(57)【要約】  本発明は市販のグリオキサールに通常存在する酸が除去されているグリオキサール溶液を含む、組織標本の固定用組成物である。本発明の組成物は組織における構造、抗原成分及び核酸の保存用の最適な固定剤を提供する。無酸グリオキサールは毒性が限られ、発がん物質と見なされず、組織及び細胞固定用ホルマリンの有効な代替物となる。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織固定のための無酸グリオキサール水溶液の使用。
【請求項２】
前記グリオキサール溶液が０．１％から９０％の重量濃度を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記グリオキサール溶液が２％の重量濃度を有する、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記溶液のｐＨが７．１から８．０である請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記溶液がグリオキサール市販溶液をイオン交換樹脂を用いて処理することにより得られる、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
組織学的、細胞学的、免疫組織化学的評価のため、及び遺伝子分析のために、ヒト、動物及び植物細胞及び組織を固定及び保存するための、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記溶液が空気接触を防止することにより酸化及び酸性化から保護される、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記溶液が「バッグインボックス」容器及び／又は真空容器への分配、並びに／あるいはエタノール又はメタノールなどの抗酸化剤の任意の添加により、酸化及び酸性化から保護される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記溶液が使用時まで−１℃から−８０℃の温度で凍結される、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１から８に示された前記溶液、及び組織学で用いられる他の従来の試薬を含有する「バッグインボックス」型の気密容器を含む、組織学的サンプルの組織固定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸を含有しないグリオキサールの溶液を含む、組織及び細胞標本の固定用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、組織学的組織の保存及び固定は、ホルムアルデヒドを含有する水溶液、詳細にはホルマリンとして知られる、水に４％ホルムアルデヒドを含有する溶液を用いて行われる。
【０００３】
ホルマリンは製造業においては樹脂の製造、及び皮革の固定のため、医療分野では組織の移動、その保管（例えば博物館において）、組織学においては固定のため、非常に広範囲に用いられている。これは組織学的診断に顕微鏡検査を行うため、組織標本のパラフィン包埋、薄切及び染色より前に行う必要がある（Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  ｆｉｘａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，３３，８４５−８５３，１９８５）。
【０００４】
ホルマリンの使用は世界中に広まっており、イタリアのみでその消費は何百万リットルほどである。従って、ホルマリンの使用は、ホルマリンを使用し、ホルムアルデヒド蒸気を吸入する技術者及び看護師並びに病理医に影響を与える。
【０００５】
ホルムアルデヒドの毒性は昔から知られている。皮膚湿疹及び呼吸器ぜんそくを引き起こすことがあるアレルギー性及び毒性物質であり、発がん性に分類される。ホルムアルデヒドはいまだ最適な固定剤と見なされているが（Ｂｕｅｓａ  ＲＪ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １２（２００８）３８７−３９６））、その使用は問題を伴う。
【０００６】
環境局はこの揮発性試薬の毒性を次第に懸念しており、従ってＥＣ規則第１２７２／２００８号を修正している２０１４年６月５日のＥＣ規則第６０５／２０１４号の結果として、２０１６年からホルマリン禁止令が欧州諸国で提案されている。この試薬が発がん物質（区分１Ｂ／２）及び突然変異原として定義されていることにより正当化されているが、この決定は診断病理学に対して重く、おそらく受け入れがたい影響を与えたかもしれない。現在この状況に対する反応は、ホルムアルデヒド蒸気への過剰な暴露を防止するために策定された保護手順の採用に限定されているが、ホルマリンに代わる非毒性固定剤の採用によってのみ、この状況を解決することができることは間違いない。
【０００７】
ホルマリンに代わる多くの固定剤が提案されている（上記引用したＢｕｅｓａ  ＲＪ．；Ｚａｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ２０１２，１１：５９）が、これらのいずれも速く十分な固定を行うことはいまだ判明していない。
【０００８】
組織固定用ホルマリン代替物としてのグリオキサール（オキサルアルデヒド）の使用は、Ｗｉｃｋｓ及びＳｕｎｔｚｅｆｆ（Ｗｉｃｋｓ  ＬＦ  ａｎｄ  Ｓｕｎｔｚｅｆｆ  Ｖ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，９８，２０４，１９４３）により最初に提案された。このような二官能性試薬は溶液中でポリマーを形成し、タンパク質で分子内及び分子間架橋を形成する傾向がある（Ｈｏｐｗｏｏｄ  Ｄ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｅ，２０，１２７−１３２，１９６９）。溶液中、グリオキサールは様々な水和形態となり、最も一般的なものは室温で形成される環状二量体の１，３ジオキソランである（Ｄａｐｓｏｎ  ＲＷ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃ＆Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２００７，８２（３）：１６１＿１６６）。グリオキサールは非常に低い蒸気圧を有し、比較的高温（２５〜６０℃）でも蒸気とならないため、蒸気吸引のリスクがない（Ａｎｏｎ．１９８６，Ｇｌｙｏｘａｌ，ａ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｒｏｃｈｕｒｅ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ．５０ｐｐ．）。
【０００９】
組織固定剤としてのこの物質の使用に関して、多数の研究が行われている（Ｓａｂａｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９６３  Ａｐｒ；１７：１９−５８）。組織固定の結果を改善するため、グリオキサールの亜鉛塩又はアルコールとの混合物の使用が、それぞれ米国特許第７３６８１３２号明細書及びカナダ国特許発明第２１１９５５４号明細書に記載された。
【００１０】
しかしながら、グリオキサールがホルマリンによるものに類似する満足のいく形態学的保存を保証しないことが、いくつかの研究により確認された（Ｂｕｅｓａ  ＲＪ．，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １２（２００８）３８７−３９６；Ｍａｒｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｅｓ  ｄｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ  ２９，４６０−４６７；２００９）。ホルマリンに代わる固定剤として市販される多数の製剤は、エタノール、メタノール又は金属（亜鉛）など他の物質に添加されたグリオキサールを含有し、これらの製剤でさえ満足のいく結果ではなく、このいずれも組織学者の支持を得られなかった。Ｍａｒｃｏｎらの研究では、筆者らはグリオキサールに基づく様々な溶液の固定特性を、基準としてホルムアルデヒド溶液と比較した。評価段階で様々なパラメータ（形態学的保存、核酸保存など）に関する結果を比較して、グリオキサールに基づく溶液はホルマリンよりはるかに悪い結果となった。著者らは赤血球の溶解（Ｂｕｅｓａ、２００８；Ｍａｃｏｎら、２００９）又は微小石灰化の溶解（Ｕｍｌａｓ  Ｊ．ａｎｄ  Ｔｕｌｅｃｋｅ  ＭＴ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３５，１０５８−６２，２００４）などの有害作用のため、グリオキサール系溶液を推奨することはできないと結論付けた。また、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析は技術的に許容できない結果となり（Ｔｕｂｂｓ  ＲＲ，Ｈｓｉ  ＥＤ，Ｈｉｃｋｓ  Ｄ，Ｇｏｌｄｂｌｕｍ  Ｊ．Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００４；２８（３）：４１７−４１９；Ｗｉｌｌｍｏｒｅ−Ｐａｙｎｅ  Ｃ，Ｍｅｔｚｇｅｒ  Ｋ，Ｌａｙｆｉｅｌｄ  ＬＪ．Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｍｏｒｐｈｏｌ  ２００７；１５（１）：８４−８７）、核酸の抽出及び配列決定は不十分であることが判明した（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  ＪＷ．Ｂｅｓｔ  ＣＪ，Ｂｉｃｈｓｅｌ  ＶＥ，Ｃｏｌｅ  ＫＡ，Ｇｒｅｅｎｈｕｔ  ＳＦ，Ｈｅｗｉｔｔ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｈｏｌ  ２００２；１６０（２）：４４９−４５７）。このような結果は商業的グリオキサール系固定剤により示される。これらの試薬の正確な組成は公知ではないが、グリオキサール、エタノール、メタノール及び亜鉛を含む。
【００１１】
すべての登録商標をもつ固定剤（Ｇｌｙｏ−Ｆｉｘ（登録商標）、シャンドン；Ｈｉｓｔｏ−Ｆｉｘ（登録商標）、バイオワールド；Ｈｉｓｔｏ−ＣＨＯＩＣＥ（登録商標）、アムレスコ；Ｐｒｅｓｅｒｖｅ（登録商標）、アナテック、及びＳａｆｅ−Ｆｉｘ  ＩＩ（登録商標）、フィッシャーサイエンティフィック）は酸性であると報告されている（ｐＨ４の範囲内）。Ｍａｒｃｏｎら（２００９）及びＧｅｈｉｎ−Ｍａｒｃｏｎ  Ｎ．（２００８年６月１３日に論じられた論文、ナンシー大学）は異なるｐＨの異なるグリオキサールのリン酸バッファ溶液を試したが、この研究は主にｐＨ４のグリオキサール溶液について行われた。詳細には、Ｇｅｈｒｉｎ−Ｍａｒｃｏｎ（２００８）は彼女の論文において、「我々は初期の研究（試験）により、ｐＨ７の４％グリオキサールが組織固定剤として不良であり、微小解剖学の良好な保存を行うことができないことを確認している。低パーセントのエタノール（１０％）の添加及び溶液の酸性化（ｐＨ４）は、より優れた結果を得ることができる」と言及している（Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ、１４２〜１４３ページ）。なお、この論文は、市販の４％グリオキサールをｐＨ７のバッファに添加することにより調製される固定剤が調製直後又はその後に用いられるかどうか、固定剤の最終ｐＨが確認されるかどうか（溶液は時間と共に不安定となる）を明確にしていない。さらに、使用時の溶液のｐＨについて何の情報もない。また、酸がグリオキサール溶液から除去されていなかった。この問題は本発明の明細書、特に実施例５で検討される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第７３６８１３２号明細書
【特許文献２】カナダ国特許発明第２１１９５５４号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｆｏｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  ｆｉｘａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，３３，８４５−８５３，１９８５
【非特許文献２】Ｂｕｅｓａ  ＲＪ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １２（２００８）３８７−３９６
【非特許文献３】Ｚａｎｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ２０１２，１１：５９
【非特許文献４】Ｗｉｃｋｓ  ＬＦ  ａｎｄ  Ｓｕｎｔｚｅｆｆ  Ｖ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，９８，２０４，１９４３
【非特許文献５】Ｈｏｐｗｏｏｄ  Ｄ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｅ，２０，１２７−１３２，１９６９
【非特許文献６】Ｄａｐｓｏｎ  ＲＷ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃ＆Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２００７，８２（３）：１６１＿１６６
【非特許文献７】Ａｎｏｎ．１９８６，Ｇｌｙｏｘａｌ，ａ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｂｒｏｃｈｕｒｅ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ．５０ｐｐ．
【非特許文献８】Ｓａｂａｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９６３  Ａｐｒ；１７：１９−５８
【非特許文献９】Ｂｕｅｓａ  ＲＪ．，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １２（２００８）３８７−３９６
【非特許文献１０】Ｍａｒｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｅｓ  ｄｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ  ２９，４６０−４６７；２００９
【非特許文献１１】Ｕｍｌａｓ  Ｊ．ａｎｄ  Ｔｕｌｅｃｋｅ  ＭＴ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３５，１０５８−６２，２００４
【非特許文献１２】Ｔｕｂｂｓ  ＲＲ，Ｈｓｉ  ＥＤ，Ｈｉｃｋｓ  Ｄ，Ｇｏｌｄｂｌｕｍ  Ｊ．Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００４；２８（３）：４１７−４１９
【非特許文献１３】Ｗｉｌｌｍｏｒｅ−Ｐａｙｎｅ  Ｃ，Ｍｅｔｚｇｅｒ  Ｋ，Ｌａｙｆｉｅｌｄ  ＬＪ．Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｍｏｒｐｈｏｌ  ２００７；１５（１）：８４−８７
【非特許文献１４】Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  ＪＷ．Ｂｅｓｔ  ＣＪ，Ｂｉｃｈｓｅｌ  ＶＥ，Ｃｏｌｅ  ＫＡ，Ｇｒｅｅｎｈｕｔ  ＳＦ，Ｈｅｗｉｔｔ  ＳＭ，ｅｔ  ａｌ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｈｏｌ  ２００２；１６０（２）：４４９−４５７
【非特許文献１５】Ｚｈｉｙｏｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｄｉｓｈｕｎ  Ｚｈａｏ  ａｎｄ  Ｂａｏｙｕｎ  Ｘｕ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３；５１：８９３−８９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
現在、驚くべきことに、以前の研究に反して、固定剤としてのグリオキサールの特性は酸内容物を除去することにより著しく改善することができることが見出されている。
【００１５】
純粋試薬として現在利用できるグリオキサール（グリオキサール、４０ｗｔ％水溶液、製品番号１２８４６５、シグマアルドリッチ、ミラノ）は、グリオキサールの調製中及び調製後徐々に、アルデヒド部分が分解及び酸化する結果として形成されるグリオキシル酸、シュウ酸、グリコール酸、酢酸及びギ酸の存在により、実際には強酸ｐＨ（ｐＨ４付近）を有する（Ｚｈｉｙｏｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｄｉｓｈｕｎ  Ｚｈａｏ  ａｎｄ  Ｂａｏｙｕｎ  Ｘｕ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１３；５１：８９３−８９８）。これらの酸は強塩基（ＮａＯＨ）を用いて中和することができ、又はイオン交換樹脂を用いて除去することができる。このようにして得られた試薬は明白な濃度を有するグリオキサール無酸（Ｇ．Ａ．Ｆ）水溶液としてここで定義され、細胞及び組織の保存に優れた品質を有する組織固定剤であることが分かった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
従って、本発明は組織固定剤としての無酸グリオキサールの使用に関する。
【００１７】
また、本発明は本発明の固定剤又は他の試薬（組織学で一般的に使用される染料、バッファ及び他の試薬）を含有する「バッグインボックス」型の容器、あるいは真空下のバッグを含む組織学的組織固定用キットである。
【００１８】
ホルマリンと比較して、本発明の固定剤は（ホルムアルデヒドとは反対に）毒性蒸気を放出しないだけでなく、素早く、組織に直ちに浸透し、生命条件で存在するのと同様に組織及び細胞の特徴を保存する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】結腸がん。無酸グリオキサールで固定。ヘマトキシリン・エオシンで染色。細胞及び組織のより優れた保存が明らかである。
【図２】結腸がん。上記と同じ例であるが、ホルマリンで規定通りに固定した。固定及び構造保存の相似は明らかである。
【図３】結腸がんの肝転移。２％無酸グリオキサール含有ｐＨ７．３、０．１Ｍのリン酸バッファで固定。構造の最適な保存が明らかである。赤血球は肝類洞で確認でき、溶解は見られない。
【図４】結腸がん。無酸グリオキサールの固定。赤血球及び好酸球は間質で確認できる。
【図５】サンプルの吸収スペクトル。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
「無酸グリオキサール」という語は、０．１から９０％、好ましくは１．５から５０％、より好ましくは２から２０％の重量濃度、７．１から８．０、好ましくは７．２〜７．４のｐＨを有するグリオキサール水溶液を意味する。ｐＨ７．３±０．２の２％溶液が特に好ましい。
【００２１】
組織及び細胞固定剤として用いられる本発明にかかる溶液は、イオン交換樹脂を用いた酸内容物の除去により、あるいはアンモニア、ＮａＯＨ、ＫＯＨなどのアルカリ水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸亜鉛、炭酸バリウムなどの炭酸塩、又は重炭酸塩を用いた中和により、市販の４０％グリオキサール溶液から調製することができる。
【００２２】
酸を除去する手順の例を説明する。
【００２３】
イオン交換樹脂による酸の除去
イオン交換樹脂バイオラッドＡＧ５０１−Ｘ８（バイオラッド；ミラノ）３０ｇを市販の４０％グリオキサールの溶液（シグマ）１５０ｍｌに添加した。６０分後、複合物をろ過して、１５０ｍｌの透明溶液が得られた。蒸留水又は生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）をこの液体に添加して、２％ｗ／ｗ濃度のグリオキサールとした。この溶液のｐＨは中性付近となり、従ってイオン交換樹脂による酸の除去が確認された。
【００２４】
無酸グリオキサールを０．１Ｍ、ｐＨ７．２のリン酸バッファに添加することにより、ｐＨが７．２で保持された２％グリオキサール溶液が得られた。
【００２５】
同様に、強塩基性イオン交換樹脂（アンバーライト（登録商標）ＩＲＡ−４００塩化物形；シグマ、ミラノ）を用い、上記手順に従って、グリオキサール溶液から酸を完全に除去した。この２％グリオキサール溶液含有生理食塩水又はリン酸バッファを、組織固定剤として使用される試薬とした。
【００２６】
反対に、市販の強酸性グリオキサール（シグマ）をｐＨ７．０又は７．２の０．１Ｍリン酸バッファに添加して最終濃度２％又は４％にすると、得られる溶液は中性をはるかに下回り、強酸となった。
【００２７】
イオン交換樹脂により酸を除去した４０％グリオキサール溶液１００ｍｌを室温で保持した。１週間後、この溶液のｐＨは最初は中性付近であったが、グリオキサールのグリオキシル酸への酸化の結果として徐々に低下し、ｐＨ４．８に達した。
【００２８】
この酸性化のプロセスにより、組織の構造及び成分の保存に不十分な固定剤となった。
【００２９】
これは、グリオキサール溶液から酸を除去した後、酸形成を引き起こす試薬の酸化を防止する必要があることを意味する。
【００３０】
これは以下の手順を用いることにより行うことができる（任意で組み合わせる）：ａ）溶液が空気と接触するのを防止する容器を使用する、あるいはｂ）使用するまで溶液を凍結する、あるいはｃ）抗酸化物質、例えばアスコルビン酸又は硫化物又はエタノールなどのアルコールを添加する。
【００３１】
ａ）ワインを保存するため、空気暴露を防止するのに現在用いられる「バッグインボックス」の技術は、１９５５年にＷｉｌｌｉａｍ  Ｓｃｈｏｌｌｅにより提案された。液体をプラスチック箱に入れた後、バッグの栓を閉じ、存在する空気を完全に除去する。  その後バッグをボックスに入れ、栓を外に出す。液体の使用によりバッグの体積は低減するが、空気の流入は防止する。
【００３２】
例として、ｐＨ７．１の２％無酸グリオキサール溶液３リットルを「バッグインボックス」に入れた（Ｏｎｄｕｌａｔｉ  ｅ  Ｉｍｂａｌｌａｇｇｉ  ｄｅｌ  Ｆｒｉｕｌｉ  ｓｐａ、ヴィレッセ、ゴリツィア）。液体を固定剤としてこの容器から抜き取り、ｐＨを常に確認した。６ヶ月後、溶液のｐＨはまだ７超で保持され、従って酸化による酸性化を受けていないことを確認した。
【００３３】
空気との接触、従ってグリオキサールの酸化を防止する目的を常に有する代替物として、２％無酸グリオキサール溶液（ｐＨ７．３）１０００ｍｌをプラスチックバッグのＳｅａｌ−ＳＡＦＥ（マイルストーン、Ｓｏｒｅｓｏｌｅ（ＢＧ）、イタリア）に入れた後、真空手順をＴｉｓｓｕｅ−ＳＡＦＥ（マイルストーン）の装置を用いて適用した。６ヶ月後、ｐＨは未だ７超であり、酸化による酸性化を受けていないことを確認した。
【００３４】
ｂ）無酸グリオキサール溶液はｐＨ７．２〜７．４、優先的に７．３のリン酸バッファなどの緩衝溶液に添加されていてもいなくても、−１℃から−８０℃、優先的に−２０℃の温度で凍結されていれば安定を維持する。一度凍結した液体は酸化及び酸性化を受けず、解凍すれば固定に用いることができる。
【００３５】
ｃ）グリオキサールの酸化、従ってその酸性化（中性未満のｐＨに低下して、固定の質を悪化させる）を防止するため、アスコルビン酸（シグマ）などの酸化防止剤を０．０１から２０％、好ましくは１％の割合で、及び／又はトリメチルフェノール（シグマ）を０．０１から２０％、好ましくは０．１％の割合で、又はエタノール（カルロエルバ、ミラノ）などのアルコールを１％から９０％の割合で添加した。
【００３６】
詳細には、２０％無酸グリオキサールの５０％エタノール溶液は数ヶ月間中性付近のｐＨを維持する。
【００３７】
また我々は、０．１から５０％、優先的には５％濃度のエチレングリコール及びポリエチレングリコールなどの他の試薬が、経時的なグリオキサール溶液の酸性化を防止するのに有効であることも観察している。
【００３８】
以下の実施例は本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【００３９】
（大腸壁、結腸がん、乳がんの２０症例から）組織サンプルを診断目的より多く採取した。
【００４０】
手術室から出た直後の断片は３〜４ｍｍの厚みを有し、診断目的に現在利用されるものと同様であった。カセットに包埋したサンプルを室温で固定液に浸漬した。
【００４１】
同じ症例から、同時に採取したサンプルを３つの異なる種類の固定剤に浸漬した：１）リン酸緩衝ホルマリン（ＰＢＦ）（Ｄｉａｐａｔ、ベルガモ）、２）ｐＨ７．２のリン酸バッファに溶解した市販の２％グリオキサール（シグマ、ミラノ）（その後、この溶液のｐＨを確認し、最終ｐＨは６．５であった）；３）２％無酸グリオキサール含有ｐＨ７．３のリン酸バッファ。
【００４２】
室温で３又は２４時間固定した後、ライカプロセッサー（ライカ、ミラノ）を用いて、カセットをアルコール脱水及びパラフィン包埋により規定通りに処理した。
【００４３】
組織切片をパラフィンブロックから得、ヘマトキシリン・エオシンで同時に染色した。
【００４４】
免疫組織化学的染色を以下の抗原：サイトケラチン広範囲；サイトケラチン１９；ＣＤＸ２及びＫｉ６７に対して、ホルマリン（製剤１）及び無酸グリオキサール（製剤３）で固定した断片の切片に行った。類似切片で、ＡＬＫ及びＨＥＲ２遺伝子に対するＦＩＳＨ染色も行った。
【００４５】
結果
顕微鏡検査で、製剤２、すなわち最終ｐＨ６．５の市販２％グリオキサール溶液で固定した組織は、文献（Ｄａｐｓｏｎ、２００７年；Ｂｕｅｓａ、２００８年；Ｍａｃｏｎら、２００９年）に記載されるようなグリオキサールを用いた固定に関連する欠点、つまり上皮及び間質間の縮みを伴う組織の収縮、赤血球溶解、核物質を欠損した透明な核、を示した。
【００４６】
反対に、無酸グリオキサール（製剤３）で固定した組織は、上記の欠陥が無く、ホルマリン（製剤１）で固定した組織で得られるものに類似する最適な固定を示した。
【００４７】
ホルマリン及び無酸グリオキサールで固定した組織に同時に実施したサイトケラチンＬ：Ｓ：、サイトケラチン１９、ＣＤＸ２及びＫｉ６７に対する免疫組織化学的反応は、基本的に同じ結果となった。
【００４８】
すべての類似点において、ＡＬＫ及びＨＥＲ２に対するＦＩＳＨ反応は同様の結果であった。
【実施例２】
【００４９】
記載した手順に従って、イオン交換樹脂（「アンバーライト」ＩＲＡ−４００塩化物形）を用いて酸を除いた４０％グリオキサールを調製し、−２０℃で直ちに凍結させた。代替物として、グリオキサールをｐＨ７．４のリン酸バッファと混合し、−２０℃で凍結した。
【００５０】
これらのサンプルを３ヶ月間凍結させた後、解凍し、０．１Ｍ、ｐＨ７．３のリン酸バッファに２％無酸グリオキサールを含有する固定溶液を調製するために用いた。この試薬を実施例１に記載したように、組織を固定するために用いた。この結果は非常に優れた固定を確認し、従って固定特性を悪化させる固定剤の酸性化は凍結により防止されることを確認した。
【実施例３】
【００５１】
実施例１のように結腸がんの組織サンプルを選択し、以下の液体；１）４％ホルムアルデヒド含有ｐＨ７．４、０．１Ｍのリン酸バッファ（Ｄｉａｐａｔ、ベルガモ）、２）２％無酸グリオキサール含有ｐＨ７．３、０．１Ｍのリン酸バッファ、３）２％無酸グリオキサール含有０．９％、ｐＨ７．２〜７．４のＮａＣｌ；４）「バッグインボックス」容器で保存した２％無酸グリオキサール含有ｐＨ７．３、０．１Ｍのリン酸バッファ；５）「Ｓｅａｌ−ＳＡＦＥバッグ」で保存した２％無酸グリオキサール含有ｐＨ７．３、０．１Ｍのリン酸バッファ、で固定した。
【００５２】
固定剤２及び３は調製後、直ちに使用したが、固定剤４及び５は気密条件で３ヶ月まで保持した。
【００５３】
結果
異なる種類の固定剤で固定したサンプルの組織学的検査は、固定剤２及び３で固定した組織において、ホルマリン（固定剤１）で固定した組織で得られるものと類似する最適な保存を確認し、バッグインボックス又は真空手順を用いた空気暴露の防止が、酸化及びグリオキシル酸の形成を防止することにより無酸グリオキサール固定剤の固定特性を保持することを示した。
【実施例４】
【００５４】
グリオキサールから酸を除去して無酸グリオキサール（ＧＡＦ）を得るため、以下の手順を行った：強塩基性イオン交換樹脂である「アンバーライト」ＩＲＡ−４００塩化物形（シグマアルドリッチ）２５０ｇを脱イオンＨ２Ｏで湿らせた後、１ＭのＮａＯＨで素早く洗浄することにより活性化させた。水で数回洗浄して水酸化ナトリウムを除去した後、グリオキサール１５０ｍｌを添加した。樹脂を室温で３０分間作用させた後、フィルタを通して除去した。得られた中性付近のｐＨを有する無色透明の液体は酸が除去された４０％グリオキサール（ＧＡＦ）であった。ＧＡＦの２％溶液を最適な固定剤として用いた。
【００５５】
ｐＨ７．３の０．１Ｍリン酸バッファの２％ＧＡＦ溶液は数週間安定しており、その後徐々に酸化を受け、最適ではない固定特性を有する酸性反応物を産生する。安定性の問題を克服するため、５０％エタノール（カルロエルバ、ミラノ、イタリア）に２０％ＧＡＦを含有する母液を調製し、この溶液（母液）１００ｍｌに炭酸カルシウム（シグマアルドリッチ）０．１ｇを添加した。あるいは、エタノールをメタノールなど別のアルコールで置換した。ｐＨ７．３の０．１１Ｍリン酸バッファに母液を１：１０で希釈することにより、ＧＡＦ固定剤として使用する最終（使用）溶液を得た。
【００５６】
この研究は、複数のサンプリングを同時に行うため、手術室から出て直後の、及び適当な寸法（＞２ｃｍ）の病変を含む一連の外科的サンプルを含む。結腸直腸腺がんの８症例を標準法によりサンプリングし、リン酸緩衝ホルマリン（ＰＢＦ）及びＧＡＦ（使用溶液）で同時に固定した。
【００５７】
室温で一晩固定した後、アルコール脱水及びパラフィン包埋を自動プロセッサー（ライカＡＳＰ３００、ライカマイクロシステムズ、ヴェッツラー、ドイツ）を用いてパラフィン包埋の標準手順に従って行った。８症例の切片をヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、分子解析用に処理した。
【００５８】
ＤＮＡ配列研究のため、９枚の切片（５μｍ厚）を２５の結腸直腸腺がんのパラフィン包埋組織ブロックから得た。同時に選択し処理した試料をＧＡＦ及びＰＢＦで固定した。キシレン１ｍｌを用いて、切片を脱パラフィンした。５６℃でプロテイナーゼＫと一晩インキュベーションした後、ＭａｇＣｏｒｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥキットを用い、ＭａｇＣｏｒｅ自動抽出装置（ＲＢＣバイオサイエンス、新北市、台湾）で、メーカーのプロトコールに従って、ＤＮＡを５枚の切片から単離した。
【００５９】
ＤＮＡ抽出物をＱｕｂｉｔフルオロメーター（インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）及びＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）でＱｕｂｉｔＢＲアッセイにより定量した。
【００６０】
ＤＮＡの完全性をＤＮＡ  ＨＳチップでＤＮＡ高感度試薬を用い、アジレント２１００バイオアナライザ（アジレントテクノロジー、サンタクララ、カリフォルニア州）により評価した。サンプルを２ｎｇ／μＬに希釈し、ＤＮＡ長分析をメーカーの取扱説明書に従って実施した。
【００６１】
ＤＮＡ直接配列決定のため、合計５０ｎｇのＤＮＡをＫＲＡＳ（２４６ｂｐ）のエクソン２に対して以下のＰＣＲ条件を用いて増幅させた：１ｘバッファ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４μＭのフォワード及びリバースプライマ（フォワード：５’−ＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡＧＴＧＴＡＴＴＡＡＣＣ−３’及びリバース：５’−ＡＧＡＡＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡ−３’）、並びにＴａｑポリメラーゼ０．２単位、最終体積２５μＬ。ＰＣＲ反応を以下のタッチダウンプログラムに従って行った：９４℃２分、次に９４℃１５秒、６４℃３０秒、及び７０℃３０秒の３サイクル；９４℃１５秒、６１℃３０秒及び７２℃３０秒の３サイクル；９４℃１５秒、５８℃３０秒、及び７２℃３０秒の３サイクル；９４℃１５秒、５７℃３０秒、７２℃３０秒の３５サイクル、最終伸長７０℃５分。ＰＣＲテンプレートを３％アガロースゲルの電気泳動により可視化し、続く配列解析のため、ＥｘｏＰｒｏＳｔａｒ（ＧＥヘルスケア、ミラノ、イタリア）を用いて精製した。最終ＰＣＲ産物１５ｎｇをＥｘｏＰｒｏＳｔａｒで精製し、配列解析に用いた。サイクルシーケンスＰＣＲ反応をＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１サイクルシーケンスキット（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて設定し、同じ増幅プライマを２０μＬの体積に最終濃度５ｐｍｏｌ／μＬで添加した。サイクル条件は９６℃１０秒、５０℃５秒、及び６０℃４分で２５サイクルであり、反応を４℃で終了した。サイクルシーケンス産物をＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＣｌｅａｎＳＥＱ（ベックマンコールター、カリフォルニア、米国）を用いて精製し、ＤＮＡの配列を自動１６キャピラリシーケンサ（３７３０ＤＮＡアナライザ、アプライドバイオシステムズ、カリフォルニア州、米国）を用いて決定した。
【００６２】
ピロシーケンスのため、ＫＲＡＳエクソン２を増幅し、配列決定して、ピロシーケンスにより、コドン１２及び１３の状態を評価した。ピロシーケンスはＰＳＱ９６（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用い、「合成による配列決定」原理に基づく方法である。ＤＮＡ増幅は以下のプライマを用いて実施した：フォワード５’−ＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＣＧ−３’、リバース５’−ビオチン−ＧＣＴＣＴＡＴＣＧＴＣＡＴＧＧＣＴＣＴ−３’（サイズ８０ｂｐ）。ＤＮＡサンプルを９４℃５分間変性後、９４℃４５秒、５７℃４５秒及び７２℃１分で４０サイクル、最終伸長７２℃５分に付した；５’−ビオチン化ＰＣＲ産物をストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（ＧＥヘルスケア）に結合させ、０．１ｍｏｌ／ｌのＮａＯＨにより変性させ、ＰｙｒｏＭａｒｋＶａｃｕｕｍＰｒｅｐＷｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（キアゲン）を用い、メーカーの取扱説明書に従って単離した。これらの反応はＰｙｒｏＧｏｌｄＲｅａｇｅｎｔｓ（キアゲン）を用いて９６ウェルプレートで実施した。出発物質の一本鎖ＤＮＡテンプレートをシーケンスプライマ５’−ＣＴＴＧＴＧＧＴＡＧＴＴＧＴＡＧＣＴ−３’を用いて、コドン１２及び１３を含む領域のリアルタイム配列決定を行った。得られたピログラムをＰｙｒｏＭａｒｋ  ＩＤ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ１．０（キアゲン）を用いて分析した。
【００６３】
この研究で採取した８つの結腸直腸腺がんのＰＢＦ固定サンプルに規定通りにシーケノムマスアレイ（登録商標）を行い、ＫＲＡＳ変異をスクリーニングし、６個がＫＲＡＳ変異を有することを見出した。結腸直腸がん８例（前の試験によるＫＲＡＳ６変異体及び２つの野生型）の相似するＰＢＦ及びＧＡＦ固定サンプルに相当するＤＮＡに対して、その後直接配列決定、ピロシーケンス及び「シーケノムマスアレイ」を行った。ＰＢＦ固定試料で前に特定されたコドン１２に影響する病原性ＫＲＡＳ変異は、すべてＧＡＦ固定サンプルで確認された。両方の技術により、各試料で検出された特定のＫＲＡＳ変異は、ＰＢＦ固定ミラーサンプルで検出されるものに匹敵する突然変異対立遺伝子頻度を示した（表１）。
【００６４】
【表１】
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【実施例５】
【００６５】
市販のグリオキサール溶液はグリオキサールの産生及び保存中の酸化及び分解プロセスに由来する多数の酸を含有する（Ｚｈｉｙｏｎｇ  Ｚｈａｎｇ，Ｄｉｓｈｕｎ  Ｚｈａｏ  ａｎｄ  Ｂａｏｙｕｎ  Ｘｕ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１３；５１：８９３−８９８）。これらの酸はイオン交換樹脂の通過後完全に除去されるが、この通過後間もなく、空気暴露の結果として、又は分解プロセスのため、保存中の固定剤で新しい酸が漸次形成される。
【００６６】
これらの酸の１つ（及び最も反応性の高い）、すなわちグリオキシル酸のこれらの固定剤における含有量の分析的評価が行われている。
【００６７】
この分析は市販の２％グリオキサール（原溶液：４０％グリオキサール、シグマ）を添加した０．１Ｍ、ｐＨ７．４のリン酸バッファを含有する水溶液で実施した。
【００６８】
この少量のグリオキサールの添加は、グリオキサールの強酸性のため、存在するバッファにも関わらず希釈溶液のｐＨの低下を伴う（溶液１：分析１週間前に調製した）。
２）上述と全く同様の溶液であるが、分析６ヶ月前に調製した。この溶液のｐＨは酸化及び分解による酸形成の進行の結果として、強酸性である（ｐＨ４．５）。
３）イオン交換樹脂の通過により調製した２％無酸グリオキサールを添加したｐＨ７．４、０．１Ｍのリン酸バッファを含有する水溶液。この溶液は分析２ヶ月前に調製し、−２０℃で凍結保持した。
４）ｐＨ７．４、０．１Ｍのリン酸バッファを含有する水溶液を、イオン交換樹脂の通過及び１０％エタノール（カルロエルバ）により調製した２％無酸グリオキサール溶液に添加した。酸化防止活性を有するエタノールの存在は、試薬の酸化、従って酸性化を防止するように仕上げられる。
【００６９】
分析条件
４サンプルにおけるグリオキシル酸の含有量は、電気伝導度測定を用いたイオンクロマトグラフィで測定した。
【００７０】
グリオキシル酸に分類されるシグナルの同定は標準グリオキシル酸（シグマ）であるコントロールの前に確認した。グリオキサールの直接酸化に由来することがあるグリオキシル酸の濃度を測定する同じ手順を用いた。
【００７１】
分析に用いた装置はダイオネクスＤＸ５００イオンクロマトグラフであった。データを可視ＵＶスペクトルも用いて記録した。
【００７２】
Ｂ．結果の要約
表：４サンプル中のグリオキシル酸含有量の測定結果
サンプル１  ０．６７±０．０７ｍＭ  ＜ＬＯＤ［ｉ］
サンプル２  ３７．８±１．２ｍＭ  １．７±０．２
サンプル３  ０．２８±０．０５ｍＭ  ＜ＬＯＤ［ｉ］
サンプル４  ０．２１±０．０３ｍＭ  ＜ＬＯＤ［ｉ］
［ｉ］グリオキシル酸の検出限界（ＬＯＤ）は約１−２ｘ１０−３ｍＭの範囲である。
【００７３】
２％ｗ／ｗグリオキサール溶液が約３８０ｍＭの濃度を有することを考慮し、サンプル２のグリオキシル酸濃度は、最初に存在するグリオキサールの約１０％である。
【００７４】
Ｃ）結論
１）溶液中のグリオキサールは進行する酸化及び酸性化を伴う変性を受ける。酸性化は市販のグリオキサール溶液の実際のｐＨであるｐＨ４〜４．５付近で平衡に達する。２％グリオキサールを含有するサンプル２においては、６ヶ月後、ｐＨがｐＨ４．５まで低下し、非常に高いグリオキシル酸含有量を示した。
【００７５】
２）イオン交換樹脂（アンバーライト）の通過は酸を除去したが、間もなくグリオキシル酸が新規に形成される。しかし、そのレベルはサンプル１（市販のグリオキサールを含有する）よりもはるかに低い。これは２％グリオキサール溶液（固定剤で使用されるものとして）において、０．３ｍＭより低いグリオキシル酸濃度はイオン交換樹脂で酸を除去することのみにより得ることができることを示す。実際、サンプル１のグリオキシル酸濃度は上記限界よりも高い。
【００７６】
３）グリオキシル酸形成を引き起こす酸化及び変性プロセスは、溶液を凍結すること（サンプル３）、又は酸化防止剤として作用するエタノールなどのアルコールを添加すること、により防止することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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