(57)【要約】  本発明は、関節炎の組織病理学的環境下での安定性が改善されたＮｋｘ３．２断片及び活性成分としてＮｋｘ３．２断片を含有する医薬組成物に関する。本発明のＮｋｘ３．２断片は、全長Ｎｋｘ３．２と類似のレベルでＮＦ−κＢを活性化する機能及びＳｉａｈ１によるタンパク質分解に対する耐性を有する。加えて、Ｎｋｘ３．２断片は、動物モデルに基づくｉｎ  ｖｉｖｏ有効性評価においてＮｋｘ３．２と比較して変形性関節炎治療効果に少なくとも１０倍の改善を呈した。したがって、Ｎｋｘ３．２断片は、関節炎の予防又は治療に有利に使用され得る。
2019535310.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）：
Ｎ末端伸長ドメイン−コアドメイン−Ｃ端末伸長ドメイン（Ｉ）
により表されるポリペプチドであり、
上記式（Ｉ）において、
前記コアドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり；
前記Ｎ末端伸長ドメインが、１〜５３個のアミノ酸が配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続して削除可能である配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり；
前記Ｃ末端伸長ドメインが、１〜２３個のアミノ酸が配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続して削除可能である配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、ポリペプチド。
【請求項２】
前記Ｎ末端伸長ドメインが、１１個のアミノ酸が配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されている配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｎ末端伸長ドメインが、１８個のアミノ酸が配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されている配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記Ｎ末端伸長ドメインが、３８個のアミノ酸が配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されている配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記Ｎ末端伸長ドメインが、４１個のアミノ酸が配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されている配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｎ末端伸長ドメインが、４４個のアミノ酸が配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されている配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記Ｎ末端伸長ドメインが、４７個のアミノ酸が配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されている配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記Ｎ末端伸長ドメインが、５０個のアミノ酸が配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されている配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記Ｎ末端伸長ドメインが、５３個のアミノ酸が配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されている配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記Ｃ末端伸長ドメインが、１３個のアミノ酸が配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続的に削除されている配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記Ｃ末端伸長ドメインが、１５個のアミノ酸が配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続的に削除されている配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記Ｃ末端伸長ドメインが、１７個のアミノ酸が配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続的に削除されている配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記Ｃ末端伸長ドメインが、１９個のアミノ酸が配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続的に削除されている配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記Ｃ末端伸長ドメインが、２１個のアミノ酸が配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続的に削除されている配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記Ｃ末端伸長ドメインが、２３個のアミノ酸が配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続的に削除されている配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、配列番号１３、１４、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
以下の式（ＩＩ）：
Ｎ末端伸長ドメイン−コアドメイン−Ｃ端末伸長ドメイン（ＩＩ）
により表されるポリペプチドであり、
上記式（ＩＩ）において、
前記コアドメインが、配列番号３７のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり；
前記Ｎ末端伸長ドメインが、１〜４１個のアミノ酸が配列番号３９の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続して削除可能である配列番号３９のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり；
前記Ｃ末端伸長ドメインが、１〜１５個のアミノ酸が配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続して削除可能である配列番号４１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、ポリペプチド。
【請求項１８】
前記Ｎ末端伸長ドメインが、１１個のアミノ酸が配列番号３９の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されている配列番号３９のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記Ｎ末端伸長ドメインが、１８個のアミノ酸が配列番号３９の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されている配列番号３９のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記Ｎ末端伸長ドメインが、３８個のアミノ酸が配列番号３９の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されている配列番号３９のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記Ｎ末端伸長ドメインが、４１個のアミノ酸が配列番号３９の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されている配列番号３９のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記Ｃ末端伸長ドメインが、３個のアミノ酸が配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続的に削除されている配列番号４１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記Ｃ末端伸長ドメインが、６個のアミノ酸が配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続的に削除されている配列番号４１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記Ｃ末端伸長ドメインが、９個のアミノ酸が配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続的に削除されている配列番号４１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記Ｃ末端伸長ドメインが、１３個のアミノ酸が配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続的に削除されている配列番号４１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記Ｃ末端伸長ドメインが、１５個のアミノ酸が配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続的に削除されている配列番号４１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１７に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１又は１７に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２９】
請求項２８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項３０】
活性成分として、請求項１又は１７に記載のポリペプチドを含む、関節炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項３１】
前記関節炎が、骨関節炎、関節リウマチ、変形性関節炎、痛風関節炎、若年性関節炎、反応性関節炎、及びその組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
請求項２７のポリヌクレオチドを含む組換えウイルス。
【請求項３３】
前記ウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項３２に記載の組換えウイルス。
【請求項３４】
活性成分として、請求項３２に記載の組換えウイルスを含む、関節炎を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項３５】
前記関節炎が、骨関節炎、関節リウマチ、変形性関節炎、痛風関節炎、若年性関節炎、反応性関節炎、及びその組合せからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
それを必要とする対象に請求項３０又は３４に記載の医薬組成物を投与することを含む、関節炎を予防又は治療するための方法。
【請求項３７】
前記投与が、関節内投与により実施される、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節炎の病理学的組織環境下での安定性が改善されたＮｋｘ３．２断片及び活性成分としてＮｋｘ３．２断片を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
最も一般的に起こる関節炎の１つである変形性関節炎は、変性変化が、関節を保護する軟骨組織、骨及び関節を形成する靭帯、等に損傷を与える疾患であり、それによって炎症及び痛みをもたらす。従来、変形性関節炎の治療は、炎症の制御によって主に実施されてきた。しかしながら、炎症の制御は、根本的な治療的技術であり得ないということが証明された。
【０００３】
したがって、変形性関節炎の原因を治療するためには、過程、例えば軟骨細胞の生成、分化、死、カルシウム沈着を調節する標的の同定、及び標的を制御する方法の開発が必要である。
【０００４】
一方、過剰発現するＮｋｘ３．２（ＮＫ３ホメオボックス２）が、変形性関節炎によって引き起こされる軟骨組織の喪失を抑制することが示されており、したがってこのタンパク質を、変形性関節炎の治療に使用してもよい。この関連において、韓国特許番号１０−１１５０９００は、Ｎｋｘ３．２タンパク質を使用する関節炎を治療するための組成物、関節炎診断用キット、又は関節炎用の治療的薬剤をスクリーニングする方法について記述している。
【０００５】
加えて、Ｎｋｘ３．２タンパク質の分解が、軟骨細胞の肥大及びカルシウム沈着の過程において活性化されるインディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）シグナル伝達によって促進され、この現象が、タンパク質分解酵素、Ｓｉａｈ１により媒介されることが示された。さらに、インディアンヘッジホッグシグナル伝達が、軟骨細胞カルシウム沈着を併発する変形性関節炎の発生と共に増大し、インディアンヘッジホッグシグナル伝達の制御が、動物モデルにおいて変形性関節炎の進行を抑制することが示された。
【発明の詳細な説明】
【０００６】
[技術的課題]
本発明者らは、変形性関節炎の病理学的環境下で効果的に機能できるＮｋｘ３．２バリアントを使用する変形性関節炎の治療法を開発する研究を行った。その結果、本発明者らは、Ｓｉａｈ１により誘導されるタンパク質分解に耐性のあるＮｋｘ３．２断片を作製した。本発明者らは、上述したＮｋｘ３．２断片が、全長Ｎｋｘ３．２と同程度のレベルでＮＦ−κＢ活性化を誘導できることも同定した。さらに、本発明者らは、Ｎｋｘ３．２断片が、変形性関節炎に対して全長Ｎｋｘ３．２と比較して著しく改善された治療的効能を呈することを発見した。
【０００７】
[課題の解決手段]
上記の目的を達成するために、
本発明は、式（Ｉ）：
Ｎ末端伸長ドメイン−コアドメイン−Ｃ端末伸長ドメイン（Ｉ）
により表されるポリペプチドを提供し、
上記式（Ｉ）において、
コアドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｎ末端伸長ドメインは、１〜５３個のアミノ酸が配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続して削除可能である配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｃ末端伸長ドメインは、１〜２３個のアミノ酸が配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続して削除可能である配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【０００８】
本発明は、式（ＩＩ）：
Ｎ末端伸長ドメイン−コアドメイン−Ｃ端末伸長ドメイン（ＩＩ）
により表されるポリペプチドも提供し、
上記式（ＩＩ）において、
コアドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｎ末端伸長ドメインは、１〜４１個のアミノ酸が配列番号３９の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続して削除可能である配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｃ末端伸長ドメインは、１〜１５個のアミノ酸が配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続して削除可能である配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【０００９】
さらに、本発明は、上述したポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００１０】
加えて、本発明は、上述したポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、上述した発現ベクターを保有する宿主細胞を提供する。
【００１２】
加えて、本発明は、活性成分として上述したポリペプチドのいずれかを含む、関節炎を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、上述したポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを提供する。
【００１４】
加えて、本発明は、活性成分として上述した組換えウイルスのいずれかを含む、関節炎を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。
【００１５】
さらに、本発明は、それを必要とする対象に上述した医薬組成物を投与する工程を含む、関節炎を予防又は治療する方法を提供する。
【００１６】
[発明の有利な効果]
本発明のＮｋｘ３．２断片は、全長Ｎｋｘ３．２と同程度のレベルでＮＦ−κＢを活性化する機能があり、Ｓｉａｈ１により媒介されるタンパク質分解に耐性がある。加えて、上述したＮｋｘ３．２断片は、動物モデルに基づくｉｎ  ｖｉｖｏ有効性評価において全長Ｎｋｘ３．２と比較して変形性関節炎に対して改善された治療的効果を呈する。したがって、Ｎｋｘ３．２断片は、関節炎を予防又は治療するために効果的に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、Ｓｉａｈ１により媒介されるタンパク質分解に対するＮｋｘ３．２断片の耐性を示す写真である。
【図２】図２は、ＩκＢαに対するＮｋｘ３．２断片の結合を示す写真である。
【図３】図３は、ＮＫｘ３．２断片によるＩκＢαの分解の誘導を示す写真である。
【図４】図４は、ＮＫｘ３．２断片によるＮＦ−κＢの転写活性の活性化を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｎｋｘ３．２により誘導されるＮＦ−κＢ活性化過程の基礎になる分子機序を図示する概念図である。
【図６】図６は、変形性関節炎誘導動物モデルを使用するＮｋｘ３．２断片の治療的効果の評価の動物実験手順の概念図である。
【図７】図７は、罹患した領域において発現されるＮｋｘ３．２又はＮｋｘ３．２断片の変形性関節炎に対する治療的効能の組織病理学的評価を示す写真である。
【図８】図８は、組織学的分析によって得られた全体のデータの定量的評価に基づく０〜５段階の変形性関節炎の重症度を示すグラフである。
【発明を実施するための最善な様式】
【００１８】
以下に、本発明が、詳細に述べられることになる。
【００１９】
本発明は、式（Ｉ）：
Ｎ末端伸長ドメイン−コアドメイン−Ｃ端末伸長ドメイン（Ｉ）
により表されるポリペプチドを提供し、
上記式（Ｉ）において、
コアドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｎ末端伸長ドメインは、１〜５３個のアミノ酸が配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続して削除可能である配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｃ末端伸長ドメインは、１〜２３個のアミノ酸が配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続して削除可能である配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００２０】
コアドメインは、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列１６６位〜３０９位を含むポリペプチドである。全長Ｎｋｘ３．２タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含んでもよく、コアドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２１】
Ｎ末端伸長ドメインは、上述のコアドメインのＮ末端に結合しているドメインであり、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列１１２位〜１６５位を含むポリペプチドである。Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２２】
Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２若しくは５３個のアミノ酸残基が、配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に削除されている配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。本発明の幾つかの態様において、Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１１、１８、３８、４１、４４、４７、５０若しくは５３個のアミノ酸残基が、配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に削除されている配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００２３】
Ｃ末端伸長ドメインは、上述のコアドメインのＣ末端に結合しているドメインであり、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列３１０〜３３３位を含むポリペプチドである。Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２４】
Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２若しくは２３個のアミノ酸残基が、配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００２５】
具体的には、Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２若しくは２３個のアミノ酸残基が、配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００２６】
本発明の幾つかの態様において、Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１３、１５、１７、１９、２１若しくは２３個のアミノ酸残基が、配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００２７】
アミノ酸残基の削除は、Ｎ末端伸長ドメインとＣ末端伸長ドメインの一方又は両方において起こってもよい。ある特定の態様において、ポリペプチドは、配列番号１３、１４、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２８】
本発明は、配列番号１３又はその断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。断片は、１〜５３個のアミノ酸が配列番号１３の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されている配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。加えて、断片は、１〜２３個のアミノ酸が配列番号１３の３３３位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続的に削除されている配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００２９】
本発明の他の態様において、ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含んでもよい。加えて、ポリペプチドは、１１、１８、３８、４１、４４、４７、５０又は５３個のアミノ酸残基が、配列番号１３の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に削除されている配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。加えて、ポリペプチドは、１３、１５、１７、１９、２１又は２３個のアミノ酸残基が、配列番号１３の３３３位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００３０】
加えて、本発明は、式（ＩＩ）：
Ｎ末端伸長ドメイン−コアドメイン−Ｃ端末伸長ドメイン（ＩＩ）
により表されるポリペプチドを提供し、
上記式（ＩＩ）において、
コアドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｎ末端伸長ドメインは、１〜４１個のアミノ酸が配列番号３９の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続して削除可能である配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｃ末端伸長ドメインは、１〜１５個のアミノ酸が配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続して削除可能である配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００３１】
コアドメインは、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列１５４位〜３１７位を含むポリペプチドである。全長Ｎｋｘ３．２タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含んでもよく、コアドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３２】
Ｎ末端伸長ドメインは、上述のコアドメインのＮ末端に結合しているドメインであり、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列１１２位〜１５３位を含むポリペプチドである。Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３３】
Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０若しくは４１個のアミノ酸残基が、配列番号３９の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に削除されている配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。本発明の態様において、Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１１、１８、３８若しくは４１個のアミノ酸残基が、配列番号３９の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に削除されている配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００３４】
Ｃ末端伸長ドメインは、上述のコアドメインのＣ末端に結合しているドメインであり、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列３１８位〜３３３位を含むポリペプチドである。Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００３５】
Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５個のアミノ酸残基が、配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００３６】
具体的には、Ｃ末端伸長ドメインは、１３又は１５個のアミノ酸残基が、配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００３７】
本発明の態様において、Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は３、６、９、１３若しくは１５個のアミノ酸残基が、配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００３８】
上記の式（Ｉ）又は（ＩＩ）により表されるポリペプチドは、Ｎｋｘ３．２タンパク質の断片であり、生体には天然に存在しない。にもかかわらず、ポリペプチドは、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質と同等の活性を有するが、ｉｎ  ｖｉｖｏで容易に分解されず、したがって、全長Ｎｋｘ３．２より長く体内に存在し続け、優れた活性を呈し得る。
【００３９】
本発明は、上記の式（Ｉ）又は（ＩＩ）により表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００４０】
本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号２又は３８、配列番号３６又は４０及び配列番号６又は４２のヌクレオチド配列をそれぞれ含んでもよい、コアドメイン、Ｎ末端伸長ドメイン及びＣ末端伸長ドメインをコードする。
【００４１】
ポリヌクレオチドは、上記の通りＮ末端伸長ドメイン及びＣ末端伸長ドメインにおけるアミノ酸残基の削除により得られる断片をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３５又は配列番号５のポリペプチドを発現する別のヌクレオチド配列で置換されたポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００４２】
加えて、ポリヌクレオチドは、上記の通りＮ末端伸長ドメイン及びＣ末端伸長ドメインにおけるアミノ酸残基の削除により得られる断片をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号３７、配列番号３９又は配列番号４１のポリペプチドを発現する別のヌクレオチド配列で置換されたポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００４３】
本発明は、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【００４４】
発現ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター又はウイルスベクターでもよい。発現ベクターは、本発明によるポリヌクレオチドが発現され、その中に分泌され得るように当業者により構築され得る。
【００４５】
加えて、本発明は、発現ベクターを保有する宿主細胞を提供する。
【００４６】
宿主細胞は、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターをトランスフェクトされた細胞であり、原核生物細胞又は真核生物細胞であってもよい。具体的には、宿主細胞は、哺乳動物細胞であってもよい。トランスフェクションは、当業者に公知の方法を使用して実施することができる。一方、原核生物細胞の例は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であってもよく、真核生物細胞の例は酵母であってもよい。加えて、哺乳動物細胞は、ＮＳ／０骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＨｅＬａ細胞、ＣａｐＴ細胞（ヒト羊水由来細胞）又はＣＯＳ細胞であってよい。
【００４７】
本発明は、ここで提供されるポリヌクレオチドを含む、組換えウイルスを提供する。
【００４８】
ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。具体的には、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であってもよい。アデノ随伴ウイルスは、特定の血清型に限定されず、幾つかの態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ９のいずれか１つであってもよい。
【００４９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、分裂しない細胞に感染する能力があり、様々な型の細胞に感染する能力を有するので、アデノ随伴ウイルスが、本発明の遺伝子送達システムとして適当に使用される。調製物の詳細及びＡＡＶベクターの使用については、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に記述されている。
【００５０】
一般に、ＡＡＶは、２つのＡＡＶ末端反復に隣接する目的の遺伝子配列を含むプラスミドと末端反復を含まない野生型ＡＡＶコード配列を含む発現プラスミドとの同時トランスフェクションにより作製できる。
【００５１】
本発明の態様において、本発明者らは、Ｎｋｘ３．２断片を作製し、その断片がＳｉａｈ１によって分解されないことを発見した（図１）。本発明者らは、ここで提供されるＮＫｘ３．２断片が、ＩκＢαに結合することによってＩκＢαの分解を誘導し（図２及び図３）、ＮＦ−κＢの転写活性化を誘導する（図４）ことも発見した。加えて、本発明者らは、Ｎｋｘ３．２断片をコードするポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルスが、変形性関節炎誘導マウスに投与されると、損傷を受けた軟骨組織が回復することを発見した（図７及び図８）。したがって、本発明のＮｋｘ３．２断片は、関節炎を予防又は治療するために効果的に使用され得る。
【００５２】
本発明は、活性成分としてここで提供されるポリペプチドを含む、関節炎を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。具体的には、本発明は、活性成分としてここで提供されるＮｋｘ３．２断片を含む、関節炎を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。
【００５３】
Ｎｋｘ３．２断片は、式（Ｉ）：
Ｎ末端伸長ドメイン−コアドメイン−Ｃ端末伸長ドメイン（Ｉ）
により表されるポリペプチドであってもよく、
上記式（Ｉ）において、
コアドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｎ末端伸長ドメインは、１〜５３個のアミノ酸が配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続して削除可能である配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｃ末端伸長ドメインは、１〜２３個のアミノ酸が配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続して削除可能である配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００５４】
コアドメインは、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列１６６位〜３０９位を含むポリペプチドである。全長Ｎｋｘ３．２タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含んでもよく、コアドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００５５】
Ｎ末端伸長ドメインは、上述のコアドメインのＮ末端に結合しているドメインであり、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列１１２位〜１６５位を含むポリペプチドである。Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００５６】
Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２若しくは５３個のアミノ酸残基が、配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に削除されている配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。本発明の態様において、Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１１、１８、３８、４１、４４、４７、５０若しくは５３個のアミノ酸残基が、配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に削除されている配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００５７】
Ｃ末端伸長ドメインは、上述のコアドメインのＣ末端に結合しているドメインであり、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列３１０位〜３３３位を含むポリペプチドである。Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００５８】
Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２若しくは２３個のアミノ酸残基が、配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００５９】
具体的には、Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２若しくは２３個のアミノ酸残基が、配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００６０】
ある特定の態様において、Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１３、１５、１７、１９、２１若しくは２３個のアミノ酸残基が、配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００６１】
アミノ酸残基の削除は、Ｎ末端伸長ドメインとＣ末端伸長ドメインの一方又は両方において起こってもよい。幾つかの態様において、ポリペプチドは、配列番号１３、１４、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００６２】
本発明は、配列番号１３又はその断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。断片は、１〜５３個のアミノ酸が配列番号１３の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されている配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。加えて断片は、１〜２３個のアミノ酸が配列番号１３の３３３位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続的に削除されている配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００６３】
本発明の態様において、ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含んでもよい。加えて、ポリペプチドは、１１、１８、３８、４１、４４、４７、５０又は５３個のアミノ酸残基が、配列番号１３の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に削除されている配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。加えて、ポリペプチドは、１３、１５、１７、１９、２１又は２３個のアミノ酸残基が、配列番号１３の３３３位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号１３のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００６４】
加えて、Ｎｋｘ３．２断片は、式（ＩＩ）：
Ｎ末端伸長ドメイン−コアドメイン−Ｃ端末伸長ドメイン（ＩＩ）
により表されるポリペプチドであってもよく、
上記式（ＩＩ）において、
コアドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｎ末端伸長ドメインは、１〜４１個のアミノ酸が配列番号３９の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続して削除可能である配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｃ末端伸長ドメインは、１〜１５個のアミノ酸が配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続して削除可能である配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６５】
コアドメインは、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列１５４位〜３１７位を含むポリペプチドである。全長Ｎｋｘ３．２タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含んでもよく、コアドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００６６】
Ｎ末端伸長ドメインは、上述のコアドメインのＮ末端に結合しているドメインであり、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列１１２位〜１５３位を含むポリペプチドである。Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００６７】
Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０若しくは４１個のアミノ酸残基が、配列番号３９の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に削除されている配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。本発明の態様において、Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１１、１８、３８若しくは４１個のアミノ酸残基が、配列番号３９の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に削除されている配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００６８】
Ｃ末端伸長ドメインは、上述のコアドメインのＣ末端に結合しているドメインであり、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列３１８位〜３３３位を含むポリペプチドである。Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００６９】
Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５個のアミノ酸残基が、配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００７０】
具体的には、Ｃ末端伸長ドメインは、１３又は１５個のアミノ酸残基が、配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００７１】
本発明の態様において、Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は３、６、９、１３若しくは１５個のアミノ酸残基が、配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００７２】
上記の式（Ｉ）又は（ＩＩ）により表されるポリペプチドは、Ｎｋｘ３．２タンパク質の断片であり、生体には天然に存在しない。しかしながら、ポリペプチドは、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質と同等の活性を有するが、ｉｎ  ｖｉｖｏで容易に分解されず、したがって、全長Ｎｋｘ３．２より長く体内に存在し続け、優れた活性を呈し得る。
【００７３】
Ｎｋｘ３．２断片は、（Ｉ）又は（ＩＩ）により表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをトランスフェクトした宿主細胞により得ることができる。
【００７４】
ポリヌクレオチドは、配列番号２又は３８、配列番号３６又は４０及び配列番号６又は４２のヌクレオチド配列をそれぞれ含んでもよい、上述のコアドメイン、Ｎ末端伸長ドメイン及びＣ末端伸長ドメインをコードする。
【００７５】
ポリヌクレオチドは、上記の通りＮ末端伸長ドメイン及びＣ末端伸長ドメインにおけるアミノ酸残基の削除により得られる断片をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３５又は配列番号５のポリペプチドを発現する別のヌクレオチド配列で置換されたポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００７６】
加えて、ポリヌクレオチドは、上記の通りＮ末端伸長ドメイン及びＣ末端伸長ドメインにおけるアミノ酸残基の削除により得られる断片をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号３７、配列番号３９又は配列番号４１のポリペプチドを発現する別のヌクレオチド配列で置換されたポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００７７】
発現ベクターは、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター又はウイルスベクターでもよい。発現ベクターは、本発明によるポリヌクレオチドが発現され、その中に分泌され得るように当業者により構築され得る。
【００７８】
宿主細胞は、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクターをトランスフェクトされた細胞であり、原核生物細胞又は真核生物細胞であってもよい。具体的には、宿主細胞は、哺乳動物細胞であってもよい。トランスフェクションは、当業者に公知の方法により実施することができる。一方、原核生物細胞の例は大腸菌であってもよく、真核生物細胞の例は酵母であってもよい。加えて、哺乳動物細胞は、ＮＳ／０骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＨｅＬａ細胞、ＣａｐＴ細胞（ヒト羊水由来細胞）又はＣＯＳ細胞であってよい。
【００７９】
関節炎は、骨関節炎、関節リウマチ、変形性関節炎、痛風関節炎、若年性関節炎、老化関節炎、反応性関節炎、及びその組合せからなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。
【００８０】
医薬組成物は、医薬組成物の総重量に対して活性成分として０．１％〜９９重量％、１％〜９０重量％及び１０％〜８０重量％の本発明によるポリペプチドを含んでもよい。加えて、本発明の医薬組成物は、上記の活性成分に加えて同じ又は類似の機能を呈する１つ以上の活性成分をさらに含んでもよい。
【００８１】
本発明による医薬組成物は、上記の活性成分に加えて投与のために１つ以上の薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。
【００８２】
関節炎を予防又は治療するための、活性成分としてＮｋｘ３．２断片を含む医薬組成物の投薬は、疾患の型、疾患の重症度、活性成分及び医薬組成物に含まれる他の成分の型及び内容物、製剤の型、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与の期間、投与経路、治療の期間、並びに同時に使用される薬物を含めた様々な因子に応じて調整されてもよい。
【００８３】
しかしながら、所望の効果のために、本発明による医薬組成物に含まれるポリペプチドの投薬は、０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇでもよい。ここで、投与は、１日に１回実施されても又は数回に分けられてもよい。
【００８４】
本発明は、活性成分として組換えウイルスを含む、関節炎を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。具体的には、本発明は、活性成分として、Ｎｋｘ３．２断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを含む、関節炎を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。
【００８５】
組換えウイルスに搭載されるポリヌクレオチドは、以下の式（Ｉ）：
Ｎ末端伸長ドメイン−コアドメイン−Ｃ端末伸長ドメイン（Ｉ）
によって表されるポリペプチドをコードしてもよく、
上記式（Ｉ）において、
コアドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｎ末端伸長ドメインは、１〜５３個のアミノ酸が配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続して削除可能である配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｃ末端伸長ドメインは、１〜２３個のアミノ酸が配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続して削除可能である配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００８６】
コアドメインは、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列１６６位〜３０９位を含むポリペプチドである。全長Ｎｋｘ３．２タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含んでもよく、コアドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００８７】
Ｎ末端伸長ドメインは、上述のコアドメインのＮ末端に結合しているドメインであり、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列１１２位〜１６５位を含むポリペプチドである。Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００８８】
Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２若しくは５３個のアミノ酸残基が、配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に削除されている配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。本発明の態様において、Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１１、１８、３８、４１、４４、４７、５０若しくは５３個のアミノ酸残基が、配列番号３５の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に削除されている配列番号３５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり得る。
【００８９】
Ｃ末端伸長ドメインは、上述のコアドメインのＣ末端に結合しているドメインであり、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列３１０位〜３３３位を含むポリペプチドである。Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００９０】
Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２若しくは２３個のアミノ酸残基が、配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００９１】
具体的には、Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２若しくは２３個のアミノ酸残基が、配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００９２】
本発明の態様において、Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１３、１５、１７、１９、２１若しくは２３個のアミノ酸残基が、配列番号５の２４位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号５のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００９３】
アミノ酸残基の削除は、Ｎ末端伸長ドメインとＣ末端伸長ドメインの一方又は両方において起こってもよい。本発明の態様において、ポリペプチドは、配列番号１３、１４、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００９４】
加えて、組換えウイルスに搭載されるポリヌクレオチドは、以下の式（ＩＩ）：
Ｎ末端伸長ドメイン−コアドメイン−Ｃ端末伸長ドメイン（ＩＩ）
によって表されるポリペプチドをコードしてもよく、
上記式（ＩＩ）において、
コアドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｎ末端伸長ドメインは、１〜４１個のアミノ酸が配列番号３９の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続して削除可能である配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；
Ｃ末端伸長ドメインは、１〜１５個のアミノ酸が配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続して削除可能である配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００９５】
コアドメインとは、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質の１５４位〜３１７位のアミノ酸配列を含むポリペプチドのことを指す。全長Ｎｋｘ３．２タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を含んでもよく、コアドメインは、配列番号３７のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００９６】
Ｎ末端伸長ドメインは、上述のコアドメインのＮ末端に結合しているドメインであり、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列１１２位〜１５３位を含むポリペプチドである。Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００９７】
Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０若しくは４１個のアミノ酸残基が、配列番号３９の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に削除されている配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。本発明の態様において、Ｎ末端伸長ドメインは、配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１１、１８、３８若しくは４１個のアミノ酸残基が、配列番号３９の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に削除されている配列番号３９のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【００９８】
Ｃ末端伸長ドメインは、上述のコアドメインのＣ末端に結合しているドメインであり、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質のアミノ酸配列３１８位〜３３３位を含むポリペプチドである。Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００９９】
Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５個のアミノ酸残基が、配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【０１００】
具体的には、Ｃ末端伸長ドメインは、１３又は１５個のアミノ酸残基が、配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【０１０１】
本発明の態様において、Ｃ末端伸長ドメインは、配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は３、６、９、１３若しくは１５個のアミノ酸残基が、配列番号４１の１６位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されている配列番号４１のアミノ酸配列を含むポリペプチドであってもよい。
【０１０２】
上記の式（Ｉ）又は（ＩＩ）により表されるポリペプチドは、Ｎｋｘ３．２タンパク質の断片であり、ｉｎ  ｖｉｖｏで存在しない。しかしながら、ポリペプチドは、全長Ｎｋｘ３．２タンパク質と同じ活性を有するが、ｉｎ  ｖｉｖｏで容易に分解されず、したがって、全長Ｎｋｘ３．２より長く体内に存在し続けて優れた活性を呈する。
【０１０３】
Ｎｋｘ３．２断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルスは、（Ｉ）又は（ＩＩ）により表されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをトランスフェクトされた宿主細胞によって得ることができる。
【０１０４】
ポリヌクレオチドは、配列番号２又は３８、配列番号３６又は４０及び配列番号６又は４２のヌクレオチド配列をそれぞれ含んでもよい、上述のコアドメイン、Ｎ末端伸長ドメイン及びＣ末端伸長ドメインをコードする。
【０１０５】
ポリヌクレオチドは、上記の通りＮ末端伸長ドメイン及びＣ末端伸長ドメインにおけるアミノ酸残基の削除により得られる断片をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３５又は配列番号５のポリペプチドを発現する別のヌクレオチド配列で置換されたポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０１０６】
加えて、ポリヌクレオチドは、上記の通りＮ末端伸長ドメイン及びＣ末端伸長ドメインにおけるアミノ酸残基の削除により得られる断片をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号３７、配列番号３９又は配列番号４１のポリペプチドを発現する別のヌクレオチド配列で置換されたポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０１０７】
ポリヌクレオチドは、配列番号１３、１４、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１０８】
ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。具体的には、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であってもよい。アデノ随伴ウイルスは、特定の血清型に限定されず、好ましくは、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ９のいずれか１つであってもよい。
【０１０９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、分裂しない細胞に感染する能力があり、様々な型の細胞に感染する能力を有するので、アデノ随伴ウイルスが、本発明の遺伝子送達システムとして適当に使用される。調製物の詳細及びＡＡＶベクターの使用については、米国特許第５，１３９，９４１号及び第４，７９７，３６８号に記述されている。
【０１１０】
一般に、ＡＡＶは、２つのＡＡＶ末端反復に隣接する目的の遺伝子配列を含むプラスミドと末端反復がない野生型ＡＡＶコード配列を含む発現プラスミドとの同時トランスフェクションにより作製できる。
【０１１１】
関節炎は、骨関節炎、関節リウマチ、変形性関節炎、痛風関節炎、若年性関節炎、老化関節炎、反応性関節炎、及びその組合せからなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。
【０１１２】
本発明による医薬組成物は、上記の活性成分に加えて投与のために１つ以上の薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。
【０１１３】
活性成分として、Ｎｋｘ３．２断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを含む、関節炎を予防又は治療するための医薬組成物の投薬は、疾患の型、疾患の重症度、活性成分及び医薬組成物に含まれる他の成分の型及び内容物、製剤の型、患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事、投与の期間、投与経路、治療の期間、並びに同時に使用される薬物を含めた様々な因子に応じて調整されてもよい。
【０１１４】
しかしながら、所望の効果のために本発明による医薬組成物に含まれる組換えウイルスは、成人の場合１日につき１．０×１０５〜１．０×１０１５個ウイルスゲノムの量で投与されてもよい。具体的には、本発明の医薬組成物の投薬は、投与が、成人の場合１日につき１．０×１０５〜１．０×１０１５、１．０×１０７〜１．０×１０１３、１．０×１０８〜１．０×１０１２、又は１．０×１０９〜１．０×１０１０個の量で実施されるものでもよい。
【０１１５】
本発明は、それを必要とする対象に医薬組成物を投与する工程を含む、関節炎を予防又は治療する方法を提供する。具体的には、本発明は、それを必要とする対象に、活性成分としてＮｋｘ３．２断片又はＮｋｘ３．２断片をコードするポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを含む、関節炎を予防又は治療するための医薬組成物を投与する工程を含む、関節炎を予防又は治療する方法を提供する。
【０１１６】
対象は、哺乳動物、特にヒトであってもよい。投与経路は、投与方法、容積及び体液の粘性、等を考慮して当技術に熟達した者により適切に選択され得る。具体的には、医薬組成物は、関節内投与であってもよい。
【０１１７】
医薬組成物は、関節内投与であってもよい。ここで、用語「関節内」は、投与が、関節内の骨の間の隙間である関節包に囲まれた内腔を介して実施されることを意味する。関節内投与を実施する様々な方法が存在する。例えば、患者が、天井を見る姿勢で横になった状態で片膝を９０°曲げるよう求められ、注射器が関節内に挿入される方法がある。この姿勢では、内側及び外側の関節境界を、手で比較的容易に区別できる。注射は、内側と外側関節境界の一方又は両方で実施され得、内側関節境界線でほとんどの場合実施される。加えて、膝が伸展された姿勢で注射を実施する方法もある。両方の姿勢の場合、注射器が既定の注射部位に正しく挿入されれば、注射溶液はほとんど抵抗なく注射できる。しかしながら、注射器を押したときに、薬物がうまく入らず、抵抗感が認識される、又は患者が激しい痛みを訴える場合、注射器の注射部位が調整されるべきである。
【０１１８】
本発明は、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドのいずれか１つの領域を削除する工程を含む、体内での安定性を増大させたＮｋｘ３．２断片を作製する方法を提供し、その領域は、Ｎ末端領域及びＣ末端領域、並びにその組合せからなる群から選択される。
【０１１９】
Ｎ末端領域の削除は、１〜１６５個のアミノ酸が配列番号７の１位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されるものであってもよい。具体的には、削除は、１〜５３個のアミノ酸が配列番号７の１１２位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に連続的に削除されるものであってもよい。本発明の態様において、Ｎ末端領域の削除は、１１、１８、３８、４１、４４、４７、５０又は５３個のアミノ酸残基が、配列番号７の１１２位のアミノ酸から開始してＮ末端からＣ末端方向に削除されるものであってもよい。
【０１２０】
Ｃ末端領域の削除は、１〜２３個のアミノ酸が配列番号７の３３３位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に連続的に削除されるものであってもよい。本発明の態様において、Ｃ末端領域の削除は、１３、１５、１７、１９、２１又は２３個のアミノ酸残基が、配列番号７の３３３位のアミノ酸から開始してＣ末端からＮ末端方向に削除されるものであってもよい。
【０１２１】
アミノ酸残基の削除は、Ｎ末端領域とＣ末端領域の一方又は両方で起こってもよい。本発明の態様において、Ｎｋｘ３．２断片は、配列番号１３、１４、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７又は２８のアミノ酸配列を含んでもよい。
【０１２２】
アミノ酸残基の削除は、当技術に熟達した者により適切な方法で実施され得る。上記の方法により作製された、体内での安定性を増大させたＮｋｘ３．２断片は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＳｉａｈ１によって容易に分解されず、したがって野生型Ｎｋｘ３．２タンパク質より長く体内に存在してもよい。
【本発明を実施するための様式】
【０１２３】
以下に、本発明が、以下の例により詳細に述べられることになる。しかしながら、以下の例は本発明を例示することを単に目的とするものであり、本発明は、それに限定されない。
【０１２４】
例１
Ｎｋｘ３．２断片を発現するベクターの構築
Ｓｉａｈ１によって媒介されるタンパク質分解に耐性のあるバリアントを得るために、Ｎｋｘ３．２断片を発現するベクターを以下の方法により構築した。
【０１２５】
具体的には、配列番号８により表されるヌクレオチド配列を有するＮｋｘ３．２遺伝子を鋳型として使用し、製造業者のプロトコールにしたがってＬａｍｐ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号ＬＰ１１６−２５０、ＢＩＯＦＡＣＴ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、韓国）を使用して増幅した。増幅したＰＣＲ産物のそれぞれを、制限酵素ＥｃｏＲＩ（カタログ番号ＦＤ０２７４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．米国）、及びＸｈｏＩ（カタログ番号ＦＤ０６９４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．米国）又はＸｂａＩ（カタログ番号ＦＤ０６８４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．米国）で切断し、Ｔ４リガーゼ（カタログ番号ＥＬ００１１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．米国）を使用してｐＣＳ発現ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ  カタログ番号１７０９５）にそれぞれ挿入した。
【０１２６】
結果として、Ｎｋｘ３．２断片を発現する発現ベクターを２０種類、下記の表１に示すように構築した。
【０１２７】
【表１】
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【０１２８】
例２
Ｓｉａｈ１により媒介されるタンパク質分解に耐性のあるＮｋｘ３．２断片の選択
例１において構築したＮｋｘ３．２断片を発現する発現ベクターを使用して、Ｓｉａｈ１によって分解されないＮｋｘ３．２断片を、以下の方法により選択した。
【０１２９】
第１に、Ｓｉａｈ１（配列番号２９；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＡＨ３５５６２．１）を、例１に記載される同じ条件及び方法でＰＣＲによって増幅し、増幅されたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩで切断した。Ｓｉａｈ１を発現する発現ベクターを構築するために、得られた産物を、同じ制限酵素で切断されており、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）アミノ酸配列（配列番号３３；ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）が３回繰り返されているタグを含むｐＣＳ３ＨＡ発現ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１７０９５、ｐＣＳ２Ｐ＋のＥｃｏＲＩとＣｌａＩ部位の間に３−ＨＡエピトープタグが挿入されているベクター）に挿入した。
【０１３０】
一方、２９３Ｔ腎臓細胞株（カタログ番号ＣＲＬ−３２１６、ＡＴＣＣ、米国）を、１０％（体積／体積）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培地中で３７℃及び５％ＣＯ２の条件で培養した。調製した細胞を、細胞数が５×１０５個になるように、６０×１５ｍｍ細胞培養プレートに分注した。Ｎｋｘ３．２を発現する発現ベクター２μｇ及びＮｋｘ３．２断片を発現する発現ベクターのそれぞれ４μｇを、それぞれ、Ｓｉａｈ１を発現する発現ベクター２μｇと一緒に使用して、細胞に一過性にトランスフェクションを行った。トランスフェクションを、製造業者のプロトコールにしたがってＶｉｖａＭａｇｉｃ（カタログ番号ＶＭ００１、ＶＩＶＡＧＥＮ  ＣＯ．，ＬＴＤ．、韓国）を使用して実施した。
【０１３１】
全タンパク質を、トランスフェクトした細胞から単離し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓタンパク質キット（カタログ番号５００−０１１６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．米国）を使用して定量化した。次いで、Ｎｋｘ３．２、Ｓｉａｈ１及びβアクチンのそれぞれに対するウェスタンブロッティングを従来の方法により実施した。ここで、抗Ｎｋｘ３．２抗体（カタログ番号Ａｂ８３２８８、Ａｂｃａｍ、イギリス）、抗ＨＡ抗体（カタログ番号１１５８３８１６００１、Ｒｏｃｈｅ、スイス）、抗Ｍｙｃ抗体（カタログ番号１１６６７１４９００１、Ｒｏｃｈｅ、スイス）、及び抗βアクチン抗体（カタログ番号ＬＦ−ＰＡ０２０７、ＡｂＦｒｏｎｔｉｅｒ、韓国）を、３％（体積／体積）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴＢＳＴ緩衝液にそれぞれ１：１，０００、１：５，０００、１：５，０００及び１：５，０００で希釈し、使用した。結果として、ウェスタンブロッティングバンドの写真を図１に例示し、下記の表２に要約する。
【０１３２】
【表２】
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【０１３３】
ＦＩＧ．１に例示され、表２に示される通り、全長Ｎｋｘ３．２（１〜３３３）とは異なり、Ｓｉａｈ１によるＮｋｘ３．２タンパク質の分解は、断片Ｎｋｘ３．２（１〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１〜３０７）、Ｎｋｘ３．２（１２３〜３３３）、Ｎｋｘ３．２（９９〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１１２〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１２３〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１３０〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１５０〜３２０）及びＮｋｘ３．２（１５３〜３１８）において起こらなかった。
【０１３４】
例３
Ｎｋｘ３．２断片がＩκＢαに結合するかどうかの同定
Ｎｋｘ３．２は、ＩκＢαに結合することによってＮＦ−κＢ活性化を誘導する。したがって、免疫沈降を使用して、断片Ｎｋｘ３．２（１１２〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１２３〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１３０〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１５０〜３２０）及びＮｋｘ３．２（１５３〜３１８）が、ＩκＢαに結合するかどうか同定した。
【０１３５】
第１に、ＩκＢα（配列番号３１；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＣＡＢ６５５５６）を、例１に記載される同じ条件及び方法でＰＣＲによって増幅し、増幅されたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで切断した。ＩκＢαを発現する発現ベクターを構築するために、得られた産物を、同じ制限酵素で切断されており、Ｍｙｃアミノ酸配列（配列番号３４：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）が６回繰り返されたタグを含むｐＣＳ６Ｍｙｃ発現ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃１７０９５、ｐＣＳ２Ｐ＋のＥｃｏＲＩとＣｌａＩ部位の間に６−Ｍｙｃエピトープタグが挿入されているベクター）に挿入した。
【０１３６】
次いで、Ｎｋｘ３．２（１〜３３３）を発現する発現ベクター及び例１において作製した断片を発現する発現ベクターのそれぞれ８μｇを、それぞれ、等量のＩκＢαを発現する発現ベクターと一緒に使用して、２９３Ｔ腎臓細胞株に例２に記載の同じ条件及び方法でトランスフェクションを行った。ここで、ＩκＢαタンパク質が、Ｎｋｘ３．２タンパク質によって分解されることを防ぐために、プロテアソーム分解サプレッサーであるＭＧ１３２（カタログ番号４７４７９０、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ドイツ）を、濃度２０μＭで添加した。６時間後に、全タンパク質を細胞から単離し、免疫沈降を、ＩκＢαを標識しているＭｙｃを認識する抗Ｍｙｃ抗体を使用して従来通りの方法で実施した。次いで、ウェスタンブロッティングを、上記の抗体を使用して実施した。得られた結果の写真を、図２に例示する。
【０１３７】
図２に例示するように、全長Ｎｋｘ３．２（１〜３３３）と類似して、バンドが、断片Ｎｋｘ３．２（１１２〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１２３〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１３０〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１５０〜３２０）及びＮｋｘ３．２（１５３〜３１８）に対して形成された。したがって、Ｎｋｘ３．２断片は、ＩκＢαに結合して、ＮＦ−κＢの活性化に必ず必要とされる複合体を形成する機能を有すると同定された。
【０１３８】
例４
ＩκＢαタンパク質が、Ｎｋｘ３．２断片により分解されるかどうかの同定
Ｎｋｘ３．２は、ＩκＢαに結合し、したがってプロテアソームによるＩκＢαのユビキチン化及び分解を促進する。したがって、ウェスタンブロッティングを実施して、断片Ｎｋｘ３．２（１１２〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１２３〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１３０〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１５０〜３２０）及びＮｋｘ３．２（１５３〜３１８）が、これらの活性を維持するかどうか同定した。
【０１３９】
一方、ＡＴＤＣ５軟骨細胞株（カタログ番号ＲＣＢ０５６５、理研、日本）を、１０％（体積／体積）ウシ胎仔血清で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコ改変イーグル培地：栄養混合物Ｆ−１２）培地中で３７℃及び５％ＣＯ２の条件で培養した。調製した細胞を、細胞数が５×１０５個になるように、９０×２０ｍｍ細胞培養プレートに分注した。Ｎｋｘ３．２（１〜３３３）を発現する発現ベクター４μｇ及びＮｋｘ３．２断片を発現する発現ベクターのそれぞれ８μｇを、それぞれ、ＩκＢαを発現する発現ベクター１μｇと一緒に使用して、細胞に一過性にトランスフェクションを行った。トランスフェクションを、製造業者のプロトコールにしたがってＶｉｖａＭａｇｉｃ（カタログ番号ＶＭ００１、ＶＩＶＡＧＥＮ  ＣＯ．，ＬＴＤ．、韓国）を使用して実施した。
【０１４０】
その後の過程は、ウェスタンブロッティングを例２に記載の同じ条件及び方法で実施したものであり、得られた結果の写真を図３に例示する。
【０１４１】
図３に示すように、全長Ｎｋｘ３．２（１〜３３３）と類似の強度を持つバンドが、断片Ｎｋｘ３．２（１１２〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１２３〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１３０〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１５０〜３２０）及びＮｋｘ３．２（１５３〜３１８）に対して形成された。それ故、Ｎｋｘ３．２断片は、全長Ｎｋｘ３．２と同じレベルでＩκＢαのタンパク質分解を誘導すると同定される。
【０１４２】
例５
ＮＦ−κＢの転写機能が、Ｎｋｘ３．２断片により活性化されるかどうかの同定
Ｎｋｘ３．２は、ＮＦ−κＢ活性化を誘導することにより軟骨細胞の細胞死を抑制する。したがって、Ｎｋｘ３．２断片によるＮＦ−κＢ活性化を測定するために、ＮＦ−κＢ特異的ＤＮＡ結合部位（配列番号３５：ＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣ）が４回繰り返されるポリヌクレオチド配列を、ＭｌｕＩ及びＸｈｏＩを使用してｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（カタログ番号Ｅ１７５１、Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）に挿入して、４ｘ−κＢ−Ｌｕｃ発現ベクターを構築した。さらに、発現ベクターを使用して、ルシフェラーゼ活性を分析することによりＮｋｘ３．２によるＮＦ−κＢの転写機能の活性化を測定した。
【０１４３】
最初に、全長Ｎｋｘ３．２（１〜３３３）を発現する発現ベクター及びＮｋｘ３．２断片を発現する発現ベクターのそれぞれ２００ｎｇ、４ｘ−κＢ−Ｌｕｃ発現ベクター１００ｎｇ、並びにｐＲＬ−ＴＫ発現ベクター（カタログ番号Ｅ２２４１、Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）２０ｎｇをそれぞれ使用して、２９３Ｔ腎臓細胞株に一過性にトランスフェクションを行った。
【０１４４】
トランスフェクションを、製造業者のプロトコールにしたがってＶｉｖａＭａｇｉｃを使用して実施した。２４時間後に、ルシフェラーゼアッセイを、製造業者のプロトコールにしたがってＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（カタログ番号Ｅ１９１０、Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を使用して実施した。
【０１４５】
具体的には、トランスフェクトした２９３Ｔ腎臓細胞株の培養を除去し、１×ＰＢＳで洗浄した。１×受動的溶解緩衝液（ＰＬＢ）１５０μｌをそれに添加し、細胞を室温で１５分間溶解させた。細胞溶解物１０μｌに、ＬＡＲ  ＩＩ  ５０μｌを添加し、得られたものを反応させておいた。次いで、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。このために、Ｓｔｏｐ  ＆  Ｇｌｏ  ５０μｌを添加し、レニラルシフェラーゼ活性を測定した。各サンプルの、実験結果において、レニラルシフェラーゼ活性を、ホタルルシフェラーゼ活性に対して標準化し、パーセンテージの平均を、したがって、図４に例示する。
【０１４６】
図４に示すように、陰性対照としてｐＣＳ２ベクターだけをトランスフェクトした細胞におけるルシフェラーゼ活性を１と設定した場合、全長Ｎｋｘ３．２（１〜３３３）だけでなく断片Ｎｋｘ３．２（１１２〜３２０）、ＮＫｘ３．２（１２３〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１３０〜３２０）、Ｎｋｘ３．２（１５０〜３２０）及びＮｋｘ３．２（１５３〜３１８）も有意に増大したルシフェラーゼ活性を呈した。したがって、Ｎｋｘ３．２断片は、全長Ｎｋｘ３．２と類似のレベルでＮＦ−κＢの転写機能を活性化する機能を保持すると同定される。
【０１４７】
例６
変形性関節炎に対するＮｋｘ３．２断片の改善された治療的効能の同定
上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験によって、全長Ｎｋｘ３．２と比較したＮｋｘ３．２断片の機能的優位性が同定された。したがって、Ｎｋｘ３．２断片のｉｎ  ｖｉｖｏ機能の改善を同定するために、変形性関節炎に対するＮｋｘ３．２断片（１２３〜３２０）及び全長Ｎｋｘ３．２（１〜３３３）の治療的効能を比較し、分析した。この目的のために、内側半月の不安定化（ＤＭＭ）と呼ばれる外科的手順によって変形性関節炎を誘導したマウスモデルを選択した。実験を実施する過程を、図６に図式的に例示する。
【０１４８】
具体的には、膝組織中の内側半月靭帯を切って、内側半月の構造的な不安定化を誘導し、したがって大腿軟骨と脛骨軟骨が互いに衝突し、その結果軟骨損傷が誘導され、それにより変形性関節炎を誘導した。対照のために、膝の外皮及び内皮を模擬手術により解剖し、縫合した動物群を使用した。変形性関節炎を誘導した動物群及び模擬手術を実行した対照を、８週間育てた。次いで、Ｎｋｘ３．２断片（１２３〜３２０）若しくは全長Ｎｋｘ３．２（１〜３３３）を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又は空のベクターＡＡＶを、相当する膝に関節内注射し、動物群を４週間育てた。変形性関節炎の進行程度を、組織病理学的分析により分析した。
【０１４９】
組織病理学的分析には、サフラニンＯ染色法を利用した。サフラニンＯは、陽イオン性化合物染色剤であり、軟骨ヘパラン硫酸プロテオグリカンの陰イオン基に効果的に付着し、その結果赤色を呈する。赤みを帯びた暗染色された領域を、健康な状態の軟骨組織であると評価する。反対に、サフラニン−Ｏ染色が弱い又は呈さない部分及び損傷組織がある部分を、変形性関節炎の病理学が進行した病変と解釈する。
【０１５０】
図７に示すように、空のベクターＡＡＶを関節内注射した対照群の場合、投与したウイルス粒子の量に関係なく、非常に激しい軟骨損傷及び変性現象が観察された。
【０１５１】
全長Ｎｋｘ３．２（１〜３３３）を発現するＡＡＶを関節内注射した比較群の場合、変形性関節炎に対する有意な治療的効能が、１×１０１０個でＡＡＶ投与した群においてのみ観察された。
【０１５２】
反対に、ＮＫｘ３．２断片（１２３〜３２０）を発現するＡＡＶを関節内注射した実験群の場合、変形性関節炎に対する優れた治療的効果を、１．２５×１０９個でＡＡＶ投与した群が呈し、それが最も低い用量である。すなわち、Ｎｋｘ３．２断片（１２３〜３２０）の場合、変形性関節炎に対する治療的効能が、全長Ｎｋｘ３．２（１〜３３３）と比較して少なくとも１０倍改善されると同定される。
【０１５３】
組織病理学的分析によって得られた全てのデータを定量的に評価し、結果を図８に視覚的に例示する。各実験群において分析した動物数は３匹であり、変形性関節炎の重症度を０〜５段階で評価した。結果から棒グラフを作成した。平均とＳＥＭを、エラーバーで示した。ウイルス粒子用量Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、この増大順序でそれぞれ１．２５×１０９、２．５×１０９、５×１０９及び１×１０１０個であった。
【０１５４】
図８に示すように、空のベクターＡＡＶを関節内注射した対照の場合、投与したウイルス粒子の量に関係なく、４．５〜５の高い点数が評価された。加えて、全長Ｎｋｘ３．２（１〜３３３）を発現するＡＡＶを関節内注射した比較群において、低い点数１．５が、１×１０１０個でＡＡＶ投与した群においてのみ評価された。反対に、ＮＫｘ３．２断片（１２３〜３２０）を発現するＡＡＶを関節内注射した実験群の場合、１又はより小さい非常に低い点数が、１．２５×１０９個でＡＡＶ投与した群から開始して評価され、それは最も低い用量である。すなわち、Ｎｋｘ３．２断片（１２３〜３２０）は、全長Ｎｋｘ３．２（１〜３３３）と比較して、変形性関節炎に対する優れた治療的効能を有すると同定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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