(57)【要約】  本開示は、細胞を２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグと接触させることを含む、ＴＰ５３野生型癌細胞の増殖を阻害するための方法および戦略を提供する。また、それを必要とする対象において野生型ＴＰ５３を有することを特徴とする癌を治療するための関連方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＰ５３野生型癌細胞を、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグ、または２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグおよび薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物と接触させることを含む、ＴＰ５３野生型癌細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２】
前記２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグが、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグのシリル化化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグが、３’，５’−ジ（トリメチルシリル）−２’，２’−ジフルオロ−アザ−２’−デオキシシチジンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコフェロールリン酸プロドラッグである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プロドラッグが、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコトリエノールリン酸プロドラッグである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記癌細胞が固形腫瘍、好ましくは固形腫瘍癌である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記固形腫瘍が、非小細胞肺ＮＳＣＬ、結腸、腎臓、中枢神経系ＣＮＳ、メラノーマ、卵巣、前立腺、膵臓および乳癌から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記癌細胞が血液悪性腫瘍、好ましくは白血病、リンパ腫または多発性骨髄腫に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞がインビトロで存在する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が被験体においてインビボであり、有効量の２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグが被験体に投与され、好ましくは、被験体がヒトである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグ、または２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグおよび薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物の治療的有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、野生型ＴＰ５３を有することを特徴とする癌の治療方法。
【請求項１２】
前記２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグが、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグのシリル化化合物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、３’，５’−ジ（トリメチルシリル）−２’，２’−ジフルオロ−アザ−２’−デオキシシチジンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコトリエノールリン酸プロドラッグである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコトリエノールリン酸プロドラッグである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記癌が固形腫瘍、好ましくは固形腫瘍癌である、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記固形腫瘍癌は、非小細胞肺ＮＳＣＬＣ、結腸、腎臓、中枢神経系ＣＮＳ、メラノーマ、卵巣、腎臓、前立腺、膵臓および乳癌から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌が血液悪性腫瘍、好ましくは白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象がヒトである、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ＴＰ５３野生型癌細胞の増殖を阻害するための、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグ、または２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグおよび薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物の使用。
【請求項２１】
２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグが、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグシリル化化合物である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、３’，５’−ジ（トリメチルシリル）−２’，２’−ジフルオロ−アザ−２’−デオキシシチジンである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
前記２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコトリエノールリン酸プロドラッグである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２４】
前記プロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコトリエノールリン酸プロドラッグである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２５】
前記癌細胞が固形腫瘍、好ましくは固形腫瘍癌である、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
前記固形腫瘍癌は、非小細胞肺ＮＳＣＬ、結腸、腎臓、中枢神経系ＣＮＳ、メラノーマ、卵巣、前立腺、膵臓および乳癌から選択される、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記癌細胞が血液悪性腫瘍、好ましくは白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫に由来する、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
前記細胞がインビトロである、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記細胞が被験体においてインビボであり、有効量の２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグを被験体に投与され、好ましくは、被験体はヒトである、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
野生型ＴＰ５３を有することを特徴とする癌を治療するための、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグ、または２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグおよび薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物の使用。
【請求項３１】
前記２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグが、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグシリル化化合物である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、３’，５’−ジ（トリメチルシリル）−２’，２’−ジフルオロ−アザ−２’−デオキシシチジンである、請求項３０に記載の使用。 
【請求項３３】
前記２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコトリエノールリン酸プロドラッグである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３４】
前記プロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコトリエノールリン酸プロドラッグである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３５】
前記癌が固形腫瘍、好ましくは固形腫瘍癌である、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
前記固形腫瘍癌は、非小細胞肺ＮＳＣＬＣ、結腸、腎臓、中枢神経系ＣＮＳ、メラノーマ、卵巣、腎臓、前立腺、膵臓および乳癌から選択される、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記癌が血液悪性腫瘍、好ましくは白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３８】
前記被験体がヒトである、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年２月２６日に出願された米国仮出願第６２／３００．６５５号の利益を主張し、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
異常なＤＮＡメチル化は、腫瘍形成を抑制する遺伝子の発現を不活性化するエピジェネティックなメカニズムである。関与する遺伝子には、腫瘍抑制遺伝子が含まれる。アポトーシス、転移および血管新生を抑制する遺伝子；ＤＮＡを修復する遺伝子；および腫瘍関連抗原を発現する遺伝子が含まれる。サイレンシング遺伝子発現の分子機構は、５−メチルシトシン結合タンパク質が転写因子の作用をブロックするメチル化プロモーターに結合するためであると思われる。
【背景技術】
【０００３】
このエピジェネティックな変化は可逆的であるため、化学療法介入の有望な標的となる。例えば、腫瘍抑制遺伝子ＴＰ５３は、ヒトの癌発達および進行を防止する上で極めて重要であり、しばしば「ゲノムの保護者」と呼ばれる。コードする遺伝子の突然変異は、すべてのタイプのヒト癌（いわゆるＴＰ５３ヌルまたは突然変異体）の約５０％で検出される。ＴＰ５３（ＴＰ５３ＷＴ）の野生型のままで残っている残りの癌は、しばしば、翻訳後のメカニズムおよびＤＮＡメチル化のようなエピジェネティックな修飾のような、関連するｐ５３タンパク質の発現、安定性および／または機能性に影響を及ぼす改変を有する。これらの修飾により、ｐ５３タンパク質は、ＴＰ５３ ＷＴ癌においてさえもしばしば不活性化されるが、これは、ｐ５３タンパク質が、そうでなければ癌細胞に有害な細胞増殖停止、アポトーシス、誘引または老化を引き起こし、ｐ５３タンパク質も細胞移動、代謝、または血管新生であり、そうでなければ癌細胞の進行および転移に有利であろう。ＴＰ５３が経時的に突然変異を起こし、不活性ｐ５３タンパク質を介した癌の積極性を高めることができることを考えると、ＴＰ５３ ＷＴ癌は早期介入療法の有用な標的である。
【０００４】
いくつかのピリミジン類似体が、新生物、より詳細には癌の治療について試験されている。５−アザシチジンは、新生物の治療のためにＦＤＡによって承認された最初の低メチル化剤であり、デオキシ類似体、５−アザデオキシシチジンまたはデシタビンは、ＴＰ５３のような腫瘍抑制遺伝子のメチル化を予防または逆転させることと同じ表示でその後直ちに承認された。両薬剤とも、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）患者の半数以上で寛解または臨床的改善をもたらす。応答の特徴には、複数の治療サイクル、遅い応答、および実際のクローン除去の要件が含まれます。治療の最適化には、（１）細胞傷害性よりも低メチル化に有利な用量を減少させること、（２）投与スケジュールを延長すること、および（３）細胞毒性に達することなく用量強度を増加することが含まれてきた。分子的に、低メチル化および遺伝子再活性化が示されており、応答に必要と思われる。ＭＤＳのデータは、エピジェネティック療法の原理の証明である。この治療法は効果的であり、何人かの患者において完全な反応が数ヶ月から数年間続いているにもかかわらず、患者の大部分において耐性が発現しているようであり、耐性の機序は不明である。しかしながら、デシタビンはＴＰ５３ヌル細胞においてＴＰ５３ ＷＴ細胞よりも多くのアポトーシスを誘導することが報告されている。これらの結果は、デシタビンによるＤＮＡメチル化の部分的阻害が、ＷＴ細胞ではなく、ＴＰ５３欠損細胞では致死を引き起こすという仮説を提起している。
【０００５】
ゲムシタビンは、膵臓癌の一次治療として、および他の固形腫瘍の併用療法として承認されている。それはＤＮＡ合成の阻害剤であり、ＮＵＣ０１３に最も関連して、ゲムシタビン二リン酸はリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）を阻害する。ＲＮＲの阻害は、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）を含むデオキシヌクレオチドの濃度を低下させる。ゲムシタビン三リン酸がｄＣＴＰとＤＮＡの取り込みに競合するので、ｄＣＴＰの細胞内濃度の低下はゲムシタビン三リン酸のＤＮＡへの取り込みを増強する（自己増強として記載されてきたメカニズム）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本技術分野における進歩にもかかわらず、癌細胞における有害なエピジェネティックな改変の影響を改善することにより、腫瘍抑制遺伝子の不活性化に対処する早期介入戦略が必要とされている。本開示は、このことおよび関連するニーズに対処する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この要約は、以下の詳細な説明でさらに説明される実施形態の選択を導入するために提供される。 この要約は、特許請求された主題の主な特徴を特定することを意図するものではなく、特許請求された主題の範囲を決定するための唯一の部分として使用されることも意図していない。本発明の化合物、組成物、方法および使用のさらなる目的および特徴は、例示的な実施形態の以下の非限定的な説明を読むことにより明らかになるが、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０００８】
一実施形態において、ＴＰ５３野生型癌細胞の増殖を阻害する方法が提供され、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグ、または２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグおよび薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物により、前記ＴＰ５３野生型癌細胞と接触させることを含む。
【０００９】
一実施形態では、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグが、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグのシリル化化合物である、そこに記載された方法が提供される。
【００１０】
一実施形態では、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグが、３’，５’−ジ（トリメチルシリル）−２’，２’−ジフルオロ−アザ−２’−デオキシシチジンである、そこに記載された方法が提供される。
【００１１】
一実施形態では、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコフェロールリン酸プロドラッグである、そこに記載された方法が提供される。
【００１２】
一実施形態では、プロドラッグが２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコトリエノールリン酸プロドラッグである、そこに記載された方法が提供される。
【００１３】
一実施形態では、癌細胞が固形腫瘍、好ましくは固形腫瘍の癌に由来する、そこに記載された方法が提供される。一実施形態では、固形腫瘍癌は、非小細胞肺ＮＳＣＬ、結腸、腎臓、中枢神経系ＣＮＳ、メラノーマ、卵巣、前立腺、膵臓および乳癌から選択される、そこに記載された方法が提供される。
【００１４】
一実施形態では、癌細胞が血液悪性腫瘍、好ましくは白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫に由来する、そこに記載の方法が提供される。一実施形態では、細胞がインビトロで存在する、そこに記載の方法が提供される。
【００１５】
一実施形態では、細胞が被験体においてインビボであり、有効量の２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグが被験体に投与され、好ましくは、被験体がヒトである、そこに記載の方法が提供される。
【００１６】
野生型ＴＰ５３を有することを特徴とする癌の治療方法は、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグ、または２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグおよび薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物の治療的有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００１７】
一実施形態では、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグが、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグのシリル化化合物である、そこに記載の方法が提供される。
【００１８】
一実施形態では、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、３’，５’−ジ（トリメチルシリル）−２’，２’−ジフルオロ−アザ−２’−デオキシシチジンである、そこに記載の方法が提供される。
【００１９】
一実施形態では、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコトリエノールリン酸プロドラッグである、そこに記載の方法が提供される。
【００２０】
一実施形態では、プロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコトリエノールリン酸プロドラッグである、そこに記載の方法が提供される。
【００２１】
一実施形態では、癌が固形腫瘍、好ましくは固形腫瘍癌である、そこに記載の方法が提供される。一実施形態では、固形腫瘍癌は、非小細胞肺ＮＳＣＬＣ、結腸、腎臓、中枢神経系ＣＮＳ、メラノーマ、卵巣、腎臓、前立腺、膵臓および乳癌から選択される。
【００２２】
一実施形態では、癌が血液悪性腫瘍、好ましくは白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である、そこに記載の方法が提供される。
【００２３】
一実施形態では、被験体がヒトである、そこに記載の方法が提供される。
【００２４】
一実施形態では、ＴＰ５３野生型癌細胞の増殖を阻害するための、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグ、または２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグおよび薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物の使用が提供される。
【００２５】
一実施形態では、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグが、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグシリル化化合物である、そこに記載の使用が提供される。
【００２６】
一実施形態では、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、３’，５’−ジ（トリメチルシリル）−２’，２’−ジフルオロ−アザ−２’−デオキシシチジンである、そこに記載の使用が提供される。
【００２７】
一実施形態では、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコトリエノールリン酸プロドラッグである、そこに記載の使用が提供される。
【００２８】
一実施形態では、プロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコトリエノールリン酸プロドラッグである、そこに記載の使用が提供される。
【００２９】
一実施形態では、癌細胞が固形腫瘍、好ましくは固形腫瘍癌である、そこに記載される使用が提供される。一実施形態では、固形腫瘍癌は、非小細胞肺ＮＳＣＬ、結腸、腎臓、中枢神経系ＣＮＳ、メラノーマ、卵巣、前立腺、膵臓および乳癌から選択される。
【００３０】
一実施形態では、癌細胞が血液悪性腫瘍、好ましくは白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫に由来する、そこに記載される使用が提供される。
【００３１】
一実施形態では、細胞がインビトロである、そこに記載される使用が提供される。
【００３２】
一実施形態では、細胞が被験体においてインビボであり、有効量の２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグを被験体に投与され、好ましくは、被験体はヒトである、そこに記載される使用が提供される。
【００３３】
一実施形態では、野生型ＴＰ５３を有することを特徴とする癌を治療するための、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグ、または２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグおよび薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物の使用が提供される。
【００３４】
一実施形態では、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグが、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグシリル化化合物である、そこに記載される使用が提供される。
【００３５】
一実施形態では、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、３’，５’−ジ（トリメチルシリル）−２’，２’−ジフルオロ−アザ−２’−デオキシシチジンである、そこに記載の使用が提供される。
【００３６】
一実施形態では、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコトリエノールリン酸プロドラッグである、そこに記載の使用が提供される。
【００３７】
一実施形態では、プロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコトリエノールリン酸プロドラッグである、そこに記載の使用が提供される。
【００３８】
一実施形態では、癌が固形腫瘍、好ましくは固形腫瘍癌である、そこに記載の使用が提供される。
【００３９】
一実施形態では、固形腫瘍癌は、非小細胞肺ＮＳＣＬＣ、結腸、腎臓、中枢神経系ＣＮＳ、メラノーマ、卵巣、腎臓、前立腺、膵臓および乳癌から選択される、そこに記載の使用が提供される。
【００４０】
一実施形態では、癌が血液悪性腫瘍、好ましくは白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である、そこに記載の使用が提供される。
【００４１】
一実施形態では、被験体がヒトである、そこに記載の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
本発明の前述の態様および付随する多くの利点は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を参照することにより、よりよく理解されるようになるにつれて、より容易に理解されるであろう。
【図１】図１は、デシタビンまたはＮＵＣ０１３に由来するＴＰ５３ ＷＴ結腸癌細胞株Ｌｓｌ７４Ｔの増殖阻害の比較を図式的に示す。
【図２】図２は、デシタビンまたはＮＵＣ０１３に由来するＴＰ５３ ＷＴ結腸癌細胞株ＬｏＶｏの増殖阻害の比較を図式的に示す。
【図３】図３は、腫瘍移植後の腫瘍体積を時間の関数として示す。各グラフ上の最初のデータポイントは、研究薬物治療開始日におけるものである。値は±標準偏差である。Ａ：ＮＵＣ０１３  ２０ｍｇ／ｋｇ対対照生理食塩水のＨＬ−６０比較。Ｂ：ＮＵＣ０１３  ２０ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇ対対照生理食塩水のＬｏＶｏ比較。
【００４３】
本開示は、フッ素化ピリミジン類似体、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジン（「ＮＵＣ０１３」とも呼ばれる）、またはそのプロドラッグバージョンを用いてＴＰ５３野生型癌に対処する治療戦略を提供する。この開示は、多くのＴＰ５３ヌル／突然変異細胞の治療においてＮＵＣ０１３が関連するピリミジン類似体デシタビンとして有意に活性であるが、ＮＵＣ０１３はＴＰ５３野生型細胞の治療においてさらに重要であるという驚くべき発見に基づいている。 さらに、ＮＵＣ０１３およびそのプロドラッグＮＵＣ０４１はＴＰ５３ ＷＴ癌の異種移植モデルにおいてデシタビンよりも毒性が低く、同様の組成物よりもＮＵＣ０１３の驚くべき利点をさらに証明している。
【００４４】
したがって、一態様において、本開示は、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグをＴＰ５３野生型癌細胞と接触させることを含む、ＴＰ５３野生型癌細胞の成長を阻害する方法を提供する。
【００４５】
ＴＰ５３野生型癌細胞
【００４６】
本明細書で使用される「ＴＰ５３野生型」または「ＴＰ５３ ＷＴ」という用語は、野生型ｐ５３タンパク質をコードする配列を有する１つまたは複数の遺伝子を含む細胞を指す。一実施形態では、ＴＰ５３ ＷＴは、野生型ｐ５３タンパク質をコードする配列を有する少なくとも１つの遺伝子を有する細胞を指す。別の実施形態では、ＴＰ５３ ＷＴは、野生型ｐ５３タンパク質をコードする配列を有する遺伝子についてホモ接合体である細胞を指す。
【００４７】
そのＴＰ５３遺伝子配列の細胞の状態は、当業者が既知の技術を用いて容易に決定することができる。ＴＰ５３遺伝子またはその相同体の配列は公知である。例えば、ヒトにおいて、典型的な野生型ＴＰ５３転写物の配列は、ジェンバンク（Genbank）エントリーＮＭ＿００１２７６７６１に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。「ＴＰ５３ヌル」は、ｐ５３の発現の欠如をもたらすＴＰ５３遺伝子の突然変異または他の配列変異体を含む細胞であり、「ＴＰ５３突然変異体」細胞は突然変異または他の変異体の発現を含む。本明細書に示すように、全タイプのヒト癌の約５０％がＴＰ５３遺伝子（ＴＰ５３ヌル／突然変異体）において突然変異を有する。ＴＰ５３ ＷＴ癌では、細胞がＷＴ ｐ５３タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を有するが、遺伝子は、例えばＤＮＡメチル化によってサイレンシングされ得るか、またはｐ５３タンパク質の機能および安定性が、例えば、翻訳後メカニズムを介して廃止され得る。ｐ５３タンパク質はしばしば、細胞増殖停止、アポトーシス、遊走、または老化におけるその役割を考慮して、癌において不活性化され、それは癌細胞およびそれらの進行および／または転移能に有害な細胞移動、代謝または血管新生を妨げる。例えば、Zhang Qら「癌治療のためのｐ５３−ＭＤＭ２−ＭＤＭＸループの標的化」Subcell Biochem，85：281-319（2014）を参照のこと。
【００４８】
２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンおよびプロドラッグ形態
【００４９】
２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンは、本明細書において「ＮＵＣ０１３」とも呼ばれ、５-アザシチジンの塩基およびゲムシタビンの糖部分からなるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（ＤＮＭＴＩ）である。２つのＦＤＡ承認５−アザシチジンの場合、糖は未修飾であり、５−アザシチジンの場合におけるリボースであるか、５−アザ−２’−デオキシシチジンまたはデシタビンの場合におけるデオキシリボースである。両方の化合物がＤＮＭＴＩであることが示されている。ＤＮＭＴＩとして活性化するためには、５−アザシチジンをリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）によって５−アザ−２’−デオキシシチジンに還元する必要がある。５−アザ−２’−デオキシシチジンは、キナーゼによって５−アザ−２’−デオキシシチジン三リン酸にリン酸化されなければならず、そのことはＤＮＡに組み込まれ得、共有結合のためのホルミル基をその酵素の活性部位に供与することによってＤＮＭＴを不活性化することができ、その結果ＤＮＭＴの枯渇をもたらす。Saunthararajah Y「骨髄異形成症候群の５−アザシチジンおよびデシタビン治療後の主要な臨床観察は、より良い結果のための実用的な解決策を示唆する。」，Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013:511-21 (2013)、および、Christman JK「ＤＮＡメチル化の阻害剤としての５−アザシチジンおよび５−アザ−２’−デオキシシチジン：機構的研究および癌治療へのその含意」Oncogene, 21：5483-5495（2002）を参照してください、その各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。他方、ゲムシタビン（２’，２’−ジフルオロ−２’−デオキシシチジン）は、修飾された二フッ素化糖からなるが、未修飾のシトシン塩基を有する。生物学的に活性であるためには、ゲムシタビンはキナーゼによってゲムシタビン二リン酸およびゲムシタビン三リン酸に変換される必要がある。ゲムシタビンは、多くの異なる生物学的活性を有するが、現在の文脈において最も興味深いのは、ＲＮＲの阻害である。この阻害は、デオキシシチジン三リン酸によるＤＮＡへの取り込みのための競合を減少させることにより、ＤＮＡにおけるゲムシタビンの取り込みの可能性を増加させる。Mini E、et al「ゲムシタビンの細胞薬理学」Ann Oncol。 17（Suppl 5）：v7-12（2006）を参照されたい。その全体が参照により組み込まれる。以下により詳細に記載されるように、同じ化合物（すなわち、ＮＵＣ０１３）中のゲムシタビン由来の２’、２’−二フッ素化糖と５−アザシチジンからの５−アザシトシン塩基の結合は、おそらく活性に関与することが実証されている単独でまたは併用投与のいずれにせよ、薬物（すなわち、アザシチジンまたはゲムシタビン）はいずれも提供できないことを示している。
【００５０】
２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＮＵＣ０１３）を合成するための例示的な戦略の説明は、以下の実施例１に提供される。２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンの最初の特徴付けは米国特許公開第２０１４／００２４６１２号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００５１】
ＮＵＣ０１３のアノマーおよびプロドラッグもまた、本方法における使用のために企図される。ＮＵＣ０１３の種々のプロドラッグが記載されている。例えば、シリル化プロドラッグを記載している国際公開第２０１４／１４３０５１号およびＮＵＣ０１３のビタミンＥを基にしたプロドラッグを記載している国際公開第２０１６／０５７８２５号を参照されたい。各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５２】
特定の実施形態では、本開示の方法は、ＮＵＣ０１３プロドラッグを有利に利用する。一実施形態では、代表的な有用なＮＵＣ０１３プロドラッグは、ＮＵＣ０１３自体と比較して改善された薬物動態特性を有することができるシリル化プロドラッグおよびビタミンＥプロドラッグを含む。
【００５３】
一実施形態では、有用なシリル化プロドラッグには、リボース糖の１つ以上のヒドロキシル位または塩基のアミノ基に結合したシリル基（例えば、-SiR3）を有するＮＵＣ０１３類似体が含まれる。代表的なシリル化プロドラッグを以下に記載する。
【００５４】
一実施形態では、シリル化プロドラッグは、式：
【化１】
2019506434.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ７及びＲ８は、独立して水素またはＳｉ（Ｒ４）（Ｒ５）（Ｒ６）から選択され、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立して水素またはアルキルから選択され、但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ７又はＲ８の少なくとも一つはＳｉ（Ｒ４）（Ｒ５）（Ｒ６）である。一実施形態では、Ｒ１はＳｉ（Ｒ３）（Ｒ４）（Ｒ５）であり、Ｒ２は水素である。別の実施形態において、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＳｉ（Ｒ３）（Ｒ４）（Ｒ５）である。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２はＳｉ（Ｒ３）（Ｒ４）（Ｒ５）である。一実施形態では、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はメチルである。）を有する。
【００５５】
別の実施形態において、シリル化プロドラッグは、式：
【化２】
2019506434.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ７は、独立して水素またはＳｉ（Ｒ４）（Ｒ５）（Ｒ６）から選択され、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立して水素またはアルキルから選択され、但し、Ｒ１、Ｒ２又はＲ７の少なくとも一つはＳｉ（Ｒ４）（Ｒ５）（Ｒ６）である。一実施形態では、Ｒ１はＳｉ（Ｒ３）（Ｒ４）（Ｒ５）であり、Ｒ２は水素である。別の実施形態において、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＳｉ（Ｒ３）（Ｒ４）（Ｒ５）である。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２はＳｉ（Ｒ３）（Ｒ４）（Ｒ５）である。一実施形態では、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はメチルである。）を有する。
【００５６】
さらなる実施形態では、シリル化プロドラッグは、式：
【化３】
2019506434.tif 000005
（式中、Ｒ１及びＲ２は、独立して水素またはＳｉ（Ｒ４）（Ｒ５）（Ｒ６）から選択され、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立して水素またはアルキルから選択され、但し、Ｒ１又はＲ２の少なくとも一つはＳｉ（Ｒ４）（Ｒ５）（Ｒ６）である。一実施形態では、Ｒ１はＳｉ（Ｒ３）（Ｒ４）（Ｒ５）であり、Ｒ２は水素である。別の実施形態において、Ｒ１は水素であり、Ｒ２はＳｉ（Ｒ３）（Ｒ４）（Ｒ５）である。さらなる実施形態において、Ｒ１およびＲ２はＳｉ（Ｒ３）（Ｒ４）（Ｒ５）である。一実施形態では、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５はメチルである。）を有する。
【００５７】
本明細書で使用する「アルキル」という用語は、トリアルキルシリル基のアルキル基を指し、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル）であり、直鎖、分枝または環状アルキル基であってもよい。特定の実施形態では、アルキル基はＣ１〜Ｃ６アルキル基である。 特定の実施形態では、アルキル基はＣ１〜Ｃ４アルキル基である。 特定の特定の実施形態では、アルキル基はメチル基である。特定の実施形態では、トリアルキルシリル基の各アルキル基は同じである（例えば、トリメチルシリル）。他の実施形態において、トリアルキルシリル基は、２つまたは３つの異なるアルキル基（例えば、ｔ−ブチルジメチルシリル）を含む。
【００５８】
有用なビタミンＥプロドラッグには、リン酸エステルまたはホスホルアミデート結合を介してビタミンＥ誘導体にコンジュゲートされたＮＵＣＯ１３類似体が含まれる。
【００５９】
本方法に有用なビタミンＥプロドラッグは、式（Ｉ）
【化４】
2019506434.tif 000006
（式中、Ｙはトコフェロール部分またはトコトリエノール部分であり；
Ｌはリン酸エステルまたはホスホルアミデートリンカーであり；およびＮｕはＮＵＣ０１３である。）を有する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ＹはビタミンＥ部分である。 例えば、Ｙはトコフェロール部分であり得る。いくつかの実施形態では、Ｙはトコトリエノール部分である。
【００６１】
一実施形態では、ビタミンＥプロドラッグは、式（ＩＩ）：を有する。
【化５】
2019506434.tif 000007
またはその薬学的に許容される塩であって、
（式中、Ｒ１は
【化６】
2019506434.tif 000008
であり、
式中、Ｒ７は、ＨまたはＣ１−６アルキルアルキルであり；
Ｒ２およびＲ３はフルオロであり；
Ｒ６ａは、存在しない、ＨおよびＣ１−６アルキルから選択され；
ＷはＯまたはＮＲ６ｂであり、ここでＲ６ｂはＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシから選択され、ここで前記Ｃ１−６アルキルおよびＣ１−６アルコキシはそれぞれアリールおよびヘテロアリールから独立して選択される１つまたは２つの置換基であり、前記アリールまたはヘテロアリールは、場合により、シアノおよびニトロから独立して選択される１つまたは２つの置換基で置換されており；
そして
Ｘは
【化７】
2019506434.tif 000009
ここで、
Ｒ８はＣ１２−２４アルキル、Ｃ１２−２４アルケニル、Ｃ１２−２４ハロアルキルおよびＣ１２−２４ハロアルケニルから選択され、および
Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキルおよびハロから選択される。）を有する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ＷはＯである。いくつかの実施形態では、ＷはＮＲ６ｂである。
【００６３】
いくつかの実施形態では、Ｒ６ｂはＨまたはアルキルである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、Ｒ６ａは存在しない。いくつかの実施形態では、Ｒ６ａが存在しない場合、ＷはＯである。
【００６５】
いくつかの実施形態では、Ｒ６ａは存在しないか、またはＨである。いくつかの実施形態において、Ｒ６ａは、存在しないかまたはＣ１−６アルキルである。Ｒ６ａが存在しない場合、
2019506434.tif 000010
いくつかの実施形態では、Ｒ６ａは、Ｈまたはアルキルである。いくつかの実施形態において、Ｒ６ａは、Ｈ、メチルまたはエチルである。 いくつかの実施形態では、Ｒ６ａはＨまたはメチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ６ａおよびＲ６ｂは、それぞれ独立して、Ｈ、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ６ａおよびＲ６ｂは、それぞれ独立して、Ｈまたはメチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ６ａおよびＲ６ｂはそれぞれＨである。
【００６６】
いくつかの実施形態では、Ｒ７はＨ、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ７はＨまたはメチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ７はＨである。
【００６７】
いくつかの実施形態では、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれメチルである。いくつかの実施形態では、Ｒ９およびＲ１２はそれぞれメチルであり、Ｒ１０およびＲ１１はＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ９、Ｒ１０およびＲ１２はそれぞれメチルであり、Ｒ１１はＨである。
【００６８】
いくつかの実施形態では、Ｒ８は、Ｃ１６アルキル、Ｃ１６アルケニル、Ｃ１６ハロアルキルおよびＣ１６ハロアルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ８は、Ｃ１６アルキルまたはＣ１６アルケニルである。
【００６９】
いくつかの実施形態において、Ｘは、α-トコフェリル、β-トコフェリル、γ-トコフェリル、δ-トコフェリル、α-トコトリエニル、β-トコトリエニル、γ-トコトリエニルおよびδ-トコトリエニルから選択される。特定の実施形態では、Ｘは、
【化８】
2019506434.tif 000011
から選択される。
【００７０】
特定の実施形態では、ビタミンプロドラッグは、
【化９】
2019506434.tif 000012
またはその薬学的に許容される塩から選択される。
【００７１】
本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本技術に関連する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。便宜上、本明細書で使用する特定の用語および語句の意味を以下に示す。本明細書中に参考として援用される刊行物、特許および特許出願における用語の定義が本明細書に記載された定義に反している限り、本明細書の定義は制御する。本明細書で使用されるセクション見出しは、編成目的のみのためのものであり、開示される主題を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で使用する用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではない。単数形「a」、「an」および「the」には、その内容が明確に指示しない限り、複数形も含まれることに留意されたい。したがって、例えば、「化合物」を含む組成物への言及は、２つ以上の化合物の混合物も意図する。内容が明確に指示しない限り、用語「または」は、一般的に「および／または」を含むその意味で用いられることにも留意すべきである。さらに、「含む（including）」、「含む（includes）」、「有する（having）」、「有する（has）」、「有する（with）」、またはそれらの変形が、詳細な説明および／または特許請求の範囲において使用される限り、そのような用語は、用語「含む（comprising）」と同様の態様で包含する。
【００７２】
本明細書で使用される「薬学的に許容されるプロドラッグ」という表現は、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび下等動物の組織と接触させて使用するのに適した、本明細書の方法によって形成される化合物のプロドラッグをいう。過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを引き起こし、合理的な利益／リスク比に相応しく、それらの意図された使用に有効である。本明細書で使用される「プロドラッグ」は、代謝手段（例えば、加水分解）によって生体内で変換可能であり、本明細書の式によって示される化合物を与える化合物を意味する。様々な形態のプロドラッグが当該分野で公知である。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「アルキル」は、直鎖（例えば、直鎖（linear））または分枝鎖である飽和炭化水素基を指すことを意味する。アルキル基の例には、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（例えばｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル）、ペンチル（例えばｎ−ペンチル、ネオペンチル）等が挙げられる。アルキル基は、１〜約３０個、１〜約２４個、２〜約２４個、約１〜約２０個、約２〜約２０個、約１〜約１０個、約１〜約８個、約６個、約１〜約４個、または約１〜約３個の炭素原子を含む。
【００７４】
本明細書で使用する「アルキレン」という用語は、連結アルキル基を指す。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、１つ以上の二重炭素−炭素結合を有するアルキル基を指す。アルケニル基は、直鎖状でも分枝状でもよい。アルケニル基の例には、エテニル、プロペニルなどが含まれる。アルケニル基は、２〜約３０個、２〜約２４個、２〜約２０個、２〜約１０個、２〜約８個、２〜約６個、または２〜約４個の炭素原子を含むことができる。
【００７６】
本明細書で使用される「アルケニレン」は、連結アルケニル基を指す。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「ハロアルキル」とは、１つ以上のハロゲン置換基を有するアルキル基を指す。ハロアルキル基の例には、ＣＦ３、Ｃ２Ｆ５、ＣＨＦ２、ＣＣ１３、ＣＨＣｌ２、Ｃ２Ｃｌ５などが含まれる。
【００７８】
本明細書で使用する「ハロアルキレン」は、連結ハロアルキル基を指す。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「ハロアルケニル」は、１つ以上のハロゲン置換基を有するアルケニル基をいう。
【００８０】
本明細書で使用される「ハロアルケニレン」は、連結ハロアルケニル基を指す。
【００８１】
いくつかの実施形態では、プロドラッグは、３’，５’−ジ（トリメチルシリル）−２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンである。いくつかの実施形態において、プロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコフェロールリン酸プロドラッグである。いくつかの実施形態において、プロドラッグは、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンのトコトリエノールホスフェートプロドラッグである。
【００８２】
したがって、この態様では、２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＮＵＣ０１３）または２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグをＴＰ５３野生型の癌細胞に接触させる。
【００８３】
一実施形態では、本出願で定義される化合物を、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とともに含む医薬組成物が提供される。
【００８４】
さらなる態様は、本明細書に記載の疾患または状態の治療または予防において、本出願で定義される化合物またはそのような化合物の使用に関する。同様に、この態様は、本明細書に記載の疾患または状態を治療または予防するための医薬の製造における、本出願の化合物の使用に関する。この態様はさらに、治療上有効な量の本明細書に定義する化合物を、それを必要とする対象に投与することを含む、そこに記載の疾患または状態を治療するための方法に関する。
【００８５】
癌細胞
【００８６】
いくつかの実施形態では、癌細胞は固形腫瘍由来である。例えば、固形腫瘍は、非小細胞肺、結腸、腎臓、中枢神経系（ＣＮＳ）、メラノーマ、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、または乳癌であり得る。以下に記載されるように、ＮＵＣ０１３の広域スペクトル活性が与えられると、本開示はまた、固形腫瘍が子宮内膜、甲状腺、食道、胃、直腸、肝臓、膀胱、精巣、骨、ＳＬＣ、他の癌腫または他の腫瘍であり得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、癌は血液悪性腫瘍に由来する。例えば、いくつかの実施形態において、癌は、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である。
【００８８】
該方法は、細胞培養物中にあるＴＰ５３野生型癌細胞を接触させることを含む方法におけるようなインビトロで行うことができる。この細胞は、確立された多世代細胞培養系に由来するものであってもよく、または生検または生体試料などの被験体から得られた細胞であってもよい。癌細胞を培養で維持するための方法、条件および試薬は、当業者の能力の範囲内で公知である。この開示のこの側面は、応答性を確認するため、または細胞に対するＮＵＣ０１３の効果を特徴付けるために使用することができる。
【００８９】
さらに、この態様の方法は、ＴＰ５３ ＷＴ癌を有する対象においてインビボで行うことができる。有効量の２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、既知および許容されるプロトコルに従って被験体に投与される。２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、任意の適切な送達様式のための既知の方法に従って適切に処方され、投与される。
【００９０】
癌の治療
【００９１】
別の態様では、本開示は、野生型ＴＰ５３を発現することを特徴とする癌を治療する方法を提供する。この方法は、治療有効量の２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグを含む組成物を必要とする対象に投与することを含む。
【００９２】
本明細書で使用される場合、用語「治療的に有効な」は、癌に起因する対象の状態の何らかの改善をもたらす、任意の品質、例えば投与量または形態を指す。治療効果は、予防的または予防的効果を得ること、または身体検査の手段、実験室もしくは器械的方法によって検出することができる状態の兆候および症状の重症度の緩和を含むことができる。
【００９３】
本明細書で使用される用語「癌を治療する」または類似の言語は、対象における癌の存在に関連する疾患、障害および／または状態の阻害すること、例えばその発達または進行の遅延または阻止；および／または、疾患、障害および／または状態の退行を引き起こすなどの、疾患、障害または状態を緩和することに有用である。進行は、治療がない場合の発達と比較することによって確認することができる。
【００９４】
いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。本開示に包含される固形腫瘍の例は、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、癌は血液悪性腫瘍である。本開示に包含される血液悪性腫瘍の例は、本明細書に記載される。
【００９５】
２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグのような本開示の化合物は、組成物、エマルジョン製剤、マイクロエマルジョン製剤、またはミセル製剤のような当該分野で十分に理解されているように、任意の適切な投与経路のために製剤化することができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本開示の化合物、例えば２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンまたは２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジンプロドラッグは、許容される担体、希釈剤、賦形剤なども含む組成物中に処方される。好ましくは、担体、希釈剤または賦形剤は薬学的に許容されるものである。
【００９７】
治療有効量の化合物は、一般に、最大耐容量までの範囲にあるが、濃度は重要ではなく、広く変動し得る。主治医によって使用される正確な量は、もちろん、化合物、投与経路、患者の身体状態および他の要因に応じて変化する。１日投与量は、単回投与として投与してもよいし、投与のために複数回投与に分割してもよい。
【００９８】
実際に投与される化合物の量は、本質的に有益な効果を生じるために必要な量を示すために本明細書で使用される治療有効量であろう。有効な用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導された用量反応曲線から外挿することができる。動物モデルはまた、典型的には、望ましい用量範囲および投与経路を決定するためにも使用される。そのような情報は、その後、ヒトまたは他の哺乳動物における投与のための有用な用量および経路を決定するために使用され得る。有効用量の決定は十分に当業者の能力の範囲内である。従って、実際に投与される量は、治療が適用される個体に依存し、好ましくは、有意な副作用なしに所望の効果が達成されるような最適量である。
【００９９】
本開示の化合物の治療効果および可能性のある毒性は、標準的な製薬手順、細胞培養または実験動物によって決定され得る（例えば、集団の５０％において治療上有効な用量であるＥＤ５０；および人口の５０％に致命的な用量であるＬＤ５０）。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療指数であり、それは比ＬＤ５０〜ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す改変された治療薬化合物は、本開示の方法の実施において特に適切である。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトまたは他の哺乳動物における使用のための用量の範囲を定式化する際に使用され得る。このような化合物の投与量は、毒性がほとんどまたは全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、典型的には、使用される剤型、患者の感受性、および投与経路に依存して、この範囲内で変化する。したがって、最適量は投与方法によって変化し、一般的には、同じまたは類似の形態で投与される従来の薬剤の量に従う。
【０１００】
本開示の化合物は、単独で、または１つ以上のさらなる治療剤と組み合わせて投与することができる。例えば、癌の治療において、本化合物は、限定するものではないが、フルタミドおよびルプリリドなどのアンドロゲン阻害剤；抗エストロゲン、例えばタモキシフェン；イホスファミド、プロカルバジン、ミュータマイシン、ブスルファン、ブレオマイシン、ブレオマイシン、ブレオマイシンなどの代謝拮抗物質およびダウノルビシン、フルオロウラシル、フロクスルリジン、インターフェロンα、メトトレキセート、プリカマイシン、メルカプトプリン、チオグアニン、アドリアマイシン、カルムスチン、ミトキサントロン、カルボプラチン、シスプラチン、ストレプトゾシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシンおよびイダマイシン；エストラジオール、エストラジオール、ロイプロリド、メゲストロール、オクトレオチド、ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、エトポシド、ポドフィロトキシン、およびゴセレリンのようなホルモン；メトロキシプロゲステロン、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、およびチオテパなどの窒素マスタード誘導体、ベタメタゾンなどのステロイド；生マイコバクテリウム・ボビス、ダカババジン、アスパラギナーゼ、ロイコボリン、ミトタン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびタキソテールなどの他の抗新生物剤が含まれ、本開示の化合物と組み合わせて投与することができる。それぞれの場合における適切な量は、特定の薬剤によって変化し、当業者に容易に知られているか、または日常的な実験によって容易に決定可能である。
【０１０１】
本開示の化合物の投与は、任意の有効な経路、例えば、非経口経路、局所経路または経口経路によって達成される。吸入（inhalational）、口腔（buccal）、髄内（intramedullary）、静脈内（intravenous）、鼻腔内（intranasal）、直腸内（intrarectal）、眼内（intraocular）、腹腔内（intraabdominal）、動脈内（intraarterial）、関節内（intraarticular）、カプセル内（intracapsular）、子宮内（intracervical）、頭蓋内（intracranial）、管内（intraductal）、内腔内（intradural）、病巣内（intralesional）、筋肉内の（intramuscular）、腰椎（intralumbar）、壁内（intramural）、眼内（intraocular）、術中（intraoperative）、内科（intraparietal）、腹腔内（intraperitoneal）、胸膜腔内（intrapleural）、肺内（intrapulmonary）、脊髄内（intraspinal）、胸腔内（intrathoracic）、気管内（intratracheal）、中耳炎（intratympanic）、子宮内（intrauterine）、血管内（intravascular）、脳室内投与（intraventricular administration）、および他の従来の手段によって投与することができる。抗腫瘍活性を有する本開示の化合物は、腫瘍に、腫瘍の近傍に、または腫瘍に血液を供給する血管に直接注入することができる。
【０１０２】
本開示のエマルション、マイクロエマルション、およびミセル製剤は、化合物の肺送達のための当技術分野で知られている適切なエアロゾル推進薬を使用して噴霧することができる。組成物はまた、従来の手段（例えば、コーティング）によって、適切な放出特性、持続放出、または標的放出を提供するように修飾されてもよい。化合物を含有するように処方された組成物および許容される担体が調製された後、それらは適切な容器に入れられ、使用のために標識され得る。したがって、別の態様において、本開示はキットを提供する。
【０１０３】
本開示のビタミンＥ修飾ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体は、水中油型エマルジョンおよびミセル製剤としての投与に適している。該化合物は、投与のために少量を可能にするために高薬物負荷を提供する。
【０１０４】
ユーティリティのデモンストレーション
【０１０５】
以下は、ＮＵＣ０１３またはその類似体が、関連するデシタビン類似体、ゲムシタビンまたは５−アザシチジンと比較して、ＴＰ５３ ＷＴ癌細胞の増殖および発達の予防において有意に強化された有効性を有し得るという驚くべき発見に取り組む研究を記載する。
【０１０６】
本明細書に示すように、異常なＤＮＡメチル化は、腫瘍形成を抑制する遺伝子、例えばＴＰ５３の発現を不活性化し得る後成的メカニズム（an epi genetic mechanism）である。サイレンシング遺伝子発現の分子機構は、５−メチルシトシン結合タンパク質が転写因子の作用をブロックするメチル化プロモーターに結合するためであると思われる。Momparler RL、「５−アザ−２’−デオキシシチジン（デシタビン）による癌のエピジェネティックな治療」，Semin Oncol，32：443-451（2005）はその全体が参照により組み込まれる。研究は、ピリミジン類似体デシタビンがＴＰ５３ヌル（null）細胞においてＴＰ５３ＷＴ細胞におけるよりも多くのアポトーシスを誘発し、デシタビンによるＤＮＡメチル化の部分的阻害がｐ５３欠損細胞の致死性を引き起こすがＷＴ細胞は引き起こさないという仮説を導いた。例えば、Nieto Mら、「ｐ５３が存在しないことは、５−アザ−２’−デオキシシチジンによるアポトーシスの誘導に重要である」，Oncogene. 23(3):735-43 (2004)、Leonova KIら、「ｐ５３は、ＤＮＡメチル化および自殺的インターフェロン応答と協力して、反復および非コードＲＮＡのエピジェネティックなサイレンシングを維持する」，Proc Natl Acad Sci USA. 110(l):E89-98 (2013)、およびYi Lら、「ＤＮＡメチル化を阻害する選択された薬剤は、ｐ５３欠損細胞を優先的に死滅させることができる。」，Oncotarget，5(19):8924-36 (2014)  を参照のこと。その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本研究は、別のピリミジン類似体、ＮＵＣ０１３（２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジン）がデシタビンに匹敵する活性を有するかどうかを検討した。結果は、驚くべきことに、デシタビンと比較して、ＮＵＣ０１３は少なくとも処理されたＴＰ５３ヌル細胞では活性を有したが、ＴＰ５３ ＷＴ細胞の処理ではデシタビンよりも有意に活性が高いことを示した。
【０１０７】
ＮＣＩ−６０細胞株パネルは、国立癌研究所によりインビトロ抗癌剤スクリーニングとして組み立てられた。パネルは、乳癌、結腸癌、中枢神経系、腎臓癌、肺癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、および血液性の９つの異なる組織起源を表すヒト癌細胞株を含む。これらの細胞系は非常によく特徴づけられており、それらのＴＰ５３状態（ヌル／変異体またはＷＴとして）が報告されている。例えば、Leroy et al、「ヒト癌細胞株におけるＴＰ５３突然変異状態の分析：研究結果」，Hum Mutat 2014 35（6）：756-765、を参照のこと。
【０１０８】
2007年初頭、ＮＣＩ ６０細胞パネルに提出された全ての化合物は、最初に単回用量（１０μＭ）で試験された。したがって、１０μＭでの活性を比較することのみが可能である；デシタビンについては、対数ＧＩ５０が＜−５．０Ｍまたは＞−５．０Ｍであるか否か、同時に、ＮＵＣ０１３については、１０μＭの増殖で＞ ５０％または＜５０％であるかどうか。以下の表１は、ＮＣＩ ６０細胞株パネル中の細胞株のＴＰ５３状態を提供する。
【０１０９】
１０μＭのカットオフを用いて、ＮＣＩ ６０細胞系統パネルにおけるデシタビンおよびＮＵＣ０１３の活性を要約して比較することができ、もし何かあれば、ＴＰ５３ ＷＴの存在が２ｘ２の不測の事態（contingency）の表においてデシタビンまたはＮＵＣ０１３による成長阻害がある。デシタビンおよびＮＵＣ０１３の両方について試験された細胞系のみ、すなわち５７細胞株がこの表に列挙されており、そのパネルの組成が時間とともに変化してきた。５５の細胞株は報告されたＴＰ５３の状態（野生型またはヌル／突然変異体のいずれか）を有する。ＮＵＣ０１３は、乳癌、結腸癌、中枢神経系、腎臓、肺、メラノーマ、卵巣および前立腺を含むＮＣＩ ６０細胞株パネルで試験された全固形腫瘍組織由来の１０μＭおよび少なくとも１つの細胞株で、５０％を超える血行性腫瘍細胞株の増殖を阻害することが示されてきた。
【０１１０】
表１．ＮＣＩ ６０細胞株パネルにおけるデシタビンおよびＮＵＣ０１３の増殖阻害活性の比較。ＮＵＣ０１３の活性を１０μＭで測定した。＜５０％の成長はＧＩ５０が＜１０−５Ｍであることを、逆に≧５０％の成長はＧＩ５０≧１０−５Ｍであることを意味する。表中の細胞は、暗い灰色でＧＩ５０≧１０−５Ｍまたは成長≧５０％、および薄灰色でＧＩ５０＜１０−５Ｍまたは成長＜５０％である。
【０１１１】
【表１】
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2019506434.tif 000014
2019506434.tif 000015
【０１１２】
（＞１０μＭ）および（＜１０μＭ）で５０％増殖阻害剤に薬物活性を二分すると、ＮＣＩ−６０細胞株パネルにおけるデシタビンおよびＮＵＣ０１３の活性を要約して比較することが可能であり、ＴＰ５３ ＷＴの存在は、２×２の不測の事態（contingency）の表における薬物による増殖阻害にある。
【０１１３】
フィッシャーの厳密検定は、分立表（contingency tables）の分析に使用される統計的有意性検定である。デシタビンの活性の場合、ｐ値は０．６６であり、真の帰無仮説の確率が非常に高いこと、すなわちＴＰ５３状態がデシタビンＧＩ５０に影響を及ぼさないことが確認されている。この統計分析は、Nietoら（上記）によって生成された実験データと適合し、デシタビンはＴＰ５３ ＷＴ細胞においてアポトーシスを誘発するのに特に有効ではないことが示されている。
【０１１４】
【表２】
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【０１１５】
デシタビンについての表２に示すデータと表３のデータとの対比において、ＴＰ５３状態とＮＵＣ０１３の細胞増殖阻害との間に統計的に有意な関連があり、ＴＰ５３ ＷＴ状態およびＮＵＣ０１３活性とのこの関連性は偶然によるものである非常に低い確率（1.3％）である。
【０１１６】
【表３】
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【０１１７】
データを見るもう１つの方法は、ＴＰ５３ヌル／突然変異細胞株におけるＮＵＣ０１３効能対デシタビンの比較が統計学的に有意である（ｐ＝0.027、フィッシャーの厳密検定、両側検定）が、ＴＰ５３ ＷＴ細胞株における結果はさらに厳しいレベルの統計的有意性に達している（ｐ＝0.0025、フィッシャーの厳密検定、両側検定）。
【０１１８】
ＮＵＣ０１３とデシタビンとの間の活性のこのような違いの確認は、表１に示すＮＣＩ ６０細胞パネルの一部ではない他のＴＰ５３ ＷＴ細胞株においてさらに実証された。さらなる比較の２つの例が、結腸癌細胞株（ＴＰ５３ ＷＴ結腸癌細胞株Ｌｓ１７４ＴおよびＴＰ５３ ＷＴ結腸癌細胞株ＬｏＶｏ）について以下に提供される。
【０１１９】
これらのアッセイでは、各細胞株の２つの９６ウェルプレートに、１ウェルあたり５，０００細胞の総容量５０ｐＬを播種し、一晩インキュベートした。翌日、細胞を異なる濃度のＮＵＣ０１３に曝露した。７２時間の暴露期間の終わりに、プレートをCellTiter-Glo（登録商標）アッセイ用に取り出した。ルミネセンスはSynergy 4.0で記録された。
【０１２０】
図１および図２に示すように、ＧＩ５０は、Ｌｓ１７４ＴおよびＬｏＶｏ細胞株の両方においてゲムシタビンについて５０μＭより大きく、ＮＵＣ０１３については、ＧＩ５０はＬｓ１７４Ｔ細胞系で１．３μＭおよびＬｏＶｏ細胞株で３．０μＭである。
【０１２１】
図１および図２に示す活性の著しい違いは、デシタビンとＮＵＣ０１３との構造的相違に関連する可能性が高い；すなわち、デシタビンの場合の天然糖とは対照的に、ＮＵＣ０１３の場合はゲムシタビンからの修飾糖の存在である。多くの２’−置換−２’−デオキシヌクレオチドは強力な機構に基づくＲＮＲ阻害剤であることが示されている。２−フルオロ，２−クロロおよび２−アジド誘導体に関する詳細な研究は、これらの基質アナログによる一般的な阻害メカニズムの基礎を提供している。[Wang J、Lohman GJ、Stubbe J.「ゲムシタビン−５’ジホスフェート阻害リボヌクレオチドレダクターゼとの強化されたサブユニット相互作用」，Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104（36）：14324-14329はその全体が参照により組み込まれる。
【０１２２】
ゲムシタビンは、ＲＮＲ、特にｐ５３Ｒ２の阻害をもたらすことが示されている。Wang Jら、「ゲムシタビン５’−二リン酸によるヒトリボヌクレオチドレダクターゼのｐ５３Ｒ２による不活性化のメカニズム」，Biochemistry. 48(49): 11612-21 (2009)はその全体が参照により組み込まれる。ｐ５３Ｒ２遺伝子は、ＲＮＲの小サブユニットをコードし、ｐ５３誘導性遺伝子として同定されている。他の活性の中でも、ｐ５３Ｒ２は、ｐ５３活性化に応答してデオキシヌクレオチドを提供する。ｐ５３Ｒ２はまた、デシタビンによって誘導可能であることが示されている。Link PAら、「ｐ５３誘導性リボヌクレオチドレダクターゼ（ｐ５３Ｒ２／ＲＲＭ２Ｂ）は、骨髄異形成症候群／急性骨髄性白血病における臨床応答と相関するＤＮＡ低メチル化非依存デシタビン遺伝子標的である。」，Cancer Res，68（22）：9358-66（2008）とされ、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。より最近では、ｐ５３Ｒ２の発現は、癌の進行および治療に対する耐性と関連している。例えば、Yousefi B.ら、「Ａｋｔ及びｐ５３Ｒ２、癌の進行および侵襲性を指示するパートナー」，DNA Repair (Amst). 22:24-29 (2014)、Qi J.J.ら、「Ｅ２Ｆ１はｐ５３欠損細胞におけるｐ５３Ｒ２遺伝子発現を調節する」，Mol Cell Biochem. 399(1-2): 179-88 (2015)およびMatsushita S.ら、「Ｔｐ５３Ｒ２はメラノーマの予後因子であり、メラノーマ細胞の増殖および化学感受性を調節する」，J Dermatol Sci. 68(l): 19-24 (2012)を参照されたい。各々はその全体が参照により組み込まれる。
【０１２３】
ゲムシタビンによるＲＮＲの阻害は、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）の強力なフィードバック阻害剤であるデオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）の枯渇をもたらし、ゲムシタビンのより効率的なリン酸化を導く。さらに、ゲムシタビンはｄＣＴＰと競合するので、ｄＣＴＰプールの減少は、ＤＮＡへのゲムシタビンの取り込みを増加させ、自己増強として記載されているメカニズムである。Mini E.ら、「ゲムシタビンの細胞薬理学」，Ann Oncol. 17 Suppl 5:v7-12 (2006)はその全体が参照により組み込まれる。
【０１２４】
化合物がＲＮＲを阻害するかどうかを判断するには、２つのアプローチがある。より一般的なアプローチは、ヌクレオシド二リン酸を合成し、次にそれがＲＮＲまたはｐ５３Ｒ２を阻害するかどうかを決定することである。このアプローチは、二リン酸塩が５−アザシチジンを用いて生成されたデータに基づいて非常に不安定である可能性があるため、ＮＵＣＯ１３を用いることは技術的に非常に困難であろう。［Zielinski WS、Sprinzl M.，「５−アザシチジンヌクレオチドの化学合成およびその３’末端に５−アザシチジンを含むｔＲＮＡの調製」，Nucleic Acids Research. 1984; 12(12):5025-5036はその全体が参照により組み込まれる。］に記載されており、デシタビン一リン酸塩の合成を経験している。もう１つのアプローチは、組織培養中の細胞を薬物に曝露し、次いで対照細胞と比較してデオキシヌクレオチド合成が阻害されるかどうかを調べようとすることである。デオキシヌクレオチドの測定は、ラジオイムノアッセイまたはＨＰＬＣによって行うことができる。ラジオイムノアッセイの不利益は、一度に単一のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）のみを測定することができ、典型的にはトリチウム化ヌクレオチドを必要とすることであるが、ｄＣＴＰを測定する好ましい方法である。［Piall EM、Aherne GW、Marks V.，「細胞抽出液中の２’−デオキシシチジン−５’三リン酸のラジオイムノアッセイによる定量」，Anal Biochem. 1986; 154(1):276-281はその全体が参照により組み込まれる］。一方、ＨＰＬＣは、放射性標識を必要とせずに複数のヌクレオチドを測定することができるが、おそらくは培地からのｄＣＴＰの流入の人工物として、ｄＣヌクレオチドが不十分に定量することに注目されている。［Bianchi V、Pontis E、Reichard P.，「ヒドロキシウレアによって誘導されたデオキシリボヌクレオシド三リン酸プールおよびそれらのＤＮＡ合成との関係」，J Biol Chem. 1986; 261(34): 16037-16042はその全体が参照により組み込まれる］。このアプローチは、ＮＵＣＯ１３によるＲＮＲ阻害を決定するために用いられた。
【０１２５】
簡潔には、ＨｅＬａ細胞（ＴＰ５３ヌル細胞）を、薬物の存在下または非存在下で、この場合はゲムシタビンまたはＮＵＣ０１３で増殖させた。１６時間のインキュベーションの終わりに、培地を吸引し、細胞単層をＰＢＳで２回洗浄し、ヌクレオチド抽出のために使用された。氷冷８０％アセトニトリル（ＡＣＮ）を１時間添加することにより、細胞単層からヌクレオチドを抽出した。抽出物を遠心分離して細胞残渣を除去し、メタノール、水およびＡＣＮで予備コンディショニングしたＳＡＸカラム（１００ｍｇ、Ｓｕｐｅｌｃｏ（登録商標））に充填した。サンプルが完全に流出したら、カートリッジを３ｍｌの８０%ＡＣＮおよび３ｍｌの水で洗浄し、１Ｍ ＫＣｌで溶離した。溶離液を０．４５μｍのフィルター膜（Ｒｏｔｈ）で濾過し、ＨＰＬＣで分析した。異なるヌクレオシド一リン酸、二リン酸および三リン酸のピーク同定は、それらの特徴的なＵＶ吸収スペクトルおよび保持時間を、細胞抽出物の直前に実行される標準の混合物のものと比較して行った。個々のピークの面積は、ChemStation（登録商標）ソフトウェア（Agilent）を使用して測定した。
【０１２６】
結果は次の通りであった：
【０１２７】
表４：Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｔ：チミジン、Ｕ：ウリジン、ｄ：デオキシ、ＤＰ：二リン酸、ＴＰ：三リン酸およびＡＵ：吸光度単位として、５０μＭのゲムシタビンまたはＮＵＣ０１３の処理物対コントロールのＴ１及びＴ２複製物と比較したＨｅＬａ細胞抽出物由来のヌクレオチドの濃度。Ｔ１及びＴ２は、薬物を含まないコントロールの２つの複製物である。
【０１２８】
【表４】
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【０１２９】
表４は、ゲムシタビンもＮＵＣ０１３もリボヌクレオチド濃度に影響しないことを示している。しかし、ゲムシタビンまたはＮＵＣ０１３、特にｄＡＴＰ、ｄＧＤＰ及びｄＵＴＰで処理した細胞由来の溶解物から、より低い濃度のデオキシヌクレオチドが注目される。ｄＴＤＰは、おそらくはサルベージ経路の存在の結果として、ＮＵＣ０１３の存在によって影響を受けないようであるが、ゲムシタビンによるｄＴＤＰのレベルの上昇は、ゲムシタビン−ＤＰとの同時溶出によるものであり得る。これらの結果は、ゲムシタビンおよびＮＵＣ０１３の両方によるＲＮＲ阻害に適合する。ＲＮＲ阻害剤としての化合物の相対的有効性は、アッセイに使用される細胞株に依存して変化し得ることおよびＨｅＬａ細胞がＴＰ５３ヌルであることに留意すべきである。
【０１３０】
ｐ５３Ｒ２遺伝子は、ＲＮＲの小サブユニットをコードし、ｐ５３誘導性遺伝子として同定されている。ゲムシタビンはｐ５３Ｒ２を誘導しないが、その阻害をもたらすことが示されている。［Wang J、Lohman GJ、Stubbe J.，「ゲムシタビン５’−二リン酸によるｐ５３Ｒ２を有するヒトリボヌクレオチドレダクターゼの不活性化の機構」，Biochemistry. 2009; 48(49): 11612-11621］。逆に、ｐ５３Ｒ２はデシタビンによって誘導可能であることが示されており、他の活性の中でもｐ５３Ｒ２はｐ５３活性化に応答してデオキシヌクレオチドを提供する。［Link PA、Baer MR、James SR、Jones DA、Karpf AR，「ｐ５３誘導性リボヌクレオチドレダクターゼ（ｐ５３Ｒ２／ＲＲＭ２Ｂ）は、骨髄異形成症候群／急性骨髄性白血病における臨床応答と相関するＤＮＡ低メチル化非依存性デシタビン遺伝子標的である」，Cancer Res. 2008; 68(22):9358-9366］。より最近になって、ｐ５３Ｒ２の発現は、癌の進行および耐性に関連している。［Yousefi B、Samadi N、Ahmadi Y.，「Ａｋｔおよびｐ５３Ｒ２、癌の進行および侵襲性を決定づけるパートナー」，DNA Repair (Amst). 2014; 22:24-29。Qi JJ、Liu L、Cao JX、An、GS、Li SY、Li G ら，「Ｅ２Ｆ１は、ｐ５３欠損細胞におけるｐ５３Ｒ２遺伝子発現を調節する」，Mol Cell Biochem. 2015; 399(1-2): 179-188。Matsushita S, Ikeda R, Fukushige T, Tajitsu Y, Gunshin K, Okumura Hら，「Ｔｐ５３Ｒ２はメラノーマの予後因子であり、メラノーマ細胞の増殖および化学感受性を調節する」，J Dermatol Sci. 2012; 68(1): 19-24］。ＲＮＲは、２つのタンパク質間の、すなわち、アロステリック部位を含む大きな触媒タンパク質Ｒ１およびより小さなタンパク質Ｒ２の複合体である。両方のタンパク質は、初期のＳ期の間に転写的に活性化され、ＤＮＡ複製に必要なｄＮＴＰを送達するためにほぼ等しい量で存在する。Ｒ２は後期有糸分裂の間に分解され、したがって有糸分裂後休止細胞は本質的にＲ２を欠いているが、いくらかのＲ１を保持している。分裂停止後の休止細胞では、有糸分裂において分解されないので、ｐ５３Ｒ２のみがＲＮＲの機能する小サブユニットとして作用することができる。ＤＮＡ損傷後、ｐ５３Ｒ２はｐ５３によって転写活性化され、核に移行するが、サイトゾル（cytosol）にも存在することが示されている。［Pontarin G、Ferraro P、Bee L、Reichard P、Bianchi V.，「哺乳類リボヌクレオチド還元酵素サブユニットｐ５３Ｒ２が休止細胞におけるミトコンドリアＤＮＡ複製及びＤＮＡ修復のために必要とされる。」，Proc Natl Acad Sci U S A. 2012; 109(33): 13302-13307］。
【０１３１】
デシタビンはＳ期特異的薬剤と考えられている。しかし、最近、デシタビンの細胞周期依存性は絶対的ではないことが示されている。その二次的なエピジェネティックな効果は複製に依存するが、その主要な効果であるＤＮＭＴ１酵素枯渇は、Ｓ期の細胞のフラクションとは関係のない排除半減期で直ちに起こる。従って、拘束されたコンフルエントな細胞におけるＤＮＡ修復および改造（remodeling）活性は、デシタビンの一次分子作用を支持するのに十分であり得るが、二次的なエピジェネティックな効果は、Ｓ期による細胞周期の進行を必要とする。［Al-Salihi M、Yu M、Burnett DM、Alexander A、Samlowski WE、Fitzpatrick FA，「ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ−１の枯渇および５−アザ−２’−デオキシシチジン（デシタビン）のエピジェネティックな効果は、細胞周期の進行によって示差的に調節される。」，Epigenetics. 2011; 6(8): 1021-1028］一実施形態では、ＮＵＣ０１３の活性は、実質的な細胞増殖停止を引き起こし、そのエピジェネティックな効果の発現を助長する濃度より低い濃度で、ＤＮＭＴを阻害する。
【０１３２】
ゲムシタビンによるＲＮＲの阻害は、デオキシシチジンキナーゼの強力なフィードバック阻害剤であるｄＣＴＰの枯渇をもたらし、ゲムシタビンのより効率的なリン酸化を導くことが報告されている。さらに、ゲムシタビンはｄＣＴＰと競合するので、ｄＣＴＰプールの減少は、ゲムシタビンのＤＮＡへの取り込みを増加させ、自己増強として記載されているメカニズムである。［Mini E、Nobili S、Caciagli B、Landini I、Mazzei T.，「ゲムシタビンの細胞薬理学，Ann Oncol. 2006; 17 Suppl 5：v7-12はその全体が参照により組み込まれる。」この同じ作用機序は、ＮＵＣ０１３およびＲＮＲ及びｐ５３Ｒ２の阻害に適用することが仮定される。したがって、ＮＵＣ０１３は、Ｓ期の間だけでなく細胞周期を通してｄＮＴＰ合成を阻害することができる。対照的に、デシタビンによりｐ５３ ＷＴの回復が機能する。［Zhu WG、Hileman T、Ke Y、Wang P、Lu S、Duan Wら，「５−アザ−２’−デオキシシチジンは、ｐ５３／ｐ２１  Ｗａｆ１／Ｃｉｐｌ経路を活性化して、細胞増殖を阻害する。」，J Biol Chem. 2004; 279(15): 15161-15166。］そしてｐ５３Ｒ２の誘導は、ｄＣＴＰのプールを増加させ、それにより、「自己拮抗作用」と呼ばれる機構である、休止期のデシタビンの取り込みを減少させるはずである。この自己拮抗作用は、ＮＵＣ０１３と比較した場合、デシタビンのより少ない活性の１つの理由であり得る。
【０１３３】
ＴＰ５３ ＷＴ腫瘍の治療におけるＮＵＣ０１３の注目すべき活性は、ＮＵＣ０１３に特有であり、ゲムシタビンとデシタビンとの併用療法によって複製可能である可能性は低く、ゲムシタビンと５−アザシチジンとの併用では複製可能である可能性はさらに低い。５−アザシチジンの場合、ゲムシタビンはＲＮＲを阻害し、ＲＮＲは５−アザシチジンの５−アザ−２’−デオキシシチジンへの還元に必須である。ゲムシタビンとデシタビンは両方ともシチジン類似体であるため、ポリメラーゼａを含むＤＮＡ中のデオキシシチジン三リン酸アナログとしてそれらの取り込みに必要な多くの同じ酵素系について互いに競合するであろう。さらに、ゲムシタビンとデシタビンの両方の投与は、２つの化学療法剤の副作用のリスクを患者にもたらし、そのような治療レジーム（regime）を起こさない可能性がある。
【０１３４】
約すると、ＴＰ５３ヌル／突然変異細胞系に対して活性であるが、ＤＮＭＴＩ ＮＵＣ０１３は、ＴＰ５３ ＷＴ腫瘍細胞系を治療する独特な能力を有することが示されている。
【０１３５】
安全性プロファイルのデモンストレーション
【０１３６】
以下は、マウス異種移植モデルにおけるデシタビンおよびＮＵＣ０１３の有効性および毒性を比較する研究を記載し、ＴＰ５３ ＷＴ細胞系を移植した動物の治療において、ＮＵＣ０１３がデシタビンよりも有意に毒性が低いという驚くべき発見を実証し、同時に腫瘍増殖を予防するというより大きな効能を示している。
【０１３７】
ヌクレオシドへの軽微な構造変化は、細胞機能におけるヌクレオシドの中心的役割のために、毒性に関する仮定を困難にする。その一例はフィアルウリジン（ＦＩＡＵ；１−（２−デオキシ−２−フルオロ−１−Ｄ−アラビノフラノシル）−５’−ヨードウラシル）であり、糖の２’位の水素に対するフッ素と塩基の５’位の水素に対するヨウ素の置換によるウリジンと異なるヌクレオシド類似体である。２つの置換（ＮＵＣ０１３とデシタビンの構造の差異の程度に類似）に関連するこれらの構造変化は予想外の毒性をもたらした。１９９３年６月、ＦＩＡＵのＢ型肝炎治療の臨床試験が、国立衛生研究所（ＮＩＨ）の研究に参加した１５人の外来患者のうちの１人が急に肝不全で入院したときに突然終了した。残りの患者のすべてに接触し、投薬を中止するように言われたが、次の数週間で６人が重度の毒性を発症した。５人の患者が死亡し、残りの２人はおそらく肝臓移植のみで死亡したと考えられている。このことは疾患治療薬としてのヌクレオシド類似体における毒性リスクの可能性、そこでは軽度の変異が毒性の大きな増加をもたらすことがありうることを説明している。
【０１３８】
動物モデルでは、ＮＵＣ０１３は承認された薬物デシタビンよりも安全性が高いことが示されている。この改善された安全性プロファイルは、デシタビンのようにＤＮＡメチルトランスフェラーゼを標的化することに加えて、ＮＵＣ０１３もまたリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）も標的とするため、予想外であった。そのような活性の向上したスペクトルはまた、毒性のより大きなリスクにつながると予想されていたであろう。しかし、これは動物の腫瘍モデルで観察された結果ではない。例えば、ＨＬ−６０（白血病、ＴＰヌル）またはＬｏＶｏ（結腸癌、ＴＰ ＷＴ）を移植したヌードマウスの異種移植モデルでは、ＮＵＣ０１３はデシタビンよりも有効性が高く毒性も低いことが示されている。
【０１３９】
具体的には、３週間に連続３日間で５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、デシタビンは生理食塩水よりも効果的ではなく、生理食塩水コントロール群で起こる事象の可能性で割った、ＨＬ−６０を移植したヌードマウスでは容認されなかった（ハザード比（ＨＲ）＝０．７７、ｐ＝０．６２）（ハザード比は、治療群で発生する事象の可能性と解され得る（死亡、潰瘍化した腫瘍または腫瘍＞４ｇと定義される））。デシタビンで処置した１０匹のマウスのうち４匹は、研究の終了前に死亡または瀕死であった。これらの結果は、当モル容量（５．８ｍｇ／ｋｇ）でのＮＵＣ０１３による処置と対照的であり、死亡または瀕死のために研究から動物を除いた生理食塩水対照と比較したときに、生存率の改善傾向を示した（ＨＲ＝０．４６、ｐ＝０．０１９）。２０ｍｇ／ｋｇのＮＵＣＯ１３の用量で、ＮＵＣＯ１３で処置したマウスは、研究の終了時に生理食塩水対照マウス（ＨＲ＝０．２６、ｐ＝０．０３２）に対して改善された生存率を有した。
【０１４０】
５．８ｍｇ／ｋｇで処置した動物と生理食塩水対照との間で腫瘍重量は有意に異なるわけではなかったが、２０ｍｇ／ｋｇで腫瘍体積の有意な減少が観察され（ｐ＜０．０５、マンホイットニーＵ検定、両側検定）、研究第１８日〜第２８日に、図３Ａに示されている。
【０１４１】
デシタビン５ｍｇ／ｋｇで処置したＬｏＶｏを移植したマウスでの試験では、腫瘍移植の３５日以内に腫瘍潰瘍のために１０人中８人が死亡し、残りの２匹（１０匹中の）は安楽死させなければならなかった。これらの結果は、生理食塩水対照群（生存中央値デシタビン３１日、６０日にわたる生存中央値生理食塩水、ＨＲ＝２６．８９、ｐ．０００１）におけるマウスの生存よりも有意に悪く、４／１０マウスが４ｇを超える腫瘍で安楽死されたが、残りの６／１０は実験終了まで生存した。５．８ｍｇ／ｋｇでは、ＮＵＣＯ１３は生理食塩水対照と比較して生存に差はなかったが、処置の終了後８日目に、平均腫瘍重量は、対照群（ｐ＝０．０４８）と比較して２４．３％減少した。２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇの投与量では、平均腫瘍体積は、実験した９日目〜５１日目の生理食塩水対照と比較して、両方の処置群で有意に低く（ｐ＜０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定、両側検定）、図３Ｂに示す。
【０１４２】
さらにＮＵＣ０１３の最大耐量（ＭＴＤ）はヌードマウスではまだ確立されていないが、ＮＵＣＯ１３を３週間連続３日間静脈内投与した場合、１２０ｍｇ／ｋｇよりも大きいことが示されており、 デシタビンよりも著しく良好な治療指数である。このような毒性の相対的な欠如は、膵臓癌（例えば、細胞系ＣＦＰＡＣ−１のＧＩｓｏは５３．８μＭ）などのＮＵＣＯ１３に対して比較的耐性の腫瘍の治療を可能にする可能性がある。
【０１４３】
ＮＵＣ０１３（ＮＵＣ０４１、３’，５’−ジ（トリメチルシリル）−２’，２’−ジフルオロ−５−アザ−２’−デオキシシチジン）のプロドラッグによる処理は、ＨＬ−６０またはＬｏＶｏを移植したヌードマウスに対しても活性を示した。ＮＵＣ０１３は加水分解されるので、ＮＵＣ０４１は疎水性マトリックス中に配合されるように設計される。１００ｎｍ未満の液滴サイズを有する水中油型乳剤中のＮＵＣ０４１を用いた元の実験は、ＮＵＣ０１３よりも薬物動態学的な利点を示さなかった。それにもかかわらず、静脈内投与された３１ｍｇ／ｋｇの用量（ＮＵＣ０１３の２０ｍｇ／ｋｇの用量と等モル）で、ＮＵＣ０４１処置ＨＬ−６０マウスは、生理食塩水対照と比較して生存率の改善傾向があった（ＨＲ＝０．５１、ｐ＝０．２６）。ＬｏＶｏを移植したマウスでは、ＮＵＣ０４１で処置したマウスの腫瘍重量は、処置終了後８日目に生理食塩水対照より２６．６％少なかった（ｐ＝０．０２０）。より最近になって、マウスに皮下投与されたリン脂質ゲルデポー（depot）中のＮＵＣ０４１の製剤化は、薬物動態パラメータの劇的な改善を示した。マウスにＩＶ投与されたＮＵＣ０１３の半減期は２０分であるが、ゲル中のＮＵＣ０４１から放出されるＮＵＣ０１３の最大平均濃度（Ｔｍａｘ）の時間は４時間であり、薬剤は皮下注射の２４時間後に循環中にまだ存在する。
【０１４４】
表５：ＮＵＣ０４１（１００ｍｇ／ｋｇ）のマウスへのＳＣ投与後の血漿中のＮＵＣ０４１及びＮＵＣ０１３の平均濃度に由来する薬物動態パラメータ
【０１４５】
【表５】
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【０１４６】
ＮＵＣ０４１のための製剤の最適化はまだ完了しておらず、これはプロドラッグの観察された薬理学および治療効果をさらに増強することが期待される。
【０１４７】
したがって、ＮＵＣ０１３及びＮＵＣ０１３、ＮＵＣ０４１のプロドラッグは、異種移植腫瘍モデルにおいて、ＴＰ５３ ＷＴ及びＴＰ５３ヌル細胞系の両方のデシタビンより有効であることが実証されている。さらに、その毒性の相対的な欠如は、インビボでの効力を高めるためにより高い用量を使用することを可能にする。
【実施例】
【０１４８】
以下の実施例は、開示の態様を例示するために提供され、開示された発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１４９】
実施例１
２’−２’−ジフルオロ−５−アザデオキシシチジン（ＮＵＣ０１３）の調製
【０１５０】
２’−２’−ジフルオロ−５−アザ−デオキシシチジン（化合物ＩＶ）（ＮＵＣ０１３）を調製するために、スキームＩに示す２つの代替経路を使用した。
【０１５１】
経路１  −工程Ａ−  １−ブロモ−２−デオキシ−２，２−ジフルオロ−Ｄ−リボフラノシル−３，５−ジベンゾアート（化合物Ｉ）を介した３’，５’−ジベンゾイル−２’，２’−ジフルオロ−５−アザデオキシシチジン（化合物ＩＩＩ）の調製。
【０１５２】
（１）当技術分野で知られている出発物質２−デオキシ−２，２−ジフルオロ−Ｄ−リボフラノシル−３，５−ジベンゾエート（Chouら，Synthesis 1992，vp565-570）を国際公開第２００６／０７０９８５号に記載されている方法と同様の方法により、１−ブロモ類似体に変換された。出発リボース（３．９ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）を３１ｍｌのトルエンに溶解し、乾燥トリエチルアミン（１．４３ｍｌ、１０．３ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を０℃に冷却し、８ｍｌのトルエン中のジフェニルホスホリルクロライド（２．６４ｍｌ、１２．３ｍｍｏｌ）を１５分間で加えた。反応混合物を室温に温め、３．５時間インキュベートした。１Ｍ ＨＣｌ（１０．２ｍｌ）の添加により反応を停止し、トルエン層を分離し、水層を１０ｍｌのエーテルで抽出した。有機層を合わせ、水、飽和ＮａＨＣＯ３および飽和ＮａＣｌ（それぞれ２０ｍｌ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を除去し、ヘキサン−酢酸エチル勾配のシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーにより生成物を単離した。収量４．６ｇ、７３％。
【０１５３】
（２）工程（１）に記載のように調製した中間体ジフェニルホスフェート類似体（４．６ｇ、７．５ｍｍｏｌ）に酢酸（３０%、１６．２ｍｌ、８１．３ｍｍｏｌ）中のＨＢｒを加え、反応混合物を室温で６．５時間インキュベートした。反応混合物を塩化メチレン８０ｍｌで希釈し、氷水、飽和ＮａＨＣＯ３および飽和ＮａＣｌ（各１００ｍｌ）で２回抽出した。 有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、蒸発させて、１−ブロモ−２−デオキシ−２，２−ジフルオロ−Ｄ−リボフラノシル−３，５−ジベンゾエート（化合物Ｉ、３．１ｇ、９３％）を得た。ａおよびＰ異性体の９：１混合物である。
【０１５４】
（３）５−アザシトシン（９８%、アルドリッチ、５．０ｇ、４４．８ｍｍｏｌ）および硫酸アンモニウム（２５ｍｇ）をヘキサメチルジシラザン（２５ｍｌ）に懸濁し、クロロトリメチルシラン（０．２ｍｌ）を加えた。反応混合物を還流温度で１７時間加熱した。透明な溶液を冷却し、蒸発させ、乾燥キシレンで２回共蒸発させ、真空乾燥させて、シリル化５−アザシトシン（約７ｇ）の白っぽい固体を得、これを次のグリコシル化工程に全体として使用した。
【０１５５】
（４）グリコシル化工程のために、工程（２）に記載したように調製した１−ブロモ−２−デオキシ−２，２−ジフルオロ−Ｄ−リボフラノシル−３，５−ジベンゾエート（化合物Ｉ）（０．７８ｇ、１．７７ｍｍｏｌ）を４ｍｌアニソールに溶解し、工程（３）で調製したシリル化５−アザシトシン固体に移した。懸濁液を１５０℃に加熱し、２ｍｌのアニソールを添加してすべての固体を完全に溶解させた。４時間後、反応混合物を冷却し、ＳｎＣｌ４（０．２ｍｌ、２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１５０℃で６時間再加熱し、室温に冷却し、塩化メチレン（３０ｍｌ）、メタノール（１０ｍｌ）およびシリカゲル（２０ｇ）を加えてクエンチし、乾燥させて３’，５’−ジベンゾイル−２’，２’−ジフルオロ−５−アザデオキシシチジン（化合物ＩＩＩ）を得た。得られた粉末を充填シリカゲルカラムの頂部に適用し、クロロホルム−メタノール勾配中のフラッシュクロマトグラフィーにより生成物を単離した。最初にＰ−異性体が溶出した後にａ−異性体が得られた（部分的分離のみが達成され、Ｐ−異性体１２％、ａ−異性体５％の収率）。完全異性体分離は、５０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ７．５）−アセトニトリル勾配中のＧｅｍｉｎｉ Ｃ１８ ５ｕ（２１．２×２５０ｍｍカラム）上のＲＰ ＨＰＬＣによって達成された。
【０１５６】
化合物ＩＩＩ  Ｐ異性体についてのＣＤＣ中のＮＭＲ：８．１２ｐｐｍ（ｓ、１Ｈ、Ｈ６）、７．８−８．１（ｍ、４Ｈ、ベンゾイル）、７．４−７．６（ｍ、２Ｈ、ベンゾイル）、７．２−７．４（ｍ、４Ｈ、ベンゾイル）、６．３８（ｂｒ．ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ１’）、５．６５（ｍ、１Ｈ、Ｈ３’）、４．７０（ｍ、２Ｈ、Ｈ５’）、４．５８（ｍ、１Ｈ、Ｈ４’）。ＥＳＩ ＭＳ：４７３．３［Ｍ＋Ｈ］＋、４７１．１［Ｍ−Ｈ］−。
【０１５７】
経路１  −工程Ｂ  ２’−２’−ジフルオロ−５−アザデオキシシチジン（化合物ＩＶ）
【０１５８】
工程Ａのように調製した３’，５’−ジベンゾイル−２’，２’−ジフルオロ−５−アザデオキシシチジン（化合物ＩＩＩ）（１５ｍｇ、ａおよびＰ異性体の３：１混合物）を、無水ＭｅＯＨで溶解し、ＭｅＯＨ（０．１ｍｌ）中の１Ｍ ＮａＯＭｅを添加した。室温で１時間後、反応混合物を蒸発させ、脱保護した異性体を、５０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ７．５）−アセトニトリル勾配中のＧｅｍｉｎｉ Ｃ１８ ５ｕ（２１．２×２５０ｍｍカラム）のＲＰ ＨＰＬＣによって単離した。直後にＰ異性体に相当する分離画分をプールし、１０℃未満で蒸発させて０．４ｍｇ（１９％）の２’，２’−ジフルオロ−５−アザデオキシシチジン（化合物ＩＶ）を得た。
【０１５９】
化合物ＩＶのＰ−異性体についてのＤＭＳＯ−ｄ６中の１ＮＭＲ：８．４８ｐｐｍ（ｓ、１Ｈ、Ｈ６）、７．７９（ｂｒ、２Ｈ、ＮＨ２）、６．３５（ｂｒ、１Ｈ、３’−ＯＨ）、６．０７ｔ、Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ４’，５．３０（ｂｒ、１Ｈ、５’−ＯＨ）、４．９０（ｂｒ、１Ｈ、５’−ＯＨ）、４．２３（ｂｒ．ｍ、１Ｈ、Ｈ３’）、３．８５（ｍ、１Ｈ、Ｈ４’）、３．７８（ｍ、１Ｈ、Ｈ５’）、３．６３（ｍ、１Ｈ、Ｈ５’）、５０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ７．５）中のＵＶ ２４０ｎｍ（ｓｈ）。
【０１６０】
経路２  −工程Ｃ−  １−メチルスルホニル−２−デオキシ−２，２−ジフルオロ−Ｄ−リボフラノシル−３，５−ジベンゾアート（化合物ＩＩ）を介した３’，５’−ジベンゾイル−２’，２’−ジフルオロ−５−アザデオキシシチジン（化合物ＩＩＩ）の調製。
【０１６１】
工程Ａ（３）に記載のように調製したシリル化５−アザシトシン（２．３ｇ、９ｍｍｏｌ）をアニソール２ｍｌに１３０℃で溶解した。当技術分野で記載されているように調製された１−メチルスルホニル−２−デオキシ−２，２−ジフルオロ−Ｄ−リボフラノシル−３，５−ジベンゾエート（化合物ＩＩ）（０．４ｇ、０．８７ｍｍｏｌ）（Chouら、Synthesis，vp 565-570、1992）を１ｍｌのアニソールに溶解し、シリル化５−アザシトシンの高温溶液に加えた。反応混合物を１５０℃で７時間インキュベートし、室温に冷却し、１５ｍｌの塩化メチレン、１５ｇのシリカゲル及び５ｍｌのメタノールを加えてクエンチし、懸濁液を真空乾燥した。得られた粉末を充填シリカゲルカラムの頂部に適用し、クロロホルム−メタノール勾配中のフラッシュクロマトグラフィーにより生成物を単離した。適切な画分をプールし、蒸発させてａ−およびＰ−異性体の２：１混合物として３’，５’−ジベンゾイル−２’，２’−ジフルオロ−５−アザデオキシシチジン（化合物ＩＩＩ）を得た（１００ｍｇ、収率２５％）。
【０１６２】
経路２−工程Ｄ−  ２’，２’−ジフルオロ−５−アザデオキシシチジン（化合物ＩＶ）の調製
【０１６３】
工程Ｃにおけるように調製した３’，５’−ジベンゾイル−２’，２’−ジフルオロ−５−アザデオキシシチジン（化合物ＩＩＩ）（８０ｍｇ、ａおよびＰ異性体の２：１混合物）を、２ｍｌの無水ＭｅＯＨで溶解し、ＭｅＯＨ（０．１ｍｌ）中の１Ｍ ＮａＯＭｅを添加した。室温で１時間後、反応混合物を蒸発させ、脱保護した異性体を、５０ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート（ｐＨ７．５）−アセトニトリル勾配中のＧｅｍｉｎｉ Ｃ１８ ５ｕ（２１．２×２５０ｍｍカラム）のＲＰ ＨＰＬＣによって単離した。直後にＰ異性体に相当する分離画分をプールし、１０℃未満で蒸発させて２．１ｍｇ（１３％）の２’，２’−ジフルオロ−５−アザデオキシシチジン（化合物ＩＶ）を得た。
【０１６４】
ＲＰ ＨＰＬＣ保持時間および化合物ＩＶのスペクトル特性（すなわち、１ＨＮＭＲおよびＵＶ）は、工程Ｂと同じであった。ＥＳＩ ＭＳ：２６５．２ ［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１６５】
スキーム１．  ３’，５’−ジベンゾイル−２’，２’−ジフルオロ−５−アザデオキシシチジン（化合物ＩＩＩ）および２’，２’−ジフルオロ−５−アザデオキシシチジン（化合物ＩＶ）（ＮＵＣ０１３）の合成。
【０１６６】
【化１０】
2019506434.tif 000020
【０１６７】
以下の表６は、本特許出願において言及された構造をまとめたものである。
【０１６８】
【表６】
2019506434.tif 000021
2019506434.tif 000022
2019506434.tif 000023
【０１６９】
全ての引用文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
本開示の好ましい実施形態を図示し説明したが、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができることが理解される。
【図１】
2019506434.tif 000024
【図２】
2019506434.tif 000025
【図３】
2019506434.tif 000026
【国際調査報告】
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2019506434.tif 000028
2019506434.tif 000029
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