(57)【要約】  本開示は、タバコの吸枝成長に関与する遺伝子の検証を提供する。タバコの腋芽で優先的に活動するプロモーターもまた提供される。さらにまた、吸枝の成長が低下した又は存在しない改変タバコ植物が提供される。さらにまた、吸枝の成長が低下した又は存在しない改変タバコ植物を作出するための方法及び組成物が提供される。
2019512247.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
類似条件下で育成したときの同じ変種のコントロールタバコ植物と比較して全く存在しないか又は減少した吸枝を含む改変タバコ植物であって、前記改変タバコ植物が、配列番号: 161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80及び82から成る群から選択されるポリペプチドをコードするトランスジーンを含む、前記改変タバコ植物。
【請求項２】
前記トランスジーンが、腋生分裂組織特異的プロモーターに作動できるように連結される、請求項1に記載の改変タバコ植物。
【請求項３】
前記トランスジーンが、配列番号:113−118、148−160、204及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％配列同一性を有する核酸配列を含むプロモーターに作動できるように連結される、請求項1に記載の改変タバコ植物。
【請求項４】
前記減少した吸枝が、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％少ない吸枝を含む、請求項1に記載の改変タバコ植物。
【請求項５】
前記減少した吸枝が、減少した質量、減少した長さ、又は両方を含む、請求項1に記載の改変タバコ植物。
【請求項６】
前記改変タバコ植物が、類似条件下で育成したときのコントロールタバコ植物と比較して、吸枝制御のための軽減した管理を要求する、請求項1に記載の改変タバコ植物。
【請求項７】
前記軽減した管理が、吸枝制御のための軽減された手作業による除去の頻度、吸枝制御のための軽減された化学薬剤適用の頻度、吸枝制御のための軽減された化学薬剤適用の量、又は前記の任意の組合せを含む、請求項6に記載の改変タバコ植物。
【請求項８】
前記吸枝制御のための軽減された手作業による除去の頻度が、類似条件下で育成したときのコントロール植物における頻度の少なくとも10％未満、少なくとも20％未満、少なくとも30％未満、少なくとも40％未満、少なくとも50％未満、少なくとも60％未満、少なくとも70％未満、少なくとも75％未満、少なくとも80％未満、少なくとも85％未満、少なくとも90％未満、又は少なくとも95％未満である、請求項7に記載の改変タバコ植物。
【請求項９】
改変タバコ植物であって、類似条件下で育成したときの同じ変種のコントロールタバコ植物と比較して、存在しないか又は減少した吸枝を含む、前記改変タバコ植物。
【請求項１０】
前記吸枝が、上部切取りにより誘発される吸枝である、請求項9に記載の改変タバコ植物。
【請求項１１】
前記改変タバコ植物が、1つ以上の変異を含む、請求項9に記載の改変タバコ植物。
【請求項１２】
前記改変タバコ植物が、1つ以上のトランスジーンを含む、請求項9に記載の改変タバコ植物。
【請求項１３】
前記1つ以上のトランスジーンが、腋生分裂組織特異的プロモーターを含む、請求項12に記載の改変タバコ植物。
【請求項１４】
前記腋生分裂組織特異的プロモーターが、腋生分裂組織の中央帯、周辺帯、髄状帯又は前記の組合せにおいて機能するか又は優先的に機能する、請求項13に記載の改変タバコ植物。
【請求項１５】
前記1つ以上の変異が、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子に存在する、請求項9に記載の改変タバコ植物。
【請求項１６】
前記改変タバコ植物が、類似条件下で育成したときの前記コントロールタバコ植物と比較して、同様又はより多くの葉の収量を有する、請求項9に記載の改変タバコ植物。
【請求項１７】
前記改変タバコ植物が、類似条件下で育成したときの前記コントロールタバコ植物と比較して同様な植物高を有する、請求項9に記載の改変タバコ植物。
【請求項１８】
前記上部切取り誘発吸枝の減少が、類似条件下で育成したときのコントロールタバコ植物の上部切取り誘発吸枝と比較したとき、減少した吸枝総量、より小さな吸枝、又は両方を含む、請求項9に記載の改変タバコ植物。
【請求項１９】
前記減少した吸枝総量が、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％少ない吸枝を含む、請求項18に記載の改変タバコ植物。
【請求項２０】
請求項9に記載の改変タバコ植物のタバコ葉。
【請求項２１】
請求項9に記載の改変タバコ植物に由来する乾燥タバコ素材を含むタバコ製品。
【請求項２２】
前記タバコ製品が、紙巻きタバコ、クレテック、ビディシガレット、葉巻、シガリロ、ノンベンチレーション紙巻きタバコ、ベントリセスフィルター紙巻きタバコ、パイプタバコ、嗅ぎタバコ、噛みタバコ、湿潤無煙タバコ、ファインカット噛みタバコ、ロングカット噛みタバコ、ポーチ入り噛みタバコ製品、ガム、錠剤、ロゼンジ及び溶解ストリップから成る群から選択される、請求項21に記載のタバコ製品。
【請求項２３】
組換えポリヌクレオチドを含む植物又は種子であって、
前記組換えポリヌクレオチドが、下記a、
a．L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯又は前記の組合せにおいて機能するプロモーターであって、下記b、
b．配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む構造性核酸分子、
に作動できるように連結されたプロモーターを含むことを特徴とする植物又は種子。
【請求項２４】
前記プロモーターが、配列番号:113−118、148−160、204及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項23に記載の植物又は種子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互引用）本出願は、米国仮特許出願62/307,035（2016年3月11日出願）及び米国仮特許出願62/399,181（2016年9月23日出願）に対し優先権を主張する。前述の出願はいずれも参照によってその全体が本明細書に含まれる。
（技術分野）
本開示は、吸枝(sucker)の成長に関与する腋芽特異的プロモーター及び遺伝子を明らかにする。さらにまた、タバコ植物の吸枝の減少又は除去に関係する方法及び組成物、育種又はトランスジェニック的手法によるそれらの開発、並びに当該タバコ植物に由来するタバコ製品の製造が提供される。
（配列表の取り込み）“P34370WO00_SL.TXT”と称するファイルに含まれる配列表（735,049バイト（MS-Windows(商標)で判定）、2017年2月24日作成）は、本明細書とともに電子出願され、参照によってその全体が本明細書に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
タバコは甚だしく強い頂芽優勢を示す植物種である。シュート頂端(apical)分裂組織(meristem)（SAM）に由来する分子シグナルは、腋芽の成長を効果的に阻害するホルモンシグナルを媒介する。SAMの除去（“上部切取り”としても知られている）に際して、生理学的及び分子的変化が生じ腋生(auxillary)分裂組織(meristem)（芽）に由来する新規なシュート（又は“吸枝”）の成長が可能になる。吸枝の成長は収量及び葉の品質の低下をもたらす。吸枝は手作業での除去及び化学薬剤の適用によって制御されてきた。マレイン酸ヒドラジド及びフルメトラリンは上部切取り植物で日常的に用いられ、腋芽の成長（“吸枝成長”）が阻害される。しかしながら吸枝を制御する労力及び化学薬剤は非常に高価である。数十年の間、通常育種、変異誘導育種及びトランスジェニック的手法が主要な目標であったが、これらの手法による吸枝成長の阻害又は停止の成功は今日まで達成されていない。したがって、吸枝成長が制限された又は吸枝成長が存在しないタバコの特質を開発することは、化学薬剤使用の削減をもたらし、タバコ製造に関わるコスト及び労力を減少させるであろう。
【発明の概要】
【０００３】
ある特徴では、本開示は改変タバコ植物を提供し、前記タバコ植物は、類似条件(comparable condition)下で育成したときの同じ変種のコントロールタバコ植物と比較して、吸枝成長が存在しないか又は吸枝成長が低下する。
ある特徴では、本開示は改変タバコ植物を提供し、前記改変タバコ植物は、類似条件下で育成したときの同じ変種のタバコ植物と比較して、腋生分裂組織の成長の阻害もしくは停止、腋生分裂組織の維持の阻害もしくは停止、又は前記の組み合わせを示す。
ある特徴では、本開示は組換えポリヌクレオチドを含む植物又は種子を提供し、この場合、当該組換えポリヌクレオチドは、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の組み合わせにおいて機能するプロモーターを含み、前記プロモーターはある核酸配列を含む構造性核酸配列に作動できるように連結され、ここで、当該核酸配列は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
ある特徴では、本開示は組換えDNA構築物を提供し、前記構築物は、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の組み合わせにおいて機能するプロモーター、及び異種でありかつ作動できるよう連結された核酸配列を含み、ここで、当該核酸配列は非コードRNA又はポリペプチドをコードする。
【０００４】
ある特徴では、本開示は、タバコ植物で上部切取りにより誘発される吸枝(topping-induced sucker)成長を低下又は消失させる方法を提供し、この場合、前記方法は、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の組み合わせにおいて機能するプロモーターを含む組換えDNA構築物でタバコ植物を形質転換する工程を含む。
ある特徴では、本開示は組換えDNA構築物でタバコ植物を形質転換する工程を含む方法を提供し、前記構築物は、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の組み合わせにおいて機能し、かつ内因性遺伝子のレベルを抑制するRNA分子に転写されるポリヌクレオチドに作動できるよう連結される異種プロモーターを含み、ここで、前記内因性遺伝子は腋生分裂組織の成長、腋生分裂組織の維持又はその両方を促進するか又はそのために要求される。
ある特徴では、本開示はタバコ植物を作出する方法を提供し、前記方法は、第一のタバコの変種である少なくとも1つのタバコ植物を第二のタバコの変種である少なくとも1つのタバコ植物と交配する工程（この場合、第一のタバコの変種の当該少なくとも1つのタバコ植物は、類似の条件下で育成した同じ変種のコントロールタバコ植物と比較して上部切取りにより誘発される吸枝成長が存在しないか又は吸枝成長の低下を示す）、及び類似の条件下で育成した同じ交配のコントロールタバコ植物と比較して上部切取りにより誘発される吸枝成長が存在しないか又は吸枝成長の低下を示す子孫タバコ植物について選別する工程を含む。
【０００５】
ある特徴では、本開示は、あるポリヌクレオチドに作動できるように連結された異種プロモーターを含むタバコ植物又はその部分を提供し、前記ポリヌクレオチドは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
ある特徴では、本開示は、あるポリヌクレオチドに作動できるように連結された異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を提供し、前記ポリヌクレオチドは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【０００６】
ある特徴では、本開示は改変タバコ植物を育成する方法を提供し、前記方法は、あるポリヌクレオチド（前記ポリヌクレオチドは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードする）に作動できるように連結される異種プロモーターを含む改変タバコ種子を植え付ける工程、及び当該種子に由来する改変タバコ植物を育成する工程を含む。
ある特徴では、本開示は、上部切取りにより誘発される吸枝成長を植物で制御する方法を提供し、前記方法はある組換えDNA構築物で当該植物を形質転換する工程を含み、ここで当該組換えDNA構築物は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結されるプロモーターを含む。
【０００７】
ある特徴では、本開示は、非コードRNA分子をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結された異種プロモーターを含むタバコ植物又はその部分を提供し、この場合、当該非コードRNA分子は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、70、72、74、76、78、161−185、187、189、191、197、199、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするRNAと結合することができ、さらに当該非コードRNA分子は当該ポリペプチドの発現を抑制する。
ある特徴では、本開示は、非コードRNA分子をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結された異種の腋生分裂組織特異的プロモーターを含む組換えDNA構築物を提供し、この場合、当該非コードRNA分子は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、70、72、74、76、78、161−185、187、189、191、197、199、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするRNAと結合することができ、さらに当該非コードRNA分子は当該ポリペプチドの発現を抑制する。
【０００８】
ある特徴では、本開示は改変タバコ植物を育成する方法を提供し、前記方法は、組換えDNA構築物を含む改変タバコ種子を植え付ける工程、及び当該種子に由来する改変タバコ植物を育成する工程を含み、前記構築物は、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の組み合わせにおいて機能し、かつ非コードRNA分子をコードするポリヌクレオチドに作動できるよう連結される異種プロモーターを含み、この場合、当該非コードRNA分子は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、70、72、74、76、78、161−185、187、189、191、197、199、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするRNAと結合することができ、さらに当該非コードRNA分子は当該ポリペプチドの発現を抑制する。
ある特徴では、本開示は、上部切取りにより誘発される吸枝成長を植物で制御する方法を提供し、前記方法はある組換えDNA構築物で当該植物を形質転換する工程を含み、この場合、当該組換えDNA構築物は、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の組み合わせにおいて機能する異種プロモーターを含み、当該プロモーターは非コードRNA分子をコードするポリヌクレオチドに作動できるよう連結され、当該非コードRNA分子は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、70、72、74、76、78、161−185、187、189、191、197、199、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするRNAと結合することができ、さらに当該非コードRNA分子は当該ポリペプチドの発現を抑制する。
【０００９】
ある特徴では、本開示は、本明細書で提供する組換えDNA構築物を含む細菌細胞を提供する。
ある特徴では、本開示は、本明細書で提供する組換えDNA構築物を含む植物ゲノムを提供する。
ある特徴では、本開示は改変種子を製造する方法を提供し、前記方法は、本明細書で提供する組換えDNA構築物を植物細胞に導入する工程、植物細胞集団を当該組換えDNA構築物についてスクリーニングして当該集団から1つ以上の植物細胞を選別し、当該1つ以上の植物細胞から1つ以上の改変植物を生じさせる工程、及び当該1つ以上の改変植物から1つ以上の改変種子を収集する工程を含む。
ある特徴では、本開示は、吸枝成長を低下又は消失させるために改変タバコ植物を作出する方法を提供し、この場合、前記方法は、1つ以上のタバコゲノムの遺伝子座に1つ以上の変異を導入する工程を含む。
ある特徴では、本開示は、吸枝成長を低下又は停止させるために改変タバコ植物を作出する方法を提供し、この場合、前記方法は、1つ以上のタバコゲノムの遺伝子座に1つ以上の変異を導入する工程を含み、さらに当該改変タバコ植物からタバコ製品を製造する。
【００１０】
ある特徴では、本開示は組換えポリヌクレオチドを含む植物又は種子を提供し、この場合、当該組換えポリヌクレオチドは、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の組み合わせにおいて機能するプロモーターを含み、当該プロモーターはある核酸配列を含む構造性核酸分子に作動できるように連結され、当該核酸配列はオーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質をコードする。
ある特徴では、本開示は組換えDNA構築物を提供する。前記構築物は、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の組み合わせにおいて機能するプロモーター、及び異種でありかつ作動できるように連結された核酸配列を含み、当該核酸配列はオーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質をコードする。
ある特徴では、本開示は組換えDNA構築物を提供する。前記構築物は、あるポリヌクレオチドに作動できるように連結された異種の腋生分裂組織特異的プロモーターを含み、当該ポリヌクレオチドはオーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質をコードする。
ある特徴では、本開示は異種プロモーターを含むタバコ植物又はその部分を提供し、前記異種プロモーターは、配列番号:113−118、148−160、204、及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％配列同一性を有し、オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結される。
ある特徴では、本開示は上部切取り誘発吸枝を植物で制御する方法を提供する。前記方法は組換えDNA構築物で前記植物を形質転換する工程を含み、この場合、当該組換えDNA構築物は、オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結されるプロモーターを含む。
【００１１】
配列の簡単な説明
配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252及び254は核酸配列である。配列番号:83−101はRNAi構築物である。配列番号:113−118、148−160、及び204はプロモーター又は調節核酸配列である。配列番号:119−122はTALEN変異誘導で用いられる配列である。
配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255はポリペプチド配列である。本明細書で提供される配列番号に関する追加の記載は表1で見出すことができる。
【００１２】
表1：配列の説明
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【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】二元ベクターp45-2-7（配列番号:112）のプラスミドマップである。
【図２】コントロールタバコ植物及び配列番号:11を過剰発現する改変タバコ植物の写真を示す（配列番号:11はタバコで吸枝の成長を促進する生成物をコードする）。上部切取り時（0時間）及び上部切取り後1週間の植物が示される。
【図３Ａ】コントロールタバコ植物及び配列番号:81を過剰発現する改変タバコ植物の写真を示す（配列番号:81はアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）BRANCHED1をコードする）。図3Aは、上部切取り時（0時間）及び上部切取り後1週間の植物を示す。改変植物は、コントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す。
【図３Ｂ】コントロールタバコ植物及び配列番号:81を過剰発現する改変タバコ植物の写真を示す（配列番号:81はアラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）BRANCHED1をコードする）。図3Bは、配列番号:81を過剰発現する改変植物はコントロール植物と比較して成長阻害を提示することを示す。
【図４】コントロールタバコ植物及び配列番号:83を発現する改変タバコ植物の写真を示す（配列番号:83は配列番号:1を標的として阻害するRNAi構築物である）。上部切取り時（0時間）及び上部切取り後1週間の植物が示される。改変植物は、コントロール植物と比較して吸枝成長の強化を示す。
【図５】コントロールタバコ植物及び配列番号:83を発現する改変タバコ植物における腋生シュートの成長を示す（配列番号:83は配列番号:1を標的として阻害するRNAi構築物である）。図5Aでは、代表的なコントロール及び改変植物だけでなく、上部切取り後2週間の1つの植物の全腋生シュートも示される。改変植物は、コントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す。図5Bは、上部切取り後2週間のコントロール及び改変植物の腋生シュートの総新鮮重量を示すグラフである。改変植物は、コントロール植物と比較して腋生シュート質量の増加を示す。
【図６】コントロールタバコ植物及び配列番号:86を発現する改変タバコ植物の写真を示す（配列番号:86は配列番号:13を標的として阻害するRNAi構築物である）。上部切取り時（0時間）及び上部切取り後1週間の植物が示される。改変植物は、コントロール植物と比較して吸枝成長の強化を示す。
【図７】コントロール植物及び配列番号:86を発現する改変タバコ植物に由来する上部切取り後2週間の腋生シュートの総新鮮重量を示すグラフである（配列番号:86は配列番号:1を標的として阻害するRNAi構築物である）。独立した6つの改変タバコ系統のデータが示される。改変植物は、コントロール植物と比較して吸枝質量の増加を示す。
【図８】配列番号:95を発現する改変タバコ植物の写真を示す（配列番号:95は配列番号:35を標的として阻害するRNAi構築物である）。改変植物は上部切取り前に吸枝の伸長を示す。矢印は吸枝を示す。
【図９】コントロールタバコ植物及び配列番号:101を発現する3つの独立系統の改変タバコ植物の写真を示す（配列番号:101はタバコCENTRORADIALIS（配列番号:108−110）を標的とするRNAi構築物である）。写真は、上部切取り後1週間の植物の頂端（上パネル）又は完全な植物（下パネル）を示す。改変植物で吸枝の成長は低下する。
【図１０】コントロールタバコ植物及び配列番号:96を発現する改変タバコ植物の写真を示す（配列番号:96は配列番号:49を標的として阻害するRNAi構築物である）。改変タバコ植物は、コントロール植物と比較して吸枝の成長の低下（矢印）を示す。
【図１１】β-グルクロニダーゼに融合させたプロモーターP1（配列番号:113）の発現パターンであって、上部切取り時（0時間）のタバコシュート頂端分裂組織（SAM）におけるパターン、並びに上部切取り後0時間、24時間及び72時間の腋芽におけるパターンを示す。黒いGUS蓄積領域はプロモーターP1が活動的である場所を示す。プロモーターP1はシュート頂芽及び腋芽の両方で機能する。
【図１２】タバコの苗木、タバコの苗木のシュート頂端分裂組織（SAM）、上部切取り時（0時間）の成熟SAM、並びに上部切取り時、上部切取り後3日、5日及び7日の腋芽における、β-グルクロニダーゼ（GUS）に融合させたプロモーターP11（配列番号:116）の発現パターンを示す。黒いGUS蓄積領域はプロモーターP11が活動的である場所を示す。プロモーターP11の活性は上部切取り前の腋芽で弱く、上部切取り後3日の腋芽でより高い。プロモーターP11の活性は上部切取り後5及び7日までに低下した。プロモーターP11はまた上部切取り前のSAMで活動的である。GUS染色は苗木では検出されない。
【図１３Ａ】β-グルクロニダーゼ（GUS）に融合させたプロモーターP15（配列番号:117）のタバコにおける発現パターンを示す。黒いGUS蓄積領域はプロモーターP15が活動的である場所を示す。図13Aは、タバコの苗木、タバコの苗木のシュート頂端分裂組織（SAM）、上部切取り時（0時間）の成熟SAM、並びに上部切取り時、上部切取り後3日、5日、7日及び15日の腋芽におけるプロモーターP15の活性を示す。プロモーターP15は苗木では活動的ではない。プロモーターP15はSAMの基部で活動的であるが、花の分裂組織では活動的ではない。プロモーターP15は上部切取り前の腋芽で強い活性を示し、当該活性は上部切取り後少なくとも15日間維持される。
【図１３Ｂ】β-グルクロニダーゼ（GUS）に融合させたプロモーターP15（配列番号:117）のタバコにおける発現パターンを示す。黒いGUS蓄積領域はプロモーターP15が活動的である場所を示す。図3BはさらにプロモーターP15の腋芽特異性を示す。図13Bは、上部切取り時（0時間）、上部切取り後7日及び10日にプロモーターP15によって駆動されるGUS発現を示す。独立した2つの改変タバコ系統に由来する腋芽の例示的GUS染色が各々の時点で示される。図13Cは、上部切取り時（0時間）、上部切取り後24時間及び72時間における個々の植物に由来する複数の腋芽のGUS染色を示す。
【図１３Ｃ】β-グルクロニダーゼ（GUS）に融合させたプロモーターP15（配列番号:117）のタバコにおける発現パターンを示す。黒いGUS蓄積領域はプロモーターP15が活動的である場所を示す。図13Cは、上部切取り時（0時間）、上部切取り後24時間及び72時間における個々の植物に由来する複数の腋芽のGUS染色を示す。
【図１４】緑色蛍光タンパク質（GFP）融合腋芽特異的プロモーターの活性を提示する顕微鏡写真を示す。図14Aは、シュート頂端分裂組織（SAM）及び腋芽（左パネル）並びに腋芽（右パネル）におけるプロモーターP15（配列番号:117）::GFP融合物の結果を示す。プロモーターP15の活性は腋芽に制限される。図14Bは、シュート頂端分裂組織（SAM）及び腋芽（左パネル）並びに腋芽（右パネル）におけるプロモーターP1（配列番号:113）::GFP融合物の結果を示す。
【図１５】β-グルクロニダーゼ（GSU）融合腋芽チオニンプロモーター（pABTh、配列番号:118）の上部切取り時（0時間）及び上部切取り後30時間のタバコの頂端分裂組織及び腋生分裂組織における発現パターンを示す。黒いGUS蓄積領域はプロモーターP15が活動的である場所を示す。
【図１６】プロモーターP1（配列番号:113）、プロモーターP15（配列番号:117）及びプロモーターpABTh（配列番号:118）におけるcis-調節エレメントの位置を示す。+1は転写開始部位を示す。
【図１７】コントロールタバコ植物及び改変タバコ植物の写真を示す。前記改変タバコ植物は、配列番号:81（アラビドプシス・タリアナBRANCHED1をコードし、吸枝の成長を阻害する）及び配列番号:101（タバコのCENTRORADIALISを標的とし吸枝の成長を低下させるRNAi）（前記は腋芽特異的プロモーターP15（配列番号:117）によって駆動される）を発現する。上部切取り後8日及び15日の植物が示される。改変植物は、コントロール植物と比較して吸枝の成長の低下を示す（矢印）。
【図１８】上部切取り後8日のコントロール植物及び改変タバコ植物（プロモーターP15（配列番号:117）の制御下で配列番号:59（ニコチアナ・タバクムサイトキニンオキシダーゼ13）を発現する）の写真を示す。改変植物は、コントロール植物と比較して吸枝の成長の低下を示す（矢印）。
【図１９】コントロール植物及び2つの独立系統の改変タバコ植物（プロモーターP15（配列番号:117）の制御下で配列番号:79（バルナーゼ）を発現する）の写真を示す。改変植物は、コントロール植物と比較して吸枝の成長の低下を示す（矢印）。改変植物の上部を切り取る前には腋生分裂組織の原基は認められない。
【図２０Ａ】コントロール植物及び2つの独立系統の改変タバコ植物の写真を示す。前記改変タバコ植物は、プロモーターP15（配列番号:117）の制御下で配列番号:79（バルナーゼ）を発現する。改変植物は、コントロール植物と比較して上部切取り1週間後（図20A）、2週間後（図20B）及び3週間後（図20C）に吸枝の成長の低下を示す（矢印）。
【図２０Ｂ】コントロール植物及び2つの独立系統の改変タバコ植物の写真を示す。前記改変タバコ植物は、プロモーターP15（配列番号:117）の制御下で配列番号:79（バルナーゼ）を発現する。改変植物は、コントロール植物と比較して上部切取り1週間後（図20A）、2週間後（図20B）及び3週間後（図20C）に吸枝の成長の低下を示す（矢印）。
【図２０Ｃ】コントロール植物及び2つの独立系統の改変タバコ植物の写真を示す。前記改変タバコ植物は、プロモーターP15（配列番号:117）の制御下で配列番号:79（バルナーゼ）を発現する。改変植物は、コントロール植物と比較して上部切取り1週間後（図20A）、2週間後（図20B）及び3週間後（図20C）に吸枝の成長の低下を示す（矢印）。
【図２１】実施例15に記載するようにアグロインフィルトレーションに付したタバコの葉の写真を示す。配列番号:79（バルナーゼ）を発現するベクターを陽性コントロールとして用い、挿入物を欠くベクター（空ベクター）を陰性コントロールとして用いる。実施例15にしたがって対象の遺伝子の細胞死をタバコの葉で誘発する能力を試験する。例えば、配列番号:232は、タバコの葉で発現されるときに細胞死を引き起こす。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
特段の規定がなければ、本明細書で用いられる技術用語及び学術用語は、当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。本開示の実施で多くの方法を用いえることは当業者には理解されるであろう。実際、本開示は記載した方法論及び材料に全く限定されない。本開示の目的のために、以下の用語は下記のように規定される。
本明細書で用いられるように、単数形“a”、“an”及び“the”は、文脈が明瞭にそうでないことを指示しない限り複数の対応語を含む。例えば、“a compound（1つの化合物）”、又は“at least one compound（少なくとも1つの化合物）”は、複数の化合物（化合物の混合物を含む）を含むことができる。
“約”という用語は、大体、おおざっぱ、その周辺又は近くであることを意味するために本明細書で用いられる。“約”という用語がある数字域と一緒に用いられるとき、前記用語は、提示の数値の上下の境界を拡張することによって当該範囲を修正する。
【００１５】
本明細書で用いられるように、タバコ植物はニコチアナ・タバクム属の任意の植物に由来し得る。前記植物には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：ニコチアナ・タバクム・タバクム（Nicotiana tabacum tabacum）；ニコチアナ・タバクム・アンプレキシカウリス（amplexicaulis）PI 271989；ニコチアナ・タバクム・ベンタミアナ（benthamiana）PI 555478；ニコチアナ・タバクム・ビゲロヴィイ（bigelovii）PI 555485；ニコチアナ・タバクム・デブネイイ（debneyi）；ニコチアナ・タバクム・エクセルシア（excelsior）PI 224063；ニコチアナ・タバクム・グルチノサ（glutinosa）PI 555507；ニコチアナ・タバクム・グードスペーディイ（goodspeedii）PI 241012；ニコチアナ・タバクム・ゴッセイ（gossei）PI 230953；ニコチアナ・タバクム・ヘスペリス（hesperis）PI 271991；ニコチアナ・タバクム・クナイチアナ（knightiana）PI 555527；ニコチアナ・タバクム・マリチマ（maritima）PI 555535；ニコチアナ・タバクム・メガロスピフォン（megalosiphon）PI 555536；ニコチアナ・タバクム・ヌーディカウリス（nudicaulis）PI 555540；ニコチアナ・タバクム・パニクラタ（paniculata）PI 555545；ニコチアナ・タバクム・プルムバギニフォリア（plumbaginifolia）PI 555548；ニコチアナ・タバクム・レパンダ（repanda）PI 555552；ニコチアナ・タバクム・ルスチカ（rustica）；ニコチアナ・タバクム・スアベオレンス（suaveolens）PI 230960；ニコチアナ・タバクム・シルベストリス（sylvestris）PI 555569；ニコチアナ・タバクム・トメントサ（tomentosa）PI 266379；ニコチアナ・タバクム・トメントシフォルミス（tomentosiformis）及びニコチアナ・タバクム・トリゴノフィラ（trigonophylla）PI 555572。
【００１６】
ある特徴では、本開示は、改変されたタバコ植物、種子、植物成分、植物細胞、並びに改変タバコ植物、種子、植物部分及び植物細胞から調製される製品に関連する方法及び組成物を提供する。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物、種子、植物成分、植物細胞又は植物ゲノムは、本明細書で提供される組換えDNA構築物を含む。別の特徴では、本明細書で提供される乾燥（cured）タバコ素材又はタバコ製品は、本明細書で提供される改変タバコ植物、植物成分、植物細胞又は植物ゲノムを含む。
本明細書で用いられるように、“改変されている”とは、変異誘導、ゲノム編集、遺伝的形質転換、又は前記の組み合わせに付された植物、種子、植物成分、植物細胞及び植物ゲノムを指す。
ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、類似の条件下で育成したときの同じ変種のコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長が存在しないか又は低下を示す。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、類似の条件下で育成したときの同じ変種のコントロールタバコ植物と比較して、上部切取りにより誘発される吸枝成長が存在しないか又は低下を示す。さらにまた改変タバコ植物を作出する方法が提供され、前記改変タバコ植物は、類似の条件下で育成したときの同じ変種のコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長が存在しないか又は低下を示す。ある特徴では、本明細書で提供される方法は、類似の条件下で育成したときの同じ変種のコントロールタバコ植物と比較して、上部切取り誘発吸枝成長が存在しないか又は低下を示す改変タバコ植物を生じる。
【００１７】
本明細書で用いられるように、“シスジェネシス”又は“シスジェニック”は、植物、植物細胞又は植物ゲノムの遺伝的改変を指し、この場合、すべての成分（例えばプロモーター、ドナー核酸、選別遺伝子）は植物にのみ由来する（すなわち非植物起原の成分は用いられない）。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物、植物細胞又は植物ゲノムはシスジェニックである。本明細書で提供されるシスジェニックな植物、植物細胞及び植物ゲノムはすぐに使える系統をもたらすことができる。別の特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、非タバコ遺伝物質又は配列を含まない。
本明細書で用いられるように、“吸枝成長”とは、葉と軸の間で成長する腋生分裂組織から生じる腋芽（又は側芽）の発生及び/又は成長を指す。腋芽は、腋生分裂組織、周辺の葉の組織及び周辺の茎組織を含む胚性シュートである。ある特徴では、吸枝生長は植物の上部を切り取ることによって誘発される。
本明細書で用いられるように、“上部切取り”とは、植物が成熟に近づいた時の軸頂端（SAM、花及び数枚までの隣接する葉を含む）の除去を指す。タバコ植物の上部切取りは頂芽優勢の消失をもたらす。上部切取り前には、吸枝成長はSAMから生じるホルモンシグナルによってほとんど休眠状態で維持される。上部切取りはこのホルモンシグナルを除去し、吸枝を伸長させることができる（上部切取り誘発吸枝成長）。吸枝成長の十分な制御を条件として、上部切取りは収量を増し、1エーカー当たりの価値を増加させ、タバコの葉の物理的及び化学的特性に所望の改変をもたらす。
【００１８】
本明細書で用いられるように、“類似の育成条件”とは、2つ以上の植物遺伝子型における成長及び有意義な比較のための同様な環境条件及び/又は農作業を指し、したがっていずれの環境条件又は農作業も、当該2つ以上の植物遺伝子型間で観察される一切の相違に対して影響を与えず又はその説明とならない。環境条件には、例えば光、温度、水、湿度、及び栄養（例えば窒素及びリン）が含まれる。農作業には、例えば苗木管理、刈込み、下部切取り、移植、上部切取り及び吸枝成長が含まれる。以下を参照されたい：Chapters 4B and 4C of Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford (1999), pp.70-103。
本明細書で用いられるように、“上部切取り誘発吸枝成長の低下”とは、類似の条件下で育成したときのコントロール植物と比較して、吸枝の数の減少、吸枝（例えばバイオマス）のサイズの減少、及び/又は吸枝成長が農業生産性（例えば収量、品質及び植物の全体的生産力）に対して有する影響の減少を指す。本明細書で用いられるように、吸枝の数、吸枝のサイズ、及び/又は吸枝が農業生産性に対して有する影響の“減少”とは統計的に有意な減少を指す。本明細書で用いられるように、“統計的に有意”とは、統計的有意の適切な測定（例えば片側2サンプルｔ検定）を用いたとき、0.05未満のp値、0.025未満のp値、0.01未満のp値、又は0.001未満のp値を指す。
本開示は、所望の又は強化された特性（例えば上部切取り前又は後の吸枝成長の阻害又は低下）を有する改変タバコ植物を提供する。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物は、類似の条件下で育成したときのそのような改変を欠くコントロール植物と比較してより低い吸枝総量、より小さな吸枝、又はその両方を含む。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物のより小さな吸枝は、類似の条件下で育成したコントロールの吸枝と比較して質量の減少、長さの減少、直径の減少又は前記の組合せを含む。吸枝の直径は吸枝の基部で測定される（当該基部で吸枝は植物の主茎と隣り合う）。
【００１９】
ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物の吸枝の質量は、類似の条件下で育成した非改変コントロールタバコ植物の吸枝の質量と比較して、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％減少する。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物の吸枝の質量は、類似の条件下で育成した非改変コントロールタバコ植物の吸枝の質量と比較して、1％−25％、1％−50％、1％−75％、1％−100％、5％−25％、5％−50％、5％−75％、5％−100％、10％−25％、10％−50％、10％−75％、10％−100％、25％−50％、25％−75％、25％−100％、50％−75％、又は50％−100％減少する。別の特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物の吸枝の長さは、類似の条件下で育成した非改変コントロールタバコ植物の吸枝の長さと比較して、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％減少する。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物の吸枝の長さは、類似の条件下で育成した非改変コントロールタバコ植物の吸枝の長さと比較して、1％−25％、1％−50％、1％−75％、1％−100％、5％−25％、5％−50％、5％−75％、5％−100％、10％−25％、10％−50％、10％−75％、10％−100％、25％−50％、25％−75％、25％−100％、50％−75％、又は50％−100％減少する。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物の吸枝の直径は、類似の条件下で育成した非改変コントロールタバコ植物の吸枝の直径と比較して、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％減少する。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物の吸枝の直径は、類似の条件下で育成した非改変コントロールタバコ植物の吸枝の直径と比較して、1％−25％、1％−50％、1％−75％、1％−100％、5％−25％、5％−50％、5％−75％、5％−100％、10％−25％、10％−50％、10％−75％、10％−100％、25％−50％、25％−75％、25％−100％、50％−75％、又は50％−100％減少する。
【００２０】
別の特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、類似の条件下で育成した非改変コントロールタバコ植物と比較して、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも10、少なくとも15、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、又は少なくとも60少ない吸枝総量を含む。別の特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、類似の条件下で育成した非改変コントロールタバコ植物と比較して、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％少ない吸枝を含む。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物の吸枝の数は、類似の条件下で育成した非改変コントロールタバコ植物の吸枝の数と比較して、1％−25％、1％−50％、1％−75％、1％−100％、5％−25％、5％−50％、5％−75％、5％−100％、10％−25％、10％−50％、10％−75％、10％−100％、25％−50％、25％−75％、25％−100％、50％−75％、又は50％−100％減少する。
シュート頂端分裂組織及び腋生分裂組織は、2つの主な機能（一群の多能性細胞としてそれら自体を維持すること及び植物の側生地上器官（例えば茎、葉、花）を発生させること）を有する。ある分裂組織がそれ自体の維持に失敗した場合、当該分裂組織は最終的にはその多能性細胞を使い果たし追加の器官の発生は停止するであろう。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、類似の条件下で育成したときの同じ変種のコントロール植物と比較して、腋生分裂組織の成長の阻害又は停止、腋生分裂組織の維持の阻害又は停止、又は前記の組合せを示す。
【００２１】
ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、類似条件下で育成したときのコントロールタバコ植物と比較して葉の収量が同様か又は多い。ある特徴では、葉の収量は、新鮮収量、乾燥収量及び加工収量から成る群から選択される。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は葉の収量において、類似条件下で育成したときのコントロールタバコ植物と比較して、約50％以内、約45％以内、約40％以内、約35％以内、約30％以内、約25％以内、約20％以内、約15％以内、約10％以内、約5％以内、約4％以内、約3％以内、約2％以内、約1％以内、又は約0.5％以内の質量を産出する。別の特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は葉の収量において、類似の条件下で育成したときのコントロールタバコ植物と比較して、少なくとも0.25％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、又は100％を超える質量を産出する。別の特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は葉の収量において、類似の条件下で育成したときのコントロールタバコ植物と比較して、0.25％−100％、0.5％−100％、1％−100％、2.5％−100％、5％−100％、10％−100％、15％−100％、20％−100％、25％−100％、30％−100％、40％−100％、50％−100％、60％−100％、70％−100％、80％−100％、90％−100％、100％−200％、100％−175％、100％−150％、100％−125％、0.25％−50％、0.5％−50％、1％−50％、2.5％−50％、5％−50％、10％−50％、15％−50％、20％−50％、25％−50％、30％−50％、40％−50％、50％−200％、50％−175％、50％−150％、50％−125％、0.25％−25％、0.5％−25％、1％−25％、2.5％−25％、5％−25％、10％−25％、15％−25％、20％−25％、25％−200％、25％−175％、25％−150％、又は25％−125％の質量を産出する。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、類似の条件下で育成した非改変コントロールタバコ植物によって産出される葉の数の75％以内、60％以内、50％以内、45％以内、40％以内、35％以内、30％以内、25％以内、20％以内、15％以内、10％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内又は0.5％以内の葉の数を生じる。
【００２２】
ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、類似の条件下で育成したときのコントロールタバコ植物と比較して同様又は類似の植物の高さを有する。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、類似の条件下で育成したときのコントロールタバコ植物と比較して、約50％以内、約45％以内、約40％以内、約35％以内、約30％以内、約25％以内、約20％以内、約15％以内、約10％以内、約5％以内、約4％以内、約3％以内、約2％以内、約1％以内、又は約0.5％以内の高さを有する。別の特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、類似の条件下で育成したときのコントロールタバコ植物と比較して、高さが0.25％、0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、又は100％を超える。別の特徴では、改変タバコ植物は、類似の条件下で育成したときのコントロールタバコ植物と比較して、高さが0.25％−100％、0.5％−100％、1％−100％、2.5％−100％、5％−100％、10％−100％、15％−100％、20％−100％、25％−100％、30％−100％、40％−100％、50％−100％、60％−100％、70％−100％、80％−100％、90％−100％、100％−200％、100％−175％、100％−150％、100％−125％、0.25％−50％、0.5％−50％、1％−50％、2.5％−50％、5％−50％、10％−50％、15％−50％、20％−50％、25％−50％、30％−50％、40％−50％、50％−200％、50％−175％、50％−150％、50％−125％、0.25％−25％、0.5％−25％、1％−25％、2.5％−25％、5％−25％、10％−25％、15％−25％、20％−25％、25％−200％、25％−175％、25％−150％、又は25％−125％である。
【００２３】
ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、類似の条件下で育成したときのコントロールタバコ植物と比較して、同様であるか又は高いUSDA等級インデックス値を有する葉を産出する。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、類似の条件下で育成したときのコントロールタバコ植物と比較して、約50％以内、約45％以内、約40％以内、約35％以内、約30％以内、約25％以内、約20％以内、約15％以内、約10％以内、約5％以内、約4％以内、約3％以内、約2％以内、約1％以内、又は約0.5％以内のUSDA等級インデックス値を有する葉を産出する。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、55以上、60以上、65以上、70以上、75以上、80以上、85以上、90以上、又は95以上のUSDA等級インデックス値を有する葉を産出することができる。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、類似の条件下で育成したときのコントロールタバコ植物と比較して、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50又は50ユニットより高いUSDA等級インデックス値を有する葉を産出する。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、類似の条件下で育成したときのコントロールタバコ植物と比較して、USDA等級インデックス値が1−50、1−45、1−40、1−35、1−30、1−29、1−28、1−27、1−26、1−25、1−24、1−23、1−22、1−21、1−20、1−19、1−18、1−17、1−16、1−15、1−14、1−13、1−12、1−11、1−10、1−9、1−8、1−7、1−6、1−5、1−4、1−3、1−2、2−50、2−15、2−40、2−35、2−30、2−29、2−28、2−27、2−26、2−25、2−24、2−23、2−22、2−21、2−20、2−19、2−18、2−17、2−16、2−15、2−14、2−13、2−12、2−11、2−10、2−9、2−8、2−7、2−6、2−5、2−4、2−3、3−50、3−45、3−40、3−35、3−30、3−29、3−28、3−27、3−26、3−25、3−24、3−23、3−22、3−21、3−20、3−19、3−18、3−17、3−16、3−15、3−14、3−13、3−12、3−11、3−10、3−9、3−8、3−7、3−6、3−5、3−4、4−50、4−45、4−40、4−35、4−30、4−29、4−28、4−27、4−26、4−25、4−24、4−23、4−22、4−21、4−20、4−19、4−18、4−17、4−16、4−15、4−14、4−13、4−12、4−11、4−10、4−9、4−8、4−7、4−6、4−5、5−50、5−45、5−40、5−35、5−30、5−29、5−28、5−27、5−26、5−25、5−24、5−23、5−22、5−21、5−20、5−19、5−18、5−17、5−16、5−15、5−14、5−13、5−12、5−11、5−10、5−9、5−8、5−7、5−6、10−50、10−40、10−30、10−20、20−50、20−30、20−40、又は20−30ユニットより高い葉を産出する。
【００２４】
タバコの等級は以下を含む要件（ただしこれらに限定されない）を基準に評価される：葉軸の位置、葉のサイズ、葉の色、葉の均質性及び完全性、熟度、手触り、弾力、光沢（葉の着色の濃さ及び深さとともに輝きに関係する）、吸湿性（タバコの葉の周囲水分を吸収及び保持する能力）、及び緑色の色合い又は外観。葉の等級は、例えば以下が公表する公式標準等級を用いて決定できる（Agricultural Marketing Service of the US Department of Agriculture（7 U.S.C.§511））。例えば以下を参照されたい：Official Standard Grades for Burley Tobacco（U.S.Type 31 and Foreign Type 93）、1990年11月5日実施（55 F.R.40645）；Official Standard Grades for Flue-Cured Tobacco （U.S.Types 11, 12, 13, 14 and Foreign Type 92）、1989年3月27日実施（54 F.R.7925）；Official Standard Grades for Pennsylvania Seedleaf Tobacco（U.S.Type 41）、1965年1月8日実施（29 F.R.16854）；Official Standard Grades for Ohio Cigar-Leaf Tobacco（U.S.Types 42, 43, and 44）、1963年12月8日実施（28 F.R.11719 and 28 F.R.11926）；Official Standard Grades for Wisconsin Cigar-Binder Tobacco（U.S.Types 54 and 55）、1969年11月20日実施（34 F.R.17061）；Official Standard Grades for Wisconsin Cigar-Binder Tobacco（U.S.Types 54 and 55）、1969年11月20日実施（34 F.R.17061）；Official Standard Grades for Georgia and Florida Shade-Grown Cigar-Wrapper Tobacco（U.S.Type 62）、1971年4月1日実施。USDA等級インデックス値は業界受け入れ等級インデックスにしたがって決定できる。例えば以下を参照されたい：Bowman et al, Tobacco Science, 32:39-40, 1988；Legacy Tobacco Document Library（Bates Document #523267826-523267833, July 1, 1988, Memorandum on the Proposed Burley Tobacco Grade Index）；及びMiller et al., 1990, Tobacco Intern., 192:55-57（前述のすべての参考文献は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。また別には、葉の等級はハイパースペクトラルイメージングにより決定できる。例えばWO 2011/027315（2011年3月10日公開）を参照されたい（前記はその全体が本明細書に含まれる）。
【００２５】
ある特徴では、本明細書で提供される改変植物は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物と比較して吸枝成長の制御のための管理の軽減を要求する。本明細書で用いられるように、“管理”とは、手作業による吸枝の除去、吸枝の阻害又は除去のための化学薬剤（例えばマレイン酸ヒドラジド、フルメトラリン）の適用、又はその両方を指す。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物は、類似の条件下で育成したコントロール植物と比較して、手作業による吸枝の除去の頻度の軽減、化学薬剤適用の頻度の軽減、化学薬剤適用の量の削減、又は前記の組み合わせを要求する。例えば以下を参照されたい：Fisher et al.“Topping, Managing Suckers, and Using Ethephon,” pages 96-117 In: 2016 Flue-Cured Tobacco Information, North Carolina State University（前記は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物の手作業吸枝除去の頻度の10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、又は95％を要求する。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物の手作業吸枝除去の頻度の10％未満、20％未満、30％未満、40％未満、50％未満、60％未満、70％未満、75％未満、80％未満、85％未満、90％未満、又は95％未満を要求する。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物の手作業吸枝除去の頻度の10％−95％、20％−95％、30％−95％、40％−95％、50％−95％、60％−95％、70％−95％、80％−95％、85％−95％、90％−95％、10％−50％、20％−50％、30％−50％、40％−50％、10％−20％、10％−30％、10％−40％、10％−50％、10％−60％、10％−70％、10％−80％、10％−85％、又は10％−90％を要求する。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物は、吸枝成長の制御のために、類似の条件下で育成したときのコントロール植物の化学薬剤適用の頻度の10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、又は95％を要求する。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物は、吸枝成長の制御のために、類似の条件下で育成したときのコントロール植物の化学薬剤適用の頻度の10％未満、20％未満、30％未満、40％未満、50％未満、60％未満、70％未満、75％未満、80％未満、85％未満、90％未満、又は95％未満を要求する。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物は、吸枝成長の制御のために、類似の条件下で育成したときのコントロール植物の化学薬剤適用の頻度の10％−95％、20％−95％、30％−95％、40％−95％、50％−95％、60％−95％、70％−95％、80％−95％、85％−95％、90％−95％、10％−50％、20％−50％、30％−50％、40％−50％、10％−20％、10％−30％、10％−40％、10％−50％、10％−60％、10％−70％、10％−80％、10％−85％、又は10％−90％を要求する。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物で吸枝成長の制御に用いられる化学薬剤スプレー体積の10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、又は95％を要求する。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物で吸枝成長の制御に用いられる化学薬���スプレー体積の10％未満、20％未満、30％未満、40％未満、50％未満、60％未満、70％未満、75％未満、80％未満、85％未満、90％未満、又は95％未満を要求する。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物の化学薬剤スプレー体積の10％−95％、20％−95％、30％−95％、40％−95％、50％−95％、60％−95％、70％−95％、80％−95％、85％−95％、90％−95％、10％−50％、20％−50％、30％−50％、40％−50％、10％−20％、10％−30％、10％−40％、10％−50％、10％−60％、10％−70％、10％−80％、10％−85％、又は10％−90％未満を要求する。
【００２６】
特段の規定がなければ、タバコ植物、変種、栽培品種又は系統に関して本明細書に記載する吸枝の長さ、吸枝の質量、吸枝の数、葉の収量、又は葉の等級インデックス値の測定値は平均測定値を指し、前記は、例えばただ1つの植物の複数の葉（例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又は21以上葉）の平均、又はただ1つの変種、栽培品種もしくは系統に由来するタバコ植物集団の平均測定値を含む。平均測定値（例えば新鮮重量又は葉の等級）を決定するためのタバコ植物集団又はタバコの葉の収集物は、任意のサイズ（例えば5、10、15、20、25、30、40、又は50）であり得る。業界に受け入れられた標準プロトコルにしたがって平均測定値又は等級インデックス値が決定される。
【００２７】
ある特徴では、改変植物又は葉は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物と比較して同様な化学プロフィールを有する。葉の化学プロフィールは、タバコ植物又はタバコの葉のアルカロイド（例えばニコチン、ノルニコチン、アナバシン、アナタビン）、リンゴ酸及び還元糖（例えばデキストロース）の量又は前記の組合せを含むが、ただしこれらに限定されない。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物又は葉は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物の総アルカロイドレベルの約50％以内、約45％以内、約40％以内、約35％以内、約30％以内、約25％以内、約20％以内、約15％以内、約10％以内、約5％以内、約4％以内、約3％以内、約2％以内、約1％以内、又は約0.5％以内の総アルカロイドレベルを含む。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物又は葉は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物のニコチンレベルの約50％以内、約45％以内、約40％以内、約35％以内、約30％以内、約25％以内、約20％以内、約15％以内、約10％以内、約5％以内、約4％以内、約3％以内、約2％以内、約1％以内、又は約0.5％以内のニコチンレベルを含む。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物又は葉は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物のノルニコチンレベルの約50％以内、約45％以内、約40％以内、約35％以内、約30％以内、約25％以内、約20％以内、約15％以内、約10％以内、約5％以内、約4％以内、約3％以内、約2％以内、約1％以内、又は約0.5％以内のノルニコチンレベルを含む。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物又は葉は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物のアナバシンレベルの約50％以内、約45％以内、約40％以内、約35％以内、約30％以内、約25％以内、約20％以内、約15％以内、約10％以内、約5％以内、約4％以内、約3％以内、約2％以内、約1％以内、又は約0.5％以内のアナバシンレベルを含む。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物又は葉は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物のアナタビンレベルの約50％以内、約45％以内、約40％以内、約35％以内、約30％以内、約25％以内、約20％以内、約15％以内、約10％以内、約5％以内、約4％以内、約3％以内、約2％以内、約1％以内、又は約0.5％以内のアナタビンレベルを含む。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物又は葉は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物のリンゴ酸レベルの約50％以内、約45％以内、約40％以内、約35％以内、約30％以内、約25％以内、約20％以内、約15％以内、約10％以内、約5％以内、約4％以内、約3％以内、約2％以内、約1％以内、又は約0.5％以内のリンゴ酸レベルを含む。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物又は葉は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物の還元糖レベルの約50％以内、約45％以内、約40％以内、約35％以内、約30％以内、約25％以内、約20％以内、約15％以内、約10％以内、約5％以内、約4％以内、約3％以内、約2％以内、約1％以内、又は約0.5％以内の還元糖レベルを含む。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物又は葉は、類似の条件下で育成したときのコントロール植物のデキストロースレベルの約50％以内、約45％以内、約40％以内、約35％以内、約30％以内、約25％以内、約20％以内、約15％以内、約10％���内、約5％以内、約4％以内、約3％以内、約2％以内、約1％以内、又は約0.5％以内のデキストロースレベルを含む。
【００２８】
ある特徴では、本明細書で提供される改変植物又は葉は、コントロール植物と比較して吸枝が存在しないか又は減少し、さらに類似の条件下で育成したときのコントロール植物のニコチンレベルよりも少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、又は少なくとも99.9％低いニコチンレベルを含む。
ある特徴では、本明細書で提供される植物成分には、葉、茎、根、種子、花、花粉、葯、胚珠、小花柄、果実、分裂組織、子葉、胚軸、莢、胚、内乳、外植片、カルス、組織培養、シュート、細胞及びプロトプラストが含まれる（ただしこれらに限定されない）。さらに別の特徴では、本開示は、繁殖材料ではなく、かつ植物の天然の繁殖を媒介しないタバコ植物細胞、組織及び器官を提供する。別の特徴では、本開示はまた、繁殖材料であり、かつ植物の天然の繁殖を媒介するタバコ植物細胞、組織及び器官を提供する。別の特徴では、本開示は、光合成を介してそれら自体を維持することができないタバコ植物細胞、組織及び器官を提供する。別の特徴では、本開示はタバコ植物の体細胞を提供する。体細胞は、生殖系列細胞とは対照的に植物の繁殖を媒介しない。
提供される細胞、組織及び器官は、種子、果実、葉、子葉、胚軸、分裂組織、胚、内乳、根、シュート、茎、莢、花、花序、軸、小花柄、花柱、柱頭、花托、花弁、萼、花粉、葯、花糸、子房、胚珠、果皮、篩管部及び維管束組織に由来し得る。別の特徴では、本開示は、タバコ植物の葉緑体を提供する。さらに別の特徴では、本開示は、表皮細胞、気孔細胞、葉毛（毛状突起）、根毛又は貯蔵根を提供する。別の特徴では、本開示はタバコのプロトプラストを提供する。
タバコ植物は天然には種子により繁殖し、無性生殖又は栄養繁殖で繁殖しないことは当業者には理解される。ある特徴では、本開示はタバコの内乳を提供する。別の特徴では、本開示はタバコの内乳細胞を提供する。さらに別の特徴では、本開示は、人間の介入がなければ繁殖できない無菌的雄性又は雌性植物細胞を提供する。
【００２９】
ある特徴では、本明細書で提供される植物、種子、植物部分又は植物細胞は天然には出現しない1つ以上の変異を含む。ある特徴では、本明細書で提供される変異は植物の吸枝成長を抑制する。別の特徴では、本明細書で提供される変異は植物の上部切取り誘発吸枝成長を抑制する。さらに別の特徴では、本明細書で提供される変異は上部切取り前に植物で吸枝成長を抑制する。本明細書で提供される変異のタイプには、例えば置換（点変異）、れる変異は植物の上部切取り誘発吸枝成長を抑制する。本明細書で提供される変異のタイプには、例えば置換（点変異）、欠失、挿入、重複及び倒置が含まれる。そのような変異は望ましくは遺伝子のコード領域に存在するが、しかしながらプロモーターもしくは他の調節領域、イントロン、イントロン-エクソン境界又は遺伝子の非翻訳領域の変異もまた所望し得る。
【００３０】
ある特徴では、本明細書で提供される方法は、変異誘導を用いて吸枝成長が低下したタバコ植物を産出することができる。変異誘導の方法には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：化学的変異誘導、例えばメチル硫酸エチル（EMS）による種子の処理（Hildering and Verkerk, In, The use of induced mutations in plant breeding.Pergamon Press, pp.317-320, 1965）；又はUV照射、X-線、電子ビーム、イオンビーム（例えば炭素イオンビーム、ヘリウムイオンビーム、ネオンイオンビーム）、及び高速ニュートロン照射（例えば以下を参照されたい：Verkerk, Neth.J.Agric.Sci.19:197-203, 1971；Poehlman, Breeding Field Crops, Van Nostrand Reinhold, New York (3.sup.rd ed.), 1987；及びTanaka, J.Radiat.Res.51:223-233, 2010）；トランスポゾンタッギング（Fedoroff et al., 1984; U.S.Pat.No.4,732,856 and U.S.Pat.No.5,013,658）；及びT-DNA挿入方法論（Hoekema et al., 1983; U.S.Pat.No.5,149,645）。EMS誘発-変異誘導は、ゲノム全長にわたってランダム点変異を化学的に導入することから成る。高速ニュートロン変異誘導は、二本鎖DNA断裂を介して大きな欠失を引き起こすニュートロンボンバードメントに種子を暴露することから成る。トランスポゾンタッグ付加は、内因性遺伝子内にトランスポゾンを挿入して当該遺伝子の発現を排除する工程を含む。
【００３１】
加えて、化学的に誘導した変異のスクリーニングのための迅速で自動化可能な方法、TILLING（ゲノム内標的指定局所誘導傷害（Targeting Induced Local Lesions In Genomes））（選択したPCR生成物の変性HPLC又は選択的エンドヌクレアーゼ消化を用いる）もまた本開示に適用できる（以下を参照されたい：McCallum et al.(2000) Nat.Biotechnol.18:455-457）。本明細書で提供される遺伝子発現に影響を与えるか又は遺伝子の機能に干渉する変異は、当業界で周知の方法を用いて決定できる。遺伝子のエクソンの挿入変異は通常ヌル変異体をもたらす。保存残基の変異はタンパク質の機能の阻害に特に有効であり得る。
変異を導入したタバコ植物のスクリーニング及び選別は当業者に公知の任意の方法論によることができる。スクリーニング及び選別の方法論の例には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：サザン分析、ヌクレオチド検出用PCR増幅、ノザンブロット、RNase保護、プライマー伸長、RNA転写物検出用RT-PCR増幅、サンガーシーケンシング、次世代シーケンシング技術（例えばIllumina, PacBio, Ion Torrent, 454）、ポリペプチド及びポリヌクレオチドの酵素活性又はリボザイム活性を検出するために酵素アッセイ、並びにタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、免疫沈澱、及びポリペプチドを検出するための酵素連結免疫アッセイ。他の技術、例えばin situハイブリダイゼーション、酵素染色、及び免疫染色もまた、ポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドの存在又は発現の検出に用いることができる。言及した技術のいずれの実施方法も公知である。
【００３２】
ある特徴では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドと比較して少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10、又は少なくとも10を超える変異を含む。別の特徴では、本明細書で提供される変異は、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252及び254から成る群から選択されるポリヌクレオチド内に位置する。ある特徴では、本明細書で提供される変異は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド内に位置する。
【００３３】
ある特徴では、本明細書で提供される植物ゲノムは、メガヌクレアーゼ、ジンク-フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、CRISPR/Cas9ヌクレアーゼ又はCRISPR/Cpf1ヌクレアーゼから成る群から選択されるヌクレアーゼによって変異を生じる（編集される）。別の特徴では、本明細書で提供される植物ゲノムは、CRISPR/CasX又はCRISPR/CasYヌクレアーゼによって変異を生じる。本明細書で用いられるように、“編集”又は“ゲノム編集”とは、内因性植物ゲノム核酸配列の少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、もしくは少なくとも10のヌクレオチドの標的指定変異誘導、又は内因性植物ゲノム核酸配列の除去もしくは取替えを指す。ある特徴では、本明細書で提供される編集された核酸配列は、内因性核酸配列と少なくとも99.9％、少なくとも99.5％、少なくとも99％、少なくとも98％、少なくとも97％、少なくとも96％、少なくとも95％、少なくとも94％、少なくとも93％、少なくとも92％、少なくとも91％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、又は少なくとも75％配列同一性を有する。ある特徴では、本明細書で提供される編集核酸配列は、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも99.9％、少なくとも99.5％、少なくとも99％、少なくとも98％、少なくとも97％、少なくとも96％、少なくとも95％、少なくとも94％、少なくとも93％、少なくとも92％、少なくとも91％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、又は少なくとも75％配列同一性を有する。別の特徴では、本明細書で提供される編集核酸配列は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも99.9％、少なくとも99.5％、少なくとも99％、少なくとも98％、少なくとも97％、少なくとも96％、少なくとも95％、少なくとも94％、少なくとも93％、少なくとも92％、少なくとも91％、少なくとも90％、少なくとも85％、少なくとも80％、又は少なくとも75％配列同一性を有する。
【００３４】
ある特徴では、本明細書で提供されるヌクレアーゼは植物ゲノム遺伝子座の編集に用いられ、前記遺伝子座は、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有する配列をコードする。
別の特徴では、本明細書で提供されるヌクレアーゼは植物ゲノム遺伝子座の編集に用いられ、前記遺伝子座は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードする。別の特徴では、本明細書で提供されるヌクレアーゼは植物ゲノム遺伝子座の編集に用いられ、前記遺伝子座は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列類似性を有するポリペプチドをコードする。
【００３５】
メガヌクレアーゼ、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9及びCRISPR/Cpf1は、ゲノム配列の標的部位で二本鎖DNA断裂を誘発し、前記はその後で相同組換え（HR）又は非相同末端結合（NHEJ）の天然のプロセスによって修復される。配列の改変が続いて当該切断部位で生じ、前記改変は、NHEJの場合には遺伝子の破壊をもたらす欠失又は挿入を、HRではドナー核酸配列の組み込みを含むことができる。ある特徴では、本明細書で提供される方法は、本明細書で提供されるヌクレアーゼで植物ゲノムを編集する工程を含み、当該植物ゲノムの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10ヌクレオチド、又は10を超えるヌクレオチドがドナーポリヌクレオチドによりHRを介して変異する。ある特徴では、本明細書で提供される変異は非相同末端結合又は相同組換えによって引き起こされる。
メガヌクレアーゼ（一般的には微生物で確認される）は、高い活性及び長い認識配列（＞14bp）を有する他に類のない酵素であり、標的DNAの位置特異的消化をもたらす。天然には出現しないメガヌクレアーゼの操作型は典型的には延伸されたDNA認識配列を有する（例えば14から40bp）。
【００３６】
ある特徴では、本明細書で提供されるメガヌクレアーゼは、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリヌクレオチドを編集する。別の特徴では、本明細書で提供されるメガヌクレアーゼは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを編集する。別の特徴では、本明細書で提供されるメガヌクレアーゼは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを編集する。
【００３７】
メガヌクレアーゼの操作はZFN及びTALENの操作より困難なことがある。なぜならば、メガヌクレアーゼのDNA認識及び切断機能は1つの単一ドメイン内で絡み合っているからである。変異誘導及び大量処理スクリーニングのための特殊化された方法が、固有の配列を認識し改善されたヌクレアーゼ活性を有する新規なメガヌクレアーゼ変種の作出に用いられている。
ZFNは、FokI制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合されている、操作されたジンクフィンガーDNA結合ドメインから成る。ほぼ任意の長い二本鎖DNAの一続きを切断するようにZFNを設計して、ジンクフィンガーDNA結合ドメインを改変することができる。ZFNは、FokIエンドヌクレアーゼの非特異的DNA切断ドメインを含むモノマーからダイマーを形成し、前記DNA切断ドメインは標的DNA配列と結合するように操作されたジンクフィンガーアレーと融合される。
ZFNのDNA結合ドメインは典型的には3−4のジンクフィンガーアレーを含む。ジンクフィンガー∞-ヘリックスの開始に対して-1、+2、+3及び+6位のアミノ酸（標的DNAとの位置特異的結合に寄与する）を変化させ、特異的な標的配列に適合するようにカスタマイズさせることができる。他のアミノ酸は、種々の配列特異性を有するZFNを作製するためにコンセンサス骨格を形成する。ZFNのための標的配列を選択するルールは当業界で公知である。
FokIヌクレアーゼドメインはDNA切断のためにダイマー化を必要とし、したがってC-末端領域を有する2つのZFNが、切断部位の向かい合うDNA鎖と結合するために必要である（5−7bpによって分離される）。ZFNモノマーは、2ZFN結合部位がパリンドロームである場合、ZFNモノマーは標的部位を切断できる。本明細書で用いられるZFNという用語はおおまかであり、別のZFNの補助なしに二本鎖DNAを切断できるモノマーZFNを含む。ZFNという用語はまた、同じ部位でDNAを切断するために一緒に働くように操作した一対のZFNの一方又は両方のメンバーを指すために用いられる。
いずれの学術的理論にも拘束されないが、ジンクフィンガードメインのDNA結合特異性は原則として多様な方法の1つを用いて再操作され得るので、カスタマイズされたZFNは理論的にほぼ任意の遺伝子配列を標的とするように構築され得る。ジンクフィンガードメインの一般に公開されている操作方法には、コンテキスト依存アッセンブリー（CoDA）、オリゴマー化プール操作（OPEN）及びモデュールアッセンブリーが含まれる。
【００３８】
ある特徴では、本明細書で提供されるZFNは、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリヌクレオチドを編集する。別の特徴では、本明細書で提供されるZFNは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを編集する。別の特徴では、本明細書で提供されるZFNは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを編集する。
【００３９】
TALENは、転写アクチベーター様エフェクター（TALE）DNA結合ドメインをFokIヌクレアーゼドメインと融合させることによって作製された人工制限酵素である。TALEN対の各メンバーが標的部位とフランキングするDNA部位と結合するとき、FokIモノマーはダイマーを形成し、当該標的部位で二本鎖DNA断裂を引き起こす。
本明細書で用いられるTALENという用語はおおまかであり、別のTALENの補助なしに二本鎖DNAを切断できるモノマーTALENを含む。TALENという用語はまた、同じ部位でDNAを切断するために一緒に働く一対のTALENの一方又は両方のメンバーを指すために用いられる。
転写アクチベーター様エフェクター（TALE）は事実上任意のDNA配列と結合するように操作することができる。TALEタンパク質は、キサントモナス属（Xanthomonas）の多様な植物細菌病原体に由来するDNA結合ドメインである。X病原体は感染時にTALEを宿主植物中に分泌する。TALEは核に移動し、ここで、TALEは、宿主ゲノムの特異的遺伝子のプロモーター領域内の特異的DNA配列をもつプロモーター領域の特異的DNA配列を認識し結合する。TALAは、33−34アミノ酸の13−28のリピートモノマーを含む中央のDNA結合ドメインを有する。各モノマーのアミノ酸は、12及び13位の超可変アミノ酸残基を除いて高度に保存される。前記2つの可変アミノ酸はリピート可変2残基（RVD）と称される。RVDのアミノ酸対、NI、NG、HD及びNNはそれぞれ優先的にアデニン、チミン、シトシン、及びグアニン/アデニンを認識し、RVDを調節することによって連続するDNA塩基が認識される。アミノ酸配列とDNA認識との間のこの単純な関係は、適切なRVDを含むリピートセグメントの組合せを選択することによって、特異的なDNA結合ドメインの操作を可能している。
【００４０】
野生型FokI切断ドメインの他に、変異を有するFokI切断ドメインの変種を設計して切断特異性及び切断活性が改善されている。FokIドメインはダイマーとして機能し、2つの構築物を必要とする。前記2つの構築物は、標的ゲノム中の複数の部位のために適切な向き及び間隙を有する複数の固有のDNA結合ドメインを有する。TALEN DNA結合ドメインとFokI切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数、及び2つの個々のTALEN結合部位との間の塩基の数の両方が高レベルの活性の達成のためのパラメーターである。
TALE結合ドメインのアミノ酸配列とDNA認識との間の関係がタンパク質指定能力を可能にする。ソフトウェアプログラム、例えばDNA Worksを用いてTALE構築物を設計することができる。TALE構築物を設計する他の方法は当業者には公知である。以下を参照されたい：Doyle et al,.Nucleic Acids Research (2012) 40: W117-122；Cermak et al., Nucleic Acids Research (2011).39:e82；及びtale-nt.cac.cornell.edu/about。
【００４１】
ある特徴では、本明細書で提供されるTALENは、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリヌクレオチドを編集する。別の特徴では、本明細書で提供されるTALENは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを編集する。別の特徴では、本明細書で提供されるTALENは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを編集する。
【００４２】
CRISPR/Cas9系又はCRISPR/Cpf1系はFok1系方法（ZFN及びTALEN）の代案である。CRISPR系は、標的部位のDNA配列の認識に相補性塩基対を利用する、RNAによってガイドされる操作ヌクレアーゼを土台とする。
CRISPR/Cas9系は細菌及び古細菌の適応免疫系の部分であり、外来DNAを配列依存性態様で切断することにより侵入核酸（例えばウイルス）から当該細菌及び古細菌を防御する。免疫は、CRISPR遺伝子座の近位端の2つの隣接リピートの間のスペーサーとして識別される侵入DNAの短いフラグメントの組み込みによって獲得される。CRISPRアレー（スペーサーを含む）は侵入DNAとのその後の遭遇時に転写され、長さが約40ntの小さな干渉CRISPR RNA（crRNA）にプロセッシングされる。前記はtrans-活性化CRISPR RNA（tracrRNA）と結合してCas9ヌクレアーゼを活性化し前記をガイドする。Cas9ヌクレアーゼは、侵入DNAのプロトスペーサーとして識別される相同な二本鎖DNA配列を切断する。切断の前提条件は、標的DNAの下流の保存プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の存在である。通常PAMは配列5-NGG-3（それほど頻繁ではないがNAG）を有する。特異性は、いわゆる“シード配列”（PAMの12塩基上流）によって提供され、前記は当該RNAと標的DNAとの間で適合する必要がある。Cpf1はCas9と同様な態様で作用するが、しかしながらCpf1はtracrRNAを必要としない。
【００４３】
ある特徴では、本明細書で提供される操作されたガイドRNAは、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリヌクレオチドへCas9又はCpf1ヌクレアーゼをガイドする。別の特徴では、本明細書で提供される操作されたガイドRNAは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドへCas9又はCpf1ヌクレアーゼをガイドする。別の特徴では、本明細書で提供される操作されたガイドRNAは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドへCas9又はCpf1ヌクレアーゼをガイドする。
【００４４】
ある特徴では、本明細書で提供されるCas9又はCpf1ヌクレアーゼは、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリヌクレオチドを切断する。別の特徴では、本明細書で提供されるCas9又はCpf1ヌクレアーゼは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを切断する。別の特徴では、本明細書で提供されるCas9又はCpf1ヌクレアーゼは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを切断する。
【００４５】
ある特徴では、本明細書で提供される変異誘導系（例えば化学的変異誘導、照射変異誘導、トランスポゾン変異誘導、アグロバクテリウム媒介変異誘導、メガヌクレアーゼ、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9系、CRISPR/Cpf1系）、又は本明細書で提供される変異誘導系の組合せは、1つ以上の変異をタバコ植物に導入する方法で用いられ、前記はそのままで少なくとも1つのタバコ腋生分裂組織細胞で発現される。
さらに別の特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物は、さらに、ニコチンデメチラーゼをコードする1つ以上の遺伝子座に1つ以上の変異を含み（例えばCYP82E4、CYP82E5、CYP82E10）、前記変異は、ニコチンデメチラーゼをコードする1つ以上の遺伝子座に1つ以上の変異を欠くコントロール植物と比較してニコチン量の減少を付与する（U.S.Pat.No.8,319,011、8,124,851、9,187,759、9,228,194、9,228,195、9,247,706を参照されたい）。別の特徴では、本明細書で提供されるタバコ植物は、さらにNic1遺伝子座、Nic2遺伝子座又はその両方に1つ以上の変異を含み、前記変異は、Nic1遺伝子座、Nic2遺伝子座又はその両方に1つ以上の変異を欠くコントロール植物と比較してニコチン量の減少を付与する。
ある特徴では、本明細書で提供される組換えDNA構築物又は発現カセットは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び組織優先プロモーター（例えば葉特異的プロモーター、根特異的プロモーター、又は分裂組織特異的プロモーターであるが、ただしこれらに限定されない）から成る群から選択されるプロモーターを含む。
【００４６】
ある特徴では、本明細書で提供されるプロモーターは腋芽特異的プロモーターである。ある特徴では、本明細書で提供されるプロモーターは腋生分裂組織特異的プロモーターである。ある特徴では、本明細書で提供される腋生分裂組織特異的プロモーターは、L1層、L2層、L3層又はその組み合わせで機能するか又は優先的に機能する。双子葉植物のシュート頂端分裂組織及び腋生分裂組織は以下の3つの別個の細胞層を含む：L1層（最外側層）、L2層（中間層）、及びL3層（最内側層）。L1及びL2層は外衣を形成し、それらは背斜的に分裂する（分裂面は分裂組織の表面に対して垂直である）。L3層又は内体は全方向に分裂する。L1層は最終的には表皮組織を生じ、L2層は基本組織（例えば実質組織、厚角組織、厚壁組織）を生じ、L3層は典型的には維管束組織（例えば木部、篩管部）を生じる。
シュート頂端及び腋生分裂組織はまた3つの帯部（中央帯、周辺帯、及び髄状帯）に分かれることができる。中央帯の細胞（分裂組織の先端のL1、L2及びL3層の部分を含む）は分裂組織を組織化し維持するために働き、中央帯は多能性幹細胞を含む。周辺帯は中央帯を取り囲み、器官（例えば葉の原基、花の原基）を形成し形態発生を経るであろう。周辺帯は高い有糸分裂活性を含む。髄状帯又は髄状分裂組織は中央帯の下部に位置し、髄状帯は茎及び維管束組織を生じる。ある特徴では、本明細書で提供される腋生分裂組織特異的プロモーターは、中央帯、周辺帯、髄状帯、又は前記の組合せで機能するか又は優先的に機能する。
【００４７】
ある特徴では、腋芽特異的プロモーターは、配列番号:113-118、148−160、204及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。別の特徴では、腋生分裂組織特異的プロモーターは、配列番号:113-118、148−160、204及びそのフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。さらに別の特徴では、L1層、L2層、L3層、又は前記の組合せで活性なプロモーターは、配列番号:113-118、148−160、204及びそのフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。別の特徴では、中央帯、周辺帯、髄状帯、又は前記の組合せで活性なプロモーターは、配列番号:113-118、148−160、204及びそのフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。ある特徴では、本明細書で提供されるプロモーターフラグメントは、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも200、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500、少なくとも4000、少なくとも4500、少なくとも4999ヌクレオチドの長さを有する。別の特徴では、本明細書で提供されるプロモーターフラグメントは、500から200、100から200、100から300、100から400、100から500、100から600、100から700、100から800、100から900、100から1000、100から2000、200から300、200から400、200から500、200から600、200から700、200から800、200から900、200から1000、200から2000、200から2500、200から3000、500から1000、500から1500、500から2000、500から2500、500から3000、1000から2000、1000から3000、1500から2000、1500から2500、1500から3000、2000から3000のヌクレオチド、100から3500、100から4000、100から4500、100から4999，500から3500、500から4000、500から4500、500から4999、1000から3500、1000から4000、1000から4500、1000から4999、2000から3500、2000から4000、2000から4500、2000から4999、3000から3500、3000から4000、3000から4500、3000から4999、3500から4000、3500から4500、3500から4999、4000から4500、4000から4999，4500から4999ヌクレオチドの長さを有する。
【００４８】
ある特徴では、本開示の組換えDNA構築物は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結された、配列番号:113-118、148−160、204及びそのフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
ある特徴では、本開示の組換えDNA構築物は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結された、配列番号:113-118、148−160、204及びそのフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
【００４９】
ある特徴では、本開示の組換えDNA構築物は、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリヌクレオチドに作動できるように連結された、配列番号:113-118、148−160、204及びそのフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。
ある特徴では、本開示のタバコ植物又はその部分は、オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結された、配列番号:113-118、148−160、204及びそのフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％配列同一性を有する異種プロモーターを含む。
【００５０】
例示的な構成的プロモーターには以下が含まれる：Rsyn7プロモーターのコアプロモーター及びU.S.Pat.No.6,072,050に開示される他の構成的プロモーター；コアCaMV 35Sプロモーター（Odell et al.(1985) Nature 313:810-812）；ユビキチン（Christensen et al.(1989) Plant Mol.Biol.12:619-632、及びChristensen et al.(1992) Plant Mol.Biol.18:675-689）；pEMU（Last et al.(1991) Theor.Appl.Genet.81:581-588）；MAS（Velten et al.(1984) EMBO J 3:2723-2730）；ALSプロモーター（U.S.Pat.No.5,659,026）など。
例示的な化学誘導性プロモーターにはタバコPR-1aプロモーターが含まれ、前記はサリチル酸によって活性化される。興味深い他の化学誘導性プロモーターには、ステロイド応答プロモーター（例えばグルココルチコイド誘導性プロモーター（Schena et al.(1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10421-10425、及びMcNellis et al.(1998) Plant J.14(2):247-257）及びテトラサイクリン誘導性プロモーター（例えば以下を参照されたい：Gatz et al.(1991) Mol.Gen.Genet.227:229-237、並びにU.S.Pat.No.5,814,618及び 5,789,156）が含まれる。本明細書で用いることができる、追加される例示的プロモーターは、熱調節遺伝子発現、光調節遺伝子発現（例えばエンドウ豆rbcS-3A；トウモロコシrbcSプロモーター；エンドウ豆で見いだされる葉緑素alb結合タンパク質遺伝子；又はArabssuプロモーター）、ホルモン調節遺伝子発現（例えばコムギのEm遺伝子に由来するアブシシン酸（ABA）応答配列；オオムギ及びアラビドプシスのABA誘導性HVA1及びHVA22並びにrd29Aプロモーター）、及び創傷誘導性遺伝子発現（例えばwunlの発現）、器官特異的遺伝子発現（例えば塊茎特異的貯蔵タンパク質遺伝子、記載されたトウモロコシ由来23kDaゼイン遺伝子もしくはフレンチビーン由来遺伝子（β-ファセオリン遺伝子））に対して応答し得るもの、又は病原体誘導性プロモーター（例えばPR-1、prp-1）、β-1,3グルカナーゼプロモーター、コムギの真菌誘導性wirlaプロモーター、線虫誘導性プロモーター（タバコ及びパセリのそれぞれTobRB7-5A及びHmg-1）である。
追加される例示的な組織優先プロモーターには以下に開示されたものが含まれる：Yamamoto et al.(1997) Plant J.12(2):255-265；Kawamata et al.(1997) Plant Cell Physiol.38(7):792-803；Hansen et al.(1997) Mol.Gen.Genet.254(3):337-343；Russell et al.(1997) Transgenic Res.6(2):157-168；Rinehart et al.(1996) Plant Physiol.112(3):1331-1341；Van Camp et al.(1996) Plant Physiol.112(2):525-535；Canevascini et al.(1996) Plant Physiol.112(2):513-524；Yamamoto et al.(1994) Plant Cell Physiol.35(5):773-778；Lam (1994) Results Probl.Cell Differ.20:181-196；Orozco et al.(1993) Plant Mol.Biol.23(6):1129-1138；Matsuoka et al.(1993) Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590；及びGuevara-Garcia et al.(1993) Plant J.4(3):495-505。
【００５１】
本明細書で用いられるように、“作動できるように連結される”とは2つ以上の成分間の機能的連結を指す。例えば、対象のポリヌクレオチドと調節配列（例えばプロモーター）との作動できる連結は、対象のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的連結である。作動できるように連結される成分は連続性でも非連続性でもよい。ある特徴では、本明細書で提供されるプロモーターは、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと作動できるように連結される。別の特徴では、本明細書で提供されるプロモーターは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動できるように連結される。
【００５２】
本明細書で用いられるように、“異種”とは、外来種を起源とするか、又は同じ種に由来する場合は、人間の意図的な介入によって組成及び/又はゲノム遺伝子座におけるその本来の形態から実質的に改変された配列を指す。前記用語はまた、核酸構築物（本明細書では“ポリヌクレオチド構築物”又は“ヌクレオチド構築物”とも称される）にも適用できる。前記態様では、“異種”核酸構築物は、外来種を起源とするか、又は同じ種に由来する場合は、人間の意図的な介入によって組成及び/又はゲノム遺伝子座におけるその本来の形態から実質的に改変された構築物を意味することが意図される。異種核酸構築物には、形質転換方法又は興味のある別の植物とのその後の育種により植物又はその植物部分に導入された組換えヌクレオチド構築物が含まれる（ただし前記に限定されない）。
ある特徴では、本明細書で提供される改変植物、種子、植物成分、植物細胞、又は植物ゲノムは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結された異種プロモーターを含む。別の特徴では、本明細書で提供される組換えDNA構築物は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結された異種プロモーターを含む。
【００５３】
エンハンサーエレメントは、タンパク質によって結合されてRNA転写を活性化できるDNAの領域である。ある特徴では、本明細書で提供されるプロモーターはエンハンサーエレメントに作動できるように連結される。別の特徴では、配列番号:113−118、148−160、204及びそのフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドはエンハンサーエレメントに作動できるように連結される。ある特徴では、本明細書で提供されるエンハンサーエレメントは、少なくとも10、少なくとも25、少なくとも50、少なくとも75、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも350、少なくとも400、少なくとも450、少なくとも500、少なくとも550、少なくとも600、少なくとも650、少なくとも700、少なくとも750、少なくとも800、少なくとも850、少なくとも900、少なくとも950、少なくとも1000、少なくとも1100、少なくとも1200、少なくとも1300、少なくとも1400、少なくとも1500、少なくとも1750、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500、少なくとも4000、少なくとも4500、又は少なくとも5000ヌクレオチドの長さを有する。ある特徴では、本明細書で提供されるエンハンサーエレメントはCsVMVプロモーターである。
多くの遺伝子プロモーターは、遺伝子転写を調節するために機能するcis-調節エレメントを含む。cis-調節エレメントは、しばしば転写因子のための結合部位として作用することによって機能する。ある特徴では、本明細書で提供されるプロモーターは、芽の休眠エレメント（BDE）、腋芽成長UP1エレメント、腋芽成長UP2エレメント、シュクロース応答エレメント（SRE）、糖応答エレメント（SURE）、及び芽活性化又はTCP結合エレメント（BAE）から成る群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つのcis-調節エレメントを含む。別の特徴では、本明細書で提供される組換えヌクレオチドはプロモーターを含み、この場合当該プロモーターは、芽の休眠エレメント（BDE）、腋芽成長UP1エレメント、腋芽成長UP2エレメント、シュクロース応答エレメント（SURE）、糖応答エレメント（SRE）、及び芽活性化又はTCP結合エレメント（BAE）から成る群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つのcis-調節エレメントを含む。
【００５４】
ある特徴では、本明細書で提供されるプロモーターは少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つのcis-調節エレメントを含み、前記エレメントは、転写開始部位から1、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、7500、又は1000ヌクレオチド内にある。別の特徴では、本明細書で提供されるプロモーターは少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つのcis-調節エレメントを含み、前記エレメントは、転写開始部位から1−10,000、1−7500、1−5000、1−4900、1−4800、1−4700、1−4600、1−4500、1−4400、1−4300、1−4200、1−4100、1−4000、1−3900、1−3800、1−3700、1−3600、1−3500、1−3400、1−3300、1−3200、1−3100、1−3000、1−2900、1−2800、1−2700、1−2600、1−2500、1−2400、1−2300、1−2200、1−2100、1−2000、1−1900、1−1800、1−1700、1−1600、1−1500、1−1400、1−1300、1−1200、1−1000、1−900、1−800、1−700、1−600、1−500、1−400、1−300、1−200、1−100、1−75、1−50、1−45、1−40、1−35、1−30、1−25、1−20、1−15、5−10,000、5−7500、5−5000、5−4900、5−4800、5−4700、5−4600、5−4500、5−4400、5−4300、5−4200、5−4100、5−4000、5−3900、5−3800、5−3700、5−3600、5−3500、5−3400、5−3300、5−3200、5−3100、5−3000、5−2900、5−2800、5−2700、5−2600、5−2500、5−2400、5−2300、5−2200、5−2100、5−2000、5−1900、5−1800、5−1700、5−1600、5−1500、5−1400、5−1300、5−1200、5−1100、5−1000、5−900、5−800、5−700、5−600、5−500、5−400、5−300、5−200、5−100、5−75、5−50、5−45、5−40、5−35、5−30、5−25、5−20、20−10,000、20−7500、20−5000、20−4900、20−4800、20−4700、20−4600、20−4500、20−4400、20−4300、20−4200、20−4100、20−4000、20−3900、20−3800、20−3700、20−3600、20−3500、20−3400、20−3300、20−3200、20−3100、20−3000、20−2900、20−2800、20−2700、20−2600、20−2500、20−2400、20−2300、20−2200、20−2100、20−2000、20−1900、20−1800、20−1700、20−1600、20−1500、20−1400、20−1300、20−1200、20−1100、20−1000、20−900、20−800、20−700、20−600、20−500、20−400、20−300、20−200、20−100、20−75、20−50、20−45、20−40、20−35、20−30、20−25、50−10,000、50−7500、50−5000、50−4900、50−4800、50−4700、50−4600、50−4500、50−4400、50−4300、50−4200、50−4100、50−4000、50−3900、50−3800、50−3700、50−3600、50−3500、50−3400、50−3300、50−3200、50−3100、50−3000、50−2900、50−2800、50−2700、50−2600、50−2500、50−2400、50−2300、50−2200、50−2100、50−2000、50−1900、50−1800、50−1700、50−1600、50−1500、50−1400、50−1300、50−1200、50−1100、50−1000、50−900、50−800、50−700、50−600、50−500、50−400、50−300、50−200、50−100、50−75、100−10,000、100−7500、100−5000、100−4900、100−4800、100−4700、100−4600、100−4500、100−4400、100−4300、100−4200、100−4100、100−4000、100−3900、100−3800、100−3700、100−3600、100−3500、100−3400、100−3300、100−3200、100−3100、100−3000、100−2900、100−2800、100−2700、100−2600、100−2500、100−2400、100−2300、100−2200、100−2100、100−2000、100−1900、100−1800、100−1700、100−1600、100−1500、100−1400、100−1300、100−1200、100−1100、100−1000、100−900、100−800、100−700、100−600、100−500、100−400、100−300、100−200、500−10,000、500−7500、500−5000、500−4900、500−4800、500−4700、500−4600、500−4500、500−4400、500−4300、500−4200、500−4100、500−4000、500−3900、500−3800、500−3700、500−3600、500−3500、500−3400、500−3300、500−3200、500−3100、500−3000、500−2900、500−2800、500−2700、500−2600、500−2500、500−2400、500−2300、500−2200、500−2100、500−2000、500−1900、500−1800、500−1700、500−1600、500−1500、500−1400、500−1300、500−1200、500−1100、500−1000、500−900、500−800、500−700、又は500−600ヌクレオチド内にある。
【００５５】
ある特徴では、本明細書で提供されるプロモーターは腋芽細胞で機能し、芽の休眠エレメント（BDE）、腋芽成長UP1エレメント、腋芽成長UP2エレメント、シュクロース応答エレメント（SURE）、糖応答エレメント（SRE）、及び芽活性化又はTCP結合エレメント（BAE）から成る群から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つのcis-調節エレメントを含む。
さらにまた本明細書で提供されるものは、当業界で公知の適切な任意の形質転換方法を用いる、本明細書に記載の組換え構築物又は発現カセットによるタバコ植物の形質転換である。タバコ植物にポリヌクレオチ配列を導入する方法は当業界では公知であり、安定的形質転換方法、一過性形質転換方法、及びウイルス媒介方法が含まれる（ただしこれらに限定されない）。“安定的形質転換”とは、植物に導入される対象ヌクレオチド構築物が植物のゲノムに組み込まれ、その子孫によって継承され得る形質転換を指す。“一過性形質転換”は、ある配列が植物に導入され、単に一時的に発現されるか、又は当該植物に単に一過性に存在することを意味することが意図される。
ある特徴では、本明細書で提供される方法及び組成物は、1つ以上のポリヌクレオチドの1つ以上の植物細胞への導入を含む。ある特徴では、本明細書で提供される植物ゲノムは改変されて、導入ポリヌクレオチド又は組換えDNA構築物を含む。本明細書で用いられるように、“植物ゲノム”とは、植物細胞の核ゲノム、ミトコンドリアゲノム、又はプラスチド（例えば葉緑体）ゲノムを指す。別の特徴では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは人工染色体に組み込まれる。ある特徴では、本明細書で提供されるポリヌクレオチドを含む人工染色体は植物細胞に組み込まれる。
【００５６】
ある特徴では、本明細書で提供される改変植物、種子、植物成分、植物細胞、又は植物ゲノムは1つ以上のトランスジーンを含む。ある特徴では、本明細書で提供されるトランスジーンは吸枝成長を植物で抑制する。別の特徴では、本明細書で提供されるトランスジーンは、上部切取りにより誘発される吸枝成長を植物で抑制する。さらに別の特徴では、本明細書で提供されるトランスジーンは、上部切取りの前に植物で吸枝成長を抑制する。本明細書で用いられるように、“トランスジーン”とは、当業界で公知の任意の方法によりゲノムに転移されるポリヌクレオチドを指す。ある特徴では、トランスジーンは外因性ポリヌクレオチドである。ある特徴では、トランスジーンは内因性ポリヌクレオチドであり、当該ポリヌクレオチドは、天然には見出されない新規ゲノム遺伝子座に組み込まれる。
ある特徴では、本明細書で提供されるトランスジーンは組換えDNA構築物を含む。ある特徴では、本明細書で提供される組換えDNA構築物又は発現カセットは、トランスジェニック細胞選別のために選別可能なマーカーを含むことができる。選別可能マーカー遺伝子には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：抗生物質耐性をコードする遺伝子（例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（NEO）及びヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（HPT）をコードするもの）とともに除草剤（例えばグルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、スルホニルウレア（例えばクロロスルフロン及びスルホメツロンメチル）、及び2,4-ジクロロフェノキシアセテート（2,4-D））に対する耐性を付与する遺伝子。追加される選別可能マーカーには、表現型マーカー、例えばβ-ガラクトシダーゼ及び蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質（GFP））が含まれる。
【００５７】
ある特徴では、本明細書で提供される方法及び組成物はベクターを含む。本明細書で用いられるように、“ベクター”又は“プラスミド”という用語は互換的に用いられて環状、二本鎖DNA分子を指し、前記分子は染色体DNAから物理的に分離している。ある特徴では、本明細書で用いられるプラスミド又はベクターはin vivoで複製することができる。本明細書で用いられる“形質転換ベクター”とは、植物細胞を形質転換できるプラスミドである。ある特徴では、本明細書で提供されるプラスミドは細菌プラスミドである。別の特徴では、本明細書で提供されるプラスミドは、アグロバクテリウムTiプラスミドであるか又はアグロバクテリウムTiプラスミドから誘導される。
ある特徴では、本明細書で提供されるプラスミド又はベクターは組換えベクターである。本明細書で用いられるように、“組換えベクター”という用語は、遺伝子組換えの実験室的方法（例えば分子クローニング）によって形成されるベクターを指す。別の特徴では、本明細書で提供されるプラスミドは合成プラスミドである。本明細書で用いられるように、“合成プラスミド”とは人工的に作製されたプラスミドであり、前記は天然のプラスミド（例えばTiプラスミド）と同じ機能（例えば複製）を有することができる。例を挙げれば、個々のヌクレオチドによってプラスミドを合成することにより、又は種々の既存のプラスミドから核酸分子を一緒にスプライシングすることにより、当業者はde novoに合成プラスミドを作製できる。
ベクターは市場で入手可能であり、又は当業界で日常的な組換えDNA技術によって調製することができる。ある特徴では、本明細書で提供されるベクターは配列番号:112の全部又は部分を含む。核酸を収容するベクターは、そのような核酸に作動できるように連結される発現エレメントを有することができ、さらにまた、例えば選別可能マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）をコードするような配列を含むことができる。核酸を収容するベクターは、キメラ又は融合ポリペプチドをコードすることができる（すなわち、異種ポリペプチドに作動できるように連結されるポリペプチドであって、それは当該異種ポリペプチドのN-末端又はC-末端のどちらにも存在し得る）。代表的な異種ポリペプチドは、コードされるポリペプチドの精製に用いることができるものである（例えば6xHisタグ（配列番号:26）、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST））。
【００５８】
本開示の植物細胞にポリヌクレオチ（例えばトランスジーン、組換えベクター、組換えDNA構築物、発現構築物）を導入する適切な方法には以下が含まれる：マイクロインジェクション（Crossway et al.(1986) Biotechniques 4:320-334）、エレクトロポレーション（Shillito et al.(1987) Meth.Enzymol.153:313-336；Riggs et al.(1986) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602-5606）、アグロバクテリウム媒介形質転換（U.S.Pat.No.5,104,310、5,149,645、5,177,010、5,231,019、5,463,174、5,464,763、5,469,976、4,762,785、5,004,863、5,159,135、5,563,055及び5,981,840）、直接遺伝子転移（Paszkowski et al.(1984) EMBO J.3:2717-2722）、弾道粒子加速（例えば以下を参照されたい：U.S.Pat.No.4,945,050、5,141,131、5,886,244、5,879,918及び5,932,782；Tomes et al.(1995) in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture Fundamental Methods, ed.Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin)；McCabe et al.(1988) Biotechnology 6:923-926）。さらにまた以下を参照されたい：Weissinger et al.(1988) Ann.Rev.Genet.22:421-477；Christou et al.(1988) Plant Physiol.87:671-674（ダイズ）；McCabe et al.(1988) Bio/Technology 6:923-926（ダイズ）；Finer and McMullen (1991) In Vitro Cell Dev.Biol.27P: 175-182（ダイズ）；Singh et al.(1998) Theor.Appl.Genet.96:319-324（ダイズ）；De Wet et al.(1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed.Chapman et al.(Longman, N.Y.), pp.197-209（花粉）；Kaeppler et al.(1990) Plant Cell Reports 9:415-418 and Kaeppler et al.(1992) Theor.Appl.Genet.84:560-566（ウィスカー媒介形質転換）；D'Halluin et al.(1992) Plant Cell 4:1495-1505（エレクトロポレーション）。
【００５９】
別の特徴では、本明細書で提供される組換え構築物又は発現カセットは、植物をウイルス又はウイルス核酸に接触させることによって植物に導入され得る。一般的には、そのような方法は、本開示の発現カセットをウイルスDNA又はRNA分子内に取り込む工程を必要とする。本明細書で提供される発現カセットで使用されるプロモーターはまたウイルスRNAポリメラーゼによる転写に利用されるプロモーターを包含することは理解されている。植物にポリヌクレオチドを導入しその中のコードタンパク質（ウイルスDNA又はRNA分子を含む）を発現させる方法は当業界では公知である。例えば以下を参照されたい：U.S.Pat.No.5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931、及びPorta et al.(1996) Molecular Biotechnology 5:209-221。
クローンの方法を用いて（器官発生にしろ胚発生にしろ）その後で増殖させることができる任意の植物組織を、本明細書で提供される組換え構築物又は発現カセットを用いて形質転換できる。“器官発生”によって、シュート及び根が分裂組織中心から連続して発生するプロセスが意図される。“胚発生”によって、シュート及び根が体細胞からであれ配偶子からであれ協調的態様で（連続的ではなく）一緒に発生するプロセスが意図される。本明細書に記載する多様な形質転換に適切な例示的組織には、カルス組織、既存の分裂組織（例えば頂端分裂組織、腋芽及び根の分裂組織）及び誘発される分裂組織（例えば子葉分裂組織及び胚軸分裂組織）、胚軸、子葉、リーフディスク、花粉、胚などが含まれる（ただしこれらに限定されない）。
【００６０】
ある特徴では、本開示は組換えヌクレオチドを含む植物又は種子を提供し、この場合、当該組換えポリヌクレオチドは、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の任意の組合せで機能するプロモーターを含み、前記プロモーターはある核酸配列を含む構造性核酸分子に作動できるように連結され、前記核酸配列は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【００６１】
ある特徴では、オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質は、配列番号:235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択される。別の特徴では、オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質は、配列番号:235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を含む。別の特徴では、オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質は、配列番号:235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列類似性を含む。ある特徴では、オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質はある核酸配列によってコードされ、この場合、当該核酸配列は、配列番号:235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【００６２】
ある特徴では、オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質は、配列番号:234、236、238、240、242、244、246、248、250、252及び254から成る群から群から選択されるポリヌクレオチドによってコードされる。ある特徴では、オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質は、配列番号:234、236、238、240、242、244、246、248、250、252及び254から成る群から群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
ある特徴では、本開示は組換えポリヌクレオチドを含む植物又は種子を提供し、この場合、当該組換えポリヌクレオチドは、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の組合せで機能するプロモーターを含み、前記プロモーターはある核酸配列を含む構造性核酸分子に作動できるように連結され、前記核酸配列は、オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質をコードする。
別の特徴では、本開示は組換えDNA構築物を提供し、前記組換えDNA構築物は、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の組合せで機能するプロモーター及び異種でかつ作動できるように連結された核酸配列を含み、この場合、前記核酸配列は非コードRNA又はポリペプチドをコードする。別の特徴では、本開示は組換えDNA構築物を提供し、前記組換えDNA構築物は、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の組合せで機能するプロモーター及び異種でかつ作動できるように連結された核酸配列を含み、この場合、前記核酸配列はオーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質をコードする。
ある特徴では、本開示は、異種腋生分裂組織特異的プロモーターを含む組換えDNA構築物を提供し、前記プロモーターは、オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結されている。
【００６３】
ある特徴では、本開示は、上部切取りにより誘発される吸枝成長をタバコ植物で低下又は消失させる方法を提供し、前記方法は、タバコ植物をある組換えDNA構築物により形質転換する工程を含み、前記組換えDNA構築物は、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の組合せで発現するプロモーターを含む。別の特徴では、本開示は、タバコ植物を組換えDNA構築物で形質転換する工程を含む方法を提供し、前記組換えDNA構築物は、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の組合せで機能し、かつあるポリヌクレオチドに作動できるように連結される異種プロモーターを含み、前記あるポリヌクレオチドは内因性遺伝子のレベルを抑制するRNA分子に転写され、当該内因性遺伝子は、腋生分裂組織の成長、腋生分裂組織の維持又はその両方を促進するか又はそのために必要である。
ある特徴では、本開示は上部切取り誘発吸枝成長を植物で制御する方法を提供し、前記方法は組換えDNA構築物で植物を形質転換する工程を含み、この場合、前記組換えDNA構築物はあるポリヌクレオチドに作動できるように連結されるプロモーターを含み、前記ポリヌクレオチドは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【００６４】
ある特徴では、本開示は上部切取り誘発吸枝成長を植物で制御する方法を提供し、前記方法は組換えDNA構築物で植物を形質転換する工程を含み、この場合、前記組換えDNA構築物は、オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結されるプロモーターを含む。
本開示のいずれの改変タバコ植物も、例えば当業界で公知の技術を用いて遺伝子構築物又はトランスジーンで形質転換することによって、農学的に所望される追加の特質をさらに含むことができることは理解される。例を挙げれば、所望される特質の例は除草剤耐性、害虫耐性、耐病性、高収量、高等級インデックス値、加工性、加工品質、機械収穫性、保持能力、葉の品質、丈、植物成熟（例えば早熟性、早熟から中熟性、中熟性、中熟から晩熟性、又は晩熟性）、軸サイズ（例えば小、中又は長大軸）、又は一植物当たりの葉の数（例えば小数（例えば5−10葉）、中等度（例えば11−15葉）、又は多数（例えば16−21）の葉）、又は任意の組合せである。ある特徴では、本明細書で提供される吸枝成長低下タバコ植物又は種子は、1つ以上の殺虫性タンパク質（例えばバシルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）の結晶タンパク質、又はバシルス・セレウス（Bacillus cereus）の植物性殺虫タンパク質、例えばVIP3（例えば以下を参照されたい：Estruch et al., 1997, Nat.Biotechnol.15:137））を発現する1つ以上のトランスジーンを含む。別の特徴では、本明細書で提供されるタバコ植物はさらに、落葉病耐性（U.S.Pat.No.5,689,035）又はシスト線虫耐性（U.S.Pat.No.5,491,081）を付与する遺伝子移入による特質を含む。
【００６５】
本明細書で提供されるポリペプチドのレベル及び/又は活性は、タンパク質又はRNAの発現を形質転換植物で指令することができないポリヌクレオチドを利用することによって調整することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを用いて、生物のゲノムヌクレオチド配列を変更又は変異させる方法で利用することができるポリヌクレオチ構築物を設計することができる。そのようなポリヌクレオチド構築物には、RNA:DNAベクター、RNA:DNA変異ベクター、RNA:DNA修復ベクター、混合デュープレックスオリゴヌクレオチド、自己相補性RNA:DNAオリゴヌクレオチド、及び組換え誘導オリゴ核酸が含まれる（ただしこれらに限定されない）。そのようなヌクレオチド構築物及び使用方法は当業界で公知である。以下を参照されたい：U.S.Pat.No.5,565,350；5,731,181；5,756,325；5,760,012；5,795,972及び5,871,984（前記の各々は参照によってあたかもその全体が示されたかのように本明細書に含まれる）。さらにまた以下を参照されたい：国際特許出願公開No.WO 98/149350、WO 99/107865及びWO 99/125921；並びにBeetham et al.(1999) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:8774-8778。
【００６６】
本開示は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択される1つ以上のポリペプチドの発現又は機能を植物で、特にニコチアナ・タバクム属（多様な商業変種のタバコ植物を含む）で阻害する組成物及び方法を提供する。
ある特徴では、本明細書で提供される1つ以上のポリペプチドの発現の阻害は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドの発現によるRNA干渉（RNAi）によって達成できる。ある特徴では、RNAiは非コードRNAを発現する工程を含む。本明細書で用いられるように、“非コードRNA”は、ミクロRNA、（miRNA）、小さい干渉RNA（siRNA）、trans-作動性siRNA（ta-siRNA）、転移RNA（tRNA）、リボソームRNA（rRNA）、イントロン、ヘアピンRNA（hpRNA）、及びイントロン収容ヘアピンRNA（ihpRNA）から成る群から選択される。ある特徴では、本明細書で提供される1つの単一非コードRNAが、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10ポリペプチド、又は10を超えるポリペプチドの発現を阻害する。ある特徴では、本明細書で提供される非コードRNAは植物ゲノムに安定的に形質転換される。別の特徴では、本明細書で提供される非コードRNAは植物ゲノムに一過性に形質転換される。
【００６７】
ある特徴では、本開示は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択される1つ以上のポリペプチドの発現又は機能の阻害に有用なRNA分子を提供する。ある特徴では、本明細書で提供されるRNA分子は非コードRNAである。
別の特徴では、組換えDNA構築物は二本鎖RNAをコードする。さらにまた提供されるものは、改変タバコ植物又はその部分、乾燥タバコ素材、又はこれら組換えDNA構築物を含むタバコ製品である。ある特徴では、これらトランスジェニック植物、乾燥タバコ素材又はタバコ製品は、当該組換えDNA構築物を含まないコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を含む。さらにまた提供されるものはタバコ植物の吸枝成長を低下させる方法であり、前記方法は、これら組換えDNA構築物のいずれかでタバコ植物を形質転換する工程を含む。
ある特徴では、本明細書で提供されるタバコ植物又はその部分は、非コードRNA分子をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結される異種プロモーターを含み、この場合、前記非コードRNA分子は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択される1つ以上のポリペプチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードするRNAと結合することができ、前記非コードRNA分子は当該ポリペプチドの発現を抑制する。
【００６８】
本明細書で用いられるように、“抑制する”、“阻害する”、“抑制”及び“阻害”という用語は、対象の遺伝子生成物（例えばmRNA、タンパク質、非コードRNA）の発現又は機能を低下させる、当業界で公知の又は本明細書に記載の任意の方法と定義される。“阻害”は、2つの植物（例えば改変植物対コントロール植物）との比較の関係であり得る。また別には、標的遺伝子生成物の発現又は機能の阻害は、同じ植物内の植物細胞、小器官、器官、組織もしくは植物成分間の比較、又は異なる植物間の比較の関係であることができ、さらに同じ植物もしくは植物成分内の発育中の期間もしくは一過性時期間の比較、又は複数の植物もしくは植物成分間の比較を含む。“阻害”は、対象の遺伝子生成物の機能又は産生の、当該遺伝子生成物の機能又は産生の完全な除去までの任意の相対的低下を含む（完全な除去を含む）。“阻害”という用語は、標的遺伝子生成物の翻訳及び/又は転写、又は標的遺伝子生成物の機能的活性をダウンレギュレートする任意の方法又は組成物を包含する。
“阻害配列”という用語は、植物で遺伝子の発現又は機能を阻害することができる任意のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列を包含し、前記は、例えば完全長ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列、切端ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列のフラグメント、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列の変種、センス方向のヌクレオチド配列、アンチセンス方向のヌクレオチド配列、センスもしくはアンチセンス方向のヌクレオチド配列の相補物、ヌクレオチド配列の倒置領域、ヌクレオチド配列のヘアピン、二本鎖ヌクレオチド配列、一本鎖ヌクレオチド配列、前記の組合せなどである。“ポリヌクレオチド配列”という用語は、RNA、DNA、化学的改変核酸、核酸アナログの配列、前記の組合せなどを含む。
阻害配列は本明細書では標的遺伝子生成物の名称によって明示される。したがって、非限定的な例を示せば、“NTH15阻害配列”は、植物でNTH15遺伝子座の発現を例えば転写及び/又は翻訳レベルで阻害するか、又は遺伝子生成物の機能を阻害できる阻害配列を指す。“阻害することができる”という語句がポリヌクレオチド阻害配列の関係で用いられるとき、当該阻害配列それ自体が阻害効果を示すことを意味するか、又は、当該阻害配列が阻害ヌクレオチド分子（例えばヘアピンRNA、miRNA又は二本鎖RNAポリヌクレオチド）をコードするかもしくは阻害ペプチド（例えば標的遺伝子生成物の発現又は機能を阻害するポリペプチド）をコードする場合は、その転写（例えば、ヘアピンRNA、miRNA又は二本鎖RNAポリヌクレオチドの場合）又はその転写及び翻訳（阻害ポリペプチドをコードする阻害配列の場合）の後で、当該転写生成物又は翻訳生成物がそれぞれ当該標的遺伝子生成物に対して阻害効果を示す（例えば標的遺伝子生成物の発現又は機能を阻害する）ことが意図される。
【００６９】
本明細書で提供される阻害配列は、当業界で公知の任意のサイレンシング経路又はメカニズムを介して遺伝子サイレンシングを誘引する配列であることができ、前記にはセンスサプレッション/コサプレッション、アンチセンスサプレッション、二本鎖RNA（dsRNA）干渉、ヘアピンRNA干渉及びイントロン収容ヘアピンRNA干渉、アンプリコン媒介干渉、リボザイム、小さい干渉RNA、人工もしくは合成ミクロRNA、及び人工trans-作動性siRNAが含まれる（ただしこれらに限定されない）。阻害配列は、所望される成果に応じて、本開示のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも50ヌクレオチド、少なくとも70ヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも150ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチド、少なくとも250ヌクレオチド、少なくとも300ヌクレオチド、少なくとも350ヌクレオチド、少なくとも400ヌクレオチド、及び完全長までの範囲であり得る。ある特徴では、阻害配列は、約50から約400ヌクレオチド、約70から約350ヌクレオチド、約90から約325ヌクレオチド、約90から約300ヌクレオチド、約90から約275ヌクレオチド、約100から約400ヌクレオチド、約100から約350ヌクレオチド、約100から約325ヌクレオチド、約100から約300ヌクレオチド、約125から約300ヌクレオチド、又は約125から約275ヌクレオチドのフラグメントであり得る。
【００７０】
ある特徴では、本開示はタバコ細胞で機能するプロモーターを含む組換えDNA構築物を提供し、さらに前記プロモーターはあるRNAと結合できるRNA分子をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結され、前記あるRNAは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255及び前記のフラグメントから成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。ある特徴では、本開示はタバコ細胞で機能するプロモーターを含む組換えDNA構築物を提供し、さらに前記プロモーターはあるポリヌクレオチドに作動できるように連結され、前記ポリヌクレオチドは、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％同一性を有する。
【００７１】
ある特徴では、本開示はタバコ細胞で機能するプロモーターを含む組換えDNA構築物を提供し、さらに前記プロモーターはあるRNAと結合できるRNA分子をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結され、前記あるRNAは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255及び前記のフラグメントから成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％同一性のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、この場合、前記RNA分子は当該ポリペプチドの発現を抑制する。ある特徴では、本開示はタバコ細胞で機能するプロモーターを含む組換えDNA構築物を提供し、さらに前記プロモーターはあるポリヌクレオチドに作動できるように連結され、前記ポリヌクレオチドは、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％同一性を有し、この場合、前記RNA分子は当該ポリヌクレオチの発現を抑制する。
【００７２】
ある特徴では、本開示は組換えDNA構築物を提供する。前記構築物は、非コードRNA分子をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結された異種腋生分裂組織特異的プロモーターを含み、この場合、前記非コードRNA分子は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、70、72、74、76、78、161−185、187、189、191、197、199、224、229、231、233、245、247、249、251、253、及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードするRNAと結合することができ、さらに前記非コードRNA分子は当該ポリペプチドの発現を抑制する。
ある特徴では、本開示は上部切取り誘発吸枝成長を植物で制御する方法を提供する。前記方法は組換えDNA構築物で当該植物を形質転換する工程を含み、この場合、前記組換えDNA構築物は、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の組合せで機能する異種プロモーターを含み、さらに前記プロモーターは、非コードRNA分子をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結され、前記非コードRNA分子は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、70、72、74、76、78、161−185、187、189、191、197、199、224、229、231、233、245、247、249、251、253、及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードするRNAと結合することができ、さらに前記非コードRNA分子は当該ポリペプチドの発現を抑制する。
【００７３】
ミクロRNA（miRNA）は非タンパク質コードRNAであり（全般的には約19から約25ヌクレオチド、植物では一般的に20−24ヌクレオチド）、標的転写物の切断をtrans様式でガイドし、多様な調節及び発生経路に関与する遺伝子の負の調節を行う（Bartel (2004) Cell, 116:281-297）。いくつかの事例では、miRNAはsiRNA一次転写物の同調プロセッシングをガイドするために役立つ（Allen et al.(2005) Cell, 121:207-221）。
多くのmiRNA遺伝子（MIR遺伝子）が確認され、データベースに公開されている（“miRBase”、オンライン（microrna.sanger.ac.uk/sequences）で入手できる、以下もまた参照されたい：Griffiths-Jones et al.(2003) Nucleic Acids Res., 31:439-441）。MIR遺伝子は、遺伝子間領域に（ゲノム内に単独及びクラスターの両方で）生じると報告されているが、他の遺伝子（タンパク質コード遺伝子及び非タンパク質コード遺伝子の両方）のイントロン内に全体として又は部分として存在することも可能である。miRNAのバイオジェネシスに関する最近の概論については以下を参照されたい：Kim (2005) Nature Rev.Mol.Cell.Biol., 6:376-385。MIR遺伝子の転写は、少なくともいくつかの事例ではMIR遺伝子自身のプロモーターの促進性制御下にある。一次転写物（“pri-miRNA”と称される）は極めて大きく（数キロベース）、ポリシストロン性で、1つ以上のpre-miRNA（ステム-ループ形式を含む折り返し構造で、成熟miRNAにプロセッシングされる）とともにmRNAの通常の5’“キャップ”及びポリアデニル化テールを含むおとができる。例えば以下の文献（Kim (2005) Nature Rev.Mol.Cell.Biol., 6:376-385）の図1を参照されたい。
【００７４】
miRNAのその対応する前駆体（pri-miRNA及びpre-miRNA）からの成熟は動物と植物で顕著に異なる。例えば、植物細胞では、ミクロRNA前駆体分子はほとんどが核内で完全に成熟miRNAにほぼプロセッシングされると考えられ、一方、動物細胞では、pri-miRNA転写物は動物特異的酵素Droshaによって核内でプロセッシングされ、続いてpre-miRNAは細胞質に輸送され、細胞質で成熟miRNAにさらにプロセッシングされる。植物の成熟miRNAは典型的には長さが21ヌクレオチドである。植物及び動物のmiRNAバイオジェネシスに関する最近の概説については以下を参照されたい：Kim (2005) Nature Rev.Mol.Cell.Biol., 6:376-385。miRNAバイオジェネシス及び機能に関する追加される概論は例えば以下で見いだされる：Bartel (2004) Cell, 116:281-297；Murchison and Hannon (2004) Curr.Opin.Cell Biol., 16:223-229；及びDugas and Bartel (2004) Curr.Opin.Plant Biol., 7:512-520。
【００７５】
miRNA（天然に生じるものであれ人工配列であれ）のトランスジェニック発現を利用して、1つ又は複数のmiRNA標的遺伝子の発現を調節することができる。トランスジェニック発現転写物中へのmiRNA認識部位の挿入もまた転写物の発現調節に有用である。例えば以下を参照されたい：Parizotto et al.(2004) Genes Dev., 18:2237-2242。miRNAの認識部位はmRNAのすべての領域（5’非翻訳領域、コード領域及び3’非翻訳領域を含む）で立証され、コード領域に対するmiRNA標的部位の位置は必ずしも抑制に影響を与えない可能性があることが示された（例えば以下を参照されたい：Jones-Rhoades and Bartel (2004).Mol.Cell, 14:787-799；Rhoades et al.(2002) Cell, 110:513-520；Allen et al.(2004) Nat.Genet., 36:1282-1290；Sunkar and Zhu (2004) Plant Cell, 16:2001-2019）。miRNAは真核細胞では重要な調節エレメントであるので、miRNAのトランスジェニック抑制は生物学的経路及び応答の操作のために有用である。最後に、MIR遺伝子のプロモーターは非常に特異的な発現パターン（例えば細胞特異性、組織特異性、時間的特異性又は誘導性）を有することができ、したがって、プロモーターが作動できるように連結されるDNA配列のそのような特異的転写の誘導のために組換え構築物で有用である。miRNA、それらの前駆体、それらの認識部位、及びそれらのプロモーターの多様な有用性は、米国特許出願公開2006/0200878 A1（参照により本明細書に含まれる）に詳細に記載されている。これらの有用性の非限定的な例を示せば以下が含まれる：（1）標的遺伝子を抑制するために本来のmiRNA又はmiRNA前駆体配列を発現させる；（2）標的遺伝子を抑制するために人工miRNA又はmiRNA前駆体配列を発現させる；（3）miRNA認識部位を有するトランスジーンの発現（この場合、成熟miRNAが発現されるときにトランスジーンは抑制される）；（4）miRNAプロモーターによって駆動されるトランスジーンの発現。
【００７６】
人工miRNA配列の設計は、Zengら（Zeng et al.(2002) Mol.Cell, 9:1327-1333）が示すように、miRNA前駆体のmiRNAステム領域中のヌクレオチドに対し目的の標的と相補性を有する配列を置換するのと同じように簡単であり得る。操作されたmiRNA前駆体を作製するために本来のmiRNA配列のヌクレオチド変更を決定する一般的方法の1つの非限定的な例では以下の工程がを含まれる：（a）標的転写物のオルトログ及び無関係遺伝子との潜在的な一切の適合を識別するために、例えばタバコcDNA及びゲノムDNAデータベースの両方で標的遺伝子に特異的な少なくとも18のヌクレオチドの固有の標的配列を、例えばBLAST（例えば以下を参照されたい：Altschul et al.(1990) J.Mol.Biol., 215:403-410；Altschul et al.(1997) Nucleic Acids Res., 25:3389-3402）のような配列アラインメントツールを用いることによって選択し、それによって非標的配列の意図せぬサイレンシングを回避する工程：（b）望ましくない配列（例えば非標的種に由来する配列との適合）について標的遺伝子を分析し、GC含有量、Reynoldsスコア（以下を参照されたい：Reynolds et al.(2004) Nature Biotechnol., 22:326-330）、及び自由エネルギーの差がマイナスであることによって特徴づけられる機能的非対称（".DELTA..DELTA.G"又は“ΔΔG”）（以下を参照されたい：Khvorova et al.(2003) Cell, 115:209-216）について潜在性を有する各19-merセグメントを採点する工程（好ましくは以下の特徴の全部又は大半を有する19-merが選択される：（1）Reynoldsスコアは＞4、（2）GC含有量は約40％から約60％、（3）マイナスのΔΔG、（4）末端がアデノシン、（5）同じヌクレオチドが4つ以上連続しないこと、（6）標的遺伝子の3'末端近くに位置すること、（7）miRNA前駆体転写物との相違が最小限であること。siRNAで3番目ごとのヌクレオチドの位置はRNAi有効性で特に重要であることが報告され、アルゴリズム、"siExplorer"はrna.chem.t.u-tokyo.ac.jp/siexplorer.htmで公開されている（以下を参照されたい：Katoh and Suzuki (2007) Nucleic Acids Res., 10.1093/nar/gkl1120））；（c）改変成熟miRNAの調製で用いられる選択19-merの逆相補物を決定する工程（20位の追加ヌクレオチドは好ましくは選択標的配列と適合し、さらに21位のヌクレオチドは、標的転写物でのサイレンシングの拡大を防ぐために塩基対を形成しないように選択されるか、又は標的転写物でのサイレンシングの拡大を促進するために標的配列と塩基対を形成するように選択される）；及び人工miRNAで植物を形質転換する工程。
【００７７】
ある特徴では、本明細書で提供される人工miRNAは、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、69、71、73、75、77、83−160、186、188、190、196、198、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリヌクレオチドと相補性である。別の特徴では、本明細書で提供される人工miRNAは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、70、72、74、76、78、161−185、189、191、197、199、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補性である。さらに別の特徴では、本明細書で提供される人工miRNAは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、70、72、74、76、78、161−185、189、191、197、199、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列類似性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと相補性である。
【００７８】
ある特徴では、本明細書で提供される人工miRNAは標的遺伝子のRNA転写又はタンパク質翻訳を低下又は消失させる。
ある特徴では、本明細書で提供されるmiRNA又は人工miRNAは組織特異的プロモーターの制御下にある。別の特徴では本明細書で提供されるmiRNA又は人工miRNAは、配列番号:113−118、148−160、204、及び前記のフラグメントから成る群から選択されるプロモーターの制御下にある。ある特徴では、本明細書で提供される改変植物は、配列番号:113−118、148−160、204、及び前記のフラグメントから成る群から選択される異種プロモーターの制御下にある人工miRNAを含む。
植物のミクロRNAは、標的転写物中のほぼ完全に相補的な配列（miRNA認識部位）を認識して結合し、続いてRNase III酵素（例えばArgonaute1）によって当該転写物を切断することによってそれらの標的遺伝子を調節する。植物では、あるmiRNA認識部位と対応する成熟miRNAとの間のある種のミスマッチ、特に成熟miRNAの10位と11位のヌクレオチドのミスマッチは容認されない。成熟miRNA内の位置は5’から3’方向で与えられる。あるmiRNA認識部位と対応する成熟miRNAとの間の完全な相補性は、通常成熟miRNAの10位及び11位で要求される。例えば以下を参照されたい：Franco-Zorrilla et al.(2007) Nature Genetics, 39:1033-1037；及びAxtell et al.(2006) Cell, 127:565-577。
【００７９】
植物miRNAのこの特徴を利用して、“ミクロRNAおとり配列”を予測するための法則に到達する。おとり配列は、すなわち内因性成熟miRNAによって認識され結合され得る配列であって、miRNAおとり配列と内因性成熟miRNAとの間で塩基対の形成を生じ、したがってmiRNAおとり配列と成熟miRNA配列との間のミスマッチの存在のために切断されない切断耐性RNAデュープレックスを形成する。ミスマッチには、正統的ミスマッチ（例えばG-A、C-U、C-A）とともにG::U揺らぎ対及びインデル（ヌクレオチド挿入（insertion）又は欠失（deletion））が含まれる。一般的には、これらの法則は、（1）必要とされるミスマッチ、及び（2）許容されるが必要というわけではないミスマッチを規定する。
必要とされるミスマッチには以下が含まれる：（a）内因性成熟miRNAの9、10又は11位でmiRNAおとり配列と内因性成熟miRNAとの間に少なくとも1つのミスマッチ、また別には、（b）内因性成熟miRNAの9、10又は11位に対応するmiRNAおとり配列の位置に1、2、3、4又は5つの挿入（すなわち余分なヌクレオチド）。
許容されるミスマッチには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：（a）内因性成熟miRNAの1、2、3、4、5、6、7、8及び9位でmiRNAおとり配列と内因性成熟miRNAとの間に0、1又は2つのミスマッチ、及び（b）内因性成熟miRNAの12位から最後の位置（すなわち21ヌクレオチドの成熟miRNAの21位）までにmiRNAおとり配列と内因性成熟miRNAとの間に0、1、2、又は3つのミスマッチ、この場合、内因性成熟miRNAの12位から最後の位置までのミスマッチの各々は少なくとも1つの相補性塩基対と隣接する（すなわち、内因性成熟miRNAの12位から最後の位置までにせいぜい2つの連続するミスマッチが存在する）。
【００８０】
miRNAおとり配列の長さは、内因性成熟miRNAによって認識及び結合され切断耐性RNAデュープレックスを形成する任意の長さであり得る。ある特徴では、miRNAおとり配列は約18から約36ヌクレオチドを含む。別の特徴では、本明細書で提供されるミクロRNAは、成熟miRNAと結合できる、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、又は30を超えるヌクレオチドの小さなRNA分子である。例えばWO2008/133643を参照されたい（前記は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。
ある特徴では、内因性成熟miRNAは本明細書で提供されるおとりmiRNAによって調節される。本明細書で提供されるおとりミクロRNAは、相補的な成熟miRNAとその自然の標的遺伝子との結合を防ぎ、それによって標的遺伝子の発現を増加させることができる。
別の特徴では、本明細書で提供される組換えDNA構築物は、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10、又は10を超えるおとりmiRNAを含む。ある特徴では、本明細書で提供されるおとりmiRNAは、配列番号:113−118、148−160、204及び前記のフラグメントから成る群から選択される調節配列の制御下にある。
【００８１】
別の特徴では、少なくとも1つのmiRNA結合部位を変異させるために、本明細書で提供される位置特異的ヌクレアーゼを用いて内因性miRNA標的を編集し、それによって内因性miRNA標的をmiRNA媒介分解に対して耐性にする。本明細書で用いられるように、“miRNA標的”とは、成熟miRNAと少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも88％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有する、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、又は30を超えるヌクレオチドの連続する一続きを指す。ある特徴では、miRNA標的は成熟miRNAとハイブリダイズすることができ、続いて典型的な細胞条件下で成熟miRNA/Argonaute RNA誘発サイレンシング複合物によって切断される。
【００８２】
さらに本明細書で提供されるものは、本明細書で提供されるタバコ植物又は植物成分から調製される乾燥タバコ素材である。“乾燥”とは、水分を低下させて葉緑素を破壊しタバコの葉に黄金色を残し、それによってデンプンを糖に変換する熟成プロセスである。乾燥タバコはしたがって、収穫した緑色の葉と比較して還元糖含有量が高くデンプン含有量が低い。ある特徴では、本明細書で提供されるタバコ植物又は植物成分は、通常的手段（例えば熱風乾燥、倉庫乾燥、火力乾燥、空気乾燥又は天日乾燥）を用いて乾燥させることができる。種々のタイプの乾燥方法の説明については、例えばTsoの著書を参照されたい（1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford）。通常、乾燥タバコは、圧縮条件下で数年間（例えば2から5年）10％から約25％の範囲の水分含有量で、木製円筒容器（例えば大樽）又は厚紙カートンで熟成される。米国特許4,516,590号及び5,372,149号を参照されたい。その後、乾燥及び熟成タバコをさらに加工することができる。更なる加工には、種々の温度で蒸気を導入して又は導入しないで真空下でタバコを条件付けする工程、殺菌、及び発酵が含まれる。発酵は典型的には、高い初期水分含有量、熱発生及び乾燥重量の10から20％低下を特徴とする。例えば以下を参照されたい：米国特許4,528,993号、4,660,577号、4,848,373号、5,372,149号；米国特許公開No.2005/0178398；及びTso（1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford）。乾燥、熟成及び発酵を実施したタバコをさらに加工することができる（例えば、カット、細断、膨張又はブレンド）。例えば、米国特許4,528,993号、4,660,577号、及び4,987,907号を参照されたい。ある特徴では、本開示の乾燥タバコ素材は熱風乾燥、天日乾燥、空気乾燥又は火力乾燥される。
【００８３】
本開示の改変タバコ系統、品種又はハイブリッドから得られるタバコ素材をタバコ製品の製造に用いることができる。本明細書で用いられるように、“タバコ製品”は、人間での使用又は消費を意図するタバコから調製又は誘導される任意の製品と定義される。ある特徴では、本明細書で提供されるタバコ製品は、本明細書で提供される改変タバコ植物由来の乾燥成分を含む。別の特徴では、本明細書で提供されるタバコ製品は、本明細書で提供される改変タバコ植物由来の乾燥タバコ葉を含む。
本明細書で提供されるタバコ製品には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：紙巻きタバコ製品（例えば紙巻きタバコ、ビディ(bidi)シガレット、クレテック（kreteck））、葉巻製品（例えば葉巻、シガーラッピングタバコ、シガリロ）、パイプタバコ製品、タバコ派生製品、タバコ由来ニコチン製品、無煙(smokeless)タバコ製品（例えば湿潤嗅ぎ(snuff)タバコ、乾燥(dry)嗅ぎタバコ、噛み(chewing)タバコ、湿潤無煙(moist smokeless)タバコ、ファインカット噛みタバコ、ロングカット噛みタバコ、ポーチ入り(pouched)噛みタバコ）、フィルム、チュワブル（例えばガム）、ロゼンジ、溶解性細片、タブ、錠剤、シェイプドパーツ、ゲル、コンシューマブルユニット、不溶性マトリックス、中空形状物、再構成タバコ、膨張タバコなど。例えば米国特許公開US 2006/0191548を参照されたい。
本明細書で用いられるように、“紙巻きタバコ”は“棒状部”及び“充填物”を有するタバコ製品を指す。紙巻きタバコの“棒状部”は、紙巻きタバコ紙、フィルター、プラグラップ（ろ過材を収納するために用いられる）、フィルターに紙巻きタバコ紙（充填物を含む）を固定するチッピングペーパー、及びこれら成分を一緒に保持する全ての接着剤を含む。“充填物”は以下を含む：（1）全てのタバコ（再構成及び膨張タバコを含む（ただしこれらに限定されない））、（2）非タバコ代替物（ハーブ、非タバコ植物素材及び紙巻きタバコ紙に巻き込まれるタバコに付随し得る他の種を含む（ただしこれらに限定されない））、（3）ケーシング、（4）香料、及び（5）他の全ての添加物（タバコ及び代替物に混合され紙巻きタバコ中に巻き込まれるもの）。
【００８４】
ある特徴では、本開示は、本明細書で提供される改変タバコ植物に由来するニコチン、及び製品で使用するためのニコチン製造方法を提供する。
ある特徴では、本明細書で提供される方法は、本明細書で提供される改変タバコ植物由来の乾燥タバコ葉を用いてタバコ製品を調製する工程を含む。
本明細書で用いられるように、“再構成タバコ”は、タバコダスト及び他のタバコスクラップ素材から調製されるタバコ充填物の部分を指し、前記はシート形に加工され、タバコに似せて細片にカットされる。コスト削減に加えて、再構成タバコは、アンモニアと糖との間の反応を利用して香りの発生を進行させることにより紙巻きタバコの味に対するその寄与のために非常に重要である。
本明細書で用いられるように、“膨張タバコ”は、適切な気体の膨張を介して加工されるタバコ充填物の部分を指し、したがってタバコは“膨らまされ”て密度の低下及び充填性能の増加を生じる。膨張タバコは紙巻きタバコで用いられるタバコの重量を削減する。
【００８５】
本開示の植物に由来するタバコ製品にはまた紙巻きタバコ及び他の喫煙物品、特にフィルター成分を含む喫煙物品が含まれ、この場合、喫煙可能素材の棒状部はタバコブレンド内に乾燥タバコを含む。ある特徴では、本開示のタバコ製品は以下から成る群から選択される：シガリロ、ノンベンチレーションリセスフィルター紙巻きタバコ（non-ventilated recess filter cigarette）、ベントリセスフィルター紙巻きタバコ（vented recess filter cigarette）、ビディ紙巻きタバコ、葉巻、嗅ぎタバコ、パイプタバコ、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ、水タバコ、刻みタバコ及びカットタバコ。別の特徴では、本開示のタバコ製品は無煙タバコ製品である。無煙タバコ製品は燃焼せず、噛みタバコ、湿潤無煙タバコ、嗅ぎタバコ及び乾燥嗅ぎタバコが含まれる（ただしこれらに限定されない）。噛みタバコは粗く分割されたタバコ葉であり、典型的には大きなポーチ様パッケージに包装され、プラグ状で又は撚って使用される。湿潤無煙タバコは湿り気を有するより細かく分割されたタバコであり、分散形又はポーチ形で提供され、典型的には円形缶に包装され、成人のタバコ消費者の頬と歯茎の間に入れて締め付けて又は袋中で使用される。スヌースは熱処理無煙タバコである。乾燥嗅ぎタバコは細かくすり潰されたタバコであり、口内に置くか又は鼻で使用される。さらに別の特徴では、本開示のタバコ製品は、ルーズリーフ噛みタバコ、プラグ噛みタバコ、湿潤嗅ぎタバコ、及び鼻嗅ぎタバコから成る群から選択される。さらに別の特徴では、本開示のタバコ製品は、電子加熱タバコ、e-タバコ、電子式気化装置から成る群から選択される。
【００８６】
本開示はさらにまた、本明細書で提供されるタバコ植物に由来するタバコ素材を含むタバコ製品を製造する方法を提供する。ある特徴では、本明細書で提供される方法は、本明細書で提供されるタバコ植物から調製される熟成タバコ素材をその水分含有量を約12.5％及び約13.5％から約21％に増加させるために条件付けする工程、所望のブレンドを得るために当該条件付けタバコ素材をブレンドする工程を含む。ある特徴では、本明細書で提供されるタバコ製品を製造する方法はさらにまた当該ブレンドのケーシング又は香り付け工程を含む。一般的には、ケーシングプロセスの間にケーシング又はソース材料がブレンドに添加され、化学組成のバランスをとることによってそれらの品質が高められ、さらに一定の望ましい香り特性がもたらされる。ケーシングプロセスの更なる詳細は以下で見出すことができる：Tobacco Production, Chemistry and Technology, Edited by L.Davis and M.Nielsen, Blackwell Science, 1999。
本明細書で提供されるタバコ素材はまた、以下を含む方法（ただしこれらに限定されない）を用いて加工できる：熱処理（例えば煮沸、トースト）、香り付け、酵素処理、膨張及び/又は熟成。発酵及び非発酵タバコの両方をこれらの技術で加工することができる。適切な加工タバコの例には、暗所空気乾燥、暗所火力乾燥、バーレー、熱風乾燥、及びシガーフィラー又はラッパーとともに全葉ステミング操作から得られる製品が含まれる。ある特徴では、タバコの線維は新鮮重量基準で70％までのダークタバコを含む。例えば、タバコは、加熱、発酵及び/又は殺菌工程によって条件付けできる（米国特許公開No.2004/0118422又は2005/0178398に記載）。
【００８７】
本明細書で提供されるタバコ素材は発酵させることができる。発酵は典型的には、高い初期水分含有量、熱発生、及び10から20％の乾燥重量低下を特徴とする。例えば、米国特許4,528,993号、4,660,577号、4,848,373号及び5,372,149号を参照されたい。葉の芳香の改変に加えて、発酵は葉の色及び手触りの一方又は両方を変化させることができる。さらにまた、発酵過程の間に、ガス発生が生じ、酸素が取り込まれ、pHが変化し、保持される水の量が変化し得る。例えば以下を参照されたい：米国特許公開No.2005/0178398；及びTso（1999, Chapter 1 in Tobacco, Production, Chemistry and Technology, Davis & Nielsen, eds., Blackwell Publishing, Oxford）。乾燥タバコ又は乾燥発酵タバコは、口腔製品に取り込む前に更なる加工を施すことができる（例えばカット、膨張、ブレンド、すり潰し、粉砕）。いくつかの事例では、タバコは、ロングカットの発酵させ乾燥させた湿潤タバコであり、前記は、コポリマーと、場合によって香料及び他の添加物と混合する前に48から50重量パーセントのオーブン揮発成分含有量を有する。
ある特徴では、本明細書で提供されるタバコ素材は所望のサイズに加工できる。ある種の特徴では、タバコの線維は200ミクロン未満の平均線維サイズを有するように加工できる。ある特徴では、タバコの線維は75から125ミクロンである。別の特徴では、タバコの線維は75ミクロン以下のサイズを有するように加工される。ある特徴では、タバコの線維はロングカットタバコを含み、前記は、約25.4ミリメートル（1インチ）当たり約10カットから約110カットまでの幅、さらに約2.54ミリメートル（約0.1インチ）から約25.4ミリメートル（約1インチ）までの長さに切断又は細断され得る。ダブルカットタバコ線維は、ダブルカットタバコ線維の約70％が-20メッシュから80メッシュのメッシュサイズとなるような粒子サイズの範囲を有することができる。
【００８８】
本明細書で提供されるタバコ素材は、オーブン揮発成分総含有量が約10重量％以上、約20重量％以上、約40重量％以上、約15重量％から約25重量％、約20重量％から約30重量％、約30重量％から約50重量％、約45重量％から約65重量％、又は約50重量％から約60重量％であるように加工できる。 “湿潤”タバコは典型的には、約40重量％から約60重量％（例えば、約45重量％から約55重量％、又は約50重量％）のオーブン揮発成分含有量を有するタバコを指すことは当業者には理解されよう。本明細書で用いられるように、“オーブン揮発成分”は、予熱した110℃の強制通風オーブンで3.25時間サンプルを乾燥させた後で、サンプルの重量低下のパーセンテージを計算することによって決定される。口腔製品は、当該口腔製品を調製するために用いられるタバコ線維のオーブン揮発成分含有量と異なる全体的オーブン揮発成分含有量を有することができる。本明細書に記載する加工工程はオーブン揮発成分含有量を低下又は増加させることができる。
ある特徴では、本明細書で提供されるタバコ植物、種子、植物成分、植物細胞、及び植物ゲノムは、熱風乾燥タバコ、天日乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗所空気乾燥タバコ、及び暗所火力乾燥から成る群から選択されるタバコタイプに由来する。別の特徴では、本明細書で提供されるタバコ植物、種子、植物成分、植物細胞、及び植物ゲノムは、バーレータバコ、メリーランドタバコ、ブライトタバコ、バージニアタバコ、オリエンタルタバコ、トルコタバコ、及びガルパオタバコから成る群から選択されるタバコタイプに由来する。ある特徴では、本明細書で提供されるタバコ植物又は種子はハイブリッド植物又は種子である。本明細書で用いられるように、“ハイブリッド”は、異なる品種又は種に由来する2つの植物を交配することによって作出され、したがって子孫は各親由来の遺伝物質を含む。より高次のハイブリッドも同様に作出できることは当業者には理解される。例えば、品種Cを品種Dと交配してCｘDハイブリッドを作出することによって第一のハイブリッドを作製し、品種Eを品種Fと交配してEｘFハイブリッドを作出することによって第二のハイブリッドを作製することができる。第一及び第二のハイブリッドをさらに交配して、より高次のハイブリッド（CｘD）ｘ（EｘF）を作出することができ、前記は4つの親品種全ての遺伝情報を含む。
【００８９】
熱風乾燥タバコ（ブライトタバコのバージニアとも称される）は世界のタバコ生産のほぼ40％に達する。熱風乾燥タバコは、乾燥中に黄金色から深いオレンジ色に達するのでしばしば“ブライトタバコ”とも称される。熱風乾燥タバコは軽く華やかな芳香及び味を有する。熱風乾燥タバコは一般的に糖が多く油が少ない。主な熱風乾燥タバコの生育国はアルゼンチン、ブラジル、中国、インド、タンザニア、及び米国である。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物又は種子は以下から成る群から選択される熱風乾燥タバコのバックグラウンドを有する：CC 13、CC 27、CC 33、CC35、CC 37、CC 65、CC 67、CC 700、GF 318、GL 338、GL 368、GL 939、K 346、K 399、K326、NC 102、NC 196、NC 291、NC 297、NC 299、NC 471、NC 55、NC 606、NC 71、NC 72、NC 92、PVH 1118、PVH 1452、PVH 2110、SPEIGHT 168、SPEIGHT 220、SPEIGHT 225、SPEIGHT 227、SPEIGHT 236及び任意の変種、特に前述の変種のいずれか1つから派生するもの。別の特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物又は種子は以下から成る群から選択される熱風乾燥タバコのバックグラウンドを有する：コーカー（Coker）48、コーカー176、コーカー371-ゴールド、コーカー319、コーカー347、GL 939、K 149、K326、K 340、K 346、K 358、K 394、K 399、K 730、NC 27NF、NC 37NF、NC 55、NC 60、NC 71、NC 72、NC 82、NC 95、NC 297、NC 606、NC 729、NC 2326、マクネア（McNair）373、マクネア944、Ox 207、Ox 414 NF、リームス（Reams）126、リームス713、リームス744、RG 8、RG 11、RG 13、RG 17、RG 22、RG 81、RG H4、RG H51、スペイト（Speight）H-20、スペイトG-28、スペイトG-58、スペイトG-70、スペイトG-108、スペイトG-l11、スペイトG-l17、スペイト168、スぺイト179、スペイトNF-3、Va 116、Va 182及び任意の変種、特に前述の変種のいずれか1つから派生するもの。WO 2004/041006 A1を参照されたい。さらに別の特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物、種子、ハイブリッド、変種、又は系統は、K326、K346及びNC196から成る群から選択される任意の熱風乾燥バックグラウンドを有する。
【００９０】
空気乾燥タバコにはバーレー、メリーランド及びダークタバコが含まれる。共通要件は、乾燥に主として人工的な熱源及び水分源が存在しないことである。バーレータバコは淡褐色から暗褐色であり油が多く糖は少ない。バーレータバコは倉庫で空気乾燥される。主なバーレー生育国はアルゼンチン、ブラジル、イタリア、マラウィ、及び米国である。メリーランドタバコは綿毛のように甚だしくふわふわし、良好な燃焼特性を有し、低ニコチン及び中性芳香を有する。主要なメリーランド生育国には米国及びイタリアが含まれる。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物又は種子は以下から成る群から選択されるバーレータバコのバックグラウンドを有する：クレー（Clay）402、クレー403、クレー502、Ky 14、Ky 907、Ky 910、Ky 8959、NC 2、NC 3、NC 4、NC 5、NC 2000、Tn 86、Tn 90、Tn 97、R 610、R 630、R 711、R 712、NCBH 129、HB4488PLC、PD 7319LC、Bu 21×Ky 10、HB04P、Ky 14×L 8、Kt 200、ニュートン（Newton）98、ペディゴ（Pedigo）561、Pf561及びVa 509。さらに別の特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物、種子、ハイブリッド、変種、又は系統は、TN 90、KT 209、KT 206、KT212及びHB 4488から成る群から選択される任意のバーレーのバックグラウンドを有する。別の特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物又は種子は、Md 10、Md 40、Md 201、Md 609、Md 872及びMd 341から成る群から選択されるメリーランドタバコのバックグラウンドを有する。
【００９１】
ダーク空気乾燥タバコは主としてその乾燥工程から他のタイプと識別され、当該乾燥工程は中程度から濃い褐色及び明瞭な芳香をダーク空気乾燥タバコに与える。ダーク空気乾燥タバコは主として噛みタバコ及び嗅ぎタバコの製造に用いられる。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物又は種子は、以下から成る群から選択されるダーク空気乾燥タバコのバックグラウンドを有する：スマトラ（Sumatra）、ジャティム（Jatim）、ドミニカンキューバノ（Dominican Cubano）、ベスキ（Besuki）、ワンサッカー（One sucker）、グリーンリバー（Green River）、バージニア天日干し、及びパラグアンパッサード（Paraguan Passado）。
ダーク火力乾燥タバコは一般的に、密閉乾燥室の床上での低燃焼木材火力により乾燥される。ダーク火力乾燥タバコは、パイプブレンド、紙巻きタバコ、噛みタバコ、嗅ぎタバコ及び味が強い葉巻を調製するために用いられる。ダーク火力乾燥タバコの主要な生育国は米国のテネシー、ケンタッキー及びバージニアである。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物又は種子は、以下から成る群から選択されるダーク火力乾燥タバコのバックグラウンドを有する：細葉マドール（Madole）、改良マドール、トムロッソンマドール（Tom Rosson Madole）、ニュートンのVHマドール、リトルクリッテンデン（Little Crittenden）、グリーンウッド（Green Wood）、リトルウッド（Little Wood）、小軸マンモス（Small Stalk Black Mammoth）、DT 508、DT 518、DT 592、KY 171、DF 911、DF 485、TN D94、TN D950、VA 309及びVA 359。
【００９２】
オリエンタルタバコはまた、ギリシャタバコ、芳香タバコ及びトルコタバコと称される。その理由は、それらタバコが典型的には東部地中海地域（例えばトルコ、ギリシャ、ブルガリア、マケドニア、シリア、レバノン、イタリア及びルーマニア）で育成されるという事実による。小さなサイズの植物及び葉（今日のオリエンタル変種の特徴）とともにその固有の芳香特性は、当該植物がこれまで何世紀にもわたって進化した、痩せた土壌及びストレスの多い気候条件への当該植物の順応の結果である。ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物又は種子は、以下から成る群から選択されるオリエンタルタバコのバックグラウンドを有する：イズマー（Izmir）、カテリニ（Katerini）、サムソン（Samsun）、バスマアンドクルモフグラド（Basma and Krumovgrad）、トラブゾン（Trabzon）、テサリアン（Thesalian）、タソバ（Tasova）、シノップ（Sinop）、イズミット（Izmit）、ヘンデク（Hendek）、エダーン（Edirne）、セムジンリ（Semdinli）、アジヤンマン（Adiyanman）、ヤイラダグ（Yayladag）、イスケンダルン（Iskenderun）、ダズス（Duzce）、マケドニアン（Macedonian）、マブラ（Mavra）、プリレプ（Prilep）、バフラ（Bafra）、ブルサ（Bursa）、ブカク（Bucak）、ビトリス（Bitlis）、バリケサー（Balikesir）、及び特に前述の変種のいずれか1つから派生する任意の変種。
【００９３】
ある特徴では、本明細書で提供される改変タバコ植物、種子、ハイブリッド、変種、又は系統は特に以下から派生するか、又は以下のバックグラウンドを有する：BU 64、CC 101、CC 200、CC 13、CC 27、CC 33、CC 35、CC 37、CC 65、CC 67、CC 301、CC 400、CC 500、CC 600、CC 700、CC 800、CC 900、CC 1063、コーカー（Coker）176、コーカー319、コーカー371ゴールド、コーカー48、CU 263、DF911、ガルパオ、GL 26H、GL 338、GL 350、GL 395、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、GF 157、GF 318、RJR 901、HB 04P、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、NC 196、NC 37NF、NC 471、NC 55、NC 92、NC2326、NC 95、NC 925、PVH 1118、PVH 1452、PVH 2110、PVH 2254、PVH 2275、VA 116、VA 119、KDH 959、KT 200、KT204LC、KY 10、KY 14、KY 160、KY 17、KY 171、KY 907、KY 907LC、KTY14 x L8 LC、リトルクリッテンデン、マクネア373、マクネア944、雄性不稔KY 14 x L8、細葉マドール、MS KY171、細葉マドール（phph）、MS細葉マドール、MS TND950、PD 7302LC、PD 7305LC、PD 7309LC、PD 7312LC、PD 7318LC、PD 7319LC、MSTKS 2002、TKF 2002、TKF 6400、TKF 4028、TKF 4024、KT206LC、KT209LC、KT210LC、KT212LC、NC 100、NC 102、NC 2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、ニールスミスマドール（Neal Smith Madole）、OXFORD 207、‘ペリケ’（‘Ｐerique’）、PVH03、PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R 7-11、R 7-12、RG 17、RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、スペイト168、スペイト172、スペイト179、スペイト210、スペイト220、スペイト225、スペイト227、スペイト234、スペイトG-28、スペイトG-70、スペイトH-6、スペイトH20、スペイトNF3、TI 1406、TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN90LC、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、a TR（トムロッソン）マンドール、VA 309, VA 359、又は当業界で公知の標準的なタバコ育種技術による任意の市場のタバコ変種。
【００９４】
前述のダーク空気乾燥、バーレー、メリーランド、ダーク火力乾燥、又はオリエンタルタイプの具体的変種は全て例示のために列挙されているだけである。追加される全てのダーク空気乾燥、バーレー、メリーランド、ダーク火力乾燥、オリエンタル変種がまた本出願に包含される。
さらにまた本明細書で提供されるものは本明細書に記載するタバコ植物の集団である。ある特徴では、本明細書で提供されるタバコ植物の集団は、約4,047m2（1エーカー）当たり約5,000から約8,000、約5,000から約7,600、約5,000から約7,200、約5,000から約6,800、約5,000から約6,400、約5,000から約6,000、約5,000から約5,600、約5,000から約5,200、約5,200から約8,000、約5,600から8,000、約6,000から約8,000、約6,400から約8,000、約6,800から約8,000、約7,200から約8,000、又は約7,600から約8,000植物の植え付け密度を有する。別の特徴では、本明細書で提供されるタバコ植物の集団は。低い又は中程度の肥沃度を有する土壌タイプに存在する。
さらにまた本明細書で提供されるものは、本明細書に記載するタバコ植物の種子の容器である。本開示のタバコ種子の容器は任意の数、重量又は体積の種子を収納する。例えば、容器は、少なくとも約100又は前記を超える、少なくとも約200又は前記を超える、少なくとも約300又は前記を超える、少なくとも約400又は前記を超える、少なくとも約500又は前記を超える、少なくとも約600又は前記を超える、少なくとも約700又は前記を超える、少なくとも約800又は前記を超える、少なくとも約900又は前記を超える、少なくとも約又は前記を超える、少なくとも約又は前記を超える、少なくとも約1000又は前記を超える、少なくとも約1500又は前記を超える、少なくとも約2000又は前記を超える、少なくとも約2500又は前記を超える、少なくとも約3000又は前記を超える、少なくとも約3500又は前記を超える、又は約4000以上の種子を収納することができる。また別には、容器は、少なくとも約28.35g（約1オンス）又は前記を超える、少なくとも約141.75g（約5オンス）又は前記を超える、少なくとも約283.5g（約10オンス）又は前記を超える、少なくとも約0.4536kg（約1ポンド）又は前記を超える、少なくとも約0.9072kg（約2ポンド）又は前記を超える、少なくとも約1.3608kg（約3ポンド）又は前記を超える、少なくとも約1.8144kg（約4ポンド）又は前記を超える、又は約2.268kg（約5ポンド）以上の種子を収納することができる。タバコ種子の容器は当業界で利用可能な任意の容器であり得る。非限定的な例として、容器は、箱、バッグ、小包み、ポーチ、テープロール、チューブ、又はビンであり得る。
【００９５】
本開示はまた、吸枝成長が低下又は消失したタバコの系統、栽培品種又は変種の育種方法を開示する。育種は任意の公知の手順により実施することができる。DNAフィンガープリント手技、SNPマッピング、ハロタイプマッピング、又は同様な技術をマーカー支援選別（MAS）育種プログラムで用いて、所望の特質又は対立遺伝子をタバコ植物に移し又は殖やすことができる。例えば。育種業者は、本明細書で提供されるF1ハイブリッド植物を用いて、又はF1ハイブリッド植物を農学的に所望される遺伝子型を有する他のドナー植物とさらに交配して、F2又は戻し交配世代で分離集団を作出することができる。F2又は戻し交配世代の植物を所望の芳香特質又は所望の化学的プロフィールについて、当業界で公知の又は本明細書で列挙する技術の1つを用いてスクリーニングすることができる。予想される継承パターン又は用いられるMAS技術にしたがって、所望される個々の植物の同定を促進するために各戻し交配サイクルの前に選別植物の自家受粉を実施することができる。反復親の所望の表現型が回収されるまで、戻し交配又は他の育種手順を繰り返すことができる。ある特徴では、本開示の本復親は熱風乾燥変種、バーレー変種、ダーク空気乾燥変種、ダーク火力乾燥変種、又はオリエンタル変種であり得る。別の特徴では、反復親は改変タバコ植物、系統、又は変種であり得る。他の育種技術は例えば以下で見出すことができる：Wernsman, E.A., and Rufty, R.C.1987.Chapter Seventeen.Tobacco.Pages 669-698 In: Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr (ed.), MacMillan Publishing Go., Inc., New York, N.Y.（前記は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。
【００９６】
本明細書に記載の改変タバコ植物を用いる植物育種プログラムの結果は、本開示の有用な系統、栽培品種、変種、子孫、インブレッド及びハイブリッドを含む。本明細書で用いられるように、“変種”は、植物を同じ種の他の種から分離する不変の特徴を共有する植物の集団を指す。常にというわけではないが、変種はしばしば市場で販売される。1つ以上の弁別的な特質を有しつつ、変種はさらに当該変種内の個体間における非常に小さな全体的変動を特徴とする。“純系”変種は、数世代の自家受粉及び選別によって、又は組織もしくは細胞培養技術を用いて単一の親から栄養繁殖によって作出され得る。変種は本質的に別の系統又は変種から誘導し得る。植物新変種の保護のための国際会議（International Convention for the Protection of New Varieties of Plants, 1961年12月2日）によって規定されたように（1972年11月10日、1978年10月23日、及び1991年3月19日にジュネーブで改正）、変種は下記の場合に最初の変種から“本質的に誘導される”：a）主として最初の変種から、又は主として最初の変種から誘導された変種から誘導され、一方、最初の変種の遺伝子型又は遺伝子型組合せから生じる本質的特徴の発現を保持する；b）最初の変種とは明瞭に区別され得る；及びc）誘導作用から生じる相違を除いて、最初の変種の遺伝子型又は遺伝子型の組合せから生じる本質的特徴の発現で最初の変種と一致する。本質的誘導変種は、例えば天然のもしくは誘発された変異体、体細胞クローン変種、最初の変種植物に由来する変種個体、戻し交配、又は形質転換の選別によって得ることができる。第一のタバコ変種及び第一の変種が本質的に誘導される第二のタバコ変種は、本質的に同一の遺伝的バックグラウンドを有すると考えられる。変種とは区別される“系統”はしばしば植物のグループを指し、前記は非商業的に例えば植物研究で用いられる。系統は1つ以上の問題の特質について個体間で全体的な変動をほとんど示さないが、ただし他の特質については個体間でいくつかの変動を示すことがある。
【００９７】
ある特徴では、本開示は以下の工程を含むタバコ植物を作製する方法を提供する：第一のタバコ変種の少なくとも1つのタバコ植物を第二のタバコ変種の少なくとも1つのタバコ植物と交配する工程（ここで、第一の変種の少なくとも1つのタバコ植物は、類似の条件下で育成した同じ変種のコントロールタバコ植物と比較して上部切取り誘発吸枝成長が存在しないか又は低下している）、及び類似条件下で育成した同じ交配のコントロールタバコ植物と比較して上部切取り誘発吸枝成長が存在しないか又は低下している子孫タバコ植物を選別する工程。ある特徴では、本明細書で提供される第一のタバコ変種は改変タバコ植物を含む。別の特徴では、本明細書で提供される第二のタバコ変種は改変タバコ植物を含む。ある特徴では、第一又は第二のタバコ変種は雄性不稔である。別の特徴では、第一又は第二のタバコ変種は細胞質雄性不稔である。別の特徴では、第一又は第二のタバコ変種は雌性不稔である。ある特徴では、第一又は第二のタバコ変種はエリート変種である。別の特徴では、第一又は第二のタバコ変種はハイブリッドである。
ある特徴では、本開示は、タバコ変種に1つ以上のトランスジーンを遺伝子移入する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）1つ以上のトランスジーンを含む第一のタバコ変種を、当該1つ以上のトランスジーンを含まない第二のタバコ変種と交配して1つ以上の子孫タバコ植物を作出する工程；（b）当該1つ以上のトランスジーンについて当該1つ以上の子孫タバコ植物の遺伝子型を決定する工程；及び（c）当該1つ以上のトランスジーンを含む子孫タバコ植物を選別する工程。別の特徴では、これらの方法はさらに、当該選別した子孫タバコ植物を当該第二のタバコ変種と戻し交配する工程を含む。さらに別の特徴では、これらの方法はさらに、（d）当該選別した子孫植物をそれ自体と、又は当該第二のタバコ変種と交配して1つ以上のさらに別の子孫タバコ植物を作出する工程、及び（e）当該1つ以上のトランスジーンを含むさらに別の子孫タバコ植物を選別する工程を含む。ある特徴では、当該第二のタバコ変種はエリート変種である。
【００９８】
ある特徴では、本開示は、タバコ変種に1つ以上の変異を遺伝子移入する方法を提供する。前記方法は以下の工程を含む：（a）1つ以上の変異を含む第一のタバコ変種を、当該1つ以上の変異を含まない第二のタバコ変種と交配して1つ以上の子孫タバコ植物を作出する工程；（b）当該1つ以上の変異について当該1つ以上の子孫タバコ植物の遺伝子型を決定する工程；及び（c）当該1つ以上の変異を含む子孫タバコ植物を選別する工程。別の特徴では、これらの方法はさらに、当該選別した子孫タバコ植物を当該第二のタバコ変種と戻し交配する工程を含む。さらに別の特徴では、これらの方法はさらに、（d）当該選別した子孫植物をそれ自体と、又は当該第二のタバコ変種と交配して1つ以上のさらに別の子孫タバコ植物を作出する工程、及び（e）当該1つ以上の変異を含むさらに別の子孫タバコ植物を選別する工程を含む。ある特徴では、当該第二のタバコ変種はエリート変種である。
ある特徴では、本開示は、吸枝成長が存在しないか又は低下した改変タバコ植物の集団を育成する方法を提供する。前記方法は、1つ以上の変異、1つ以上のトランスジーン、又は両方を含むタバコ種子の集団を植え付ける工程を含み、この場合、前記1つ以上の改変タバコ植物は、類似の条件下で育成した同じ変種のコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長が存在しないか又は低下する。
【００９９】
ある特徴では、本開示は改変タバコ植物を育成する方法を提供し、前記方法は、改変タバコ種子を植え付ける工程及び当該種子に由来する改変タバコ植物を育成する工程を含み、前記改変タバコ種子は、あるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結される異種プロモーターを含み、前記ポリペプチドは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードする。別の特徴では、本開示は改変タバコ植物を育成する方法を提供し、前記方法は、改変タバコ種子を植え付ける工程及び当該種子に由来する改変タバコ植物を育成する工程を含み、前記改変タバコ種子は、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯、又は前記の組み合わせにおいて機能し、かつ非コードRNA分子をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結される異種プロモーターを含む組換えDNA構築物を含み、ここで、前記非コードRNA分子は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、70、72、74、76、78、161−185、187、189、191、197、199、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は100％配列同一性を有するポリペプチドをコードするRNAと結合することができ、さらに前記非コードRNA分子は当該ポリペプチドの発現を抑制する。ある特徴では、育成工程は種子を発芽させる工程を含む。別の特徴では、育成工程は、土壌、寒天、寒天系培地又は水耕栽培系に苗木を配置する工程を含む。別の特徴では、育成工程は、種子又は植物に水、光（例えば人工光、太陽光）、肥料、発根培地、又は前記の組合せを提供する工程を含む。ある特徴では、育成工程は室内（例えば温室）又は屋外（例えば田畑）で行うことができる。ある特徴では、育成工程は種子又は植物を容器に配置する工程を含む。
ある特徴では、本開示は改変種子を製造する方法を提供する。前記方法は以下を含む：本明細書で提供される組換えDNA構築物を植物細胞に導入する工程；植物細胞の集団を当該組換えDNA構築物についてスクリーニングする工程；当該集団から1つ以上の植物細胞を選別する工程；当該1つ以上の植物細胞から1つ以上の改変植物を作出する工程；及び当該1つ以上の改変植物から1つ以上の改変種子を収集する工程。
【０１００】
本明細書で用いられるように、“遺伝子座”は、多形核酸、特質決定基、遺伝子、又はマーカーが位置する染色体領域である。本開示の遺伝子座は1つの集団内に1つ以上の多形性を含み、例えば代替となる対立遺伝子がいくつかの個体に存在する。本明細書で用いられるように、“対立遺伝子”は個々の遺伝子座における代替となる核酸配列を指す。対立遺伝子の長さは1ヌクレオチド塩基でも可能であるが、典型的にはもっと大きい。例えば、第一の対立遺伝子はある染色体に存在し、一方、第二の対立遺伝子は第二の相同な染色体に存在することができ、例えば、1つの集団でヘテロ接合個体の別個の染色体について、又は別個のホモ接合もしくはヘテロ接合個体間で生じる。本明細書で用いられるように、二倍体植物の染色体は、1つの遺伝子座のただ1つのコピーだけが存在するときは“ヘミ接合”である。例えば、挿入されるトランスジーンは、前記が1つの姉妹染色体にのみ挿入されるときはヘミ接合である（すなわち第二の姉妹染色体は挿入トランスジーンを含まない）。
ある特徴では、改変植物、種子、植物成分、植物細胞、又は植物ゲノムは本明細書で提供されるトランスジーンについてホモ接合である。別の特徴では、改変植物、種子、植物成分、植物細胞、又は植物ゲノムは本明細書で提供されるトランスジーンについてヘテロ接合である。ある特徴では、改変植物、種子、植物成分、植物細胞、又は植物ゲノムは本明細書で提供されるトランスジーンについてヘミ接合である。ある特徴では、改変植物、種子、植物成分、植物細胞、又は植物ゲノムは本明細書で提供される変異についてホモ接合である。別の特徴では、改変植物、種子、植物成分、植物細胞、又は植物ゲノムは本明細書で提供される変異についてヘテロ接合である。ある特徴では、改変植物、種子、植物成分、植物細胞、又は植物ゲノムは本明細書で提供される変異についてヘミ接合である。
【０１０１】
本明細書で用いられるように、“遺伝子移入”又は“遺伝子移入する”は、ある遺伝子座の所望される対立遺伝子を1つの遺伝的バックグラウンドから別の遺伝的バックグラウンドへ移すことを指す。
本明細書で用いられるように、“交配する”又は“交配”は繁殖により子孫を生じることを意味し（例えば細胞、種子、又は植物）、異なる植物間での交配（有性交配）及び自家受精（単体繁殖）を含む。
本明細書で用いられるように、“戻し交配”及び“戻し交配する”とは、子孫植物をその親の１つと繰り返し交配することを指す。戻し交配スキームでは、“ドナー”親は、遺伝子移入されるべき所望の遺伝子又は遺伝子座を有する親植物を指す。“レシピエント”親（1回以上用いられる）又は“反復”親（2回以上用いられる）は、遺伝子又は遺伝子座が導入されている親植物を指す。最初の交配はF1世代を生じる。“BC1”という用語は反復親の2回目の使用を指し、“BC2”は反復親の3回目の使用指す（以下同様）。ある特徴では、戻し交配は繰り返し実施され、連続する戻し交配世代の各々の子孫個体それ自体が同じ親遺伝子型と戻し交配される。
本明細書で用いられるように、“エリート変種”は優れた農学的性能のために育種及び選別されて得られた任意の変種を意味する。
本明細書で用いられるように、育種の関係で“選別する”又は“選別”は、所望の個体を通常は1つの集団から予め定めた一定の基準に基づいて採集又は選択する作業を指す。
【０１０２】
ある特徴では、本明細書で提供されるタバコ植物はハイブリッド植物である。ハイブリッドは、第一の変種の雌性親植物（例えば種子親）の自家受粉を防止し、第二の変種の雄性親植物の花粉を当該雌性親植物に受精させ、当該雌性植物でF1ハイブリッド種子を形成することによって作出できる。雌性植物の自家受粉は花の発生初期に花を除雄することによって防ぐことができる。また別には、雄性不稔の形式を用いて、雌性親植物で花粉の形成を妨げることができる。例えば、雄性不稔は、雄性不稔（MS）、又はトランスジェニック雄性不稔（トランスジーンは小胞子生成及び/又は花粉形成を阻害する）、又は自家不和合性によってもたらされ得る。MSを含む雌性親植物が特に有用である。雌性親植物がMSである場合には、花粉を雄性稔性植物から採集し、MS雌性親植物の柱頭に手作業で適用し、得られるF1種子を採集することができる。加えて、雌性不稔植物もまた自家受精の防止に用いることができる。
植物を用いてシングル交配タバコF1ハイブリッドを形成できる。雄性親植物の花粉を除雄雌性親植物又は雄性不稔雌性親植物に手作業で移してF1種子を形成する。また別には、3様式交配を実施できる。前記ではシングル交配F1ハイブリッドが雌性親として用いられ、さらに異なる雄性親と交配される。別の選択肢として、ダブル交配ハイブリッドを作出でき、この場合、2つの異なるシングル交配のF1子孫がそれら自体と交配される。自家不和合性を個々の便宜に対して用い、ダブル交配ハイブリッドを形成するときに雌性親の自家受粉を防ぐことができる。
【０１０３】
ある特徴では、本明細書で提供されるタバコ変種は雄性不稔である。別の特徴では、本明細書で提供されるタバコ変種は細胞質性雄性不稔（CMS）である。雄性不稔タバコ植物は当業界で公知の任意の方法によって作出できる。雄性不稔タバコを作出する方法は以下に記載されている：Wernsman, E.A., and Rufty, R.C.1987.Chapter Seventeen.Tobacco.Pages 669-698 In: Cultivar Development.Crop Species.W.H.Fehr (ed.), MacMillan Publishing Go., Inc., New York, N.Y.761 pp。別の特徴では、本明細書で提供されるタバコ変種は雌性不稔である。非限定的な例として、雌性不稔植物はSTIG1遺伝子を変異させることによって作製できる。例えば以下を参照されたい：Goldman et al.1994, EMBO Journal 13:2976-2984。
【０１０４】
本明細書で用いられるように、2つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の関係で“配列同一性”又は“同一性”という用語は、指定の比較ウィンドウにわたって最大一致のためにアラインメントしたとき同じである2つの配列の残基を言う。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージが用いられるとき、同一でない残基の位置は保存的アミノ酸置換によってしばしば相違することは理解されよう（保存的置換では、アミノ酸残基は同様な化学的特性（例えば電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基のために置換され、したがって当該分子の機能的特性を変化させない）。配列が保存的置換で相違するとき、パーセント配列同一性は上方調整して置換の保存的性質のために修正することができる。そのような保存的置換によって相違する配列は“配列類似性”又は“類似性”を有すると称される。
【０１０５】
“ポリヌクレオチド”という用語の使用は、本開示をDNAを含むポリヌクレオチドに制限することを意図しない。ポリヌクレオチド及び核酸分子はリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組合せを含むことができることは当業者には理解されるであろう。そのようなデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドには天然に生じる分子及び合成アナログの両方が含まれる。本開示のポリヌクレオチドはまた、配列の全ての形態（一本鎖形、二本鎖形、ヘアピン、ステムアンドループ構造などを含む（ただしこれらに限定されない））を包含する。
本明細書で用いられるように、“ポリペプチド”という用語は、少なくとも2つの共有結合したアミノ酸の鎖を指す。
【０１０６】
本開示は、組換え、精製、単離、又は加工された核酸及びポリペプチドを提供する。ある特徴では、本開示は、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254及び前記のフラグメントから成る群から選択される配列と少なくとも約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％、又は約100％同一性を含む核酸分子を提供する。ある特徴では、本開示は、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225−228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、及び254から成る群から選択されるポリヌクレオチドと同一である連続する少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも26、少なくとも27、少なくとも28、少なくとも29、少なくとも30、又は30を超えるヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。
【０１０７】
別の特徴では、本開示は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は約100％配列同一性を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。別の特徴では、本開示は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は約100％類似性を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０１０８】
ある特徴では、本開示は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は約100％配列同一性を含むポリペプチドを提供する。ある特徴では、本開示は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、又は約100％類似性を含むポリペプチドを提供する。ある特徴では、本開示は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるポリペプチドのアミノ酸配列と同一である連続する少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、又は50を超えるアミノ酸残基を含むポリペプチドを提供する。
【０１０９】
別の特徴では、本開示は、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質の生物学的に活性な変種を提供する。本開示のタンパク質の生物学的に活性な変種は、当該タンパク質とは1−15アミノ酸残基だけ、10残基だけ、9残基だけ、8残基だけ、7残基だけ、6残基だけ、5残基だけ、4残基だけ、3残基だけ、2残基だけ、1アミノ酸残基だけ相違し得る。さらにまた本明細書で提供されるものは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253及び255から成る群から選択される遺伝子又はタンパク質のオルトログ遺伝子又はタンパク質である。“オルトログ”は共通の祖先遺伝子に由来する遺伝子であり、それらは種分化の結果として異なる種で見いだされる。オルトログは、ヌクレオチド配列及び/又はアミノ酸配列レベルで少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、又は99％を超える配列同一性又は類似性を共有し得る。オルトログの機能は種の間でしばしば高度に保存される。
【０１１０】
本明細書で提供される核酸分子、ポリペプチド、又はタンパク質は単離されるか又は実質的に精製され得る。“単離”又は“精製”核酸分子、ポリペプチド、タンパク質、又は前記の生物学的に活性な部分は、前記が天然に存在する環境で見いだされるポリヌクレオチド又はタンパク質と通常一緒に存在する又は前記と相互作用する成分を実質的に又は本質的に含まない。例えば、単離又は精製ポリヌクレオチド又はタンパク質は、他の細胞性物質又は培地（組み換え技術で生成される場合）を実質的に含まないか、又は化学的前駆体又は化学物質（化学的に合成される場合）を実質的に含まない。ある特徴では、本明細書で提供される単離ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムDNAで当該ポリヌクレオチドと天然の状態でフランキングしている核酸配列の約5000ヌクレオチド未満、約4000ヌクレオチド未満、約3000ヌクレオチド未満、約2000ヌクレオチド未満、約1000ヌクレオチド未満、約500ヌクレオチド未満、約100ヌクレオチド未満を含むことができる。ある特徴では、本明細書で提供される単離ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムDNAで当該ポリヌクレオチドと天然の状態でフランキングしている核酸配列の100−5000、500−5000、1000−5000、2000−5000、3000−5000、4000−5000、1−500、1−1000、1−2000、1−3000、1−4000、1−5000、100−500、100−1000、100−2000、100−3000又は100−4000ヌクレオチドを含むことができる。別の特徴では、本明細書で提供される単離ポリペプチドは調製物中に細胞性物質を実質的に含まず、化学的前駆体又は対象非タンパク質性化学物質を乾燥重量で約30％未満、約20％未満、約10％未満、約5％未満、又は約1％未満含む。前記によってコードされる開示のポリヌクレオチド及びポリペプチドのフラグメントもまた本発明に包含される。ポリヌクレオチドのフラグメントは、本来のポリペプチドの生物学的活性を保持するポリペプチドフラグメントをコードすることができる。また別には、当業界で公知の方法を使用するハイブリダイゼーションプローブ又はPCRプライマーとして有用なポリヌクレオチドのフラグメントは、一般的には、生物学的活性を保持するフラグメントポリペプチドをコードしない。本明細書で提供されるポリヌクレオチドのフラグメントは、所望の成果に応じて、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくとも約20ヌクレオチド、約50ヌクレオチド、約70ヌクレオチド、約100ヌクレオチド、約150ヌクレオチド、約200ヌクレオチド、約250ヌクレオチド、約300ヌクレオチド、及びその完全長までの範囲であり得る。
【０１１１】
核酸は当業界で日常的な技術を用いて単離することができる。例えば、核酸は、組換え核酸技術及び/又はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含む任意の方法（ただしこれらに限定されない）を用いて単離することができる。一般的なPCR技術は例えば以下に記載されている：PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995。組換え核酸技術は例えば制限酵素消化及び連結を含み、前記を用いて核酸を単離できる。単離核酸はまた、単一核酸分子として又は一連のオリゴヌクレオチドとして化学的に合成できる。ポリペプチドは、例えばDEAEイオン交換、ゲルろ過及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのような公知の方法によって、天然の供給源（例えば生物学的サンプル）から精製することができる。ポリペプチドはまた、例えば発現ベクターで核酸を発現することによって精製することができる。加えて、精製ポリペプチドは化学合成によって入手できる。ポリペプチドの精製の程度は、任意の適切な方法（例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はHPLC分析）を用いて測定できる。
ある特徴では、本開示は組換え核酸及びポリペプチドを植物細胞で検出する方法を提供する。核酸は又はイブリダイゼーションを用いて検出できる（ただし前記に限定されない）。核酸間のハイブリダイゼーションは以下で詳細に考察されている：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 1989。
ポリペプチドは抗体を用いて検出できる。抗体を用いてポリペプチドを検出する技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈澱及び免疫蛍光が含まれる。本明細書で提供される抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であり得る。本明細書で提供されるポリペプチドに対して特異的な結合親和性を有する抗体は当業界で周知の方法を用いて生成できる。当業界で公知の方法を用いて、本明細書で提供される抗体を固体の支持体（例えばマイクロタイタープレート）に付着させることができる。
検出（例えば増幅生成物、ハイブリダイゼーション複合物、ポリペプチドの検出）は、検出可能な標識を用いて達成できる。“標識”という用語は、直接標識とともに間接標識の使用を包含することが意図される。検出可能標識には、酵素、補欠分子族、蛍光物質、化学発光物質、生物発光物質及び放射能物質が含まれる。
【０１１２】
以下の例示的な非限定的実施態様が想定される：
1．類似の条件下で育成したときの同じ変種のコントロールタバコ植物と比較して、吸枝が存在しないか又は減少する改変タバコ植物。
2．前記吸枝が上部切取り誘発吸枝である、実施態様1に記載の改変タバコ植物。
3．前記改変タバコ植物が1つ以上の変異を含む、実施態様1に記載の改変タバコ植物。
4．前記改変タバコ植物が1つ以上のトランスジーンを含む、実施態様1に記載の改変タバコ植物。
5．前記1つ以上の変異が吸枝を抑制する、実施態様3に記載の改変タバコ植物。
6．前記1つ以上のトランスジーンが吸枝を抑制する、実施態様4に記載の改変タバコ植物。
7．前記1つ以上の変異が上部切取り誘発吸枝を抑制する、実施態様3に記載の改変タバコ植物。
8．前記1つ以上のトランスジーンが上部切取り誘発吸枝を抑制する、実施態様4に記載の改変タバコ植物。
9．前記1つ以上の変異が上部切取り前に吸枝を抑制する、実施態様3に記載の改変タバコ植物。
10．前記1つ以上のトランスジーンが上部切取り前に吸枝を抑制する、実施態様4に記載の改変タバコ植物。
11．前記1つ以上の変異が、挿入、欠失、倒置、置換、及び前記の組合せから成る群から選択される、実施態様3に記載の改変タバコ植物。
12．前記1つ以上のトランスジーンが腋生分裂組織特異的プロモーターを含む、実施態様4に記載の改変タバコ植物。
13．前記腋生分裂組織特異的プロモーターがL1層、L2層、L3領域又は前記の組合せで優先的に機能する、実施態様12に記載の改変タバコ植物。
14．前記腋生分裂組織特異的プロモーターが腋生分裂組織の中央帯、周辺帯、髄状帯又は前記の組合せで優先的に機能する、実施態様12に記載の改変タバコ植物。
15．前記1つ以上の変異が、化学的変異誘導、照射変異誘導、トランスポゾン変異誘導、アグロバクテリウム媒介形質転換、メガヌクレアーゼ、ジンク-フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、クラスターを形成し規則的に間隙を有する短いパリンドロームリピート（CRISPR）/Cas9系、CRISPR/Cpf1系、及び前記の組合せから成る群から選択される系を介して導入される、実施態様11に記載の改変タバコ植物。
16．前記1つ以上の変異が、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子中に存在する、実施態様11に記載の改変タバコ植物。
17．前記改変タバコ植物が、類似の条件下で育成したときの前記コントロールタバコ植物と比較して同様な又はより高い葉の収量を有する、実施態様3又は4に記載の改変タバコ植物。
18．前記より高い葉の収量が少なくとも0.5％、1％、2.5％、5％、10％、15％、又は少なくとも20％高い、実施態様17に記載の改変タバコ植物。
19．前記改変タバコ植物が、類似の条件下で育成したときの前記コントロールタバコ植物と比較して同様な植物の高さを有する、実施態様3又は4に記載の改変タバコ植物。
20．前記同様な植物の高さが1％、5％、10％、20％、又は25％以内である、実施態様19に記載の改変タバコ植物。
21．前記改変タバコ植物が、類似の条件下で育成したときの前記コントロールタバコ植物と比較して同様な乾燥葉の化学プロフィールを有する、実施態様3又は4に記載の改変タバコ植物。
22．前記改変タバコ植物が、類似の条件下で育成したときの前記コントロールタバコ植物に由来する乾燥葉と比較して同様な又はより高いUSDA等級インデックス値を生じる、実施態様3又は4に記載の改変タバコ植物。
23．前記上部切取り誘発吸枝の減少が、類似の条件下で育成したときのコントロールタバコ植物の上部切取り誘発吸枝と比較したとき、より少ない吸枝総量、より小さな吸枝、又は両方を含む、実施態様1に記載の改変タバコ植物。
24．前記より小さな吸枝が、類似の条件下で育成したときのコントロールタバコ植物の上部切取り誘発吸枝と比較したとき質量の減少、長さの減少、又は両方を含む、実施態様23に記載の改変タバコ植物。
25．前記改変タバコ植物が、類似の条件下で育成したときのコントロールタバコ植物と比較して吸枝制御のために処理の軽減を要求する、実施態様3又は4に記載の改変タバコ植物。
26．前記処理の軽減が、類似の条件下で育成したときのコントロールタバコ植物と比較して、吸枝制御のための手作業による除去の頻度の軽減、吸枝制御のための化学薬剤適用の頻度の軽減、吸枝制御のための化学薬剤適用の量の軽減、又は前記の任意の組合せを含む、実施態様25に記載の改変タバコ植物。
27．前記吸枝制御のための手作業による除去の頻度の軽減が、類似条件下で育成したときのコントロール植物の10％未満、20％未満、30％未満、40％未満、50％未満、60％未満、70％未満、75％未満、80％未満、85％未満、90％未満、又は95％未満の頻度を含む、実施態様26に記載の改変タバコ植物。
28．前記改変タバコ植物が、前記1つ以上のトランスジーン又は1つ以上の変異についてホモ接合である、実施態様3又は4に記載の改変タバコ植物。
29．前記改変タバコ植物が、前記1つ以上のトランスジーン又は1つ以上の変異についてヘミ接合である、実施態様3又は4に記載の改変タバコ植物。
30．前記改変タバコ植物が、前記1つ以上のトランスジーン又は1つ以上の変異についてヘテロ接合である、実施態様3又は4に記載の改変タバコ植物。
31．前記植物が、熱風乾燥変種、ブライト変種、バーレー変種、バージニア変種、メリーランド変種、ダーク変種、オリエンタル変種、及びトルコ変種から成る群から選択される、実施態様1に記載の改変タバコ植物。
32．前記タバコ植物が、BU 64植物、CC 101植物、CC 200植物、CC 13植物、CC 27植物、CC 33植物、CC 35植物、CC 37植物、CC 65植物、CC 67植物、CC 301植物、CC 400植物、CC 500植物、CC 600植物、CC 700植物、CC 800植物、CC 900植物、CC 1063植物、コーカー176植物、コーカー319植物、コーカー371ゴールド植物、コーカー48植物、CU 263植物、DF911植物、ガルパオ植物、GL 26H植物、GL 338植物、GL 350植物、GL 395植物、GL 600植物、GL 737植物、GL 939植物、GL 973植物、GF 157植物、GF 318植物、RJR 901植物、HB 04P植物、K 149植物、K 326植物、K 346植物、K 358植物、K394植物、K 399植物、K 730植物、NC 196植物、NC 37NF植物、NC 471植物、NC 55植物、NC 92植物、NC2326植物、NC 95植物、NC 925植物、PVH 1118植物、PVH 1452植物、PVH 2110植物、PVH 2254植物、PVH 2275植物、VA 116植物、VA 119植物、KDH 959植物、KT 200植物、KT204LC植物、KY 10植物、KY 14植物、KY 160植物、KY 17植物、KY 171植物、KY 907植物、KY 907LC植物、KTY14 x L8 LC植物、リトルクリッテンデン植物、マクネア373植物、マクネア944植物、雄性不稔KY 14 x L8植物、細葉マドール植物、MS KY171植物、細葉マドール（phph）植物、MS細葉マドール植物、MS TND950植物、PD 7302LC植物、PD 7305LC植物、PD 7309LC植物、PD 7312LC植物、PD 7318LC植物、PD 7319LC植物、MSTKS 2002植物、TKF 2002植物、TKF 6400植物、TKF 4028植物、TKF 4024植物、KT206LC植物、KT209LC植物、KT210LC植物、KT212LC植物、NC 100植物、NC 102植物、NC 2000植物、NC 291植物、NC 297植物、NC 299植物、NC 3植物、NC 4植物、NC 5植物、NC 6植物、NC7植物、NC 606植物、NC 71植物、NC 72植物、NC 810植物、NC BH 129植物、NC 2002植物、ニールスミスマドール植物、OXFORD 207植物、‘ペリケ’植物、PVH03植物、PVH09植物、PVH19植物、PVH50植物、PVH51植物、R 610植物、R 630植物、R 7-11植物、R 7-12植物、RG 17植物、RG 81植物、RG H51植物、RGH 4植物、RGH 51植物、RS 1410植物、スペイト168植物、スペイト172植物、スペイト179植物、スペイト210植物、スペイト220植物、スペイト225植物、スペイト227植物、スペイト234植物、スペイトG-28植物、スペイトG-70植物、スペイトH-6植物、スペイトH20植物、スペイトNF3植物。TI 1406植物、TI 1269植物、TN 86植物、TN86LC植物、TN 90植物、TN90LC植物、TN 97植物、a TN97LC植物、TN D94植物、TN D950植物、TR（トム・ロッソン）マドール植物、VA 309植物、及びVA 359植物から成る群から選択される、実施態様1に記載の改変タバコ植物。
33．前記改変タバコ植物がハイブリッドである、実施態様1に記載の改変タバコ植物。
34．前記改変タバコ植物が雄性不稔又は細胞質性雄性不稔（CMS）である、実施態様1に記載の改変タバコ植物。
35．前記改変タバコ植物が雌性不稔である、実施態様1に記載の改変タバコ植物。
36．実施態様1に記載の改変タバコ植物のタバコ葉。
37．前記タバコ葉が乾燥タバコ葉である、実施態様35に記載のタバコ葉。
38．前記乾燥タバコ葉が空気乾燥、火力乾燥、天日乾燥、又は熱風乾燥される、実施態様36に記載のタバコ葉。
39．実施態様1に記載の改変タバコ植物の乾燥タバコ素材を含む、タバコ製品。
40．前記タバコ製品が、紙巻きタバコ、クレテック、ビディシガレット、葉巻、シガリロ、ノンベンチレーション紙巻きタバコ（non-ventilated cigarette）、ベントリセスフィルター紙巻きタバコ（vented recess filter cigarette）、パイプタバコ、嗅ぎタバコ、噛みタバコ、湿潤無煙タバコ、ファインカット噛みタバコ、ロングカット噛みタバコ、ポーチ入り噛みタバコ製品、ガム、錠剤、ロゼンジ及び溶解ストリップから成る群から選択される、実施態様39に記載のタバコ製品。
41．実施態様1に記載の改変タバコ植物を生じる種子。
42．実施態様1に記載の改変タバコ植物の乾燥タバコ葉を用いてタバコ製品を調製する工程を含む方法。
43．前記改変タバコ植物が、類似の条件下で育成したときの同じ変種のコントロールタバコ植物と比較して以下を示す、改変タバコ植物：
a．腋生分裂組織の増殖の阻害又は消失；
b．腋生分裂組織の維持の阻害又は消失；又は
c．前記の組合せ。
44．組換えポリヌクレオチドを含む植物又は種子であって、前記組換えポリヌクレオチドが、
a．L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯又は前記の組合せで機能し、下記bに作動できるように連結されるプロモーター、
b．ある核酸配列を含む構造性核酸配列を含み、
ここで前記核酸配列が、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードする、前記植物又は種子。
45．前記プロモーターが、配列番号:113−118、148−160、204及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％配列同一性を有する核酸配列を含む、実施態様43に記載の植物又は種子。
46．前記植物又は種子がタバコ植物又は種子である、実施態様43に記載の植物又は種子。
47．以下を含む、組換えDNA構築物：
a．L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯又は前記の組合せで機能するプロモーター、及び
b．異種でかつ作動できるように連結される核酸配列（前記核酸配列は非コードRNA又はポリペプチドをコードする）。
48．前記プロモーターが、配列番号:113−118、148−160、204及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％配列同一性を有する核酸配列を含む、実施態様46に記載の組換えDNA構築物。
49．上部切取り誘発吸枝をタバコ植物で減少又は消失させる方法であって、前記方法が、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯又は前記の組合せで機能するプロモーターを含む組換えDNA構築物でタバコ植物を形質転換する工程を含む、前記方法。
50．前記プロモーターが、配列番号:113−118、148−160、204及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％配列同一性を有する核酸配列を含む、実施態様48に記載の方法。
51．タバコ植物を組換えDNA構築物で形質転換する工程を含む方法であって、前記構築物が、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯又は前記の組合せで機能し、かつ内因性遺伝子のレベルを抑制するRNA分子に転写されるポリヌクレオチドに作動できるように連結される異種プロモーターを含み、前記内因性遺伝子プロモーターが、腋生分裂組織の成長、腋生分裂組織の維持又は両方のために要求される、前記方法。
52．タバコ植物を作出する方法であって、前記方法が、
a．第一のタバコ変種の少なくとも1つのタバコ植物を第二のタバコ変種の少なくとも1つのタバコ植物と交配する工程（ここで、前記第一の変種の少なくとも1つのタバコ植物は、類似の条件下で育成した同じ変種のコントロールタバコ植物と比較して上部切取り誘発吸枝が存在しないか又は少ない）、及び
b．類似条件下で育成した同じ交配のコントロールタバコ植物と比較して上部切取り誘発吸枝が存在しないか又は少ない子孫タバコ植物を選別する工程を含む、前記タバコ植物を作出する方法。
53．タバコ植物又はその部分であって、異種プロモーターを含み、前記異種プロモーターが、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結される、前記タバコ植物又はその部分。
54．前記プロモーターが、配列番号:113−118、148−160、204及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％配列同一性を有する核酸分子を含む、実施態様52に記載のタバコ植物又はその部分。
55．前記ポリヌクレオチドが、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、67、69、71、73、75、77、79、81、83−160、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、及び254から成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％配列同一性を有する、実施態様52に記載のタバコ植物又はその部分。
56．前記ポリペプチドが、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択される前記ポリペプチドと同一である連続する少なくとも15アミノ酸残基を含む、実施態様52に記載のタバコ植物又はその部分。
57．組換えDNA構築物であって、前記構築物が、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結される異種プロモーターを含む、前記組換えDNA構築物。
58．改変タバコ植物を育成する方法であって、前記方法が、改変タバコ種子を植え付ける工程及び前記種子に由来する前記改変タバコ植物を育成する工程を含み、前記種子が異種プロモーターを含み、前記プロモーターが、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結される、前記改変タバコ植物の育成方法。
59．植物で上部切取り誘発吸枝を制御する方法であって、前記方法が組換えDNA構築物で前記植物を形質転換する工程を含み、前記組換えDNA構築物がプロモーターを含み、前記プロモーターが、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、68、70、72、74、76、78、80、82、161−185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結される、前記上部切取り誘発吸枝を制御する方法。
60．非コードRNA分子をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結される異種プロモーターを含むタバコ植物又はその部分であって、前記非コードRNA分子があるRNAと結合することができ、前記あるRNAが、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、64、66、70、72、74、76、78、161−185、187、189、191、197、199、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードし、前記非コードRNA分子が前記ポリペプチドの発現を抑制する、前記タバコ植物又はその部分。
61．前記プロモーターが、配列番号:113−118、148−160、204及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％配列同一性を有する核酸配列を含む、実施態様59に記載のタバコ植物又はその部分。
62．前記ポリヌクレオチドが、配列番号:83−101から成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％配列同一性を有する、実施態様59に記載のタバコ植物又はその部分。
63．前記ポリヌクレオチドが、配列番号:83−101から成る群から選択されるポリヌクレオチドと同一の連続する少なくとも18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、又は30を超えるヌクレオチドを含む、実施態様59に記載のタバコ植物又はその部分。
64．異種の腋生分裂組織特異的プロモーターを含む組換えDNA構築物であって、前記プロモーターがある非コードRNA分子をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結され、前記非コードRNA分子が、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、64、66、70、72、74、76、78、161−185、187、189、191、197、199、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするRNAと結合することができ、さらに前記非コードRNA分子が前記ポリペプチドの発現を抑制する、前記組換えDNA構築物。
65．改変タバコ植物を育成する方法であって、前記方法が、組換えDNA構築物を含む改変タバコ種子を植え付ける工程及び前記種子に由来する改変タバコ植物を育成する工程を含み、前記構築物が異種プロモーターを含み、前記プロモーターが、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯又は前記の組合せで機能し、かつ非コードRNA分子をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結され、前記非コードRNA分子が、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、64、66、70、72、74、76、78、161−185、187、189、191、197、199、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするRNAと結合することができ、さらに前記非コードRNA分子が前記ポリペプチドの発現を抑制する、前記改変タバコ植物を育成する方法。
66．上部切取り誘発吸枝を植物で制御する方法であって、前記方法が組換えDNA構築物で前記植物を形質転換する工程を含み、前記組換えDNA構築物が異種プロモーターを含み、前記プロモーターが、L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯又は前記の組合せで機能しかつ非コードRNA分子をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結され、前記非コードRNA分子が、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、64、66、70、72、74、76、78、161−185、187、189、191、197、199、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするRNAと結合することができ、さらに前記非コードRNA分子が前記ポリペプチドの発現を抑制する、前記上部切取り誘発吸枝を植物で制御する方法。
67．実施態様46、56、又は63のいずれかの実施態様に記載の組換えDNA構築物を含む、細菌細胞。
68．実施態様46、56、又は63のいずれかの実施態様に記載の組換えDNA構築物を含む、植物ゲノム。
69．以下の工程を含む、改変種子を製造する方法：
a．実施態様46、56、又は63のいずれかの実施態様に記載の組換えDNA構築物を植物細胞に導入する工程；
b．前記組換えDNA構築物について植物細胞の集団をスクリーニングする工程；
c．前記集団から1つ以上の植物細胞を選別する工程；
d．前記1つ以上の植物細胞から1つ以上の改変植物を生じる工程；
e．前記1つ以上の改変植物から1つ以上の改変種子を収集する工程。
70．吸枝が減少又は消失する改変タバコ植物を作出する方法であって、前記方法が、1つ以上の変異を1つ以上のタバコゲノム遺伝子座に導入する工程を含む、前記方法。
71．前記1つ以上の変異が、化学的変異誘導、照射変異誘導、トランスポゾン変異誘導、アグロバクテリウム媒介形質転換、メガヌクレアーゼ、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9系、CRISPR/Cpf1系、及び前記の組合せから成る群から選択される系を介して導入される、実施態様69に記載の方法。
72．以下を含む組換えDNA構築物：
a．L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯又は前記の組合せで機能するプロモーター、及び
b．異種でかつ作動できるように連結される人工ミクロRNA（前記人工ミクロRNAは、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、58、60、62、64、66、70、72、74、76、78、161−185、187、189、191、197、199、224、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするRNAと少なくとも70％同一性を有し、さらに前記人工ミクロRNAは前記ポリペプチドの発現を抑制する）。
73．組換えポリヌクレオチドを含む植物又は種子であって、前記組換えポリヌクレオチドが、
a．L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯又は前記の組合せで機能し、下記bに作動できるように連結されるプロモーター、
b．ある核酸配列を含む構造性核酸分子を含み、
ここで、前記核酸配列がオーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質をコードする、前記植物又は種子。
74．以下を含む組換えDNA構築物：
a．L1層、L2層、L3領域、髄状帯、中央帯、周辺帯又は前記の任意の組合せで機能するプロモーター、及び
b．異種でかつ作動できるように連結される核酸配列（前記核酸配列はオーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質をコードする）。
75．あるポリヌクレオチドに作動できるように連結される異種腋生分裂組織特異的プロモーターを含む、組換えDNA構築物であって、前記ポリヌクレオチドが、オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質をコードする、前記組換えDNA構築物。
76．前記オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質が、配列番号:235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、実施態様74に記載の組換えDNA構築物。
77．異種プロモーターを含むタバコ植物又はその部分であって、前記プロモーターが、配列番号:113−118、148−160、204、及び前記のフラグメントから成る群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも90％配列同一性を有し、オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結されてある、前記タバコ植物又はその部分。
78．前記オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質が、配列番号:235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、実施態様76に記載のタバコ植物又はその部分。
79．上部切取り誘発吸枝を植物で制御する方法であって、前記方法が組換えDNA構築物で前記植物を形質転換する工程を含み、前記組換えDNA構築物が、オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動できるように連結されるプロモーターを含む、前記上部切取り誘発吸枝を制御する方法。
80．前記オーキシン生合成タンパク質又はオーキシン輸送タンパク質が、配列番号:235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、及び255から成る群から選択されるポリペプチドと少なくとも70％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、実施態様78に記載の方法。
81．前記のより少ない総吸枝が、類似の条件下で育成した非改変コントロールタバコ植物と比較して、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％少ない総吸枝を含む、実施態様23に記載の改変タバコ植物。
82．前記質量の減少が、類似の条件下で育成した非改変コントロールタバコ植物の吸枝の質量と比較して、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％少ない質量を含む、実施態様24に記載の改変タバコ植物。
83．前記長さの減少が、類似の条件下で育成した非改変コントロールタバコ植物の吸枝の長さと比較して、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％短い長さを含む、実施態様24に記載の改変タバコ植物。
これまで本開示を一般的に記載してきたが、本開示は下記の実例を参照してより容易に理解されるであろう。当該実例は例証として提供され、特段の指定がなければ本開示を制限することを意図しない。
【実施例１】
【０１１３】
上部切取りにより誘導され得る遺伝子の同定
4週齢のTN90タバコ植物のRNAサンプルを10組織タイプから入手する（上部切取り前の腋芽；上部切取り2時間後の腋芽；上部切取り6時間後の腋芽；上部切取り24時間後の腋芽；上部切取り72時間後の腋芽；上部切取り前の根；上部切取り24時間後の根；上部切取り72時間後の根；上部切取り時の若葉；シュート頂端分裂組織）。得られたRNAサンプル（各組織タイプについてそれぞれ別々に採集した3つのサンプル）を、イルミナ（Illumina）1x100bpシーケンシングのための出発材料として用いた。
イルミナの読みをマップし、高い腋芽発現を示す候補遺伝子のリストを検証する。候補遺伝子の発現はRT-PCRを用いて確認する。例えば以下を参照されたい：米国特許出願No.14/875,928（2015年10月6日出願、US 2016/0281100として2016年9月29日公開）（前記は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。候補遺伝子が腋芽で弁別的に発現されることを確認した後、予想される完全長のcDNA配列から設計される遺伝子特異的プライマーを用いて完全長の候補遺伝子をクローニングする（表2A）。選択した遺伝子座についての標準化イルミナ読みカウントは表2Bに提供される。
【０１１４】
表2A：腋芽で弁別的発現を示す選択完全長候補遺伝子
2019512247.tif 000014
【０１１５】
表2B：選択候補遺伝子の標準化イルミナ読みカウント
2019512247.tif 000015
【実施例２】
【０１１６】
改変植物の開発
発現ベクター、p45-2-7（配列番号:112、図1）を骨格として用い、マルチ形質転換ベクターを作製する（実施例6−10及び13−20を参照されたい）。p45-2-7は、CsVMVプロモーター、NOSターミネーター、及びカナマイシン選別マーカー（NPT II）含有カセット（Actin2プロモーター及びNOSターミネーターに作動できるように連結されている）を含む。対象のトランスジーンを含む核酸ベクターをアグロバクテリウム形質転換によりタバコ葉ディスクに導入する。例えば以下を参照されたい：Mayo et al., 2006, Nat Protoc.1:1105-11；及びHorsch et al., 1985, Science 227:1229-1231。
細葉マドール（NLM）タバコ植物をMagentaTM GA-7ボックスで育成し、葉ディスクを切断してペトリ皿に置く。形質転換ベクターを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）細胞を、50mL遠心管により20mLの細胞懸濁物を3500RPMで10分間遠心分離することによって収集する。上清を除去し、アグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞ペレットを40mLの液体再懸濁培地に再懸濁する。タバコ葉（中肋を避ける）を＃15の剃刀刃で8つの0.6cmディスクに切断し、上面を下にしてペトリ皿に置く。B5ビタミンを含むMurashige & Skoogの液体再懸濁培地の薄い層を前記ペトリ皿に添加し、先端のとがった針で均等につつく。約25mLのアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁物をペトリ皿に添加し、前記葉ディスクを懸濁状態で10分間インキュベートする。
葉ディスクを共培養ペトリ皿（1/2 MS培地）に移す。ディスクは上面を下にして置き、共培養TOM培地（20g/Lシュクロース、1mg/Lインドール-3-酢酸、及び2.5mg/L 6-ベンジルアミノプリン（BAP）を含むMS培地）上に重ねたフィルターと接触させる。インキュベーション前にペトリ皿をパラフィルムで封をする。インキュベーションは、18時間ONと6時間OFの光周期による薄明かり（60−80 mE/ms）下に24℃で3日間実施される。インキュベーション後に葉ディスクを再生/選別TOM K培地（300mg/Lのカナマイシンを含むTOM培地）のペトリ皿に移す。葉ディスクを隔週で新しいTOM K培地でサブ培養する。サブ培養は、シュートが切除可能になるまで、18時間ONと6時間OFの光周期による薄明かり（60−80 mE/ms）下に24℃で実施される。葉から生じるシュートをピンセットで取り出し、100mg/Lのカナマイシンを含むMS基礎培地に挿入する。100mg/Lカナマイシン含有MS基礎培地上で、18時間ONと6時間OFの光周期による高強度光（6080 mE/ms）下でシュートを24℃でインキュベートして発根を誘発する。
シュート及び根の両方を含む小植物が十分に大きく生育するとき（例えばMagentaTM GA-7ボックスの約半分の高さに達するとき）、それらを土壌に移す。生育した苗木を更なる分析のために温室に移し、種子をつけさせる。
吸枝成長表現型の評価は、発育停止期（layby stage）まで改変植物（T0、T1、T2又はその後の世代）及びコントロール植物を育成することによって実施される。コントロール植物は、形質転換されていない、又はp45-2-7ベクターで形質転換されたNLM植物である。発育停止期に達した植物の上部切取りを手作業で実施し（シュート頂端分裂組織及び周囲組織が除去される）、上部切取り後に特定時点で腋芽の成長を評価する。典型的には、観察は、上部切取り時（すなわち0時間）、上部切取り後24時間（すなわち1日）、上部切取り後7−8日（すなわち1週間）、及び/又は上部切取り後14−15日（すなわち2週間）に実施される。観察は、腋芽の成長の有無及び全体的な植物の外観の定性的な調査を含む。観察はまた、上部切取り後の特定の時点における全腋芽の新鮮重量の定量的測定及び/又は上部切取り後の特定の時点における全腋芽側枝の長さの測定を含む。
【実施例３】
【０１１７】
吸枝発生で機能するタバコ遺伝子の同定
形質転換ベクター及び改変タバコ植物を作製して、完全長コード配列をタバコ遺伝子から過剰発現させる（例えば配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、57、59、及び69）。
例示のように、配列番号:11をp45-2-7形質転換ベクターに取り込み、実施例2にしたがって改変タバコ植物を作製する。改変タバコ植物（T0世代）及びコントロールタバコ植物を発育停止期まで育成し、続いて、実施例2にしたがい植物の上部切取りを実施してシュート頂端分裂組織を除去する。吸枝成長は、上部切取り時及び上部切取り1週間後に評価される。配列番号:11の過剰発現はタバコで芽の伸長を増加させ、配列番号:11の発現は吸枝成長を促進することを示す（図2）。
【実施例４】
【０１１８】
タバコの吸枝成長に影響を及ぼす非タバコ起源遺伝子の発現
多数の遺伝子が非タバコ種の吸枝成長で役割を果たすことが検証されている。形質転換ベクター及び改変タバコ植物を作製し、非タバコ起源の完全長遺伝子（例えば配列番号:55、67、79、及び81）を発現させる。配列番号:81（アラビドプシス・タリアナBRANCHED1（BRC1）をコードする）をp45-2-7形質転換ベクターに取り込み、実施例2にしたがい改変タバコ植物を作製する。アラビドプシスでは、BRC1は発生中の芽で発現され、そこではBRC1は芽の発生を停止するために機能する。例えば以下を参照されたい：Gonzalez-Grandio et al., 2013, Plant Cell 25: 834-850（前記は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。
改変タバコ植物（T0世代）及びコントロールタバコ植物を発育停止期まで育成し、続いて、実施例2にしたがい植物の上部切取りを実施してシュート頂端分裂組織を除去する。吸枝成長は、上部切取り時及び上部切取り1週間後に評価する（図3A）。タバコでの配列番号:81の発現は芽の伸長を低下させる。これらの植物はまた発育の阻害を示す（図3B）。
【実施例５】
【０１１９】
吸枝成長を阻害する本来のタバコ遺伝子の同定
形質転換ベクター及び改変タバコ植物を作製し、RNAiを用いて内因性タバコ遺伝子（例えば配列番号:83−107）を阻害し、吸枝の伸長におけるそれらの役割を検証する。
3つのタバコの遺伝子（配列番号:1、13及び35）がアラビドプシスBRC1と相同性を有するTCPファミリータンパク質として同定されている。実施例2にしたがって形質転換ベクター及び改変タバコ植物を作製し、得られた改変タバコ植物の表現型を実施例2にしたがって上部切取り後に評価する。
第一の形質転換ベクターはp45-2-7骨格に挿入された配列番号:83を含み（前記配列はRNAiを介して本来の配列番号:1を構成的に抑制する）、このベクターを含む植物は以降においてRNAi_1植物と称される。RNAi_1タバコ植物（T0世代）及びコントロールタバコ植物を発育停止期まで育成し、シュート頂端分裂組織を除去する。吸枝の成長は上部切取り時及び上部切取り1週間後に評価される。芽の伸長は上部切取り前のRNAi_1植物で明白であり、さらに芽の伸長は上部切取り後増加する(図4)。RNAi_1 T1世代植物は、上部切取り後少なくとも2週間、芽の伸長増加を示し続ける(図5A及びB)。T1 RNAi_1植物の上部切取り後2週間の全腋生シュートの新鮮重量の平均は〜600グラムであり、コントロール植物の上部切取り後2週間の全腋生シュートの新鮮重量は〜300グラムである（図5B）。これらの結果は、配列番号:1はタバコで吸枝伸長を阻害するために機能することを示している。
第二の形質転換ベクターはp45-2-7骨格に挿入された配列番号:86を含む。この第二の形質転換ベクターは、RNAiメカニズムを介して本来の配列番号:13を抑えるために設計され、このベクターを含む植物は以降においてRNAi_7植物と称される。RNAi_7タバコ植物（T0世代）及びコントロールタバコ植物を発育停止期まで育成し、続いて植物の上部切取りを実施してシュート頂端分裂組織を除去する。吸枝の成長は上部切取り時及び上部切取り1週間後に評価される。芽の伸長はRNAi_7植物で増加する(図6)。T1世代RNAi_7植物は、上部切取り後少なくとも2週間、芽の伸長増加を示し続ける(図7)。7つのT1 RNAi_7植物系統の上部切取り後2週間の全腋生シュートの新鮮重量の平均は〜600グラム、〜700グラム、〜400グラム、〜250グラム、〜200グラム、及び〜375グラムであり、コントロール植物の上部切取り後2週間の全腋生シュートの新鮮重量は〜300グラムである（図7）。これらの結果は、配列番号:13はタバコで吸枝伸長を阻害するために機能することを示している。
第三の形質転換ベクターはp45-2-7骨格に挿入された配列番号:95を含む。この第三の形質転換ベクターは、RNAiメカニズムを介して本来の配列番号:35を抑えるために設計され、このベクターを含む植物は以降ではRNAi_18植物と称される。RNAi_18植物は上部切取り前の全ての結節で腋生分枝を発生させる(図8)。これらの結果は、配列番号:35はタバコで吸枝伸長を阻害するために機能することを示している。
【実施例６】
【０１２０】
吸枝の成長を促進する本来のタバコ遺伝子の同定
本来いくつかのタバコ遺伝子は吸枝伸長を促進するために機能する。RNAi構築物を用いるこれらの遺伝子の阻害は吸枝の伸長を低下させ、阻害は、タバコの吸枝伸長の促進因子として当該遺伝子の肯定的検証をもたらす。予想される吸枝伸長促進因子のRNAiメカニズムによる阻害のために設計される形質転換ベクターを実施例2にしたがって作製する。当該改変ベクターを含む改変タバコ植物を作出し、実施例2にしたがって表現型を評価する。
形質転換ベクターはp45-2-7骨格に配列番号:101を含むように設計される。前記配列は、CET2の領域、CENTRORADIALISと相同である（タバコのCEN様遺伝子（配列番号:108−110）（CEN-like gene from Tobacco））。CET遺伝子はタバコのシュート頂端分裂組織では発現されないが、ただしCENはアンチリヌム・マジュス（Antirrhinum majus）のシュート頂端分裂組織の成長に要求される。タバコでは、CENの発現は栄養相に及び、開花を遅らせる。例えば以下を参照されたい：Amaya et al., 1999, Plant Cell 11:1405-1418(前記は参照によってその全体が本明細書に含まれる)。配列番号:101を含む形質転換ベクターを含む植物は以降ではRNAi_NtCET2植物と称される。
RNAi_NtCET2植物（T0世代）及びコントロールタバコ植物を発育停止期まで育成し、続いて植物の上部切取りを実施してシュート頂端分裂組織を除去する。吸枝の成長は上部切取り時及び上部切取り1週間後に評価される。芽の伸長はRNAi_NtCET2植物で低下し(図9)、本来のNtCET2は吸枝の成長を促進することを示す。
別の形質転換ベクターは配列番号:96を含み、このベクターを含む植物は以降ではRNAi_26植物と称される。RNAi_26植物（T0世代）及びコントロールタバコ植物を発育停止期まで育成し、続いて植物の上部切取りを実施してシュート頂端分裂組織を除去する。吸枝の成長は上部切取り時及び上部切取り1週間後に評価される。芽の伸長はRNAi_26植物で低下し(図10)、配列番号:49は吸枝の成長を促進するために機能することを示す。
【実施例７】
【０１２１】
腋芽特異的プロモーターの同定
配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、67、69、79、81、及び83−107の発現（実施例6−８参照）を巧みに利用し、もし当該ポリヌクレオチドが組織依存性態様で（例えば腋芽だけで）発現されるならば、改変植物で吸枝の伸長を低下又は消失させることができる。28の候補遺伝子の発現パターンを分析し、腋芽で高発現を有するが他の組織では発現が低い遺伝子のプロモーターを選択する（表3）。候補遺伝子の発現パターンはリアルタイムPCR分析で確認する。6つの腋生分裂組織特異的プロモーター（配列番号:113−118）をタバコT90ゲノムDNAから遺伝子特異的プライマーを用いてPCR法によってクローニングする。
候補プロモーターの発現パターンは、実施例2に記載した同じプラスミド骨格（p45-2-7）内のキメラ候補プロモーター::ベータ-グルクロニダーゼ（GUS）レポーター遺伝子を用いてタバコを形質転換することによって分析する。当該キメラ遺伝子をアグロバクテリウム媒介形質転換によりNLM系統に導入する。GUS染色を用い、組織特異的プロモーター発現をCroneらの方法にしたがって検証する（Crone et al., 2001, Plant Cell Environ.24:869-874）。
簡単に記せば、候補プロモーター::GUS形質転換構築物を含む若い苗木の組織を氷上の冷90%アセトンに置く。全サンプルを採集したとき、サンプルを室温に20分間置く。サンプルを氷上に戻し、アセトンをサンプルから除去する。次に、染色緩衝液（0.2％トリトンX-100；50mM NaHPO4（pH7.2）；2mMフェロシアン化カリウム）をサンプルに添加する。X-Glucを染色緩衝液に最終濃度2mMで添加する。サンプルから染色緩衝液を除去し、X-Glucを含む新しい染色緩衝液を添加する。続いて氷上で15から20分間、真空下でサンプルに浸透させる。染色緩衝液を除去する前に、サンプルを37℃で2−18時間インキュベートする。暗所でサンプルをエタノールシリーズ（すなわち10％、30％、50％、70％、95％）で各洗浄につき30分間洗浄する。最後にサンプルを100％エタノールに移す。
GUS陽性植物組織を明視野顕微鏡（Leica Q500MC；Cambridge, England）により低倍率で調べ、デジタルカメラで撮影する。3つの異なるプロモーター（配列番号:113、116及び117）を用いた実験結果は、それぞれ図11、12及び13に示される。これらのプロモーター配列を用いて、対象の配列の発現を腋芽で絶対的に又は優先的に駆動し、一方では植物の他の部分での発現を制限できる。
GSU陽性発現（配列番号:113、116及び117により駆動される発現を示す）は腋芽に集中する。したがって、配列番号:113、116及び117は組織特異的プロモーターであり、前記は腋芽で活性を有するが、茎又は葉の組織では活性を示さない（図11、12及び13）。配列番号:113（以降ではプロモーターP1）及び配列番号:116（以降ではプロモーターP11）の指令下でのGUSの発現は上部切取り後に低下し、これは、これらのプロモーターによって通常調節される内因性遺伝子について観察される遺伝子発現パターンと一致する（図11及び12）。プロモーターP1及びプロモーターP11はまたタバコのシュート頂端分裂組織で機能する。
対照的に、配列番号:117（以降ではプロモーターP15）は、上部切取り前及び上部切取り後少なくとも15日間腋生分裂組織でGUS発現を駆動し、これは、このプロモーターによって通常調節される内因性遺伝子について観察される遺伝子発現パターンと一致する（図13A−C）。プロモーターP15はまたシュート頂端分裂組織の基部で機能する（図13A）。
吸枝伸長を制御する、上部切取り誘発及び組織特異的プロモーターの追加の候補プロモーターには配列番号:148−160及び204が含まれ、前記は以下を表す：腋芽特異的チオニン5’上流調節配列（配列番号:148）、タバコラテラルサプレッサー1（LAS1）5’上流調節配列（配列番号:149）、LAS1 3’下流調節配列（配列番号:150）、LAS2 5’上流調節配列（配列番号:151）、LAS2 3’下流調節配列（配列番号:152）、腋生分裂組織のタバコ調節因子1（RAX1）5’上流調節配列（配列番号:153）、RAX1 3’下流調節配列（配列番号:154）、RAX2 5’上流調節配列（配列番号:155）、RAX2 3’下流調節配列（配列番号:156）、プロモーターP15 5’領域（配列番号:157）、プロモーターP15 3’下流領域（配列番号:158）、P15ホモログの5’上流調節配列（配列番号:159）、P15ホモログの3’下流調節配列（配列番号:160）、及びトマト（ソラヌム・リコペルシクム（Solanum lycopersicum））のP15ホモログの調節領域（配列番号:204）。これらの配列をNLMゲノムDNAから遺伝子特異的プライマーを用いてPCR法によってクローニングする。これらの調節配列を、プロモーターP1、P11及びP15について示したようにその組織特異性及び発生の調節について試験する。異種遺伝子発現の駆動及び吸枝成長の調整のために、腋生分裂組織特異的又は優先的発現を示す調節配列を用いる。
【０１２２】
表3：プロモーターの分析のために選択したクローン
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【０１２３】
表4腋芽優先プロモーターcis-エレメント
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【実施例８】
【０１２４】
プロモーターP1、プロモーターP15及びプロモーターPABチオニンの細胞特異性
プロモーターP1（配列番号:113）及びプロモーターP15（配列番号:117）の発現パターンを分裂組織領域の細胞レベルで分析するために、プロモーターP1又はプロモーターP15のどちらかの制御下に緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を含むベクターを実施例2にしたがって作製する。キメラベクターをアグロバクテリウム媒介形質転換を介してNLMタバコ植物に導入する。GFP発現は蛍光顕微鏡を用いて観察する。P15は腋芽内の組織に限定される（図14A）。プロモーターP1はわずかに広い発現パターンを有する（図14B）。
0.9kb長のプロモーターPABチオニン（pABTh-0.9kb、配列番号:118）の発現パターンの分裂組織領域の細胞レベルでの分析のために、実施例2の記載にしたがって、プロモーターPABチオニンの制御下にあるGUS遺伝子を含むベクターを作製する。キメラベクターをアグロバクテリウム媒介形質転換を介してNLMタバコ植物に導入する。GUS発現は腋芽組織及び分裂組織で観察される（図15）。
プロモーターP1、P15及びPABチオニン（pABth-5kb、配列番号:148）を同様な及び/又は固有のcis-調節エレメントについて分析する。6つのcis-調節エレメントが、プロモーターP1、P15及びPABチオニンによって本来調節される遺伝子の転写開始部位の上流で同定される（表4）（図16）。これらのcis-調節エレメントは、吸枝特異的又は分裂組織特異的発現パターンの調節に対して直接的又は間接的作用を有することができる。
【実施例９】
【０１２５】
吸枝阻害構築物の有効性試験
候補プロモーターの組織特異的発現パターンをトランスジェニック植物でプロモーター::GUS融合分析を用いて試験した後、実施例2にしたがってベクター及び改変植物を構築し、腋芽でのみ標的遺伝子を発現させる。例示的構築物は表5に示される。
【０１２６】
表5：標的遺伝子の腋芽特異的発現のための例示的構築物
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構築物1−20の影響についての有効性試験を温室及び野外条件下で実施する。トランスジェニック植物及び適合する野生型コントロールを発育停止期まで育成し、続いて上部切取りを実施し実施例2の記載にしたがって表現型を評価する。野外有効性試験はまた、通常の農業慣行の下で必要とされる吸枝制御のための化学薬剤適用のタイプ及び程度を決定する。
【実施例１０】
【０１２７】
遺伝子過剰発現による腋芽伸長の調節
吸枝伸長は、分枝形成を調節する遺伝子及び/又は遺伝子経路の発現を改変することによって調節できる。本来いくつかの遺伝子は芽の伸長を制限するために機能し、それら遺伝子は分枝形成が強化された変異体によって明示される。それら変異体は、例えばアラビドプシスBRANCHED1遺伝子（配列番号:81）及びタバコのホモログ（配列番号:1、13、35、37及び39）；並びにアラビドプシスMORE AXILLARY BRANCHING1（MAX1）及びMAX2遺伝子（配列番号:193及び195）とタバコのホモログ（配列番号:197及び199）である。例えば以下を参照されたい：Stirnberg et al., 2002, Development 129: 1131-1141（前記は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。
タバコで吸枝伸長を制限する形質転換ベクターを作出する。配列番号:1、13、35、37、39及び81の1つを含むそれぞれ別々の形質転換ベクターをp45-2-7形質転換ベクターに取り込ませる。腋芽特異的プロモーターP15（配列番号:117）によって駆動される配列番号:1、13、35、37、39及び81の1つを含む追加の形質転換ベクターを作製する。これらの形質転換ベクターから実施例2にしたがって改変タバコ植物を作出する。続いて改変タバコ植物（T0世代）及びコントロールタバコ植物の表現型を実施例2の記載にしたがって評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す。
【実施例１１】
【０１２８】
吸枝成長を促進する遺伝子の抑制による腋芽伸長の調節
いくつかの遺伝子は腋生分裂組織の発生を促進し、それらは分枝形成が低下した変異体によって明示される。例えば、LAS遺伝子（配列番号:201）及びタバコのホモログ（配列番号:71及び73）；アラビドプシスRAX遺伝子（配列番号:203）とともにタバコのホモログ（配列番号:75及び77）である。例えば以下を参照されたい：Greb et al., 2003, Genes & Development 17: 1175-1187；及びKeller et al., 2006, Plant Cell 18: 598-611（前記両文献は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。
RNAi構築物を含む形質転換ベクターを設計して、吸枝伸長を促進するタバコのタンパク質を阻害する。それぞれ別々の形質転換ベクターが配列番号:71、73、75及び77の1つを含み、それらをp45-2-7形質転換ベクターに取り込ませる。腋芽特異的プロモーターP15（配列番号:117）によって駆動される配列番号:71、73、75及び77の1つを含む追加の形質転換ベクターを作製する。これらのベクターを用い実施例2にしたがって改変タバコ植物を作出する。続いて改変タバコ植物及びコントロールタバコ植物の表現型を実施例2の記載にしたがって評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す。
【実施例１２】
【０１２９】
RNAi、miRNA及び遺伝子過剰発現を用いる吸枝成長の調節
プロモーターP15（配列番号:117）が配列番号:81（BRC1）及び配列番号:101（NtCET2を標的とするRNAi）の発現を組織特異的態様で駆動する形質転換ベクターを作製する。プロモーターP15::BRC1::NtCET2ベクターは、腋芽でBRC1を過剰発現しNtCET2を阻害する。前記形質転換ベクター及び改変タバコ植物を実施例2の記載にしたがって作出する。
プロモーターP15::BRC1::NtCET2構築物を有する改変タバコ植物（T0世代）及びコントロールタバコ植物を発育停止期まで育成し、続いて植物の上部切取りを実施してシュート頂端分裂組織を除去する。上部切取り時、上部切取り8日後、及び上部切取り15日後に吸枝の成長を評価する（図17）。プロモーターP15によって駆動される配列番号:81及び101の発現はタバコで吸枝成長を消失させる。
プロモーターP15（配列番号:117）が人工miRNAの発現を駆動する、追加の形質転換ベクターを作製する。前記miRNAは、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、69、71、73、75、77、123−147、186、188、190、196及び198の転写又は翻訳を低下させるように設計される。前記形質転換ベクター及び改変タバコ植物を実施例2の記載にしたがって作出する。
プロモーターP15::人工miRNA構築物を有する改変タバコ植物（T0世代）及びコントロールタバコ植物を発育停止期まで育成し、続いて植物の上部切取りを実施してシュート頂端分裂組織を除去する。上部切取り時、上部切取り8日後、及び上部切取り15日後に吸枝の成長を評価する。改変及びコントロールタバコ植物の表現型を実施例2にしたがって評価する。
【実施例１３】
【０１３０】
サイトキニン合成及び分布の改変による吸枝成長の調節
シュート頂端分裂組織の除去は腋芽の休眠を解除し腋芽の伸長を促進する。無傷のシュート頂端分裂組織から誘導されるオーキシンは吸枝の伸長を抑制し、一方、シュート頂端分裂組織の除去によって誘発されるサイトキニンは吸枝の伸長を促進する。
腋芽特異的プロモーターによるサイトキニン代謝関与遺伝子の過剰発現による腋芽領域のサイトキニンの枯渇を利用して、サイトキニンを減少させ腋生分裂組織の伸長を阻害する。例えば、アラビドプシスのサイトキニンオキシダーゼ（CEX、配列番号:55）、タバコCKX（配列番号:57及び59）；及びタバコのアデノシンホスフェート-イソペンテニルトランスフェラーゼ遺伝子（配列番号:61）を試験する。プロモーターP15（配列番号:117）によって駆動される配列番号:59を含む形質転換ベクターを実施例2にしたがって作製する。このベクターを用いて改変タバコ植物を作出し、続いて実施例2にしたがって表現型を評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す（図18）。
【実施例１４】
【０１３１】
腋生分裂組織幹細胞のシグナリングの阻害による吸枝成長の調節
シュート分裂組織は幹細胞を含む。前記幹細胞は、WUSCHEL（WUS）-CLAVATA（CLV）シグナリング経路を必要とするフィードバック回路を介して持続的に補充される。例えば以下を参照されたい：Yadav et al., 2011, Genes & Development 25:2025-2030（前記文献は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。この経路の遺伝子には、例えばWUS（配列番号:63及び65）、CLV1、CLV2、及びCLV3（配列番号:67及び69）が含まれる。プロモーターP15（配列番号:117）によって駆動される配列番号:67をふくむ形質転換ベクターを作製する（前記は腋芽でCLV3の過剰発現を引き起こす）。改変タバコ植物を前記形質転換ベクターを用いて作出し、実施例2にしたがって表現型を評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝の成長低下を示す。
プロモーターP15（配列番号:117）によって駆動される配列番号:63又は65を含む、追加の形質転換ベクターを実施例2にしたがって作製する（前記はRNAiを介してWUSを阻害する）。改変タバコ植物をこれらの形質転換ベクターを用いて作出し、続いて実施例2にしたがって表現型を評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝の成長低下を示す。
アラビドプシスのSHOOT MERISTEMLESS（STM）は、シュート分裂組織形成及び維持のために必須のKNOXタンパク質である。例えば以下を参照されたい：Long et al., 1996, Nature 379:66-69（前記文献は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。NTH15（配列番号:189）は、タバコの分裂組織で発現されるSTMのタバコホモログである。例えば以下を参照されたい：Tanaka-Ueguchi et al., 1998, Plant Journal 15:391-400（前記文献は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。プロモーターP15（配列番号:117）によって駆動されるRNAi構築物（阻害のために配列番号:188を標的とする）を含む形質転換ベクターを作製する。改変タバコ植物をこれらの形質転換ベクターを用いて作出し、実施例2にしたがって表現型を評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝の成長低下を示す。
【実施例１５】
【０１３２】
アグロインフィルトレーションを用いる吸枝制御遺伝子のスクリーニング
いくつかの植物遺伝子の発現は（例えばRNase、プロテアーゼ、細胞周期遺伝子、転写因子、キナーゼ、カスパーゼであるが、ただしこれらに限定されない）、一定の時期及び/又は細胞タイプで発現されるときに細胞死応答を引き出すことができる。そのような遺伝子の同定が所望される。なぜならば、そのような遺伝子を腋芽優先又は腋芽特異的プロモーターに（例えばプロモーターP15（配列番号:117））に作動できるように連結して、腋芽の成長及び/又は発生を低下又は消失させることができるからである。
アグロインフィルトレーションを用いて、タバコの葉でタバコの遺伝子（例えば配列番号:20−222、228、230及び232）を一過性に発現させる。対象の植物遺伝子をpBIN19プラスミドに挿入してアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞を形質転換する。前記形質転換細菌を液体培地で増殖させ、洗浄して緩衝溶液に懸濁する。形質転換A.ツメファシエンス細胞を含む緩衝溶液を1つ以上の生きたタバコ葉に注入する。続いて5日後に植物の葉の表現型を細胞死について判定する。空プラスミドを陰性コントロールとして用い、一方、バルナーゼ遺伝子（配列番号:79）を含むプラスミドを陽性コントロールとして用いる。タバコ葉で細胞死を誘発する植物遺伝子を、腋芽の成長及び/又は発生を低下させるために用いる。
ニコチアナ・タリアナマイトジェン活性化タンパク質キナーゼキナーゼ2（NtMEK2、配列番号:232）は、タバコで細胞死応答を誘発できると検証されている。配列番号:232の発現は、その発現をプロモーターP15（配列番号:117）で駆動することによって腋芽に対して指令される。
プロモーターP15（配列番号:117）によって駆動される配列番号:201−222、228、230及び232の1つを含むそれぞれ別々のベクターを作製する。続いて、プロモーターP15::細胞死遺伝子ベクターを用いて改変タバコ植物を作出し、実施例2にしたがって表現型を評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す。
【実施例１６】
【０１３３】
RNaseを用いる吸枝成長の調節
通常は発現されない細胞で又は通常は存在しない細胞部分で、いくつかのタンパク質が増加レベルで存在することによって細胞死を誘発することができる。腋芽特異的プロモーター（例えばプロモーターP1（配列番号:113）及びプロモーターP15（配列番号:117））を用いて、腋芽に有害であり最終的にはその死をもたらす異種遺伝子を発現させる。
RNA分解酵素（例えば細菌のRNaseバルナーゼ（配列番号:79）（例えば以下を参照されたい：Hartley, 1989, Trends in Biochemical Sciences 14:450-454））を用い、その発現がプロモーターP15（配列番号:117）によって駆動されるときに腋芽で細胞死を誘発させる。実施例2にしたがって、プロモーターP15（配列番号:117）によって駆動される配列番号:79を含む形質転換ベクターを作製する。続いてプロモーターP15::バルナーゼベクターを用いて実施例2にしたがって改変タバコ植物を作出する。改変タバコ植物（T0世代）及びコントロールタバコ植物を発育停止期まで育成し、続いて植物の上部切取りを実施してシュート頂端分裂組織を除去する。上部切取り時、上部切取り24時間後、上部切取り1週間後、上部切取り2週間後、及び上部切取り15日後に吸枝の成長を評価する（図19及び20）。プロモーターP15によって駆動される配列番号:79の発現はタバコで吸枝の伸長を消失させる。
プロモーターP15::バルナーゼと同様な追加の形質転換ベクターもまた、以下の内因性タバコRNaseをバルナーゼ（配列番号:79）の代わりに用いて作製される：RNase Phy3（配列番号:123）、RNase H（配列番号:124）、RNase P（配列番号:125）、RNase III（配列番号:126）、及びRNase T2（配列番号:127−136）。これらのベクターの各々を用いて改変タバコ植物を作出し、続いて実施例2にしたがってタバコ植物の表現型を評価する。
【実施例１７】
【０１３４】
液胞内プロセッシング酵素を用いる吸枝成長の調節
液胞内プロセッシング酵素（VPE）はプロテアーゼであり。前記は正常な植物の成長及び発生で機能を有し、さらにまたそのカスパーゼ様活性を介して液胞依存性のプログラムされた細胞死に関与することもまた示唆されている。タバコゲノムで見いだされる17のVPEタンパク質のうち8つが、カスパーゼ様活性に必要な全残基を含むプロテアーゼドメインを含む（配列番号:137−143）。配列番号:137−143の発現は、プロモーターP15（配列番号:117）でそれらの発現を駆動することによって腋芽に指令される。配列番号:137−143によってコードされるタンパク質の発現はさらにまた、N-末端液胞割り当てシグナルを含むことによって腋芽内の液胞に制限することができる。
プロモーターP15（配列番号:117）によって駆動される配列番号:137−143の1つを含むそれぞれ別々の形質転換ベクターを実施例2にしたがって作製する。続いて、プロモーターP15::VPEベクターを用いて改変タバコ植物を作出し、続いて表現型を実施例2にしたがって評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す。
【実施例１８】
【０１３５】
プロテアーゼを用いる吸枝成長の調節
ある種の組織では追加の植物プロテアーゼが発現され、腋生シュート分裂組織の発生に応答し得る細胞を排除する。タンパク質分解酵素はその触媒ドメインを基準にして4つのグループに分類される（アスパラギン酸プロテアーゼ、システインプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼ）。これらプロテアーゼファミリーの全てがタバコで見いだされ、腋生シュート分裂組織の発生の阻害に用いられる。例えば、アスパラギン酸プロテアーゼ（配列番号:144）、システインプロテアーゼ（配列番号:145）、メタロプロテアーゼ（配列番号:146）又はセリンプロテアーゼ（配列番号:147）は組織特異的プロモーター（配列番号:113−118、148−160、及び204）により発現される。
プロモーターP15（配列番号:117）によって駆動される配列番号:144−147の1つを含むそれぞれ別々の形質転換ベクターを実施例2にしたがって作製する。続いて、プロモーターP15::プロテアーゼベクターを用いて改変タバコ植物を作出し、続いて実施例2にしたがって表現型を評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す。
【実施例１９】
【０１３６】
TALENを用いるゲノム編集
転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）技術を用いて、市場のタバコ変種（例えばTN90、K326及び細葉マンドール）を改変する。TALENは、標的DNA配列に二本鎖断裂を導入することにより遺伝的改変を可能にする。非相同性末端結合（NHEJ）又は相同性指向修復（HDR）媒介経路によるその後のDNA断裂修復を活用して、所望の改変を導入する（例えば遺伝子破壊、遺伝子修正又は遺伝子挿入）。
PEG媒介プロトプラスト形質転換を用いて、TALEN及びドナーDNA分子を植物細胞に導入する。無菌培養の4−8週齢のタバコ植物に由来するタバコ葉を細片に切断し、ろ過滅菌酵素溶液（1.0％セルラーゼonuzuka R10及び0.5％Macerozymを含む）を含むペトリ皿に移す。ペトリ皿中のこの葉の細片をデシケーターを用いて暗所で30分間真空浸潤に付す。インキュベーション後、消化された葉を45RPMで230分間振盪することによって再懸濁させ、続いて50mLの遠心分離管中で収集することによって100μmの滅菌ナイロンフィルターでろ過する。前記溶液をLymphoprepに適用し、100ｘgで10分間の遠心分離により分離する。ピペットを用いてプロトプラストバンドを収集し、精製プロトプラストを等体積のW5n（NaCl、CaCl2、KCl、MES及びグルコースを含む）で洗浄してから、2000RPMで5分間の追加の遠心分離を実施する。プロトプラストペレットをW5n溶液に2ｘ105/mLに再懸濁させ、氷上に30分放置する。次に、上清を除去し、プロトプラストペレットをMMM溶液（マンニトール、MgCl2及びMESを含む）に再懸濁させる。
Zhangら（2013, Plant Physiology 161:20-27）の記載した方法にいくつかの改変を加え、タバコプロトプラストのPEGトランスフェクションを実施する。500μLアリコットのプロトプラスト懸濁物を10mLの培養管に移し、25μL（〜10μg）のプラスミドDNAをゆっくりと前記プロトプラスト懸濁物に加える。次に、525μLのPEG溶液をプロトプラスト-DNA溶液に加え、管を注意深くたたくことによって混合する。管を20分間インキュベートし、続いて2.5mLのW5n溶液を加えて反応を停止させる。溶液を100ｘgで5分間遠心分離し、さらに培養液でプロトプラストを洗浄する。PEG処理プロトプラストを1mLの培養液（0.1mg/LのNAA及び0.5mg/LのBAPを含む）に再懸濁し、1mLの低温融解寒天と混合してプロトプラストビーズを作る。プロトプラストビーズを液体培地で培養し、プロトプラストから成長したカルスを固形シュート形成培地上に移す。シュートが十分に発達したとき、それらを根の形成のためにMagentaTM GA-7ボックスに移す。根の系が十分に発達しシュートの成長が再開したとき、植物を土壌に移植する。
複数のTALENアプローチを用いてタバコの吸枝成長を妨げ又は低下させる。通常的な形質転換方法を用いてタバコゲノムに遺伝子をランダムに挿入する代わりに、TALENを内因性コード配列の標的指定入れ替えに用いる。ある例では、問題のコード配列（例えば配列番号:123−147）を腋芽特異的プロモーター配列（例えば配列番号:113−118、148−160、及び204）の制御下に置くことができる。さらに前記構築物をTALENとともに用いて、当該プロモーターによって制御される内因性ゲノム領域に前記構築物を相同組換えさせることができる。TALENドナー配列は配列番号:119に示され、TALEN標的配列は配列番号:120に示される。
第二の例は、腋芽特異的プロモーター及び本来の腋芽特異的プロモーターの制御下にある問題のコード配列を用い、2用量のプロモーター制御を提供する。第一のプロモーター（配列番号:118）、第二のプロモーター（配列番号:113）、及びコード配列（配列番号:13）を含む構築物は、TALENを用いて本来の配列番号:118を含むゲノム領域に対して相同組換えされ、それによってコード配列の発現が両プロモーター（配列番号:118及び113）によって指令される。TALENドナー配列は配列番号:121に示される。
第三の例はTALENを用いて、吸枝成長及び/又は発生を促進する標的遺伝子を破壊する。TALEN標的配列を以下の核酸配列（例えば、配列番号:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、69、71、73、75、77、108−110、123−147、186、188、190、196、198）又は以下のポリペプチド（例えば、配列番号:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、70、72、74、76、78、161−185、187、189、191、197、199）をコードする核酸配列について検証する。遺伝子特異的TALENを設計してタバコ細胞に導入し、内因性標的遺伝子に欠失又は挿入を引き起こす。例えば、コード配列（配列番号:11）の潜在的TALEN標的部位を同定し、当該遺伝子のコード配列内の相同な組換え部位を選択する。TALEN標的配列は配列番号:122に示される（標的配列には下線が付される）。
【実施例２０】
【０１３７】
遺伝子編集技術を用いる吸枝成長を調節する追加的方法
遺伝子編集技術、例えばCRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、ジンク-フィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）を用いて、腋生分裂組織特異的遺伝子のコード領域を細胞死/腋生シュート抑制配列と入れ替える。これらの遺伝子編集技術はまた、内因性プロモーター配列を編集し又は入れ替えて腋芽でその同族タンパク質の発現を駆動するためにも用いられる。例えば、内因性RNaseプロモーターを編集し又は入れ替えて腋芽でRNaseのみを発現させる（腋芽で、RNaseは細胞死の誘発を介して吸枝の伸長を低下させるために機能し得る）。また別に、腋生分裂組織の調節因子遺伝子のプロモーターを変異させて（編集して）、吸枝活性化及び/又は伸長時のタイムリーな発現に必要な調節領域を除去する（これは腋生シュートの成長不全及び/又は死をもたらすことができる）。さらにまた、腋芽で本来機能する内因性遺伝子の編集又は入れ替えのために遺伝子編集技術が用いられる。内因性遺伝子（例えばNtCET2）を編集して、もはや機能的タンパク質を生成できないようにし、それによって吸枝の伸長を阻害する。
配列番号:123−147のそれぞれ1つのプロモーター配列を認識させてハイブリダイズさせるために、それぞれ別々にCRISPR/Cas9又はCRISPR/Cpf1ガイドRNAを構築する。この操作したガイドRNA及びプロモーターP15（配列番号:117）を含むドナーポリヌクレオチドをタバコ植物に提供し、プロモーターP15を配列番号:123−147の内因性プロモーターと入れ替えさせて腋芽に対して内因性配列番号:123−147の発現を制限する。編集を実施されたタバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す。
【実施例２１】
【０１３８】
ランダム変異誘導による新規な変異の発生
タバコ植物のランダム変異誘導は、メタンスルホン酸エチル（EMS）変異誘導又は高速ニュートロンボンバードメントを用いて実施される。EMS変異誘導は、ランダム点変異を化学的に誘導する工程から成る。高速ニュートロン変異誘導は、二本鎖DNA断裂を介して大きな欠失を引き起こすニュートロンボンバードメントに種子を暴露する工程から成る。
EMS変異誘導のために、テネシー90タバコ（TN90）の種子1グラム（約10,000個の種子）を0.1％Tweenで15分間洗浄し、続いて30mLのddH2Oに2時間浸漬する。続いて150μLの0.5％EMS（Sigma, Catalogue No.M-0880）を前記種子/ddH2O溶液と混合し、フードの下で8−12時間室温（RT、約20℃）でインキュベートする（30RPMで回転）。続いて、前記液体を種子から取り除き、汚染防止及び廃棄のために1MのNaOHと一晩混合する。続いて種子を100mLのddH2Oで2回2−4時間洗浄する。
寒天溶液中のEMS処理種子を、平台の水浸カロライナチョイスタバコミックス（Carolina’s Choice Tobacco Mix（Carolina Soil Company, Kinston, NC））上に〜2000種子/平台で均等に散布する。続いて、前記平台をプラスチックラップで覆い、生育チャンバーに置く。苗木が土壌から現れたら、プラスチックラップに穴をあけて湿度を徐々に低下させる。2週間後にプラスチックラップを完全に除去する。平台を温室に移し、NPKファーティライザーで施肥する。苗木をフロートトレーに再度差し込み、移植サイズまで育成する。続いて前記植物を野外に移植する。生育中に、植物は自家受粉してM1種子を形成する。成熟期に、各植物から5莢を採集し、各植物の種子セットに個々の名称を付与する。前記はM1集団を形成する。各M0植物に由来するM1種子混成物を成長させ、植物の表現型を実施例2にしたがって評価する。吸枝成長の強化又は低下を示すM1植物を選別し、当業界で公知のDNAシーケンシング及び遺伝子マッピング技術を用いて変異についてスクリーニングする。
【実施例２２】
【０１３９】
誘導性プロモーターを用いる吸枝成長の調節
誘導性プロモーターはまた、機能性遺伝子を制御性態様で発現させて吸枝の発生を低下又は消失させるために用いられる。これらのプロモーターは、化学薬剤の噴霧によって又は一定の時点で（すなわち上部切取り後）誘導される。例示的プロモーターには以下が含まれる：アルコール調節プロモーター；テトラサイクリン調節プロモーター；ステロイド調節プロモーター（例えばグルココルチコイド（例えば以下を参照されたい：Schena et al., 1991, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 88:10421-10425（前記は参照によってその全体が本明細書に含まれる））；及び金属調節プロモーター。例えば、RNase（例えば配列番号:79及び123−136）、VPE（例えば配列番号:137−143）、又はプロテアーゼ（配列番号:144−147）が、誘導性プロモーターによりタバコ植物で発現される。
ある例では、構成的CsVMVプロモーターの制御下のラットグルココルチコイド受容体を含む第一のベクター、及び1つ以上のグルココルチコイド応答エレメントに作動できるように連結される対象の配列（例えば配列番号:83−101）を含む第二のベクターを実施例2にしたがって作製する。続いて、これらのベクターの両方を含む改変タバコ植物を作出する。デキサメタゾンを前記植物に噴霧して対象の配列の発現を誘導し、続いて植物の表現型を評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す。
第二の例では、プロモーターP15（配列番号:117）の制御下のラットグルココルチコイド受容体を含む第一のベクター、及び1つ以上のグルココルチコイド応答エレメントに作動できるように連結される対象の配列（例えば配列番号:79及び123−147）を含む第二のベクターを実施例2にしたがって作製する。続いて、これらのベクターの両方を含む改変タバコ植物を作出する。デキサメタゾンを前記植物に噴霧して対象の配列の発現を誘導し、続いて植物の表現型を評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す。
【実施例２３】
【０１４０】
植物毒素及び免疫受容体を用いる吸枝成長の調節
タバコ植物の代謝を操作して、1つ以上の植物毒素（例えばタブトキシン、コロナチン、シリンゴマイシン、シリンゴペプチン、ファゼオロトキシン）又は免疫受容体を腋生分裂組織で産生させ、腋生シュート分裂組織内の細胞成長又は細胞分裂を阻害する。例えば以下を参照されたい：Bender et al., 1999, Microbiology and Molecular Biology Reviews 63:266-292（前記文献は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。例として、タブトキシンの産生に要求される、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）のtabA/tblA遺伝子を組織特異的プロモーター（例えば配列番号:113−118、148−160、及び204）により発現させる。免疫受容体遺伝子には広範囲の遺伝子が含まれる。いくつかの例には、アラブドプシス・タリアナの耐病タンパク質RPS5（配列番号:222）及びタバコ耐TMVN遺伝子（配列番号:224）が含まれる。
プロモーターP15（配列番号:117）によって駆動される配列番号:221を含む形質転換ベクターを実施例2にしたがって作製する。続いて、プロモーターP15::RPS5ベクターを含む改変タバコ植物を作出し、実施例2にしたがって植物の表現型を評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す。
【実施例２４】
【０１４１】
プログラム化細胞死誘導遺伝子を用いる吸枝成長の調節
通常は発現されない細胞で又は通常は存在しない細胞部分で、いくつかのタンパク質が増加レベルで存在することによって細胞死を誘発することができる。腋芽特異的プロモーター（例えばプロモーターP1（配列番号:113）及びプロモーターP15（配列番号:117））を用いて、腋芽細胞でかつ最終的には腋芽の死をもたらす異種遺伝子を発現させる。
プログラム化細胞死誘導（PCD誘導）酵素（例えば転写因子（配列番号:208、210及び212）、キナーゼ（配列番号:214）、システインプロテアーゼ（配列番号:216及び218）、及びカスパーゼ（配列番号:220）（表6参照））を用いて細胞死を腋芽で誘発する（このときそれら酵素の発現はプロモーターP15（配列番号:117）によって駆動される）。実施例2にしたがって、プロモーターP15（配列番号:117）によって駆動される配列番号:208、210、212、214、216、218及び220を含む形質転換ベクターを作製する。続いて、プロモーターP15::PCD誘導酵素ベクターを含む改変タバコ植物を実施例2にしたがって作出する。改変タバコ植物（T0世代）及びコントロールタバコ植物を発育停止期まで育成し、続いて、植物の上部切取りを実施してシュート頂端分裂組織を除去する。吸枝成長は、上部切取り時、上部切取り24時間後、及び上部切取り1週間後に観察される。プロモーターP15によって駆動されるPCD誘導酵素の発現はタバコの吸枝伸長を消失させる。
【０１４２】
表6：プログラム化細胞死（PCD）誘導遺伝子
2019512247.tif 000019
【実施例２５】
【０１４３】
ミクロRNA調節による吸枝成長の調節
miRNAは腋芽の発生の調節に関与できる。以下を参照されたい: Ortiz-Morea et al., 2013, Journal of Experimental Botany 64:2307-2320；及びWang et al., 2010, Molecular Plant 3:794-806（前記は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。タバコの吸枝の発生に関与するmiRNAを同定するために、上部切取り前に及び上部切取り後いくつかの時点で（例えば上部切取り2時間後、上部切取り6時間後、上部切取り24時間後、上部切取り72時間後、上部切取り96時間後）、4週齢のTN90タバコ植物の腋芽及び篩部から全RNAサンプルを抽出する。全RNAから小さなRNA（sRNA）を分離し精製する。得られたsRNAサンプル（各組織タイプについて別個に収集した3つのサンプル）を処理しイルミナシーケンシングに付す。イルミナの読みをマッピングし、miRNA及び他の小TNA（例えば小さな干渉RNA（siRNA）、trans-作動性siRNA）の発現プロフィールの評価に用いる。上部切取り前及び上部切取り後に弁別的発現を示す小RNA（miRNAを含む）を同定する。これらのsRNAは吸枝の形成又は伸長で役割を果たす。同定したsRNAの前駆体配列及びゲノム配列を続いて同定する。
いくつかのタバコのsRNAは吸枝発生及び/又は吸枝成長の低下と密接に関係する。これらのsRNAの過剰発現を用いて吸枝を阻害する。吸枝発生及び/又は吸枝成長の低下と密接に関係することが見いだされたsRNAを、腋芽で機能するプロモーター（例えば配列番号:113−118、148−160、及び204）の調節下又は構成的プロモーター（例えばCaMV 35S）下に実施例2にしたがって配置する。
実施例2にしたがって、プロモーターP1、P11、P15、又はPABチオニン（配列番号:118）によって駆動される対象のsRNAを含む形質転換ベクターを作製する。続いて、改変タバコ植物を作出し、実施例2にしたがって表現型を評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す。
遺伝子を抑制することによって吸枝形成又は吸枝伸長を促進するか、或いは吸枝形成又は吸枝伸長を阻害するmiRNAが調節のために標的に誘導される。前記調節は、腋芽で機能するプロモーター（例えば配列番号:113−118、148−160、及び204）又は構成的プロモーター（例えばCaMV 35S）の調節下に少なくとも1つのおとりmiRNAを含む構築物を実施例2にしたがって作製することによって実施される。
実施例2にしたがって、プロモーターP1、P11、P15、又はPABチオニン（配列番号:118）によって駆動される、おとりmiRNAを含む形質転換ベクターを作製する。続いて、改変タバコ植物を作出し、実施例2にしたがって表現型を評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す。
さらにまた、プロモーターPABチオニン（配列番号:118）によって駆動される、タバコmiR159おとりを含む形質転換ベクターを実施例2にしたがって作製する。タバコの成熟miR159（配列番号:227）は少なくとも配列番号:1、13及び35と相補性である（前記はいずれもタバコで機能し吸枝成長を阻害する）。配列番号:1、13及び35のmiR159媒介分解の防止は吸枝の成長を低下させる。続いて、改変タバコ植物を腋芽分裂組織プロモーター::miR159おとりベクターで作出し、実施例2にしたがって表現型を評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す。
【実施例２６】
【０１４４】
オーキシン合成及び輸送の改変による吸枝成長の調節
シュート頂端分裂組織の除去は、腋芽を休眠から解放し吸枝の伸長を促進する。無傷のシュート頂端分裂組織から誘導されるオーキシンは吸枝の伸長を抑制する。典型的には、シュート頂端分裂組織の除去によって誘発されるサイトキニンは腋芽分裂組織の伸長を促進する。いかなる科学的理論にも拘束されないが、シュート頂端分裂組織除去後の腋芽内又はその周辺における高いオーキシン:サイトキニン比の維持によって腋芽の伸長を抑制できる。
腋芽領域内又はその周辺におけるオーキシン濃度の局在的増加は吸枝伸長を抑制できる。オーキシ生合成及び/又は輸送に関係する遺伝子を用いて腋生分裂組織の伸長を抑制する（このとき、それら遺伝子の発現はプロモーターP15（配列番号:117）又は腋芽で機能する他のプロモーター（例えば配列番号:113−118、148−160、及び204）によって駆動される）。プロモーターP15（配列番号:117）によって駆動される配列番号:234（YUCCA1（フラビンモノオキシゲナーゼ））を含む形質転換ベクターを実施例2にしたがって作製する。続いて、改変タバコ植物をプロモーターP15::YUCCA1ベクターにより実施例2にしたがって作出する。改変タバコ植物（T0世代）及びコントロールタバコ植物を発育停止期まで育成し、続いて、植物の上部切取りを実施してシュート頂端分裂組織を除去する。吸枝成長は、上部切取り時、上部切取り24時間後、上部切取り1週間後、上部切取り2週間後、及び上部切取り3週間後に観察される。プロモーターP15によって駆動される配列番号:234の発現はタバコの吸枝伸長を抑制する。
プロモーターP15::YUCCA1と同様な追加の形質転換ベクターがまた、アラビドプシス由来の例えば以下の他のオーキシン生合成及びオーキシン輸送遺伝子を用いて作製される：PIN-FORMED1（PIN1（配列番号:236））；トリプトファンアミノトランスフェラーゼ1/輸送阻害因子レスポンス2（TAA1/TIR2（配列番号:238））；アルデヒドオキシダーゼ1（AAO1（配列番号:240））；及びインドール-3-アセトアミドヒドロラーゼ1（AMI1（配列番号:242））。プロモーターP15に加えて、腋芽で機能するいくつかのプロモーター（例えば配列番号:113−118、148−160、204及び前記のフラグメント）を、オーキシン生合成及びオーキシン輸送遺伝子（例えば配列番号:234、236、238、240及び242）の発現を駆動するために用いる。さらにまた、アラビドプシスのオーキシン生合成及びオーキシン輸送遺伝子のタバコ遺伝子ホモログ（例えばNtYUCCA様、配列番号:244及び246；NtPIN1様、配列番号:248；NtTAA1/NtTIR2様、配列番号:250；NtAAO1様、配列番号:252；及びNtAMI1様、配列番号:254）がそれぞれ別々のベクター構築物に含まれる（前記構築物ではプロモーターP15とともに腋芽で機能する他のプロモーター（例えば配列番号:113−118、148、160、204及び前記のフラグメント）が用いられる）。
前記ベクターの各々を用いて改変タバコ植物を作出し、さらに実施例2にしたがって当該タバコ植物の表現型を評価する。改変タバコ植物はコントロールタバコ植物と比較して吸枝成長の低下を示す。
【０１４５】
表7：オーキシン生合成及びオーキシン輸送遺伝子
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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