(57)【要約】式（I）2019507753.tif 000054のセレンテラジン類似体、前記類似体の製造方法、前記類似体を含むキット、及びルシフェラーゼをベースとするアッセイにおいて発光を検出するための前記化合物の使用方法を開示している。【選択図】なし
2019507753.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
2019507753.tif 000039
または互変異性体、またはその薬学的に許容可能な塩であって、式中、
Ｒ1は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、二環式アリール、三環式アリール、ヘテロアリール、二環式ヘテロアリール、三環式ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、ヘテロアリールカルボニル、またはホスホネートであり、
ｑは、０〜２であり、
前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、二環式アリール、三環式アリール、ヘテロアリール、二環式ヘテロアリール、三環式ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、ヘテロアリールカルボニル及びホスホネートは、それぞれの存在において、独立して、置換されているかまたは非置換であり、
ただし、ｑが０の場合、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ5アルキルまたは
2019507753.tif 000040
ではなく、ここでＲaは、ＮＨ2、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ1〜Ｃ7アルキル、またはＣＯ2Ｃ1〜Ｃ7アルキルであり、
ｑが１の場合、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、
2019507753.tif 000041
ではなく、ここでＲcは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ1〜Ｃ7アルキル、ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｃ1〜Ｃ7アルキルであり、Ｘは、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、ＮＣＨ3またはＮＣＨ2ＣＨ3であり、Ｚは、ＣＨまたはＮであり、
ｑが２の場合、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ3アルキルではなく、かつ
前記式（Ｉ）の化合物は、８−ベンジル−２−（（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オンではない、
前記化合物、または互変異性体、またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
Ｒ1が、フェニル、ピリジニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾトリアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、チエノピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、チエノチエニル、チエニル、ジエチルホスホネート、イソキサゾリル、イミダゾチアゾリル、１，３−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオニル、フラニル、ピラゾリル、ベンゾチエニル、Ｃ10〜Ｃ12アルキル、ベンゾチアゾリル、シンナミル、ジベンゾフラニル、クロメニルまたはナフタレニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
８−ベンジル−２−（４−フルオロベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−メトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（４−フルオロ−３−メトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−ヒドロキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（４−フルオロ−３−ヒドロキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−フルオロ−４−メトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（４−フルオロ−２−メトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（４−メトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
ｔｅｒｔ−ブチル（３−（（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）フェニル）カルバメート、
８−ベンジル−２−（（５−メトキシチオフェン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（３−アミノベンジル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（ナフタレン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（（２Ｈ−クロメン−３−イル）メチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（１，３−ジフェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラン−４−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−シンナミル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（（３−アセチルベンゾ［ｄ］チアゾール−２（３Ｈ）−イリデン）メチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
ｔｅｒｔ−ブチル（４−（（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）フェニル）カルバメート、
２−（４−アミノベンジル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（４−（アリルオキシ）−３−メトキシベンジル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−（（４−メチル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）チオ）フラン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−（（５−（ピリジン−２−イル）チオフェン−２−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イルメチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−ドデシル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルメチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−（ピリジン−４−イルメチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−シクロヘキシルチオフェン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（［２，２’−ビチオフェン］−５−イルメチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−イソブチルチオフェン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−（１−メチル−５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）チオフェン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−（（５−（トリフルオロメチル）フラン−２−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
４−（（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）安息香酸、
８−ベンジル−２−（（５−（メトキシメチル）フラン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（ペルフルオロフェニル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（１−メチル−３−（チオフェン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３，５−ビス（トリフルオロメチル）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−クロロ−１−メチル−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−メチルフラン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
３−（（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）安息香酸、
８−ベンジル−２−（（５−（モルホリノメチル）フラン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（３−（アミノメチル）ベンジル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
５−（（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−１，３−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン、
８−ベンジル−２−（イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−６−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
Ｎ−（３−（（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）フェニル）メタンスルホンアミド、
８−ベンジル−２−（（３，５−ジメチルイソキサゾール−４−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−（ピリジン−３−イルメチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
ジエチル（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）ホスホネート、
８−ベンジル−２−（４−メトキシ−３−（メトキシメチル）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−（ジメチルアミノ）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−（メトキシメチル）チオフェン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−（メトキシメチル）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−（ヒドロキシメチル）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（２−メトキシピリミジン−５−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（３，４−ジメチルチエノ［２，３−ｂ］チオフェン−２−イル）メチル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−（ピラジン−２−イルメチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−（（２−（プロピルチオ）ピリミジン−５−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（４−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（（１，２，３−チアジアゾール−５−イル）メチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール−５−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３，４−ジメトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−（メチルチオ）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルメチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−（（ジメチルアミノ）メチル）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−エトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−メチルピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−（２，４，６−トリフルオロベンジル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（２，６−ジメトキシピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−クロロ−４−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−フルオロ−２−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（２−フルオロ−６−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（２，６−ジフルオロピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−ブロモピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−クロロピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（２−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（２，６−ジクロロピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−スチリル−１，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（２Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−（２−メトキシエトキシ）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、及び
３−（（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）ベンゾニトリル、
またはその薬学的に許容可能な塩
からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物を含む、キット。
【請求項５】
ルシフェラーゼをさらに含む、請求項４に記載のキット。
【請求項６】
緩衝剤試薬をさらに含む、請求項４に記載のキット。
【請求項７】
試料内の発光を検出する方法であって、
試料と請求項１に記載の化合物とを接触させること、
前記試料中に存在しない場合に、前記試料とセレンテラジンを利用するルシフェラーゼとを接触させること、及び
発光を検出すること、
を含む、前記方法。
【請求項８】
前記試料が生細胞を含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記試料がセレンテラジンを利用するルシフェラーゼを含有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
トランスジェニック動物内での発光を検出する方法であって、
請求項１に記載の化合物をトランスジェニック動物に投与すること、及び
発光を検出すること、
を含み、前記トランスジェニック動物がセレンテラジンを利用するルシフェラーゼを発現する、前記方法。
【請求項１１】
式（Ｉ）の化合物
2019507753.tif 000042
の調製方法であって、式中、Ｒ1は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、二環式アリール、三環式アリール、ヘテロアリール、二環式ヘテロアリール、三環式ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、ヘテロアリールカルボニル、またはホスホネートであり、ｑは、０〜２であり、
前記方法が、化合物（ｖｉ）
2019507753.tif 000043
を式（Ｉ）の化合物へ転換することを含む、前記方法。
【請求項１２】
化合物（ｖｉ）を式（Ｉ）の化合物へ転換することが、ヒドリド還元剤による還元を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒドリド還元剤が、水素化ホウ素ナトリウムである、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
化合物（Ａ）
2019507753.tif 000044
を溶媒の存在下で塩基及びＲ1−Ｃ（Ｏ）Ｈと反応させて、化合物（ｖｉ）を生成することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記塩基が、１，１，３，３−テトラメチルグアニジンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記溶媒がメタノールである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
化合物（Ｂ）
2019507753.tif 000045
を溶媒の存在下で塩基及びＲ1−Ｃ（Ｏ）Ｈと反応させて、化合物（ｖｉ）を生成することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記塩基が、１，１，３，３−テトラメチルグアニジンである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶媒がメタノールである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
化合物（ｉｘ）
2019507753.tif 000046
を無水酢酸及び塩基と反応させて、化合物（ｖｉ）を生成することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
化合物（ｖｉｉ）
2019507753.tif 000047
をトリフルオロ酢酸と反応させて、化合物（ｉｘ）を生成することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
化合物（Ｃ）
2019507753.tif 000048
を溶媒の存在下で塩基及びＲ1−Ｃ（Ｏ）Ｈと反応させて、化合物（ｖｉｉ）を生成することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記塩基が、１，１，３，３−テトラメチルグアニジンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記溶媒がメタノールである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
式（Ｉ）の化合物
2019507753.tif 000049
の調製方法であって、式中、Ｒ1は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、二環式アリール、三環式アリール、ヘテロアリール、二環式ヘテロアリール、三環式ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、ヘテロアリールカルボニル、またはホスホネートであり、ｑは、０〜２であり、
前記方法が、化合物（ｘｉ）
2019507753.tif 000050
を式（Ｉ）の化合物へ転換することを含む、前記方法。
【請求項２６】
化合物（ｘｉ）を式（Ｉ）の化合物へ転換することが、化合物（ｘｉ）とカルボニルジイミダゾールとの反応を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
化合物（ｖｉｉｉ）
2019507753.tif 000051
をトリフルオロ酢酸と反応させて、化合物（ｘｉ）を生成することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
化合物（ｖｉｉ）
2019507753.tif 000052
を金属触媒の存在下で水素添加して、化合物（ｖｉｉｉ）を生成することをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記金属触媒がロジウムを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
化合物（Ｃ）
2019507753.tif 000053
を溶媒の存在下で塩基及びＲ1−Ｃ（Ｏ）Ｈと反応させて、化合物（ｖｉｉ）を生成することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記塩基が、１，１，３，３−テトラメチルグアニジンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記溶媒がメタノールである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
Ｒ1が、フェニル、ピリジニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾトリアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、チエノピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、チエノチエニル、チエニル、ジエチルホスホネート、イソキサゾリル、イミダゾチアゾリル、１，３−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオニル、フラニル、ピラゾリル、ベンゾチエニル、Ｃ10〜Ｃ12アルキル、ベンゾチアゾリル、シンナミル、ジベンゾフラニル、クロメニルまたはナフタレニルである、請求項１１または請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年２月１５日出願の米国仮特許出願番号第６２／２９５，３６３号の利益を享受し、この内容を全て本明細書に参照により組み込む。
【０００２】
技術分野
本開示は、セレンテラジン類似体、セレンテラジン類似体の作成方法、及びルシフェラーゼをベースとするアッセイにおけるセレンテラジン類似体の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
生物発光アッセイは、細胞生理学の研究、特に遺伝子発現に関するプロセスにおいて広く使用されている。具体的には、ルシフェラーゼレポーター酵素は、この技術分野では極めて有用なツールであり、これまでは、生物発光アッセイに有用であり得る小さくかつ環境に反応しないルシフェラーゼを得るための集中的なタンパク質操作が行われてきている。全細胞バイオセンサ−測定、ハイスル−プットスクリーニングによる創薬、及びｉｎ  ｖｉｖｏイメ−ジングを可能にする多数の有効なルシフェラーゼレポーターが存在し、それはさらに、生細胞内でのタンパク質−タンパク質相互作用、アポトーシス及び細胞生存度の研究をも可能にする。基質としてセレンテラジン及びセレンテラジン類似体を使用するルシフェラーゼは、その輝度及び許容性に起因して全細胞応用の中で最も広く使用されている系である。
【発明の概要】
【０００４】
多数の既知のセレンテラジン類似体には欠陥があり、それが、ルシフェラーゼ基質としてのその有効性及びルシフェラーゼをベースとする発光アッセイにおける有用性を制限している。前記欠陥としては、細胞毒性、光感受性、熱力学的不安定性、水溶解度の低さ、及び細胞透過性の低さが挙げられる。したがって、その性質及び合成方法が改良されたセレンテラジン類似体が必要とされている。
【０００５】
一態様では、式（Ｉ）：
2019507753.tif 000003
の化合物もしくは互変異性体、またはその薬学的に許容可能な塩が開示されており、式中、Ｒ1は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、二環式アリール、三環式アリール、ヘテロアリール、二環式ヘテロアリール、三環式ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、ヘテロアリールカルボニル、またはホスホネートであり、そしてｑは、０〜２であって、式中、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、二環式アリール、三環式アリール、ヘテロアリール、二環式ヘテロアリール、三環式ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、ヘテロアリールカルボニル及びホスホネートは、それぞれの存在において、独立して、置換されているかまたは非置換である。
【０００６】
さらに、前記化合物の製造方法、前記化合物を含むキット、及びルシフェラーゼをベースとする発光アッセイにおいて前記化合物をルシフェラーゼ基質として使用する方法も開示されている。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】セレンテラジンと比較した、ＨＥＫ２９３細胞中の典型的な化合物の細胞生物発光活性を表すグラフである。
【図２】セレンテラジンとの相対的なシグナル強度による、式（Ｉ）の化合物の等級序列を表すグラフである。
【図３】ＨｅＬａ細胞中の典型的な化合物を用いた細胞生存率アッセイの結果を示すグラフである。
【図４】ＨｅＬａ細胞中の典型的な化合物を用いた細胞生存率アッセイの結果を示すグラフである。
【図５】ＨＥＫ２９３細胞中の典型的な化合物を用いた細胞生存率アッセイの結果を示すグラフである。
【図６】ＨＥＫ２９３細胞中の典型的な化合物を用いた細胞生存率アッセイの結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明
本明細書には、セレンテラジン類似体が開示されている。セレンテラジン類似体は、式（Ｉ）の化合物であり得、しかも発光するのにセレンテラジンを利用するタンパク質の有用な基質であり得、刺胞物類（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）、クラゲ（例えば、Ａｅｑｕｏｒｅａクラゲ由来のエクオリン）及び十脚類ルシフェラーゼ（例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓのルシフェラーゼ複合体）などの様々な海洋生物中に含まれているルシフェラーゼ及び発光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。セレンテラジンと比較して、式（Ｉ）の化合物は、改善された水溶解度、改善された安定性、改善された細胞透過性、細胞との高い生体適合性、低減された自家生物発光、及び低い毒性のうち少なくとも１つを有している可能性がある。
【０００９】
さらに、本明細書には、セレンテラジン類似体［式（Ｉ）の化合物］の製造方法も開示されている。セレンテラジン類似体の調製を目的とした、ロバストで万能な手法が３つ開示されている。これらの方法は、既存の合成方法を用いて調整できなかった類似体の調製を可能にする。記載されている方法論は、Ｒ1位にある様々な置換基を利用できるようにし、また、入手が容易な多様な出発物質を利用して穏やかな条件下で実行可能である。開示されている合成方法論は、予想外なことに、セレンテラジン類似体をベースとした生物発光法において様々な新規応用及び進展を提供する。
【００１０】
１．定義
別段の定義がなければ、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、当業者に一般に理解されているものと同じ意味を持つ。矛盾する場合は、定義を含む、本明細書に従う。好ましい方法及び物質を以下に説明するが、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法及び物質も本発明の実施または試験に用いることができる。本明細書に記載の刊行物、特許出願書類、特許及び他の参考文献はいずれもその全体が参照により組み込まれる。本明細書に開示される物質、方法及び実施例は、単なる例示であって、限定を意図とするものではない。
【００１１】
本明細書で使用するとき、用語「含む」、「包含する」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｈａｓ（有する）」、「可能である」、「含有する」、及びそれらの変形は、制限的ではない移行句、用語または単語を意図とするものであって、付加的な作用または構造の可能性を除外するものではない。単数形（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数の意味を包含する。本開示はさらに、明確に記載されていようとなかろうと、本明細書に示された実施形態または構成要素を「含む」、それ「からなる」及びそれ「から本質的になる」他の実施形態も企図する。
【００１２】
数量とともに用いられる修飾語句「約」は、言及される値を包含し、そして文脈によって決定される意味を有する（例えば、それは、特定の測定数値に関して少なくともある程度の誤差を包含する）。修飾語句「約」はさらに、２つの終点の絶対値で定義された範囲をも開示すると考えられるべきである。例えば、「約２〜約４まで」という表現は、「２〜４まで」の範囲も開示する。用語「約」は、示された数の±１０％を指す可能性がある。例えば、「約１０％」は、９％〜１１％の範囲を示す可能性があり、また、「約１」は、０．９〜１．１を表す可能性がある。「約」のもう一つの意味は、四捨五入のように文脈から明らかな場合もあり、例えば、「約１」は０．５〜１．４を表す場合もある。
【００１３】
具体的な官能基及び化学用語の定義について、以下にさらに詳細に説明する。この開示のために、化学元素は、元素周期律表（ＣＡＳバ−ジョン、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，７５th  Ｅｄ．の扉）に従って確認され、また、具体的な官能基は通常、そこに記載されたものと定義される。さらに、有機化学の一般的原理ならびに具体的な官能部分及び反応性は、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ（１９９９）、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｈ  Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５th  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）、Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ，Ｓｏｍｅ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３rd  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ（１９８７）に記載されており、その内容全てが参照により本明細書に組み込まれる。
【００１４】
本明細書で使用するとき、用語「アルコキシ」は、酸素原子によって親分子部分に付加された、本明細書で定義されたとおりのアルキル基を指す。アルコキシの代表例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、２−プロポキシ、ブトキシ及びｔｅｒｔ−ブトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
本明細書で使用するとき、用語「アルキル」は、炭素原子１〜１０個を含有する直鎖または分枝状の飽和炭化水素鎖を意味する。用語「低級アルキル」または「Ｃ1〜Ｃ6アルキル」は、炭素原子１〜６個を含有する直鎖または分枝状の炭化水素鎖を意味する。用語「Ｃ1〜Ｃ3アルキル」は、炭素原子１〜３個を含有する直鎖または分枝状の炭化水素鎖を意味する。アルキルの代表例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、３−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，３−ジメチルペンチル、ｎ−へプチル、ｎ−オクチル、ｎ−ノニル及びｎ−デシルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
本明細書で使用するとき、用語「アルケニル」は、炭素原子２〜１０個を含有し、炭素−炭素二重結合を少なくとも１つ有する炭化水素鎖を意味する。アルケニル基は、置換されていてもまたは非置換であってもよい。例えば、アルケニル基は、フェニルなどのアリール基で置換されていてもよい。
【００１７】
本明細書で使用するとき、用語「アルキニル」は、炭素原子２〜１０個を含有し、炭素−炭素三重結合を少なくとも１つ有する炭化水素鎖を意味する。アルキニル基は、置換されていてもまたは非置換であってもよい。例えば、アルキニル基は、フェニルなどのアリール基で置換されていてもよい。
【００１８】
本明細書で使用するとき、用語「アルコキシアルキル」は、本明細書で定義されたとおりのアルキル基によって親分子部分に付加された、本明細書で定義されたとおりのアルコキシ基を指す。
【００１９】
本明細書で使用するとき、用語「アルキレン」は、炭素原子１〜１０個、例えば炭素原子２〜５個からなる直鎖または分枝状の炭化水素鎖由来の二価基を指す。アルキレンの代表例としては、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、及び−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
本明細書で使用するとき、用語「アリール」は、フェニル基、または二環式アリール融合環系もしくは三環式アリール融合環系を指す。二環式の融合環系は、親分子部分に付加されかつフェニル基と融合したフェニル基で例示される。三環式の融合環系は、親分子部分に付加されかつ２個の他のフェニル基と融合したフェニル基で例示される。二環式アリールの代表例としては、ナフチルが挙げられるが、これに限定されない。三環式アリールの代表例としては、アントラセニルが挙げられるが、これに限定されない。単環アリール、二環式アリール、及び三環式アリールは、環に含まれる任意の炭素原子によって親分子部分と結合しており、非置換であっても置換されていてもよい。
【００２１】
本明細書で使用するとき、用語「シクロアルキル」は、炭素原子３〜１０個、ヘテロ原子０個及び二重結合０個を含有する炭素環系を指す。シクロアルキルの代表例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル及びシクロデシルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書で使用するとき、用語「シクロアルケニル」は、炭素−炭素二重結合を少なくとも１つ含有しかつ好ましくは環当たり５〜１０個の炭素原子を有する非芳香族単環系または多環式環系を意味する。単環シクロアルケニルの代表例としては、シクロペンテニル、シクロヘキセニルまたはシクロヘプテニルが挙げられる。
【００２３】
本明細書で使用するとき、用語「フルオロアルキル」は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個の水素原子がフッ素で置換された、本明細書で定義されたとおりのアルキル基を意味する。フルオロアルキルの代表例としては、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、ペンタフルオロエチル、及び３，３，３−トリフルオロプロピルなどのトリフルオロプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
本明細書で使用するとき、用語「アルコキシフルオロアルキル」は、本明細書で定義されたとおりのフルオロアルキル基によって親分子部分に付加された、本明細書で定義されたとおりのアルコキシ基を指す。
【００２５】
本明細書で使用するとき、用語「フルオロアルコキシ」は、酸素原子によって親分子部分に付加された、少なくとも１つの、本明細書で定義されたとおりのフルオロアルキル基を意味する。フルオロアルキロキシの代表例としては、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ及び２，２，２−トリフルオロエトキシが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
本明細書で使用するとき、用語「ハロゲン」または「ハロ」は、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＦを意味する。
【００２７】
本明細書で使用するとき、用語「ハロアルキル」は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個の水素原子がハロゲンで置換された、本明細書で定義されたとおりのアルキル基を意味する。
【００２８】
本明細書で使用するとき、用語「ハロアルコキシ」は、酸素原子によって親分子部分に付加された、少なくとも１つの、本明細書で定義されたとおりのハロアルキル基を意味する。
【００２９】
本明細書で使用するとき、用語「ヘテロアルキル」は、１つ以上の炭素原子がＳ、Ｓｉ、Ｏ、Ｐ及びＮから選択されるヘテロ原子で置換された、本明細書で定義されたとおりのアルキル基を意味する。ヘテロ原子は酸化されていてもよい。ヘテロアルキルの代表例としては、アルキルエ−テル、二級及び三級アルキルアミン、アミド、ならびにアルキルスルフィドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
本明細書で使用するとき、用語「ヘテロアリール」は、芳香族単環系または芳香族二環式環系もしくは芳香族三環式環系を指す。芳香族単環は、Ｎ、Ｏ及びＳからなる群から独立して選択される少なくとも１個のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ及びＮから独立して選択される１個、２個、３個または４個のヘテロ原子）を含有する５員環または６員環である。５員の芳香族単環は２つの二重結合を有し、また、６員の芳香族単環は３つの二重結合を有する。二環式ヘテロアリール基は、親分子部分に付加され、かつ本明細書で定義されたとおりの、単環のシクロアルキル基、本明細書で定義されたとおりの、単環のアリール基、本明細書で定義されたとおりの、単環のヘテロアリール基、または本明細書で定義されたとおりの、単環の複素環と融合した単環ヘテロアリール環で例示される。三環式ヘテロアリール基は、親分子部分に付加され、かつ本明細書で定義されたとおりの、単環のシクロアルキル基、本明細書で定義されたとおりの、単環のアリール基、本明細書で定義されたとおりの、単環のヘテロアリール基、または本明細書で定義されたとおりの、単環の複素環のうちの二つと融合した単環ヘテロアリール環で例示される。単環ヘテロアリールの代表例としては、ピリジニル（ピリジン−２−イル、ピリジン−３−イル、ピリジン−４−イルを包含する）、ピリミジニル、ピラジニル、チエニル、フリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イソキサゾリル、ピラゾリル、及び２−オキソ−１，２−ジヒドロピリジニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式ヘテロアリールの代表例としては、クロメニル、ベンゾチエニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾトリアゾリル、キノリニル、チエノピロリル、チエノチエニル、イミダゾチアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、インドリル、キノリニル、イミダゾピリジン、ベンゾオキサジアゾリル、及びベンゾピラゾリルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式ヘテロアリールの代表例としては、ジベンゾフラニル及びジベンゾチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。単環、二環式及び三環式のヘテロアリールは、環に含まれる任意の炭素原子または任意の窒素原子によって親分子部分と結合しており、非置換であっても置換されていてもよい。
【００３１】
本明細書で使用するとき、用語「複素環」または「複素環式」は、単環式複素環、二環式複素環または三環式複素環を意味する。単環式複素環は、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から独立して選択されるヘテロ原子を少なくとも１個を含有する３員環、４員環、５員環、６員環、７員環または８員環である。３員環または４員環は、二重結合を０個または１個と、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択されるヘテロ原子１個とを含有する。５員環は、二重結合を０個または１個と、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択されるヘテロ原子１個、２個または３個とを含有する。６員環は、二重結合を０個、１個または２個と、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択されるヘテロ原子１個、２個または３個とを含有する。７員環及び８員環は、二重結合を０個、1個、２個または３個と、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択されるヘテロ原子１個、２個または３個とを含有する。単環式複素環の代表例としては、アゼチジニル、アゼパニル、アジリジニル、ジアゼパニル、１，３−ジオキサニル、１，３−ジオキソラニル、１，３−ジチオラニル、１，３−ジチアニル、１，３−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ、３Ｈ）−ジオン、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリニル、イソチアゾリジニル、イソキサゾリニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、オキサジアゾリニル、オキサジアゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキセタニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピラニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピロリニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロチエニル、チアジアゾリニル、チアジアゾリジニル、１，２−チアジナニル、１，３−チアジアナニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキシドチオモルホリニル（チオモルホリンスルホン）、チオピラニル及びトリチアニルが挙げられるが、これらに限定されない。二環式複素環は、フェニル基と融合した単環式複素環、または単環シクロアルキルと融合した単環式複素環、または単環シクロアルケニルと融合した単環式複素環、または単環式複素環と融合した単環式複素環、またはスピロ複素環基、または架橋した単環式複素環系であって、その環の２個の非隣接原子が、炭素原子１個、２個、３個または４個からなるアルキレン架橋または炭素原子２個、３個または４個からなるアルケニレン架橋によって結合したもの、である。二環式複素環の代表例としては、ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニル、クロマニル、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、２，３−ジヒドロベンゾチエニル、２，３−ジヒドロイソキノリン、２−アザスピロ［３．３］ヘプタン−２−イル、アザビシクロ［２．２．１］ヘプチル（２−アザビシクロ［２．２．１］ヘプタ−２−イルを含む）、２，３−ジヒドロ−１Ｈ−インドリル、イソインドリニル、オクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロリル、オクタヒドロピロロピリジニル及びテトラヒドロイソキノリニルが挙げられるが、これらに限定されない。三環式複素環は、フェニル基と融合した二環式複素環、または単環シクロアルキルと融合した二環式複素環、または単環シクロアルケニルと融合した二環式複素環、または単��式複素環と融合した二環式複素環、または二環式複素環であって、二環式環の２個の非隣接原子が炭素原子１個、２個、３個または４個からなるアルキレン架橋または炭素原子２個、３個または４個からなるアルケニレン架橋によって結合したもの、で例示される。三環式複素環の例としては、オクタヒドロ−２，５−エポキシペンタレン、ヘキサヒドロ−２Ｈ−２，５−メタノシクロペンタ［ｂ］フラン、ヘキサヒドロ−１Ｈ−１，４−メタノシクロペンタ［ｃ］フラン、アザ−アダマンタン（１−アザトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）、及びオキサ−アダマンタン（２−オキサトリシクロ［３．３．１．１3,7］デカン）が挙げられるが、これらに限定されない。単環、二環式及び三環式の複素環は、その環に含まれる任意の炭素原子または任意の窒素原子によって親分子部分と結合しており、非置換であっても置換されていてもよい。
【００３２】
本明細書で使用するとき、用語「ヒドロキシル」は、−ＯＨ基を意味する。
【００３３】
場合によっては、ヒドロカルビル置換基（例えば、アルキルまたはシクロアルキル）中の炭素原子の数は、前に付ける「Ｃx〜Ｃy−」で示され、式中、ｘは、置換基中の炭素原子の最小値であり、また、ｙは、置換基中の炭素原子の最大値である。そのため、例えば「Ｃ1〜Ｃ3−アルキル」は、１個〜３個の炭素原子を含有するアルキル置換基を指す。
【００３４】
用語「置換基」は、アリール基、ヘテロアリール基、フェニル基またはピリジニル基に、前記基の任意の原子位置で「置換された」基を指す。任意の原子は置換されていてもよい。
【００３５】
用語「置換された」とは、１つ以上の非水素置換基でさらに置換され得る基を指す。置換基としては、ハロゲン、＝Ｏ、＝Ｓ、シアノ、ニトロ、フルオロアルキル、アルコキシフルオロアルキル、フルオロアルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、−ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート及びアシルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本明細書に記載の化合物において、その基及び置換基は、原子及び置換基の許容される原子価に従って選択されてよく、その選択及び置換が結果として安定な化合物であって、例えば、転位、環化、脱離などによって自発的に変態しないものをもたらす。
【００３７】
本明細書中の数値範囲の記述において、その範囲中に介在する数がそれぞれ同じ精度で明確に企図される。例えば、６〜９の範囲の場合、数７及び８も６及び９に加えて企図され、また、６．０〜７．０の範囲の場合、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９及び７．０も明確に企図される。
【００３８】
２．化合物
式（Ｉ）
2019507753.tif 000004
の化合物もしくは互変異性体、またはその薬学的に許容可能な塩が開示されており、式中、Ｒ1は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、二環式アリール、三環式アリール、ヘテロアリール、二環式ヘテロアリール、三環式ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、ヘテロアリールカルボニル、またはホスホネートであり、そしてｑは、０〜２であって、式中、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、二環式アリール、三環式アリール、ヘテロアリール、二環式ヘテロアリール、三環式ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、ヘテロアリールカルボニル及びホスホネートは、それぞれの存在において、独立して、置換されているかまたは非置換である。
【００３９】
特定の実施形態において、Ｒ1は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、二環式アリール、三環式アリール、ヘテロアリール、二環式ヘテロアリール、三環式ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、ヘテロアリールカルボニル、またはホスホネートであり、ｑは、０〜２であって、式中、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、二環式アリール、三環式アリール、ヘテロアリール、二環式ヘテロアリール、三環式ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、ヘテロアリールカルボニル及びホスホネートは、それぞれの存在において、ハロゲン、＝Ｏ、＝Ｓ、シアノ、カルバメート、ニトロ、フルオロアルキル、アルコキシフルオロアルキル、フルオロアルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アリルオキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、−ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート、シリル、置換シリルオキシ、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ、アルキルスルファニル、スルファニル、チオトリアゾリル及びアシルからなる群から独立して選択される１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個の官能基で独立して置換されているかまたは非置換である。
【００４０】
特定の実施形態において、Ｒ1は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、二環式アリール、三環式アリール、ヘテロアリール、二環式ヘテロアリール、三環式ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、ヘテロアリールカルボニル、またはホスホネートであり、そしてｑは、０〜２であって、式中、前記アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、二環式アリール、三環式アリール、ヘテロアリール、二環式ヘテロアリール、三環式ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、ヘテロアリールカルボニル及びホスホネートは、それぞれの存在において、独立して、置換されているかまたは非置換であり、
ここで、ｑが０の場合、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ5アルキルまたは
2019507753.tif 000005
ではなく、式中、Ｒaは、ＮＨ2、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ1−Ｃ7−アルキル、またはＣＯ2Ｃ1−Ｃ7−アルキルであり、
ここで、ｑが１の場合、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、
2019507753.tif 000006
ではなく、式中、Ｒcは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ1−Ｃ7−アルキル、ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｃ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｘは、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、ＮＣＨ3またはＮＣＨ2ＣＨ3であり、そしてＺは、ＣＨまたはＮであり、そして
ここで、ｑが２の場合、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ3アルキルではなく、かつ式中、式（Ｉ）の化合物は、８−ベンジル−２−（（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オンではない。
【００４１】
特定の実施形態において、Ｒ1は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、二環式アリール、三環式アリール、ヘテロアリール、二環式ヘテロアリール、三環式ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、ヘテロアリールカルボニル、またはホスホネートであり、ｑは、０〜２であって、式中、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、二環式アリール、三環式アリール、ヘテロアリール、二環式ヘテロアリール、三環式ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、ヘテロアリールカルボニル及びホスホネートは、それぞれの存在において、ハロゲン、＝Ｏ、＝Ｓ、シアノ、カルバメート、ニトロ、フルオロアルキル、アルコキシフルオロアルキル、フルオロアルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アリルオキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、−ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート、シリル、置換シリルオキシ、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ、アルキルスルファニル、スルファニル、チオトリアゾリル及びアシルからなる群から独立して選択される１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個の官能基で独立して置換されているかまたは非置換であり、
ここで、ｑが０の場合、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ5アルキルまたは
2019507753.tif 000007
ではなく、式中、Ｒaは、ＮＨ2、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ1−Ｃ7−アルキル、またはＣＯ2Ｃ1−Ｃ7−アルキルであり、
ここで、ｑが１の場合、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、
2019507753.tif 000008
ではなく、式中、Ｒcは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ1−Ｃ7−アルキル、ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｃ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｘは、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、ＮＣＨ3またはＮＣＨ2ＣＨ3であり、そしてＺは、ＣＨまたはＮであり、そして
ここで、ｑが２の場合、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ3アルキルではなく、かつ式中、式（Ｉ）の化合物は、８−ベンジル−２−（（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オンではない。
【００４２】
特定の実施形態において、Ｒ1は、フェニル、ピリジニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾトリアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、チエノピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、チエノチエニル、チエニル、ジエチルホスホネート、イソキサゾリル、イミダゾチアゾリル、１，３−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオニル、フラニル、ピラゾリル、ベンゾチエニル、Ｃ10〜Ｃ12アルキル、ベンゾチアゾリル、シンナミル、ジベンゾフラニル、クロメニルまたはナフタレニルであり、そしてｑは、０〜２であり、式中、前記フェニル、ピリジニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾトリアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、チエノピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、チエノチエニル、チエニル、ジエチルホスホネート、イソキサゾリル、イミダゾチアゾリル、１，３−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオニル、フラニル、ピラゾリル、ベンゾチエニル、Ｃ10〜Ｃ12アルキル、ベンゾチアゾリル、シンナミル、ジベンゾフラニル、クロメニル及びナフタレニルは、それぞれの存在において、独立して置換されているかまたは非置換であり、
ここで、ｑが０の場合、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ5アルキルまたは
2019507753.tif 000009
ではなく、式中、Ｒaは、ＮＨ2、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ1−Ｃ7−アルキル、またはＣＯ2Ｃ1−Ｃ7−アルキルであり、
ここで、ｑが１の場合、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、
2019507753.tif 000010
ではなく、式中、Ｒcは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ1−Ｃ7−アルキル、ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｃ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｘは、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、ＮＣＨ3またはＮＣＨ2ＣＨ3であり、そしてＺは、ＣＨまたはＮであり、そして
ここで、ｑが２の場合、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ3アルキルではなく、かつ式中、式（Ｉ）の化合物は、８−ベンジル−２−（（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オンではない。
【００４３】
特定の実施形態において、Ｒ1は、フェニル、ピリジニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾトリアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、チエノピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、チエノチエニル、チエニル、ジエチルホスホネート、イソキサゾリル、イミダゾチアゾリル、１，３−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオニル、フラニル、ピラゾリル、ベンゾチエニル、Ｃ10〜Ｃ12アルキル、ベンゾチアゾリル、シンナミル、ジベンゾフラニル、クロメニルまたはナフタレニルであり、そしてｑは、０〜２であり、式中、前記フェニル、ピリジニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾトリアゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、チエノピロリル、ピリミジニル、ピラジニル、チエノチエニル、チエニル、ジエチルホスホネート、イソキサゾリル、イミダゾチアゾリル、１，３−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオニル、フラニル、ピラゾリル、ベンゾチエニル、Ｃ10〜Ｃ12アルキル、ベンゾチアゾリル、シンナミル、ジベンゾフラニル、クロメニル及びナフタレニルは、それぞれの存在において、ハロゲン、＝Ｏ、＝Ｓ、シアノ、カルバメート、ニトロ、フルオロアルキル、アルコキシフルオロアルキル、フルオロアルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、ヘテロシクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロアリールアルキル、アリールアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アリルオキシ、アルコキシアルキル、アルキレン、アリールオキシ、フェノキシ、ベンジルオキシ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アミノアルキル、アリールアミノ、スルホニルアミノ、スルフィニルアミノ、スルホニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、スルフィニル、−ＣＯＯＨ、ケトン、アミド、カルバメート、シリル、置換シリルオキシ、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシ、アルキルスルファニル、スルファニル、チオトリアゾリル及びアシルからなる群から独立して選択される１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個の官能基で独立して置換されているかまたは非置換であり、
ここで、ｑが０の場合、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ5アルキルまたは
2019507753.tif 000011
ではなく、式中、Ｒaは、ＮＨ2、ハロゲン、ＯＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ1−Ｃ7−アルキル、またはＣＯ2Ｃ1−Ｃ7−アルキルであり、
ここで、ｑが１の場合、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、
2019507753.tif 000012
ではなく、式中、Ｒcは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣ（Ｏ）Ｃ1−Ｃ7−アルキル、ＯＣＨ2ＯＣ（Ｏ）Ｃ1−Ｃ7−アルキルであり、Ｘは、Ｓ、Ｏ、ＮＨ、ＮＣＨ3またはＮＣＨ2ＣＨ3であり、そしてＺは、ＣＨまたはＮであり、そして
ここで、ｑが２の場合、
Ｒ1は、Ｃ1〜Ｃ3アルキルではなく、かつ式中、式（Ｉ）の化合物は、８−ベンジル−２−（（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オンではない。
【００４４】
代表的な式（Ｉ）の化合物としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されない。
８−ベンジル−２−（４−フルオロベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（２，４−ジフルオロベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−メトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（４−フルオロ−３−メトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−ヒドロキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（４−フルオロ−３−ヒドロキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−フルオロ−４−メトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（４−フルオロ−２−メトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（４−メトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
ｔｅｒｔ−ブチル（３−（（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）フェニル）カルバメート、
８−ベンジル−２−（（５−メトキシチオフェン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（３−アミノベンジル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（４−（ｔｅｒｔ−ブチル）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（ナフタレン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（［１，１’−ビフェニル］−４−イルメチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（（２Ｈ−クロメン−３−イル）メチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（１，３−ジフェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラン−４−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−シンナミル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（（３−アセチルベンゾ［ｄ］チアゾール−２（３Ｈ）−イリデン）メチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
ｔｅｒｔ−ブチル（４−（（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）フェニル）カルバメート、
２−（４−アミノベンジル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（４−（アリルオキシ）−３−メトキシベンジル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−（（４−メチル−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）チオ）フラン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−（（５−（ピリジン−２−イル）チオフェン−２−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イルメチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−ドデシル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−２−イルメチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−（ピリジン−４−イルメチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−シクロヘキシルチオフェン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（［２，２’−ビチオフェン］−５−イルメチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−イソブチルチオフェン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−（１−メチル−５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）チオフェン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−（（５−（トリフルオロメチル）フラン−２−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
４−（（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）安息香酸、
８−ベンジル−２−（（５−（メトキシメチル）フラン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（ペルフルオロフェニル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（１−メチル−３−（チオフェン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３，５−ビス（トリフルオロメチル）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−クロロ−１−メチル−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−メトキシフラン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
３−（（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）安息香酸、
８−ベンジル−２−（（５−（モルホリノメチル）フラン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（３−（アミノメチル）ベンジル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
５−（（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）−１，３−ジメチルピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン、
８−ベンジル−２−（イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾール−６−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
Ｎ−（３−（（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）フェニル）メタンスルホンアミド、
８−ベンジル−２−（（３，５−ジメチルイソキサゾール−４−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−（ピリジン−３−イルメチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
ジエチル（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）ホスホネート、
８−ベンジル−２−（４−メトキシ−３−（メトキシメチル）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−（ジメチルアミノ）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−（メトキシメチル）チオフェン−２−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−（メトキシメチル）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−（ヒドロキシメチル）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（２−メトキシピリミジン−５−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（３，４−ジメチルチエノ［２，３−ｂ］チオフェン−２−イル）メチル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−（ピラジン−２−イルメチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−（（２−（プロピルチオ）ピリミジン−５−イル）メチル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（４−メチル−４Ｈ−チエノ［３，２−ｂ］ピロール−５−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（（１，２，３−チアジアゾール−５−イル）メチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（１−メチル−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾール−５−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３，４−ジメトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−（メチルチオ）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
２−（ベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イルメチル）−８−ベンジル−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−（（ジメチルアミノ）メチル）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−エトキシベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−メチルピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−（ジメチルアミノ）ピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−（２，４，６−トリフルオロベンジル）イミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（２，６−ジメトキシピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−クロロ−４−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−フルオロ−２−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（２−フルオロ−６−メトキシピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（５−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（２，６−ジフルオロピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−ブロモピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（６−クロロピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（２−フルオロピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（（２，６−ジクロロピリジン−３−イル）メチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
８−ベンジル−６−フェニル−２−スチリル−１，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（２Ｈ）−オン、
８−ベンジル−２−（３−（２−メトキシエトキシ）ベンジル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン、
３−（（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）メチル）ベンゾニトリル、
及びそれらの薬学的に許容可能な塩。
【００４５】
化合物名は、ＣＨＥＭＤＲＡＷ（登録商標）ＵＬＴＲＡ  ｖ．１２．０の一環としてＳｔｒｕｃｔ＝Ｎａｍｅ命名アルゴリズムを使用して割り当てている。
【００４６】
化合物は、非対称中心または不斉中心を含む立体異性体として存在する可能性がある。立体異性体は、不斉炭素原子周囲の置換基の構造に応じて「Ｒ」または「Ｓ」である。本明細書で使用するとき、用語「Ｒ」及び「Ｓ」は、ＩＵＰＡＣ  １９７４，Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｅ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｉｎ  Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．  Ｃｈｅｍ．（１９７６）４５：１３−３０に定義されている通りの構造である。本開示は、様々な立体異性体及びその混合物を企図するものであって、これらは具体的には、本発明の範疇に含まれる。立体異性体としては、鏡像異性体及びジアステレオマ−、ならびに鏡像異性体またはジオステレオマ−の混合物が挙げられる。化合物の個々の立体異性体は、市販の出発物質から合成的に調製され得、これは非対称中心もしくは不斉中心を含み、またはラセミ混合物の調製に続き、当業者に周知の分割方法により調製され得る。前記分割方法は、（１）Ｆｕｒｎｉｓｓ，Ｈａｎｎａｆｏｒｄ，Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｔａｔｃｈｅｌｌ，“Ｖｏｇｅｌ’ｓ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，５th  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＆  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ，Ｅｓｓｅｘ  ＣＭ２０  ２ＪＥ，Ｅｎｇｌａｎｄに記載されている通り、鏡像異性体の混合物をキラル補助基へ結合し、得られたジアステレオマ−混合物を再結晶もしくはクロマトグラフィーで分離して、光学的に純粋な生成物を前記補助基から選択的に遊離すること、または（２）光学鏡像異性体混合物をキラルクロマトグラフィーカラムで直接分離すること、または（３）分別再結晶法によって例示される。
【００４７】
化合物は、互変異性体形に加えて構造異性体も有する可能性があり、また、これらがさらに本発明の態様を構成すると考えられるべきである。
【００４８】
本開示はさらに、同位体で標識された化合物も包含しており、１個以上の原子が自然界に通常見られる原子質量もしくは質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子で置換されているという事実を別にすれば、式（Ｉ）に挙げたものと同一である。本発明の化合物に包含するのに好適な同位体の例は、水素、炭素、窒素、酸素、りん、硫黄、フッ素及び塩素であり、例えば、それぞれ2Ｈ、3Ｈ、13Ｃ、14Ｃ、15Ｎ、18Ｏ、17Ｏ、31Ｐ、32Ｐ、35Ｓ、18Ｆ、及び36Ｃｌであるが、これらに限定されない。重水素、すなわち2Ｈのようにより重い同位体で置換すると、代謝安定性が大きくなることに起因する特定の治療上の優位性、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の増加または必要用量の減少をもたらす可能性があり、それ故に、状況次第では好ましい可能性もある。化合物は、受容体の分配を決定するための医用画像及び陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）の研究において、陽電子放出同位体を組み込んでもよい。式（Ｉ）の化合物に組み込むことができる好適な陽電子放出同位体は、11Ｃ、13Ｎ、15Ｏ、18Ｆである。同位体で標識された式（Ｉ）の化合物は一般に、当業者に既知の従来技術によって調製されても、または同位体で標識されていない試薬の代わりに同位体で標識された適切な試薬を用いて添付の実施例における記載と類似の過程によって調製されてもよい。
【００４９】
Ａ．式（Ｉ）の化合物の性質
式（Ｉ）の化合物は、発光を生じるルシフェラーゼの基質であり得る。化合物は、改善された水溶解度、改善された安定性、改善された細胞透過性、細胞との高い生体適合性、低減された自家生物発光、及び低い毒性を有していてよい。
【００５０】
「発光」とは、適切な条件下、例えばセレンテラジン類似体などの適した基質の存在下での、ルシフェラーゼの光出力を指す。光出力は、発光反応開始時の光出力の即時または近即時測定値（「Ｔ＝０」発光または「フラッシュ」と称されることもある）として測定することができ、この反応は、セレンテラジン基質を追加すると開始し得る。様々な実施形態において、発光反応は溶液中で行われる。他の実施形態において、発光反応は固体支持体上で行われる。溶液は、溶解物、例えば原核または真核生物発現系における細胞由来のものを含有してもよい。別の実施形態では、発現が無細胞系で生じるかまたはルシフェラーゼタンパク質が細胞外培地に分必され、後者の場合、溶解物を生成する必要はない。いくつかの実施形態において、反応は、適切な物質、例えばセレンテラジン類似体、緩衝液などを、発光タンパク質を入れた反応チャンバ（例えば、９６ウェルプレートなどのマルチウェルプレートのウェル）へ投入することによって開始する。さらに別の実施形態では、ルシフェラーゼ及び／またはセレンテラジン類似体（例えば、式（Ｉ）の化合物）を宿主に導入して、全生物または細胞、組織、外植片、あるいはその抽出物を包含する宿主またはその一部において発光測定を行うことができる。反応チャンバは読み取り装置内に位置してもよく、それにより、例えばルミノメーターまたは光電子増倍管を用いて光出力を測定することができる。光出力または発光はまた、例えば同じ反応チャンバ内で数秒間、数分間、数時間など、経時的に測定することもできる。光出力または発光は、経時的平均、信号衰退の半減期、一定時間にわたる信号の合計、またはピ−ク出力として報告することができる。発光は、相対的発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔｓ、ＲＬＵ）で測定され得る。
【００５１】
式（Ｉ）の化合物のＲＬＵは、セレンテラジンまたは既知のセレンテラジン類似体と相対的に、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、または１００以上であってよい。
【００５２】
「生体適合性」とは、細胞（例えば、原核または真核生物）のセレンテラジン類似体（例えば、式（Ｉ）の化合物）に対する耐容性を指す。セレンテラジン類似体の生体適合性は、宿主細胞で生じるストレスに関係している。
【００５３】
セレンテラジン類似体（例えば、式（Ｉ）の化合物）の高い生体適合性は、細胞生存率及び／または細胞の成長速度を測定することによって求めることができる。例えば、セレンテラジン類似体の高い生体適合性は、セレンテラジン類似体に暴露された細胞にルシフェラーゼ発現がない場合に天然のまたは既知のセレンテラジンと比較して細胞生存率を測定して、セレンテラジン類似体が細胞に対してどれほど適合し及び／または毒性があるかを測定することによって求めることができる。
【００５４】
具体的には、高い生体適合性は、細胞生存率解析を用いて（例えば、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）発光細胞生存率アッセイを用いて）、アポトーシスアッセイを用いて（例えば、ＣＡＳＰＡＳＥ−ＧＬＯ（登録商標）法を用いて）、または当該技術分野において既知の別の方法を用いて求めることができる。式（Ｉ）の化合物の細胞生存率またはアポトーシスに対する影響を、天然のまたは既知のセレンテラジン類似体の細胞生存率またはアポトーシスに対する影響と比較してもよい。
【００５５】
高い生体適合性はまた、セレンテラジン類似体（例えば、式（Ｉ）の化合物）の細胞成長または遺伝子発現に対する影響を測定することによっても求めることができる。例えば、式（Ｉ）の化合物の高い生体適合性は、式（Ｉ）の化合物に暴露した細胞試料内で一定期間後に細胞数を測定するかまたは天然のもしくは既知のセレンテラジンに暴露した細胞またはセレンテラジンに暴露していない細胞と比較してストレス反応遺伝子の発現を測定することによって求めることができる。式（Ｉ）の化合物の細胞成長または遺伝子発現に対する影響は、天然のまたは既知のセレンテラジンと比較してよい。
【００５６】
塩基性付加塩は、カルボキシル基と、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムもしくはアルミニウムなどの金属カチオンの水酸化物、炭酸塩または重炭酸塩、あるいは１級、２級または３級有機アミンなどの適した塩基との反応によって、開示する化合物の最終的な単離精製中に調製され得る。四級アミン塩、例えばメチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン、１−エフェナミン及びＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピぺリジン、ピペラジンなどに由来するものなどを調製してもよい。
【００５７】
Ｂ．式（Ｉ）の化合物の合成
セレンテラジン類似体を生成する現行法は、厳しい反応条件を用いる。この合成プロトコルの制限から、新規類似体の研究が遅くなった。さらに、前記方法の条件と様々な官能基との不適合性、及びケトアルデヒド／ケト酸前駆体を合成できないことが、セレンテラジンのＣ−２位での構造変化の制限の原因にもなっていた。
2019507753.tif 000013
【００５８】
ここで、式（Ｉ）の化合物の調製を遂行する３つのロバストな汎用的方法について説明する。前記方法は、現存する合成方法を使用して製造できなかった類似体の調製に有用である。開示されている方法論は、Ｃ−２位にある様々な置換基を利用できるようにし、また、多様なすぐに入手できるアルデヒドを出発物質として利用して比較的穏やかな条件下で実行され得る。
【００５９】
式（Ｉ）の化合物は、合成過程で調整されても、または代謝過程で調製されてもよい。代謝過程による化合物の調製には、人体内もしくは動物体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で生じるものまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで生じる過程が包含される。
【００６０】
式（Ｉ）の化合物であって、式中、特に断りのない限り、Ｒ1基及びｑが発明の概要欄に記載したような意味を有するものは、スキーム１〜３に示す通りに合成することができる。
【００６１】
以下のスキームの説明で使用している略語は次の通りである。Ａｃ2Ｏは無水酢酸、ＣＤＩはカルボニルジイミダゾール、ＭｅＯＨはメタノール、ＴＭＧは１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、及びＴＦＡはトリフルオロ酢酸である。
【００６２】
スキーム１．中間体Ａ〜Ｃの合成
2019507753.tif 000014
スキーム１に示すように、中間体Ａ〜Ｃは、アミノピラジンｉから調製することができる。ｉをＲｈ2（Ｏａｃ）4存在下、ジアゾカルボニル類ｉｉ〜ｉｖで処理すると、アミノピラジンアセトホスホネートＡ〜Ｃが形成され得る。中間体Ａ〜Ｃは、室温で安定であり得、そして様々な類似体に出発物質を提供する可能性がある。
【００６３】
スキーム２．式（Ｉ）の化合物の合成
2019507753.tif 000015
スキーム２は、式（Ｉ）の化合物への中間体Ａ及びＢの転換を表しており、式中、ｎは１である。中間体Ａ及びＢは、１，１，３，３−テトラメチルグアニジンで処理されてアルデヒドｖとのホーナー・ワズワース・エモンズオレフィン化反応（式中、Ｒ1は発明の概要欄で定義した通りである）を生じることで、中間体ｖｉを生成することができる。中間体ｖｉを還元すると、式（Ｉ）の化合物を得ることができる。
【００６４】
スキーム３．式（Ｉ）の化合物の合成
2019507753.tif 000016
スキーム３は、中間体Ｃからの２つのルートによる式（Ｉ）の化合物の調製を表している。中間体Ｃは、１，１，３，３−テトラメチルグアニジンで処理されてアルデヒドｖとホーナー・ワズワース・エモンズオレフィン化反応（式中、Ｒ1は発明の概要欄で定義した通りである）を生じることで、中間体ｖｉｉを得ることができる。中間体ｖｉｉを水素添加することで中間体ｖｉｉｉが生成し、次いで、ＴＦＡで処理した後、カルボニルジイミダゾールの添加によって促進される環化により、式（Ｉ）の化合物へと転換され得る。別法としては、中間体ｖｉｉをＴＦＡで処理することで、ｔ−ブチルエステルの加水分解が生じて中間体ｉｘが形成され得る。その後、無水酢酸、次いで水素化ホウ素ナトリウムを添加すると、式（Ｉ）の化合物が提供され得る。
【００６５】
各ステップそれぞれに最適な反応条件及び反応時間は、用いられる特定の反応物と使用される反応物中に含まれる置換基とによって異なる可能性がある。具体的な手順は、実施例欄で展開する。反応は常套法で後処理を行うことができ、例えば、残渣から溶媒を除去してさらに、限定されないが、結晶化、蒸留、抽出、粉砕及びクロマトグラフィーなどの当該技術において一般に知られた方法論に従って精製されてよい。特に断りのない限り、出発物質及び試薬は市販のものであり、または市販の物質から化学文献に記載の方法を用いて当業者によって調製されてもよい。出発物質は、市販されていない場合、標準的な有機化学技法、既知の構造上同様の化合物の合成と類似した技法、もしくは上述のスキームと類似した技法から選択される手順、または合成例欄で説明する手順によって調製することができる。
【００６６】
反応条件、試薬及び合成ル−トの順序の適切なコントロ−ル、反応条件と適合できない任意の化学官能基の保護、及び前記方法の反応順序内の好適な位置での脱保護を包含する所定の実験は、発明の範疇に包含される。好適な保護基、及び前記好適な保護基を用いた別の置換基の保護及び脱保護方法は、当業者に周知であり、その例は、ＰＧＭ  Ｗｕｔｓ  ａｎｄ  ＴＷ  Ｇｒｅｅｎｅ，ｉｎ  Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  ｂｏｏｋ  ｔｉｔｌｅｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（４th  ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（２００６）に見出すことができ、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。本発明の化合物の合成は、前記合成スキーム及び具体例に記載のものと類似した方法によって達成され得る。
【００６７】
開示する化合物の光学活性形が必要な場合、光学活性な出発物質（例えば、好適な反応ステップの不斉誘導によって調製されたもの）を用いて本明細書に記載の手順のうちの１つを行うことによって、または標準的な手順（クロマトグラフィー分離、再結晶または酵素的分割など）を用いて化合物もしくは中間体の立体異性体混合物を分割することによって得ることができる。
【００６８】
同様に、化合物の純粋な構造異性体が必要な場合も、出発物質として純粋な構造異性体を用いて前記手順のうちの１つを行うことによって、または標準的な手順（クロマトグラフィー分離など）を用いて化合物もしくは中間体の構造異性体の混合物を分割することによって得ることができる。
【００６９】
記載されているような合成スキーム及び具体例は例示であって、添付の請求項に定義されているとして本発明の範囲を制限するものと解されるべきではないと理解され得る。合成方法及び具体例の変更、修正及び均等物はいずれも、本請求項の範疇に包含される。
【００７０】
３．使用方法及びキット
開示の化合物及びタンパク質は、ルシフェラーゼ基質、例えばセレンテラジン類似体が使用されていた任意の方法で使用され得る。例えば、セレンテラジン類似体を用いた生体発光法において使用して試料中の１つ以上の分子、例えば酵素、酵素反応の補因子、酵素基質、酵素阻害剤、酵素活性剤、もしくはＯＨラジカル、または１つ以上の条件、例えばレドックス条件を検出することが可能である。試料としては、動物（例えば、脊椎動物）、植物、真菌、生理液（例えば、血液、血漿、尿、粘膜分泌物）、細胞、細胞溶解物、細胞上清、または精製された細胞画分（例えば、細胞下画分）をあげることができる。前記分子の存在、量、スペクトル分布、放出動態または比活性度は検出または定量化され得る。分子は、多相溶液（例えば、エマルションもしくは懸濁液）を包含する溶液中で、または固体支持体（例えば、粒子、毛細管もしくはアッセイ容器）上で、検出または定量化され得る。
【００７１】
特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物を使用してセレンテラジンを定量化することができる。いくつかの実施形態において、セレンテラジン（例えば、天然のもしくは既知のセレンテラジンまたは式（Ｉ）の化合物）は、比生化学活性、例えばアポトーシスまたは薬物代謝、のプローブとして使用することもできる。いくつかの実施形態では、セレンテラジン濃度は、対象である特定の酵素により作用し得る「プロセレンテラジン」または「プロ基質」によって特定の酵素活性とつながっている。いくつかの実施形態において、プロセレンテラジンは、ルシフェラーゼと併用したときに発光を直接支持できない分子であるが、対象である特定の酵素によって触媒過程を経てセレンテラジンへと転換され得る。いくつかの実施形態において、前記手法は、薬物代謝に使用される酵素、例えばシトクロムＰ４５０酵素、モノアミン酸化酵素、及びグルタチオンＳ−転移酵素、ならびにアポトーシスに使用される酵素、例えばカスパーゼなどの場合に使用され得る。例えば、セレンテラジン（例えば、天然のもしくは既知のセレンテラジン、または式（Ｉ）の化合物）は、６’−Ｏ−メチルなどの開裂基を含有するように修飾されてもよい。いくつかの実施形態において、特定のシトクロムＰ４５０酵素を使って培養した場合、６’Ｏ−メチルが開裂して、プロセレンテラジンがセレンテラジンへ転換して、ルシフェラーゼによって検出され得る。いくつかの実施形態において、プロセレンテラジンは、発光を支持する必要のある別の構成要素、例えば、ルシフェラーゼなどの発光タンパク質と併用することで、単一試薬及び均質なアッセイを提供することができる。例えば、試薬を試料に添加した場合、プロセレンテラジンがセレンテラジンへ転換するときに発光が生じる。様々な実施形態において、同様のアッセイは、他の酵素、小細胞、またはプロセレンテラジンからのセレンテラジンの生成に関連し得る他の細胞過程のために展開することができる。
【００７２】
特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、生細胞内での発光を検出するのに使用され得る。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼは、細胞（レポーターまたはそれ以外として）及びセレンテラジンで処理された細胞（例えば、式（Ｉ）の化合物）内で発現して、培養液中で細胞に浸透して、ルシフェラーゼと反応して発光を生じる。細胞浸透性に加えて、式（Ｉ）の化合物は、細胞生存率の観点から天然のセレンテラジンと同等の生体適合性を示す。いくつかの実施形態において、培地における天然セレンテラジンの安定性を高めることが知られている化学修飾を含有する式（Ｉ）の化合物は、合成されて、よりロバストな生細胞ルシフェラーゼをベースとするレポ−ターアッセイに使用され得る。また別の実施形態において、ルシフェラーゼと式（Ｉ）の化合物とを含有する試料（細胞、組織、動物などを包含する）は、様々な顕微鏡検査及び画像技術を用いて検査されてよい。さらに別の実施形態において、分泌型ルシフェラーゼは、細胞内で生細胞レポーター系の一部として発現される。
【００７３】
特定の実施形態において、本明細書で開示する式（Ｉ）の化合物は、キットの一部として提供されてよい。いくつかの実施形態において、キットは、１つ以上のルシフェラーゼ（ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの形態、またはその両方で）及びセレンテラジンと共に、好適な試薬及び本明細書で開示しているようなアッセイをユ−ザが実行できるようにする指示書をも包含し得る。セレンテラジンは、天然であっても、既知のものであっても、または本明細書で開示している式（Ｉ）の化合物であってもよい。キットはさらに、本明細書で開示しているような緩衝液を１つ以上包含してもよい。
【実施例】
【００７４】
４．実施例
実施例１．共通中間体（Ａ、Ｂ、Ｃ）の合成
スキーム４．中間体Ａ〜Ｃの合成
2019507753.tif 000017
Ａ〜Ｃの一般的な合成手順：５ｍＬ丸底フラスコにアミノピラジン（１、５００ｍｇ、１．９ミリモル）、ジアゾ化合物（２〜４、３．８３ミリモル、２当量）、Ｒｈ2（ＯＡｃ）4（８４．５７ｍｇ、１０モル％）及びクロロベンゼン３ｍＬを入れた。反応混合物を１００℃で２４時間加熱した。反応の進捗はＬＣＭＳでモニターした。２４時間後、反応が１００％転化に達した。混合物をセライトに吸着させて、ヘプタン中４０％ＥｔＯＡｃを溶出液として用いてシリカカラムで精製した、所望の生成物を褐色固体として７８〜９０％の収率で純粋に単離した。必要とされるジアゾホスホノアセテートは、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｌｅｔｔ，２００７，１１，１６８３−１６８６に従って合成した。
【００７５】
メチル２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（Ａ）：収率９０％、1Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ＝８．４０（ｓ，１Ｈ），７．９５−７．９１（ｍ，２Ｈ），７．４９−７．４０（ｍ，２Ｈ）， ７．４０−７．１９ （ｍ， ６Ｈ）， ５．３３−５．１９ （ｍ， ２Ｈ），４．２５（ｓ，２Ｈ），４．１８−３．８５（ｍ，４Ｈ），３．７３（ｓ， ３Ｈ），１．２５ （ｔ， Ｊ＝６， ３Ｈ）， １．２０ （ｔ， Ｊ＝６， ３Ｈ），13Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3）δ＝１６８．３４， １６８．３２，１４９．７６，１４９．６４，１４２．２４，１４１．７２，１３７．１４，１３６．６６，１３６．４０，１２８．８５，１２８．７７， １２８．７６ １２８．０６， １２６．９６， １２５．７８， ６３．７２， ６３．６５， ６３．６３， ６３．５６， ５３．５５， ５２．９６， ５１．６１， ４０．８４， １６．３３， １６．２９， １６．２５， １６．２１．ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ２４Ｈ２９Ｎ３Ｏ５Ｐ）実測値４７０．
【００７６】
ベンジル２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（Ｂ）：収率７８％、1Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ＝８．３５（ｓ，１Ｈ），７．９４（ｄ， Ｊ＝７．２， ２Ｈ）， ７．５０−７．４２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．４０ − ７．１８ （ｍ， １１Ｈ）， ５．４３ − ５．０６ （ｍ， ４Ｈ）， ４．２５ （ｓ， ２Ｈ）， ４．１７ − ３．７６ （ｍ， ４Ｈ）， １．１９ （ｔ， Ｊ＝７．１， ３Ｈ）， １．１６ （ｔ， Ｊ＝７．０， ３Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ ＝ １６７．７０， １６７．６８， １４９．８２， １４９．７０， １４２．２７， １４１．７３， １３７．１８， １３６．６３， １３６．３９， １３５．２０， １２８．８５， １２８．７９， １２８．７７， １２８．４３， １２８．３０， １２８．２９， １２８．０７， １２６．９４， １２５．８０， ６７．５７， ６３．７２， ６３．６４， ６３．６０， ６３．５１， ５３．９６， ５２．０４， ４０．８４， １６．２９， １６．２４， １６．２１， １６．１６；ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ３０Ｈ３２Ｎ３Ｏ５Ｐ）実測値５４６．
【００７７】
ｔｅｒｔ−ブチル２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（Ａ）：収率８３％、1Ｈ ＮＭＲ（３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ＝８．４１（ｓ，１Ｈ），７．９５ （ｄ， Ｊ＝５．２， ２Ｈ）， ７．５２ − ７．１６ （ｍ， ８Ｈ）， ５．３０ − ５．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ４．３１ − ４．１７ （ｍ， ２Ｈ）， ４．１５ − ３．８３ （ｍ， ４Ｈ）， １．４４ （ｓ， ９Ｈ）， １．２５ （ｔ， Ｊ＝９， ３Ｈ）， １．１９ （ｔ， Ｊ＝９ ３Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ ＝ １６６．５４， １６６．５２， １４９．８９， １４９．７９， １４１．９４， １４１．６０， １３７．２５， １３６．５８， １３６．４９， １２８．８０， １２８．７５， １２７．９８， １２６．８４， １２５．７３， ８２．８６， ６３．４６， ６３．３８， ６３．２９， ６３．２０， ５４．４３， ５２．５０， ４０．７５， ２７．８４， １６．３４， １６．２６；ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ２７Ｈ３５Ｎ３Ｏ５Ｐ）実測値５１２．
【００７８】
実施例２．式（Ｉ）の化合物の合成方法
スキーム５  方法Ｉ
2019507753.tif 000018
式（Ｉ）の化合物を合成するための方法論の開発は、上記スキームに示すＨＷＥ（ホーナー・ワズワース・エモンズ）オレフィン化反応の反応条件を研究することから始まった。ｐ−フルオロベンズアルデヒドと化合物ＡとのＴＨＦ中でのＨＷＥオレフィン化反応では様々な塩基をスクリーニングした。これら初期実験からは、用いた塩基のｐＫａが１１未満のとき（Ｋ2ＣＯ3またはＤＩＰＥＡ）に反応が進まないことが分かった。また一方、ｐＫａが１２以上の強い窒素塩基またはアルカリ金属塩基は、分解生成物からなる複合混合物を生成した。驚くことに、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（ＴＭＧ）のＴＨＦ溶液（ｐＫａ約１３．６）を使用すると、オレフィン化生成物の収率が低下した（表１のエントリー２参照）。
【００７９】
大部分のアルデヒドは、化合物ＡとのＨＷＥ反応で使用されたときに、不飽和エステルｘだけを提供するとは限らなかった。その代わり、ｘは環化してｖｉを生成する傾向があった（スキーム５参照）。また一方、これら化合物は一般には不安定であり、特に非プロトン溶媒中及び高ｐＨでは不安定であった。溶媒／塩基の組み合わせを用いた追加実験からは、多様なプロトン溶媒、好ましくはＭｅＯＨが環化生成物ｖｉを安定化するが（下記スキーム及び表１参照）、Ａをメタノール中ＴＭＧで前処理することで、環化ジエチルホスホネート［ジエチル（８−ベンジル−３−オキソ−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−２−イル）ホスホネート、化合物１］が生じることが分かった。
【００８０】
ｐ−フルオロベンズアルデヒドを用いたモデル系では、いくつかの窒素塩基が、Ａとｐ−フルオロベンズアルデヒドとの反応において所望の環化生成物Ｅをもたらした。一般に、ＭｅＯＨ中でＴＭＧ以外の塩基を使用することに利点はなかった（表１）。
2019507753.tif 000019
【表１】
2019507753.tif 000020
反応条件のスクリーニングで使用した塩基及び溶媒の頭文字：ＴＭＧ：１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、ＤＢＵ：１，８−ジアザビシクロウンデカ−７−エン、ｔ−ＢｕＴＭＧ：２−ｔｅｒｔ−ブチル−１，１，３，３−テトラメチルグアニジン、ＴＢＤ：１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．０］デカ−５−エン、ＭｅＴＢＤ：７−メチル−１，５，７−トリアザビシクロ［４．４．４０］デカ−５−エン。
*生成物Ｄ及びＥの収率は、対応する反応混合物のＬＣＭＳトレ−スの積分によって得られた。条件：室温、Ａ  １０ｍｇ、溶媒（４ｍＬ）、ＴＭＧ（３当量）、４−フルオロベンズアルデヒドアルデヒド３当量。
【００８１】
Ａとｐ−フルオロベンズアルデヒドとの反応では、ＤとＥの生成物比がＴＭＧ−メタノール溶液中で確立される平衡によって決定され、そして前記条件下でのＥの不安定性が２４時間以内に反応成分を完全な崩壊に導くと推測された。個別に単離されたＤとＥを反応条件に再暴露すると、同様の比率のＤとＥをもたらした。さらに、反応をｎ−ブタノール中で行うと、同様の比率のＤとＥが生成されるが、ｎ−Ｂｕ−エステル（Ｒ5＝ｎ−Ｂｕ）も形成された。そのため、最も広範な基質には、溶媒としてのメタノールがＥを利用しやすかった。典型的に、メタノール中でのＥの合成は４時間も必要とせず、しかもＥの著しい分解が認められる前に反応を停止すると良好な収率で進んだ。
【００８２】
方法Ｉの基本手順：２０ｍＬバイアル瓶にメチル２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（Ａ）（１００ｍｇ、０．２１ミリモル、１当量）、アルデヒド（０．２３ミリモル、１．１当量）及びメタノール１２ｍＬを入れた。前記溶液に、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（７４ｍｇ、０．６４ミリモル、３当量）を加えた。反応混合物を、最大転化に達するまで室温で攪拌した（２〜６時間）。反応の進捗はＬＣＭＳでモニターした。混合物を水に流し込み、酢酸エチルで抽出してＭｇＳＯ4によって乾燥させた。乾燥剤をろ別して、溶媒を減圧下で濃縮した。残渣は、シリカゲルにおいてジクロロメタンを溶出液としてフラッシュクロマトグラフィーを行った。一般構造ｖｉに相当するデヒドロセレンテラジンを赤色固体として単離して、それ以上精製せずに次のステップで使用した。デヒドロセレンテラジンｖｉをジクロロメタン２５ｍＬ及びメタノール１０ｍＬに溶解して０℃まで冷却した。この溶液に、ＮａＢＨ4（２４．２ｍｇ、０．６４ミリモル、３当量）を加えて、反応混合物を０℃で３０分間攪拌した。反応混合物は、０．１Ｍ  ＨＣＬ  ５０ｍＬで反応を停止し、ジクロロメタンで抽出して、ＭｇＳＯ4によって乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧下で濃縮して、残渣を、ジクロロメタン／メタノールを溶出液として使用してシリカゲルで精製した。目的のセレンテラジン類似体を黄色固体として純粋に単離して、高真空下で乾燥させた。
【００８３】
共通中間体Ａと前記方法Ｉの基本手順を用いて、以下の化合物を製造した。収率は、中間体Ａから開始する２段階手順で算出した。
【表２−１】
2019507753.tif 000021
【表２−２】
2019507753.tif 000022
【表２−３】
2019507753.tif 000023
【表２−４】
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【表２−５】
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【００８４】
実施例３．式（Ｉ）の化合物を合成するための方法Ｉの変更
スキーム６．変更した方法Ｉ
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方法Ｉのさらなる研究から、環化オレフィン中間体と未環化オレフィン中間体との平衡に時間がかかる場合、中間体Ｂの使用が有用であることが分かった。オレフィン化反応完了直後にｖｉが形成され、未環化中間体は反応混合物中では検出されなかった。また一方、ｖｉは、メトキシドアタックによっても開環を生じて、ｘをもたらした。ｘを形成させないために、Ｂの１００％転化（１０〜２０分）後に反応を停止した。にもかかわらず、ｖｉを還元することで、式（Ｉ）の化合物はスムーズに得られた。この２段階手順は、１０〜２０分で完了する可能性がある。さらに、課題である基質の収率が増加する可能性もある。
【００８５】
この研究全体において、Ｒ1位にある電子吸引性置換基は、閉環形ｖｉの形成に有利に働く傾向があることが認められた。これをうまく利用して、変更した方法Ｉを用いて、Ｒ1位にピリジニル基を含有する式（Ｉ）の化合物を調製した。
【００８６】
共通中間体Ｂと実施例２の方法Ｉの基本手順を用い、類似したやり方で、以下の化合物を製造した。収率は、中間体Ｂから開始する２段階手順で算出した。
【表３】
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【００８７】
実施例４．式（Ｉ）の化合物を合成するための方法ＩＩ及びＩＩＩ
方法Ｉは、様々な式（Ｉ）の化合物を利用可能とする、反応時間の短い、便利で迅速な方法である。しかしながら、電子不足の芳香環または反応性を示す複素環をＲ1位に含有する多くの式（Ｉ）化合物は、方法Ｉでは製造できない。場合により、オレフィン化及びその後の環化には時間がかかり、しかも生成物の著しい分解が認められた。他方、電子が豊富なアルデヒドは、ＨＷＥオレフィン化反応において転化速度が遅い傾向があり、非生産的な中間体であるかなりの量の１を形成する原因にもなった（実施例２参照）。
【００８８】
この課題を回避するために、２つの代替ル−トが開発された。Ｃを利用することで、ＨＷＥ反応中にイミダゾリノン環への環化を抑えることにより、不飽和エステルｖｉｉのみが提供された。その後、ＴＦＡで処理することで不飽和酸ｉｘが生成され、２段階の環化及び還元順序によって式（Ｉ）の化合物へと転化された（方法ＩＩ）。この方法では、ｖｉｉが典型的に、優れた収率で単離された。加水分解手法の後に、方法ＩＩは、影響を受けやすい中間体が高ｐＨ条件に暴露されないようにする。このようにして、生成物ｉｘがＴＦＡ処置に対して安定であれば、方法ＩＩは式（Ｉ）の化合物を方法Ｉよりも高収率で提供したが、手順はより時間がかかった。
【００８９】
スキーム７．方法ＩＩ
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方法ＩＩの基本手順：２０ｍＬバイアル瓶にｔｅｒｔ−ブチル２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（Ｃ）（２００ｍｇ、０．３９ミリモル、１当量）、アルデヒド（０．４３ミリモル、１．１当量）及びメタノール１５ｍＬを入れた。前記溶液に、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（１３５ｍｇ、１．２ミリモル、３当量）を加えて、反応混合物を室温で２時間攪拌した。反応の進捗はＬＣＭＳでモニターした。反応混合物を水に流し込み、酢酸エチルで抽出してＭｇＳＯ4によって乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧下で濃縮して、一般構造ｖｉｉを有する生成物はそれ以上精製せずに次のステップで使用した。
【００９０】
ｖｉｉのジクロロメタン（５ｍＬ）溶液に、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で４時間攪拌した。反応の進捗はＬＣＭＳでモニターした。反応完了後、揮発物質を全て減圧下で除去し、残渣を高真空下で乾燥させた。得られた不飽和酸をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解し、この溶液に、無水酢酸（３９８ｍｇ、３．９ミリモル、１０当量）、トリエチルアミン（３９５ｍｇ、３．９ミリモル、１０当量）及びＤＭＡＰ（４．８ｍｇ、０．０３９ミリモル、０．１当量）を加えた。反応混合物を室温で３０分間攪拌して水に流し込み、その後、ジクロロメタンで抽出して、ＭｇＳＯ4によって乾燥させた。乾燥剤をろ別して、溶媒を減圧下で濃縮した。残渣は、シリカゲルにおいてジクロロメタンを溶出液としてフラッシュクロマトグラフィーを行った。一般構造ｖｉに相当するデヒドロセレンテラジンを赤色固体として単離して、それ以上精製せずに次のステップで使用した。
【００９１】
デヒドロセレンテラジンｖｉをジクロロメタン２５ｍＬ及びメタノール１０ｍＬに溶解して０℃まで冷却した。この溶液に、ＮａＢＨ4（４４．２６ｍｇ、１．２ミリモル、３当量）を加えて、反応混合物を０℃で３０分間攪拌した。反応混合物は、０．１Ｍ  ＨＣＬ  １００ｍＬで反応を停止し、ジクロロメタンで抽出して、ＭｇＳＯ4によって乾燥させた。乾燥剤をろ別し、溶媒を減圧下で濃縮して、残渣をジクロロメタン／メタノールを溶出液としてシリカゲルで精製した。目的の式（Ｉ）のセレンテラジン類似体を黄色固体として純粋に単離して、高真空下で乾燥させた。
【００９２】
方法ＩＩＩは、潜在的に不安定な合成中間体を回避する２つ目の代替手段である。不飽和エステルｖｉｉの水素添加は、ウィルキンソン触媒の存在下、高圧水素下で達成され、典型的に単離精製が容易な中間体ｖｉｉｉを得た。ｖｉｉｉをＴＦＡ処理した後、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を用いて対応する酸の分子内環化を行うことで、式（Ｉ）の化合物が得られた。方法ＩＩＩは、穏やかな反応条件を用いて、酸素及び水分の影響を受けやすい反応中間体を回避するが、この方法は、影響を受けやすい官能基を含有するセレンテラジン類似体のスケールアップと調製のいずれにも適している。しかしながら、高圧と長い反応時間が必要である。
【００９３】
スキーム８．方法ＩＩＩ
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方法ＩＩＩの基本手順：２０ｍＬバイアル瓶にｔｅｒｔ−ブチル２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）−２−（ジエトキシホスホリル）アセテート（Ｃ）（２００ｍｇ、０．３９ミリモル、１当量）、アルデヒド（０．４３ミリモル、１．１当量）及びメタノール１５ｍＬを入れた。前記溶液に、１，１，３，３−テトラメチルグアニジン（１３５ｍｇ、１．２ミリモル、３当量）を加えて、反応混合物を室温で１〜２時間攪拌した。反応の進捗はＬＣＭＳでモニターした。反応完了後、混合物を水に流し込み、酢酸エチルで抽出してＭｇＳＯ4によって乾燥させた。乾燥剤をろ別して、溶媒を減圧下で濃縮した。残渣を、ヘプタン／酢酸エチルを溶出液として用いシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィーを使用して精製し、そして目標化合物ｖｉｉを無色油として単離した。
【００９４】
ｐａｒｒ−ｓｈａｋｅｒ反応フラスコにｔｅｒｔ−ブチル２−（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イルアミノ）−アクリレート誘導体ｖｉｉ（０．３ミリモル、１当量）、Ｒｈ（ＰＰｈ3）3Ｃｌ（０．０３ミリモル、０．１当量）及びエタノール５０ｍＬを入れた。反応容器にＨ2（５０ｐｓｉ）を充満させて、室温で２０時間振とうした。反応の進捗はＬＣＭＳでモニターした。次に、揮発物質を全て減圧下で除去し、残渣は、ヘプタン／酢酸エチルを溶出液として用いてシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィーを行った。還元したアミノピラジン誘導体ｖｉｉｉを無色油として純粋に単離した。
【００９５】
化合物ｖｉｉｉ（０．２５ミリモル、１当量）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解して、この溶液にトリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で１２時間攪拌した。反応の進捗はＬＣＭＳでモニターした。反応完了後、揮発物質を全て減圧下で除去し、残渣をトルエン１０ｍＬと３回共蒸発させることでＴＦＡを全て除去して、化合物ｘｉを得た。高真空下で乾燥させた後、化合物ｘｉをジクロロメタン（１５ｍＬ）に溶解し、この溶液にカルボジイミダゾール（ＣＤＩ）（１２２ｍｇ、０．７５ミリモル、３当量）を加えた。反応混合物を室温で２０分間攪拌した後、０．０１Ｍ  ＨＣｌ（５０ｍＬ）に流し込み、ジクロロメタンで抽出して、ＭｇＳＯ4によって乾燥させた。乾燥剤をろ別して、溶媒を減圧下で濃縮した。残渣は、ジクロロメタン／メタノールを溶出液としてシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィーを行った。式（Ｉ）に相当するセレンテラジンを黄色固体として純粋に単離した。
【００９６】
以下の典型的な中間体を単離して、方法ＩＩＩを用いて特性評価をした。
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｅ）−２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）−３−（３−シアノフェニル）アクリレート
2019507753.tif 000030
1Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ ＝ １０．０３ （ｓ， １Ｈ）， ８．３１ （ｓ， １Ｈ）， ８．１５ （ｔｄ， Ｊ＝０．６， １．６， １Ｈ）， ８．１２ − ８．０８ （ｍ， １Ｈ）， ７．９６ − ７．８７ （ｍ， ２Ｈ）， ７．６８ （ｔ， Ｊ＝７．７， １Ｈ）， ７．５１ − ７．３５ （ｍ， ４Ｈ）， ７．３３ − ７．２３ （ｍ， ３Ｈ）， ７．２１ − ７．０７ （ｍ， １Ｈ）， ６．９８ （ｓ， １Ｈ）， ６．３４ （ｓ， １Ｈ）， ４．３０ （ｓ， ２Ｈ）， １．４６ （ｓ， ９Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ ＝ １８９．９１， １６４．２９， １４８．１６， １４３．７４， １４２．８９， １３７．１８， １３６．８５， １３６．７９， １３６．７６， １３６．６２， １３６．１３， １３３．２７， １３３．１２， １３２．２９， １３２．２３， １３１．０８， １３０．２３， １３０．０９， １２９．２０， １２９．１２， １２８．８３， １２８．５４， １２８．４９， １２７．４１， １２６．０２， １２１．９９， １１８．３９， １１７．５４， １１３．６８， １１２．５５， １０４．９９， ８２．４３， ４１．１５， ２７．８９；ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ３１Ｈ２９Ｎ４Ｏ２）実測値４８９．
ｔｅｒｔ−ブチル２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）−３−（３−シアノフェニル）プロパノエート
2019507753.tif 000031
1Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ ＝ ８．４０ （ｓ， １Ｈ）， ７．９８ − ７．９２ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５０ − ７．４３ （ｍ， ３Ｈ）， ７．３８ − ７．２３ （ｍ， ７Ｈ）， ７．２２ − ７．１８ （ｍ， １Ｈ）， ７．１１ （ｄｔ， Ｊ＝１．５， ７．８， １Ｈ）， ５．０２ （ｄ， Ｊ＝６．８， １Ｈ）， ４．９３ − ４．７９ （ｍ， １Ｈ）， ４．１５ （ｑ， Ｊ＝１５．３， ３Ｈ）， ３．１０ （ｄｄｄ， Ｊ＝５．８， １３．９， ３４．０， ２Ｈ）， １．３８ （ｓ， ９Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ ＝ １７０．８１， １５０．０１， １４１．２１， １４１．１４， １３８．３４， １３７．３５， １３６．７９， １３６．４５， １３３．９１， １３２．９４， １３０．３６， １２８．９３， １２８．９１， １２８．７７， １２８．５８， １２７．８８， １２７．０３， １２５．６６， １１８．７２， １１２．１５， ８２．５０， ５５．０９， ４０．９４， ３７．４６， ２７．９６；ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ３１Ｈ３１Ｎ４Ｏ２）実測値４９１．
ｔｅｒｔ−ブチル（Ｅ）−２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）−３−（１，２，３−チアジアゾール−５−イル）アクリレート
2019507753.tif 000032
1Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ ＝ ９．４５ （ｓ， １Ｈ）， ８．５１ （ｓ， １Ｈ）， ８．２７ （ｓ， １Ｈ）， ８．０３ − ７．９６ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５２ − ７．４５ （ｍ， ４Ｈ）， ７．４３ − ７．３１ （ｍ， ３Ｈ）， ７．３０ − ７．２２ （ｍ， １Ｈ）， ６．７０ （ｓ， １Ｈ）， ４．４３ （ｓ， ２Ｈ）， １．４８ （ｓ， ９Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ ＝ １６４．３５， １５９．０３， １４７．８５， １４４．４４， １４３．６１， １３６．９０， １３６．８７， １３６．４２， １３５．８０， １３３．０５， １２９．０７， １２８．８５， １２８．７４， １２８．５４， １２６．８１， １２６．０９， １０４．１８， ８２．１０， ４０．３４， ２７．８７；ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ２６Ｈ２６Ｎ５Ｏ２Ｓ）実測値４７２
ｔｅｒｔ−ブチル２−（（３−ベンジル−５−フェニルピラジン−２−イル）アミノ）−３−（１，２，３−チアジアゾール−５−イル）プロパノエート
2019507753.tif 000033
1Ｈ ＮＭＲ （３００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ ＝ ８．４２ （ｓ， １Ｈ）， ７．９９ − ７．９３ （ｍ， ２Ｈ）， ７．５１ − ７．４２ （ｍ， ３Ｈ）， ７．４１ − ７．２３ （ｍ， ６Ｈ）， ５．４１ （ｄ， Ｊ＝６．６， １Ｈ）， ５．００ （ｄｔ， Ｊ＝５．０， ６．５， １Ｈ）， ４．１９ （ｄｄ， Ｊ＝１５．２， ５８．４， ２Ｈ）， ３．８２ − ３．６２ （ｍ， ２Ｈ）， １．３６ （ｓ， ９Ｈ）；13Ｃ ＮＭＲ （７５ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ3） δ ＝ １７０．５２， １５８．４１， １４９．８７， １４１．２６， １４１．１２， １３７．３８， １３６．９１， １３６．８７， １３２．９５， １２９．０２， １２８．８１， １２８．７８， １２７．８８， １２７．０１， １２５．６５， ８２．６０， ５３．９２， ４０．９８， ３０．０６， ２７．８３；ＥＳＩ−ＭＳ （ｍ／ｚ） ［Ｍ＋Ｈ］ （Ｃ２６Ｈ２８Ｎ５Ｏ２Ｓ）実測値４７４．
【００９７】
以下の化合物は、前記方法ＩＩ及びＩＩＩによって製造した。収率は、中間体Ｃから開始する４段階手順で算出した。
【表４】
2019507753.tif 000034
化合物は、ＮａＢＨ4による最終還元ステップを排除したこと以外は、方法ＩＩによって製造した。
【００９８】
そのため、複数の合成方法論が確立されたが、これらの方法の作用域及び効用は、Ｒ1位に多様な置換基を有する式（Ｉ）の化合物を合成することによって実証された。先に示したように、電子吸引性置換基を有する芳香族基、電子供与性置換基を有する芳香族基、立体的に厳しい基、及び極性複素環モチ−フはいずれも、これら新規方法のうち一つを用いて合成するのに適している。
【００９９】
実施例５．発光特性
発光アッセイ手順：スクリーニングしようとする化合物をそれぞれ、ＤＭＳＯ（５ｍＭ）に溶解した後、さらにＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液で１００ｕＭまで希釈した。次に、希釈した基質をそれぞれ、精製ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼと等体積で混合してＣＯ2非依存培地＋１０％ＦＢＳで希釈した。各基質の初期光出力は、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）マルチ＋ルミノメーターで、基質の添加３分後及びその後、信号半減期を求める手法として５分間の間隔をあけて測定した。
【０１００】
合成されたセレンテラジン類似体（式（Ｉ）の化合物）の一部について、ルシフェラーゼ基質としての適合性を評価した。ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）ルシフェラーゼをスクリーニングに用いたが、これは、小さくて（１９ｋＤａ）、安定で、しかも特に明るい酵素であるためである。表２は、相対的発光量（ＲＬＵ）及び半減期デ−タ（天然セレンテラジンとの対比）が、中程度の電子供与性及び電子吸引性官能基で十分な耐容性があることを示すことを実証している。様々なピリジニル基も全体耐容性を示し、かなりの数がセレンテラジンよりも優れていることを実証した。全体的に、かなりの数の類似体が、発光する点でセレンテラジンよりも優れていた。
【表５】
2019507753.tif 000035
【０１０１】
式（Ｉ）の化合物はさらに、追加アッセイにおいてルシフェラーゼ基質である可能性についても評価した。このアッセイでは、前記類似体を、既知のセレンテラジン類似体であって、ルシフェラーゼ基質としてセレンテラジンよりも優れていることが知られている８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン（Ｃ−１）と比較した。表３は、かなりの数の類似体が耐容性を示し、しかも８−ベンジル−２−（フラン−２−イルメチル）−６−フェニルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３（７Ｈ）−オン）と同等またはより良好に機能することを実証している。
【表６】
2019507753.tif 000036
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2019507753.tif 000038
【０１０２】
実施例６．細胞透過性及び生物発光活性
細胞培養：ＨｅＬａ細胞及びＨＥＫ２９３細胞を、グルタミン０．３ｍｇ／ｍｌ、ペニシリン１００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ及び１０％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥＭ中、３７℃において５％ＣＯ2中で保持した。ダルベッコ変法イ−グル培地（ＤＭＥＭ）、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、ペニシリン／ストレプトマイシン及びトリプシン−ＥＤＴＡは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ）から入手した。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、ＨｙＣｌｏｎｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から入手した。マイクロタイタ−プレートは、Ｃｏｒｎｉｎｇから入手した。
【０１０３】
細胞ベースのルシフェラーゼアッセイ：ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）ルシフェラーゼをＣＭＶプロモ−タ−の支配下で安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、白色のＴＣ処理済９６ウェルプレートのウェル中の成長培地（１０％ＦＢＳを追加したＤＭＥＭ）１００μｌに、ウェル当たり細胞１００００個の密度で蒔いて、２４時間培養した。成長培地をその後、前記基質１２．５μＭを含有するＯｐｔｉＭＥＭ  １００μｌと置き換えた。基質の追加直後に、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅマルチモ−ド検出プレート読み取り装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて発光シグナルを解析した。
【０１０４】
特定の化合物（６４〜７７）の細胞透過性及び生物発光活性を、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）ルシフェラーゼを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を用いてセレンテラジンと比較して求めた（図１）。試験した化合物のうち大部分は、セレンテラジンと同等またはそれより強い発光シグナルを示し、また、少なくとも６つは、セレンテラジンよりも大幅な増加（５倍超）を示した。さらに、セレンテラジンとのシグナル強度比較による化合物の等級序列からも、生化学的アッセイと細胞ベースのルシフェラーゼアッセイとの間に強い相関関係が示された（図２）。合わせて前記結果は、試験した類似体が生体膜を自由に透過できて、生細胞内で良好な生物発光活性を示すことも示唆している。
【０１０５】
実施例７．細胞生存率
細胞生存率アッセイ；ＨＥＫ２９３細胞またはＨｅＬａ細胞を、白色のＴＣ処理済９６ウェルプレートのウェル中の成長培地（１０％ＦＢＳを追加したＤＭＥＭ）１００μｌに、ウェル当たり細胞１００００個の密度で蒔いて、２４時間培養した。成長培地をその後、前記化合物の段階希釈物を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地１００μｌと置き換えた。次に、２４時間培養後にＣＥＬＬＴＩＴＥＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、製造者指示書に従って細胞生存率の変化を測定した。発光測定はいずれも、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）Ｄｉｓｃｏｖｅｒマルチモ−ドプレート読み取り装置（Ｐｒｏｍｅｇａ）で行った。
【０１０６】
ＨｅＬａ細胞（図３及び４）及びＨＥＫ２９３細胞（図５及び６）における化合物誘導型細胞毒性の評価からは、２つの異なる細胞株全体で基質毒性パターンに根本的な違いがないことが分かった。興味深いことに、フッ素化化合物６５〜６８は一般に、セレンテラジンと比べると、両方の細胞株における毒性が低いことが実証された。その上、化合物７６はさらに、いずれの細胞株においても毒性が特に低く、また、細胞ベースのアッセイではより高濃度の基質を使用してよいことが示された。
【０１０７】
前述の発明の詳細な説明及び添付の実施例は、単なる例示であって、本発明の範囲を制限するものと解されるべきではなく、それは添付の請求項及びその均等物によってのみ定義されるものであることが理解される。
【０１０８】
開示された実施形態に対する様々な変更及び修正は当業者に自明であろう。かかる変更及び修正は、限定されないが、化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、組成物、配合物、または本発明の使用方法を包含するものであって、その趣旨及び範囲を逸脱することなく実行可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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