における明細書は、ムコン酸の効率的な生成のための微生物株の構築に関する本発明のいくつかの異なる態様を提供する。当業者であれば、ムコン酸の生成のために非常に高い効率で生体触媒を構築するために本発明のいくつかの異なる態様を編集することができる。
【実施例】
【００６６】
総論
株および接種材料の調製：本発明において用いられる細菌株の一覧を、表１および表２に提供する。本発明において用いられるプラスミドの一覧を、表３に提供する。本明細書に開示される株コンストラクションの全ての特定例は、野生型大腸菌Ｃ株（ＡＴＣＣ８７３９）または大腸菌Ｋ−１２株（ＹＭＣ９もしくはＭＭ２９４）から誘導されるが、本明細書に開示される遺伝子エレメントを、任意の他の好適な大腸菌株中で集合させることができ、本明細書に開示される遺伝子エレメントの発現カセットまたは適切な類似体および相同体を、発酵プロセスによるｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の商業生産のために用いることができる他の種の細菌、古細菌、酵母、藻類、および糸状菌などの、任意の他の好適な微生物中で集合させることができる。
【００６７】
大腸菌Ｃは、ＡＭ１ミネラル培地中で１０％グルコースを発酵させることができる。ＡＭ１培地は、２．６３ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、０．８７ｇ／ＬのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、１．５ｍＭのＭｇＳＯ４、１．０ｍＭのベタイン、および１．５ｍｌ／Ｌの微量元素を含有する。微量元素は、１０００Ｘ保存液として調製され、以下の成分：１．６ｇ／ＬのＦｅＣｌ３、０．２ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＣｕＣｌ２、０．２ｇ／ＬのＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＮａＭｏＯ４、０．０５ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、および０．３３ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏを含有する。発酵培養液のｐＨは、１．０〜１０．０ＭのＫＯＨまたは１．０〜９．０Ｍの水酸化アンモニウムを用いて７．０に維持される。
【００６８】
発酵：遺伝子操作され、−８０℃冷凍庫で保存された大腸菌株の４０％グリセロール保存液から新鮮なＮＢＳ−２％グルコース(Jantama et al., 2008a)プレート上にストリークすることにより、発酵を開始した。存在する場合、プラスミドを、寒天プレートおよび液体培地中に適切な抗生物質（複数可）を含有させることにより保持する。アンピシリン（ナトリウム塩）を１５０ｍｇ／Ｌで、スペクチノマイシンＨＣＬを１００ｍｇ／Ｌで、テトラサイクリンＨＣｌを１５ｍｇ／Ｌで、カナマイシン硫酸塩を５０ｍｇ／ｌで使用する。２４〜４８時間（３７℃）後、単一のコロニーを振とうフラスコ中の２５ｍｌの同じ培地中に拾う。細胞が約１．０のＯD６００に増殖するまで３７℃、２００ｒｐｍで振とうした後、培養液を氷上で冷却し、等量の滅菌８０％グリセロールを添加する。次いで、２ｍｌアリコートを−８０℃で凍結し、発酵のための接種材料として用いる。用語「力価」とは、発酵液の単位容量あたりに生成される発酵生成物の量を意味し、用語「収率」とは、生成される発酵生成物の、消費される炭素源に対する比（ｇ／ｇまたはｍｏｌ／ｍｏｌ）を意味する。
【００６９】
細胞増殖：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ２０分光光度計を用いて５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）または６００ｎｍ（ＯＤ６００）での光密度を測定することにより、細胞量を見積もった。
【００７０】
シキミ酸経路およびムコン酸経路における中間体の分析：ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸およびｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸を含む、発酵培養液中で生成された全ムコン酸、および他の生化学的中間体を、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ装置を用いるＨＰＬＣ、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した標準物を用いる、２１０ｎｍでの吸光度または４５℃での屈折率をモニタリングすることによりアッセイした。カラムは、０．６ｍｌ／ｍｉｎの流量で４０分間、移動相としての８ｍＭ硫酸を用いて５０℃で泳動したＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈであった。購入した標準物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のクロマトグラフを、図３に示す。ＨＰＬＣのために調製するために、発酵試料を０．０５Ｍリン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．０中で１０倍または１００倍希釈して、ｃｉｓ，ｃｉｓ型のムコン酸がｃｉｓ，ｔｒａｎｓ型に異性化しないように保護する。
【００７１】
ムコン酸の異性体を分離するために、上記のように調製された試料を、第２のＨＰＬＣ系中で泳動した。装置はＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣであり、カラムはリン酸でｐＨ３．０に調整された３０％メタノール中の５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４の移動相を用いて３０℃で泳動されたＡｇｉｌｅｎｔ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８、４．６ｘ１５０ｍｍであった。流量は１ｍｌ／ｍｉｎで４分間であり、２７８ｎｍでの吸光度により検出を行った。ｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ムコン酸標準物を、水中にｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を溶解し、それに、ＨＰＬＣピークが新しい位置に完全にシフトするまで、室温で約２時間、同時酸触媒異性化を受けさせることにより作出した。他の標準物を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。標準物を示すクロマトグラフを、図５に示す。
【００７２】
発酵プロセスのためのムコン酸生成培地の組成：１リットルの発酵培地は、５０ｍｌ／Ｌの１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍｌの２００ｇ／Ｌクエン酸＋２５ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄、１．２ｍｌの９８％硫酸、および１滴の消泡剤２０４を含有する。これらの成分を、十分な水と混合して、以下の他の成分の添加のために部屋に置いた。オートクレーブした後、以下の成分を添加した：１０、２０、３０または４０ｍｌの５０％グルコース（最終的に５、１０、１５、または２０ｇ／ｌを得るため）、２ｍｌの１Ｍ  ＭｇＳＯ４、１ｍｌの０．１Ｍ  ＣａＣｌ２、１０ｍｌの１０００Ｘ微量元素(Jantama et al. 2008a)、および必要に応じて１、２、４、または８ｍｌの５０ｇ／Ｌフェニルアラニン＋５０ｇ／Ｌチロシン＋５０ｇ／Ｌトリプトファン（最終的に０．５、０．１、０．２、または０．４ｇ／ｌを得るため）、１０ｍｌの１ｇ／Ｌのｐ−ヒドロキシ安息香酸＋１ｇ／ｌのｐ−アミノ安息香酸＋１ｇ／Ｌの２，３−ジヒドロキシ安息香酸（最後の３つの化合物は、芳香族「ビタミン」または「ビタミン様化合物」と呼ばれる）、ならびに必要に応じて、１ｍｌの１５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナトリウム塩）および／または１ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌスペクチノマイシンＨＣｌ。芳香族アミノ酸およびビタミンは、機能的なＡｒｏＥタンパク質を発現する株については必要なく、使用されなかった。
【００７３】
振とうフラスコについては、ＮＢＳ塩(Jantama et al.2008a)＋０．２Ｍ  ＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．４を、上記の予備オートクレーブ混合物に置換したが、グルコースおよび他の添加物は同じであった。フェドバッチ式発酵については、供給ボトルは６００ｇ／Ｌの無水グルコースおよび必要に応じて、３２ｍｌ／Ｌの５０ｇ／Ｌフェニルアラニン＋５０ｇ／Ｌチロシン＋５０ｇ／Ｌトリプトファンを含有していた。９Ｍ  ＮＨ４ＯＨを塩基として用いて、発酵培地のｐＨを維持した。芳香族アミノ酸およびビタミンは、機能的なＡｒｏＥタンパク質を発現する株については必要なく、使用されなかった。
【００７４】
フェドバッチ発酵を、ＤＣＵコントローラまたはＢｉｏｃｏｍｍａｎｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅにより制御されたｐＨ、ＤＯ、温度、グルコース、および供給速度を用いて、７ＬのＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ中で実施した。培地は、５０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、２０ｍＭ  Ｋ２ＳＯ４、３ｍＭ  ＭｇＳＯ４および微量元素であった。微量元素は、５０Ｘ保存液として調製され、以下の成分：１．６ｇ／ＬのＦｅＣｌ３、０．１ｇ／ＬのＣｕＣｌ２、０．２ｇ／ＬのＺｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ＬのＮａＭｏＯ４、０．０５ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、および０．５５ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏを含有していた。温度を３７℃に維持し、ｐＨを９Ｎアンモニウム水により７．０に維持した。通気は０．５ｖｖｍであり、羽根車速度を７５０ｒｐｍから１２００ｒｐｍまで自動的に増加させることによって、溶解酸素（ＤＯ）を３０％に維持した。培地中の初期グルコース濃度は、約２０〜２５ｇ／Ｌであった。濃度が５ｇ／Ｌ以下に低下した場合、供給グルコース溶液を発酵器に添加した。初期グルコース供給速度は、４ｇ／Ｌ／ｈであり、４８時間までに７ｇ／Ｌ／ｈの供給速度に増加させた後、それを７ｇ／Ｌ／ｈに維持した。
【００７５】
ムコン酸経路遺伝子を発現するプラスミドの構築：ＤＨＳのムコン酸への変換に必要とされる３つの異種遺伝子を、単独で、または組み合わせて、低コピープラスミドｐＣＬ１９２１(Lerner and Inouye, 1990)中にクローニングした。ｐＣＬ１９２１のＤＮＡ配列を、表７中の配列番号２０に与える。簡単に述べると、ｃａｔＡＸ、ａｒｏＹおよびａｒｏＺ類似体または相同体のコード配列を、大腸菌中での発現のためにコドン最適化し、商業的に合成した（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。次いで、これらの配列を、ユニークなリボソーム結合部位を担持するフォワードプライマーおよびそれぞれの遺伝子のためのユニークなターミネーター配列を担持するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ断片を制限酵素で消化し、標準的な分子クローニング手順によりユニークな構成的プロモーター配列の下流にクローニングした。プロモーター配列を、以前に記載された（米国特許出願第２００９０１９１６１０号；米国特許第７，２４４，５９３号）起源ＤＮＡ配列からのＰＣＲ増幅によりクローニングした後、制限消化し、標準的な分子クローニングを行った。プロモーター−ＲＢＳ−コード配列−ターミネーター配列も一緒に発現カセットを構成した。次に、個々の発現カセットを組み合わせて、１、２または３つ全部のムコン酸経路遺伝子を発現するプラスミドを作成した。
【００７６】
本発明を、以下の実施例を用いてさらに例示する；しかしながら、単独で、またはその任意の組合せで本明細書に提供される実施例は、本発明の範囲または実施形態を限定すると解釈されるべきである。最後に提供される特許請求の範囲が、本発明の範囲を定義する。当業者であれば、特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を明確に理解できる。当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明によって提供される技術的解決法に対する改変または変更を加えることができる。
【実施例１】
【００７７】
ａｒｏＧおよびａｒｏＦ遺伝子の発現の増加
大腸菌のｔｙｒＲ遺伝子を、化学的もしくは放射線突然変異誘発およびスクリーニング（例えば、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定による）または類似体耐性（例えば、４−フルオロチロシンに対する耐性）に関する選択、トランスポゾン突然変異誘発、バクテリオファージＭｕ突然変異誘発、または形質転換などのいくつかの周知の方法のいずれか１つにより突然変異させることができる。好ましい実施形態においては、ｔｙｒＲ遺伝子中の突然変異は、ヌル突然変異（検出可能な活性を無くする突然変異）であり、より好ましい実施形態においては、ｔｙｒＲ遺伝子少なくとも一部が検出される。これを、例えば、線状ＤＮＡ分子を用いる２工程の形質転換法を用いることにより達成することができる(Jantama et al, 2008a; Jantama et al, 2008b)。第１の工程においては、ｃａｍＲ、ｓａｃＢカセットがｔｙｒＲ遺伝子座に組込まれて、二重組換えおよびクロラムフェニコール耐性の選択により、ｔｙｒＲオープンリーディングフレームの多くまたは全部が置きかわる。第２の工程においては、欠失型のｔｙｒＲ遺伝子を含む線状ＤＮＡが、二重組換え、ＬＢなどの富栄養培地中の５％スクロースに対する耐性の選択により組込まれる。正確な欠失は、診断的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により同定および確認される。ｔｙｒＲを欠失させる目的は、ａｒｏＧおよびａｒｏＦの発現を増加させることである。同様の結果を達成する代替的な手法は、ａｒｏＧおよび／またはａｒｏＦの前の天然プロモーターを、強力な構成的プロモーターと置きかえ、必要に応じて、転写ターミネーターを付加することである。これをどのように達成するかに関するさらなる詳細は、一般に、以下の実施例４に与えられる。
【００７８】
ｔｙｒＲの欠失はａｒｏＬＭなどの遺伝子の望ましくない過剰発現を引き起こし得るため(Neidhardt and Curtiss, 1996)、ＴｙｒＲタンパク質によるＡｒｏＧおよびＡｒｏＦ活性の抑制を克服するためには、上記の２つの手法のうちの後者が好ましい。これをどのように達成するかに関するさらなる詳細は、一般に、以下の実施例４に与えられる。
【実施例２】
【００７９】
フィードバック耐性ＡｒｏＧおよびＡｒｏＦ
フィードバック耐性ＡｒｏＧ酵素（３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソネート−７−リン酸シンターゼまたはＤＡＨＰＳ）をもたらすａｒｏＧ遺伝子中の突然変異は、当業界で周知である(Shumilin et al, 1999; Kikuchi et al, 1997; Shumilin et al, 2002)。また、そのような突然変異を作出、同定、および特性評価する方法も周知である(Ger et al., 1994, Hu et al., 2003)。好ましい突然変異は、フェニルアラニンによる阻害に対する完全な耐性をもたらすものである。公知の公開されたフィードバック耐性突然変異のいずれかを、いくつかの周知の方法のいずれかにより染色体中またはプラスミド上に含まれるａｒｏＧ遺伝子中に導入することができ、その一例は、所望の突然変異をＰＣＲプライミングオリゴヌクレオチドの一部として合成する突然変異誘発性ＰＣＲである(Hu et al., 2003)。突然変異の正確な導入は、ＤＮＡ配列決定により確認される。大腸菌Ｃに由来する野生型ａｒｏＧ遺伝子の配列を、配列番号１８に与える。好ましい突然変異は、例えば、コドン１５０をＣＣＡからＣＴＡに変化させることによる、ＡｒｏＧのアミノ酸１５０をプロリンからロイシンに変化させる点突然変異である(Hu et al, 2003)。より好ましい実施形態においては、コドン１５０を、大腸菌における好ましいコドンである、ＣＣＡからＣＴＧに変化させる。コードされたＤＡＨＰシンターゼは最大３ｍＭでフェニルアラニンによる阻害に対して完全に耐性であり、それは野生型酵素と同様の比活性を有するため(Hu et al, 2003)、ａｒｏＧのこの特定の対立遺伝子が好ましい。
【００８０】
さらなるフィードバック耐性ａｒｏＧ対立遺伝子を、突然変異誘発ならびにベータ−２−チエニルアラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ｐ−クロロフェニルアラニン、ｏ−フルオロフェニルアラニン、およびｏ−クロロフェニルアラニンなどの１つまたは複数のフェニルアラニン類似体に対する耐性の選択、次いで、耐性を引き起こす突然変異がａｒｏＧ遺伝子に連結されていることの証明により取得することができる(Ger et al., 1994; 米国特許第４，６８１，８５２号)。ａｒｏＧへの連結を、フェニルアラニンの存在下および非存在下でのＤＮＡ配列決定もしくは酵素アッセイにより直接的に(Ger et al., 1994)、またはファージ媒介性形質導入および遺伝子マーカーについて、もしくはそれに対して選択することができるａｒｏＧ遺伝子座にある、もしくはその近くにある遺伝子マーカーの選択により間接的に証明することができる（米国特許第４，６８１，８５２号）。そのような遺伝子マーカーは、ａｒｏＧ遺伝子自体の中の欠失もしくは点突然変異、または大腸菌の場合、ｎａｄＡなどの任意の好適な密接に関連する遺伝子中の突然変異であってもよい。大腸菌における例については、突然変異誘発およびフェニルアラニン類似体耐性の選択の後、個々の突然変異体または突然変異体のプールを、３つ全部のＤＡＨＰシンターゼ遺伝子、ａｒｏＧ、ａｒｏＦ、およびａｒｏＨについて欠失されたナイーブなレシピエントへのＰ１媒介性形質導入、ならびに適切な最少培地上での増殖に関する選択のためのドナーとして用いることができる。次いで、形質導入体を、所望の遺伝子（複数可）における突然変異について富化することができる。あるいは、突然変異誘発および類似体耐性の選択後、個々の突然変異体または突然変異体のプールを、ｎａｄＡ遺伝子中にヌル突然変異を含むナイーブなレシピエント株中へのＰ１媒介性形質導入、また、ニコチンアミドを含まない適切な最少培地上での増殖に関する選択のためのドナーとして用いることができる。別の手法は、トランスポゾン、例えば、Ｔｎ１０、ｎａｄＡ遺伝子中などのａｒｏＧ遺伝子の近くの挿入を含む株バックグラウンド中の耐性突然変異体について選択することである。類似体耐性突然変異体から前記トランスポゾンを含まない株バックグラウンド中へのＰ１形質導入およびテトラサイクリンまたは他の適切な抗生物質耐性の選択は、所望のａｒｏＧ突然変異について富化することができる。全てのそのような手法において、フィードバック耐性は、酵素アッセイおよび遺伝子のＤＮＡ配列決定によって最終的に確認される。本発明者らは、フィードバック阻害に耐性であるａｒｏＧの対立遺伝子を、ａｒｏＧ＊と呼ぶ。
【００８１】
株ＷＭ１９１（ΔｔｙｒＲ、ΔａｒｏＦ）は、ＹＭＣ９（ＡＴＣＣ３３９２７）から誘導されたものであった。２工程遺伝子置きかえ法(Jantama et al., 2008a)を用いて、ｔｙｒＲとａｒｏＦの両方にクリーンな欠失を導入して、株ＷＭ１９１を得た。次に、ｎａｄＡ：：Ｔｎ１０対立遺伝子をＣＡＧ１２１４７（ＣＧＳＣ７３５１、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から導入して、株ＷＭ１８９（ΔｔｙｒＲ、ΔａｒｏＦ、ｎａｄＡ：：Ｔｎ１０）を得た。選択は、ＬＢ＋テトラサイクリンＨＣｌ（１５ｍｇ／ｌ）上であった。株ＲＹ８９０（ΔｔｙｒＲ：：ｋａｎ、ａｒｏＦ３６３）を、Ｐ１形質導入による３工程においてＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３３６２５）から誘導した。ドナー株は、順に、ＪＷ１３１６−１（ＣＧＳＣ９１７９、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ＮＫ６０２４（ＣＧＳＣ６１７８、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、およびＡＢ３２５７（ＣＧＳＣ３２５７、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）であり、３つの選択は、順に、ＬＢ＋硫酸カナマイシン（５０ｍｇ／ｌ）、ＬＢ＋塩酸テトラサイクリン（１５ｍｇ／ｌ）、およびＮＢＳ最少グルコース(Jantama et al.,2008a)＋チアミンＨＣｌ（５ｍｇ／ｌ）であった。
【００８２】
ＷＭ１８９を、ＵＶ光で約２０％の生存率まで突然変異誘発して、ｏ−フルオロフェニルアラニン（１ｍＭ）、チアミン（５ｍｇ／ｌ）、およびニコチンアミド（１ｍＭ）を含有するＮＢＳ最少グルコース培地(Jantama et al.,2008a)上に塗布した。いくつかのプレートのそれぞれからのコロニーを別々のプールに集め、Ｐ１ｖｉｒ溶解物を各プール上で作製した。これらの溶解物を用いて、ＬＢ培地上でＷＭ１９１にテトラサイクリン耐性（１５ｍｇ／ｌ）を形質導入し、得られたコロニーを１ｍＭのｏ−フルオロフェニルアラニン、チアミン（５ｍｇ／ｌ）、およびニコチンアミド（１ｍＭ）を含有するＮＢＳ最少グルコース培地にレプリカ塗布した。テトラサイクリンと類似体の両方を生存したコロニーレプリカは、ａｒｏＧ中にフィードバック耐性突然変異を含有すると推測された。５つの独立したプールに由来する８個の個々のコロニーを、ＤＮＡ配列決定のために選択した。ａｒｏＧコード領域をポリメラーゼ連鎖反応により増幅し、配列決定した。表４に示される結果は、８つの株のそれぞれがそのａｒｏＧ遺伝子中に点突然変異を含有することを示していた。いくつかの対立遺伝子は、公開された対立遺伝子と同一であったが、いくつかは新規であった。
【００８３】
上記のプールの１つに由来するＰ１ｖｉｒ溶解物を用いて、上記のようにレプリカ塗布することにより、ＲＹ８９０（ａｒｏＧ野生型対立遺伝子を有する）にテトラサイクリン耐性およびｏ−フルオロフェニルアラニン（０．３ｍＭ）に対する耐性を形質導入した。ＲＹ８９３、ＲＹ８９７、ＲＹ８９９、およびＲＹ９０１という名称の４つのコロニーを、ＤＮＡ配列決定のために拾ったところ（表４）、再度、２つの対立遺伝子は公開された対立遺伝子と同一であったが、２つは新規であった。後者の４つの株と同系であるが、野生型ａｒｏＧ遺伝子を含有する株ＲＹ９０２を、ＣＡＧ１２１４７からの形質導入により、対照として構築した。これらの５つの株を、２５ｍｌのＮＢＳ最少グルコース（１５ｇ／ｌ）＋チアミンＨＣｌ（５ｍｇ／ｌ）およびニコチンアミド（１ｍＭ）中、振とうフラスコ中で一晩増殖させた。得られた細胞を遠心分離により収穫し、１０ｍｌの水を用いて再懸濁して洗浄し、再度遠心分離して、０．５ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０中に再懸濁した。懸濁した細胞を、３滴のクロロホルムと共にボルテックスすることにより溶解し、粗溶解物を、以下の改変と共に、文献(Hu et al., 2003)に記載の方法と類似する方法を用いてＤＡＨＰシンターゼ活性についてアッセイした。リン酸バッファーは５０ｍＭ（最終濃度）、ｐＨ７．０であり、最終エリスロース−４−リン酸濃度は２ｍＭであり、最終ホスホエノールピルビン酸濃度は５ｍＭであり、インキュベーション温度は３０℃であり、反応を１０分で停止させた。本発明者らは、１分あたり、１ミリグラムのタンパク質あたり１ｎＭｏｌｅのＤＡＨＰを生成した活性を１ｍＵと定義する。フィードバック耐性を試験するために、それぞれの粗溶解物を、１８ｍＭの最終濃度のフェニルアラニンを用いて、または用いずにアッセイした。そのアッセイの結果を表５に示す。酵素は変化する比活性およびフェニルアラニンに対する耐性を示したが、試験した全ての選択された突然変異型は野生型対照よりも有意に高い耐性を有していた。
【００８４】
上記のＲＹ８９３、ＲＹ８９９、ＲＹ９０１、およびＲＹ９０２に由来するａｒｏＧ対立遺伝子を、以下のようにムコン酸生成株バックグラウンド中に導入した。ａｒｏＧ＊およびａｒｏＧｗｔドナー株に由来するＰ１ｖｉｒ溶解物を用いて、ＭＹＲ２１９（大腸菌Ｃ、ΔａｒｏＥ、Δａｃｋ：：Ｐ１５−ａｒｏＢ、ｐＭＧ３７）にテトラサイクリンＨＣｌ耐性（１５ｍｇ／ｌ）を形質導入して、それぞれ新しい株ＲＹ９０３、ＲＹ９０９、ＲＹ９１１、およびＲＹ９１２を得た。次いで、これらの株のそれぞれに、ＪＷ１３１６−１のＰ１ｖｉｒ溶解物を用いて硫酸カナマイシン耐性（５０ｍｇ／ｌ）を形質導入して、ΔｔｙｒＲ：：ｋａｎ対立遺伝子を導入して、それぞれ、株ＲＹ９１３、ＲＹ９１９、ＲＹ９２１、およびＲＹ９２２を得た。ムコンプラスミドを維持するために、スペクチノマイシン選択を維持した。得られた４つの株を、２０ｇ／ｌのグルコース、０．２ＭのＭＯＰＳバッファー、ｐＨ７．４、ニコチンアミド（１ｍＭ）、フェニルアラニン（１００ｍｇ／ｌ）、チロシン（１００ｍｇ／ｌ）、トリプトファン（１００ｍｇ／ｌ）、ｐ−ヒドロキシ安息香酸（１ｍｇ／ｌ）、ｐ−アミノ安息香酸（１ｍｇ／ｌ）、２，３−ジヒドロキシ安息香酸（１ｍｇ／ｌ）、フェノールレッド（１０ｍｇ／ｌ）、および硫酸アンモニウム（１ｇ／ｌ）の添加物を含有する２５ｍｌのＮＢＳ最少培地(Jantama et al., 2008a)中、振とうフラスコ中で３７℃で４８時間増殖させた。振とうフラスコに要求通り１．０ＭのＫＯＨの１ｍｌアリコートを手動で添加することにより、ｐＨ７．０標準に対して、フェノールレッドの色から眼により見積もられるように、ｐＨを７付近に保持した。生成されたムコン酸を上記のようにＨＰＬＣによりアッセイし、その結果を表６に示す。フィードバック耐性ａｒｏＧ＊対立遺伝子を含有する３つの株は全て、野生型ａｒｏＧ対立遺伝子を含有する同系株よりも多くのムコン酸を生成した。本明細書に開示される個別の実験において、多コピープラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰ上にａｒｏＧを含有する株ＭＹＲ２０５は、振とうフラスコ中で１．５ｇ／ｌのムコン酸を生成した。かくして、本発明者らは、ΔｔｙｒＲと単コピーの染色体ａｒｏＧ＊との組合せが、同系のａｒｏＧプラスミド含有株と比較して良好に機能し、振とうフラスコ中でムコン酸を生成することができることを示した。プラスミド対立遺伝子と比較した染色体対立遺伝子の固有の優れた遺伝的安定性＋プラスミド中で保持するための選択培地の必要性の軽減は、本明細書に記載の新規株を、大規模商業発酵にとってより好適なものにする。さらに、ムコン酸経路遺伝子の発現のために化学的誘導因子は必要なかった。かくして、上記の本発明の株は、全て望ましくない多コピープラスミド上にＤＡＨＰシンターゼの過剰発現のための遺伝子を含有する先行技術のもの(Niu et al., 2002)と比較して改善されている。
【００８５】
ＡｒｏＧについて上記されたものと同様の様式で、チロシンによるフィードバック阻害に対して耐性であるＡｒｏＦまたはＡｒｏＨアイソザイムをもたらす突然変異を、プラスミド上または染色体中に導入することができる。好ましい突然変異は、例えば、コドン１４８をＣＣＧからＣＴＧに変化させることにより(Weaver et al., 1990)、ＡｒｏＦのアミノ酸１４８をプロリンからロイシンに変化させて、ａｒｏＦ＊という名称の遺伝子を得る点突然変異である。ａｒｏＦ＊の他の対立遺伝子を、ａｒｏＧ＊対立遺伝子について上記されたものと同様の様式で、チロシン類似体（例えば、ｏ−フルオロチロシン、ｍ−フルオロチロシン、ｐ−フルオロフェニルアラニンなど）に対する耐性により単離することができる。ａｒｏＦ＊対立遺伝子を、例えば、ＪＷ２５８４（ＣＧＳＣ１００５１、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）などの株中のような密接に関連するΔｙｆｉＲ：：ｋａｎにおけるトランスポゾンへの連結またはカナマイシン耐性挿入により選択、富化および形質導入することができる。
【実施例３】
【００８６】
染色体ＤＮＡからのａｒｏＥの欠失およびムコン酸生成
本実施例においては、多コピープラスミド上でのａｒｏＢおよびａｒｏＧの過剰発現の効果ならびにムコン酸経路において機能的なタンパク質をコードする遺伝子の発現を調査した。シキメートデヒドロゲナーゼをコードするａｒｏＥ遺伝子中に欠失を含む株ＭＹＲ３４を、これらの試験における親株として用いた。ａｒｏＥの染色体コピーの欠失を、実施例１に上記されたものと同様の様式で達成した。ＭＹＲ３４を、シキミ酸経路において機能的なＤＡＨＰシンターゼタンパク質をコードするａｒｏＧ遺伝子を過剰発現するプラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰを用いて形質転換した場合、ＤＨＳの蓄積が有意に増加した。ＭＹＲ３４を、構成的プロモーターからａｒｏＢを発現するプラスミドを用いて形質転換した場合、ＤＨＳの蓄積の有意な増加は見られなかった。しかしながら、大腸菌株ＭＹＲ３４を、ａｒｏＢとａｒｏＧ遺伝子の両方を発現するプラスミドを用いて形質転換した場合、ａｒｏＧのみを用いて形質転換されたＭＹＲ３４について観察されたものよりもＤＨＳの蓄積が増加し、かくして、これはａｒｏＢがＤＨＳ生成における第２のボトルネックであることを示唆している（図６）。
【００８７】
図７に例示される実験において、宿主染色体ＤＮＡ中に組込まれたさらなるコピーのａｒｏＢ遺伝子の効果を検査した。ＭＹＲ３４から誘導された大腸菌株ＭＹＲ１７０において、Ｐ１５プロモーターの制御下にあるさらなるコピーのａｒｏＢ遺伝子を、ａｃｋ遺伝子座で宿主染色体中に組込んだ。ＭＹＲ１７０株をｐＣＰ３２ＡＭＰプラスミドを用いて形質転換した場合、同じプラスミドを用いて形質転換したＭＹＲ３４株において検出されたＤＨＳ蓄積と比較してＤＨＳ蓄積がわずかに増加した。ＭＹＲ１７０におけるＤＨＳの蓄積のこのわずかな増加は、宿主染色体ＤＮＡ中に組込まれたさらなるコピーのａｒｏＢ遺伝子に帰する可能性がある。ＭＹＲ１７０を、ａｒｏＢとａｒｏＧ遺伝子の両方を発現するｐＣＰ５４を用いて形質転換した場合、ＤＨＳ蓄積がさらに増加し、これは、ａｒｏＢがＤＨＳ生成における第２のボトルネックであることを示唆している。
【００８８】
図８は、大腸菌株ＭＹＲ３４およびＭＹＲ１７０を用いるムコン酸生成に関する結果を提供する。ａｒｏＥ欠失株ＭＹＲ３４およびＭＹＲ１７０において、ａｒｏＢおよびａｒｏＧ遺伝子の過剰発現と共に、ＤＨＳの蓄積が存在することが確立されたら、ムコン酸生成経路において機能的なタンパク質をコードする「ムコン経路」遺伝子の発現がＤＨＳのｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸への変換をもたらすかどうかを見るための努力が為された。これらの実験においては、大腸菌株ＭＹＲ３４およびＭＹＲ１７０を、プラスミドｐＭＧ３７のみ、またはプラスミドｐＭＧ３７とｐＣＰ３２ＡＭＰの両方を用いて形質転換した。プラスミドｐＭＧ３７は、ムコン酸経路において機能的なタンパク質をコードするａｒｏＺ、ａｒｏＹおよびｃａｔＡＸ遺伝子を発現する。ＭＹＲ３４とＭＹＲ１７０の両方におけるムコン酸生成は、これらの細菌株をプラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰとｐＭＧ３７の両方を用いて形質転換した場合、ｐＭＧ３７プラスミドのみを用いて形質転換されたこれらの２つの株におけるムコン酸生成と比較して増加したが、これは、これらの株において、ａｒｏＢ発現がｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸生成のためのボトルネックであることを示唆している。
【実施例４】
【００８９】
ｔｋｔＡの過剰発現
ｔｋｔＡによりコードされるトランスケトラーゼは、ペントースリン酸経路における重要な酵素であり、ムコン酸の生成における重要な中間体の１つであるエリスロース−４−リン酸の生成を制限すると考えられる。トランスケトラーゼをコードするｔｋｔＡの過剰発現は、多コピープラスミド上で遺伝子にその天然プロモーターを導入することにより(Sprenger et al, 1995, 1995a)、芳香族経路への流動を改善することが知られている(Draths et al., 1992)。しかしながら、そのようなプラスミドは不安定であり、維持のために抗生物質選択を必要とすることが多い。先行技術における別の手法は、１個のさらなるコピーのｔｋｔＡ遺伝子を、宿主株の染色体に付加することであった(Niu et al., 2002)。しかしながら、天然プロモーターは理想にあまり近いものではないため、天然プロモーターを含む１個のさらなるコピーのｔｋｔＡは、芳香族経路をエリスロース−４−リン酸で飽和させるには十分なものではない。そのようなものとして、このプロセスは実質的な改善を必要とする。
【００９０】
例えば、染色体中の天然のｔｋｔＡプロモーターを強力な構成的プロモーター、例えば、バチルス・サブチリスファージＳＰＯ１に由来するＰ１５もしくはＰ２６プロモーター（それぞれ、配列番号１および配列番号２）、またはバクテリオファージラムダに由来するＰＲプロモーター（配列番号３）と置換することにより、ｔｋｔＡの過剰発現の改善を得ることができる。これは、ｃａｍＲ、ｓａｃＢカセットを用いて、第１の工程における天然の染色体ｔｋｔＡプロモーターを置きかえる以外は、実施例１に記載のような２つの工程において達成される。第２の工程において、強力な構成的プロモーターは、強力な構成的プロモーターの下流側のｔｋｔＡコード領域の５’末端の少なくとも５０塩基および強力な構成的プロモーターの上流側の天然ｔｋｔＡプロモーターのすぐ上流の相同な少なくとも５０塩基対に隣接する、強力な構成的プロモーターを含む線状ＤＮＡを用いて形質転換し、スクロース耐性について選択することにより導入される。そのような発現カセットからの発現の改善はまた、発現カセットから転写されるｍＲＮＡの安定性を増加させることによって達成される。ｍＲＮＡ安定性の改善は、ｍＲＮＡの５’末端、ｍＲＮＡの３’末端、またはその両方にステムループ構造を付加することによって達成される。ステムループ構造は、ｒｈｏ非依存的転写ターミネーターによって天然に終結するｍＲＮＡの末端に存在することが多いが、そうでない場合、ｒｈｏ非依存的転写ターミネーターを、遺伝子操作の周知の方法（ライゲーション、ＰＣＲなど）によりＤＮＡ配列に付加することができる。そのようなターミネーターは、３個以上の塩基の「ループ」により隔てられた、各リピート中の４〜２０塩基の逆向き反復配列、次いで、Ｔ（デオキシチミジン）について富化された１つまたは複数の塩基の領域を含んでもよい。逆向き反復配列は、ＧおよびＣ（デオキシグアニジンおよびデオキシシチジン）に富む。同様に、転写の開始点からすぐ下流であるが、上記のステムループを含むが、Ｔに富む領域を含まない、リボソーム結合部位の前にＤＮＡ配列を挿入することにより、ステムループをｍＲＮＡの５’末端中で構築することができる。この例を、Ｐ１５プロモーターと共に与える（配列番号１）。
【００９１】
シキミ酸経路を介する炭素の流動に対するｔｋｔＡ遺伝子の過剰発現の効果の分析において、大腸菌株ＭＹＲ１７０を親株として用いた。ＭＹＲ１７０は、シキメートデヒドロゲナーゼ酵素をコードするａｒｏＥ遺伝子中に欠失を有し、ａｃｋ遺伝子座にさらなるコピーのａｒｏＢ遺伝子を有する。
【００９２】
図９、１０および１１に記載の実験においては、２つの異なるプラスミド、すなわち、ｐＣＰ３２ＡＭＰおよびｐＣＰ５０を用いた。プラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰはその天然プロモーターからＤＡＨＰシンターゼａｒｏＧ遺伝子のみを発現し、プラスミドｐＣＰ５０はａｒｏＧ遺伝子と共に、その天然プロモーターからトランスケトラーゼ遺伝子ｔｋｔＡを発現する。染色体ＤＮＡのａｃｋ遺伝子座に組込まれたＰ１５プロモーターの制御下にａｒｏＥ欠失およびさらなるコピーのａｒｏＢ遺伝子を有するＭＹＲ１７０を、ｐＣＰ３２ＡＭＰおよびｐＣＰ５０プラスミドを用いて個別に形質転換した。図８に示されるように、ＤＨＳ蓄積は、ａｒｏＧ遺伝子のみを発現する大腸菌細胞と比較した場合、ｔｋｔＡ遺伝子と共にａｒｏＧ遺伝子を発現したものについてさらに増加した。
【００９３】
図１０は、プラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰまたはｐＣＰ５０を用いて形質転換された２つの異なる株、すなわち、ＭＹＲ３４、ＭＹＲ１７０におけるＤＨＳ収率に関するデータを提供する。ａｒｏＥ遺伝子欠失を有するＭＹＲ３４株により、消費されたグルコース１グラムあたり０．１グラムのＤＨＳが得られた。ＭＹＲ３４におけるＤＨＳ収率は、この株をａｒｏＧ遺伝子を過剰発現するｐＣＰ３２ＡＭＰプラスミドを用いて形質転換した場合、消費されたグルコース１グラムあたり０．１５グラムのＤＨＳに増加した。ＭＹＲ１７０は、ａｃｋ遺伝子座に挿入されたさらなるコピーのａｒｏＢ遺伝子を有する。このさらなるコピーのａｒｏＢ遺伝子の存在の結果として、ｐＣＰ３２ＡＭＰを用いて形質転換されたＭＹＲ１７０株におけるＤＨＳ生成の収率は、ｐＣＰ３２ＡＭＰを用いて形質転換されたＭＹＲ３４株において見られたＤＨＳ収率よりもわずかに高かった。かくして、ＭＹＲ１７０におけるさらなるコピーのａｒｏＢの存在は、シキミ酸経路を介する炭素流動の増加を引き起こした。ＭＹＲ１７０株を、ａｒｏＧとｔｋｔＡ遺伝子の両方を発現するプラスミドｐＣＰ５０を用いて形質転換した場合、ＤＨＳ収率のさらなる増加が観察された。かくして、さらなるコピーのｔｋｔＡの存在は、シキミ酸経路を介する炭素流動の増加の原因となった。より詳細には、さらなるａｒｏＢおよびｔｋｔＡ遺伝子の存在の効果は、ＤＨＳ収率に対する付加的な効果を引き起こした。
【００９４】
図１１に記載の実験において用いられるＭＹＲ２６１を操作して、ＭＹＲ１７０の染色体ＤＮＡ中のｐｏｘＢ遺伝子座にさらなるコピーのｔｋｔＡ遺伝子を組込んだ。ＭＹＲ２６１株における所望の遺伝子置きかえ（ｐｏｘＢ：：ｔｋｔＡ）を、ＰＣＲにより確認した。ＭＹＲ２６１を、ｐＣＰ３２ＡＭＰ（ａｒｏＧ過剰発現）プラスミドまたはｐＣＰ５０（ａｒｏＧおよびｔｋｔＡ過剰発現）プラスミドを用いて形質転換した。対照として、ＭＹＲ１７０をｐＣＰ３２ＡＭＰプラスミドを用いて形質転換した。図１１に示される結果が示すように、ＭＹＲ２６１の染色体ＤＮＡ中のさらなるコピーのｔｋｔＡ遺伝子の存在は、同じプラスミドを用いて形質転換されたＭＹＲ１７０株において観察されたＤＨＳ生成の力価と比較した場合、ｐＣＰ３２ＡＭＰプラスミドに関するＤＨＳ生成の力価を増加させた。トランスケトラーゼを過剰発現するプラスミドｐＣＰ５０を用いて形質転換された場合、ＭＹＲ２６１株中でのトランスケトラーゼレベルのさらなる増加は、ＤＨＳ生成の力価のさらなる増加をもたらした。ｐｏｘＢによりコードされる酵素、ＰｏｘＢ、またはピルビン酸オキシダーゼは、反応生成物としてアセテートを生成する。そのようなものとして、本明細書に記載のｔｋｔＡの挿入から得られるｐｏｘＢの欠失は、アセテート生成のための潜在的に活性な経路を除去する。同様に、Ｐ１５ａｒｏＢの同時的挿入および以下の実施例１２に記載のようなＡｃｋＡ、またはアセテートキナーゼをコードするａｃｋＡの欠失は、アセテートに向かう別の潜在的に活性な経路を除去する。アセテートの生成は一般に、発酵においては望ましくない(Jantama et al., 2008b)。そのようなものとして、これらの欠失は、アセテート生成を減少させるのに有用であり得る。
【００９５】
図１２は、プラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰおよびｐＭＧ３７を用いる形質転換後の、大腸菌のＭＹＲ１７０、ＭＹＲ２６１およびＭＹＲ３０５株におけるムコン酸および酢酸生成の力価を提供する。ＭＹＲ３０５は、染色体ＤＮＡからｐｏｘＢ遺伝子を欠失させることによりＭＹＲ１７０から誘導されたものであるが、ＭＹＲ２６１はｐｏｘＢ遺伝子がさらなるコピーのｔｋｔＡ遺伝子を挿入することによって不活化されたＭＹＲ１７０誘導体である。上記のように、プラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰは、シキミ酸生合成経路において機能するＤＡＨＰシンターゼタンパク質をコードするａｒｏＧ遺伝子を発現し、大腸菌株ＭＹＲ１７０、ＭＹＲ２６１およびＭＹＲ３０５中でのａｒｏＥ遺伝子の欠失のためＤＨＳの蓄積を誘導する。プラスミドｐＭＧ３７上でのムコン経路遺伝子、すなわち、ａｒｏＺ、ａｒｏＹおよびｃａｔＡＸの発現に関して、ＤＨＳは図２に示されるようにｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸に変換される。ＭＹＲ２６１株におけるさらなるコピーのａｒｏＢ遺伝子およびｔｋｔＡ遺伝子の存在に関して、酢酸の蓄積の低下を伴うムコン酸の生成のわずかな増加が存在した。
【実施例５】
【００９６】
ｔａｌＡまたはｔａｌＢの過剰発現
ｔａｌＢ遺伝子は大腸菌において優勢なトランスアルドラーゼをコードするが、ｔａｌＡ遺伝子はまた、少量のトランスアルドラーゼもコードする。トランスアルドラーゼの過剰生成は、芳香族経路への流動を改善することが知られている(Lu and Liao, 1997; Sprenger, 1995; Sprenger et al, 1995b)。先行技術においては、これは、天然プロモーターからの多コピープラスミド上のｔａｌ遺伝子（現在はｔａｌＢ遺伝子として知られる）の過剰発現により達成された(Lu et al., 1997, Sprenger et al., 1995b)。しかしながら、そのようなプラスミドは不安定であり、維持のために抗生物質選択を必要とする。かくして、改善されたプロセスが必要である。ｔａｌＢの改善された発現を、例えば、染色体中の天然のｔａｌＢプロモーターを、強力な構成的プロモーター、例えば、バチルス・サブチリスファージＳＰＯ１に由来するＰ１５もしくはＰ２６プロモーター（それぞれ、配列番号１および配列番号２）、またはバクテリオファージラムダに由来するＰＲプロモーター（配列番号３）で置換することにより得ることができる。これは、ｃａｍＲ、ｓａｃＢカセットを用いて、第１の工程において天然の染色体ｔａｌＢプロモーターを置きかえる以外は実施例１に記載のように２つの工程において達成される。第２の工程において、強力な構成的プロモーターは、強力な構成的プロモーターの下流側のｔａｌＢコード領域の５’末端の少なくとも５０塩基および強力な構成的プロモーターの上流側の天然のｔａｌＢプロモーターのすぐ上流の相同な少なくとも５０塩基対に隣接した強力な構成的プロモーターを含む線状ＤＮＡで形質転換し、スクロース耐性について選択することにより導入される。ｔａｌＡ遺伝子を、同様の方法により過剰発現させることもできるが、ｔａｌＢ遺伝子は優勢な活性をコードするため、それを過剰発現させるのが好ましい(Sprenger, 1995; Sprenger et al, 1995b)。過剰発現のために設計された発現カセットの構築に関するさらなる詳細については、実施例４を参照されたい。
【実施例６】
【００９７】
ａｒｏＺ、ａｒｏＹおよびｃａｔＡＸ遺伝子の発現
大腸菌により生成された内因性ＤＨＳのムコン酸への変換を証明するために、異種遺伝子、アシネトバクター種ＡＤＰ１に由来するｃａｔＡＸ、クレブシエラ・ニューモニアに由来するａｒｏＹ、およびアシネトバクター種ＡＤＰ１に由来するｑｕｉＣを、低コピープラスミドｐＣＬ１９２１(Lerner and Inouye, 1990)中に強力な構成的プロモーター（それぞれ、Ｐ１５、ＰＲ、およびＰ２６）の下でクローニングして、「ムコンプラスミド」ｐＭＧ３７を作成した。空のベクター（ｐＣＬ１９２１）またはｐＭＧ３７を担持するＭＹＲ３４株誘導体を、２％グルコースを含有する振とうフラスコ培地（芳香族アミノ酸およびビタミンを添加したＮＢＳ最少培地）中、３７℃で１７ｈ増殖させた。上清を回収し、ＨＰＬＣにより分析した。ＤＨＳの蓄積を示すＭＹＲ３４／ｐＣＬ１９２１とは対照的に、ＭＹＲ３４／ｐＭＧ３７はムコン酸の生成を示す（図１３）。後者の株からは有意な量のＤＨＳ、またはＰＣＡおよびカテコールなどの中間生成物は検出されなかったが、これは、ｐＭＧ３７から発現された異種遺伝子が機能的であり、十分であったことを示唆している。
【実施例７】
【００９８】
ａｒｏＺ相同体の比較
３つの異なるａｒｏＺ相同体および類似体を、ＤＨＳをムコン酸生成経路に向かわせるその能力について比較した（図１４）。アシネトバクター種ＡＤＰ１に由来するｑｕｉＣ、バチルス・チューリンゲンシスに由来するａｓｂＦ、およびニューロスポラ・クラッサに由来するｑａ−４は、ＡｒｏＺ様活性を有するタンパク質をコードすると報告されている(Elsemore and Ornston, 1995; Fox et al, 1995; Rutledge, 1984)。これらの遺伝子はそれぞれ、大腸菌における発現のためにコドン最適化され、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって合成され、それぞれＰ１５およびＰＲプロモーターからｃａｔＡＸおよびａｒｏＹ遺伝子も発現する低コピー「ムコンプラスミド」中の強力な構成的Ｐ２６プロモーターの下にクローニングされた。ＭＹＲ３４／ｐＣＬ１９２１、ＭＹＲ３４／ｐＭＧ３７（ａｒｏＺとしてｑｕｉＣを有するムコンプラスミド）、ＭＹＲ３４／ｐＭＧ4７（ａｒｏＺとしてｑａ−４を有するムコンプラスミド）、およびＭＹＲ３４／ｐＭＧ７０（ａｒｏＺとしてａｓｂＦを有するムコンプラスミド）を、２％グルコース、芳香族アミノ酸および芳香族ビタミンを含有する最少培地を含む振とうフラスコ中、３７℃で４８ｈ増殖させた。上清を回収し、ＨＰＬＣにより分析した。予想通り、空のベクターで形質転換したＭＹＲ３４はＤＨＳを蓄積し、ムコン酸を生成しなかった。検査した２つのａｒｏＺ相同体および１つの類似体は、ムコン酸生成にＤＨＳを向かわせることにおいて機能的であったが、その程度は異なっていた。ｑｕｉＣ遺伝子を発現するＭＹＲ３４誘導体は最も強固であり、ＤＨＳのムコン酸へのほぼ１００％の変換を示し、有意でない量のＤＨＳ保持を示した。真菌のａｒｏＺ相同体ｑａ−４を発現するＭＹＲ３４誘導体は、次いで、ＤＨＳのムコン酸への約８０％の変換および２０％のＤＨＳ保持を示した。最後に、ａｓｂＦ遺伝子を発現するＭＹＲ３４誘導体は、ＤＨＳのムコン酸へのわずかに５０％の変換および５０％のＤＨＳ保持を示した。総合すると、本発明者らの振とうフラスコアッセイ条件下では、ｑｕｉＣ遺伝子の発現および／または活性は、他のａｒｏＺ相同体のものと比較して最も高いと考えられた。
【実施例８】
【００９９】
ｃａｔＡＸ、ａｒｏＹおよびｑｕｉＣの染色体組込み
ａｄｈＥ遺伝子座の構成的プロモーターから発現される染色体のみに組込まれた単一コピーのｃａｔＡ−Ｘ、ａｒｏＹおよびｑｕｉＣを含む株により、ムコン酸を生成させることができる。
【０１００】
高いＤＨＳ生成株であるＭＹＲ１７０（ΔａｒｏＥ、Δａｃｋ：：Ｐ１５−ａｒｏＢ）は、染色体中のａｄｈＥ遺伝子座にムコン酸経路遺伝子を組込むために用いられた宿主株であった（配列番号４１）。得られた株ＭＹＲ３５２を、プラスミドＹＥｐ２４（中コピー、空のベクター）、ｐＣＰ３２ＡＭＰ（中コピー、天然プロモーターから発現されるａｒｏＧ）、またはｐＣＰ５０（中コピー、その対応する天然プロモーターから発現されるａｒｏＧおよびｔｋｔＡ）を用いて形質転換して、誘導体株を作成した。後者の２つのプラスミドを用いて、ＤＨＳ生成を増加させた。株を、上記のように２％グルコースを含有する振とうフラスコ培地中、３７℃で７２ｈ増殖させた。７２ｈで上清を回収し、ＨＰＬＣにより分析した。予想通り、ａｒｏＧおよびａｒｏＧ／ｔｋｔＡで形質転換されたＭＹＲ３５２誘導体は、空のベクターの対照と比較して総生成物形成の全体的な増加を示した（図１５）。ＭＹＲ３５２形質転換体は全て、測定可能な力価のムコン酸を生成したが、これは、組込まれた「ムコン経路」遺伝子のみを含有し、遺伝子発現の供給化学誘導因子を含まない株によってムコン酸を初めて生成することができることを証明している。
【０１０１】
これらのＭＹＲ３５２誘導体株のいずれかにおいて生成された全てのＤＨＳが最終生成物であるムコン酸に変換されたわけではなかった。その代わりに、有意な量のカテコール蓄積が存在し（図１５）、これは、ｃａｔＡＸの発現または活性は、それが染色体上の単一コピーから発現される場合、限られていることを示唆している。主な蓄積する中間体はカテコールであったため、ｑｕｉＣおよびａｒｏＹ遺伝子発現および／または活性は、ムコン酸合成のためのＭＹＲ３５２株バックグラウンドにおいて十分であると考えられる。
【０１０２】
ＭＹＲ３５２株誘導体を、類似するＭＹＲ２１９株誘導体と平行して比較した。ＭＹＲ２１９株は、ＭＹＲ１７０株と同じであるが、ムコン酸経路遺伝子を発現する低コピープラスミドｐＭＧ３７を含む。かくして、ＭＹＲ３５２とＭＹＲ２１９株との主な差異は、ムコン酸経路遺伝子の量に関するものである（それぞれ、１コピー対約５コピー）。ＭＹＲ３５２誘導体株とは対照的に、ＭＹＲ２１９誘導体株は、カテコールまたは他の中間体の非常に少ない蓄積を示し、最終生成物であるムコン酸を上手く生成した。まとめると、これらの結果は、ＭＹＲ３５２などの株においてｃａｔＡＸ活性を増加させる必要性を示している。
【実施例９】
【０１０３】
ｃａｔＡＸの発現
ＭＹＲ３５２株におけるカテコールの蓄積およびムコン酸の非効率的生成は、ｃａｔＡＸ遺伝子産物（複数可）の用量および／または活性が限られていることに起因する。上記のように、ＭＹＲ３５２は、強力な構成的プロモーターの下にΔａｒｏＥ、Δａｃｋ：：Ｐ１５−ａｒｏＢならびに染色体に組込まれた単一コピーのｃａｔＡＸ、ａｒｏＹおよびｑｕｉＣ遺伝子を含む。この株を、中コピーの空ベクター対照（ＹＥｐ２４）またはａｒｏＧ／ｔｋｔＡ発現プラスミド（ｐＣＰ５０）を用いて形質転換して、芳香族アミノ酸合成経路への炭素の流動を増加させ、多量のＤＨＳを生成させた。上記のように２％グルコースを添加した振とうフラスコ培地中、３７℃で７２ｈ、形質転換された株を増殖させることにより、カテコール中間体の蓄積が得られた。この結果は、ｃａｔＡＸ活性がＭＹＲ３５２において不十分であり得ることを示唆していた。この仮説を確認するために、低コピープラスミドから発現された１つまたは複数のムコン酸経路遺伝子がＭＹＲ３５２／ｐＣＰ５０中でのカテコール蓄積を軽減する能力を試験した（図１６）。具体的には、ＭＹＲ３５２／ｐＣＰ５０を、低コピーの空ベクター対照（ｐＣＬ１９２１）またはムコン酸生成経路の３つ全部の遺伝子、２つの遺伝子、もしくは１つの遺伝子を発現するプラスミドを用いてさらに形質転換した。誘導体株を、上記のように振とうフラスコ実験においてアッセイした。ａｒｏＹのみ（ｐＭＧ２７から）またはｑｕｉＣのみ（ｐＭＧ３９から）の量の増加はカテコール蓄積を軽減しなかったが、ムコン酸経路遺伝子の全部の発現（ｐＭＧ３７から）またはｃａｔＡＸおよびａｒｏＹの同時発現（ｐＭＧ３３から）により、カテコールのムコン酸への変換の成功が得られた。さらに、ｃａｔＡＸのみの発現（ｐＭＧ３１から）は、ムコン酸の生成にとって十分なものであり、カテコールの蓄積を防止した。
【実施例１０】
【０１０４】
漏れやすいａｒｏＥ突然変異の構築
ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を生成するための先行技術のプロセスにおいて、宿主株は、ヌル突然変異であるａｒｏＥ３５３という名称のａｒｏＥ遺伝子中の突然変異を含む。結果として、この株は、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン）ならびにシキメート経路から作られた芳香族ビタミン（ｐ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸、および２，３−ジヒドロキシ安息香酸）の供給を必要とする。芳香族アミノ酸は、商業的に魅力的なプロセスにおいて供給するにはあまりにも高価である。そのようなものとして、先行技術のプロセスは、実質的な改善を必要とする。これを、本発明者らがａｒｏＥ＊と呼ぶ漏れやすい型のａｒｏＥ遺伝子を導入することにより達成することができる。漏れやすい突然変異は、ヌル表現型をもたらすａｒｏＥコード配列中の１個のアミノ酸を変化させるミスセンス突然変異を最初に作成することにより得られる。これを、任意の形態の突然変異誘発および上記に列挙された６つの芳香族化合物の同時的栄養要求性のスクリーニングにより達成することができる。好ましい方法は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、鋳型としての野生型大腸菌ＣゲノムＤＮＡ、ならびにａｒｏＥコード領域の約１０００塩基対上流および１０００塩基対下流にハイブリダイズするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、変異性ＰＣＲ突然変異誘発により、ａｒｏＥ突然変異遺伝子のプールを作出することである。線状ＤＮＡ分子の得られるプールを用いて、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を生成し、ａｒｏＥコード領域（関連する例については実施例４を参照されたい）を置きかえた組込まれたｃａｍＲ、ｓａｃＢカセットを含む大腸菌Ｃ誘導体を形質転換し、スクロース耐性について選択する。次いで、形質転換体を、クロラムフェニコール耐性を喪失した、上記に列挙された６つの芳香族化合物を要求する栄養要求株についてスクリーニングする。いくつかの独立した栄養要求株を拾い、６つの芳香族化合物を含まない最少グルコースプレート上に約１０７、１０８、または１０９個の細胞（最少グルコース培地中で洗浄）を塗布することにより、復帰突然変異性（ｒｅｖｅｒｔａｂｉｌｉｔｙ）について試験する。プレート上にコロニーとして生じる復帰突然変異体を拾い、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の生成について試験するが、それらは実質的なレベルの芳香族アミノ酸を生成しない。そのような復帰突然変異体はａｒｏＥ遺伝子中に１つまたは複数の突然変異を担持する株であり、ＡｒｏＥ酵素は増殖のための十分な芳香族アミノ酸およびビタミンを提供するが、余剰のこれらの芳香族化合物は提供しない。漏れやすいａｒｏＥ突然変異体を得るための別の方法は、ａｒｏＥ３５３およびａｒｏＥ２４（両方ともＣｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴ、ＵＳＡから入手可能である）などの古典的な復帰突然変異性ａｒｏＥ突然変異体の１つを、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸生成株中に導入し、上記のような復帰突然変異体を選択することである。
【実施例１１】
【０１０５】
促進拡散によるグルコースの移入
芳香族経路の第１の関連する工程における基質の１つは、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）である。ＰＥＰは、細菌ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）によりグルコースおよびいくつかの他の糖を移入するためのリン酸およびエネルギーの供給源でもある。かくして、細菌がＰＴＳ依存的糖上で増殖している場合、ＰＥＰに関するＰＴＳと芳香族経路との競合が存在する。そのようなものとして、芳香族経路への流動の増加における有意な改善を、ＰＴＳを欠失させ、糖取込みのための代替経路を提供することにより達成することができる。この問題に対する１つの解決法は、ＰＴＳを、グルコース取込みのために合理的に良好に動作するプロトン共輸送体である大腸菌ＧａｌＰパーミアーゼと置きかえることである（米国特許第６，６９２，７９４号）。しかしながら、プロトン共輸送体は依然として、パーミアーゼを駆動するのに必要なプロトン勾配を維持するためにエネルギーを使用する。そのようなものとして、プロセスにおけるさらなる改善が必要である。
【０１０６】
キシロースなどのいくつかの糖を、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）の加水分解からエネルギーを誘導する輸送タンパク質により移入することができる。再度、エネルギー依存的輸送体を、あまりエネルギーを必要としない輸送体により置きかえることができる場合、ＡＴＰにおいて固有のエネルギーを他の有益な使用のために保存することができるため、改善を為すことができる。
【０１０７】
糖の移入にエネルギーを消費しない促進拡散輸送体を用いることにより、有意な改善を得ることができる(Parker et al, 1995; Snoep et al, 1994)。例えば、ｇｌｆ遺伝子によりコードされる、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ）に由来するグルコース促進因子を、３−デヒドロシキメート（ＤＨＳ）生成株においてＰＴＳの代わりに、またはそれに加えて用いることができる(Yi et al., 2003)。しかしながら、これらの株は依然として、グルコース移入のためにＧａｌＰに少なくとも一部依拠する。ＧａｌＰはグルコースの移入のためにプロトン勾配の形態のエネルギーを必要とするため、ムコン生成株に関するグルコース移入の効率の改善が必要である。
【０１０８】
またザイモモナス・モビリスに由来するｇｌｆ＋グルコキナーゼ遺伝子ｇｌｋの発現のためのカセットを、強力な構成的プロモーター、例えば、Ｐ２６と共に集合させることができる。次いで、このカセットを、所望の化合物、この場合、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の生成を妨害しない位置で宿主株のゲノム中に組込むことができる。大腸菌染色体中のそのような位置の例は、トレオニン分解オペロン、ｔｄｃＡＢＣＤＥＦＧである。増殖培地がトレオニンを含まない場合、このオペロンは必要ではなく、または発現されず、従って、そのオペロン中への発現カセットの挿入は代謝を妨害しない。
【０１０９】
上記の改善を達成するために、ＰＴＳ機能をコードする１つまたは複数の遺伝子を、実施例１に開示されたものと同様の方法を用いて欠失させる。例えば、ｐｔｓＨ、ｐｔｓＩ、ｃｒｒ、またはｐｔｓＧのうちの１つまたは複数を欠失させることができる。次に、米国特許第８，８７１，４８９号に記載のプロセスを用いて、ｇａｌＰを欠失させる。次いで、Ｐ２６−ｇｌｆ、ｇｌｋカセットを、実施例１に記載のものと同様の２つの工程において導入することができる。第１の工程においては、ｃａｍＲ、ｓａｃＢカセットを、ｐＡＣ２１から誘導される線状ＤＮＡ（配列番号１５）を用いてｔｄｃオペロンに組込み、クロラムフェニコール（３０ｍｇ／ｌ）耐性について選択する。第２の工程においては、Ｐ２６−ｇｌｆ、ｇｌｋカセットを、ｐＡＣ１９から誘導される線状ＤＮＡ（配列番号１５）を用いて、ｔｄｃオペロンに組込み、スクロース耐性について選択し、クロラムフェニコール感受性、この場合、最少グルコース培地上での増殖の改善についてスクリーニングする。
【０１１０】
グルコースの促進拡散が大腸菌における従来のグルコース移入系の代わりになるかどうかを試験するために、ｐｔｓＨＩ遺伝子およびｇａｌＰ遺伝子を、ＭＹＲ３４（ΔａｒｏＥ）から欠失させた後、Ｐ２６−ｇｌｆ、ｇｌｋカセットを、ｐＡＣ１９から誘導される線状ＤＮＡ（配列番号１５）を用いて、ｔｄｃオペロンに組込み、株ＭＹＲ２１７を得た。ＭＹＲ２１７は要求される３つの芳香族アミノ酸および３つの芳香族ビタミン様化合物を添加した最少グルコース培地上で合理的に良好に増殖する（図１７）。しかしながら、ｐｔｓＨＩおよびｇａｌＰの欠失を含むが、ｇｌｆ、ｇｌｋカセットを含まない株ＭＹＲ３１は、いかなる測定可能な増殖も示さなかった（図１７）。かくして、促進拡散は、本発明者らの株バックグラウンドにおいて２つの従来のグルコース移入系を置きかえるのに十分である。
【０１１１】
促進拡散が芳香族経路から誘導される化合物を生成させるのに有用であるかどうかを試験するために、ＭＹＲ３４およびＭＹＲ２１７をｐＣＰ５４（ａｒｏＧ、ａｒｏＢ）およびｐＣＰ５５（ａｒｏＧ、ａｒｏＢ、ｔｋｔＡ）を用いて形質転換した。振とうフラスコ中での芳香族中間体３−デヒドロシキメート（ＤＨＳ）の生成を、これらの２つの株について比較した（図１８）。ｐＣＰ５４またはｐＣＰ５５を用いた場合、促進拡散を用いる株は、従来のグルコース移入系を用いる株よりもはるかに多い、またはより多いＤＨＳを生成した。ＤＨＳの生成は、操作された大腸菌株におけるムコン酸生成のための良好な代理であり、従って本発明者らは、グルコースの促進拡散がムコン酸生成のための有用な改善であると結論付けることができる。
【実施例１２】
【０１１２】
ａｒｏＢ遺伝子の過剰発現
ａｒｏＢ遺伝子の発現は、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸生成にとって律速であると報告されている(Niu et al., 2002)。先行技術においては、これは、第２のコピーのａｒｏＢ遺伝子にその天然のプロモーターを組込むことにより解決されたと言われている。しかしながら、ａｒｏＢ遺伝子の天然のプロモーターおよびリボソーム結合部位は理想からは遠いため、これはａｒｏＢ制限を軽減するには不十分である。そのようなものとして、このプロセスは実質的な改善を必要とする。
【０１１３】
例えば、染色体中の天然のａｒｏＢプロモーターを強力な構成的プロモーター、例えば、バチルス・サブチリスファージＳＰＯ１に由来するＰ１５もしくはＰ２６プロモーター（それぞれ、配列番号１および配列番号２）、またはバクテリオファージラムダに由来するＰＲプロモーター（配列番号３）で置きかえることにより、ａｒｏＢの過剰発現の改善を得ることができる。これは、ｃａｍＲ、ｓａｃＢカセットを用いて、第１の工程において天然の染色体ａｒｏＢプロモーターおよび／またはリボソーム結合部位を置きかえる以外は、実施例４に記載のような２つの工程において達成される。第２の工程においては、強力な構成的プロモーターは、強力な構成的プロモーター、次いで、リボソーム結合部位、ならびに強力な構成的プロモーターの下流側のＡＴＧ開始コドンを含むａｒｏＢコード配列の５’末端から少なくとも５０塩基、および強力な構成的プロモーターの上流側の天然のａｒｏＢプロモーターのすぐ上流の相同な少なくとも５０塩基対を含む線状ＤＮＡを用いて形質転換し、スクロース耐性について選択することにより導入される。同様の方法を用いて、より強力なプロモーターを導入することに加えて、またはその代わりに、より強力なリボソーム結合部位、例えば、ＡＧＧＡＧＧを、ａｒｏＢのＡＴＧ翻訳開始コドンの約４〜１０塩基対上流に導入することができる。１コピーのそのような合成カセット、例えば、Ｐ１５−ａｒｏＢカセットを、天然のａｒｏＢ遺伝子座とは異なる遺伝子座、例えば、ａｃｋ遺伝子座で染色体中に組込むことができる。実施例４に記載のような、ａｃｋ遺伝子、ならびにｐｏｘＢ遺伝子の同時的欠失は、発酵中の望ましくないアセテートの形成を減少させるのに役立ち得る。
【実施例１３】
【０１１４】
ペントースリン酸経路の酸化的分岐を介する流動の低下
芳香族経路における第１の関連する工程にとって必要とされるエリスロース−４−リン酸は、ペントースリン酸経路（ＰＰＰ）の非酸化的部分から誘導される。炭素がＰＰＰに進入することができる２つの異なる経路が存在する。第１は、酵素グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ遺伝子によりコードされる）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｇｌ遺伝子によりコードされる）、および６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ遺伝子によりコードされる）によるグルコース−６−リン酸に由来し、リブロース−５−リン酸が得られる。これらの３つの工程の最後において、１個の炭素がＣＯ２として失われる。ＰＰＰへのこの経路は、ＰＰＰの酸化的分岐と呼ばれる。次いで、リブロース−５−リン酸は、イソメラーゼ、エピメラーゼ、トランスケトラーゼ、およびトランスアルドラーゼの作用により様々な他の糖リン酸に変換される。リブロース−５−リン酸から始まる、この群の可逆的反応は、ＰＰＰの非酸化的分岐と呼ばれる。炭素がＰＰＰに進入することができる第２の経路は、フルクトース−６−リン酸およびグリセルアルデヒド（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｅ）−３−リン酸（両方とも解糖としても知られる、Ｅｍｂｄｅｎ−Ｍｙｅｒｈｏｆｆ経路に由来する）を介するものであり、トランスアルドラーゼおよびトランスケトラーゼにより組合せ、再配置されて、様々な他の糖リン酸を与え、その１つはエリスロース−４−リン酸である。炭素がこの第２の経路を介してＰＰＰに進入する場合、ＣＯ２は失われない。グルコースからのｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の収率を改善するために、ＰＰＰに進入する全ての炭素がフルクトース−６−リン酸およびグリセルアルデヒド−３−リン酸から非酸化的経路を介して来なければならないように、ＰＰＰの酸化的分岐を遮断することによりＣＯ２の喪失を防止することができる。ＰＰＰの酸化的分岐の遮断は、ｔｙｒＲ遺伝子を欠失させるための実施例１に開示されたものと同様の２工程の方法を用いて、ｚｗｆ遺伝子を欠失させることにより達成される。
【実施例１４】
【０１１５】
芳香族経路へのＰＥＰへの、およびそれを介する流動の増加
ＰＥＰがｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸への経路上の律速中間体ではないことを確保することが望ましい。これは、例えば、他の実施例において上記のｐｐｓ遺伝子の過剰発現カセットを組込むことにより達成される、酵素ＰＥＰシンテターゼによるＰＥＰへのピルビン酸の再利用を増加させることにより達成される。別の手法は、大腸菌においてｐｙｋＡおよびｐｙｋＦ遺伝子によりコードされるピルビン酸キナーゼによるＰＥＰの消費を制限することである。この場合、手法は、酵素（複数可）の活性を低下させることである。これは、ピルビン酸キナーゼ（ｔｙｒＲについて実施例１および米国特許第９，０１７，９７６号に記載されたような）をコードする１つもしくは複数の遺伝子を欠失させるか、または例えば、ピルビン酸キナーゼ活性のレベルが低下するように、プロモーター、リボソーム結合部位、もしくはコード配列を突然変異させることにより、１つもしくは複数のこれらの遺伝子の発現の強度を低下させることにより達成される。例えば、大腸菌ｐｙｋＡ遺伝子の前のＲＢＳは、５’ＣＧＧＡＧＴＡＴＴＡＣＡＴＧである。ＡＴＧ翻訳開始コドンには下線を付ける。ＲＢＳ配列を、同時的な１塩基変化によるＡＧＧＡＧＧのコンセンサスＲＢＳとあまり類似しないようにするように、この配列をＣａＧＡＧＴＡＴＴＡＣＡＴＧ、ＣａａＡＧＴＡＴＴＡＣＡＴＧ、ＣａａｔＧＴＡＴＴＡＣＡＴＧ、ＣａａｔａＴＡＴＴＡＣＡＴＧなどに突然変異させることができる。次いで、それぞれの突然変異型を、ｐｙｋＡ遺伝子座で染色体中に導入し、野生型を置きかえ、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸生成レベルを改善のために測定する。
【実施例１５】
【０１１６】
スクロース上での増殖の付与
大腸菌Ｃから誘導される株は唯一の炭素源としてスクロース上で増殖しない。しかしながら、それらを遺伝子操作して、その全体が参照により本明細書に組込まれる国際特許出願公開ＷＯ２０１２／０８２７２０および米国特許出願公開第２０１３／０３３７５１９号に開示されたようにそうすることができる。そのようなものとして、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸生成株を、上記の出願に開示されたようにスクロース上で増殖するように操作することができる。
【実施例１６】
【０１１７】
ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の改善された生成株
実施例１〜１５に記載の全ての特徴を、次々に特徴を導入することによって１株の大腸菌中で組み合わせることができる。得られる株は、改善されたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸生成株を含む。次いで、得られる株は、上記のそれぞれの過剰発現カセットの第２のコピーを同時に、第１のコピーの位置とは別の位置に組込むことによりさらに改善することができる。便利で安全な位置の一例は、リボソームＲＮＡをコードするｒｒｆＦのターミネーターからすぐ下流のＢｓｒＢ１制限部位である。所望のカセットは、プラスミドｐＭＨ１７ＦのユニークなＢｓｒＢ１部位中に平滑線状ＤＮＡとして連結される（配列番号１７）。一例は、ｐｃａｔＡＸという名称のプラスミドを得るためのｃａｔＡＸ発現カセットのライゲーションである。平行して、ｃａｍＲ、ｓａｃＢカセットを、ｐＭＨ１７Ｆ中への平滑断片としてライゲートして、ｐＭＨ２８Ｆを得る（配列番号１９）。ＰＣＲによるか、または制限酵素切断によりｐＭＨ２８から誘導される線状ＤＮＡを用いて、ｒｒｆＦ部位にｃａｍＲ、ｓａｃＢカセットを置く。次に、ＰＣＲによるか、または制限酵素切断によりｐｃａｔＡＸから誘導される線状ＤＮＡを用いて、スクロース上での選択を用いて、ｒｒｆＦ遺伝子座に第２のコピーのｃａｔＡＸカセットを導入する。次いで、得られる株を、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸生成のためのその祖父母株と比較して、ｃａｔＡＸが律速段階であったことを決定する。同様の方法により、実施例２〜１５に由来するそれぞれのカセットを、律速段階について試験する。段階が律速であるとわかった場合、１つまたは複数のさらなるコピーの関連カセットを、染色体中のさらに他の適切な位置に組込み、プラスミドまたは誘導的プロモーターを必要とすることなく、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸生成のさらなる改善をもたらす。
【実施例１７】
【０１１８】
発酵によるｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の生成
上記の実施例１〜１５に開示される遺伝子操作された微生物により、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を生成させることができる。増殖培地は広く変化してもよく、微生物の十分な増殖を支援する任意の培地であってもよい。好ましい培地は、ミネラル塩およびグルコース、キシロース、ラクトース、グリセロール、アセテート、アラビノース、ガラクトース、マンノース、マルトース、またはスクロースなどの非芳香族炭素源を含有する最少培地である（好ましい最少増殖培地の例については上記を参照されたい）。操作された微生物と増殖培地とのそれぞれの組合せについて、温度、ｐＨ、通気速度、およびｐＨを維持するために用いられる化合物（複数可）などの、発酵パラメータを体系的に変化させる日常的な実験により、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を生成させるための適切な条件を決定する。ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸が生成されるにつれて、１つまたは複数の化合物を発酵器中に供給して、ｐＨが低くなり過ぎるのを防がなければならない。酸を中和するための好ましい化合物としては、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムの酸化物、水酸化物、炭酸塩、および重炭酸塩などのアルカリ塩、またはそのようなアルカリ塩の２つ以上の組合せが挙げられる。
【０１１９】
７リットルの発酵器中での大腸菌のＭＹＲ４２８株によるムコン酸生成を、図１９に示す。ΔａｒｏＥΔａｃｋＡ：：Ｐ１５−ａｒｏＢΔｐｏｘＢ：：ｔｋｔＡの遺伝子型を有する大腸菌のＭＹＲ２６１株を、プラスミドｐＣＰ３２ＡＭＰおよびｐＭＧ３７を用いて形質転換して、ＭＹＲ４２８を作成した。ＭＹＲ４２８を、グルコース供給を４８時間行いながら、上記の７リットルの発酵器中で増殖させた。最終ムコン酸力価は、１６ｇ／ｌであった（図１９を参照されたい）。
【０１２０】
発酵が完了した後、細胞を凝集（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）、遠心分離、および／または濾過により除去した後、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を、１つまたは複数のその後の工程、例えば、沈降、結晶化、電気分解、クロマトグラフィー（イオン交換、疎水的親和性、および／もしくはサイズに基づく）、精密濾過、ナノ濾過、逆浸透、および蒸発の組合せにより、明澄化された培養液から精製する。
【実施例１８】
【０１２１】
３，４−ジヒドロキシ安息香酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＡｒｏＹ）活性の改善
表２に提供される遺伝子型を有する大腸菌株ＭＹＲ９９３を、親株として用いて、ｕｂｉＸ遺伝子またはｕｂｉＤ遺伝子のいずれかに欠失を有する株を生成した。ｕｂｉＸ中に欠失を有する大腸菌株の構築においては、ｕｂｉＸ遺伝子のそれぞれの末端に対する４５ｂｐの相同性を有するプライマーＭＳ６０８およびＭＳ６０９を用いて、カナマイシン耐性カセットを増幅した。ｕｂｉＤ中に欠失を有する大腸菌株の構築においては、ｕｂｉＤ遺伝子のそれぞれの末端に対する４５ｂｐの相同性を有するプライマーＭＳ６０４およびＭＳ６０５を用いて、カナマイシン耐性カセットを増幅した。ＰＣＲ産物をカラム精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）し、それを用いて、以前に開発された方法（Datsenko KA, Wanner BL (2000) One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA97:6640-6645）を用いて大腸菌株ＭＹＲ９９３（表２）を形質転換して、ｕｂｉＸ遺伝子またはｕｂｉＤ遺伝子のいずれかに欠失を有する大腸菌株（表２−ＭＹＲ９９３ΔｕｂｉＸおよびＭＹＲ９９３ΔｕｂｉＤ）を生成した。欠失株は、呼吸に障害があると予想されるため、グルコースをＬＢ選択プレートに添加して、発酵増殖を提供した。
【０１２２】
大腸菌株ＭＹＲ９９３、ＭＹＲ９９３ΔｕｂｉＸおよびＭＹＲ９９３ΔｕｂｉＤを、炭素源としてグルコースを用いて、５ｇのＫ２ＨＰＯ４、３．５ｇのＫＨ２ＨＰＯ４、３．５ｇの（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、微量元素（１．６ｍｇのＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．２ｍｇのＺｎＣｌ２、０．２ｍｇのＮａ２ＭｓＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０５ｍｇのＨ３ＢＯ３、０．５５ｍｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、および０．２ＭのＭＯＰＳバッファー（全て１リットルあたり）を含む培地中、２５０ｒｐｍ、３７℃で４８時間、２５０ｍｌの振とうフラスコ中、２５ｍｌ培養物として増殖させた。４８時間の増殖の終わりに、培養上清をムコン酸およびＰＣＡ含量について分析した。図２０に示される結果が示すように、親株ＭＹＲ９９３は培養培地中に主にムコン酸を蓄積させ、ＰＣＡは非常に少なかったが、大腸菌株ＭＹＲ９９３ΔｕｂｉＸはＰＣＡのみを蓄積させ、ムコン酸は検出不可能であった。他方、大腸菌株ＭＹＲ９９３ΔｕｂｉＤは、ムコン酸とＰＣＡの両方の蓄積の減少を示した。結論は、ＵｂｉＸタンパク質がＡｒｏＹ（ＰＣＡデカルボキシラーゼ）活性にとって必要であることであった。
【実施例１９】
【０１２３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるＵｂｉＸ相同体の活性の比較
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを行って、ＵｂｉＸおよびその４つの相同体の活性を比較した。このｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいては、ＡｒｏＹタンパク質を過剰発現する大腸菌株に由来する溶解物を、ＵｂｉＸタンパク質またはその相同体を発現する別の大腸菌株に由来する溶解物と混合し、混合した溶解物を、基質としてＰＣＡを消費するその能力についてアッセイした。大腸菌株を生成するムコン酸においては、ＰＣＡはＡｒｏＹタンパク質によって脱カルボキシル化され、カテコールが得られ、次いで、ＣａｔＡタンパク質によってムコン酸に変換される。ＡｒｏＹタンパク質の脱カルボキシル化活性は、ＵｂｉＸまたはその相同体の１つの存在によって増強されると予想され、ＵｂｉＸまたはその相同体の効率に応じて、アッセイ溶液中のＰＣＡは異なる速度で消費される。
【０１２４】
このｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ＵｂｉＸおよびその４つの相同体、すなわち、ＫｐｄＢはクレブシエラ・ニューモニエのｋｐｄＢ遺伝子（ｋｐｄＢ）によりコードされ（配列番号４２）、Ｅｌｗは大腸菌Ｗのｅｌｗ遺伝子によりコードされ（配列番号４６）、Ｋｏｘはクレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）のｋｏｘ遺伝子（ｋｏｘ）によりコードされ（配列番号４８）、およびＬｐｌはラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のｌｐｌ遺伝子（ｌｐｌ）によりコードされる（配列番号５０）。最後の３つの相同体の名称は、本開示のために与えられる単なる暫定名である。ＡｒｏＹ、ＵｂｉＸ、ＫｐｄＢ、Ｅｌｗ、ＫｏｘおよびＬｐｌを、低コピープラスミド（ＳＣ１０１複製起点）上の強力な構成的ラムダファージプロモーターＰＲ（配列番号３）から発現させた。プラスミドｐＣＡＴ３５０（配列番号５５）およびｐＣＰ１６５（配列番号５６）を、遺伝子クローニングのために用いた。ＡｒｏＹプラスミドの構築において、プライマーＲＰ７１２およびＲＰ７１４を用いて、ａｒｏＹ遺伝子を増幅し、プライマーＭＳ４６１およびＭＳ３４６を用いて、ｐＣＡＴ３５０プラスミド骨格を増幅した。得られるＰＣＲ産物をライゲートして、ＡｒｏＹタンパク質を過剰発現するプラスミドを得た。ＫｐｄＢプラスミドの構築において、プライマーＲＰ７３１およびＲＰ７３２を用いてｋｐｄＢ遺伝子を増幅し、プライマーＭＳ４６１およびＭＳ３４６を用いてｐＣＡＴ３５０プラスミド骨格を増幅した。得られるＰＣＲ産物をライゲートして、ＫｐｄＢタンパク質を過剰発現するプラスミドを得た。ＵｂｉＸプラスミドの構築において、プライマーＭＳ６６９およびＭＳ６６６を用いてｕｂｉＸ遺伝子を増幅し、プライマーＭＳ４６１およびＲＰ６０７を用いてｐＣＡＴ３５０プラスミド骨格を増幅した。得られるＰＣＲ産物をライゲートして、ＵｂｉＸタンパク質を過剰発現するプラスミドを得た。Ｅｌｗプラスミドの構築において、プライマーＭＳ６７６およびＭＳ６８０を用いてｅｌｗ遺伝子を増幅し、プライマーＭＳ４６１およびＭＳ６２１を用いてｐＣＰ１６５プラスミド骨格を増幅した。得られるＰＣＲ産物をライゲートして、Ｅｌｗタンパク質を過剰発現するプラスミドを得た。Ｋｏｘプラスミドの構築において、プライマーＭＳ６８６およびＭＳ６８４を用いてｋｏｘ遺伝子を増幅し、プライマーＭＳ４６１およびＭＳ６２１を用いてｐＣＰ１６５プラスミド骨格を増幅した。得られるＰＣＲ産物をライゲートして、Ｋｏｘタンパク質を過剰発現するプラスミドを得た。Ｌｐｌプラスミドの構築において、プライマーＭＳ６９２およびＭＳ６９１を用いてｌｐｌ遺伝子を増幅し、プライマーＭＳ４６１およびＭＳ６２１を用いてｐＣＰ１６５プラスミド骨格を増幅した。得られるＰＣＲ産物をライゲートして、Ｌｐｌタンパク質を過剰発現するプラスミドを得た。全ての断片は、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いたクローニングを可能にするために２０ｂｐの相同性を含有し、ＮＥＢ５α大腸菌細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）中にクローニングした。
【０１２５】
プラスミドのクローニング後、ＡｒｏＹ活性を証明するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイを開発した。１ｍＬの一晩ＬＢ増殖培養物をスピンダウンし、２００μＬの細菌タンパク質抽出試薬（Ｂ−ＰＥＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁した。回転式混合機中で５分間インキュベートした後、卓上遠心分離機中、１３，０００ｒｐｍで試料を遠心分離することにより、細胞破片を除去した。明澄化された粗溶解物上清を新しいチューブに移し、氷上で保存した。２０μＬのＡｒｏＹ過剰発現溶解物を、１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーｐＨ６．４、２５ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍＭのプロトカテク酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１５０μＬの反応液（最終容量）中で、２０μＬのＵｂｉＸまたは相同体の溶解物と混合した。２９０ｎｍでの吸光度を、６０分間にわたって毎分読み取った。Ａ２９０でのＰＣＡの消失をモニタリングすることにより、ＡｒｏＹ活性を測定した。ＵｂｉＸおよびその相同体の相対活性を、図２１に示す。試験した全てのＵｂｉＸ相同体はＡｒｏＹ活性を改善したが、試験した特定の相同体に応じて、様々な酵素活性が生成された。最も高いＡｒｏＹ活性は、ＫｐｄＢを用いて達成されたが、最も低い活性はラクトバチルス相同体から観察された。最も高い活性が常に最適でなくてもよいため、示された様々な活性を用いて、ムコン酸経路の性能を改善することができる。
【実施例２０】
【０１２６】
ＡｒｏＹの活性に対するｋｐｄＢ発現レベルの効果
ＫｐｄＢタンパク質の発現がｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＡｒｏＹタンパク質の活性を増強することを確立したら、ムコン酸生成生体触媒内のＫｐｄＢタンパク質の発現レベルがムコン酸生成のレベルに影響するかどうかを決定するための努力を行った。この実験において、ムコン酸生成株ＭＹＲ１３０５を、異なるレベルでＫｐｄＢを発現する様々なプラスミドで形質転換した。ＭＹＲ１３０５の形質転換を、３つの異なるプラスミドを用いて行った。実験対照においては、ＭＹＲ１３０５を、ＫｐｄＢタンパク質をコードする遺伝子を含まない対照プラスミドｐＣＰ１４０で形質転換した。ｐＣＰ１４０のＤＮＡ配列を、配列番号５７に記載する。簡単に述べると、ｐＣＰ１４０を、Ｐ１５プロモーター下で大腸菌コドン最適化されたｃａｔＡＸを、天然大腸菌プロモーター下で大腸菌ｔｋｔＡを、Ｐ１５プロモーター下で大腸菌ａｒｏＢを、およびＰ２６プロモーター下で大腸菌ａｒｏＤを発現するように構築した（配列番号２）。ＭＹＲ１３０５を形質転換するために用いた第２のプラスミドｐＣＰ１６９は、Ｐ２６プロモーター下にｋｐｄＢ遺伝子をさらに有するｐＣＰ１４０の誘導体である。ＭＹＲ１３０５を形質転換するために用いた第３のプラスミドｐＣＰ１７０は、大腸菌ｐｇｉプロモーター下にｋｐｄＢをさらに有するｐＣＰ１４０の誘導体である（配列番号５２）。低レベル発現を、Ｐ２６プロモーターを用いて達成したが、高レベル発現を、大腸菌ｐｇｉプロモーターを用いて達成した。ｐＣＰ１４０プラスミドを、２セットのプライマー（第１の断片についてはＰＣＲプライマーＲＰ６０７およびＲＰ６７７ならびに第２の断片についてはＰＣＲプライマーＲＰ６７１およびＲＰ６６４）を用いて２つの断片中で最初に増幅することによって、ｐＣＰ１６９およびｐＣＰ１７０を構築した。２つのより小さいＰＣＲ産物は、単一の大きいＰＣＲ産物よりも容易なプラスミド構築を容易にする。プラスミドｐＣＰ１６９の構築においては、Ｐ２６プロモーターを、プライマーＲＰ７０２およびＲＰ７８３を用いて増幅し、ｋｐｄＢを、プライマーＲＰ７８１およびＲＰ７８０を用いて増幅した。プラスミドｐＣＰ１７０の構築においては、ｐｇｉプロモーターを、プライマーＲＰ７００およびＲＰ７８４を用いて増幅し、ｋｐｄＢを、プライマーＲＰ７７９およびＲＰ７８０を用いて増幅した。全てのＰＣＲ産物は、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いるクローニングを可能にするための２０ｂｐの相同性重複を有していた。図２２に示されるように、ｋｐｄＢを発現する株は、ｋｐｄＢ遺伝子発現を示さない対照株よりも高レベルのムコン酸を生成した。さらに、ＰＣＡ蓄積は、外因性ｋｐｄＢ遺伝子を発現する株中では排除された。生成されたムコン酸のレベルは、ｋｐｄＢ遺伝子の発現の増加と共に増加しなかったが、これは、外因性ｋｐｄＢ遺伝子が低レベルの発現下で発現された場合であっても、飽和レベルの活性が達成されたことを示唆している。
【実施例２１】
【０１２７】
ｐｐｃ突然変異体の補完およびムコン酸形成に対する効果
ムコン酸形成に関するＰＥＰの利用可能性の増大を、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ）遺伝子が欠失した細菌株を用いて調査した。大腸菌株ＭＹＲ１６７４を遺伝子操作して、ムコン酸生成のための生体触媒として用いた。ＭＹＲ１６７４は、炭素源としてのグルコースおよびエネルギーを含有する最少培地中で増殖し、ムコン酸を生成することができる。しかしながら、ｐｐｃ遺伝子がＭＹＲ１６７４から欠失した場合、得られる株ＭＹＲ１６７４Δｐｐｃは、グルコースを含有する最少培地中で増殖することができず、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）などのリッチ培地上でのみ生存可能である。最少培地上で増殖するＭＹＲ１６７４Δｐｐｃの能力の喪失を、大腸菌のＭＹＲ１６７４Δｐｐｃ株中の元のｐｐｃ遺伝子座にピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ遺伝子を挿入することにより、復帰させることができる。
【０１２８】
サッカロミセス・セレビジアに由来するピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）遺伝子（配列番号５３）を、大腸菌ｐｐｃプロモーターおよびターミネーターに対する隣接相同性を含有する、プライマーＭＳ１３８３およびＭＳ１３８４を用いてクローニングした。最少培地上での強力な増殖を容易にするために、強力な構成的右向きラムダファージプロモーターＰＲが必要であった。ＰＲプロモーターを、ＭＳ１４２９およびＭＳ１４３０を用いて増幅し、得られたＰＣＲ産物を用いて、内因性ｐｐｃプロモーターを置きかえた。Δｐｐｃ：：ＰＲ−ｐｙｃ遺伝子座の最終ヌクレオチド配列を、配列番号５８に示す。サッカロミセス・セレビジアのｐｙｃ遺伝子は、いかなる大腸菌遺伝子とも密接に関連しないため、それを選択し、異なるコドン使用に起因する予想される低発現は、ムコン酸生成のためにＰＥＰを保持するのに有益であり得た。ピルビン酸カルボキシラーゼを含有する多くの生物が存在し、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有する任意の相同体または類似体を用いることができる。元のｐｐｃ遺伝子座にΔｐｐｃ：：ＰＲ−ｐｙｃを組み込むことによってＭＹＲ１６７４から誘導される新しい株ＭＹＲ１７７２は、クローニングされたサッカロミセス・セレビジアのｐｙｃ遺伝子の機能を確認する最少培地上で生存可能であった。ＭＹＲ１７７２およびその親ＭＹＲ１６７４株を、ムコン酸を生成するその能力について、振とうフラスコ実験で比較した。図２３に示される結果が示すように、ＭＹＲ１７７２株は親ＭＹＲ１６７４よりも高力価のムコン酸生成をもたらしたが、これは、内因性ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ酵素を、外因性ピルビン酸カルボキシラーゼ酵素で置きかえる際の利点を証明している。
【実施例２２】
【０１２９】
ムコン酸生成の測定
細菌株ＭＹＲ８１４、ＭＹＲ９９３、ＭＹＲ１５３６、ＭＹＲ１５５７、ＭＹＲ１５７０、ＭＹＲ１５９５、ＭＹＲ１６３０、ＭＹＲ１６７４およびＭＹＲ１７７２を、振とうフラスコ中で一晩増殖させ、ムコン酸生成に関する力価および収率を決定した。さらに、６００ｎｍでの吸光度を測定することによって増殖速度を決定し、様々な細菌株の相対的増殖を表８に提供する。「＋＋＋」で表される細菌増殖は、野生型大腸菌株において見られる増殖と類似する増殖を示す。「＋」で表される細菌増殖は、弱い増殖を示す。中間の増殖は「＋＋」で表される。特定の株が弱い増殖を示している場合、その株を５回の一晩トランスファーにかけて増殖を改善し、それぞれのトランスファーは約１０世代または倍加をもたらす。
【０１３０】
細菌株ＭＹＲ８１４、ＭＹＲ１５７０、ＭＹＲ１６３０およびＭＹＲ１６７４を、フェドバッチ様式で、７リットル発酵器中で増殖させ、ムコン酸生成に関する力価および収率を決定した（表９）。ムコン酸力価および収率について試験した細菌株は、非常に少ない副生成物を生成した。例えば、フェドバッチ式発酵の７２時間後の細菌株は、わずか０．０８ｇ／ＬのＰＣＡおよび副生成物として０．０７ｇ／Ｌのフマレートを示した。
【０１３１】
【表１】
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【０１３２】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【０１３３】
【表３】
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【０１３４】
【表４】
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【０１３５】
【表５】
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【０１３６】
【表６】
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【０１３７】
【表７−１】
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【０１３８】
【表７−２】
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【０１３９】
【表７−３】
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【０１４０】
【表７−４】
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【表７−５】
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【０１４１】
【表８】
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【０１４２】
【表９】
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【０１４３】
参考文献
全ての特許、特許出願、公開、配列および他の刊行物は、出典明示により本願明細書に包含させる。
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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