(57)【要約】  本発明は、定義されたホスホリパーゼＡ２活性に対するホスホリパーゼＡ１活性の比を有する脂肪分解酵素を併用する、ベーキング製品の特性を改良するための組成物および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．０１〜１００の範囲、好ましくは０．０１〜８０の範囲、より好ましくは０．０１〜５０の範囲、より好ましくは１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは０．０１〜２５の間、なおいっそうより好ましくは１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜２５の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素と、
５０００〜６００００の範囲、好ましくは１００００〜５００００の間、より好ましくは１５０００〜５００００の間のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素と
を含む組成物。
【請求項２】
前記第１の酵素が、カエトミウム・サーモフィルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、メイオサーマス・ルバー（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、メイオサーマス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、および／またはフザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１の酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および／または配列番号５のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、好ましくは配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、より好ましくは配列番号２および／または配列番号３のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、なおいっそうより好ましくは配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記第１の酵素が、４５℃に等しい、またはそれより高い温度で至適ホスホリパーゼ活性を有することにより特徴づけられる、先行する請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記第２の酵素が、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性およびリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、またはフザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）由来のホスホリパーゼ活性およびリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素から選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記第２の酵素が、配列番号６および／もしくは配列番号７のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、またはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ社のＬｉｐｏｐａｎ（登録商標）Ｍａｘ、もしくはＡＢ  ｅｎｚｙｍｅｓ社のＶｅｒｏｎ（登録商標）Ｈｙｐｅｒｂａｋｅ  Ｔから選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
ベーカリー用途における、請求項１〜６に記載の組成物の使用。
【請求項８】
パン改良剤における請求項７に記載の使用。
【請求項９】
パンまたはパティセリー製品、好ましくはケーキ、パン、バゲット、またはロールにおける、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物を含むパン改良剤。
【請求項１１】
０．０１〜１００の範囲、好ましくは０．０１〜８０の範囲、より好ましくは０．０１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは０．０１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜２５の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素と、
５０００〜６００００の範囲、好ましくは１００００〜５００００の間、より好ましくは１５０００〜５００００の間のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素と
を、ベーキング前にパン生地またはバッターに添加する工程を含む、ベーキング製品を調製する方法。
【請求項１２】
前記パン生地またはバッターが、５０００〜１０００００ＰｍＵ／粉１００ｋｇの間、好ましくは７０００〜５００００ＰｍＵ／粉１００ｋｇの間、より好ましくは１００００〜３００００ＰｍＵ／粉１００ｋｇの間の前記第１の酵素、および１００００〜１０００００ＬｍＵ／粉１００ｋｇの間、好ましくは２００００〜７００００ＬｍＵ／粉１００ｋｇの間の前記第２の酵素を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記パン生地またはバッターが、改良された許容度を示す、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベーキング製品が、改良された新鮮度を示す、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物を含むパン生地またはバッターから調製されるベーキング製品。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、１つ以上の脂肪分解酵素を含む、ベーカリー製品を改良するための新規組成物および方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
ベーキングでは、粉の脂質はパン生地またはバッター（batter）中のタンパク質およびデンプンと相互作用し、パン生地またはバッターの流体力学的特性、ならびにベーキング製品の品質に影響を及ぼすので、粉の質量の２％しか占めないにもかかわらず、重要な技術的役割を演ずる。脂質は、遊離脂質と結合脂質に分割可能であり、両画分は極性脂質または非極性脂質のいずれかを含有する。およそ、脂質の半分が極性であり、また非極性脂質に対する極性脂質の比はパンの容積と強い相関関係を有するので、製パンにおいて極めて重要である。極性脂質画分は、リゾホスホリピド、リン脂質、およびガラクトリピドから主に構成される。
【０００３】
指摘すべき重要事項として、脂質はパン生地またはバッター中の異なる場所に位置することが挙げられる。ほとんどの極性脂質はデンプン顆粒内部にある。遊離脂質の一部は、自発的に気水界面に移動し、一部はデンプン顆粒表面または内部にとどまる、またはグルテン分子に連結し、そして一部はデンプン糊化後にのみ利用可能である。
【０００４】
一般的に、脂質の主要な機能として、そのガスセル安定性およびグルテン強度増加に対する効果が挙げられる。また、特に、極性脂質は、デンプンのレトログラデーションを低下させる能力を有する。酵母菌発酵に起因する気泡を安定化させれば、より大容積のベーキング製品が実現する。グルテンネットワークを強度増加させれば、より良好なパン生地安定性が実現し、またパンの身の柔軟性およびテクスチャーが増強し、したがって保管寿命が延びる。しかし、脂質は粉中で微量であることに起因して、粉の天然リン脂質画分が、パン生地またはバッターの特性およびベーキング製品の品質に対して、有意な効果をそれ自体が与えるには十分でない。さらに、リン脂質分子の一部には、パン生地特性に対してプラスの効果を有さず、マイナスの効果さえも有するものが存在する。したがって、外因性リン脂質および／または乳化剤が、ベーキング製品の均一な品質および保管寿命安定性を保証するのに使用される。この問題に対処するための別の方法として、脂肪分解酵素（たとえば、ホスホリパーゼおよびリパーゼ等）の使用、ならびに対応するリゾ脂質を放出するトリグリセリド、リン脂質、およびガラクトリピドのインサイチュー改変の実施が挙げられる。リゾ脂質は、オリジナルの分子と比較して、それよりも良好な乳化特性を有し、またパンおよびケーキ製造プロセスにおける湿潤剤としてより機能的である。
【０００５】
さらに、優れた乳化特性を有するリゾ脂質がより多く放出されれば、パン生地またはバッターの流体力学的特性が改良されることとなる。特に、ケーキ製造では、そのような放出の改良は、フォームまたはスポンジケーキの水相内への空気取り込みが強化され、またレイヤーケーキバッター内のベーカリー脂肪の分散が改良される。
【０００６】
脂質はパン生地およびバッターの系内で均等に分布していないという事実から、脂質は必ずしもリパーゼおよびホスホリパーゼによる加水分解を受けることができない。異なる温度において、ｐＨ条件、イオン強度、および／または糖濃度を変化させることにより、このような脂質の利用能が改変される。そのような場合、このような異なる温度および条件において活性であり、また所望の特異性を有する酵素が必要となる。一方、基質が過剰に加水分解されると、ベーキング製品の品質特性に対してマイナスの効果を有する分子が生ずる。
【０００７】
いくつかのリパーゼおよび／またはホスホリパーゼが、ベーキング製品の調製におけるそのプラスの特性についてすでに記載されているが、その異なる特異性、その異なる加水分解生成物、その潜在的相乗作用、またはプロセス条件、または基質に起因して、その使用結果は極めて予測不能である。したがって、今日、ベーキング製品の特性、たとえばパン生地またはバッターの許容度、容積、および／または新鮮度等をさらに改良する組成物および方法に対する必要性がなおも存在する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明者らは、ベーカリー用途、特に製パンにおいて脂肪分解酵素と特定のホスホリパーゼを組み合わせて使用すると、パン生地の許容度に対して相乗的効果を有することを見出した。
【０００９】
したがって、第１の側面では、本発明は、
０．０１〜１００の範囲、好ましくは０．０１〜８０の範囲、より好ましくは０．０１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは０．０１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜２５の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素と、
５０００〜６００００の範囲、好ましくは１００００〜５００００の間、より好ましくは１５０００〜５００００の間のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素と、
を含む組成物に関する。
【００１０】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第１の酵素が、カエトミウム・サーモフィルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、メイオサーマス・ルバー（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、メイオサーマス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、および／またはフザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、好ましくはメイオサーマス・ルバー（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、および／またはメイオサーマス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、より好ましくはメイオサーマス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素から選択されることを提供する。
【００１１】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第１の酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および／または配列番号５のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、好ましくは配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、より好ましくは配列番号２および／または配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有する、なおいっそうより好ましくは配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有することを提供する。
【００１２】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第１の酵素が、４５℃に等しい、またはそれより高い温度で至適ホスホリパーゼ活性を有することにより特徴づけられることを提供する。
【００１３】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第１の酵素が、５０℃で３０分間インキュベートした後でも、そのホスホリパーゼ活性の５０％超を保持することを提供する。
【００１４】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第２の酵素が、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性およびリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、またはフザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）由来のホスホリパーゼ活性およびリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素から選択されることを提供する。
【００１５】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第２の酵素が、配列番号６および／もしくは配列番号７のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、またはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ社のＬｉｐｏｐａｎ（登録商標）Ｍａｘ、もしくはＡＢ  ｅｎｚｙｍｅｓ社のＶｅｒｏｎ（登録商標）Ｈｙｐｅｒｂａｋｅ  Ｔから選択されることを提供する。
【００１６】
さらに、さらなる側面では、本発明は、ここに開示する組成物のベーカリー用途での使用に関する。
【００１７】
特別な態様では、ここに開示する組成物のパン改良剤（bread improver）での使用が提供される。
【００１８】
特別な態様では、ここに開示する組成物の、パンまたはパティセリー製品、好ましくはケーキ、パン、バゲット、またはロールでの使用が提供される。
【００１９】
さらに、さらなる側面では、本発明は、ここに開示する組成物を含むパン改良剤に関する。
【００２０】
さらに、さらなる側面では、本発明は、
０．０１〜１００の範囲、好ましくは０．０１〜８０の範囲、より好ましくは０．０１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは０．０１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜２５の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素と、
５０００〜６００００の範囲、好ましくは１００００〜５００００の間、より好ましくは１５０００〜５００００の間のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素と
を、ベーキング前にパン生地またはバッターに対して添加する工程を含む、ベーキング製品を調製する方法に関する。
【００２１】
特別な態様では、ここに開示する方法は、前記パン生地またはバッターが、５０００〜１０００００ＰｍＵ／粉１００ｋｇの間、好ましくは７０００〜５００００ＰｍＵ／粉１００ｋｇの間、より好ましくは１００００〜３００００ＰｍＵ／粉１００ｋｇの間の前記第１の酵素と、１００００〜１０００００ＬｍＵ／粉１００ｋｇの間、好ましくは２００００〜７００００ＬｍＵ／粉１００ｋｇの間の前記第２の酵素を含むことを提供する。
【００２２】
特別な態様では、ここに開示する方法は、前記パン生地またはバッターが、改良された許容度を示すことを提供する。
【００２３】
特別な態様では、ここに開示する方法は、前記ベーキング製品が、改良された新鮮度を示すことを提供する。
【００２４】
さらに、さらなる側面では、本発明は、ここに開示する組成物を含むパン生地またはバッターから調製されるベーキング製品に関する。
【詳細な説明】
【００２５】
本発明の製品、組成物、使用、および方法について記載する前に、記載された特定の製品、組成物、使用、および方法、および組み合わせは、もちろん変化しても良いので、本発明は、そのような製品、組成物、使用、および方法、または組み合わせに限定されないものと理解される。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、ここで使用される用語は限定の意味合いを有さないものとやはり理解される。
【００２６】
ここで使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈が別途明示しない限り、単数形および複数形の指示物の両方が含まれる。
【００２７】
用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」は、ここで使用する場合、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、または「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義であり、また包括的または非制限的であり、そして列挙されていない追加のメンバー、要素、または方法の工程を除外しない。用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」は、ここで使用する場合、用語「から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」、「構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｓ）」、および「から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」を含むものと認識される。
【００２８】
終点による数値範囲の列挙には、各範囲内に包含されるすべての数字および端数、ならびに列挙した終点が含まれる。
【００２９】
用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、ここで使用する場合、測定可能な数値、たとえばパラメーター、量、時間的な期間等に言及するとき、所定の数値のおよびそれから±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、およびなおもより好ましくは±０．１％以下の変動を、そのような変動が開示される発明の実施に適する限り含むように意図されている。修飾語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」によって言及される値も、それ自体、具体的および好適に開示されるものと理解される。
【００３０】
用語「１つ以上の」または「少なくとも１つの」、たとえばメンバーの群の１つ以上のまたは少なくとも１つのメンバー（複数可）等が、さらなる事例によってそれ自体明白であるとき、該用語は、任意の１つの前記メンバー、または任意の２つもしくはそれ超の前記メンバー、たとえば任意の≧３、≧４、≧５、≧６、または≧７等の前記メンバー等、および最大すべての前記メンバーの参照を特に含む。
【００３１】
本明細書で引用されたすべての参考資料は、本明細書により参考としてそのまま組み込まれる。特に、ここで具体的に参照するすべての参考資料の教示は、参考として組み込まれる。
【００３２】
別途規定されなければ、本発明を開示する際に使用されるすべての用語は、技術的および科学的用語を含め、本発明が属する当業者により一般的に理解される意味と同一の意味を有する。本発明の教示をより深く理解されるように、さらなるガイダンスとして、用語の定義が含まれる。
【００３３】
下記の節において、本発明の異なる側面が、より詳細に定義される。そのように定義された各側面は、明確に反対の記載のない限り、任意のその他の１つの側面または複数の側面と組み合わせてもよい。特に、好ましいまたは有利と示唆される任意の特性は、好ましいまたは有利と示唆される任意のその他の１つの特性または複数の特性と組み合わせてもよい。本明細書全体を通じて、「１つの態様」または「一態様」という場合、それは該態様と関連して記載される特定の特性、構造、または特徴が、本発明の少なくとも１つの態様に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通じて、慣用句「１つの態様では」または「一態様では」が様々な場所で現れても、それは必ずしも同一の態様をすべて指すものではないが、そうであってもよい。さらに、当業者にとって本開示から明白であるように、１つ以上の態様において、特定の特性、構造、または特徴を、任意の適する方式で組み合わせてもよい。さらに、ここに記載するいくつかの態様は、その他の態様に含まれるその他の特性ではないいくつかの特性を含むが、当業者により理解されるように、異なる態様の特性の組み合わせも、本発明の範囲内であるように意図されており、また異なる態様を形成する。たとえば、添付の特許請求の範囲では、任意の主張された態様は、任意の組み合わせで利用可能である。
【００３４】
ベーカリー用途での使用、および特にパン改良剤として、またはパン改良剤での使用に特に適する、ホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比が大きい第２の酵素と組み合わせた、ホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比が小さい第１の酵素を含む組成物が、ここに開示される。
【００３５】
本発明者らは、ここに開示するような特定の特性を有する２つまたはそれ超のリパーゼおよび／またはホスホリパーゼを含む組成物を使用すると、改良された特徴を有するベーキング製品の取得が可能になることを驚くべきことに見出した。特に、バッターおよび／またはパン生地の特性（たとえば、許容度）が顕著に改良される。また、ベーキング製品は、改良された容積および／または新鮮度を示すことも判明した。
【００３６】
ここで使用する場合、用語「リパーゼ」とは、酵素エントリーＥＣ３．１．１．３により定義されるトリアシルグリセロールリパーゼまたはトリアシルグリセロールアシルヒドロラーゼを一般的に指す。リパーゼは、トリアシルグリセロールの加水分解を触媒して、遊離した脂肪酸、ジアシルグリセロール、モノアシルグリセロール、およびグリセロールをもたらす酵素として、ここでは定義される。ここで定義する組成物で使用されるリパーゼは、副次的酵素活性、たとえばホスホリパーゼ活性等を含んでもよい。本発明の文脈において、リパーゼ活性は、ｐ−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰＰ）を基質として使用し、およびここに記載する方法に基づき測定される。また、酵素活性は、当業者により公知のその他のリパーゼ活性アッセイ法を用いても測定可能である（レビュー用として、たとえばＳｔｏｙｔｃｈｅｖａ  Ｍ．＆  ａｌ、２０１２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ８，ｐ．４００を参照）。
【００３７】
特に、リパーゼ活性は、ｐ−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰＰ）を基質として使用して測定される。リパーゼによりｐ−ニトロフェニルパルミテートが加水分解されて、黄色のｐ−ニトロフェノールが放出され、分光光度法により４１４ｎｍにおいて測定される。リパーゼ、１ミリ単位（ＬｍＵ）は、４０℃およびｐＨ７．５において、１分間に、ｐ−ニトロフェニルパルミテートからｐ−ニトロフェノール、１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）を放出するのに必要とされる酵素の量として定義される。リパーゼ活性測定に関するより多くの詳細事項が、実施例に記載されている。
【００３８】
ここで使用する場合、用語「ホスホリパーゼ」とは、リン脂質を、脂肪酸とその他の親油性物質に、たとえば加水分解の部位に応じて、リゾホスホリピド、ジアシルグリセロール、コリンリン酸およびホスファチジン酸等に加水分解する酵素を一般的に指す。リン脂質分子内の標的とされる特定の結合に応じて、ホスホリパーゼは、異なるタイプ、たとえばＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ等に分類される。
【００３９】
本発明の文脈において、ホスホリパーゼ活性は、ｐ−ニトロフェニルホスホリルコリンを基質として使用して測定され、該ホスホリパーゼ活性は、５０℃およびｐＨ７．５において、１分間に、ｐ−ニトロフェニルホスホリルコリンからｐ−ニトロフェノール、１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）を、放出するのに必要とされる酵素の量として定義されるミリ単位（ＰｍＵ）で表される。また、ホスホリパーゼ活性は、当業者により公知のその他のホスホリパーゼ活性アッセイ法、たとえばホスファチジルコリンの加水分解等によっても測定可能である。
【００４０】
特に、ホスホリパーゼ活性は、ｐ−ニトロフェニルホスホリルコリン（ｐＮＰＰＣ）を基質として使用して測定される。ホスホリパーゼによりｐ−ニトロフェニルホスホリルコリンが加水分解されて、黄色のｐ−ニトロフェノールが放出され、分光光度法により４１４ｎｍにおいて測定される。ホスホリパーゼ、１ミリ単位（ＰｍＵ）は、５０℃およびｐＨ７．５において、１分間に、ｐ−ニトロフェノール、１ｎｍｏｌを放出するのに必要とされる酵素の量として定義される。ホスホリパーゼ活性測定に関するより多くの詳細事項が、実施例に記載されている。
【００４１】
ここで使用する場合、用語「ホスホリパーゼＡ」とは、リン脂質において１つ以上の結合の加水分解を触媒する脂肪分解酵素を指す。脂肪のアシル部分をグリセロール骨格と結びつけるエステル結合（複数可）を加水分解する、異なる２種類のホスホリパーゼＡ活性が区別され得る。酵素エントリーＥＣ３．１．１．３２により定義されるホスホリパーゼＡ１、および酵素エントリーＥＣ３．１．１．４により定義されるホスホリパーゼＡ２は、１つの脂肪アシル基のジアシルグリセロホスホリピドからの脱アシル化を、ｓｎ−１およびｓｎ−２位においてそれぞれ触媒して、リゾホスホリピドを生成する。
【００４２】
本発明の文脈において、ホスホリパーゼ活性は、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、および色素標識されたＮ−（（６−（２，４−ＤＮＰ）アミノ）ヘキサノイル）−１−（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ  Ｃ５）−２−ヘキシル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ホスホリパーゼＡ１の場合）からなる脂質混合物、またはジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、および色素標識された１−Ｏ−（６−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８−アミノヘキシル）−２−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ  Ｃ５−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ホスホリパーゼＡ２の場合）からなる脂質混合物をそれぞれ基質として使用し、そしてここに記載する方法に基づき測定される。また、ホスホリパーゼ活性は、当業者により公知のその他のリパーゼ活性アッセイ法を用いて、たとえばホスホリパーゼＡ１活性をアッセイする場合、ｒａｃ−１，２−Ｓ，Ｏ−ジデカノイル−３−ホスホコリン−１−メルカプト−２，３−プロパンジオール基質、およびホスホリパーゼＡ２活性をアッセイする場合、２−ヘキサデカノイルチオ−１−エチル−ホスホコリン基質を使用するなどして測定することも可能である。
【００４３】
特に、ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）活性は、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、および色素標識されたＮ−（（６−（２，４−ＤＮＰ）アミノ）ヘキサノイル）−１−（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ  Ｃ５）−２−ヘキシル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＥＤ−Ａ１）からなる脂質混合物（たとえば、ＥｎｚＣｈｅｋホスホリパーゼＡ１アッセイキット−ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社において見出され得る）を基質として使用して測定される。ＰＥＤ−Ａ１は、ＰＬＡ１に対して特異的であり、またｓｎ−１位において、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ色素標識されたアシル鎖とジニトロフェニルクエンチャー修飾頭部基を有する色素標識されたグリセロホスホエタノールアミンである。ホスホリパーゼＡ１、１ミリ単位（ＰＡ１ｍＵ）は、４０℃およびｐＨ７．４において、１分間に、ＰＥＤ−Ａ１のｓｎ−１位において置換された蛍光脂肪酸、１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）を放出するのに必要とされる酵素の量として定義される。ホスホリパーゼＡ１活性測定に関するより多くの詳細事項が、実施例に記載されている。
【００４４】
特に、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性は、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、および色素標識された１−Ｏ−（６−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８−アミノヘキシル）−２−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ  Ｃ５−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｒｅｄ／Ｇｒｅｅｎ  ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＰＣ−Ａ２）からなる脂質混合物（たとえば、ＥｎｚＣｈｅｋホスホリパーゼＡ２アッセイキット−ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社において見出され得る）を基質として使用して測定される。Ｒｅｄ／Ｇｒｅｅｎ  ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＰＣ−Ａ２基質は、ＰＬＡ２に対して選択的であり、またＰＬＡ２酵素活性の高感度で迅速なリアルタイム連続監視を提供する。ホスホリパーゼＡ２、１ミリ単位（ＰＡ２ｍＵ）は、４０℃およびｐＨ８．９において、１分間に、Ｒｅｄ／Ｇｒｅｅｎ  ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＰＣ−Ａ２のｓｎ−２位において置換された蛍光脂肪酸、１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）を放出するのに必要とされる酵素の量として定義される。ホスホリパーゼＡ２活性測定に関するより多くの詳細事項が、実施例に記載されている。
【００４５】
したがって、第１の側面では、本発明は、
０．０１〜１００の範囲、好ましくは０．０１〜８０の範囲、より好ましくは０．０１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは０．０１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜２５の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素と、
５０００〜６００００の範囲、好ましくは１００００〜５００００の間、より好ましくは１５０００〜５００００の間のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素と
を含む組成物に関する。
【００４６】
特に、リパーゼ活性は、４０℃およびｐＨ７．５において、１分間に、ｐ−ニトロフェニルパルミテートからｐ−ニトロフェノール、１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）を放出するのに必要とされる酵素の量として定義されるミリ単位（ＬｍＵ）で表され、ホスホリパーゼＡ１活性は、４０℃およびｐＨ７．４において、１分間に、Ｎ−（（６−（２，４−ＤＮＰ）アミノ）ヘキサノイル）−１−（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ  Ｃ５）−２−ヘキシル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンのｓｎ−１位において置換された蛍光脂肪酸、１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）を加水分解する酵素の量として定義されるミリ単位（ＰＡ１ｍＵ）で表され、およびホスホリパーゼＡ２活性は、４０℃およびｐＨ８．９において、１分間に、１−Ｏ−（６−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８−アミノヘキシル）−２−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ  Ｃ５−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンのｓｎ−２位において置換された蛍光脂肪酸、１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）を加水分解する酵素の量として定義されるミリ単位（ＰＡ２ｍＵ）で表される。
【００４７】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、
０．０１〜５０の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素と、
１５０００〜５００００の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素と
を含む。
【００４８】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、
１〜５０の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素と、
１５０００〜５００００の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素と
を含む。
【００４９】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、
２〜５０の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素と、
１５０００〜５００００の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素と
を含む。
【００５０】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、
０．０１〜２５の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素と、
１５０００〜５００００の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素と
を含む。
【００５１】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、
１〜２５の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素と、
１５０００〜５００００の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素と
を含む。
【００５２】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、
２〜２５の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素と、
１５０００〜５００００の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素と
を含む。
【００５３】
本発明者らは、ここに開示するような組成物の酵素は、ベーキング製品特性の改良において相乗的に作用することを見出した。
【００５４】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第１の酵素が、４５℃に等しい、またはそれより高い温度で至適ホスホリパーゼ活性を有することにより特徴づけられることを提供する。
【００５５】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第１の酵素が、カエトミウム・サーモフィルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、メイオサーマス・ルバー（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、メイオサーマス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、および／またはフザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、好ましくはメイオサーマス・ルバー（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、および／またはメイオサーマス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、より好ましくはメイオサーマス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素から選択されることを提供する。
【００５６】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第１の酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および／または配列番号５（表Ａを参照）のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有し、好ましくは配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有し、より好ましくは配列番号２および／または配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有し、なおいっそうより好ましくは配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有することを提供する。
【００５７】
とりわけ、前記第１の酵素は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および／または配列番号５に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有し、好ましくは配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３のいずれかと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有し、より好ましくは配列番号２および／または配列番号３と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有し、なおいっそうより好ましくは配列番号３と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する脂肪分解酵素である（表Ａを参照）。
【００５８】
【表１−１】
2019514385.tif 000002
【００５９】
【表１−２】
2019514385.tif 000003
【００６０】
【表１−３】
2019514385.tif 000004
【００６１】
とりわけ、前記第１の酵素は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および／または配列番号５に対して１００％の配列同一性を有し、好ましくは配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３のいずれかと１００％の配列同一性を有し、より好ましくは配列番号２および／または配列番号３と１００％の配列同一性を有し、なおいっそうより好ましくは配列番号３と１００％の配列同一性を有する脂肪分解酵素である。
【００６２】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第１の酵素が、カエトミウム・サーモフィルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素であり、有利には配列番号１を有する酵素、またはその近縁バリアントであることを提供する。特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第１の酵素が、メイオサーマス・ルバー（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素であり、有利には配列番号２を有する酵素、またはその近縁バリアントであることを提供する。特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第１の酵素が、メイオサーマス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素であり、有利には配列番号３を有する酵素、またはその近縁バリアントであることを提供する。特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第１の酵素が、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素であり、有利には配列番号４を有する酵素、またはその近縁バリアント、より好ましくはＮａｇａｓｅ社のＮａｇａｓｅ  １０Ｐであることを提供する。特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第１の酵素が、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素であり、有利には配列番号５を有する酵素、またはその近縁バリアントであり、より好ましくはＤＳＭ社のＰａｎａｍｏｒｅ（登録商標）Ｇｏｌｄｅｎであることを提供する。
【００６３】
本発明の文脈において、ここで引用する「近縁バリアント」は、上記のようにベーキング製品（の品質）を改良し、および配列番号１〜５と有意な同一性を共有する酵素である。「有意な同一性」とは、本発明の文脈において、配列番号１〜５との、少なくとも８５％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の同一性、または少なくとも９９％の同一性さえも指す。
【００６４】
２つのアミノ酸配列の間、または２つのヌクレオチド配列の間の関連性は、パラメーター「同一性」により記載される。本目的において、２つのアミノ酸配列の間の同一性の程度は、好ましくはバージョン３．０．０またはそれ以降のＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実施されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して、国際公開第２０１０／０１４２  ６９７号の記載に従い決定される。使用される任意のパラメーターとして、ギャップ開始ペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスが挙げられる。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長同一性」（ｎｏｂｒｉｅｆ  ｏｐｔｉｏｎを使用して取得される）のアウトプットは、同一性の割合（％）として用いられ、また以下のように計算される：（同一残基×１００）／（アライメントの長さ−アライメント内のギャップの合計数）。
【００６５】
特別な態様では、第１の酵素は、４５℃に等しい、またはそれより高い温度で至適ホスホリパーゼ活性を有することにより特徴づけられる。
【００６６】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第１の酵素が、５０℃で３０分間インキュベートした後、そのホスホリパーゼ活性の５０％超を保持することを提供する。
【００６７】
活性は、ここに示すようにホスホリパーゼ活性を決定することにより測定される（ｐ−ニトロフェニルホスホリルコリンを基質として使用する）。
【００６８】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第２の酵素が、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性およびリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、またはフザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）由来のホスホリパーゼ活性およびリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素から選択されることを提供する。
【００６９】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第２の酵素が、配列番号６および／もしくは配列番号７（表Ａを参照）のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、またはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ社のＬｉｐｏｐａｎ（登録商標）Ｍａｘ、もしくはＡＢ  ｅｎｚｙｍｅｓ社のＶｅｒｏｎ（登録商標）Ｈｙｐｅｒｂａｋｅ  Ｔから選択されることを提供する。
【００７０】
とりわけ、前記第２の酵素は、配列番号６および／または配列番号７（表Ａを参照）に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する脂肪分解酵素である。
【００７１】
とりわけ、前記第２の酵素は、配列番号６および／または配列番号７に対して１００％の配列同一性を有する脂肪分解酵素である。
【００７２】
特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第２の酵素が、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素であり、有利には配列番号６を有する酵素、またはその近縁バリアントであることを提供する。特別な態様では、ここに開示する組成物は、前記第１の酵素が、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素であり、有利には配列番号７を有する酵素、またはその近縁バリアントであることを提供する。
【００７３】
なおいっそうより好ましくは、第２の酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社のＬｉｐｏｐａｎ（登録商標）Ｍａｘ、またはＡＢ  ｅｎｚｙｍｅｓ社のＶｅｒｏｎ（登録商標）Ｈｙｐｅｒｂａｋｅ  Ｔである。
【００７４】
なおも好ましい態様では、ここに提示する組成物は、配列番号１の、配列番号２の、配列番号３の、好ましくは配列番号２のまたは配列番号３の、なおいっそうより好ましくは配列番号３の、またはその近縁バリアントのアミノ酸配列を有する第１の酵素、ならびに５０００〜６００００の間、好ましくは１００００〜５００００の間、より好ましくは１５０００〜５００００の間のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００に等しいまたはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する第２の酵素を含む。
【００７５】
なおも好ましい態様では、ここに提示する組成物は、配列番号１の、配列番号２の、配列番号３の、好ましくは配列番号２のまたは配列番号３の、なおいっそうより好ましくは配列番号３の、またはその近縁バリアントのアミノ酸配列を有する第１の酵素、および配列番号６の、配列番号７の、またはその近縁バリアントのアミノ酸配列を有する第２の酵素、好ましくは配列番号６の配列を有する第２の酵素またはその近縁バリアントを含む。
【００７６】
より一層好ましい態様では、ここに開示する組成物は、配列番号１の、またはその近縁バリアントのアミノ酸配列を有する第１の酵素、ならびに５０００〜６００００の間、好ましくは１００００〜５００００の間、より好ましくは１５０００〜５００００の間のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００に等しいまたはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する第２の酵素、好ましくは配列番号６の、配列番号７の、またはその近縁バリアントのアミノ酸配列を有する第２の酵素、より好ましくは配列番号６の配列を有する第２の酵素またはその近縁バリアントを含む。
【００７７】
より一層好ましい態様では、本明細書に開示する組成物は、配列番号２の、またはその近縁バリアントのアミノ酸配列を有する第１の酵素、ならびに５０００〜６００００の間、好ましくは１００００〜５００００の間、より好ましくは１５０００〜５００００の間のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００に等しいまたはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する第２の酵素、好ましくは配列番号６の、配列番号７の、またはその近縁バリアントのアミノ酸配列を有する第２の酵素、より好ましくは配列番号６の配列を有する第２の酵素、またはその近縁バリアントを含む。
【００７８】
より一層好ましい態様では、ここに開示する組成物は、配列番号３の、またはその近縁バリアントのアミノ酸配列を有する第１の酵素、ならびに５０００〜６００００の間、好ましくは１００００〜５００００の間、より好ましくは１５０００〜５００００の間のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００に等しいまたはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する第２の酵素、好ましくは配列番号６の、配列番号７の、またはその近縁バリアントのアミノ酸配列を有する第２の酵素、より好ましくは配列番号６の配列を有する第２の酵素またはその近縁バリアントを含む。
【００７９】
さらに、さらなる側面では、本発明は、ここに開示する組成物を含むパン改良剤に関する。
【００８０】
本発明の組成物は、有利には、パン改良剤またはパティセリー混合物もしくは事前混合物の一部であってもよい。「パン改良剤」（「パン生地コンディショナー」または「パン生地改良剤」または「改良剤」または「粉処理剤」とも呼ばれる）は、ベーキング製品のテクスチャー、容積、香り、および新鮮度を改良し、ならびにパン生地の機械加工性および安定性を改良するために、パン生地に一般的に添加される。一般的に、パン改良剤は、１つ以上の酵素（たとえばアミラーゼ（α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、生デンプン分解アミラーゼ（raw starch degrading amylase））、キシラナーゼ（ヘミセルラーゼ）、セルラーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、オキシダーゼ（ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、炭水化物オキシダーゼ、スルフルヒドリルオキシダーゼ）、リポオキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ラッカーゼ、トランスグルタミナーゼ、アシルトランスフェラーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ等）、１つ以上の酸化剤または還元剤（たとえばアスコルビン酸、グルタチオン、システイン等）、１つ以上の乳化剤（たとえばジアセチル酒石酸モノグリセリドエステル（ＤＡＴＥＭ）、ステアロイル乳酸ナトリウム（ＳＳＬ）、ステアロイル乳酸カルシウム（ＣＳＬ）、グリセロールモノステアレート（ＧＭＳ）、ラムノリピド、レシチン、スクロエステル、胆汁酸塩等）、１つ以上の脂肪性物質（たとえばマーガリン、バター、油、ショートニング等）、１つ以上のビタミン（たとえばパントテン酸およびビタミンＥ等）、１つ以上のガム、および／または１つ以上のファイバー原料（たとえばエンバクファイバー等）を含む、またはそれから構成される。ケーキ（パティセリー）混合物は、水、脂肪（油、バター、マーガリン）および卵を除き、ケーキレシピーのすべての成分を一般的に含む。ケーキ事前混合物は、一般的に粉および糖の全部または一部が除去されたケーキ混合物である。
【００８１】
特定の態様では、組成物は、上記のように、ホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比が小さい第１の酵素と、ホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比が大きい第２の酵素と、および酵素（複数可）、酸化剤（複数可）、還元剤（複数可）、乳化剤（複数可）、脂質（複数可）、ビタミン（複数可）、ファイバー（複数可）のリストから選択される少なくとも１つ、好ましくは２つの追加の成分とを含む。本発明者らは、組成物内に、アミラーゼ（α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、生デンプン分解アミラーゼ）、キシラナーゼ（へミセルラーゼ）、セルラーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、オキシダーゼ（ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、炭水化物オキシダーゼ、スルフルヒドリルオキシダーゼ）、リポオキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ラッカーゼ、トランスグルタミナーゼ、アシルトランスフェラーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼの群から選択される１つ以上の酵素（複数可）を含むことが特に好都合であることを見出した。
【００８２】
さらに、さらなる側面では、本発明は、ここに開示する組成物のベーカリー用途での使用に関する。本発明の文脈において、ベーカリー用途とは、パンおよびパティセリー製品の両方と関連する用途を指す。
【００８３】
ここに提示する組成物を使用すれば、望ましくないパン生地またはバッター成分、たとえば乳化剤等の使用を低下させることができ、または抑制することさえも可能となることを見出した。特別な態様では、ここに開示する組成物のパン改良剤での使用が提供される。
【００８４】
特別な態様では、ここに開示する組成物の、パンまたはパティセリー製品、好ましくはケーキ、パン、バゲット、またはロールでの使用が提供される。
【００８５】
ホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比が小さい第１の酵素、およびホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比が大きい第２の酵素が調製法で使用される、ベーキング製品を調製する方法についてもここに開示される。
【００８６】
さらに、さらなる側面では、本発明は、
０．０１〜１００の範囲、好ましくは０．０１〜８０の範囲、より好ましくは０．０１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは〜の範囲、なおいっそうより好ましくは０．０１〜２５の間、なおいっそうより好ましくは１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜２５の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素と、
５０００〜６００００の範囲、好ましくは１００００〜５００００の間、より好ましくは１５０００〜５００００の間のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素と
を、ベーキング前にパン生地またはバッターに添加する工程を含む、ベーキング製品を調製する方法に関する。
【００８７】
前記方法では、リパーゼ活性は、４０℃およびｐＨ７．５において、１分間に、ｐ−ニトロフェニルパルミテートからｐ−ニトロフェノール、１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）を放出するのに必要とされる酵素の量として定義されるミリ単位（ＬｍＵ）で表され、ホスホリパーゼＡ１活性は、４０℃およびｐＨ７．４において、１分間に、Ｎ−（（６−（２，４−ＤＮＰ）アミノ）ヘキサノイル）−１−（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ  Ｃ５）−２−ヘキシル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンのｓｎ−１位において置換された蛍光脂肪酸、１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）を加水分解する酵素の量として定義されるミリ単位（ＰＡ１ｍＵ）で表され、ならびにホスホリパーゼＡ２活性は、４０℃およびｐＨ８．９において、１分間に、１−Ｏ−（６−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８−アミノヘキシル）−２−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ  Ｃ５−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンのｓｎ−２位において置換された蛍光脂肪酸、１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）を加水分解する酵素の量として定義されるミリ単位（ＰＡ２ｍＵ）で表され、ならびにホスホリパーゼ活性は、５０℃およびｐＨ７．５において、１分間に、ｐ−ニトロフェニルホスホリルコリンからｐ−ニトロフェノール、１ナノモル（ｎｍｏｌ）／分放出するのに必要とされる酵素の量として定義されるミリ単位（ＰｍＵ）で表される。
【００８８】
本発明の方法の特別な態様では、第１の酵素は、４５℃に等しい、またはそれより高い温度で至適ホスホリパーゼ活性を有することにより特徴づけられる。
【００８９】
ここに開示する組成物は、ここに開示する方法で使用するのに特に適することを見出した。
【００９０】
特別な態様では、ここに開示する方法は、前記パン生地またはバッターが、５０００〜１０００００ＰｍＵ／粉１００ｋｇの間、好ましくは７０００〜５００００ＰｍＵ／粉１００ｋｇの間、より好ましくは１００００〜３００００ＰｍＵ／粉１００ｋｇの間の前記第１の酵素、および１００００〜１０００００ＬｍＵ／粉１００ｋｇの間、好ましくは２００００〜７００００ＬｍＵ／粉１００ｋｇの間の前記第２の酵素を含むことを提供する。
【００９１】
ここに開示する方法は、バッターまたはパン生地の許容度の改良、および／またはベーキング製品特性、たとえば容積または新鮮度等の改良を有利に可能にする。
【００９２】
特別な態様では、ここに開示する方法は、前記パン生地またはバッターが、改良された許容度を示すことを提供する。
【００９３】
本発明者らは、ベーカリー用途、および特にパン製品の調製において、脂肪分解酵素と特定のホスホリパーゼを組み合わせて使用すると、パン生地の許容度に対して相乗的効果を有することを見出した。
【００９４】
本文脈において、パン生地の許容度とは、ストレス状態に置かれた際、たとえばプルーフィング時間が延長された、またはプルーフィング期間中もしくはその後に機械的ショックを受けたなどの際に、その形状を維持し、およびベーキング後に、ストレス無負荷のパン生地またはバッターから得られるベーキング製品に匹敵する特性（たとえば、容積）を備えたベーキング製品を提供するパン生地またはバッター、好ましくはベーカリーパン生地の能力を指す。
【００９５】
特別な態様では、ここに開示する方法は、前記ベーキング製品が改良された新鮮度を示すことを提供する。
【００９６】
本文脈において、新鮮度とは、テクスチャーパラメーター、たとえば、柔軟性、湿り気、粘着性、粘り気、および弾力性等の組み合わせを指す。新鮮度の喪失は、老化と通常関連する。とりわけ、ベーキング製品の改良された新鮮度は、参照品と比較したとき、改良された柔軟性、および／または改良された湿り気、および／または改良されたショートバイト（short bite）に対応する。このようなパラメーターは、テクスチュロメーター等による物理的方法により、または専門的判定パネルを用いて実施される官能分析（sensorial analysis）により有利に測定されてもよい。
【００９７】
ホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比が小さい第１の酵素と、ホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比が大きい第２の酵素とを含むベーキング製品もここに開示される。
【００９８】
さらに、さらなる側面では、本発明は、ここに開示する組成物を含むパン生地またはバッターから調製されるベーキング製品に関する。
【００９９】
本発明の文脈において、ベーキング製品は、当技術分野において公知のベーカリーまたはパティセリー製品、たとえばパン、ソフトロール、ベーグル、ドーナッツ、デニッシュペストリー、ハンバーガーロール、ピザ、ピタパン、チャバタ、スポンジケーキ、クリームケーキ、パウンドケーキ、マフィン、カップケーキ、蒸し菓子、ワッフル、ブラウニー、ケーキドーナッツ、酵母菌で膨らませたドーナッツ、バゲット、ロール、クラッカー、ビスケット、クッキー、パイの皮、ラスク、およびその他のベーキング製品を含む群から選択される製品等である。より好ましくは、本発明は、パン、バゲット、およびロールを指す。
【０１００】
本発明のさらなる目的は、ベーキング製品を調製するための組成物、パン改良剤、パティセリー混合物、および／またはパティセリー事前混合物の使用に関する。
【０１０１】
［実施例］
例１
酵素活性測定
リパーゼ：
リパーゼ活性は、ｐ−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰＰ）を基質として使用して測定する。リパーゼによりｐ−ニトロフェニルパルミテートが加水分解されて、黄色のｐ−ニトロフェノールが放出され、分光光度法により４１４ｎｍにおいて測定する。リパーゼ、１ミリ単位（ＬｍＵ）は、４０℃およびｐＨ７．５において、１分間に、ｐ−ニトロフェニルパルミテートからｐ−ニトロフェノール、１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）を放出するのに必要とされる酵素の量として定義される。試験を実施するために、１ｍＭのｐＮＰＰ溶液（０．６９Ｍのアセトンおよび０．００４９ＭのトリトンＸ−１００を含有する、０．０５ＭのＮａ−リン酸バッファー、ｐＨ７．５に溶解）、１２０μｌを、酵素サンプル、６０μｌと混合し、そして４０℃で３０分間インキュベートする。吸収は、９６ウェルマイクロプレート内で、基質ブランクに対して４１４ｎｍにおいて測定する。活性は、ＬｍＵ／ｍｌ＝（（（酵素の吸収−ブランクの吸収）／３０）×０．１８）／（１３３８０×０．０６）×サンプル希釈率×１００００００として表される。
［３０＝分表示の反応時間；０．１８＝ｍｌ表示の反応容積；１３３８０＝４１４ｎｍにおけるモル吸光係数（Ｍ−１ｃｍ−１）；０．０６＝ｍｌ表示の酵素サンプル容積；１００００００はＬｍＵ／ｍｌに変換する］
ホスホリパーゼ：
ホスホリパーゼ活性は、ｐ−ニトロフェニルホスホリルコリン（ｐＮＰＰＣ）を基質として使用して測定する。ホスホリパーゼによりｐ−ニトロフェニルホスホリルコリンが加水分解されて、黄色のｐ−ニトロフェノールが放出され、分光光度法により４１４ｎｍにおいて測定する。ホスホリパーゼ、１ミリ単位（ＰｍＵ）は、５０℃およびｐＨ７．５において、１分間に、１ｎｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを放出するのに必要とされる酵素の量として定義される。試験を実施するために、０．０２ＭのｐＮＰＰＣ溶液（０．６９Ｍのアセトンおよび０．００４９ＭのトリトンＸ−１００を含有する、０．０５ＭのＮａ−リン酸バッファー、ｐＨ７．５に溶解）、１２０μｌを、酵素サンプル、６０μｌと混合し、そして５０℃で３０分間インキュベートする。その後、１ＭのＮａ２ＣＯ３、７２０μｌを添加して反応を停止する。吸収は、９６ウェルマイクロプレート内で、基質ブランクに対して４１４ｎｍにおいて測定する。
【０１０２】
活性は、ＰｍＵ／ｍｌ＝（（（酵素の吸収−ブランクの吸収）／３０）×０．９）／（１３３８０×０．０６）×サンプル希釈率×１００００００として表される。
［３０＝分表示の反応時間；０．９＝ｍｌ表示の反応容積；１３３８０＝４１４ｎｍにおけるモル吸光係数（Ｍ−１ｃｍ−１）；０．０６＝ｍｌ表示の酵素サンプル容積；１００００００はＰｍＵ／ｍｌに変換する］
ホスホリパーゼＡ１：
ホスホリパーゼＡ１（ＰＬＡ１）活性は、１６．５μＭのジオレオイルホスファチジルコリン、１６．５μＭのジオレオイルホスファチジルグリセロール、および３．３μＭの色素標識されたＮ−（（６−（２，４−ＤＮＰ）アミノ）ヘキサノイル）−１−（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ  Ｃ５）−２−ヘキシル−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＥＤ−Ａ１）からなる脂質混合物（ＥｎｚＣｈｅｋ  ホスホリパーゼＡ１アッセイキット−ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社において取得される）を基質として使用して測定する。ＰＥＤ−Ａ１は、ＰＬＡ１に対して特異的であり、またｓｎ−１位においてＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ色素標識されたアシル鎖とジニトロフェニルクエンチャー修飾頭部基を有する色素標識されたグリセロホスホエタノールアミンである。ホスホリパーゼＡ１、１ミリ単位（ＰＡ１ｍＵ）は、４０℃およびｐＨ７．４において、１分間に、ＰＥＤ−Ａ１のｓｎ−１位において置換された蛍光脂肪酸、１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）を放出するのに必要とされる酵素の量として定義される。試験は、９６ウェルマイクロプレート内で、１ウェル当たり１００μｌの総容積を使用して実施する。異なる脂質溶液を、２５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、０．７ＭのＮａＣｌ、および１０ｍＭのＣａＣｌ２を含有する反応バッファー、ｐＨ７．４中で調製した。サンプルおよびコントロールを、脂質混合物と共に、１：１（サンプル／コントロール、５０μｌ、および脂質混合物、５０μｌ）の比で混合する。酵素反応を、４０℃で３０分間実施する。較正曲線は、キット（Ｌｅｃｉｔａｓｅ  Ｕｌｔｒａ）に提供された、異なる濃度のホスホリパーゼＡ１を使用して作成する。蛍光測定は、４８０ｎｍでの励起、および５１５ｎｍでの発光により実施する。
【０１０３】
活性は、ＰＡ１ｍＵ／ｍｌ＝（（（酵素の蛍光強度−ブランクの蛍光強度）−切片の値）／較正曲線のスロープ値）×サンプル希釈率×１０００として表される。［１０００はＰＡ１ｍＵ／ｍｌに変換する］
ホスホリパーゼＡ２：
ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）活性は、１６．５μＭのジオレオイルホスファチジルコリン、１６．５μＭのジオレオイルホスファチジルグリセロール、および１．７μＭの色素標識された１−Ｏ−（６−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８−アミノヘキシル）−２−ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ  Ｃ５−Ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｒｅｄ／Ｇｒｅｅｎ  ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＰＣ−Ａ２）からなる脂質混合物（ＥｎｚＣｈｅｋホスホリパーゼＡ２アッセイキット−ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社において取得される）を基質として使用して測定する。Ｒｅｄ／Ｇｒｅｅｎ  ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＰＣ−Ａ２基質は、ＰＬＡ２に対して選択的であり、またＰＬＡ２酵素活性の高感度で迅速なリアルタイム連続監視を提供する。ホスホリパーゼＡ２、１ミリ単位（ＰＡ２ｍＵ）は、４０℃およびｐＨ８．９において、１分間に、Ｒｅｄ／Ｇｒｅｅｎ  ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＰＣ−Ａ２のｓｎ−２位において置換された蛍光脂肪酸、１ナノモル（ｎｍｏｌｅ）を放出するのに必要とされる酵素の量として定義される。試験は、９６ウェルマイクロプレート内で、１ウェル当たり１００μｌの総容積を使用して実施する。異なる脂質溶液を、２５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、および５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する反応バッファー、ｐＨ８．９中で調製した。サンプルおよびコントロールを、脂質混合物と共に、１：１（サンプル／コントロール、５０μｌ、および脂質混合物、５０μｌ）の比で混合する。酵素反応は、４０℃で１０分間実施する。較正曲線は、キット提供のミツバチの毒液に由来する異なる濃度のホスホリパーゼＡ２を使用して作成する。蛍光測定は、４８０ｎｍでの励起、および５１５ｎｍでの発光により実施する。
【０１０４】
活性は、ＰＡ２ｍＵ／ｍｌ＝（（（酵素の蛍光強度−ブランクの蛍光強度）−切片の値）／較正曲線のスロープ値）×サンプル希釈率×１０００として表される。［１０００＝ＰＡ２ｍＵ／ｍｌ］
例２
酵素
下記の酵素を、下記の例で使用した。
【０１０５】
−  配列番号１のアミノ酸配列を有するカエトミウム・サーモフィルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素（ＰＨ２）。
【０１０６】
−  配列番号２のアミノ酸配列を有するメイオサーマス・ルバー（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素（ＰＨ３）。
【０１０７】
−  配列番号３のアミノ酸配列を有するメイオサーマス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素（ＰＨ４）。
【０１０８】
−  Ｌｉｐｏｐａｎ（登録商標）Ｍａｘ（サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼ；Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）（ＬＩＭ）
−  Ｎａｇａｓｅ  １０Ｐ（ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）由来のホスホリパーゼＡ２；Ｎａｇａｓｅ社）（ＮＡＧ）
−  Ｐａｎａｍｏｒｅ（登録商標）Ｇｏｌｄｅｎ（フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）由来のリパーゼ；ＤＳＭ社）（ＰＡＮ）
−  Ｌｅｃｉｔａｓｅ  Ｕｌｔｒａ（サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のタンパク質工学により作出されたカルボキシエステルヒドロラーゼ；Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社）（ＬＥＣ）
−  Ｂａｋｅｚｙｍｅ（登録商標）ＰＨ８００ＢＧ（フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来のリパーゼ；ＤＳＭ社）（ＢＡＫ）
−  Ｖｅｒｏｎ（登録商標）Ｈｙｐｅｒｂａｋｅ−Ｔ（フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）由来のリパーゼ；ＡＢ  ｅｎｚｙｍｅｓ社）（ＨＹＰ）
ＰＨ２、ＰＨ３、およびＰＨ４酵素は、後でここに記載する対応する遺伝子のクローニングおよび発現により取得した。その他の酵素は、その各供給業者から取得した。
【０１０９】
ＰＨ２、ＰＨ３、およびＰＨ４遺伝子のクローニング
ｐｅｌＢリーダー配列および下記の標準的なプロトコールを使用して、ｐＥＴ２２ｂプラスミド中に発現させるために、推定脂肪分解酵素遺伝子の同定された配列に基づき、酵素をコードするＤＮＡ配列を合成した。
【０１１０】
ＰＨ２、ＰＨ３、およびＰＨ４に対応するＤＮＡ配列を表Ａに示し、それぞれ、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０に該当する（表Ａを参照）。
【０１１１】
完全合成したＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１９誘導プラスミド中にサブクローン化した。このプラスミドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α（登録商標）ウルトラコンピテント細胞を形質転換するのに使用した。Ｐｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて作製した精製プラスミド調製物を該当する制限酵素を使用して消化し、脂肪分解酵素コーディング配列を含有するＤＮＡ断片を単離した。この断片を、ｐＥＴ２２ｂ（＋）クローニングベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）中にサブクローン化し、そして得られた組換えプラスミドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中に形質転換した。Ｐｕｒｅ  Ｙｉｅｌｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて作製した精製プラスミド調製物を、ＡＢＩ３７００ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して配列決定した。挿入された断片の配列決定を、ユニバーサルプライマーのＴ７プロモーターおよびＴ７ターミネーター、ならびに内部ＤＮＡ配列に対応するプライマーを使用して実施した。得られた配列は、予想した配列と同一であった。
【０１１２】
組換え株の培養およびＰＨ２、ＰＨ３、およびＰＨ４の生成
脂肪分解酵素遺伝子を担持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を５時間、事前培養（３７℃）し、その１５ｍｌを１００００ｇで１分間遠心分離し、そしてペレットを、２リットル振盪フラスコ内で、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴｅｒｒｉｆｉｃ  ｂｒｏｔｈ（１２ｇ／ｌのＢａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ社）、２４ｇ／ｌの酵母菌抽出物（Ｄｉｆｃｏ社）、４ｍｌ／ｌのグリセロール、１２．５４ｇ／ｌのＫ２ＨＰＯ４、２．３１ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４）、５００ｍｌ中に再懸濁した。培養物を３７℃および２５０ｒｐｍでインキュベートし、５５０ｎｍにおける吸収が３〜４に達したら、１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−ガラクトピラノシドを用いて酵素の発現を誘発した。
【０１１３】
ＰＨ２、ＰＨ３、およびＰＨ４の回収
３７℃で１５時間インキュベーションした後、４℃、１８０００ｇで３０分間遠心分離して細胞を採取し、１０ｍＭのＮａＣｌを含有する５０ｍＭのＢＩＣＩＮＥ中に再懸濁し、予め冷却した細胞破砕装置（Ｐａｎｄａ  ２Ｋ、Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ社、ＧＥＡ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）内、１５００ｂａｒｓにおいて破壊し、そして４０，０００ｇで３０分間遠心分離した。０．２％の硫酸プロタミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いて処理し、そして４０，０００ｇで３０分間遠心分離することにより、染色体ＤＮＡを未精製の細胞ライセートから除去した。２５単位のベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ社、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）を、次に溶液に添加した。そのような処理の後、脂肪分解酵素調製物を、カットオフの範囲が０．０５〜１μｍのミリポアＰＯＤシステム上でのエンド濾過により清澄化し、次に５ｋＤａのカットオフ値を有するクロスフロー濾過システム（Ｓａｔｏｃｏｎ−Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）上での限外濾過により濃縮した。濃縮した酵素溶液を、０．８〜０．２２μｍのエンド濾過（アブソリュートフィルター）を含む滅菌濾過システム上で濾過した。
【０１１４】
リパーゼおよびホスホリパーゼの酵素活性を、例１のプロトコールを使用して決定した。結果を表１に示す。
【０１１５】
【表２】
2019514385.tif 000005
【０１１６】
試験の温度を除き、例１のホスホリパーゼアッセイ法を使用して、酵素活性を温度の関数として決定した。結果を表２に示す。
【０１１７】
【表３】
2019514385.tif 000006
【０１１８】
酵素の安定性を、酵素サンプルを５０℃で３０、６０、および２４０分間、事前インキュベートした後、例１と同様にホスホリパーゼアッセイを実施することにより決定した。結果を表３に示す。
【０１１９】
【表４】
2019514385.tif 000007
【０１２０】
例３
クラスティロール
脂肪分解酵素を組み合わせたときの効果を、クラスティロール製造において試験した。クラスティロールを、表４のパン生地組成物を使用して調製した。
【０１２１】
【表５】
2019514385.tif 000008
【０１２２】
成分を、Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ  Ｎ２４ミキサー中にて、低速で２分間、および高速で５分間混合した。最終パン生地温度、ならびに休止およびプルーフィング温度は、２５℃であった。２５℃で１５分間休ませた後、パン生地を手作業により再加工し、そしてさらに１０分間休ませた。その後、２ｋｇのパン生地ピースを成形し、そして１０分間プルーフィングした。２ｋｇのパン生地ピースを分割し、そしてＲｏｔａｍａｔを使用して成形した。５０ｇｒの丸まったパン生地ピースを得た。さらに５分間休ませた後、パン生地ピースをプレスにより裁断し、そしてパン生地ピースの５０％を３５℃で１２０分間行われる最終プルーフィング段階に供し、またパン生地ピースの５０％をショック試験（パン生地を収納するトレーを、１０ｃｍの高さから棚上に落下させる）に供し、そして３５℃で１２０分間行われる最終プルーフィング段階に供した。パン生地ピースを、蒸気発生装置付きのＭＩＷＥ  Ｒｏｌｌ−Ｉｎオーブン（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗｅｎｚ−Ａｒｎｓｔｅｉｎ社−ドイツ）中にて、２３０℃で焼き上げた。一般的に使用されるナタネ置換法（rapeseed displacement method）を使用して、６個のロールの容積を測定した。
【０１２３】
結果を表５に示す。
【０１２４】
【表６】
2019514385.tif 000009
【０１２５】
結果は、本発明による組成物の第１の酵素に対応する酵素１、および本発明による組成物の第２の酵素に対応する酵素２を使用すれば（「１＋２」）、参照品（「無し」）よりも、または酵素を単独使用する場合（「１」もしくは「２」）よりも良好な容積の改良、および良好なパン生地許容度が得られることを示す。さらに、この効果は、酵素を組み合わせれば、酵素を個別に使用して得られる結果の合計（「１／２」）よりも高い結果が得られるので相乗的である。
【０１２６】
例４
クラスティロール
脂肪分解酵素を組み合わせたときの効果をクラスティロール製造において試験した。
【０１２７】
例３と同様に、クラスティロールを調製および評価した。酵素を、表６のスキームに基づき、パン生地に添加した。酵素用量は下記の通りであった：ＰＨ３  ３１５ＰｍＵ／パン生地；ＬＩＭ  ６９０ＬｍＵ／パン生地；ＨＹＰ  １２００ＬｍＵ／パン生地；ＬＥＣ  １４００ＬｍＵ／パン生地。
【０１２８】
【表７】
2019514385.tif 000010
【０１２９】
結果は、本発明による組成物の第１の酵素に対応する酵素１（ＰＨ３）、および本発明による組成物の第２の酵素に対応する酵素２（ＬＩＭまたはＨＹＰ）を使用すれば、参照品よりも、または酵素を単独使用する場合よりも良好な容積の改良および良好なパン生地許容度が得られることを示す。
【０１３０】
例５
ブタ膵臓リパーゼ
ブタ膵臓由来のホスホリパーゼＡ２（ＰＰＬ；Ｓｉｇｍａ社から購入、ｒｅｆ．Ｐ６５３４−１０ＭＧ）について、例１の酵素活性を決定した。
【０１３１】
【表８】
2019514385.tif 000011
【０１３２】
精製された酵素のタンパク質含有量は、３．６６ｍｇ／ｍｌである。
【０１３３】
例３と同様に、クラスティロールを調製および評価した。酵素用量はそれぞれ下記の通りであった：ＬＩＭ：６９０ＬｍＵ／パン生地；ＰＨ４：７０３ＰｍＵ／パン生地；ＰＰＬａ：０．４４ｍｇ／パン生地；ＰＰＬｂ：１．７６ｍｇ／パン生地。
【０１３４】
結果を表８に示す。
【０１３５】
【表９】
2019514385.tif 000012
【０１３６】
この結果は、ブタ膵臓ホスホリパーゼＡ２はパン生地許容度に対して相乗的効果を有さないこと、および酵素の用量を増加しても効果を有さないことを示す。
【０１３７】
例６
乳化剤の置き換え
ピコロス製造における乳化剤の置き換えについて、脂肪分解酵素を組み合わせたときの効果を試験した（オーバーナイト法）。ピコロスを、表９のパン生地組成物を使用して調製した。
【０１３８】
【表１０】
2019514385.tif 000013
【０１３９】
成分を、Ｅｂｅｒｈａｒｄｔ  Ｎ２４ミキサー中、低速で２分間、および高速で５分間混合した。最終パン生地温度、ならびに休止およびプルーフィング温度は、２５℃であった。２５℃で５分間休ませた後、パン生地を手作業により再加工し、そしてさらに５分間休ませた。その後、パン生地を分割し、そしてＲｏｔａｍａｔを使用して成形した。７０ｇｒのパン生地ピースを得た。パン生地ピースを、Ｋｏｍａプルーフボックス中、約２℃、オーバーナイトで保管した。プルーフボックスの温度を６時間かけて２５℃まで徐々に高めた。２５℃および湿度９５％で３０分間、最終プルーフィングを行った後、パン生地ピースをナイフで１回裁断し、そして蒸気発生装置付きのＭＩＷＥ  Ｒｏｌｌ−Ｉｎオーブン（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗｅｎｚ−Ａｒｎｓｔｅｉｎ社−ドイツ）中、２３０℃で１８分間焼き上げた。一般的に使用されるナタネ置換法を使用して、６個のピコロスの容積を測定した。
【０１４０】
結果を表１０に示す。
【０１４１】
【表１１】
2019514385.tif 000014
【０１４２】
結果は、本発明による酵素を組み合わせれば、パン生地レシピーにおいて、乳化剤の完全な置き換えが可能になることを示す。
【配列表】
2019514385000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月10日(2019.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．０１〜１００の範囲、好ましくは０．０１〜８０の範囲、より好ましくは０．０１〜５０の範囲、より好ましくは１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは０．０１〜２５の間、なおいっそうより好ましくは１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜２５の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素であって；
前記第一の酵素は、４５℃に等しい、またはそれより高い温度で至適ホスホリパーゼ活性を有することにより特徴づけられ；および、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、より好ましくは配列番号２および／または配列番号３のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、なおいっそうより好ましくは配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有する、前記第一の酵素；および；
５０００〜６００００の範囲、好ましくは１００００〜５００００の間、より好ましくは１５０００〜５００００の間のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素であって；配列番号６および／または配列番号７のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、前記第２の酵素;
を含む組成物。
【請求項２】
前記第１の酵素が、カエトミウム・サーモフィルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、メイオサーマス・ルバー（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、および／または、メイオサーマス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第２の酵素が、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性およびリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、またはフザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）由来のホスホリパーゼ活性およびリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素から選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４】
ベーカリー用途における、請求項１〜３に記載の組成物の使用。
【請求項５】
パン改良剤における請求項４に記載の使用。
【請求項６】
パンまたはパティセリー製品、好ましくはケーキ、パン、バゲット、またはロールにおける、請求項４または５に記載の使用。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物を含むパン改良剤。
【請求項８】
０．０１〜１００の範囲、好ましくは０．０１〜８０の範囲、より好ましくは０．０１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは０．０１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜２５の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素であって、
前記第一の酵素は、４５℃に等しい、またはそれより高い温度で至適ホスホリパーゼ活性を有することにより特徴づけられ；および、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、より好ましくは配列番号２および／または配列番号３のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、なおいっそうより好ましくは配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有する、前記第１の酵素；および；
５０００〜６００００の範囲、好ましくは１００００〜５００００の間、より好ましくは１５０００〜５００００の間のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素であって；配列番号６および／または配列番号７のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、前記第２の酵素；
を、ベーキング前にパン生地またはバッターに添加する工程を含む、ベーキング製品を調製する方法。
【請求項９】
前記パン生地またはバッターが、５０００〜１０００００ＰｍＵ／粉１００ｋｇの間、好ましくは７０００〜５００００ＰｍＵ／粉１００ｋｇの間、より好ましくは１００００〜３００００ＰｍＵ／粉１００ｋｇの間の前記第１の酵素、および１００００〜１０００００ＬｍＵ／粉１００ｋｇの間、好ましくは２００００〜７００００ＬｍＵ／粉１００ｋｇの間の前記第２の酵素を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記パン生地またはバッターが、改良された許容度を示す、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ベーキング製品が、改良された新鮮度を示す、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物を含むパン生地またはバッターから調製されるベーキング製品。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
結果は、本発明による酵素を組み合わせれば、パン生地レシピーにおいて、乳化剤の完全な置き換えが可能になることを示す。
以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
［１］
０．０１〜１００の範囲、好ましくは０．０１〜８０の範囲、より好ましくは０．０１〜５０の範囲、より好ましくは１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは０．０１〜２５の間、なおいっそうより好ましくは１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜２５の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素と、
５０００〜６００００の範囲、好ましくは１００００〜５００００の間、より好ましくは１５０００〜５００００の間のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素と
を含む組成物。
［２］
前記第１の酵素が、カエトミウム・サーモフィルム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、メイオサーマス・ルバー（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｒｕｂｅｒ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、メイオサーマス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｉｌｖａｎｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、ストレプトマイセス・バイオラセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｒｕｂｅｒ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、および／またはフザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）由来のホスホリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素から選択される、［１］に記載の組成物。
［３］
前記第１の酵素が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および／または配列番号５のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、好ましくは配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、より好ましくは配列番号２および／または配列番号３のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、なおいっそうより好ましくは配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有する、［１］または［２］に記載の組成物。
［４］
前記第１の酵素が、４５℃に等しい、またはそれより高い温度で至適ホスホリパーゼ活性を有することにより特徴づけられる、先行するいずれか１態様に記載の組成物。
［５］
前記第２の酵素が、サーモミセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のホスホリパーゼ活性およびリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素、またはフザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）由来のホスホリパーゼ活性およびリパーゼ活性を有する脂肪分解酵素から選択される、先行するいずれか１態様に記載の組成物。
［６］
前記第２の酵素が、配列番号６および／もしくは配列番号７のいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有する、またはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ社のＬｉｐｏｐａｎ（登録商標）Ｍａｘ、もしくはＡＢ  ｅｎｚｙｍｅｓ社のＶｅｒｏｎ（登録商標）Ｈｙｐｅｒｂａｋｅ  Ｔから選択される、先行するいずれか１態様に記載の組成物。
［７］
ベーカリー用途における、［１］〜［６］に記載の組成物の使用。
［８］
パン改良剤における［７］に記載の使用。
［９］
パンまたはパティセリー製品、好ましくはケーキ、パン、バゲット、またはロールにおける、［７］または［８］に記載の使用。
［１０］
［１］〜［６］のいずれか１に記載の組成物を含むパン改良剤。
［１１］
０．０１〜１００の範囲、好ましくは０．０１〜８０の範囲、より好ましくは０．０１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは１〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜５０の範囲、なおいっそうより好ましくは０．０１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは１〜２５の範囲、なおいっそうより好ましくは２〜２５の範囲のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比を有する少なくとも１つの第１の酵素と、
５０００〜６００００の範囲、好ましくは１００００〜５００００の間、より好ましくは１５０００〜５００００の間のホスホリパーゼＡ１活性／ホスホリパーゼＡ２活性の比、および５００またはそれ超のホスホリパーゼＡ１活性／リパーゼ活性の比を有する少なくとも１つの第２の酵素と
を、ベーキング前にパン生地またはバッターに添加する工程を含む、ベーキング製品を調製する方法。
［１２］
前記パン生地またはバッターが、５０００〜１０００００ＰｍＵ／粉１００ｋｇの間、好ましくは７０００〜５００００ＰｍＵ／粉１００ｋｇの間、より好ましくは１００００〜３００００ＰｍＵ／粉１００ｋｇの間の前記第１の酵素、および１００００〜１０００００ＬｍＵ／粉１００ｋｇの間、好ましくは２００００〜７００００ＬｍＵ／粉１００ｋｇの間の前記第２の酵素を含む、［１１］に記載の方法。
［１３］
前記パン生地またはバッターが、改良された許容度を示す、［１１］または［１２］に記載の方法。
［１４］
前記ベーキング製品が、改良された新鮮度を示す、［１１］または［１２］に記載の方法。
［１５］
［１］〜［６］のいずれか１に記載の組成物を含むパン生地またはバッターから調製されるベーキング製品。
【国際調査報告】
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