(57)【要約】  本開示は、抗化学忌避剤と組み合わせて融合タンパク質を用いた、疾患（例えば、癌）の免疫治療に関する。特に、融合タンパク質は、抗原結合ドメイン（例えば、抗体または抗体フラグメント）およびストレスタンパク質ドメインを含む。【選択図】  図１
2019534249.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする患者において癌を治療する方法であって、
前記癌は、化学忌避特性を発現し、
前記方法は、前記患者に、
ａ）有効量の融合タンパク質を投与するステップ、その融合タンパク質は、癌細胞結合構成要素およびストレスタンパク質構成要素を含み、ここで、前記癌細胞結合構成要素は、前記癌細胞に結合して、前記ストレスタンパク質構成要素は、樹状細胞を活性化して、癌抗原を標的化するＣＤ３陽性Ｔ細胞の発生をもたらす；および
ｂ）前記患者に、有効量の抗化学忌避剤を同時に投与するステップ；
を含み、
ここで、前記融合タンパク質および前記抗化学忌避剤の組み合わせは、前記癌を治療する、
方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、
前記抗化学忌避剤は、ＡＭＤ３１００またはその誘導体、ＡＭＤ１１０７０、ＡＭＤ１２１１８、ＡＭＤ１１８１４、ＡＭＤ１３０７３、ＦＡＭＤ３４６５、Ｃ１３１、ＢＫＴ１４０、ＣＴＣＥ−９９０８、ＫＲＨ−２７３１、ＴＣ１４０１２、ＫＲＨ−３９５５、ＢＭＳ−９３６５６４／ＭＤＸ−１３３８、ＬＹ２５１０９２４、ＧＳＫ８１２３９７、ＫＲＨ−１６３６、Ｔ−２０、Ｔ−２２、Ｔ−１４０、ＴＥ−１４０１１、Ｔ−１４０１２、ＴＮ１４００３、ＴＡＫ−７７９、ＡＫ６０２、ＳＣＨ−３５１１２５、タンニン酸、ＮＳＣ  ６５１０１６、サリドマイド、ＧＦ  １０９２３０Ｘ、化学忌避ケモカインの二量体化と干渉する抗体、および、化学忌避ケモカインに関する受容体の二量体化と干渉する抗体からなる群より選択される、
方法。
【請求項３】
請求項２の方法であって、
前記抗化学忌避剤は、ＡＭＤ３１００である、
方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一項の方法であって、
前記ストレスタンパク質は、ＨＳＰ７０またはその免疫活性化フラグメントおよび／または改変配列である、
方法。
【請求項５】
請求項４の方法であって、
前記のＨＳＰ７０またはその免疫活性化フラグメントおよび／または改変配列は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来である、
方法。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項の方法であって、
前記癌細胞結合構成要素は、単鎖抗体、可変ドメイン、または、Ｆａｂドメインである、
方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項の方法であって、
前記融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列と少なくとも８５％の配列相同性を有するペプチドを含む、
方法。
【請求項８】
請求項７の方法であって、
前記融合タンパク質は、配列番号２のペプチド配列を含む、
方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項の方法であって、
前記抗化学忌避剤および前記融合タンパク質は、共投与される、
方法。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれか一項の方法であって、
前記抗化学忌避剤は、前記融合タンパク質の投与の前に投与される、
方法。
【請求項１１】
請求項１から８のいずれか一項の方法であって、
前記抗化学忌避剤は、前記融合タンパク質の投与の後に投与される、
方法。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項の方法であって、
前記癌細胞結合構成要素は、メソテリン、アルファフェトプロテイン、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２Ｎｅｕ、ＥＴＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＭＡ、前立腺特異的抗原、ＨＰＶ１７Ｅ７、突然変異体ｐ５３、ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ、ｒａｓ、ＭＡＧＥ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＷＴ１、ＰＲ１、葉酸結合タンパク質、ＣＡ−１９−９、ＦＡＰ、Ｇ２５０、およびＡ３３からなる群より選択されるタンパク質に特異的である、
方法。
【請求項１３】
請求項１２の方法であって、前記抗体は、メソテリンに特異的である、
方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法であって、
前記癌は、中皮腫、乳癌、頭頚部癌、白血球癌、肝臓癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、骨癌、脳腫瘍、白血病癌、肺癌、結腸癌、肛門癌、ＣＮＳ癌、メラノーマ癌、腎癌、子宮頸癌、食道癌、精巣癌、脾臓癌、腎臓癌、リンパ性癌、膵癌、胃癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、胃腸癌、または甲状腺癌を含む、
方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項の方法であって、
前記癌は、メソテリンを発現する、
方法。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項の方法であって、
前記融合タンパク質は、注入を介して投与される、
方法。
【請求項１７】
請求項１６の方法であって、
前記融合タンパク質は、腫瘍内に直接注入される、
方法。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項の方法であって、
前記抗化学忌避剤は、注入を介して投与される、
方法。
【請求項１９】
融合タンパク質および抗化学忌避剤を含む医薬組成物であって、
前記融合タンパク質は、癌細胞結合構成要素およびストレスタンパク質構成要素を含む、
医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１９の組成物であって、
抗原提示細胞をさらに含む、
組成物。
【請求項２１】
請求項２０の組成物であって、
前記抗原提示細胞は、樹状細胞である、
組成物。
【請求項２２】
請求項１９から２１のいずれか一項の組成物であって、
前記抗化学忌避剤は、ＡＭＤ３１００またはその誘導体、ＡＭＤ１１０７０、ＡＭＤ１２１１８、ＡＭＤ１１８１４、ＡＭＤ１３０７３、ＦＡＭＤ３４６５、Ｃ１３１、ＢＫＴ１４０、ＣＴＣＥ−９９０８、ＫＲＨ−２７３１、ＴＣ１４０１２、ＫＲＨ−３９５５、ＢＭＳ−９３６５６４／ＭＤＸ−１３３８、ＬＹ２５１０９２４、ＧＳＫ８１２３９７、ＫＲＨ−１６３６、Ｔ−２０、Ｔ−２２、Ｔ−１４０、ＴＥ−１４０１１、Ｔ−１４０１２、ＴＮ１４００３、ＴＡＫ−７７９、ＡＫ６０２、ＳＣＨ−３５１１２５、タンニン酸、ＮＳＣ  ６５１０１６、サリドマイド、ＧＦ  １０９２３０Ｘ、化学忌避ケモカインの二量体化と干渉する抗体、および、化学忌避ケモカインに関する受容体の二量体化と干渉する抗体からなる群より選択される、
組成物。
【請求項２３】
請求項２２の組成物であって、
前記抗化学忌避剤は、ＡＭＤ３１００である、
組成物。
【請求項２４】
請求項１９から２３のいずれか一項の組成物であって、
前記ストレスタンパク質は、ＨＳＰ７０またはその免疫活性化フラグメントおよび／または改変配列である、
組成物。
【請求項２５】
請求項２４の組成物であって、
前記のＨＳＰ７０またはその免疫活性化フラグメントおよび／または改変配列は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来である、
組成物。
【請求項２６】
請求項１９から２５のいずれか一項の組成物であって、
前記癌細胞結合構成要素は、単鎖抗体、可変ドメイン、または、Ｆａｂドメインである、
組成物。
【請求項２７】
請求項１９から２６のいずれか一項の組成物であって、
前記癌細胞結合構成要素は、メソテリン、アルファフェトプロテイン、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２Ｎｅｕ、ＥＴＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＭＡ、前立腺特異的抗原、ＨＰＶ１７Ｅ７、突然変異体ｐ５３、ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ、ｒａｓ、ＭＡＧＥ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＷＴ１、ＰＲ１、葉酸結合タンパク質、ＣＡ−１９−９、ＦＡＰ、Ｇ２５０、およびＡ３３からなる群より選択されるタンパク質に特異的である、
組成物。
【請求項２８】
請求項２７の組成物であって、
前記抗体は、メソテリンに特異的である、
組成物。
【請求項２９】
請求項２８の組成物であって、
前記融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列と少なくとも８５％の配列相同性を有するペプチドを含む、
組成物。
【請求項３０】
請求項２９の組成物であって、
前記融合タンパク質は、配列番号２のペプチド配列を含む、
組成物。
【請求項３１】
請求項１９から３０のいずれか一項の組成物であって、
注入のために製剤化される、
組成物。
【請求項３２】
請求項１９から３１のいずれか一項の組成物であって、
薬学的に許容できる賦形剤をさらに含む、
組成物。
【請求項３３】
患者における癌の治療のためのパーツのキットであって、
前記キットは、治療的に有効量の抗化学忌避剤、および、癌細胞結合構成要素およびストレスタンパク質構成要素を含む融合タンパク質を含み、
前記癌細胞結合構成要素は、前記癌によって発現される抗原を認識する、
パーツのキット。
【請求項３４】
請求項３３のパーツのキットであって、
前記抗化学忌避剤は、ＡＭＤ３１００またはその誘導体、ＡＭＤ１１０７０、ＡＭＤ１２１１８、ＡＭＤ１１８１４、ＡＭＤ１３０７３、ＦＡＭＤ３４６５、Ｃ１３１、ＢＫＴ１４０、ＣＴＣＥ−９９０８、ＫＲＨ−２７３１、ＴＣ１４０１２、ＫＲＨ−３９５５、ＢＭＳ−９３６５６４／ＭＤＸ−１３３８、ＬＹ２５１０９２４、ＧＳＫ８１２３９７、ＫＲＨ−１６３６、Ｔ−２０、Ｔ−２２、Ｔ−１４０、ＴＥ−１４０１１、Ｔ−１４０１２、ＴＮ１４００３、ＴＡＫ−７７９、ＡＫ６０２、ＳＣＨ−３５１１２５、タンニン酸、ＮＳＣ  ６５１０１６、サリドマイド、ＧＦ  １０９２３０Ｘ、化学忌避ケモカインの二量体化と干渉する抗体、および、化学忌避ケモカインに関する受容体の二量体化と干渉する抗体からなる群より選択される、
パーツのキット。
【請求項３５】
請求項３３のパーツのキットであって、
前記抗化学忌避剤は、ＡＭＤ３１００である、
パーツのキット。
【請求項３６】
請求項３３から３５のいずれか一項のパーツのキットであって、
前記ストレスタンパク質は、ＨＳＰ７０またはその免疫活性化フラグメントおよび／または改変配列である、
パーツのキット。
【請求項３７】
請求項３６のパーツのキットであって、
前記のＨＳＰ７０またはその免疫活性化フラグメントおよび／または改変配列は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来である、
パーツのキット。
【請求項３８】
請求項３３から３７のいずれか一項のパーツのキットであって、
前記癌細胞結合構成要素は、単鎖抗体、可変ドメイン、または、Ｆａｂドメインである、
パーツのキット。
【請求項３９】
請求項３３から３８のいずれか一項のパーツのキットであって、
前記融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列と少なくとも８５％の配列相同性を有するペプチドを含む、
パーツのキット。
【請求項４０】
請求項３９のパーツのキットであって、
前記融合タンパク質は、配列番号２のペプチド配列を含む、
パーツのキット。
【請求項４１】
請求項３３から４０のいずれか一項のパーツのキットであって、
前記融合タンパク質および／または前記抗化学忌避剤は、注入のために製剤化される、
パーツのキット。
【請求項４２】
請求項３３から４１のいずれか一項のパーツのキットであって、
前記融合タンパク質および前記抗化学忌避剤は、同一の製剤内である、
パーツのキット。
【請求項４３】
請求項３３から４２のいずれか一項のパーツのキットであって、
前記癌を治療するための指示書をさらに含む、
パーツのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［優先権の陳述］
本出願は、２０１６年９月９日に出願された米国仮出願番号６２／３８５，８７７の利益を主張し、その内容全体は本明細書中に参照により援用される。
【０００２】
［政府支援の陳述］
本発明は、政府支援によってなされた。米国政府は、本発明における特定の権限を有する。
【０００３】
［本発明の分野］
本開示は、抗化学忌避剤と組み合わせて融合タンパク質を用いた、疾患（例えば、癌）の免疫治療に関する。特に、融合タンパク質は、抗原結合ドメイン（例えば、抗体または抗体フラグメント）およびストレスタンパク質ドメインを含む。
【背景技術】
【０００４】
免疫療法は、癌ならびに他の疾患のための有望な治療である。免疫療法は、患者における免疫応答を誘導、亢進、増強、または抑制することによって疾患を治療する。
【０００５】
免疫療法の一態様は、疾患と関係がある抗原に対する患者の自身の免疫応答を増大しようとする。例えば、米国特許番号８，１４３，３８７および７，９４３，１３３は、Ｔ細胞が介在する免疫応答を誘発するのに効果的な、ストレスタンパク質に融合した抗体部分を有する融合タンパク質を記載する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
癌および他の疾患に対する患者の免疫応答を高めるための改善された免疫療法に関する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、抗化学忌避（すなわち、抗−ｆｕｇｅｔａｃｔｉｃ）剤と組み合わせた、融合タンパク質を用いた癌の免疫治療に関する。特に、融合タンパク質は、抗原結合ドメイン（例えば、抗体または抗体フラグメント）およびストレスタンパク質ドメインを含む。
【０００８】
ストレスタンパク質は、抗原を抗原提示細胞に提示してＴ細胞応答を引き起こすのに非常に効率的である。それらは、このパスウェイによる細胞が介在する免疫性および体液性免疫応答を誘発するのに特に効果的である。
【０００９】
融合タンパク質は、高い親和性で抗原に結合して、非常に免疫原性であり、ＭＨＣクラスＩプライミングを示し、Ｔ細胞応答を引き起こし、Ｅ．ｃｏｌｉのような非哺乳類系において生産されることが可能である。したがって、融合タンパク質は、癌を含む多くの疾患の予防または治療のための高免疫原性ワクチンとしての使用に適切である。融合タンパク質の非限定的な例は、米国特許番号８，１４３，３８７および７，９４３，１３３およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２１９１１に見ることができ、それぞれ、その全体で参照により本明細書中に援用される。
【００１０】
一部の腫瘍細胞は、腫瘍部位から免疫細胞を追い払うのに十分な濃度のケモカインを分泌し、したがって、腫瘍の周りに「ｆｕｇｅｔａｃｔｉｃ壁」または「化学忌避壁」を作る。化学忌避壁は、腫瘍を標的化および根絶する免疫系の能力を減少させる。例えば、高レベルのＣＸＣＬ１２またはインターロイキン８（ＩＬ−８）を発現している腫瘍から、腫瘍抗原に特異的なＴ細胞などを反発させることは、腫瘍細胞が免疫制御を回避するのを可能にさせる。抗化学忌避剤は、腫瘍細胞の化学忌避活性を阻害して、患者の免疫系が腫瘍を標的化するのを可能にさせる。抗化学忌避剤および抗化学忌避剤の全身性送達は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許出願公開番号２００８／０３００１６５を参照、その全体で参照により本明細書中に援用される）。
【００１１】
理論によって拘束されずに、融合タンパク質の抗原結合ドメインは、標的（例えば、癌細胞）に結合して、ストレスタンパク質ドメインは、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）の成熟を誘導して、標的に対するＴ細胞応答をもたらすと考えられる。組み合わせて、抗化学忌避剤は、免疫細胞が「化学忌避壁」を通って標的に近づくことが可能なように、未熟な抗原提示細胞および／またはＴ細胞に関して標的の化学忌避活性を阻害する。一部の実施態様では、組み合わせは、相加または相乗効果をもたらす。
【００１２】
一実施態様では、本発明は、患者における癌を治療する方法に関し、ここで、癌は、化学忌避特性を発現し、当該方法は、患者に、ａ）有効量の融合タンパク質を投与するステップ（そのタンパク質は、癌細胞結合構成要素およびストレスタンパク質構成要素を含み、ここで、癌細胞結合構成要素は、癌細胞に結合して、ストレスタンパク質構成要素は、樹状細胞を活性化して、標的腫瘍抗原を標的化するＣＤ３陽性Ｔ細胞の発生をもたらす）；およびｂ）患者に、有効量の抗化学忌避剤を同時に投与するステップを含み；ここで、融合タンパク質および抗化学忌避剤の組み合わせは、癌を治療する。
【００１３】
抗化学忌避剤は、制限されずに、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７の発現を阻害する分子（例えば、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡ分子）、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７に結合してそれらの機能を阻害する分子（例えば、抗体またはアプタマー）、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７の二量体化を阻害する分子、および、ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７の拮抗薬を含んでよい。一実施態様では、ＣＸＣＬ１２シグナル伝達の阻害剤は、ＣＸＣＲ４拮抗薬である。一実施態様では、抗化学忌避剤は、ＡＭＤ３１００またはその誘導体、ＡＭＤ１１０７０（ＡＭＤ０７０とも呼ばれる）、ＡＭＤ１２１１８、ＡＭＤ１１８１４、ＡＭＤ１３０７３、ＦＡＭＤ３４６５、Ｃ１３１、ＢＫＴ１４０、ＣＴＣＥ−９９０８、ＫＲＨ−２７３１、ＴＣ１４０１２、ＫＲＨ−３９５５、ＢＭＳ−９３６５６４／ＭＤＸ−１３３８、ＬＹ２５１０９２４、ＧＳＫ８１２３９７、ＫＲＨ−１６３６、Ｔ−２０、Ｔ−２２、Ｔ−１４０、ＴＥ−１４０１１、Ｔ−１４０１２、ＴＮ１４００３、ＴＡＫ−７７９、ＡＫ６０２、ＳＣＨ−３５１１２５、タンニン酸、ＮＳＣ  ６５１０１６、サリドマイド、ＧＦ  １０９２３０Ｘ、化学忌避ケモカイン、例えばＣＸＣＬ１２の二量体化と干渉する抗体、または化学忌避ケモカインに関する受容体、例えばＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７の二量体化と干渉する抗体である。一実施態様では、抗化学忌避剤は、ＡＭＤ３１００（１，１’−［１，４−フェニレンビス（メチレン）］ビス［１，４，８、１１−テトラアザシクロテトラデカン］；プレリキサフォル）である。ＡＭＤ３１００は、米国特許番号５，５８３，１３１に記載されて、その全体で参照により本明細書中に援用される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、ＣＸＣＲ７拮抗薬である。ＣＸＣＲ７拮抗薬は、制限されないが、ＣＣＸ７７１、ＣＣＸ７５４、または、ＣＸＣＲ７の二量体化と干渉する抗体であってよい。特定の実施態様では、抗化学忌避剤は、抗体ではない。特定の実施態様では、抗化学忌避剤は、ヘパリン類似物質ではない。特定の実施態様では、抗化学忌避剤は、ペプチドではない。
【００１４】
一実施態様では、抗化学忌避剤および融合タンパク質は、共投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、融合タンパク質の投与の前に投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、融合タンパク質の投与の後に投与される。
【００１５】
一態様では、ストレスタンパク質構成要素は、ヒートショックタンパク質またはそのフラグメントおよび／または改変配列を含む。一実施態様では、ヒートショックタンパク質は、ＨＳＰ７０またはその免疫活性化フラグメントおよび／または改変配列である。一実施態様では、ＨＳＰ７０またはその免疫活性化フラグメントおよび／または改変配列は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来である。
【００１６】
癌細胞結合構成要素は、目的の癌細胞を認識する任意の抗体または他の分子であってよい。一態様では、癌細胞結合構成要素は、単鎖抗体である。一態様では、癌細胞結合構成要素は、可変ドメインフラグメントである。一態様では、癌細胞結合構成要素は、抗体のＦａｂ部分である。
【００１７】
一態様では、癌細胞結合構成要素は、癌抗原に特異的である（例えば、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原）。癌抗原は、目的の癌によって発現される任意の特定可能な細胞表面抗原であってよい。一実施態様では、癌抗原は、メソテリン、アルファフェトプロテイン、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２Ｎｅｕ、ＥＴＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＭＡ、前立腺特異的抗原、ＨＰＶ１７Ｅ７、突然変異体ｐ５３、ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ、ｒａｓ、ＭＡＧＥ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＷＴ１、ＰＲ１、葉酸結合タンパク質、ＣＡ−１９−９、ＦＡＰ、Ｇ２５０、またはＡ３３である。
【００１８】
一実施態様では、抗体は、メソテリンに特異的である。メソテリンを認識および結合する融合タンパク質は、例えば、米国特許番号７，９４３，１３３に記載されて、その全体で参照により本明細書中に援用される。さらなる融合タンパク質は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２１９１１に記載されて、その全体で参照により本明細書中に援用される。
【００１９】
一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列と少なくとも８５％の配列相同性を有するペプチドを含む。好ましくは、融合タンパク質は、ＡＰＣ細胞表面上に腫瘍特異的抗原を有する活性化されたＡＰＣを生産する能力を保持する。一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号１のペプチド配列を含む。一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号２のペプチド配列を含む。一実施態様では、融合タンパク質は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２１９１１に開示される融合タンパク質配列のペプチド配列を含む。
【００２０】
本明細書に記載の方法および組成物は、任意の癌、例えば、融合タンパク質を注入することのできる任意の癌を治療するために用いられ得る。一部の実施態様では、癌は、化学忌避効果を示す。一実施態様では、化学忌避効果は、癌によるＣＸＣＬ１２または他の化学忌避ケモカインの過剰発現によって仲介される。一実施態様では、当該方法は、化学忌避効果を示す癌を有する患者を選択するステップをさらに含む。
【００２１】
一実施態様では、癌は、乳癌、白血球癌、肝臓癌、卵巣癌、頭頚部癌、膀胱癌、前立腺癌、皮膚癌、骨癌、脳腫瘍、白血病癌、肺癌、結腸癌、肛門癌、ＣＮＳ癌、メラノーマ癌、腎癌、子宮頸癌、食道癌、精巣癌、脾臓癌、腎臓癌、リンパ性癌、膵癌、胃癌または甲状腺癌を含む。一実施態様では、癌は中皮腫である。一実施態様では、癌は血液学的悪性腫瘍である。血液学的悪性腫瘍は、血液、骨髄、リンパ、およびリンパ系の癌を含み、制限されないが、白血病、リンパ腫、および骨髄腫を含む。一実施態様では、癌は、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）陽性癌である。
【００２２】
一実施態様では、融合タンパク質は、注入を介して投与される。一実施態様では、融合タンパク質は、腫瘍内に直接注入される。一実施態様では、融合タンパク質は、腫瘍を含む体腔または腫瘍を供給している血管内に注入される。一実施態様では、融合タンパク質は、全身性に投与される。
【００２３】
一実施態様では、抗化学忌避剤は、注入を介して投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、腫瘍または腫瘍の近位に直接投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、腫瘍を含む体腔または腫瘍を供給している血管内に注入される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、全身性に投与される。
【００２４】
一態様では、本発明は、融合タンパク質および抗化学忌避剤を含む医薬組成物に関する。一実施態様では、組成物は、抗原提示細胞をさらに含む。一実施態様では、抗原提示細胞は、樹状細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＶＩＣ−００７（配列番号１）およびＶＩＣ−００８（配列番号２）のペプチド配列を示す。
【図２Ａ】０週（Ｗ０）、１週（Ｗ１）、２週（Ｗ２）、３週（Ｗ３）、４週（Ｗ４）および５週（Ｗ５）における、それぞれの処置（生理食塩水、ＶＩＣ−００７、またはＶＩＣ−００８）に関する、生物発光シグナルを用いた腹腔内卵巣腫瘍増殖を示す。
【図２Ｂ】図２Ａに示される腫瘍増殖のグラフ表示である。
【図３】生理食塩水、ＶＩＣ−００７、またはＶＩＣ−００８の投与後の、卵巣癌細胞を接種したマウスの生存パーセントを示す。
【図４】腫瘍接種（中皮腫）の後に、生理食塩水、ＶＩＣ−００８単独、ＡＭＤ３１００単独、または、ＶＩＣ−００８とＡＭＤ３１００を投与する処置プロトコルを示す。
【図５】生理食塩水、ＶＩＣ−００８単独、ＡＭＤ３１００単独、または、ＶＩＣ−００８とＡＭＤ３１００の投与後の、中皮腫癌細胞、Ｌｕｃ−４０Ｌを接種したマウスの生存パーセントを示す。
【図６】生理食塩水、ＶＩＣ−００８単独、ＡＭＤ３１００単独、または、ＶＩＣ−００８とＡＭＤ３１００の投与後の、中皮腫癌細胞、Ｌｕｃ−ＡＥ１７を接種したマウスの生存パーセントを示す。
【図７Ａ−７Ｄ】異なる処置群における腫瘍増殖およびマウス生存を示す。４０Ｌ（ｎ＝１０）（Ａ）およびＡＥ１７（ｎ＝１０）（Ｂ）マウスにおいて、全ての腹腔内腫瘍を、最後の処置後に７日目に集めて計量した。４０Ｌ（ｎ＝１２）（Ｃ）およびＡＥ１７（ｎ＝１２）（Ｄ）腫瘍を保有するマウスの生存。Ｘ軸上の数は、マウスへの腫瘍細胞の接種後のマウス生存の日数を表わす。ＮＳ，有意でない、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。データは、平均±ＳＥＭとして表した。
【図８Ａ−８Ｆ】ＶＩＣ−００８が、リンパ球浸潤を促進することを示す。（Ａ）浸潤したリンパ球に関するゲート戦略。４０Ｌ（ｎ＝６）（Ｂ）およびＡＥ１７（ｎ＝５）（Ｃ）マウスにおける、合計の生存脾細胞中のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。ＡＥ１７マウス（ｎ＝５）（Ｄ）のリンパ節における、合計の生存細胞中のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。４０Ｌ（ｎ＝６）（Ｅ）およびＡＥ１７（ｎ＝５）（Ｆ）マウスの腫瘍における、合計の生存細胞中のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。データは、平均±ＳＥＭとして表される。
【図９Ａ−９Ｄ】ＶＩＣ−００８が、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌を促進したことを示す。（Ａ）異なる処置群におけるＩＦＮ−γ分泌細胞の代表的なドットプロット。４０Ｌ（ｎ＝６）（Ｂ）およびＡＥ１７（ｎ＝５）（Ｃ）マウスの脾臓における、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＦＮ−γ分泌細胞の割合。ＡＥ１７マウス（ｎ＝５）（Ｄ）のリンパ節における、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＩＦＮ−γ分泌細胞の割合。＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。データは、平均±ＳＥＭとして表される。
【図１０Ａ−１０Ｅ】ＡＭＤ３１００が、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ−１発現を低減させたことを示す。４０Ｌ（ｎ＝６）（Ａ）およびＡＥ１７（ｎ＝５）（Ｂ）マウスの脾臓における、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＰＤ−１を発現している細胞の割合。ＡＥ１７マウス（ｎ＝５）（Ｃ）のリンパ節における、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＰＤ−１を発現している細胞の割合。４０Ｌ（ｎ＝６）（Ｄ）およびＡＥ１７（ｎ＝５）（Ｅ）マウスの腫瘍における、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＰＤ−１を発現している細胞の割合。＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１。データは、平均±ＳＥＭとして表される。
【図１１Ａ−１１Ｆ】ＡＭＤ３１００が、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇを減少させたことを示す。４０Ｌ（ｎ＝６）（Ａ）およびＡＥ１７（ｎ＝５）（Ｂ）マウスにおける、合計の生存脾細胞中のＴｒｅｇの割合。ＡＥ１７マウス（ｎ＝５）（Ｃ）のリンパ節における、合計の生存細胞中のＴｒｅｇの割合。ＡＥ１７マウス（ｎ＝５）（Ｄ）のリンパ節における、Ｔｒｅｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比。４０Ｌマウス（ｎ＝６）（Ｅ）の腫瘍における、合計の生存細胞中のＴｒｅｇの割合。４０Ｌマウス（ｎ＝６）（Ｆ）の腫瘍における、Ｔｒｅｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、データは、平均±ＳＥＭとして表される。
【図１２Ａ−１２Ｅ】ＡＭＤ３１００が、Ｔｒｅｇをヘルパー生存細胞に再プログラミングしたことを示す。４０Ｌ（ｎ＝６）（Ａ）の腫瘍およびＡＥ１７（ｎ＝５）（Ｂ）マウスのリンパ節における、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞集団中のＣＤ２５＋細胞に対するＣＤ２５−の比。異なる処置群におけるＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５−Ｔｒｅｇ集団中のＩＬ−２＋ＣＤ４０Ｌ＋細胞の代表的な密度プロット（Ｃ）。４０Ｌ（ｎ＝６）の腫瘍（Ｄ）およびＡＥ１７（ｎ＝５）（Ｅ）マウスのリンパ節における、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５−Ｔｒｅｇ集団中のＩＬ−２＋ＣＤ４０Ｌ＋細胞の割合。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。データは、平均±ＳＥＭとして表される。
【図１３Ａ−１３Ｆ】ＡＭＤ３１００によって駆動されるＴｒｅｇ再プログラミングは、ＴＣＲ活性化が必要であったことを示す。（Ａ）抗−ＣＤ３／ＣＤ２８刺激無しの下でＡＭＤ３１００処置有りまたは無しのＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５−およびＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋集団の代表的なドットプロット（Ａ）、および、ウェルチの補正による独立ｔ検定を用いて統計的な違いを分析した（ｎ＝４）（Ｂ）。抗−ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の下でＡＭＤ３１００処置有りまたは無しのＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５−およびＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋集団の代表的なドットプロット（Ｃ）、および、ウェルチの補正による独立ｔ検定を用いて統計的な違いを分析した（ｎ＝４）（Ｄ）。抗−ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の下でＡＭＤ３１００処置有りまたは無しのＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５−Ｔｒｅｇ集団中のＩＬ−２＋ＣＤ４０Ｌ＋細胞の代表的な密度プロット（Ｅ）、および、ウェルチの補正による独立ｔ検定を用いて統計的な違いを分析した（ｎ＝４）（Ｆ）。データは、平均±ＳＥＭとして表される。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
この説明を読んだ後、様々な代替の実施態様および代替の適用における本発明の実施の仕方が当業者に明らかになる。しかしながら、本発明の全ての実施態様が本明細書中に記載されるわけではない。本明細書中に示される実施態様は、例示目的でのみ示されて、制限ではないことが理解される。したがって、様々な代替の実施態様のこの詳細な説明は、以下に示される本発明の範囲または幅を制限すると解釈されるべきでない。
【００２７】
本発明が開示および説明される前に、以下に説明される態様は、特定の組成物、そのような組成物を調製する方法、またはその使用に制限されず、したがって、もちろん変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書において用いられる専門用語は、特定の態様を説明する目的のみのためであり、限定を意図しないことも理解されるべきである。
【００２８】
［定義］
別段の定義がされない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者の１人によって一般に理解されるのと同一の意味を有する。
【００２９】
本明細書において、および、その後の特許請求の範囲において、以下の意味を有することが定義されるいくつかの用語に対して参照がなされる：
【００３０】
本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、本発明の限定を意図しない。本明細書において用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形も同様に含むことが意図される。
【００３１】
範囲を含む全ての数字表示、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、量、および分子量は、適切な場合、１０％、１％、または０．１％（＋）または（−）に変動する近似値である。常に明示的に述べられるわけではないが、全ての数字表示は、用語「約」が前に付いてよいことが理解される。また、常に明示的に述べられるわけではないが、本明細書に記載される試薬は単なる例示であること、および、そのような同等物は当技術分野で知られていることも理解される。
【００３２】
「任意選択の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「任意選択で（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、その後に記載される事象または状況が生じ得るまたは生じ得ないこと、および、事象または状況が生じる事実およびそうでない事実をその記載が含むことを意味する。
【００３３】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、組成物および方法が、挙げられたエレメントを含むが、他のものを除かないことを意味することを意図する。「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために用いられる場合、組み合わせに対する任意の本質的な意義の他のエレメントを除くことを意味する。例えば、本明細書に定義されるエレメントから本質的になる組成物は、特許請求の範囲に記載された発明の基礎および新規の特徴（単数または複数）に実質的に影響を与えない他のエレメンツを除外しない。「からなる」は、微量より多い他の成分および挙げられた実質的な方法ステップを除くことを意味する。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施態様は、本発明の範囲内である。
【００３４】
用語「患者」、「対象」、「個体」などは、本明細書において相互交換可能に用いられ、インビトロまたはインサイチュであろうと、本明細書に記載の方法に適している任意の動物またはその細胞を指す。一実施態様では、患者、対象、または個体は、哺乳類である。一部の実施態様では、哺乳類は、マウス、ラット、モルモット、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、または家畜動物（例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ）である。一部の実施態様では、患者、対象、または個体は、ヒトである。
【００３５】
用語「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、ヒトなどの対象における、本明細書に記載の疾患または障害の治療をカバーし、および、（ｉ）疾患または障害を阻害する、すなわち、その発達を停止させる；（ｉｉ）疾患または障害を緩和させる、すなわち、疾患または障害の回帰を生じさせる；（ｉｉｉ）疾患または障害の進行を遅延させる；および／または、（ｉｖ）疾患または障害の１つまたは複数の症候の進行を阻害、緩和、または遅延させることを含む。例えば、癌または腫瘍の治療は、制限されないが、腫瘍のサイズの縮小、腫瘍および／またはその転移の除去、癌の寛解、腫瘍の転移の阻害、癌の少なくとも１つの兆候の縮小または除去などを含む。
【００３６】
対象への、薬剤の「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」または「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」という用語は、その意図した機能を発揮するために、化合物を対象に導入または送達する任意の経路を含む。投与は、経口、鼻腔内、非経口的（静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、または局所的を含む、任意の適切な経路によって行なうことができる。投与は、自己投与および他人による投与を含む。
【００３７】
「薬学的に許容できる組成物」は、哺乳類、特にヒトへの投与に適切な組成物を指す。
【００３８】
また、記載される医学的疾患および症状の治療または予防の様々なモデルは、「実質的」を意味することが意図されることも理解されるべきであり、それは、全てを含むが、全てよりも少ない治療または予防も含み、一部の生物学的または医学的に関連のある結果が達成される。
【００３９】
語句「同時に投与する」は、少なくとも２つの薬剤の長年にわたる患者への投与を指す。本明細書において用いられる単語「同時に」は、十分に時間が近くて、組み合わせた効果を生じることを意味する（すなわち、同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）は、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）であってよく、または、２以上の事象が互いに前後で短期間以内に生じてよい）。同時投与は、制限されずに、別個、連続、および同時の投与を含む。
【００４０】
用語「別個の」投与は、異なる組成物における、または、異なる経路による、同時または実質的に同時の少なくとも２つの有効成分の投与を指す。
【００４１】
用語「連続的な」投与は、異なる時の、少なくとも２つの有効成分の投与を指し、投与経路は同一または異なる。より具体的には、連続的な使用は、他方（単数または複数）の投与の開始前の、有効成分のうちの一方の全体的な投与を指す。したがって、他方の有効成分（単数または複数）の投与の前に、有効成分のうちの一方を、数分、数時間、または数日にわたって投与することが可能である。
【００４２】
用語「同時の」投与は、少なくとも２つの有効成分を、同一経路によって、同時または実質的に同時に投与することを指す。
【００４３】
本明細書において用いられる用語「治療的」は、治療を意味する。治療的効果は、病状の抑制、寛解、または根絶によって得られる。
【００４４】
本明細書において用いられる用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」または「予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）」は、予防的治療を意味する。予防的効果は、病状の発症を遅延させる、または、発生した場合に病状の重症度を低減させることによって得られる。
【００４５】
用語「治療的有効量」、「予防的有効量」または「有効量」は、投与された場合に所望の効果を引き起こすのに十分な薬剤の量を指す。例えば、有効量の抗化学忌避剤は、癌細胞または腫瘍に対して抗化学忌避効果を有する（例えば、腫瘍または癌細胞からの化学忌避効果を減衰させる）のに十分な量であってよい。治療的に有効量の薬剤は、治療される腫瘍およびその重症度、ならびに、治療される患者の年齢、体重などに応じて変化し得る。熟練した当業者は、これらおよび他の因子に応じて適切な用量を決定することができる。また、組成物は、１つまたは複数のさらなる治療的化合物と組み合わせて投与してもよい。本明細書に記載の方法では、治療的化合物は、疾患または障害の１つまたは複数の兆候または症候を有する対象に投与され得る。
【００４６】
細胞／細胞集団に関して、用語「死滅させる」は、その細胞／細胞集団の死を導く任意のタイプの操作を含むことを目的とする。
【００４７】
本明細書において用いられる「抗体」は、従来の方法論に従って調製される、ポリクローナル、モノクローナル、単鎖、キメラ、ヒト化およびヒト抗体を含む。
【００４８】
「ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２拮抗薬」または「ＣＸＣＲ７／ＣＸＣＬ１２拮抗薬」は、ＣＸＣＲ４および／またはＣＸＣＲ７に対するＣＸＣＬ１２結合に拮抗する、または他の方法でＣＸＣＬ１２の化学忌避効果を減少させる化合物を指す。
【００４９】
「化学忌避活性」または「化学忌避効果」は、遊走能力を有する真核生物細胞を忌避する（または化学忌避する）薬剤の能力（すなわち、細胞は、忌避刺激から遠ざかることができる）、ならびに、腫瘍細胞などの細胞によって分泌されるケモカインの化学忌避効果を意味する。通常、化学忌避効果は、細胞の周りの領域に存在し、そこでは、ケモカインの濃度は、化学忌避効果を与えるのに十分である。インターロイキン８およびＣＸＣＬ１２を含む一部のケモカインは、高濃度（例えば、約１００ｎＭよりも上）で化学忌避活性を発揮し得て、一方で、より低い濃度は、化学忌避効果を示さず、化学誘引物質にさえもなり得る。
【００５０】
したがって、化学忌避活性を有する薬剤は、「化学忌避剤」である。そのような活性は、当技術分野でよく知られている任意の様々なシステムを用いて検出され得る（例えば、米国特許番号５，５１４，５５５および米国特許出願公開番号２００８／０３００１６５を参照、それぞれ、その全体で参照により本明細書中に援用される）。本明細書における使用に好ましいシステムは、米国特許番号６，４４８，０５４に記載されて、その全体で参照により本明細書中に援用される。
【００５１】
用語「抗化学忌避効果」は、抗化学忌避剤がケモカインの化学忌避効果を減衰または除去する効果を指す。
【００５２】
本明細書において用いられる「免疫細胞」は、抗原の特異的な認識に関与する造血系起源の細胞である。免疫細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞またはマクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞などを含む。
【００５３】
本明細書において用いられる用語「抗癌治療」は、化学療法および放射線療法ならびにワクチン療法を含む、伝統的な癌治療を指す。
【００５４】
用語「改変された抗体」は、抗体の重鎖および／または軽鎖の可変ドメインに由来する抗原結合部位を含む少なくとも抗体フラグメントを含む組み換え分子を指し、任意選択で、任意のＩｇクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＹ）由来の抗体の可変および／または定常ドメインの全体または一部を含んでもよい。
【００５５】
用語「エピトープ」は、抗体が優先的および特異的に結合する抗原の領域を指す。モノクローナル抗体は、分子的に定義され得る分子の単一の特異的なエピトープに優先的に結合する。本発明では、多数のエピトープが、多重特異性抗体によって認識され得る。
【００５６】
「融合タンパク質」または「融合ポリペプチド」は、少なくとも２つの異なるポリペプチド由来のポリペプチド部分を含む複合型ポリペプチドを指す。その部分は、同一生物のタンパク質由来であってよく、その場合、融合タンパク質は、「種内」、「遺伝子内」などと呼ばれる。様々な実施態様では、融合ポリペプチドは、第一のポリペプチドに結合された１つまたは複数のアミノ酸配列を含んでよい。１よりも多いアミノ酸配列が第一のポリペプチドに融合される場合では、融合配列は、同一配列の多コピーであってよく、またはあるいは、異なるアミノ酸配列であってよい。第一のポリペプチドは、第二のポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、または、ＮおよびＣ末端に融合されてよい。さらに、第一のポリペプチドは、第二のポリペプチドの配列内に挿入されてよい。
【００５７】
用語「免疫原性」は、免疫応答を誘発する物質の能力を指す。「免疫原性組成物」または「免疫原性物質」は、免疫応答を誘発する組成物または物質である。「免疫応答」は、抗原の存在に対する対象の反応を指し、以下の少なくとも１つ：抗体の作製、免疫の発生、抗原に対する過敏性の発生、および、寛容の発生を含んでよい。
【００５８】
用語「リンカー」は、当該分野で認識されていて、２つの化合物、例えば２つのポリペプチドを結合する分子または分子の基を指す。リンカーは、単一の結合分子からなってよく、または、特定の距離によって結合分子および化合物を分離させることを意図するスペーサー分子および結合分子を含んでよい。
【００５９】
本明細書において用いられる「ストレスタンパク質」は、「ヒートショックタンパク質」または「Ｈｓｐ」としても知られ、ストレス遺伝子によってコードされるタンパク質であり、したがって、生物に対するストレス要因の接触または曝露の際に著しくより多い量で典型的に生産される。本明細書において用いられる用語「ストレスタンパク質」は、ストレスタンパク質のそのような部分およびペプチドを含むことが意図される。「ストレス遺伝子」は、本明細書において用いられる「ヒートショック遺伝子」としても知られ、制限されないが、ヒートショック、低酸素状態、グルコース欠乏、重金属塩類、エネルギー代謝および電子輸送の阻害剤、および、タンパク質変性剤のような、ストレス要因に対する、または、特定のベンゾキノンアンサマイシンに対する、生物（遺伝子を含む）の接触または曝露に起因して、活性化または他の方法で検出可能に上方制御される遺伝子を指す。Ｎｏｖｅｒ，Ｌ．，Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９９１）。「ストレス遺伝子」は、公知のストレス遺伝子ファミリー内の相同遺伝子、例えば、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ９０ストレス遺伝子ファミリー内の特定の遺伝子も含む（そのような相同遺伝子は、それら自体は、ストレス要因によって誘導されないが）。本明細書において用いられる用語「ストレス遺伝子」および「ストレスタンパク質」のそれぞれは、文脈が別段の指示をしない限り、他が含まれてよい。
【００６０】
用語「ワクチン」は、免疫応答を誘発して対象に対する防御免疫も与える物質を指す。
【００６１】
［抗化学忌避剤］
多くの腫瘍は、腫瘍細胞によって分泌されるケモカインに起因して、例えば、免疫細胞に対して化学忌避効果を有する。腫瘍細胞によって分泌される高濃度のケモカインは、細胞に対して化学忌避効果を有し得るが、一方で、より低い濃度は、そのような効果を有さず、または化学誘引さえもたらす。例えば、Ｔ細胞は、濃度依存性およびＣＸＣＲ４受容体が介在するメカニズムによって、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ−１）によってはね返される。
【００６２】
抗化学忌避剤は、米国特許出願公開番号２００８／０３００１６５に記載の抗化学忌避剤のような、当技術分野で知られている任意の薬剤であってよく、その全体で参照により本明細書中に援用される。
【００６３】
抗化学忌避剤は、ケモカインおよび／またはケモカイン受容体の二量体化を特異的に阻害し、それにより、化学忌避剤に対する化学忌避応答をブロックする、任意の薬剤を含む。ＩＬ−８およびＣＸＣＬ１２を含む特定のケモカインは、多くのケモカインが二量体として存在する高濃度（例えば、１００ｎＭよりも上）で、化学忌避物質としての役割を果たすこともできる。ケモカインの二量体化は、細胞において示差的応答を誘発して、ケモカイン受容体の二量体化を引き起こし、その活性は、化学忌避シグナルとして解釈される。腫瘍によって分泌される高濃度のケモカインの化学忌避効果のブロックは、例えば、ケモカイン二量体形成またはケモカイン受容体二量体形成を阻害する抗化学忌避剤によって達成され得る。例えばリガンド結合または二量体化ドメインの妨害によって、例えばケモカイン受容体二量体化を標的化およびブロックする抗体は、抗化学忌避剤であり得る。他の作用機構を介して作用する、例えば、細胞によって分泌される化学忌避サイトカインの量を低減させる、二量体化を阻害する、および／または、標的受容体に対するケモカインの結合を阻害する、抗化学忌避剤も、本発明に含まれる。所望の場合は、この効果は、単量体ケモカインの走化性作用を阻害せずに達成することができる。
【００６４】
他の実施態様では、抗化学忌避剤は、ＣＸＣＲ４拮抗薬、ＣＸＣＲ７拮抗薬、ＣＸＣＲ３拮抗薬、ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２拮抗薬、ＣＸＣＲ７／ＣＸＣＬ１２拮抗薬、または選択的ＰＫＣ阻害剤である。抗化学忌避剤は、制限されずに、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７の発現を阻害する分子（例えば、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡ分子）、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７に対して結合してそれらの機能を阻害する分子（例えば、抗体またはアプタマー）、ＣＸＣＬ１２またはＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７の二量体化を阻害する分子、および、ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７の拮抗薬を含んでよい。
【００６５】
ＣＸＣＲ４拮抗薬は、制限されないが、ＡＭＤ３１００（プレリキサフォル）またはその誘導体、ＡＭＤ１１０７０（ＡＭＤ０７０とも呼ばれる）、ＡＭＤ１２１１８、ＡＭＤ１１８１４、ＡＭＤ１３０７３、ＦＡＭＤ３４６５、Ｃ１３１、ＢＫＴ１４０、ＣＴＣＥ−９９０８、ＫＲＨ−２７３１、ＴＣ１４０１２、ＫＲＨ−３９５５、ＢＭＳ−９３６５６４／ＭＤＸ−１３３８、ＬＹ２５１０９２４、ＧＳＫ８１２３９７、ＫＲＨ−１６３６、Ｔ−２０、Ｔ−２２、Ｔ−１４０、ＴＥ−１４０１１、Ｔ−１４０１２、またはＴＮ１４００３、それらの誘導体、または、ＣＸＣＲ４の二量体化と干渉する抗体であってよい。さらなるＣＸＣＲ４拮抗薬は、例えば、米国特許公開番号２０１４／０２１９９５２およびＤｅｂｎａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，２０１３；３（１）：４７−７５に記載されて、それぞれ、その全体で参照により本明細書中に援用されて、ＴＧ−００５４（ｂｕｒｉｘａｆｏｒ）、ＡＭＤ３４６５、ＮＩＢＲ１８１６、ＡＭＤ０７０、およびそれらの誘導体を含む。
【００６６】
ＣＸＣＲ３拮抗薬は、制限されないが、ＴＡＫ−７７９、ＡＫ６０２、またはＳＣＨ−３５１１２５、または、ＣＸＣＲ３の二量体化と干渉する抗体であってよい。
【００６７】
ＣＸＣＲ４／ＣＸＣＬ１２拮抗薬は、制限されないが、タンニン酸、ＮＳＣ  ６５１０１６、または、ＣＸＣＲ４および／またはＣＸＣＬ１２の二量体化と干渉する抗体であってよい。
【００６８】
ＣＸＣＲ７／ＣＸＣＬ１２拮抗薬は、制限されないが、ＣＣＸ７７１、ＣＣＸ７５４、または、ＣＸＣＲ７および／またはＣＸＣＬ１２の二量体化と干渉する抗体であってよい。
【００６９】
選択的なＰＫＣ阻害剤は、制限されないが、サリドマイドまたはＧＦ  １０９２３０Ｘであってよい。
【００７０】
一実施態様では、抗ｆｕｇｅｔａｃｔｉｃ剤は、ＡＭＤ３１００（プレリキサフォル）である。ＡＭＤ３１００は、米国特許番号５，５８３，１３１に記載され、その全体で参照により本明細書中に援用される。
【００７１】
一実施態様では、抗化学忌避剤は、ＡＭＤ３１００誘導体である。ＡＭＤ３１００誘導体は、限定されないが、米国特許番号７，９３５，６９２および５，５８３，１３１（ＵＳＲＥ４２１５２）に見られるものを含み、それぞれ、その全体で参照により本明細書中に援用される。
【００７２】
特定の実施態様では、抗化学忌避剤は、抗体ではない。特定の実施態様では、抗化学忌避剤は、ヘパリン類似物質ではない。特定の実施態様では、抗化学忌避剤は、ペプチドではない。
【００７３】
一実施態様では、抗化学忌避剤は、腫瘍の標的化を可能にする分子と連結される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、標的化されるべき腫瘍に特異的な抗体と連結（例えば結合）される。一実施態様では、腫瘍の標的化を可能にする分子に連結された抗化学忌避剤は、全身性に投与される。
【００７４】
一実施態様では、抗化学忌避剤は、薬剤の抗化学忌避活性を高めるさらなる化合物と組み合わせて投与される。一実施態様では、さらなる化合物は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。一実施態様では、Ｇ−ＣＳＦは投与されない。
【００７５】
［融合タンパク質］
本開示は、ストレスタンパク質構成要素および癌細胞結合構成要素を含む融合タンパク質、および、それを用いる方法に関する。特に、本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質によって認識され得る、癌細胞または腫瘍のような疾患を有する患者の治療に関する。好ましくは、疾患は、免疫細胞が癌細胞の付近で阻害されるように化学忌避活性を発現する。
【００７６】
本発明において検討される融合タンパク質を作製する実施例および方法は、米国特許番号８，１４３，３８７および７，９４３，１３３およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２１９１１に記載され、それぞれ、その全体で参照により本明細書中に援用される。
【００７７】
［ストレスタンパク質構成要素］
ストレスタンパク質構成要素（ストレスタンパク質ドメインとも呼ばれる）は、ＡＰＣを活性化する任意のポリペプチド配列を含んでよい。一部の実施態様では、ポリペプチド配列は、ストレスタンパク質に由来する。しかしながら、任意のＡＰＣ活性化ポリペプチドが検討される。
【００７８】
任意の適切なストレスタンパク質（例えば、ヒートショックタンパク質（Ｈｓｐ））を、本発明の融合ポリペプチドにおいて用いることができる。例えば、Ｈｓｐ６０および／またはＨｓｐ７０を用いることができる。ストレスタンパク質一般を向くと（Ｔｕｒｎｉｎｇ  ｔｏ）、細胞は、ストレスまたはヒートショック遺伝子と一般に呼ばれる遺伝子のグループの発現を増大させることによって、ストレス要因（典型的にヒートショック処置）に反応する。ヒートショック処置は、細胞または生物を、細胞が適応される温度よりも１〜数度高いセ氏温度である温度に曝すことを含む。そのような遺伝子の誘導と協調して、ストレスのかかった細胞において、対応するストレスタンパク質のレベルは増大する。
【００７９】
細菌では、優勢のストレスタンパク質は、約７０および６０ｋＤａの分子サイズを有するタンパク質であり、それぞれＨｓｐ７０およびＨｓｐ６０と一般に呼ばれる。ストレスタンパク質は、タンパク質合成、細胞内トラフィッキング、および、タンパク質複合体の集合および分解のような、重要な細胞プロセスに関与すると考えられる。ストレス中に合成される増大した量のストレスタンパク質は、主に、誘導されたタンパク質のアンフォールディングの結果を最小限にするように作用すると考えられる。実際に、ストレスタンパク質の合成を誘導する軽度のストレス条件に細胞を事前に曝露することは、その後の、より極度のストレスの有害効果からの保護を細胞に与える。
【００８０】
主なストレスタンパク質は、これまでに試験された全ての生物および組織タイプにおいて発現されると考えられる。また、ストレスタンパク質は、現在までに同定されたタンパク質の最も高く保存されたグループを表わすと考えられる。例えば、広く多様な生物におけるストレスタンパク質が比較される場合、Ｈｓｐ９０およびＨｓｐ７０は、アミノ酸レベルで５０％またはそれよりも高い同一性を示し、同一でない位置において多くの類似性を共有する。同様またはより高いレベルの相同性が、種内の特定のストレスタンパク質ファミリーの異なるメンバー間に存在する。
【００８１】
ストレスタンパク質、特にＨｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ２０−３０およびＨｓｐ１０は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅによる感染に対する免疫応答において宿主免疫系によって認識される主な決定要因である。しかしながら、マイコバクテリア感染または自己免疫疾患の病歴がない健康な個体を含む個体は、細菌およびヒトの両方のＨｓｐ６０エピトープを認識するＴ細胞も保有する。ストレスタンパク質エピトープを認識するこのシステムは、侵入する生物に対する「早期防御システム」をおそらく構成する。そのシステムは、細菌およびウイルスによる頻繁な刺激によって維持され得る。
【００８２】
融合ポリペプチドでの使用のためのストレス遺伝子およびタンパク質のファミリーは、当技術分野でよく知られているものであり、例えば、Ｈｓｐ１００−２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｌｏｎ、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０、ＴＦ５５、Ｈｓｐ４０、ＦＫＢＰ、シクロフィリン、Ｈｓｐ２０−３０、ＣｌｐＰ、ＧｒｐＥ、Ｈｓｐ１０、ユビキチン、カルネキシン、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを含む。特定の実施態様では、ストレスタンパク質は、Ｈｓｐ７０またはＨｓｐ６０である。特定の実施態様では、ストレスタンパク質は、Ｈｓｐ７０またはＨｓｐ６０のフラグメントおよび／またはＨｓｐ７０またはＨｓｐ６０の改変配列である。本明細書において用いられるＨｓｐ７０のようなストレスタンパク質の「改変配列」は、ストレスタンパク質の生物学的活性の少なくとも１つ、例えば、抗原提示細胞を刺激する能力の少なくとも５０％、例えば、生物学的活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれよりも多くを維持する、１つまたは複数の付加、欠失、または置換を含む配列である。一部の実施態様では、改変配列は、野生型配列と比較して高められた生物学的活性を有する。一部の実施態様では、改変配列は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２１９１１に開示されるものであり、その全体で参照により本明細書中に援用される。
【００８３】
Ｈｓｐｌ００−２００の例は、Ｇｒｐ１７０（グルコースによって調節されるタンパク質）を含む。Ｈｓｐ１００の例は、哺乳類のＨｓｐ１１０、酵母Ｈｓｐ１０４、ＣｌｐＡ、ＣｌｐＢ、ＣｌｐＣ、ＣｌｐＸおよびＣｌｐＹを含む。Ｈｓｐ９０の例は、ＨｔｐＧ（大腸菌）、Ｈｓｐ８３およびＨｓｃ８３（酵母）、およびＨｓｐ９０α、Ｈｓｐ９０βおよびＧｒｐ９４（ヒト）を含む。Ｈｓｐ７０の例は、哺乳類細胞由来のＨｓｐ７２およびＨｓｃ７３、細菌、特にマイコバクテリア、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ、本明細書においてＨｓｐ７１と呼ばれる）由来のＤｎａＫ、大腸菌、酵母、および他の原核生物由来のＤｎａＫ、および、ＢｉＰおよびＧｒｐ７８を含む。Ｈｓｐ６０の例は、マイコバクテリア由来のＨｓｐ６５を含む。細菌Ｈｓｐ６０は、大腸菌由来のＧｒｏＥＬのような、ＧｒｏＥＬとしても一般に知られる。ＴＦ５５の例は、Ｔｅｐ１、ＴＲｉＣおよびサーモソームを含む。Ｈｓｐ４０の例は、大腸菌およびマイコバクテリアのような原核生物由来のＤｎａＪ、および、ＨＳＪ１、ＨＤＪ１およびＨｓｐ４０を含む。ＦＫＢＰの例は、ＦＫＢＰ１２、ＦＫＢＰ１３、ＦＫＢＰ２５、およびＦＫＢＰ５９、Ｆｐｒ１およびＮｅｐ１を含む。シクロフィリンの例は、シクロフィリンＡ、ＢａｎｄＣを含む。Ｈｓｐ１０の例は、ＧｒｏＥＳおよびＣｐｎ１０を含む。
【００８４】
００８９］特定の実施態様では、本発明のストレスタンパク質は、腸内細菌、マイコバクテリア（特に、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｖａｃｃａｅ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓおよびＭ．ｂｏｖｉｓ）、大腸菌、酵母、ショウジョウバエ、脊椎動物、鳥類、ニワトリ、哺乳類、ラット、マウス、霊長類、またはヒトから得られる。
【００８５】
一実施態様では、ストレスタンパク質は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のヒートショックタンパク質７０（ＭｔｂＨｓｐ７０）を含む。ＭｔｂＨｓｐ７０は、よく特徴付けられていて、強力な免疫活性化アジュバントとして機能する。それは、単球および樹状細胞（ＤＣ）を刺激してＣＣ−ケモカインを生産して、抗原をプロセッシングおよび提示しているマクロファージ、ＤＣ、およびエフェクターＴおよびＢ細胞を引き付ける。
【００８６】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載のストレスタンパク質と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含んでよい。
【００８７】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載のストレスタンパク質のフラグメントおよび／または改変であるアミノ酸配列を含んでよい。
【００８８】
［標的結合構成要素］
融合タンパク質の標的結合構成要素は、治療される疾患と関連する抗原に特異的に結合する任意の分子であってよい。特定の実施態様では、標的結合構成要素は、抗体またはそのフラグメントである。用語「抗原結合」、「標的結合」および「腫瘍結合」は、本明細書において相互交換可能に用いられる。
【００８９】
一態様では、標的結合構成要素は、単鎖抗体である。一態様では、標的結合構成要素は、可変ドメインフラグメントである。一態様では、標的結合構成要素は、抗体のＦａｂ部分である。
【００９０】
一態様では、標的結合構成要素は、癌抗原に関して特異的であり（例えば、腫瘍特異的抗原または腫瘍関連抗原）、癌細胞または腫瘍結合構成要素と呼ばれてよい。癌抗原は、目的の癌細胞によって発現される、任意の同定可能な細胞表面抗原であってよい。一実施態様では、癌抗原は、メソテリン、アルファフェトプロテイン、ＣＥＡ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、Ｈｅｒ２Ｎｅｕ、ＥＴＡ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＭＡ、前立腺特異的抗原、ＨＰＶ１７Ｅ７、突然変異体ｐ５３、ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ、ｒａｓ、ＭＡＧＥ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＷＴ１、ＰＲ１、葉酸結合タンパク質、ＣＡ−１９−９、ＦＡＰ、Ｇ２５０、またはＡ３３である。一実施態様では、抗体は、メソテリンに関して特異的である。メソテリンを認識するおよび結合する融合タンパク質は、例えば、米国特許番号７，９４３，１３３に記載されて、その全体で参照により本明細書中に援用される。
【００９１】
［メソテリンを標的化する融合タンパク質］
一実施態様では、標的結合構成要素は、メソテリンに特異的である。ＭＳＬＮは、上皮悪性中皮腫および卵巣癌を含む一般的な上皮癌の表面上に非常に過剰発現されるが、健康な個体内の胸膜、心膜、および腹膜に並んでいる中皮細胞では相対的に低いレベルでのみ発現される。
【００９２】
理論的には、抗−ＭＳＬＮ  ｓｃＦｖおよびＭｔｂＨｓｐ７０の融合は、ＭｔｂＨｓｐ７０の免疫活性化作用およびｓｃＦｖの腫瘍標的化活性を活用して、腫瘍抗原の最も広いプロファイルに対する抗腫瘍応答を生じさせる。
【００９３】
一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列と少なくとも約８５％配列相同性を有するペプチドを含む。一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列と少なくとも約９０％配列相同性を有するペプチドを含む。一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列と少なくとも約９１％配列相同性を有するペプチドを含む。一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列と少なくとも約９２％配列相同性を有するペプチドを含む。一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列と少なくとも約９３％配列相同性を有するペプチドを含む。一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列と少なくとも約９４％配列相同性を有するペプチドを含む。一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列と少なくとも約９５％配列相同性を有するペプチドを含む。一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列と少なくとも約９６％配列相同性を有するペプチドを含む。一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列と少なくとも約９７％配列相同性を有するペプチドを含む。一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列と少なくとも約９８％配列相同性を有するペプチドを含む。一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号１または配列番号２のペプチド配列と少なくとも約９９％配列相同性を有するペプチドを含む。一実施態様では、融合タンパク質は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２１９１１（その全体で参照により本明細書中に援用される）に開示される配列、または、そこに開示される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％配列相同性を有する配列を有するペプチドを含む。
【００９４】
一実施態様では、融合タンパク質は、癌抗原と結合する能力を維持する。一実施態様では、融合タンパク質は、ＡＰＣを活性化する能力を維持する。一実施態様では、融合タンパク質は、ＡＰＣ細胞表面上に癌特異的抗原を有する活性化されたＡＰＣの生産を促進する能力を維持する。
【００９５】
一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号１のペプチド配列を含む。一実施態様では、融合タンパク質は、配列番号２のペプチド配列を含む。
【００９６】
［治療の方法］
本明細書に記載の融合タンパク質を抗化学忌避剤と組み合わせて用いて、化学忌避効果と関連する癌細胞または腫瘍を治療することができる。
【００９７】
一態様では、本発明は、患者における腫瘍などの癌を治療するための方法に関し、ここで、癌または腫瘍は、化学忌避特性を発現して、当該方法は、患者に、ａ）有効量の融合タンパク質を投与するステップ；およびｂ）有効量の抗化学忌避剤を患者に同時に投与するステップを含み；ここで、融合タンパク質および抗化学忌避剤の組み合わせは、癌または腫瘍を治療する。一実施態様では、融合タンパク質は、癌細胞結合構成要素およびストレスタンパク質構成要素を含み、ここで、癌細胞結合構成要素は、癌に結合して、ストレスタンパク質構成要素は、樹状細胞を活性化して、癌抗原を標的化するＣＤ３陽性Ｔ細胞の発生をもたらす。
【００９８】
一実施態様では、抗化学忌避剤および融合タンパク質は、例えば同一または異なる経路によって、別個に投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤および融合タンパク質は、同一または異なる組成物において、例えば同一または異なる経路によって、同時に投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤および融合タンパク質は、例えば同一または異なる経路によって連続して投与される。
【００９９】
一実施態様では、抗化学忌避剤は、融合タンパク質の投与の前に投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、融合タンパク質の投与の後に投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、融合タンパク質の投与前、投与中、および／または投与後に投与される。
【０１００】
一部の実施態様では、抗化学忌避剤は、融合タンパク質の投与の１分〜２４時間前に投与される。一部の実施態様では、抗化学忌避剤は、融合タンパク質の投与の１、２、３、４、５、６、または７日前に投与される。
【０１０１】
一部の実施態様では、抗化学忌避剤は、例えば、抗化学忌避剤が抗化学忌避効果を有するように、腫瘍の化学忌避効果を減少または減衰させるのに十分な期間、投与されて；それから、腫瘍の化学忌避効果が減少または減衰される期間、融合タンパク質が投与されてよい。
【０１０２】
一部の実施態様では、抗化学忌避剤は、融合タンパク質の投与の１分〜２４時間後に投与される。一部の実施態様では、抗化学忌避剤は、融合タンパク質の投与の１、２、３、４、５、６、または７日後に投与される。
【０１０３】
一実施態様では、抗化学忌避剤および／または融合タンパク質は、静脈内、皮下、経口で、または腹腔内に投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、腫瘍の近位（例えば、それと同一の体腔付近または体腔内）に投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、腫瘍内または腫瘍を供給している血管内に直接投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、全身性に投与される。さらなる実施態様では、抗化学忌避剤は、マイクロカテーテル、移植されたデバイス、または移植された剤形によって投与される。
【０１０４】
一実施態様では、抗化学忌避剤は、規定された期間、連続的な様式で投与される。別の実施態様では、抗化学忌避剤は、拍動性の様式で投与される。例えば、抗化学忌避剤は、長年にわたり間欠的に投与され得る。
【０１０５】
本明細書に記載の化合物および方法によって治療され得る癌または腫瘍は、限定されないが：肛門癌；胆管癌；グリア芽腫および髄芽腫を含む脳腫瘍；乳癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌、胃癌；頭頚部癌；急性リンパ性および骨髄性白血病を含む血液腫瘍；多発性骨髄腫；ＡＩＤＳ関連の白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫；ボーエン病およびパジェット病を含む上皮内腫瘍；肝癌（肝細胞癌）；肺癌；ホジキン病およびリンパ性リンパ腫を含むリンパ腫；中皮腫；神経芽細胞腫；扁平上皮細胞癌腫を含む口腔癌；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉系細胞から生じるものを含む卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫を含む肉腫；メラノーマ、カポシ肉腫、基底細胞癌および扁平上皮細胞癌を含む皮膚癌；胚腫瘍（セミノーマ、非セミノーマ［テラトーマ、絨毛癌］）、間質腫瘍および胚細胞腫瘍を含む精巣癌；甲状腺癌および髄様癌を含む甲状腺癌；および、腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎癌を含む。重要な実施態様では、免疫認識を回避する癌または腫瘍は、グリオーマ、結腸癌腫、結腸直腸癌、肛門癌、頭頚部癌、卵巣癌、リンパ系細胞由来の白血病、絨毛癌、およびメラノーマを含む。一実施態様では、腫瘍細胞は、中皮腫由来である。一実施態様では、腫瘍細胞は、血液学的悪性腫瘍由来である。一実施態様では、癌は、ＨＰＶ陽性である。
【０１０６】
一実施態様では、癌は、固形腫瘍である。一実施態様では、癌は、白血病、リンパ腫、または骨髄腫である。一実施態様では、癌は、ＣＸＣＬ１２を過剰発現し、例えば、腫瘍微小環境内で化学忌避効果を有するのに十分なＣＸＣＬ１２の量を発現する。一実施態様では、ＣＸＣＬ１２の癌発現は、本明細書に記載の組成物の投与前に評価され得る。例えば、ＣＸＣＬ１２を発現または過剰発現する（例えば、約１００ｎＭまたはそれよりも高い、例えば、約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ｎＭの濃度）と判定された癌を有する患者は、本明細書に記載の方法および／または組成物を用いて治療される。
【０１０７】
［投与量および投与］
本明細書に記載の組成物は、有効量で投与される。有効量は、投与モード、治療される特定の状態および所望の成果に依存する。それはまた、上記に述べられるように、状態のステージ、対象の年齢および健康状態、もしあるならば同時的な治療の性質、および、医師によく知られた同様の因子にも依存する。治療的適用については、医学的に望ましい結果を達成するのに十分な量である。
【０１０８】
一般に、本発明の抗化学忌避剤の投与量は、１日あたり約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、１日あたり約５ｍｇ／ｋｇ体重〜１日あたり約５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、１日あたり約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０ｍｇ／ｋｇであり、エンドポイントを含むその間の全ての値および範囲を含む。一実施態様では、投与量は、１日あたり約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、投与量は、１日あたり約１０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、投与量は、１日あたり約１０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、投与量は、１日あたり約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、投与量は、１日あたり約５０ｍｇを超えない。
【０１０９】
一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約５０ｍｇ／ｋｇ〜１週あたり約３５０ｍｇ／ｋｇであり、エンドポイントを含むその間の全ての値および範囲を含む。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約５０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、化学忌避剤の投与量は、１週あたり約６０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約７０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約８０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、１週あたり抗化学忌避剤の投与量は、約９０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約１００ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約１１０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約１２０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約１３０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約１４０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約１５０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約１６０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約１７０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約１８０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約１９０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約２００ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約２１０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約２２０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約２３０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約２４０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約２５０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約２６０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約２７０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約２８０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約２９０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約３００ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約３１０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約３２０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約３３０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約３４０ｍｇ／ｋｇである。一実施態様では、抗化学忌避剤の投与量は、１週あたり約３５０ｍｇ／ｋｇあたり週である。
【０１１０】
本発明の一態様では、抗化学忌避剤の投与は拍動性である。一実施態様では、抗化学忌避剤の量は、１時間ごと〜２４時間ごと、例えば、１時間ごと、２時間ごと、３時間ごと、４時間ごと、５時間ごと、６時間ごと、７時間ごと、８時間ごと、９時間ごと、１０時間ごと、１１時間ごと、１２時間ごと、１３時間ごと、１４時間ごと１５時間ごと、１６時間ごと、１７時間ごと、１８時間ごと、１９時間ごと、２０時間ごと、２１時間ごと、２２時間ごと、２３時間ごと、または２４時間ごとに投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤の量は、１日ごと、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、７日ごと、８日ごと、９日ごと、または１０日ごとに投与される。
【０１１１】
本発明の一態様では、抗化学忌避剤の投与量は、抗化学忌避効果を有する（例えば、腫瘍細胞の化学忌避効果を減衰させる）のに十分な期間、拍動性な様式で投与される。一実施態様では、期間は約１日〜約１０日である。例えば、期間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日であってよい。一部の実施態様では、融合タンパク質は、抗化学忌避効果が生じた後、例えば、抗化学忌避剤が投与された１または複数日後に投与される。一部の実施態様では、化学忌避剤の投与は、融合タンパク質が投与される間、続けられる。
【０１１２】
様々な投与経路が利用可能である。本発明の方法は、一般的に言えば、医学的に許容できる任意の投与モードを用いて実施され得て、臨床上受け入れ難い副作用を引き起こさずに効果的なレベルの活性化合物を生産する任意のモードを意味する。
【０１１３】
投与モードは、経口、直腸、局所、経鼻、皮内、または非経口の経路を含む。用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、またはインフュージョンを含む。静脈内または筋肉内経路は、長期の治療および予防には、特に適切でない。しかしながらそれらは、緊急の状況では好ましくあり得る。経口投与は、投与スケジュールならびに患者に対する便利性のため予防的治療に好ましい。ペプチドが治療的に用いられる場合、特定の実施態様では、投与の望ましい経路は、肺のエアロゾルによるものである。ペプチドを含むエアロゾル送達システムを調製する技術は、当業者によく知られている。一般に、そのようなシステムは、パラトープ結合能のような抗体の生物学的特性を著しく損なわない構成要素を利用すべきである（例えば、Ｓｃｉａｒｒａ  ａｎｄ  Ｃｕｔｉｅ「Ａｅｒｏｓｏｌｓ」Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，ｐｐ  １６９４−１７１２を参照；参照により援用される）。当業者は、過度の実験を行なわずに、抗体またはペプチドエアロゾルを産生するための様々なパラメーターおよび条件を容易に決定することができる。
【０１１４】
経口投与に適切な組成物は、カプセル、錠剤、トローチのような個別単位として提供されてよく、それぞれ、所定の量の活性剤（単数または複数）を含む。他の組成物は、シロップ、エリキシル剤またはエマルションのような水性液体または非水性液体中の懸濁液を含む。
【０１１５】
非経口投与のための製剤は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルションを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、および、オレイン酸エチルのような注入可能な有機エステルである。水性担体は、水、アルコール／水溶液、エマルションまたは懸濁液を含み、生理食塩水および緩衝化媒体を含む。非経口ビヒクルは、食塩水、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸リンゲルまたは固定２５油類を含む。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補給、電解質補給（例えば、リンゲルブドウ糖に基づくもの）などを含む。防腐剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどが存在してもよい。より低い投与量は、静脈内投与のような他の投与形態に起因する。対象における応答が、適用された最初の投与量では不十分である場合は、より高い投与量（または、異なる、より局所化された送達経路によって、効果的により高い投与量）が、患者耐性が許容する程度まで用いられてよい。１日あたり多数の投与量が、適切な全身性レベルの化合物を達成するために検討される。
【０１１６】
一実施態様では、抗化学忌避剤は、非経口的に投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、腫瘍に近位の血管へ、マイクロカテーテルを介して投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、腫瘍内の血管へ、マイクロカテーテルを介して投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、皮下に投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、皮内に投与される。
【０１１７】
他の送達システムは、時間放出、遅延放出、または持続放出送達システムを含んでよい。そのようなシステムは、抗化学忌避剤の繰り返し投与を避けることができて、対象および医師の便利性を増大させる。多くのタイプの放出送達システムが利用可能であり、当業者に公知である。それらは、ポリマーベースのシステム、例えば、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ酸無水物を含む。薬剤を含む前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許番号５，０７５，１０９に記載される。送達システムは、非ポリマーシステムを含んでもよく、すなわち：ステロール類、例えば、コレステロール、コレステロールエステル類および脂肪酸またはモノ−  ジ−およびトリ−グリセリドのような中性脂肪を含む、脂質類；ヒドロゲル放出システム；シラスティック（ｓｙｌａｓｔｉｃ）システム；ペプチドに基づくシステム；ワックスコーティング；従来の結合剤および賦形剤を用いた圧縮錠剤；部分的に融合された移植片；などである。
【０１１８】
一実施態様では、抗化学忌避剤は、時間放出、遅延放出または持続放出送達システムにおいて投与される。一実施態様では、抗化学忌避剤を含む時間放出、遅延放出または持続放出送達システムは、腫瘍へ直接挿入される。一実施態様では、抗化学忌避剤を含む時間放出、遅延放出または持続放出送達システムは、腫瘍に近位の患者内に移植される。さらなる移植可能な製剤は、例えば、米国特許出願公開番号２００８／０３００１６５に記載されて、その全体で参照により本明細書中に援用される。
【０１１９】
加えて、本発明の重要な実施態様は、ポンプに基づくハードウェア送達システムを含み、その一部は、移植に適応している。そのような移植可能なポンプは、制御放出マイクロチップを含む。例示的な制御放出マイクロチップは、Ｓａｎｔｉｎｉ，Ｊ  Ｔ  Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９９，３９７：３３５−３３８に記載されて、その内容は参照により本明細書中に明示的に援用される。
【０１２０】
投与される場合、本発明の医薬品は、薬学的に許容できる量および薬学的に許容できる組成物で適用される。そのような製剤は、日常的に、塩、緩衝剤、防腐剤、適合する担体、および、任意選択で他の治療的薬剤を含んでよい。医薬品で用いられる場合、塩は薬学的に許容されるべきであるが、薬学的に許容できない塩が、その薬学的に許容できる塩を調製するために好適に用いられ得て、本発明の範囲から除外されない。そのような薬理学的および薬学的に許容できる塩は、限定されないが、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製されるものを含む。また、薬学的に許容できる塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩のような、アルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製され得る。
【０１２１】
［医薬組成物］
一態様では、本発明は、抗化学忌避剤および本明細書に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。一実施態様では、組成物は、抗原提示細胞をさらに含む。一実施態様では、抗原提示細胞は、樹状細胞である。一実施態様では、抗原提示細胞は、治療される患者から得られる。一実施態様では、抗原提示細胞は、細胞表面上にＣＸＣＲ４および／またはＣＸＣＲ７を発現する。
【０１２２】
一実施態様では、組成物は、抗原提示細胞を活性化するのに有効量の融合タンパク質を含む。一実施態様では、組成物は、癌の化学忌避効果を減少させるのに有効量の抗化学忌避剤を含む。一実施態様では、組成物は、癌に対してＴ細胞の活性化をもたらすのに有効量の抗原提示細胞を含む。
【０１２３】
一実施態様では、医薬組成物は、注入のために製剤化される。
【０１２４】
一実施態様では、組成物は、薬学的に許容できる賦形剤を含む。許容できる賦形剤は、非毒性であり、投与を助け、特許請求の範囲に記載された化合物の治療的利益に悪影響を及ぼさない。そのような賦形剤は、当業者が一般に利用できる任意の固体、液体、半固体またはガス状の賦形剤であってよい。
【０１２５】
固体の製剤賦形剤は、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、脱脂粉乳などを含む。液体および半固体の賦形剤は、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール、および、石油、動物、植物または合成起源のものを含む様々な油類、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などから選択されてよい。特に注入可能な溶液のための好ましい液体担体は、水、生理食塩水、水性ブドウ糖、およびグリコールを含む。他の適切な調剤賦形剤およびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ編集（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２２ｎｄ  ｅｄ．，２０１３）に記載される。
【０１２６】
樹状細胞および融合タンパク質が、患者に投与された時点で相互作用することを確実にするために、細胞およびタンパク質は、投与の前に組み合わせてよい。一実施態様では、細胞およびタンパク質は、患者への投与のすぐ（例えば、数秒〜１または２時間）前に組み合わされる。
【０１２７】
理論によって拘束されずに、患者への投与の前の抗原提示細胞および抗化学忌避剤の組み合わせは、細胞表面受容体（例えば、ＣＸＣＲ４またはＣＸＣＲ７）への抗化学忌避剤の結合を可能にして、それにより、細胞が腫瘍の化学忌避効果に打ち勝つのを可能にすると考えられる。対照的に、抗化学忌避剤の全身性送達は、体全体にわたるＣＸＣＲ４および／またはＣＸＣＲ７受容体へのその薬剤の無差別な結合をもたらすと考えられる。
【０１２８】
［パーツのキット］
一態様では、本発明は、疾患の治療のためのパーツのキットに関し、キットは、融合タンパク質および抗化学忌避剤を含む。
【０１２９】
一実施態様では、患者における癌、例えば、腫瘍を治療するためのパーツのキットが提供されて、キットは、治療的に有効量の抗化学忌避剤および癌細胞結合構成要素およびストレスタンパク質構成要素を含む融合タンパク質を含み、癌細胞結合構成要素は、癌によって発現される抗原を認識する。
【０１３０】
一実施態様では、抗化学忌避剤は、以前に開示される任意の薬剤であり、例えば、ＡＭＤ３１００またはその誘導体、ＡＭＤ１１０７０（ＡＭＤ０７０とも呼ばれる）、ＡＭＤ１２１１８、ＡＭＤ１１８１４、ＡＭＤ１３０７３、ＦＡＭＤ３４６５、Ｃ１３１、ＢＫＴ１４０、ＣＴＣＥ−９９０８、ＫＲＨ−２７３１、ＴＣ１４０１２、ＫＲＨ−３９５５、ＢＭＳ−９３６５６４／ＭＤＸ−１３３８、ＬＹ２５１０９２４、ＧＳＫ８１２３９７、ＫＲＨ−１６３６、Ｔ−２０、Ｔ−２２、Ｔ−１４０、ＴＥ−１４０１１、Ｔ−１４０１２、ＴＮ１４００３、ＴＡＫ−７７９、ＡＫ６０２、ＳＣＨ−３５１１２５、タンニン酸、ＮＳＣ  ６５１０１６、サリドマイド、ＧＦ  １０９２３０Ｘ、化学忌避ケモカインの二量体化と干渉する抗体、および、化学忌避ケモカインに関する受容体の二量体化と干渉する抗体からなる群より選択される。一実施態様では、抗化学忌避剤は、ＡＭＤ３１００またはその誘導体である。一実施態様では、抗化学忌避剤は、ＡＭＤ３１００である。
【０１３１】
一実施態様では、ストレスタンパク質は、ＨＳＰ７０またはその免疫活性化フラグメントおよび／または改変配列である。一実施態様では、ＨＳＰ７０またはその免疫活性化フラグメントまたは改変配列は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来である。
【０１３２】
一実施態様では、腫瘍結合構成要素は、単鎖抗体、可変ドメイン、または、Ｆａｂドメインである。
【０１３３】
一実施態様では、融合タンパク質および／または抗化学忌避剤は、注入のために製剤化される。
【０１３４】
一実施態様では、融合タンパク質および抗化学忌避剤は、同一の製剤内である。
【０１３５】
一実施態様では、キットは、癌または腫瘍を治療するための指示書をさらに含む。一実施態様では、パーツのキットは、抗化学忌避剤および融合タンパク質の投薬および／または投与のための可読媒体における指示書を含む。
【０１３６】
本明細書において用いられる用語「可読媒体」は、例えばヒトまたは機械によって読み取ることのできるデータの表示を指す。ヒト可読形式の非限定的な例は、パンフレット、インサート、または他の書面形式を含む。機械可読形式の非限定的な例は、機械（例えば、コンピューター、タブレット、および／またはスマートフォン）によって可読な形式で情報を提供する（すなわち、保管および／または伝送する）任意のメカニズムを含む。例えば、機械可読媒体は、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）；ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）；磁気ディスク記憶媒体；光記憶媒体；およびフラッシュメモリ装置を含む。一実施態様では、機械可読媒体はＣＤ−ＲＯＭである。一実施態様では、機械可読媒体はＵＳＢドライブである。一実施態様では、機械可読媒体はクイックレスポンスコード（ＱＲコード）または他のマトリックスバーコードである。
【実施例】
【０１３７】
実施例１．ＶＩＣ−００８融合タンパク質の構築
融合タンパク質ｓｃＦｖ−ＭｔｂＨｓｐ７０は、我々の以前の研究（Ｙｕａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｈｓｐ７０−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｏｎｇｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ＆Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１４；７：１５）に示されている、（Ｇ４Ｓ）３リンカーを間に有する全長ＭｔｂＨｓｐ７０に融合された、抗−ＭＳＬＮ  ｐ４  ｓｃＦｖ（Ｂｅｒｇａｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ  ｂｉｏｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ＣＡ１２５／Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．２００７；２５５（２）：２６３−７４）由来のＶＨおよびＶＬによって構築された。ＶＩＣ−００８が基づく、オリジナルの融合タンパク質ＶＩＣ−００７は、腫瘍保有マウスの生存の延長および腫瘍増殖の有意な制御を達成したが、処置レジメンの抗腫瘍性の有効性は最適でなかった。抗原性ペプチドは、非共有の相互作用を通してＭｔｂＨｓｐ７０に結合して、ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８＋およびＭＨＣクラスＩＩ制限ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の両方を誘発することができる。ｓｃＦｖ−ＭｔｂＨｓｐ７０融合タンパク質の新バージョン、ＶＩＣ−００８が開発されて、それは、余剰アミノ酸の除去、および、単一アミノ酸突然変異の導入、ＭｔｂＨｓｐ７０の３８１位における、バリン（Ｖ）の代わりにフェニルアラニン（Ｆ）によって、オリジナルのＶＩＣ−００７から改変された（図１）。この変更は、ＭｔｂＨｓｐ７０が偶発的に結合してオフターゲット効果または寛容または自己免疫の誘導をもたらし得る他の抗原を送達する可能性を減少させるために、タンパク質の免疫刺激能を維持しながらペプチド結合を防ぐように設計される。
【０１３８】
融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞において、ＷｕＸｉ  Ａｐｐ  Ｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）によって構築および発現されて、ＨＰＬＣによって９５％よりも上の純度および１．０ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンレベルで提供された。ＶＩＣ−００８は、Ｚｅｎｇ  Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｌ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｏｖａｒｉａｎ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｌｉｎ  Ｒｅｓ  ２０１６；３：０５）および米国仮出願番号６２／３０６，１６８においてさらに説明されて、それぞれ、その全体で参照により本明細書中に援用される。
【０１３９】
実施例２．ＶＩＣ−００８は、腫瘍増殖の制御を高める
卵巣癌を、６週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの、同系癌細胞、Ｌｕｃ−ＩＤ８（５×１０６細胞／マウス）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注入によって確立した。全てのマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。マウスを、腫瘍細胞の接種後１週間、毎日観察した。腫瘍の発生は、一貫して、悪性腹水に次ぐ腹部の膨満を介して初めに明らかとなり、腫瘍保有マウスは、毛の逆立ち、速い呼吸速度、猫背の姿勢、活性の減少、および、進行性の腹水形成を含む、苦痛の兆候が存在するエンドポイントにおいて安楽死させた。
【０１４０】
卵巣腫瘍を有するマウスを、ＶＩＣ−００７（４μｇ／マウス）、ＶＩＣ−００８（４μｇ／マウス）、または正常の生理食塩水のｉ．ｐ．注入により、腫瘍細胞接種の７日後に処置した。この後に、７日間隔で３回のさらなる処置を続けた。
【０１４１】
腹腔内腫瘍増殖を、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）によるインビボの生存イメージングを用いて、腫瘍細胞接種後に毎週モニタリングした。マウスは、１５０ｍｇ／ｋｇ体重のＤ−ルシフェリンを１０分前もって腹腔内に注入されて、続いて、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍによってイメージングされた。
【０１４２】
図２Ａ〜２Ｂに示されるように、ＶＩＣ−００７およびＶＩＣ−００８の両方とも、生理食塩水と比較して、生物発光シグナルによって記録されるように、腫瘍増殖を有意に遅くさせて（ｐ＜０．０００１およびｐ＜０．０００１）、一方で、ＶＩＣ−００８は、ＶＩＣ−００７と比較して、腫瘍増殖をさらに有意に遅延させた（ｐ＜０．０００１）。３以上の実験群の間の統計的な違いを、それぞれの群の平均が全ての他の群の平均と比較される場合に、Ｔｗｏ−Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡの後にテューキー多重比較検定を用いて分析した。
【０１４３】
実施例３．ＶＩＣ−００８は、マウス生存の延長を高める
腫瘍保有マウスにおいて生存を延長するＶＩＣ−００７およびＶＩＣ−００８の有効性を、実施例２に記載のように処置したマウスにおいて評価した。
【０１４４】
図３に示されるように、ＶＩＣ−００７およびＶＩＣ−００８の両方とも、生理食塩水と比較して、腫瘍保有マウスの生存を有意に高めて（ｐ＝０．０２５３およびｐ＝０．０００２）、生理食塩水による５５日のメジアン生存からＶＩＣ−００７による６０日に増大し、さらに、ＶＩＣ−００８による６５日に増大した。ＶＩＣ−００８は、ＶＩＣ−００７と比較して、腫瘍保有マウスの生存をさらに有意に延長させた（ｐ＝０．０３０１）。生存は、対数順位検定を用いて分析した。
【０１４５】
合わせると、これらのデータは、融合タンパク質ＶＩＣ−００８の新バージョンは、卵巣癌の同系ミューリンモデルにおいて、腫瘍増殖を有意に遅延させて、生存を延長させることを示した。ＶＩＣ−００７と比較したＶＩＣ−００８の改善されたマウス生存は、タンパク質配列に対してなされた変更に関係すると考えられる。
【０１４６】
実施例４．ＡＭＤ３１００とＶＩＣ−００８の組み合わせ処置は、マウス生存をさらに延長する
中皮腫腫瘍を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの、癌細胞、Ｌｕｃ−４０ＬまたはＬｕｃ−ＡＥ１７のｉ．ｐ．注入によって確立した。１週間後、図４に示されるように、生理食塩水、ＶＩＣ−００８（２０μｇ）、および／またはＡＭＤ３１００（１μｇ／ｇ体重）を１週間に１回、４週間投与した。
【０１４７】
図５（Ｌｕｃ−４０Ｌ）に示されるように、ＶＩＣ−００８は、生理食塩水と比較して、腫瘍保有マウスの生存を有意に高めたが（ｐ＝０．０２１４）、一方で、ＶＩＣ−００８およびＡＭＤ３１００の組み合わせは、生存をさらに高めた（生理食塩水に対してｐ＜０．０００１）。同様の結果が、Ｌｕｃ−ＡＥ１７で観察された（図６）。ＡＭＤ３１００は、生存に対してわずかな効果を有したが、この効果は、この試験において有意性に到達しなかった。
【０１４８】
これらのデータは、ＶＩＣ−００８単独は、中皮腫の両方のモデルにおいて生存を延長させることができて、ＡＭＤ３１００単独は、わずかに生存の利益となることを示す。ＶＩＣ−００８およびＡＭＤ３１００による組み合わせ処置は、中皮腫激増を有意に抑制して、中皮腫腫瘍を有するマウスの生存を延長する。
【０１４９】
実施例５．中皮腫に関するＡＭＤ３１００とＶＩＣ−００８の組み合わせ処置
材料および方法
試薬
融合タンパク質を上述のように構築して、ＣＨＯ細胞においてＷｕＸｉ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）によって発現して、ＨＰＬＣによって９５％よりも上の純度および１．０ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンレベルで提供した。ＡＭＤ３１００は、Ａｂｃａｍ（＃ａｂ１２０７１８）から購入した。
【０１５０】
腫瘍細胞
４０ＬおよびＡＥ１７マウス中皮腫細胞株は、ブラウン大学のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＡｇｎｅｓ  Ｋａｎｅ博士から寄贈された。細胞を、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、および１０％ウシ胎児血清で補充されたＤＭＥＭ中で３７℃にて培養した。
【０１５１】
動物モデル
５週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから取得して、施設のガイドラインおよびポリシーに従ってＭａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＭＧＨ）のノトバイオート動物施設内に維持した。１週の順化後、腫瘍を、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与されたマウスあたり、４×１０６  ４０Ｌ細胞または２×１０６  ＡＥ１７細胞で開始した。それぞれの群由来のマウスのサブセットは、最後の処置の７日後にケタミン（生理食塩水中９ｍｇ／ｍｌ）およびキシラジン（生理食塩水中０．９ｍｇ／ｍｌ）のｉ．ｐ．投与によって安楽死されて、腫瘍、リンパ節および脾臓の免疫プロファイリングのためにサンプル採取された。それぞれの群内の残りの動物を、生存に関してモニターした。生存試験のために、マウスは、腫瘍細胞の接種後毎日観察された。腫瘍の発生は、一貫して、悪性腹水に次ぐ腹部の膨満の出現を介して初めに明らかとなり、腫瘍保有マウスは、毛の逆立ち、速い呼吸速度、猫背の姿勢、活性の減少、および、進行性の腹水形成を含む、苦痛の兆候が存在するエンドポイントにおいて安楽死させた。
【０１５２】
トランスジェニックＴ−Ｒｅｄ／ＦｏｘＰ３  ＧＦＰマウス由来の脾細胞を、以下に記載されるように細胞ソーティングによる蛍光タグ化Ｔｒｅｇ細胞のソースとして用いた。Ｔ−Ｒｅｄ／ＦｏｘＰ３  ＧＦＰマウスは、Ｔ−ｒｅｄマウスをＦｏｘＰ３  ＧＦＰマウスと交雑することによって生産されたトランスジェニックマウスの完全に戻し交雑されたＣ５７ＢＬ／６株である。Ｔ−ｒｅｄマウスは、ネガティブコントロールエレメントを欠くように改変されたＣＤ４プロモーターの制御下でｄｓＲｅｄＩＩを発現し、それにより、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方における発現を可能にする。ＦｏｘＰ３  ＧＦＰマウスでは、ＧＦＰは、過剰発現を防ぐためにＦｏｘＰ３に対して内部欠失を有するＦｏｘＰ３プロモーターの制御下から発現される。全ての動物試験は、ＭＧＨの動物実験委員会によって承認された。
【０１５３】
処置
腫瘍接種の７日後に開始して、処置は、１週間に１回、連続する４週間、ｉ．ｐ．注入によって投与された。ＶＩＣ−００８は、１週間に１回、マウスあたり、１００μｌの生理食塩水中２０μｇで、ｉ．ｐ．投与されて、ＡＭＤ３１００は、１００μｌの生理食塩水中１ｍｇ／ｋｇ体重で、ｉ．ｐ．注入によって１週間に１回与えられた。
【０１５４】
フローサイトメトリーによる免疫プロファイリング
腫瘍は、滅菌レーザー刃を用いて機械的に分解されて、４０Ｌ腫瘍についてコラゲナーゼタイプＩＶまたはＡＥ１７腫瘍についてタイプＩ（２ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）、ＤＮａｓｅ（０．１ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）、ヒアルロニダーゼ（０．１ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）、およびＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）を用いて、ＲＰＭＩ  １６４０中で、３７℃で２時間消化された。細胞懸濁液を１００μｍフィルターに通して、凝集体を除去した。リンパ節および脾臓をすり潰して、４０μｍストレーナーを通して濾過した。染色バッファー（＃４２０２０１，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて細胞を洗浄して、表面マーカーに関してコンジュゲート抗体を用いて染色した。合計の生存細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，＃Ｌ２３１０５）によって決定した。
【０１５５】
細胞内サイトカイン検出のために、表面マーカーの染色後に、細胞を固定して、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（＃４２４４０１）またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（＃００−５５２１−００）由来の固定化／透過化試薬を用いて透過処理して、細胞内マーカーに関してコンジュゲート抗体を用いて染色した。
【０１５６】
ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ由来のコンジュゲート抗体は、以下のとおりであった：ＣＤ４０Ｌ（クローンＭＲ１）、およびＰＤ−１（クローンＪ４３）。以下のコンジュゲート抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した：ＣＤ３（クローン１７Ａ２）、ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）、ＣＤ８ａ（クローン５３−６．７）、Ｆｏｘｐ３（クローンＭＦ−１４）、ＩＬ−２（クローンＪＥＳ６−５Ｈ４）、およびＩＦＮ−γ（クローンＸＭＧ１．２）。ＣＤ２５（クローンＰＣ６１）抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来であった。
【０１５７】
フローサイトメトリー分析を、ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行なった。ゲート戦略を、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｎｕｓ  Ｏｎｅによって決定した。流れのデータをＦｌｏｗＪｏ  Ｖ１０（ＴｒｅｅＳｔａｒ）によって分析した。
【０１５８】
脾細胞のエクスビボ培養およびサイトカイン検出
脾細胞を、すり潰された脾臓から採取して、４０μｍ細胞ストレーナーを通して濾過して、赤血球溶解バッファーによって処理した。２×１０６脾細胞を、Ｌ−グルタミンで補充されたＲＰＭＩ  １６４０培地中、２４ウェルプレート内にウェルあたり置いて、２μｇ／ｍｌの組み換えマウスメソテリン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，＃５９４００６）を用いて７２時間刺激した。最後の５時間中に、ブレフェルジンＡおよびＭｏｎｅｓｉｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，＃４２０６０１および＃４２０７０１）を培養培地に加えた。それから、脾細胞を採取して、サイトメトリー分析に関して対応する抗体を用いて細胞内サイトカイン染色を行なった。
【０１５９】
Ｔｒｅｇ細胞のインビトロ再プログラミング
ｒＧＨ−ｆｆＬｕｃ−ｅＧＦＰトランスジェニックマウスは、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞において、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する。脾臓をこれらのマウスから集めて、すり潰して、４０μｍストレーナーを通して濾過した。ＣＤ４＋脾細胞由来のＧＦＰ−Ｆｏｘｐ３を発現している細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でソートして、それから、抗−ＣＤ３／ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ）の存在または不存在下で２４時間、ＡＭＤ３１００（５μｇ／ｍｌ）に曝した。最後の５時間中に、ブレフェルジンＡおよびＭｏｎｅｓｉｎ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，＃４２０６０１および＃４２０７０１）を培養培地中に加えた。それから、細胞を採取して、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ２５、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ−２およびＣＤ４０Ｌに特異的なコンジュゲート抗体によって染色して、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１６０】
統計分析
ｐ値はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６によって計算した。別段の記載がない限り、群の間を比較するためのｐ値は、ダネット多重比較検定によるＯｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡまたはウェルチの補正による独立ｔ検定によって得られた。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法および対数順位検定を用いて、群の間の生存を比較した。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意と考えられる。データは、平均±ＳＥＭとして表される。
【０１６１】
結果
ＡＭＤ３１００およびＶＩＣ−００８による併用療法は、腫瘍制御およびマウス生存を増大させる
２つの腹腔内悪性中皮腫モデルを、同系４０ＬおよびＡＥ１７細胞株を別個に用いて免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて確立した。ここで、中皮腫保有マウスにおける腫瘍増殖および動物生存に対するＡＭＤ３１００およびＶＩＣ−００８の効果は、単独または組み合わせで用いて試験された。ＶＩＣ−００８単独（２０μｇ／マウス）によって処置された動物では、４０ＬおよびＡＥ１７モデルの両方において、生理食塩水コントロール処置と比較して、最後の処置の１週間後に集められた腹腔内腫瘍の合計重量が一般に減少して（図７Ａ〜７Ｂ）、動物生存が有意に延長された（図７Ｃ−７Ｄ）（それぞれ、Ｐ＜０．０１およびＰ＜０．０１）。１ｍｇ／ｋｇのマウス体重でのＡＭＤ３１００単独は、生理食塩水コントロール処置と比較して、４０ＬおよびＡＥ１７マウスＭＭモデルの両方において、生存に対するほんのわずかな利益を与えた。しかしながら、ＶＩＣ−００８およびＡＭＤ３１００による組み合わせの処置は、４０ＬおよびＡＥ１７モデルの両方において、生理食塩水コントロールと比較して、腫瘍制御を有意に高めて（それぞれ、Ｐ＜０．０００１およびＰ＜０．００１）、動物生存を延長させた（それぞれ、Ｐ＜０．０００１およびＰ＜０．０００１）。さらに、組み合わせの処置は、４０ＬおよびＡＥ１７モデルの両方において、ＶＩＣ−００８単剤療法と比較して、腫瘍増殖の阻害（それぞれ、Ｐ＜０．００１およびＰ＜０．０５）およびマウス生存の延長（それぞれ、Ｐ＜０．０００１およびＰ＜０．００１）に対するさらに有意に改善された抗腫瘍有効性を示した。これらのデータは、組み合わされると、ＡＭＤ３１００は、いずれかの薬剤による単剤療法と比較して、４０ＬおよびＡＥ１７  ＭＭマウスモデルの両方において、ＶＩＣ−００８の抗腫瘍効果を有意に高めることを示唆する。
【０１６２】
ＶＩＣ−００８は、脾臓、リンパ節および腫瘍におけるリンパ球浸潤を増大させる
脾臓、腋窩リンパ節および鼡径リンパ節、および腹腔内腫瘍を、最後の処置の１週間後に腫瘍保有マウスから集めた。単一細胞をこれらの組織から調製して、フローサイトメトリーによって分析した（図８Ａ）。４０ＬおよびＡＥ１７モデルの両方に関して脾臓（それぞれ、Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．０５）および腫瘍（それぞれ、Ｐ＜０．０１およびＰ＜０．０１）から、および、ＡＥ１７モデルにおいてリンパ節（Ｐ＜０．０１）から、回収された合計の生存細胞中のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、生理食塩水コントロール群におけるものと比較して、ＶＩＣ−００８処置群において有意に増大した（図８Ｂ〜８Ｆ）。ＶＩＣ−００８およびＡＭＤ３１００の組み合わせ処置群では、４０ＬおよびＡＥ１７モデルの両方に関して脾臓（それぞれ、Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．０５）および腫瘍（それぞれ、Ｐ＜０．０１およびＰ＜０．０５）から、および、ＡＥ１７モデルにおいてリンパ節（Ｐ＜０．００１）から、回収された合計の生存細胞中のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、生理食塩水コントロール群におけるものと比較して有意に増大した。ＡＭＤ３１００処置は、これらの組織におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を増大させなかった。さらに、ＶＩＣ−００８および組み合わせ処置群の間でＣＤ８＋Ｔ細胞の割合に違いはなく、ＶＩＣ−００８が、これらの組織のリンパ球浸潤を増大させることを示唆した。
【０１６３】
ＶＩＣ−００８は、腫瘍抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を高める
次に、腫瘍保有マウス由来の脾臓およびリンパ節から単離された単一細胞を、エクスビボで組み換えメソテリンによって再刺激して、ＣＤ８＋Ｔ細胞における細胞内ＩＦＮ−γを分析した。４０Ｌ（Ｐ＜０．００１）およびＡＥ１７（Ｐ＜０．００１）モデルの両方における脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞中およびＡＥ１７モデル（Ｐ＜０．０１）におけるリンパ節ＣＤ８＋Ｔ細胞中のメソテリン特異的なＩＦＮ−γ発現は、生理食塩水によって処置されたマウスにおけるものと比較して、ＶＩＣ−００８単独で処置されたマウスにおいて有意に高かった（図９Ａ〜９Ｄ）。ＶＩＣ−００８およびＡＭＤ３１００の組み合わせ処置群では、４０Ｌ（Ｐ＜０．０１）およびＡＥ１７（Ｐ＜０．０１）モデルの両方における脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞中およびＡＥ１７モデル（Ｐ＜０．００１）におけるリンパ節ＣＤ８＋Ｔ細胞中のメソテリン特異的なＩＦＮ−γ発現は、生理食塩水によって処置されたマウスにおけるものと比較して有意に高かった。ＡＭＤ３１００処置はそれ自体、ＣＤ８＋Ｔ細胞における抗原特異的なＩＦＮ−γ分泌を高めなかった。合わせると、これらのデータは、４０ＬおよびＡＥ１７中皮腫マウスモデルの両方において、ＶＩＣ−００８処置が抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を高めるという見解を支持する。
【０１６４】
ＡＭＤ３１００は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ−１発現を低減させる
次に、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のプログラム化された細胞死タンパク質−１（ＰＤ−１）の発現を、脾臓、腫瘍およびリンパ節において評価した。４０ＬおよびＡＥ１７腫瘍保有マウスの両方における脾臓中およびＡＥ１７マウスに関するリンパ節中のＰＤ−１を発現しているＣＤ８＋Ｔ細胞の割合に、ＶＩＣ−００８処置群および生理食塩水コントロール群の間で有意差は無かった（図１０Ａ〜１０Ｃ）。著しい対照において、生理食塩水によって処置されたコントロールと比較して、ＶＩＣ−００８処置群における有意により多い腫瘍内のＣＤ８＋Ｔ細胞が、４０Ｌ腫瘍（Ｐ＜０．０５）およびＡＥ１７腫瘍（Ｐ＜０．０１）においてＰＤ−１を発現した（図１０Ｄ〜１０Ｅ）。ＰＤ−１を発現しているＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、脾臓およびリンパ節におけるたった５〜１０％と比較して、４０Ｌ腫瘍およびＡＥ１７腫瘍においてそれぞれ４３〜７６％および２８〜４７％の範囲であった。これらのデータは、ＶＩＣ−００８処置によって誘導される腫瘍環境におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の抗腫瘍活性が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１パスウェイの活性化によって妨げられ得ることを示す。
【０１６５】
ＶＩＣ−００８のこの効果と比較して、驚くべきことに、ＡＭＤ３１００は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ−１発現を減少させることが見いだされた。ＡＭＤ３１００処置単独は、生理食塩水によって処置されたマウスにおけるよりも、４０ＬおよびＡＥ１７腫瘍保有マウスの両方において脾臓（それぞれ、Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．０１）および腫瘍（それぞれ、Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．０５）において、および、ＡＥ１７マウスに関してリンパ節において（Ｐ＜０．０１）、有意に少ないＰＤ−１発現ＣＤ８＋Ｔ細胞をもたらした。ＡＭＤ３１００およびＶＩＣ−００８の組み合わせ処置群では、生理食塩水によって処置されたコントロールと比較して、有意により少ないＣＤ８＋Ｔ細胞が、１４０ＬおよびＡＥ１７腫瘍保有マウスの両方において脾臓（それぞれＰ＜０．０５およびＰ＜０．０１）および腫瘍（それぞれ、Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．０５）において、および、ＡＥ１７マウスに関してリンパ節（Ｐ＜０．０１）において、ＰＤ−１を発現した。ＡＭＤ３１００単剤療法およびＡＭＤ３１００−ＶＩＣ−００８併用療法の群の間で、これらの組織中のＰＤ−１を発現しているＣＤ８＋Ｔ細胞の割合に有意差はなかった。これらのデータは、ＡＭＤ３１００が、脾臓、リンパ節および腫瘍においてＣＤ８＋Ｔ細胞がＰＤ−１を発現するのを阻害することができることを示唆した。
【０１６６】
ＡＭＤ３１００は、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ細胞を減少させる
次に、Ｔｒｅｇ細胞に対するＡＭＤ３１００の影響を評価した。ＡＭＤ３１００は、４０Ｌ腫瘍保有マウスの脾臓中に見られるＴｒｅｇ細胞の割合を変化させなかった（図１１Ａ〜１１Ｂ）。ＡＥ１７腫瘍保有マウスでは、ＡＭＤ３１００単独は、リンパ節中のＴｒｅｇを一般に減少させて（図１１Ｃ）、ＡＭＤ３１００は、単独またはＶＩＣ−００８と組み合わせて、生理食塩水処置と比較して、Ｔｒｅｇ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞比を有意に増大させた（それぞれ、Ｐ＜０．０１およびＰ＜０．０００１）（図１１Ｄ）。４０ＬおよびＡＥ１７モデル由来の腫瘍では、両方とも、単剤療法として適用されたＡＭＤ３１００は、生理食塩水処置と比較して、Ｔｒｅｇの割合を有意に低減させて（それぞれ、Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．０１）、Ｔｒｅｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比を増大させた（それぞれ、Ｐ＜０．００１およびＰ＜０．０１）（図１１Ｅ〜１１Ｆ）。ＡＭＤ３１００およびＶＩＣ−００８の組み合わせの処置群では、４０ＬおよびＡＥ１７モデルの両方において、生理食塩水処置と比較して、Ｔｒｅｇの割合は有意に低減して（それぞれ、Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．０５）、Ｔｒｅｇに対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比は増大した（それぞれ、Ｐ＜０．００１およびＰ＜０．０００１）。これらの２つのミューリン中皮腫モデルでは、ＡＭＤ３１００は、腫瘍内のＴｒｅｇ浸潤を減少させた。
【０１６７】
ＡＭＤ３１００は、Ｔヘルパー表現型に向けてＴｒｅｇ細胞を調整する
ＡＭＤ３１００は、単独またはＶＩＣ−００８と組み合わせて、４０Ｌ（図１２Ａ、それぞれ、Ｐ＜０．０１およびＰ＜０．００１）およびＡＥ１７（図１２Ｂ、それぞれ、Ｐ＜０．００１およびＰ＜０．０１）モデルにおけるリンパ節の両方において、Ｆｏｘｐ３＋集団内のＣＤ２５＋細胞に対するＣＤ２５−細胞の比を有意に増大させることが観察された。Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５−Ｔｒｅｇ集団中、有意により多くの細胞が、ＡＭＤ３１００単剤療法およびＶＩＣ−００８との併用療法後に表現型的にＩＬ−２＋ＣＤ４０Ｌ＋であり（図１２Ｃ〜１２Ｅ）、Ｔｒｅｇ細胞からＦｏｘｐ３を失わずにＣＤ２５を失っているヘルパー様細胞への変化を示唆した（それらの免疫抑制機能を失っていてよい）。ＡＭＤ３１００単剤療法および併用療法群の間で、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ２５−Ｔｒｅｇ集団中のＩＬ−２＋ＣＤ４０Ｌ＋細胞の割合に違いはなく、ＡＭＤ３１００処置が、ヘルパー様細胞へのＴｒｅｇの再プログラミングの主な駆動体であり得ることを示唆した。
【０１６８】
ＡＭＤ３１００によって駆動されるＴｒｅｇ表現型の調節は、ＴＣＲ活性化を必要とする
次に、ＡＭＤ３１００によって駆動されるＴｒｅｇ調節が、単離された単一細胞において開始され得るかどうか取り組んだ。Ｔ−Ｒｅｄ／ＦｏｘＰ３  ＧＦＰトランスジェニックマウスにおいてＣＤ４＋脾細胞からＧＦＰ−Ｆｏｘｐ３を発現している細胞をソートして、ＡＭＤ３１００によってインビトロで処置した。ＡＭＤ３１００処置単独は、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋集団中のＣＤ２５＋細胞に対するＣＤ２５−細胞の割合の比を変化させなかった（図１３Ａ〜１３Ｂ）。しかしながら、ＴＣＲ活性化をトリガーするための抗−ＣＤ３／ＣＤ２８抗体による刺激の存在下では、ＡＭＤ３１００処置は、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋集団中のＣＤ２５＋細胞に対するＣＤ２５−細胞の割合の比を有意に増大させて（図１３Ｃ〜１３Ｄ、Ｐ＝０．００１７）、より多くのＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５−ＴｒｅｇをＩＬ−２＋ＣＤ４０Ｌ＋細胞に変換した（図１３Ｅ−１３Ｆ、Ｐ＝０．００１５）。これらのデータは、ヘルパー様細胞へのＴｒｅｇ細胞の変換が、ＴＣＲ活性化の際の単一細胞のＡＭＤ３１００処置によって仲介され得ることを示唆した。
【０１６９】
前述は本発明の例示であり、その限定と解釈されるべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって定義されて、特許請求の範囲の等価物はその中に含まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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