(57)【要約】  本開示は、テネイシンＣの中和エピトープ、およびそれに特異的な結合ドメイン、例えば抗体またはその結合断片、それを含む医薬組成物、ならびに治療、特に炎症性疾患の治療における前述の抗体、結合断片または組成物の使用に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｌａ２２１５，Ｔｙｒ２１１６，Ａｓｎ２１１８，Ｓｅｒ２１３１，Ｉｌｅ２１３３，Ｔｙｒ２１４０，Ａｒｇ２１４７，Ａｓｎ２１４８，Ｃｙｓ２１４９，Ｈｉｓ２１５０，Ａｒｇ２１５１，Ｈｉｓ２１６３，Ｓｅｒ２１６４，Ｐｈｅ２１７０，Ｈｉｓ２１７１，およびＨｉｓ２１７５の群から選択される少なくとも５個のアミノ酸を含み、前記アミノ酸残基の位置は、配列番号１の位置である、テネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項２】
少なくとも１つの荷電残基、例えばＡｒｇ  ２１４７を含む、請求項１に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項３】
荷電残基、例えばＡｒｇ２１５１を含む、請求項１又は２に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項４】
少なくとも１つの疎水性残基、例えばＩｌｅ  ２１３３を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項５】
アミノ酸Ａｒｇ２１４７、Ａｓｎ２１４８、Ｃｙｓ２１４９、Ｈｉｓ２１５０、およびＡｒｇ２１５１の直鎖状配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項６】
極性残基Ｈｉｓ２１６３を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項７】
Ｃｙｓ２１４９を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項８】
疎水性残基Ｈｉｓ２１７１を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項９】
前記極性アミノ酸Ｔｙｒ２１１６を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項１０】
前記疎水性残基Ｐｈｅ２１７０を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項１１】
Ｉｌｅ２１３３、Ａｒｇ２１４７、Ａｓｎ２１４８、Ｈｉｓ２１６３、およびＰｈｅ２１７０を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項１２】
アミノ酸残基Ｓｅｒ２１３１をさらに含む、請求項１１に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項１３】
アミノ酸残基Ｔｙｒ２２１６をさらに含む、請求項１１または１２に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項１４】
残基Ａｌａ２１１５、Ａｓｎ２１１８、Ｓｅｒ２１３１、Ａｒｇ２１４７、Ａｓｎ２１４８、Ｃｙｓ２１４９、Ｈｉｓ２１５０、Ａｒｇ２１５１、Ｓｅｒ２１６４、Ｈｉｓ２１７１、およびＨｉｓ２１７５を含む、請求項１に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項１５】
残基Ａｌａ２１１５、Ｔｙｒ２１１６、Ａｓｎ２１１８、Ｓｅｒ２１３１、Ｔｙｒ２１４０、Ａｒｇ２１４７、Ａｓｎ２１４８、Ｃｙｓ２１４９、Ｈｉｓ２１５０、Ａｒｇ２１５１、Ｈｉｓ２１６３、Ｓｅｒ２１６４、Ｐｈｅ２１７０、Ｈｉｓ２１７１およびＨｉｓ２１７５を含む、請求項１に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項１６】
残基Ａｌａ２１１５、Ｔｙｒ２１１６、Ａｓｎ２１１８、Ｓｅｒ２１３１、Ｉｌｅ２１３３、Ｔｙｒ２１４０、Ａｒｇ２１４７、Ａｓｎ２１４８、Ｃｙｓ２１４９、Ｈｉｓ２１５０、Ａｒｇ２１５１、Ｈｉｓ２１６３、Ｓｅｒ２１６４、Ｐｈｅ２１７０、Ｈｉｓ２１７１、Ｈｉｓ２１７５を含む、請求項１に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項１７】
６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６の前記アミノ酸残基を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のエピトープに結合する、中和抗体またはその結合断片。
【請求項１９】
前記抗体または断片の少なくともアミノ酸１００が前記エピトープと相互作用し、アミノ酸１００はエピトープの４オングストローム以内に位置し、例えば当該重鎖のアミノ酸残基１００は極性であり、例えばチロシンである、請求項１８に記載の中和抗体または結合断片。
【請求項２０】
前記重鎖の少なくともアミノ酸１０１は極性アミノ酸、例えばＧｌｎである、請求項１８または１９に記載の中和抗体またはその結合断片。
【請求項２１】
前記重鎖の少なくともアミノ酸１０２は極性であり、例えばセリンである、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の中和抗体または結合断片。
【請求項２２】
前記重鎖の少なくともアミノ酸１０４は荷電しており、例えばＧｌｕである、請求項１８〜２１に記載の中和抗体または結合断片。
【請求項２３】
少なくともアミノ酸１０５が負に荷電したアミノ酸、例えばＡｓｐである、請求項１８〜２２に記載の中和抗体または結合断片。
【請求項２４】
前記抗体またはその結合断片はヒト又はヒト化である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の中和抗体または結合断片。
【請求項２５】
その親和性が５ｐＭ〜５００ｎＭの範囲である、請求項１８〜２４のいずれか一項に記載の中和抗体または結合断片。
【請求項２６】
請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の抗体または結合断片および希釈剤、賦形剤および／または担体を含む医薬組成物。
【請求項２７】
治療に使用するための、請求項１８〜２６に記載の中和抗体もしくは結合断片、または請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
慢性炎症の治療に使用するための、請求項２７に記載の中和抗体または結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、テネイシンＣの中和エピトープ、およびそれに特異的な結合ドメイン、例えば抗体またはその結合断片、それを含む医薬組成物、ならびに治療、特に炎症性疾患の治療における前記抗体、結合断片または組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
いくつかの研究は、テネイシンＣのＦＢＧドメインのＰサブドメインのいわゆるループ５、ループ７およびループ１０がＴＬＲ４受容体に結合するための重要なエピトープであることを示唆している。テネイシンＣのＦＢＧドメインとＴＬＲ４との相互作用は、インビボでの炎症反応の持続性を増大させる原因であると考えられている。ＦＢＧドメインのこれらの領域、特にループ５は、抗体および結合断片などの阻害剤を用いた標的化にとって関心のある領域と考えられる。
【０００３】
驚くべきことに、本発明者らは、ループ５由来のいかなる残基も含まない立体配座エピトープが、テネイシンＣのＦＢＧドメインの「炎症活性」を中和することを確立した。
【発明の概要】
【０００４】
一態様では、Ａｌａ２２１５、Ｔｙｒ２１１６、Ａｓｎ２１１８、Ｓｅｒ２１３１、Ｉｌｅ２１３３、Ｔｙｒ２１４０、Ａｒｇ２１４７、Ａｓｎ２１４８、Ｃｙｓ２１４９、Ｈｉｓ２１５０、Ａｒｇ２１５１、Ｈｉｓ２１６３、Ｓｅｒ２１６４、Ｐｈｅ２１７０，Ｈｉｓ２１７１およびＨｉｓ２１７５の群から独立して選択される少なくとも５個のアミノ酸を含むテネイシンＣの中和エピトープが提供され、前記アミノ酸残基の位置は、ユニプロットＩＤ：Ｐ２４８２１（配列番号１）に開示されているタンパク質に関して定義される。
【０００５】
一実施形態では、本開示のエピトープは立体配座エピトープである。
【０００６】
一実施形態では、エピトープは、例えば抗体または断片、特に本明細書に開示される抗体Ｃ３の結合ドメインの結合エンティティの４Å、３．５Åまたは３．０Å内に位置するアミノ酸残基として定義される。
【０００７】
一実施形態では、本開示によるテネイシンＣの中和エピトープは、少なくとも１つの荷電残基Ａｒｇ２１４７を含む。
【０００８】
一実施形態では、本開示によるテネイシンＣの中和エピトープは、荷電残基Ａｒｇ２１５１を含む。
【０００９】
一の実施形態において、本開示によるテネイシンＣの中和エピトープは、少なくとも１つの疎水性残基Ｉｌｅ２１３３を含む。
【００１０】
一実施形態では、本発明によるテネイシンＣの中和エピトープは、アミノ酸Ａｒｇ２１４７、Ａｓｎ２１４８、Ｃｙｓ２１４９、Ｈｉｓ２１５０、およびＡｒｇ２１５１の直鎖状配列を含む。
【００１１】
一実施形態では、本開示によるテネイシンＣの中和エピトープは、極性残基Ｈｉｓ２１６３を含む。
【００１２】
一実施形態では、本開示によるテネイシンＣの中和エピトープは、Ｃｙｓ２１４９を含む。
【００１３】
一実施形態において、テネイシンＣの中和エピトープは、疎水性残基Ｈｉｓ２１７１を含む。
【００１４】
一実施形態では、本開示によるテネイシンＣの中和エピトープは極性アミノ酸Ｔｙｒ２１１６を含む。
【００１５】
一実施形態では、本開示によるテネイシンＣの中和エピトープは、疎水性残基Ｐｈｅ  ２１７０を含む。
【００１６】
一実施形態では、本開示によるテネイシンＣの中和エピトープは、Ｉｌｅ２１３３、Ａｒｇ２１４７、Ａｓｎ２１４８、Ｈｉｓ２１６３、およびＰｈｅ２１７０を含む。
【００１７】
一実施形態では、本開示によるテネイシンＣの中和エピトープは、アミノ酸残基Ｓｅｒ２１３１をさらに含む。
【００１８】
一実施形態では、本開示によるテネイシンＣの中和エピトープは、アミノ酸残基Ｔｙｒ２２１６をさらに含む。
【００１９】
一実施形態では、本開示によるテネイシンＣの中和エピトープは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６個の前記アミノ酸残基を含む。
【００２０】
一実施形態では、エピトープの阻害剤、例えば小さな化学物質、抗体またはそれらの結合断片が提供される。
【００２１】
一実施形態では、例えば中和抗体またはその結合断片において、本開示によるエピトープに結合する結合ドメインが提供される。
【００２２】
本発明はまた、本発明によって提供される中和エピトープに結合する、および／またはそれと相互作用する抗体およびその結合断片を提供する。抗体は、本発明のエピトープと直接的または間接的に、例えば直接結合によってまたはアロステリック相互作用によって相互作用することができることが理解されよう。特に、本開示の一態様を形成する抗体および結合断片は、親和性など、本明細書に開示されている抗体Ｃ３の特性と同様の１つまたは複数の特性を有する。
【００２３】
一実施形態では、本開示による結合ドメインは、例えばキメラ抗原受容体の一部として、細胞表面に発現される。
【００２４】
一実施形態では、本開示による中和抗体または結合断片は、エピトープと相互作用する抗体または結合断片の重鎖の残基１００、１０１、１０２、１０４および１０５から選択される少なくとも１つのアミノ酸を有し、アミノ酸はエピトープの４オングストローム内に位置し、例えば２、３、４または５個の残基がエピトープと相互作用する。
【００２５】
一実施形態では、抗体または結合断片の重鎖のアミノ酸残基１００は極性であり、例えばチロシンである。
【００２６】
一実施形態では、抗体または結合断片の重鎖のアミノ酸１０１は極性アミノ酸、例えばＧｌｎである。
【００２７】
一実施形態では、抗体または結合断片の重鎖のアミノ酸１０２は極性であり、例えばセリンである。
【００２８】
一実施形態では、抗体または結合断片の重鎖のアミノ酸１０４は荷電しており、例えばＧｌｕである。
【００２９】
一実施形態では、抗体または結合断片の重鎖のアミノ酸１０５は、負に荷電したアミノ酸、例えばＡｓｐである。
【００３０】
一実施形態では、本開示による中和抗体または結合断片は、エピトープと相互作用する抗体または結合断片の軽鎖の残基２８、３０、３１、３２、５０、５１、５２、５３、６４、９１および９２から選択される少なくとも１つのアミノ酸を有し、アミノ酸はエピトープの４オングストローム以内に位置し、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個の残基がエピトープと相互作用する。
【００３１】
一実施形態では、抗体または結合断片の軽鎖のアミノ酸残基２８は極性であり、例えばチロシンである。
【００３２】
一実施形態では、抗体または結合断片の軽鎖のアミノ酸３０は極性アミノ酸、例えばグルタミンである。
【００３３】
一実施形態では、抗体または結合断片の軽鎖のアミノ酸３１は疎水性、例えばグリシンである。
【００３４】
一実施形態では、抗体または結合断片の軽鎖のアミノ酸３２は疎水性、例えばフェニルアラニンである。
【００３５】
一実施形態では、抗体または結合断片の軽鎖のアミノ酸５０は荷電アミノ酸、例えばアスパラギン酸である。
【００３６】
一実施形態では、抗体または結合断片の軽鎖のアミノ酸５１は疎水性、例えばアラニンである。
【００３７】
一実施形態では、抗体または結合断片の軽鎖のアミノ酸５２は疎水性、例えばグリシンである。
【００３８】
一実施形態では、抗体または結合断片の軽鎖のアミノ酸５３は極性アミノ酸、例えばアスパラギンである。
【００３９】
一実施形態では、抗体または結合断片の軽鎖のアミノ酸６４は疎水性、例えばグリシンである。
【００４０】
一実施形態では、抗体または結合断片の軽鎖のアミノ酸９１は荷電アミノ酸、例えばセリンである。
【００４１】
一実施形態では、抗体または結合断片の軽鎖のアミノ酸９２は極性アミノ酸、例えばチロシンである。
【００４２】
一実施形態では、抗体又は結合断片はヒトまたはヒト化である。
【００４３】
一実施形態では、親和性を有する抗体または結合断片は、５ｐＭ〜５００ｎＭの範囲、例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、９００または９５０ｐＭ、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または４５０ｎＭにある。
【００４４】
一実施形態では、本開示の抗体または結合断片は、Ｃ３抗体のＣＤＲを含まない。
【００４５】
一実施形態では、本開示の抗体または結合断片は、Ｂ１２抗体のＣＤＲを含まない。
【００４６】
一実施形態では、本開示の抗体または結合断片は、２Ａ５抗体のＣＤＲを含まない。
【００４７】
本開示による抗体または結合断片ならびに希釈剤、賦形剤および／または担体を含む医薬組成物もまた提供される。
【００４８】
一態様では、本開示は、治療に使用するための、特に慢性炎症の治療に使用するための、中和抗体もしくは結合断片、またはそれらのいずれかを含む医薬組成物に及ぶ。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
文脈が他に示さない限り、抗体およびその結合断片は６つのＣＤＲ配列を含む。
【００５０】
本明細書で使用される「Ｃ３、Ｂ１２および２Ａ５のＣＤＲを含まない」とは、ＣＤＲ  Ｈ１、ＣＤＲ  Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２  Ｌ３のうちのいずれか１つ、およびその２つ以上の組み合わせにおける少なくとも１つのアミノ酸が置換、付加または欠失されている、例えばＣＤＲ配列が本明細書に開示（前記抗体の系列メンバーを含む）された配列と同一でないことを意味する。
【００５１】
一実施形態において、本開示の抗体または結合断片は、本明細書に開示されるＣＤＲ配列とは異なる、特に、少なくとも１つのＣＤＲ配列中の１、２、３、４、５、６個以上のアミノ酸などの少なくとも１つのアミノ酸の、例えば付加、置換または欠失（特に置換または欠失）によって異なる少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【００５２】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ１は、本明細書に開示される配列とは異なるように修飾される。
【００５３】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ２は、本明細書に開示される配列とは異なるように修飾される。
【００５４】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｈ３は、本明細書に開示される配列とは異なるように修飾される。
【００５５】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｌ１は、本明細書に開示される配列とは異なるように修飾される。
【００５６】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｌ２は、本明細書に開示される配列とは異なるように改変される。
【００５７】
一実施形態では、ＣＤＲ  Ｌ３は、本明細書に開示されている配列と異なるように修飾されている。
【００５８】
一の実施形態では、抗体または結合断片の結合ドメイン中の２つのＣＤＲは異なり、例えばＣＤＲ  Ｈ１およびＨ２；ＣＤＲＨ１およびＨ３；ＣＤＲ  Ｈ２およびＨ３  ；ＣＤＲ  Ｌ１およびＬ２；ＣＤＲＬ１およびＬ３；ＣＤＲ  Ｌ２およびＬ３；ＣＤＲ  Ｈ１およびＣＤＲ  Ｌ１；ＣＤＲ  Ｈ２およびＬ１；ＣＤＲ  Ｈ３およびＬ１；ＣＤＲ  Ｈ１およびＬ２；ＣＤＲ  Ｈ２およびＬ２；ＣＤＲ  Ｈ３およびＬ２；ＣＤＲ  Ｈ１およびＬ３；ＣＤＲ  Ｈ２およびＬ３；ＣＤＲ  Ｈ３およびＬ３は、例えば少なくとも１つのアミノ酸の付加、置換または欠失（特に置換または欠失）によって本明細書の配列と異なり、例えば１、２、３、４、５、６個以上のアミノ酸が少なくとも１つのＣＤＲ配列において異なる。
【００５９】
一実施形態では、抗体または結合断片の結合ドメイン中の３つのＣＤＲは異なり、例えばＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３；ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２およびＬ３、ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２およびＬ１；ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２およびＬ２；ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２およびＬ３；ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ３およびＬ１；ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ３およびＬ２；ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ３およびＬ３；ＣＤＲ  Ｈ２、Ｈ３およびＬ１；ＣＤＲ  Ｈ２、Ｈ３およびＬ２；ＣＤＲ  Ｈ２、Ｈ３およびＬ３；ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２およびＨ１；ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２およびＨ２；ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２およびＨ３；ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ３およびＨ１；ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ３およびＨ２；ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ３およびＨ３；ＣＤＲ  Ｌ２、Ｌ３およびＨ１；ＣＤＲ  Ｌ２、Ｌ３およびＨ２；ＣＤＲ  Ｌ２、Ｌ３およびＨ３は、例えば少なくとも１つのアミノ酸の付加、置換または欠失（特に置換または欠失）によって本明細書の配列と異なり、例えば１、２、３、４、５、６個以上のアミノ酸が少なくとも１つのＣＤＲ配列において異なる。
【００６０】
一実施形態では、結合ドメイン内の４つのＣＤＲは、本明細書に開示されている対応する抗体ＣＤＲとは異なる。
【００６１】
一実施形態では、結合ドメイン内の５つのＣＤＲは、本明細書に開示されている対応する抗体ＣＤＲとは異なる。
【００６２】
一実施形態では、結合ドメイン内の６つのＣＤＲは、本明細書に開示されている対応する抗体ＣＤＲとは異なる。
【００６３】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号２７、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号２８、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号２９、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号３１である。
【００６４】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号３４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号３５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号３６、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号３８、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号３９、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号４０である。
【００６５】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号２２、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号２４である。
【００６６】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号４３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９である。
【００６７】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号４６、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９である。
【００６８】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号４９、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９である。
【００６９】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号６、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９である。
【００７０】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４であり、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号５３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９である。
【００７１】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１５、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９である。
【００７２】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号２１、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９である。
【００７３】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号４５、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９である。
【００７４】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号５１、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９である。
【００７５】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７である。
【００７６】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号５６、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７である。
【００７７】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号５８、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７である。
【００７８】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号６０、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７である。
【００７９】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号６２、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７である。
【００８０】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号６４、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７である。
【００８１】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号６６、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７である。
【００８２】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号６８、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７である。
【００８３】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号７０、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７である。
【００８４】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号７２、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７である。
【００８５】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号７４、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７である。
【００８６】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号７６、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７である。
【００８７】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号７８、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７である。
【００８８】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号８０である。
【００８９】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号８３である。
【００９０】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号８６である。
【００９１】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号８９である。
【００９２】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９２である。
【００９３】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９５である。
【００９４】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９８である。
【００９５】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１０１または１０２である。
【００９６】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１０５である。
【００９７】
一実施形態では、少なくとも１つ、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲが異なり、ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１０８である。
【００９８】
本明細書中で使用される場合、異なるとは、例えば１、２、３、４、５または６個のＣＤＲの少なくとも１つのＣＤＲ配列中の、例えば１、２、３、４、５、６個以上のアミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸の付加、置換または欠失（特に置換または欠失）をいう。
【００９９】
本明細書で使用される「中和エピトープ」は、阻害または遮断され、それによってテネイシン（例えばテネイシンＣ）のＦＢＧドメイン、特にそのＰ-サブドメインの生物学的シグナル伝達活性を１つ以上の受容体、例えばＴＬＲ４に中和することができるエピトープを指す。
【０１００】
本明細書で使用する場合、用語「中和抗体」は、テネイシン（例えば、テネイシンＣ）のＦＢＧドメイン、特にそのＰ−サブドメインの生物学的シグナル伝達活性を１つまたは複数の受容体、例えばＴＬＲ４に中和することができる抗体を表現する。
【０１０１】
本明細書で使用される「中和」という用語は、部分的または完全であり得る生物学的シグナル伝達活性の減少を意味することが理解されるであろう。
【０１０２】
抗体可変ドメイン中の残基は、従来、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従って番号付けされている。このシステムは、Ｋａｂａｔら，１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，アメリカ合衆国保健福祉省、アメリカ国立衛生研究所（以降、「Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｓｕｐｒａ）」に記載されている。この番号付け方式は、他に指示がない限り、本明細書において使用される。
【０１０３】
Ｋａｂａｔ残基の指定は、必ずしもアミノ酸残基の線状番号付けと直接対応しない。実際の直鎖状アミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワークであろうと相補性決定領域（ＣＤＲ）であろうと、構造要素の短縮または挿入に対応する厳密なＫａｂａｔ番号付けよりも少ないまたは追加のアミノ酸を含み得る。残基の正しいＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列中の相同性の残基を「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列と整列させることによって、所与の抗体について決定され得る。
【０１０４】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付け体系に従って、残基３１〜３５（ＣＤＲ  -Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ-Ｈ２）および残基９５〜１０２（ＣＤＲ-Ｈ３）に位置する。しかしながら、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ．ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６，９０１-９１７（１９８７））によれば、ＣＤＲ-Ｈ１に相当するループは残基２６から残基３２まで伸びている。したがって、本明細書で使用される「ＣＤＲ-Ｈ１」は、Ｋａｂａｔ番号付け体系とＣｈｏｔｈｉａの位相幾何学的ループ定義の組み合わせによって記載されるように、残基２６〜３５を含む。
【０１０５】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付け体系に従って、残基２４〜３４（ＣＤＲ-Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ-Ｌ２）および残基８９〜９７（ＣＤＲ-Ｌ３）に位置する。
【０１０６】
本発明における使用のための抗体は、全抗体および機能的活性断片もしくはその誘導体を含み、限定されないが、モノクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、ドメイン抗体、例えばＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントならびに上記のいずれかのエピトープ結合断片であってもよい。他の抗体断片としては、国際特許出願ＷＯ２００５００３１６９、ＷＯ２００５００３１７０およびＷＯ２００５００３１７１に記載されているものが挙げられる。抗体断片およびそれらを製造する方法は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｖｅｒｍａら，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５−１８１；Ａｄａｉｒ  ａｎｄ  Ｌａｗｓｏｎ，２００５．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ  ２（３）：２０９−２１７を参照されたい。
【０１０７】
本発明における使用のための抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分，すなわち、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子が含まれる。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）またはサブクラスのものであり得る。本発明の抗体分子の定常領域ドメインは、もしこれが存在すれば、抗体分子の提案された機能、特に必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択され得る。例えば、定常領域ドメインは、ヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであり得る。特に、抗体分子が治療的使用を目的とし、抗体エフェクター機能が必要とされる場合、ヒトＩｇＧ定常領域ドメイン、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプを使用することができる。あるいは、抗体分子が治療目的に意図され、抗体エフェクター機能が必要とされない場合、例えば単純な遮断作用のためには、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用してもよい。これらの定常領域ドメインの配列改変体もまた使用され得ることが理解されよう。例えば、Ａｎｇａｌら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９３、３０（１）、１０５〜１０８に記載されているように、２４１位のセリンがプロリンに変更されている、ＩｇＧ４分子を使用することができる。この変更を含むＩｇＧ４定常ドメインが特に好ましい。抗体が様々な翻訳後修飾を受けてもよいことも当業者には理解されよう。これらの改変の種類および程度は、抗体を発現するために使用される宿主細胞株ならびに培養条件に依存することが多い。そのような修飾は、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化およびアスパラギン脱アミド化における変動を含み得る。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基性残基（リジンまたはアルギニンなど）の喪失である（Ｈａｒｒｉｓ、ＲＪ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ７０５：１２９−１３４、１９９５に記載）。
【０１０８】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２）及びＥＢＶ-ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ｐｐ７７〜９６、Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５）などの当該分野に公知のいかなる方法によって調製されてもよい。
【０１０９】
本発明における使用のための抗体はまた、例えばＢａｂｃｏｏｋ、ｊ．ら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３（１５）：７８４３−７８４８１、ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８および国際特許出願番号ＷＯ２００４／１０６３７７による、特異的抗体の産生のために選択された単一リンパ球から生成された免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングおよび発現させることによる単一リンパ球抗体方法を使用して生成され得る。
【０１１０】
ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照）。
【０１１１】
キメラ抗体は、軽鎖および重鎖遺伝子が異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントからなるように遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる抗体である。これらのキメラ抗体は抗原性が低い可能性がある。
【０１１２】
二価抗体は、当技術分野において公知の方法によって作製することができる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９；ＷＯ９３／０８８２９，Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５-３６５９）。多価抗体は、多重特異性または単一特異性であり得る（例えば、ＷＯ９２／２２８５３及びＷＯ０５／１１３６０５を参照）。
【０１１３】
本発明において使用するための抗体はまた、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ方法を使用して生成され得、またＢｒｉｎｋｍａｎら、（ｉｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，１８２：４１−５０），Ａｍｅｓら、（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４：１７７〜１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、（Ｅｕｒ．．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４、２４：９５２〜９５８）、Ｐｅｒｓｉｃら、（Ｇｅｎｅ，１９９７  １８７  ９−１８），Ｂｕｒｔｏｎら、（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９４，５７：１９１−２８０）ならびにＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；およびＵＳ５，６９８，４２６；５，２２３，４０９；５，４０３，４８４；５，５８０，７１７；５，４２７，９０８；５，７５０，７５３；５，８２１，０４７；５７１，６９８；５，４２７，９０８；５，５１６，６３７；５，７８０，２２５；５，６５８，７２７；５，７３３，７４３および５，９６９，１０８によって開示されているものが含まれる。一本鎖抗体の産生のための技術、例えばＵＳ４，９４６，７７８に記載されているものなども、本開示に従ってエピトープに結合する一本鎖抗体を産生するために適合させることができる。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物の生物を用いてヒト化抗体を発現させることができる。
【０１１４】
本明細書に開示される抗体および結合断片は、新しい抗体および結合断片を提供するために突然変異され得、操作され得、および／または親和性成熟および／または軽鎖が交換され得る。あるいは、特発性抗体は、本明細書中に開示される抗体の結合部位に特異的に生成され得る。このようにして生成されたこれらの特発性抗体は、本開示の元の抗体と同じエピトープに結合する傾向が高い可能性がある。
【０１１５】
完全ヒト抗体は、重鎖および軽鎖両方の可変領域および定常領域（存在する場合）がすべてヒト起源であるか、またはヒト起源の配列と実質的に同一である抗体であり、必ずしも同じ抗体に由来するわけではない。完全ヒト抗体の例としては、例えば上記のファージディスプレイ法によって産生される抗体、およびマウス免疫グロブリン可変領域遺伝子および定常領域遺伝子がそれらのヒト対応物によって置換されているマウスによって産生される抗体が挙げられ得、例えばＥＰ０５４６０７３Ｂ１、ＵＳ５，５４５，８０６、ＵＳ５，５６９，８２５、ＵＳ５，６２５，１２６、ＵＳ５，６３３，４２５、ＵＳ５，６６１，０１６、ＵＳ５，７７０，４２９、ＥＰ０４３８４７４Ｂ１およびＥＰ０４６３１５１Ｂ１に一般的用語で記載されている。
【０１１６】
当技術分野において公知の任意の適切な方法、例えば、水素−重水素交換、部位特異的突然変異誘発、質量分析、ＮＭＲおよびＸ線結晶学によって提供される抗体によって結合される残基を決定するために使用することができる。例えば、ＷＯ２００７／１４９０３２に記載されている方法を参照されたい。
【０１１７】
所望であれば、本発明において使用するための抗体は、１つまたは複数のエフェクター分子に結合させることができる。エフェクター分子は、例えば本発明の抗体に結合することができる単一の部分を形成するように連結された単一のエフェクター分子または２つ以上のそのような分子を含み得ることが理解されよう。エフェクター分子に結合した抗体断片を得ることが望まれる場合、これは抗体断片が直接またはカップリング剤を介してエフェクター分子に結合する標準的な化学的または組換えＤＮＡ手順によって調製され得る。そのようなエフェクター分子を抗体に結合させるための技術は当技術分野において周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，ｅｄｓ．，１９８７，ｐｐ．６２３−５３；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８  およびＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７−１２３を参照）。  特定の化学的手順としては、例えばＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６およびＷＯ０３０３１５８１に記載されているものが含まれる。あるいは、エフェクター分子がタンパク質またはポリペプチドである場合、結合は、例えばＷＯ８６／０１５３３およびＥＰ  ０３９２７４５に記載されているように、組換えＤＮＡ手順を用いて達成することができる。
【０１１８】
本明細書で使用されるエフェクター分子という用語は、例えば、抗腫瘍薬、薬物、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体または抗体断片、合成または天然ポリマー、核酸およびその断片ト、例えばＤＮＡ、ＲＮＡおよび断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子およびレポーター基、例えば蛍光化合物またはＮＭＲもしくはＥＳＲ分光法によって検出され得る化合物が含まれる。
【０１１９】
エフェクター分子の例は、細胞に有害（例えば死滅）な任意の薬剤を含む細胞毒素または細胞毒性薬を含み得る。例としては、コンブレスタチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステルリン、タキソール、シトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシンを含みますジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンならびにそれらの類似体または同族体が挙げられる。
【０１２０】
エフェクター分子としてはまた、限定されないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６-メルカプトプリン、６-チオグアニン、シタラビン、５-フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵＳ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン）（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシンまたはデュオカルマイシン）、および抗有糸分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
【０１２１】
他のエフェクター分子としては、１１１Ｉｎおよび９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２およびタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化放射性核種；または、限定されないが、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイドおよびスラミンなどの薬剤が挙げられる。
【０１２２】
他のエフェクター分子にはタンパク質、ペプチドおよび酵素が含まれる。対象となる酵素は、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼを含むが、これらに限定されない。対象のタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドとしては、限定されないが、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、若しくはジフテリア毒素などの毒素、インスリン、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子若しくは組織プラスミノーゲンアクチベーターなどのタンパク質、血栓症薬剤または血管新生阻害剤、例えばアンギオスタチン若しくはエンドスタチン、または生物学的応答調節剤、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ-２）、インターロイキン-６（ＩＬ-６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ-ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）または他の成長因子および免疫グロブリンが挙げられる。
【０１２３】
他のエフェクター分子は、例えば診断において有用な検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子放出断層撮影法に使用するため）、および非放射性常磁性金属イオンが含まれる。診断薬として使用するために抗体に結合することができる金属イオンについては、一般に米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適切な補欠分子族はストレプトアビジン、アビジンおよびビオチンを含む。適切な蛍光物質は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジアミンアミンフルオレセイン、塩化ダンシルおよびフィコエリスリンを含む。適切な発光材料はルミノールを含む。適切な生物発光材料には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが含まれる。適切な放射性核種としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎおよび９９Ｔｃが挙げられる。
【０１２４】
別の例では、エフェクター分子は、インビボでの抗体の半減期を増加させる、および／または抗体の免疫原性を低下させる、および／または上皮バリアを越えて免疫系への抗体の送達を増強することができる。このタイプの適切なエフェクター分子の例には、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質、またはＷＯ０５／１１７９８４に記載されているものなどのアルブミン結合化合物が含まれる。
【０１２５】
エフェクター分子がポリマーである場合、それは一般に合成または天然のポリマー、例えば任意に置換された直鎖もしくは分岐鎖のポリアルキレン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマーまたは分岐もしくは非分岐の多糖類、例えばホモもしくはヘテロ多糖類であり得る。
【０１２６】
上述の合成ポリマー上に存在してもよい特定の任意の置換基は、１つ以上のヒドロキシ、メチルまたはメトキシ基を含む。
【０１２７】
合成ポリマーの特定の例には、任意に置換されている直鎖または分枝鎖ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）またはそれらの誘導体、特に任意に置換されているポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体が挙げられる。
【０１２８】
特定の天然に存在するポリマーは、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲンまたはそれらの誘導体を含む。
【０１２９】
本明細書で使用される「誘導体」は、反応性誘導体、例えばマレイミドなどのチオール選択的反応基を含むことを意図している。反応性基は、直接またはリンカーセグメントを介してポリマーに結合していてもよい。そのような基の残基は、ある場合には抗体フラグメントとポリマーとの間の連結基として生成物の一部を形成するであろうことが理解されるであろう。
【０１３０】
ポリマーの大きさは所望に応じて変えることができるが、一般に５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、好ましくは５０００〜４００００Ｄａ、より好ましくは２００００〜４００００Ｄａの範囲の平均分子量であろう。ポリマーサイズは、特に製品の意図される用途、例えば腫瘍のような特定の組織に局在する能力または循環半減期を延長する能力に基づいて選択され得る（総説についてはＣｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１−５４５を参照）したがって、例えば、生成物が、例えば腫瘍の治療における使用のために、循環を離れて組織を貫通することを意図される場合、例えば、約５０００Ｄａの分子量を有する小分子量ポリマーを使用することが有利であり得る。生成物が循環中に留まる用途のためには、例えば２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲の分子量を有する、より高分子量のポリマーを使用することが有利であり得る。
【０１３１】
特に好ましいポリマーとしては、ポリ（エチレングリコール）、または特にメトキシポリ（エチレングリコール）またはその誘導体などの、特に約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリアルキレンポリマーが挙げられる。
【０１３２】
一例では、本発明で使用される抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合している。１つの特定の例において、抗体は抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片中に位置する任意の利用可能なアミノ酸側鎖または末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシルまたはカルボキシル基を通して結合し得る。そのようなアミノ酸は、抗体断片中に天然に存在してもよく、または組換えＤＮＡ法を用いて断片中に操作されてもよい（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ５，６６７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１参照）。一例では、本発明の抗体分子は修飾Ｆａｂフラグメントであり、ここで修飾はエフェクター分子の付着を可能にするためのその重鎖のＣ末端への１以上のアミノ酸の付加である。好ましくは、追加のアミノ酸は、エフェクター分子が結合し得る１つ以上のシステイン残基を含有する修飾ヒンジ領域を形成する。複数の部位を用いて２つ以上のＰＥＧ分子を結合することができる。
【０１３３】
好ましくは、ＰＥＧ分子は、抗体断片に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合している。修飾抗体断片に結合した各ポリマー分子は、断片中に位置するシステイン残基の硫黄原子に共有結合することができる。共有結合は、一般に、ジスルフィド結合、または特に硫黄−炭素結合であろう。チオール基が結合点として使用される場合、適切に活性化されたエフェクター分子、例えば、マレイミドなどのチオール選択的誘導体およびシステイン誘導体が使用され得る。活性化ポリマーは、上記のようにポリマー修飾抗体フラグメントの調製における出発材料として使用され得る。活性化ポリマーは、α-ハロカルボン酸またはエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホンまたはジスルフィドのようなチオール反応性基を含有する任意のポリマーであり得る。そのような出発物質は、市販されているか（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、アラバマ州ハンツビル、米国）、または市販の出発物質から従来の化学手順を使用して調製することができる。特定のＰＥＧ分子には、２０Ｋメトキシ-ＰＥＧ-アミン（Ｎｅｋｔａｒから入手可能、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒ；およびＳｕｎＢｉｏ）およびＭ-ＰＥＧ-ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒから入手可能、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒ）が含まれる。
【０１３４】
一実施形態では、抗体は、ＰＥＧ化されている修飾Ｆａｂフラグメントであり、すなわち、例えばＥＰ０９４８５４４に開示されている方法にしたがって抗体に共有結合させたＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有している［「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，１９９２，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（ｅｄ），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，１９９７，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  ｓ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（ｅｄｓ），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣおよび「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｗｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，１９９８，Ｍ．Ａｓｌａｍ  ａｎｄ  Ａ．Ｄｅｎｔ，Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．２００２，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００２，５４：５３１−５４５も参照］。一例では、ＰＥＧはヒンジ領域のシステインに結合している。一例では、ＰＥＧ修飾Ｆａｂフラグメントは、修飾ヒンジ領域の単一のチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リジン残基はマレイミド基に共有結合されてもよく、リジン残基上の各アミン基には約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合されてもよい。したがって、Ｆａｂフラグメントに結合したＰＥＧの総分子量は約４０，０００Ｄａであり得る。
【０１３５】
一実施形態では、本発明の中和抗体分子は、その重鎖のＣ末端にエフェクター分子が結合している少なくとも１つのシステイン残基を含有する修飾ヒンジ領域を有する修飾Ｆａｂフラグメントである。  好ましくは、エフェクター分子はＰＥＧであり、（ＷＯ９８／２５９７１およびＷＯ２００４０７２１１６）に記載されている方法を用いて結合され、それによってリシル−マレイミド基が重鎖のＣ末端でシステイン残基に結合し、リシル残基の各アミノ基はそれに共有結合して約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基を有する。それ故、抗体に結合したＰＥＧの総分子量は約４０，０００Ｄａである。
【０１３６】
別の例において、エフェクター分子は、国際特許出願ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０およびＷＯ２００５／００３１７１に記載されている方法を用いて抗体フラグメントに結合させることができる。
【０１３７】
本発明はまた、本発明の抗体分子の重鎖および／または軽鎖をコードする単離されたＤＮＡ配列を提供する。好ましくは、ＤＮＡ配列は本発明の抗体分子の重鎖または軽鎖をコードする。本発明のＤＮＡ配列は、例えば化学処理によって生成された合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０１３８】
本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列は、当業者に周知の方法によって得ることができる。例えば、抗体重鎖および軽鎖の一部または全部をコードするＤＮＡ配列は、決定されたＤＮＡ配列から、または対応するアミノ酸配列に基づいて、必要に応じて合成され得る。
【０１３９】
受容体フレームワーク配列をコードするＤＮＡは当業者に広く利用可能であり、それらの既知のアミノ酸配列に基づいて容易に合成することができる。
【０１４０】
分子生物学の標準的な技術を用いて本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を調製することができる。所望のＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を用いて完全にまたは部分的に合成することができる。部位特異的突然変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を適宜使用することができる。
【０１４１】
本発明はまた、本発明の１つ以上のＤＮＡ配列を含むクローニングまたは発現ベクターに関する。したがって、本発明の抗体をコードする１つ以上のＤＮＡ配列を含むクローニングまたは発現ベクターが提供される。好ましくは、クローニングまたは発現ベクターは、それぞれ本発明の抗体分子の軽鎖および重鎖をコードする２つのＤＮＡ配列を含む。
【０１４２】
ベクターを構築することができる一般的な方法、トランスフェクション方法および培養方法は当業者に周知である。この点に関して、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ），Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよびｔｈｅ  Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇが参照される。
【０１４３】
本発明の抗体をコードする１つ以上のＤＮＡ配列を含む１つ以上のクローニングまたは発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現には、任意の適切な宿主細胞／ベクター系を使用することができる。細菌、例えば大腸菌  他の微生物系を使用してもよく、または真核生物、例えば哺乳動物の宿主細胞発現系を使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、骨髄腫またはハイブリドーマ細胞が含まれる。
【０１４４】
本発明はまた、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからタンパク質を発現させるのに適した条件下で本発明のベクターを含む宿主細胞を培養することを含む、本発明による抗体分子の製造方法を提供する。そして、抗体分子を単離する。
【０１４５】
抗体分子は、重鎖または軽鎖ポリペプチドのみを含み得、その場合、重鎖または軽鎖ポリペプチドコード配列のみが宿主細胞をトランスフェクトするために使用される必要がある。重鎖および軽鎖の両方を含む生成物を産生するために、細胞株は、２つのベクター、軽鎖ポリペプチドをコードする第一のベクターおよび重鎖ポリペプチドをコードする第二のベクターでトランスフェクトされ得る。あるいは、単一のベクターを使用してもよく、そのベクターは軽鎖および重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。
【０１４６】
本発明の抗体は病的状態の治療および／または予防に有用であるので、本発明はまた、１種以上の薬剤的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体と組み合わせて本発明の抗体分子を含む医薬または診断用組成物を提供する。したがって、医薬品の製造のための本発明による抗体の使用が提供される。組成物は、通常、薬剤的に許容できる担体を通常含むであろう無菌の薬学的組成物の一部として供給されるであろう。本発明の医薬組成物は、薬剤的に許容できるアジュバントをさらに含み得る。
【０１４７】
本発明はまた、本発明の抗体分子を１種以上の薬剤的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体と一緒に添加および混合することを含む、医薬組成物または診断組成物の調製方法を提供する。
【０１４８】
抗体分子は、医薬組成物又は診断用組成物中の唯一の活性成分であってもよく、または、例えば、他の抗体成分を含む他の活性成分、抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１β、抗Ｔ細胞、抗γＩＦＮ又は伴うことができます抗ＬＰＳ抗体、またはキサンチンなどの非抗体成分。
【０１４９】
医薬組成物は、好ましくは治療上有効量の本発明の抗体を含む。本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、標的とする疾患または状態を治療、改善または予防するために、あるいは検出可能な治療または予防効果を発揮するために必要な治療薬の量を指す。いずれの抗体についても、治療有効量は、細胞培養アッセイまたは動物モデル、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタまたは霊長類のいずれかにおいて最初に推定することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するためにも使用され得る。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定することができる。
【０１５０】
ヒト対象についての正確な治療有効量は、病状の重篤度、対象の一般的な健康状態、対象の年齢、体重および性別、食事、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性と治療に対する耐性／反応に依存するであろう。この量は日常的な実験によって決定することができ、そして臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであろう。医薬組成物は、投与量あたり所定量の本発明の活性剤を含有する単位剤形で都合よく提示され得る。
【０１５１】
組成物は、患者に個別に投与され得るか、または他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、連続的にまたは別々に）投与され得る。
【０１５２】
本発明の抗体分子が投与される用量は、治療されるべき状態の性質、存在する炎症の程度、および抗体分子が予防的に使用されているかまたは既存の状態を治療するために使用されているかに依存する。
【０１５３】
投与頻度は、抗体分子の半減期およびその効果の持続期間に依存するであろう。抗体分子が短い半減期（例えば、２〜１０時間）を有する場合、１日に１回以上の用量を与えることが必要であり得る。あるいは、抗体分子が長い半減期（例えば、２〜１５日）を有する場合、１日に１回、１週間に１回、または１〜２ヶ月に１回しか投与が必要でない場合も得る。
【０１５４】
薬剤的に許容できる担体はそれ自体、組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘導するべきではなく、そして毒性であるべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子のような大きくゆっくり代謝される高分子であり得る。
【０１５５】
薬剤的に許容できる塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩などの鉱酸塩、あるいは酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩などの有機酸の塩を使用することができる。
【０１５６】
治療用組成物中の薬剤的に許容できる担体は、水、食塩水、グリセロールおよびエタノールなどの液体をさらに含み得る。さらに、湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝物質などの補助物質がそのような組成物中に存在してもよい。このような担体は、患者による摂取のために、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤および懸濁剤として処方することを可能にする。
【０１５７】
投与のための好ましい形態としては、例えば注射または注入による、例えばボーラス注射または持続注入による非経口投与に適した形態が挙げられる。製品が注射または注入のためのものである場合、それは油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態をとり得、そして懸濁剤、保存剤、安定化剤および／または分散剤のような処方剤を含み得る。あるいは、抗体分子は、使用前に適切な滅菌液体、例えば注射用水、食塩水、グルコースなどで再構成するために乾燥形態であり得る。
【０１５８】
製剤化されたら、本発明の組成物を対象に直接投与することができる。処置されるべき対象は動物であり得る。しかしながら、組成物はヒト対象への投与に適していることが好ましい。したがって、一実施形態では、患者はヒトである。
【０１５９】
本発明の医薬組成物は、限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄腔内、脳室内、経皮、経皮性（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、膣内または直腸経路を含むさまざまな経路で投与することができる。皮下噴射器も本発明の医薬組成物を投与するために使用することができる。典型的には、治療用組成物は注射剤として、液剤または懸濁剤として調製することができる。注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁させるのに適した固体形態も調製することができる。
【０１６０】
組成物の直接送達は、一般に、注射、皮下、腹腔内、静脈内または筋肉内で達成されるか、または組織の間質腔に送達される。組成物は病巣に投与することもできる。投薬治療は、単回投与計画または複数回投与計画であり得る。
【０１６１】
組成物中の活性成分は抗体分子であることは理解されるであろう。そのため、、活性成分は胃腸管における分解を受けやすいであろう。したがって、組成物が胃腸管を使用する経路によって投与される場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、抗体が胃腸管から吸収されると抗体を放出する薬剤を含有する必要があるだろう。
【０１６２】
薬剤的に許容できる担体の徹底的な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．１９９１）を利用できる。
【０１６３】
本発明の抗体は遺伝子治療の使用により投与されるであろうこともまた想定される。これを達成するために、適切なＤＮＡ成分の制御下で抗体分子の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列を、抗体鎖がＤＮＡ配列から発現され、その場で組み立てられるように患者に導入される。
【０１６４】
本発明はまた、炎症性疾患の制御に使用するための抗体またはその結合断片を提供する。好ましくは、抗体分子を用いて炎症過程を軽減するかまたは炎症過程を予防することができる。
【０１６５】
炎症過程には不適当な炎症と関連するあらゆる症状が関係する慢性炎症状態が含まれる。そのような症状としては、限定されないが、関節リウマチ（ＲＡ）、自己免疫状態、炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎を含む）、非治癒性創傷、多発性硬化症、癌、アテローム性動脈硬化症、シェーグレン病、糖尿病、ループスエリテマトーデス（全身性エリテマトーデスを含む）、喘息、線維性疾患（肝硬変を含む）、肺線維症、紫外線障害、乾癬、強直性脊椎炎、心血管疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病を挙げることができる。
【０１６６】
本明細書の文脈において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と解釈されるべきである。
【０１６７】
特定の特徴／要素を含む本発明の実施形態は、関連する要素／特徴「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」代替の実施形態にも及ぶことも意図する。
【０１６８】
技術的に適切な場合には、本発明の実施形態を組み合わせることができる。特許及び出願などの技術的参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
本明細書に具体的かつ明示的に列挙された任意の実施形態は、単独で、又は１つもしくは複数のさらなる実施形態と組み合わせて、「除くクレーム」に基づいて形成し得る。
【０１７０】
本発明は、例示のためだけにある以下の例においてさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】図１は、１：１の最適化されたモル比でのＦａｂ‘−テネイシン複合体の形成を示すクロマトグラフである。
【図２】図２Ａは、Ｆａｂ’−テネイシン複合体の形成の成功を示すクロマトグラフである。図２ＢおよびＣは、Ｆａｂ‘−テネイシン複合体が正しいサイズであることを確認するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示すウエスタンブロットの写真である。
【図３】図３は、Ｆａｂ’-テネイシン複合体の結晶のＡ）白色光下での撮影Ｂ）ＵＶ光下での撮影を示す。
【図４】図４は、最終的に最適化されたプロセス条件を用いて製造されたＦａｂ’−テネイシン複合体の単一のよく回折する結晶の画像である。
【図５】図５は、Ｆａｂ’−テネイシン複合体のコンピューターモデルの画像である。
【図６−１】図６は、Ｆａｂ’−テネイシン複合体およびテネイシンＣ複合体上の対象の残基を示す画像である。Ａ）対象の全残基を示す概要。Ｂ）残基２０９６〜２１０２。Ｃ）残基２１３０〜２１３５。Ｄ）残基２１７０〜２１９３。
【図６−２】同上。
【図７−１】図７は、Ｆａｂ’−テネイシン複合体のコンピューターモデルを示す。Ａ）複合体の表面表示Ｂ）テネイシンＣ）上の対象の残基およびＤ）Ｆａｂ’とテネイシンＣとの間の相互作用点の拡大
【図７−２】同上。
【図８】図８は、Ｆａｂ’−テネイシン複合体のコンピューターモデルを示す。Ｆａｂ’上の目的の残基（テネイシン構築物の４Å以内）が示されている。
【図１０】
【０１７２】
配列
配列番号１  テネイシンＣのアミノ酸配列ユニプロットＩＤ番号：Ｐ２４８２１
配列番号２  Ｃ３抗体のＦａｂ’の重鎖アミノ酸配列
配列番号３  Ｃ３抗体のＦａｂ’の軽鎖アミノ酸配列
配列番号４  配列番号２のＦａｂ’ＶＨ  ＣＤＲ１アミノ酸配列（この配列も抗体Ｂ１２のＣＤＲ  Ｈ１である）
配列番号５  配列番号２のＦａｂ’ＶＨ  ＣＤＲ２アミノ酸配列（この配列も抗体Ｂ１２のＣＤＲ  Ｈ２である）
配列番号６  配列番号２のＦａｂ’ＶＨ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号７  配列番号３のＦａｂ’ＶＬ  ＣＤＲ１アミノ酸配列（この配列も抗体２Ａ５、抗体Ｂ１２、抗体Ｄ８のＣＤＲ  Ｌ１である）
配列番号８  配列番号３のＦａｂ’ＶＬ  ＣＤＲ２アミノ酸配列（この配列も抗体Ｂ１２および抗体Ｄ８のＣＤＲ  Ｌ２である）
配列番号９  配列番号３のＦａｂ’ＶＬ  ＣＤＲ３アミノ酸配列
配列番号１０  テネイシンＣ構築物のアミノ酸配列（本明細書ではＴＮＣフラグメントとも称す）
配列番号１１  は、抗体２Ａ５からのＣＤＲ  Ｈ１である。
配列番号１２  は、抗体２Ａ５からのＣＤＲ  Ｈ２である。
配列番号１３  は、抗体２Ａ５からのＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番号１４  は、抗体２Ａ５のＶＨドメインである。
配列番号１５  は、抗体Ａ４のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番号１６  は、抗体２Ａ５からのＣＤＲ  Ｌ２である。
配列番号１７  は、抗体２Ａ５からＣＤＲ  Ｌ３である。
配列番号１８  は、抗体２Ａ５のＶＬドメインである。
配列番号１９  は、抗体２Ａ５のための代替ＶＬドメインである。
配列番号２０  は、抗体Ａ４のＶＨドメインである。
配列番号２１  は、抗体Ｂ３のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番号２２  は、抗体Ｂ１２のＣＤＲ  Ｌ３である。
配列番号２３  は、抗体Ｂ１２のＶＨドメインである。
配列番号２４  は、抗体Ｂ３のＶＨドメインである。
配列番号２５  は、抗体Ｂ１２のＶＬドメインである。
配列番号２６  は、抗体Ｂ１２の代替ＶＬドメインである。
配列番号２７  は、抗体Ｄ８のＣＤＲ  Ｈ１である。
配列番号２８  は、抗体Ｄ８のＣＤＲ  Ｈ２である。
配列番号２９  は、抗体Ｄ８のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番号３０  は、抗体Ｄ８のＶＨドメインである。
配列番号３１  は、抗体Ｄ８のためのＣＤＲ  Ｌ３である。
配列番号３２  は、抗体Ｄ８のためのＶＬドメインである。
配列番号３３  は、抗体Ｄ８のための代替ＶＬドメインである。
配列番号３４  は、抗体Ｆ３のためのＣＤＲ  Ｈ１である。
配列番号３５  は、抗体Ｆ３のためのＣＤＲ  Ｈ２である。
配列番号３６  は、抗体Ｆ３のためのＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番号３７  は、抗体Ｆ３のためのＶＨドメインである。
配列番号３８  は、抗体Ｆ３のＣＤＲ  Ｌ１である。
配列番号３９  は、抗体Ｆ３のＣＤＲ  Ｌ２である。
配列番号４０  は、抗体Ｆ３のＣＤＲ  Ｌ３である。
配列番号４１  は、抗体Ｆ３のＶＬドメインである。
配列番号４２  は、抗体Ｆ３の代替ＶＬドメインである。
配列番号４３  は、抗体Ｂ１のためのＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番号４４  は、抗体Ｂ１のＶＨドメインである。
配列番号４５  は、抗体Ｅ１のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番号４６  は、抗体Ｂ６のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番号４７  は、抗体Ｂ６のＶＨドメインである。
配列番号４８  は、抗体Ｅ１のＶＨドメインである。
配列番４９  は、抗体Ｄ１のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番５０  は、抗体Ｄ１のＶＨドメインである。
配列番５１  は、抗体Ｆ５のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番５２  は、抗体Ｃ３のＶＨドメインである。
配列番５３  は、抗体Ｄ４のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番５４  は、抗体Ｄ４のＶＨドメインである。
配列番５５  は、抗体Ｆ５のＶＨドメインである。
配列番５６  は、抗体Ｅ３のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番５７  は、抗体Ｅ３のＶＨドメインである。
配列番５８  は、抗体Ｄ６のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番５９  は、抗体Ｄ６のＶＨドメインである。
配列番６０  は、抗体Ｈ４のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番６１  は、抗体Ｈ４のＶＨドメインである。
配列番６２  は、抗体Ａ４のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番６３  は、抗体Ａ４のＶＨドメインである。
配列番６４  は、抗体Ｆ１のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番６５  は、抗体Ｆ１のＶＨドメインである。
配列番６６  は、抗体Ｇ２のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番６７  は、抗体Ｇ２のＶＨドメインである。
配列番６８  は、抗体Ｆ６のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番号６９  は、Ｆ６のＶＨドメインである。
配列番号７０  は、抗体Ａ１２のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番号７１  は、抗体Ａ１２のＶＨドメインである。
配列番号７２  は、抗体Ｃ０９のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番号７３  は、抗体Ｃ０９のＶＨドメインである。
配列番号７４  は、抗体Ｈ１０のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番号７５  は、抗体Ｈ１０のＶＨドメインである。
配列番号７６  は、抗体Ｃ１１のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番号７７  は、抗体Ｃ１１のＶＨドメインである。
配列番号７８  は、抗体Ｄ３のＣＤＲ  Ｈ３である。
配列番号７９  は、抗体Ｄ３のＶＨドメインである。
配列番号８０  は、抗体Ｃ６のＣＤＲ  Ｌ３である。
配列番号８１  は、抗体Ｃ６のＶＬドメインである。
配列番号８２  は、抗体Ｃ６の代替ＶＬドメインである。
配列番号８３  は、抗体Ｈ５のＣＤＲ  ｌ３である。
配列番号８４  は、Ｈ５抗体のＶＬドメインである。
配列番号８５  は、抗体Ｈ５の代替ＶＬドメインである。
配列番号８６  は、抗体Ｆ３のＣＤＲ  Ｌ３である。
配列番号８７  は、抗体Ｆ３のＶＬドメインである。
配列番号８８  は、抗体Ｆ３の代替ＶＬドメインである。
配列番号８９  は、抗体Ｃ１のＣＤＲ  Ｌ３である。
配列番号９０  は、抗体Ｃ１のＶＬドメインである。
配列番号９１  は、抗体Ｃ１の代替ＶＬドメインである。
配列番号９２  は、抗体Ｃ２のＣＤＲ  ｌ３である。
配列番号９３  は、抗体Ｃ２のＶＬドメインである。
配列番号９４  は、抗体Ｃ２の代替ＶＬドメインである。
配列番号９５  は、抗体Ｆ４のＣＤＲ  Ｌ３である。
配列番号９６  は、抗体Ｆ４のＶＬドメインである。
配列番号９７  は、抗体Ｆ４の代替ＶＬドメインである。
配列番号９８  は、抗体Ｃ３のＣＤＲ  ｌ３である。
配列番号９９  は、抗体Ｃ３のＶＬドメインである。
配列番号１００  は、抗体Ｃ３の代替ＶＬドメインである。
配列番号１０１  は、抗体Ｅ１１のＣＤＲ  ｌ３である。
配列番号１０２  は、抗体Ｅ１１の代替ＣＤＲ  ｌ３である。
配列番号１０３  は、抗体Ｅ１１のＶＬドメインである。
配列番号１０４  は、抗体Ｅ１１の代替ＶＬドメインである。
配列番号１０５  は、抗体Ａ１２の代替ＣＤＲ  Ｌ３である。
配列番号１０６  は、抗体Ａ１２のＶＬドメインである。
配列番号１０７  は、抗体Ａ１２の代替ＶＬドメインである。
配列番号１０８  は、抗体Ｄ１１の代替ＣＤＲ  Ｌ３である。
配列番号１０９  は、抗体Ｄ１１のＶＬドメインである。
配列番号１１０  は、抗体Ｄ１１の代替ｖｌドメインである。
配列番号１１１  は、Ａｎｇａｌ  １９９３に記載されているヒンジ改変を有する抗体Ｃ３のＩｇＧ４のフォーマットである。
配列番号１１２  ヒトテネイシンＣ  ＦＢＧドメイン。
配列番号１１３  マウステネイシンＣ  ＦＢＧドメイン。
配列番号１１４  ラットテネイシンＣ  ＦＢＧドメイン。
配列番号１１５  イヌテネイシンＣ  ＦＢＧドメイン。
配列番号１１６  ヒトテネイシンＲ  ＦＢＧドメイン。
配列番号１１７  生殖系列化ＶＨフレームワークのアミノ酸配列（抗体２Ａ５）。
配列番号１１８  生殖系列ＶＬフレームワークのアミノ酸配列（抗体２Ａ５）。
配列番号１１９  生殖系列化ＶＬフレームワークのアミノ酸配列（抗体２Ａ５）。
配列番号１２０  抗体２Ａ５および２Ａ５の系列のための代替ＣＤＲ  Ｌ２。
配列番号１２１  生殖系列化ＶＨフレームワークの配列（抗体Ｂ１２）。
配列番号１２２  抗体Ｂ１２およびＢ１２の系列のための代替のＣＤＲ  Ｈ２。
配列番号１２３  生殖系列化ＶＬフレームワークのアミノ酸配列（抗体Ｂ１２）。
配列番号１２４  生殖系列化ＶＬフレームワークのアミノ酸配列（抗体Ｂ１２）。
配列番号１２５  抗体Ｂ１２、Ｄ８およびＢ１２系列のための代替ＣＤＲ  ｌ２。
配列番号１２６  生殖系列化ＶＨフレームワークのアミノ酸配列（抗体Ｄ８）。
配列番号１２７  生殖系列化ＶＬフレームワークのアミノ酸配列（抗体Ｄ８）。
配列番号１２８  生殖系列化ＶＬフレームワークのアミノ酸配列（抗体Ｄ８）。
配列番号１２９  生殖系列化ＶＨフレームワークのアミノ酸配列（抗体Ｆ３）。
配列番号１３０  生殖系列化ＶＬフレームワークのアミノ酸配列（抗体Ｆ３）。
配列番号１３１  生殖系列化ＶＬフレームワークのアミノ酸配列（抗体Ｆ３）。
配列番号１３２〜１３４  テネイシンＣの断片
配列番号１３５〜１４８  プライマー配列
【０１７３】
最も近縁の生殖細胞系列をＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎを用いて決定した：
Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ  Ｆ．，Ｋａａｓ  Ｑ．ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ．Ｐ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３８，Ｄ３０１−３０７（２０１０）。
【０１７４】
抗体Ｄ８：  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号２７、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号２８、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号２９、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号３１、ＶＨは配列番号３０、およびＶＬは配列番号３２または３３である。
抗体Ｆ３′：  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号３４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号３５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号３６、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号３８、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号３９、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号４０、ＶＨは配列番号３７およびＶＬは配列番号４１または４２である。
【０１７５】
Ｂ１２抗体系列
抗体Ｂ１２  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号２２、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号２４、ＶＨは配列番号２３およびＶＬは配列番号２５または２６である。
抗体Ｂ１  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号４３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９、ＶＨは配列番号４４およびＶＬは配列番号２５または２６である。
抗体Ｂ６  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号４６、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９、ＶＨは配列番号４７およびＶＬは配列番号２５または２６である。
抗体Ｄ１  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号４９、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９、ＶＨは配列番号５０およびＶＬは配列番号２５または２６である。
抗体Ｃ３  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号６、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９、ＶＨは配列番号５２およびＶＬは配列番号２５または２６である。
抗体Ｄ４  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号５３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９、ＶＨは配列番号５４およびＶＬは配列番号２５または２６である。
抗体Ａ４  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１５、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９、ＶＨは配列番号２０およびＶＬは配列番号２５または２６である。
抗体Ｂ３  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号２１、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９、ＶＨは配列番号２４およびＶＬは配列番号２５または２６である。
抗体Ｅ１  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号４５、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９、ＶＨは配列番号２４およびＶＬは配列番号２５または２６である。
抗体Ｆ５  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号４、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号５、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号５１、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号８、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９、ＶＨは配列番号５５およびＶＬは配列番号２５または２６である。
【０１７６】
２Ａ５抗体系列
抗体２Ａ５  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７、ＶＨは配列番号１４およびＶＬは配列番号１８または１９である。
抗体Ｅ３  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号５６、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７、ＶＨは配列番号５７およびＶＬは配列番号１８または１９である。
抗体Ｄ６  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号５８、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７、ＶＨは配列番号５９及びＶＬは配列番号１８または１９である。
抗体Ｈ４  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号６０、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７、ＶＨは配列番号６１およびＶＬは配列番号１８または１９である。
抗体Ａ４  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号６２、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７、ＶＨは配列番号６３およびＶＬは配列番号１８または１９である。
抗体Ｆ１  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号６４、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７、ＶＨは配列番号６５およびＶＬは配列番号１８または１９である。
抗体Ｇ２  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号６６、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７、ＶＨは配列番号６７およびＶＬは配列番号１８または１９である。
抗体Ｆ６  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号６８、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７、ＶＨは配列番号６９、ＶＬは配列番号１８または１９である。
抗体Ａ１２  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号７０、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７、ＶＨは配列番号７１およびＶＬは配列番号１８または１９である。
抗体Ｃ０９  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号７２、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７、ＶＨは配列番号７３およびＶＬは配列番号１８または１９である。
抗体Ｈ１０  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号７４、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７、ＶＨは配列番号７５およびＶＬは配列番号１８または１９である。
抗体Ｃ１１  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号７６、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７、ＶＨは配列番号７７およびＶＬは配列番号１８または１９である。
抗体Ｄ３  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号７８、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１７、ＶＨは配列番号７９およびＶＬは配列番号１８または１９である。
抗体Ｃ６  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号８０、ＶＨは配列番号１４およびＶＬは配列番号８１または８２である。
抗体Ｈ５  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号８３、ＶＨは配列番号１４およびＶＬは配列番号８４または８５である。
抗体Ｆ３  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号８６、ＶＨは配列番号１４およびＶＬは配列番号８７または８８である。
抗体Ｃ１  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号８９、ＶＨは配列番号１４およびＶＬは配列番号９０または９１である。
抗体Ｃ２  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７であり、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６であり、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９２、ＶＨは配列番号１４およびＶＬは配列番号９３または９４である。
抗体Ｆ４  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９５、ＶＨは配列番号１４およびＶＬは配列番号９６または９７である。
抗体Ｃ３  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号９８、ＶＨは配列番号１４およびＶＬは配列番号９９または１００である。
抗体Ｅ１１  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７であり、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６であり、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１０１または１０２、ＶＨは配列番号１４およびＶＬは配列番号１０３または１０４である。
抗体Ａ１２  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１０５、ＶＨは配列番号１４およびＶＬは配列番号１０６または１０７である。
抗体Ｄ１１  ＣＤＲ  Ｈ１は配列番号１１、ＣＤＲ  Ｈ２は配列番号１２、ＣＤＲ  Ｈ３は配列番号１３、ＣＤＲ  Ｌ１は配列番号７、ＣＤＲ  Ｌ２は配列番号１６、ＣＤＲ  Ｌ３は配列番号１０８、ＶＨは配列番号１４およびＶＬは配列番号１０９または１１０である。
【実施例】
【０１７７】
実施例１  抗原としての精製テネイシンＣ  ＦＢＧの生成およびアッセイ試薬
テネイシンＣのＦＢＧドメイン（ＴＮＣ  ＦＢＧ）を含む精製可溶性タンパク質を、抗体選択における抗原、その後のスクリーニングおよび特徴付けアッセイにおける試薬として使用するために生成した。複数の哺乳動物種のテネイシンＣに結合する抗体を単離するための選択戦略を可能にするために、ヒト、マウス、ラットまたはイヌのいずれかのＴＮＣ  ＦＢＧドメインを組み込んだ一連のＤＮＡ発現構築物を合成した。このホモログへの望ましくない結合を示した抗体を同定するために、ヒトテネイシンＲ  ＦＢＧ構築物も調製した。構築物は、以下に記載するようにＣ末端またはＮ末端のいずれかのＦＢＧドメインに結合したラットＣＤ４またはヒトＩｇＧ１  Ｆｃタグのいずれかを有する６Ｈｉｓタグ化タンパク質として作製した。
【０１７８】
タンパク質発現構築物
抗原発現のための全ての合成ＤＮＡ構築物を合成し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＵＳＡ）により配列を確認した。ＦＢＧドメインを、発現ドメインがラットＣｄ４（ドメイン３および４）タグ（Ｃｈａｐｐｌｅら、２００６）またはヒトＩｇＧ１  Ｆｃタグ（Ｆａｌｋら、２０１２）のいずれかと融合するそれぞれの哺乳動物発現ベクターｐＢＩＯＣＡＭ４またはＢＩＯＣＡＭ５にクローニングした。ベクターは、発現タンパク質の分泌のために、マウスＶＨ鎖に由来する小胞体（ＥＲ）シグナル配列を含むｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ＥＲプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（Ｆａｌｋら、２０１２）から改変した。Ｎ末端ＦＢＧに生じた全構築物（例えば、ＦＢＧ-Ｆｃ-ＨｉｓまたはＦＢＧ-ｒＣｄ４-Ｈｉｓ）について、消化したＰＣＲ産物をＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ切断ｐＢＩＯＣＡＭ４またはｐＢＩＯＣＡＭ５ベクターと連結した。Ｃ末端ＦＢＧに生じた全構築物（例えば、Ｆｃ-Ｈｉｓ-ＦＢＧまたはｒＣｄ４-Ｈｉｓ-ＦＢＧ）について、消化したＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＢＩＯＣＡＭ４またはｐＢＩＯＣＡＭ５ベクターと連結した。ＦＢＧドメインを増幅するために使用したプライマーを図１０に列挙する。全ての構築物を配列確認した。ＥＬＩＳＡスクリーニングを容易にするために、ＦＢＧ−Ｘ（Ｎ−末端  ＦＢＧ）融合をもつ発現プラスミドのためにＨＩＳタグをコードするインサート（プライマー２５７４および２５７５）をＢａｍＨＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間にクローン化した。完全長テネイシンＣをＢｓｔＸＩおよびＢａｍＨＩによる消化によってＧｅｎｓｃｒｉｐｔ  ｐＵＣ５７プラスミドから直接クローン化し、ＢｓｔＸＩ／ＢａｍＨＩ切断発現ベクターｐＦＢＧ−Ｆｃ−Ｈｉｓ６にクローン化した。Ｈｉｓ−ＦＢＧ構築物を作製するために、プライマーを設計し、ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ発現プラスミドからＰＣＲを行い、Ｈｉｓ−ＦＢＧをコードするＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＢＩＯＣＡＭ５にクローン化した。
【０１７９】
タンパク質発現と細胞培養
トランスフェクション品質のプラスミドＤＮＡを、マッハライ・ナーゲル社ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ  Ｘｔｒａ  Ｍｉｄｉキット（７４０４１０．５０、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）を用いて調製した。抗原および抗体発現のためのＨＥＫ２９３Ｆ懸濁細胞およびＦｒｅｅｓｔｙｌｅ培地、ならびにＲＰＭＩ培地はＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）から入手した。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞のトランスフェクションは、以前に記載されたようにして行った（Ｃｈａｐｐｌｅら、２００６）。
【０１８０】
タンパク質精製と品質管理
タンパク質アフィニティー精製は、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースまたは固定化組換えプロテインＡ樹脂のいずれかを用いた。
【０１８１】
Ｈｉｓタグ付加タンパク質の精製のために、培養上清をＮｉ−ＮＴＡアガロース（１０１８２４０、Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｒａｗｌｅｙ、ＵＫ）と１時間混合し、遠心分離（２００ｘｇ、２分）のために樹脂をプロテウス１ステップミディスピンカラム（Ｇｅｎｅｒｏｎ，ＵＫ）に移した。未結合タンパク質を、２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）を補充したリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗い流した。結合したタンパク質を、ＰＢＳ中の３００ｍＭイミダゾール（ｐＨ８）の添加およびカラム遠心分離（２００×ｇ、２分）によって画分に溶出した。溶出したタンパク質を含むプールした画分をＧｅｂａｆｌｅｘ  Ｍｉｄｉ透析チューブ（Ｇｅｎｅｒｏｎ  Ｄ０１０；分子量カットオフ３．５ｋＤａ）に入れ、ＰＢＳに対して透析した。
【０１８２】
Ｆｃタグ化タンパク質およびヒトＩｇＧ４として発現させた抗体をプロテインＡセファロース（ＰＣ-Ａ２５、Ｇｅｎｅｒｏｎ、メイデンヘッド、ＵＫ）を用いて精製した。培養上清を遠心分離（２５００×ｇ、１５分）により清澄化し、４℃で一晩プロテインＡセファロースと混合した後、樹脂をプロテウス１ステップミディスピンカラム（Ｇｅｎｅｒｏｎ、ＵＫ）に移した。カラムを遠心分離し（２００×ｇ、２分）、ＰＢＳで洗浄して未結合タンパク質を除去した。遠心分離（２００ｘｇ、２分）によって、０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．８）を用いてプロテインＡから画分で、Ｆｃタグ化タンパク質またはＩｇＧ４タンパク質をトリス塩酸（ｐＨ８）中に溶出した。溶出画分をプールし、Ｇｅｂａｆｌｅｘ  Ｍａｘｉ透析チューブ（Ｇｅｎｅｒｏｎ  Ｄ０４５；分子量カットオフ８ｋＤａ）中でＰＢＳに対して透析した。
【０１８３】
タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１２％ゲル）および分光光度法（理論吸光係数を用いてＯＤ  ２８０）によって純度および濃度について分析した。精製タンパク質を細胞ベースのアッセイにおいて使用した場合、エンドトキシン含有量は、リムルスアメーバ様細胞溶解物発色性エンドトキシンアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって最初に決定された。エンドトキシンレベルが１ミリグラムあたり１エンドトキシン単位（すなわち１ＥＵ／ｍｇ）を超える場合、タンパク質は使用しなかった。
【０１８４】
実施例２一次抗ＦＢＧ抗体の単離
抗体ファージディスプレイ
テネイシンＣ  ＦＢＧドメインに対する抗体は、４３のヒトリンパ球ドナーから単離されたＤＮＡを用いて構築された、Ｉｏｎｔａｓ  Ｌｔｄ独自のヒト抗体ファージディスプレイライブラリーを用いて単離された。選択、ファージレスキューおよびｐＳＡＮＧ１０へのサブクローニング（Ｍａｒｔｉｎら、２００６）は全て、当技術分野で周知の技術を用いて以前に記載されたように（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄら、２００７）行われた。
【０１８５】
融合パートナーのＮ末端（例えばＦＢＧ-Ｆｃ、ＦＢＧ-ｒＣｄ４）またはＣ末端（Ｆｃ-ＦＢＧ、ｒＣｄ４-ＦＢＧ）のいずれかでヒトＩｇＧ１  ＦｃまたはｒＣｄ４に融合した固定化ＴＮＣ  ＦＢＧに対して２ラウンドのパニング選択を行った。定常軽鎖（ＣＬ）カッパ（κ）またはラムダ（λ）のいずれかを含有するＦａｂ発現ベクターへの後のサブクローニングを容易化するため、カッパ（κ）またはラムダ（λ）可変軽鎖（ＶＬ）のいずれかを含むファージ抗体ライブラリーを別々にパンニングした。
【０１８６】
選択した集団からポリクローナルファージ集団を調製し、ＴＮＣ  ＦＢＧ抗原または適切な融合パートナー（ＦｃまたはｒＣｄ４）で被覆したＥＬＩＳＡプレートを用いたＥＬＩＳＡ（ポリクローナルファージＥＬＩＳＡ）で試験した。ファージと共にインキュベートした後、プレートを洗浄し、そしてペルオキシダーゼ結合抗Ｍ１３抗体を用いて結合ファージを検出した。ラウンド２の出力集団における選択のラウンド１と２の間の抗原特異的結合剤および抗Ｆｃまたは−ｒＣｄ４ファージと比較してより高い割合のＦＢＧ結合剤の濃縮は、選択が成功したことを示す。
【０１８７】
抗原へのｓｃＦｖ結合の確認およびＥＬＩＳＡによる交差反応性アッセイ
ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおける抗原認識を確認するために、ラウンド２選択出力を個々のｓｃＦｖクローンとして表した。出力集団を細菌発現ベクターｐＳＡＮＧ１０（Ｍａｒｔｉｎら、２００６）にサブクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、そして個々の形質転換体を以前に記載されたように９６ウェルプレート中で誘導した（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄら、２００７）。大腸菌上清を収集し、ユーロピウム標識抗ＦＬＡＧ検出抗体を用いて、ＤＥＬＦＩＡベースのＥＬＩＳＡを用いてｓｃＦｖのＴＮＣ  ＦＢＧへの結合についてアッセイした。
【０１８８】
λライブラリーによる最も成功した選択は、抗原ｒＣｄ４−ＦＢＧおよびＦｃ−ＦＢＧに対する選択に基づいた（選択１４７および１４８）。κライブラリーについては、最も成功した選択は抗原ＦＢＧ−ｒＣｄ４（１５０）、ｒＣｄ４−ＦＢＧ（１５２）およびＦｃ−ＦＢＧ（１５３）で得られた。このＥＬＩＳＡスクリーニングからの７９個の陽性クローンをさらなる分析のために選択した。
【０１８９】
交差反応性ＥＬＩＳＡは、６７／７９（８５％）の抗ヒトＦＢＧ  ｓｃＦｖがマウスＴＮＣ  ＦＢＧに対して交差反応性であることを示した。抗ＦＢＧ  ｓｃＦｖのＤＮＡ配列分析は優れた配列多様性を示した。例えば、ＶＬλライブラリーからの選択１４７及び１４８は、９２％の固有の可変重鎖（ＶＨ）の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の配列を含有し、また  ＶＬκライブラリーからの選択１５０、１５２及び１５３は、それぞれ６７％、９１および１００％の固有の可変ＶＨ  ＣＤＲ３配列を含んだ。
【０１９０】
最も有効な選択から単離されたさらなる１４２５クローンをＥＬＩＳＡによってスクリーニングし、これにより、ＦＢＧ結合特異性を有するさらなる４０１  ｓｃＦｖの同定が得られた。。これらのクローンを最初のＥＬＩＳＡで同定された７９  ｓｃＦｖと共にさらなる評価のために選択した。
【０１９１】
１４２５のクローンをさらに特異性ＥＬＩＳＡで試験し、各ｓｃＦｖをヒトテネイシンＲ  ＦＢＧならびにヒト、マウス、ラットおよびイヌＴＮＣ  ＦＢＧへの結合についても試験した。テネイシンＲ  ＦＢＧ結合のシグナルによって分類したテネイシンＣへの結合で得られたＥＬＩＳＡシグナルにしたがってクローンをランク付けした。５０を超える比を有する上位２５０クローンをサブクローニングおよびさらなる分析のために採取した。
【０１９２】
実施例３  機能的アッセイにおける一次抗ＦＢＧ抗体のスクリーニング
抗ＦＢＧ  ｓｃＦｖを、全細胞アッセイ系におけるＦＢＧ誘発シグナル伝達の阻害剤としてのそれらの活性の評価のために、二価ｓｃＦｖ-Ｆｃまたは単量体Ｆａｂとして再フォーマットした。
【０１９３】
各選択１４７、１４８、１５０、１５２および１５３について、一次ＥＬＩＳＡシグナルによってランク付けされた上位５０の抗ＦＢＧ  ｓｃＦｖを、個々の選択集団として哺乳動物発現プラスミドｐＢＩＯＣＡＭ５（Ｆａｌｋら、２０１２）にサブクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞における一過性トランスフェクションによって発現させた（Ｃｈａｐｐｌｅら、２００６）。Ｆａｂ発現のために、プールされたλまたはκｓｃＦｖ可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）インサートを、独自のＩｏｎｔａｓ  Ｌｔｄプロトコルを使用してデュアルプロモーターＦａｂ発現ベクター（軽鎖生殖系列にしたがったｐＦａｂ−デュアル−κまたはｐＦａｂ−デュアル−λ）にクローニングした。培養上清をＴＨＰ−１細胞アッセイにおける活性についてスクリーニングし、選択したｓｃＦＶ−ＦｃおよびＦａｂヒットを再アッセイおよび阻害活性の確認のためにアフィニティー精製した。
【０１９４】
ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）レポーター細胞アッセイ
テネイシンＣは、ＦＢＧドメインと細胞性ＴＬＲ４との相互作用によって炎症性細胞および線維芽細胞におけるサイトカインの生成を誘発することが示されている（Ｍｉｄｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ、２００９）。ＴＮＦα、ＩＬ−８およびＩＬ−６などの炎症性サイトカインの生成をもたらす受容体シグナル伝達カスケードは、転写因子ＮＦ−κＢの活性化を伴う。このプロセスは、容易に測定されるタンパク質シグナルの生成を伴うＮＦ−κＢ活性化に応答するように改変された「レポーター」細胞株において研究され得る。ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）レポーター細胞株（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ；Ｔｏｕｌｏｕｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）はヒトＴＨＰ−１単球細胞株に由来し、ＮＦ−κＢ誘導性分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター構築物を安定的に発現する。これらの細胞はまた構成的に細胞表面ＴＬＲ４を発現することから、ＴＮＣ  ＦＢＧ融合タンパク質のシグナル伝達活性を、中−高処理量アッセイ法を用いて培養上清中でＳＥＡＰを比色定量または蛍光定量することで容易に測定することがえきる。
【０１９５】
低ＦＢＧ濃度における活性は、任意のスクリーニングアッセイの成功に重要であり、すなわちレポータータンパク質のロバスト増加を産み出すために必要なＦＢＧ濃度が高すぎる場合、その後の任意の多くのシグナルの完全な阻害に必要な発現レベルおよび濃度のｓｃＦｖ、Ｆｃ-ＳｃＦｖまたはＦａｂ構築物はスクリーニングでは受け入れられないであろう。この細胞アッセイにおいて、Ｆｃ−ＦＢＧは低ｎＭレベルで頑健なＳＥＡＰシグナルを生じる（ＣＤ４−ＦＢＧはこの濃度範囲では応答を生じなかった）。
【０１９６】
ＴＨＰ１-Ｂｌｕｅ（商標）細胞を培養し、そして供給者のプロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ＰＤＦ／ＴＨＰ１＿Ｂｌｕｅ＿ＮＦ＿ｋＢ＿ＴＤＳ．ｐｄｆ）に従って補充したＲＰＭＩ培地中で継代した。ただし、細胞を超低接着Ｔ７５フラスコ中で増殖させた。アッセイのために、ＴＨＰ１-Ｂｌｕｅ（商標）細胞を、ＲＰＭＩ培地中のＦｃ-ＦＢＧ（３または１０ｎＭ）を含有する９６ウェル組織培養プレート（１００，０００細胞／ウェル）に総量１７０μｌで添加した。発現されたｓｃＦｖ-ＦｃもしくはＦａｂ、またはＰＢＳ中の親和性精製抗体を含有する培養上清を３０μｌの容量で添加し、そして細胞を３７℃で１８時間インキュベートした。上清を回収し、そしてＡｔｔｏｐｈｏｓ  ＡＰ蛍光定量システム（Ｓ１０００；Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いるＳＥＡＰまたはＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＹ２０８；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）を用いるＩＬ−８含有量のいずれかを供給業者の指示に従ってアッセイした。データをプロットし、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて曲線を当てはめた。
【０１９７】
ＨＥＫ２９３Ｆ培養上清としての抗ＦＢＧ抗体のスクリーニングは、ＴＨＰ１-Ｂｌｕｅ（商標）細胞におけるＦｃ-Ｈｉｓ-ＦＢＧ誘発シグナル伝達の推定上の阻害剤を強調し、そのうちの９は精製ｓｃＦｖ-ＦｃまたはＦａｂとして再アッセイしたとき確認された。Ｆｃ-Ｈｉｓ-ＦＢＧは効力アッセイをうまく機能させるための鍵である。単量体ＦＢＧは、ＴＨＰ−１Ｂｌｕｅおよびヒト細胞においていかなるサイトカイン反応も誘発しない。
【０１９８】
実施例４-一次抗ＦＢＧ抗体の機能的特徴付け
ＥＬＩＳＡ交差反応性アッセイ
ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）機能アッセイで同定された９つのヒトＦＢＧシグナル伝達阻害剤のパネルを、ラット、マウス、およびイヌのＦＢＧに対する交差反応性についてＥＬＩＳＡによって評価した。ヒトテネイシンＲ  ＦＢＧホモログへの結合もまた決定された。アッセイウェルをヒト、ラット、マウス、およびイヌのＴＮＣ  ＦＢＧ−ｒＣＤ４、またはヒトＴＮＲ  ＦＢＧ−ｒＣｄ４融合タンパク質で被覆し、Ｆａｂの結合を抗カッパまたは抗ラムダｍＡｂ、続いてユーロピウム結合抗マウスｍＡｂを用いて検出した。ＥＬＩＳＡの結果は、Ｃ３抗体がヒトＴＮＣ  ＦＢＧの他の哺乳動物相同体に対して良好な交差反応性を示し、ヒトＴＮＲ  ＦＢＧに対する見かけの結合が低いことを明らかにした。これらが：
【０１９９】
表面プラズモン共鳴による結合親和性の決定
ヒト、ラットおよびマウスのＴＮＣ  ＦＢＧ、ならびにヒトＴＮＲ  ＦＢＧへの結合についての選択されたＦａｂの親和性ならびに会合および解離速度は、２５℃で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した。ヒトＦａｂ捕獲キット（ＧＥ、２８−９５８３−２５）と共に提供されるプロトコルに従って、ＣＭ５センサーチップを備えたＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００機器を使用して実験を行った。様々な濃度のｒＣｄ４-ＦＢＧを、固定化Ｆａｂおよび参照フローセルと共にフローセルに注入した。参照シグナルを差し引いた後、Ｔ１００  ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、データをグローバル１：１フィットにフィットさせた。
【０２００】
計算された速度定数を表３に示す。ヒトＴＮＣ  ＦＢＧに対するＦａｂの親和性の順位はＢ１２（１１０ｐＭ）以下であった。全てのＦａｂはげっ歯類ＴＮＣ  ＦＢＧに対して低いナノモルの親和性を示し、ヒトＴＮＲ  ＦＢＧに対する親和性は典型的にはヒトＴＮＲ  ＦＢＧよりも６０倍以上低かった。
【０２０１】
抑制効力アッセイ
ｈｕＦｃ-Ｈｉｓ-ＦＢＧ活性の中和についての精製Ｆａｂの効力は、ＴＬＲ４媒介分泌アルカリホスファターゼおよびＩＬ-８サイトカイン産生の尺度を使用して、ＴＨＰ１-Ｂｌｕｅ（商標）アッセイにおいて決定した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してＩＣ５０値の計算を可能にするために、精製Ｆａｂをある範囲の濃度（０．３〜１００ｎＭ）でアッセイウェルに添加した以外は、実施例２に記載したようにアッセイを行った。
【０２０２】
本開示のＣ３抗体は、Ｂ１２と呼ばれる抗体に由来する。
【０２０３】
【表１】
2019535236.tif 000003
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法により決定した抗ＦＢＧ  Ｆａｂ結合速度論データＫD、平衡解離定数。Ｋａ、会合定数。Kd、解離定数。
【０２０４】
実施例５-ｈｕＴＮＣ  ＦＢＧドメインに対する最適化抗体の作製および単離
標的化ＣＤＲ突然変異誘発による親和性成熟
抗ＦＢＧ抗体Ｂ１２を親和性成熟のために選択した。標的ＣＤＲ突然変異誘発は、Ｋｕｎｋｅｌ突然変異誘発を用いて６アミノ酸のブロックでＶＨおよびＶＬのＣＤＲ３残基をランダム化することによって行われた（Ｆｅｌｌｏｕｓｅ  ａｎｄ  Ｓｉｄｈｕ，２００７；Ｋｕｎｋｅｌら、１９８７；Ｓｉｄｈｕ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，２００４）。所与のクローンについてのより長いＶＨ  ＣＤＲ３（１０〜１６残基）のために、ランダム化を３つの重複ブロックで行い、そしてＶＬ  ＣＤＲ３（９残基）を２つの重複ブロックで無作為化した。３２個のコドンの組み合わせから所定の位置に２０個のアミノ酸（および単一のアンバー終止コドンのみ）のいずれかをコードし得るＮＮＳ（Ｎ＝Ａ／Ｇ／Ｃ／ＴおよびＳ＝Ｇ／Ｃ）縮重プライマーを用いて無作為化を行った。以下のライブラリーが作成された。
【０２０５】
【表２】
2019535236.tif 000004
ＣＤＲ３ランダム化ライブラリーの推定サイズ
【０２０６】
高ストリンジェントファージディスプレイの選択
ストレプトアビジンダイナビーズ上のファージ抗体選択を以前に記載されたように実施した（Ｄｙｓｏｎら、２０１１）。親和性が向上したクローンを濃縮するために、ビオチン化ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧに対して複数回の液相選択を行った。各ラウンドの最適抗原濃度は、ある範囲の抗原濃度に対して選択し、産生数を無抗原対照と比較することによって経験的に決定した。各ラウンドで使用される抗原の量を減らすことによって、選択の厳密性が増した。選択ウィンドウ（選択出力からのファージ力価と抗原対照なしのファージ力価との間の倍数差）が１０を下回った後、さらなる選択ラウンドは行わなかった。したがって、ラウンド３で観察された大きな選択ウィンドウのために４回目の選択を受けたＢ１２を除くすべてのライブラリーについて、ビオチン化ヒトｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧについて3ラウンドの選択を行った。ストレプトアビジンまたはテネイシン-Ｒに対する望ましくない交差反応性を回避するために、各ラウンドの選択において、すべてのライブラリーをストレプトアビジンビーズおよびテネイシン-Ｒ（ラウンド１〜３については１００ｎＭ、ラウンド４については１ｎＭ）に対する選択解除にかけた。さらに、ヒトとマウスの抗原を選択ラウンドの間で交互に使用するハイブリッド選択戦略を、Ｂ１２無作為化ライブラリーについてのみ行った。Ｂ１２ライブラリーに対してこの追加の選択を行う理由は、ヒトおよびマウスのｒＣｄ４−ｈｉｓ−ＦＢＧに結合するＢ１２親抗体について観察された親和性の大きな違いであった。さらに、優れたオフレートを有する抗体クローンを選択するために追加の選択ラウンドが行われた。オフレート選択では、ファージをビオチン化抗原（この場合は１ｎＭ）に結合させ、続いて大過剰の非ビオチン化抗原（５００ｎＭ）を反応に添加し、２０時間または４０時間インキュベートした。非ビオチン化抗原は競合物として働き、ビオチン化抗原から解離するファージ抗体を捕獲する、すなわち、より長いオフレートを有する抗体のみが選択の最後に回収されるであろう（Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２；Ｚａｈｎｄら 、２０１０）。各選択ラウンドについての出力ファージ力価を、計算された選択ウィンドウと共に以下の表に示す。
【０２０７】
【表３】
2019535236.tif 000005
選択出力タイトルラウンド1の選択ファージ産生力価を以前に記載されたように決定した（Schofield et al、2007）。
【０２０８】
【表４】
2019535236.tif 000006
選択出力力価2回目の選択ファージ産生力価を以前に記載されたように決定した（Schofield et al、2007）。
【０２０９】
【表５】
2019535236.tif 000007
選択出力力価ラウンド3の選択。ファージ産生力価を以前に記載されたように決定した（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄら、２００７）。 
【０２１０】
ＥＬＩＳＡスクリーン
抗ＦＬＡＧ捕捉ＥＬＩＳＡを実施して、親抗体と比較してマウスＦＢＧ結合に対して改善された親和性を有するクローンをスクリーニングした。
【０２１１】
ｓｃＦｖ  ｐＳＡＮＧ１０発現プラスミドを保有する大腸菌クローンを、以前に記載されているように（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄら、２００７）、自己誘導培地を用いて９６ウェルプレート中で誘導した。  大腸菌上清をＥＬＩＳＡアッセイのために回収した。ＥＬＩＳＡは、ユーロピウム標識抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）を用いたＤＥＬＦＩＡ（解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ）システムを使用した。黒色免疫吸着プレート（Ｎｕｎｃ）を、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｆ３１６５、５μｇ／ｍｌのＰＢＳ、１ウェルあたり５０μｌ）で一晩被覆させて、２％粉乳、ＰＢＳ（ＰＢＳ-Ｍ、１ウェルあたり３００μｌ）の添加によってブロックした。プレートをＰＢＳ-Ｔ（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ-２０）で３回およびＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ-Ｍ中に発現ｓｃＦｖを含有する９６ウェル自己誘導培養上清の１：２希釈物を添加した（１ウェルあたり５０μｌ）。プレートを１時間インキュベートし、上記のように洗浄し、ビオチン化マウスまたはヒトｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ（ＰＢＳ−Ｍ中５μｇ／ｍｌ、５０μｌ）を各ウェルに加えた。プレートをさらに１時間インキュベートし、洗浄し、そしてストレプトアビジン−Ｅｕを添加し（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、１μｇ／ｍｌ、ＰＢＳ−Ｍ、５０μｌ）、３０分間インキュベートし、洗浄し、そしてＤＥＬＦＩＡ増強溶液を添加した（５０μｌ）して、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎプレートリーダー（励起＝３２０ｎｍ、発光６２０ｎｍ）でプレートを読み出した。アッセイのフォーマットに示されている。
【０２１２】
このアッセイでは、自己誘導培養物中のｓｃＦｖの発現レベルが抗ＦＬＡＧ被覆ウェルを飽和させるので、ｓｃＦｖ発現レベルの差は正規化される。したがって、アッセイで得られたシグナルは、洗浄後に結合したビオチン化ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧの量を反映しており、これはマウスまたはヒトＦＢＧに対するそのクローンの解離速度の関数となる。Ｂ１２サブライブラリーからの選択出力のＥＬＩＳＡスクリーニングは、マウスＴＮＣ  ＦＢＧへの有意に改善された結合を有するクローンを明らかにした。
【０２１３】
ＨＴＲＦスクリーン
ＨＴＲＦベースの競合アッセイは、ヒトＴＮＣ  ＦＢＧへの結合が改善された抗体変異体をスクリーニングするために開発された。
【０２１４】
すべてのサンプルおよび試薬は４ｘ  定常濃度でアッセイ緩衝液（５０ｍＭのＮａＰＯ４、０．１％ＢＳＡ、０．４Ｍ  ＫＦ、ｐＨ７．０）中に調製した。続いて５μｌの各試薬を低容量の３８４ウェルアッセイプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、７８４０７５）に添加し、２０μｌの最終反応容量を得た。ＩｇＧ抗体を、製造業者の指示に従ってｄ２標識化キット（ＣｉｓＢｉｏ、６２Ｄ２ＤＰＥＡ）を用いて標識した。ストレプトアビジンユーロピウムクリプテート（ＣｉｓＢｉｏ、６１０ＳＡＫＬＡ、ロット番号２５Ｃ）を、製造業者によって推奨されるように、２０μｌの反応あたり１．８ｎｇの活性部分（ＳＡ）の最終濃度で使用した。ビオチン化ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧはＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１３２７）を用いて調製し、ビオチン化の程度はビオチン化蛍光定量キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、４６６１０）を用いて定量した。適切な場合には、ｓｃＦｖを含有する上清（ＥＬＩＳＡアッセイについて上述したように調製）を１／２０の最終希釈（すなわちアッセイ緩衝液中１／５希釈し、次に希釈サンプル５μｌを２０μｌのＦＲＥＴアッセイ液に加えた）で３８４ウェルアッセイプレートに添加した。スクリーニングに用いたｄ２標識Ｂ１２  ＩｇＧの濃度は１．２５ｎＭであった。特に明記しない限り、ビオチン化ｒＣｄ４-Ｈｉｓ-ＦＢＧ（ビオチン：タンパク質比＝１．８：１）は２．２ｎＭ（２Ａ５  ＩｇＧ抗体を用いるアッセイにおいて）または１ｎＭ（Ｂ１２  ＩｇＧを用いる実験において）のいずれかで存在した。サンプルを室温で約１時間インキュベートし、ＦＲＥＴシグナルをＢＭＧ  Ｐｈｅｒａｓｔａｒ機器を使用して決定した。励起＝３２０ｎｍ、発光＝６２０ｎｍおよび６６５ｎｍ。積分開始時間＝６０μｓ、積分時間＝５００μｓ。１ウェルあたり１００回点滅。培養上清を含む競合アッセイのために、ビオチン化ｒＣｄ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ抗原を、アッセイプレートに試薬を添加する前に、ストレプトアビジンユーロピウムクリプテートと共に４５分間プレインキュベートした。全てのＦＲＥＴシグナルはΔＲとして示され、ここでＲ  ＝（Ｅ６６５／Ｅ６２０×１０４）およびΔＲ  ＝（Ｒサンプル−Ｒバックグラウンド蛍光）である。
【０２１５】
親和性選択突然変異体ライブラリーからの非標識ｓｃＦｖクローンを含む培養上清を、ＦＢＧとフルオロフォア標識親ＩｇＧ抗体との間の相互作用の阻害について試験した。両方のアッセイにおいて有用な範囲内のＦＲＥＴシグナルを示すクローンの相対的な順位付けは広く変化しておらず、それらが類似のエピトープについて競合していたことを示している。したがって、親和性成熟選択からのすべてのＢ１２  ｓｃＦｖ変異体を、Ｂ１２  ＩｇＧ分子のヒトＴＮＣ  ＦＢＧへの結合を阻害するそれらの能力に関してスクリーニングした。親和性成熟クローンと並行してｓｃＦｖとして表される親クローンをベンチマークとして使用した。
【０２１６】
ＳｃＦｖを配列決定し、それぞれＥＬＩＳＡおよびＨＴＲＦアッセイにおけるマウスおよびヒトＴＮＣ  ＦＢＧへのそれらの結合に基づいて、固有のＶＨまたはＶＬ  ＣＤＲ３配列を有するクローンのパネルをヒトＩｇＧ４フォーマットでのさらなる研究のために選択した。
【０２１７】
【表６】
2019535236.tif 000008
ヒトｒＣＤ４ - ＦＢＧに対する親和性が改善されたクローンについてのＨＴＲＦスクリーニング。
【０２１８】
抗体Ｂ１２の変種は、マウスＦＢＧ結合に関して４倍以上の改善、およびＨＴＲＦシグナルの９１％以上の阻害を示した。全部で、これらの基準に独特のＣＤＲ３配列を合わせた３１クローンが以下に同定された。
【０２１９】
【表７】
2019535236.tif 000009
【０２２０】
クローンの重鎖または軽鎖ＣＤＲ３配列は、マウスおよびヒトＴＮＣ  ＦＢＧへの結合が改善されていると同定され、さらなる研究のためにヒトＩｇＧフォーマットへの変換のために選択された。
【０２２１】
これらは、ヒトおよびマウスのＴＮＣ  ＦＢＧに結合し、したがって本発明の方法、使用、組成物および化合物において潜在的な有用性を有する抗体クローンの重鎖または軽鎖配列である。例えば、これらのＣＤＲ３配列を有するＴＮＦ  ＦＢＧに結合する抗体は、ＴＮＣまたはＴＮＣ  ＦＢＧの同定、その機能の阻害、検出および精製において有用であり得る。
【０２２２】
ＩｇＧ４フォーマットへの変換と結合速度論の決定
対象の３１  ｓｃＦｖを、ヒンジ安定化変異を有するヒトＩｇＧ４として抗体を生成するためにヒトＩｇＧ４発現ベクターにサブクローニングした（Ｓ２４１Ｐ；Ａｎｇａｌら、１９９３）。ＩｇＧ４抗体をＨＥＫ−２９３Ｆ細胞で一過性に発現させ、培養上清を、ヒトおよびマウスＴＮＣ  ＦＢＧ、ならびにヒトＴＮＲ  ＦＢＧへの結合についてのオフレートのランク付けのために表面プラズモン共鳴分光法を用いてスクリーニングした。手短に言えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００機器を用いて行い、そしてヒト抗体捕捉キットプロトコル（ＧＥ、ＢＲ-１００８-３９）に従ったプロトコルに従った。オフレートスクリーニングのために、１０，０００応答単位（ＲＵ）の抗ヒトＦｃ  ＩｇＧ（ＧＥ、ＢＲ−１００８−３９）を、アミンカップリングキットプロトコル（ＧＥ、ＢＲ-１０００-５０）に従ったＥＤＣ／ＮＨＳ架橋化学を使用してシリーズ５  ＣＭ５デキストランセンサーチップ（ＢＲ−１００５-３０）のフローセル（ＦＣ１およびＦＣ２）に固定化した。発現されたＩｇＧ４を含む培養上清を２×ＰＢＳ-Ｔで１：２に希釈し、そしてＦＣ２に注入し（流速５μｌ／分、６０秒間の接触時間）、２５℃での抗体捕捉を可能にした。抗体捕捉レベルは、上清中の抗体の発現レベルに応じて３０８〜１９７５ＲＵの範囲であった。固定濃度の抗原（１５ｎＭのヒトおよびマウスＴＮＣ  ｒＣｄ  ４  −Ｈｉｓ−ＦＢＧおよび１００ｎＭのヒトＴＮＲ  ｒＣｄ  ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ）を、ＦＣ  １（参照フローセル）およびＦＣ２（抗体捕獲フローセル）の流路を介し、流速３０μｌ／分で流入させて、結合相および解離相をそれぞれ１分および５分間にわたり測定した。結合表面の再生は、３０秒の接触時間で３ＭのＭｇＣｌ２を用いた。オフレートは、参照細胞を引き算し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ、ＢＲ-１００５-９７）を用いて１：１の相互作用を仮定したセンサーグラム実験データに当て嵌めて決定した。オフレートスクリーニングの結果は、以下の表に要約した。
【０２２３】
【表８】
2019535236.tif 000010
ヒトＩｇＧ４  抗ＦＢＧ解離速度のランク付けのための表面プラズモン共鳴スクリーニング 
【０２２４】
クローンは、ヒトおよびマウスのＴＮＣ  ｒＣｄ４-Ｈｉｓ-ＦＢＧについての低いオフレート、およびヒトＴＮＲ  ｒＣｄ４-Ｈｉｓ-ＦＢＧについての高いオフレートに従ってランク付けされた。各ライブラリーからの３つの最高ランクの抗体を、精製ＩｇＧ４として、より詳細な速度論的分析のために優先した。これらのクローンを以下の表に示す。
【０２２５】
【表９】
2019535236.tif 000011
ＦＢＧ結合解離速度特性が改善されたＢ１２突然変異体の重鎖ＣＤＲ３アミノ酸配列
【０２２６】
９つの優先順位付けされたＩｇＧ４抗体について詳細な速度論的パラメータを評価した。結合特性は、ヒト、ラットおよびイヌのＴＮＣ  ｒＣＤ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧ、およびヒトＴＮＲ  ｒＣＤ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧとの相互作用について決定された。動力学的アッセイは、以下のようないくつかの改変を伴って、上記のオフレート決定の場合と本質的に同じプロトコルに従った。速度論的パラメータ決定の精度を向上させるために、抗ヒトＦｃ  ＩｇＧをより低いレベル（２２２９  ＲＵ）で固定化した結果、捕捉された抗ＦＢＧ  ＩｇＧ４の量が対応して減少した。精製抗ＦＢＧ  ＩｇＧ４をＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ-２０中で３．５ｎＭの濃度に希釈し、１０μｌ／分の流速で６０秒間の接触時間でＦＣ２に注入した。これは典型的には平均８０ＲＵ（範囲：５５ＲＵ〜９０ＲＵ）の抗体の捕捉をもたらした。ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ-２０（７ｎＭであるマウスｒＣＤ４-Ｈｉｓ-ＦＢＧを除いて最高濃度１００ｎＭ）で希釈を２倍にすることによって抗原を調製した。フローセルおよび注入チャンバーの両方をこの温度に平衡化して、アッセイを３７℃（３０μｌ／分、１２０秒の接触時間；マウスｒＣＤ４−Ｈｉｓ−ＦＢＧＦＢＧ  １０μｌ／分、６０秒の接触時間）で実施した。前述のように、速度論的パラメータは、参照細胞を差し引いて、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ、ＢＲ-１００５-９７）を用いて１：１の相互作用を仮定してセンソグラム実験データを適合させることによって決定した。
【０２２７】
９つ全ての抗体は、非親和性成熟親クローンと比較してマウスＴＮＣ  ＦＢＧドメインへの改善された結合を示し、そして抗体１６５＿１３＿Ｂ１、１６５＿１３＿Ｃ３、および１６０＿０１＿Ａ４は、ヒトＴＮＣ  ＦＢＧへの結合に対してサブナノモルＫＤ値を示し、ヒトＴＮＲ  ＦＢＧ類縁体に対しては７０倍以上低い親和性をもつことを示した。
【０２２８】
【表１０】
2019535236.tif 000012
３７℃での表面プラズモン共鳴によって決定された抗ＦＢＧ ＩｇＧ４結合動態データ。  
【０２２９】
実施例６-Ｃ３抗体が結合するＦＢＧ-Ｃエピトープの決定
Ｈｉｓ−ＴＮＣ−ＦＢＧの生産
Ｈｉｓ−ＴＮＣ−ＦＢＧをクローン化し、そしてＣＨＯ細胞において発現させた。生産期の終わりに、培養物を遠心分離した（１０００ｇ、３０分、１５℃）。５ｍＬのＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化した。カラムに上清を負荷した後、カラムをＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、ＰＢＳ中０．５Ｍイミダゾール中に溶出した。溶出したタンパク質をＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇに負荷し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１３０ｍＭ  ＮａＣｌで泳動した。
【０２３０】
単量体ピークをプールし、そして最終生成物を１ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、そして小分注中で凍結保存した。
【０２３１】
ＮＳＣＴ−１４１の生産
ＮＳＣＴ−１４１産物をクローニングし、ＣＨＯ細胞中で発現させた。産生培養物を回収し、清澄化した上清をＭａｂｓｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製する前に接線流濾過によって濃縮した。生成物を２×ＰＢＳの添加により中和し、そして希水酸化ナトリウム溶液で約ｐＨ７．２に調整し、分注中＋５℃で貯蔵した。
【０２３２】
Ｃ３  Ｆａｂ’−テネイシンＣ複合体の形成
Ｃ３  Ｆａｂ’抗体を産生するために、Ｃ１６５＿１３＿Ｃ３＊  ＩｇＧ４抗体をペプシン切断に供した。ペプシン切断後、Ｆａｂ′を、Ｆａｂ’中のヒンジ領域ジスルフィド結合を選択的に還元する温和な還元剤である２-メルカプトエチルアミン-ＨＣｌ（２-ＭＥＡ）にかけた。これに続いてＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）処理を行い、次いで還元システイン残基と安定な共有チオエーテル結合を形成し、それらが永久的にブロックされてさらなるジスルフィド結合形成を防ぐことを可能にした。
【０２３３】
Ｃ３  Ｆａｂ′−テネイシンＣ複合体の製造に最適なモル比を決定するために実験を行った。図１は、最適化モル比１：１で複合体形成を確認したＳＥＣ分析のクロマトグラフを示す。
【０２３４】
試験の結果に基づいて、Ｆａｂ′−テネイシン複合体の大規模生産のために１０ｍｇのＨｉ-ＨＴＮＣ-ＦＢＧペプチド（配列番号１０）を２０ｍｇのＣ３  Ｆａｂ′と共にインキュベートした。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により複合体を精製した。精製複合体を、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．５、１５０ｍＮ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液を用いて溶出した。
【０２３５】
図２Ａは、溶出試料が実質的に純粋であることを示すＦａｂ’-テネイシンＣ複合体のクロマトグラフを示す。次にサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた（図２Ｂおよび２Ｃ参照）。バンドは予想されたサイズを有した。
【０２３６】
最後に、Ｆａｂ’−テネイシンＣ複合体を結晶化に使用する前に３８．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
【０２３７】
Ｆａｂ’−テネイシン複合体の結晶化
Ｃ３  Ｆａｂ’とテネイシンＣとの間の相互作用をＸ線結晶学によって研究した。
【０２３８】
ヒトテネイシンＣ、Ｃ３  Ｆａｂ’と複合したフィブリノーゲンＣ末端ドメインの結晶化、構造決定および結晶構造の精密化
【０２３９】
結晶化
ヒトテネイシンＣ（残基１９７４〜２２０１）／Ｃ３  Ｆａｂ’複合体を、Ｌｏｗ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｓｗｉｓｓ−  Ｓｃｉ  ３ウエルプレート中、１００ｍＭのビス−トリスｐＨ６．５、２００ｍＭの塩化マグネシウム、２０％ＰＥＧ  ６０００を含む３０μｌのリザーバ溶液に対して２２℃で気相を通してシッティングドロップで結晶化させた。液滴は、２５ｍＭトリスｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ＋  ８０ｎｌリザーバ溶液および２０ｎｌシード溶液中に１１．８ｍｇ／ｍｌ（推定消衰係数１２２，０００Ｍ  −１  ｃｍ  −１およびＭＷ  ７７．４ｋＤａに基づく）の１００μｌのタンパク質を含有した。これは結晶形態を改善するために必要とされた。結晶は、格子乗数ａ＝７５．８Å、ｂ＝１１６．９Å、ｃ＝７８．７Å、およびα＝γ＝９０°、β＝９０．４°の  空間群Ｐ２１に属する。２分子のテネイシンＣ／Ｃ３  Ｆａｂ’複合体は非対称単位にある。
【０２４０】
Ｘ線回折コレクション
液体窒素中でフラッシュ冷却する前に、結晶を２０％（ｖ／ｖ）グリセロール（リザーバ溶液中に希釈）中でクライオプロテクションを行った。Ｘ線回折データは、フランス、グルノーブルのヨーロッパシンクロトロン放射光施設シンクロトロンのＩＤ３０ＢビームラインステーションのＰＩＬＡＴＵＳ  ６Ｍ-Ｆ上の単結晶から収集した。Ｘ線ビームの波長は０．９７６３Åであった。データは  ＸＤＳ＋Ａｉｍｌｅｓｓで処理された（Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６，１２５-１３２（２０１０）；Ｅｖａｎｓ，Ｐ．Ｒ．およびＭｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６９，１２０４-１２１４（２０１３））。
【０２４１】
構造決定
ヒトテネイシンＣ、フィブリノーゲンＣ末端ドメイン／Ｃ３  Ｆａｂ’複合体の結晶構造は、プログラムＰｈａｓｅｒ（ＭｃＣｏｙ，Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．４０、６５８〜６７４（２００７））。分子置換の出発モデルとして、ＰＤＢエントリー４Ｒ９Ｊおよび５Ｉ１５の修正版を使用した。リモデリング、再構築および精製は、それぞれＣＯＯＴ、ＢｕｃｃａｎｎｅｒおよびＲｅｆｍａｃを用いて行われた（Ｅｍｓｌｅｙ、Ｐ．ら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ６６、４８６−５０１（２０１０）；Ｃｏｗｔａｎ、Ｋ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ６２、１００２−１０１１（２００６）；Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ、Ｇ．Ｎ．ら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ５３，２４０-２５５（１９９７））。最終的な分解能は１．９Åと決定された。
【０２４２】
テネイシンＣ／Ｃ３  Ｆａｂ’複合体のモデルは、テネイシンＣの残基１９７５〜２１９３（配列番号、ユニプロット：Ｐ２４８２１参照）、Ｃ３  Ｆａｂの軽鎖の残基１〜２１３（配列番号３）および  Ｃ３  Ｆａｂの重鎖の残基１〜２１９（配列番号２）を包含する。このモデルのＲ−ｆａｃｔｏｒ  は０．１５１、Ｒ−ｆｒｅｅ  は０．１９７である。標準幾何学形状からの平均二乗偏差は、結合長については０．０２４Åであり、結合角度については２．１３°である。
【０２４３】
エピトープ
テネイシンＣ（残基１９７４〜２２０１）／Ｃ３Ｆａｂ’の構造は、Ｃ３ＦａｂとテネイシンＣとの間の主要な接触部位を明らかにし、そして主に抗体のＣＤＲループおよびテネイシンの一方の面に集まっていると同定された。テネイシンＣタンパク質の配列番号１に示された番号付けした配列にしたがって、３．０Å以内でＣ３  Ｆａｂ’のＣＤＲ領域と最も密接に相互作用する残基は、Ａｌａ２１１５、Ａｓｎ２１１８、Ｓｅｒ２１３１、Ａｒｇ２１４７、Ａｓｎ２１４８、Ｃｙｓ２１４９、Ｈｉｓ２１５０、Ａｒｇ２１５１、Ｓｅｒ２１６４、Ｈｉｓ２１７１、およびＨｉｓ２１７５である。３．５Å以内でＣ３  Ｆａｂ’と接触するテネイシンＣの主な残基は、Ａｌａ２１１５、Ｔｙｒ２１１６、Ａｓｎ２１１８、Ｓｅｒ２１３１、Ｔｙｒ２１４０、Ａｒｇ２１４７、Ａｓｎ２１４８，Ｃｙｓ２１４９，Ｈｉｓ２１５０，Ａｒｇ２１５１，Ｈｉｓ２１６３，Ｓｅｒ２１６４，Ｐｈｅ２１７０、Ｈｉｓ２１７１、Ｈｉｓ２１７５である。
【０２４４】
４．０Å以内でＣ３  Ｆａｂ’と接触する残基は、Ａｌａ  ２  １１  ５、Ｔｙｒ  ２  １１  ６、Ａｓｎ  ２  １１  ８、Ｓｅｒ  ２  １３  １、Ｉｌｅ  ２  １３  ３、Ｔｙｒ  ２１４０、Ａｒｇ  ２１４７、Ａｓｎ  ２  １４８、Ｃｙｓ  ２１９９、Ｈｉｓ  ２１５０、Ａｒｇ  ２１５１、Ｈｉｓ  ２１６３、Ｓｅｒ  ２１６４、Ｐｈｅ  ２１７０、Ｈｉｓ  ２１７１、Ｈｉｓ  ２１７５である。
【０２４５】
これらの残基の位置およびそれらとＦａｂ’との相互作用を図７に示す。これらの残基はＣ３抗体のエピトープを規定する。
【０２４６】
モデリング構造
次いで、Ｆａｂ‘−テネイシンＣ複合体の結晶を構造モデリングに使用した。構造自体は分子置換によって決定された。図５は、Ｆａｂ’−テネイシン複合体のモデル化構造を示す。図に示すように、２つの複合体が非対称単位で観察された。
【０２４７】
図６は、興味のあるテネイシンＣの種々の残基を示す。図６Ａは、図６Ｂ〜図６Ｄの概観図である。残基２０９６〜２１０２および２１３０〜２１３５はスティック表示により黒で強調表示されている。画像表現では、残基２０７１−２１４８および２１７０−２１９３が濃い灰色で強調表示されている。残基２１９４−２２０１は構造内では見えず、薄灰色で示されている。Ｆａｂ’は表面表現によって示される。残基は、ユニプロットＩＤ  Ｐ２４８２１に記載の配列を用いて定義される。
【０２４８】
これらの残基はまた以下の配列番号１のアミノ酸配列で示されるように、太字の残基２０９６〜２１０２および２１３０〜２１３５、斜体の残基２１９４〜２２０１を含む。
ＥＬＲＶＤＬＲＤＨＧＥＴＡＦＡＶＹＤＫＦＳＶＧＤＡ  ＫＴＲＹＫＬＫ  ＶＥＧＹＳＧＴＡＧＤＳＭＡＹＨＮＧＲＳＦＳＴ（残基２０７１−２１２４）
ＲＳＦＳＴＦＤＫＤＴ  ＤＳＡＩＴＮ  ＣＡＬＳＹＫＧＡＦＷＹＲＮ（残基２１２０〜２１４８）
ＦＨＷＫＧＨＥＨＳＩＱＦＡＥＭＫＬＲＰＳＮＦＲＮ  ＬＥＧＲＲＫＲＡ（残基２１７０−２２０１）
【０２４９】
同様に、テネイシンＣ構築物の４Å以内に位置するＦａｂ  ‘内のいくつかの残基が同定された。
【０２５０】
【表１１】
2019535236.tif 000013
Ｆａｂ'−テネイシン複合体構造上のこれらの残基の位置を図８に示す。
【図１】
2019535236.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
2019535236.tif 000021
【図７−２】
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【図８】
2019535236.tif 000023
【図１０】
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【配列表】
2019535236000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月18日(2019.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｌａ２１１５，Ｔｙｒ２１１６，Ａｓｎ２１１８，Ｓｅｒ２１３１，Ｉｌｅ２１３３，Ｔｙｒ２１４０，Ａｒｇ２１４７，Ａｓｎ２１４８，Ｃｙｓ２１４９，Ｈｉｓ２１５０，Ａｒｇ２１５１，Ｈｉｓ２１６３，Ｓｅｒ２１６４，Ｐｈｅ２１７０，Ｈｉｓ２１７１，およびＨｉｓ２１７５の群から選択される少なくとも６個のアミノ酸を含み、前記アミノ酸残基の位置は、配列番号１の位置である、テネイシンＣの中和立体配座エピトープであって、
前記エピトープが少なくともＡｒｇ２１４７、Ａｒｇ２１５１、およびＩｌｅ２１３３を含み、前記エピトーム中の残基が配列番号２および３に示される前記Ｃ３抗体結合ドメインの４Å内にあり、
前記エピトームの阻害または遮断が、テネイシンの前記ＦＢＧドメインの生物学的シグナル伝達活性を中和する、テネイシンＣの中和立体配座エピトーム。
【請求項２】
少なくとも１つの荷電残基、例えばＡｒｇ  ２１４７を含む、請求項１に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項３】
極性残基Ｈｉｓ２１６３を含む、請求項１または２に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項４】
Ｃｙｓ２１４９を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項５】
疎水性残基Ｈｉｓ２１７１を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項６】
前記極性アミノ酸Ｔｙｒ２１１６を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項７】
前記疎水性残基Ｐｈｅ２１７０を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項８】
Ｉｌｅ２１３３、Ａｒｇ２１４７、Ａｓｎ２１４８、Ｈｉｓ２１６３、およびＰｈｅ２１７０を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項９】
アミノ酸残基Ｓｅｒ２１３１をさらに含む、請求項８に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項１０】
アミノ酸残基Ｔｙｒ２１１６をさらに含む、請求項８または９に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項１１】
残基Ａｌａ２１１５、Ａｓｎ２１１８、Ｓｅｒ２１３１、Ａｒｇ２１４７、Ａｓｎ２１４８、Ｃｙｓ２１４９、Ｈｉｓ２１５０、Ａｒｇ２１５１、Ｓｅｒ２１６４、Ｈｉｓ２１７１、およびＨｉｓ２１７５を含む、請求項１に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項１２】
残基Ａｌａ２１１５、Ｔｙｒ２１１６、Ａｓｎ２１１８、Ｓｅｒ２１３１、Ｔｙｒ２１４０、Ａｒｇ２１４７、Ａｓｎ２１４８、Ｃｙｓ２１４９、Ｈｉｓ２１５０、Ａｒｇ２１５１、Ｈｉｓ２１６３、Ｓｅｒ２１６４、Ｐｈｅ２１７０、Ｈｉｓ２１７１およびＨｉｓ２１７５を含む、請求項１に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項１３】
残基Ａｌａ２１１５、Ｔｙｒ２１１６、Ａｓｎ２１１８、Ｓｅｒ２１３１、Ｉｌｅ２１３３、Ｔｙｒ２１４０、Ａｒｇ２１４７、Ａｓｎ２１４８、Ｃｙｓ２１４９、Ｈｉｓ２１５０、Ａｒｇ２１５１、Ｈｉｓ２１６３、Ｓｅｒ２１６４、Ｐｈｅ２１７０、Ｈｉｓ２１７１、Ｈｉｓ２１７５を含む、請求項１に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項１４】
６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６の前記アミノ酸残基を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のテネイシンＣの中和エピトープ。
【請求項１５】
前記抗体がＣ３、Ｂ１２または２Ａ５のＣＤＲを含まない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の中和抗体またはその結合断片。
【請求項１６】
Ｋａｂａｔ番号付け体系に従って、前記重鎖の少なくともアミノ酸１０１が極性であり、例えばＧｌｎである、請求項１５に記載の中和抗体または結合断片。
【請求項１７】
Ｋａｂａｔ番号付け体系に従って、前記重鎖の少なくともアミノ酸１０２は極性であり、例えばセリンである、請求項１５または１６のいずれかに記載の中和抗体または結合断片。
【請求項１８】
Ｋａｂａｔ番号付け体系に従って、前記重鎖の少なくともアミノ酸１０４は荷電しており、例えばＧｌｕである、請求項１５〜１７に記載の中和抗体または結合断片。
【請求項１９】
Ｋａｂａｔ番号付け体系に従って、少なくともアミノ酸１０５が負に荷電したアミノ酸、例えばＡｓｐである、請求項１５〜１８に記載の中和抗体または結合断片。
【請求項２０】
前記抗体またはその結合断片はヒト又はヒト化である、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の中和抗体または結合断片。
【請求項２１】
表面プラズモン共鳴による測定で、その親和性が５ｐＭ〜５００ｎＭの範囲である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の中和抗体または結合断片。
【請求項２２】
請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の抗体または結合断片および希釈剤、賦形剤および／または担体を含む医薬組成物。
【請求項２３】
治療に使用するための、請求項１８〜２１に記載の中和抗体もしくは結合断片、または請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
慢性炎症の前記治療に使用するための、請求項２３に記載の中和抗体または結合断片。
【国際調査報告】
2019535236.tif 000025
2019535236.tif 000026
2019535236.tif 000027