(57)【要約】炭化水素で汚染された水のバイオレメディエーション方法であって、汚染された水を少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）と接触させることと、汚染された水に存在しそして炭化水素を代謝することができる微生物が好気的条件下で炭化水素を発生および分解することを可能にすることを含む、方法。ＰＨＡは、好ましくは粒子の形態で、特に粉末または微小顆粒の形態で汚染された水中に分散される。驚くべきことに、ＰＨＡは他の物質を添加することなく、炭化水素を代謝することができる微生物の代謝活性を単独で刺激することができ、余分な非生分解性材料を環境に導入することなく、比較的短時間で環境汚染を大幅に減らすことが見出された。バイオレメディエーション活性のさらなる増加は、微生物のための少なくとも１種の栄養素および／または炭化水素を代謝することができる少なくとも１種の微生物をＰＨＡに添加することによって得ることができる。
2019534692.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭化水素で汚染された水のバイオレメディエーション方法であって、
汚染された水を少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）と接触させることと、
汚染された水に存在しそして炭化水素を代謝することができる微生物が好気的条件下で炭化水素を発生および分解することを可能にすることを含む、方法。
【請求項２】
前記ＰＨＡは、粒子の形態で、特に粉末または微小顆粒の形態で、汚染された水中に分散される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子は、平均粒径が０．１μｍから１０００μｍ、好ましくは１μｍから５００μｍの範囲である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＨＡは、微生物の発生を促進するのに適した少なくとも１種の栄養物質をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＨＡは、炭化水素を代謝することができる少なくとも１種の微生物をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＨＡは、ポリ−３−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ−３−ヒドロキシバレレート（ＰＨＶ）、ポリ−３−ヒドロキシヘキサノエート（ＰＨＨ）、ポリ−３−ヒドロキシオクタノエート（ＰＨＯ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシエキサノエート）（ＰＨＢＨ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート）、ポリ（３−ヒドロキシオクタノエート−ｃｏ−３−ヒドロキシウンデセン−１０−エノエート）（ＰＨＯＵ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート−ｃｏ−４−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶＶ）、またはそれらの混合物、から選択される、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種の栄養物質は、ＰＨＡ１グラム当たり０．０１ｇ〜２ｇ、好ましくは０．０５〜１ｇの範囲の量で前記ＰＨＡに含まれる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１種の栄養物質は、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）、リン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、塩化第一鉄四水和物（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、尿素（ＣＨ４Ｎ２Ｏ）、またはそれらの混合物から選択される、請求項４または７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１種の栄養物質は、汚染された水１リットル当たり０．０１〜１００ｇ、好ましくは０．５〜５０ｇの範囲の濃度を得るような量でバイオレメディエーションされるべき水に添加される、請求項４、７、および８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
炭化水素を代謝することができる前記微生物は、１グラムのＰＨＡ当たり１０３〜１０１０、好ましくは１グラムのＰＨＡ当たり１０５〜１０８の範囲で、不可欠な細胞単位（コロニー形成単位、ＵＣＦ）の濃度を得るような量でＰＨＡに含まれる、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＨＡは少なくとも１種の界面活性剤をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１種の界面活性剤は、ＰＨＡ１グラム当たり０．０１ｇから２ｇ、好ましくは０．０５ｇから１ｇの範囲の量でＰＨＡ中に存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＨＡは、汚染された水１リットル当たり０．０１〜１０００ｇ、好ましくは０．５〜２００ｇの範囲の濃度を得るような量でバイオレメディエーションされるべき水に添加される、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生分解性ポリマーをベースとする組成物の使用を含む、炭化水素で汚染された水のバイオレメディエーション方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの微生物、特に細菌は、様々な種類の化学物質、特に石油起源の炭化水素物質の流出のために水域に存在する可能性がある多数の汚染物質を代謝することができることが知られている。これらの微生物は、水と二酸化炭素が得られるまで酸化型の代謝過程を通してこれらの物質を分解する。バイオレメディエーションとして知られている汚染された水の浄化のためのプロセスはこの自然な効果に基づいている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、バイオレメディエーションは、主に、環境内に存在する微生物の量が少なすぎるため、許容できる時間内に、または修復されるべき場所の環境条件下で分解を引き起こすことがあり、細菌増殖には最適ではないため、全く効果がない場合がある。
【０００４】
したがって、場合によっては、有機および／または無機の形で、栄養補給による生分解能力を有する天然の微生物群集の成長速度の刺激技術を適用することを含む、いわゆる修復すべき部位の生物刺激を行うことが効果的である。
【０００５】
海洋環境では、バクテリアの成長は一般に、窒素やリン化合物で通常表される低濃度の栄養素によって制限される。海洋生態系は、実際には生物的および非生物的理由で、一般的にこれらの物質を欠いており、原油（植物プランクトンも含む）を劣化させない微生物側に強い「摂取（uptake）」を受ける可能性がある。
【０００６】
炭化水素を分解することができる細菌の自生集団の成長を支えるために、バイオレメディエーションプロセスで最も広く採用されている技術の１つは、栄養源としての肥料、例えば可溶性窒素ベースの肥料、徐放性肥料（ＳＦＲ）または親油性肥料の使用である。無機塩（例えば、ＫＮＯ３、ＮａＮＯ３、ＮＨ４ＮＯ３、Ｋ２ＨＰＯ４、ＭｇＮＨ４ＰＯ４）および市販の無機肥料などの水溶性栄養素の導入によって、栄養素の別の供給を提供することができる。
【０００７】
他の栄養素（例えば、親油性栄養素）と比較すると、水溶性栄養素は微生物代謝に利用しやすい。しかしながら、それらの溶解性のために、それらは波と潮の作用によってより容易に希釈されそして分散されるという主な欠点を有する。
【０００８】
バイオレメディエーションプロセスを強化するために、いわゆるバイオオーグメンテーションを行うことも効果的であり得、これは、汚染物質の分解を加速または活性化するために、固有の個体群を統合するように、修復されるシステムに、特定の異化の性能を有する高密度の細菌集団（単一の細菌または微生物集団）を追加することからなる。いくつかの研究によれば、バイオオーグメンテーションは、本質的な分解の可能性がほとんどまたは全くない堆積物中の多環式芳香族炭化水素（ＩＰＡ）の修復に非常に有効であることが証明されており、一方、他の研究では、この手法では自然減衰の可能性があるものを大幅には改善しないことが実証されている。
【０００９】
バイオオーグメンテーションの適用において見られる問題は、環境中に導入された生物の生存および活性を保証することである。さらに、バイオオーギュメンテーションは、様々な要因によって阻害される可能性があり、その中には、高い酸化還元電位および毒性汚染物質を有する生成物の存在およびｐＨ、汚染物質の濃度およびバイオアベイラビリティ、あるいは特定の基質の欠如がある。ただし、この手法の成功を検討するための重要な要素は、明確に、菌株および／または細菌コンソーシアムの選択であり、検討対象の環境に存在するコミュニティの種類を考慮に入れなければならない。
【００１０】
バイオオーグメンテーション戦略は、とりわけ、適切な異化経路を有する特殊化された細菌が汚染された環境に存在しないかもしれないという、人類起源の汚染物質の修復において上記の全てに効果的であることを証明することができる。自然の生物分解プロセスの制限要因が、固有の微生物群集における特定の異化遺伝子の欠如である場合、修復戦略としてのバイオオーグメンテーションの選択は重要になる。遺伝情報のこの欠如は、それゆえ導入された株によって完成するであろう。
【００１１】
炭化水素を分解することができる、環境中に存在する微生物に関して、これらは通常、炭化水素分解細菌または油を食べる細菌（ＢＩＣ）として知られる細菌である。単一の細菌種は、限られた数の油性化合物しか分解できないが、一方、さまざまな細菌種から構成されるコンソーシアム（異なる酵素的特徴を持つ）は、代謝同位体を発達させる可能性があり、それは、最大でＣＯ２およびＨ２Ｏの生成までの炭化水素の完全な鉱化作用をもたらす可能性がある。油性炭化水素を分解する能力は少数の微生物に制限されておらず：３０種類以上の海洋細菌が同定され、異なる（亜）門（α−、β−、γ−プロテオバクテリア；グラム陽性菌；フレキシバクター−サイトファガ−バクテロイデス）に分布している。（単離頻度に基づく）最も重要な種類の中で、以下のものを挙げることができる：シュードモナス、アクロモバクター、ノカルディア、ミクロコッカス、ビブリオ、アシネトバクター、ブレビバクター、フラボバクテリウム。
【００１２】
これらの従属栄養細菌に加えて（すなわち、炭化水素源に加えて代替の炭素源を使用することができる）、貧栄養条件下での遅い成長を特徴とする、炭化水素を唯一の炭素源として含む様々な培養方法とそれに続く分類学的および生理学的分析によって、新たな一連の炭化水素分解性海洋細菌が単離され、唯一の炭素とエネルギーの供給源でもっぱら石油系炭化水素を使用するのに適格性があることが証明されている。
【００１３】
１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子配列の分析は、これらのＢＩＣがγ−プロテオバクテリアの群に属するマリノモナス・バガ、オセアノスピリラム・リナムおよびハロモナス・エロンガーテートと相関することがしばしば証明されることを明らかにする。
【００１４】
それらの代謝特性に関して、これらは脂肪族炭化水素を分解するものと芳香族炭化水素を分解するものの２つのグループに細分することができる。アルカニボラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）（北海から分離）、アルカニボラックス（Alcanivorax）種−ＳＴ１（日本海）、マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス（Marinobacter hydrocarbonoclasticus）（地中海）、マリノバクター（Marinobacter）種ＣＡＢ（地中海）は直鎖または分岐鎖の脂肪族鎖を分解し、一方、サイクロクラスティクス・オリゴトロフス（Cycloclasticus oligotrophus）、Ｃ．プゲッティ（C. pugetii）、およびサイクロセルペンス・ブルトネンシス（Psychroserpens burtonensis）は、唯一の炭素源としてのトルエン、ナフタレン、フェナントレンおよびアントラセンなどの芳香族炭化水素を使用している。
【００１５】
ＢＩＣは、環境中に存在する通常の独立栄養性および従属栄養性微生物叢には比較的使用が困難な脂肪族および芳香族炭化水素を消費することが好ましいためグローバルな炭素循環に関与する従属栄養細菌の中で独特の栄養ニッチを占める。これらの細菌は異常な生理学的特徴を有するので、それらはまた、少数のｒＲＮＡオペロン（１または２）、少数の細胞質タンパク質（３００以下）および小さいゲノム（３〜４Ｍｂｐ）も有する。さらに、膜タンパク質の数は、大腸菌またはシュードモナスなどの他の従属栄養細菌よりも１．５〜２倍少なく、これはおそらく、細胞がいくつかの基質しか使用できないという事実によって説明することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本出願人は、プロセスを複雑で高価なものにし、環境の観点からのリスクがないわけではない、処理後に除去しなければならない非生分解性材料を供給することなく、炭化水素を代謝することができる好気性微生物の開発に何らかの形で有利となり得る物質の供給を通じてバイオレメディエーションプロセスの有効性を高めるという問題を考慮した。
【００１７】
この問題および以下により詳細に説明される他の問題は、炭化水素で汚染された水を、本出願人が、他の物質を添加することなく、単独で、炭化水素を代謝することができる好気性微生物の代謝活性を単独で刺激することが驚くほど可能であると検証した、高度に生分解性のあるポリマー材料であるポリ−ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）と接触させることによって解決された。これらの微生物が好気的条件下で炭化水素に作用することを可能にすることによって、環境中に余分な非生分解性材料を導入することなく、環境汚染の有意な減少が比較的短時間で得られる。
【００１８】
さらに、本出願人は、ＰＨＡが、炭化水素流出が存在する生態学的地位におけるそれらの永続性を保証するように、前記物質および／または微生物に対する支持体として作用するという事実のおかげで、バイオレメディエーション活性のさらなる増加が、少なくとも１種の微生物用の栄養物質および／または少なくとも１種の炭化水素を代謝することができる微生物をＰＨＡに添加することによって得られることを見出した。
【００１９】
第１の態様によれば、本発明は、よって、炭化水素で汚染された水のバイオレメディエーション方法に関し、方法は、
汚染された水を少なくとも１種のポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）と接触させることと、
汚染された水に存在しそして炭化水素を代謝することができる微生物が好気的条件下で炭化水素を発生および分解することを可能にすることを含む。
【００２０】
前記ＰＨＡは、粒子の形態で、特に粉末または微小顆粒の形態で、汚染された水中に分散されることが好ましい。
【００２１】
前記ＰＨＡは、微生物の発生を促進するのに適した少なくとも１種の栄養物質をさらに含むことが好ましい。
【００２２】
前記ＰＨＡはまた、炭化水素を代謝することができる少なくとも１種の微生物を含むことが好ましい。このような代謝能力は全体的、すなわち炭化水素の完全な分解を伴うもの、または部分的なものであり得る。
【００２３】
本発明の解釈理論に拘束されることを意図せずに、ＰＨＡが驚くべきことに単独で、他の物質を添加することなく、炭化水素を代謝することができる微生物の代謝活性を刺激することができるという事実は、有機基質の発酵プロセスを通じて産生され、したがって一般に微生物、特に炭化水素分解細菌および／または食用細菌（ＢＩＣ）に類似しているＰＨＡ自体の高度に生分解性の性質に起因し得る。
【００２４】
さらに、細菌および／またはその栄養物質の支持体としてのＰＨＡの使用は、特に炭化水素の流出が起こった生態学的ニッチにおいてバイオレメディエーション効果を延長することを可能にする。ＰＨＡは実際には炭化水素と高い親和性を有する水に不溶性の生分解性材料であり、その結果汚染物質と接触して局在化し、微生物および／または栄養物質が、例えば、海（沿岸および／または遠海）、湖または河川などの水域に存在する波および流れの動きにより、それらの機能を発揮できずに環境中に急速に分散することを回避する。
【００２５】
ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、自然環境から単離された微生物によって、または、不利な増殖条件下および過剰な炭素源の存在下で、炭素およびエネルギーの蓄えとして働き、そして様々な種類の細菌によって蓄積される遺伝子組み換え微生物によっても製造されるポリマーである。ＰＨＡは、例えば、バチルス、ロドコッカス、ロドスピリラム、シュードモナス、アルカリゲネス、アゾトバクター、リゾビウムのような９０種類以上のグラム陽性およびグラム陰性細菌内に含まれる約３００の異なる微生物種によって合成および蓄積される。細胞内では、ＰＨＡは微小顆粒の形で貯蔵されており、細胞あたりの大きさと数は細菌の種類によって異なる。
【００２６】
一般に、ＰＨＡは式：
−Ｏ−ＣＨＲ１−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−      （Ｉ）
を有する反復単位を含有するポリマーである。
ここで、Ｒ１は、場合によりハロゲン（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ）、−ＣＮ、−ＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＲ、−ＣＯＯＲ（Ｒ＝Ｃ１−Ｃ４アルキル、ベンジル）から選択される少なくとも１つの基で置換された、−Ｈ、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｃ４−Ｃ１６シクロアルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルケニルから選択される。ｎは０または１〜６の整数であり、好ましくは１または２である。
【００２７】
好ましくは、Ｒ１はメチルまたはエチルであり、そしてｎは１または２である。ＰＨＡはホモポリマーまたはコポリマーまたはターポリマーのいずれかであり得る。コポリマーまたはターポリマーの場合、これらは、ヒドロキシアルカノエートと共重合することができるコモノマー、例えばラクトンまたはラクタムから誘導される少なくとも１種の反復単位と組み合わせて、式（Ｉ）を有する異なる繰り返し単位、または式（Ｉ）を有する少なくとも１種の繰り返し単位からなることができる。後者の場合、式（Ｉ）を有する繰り返し単位は、繰り返し単位の総モル数に対して少なくとも１０モル％に等しい量で存在する。
【００２８】
式（Ｉ）を有する特に好ましい繰り返し単位は、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシウンデカ−１０−エノエート、４−ヒドロキシバレレートから誘導されるものである。
【００２９】
ＰＨＡは、モノマー単位を形成する炭素原子の数に関して、３つの群に分類することができ、ＰＨＡｓｃｌ（短鎖長）は、３〜５個の炭素原子を有するモノマー単位から構成され、ＰＨＡｍｃｌ（中鎖長）は、６〜１５個の炭素原子を有するモノマー単位から構成され、一方、ＰＨＡｌｃｌ（長鎖長）は、１５個を超える炭素原子を有するモノマー単位から構成される。ＰＨＡｓｃｌは高度の結晶化度を有するのに対して、ＰＨＡｍｃｌおよびＰＨＡｌｃｌは低い結晶化度を有しそして低い融点を有するエラストマーである。
【００３０】
特に好ましいＰＨＡは：ポリ−３−ヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリ−３−ヒドロキシバレレート（ＰＨＶ）、ポリ−３−ヒドロキシヘキサノエート（ＰＨＨ）、ポリ−３−ヒドロキシオクタノエート（ＰＨＯ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシエキサノエート）（ＰＨＢＨ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−４−ヒドロキシブチレート）、ポリ（３−ヒドロキシオクタノエート−ｃｏ−３−ヒドロキシウンデセン−１０−エノエート）（ＰＨＯＵ）、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート−ｃｏ−４−ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶＶ）、またはそれらの混合物である。
【００３１】
ＰＨＡは、好ましくは５，０００から１，５００，０００Ｄａ、より好ましくは１００，０００から１，０００，０００Ｄａの範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を有する。重量平均分子量は、公知の技術に従って、特にＧＰＣ（ゲル浸透クロマトグラフィー）分析によって測定することができる。
【００３２】
ＰＨＡの生産に関する限り、これは、ＰＨＡを生産することができる微生物株による有機基質（例えば、炭水化物またはグリセロールなどの他の発酵性基質）の微生物発酵、およびその後の細胞塊からのＰＨＡの回収によって得られることが好ましい。さらなる詳細については、例えば特許出願ＷＯ９９／２３１４６、ＷＯ２０１１／０４５６２５およびＷＯ２０１５／０１５３１５を参照されたい。発酵によるＰＨＡの製造に適した基質は、特に野菜、例えばジュース、糖蜜、テンサイ加工からのパルプ、サトウキビの加工から得ることができる。これらの基質は一般に、スクロースおよび他の炭水化物に加えて、有機成長因子、窒素、リンおよび／または細胞成長のための栄養素として有用な他のミネラルを含む。代替物は、バイオディーゼルの生産の副産物であるため、低コストの有機炭素源であるグリセロールからなる（例えば、特許ＵＳ８９５６８３５Ｂ２参照）。
【００３３】
本発明の実施のために、ＰＨＡは、環境との交換表面、したがってバイオレメディエーション効果を増大させるために、粒子の形態で有利に使用される。粒子は、好ましくは０．１μｍ〜１，０００μｍ、より好ましくは１μｍ〜５００μｍの範囲の平均サイズを有する。これらの寸法は、動的光散乱（ＤＬＳ）技術（標準ＩＳＯ１３３２０−２００９を参照）として知られている、レーザー検出器を吊り下げた粒子サイズ検出システムなどの当技術分野で周知の技術に従って測定することができる。代替として、デジタル分析によって処理される電子顕微鏡画像を使用することができる（ＳＥＭ）。
【００３４】
あるいは、ＰＨＡは、他の形態、例えば環境との交換表面を増大させ、水に分散した炭化水素との浮遊または接触を促進する形態を有する要素、例えば有孔パネル、中空タイルなどで使用することができる。これらの要素は、プラスチック材料の加工および成形に関して周知の成形、押出しまたは他の方法によって得ることができる。
【００３５】
炭化水素を代謝する能力がある微生物がＰＨＡに含まれる場合、これらは、好ましくは１グラムのＰＨＡ当たり１０３〜１０１０、より好ましくは１グラムのＰＨＡ当たり１０５〜１０８の必須細胞単位（ユニット形成コロニー、（ＵＦＣ））の濃度を得るような量でポリマー中に含まれ得る。
【００３６】
炭化水素を代謝することができる微生物には多くの種類があり、それらは一般に細菌であるが真菌または酵母でもある。それらは、水中に自然に溶存する酸素によって保証される好気的条件下でのＰＨＡの存在によって刺激される。
【００３７】
具体的には、好気性細菌は次のように分類できる：
（ａ）水および二酸化炭素が得られるまで炭化水素を完全に代謝することができる油食性細菌（ＢＩＣ）、
（ｂ）水および二酸化炭素の形成に達することなく、より小さい分子を有する炭化水素のみを分解することができる炭化水素分解細菌。
【００３８】
油食性細菌は、例えば、以下の種に属することができる：
アルカニボラックス（Alcanivorax）
サイクロクラスティカス（Cycloclasticus）
オレイフィラス（Oleiphilus）
オレイスピラ（Oleispira）
タラソリトゥス（Thalassolituus）。
【００３９】
炭化水素分解細菌は、例えば、以下の種に属することができる：
アシネトバクター（Acinetobacter）（ガンマプロテオバクテリア）
エロモナス（Aeromonas）（ガンマプロテオバクテリア）
アルカリゲネス（Alcaligenes）（ベータプロテオバクテリア）
アルテロモナス（Alteromonas）（ガンマプロテオバクテリア）
アルスロバクター（Arthrobacter）（高ＧＣグループ）
バチルス（Bacillus）（ファーミキューテス）
フラボバクテリウム（Flavobacterium）（ＣＦＢグループ）
ゲオルグフューシャ（Georgfuchsia）（ベータプロテオバクテリア）
ハロモナス（Halomonas）（ガンマプロテオバクテリア）
イディオマリーナ（Idiomarina）（ガンマプロテオバクテリア）
クレブシエラ（Klebsiella）（ガンマプロテオバクテリア）
ラブレンジア（Labrenzia）（アルファプロテオバクテリア）
マリノバクター（Marinobacter）（ガンマプロテオバクテリア）
マリモナス（Marinomonas）（ガンマプロテオバクテリア）
マリティミバクター（Maritimibacter）（アルファプロテオバクテリア）
メチロファガ（Methylophaga）（ガンマプロテオバクテリア）
ムリカウダ（Muricauda）（ＣＦＢグループバクテリア）
ネプチューノモナス（Neptunomonas）（ガンマプロテオバクテリア）
ノボスフィンゴビウム（Novosphingobium）（アルファプロテオバクテリア）
ノカルジア（Nocardia）（高ＧＣ群）
オレイバクター（Oleibacter）（ガンマプロテオバクテリア）
パラコッカス（Paracoccus）（アルファプロテオバクテリア）
ペラジバクター（Pelagibacter）（アルファプロテオバクテリア）
ポーチコッカス（Porticoccus）（ガンマプロテオバクテリア）
シュードアルテロモナス（Pseudoalteromona）（ガンマプロテオバクテリア）
シュードモナス（Pseudomonas）（ガンマプロテオバクテリア）
サイクロセルペン（Psycroserpens）（ガンマプロテオバクテリア）
レインヘイメラ（Rheinheimera）（ガンマプロテオバクテリア）
ロドバクター（Rhodobacter）（アルファプロテオバクテリア）
ロドコッカス（Rhodococcus）（高ＧＣ群）
ロゼオバクター（Roseobacter）（アルファプロテオバクテリア）
ロゼオバリウス（Roseovarius）（アルファプロテオバクテリア）
サルシナ（Sarcina）（ファーミキューテス）
シュワネラ（Shewanella）（ガンマプロテオバクテリア）
スフィンゴモナス（Sphingomonas）（アルファプロテオバクテリア）
スルフィトバクター（Sulfitobacter）（アルファプロテオバクテリア）
タラソスピラ（Thalassospira）（アルファプロテオバクテリア）
ビブリオ（Vibrio）（ガンマプロテオバクテリア）。
【００４０】
炭化水素を代謝的に攻撃および分解するための特に好ましい微生物は以下の通りである：
アルカニボラックス種（Alcaniviorax spp）（グラム陰性、無芽胞性）
バチルス種（Bacillus spp）（グラム陽性、無芽胞性）
マリノバクター種（Marinobacter spp）（グラム陰性、無芽胞性）
ネプチューノモナス種（Neptunomonax spp）（グラム陰性、無芽胞性）
シュードモナス種（Pseudomonas spp）（グラム陰性、無芽胞性）
ロドコッカス種（Rhodococcus spp）（グラム陽性、無芽胞性）。
【００４１】
微生物は、広範囲の異なる環境条件内で炭化水素の分解効率を増大させるために、単一の株として、または好ましくは異なる株の混合物（コンソーシアム）として使用することができる。
【００４２】
あるいは炭化水素を代謝することができる微生物と組み合わせて、栄養物質がＰＨＡに含まれる場合、これらは、ＰＨＡ１グラム当たり、通常０．０１ｇ〜２ｇ、より好ましくは０．０５ｇ〜１ｇの範囲の量で導入される。
【００４３】
目的に適した栄養物質は、有機または無機の幅広い製品：ホウ酸（Ｈ３ＢＯ３）、クエン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７）、フマル酸、酢酸アンモニウム（ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４）、酢酸ナトリウム（ＣＨ３ＣＯＯＮａ）、酢酸カリウム（ＣＨ３ＣＯＯＫ）、重炭酸アンモニウム（ＮＨ４ＨＣＯ３）、臭化アンモニウム（ＮＨ４Ｂｒ）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、炭酸ナトリウム（Ｎａ２ＣＯ３）、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）、塩素酸アンモニウム（ＮＨ４ＣｌＯ３）、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、塩化カドミウム（ＣｄＣｌ２）塩化第一鉄（ＦｅＣｌ２）、塩化第二鉄（ＦｅＣｌ３）、塩化第一鉄四水和物（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物（ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、塩化マグネシウム六水和物（ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）、塩化銅（ＩＩ）二水和物（ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ）、塩化ストロンチウム（ＳｒＣｌ２）、塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）、二クロム酸カリウム（Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）、リン酸二水素アンモニウム（ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４）、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、フッ化アンモニウム（ＮＨ４Ｆ）、フッ化カルシウム（ＣａＦ２）、フッ化ナトリウム（ＮａＦ）、リン酸アンモニウム（ＮＨ４）３ＰＯ４、リン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）、リン酸ナトリウム（Ｎａ３ＰＯ４）、リン酸第二鉄（ＦｅＰＯ４）、リン酸第一鉄［Ｆｅ３（ＰＯ４）２］、水素化リン酸ナトリウムアンモニウム（（ＮＨ４・ＮａＨＰＯ４・４Ｈ２Ｏ）、リン酸水素アンモニウムおよびリン酸水素ナトリウム［ＮａＮＨ４ＨＰＯ４・４Ｈ２Ｏ］、リン酸水素二アンモニウム［（ＮＨ４）２ＨＰＯ４］、リン酸水素マグネシウム（ＭｇＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ）、リン酸水素カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）、リン酸水素ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、ヨウ化アンモニウム（ＮＨ４Ｉ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、硝酸アルミニウム［Ａｌ（ＮＯ３）３］、硝酸アンモニウム（ＮＨ３ＮＯ３）、硝酸カルシウム（［Ｃａ（ＮＯ３）２］、硝酸鉛［Ｐｂ（ＮＯ３）２］、硝酸カリウム（ＫＮＯ３）、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）、硝酸ストロンチウム［Ｓｒ（ＮＯ３）２］、硝酸タリウム（ＴｌＮＯ３）硝酸亜鉛［Ｚｎ（ＮＯ３）２］亜硝酸アンモニウム（ＮＨ４ＮＯ２）、亜硝酸カリウム（ＫＮＯ２）、亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）、シュウ酸ジアンモニウム［（ＮＨ４）２Ｃ２Ｏ４］、酸化鉄（Ｆｅ２Ｏ３）、過塩素酸アンモニウム（ＮＨ４ＣｌＯ４）、過マンガン酸カリウム（ＫＭｎＯ４）、ペルオキシ二硫酸アンモニウム［（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ８］、硫酸アンモニウム［（ＮＨ４）２ＳＯ４］、硫酸カリウムクロム１２水和物［ＣｒＫ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏ］、硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）、硫酸第二鉄［Ｆｅ２（ＳＯ４）３］、硫酸第一鉄（ＦｅＳＯ４）、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）、硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）、亜硫酸アンモニウム［（ＮＨ４）２ＳＯ３］、亜硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ３）、硫化アンモニウム［（ＮＨ４）２Ｓ］、硫化カリウム（Ｋ２Ｓ）、硫化第二鉄（Ｆｅ２Ｓ３）、硫化第一鉄（ＦｅＳ）、硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）、尿素（ＣＨ４Ｎ２Ｏ）、またはそれらの混合物、の中から選択することができる。
【００４４】
栄養物質は、微生物の増殖を促進するのにより適した組成物を得るために、明らかに個々に含まれるか、または好ましくは互いに混合されることができる。
【００４５】
栄養物質の中で、以下は炭化水素を代謝的に攻撃することができる微生物の増殖を促進するために特に好ましい：
塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）、リン酸カリウム（Ｋ３ＰＯ４）、リン酸二水素カリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、塩化第一鉄四水和物（ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ）、尿素（ＣＨ４Ｎ２Ｏ）、またはそれらの混合物。
【００４６】
バイオレメディエーションされる水に添加される栄養物質の量は、汚染された水または土壌１リットル当たり、好ましくは０．０１ｇから１００ｇ、より好ましくは０．５ｇから５０ｇの範囲の濃度を得るようなものである。
【００４７】
ＰＨＡは好ましくは少なくとも１つの界面活性剤も含む。界面活性剤の添加は、微小液滴の形での炭化水素の分散を促進すること、従って改良された表面／体積比のおかげで微生物の攻撃を促進することの主な目的を有する。界面活性剤は、広範囲の製品の中で、特に環境の観点から最も安全な製品から選択することができ、それらは微生物の増殖を促進することができる。これらのうち、糖脂質（特にラムノリピド、ソフォロリピド、トレロリピド）、リポタンパク質およびリポペプチド、脂肪酸、おそらくエトキシル化リン脂質が特に好ましい。
【００４８】
前記少なくとも１つの界面活性剤は、好ましくは、ＰＨＡ１グラム当たり、一般に０．０１ｇ〜２ｇ、より好ましくは０．０５ｇ〜１ｇの範囲の量で組成物中に存在する。
【００４９】
バイオレメディエーションされる水に添加される界面活性剤の量は、汚染された水または土壌１リットル当たり、好ましくは０．０１ｇから１００ｇ、より好ましくは０．５ｇから５０ｇの範囲の濃度が得られるような量である。
【００５０】
本発明による組成物の製造は、公知の技術に従って、例えばバッチ式または連続式で操作される密閉または開放混合機によって、特別な注意を払うことなく行うことができ、使用される材料の部分的な劣化さえ引き起こさない限り、提供されるプロセス温度が使用される。特に、栄養物質がＰＨＡに基づく組成物中に含まれる場合、プロセス温度は１２０℃以下の値に保たれ、一方、微生物がＰＨＡに取り込まれる場合、より高い温度では微生物自体の活力が著しく低下する可能性があるので、プロセス温度は６０℃以下が好ましい。
【００５１】
本発明に従う組成物の製造のために、それを沈殿させそして乾燥する必要なしに、それ自体を生産する細菌発酵方法から直接得られるＰＨＡの水性懸濁液を使用することが有利である。製造方法から直接得られる水性懸濁液は、ＰＨＡの均質性、分散性および粒径に関して最適な特性を有する。発酵プロセスから得られるＰＨＡの水性懸濁液は、いずれの場合も、発酵ブロス中に存在する残留物および物質を除去するために、好ましくは予め精製および白色化工程に供される。
【００５２】
汚染された水に加えられそして分散されるべきＰＨＡの量に関する限り、これは処理されるべき汚染の種類および実体に関して主に予め決定され、そしてそれ故広い範囲内で変化し得る。バイオレメディエーションされるべき水に添加されるＰＨＡの量は、一般に、汚染された水１リットル当たり、好ましくは０．０１ｇから１，０００ｇ、より好ましくは０．５ｇから２００ｇの範囲の濃度を得るような量である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、総細菌存在量（ＤＡＰＩ数）の測定結果を示すグラフである。
【図２】図２は、初期量（重量％）に対する残留炭化水素の量の測定を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
以下の実施形態は、本発明の純粋に例示を目的として提供されており、添付の特許請求の範囲によって定義される保護範囲を限定するものと見なされるべきではない。
【００５５】
実施例１
水中のポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）の懸濁液は、テンサイ糖蜜上での細菌発酵によってポリマーが生産された培養ブロスの精製プロセスから直接集められた。ＰＨＢの重量平均分子量（ＧＰＣにより測定）は約９５０ｋＤａであった。懸濁液は懸濁液１リットル当たり１９０ｇのＰＨＢを含有していた。
【００５６】
ＰＨＡ懸濁液を２３０℃の温度で噴霧乾燥することによって乾燥工程に供した。
【００５７】
最終生成物は、見掛け密度が０．３５÷０．４５ｋｇ／Ｌ、平均粒径が２０〜３０μｍのＰＨＢの粉末であった。含水率は１％未満であった。製品は、袋詰めおよび直接使用の準備ができていた。
実施例２
【００５８】
水中のポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）の懸濁液は、テンサイ糖蜜上での細菌発酵によってポリマーが生産された培養ブロスの精製プロセスから直接集められた。ＰＨＢの重量平均分子量（ＧＰＣにより測定）は約８００ｋＤａであった。懸濁液は、懸濁液１リットル当たり１２０ｇのＰＨＢを含有していた。
【００５９】
このようにして構成された無機塩の水溶液からなる栄養物質の混合物をＰＨＡ懸濁液に添加した：
塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）８０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）８ｇ／Ｌ、硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ３）２０ｇ／Ｌ。
【００６０】
上記混合物を含有するＰＨＡ懸濁液を２２０℃の温度で噴霧乾燥することにより乾燥工程にかけた。
【００６１】
最終生成物は、見かけ密度が０．２５÷０．３５ｋｇ／Ｌ、平均粒径が２０〜３０μｍのＰＨＢと無機塩を含む粉末であった。含水率は１％未満であった。 製品は、袋詰めおよび直接使用の準備ができていた。
実施例３
【００６２】
約５００ｋＤａの重量平均分子量（ＧＰＣにより測定）を有する、粉末形態のポリマーから出発して、水中のポリ−（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシバレレート−ｃｏ−４−ヒドロキシベールレート（ＰＨＢＶＶ））の懸濁液を調製した。懸濁液は懸濁液１リットル当たり９０ｇのＰＨＢＶＶを含有していた。
【００６３】
アルカニボラクス（Alcanivorax）種、マリノバクター（Marinobacter）種、スフィンゴモナス（Sphingongomonas）種、ロドコッカス（Rhodococcus）種、バチルス（Bacillus）種からなる細菌の混合物をＰＨＢＶＶ懸濁液に加えた。胞子、栄養型および／または静止型の様々な細菌種を、懸濁液中に存在する１グラムのＰＨＢＶＶあたり約１０６細胞体の濃度で挿入した。
【００６４】
上記混合物を含むＰＨＢＶＶの懸濁液を直交濾過法にかけ、３５％の水分を有するケーキを得た。このようにして得られたケーキを、６０℃の温度で床乾燥機を使用して乾燥工程にかけた。
【００６５】
このようにして得られた、ＰＨＢＶＶおよび細菌混合物を含有する生成物は、見掛け密度０．５５÷０．６５ｋｇ／Ｌの粉末形態であった。含水率は０．８％未満であった。製品は包装およびその後の直接使用の準備ができていた。
実施例４
【００６６】
バイオレメディエーションプロセスにおける実施例１および２に従って調製された材料の有効性を検証するために、以下に記載されるようにある量の油が添加されたある量の海水に対してマイクロスケール実験が行われた。
【００６７】
以下の生成物を７８ｃｍ×３３ｃｍ×４２ｃｍの寸法を有するタンクに導入した（総容量は１０８Ｌに等しい）：
ａ）沿岸海水９０リットル；おそらく存在する後生動物、粒子状物質および／または破片の除去を促進するために、水をタンクに導入する前に、３００μｍに等しい多孔度を有するフィルターで濾過した：
ｂ）４５ｍＬのオイルＤａｎｓｋ  Ｂｌｅｎｄ  Ｃｒｕｄｅ  Ｏｉｌ（重力ＡＰＩ：３３．５０）。
【００６８】
タンクの内容物を、５Ｌ／ｈｒに等しい再循環で内部ポンプによって動かし続け、これにより非乱流撹拌を維持することができた。このシステムには、継続的な交換を保証し、海洋環境に存在する条件をシミュレートするために、「オーバーフロー」システムと連続的な海水チャージ（１Ｌ／ｈｒ）も含まれた。
ＰＨＢ単独での治療（オイル（ＯＩＬ）−ＰＨＡ）
【００６９】
油を導入した後、実施例１に従って製造した５１ｇのＰＨＢをタンク中に分散させた。粉末は、油汚れと一致してかつその上に均質に表面上に分布していた。ＰＨＢ粉末は油に付着する顕著な傾向を示し、塊を形成し、それは部分的に沈殿する傾向があった。しかしながら、再循環システムは、ＰＨＢの塊を懸濁状態に保つことを可能にした。
【００７０】
代表的なサンプルを一定の時間間隔で収集し、そして以下のパラメーターを測定した：
−総細菌存在量（ＤＡＰＩ数）の測定：直接細胞数は、ＡＰＡＴおよびＩＲＳＡ−ＣＮＲの刊行物に記載されている標準的な方法に従って、特定の蛍光色素で着色した後に落射蛍光顕微鏡で実施し「水の分析方法」29/2003、第9040章（1149-1153ページ）、値は、試料１ｍＬあたりの細胞数の対数として表され、
−イオン化フレームガスクロマトグラフィー（ＧＣ−ＦＩＤ）によって測定された、初期量（重量％）に対する残留炭化水素の量の測定。
【００７１】
結果は図１および２のグラフに示されている。図１はまた、海水それ自体に存在する微生物存在量（ＮＳＷ、天然海水）の値も示す。
【００７２】
これらのグラフに見られるように、実験の時間ゼロに関して、４日目から開始して、おそらくＰＨＢの存在に起因して、天然微生物集団の定量値（存在量）の増加が観察された。同時に、炭化水素分解細菌フローラの代謝活性に起因する生分解プロセスの開始と相関して、炭化水素の量の有意な減少が観察された。この活性は、実験期間の終わり（３０日）まで継続し、そのとき総減少は約６０％に等しいと判明したが、劣化ピーク（約６５％）は実験の２０日目に観察された（図２）。
【００７３】
ＰＨＢと栄養物質（オイル−ＰＨＡ−ＭＩＸ１）による治療。
実施例１と同様にＰＨＢ単独の代わりに、１００ｇの量で加えられた実施例２に従って調製された栄養物質およびＰＨＢからなる組成物を使用して、上記と同じ操作手順に従って実験を行った。
【００７４】
結果は図１および図２に示されており、これらの図では、オイル−ＰＨＡの場合と実質的に同様のＤＡＰＩ数および炭化水素の減少の傾向が観察され、わずかに改善された値を有する（炭化水素削減量は１４日後にはすでに約７０％に相当する）。
【００７５】
比較の目的で、ＰＨＢおよび／または栄養物質を添加せずに、すなわちタンクにオイル（ＯＩＬ）のみを注ぎ、同じ実験を行った。結果は図１および２にも示されており、そこから、ＰＨＢまたはＰＨＢおよび栄養物質の添加による炭化水素の減少に関する改善が明らかである。
【図１】
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【図２】
2019534692.tif 000004
【国際調査報告】
2019534692.tif 000005
2019534692.tif 000006
2019534692.tif 000007