(57)【要約】  頬上皮細胞懸濁液を調製し、成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。【選択図】図1
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
頬上皮細胞懸濁液の調製方法であって、
(a) 頬粘膜組織を対象から採取するステップ;
(b) (a)からの組織を化学的解離剤で処理するステップ;
(c) (b)からの組織サンプルを栄養培地で洗浄するステップ;
(d) 洗浄した組織の真皮から表皮を分離するステップ;
(e) ミンチにし、ろ過して、表皮から均一な上皮細胞懸濁液を得るステップ;
(f) 任意選択で、播種して、細胞増殖を可能にするステップ;
(g) 酵素(複数可)を用いて細胞単層を採取するステップ;
(h) 遠心分離し、上清を捨てるステップ;
(i) 栄養培地と混合するステップ;
(j) 頬上皮細胞懸濁液を分析するステップ;
(k) V字形1mlバイアル中に0.4mlの頬上皮細胞懸濁液を充填するステップ; 及び
(l) 任意選択で、(a)におけるのと同じ対象へ輸送するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
対象が、成人対象である、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項３】
前記方法が、任意選択で、対象の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植しながら、ゲルと混合するステップをさらに含み、ゲルが、生体適合性送達システム、例えば、フィブリノゲン及び/又はトロンビン及び/又は熱可逆性ゲル化ポリマー(TGP)ゲル及び/又はキトサンなどの組み合わせから選択される、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項４】
化学的解離剤が、トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン-EDTA、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、パパイン、及びパンクレアチンから選択される、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項５】
栄養培地が、必要な増殖因子を有する、DMEM、EMEM、F12、IMDMなどから選択される、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項６】
播種が、T-25及び/又はT-75及び/又はT-150フラスコなどの中で行われる、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項７】
採取のための酵素が、トリプシン-EDTA、コラゲナーゼなどから選択される、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項８】
実施される分析が、外観、無菌性、マイコプラズマ、内毒素、細胞計数、細胞生存性、細胞純度試験、細胞特徴付け、及び核型決定分析である、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項９】
採取される頬粘膜組織が、成人の頬の内側由来であり、約1×1.5cm2である、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項１０】
輸送が、2〜8摂氏温度におけるものである、請求項１に記載の頬上皮細胞懸濁液の調製方法。
【請求項１１】
成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法であって、
(a) ヒト頬粘膜組織を成人の頬の内側から採取するステップ;
(b) (a) からの組織を化学的解離剤に供するステップ;
(c) (b) からの組織サンプルを栄養培地で洗浄するステップ;
(d) 洗浄した組織の真皮から表皮を分離するステップ;
(e) ミンチにし、ろ過して、表皮から均一な上皮細胞懸濁液を得るステップ;
(f) 任意選択で、播種して、細胞増殖を可能にするステップ;
(g) 酵素(複数可)を用いて細胞単層を採取するステップ;
(h) 遠心分離し、上清を捨てるステップ;
(i) 栄養培地と混合するステップ;
(j) 頬上皮細胞懸濁液を分析するステップ;
(k) 任意選択で、V字形1mlバイアル中に頬上皮細胞懸濁液を充填し、輸送するステップ; 及び
(l) 任意選択で、成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植しながら、ゲルと混合するステップ
を含む、方法。
【請求項１２】
化学的解離剤が、トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン-EDTA、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、パパイン、及びパンクレアチンから選択される、請求項１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。
【請求項１３】
栄養培地が、必要な増殖因子を有する、DMEM、EMEM、F12、IMDMなどから選択される、請求項１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。
【請求項１４】
播種が、T-25及び/又はT-75及び/又はT-150フラスコなどの中で行われる、請求項１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。
【請求項１５】
酵素が、トリプシン-EDTA、コラゲナーゼなどから選択される、請求項１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。
【請求項１６】
実施される分析が、外観、無菌性、マイコプラズマ、内毒素、細胞計数、細胞生存性、細胞純度試験、細胞特徴付け、及び核型決定分析である、請求項１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。
【請求項１７】
ヒトの頬の内側から採取されるヒト頬粘膜組織が、約1×1.5cm2である、請求項１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。
【請求項１８】
輸送が、2〜8摂氏温度におけるものである、請求項１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。
【請求項１９】
ゲルが、生体適合性送達システム、例えば、フィブリノゲン及び/又はトロンビン及び/又は熱可逆性ゲル化ポリマー(TGP)ゲル及び/又はキトサンなどの組み合わせから選択される、請求項１１に記載の成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、頬上皮細胞懸濁液を調製し、成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国特許出願公開第2010/0184220号(M/s. The Technische Univeristy Dresdenに譲渡されている)は、ヒト又は動物の臓器の再建のための生体適合性無細胞膜及び微小血管膀胱内皮細胞を含む組織移植構築物を特許請求する。しかし、本発明は、いかなる膜又は足場も欠いている頬粘膜上皮細胞を含む。
【０００３】
European Urology 53 (2008) 1263-1271、表題Tissue-Engineered Buccal Mucosa Urethroplasty - Clinical Outcomesは、尿道狭窄を治療するための、DED(脱表皮化真皮(de-epidermised dermis))の乳頭状表面に播種されるケラチノサイト及び線維芽細胞を含む、自己組織工学頬粘膜の使用を開示する。しかし、本発明は、DED上に播種されない自己頬上皮細胞懸濁液を含む。
【０００４】
European Urology Supplement 2014:13:eV60、表題Reconstruction of extended urethral stricture with tissue engineered autologous buccal mucosal graft (Mukocell)は、3週間後にアンレー（onlay）として移植される、コラーゲン足場の表面上の5×5mmの口腔粘膜移植片の拡張及び培養を開示する。細胞は、増殖のためにコラーゲン膜上に播種される(継代数P1)。普通、1cm2あたり≧1×105個の細胞が、移植片上に埋め込まれる。本発明は、いかなる細胞播種移植片も使用せず、自己頬上皮細胞懸濁液を、最大2週間培養し、移植前にゲルと混合する。
【０００５】
しかし、本発明の方法は、継代数(P1)を用いて調製された細胞と比較して、細胞の形態、増殖速度、タンパク質発現を変えない可能性がある、より少ない継代数のP0を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の目的
本発明の目的は、成体の尿道における欠損を修復するための頬上皮細胞懸濁液を調製する方法である。この方法は、少量の頬粘膜組織を用いて実施される。
【０００７】
別の目的は、生体適合性送達システム、例えば、フィブリノゲン及び/又はトロンビン及び/又は熱可逆性ゲル化ポリマー(TGP)ゲル及び/又はキトサンなどの組み合わせと共に又はそれ無しで、成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
頬上皮細胞懸濁液（懸濁物）の調製方法であって、
(a) 頬粘膜組織を対象から採取するステップ;
(b) (a)からの組織を化学的解離剤で処理するステップ;
(c) (b) からの組織サンプルを栄養培地で洗浄するステップ;
(d) 洗浄した組織の真皮から表皮を分離するステップ;
(e) ミンチにし(細かくし）、ろ過して、表皮から均一な上皮細胞懸濁液を得るステップ;
(f) 任意選択で、播種して、細胞増殖を可能にするステップ;
(g) 酵素(複数可)を用いて細胞単層を採取するステップ;
(h) 遠心分離し、上清を捨てるステップ;
(i) 栄養培地と混合するステップ;
(j) 頬上皮細胞懸濁液を分析するステップ;
(k) V字形1mlバイアル中に0.4mlの頬上皮細胞懸濁液を充填するステップ; 及び
(l) 任意選択で、(a)におけるのと同じ対象へ輸送するステップ
を含む、方法。
【０００９】
成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法であって、
(a) ヒト頬粘膜組織を成人の頬の内側から採取するステップ;
(b) (a) からの組織を化学的解離剤に供するステップ;
(c) (b) からの組織サンプルを栄養培地で洗浄するステップ;
(d) 洗浄した組織の真皮から表皮を分離するステップ;
(e) ミンチにし(細かくし)、ろ過して、表皮から均一な上皮細胞懸濁液を得るステップ;
(f) 任意選択で、播種して、細胞増殖を可能にするステップ;
(g) 酵素(複数可)を用いて細胞単層を採取するステップ;
(h) 遠心分離し、上清を捨てるステップ;
(i) 栄養培地と混合するステップ;
(j) 頬上皮細胞懸濁液を分析するステップ;
(k) 任意選択で、V字形1mlバイアル中に0.4mlの頬上皮細胞懸濁液を充填し、輸送するステップ; 及び
(l) 任意選択で、成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植しながら、ゲルと混合するステップ
を含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】頬上皮細胞培養プロセス
【図２】頬上皮細胞懸濁液の調製のためのプロセスステップ
【図３】リアルタイムPCRに基づく頬上皮細胞特徴付け
【図４】CK14+表面マーカーを用いたフローサイトメトリーに基づく頬上皮細胞特徴付け
【図５】頬上皮細胞製造ステップで実施された核型決定分析の結果
【図６】混合手順: デュプロジェクト(duploject)を用いた概略図
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の説明
尿道狭窄は、最も古く知られている泌尿器疾患の1つであり、一般的でかつ困難な泌尿器状態であり続けている。尿道狭窄は、尿が膀胱から流れる通路を狭めるか、又は遮断する、尿道中又は尿道周囲の瘢痕化である。尿道狭窄は、女性よりも男性でよく起こる。
【００１２】
尿道狭窄の治療は、3つの主なカテゴリーに分けることができる; 非手術的処置、エンドウロロジー処置(endourological procedure)、及び開放外科的再建。
【００１３】
尿道狭窄を管理するための現在使用されている治療は、以下の通りである。
1. 開放外科的再建処置
2. 狭窄における切除及び端々吻合術; 及び
3. 移植片における尿道形成術
【００１４】
使用される処置に関係なく、尿道狭窄の再発率％は、約40.0％〜50.0％の程度まで高い。また、疾患性の外科的処置は、高い感染率を招くことが報告されている。
【００１５】
使用されている別の技術は、細胞性又は無細胞性足場を介して増殖及び送達される自己頬上皮細胞の適用である。
【００１６】
本発明者らは、驚くべきことに、対象に由来する頬上皮細胞が、単離され、増殖され、特徴付けられ、及び尿道狭窄などの泌尿器障害を治療するための足場を用いることなく同じ対象に膀胱鏡的に移植され得ることを見出した。
【００１７】
一実施形態によれば、本発明は、頬上皮細胞懸濁液の調製方法であって、頬粘膜組織を対象から採取するステップ、化学的解離剤で処理するステップ、栄養培地で洗浄するステップ、真皮から表皮を分離するステップ、細かくし、ろ過することによって、表皮から均一な頬上皮細胞懸濁液を調製するステップ、任意選択で、播種するステップ、酵素(複数可)を用いて細胞単層を採取するステップ、遠心分離し、上清を捨てるステップ、栄養培地と混合するステップ、頬上皮細胞懸濁液を分析するステップ、V字形1mlバイアル中に頬上皮細胞懸濁液を充填するステップ、及び任意選択で、同じ対象へ輸送するステップを含む、方法である。
【００１８】
対象は、成人対象である。
【００１９】
本発明の頬上皮細胞懸濁液は、任意選択で、対象の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植しながら、ゲルと混合される。
【００２０】
欠損は、尿道狭窄であってもよい。
【００２１】
対象から採取された頬粘膜組織は、約2.5×2.5cm2、好ましくは2×1.5cm2であってよく、最も好ましくは1×1.5cm2の口腔の頬粘膜組織が対象から採取される。
【００２２】
採取された頬粘膜組織は、トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン-EDTA、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、パパイン、及びパンクレアチンから選択される化学的解離剤で処理されてもよい。使用されるトリプシンの量は、溶液の体積あたり5〜0.1％、好ましくは2.5〜0.25％、最も好ましくは0.5％であってよい。組織サンプルをトリプシン溶液に供する時間は、頬粘膜組織のサイズに応じて変わってもよく、好ましくは組織層間の粘着性結合を弱めるのに十分な時間であってよく、最も好ましくは2〜8℃で16〜18時間であってもよい。
【００２３】
解離後、組織サンプルを、必要な増殖因子を有する、DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)、EMEM(イーグル最小必須培地)、F12、IMDM(イスコフ改変ダルベッコ培地)などから選択される栄養培地で洗浄する。組織サンプルを洗浄することは、処理されたサンプルを栄養培地中に部分的に又は完全にのいずれかで浸すことを含んでもよい。あるいは、及びより好ましくは、洗浄溶液は、サンプルの表面からあらゆる過剰なトリプシン溶液を除去する及び又は著しく希釈するのに十分な体積で組織サンプル上に滴下される。
【００２４】
この方法で使用される栄養培地は、希釈又は中和のいずれかによって、トリプシンの効果を著しく減少させ、より好ましくは除去することが可能であるべきである。この方法で使用される栄養培地は、好ましくは、(i)患者に適用されるまで細胞の生存性を維持することが可能であり、及び(ii)組織移植を受けている患者の領域に直接適用するのに適している、という特徴を有してもよい。溶液は、塩基性塩溶液から、より複雑な栄養溶液までいずれでもよい。好ましくは、栄養培地は、体液中に見られる物質に似た様々な塩を含有するべきである; この種の溶液は、しばしば生理食塩水と呼ばれる。pHをほぼ生理的レベルに維持するために、リン酸塩又は他の非毒性物質も溶液を緩衝し得る。特に好ましい適切な栄養培地は、DMEM溶液である。
【００２５】
組織を、洗浄した組織の表皮及び真皮の分離に供し、次いで、細かくし、ろ過して、表皮から上皮細胞懸濁液を得て、続いて任意選択で、T-25及び/又はT-75及び/又はT-150フラスコ中に播種し、細胞増殖を可能にする。細胞増殖は2週間行われ、これは一段階細胞培養生成物(P0)である。
【００２６】
細胞単層を、トリプシン-EDTA、コラゲナーゼなどから選択される酵素を用いて採取し、続いて、遠心分離し、上清を捨て、ペレットを、IMDM、EMEM、DMEMなどから選択される栄養培地と混合する。頬上皮細胞懸濁液を、外観、無菌性、マイコプラズマ、内毒素、細胞計数、細胞生存性、細胞純度試験、細胞特徴付け、及び核型決定分析について分析し、V字形1mlバイアル中に充填し、任意選択で、72時間以内に2〜8摂氏温度で同じ対象に輸送する。各1mlバイアルは、0.4mlのDMEM中に250万個以上の細胞(NLT250万個の細胞)を含む。1mlバイアルは、250万個の細胞を含む0.4mlの頬上皮細胞懸濁液を含む。典型的には、それぞれ0.4mlの頬上皮細胞懸濁液を含む2つのバイアルを、4cmサイズの狭窄又は欠損について使用する。それ故、0.2ml(125万個の細胞)が、1cmの欠損サイズについて適用される。
【００２７】
さらに、分析され、特徴付けされる細胞を含む頬上皮細胞懸濁液は、任意選択でゲルと共に、対象の尿道の欠損部位に膀胱鏡的に移植されてもよい。ゲルは、生体適合性送達システム、例えば、フィブリノゲン及び/又はトロンビン及び/又は熱可逆性ゲル化ポリマー(TGP)ゲル及び/又はキトサンなどの組み合わせから選択されてもよい。
【００２８】
本発明の別の実施形態によれば、成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法である。
【００２９】
成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植する方法は、頬上皮細胞懸濁液を調製するステップ、栄養培地と混合するステップ、頬上皮細胞懸濁液を分析するステップ、任意選択で、V字形バイアル中に頬上皮細胞懸濁液を充填し、輸送するステップ、続いて、任意選択でゲルと混合することによって、成人の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植するステップを含む。
【００３０】
頬上皮細胞懸濁液の調製方法は、頬粘膜組織を対象から採取するステップ、化学的解離剤で処理するステップ、栄養培地で洗浄するステップ、真皮から表皮を分離するステップ、細かくし、ろ過することによって、表皮から均一な頬上皮細胞懸濁液を調製するステップ、任意選択で、播種するステップ、酵素(複数可)を用いて細胞単層を採取するステップ、遠心分離し、上清を捨てるステップ、栄養培地と混合するステップ、頬上皮細胞懸濁液を分析するステップ、V字形1mlバイアル中に頬上皮細胞懸濁液を充填するステップ、及び任意選択で、同じ対象へ輸送するステップを含む。
【００３１】
対象から採取された頬粘膜組織は、約2.5×2.5cm2、好ましくは2×1.5cm2であってよく、最も好ましくは1×1.5cm2の口腔の頬粘膜組織が対象から採取される。
【００３２】
採取された頬粘膜組織は、トリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン-EDTA、プロナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、パパイン、及びパンクレアチンから選択される化学的解離剤で処理されてもよい。使用されるトリプシンの量は、溶液の体積あたり5〜0.1％、好ましくは2.5〜0.25％、最も好ましくは0.5％であってよい。組織サンプルをトリプシン溶液に供する時間は、頬粘膜組織のサイズに応じて変わってもよく、好ましくは組織層間の粘着性結合を弱めるのに十分な時間であってよく、最も好ましくは2〜8℃で16〜18時間であってもよい。解離後、組織サンプルを、必要な増殖因子を有する、DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地)、EMEM(イーグル最小必須培地)、F12、IMDM(イスコフ改変ダルベッコ培地)などから選択される栄養培地で洗浄する。組織サンプルを洗浄することは、処理されたサンプルを栄養溶液中に部分的に又は完全にのいずれかで浸すことを含んでもよい。あるいは、及びより好ましくは、洗浄溶液は、サンプルの表面からあらゆる過剰なトリプシン溶液を除去する及び又は著しく希釈するのに十分な体積で組織サンプル上に滴下される。
【００３３】
この方法で使用される栄養培地は、希釈又は中和のいずれかによって、トリプシンの効果を著しく減少させ、より好ましくは除去することが可能であるべきである。この方法で使用される栄養培地は、好ましくは、(i)患者に適用されるまで細胞の生存性を維持することが可能であり、及び(ii)組織移植を受けている患者の領域に直接適用するのに適している、という特徴を有してもよい。培地は、塩基性塩溶液から、より複雑な栄養溶液までいずれでもよい。好ましくは、栄養培地は、体液中に見られる物質に似た様々な塩を含有するべきである; この種の溶液は、しばしば生理食塩水と呼ばれる。pHをほぼ生理的レベルに維持するために、リン酸塩又は他の非毒性物質も溶液を緩衝し得る。特に好ましい適切な栄養培地は、DMEM溶液である。
【００３４】
組織を、洗浄した組織の表皮及び真皮の分離に供し、次いで、細かくし、ろ過して、表皮から上皮細胞懸濁液を得て、続いて任意選択で、T-25及び/又はT-75及び/又はT-150フラスコなどの中に播種し、細胞増殖を可能にする。細胞増殖は2週間行われ、これは一段階細胞培養生成物(P0)である。
【００３５】
細胞単層を、トリプシン-EDTA、コラゲナーゼなどから選択される酵素を用いて採取し、続いて、遠心分離し、上清を捨て、ペレットを、IMDM、EMEM、DMEMなどから選択される栄養培地と混合する。頬上皮細胞懸濁液を、外観、無菌性、マイコプラズマ、内毒素、細胞計数、細胞生存性、細胞純度試験、細胞特徴付け、及び核型決定分析について分析し、V字形1mlバイアル中に充填し、任意選択で、2〜8摂氏温度で同じ対象に輸送する。バイアルは、0.4mlのDMEM中に250万個以上の細胞(NLT250万個の細胞)を含む。1mlバイアルは、250万個の細胞を含む0.4mlの頬上皮細胞懸濁液を含む。典型的には、0.8mlの頬上皮細胞懸濁液を含む2つのバイアルを、4cmサイズの狭窄又は欠損について使用する。それ故、0.2ml(125万個の細胞)が、1cmの欠損サイズについて適用される。
【００３６】
本発明の頬上皮細胞懸濁液は、任意選択で、対象の尿道の欠損部位に頬上皮細胞懸濁液を膀胱鏡的に移植しながら、ゲルと混合される。ゲルは、生体適合性送達システム、例えば、フィブリノゲン及び/又はトロンビン及び/又は熱可逆性ゲル化ポリマー(TGP)ゲル及び/又はキトサンなどの組み合わせから選択されてもよい。
【００３７】
膀胱鏡的移植は、典型的には以下のように実施されてもよい。
【００３８】
(1) 内部膀胱鏡ナイフ(internal cystoscopic knife)を使用して、完全な尿道狭窄を軽減するために尿道切開術を実施する。主に12時の位置で。   
(2) スコープ(scope)を用いて、狭窄領域を可視化する。   
(3) 14フレンチのフォーリーカテーテルを尿道に通し、フォーリーカテーテルバルーンを膨張させる。   
(4) 6フレンチの尿道鏡を尿道に通し、狭窄領域を可視化する。   
(5) 6フレンチのスコープを尿道中に保ちながら、5フレンチの乳児栄養チューブを通す。  
(6) このとき、膀胱鏡及びカテーテルが、乳児栄養チューブと共に、尿道中に存在する。
(7) 同じ膀胱鏡検査で、狭窄領域を可視化し、また、乳児栄養チューブの先端を可視化して、膀胱側の狭窄の開始において狭窄領域に向ける。   
(8) フォーリーカテーテルの最小牽引力を与え、生理食塩水の流れを止める。   
(9) 乳児栄養チューブを通して生理食塩水を吸引することにより乾燥させるべき狭窄領域。   
(10) 頬上皮細胞懸濁液を、生体適合性送達システム、例えば、フィブリノゲン及び/又はトロンビン及び/又は熱可逆性ゲル化ポリマー(TGP)ゲル及び/又はキトサンなどの組み合わせの助けを借りて、狭窄領域で乳児栄養チューブを通して、狭窄領域に移植する。乳児栄養チューブを、狭窄のもう一方の端まで少し引き抜く。   
(11) 尿道の欠損部位における移植のための頬上皮細胞懸濁液の最終調製方法であって、
a. 1mlのバイアル1内容物を吸引し、バイアル2内容物と混合し、内容物をシリンジAへ吸引するステップ;
b. 1mlのバイアル1内容物を吸引し、バイアル3内容物と混合するステップ;
c. バイアル3から0.2mlを吸い込み、空のバイアル4に注入するステップ;
d. 0.4ml+0.4ml(頬上皮細胞懸濁液のバイアル(複数可)由来)を吸い込み、バイアル4へ注入し、内容物をシリンジBへ吸引するステップ;
e. シリンジA及びBをアプリケーター/ホルダー上に置くステップ;
f. ブラント針を含むY字形のカニューレを2つのシリンジへ固定するステップ; 及び
g. 膀胱鏡検査を使用することによって対象の尿道の欠損部位に最終2mlの最終生成物を移植するステップ
を含む、方法。   
(12) 生体適合性送達システム、例えば、フィブリノゲン及び/又はトロンビン及び/又は熱可逆性ゲル化ポリマー(TGP)ゲル及び/又はキトサンなどの組み合わせは、フォーリーカテーテルによって囲まれ、円筒形で狭窄領域を覆う。   
(13) 膀胱鏡及び乳児用チューブを取り除き、フォーリーカテーテルを尿道中に保持する。   
(14) 陰茎を垂直位置に保持して6〜7分待ち、フォーリーカテーテルで最小牽引力を維持する。   
(15) 陰茎を絆創膏で腹部に固定し、フォーリーカテーテルも固定し、そのため、フォーリーカテーテルはぐらつかず、動きはない。   
(16) 尿バッグをフォーリーカテーテルに取り付ける。
【実施例】
【００３９】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、本発明による好ましい実施形態を説明する。
【００４０】
実施例１
口腔粘膜組織1×1.5cm2を、尿道狭窄を有する成人患者の頬の内側の領域から採取する。採取した組織を、カルシウム及びマグネシウムイオンを含まないリン酸緩衝生理食塩水中の0.5％酵素トリプシン中に2〜8℃で16〜18時間置く。組織サンプルを溶液から取り出し、DMEM溶液で洗浄する。組織サンプルの細胞層をピンセットで分離し、細かくし、ろ過して、上皮細胞の均一な細胞懸濁液を得る。細胞をDMEM培地中に懸濁し、T-25フラスコ中に播種する。
【００４１】
DMEM培地を1日おきに交換し、細胞コンフルエンシーが約80〜90％である時に、細胞単層を酵素トリプシン-EDTAを用いて採取する。細胞懸濁液を遠心分離に供し、上清を捨てる。ペレットを栄養培地と混合する。狭窄部位への輸送のために、適切な数の頬上皮細胞懸濁液を、透明なV字形1mlバイアル中に充填する。
【００４２】
外観、無菌性、マイコプラズマ、内毒素、細胞計数、細胞生存性、細胞純度試験、細胞特徴付け、及び核型決定分析などの品質管理試験(複数可)を、以下に言及するように実施する。
【００４３】
a) 外観
標準:
混合した沈殿した淡白色の頬上皮細胞懸濁液を含有する、赤色培養培地(DMEM)。この内容物は、振ると濁る。
【００４４】
b) 無菌性試験
標準:
インド薬局方の生物学的試験方法のセクション2.2.11の無菌性試験によれば、微生物増殖の証拠が見出されない場合、検査中の調製物は、無菌性の試験に適合する。
【００４５】
c) マイコプラズマ試験(PCR法)
標準:
言及される試験に従って試験した場合、マイコプラズマは検出されないものとする。
【００４６】
d) 内毒素試験
標準:
生物製剤標準、及び2007年のインド薬局方の生物学的方法のセクション2.2.3にある細菌性内毒素試験方法の方法Dによれば、試験中に3EU/mL未満の内毒素があるべきである。
【００４７】
e) 細胞計数試験
標準:
試験した場合、1バイアルあたり≧2,500,000個の細胞が含まれるものとする。
【００４８】
f) 細胞生存性試験
標準:
試験した場合、生細胞は、全細胞数の80％超であるものとする。
【００４９】
g) 細胞純度試験
標準:
試験した場合、総アルブミン含有量は、1.0g/dL未満であるものとする。
【００５０】
h) 細胞特徴付け試験:
標準:
試験した場合、CD36+/CK5+/CK14+抗体に対する陽性染色細胞の発現は、80％超であるものとする。
試験した場合、CD90-抗体に対する陰性染色細胞の発現は、ごくわずかであるものとする。
【００５１】
i) 細胞の核型決定
標準:
カリオグラム画像化及び分析において染色体異常があるべきではない。
【００５２】
実施例２: 10人の異なる対象からの頬上皮細胞懸濁液の分析データ
【００５３】
【表１】
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【００５４】
他の試験
・微小無菌性(micro sterility): 全てのサンプルにおいて陰性
・マイコプラズマ: 全てのサンプルにおいて陰性
・FACS及びRT-PCRによる細胞特徴付け(CK14+発現): 高レベルのCK14+発現の実証は、頬上皮細胞の高い効力(潜在力)を示す。
・RT-PCRによる細胞特徴付け(CD90-発現): 全てのサンプルにおいてごくわずか
・核型分析: 全てのサンプルにおいて染色体異常なし
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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