(57)【要約】  本発明は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合することができる抗体分子およびそれらの機能的断片、それらの製造プロセス、およびそれらの治療用途に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合することができる抗体またはその機能的断片であって、（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号２に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＬドメインと、（ｉｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号５に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨドメインと、を含む、抗体または機能的断片。
【請求項２】
（ｉ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＬドメインと、（ｉｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨドメインと、を含む、請求項１に記載の抗体または機能的断片。
【請求項３】
（ｉ）１００ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＴＮＦαに結合し、
（ｉｉ）Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）ＴＮＦαおよびＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＴＮＦαと交差反応性であり、
（ｉｉｉ）Ｌ９２９アッセイによって測定された場合、インフリキシマブよりも高いＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害する効力を有し、
（ｉｖ）示差走査型蛍光測定法によって測定された、少なくとも７０℃の融解温度を有する可変ドメインを含み、かつ／または
（ｖ）少なくとも２の化学量論比（抗体：ＴＮＦαＴｒｉｍｅｒ）でヒトＴＮＦαＴｒｉｍｅｒに結合することができる、請求項１または２に記載の抗体または機能的断片。
【請求項４】
ヒトＴＮＦαに７０ｐＭ未満のＫＤで結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片。
【請求項５】
前記抗体または機能的断片が、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片。
【請求項６】
前記抗体または機能的断片が、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片。
【請求項７】
一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の機能的断片。
【請求項８】
前記ｓｃＦｖは、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の機能的断片。
【請求項９】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項８に記載の機能的断片と本質的に同じエピトープに結合する抗体またはその機能的断片。
【請求項１１】
（ｉ）配列番号３１〜３３を有する、それぞれのヒトＶκ１コンセンサス配列とは異なる前記抗体または機能的断片の前記可変軽鎖ドメインのフレームワーク領域Ｉ〜ＩＩＩ中のアミノ酸の数と、（ｉｉ）配列番号３４〜３７から選択される、最も類似したヒトλ生殖系列配列とは異なる前記抗体または前記機能的断片の前記可変軽鎖ドメインのフレームワーク領域ＩＶ中のアミノ酸の数との合計が、７未満、好ましくは４未満である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片。
【請求項１２】
前記抗体または機能的断片の前記可変軽鎖ドメインの前記フレームワーク領域Ｉ〜ＩＩＩは、それぞれ配列番号３１〜３３を有する前記ヒトＶκ１コンセンサス配列からなり、および前記フレームワーク領域ＩＶは、配列番号３４〜３７から選択される前記λ生殖系列配列からなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の前記抗体または機能的断片をコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含むベクターまたはプラスミド。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸、または請求項１４に記載のベクターもしくはプラスミドを含む細胞。
【請求項１６】
前記抗体または機能的断片をコードする前記核酸を発現させ得る条件下で、請求項１５に記載の細胞を培地で培養することと、前記抗体または機能的断片を前記細胞または前記培地から回収することと、を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片を調製する方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の前記抗体または機能的断片、ならびに任意により薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１８】
炎症性障害またはＴＮＦα関連障害を治療する方法における使用のための請求項１〜１２のいずれか一項に定義されている抗体または機能的断片。
【請求項１９】
前記炎症性障害が胃腸管の炎症性障害である、請求項１８に記載の使用のための抗体または機能的断片。
【請求項２０】
前記胃腸管の前記炎症性障害が炎症性腸疾患である、請求項１９に記載の使用のための抗体または機能的断片。
【請求項２１】
前記胃腸管の前記炎症性障害がクローン病または潰瘍性大腸炎である、請求項１９または２０に記載の使用のための抗体または機能的断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合することができる抗体分子およびそれらの機能的断片、それらの製造プロセス、およびそれらの治療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦαは、免疫系の細胞によって放出され、免疫系の細胞と相互作用するホモ三量体の炎症促進性サイトカインである。ＴＮＦαは、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、および多発性硬化症などの慢性疾患など、複数のヒト疾患においてアップレギュレーションされることもわかっている。
【０００３】
ＴＮＦαに対する抗体は、エンドトキシンショックの予防および治療のために提唱されている（Ｂｅｕｔｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４，４７０−４７４，１９８５）。Ｂｏｄｍｅｒら（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２１，Ｓ４４１−Ｓ４４６，１９９３）およびＷｈｅｒｒｙら（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２１，Ｓ４３６−Ｓ４４０，１９９３）は、敗血症性ショックの治療における抗ＴＮＦα抗体の治療可能性を議論している。敗血症性ショックの治療における抗ＴＮＦα抗体の使用は、Ｋｉｒｓｃｈｅｎｂａｕｍら（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２６，１６２５−１６２６，１９９８）によっても議論されている。コラーゲン誘発性関節炎は、抗ＴＮＦαモノクローナル抗体（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、（ＰＮＡＳ−ＵＳＡ，８９，９７８４−９７８８，１９９２））を用いて、効果的に治療することができる。
【０００４】
慢性関節リウマチおよびクローン病の治療における抗ＴＮＦα抗体の使用は、Ｆｅｌｄｍａｎら（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ，３０，４１２６−４１２７，１９９８）、Ａｄｏｒｉｎｉら（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，１８，２０９−２１１，１９９７）、およびＦｅｌｄｍａｎら（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６４，２８３〜３５０，１９９７）において議論されている。このような治療において以前に使用されたＴＮＦαに対する抗体は、一般に、キメラ抗体であり、例えば、米国特許第５，９１９，４５２号に記載されているものなどである。
【０００５】
ＴＮＦαに対するモノクローナル抗体は、先行技術において記載されている。Ｍｅａｇｅｒら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６，３０５−３１１，１９８７）は、組換えＴＮＦαに対するマウスモノクローナル抗体を記載している。Ｆｅｎｄｌｙら（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６，３５９−３７０，１９８７）は、ＴＮＦ上の中和エピトープを規定する際の組換えＴＮＦαに対するマウスモノクローナル抗体の使用について記載している。さらに、国際特許出願９２／１１３８３号には、ＴＮＦαに特異的なＣＤＲグラフト化抗体を含む組換え抗体が開示されている。Ｒａｎｋｉｎら（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，３４，３３４−３４２，１９９５）は、慢性関節リウマチの治療におけるこのようなＣＤＲグラフト化抗体の使用について記載している。米国特許第５，９１９，４５２号は、ＴＮＦαの存在に関連する病状の治療における抗ＴＮＦαキメラ抗体およびそれらの使用を開示する。さらなる抗ＴＮＦα抗体は、Ｓｔｅｐｈｅｎｓら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８５，６６８−６７４，１９９５）、独国特許２４６  ５７０（Ａ２）号、独国特許２９７  １４５（Ａ２）号、米国特許第８，６７３，３１０号、米国特許第２０１４／０１９３４００号、欧州特許第２  ３９０  ２６７（Ｂ１）号、米国特許第８，２９３，２３５号、米国特許第８，６９７，０７４号、国際特許出願２００９／１５５７２３（Ａ２）号、および国際特許出願２００６／１３１０１３（Ａ２）号に開示されている。
【０００６】
先行技術の組換え抗ＴＮＦα抗体分子は、一般に、超可変領域またはＣＤＲが由来する抗体と比較して、ＴＮＦαに対して低い親和性を有する。現在市販されているＴＮＦαの阻害剤はすべて、ボーラス注射として週に１回またはそれ以上の間隔で静脈内または皮下に投与され、結果として開始濃度が高くなり、次の注射まで確実に減少する。
【０００７】
現在承認されている抗ＴＮＦα生物療法剤としては、（ｉ）インフリキシマブ、キメラＩｇＧ抗ヒトモノクローナル抗体（レミケード（登録商標）；Ｗｉｅｋｏｗｓｋｉ  Ｍら：「インフリキシマブ（レミケード）」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００７−０１−０１、ｐ．８８５−９０４）、（ｉｉ）エタネルセプト、ＴＮＦＲ２二量体融合タンパク質、ＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））、（ｉｉｉ）アダリムマブ、完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）；Ｋｕｐｐｅｒ  Ｈら：「アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）」、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ；Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、２００７−０１−０１，ｐ．６９７−７３２）、（ｉｖ）セルトリズマブ、ＰＥＧ化されたＦａｂ断片（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）；Ｍｅｌｍｅｄ  ＧＹら：「Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ；Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ,Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，ＧＢ、第７巻、第８号、２００８−０８−０１、ｐ．６４１−６４２）、（ｖ）ゴリムマブ、ヒトＩｇＧ１Ｋモノクローナル抗体（Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）；Ｍａｚｕｍｄａｒ  Ｓら；「ゴリムマブ」、ｍＡｂｓ、Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳ、第１巻、第５号，２００９−０９−０１，ｐ．４２２−４３１）が挙げられる。しかし、様々なバイオシミラーが開発中であり、Ｒｅｍｓｉｍａとして知られているインフリキシマブ模倣物は既に欧州で承認されている。
【０００８】
インフリキシマブは、ＴＮＦαに対して比較的低い親和性（ＫＤ＞０．２ｎＭ；Ｗｅｉｒら、２００６，Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：５３５）を有し、かつＬ９２９アッセイにおいて限定された中和効力を有する。さらに、インフリキシマブは、カニクイザルまたはアカゲザル由来のＴＮＦαとの交差反応性を実質的に示さない。しかし、抗ＴＮＦα抗体については、サル由来のＴＮＦαとの交差反応性が非常に望ましく、これにより、霊長類を用いた動物試験が可能になるためであり、多くの面でヒトの状況を反映する。
【０００９】
エタネルセプトは、二価分子であるが、１つのエタネルセプト分子当たり１つの三量体の比率でＴＮＦαに結合し、大きい抗原−生物学的治療複合体の形成を妨げる（Ｗａｌｌｉｓ，２００８，Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ８：６０１）。これが単球におけるＬＰＳ誘発サイトカイン分泌を阻害することはない（Ｋｉｒｃｈｎｅｒら，２００４，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，２８：６７）。
【００１０】
アダリムマブの効力は、インフリキシマブの効力に類似している。アダリムマブのもう一つの欠点は、例えば、熱アンフォールディング試験で決定されるように、安定性が乏しいことである。こうした試験におけるアダリムマブの融解温度（Ｔｍ）は６７．５℃であると測定された。しかし、抗体のＴｍ値が低いほど、一般的な安定性は低い。低Ｔｍでは、例えば経口投与のための抗体の医薬用途への適合性が低下する。
【００１１】
セルトリズマブの効力は、インフリキシマブの効力よりわずかに高いが、それでも満足できるものではない。セルトリズマブは、ＭＬＲにおいてＴ細胞の増殖を阻害することはない（Ｖｏｓら、２０１１，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１４０：２２１）。
【００１２】
欧州明細書第２６２３５１５（Ａ１）号は、ヒト化抗ＴＮＦα抗体およびそれらの抗原結合断片（Ｆａｂ）を開示している。開示された実施例から明らかになるように、得られたヒト化Ｆａｂ断片の効力は、Ｌ９２９中和アッセイにおいてインフリキシマブの効力に匹敵する（表２および５参照）。交差反応性について試験した唯一の抗ＴＮＦαＩｇＧ抗体は、アカゲザルＴＮＦ−αに弱く結合するのみである（［００６９］；図３参照）。カニクイザルＴＮＦαとの交差反応性は試験しなかった。さらに、ヒトＴＮＦβとの弱い結合が存在する（図３参照）。したがって、欧州特許第２６２３５１５（Ａ１）号は、インフリキシマブの効力よりも高いＬ９２９細胞におけるＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害する効力を有し、アカゲザルＴＮＦαおよびカニクイザルＴＮＦαと交差反応性である抗ＴＮＦα抗体またはそれらの機能的断片を開示していない。
【００１３】
国際出願第２０１２／００７８８０（Ａ２）号は、１つ以上の標的（例えば、ＴＮＦα）、リンカー、および１つ以上のポリマー分子に結合する、１つ以上の単一抗原結合ドメインを含む融合タンパク質の形態にある修飾単一ドメイン抗原結合分子（ＳＤＡＢ）について開示している。示された唯一の具体例は、ＳＤＡＢ−０１と呼ばれ、柔軟なリンカーと連結させたＴＮＦαに結合する２つの抗原結合ドメイン、および部位特異的ＰＥＧ化を支持するＣ末端システインを含む（図３参照）。国際出願第２０１２／００７８８０（Ａ２）号では、Ｌ９２９細胞を用いた中和アッセイにおいて、インフリキシマブなどの既知のＴＮＦα抗体に対するＳＤＡＢ−０１の効力を比較することができないか、またはＴＮＦα−ＴＮＦＲＩ／ＩＩ相互作用およびＴＮＦβに対するＴＮＦαの結合選択性をブロックする有効性などの他のＳＤＡＢ−０１特異的パラメータを評価することができない。ヒトＴＮＦαが過剰発現する多発性関節炎トランスジェニックマウスモデル（５４頁、実施例８を参照されたい）において、ＳＤＡＢ−０１およびインフリキシマブを用いた治療を比較するアッセイにおいて、そのうちの２つが関節炎のさらなる発現を予防するのに同様に有効であると考えられる（例えば、図１７および図１８）。しかし、ＳＤＡＢ−０１の分子量がインフリキシマブの分子量の半分未満であるために、この実施例での用量は誤解を招くことになる。したがって、国際公開第２０１２／００７８８０（Ａ２）号では、インフリキシマブの効力よりも高い、Ｌ９２９細胞においてＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害する効力を有する抗ＴＮＦα抗体については開示していない。
【００１４】
国際出願第２０１５／１４４８５２（Ａ１）号では、「ｓｃＦｖ１」と命名された抗ＴＮＦ−αｓｃＦｖの特性を調べている。このｓｃＦｖは、ＰＫ−１５細胞アッセイにおいて、インフリキシマブのＴＮＦα中和能に匹敵するＴＮＦα中和能を示した（［０２３６］参照）。さらに、ｓｃＦｖは、アカゲザルおよびカニクイザル由来のＴＮＦ−αに対してある程度の交差反応性を有すると考えられる（実施例８を参照されたい）。国際出願第２０１５／１４４８５２（Ａ１）号には親和性データは報告されていない。しかし、中程度の親和性のみ有することがわかっている一本鎖抗体断片ＤＬＸ１０５（ＥＳＢＡ１０５としても公知である）（ＫＤ＝１５７ｐＭ（Ｕｒｅｃｈら、２０１０  Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６９：４４３を参照されたい）は、ｓｃＦｖ１よりもＴＮＦαへのより良好な結合を示す（国際出願第２０１５／１４４８５２（Ａ１）号の図１参照）。したがって、国際公開第２０１５／１４４８５２（Ａ１）号では、ヒトＴＮＦαに対して高い親和性を有する抗ＴＮＦ−α抗体（ＫＤ＜１００ｐＭ）については開示していない。
【００１５】
国際公開第２０１５／０６５９８７（Ａ１）号には、抗ＴＮＦ−α抗体、抗ＩＬ−６抗体、および両方の抗原に結合する二重特異性抗体が記載されている。ある種の抗ＴＮＦα抗体は、カニクイザル由来のＴＮＦαとある程度の交差反応性を示した（図１７）。しかし、抗ＴＮＦα抗体は、Ｌ９２９中和アッセイにおいてインフリキシマブよりも有意に低い効力を呈した（［０１５２］図５）。したがって、国際公開第２０１５／０６５９８７（Ａ１）号では、インフリキシマブの効力よりも高い、Ｌ９２９細胞においてＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害する効力を有する抗ＴＮＦα抗体については開示していない。
【００１６】
Ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｒ＆Ｄ（第４巻、第３号、２００３年、１７４−１７８頁）では、高親和性を有するモノクローナル抗ＴＮＦα抗体であるヒト化抗体「Ｈｕｍｉｃａｄｅ」（ＣＤＰ５７１；ＢＡＹ１０３３５６）を開示している。しかし、Ｌ９２９細胞においてＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害するＨｕｍｉｃａｄｅの効力は制限されていると考えられる（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１９９６７９（Ａ１）号［０１８９］参照）。したがって、参考文献は、インフリキシマブの効力よりも高い、Ｌ９２９細胞においてＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害する効力を有する抗ＴＮＦ−α抗体については開示していない。
【００１７】
Ｓａｌｄａｎｈａ  Ｊ  Ｗら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉ：Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ」（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，第６章，２００７年１月１日，ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１１９−１４４頁）には、ＣＤＲグラフト化、リサーフェシング／ベニヤリング（Ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、ＳＤＲ転送、除染技術などのモノクローナル抗体のヒト化に対する異なる戦略が開示されている。
【００１８】
炎症性腸疾患などの慢性炎症性疾患を治療するための改善された抗体分子が必要とされている。抗体分子は、（ｉ）ヒトＴＮＦαに対する高親和性（すなわち、ＫＤ＜１００ｐＭ）、（ｉｉ）Ｌ９２９細胞においてＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害する高い効力、（ｉｉｉ）カニクイザルおよびアカゲザル由来のＴＮＦαに対する実質的な親和性（例えば、ＫＤ＜１ｎＭ）、および（ｉｖ）熱アンフォールディング実験で決定される可変ドメインの高融解温度（例えば、Ｔｍ＞７０℃）、を少なくとも有するものとする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本出願の発明者らは、特定の抗ＴＮＦα抗体およびそれらの機能的断片が、ヒトＴＮＦαに対する高親和性（ＫＤ＜１００ｐＭ）、インフリキシマブの効力よりも高い、Ｌ９２９細胞においてＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害する効力、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）および／またはアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）などの動物由来のＴＮＦαに対する実質的な親和性（ＫＤ＜１ｎＭ）などの好ましい特性の組み合わせを呈することを見出した。さらに、抗体およびそれらの機能的断片は、可変ドメインの熱アンフォールディングアッセイで決定されるように、ＴＮＦβに有意に結合せず、有意な安定性を呈するという点でＴＮＦαに特異的であった。
【００２０】
本発明は、抗体分子およびそれらの機能的断片を提供する。
【００２１】
従って、本発明は、下記（１）〜（４７）に記載の項目に定義された主題に関する：
（１）ヒト腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）に結合することができる抗体またはその機能的断片であって、（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号２に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＬドメインと、（ｉｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号５に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨドメインと、を含む、抗体またはその機能的断片、
（２）項目（１）の抗体または機能的断片であって、（ｉ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＬドメインと、（ｉｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨドメインと、を含む、抗体または機能的断片、
（３）抗体または機能的断片が、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む、項目（１）または（２）に記載の抗体または機能的断片、
（４）配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、好ましくは配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、ＶＬドメインを含む、項目（１）〜（３）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（５）ヒトＴＮＦαに特異的に結合する、項目（１）〜（４）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（６）抗体または機能的断片がＴＮＦβに有意に結合しない、項目（１）〜（５）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（７）
（ｉ）１００ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）でヒトＴＮＦαに結合し、
（ｉｉ）Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａＴＮＦαおよびＭａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓＴＮＦαと交差反応性であり、
（ｉｉｉ）Ｌ９２９アッセイによって測定された場合、インフリキシマブよりも高い効力を有し、かつ／または
（ｉｖ）少なくとも２の化学量論比（抗体：ＴＮＦαＴｒｉｍｅｒ）でヒトＴＮＦαＴｒｉｍｅｒに結合することができる、項目（１）〜（６）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（８）ヒトＴＮＦαに７５ｐＭ未満のＫＤで結合する、項目（１）〜（７）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（９）Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ由来のＴＮＦαに１ｎＭ未満のＫＤで結合する、項目（１）〜（８）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（１０）Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ由来のＴＮＦαに１ｎＭ未満のＫＤで結合する、項目（１）〜（９）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（１１）Ｌ９２９アッセイで決定されたインフリキシマブの効力（相対効力）に対して、ＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害する抗体または機能的断片の効力が５より高く、相対効力は、Ｌ９２９アッセイにおいてインフリキシマブのＩＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）とＬ９２９アッセイにおけるｓｃＦｖフォーマットの抗体のＩＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）との比である、項目（１）〜（１０）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（１２）示差走査型蛍光測定法によって決定されたｓｃＦｖフォーマットの抗体の可変ドメインの融解温度が少なくとも６５℃である、項目（１）〜（１１）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（１３）示差走査型蛍光測定法によって決定されたｓｃＦｖフォーマットの抗体の可変ドメインの融解温度が少なくとも７０℃である、項目（１）〜（１２）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（１４）示差走査型蛍光測定法によって測定される融解温度が少なくとも７５℃である、項目（１）〜（１３）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（１５）５回連続凍結−融解サイクル後のモノマー含量の損失が０．２％未満である、項目（１）〜（１４）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（１６）４℃で４週間保存後のモノマー含量の損失が１％未満である、項目（１）〜（１５）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（１７）阻害ＥＬＩＳＡで測定した場合に、インフリキシマブの効力に対するヒトＴＮＦαとＴＮＦレセプターＩ（ＴＮＦＲＩ）との間の相互作用をブロックする抗体または機能的断片の効力（相対効力）が、少なくとも１．３であり、相対効力は、インフリキシマブのＩＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）とｓｃＦｖフォーマットにおける抗体のＩＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）との比である、項目（１）〜（１６）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（１８）阻害ＥＬＩＳＡで測定した場合に、インフリキシマブの効力に対するヒトＴＮＦαとＴＮＦレセプターＩＩ（ＴＮＦＲＩＩ）との間の相互作用をブロックする抗体または機能的断片の効力（相対効力）が、少なくとも１．３であり、相対効力は、インフリキシマブのＩＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）とｓｃＦｖフォーマットにおける抗体のＩＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）との比である、項目（１）〜（１７）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（１９）混合リンパ球反応における末梢血単核細胞の細胞増殖を阻害することができる、項目（１）〜（１８）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（２０）ＣＤ１４＋単球からのインターロイキン−１βのＬＰＳ誘発性分泌を阻害することができる、項目（１）〜（１９）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（２１）インターロイキン−１βのＬＰＳ誘発性分泌を阻害するためのＩＣ５０値が１ｎＭ未満である、項目（２０）に記載の抗体または機能的断片、
（２２）モル基準で、インターロイキン−１βのＬＰＳ誘発性分泌を阻害するためのＩＣ５０値が、アダリムマブのＩＣ５０値より低い、項目（２１）に記載の抗体または機能的断片、
（２３）ＣＤ１４＋単球からのＴＮＦαのＬＰＳ誘発性分泌を阻害することができる、項目（１）〜（２２）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（２４）ＴＮＦαのＬＰＳ誘発性分泌を阻害するためのＩＣ５０値が１ｎＭ未満である、項目（２３）に記載の抗体または機能的断片、
（２５）モル基準で、ＴＮＦαのＬＰＳ誘発性分泌を阻害するためのＩＣ５０値が、アダリムマブのＩＣ５０値より低い、項目（２４）に記載の抗体または機能的断片、
（２６）免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である、項目（１）〜（２５）のいずれか一項に記載の抗体、
（２７）一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、項目（１）〜（２５）のいずれか一項に記載の機能的断片、
（２８）ｓｃＦｖが、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択され、好ましくは配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、項目（２７）に記載の機能的断片、
（２９）ダイアボディである、項目（１）〜（２５）のいずれか一項に記載の機能的断片、
（３０）配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインと、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインと、を含み、好ましくは、機能的断片は、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＶＬを含む抗体として、ヒトＴＮＦα上で本質的に同じエピトープに結合する抗体またはその機能的断片であって、特に、上記の項目１〜２９で言及された特徴のうちの１つ以上を呈する、抗体または機能的断片、
（３１）（ｉ）配列番号３１〜３３を有する、それぞれのヒトＶκ１コンセンサス配列とは異なる抗体または機能的断片の可変軽鎖ドメインのフレームワーク領域Ｉ〜ＩＩＩ中のアミノ酸の数（表１０参照）と、（ｉｉ）配列番号３４〜３７から選択される、最も類似したヒトλ生殖系列配列とは異なる抗体または機能的断片の可変軽鎖ドメインのフレームワーク領域ＩＶ中のアミノ酸の数（表１１参照）との合計が、７未満、好ましくは４未満である、項目（１）〜（３０）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（３２）抗体または機能的断片の可変軽鎖ドメインのフレームワーク領域Ｉ〜ＩＩＩは、それぞれ配列番号３１〜３３とのヒトＶκ１コンセンサス配列からなり、およびフレームワーク領域ＩＶは、配列番号３４〜３７から選択されるλ生殖系列配列からなる、項目（１）〜（３２）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、
（３３）項目（１）〜（３２）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片をコードする核酸、
（３４）項目（３３）の核酸を含むベクターまたはプラスミド、
（３５）項目（３４）の核酸、または項目（３３）のベクターもしくはプラスミドを含む細胞、
（３６）抗体または機能的断片をコードする核酸を発現させ得る条件下で、項目（３５）の細胞を培地で培養することと、抗体または機能的断片を細胞または培地から回収することと、を含む、項目（１）〜（３２）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片を調製する方法、
（３７）項目（１）〜（３２）のいずれか一項に記載の抗体または機能的断片、ならびに任意により薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物、
（３８）炎症性疾患またはＴＮＦα関連障害を治療する方法に用いるための項目（１）〜（３２）のいずれか一項に定義されている抗体または機能的断片、
（３９）炎症性障害またはＴＮＦα関連障害が、以下の「治療対象障害」のセクションに列挙される疾患および障害のリストから選択される、項目（３８）に記載の使用するための抗体または機能的断片、
（４０）炎症性疾患が胃腸管の炎症性疾患である、項目（３８）に記載の使用するための抗体または機能的断片、
（４１）胃腸管の炎症性障害が炎症性腸疾患である、項目（４０）に記載の使用するための抗体または機能的断片、
（４２）胃腸管の炎症性障害がクローン病である、項目（４０）または（４１）に記載の使用するための抗体または機能的断片、
（４３）クローン病が、回腸、結腸、回腸結腸、および／または単離上部クローン病（胃、十二指腸、および／または空腸）からなる群から選択され、非狭窄性／非浸透性、狭窄性、浸透性および肛門周囲疾患の挙動などを含み、上記のいずれかの局在化および疾患の挙動の任意の組合せが可能になる、項目（４２）に記載の使用するための抗体または機能的断片、
（４４）胃腸管の炎症性障害が潰瘍性大腸炎である、項目（４０）または（４１）に記載の使用するための抗体または機能的断片、
（４５）潰瘍性大腸炎が、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、左側結腸炎、全大腸型潰瘍性大腸炎、および嚢炎からなる群から選択される、項目（４４）に記載の使用するための抗体または機能的断片、
（４６）胃腸管の炎症性障害が顕微鏡的大腸炎である、項目（４０）または（４１）に記載の使用するための抗体または機能的断片、
（４７）方法が、抗体または機能的断片を対象に経口投与することを含む、項目（３８）〜（４６）のいずれか一項に記載の使用するための抗体または機能的断片。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ヒト化プロセスの概略を示す図である。
【図２】ｓｃＦｖの精製ヒト化ｓｃＦｖ調製物のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である。ｓｃＦｖモノマーは８．４〜９．５分の保持時間で溶出するが、緩衝液成分は＞１０分で溶出する。カラムのデッドボリュームからそれぞれのｓｃＦｖモノマーまでのすべてのピークは、凝集体／オリゴマーとして統合され、相対ピーク面積の計算に使用された。
【図３】３つのｓｃＦｖ構築物のＤＳＦ測定からの熱アンフォールディング曲線を示す図である。各構築物について、重複している測定値が示されている。得られたＴｍ値は、遷移の中間点を得るためにデータをボルツマン方程式に適合させることによって決定されている。
【図４】保存中の３つのｓｃＦｖ構築物のモノマー含量の時間経過を示す図である。ＳＥ−ＨＰＬＣで測定したモノマー含量は、４週間にわたる保存温度４℃、−２０℃および＜−６５℃でプロットした。
【図５】３つのｓｃＦｖ分子に関するＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムのオーバーレイを示す図である。各ｓｃＦｖについて、ｄ０と、４℃で４週間保存した後の試料（１０ｍｇ／ｍＬ）とを示す。さらに、５サイクルの凍結融解後の試料のクロマトグラムを示す。挿入パネルには、各分子についてｙ軸の約１５倍ズームを示し、オリゴマー含量の微小な変化を視覚化している。
【図６】保存中のヒト化ｓｃＦｖのモノマー含量の時間経過を示す図である。１０ｍｇ／ｍＬ試料について、ＳＥ−ＨＰＬＣによって測定したモノマー含量を、３７℃の保存温度で４週間にわたってプロットした。
【図７】３つのｓｃＦｖのＬ９２９アッセイにおけるヒトＴＮＦαを中和する効力を示す図である。各実験について、ｓｃＦｖおよび参照抗体インフリキシマブの用量反応曲線を示す。ｓｃＦｖおよびインフリキシマブの最高濃度、ならびに陰性対照は、増殖の１００％および０％に設定した。
【図８】Ｌ９２９アッセイにおける非ヒト霊長類およびヒトＴＮＦαを中和する２つのｓｃＦｖの効力を示す図である。ヒト、カニクイザル、およびアカゲザルのＴＮＦαの中和に関する用量反応曲線を示す。最高ｓｃＦｖ濃度および陰性対照は、１００％および０％の増殖に設定した。
【図９】ＴＮＦα−ＴＮＦＲＩ相互作用をブロックする２つのｓｃＦｖの効力を示す図である。用量反応曲線が示されている。最高ｓｃＦｖ濃度および陰性対照は、ＴＮＦαのＴＮＦＲＩへの結合の０％および１００％に設定した。
【図１０】ＴＮＦα−ＴＮＦＲＩＩ相互作用をブロックする２つのｓｃＦｖの効力を示す図である。用量反応曲線が示されている。最高ｓｃＦｖ濃度および陰性対照は、ＴＮＦαのＴＮＦＩＩへの結合の０％および１００％に設定した。
【図１１】ｓｃＦｖの標的特異性を示す図である。ビオチン化ＴＮＦαとＴＮＦαおよびＴＮＦβによるｓｃＦｖとの相互作用を阻害する可能性を競合ＥＬＩＳＡによって分析した。ＴＮＦαおよびＴＮＦβの用量依存的効果が示されている。
【図１２】ＳＥ−ＨＰＬＣ（実施例４）によって決定された１７−２２−Ｂ０３−ｓｃＦｖ：ＴＮＦα複合体の形成を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ヒトＴＮＦαに結合することができる抗体またはその機能的断片に関する。
【００２４】
本出願の文脈において、用語「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤクラス（または任意のサブクラス）に属する、そのすべての従来公知の抗体およびそれらの機能的断片を含むタンパク質として定義される「免疫グロブリン」（Ｉｇ）の同義語として用いられる。本発明の文脈において、抗体／免疫グロブリンの「機能的断片」は、抗原結合断片、または上述の項目（１）〜（３０）で言及されているこうした親抗体の１つ以上の特性を本質的に維持する親抗体の他の誘導体として定義される。抗体／免疫グロブリンの「抗原結合断片」は、抗原結合領域を保持する断片（例えば、ＩｇＧの可変領域）として定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には抗体の１つ以上の超可変領域（すなわち、ＣＤＲ−１、−２および／または−３領域）に見出される。本発明の「抗原結合断片」は、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦａｂ断片のドメインを含む。本発明の「機能的断片」には、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディおよびＦｃ融合タンパク質を含む。Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂは、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインとの間で生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小限にするか、または完全に除去するように設計され得る。本発明の抗体または機能的断片は、二重または多機能構築物の一部であってもよい。
【００２５】
本発明における好ましい機能的断片は、ｓｃＦｖおよびダイアボディである。
【００２６】
ｓｃＦｖは、可変軽鎖（「ＶＬ」）ドメインおよび可変重鎖（「ＶＨ」）ドメインがペプチド架橋によって連結されている一本鎖Ｆｖ断片である。
【００２７】
ダイアボディとは、２つの断片からなる二量体であり、それぞれがリンカーなどを介して一緒に連結された可変領域を有し（以下、ダイアボディ形成断片と称する）、典型的には２つのＶＬおよび２つのＶＨを含む。ダイアボディ形成断片には、ＶＬおよびＶＨ、ＶＬおよびＶＬ、ＶＨおよびＶＨなど、好ましくはＶＨおよびＶＬからなる断片が含まれる。ダイアボディ形成断片において、可変領域を連結するリンカーは、特に限定されないが、好ましくは、同じ断片中の可変領域間の非共有結合を回避するために十分に短い。そのようなリンカーの長さは、当業者によって適切に決定され得るが、典型的には２〜１４個のアミノ酸、好ましくは３〜９個のアミノ酸、特に４〜６個のアミノ酸である。この場合、同じ断片上にコードされたＶＬおよびＶＨは、同じ鎖上のＶＬとＶＨとの間の非共有結合を回避するように、かつ一本鎖可変領域断片の形成を回避するように、十分に短いリンカーを介して連結され、これにより別の断片を有する二量体が形成され得るようになる。二量体は、共有結合または非共有結合のいずれか、またはその両方を介して、ダイアボディ形成断片間に形成され得る。
【００２８】
さらに、ダイアボディ形成断片は、リンカーなどを介して連結されて、一本鎖ダイアボディ（ｓｃ（Ｆｖ）２）を形成することができる。ダイアボディ形成断片を約１５〜２０個のアミノ酸の長いリンカーを用いて連結することにより、同じ鎖上に存在するダイアボディ形成断片間に非共有結合が形成されて、二量体を形成することができる。ダイアボディを調製するのと同じ原理に基づいて、三量体または四量体などの重合抗体もまた、３つ以上のダイアボディ形成断片を連結することによって調製することができる。
【００２９】
好ましくは、本発明の抗体または機能的断片は、ＴＮＦαに特異的に結合する。本明細書で使用される場合、抗体または機能的断片が、ヒトＴＮＦαと１つ以上の参照分子との間を識別することができる場合、抗体またはその機能的断片は、ヒトＴＮＦαを「特異的に認識している」または「特異的に結合している」。好ましくは、参照分子の各々への結合についてのＩＣ５０値は、特に実施例２の２．１．４項に記載されるように、ＴＮＦαへの結合についてのＩＣ５０値よりも少なくとも１，０００倍高い。最も一般的な形態（および定義された参照が記載されていない場合）において、「特異的結合」とは、例えば、当技術分野で公知の特異性アッセイ法により測定される場合、ヒトＴＮＦαと非関連生体分子とを区別する抗体または機能的断片の能力を指す。このような方法は、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ試験を含むが、これに限定されない。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実施することができる。典型的には、結合特異性の決定は、単一の参照生体分子ではなく、ミルクパウダー、ＢＳＡ、トランスフェリンなどの約３〜５個の非関連生体分子のセットを使用することによって行われる。一実施形態では、特異的結合は、ヒトＴＮＦαとヒトＴＮＦβとを識別する抗体または断片の能力を指す。
【００３０】
本発明の抗体または本発明の機能的断片は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む。ＶＬドメインは、ＣＤＲ１領域（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ２領域（ＣＤＲＬ２）、ＣＤＲ３領域（ＣＤＲＬ３）、およびフレームワーク領域を含む。ＶＨドメインは、ＣＤＲ１領域（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ２領域（ＣＤＲＨ２）、ＣＤＲ３領域（ＣＤＲＨ３）、およびフレームワーク領域を含む。
【００３１】
用語「ＣＤＲ」は、主に抗原結合に寄与する抗体の可変ドメイン内の６つの超可変領域のうちの１つを指す。６つのＣＤＲの最も一般的に使用される定義の１つは、Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）のＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２）によって提供された。本明細書で使用される場合、ＫａｂａｔのＣＤＲの定義は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、またはＬ１、Ｌ２、Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、またはＨ２、Ｈ３）のみ適用される。しかし、本明細書で使用される場合、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１またはＨ１）は、以下の残基（Ｋａｂａｔ番号付け）によって定義される：位置２６で開始し、位置３６より前に終わる。
【００３２】
ＶＬドメインのＣＤＲ１領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列からなる。好ましくは、ＶＬドメインのＣＤＲ１領域は、配列番号７、配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１９からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。最も好ましくは、ＶＬドメインのＣＤＲ１領域は、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなる。
【００３３】
ＶＬドメインのＣＤＲ２領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列からなる。好ましくは、ＶＬドメインのＣＤＲ２領域は、配列番号８、配列番号１３、および配列番号２０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。最も好ましくは、ＶＬドメインのＣＤＲ２領域は、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる。
【００３４】
ＶＬドメインのＣＤＲ３領域は、配列番号３に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列からなる。好ましくは、ＶＬドメインのＣＤＲ３領域は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列からなる。特定の実施形態では、ＶＬドメインのＣＤＲ３領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなる。
【００３５】
ＶＨドメインのＣＤＲ１領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列からなる。好ましくは、ＶＬドメインのＣＤＲ１領域は、配列番号１０および配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。最も好ましくは、ＶＨドメインのＣＤＲ１領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる。
【００３６】
ＶＨドメインのＣＤＲ２領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列からなる。好ましくは、ＶＨドメインのＣＤＲ２領域は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、および配列番号１５からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。最も好ましくは、ＶＨドメインのＣＤＲ２領域は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなる。
【００３７】
ＶＨドメインのＣＤＲ３領域は、配列番号６に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列からなる。
【００３８】
特定の実施形態では、本発明の抗体または本発明の機能的断片は、（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号２に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号３に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＬドメインと、（ｉｉ）配列番号４に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号５に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号６に示されるアミノ酸配列によるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨドメインと、を含む。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明の抗体または本発明の機能的断片は、（ｉ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＬドメインと、（ｉｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨドメインと、を含む。
【００４０】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体または本発明の機能的断片は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む。別のより好ましい実施形態では、抗体または機能的断片は、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。さらにより好ましい実施形態では、抗体または機能的断片は、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。最も好ましくは、本発明の抗体または本発明の機能的断片は、（ｉ）配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、および（ｉｉ）配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。
【００４１】
特に好ましい実施形態では、機能的断片は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、および配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、好ましくは、ペプチドリンカーによって連結される。ペプチドリンカー（以下、「リンカーＡ」と称する）は、典型的には約１０〜約３０個のアミノ酸、より好ましくは約１５〜約２５個のアミノ酸の長さを有する。リンカーＡは、典型的にはＧｌｙおよびＳｅｒ残基を含むが、他のアミノ酸も可能である。好ましい実施形態では、リンカーは、配列ＧＧＧＧＳ（配列番号３０）の複数の繰り返し、例えば、配列番号３０に示されるアミノ酸配列の２〜６、または３〜５、または４つの連続する繰り返しを含む。最も好ましくは、リンカーＡは、配列番号２９に示されるアミノ酸配列からなる。ｓｃＦｖは、以下の構造を有し得る（Ｎ末端が左、Ｃ末端が右である）：
ＶＬ−ＬｉｎｋｅｒＡ−ＶＨ、または
ＶＨ−ＬｉｎｋｅｒＡ−ＶＬ
【００４２】
最も好ましくは、機能的断片は、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）である。
【００４３】
別の特に好ましい実施形態では、機能的断片は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、および配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含むダイアボディである。ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、ペプチドリンカーによって連結される。ペプチドリンカー（以下、「リンカーＢ」と称する）は、好ましくは約２〜約１０個のアミノ酸、より好ましくは約５個のアミノ酸の長さを有する。リンカーＢは、典型的にはＧｌｙおよびＳｅｒ残基を含むが、他のアミノ酸も可能である。最も好ましくは、リンカーＢは、配列番号３０に示されるアミノ酸配列からなる。
【００４４】
ダイアボディは、好ましくは単一特異的ダイアボディであり、すなわち、１つのエピトープのみに向けられる。ダイアボディは、好ましくはホモ二量体である。ダイアボディは、互いに共有結合していない２つのポリペプチド鎖の二量体であってもよい。各モノマーは、以下の構造を有するポリペプチド鎖であってもよい：
ＶＬ−ＬｉｎｋｅｒＢ−ＶＨ；または
ＶＨ−ＬｉｎｋｅｒＢ−ＶＬ
【００４５】
さらに、ダイアボディ形成断片は、リンカーＡなどを介して連結されて、一本鎖ダイアボディ（ｓｃ（Ｆｖ）２）を形成することができる。ダイアボディ形成断片を約１５〜２０個のアミノ酸の長いリンカーを用いて連結することにより、同じ鎖上に存在するダイアボディ形成断片間に非共有結合が形成されて、二量体を形成することができる。一本鎖ダイアボディの配置の例としては、以下のものが挙げられる。
ＶＨ−ｌｉｎｋｅｒＢ−ＶＬ−ｌｉｎｋｅｒＡ−ＶＨ−ｌｉｎｋｅｒＢ−ＶＬ
ＶＬ−ｌｉｎｋｅｒＢ−ＶＨ−ｌｉｎｋｅｒＡ−ＶＬ−ｌｉｎｋｅｒＢ−ＶＨ
好ましくは、本発明のダイアボディは以下の構造を有する：
ＶＬ−ｌｉｎｋｅｒＢ−ＶＨ−ｌｉｎｋｅｒＡ−ＶＬ−ｌｉｎｋｅｒＢ−ＶＨ
【００４６】
ダイアボディを調製するのと同じ原理に基づいて、三量体または四量体などの重合抗体もまた、３つ以上のダイアボディ形成断片を連結することによって調製することができる。
【００４７】
別の特定の実施形態では、本発明の抗体は免疫グロブリン、好ましくは免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。本発明のＩｇＧのサブクラスは、これに限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が挙げられる。好ましくは、本発明のＩｇＧはサブクラス１である。すなわちＩｇＧ１分子である。
親和性
【００４８】
本発明の抗体または機能的断片は、ヒトＴＮＦαに対して高い親和性を有する。用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指す。典型的には、本発明の抗体または機能的断片は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ装置で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して測定した場合、約２×１０−１０Ｍ未満、好ましくは１．５×１０−１０Ｍ未満、好ましくは１×１０−１０Ｍ未満、最も好ましくは７×１０−１１Ｍ未満、またはさらにそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＴＮＦαに結合する。特に、ＫＤの決定は、実施例２の２．１．１項に記載されているように実施する。
カニクイザルまたはアカゲザル由来のＴＮＦαに対する交差反応性
【００４９】
特定の実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）および／またはアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）などの動物由来のＴＮＦαに対する実質的な親和性を有する。毒性研究などの抗ヒトＴＮＦα抗体の前臨床試験が好ましくはこのような動物で行われるので、これは有利である。したがって、本発明の抗体または機能的断片は、好ましくは、カニクイザルおよび／またはアカゲザルなどの動物由来のＴＮＦαと交差反応性である。親和性の測定は、実施例２の２．１．１項に記載されているように実施する。
【００５０】
一実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ由来のＴＮＦαと交差反応性である。本発明の抗体または機能的断片は、好ましくは、１０倍未満、特に５倍未満、さらにより具体的には２倍未満、さらには１．５倍未満ヒトＴＮＦαに対する親和性とは異なる、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓＴＮＦαに対する親和性を有する。典型的には、本発明の抗体または機能的断片は、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ由来のＴＮＦαと、解離平衡定数（ＫＤ）で結合し、（ｉ）Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ由来のＴＮＦαへの結合のＫＤと（ｉｉ）ヒトＴＮＦαへの結合のＫＤとの比ＲＭ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓが１０未満である。
【数１】
2019512269.tif 000002
【００５１】
ＲＭ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓは、好ましくは５未満、特に２未満、さらにより好ましくは１．５未満である。
【００５２】
別の実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ由来のＴＮＦαと交差反応性である。本発明の抗体または機能的断片は、好ましくは、２０倍未満、より具体的には１０倍未満、さらにより具体的には５倍未満ヒトＴＮＦαとの親和性とは異なる、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ  ＴＮＦαに対する親和性を有する。典型的には、本発明の抗体または機能的断片は、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ由来のＴＮＦαと、解離平衡定数（ＫＤ）で結合し、（ｉ）Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ由来のＴＮＦαへの結合のＫＤと（ｉｉ）ヒトＴＮＦαへの結合のＫＤとの比ＲＭ．ｍｕｌａｔｔａが２０未満である。
【数２】
2019512269.tif 000003
ＲＭ．ｍｕｌａｔｔａは、好ましくは２０未満、特に１０未満、さらにより好ましくは５未満である。
【００５３】
さらに別の実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ由来のＴＮＦαおよびＭａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ由来のＴＮＦαと交差反応性である。本発明の抗体または機能的断片は、好ましくは、１０倍未満、特に５倍未満、さらにより具体的には２倍未満、または１．５倍未満、ヒトＴＮＦαに対する親和性とは異なる、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓＴＮＦαに対する親和性を有し、好ましくは、ヒトＴＮＦαとは２０倍未満、より具体的には１０倍未満、さらにより具体的には５倍未満異なる、Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａＴＮＦαに対する親和性を有する。抗体または機能的断片の比ＲＭ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓは、好ましくは１０未満、特に５未満、さらにより具体的には２未満であり、さらにより具体的には１．５未満、抗体または機能的断片の比ＲＭ．ｍｕｌａｔｔａは、好ましくは２０未満、具体的には１０未満、さらにより具体的には５未満である。
Ｌ９２９細胞のＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害する効力
【００５４】
本発明の抗体または機能的断片は、Ｌ９２９細胞のＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害する高い効力を有する。特定の実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、既知の抗体インフリキシマブよりも高いＬ９２９細胞のＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害する効力を有する。
【００５５】
インフリキシマブに対する効力は、本出願の実施例２の２．１．２項に記載されるＬ９２９アッセイにおいて決定することができる。本発明の抗体または機能的断片の相対効力は、１．５より高く、好ましくは２より高く、より好ましくは３より高く、より好ましくは５より高く、より好ましくは７．５より高く、またはさらに１０より高く、相対効力は、（ｉ）Ｌ９２９アッセイにおけるインフリキシマブのＩＣ５０値と、（ｉｉ）Ｌ９２９アッセイにおける本発明の抗体または機能的断片のＩＣ５０値に対するＩＣ５０値との比であり、ＩＣ５０は、Ｌ９２９細胞のＴＮＦ誘導アポトーシスの最大阻害の５０％を達成するために必要なそれぞれの分子の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。
【００５６】
別の実施形態では、本発明の抗体または機能的断片の相対効力は、１．５より高く、好ましくは２より高く、より好ましくは３より高く、より好ましくは５より高く、より好ましくは７．５より高く、またはさらに１０より高く、相対効力は、（ｉ）Ｌ９２９アッセイにおけるインフリキシマブのＩＣ９０値対（ｉｉ）Ｌ９２９アッセイにおける本発明の抗体または機能的断片のＩＣ９０値の比であり、ＩＣ９０値は、Ｌ９２９細胞のＴＮＦ誘導アポトーシスの最大阻害である９０％を達成するために必要なそれぞれの分子の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。
ＬＰＳ誘発サイトカイン分泌の阻害
【００５７】
本発明の抗体または機能的断片は、単球からのＬＰＳ誘発サイトカイン分泌を阻害することができる。単球からのＬＰＳ誘発サイトカイン分泌は、実施例７に記載のとおり決定することができる。
【００５８】
一実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＣＤ１４＋単球からのインターロイキン−１βのＬＰＳ誘発分泌を阻害することができる。インターロイキン−１βのＬＰＳ誘発分泌を阻害するためのＩＣ５０値は、好ましくは１ｎＭ未満および／または１００ｐｇ／ｍＬ未満であってもよい。モル基準および／または体積当たりの重量基準において、インターロイキン−１βのＬＰＳ誘発分泌を阻害するためのＩＣ５０値は、好ましくはアダリムマブのＩＣ５０値よりも低くてもよい。
【００５９】
別の実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ＣＤ１４＋単球からのＴＮＦαのＬＰＳ誘発分泌を阻害することができる。ＴＮＦαのＬＰＳ誘発分泌を阻害するためのＩＣ５０値は、好ましくは１ｎＭ未満および／または１５０ｐｇ／ｍＬ未満であってもよい。モル基準および／または体積当たりの重量基準において、ＴＮＦαのＬＰＳ誘発分泌を阻害するためのＩＣ５０値は、好ましくはアダリムマブのＩＣ５０値よりも低くてもよい。
細胞増殖の阻害
【００６０】
本発明の抗体または機能的断片は、典型的には、混合リンパ球反応における末梢血単核細胞の細胞増殖を阻害することができる。細胞増殖の阻害は、実施例６に記載のとおり決定することができる。実施例６に従って決定された抗体または機能的断片、例えば本発明のｓｃＦｖまたはダイアボディの刺激指数は、５未満、または４．５未満であってもよい。特定の実施形態では、抗体の刺激指数、例えば本発明のＩｇＧの刺激指数は、４未満または３未満である。
ＴＮＦαとＴＮＦレセプターとの間の相互作用の阻害
【００６１】
典型的には、本発明の抗体または機能的断片は、ヒトＴＮＦαとＴＮＦレセプターＩ（ＴＮＦＲＩ）との間の相互作用を阻害することができる。ヒトＴＮＦαとＴＮＦＲＩとの間の相互作用の阻害は、以下の実施例２の２．１．３項に記載している阻害ＥＬＩＳＡにおいて決定することができる。
【００６２】
インフリキシマブの効力に対する、ヒトＴＮＦαとＴＮＦＲＩとの間の相互作用を阻害する本発明の抗体または機能的断片の効力（相対効力）は、阻害ＥＬＩＳＡにおいて測定された場合、好ましくは少なくとも１．３であり、相対効力は、インフリキシマブのＩＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）と、抗体またはその機能的断片のＩＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）との比である。
【００６３】
典型的には、本発明の抗体または機能的断片は、ヒトＴＮＦαとＴＮＦレセプターＩＩ（ＴＮＦＲＩＩ）との間の相互作用を阻害することができる。ヒトＴＮＦαとＴＮＦＲＩＩとの間の相互作用の阻害は、以下の実施例２の２．１．３項に記載している阻害ＥＬＩＳＡにおいて決定することができる。
【００６４】
インフリキシマブの効力に対する、ヒトＴＮＦαとＴＮＦＲＩＩとの間の相互作用を阻害する本発明の抗体または機能的断片の効力（相対効力）は、阻害ＥＬＩＳＡにおいて測定された場合、好ましくは少なくとも１．３であり、相対効力は、インフリキシマブのＩＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）と、抗体またはその機能的断片のＩＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）との比である。
化学量論比および架橋
【００６５】
本発明の抗体または機能的断片は、典型的には、少なくとも２の化学量論比（抗体：ＴＮＦαＴｒｉｍｅｒ）でヒトＴＮＦαＴｒｉｍｅｒに結合することができる。化学量論比（抗体：ＴＮＦαＴｒｉｍｅｒ）は、好ましくは２超であり、または少なくとも２．５、または少なくとも３である。一実施形態では、化学量論比（抗体：ＴＮＦαＴｒｉｍｅｒ）は、約３である。化学量論比（抗体：ＴＮＦαＴｒｉｍｅｒ）は、以下の実施例４に記載するように決定することができる。
【００６６】
別の実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、ヒトＴＮＦαと複合体を形成することができ、複合体は少なくとも２分子のＴＮＦαおよび少なくとも３分子の抗体または機能的断片を含む。この実施形態による機能的断片は、例えばダイアボディなど、ＴＮＦαのための少なくとも２つの別個の結合部位を含む。複合体の形成は、以下の実施例５に記載するように決定することができる。
【００６７】
一実施形態では、抗体はＩｇＧであり、ＴＮＦαと少なくとも６００ｋＤａの複合体を形成することができる。別の実施形態では、機能的断片はダイアボディであり、ＴＮＦαと少なくとも３００ｋＤａの複合体を形成することができる。
標的選択性
【００６８】
特定の実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は、高い標的選択性を有する、すなわちＴＮＦαとＴＮＦβとを区別することができる。好ましくは、実施例２の２．１．４項に記載の競合ＥＬＩＳＡで測定した場合、ＴＮＦβのＩＣ５０値は、ＴＮＦαのＩＣ５０値よりも少なくとも１，０００倍高い。より好ましくは、実施例２の２．１．４項に記載の競合ＥＬＩＳＡで測定した場合、ＴＮＦβのＩＣ５０値は、ＴＮＦαのＩＣ５０値よりも少なくとも５，０００倍、最も好ましくは少なくとも１０，０００倍高い。
発現収率およびリフォールディング収率
【００６９】
他の実施形態では、本発明の抗体または機能的断片、好ましくはｓｃＦｖまたはダイアボディは、細菌などの微生物、または他の細胞において高収率で組換えにより発現され得る。好ましくは、実施例２に記載したように決定した大腸菌における発現収率は、少なくとも０．２５ｇ／Ｌである。これは特に、ｓｃＦｖなどの機能的断片に適用される。
【００７０】
実施例２に記載されるとおり決定されたリフォールディング収率は、少なくとも５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは少なくとも２０ｍｇ／Ｌである。これは特に、ｓｃＦｖなどの機能的断片に適用される。
安定性
【００７１】
典型的には、本発明の抗体または機能的断片、好ましくはｓｃＦｖまたはダイアボディは高い安定性を有する。安定性は、異なる方法論によって評価することができる。実施例２の２．２．４項に記載されている示差走査型蛍光測定（ＤＳＦ）によって決定された、本発明の抗体または機能的断片の可変ドメインの「融解温度」Ｔｍは、好ましくは少なくとも６５℃、より好ましくは少なくとも６８℃、より好ましくは少なくとも７０℃、最も好ましくは少なくとも７４℃である。本明細書で使用される場合、「可変ドメインの融解温度」とは、配列ＶＬ−ＬｉｎｋｅｒＡ−ＶＨからなるｓｃＦｖの融解温度を意味し、リンカーＡのアミノ酸配列は配列番号２９に示されるアミノ酸配列からなる。例えば、ＩｇＧの可変ドメインの融解温度は、上で定義した対応するｓｃＦｖの融解温度として定義される。
【００７２】
実施例２の２．２．５項に記載の分析用サイズ排除クロマトグラフィで測定した場合、４℃で４週間保存した後のモノマー含量の損失（１０ｇ／Ｌの濃度で、初期モノマー含量＞９５％）は、好ましくは５％未満、より好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満である。実施例２の２．２．５項に記載の分析用サイズ排除クロマトグラフィで測定した場合、−２０℃で４週間保存した後のモノマー含量の損失（１０ｇ／Ｌの濃度で、初期モノマー含量＞９５％）は、好ましくは５％未満、より好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満である。実施例２の２．２．５項に記載の分析用サイズ排除クロマトグラフィで測定した場合、−６５℃で４週間保存した後のモノマー含量の損失（１０ｇ／Ｌの濃度で、初期モノマー含量＞９５％）は、好ましくは５％未満、より好ましくは３％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは０．５％未満である。
【００７３】
実施例２に記載のとおりに測定した場合、５回連続凍結−融解サイクル後のモノマー損失は、５％未満、より好ましくは１％未満、より好ましくは０．５％未満、最も好ましくは０．２％未満、例えば０．１％または０．０％である。
抗体および機能的断片
【００７４】
本発明の特定の実施形態は、本明細書に記載の抗体の機能的断片に関する。機能的断片には、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディおよびテトラボディが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、機能的断片は、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）またはダイアボディである。より好ましくは、ｓｃＦｖまたはダイアボディの非ＣＤＲ配列は、ヒト配列である。
【００７５】
好ましくは、ヒトにおける免疫原性の可能性を最小限にするために、選択されたアクセプター足場は、ヒトコンセンサス配列またはヒト生殖系列配列に由来するフレームワーク領域から構成される。特に、可変軽鎖ドメインのフレームワーク領域Ｉ〜ＩＩＩは、配列番号３１〜３３によるヒトＶκ１コンセンサス配列と、配列番号３４〜３７から選択されるλ生殖系列ベースの配列のフレームワーク領域ＩＶとからなる。ヒトコンセンサスまたはヒト生殖系列残基ではない残基が免疫反応を引き起こす可能性があるので、各可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）におけるこうした残基の数は、できるだけ少なく、好ましくは７未満、より好ましくは４未満、最も好ましくは０であるものとする。
【００７６】
好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、それが産生される方法ではなく、任意の真核生物、原核生物またはファージクローンなどの単一のクローンに由来する抗体を指す。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージ提示技術、またはこれらの組み合わせの使用など、当技術分野で公知の多種多様な技術を用いて調製することができる（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．）。
【００７７】
ヒトにおける抗ＴＮＦα抗体のインビボでの使用に関する実施形態を含む他の実施形態では、キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体、またはヒトの抗体を使用することができる。好ましい実施形態では、抗体はヒト抗体またはヒト化抗体、より好ましくはモノクローナルヒト抗体またはモノクローナルヒト化抗体である。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「キメラ」抗体は、非ヒト免疫グロブリン（例えば、ラットまたはマウス抗体）由来の可変配列、およびヒト免疫グロブリン定常領域（典型的にはヒト免疫グロブリン鋳型から選択される）を有する抗体を指す。キメラ抗体を産生するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９（４７１９）：１２０２−７；Ｏｉら、１９８６年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４−２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓら、１９８５年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、および同４，８１６３９７号を参照されたい。これらは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００７９】
当業者は、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体の他の標的結合サブ配列）などを作製することによって、非ヒト（例えばマウス）抗体をよりヒト様にするために、異なる組換え方法論が利用可能であり、これらは、このような非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む。一般に、得られる組換え抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのうちの実質的にすべてを含み、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのすべてまたは実質的にすべてに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列、特にヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のすべてまたは実質的にすべてに対応する。ＣＤＲグラフト化抗体は、ヒト免疫グロブリン分子から所望の抗原およびフレームワーク（ＦＲ）領域に結合する非ヒト種において最初に生成された抗体由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体分子である（欧州特許第２３９４００号、ＰＣＴ公開国際出願９１／０９９６７、米国特許第５，２２５，５３９号、同５，５３０，１０１号、および同５，５８５，０８９号）。多くの場合、「ヒト化」と呼ばれるプロセスにおいて、ヒトフレームワーク領域内のフレームワーク残基は、抗原結合を変更、好ましくは改善するために、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基でさらに置換される。これらのフレームワーク置換は、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデル化、および特定の位置での異常なフレームワーク残基を同定するための配列の比較などによる、当該分野で周知の方法によって同定される。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９８８年，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−７，およびＱｕｅｅｎら，米国特許第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号（これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。抗体は、例えば、ベニヤリングまたはリサーフェシング（欧州特許第５９２１０６号、同第５１９５９６号、Ｐａｄｌａｎ，１９９１年，Ｍｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ，２８：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、１９９４年、Ｐｒｏｔ，Ｅｎｇ．７：８０５−８１４；Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９６９−９７３、および鎖シャッフリング米国特許第５，５６５，３３２号）など、様々な追加技術を用いてより多くのヒトに行うことができる。これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＣＤＲグラフト化またはヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的には選択されたヒト免疫グロブリン鋳型の少なくとも一部分を含むことができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、Ｑｕｅｅｎら、米国５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、および同第６，１８０，３７０号（これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）に記載されているように調製される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、ヒト抗体である。完全「ヒト」抗ＴＮＦα抗体は、ヒト患者の治療的処置に望ましい可能性がある。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、およびヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、または１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニック動物から単離された抗体を含み、これらは内因性免疫グロブリンを発現しない。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いて上記のファージディスプレイ法を含む、当技術分野で公知の様々な方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号、ならびにＰＣＴ公報国際出願第９８／４６６４５号、国際出願第９８／５０４３３号、国際出願第９８／２４８９３号、国際出願第９８／１６６５４号、国際出願第９６／３４０９６号、国際出願第９６／３３７３５号、および国際出願第９１／１０７４１号に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ヒト抗体はまた、機能的内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて産生することができる。例えば、ＰＣＴ公開国際出願第９８／２４８９３号、国際出願第９２／０１０４７号、国際出願第９６／３４０９６号、国際出願第９６／３３７３５号、米国特許第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８８５，７９３号、同第５，９１６，７７１号、および同第５，９３９，５９８号を参照されたい。これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技術を用いて生成することができる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓら，１９８８年，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：８９９−９０３）。
【００８２】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、霊長類化抗体である。用語「霊長類化抗体」は、サルの可変領域およびヒト定常領域を含む抗体を指す。霊長類化抗体を産生するための方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，６５８，５７０号、同第５，６８１，７２２号、および同第５，６９３，７８０号を参照されたい。これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、誘導体化抗体である。例えば、これらに限定されないが、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への連結などによって修飾された誘導体化抗体（抗体コンジュゲートの考察については以下を参照のこと）。これらに限定されないが、ツニカマイシンの特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、代謝合成などを含む既知の技術によって、多数の化学修飾のいずれかを実施することができる。さらに、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含むことができる。
【００８４】
さらに他の態様では、抗ＴＮＦα抗体は、例えば米国特許第２００７／０２８０９３１号に記載されているように、その超可変領域の１つ以上に挿入された１つ以上のアミノ酸を有する。
抗体コンジュゲート
【００８５】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、例えば、任意のタイプの分子の抗体への共有結合による結合により修飾された抗体コンジュゲートである。これにより、共有結合による結合が、ＴＮＦαへの結合を妨害しないようになる。エフェクター部分を抗体にコンジュゲート結合させる技術は、当技術分野において周知である（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒａｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，第２版，６２３−５３頁（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、編、１９８７年）、Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８、およびＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ８３：６７−１２３を参照されたい）。
【００８６】
１つの例において、抗体またはその断片は、共有結合（例えば、ペプチド結合）を介して、任意によりＮ末端またはＣ末端で、別のタンパク質のアミノ酸配列（またはその一部；好ましくはタンパク質の少なくとも１０、２０または５０個のアミノ酸部分）に融合される。好ましくは、抗体またはその断片は、抗体の定常ドメインのＮ末端で他のタンパク質に連結される。このような融合物を作製するために、例えば国際出願第８６／０１５３３号および欧州特許第０３９２７４５号に記載されているように、組換えＤＮＡ手順を使用することができる。別の例において、エフェクター分子はインビボで半減期を増加させることができる。このタイプの好適なエフェクター分子の例には、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、または国際出願第２００５／１１７９８４号に記載されているようなアルブミン結合化合物が含まれる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、抗ＴＮＦα抗体をポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合させることができる。例えば、抗体が抗体断片である場合、ＰＥＧ部分は、抗体断片に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を介して結合され得る。このようなアミノ酸は、抗体断片中に自然に発生し得るか、または組換えＤＮＡ法を用いて断片中に設計され得る。例えば米国特許第５，２１９，９９６号を参照されたい。複数の部位を用いて、２つ以上のＰＥＧ分子を結合させることができる。好ましくは、ＰＥＧ部分は、抗体断片中に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合により連結される。チオール基が結合点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター部分、例えば、マレイミドおよびシステイン誘導体などのチオール選択的誘導体を使用することができる。
【００８８】
別の例では、抗ＴＮＦα抗体コンジュゲートは、例えば欧州特許第０９４８５４４号に開示された方法に従ってＰＥＧ化された、すなわちそれに共有結合により結合されたＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する修飾Ｆａｂ’断片である。また、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ，１９９７）；およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍ．Ａｓｌａｍ  ａｎｄ  Ａ．Ｄｅｎｔ，（編），Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９８）；およびＣｈａｐｍａｎ，２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：５３１−５４５を参照されたい。
医薬組成物および治療
【００８９】
疾患の治療は、あらゆる臨床段階または症状、疾患の症状もしくは兆候の発症、進展、もしくは憎悪、もしくは悪化の遅延、および／または疾患の重篤度の予防および／もしくは軽減において、疾患の任意の形態を有すると既に診断された患者の治療を包含する。
【００９０】
抗ＴＮＦα抗体またはその機能的断片が投与される「対象」または「患者」は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）などの哺乳動物、または霊長類（例えば、サルもしくはヒト）であってもよい。ある態様では、ヒトは小児患者である。他の態様では、ヒトは成人患者である。
抗ＴＮＦα抗体、および任意により１つ以上の追加の治療剤、例えば以下に記載の第２の治療剤を含む組成物が本明細書に記載される。組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含む無菌の医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、（患者に投与する所望の方法に応じて）任意の好適な形態であり得る。
【００９１】
抗ＴＮＦα抗体および機能的断片は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、局部（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）または局所（ｌｏｃａｌｌｙ）などの様々な経路によって患者に投与することができる。任意の所定の場合の投与のための最も好適な経路は、特定の抗体、対象、および疾患の性質および重症度、ならびに対象の身体的状態に依存する。典型的には、抗ＴＮＦα抗体またはその機能的断片は静脈内投与される。
【００９２】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体または機能的断片は経口投与される。投与が経口経路によるものである場合、機能的断片は、好ましくは一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、またはＩｇＧである。
典型的な実施形態では、抗ＴＮＦα抗体または機能的断片は、０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の静脈内投与を可能にするのに十分な濃度で医薬組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法における使用に好適な抗体または断片の濃度としては、これらに限定されないが、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、または、例えば１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、もしくは１０ｍｇ／ｋｇ〜１８ｍｇ／ｋｇなどの前述のいずれかの間の範囲の濃度が挙げられる。
【００９３】
抗ＴＮＦα抗体または機能的断片の有効用量は、単回（例えば、ボーラス）投与、複数回投与または連続投与につき約０．００１〜約７５０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよく、または単回（例えば、ボーラス）投与、複数回投与または連続投与につき０．０１〜５０００μｇ／ｍＬの血清濃度を達成するような範囲であってもよいか、または処置される状態、投与経路、ならびに対象の年齢、体重、および状態に応じて、その中の任意の有効な範囲または値の範囲であってもよい。特定の実施形態では、各用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重または約３ｍｇ／ｋｇ体重〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。抗体は、水溶液として配合してもよい。
【００９４】
医薬組成物は、用量当たり所定量の抗ＴＮＦα抗体または機能的断片を含有する単位用量形態で便利なように提示することができる。こうした単位は、０．５ｍｇ〜５ｇ、例えば、これらに限定されないが、１ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、１０００ｍｇ、または上記の値の任意の２つの間の任意の範囲、例えば、１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、２０ｍｇ〜５０ｍｇ、または３０ｍｇ〜３００ｍｇを含んでもよい。薬学的に許容される担体は、例えば、処置される状態または投与経路に応じて、多種多様な形態をとることができる。
【００９５】
抗ＴＮＦα抗体またはその機能的断片の有効用量、総用量数および処置期間の決定は、十分に当業者の能力の範囲内であり、また標準用量漸増研究を用いて決定することができる。
【００９６】
本明細書に記載の方法に好適な抗ＴＮＦα抗体および機能的断片の治療用配合物は、所望の純度を有する抗体を、当該技術分野で典型的に使用される任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤、すなわち、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、等張剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、および他の雑多な添加物など（本明細書では、それらのすべてを「担体」と称する）と混合することによって、凍結乾燥配合物または水溶液として保存するために調製することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版（Ｏｓｏｌ（編），１９８０年）を参照されたい。このような添加剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して無毒でなければならない。
【００９７】
緩衝剤は、生理学的条件に近い範囲のｐＨを維持するのに役立つ。これらは、約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在することができる。適切な緩衝剤には、有機酸および無機酸の両方およびそれらの塩、例えば、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸塩緩衝液（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸塩緩衝液（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）、および酢酸緩衝液（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）が挙げられる。さらに、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、およびトリスなどのトリメチルアミン塩を使用することができる。
【００９８】
防腐剤は、微生物増殖を遅らせるために添加することができ、０．２％〜１％（重量／体積）の範囲の量で添加することができる。好適な防腐剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば塩化物、臭化物およびヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、およびメチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノールなどが挙げられる。安定剤としても公知であることのある等張剤は、液体組成物の等張性を確実にするために添加することができ、多価糖アルコール、好ましくはグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトールなどの３価以上の糖アルコールが挙げられる。安定化剤は、増量剤から、治療薬を可溶化する添加剤、または変性もしくは容器壁への付着を防ぐのに役立つ添加剤まで、さまざまな機能となり得る賦形剤の幅広いカテゴリーを指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上記に列挙）、アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン、などのアミノ酸、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクチトール、グリセロールなどの有機糖または糖アルコール（イノシトールなどのシクリトール）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよび硫酸チオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基以下のペプチド）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドン、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなどの単糖類、ラクトース、マルトース、スクロースなどの二糖類、ラフィノースなどの三糖類；およびデキストランなどの多糖類などの親水性ポリマーであってもよい。安定化剤は、活性タンパク質１重量部当たり０．１〜１０，０００重量の範囲で存在してもよい。
【００９９】
非イオン性界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）または界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）（「湿潤剤」としても知られている）を添加して、治療剤の可溶化を助けるとともに、撹拌誘発凝集から治療用タンパク質を保護することができ、これにより、タンパク質の変性を引き起こすことなく、応力が加えられた剪断表面に配合物が曝され得る。好適な非イオン性界面活性剤としては、ポリソルベート（２０、８０など）、ポリオキサマー（１８４、１８８など）、プルロニックポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０など）が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬの範囲、または約０．０７ｍｇ／ｍＬ〜約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で存在することができる。
【０１００】
追加の雑多な賦形剤としては、増量剤（例えばデンプン）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、プロテアーゼ阻害剤、および共溶媒が挙げられる。
【０１０１】
本明細書の配合物はまた、抗ＴＮＦα抗体またはその機能的断片に加えて、第２の治療剤を含んでもよい。好適な第２の治療薬の例を以下に示す。
【０１０２】
投薬スケジュールは、疾患のタイプ、疾患の重症度、および抗ＴＮＦα抗体または機能的断片に対する患者の感受性などの臨床因子の数に応じて、毎日１回から毎月１回まで変化し得る。特定の実施形態では、抗ＴＮＦα抗体またはその機能的断片は、毎日１回、週に２回、週に３回、隔日、５日ごと、１０日ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごともしくは月１回、例えば４日ごとから月１回、１０日ごとから２週間ごと、もしくは週に２〜３回など、上記の値の任意の２つの間の任意の範囲内で投与される。
【０１０３】
投与される抗ＴＮＦα抗体または機能的断片の投与量は、特定の抗体、対象、ならびに疾患の性質および重症度、対象の体調、治療レジメン（例えば、第２の治療剤が使用されるか否か）、および選択された投与経路によって異なり、適切な投薬量は、当業者によって容易に決定され得る。
【０１０４】
当業者であれば、抗ＴＮＦα抗体またはその機能的断片の個々の投薬量の最適な量および間隔は、治療される状態の性質および程度、投与形態、投与経路、および投与部位、ならびに治療される特定の対象の年齢および状態によって決定され、医師が、使用する適切な用量を最終的に決定することは認識するであろう。この投薬は、適切な回数繰り返すことができる。副作用が発現する場合、投薬の量および／または頻度は、正常な臨床診療に従って、変更または減少させることができる。
治療対象障害
【０１０５】
本発明は、本明細書で定義される抗体または機能的断片を対象に投与することを含む、対象におけるヒトＴＮＦα関連疾患を治療または予防する方法に関する。用語「ＴＮＦ関連障害」または「ＴＮＦ関連疾患」は、ＴＮＦαの関与を必要とする症状または疾患状態の任意の障害、発症、進行または持続性を指す。例示的なＴＮＦ関連障害には、これに限定されるものではないが、一般的には炎症の慢性および／または自己免疫状態、一般的には免疫媒介性の炎症性障害、炎症性ＣＮＳ疾患、眼、関節、肌、粘膜、中枢神経系、消化管、尿路、または肺に影響を及ぼす炎症性疾患、一般的なブドウ膜炎の状態、網膜炎、ＨＬＡ−Ｂ２７＋ブドウ膜炎、ベーチェット病、ドライアイ症候群、緑内障、シェーグレン症候群、真性糖尿病（糖尿病性神経障害を含む）、インスリン抵抗性、一般的な関節炎の状態、リウマチ性関節炎、変形性関節症、反応性関節炎およびライター症候群、若年性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、ギランバレー症候群、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症、サルコイドーシス、糸球体腎炎、慢性腎臓病、膀胱炎、乾癬（乾癬性関節炎を含む）、化膿性汗腺炎、皮下脂肪組織炎、壊疽性膿皮症、ＳＡＰＨＯ症候群（滑膜炎、座瘡、膿疱症、骨粗鬆症および骨炎）、座瘡、Ｓｗｅｅｔ症候群、天疱瘡、クローン病（腸外症状を含む）、潰瘍性大腸炎、喘息気管支、過敏性肺炎、一般的なアレルギー、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、ウェゲナー肉芽腫症、川崎病候群、巨細胞性動脈炎、チャーグ−ストラウス血管炎、結節性多発動脈炎、火傷、移植片対宿主病、宿主対移植片反応、臓器移植または骨髄移植後の拒絶エピソード、一般的に血管炎の全身および局所状態、全身性及び皮膚性エリテマトーデス、多発性筋炎および皮膚筋炎、強皮症、子癇前症、急性および慢性膵炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、眼の手術後（例えば、白内障（眼球レンズ置換）または緑内障手術）などの手術後の炎症、関節手術（関節鏡視下手術を含む）、関節関連構造（例えば、靭帯）での手術、口腔および／または歯科手術、低侵襲性心血管手順（例えば、ＰＴＣＡ、アテレクトミー、ステント配置）、腹腔鏡下および／または内視鏡内腹腔内および婦人科的処置、内視鏡泌尿器科処置（例えば、前立腺手術、尿管鏡検査、膀胱鏡検査、間質性膀胱炎）、または、一般に術中の炎症（予防）、水疱性皮膚炎、好中球性皮膚炎、毒性表皮壊死症、膿疱性皮膚炎、脳マラリア、溶血性尿毒症症候群、同種移植片拒絶反応、中耳炎、ヘビ咬傷、結節性紅斑、骨髄異形成症候群、原発性硬化性胆管炎、血清陰性脊椎関節症、自己免疫性溶血性貧血、口腔顔面肉芽腫症、ｐｙｏｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｅｇｅｔａｎｓ、アフタ性口内炎、地図状舌、移動性口内炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ベル麻痺、クロイツフェルト・ヤコブ病、ならびに一般的に神経変性状態が挙げられる。
【０１０６】
癌関連骨破壊、癌関連炎症、癌関連疼痛、癌関連悪液質、骨転移、急性および慢性痛みのほか、ＴＮＦαの中枢作用または末梢作用に起因するかどうか、およびそれらが炎症に分類されるかどうかにかかわらず、侵害受容性または神経障害性の痛み、坐骨神経痛、腰痛、手根管症候群、複合性局所疼痛症候群（ＣＲＰＳ）、痛風、ヘルペス後神経痛、線維筋痛、局所疼痛状態、転移性腫瘍に起因する慢性疼痛症候群、月経不順。
【０１０７】
治療される特定の障害としては、一般に関節炎の状態、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、反応性関節炎、若年性関節炎、乾癬を含む乾癬性関節炎、クローン病などの炎症性腸疾患、直腸炎などの潰瘍性大腸炎、Ｓ状結腸炎、左側大腸炎、広範な大腸炎および膵炎、未確定大腸炎、コラーゲンおよびリンパ球性大腸炎などの顕微鏡的大腸炎、結合組織疾患における大腸炎、転流性大腸炎、憩室疾患の大腸炎、好酸球性大腸炎、および嚢胞性炎が挙げられる。
【０１０８】
最も好ましくは、本発明の抗体または機能的断片は、炎症性腸疾患、特にクローン病、潰瘍性大腸炎、または顕微鏡的大腸炎を治療するために使用される。クローン病は、非狭窄性/非浸透性、狭窄性、浸透性および肛門周囲疾患の挙動などを含む、回腸、結腸、回腸結腸、または単離上部クローン病（胃、十二指腸、および／または空腸）であってもよく、上記のいずれかの局在化および疾患の挙動の任意の組合せが可能である。潰瘍性大腸炎は、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、左側結腸炎、汎潰瘍性大腸炎、および嚢炎であり得る。
併用療法および他の態様
【０１０９】
好ましくは、抗ＴＮＦα抗体またはその機能的断片で治療されている患者は、別の従来の薬剤でも治療される。例えば、炎症性腸疾患患者、特に中等度から重度の疾患を有する場合には、典型的には、メサラジンもしくはその誘導体、またはプロドラッグ、ブデソニド、またはプレドニゾロンなどのコルチコステロイド（経口または静脈内）、免疫抑制剤、例えばアザチオプリン／６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）もしくはメトトレキセート、シクロスポリンもしくはタクロリムスにより治療される。患者に同時投与することができる他の薬剤としては、インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、セトリツマブペゴールなどの生物配合物が挙げられる。患者に同時投与することができるさらなる薬剤としては、安定し、かつより長期の寛解を維持するために、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン／６−ＭＰまたはメトトレキセートまたは経口シクロスポリン）が挙げられる。本発明のさらに別の態様は、炎症を減少させるための上記で定義した抗ＴＮＦα抗体または機能的断片の使用である。
【０１１０】
本発明のさらに別の態様は、炎症状態に罹患している患者の炎症を減少させる際に使用するための、上記に定義した抗ＴＮＦα抗体または機能的断片である。
【０１１１】
本発明のさらなる態様は、炎症状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に、上記に定義した抗ＴＮＦα抗体または機能的断片の有効量を投与することを含む方法である。炎症状態は、好ましくは上記の状態のうちの１つである。
【表１】
2019512269.tif 000004
2019512269.tif 000005
実施例
実施例１：ヒトＴＮＦαに対するウサギ抗体の作製
１．結果
１．１免疫化
【０１１２】
ウサギは、精製組換えヒトＴＮＦαにより免疫化した（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３００−０１Ａ）。免疫化過程の間に、抗原に対するポリクローナル血清抗体の検出可能な結合を依然として作り出した各ウサギの血清に対する最大希釈（力価）を決定することにより、抗原に対する体液性免疫応答の強さを定性的に評価した。固定化組換えヒトＴＮＦαに対する血清抗体力価は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ、２．２．１参照）を用いて評価した。３匹すべてのウサギは、血清の１０×１０６倍希釈で依然として非常に高い力価を示し、ＥＬＩＳＡにて陽性シグナルとなった（バックグラウンド対照として使用された未処置非関連動物由来の血清で得られたシグナルより、少なくとも３倍高かった）。さらに、異なるウサギ血清がＴＮＦαの生物学的活性を阻害する能力を、マウスＬ９２９細胞を用いたアッセイ（２．２．３参照）により評価した。３つの血清すべてが、マウスＬ９２９線維芽細胞のＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害した。ウサギ＃３は、１：１５５，０００の血清希釈で５０％阻害（ＩＣ５０）に達し、最も強い中和活性を示した。ウサギ＃３と比較して、ウサギ＃２およびウサギ＃１は約３および２１倍低い活性を示し、それぞれ１：５５，５００および１：７，２１０の血清希釈で５０％阻害に達した。
【０１１３】
３匹すべての動物の脾臓から単離したリンパ球を、その後のヒット同定手順のために選択した。動物は、Ｌ９２９アッセイにおいて、ＴＮＦαの生物学的活性を阻害する効力に基づいて優先させた。したがって、培養されたヒット数はウサギ＃３由来で最も多く、最も少ないヒット数はウサギ＃１由来であった。
１．２ヒットの同定
１．２．１ヒットの選別
【０１１４】
ヒット同定手順の前に、高親和性ＴＮＦα結合性Ｂ細胞（２．１参照）を特異的に検出して単離することができるフローサイトメトリーに基づく選別手順が開発された。
【０１１５】
全３匹のウサギ由来の合計３３×１０６個のリンパ球（単離された総リンパ球の１．５％に相当）を、２回の独立した選別キャンペーンで特徴付けを行った。ＴＮＦα特異的抗体（ＩｇＧ）を発現する、全３４５２個のＢ細胞のうち、分析した３３×１０６個の細胞の中から単離した。３匹のウサギに関して、クローン化されたリンパ球の数は異なった。これは、Ｌ９２９アッセイにおいて、血清が強いＴＮＦα阻害を示したウサギからより多くの細胞が単離されたためであった。単離されたＢ細胞のうち、７９２個のクローンはウサギ＃１由来であり、１１４４個のクローンはウサギ＃２由来であり、１４０８個のクローンはウサギ＃３由来であった。１０８個のクローンについては、それぞれのウサギ起源は不明である。これは、それらは全３匹のウサギの残存リンパ球の混合物に由来し、バイアルから少量のリンパ球を最適に回収できるためである。
１．２．２ヒットのスクリーニング
【０１１６】
スクリーニング段階の間に得られた結果は、抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の培養上清からの非精製抗体を用いて行われたアッセイに基づいている。これは、高スループット培養の規模では、個々のウサギ抗体を精製することができないためである。このような上清は、結合親和性を除いて絶対値（例えば、ＴＮＦαの生物学的活性の阻害について）とならないように、多数の抗体を互いに対してランク付けするために使用された。ＡＳＣ上清は、組換えヒトＴＮＦαとの結合について高スループットＥＬＩＳＡでスクリーニングした。ＴＮＦα結合上清は、ＥＬＩＳＡ、結合反応動力学により、カニクイザルＴＮＦαへの結合について、またＬ９２９アッセイにおけるヒトＴＮＦαの生物学的活性を中和するそれらの可能性について、さらに特徴付けられた。結合反応動力学を除いて、高スループットスクリーニングの報告値は、単点測定（用量応答なし）に基づく「はい」または「いいえ」の回答として解釈されるべきである。カニクイザルＴＮＦαおよびマウスＴＮＦαに対する親和性は、抗体重鎖および軽鎖可変ドメインの増幅およびシーケンシングのために選択された１０２個の全クローンについて分析した。
１．２．２．１ヒトＴＮＦαへの結合
【０１１７】
一次スクリーニングの目的は、ヒトＴＮＦαに特異的な抗体を産生するＡＳＣクローンを同定することである。この目的のために、ヒトＴＮＦαに対する抗体の存在について、ＥＬＩＳＡにより３４５２個のＡＳＣクローンの細胞培養上清を分析した（２．２．１参照）。使用されるＥＬＩＳＡ法では、組換えヒトＴＮＦαに結合したＩｇＧサブタイプの抗体の「量」を評価するが、抗体の親和性または濃度に関する情報を与えるものではない。このアッセイにおいて、８９４個のＡＳＣクローンの上清は、明らかにバックグラウンドを上回るシグナルを産生した。スクリーニングにおけるヒット率は、ウサギ＃１とウサギ＃２については類似しており、ウサギ＃１で同定された７９２個のうち１５３個（１９．３％）であり、ウサギ＃２で同定された１１４４個のうち２２５個（１９．７％）であった。ウサギ＃３は、３４．４％という著しく高いヒット率を示し、１４０８個のうちの４８４個のヒットが同定された。この一次スクリーニングで同定された８９４個の全ヒットを、ＳＰＲ（二次スクリーニング）による結合反応動力学の測定に供した。
１．２．２．２ＴＮＦα結合反応動力学
【０１１８】
二次スクリーニングの目的は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、２．２．２参照）による一次スクリーニングからの各ヒットに対する標的結合の質に関する定量的情報を得ることである。一次スクリーニング中に使用されるＥＬＩＳＡとは対照的に、この方法では、時間に応じて標的結合の反応動力学を評価する。これは、その標的からの抗体の会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）である速度定数を決定できる。ｋｄ／ｋａ比は、抗体のその標的に対する親和性を反映する平衡解離定数（ＫＤ）を提供する。一次スクリーニングで同定された８９４個のヒットのうち、８３９個のモノクローナルウサギ抗体について、ヒトＴＮＦαに対する結合親和性を決定することができた。残りの５５個の抗体については、ＡＳＣ上清中の抗体濃度がそれぞれの設定においてＳＰＲ装置の検出限界未満であったため、親和性を測定することができなかった。測定することができた８３９個の抗ＴＮＦα抗体は、１．３６×１０−１３Ｍ未満から１．１４×１０−８Ｍ未満の範囲の解離定数（ＫＤ）を示した。分析された全抗体の６９％は、０．５ｎＭ未満のＫＤを有した。
【０１１９】
ウサギ＃２および＃３から同定されたスクリーニングヒットの中央値ＫＤは、２．２１×１０−１０Ｍおよび２．０９×１０−１０Ｍであり、双方が類似しており、ウサギ＃１では中央値ＫＤが４．６５×１０−８Ｍであり、約２倍高い値を示した。中和スクリーニングヒットのみを考慮すると、親和性分布は、中央値ＫＤ（中央値ＫＤは１．４×１０−１０Ｍ〜１．２７×１０−１０Ｍ）の低い値を有する３匹の動物すべてにおいて類似していた。ウサギ＃１、＃２および＃３のスクリーニングヒットの５％について、０．０４１ｎＭ、０．０２９ｎＭ、および０．０２６ｎＭ未満の親和性をそれぞれ測定した。上清の２％の場合、親和性は低ピコモル濃度範囲（６．２ｐＭ、７．９ｐＭ、および１１ｐＭ未満）でさえあった。二次スクリーニングによる高親和性抗体の優れた収率は、ヒト化およびリフォーマットのための最も適切な抗体を選択するための広範な基礎となる。
１．２．２．３効力
【０１２０】
効力の評価のために、細胞ベースのアッセイ（Ｌ９２９アッセイ）が開発されている（２．２．３参照）。８９４個の選択された抗体のうち５０６個（５６．６％）は、Ｌ９２９アッセイにおいて、ＴＮＦα誘導アポトーシスを５０％以上阻害した。力価分析中に得られた結果と一致して、最も高い中和ヒット率は、ウサギ＃３のヒット率６２．８％であり、次いでウサギ＃２では、ヒット率５６．４％であり、最も低いヒット率のウサギ＃１では３９．９％であった。これらの中和抗体の親和性は、１．３６×１０−１３から１．１９×１０−９Ｍの範囲であった。
１．２．２．４種交差反応性（カニクイザル）
【０１２１】
カニクイザルＴＮＦαに対する種交差反応性について、一次スクリーニングで同定された８９４個のヒットすべてを、ＥＬＩＳＡ（２．２．１参照）によって分析した。この追加のスクリーニングの目的は、カニクイザルＴＮＦαと交差反応することが知られているＡＳＣクローンの選択を可能にすることであった。使用されるＥＬＩＳＡ法は、組換えカニクイザルＴＮＦαに結合したＩｇＧサブタイプの抗体の「量」を評価するが、抗体の親和性または濃度に関する情報を与えるものではない。４１４個のＡＳＣクローンの上清（４６％）は、明瞭なシグナルを生成した（光学密度（ＯＤ）≧１）。カニクイザルＴＮＦαと交差反応するヒット率は、ウサギ＃１とウサギ＃３については類似しており、ウサギ＃１では、同定された１５３個のうち８１個（５２．９％）であり、ウサギ＃３では、同定された４８４個のうち２３６個（４８．８％）であった。ウサギ＃２は、３７．８％であり、わずかに低いヒット率を示し、２２５個のうち８２個のヒットが同定された。
１．２．２．５ＲＴ−ＰＣＲのためのクローンの選択
【０１２２】
ウサギ抗体のヒット確認、遺伝子配列解析、およびその後のヒト化のための前提条件として、ウサギ抗体可変ドメインをコードする遺伝情報を検索する必要がある。これは、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へのそれぞれのメッセンジャーＲＮＡの逆転写（ＲＴ）、続いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による二本鎖ＤＮＡの増幅によって行われた。ＲＴ−ＰＣＲに供するＡＳＣクローンの選択は、主に親和性および中和活性に基づくものだった。さらなる基準として、カニクイザルＴＮＦαに対する交差反応性が考慮された。合計で１０２個のＡＳＣクローンをＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子クローニングのために選択した。第１に、Ｌ９２９アッセイにおいて、ＴＮＦαの生物学的活性を５０％以上阻害し、カニクイザルＴＮＦαとの有意な結合を示した８０ｐＭ未満のＫＤを有する９３個の最もランキングの高いＡＳＣ（親和性に関して）を選択した。さらに、ＴＮＦα活性を５０％以上中和したが、カニクイザルＴＮＦαに結合しなかった２０ｐＭ未満のＫＤを有する９個の最もランキングの高いＡＳＣクローンもすべて選択された。合計で、１２個、１３個、および６６個のＡＳＣクローンは、それぞれウサギ＃１、＃２、および＃３からうまく増幅され、配列決定された。
１．２．２．６所望の特性を有する関連クローンの同定
【０１２３】
単離されたＡＳＣクローンのパネルの遺伝的多様性を特徴付けるために、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を抽出し、多重配列アラインメントに供し、これにより系統樹における配列クラスタ化を可能にした。
【０１２４】
この分析は、ヒト化およびリフォーマット実験に繰り越されるクローン配列の多様なセットの選択を可能にする一方で、ウサギの共通の親Ｂ細胞クローンを共有すると思われるクローン配列の相同クラスタも同定する。これらの配列クラスタの特質は、ＣＤＲにおける高配列相同性および薬力学的特性の一貫したパターンである。表２および表３には、８個のクローンのクラスタについて、これらの機能を両方ともまとめている。この配列クラスタの機能的保存にもかかわらず、表３のコンセンサス配列は、ＣＤＲのある種の可変性が許容され、依然として所望の薬力学的プロフィールをもたらすことを明らかにする。  
【表２】
2019512269.tif 000006
【表３】
2019512269.tif 000007
＊「Ｘ」と命名されたアミノ酸は、付随する配列表に定義されている意味を有する。
１．２．２．７カニクイザルＴＮＦαに対する交差反応性（ＳＰＲによる）
【０１２５】
ＴＮＦαを強力に中和した高親和性ヒットの数が多いので、ヒットを確認するためのＡＳＣクローンの選択を容易にするために、ＲＴ−ＰＣＲに供したすべてのモノクローナルウサギ抗体について種交差反応性を評価した。カニクイザルＴＮＦαに対する親和性を、上記と同様にＳＰＲ測定によって決定した（２．２．２も参照）。カニクイザルＴＮＦαについて９３個の試験抗体の親和性は、９．６×１０−１２から２．１×１０−９Ｍの範囲であった。９３個の交差反応性抗体のうちの３８個は、類似の親和性でヒトおよびカニクイザルＴＮＦαに結合した（ＫＤの差は２倍未満）。さらに、ヒトとカニクイザルとの間の親和性の差は、９３個の交差反応性抗体のうちの７９個について２０倍未満であり、そのうちの６２個については１０倍未満であり、これにより、カニクイザルにおける前臨床発現にふさわしくなる。
２．方法
２．１選別アッセイ
【０１２６】
ウサギのリンパ組織から抗原特異的Ｂ細胞を単離するためのフローサイトメトリーを利用した選別手順は、Ｌａｌｏｒら（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２；２２．３００１−２０１１）によって概要が記載されているとおりに実施した。
２．２スクリーニングアッセイ
２．２．１ＴＮＦα結合ＥＬＩＳＡ（ヒトおよびカニクイザルＴＮＦα）
【０１２７】
組換えヒトＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３００−０１）を９６穴マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。ＡＳＣ培養上清中におけるウサギ抗体の固定化ＴＮＦαへの結合は、二次ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧにより検出された（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１１−０３５−０４６）。ＴＭＢ物質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、ＫＰＬ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５３−００−００）を添加し、Ｈ２ＳＯ４を添加することにより呈色反応を停止させた。プレートを、マイクロタイタープレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ｒｅａｄｅｒ  Ｍ２００  Ｐｒｏ，Ｔｅｃａｎ）を用いて４５０ｎｍの波長で読み取った。
【０１２８】
スクリーニングキャンペーン中のアッセイ性能を、市販の陽性対照抗ＴＮＦαウサギポリクローナル抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、Ｃａｔ．Ｎｏ．９２９５−０１７４）によってモニターした。この目的のために、各スクリーニングプレート上で１００ｎｇ／ｍＬおよび２５０ｎｇ／ｍＬの二通りで陽性対照抗体を試験した。各プレートについて、陽性対照の応答の堅牢性および精度をモニターした。最終アッセイ条件では、シグナル対バックグラウンドの比は２５０ｎｇ／ｍＬの陽性対照で３０〜４０であり、陽性対照の変動係数（ＣＶ）は１０％未満であった。２５０ｎｇ／ｍＬ陽性対照に対して１００％以上の光学密度を有するシグナルを、一次スクリーニングヒットとみなした。
【０１２９】
血清力価測定のために、上記と同じＥＬＩＳＡ設定を使用した。血清希釈液は、免疫血清の結合シグナルが未処置の非関連動物のシグナルと比較して少なくとも３倍高い場合、陽性とみなされた。
【０１３０】
カニクイザルに対する種交差反応性は、上記と同様のＥＬＩＳＡを用いて測定した。組換えカニクイザルＴＮＦα（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｃａｔ．Ｎｏ．９００１８−ＣＮＡＥ）を９６穴マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート上にコーティングした。ＡＳＣ培養上清中のウサギ抗体の固定化カニクイザルＴＮＦαへの結合は、上記のＨＲＰ標識二次抗体によって検出された。ウサギ＃２由来の免疫血清は、１：８０，０００および１：３２０，０００の希釈で陽性対照として使用した。各プレートについて、陽性対照の応答の堅牢性および精度をモニターした。最終アッセイ条件では、シグナル対バックグラウンド比は、１：８０，０００の希釈で陽性対照については２０〜３０であり、陽性対照のＣＶは１０％未満であった。
【０１３１】
２．２．２ＳＰＲによるＴＮＦαへの結合反応動力学（ヒトおよびカニクイザル）
ヒトＴＮＦαに対する抗体の結合親和性を、ＭＡＳＳ−１  ＳＰＲ装置（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。この装置の性能は、標準的な参照溶液を用いて、およびインフリキシマブ−ＴＮＦα相互作用などの参照抗体−抗原の相互作用の分析によっても適切とされた。
【０１３２】
親和性スクリーニングのために、ウサギＩｇＧのＦｃ領域に特異的な抗体（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１２０−１１１Ａ）を、標準的なアミンカップリング手順を用いてセンサーチップ（ＳＰＲ−２アフィニティーセンサー、高容量アミン、Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）上に固定化した。ＡＳＣ上清中のウサギモノクローナル抗体を、固定化抗ウサギＩｇＧ抗体によって捕捉した。モノクローナル抗体の捕捉後、ヒトＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３００−０１）をフローセルに３分間９０ｎＭの濃度で注入し、センサーチップ上に捕捉されたＩｇＧからのタンパク質の解離を５分間進行させた。各注入サイクルの後、１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌを２回注入して、表面を再生した。見かけ解離（ｋｄ）および会合（ｋａ）速度定数、ならびに見かけ解離平衡定数（ＫＤ）は、１対１のラングミュア結合モデルにより、ＭＡＳＳ−１分析ソフトウェア（Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）を用いて算出し、フィッティングの質は、相対的なカイ二乗（アナライトの外挿された最大結合レベルに正規化されたカイ二乗）に基づいてモニターした。これは曲線フィッティングの質の尺度である。ヒットのほとんどでは、相対的カイ二乗値は１５％以下であった。リガンド結合の応答単位（ＲＵ）が抗体捕捉のためのＲＵの少なくとも２％であった場合、結果は有効であるとみなされた。ＲＵ抗体捕捉のためのＲＵの２％未満であるリガンド結合のＲＵを有する試料は、捕捉抗体へのＴＮＦαの特異的結合を示さないと考えられた。
【０１３３】
カニクイザルＴＮＦαに対する種交差反応性（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｎｏ．９００１８−ＣＮＡＥ）は、同じアッセイ設定およびＴＮＦα濃度を用いて測定し、同じ品質基準を適用した。相対的なカイ二乗は、分析されたＡＳＣ上清の大部分の１５％未満であった。
【０１３４】
２．２．３Ｌ９２９線維芽細胞におけるＴＮＦα誘導アポトーシス
ＡＳＣ培養上清由来のウサギＩｇＧが組換えヒトＴＮＦαの生物学的活性を中和する能力は、マウスＬ９２９線維芽細胞を用いて評価した（ＡＴＣＣ／ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＣＬ−１）。Ｌ９２９細胞は、１μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤを添加することによりＴＮＦα誘導アポトーシスに対して感作させた。細胞を、５０％ＡＳＣ培養上清および１００ｐＭ（５．２ｎｇ／ｍＬ）のヒトＴＮＦαの存在下で、９６ウェル平底マイクロタイタープレートにおいて２４時間培養させた（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３００−０１）。ヒットスクリーニングのためには、ＡＳＣ上清の存在下で、精製された抗体と比較して、より高濃度のＴＮＦαを使用しなければならない。細胞の生存を、ＷＳＴ−８（２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、モノナトリウム塩）細胞増殖試薬（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．９６９９２）を用いた比色アッセイによって決定した。ＷＳＴ−８は、細胞デヒドロゲナーゼによって橙黄色のホルマザン生成物に還元される。生成されたホルマザンの量は、生存細胞の数に直接正比例する。データは、Ｓｏｆｔｍａｘデータ解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いた４パラメータロジスティック曲線フィットを用いて分析し、ＴＮＦα誘導アポトーシスを５０％中和するのに必要なインフリキシマブ濃度（ＩＣ５０）は、３６．２ｎｇ／ｍＬの濃度で算出した。したがって、このアッセイの推定下限検出限界は３０〜４０ｎｇ／ｍＬである。ＴＮＦαをブロックする可能性は、モノクローナル抗体の濃度に依存するだけでなく、標的に対する抗体の親和性にも依存するので、この値は、検出限界のおおよその推定に過ぎない。しかし、ほとんどのＡＳＣ上清中のＩｇＧ濃度が濃度４０ｎｇ／ｍＬ以上であるため、アッセイの感度はＡＳＣ上清のスクリーニングには十分である。ＴＮＦα誘導アポトーシスの５０％中和をもたらす上清を陽性とみなした。
【０１３５】
スクリーニングキャンペーン中の堅牢なアッセイ性能を確実にするために、各スクリーニングプレート上で１１５ｎｇ／ｍＬ（０．８ｎＭ）および５８ｎｇ／ｍＬ（０．４ｎＭ）の二通りで陽性対照抗体インフリキシマブを試験した。陽性対照に対する阻害率および応答の精度を各スクリーニングプレートについてモニターした。各プレートの受容基準は以下のように設定した：陽性対照抗体により、１１５ｎｇ／ｍＬの濃度で、少なくとも６０％の阻害、変動係数（ＣＶ）２０％未満。
実施例２：ｓｃＦｖのヒト化および生成
１．結果
１．１ヒト化のためのヒットの確認およびヒットの選択
親ウサギの軽鎖および重鎖可変ドメインの７３個のユニークセットを、ヒットスクリーニングの間に回収し、配列アライメントによって分析した。スクリーニングアッセイの結果、および個々のウサギＩｇＧクローンの配列相同性に基づいて、ヒット確認のために３０個の候補が選択された。２９個のモノクローナル抗体を製造し、ヒト化およびリード候補生成のために親和性および効力に関して最も優れたクローンが選択された。クローンの選択基準は、ｉ）Ｌ９２９アッセイにおけるヒトＴＮＦαの中和、ｉｉ）ヒトＴＮＦαに対する高親和性、ｉｉｉ）カニクイザルおよびアカゲザルＴＮＦαに対する交差反応性、およびｉｖ）配列多様性であった。１つのクローン（１７−２２−Ｂ０３）がヒト化のために選択されており、これはＬ９２９アッセイにおいてヒトＴＮＦαを中和する効力の点で最も優れたＩｇＧの１つである。結合強度に関して、ヒト化およびｓｃＦｖフォーマットへのリフォーマットの結果としてある種の親和性の損失が予想される必要があるため、高い親和性が望ましい。
【０１３６】
ＩｇＧクローンＮｏ．１７−２２−Ｂ０３のデータを表４にまとめる。
【表４】
2019512269.tif 000008
１．２ヒト化ｓｃＦｖ断片の生成および選択
【０１３７】
相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする配列は、国際出願第２０１４／２０６５６１号に記載のとおり、ＣＤＲ−ループグラフト化によりインシリコでヒト可変ドメイン足場配列に移入された。さらに、免疫グロブリンドメインおよびＣＤＲ位置に構造的に関連する位置でドナー配列から追加のアミノ酸を移入させた１個のウサギクローンに対して、２番目の構築物を作製した。それぞれのヒト化一本鎖抗体Ｆｖ（ｓｃＦｖ）をコードするための人工遺伝子（細菌発現のために最適化されたコドンを使用することにより）が合成された（対応する可変軽鎖および重鎖から）。次いで、ポリペプチドを産生させ、続いてヒット確認の間に記載したのと同様のアッセイを用いて特徴付けを行った。
１．２．１ヒト化ｓｃＦｖ（ＡＰＩ）のヒト化および製造
【０１３８】
選択されたクローンのヒト化は、ウサギＣＤＲの、国際出願２０１４／２０６５６１に記載されているようなＶκ１／ＶＨ３型のｓｃＦｖアクセプターフレームワークへの移入を含んでいた。図１に模式的に示されるこのプロセスでは、６つのＣＤＲ領域のアミノ酸配列がドナー配列（ウサギｍＡｂ）上で同定され、アクセプター足場配列にグラフト化され、「ＣＤＲグラフト化片」と呼ばれる構築物が得られた。
【０１３９】
さらに、位置Ｌ１５、Ｌ２２、Ｌ４８、Ｌ５７、Ｌ７４、Ｌ８７、Ｌ８８、Ｌ９０、Ｌ９２、Ｌ９５、Ｌ９７、Ｌ９９、およびＨ２４、Ｈ２５、Ｈ５６、Ｈ８２、Ｈ８４、Ｈ８９、Ｈ１０８（ＡＨｏ番号付け）上のウサギドナーからのさらなるアミノ酸修飾を含む第２のグラフト化片を設計した。これらのグラフト化片は潜在的にＣＤＲの位置づけに影響を及ぼし、したがって抗原結合に影響を及ぼすことが記載されていた（Ｂｏｒｒａｓら、２０１０年，ＪＢＣ  ２８５：９０５４−９０６６）。これらのヒト化構築物は、「構造（ＳＴＲ）グラフト化片」と呼ばれる。これら２つの初期構築物の特徴付けデータを比較することで、ＳＴＲ構築物の有意な利点が明らかになる場合には、ＣＤＲグラフト化ＶＬをＳＴＲグラフト化ＶＨと組み合わせたさらなる変異体が設計された。この組み合わせは、ＳＴＲグラフト化片の活性を保持するために多くの場合十分であることが証明されており（Ｂｏｒｒａｓら、ＪＢＣ．２０１０年，２８５：９０５４−９０６６）、ヒトアクセプター足場の非ヒト改変が少なくなることで、安定性を損なう危険性、および免疫原性の可能性が軽減されるため、一般的に好ましい。
【０１４０】
前項で説明したインシリコ構築物設計が完了すると、対応する遺伝子を合成し、細菌発現ベクターを構築させた。発現構築物の配列はＤＮＡレベルで確認され、構築物は一般的な発現および精製プロトコルに従って製造された。
【０１４１】
タンパク質の異種発現は、不溶性封入体として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で行った。発現培養物に指数関数的に増殖する出発培養物を播種した。培養は、市販のリッチ培地を用いて、オービタルシェーカーの振とうフラスコ中で行った。細胞は、定義されたＯＤ６００の２まで増殖させ、１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で一晩発現させることにより誘導した。発酵の終わりに、細胞を遠心によって採取し、超音波処理によって均質化した。この時点で、異なる構築物の発現レベルを、細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定した。封入体は、細胞破片および他の宿主細胞不純物を除去するためのいくつかの洗浄ステップを含む遠心プロトコルによって、均質化した細胞ペレットから単離した。精製された封入体を変性緩衝液（１００ｍＭトリス／ＨＣｌ  ｐＨ８．０，６Ｍ  Ｇｄｎ−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に可溶化し、ｓｃＦｖを、ミリグラム量の自然に折り畳まれた単量体ｓｃＦｖを生成するスケーリング可能なリフォールディングプロトコルによりリフォールディングさせた。ｓｃＦｖを精製するために標準化されたプロトコルを用いたが、これには以下のステップが含まれた。リフォールディング後の生成物を、Ｃａｐｔｏ  Ｌアガロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたアフィニティークロマトグラフィによって捕捉し、精製ｓｃＦｖを得た。最初の試験で親和性および効力の基準を満たすリード候補を、ＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する研磨サイズ排除クロマトグラフィによってさらに精製した。精製プロトコルに続いて、タンパク質を緩衝食塩水中で配合し、以下に記載するように、種々の生物物理学的、タンパク質相互作用、および生物学的方法によって特徴付けを行った。異なる構築物の生産性を、バッチの精製タンパク質の最終収量を求め、この値を１リットルのリフォールディング容量に正規化することによって比較した。
１．２．２ヒト化ｓｃＦｖの生物物理的特徴
【０１４２】
安定性および生産性に関するｓｃＦｖの生物物理学的特性を表５にまとめた。ｓｃＦｖ構築物の生産性および安定性は、後の項で論じられるように異なる報告点によって特徴付けられた。
【０１４３】
以下に説明するように、特定の基準についてｓｃＦｖを調査した。
【０１４４】
生産性基準は、選択されたｓｃＦｖエンティティが、後のリード分子の開発を支援するのに十分な量で発現、リフォールディング、および精製され得ることを保証するものとする。定義された基準は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した場合の発酵ブロス１リットル当たりのｓｃＦｖの発現収率、およびＵＶ分光分析による精製タンパク質の量の測定によって評価し、１リットルのリフォールディング溶液に戻して計算した場合の、一般的なラボスケールプロセスで達成された精製収率であった。
【０１４５】
安定性の基準は、分子の製造プロセス中の凝集傾向、ならびに保存およびさらなる取り扱い中のそれらの構造的完全性を評価することを意図していた。精製プロセス（２．２．３）中の分子のコロイド安定性は、ＳＥ−ＨＰＬＣによって決定されたモノマー含量により評価することができる。その後の安定性試験では、モノマー含量は、１および１０ｍｇ／ｍＬで４週間の期間にわたり試験し、４℃、−２０℃、および−６５℃で保存した。さらに、タンパク質のコロイド安定性を、５回の凍結および融解サイクル後に試験した。追加の安定性指標パラメータとして、示差走査熱量計（ＤＳＦ）（２．２．４）により熱アンフォールディングの中間点を決定し、リード候補のコンフォメーション安定性に関する読み出しを提供した。
【表５】
2019512269.tif 000009
１．２．２．１生産性の評価
【０１４６】
リード候補ｓｃＦｖ分子を、バッチモードでの振とうフラスコ発酵により発現させ、一般的なラボスケール法で精製して、さらなる特徴付けのためのタンパク質試料を得た。このプロセスの間に、いくつかの重要な性能パラメータをモニターして候補分子を比較し、潜在的に発現が困難であり得る構築物を同定した。
【０１４７】
発現力価は、遠心による細胞採取後の粗大腸菌溶解物のレベルで決定した。収穫の間、細胞のわずかな損失が予想されるが、生産性のより慎重な推定に有利な表現収率を計算するために、この因子は無視されるように選択された。溶解物クーマシ中のｓｃＦｖ生成物を定量化するために、染色された還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２．２．１）を、試料中の宿主細胞タンパク質からの生成物を識別することができる方法の高い特異性のために選択させた。
【０１４８】
生産性を評価する第２の基準は、リフォールディング溶液１リットル当たりで計算されたｓｃＦｖの精製収率である。このパラメータは、タンパク質リフォールディングステップを含む、予想される製造プロセスにおける潜在的なボトルネックに対処する。同等の製造プロセスにおいてリフォールディング手順の効率が有限であることが判明していることから、規定されたリフォールディング量に対して正規化された生産性に対して、異なる構築物の性能を比較するように決定されている。収率の計算のために、各バッチの最終タンパク質試料をＵＶ吸光度（２．２．２）によって定量化し、それぞれの精製の実際のリフォールディング容量で割った（表６）。
【表６】
2019512269.tif 000010
１．２．２．２安定性評価
【０１４９】
ｓｃＦｖ構築物のコンフォメーション安定性、単分散性、および構造的完全性の評価は、開発性に関して、異なる分子をランク付けするための必須要素である。異なる構築物を有意に比較するための前提条件は、同様の品質の精製分子を調製することである。ＳＥ−ＨＰＬＣによって決定される「モノマー純度」基準は、異なる試験物質が適合する品質を保証することを意図している。ＳＥ−ＨＰＬＣ分析に加えて、タンパク質純度および同一性を決定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、試験対象の調製物の同等の品質を確認した。
【０１５０】
３つのｓｃＦｖのＳＥ−ＨＰＬＣ結果は、すべての調製物が少なくとも９９％のモノマー含量に精製され得ることを明らかにしている（図２）。
【０１５１】
リード候補の熱アンフォールディング挙動を示差走査型蛍光測定法（ＤＳＦ）によって試験し、それらの予想されるコンフォメーション安定性に関する分子のランク付けを可能にした。蛍光生データの正規化されたプロットを図３に示しており、これは各試料の重複している測定値を示している。協働的アンフォールディング挙動が観察された。３つの分子１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０２、１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０８、および１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ１２は、それぞれ７７．５℃、７６．２℃および７４．９℃のＴｍを示した。
【０１５２】
安定性評価の第２の研究では、異なる温度で４週間の期間にわたって分子の単分散性をモニターした。安定性試験の結果および得られたモノマー含量を図４に示す。３つすべての分子（１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０２、１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０８、および１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ１２）は、最低９５％モノマーを超えるモノマー含量で開始し、それぞれの開始値に対して、濃度１０ｍｇ／ｍＬにおいて、モノマーの損失は、５％未満であった。−２０℃および＜−６５℃での凍結状態では、試料は時間の経過と共に示したのは、最小の差のみであった。最も厳しい条件（４℃）では、分子７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０８は４週間でモノマーの損失はわずかに０．５％であった。さらに、ストレス安定性試験を温度３７℃およびｓｃＦｖ濃度１０ｍｇ／ｍＬで最長４週間実施した。この条件では、異なる構築物の凝集の傾向がより厳しく識別されることが期待される。図６に要約した結果のデータから、１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０２および１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０８については、２８日後に２８％のモノマーが損失したことが明らかになった。ｓｃＦｖは双方とも、ストレス条件下で良好なモノマー安定性を示した。４℃での安定性試験のクロマトグラムを図５に示しており、４℃での０日目および２８日目の試料を示す。このクロマトグラムオーバーレイでは、凍結／融解安定性の結果も示す。研究のこの部分では、試料の凍結、融解を全部で５サイクル繰り返しした。分析的ＳＥ−ＨＰＬＣによるモノマー含量の、結果として得られた定量化では、２つの試料における変化は明らかにならなかった（表５）。
【０１５３】
２つのｓｃＦｖについてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行って、ＵＶ吸光度による定量化のための裏付けデータを生成し、試料調製物の純度を確認し、これによって含量定量化の特性とした。この分析の別の態様において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果により、安定性試験中、タンパク質の変性がないことを明らかにした（４℃、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で２８日間。−６５℃で保存した第０日の試料と比較）。これは開発性の観点から重要な特徴である。
【０１５４】
この評価の範囲内で実施された様々な研究は、タンパク質安定性の明確な機構的態様に対処することに注意することが重要である。タンパク質の熱アンフォールディング温度を決定することで、高温での保存時のＳＥ−ＨＰＬＣによる単分散性の測定を補足する結果となるであろう。どちらの方法も潜在的な製品貯蔵寿命および安定性の推定となるように設計されているが、取り組まれたメカニズムは根本的に異なっている。熱アンフォールディングによって割り当てられた転移（Ｔｍ）の中間点は、タンパク質ドメインの安定性についての定性的尺度である（ΔＧを熱力学的に決定することはできない）。高安定性タンパク質ドメイン（高Ｔｍ）は、周囲温度で自発的にアンフォールドされる可能性は少なく、かつ折りたたまれていないドメインの相互作用によって引き起こされる不可逆的な凝集／沈殿を受けにくい。高ドメイン安定性は、アミノ酸残基が高密度にパッケージングされていることを示し、これは、プロテアーゼ切断に対する耐性とも相関する。他方で、ＳＥ−ＨＰＬＣ評価では、単量体画分並びに可溶性オリゴマー／凝集体の含量を定量的に決定する。このような可溶性オリゴマーは、多くの場合、可逆的であり、かつ正確に折りたたまれたタンパク質間の静電的相互作用または疎水性相互作用によって引き起こされる会合は比較的緩い。特に、「境界線」安定性を有するタンパク質に関して、熱アンフォールディングによって評価されるＴｍとＳＥ−ＨＰＬＣによって評価されるオリゴマー／凝集体形成の傾向との間にはいくらかの相関がある。抗体可変ドメインは、一定のＴｍ閾値である約６０℃を超えると、周囲温度での部分的ドメインの巻き戻しにより、凝集／沈降およびタンパク質分解に対する耐性が一般に十分に安定している。しかしながら、表面残留物の疎水的相互作用および／または静電的相互作用によって引き起こされるオリゴマー化は、依然として起こり得る。重要なことに、高温（例えば、３７℃）での加速（ストレス）安定性試験では、オリゴマーの形成および沈殿の様々なメカニズムが同時に起こり得る。
１．２．３ヒト化ｓｃＦｖのインビトロ結合および活性の特徴付け
【０１５５】
以下では、ヒト化ｓｃＦｖを、その標的結合特性および効力についてインビトロで特徴付けを行った。Ｌ９２９線維芽細胞のヒトＴＮＦαへの結合反応動力学（ｋａ、ｋｄ、およびＫＤ）ならびにＴＮＦα誘導アポトーシスを中和するための効力を分析した。さらに、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）およびアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）ＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害するための効力、ならびにＥＬＩＳＡによるヒトＴＮＦαとＴＮＦＲＩ／ＴＮＦＲＩＩとの相互作用、およびＴＮＦβに対するＴＮＦαへの結合の標的選択性を阻害する効力を決定した。
【０１５６】
以下の結果を理解するためには、ウサギＣＤＲのヒト可変ドメイン足場への移動、ならびにフルサイズＩｇＧからｓｃＦｖ断片へのフォーマットの変化が、薬理学的特性に影響を与え得ることに留意することが重要である。例えば、ある種の親和性の喪失は、通常、ヒト化に関連する。さらに、ＩｇＧと比較してｓｃＦｖのサイズが小さいので、立体障害により相互作用パートナーを妨害するｓｃＦｖの能力が大幅に低下する。最後に重要なことに、ホモ三量体ＴＮＦαへの二価結合様式のために、親ＩｇＧの親和性が非常に高く報告されている可能性があることに留意されたい（ＳＰＲアーチファクト）。その結果、二価の親ウサギＩｇＧと一価のヒト化ｓｃＦｖとの親和性を比較した場合に、報告された「親和性の喪失」が過大に評価される可能性がある。
１．２．３．１親和性
【０１５７】
ヒトＴＮＦαに対するヒト化ｓｃＦｖの親和性をＳＰＲ測定によって決定した（２．１．１も参照のこと）。親和性は、それぞれのｓｃＦｖの２倍連続希釈を用いて決定した。ｓｃＦｖはウサギモノクローナル抗体由来であった。２つのｓｃＦｖ変異体が生成され、「ＣＤＲ」（ＣＤＲ）および「構造グラフト化片」（ＳＴＲ）と命名された。軽鎖および重鎖におけるフレームワーク置換の相対的寄与を評価し、ヒトフレームワークに導入されたウサギアミノ酸残基の数をおそらく減少させるように、ドメインシャフリング実験を行った。したがって、クローン１７−２２−Ｂ０３について、ＣＤＲグラフト化軽鎖および構造グラフト化重鎖を含むｓｃＦｖ構築物（ＣＤＲ／ＳＴＲ）を作製した。
【０１５８】
最上位ランキングのｓｃＦｖ  １７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０２（ＳＴＲ）、１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０８（ＣＤＲ／ＳＴＲ）、および１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ１２（ＣＤＲ（Ｃ９０Ｓ）／ＳＴＲ）は、それぞれ５．２×１０−１１、６．１ｘ１０−１１、および４．８×１０−１１Ｍの親和性で結合した。３つの「構造グラフト化片」間の親和性に変動はほとんどなかった（表７を参照されたい）。
１．２．３．２効力
【０１５９】
ヒトＴＮＦαを中和するヒト化ｓｃＦｖの能力を、Ｌ９２９アッセイ（２．１．２参照）を用いて分析した。ＴＮＦα誘導アポトーシスを中和する効力（ＩＣ５０およびＩＣ９０）を、１７−２２−Ｂ０３由来ｓｃＦｖについて分析し、異なるアッセイプレートのＩＣ５０値およびＩＣ９０値を直接比較できるようにする参照抗体インフリキシマブの効力と比較した。相対ＩＣ５０およびＩＣ９０値を、インフリキシマブおよびｓｃＦｖの質量単位（ｎｇ／ｍＬ）で計算した。効力分析は、異なるロットの抗体断片で異なる日に数回実施した。図７は、２つのｓｃＦｖの各々について、１つの実験からの代表的な用量反応曲線を示す。繰り返し測定値の平均値を表７に示す（標準偏差は表の説明に要約されている）。
【０１６０】
ヒト化ｓｃＦｖはＴＮＦα誘導アポトーシスを阻害し、インフリキシマブよりも低いＩＣ５０およびＩＣ９０値を示した（表７参照）。ＳＰＲ結果と一致して、ドメインシャッフル変異体１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０８（ＣＤＲ／ＳＴＲ）は、構造グラフト化片１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０２（ＳＴＲ）と比較して等しい効力を呈した。ｓｃＦｖ  １７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０２、１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０８、および１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ１２は、優れたＴＮＦα中和活性を示し、ＩＣ５０値は、インフリキシマブよりもそれぞれ２３．７倍、２６．０倍、および１３．４倍良好であった。１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０２、１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０８、および１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ１２のＩＣ９０値は、それぞれインフリキシマブよりも２９．４倍、２６．６倍、および１１．７倍良好であった。親ウサギモノクローナル抗体について観察されたように、抗体の親和性と効力との間に明確な相関はなかった（相関は示されなかった）。さらに、中和アッセイの結果は、ＴＮＦαシグナル伝達を効率的に阻害するために、ある閾値の親和性が達成される必要があることを示唆している。例えば、ｓｃＦｖ  １６−１４−Ｄ０８−ｓｃ０１（ＣＤＲ）、１６−１５−Ｃ０９−ｓｃ０１（ＣＤＲ）、１６−２４−Ｈ０７−ｓｃ０１（ＣＤＲ）、および１７−２０−Ｇ０１−ｓｃ０１（ＣＤＲ）は、１ｎＭを超える親和性でＴＮＦαに結合している場合にはすべて、ＴＮＦαを中和する可能性が低いことを示している（図示せず）。
１．２．３．３種交差反応性（カニクイザルおよびアカゲザルＴＮＦα）
【０１６１】
最上位のｓｃＦｖの種交差反応性は、１）Ｌ９２９アッセイにおいてカニクイザルおよびアカゲザルＴＮＦαを中和する効力、および２）ＳＰＲによるカニクイザルおよびアカゲザルＴＮＦαに対する親和性の２つの方法によって決定した。異なる種由来のＴＮＦαを中和する効力は、カニクイザルおよびアカゲザルＴＮＦαをそれぞれ用いて、ヒトＴＮＦαについて上記したのと同様に、Ｌ９２９アッセイによって決定した（２．１．２参照）。両方の種由来のＴＮＦαは、Ｌ９２９アポトーシスを誘導する非常に類似している効力を示した（データは示していない）。したがって、種交差反応性試験には、同じ濃度のヒトおよびサルＴＮＦαを使用した。さらに、カニクイザルおよびアカゲザルＴＮＦαに対する結合反応動力学（ＳＰＲによる）を、ヒトＴＮＦα（２．１．１も参照）と同様のアッセイを用いて決定した。
【０１６２】
クローン１７−２２−Ｂ０３由来のすべてのｓｃＦｖは、カニクイザルおよびアカゲザルＴＮＦαに対する交差反応性を示した（表７参照）。１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０２の場合、これらの親和性は類似しており、すなわち、カニクイザルおよびアカゲザルでそれぞれ５．０×１０−１１および１．５×１０−１０Ｍであった。ヒトとアカゲザルのＴＮＦαとの親和性の差は、約３倍であり、カニクイザルＴＮＦαに対する親和性は、ヒトＴＮＦαに匹敵するものであった（表７および図８を参照されたい）。要約すると、クローン１７−２２−Ｂ０３由来のｓｃＦｖは、カニクイザルおよびアカゲザルＴＮＦαに対する種交差反応性を示した。
１．２．３．４ヒトＴＮＦα−ＴＮＦＲＩ／ＩＩ相互作用のブロック
【０１６３】
Ｌ９２９アッセイに加えて、ヒトＴＮＦαとＴＮＦＲＩ／ＩＩとの間の相互作用を阻害する各ヒト化ｓｃＦｖの効力をＥＬＩＳＡ（２．１．３参照）によって評価した。Ｌ９２９アッセイと同様に、各プレート上の個々のＩＣ５０値は、各プレートに沿って採取した参照分子インフリキシマブのＩＣ５０に対して較正し、相対ＩＣ５０およびＩＣ９０値は、インフリキシマブおよびｓｃＦｖの質量単位（ｎｇ／ｍＬ）に換算した。
【０１６４】
中和アッセイは、効力アッセイで使用される標的濃度よりも高い平衡結合定数（ＫＤ）で標的を結合する場合（ＫＤ＞標的濃度）のみ、標的ブロック抗体の効力を識別することができる。Ｌ９２９アッセイでは、５ｐＭのＴＮＦα濃度を使用し、ＴＮＦＲＩ／ＩＩ阻害ＥＬＩＳＡでは、９６０ｐＭのＴＮＦα濃度を使用した。したがって、理論的には、Ｌ９２９アッセイは、ＫＤ＞５ｐＭでｓｃＦｖ間の効力を区別することができるが、阻害ＥＬＩＳＡは、ＫＤ＞９６０ｐＭでｓｃＦｖ間の効力のみを区別することができる。分析したすべてのｓｃＦｖが９６０ｐＭ未満のＫＤを示したので、異なる親和性（しかし類似の作用機序）を有するｓｃＦｖ間の効力は、Ｌ９２９アッセイにおいてのみ区別することができる。
【０１６５】
１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０２、１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０８、および１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ１２は、インフリキシマブと比較した場合に、それぞれ、１．５倍、２．３倍、および１．５倍高い、ＴＮＦα−ＴＮＦＲＩ相互作用をブロックする効力を示したが、Ｌ９２９アッセイにおいて、インフリキシマブと比較した場合の効力は、有意に高かった（２３．７倍、２６．０倍および１３．４倍）。ＴＮＦα−ＴＮＦＲＩＩ相互作用の阻害は、ＴＮＦα−ＴＮＦＲＩブロックと同様の範囲であった。親ウサギＩｇＧ（表４参照）の相対ＩＣ５０値をヒト化ｓｃＦｖの相対ＩＣ５０値（表７）と比較すると、ｓｃＦｖの効力は親ＩｇＧと比較して一般にわずかに高いが、親和性は一般に親ウサギＩｇＧと同じ範囲である。抗体およびｓｃＦｖの効力は、質量単位で比較されているため、各濃度での価数（ＴＮＦα結合部位）は、二価のＩｇＧでは５倍を超えているものと比較して、一価のｓｃＦｖについては約２．９倍高い。非常に高い結合親和性のｓｃＦｖでは、結合活性の欠如が活性にとってもはや重要ではないため、結果として、ＴＮＦαおよびＴＮＦＲＩ／ＩＩ相互作用のより強力なブロックをもたらす。対照的に、低親和性の一価のドメインを有する場合には、反対のことが公開されている（Ｃｏｐｐｉｅｔｅｒｓら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ＆Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，２００６；５４：１８５６−１８６６）。上記の理由から、阻害ＥＬＩＳＡの結果は、異なる抗体間の効力のランク付けには使用されず、主に、ＴＮＦＲＩ対ＴＮＦＲＩＩとの相互作用をブロックする抗体の可能性を比較するために使用された。調査したｓｃＦｖは、同等の効力で両方のＴＮＦαレセプター間の相互作用をブロックした（表９、図９および図１０）。
１．２．３．５標的特異性（ＴＮＦαとＴＮＦβとの結合に対する選択性）
【０１６６】
ＴＮＦβに対するＴＮＦαの３つのｓｃＦｖ（１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０２、１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ０８、および１７−２２−Ｂ０３−ｓｃ１２）の特異性は、ＴＮＦαと比較した場合の、各ｓｃＦｖへのＴＮＦαの結合を最大限５０％阻害するＴＮＦβの相対効力を評価することによって確認され、競合ＥＬＩＳＡで測定した（２．１．４も参照のこと）。組換えヒトＴＮＦβの品質は、１）ＳＤＳ−ｐａｇｅおよびＨＰＬＣ分析による純度について、および２）タンパク質の製造者によるマウスＬ９２９細胞毒性アッセイにおける生物学的活性について分析されている。図１１に示すように、ビオチン化ＴＮＦαを有するｓｃＦｖの各々の間の相互作用は、６０〜２６０ｎｇ／ｍＬの範囲のＩＣ５０値で非標識ＴＮＦαによってブロックされたが、ＴＮＦβは、試験対象のＴＮＦβの最高濃度（１２５０μｇ／ｍＬ）であっても、いずれの有意な効果も示さなかった。したがって、分析されたｓｃＦｖはすべて、ＴＮＦαに特異的に結合するが、その最も近い同族体であるＴＮＦβには結合しない。ＴＮＦβは、試験対象濃度では、ｓｃＦｖへ結合するＴＮＦαの任意の有意な阻害を示さなかった。したがって、ＴＮＦα結合を最大限５０％阻害するのに必要なＴＮＦβ濃度は、アッセイで使用されるＴＮＦβの最高濃度（１２５０μｇ／ｍＬ）よりも有意に高くなければならない。ｓｃＦｖへのＴＮＦα結合を最大限５０％阻害するのに必要なＴＮＦαおよびＴＮＦβの濃度を比較すると、ＴＮＦβに対するＴＮＦαへの結合の選択性は、試験対象のすべての断片について約５０００〜２０，０００倍、有意に高い（表７も参照のこと）。したがって、ｓｃＦｖのいずれかの標的以外の結合は非常に起こりにくいと考えられる。
【０１６７】
上記の実験の結果を表７〜９にまとめる。
【表７】
2019512269.tif 000011
【表８】
2019512269.tif 000012
【表９】
2019512269.tif 000013
２．方法
２．１リード特性解析
２．１．１ＳＰＲによる結合反応動力学および種交差反応性
【０１６８】
ヒトＴＮＦαに対するｓｃＦｖの結合親和性は、ＭＡＳＳ−１  ＳＰＲ装置（Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）を用いて、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。ＳＰＲアッセイの性能は、参照抗体抗原相互作用（セルトリズマブペゴル−ＴＮＦα相互作用など）の分析によって適切とされた。ペグ化されたＦａｂ断片のセルトリズマブは、ｓｃＦｖの親和性と類似しているその一価結合様式により、参照として選択された。ｓｃＦｖの親和性測定と同じアッセイ設定を用いて、ＴＮＦαに対するセルトリズマブの親和性として、９．９４×１０−１１Ｍの値に決定した。この値は、公表されたＫＤ値９．０２±１．４３ｘ１０−１１Ｍ（ＢＬＡセルトリズマブ；±ＢＬＡ番号：１２５１６０；提出日：２００７年４月３０日）と上手く一致する。
【０１６９】
ｓｃＦｖの親和性測定のために、ヒトＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３００−０１）は、センサーチップ（ＳＰＲ−２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒ，Ａｍｉｎｅ，Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）上に、５０〜１００ＲＵの固定化レベルに達するようにアミンカップリングにより固定化した（ＳＰＲ分析中に得られた固定化レベルは４０〜１２０ＲＵであった）。第１のステップにおいて、ｓｃＦｖの親和性スクリーニングは、ｓｃＦｖ濃度（９０ｎＭ）を１つのみ用いて行った。第２のステップでは、最良に実施しているｓｃＦｖについて、６つのアナライト試料を異なる濃度でＭＡＳＳ−１システムの８つの平行チャネルの各々に同時に注入することによって、単一注入サイクルからの単一注入サイクル反応動力学（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｃｙｃｌｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ：ＳｉＣＫ）を測定した。アフィニティースクリーニングのために、ヒト化ｓｃＦｖを９０ｎＭの濃度でフローセルに３分間注入し、解離を１２分間モニターした。その後、より正確な親和性を決定するために、４５〜１．４ｎＭの範囲のｓｃＦｖの２倍連続希釈物をフローセルに３分間注入し、センサーチップ上に固定化したＴＮＦαからのタンパク質の解離を１２分間進行させた。見かけ解離（ｋｄ）および会合（ｋａ）速度定数、ならびに見かけ解離平衡定数（ＫＤ）は、１対１のラングミュア結合モデルにより、ＭＡＳＳ−１分析ソフトウェア（Ａｎａｌｙｚｅｒ，Ｓｉｅｒｒａ  Ｓｅｎｓｏｒｓ）を用いて算出し、フィッティングの質は、曲線フィッティングの質の尺度であるカイ二乗に基づいてモニターした。カイ二乗の値が小さいほど、１対１のラングミュア結合モデルへのフィッティングが正確になる。親和性スクリーニングについては、分析した濃度のカイ二乗が１０未満であれば、結果は有効とみなされた。いくつかのｓｃＦｖ濃度を分析した場合、試験を行ったすべての濃度の平均カイ二乗が１０未満であれば、結果は有効とみなされた。試験対象のすべてのｓｃＦｖにおいて、合格基準が満たされていた。
【０１７０】
カニクイザル（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｎｏ．９００１８−ＣＮＡＥ）およびアカゲザル（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１０７０−ＲＭ−０２５／ＣＦ）ＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．３１５−０１Ａ）に対する種交差反応性は、ヒトＴＮＦαについて上記したのと同じアッセイ設定を使用し、かつ同じ品質測定値を適用して測定した。カニクイザルおよびアカゲザルＴＮＦαについては、それぞれ、５０〜１８０ＲＵ、および９０〜２５０ＲＵの範囲の固定化レベルが達成された。ｓｃＦｖを、２倍連続希釈を用いて、４５〜１．４ｎＭの範囲の濃度で分析した。試験対象のすべてのｓｃＦｖについて、平均カイ二乗値は１０未満であった。
２．１．２Ｌ９２９線維芽細胞におけるＴＮＦ誘導アポトーシス（ｓｃＦｖによるヒト、非ヒト霊長類およびＴＮＦαの中和）
【０１７１】
ｓｃＦｖが組換えヒトＴＮＦαの生物学的活性を中和する能力は、マウスＬ９２９線維芽細胞を用いて評価した（ＡＴＣＣ／ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＣＬ−１）。Ｌ９２９細胞は、１μｇ／ｍＬのアクチノマイシンＤを添加することによって、ＴＮＦ誘導アポトーシスに対して感作させた。抗ＴＮＦα参照抗体またはｓｃＦｖ（３０００〜０．０５ｎｇ／ｍＬ）および５ｐＭ組換えヒトＴＮＦαの３倍連続希釈物（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３００−０１）を室温で１時間プレインキュベートした。使用されたＴＮＦα濃度（５ｐＭ）は、最大値以下のＬ９２９アポトーシス（ＥＣ９０）を誘導する。アゴニスト／阻害剤混合物の添加後、細胞を２４時間インキュベートした。細胞の生存を、ＷＳＴ−８（２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、モノナトリウム塩）細胞増殖試薬（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．９６９９２）を用いた比色アッセイによって決定した。ＷＳＴ−８は、細胞デヒドロゲナーゼによって橙黄色のホルマザン生成物に還元される。生成されたホルマザンの量は、生存細胞の数に直接正比例する。データは、Ｓｏｆｔｍａｘデータ解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いた４パラメータロジスティック曲線フィットを用いてデータを分析し、ＴＮＦα誘導アポトーシスを５０％および９０％中和するのに必要な参照抗体およびｓｃＦｖの濃度（ＩＣ５０およびＩＣ９０）を算出した（図７も参照されたい）。ＩＣ５０およびＩＣ９０値を、異なる日、または異なるアッセイプレート上で実施された実験間で直接比較できるようにするために、ＩＣ５０値およびＩＣ９０値を参照抗体インフリキシマブに対して較正した。応答の精度を制御するために、用量−応答曲線を二通り分析した。各測定点について、標準偏差およびＣＶを計算した（ＣＶ＜２０％）。
【０１７２】
カニクイザル（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｎｏ．９００１８−ＣＮＡＥ）およびアカゲザル（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１０７０−ＲＭ−０２５／ＣＦ）に対する種交差反応性は、ヒトＴＮＦαについて上記したのと同じアッセイ設定を使用し、かつ同じ品質測定値を適用して測定した。ヒト対応物と同様に、最大以下のＬ９２９アポトーシス（ＥＣ９０）を誘導するＴＮＦα濃度を種交差反応性試験に使用した。両方の種由来のＴＮＦαは、ヒトＴＮＦαと非常に類似している効力を示し、Ｌ９２９マウス線維芽細胞アポトーシスを誘導した。その結果、試験対象の両方の種について、同じ濃度のＴＮＦα（５ｐＭ）を使用した。種交差反応性試験の間、重複測定点のほとんどのＣＶは、１０％未満であった。
２．１．３ＴＮＦα阻害ＥＬＩＳＡ
リガンド結合に対するｓｃＦｖの阻害効果を、ＴＮＦαとＴＮＦＲＩおよびＴＮＦＲＩＩとの間の相互作用を単独で再現する生化学的方法であるＥＬＩＳＡを用いて評価した。
【０１７３】
第１の阻害ＥＬＩＳＡのために、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合したＴＮＦＲＩの細胞外ドメイン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３７２−ＲＩ）を、濃度０．５μｇ／ｍＬで９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡ上にコーティングした。第２の阻害ＥＬＩＳＡのために、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合したＴＮＦＲＩＩの細胞外ドメイン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．７２６−Ｒ２）を、濃度２μｇ／ｍＬでコーティングした。すべての後続のステップは、両方のアッセイで同一とした。ＴＮＦＲＩおよびＴＮＦＲＩＩに対するＴＮＦαの結合を検出するために、ＴＮＦαを使用前にビオチン化した。ビオチン化ヒトＴＮＦα（９６０ｐＭ、５０ｎｇ／ｍＬ）を、３倍連続希釈ヒト化抗ＴＮＦαｓｃＦｖおよびインフリキシマブ（１０，０００ｎｇ／ｍＬ〜０．２ｎｇ／ｍＬ）とともに室温で１時間インキュベートした。ＴＮＦα／抗体断片混合物をＴＮＦレセプター固定化プレートに移し、ビオチン結合ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＳＤＴ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＰ４０Ｃ）で、室温にて２０分間インキュベートした後、ブロックされていないＴＮＦαの固定化ＴＮＦαレセプターへの結合を検出した。３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を添加することで、ＴＮＦＲＩおよびＴＮＦＲＩＩへのＴＮＦαの結合に比例する比色読み出しとなった。競合ＥＬＩＳＡでの使用前に、ビオチン化ＴＮＦαの生物学的活性がＬ９２９アッセイで確認された。ビオチン化ＴＮＦαのＥＣ５０は、非標識ＴＮＦαのＥＣ５０と類似していた（データ示さず）。上記のＬ９２９アッセイと同様に、Ｓｏｆｔｍａｘデータ解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いた４パラメータロジスティック曲線フィッティングを用いてデータを分析し、かつＴＮＦαおよびＴＮＦＲの相互作用を５０％および９０％阻害する（ＩＣ５０およびＩＣ９０）のに必要なｓｃＦｖの濃度を計算した。ＩＣ５０およびＩＣ９０値を、異なる日、または異なるアッセイプレート上で実施された実験間で直接比較できるようにするために、ＩＣ５０値およびＩＣ９０値を参照抗体インフリキシマブに対して較正した。
【０１７４】
応答の精度を制御するために、用量−応答曲線を二通り分析した。各測定点について、標準偏差およびＣＶを計算した（ＣＶ＜２５％）。
２．１．４標的の特異性
【０１７５】
抗ＴＮＦαｓｃＦｖの特異性を確認するために、最も相同であるファミリーメンバーのＴＮＦβに対する結合を評価した。非標識ＴＮＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．３００−０１Ｂ）およびＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．３００−０１）によるビオチン化ＴＮＦαのｓｃＦｖとの相互作用を阻害する可能性は、競合ＥＬＩＳＡによって分析した。この目的のために、ｓｃＦｖを９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート上に１μｇ／ｍＬの濃度でコーティングした。５倍連続希釈された未標識ＴＮＦα（５０μｇ／ｍＬ〜０．０００１３μｇ／ｍＬ）またはＴＮＦβ（１２５０μｇ／ｍＬ〜０．０００１３μｇ／ｍＬ）の存在下での、ビオチン化ＴＮＦα（７５ｎｇ／ｍＬ）のコーティングされたｓｃＦｖへの結合は、上記のとおり、ビオチン結合ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＳＤＴ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｃａｔ．ＳＰ４０Ｃ）を用いて検出された。ＴＮＦαデータを用いた用量反応曲線については、Ｓｏｆｔｍａｘデータ解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いた４パラメータロジスティック曲線フィッティングを用いて分析し、ビオチン化ＴＮＦαとコーティングされたｓｃＦｖとの相互作用を５０％ブロックする（ＩＣ５０）のに必要な非標識ＴＮＦの濃度を算出した。ＴＮＦ−βは、ビオチン化ＴＮＦαとｓｃＦｖとの間の相互作用のいかなる有意な阻害も示さなかった（図１１も参照のこと）。各ｓｃＦｖへのＴＮＦαの結合を阻害するＴＮＦαと比較した場合に、ＴＮＦβの相対的な可能性を定量化するために、ＴＮＦαに対するＴＮＦβによる相互作用を阻害するＩＣ５０を計算した。βＴＮＦαのＩＣ５０よりも約５，０００〜２０，０００倍高い濃度でＴＮＦβを使用した場合、有意な阻害は観察されなかったので、ＴＮＦβに対するＴＮＦαへの結合の選択性は、５，０００〜２０，０００倍より有意に高くなると判断された。応答の精度を制御するために、用量−応答曲線を二通り分析した。各測定点について、標準偏差およびＣＶを計算した（試験対象のＴＮＦα／β濃度のうちの１つを除くすべてはＣＶ＜２５％）。すべてのｓｃＦｖがこの基準を満たした。
２．２ＣＭＣ分析
２．２．１還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
【０１７６】
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、定性的特徴付けのため、およびタンパク質の純度を制御するために使用される分析技術である。米国薬局方（ＵＳＰ）（ＵＳＰ第１０５６章）によれば、分析用ゲル電気泳動は、薬物物質中のタンパク質の均質性を同定するため、および評価するための適切かつ慣例的な方法である。
【０１７７】
この方法は、発酵後の発現収率を得るために大腸菌溶解物由来のｓｃＦｖ生成物の量を定量化するために使用される。この方法の別の応用は、理論値に対し、分子量に基づいて試験物質の同一性を検証することである。支持的目的のために、この方法は、プロセス関連不純物（宿主細胞タンパク質）および生成物関連不純物（分解産物または付加物）に関する試験試料の純度を定量化するために使用される。
【０１７８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から入手した市販のプレキャストゲルシステム「Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｎ」を用いて行った。ヒト化ｓｃＦｖは、「Ａｎｙ  ｋＤ」分割ゲル（＃４５６−９０３６）で分析した。両方の場合において、製造者が推奨するトリス／グリシン緩衝系を使用した。タンパク質バンドの検出のために、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＴＭ染色溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，＃ＬＣ６０６０）によるクーマシ染色、またはＰｉｅｒｃｅ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，＃２４６１２）による銀染色のいずれかを用いた。染色手順については、それぞれの供給者のプロトコルに従った。
【０１７９】
染色されたタンパク質ゲルの記録および分析は、ドキュメンテーションシステムＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，＃１７０−８２６５）およびソフトウェアＩｍａｇｅ  Ｌａｂ，バージョン４．０．１（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，＃１７０−９６９０）を用いて実施した。
溶解物試料の力価測定
【０１８０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、宿主細胞タンパク質の混合物内における目的のタンパク質の特異的検出が可能になる。方法の線形範囲における参照標準希釈系列（予め決定された）は、すべてのゲルに含めた。参照濃度の標準濃度に対するバンド強度の線形回帰（デンシトメトリーで測定）を用いて標準曲線を計算し、次に試料中のｓｃＦｖ含量を外挿した。
【０１８１】
未知の生成物濃度の溶解物試料を、異なる希釈物（少なくとも１：１０の希釈緩衝液）に加えて、この方法の線形範囲内に少なくとも１つのｓｃＦｖ濃度を有するようにした。生成物量は、ｓｃＦｖの測定バンド強度に基づいて計算し、濃度は、試料調製物の希釈係数を用いて決定した。値は、標準曲線の線形範囲内にあったすべての試料について平均化した。
【０１８２】
溶解物試料の定量化のための方法の適合性の追加の試験として、既知量の参照標準で溶解物試料をスパイクすることによって、阻害／増強試験を実施した。希釈緩衝液中の１：１０の試料希釈におけるスパイク回収の計算では、９５．４％の値となった。これは、希釈緩衝液中の参照標準で観察されたのと同じレベルの精度である。したがって、細胞溶解物中で有意なマトリックス干渉は観察されず、この方法は、細胞溶解物中のｓｃＦｖ含量の定量化に好適であると考えられた。
タンパク質の純度および含量
【０１８３】
含量を決定するための方法の適合性およびそれによって試験試料の純度を示すために、参照ｓｃＦｖの検出下限（ＬＯＤ）を、０．０２μｇの公称負荷で視覚的に（タンパク質バンドを同定することによって）決定した。各レーンの強度ヒストグラムの評価は、この負荷で約２の信号対雑音比を示す。さらに、定量化のための線形範囲は、主バンドを濃度計で分析することによって決定した。
【０１８４】
線形回帰によるデータのフィッティングは、０．９９９８の決定係数（Ｒ２）をもたらし、したがってフィッティングの良好な品質を示す。フィッティングの全体的な品質に加えて、個々のデータの各点の相対誤差を、選択された範囲内の方法の適合性を証明するために求めた。この方法の良好な精度を示すすべてのデータ点について、相対誤差は１０％未満である。
２．２．２２８０ｎｍでのＵＶ吸光度
【０１８５】
２８０ｎｍでの方法ＵＶ吸光度は、ＵＳＰ第１０５７章に概説されている全タンパク質アッセイである。タンパク質溶液は、芳香族アミノ酸が存在するために、２８０ｎｍの波長でＵＶ光を吸収する。ＵＶ吸光度は、タンパク質中のチロシンおよびトリプトファン残基の含量の関数であり、タンパク質濃度に比例する。未知のタンパク質溶液の吸光度は、ビールの法則Ａ＝ε＊ｌ＊ｃを適用することによって分光法に関するＵＳＰ第８５１章に従って、求めることができる。式中、吸光度（Ａ）は、モル吸光率（ε）、吸収経路の長さ、および物質の濃度の積に等しい。ｓｃＦｖのモル吸光率は、ソフトウェアＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて計算した。
【０１８６】
ＵＶ吸光度の測定は、Ｎａｎｏｑｕａｎｔプレート（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．）を備えたＩｎｆｉｎｉｔｙリーダーＭ２００  Ｐｒｏを用いて実施した。タンパク質試料の吸光度を２８０ｎｍおよび３１０ｎｍで測定し、後者の波長は２８０ｎｍシグナルから差し引かれた参照シグナルとして役立った。試料マトリックスの潜在的な干渉を説明するために、各測定についてブランク減算を実施した。得られたタンパク質試料の最終吸光度シグナルを使用して、ランベルト−ビールの法則を用いて、タンパク質濃度を計算した。
【０１８７】
すべての測定は、０〜４ＯＤの測定範囲で機器仕様によって提示された範囲内で実施され、再現性＜１％および均一性＜３％が製造業者によって指定されている。
２．２．３ＳＥ−ＨＰＬＣ（サイズ排除高圧液体クロマトグラフィ）
【０１８８】
ＳＥ−ＨＰＬＣは、ＵＳＰ第６２１章に概説されている固体固定相および液体移動相を利用した分離技術である。この方法は、疎水性固定相および水性移動相を利用して、分子のサイズおよび形状に基づいて分子を分離する。分子の分離は、特定のカラムの空隙容量（Ｖ０）と全透過容量（ＶＴ）との間で起こる。ＳＥ−ＨＰＬＣによる測定は、自動試料注入および２８０ｎｍの検出波長に設定されたＵＶ検出器を備えたＣｈｒｏｍａｓｔｅｒ  ＨＰＬＣシステム（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈｉｇｈ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で行った。この装置は、結果として生じるクロマトグラムの分析もサポートするソフトウェアＥＺＣｈｒｏｍ  Ｅｌｉｔｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，バージョン３．３．２  ＳＰ２）によって制御される。タンパク質試料を遠心によって清澄化し、注入前にオートサンプラー中で６℃の温度に保った。ｓｃＦｖ試料の分析のために、カラムＳｈｏｄｅｘ  ＫＷ４０２．５−４Ｆ（Ｓｈｏｗａ  Ｄｅｎｋｏ  Ｉｎｃ．，＃Ｆ６９８９２０１）を、標準化された緩衝生理食塩水移動相（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０、２５０ｍＭ塩化ナトリウム）とともに、推奨流速０．３５ｍＬ／分で用いた。注入１回当たりの標的試料負荷は５μｇであった。試料は、２８０ｎｍの波長でＵＶ検出器によって検出され、データは、適切なソフトウェアスイートによって記録された。得られたクロマトグラムをＶ０〜ＶＴの範囲で分析し、それによって溶出時間＞１０分のマトリックス関連ピークを除外した。
【０１８９】
この方法の中間的精度を保証するために、参照標準を各ＨＰＬＣ配列の始めと終わりに日常的に測定した。このシステム適合性試験に使用した参照標準は、バッチとして製造したｓｃＦｖであり、各測定時点で使用するために等分した。
２．２．４ＤＳＦ（示差走査型蛍光測定法）
【０１９０】
方法ＤＳＦは、温度依存性タンパク質のアンフォールディングを測定するための公定書に収載されていない方法である。ＤＳＦによる熱アンフォールディング温度の測定は、ＭＸ  Ｐｒｏソフトウェアパッケージ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で制御され、４９２／６１０ｎｍに設定された励起／発光フィルターを備えたＭＸ３００５Ｐ  ｑＰＣＲ装置（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行った。反応は、Ｔｈｅｒｍｏ  ｆａｓｔ９６白色ＰＣＲプレート（Ａｂｇｅｎｅ；＃ＡＢ−０６００／Ｗ）に設定した。タンパク質アンフォールディングの検出のために、色素ＳＹＰＲＯオレンジ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；＃Ｓ６６５０）の市販の原液を最終希釈１：１，０００で使用した。タンパク質試料を、アンフォールディング測定のために、標準化緩衝食塩水中、最終濃度５０μｇ／ｍＬに希釈した。熱アンフォールディングは、２５℃で開始して、持続時間３０秒で１℃ごとに最高９６℃まで上昇させる温度プログラムによって実施した。温度プログラム中、各試料の蛍光発光を記録した。記録された生データは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌテンプレートのパッケージ（Ｎｉｅｓｅｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ２００７，第２巻、第９号）で処理され、評価され、蛍光データは、プログラムＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて、ボルツマン方程式でフィッティングさせて、遷移の中間点（Ｔｍ）を得た。
【０１９１】
アンフォールディングの中間点の信頼性の高い堅牢な測定値とするために、少なくとも重複測定が行われた。データ品質に関しては、良好適合度（Ｒ２）＞０．９９００および０．５％未満のＴｍの９５％信頼区間を有する測定のみが考慮された。
【０１９２】
中間精度の評価のために、参照標準（特徴付けられた既知のｓｃＦｖ）をすべての測定に含めて、異なる日のアッセイ性能の比較を可能にした。
２．２．５安定性研究
【０１９３】
これらの分子の開発可能性のための読み出しとして異なるｓｃＦｖ構築物の安定性を評価するために、短期安定性試験プロトコルを設計した。タンパク質構築物は、単純な緩衝食塩水配合物（上記参照）中で、１および１０ｍｇ／ｍＬの標的濃度まで濃縮した。モノマー含量をＳＥ−ＨＰＬＣで測定して、純度が＞９５％の成功基準を超えていることを確認した。続いて、タンパク質試料を＜−６５℃、−２０℃、４℃および３７℃で４週間保存し、アリコートを様々な時点で分析した。主な読み出しは、ＳＥ−ＨＰＬＣによる分析であり、これにより可溶性高分子量のオリゴマーおよび凝集体の定量化が可能になる。支持的な測定として、タンパク質含量が２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって決定され、これは、保存期間中に実質的な量のタンパク質が沈殿によって失われたかどうかを示す。保存スクリューキャップについては、アリコート当たり３０〜１５００μｇの充填量のチューブを使用した（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｃａｔ．Ｎｏ．７２．６９２．００５）。さらに、純度は、分解または共有結合多量体化に関する構築物の安定性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される。
実施例３：ヒト化ダイアボディおよびＩｇＧの作製
【０１９４】
可変ドメインをＶＬＡ−Ｌ１−ＶＨＢ−Ｌ２−ＶＬＢ−Ｌ３−ＶＨＡ配置に配置することにより、一本鎖ダイアボディ構築物を設計する。これらの構築物において、ＶＬＡおよびＶＨＡおよびＶＬＢおよびＶＨＢドメインは、共同してＴＮＦαの結合部位を形成する。可変ドメインを連結するペプチドリンカーＬ１〜Ｌ３は、グリシン／セリンリピートから構築する。２つの短いリンカーＬ１およびＬ３は、単一のＧ４Ｓ（配列番号３０）リピートから構成され、長いリンカーＬ２は、配列（Ｇ４Ｓ）４（配列番号２９）から構成される）。ヒト化可変ドメインをコードするヌクレオチド配列（実施例２；１．２．１．）をｄｅ  ｎｏｖｏ合成し、ｐＥＴ２６ｂ（＋）骨格（Ｎｏｖａｇｅｎ）に基づく大腸菌発現用の適合ベクターにクローニングする。発現および精製は、実施例２；１．２．１．のｓｃＦｖについて記載したように行う。
【０１９５】
ヒト化ＩｇＧは、可変ドメインである、リーダー配列を含む一過性異種発現のための好適な哺乳類発現ベクター、およびそれぞれの定常ドメイン、例えばｐＦＵＳＥ−ｒＩｇＧベクター（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をクローニングすることによって構築した。機能的ＩｇＧの一過性発現は、ＣＨＯ  Ｓ細胞において、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸシステムを用いて、重鎖および軽鎖をコードするベクターの同時トランスフェクションによって行われる。数日間培養後、精製のために抗体分泌細胞の上清を回収する。続いて、分泌されたＩｇＧをプロテインＡセファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によってアフニティー精製する。溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度、およびＳＥ−ＨＰＬＣで分析する。
【０１９６】
抗体分子の親和性は、実施例２の２．１．１に記載されるＢｉａｃｏｒｅ機器を用いて決定する。
【０１９７】
抗体分子の効力を、Ｌ９２９アッセイで決定する（この方法は実施例２の２．１．２に記載されている）。
実施例４：ＴＮＦα結合の化学量論的測定の決定
【０１９８】
ＴＮＦαに対する１７−２２−Ｂ０３の結合化学量論比をＳＥ−ＨＰＬＣを用いて測定した。１７−２２−Ｂ０３−ｓｃＦｖおよびＴＮＦαを、２つの異なるモル比、すなわちモル比１：１および４．５：１でインキュベートした。ＴＮＦαは溶液中において三量体として存在するため、示されたモル比はＴＮＦαｔｒｉｍｅｒを指す。したがって、４．５：１の比では、１７−２２−Ｂ０３−ｓｃＦｖは過剰であり、１つのＴＮＦαｔｒｉｍｅｒと３つのｓｃＦｖとの複合体を生じるすべてのＴＮＦαｔｒｉｍｅｒ結合位置を占有する必要がある。しかしながら、等モル条件下では、３つの理論上のＴＮＦα結合部位のすべてを飽和させるのに十分なｓｃＦｖは存在しない。したがって、３未満のｓｃＦｖ結合を有する複雑な変異体も予想される。ＴＮＦαおよび１７−２２−Ｂ０３−ｓｃＦｖを室温で２時間インキュベートして、複合体形成を可能にした。次いで、試料を４℃で１０分間遠心分離した。１０μＬの各試料をＳＥ−ＨＰＬＣで分析した。ＳＥ−ＨＰＬＣ分析は、０．３５ｍＬ／分の流速で、溶出液として５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．５、３００ｍＭのＮａＣｌを用いて行った。溶出したタンパク質のピークは、２８０ｎｍの波長で検出された。見かけの分子量を決定するためにＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＬＭＷ、ＨＭＷ）のＧｅｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてカラムを較正した。
【０１９９】
図１２の下のパネルは、ＴＮＦαｔｒｉｍｅｒ単独およびｓｃＦｖ単独のプロファイルとオーバーレイされている、等モル量のｓｃＦｖおよびＴＮＦαを有する溶出プロファイルを示す。溶液中でのＴＮＦαの三量体化のために、各三量体上に存在するｓｃＦｖには理論上最大３つの等価な結合部位が存在しており、したがってｓｃＦｖ分子は限定されている。これらの条件下で、３つの複合種（３：１、２：１、１：１）がすべて同定された。図１２の上部パネルは、過剰量のｓｃＦｖを含む複合体の溶出プロファイルを示す。結合していないｓｃＦｖの余剰分は、予想される保持時間で溶出した。ＴＮＦαピークは複合体形成のために定量的に消費され、完全に消失した。この複合体のピークはより短い保持時間に向かってシフトし、等モルの設定の最大分子量を有するピークの保持時間と十分に相関した。この理由から、ｓｃＦｖが過剰に利用可能である場合、ＴＮＦα上の利用可能な結合部位のすべてがｓｃＦｖによって占有され、したがって結合化学量論比は３：１（ｓｃＦｖ：ＴＮＦα）であると結論付けられた。
【０２００】
これらの定性的観察に加えて、見かけの結合化学量論比も、ＳＥ−ＨＰＬＣによって決定された１７−２２−Ｂ０３−ｓｃＦｖ：ＴＮＦα複合体の見かけのＭＷに基づいて計算した。保持時間に基づいて、見かけのＭＷは１４９．２ｋＤａと計算された。以下の式（１）によれば、見かけの結合化学量論比は、３．６と計算された。これは、ＴＮＦαｔｒｉｍｅｒ上のｓｃＦｖに利用可能な３つの等価な結合部位の理論的な数、および３：１の結合化学量論比が決定された上記の観察結果と十分に相関している。
【数３】
2019512269.tif 000014
ＭＷ（複合体、見かけ）：１４９．２ｋＤａ
ＭＷ（ＴＮＦα理論）：５２．２ｋＤａ
ＭＷ（ｓｃＦｖ理論）：２６．５ｋＤａ
実施例５：ＴＮＦα：抗体複合体の形成（ＴＮＦαの架橋）
【０２０１】
２つのＴＮＦα分子に同時に結合する１７−２２−Ｂ０３−ダイアボディの能力を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＨＥＰＥＳ緩衝液中で、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器により試験する。ビオチン化ＴＮＦα（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ｂｉｏｔｉｎ  ＣＡＰｔｕｒｅ  キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を製造者の指示に従って使用して、ビオチン化ｓｓＤＮＡオリゴを介して捕捉する。０．２５μｇ／ｍＬのビオチン化ＴＮＦαを１０μＬ／分の流速で３分間注入して、約２００〜３００ＲＵ（共鳴単位）の捕捉レベルに到達させる。ダイアボディおよび対照としての抗体１７−２２−Ｂ０３−ｓｃＦｖを、９０ｎＭの濃度にて３０μＬ／分の流速で２分間、ＴＮＦα固定化表面に注入した。抗体断片の会合後、ＴＮＦα（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を、９０ｎＭにて、３０μＬ／分の流速で５分間注入する。抗体およびＴＮＦα濃度は、結合の飽和に近くなるように選択する。測定は２５℃で行う。二価の１７−２２−Ｂ０３−ダイアボディは、２つのＴＮＦα分子に同時に結合することができるが、予想通り、一価の１７−２２−Ｂ０３−ｓｃＦｖは１つのＴＮＦα分子にのみ結合する。
【０２０２】
さらに、ＴＮＦα−抗体複合体の形成を、ＳＥ−ＨＰＬＣを用いて異なる比率のＴＮＦαおよび１７−２２−Ｂ０３抗体フォーマットで評価できる。結合部位に関して、１７−２２−Ｂ０３−ＩｇＧ（１５０ｋＤａ）および１７−２２−Ｂ０３−ｓｃＤｂ（約５２ｋＤａ）は、ＴＮＦαとともに異なるモル比（１：３、１：１、３：１）でインキュベートする。したがって、ＩｇＧおよびｓｃＤｂは２つの結合部位を有し、ＴＮＦαは３つの結合部位を有する。抗体−ＴＮＦα混合物は、３７℃で少なくとも３０分間インキュベートし、室温で１０分間冷却し、２〜８℃で一晩保存した。約５〜１０μＬのタンパク質混合物を、約１ｍｇ／ｍＬの濃度で、ＴＯＳＨＯ  ＴＳＫｇｅｌ  ＵＰ−ＳＷ３０００カラムに注入する。分析は、０．３ｍＬ／分の流速で、溶出液として１５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．８、１００ｍＭのＮａＣｌを用いて行う。溶出したタンパク質のピークは、２１４ｎｍの波長で検出される。このカラムは、複合体のおおよその分子量を決定するために、予めＢＥＨ４５０  ＳＥＣタンパク質標準混合（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて較正する。６００ｋＤａ以上の複合体は、２つ以上のＴＮＦαおよび３つ以上のＩｇＧ分子からなる複合体の形成を示す。３００ｋＤａ以上の複合体は、２つ以上のＴＮＦαおよび３つ以上のｓｃＤｂ分子からなる複合体の形成を示す。
実施例６：細胞増殖の阻害
【０２０３】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖を阻害する１７−２２−Ｂ０３およびアダリムマブの異なる抗体フォーマットの能力は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）において試験する。２名の健康なドナーからのＰＢＭＣを９６ウェルプレート中、３７℃／５％ＣＯ２で４８時間、１：１の比で培養する（ＲＰＭＩ１６４０）。活性化後、細胞は、３７℃／５％ＣＯ２でさらに５日間、六通りで、抗ＴＮＦα抗体またはＩｇＧ対照抗体（すべて最終濃度１０μｇ／ｍＬで）を用いて処理する。インキュベーション終了前の２４時間で、ＢｒｄＵ（２０μＬ／ウェル）を各ウェルに添加し、市販の細胞増殖ＥＬＩＳＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いてＢｒｄＵの取り込みを測定することによって、増殖を判定する。刺激指数は、抗体処理細胞とマイトマイシンＣ（２５ｎｇ／ｍＬ）処理細胞との間のＢｒｄＵの取り込みの比を計算することによって決定する。１７−２２−Ｂ０３の試験対象のすべての抗体フォーマットが、アダリムマブに匹敵して、Ｔ細胞増殖を有意に阻害することが期待されている。
実施例７：ＬＰＳ誘発サイトカイン分泌の阻害
【０２０４】
ＲＰＭＩ１６４０中のＣＤ１４＋単球を９６ウェルプレートに播種し、加湿インキュベーター内で３７℃／５％ＣＯ２で１６時間インキュベートする。次いで、２〜２０００ｎｇ／ｍＬの範囲の最終抗体濃度を用いて、細胞を抗ＴＮＦα抗体またはＩｇＧ対照抗体で１時間２回処理する。単球を細胞培養培地で３回洗浄し、続いてＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）と共に３７℃／５％ＣＯ２で４時間インキュベートする。細胞培養上清中のＩＬ−１βおよびＴＮＦα濃度は、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定する。４パラメータロジスティック曲線フィッティングを用いて、ＩＣ５０を決定する。
【表１０】
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【表１１】
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
2019512269.tif 000027
【図８】
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【図９】
2019512269.tif 000029
【図１０】
2019512269.tif 000030
【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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