(57)【要約】  本発明は、タンパク質の半減期を延長するためにアンチトロンビン（ＡＴ）に対する単離単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。本発明者らは、アンチトロンビンに対する単離単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を生成した。本発明者らは、アミド分解アッセイで、ｓｄＡｂによって、ヘパリンの存在においてトロンビン及び第Ｘａ因子に対する阻害性アンチトロンビン活性を遮断することができないことを観察した。ｓｄＡｂの異なる組み合わせによって、マウスにおいてトロンビン及び第Ｘａ因子に対する阻害性アンチトロンビン活性を遮断することができた。このように、本発明者らは、トロンビン生成を促進し、このように血友病及び出血に関連付けられる他の状態を処置するために、アンチトロンビンの阻害機能を遮断するためのｓｄＡｂの異なる組み合せを使用することを提案する。したがって、本発明はまた、それを必要とする被験体において出血障害を防止又は処置する方法に関し、本発明の単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートの治療的に効果的な量を前記被験体に投与することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチトロンビン（ＡＴ）に対する単離単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）。
【請求項２】
請求項１記載の単離単一ドメイン抗体であって、前記ｓｄＡｂが以下を含む、
‐配列番号１として示す配列を有するＣＤＲ１、配列番号２として示す配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３として示す配列を有するＣＤＲ３；
‐配列番号５として示す配列を有するＣＤＲ１、配列番号６として示す配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号７として示す配列を有するＣＤＲ３；
‐配列番号９として示す配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０として示す配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１１として示す配列を有するＣＤＲ３；
‐配列番号１３として示す配列を有するＣＤＲ１、配列番号１４として示す配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１５として示す配列を有するＣＤＲ３；
‐配列番号１７として示す配列を有するＣＤＲ１、配列番号１８として示す配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１９として示す配列を有するＣＤＲ３；
‐配列番号２１として示す配列を有するＣＤＲ１、配列番号２２として示す配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２３として示す配列を有するＣＤＲ３；又は
‐配列番号２５として示す配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６として示す配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２７として示す配列を有するＣＤＲ３。
【請求項３】
請求項１又は２記載の単離単一ドメイン抗体であって、前記ｓｄＡｂが以下である：
‐ＫＢ−ＡＴ−００１（配列番号４）、
‐ＫＢ−ＡＴ−００２（配列番号８）、
‐ＫＢ−ＡＴ−００３（配列番号１２）、
‐ＫＢ−ＡＴ−００４（配列番号１６）、
‐ＫＢ−ＡＴ−００５（配列番号２０）、
‐ＫＢ−ＡＴ−００６  （配列番号２４）、又は
‐ＫＢ−ＡＴ−００７（配列番号２８）。  
【請求項４】
異種部分に連結された、請求項１〜３記載の単離単一ドメイン抗体を含む薬物コンジュゲート。
【請求項５】
異種部分が異種ポリペプチドである、請求項４記載の薬物コンジュゲート。
【請求項６】
異種ポリペプチドが、請求項１〜３記載の単一ドメイン抗体に融合されて融合タンパク質を形成する、請求項４又は５記載の薬物コンジュゲート。
【請求項７】
融合タンパク質が、そのＣ末端で異種ポリペプチドのＮ末端に、もしくはそのＮ末端で異種ポリペプチドのＣ末端に直接的に又はスペーサーを介して融合されている、請求項１〜３記載の少なくとも１つの単離単一ドメイン抗体（ｓｂＡｂ）を含む、請求項４記載の薬物コンジュゲート。
【請求項８】
融合タンパク質がバイパラトープポリペプチドである、請求項４記載の薬物コンジュゲート。
【請求項９】
融合タンパク質が以下を含むバイパラトープ抗体である、請求項４記載の薬物コンジュゲート：
‐単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００３に連結された単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００２；
‐請求項１〜３記載の単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００２に連結された単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００１、
‐請求項１〜３記載の単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００３に連結された単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００１、又は
‐請求項１〜３記載の単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００５に連結された単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００１。
【請求項１０】
融合タンパク質が三価抗体である、請求項４記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１１】
三価抗体が以下を含む、請求項１０記載の薬物コンジュゲート：
‐請求項１〜３記載の単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００２に連結された２つの単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００１、
‐請求項１〜３記載の単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００３に連結された２つの単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００１、又は
‐請求項１〜３記載の単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００５に連結された２つの単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００１。
【請求項１２】
融合タンパク質が四価抗体である、請求項４記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１３】
四価抗体が、請求項１〜３記載の単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００３に連結された単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００２に連結された２つの単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００１を含む、請求項１２記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１４】
異種部分がポリペプチドである、請求項４記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１５】
ポリペプチドがＶＷＦ−Ａ１ドメインである、請求項４又は１４記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１６】
ポリペプチドがＣ４ＢＰから由来するＡポリペプチドである、請求項４又は１４記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１７】
異種部分が循環タンパク質である、請求項６記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１８】
循環タンパク質が凝固因子である、請求項１８記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１９】
請求項１〜３記載の単一ドメイン抗体又は請求項４〜１８記載の薬物コンジュゲートを含むベクター。
【請求項２０】
ベクターがＡＡＶベクターである、請求項１９記載のベクター。
【請求項２１】
治療用ポリペプチドのポリペプチド配列に、請求項１〜３記載のアンチトロンビン又は、ベクターに挿入されたもしくは挿入されていない請求項４〜１８記載の薬物コンジュゲートに対する少なくとも１つのｓｄＡｂを加える工程を含む、治療用ポリペプチドの半減期を延長又は増加させる方法。
【請求項２２】
ベクターに挿入されているもしくは挿入されていない、請求項１〜３記載の単一ドメイン抗体又は請求項６〜１８記載の薬物コンジュゲートの半減期を延長又は増加させる方法。
【請求項２３】
ベクターに挿入されているもしくは挿入されていない、請求項１〜３記載の単一ドメイン抗体又は請求項４〜１８記載の薬物コンジュゲートの治療的に効果的な量を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体において出血障害を防止又は処置する方法。
【請求項２４】
出血障害が血友病Ａ又は血友病Ｂである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ベクターに挿入されているもしくは挿入されていない、請求項１〜３記載の単一ドメイン抗体又は請求項４〜１８記載の薬物コンジュゲートの治療的に効果的な量を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体においてヘパリン誘導性出血を防止又は処置する方法。
【請求項２６】
ベクターに挿入されているもしくは挿入されていない、請求項１〜３記載の単一ドメイン抗体又は請求項４〜１８記載の薬物コンジュゲートを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は免疫療法の分野にある。特に、本発明は、タンパク質の半減期を延長するためにアンチトロンビン（ＡＴ）に対する単離単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。
【０００２】
本発明はまた、アンチトロンビン（ＡＴ）に対する単離単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）及びそれを含むポリペプチド（例えば血液凝固因子など）、ならびに治療における（例えば止血障害の防止及び処置などにおける）その使用に関する。
【０００３】
発明の背景：
治療適用のためのポリペプチド（例えばタンパク質など）の使用が、主に、多くの疾患の根底にある分子生物学的原理の高度な知識ならびにヒトポリペプチドのための改善された組換え発現及び送達システムの利用可能性のために近年拡大している。ポリペプチド治療薬は、特定の天然ポリペプチドが、遺伝的な遺伝子欠損のために患者において欠陥又は喪失している疾患において主に利用されている。例えば、血友病は、特定の血漿タンパク質の欠損により起こされる疾患である。血友病患者は、血液の凝血カスケードのタンパク質成分の妨げられた機能により起こされる出血性の病的状態に苦しむ。罹患した凝固因子に応じて、２つの型の血友病を鑑別することができる。両者は共通して、可溶性フィブリノゲンの不溶性フィブリン塊への変換阻害を有する。
【０００４】
先行技術では、ポリペプチド治療薬の短い循環半減期は、ポリペプチドへのポリマーの共有結合により対処されてきた。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、又はヒドロキシエチルスターチ（ＨＥＳ）の結合によって、一部のポリペプチドの半減期のある程度の改善が示されている。しかし、多くの問題がポリマーの結合で観察されている。例えば、ポリマーの結合は、薬物活性の減少に導きうる。さらに、ポリマーをタンパク質に共役させるために使用される特定の試薬は反応性が不十分であり、従って、タンパク質の変性及び／又は不活性化が生じうる長い反応時間が要求される。また、不完全又は不均一な結合は、異なる特性を有する化合物の混合集団に導く。ＷＯ  ２００９／１３５８８８には、標的タンパク質及び少なくとも１つの結合分子を含む複合体が開示されており、それにおいて、結合分子は少なくとも１つの水溶性ポリマーに結合している。
【０００５】
治療用タンパク質の半減期を増加させて効率を増加させる、あるいは治療用タンパク質の量及び／又は患者に適用される注入の頻度を低下させる新たな産物を開発する必要性が依然としてある。これはまた、処置の費用を低下させうる。
【０００６】
発明の概要
本発明は、タンパク質の半減期を延長するためにアンチトロンビン（ＡＴ）に対する単離単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。特に、本発明は請求項により定義する。
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明者らは、アンチトロンビンに対する単離単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を生成した。本発明者らは、アミド分解アッセイで、ｓｄＡｂによって、ヘパリンの存在においてトロンビン及び第Ｘａ因子に対する阻害性アンチトロンビン活性を遮断することができないことを観察した。驚くべきことに、ｓｄＡｂの異なる組み合わせによって、トロンビン及び第Ｘａ因子に対する阻害性アンチトロンビン活性を遮断することができた。このように、本発明者らは、トロンビン生成を促進し、このように血友病及び出血に関連付けられる他の状態を処置するために、アンチトロンビンの阻害機能を遮断するためのｓｄＡｂの異なる組み合せを使用することを提案する。
【０００８】
出血状態に関するこれらの結果に加えて、本発明者らは、これらの異なる組み合わせが、治療用タンパク質の半減期（例えば血友病の処置のために使用される治療用タンパク質の半減期など）を増加させるために使用できうることを示している。
【０００９】
第一態様では、本発明は、アンチトロンビン（ＡＴ）に対する単離単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。
【００１０】
「単離」により、それは、本発明に従った単一ドメイン抗体を指す場合、示した分子が、同じ型の他の生物学的な巨大分子の実質的な非存在において存在することを意味する。
【００１１】
本明細書中で使用するように、用語「単一ドメイン抗体」（ｓｄＡｂ）は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、天然では軽鎖を欠いているラクダ科の哺乳動物において見出すことができる型の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。そのような単一ドメイン抗体はＶＨＨ又は「ナノボディー（登録商標）」とも呼ばれる。（単一）ドメイン抗体の一般的な記載については、上で引用する先行技術、ならびにＥＰ  ０  ３６８  ６８４、Wardら（Nature 1989 OcT1/2; 341 (6242): 544-6)、Holt et al, Trends Biotechnol, 2003, 21(11):484-490；及びＷＯ  ０６／０３０２２０、ＷＯ  ０６／００３３８８も参照する。単一ドメイン抗体のアミノ酸配列及び構造は、４つのフレームワーク領域又は「ＦＲ」で構成されると考えることができ、それらは、当技術分野及び本明細書においてそれぞれ「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」として；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」として；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」として；及び「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」として言及し；それらのフレームワーク領域は、３つの相補性決定領域又は「ＣＤＲ」により中断されており、それらは、当技術分野においてそれぞれ「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」として；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」として；及び「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」として言及する。したがって、単一ドメイン抗体は、一般的な構造：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を伴うアミノ酸配列として定義することができ、それにおいてＦＲ１からＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４を指し、及びそれにおいてＣＤＲ１からＣＤＲ３は相補性決定領域１〜３を指す。本発明の文脈では、単一ドメイン抗体のアミノ酸残基は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システムアミノ酸ナンバリング（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）により与えられるＶＨドメインについての一般的なナンバリングに従って番号付けする。
【００１２】
アンチトロンビン（ＡＴ）は血液の凝血を防止する抗凝固因子である。それは、凝血経路において機能するトロンビン、ＦＸａ、及び他のセリンプロテアーゼを阻害する。それは４３２のアミノ酸からなり、肝臓の肝細胞により産生され、２．５日の長い血漿中半減期を有する（Collen, Schetz et al. 1977）。ＡＴのアミノ酸配列はよく保存されており、ウシ、ヒツジ、ウサギ、マウス、及びヒトの間での相同性は８４%〜８９%である（Olson and Bjork 1994）。ＡＴの主要な生理学的標的はトロンビン及びＦＸａであるが、ＡＴはＦＩＸａ、ＦＸｌａ、ＦＸＩｌａならびにＦＶＩＩａもより少ない程度で阻害する。ＡＴは、その阻害をヘパリンと一緒に発揮する。ヘパリンの存在において、ＡＴによるトロンビン及びＦＸａの阻害率は、７−１１×１０３/M/秒から１．５−４×１０７/M/秒まで、及び２．５×１０３/M/秒から１．２５−２．５×１０７/M/秒まで３〜４桁増加する（Olson, Swanson et al. 2004）。それぞれ開始段階及び増幅段階のみで凝血を阻害するＴＦＰＩ及びＡＰＣとは異なり、ＡＴは開始段階及び増幅段階の両方で凝血に対する阻害を発揮する。従って、ＡＴを遮断することは、ＴＦＰＩ又はＡＰＣのいずれかを単独で遮断するよりも強力な凝血促進効果を有しうる。
【００１３】
本発明者らは、要求される特性を伴ういくつかの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を単離し、前記ｓｄＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）により特徴付け、このように前記ｓｄＡｂのＣＤＲを決定している（以下の表）：
【表１】
2019516347.tif 000002
【００１４】
特に、本発明は、配列番号１として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ１、配列番号２として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ２、  及び配列番号３として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ３を含む単離単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。
【００１５】
本発明に従い、第２のアミノ酸配列と少なくとも５０%の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸配列が、第２のアミノ酸配列と５０%；５１%；５２%；５３%；５４%；５５%；５６%；５７%；５８%；５９%；６０%；６１%；６２%；６３%；６４%；６５%；６６%；６７%；６８%；６９%；７０%；７１%；７２%；７３%；７４%；７５%；７６%；７７%；７８%；７９%；８０%；８１%；８２%；８３%；８４%；８５%；８６%；８７%；８８%；８９%；９０%；９１%；９２%；９３%；９４%；９５%；９６%；９７%；９８%；９９%又は１００%の同一性を有することを意味する。配列同一性は、パーセンテージ同一性（又は類似性もしくは相同性）に関してしばしば測定する；パーセンテージが高いほど、２つの配列がより類似している。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。種々のプログラム及びアラインメントアルゴリズムが、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970；Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444, 1988；Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244, 1988；Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989；Corpet et al. Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, 1988；Huang et al., Comp. Appls Biosci., 8:155-165, 1992；及びPearson et al., Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994において記載されている。Altschul et al., Nat. Genet., 6:119-129, 1994には、配列アライメント方法及び相同性計算の詳細な考察を提示している。例えば、アライメントツールＡＬＩＧＮ（Myers and Miller, CABIOS 4:11-17, 1989）又はＬＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman, 1988）を使用して配列比較を実施してもよい（Internet Program（登録商標） 1996, W. R. Pearson and the University of Virginia, fasta20u63 version 2.0u63、発売日１９９６年１２月）。ＡＬＩＧＮでは配列全体を互いに比較し、ＬＦＡＳＴＡでは局所的類似性の領域を比較する。これらのアライメントツールとそれぞれのチュートリアルは、例えばインターネット上のＮＣＳＡウェブサイトで入手可能である。あるいは、約３０アミノ酸を上回るアミノ酸配列の比較のために、Ｂｌａｓｔ  ２配列機能を、デフォルトパラメーターにデフォルトＢＬＡＳＴＵＭ６２マトリックスを使用して用いることができる（ギャップ存在コスト１１、及び残基当たりギャップコスト１）。短いペプチド（約３０アミノ酸未満）を整列させる場合、アラインメントは、デフォルトパラメーターにＰＡＭ３０マトリックスセットを用いて（オープンギャップ９、エクステンションギャップ１ペナルティー）、Ｂｌａｓｔ２配列機能を使用して実施すべきである。ＢＬＡＳＴ配列比較システムは、例えばＮＣＢＩウェブサイトから入手可能である；また、Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990；Gish. & States, Nature Genet., 3:266-272, 1993;Madden et al. Meth. Enzymol., 266:131-141, 1996；Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997；及びZhang & Madden, Genome Res., 7:649-656, 1997を参照のこと。
【００１６】
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号１として示す配列を有するＣＤＲ１、配列番号２として示す配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３として示す配列を有するＣＤＲ３を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、配列番号４として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する配列ＫＢ−ＡＴ−００１を含む、本発明に従った単離単一ドメイン抗体。
【００１８】
本発明に従い、第２のアミノ酸配列と少なくとも７０%の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１のアミノ酸配列が、第２のアミノ酸配列と７０%；７１%；７２%；７３%；７４%；７５%；７６%；７７%；７８%；７９%；８０%；８１%；８２%；８３%；８４%；８５%；８６%；８７%；８８%；８９%；９０%；９１%；９２%；９３%；９４%；９５%；９６%；９７%；９８%；９９%、又は１００%の同一性を有することを意味する。
【００１９】
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号４として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００１を含む。
【００２０】
ｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−００１は、前臨床評価試験及び毒物学的試験のための関心であるウサギ、サル、ラット、及びマウスＡＴと交差反応することにさらに注意すべきである。
【表２】
2019516347.tif 000003
【００２１】
特に、本発明は、配列番号５として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ１、配列番号６として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ２、及び配列番号７として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ３を含む単離単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。
【００２２】
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号５として示す配列を有するＣＤＲ１、配列番号６として示す配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号７として示す配列を有するＣＤＲ３を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、配列番号８として示す配列と少なくとも７０%の同一性を有する配列ＫＢ−ＡＴ−００２を含む、本発明に従った単離単一ドメイン抗体。
【００２４】
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号８として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００２を含む。
【００２５】
ｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−００２は、前臨床評価試験及び毒物学的試験のための関心であるウサギ、イヌ、サル、ウシ、ブタ、ラット、及びマウスＡＴと交差反応することにさらに注意すべきである。
【表３】
2019516347.tif 000004
【００２６】
特に、本発明は、配列番号９として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ１、配列番号１０として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ２、及び配列番号１１として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ３を含む単離単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。
【００２７】
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号９として示す配列を有するＣＤＲ１、配列番号１０として示す配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１１として示す配列を有するＣＤＲ３を含む。
【００２８】
一部の実施形態では、配列番号１２として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する配列ＫＢ−ＡＴ−００３を含む、本発明に従った単離単一ドメイン抗体。
【００２９】
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号１２として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００３を含む。
【００３０】
ｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−００３は、前臨床評価試験及び毒物学的試験のための関心であるイヌ、サル、ラット、及びマウスＡＴと交差反応することにさらに注意すべきである。
【表４】
2019516347.tif 000005
【００３１】
特に、本発明は、配列番号１３として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ１、配列番号１４として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ２、及び配列番号１５として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ３を含む単離単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。
【００３２】
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号１３として示す配列を有するＣＤＲ１、配列番号１４として示す配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１５として示す配列を有するＣＤＲ３を含む。
【００３３】
一部の実施形態では、配列番号１６として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する配列ＫＢ−ＡＴ−００４を含む、本発明に従った単離単一ドメイン抗体。
【００３４】
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号１６として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００４を含む。
【００３５】
ｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−００４は、前臨床評価試験及び毒物学的試験のための関心であるイヌ、サル、ブタ、ラット、及びマウスＡＴと交差反応することにさらに注意すべきである。
【表５】
2019516347.tif 000006
【００３６】
特に、本発明は、配列番号１７として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ１、配列番号１８として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ２、及び配列番号１９として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ３を含む単離単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。
【００３７】
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号１７として示す配列を有するＣＤＲ１、配列番号１８として示す配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１９として示す配列を有するＣＤＲ３を含む。
【００３８】
一部の実施形態では、配列番号２０として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する配列ＫＢ−ＡＴ−００５を含む、本発明に従った単離単一ドメイン抗体。
【００３９】
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号２０として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００５を含む。
【００４０】
ｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−００５は、前臨床評価試験及び毒物学的試験のための関心であるサル及びマウスＡＴと交差反応することにさらに注意すべきである。
【表６】
2019516347.tif 000007
【００４１】
特に、本発明は、配列番号２１として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ１、配列番号２２として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ２、及び配列番号２３として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ３を含む単離単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。
【００４２】
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号２１として示す配列を有するＣＤＲ１、配列番号２２として示す配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２３として示す配列を有するＣＤＲ３を含む。
【００４３】
一部の実施形態では、配列番号２４として示す配列と少なくとも７０%を有する配列ＫＢ−ＡＴ−００６を含む、本発明に従った単離単一ドメイン抗体。
【００４４】
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号２４として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００６を含む。
【００４５】
ｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−００６は、前臨床評価試験及び毒物学的試験のための関心であるウサギ、イヌ、サル、ブタ、ラット、及びマウスＡＴと交差反応することにさらに注意すべきである。
【表７】
2019516347.tif 000008
【００４６】
特に、本発明は、配列番号２５として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ１、配列番号２６として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ２、及び配列番号２７として示す配列と少なくとも５０%の配列同一性を有するＣＤＲ３を含む単離単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。
【００４７】
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号２５として示す配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６として示す配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２７として示す配列を有するＣＤＲ３を含む。
【００４８】
一部の実施形態では、配列番号２８として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する配列ＫＢ−ＡＴ−００７を含む、本発明に従った単離単一ドメイン抗体。
【００４９】
一部の実施形態では、本発明に従った単離単一ドメイン抗体は、配列番号２８として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００７を含む。
【００５０】
ｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−００７は、前臨床評価試験及び毒物学的試験のための関心であるサル及びマウスＡＴと交差反応することにさらに注意すべきである。
【００５１】
一部の実施形態では、単一ドメイン抗体は「ヒト化」単一ドメイン抗体である。本明細書中で使用するように、用語「ヒト化」は、天然に生じるＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列が「ヒト化」されている、即ち、前記の天然に生じるＶＨＨ配列のアミノ酸配列中（及び、特にフレームワーク配列中）の１つ以上のアミノ酸残基を、ヒトからの従来の鎖抗体からのＶＨドメイン中の対応する位置で生じるアミノ酸残基の１つ以上により置換することによる、本発明の単一ドメイン抗体を指す。単一ドメイン抗体をヒト化するための方法は、当技術分野において周知である。典型的には、ヒト化置換は、結果として得られるヒト化単一ドメイン抗体が、本発明の単一ドメイン抗体の好ましい特性を依然として保持するように選ぶべきである。当業者は、適切なヒト化置換又はヒト化置換の適切な組み合わせを決定及び選択することができる。
【００５２】
第２の態様において、本発明は、異種部分に連結された、本発明の単離単一ドメイン抗体を含む薬物コンジュゲートに関する。
【００５３】
一部の実施形態では、異種部分は、アプタマー、核酸、ポリペプチド、別の単一ドメイン抗体、又は治療用ポリペプチドである。
【００５４】
一部の実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、異種部分にコンジュゲートされる。本明細書中で使用するように、用語「コンジュゲーション」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、化学的コンジュゲーションを意味する。異種部分をポリペプチドにコンジュゲートするための技術は、当技術分野において周知である（例、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985)；Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” in Controlled Drug Delivery(Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987)；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications(Pinchera et al. eds., 1985)；“Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,”in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy(Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985)；及びThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照のこと。また、ＰＣＴ公開ＷＯ  ８９／１２６２４．を参照のこと）。典型的には、核酸分子は、Ｎヒドロキシスクシンイミドエステル又はマレイミド官能基をそれぞれ通じて、抗体上のリジン又はシステインに共有結合される。操作されたシステインを使用したコンジュゲーション又は非天然アミノ酸の取り込みの方法が、コンジュゲートの均一性を改善することが報告されている（Axup,J.Y., Bajjuri, K.M., Ritland, M., Hutchins, B.M., Kim, C.H., Kazane, S.A., Halder, R., Forsyth, J.S., Santidrian, A.F., Stafin, K., et al. (2012). Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 16101-16106.；Junutula, J.R., Flagella, K.M., Graham, R.A., Parsons, K.L., Ha, E., Raab, H., Bhakta, S., Nguyen, T., Dugger, D.L., Li, G., et al.(2010). Engineered thio-trastuzumab-DM1 conjugate with an improved therapeutic index to target human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. Clin. Cancer Res.16, 4769-4778.）。Junutulaら（２００８）は、従来のコンジュゲーション方法と比較し、改善された治療指数を呈することが要求される「ＴＨＩＯＭＡＢ」（ＴＤＣ）と呼ばれるシステインベースの部位特異的コンジュゲーションを開発した。特に、当業者はまた、ポリペプチド操作（例、ポリペプチド上でのアミノ酸欠失、挿入、置換、又は変異を介して）により反応性に作製されたアシルドナーグルタミン含有タグ（例、Ｇｉｎ含有ペプチドタグ又はＱタグ）又は内因性グルタミンを用いて操作されたポリペプチドも予想することができる。次に、トランスグルタミナーゼは、アミンドナー薬剤（例、反応性アミンを含む、又はそれに結合された小分子）を用いて、共有結合的に架橋し、操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートの安定で均一な集団を形成することができ、アミンドナー薬剤は、アシルドナーグルタミン含有タグ又は接近可能な／曝露された／反応性の内因性グルタミンを通じてＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的にコンジュゲートされている（ＷＯ  ２０１２０５９８８２）。用語「トランスグルタミナーゼ」は「ＴＧａｓｅ」又は「ＴＧ」と互換的に使用され、ペプチド結合グルタミンのγカルボキサミド基とリジン又は構造的に関連する第一級アミンのεアミノ基、例えばアミノペンチル基など（例、ペプチド結合リジン）の間でのアシル転移反応を通じてタンパク質��架橋し、ε（γグルタミル）リジンイソペプチド結合をもたらすことが可能な酵素を指す。ＴＧアーゼには、とりわけ、細菌トランスグルタミナーゼ（ＢＴＧ）、例えばＥＣリファレンスＥＣ  ２．３．２．１３（タンパク質−グルタミン−γ−グルタミルトランスフェラーゼ）を有する酵素などが含まれる。一部の実施形態では、本発明の単一ドメイン抗体は、リンカー分子により異種部分にコンジュゲートされる。本明細書中で使用するように、用語「リンカー分子」は、本発明の単一ドメイン抗体に結合された任意の分子を指す。結合は典型的には共有結合的である。一部の実施形態では、リンカー分子は可動性であり、本発明の単一ドメイン抗体の結合と干渉しない。
【００５５】
一部の実施形態では、異種部分が異種ポリペプチドである場合、本発明の単一ドメイン抗体は異種ポリペプチドに融合されて融合タンパク質を形成する。
【００５６】
「融合」又は「キメラ」タンパク質又はポリペプチドは、天然において天然には連結されていない第２のアミノ酸配列に連結された第１のアミノ酸配列を含む。別々のタンパク質中に通常存在するアミノ酸配列は、融合ポリペプチド中に一緒にすることができる。融合タンパク質は、例えば、化学合成により、又はポリペプチド領域が所望の関係においてコードされるポリヌクレオチドを作製及び翻訳することにより作製する。
【００５７】
本発明に従い、融合タンパク質は、そのＣ末端で異種ポリペプチドのＮ末端に、もしくはそのＮ末端で異種ポリペプチドのＣ末端に直接的に又はスペーサーを介して融合されている、本発明に従った少なくとも１つの単離単一ドメイン抗体（ｓｂＡｂ）を含む。本明細書中で使用するように、用語「直接的に」は、単一ドメイン抗体の末端（Ｎ末端又はＣ末端）の（最初又は最後の）アミノ酸が、異種ポリペプチドの末端（Ｎ末端又はＣ末端）で（最初又は最後の）アミノ酸に融合されている。換言すれば、本実施形態では、前記ｓｄＡｂのＣ末端の最後のアミノ酸は、前記異種ポリペプチドのＮ末端の最初のアミノ酸に共有結合により直接的に連結している、又は前記ｓｄＡｂのＮ末端の最初のアミノ酸は、前記異種ポリペプチドのＣ末端の最後のアミノ酸に共有結合により直接的に連結している。本明細書中で使用するように、用語「スペーサー」は、「リンカー」とも呼ばれ、本発明のｓｄＡｂを異種ポリペプチドに連結する少なくとも１つのアミノ酸の配列を指す。そのようなスペーサーは、立体障害を防止するために有用でありうる。本発明で開示するリンカーの例は、以下の配列（Ｇｌｙ３−Ｓｅｒ）４、（Ｇｌｙ３−Ｓｅｒ）、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、又は（Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ）を有する。
【００５８】
一部の実施形態では、異種部分は、本発明の別の単一ドメイン抗体である。したがって、本発明に従い、薬物コンジュゲートは、このように、本明細書で「一価」薬物コンジュゲートとして言及される唯一の単一ドメイン抗体を含むことができる。本発明に従った２つ以上の単一ドメイン抗体を含むか、又は本質的にそれらからなる薬物コンジュゲートは、本明細書では「多価」ポリペプチドとして言及される。典型的には、多価ポリペプチドは、二重パラトープ抗体、三価抗体、又は四価抗体でありうる。
【００５９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は二重パラトープポリペプチドである。本明細書中で使用するように、用語「二重パラトープ」ポリペプチドは、本明細書中で定義する単一ドメイン抗体及び第２の単一ドメイン抗体を含むポリペプチドを意味し、これらの２つの単一ドメイン抗体は、１つの抗原の２つの異なるエピトープ（例、アンチトロンビン）に結合することが可能であり、このエピトープは、通常、１つの単一特異性免疫グロブリン（例えば従来の抗体又は単一ドメイン抗体など）により同時に結合されない。二重パラトープポリペプチドは二価抗体とも呼ばれる。
【００６０】
一部の実施形態では、本発明の二重パラトープポリペプチドの２つの単一ドメイン抗体は、直接的に（即ち、リンカーを使用せずに）又はリンカーを介して互いに連結することができる。リンカーは、典型的には、リンカーペプチドであり、本発明に従い、アンチトロンビンのそれらの少なくとも２つの異なるエピトープのへの２つの単一ドメイン抗体の結合を可能にするように選択される。適切なリンカーは、とりわけ、エピトープ及び、具体的には、単一ドメイン抗体が結合するアンチトロンビン上のエピトープ間の距離に依存し、任意に、特定の限定された程度の日常的実験後に、本明細書の開示に基づいて当業者に明らかになる。また、アンチトロンビンに結合する２つの単一ドメイン抗体は、第３の単一ドメイン抗体を介して互いに連結されうる（２つの単一ドメイン抗体が第３のドメイン抗体に直接的に又は適切なリンカーを介して連結されうる）。そのような第３の単一ドメイン抗体は、例えば、増加した半減期を提供する単一ドメイン抗体でありうる。例えば、後者の単一ドメイン抗体は、（ヒト）血清タンパク質、例えば（ヒト）血清アルブミン又は（ヒト）トランスフェリンなどに結合することが可能である単一ドメイン抗体であってもよい。一部の実施形態では、アンチトロンビンに結合する２つ以上の単一ドメイン抗体は、（直接的に、又は適切なリンカーを介して）直列で連結されており、第３の（単一）単一ドメイン抗体（上に記載するように、半減期が増加しうる）は、これらの２つ以上の前述の単一ドメイン抗体のうちの１つに直接的に、又はリンカーを介して結合される。適切なリンカーを、本発明の特定のポリペプチドに関連して本明細書に記載しており、例えば、限定しないが、アミノ酸配列（このアミノ酸配列は、好ましくは９又はそれ以上のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１７のアミノ酸、例えば約２０〜４０のアミノ酸などの長さを有する）を含みうる。しかし、その上限は重要ではないが、例えばそのようなポリペプチドの生物医薬的生産に関する利便性の理由で選択される。リンカー配列は天然配列又は非天然配列であってもよい。治療的な目的のために使用される場合、リンカーは、好ましくは、本発明の抗アンチトロンビンポリペプチドが投与される被験体において非免疫原性である。リンカー配列の１つの有用な群は、ＷＯ  ９６／３４１０３及びＷＯ  ９４／０４６７８に記載される重鎖抗体のヒンジ領域から由来するリンカーである。他の例は、ポリアラニンリンカー配列（例えばＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａなど）である。リンカー配列のさらに好ましい例は、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）４、（ｇｌｙ４ｓｅｒ）、（ｇｌｙ３ｓｅｒ）、ｇｌｙ３、ならびに（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）４、（ｇｌｙ３ｓｅｒ）４及びＳｅｒ−Ｇｌｙを含む、異なる長さのＧｌｙ／Ｓｅｒリンカーである。
【００６１】
一部の実施形態では、異種部分は、本発明に従った単一ドメイン抗体である。したがって、融合タンパク質は、上に記載する少なくとも１つの単一ドメイン抗体を含む。
【００６２】
特定の実施形態では、融合タンパク質は二重パラトープ抗体である。典型的には、融合タンパク質は２つの単一ドメイン抗体を含む。例えば、第１の単一ドメイン抗体は、リンカーを介して自然では天然には連結していない別の単一ドメイン抗体に直接的に連結されている。
【００６３】
特定の実施形態では、本発明は、上で定義するＫＢ−ＡＴ−００２誘導体及び上で定義するＫＢ−ＡＴ−００３誘導体を含む二重パラトープ抗体に関する。この二重パラトープ抗体は以下の配列を有する：
【表８】
2019516347.tif 000009
【００６４】
一部の実施形態では、配列番号２９として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する配列ＫＢ−ＡＴ−００２及びＫＢ−ＡＴ−００３を含む本発明に従った融合タンパク質。
【００６５】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号２９として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００２／００３を含む。
【００６６】
特定の実施形態では、本発明は、上に記載するような単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００２に連結された、上に記載する単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００１を含む二相性抗体に関する。この二重パラトープ抗体は以下の配列を有する：
【表９】
2019516347.tif 000010
【００６７】
一部の実施形態では、配列番号３０として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する配列ＫＢ−ＡＴ−００１及びＫＢ−ＡＴ−００２を含む本発明に従った融合タンパク質。
【００６８】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号３０として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００１／００２を含む。
【００６９】
特定の実施形態では、本発明は、上に記載する単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００３に連結された、上に記載する単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００１を含む二重パラトープ抗体に関する。この二重パラトープ抗体は以下の配列を有する：
【表１０】
2019516347.tif 000011
【００７０】
一部の実施形態では、配列番号３１として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する配列ＫＢ−ＡＴ−００１及びＫＢ−ＡＴ−００３を含む本発明に従った融合タンパク質。
【００７１】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号３１として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００１／００３を含む。
【００７２】
特定の実施形態では、本発明は、上に記載する単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００５に連結された、上に記載する単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００１を含む二重パラトープ抗体に関する。この二重パラトープ抗体は以下の配列を有する：
【表１１】
2019516347.tif 000012
【００７３】
一部の実施形態では、配列番号３２として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する配列ＫＢ−ＡＴ−００１及びＫＢ−ＡＴ−００５を含む本発明に従った融合タンパク質。
【００７４】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号３２として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００１／００５を含む。
【００７５】
特定の実施形態では、融合タンパク質は三価抗体である。典型的には、融合タンパク質は、２つのリンカーを介して連結された２つの単一ドメイン抗体を含む。
【００７６】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、本発明に従った単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００２に連結された、本発明に従った２つの単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００１を含む三価抗体である。この三価抗体は以下の配列を有する：
【表１２】
2019516347.tif 000013
【００７７】
一部の実施形態では、配列番号３３として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する２つの配列ＫＢ−ＡＴ−００１及び１つのＫＢ−ＡＴ−００２配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
【００７８】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号３３として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−１１２を含む。
【００７９】
特定の実施形態では、本発明は、本発明に従った単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００３に連結された、本発明に従った２つの単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００１を含む三価抗体に関する。この３価抗体は以下の配列を有する：
【表１３】
2019516347.tif 000014
【００８０】
一部の実施形態では、配列番号３４として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する２つの配列ＫＢ−ＡＴ−００１及び１つのＫＢ−ＡＴ−００３配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
【００８１】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号３４として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−１１３を含む。
【００８２】
特定の実施形態では、本発明は、本発明に従った単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００５に連結された、本発明に従った２つの単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００１を含む三価抗体に関する。この三価抗体は以下の配列を有する：
【表１４】
2019516347.tif 000015
【００８３】
一部の実施形態では、配列番号３５として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する２つの配列ＫＢ−ＡＴ−００１及び１つのＫＢ−ＡＴ−００５配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
【００８４】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号３５として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−１１５を含む。
【００８５】
特定の実施形態では、融合タンパク質は四価抗体である。典型的には、融合タンパク質は、３つのリンカーを介して互いに連結された４つの単一ドメイン抗体を含む。
【００８６】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００３に結合された、本発明に従った単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００２に連結された、本発明に従った２つの単離単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００１を含む四価抗体である。この四価抗体は以下の配列を有する：
【表１５】
2019516347.tif 000016
【００８７】
一部の実施形態では、配列番号３６として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する２つの配列ＫＢ−ＡＴ−００１、１つのＫＢ−ＡＴ−００２配列、及び１つのＫＢ−ＡＴ−００３配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
【００８８】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号３６として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−１１２３を含む。
【００８９】
一部の実施形態では、異種部分はポリペプチドである。典型的には、本発明に従った単一ドメイン抗体又は多価抗体は、ポリペプチド、例えばアルブミン、アルブミン結合ペプチド、ＶＷＦもしくはその断片、又はＣ４ＢＰ由来ポリペプチドなどに連結される。
【００９０】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＶＷＦ  Ａ１ドメインに連結された、上に記載する二重パラトープ抗体を含む。典型的には、二重パラトープ抗体は、ＶＷＦ  Ａ１ドメイン配列に連結されたＫＢ−ＡＴ−００２／００３である。そのような融合タンパク質は以下の配列を有する：
【表１６】
2019516347.tif 000017
【００９１】
一部の実施形態では、配列番号３７として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する、ＫＢ−ＡＴ−００２の１つの配列、ＫＢ−ＡＴ−００３の１つの配列、及びヒトＶＷＦ  Ａ１ドメインの配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
【００９２】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号３７として示す配列を有するＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−ＡＴ−００２／００３を含む。
【００９３】
特定の実施形態では、異種ポリペプチドは、Ｃ４ＢＰから由来するポリペプチドである。
【００９４】
本明細書中で使用するように、用語「Ｃ４ＢＰ」は、阻害剤として作用する補体系に関与するタンパク質であるＣ４ｂ結合タンパク質を指す。Ｃ４ＢＰは、中心の茎及び７つの分枝α鎖を伴うタコ様構造を有する。ヒト血液中のＣ４ＢＰの主な形態は、７つの同一のアルファ鎖及び１つの特有のベータ鎖で構成され、それは次に抗凝固剤であるビタミンＫ依存性プロテインＳと結合する。Ｃ４ＢＰは、肝臓中で主に合成される、推定血漿濃度２００マイクログラム/mLを伴う大きな糖タンパク質（５００kDa)である。
【００９５】
特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃ４ＢＰ配列と融合された、本発明に従った単離単一ドメイン抗体を含む。典型的には、単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００２はＣ４ＢＰに連結される。そのようなタンパク質は以下の配列を有する：
【表１７】
2019516347.tif 000018
【００９６】
一部の実施形態では、配列番号３８として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する１つのＫＢ−ＡＴ−００２及びヒトＣ４ＢＰの配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
【００９７】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号３８として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００２−Ｃ４ＢＰを含む。
【００９８】
一部の実施形態では、単一ドメイン抗体ＫＢ−ＡＴ−００３はＣ４ＢＰに連結される。そのようなタンパク質は以下の配列を有する：
【表１８】
2019516347.tif 000019
【００９９】
一部の実施形態では、配列番号３９として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する１つのＫＢ−ＡＴ−００３及びヒトＣ４ＢＰの配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
【０１００】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号３９として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００３／Ｃ４ＢＰを含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、マウスＦＶＩＩ変異体に連結された、上に記載する二重パラトープ抗体を含む。典型的には、二重パラトープ抗体は、マウスＦＶＩＩ変異体配列に連結されたＫＢ−ＡＴ−００２／００３である。そのような融合タンパク質は以下の配列を有する：
【表１９】
2019516347.tif 000020
【０１０２】
一部の実施形態では、配列番号４０として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する１つのＫＢ−ＡＴ−００２配列、１つのＫＢ−ＡＴ−００３配列、及びマウスＦＶＩＩの配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
【０１０３】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号４０として示す配列を有するｍＦＶＩＩ−ＡＴ−０２０３を含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＦＶＩＩＩ変異体に連結された、上に記載する二重パラトープ抗体を含む。典型的には、二重パラトープ抗体は、ＦＶＩＩＩ変異体配列に連結されたＫＢ−ＡＴ−００２／００３である。そのような融合タンパク質は以下の配列を有する：
【表２０】
2019516347.tif 000021
2019516347.tif 000022
【０１０５】
一部の実施形態では、配列番号４１として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する、ＫＢ−ＡＴ−００２の１つの配列、ＫＢ−ＡＴ−００３の１つの配列、及びヒトＦＶＩＩＩの配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
【０１０６】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号４１として示す配列を有するＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３を含む。
【表２１】
2019516347.tif 000023
【０１０７】
一部の実施形態では、配列番号４２として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する２つの配列ＫＢ−ＡＴ−００１及び１つのＫＢ−ＡＴ−００４配列を含む本発明に従った融合タンパク質。
【０１０８】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号４２として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−１１４を含む。
【表２２】
2019516347.tif 000024
【０１０９】
一部の実施形態では、配列番号４３として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する１つの配列ＫＢ−ＡＴ−００６及び２つのＫＢ−ＡＴ−００４配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
【０１１０】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号４３として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−６４４を含む。
【表２３】
2019516347.tif 000025
【０１１１】
一部の実施形態では、配列番号４４として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有する１つの配列ＫＢ−ＡＴ−００２及び２つのＫＢ−ＡＴ−００４配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
【０１１２】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号４４として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−２４４を含む。
【表２４】
2019516347.tif 000026
【０１１３】
一部の実施形態では、配列番号４５として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有するＫＢ−ＡＴ−００４の２つの配列及びＫＢ−ＡＴ−００３の１つの配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
【０１１４】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号４５として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−４４３を含む。
【表２５】
2019516347.tif 000027
【０１１５】
一部の実施形態では、配列番号４６として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有するＫＢ−ＡＴ−００２の１つの配列及びＫＢ−ＡＴ−００４の１つの配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
【０１１６】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号４６として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００２００４を含む。
【表２６】
2019516347.tif 000028
2019516347.tif 000029
【０１１７】
一部の実施形態では、配列番号４７として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有するＫＢ−ＡＴ−００４の２つの配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
【０１１８】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号４７として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００４００４を含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、配列番号４８として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有するＫＢ−ＡＴ−００２の１つの配列及びＫＢ−ＡＴ−００６の１つの配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
【０１２０】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号４８として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００２００６を含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、配列番号４９として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有するＫＢ−ＡＴ−００１の２つの配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
【０１２２】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号４９として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−００１００１を含む。
【０１２３】
一部の実施形態では、配列番号５０として示す配列と少なくとも７０%の配列同一性を有するＫＢ−ＡＴ−００６の２つの配列、ＫＢ−ＡＴ−００２の１つの配列、及びＫＢ−ＡＴ−００３の１つの配列を含む、本発明に従った融合タンパク質。
【０１２４】
一部の実施形態では、本発明に従った融合タンパク質は、配列番号５０として示す配列を有するＫＢ−ＡＴ−６６２３を含む。
【０１２５】
一部の実施形態では、異種部分は循環タンパク質である。典型的には、本発明に従った単一ドメイン抗体又は多価抗体は、循環タンパク質に連結される。
【０１２６】
「循環タンパク質」により、身体器官の細胞により合成され、血流内で輸送されるタンパク質を意味する。循環タンパク質の例は、血液の凝血因子、タンパク質、及びホルモンである。
【０１２７】
一部の実施形態では、循環タンパク質は治療用タンパク質、即ち、被験体の処置のために使用することができるタンパク質である。このように、一部の実施形態では、異種部分は、特に短い半減期を有し、それを必要とする患者に反復投与をもたらす治療用ポリペプチドである。そのような治療用ポリペプチドは、例えば、インスリン、グルカゴン、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、アンジオポエチン２（ＡＮＧＰＴ２）、フリン、成長因子、又は他のペプチドホルモンでありうる。
【０１２８】
本明細書中で使用するように、用語「半減期」は、インビボでの特定のポリペプチドの生物学的半減期を指す。半減期は、被験体に投与される量の半分が動物における循環及び／又は他の組織から除去されるために要求される時間により表してもよい。所与のポリペプチドのクリアランス曲線が時間の関数として構築される場合、曲線は通常、迅速なα相及びより長いβ相を伴う二相性である。
【０１２９】
特定の実施形態では、循環タンパク質は凝固因子（血液の凝血因子とも呼ばれる）である。
【０１３０】
本明細書中で使用するように、用語「凝固因子」は、被験体における出血エピソードの持続を防止又は減少させる、天然に生じる又は組み換え産生された分子又はその類似体を指す。換言すれば、それは、凝固促進活性を有する、即ち、促進する分子が、フィブリノゲンを不溶性フィブリンの網目に変換し、血液を凝血又は凝固させることに関与することを意味する。凝固因子には、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）、第ＶＩＩＩ因子、ビタミンＫ依存性凝血タンパク質（第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、及びプロトロンビンを含む）、及び凝固因子Ｖが含まれる。本発明の凝固因子は、野生型凝固因子の変異体であってもよい。用語「変異体」は、保存的又は非保存的な挿入、欠失、及び置換を含み、そこでは、そのような変化によって、それぞれの凝固因子の生物学的活性を付与する活性部位又は活性ドメインは実質的に変化しない。好ましくは、凝固因子は、ＶＷＦ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、及びＦＸからなる群より選択する。
【０１３１】
第３の態様では、本発明は、本発明の単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートを含むベクターに関する。
【０１３２】
典型的には、単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートは、ベクターに関連して送達されうる。本発明の単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートは、適切なベクター、例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、又はウイルスベクターなどに含まれる。そのため、本発明のさらなる目的は、本発明の単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートを含むベクターに関する。典型的には、ベクターはウイルスベクターであり、それはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ポリオーマウイルス、又は感染性ウイルスである。一部の実施形態では、ベクターはＡＡＶベクターである。本明細書中で使用するように、用語「ＡＡＶベクター」は、アデノ随伴ウイルス血清型から由来するベクターを意味し、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びそれらの変異形態を含むが、これらに限定しない。ＡＡＶベクターは、全部又は一部が欠失したＡＡＶ野生型遺伝子の１つ以上、好ましくはｒｅｐ遺伝子及び／又はｃａｐ遺伝子を有するが、機能的な隣接ＩＴＲ配列を保持することができる。レトロウイルスは、それらの遺伝子を宿主ゲノム中に組み込み、多量の外来遺伝物質を移し、広範囲の種及び細胞型に感染させ、特別な細胞系においてパッケージするそれらの能力のために、遺伝子送達ベクターとして選ばれうる。レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノム中に挿入して、複製欠損であるウイルスを産生する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及び／又はｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ及び／又はパッケージング成分を伴わないパッケージング細胞系を構築する。レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列と一緒にｃＤＮＡを含む組換えプラスミドを（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）この細胞株に導入する場合、パッケージング配列によって、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子中にパッケージングされ、次に培養培地中に分泌される。組換えレトロウイルスを含む培地を次に収集し、任意に濃縮し、遺伝子導入に用いる。レトロウイルスベクターは広範囲の細胞型に感染することができる。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、調節機能又は構造機能を伴う他の遺伝子を含む。より高い複雑性によって、潜伏感染の経過などのように、ウイルスがそのライフサイクルを調節することが可能になる。レンチウイルスの一部の例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１、ＨＩＶ２）及びシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ毒性遺伝子を複数回弱毒化することにより生成されており、例えば遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、及びｎｅｆが欠失されており、ベクターを生物学的に安全にする。レンチウイルスベクターは当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，０１３，５１６号及び第５，９９４，１３６号を参照のこと。これらの両方を、参照により本明細書中に組み入れる。一般的に、ベクターはプラスミドベース又はウイルスベースであり、宿主細胞中への核酸の選択及び移入のために、外来核酸を組み入れるための必須配列を保持するように設定される。目的のベクターのｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びｅｎｖ遺伝子も当技術分野で公知である。このように、関連遺伝子を選択されたベクター中にクローニングし、次に目的の標的細胞を形質転換するために使用する。適切な宿主細胞が、パッケージング機能、即ち、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ、ならびにｒｅｖ及びｔａｔを保有する２つ以上のベクターでトランスフェクトされた非分裂細胞に感染することが可能である組換えレンチウイルスが、米国特許第５，９９４，１３６号に記載されており、参照により本明細書中に組み入れる。これは、ウイルスｇａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子をコードする核酸を提供することができる第１のベクター、ならびにパッケージング細胞を産生するためにウイルスｅｎｖをコードする核酸を提供することができる別のベクターを記載する。そのパッケージング細胞中に異種遺伝子を提供するベクターを導入することによって、目的の外来遺伝子を保有する感染性ウイルス粒子を放出する産生細胞がもたらされる。ｅｎｖは、好ましくは、ヒト及び他の種の細胞の形質導入を可能にする両種指向性エンベロープタンパク質である。典型的には、本発明の核酸分子又はベクターは、「制御配列」を含み、これは、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」））、エンハンサーなどを集合的に指し、これらは、レシピエント細胞においてコード配列の複製、転写、及び翻訳を集合的に提供する。選択されたコード配列が適当な宿主細胞において複製、転写、及び翻訳されることが可能である限り、これらの制御配列の全てが常に存在する必要はない。別の核酸配列は、本明細書において、その通常の意味において、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指すために使用される「プロモーター」配列であり、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合して、下流（３’方向）コード配列の転写を開始することが可能である遺伝子から由来する。転写プロモーターには、「誘導性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などにより誘導される）、「抑制性プロモーター」（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子、調節タンパク質などにより誘導される）、及び「構成的プロモーター」が含まれる。
【０１３３】
第４の態様では、本発明は、治療用ポリペプチドの半減期を延長又は増加させる方法に関し、前記治療用ポリペプチドのポリペプチド配列に、アンチトロンビン又は、本発明に従ったベクターに挿入されたもしくは挿入されていない薬物コンジュゲートに対する少なくとも１つのｓｄＡｂを加える工程を含む。
【０１３４】
典型的には、本発明の単一ドメイン抗体又は多価抗体は、循環タンパク質の半減期を延長又は増加させるために適切である。
【０１３５】
一部の実施形態では、本発明に従った単一ドメイン抗体をフォン・ヴィレブランド（ＶＷＦ）因子に融合させる。特に、本発明に従った単一ドメイン抗体をＶＷＦ−Ａ１ドメインに融合させる。そのような構築物は、上に記載するＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−ＡＴ−００２／００３に対応する。
【０１３６】
一部の実施形態では、本発明に従った単一ドメイン抗体を第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）に融合させる。特に、本発明に従った単一ドメイン抗体をＦＶＩＩに融合させる。そのような構築物は、上に記載するＦＶＩＩ−ＡＴ−０２０３に対応する。
【０１３７】
一部の実施形態では、本発明に従った単一ドメイン抗体を第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）に融合させる。特に、本発明に従った単一ドメイン抗体をＦＶＩＩＩに融合させる。このような構築物は、上に記載するＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３に対応する。
【０１３８】
特定の実施形態では、薬物コンジュゲートは、ＡＴに対して向けられ、被験体に投与される前記ｓｄＡｂに連結されていない対応するポリペプチドと比較して、低下したクリアランス速度、このように、被験体に投与された場合の延長された半減期を示す。
【０１３９】
特定の実施形態では、本発明は、ベクターに挿入された又は挿入されていない本発明に従った単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートの半減期を延長又は延長させる方法に関する。
【０１４０】
さらなる実施形態では、本発明に従った単一ドメイン抗体の半減期は、Ｃ４ＢＰにより延ばすことができる。典型的には、本発明に従った単一ドメイン抗体をＣ４ＢＰに融合させる。そのような構築物を上に記載している（融合タンパク質ＫＢ−ＡＴ−００２／Ｃ４ＢＰ及びＫＢ−ＡＴ−００３／Ｃ４ＢＰを参照のこと）。
【０１４１】
第５の態様では、本発明は、それを必要とする被検体の出血障害を防止又は処置する方法に関し、ベクターに挿入された又は挿入されていない本発明に従った単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートの治療的に効果的な量を前記被験体に投与することを含む。
【０１４２】
本明細書中で使用するように、用語「処置する」又は「処置」は、疾患に罹患するリスクがある、又は疾患に罹患している疑いのある被験者、ならびに病気である、又は疾患もしくは医学的状態に苦しんでいると診断された被験体の処置を含む、予防的又は防止的処置ならびに治癒又は疾患修飾処置の両方を指し、及び臨床的再発の抑制を含む。処置は、障害又は再発性障害の１つ以上の症状を防止、治癒、その発症の遅延、重症度の低下、もしくは寛解させるために、又はそのような処置の非存在下で予想される生存を超えて被験体の生存を延長させるために、医学的障害を有する、又は最終的に障害を獲得しうる被験体に投与してもよい。「治療レジメン」により、病気の処置のパターン、例えば治療の間に使用される投薬パターンを意味する。治療レジメンは、誘導レジメン及び維持レジメンを含みうる。語句「誘導レジメン」又は「誘導期間」は、疾患の初期処置のために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。誘導レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間の間に高レベルの薬物を被験体に提供することである。誘導レジメンは、「負荷レジメン」を（一部又は全部で）使用してもよく、医師が維持レジメンの間に用いうるよりも多い用量の薬物を投与すること、医師が維持療法レジメンの間に薬物を投与しうるよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含みうる。語句「維持レジメン」又は「維持期間」は、病気の処置の間での患者の維持のために、例えば、被験体を長期間（月又は年）にわたり緩解に保つために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの部分）を指す。維持レジメンは、連続治療（例、例えば毎週、毎月、毎年などの定期的な間隔で薬物を投与する）又は間欠的治療（例、断続的処置、間欠的処置、再発時の処置、又は特定の予め定められた基準［例、疼痛、疾患の徴候など］の達成時での処置）を用いうる。
【０１４３】
本明細書中で使用するように、用語「被験体」は、任意の哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類などを指す。特に、本発明において、被験体は、出血性障害に罹患しているか、又は罹患しやすいヒトである。
【０１４４】
本発明の融合タンパク質の投与により処置されうる出血障害は、血友病ならびにフィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、ＦＩＸ、又は第Ｘ因子の欠損又は構造異常を含むが、これらに限定しない。
【０１４５】
特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質の投与により処置されうる出血障害は、血友病Ａ又は血友病Ｂである。
【０１４６】
「治療的に効果的な量」とは、任意の医療処置に適用可能な合理的な利益／リスク比での出血障害の処置のための方法における使用のための、防止するために十分な量のポリペプチド（又はポリペプチドを含むベクター）を意味する。本発明の化合物及び組成物の毎日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決められることが理解されるであろう。任意の特定の患者のための特定の治療的に効果的な用量レベルは、患者の年齢、体重、一般的な健康、性別、及び食事；用いられる特定の化合物の投与時間、投与経路、及び排泄速度；処置の持続期間；用いられる特定のポリペプチドと組み合わせで又はそれと同時に使用される薬物；及び医学的技術分野において周知の同様の因子を含む種々の因子に依存する。例えば、所望の治療的効果を達成するために、及び所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させるために要求されるものよりも低いレベルで化合物の用量を開始することは、当業者の技術内で周知である。しかし、産物の１日投与量は、０．０１〜１，０００mg／成人／日の広範囲にわたり変動しうる。好ましくは、組成物は、処置される患者への投与量の症候性調整のために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０、及び５００mgの活性成分を含む。医薬は、典型的には、約０．０１mg〜約５００mgの活性成分を、好ましくは１mg〜約１００mgの活性成分を含む。効果的な量の薬物は、普通は、０．０００２mg/kg〜約１００mg/kg体重/日の投与量レベルで供給される。
【０１４７】
一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体においてヘパリン誘導性出血を防止又は処置するための方法に関し、本発明に従った単一ドメイン抗体、薬物コンジュゲート、又は単一ドメイン抗体もしくは薬物コンジュゲートを含むベクターの治療的に効果的な量を前記被験体に投与することを含む。
【０１４８】
ヘパリンは広く使用されている注射可能な血液溶剤である。これは、深部静脈血栓症及び肺塞栓症を処置及び防止するために使用される。ヘパリンは変動する鎖サイズのポリマーである。医薬品としての未分画ヘパリン（ＵＦＨ）は、低分子量を伴う分子の画分を隔離するために分画されていないヘパリンである。対照的に、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）は、その薬力学をより予測可能にする目的のための分画を経ている。用語「ヘパリン誘導性出血」は、治療的に投与された場合でのヘパリンの主要な副作用である出血を指す。
【０１４９】
第６の態様では、本発明は、ベクターに挿入されている又は挿入されていない、本発明に従った単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲートを含む医薬組成物に関する。
【０１５０】
本発明の単一ドメイン抗体及び薬物コンジュゲート（又は単一ドメイン抗体及び薬物コンジュゲートを含むベクター）は、医薬組成物を形成するために、医薬的に許容可能な賦形剤、及び、任意に徐放性マトリックス（例えば生分解性ポリマーなど）と組み合わせてもよい。本明細書中で使用するように、用語「医薬的に」又は「医薬的に許容可能な」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与した場合、有害な、アレルギー性の、又は他の厄介な反応を産生しない分子実体及び組成物を指す。医薬的に許容可能な担体又は賦形剤は、非毒性の固体、半固体、もしくは液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料、又は任意の型の補助製剤を指す。
【０１５１】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、又は直腸投与のための本発明の医薬組成物において、活性成分は、単独で又は別の活性成分との組み合わせで、従来の医薬的支持体との混合物として、動物及びヒトに単位投与形態で投与することができる。適切な単位投与形態は、経口経路形態（例えば錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒剤及び経口懸濁剤又は溶液など）、舌下及び頬側投与形態、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、髄腔内及び鼻腔内投与形態及び直腸投与形態を含む。
【０１５２】
好ましくは、医薬組成物は、注射することが可能な製剤用の医薬的に許容可能である賦形剤を含む。これらは、特に等張性の無菌生理食塩溶液（リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムなど、あるいはそのような塩の混合物）、又は乾燥、特に凍結乾燥組成物でありうるが、それらは、場合に依存して、滅菌水又は生理学的食塩水の添加時に注射可能な溶液の構成を許す。
【０１５３】
注射可能な使用のために適切な医薬的形態は、無菌水溶液又は分散剤；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び無菌の注射可能な溶液又は分散剤の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで液体でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば細菌及び真菌など）の汚染作用に対して保存されなければならない。
【０１５４】
遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩としての本発明の化合物を含む溶液は、界面活性剤（例えばヒドロキシプロピルセルロースなど）と適切に混合し、水中で調製することができる。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中ならびに油中で調製することができる。保存及び使用の普通の条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含む。
【０１５５】
単一ドメイン抗体又は薬物コンジュゲート（又は単一ドメイン抗体もしくは薬物コンジュゲートを含むベクター）は、中性又は塩の形態の組成物中に製剤化することができる。医薬的に許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含み、それらは、無機酸、例えば、塩酸又はリン酸、あるいは有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などと形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄など、及び有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから由来しうる。
【０１５６】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び野菜油を含む溶媒又は分散媒質でありうる。適した流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチンなど）の使用により、要求される粒子サイズの維持により（分散剤の場合において）、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬剤及び抗真菌薬剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によりもたらすことができる。多くの場合において、等張薬剤（例えば、糖又は塩化ナトリウム）を含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤の組成物（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）中での使用によりもたらすことができる。
【０１５７】
無菌の注射可能な溶液は、上に列挙する他の成分のいくつかを伴う適当な溶媒中に、要求される量で活性ポリペプチドを取り込ませることにより調製し、必要な場合、ろ過滅菌が続く。一般的に、分散剤は、種々の滅菌活性成分を、塩基性分散媒及び上に列挙するものからの要求される他の成分を含む無菌賦形剤中に取り込ませることにより調製する。無菌の注射可能な溶液の調製のための無菌粉末の場合において、好ましい調製方法は真空乾燥技術及び凍結乾燥技術であり、それによって、活性成分＋先に無菌ろ過したその溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末がもたらされる。
【０１５８】
製剤化時、溶液は、投与製剤と適合する様式で治療的に効果的な量で投与されうる。製剤は、種々の投与形態（例えば上に記載する注射可能な溶液の型など）で容易に投与されるが、しかし、薬物放出カプセルなどを用いることもできる。
【０１５９】
水溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液は、必要な場合、適切に緩衝化し、液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適切である。これに関連して、用いることができる無菌水性媒質は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１投与量を、１mlの等張性ＮａＣｌ溶液中に溶解し、１０００mlの皮下注入液に添加する、又は提案された注入部位に注射することができうる。投与量における一部の変動が、処置されている被験体の状態に依存して必然的に生じる。投与に責任のある人は、任意の事象において、個々の被験体のための適当な用量を決定する。
【０１６０】
ポリペプチド（又はポリペプチドを含むベクター）を、約０．０００１〜１．０ミリグラム、又は約０．００１〜０．１ミリグラム、又は約０．１〜１．０、又はさらには約１００ミリグラム／用量を含むように治療用混合物内で製剤化してもよい。複数用量を投与することもできる。本発明をさらに、以下の図面及び実施例により例証する。
【０１６１】
本発明を、以下の図面及び実施例によりさらに例証する。しかし、これらの実施例及び図面は、決して、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】固定化された一価ｓｄＡｂへのヒト及びマウスアンチトロンビンの結合。ヒト及びマウスアンチトロンビン（０〜５マイクロモル）を、一価ｓｄＡｂでコーティングしたウェルに加えた。結合したアンチトロンビンを、ポリクローナル抗アンチトロンビン抗体を使用してプローブし、ＴＭＢ加水分解を介して検出した。プロットしているのは、アンチトロンビン濃度に対する４５０nmで観察されたＯＤである。
【図２】ＫＢ−ＡＴ−００２／００３に融合したＶＷＦ  Ａ１／ｐ．Ｋ１３６２Ａのインビボ生存率。ＶＷＦ  Ａ１／ｐ．Ｋ１３６２Ａを無関係のｓｄＡｂ（ＫＢ−ＵＴ−０１）又はＫＢ−ＡＴ−００２／００３に融合させて、それぞれＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−ＵＴ−０１及びＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−ＡＴ−００２／００３を生成した。精製タンパク質を野生型Ｃ５７Ｂ／６マウスに静脈内投与した。示された時間点で、血液を収集し、残留ＶＷＦ−Ａ１抗原を測定した。プロットしているのは注射後の時間に対する残存抗原である。ＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−００２／００３は、ＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−ＵＴ−０１よりも著しく遅く循環から除去される。
【図３】アンチトロンビンの存在におけるトロンビン活性に対する一価ｓｄＡｂの効果。合成基質Ｓ−２２３８に対するトロンビンの残存アミド分解活性を、１０倍モル過剰のアンチトロンビンの非存在及び存在において測定した。アンチトロンビンは、アンチトロンビンを認識する１０倍モル過剰の一価ｓｄＡｂの非存在又は存在においてプレインキュベートした。プロットしているのは、種々の型のインキュベーション混合物に対する残留トロンビン活性（ΔＯＤ／分として表す）である。全ての一価ｓｄＡｂによって、トロンビンのアンチトロンビン媒介性阻害を部分的に（５５〜６７%）中和することができた。
【図４】アンチトロンビン及び未分画ヘパリンの存在におけるトロンビン活性に対する一価ｓｄＡｂの効果。合成基質Ｓ−２２３８に対するトロンビンの残存アミド分解活性を、１０倍モル過剰のアンチトロンビンの非存在及び存在において測定した。アンチトロンビンを、アンチトロンビンを認識する１０倍モル過剰の一価ｓｄＡｂの存在又は非存在においてヘパリン（１U/ml）とプレインキュベートした。プロットしているのは、種々の型のインキュベーション混合物に対する残留トロンビン活性（ΔＯＤ／分として表す）である。ｓｄＡｂがトロンビンのアンチトロンビン媒介性阻害を中和することができるパーセンテージは５%未満であった。
【図５】アンチトロンビン及び低分子量（ＬＭＷ）−ヘパリンの存在における第Ｘａ因子活性に対する一価ｓｄＡｂの効果。合成基質Ｓ−２７６５に対する第Ｘａ因子の残留アミド溶解活性を、１０倍モル過剰のアンチトロンビンの非存在及び存在において測定した。アンチトロンビンを、アンチトロンビンを認識する１０倍モル過剰の一価ｓｄＡｂの存在又は非存在においてＬＭＷ−ヘパリン（１U/ml）とプレインキュベートした。プロットしているのは、種々の型のインキュベーション混合物に対する残留第Ｘａ因子活性（ΔＯＤ／分として表す）である。ｓｄＡｂが第Ｘａ因子のアンチトロンビン媒介性阻害を中和することができるパーセンテージは１５%未満であった。
【図６】アンチトロンビン及び未分画ヘパリンの存在におけるトロンビン活性に対するバイパラトープｓｄＡｂの効果。合成基質Ｓ−２２３８に対するトロンビンの残存アミド分解活性を、１０倍モル過剰のアンチトロンビンの非存在及び存在において測定した。アンチトロンビンを、アンチトロンビンを認識する１０倍モル過剰のバイパラトープｓｄＡｂの非存在又は存在においてヘパリン（１U/ml）とプレインキュベートした。プロットしているのは、種々の型のインキュベーション混合物に対する残留トロンビン活性（ΔＯＤ／分として表す）である。全てのバイパラトープｓｄＡｂによって、トロンビンのアンチトロンビン媒介性阻害を部分的に（２８〜５６%）中和することができた。
【図７】アンチトロンビン及び低分子量（ＬＭＷ）−ヘパリンの存在における第Ｘａ因子活性に対するバイパラトープｓｄＡｂの効果。合成基質Ｓ−２７６５に対する第Ｘａ因子の残留アミド溶解活性を、１０倍モル過剰のアンチトロンビンの非存在及び存在において測定した。アンチトロンビンを、アンチトロンビンを認識する１０倍モル過剰のバイパラトープｓｄＡｂの非存在又は存在においてＬＭＷ−ヘパリン（１U/ml）とプレインキュベートした。プロットしているのは、種々の型のインキュベーション混合物に対する残留第Ｘａ因子活性（ΔＯＤ／分として表す）である。全てのバイパラトープｓｄＡｂによって、第Ｘａ因子のアンチトロンビン媒介性阻害を部分的に（３４〜６８%）中和することができた。
【図８】ＦＶＩＩＩ欠損血漿中でのトロンビン生成に対するバイパラトープｓｄＡｂの効果。種々の濃度のＦＶＩＩＩ（２．５%、１０%、又は１００%）又はバイパラトープｓｄＡｂ（１０マイクロモル）の単回用量を用いて添加された又は添加されていないＦＶＩＩＩ欠損血漿から得られたトロンビン生成曲線の例を提示している。トロンビン生成の促進においてｓｄＡｂの中で最も効率的であったのはＫＢ−ＡＴ−００２／００３であった。
【図９】アンチトロンビン及び未分画ヘパリンの存在におけるトロンビン活性に対する多価ｓｄＡｂの効果。合成基質Ｓ−２２３８に対するトロンビンの残存するアミド分解活性を、１０倍モル過剰のアンチトロンビンの非存在及び存在において測定した。アンチトロンビンを、アンチトロンビンを認識する種々の濃度の多価ｓｄＡｂの非存在又は存在においてヘパリン（１U/ml）とプレインキュベートした。プロットしているのは、モル比ｓｄＡｂ／アンチトロンビンに対する回復トロンビン活性（アンチトロンビンの非存在におけるトロンビン活性%）である。多価ｓｄＡｂであるＫＢ−ＡＴ−１１３及びＫＢ−ＡＴ−１１２３によって、アンチトロンビン及びヘパリンの存在において＞９５%のトロンビン活性を回復することができた。
【図１０】ＦＶＩＩＩ欠損血漿中でのトロンビン生成に対する多価ｓｄＡｂの効果。種々の濃度のＦＶＩＩＩ（２．５%、１０%、又は１００%）又は多価ｓｄＡｂ（１０マイクロモル）の単回用量を用いて添加された又は添加されなかったＦＶＩＩＩ欠損血漿から得られたトロンビン生成曲線の例を提示している。トロンビン生成の促進においてｓｄＡｂの中で最も効率的であったのはＫＢ−ＡＴ−１１３及びＫＢ−ＡＴ−１１２３であった。
【図１１】ＫＢ−ＡＴ−００２／００３を受けたＦＶＩＩＩ欠損マウスにおける失血の低下。ＫＢ−ＡＴ−００２／００３（１０mg/kg）又は賦形剤をＦＶＩＩＩ欠損マウスに静脈内投与し、注射後１０分に麻酔したマウスの側静脈を直径２．３mm及び深さ０．７mmで横切開した。血液を３０分間にわたり収集し、流出した血液の容量を決定した。失血は、賦形剤を受けた対照マウスと比較して、ＫＢ−ＡＴ−００２／００３を受けたマウスで有意に低下した。
【図１２】ＫＢ−ＡＴ−００３／Ｃ４ＢＰの発現によって、ヘパリン過剰投与時の出血の停止が可能になる。ヘパリン過剰投与時の出血時間を低下させるＫＢ−ＡＴ−００３／Ｃ４ＢＰの能力を、野生型Ｃ５７Ｂ６／ＪマウスにおけるプラスミドｐＬＩＶＥ−ＫＢ−ＡＴ−００３／Ｃ４ＢＰの一過性発現を介してテストした。対照として、マウスに空の発現プラスミド（ｐＬＩＶＥ−ｅｍｐｔｙ）を与えた。遺伝子導入の４日後、マウスは未分画ヘパリン（２０００U/kg）を単回皮下注射された。ヘパリン注射から１５分後、麻酔したマウスにおいて尾の末端を切断した。出血を停止するのに要する時間をモニターし、各々のマウスについて提示した。出血時間は、ＫＢ−ＡＴ−００３／Ｃ４ＢＰを発現するマウスにおいて有意に短かった。
【図１３】ＫＢ−ＡＴ−１１３を受けたＦＶＩＩＩ欠損マウスにおける失血の低下。ＫＢ−ＡＴ−１１３（１０mg/kg）又は賦形剤をＦＶＩＩＩ欠損マウスに静脈内投与し、注射後１０分に麻酔したマウスの側静脈を直径２．３mm及び深さ０．７mmで横切開した。血液を６０分間にわたって収集し、流出した血液の容量を決定した。失血は、賦形剤を受けた対照マウスと比較して、ＫＢ−ＡＴ−１１３を受けたマウスで有意に低下した。
【図１４】血友病マウスにおける止血の矯正。ＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱ及びＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３は、流体力学的な遺伝子送達（ＨＧＤ；１．５マイクログラム／マウス）を介して第ＶＩＩＩ欠損マウスにおいて発現された。ＨＧＤの５日後、麻酔したマウスの尾静脈を切開した。失血を３０分間にわたって測定した。流出した血液の容量を決定し、各々のマウスについて提示した。ＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱ及びＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３を発現するマウス間での失血における有意差は観察されず、第ＶＩＩＩ因子分子中でのＫＢ−ＡＴ−０２０３の導入によってその機能が損なわれないことを示す。
【図１５】ＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３のインビボ生存率。ＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱ及びＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３は、流体力学的な遺伝子送達（ＨＧＤ；１００μg/マウス）を介して第ＶＩＩＩ因子欠損マウスにおいて発現された。ＨＧＤの４日後、血漿を採取した。ＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱ又はＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３を発現する第ＶＩＩＩ因子欠損マウスからの血漿を次に、第ＶＩＩＩ因子欠損マウスにおいて１U/マウスの用量で注入した。対照として、組換えＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱを同様の用量で使用した。示した時間点で、血液を採取し、第ＶＩＩＩ因子活性を決定した。注入された量に対する残留活性を、注入後の時間に対してプロットしている。ＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３は、ＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱより２．５倍遅く循環系から除去される。記号：白四角は、ＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱを含む血漿を注入されたマウスを表す；  黒丸は、精製された組換えＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱを受けたマウスを表す；灰色四角は、ＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３を含む血漿を注入したマウスを表す。
【図１６】ＦＶＩＩＩ欠損血漿中でのトロンビン生成に対するＫＢ−ＡＴ−４４３の効果。種々の濃度のＦＶＩＩＩ（１０%又は１００%）を添加、若しくは添加されなかった、又はＫＢ−ＡＴ−４４３（４マイクロモル）の単回用量を添加されたＦＶＩＩＩ欠損血漿から得られたトロンビン生成曲線の例を提示する。ＫＢ−ＡＴ−４４３によって、ＦＶＩＩＩの非存在においてトロンビン生成が強く増強される。
【０１６３】
実施例：実施例１：ヒト及びマウスアンチトロンビンへの抗アンチトロンビンｓｄＡｂの結合。
【０１６４】
アンチトロンビンを認識するｓｄＡｂ（ＫＢ−ＡＴ−００１、−００２、−００３、−００４、−００５、−００６、及び−００７）を、ハーフウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）中の５０マイクロリットルの容量において４℃で１６時間にわたり１０mM  ＮａＨＣＯ３、５０mM  Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．５）中で固定化した（５マイクログラム/ml）。０．１%Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）を添加したＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ  ７．６）を使用してウェルを１００マイクロリットル／ウェルで３回洗浄した後、ウェルを、５%スキムミルクを添加した１００マイクロリットル／ウェルのＴＢＳ−Ｔで、３７℃で３０分間にわたりブロッキングした。ウェルを上に記載するように洗浄し、その後、異なる濃度の精製ヒトアンチトロンビン又はマウスアンチトロンビン（５%スキムミルクを添加したトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ７．６）中に０〜５マイクロモルに希釈；５０マイクロリットル／ウェル）を、固定化したｓｄＡｂの各々に加えて、２時間にわたりインキュベートした。ウェルを次に、ＴＢＳ−Ｔを用いて１００マイクロリットル／ウェルで３回洗浄した。結合したアンチトロンビンを、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナルウサギ抗アンチトロンビン抗体（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ、Ａｓｎｉｅｒｓ−ｓｕｒ−Ｓｅｉｎｅ、Ｆｒａｎｃｅ；希釈１／１００）を用いて、３７℃で１時間にわたり５０マイクロリットル／ウェルでプローブした。ウェルを次に、ＴＢＳ−Ｔを使用して１００マイクロリットル／ウェルで３回洗浄した。残留ペルオキシダーゼ活性を、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ媒介性加水分解を測定することにより検出した。ＯＤ値をアンチトロンビン濃度に対してプロットした（図１）。
【０１６５】
最大ＯＤ値における差が３０%未満である場合、ｓｄＡｂはヒト及びマウスアンチトロンビンを同様に認識すると考えられた。この基準を使用して、ｓｄＡｂｓ  ＫＢ−ＡＴ−００１、−００２、−００３、及び００４は、ヒト及びマウスアンチトロンビンへの同様の結合を呈した。ＫＢ−ＡＴ−００６及びＫＢ−ＡＴ−００７は、マウスアンチトロンビンと比較して、ヒトアンチトロンビンにより効率的に結合したのに対し、ＫＢ−ＡＴ−００５は、ヒトアンチトロンビンと比較して、マウスアンチトロンビンへの結合においてより効率的であった。
【０１６６】
見掛けの解離定数（ＫＤ、ａｐｐ）を決定するために、ヒトアンチトロンビンに対するｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−００１、ＫＢ−ＡＴ−００２、ＫＢ−ＡＴ−００３、及びＫＢ−ＡＴ−００６の間での相互作用を、Ｏｃｔｅｔ−ＱＫ装置を使用した生体層−干渉法分析を介してさらに分析した。この目的のために、ｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−００１、ＫＢ−ＡＴ−００２、ＫＢ−ＡＴ−００３、及びＫＢ−ＡＴ−００６を、ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化アミン反応性バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ、ＵＳＡ）に共役するために、２００マイクログラム/mlの濃度に０．１M  Ｍｅｓ（ｐＨ５．０）中に希釈した。センサーを０．２mlの０．１M  ＭＥＳ、ｐＨ５．０中で３００秒間にわたり再水和させた。センサーを次に、０．１mlの０．２M  ＥＤＣ／０．０９５M  ＮＨＳ混合物とのインキュベーションを介して３００秒間にわたり活性化し、その後、０．１mlのｓｄＡｂ溶液と６００秒間にわたりインキュベートした。非占有アミン反応部位を１Mエタノールアミンと１８０秒間にわたりインキュベートすることによりクエンチし、センサーを、０．１%Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）を添加したリン酸緩衝食塩水との３００秒間にわたるインキュベーションを介して、安定したベースラインレベルに到達させた。ｓｄＡｂ被覆センサーを次に、種々の濃度の精製アンチトロンビン（ＰＢＳ−Ｔ中０、１２．５、２５、及び５０μg/ml）を含むウェルに移し、アンチトロンビンと固定化ｓｄＡｂとの会合を視覚化するために６００秒間にわたりインキュベートした。この会合段階に続き、センサーをＰＢＳ−Ｔを含むウェルに移し、９００秒間にわたりインキュベートし、アンチトロンビン−ｓｄＡｂ複合体の解離を可能にした。得られたデータは、その後、Ｏｃｔｅｔ−ＱＫデータ解析ソフトウェア（Ｏｒｉｇｉｎ  ｖｓ  ４）を使用して分析し、ＫＤ、ａｐｐを推定した。この分析によって、以下の値が明らかになった：ＫＢ−ＡＴ−００１、ＫＢ−ＡＴ−００２、ＫＢ−ＡＴ−００３、及びＫＢ−ＡＴ−００６について、それぞれＫＤ、ａｐｐ＝１４nM、４nM、０．４nM、及び２２nM。
【０１６７】
実施例２：これらのタンパク質の半減期を延長する抗アンチトロンビンｓｄＡｂへのタンパク質の融合。
【０１６８】
バイパラトープｓｄＡｂ変異体ＫＢ−ＡＴ−００２／００３に融合した位置１３６２（全長ＶＷＦに対応する番号付け）にＫからＡの変異を含むヒトフォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）−Ａ１ドメインをコードする構築物を確立したが、これはｓｄＡｂｓ  ＫＢ−ＡＴ−００２とＫＢ−ＡＴ−００３（配列番号３８）を組み合わせている。変異は、単離されたＡ１ドメインが血小板受容体糖タンパク質Ｉｂαと相互作用しないことを確実にするために導入された。結果として得られたタンパク質をＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−ＡＴ−００２／００３と命名した。対照として、ＶＷＦ  Ａ１／ｐ．Ｋ１３６２Ａを非特異的ｓｄＡｂに融合させ、これはマウス血漿タンパク質と反応しない（ＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−ＵＴ−０１）。精製ＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−ＡＴ−００２／００３又はＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−ＵＴ−０１を、野生型Ｃ５７Ｂ／６マウスに静脈内（１０mg/kg）投与した。注射後の異なる時間点（５分、１５分、３０分、１時間、３時間、６時間、及び２４時間）で、血液サンプルを、イソフルラン麻酔したマウスからの眼窩後穿刺により得て、血漿を遠心分離（１５００ｇ、２２℃で２０分間）により調製した。残留血漿濃度は、捕捉抗体としてのマウスモノクローナル抗体ｍＡｂ７１２及びプロービング抗体としてのペルオキシダーゼ標識マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ７２４を用いて、ヒトＶＷＦ  Ａ１ドメインを特異的に測定する自家製ＥＬＩＳＡを使用して測定した。
【０１６９】
注射後５分での回復は、ＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−ＵＴ−０１と比較してＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−ＡＴ−００２／００３について有意に高かった（９２．７±１７．７%対４７．１±６．７%；等しいＳＤを伴う対応のないｔ検定においてｐ＝０．０１２）。本発明者らは次に、注射後の時間に対して残留タンパク質濃度をプロットし（図２）、注射後の全ての時間点での残留タンパク質レベルにおける顕著な差を明らかにした。両方のタンパク質は、双方向指数関数的な様式において循環から排除されたように見えた。双指数関数的減衰についてのモデルを使用して見掛けの初期半減期及び終末半減期を算出した。初期半減期（Ｔ１／２α）を、ＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−ＡＴ−００２／００３及びＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−ＵＴ−０１のそれぞれについて０．３０時間（９５%信頼区間（ＣＩ）０．２０〜０．６０時間）及び０．０３時間（９５%ＣＩ  ０．０２〜０．０５時間）と算出した。終末半減期（Ｔ１／２β）を、ＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−ＡＴ−００２／００３及びＶＷＦ−Ａ１／ＫＢ−ＵＴ−０１のそれぞれについて３８時間（９５%ＣＩ  ２１〜１７８時間）及び０．７時間（９５%ＣＩ  ０．５〜１．０時間）と算出した。これによって、アンチトロンビンを認識するｓｄＡｂへの比較的短い半減期を伴うタンパク質の融合により、そのようなタンパク質の循環中での半減期がかなり増加することが実証される。
【０１７０】
実施例３：ヘパリンの非存在におけるトロンビンのアンチトロンビン媒介性阻害の中和。
【０１７１】
精製されたヒトアンチトロンビン（５nM）を、ＴＢＳＣ緩衝液（５０mM  ＣａＣｌ２、０．１%プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、０．１%  ＰＥＧ８０００、ｐＨ  ７．４を添加したトリス緩衝生理食塩水）中で、一価ｓｄＡｂ（１００nM）の非存在又は存在において１５分間にわたり３７℃でインキュベートした。この混合物を、その後、アミド分解基質Ｓ−２２３８の存在においてトロンビン（０．５nM）に加えて、加水分解を波長４０５nmで光学密度（ＯＤ）を測定することにより２０分間にわたりモニターした。図３にプロットしているのは、アンチトロンビンの非存在又は存在におけるトロンビンについての、ならびにトロンビン、アンチトロンビン、及びｓｄＡｂを含む混合物についての基質加水分解の速度（デルタＯＤ／分）である。これらのデータによって、アンチトロンビンに対するｓｄＡｂの各々により、アンチトロンビンの存在においてトロンビン活性を増加させることができることが示され、これは、これらの条件下でトロンビンに対するアンチトロンビンの阻害活性に干渉するｓｄＡｂと適合性がある。ｓｄＡｂがアンチトロンビン媒介性トロンビン阻害を中和するパーセンテージを表１にまとめている。
表１：ヘパリンの非存在における一価ｓｄＡｂによるアンチトロンビンの中和：
【表２７】
2019516347.tif 000030
【０１７２】
このように、テストした全ての一価ｓｄＡｂによって、トロンビンに対するアンチトロンビン活性を部分的に中和することができた（図３及び表１）。しかし、それらのいずれでも、アンチトロンビン活性を完全に遮断することはできなかった。
【０１７３】
実施例４：ヘパリンの存在における一価ｓｄＡｂによるトロンビンのアンチトロンビン媒介性阻害の中和の欠如。
【０１７４】
精製されたヒトアンチトロンビン（５nM）を、ＴＢＳＣ緩衝液（５０mM  ＣａＣｌ２、０．１%プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、０．１%  ＰＥＧ８０００、ｐＨ  ７．４を添加したトリス緩衝生理食塩水）中で、一価ｓｄＡｂ（１００nM）の非存在又は存在において１５分間にわたり３７℃で未分画ヘパリン（１U/ml）とインキュベートした。この混合物を、その後、アミド分解基質Ｓ−２２３８の存在においてトロンビン（０．５nM）に加えて、加水分解を波長４０５nmで光学密度（ＯＤ）を測定することにより２０分間にわたりモニターした。図４にプロットしているのは、アンチトロンビン＆ヘパリンの非存在又は存在におけるトロンビンについての、ならびにトロンビン、アンチトロンビン、ヘパリン、及びｓｄＡｂを含む混合物についての基質加水分解の速度（デルタＯＤ／分）である。これらのデータは、アンチトロンビンに対するｓｄＡｂのいずれも、アンチトロンビン＆ヘパリンの存在においてトロンビン活性を増加させることができないことを示す。ｓｄＡｂがアンチトロンビン媒介性トロンビン阻害を中和するパーセンテージは５%未満であった。これによって、一価ｓｄＡｂが、未分画ヘパリンの存在においてトロンビンのアンチトロンビン媒介性阻害に干渉する能力を欠くことが実証される。
【０１７５】
実施例５：ヘパリンの存在における一価ｓｄＡｂによる第Ｘａ因子のアンチトロンビン媒介性阻害の中和の欠如。
【０１７６】
精製されたヒトアンチトロンビン（５nM）を、ＴＢＳＣ緩衝液（５０mM  ＣａＣｌ２、０．１%プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、０．１%  ＰＥＧ８０００、ｐＨ  ７．４を添加したトリス緩衝生理食塩水）中で、一価ｓｄＡｂ（１００nM）の非存在又は存在において１５分間にわたり３７℃で低分子量ヘパリン（ＬＭＷ−ヘパリン；Ｌｏｖｅｎｏｘ；１U/ml）とインキュベートした。この混合物を、その後、アミド分解基質Ｓ−２７６５の存在において第Ｘａ因子（０．５nM）に加えて、加水分解を波長４０５nmで光学密度（ＯＤ）を測定することにより２０分間にわたりモニターした。図５にプロットしているのは、アンチトロンビン＆ＬＭＷヘパリンの非存在又は存在における第Ｘａ因子についての、ならびに第Ｘａ因子、アンチトロンビン、ヘパリン、及びｓｄＡｂを含む混合物についての基質加水分解の速度（デルタＯＤ／分）である。これらのデータは、アンチトロンビンに対するｓｄＡｂのいずれも、アンチトロンビン＆ＬＭＷヘパリンの存在において第Ｘａ因子活性を実質的に増加させることができないことを示す。ｓｄＡｂがアンチトロンビン媒介性第Ｘａ因子阻害を中和するパーセンテージは１５%未満であった。これによって、一価ｓｄＡｂが、ＬＭＷヘパリンの存在において第Ｘａ因子のアンチトロンビン媒介性阻害に弱く干渉することが実証される。
【０１７７】
実施例６：ヘパリンの存在におけるバイパラトープｓｄＡｂによるトロンビンのアンチトロンビン媒介性阻害の中和。
【０１７８】
アンチトロンビンに対する２つの異なるｓｄＡｂからなるｓｄＡｂ組み合わせをコードする構築物を確立した（バイパラトープｓｄＡｂ）：ＫＢ−ＡＴ−００１／００２（配列番号３０）、ＫＢ−ＡＴ−００１／００３（配列番号３１）、ＫＢ−ＡＴ−００１／００５（配列番号３２）、及びＫＢ−ＡＴ−００２／００３（配列番号２９）。精製されたヒトアンチトロンビン（５nM）を、ＴＢＳＣ緩衝液（５０mM  ＣａＣｌ２、０．１%プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、０．１%  ＰＥＧ８０００、ｐＨ  ７．４を添加したトリス緩衝生理食塩水）中で、バイパラトープｓｄＡｂ（１００nM）の非存在又は存在において１５分間にわたり３７℃で未分画ヘパリン（１U/ml）とインキュベートした。この混合物を、その後、アミド分解基質Ｓ−２２３８の存在においてトロンビン（０．５nM）に加えて、加水分解を波長４０５nmで光学密度（ＯＤ）を測定することにより２０分間にわたりモニターした。図６にプロットしているのは、アンチトロンビン＆ヘパリンの非存在におけるトロンビン活性と比較した、残留トロンビン活性のパーセンテージである。アンチトロンビン＆ヘパリンのみの存在における残留トロンビン活性は５%未満であったのに対し、有意に高いトロンビン活性がバイパラトープｓｄＡｂの存在において測定された。バイパラトープｓｄＡｂがアンチトロンビン媒介性トロンビン阻害を中和するパーセンテージは表２に要約される。これらのデータによって、異なるｓｄＡｂを組み合わせにより、未分画ヘパリンの存在においてアンチトロンビン機能を中和する能力がこれらの組み合わせに与えられることが実証される。
表２：ヘパリンの存在におけるバイパラトープｓｄＡｂによるアンチトロンビンの中和：
【表２８】
2019516347.tif 000031
【０１７９】
実施例７：バイパラトープｓｄＡｂによるヘパリンの存在における第Ｘａ因子のアンチトロンビン媒介性阻害の中和。
【０１８０】
バイパラトープｓｄＡｂも、ＬＭＷ−ヘパリンの存在において第Ｘａ因子に対するアンチトロンビン活性を中和するそれらの能力についてテストした。精製されたヒトアンチトロンビン（５nM）を、ＴＢＳＣ緩衝液（５０mM  ＣａＣｌ２、０．１%プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、０．１%  ＰＥＧ８０００、ｐＨ  ７．４を添加したトリス緩衝生理食塩水）中で、バイパラトープｓｄＡｂ（１００nM）の非存在又は存在において１５分間にわたり３７℃で低分子量（ＬＭＷ−ヘパリン；Ｌｏｖｅｎｏｘ；１U/ml）とインキュベートした。この混合物を、その後、アミド分解性基質Ｓ−２７６５の存在において第Ｘａ因子（０．５nM）に加えて、加水分解を波長４０５nmで光学密度（ＯＤ）を測定することにより２０分間にわたりモニターした。図７にプロットしているのは、アンチトロンビン＆ＬＭＷ−ヘパリンの非存在における第Ｘａ因子活性と比較した、残留第Ｘａ因子活性のパーセンテージである。アンチトロンビン＆ＬＭＷ−ヘパリンのみの存在における残留第Ｘａ因子活性は５%未満であったのに対し、有意に高い第Ｘａ因子活性がバイパラトープｓｄＡｂの存在において測定された。バイパラトープｓｄＡｂがアンチトロンビン媒介性トロンビン阻害を中和するパーセンテージを表３にまとめている。これらのデータによって、異なるｓｄＡｂを組み合わせることにより、ＬＭＷ−ヘパリンの存在においてアンチトロンビン機能を中和する能力がこれらの組み合わせに与えられることが実証される。
表３：ＬＭＷ−ヘパリンの存在におけるバイパラトープｓｄＡｂによるアンチトロンビンの中和：
【表２９】
2019516347.tif 000032
【０１８１】
実施例８：血友病血漿を使用したトロンビン生成アッセイにおけるバイパラトープｓｄＡｂの効果。
【０１８２】
バイパラトープｓｄＡｂを、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）欠損血漿中のトロンビン生成を回復させるそれらの能力について分析した。トロンビン生成を、ディスペンサーを備えたＦｌｕｏｒｏｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  ＯＹ、Ｈｅｌｓｉｎｋ、Ｆｉｎｌａｎｄ）において、Ｈｅｍｋｅｒら（pathophysiology of haemostasis and thrombosis(2002)32:249-253）により記載された方法に従って測定した。簡単には、生理食塩水（対照）、精製ＦＶＩＩＩ（０．０２５、０．１、１U/ml  Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）ＦＳ、Ｂａｙｅｒ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ、Ｐｕｔｅａｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）、又はバイパラトープｓｄＡｂ（１０マイクロモル）を添加した８０μlの血漿を、丸底９６ウェルマイクロタイタープレート中に分注した。ＴＦ（組換え脂質化ヒト組織因子、Ｉｎｎｏｖｉｎ（登録商標）、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇから得た）及びリン脂質（ＰＬ）小胞を含む２０マイクロリットルの混合物を血漿サンプルに加えて、１pMのＴＦ及び４マイクロモルのＰＬ小胞の最終濃度を得た。ＰＬ小胞を、Ｌ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリン（ＰＳ）Ｌ−α−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びＬ−α−フォスファチジルコリン（ＰＣ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒｌｉｐｉｄｓ、Ａｌｂａｓｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａ、ＵＳＡ）からＰＣ：ＰＥ：ＰＳ＝３：１：１の比率で調製し、公称１００nm直径であった。
【０１８３】
トロンビン生成は、蛍光発生基質及びＣａＣｌ２を含む２０マイクロリットルの出発試薬を加えることにより誘発させた。蛍光発生基質Ｉ−１１４０（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）はＢａｃｈｅｍ  ＡＧ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、スイス）からであった。凝固血漿中でのトロンビン生成の動態を、較正された自動トロンボグラムを使用して３７℃で６０分間にわたりモニターし、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅソフトウェア（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、オランダ）を使用して分析した。４つのウェルが各々の実験のために必要であった（血漿サンプルのトロンビン生成を測定するための２つのウェル及び較正のための２つのウェル）。全ての実験をトリプリケートで実施し、平均値を報告した。内因性トロンビンポテンシャル（ＥＴＰ）、即ち、曲線下面積、ピークトロンビン、及びトロンビン検出についての遅延時間を決定した。
【０１８４】
図８には、トロンビン生成曲線の例を示している。図８Ａには、ＦＶＩＩＩ欠損血漿及び異なる濃度のＦＶＩＩＩ（２．５%、１０%、及び１００%）を用いてスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図８Ｂには、ＦＶＩＩＩ欠損血漿、２．５%ＦＶＩＩＩでスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿、及びＫＢ−ＡＴ−００１／００２（１０マイクロモル）でスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図８Ｃには、ＦＶＩＩＩ欠損血漿、２．５%ＦＶＩＩＩでスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿、及びＫＢ−ＡＴ−００１／００３（１０マイクロモル）でスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図８Ｄには、ＦＶＩＩＩ欠損血漿、２．５%ＦＶＩＩＩでスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿、及びＫＢ−ＡＴ−００１／００５（１０マイクロモル）をスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図８Ｅには、ＦＶＩＩＩ欠損血漿、２．５%ＦＶＩＩＩでスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿、及びＫＢ−ＡＴ−００２／００３（１０マイクロモル）でスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿でのトロンビン生成を示す。トロンビン生成パラメータを表４にまとめる。これらのトロンビン生成曲線は、ｓｄＡｂの組み合せＫＢ−ＡＴ−００１／００２、ＫＢ−ＡＴ−００１／００３、及びＫＢ−ＡＴ−００１／００５によって、ＦＶＩＩＩ欠損血漿中でのトロンビン生成を限られた範囲でのみ刺激し、ＦＶＩＩＩの２．５%未満に相当するトロンビン生成レベルに達することを示す。対照的に、組み合わせＫＢ−ＡＴ−００２／００３は、トロンビン生成量においてずっとより効率的である（１００%ＦＶＩＩＩと比較して１．７倍）。それにもかかわらず、トロンビン生成が開始する前の遅延時間は、１００%ＦＶＩＩＩの存在と比較して、依然として有意に遅延している（表４を参照のこと）。
表４：バイパラトープｓｄＡｂについてのトロンビン生成パラメータ：
【表３０】
2019516347.tif 000033
【０１８５】
実施例９：多価ｓｄＡｂによるヘパリンの存在におけるトロンビンのアンチトロンビン媒介性阻害の中和。
【０１８６】
アンチトロンビンに対する２つ又は３つの異なるｓｄＡｂからなるｓｄＡｂの組み合わせをコードする構築物を確立した。それにおいて、ｓｄＡｂの少なくとも１つが二重に存在した：（多価ｓｄＡｂ）：ＫＢ−ＡＴ−００１／００１／００２（配列番号３３、ＫＢ−ＡＴ−１１２として言及する）、ＫＢ−ＡＴ−００１／００１／００３（配列番号３４、ＫＢ−ＡＴ−１１３）、ＫＢ−ＡＴ−００１／００１／００５（配列番号３５；ＫＢ−ＡＴ−１１５）、及びＫＢ−ＡＴ−００１／００１／００２／００３（配列番号３６；ＫＢ−ＡＴ−１１２３）。
【０１８７】
精製されたヒトアンチトロンビン（５nM）を、ＴＢＳＣ緩衝液（５０mM  ＣａＣｌ２、０．１%プロテアーゼ不含ウシ血清アルブミン、０．１%  ＰＥＧ８０００、ｐＨ  ７．４を添加したトリス緩衝生理食塩水）中で、多価ｓｄＡｂ（１００nM）の非存在又は存在において１５分間にわたり３７℃で未分画ヘパリン（１U/ml）とインキュベートした。この混合物を、その後、アミド分解性基質Ｓ−２２３８の存在においてトロンビン（０．５nM）に加えて、加水分解を波長４０５nmで光学密度（ＯＤ）を測定することにより２０分間にわたりモニターした。図９にプロットしているのは、アンチトロンビン＆ヘパリンの非存在におけるトロンビン活性と比較した、残留トロンビン活性のパーセンテージである。アンチトロンビン＆ヘパリンのみの存在における残留トロンビン活性は５%未満であったのに対し、有意に高いトロンビン活性が多価ｓｄＡｂの存在において測定された。多価ｓｄＡｂがアンチトロンビン媒介性トロンビン阻害を中和するパーセンテージを表５にまとめている。これらのデータによって、異なるｓｄＡｂを組み合わせることにより、未分画ヘパリンの存在においてアンチトロンビン機能を中和する能力がこれらの組み合わせに与えられることが実証される。
表５：ヘパリンの存在における多価ｓｄＡｂによるアンチトロンビンの中和。
【表３１】
2019516347.tif 000034
【０１８８】
実施例１０：血友病血漿を使用したトロンビン生成アッセイにおける多価ｓｄＡｂの効果。
【０１８９】
多価ｓｄＡｂを、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）欠損血漿中のトロンビン生成を回復させるそれらの能力について分析した。トロンビン生成を、ディスペンサーを備えたＦｌｕｏｒｏｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  ＯＹ、Ｈｅｌｓｉｎｋ、Ｆｉｎｌａｎｄ）において、Ｈｅｍｋｅｒら（pathophysiology of haemostasis and thrombosis(2002)32:249-253）により記載された方法に従って測定した。簡単には、生理食塩水（対照）、精製ＦＶＩＩＩ（０．０２５、０．１、１U/ml  Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）ＦＳ、Ｂａｙｅｒ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ、Ｐｕｔｅａｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）、又は多価ｓｄＡｂ（１０マイクロモル）を添加した８０μlの血漿を、丸底９６ウェルマイクロタイタープレート中に分注した。ＴＦ（組換え脂質化ヒト組織因子、Ｉｎｎｏｖｉｎ（登録商標）、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇから得た）及びリン脂質（ＰＬ）小胞を含む２０マイクロリットルの混合物を血漿サンプルに加えて、１ｐＭのＴＦ及び４マイクロモルのＰＬ小胞の最終濃度を得た。ＰＬ小胞を、Ｌ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリン（ＰＳ）Ｌ−α−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びＬ−α−フォスファチジルコリン（ＰＣ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒｌｉｐｉｄｓ、Ａｌｂａｓｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａ、ＵＳＡ）からＰＣ：ＰＥ：ＰＳ＝３：１：１の比率で調製し、公称１００nm直径であった。
【０１９０】
トロンビン生成は、蛍光発生基質及びＣａＣｌ２を含む２０マイクロリットルの出発試薬を加えることにより誘発させた。蛍光発生基質Ｉ−１１４０（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）はＢａｃｈｅｍ  ＡＧ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、スイス）からであった。凝固血漿中でのトロンビン生成の動態を、較正された自動トロンボグラムを使用して３７℃で６０分間にわたりモニターし、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅソフトウェア（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、オランダ）を使用して分析した。４つのウェルが各々の実験のために必要であった（血漿サンプルのトロンビン生成を測定するための２つのウェル及び較正のための２つのウェル）。全ての実験をトリプリケートで実施し、平均値を報告した。内因性トロンビンポテンシャル（ＥＴＰ）、即ち、曲線下面積、ピークトロンビン、トロンビン検出についての遅延時間、及びトロンビンピークまでの時間を決定した。
【０１９１】
図１０には、トロンビン生成曲線の例を示している。図１０Ａには、ＦＶＩＩＩ欠損血漿及び異なる濃度のＦＶＩＩＩ（２．５%、１０%、及び１００%）を用いてスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図１０Ｂには、ＦＶＩＩＩ欠損血漿、２．５%ＦＶＩＩＩでスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿、及びＫＢ−ＡＴ−１１２（１０マイクロモル）でスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図１０Ｃには、ＦＶＩＩＩ欠損血漿、１００%ＦＶＩＩＩでスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿、及びＫＢ−ＡＴ−１１３（１０マイクロモル）でスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図１０Ｄには、ＦＶＩＩＩ欠損血漿、２．５%ＦＶＩＩＩでスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿、及びＫＢ−ＡＴ−１１５（１０マイクロモル）でスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿でのトロンビン生成を示す。図１０Ｅには、ＦＶＩＩＩ欠損血漿、１００%ＦＶＩＩＩでスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿、及びＫＢ−ＡＴ−１１２３（１０マイクロモル）でスパイクしたＦＶＩＩＩ欠損血漿でのトロンビン生成を示す。トロンビン生成パラメータを表６にまとめる。これらのトロンビン生成曲線は、ｓｄＡｂの組み合せＫＢ−ＡＴ−１１２及びＫＢ−ＡＴ−１１５によって、ＦＶＩＩＩ欠損血漿中でのトロンビン生成を限られた範囲でのみ刺激し、ＦＶＩＩＩの２．５%未満に相当するトロンビン生成レベルに達することを示す。組み合せＫＢ−ＡＴ−１１３は、その存在により、１０%ＦＶＩＩＩの存在と比較してより多くのトロンビン生成がもたらされるため、より効率的である。それにもかかわらず、１００%ＦＶＩＩＩと比較してより少ないトロンビンが生成される。対照的に、組み合わせＫＢ−ＡＴ−１１２３は、トロンビン生成量においてずっとより効率的である（１００%ＦＶＩＩＩと比較して１．４倍）。さらに、トロンビン生成が開始されるまでの遅延時間は、１００%ＦＶＩＩＩの存在と比較して有意に短い（表６を参照のこと）。これらのデータは、ｓｄＡｂの異なる組み合せの全てが、ＦＶＩＩＩ欠損血漿中のトロンビン生成を異なる程度にまで調節すること、ならびに、特定の組み合わせ（この場合、ＫＢ−ＡＴ−１１２３）だけが、より多くのトロンビン産生することにより、及びより急速なトロンビン形成の開始により、このトロンビン生成テストにおいてＦＶＩＩＩをしのぐことができることを示す。
表６：多価ｓｄＡｂについてのトロンビン生成パラメータ。
【表３２】
2019516347.tif 000035
【０１９２】
実施例１１：血友病マウスを使用した尾静脈横切開アッセイにおける失血に対するバイパラトープｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−００２／００３の効果。
【０１９３】
８〜１２週齢の血友病マウスに、静脈内尾注射を介して賦形剤（生理食塩水）又はｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−００２／００３（１０mg/kg）を与えた。注射後１０分に、イソフルラン麻酔したマウスの側静脈を０．７mmの深さで切断し、そこでは尾の直径は２．３mmであった。横切開した尾を、温かい生理食塩水で満たした１０mlチューブに横切開後直ちに浸した。血液を３７℃で３０分間にわたり収集した。３０分後、血液及び生理食塩水の混合物を１５００gで遠心した。赤血球ペレットを次に、Ｈ２Ｏ中で溶解し、４１６nmでの吸光度を読み取ることによりヘモグロビンの量を得た。上に記載するようにヘモグロビンを抽出するために、Ｈ２Ｏ中の一定量（２０マイクロリットル、４０マイクロリットル、６０マイクロリットル、８０マイクロリットル、及び１００マイクロリットル）のマウス血液を溶解することにより得られた標準曲線から各々のサンプル中の失われた血液の容量を算出した。賦形剤及びＫＢ−ＡＴ−００２／００３処置マウスでの失血を図１１に示す。ＫＢ−ＡＴ−００２／００３の注入によって、血友病マウスにおける失血の低下がもたらされる。失血は、ＫＢ−ＡＴ−００２／００３（１０mg/kg）を受けたマウスについて３３４±１３３マイクロリットル（平均値±ＳＥ；ｎ＝４）及び賦形剤を受けたマウスについて７５５±９０マイクロリットル（ｎ＝７）であった。この差は、等しいＳＤを伴う対応のないｔ検定において分析した場合に統計的に有意であった（ｐ＝０．０２４３）。これらのデータは、ＫＢ−ＡＴ−００２／００３によるアンチトロンビンの中和によって、血友病マウスにおいて少なくとも部分的に止血が回復することを示す。
【０１９４】
実施例１２：七量体ｓｄＡｂ−Ｃ４ＢＰ融合タンパク質のインビボ発現によって、ヘパリンの過剰投与により誘導される出血傾向が中和される。
【０１９５】
Ｃ４ＢＰの５７アミノ酸ペプチドモチーフに融合されたＫＢ−ＡＴ−００３をコードする構築物を確立したが、これによってタンパク質のヘプタマー化を可能になる（配列番号４０；ＫＢ−ＡＴ−００３／Ｃ４ＢＰとして言及する）。ＫＢ−ＡＴ−００３／Ｃ４ＢＰをコードするｃＤＮＡをｐＬＩＶＥ−プラスミド（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）中にクローニングした。空のｐＬＩＶＥ−プラスミドを陰性対照として使用した。プラスミド（１００マイクログラム／マウス）を、流体力学的遺伝子導入を介して野生型Ｃ５７Ｂ６マウス中に注射した：プラスミドを、動物の体重の１０%に相当する容量（即ち、２０グラムのマウスについては２ml）で０．９%生理食塩水中に希釈する。この溶液を５秒以内に尾静脈に注射する。遺伝子導入の４日後、マウスに、出血を誘導するのに十分な用量の未分画ヘパリン（２０００U/kg）の単回皮下注射を与えた。ヘパリンの注射後１５分に、尾の末端３mmをケタミン／キシラジン麻酔したマウスから切断した。切断した尾を、生理食塩水（３７℃）で満たした５０mlのチューブに横切開直後に浸し、出血の停止までの時間を、１０分間の観察期間の間にモニターした。各々のマウスについての出血の停止までの時間を図１４に示す。出血時間は、ＫＢ−ＡＴ−００３／Ｃ４ＢＰをコードするプラスミドを受けたマウスと比較して、対照の空のｐＬＩＶＥ−プラスミドを与えたマウスにおいて有意により長かった（ｐＬＩＶＥ−ｅｍｐｔｙ及びｐＬＩＶＥ−ＫＢ−ＡＴ−００３／Ｃ４ＢＰについてそれぞれ８．６±３．６分対４．１±２．７分；平均値±ＳＤ；等しいＳＤを伴う対応のないｔ検定においてｐ＝０．０２）。実際に、出血は、対照マウス６匹中５匹において１０分間の観察期間の間に止まらず、ＫＢ−ＡＴ−００３／Ｃ４ＢＰを発現する８匹中７匹で５分以内に出血が止まった。
【０１９６】
実施例１３：異なる種の血漿中に存在するアンチトロンビンへのｓｄＡｂの結合
【０１９７】
ｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−００１、−００２、−００３、−００４、−００５、−００６、及び００７を、ハーフウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）において１０mM  ＮａＨＣＯ３、５０mM  Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．５）中の５０μlの容量中で、４℃で１６時間にわたり培養した。陽性対照として、ポリクローナル抗アンチトロンビン抗体（ＭＡＴＩＩＩ−ＥＩＡキット、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ａｎｃａｓｔｅｒ  Ｃａｎａｄａ）も同様の様式において固定化した。陰性対照として、抗フォン・ヴィレブランドｓｄＡｂ  ＫＢ−ＶＷＦ−００６を固定化した。ウェルを、０．１%Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）を添加したトリス緩衝化生理食塩水（ｐＨ  ７．６）を使用して、１００μl/ウェルで３回洗浄した後、ウェルを、３%ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した１００マイクロリットル／ウェルのＴＢＳ−Ｔを用いて３７℃で３０分間にわたりブロッキングした。ウェルを上に記載するように洗浄し、その後、以下の血漿調製物（ＴＢＳ−Ｔ／３%ＢＳＡで１／４希釈、ウェル当たり１００マイクロリットル、３７℃で２時間）を、固定化ｓｄＡｂの各々及び両方の型の対照ウェルに加えた：ウサギ血漿、イヌ血漿、サル血漿、ウシ血漿、ブタ血漿、ラット血漿、マウス血漿、及びヒト血漿。
【０１９８】
ウェルを次に、ＴＢＳ−Ｔを使用して１００マイクロリットル／ウェルで３回洗浄した。結合したアンチトロンビンをペルオキシダーゼ標識ポリクローナル抗アンチトロンビン抗体（ＭＡＴＩＩＩ−ＥＩＡキット、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｎｃａｓｔｅｒ  Ｃａｎａｄａ；１／１００に希釈）を用いて５０μl/ウェルで、３７℃で２時間にわたりプローブした。ウェルを次に、ＴＢＳ−Ｔを使用して１００マイクロリットル／ウェルで３回洗浄した。残留ペルオキシダーゼ活性を、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ媒介性加水分解を測定することにより検出した。
【０１９９】
陰性結合（−）は、光学密度（ＯＤ）が≦０．１であるとして定義し、中程度陽性結合（＋）は、ＯＤが＞０．１及び＜０．５であると定義し、強陽性結合（＋＋）は、ＯＤが≧０．５であると定義した。これらの定義に基づいて、ｓｄＡｂのいずれも陰性対照に中程度又は強陽性結合を呈さなかった（表１）。全ての血漿調製物が、陽性対照（ポリクローナル抗アンチトロンビン抗体）に中程度又は強陽性結合を有した。異なるｓｄＡｂへの血漿調製物の結合を表７にまとめる。
実施例１６に属する表７：異なる種のアンチトロンビンへのｓｄＡｂの結合。
【表３３】
2019516347.tif 000036
【０２００】
陽性ｃｔｌ：陽性対照、ポリクローナル抗アンチトロンビン抗体（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）。陰性ｃｔ１：抗ＶＷＦ  ｓｄＡｂ  ＫＢ−ＶＷＦ−００６固定化。
−：ＯＤが≦０．１であるとして定義する陰性結合；
＋：ＯＤが＞０．１−＜０．５であるとして定義する中程度陽性結合；
＋＋：０．５以上であるとして定義する強陽性結合。
【０２０１】
実施例１４：血友病マウスを使用した尾静脈横切開アッセイにおける失血に対する多量体ｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−１１３の効果。
【０２０２】
８〜１２週齢の血友病マウスに、静脈内尾注射を介して賦形剤（生理食塩水）又はｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−１１３（１０mg/kg）を与えた。注射後１０分に、イソフルラン麻酔したマウスの側静脈を０．７mmの深さで切断し、そこでは尾の直径は２．３mmであった。横切開した尾を、温かい生理食塩水で満たした１０mlチューブに横切開後直ちに浸した。血液を３７℃で６０分間にわたり収集した。６０分後、血液及び生理食塩水の混合物を１５００gで遠心した。赤血球ペレットを次に、Ｈ２Ｏ中で溶解し、４１６nmでの吸光度を読み取ることによりヘモグロビンの量を得た。上に記載するようにヘモグロビンを抽出するために、Ｈ２Ｏ中の一定量（２０マイクロリットル、４０マイクロリットル、６０マイクロリットル、８０マイクロリットル、及び１００マイクロリットル）のマウス血液を溶解することにより得られた標準曲線から各々のサンプル中の失われた血液の容量を算出した。賦形剤及びＫＢ−ＡＴ−１１３処置マウスでの失血を図１３に示す。ＫＢ−ＡＴ−１１３の注入によって、血友病マウスにおける失血の低下がもたらされる。失血は、ＫＢ−ＡＴ−１１３（１０mg/kg）を受けたマウスについて３６３±２３８マイクロリットル（平均値±ＳＥ；ｎ＝３）及び賦形剤を受けたマウスについて１２３５±２３３マイクロリットル（ｎ＝３）であった。この差は、等しいＳＤを伴う対応のないｔ検定において分析した場合に統計的に有意であった（ｐ＝０．０１０５）。これらのデータは、ＫＢ−ＡＴ−１１３によるアンチトロンビンの中和によって、血友病マウスにおいて少なくとも部分的に止血が回復することを示す。
【０２０３】
実施例１５：ＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３融合タンパク質の発現によって、血友病マウスにおける止血が矯正される。
【０２０４】
野生型Ｂ−ｄｏｍａｉｎｌｅｓｓ  ＦＶＩＩＩ（ＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱ）及びＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３をコードするｃＤＮＡ構築物をｐＬＩＶＥ−プラスミド（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ、ＷＩ、ＵＳＡ）中にクローニングした。プラスミド（１．５マイクログラム／マウス）を、流体力学的遺伝子導入を介して第ＶＩＩＩ因子欠損マウス中に注射した：プラスミドを、動物の体重の１０%に相当する容量（即ち、２０グラムのマウスについては２ml）で０．９%生理食塩水中に希釈する。この溶液を５秒以内に尾静脈に注射する。遺伝子導入後４日に、イソフルラン麻酔マウスからの眼窩後穿刺を介して血液を採取し、遠心（２２℃で２０分間にわたり１５００g）により血漿を調製した。血漿を次に使用し、発色２段階活性アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＦＶＩＩＩ：Ｃ；Ｈｙｐｈｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄ、Ｎｅｕｖｉｌｌｅ−ｓｕｒ−Ｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用してＦＶＩＩＩ活性を測定した。平均ＦＶＩＩＩ活性は、ＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱ（ｎ＝３）については０．１４±０．０７U/ml及びＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３については０．１２±０．０６U/mlであった。遺伝子導入後５日に、イソフルラン麻酔マウスの側方尾静脈を、直径２．３mm及び深さ０．７mmで横切開した。血液を３０分間にわたり収集し、失血の容量を測定した（図１４）。失血は、ＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱを発現するマウスについては２１６±３３３マイクロリットル（平均値±ＳＤ；ｎ＝３）であり、失血は、ＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３を発現するマウスについては８９±９２マイクロリットル（平均値±ＳＤ；ｎ＝３）であった。失血は、両方の変異体の間で有意に異ならなかった。このように、ＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３は、第ＶＩＩＩ因子欠損マウスにおける止血欠損を矯正する際に、ＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱと少なくとも同じくらい効率的である。
【０２０５】
実施例１６：ＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３は、ＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱとしてより長い循環生存を有する。
【０２０６】
野生型Ｂ−ｄｏｍａｉｎｌｅｓｓ  ＦＶＩＩＩ（ＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱ）及びＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３をコードするｃＤＮＡ構築物をｐＬＩＶＥ−プラスミド（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ、ＷＩ、ＵＳＡ）中にクローニングした。プラスミド（１００マイクログラム／マウス）を、流体力学的遺伝子導入を介して第ＶＩＩＩ因子欠損マウス（構築物当たりｎ＝２）中に注射した：プラスミドを、動物の体重の１０%に相当する容量（即ち、２０グラムのマウスについては２ml）で０．９%生理食塩水中に希釈する。この溶液を５秒以内に尾静脈に注射する。遺伝子導入後４日に、イソフルラン麻酔マウスからの眼窩後穿刺を介して血液を採取し、遠心（２２℃で２０分間にわたり１５００g）により血漿を調製した。血漿を次に使用し、発色２段階活性アッセイ（Ｂｉｏｐｈｅｎ  ＦＶＩＩＩ：Ｃ；Ｈｙｐｈｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄ、Ｎｅｕｖｉｌｌｅ−ｓｕｒ−Ｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用してＦＶＩＩＩ活性を測定した。ＦＶＩＩＩ活性は、ＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱについては３．５及び４．５U/mlであり、ＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３については５．６及び４．４U/mlであった。マウスからの血漿を、第ＶＩＩＩ因子欠損マウスの尾静脈中への静脈内注入のために使用した。投薬は１Ｕ第  ＶＩＩＩ因子／マウスであった。対照として、組換えＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱを注入した。示した時間点で、イソフルラン麻酔マウスから後眼窩穿刺により血液を採取し、遠心（２２℃で２０分間にわたり１５００g）により血漿を調製した。残存第ＶＩＩＩ因子活性を発色２段階活性アッセイにおいて測定した。注射された量（平均値±ＳＤ；ｎ＝３〜４の各時間点）に対する残存活性を、注射後の時間に対してプロットした（図１５）。このアプローチによって、残留因子ＶＩＩＩレベルが、注入後の時間点４時間、８時間、及び２４時間に、ＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３と比較して、ＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱについて有意に低いことが明らかになった。値は次の通りである：
【表３４】
2019516347.tif 000037
【０２０７】
ＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱ間の統計分析は、Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ方法（ＧｒａｐｈＰｒｉｓｍ  ｖｓ  Ｍａｃ  ＯＳ  Ｘでは６．０ｈ；ＧｒａｐｈＰａｄ  ＳｏｆｔＷａｒｅ）を使用した多重ｔ検定を使用して決定した。算出した半減期において翻訳されたＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱと比較して、ＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３のより高い残留レベルは２．５倍増加していた（３．７時間［９５%信頼区間２．４〜７．７］対１．５［９５%信頼区間：０．８−１４．２］）。半減期を、単一の指数関数的減衰を記載する式を使用して算出した。ＧｒａｐＰｒｉｓｍを使用した統計分析によって、半減期がＷＴ−ＦＶＩＩＩ−ＳＱ及びＦＶＩＩＩ−ＡＴ−０２０３について有意に異なることが明らかになった（ｐ＝０．０２６）。
【０２０８】
実施例１７血友病血漿を使用したトロンビン生成アッセイにおける多価ｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−１１３の効果。
【０２０９】
ｓｄＡｂ  ＫＢ−ＡＴ−４４３を、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）欠損血漿中のトロンビン生成を回復させるその能力について分析した。トロンビン生成を、ディスペンサーを備えたＦｌｕｏｒｏｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ  ＯＹ、Ｈｅｌｓｉｎｋ、Ｆｉｎｌａｎｄ）において、Ｈｅｍｋｅｒら（pathophysiology of haemostasis and thrombosis(2002)32:249-253）により記載された方法に従って測定した。簡単には、生理食塩水（対照）、精製ＦＶＩＩＩ（０．１又は１U/ml  Ｋｏｇｅｎａｔｅ（登録商標）ＦＳ、Ｂａｙｅｒ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ、Ｐｕｔｅａｕｘ、Ｆｒａｎｃｅ）、又はＫＢ−ＡＴ−４４３（４マイクロモル）を添加した８０μlの血漿を、丸底９６ウェルマイクロタイタープレート中に分注した。ＴＦ（組換え脂質化ヒト組織因子、Ｉｎｎｏｖｉｎ（登録商標）、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇから得た）及びリン脂質（ＰＬ）小胞を含む２０マイクロリットルの混合物を血漿サンプルに加えて、１ｐＭのＴＦ及び４μＭのＰＬ小胞の最終濃度を得た。ＰＬ小胞を、Ｌ−α−ホスファチジル−Ｌ−セリン（ＰＳ）Ｌ−α−フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）及びＬ−α−フォスファチジルコリン（ＰＣ）（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒｌｉｐｉｄｓ、Ａｌｂａｓｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａ、ＵＳＡ）からＰＣ：ＰＥ：ＰＳ＝３：１：１の比率で調製し、公称１００nm直径であった。
【０２１０】
トロンビン生成は、蛍光発生基質及びＣａＣｌ２を含む２０マイクロリットルの出発試薬を加えることにより誘発させた。蛍光発生基質Ｉ−１１４０（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＡＭＣ）はＢａｃｈｅｍ  ＡＧ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、スイス）からであった。凝固血漿中でのトロンビン生成の動態を、較正された自動トロンボグラムを使用して３７℃で６０分間にわたりモニターし、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅソフトウェア（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ  Ｂ．Ｖ．、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、オランダ）を使用して分析した。４つのウェルが各々の実験のために必要であった（血漿サンプルのトロンビン生成を測定するための２つのウェル及び較正のための２つのウェル）。全ての実験をトリプリケートで実施し、平均値を報告した。内因性トロンビンポテンシャル（ＥＴＰ）、即ち、曲線下面積、ピークトロンビン、及びトロンビン検出についての遅延時間を決定した。
【０２１１】
図１６には、トロンビン生成曲線の例を示している。トロンビン生成パラメータを表１６にまとめている。これらのトロンビン生成曲線は、ＫＢ−ＡＴ−４４３が遅延時間及びＥＴＰに関してＦＶＩＩＩ  １００%に類似していることを示す。
【表３５】
2019516347.tif 000038
【０２１２】
参考文献：
本願を通して、種々の参考文献によって、本発明が関係する最先端技術が記載されている。これらの参考文献の開示を、本開示中への参照により本明細書に組み入れる。
【図１Ａ】
2019516347.tif 000039
【図１Ｂ】
2019516347.tif 000040
【図２】
2019516347.tif 000041
【図３】
2019516347.tif 000042
【図４】
2019516347.tif 000043
【図５】
2019516347.tif 000044
【図６】
2019516347.tif 000045
【図７】
2019516347.tif 000046
【図８−１】
2019516347.tif 000047
【図８−２】
2019516347.tif 000048
【図９】
2019516347.tif 000049
【図１０−１】
2019516347.tif 000050
【図１０−２】
2019516347.tif 000051
【図１１】
2019516347.tif 000052
【図１２】
2019516347.tif 000053
【図１３】
2019516347.tif 000054
【図１４】
2019516347.tif 000055
【図１５】
2019516347.tif 000056
【図１６】
2019516347.tif 000057
【配列表】
2019516347000001.app
【国際調査報告】
2019516347.tif 000058
2019516347.tif 000059
2019516347.tif 000060
2019516347.tif 000061
2019516347.tif 000062
2019516347.tif 000063
2019516347.tif 000064
2019516347.tif 000065