(57)【要約】本開示は、外因性ネオ抗原および免疫原性エンハンサーを発現する免疫細胞、または外因性ネオ抗原を発現するＴ細胞、ならびに、腫瘍関連ネオ抗原に関するがんなどの疾患または障害の処置におけるそれらの使用に関する。関連する発現構築物、キット、宿主細胞、医薬組成物、および方法も提供される。一態様では、本開示は、疾患または障害に関連する外因性ネオ抗原をコードするポリヌクレオチドおよび免疫原性エンハンサーをコードするポリヌクレオチドを含むＴ細胞を提供する。
2019514393.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患または障害に関連する外因性ネオ抗原をコードするポリヌクレオチドおよび免疫原性エンハンサーをコードするポリヌクレオチドを含むＴ細胞。
【請求項２】
前記ネオ抗原が、腫瘍ネオ抗原を含む、請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項３】
複数のネオ抗原を含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項４】
２種から約２０種までのネオ抗原を含む、請求項３に記載のＴ細胞。
【請求項５】
２種から約１０種までのネオ抗原を含む、請求項３または４に記載のＴ細胞。
【請求項６】
ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブセントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１から５までのいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはその両方である、請求項１から６までのいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項８】
ヒトＴ細胞である、請求項１から７までのいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項９】
前記免疫原性エンハンサーが、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、誘導性細胞死因子、細菌フラジェリン、ＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、分泌型ＩＬ−２、ＣＤ２５非依存的にＴ細胞に結合する分泌型ＩＬ−２、分泌型ＩＬ−１５、分泌型ＩＬ−１５−ＩＬ−１５Ｒα複合体、分泌型ＩＦＮβ、分泌型ＩＦＮ−α１、分泌型ＩＬ−７、またはそれらの任意の組み合わせを含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項１０】
前記免疫原性エンハンサーが、ＩＬ−１２を含む、請求項１から９までのいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項１１】
前記ＩＬ−１２が、前記Ｔ細胞の細胞表面に局在するＩＬ−１２融合タンパク質を含む、請求項１０に記載のＴ細胞。
【請求項１２】
前記ＩＬ−１２融合タンパク質が、（ａ）ＩＬ−１２ドメイン；および（ｂ）膜貫通ドメインを含む、請求項１１に記載のＴ細胞。
【請求項１３】
前記ＩＬ−１２融合タンパク質が、（ｃ）前記融合タンパク質を分泌経路に導くシグナルドメインをさらに含む、請求項１２に記載のＴ細胞。
【請求項１４】
前記免疫原性エンハンサーが、ＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦを含む、請求項９から１３までのいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項１５】
前記免疫原性エンハンサーが、誘導性細胞死因子を含む、請求項９から１４までのいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項１６】
前記誘導性細胞死因子が、セリン／トレオニンキナーゼ３（ＲＩＰＫ３）と相互作用する受容体を含む、請求項１５に記載のＴ細胞。
【請求項１７】
前記誘導性細胞死因子が、細胞死シグナル伝達ドメインおよびマルチマー形成ドメインを含む融合タンパク質を含む、請求項１５に記載のＴ細胞。
【請求項１８】
前記細胞死シグナル伝達ドメインが、ＲＩＰＫ３キナーゼドメインを含み、前記マルチマー形成ドメインが、ＦＫ５０６結合タンパク質またはそのマルチマー形成部分を含む、請求項１７に記載のＴ細胞。
【請求項１９】
前記免疫原性エンハンサーが、細菌フラジェリンを含む、請求項９から１８までのいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項２０】
前記細菌フラジェリンが、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａフェーズ１フラジェリンを含む、請求項１９に記載のＴ細胞。
【請求項２１】
前記細菌フラジェリンが、前記Ｔ細胞の細胞表面に局在する細菌フラジェリン融合タンパク質を含む、請求項１９または２０に記載のＴ細胞。
【請求項２２】
前記細菌フラジェリン融合タンパク質が、（ａ）細菌フラジェリンドメイン；および（ｂ）膜貫通ドメインを含む、請求項２１に記載のＴ細胞。
【請求項２３】
前記細菌フラジェリン融合タンパク質が、（ｃ）前記融合タンパク質を分泌経路に導くシグナルドメインをさらに含む、請求項２２に記載のＴ細胞。
【請求項２４】
外因性共刺激分子をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項２５】
前記共刺激分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７ＲＰ１、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ１５４、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ２ＢＰ２、ＬＩＧＨＴ、ＫＬＲＤ１、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）のアゴニスト、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）のアゴニスト、ＣＤ２７のアゴニスト、ＣＤ２８のアゴニスト、ＣＤ４０のアゴニスト、ＣＤ１２２のアゴニスト、ＧＩＴＲのアゴニスト、ＩＣＯＳのアゴニスト、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２４に記載のＴ細胞。
【請求項２６】
前記共刺激分子が、ＣＤ８０を含む、請求項２５に記載のＴ細胞。
【請求項２７】
前記共刺激分子が、ＣＤ１３７Ｌを含む、請求項２４から２６までのいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項２８】
前記共刺激分子が、前記Ｔ細胞の細胞表面に局在する、請求項２４から２７までのいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項２９】
疾患または障害に関連する外因性ネオ抗原と、免疫細胞の細胞表面に局在するＩＬ−１２融合タンパク質を含む免疫原性エンハンサーとを含む免疫細胞であって、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、巨核球、肥満細胞、血小板、赤血球、および顆粒球から選択される免疫細胞。
【請求項３０】
前記ＩＬ−１２融合タンパク質が、（ａ）ＩＬ−１２ドメイン；および（ｂ）膜貫通ドメインを含む、請求項２９に記載の免疫細胞。
【請求項３１】
前記ＩＬ−１２融合タンパク質が、（ｃ）前記融合タンパク質を分泌経路に導くシグナルドメインをさらに含む、請求項３０に記載の免疫細胞。
【請求項３２】
ＧＭ−ＣＳＦ、誘導性細胞死因子、細菌フラジェリン、ＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、分泌型ＩＬ−２、ＣＤ２５非依存的にＴ細胞に結合する分泌型ＩＬ−２、分泌型ＩＬ−１５、分泌型ＩＬ−１５−ＩＬ−１５Ｒα複合体、分泌型ＩＦＮβ、分泌型ＩＦＮ−α１、分泌型ＩＬ−７、またはそれらの任意の組み合わせから選択される第２の免疫原性エンハンサーをさらに含む、請求項３０から３２までのいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項３３】
（ａ）請求項１から２８までのいずれか一項に記載のＴ細胞または請求項２９から３２までのいずれか一項に記載の免疫細胞、またはそれらの任意の組み合わせ、および（ｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤を含む、組成物。
【請求項３４】
疾患または障害を処置するための方法であって、請求項１から２８までのいずれか一項に記載のＴ細胞、請求項２９から３２までのいずれか一項に記載の免疫細胞、または請求項３３に記載の組成物を有効量でそれを必要とするヒト被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項３５】
ネオ抗原の発現に関連する疾患または障害を有するヒト被験体を処置するための方法であって、請求項１から２８までのいずれか一項に記載のＴ細胞、請求項２９から３２までのいずれか一項に記載の免疫細胞、または請求項３３に記載の組成物を有効量で前記被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項３６】
前記疾患または前記障害の再燃または再発が防止される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記Ｔ細胞、前記免疫細胞、または前記組成物が複数回投与される、請求項３４から３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
投与間の期間が、１週間、２週間、３週間、および１カ月から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾患または前記障害が、ウイルス感染、細菌感染、過剰増殖性障害、または自己免疫疾患である、請求項３４から３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患または前記障害が、過剰増殖性疾患または障害である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記過剰増殖性疾患または障害が血液学的悪性疾患または固形がんである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記過剰増殖性疾患または障害が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）から選択される血液学的悪性疾患である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記過剰増殖性疾患または障害が、胆管がん、膀胱がん、骨および軟部組織癌腫、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸腺癌、結腸直腸がん、類腱腫、胚性がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、胃腺癌、多形膠芽腫、婦人科腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肝臓がん、肺がん、中皮腫、悪性黒色腫、神経芽腫、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、膵管腺癌、原発性星状細胞腫瘍、原発性甲状腺がん、前立腺がん、腎臓がん、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚がん、軟部組織肉腫、精巣胚細胞腫瘍、尿路上皮がん、子宮肉腫および子宮がんから選択される固形がんである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記過剰増殖性疾患または障害が肺がんである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記過剰増殖性疾患または障害が悪性黒色腫である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記Ｔ細胞または前記免疫細胞が、前記ヒト被験体に対して同系、同種異系、または自己のものである、請求項３４から４５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｔ細胞または前記免疫細胞が、前記ヒト被験体に対して自己のものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
追加の補助治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項３４から４７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記リンパ球または前記組成物が、前記補助治療剤と同時にまたは逐次的に投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記補助治療剤が、化学療法；免疫チェックポイント分子の阻害剤；共刺激分子；免疫原性を高める分子；細胞療法；またはワクチンを含む、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記補助治療剤が、化学療法を含む、請求項４８から５０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記補助治療剤が、免疫チェックポイント分子の阻害剤を含む、請求項４８から５１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記免疫チェックポイント分子の阻害剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ２４４／２Ｂ４、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＫＩＲ、ＰＶＲ１Ｇ（ＣＤ１１２Ｒ）、ＰＶＲＬ２、アデノシン、Ａ２ａＲ、免疫抑制性サイトカイン、ＩＤＯ、アルギナーゼ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、Ｔｒｅｇ細胞、またはそれらの任意の組み合わせの活性または発現を遮断する作用物質を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の活性または発現を遮断する作用物質が、ＰＤ−１に結合する抗体を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記補助治療剤が、共刺激分子を含む、請求項４８から５４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記共刺激分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７ＲＰ１、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ１５４、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ２ＢＰ２、ＬＩＧＨＴ、ＫＬＲＤ１、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）のアゴニスト、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）のアゴニスト、ＣＤ２７のアゴニスト、ＣＤ２８のアゴニスト、ＣＤ４０のアゴニスト、ＣＤ１２２のアゴニスト、ＧＩＴＲのアゴニスト、ＩＣＯＳのアゴニスト、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記共刺激分子が、ＣＤ８０を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記共刺激分子が、ＣＤ１３７Ｌを含む、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記補助治療剤が、ワクチンを含む、請求項４８から５８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
アジュバントを投与するステップをさらに含む、請求項３４から５９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記アジュバントが、ミョウバンまたはアルミニウム塩、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマイヌリン、ＩＳＣＯＭ、リポソーム、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、またはＡｑｕｉｌａのＱＳ−２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ネオ抗原をコードする核酸分子を含むトランスポゾン発現構築物。
【請求項６３】
（ａ）プロモーター；（ｂ）第１のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン逆方向反復；（ｂ）前記ネオ抗原をコードする前記核酸分子；および（ｃ）第２のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン逆方向反復を含み、前記ネオ抗原をコードする前記核酸分子が、前記第１のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン逆方向反復と前記第２のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン逆方向反復の間に位置する、請求項６２に記載のトランスポゾン発現構築物。
【請求項６４】
前記トランスポゾン発現構築物が、プラスミド中に存在する、請求項６２または６３に記載のトランスポゾン発現構築物。
【請求項６５】
細胞表面マーカーをコードする核酸分子をさらに含む、請求項６２から６４までのいずれか一項に記載のトランスポゾン発現構築物。
【請求項６６】
前記細胞表面マーカーが、切断型ヒトＣＤ１９、切断型ヒトＥＧＦＲ、切断型ヒトＮＧＦＲ、切断型ヒトＣＤ３４、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６５に記載のトランスポゾン発現構築物。
【請求項６７】
ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、誘導性細胞死因子、細菌フラジェリン、ＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、分泌型ＩＬ−２、ＣＤ２５非依存的にＴ細胞に結合する分泌型ＩＬ−２、分泌型ＩＬ−１５、分泌型ＩＬ−１５−ＩＬ−１５受容体アルファ複合体、分泌型ＩＦＮβ、分泌型ＩＦＮ−α１、分泌型ＩＬ−７、またはそれらの任意の組み合わせから選択される免疫原性エンハンサーをコードする核酸分子をさらに含む、請求項６２から６６までのいずれか一項に記載のトランスポゾン発現構築物。
【請求項６８】
請求項６２から６７までのいずれか一項に記載のトランスポゾン発現構築物を含むキット。
【請求項６９】
請求項６２から６７までのいずれか一項に記載のトランスポゾン発現構築物を含む宿主細胞。
【請求項７０】
ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする核酸分子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ酵素発現構築物をさらに含む、請求項６９に記載の宿主細胞。
【請求項７１】
免疫系細胞である、請求項６９または７０に記載の宿主細胞。
【請求項７２】
前記免疫系細胞が、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、巨核球、肥満細胞、血小板、赤血球、または顆粒球である、請求項７１に記載の宿主細胞。
【請求項７３】
前記免疫系細胞が、Ｔ細胞である、請求項７２に記載の宿主細胞。
【請求項７４】
前記Ｔ細胞が、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブセントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項７３に記載の宿主細胞。
【請求項７５】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはその両方である、請求項７３または７４に記載の宿主細胞。
【請求項７６】
ヒト細胞である、請求項６９から７５までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項７７】
ウイルスベクターをさらに含む、請求項６９から７６までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項７８】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクターである、請求項７７に記載の宿主細胞。
【請求項７９】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項８０に記載の宿主細胞。
【請求項８０】
前記ウイルスベクターが、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、誘導性細胞死因子、細菌フラジェリン、ＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、分泌型ＩＬ−２、ＣＤ２５非依存的にＴ細胞に結合する分泌型ＩＬ−２、分泌型ＩＬ−１５、分泌型ＩＬ−１５−ＩＬ−１５受容体アルファ複合体、分泌型ＩＦＮβ、分泌型ＩＦＮ−α１、分泌型ＩＬ−７、またはそれらの任意の組み合わせから選択される免疫原性エンハンサーをコードする核酸分子をさらに含む、請求項７７から７９までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項８１】
前記ウイルスベクターが、（ａ）前記宿主細胞の細胞表面に局在する融合タンパク質中に含まれるＩＬ−１２をコードする核酸分子および（ｂ）ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸分子を含む、請求項８０に記載の宿主細胞。
【請求項８２】
前記ウイルスベクターが、共刺激分子をコードする核酸分子を含む、請求項７７から８１までのいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項８３】
前記核酸分子が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７ＲＰ１、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ１５４、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ２ＢＰ２、ＬＩＧＨＴ、ＫＬＲＤ１、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）のアゴニスト、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）のアゴニスト、ＣＤ２７のアゴニスト、ＣＤ２８のアゴニスト、ＣＤ４０のアゴニスト、ＣＤ１２２のアゴニスト、ＧＩＴＲのアゴニスト、ＩＣＯＳのアゴニスト、またはそれらの任意の組み合わせを含む共刺激分子をコードする、請求項８２に記載の宿主細胞。
【請求項８４】
請求項６９から８３までのいずれか一項に記載の宿主細胞および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物。
【請求項８５】
請求項１から２８までのいずれか一項に記載のＴ細胞を調製する方法であって、前記Ｔ細胞に、（ａ）被験体の試料中で同定されたネオ抗原をコードする核酸分子を含有するｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミド；および（ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする核酸分子を含むプラスミドを導入し、それにより、前記Ｔ細胞を調製するステップを含む、方法。
【請求項８６】
前記試料の全エキソームまたはＲＮＡ配列決定を使用して前記ネオ抗原を同定するステップ；および前記ネオ抗原をコードする前記核酸分子を前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドに挿入するステップをさらに含む、請求項８５に記載のＴ細胞を調製する方法。
【請求項８７】
ネオ抗原をコードする前記核酸分子が、タンデムなミニ遺伝子を含む、請求項８５または８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記タンデムなミニ遺伝子が、２種から約２０種までのネオ抗原を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記タンデムなミニ遺伝子が、２種から約１０種までのネオ抗原を含む、請求項８７または８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記Ｔ細胞が、前記被験体に対して同系、同種異系、または自己のものである、請求項８５から８９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記Ｔ細胞が、前記被験体に対して自己のものである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドおよび前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする核酸分子を含むプラスミドが、前記Ｔ細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで導入される、請求項８５から９１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記Ｔ細胞に免疫原性エンハンサーをコードする核酸分子を含むプラスミドを導入するステップをさらに含む、請求項８５から９２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記免疫原性エンハンサーをコードする核酸分子が、前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミド中に含まれる、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
請求項２９から３２までのいずれか一項に記載の免疫細胞を調製する方法であって、前記免疫細胞に（ａ）被験体の試料中で同定されたネオ抗原をコードする核酸分子を含有するｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミド、（ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする核酸分子を含むプラスミド、および（ｃ）前記Ｔ細胞の細胞表面に局在するＩＬ−１２融合タンパク質をコードする核酸分子を導入し、それにより、前記免疫細胞を調製するステップを含む、方法。
【請求項９６】
（ｃ）の核酸分子によりコードされるＩＬ−１２融合タンパク質が、ＩＬ−１２ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
（ｃ）の核酸分子によりコードされるＩＬ−１２融合タンパク質が、前記融合タンパク質を分泌経路に導くシグナルドメインをさらに含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記ＩＬ−１２融合タンパク質をコードする核酸分子が、プラスミド中に含まれる、請求項９５から９７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＩＬ−１２融合タンパク質をコードする核酸分子が、（ａ）のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミド中に含まれる、請求項９５から９８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記試料の全エキソームまたはＲＮＡ配列決定を使用して前記ネオ抗原を同定するステップ；および前記ネオ抗原をコードする前記核酸分子を前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドに挿入するステップをさらに含む、請求項９５から９９までのいずれかに記載の方法。
【請求項１０１】
ネオ抗原をコードする前記核酸分子が、タンデムなミニ遺伝子を含む、請求項９５から１００までのいずれかに記載の方法。
【請求項１０２】
前記タンデムなミニ遺伝子が、２種から約２０種までのネオ抗原を含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記タンデムなミニ遺伝子が、２種から約１０種までのネオ抗原を含む、請求項１０１または１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記免疫細胞が、前記被験体に対して同系、同種異系、または自己のものである、請求項９５から１０３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記免疫細胞が、前記被験体に対して自己のものである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミドおよび前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする核酸分子を含むプラスミドが、前記免疫細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで導入される、請求項９５から１０５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記免疫細胞に第２の免疫原性エンハンサーをコードする核酸分子を含むプラスミドを導入するステップをさらに含む、請求項９５から１０６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記第２の免疫原性エンハンサーが、ＧＭ−ＣＳＦを含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記第２の免疫原性エンハンサーをコードする核酸分子が、ネオ抗原をコードする核酸分子を含む前記ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミド中に含まれる、請求項１０７または１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ＧＭ−ＣＳＦをコードする核酸分子を含むプラスミドが前記免疫細胞にｅｘ  ｖｉｖｏで導入される、請求項１０９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の利益に関する声明
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与されたＣＡ１１４５３６およびＣＡ１３６５５１の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
配列表に関する記述
本願に関連する配列表は、紙コピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって参照により本明細書に組み入れられる。配列表を含むテキストファイルの名称は、３６００５６＿４４０ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。このテキストファイルは１８１ＫＢであり、２０１７年５月３日に作成されたものであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出されることになる。
【背景技術】
【０００３】
Ｔ細胞の、組織学的性質が異なるヒトがんを認識し、排除する潜在性が理解されている。例えば、Ｔ細胞調節分子（免疫チェックポイント分子）を遮断する抗体は、免疫機能を高め、抗腫瘍活性を有することが示されている（Ｂｒａｈｍｅｒら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３６６巻：２４５５頁、２０１２年；Ｔｏｐａｌｉａｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、３６６巻：２４４３頁、２０１２年）。しかし、大多数のがん患者では、免疫チェックポイント分子の阻害剤を用いて処置した場合に長続きする免疫応答は達成されず、これは、おそらく、多くの患者が、誘導またはレスキューされ得る腫瘍抗原に対する機能的なＴ細胞応答を欠くことが原因である（Ｔｕｍｅｈら、Ｎａｔｕｒｅ、５１５巻：５６８頁、２０１４年）。したがって、腫瘍抗原に対するロバストなＴ細胞応答を誘発または追加刺激（ｂｏｏｓｔ）するための方法が必要とされている。
【０００４】
従来のペプチドに基づく、および樹状細胞に基づくワクチン接種プラットフォームでは、臨床的に有効なＴ細胞応答を生じさせるのに苦戦してきた（Ｐｅｎｎｏｃｋら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、３７巻：１７０頁、２０１６年）。自己Ｔ細胞は細胞に基づくがんワクチンのための有用なプラットフォームであり得る。外来タンパク質を発現するように改変されたＴ細胞は動物（Ｂｅｒｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、１０３巻：１２６１頁、２００４年；Ｒｕｓｓｏら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．、１１７巻：３０８７頁、２００７年）およびヒト（Ｂｅｒｇｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、１０７巻：２２９４頁、２００６年；Ｂｅｒｇｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７５巻：７９９頁、２００１年；Ｒｉｄｄｅｌｌら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２巻：２１６頁、１９９６年）における免疫原性が高く、外来タンパク質に由来するペプチドエピトープに対する高頻度の長続きするＴ細胞応答を誘発する。移入されたＴ細胞は、抗原刺激が起こる二次リンパ器官に効率的に移動し、また、免疫原性が増大するようにさらに遺伝子改変することができる（Ｒｕｓｓｏら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．、１１７巻：３０８７頁、２００７年）。
【０００５】
がんワクチンの設計の間に対処しなければならない１つの問題は、ワクチンを用いて標的化する腫瘍関連抗原の選択である。腫瘍により発現される多くの「自己」抗原は、一般に、免疫寛容に起因して（例えば、ＸｉｎｇおよびＨｏｇｑｕｉｓｔ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．  Ｂｉｏｌ．、４巻：ａ００６９５７頁、２０１２年を参照されたい）、さらにオンターゲットオフ腫瘍毒性にも起因して（例えば、Ｍｏｒｇａｎ、Ｂｌｏｏｄ、２０巻：３３９２頁（２０１３年）を参照されたい）、ワクチンに含めるには不十分な候補である。しかし、がんの特質として変異があり、発がん性曝露またはゲノムの不安定性に関連するがんでは多数の体細胞変異が蓄積する可能性がある。高度に変異したがんにおけるこれらの変異のいくつかは癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子において生じ、腫瘍成長を促進する一方、大部分は「パッセンジャー」変異であり、正常細胞に再導入した場合に観察可能な表現型は導かれない。パッセンジャー変異は、これらのがんのゲノム全体を通してランダムに分布し、発現されるアミノ酸の変化の大半を形成し、Ｔ細胞によって「外来」としてサンプリングおよび認識され得る。これらの体細胞変異はネオ抗原を生じさせ、また、大多数がパッセンジャー変異であるので、大半のネオ抗原は個々の患者の腫瘍に独特なものになる（ＳｃｈｕｍａｃｈｅｒおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４８巻：６９頁、２０１５年）。腫瘍特異的ネオ抗原は、臨床的に有効なＴ細胞応答を導き得、伝統的にがんワクチン接種の標的とされてきた一部のがん特異的または過剰発現した自己抗原よりも良好ながんワクチンの標的になり得る（ＳｃｈｕｍａｃｈｅｒおよびＳｃｈｒｅｉｂｅｒ、２０１５年）。
【０００６】
ペプチド（Ｇｕｂｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、５１５巻：５７７頁、２０１４年）およびリポソームＲＮＡ調製物（Ｋｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、５２０巻：６９２頁、２０１５年）を使用するネオ抗原ワクチン手法が多数の移植可能マウスがんモデルにおいて使用されており、ペプチドでパルスされた樹状細胞ワクチンにより、黒色腫を有する患者におけるネオ抗原応答が刺激されることが見出されている（Ｃａｒｒｅｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４８巻：８０３頁、２０１５年）。高度に変異した固形腫瘍に対する免疫応答におけるネオ抗原に関する潜在的に重要な役割を支持する証拠があるにもかかわらず、広範に誘導されかつ強力な免疫応答を誘発するために個々の腫瘍におけるネオ抗原レパートリーを利用するための再現可能な戦略は欠けている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｕｂｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１４年）５１５巻：５７７頁
【非特許文献２】Ｋｒｅｉｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１５年）５２０巻：６９２頁
【非特許文献３】Ｃａｒｒｅｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５年）３４８巻：８０３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、腫瘍特異的ネオ抗原などの疾患または障害に関するネオ抗原に対する免疫応答を生じさせる、細胞に基づくワクチンが依然として必要とされている。本開示の実施形態は、そのような必要性に対処し、さらに、他の関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様では、本開示は、疾患または障害に関連する外因性ネオ抗原をコードするポリヌクレオチドおよび免疫原性エンハンサーをコードするポリヌクレオチドを含むＴ細胞を提供する。
【００１０】
別の態様では、疾患または障害に関連する外因性ネオ抗原と、Ｔ細胞の細胞表面に局在するＩＬ−１２融合タンパク質を含む免疫原性エンハンサーとを含む免疫細胞であって、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、巨核球、肥満細胞、血小板、赤血球、および顆粒球から選択される免疫細胞が提供される。
【００１１】
さらなる態様では、本開示のＴ細胞または免疫細胞、および薬学的に許容される担体、希釈剤もしくは賦形剤を含む、組成物が提供される。
【００１２】
別の態様では、本開示は、疾患または障害を処置するための方法であって、本明細書に記載のＴ細胞、免疫細胞、または組成物を有効量でそれを必要とするヒト被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００１３】
なお別の態様では、ネオ抗原の発現に関連する疾患または障害を有するヒト被験体を処置するための方法であって、本明細書に記載のＴ細胞、免疫細胞、または組成物を有効量で被験体に投与するステップを含む、方法が提供される。
【００１４】
さらに別の態様では、本開示は、ネオ抗原をコードする核酸分子を含むトランスポゾン発現構築物を提供する。本開示のトランスポゾン発現構築物を含むキットも提供される。
【００１５】
別の態様では、本開示のトランスポゾン発現構築物を含む宿主細胞が提供される。本開示の宿主細胞および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物も提供される。
【００１６】
さらなる態様では、本開示は、Ｔ細胞を調製する方法であって、Ｔ細胞に、（ａ）被験体の試料中で同定されたネオ抗原をコードする核酸分子を含有するｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミド；および（ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする核酸分子を含むプラスミドを導入し、それにより、Ｔ細胞を調製するステップを含む、方法を提供する。
【００１７】
なお別の態様では、免疫細胞を調製する方法であって、前記免疫細胞に（ａ）被験体の試料中で同定されたネオ抗原をコードする核酸分子を含有するｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンプラスミド、（ｂ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする核酸分子を含むプラスミド、および（ｃ）前記Ｔ細胞の細胞表面に局在するＩＬ−１２融合タンパク質をコードする核酸分子を含むプラスミドを導入し、それにより、前記免疫細胞を調製するステップを含む、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、個人向けの、腫瘍特異的ネオ抗原に基づくＴ細胞ワクチンを開発するための本開示の方法の概略を示す。大多数のネオ抗原は個々の患者のがんに独特なものであるので、各患者の腫瘍の「ミュータノーム（ｍｕｔａｎｏｍｅ）」が決定され、それにより、ワクチンによって標的化すべき候補ネオ抗原の同定が可能になる。Ｔ細胞を患者から得、ネオ抗原を発現するように改変し、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大させ、患者に投与することができる。
【００１９】
【図２】図２は、オボアルブミンを発現するように操作されたＴＶＡＸ細胞（「ＴＯＶＡ」細胞と称される）を用いた処置により、マウスにおけるオボアルブミン（「ＯＶＡ」）に対するＣＤ８＋応答が効率的に誘導されることを示す。６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、−１日目に類遺伝子（ＣＤ４５．１）ナイーブＯＴ−１細胞２×１０４個を注射し、０日目および１４日目にＴＯＶＡを注射した。ＯＴ−１細胞の頻度を６日目、１３日目、および２０日目に決定した。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞は、わずか２×１０５個のＴＯＶＡ細胞の投与後に用量依存的な刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）、および、１４日目における第２の２×１０５個のＴＯＶＡ細胞の投与の７日後に循環Ｔ細胞の５〜１０％までの応答の効率的な追加刺激を示した。
【００２０】
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンによる、初代ヒトＴ細胞における抗原の安定な非ウイルス性発現を示す。Ｔ細胞におけるタンパク質発現を、フローサイトメトリーを使用して評価した。（Ａ）初代ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードするプラスミドおよびＣＭＶ  ＮＬＶエピトープと翻訳的に連結した切断型ＣＤ１９をコードするｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを用いてヌクレオフェクトした。抗ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の７日後にＴ細胞をＣＤ１９について染色した。（Ｂ）迅速な拡大プロトコールの１３日目に、ＣＤ１９＋Ｔ細胞をＣＤ１９マイクロビーズによって濃縮し、ＣＤ１９について染色した。（Ｃ）ＮＬＶエピトープを安定に発現するＴ細胞と共培養した場合のＣＭＶ  ＮＬＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞によるインターフェロン産生（破線、トランスフェクトされていないＴ細胞（灰色）またはＮＬＶペプチドでパルスした、トランスフェクトされていないＴ細胞（実線）と比較して）。
【００２１】
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、少量のＲＮＡによりＣＤ８＋およびＣＤ４＋メモリー応答が効率的に拡大することを示す。ＣＭＶ陽性ドナー由来のＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞を、漸減量のＣＭＶ  ｐｐ６５遺伝子をコードするｍＲＮＡを用いて刺激した。非改変細胞およびＣＭＶ  ｐｐ６５ペプチドをパルスした非改変細胞がそれぞれ陰性対照および陽性対照としての機能を果たした。（Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞を、主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）と複合体を形成した免疫優性ＮＬＶペプチドを含有するテトラマーを用いて染色した。（Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ブレフェルジンＡの存在下で、ｐｐ６５遺伝子を包含するペプチドをパルスした自己Ｂ細胞と共にインキュベートし、細胞内ＩＦＮ−γについて染色した。
【００２２】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｂは、ＴＶＡＸによるアジュバント分子の発現により、ＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激が高まることを示す。（Ａ）６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、−１日目にトランスジェニックドナーＣＤ４．５＋／＋ＴＣＲＯＴ−１＋／−ＣＤ８＋Ｔ細胞（オボアルブミン抗原ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的なＴＣＲを有する）５００個を注射した実験の設計スキーム。０日目に、マウスは、Ｔ細胞ワクチン（ＴＯＶＡ細胞と称される全長オボアルブミンを発現するＴ細胞２×１０５個）を受けた。注射されたＴＯＶＡ細胞の３群を、さらに膜係留型ＩＬ−１２（ｍｔＩＬ−１２）を発現するように、ＧＭ−ＣＳＦを分泌するように、またはその両方をなすように形質導入した。次いで、＋７日目にマウスから採血し、Ｔ細胞をＣＤ４５．１について染色した。（Ｂ）各処置群からの、ＯＴ−１特異的ＴＣＲを有するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｂは、ＴＶＡＸによるアジュバント分子の発現により、ＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激が高まることを示す。（Ａ）６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、−１日目にトランスジェニックドナーＣＤ４．５＋／＋ＴＣＲＯＴ−１＋／−ＣＤ８＋Ｔ細胞（オボアルブミン抗原ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的なＴＣＲを有する）５００個を注射した実験の設計スキーム。０日目に、マウスは、Ｔ細胞ワクチン（ＴＯＶＡ細胞と称される全長オボアルブミンを発現するＴ細胞２×１０５個）を受けた。注射されたＴＯＶＡ細胞の３群を、さらに膜係留型ＩＬ−１２（ｍｔＩＬ−１２）を発現するように、ＧＭ−ＣＳＦを分泌するように、またはその両方をなすように形質導入した。次いで、＋７日目にマウスから採血し、Ｔ細胞をＣＤ４５．１について染色した。（Ｂ）各処置群からの、ＯＴ−１特異的ＴＣＲを有するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率。
【００２３】
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴ刺激が交差提示によって起こることを示す。（Ａ）６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＣＤ４．５＋／＋ＴＣＲＯＴ−１＋／−ＣＤ８＋Ｔ細胞５００個を注射し、クラスＩ  ＭＨＣ＋またはｂ２ｍ−／−ＴＯＶＡ細胞２×１０５個を用いてワクチン接種し、採血し、ＣＤ４５．１について染色した。（Ｂ）各処置群からの、ＯＴ−１特異的ＴＣＲを有するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴ刺激が交差提示によって起こることを示す。（Ａ）６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＣＤ４．５＋／＋ＴＣＲＯＴ−１＋／−ＣＤ８＋Ｔ細胞５００個を注射し、クラスＩ  ＭＨＣ＋またはｂ２ｍ−／−ＴＯＶＡ細胞２×１０５個を用いてワクチン接種し、採血し、ＣＤ４５．１について染色した。（Ｂ）各処置群からの、ＯＴ−１特異的ＴＣＲを有するＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率。
【００２４】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｃは、２種の抗原を発現するＴＶＡＸ細胞が内因性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答を刺激し得ることを例示する。（Ａ）６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＣＤ４抗原ＬＬＯ１９０（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ由来）をコードするウイルスを用いてさらに形質導入したＴＯＶＡ細胞を使用してワクチン接種した。ＣＤ８＋細胞の２群およびＣＤ４＋細胞の１群は、ｍｔＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦをさらに発現するものであった。＋７日目に、細胞を染色し（ＯＶＡ／ＣＤ８テトラマー；ＬＬＯ１９０／ＣＤ４についての細胞内サイトカイン染色）、選別した。（Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率としてのＯＶＡ／ＣＤ８陽性テトラマー細胞。（Ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率としての細胞内インターフェロン陽性細胞。
【図７Ｂ】同上
【図７Ｃ】同上
【００２５】
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｃは、ｍｔＩＬ−１２を発現するように操作され、ＯＶＡをモデル抗原として含有するＴＶＡＸ細胞が、移植可能マウス黒色腫モデルにおける治療有効性を有することを例示する。（Ａ）６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６Ｆ１０−オボアルブミンマウス黒色腫細胞株に由来する細胞５×１０５個を注射した。＋１日目に、マウスはＴＯＶＡ／ｍｔ−ＩＬ１２細胞２×１０５個を受け、＋１５日目および＋２９日目に追加刺激投与（同じ投与量）を伴った。動物を＋１０日目、＋１４日目、＋１７日目、および＋２１日目に屠殺し、腫瘍サイズを測定した。（Ｂ）注射後の各処置群についての腫瘍サイズ（ｍｍ３）。（Ｃ）各処置群のパーセント生存。
【図８Ｂ】同上
【図８Ｃ】同上
【００２６】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、ＴＶＡＸ細胞によりマウス肉腫ネオ抗原に対する応答が誘導されることを示す。（Ａ）６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、連結したマウスネオ抗原Ｌａｍａ４およびＡｌｇ８をコードするウイルスベクターを用いて形質導入したＴ細胞を用いてワクチン接種した。ＴＶＡＸ細胞のサブセットに、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ抗原ＬＬＯ１９０、ｍｔＩＬ−１２＋ＧＭ−ＣＳＦまたはその両方をさらに発現するように形質導入した。＋１３日目に、テトラマー染色を実施した。（Ｂ）各処置群についてのＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率としてのテトラマー陽性細胞。（Ｃ）追跡実験において、ワクチン接種したマウスは、＋２８日目に、Ａｌｇ８、Ｌａｍａ４、ｍｔ−ＩＬ１２、およびＧＭ−ＣＳＦを発現するように改変された同系Ｔ細胞２×１０５個の最初の刺激用量を受け、その後、「追加刺激」注射（細胞４×１０５個）を受けた。テトラマー染色を表示した時点で実施した。この実験における模擬ワクチン接種動物と比較したこれらのテトラマーについての検出限界は０．１％であった。群当たりＮ＝３。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。
【図９Ｂ】同上
【図９Ｃ】同上
【００２７】
【図１０】図１０は、患者腫瘍から候補ネオ抗原を同定するための典型的な方法（上）および２ラウンドの候補ネオ抗原を用いた刺激後の肺がん患者由来の末梢血からのＴ細胞応答を示すデータ（Ｅｌｉｓｐｏｔサイトカイン放出アッセイ）（左下および右下）を例示する。
【００２８】
【図１１】図１１は、本開示によるＴ細胞ワクチンを形成するために、Ｔ細胞を、ネオ抗原を発現するように改変するための例示的なスキームを示す。右下には、肺がん患者由来のＴ細胞の自己ＴＥＲＦ１  ＴＶＡＸによる活性化を示す、原理証明実験からのフローサイトメトリーのデータが提示されている。
【００２９】
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｄは、２０ｍｅｒの候補ネオ抗原ペプチドを用いた刺激後のがん患者由来の末梢血からのインターフェロン放出データ（Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ）、およびその後の候補の検証を示す。（Ａ）プールされた候補ネオ抗原ペプチドを用いた刺激後の黒色腫患者由来の血液によるサイトカインの放出。（Ｂ）プールされた候補ネオ抗原ペプチドを用いた刺激後の肺がん患者由来の血液によるサイトカインの放出。（Ｃ）（Ａ）に示されている黒色腫患者試料中の個々のペプチドに対する特異的なＴ細胞応答の検証。（Ｄ）（Ｂ）に示されている肺がん患者の試料中の個々のペプチドに対する特異的なＴ細胞応答の検証。
【図１２Ｂ】同上
【図１２Ｃ】同上
【図１２Ｄ】同上
【００３０】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜Ｃは、追加の肺がん患者３名からの血液試料からのインターフェロン放出データ（Ｅｌｉｓｐｏｔ）を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜Ｃは、追加の肺がん患者３名からの血液試料からのインターフェロン放出データ（Ｅｌｉｓｐｏｔ）を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜Ｃは、追加の肺がん患者３名からの血液試料からのインターフェロン放出データ（Ｅｌｉｓｐｏｔ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本開示は、ネオ抗原に対する免疫応答を誘発または追加刺激するための免疫原性組成物および細胞に基づくワクチンを提供する。ある特定の実施形態では、外因性ネオ抗原をコードし、１種または複数種のネオ抗原をコードする１つまたは複数の発現構築物をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球）、そのような発現構築物を含む宿主細胞、およびそれを使用するための方法が提供される。本明細書で提供する免疫細胞および宿主細胞は、腫瘍ネオ抗原などの外因性ネオ抗原を発現するように改変される。ある特定の実施形態では、免疫細胞および宿主細胞は、１種または複数種の外因性ネオ抗原に対する免疫応答を強化するために、１つまたは複数の免疫原性エンハンサー（例えば、外来またはヘルパー抗原、ＩＬ−１２（例えば、膜係留型ＩＬ−１２など）、ＧＭ−ＣＳＦ）を発現するようにさらに改変される。
【００３２】
免疫細胞または宿主細胞は、誘導またはレスキューされ得るネオ抗原（複数可）に対する機能的なＴ細胞応答をもたらし得る、特定の被験体により産生される１種または複数種のネオ抗原に対する免疫応答を誘導するための、個人向けの細胞に基づくワクチンに使用することができる。ある特定の実施形態では、ネオ抗原は、腫瘍ネオ抗原である。ネオ抗原には、１のみまたは少数の特定の個体において見出され、正常組織においては見出されない（したがって、オフターゲットの免疫原性が低減している）、および、中枢性寛容機構に供されないという利点がある。
【００３３】
本開示をより詳細に示す前に、本明細書で使用される一定の用語の定義を提供することは、本開示の理解の助けになるだろう。さらなる定義は、本開示を通して示す。
【００３４】
本明細書では、任意の濃度範囲、百分率範囲、比の範囲、または整数範囲は、別段の指示がない限り、述べられている範囲内の任意の整数の値、および適宜、その分数（例えば、整数の十分の一および百分の一）を含むと解されるものとする。また、任意の物理的特徴、例えば、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さに関して本明細書で述べられている任意の数値範囲は、別段の指示がない限り、述べられている範囲内の任意の整数を含むと解されるものとする。
【００３５】
本明細書で使用される用語「約」は、別段の指示がない限り、示されている範囲、値または構造の±２０％を意味する。
【００３６】
本明細書で使用される用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、列挙されている成分の「１つまたは複数」を指すと解されたい。代替案（例えば「または」）の使用は、代替案のどちらか一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせを意味すると解されたい。
【００３７】
加えて、本明細書に記載の組成物および置換基の様々な組み合わせに由来する個々の特徴または特徴群は、あたかも各特徴または特徴群が個々に記載されている場合と同程度に、本願により開示されていると解されたい。したがって、特定の構造または特定の置換基の選択は、本開示の範囲内である。
【００３８】
本明細書で使用される用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、同義的に使用され、これらの用語および異表記は、非限定的と解釈されることを意図したものである。
【００３９】
用語「から本質的になる」は、特許請求の範囲を、明記されている材料もしくはステップに、または特許請求された対象の基本的特徴に著しい影響を与えないものに限定する。例えば、タンパク質ドメイン、領域もしくはモジュール（例えば、結合ドメイン、ヒンジ領域、リンカーモジュール）、またはタンパク質（１つもしくは複数のドメイン、領域もしくはモジュールを有し得る）は、ドメイン、領域、モジュールまたはタンパク質のアミノ酸配列が、併せて、ドメイン、領域、モジュールもしくはタンパク質の長さの最大２０％（例えば、最大１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％または１％）に寄与し、かつドメイン、領域、モジュールまたはタンパク質の活性（例えば、結合タンパク質の標的結合親和性）に実質的な影響を与えない（すなわち、活性を５０％を超えて、例えば、４０％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％または１％も低下させない）、伸長、欠失、変異、またはそれらの組み合わせ（例えば、アミノもしくはカルボキシ末端またはドメイン間のアミノ酸）を含む場合、特定のアミノ酸配列「から本質的になる」。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」または「免疫系細胞」は、２つの主要な系統である骨髄系前駆細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞、巨核球、肥満細胞、血小板、赤血球、および顆粒球などの骨髄系細胞を生じる）およびリンパ系前駆細胞（リンパ系細胞または「リンパ球」を生じる）を生じる、骨髄における造血幹細胞に由来する免疫系の任意の細胞を意味する。本明細書で使用される場合、「リンパ球」という用語は、主にリンパ液に存在すること、および、一般に、核が大きいことを特徴とする脊椎動物免疫系の白血球の亜型を指す。リンパ球は、例えば、Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−二重陰性Ｔ細胞、γδＴ細胞、調節Ｔ細胞）、Ｂ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。別の例示的な免疫系細胞は、マクロファージおよび樹状細胞、ならびに本明細書に記載の他の骨髄系細胞を含む。マクロファージおよび樹状細胞は、ＡＰＣの表面上の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）受容体がＴ細胞の表面上のＴＣＲと相互作用するときにＴ細胞を活性化し得る特殊化した細胞である、「プロフェッショナル抗原提示細胞」（または「プロフェッショナルＡＰＣ」）と呼ぶことができる。あるいは、任意の造血幹細胞または免疫系細胞は、ＴＣＲによりまたは別の抗原結合タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体または抗体）により認識される抗原を発現する核酸分子を導入することによってＡＰＣに転換することができる。本開示のワクチン組成物または処置方法に使用される免疫細胞またはリンパ球は、当該組成物または処置方法を受ける被験体に対して自己、同種異系、または同系のものであり得る。
【００４１】
「Ｔ細胞」（または「Ｔリンパ球」）は、胸腺において成熟し、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を産生する免疫系細胞であり、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得る（濃縮または単離する）ことができ、本明細書では、「バルク」Ｔ細胞と称される。Ｔ細胞の単離後、細胞傷害性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞およびヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔ細胞の両方を、拡大する前、またはその後に、ナイーブＴ細胞亜集団、メモリーＴ細胞亜集団、およびエフェクターＴ細胞亜集団に選別することができる。Ｔ細胞は、ナイーブ（抗原に曝露されていない；ＴＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ１２７およびＣＤ４５ＲＡの発現の増大、ならびにＣＤ４５ＲＯの発現の低下）、メモリーＴ細胞（ＴＭ）（抗原経験済みおよび長寿命）およびエフェクター細胞（抗原経験済み、細胞傷害性）であり得る。ＴＭは、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ、ナイーブＴ細胞と比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ９５の発現の増大、ならびにＣＤ５４ＲＡの発現の低下）およびエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ、ナイーブＴ細胞またはＴＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、およびＣＤ４５ＲＡの発現の低下、ならびにＣＤ１２７の発現の増大）のサブセットにさらに分けることができる。エフェクターＴ細胞（ＴＥ）は、ＴＣＭと比較してＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８の発現の低下を有し、グランザイムおよびパーフォリンについて陽性である抗原経験済みＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球を指す。ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は、サイトカインを放出することによって他の免疫細胞の活性に影響を及ぼすＣＤ４＋細胞である。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、適応免疫応答を活性化も抑制もし得、いずれの作用が誘導されるかは、他の細胞およびシグナルの存在に依存する。Ｔ細胞は、公知の技術に従って収集することができ、これらの種々の亜集団または組み合わせを、抗体への親和性結合、フローサイトメトリー、または免疫磁気選択などの公知の技術によって濃縮するまたは枯渇させることができる。
【００４２】
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）は、ＭＨＣ受容体に結合した抗原ペプチドに特異的に結合することができる免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（可変結合ドメイン、定常ドメイン、膜貫通領域および短い細胞質尾部（ｓｈｏｒｔ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔａｉｌ）を有する；例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ、第３版、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、４：３３頁、１９９７年参照）を指す。ＴＣＲは、細胞の表面上にまたは可溶性の形態で見いだすことができ、一般的にαおよびβ鎖（それぞれＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても公知）またはγおよびδ鎖（それぞれＴＣＲγおよびＴＣＲδとしても公知）を有するヘテロダイマーで構成されている。免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ鎖の細胞外部分（例えば、α鎖、β鎖）は、２つの免疫グロブリンドメインである、Ｎ末端における可変ドメイン（例えば、α鎖可変ドメインまたはＶα、β鎖可変ドメインまたはＶβ；一般的にＫａｂａｔ番号付けに基づくアミノ酸１〜１１６、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、１９９１年、第５版）および細胞膜に隣接した１つの定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインまたはＣα、一般的にＫａｂａｔに基づいてアミノ酸１１７〜２５９、β鎖定常ドメインまたはＣβ、一般的にＫａｂａｔに基づいてアミノ酸１１７〜２９５）を含む。また免疫グロブリンと同様に、可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）により分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む（例えば、Ｊｏｒｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７巻、９１３８頁、１９９０年；Ｃｈｏｔｈｉａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、７巻、３７４５頁、１９８８年を参照；Ｌｅｆｒａｎｃら、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７巻、５５頁、２００３年も参照）。ある特定の実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞（または「Ｔリンパ球」）の表面上に見いだされ、ＣＤ３複合体と会合する。本開示に使用するＴＣＲの供給源は、ヒト、マウス、ラット、ウサギまたは他の哺乳動物などの、様々な動物種に由来し得る。
【００４３】
「抗原」または「Ａｇ」とは、本明細書で使用される場合、免疫応答を惹起する免疫原性分子を指し、この免疫応答は、抗体産生、特定の免疫学的にコンピテントな細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化またはその両方を伴い得る。抗原は、例えば、ペプチド、グリコペプチド、ポリペプチド、グリコポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、脂質などであり得る。抗原は、当技術分野で公知の方法を使用して、合成すること、組換えにより産生させること、または生体試料から得ることができる。例えば、新規の抗原は、染色体の再配列または断裂などの当技術分野で公知の方法を使用して生成することができる。１つまたは複数の抗原を含有し得る例示的な生体試料は、組織試料、腫瘍試料、細胞、生体液（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｌｕｉｄ）、またはこれらの組み合わせを含む。抗原は、抗原を発現するように改変または遺伝子操作された細胞によって産生させることができる。例示的な抗原は、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Ｂ７Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５１、ＣＤ２７６、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ−Ｍｅｔ、ＣＴ−７、ＣＴＬＡ−４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥｐｈＡ２、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｏ−アセチル−ＧＤ２、ＧＤ２、ＧＨＲＨＲ、ＧＨＲ、ＧＩＴＲ、ｇｐ１３０、ＨＶＥＭ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＫＤＲ、Ｌ１ＣＡＭ、Ｌｅｗｉｓ  Ａ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＬＴβＲ、ＬＩＦＲβ、ＬＲＰ５、ＭＡＧＥ、メソセリン、ＭＵＣ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、がん特異的ネオ抗原、ＯＳＭＲβ、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＳＭＡ、ＰＴＣＨ１、ＲＡＮＫ、Ｒｏｂｏ１、ＲＯＲ１、ＴＥＲＴ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、チロシナーゼ、ＴＷＥＡＫ−ＲまたはＷＴ−１（それらの免疫原性部分または断片を含む）を含む。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「腫瘍抗原」または「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」とは、体液性免疫応答、細胞性免疫応答またはその両方を誘発する、腫瘍形成細胞または腫瘍細胞において見出される変異したタンパク質を指し、腫瘍細胞においてのみ見出され得る、または腫瘍細胞および他の正常細胞において見出され得る。ＴＡＡは、変異した癌遺伝子（例えば、ｐ５３、ｒａｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ＥＧＦＲ）、変異した腫瘍抑制遺伝子（例えば、ｐＲｂ、ＴＰ５３、ＰＴＥＮ、ＣＤ９５）、細胞タンパク質を過剰発現するかまたは異常に発現する変異した遺伝子などの産物であり得る。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「ネオ抗原」とは、以前には被験体のゲノム内（すなわち、被験体由来の健康な組織の試料中）で観察されていない、または宿主の免疫系によって「見られていなかった」もしくは認識されていなかった新しい抗原または抗原エピトープが生じる構造的な変化、変更または変異を含有する宿主細胞産物を指す。ネオ抗原は、例えば、変更されたもしくは変異した産物が生じる変更（置換、付加、欠失）を有するコードするポリヌクレオチドに由来するもの、または、細胞への外因性核酸分子もしくはタンパク質の挿入に由来するもの、または遺伝子変化を生じる環境因子（例えば、化学的、放射線学的）への曝露に由来するものであり得る。ネオ抗原は、腫瘍抗原から別々に生じ得る、または腫瘍抗原から生じ得るもしくはそれに付随し得る。「腫瘍ネオ抗原」（または「腫瘍特異的ネオ抗原」）とは、腫瘍細胞または腫瘍内の複数の細胞に付随する、それから生じる、またはその中で生じるネオ抗原決定基を含むタンパク質を指す。腫瘍ネオ抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞のＤＮＡによりコードされる１つまたは複数の体細胞変異を含有する抗原性腫瘍タンパク質またはペプチド、ならびにウイルス関連腫瘍（例えば、子宮頸がん、一部の頭頸部がん）に関連するウイルスオープンリーディングフレームに由来するタンパク質またはペプチド上に見出される。例えば、腫瘍ネオ抗原は、例示的な腫瘍または他の抗原のいずれかの中でまたはそれから、ならびに「ドライバー」がん抗原（例えば、Ｔｒａｎら、Ｎ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．、３７５巻：２２５５〜２２６２頁（２０１６年）に記載されているＫＲＡＳ由来のＧ１２Ｄネオ抗原）から、ならびに変異したＢ−Ｒａｆ、ＳＦ３１、ＭＹＤ８８、ＤＤＸ３Ｘ、ＭＡＰＫ１、ＧＮＢ１、およびその他において生じ得る。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「免疫原性エンハンサー」は、細胞に含有されるポリヌクレオチドによりコードされる外因性ネオ抗原の免疫原性を高める、Ｔ細胞などの宿主細胞に含有されるポリヌクレオチドによりコードされる分子を含む。宿主細胞によりコードされる免疫原性エンハンサーは、ネオ抗原に対する免疫応答を改善する局在化されかつ濃縮されたアジュバント活性をもたらし得る。例示的な免疫原性エンハンサーとして、ＩＬ−１２（例えば、膜集合ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ、誘導性細胞死因子、細菌フラジェリン、ＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、分泌型ＩＬ−２、ＣＤ２５非依存的にＴ細胞に結合する分泌型ＩＬ−２、分泌型ＩＬ−１５、分泌型ＩＬ−１５−ＩＬ−１５Ｒα複合体、分泌型ＩＦＮβ、分泌型ＩＦＮ−α１、分泌型ＩＬ−７、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。免疫原性エンハンサーは、宿主細胞により内因的に発現されるものであってよく（例えば、宿主細胞は、例えばＧＭ−ＣＳＦを内因的に発現し得る）、その場合、宿主細胞を、免疫原性エンハンサーの発現が増大するように操作することができる。あるいは、免疫原性エンハンサーは宿主細胞に対して外因性のものであってもよい。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「ＴＶＡＸ細胞」とは、１種または複数種のネオ抗原をコードする異種ポリヌクレオチドを含むＴ細胞であって、ヒトなどの宿主に投与されると、抗原を全身的に送達するＴ細胞を指す。ＴＶＡＸ細胞などは、免疫原性エンハンサーをコードするポリヌクレオチドをさらに含んでよく、Ｔ細胞において発現するネオ抗原の免疫原性は、免疫原性エンハンサーを伴わない１種または複数種のネオ抗原をコードするＴ細胞と比較して統計的に有意に改善される。本開示のＴＶＡＸ細胞の全身投与により、全身的なネオ抗原の提示または局在化されたネオ抗原の提示、例えば、腫瘍部位または二次リンパ組織における局在化または濃縮されたネオ抗原の提示などがもたらされ得る。
【００４８】
本明細書で使用される「結合ドメイン」または「結合領域」は、標的（例えば、抗原、リガンド）を特異的に認識してその標的と結合する能力を有するタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドまたはペプチド（例えば、抗体、受容体）もしくはその一部分を指す。結合ドメインは、目的の生体分子または別の標的についての任意の天然に存在する、合成、半合成または組換えで産生された（すなわち、ヒトによって操作された）結合パートナーを含む。例示的結合ドメインとしては、免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域（例えば、ドメイン抗体、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖまたはｓＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）、受容体外部ドメイン、またはリガンド（例えば、ＩＬ−１２などのサイトカイン）が挙げられる。免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）は、本明細書では「免疫グロブリン結合ドメイン」と呼ばれる。特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するための様々なアッセイが公知であり、そのようなアッセイには、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）分析が含まれる。ある特定の実施形態では、結合ドメインは、より大きいポリペプチドまたはタンパク質の一部であり、「結合タンパク質」と呼ばれる。
【００４９】
結合ドメインの供給源としては、ヒト、齧歯類、鳥類、ウサギおよびヒツジを含む、様々な種からの抗体可変領域（抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂもしくは可溶性ＶＨドメインまたはドメイン抗体としてフォーマットすることができるもの）が挙げられる。結合ドメインのさらなる供給源としては、他の種、例えば、ラクダ科動物（ラクダ、ヒトコブラクダもしくはラマからのもの；Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１４巻：５２１頁、１９９７年；Ｖｉｎｃｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８４巻：３２７３頁、２００９年；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６３巻：４４６頁、１９９３年；Ｎｇｕｙｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７５巻：４１３頁、１９９８年）、テンジクザメ（Ｒｏｕｘら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５巻：１１８０４頁、１９９８年）、スポッテッドラットフィッシュ（Ｎｇｕｙｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５４巻：３９頁、２００２年）、またはヤツメウナギ（Ｈｅｒｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１０５巻：２０４０頁、２００８年；Ａｌｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９巻：３１９頁、２００８年）からの抗体の可変領域が挙げられる。これらの抗体は、重鎖可変領域のみを使用して抗原結合領域を形成することができるようであり、すなわち、これらの機能性抗体は、重鎖のみのホモダイマーである（「重鎖抗体」と呼ばれる）（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２巻：１１６１頁、２００４年；Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４巻：２８５３頁、２００４年；Ｂａｒａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１２巻：５８０頁、２００６年；Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３巻：３６３９頁、２００８年）。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」または「に特異的」は、試料中の任意の他の分子または成分と有意に会合も合体もしないが、１０５Ｍ−１に等しいまたはより大きい親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡会合定数）（この会合反応のオン速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）［ｋｏｎ］とオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）［ｋｏｆｆ］との比に等しい）による標的分子への結合タンパク質（例えば、受容体、抗体、ＣＡＲもしくはＴＣＲ）または結合成分（またはその融合タンパク質）の会合または合体を指す。結合タンパク質または結合ドメイン（またはその融合タンパク質）は、「高親和性」結合タンパク質または結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）または「低親和性」結合タンパク質または結合ドメイン（もしくはその融合タンパク質）と分類することができる。「高親和性」結合タンパク質または結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１または少なくとも１０１３Ｍ−１のＫａを有する結合タンパク質または結合ドメインを指す。「低親和性」結合タンパク質または結合ドメインは、最大で１０７Ｍ−１まで、最大で１０６Ｍ−１まで、最大で１０５Ｍ−１までのＫａを有する結合タンパク質または結合ドメインを指す。あるいは、親和性は、Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−５Ｍから１０−１３Ｍ）と定義することができる。
【００５１】
特定の標的に特異的に結合する本開示の結合ドメインを同定するためのおよび結合ドメインまたは融合タンパク質親和性を決定するための様々なアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、分析用超遠心分離、分光法および表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））分析は、公知である（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１巻：６６０頁、１９４９年；Ｗｉｌｓｏｎ、  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５巻：２１０３頁、２００２年；Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３巻：２５６０頁、１９９３年；および米国特許第５，２８３，１７３号、５，４６８，６１４号または等価物を参照されたい）。
【００５２】
抗体技術の当業者によって理解されている用語には、本明細書において明確に異なって定義されていない限り、各々、当技術分野で獲得された意味が与えられる。用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続されている少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含むインタクト抗体、ならびにインタクト抗体によって認識される抗原標的分子と結合する能力を有するまたは保持する、インタクト抗体の任意の抗原結合部分または断片、例えば、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦａｂ’２断片を指す。したがって、本明細書での用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含み、該ポリクローナルおよびモノクローナル抗体には、インタクト抗体およびそれらの機能性（抗原結合）抗体断片が含まれ、そのような抗体断片には、抗原結合断片（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、一本鎖抗体断片（一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む）、およびシングルドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）断片が含まれる。この用語は、免疫グロブリンの遺伝子操作された形態および／または別様に修飾された形態、例えば、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、ならびにヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば二重特異性、抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）およびテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、タンデムジｓｃＦｖ、タンデムトリｓｃＦｖを包含する。別段の記述がない限り、用語「抗体」は、その機能性抗体断片を包含すると解されたい。この用語は、任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含む、インタクトまたは完全長抗体も包含し、そのようなクラスまたはサブクラスには、ＩｇＧならびにそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＤが含まれる。
【００５３】
モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、非ヒト、キメラ、ヒト化またはヒトのものであってもよい。免疫グロブリン構造および機能は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１４章（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８年）に総説されている。
【００５４】
例えば、用語「ＶＬ」および「ＶＨ」は、抗体軽鎖および重鎖それぞれからの可変結合領域を指す。可変結合領域は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として公知の、別個の明確に定義された部分領域（ｓｕｂ−ｒｅｇｉｏｎ）で構成されている。用語「ＣＬ」は、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」または「軽鎖定常領域」、すなわち、抗体軽鎖からの定常領域を指す。用語「ＣＨ」は、「免疫グロブリン重鎖定常領域」または「重鎖定常領域」を指し、この領域は、抗体アイソタイプに依存して、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）、またはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）へとさらに分割可能である。「Ｆａｂ」（抗原結合断片）は、抗原と結合する抗体の部分であり、可変領域と、鎖間ジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている重鎖のＣＨ１とを含む。
【００５５】
「超可変領域」または「ＨＶＲ」と同義の用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」が、抗原特異性および／または結合親和性を付与する、抗体可変領域内のアミノ酸の非連続配列を指すことは、当技術分野において公知である。一般に、各重鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）があり、各軽鎖可変領域に３つのＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）がある。「フレームワーク領域」および「ＦＲ」が、重鎖および軽鎖の可変領域の非ＣＤＲ部分を指すことは、当技術分野において公知である。一般に、各完全長重鎖可変領域に４つのＦＲ（ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２、ＦＲ−Ｈ３およびＦＲ−Ｈ４）があり、各完全長軽鎖可変領域に４つのＦＲ（ＦＲ−Ｌ１、ＦＲ−Ｌ２、ＦＲ−Ｌ３およびＦＲ−Ｌ４）がある。
【００５６】
所与のＣＤＲまたはＦＲの正確なアミノ酸配列境界は、いくつかの周知スキームのいずれかを使用して容易に決定することができ、そのようなスキームには、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１年）によるもの（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら（Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３巻：９２７頁、１９９７年）によるもの（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、ＭａｃＣａｌｌｕｍら（Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２巻：７３２頁、１９９６年）によるもの（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付けスキーム）、Ｌｅｆｒａｎｃら（Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７巻：５５頁、２００３年）によるもの（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）、およびＨｏｎｅｇｇｅｒ＆Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ（Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９巻：６５７頁、２００１年）によるもの（「Ａｈｏ」番号付けスキーム）が含まれる。所与のＣＤＲまたはＦＲの境界は、同定に使用されるスキームによって変わり得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは、構造アラインメントに基づき、その一方でＣｈｏｔｈｉａスキームは、構造情報に基づく。ＫａｂａｔスキームとＣｈｏｔｈｉａスキームの両方の番号付けは、最も一般的な抗体領域配列長に基づくものであり、挿入には挿入文字、例えば「３０ａ」によって対応し、一部の抗体には欠失が出現する。２つのスキームは、ある特定の挿入および欠失（「インデル」）を異なる位置に配置するため、結果として異なる番号付けになる。Ｃｏｎｔａｃｔスキームは、複雑な結晶構造の分析に基づくものであり、多くの点でＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームと類似している。
【００５７】
下の表１はＫａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａおよびＣｏｎｔａｃｔスキームによってそれぞれ同定されるＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３およびＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３の例示的位置境界を列挙するものである。ＣＤＲ−Ｈ１については、Ｋａｂａｔ番号付けスキームとＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームの両方を使用する残基番号付けが列挙されている。ＦＲは、ＣＤＲ間に位置し、例えば、ＦＲ−Ｌ１は、ＣＤＲ−Ｌ１とＣＤＲ−Ｌ２の間に位置する、など。示されているＫａｂａｔ番号付けスキームは、Ｈ３５ＡおよびＨ３５Ｂに挿入を配置するため、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、示されているＫａｂａｔ番号付け規定を使用して番号付けしたとき、ループの長さに依存してＨ３２とＨ３４の間で変動することに注目される。
【表１】
2019514393.tif 000003
【００５８】
したがって、別段の指定がない限り、所与の抗体またはその領域、例えばその可変領域、の「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」または個々の指定ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２）は、上述のスキームのいずれかによって定義される、ある（または特異的）相補性決定領域を包含すると解されたい。例えば、特定のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｈ３）が、所与のＶＨまたはＶＬアミノ酸配列内の対応するＣＤＲのアミノ酸配列を含有すると述べられている場合、そのようなＣＤＲは、上述のスキームのいずれかによって定義される可変領域内の対応するＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ−Ｈ３）の配列を有すると解される。一部の実施形態では、指定ＣＤＲ配列が指定される。同様に、別段の指定がない限り、所与の抗体またはその領域、例えばその可変領域、のＦＲまたは個々の指定ＦＲ（例えば、ＦＲ−Ｈ１、ＦＲ−Ｈ２）は、公知スキームのいずれかによって定義される、ある（または特異的）フレームワーク領域を包含すると解されたい。一部の事例では、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＣｏｎｔａｃｔ法によって定義されるＣＤＲなどの、特定のＣＤＲ（単数または複数）またはＦＲ（単数または複数）の同定のためのスキームが指定される。他の場合、ＣＤＲまたはＦＲの特定のアミノ酸配列が与えられる。
【００５９】
提供する抗体の中には、抗体断片もある。「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の部分を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；直鎖状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、抗体は、可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域を含む一本鎖抗体断片、例えばｓｃＦｖである。
【００６０】
シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む、抗体断片である。ある特定の実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である。
【００６１】
抗体断片は、インタクト抗体のタンパク質分解性消化、ならびに組換え宿主細胞による産生を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができる。ある特定の実施形態では、抗体は、組換えで産生された断片、例えば、合成リンカー、例えばペプチドリンカー、によって連結された２つもしくはそれより多くの抗体領域または抗体鎖を有するものなどの、天然に存在しない配置（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を含む断片である。ある特定の実施形態では、抗体は、天然に存在するインタクト抗体の酵素的消化によって産生される。一部の態様では、抗体断片は、ｓｃＦｖである。
【００６２】
本明細書で使用される「Ｆｃ領域部分」は、１つまたは複数の定常ドメイン、例えば、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４またはそれらの任意の組み合わせを含み得る、抗体からのＦｃ断片の重鎖定常領域セグメント（「結晶性断片」領域またはＦｃ領域）を指す。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域部分は、ＩｇＧ、ＩｇＡもしくはＩｇＤ抗体のＣＨ２およびＣＨ３ドメインまたはそれらの任意の組み合わせ、あるいはＩｇＭまたはＩｇＥ抗体のＣＨ３およびＣＨ４ドメインおよびそれらの任意の組み合わせを含む。他の実施形態では、ＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ３ＣＨ４構造は、同じ抗体アイソタイプからの部分領域ドメインを有し、ヒトのもの、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ（例えば、ヒトＩｇＧ１からのＣＨ２ＣＨ３）である。バックグラウンドにより、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンのエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害）、ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）および補体結合、Ｆｃ受容体（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＦｃＲｎ）との結合、Ｆｃ領域を欠くポリペプチドと比べて長いｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期、プロテインＡ結合、ならびにおそらくさらには経胎盤移行に関与する（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３７巻：５２５頁、１９８９年を参照されたい）。ある特定の実施形態では、本開示の免疫グロブリン様結合タンパク質において見いだされるＦｃ領域部分は、これらのエフェクター機能の１つまたは複数を媒介することができる、あるいはこれらの活性の１つもしくは複数またはすべてを、例えば当技術分野において公知の１つまたは複数の変異によって、欠くであろう。
【００６３】
加えて、抗体は、Ｆａｂ領域とＦｃ領域の間に通常は位置するヒンジ配列を有する（しかし、ヒンジの下方セクションが、Ｆｃ領域のアミノ末端部分を含むこともある）。バックグラウンドにより、免疫グロブリンヒンジは、Ｆａｂ部分が空間内を自由に移動できるように可撓性スペーサーとしての機能を果す。定常領域とは対照的に、ヒンジは、構造的に多様であり、免疫グロブリンクラス間およびさらにはサブクラス間で配列と長さの両方が異なる。例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域は、自由に可撓性であり、これにより、Ｆａｂ断片は、それらの対称軸の周りを回転し、２つの重鎖間ジスルフィド架橋の第１の架橋を中心とする球内に移動することが可能になる。比較すると、ヒトＩｇＧ２ヒンジは比較的短く、また４つの重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化された堅いポリプロリン二重らせんを含有し、この二重らせんが可撓性を制限する。ヒトＩｇＧ３ヒンジは、その固有の伸長したヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）の点で他のサブクラスとは異なり、このヒンジ領域は、６２個のアミノ酸（２１個のプロリンおよび１１個のシステインを含む）を含有し、非可撓性ポリプロリン二重らせんを形成するが、Ｆａｂ断片がＦｃ断片から比較的遠くに離れているので、より大きい可撓性をもたらす。ヒトＩｇＧ４ヒンジは、ＩｇＧ１より短いが、ＩｇＧ２と同じ長さを有し、その可撓性は、ＩｇＧ１とＩｇＧ２の中間である。
【００６４】
本明細書で使用される、ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域内のアミノ酸残基の位置は、別段の定めがない限り、Ｋａｂａｔ番号付け規定に従ってヒトＩｇＧ１の可変領域が１２８のアミノ酸残基で構成されていると仮定して、番号付けされる。ヒトＩｇＧ１重鎖の番号付けされた定常領域は、その後、他の免疫グロブリン重鎖の定常領域内のアミノ酸残基に番号付けするための基準として使用される。ヒトＩｇＧ１重鎖以外の免疫グロブリン重鎖の定常領域内の目的のアミノ酸残基の位置は、目的のアミノ酸残基と整列する、ヒトＩｇＧ１重鎖内のアミノ酸残基の位置である。ヒトＩｇＧ１重鎖の定常領域と他の免疫グロブリン重鎖の定常領域間のアラインメントは、デフォルトパラメータを用いてＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法を使用するＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）などの、当技術分野において公知のソフトウェアプログラムを使用して行うことができる。本明細書に記載の番号付けシステムによれば、例えば、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ２領域は、他のＣＨ２領域と比較してそのアミノ末端付近にアミノ酸欠失を有することもあるが、ヒトＩｇＧ２  ＣＨ２における２９６に位置する「Ｎ」の位置は、この残基がヒトＩｇＧ１  ＣＨ２における２９７位の「Ｎ」と整列するので、やはり２９７位と見なされる。
【００６５】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリン、受容体、または他の結合ドメインもしくは結合タンパク質と特異的に結合することができる、任意のアミノ酸配列またはタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、一般に、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基を含有し、特異的三次元構造特性はもちろん特異的電荷特性も有することができる。
【００６６】
本明細書で使用される用語「ポリペプチド」および「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結されているアミノ酸残基で構成された化合物を指す。用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と同義語であることもあり、または加えて、２つまたはそれより多くのポリペプチドの複合体を指すこともある。ポリペプチドは、他の成分（例えば、共有結合されているもの）、例えば、タグ、標識、生物活性分子、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含有することもある。特定の実施形態では、ポリペプチドは、断片であってもよい。本明細書で使用される「断片」は、親ポリペプチドにおいて見いだされる１つまたは複数のアミノ酸を欠くポリペプチドを意味する。断片は、親ポリペプチドにおいて見いだされる結合ドメイン、抗原またはエピトープを含むことができる。ある特定の実施形態では、ポリペプチドの断片は、親ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸の少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより多くを有することができる。
【００６７】
本明細書に記載の「バリアント」ポリペプチド種は、本明細書に提示の基準ポリペプチドと比べて、１つまたは複数の部位に１つもしくは複数の非天然アミノ酸、１つもしくは複数のアミノ酸置換、１つもしくは複数のアミノ酸挿入、１つもしくは複数のアミノ酸欠失、またはそれらの組み合わせを有する。ある特定の実施形態では、「バリアント」は、基準ポリペプチドと比べて実質的に同様の活性（例えば、酵素機能、免疫原性）または構造を有するポリペプチドを意味する。基準ポリペプチドのバリアントは、当技術分野において公知の配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定して、基準ポリペプチドのアミノ酸配列との少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、またはそれより高い配列同一性を有することができる。バリアントは、例えば、遺伝的多型またはヒトによる操作の結果として得ることができる。アミノ酸の保存的置換は周知であり、自然に起こることもあり、またはタンパク質が組換えで産生されるときに導入されることもある。アミノ酸置換、欠失および付加を、当技術分野において公知の変異誘発方法を使用してタンパク質に導入してもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、２００１年を参照されたい）。オリゴヌクレオチド誘導部位特異的（またはセグメント特異的）変異誘発手順を利用して、所望される置換、欠失または挿入に応じて変化させた特定のコドンを有する変化したポリペプチドを得てもよい。あるいは、ランダムまたは飽和変異誘発技術、例えば、アラニンスキャニング変異誘発、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応変異誘発、およびオリゴヌクレオチド誘導変異誘発を使用して、ポリペプチドバリアントを調製してもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上掲を参照されたい）。
【００６８】
２つまたはそれより多くのポリペプチドまたは核酸分子配列の文脈での用語「同一の」または「同一性パーセント」は、当技術分野において公知の方法、例えば配列比較アルゴリズムを使用して、手動アラインメントにより、または目視検査により測定して、比較ウインドウまたは指定領域にわたって比較し、最もよく一致するように整列させたとき、同じである２つもしくはそれより多くの配列もしくは部分配列、または指定領域にわたって同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの指定百分率（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一性）を有する２つもしくはそれより多くの配列もしくは部分配列を意味する。例えば、配列同一性および配列類似性パーセントの決定に好適な好ましいアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻：３３８９頁、１９７７年）およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５巻：４０３頁、１９９０年）に、それぞれ記載されている。
【００６９】
本明細書で使用される「融合タンパク質」は、天然ではタンパク質中で一緒に見いだされない少なくとも２つの異なるドメインを有する、一本鎖ポリペプチドを含む。融合タンパク質をコードする核酸分子を、ＰＣＲを使用して構築すること、組換えにより作出すること、もしくは同様のことができ、またはそのような融合タンパク質を合成により作製することができる。融合タンパク質は、他の成分（例えば、共有結合されているもの）、例えば、タグまたは生物活性分子をさらに含有することもある。
【００７０】
「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は、３’−５’ホスホジエステル結合によって連結されているデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれかを含有する、一本鎖もしくは二本鎖直鎖状または環状ポリヌクレオチドを指す。核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはベクターＤＮＡを含む。ある特定の実施形態では、本開示の核酸は、ＰＣＲにより生成する。核酸は、天然に存在するヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドなど）、天然に存在するヌクレオチドの類似体（例えば、天然に存在するヌクレオチド、モルホリノのα鏡像異性体）または両方の組み合わせであるモノマーから構成され得る。修飾ヌクレオチドは、糖部分またはピリミジンもしくはプリン塩基部分の修飾もしくは置換を有し得る。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似体により連結され得る。ホスホジエステル結合の類似体は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホルアミデートなどを含む。
【００７１】
ある特定の実施形態では、本開示のペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の型の細胞における発現が高まるまたは最大になるようにコドン最適化することができる（例えば、Ｓｃｈｏｌｔｅｎら、Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１９巻：１３５〜１４５頁、２００６年）。本明細書で使用される場合、「コドン最適化された」ポリヌクレオチドは、宿主細胞ｔＲＮＡレベルのアバンダンスに対応するサイレント変異を用いて改変されたコドンを有する異種ポリペプチドである。
【００７２】
本開示のポリヌクレオチドのバリアントも企図される。バリアントポリヌクレオチドは、本明細書に記載の基準ポリヌクレオチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または９９．９％同一であるか、または約６５℃〜６８℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、もしくは約４２℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドというストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で規定配列の基準ポリヌクレオチドとハイブリダイズするものである。ポリヌクレオチドバリアントは、本明細書に記載の機能性を有する免疫グロブリン結合タンパク質またはその抗原結合断片をコードする能力を保持する。
【００７３】
用語「単離される」は、材料がその元の環境（例えば、その材料が天然に存在する場合には天然環境）から除去されることを意味する。例えば、生きている動物内に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、天然系に共存する材料の一部またはすべてから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であってもよく、ならびに／またはそのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物（例えば、細胞溶解物）の一部であってもよく、およびさらには、そのようなベクターもしくは組成物が核酸もしくはポリペプチドにとっての天然環境の一部でない点で単離されていることもある。
【００７４】
核酸配列を細胞に挿入する文脈での用語「導入される」は、「トランスフェクション」、「形質転換」または「形質導入」を意味し、核酸分子を細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込んでもよいし、自律レプリコンに変換してもよいし、エピソーム発現ベクター（例えば、Ｖａｎ  Ｃａｅｎｅｎｂｒｏｅｃｋら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２６７：５６６５（２０００）を参照のこと）に含まれるてもよいし、（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡを）一過性に発現してもよい、真核または原核細胞への核酸配列の組込みへの言及を含む。
【００７５】
本明細書で使用される「異種」または「外因性」核酸分子、構築物または配列は、宿主細胞にとって生得的なものではないが、宿主細胞からの核酸分子または核酸分子の一部と相同であり得る、核酸分子または核酸分子の部分を指す。異種または外因性核酸分子、構築物または配列の供給源は、異なる属または種からのものであり得る。ある特定の実施形態では、異種または外因性核酸分子は、例えばコンジュゲーション、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または同様のものにより、宿主細胞または宿主ゲノムに付加され（すなわち、宿主細胞または宿主ゲノムに内因性のものでも生得的なものでもなく）、付加された分子は、宿主ゲノムに組み込まれることもあり、または染色体外遺伝物質として（例えば、自己複製ベクターのプラスミドもしくは他の形態として）存在することもあり、および複数のコピーで存在することもある。加えて、「異種の」または「外因性の」は、宿主細胞に導入された外因性核酸分子によってコードされている非生得的酵素、タンパク質または他の活性を、たとえ宿主細胞が同種タンパク質または活性をコードしていたとしても、指す。
【００７６】
ある特定の実施形態では、１つより多い異種核酸分子を、別個の核酸分子として、ポリシストロン性核酸分子として、融合タンパク質（例えば、複数のネオ抗原）をコードする単一核酸分子として、またはそれらの任意の組み合わせとして宿主細胞に導入することができ、それでもなお、１つより多い異種核酸とみなすことができる。例えば、本明細書で開示したように、免疫細胞を、１種もしくは複数種の所望のネオ抗原をコードするまたは１種もしくは複数種のネオ抗原および免疫原性エンハンサー（例えば、フラジェリン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする、２つまたはそれよりも多くの異種性または外因性核酸分子を含有するように改変することができる。ネオ抗原または免疫原性エンハンサーをコードする、２つまたはそれよりも多くの外因性核酸分子を宿主細胞に導入する場合、２つまたはそれよりも多くの外因性核酸分子は、単一核酸分子（例えば、単一ベクター上の）として、または１つより多い核酸分子（例えば、別個のベクター上の）として導入することができ、また、エピソーム発現ベクター内に含めること、または宿主染色体内の単一の部位または多数の部位に組み込むことができ、それでもなお、２つまたはそれよりも多くの外因性核酸分子とみなすことができることが理解される。したがって、言及される異種核酸分子またはコードされる生物学的活性の数は、コード化核酸分子の数またはタンパク質活性の数を指し、宿主細胞に導入された別個の核酸分子の数ではない。
【００７７】
本明細書で使用される用語「内因性」または「生得的」は、宿主細胞中に通常存在する遺伝子、タンパク質または活性を指す。さらに、親遺伝子、タンパク質または活性と比較して変異、過剰発現、シャッフル、重複または別様に変化している遺伝子、タンパク質または活性は、それでもやはり、その特定の宿主細胞に内因性または生得的であると見なされる。例えば、第１の遺伝子からの内因性制御配列（例えば、プロモーター、翻訳減衰配列）を使用して、第２の生得的遺伝子または核酸分子の発現を変化させるまたは調節することができ、その場合、第２の生得的遺伝子または核酸分子の発現または調節は、親細胞における通常の発現または調節とは異なる。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、ヒトの介入を介した外因性核酸分子の導入により改変された細胞、微生物、核酸分子もしくはベクターを指し、または内因性核酸分子もしくは遺伝子の発現が制御、脱制御され、もしくは構成的であるように改変された細胞もしくは微生物を指し、そのような改変または修飾は、ヒトの介入を介して（例えば、遺伝子工学により）導入または誘導される。遺伝子改変は、例えば、１つまたは複数のタンパク質または酵素をコードする核酸分子（プロモーターなどの、発現制御エレメントを含み得る）を導入する修飾、または他の核酸分子の付加、欠失、置換、または細胞の遺伝物質の他の機能的破綻もしくはそれへの付加を含み得る。例示的修飾は、参照または親分子からの異種または相同ポリペプチドのコード領域またはその機能的断片におけるものを含む。外因性核酸分子を導入することによって改変された細胞、微生物、核酸分子、またはベクターは、「組換え」または「天然に存在しない」または「遺伝子操作された」または「形質転換された」または「トランスジェニック」と称することができる。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「変異」は、それぞれ参照もしくは野生型核酸分子またはポリペプチド分子と比較して核酸分子またはポリペプチド分子の配列の変化を指す。変異は、ヌクレオチド（複数可）またはアミノ酸（複数可）の置換、挿入または欠失を含む、いくつかの異なる種類の配列の変化をもたらし得る。ある特定の実施形態では、変異は、１つから３つのコドンもしくはアミノ酸の置換、１つから約５つのコドンもしくはアミノ酸の欠失またはその組み合わせである。
【００８０】
「保存的置換」は、１つのアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸による置換と当技術分野で認識されている。例示的な保存的置換は、当技術分野で周知である（例えば、国際公開第９７／０９４３３号１０頁；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．  ＮＹ、ＮＹ、７１〜７７頁、１９７５年；Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、８頁、１９９０年を参照）。
【００８１】
ネオ抗原
一部の態様では、本開示は、１種または複数種の外因性ネオ抗原を発現するＴ細胞などの免疫細胞を含む免疫原性組成物またはワクチンを提供する。
【００８２】
ある特定の実施形態では、ネオ抗原は、腫瘍ネオ抗原などの、過剰増殖性疾患または障害（例えば、がん）に関連するものである。腫瘍ネオ抗原は、多くの場合、腫瘍細胞のＤＮＡにおける体細胞「パッセンジャー」変異から生じるので、多くの腫瘍ネオ抗原は個々の患者のがんに独特である。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書に開示した免疫原性組成物またはワクチンの開発は、個々の患者の腫瘍の「ミュータノーム」を決定すること、候補腫瘍ネオ抗原を同定すること、および腫瘍ネオ抗原を被験体に送達される免疫細胞において発現させることを含む（図１）。ある特定の実施形態では、ネオ抗原は、野生型核酸分子と比較してミスセンス変異、ノンストップ変異、スプライスバリアント、遺伝子融合、フレームシフト変異（例えば、付加または欠失）、またはこれらの組み合わせを有する核酸分子によりコードされるタンパク質に由来する抗原性ペプチドまたはエピトープを含む。
【００８３】
ネオ抗原は、いくつかの周知の技術のいずれかを使用して同定することができる（例えば、Ｒａｊａｓａｇｉら、Ｂｌｏｏｄ、１２４巻：４５３頁、２０１４年を参照されたい）。背景として、また、理論により拘束されることを望むものではないが、一般に、悪性クローンにおける比較的わずかな変異により、新しい免疫応答を誘発することができる。免疫原性になるためには、変異は、発現したタンパク質のアミノ酸配列を変化させるものでなければならず、得られるタンパク質は、タンパク質分解によりプロセシングされて、アミノ酸変化を含有し、ＭＨＣ分子に結合し、個々のＴ細胞によって外来として検出されるペプチドにならなければならない。得られる変異は、それによりペプチドのプロセシングおよびＭＨＣへの結合が変更されると、またはＭＨＣ−ペプチド−Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）相互作用が、特異的結合が促進されるように変更されると、Ｔ細胞応答を潜在的に活性化し得る（Ｇｕｂｉｎら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．、１２５巻：３４１３頁、２０１５年）。プロテアソームプロセシングならびにＭＨＣへのペプチド結合を予測するためのコンピュータによるアルゴリズムが開発されてきた。
【００８４】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでＭＨＣへの潜在的なペプチド結合を同定するための例示的な予測ツールとしては、例えば、ＮｅｔＭＨＣ（人工神経回路網（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ）（ＡＮＮ）を使用して特定のヒトＭＨＣアレルについてＭＨＣクラスＩ結合を予測するためのもの）（Ａｎｄｒｅａｔｔａら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、３２巻（４号）：５１１〜５１７頁（２０１６年）；Ｓｅｇａｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６８巻（３号）：８８９〜８９２頁（２００８年）；Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．、１２巻（５号）：１００７〜１０１７頁（２００３年）；ＮｅｔＭＨＣｐａｎ（既知の配列の任意のアレルについてＭＨＣクラスＩ結合を予測するためのもの）（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＆  Ａｎｄｒｅａｔｔａ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８巻（１号）：３３頁（２０１６年）；Ｈｏｏｆら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、６１巻（１号）：１〜１３頁（２００９年）、安定化マトリクス方法（Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔｈｏｄ）（ＳＭＭ）（Ｐｅｔｅｒｓ  ＆  Ｓｅｔｔｅ、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、６巻：１３２頁（２００５年）、および平均相対的結合（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ）（ＡＲＢ）マトリクス方法（Ｂｕｉら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、５７巻（５号）：３０４〜３１４頁（２００５年）（Ｆｒｉｔｓｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ、２巻（６号）：５２２〜５２９頁（２０１４年）；ｖａｎ  Ｂｕｕｒｅｎら、Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３巻：ｅ２８８３６頁（２０１４年）；Ｔｒｏｌｌｅら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、３９巻（５号）：７６４〜７６８頁（２０１５年）も参照されたい）が挙げられる。例えば、変異（例えば、ミスセンスおよびフレームシフト）を、自己ＭＨＣアレルに結合すると予測される新規のペプチドの形成について、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ（Ｔｒｏｌｌｅら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、３９巻（５号）：７６４〜７６８頁（２０１５年））を使用して分析することができる。さらに、ＨＬＡタイピングを、ＯｐｔｉＴｙｐｅ（例えば、Ｓｚｏｌｅｋら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、３０巻（２３号）：３３１０〜３３１６頁（２０１４年）を参照されたい）を使用して次世代またはエキソーム配列決定から得ることができる。
【００８５】
本開示の免疫原性組成物またはワクチンに使用するための候補ネオ抗原は、腫瘍試料からＤＮＡを単離すること；発現した遺伝子について、エキソーム捕捉、ＲＮＡ配列決定、全ゲノム配列決定、またはこれらの組み合わせを使用して配列決定すること；およびバイオインフォマティクスを使用して、候補ネオ抗原を生じると予測される体細胞変異（例えば、点変異）を同定することにより、同定することができる。
【００８６】
ネオ抗原および免疫原性エンハンサー発現細胞
ある特定の態様では、本開示は、１種または複数種の外因性ネオ抗原および免疫原性エンハンサーを含む免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を提供する。一部の実施形態では、本明細書に開示した外因性ネオ抗原および免疫原性エンハンサーを含む免疫細胞を、ネオ抗原に対する免疫応答を誘発または追加刺激するための免疫原性組成物またはワクチンに使用することができる。例えば、本明細書に記載する実施形態のいずれかでは、Ｔ細胞を、外因性ネオ抗原を発現するように改変する。そのような操作されたＴ細胞によって送達されるネオ抗原は、被験体に投与された際の免疫原性が高く、ネオ抗原（複数可）の１つまたは複数のエピトープに対する高頻度の長続きするＴ細胞応答を誘発することができる。ネオ抗原を産生する細胞を有することが分かっている被験体に移入されたＴ細胞は、ネオ抗原刺激が起こり得る二次リンパ器官に効率的に移動することができ、また、ネオ抗原を産生する細胞に対して、他のＴ細胞を間接的に（樹状細胞によって媒介される）または直接的に活性化することができる。さらに、長続きするＴ細胞応答が生じることにより、ネオ抗原（例えば、腫瘍ネオ抗原）に関連する疾患の再燃または再発が防止され得る。
【００８７】
Ｔ細胞に基づくワクチンにより、特に個人向けのネオ抗原に基づくワクチンおよび免疫原性組成物に関して、他の手法と比較して、設計、作製、および投与のしやすさなどの追加の実用的な利点がもたらされ得る。背景として、裸のペプチドまたは核酸分子に基づくワクチンは、構築および投与が容易であるが、有効性が高くない。さらに、それらの免疫原性を増大させることは、全身性アジュバントの添加に限定され、これは、毒性であるか有効性が限定されるかまたはその両方であり得る。樹状細胞は単離すること、遺伝子改変すること、またはｅｘ  ｖｉｖｏで多数まで拡大させることが難しい。対照的に、Ｔ細胞は、容易に単離され、容易に遺伝子改変され、ｅｘ  ｖｉｖｏで拡大することができ、Ｔ細胞の養子移入の臨床的な先例がある。本明細書に記載する通り、本開示の免疫原性組成物またはワクチンに使用するためのＴ細胞は、誘発される特異的な抗がん免疫応答の抗力が増大するように改変することもできる。
【００８８】
ある特定の実施形態では、本開示は、外因性ネオ抗原および免疫原性エンハンサーをコードする核酸分子を含む免疫細胞またはリンパ球であって、核酸分子が１種または複数種の外因性ネオ抗原をコードする、免疫細胞またはリンパ球を提供する。例えば、核酸分子は、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種または２０種のネオ抗原をコードし得る。ある特定の実施形態では、免疫細胞は、２種〜約５種の外因性ネオ抗原、または２種〜約１０種の外因性ネオ抗原、または２種〜約２０種の外因性ネオ抗原をコードする核酸分子を含む。ある特定の他の実施形態では、免疫細胞またはリンパ球は、それぞれが１種または複数種の外因性ネオ抗原、例えば、２種〜約５種の外因性ネオ抗原または２種〜約１０種の外因性ネオ抗原または２種〜約２０種の外因性ネオ抗原などを独立にコードする別個の核酸分子を含む（例えば、各核酸分子は、異なる数のネオ抗原をコードし得る）。
【００８９】
ある特定の実施形態では、本開示の免疫細胞またはリンパ球は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはその両方が特異的に結合するエピトープを含む外因性ネオ抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、本開示の免疫細胞またはリンパ球は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が特異的に結合する外因性ネオ抗原をコードするポリヌクレオチドを含み、ＣＤ４＋Ｔ細胞が特異的に結合する抗原またはネオ抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、コードされるＣＤ４＋抗原またはネオ抗原は、免疫細胞またはリンパ球に対して外因性である。他の実施形態では、免疫細胞またはリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔ細胞が特異的に結合する外因性ネオ抗原をコードするポリヌクレオチドを含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞が特異的に結合する抗原またはネオ抗原をコードするポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、コードされるＣＤ８＋抗原またはネオ抗原は、免疫細胞またはリンパ球に対して外因性である。理論に束縛されることを望むものではないが、Ｔ細胞のＣＤ８活性およびＣＤ４活性の共刺激により、ネオ抗原に対する免疫応答が高まり得る。
【００９０】
上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の免疫細胞またはリンパ球（例えば、Ｔ細胞）は、外因性ネオ抗原および免疫原性エンハンサーを含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、免疫細胞またはリンパ球は、外因性ネオ抗原をコードするポリヌクレオチドおよび免疫原性エンハンサーをコードするポリヌクレオチドを含む。例示的な免疫原性エンハンサーは、ＩＬ−１２（膜係留型ＩＬ−１２を含む）、ＧＭ−ＣＳＦ、誘導性細胞死因子、抗原（例えば、細菌フラジェリン）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００９１】
上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の外因性ネオ抗原を含有する免疫細胞またはリンパ球は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）によって認識されるものなどの病原体関連分子を含む免疫原性エンハンサーを含有し得る。例えば、ＤＮＡにコードされるＴＬＲアゴニストが本開示の免疫原性組成物またはワクチンと使用するための免疫原性エンハンサー（すなわち、分子アジュバント）として機能し得る（Ａｐｐｌｅｑｕｉｓｔら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７５巻：３８８２頁、２００５年を参照されたい）。例示的な免疫原性エンハンサーは、細菌フラジェリンタンパク質を含む。細胞表面での細菌フラジェリンタンパク質の発現により免疫応答が高まることが示されている（Ａｐｐｌｅｑｕｉｓｔら、２００５年）。一部の実施形態では、コードされる免疫原性エンハンサーは、細菌フラジェリンまたはその免疫原性増強断片を含む。ある特定の実施形態では、外因性ネオ抗原をコードする核酸分子ならびに細菌フラジェリンまたはその免疫原性増強断片をコードする核酸分子を含む免疫細胞またはリンパ球が提供される。特定の実施形態では、細菌フラジェリンは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａフェーズ１フラジェリンを含む。他の実施形態では、細菌フラジェリンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３１９７．１（その配列全体として参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、細菌フラジェリンは、リンパ球の細胞表面に局在する細菌フラジェリン融合タンパク質（すなわち、膜係留型細菌フラジェリン融合タンパク質）を含む。例えば、ある特定の実施形態では、細菌フラジェリン融合タンパク質は、（ａ）細菌フラジェリンドメイン；および（ｂ）膜貫通ドメインを含む。ある特定の実施形態では、細菌フラジェリン融合タンパク質は、（ｃ）融合タンパク質を分泌経路に導くシグナルドメインをさらに含む。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＰＤＧＦ膜貫通ドメインを含む。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号５に記載されているアミノ酸配列またはその断片を含む。さらなる実施形態では、シグナルドメインは、Ｉｇκ鎖リーダー配列を含む。ある特定の実施形態では、シグナルドメインは、配列番号１に記載されているアミノ酸配列を含む。なおさらなる実施形態では、細菌フラジェリンドメインを改変して、真核生物グリコシル化部位を除去することができる。ある特定の実施形態では、細菌フラジェリンドメインは、配列番号４に記載されているアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、細菌フラジェリン融合タンパク質は、タグをさらに含む。一部の実施形態では、細菌フラジェリン融合タンパク質に含まれるタグは、配列番号２に記載されているアミノ酸配列を含む。
【００９２】
ある特定の実施形態では、細菌フラジェリン融合タンパク質は、配列番号３に記載されている核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む。
【００９３】
上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の外因性ネオ抗原を含有する免疫細胞またはリンパ球は、ヒトＩＬ−１２などのＩＬ−１２である免疫原性エンハンサーを含有する。背景として、ＩＬ−１２は、抗原送達の部位におけるＴｈ１炎症促進性応答の刺激を刺激する一方で（Ｈｓｉｅｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０巻：５４７頁、１９９３年）、全身性の毒性を限定することが示されている。例えば、膜に結合したＩＬ−１２により、移植された腫瘍細胞株に対する免疫応答が刺激され得る（Ｐａｎら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、２０巻：９２７頁、２０１２年）。本明細書で開示したある特定の実施形態では、外因性ネオ抗原および外因性ＩＬ−１２またはその機能性断片を含む免疫細胞またはリンパ球が提供される。ヒトＩＬ−１２をコードする核酸配列は配列番号７に記載されており、ヒトＩＬ−１２のアミノ酸配列は配列番号８に記載されている。ある特定の実施形態では、外因性ネオ抗原をコードする核酸分子およびＩＬ−１２をコードする核酸分子を含む免疫細胞またはリンパ球が提供される。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１２は、単鎖（ｓｃ）ＩＬ−１２を含む。単鎖ＩＬ−１２の構築は、例えば、Ｐａｎら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、２０巻（５号）：９２７〜９３７頁（２０１２年）に記載されている。さらなる実施形態では、ＩＬ−１２は、免疫細胞またはリンパ球の細胞表面に局在するＩＬ−１２融合タンパク質（すなわち、膜係留型ＩＬ−１２）を含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１２融合タンパク質は、（ａ）ＩＬ−１２ドメイン；および（ｂ）膜貫通ドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１２の膜貫通ドメインは、Ｂ７、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４７、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＴＩＭ３、ＣＤ３００、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、Ａ２ａＲ、ＤＡＰ１０、ＦｃＲα、ＦｃＲβ、ＦｃＲγ、Ｆｙｎ、ＧＡＬ９、ＫＩＲ、Ｌｃｋ、ＬＡＴ、ＬＰＡ５、ＬＲＰ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、ＮＯＴＣＨ４、ＰＴＣＨ２、ＲＯＲ２、Ｒｙｋ、Ｓｌｐ７６、ＳＩＲＰα、ｐＴα、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＩＭ３、ＴＲＩＭまたはＺａｐ７０のものである。ある特定の実施形態では、ＩＬ−１２融合タンパク質は、融合タンパク質を分泌経路に導く（すなわち、細胞膜に局在させる）（ｃ）シグナルペプチドをさらに含む。
【００９４】
上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の外因性ネオ抗原を含有する免疫細胞またはリンパ球は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である免疫原性エンハンサーを含有する。背景として、ＧＭ−ＣＳＦは、サイトカインシグナル伝達に応答して多数の細胞型から分泌され、他の機能の中でも、顆粒球および単球の産生を刺激し、これらは、その後、成熟してマクロファージおよびＤＣになる。ＧＭ−ＣＳＦは、免疫調節において役割を果たし、がん免疫療法において免疫原性エンハンサーとして使用されてきた。例えば、Ｈｏｎｇ、Ｅｘｐ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．、４８巻（７号）：ｅ２４２頁（２０１６年）を参照されたい。
【００９５】
上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示は、外因性ネオ抗原および免疫原性エンハンサー、または外因性ネオ抗原をコードするポリヌクレオチドおよび免疫原性エンハンサーをコードするポリヌクレオチドを含む免疫細胞またはリンパ球を提供し、ここで、免疫細胞またはリンパ球は、Ｔ細胞を含む。
【００９６】
樹状細胞による瀕死細胞の食作用は、交差刺激によってＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する（Ｙａｔｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３５０巻：３２８頁、２０１５年）。したがって、本開示のネオ抗原を含有する免疫細胞またはリンパ球におけるアポトーシスまたはネクロトーシスを選択的に誘導することができることにより、炎症性細胞死経路を活性化すること、およびネオ抗原交差提示を増大させることによって細胞の免疫原性を高めることが可能になり得る。ある特定の実施形態では、免疫細胞またはリンパ球は、外因性ネオ抗原および外因性誘導性細胞死因子を含む。ある特定の実施形態では、免疫細胞またはリンパ球は、外因性ネオ抗原をコードする核酸分子および外因性誘導性細胞死因子をコードする核酸分子を含む。
【００９７】
「誘導性細胞死因子」は、細胞死を誘発または促進することができ、また、その活性を選択的に誘導することができる分子を指す。一部の実施形態では、誘導性細胞死因子は、細胞死シグナル伝達ドメインおよびマルチマー形成ドメインを含む融合タンパク質である。
【００９８】
「マルチマー形成ドメイン」とは、本明細書で使用される場合、別のポリペプチド分子または領域と、直接または間接的に、優先的に相互作用するまたは会合するポリペプチド分子または領域を指し、ここで、マルチマー形成ドメインの相互作用は、マルチマー形成（すなわち、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモトリマー、ヘテロトリマー、ホモマルチマー、ヘテロマルチマーなどであり得るダイマー、トリマー、テトラマー、または高次マルチマーの形成）に実質的に寄与するまたはそれを効率的に促進する。例えば、マルチマー形成は、共有結合（例えば、ジスルフィド結合または架橋）、イオン結合、金属結合、静電相互作用、塩橋、双極子−双極子力、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、またはそれらの任意の組み合わせを含めた１つまたは複数の型の分子力に起因し得る。マルチマーは適切な条件下（例えば、生理的条件、組換えまたは操作されたタンパク質の発現、精製、または保管に適した水溶液中、または非変性または非還元性電気泳動のための条件下）で安定である。例示的なマルチマー形成ドメインは、例えば、化学的に誘導されるマルチマー形成など、マルチマー形成促進分子を介して会合し、ここで、マルチマー形成は最小のものであるまたはマルチマー形成促進分子の非存在下では起こらない。
【００９９】
ある特定の実施形態では、誘導性細胞死因子は、セリン／トレオニンキナーゼ３（ＲＩＰＫ３）と相互作用する受容体である（例えば、Ｙａｔｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３５０巻：３２８頁、２０１５年を参照されたい）。特定の実施形態では、ＲＩＰＫ３は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００６８６２（配列全体として参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を含む。ＲＩＰＫ３が活性化されると、ＴＮＦ受容体により駆動される細胞死経路によってネクロトーシスが誘発され得、また、化学的に強制されたＲＩＰＫ３のオリゴマー形成により、ネクロトーシスが誘導され得る（Ｏｒｏｚｃｏら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．、２１巻：１５１１頁、２０１４年）。したがって、ある特定の実施形態では、誘導性細胞死因子は、例えばＲＩＰＫ３細胞死シグナル伝達ドメインおよびマルチマー形成ドメインを含む融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、ＲＩＰＫ３細胞死シグナル伝達ドメインはＲＩＰＫ３キナーゼドメインを含み、マルチマー形成ドメインはＦＫ５０６結合タンパク質またはそのマルチマー形成部分を含む。ＦＫ５０６結合タンパク質は、ラパマイシンの合成二価同族化合物と高親和性で結合し、その結果、迅速なダイマー形成がもたらされる（Ｙａｔｉｍら、上記；Ｏｒｏｚｃｏら、上記）。さらなる実施形態では、マルチマー形成促進分子は、ラパマイシンまたはその類似体もしくは誘導体を含む。細胞死を導くタンパク質相互作用に関連付けられる他の分子は、混合系統キナーゼドメイン様（ＭＬＫＬ）（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３９巻：４４３頁、２０１３年を参照されたい）、ならびにカスパーゼおよびＧＳＤＭＤ（Ｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ、５２６巻：６６０頁、２０１５年を参照されたい）を含む。外因性ネオ抗原および誘導性ＭＬＫＬ、カスパーゼ、またはＧＳＭＤを含む免疫細胞、リンパ球またはＴ細胞も本開示の範囲内に入る。外因性ネオ抗原をコードする核酸分子および誘導性ＭＬＫＬ、カスパーゼ、またはＧＳＭＤをコードする核酸分子を含む免疫細胞、リンパ球またはＴ細胞も提供される。
【０１００】
本明細書に開示される細胞または方法における使用のための他の免疫原性エンハンサーとして、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、分泌型ＩＬ−２、ＣＤ２５非依存的にＴ細胞に結合する分泌型ＩＬ−２、分泌型ＩＬ−１５、分泌型ＩＬ−１５−ＩＬ−１５Ｒα複合体、分泌型ＩＦＮβ、分泌型ＩＦＮ−α１、分泌型ＩＬ−７、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１０１】
上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示は、外因性ネオ抗原および外因性誘導性細胞死因子、または外因性ネオ抗原をコードするポリヌクレオチドおよび外因性誘導性細胞死因子をコードするポリヌクレオチドを含む免疫細胞またはリンパ球を提供し、ここで、免疫細胞またはリンパ球は、Ｔ細胞を含む。
【０１０２】
上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の外因性ネオ抗原を含有する免疫細胞またはリンパ球は、共刺激分子をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、外因性ネオ抗原をコードする核酸分子および共刺激分子をコードする核酸分子を含む免疫細胞またはリンパ球が提供される。「共刺激分子」とは、本明細書で使用される場合、Ｔ細胞にシグナルを送達または伝達してＴ細胞活性化を正に調節することができる受容体、リガンド、または細胞表面分子を指す（ＣｈｅｎおよびＦｌｉｅｓ、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：２２７頁、２０１３年）。背景として、Ｔ細胞活性化および増殖には、Ｔ細胞抗原特異的受容体（ＴＣＲ）と共刺激シグナルの関与（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）、最も典型的には、ＣＤ２８へのＣＤ８０およびＣＤ８６の結合に媒介される２つのシグナルが必要である（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、７５巻：１５３１頁、１９９０年）。共刺激リガンドおよび対抗受容体は、ＡＰＣ上またはＴ細胞と相互作用する他の細胞上に頻繁に発現し、Ｔ細胞上に見出される細胞表面受容体と相互作用することによって共刺激シグナル伝達をもたらす。一部の実施形態では、外因性ネオ抗原および外因性共刺激分子を含む免疫細胞またはリンパ球が提供され、ここで、共刺激分子は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７ＲＰ１、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ１５４、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ２ＢＰ２、ＬＩＧＨＴ、ＫＬＲＤ１、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。特定の実施形態では、共刺激分子は、ＣＤ８０を含む。さらなる実施形態では、共刺激分子は、ＣＤ１３７Ｌを含む。なおさらなる実施形態では、共刺激分子は、免疫細胞またはリンパ球の細胞表面に局在する。
【０１０３】
上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示は、外因性ネオ抗原および外因性共刺激分子、または外因性ネオ抗原をコードするポリヌクレオチドおよび外因性共刺激分子をコードするポリヌクレオチドを含む免疫細胞またはリンパ球を提供し、ここで、免疫細胞またはリンパ球は、Ｔ細胞を含む。
【０１０４】
上述の実施形態のいずれかにおいて、外因性ネオ抗原を含有する免疫細胞またはリンパ球は、疾患または障害に関連する外因性ネオ抗原を含む。一部の実施形態では、ネオ抗原は、がんなどの過剰増殖性疾患または障害に関連する。ある特定の実施形態では、ネオ抗原は、腫瘍ネオ抗原を含む。特定の実施形態では、ネオ抗原は、野生型核酸分子によりコードされるタンパク質と比較してミスセンス変異またはフレームシフト変異を有する核酸分子によりコードされるタンパク質に由来する腫瘍ネオ抗原を含む。
【０１０５】
上述の実施形態のいずれかにおいて、外因性ネオ抗原、外因性免疫原性エンハンサー、外因性誘導性細胞死因子、または外因性共刺激分子を、ネオ抗原、免疫原性エンハンサー、誘導性細胞死因子、および共刺激分子の１つまたは複数をコードするＤＮＡ分子のトランスフェクション、形質導入、または電気穿孔などの当技術分野で公知の方法によって免疫細胞に導入することができる。一部の実施形態では、ネオ抗原、免疫原性エンハンサー、誘導性細胞死因子、または共刺激分子をコードするポリヌクレオチドを免疫細胞に導入するために発現構築物を使用する。例えば、一部の実施形態では、外因性ネオ抗原、外因性免疫原性エンハンサー、外因性誘導性細胞死因子、または外因性共刺激分子の１つまたは複数を、トランスポゾンベクターまたは発現構築物を使用して免疫細胞、リンパ球またはＴ細胞に導入する。
【０１０６】
発現構築物および宿主細胞
別の態様では、本開示は、１種または複数種のネオ抗原および免疫原性エンハンサーをコードする核酸分子、ならびにそのようなネオ抗原および免疫原性エンハンサーを宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）において発現させるための発現構築物を提供する。
【０１０７】
本明細書で使用される「発現構築物」は、好適な宿主において核酸分子の発現を果すことができる好適な制御配列に作動可能に連結されている核酸分子を含有するＤＮＡ構築物を指す。発現構築物は、ベクター（例えば、細菌ベクター、ウイルスベクター）内に存在してもよく、またはゲノムに組み込まれていてもよい。用語「作動可能に連結される」は、単一ポリヌクレオチド断片上の２つまたはそれより多くのポリヌクレオチドが、あるポリヌクレオチドの機能が他のポリヌクレオチドによる影響を受けるように、会合していることを指す。例えば、プロモーターとコード配列は、プロモーターがそのコード配列の発現に影響を与えることができる（すなわち、コード配列が、プロモーターの転写制御下にある）場合、作動可能に連結している。用語「発現制御配列」（調節配列とも呼ばれる）は、それらが作動可能に連結されているコード配列の発現およびプロセシングを果す、ポリヌクレオチド配列を指す。例えば、発現制御配列としては、転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；およびことによると、タンパク質分泌を増進する配列を挙げることができる。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、発現構築物は、ベクター内に存在する。「ベクター」は、別の核酸を輸送することができる核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＲＮＡベクター、または直鎖状もしくは環状ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であってもよく、これらは、染色体、非染色体、半合成もしくは合成核酸を含み得る。例示的なベクターは、自己複製能力があるもの（エピソームベクター）、または連結されている核酸を発現させる能力があるもの（発現ベクター）である。例示的なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばオルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病および水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、プラス鎖ＲＮＡウイルス、例えばピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびに二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられ、二本鎖ＤＮＡウイルスには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型および２型、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス）、およびポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘およびカナリアポックス）が含まれる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、哺乳動物Ｃ型、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプーマウイルスが挙げられる（Ｃｏｆｆｉｎ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：  Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、Ｂ．  Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６年）。一部の実施形態では、ベクターは、プラスミドベクター（例えば、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ、ｐｉｇｇｙＢａｃまたはトランスポゾンベクター）である。一部の実施形態において、ベクターは、ウイルスベクターである。一部のそのような実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターまたはγ−レトロウイルスベクターである。一部の実施形態において、ウイルスまたはプラスミドベクターは、遺伝子マーカー形質導入（例えば、緑色蛍光タンパク質、ｈｕＥＧＦＲｔ）をさらに含む。
【０１０９】
ある特定の他の態様では、本開示は、本明細書に記載の発現構築物もしくはベクターを含むか、または本明細書に記載の発現構築物により提供されるポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。本明細書で使用される用語「宿主」は、目的のポリペプチド（例えば、ネオ抗原）を産生するための異種または外因性核酸分子での遺伝子修飾の標的となる細胞（例えば、Ｔ細胞造血前駆体細胞）または微生物を指す。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、異種または外因性ネオ抗原ペプチドまたは免疫原性エンハンサーの生合成に関係するまたは関係しない所望の特性を付与する他の遺伝子修飾（例えば、検出可能なマーカーの包含）を、任意選択で、既に有することもあり、または含むように修飾されることもある。１つより多くの異種または外因性核酸分子を、別の核酸分子として、複数の個々に制御された遺伝子として、ポリシストロン性核酸分子として、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子として、またはそれらの任意の組み合わせとして、宿主細胞に導入することができる。２つまたはそれより多くの外因性核酸分子を宿主細胞に導入する場合、２つまたはそれより多くの外因性核酸分子を、単一の核酸分子として（例えば、単一のベクターを用いて）導入し、別々のベクターを用いて、宿主染色体の単一の部位または複数の部位に組み込むことができることは理解される。言及した異種核酸分子またはタンパク質活性の数は、コードする核酸分子の数またはタンパク質活性の数を指し、宿主細胞に導入される別々の核酸分子の数を指さない。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、トランスポゾン発現構築物を使用して外因性ネオ抗原または免疫原性エンハンサーを宿主細胞に導入する。「トランスポゾン」（または「転移因子」）は、トランスポザーゼの存在下でＤＮＡ分子内で位置を移動することができる可動性の遺伝学的単位を指す。トランスポゾンは、トランスポザーゼ酵素がＤＮＡに逆方向反復において結合し、当該エレメントのＤＮＡ分子からの切除を触媒し、それを別の場所に挿入するカットアンドペースト機構によって動員される。この水平な遺伝子移入のプロセスを使用して遺伝子を細胞に導入することができる。本明細書で使用される場合、「トランスポゾン系」とは、トランスポゾンおよびトランスポザーゼを含むプラスミドに基づく遺伝子移入系を指す。外因性遺伝子を細胞に導入するために使用することができるトランスポゾンは、例えば、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾン（Ｉｖｉｃｓら、Ｃｅｌｌ、９１巻：５０１頁、１９９７年）およびｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン（Ｄｉｎｇら、Ｃｅｌｌ、１２２巻：４７３頁、２００５年）を含む。ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系では、目的の遺伝子にはトランスポゾン末端逆位配列（ＩＲ）エレメントが隣接し、構築物は、一般には、トランスポザーゼ酵素を発現するプラスミドと共に細胞内に電気穿孔される。これにより、レトロウイルスベクターに関連する初代ヒトＴ細胞への効率的な安定な組み込みが導かれ（Ｎａｋａｚａｗａら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３２巻：８２６頁、２００９年）、また、これには、使いやすい、低コストの裸のＤＮＡ、および組み込みに関連する形質転換事象の理論的リスクが低いという利点がある（Ｇａｌｖａｎら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３２巻：８３７頁、２００９年）。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、ネオ抗原をコードする核酸分子を含むトランスポゾン発現構築物が提供される。さらなる実施形態では、トランスポゾン発現構築物は、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾンまたはｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンを含む。特定の実施形態では、トランスポゾン発現構築物は、（ａ）プロモーター；（ｂ）第１のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン逆方向反復；（ｂ）ネオ抗原をコードする核酸分子；および（ｃ）第２のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン逆方向反復を含み、ここで、ネオ抗原をコードする核酸分子は、第１のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン逆方向反復と第２のｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン逆方向反復の間に位置する。
【０１１２】
上述の実施形態のいずれかにおいて、トランスポゾン発現構築物は、プラスミド中に存在し得るまたはプラスミド中で細胞に送達され得る。
【０１１３】
上述の実施形態のいずれかにおいて、トランスポゾン発現構築物は、ネオ抗原をコードする核酸分子を含むミニ遺伝子を含み得る。上述の実施形態のいずれかにおいて、トランスポゾン発現構築物は、各ミニ遺伝子がネオ抗原をコードする核酸分子を含む、タンデムなミニ遺伝子を含み得る。例えば、タンデムなミニ遺伝子は、２種から約２０種までのネオ抗原、または２種から約１０種までのネオ抗原、または２種から約５種までのネオ抗原をコードする核酸分子を含み得る。
【０１１４】
上述の実施形態のいずれかにおいて、トランスポゾン発現構築物は、レポーター遺伝子をさらに含み得る。ある特定の実施形態では、レポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子である。ある特定の実施形態では、トランスポゾン発現構築物は、細胞表面マーカーをコードする核酸分子をさらに含む。例えば、特定の実施形態では、細胞表面マーカーは、切断型ヒトＣＤ１９、切断型ヒトＥＧＦＲ、切断型ヒトＣＤ３４、切断型ヒトＮＧＦＲ、または任意の他の当技術分野で公知の形質導入マーカーを含む。
【０１１５】
上述の実施形態のいずれかにおいて、トランスポゾン発現構築物は、免疫原性エンハンサーをコードする核酸分子をさらに含み得、ここで、免疫原性エンハンサーは、ＩＬ−１２（例えば、膜係留型ＩＬ−１２など）、およびＧＭ−ＣＳＦ、誘導性細胞死因子、抗原（例えば、細菌フラジェリン）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【０１１６】
上述の実施形態のいずれかにおいて、トランスポザーゼ発現構築物は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする核酸分子をさらに含み得る。例えば、トランスポザーゼは、他の外因性遺伝子およびｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン逆方向反復と同じ発現構築物によりコードされるものであり得る。他の実施形態では、トランスポザーゼは、異なる発現構築物に含有される核酸分子によりコードされる。例えば、特定の実施形態では、トランスポザーゼは、異なるプラスミド中に存在する発現構築物中の核酸分子によりコードされる。
【０１１７】
別の態様では、本明細書に記載するトランスポゾン発現構築物を含む宿主細胞が提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、上述の実施形態のいずれかのトランスポゾン発現ベクターを含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードする核酸分子を含むｐｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼ酵素発現構築物をさらに含む。特定の実施形態では、第１の構築物と第２の構築物とは、異なるプラスミド中に存在する。
【０１１８】
上述の実施形態のいずれかにおいて、宿主細胞は、免疫系細胞であり得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、樹状細胞を含む。他の実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞を含む。さらなる実施形態では、宿主細胞は、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、ナイーブおよびセントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせから選択されるＴ細胞を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞またはその両方である。
【０１１９】
上述の実施形態のいずれかにおいて、宿主細胞は、ヒトＴ細胞などのヒト細胞を含み得る。
【０１２０】
上述の実施形態のいずれかにおいて、外因性ネオ抗原、外因性免疫原性エンハンサー、外因性誘導性細胞死因子、または外因性共刺激分子をコードするポリヌクレオチドをウイルスベクターによって宿主細胞に送達する。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。
【０１２１】
上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示のポリヌクレオチドを送達するために使用されるウイルスベクターは、例えば、ＩＬ−１２（例えば、膜係留型ＩＬ−１２など）、ＧＭ−ＣＳＦ、誘導性細胞死因子、抗原（例えば、細菌フラジェリン）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される免疫原性エンハンサーをコードするポリヌクレオチドを含む。上述の実施形態のいずれかにおいて、本開示のポリヌクレオチドを送達するために使用されるウイルスベクターは、ＣＤ８０、ＣＤ１３７、ＣＤ１４０Ｌ、分泌型ＩＬ−２、Ｔ細胞結合に関してＣＤ２５非依存性になるように改変されたＩＬ−２（Ｌｅｖｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、４８４巻（７３９５号）：５２９〜３３頁、２０１２年を参照されたい）、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５−ＩＬ−１５受容体アルファ複合体、ＩＦＮ−Ｂ、ＩＦＮ−Ａ１、ＩＬ−７、小分子ダイマー形成性ＲＩＰＫ３などの誘導性デススイッチ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｄｅａｔｈ  ｓｗｉｔｃｈｅ）、またはそれらの任意の組み合わせをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１２２】
上述の実施形態のいずれかにおいて、ネオ抗原をコードする宿主細胞（例えば、Ｔ細胞などのリンパ球）は、ウイルスベクターによって送達された、共刺激分子をコードする核酸分子をさらに含む。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７ＲＰ１、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ１５４、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ２ＢＰ２、ＬＩＧＨＴ、ＫＬＲＤ１、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）のアゴニスト、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）のアゴニスト、ＣＤ２７のアゴニスト、ＣＤ２８のアゴニスト、ＣＤ４０のアゴニスト、ＣＤ１２２のアゴニスト、ＧＩＴＲのアゴニスト、ＩＣＯＳのアゴニスト、またはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸分子を含む。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＣＤ８０をコードする核酸分子を含む。他の特定の実施形態では、ウイルスベクターは、ＣＤ１３７Ｌをコードする核酸分子を含む。ある特定の実施形態では、共刺激分子は、Ｔ細胞などの宿主細胞の細胞表面に局在する。
【０１２３】
方法およびキット
さらなる態様では、外因性ネオ抗原および免疫原性エンハンサー、ならびに任意選択で任意の他の活性な分子を発現する免疫細胞またはリンパ球を調製するための方法およびキットが提供される。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、外因性ネオ抗原を含む免疫細胞またはリンパ球を調製するための方法であって、リンパ球に、（ａ）ネオ抗原（例えば、特定の被験体の試料中で同定されたもの）をコードする核酸分子を含有するトランスポゾンプラスミド（例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ）、および（ｂ）トランスポザーゼ（例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ）をコードする核酸分子を含むプラスミドを導入し、それにより、外因性ネオ抗原を含むリンパ球を調製することを含む方法が提供される。
【０１２５】
さらなる実施形態では、２種またはそれよりも多くのネオ抗原またはネオ抗原をコードする核酸分子は、タンデムなミニ遺伝子内に含有される。例えば、タンデムなミニ遺伝子を使用して、同じプラスミドに含有される複数のネオ抗原を発現させることができる。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載する方法によって調製されたネオ抗原を発現する免疫細胞またはリンパ球は、処置される被験体に対して同系、同種異系、または自己のものである。特定の実施形態では、ネオ抗原を発現する免疫細胞またはリンパ球は、処置される被験体に対して自己のものである。ある特定の実施形態では、トランスポゾンプラスミド（例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ）およびトランスポザーゼ（例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ）をコードする核酸分子を含むプラスミドを、ｅｘ  ｖｉｖｏで免疫細胞またはリンパ球（例えば、Ｔ細胞）に導入する。一部の実施形態では、ネオ抗原または免疫原性エンハンサーをコードする核酸分子を、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）系を使用することによってなど、公知のゲノム編集技術を使用して免疫細胞またはリンパ球のゲノムに導入する。例えば、Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ、３３巻：１２５６頁（２０１５年）を参照されたい；Ｌｏｍｂａｒｄｏら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１１巻：１２９８頁（２００７年）およびＰＣＴ特許出願第ＵＳ／２０１６／０３１３６６号も参照されたい。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、上記の成分または本明細書に開示したトランスポゾン発現構築物を含むキットが提供される。
【０１２８】
医薬組成物および使用方法
一部の態様では、医薬組成物、免疫原性、組成物、およびワクチンが提供される。一部の実施形態では、ロバストな免疫細胞応答を誘発するまたは追加刺激するための治療ワクチンが提供される。ある特定の実施形態では、ワクチンは、外因性ネオ抗原を発現するように改変された免疫細胞を含む。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に開示の免疫細胞またはリンパ球（例えば、Ｔ細胞）と薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含む組成物を提供する。診断および治療上の使用のための薬学的に許容される担体は、薬学技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ（編集）、第１８版、１９９０年）に、およびＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ、Ｄｒｕｇ，  ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ  （Ｓ．Ｃ．Ｓｍｏｌｉｎｓｋｉ編、１９９２年）に記載されている。例示的な薬学的に許容される担体には、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、希釈剤、保存薬、色素／着色剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒、乳化剤、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。例えば、生理的ｐＨの滅菌食塩水およびリン酸緩衝食塩水は、好適な薬学的に許容される担体であり得る。保存薬、安定剤、色素または同種のものが、医薬組成物に提供されることもある。加えて、抗酸化剤および懸濁剤が使用されることもある。医薬組成物は、希釈剤、例えば水、緩衝液、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、低分子量ポリペプチド（約１０残基未満）、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、デキストリン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、グルタチオン、ならびに他の安定剤および賦形剤も、含有することがある。中性緩衝食塩水、または非特異的血清アルブミンと混合された食塩水は、例示的な希釈剤である。
【０１３０】
別の態様では、疾患または障害を処置するための方法であって、本明細書で開示した組成物を投与するステップを含む方法が提供される。ある特定の実施形態では、本開示は、疾患または障害を処置するための方法であって、本明細書で開示したリンパ球または本明細書で開示した組成物を有効量でそれを必要とするヒト被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
【０１３１】
別の態様では、ネオ抗原の発現に関連する疾患または障害を有するヒト被験体を処置するための方法であって、本明細書で開示した免疫細胞またはリンパ球または本明細書で開示した組成物を有効量でそれを必要とするヒト被験体に投与するステップを含む方法が提供される。本明細書で開示した方法のいずれかにおいて、免疫細胞またはリンパ球は、被験体に対して自己のもの、被験体に対して同系のもの、または被験体に対して同種異系のものであり得る。本明細書で開示した方法のいずれかにおいて、リンパ球は、Ｔ細胞を含む。
【０１３２】
別の態様では、疾患または障害（例えば、がん、感染）を有するヒト被験体における当該疾患または障害の再燃または再発を防止するための方法であって、本明細書で開示したネオ抗原および免疫原性エンハンサーを含有もしくは発現するＴ細胞などのリンパ球、または本明細書で開示した組成物を有効量でそれを必要とするヒト被験体に投与するステップを含む方法が提供される。上述の実施形態のいずれかにおいて、疾患または障害は、ウイルス感染、細菌感染、過剰増殖性障害、または炎症性疾患もしくは自己免疫疾患であり得る。
【０１３３】
感染性疾患としては、感染性因子と関連するものが挙げられ、以下のうちのいずれかが挙げられる：種々の細菌（例えば、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐｐ．など）、マイコバクテリア、および寄生生物（原生動物の中の任意の公知の寄生生物メンバーを含む）。感染性ウイルスとしては、真核生物ウイルス（例えば、アデノウイルス、ブンヤウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス、パピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ）、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ラブドウイルス（例えば、狂犬病）、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザ）、ポックスウイルス（例えば、ワクシニア）、レオウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ）、フラビウイルス（例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶ）などが挙げられる。ある種の実施形態において、抗原がプロセシングされ、ＨＬＡ（ＭＨＣ）クラスＩ分子とともに示されるサイトゾル病原体での感染は、本開示の融合タンパク質で処置される。
【０１３４】
腫瘍および白血病を含む、様々ながんは、本明細書で開示する組成物および方法に感受性（ａｍｅｎａｂｌｅ）である。処置することができる例示的な種類のがんは、乳房、前立腺、および結腸の腺癌；肺のすべての型の気管支原性癌：骨髄系白血病；黒色腫；肝がん；神経芽腫；乳頭腫；アプドーマ；分離腫；鰓腫；悪性カルチノイド症候群；カルチノイド心疾患；ならびに癌腫（例えば、ウォーカー、基底細胞、基底有棘細胞、ブラウン−ピアス、管、エールリッヒ腫瘍、クレブス２、メルケル細胞、粘液性、非小細胞肺、エンバク細胞、乳頭、硬性、細気管支、気管支原性、扁平上皮細胞および移行細胞）を含む。処置することができるさらなる種類のがんは、組織球性障害；悪性組織球性白血病；ホジキン病：免疫増殖性小（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｍａｌｌ）；非ホジキンリンパ腫；形質細胞腫；細網内皮症；黒色腫；軟骨芽細胞腫；軟骨腫；軟骨肉腫；線維腫；線維肉腫；巨細胞腫；組織球腫；脂肪腫；脂肪肉腫；中皮腫；粘液腫；粘液肉腫；骨腫；骨肉腫；脊索腫；頭蓋咽頭腫；未分化胚細胞腫；過誤腫；間葉腫；中腎腫；筋肉腫；エナメル上皮腫；セメント質腫；歯牙腫；奇形腫；胸腺腫；栄養膜腫瘍を含む。さらに、以下の種類のがんも処置に感受性であると考えられる：腺腫；胆管腫；コレステリン腫；円柱腫（ｃｙｃｌｉｎｄｒｏｍａ）；嚢胞腺がん；嚢胞腺腫；顆粒膜細胞腫；半陰陽性卵巣腫瘍；肝がん；汗腺腫；膵島細胞腫瘍；ライジッヒ細胞腫；乳頭腫；セルトリ細胞腫；卵胞膜細胞腫；平滑筋腫；平滑筋肉腫；筋芽細胞腫；筋腫（ｍｙｏｍｍａ）；筋肉腫；横紋筋腫；横紋筋肉腫；上衣腫；神経節神経腫；神経膠腫；髄芽腫；髄膜腫；神経鞘腫；神経芽細胞腫；神経上皮腫；神経線維腫；神経腫；傍神経節腫；非クロム親和性傍神経節腫。処置することができる種類のがんは、被角血管腫；好酸球増加随伴性血管類リンパ組織増殖症；硬化性血管腫；血管腫症；グロムス血管腫；血管内皮腫；血管腫；血管外皮細胞腫；血管肉腫；リンパ管腫；リンパ管筋腫；リンパ管肉腫；松果体腫；癌肉腫；軟骨肉腫；葉状嚢肉腫；線維肉腫；血管肉腫；平滑筋肉腫；白血肉腫（ｌｅｕｋｏｓａｒｃｏｍａ）；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；筋肉腫；粘液肉腫；卵巣癌腫；横紋筋肉腫；肉腫；新生物；神経線維腫症（ｎｅｒｏｆｉｂｒｏｍａｔｏｓｉｓ）；および子宮頸部異形成をも含む。
【０１３５】
処置に感受性である種々の過剰増殖性障害を例示すると、Ｂ細胞リンパ腫（様々な種類のホジキン病、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または中枢神経系リンパ腫など）、白血病（急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄芽球性白血病のＢ細胞芽球形質転換など）ならびに骨髄腫（多発性骨髄腫など）がある。さらなるＢ細胞がんは、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、骨外性形質細胞腫、粘膜関連（ＭＡＬＴ）リンパ組織型節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦郭（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、バーキットリンパ腫／白血病、悪性の可能性のあるＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症および移植後リンパ増殖性障害を含む。
【０１３６】
炎症性疾患および自己免疫疾患としては、以下が挙げられる：関節炎、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、多発軟骨炎、乾癬性関節炎、乾癬、皮膚炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、封入体筋炎、炎症性筋炎、中毒性表皮壊死症、全身性強皮症および硬化症、クレスト症候群、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、呼吸窮迫症候群、成人性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、脳炎、ぶどう膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー状態、湿疹、喘息、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症応答が関わる状態、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、亜急性皮膚エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス、ループス脊髄炎、ループス脳炎、若年発症糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、視神経脊髄炎、リウマチ熱、シデナム舞踏病、サイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症と関連する免疫応答、結核、類肉腫症、ウェゲナー肉芽腫症およびチャーグ・ストラウス病を含む肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎（過敏性血管炎／脈管炎、ＡＮＣＡおよびリウマトイド血管炎を含む）、再生不良性貧血、ダイアモンド・ブラックファン貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫性溶血性貧血、悪性貧血、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球遊出が関わる疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）炎症性障害、多臓器障害症候群（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、重症筋無力症、抗原−抗体複合体媒介性の疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、ランバート・イートン筋無力症症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、固形臓器移植片拒絶、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、水疱性類天疱瘡、天疱瘡、自己免疫性多内分泌腺症候群、血清反応陰性脊椎関節症、ライター病、スティフ・マン症候群、巨細胞性動脈炎、免疫複合体腎炎、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発ニューロパチーまたはＩｇＭ媒介性ニューロパチー、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、自己免疫性血小板減少症、自己免疫精巣炎および自己免疫卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症；自己免疫甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下症、アジソン病、グレーブス病、多腺性自己免疫症候群（または多腺性内分泌障害症候群）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）ともいわれるＩ型糖尿病およびシーハン症候群を含む自己免疫性内分泌疾患；自己免疫性肝炎、リンパ球性間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植）、非特異性間質性肺炎（ＮＳＩＰ）、ギラン・バレー症候群、大型血管炎（リウマチ性多発筋痛症および巨細胞性（高安）動脈炎を含む）、中型血管炎（川崎病および結節性多発動脈炎を含む）、結節性多発動脈炎（ＰＡＮ）、強直性脊椎炎、バージャー病（ＩｇＡ腎症）、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアックスプルー（グルテン性腸症）、クリオグロブリン血症、肝炎と関連するクリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、冠動脈疾患、家族性地中海熱、顕微鏡的多発血管炎、コーガン症候群、ウィスコット・オルドリッチ症候群および閉塞性血栓血管炎。
【０１３７】
特定の実施形態では、疾患または障害は、血液学的悪性疾患または固形がんから選択される過剰増殖性疾患または障害である。ある特定の実施形態では、過剰増殖性疾患または障害は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）から選択される血液学的悪性疾患である。一部の実施形態では、過剰増殖性疾患または障害は、胆管がん、膀胱がん、骨および軟部組織癌腫、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸がん、結腸直腸腺癌、結腸直腸がん、類腱腫、胚性がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、胃腺癌、多形膠芽腫、婦人科腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肝臓がん、肺がん、中皮腫；悪性黒色腫、神経芽腫；骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、膵管腺癌、原発性星状細胞腫瘍、原発性甲状腺がん、前立腺がん、腎臓がん、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚がん、軟部組織肉腫、精巣胚細胞腫瘍、尿路上皮がん、子宮肉腫および子宮がんから選択される固形がんである。ある特定の実施形態では、処置される疾患または障害は、肺がんである。ある特定の実施形態では、処置される疾患または障害は、悪性黒色腫である。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、過剰増殖性疾患または障害を処置するための方法が提供され、過剰増殖性疾患または障害は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）または多発性骨髄腫（ＭＭ）から選択される血液学的悪性疾患である。
【０１３９】
さらなる実施形態では、過剰増殖性疾患または障害を処置するための方法が提供され、過剰増殖性疾患または障害は、胆管がん、膀胱がん、骨および軟部組織癌腫、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸腺癌、結腸直腸がん、類腱腫、胚性がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、胃腺癌、多形膠芽腫、婦人科腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肝臓がん、肺がん、中皮腫；悪性黒色腫、神経芽腫；骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、膵管腺癌、原発性星状細胞腫瘍、原発性甲状腺がん、前立腺がん、腎臓がん、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚がん、軟部組織肉腫、精巣胚細胞腫瘍、尿路上皮がん、子宮肉腫および子宮がんから選択される固形がんである。
【０１４０】
上述の実施形態のいずれかにおいて、組成物は、リンパ球または宿主細胞を含み得、リンパ球または宿主細胞は、ヒト被験体に対して同系、同種異系、または自己のものである。一部の実施形態では、組成物は、リンパ球または宿主細胞を含み得、リンパ球または宿主細胞は、ヒト被験体に対して自己のものである。
【０１４１】
本開示の組成物は、医療分野の当業者によって決定される処置（または防止）すべき疾患または状態に適切な方法で投与することができる。組成物の適切な用量、好適な投与の期間および頻度は、患者の状態、サイズ、疾患の種類および重症度、有効成分の特定の形態、ならびに投与方法のような因子により決定される。ある特定の実施形態では、本開示の細胞または組成物は、最初の「刺激」用量で投与し、その後、１つまたは複数の「追加刺激」用量を、状況に適した量および頻度および持続時間で続けることができる。ある特定の実施形態では、刺激用量および追加刺激用量の一方または両方が、外因性ネオ抗原および１種または複数種の外因性免疫原性エンハンサー（例えば、ｍｔＩＬ−１２および分泌型ＧＭ−ＣＳＦ）を含むリンパ球を含む。
【０１４２】
本開示は、本明細書で開示されるとおりの融合タンパク質を発現する細胞および薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。適切な賦形剤としては、水、食塩水、デキストロース、グリセロールなどおよびこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４３】
上述の実施形態のいずれかにおいて、方法は、追加の治療剤または補助剤を投与するステップをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、ネオ抗原およびアジュバントを含む改変されたリンパ球（例えば、Ｔ細胞）またはその組成物を、追加の治療剤または補助剤と同時にまたは逐次的に投与する。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、化学療法；免疫チェックポイント分子の阻害剤；共刺激分子；免疫原性を高める分子；細胞療法；またはワクチンを含む。
【０１４５】
ある特定の実施形態において、追加の治療剤は、化学療法を含む。例示的な化学療法剤としては、以下が挙げられる：例えば、アルキル化剤（例えば、チオテパおよびシクロホスファミド）；アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパ）；エチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含む）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）；ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）；抗生物質（例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カミノマイシン（ｃａｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（ｄｅｔｏｒｕｂｉｃｉｎ）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン（ｏｌｉｖｏｍｙｃｉｎ）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン）；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）；抗副腎皮質物質（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）（例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）；葉酸補充剤（例えば、フロリン酸）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫＴＭ；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２″−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン（例えば、パクリタキセル（タキソールＴＭ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，  Ｎ．Ｊ．）およびドセタキセル（タキソテールＴＭ、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，  Ａｎｔｏｎｙ，  Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン、カペシタビン；ならびに上記のうちのいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸または誘導体。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、免疫チェックポイント分子の阻害剤を含む。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子の阻害剤は、免疫チェックポイント分子の活性または発現を遮断する作用物質を含む。一部の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ２４４／２Ｂ４、ＨＶＥＭ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＫＩＲ、ＰＶＲ１Ｇ（ＣＤ１１２Ｒ）、ＰＶＲＬ２、アデノシン、Ａ２ａＲ、免疫抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−３５）、ＩＤＯ、アルギナーゼ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ−５、Ｔｒｅｇ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。一部の実施形態では、作用物質は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の活性または発現を遮断するものである。一部の実施形態では、作用物質は、免疫チェックポイント分子の活性を遮断するものであり、作用物質は、アンタゴニスト抗体またはその結合断片、アプタマー、リボザイム、ドミナントネガティブ阻害剤、または小分子阻害剤を含む。一部の実施形態では、作用物質は、免疫チェックポイント分子の発現を遮断するものであり、作用物質は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、アンチセンス、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮである。一部の実施形態では、作用物質は、ＰＤ−１に結合する抗体を含めた、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の活性を遮断する抗体である。
【０１４７】
一部の実施形態では、追加の治療剤は、共刺激分子を含む。一部の実施形態では、共刺激分子は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７ＲＰ１、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１２２、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ１５４、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ２ＢＰ２、ＬＩＧＨＴ、ＫＬＲＤ１、またはＣＤ８３に特異的に結合するリガンドを含む。特定の実施形態では、共刺激分子は、ＣＤ８０を含む。なおさらなる実施形態では、共刺激分子は、ＣＤ１３７Ｌを含む。一部の実施形態では、追加の治療剤は、共刺激分子のアゴニストを含む。例えば、追加の治療剤は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）アゴニスト（例えば、ウレルマブなど）、ＣＤ１３４（ＯＸ−４０）アゴニスト（例えば、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ６３８３、またはＭＥＤＩ０５６２など）、レナリドマイド、ポマリドミド、ＣＤ２７アゴニスト（例えば、ＣＤＸ−１１２７など）、ＣＤ２８アゴニスト（例えば、ＴＧＮ１４１２、ＣＤ８０、またはＣＤ８６など）、ＣＤ４０アゴニスト（例えば、ＣＰ−８７０，８９３、ｒｈｕＣＤ４０Ｌ、またはＳＧＮ−４０など）、ＣＤ１２２アゴニスト（例えば、ＩＬ−２など）、ＧＩＴＲのアゴニスト（例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１６／０５４６３８号に記載されているヒト化モノクローナル抗体など）、ＩＣＯＳのアゴニスト、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、細菌フラジェリン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ヘルパー抗原、またはそれらの任意の組み合わせなどの、免疫原性を高める分子を含む。一部の実施形態では、細菌フラジェリンは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａフェーズ１フラジェリンを含む。他の実施形態では、細菌フラジェリン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ヘルパー抗原、またはそれらの任意の組み合わせをアジュバントと組み合わせる。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、操作されたＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはその両方を含む免疫細胞などの、細胞療法を含む。さらなる実施形態では、追加の治療剤は、ペプチドワクチン、ＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチン、細胞ワクチン、またはそれらの任意の組み合わせなどのワクチンを含む。なおさらなる実施形態では、ワクチンを追加の治療剤または補助剤と共に投与する。例示的な追加の治療剤または補助剤は、Ｂ−Ｒａｆ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、細胞傷害性薬剤、ミョウバンまたはアルミニウム塩、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマイヌリン、ＩＳＣＯＭ、リポソーム、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、ビロソームおよび他のウイルス様粒子、またはＡｑｕｉｌａのＱＳ−２１  ｓｔｉｍｕｌｏｎ、ＣＤ８０、ＣＤ１３７、ＣＤ１４０Ｌ、またはＩＬ−２の分泌、Ｔ細胞結合に関してＣＤ２５非依存性になるように改変されたＩＬ−２（Ｌｅｖｉｎら、２０１２年を参照されたい）、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５−ＩＬ−１５受容体アルファ複合体、ＩＦＮ−Ｂ、ＩＦＮ−Ａ１、ＩＬ−７、小分子ダイマー形成性ＲＩＰＫ３などの誘導性デススイッチ、またはそれらの任意の組み合わせで構成され得る。
【０１５０】
本開示の免疫細胞、リンパ球、Ｔ細胞、およびその組成物、ならびに細胞に基づく追加的な療法（例えば、操作されたＴＣＲまたはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む免疫細胞）の投与は、一般に、注射によって（例えば、非経口的に）実施される。「非経口的」という用語は、本明細書で使用される場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射、または注入技術を含む。他の追加の療法、またはそれらの薬学的に許容される塩の、純粋な形態でまたは適切な医薬組成物としての投与は、同様の有用性がある薬剤についての任意の投与形式を使用して行うことができる。例えば、本開示の免疫向上剤は、注射によって、あるいは本開示の化合物を適切な薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を使用して送達することができ、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、マイクロスフェア、およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体または気体の形態の調製物に製剤化することができる。そのような医薬組成物を投与する例示的な経路は、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、頬側、直腸、膣、および鼻腔内を含む。
【０１５１】
本開示の組成物は、その中に含有される活性成分が、組成物が患者に投与された際に生物学的に利用可能なものであることが可能になるように製剤化される。被験体または患者に投与される組成物は、１つまたは複数の投与単位の形態をとり、例えば、錠剤が単一の投与単位であってよく、また、エアロゾル形態の本開示の化合物の容器に複数の投与単位を保持することができる。そのような剤形を調製する実際の方法は公知であるか、または当業者には明らかになろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２２版（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、２０１２年を参照されたい）。投与される組成物は、いずれにしても、治療有効量の本開示の免疫細胞またはリンパ球を含有する。
【実施例】
【０１５２】
（実施例１）
外因性抗原を発現するＴ細胞は、抗原に対する応答をｉｎ  ｖｉｖｏで刺激および追加刺激し得る
候補ネオ抗原を発現するように遺伝子操作された自己Ｔ細胞遺伝子（「ＴＶＡＸ」）を用いたワクチン接種を調査するためのマウスモデルを開発した。このモデルは、ＴＶＡＸ作用の機構を試験するため、およびワクチン免疫を強化するための戦略を評価するために使用することができる。オボアルブミン（「ＯＶＡ」）をモデル抗原として使用した。なぜなら、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞を定量するための試薬が容易に入手可能であり、また、ＯＶＡ発現腫瘍は腫瘍根絶の免疫機構を調査するために広く使用されているからである（Ｄｒａｎｏｆｆ、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２巻：６１頁、２０１２年）。ＯＶＡを発現するように形質導入されたマウスＴ細胞が免疫原性であるかどうかを決定するために、野生型Ｂ６マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＵＳＡ）に、少数の、ＣＤ４５．１で類遺伝子的に標識したナイーブＯＶＡ特異的ＯＴ−１  ＣＤ８＋Ｔ細胞を播種し、次いで、２つの用量レベルの、全長ＯＶＡを発現する野生型Ｔ細胞（本明細書では、「ＴＯＶＡ」細胞と称される）のうちの一方、またはＧＦＰを発現する対照Ｔ細胞を用いてワクチン接種した。抗原特異的ＯＴ−１細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおける拡大を、類遺伝子性ＣＤ４５．１マーカーを用いて追跡した。
【０１５３】
わずか２００，０００個のＴＯＶＡの投与後に、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞の用量依存的な刺激、および１４日目に、第２の２００，０００個のＴＯＶＡ細胞の用量の７日後に、循環Ｔ細胞の５〜１０％までの応答の効率的な追加刺激が観察された（図２）。ＴＯＶＡモデル系は、適度の用量のＴＯＶＡでＴ細胞応答を刺激し、追加刺激させることを可能にするものであり、また、Ｔ細胞ワクチンの刺激、追加刺激、およびメモリー形成の効率を向上させるためのＴＯＶＡ細胞に対する追加の遺伝子改変の能力を探究するために使用することができる。
【０１５４】
（実施例２）
Ｔ細胞に基づくワクチンを開発するためのマウスモデル
実施例１のＴＯＶＡモデルなどのマウスモデルを、ＴＶＡＸの効果の基礎をなす機構を解明するため、Ｔ細胞に基づくワクチンレジメンを開発するため、およびＴ細胞の腫瘍関連抗原に対する免疫応答を誘発する能力を潜在的に向上させる追加の遺伝子改変を同定するために使用することができる。実施例３〜８にＴＯＶＡマウスモデルを使用した一連の実験を記載する。以下の材料および方法を使用した。
【０１５５】
マウス
全てのマウス実験を実施例１において上記の通り６週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスで実施した。一部の実験では、ワクチンを構築するためのＴ細胞ドナーを、ベータアクチンプロモーターの制御下でニワトリオボアルブミンを発現するＢ６バックグラウンドマウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から得た。オボアルブミンＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープ（本発明においてモデルネオ抗原として使用される）に特異的なＴＣＲについてトランスジェニックであるＯＴ−ＩマウスをＣＤ４５．１マウスと交配させて（どちらもＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した）、ＯＴ−ＩトランスジェニックＴＣＲについてヘテロ接合性であり、類遺伝子性ＣＤ４５．１マーカーについてホモ接合性であるマウスを作出した。
【０１５６】
ＤＮＡ構築物
ｍｔＩＬ１２構築物（Ｐａｎら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．、２０巻（５号）：９２７〜９３７頁（２０１２年））のコード配列をＰＣＲによって増幅し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒクローニングキット（ＮＥＢ）を使用してレトロウイルスベクターＭＰ７１（Ｅｎｇｅｌｓら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１４巻（１２号）：１１５５〜１１６８頁（２００３年））のＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＪＶ１を作製した。コドン最適化されたマウスＧＭ−ＣＳＦをコードする合成ＤＮＡ断片を合成し（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＭＰ７１のＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングしてｐＪＶ８を作製した。プラスミドｐＪＶ９９を、Ｎ末端において融合するマウスＣＤ１９の切断型をコードする直鎖ＤＮＡ断片をニワトリオボアルブミン由来のＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓリステリオリシンＯのＬＬＯ１９０エピトープ（ＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳ）（グリシン−セリンリンカーで連結したエピトープ）をコードする直鎖配列と融合させ、これをレトロウイルスベクターＭＰ７１のＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ部位にクローニングすることによって作製した。プラスミドｐＪＶ９４を、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓｃｈｒｉｅｂｅｒおよび共同研究者により同定された（Ｇｕｂｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、５１５巻（７５２８号）：５７７〜５８１頁（２０１４年））マウスＬａｍａ４およびＡｌｇ８遺伝子の変異したエピトープを含有する配列でｐＪＶ７２のＳＩＩＮＦＥＫＬ配列を置き換えることによって得た。上記の参考文献および供給源からのプラスミド、構築物、ベクター、およびその配列は、それらの全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５７】
Ｔ細胞の遺伝子改変
５〜１０週齢のマウスドナー由来の総Ｔ細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＣＤ８精製キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を使用して脾臓から単離し、マウスＩＬ−２を補充したマウスＴ細胞培地中、マウスＣＤ３／ＣＤ２８  ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ））を用いて刺激した。リン酸カルシウムトランスフェクションを使用してＰｌａｔ−Ｅ細胞（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）にプラスミドレトロウイルス構築物をトランスフェクトすることによってレトロウイルスを産生させ、トランスフェクションから＋２日目および＋３日目にウイルス上清を回収した。ウイルス上清を遠心分離によってレトロネクチン（ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）上に濃縮し、刺激の＋１日目および＋２日目にＴ細胞にウイルスを用いて形質導入した。抗原の形質導入を、ｍＣＤ１９発現；抗ＩＬ１２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いた膜係留型ＩＬ−１２、およびＥＬＩＳＡによるＧＭ−ＣＳＦによってモニターした。刺激の＋３日目に、細胞を、マウスＩＬ−１５を補充した培地に移動させ、刺激の＋５日目にビーズを除去し、刺激の＋６日目に細胞を凍結保存したまたはマウスに移入した。一部の実験については、ＯＶＡを構成的に発現するドナー由来のＴ細胞に、膜係留型ＩＬ−１２および／または分泌型ＧＭ−ＣＳＦを含有するウイルスを用いて同時形質導入した。他の実験については、野生型ドナー由来のＴ細胞に、膜係留型ＩＬ−１２および／もしくは分泌型ＧＭ−ＣＳＦを含有するウイルスならびに／または抗原を含有するウイルスの組み合わせを用いて形質導入した。
【０１５８】
ワクチン接種実験
ＯＴ−Ｉマウスが関与する実験では、ＥａｓｙＳｅｐキットを使用してＣＤ８＋細胞を単離し、ワクチン接種実験に関してはワクチン接種の前日にマウス当たり５００個の細胞を移入し、Ｂ１６腫瘍実験に関してはマウス当たり１００個の細胞を移入した。２×１０５個のワクチン細胞を刺激用量のために移入し、腫瘍実験ではこれを１４日ごとに反復した。追加刺激用量を、注射前にマウスＩＬ１５を含有する培地中で終夜静置した凍結保存細胞を使用して実施した。
【０１５９】
ＯＴ−Ｉ細胞を用いる実験では、赤血球溶解後に、末梢血白血球を類遺伝子マーカーＣＤ４５．１で染色した。一部の実験では、赤血球溶解後に、抗原に対する内因性Ｔ細胞応答を、ＳＩＩＮＦＥＫＬ、変異したＡｌｇ８、変異したＬａｍａ４（Ｆｒｅｄ  Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｌａｂから入手）またはＬＬＯ１９０（ＮＩＨ  Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手）に特異的なテトラマーを用いた染色によって検出した。
【０１６０】
トランスジェニックＴ細胞を用いたワクチン接種のための有効な刺激−追加刺激レジメンを決定するために、Ｂ６マウス由来のＴＯＶＡ細胞を培養物中で拡大させ、マウスに種々の刺激−追加刺激レジメンで静脈内投与した。類遺伝子マーカーを用いた標準的なアッセイを使用してＯＶＡ特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答を測定し、それらの機能を細胞内サイトカイン染色によって評価した。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を、ＣＤ４５．１で類遺伝子的に標識したＯＶＡ特異的ＯＴ−１  Ｔ細胞２００，０００個をＢ６マウスにワクチン接種前に移入することによって調べた。末梢血中の拡大したＯＴ−１細胞を毎週測定した。ＣＤ４＋応答を調べるために、ＣＤ４５．１で類遺伝子的に標識したＯＶＡ特異的ＣＤ４＋ＯＴ−ＩＩ細胞をワクチン接種前に同様に移入した。マウスの群に、異なる刺激および追加刺激のスケジュールを用いてワクチン接種した（毎週、２週間ごと、および毎月）（群当たりマウス３匹）。内因性Ｔ細胞の応答を評価するために、当該方法をＯＴ−１／ＯＴ−ＩＩ  Ｔ細胞の移入なしでも反復した。
【０１６１】
（実施例３）
免疫原性エンハンサーの発現によりＴｖａｘ免疫応答が改善される
理論により拘束されることを望むものではないが、本開示のＴＶＡＸ細胞は、例えば二次リンパ組織および腫瘍部位にネオ抗原の提示を局在化させ、そして濃縮し得る。モデルＴＡＡを提示するＴ細胞に基づくワクチンは、マウス黒色腫モデルにおけるある程度の有効性を以前示したが、この効果のためには多数の既存の抗原特異的Ｔ細胞が必要である。Ｔｖａｘ細胞をそれらの免疫原性が増大するように改変し、それによりこの必要性を克服することができるかどうかを調査した。本実験では、マウスにトランスジェニックドナーＣＤ４５．１＋／＋ＴＣＲＯＴ−１＋／−ＣＤ８＋Ｔ細胞５００個を注射した。注射後＋１日目に、マウスにＴ細胞ワクチン（ＴＯＶＡ細胞２×１０５個）を投与した。３群のＴＯＶＡ細胞は、膜係留型ＩＬ−１２、分泌型ＧＭ−ＣＳＦまたはその両方をさらに発現するものであった。次いで、＋７日目にマウスから採血し、Ｔ細胞をＣＤ４５．１について染色した。図５Ａ。この実験からのデータは図５Ｂに示されている。免疫原性エンハンサーのいずれかまたは両方を発現するＴＯＶＡ細胞を注射した動物では、非改変ＴＯＶＡを受けた動物と比べてＯＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加が示された。ｍｔＩＬ−１２と分泌型ＧＭ−ＣＳＦの同時発現により最も強力な最適化効果が生じた。これらのデータから、ｍｔＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦなどの免疫原性エンハンサー分子を発現するように改変されたＴＶＡＸ細胞はロバストな増殖およびメモリー形成を誘導することが示される。そのような細胞は、多数の既存の抗原特異的Ｔ細胞を必要とせずに治療的利益を達成するために有用であり得る。
【０１６２】
ＴＶＡＸ免疫原性を高めるための他の改変は、例えば、誘導性細胞死因子を発現させることを含む。Ｔ細胞における、例えば誘導性ＲＩＰＫ３によるネクロトーシスの誘導を使用して、ＴＶＡＸの刺激用量および追加刺激用量の免疫原性を高めることができる。ＴＶＡＸ細胞を、炎症性細胞死経路を活性化し、抗原交差提示を増大させる誘導性ＲＩＰＫ３を発現するように改変する（Ｙａｔｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３５０巻（６２５８号）：３２８〜３３４頁（２０１５年））。さらに、これを、Ｔ細胞においてＲＩＰＫ３の小分子誘導性アレルを発現するトランスジェニックマウスにおいて試験することができる。ワクチン接種および拡大を上記の通り実施して、刺激、追加刺激またはその両方の状況において誘導されるネクロトーシスによる細胞死を伴うワクチン接種に対するＯＶＡ特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋応答の拡大および持続性を測定する。
【０１６３】
膜係留型細菌フラジェリンであり得る病原性膜タンパク質などの他の免疫原性エンハンサーも本開示のＴｖａｘに使用することができる。抗原提示細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、膜係留型細菌フラジェリンによって引き起こされる抗原提示の部位への生得的な炎症性シグナルによって活性化され得る。これは、ＴＶＡＸ細胞において、レトロウイルスベクターを使用して細菌フラジェリンの膜係留型バージョンをＴＯＶＡ細胞の表面上に導入することによって試験することができる。得られたＴＶＡＸ細胞を上記の刺激および追加刺激レジメンで特徴付ける。
【０１６４】
ＴＶＡＸに対する宿主免疫原性応答を増強させるための追加の手法は、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ１３７、ＣＤ１４０Ｌ、分泌型ＩＬ−２、Ｔ細胞結合に関してＣＤ２５非依存性になるように改変されたＩＬ−２（Ｌｅｖｉｎら、２０１２年を参照されたい）、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５−ＩＬ−１５受容体アルファ複合体、ＩＦＮ−Ｂ、ＩＦＮ−Ａ１、およびＩＬ−７を含む。
【０１６５】
（実施例４）
ＴＶＡＸ細胞によるＣＤ８刺激は交差提示によって起こる
ＴＶＡＸによる刺激または追加刺激は、ＴＶＡＸによる直接提示によってまたは宿主ＤＣからの交差提示によって起こり得る。ＴＶＡＸによる直接提示が起こるかどうかを試験するために、マウスに、ＣＤ４．５＋／＋ＴＣＲＯＴ−１＋／−ＣＤ８＋Ｔ細胞５００個を注射し、次いで、クラスＩ  ＭＨＣ＋細胞またはｂ２ｍ−／−ＴＯＶＡ細胞２×１０５個を用いてワクチン接種し、採血し、ＣＤ４５．１について染色した（図６Ａ）。図６Ｂに示されている通り、ＭＨＣ  Ｉ＋細胞を注射した群とｂ２ｍ−／−ＴＯＶＡ細胞を注射した群の間で有意差は見られず、また、ＯＴ−１特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は免疫エンハンサー分子の発現で上昇した。これらのデータから、ＣＤ８刺激にＴＶＡＸによる直接提示は必要ないことが示される。
【０１６６】
（実施例５）
ＴＶＡＸは内因性ＣＤ８およびＣＤ４応答を刺激する
次に、ＴＶＡＸが内因性ＣＤ８およびＣＤ４応答を刺激し得るかどうかを問うた。ＣＤ８実験に関しては、マウスに、模擬対照、ｍｔＩＬ−１２およびＧＭ−ＣＳＦを発現するが抗原は発現しないＴ細胞、ＯＶＡのみを発現するＴ細胞、または抗原および両方の免疫原性エンハンサー分子を発現するＴ細胞を注射した。注射後＋７日目に、ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞についてのテトラマー染色を実施した。ＣＤ４実験に関しては、マウスに、模擬対照、ウイルスにより形質導入されたＣＤ４モデル抗原（ＬＬＯ１９０）を発現するが免疫原性エンハンサーは発現しないＴ細胞、または抗原およびアジュバント分子を発現するＴ細胞を注射した。＋７日目に、細胞内インターフェロン染色を実施した（図７Ａ）。図７Ｂに示されている通り、抗原と免疫原性エンハンサー分子の同時発現により、他の試験群よりも有意に高いＣＤ８テトラマー染色が示された。ＣＤ４実験においても同様の結果が見られ、抗原および免疫原性エンハンサーを同時発現するＴ細胞の注射により、はるかに高レベルの細胞内サイトカインがもたらされた（図７Ｃ）。
【０１６７】
（実施例６）
ｍｔＩＬ１２を有するＴＶＡＸは移植可能腫瘍モデルにおいて治療的に有効である
ネオ抗原を対象とした場合のＴｖａｘの効果を移植可能腫瘍モデルにおいて試験することができる。Ｂ１６Ｆ１０移植可能黒色腫モデルは、重度に変異した腫瘍である。移植可能モデルでは慢性の抗原曝露に対する寛容性の問題が十分に対処されないが、Ｂ１６モデルは免疫原性が低く、したがって、免疫療法の比較的ストリンジェントな試験であると考えられる。
【０１６８】
オボアルブミンも発現するＢ６Ｆ１０細胞（５×１０５個）を雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注射した。翌日、マウスを、ｍｔＩＬ１２を発現するＴＯＶＡ細胞２×１０５個を用いて刺激した。追加刺激注射（同じ投与量）を腫瘍注射の１５日後および２９日日後に投与した。図８Ａ。腫瘍サイズ（ｍｍ３）を腫瘍注射の１０日後、１４日後、１７日後、および２９日後に測定し、動物の生存を６０日間追跡した。図８Ｂに示されている通り、ＴＯＶＡ／ｍｔＩＬ１２細胞を受けた群では、他の試験群とは著しく対照的に、腫瘍成長のレベルが低くなった。ＴＯＶＡ／ｍｔＩＬ１２で処置した群も生存率が有意に高く、動物の５０％が４０日目に生存していたが、他の群は３０日目よりも前に５０％生存に達した（図８Ｃ）。これらのデータから、ｍｔ１２を含むＴＶＡＸが移植可能腫瘍モデルにおいて治療的に有効であることが示される。
【０１６９】
（実施例７）
ＴＶＡＸはマウスネオ抗原に対する免疫応答を誘導する
ＯＶＡなどのモデル抗原に対するＴ細胞応答は、がんに存在する抗原に対する応答よりも惹起するのが容易である。ネオ抗原特異的Ｔ細胞の効果を評価するために、ｍｔＩＬ１２＋ＧＭ−ＣＳＦ＋Ｔ細胞を形質導入して、マウス肉腫ネオ抗原Ｌａｍａ４またはＡｌｇ８（Ｇｕｂｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、５１５巻（７５２８号）：５７７〜５８１頁（２０１４年）に記載されている）、および任意選択でＣＤ４ヘルパー抗原ＬＬＯ１９０を発現させた（図９Ａ）。表示した日にマウスから採血し、抗原特異的細胞を、テトラマー陽性である、血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合として測定した。模擬ワクチン接種動物の分析からの、この実験におけるこれらのテトラマーについての検出限界は０．１％であった。群当たりＮ＝３。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。注射後１３日目にテトラマー染色を実施した。結果は図９Ｂに示されている。アジュバント分子を発現するＴ細胞により、両方のネオ抗原に対するロバストなワクチン応答が誘導され、ヘルパー抗原の追加の存在下で最高レベルのテトラマー染色（ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率として）が見られた。
【０１７０】
（実施例８）
Ｔｏｖａにより誘導される免疫応答は、ワクチン追加刺激によって高められる
ワクチンレジメンは、多くの場合、最初の刺激投与、その後、次の１回または複数回の追加刺激注射からなる。実施例７に記載の実験の後、マウスを、ＬＬＯ１９０  ＣＤ４抗原と融合したａｌｇ８およびｌａｍａ４ネオ抗原のタンデムなミニ遺伝子をコードするウイルス、ならびに膜係留型ＩＬ−１２および分泌型ＧＭ−ＣＳＦをコードする２種の追加のウイルスを用いて形質導入した同系Ｔ細胞２×１０５個の静脈内注射によって刺激した。＋２８日目に、マウスを、ネオ抗原ａｌｇ８およびｌａｍａ４をコードするウイルスをレトロウイルスにより形質導入した同系Ｔ細胞４×１０５個の静脈内注射によって追加刺激した。データは図９Ｃに示されている。表示した日にマウスから採血し、抗原特異的細胞を、テトラマー陽性である血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合として測定した。模擬ワクチン接種動物の分析からの、この実験におけるこれらのテトラマーについての検出限界は０．１％であった。群当たりＮ＝３。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。図９Ｃに示されている通り、追加刺激注射により免疫応答が有意に増大した。
【０１７１】
（実施例９）
ヒトＴ細胞における外因性遺伝子の安定な組み込みのためのトランスポゾン系
個人向けのがんワクチンを開発するためには、患者の腫瘍において予測されるネオ抗原に基づいて各患者に対する新しいワクチン構築物を作製する必要がある。結果として、Ｔ細胞遺伝子改変のための臨床グレードのレトロウイルスの作製は実施不能である。したがって、ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンを使用して、Ｔ細胞への形質導入のための非ウイルス遺伝子送達方法を開発した。抗原を発現するＴ細胞の精製および拡大が可能になるようにＰＢ系を適合させるために、改変Ｔ細胞をＣＤ１９発現に基づいて選択するために、細胞表面マーカーである切断型ヒトＣＤ１９（ｔＣＤ１９）もコードするように構築物を設計した。
【０１７２】
実行可能性を試験するための予備実験において、ｔＣＤ１９をＨＬＡ−Ａ２制限ＣＭＶ  ｐｐ６５エピトープＮＬＶをコードするミニ遺伝子に翻訳的に連結し、得られた構築物はＰＢトランスポゾン反復が隣接するものであった。Ｎａｋａｚａｗａら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３２巻（８号）：８２６〜８６９頁（２００９年））に記載されている方法に従って、ｔＣＤ１９−ＣＭＶ構築物をヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）内に電気穿孔し、細胞をＩＬ−１５の存在下でＣＤ３およびＣＤ２８を用いて刺激した。７日間培養した後、５％から３０％の間のＴ細胞がｔＣＤ１９を安定に発現し（図３Ａ）、これにより、構築物が安定に組み込まれたことが示される。ＣＭＶ抗原を発現するＴ細胞を多数得るために、改変細胞をＣＤ１９磁気選択によって濃縮し、濃縮された細胞を、治療用Ｔ細胞産物を拡大させるために使用される迅速な拡大プロトコールを使用して拡大し、その結果、１３日間にわたって１００〜５００倍に拡大した。拡大したＴ細胞の８０％よりも多くがｔＣＤ１９マーカーを発現した（図３Ｂ）。得られた細胞は、ＣＭＶ陽性ドナーから得られたＮＬＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するそれらの能力によって実証された通り、ＮＬＶペプチドをパルスしたＴ細胞のレベルと同等のレベルまでＮＬＶ抗原を効率的に提示した（図３Ｃ）。この手順を使用すると、１０ｃｃの採血から得た５×１０６個未満またはそれと等しいＰＢＭＣから２０日間で抗原を発現するＴ細胞を１０９個よりも多く得ることができ、これにより、Ｔｖａｘ細胞を調製すること、および、Ｔｖａｘを、ネオ抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発する能力について試験することに関するこの手法の実行可能性が実証される。
【０１７３】
（実施例１０）
単球由来樹状細胞へのＲＮＡ電気穿孔により、末梢血由来のメモリーＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞が効率的に拡大する
成功裏のワクチン試験には、免疫原性抗原の正確な予測およびワクチンの製造、ならびにワクチン接種の前に存在するまたはワクチンに応答して誘発された抗原特異的Ｔ細胞応答を同定および定量化するための信頼できるツールが必要である。Ｔ細胞に基づくネオ抗原ワクチンに関しては、免疫原性ネオ抗原についてスクリーニングするためにＴｖａｘ細胞を使用することができるが、クラスＩＩ抗原の直接提示についてのそれらの効率は、抗原をクラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣの両方でＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方に直接提示し、また、Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで最適に刺激するための共刺激分子を発現する樹状細胞（ＤＣ）または活性化Ｂ細胞の効率よりも低い。
【０１７４】
したがって、電気穿孔されたｍＲＮＡのＤＣによる発現を使用して免疫原性ネオ抗原についてスクリーニングした。スクリーニングに関して、候補抗原をコードするｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡを、末梢血から得た自己単球由来ＤＣにおいて発現させた。ｍＲＮＡからの細胞内発現は、ミニ遺伝子に集合させた多数の候補抗原をスクリーニングするために使用されており（Ｔｒａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４４巻：６４１頁、２０１４年）、また、これには、ＭＨＣに結合するが、プロセシングされない細胞外ペプチドに由来する実験アーチファクトが回避されるという利点がある（Ｃａｒｒｅｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４８巻：８０３頁、２０１５年）。代替として、初代Ｂ細胞を使用することができ、これらを、ＣＤ４０Ｌと共培養することにより、小さな臨床試料からであっても１００倍よりも大きく効率的に拡大させることができる（Ｌｉｅｂｉｇら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ、３２巻：ｅ１３７３頁、２００９年）。
【０１７５】
ウイルス抗原ｍＲＮＡをミニ遺伝子に集合させ、ＤＣに挿入させ、これにより、希少な抗原特異的細胞を拡大させるために潜在性抗原の大きなプールを使用することの実行可能性を例示した。発現構築物を、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ提示を向上させるために（ａ）Ｔ７プロモーター、（ｂ）ＣＭＶ  ｐｐ６５遺伝子またはＣＭＶエピトープを含有するミニ遺伝子、および（ｃ）融合タンパク質をエンドサトーシス経路へ標的化させる配列と融合することによって作製した（Ｋｒｅｉｔｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８０巻：３０９頁、２００８年）。漸減量の、構築物からｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡをＤＣ中に電気穿孔し、ＣＭＶ陽性ドナー由来のＰＢＭＣを刺激するために使用した。標的ＤＣ中の抗原をコードするｍＲＮＡをわずか０．０１ｕｇで用いた刺激の１０日後に、免疫優性ＣＭＶ  ｐｐ６５  ＣＤ８＋エピトープに応答する細胞が効率的に拡大した（図４Ａ）。同様に、わずか０．０１ｕｇの、ｐｐ６５をコードするｍＲＮＡ構築物によりＣＭＶ  ｐｐ６５  ＣＤ４＋応答が効率的に拡大した（図４Ｂ）。これらのデータから、強力な抗原に対するロバストなウイルスメモリー応答が、少なくとも、がん特異的Ｔ細胞を特徴付け得る消耗の非存在下で拡大し得ることが示される。これらのデータから、少量の、抗原エピトープをコードするＲＮＡをプールの一部として発現させることにより、そのプール内の抗原に対するメモリーＣＤ４＋およびＣＤ８＋応答が効率的に拡大され得ることが実証される。この系を使用して、バイオインフォマティクスプラットフォームによって予測される候補ネオ抗原に対するナイーブまたはメモリー応答を評価するために、黒色腫（Ｓｎｙｄｅｒら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３７１巻：２１８９頁、２０１４年）および肺がん患者（Ｒｉｚｖｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４８巻：１２４頁、２０１５年）の臨床試料中の末梢血中に見出され得る希少なネオ抗原反応性Ｔ細胞を拡大させることができる。
【０１７６】
（実施例１１）
非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および黒色腫の臨床試料からの候補ネオ抗原の同定
血液試料および腫瘍試料を非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者（４）および黒色腫患者（２）から得た。ＤＮＡを保存用の固定組織から単離し、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、その後、ペアエンド１００配列決定を使用してエキソーム捕捉を実施した。ＭｕＴｅｃｔ（Ｃｉｂｕｌｓｋｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３１巻：２１３頁、２０１３年）、ＶａｒＳｃａｎ（Ｋｏｂｏｌｄｔら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２５巻：２２８３頁、２００９年；Ｋｏｂｏｌｄｔら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２巻：５６８頁、２０１２年）、およびＳｔｒｅｌｋａ（Ｓａｕｎｄｅｒｓら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２８巻：１８１１頁、２０１２年）からのミスセンス変異の連合を、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓデータセットからの５０の同様の腫瘍のトリム平均発現を使用して、百万当たり０．５を上回る転写物の発現についてフィルタリングした（上位および下位の十分位数は除去した）。ナンセンスに媒介される減衰を受けないフレームシフト変異を、ＶａｒＳｃａｎとＳｔｒｅｌｋａの連合を使用して同定した。この手法を使用して、ナンセンスに媒介される減衰を受けなかった２６５のミスセンス変異および８のフレームシフト変異を同定した。図１０、上の概略図を参照されたい。
【０１７７】
同定された変異を、ミニ遺伝子に、潜在的なＣＤ８＋およびＣＤ４＋エピトープが包含されるようにアミノ酸配列が変異のいずれかの側面に１３の隣接するアミノ酸を含むようにコードさせた。次いで、２７の得られたアミノ酸ミニ遺伝子を２６のタンデムなミニ遺伝子分子に集合させ、それを合成し、上記の実施例３に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写構築物に並行してクローニングし、配列を確認し、ｍＲＮＡに転写した。患者において既存のネオ抗原ＣＤ８＋およびＣＤ４＋メモリーＴ細胞応答があるかどうかを決定するために、トランスフェクトされた自己ＤＣを抗原提示細胞として使用し、ｍＲＮＡを使用してＴ細胞を刺激した。例示的なデータが図１０、左下および右下のパネルに示されている。
【０１７８】
具体的には、以前に養子移入された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで拡大させた腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いた処置後に完全な腫瘍退縮を達成した黒色腫患者２名および肺がん患者１名からの腫瘍組織に対してエキソーム捕捉およびｃＤＮＡ捕捉を実施した。白血球アフェレーシス産物も３名の患者からＴＩＬ注入の前後に得、腫瘍反応性ＴＩＬ集団および単一細胞腫瘍懸濁物を得た。腫瘍試料のエキソーム配列を同定した。ＤＣトランスフェクションおよび潜在的なネオ抗原反応性Ｔ細胞の分析のために候補発現ネオ抗原をｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写産物に組み入れた。
【０１７９】
これらの実験の結果は、ワクチン構築のためにミニ遺伝子として発現させることができる候補ネオ抗原の検証において有用である。
【０１８０】
（実施例１２）
免疫原性ネオ抗原の同定および特徴付け
患者に特異的なＭＨＣアレルへのネオ抗原結合を予測するため、およびＴＶＡＸ細胞に組み入れるための候補ネオ抗原を選択するために、配列バリアントのコンピュータによる分析を使用した。試料をＮＳＣＬＣ患者４名および黒色腫患者２名から得、ゲノム分析に供した。発現した、タンパク質をコードするバリアントを実施例１１において上記の通り同定した。ＨＬＡタイピングをエキソームデータからＯｐｔｉＴｙｐｅ（Ｓｚｏｌｅｋら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、３０巻（２３号）：３３１０〜３３１６頁（２０１４年））を使用して決定し、ミスセンス変異およびフレームシフト変異を、自己ＭＨＣアレルに結合することが予測される新規ペプチドの形成についてＮｅｔＭＨＣｐａｎ（Ｔｒｏｌｌｅら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、３１巻（１３号）：２１７４〜２１８１頁（２０１５年））を使用して分析した。
【０１８１】
ＮＳＣＬＣ患者および黒色腫患者由来の臨床試料中の希少なネオ抗原反応性細胞を検出するためのアッセイを開発した。具体的には、発現したタンパク質をコードする全ての変異を、Ｔ細胞応答を伴う抗原が、本発明者らのバイオインフォマティクスワークフローで予測されていたか否かを決定するために系統的に評価した。候補ネオ抗原を実施例１１において上記の通りタンデムなミニ遺伝子に集合させた。血液からの自己Ｔ細胞を、希少なネオ抗原反応性Ｔ細胞集団を拡大させるために、候補ネオ抗原の上位のおよそ５０種を含むプールからの２０ｍｅｒペプチドを発現するようにトランスフェクトされた（ｍＲＮＡ）自己ＤＣを用いて刺激した。次いで、得られた拡大したＴ細胞を、特異的な個々のネオ抗原に対する反応性について、これらのネオ抗原を発現するｍＲＮＡを電気穿孔したまたは合成ペプチドをパルスした自己ＤＣまたはＢ細胞と共にインキュベートし、その後、インターフェロン放出を測定することによって試験した。検証実験において、肺がん患者由来の例示的なネオ抗原（ＴＥＲＦ１）を提示するＴＶＡＸにより、同じ患者由来のがん特異的Ｔ細胞が活性化された（図１１、右下）；これらのデータは、実施例１４においてさらに考察されている。ＴＩＬを同様に分析した。このアッセイプラットフォームは、ヒト試験において免疫をモニターするため、ならびに患者におけるＴ細胞応答をバイオインフォマティクスにより首尾よく予測することができるかどうかを調査するために使用することができる。
【０１８２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて自己ナイーブＴ細胞を刺激することができる、コンピュータにより予測されたネオエピトープの数を決定するための方法を開発する。がん患者では、ワクチン接種に応答し得る潜在的に免疫原性であるほんのわずかなネオ抗原が既存のメモリー応答を有する可能性がある。例えば、公開された試験において、ネオ抗原ワクチン応答の大多数（７のうち４）はワクチン接種前には検出されなかった（Ｃａｒｒｅｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４８巻（６２３６号）：８０３〜８０８頁（２０１５年））。メモリー応答を有さないにもかかわらずプロセシングされ、提示され、Ｔ細胞応答を誘発することができる抗原を同定するために、ＤＣにおいて発現する抗原を使用してナイーブＴ細胞応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて刺激するための系を使用する（Ｂｌｅａｋｌｅｙら、Ｂｌｏｏｄ、１１５巻（２３号）：４９２３〜４９３３頁（２０１０年））。簡単に述べると、この系は、自己ＤＣにおける候補エピトープをコードするｍＲＮＡのプールを発現させ、精製されたナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ＋／ＣＤ６２Ｌ＋）Ｔ細胞をＩＬ−１２およびＩＬ−１５の存在下で培養し、その後、これらのＴ細胞を自己Ｂ細胞またはＤＣにおいて発現される抗原に対してスクリーニングすることを伴う。免疫原性ネオ抗原をメモリーＴ細胞レパートリーおよびナイーブＴ細胞レパートリーの両方において系統的に評価することにより、これらの実験は、バイオインフォマティクスによるエピトープ予測、ならびにワクチンを用いて標的とするためのネオ抗原の数および選択の判断基準を合理的に決定することを可能にする。
【０１８３】
（実施例１３）
ＮＳＣＬＣを処置する方法
免疫チェックポイント分子阻害剤療法を受けているＮＳＣＬＣ患者におけるネオ抗原反応性Ｔ細胞を用いた処置の相関的縦断的研究を行う。研究用コア針生検材料をＮＳＣＬＣ患者から免疫チェックポイント遮断療法の開始前に得る。これらの患者の血液中で既存のネオ抗原特異的Ｔ細胞応答が同定できる場合には、これらの抗原特異的Ｔ細胞に関連する独特のＴ細胞受容体ベータ（ＴＣＲＢ）配列を同定する（Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＴＣＲＢの全体的な配列決定は、ＴＣＲ頻度の感度が高く、定量的な尺度であるので、この技術を使用して、免疫チェックポイント阻害療法中のこれらの患者の腫瘍および縦断的な血液試料中のネオ抗原特異的Ｔ細胞を列挙する。テトラマー試薬をＣＤ８＋抗原特異的Ｔ細胞に対して作製し、これにより、細胞表現型の縦断的分析が可能になる。次いで、肺がん免疫療法中にネオ抗原特異的Ｔ細胞の表現型および局在を観察する。腫瘍遺伝子発現および微小環境の知見と組み合わせて、これらの観察から、応答についての予測的なバイオマーカー、または処置に対する抵抗性の機構が示唆され得る。
【０１８４】
（実施例１４）
自己ＴＶＡＸによるネオ抗原特異的Ｔ細胞の活性化
この原理証明実験では、ヒト肺がん患者由来のＴ細胞を、ｐｉｇｇｙ  ｂａｃトランスポゾン系を使用して、ネオ抗原を発現するように改変し、ネオ抗原に特異的な内因性Ｔ細胞を活性化するために使用した。プラスミドｐＪＶ５３を、マウスＩｇκ鎖に由来するＥＲ標的化シグナルペプチド（配列番号１）をコードする直鎖断片と、ヒト肺がん患者において同定されたＴＥＲＦ１変異、およびＴ２Ａ  ｓｋｉｐ配列に連結されたヒトクラスＩ  ＭＨＣのＣ末端ドメイン、および切断型ヒトＣＤ１９をコードする配列を、ｐｉｇｇｙ  ｂａｃトランスポゾン配列を含有するベクターＰＢ７１３Ｂ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）にクローニングすることによって作製した。ｐｉｇｇｙ  ｂａｃトランスポザーゼを含有するプラスミドｐｂ２００ｐａ−１をＳｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得た。Ｎａｋａｚａｗａら（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３２巻（８号）：８２６頁（２００９年））の方法に従って、ＴＥＲＦ１トランスポゾンを細胞に導入した。簡単に述べると、凍結保存したヒトＰＢＭＣを、５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−１５を含有する培地中で終夜静置し、次いで、２ｂヌクレオフェクター（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、ＳＵ）を製造者の指示に従って使用し、プログラムＵ−０１４を使用して、溶液Ｖ中５ｕｇのトランスポゾンｐＪＶ５３および５ｕｇのトランスポザーゼｐｂ２００ｐａ−１プラスミドＤＮＡでヌクレオフェクトした。細胞を、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５を伴うＣＴＬ中で２４時間静置し、次いで、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５を伴うＣＴＬ中で３／２８ヒトｄｙｎａｂｅａｄｓを７日間用いて刺激した。刺激の＋７日目に、ＣＤ１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏ）を製造者の指示に従って使用し、表面マーカー切断型ＣＤ１９を使用して改変細胞を濃縮し、次いで、以前に記載されている通り迅速な拡大プロトコールによって拡大させた。迅速な拡大の＋２１日目に細胞を抗原の提示についてアッセイした。
【０１８５】
次に、凍結保存した末梢血単核細胞を解凍し、２ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−７（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を補充したＣＴＬ（１０％ヒト血清、ベータ−メルカプトエタノール、ペニシリンおよびストレプトマイシン、およびＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ））中で終夜静置した。翌朝、細胞を洗浄し、Ｔｖａｘの存在下、細胞１０６個で刺激した。＋３日目に組換えヒトＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を１０Ｕ／ｍｌの最終濃度まで添加し、＋３日目、＋６日目、および＋９日目に補充のＩＬ−２を含む半分の培地の取り換えを実施した。＋２１日目に、抗原特異的Ｔ細胞を、細胞内サイトカイン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）について製造者の指示に従い、１０ｕｇ／ｍｌの２１ｍｅｒのＴＥＲＦ１変異体ペプチドでパルスした自己Ｂ細胞を抗原提示細胞として使用して染色した。ＣＤ４＋ＩＦＮγ分泌細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ２で選別した。選別された細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−１５を補充したＣＴＬ中で５日間静置し、次いで、以前に記載された迅速な拡大プロトコールを使用して拡大させた（Ｒｉｄｄｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７巻（５０６７号）：２３８〜２４２頁（１９９３年））。この拡大の１３日目または１４日目に細胞を使用したまたは凍結保存した。凍結保存細胞を解凍し、アッセイ前に１０ｕｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２を補充したＣＴＬ中で終夜静置した。
【０１８６】
図１１（右下のパネル）に示されている通り、自己ＴＴＥＲＦ１細胞を用いたワクチン接種により、患者由来のがん特異的Ｔ細胞によるロバストなインターフェロン−γ放出がもたらされた。これらのデータから、ヒトネオ抗原を提示する自己ＴＶＡＸが患者における免疫応答を誘導し得ることが示され、これにより、治療有効性を有し、免疫原性のリスクが低下した個人向けのＴＶＡＸを効率的に開発できることが示される。
【０１８７】
（実施例１５）
がん患者由来のネオ抗原の同定および試験
血液試料および腫瘍試料を肺がん患者および黒色腫がん患者から実施例１１に記載の通り得た。公的に入手可能なアルゴリズムＭｕｔｅｃｔおよびＳｔｒｅｌｋａを使用して、全エキソーム配列決定によって候補変異を同定した。これらのアルゴリズムの両方により同定された変異をバリアントアレル頻度によってフィルタリングし、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓにおける同様の腫瘍からの発現によって、または腫瘍のＲＮＡ  ｓｅｑが利用可能な場合にはこれによって順位づけた。各患者からの上位の約４６変異をスクリーニングのために選択した。
【０１８８】
所与の患者由来のＰＢＭＣを、ＩＬ−７中で終夜静置し、混合物（患者試料当たり約４６の候補変異を包含する約９２ペプチド、配列番号１５〜５１２に対応する）中の１ｕｇ／ｍｌの各候補（粗製）ペプチドを用いて刺激し、ＩＬ−２を＋３日目に添加した。自己Ｂ細胞を、ＣＤ１９（Ｍｉｌｌｔｅｎｙｉ）を標的とする免疫磁気ビーズを使用して単離し、ＣＤ４０Ｌを発現するＮＩＨ  ３Ｔ３細胞と１：１の比で、２００Ｕ／ｍｌのヒトＩＬ−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を補充したＴｒａｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４４巻（６１８４号）：６４１〜６４５頁（２０１４年））に記載されているＢ細胞培地中、７日間インキュベートした。その後、Ｂ細胞を回収し、４日ごとに３Ｔ３  ｃｄ４０Ｌを用いて再刺激した。刺激２または３の＋３日目にＢ細胞をアッセイにおいて抗原提示細胞として使用した。＋１４日目に、細胞を、個々の変異を表すペプチドの対を１０ｕｇ／ｍｌで用いて再刺激し、反応性をＥｌｉｓｐｏｔによって読み取った。
【０１８９】
患者５名の最初のスクリーニングからの例示的なデータが図１２Ａ、１２Ｃ、および１３Ａ〜１３Ｃに示されている。患者Ｘ１９８（黒色腫）およびＭＡ５１１（肺がん）に関しては、変異体ペプチド（または野生型対応物）を含有する、８０％純粋な２７−ｍｅｒのペプチドをＥｌｉｓｐｏｔアッセイにおいて使用して、Ｔ細胞応答が精製されたペプチドに対するものであり、変異体に特異的であることを確認した。それぞれ図１２Ｂおよび１２Ｄ。これは、患者Ｘ１９８において同定された７つの変異および患者ＭＡ５１１において同定された３つの変異に関してそうであった。
【０１９０】
本明細書において言及するおよび／または出願データシートに列挙する、米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公表文献のすべては、それら全体が参照により本明細書に組み入れられる。上記の様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を得ることができる。様々な特許、出願および公表文献の概念を利用するために必要に応じて実施形態の態様を変更して、またさらなる実施形態を得ることができる。上記の詳細な説明に照らして、これらおよび他の変更を実施形態に加えることができる。
【０１９１】
一般に、下記の特許請求の範囲において使用する用語は、本明細書および本特許請求の範囲において開示する特定の実施形態に本特許請求の範囲を限定すると解釈すべきでなく、そのような特許請求の範囲を伴う均等物の全範囲とともにすべての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、本特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
2019514393.tif 000004
【図２】
2019514393.tif 000005
【図３】
2019514393.tif 000006
【図４】
2019514393.tif 000007
【図５Ａ】
2019514393.tif 000008
【図５Ｂ】
2019514393.tif 000009
【図６Ａ】
2019514393.tif 000010
【図６Ｂ】
2019514393.tif 000011
【図７Ａ】
2019514393.tif 000012
【図７Ｂ】
2019514393.tif 000013
【図７Ｃ】
2019514393.tif 000014
【図８Ａ】
2019514393.tif 000015
【図８Ｂ】
2019514393.tif 000016
【図８Ｃ】
2019514393.tif 000017
【図９Ａ】
2019514393.tif 000018
【図９Ｂ】
2019514393.tif 000019
【図９Ｃ】
2019514393.tif 000020
【図１０】
2019514393.tif 000021
【図１１】
2019514393.tif 000022
【図１２Ａ】
2019514393.tif 000023
【図１２Ｂ】
2019514393.tif 000024
【図１２Ｃ】
2019514393.tif 000025
【図１２Ｄ】
2019514393.tif 000026
【図１３Ａ】
2019514393.tif 000027
【図１３Ｂ】
2019514393.tif 000028
【図１３Ｃ】
2019514393.tif 000029
【配列表】
2019514393000001.app
【国際調査報告】
2019514393.tif 000030
2019514393.tif 000031
2019514393.tif 000032
2019514393.tif 000033
2019514393.tif 000034
2019514393.tif 000035
2019514393.tif 000036