(57)【要約】ＥｐｈＡ２標的化ドキソルビシン生成ナノリポソームは、細胞当たり約３０００個を超えるＥｐｈＡ２受容体を発現するがん細胞を含むＥｐｈＡ２陽性がんの治療に有用である。ドセタキセルプロドラッグを封入するＥｐｈ−Ａ２標的化ナノリポソームを用いてＥｐｈＡ２陽性がん患者を特定するための診断法及び特定された患者の治療法が提供される。【選択図】図１
2019512477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者においてＥｐｈＡ２陽性のヒトのがんの治療方法であって、治療有効量の、ＥｐｈＡ２標的化抗体を含むリポソーム中に封入されたドセタキセルプロドラッグを投与して、前記ヒト患者における前記がんを治療することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＥｐｈＡ２陽性のヒトのがんが、細胞当たり少なくとも３，０００個のＥｐｈＡ２を有するがん細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＥｐｈＡ２標的化ｓｃＦｖ抗体が、ＥｐｈＡ２のエピトープに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体を含み、前記エピトープが、配列番号４１を含むｓｃＦｖ部分によって特異的に結合される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記ドセタキセルプロドラッグが、式（Ｉ）の化合物を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ドセタキセルプロドラッグが、化合物１〜６、またはその医薬上許容される塩から選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ドセタキセルプロドラッグが、リポソーム中に封入された化合物３のスクロースオクタスルフェート塩である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ドセタキセルプロドラッグが、リポソーム中に封入された化合物６のスクロースオクタスルフェート塩である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
腫瘍中の前記細胞の少なくとも１０％が、ＥｐｈＡ２を過剰発現し、及び／または腫瘍関連血管細胞の少なくとも１０％が、ＥｐｈＡ２を過剰発現する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍細胞及び／または腫瘍関連血管細胞が、平均で、細胞当たり少なくとも３，０００個のＥｐｈＡ２受容体を有するがん細胞を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＥｐｈＡ２陽性のヒトがん性腫瘍を有するヒト患者を特定するためのリポソーム−細胞会合方法であって、前記腫瘍の組織試料を得ることと、前記腫瘍中の細胞の少なくとも１０％が、ＥｐｈＡ２を過剰発現し、及び／または腫瘍関連血管細胞の少なくとも１０％がＥｐｈＡ２を過剰発現することを決定することと、を含む、前記方法。
【請求項１１】
腫瘍細胞及び／または腫瘍関連血管細胞が、平均で、細胞当たり少なくとも３，０００個のＥｐｈＡ２受容体を有するがん細胞を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍細胞が、平均で、細胞当たり少なくとも１７，５００個のＥｐｈＡ２受容体を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
ＥｐｈＡ２陽性のヒトがん性腫瘍を有するヒト患者を特定するためのリポソーム−細胞会合方法であって、前記腫瘍の組織試料を得ることと、前記腫瘍中の細胞の少なくとも１０％が、２＋の範囲でＥｐｈＡ２を過剰発現し（１７，５００個の受容体／細胞）、及び／または腫瘍関連血管細胞の少なくとも１０％が、ＥｐｈＡ２を過剰発現することを決定することと、を含む、前記方法。
【請求項１４】
治療される前記腫瘍が、固形腫瘍である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記固形腫瘍が、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、及び前立腺癌のリストから選択される、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、次の係属中の米国仮特許出願第６２／３０９，２１５号（２０１６年３月１６日出願）、及び同第６２／３２２，９７１号（２０１６年４月１５日出願）の優先権を主張し、これらのそれぞれは、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
配列表
本明細書と同時に提出されたコンピュータで読み取り可能な配列表が、その全体が参照により本明細書に組み込まれており、次の通りに特定される：「１１０７ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ．」の名称の４８．０  ＫＢ  ＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）である１ファイル。
【０００３】
本開示は、ＥｐｈＡ２陽性がんの治療で有用なエフリン受容体Ａ２を標的化するナノリポソーム、及び関連する診断方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
エフリン受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）は、いくつかの固形腫瘍において高度に過剰発現される細胞間結合タンパク質のエフリンファミリーの一部であり、予後不良に関連している。Ｅｐｈ受容体は、Ｎ末端リガンド結合ドメインの相同性に基づいて２つのグループ（Ａ及びＢ）に分けられるチロシンキナーゼ受容体の大きなファミリーから構成される。Ｅｐｈ受容体は、細胞の増殖、移動及び分化を制御するいくつかの重要なシグナル伝達経路に関与している。これらの受容体は、それらのリガンドが隣接する細胞の表面に結合するという点で特有である。Ｅｐｈ受容体及びそれらのリガンドは、発達段階で発現の特異的なパターンを呈する。例えば、ＥｐｈＡ２受容体は、胚の発生過程で神経系において発現され、また成体において増殖する上皮細胞の表面上でも発現される。ＥｐｈＡ２はまた、リガンドエフリンＡ１を通して媒介される血管新生及び腫瘍血管新生でも重要な役割を果たす。加えて、ＥｐｈＡ２は、乳癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌及び膵臓癌を含む、様々なヒト上皮腫瘍において過剰発現される。ＥｐｈＡ２の発現はまた、腫瘍の血管及び間質細胞においても同様に検出され得る。
【発明の概要】
【０００５】
我々は、機構的な単一細胞のカットオフ値、及び臨床グレードのＩＨＣアッセイに基づいて、ドセタキセルプロドラッグを封入するＥｐｈＡ−２標的化ナノリポソームを用いて治療するために、ＥｐｈＡ２＋患者の前向き選択のための診断フレームワークを開発した。本発明は、ＥｐｈＡ２を発現する細胞をＥｐｈＡ２標的化リポソーム（実施例３）とインキュベートすることが、本明細書に記載されるアッセイ法によって決定される、細胞当たり約３，０００個超のＥｐｈＡ２受容体を有する細胞に対する特異的な結合を示したという発見に一部は基づいている。例えば、図６は、実施例３のＥｐｈＡ２標的化蛍光リポソームと、異なるレベルのＥｐｈＡ２を発現する細胞とのリポソーム−細胞会合の増加を、ＥｐｈＡ２標的化部分を含まない匹敵するリポソームと比較して示しているグラフである。本明細書で使用される場合、「ＥｐｈＡ２陽性」とは、細胞当たり少なくとも約３，０００個のＥｐｈＡ２受容体を有するがん細胞（またはこのようながん細胞を含む腫瘍を有する患者）を指す。図４に示すように、ＥｐｈＡ２陽性細胞は、Ｅｐｈ−Ａ２標的化リポソームに細胞毎に特異的に結合し得る。一例では、ＥｐｈＡ２標的化リポソーム（実施例３に開示されるような）は、少なくとも約３，０００個以上（例えば、７５，５００個以上）のＥｐｈＡ２受容体を有するＥｐｈＡ２陽性がん細胞に特異的に結合し得る。実施例２は、ＩＨＣアッセイを説明している。
【０００６】
実施例１に記載されるように、我々は、抗体介在性結合及びＬｓの内在化を可能にするためのＥｐｈＡ２受容体の最小数を特定するために、リポソーム（Ｌｓ）−細胞相互作用に対してｑＦＡＣＳ及びインビトロアッセイを用いた。実施例２に記載されるように、我々は、ＥｐｈＡ２＋細胞株に対してＥｐｈＡ２−細胞株を区別することができるＩＨＣアッセイを開発した。我々は、様々な適応症の腫瘍試料におけるＥｐｈＡ２染色パターンを特性評価し、初期臨床試験において患者の選択を可能にする採点アルゴリズムを開発した。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】インビトロでの細胞株のパネルにおいて、Ｎｔ−Ｌｓに対する４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ及び４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓのリポソーム−細胞会合を示すグラフである。
【図２】インビトロで同じ細胞株で実施された４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓに対する４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓのリポソーム−細胞会合を示すグラフである。
【図３】ｑＦＡＣｓを用いて定量化された細胞株のパネルについての細胞毎の受容体中で発現されたＥｐｈＡ２の発現を示すグラフである。
【図４】インビトロでの細胞株のパネルにおけるＥｐｈＡ２の発現に関連する４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ及び４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓならびにＮＴ−Ｌｓのリポソーム−細胞会合を示すグラフである。
【図５】インビトロでの細胞株のパネルにおいて収集され、ミカエリス・メンテンの式に当てはめたＥｐｈＡ２の発現に関連する４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ及び４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓのリポソーム−細胞会合を示すグラフである。
【図６】インビトロでのＥｐｈＡ２発現及びＥｐｈＡ２陰性（−）、ＥｐｈＡ２低（＋）ならびにＥｐｈＡ２高（＋＋）細胞株を分けるカットオフ値の特定に関連する４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ及び４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓならびにＮＴ−Ｌｓのリポソーム−細胞会合を示す対数スケールでのグラフである。
【図７】ＥｐｈＡ２陰性細胞をＥｐｈＡ２陽性細胞から正確に分類するための３０００のカットオフ値の能力を例証する、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ及び４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓについての受信者動作特性曲線を示すグラフである。
【図８】異なる一次抗体濃度におけるＩＨＣ染色細胞アレイの褐色信号強度分析を示すグラフである。
【図９】ＩＨＣ染色細胞アレイから定量化された褐色信号強度とｑＦＡＣｓを用いて定量化された細胞当たりのＥｐｈＡ２受容体との間の相関関係を示すグラフである。
【図１０】ＥｐｈＡ２陰性野生型に対するＥｐｈＡ２トランスフェクト細胞の染色によって例証されるＩＨＣ染色の特異性を示す画像である。
【図１１】ＥｐｈＡ２  ＩＨＣの解釈のための採点決定行列を示すグラフである。
【図１２】ＥｐｈＡ２結合部分（抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖ  ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）を含むドセタキセル生成リポソームの図解である。
【図１３Ａ】ＥｐｈＡ２標的化ドセタキセル生成リポソームを調製するために使用され得るｓｃＦｖについてのアミノ酸配列及び対応するコード化ＤＮＡ配列である。ＤＮＡ配列は、コード化されたｓｃＦｖを発現する哺乳動物（例えば、ヒトまたは齧歯類）細胞によって切断されているＮ末端リーダー配列をさらにコード化する。
【図１３Ｂ】ＥｐｈＡ２標的化ドセタキセル生成リポソームを調製するために使用され得るｓｃＦｖについてのアミノ酸配列及び対応するコード化ＤＮＡ配列である。ＤＮＡ配列は、コード化されたｓｃＦｖを発現する哺乳動物（例えば、ヒトまたは齧歯類）細胞によって切断されているＮ末端リーダー配列をさらにコード化する。
【図１３Ｃ】ＥｐｈＡ２標的化ドセタキセル生成リポソームを調製するために使用され得るｓｃＦｖについてのアミノ酸配列及び対応するコード化ＤＮＡ配列である。ＤＮＡ配列は、コード化されたｓｃＦｖを発現する哺乳動物（例えば、ヒトまたは齧歯類）細胞によって切断されているＮ末端リーダー配列をさらにコード化する。
【図１４Ａ】ＥｐｈＡ２保有率及び臨床試料を採点するための計画を示すグラフのセットである。
【図１４Ｂ】原発腫瘍及び転移腫瘍（卵巣癌）におけるＥｐｈＡ２保有率を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
ＥｐｈＡ２標的化ナノリポソームは、ドセタキセル（例えば、封入されたドセタキセルプロドラッグ）をがん細胞及び／または腫瘍に送達させて、血管透過性亢進及び残存（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ（ＥＰＲ））効果及びＥｐｈＡ２標的化を通しての細胞特異性の組み合わせによって臓器特異性を活用するために使用することができる。本明細書に開示される診断フレームワークは、例えば、ドセタキセルプロドラッグを含有するＥｐｈＡ２標的化ナノリポソームを投与されるがん患者を選択するためのＥｐｈＡ２に基づく除外基準の臨床実施において、または任意の他の安定的に結合した（２４時間超の薬剤保持時間のＴ１／２）薬剤ペイロードに使用することができる。
【０００９】
我々は、増強した血管透過性及びＥｐｈＡ２標的化を通して細胞特異性によって臓器特異性を活用する、新規なＥｐｈＡ２標的化ドセタキセルナノリポソームを開発した。本研究の目的は、今後の臨床試験におけるＥｐｈＡ２に基づく除外基準の臨床実施を可能にする診断フレームワークを開発することであった。
【００１０】
ＥｐｈＡ２陽性腫瘍（例えば、がん細胞またはがん関連間質のいずれかによって発現される）において、ＥｐｈＡ２標的化ナノリポソームは、ＥｐｈＡ２に結合することができ、これが、腫瘍からのリポソームの流失を低減または最小限に抑えることができ、リポソームのエンドサイトーシス及びＥｐｈＡ２標的化ナノリポソーム内に封入されたドセタキセルプロドラッグの加速された放出をもたらす。これらの機構の両方共に、腫瘍に送達されるドセタキセルのレベルの増加に細胞内及び細胞内の両方で寄与し、がん細胞死及び腫瘍縮小をもたらすと考えられる。これらの機構を媒介する重要な段階は、ＥｐｈＡ２標的化ナノリポソームのＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞への結合である。
【００１１】
「ＥｐｈＡ２」とは、エフリン−Ａリガンドに結合することができ、かつエフリン−Ａリガンドによって活性化され得る受容体チロシンキナーゼである、「上皮細胞キナーゼ（ＥＣＫ）」とも呼ばれる、エフリンＡ型受容体２を指す。「ＥｐｈＡ２」という用語は、ＥｐｈＡ２の任意の天然起源のアイソフォームを指すことができる。ヒトＥｐｈＡ２のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿００４４２２．２として登録されている。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「ＥｐｈＡ２陽性」とは、細胞当たり少なくとも約３，０００個のＥｐｈＡ２受容体を有するがん細胞（またはこのようながん細胞を含む腫瘍を有する患者）を指す。ＥｐｈＡ２陽性細胞は、細胞当たりのＥｐｈ−Ａ２標的化リポソームに特異的に結合することができる。特に、ＥｐｈＡ２標的化リポソームは、細胞当たり少なくとも約３０００個以上のＥｐｈＡ２受容体を有するＥｐｈＡ２陽性細胞に特異的に結合することができる。
【００１３】
本明細書で使用される場合、非標的化リポソームは、「Ｌｓ」または「ＮＴ−Ｌｓ」と表記され得る。Ｌｓ（またはＮＴ−Ｌｓ）は、ドセタキセルプロドラッグを有するか、または有さない非標的化リポソームを指すことができる。「Ｌｓ−ＤＴＸ」とは、本明細書に開示されるこれらのドセタキセルプロドラッグと同等または代替の実施形態を含む、任意の好適なドセタキセルプロドラッグを含有するリポソームを指す。「ＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸ」とは、本明細書に開示されるこれらのドセタキセルプロドラッグと同等または代替の実施形態を含む、任意の好適なドセタキセルプロドラッグを封入する標的化部位を有さないリポソームを指す。特定のドセタキセルプロドラッグを含む非標的化リポソームの例は、フォーマット「Ｌｓ−ＤＴＸｐ［ｙ］」または「ＮＴ−ＤＴＸｐ［ｙ］」で定義することができ、この［ｙ］は、本明細書に規定される特定の化合物の番号を指す。例えば、別段の指示がない限り、Ｌｓ−ＤＴＸｐ１は、抗体標的化部位を含まない、本明細書の化合物１のドセタキセルプロドラッグを含有するリポソームである。
【００１４】
本明細書で使用される場合、標的化免疫リポソームは、「ＩＬｓ」と表記され得る。「ＩＬｓ−ＤＴＸｐ」の記述は、ｓｃＦｖなどの標的化部位を含む標的化ドセタキセル生成免疫リポソームの任意の実施形態または変更例を指す。本明細書に開示されるＩＬｓは、免疫リポソームのエピトープ結合ｓｃＦｖ部分などの生体エピトープに結合するための部分を含む免疫リポソームを指す。別段の指示がない限り、本明細書に記述されるＩＬｓは、ＥｐｈＡ２結合免疫リポソームを指す（あるいは、「ＥｐｈＡ２−ＩＬｓ」と称される）。「ＥｐｈＡ２−ＩＬｓ」という用語は、本明細書では、ＥｐｈＡ２に結合するように標的化された部分を有する、本開示により実施可能である免疫リポソームを指す。ＩＬｓは、ＥｐｈＡ２に結合する（例えば、ＥｐｈＡ２に結合する任意のｓｃＦｖ配列を用いて）部分を有するＥｐｈＡ２−ＩＬｓを含む。好ましい標的化ドセタキセル生成免疫リポソームとしては、ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３、ＩＬＳ−ＤＴＸｐ４、及びＩＬＳ−ＤＴＸｐ６が挙げられる。反対の指示がない限り、これらには、ＥｐｈＡ２結合部分と、化合物３、化合物４または化合物６（それぞれ）の封入ドセタキセルプロドラッグを有する免疫リポソームが含まれる。ＥｐｈＡ２−ＩＬｓは、ドセタキセルプロドラッグを有するか、または有さない免疫リポソーム（例えば、ドセタキセルプロドラッグを含まない、スクロースオクタスルフェートなどの捕獲剤を封入する免疫リポソーム）を指すか、または含むことができる。
【００１５】
略語フォーマット「［ｘ］ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ［ｙ］」は、本明細書で規定された特定の化合物の番号（［ｙ］）を有するドセタキセルプロドラッグ（「ＤＴＸｐ」）を封入するか、ないしは別の方法で含有するリポソームに結合された、特定の配列番号［ｘ］で規定されたアミノ酸配列を有するｓｃＦｖ「標的化」部分を含む免疫リポソーム（「ＩＬｓ」）の例を記述するために本明細書で使用される。別段の指示がない限り、標的化ＩＬｓについてのｓｃＦｖ配列は、ＥｐｈＡ２標的に結合することができる。
【００１６】
「ＮＴ−Ｌｓ」という用語は、標的化部位を有さない、本開示により実施可能である非標的化リポソームを指す。「ＮＴ−Ｌｓ−ＤＴＸ」という用語は、ドセタキセルプロドラッグ（「ＤＴＸ」）を封入する、本開示により実施可能である非標的化リポソームを指す。
【００１７】
リポソームの十分な結合に必要とされる最小のＥｐｈＡ２発現を分析して（実施例１）、細胞株のパネルを用いて、ＥｐｈＡ２発現（ｑＦＡＣｓによって測定された）とインビトロでの標的介在性リポソーム−細胞会合との間の関係を決定した。
【００１８】
実施例１に記載されるように、ＥｐｈＡ２標的化リポソーム／細胞相互作用は、発現標的と直接に相関したが、一方、非標的化リポソームの細胞との相互作用は最小であって、標的発現によって影響を受けなかった。ＥｐｈＡ２−ＩＬｓ／細胞相互作用に基づいて細胞株を階層化することができるカットオフ値を、非標的化リポソーム／細胞会合を評価することによって決定し、最高の非標的化リポソーム／細胞会合についての値（３４３リポソーム／細胞）として確立した。我々は、次に、統計的パーティション手法を用いて、最適ＥｐｈＡ２発現カットオフ値（３，０００個の受容体／細胞にほぼ等しい）を、最小の誤分類で決定した。
【００１９】
非標的化Ｌｓは、インビトロで細胞と会合しないが、細胞株起源とは関わりなく、ＥｐｈＡ２発現とＥｐｈＡ２細胞会合との間に強い相関関係がある。我々は、非標的化Ｌｓを用いて、達成され得る非特異的結合の程度（約３４０個のＬｓ／細胞）を決定し、パーティショニングを用いて、標的化の媒介で必要なＥｐｈＡ２受容体の最小数（約３，０００個の受容体／細胞）を決定した。我々は、ＥｐｈＡ２についてのｑＩＨＣアッセイを開発及び検証した（約９０％の精度、０．８の線形性、及び約５％の再現性）。我々は、様々な適応症からの約２００個の腫瘍試料のセットを染色した。ＥｐｈＡ２は、腫瘍細胞、腫瘍関連筋線維芽細胞、及び腫瘍関連血管中で発現されることが判明した。１０％の受け入れカットオフ値を用いると、ＥｐｈＡ２保有率が、評価される腫瘍型において５０％〜１００％の範囲であることが判明した。染色における有意差は、対応する試料における転移性腫瘍と原発性腫瘍との間には認められなかった。
【００２０】
結果を以下の表１にまとめる。
【表１】
2019512477.tif 000003
【実施例】
【００２１】
実施例１：インビトロでのリポソーム標的化に及ぼす標的効果の細胞発現の分析
実施例１は、実施例３の例示のＥｐｈ−Ａ２標的化リポソーム（本明細書では「ＥｐｈＡ２−ＩＬｓ」）の、その腫瘍細胞に結合する能力に関する特性評価を詳述し、ＥｐｈＡ２−ＩＬｓ結合に十分であるＥｐｈＡ２発現のカットオフ値を確立する。２つのＥｐｈＡ２標的化クローンである４０ｓｃＦｖ及び４６ｓｃＦｖを組み込む免疫リポソームの結合親和性を評価するスクリーニングアッセイからの結果を、非標的化リポソーム（ＮＴ−Ｌｓ）と比較することによって、我々は、クローン間の結合能力における高い相関関係があることを確立した（Ｒ２＝０．９７）。さらに、両ＥｐｈＡ２クローンを有する免疫リポソームは、非標的化リポソーム対照と比べて、統計的に有意な結合の増加を示した（Ｐ＜０．０００１）。その後の分析は、試験された２つのクローンのうちの、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓが、クローン４０ｓｃＦｖよりも高い、リポソーム／細胞会合の４９％の増加を示すことを決定した。加えて、ＥｐｈＡ２発現を定量化するために使用されたｑＦＡＣＳ分析は、ＥｐｈＡ２標的化リポソームのＥｐｈＡ２陽性細胞に対する高レベルの特異性を示した。ＥｐｈＡ２標的化リポソームの細胞との会合とＥｐｈＡ２の発現との間に強い相関関係があった（＞０．８のピアソン相関）。
【００２２】
材料
【表２】
2019512477.tif 000004
ＢＤからのＱｕａｎｔｉｂｒｉｔｅビーズは、ビーズ当たりのＰＥ（フィコエリスリン）分子の数についての検量線を作成するために使用した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎの説明書に従って、各実験について、５００ｕｌのＦＡＣｓ緩衝液を付属のチューブに添加し、続いてライト・リファレンスビーズ（Ｒｉｇｈｔ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｅａｄｓ）で前もって校正したＢＤ  ＦＡＣｓ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター上で読み取った。
【００２３】
細胞を、約７０〜８０％の集密度になるまで適切な培地中で培養し（細胞株の表を参照）、次いでトリプシン処理し、計数し、ＦＡＣｓ緩衝液で洗浄して、９６ウェル丸底プレートの各ウェルにおいて４×１０６細胞／ウェルの最終濃度を得た。次いで、細胞を、氷上で２００ｎＭのＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍのＥｐｈＡ２  ＰＥ抗体と２０分間インキュベートして、洗浄し、１００ｕｌのＦＡＣｓ緩衝液中に再懸濁させた。細胞をＢＤ  ＦＡＣｓ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター上で読み取り、データを、本明細書のｑＦＡＣｓ法の検証に関して記載されるように表した。
【００２４】
リポソーム−細胞会合アッセイ：共有結合性ｓｃＦｖ複合体化リポソームの細胞取込み
リポソームは、エタノール注入−押出し法によって調製される。スフィンゴミエリン（ＳＭ）リポソームについては、脂質は、スフィンゴミエリン、コレステロール及びＰＥＧ−ＤＳＧ（３：２：０．２４のモル部）から構成され、総リン脂質の０．３ｍｏｌ％の比で添加されたＤｉＩＣ１８（３）−ＤＳ（ＤｉＩ３−Ｌｓ）、またはＤｉＩＣ１８（５）−ＤＳ（ＤｉＩ５−Ｌｓ）蛍光脂質標識のいずれかを伴う。簡単に言うと、３０ｍｌのリポソームの調製については、脂質を、５０ｍｌの丸底フラスコ中で、３ｍｌのエタノールに摂氏７０度で溶解させる。ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４４ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５）を摂氏７０度の水浴中で温めて、摂氏６５度より高くし、脂質溶液と激しく攪拌しながら混合して、５０〜１００ｍＭのリン脂質を有する懸濁液を提供する。次いで、得られた白濁混合物を、６５〜７０℃で、０．２μｍ及び０．１μｍのポリカーボネート膜を通して、例えば、ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ  Ｌｉｐｅｘ押出機（Ｎｏｅｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｃａｎａｄａ）を使用して、繰り返し押出す。リン脂質濃度をリン酸塩アッセイによって測定する。粒径を動的光散乱によって分析する。この方法で調製されたリポソームは、約９５〜１１５ｎｍのサイズを有する。抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖタンパク質を哺乳動物細胞培養において発現させて、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーにより精製し、水溶液中で、Ｃ末端システイン残基のマレイミド末端リポポリマー、ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥへの、１：４のタンパク質／ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥモル比での結合を通して複合体化した。得られたミセル状のｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ複合体をＵｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ３４またはＡｃＡ４４（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）上のゲルクロマトグラフィーにより精製した。抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖタンパク質を、哺乳動物細胞培養中で発現させて、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーにより精製し、水溶液中で、Ｃ末端システイン残基のマレイミド末端リポポリマー、ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥへの、１：４のタンパク質／ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥモル比での結合を通して複合体化した。得られたミセル状のｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ複合体をＵｌｔｒｏｇｅｌ  ＡｃＡ３４（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）上のゲルクロマトグラフィーにより精製した。標的化ＤｉＩ３−ＬｓまたはＤｉＩ５−Ｌｓを、ミセル状抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ複合体と、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓについては、１０〜１２ｇ／ｍｏｌのリン脂質の、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓについては５ｇ／ｍｏｌのリン脂質のｓｃＦｖ／リポソーム比で、６０℃で３０分間インキュベートすることによって調製した。リガンドが挿入されたリポソームを、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂカラムで精製し、脂質濃度についてリン酸塩アッセイによって分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより抗体を定量化する。
【００２５】
この試験で使用された細胞は、７０〜９０％の集密度になければならない。試験の２４時間前に、培地を、ＲＰＭＩ（１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミン及びｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含有する）の新鮮なアリコートで交換し、トリプシン処理によって採取した。次いで、細胞を成長培地中に再懸濁させて、ウェル当たり１００，０００個の細胞で播種し、洗浄して、５０μＭのリンン脂質リポソームを含有する培地１００ｕｌと共にインキュベートした。続いて、細胞を、一定の振盪を加えながら３７℃の暗所で４時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで２〜３回洗浄し、ＦＡＣＳ分析用に、１００ｕｌ／ウェルのＰＢＳ中に再懸濁させた。ＤｉＩ５標識リポソームの平均細胞蛍光（ＭＣＦ）を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｓｅ）を用いて決定した。観察された蛍光信号は、表面結合ナノ粒子及び内在化ナノ粒子の両方を表すものであり、一方、ブランクリポソーム（複合体化ｓｃＦｖを有さない）とインキュベートされた細胞のＭＣＦは、非特異的結合を決定するために使用された。
【００２６】
【表３−１】
2019512477.tif 000005
【表３−２】
2019512477.tif 000006
【表３−３】
2019512477.tif 000007
【００２７】
アッセイの検証
このアッセイは、非標的化リポソームに対する共有結合性ｓｃＦｖ複合体化リポソームの取込みを定量化するために、標的介在性リポソーム−細胞会合を評価することを目的とする。我々は、ＥｐｈＡ２抗体の２つのクローン４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ及び４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓを試験した。簡単に言うと、細胞を、親油性蛍光体で蛍光標識された標的化または非標的化リポソームのいずれかと４時間インキュベートし、次いで洗浄して、フローサイトメトリーを用いて単一細胞の蛍光を測定する。既知の数の蛍光体を有する蛍光ビーズを検量線として用いて、平均蛍光値からリポソームの数を決定した。全体として、このアッセイは、高い線形性、（平均Ｒ２＝０．９８）、再現性（１０％以内の検量線についての切片及び傾き）、及び低いアッセイ内変動（技術的反復実験間の平均ＣＶ＝２．１％［０．０３％〜１９％］）を裏付けた。細胞株のサブセット（２０％＝１３／６５）を２回実行したところ、データは、実行間で再現可能なリポソーム取込みを示している：ＲＵＮ＃１はＰＯＣ１０と名付け、ＲＵＮ＃２はＲＵＮ＃７４と名付けた。アッセイ再現性については、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓを使用した。リポソームの数及び推定ドセタキセル負荷を逆算するために、我々は以下の等式を使用する。
【数１】
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【００２８】
リポソーム−細胞会合アッセイを検証するために、我々は、２つの生物学的反復実験における再現性を試験した。ＰＯＣ１０及びＲｕｎ＃７４は、１ヶ月離れて実施されたアッセイの２つの実行を表し、それぞれは４日間にわたって実行された。ＥｐｈＡ２−リポソーム（４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ）及びＮＴ−リポソームのレベルについて、２つの実行間で有意差はなかった。全てのフローサイトメトリーの実行で作成されたＲｕｎ＃７４からのＢ．検量線は、アッセイの線形性及び安定性を示している。
【表４】
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【００２９】
非標的化に対するＥｐｈＡ２標的のリポソーム−細胞会合
図１は、リポソーム−細胞会合の範囲を特性評価するために行われた分析の結果を示す。我々は、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓまたは４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓのいずれかを用いて細胞株の大規模なセットをスクリーニングして、それをＮＴ−Ｌｓと比較した。我々は、ＥｐｈＡ２−ＩＬｓが、使用されるＥｐｈＡ２クローンとは無関係に、ＮＴ−Ｌｓよりも多く、統計的に有意な様式で細胞と会合することを見出した。図１（ＮＴ−Ｌｓに対するＥｐｈＡ２−ＩＬｓの細胞会合）を参照すると、細胞株のセットを、ＥｐｈＡ２標的化免疫リポソーム４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ及び４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓで試験した。ＥｐｈＡ２−ＩＬｓは、ＮＴ−Ｌｓと比較すると、統計的に有意な細胞との高会合を実証した（対応のあるｔ検定）。両方のＥｐｈＡ２抗体クローンは、同様な結合を有したが、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓとの会合がわずかであるが統計的に有意なより高いレベルであった。
【００３０】
クローン間の相関を決定するために、３４個の細胞株のセットを、並行して評価した。両クローンは、０．９７のＲ２値によって示されるように、互いに対して高い相関を示した。しかしながら、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓは、細胞当たりのリポソームの数の平均で４９％の増加及び２１％の標準偏差を伴い、クローン４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓよりも統計的に有意に高いリポソーム−細胞会合をもたらした（ｐ＜０．０００１）。
【００３１】
図２（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓに対する４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓの細胞会合）は、２つのＥｐｈＡ２クローンを同じ試験で比較するために使用した３４個の細胞株の分析の結果を示している。強い線形相関が、両方の抗体クローン間で見られるが、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓについてのリポソーム−細胞会合が有意により高い。
【００３２】
ＥｐｈＡ２のｑＦＡＣｓアッセイの検証
ＥｐｈＡ２のｑＦＡＣＳアッセイは、定量的フローサイトメトリー（ｑＦＡＣｓ）を用いて、細胞当たりのＥｐｈＡ２分子を定量化することを目的とする。要約すると、細胞を、ＰＥに結合されたＥｐｈＡ２抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｃｌｏｎｅ  ３０３５マウスモノクローナル）と１時間インキュベートした。次いで、注目する細胞を洗浄し、フローサイトメトリーを用いて蛍光強度について評価した。ＰＥ標識ビーズ（Ｑｕａｎｔｉｂｒｉｔｅ（商標）ＰＥ定量化キット、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、フローサイトメトリーを用いて同時に分析し、各細胞に結合した抗体の数を逆算するために、線形回帰分析にかける。我々は、１つの抗体が１つだけの抗原に結合することができしたがって、抗体の数が細胞当たりの受容体の数に等しいと仮定する。アッセイ性能に関して、このアッセイが高度に線形（平均Ｒ２＝０．９９）かつ再現可能であり（検量線についての切片及び傾きが１０％以内）及びアッセイ内変動は低かった（技術的反復実験間の平均ＣＶ＝５．６％［０．６％〜３７％］）。細胞株のサブセットを２回実行し、データは再現可能なＥｐｈＡ２レベルを示している。ＥｐｈＡ２のｑＦＡＣｓアッセイの検証に関しては、アッセイの２つのランを、１ヶ月離して実施し、各ランについて４日間にわたって行った。ＥｐｈＡ２レベルについて、２つのラン間の有意差はなかった。加えて、検量線を全てのｑＦＡＣｓを用いて作成し、アッセイの線形性及び安定性を示している。
【００３３】
がん細胞株におけるＥｐｈＡ２発現の特性評価
我々は、ｑＦＡＣｓ及びリポソーム−細胞会合試験を、同日に、かつ細胞の同じバッチを用いて実施した。ｑＦＡＣｓのデータは、ＥｐｈＡ２が、細胞当たり４２２〜１４３，８８８個の受容体の範囲であることを示している（図３）。
【００３４】
標的介在性リポソーム−細胞会合に対するＥｐｈＡ２発現
このアッセイの目標は、ＥｐｈＡ２発現と標的介在性リポソーム−細胞会合との間の相関関係を評価することである。我々は、ＥｐｈＡ２抗体クローンとは無関係である、ＥｐｈＡ２発現とＥｐｈＡ２−ＩＬｓ−細胞会合との間の有意な相関関係を見出した（ピアソン相関係数＝０．８１（４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓについて）及び０．８８（Ｆ５−１０Ａ７について））。
【００３５】
図４（がん細胞株のパネルにおけるＥｐｈＡ２発現）を参照すると、ＥｐｈＡ２発現と標的介在性リポソーム会合との間の関係は、標準的な抗原−抗体結合動態を示唆しているミカエリス・メンテンの式に最良適合し、細胞株起源とは無関係であった。
【数２】
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【００３６】
ＥｐｈＡ２発現と標的介在性リポソーム会合との間の関係を考慮して、我々は、細胞株を分類することができるカットオフ値を特定した。このカットオフ値は、非標的化リポソーム−細胞会合を評価することによって決定し、約３４０個のリポソーム／細胞であるＮＴ−Ｌｓ−細胞会合の９９パーセンタイルを求めることによって確立した。我々は、統計的パーティション方法を用いて、最小限の誤分類（１％の誤差にほぼ等しい）で、最適なＥｐｈＡ２発現のカットオフ値（約３０００個の受容体／細胞）を決定した。このカットオフ値は、標的とする陰性細胞株を、標的とする陽性細胞株から分離する。図６は、特定の選択されたがん細胞株のパネルにおけるＥｐｈＡ２発現を示すグラフである。
【００３７】
第１のカットオフ値は、非標的化リポソーム−細胞会合から導出されているが、第２のカットオフ値（ＥｐｈＡ２＋をＥｐｈＡ２＋＋から分離する  図６）は、多数の細胞を分離するデータにおけるクラスタリングスポットを探すことによって決定した。特定されたクラスタリングスポットを４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓで実施し、次いで４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓに外挿した。我々は、次のレベルとして５，０００個のリポソーム／細胞を特定し、これが、パーティション分析を通して、約１７，５００個の受容体／細胞をもたらしている。４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓが、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓよりも低いリポソーム−細胞会合を有すると仮定すれば、１７，５００個の受容体／細胞は約４，０００個のリポソーム／細胞に相関した。両パーティション分析について、ＲＯＣの曲線下面積として算出されたパーティションの誤差は、４０ｓｃＦｖ−ＩＬｓ及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓについて、それぞれ０．９４及び０．９８であった。
【００３８】
実施例２：ＩＨＣアッセイ性能の定量的評価
この実施例は、ＥｐｈＡ２のＩＨＣ  ＣＤｘアッセイを記述する。このアッセイは、３０００個の受容体／細胞の特定したカットオフ値に合致するＥｐｈＡ２発現の可視的検出を可能にするように調整された。本アッセイは、許容可能なレベルの感度、特異性及び精度を実証した。全ての計画されたタスクが完了され、ＥｐｈＡ２のＩＨＣ  ＣＤｘは、ＥｐｈＡ２染色についての特異性及び感度を実証し、定量的画像解析を用いることによって定義される堅実な精度を有した。
【００３９】
ＥｐｈＡ２のＩＨＣ  ＣＤｘは、一定範囲のＥｐｈＡ２発現を有するがん細胞株のセットで試験するとき、高レベルの特異性及び感度を示した。アッセイ内及びアッセイ間変動は、細胞株及び組織試料において非常に低かった。
【００４０】
材料＆方法
細胞アレイ及びＴＭＡマップは、付録Ａで見られ、表５に記述されている。全ての組織試料を、第１相臨床試験に含まれることになる全ての関連する腫瘍型を含むように選択した。全ての細胞株について、我々が細胞パネルの大きなセットに含めた３種の腫瘍型に我々は焦点を当てた。
【表５】
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【００４１】
Ｄａｋｏ自動染色機機器で実行されたＥｐｈＡ２のＩＨＣ  ＣＤｘの切片化及び染色プロトコール
組織切片を５ミクロンの厚さに切断し、免疫組織化学分析用に正に帯電したスライド上に据え付けた。使用された一次抗体は、ウサギｍＡｂ  ＥｐｈＡ２（Ｄ４Ａ２）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２２０５０ＢＦ）であって、２μｇ／ｍｌの作用濃度に１：１０００で希釈されて使用した。濃度の範囲を試験し、許容可能な濃度を、１μｇ／ｍｌほど低く、かつ最大で１０μｇ／ｍｌと定義した（図８）。
【００４２】
使用された標識ポリマーは、Ｅｎ  Ｖｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ標識ポリマー抗ウサギ（ＤＡＫＯ  Ｋ４００３１１）であった。
【００４３】
一般手順
１．脱パラフィン化を行う
２．抗原賦活化を１０２℃で２５分間行う
３．内因性酵素ブロック（ペルオキシダーゼによる）を１０分間行う
４．緩衝液で４分間濯ぐ
５．タンパク質を１０分間ブロックする
６．緩衝液で４分間濯ぐ
７．一次抗体で、２μｇ／ｍｌの用量にて６０分間処理する
８．緩衝液で４分間濯ぐ
９．標識ポリマーで３０分間処理する
１０．緩衝液で４分間濯ぐ
１１．Ｆｌｅｘ  ＤＡＢ＋基質−クロモゲンで１０分間処理する
１２．緩衝液で４分間濯ぐ
１３．自動ヘマトキシリン染色を６分間行う
１４．緩衝液で４分間濯ぐ
１５．カバーガラスで覆う
【００４４】
定量的フローサイトメトリー
先の実施例（実施例１）で特性評価された細胞株を用いて、アッセイの性能を評価した。要約すれば、ｑＦＡＣｓを用いて６５個の細胞株において（そのうち１３個が二連で行われた）細胞当たりのＥｐｈＡ２受容体を定量化した。ＥｐｈＡ２発現は、細胞当たり４２２〜１４３，８８８個の受容体の範囲である。
【００４５】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）細胞ペレット
各細胞株を増殖するように処理し、ホルマリン固定パラフィン包埋細胞ペレットの生成をもたらす臨床的試料を模倣するように処理した。要約すると、細胞を５０００万個〜２億個の細胞まで増殖させて、ＰＢＳで洗浄し、０．０５％のトリプシンを用いてトリプシン処理し、遠心分離してＰＢＳ中で洗浄し、１０％のホルマリン中で２〜４時間固定し、その後、それらを７０％エタノールに切り替えた。細胞を、７０％のエタノール中に、４℃で、最長１週間保存した。細胞をヒストゲル中に、ヒストゲル１μｌ当たり１×１０５の密度で包埋させた。ヒストゲル包埋細胞ペレットを、パラフィン包埋処理装置で標準処理する前に、７０％のエタノール中に保存する。各ブロックから２ｍｍのコアを抽出し、それらを細胞アレイブロックに移すことによって、ＦＦＰＥブロックから細胞アレイを生成した。
【００４６】
細胞株トランスフェクション
ＥｐｈＡ２を過剰発現する細胞株を生成するために、我々は、すぐに使える粒子（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用した。構築物は、ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｌｖ１０５、ピューロマイシン選択可能なレンチウイルスベクターに基づいている。
【００４７】
ＥｐｈＡ２遺伝子情報：ＮＭ＿００４４３１．１。ウイルスカタログ番号：ＬＰ―Ａ０１２５−ＬＶ１０５−０２０５。情報及びプロトコールは、ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ／ｄｏｃｓ／Ｓｉｇｍａ／Ｇｅｎｅｒａｌ＿Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｔｒａｎｓｄｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｐｄｆ．でダウンロードすることができる。しかしながら、我々は、感染のプロトコールを必要に応じて調整かつ修正した。ＩＧＲＯＶ−１細胞株についての我々のプロトコールは以下の通りに実施する：１日目に、細胞を計数し、９６ウェルプレートに播種し（ウェル当たり１００ｕｌの培地中に４，０００個の細胞）、２日目に、１）培地を除去して、ポリブレン［例えば８μｇ／ｍｌ］と５μｌ［低ＭＯＩ］または３０ｕｌ［高ＭＯＩ］のＥｐｈＡ２発現ウイルスとを含有する１００μｌの感染溶液を添加する。２ａ）室温で２３００ｒｐｍにて９０分間遠心分離し、３７℃のインキュベータ中に一晩放置する。２ｂ）細胞がポリブレン感受性を示す場合、同日に、インキュベーションの６時間後に、１５０μｌ／ウェルの新鮮な増殖培地を添加する。２ｃ）あるいは、ポリブレンの最終濃度を４μｇ／ｍｌまで低下させる。２ｄ）細胞が長時間の遠心分離に感受性を示す場合、遠心分離時間を３０分に短縮して、温度を３０℃に上昇させる、３日目に、全ての培地を除去し、２００μｌの新鮮な増殖培地と交換し、４日目は休止であり、５日目に培地を２μｇ／ピューロマイシン含有増殖培地で置き換えることによって、５日間のピューロマイシン選択を開始し、６日目に、ＦＡＣＳまたは同様な方法によって、ＥｐｈＡ２発現レベルを試験する。
【００４８】
検証アプローチ
アッセイ内及びアッセイ間精度を評価するために、スライドを一緒に三連で３回染色して、染色スライドを生成した（ラン１．１、ラン１．２、ラン１．３、ラン２．１、ラン２．２、ラン２．３、ラン３．１、ラン３．２、ラン３．３）。染色の実行を、２人の異なる操作者で、異なる日に（１日目、３日目、５日目）行った。１）１日目では、アッセイ内精度のために実行したアッセイは、アッセイ間精度の１日目での試料を同じように表すことに留意されたい。２）３日目には、アッセイが、１日目に使用した同じＴＭＡブロックからの３つの未染色スライドの第２の反復実験セットで繰り返されるであろう。３）５日目には、アッセイは、１日目及び３日目で使用したものと同じＴＭＡブロックからの３つの未染色スライドの第３の反復実験のセットで繰り返した。
【００４９】
顕微鏡及び画像解析
画像を、ＡｐｅｒｉｏＢＦスキャンスコープ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ  ＩＬ）で、２０倍の拡大率にて収集した。ＥｐｈＡ２の褐色信号の定量化を、インハウスアルゴリズム及びＭａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を用いて開発したユーザインターフェーズを用いて行った。要約すると、細胞または組織領域を、ユーザが閾値を変化させるか、または領域を手動で含めるか、もしくは除外することができる半自動閾値ベースのアルゴリズムを用いて区分化した。コアアノテーションツールを用いてコアを試料ＩＤに一致させて、これがユーザにより、全ての画像に対してＱＣされる。スナップショット画像をさらなるＱＣのために保存する。より高い解像度の組織区分化アルゴリズムを用いて、組織または細胞の周辺のマスクを締め付ける。各コアから、平均褐色染色強度を、ＲＧＢ画像を色空間ＣＹＭＫに変換し、黄色チャネルを、褐色を最もよく描写しているものとして使用することによって、算定する。平均褐色信号強度は、ＴＭＡ内の各細胞株または腫瘍に対して捕捉され、感度、特異性、及び精度の算出に使用されるであろう。
【００５０】
統計的分析
全ての統計的分析は、ＪＭＰ（ＳＡＳ、ＮＣ）を用いて実施した。細胞株ＣＡ０２２５１５の分析については、線形回帰を行って、ＥｐｈＡ２受容体／細胞に対するＥｐｈＡ２  ＩＨＣの褐色強度の線形性を評価し、Ｒ２を線形性についての測定基準として用いた。パーティション分析を、ＥｐｈＡ２−細胞株に対するＥｐｈＡ２＋細胞株を分類するためのアッセイの能力を評価するために（我々の事前に確立した、約３，０００個の受容体／細胞の機構的カットオフ値を用いて）行った。パーティション分析を、ＥｐｈＡ２＋＋細胞株とＥｐｈＡ２＋細胞株に対するＥｐｈＡ２−細胞株を分類するためのアッセイの能力を、約１７，５００個の受容体／細胞という第２のカットオフ値に基づいて評価するためにも行った。アッセイ内及びアッセイ間変動を、線形回帰の傾きについて、及びパーティション分析のカットオフ値について、各細胞株に対するＣＶを計算することによって評価した。ＨＴＭＡ０６０９１５の分析については、アッセイ内及びアッセイ間変動を、ＴＭＡの各腫瘍試料についての変動係数（ＣＶ）を計算することによって評価した。細胞株ＣＡ１１１０１４の分析については、ＥｐｈＡ２過剰発現細胞株におけるＥｐｈＡ２の染色パターンを、それを親細胞株と比較して定性的に評価した。
【００５１】
定量的フローサイトメトリーに相関するＩＨＣ染色定量的画像解析を使用する感度及び特異性ならびに精度
ＩＨＣアッセイを、細胞株のＥｐｈＡ２−、ＥｐｈＡ２＋、ＥｐｈＡ２＋＋への分類を可能にするために最適化した。我々は、我々の細胞株パネルを使用して、プロトコールの全ての他のパラメータを同一に保ちながら、一次抗体のいくつかの濃度を試験した。我々は、０、１、２、６、１０及び２０μｇ／ｍｌの一次抗体を試験した。我々は、アッセイが高度に調整可能であることと、ＲＯＣのＡＵＣによって計算された誤差が、１、２及び５μｇ／ｍｌに対しては＜１０％であり、１０及び２０μｇ／ｍｌに対しては１１及び１４％であることを見出した。２０μｇ／ｍｌにおいては、細胞株の上限値は飽和された。信号の病理学者による検出を可能にするために、我々は、褐色染色の強度を目視により評価し、１０〜１４の強度は見ることができないことを見出し、したがって、我々は、染色の目視採点を可能にする２μｇ／ｍｌの濃度を選択する。
【００５２】
ＥｐｈＡ２のＩＨＣアッセイの感度及び特異性ならびに精度を評価するために、ＥｐｈＡ２発現の既知の変化レベルを有する６５種の特有の細胞株を含んだ７８個の細胞株を含有するブロックを切片化して染色した。相関性及び線形性を、細胞当たりの受容体に対するＥｐｈＡ２の褐色染色を分析することによって評価した（図９）。パーティション分析及びＲＯＣ分析もまた実施して、感度及び特異性を実証した（表６）。先の実験は、３，０００個の受容体／細胞が、このアッセイの感度であることを実証しており、我々は、パーティション分析のために細胞株を陽性または陰性として定義するために使用した（表６）。細胞株のさらなるクラスタリングは、約１７，５００個の受容体／細胞という第２のインビトロベースのカットオフ値の特定を可能にした。この２つのカットオフ値を踏まえて、我々は、細胞株を３つのグループＥｐｈＡ２−、ＥｐｈＡ２＋、ＥｐｈＡ２＋＋にグループ分けした。パーティション分析を用いて、我々は、定量的ＩＨＣの細胞株を分類する能力を評価した（表７）。
【表６】
2019512477.tif 000012
ＩＨＣアッセイは、＜１０％の誤差で、ＥｐｈＡ２−及びＥｐｈＡ２＋細胞株を再現可能に分類することができた。ラン内及びラン間変動は最小であった。
【表７】
2019512477.tif 000013
ＩＨＣアッセイはまた、ＥｐｈＡ２−細胞株を、２〜３％の誤差範囲で、ＥｐｈＡ２＋細胞株を２２％〜１０％の誤差範囲で、及びＥｐｈＡ２＋＋細胞株を１０％〜７％の誤差範囲で再現可能に分類することができた。カットオフ値内精度及びカットオフ値間精度は、ラン間及びラン内の非常に低い変動を示している。
【００５３】
定量的画像分析内及び定量的画像分析間の精度もまた、細胞株レベルにおけるＣＶを計算することによって評価した。全ての細胞株において計算されたＣＶは、６．２％の最大ＣＶで、１．２８％〜１．５５％の範囲のアッセイ内平均ＣＶを示した。アッセイ間では、平均ＣＶは、細胞株の＞９５％が＜２０％のＣＶを有する状態で、平均ＣＶは２．２４％であって、最大ＣＶは２３．８％であった。
【００５４】
組織マイクロアレイを用いる精度
ＴＭＡ試料を用いる精度ランは、３つの反復実験スライドについて３種の染色日数からなり、２人の操作者によって行われた。以下は、このランの説明である。
【００５５】
アッセイ内及びアッセイ間精度は、同じ免疫組織化学染色バッチ内（アッセイ内）、別個の免疫組織化学染色バッチ（アッセイ間）、異なる操作者によって実施されたもの（操作者間）、及び異なる機器で染色されたもの（機器間）の染色の再現性について評価されるであろう。平均褐色強度（単位）を、間質及び腫瘍組織の両方を含む各コアから抽出した。ＣＶを、ラン内の３つのスライドの平均（アッセイ間）を用いて、ラン内（アッセイ内）及びラン間の全てのコアについて計算した（表３）。全体として、コアは２０％のＣＶ最大許容レベル％に達せず、大部分は１０％未満であった。中央値アッセイ内ＣＶは、２％の２５％パーセンタイル及び４．７６％の７５％パーセンタイルで、２．９％であった。中央値アッセイ間ＣＶは、１．５％の２５％パーセンタイル及び３．９％の７５％パーセンタイルで、２．６％であった。アッセイ内及びアッセイ間変動は、平均褐色強度とは無関係であった（表８）。
【表８】
2019512477.tif 000014
【００５６】
ＥｐｈＡ２トランスフェクト細胞株を用いて試験したＥｐｈＡ２のＩＨＣ  ＣＤｘの特異性
ＩＧＲＯＶ−１細胞株は、ＥｐｈＡ２のＩＨＣ  ＣＤｘを使用する細胞ペレット中でも見られる、最低レベルのＥｐｈＡ２発現を有することがｑＦＡＣｓによって判明した。我々は、レンチウイルス構築物を用いてＥｐｈＡ２を過剰発現させて、ｑＦＡＣＳにより発現を確認した。親ＩＧＲＯＶ−１細胞は、１，０００個のＥｐｈＡ２受容体／細胞を有するが、一方ＩＧＲＯＶ−１−ＥｐｈＡ２は１００００個の受容体／細胞を有する。我々の機構的カットオフ値は３，０００個の受容体／細胞であるために、トランスフェクションにより、ＥｐｈＡ２＋ＩＧＲＯＶ細胞株を生成することが可能であった。中程度の発現もまた、我々がアッセイの感度を定性的に評価することを可能にする。分析が２つの対になった細胞株を比較するよう制限されるために、我々は、染色パターンの定性的評価を行い、細胞株のスナップショットを報告に含めた（図１０）。ＥｐｈＡ２のＩＨＣ  ＣＤｘは、高ＥｐｈＡ２＋細胞株においてのみ細胞膜の染色を示し、親細胞株では示さなかった。
【００５７】
ＥｐｈＡ２のＩＨＣ  採点評価ガイダンス
対照スライド
１．対照スライドを評価する。
ａ）品質管理基準が満たされない場合、ランが失敗したと見なされ、試料ＥｐｈＡ２のＩＨＣは採点されるべきではない
ｂ）閾値に近いＥｐｈＡ２＋細胞株の染色の強度は、評価され、染色強度の基準として使用されるべきである。
ｃ）組織試料のＨ＆Ｅ染色切片は、第１の評価に推奨される。（腫瘍は、ＥｐｈＡ２  ＩＨＣで染色された試料を見るとき、明らかでない場合もある。Ｈ＆Ｅ染色は、病理学者が腫瘍細胞を確認することを可能にする。）
２．試料の採点評価に進む。陽性のがん細胞及び腫瘍関連血管のパーセントを評価し、記録する。決定行列を用いて、試料についてのＥｐｈＡ２の総合評点（＋または−）を特定する。
【表９】
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【００５８】
がん細胞採点評価（ＩＨＣ）
図１３は、ＩＨＣ採点評価ガイドを提供している。
目標は、染色強度とは無関係に陽性がん細胞のパーセントを推定することである。染色強度は、採点評価ガイダンスを容易にするためだけ参照される。
−ＥｐｈＡ２染色切片を、膜染色を示す腫瘍細胞のパーセントの推定のために、最初に弱拡大視野の４倍の拡大率で評価する。
−膜染色で染色された腫瘍細胞のパーセントを確認するために、１０倍の拡大率を使用する。検体の保存状態が良くかつ十分に染色された領域を用いて、陽性腫瘍細胞のパーセントの決定を行わねばならない。
【００５９】
判定基準
染色が強いが、細胞膜及び細胞質の染色パターンの混合物を含む場合、または染色が非常に薄ぼやけている場合には、細胞膜の位置の存在を２０倍及び４０倍を用いて確認する。
・平均強度（＋＋または＋＋＋）を含む明確な染色を有するが、主として細胞質位置にあるがん細胞は、ＥｐｈＡ２＋と見なされ、陽性細胞パーセントの推定に含まれるべきである。
・薄暗い（＋）細胞染色を有するがん細胞はＥｐｈＡ２＋と見なされ、陽性細胞パーセントの推定に含まれるべきである。
・細胞膜の一部にのみ及ぶ不完全な膜染色を有するがん細胞は、陽性細胞パーセントの推定に含まれるべきである。
・細胞膜パターンを有さない薄暗い（＋）拡散する細胞質染色を有するがん細胞は除外されるべきである。
・強い細胞膜染色と弱くかつ陰性がん細胞との混合パターン。
・薄暗い（＋）細胞（黒矢印）における細胞膜の位置を確認するために、２０倍及び／または４０倍が必要である。赤矢印は、ほとんど検出できない拡散した薄暗い（＋）細胞質染色を有する陰性細胞を示す。
【００６０】
腫瘍関連血管（ＴＡＶ）採点評価ガイダンス
目標は、染色強度とは無関係に、少なくとも１つの陽性ＴＡＶを含有する高倍率視野のパーセントを推定することである。
【００６１】
少なくとも１つのＥｐｈＡ２＋ＴＡＶを有する陽性高倍率視野のパーセントの推定のために、ＥｐｈＡ２切片を、最初に低倍率で、１０倍拡大率で評価する。
方法
１．高微小血管密度及び／または内皮染色の証拠を含む腫瘍領域内またはその周辺で３〜４個の低倍率視野（１０倍を推奨）を特定する。
２．各低倍率視野について、可能であれば、３個の高倍率視野、４０倍の拡大率で総数１２個の高倍率視野を特定する。
３．ＥｐｈＡ２内皮染色を評価する。
４．１つ以上の血管が全体的または部分的に染色される場合にだけ、視野は陽性と見なされる。
５．陽性及び全高倍率視野の数を報告する。
【００６２】
判定基準
・ＥｐｈＡ２＋ＴＡＶの評価は、がん細胞を含む組織断片に制限されるべきである。良性断片は、この分析から除外されるべきである。
・ＴＡＶは、腫瘍領域から≦２ｍｍ以内の血管として定義される。腫瘍領域から＞２ｍｍの血管は、この分析から除外されるべきである。
・間質と思われるが、明確に血管ではない染色は、除外されるべきである。これは非特異的染色及び筋線維芽細胞に適用する。
・血清染色が見られることがあり、内皮染色評価を妨害することがある。弱い内皮染色及び血清染色を有する血管は、除外するべきではない。
・１０倍で見られるＥｐｈＡ２陽性ＴＡＶは、より高い拡大率において確認される。
・血清染色人工物が内皮評価を妨げる場合は除外する。
・染色が明確に内皮性でない場合は除外する。
【００６３】
実施例３：ＥｐｈＡ２標的化ドセタキセルプロドラッグナノリポソーム
ＥｐｈＡ２標的化ナノリポソームは、好ましくは、およそ１１０ｎｍの直径の単一ラメラ脂質二重層小胞であり、治療部位に存在するｐＨでドセタキセルに変換するドセタキセルプロドラッグを含有する水性空間を封入する。
【００６４】
図１２は、ドセタキセルプロドラッグを封入するペグ化ＥｐｈＡ２標的化リポソームの構造を示す概略図である。このリポソームは、リポソームに結合した（例えば、共有結合ＰＥＧ−ＤＳＰＥ部分を通して）、ｓｃＦｖなどのエフリンＡ２（ＥｐｈＡ２）標的化部分を含む。ドセタキセルプロドラッグを封入するペグ化ＥｐｈＡ２標的化リポソームは、ＥｐｈＡ２受容体を認識する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体断片を、本明細書に記載されるドセタキセルをプロドラッグの形態で含有するペグ化リポソームに共有結合的に複合体化し、免疫リポソーム製剤をもたらすことによって創り出すことができる。
【００６５】
好ましくは、ドセタキセルプロドラッグは、ドセタキセルプロドラッグを形成するためにエステル結合を通してドセタキセルの２’ヒドロキシル基に導入された第三級アミンなどの弱塩基を含む。リポソーム中にローディングするのに好適な好ましい２’−ドセタキセルプロドラッグは、酸性ｐＨにおいて比較的高い安定性によって特徴付けられるが、生理的ｐＨにおいて単純な加水分解を通してドセタキセルに変換する。
【００６６】
ドセタキセルプロドラッグは、保存中にリポソーム内部において、そしてインタクトなリポソームが全身循環にある間は、ドセタキセルプロドラッグは安定することができるが、リポソームからの放出時に、活性ドキタキセルに迅速に加水分解されて（例えば、ｔ１／２＝約１０時間）、循環血の環境に進入する。
【００６７】
ドセタキセルプロドラッグは、穏やかな酸性ｐＨにおいてローディングし、それが不溶性形態で安定化される電気化学的勾配を用いて、酸性のリポソームの内部に捕捉され得る。
【００６８】
ドセタキセル生成リポソームは、ＥｐｈＡ２標的化部分を含み得る。本明細書で使用される場合、「抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖ」という用語は、別段の指示がない限り、ＥｐｈＡ２に、好ましくはＥｐｈＡ２のＥＣＤに免疫特異的に結合するｓｃＦｖを指す。ＥｐｈＡ２特異的ｓｃＦｖは、好ましくは、ＥｐｈＡ２タンパク質中には存在しない抗原とは結合しない。標的化部分は、本明細書に開示されるドセタキセル生成リポソームを標的とするために、リポソームに共有結合され得るタンパク質である、一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）とすることができる。ｓｃＦｖは、典型的には、ＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲから構成される機能的抗原結合部位の形成を可能にするリンカーペプチドを介して、その中でＶＨ及びＶＬが互いに共有結合されている単鎖ポリペプチドから構成され得る。Ｉｇ軽鎖または重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる、３つの超可変領域と互い違いになっている複数の「フレームワーク」領域（ＦＲ）から構成されている。
【００６９】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるｓｃＦｖは、表１０に記載されるＶＨ  ＦＲ１、ＶＨ  ＦＲ２、ＶＨ  ＦＲ３、ＶＬ  ＦＲ１、ＶＬ  ＦＲ２、及びＶＬ  ＦＲ３のうちの１つまたは任意の組み合わせを含む。一実施形態では、ｓｃＦｖは、以下の表１０の配列のフレームワークを含有する。
【表１０】
2019512477.tif 000016
【００７０】
ある特定の態様では、本明細書に開示されるｓｃＦｖは、熱安定性であり、例えば、これにより、ｓｃＦｖは、堅牢かつスケーラブルな製造にうまく適合している。本明細書で使用される場合、「熱安定性」ｓｃＦｖは、例えば、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）を用いて測定される、６７℃超の、または少なくとも約７０℃の融解温度（Ｔｍ）を有するｓｃＦｖである。
【００７１】
好ましい抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖは、ＥｐｈＡ２ポリペプチドの細胞外ドメイン、すなわち、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００４４２２．２またはＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ２９３１７に記載される配列の少なくともアミノ酸残基２５〜５３４に及ぶＥｐｈＡ２タンパク質の部分に結合する。
【００７２】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＥｐｈＡ２  ｓｃＦｖは、それぞれが表１１に記載された配列を有する、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、及びＶＬ  ＣＤＲ３を含む。ＣＨ  ＣＤＲ２配列（ＣＤＲＨ２とも称される）が、表１１に記載された１８個の異なるＶＨ  ＣＤＲ２配列から選択されるいずれか１つであろうことに留意されたい。
【表１１−１】
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【００７３】
ドセタキセルプロドラッグを封入するペグ化ＥｐｈＡ２標的化リポソームの１つの特定の例において、脂質膜は、Ｎ−（ヘキサデカノイル）−スフィング−４−エニン−１−ホスホコリン（卵スフィンゴミエリン）、コレステロール、及び１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）から構成することができる。ナノリポソームは、ヒトへの非経口投与用に製剤化される滅菌医薬組成物などの水性緩衝溶液中に分散させることができる。ペグ化ＥｐｈＡ２標的化リポソームは、ＴＳ１（配列番号４０）、Ｄ２−１Ａ７（配列番号４１）または以下のｓｃＦｖ３（配列番号４６）の標的化部分を含み得る：
ＴＳ１  ＡＡ（配列番号４０）
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASVGATGPFDIWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQPPSVSVAPGQTVTITCQGDSLRSYYASWYQQKPGTAPKLLIYGENNRPSGVPDRFSGSSSGTSASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGTHLTVFGGGTKLTVLGGGSGGC**
Ｄ２−１Ａ７  ｓｃＦｖ  ＡＡ（配列番号４１）
QVQLQQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASVGATGPFDIWGQGTMVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPAVSVALGQTVSITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPLLVIYGENNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGTHLTVFGGGTKLTVLGGGSGGC**
ｓｃＦｖ３  ＡＡ（配列番号４６）
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVTVISPDGHNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASVGATGPFDIWGQGTLVTVSSASTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQPPSVSVAPGQTVTITCQGDSLRSYYASWYQQKPGTAPKLLIYGENNRPSGVPDRFSGSSSGTSASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGTHLTVFGGGTKLTVLGGGSGGC**
【００７４】
例示的なＥｐｈＡ２標的化ドセタキセル生成ナノリポソーム組成物は、「４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３」と命名され、これは、卵スフィンゴミエリン、コレステロール及びＰＥＧ−ＤＳＧから約４．４：１．６：１の重量比で形成された脂質小胞中に封入された化合物３と命名した式（Ｉ）の化合物を、（ＥｐｈＡ２への標的化を提供するために）脂質小胞に脂質小胞中のスフィンゴミエリンの総量に対して約１：１４２の重量比で結合した配列番号４６のｓｃＦｖと共に含む標的化リポソームである。
【表１２】
2019512477.tif 000018
【００７５】
好ましいＥｐｈＡ２標的化ドセタキセル生成ナノリポソーム組成物の２つの具体的な例は、４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ３（すなわち、本明細書のドセタキセルプロドラッグ化合物３を封入する免疫リポソームに結合した、配列番号４６のｓｃＦｖを含むＥｐｈＡ２標的化ドセタキセル生成ナノリポソーム組成物）及び４６ｓｃＦｖ−ＩＬｓ−ＤＴＸｐ４である。代替的な好ましい実施形態は、ＥｐｈＡ２標的化ドセタキセル生成免疫リポソームを、
（１）１つ以上の非荷電脂質成分（例えば、コレステロール、または他の成分、例えば、ジアシルグリセロール、アシル（ポリエーテル）及び／もしくはアルキルポリ（エーテル））、１つ以上の中性リン脂質（例えば、ジアシルホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、及び／またはジアシルホスファチジルエタノールアミン）、及びペグ化脂質成分を用いて、標的化免疫リポソームに所望の血漿安定性をもたらす任意の好適な比で配合された脂質小胞と、
（２）免疫リポソーム中にローディングするのに（例えば、スクロースオクタスルフェートまたは他のスルホン化ポリオールなどの捕獲剤を用いて）好適なドセタキセルプロドラッグ、例えば、本明細書の式（Ｉ）の化合物（ｎが１〜４（好ましくは、２または３）であり、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立してＣ１〜Ｃ４アルキル（好ましくはＣ２またはＣ３アルキル）である式（Ｉ）のドセタキセルプロドラッグ化合物、より好ましくは、ｎが２または３であり、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立してＣ１〜Ｃ３アルキルである式（Ｉ）のドセタキセルプロドラッグ化合物、最も好ましくは、ｎが２または３であり、Ｒ１及びＲ２が、それぞれ独立してエチルである式（Ｉ）のドセタキセルプロドラッグ化合物）と、
（３）リポソーム小胞を形成するペグ化脂質（例えば、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）に結合した、配列番号９のＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号１１〜２７のうちのいずれか１つのＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号２８のＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号２９のＶＬ  ＣＤＲ１、配列番３０のＶＬ  ＣＤＲ２、及び配列番号３１のＶＬ  ＣＤＲ３を含む、ｓｃＦｖ部分を含む脂質小胞と、
（４）ＥｐｈＡ２標的化ドセタキセル生成免疫リポソームを包囲して無菌製剤を形成する緩衝組成物、例えば、緩衝系、（例えば、クエン酸及びクエン酸ナトリウム）、等張剤（例えば、塩化ナトリウム）及び希釈剤としての滅菌水ビヒクル（例えば、注射用水）とを、共に含むことができる。
【００７６】
実施例４：エフリン受容Ａ２（ＥｐｈＡ２）のナノリポソームによる標的化：臨床解釈
エフリン受容体Ａ２（ＥｐｈＡ２）は、いくつかの固形腫瘍において高度に過剰発現される細胞間結合タンパク質のエフリンファミリーの一部であり、予後不良に関連している。我々は、増強した血管透過性及びＥｐｈＡ２標的化を通して細胞特異性によって臓器特異性を活用する、新規なＥｐｈＡ２標的化ドセタキセルナノリポソームを開発した。本研究の目的は、今後のＭＭ−３１０臨床試験におけるＥｐｈＡ２に基づく除外基準の臨床実施を可能にする診断フレームワークを開発することであった。
【００７７】
我々は、Ｌｓの抗体介在性内在化を可能にするためのＥｐｈＡ２受容体の最小数を特定するために、リポソーム（Ｌｓ）−細胞相互作用に対してｑＦＡＣＳ及びインビトロアッセイを用いた。我々は、ＥｐｈＡ２＋細胞株に対してＥｐｈＡ２−細胞株を区別することができるＩＨＣアッセイを開発した。我々は、様々な適応症の腫瘍試料におけるＥｐｈＡ２染色パターンを特性評価し、初期臨床試験において患者の選択を可能にする採点アルゴリズムを開発した。
【００７８】
非標的化Ｌｓは、インビトロで細胞と会合しないが、細胞株起源とは関わりなく、ＥｐｈＡ２発現とＥｐｈＡ２−Ｌｓ細胞会合との間に強い相関関係がある。我々は、非標的化Ｌｓを用いて、達成され得る非特異的結合の程度（約３４０個のＬｓ／細胞）を決定し、パーティショニングを用いて、標的化の媒介で必要なＥｐｈＡ２受容体の最小数（約３，０００個の受容体／細胞）を決定した。我々は、ＥｐｈＡ２についてのｑＩＨＣアッセイを開発及び検証した（約９０％の精度、０．８の線形性、及び＜５％の再現性ＣＶ）。我々は、様々な適応症からの約２００個の腫瘍試料のセットを染色した。ＥｐｈＡ２は、腫瘍細胞、腫瘍関連筋線維芽細胞、及び腫瘍関連血管中で発現されることが判明した。１０％の受け入れカットオフ値を用いると、ＥｐｈＡ２保有率が、評価される腫瘍型において５０％〜１００％の範囲であることが判明した。染色における有意差は、対応する試料における転移性腫瘍と原発性腫瘍との間には認められなかった。
【００７９】
要約すると、我々は、機構的な単一細胞のカットオフ値、及び臨床グレードのＩＨＣアッセイに基づいて、ＭＭ−３１０臨床試験用のＥｐｈＡ２＋患者の前向き選択のための診断フレームワークを開発した。
【表１３】
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【００８０】
図１４Ａは、陽性腫瘍関連血管のパーセントに対する陽性腫瘍細胞のパーセントの散布図を示している。発現のいくつかの明白なパターンを、様々な試験した腫瘍型で見ることができる。膀胱癌において、患者の大部分は、腫瘍細胞及び腫瘍関連血管において、両コンパートメントで非常に高い陽性率で、陽性である。胃癌では、分布がより均一であり、ＥｐｈＡ２＋患者において広範囲にわたる発現レベルが存在する（任意のコンパートメントにおいて＞＝１０％）。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び卵巣癌は、腫瘍関連血管の近くでより重い分布を示し、一方頭頸部及び膵臓は、腫瘍関連血管と比べて腫瘍細胞中での高い発現を有する。
【００８１】
疾患進行中のＥｐｈＡ２発現の進化を評価するために、我々は、同じ患者の対応する原発性／転移性試料中のＥｐｈＡ２の発現を評価した。我々は、試料の２つのセット（１）１２人の患者の全ての適応症のセット、（２）１０人の患者の膀胱癌のセットを取得した。ＥｐｈＡ２発現は、全ての適応症のセット及び膀胱がんセットにおいて、それぞれ９１％及び９０％の一致で、両方のセットにおける原発性と転移性との間で一致した。
【表１４】
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【００８２】
インビトロ細胞結合データを用いて、標的化リポソームが取り込むことを可能にするためのＥｐｈＡ２／細胞の最小数を特定した。ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織におけるＥｐｈＡ２についての免疫組織化学アッセイを解析的に検証し、いくつかの適応症からのヒトの腫瘍を調査するために使用した。ＥｐｈＡ２を、腫瘍細胞、間質、及び腫瘍関連血管において観察し、対応する原発性腫瘍及び転移性腫瘍において一致して発現した。ＥｐｈＡ２陰性患者は、前向きスクリーニング結果に基づいて、臨床試験から除外されるであろう。患者の転帰データが利用可能であるとき、ＥｐｈＡ２のコンパートメントの寄与度の後ろ向き分析は、ＭＭ−３１０から恩恵を受けるであろう患者に最大限に役立つように組み入れ基準を絞り込むために使用されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2019512477.tif 000032
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019512477.tif 000039
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