(57)【要約】  核酸オリゴマー化合物、ならびに前立腺、肺、膵臓、乳房、子宮頚部および骨の癌細胞を含めた癌細胞の増殖、生存または生存能力を抑制するための組成物および方法におけるそれらの使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞の増殖、生存または生存能力を阻害するための方法であって、該方法が、以下の：
ａ）ホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む骨格；
ｂ）（ｉ）少なくとも約５０％のプリン含量、または（ｉｉ）少なくとも約５０％のグアノシン−シトシン（ＧＣ）含量と共に少なくとも約４５％のプリン含量；および
ｃ）少なくとも１４核酸塩基かつ２９核酸塩基以下の長さ、
を特徴とする核酸オリゴマーであって、
ここで、ＴＨＯ複合体サブユニット４（ＴＨＯＣ４）タンパク質および一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質１（ＳＳＢ１）のうちの一方またはその両方に結合する該オリゴマー、
を腫瘍細胞内に導入することを含む方法。
【請求項２】
腫瘍細胞の増殖、生存または生存能力を阻害するための方法であって、該方法が、以下の：
ａ）ホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む骨格；
ｂ）（ｉ）少なくとも約５０％のプリン含量、または（ｉｉ）少なくとも約５０％のグアノシン−シトシン（ＧＣ）含量と共に少なくとも約４５％のプリン含量；および
ｃ）少なくとも１４核酸塩基かつ２９核酸塩基以下の長さ、
を特徴とする核酸オリゴマーであって、
ここで、ＴＨＯ複合体サブユニット４（ＴＨＯＣ４）タンパク質および一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質１（ＳＳＢ１）のうちの一方またはその両方に結合する該オリゴマー、
を腫瘍細胞内に導入することから成る方法。
【請求項３】
腫瘍細胞の増殖、生存または生存能力を阻害するための方法であって、該方法が、以下の：
ａ）ホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む骨格；
ｂ）（ｉ）少なくとも約５０％のプリン含量、または（ｉｉ）少なくとも約５０％のグアノシン−シトシン（ＧＣ）含量と共に少なくとも約４５％のプリン含量；および
ｃ）少なくとも１４核酸塩基かつ２９核酸塩基以下の長さ、
を特徴とする核酸オリゴマーであって、
ここで、ＴＨＯ複合体サブユニット４（ＴＨＯＣ４）タンパク質および一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質１（ＳＳＢ１）のうちの一方またはその両方に結合する該オリゴマー、
を腫瘍細胞内に導入することから実質的に成る方法。
【請求項４】
前記オリゴマーが１４核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴマーが７のプリンから成る、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴマーが６のプリンおよび７のＧ／Ｃから成る、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴマーが８のプリンから成る、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴマーが９のプリンから成る、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴマーが１０のプリンから成る、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴマーが１１のプリンから成る、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴマーが１２のプリンから成る、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記オリゴマーが１３のプリンから成る、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記オリゴマーが１５核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記オリゴマーが８のプリンから成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴマーが７のプリンおよび８のＧ／Ｃから成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記オリゴマーが９のプリンから成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴマーが１０のプリンから成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記オリゴマーが１１のプリンから成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記オリゴマーが１２のプリンから成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記オリゴマーが１３のプリンから成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記オリゴマーが１４のプリンから成る、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
前記オリゴマーが１６核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記オリゴマーが８のプリンから成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記オリゴマーが７のプリンおよび８のＧ／Ｃから成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記オリゴマーが９のプリンから成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記オリゴマーが１０のプリンから成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記オリゴマーが１１のプリンから成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記オリゴマーが１２のプリンから成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記オリゴマーが１３のプリンから成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記オリゴマーが１４のプリンから成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記オリゴマーが１５のプリンから成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記オリゴマーが１７核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記オリゴマーが９のプリンから成る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記オリゴマーが８のプリンおよび９のＧ／Ｃから成る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記オリゴマーが１０のプリンから成る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記オリゴマーが１１のプリンから成る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記オリゴマーが１２のプリンから成る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記オリゴマーが１３のプリンから成る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】
前記オリゴマーが１４のプリンから成る、請求項３２に記載の方法。
【請求項４０】
前記オリゴマーが１５のプリンから成る、請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記オリゴマーが１６のプリンから成る、請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
前記オリゴマーが１８核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記オリゴマーが９のプリンから成る、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記オリゴマーが８のプリンおよび９のＧ／Ｃから成る、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記オリゴマーが１０のプリンから成る、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記オリゴマーが１１のプリンから成る、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記オリゴマーが１２のプリンから成る、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記オリゴマーが１３のプリンから成る、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記オリゴマーが１４のプリンから成る、請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記オリゴマーが１５のプリンから成る、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記オリゴマーが１６のプリンから成る、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
前記オリゴマーが１７のプリンから成る、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
前記オリゴマーが１９核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記オリゴマーが１０のプリンから成る、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記オリゴマーが９のプリンおよび１０のＧ／Ｃから成る、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記オリゴマーが１１のプリンから成る、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記オリゴマーが１２のプリンから成る、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記オリゴマーが１３のプリンから成る、請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記オリゴマーが１４のプリンから成る、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記オリゴマーが１５のプリンから成る、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
前記オリゴマーが１６のプリンから成る、請求項５３に記載の方法。
【請求項６２】
前記オリゴマーが１７のプリンから成る、請求項５３に記載の方法。
【請求項６３】
前記オリゴマーが１８のプリンから成る、請求項５３に記載の方法。
【請求項６４】
前記オリゴマーが２０核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記オリゴマーが１０のプリンから成る、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記オリゴマーが９のプリンおよび１０のＧ／Ｃから成る、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記オリゴマーが１１のプリンから成る、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記オリゴマーが１２のプリンから成る、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
前記オリゴマーが１３のプリンから成る、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記オリゴマーが１４のプリンから成る、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
前記オリゴマーが１５のプリンから成る、請求項６４に記載の方法。
【請求項７２】
前記オリゴマーが１６のプリンから成る、請求項６４に記載の方法。
【請求項７３】
前記オリゴマーが１７のプリンから成る、請求項６４に記載の方法。
【請求項７４】
前記オリゴマーが１８のプリンから成る、請求項６４に記載の方法。
【請求項７５】
前記オリゴマーが１９のプリンから成る、請求項６４に記載の方法。
【請求項７６】
前記オリゴマーが２１核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記オリゴマーが１１のプリンから成る、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記オリゴマーが９のプリンおよび１１のＧ／Ｃから成る、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記オリゴマーが１２のプリンから成る、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記オリゴマーが１３のプリンから成る、請求項７６に記載の方法。
【請求項８１】
前記オリゴマーが１４のプリンから成る、請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
前記オリゴマーが１５のプリンから成る、請求項７６に記載の方法。
【請求項８３】
前記オリゴマーが１６のプリンから成る、請求項７６に記載の方法。
【請求項８４】
前記オリゴマーが１７のプリンから成る、請求項７６に記載の方法。
【請求項８５】
前記オリゴマーが１８のプリンから成る、請求項７６に記載の方法。
【請求項８６】
前記オリゴマーが１９のプリンから成る、請求項７６に記載の方法。
【請求項８７】
前記オリゴマーが２０のプリンから成る、請求項７６に記載の方法。
【請求項８８】
前記オリゴマーが２２核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
前記オリゴマーが１１のプリンから成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記オリゴマーが１０のプリンおよび１１のＧ／Ｃから成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記オリゴマーが１２のプリンから成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
前記オリゴマーが１３のプリンから成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
前記オリゴマーが１４のプリンから成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項９４】
前記オリゴマーが１５のプリンから成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項９５】
前記オリゴマーが１６のプリンから成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項９６】
前記オリゴマーが１７のプリンから成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項９７】
前記オリゴマーが１８のプリンから成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項９８】
前記オリゴマーが１９のプリンから成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項９９】
前記オリゴマーが２０のプリンから成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項１００】
前記オリゴマーが２１のプリンから成る、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記オリゴマーが２３核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記オリゴマーが１２のプリンから成る、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記オリゴマーが１０のプリンおよび１２のＧ／Ｃから成る、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記オリゴマーが１３のプリンから成る、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記オリゴマーが１４のプリンから成る、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記オリゴマーが１５のプリンから成る、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０７】
前記オリゴマーが１６のプリンから成る、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０８】
前記オリゴマーが１７のプリンから成る、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０９】
前記オリゴマーが１８のプリンから成る、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１０】
前記オリゴマーが１９のプリンから成る、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１１】
前記オリゴマーが２０のプリンから成る、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１２】
前記オリゴマーが２１のプリンから成る、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記オリゴマーが２２のプリンから成る、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１１４】
前記オリゴマーが２４核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記オリゴマーが１２のプリンから成る、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記オリゴマーが１１のプリンおよび１２のＧ／Ｃから成る、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
前記オリゴマーが１３のプリンから成る、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１８】
前記オリゴマーが１４のプリンから成る、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１９】
前記オリゴマーが１５のプリンから成る、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２０】
前記オリゴマーが１６のプリンから成る、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２１】
前記オリゴマーが１７のプリンから成る、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２２】
前記オリゴマーが１８のプリンから成る、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２３】
前記オリゴマーが１９のプリンから成る、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２４】
前記オリゴマーが２０のプリンから成る、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２５】
前記オリゴマーが２１のプリンから成る、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記オリゴマーが２２のプリンから成る、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２７】
前記オリゴマーが２３のプリンから成る、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１２８】
前記オリゴマーが２５核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２９】
前記オリゴマーが１３のプリンから成る、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記オリゴマーが１１のプリンおよび１３のＧ／Ｃから成る、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
前記オリゴマーが１４のプリンから成る、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】
前記オリゴマーが１５のプリンから成る、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３３】
前記オリゴマーが１６のプリンから成る、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３４】
前記オリゴマーが１７のプリンから成る、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３５】
前記オリゴマーが１８のプリンから成る、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３６】
前記オリゴマーが１９のプリンから成る、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３７】
前記オリゴマーが２０のプリンから成る、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３８】
前記オリゴマーが２１のプリンから成る、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３９】
前記オリゴマーが２２のプリンから成る、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記オリゴマーが２３のプリンから成る、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１４１】
前記オリゴマーが２４のプリンから成る、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１４２】
前記オリゴマーが２６核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記オリゴマーが１３のプリンから成る、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記オリゴマーが１２のプリンおよび１３のＧ／Ｃから成る、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４５】
前記オリゴマーが１４のプリンから成る、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４６】
前記オリゴマーが１５のプリンから成る、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４７】
前記オリゴマーが１６のプリンから成る、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４８】
前記オリゴマーが１７のプリンから成る、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４９】
前記オリゴマーが１８のプリンから成る、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１５０】
前記オリゴマーが１９のプリンから成る、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１５１】
前記オリゴマーが２０のプリンから成る、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１５２】
前記オリゴマーが２１のプリンから成る、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１５３】
前記オリゴマーが２２のプリンから成る、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記オリゴマーが２３のプリンから成る、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１５５】
前記オリゴマーが２４のプリンから成る、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１５６】
前記オリゴマーが２５のプリンから成る、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１５７】
前記オリゴマーが２７核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５８】
前記オリゴマーが１４のプリンから成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記オリゴマーが１２のプリンおよび１４のＧ／Ｃから成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６０】
前記オリゴマーが１５のプリンから成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６１】
前記オリゴマーが１６のプリンから成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６２】
前記オリゴマーが１７のプリンから成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６３】
前記オリゴマーが１８のプリンから成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６４】
前記オリゴマーが１９のプリンから成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６５】
前記オリゴマーが２０のプリンから成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６６】
前記オリゴマーが２１のプリンから成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６７】
前記オリゴマーが２２のプリンから成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６８】
前記オリゴマーが２３のプリンから成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記オリゴマーが２４のプリンから成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１７０】
前記オリゴマーが２５のプリンから成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１７１】
前記オリゴマーが２６のプリンから成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１７２】
前記オリゴマーが２８核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７３】
前記オリゴマーが１４のプリンから成る、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７４】
前記オリゴマーが１３のプリンおよび１４のＧ／Ｃから成る、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７５】
前記オリゴマーが１５のプリンから成る、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７６】
前記オリゴマーが１６のプリンから成る、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７７】
前記オリゴマーが１７のプリンから成る、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７８】
前記オリゴマーが１８のプリンから成る、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７９】
前記オリゴマーが１９のプリンから成る、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１８０】
前記オリゴマーが２０のプリンから成る、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１８１】
前記オリゴマーが２１のプリンから成る、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１８２】
前記オリゴマーが２２のプリンから成る、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１８３】
前記オリゴマーが２３のプリンから成る、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記オリゴマーが２４のプリンから成る、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１８５】
前記オリゴマーが２５のプリンから成る、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１８６】
前記オリゴマーが２６のプリンから成る、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１８７】
前記オリゴマーが２７のプリンから成る、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１８８】
前記オリゴマーが２９核酸塩基の長さを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８９】
前記オリゴマーが１５のプリンから成る、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９０】
前記オリゴマーが１３のプリンおよび１５のＧ／Ｃから成る、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９１】
前記オリゴマーが１６のプリンから成る、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９２】
前記オリゴマーが１７のプリンから成る、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９３】
前記オリゴマーが１８のプリンから成る、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９４】
前記オリゴマーが１９のプリンから成る、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９５】
前記オリゴマーが２０のプリンから成る、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９６】
前記オリゴマーが２１のプリンから成る、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９７】
前記オリゴマーが２２のプリンから成る、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９８】
前記オリゴマーが２３のプリンから成る、請求項１８８に記載の方法。
【請求項１９９】
前記オリゴマーが２４のプリンから成る、請求項１８８に記載の方法。
【請求項２００】
前記オリゴマーが２５のプリンから成る、請求項１８８に記載の方法。
【請求項２０１】
前記オリゴマーが２６のプリンから成る、請求項１８８に記載の方法。
【請求項２０２】
前記オリゴマーが２７のプリンから成る、請求項１８８に記載の方法。
【請求項２０３】
前記オリゴマーが２８のプリンから成る、請求項１８８に記載の方法。
【請求項２０４】
前記骨格のヌクレオシド間結合の少なくとも約７０％が、ホスホロチオアート（ＰＳ）ヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜２０３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０５】
任意の非ＰＳヌクレオシド間結合が、前記オリゴマー末端の一方またはその両方に位置する、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０６】
任意の非ＰＳヌクレオシド間結合が、前記オリゴマーの中心部に位置する、請求項２０４または２０５に記載の方法。
【請求項２０７】
任意の非ＰＳヌクレオシド間結合が、前記オリゴマー中に分散している、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２０８】
最大９のヌクレオシド間結合が非ＰＳヌクレオシド間結合である、請求項２０４〜２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０９】
最大８のヌクレオシド間結合が非ＰＳヌクレオシド間結合である、請求項２０４〜２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１０】
最大７のヌクレオシド間結合が非ＰＳヌクレオシド間結合である、請求項２０４〜２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１１】
最大６のヌクレオシド間結合が非ＰＳヌクレオシド間結合である、請求項２０４〜２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１２】
最大５のヌクレオシド間結合が非ＰＳヌクレオシド間結合である、請求項２０４〜２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１３】
最大４のヌクレオシド間結合が非ＰＳヌクレオシド間結合である、請求項２０４〜２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１４】
最大３のヌクレオシド間結合が非ＰＳヌクレオシド間結合である、請求項２０４〜２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１５】
最大２のヌクレオシド間結合が非ＰＳヌクレオシド間結合である、請求項２０４〜２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１６】
最大１のヌクレオシド間結合が非ＰＳヌクレオシド間結合である、請求項２０４〜２０７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１７】
すべてのヌクレオシド間結合がＰＳヌクレオシド間結合である、請求項２０４に記載の方法。
【請求項２１８】
前記オリゴマーが、前記腫瘍細胞の核から細胞質へのｍＲＮＡの移行を遮断することをさらなる特徴とする、請求項１〜２１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１９】
前記オリゴマーが、非腫瘍細胞による取り込みと比較して、前記腫瘍細胞によって優先的に取り込まれることをさらなる特徴とする、請求項１〜２１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２０】
前記オリゴマーが、前記腫瘍細胞のアポトーシスまたはネクローシスを引き起こすことをさらなる特徴とする、請求項１〜２１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２１】
前記オリゴマーが、非腫瘍細胞に比べて、前記腫瘍細胞と同じタイプの腫瘍細胞のより多くの死滅を引き起こす、請求項２２０に記載の方法。
【請求項２２２】
前記オリゴマーが、対照オリゴマーより高い親和性で、ＴＨＯＣ４およびＳＳＢ１のうちの一方またはその両方に結合することをさらなる特徴とする、請求項１〜２２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２３】
前記オリゴマーがインビボで腫瘍細胞内に導入される、請求項１〜２２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２４】
前記オリゴマーがインビトロで腫瘍細胞内に導入される、請求項１〜２２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２５】
前記オリゴマーが、少なくとも約４５℃の融解温度（Ｔｍ）を有することをさらなる特徴とする、請求項１〜２２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２６】
前記オリゴマーの骨格が、少なくとも１の２’−Ｏ−アルキル修飾糖部分を含む、請求項１〜２２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２７】
前記オリゴマーのヌクレオシドのうちの少なくとも約５０％が、それぞれ２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドである、請求項２２６に記載の方法。
【請求項２２８】
前記オリゴマーが、１４の核酸塩基から成り、かつ、７〜１４の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２９】
前記オリゴマーが、１５の核酸塩基から成り、かつ、８〜１５の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３０】
前記オリゴマーが、１６の核酸塩基から成り、かつ、８〜１６の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３１】
前記オリゴマーが、１７の核酸塩基から成り、かつ、９〜１７の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３２】
前記オリゴマーが、１８の核酸塩基から成り、かつ、９〜１８の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３３】
前記オリゴマーが、１９の核酸塩基から成り、かつ、１０〜１９の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３４】
前記オリゴマーが、２０の核酸塩基から成り、かつ、１０〜２０の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３５】
前記オリゴマーが、２１の核酸塩基から成り、かつ、１１〜２１の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３６】
前記オリゴマーが、２２の核酸塩基から成り、かつ、１１〜２２の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３７】
前記オリゴマーが、２３の核酸塩基から成り、かつ、１２〜２３の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３８】
前記オリゴマーが、２４の核酸塩基から成り、かつ、１２〜２４の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３９】
前記オリゴマーが、２５の核酸塩基から成り、かつ、１３〜２５の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４０】
前記オリゴマーが、２６の核酸塩基から成り、かつ、１３〜２６の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４１】
前記オリゴマーが、２７の核酸塩基から成り、かつ、１４〜２７の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４２】
前記オリゴマーが、２８の核酸塩基から成り、かつ、１４〜２８の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４３】
前記オリゴマーが、２９の核酸塩基から成り、かつ、１５〜２９の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４４】
前記オリゴマーが、から成る、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４５】
前記オリゴマーが、１５の核酸塩基から成り、かつ、７〜１５の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドを含む、請求項２２６〜２２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４６】
前記２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドが２’−Ｏ−メチルヌクレオシドである、請求項２２６〜２４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４７】
前記オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列が、トランスクリプトームに対する相補性を実質的に欠いている、請求項１〜２４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４８】
前記オリゴマーの核酸塩基の約９５％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２４９】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、トランスクリプトームの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない少なくとも１の非相補的核酸塩基を有する、請求項２４８に記載の方法。
【請求項２５０】
前記オリゴマーの核酸塩基の約９０％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２５１】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも１、２、または３の（トランスクリプトームの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、請求項２５０に記載の方法。
【請求項２５２】
前記オリゴマーの核酸塩基の約８５％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２５３】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも２、３または４の（トランスクリプトームの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、請求項２５２に記載の方法。
【請求項２５４】
前記オリゴマーの核酸塩基の約８０％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２５５】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも３、４、５または６の（トランスクリプトームの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、請求項２５４に記載の方法。
【請求項２５６】
前記オリゴマーの核酸塩基の約７５％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２５７】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも３、４、５、６または７の（トランスクリプトームの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、
請求項２５６に記載の方法。
【請求項２５８】
前記オリゴマーの核酸塩基の約７０％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２５９】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも４、５、６、７、８または９の（トランスクリプトームの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、請求項２５８に記載の方法。
【請求項２６０】
前記オリゴマーの核酸塩基の約６５％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２６１】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも５、６、７、８、９または１０の（トランスクリプトームの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、請求項２６０に記載の方法。
【請求項２６２】
前記オリゴマーの核酸塩基の約６０％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２６３】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも６、７、８、９、１０、１１または１２の（トランスクリプトームの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、請求項２６２に記載の方法。
【請求項２６４】
前記オリゴマーの核酸塩基の約５５％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２６５】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２または１３の（トランスクリプトームの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、請求項２６４に記載の方法。
【請求項２６６】
前記オリゴマーの核酸塩基の約５０％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２６７】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４の（トランスクリプトームの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、請求項２６６に記載の方法。
【請求項２６８】
前記オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列が、好適には前記腫瘍細胞がそれから生じる哺乳動物のゲノムに対して実質的な相補性を欠いている、請求項１〜２６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６９】
前記オリゴマーの核酸塩基の約９５％以下がゲノムとの塩基対合に関与できる、請求項２６８に記載の方法。
【請求項２７０】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、ゲノムの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない少なくとも１の非相補的核酸塩基を有する、請求項２６９に記載の方法。
【請求項２７１】
前記オリゴマーの核酸塩基の約９０％以下がゲノムとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２７２】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも１、２、または３の（ゲノムの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、請求項２７１に記載の方法。
【請求項２７３】
前記オリゴマーの核酸塩基の約８５％以下がゲノムとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２７４】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも２、３または４の（ゲノムの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、請求項２７３に記載の方法。
【請求項２７５】
前記オリゴマーの核酸塩基の約８０％以下がゲノムとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２７６】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも３、４、５または６の（ゲノムの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、請求項２７５に記載の方法。
【請求項２７７】
前記オリゴマーの核酸塩基の約７５％以下がゲノムとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２７８】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも３、４、５、６または７の（ゲノムの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、請求項２７７に記載の方法。
【請求項２７９】
前記オリゴマーの核酸塩基の約７０％以下がゲノムとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２８０】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも４、５、６、７、８または９の（ゲノムの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、請求項２７９に記載の方法。
【請求項２８１】
前記オリゴマーの核酸塩基の約６５％以下がゲノムとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２８２】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも５、６、７、８、９または１０の（ゲノムの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、請求項２８１に記載の方法。
【請求項２８３】
前記オリゴマーの核酸塩基の約６０％以下がゲノムとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２８４】
請求項２８３に記載の方法。前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも６、７、８、９、１０、１１または１２の（ゲノムの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、
【請求項２８５】
前記オリゴマーの核酸塩基の約５５％以下がゲノムとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２８６】
請求項２８５に記載の方法。前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２または１３の（ゲノムの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、
【請求項２８７】
前記オリゴマーの核酸塩基の約５０％以下がゲノムとの塩基対合に関与できる、請求項２４７に記載の方法。
【請求項２８８】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算される該オリゴマーの長さによって、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４の（ゲノムの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない）非相補的核酸塩基を有する、請求項２８７に記載の方法。
【請求項２８９】
前記オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列が、好適にはそれから腫瘍細胞が生じる哺乳動物のゲノムに対する相同性を欠いている、請求項１〜２８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９０】
前記オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列が、ゲノム内の参照核酸塩基配列を規定するあらゆる等長の隣接核酸塩基に対して約９５％以下の配列同一性を有する、請求項２８９に記載の方法。
【請求項２９１】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、参照核酸塩基配列の対応する位置の核酸塩基と同一でないか、またはそれと同じであるかもしくは同等な核酸塩基対合能力を有していない、少なくとも１の核酸塩基を有する、請求項２９０に記載の方法。
【請求項２９２】
前記オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列が、ゲノム内の参照核酸塩基配列を規定するあらゆる等長の隣接核酸塩基に対して約９０％以下の配列同一性を有する、請求項２８９に記載の方法。
【請求項２９３】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算されるオリゴマーの長さによって、少なくとも１、２、または３の（参照核酸塩基配列の対応する位置の核酸塩基と同一でないか、またはそれと同じであるかもしくは同等な核酸塩基対合能力を有していない）核酸塩基を有する、請求項２９２に記載の方法。
【請求項２９４】
前記オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列が、ゲノム内の参照核酸塩基配列を規定するあらゆる等長の隣接核酸塩基に対して約８５％以下の配列同一性を有する、請求項２８９に記載の方法。
【請求項２９５】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算されるオリゴマーの長さによって、少なくとも２、３または４の（参照核酸塩基配列の対応する位置の核酸塩基と同一でないか、またはそれと同じであるかもしくは同等な核酸塩基対合能力を有していない）核酸塩基を有する、請求項２９４に記載の方法。
【請求項２９６】
前記オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列が、ゲノム内の参照核酸塩基配列を規定するあらゆる等長の隣接核酸塩基に対して約８０％以下の配列同一性を有する、請求項２８９に記載の方法。
【請求項２９７】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算されるオリゴマーの長さによって、少なくとも３、４、５または６の（参照核酸塩基配列の対応する位置の核酸塩基と同一でないか、またはそれと同じであるかもしくは同等な核酸塩基対合能力を有していない）核酸塩基を有する、請求項２９６に記載の方法。
【請求項２９８】
前記オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列が、ゲノム内の参照核酸塩基配列を規定するあらゆる等長の隣接核酸塩基に対して約７５％以下の配列同一性を有する、請求項２８９に記載の方法。
【請求項２９９】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算されるオリゴマーの長さによって、少なくとも３、４、５、６または７の（参照核酸塩基配列の対応する位置の核酸塩基と同一でないか、またはそれと同じであるかもしくは同等な核酸塩基対合能力を有していない）核酸塩基を有する、請求項２９８に記載の方法。
【請求項３００】
前記オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列が、ゲノム内の参照核酸塩基配列を規定するあらゆる等長の隣接核酸塩基に対して約７０％以下の配列同一性を有する、請求項２８９に記載の方法。
【請求項３０１】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算されるオリゴマーの長さによって、少なくとも４、５、６、７、８または９の（参照核酸塩基配列の対応する位置の核酸塩基と同一でないか、またはそれと同じであるかもしくは同等な核酸塩基対合能力を有していない）核酸塩基を有する、請求項３００に記載の方法。
【請求項３０２】
前記オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列が、ゲノム内の参照核酸塩基配列を規定するあらゆる等長の隣接核酸塩基に対して約６５％以下の配列同一性を有する、請求項２８９に記載の方法。
【請求項３０３】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算されるオリゴマーの長さによって、少なくとも５、６、７、８、９または１０の（参照核酸塩基配列の対応する位置の核酸塩基と同一でないか、またはそれと同じであるかもしくは同等な核酸塩基対合能力を有していない）核酸塩基を有する、請求項３０２に記載の方法。
【請求項３０４】
前記オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列が、ゲノム内の参照核酸塩基配列を規定するあらゆる等長の隣接核酸塩基に対して約６０％以下の配列同一性を有する、請求項２８９に記載の方法。
【請求項３０５】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算されるオリゴマーの長さによって、少なくとも６、７、８、９、１０、１１または１２の（参照核酸塩基配列の対応する位置の核酸塩基と同一でないか、またはそれと同じであるかもしくは同等な核酸塩基対合能力を有していない）核酸塩基を有する、請求項３０４に記載の方法。
【請求項３０６】
前記オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列が、ゲノム内の参照核酸塩基配列を規定するあらゆる等長の隣接核酸塩基に対して約５５％以下の配列同一性を有する、請求項２８９に記載の方法。
【請求項３０７】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算されるオリゴマーの長さによって、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２または１３の（参照核酸塩基配列の対応する位置の核酸塩基と同一でないか、またはそれと同じであるかもしくは同等な核酸塩基対合能力を有していない）核酸塩基を有する、請求項３０６に記載の方法。
【請求項３０８】
前記オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列が、ゲノム内の参照核酸塩基配列を規定するあらゆる等長の隣接核酸塩基に対して約５０％以下の配列同一性を有する、請求項２８９に記載の方法。
【請求項３０９】
前記オリゴマーが、１４〜２９の核酸塩基から成り、かつ、前掲の表１から計算されるオリゴマーの長さによって、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４の（参照核酸塩基配列の対応する位置の核酸塩基と同一でないか、またはそれと同じであるかもしくは同等な核酸塩基対合能力を有していない）核酸塩基を有する、請求項３０８に記載の方法。
【請求項３１０】
前記オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列が、選択された遺伝子のアンチセンス鎖に対して実質的な相補性を有する、請求項１〜２４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１１】
前記核酸塩基配列が、選択された遺伝子の標的配列またはその転写産物に対して相補的であり、かつ、高ストリンジェンシー条件下で、それらにハイブリダイズする、請求項３１０に記載の方法。
【請求項３１２】
前記核酸塩基配列が、配列番号：１、２、３、５、６、７、１０、１２、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４４、４５、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５９、６１、６２、６３、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９１、９２、９３、９４、９８、１００、１０１、１０３、１０４、１０５、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１３、１１４、１１５、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３７、１３８、１４３、１４４、１４５、１５２、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１９１、１９２、１９６、１９８、２０３、２０６、２０７、２０９、２１０、２１１、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５６、２５８、２５９、２６１、２６３、２６４、２６５、２６９、２７０、２７１、２７２、２７４、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１および３０３から選択されるいずれか１つである、請求項１〜３１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１３】
前記核酸塩基配列が、配列番号：１、２、３、５、６、１０、１２、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２８、３２、３１、３４、３５、３６、３８、３９、４１、４４、５２、５６、５３、５４、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７９、８０、８１、８２、８３、８４、９１、９２、９３、９８、１００、１０３、１０４、１０７、１０９、１１０、１１１、１１３、１１４、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１４３、１４４、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１８０、１８１、１８２、１９１、１９２、２０３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４５、２４７、２５１、２５２、２５３、２５８、２５９、２６１、２６３、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１および３０３から選択されるいずれか１つである、請求項１〜３１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１４】
前記核酸塩基配列が、配列番号：１、２、３、５、１４、１６、１７、３１、３４、３５、３６、３８、３９、５２、５６、６７、６８、６９、７０、７１、７９、８０、８１、８２、８３、９１、９２、９３、１００、１０３、１０９、１１０、１１１、１１４、１１９、１３１、１３３、１３４、１３５、１４３、１５３、１５５、１５８、１５９、１６１、１６４、１６８、１６９、１７１、１８１、１８２、２０３、２５３、２７２、３００、３０１および３０３から選択されるいずれか１つである、請求項１〜３１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１５】
前記腫瘍細胞が、乳房、前立腺、卵巣、子宮頚部、膵臓、結腸直腸、肺、肝細胞、胃、肝臓、膀胱、尿管、甲状腺、腎、癌腫、黒色腫、脳、非小細胞性肺、頭頚部の扁平上皮細胞、子宮内膜、多発性骨髄腫、直腸、および食道の腫瘍細胞から選択される、請求項１〜３１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１６】
前記腫瘍細胞が、前立腺、肺、膵臓、乳房、卵巣または骨の腫瘍細胞から選択される、請求項１〜３１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１７】
前記オリゴマー化合物が、ＴＨＯＣ４およびｈＳＳＢ１のうちの一方またはその両方に優先的に結合するか、または親和性を有する、請求項１〜３１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１８】
前記ＴＨＯＣ４およびＳＳＢ１タンパク質がヒトのものである、請求項３１８に記載の方法。
【請求項３１９】
前記オリゴマー化合物が、３７℃にて１０ｎＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭのＮａＣｌを含有する水溶液中、約５０ｎＭ以下のＫＤでＴＨＯＣ４に結合する、請求項３１８または３１９に記載の方法。
【請求項３２０】
前記オリゴマー化合物が、３７℃にて１０ｎＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭのＮａＣｌを含有する水溶液中、約３ｎＭ以下のＫＤでＳＳＢ１（例えば、ｈＳＳＢ１）に結合する、請求項３１８または３１９に記載の方法。
【請求項３２１】
請求項１〜３１４のいずれか１項に記載のオリゴマー。
【請求項３２２】
請求項１〜３１４のいずれか１項に記載のオリゴマーおよび医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項３２３】
対象の癌を処置するかまたは予防するための方法であって、請求項１〜３１４のいずれか１項に記載のオリゴマーの有効量を該対象に投与することを含む方法。
【請求項３２４】
前記癌が固形腫瘍または血行性腫瘍である、請求項３２３に記載の方法。
【請求項３２５】
前記癌が、皮膚、組織、臓器、骨、軟骨、血液、および血管の癌から選択される、請求項３２３または３２４に記載の方法。
【請求項３２６】
前記癌が、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、肝細胞性癌、胃癌、肝臓癌、膀胱癌、尿管の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、脳癌、非小細胞肺癌、頭頚部の扁平上皮癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、直腸癌、および食道癌から選択される、請求項３２３〜３２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２７】
前記癌が、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、および骨癌から選択される、請求項３２３〜３２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２８】
前記癌が原発性癌である、請求項３２３〜３２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２９】
前記癌が転移癌である、請求項３２３〜３２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３０】
前記癌を処置するかまたは予防するために、前記オリゴマーと共に少なくとも１つの補助剤を同時に投与することをさらに含む、請求項３２３〜３２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３１】
前記補助剤が、抗感染症薬、化学療法薬、および免疫療法剤から選択される、請求項３３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本願は、２０１５年１２月２３日に出願された「Nucleic acid oligomers and uses therefor」と題した豪州特許仮出願第２０１５９０５３８０号に関する優先権を主張するものであり、その内容を全体として参照により本明細書に援用する。
【０００２】
本願発明は、概して、核酸オリゴマー化合物、ならびに前立腺、肺、膵臓、乳房、子宮頚部および骨の癌細胞を含めた癌細胞の増殖、生存または生存能力を抑制するための組成物および方法におけるその利用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌は唯一最大の世界的な健康問題である。２０３０年までには、全世界の死者の半分が癌によるものとなり、現在、我々の一生のうちで癌に罹患する数学的可能性は７０％達している。
【０００４】
医薬品開発は多くの障害に行き当たっている。化学療法薬は、直接的にまたは細胞分裂の阻害によってゲノム安定性を最初に標的とした。すべての癌が遺伝的不安定性を示すので、これらの薬剤がこれらの細胞をアポトーシスまたはネクローシスに追いやる可能性がある。しかしながら、化学療法薬は患者の正常細胞に対する毒性を示し、そして、患者の大部分がこれらの薬剤に対して抵抗性を有するようになる。彼らの癌が特定の薬剤化可能な突然変異を有する癌タンパク質によって駆動されている患者のサブタイプに向けられる癌療法もまた開発された。例としては、乳癌におけるＨＥＲ２過剰発現、および肺癌におけるＥＧＦＲ突然変異とＡＬＫ再構成が挙げられる。最近になって、固形腫瘍の一部に対して有効なＣＴＬＡ４およびＰＤ１／ＰＤＬ１経路を標的とする免疫チェックポイント阻害剤が開発されたが、これらの阻害剤の大部分が腫瘍の一部に対してのみ有能であり、そのうえ、多くの場合、患者はそれらに対して不応性になる。
【０００５】
当該技術分野において、癌の治療または予防に対する新たなアプローチに関して差し迫った必要性が未だに存在している。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本発明は、特定の骨格の化学的性質および塩基組成を有する指定された長さの核酸オリゴマー化合物がＤＮＡ修復および／または細胞のタンパク質合成機構へのＲＮＡ分子の核外輸送にかかわる細胞タンパク質に結合するという発見に基づいている。驚いたことに、これらの化合物が、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、乳癌、および子宮頚癌または骨癌に関連する腫瘍細胞を含めた腫瘍細胞の増殖を顕著に阻害するか、または死滅を刺激することが可能であることもまた発見された。これらの発見を、以下に記載のとおり、新規化合物、組成物および方法の実施にまとめた。
【０００７】
従って、一態様において、本発明は、腫瘍細胞（例えば、ヒト腫瘍細胞などの哺乳動物の腫瘍細胞）の増殖、生存または生存能力を阻害するための方法を提供する。これらの方法は、概して、以下を特徴とする核酸オリゴマーを腫瘍細胞内に導入することを含むか、そのことから成るか、またはそのことから実質的に成る：
ａ）ホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む骨格；
ｂ）（ｉ）少なくとも約５０％のプリン含量、または（ｉｉ）少なくとも約５０％のグアノシンシトシン（ＧＣ）含量と共に少なくとも約４５％のプリン含量；および
ｃ）少なくとも１４核酸塩基かつ２９核酸塩基以下の長さ、
ここで、該オリゴマーは、ＴＨＯ複合体サブユニット４（ＴＨＯＣ４）タンパク質および一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質１（ＳＳＢ１）のうちの一方またはその両方に結合する。
【０００８】
代表的な少なくとも約４５％のプリン含量とは、１４核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも６のプリン、１５核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも７のプリン、１６核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも７のプリン、１７核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも８のプリン、１８核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも８のプリン、１９核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも９のプリン、２０核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも９のプリン、２１核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも９のプリン、２２核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１０のプリン、２３核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１０のプリン、２４核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１１のプリン、２５核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１１のプリン、２６核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１２のプリン、２７核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１２のプリン、２８核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１３のプリン、および２９核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１３のプリンを包含する。
【０００９】
代表的な少なくとも約５０％のプリン含量とは、１４核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも７のプリン、１５核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも８のプリン、１６核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも８のプリン、１７核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも９のプリン、１８核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも９のプリン、１９核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１０のプリン、２０核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１０のプリン、２１核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１１のプリン、２２核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１１のプリン、２３核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１２のプリン、２４核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１２のプリン、２５核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１３のプリン、２６核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１３のプリン、２７核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１４のプリン、２８核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１４のプリン、および２９核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１５のプリンを包含する。
【００１０】
代表的な少なくとも約５０％のＧＣ含量とは、１４核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも７のＧ／Ｃ、１５核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも８のＧ／Ｃ、１６核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも８のＧ／Ｃ、１７核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも９のＧ／Ｃ、１８核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも９のＧ／Ｃ、１９核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１０のＧ／Ｃ、２０核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１０のＧ／Ｃ、２１核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１１のＧ／Ｃ、２２核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１１のＧ／Ｃ、２３核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１２のＧ／Ｃ、２４核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１２のＧ／Ｃ、２５核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１３のＧ／Ｃ、２６核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１３のＧ／Ｃ、２７核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１４のＧ／Ｃ、２８核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１４のＧ／Ｃ、および２９核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１５のＧ／Ｃを包含する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、該オリゴマーは、腫瘍細胞の核から細胞質へのｍＲＮＡの移行を妨げることをさらに特徴とする。
【００１２】
いくつかの実施形態において、該オリゴマーは、非腫瘍細胞によるその取り込みと比較して、それが腫瘍細胞によって優先的に取り込まれることをさらに特徴とする。
【００１３】
好適には、該オリゴマーは、それが腫瘍細胞のアポトーシスまたはネクローシスを引き起こすことをさらに特徴とする。こういったものに関する例示的な例では、該オリゴマーは、非腫瘍細胞のそれと比べて、前記腫瘍細胞と同じタイプの腫瘍細胞のより多くの死滅を引き起こす。
【００１４】
特定の実施形態において、該オリゴマーは、好適には本明細書中に規定される条件下、対照オリゴマーより高い親和性でＴＨＯＣ４およびＳＳＢ１のうちの一方またはその両方に結合することをさらに特徴とする。
【００１５】
腫瘍細胞内へのオリゴマーの導入はインビボでも、またはインビトロでも起こり得る。
【００１６】
好適には、骨格のヌクレオシド間結合の少なくとも約７０％がホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む。特定の実施形態において、骨格のすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、該オリゴマーは、少なくとも約４５℃の融解温度（Ｔｍ）を有することをさらに特徴とする。
【００１８】
いくつかの実施形態において、オリゴマー構成要素の骨格は、少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル修飾糖部分を含み、そしてその糖部分はまた、本明細書中で「２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド」（例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオシド）とも呼ばれる。具体例において、該オリゴマーは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドを含む。好適には、該オリゴマーのヌクレオシドの少なくとも約５０％は、それぞれ２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド（例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオシド）である。特定の実施形態において、該オリゴマーのすべてのヌクレオシドがそれぞれ２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド（例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオシド）である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、該オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列は、トランスクリプトームに対して実質的な相補性を欠いている。好適には、オリゴマーの核酸塩基の約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる。こういったものに関する例示的な例では、その核酸塩基の９５％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる１４〜２９核酸塩基のオリゴマーは、トランスクリプトームの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対できない少なくとも１の非相補的核酸塩基を有する。他の例示的な例では、その核酸塩基の９０％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる１４〜２９核酸塩基のオリゴマーは、例えば、以下の表１から計算されるように、該オリゴマーの長さによって、トランスクリプトームの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない少なくとも１、２または３の非相補的核酸塩基を有する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、該オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列は、腫瘍細胞が好適にそれから生じる哺乳動物のゲノムに対して実質的な相補性を欠いている。好適には、オリゴマーの核酸塩基の約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下がゲノムとの塩基対合に関与できる。こういったものに関する例示的な例では、核酸塩基の９５％以下がゲノムとの塩基対合に関与できる１４〜２９核酸塩基のオリゴマーは、ゲノムの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない少なくとも１の非相補的核酸塩基を有する。他の例示的な例では、その核酸塩基の９０％以下がゲノムとの塩基対合に関与できる１４〜２９核酸塩基のオリゴマーは、例えば、以下の表１から計算されるように、該オリゴマーの長さによって、ゲノムの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない少なくとも１、２または３の非相補的核酸塩基を有する。
【００２１】
いくつかの実施形態において、該オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列は、腫瘍細胞が好適にそれから生じる哺乳動物のゲノムに対して相同性を欠いている。好適には、該オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列は、ゲノムの参照核酸塩基配列を規定する任意の等長の隣接核酸塩基に対して約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下の配列同一性を有する。こういったものに関する例示的な例では、ゲノムの参照核酸塩基配列に対して９５％以下の配列同一性を有する１４〜２９核酸塩基のオリゴマーは、該参照核酸塩基配列の対応する位置の核酸塩基と同一でないか、またはそれらと同じであるかもしくは同等な核酸塩基対合能力を有していない少なくとも１の核酸塩基を有する。他の例示的な例では、ゲノムの参照核酸塩基に対して９０％以下の配列同一性を有する１４〜２９核酸塩基のオリゴマーは、例えば、以下の表１から計算されるように、該オリゴマーの長さによって、該参照核酸塩基配列の対応する位置の核酸塩基と同一でないか、またはそれと同じであるかもしくは同等な核酸塩基対合能力を有していない少なくとも１、２または３の核酸塩基を有する。
【００２２】
トランスクリプトームに対して実質的な相補性を欠いているか、またはゲノムに対して実質的な相補性または相同性を欠いているオリゴマー化合物は、本明細書中で「非標的化オリゴマー」と呼ばれる。いくつかの実施形態において、本発明の非標的化オリゴマーは、配列番号１、２、３、５、７、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４４、４５、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５９、６１、６２、６３、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９１、９２、９３、９４、９８、１００、１０３、１０４、１０５、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１３、１１４、１１５、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３７、１３８、１４３、１４４、１４５、１５２、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１９１、１９２、１９６、１９８、２０３、２０６、２０７、２０９、２１０、２１１、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５６、２５８、２５９、２６１、２６３、２６４、２６５、２６９、２７０、２７１、２７２、２７４、２７７、２８１、２８２、２８３、２８６、２８７、２９０、２９１、２９２、２９３、２９５、２９６、２９８、３００、３０１および３０３から選択されるいずれか１つの核酸塩基配列を含む。
【００２３】
他の実施形態において、該オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列は、選択された遺伝子のアンチセンス鎖に対して実質的な相補性を有する。これらの実施形態において、該核酸塩基配列は、高ストリンジェンシー条件下、選択された遺伝子によってコードされたｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡ分子を含めた選択された遺伝子またはその転写産物の標的配列に対して好適には相補的であり、そして、ハイブリダイズする。こういったオリゴマー化合物はまた、本明細書中で「アンチセンスオリゴマー」とも呼ばれる。いくつかの実施形態において、本発明のアンチセンスオリゴマーは、配列番号６、１０、１２、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、１０１、２７８、２７９、２８０、２８４、２８５、２８８、２８９、２９７および２９９から選択されるいずれか１つの核酸塩基配列を含む。
【００２４】
これらのオリゴマーは、腫瘍細胞の増殖、生存または生存能力の抑制に顕著な活性を有する。しかしながら、これらのうちのいくつかは、他のものより高い阻害力を有し、好ましい実施形態において、該オリゴマーは、配列番号１、２、３、５、６、１０、１２、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２８、３２、３１、３４、３５、３６、３８、３９、４１、４４、５２、５６、５３、５４、５９、６１、６３、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７９、８０、８１、８２、８３、８４、９１、９２、９３、９８、１００、１０３、１０４、１０７、１０９、１１０、１１１、１１３、１１４、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１４３、１４４、１４５、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１８０、１８１、１８２、１９１、１９２、２０３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２９、２３０、２３３、２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４５、２４７、２５１、２５２、２５３、２５８、２５９、２６１、２６３、２６４、２６９、２７１、２７２、２７４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１および３０３から選択されるいずれか１つの核酸塩基配列を有する。より好ましい実施形態において、該オリゴマーは、配列番号１、２、３、５、１４、１６、１７、３１、３４、３５、３６、３８、３９、５２、５６、６７、６８、６９、７０、７１、７９、８０、８１、８２、８３、９１、９２、９３、１００、１０３、１０９、１１０、１１１、１１４、１１９、１３１、１３３、１３４、１３５、１４３、１５３、１５５、１５８、１５９、１６１、１６４、１６８、１６９、１７１、１８１、１８２、２０３、２５３、２７２、３００、３０１および３０３から選択されるいずれか１つの核酸塩基配列を有する。
【００２５】
腫瘍細胞とは、悪性であるかまたは良性であるかにかかわらず新生細胞の成長および増殖があるあらゆる細胞である。それは、前癌または癌である可能性がある。特定の実施形態において、腫瘍細胞は、前立腺、肺、膵臓、乳房、子宮頚部または骨の腫瘍細胞から選択される。
【００２６】
該オリゴマー化合物は、ＴＨＯＣ４およびｈＳＳＢ１のうちの一方またはその両方に優先的に結合するか、または親和性を有する。ＴＨＯＣ４およびＳＳＢ１タンパク質は好ましくはヒトのもの（すなわち、ｈＴＨＯＣ４およびｈＳＳＢ１）である。特定の実施形態において、該オリゴマー化合物は、好適には、３７℃にて１０ｎＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭのＮａＣｌを含有する水溶液中、約５０ｎＭ以下のＫＤにてＴＨＯＣ４（例えば、ｈＴＨＯＣ４）に優先的に結合し、および／または約３ｎＭ以下のＫＤにてＳＳＢ１（例えば、ｈＳＳＢ１）に結合する。
【００２７】
本発明の別の態様は、先におよび本明細書中の他の場所に幅広く記載したオリゴマーを提供する。
【００２８】
さらに別の態様において、本発明は、先におよび本明細書中の他の場所に幅広く記載したオリゴマーおよび医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２９】
本発明のさらに別の態様は、対象の癌を治療するかまたは予防するための方法を提供する。これらの方法は、概して、先におよび本明細書中の他の場所に幅広く記載したオリゴマーの有効量を対象に投与することを含むか、それから成るか、または実質的に成る。
【００３０】
癌は、皮膚、組織、臓器、骨、軟骨、血液、および血管の癌を含め、固形腫瘍であっても、または血行性腫瘍であってもよい。癌は、原発性癌であっても、または転移癌であってもよい。特定の実施形態において、癌は、前立腺癌、肺癌、膵臓癌、乳癌、子宮頚癌および骨癌から選択される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、該方法は、オリゴマーと共に、抗感染症薬（例えば、抗生物質、殺アメーバ薬、抗真菌、抗原虫、抗マラリア、抗結核および抗ウイルスなどから選択されるもの）、化学療法薬（例えば、抗増殖／抗新生物薬、細胞増殖抑制剤、癌細胞侵襲を阻害する剤、増殖因子機能の阻害剤、抗血管新生剤、血管傷害薬などから選択されるもの）、および免疫療法剤（例えば、サイトカイン、サイトカイン発現性細胞、抗体など）から選択される少なくとも１つの補助剤を同時に投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、示したような様々な細胞株の明視野顕微鏡像を示す写真表示である。対照オリゴマーまたは非標的化オリゴマーのトランスフェクション後１６〜３６時間に画像を撮影した。非標的化オリゴマー化合物（「ＬＳＡ」）は、対照オリゴヌクレオチドトランスフェクト細胞と比較して密着性の喪失および低い集密性によって示されるように、細胞生存能力に重大な影響を有した。
【００３３】
【図２】図２は、１００ｎＭのｃｔｒｌ、Ｉｎ２Ｅ２ＬＳＡ、Ｉｎ３Ｅ３ＬＳＡ、Ｅ３Ｅ４ＬＳＡ、ＡＴＧＬＳＡオリゴマー化合物、および４種類すべてのＬＳＡ配列の混合物（ＨｅＬａ細胞のみ）でトランスフェクトしたＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞のウエスタンブロットを示す写真表示である。細胞はトランスフェクション後２４時間で採集された。ＤＮＡ損傷のマーカーとしてのγＨ２ＡＸ誘導がそうであったように、アポトーシスのマーカーとしてのＰＡＲＰ切断がＬＳＡトランスフェクト細胞で明らかであった。ｈＳＳＢ１タンパク質レベルは、ＬＳＡトランスフェクションに続いて様々な程度まで減少した。アクチンは添加対照として使用された。
【００３４】
【図３】図３は、ＬＳＡおよびＡＳＯでトランスフェクトされたＵ２ＯＳ細胞におけるアポトーシス誘発を示す写真表示である。ウエスタンブロットはＰＡＲＰ切断と相関するＨ２ＡＸのリン酸化を示し、毒性ＬＳＡ／ＡＳＯでトランスフェクトされた細胞におけるＤＮＡ損傷およびアポトーシスの誘発を確認した。ｈＳＳＢ１タンパク質レベルもまた、毒性ＬＳＡ／ＡＳＯのトランスフェクションに続いて激減した。アクチンは添加対照として使用された。
【００３５】
【図４】図４は、効果のないオリゴヌクレオチド（対照）と比較した場合に、最も効果的なＬＳＡ、ＡＴＧＬＳＡまたはＩｎ３ＬＳＡ（薬剤）用いたいくつかの癌細胞株の治療を示すグラフ表示である。細胞増殖は、７２時間にわたってＩｎｃｕＣｙｔｅによって計測された。
【００３６】
【図５】図５は、ＴＨＯＣ４およびｈＳＳＢ１のＥＭＳＡを示す写真表示およびグラフ表示である。１０ｎｍｏｌのＦＡＭ標識ＬＳＡ＿Ｉｎ３Ｅ３または陰性対照（Ｎｅｇ＿Ｃ）に対して、ＴＨＯＣ４（Ａ）およびｈＳＳＢ１（Ｂ）タンパク質の濃度増大を示すＥＭＳＡ。下方のバンドは遊離の非結合オリゴを表し、上方のバンドおよびスミア部はタンパク質に結合したオリゴを表し、（Ｃ）三連ＥＭＳＡ実験の定量化は、タンパク質に結合したオリゴのパーセンテージとして表された。精製したｈＳＳＢ１またはＴＨＯＣ４タンパク質は、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＩＧＥＰＡＬ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１００ｎｇ／μＬのＢＳＡから成るバッファー中で３７℃にて１５分間、１０ｎｍｏｌの標識オリゴと一緒にインキュベートされた。サンプルは、ＴＢＥバッファー中の１０％のＰＡＧＥゲルによる、８０Ｖ、４℃にて６０分間の電気泳動によって分離された。
【００３７】
【図６】図６は、ＡＳＯまたはＬＳＡ（１００ｎＭ）でトランスフェクトされたＨｅＬａ−ＢＣＬ２細胞におけるＧＦＰ発現アッセイを示すグラフ表示である。細胞死を引き起こすオリゴマー化合物（ＡＴＧＬＳＡ、Ｉｎ３ＬＳＡ、Ｉｎ３ＬＳＡＣＵなど）と低いＧＦＰ蛍光との間の相関関係が観察される。例えばＣＴＲＬ、ＮＥＧＣ、ＮＥＧＣ ＧＡＰ、ＮＥＧＣ ５０ｎＭ、Ｉｎ３ＬＳＡ＿ＣＴ５、ＯＰＥＮ＿ＬＳＡ１、ＣＤＣＡ３＿ＬＳＡ＿ＩＮ２Ｅ２などの非死滅誘発性オリゴヌクレオチドは、ＧＦＰプラスミドのみでトランスフェクトされた細胞（ＧＦＰ）と比較して、ＧＦＰ蛍光に顕著に影響しない。ＧＦＰ蛍光の低減は遺伝子発現の阻害を示し、ｍＲＮＡ移行の阻害と一致した。
【００３８】
【図７】図７は、ＩＮ３ＬＳＡオリゴマー化合物が、核からのポリＡｍＲＮＡ輸送を阻害することを示す写真表示である。ＨｅＬａ ＢＣＬ２細胞はＦＡＭ標識ＩＮ３ＬＳＡオリゴマー化合物またはＮＥＧＣオリゴヌクレオチドでトランスフェクトされ、そして、ｍＲＮＡ ＦＩＳＨがポストトランスフェクション後２４時間で行われた。ポリＡ ｍＲＮＡは赤色に染色され、そして、ＤＡＰＩは、核を染色するのに使用された。
【００３９】
【図８】図８は、最適なオリゴマー化合物の長さを決定するためのスクリーンの結果を示すグラフ表示である。オリゴマー化合物は、親配列の５’または３’末端からその時に１ｂｐが段階的に切断された。示されたデータは、アポトーシスのマーカーとしての凝縮した核を有する細胞のパーセンテージである（データは０〜１の等級、０＝最も低い死滅率、１＝最も高い死滅率、による各プレートの最小および最大スコアに対して正規化された）。
【００４０】
【図９】図９は、プリン含量が細胞死と相関することを示すグラフ表示である。細胞毒性のマーカー（核凝縮およびＰＩ陽性染色）を比較するドットプロット。データは、ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞の間で平均され、各プレートの最小および最大スコア、０の＝最低ＰＩ陽性、１＝最高ＰＩ陽性、に対して正規化された）。
【００４１】
【図１０】図１０は、４週間（１週間あたり２回の静脈内注射）にわたり非有効対照オリゴヌクレオチド（ｃｔｒｌ）およびＰＢＳ（黒色のドット）に対して細胞死誘発有効オリゴマー化合物ＩＮ３ＬＳＡ（Ｉｎ３、灰色の三角形）およびＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ、白色の菱形）で治療されたＳＣＩＤマウスの腫瘍増殖遅延を示すグラフ表示である。グラフは、１群あたり少なくとも７匹のマウスの腫瘍体積の平均した変化＋／−ＳＥＭを示す。星印は統計的に優位に減少した腫瘍体積を表す（ＡＮＯＶＡ、α＝０．０５、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。
【００４２】
【図１１】図１１は、４週間（１週間あたり２回の静脈内注射）にわたり非有効対照オリゴヌクレオチド（ｃｔｒｌ）およびＰＢＳ（黒色のドット）に対してオリゴマー化合物ＩＮ３ＬＳＡ（Ｉｎ３、灰色の三角形）およびＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ、白色の菱形）で治療されたＳＣＩＤマウスの体重変動を示すグラフ表示である。グラフは、１群あたり少なくとも７匹のマウスの平均体重変動＋／−ＳＥＭを表す。黒色の矢印は治療の開始を示す。
【００４３】
【図１２】図１２は、４週間の治療後に対照およびＰＢＳと比較して、ＩＮ３ＬＳＡ（Ｉｎ３（マウス番号１１０Ｈ−１、１１９Ｊ−２および８４Ａ−３）、左側のパネル）およびＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ、マウス番号１１４Ｉ−１、１２０Ｊ−３、９１Ｃ−２、右側のパネル）について腫瘍が最も低減された３匹のマウスについての体重変動を示すグラフ表示である。
【００４４】
【図１３】図１３は、Ｃｙ５．５標識Ｉｎ３ＬＳＡオリゴマー化合物からの経時的な腫瘍部位における蛍光シグナルを示すグラフ表示である。静脈内（ｉ．ｖ．）送達が腫瘍部位における強力かつ永続的なシグナルを示す一方で、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射後のシグナルは腫瘍部位において検出できない。
【００４５】
【図１４】図１４は、ＩＮ３ＬＳＡを投与したマウスの動物全体の画像化を示す写真表示である。樹立した腫瘍（体積〜９００ｍｍ３）を有する１匹のマウスには、２０ｍｇ／ｋｇの用量にてＣｙ５．５標識ＩＮ３ＬＳＡの単回静脈内注射が投与された。画像は、注射前の動物、ならびにオリゴマー化合物に関連するシグナルが明確に観察される注射後５日を示す。注射後８日目に摘出された腫瘍もまた示されている。
【００４６】
【図１５】図１５は、ホスホロチオアート（ＰＳ）もしくはホスホジエステル（ＰＤ）化学物質のいずれかによる５ｎＭのＦＡＭ標識ＬＳＡ＿Ｉｎ３Ｅ３配列、またはホスホロチオアート化学物質による陰性対照配列（Ｎｅｇ＿Ｃ）に対するｈＳＳＢ１タンパク質の濃度増大を示すｈＳＳＢ１ ＥＭＳＡのグラフ表示である。グラフは少なくとも三連実験における定量化を表し、タンパク質に結合したオリゴマー化合物の画分として表された。精製タンパク質は、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＫＣｌ、０．０１％のＩＧＥＰＡＬ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および５０ｎｇ／μＬのＢＳＡから成るバッファー中、３７℃にて１５分間、５ｎＭの標識オリゴマー化合物と共にインキュベートされた。サンプルは、ＴＢＥバッファー中の１５％のＰＡＧＥゲルによる、８０Ｖ、４℃にて１２０分間の電気泳動によって分離された。
【００４７】
【図１６】図１６は、ホスホロチオアート化学物質による５ｎＭのＦＡＭ標識ＬＳＡ＿Ｉｎ３Ｅ３配列または陰性対照配列（Ｎｅｇ＿Ｃ）に対するｈＳＳＢ２タンパク質の濃度増大に示す単回ＥＭＳＡのグラフ表示である。グラフはタンパク質に結合したオリゴの画分を表す。精製タンパク質は、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＫＣｌ、０．０１％のＩＧＥＰＡＬ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および５０ｎｇ／μＬのＢＳＡから成るバッファー中、３７℃にて１５分間、５ｎＭの標識オリゴと共にインキュベートされた。サンプルは、ＴＢＥバッファー中の１５％のＰＡＧＥゲルにより、８０Ｖ、４℃にて１２０分間の電気泳動によって分離された。
【００４８】
【図１７】図１７は、オリゴマー化合物に結合するｈＳＳＢ１の分子シミュレーションが、より高いｈＳＳＢ１結合親和力を有する配列をスクリーニングするのに使用できることを例示する図解およびグラフ表示である。Ａ．黄色のＡＴＧＬＳＡオリゴマーおよび青色のその無修飾ＲＮＡ配列。Ｂ．ピンク色のＮＥＧＣオリゴマーおよび青色のその無修飾ＲＮＡ配列。Ｃ．２００〜５００ｐｓの安定立体配座から作り出される平均ＳＳＢオリゴマー化合物結合エネルギー。Ｄ．１ｎｓにわたるその無修飾ＲＮＡヌクレオチド配列に対するそれぞれのオリゴの結合エネルギー。  結合エネルギーは、Ｅ＿結合＝Ｅ（複合体）−［Ｅ（受容体）＋Ｅ（リガンド）］、のように計算された。
【００４９】
【図１８】図１８は、ＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）オリゴマー化合物が肺癌異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を抑制することを示すグラフ表示である。Ｈ４６０肺癌皮下腫瘍を担持する雄ＳＣＩＤマウスは、静脈内尾静脈／眼窩後方注射によって４週間にわたり週２回、８０ｍｇ／ｋｇにて溶媒対照ＰＢＳ（白抜きのドット、ｎ＝７）またはＡＴＧＬＳＡオリゴマー（塗りつぶし三角形、ｎ＝８）で処理された。グラフは、処理経過中の腫瘍体積の変化の平均パーセンテージ（＋／−ｓｅｍ）を示す、＊＊＊＊：二元ＡＮＯＶＡにおいてＰ値＜０．０００１。
【００５０】
【図１９】図１９は、対照ＰＢＳまたはＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）オリゴマー化合物で処理された親肺Ｈ４６０異種移植の生物発光画像を示す写真表示である。癌細胞ルシフェラーゼ活性からのマウス腫瘍生物発光シグナルは、開始前および処理１６日時点で計測された。雄ＳＣＩＤは、ＩＶＩＳシステムを用いたシグナル取得の１５分前に２００μＬのＤ−ルシフェリンの腹腔内注射を受けた。３匹の代表的なマウスが、処理前（上のパネル）および１６日の時点（下のパネル）の、ＰＢＳ処理群（Ａ、ＢおよびＣ）、およびＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）処理群（Ｄ、ＥおよびＦ）について示されている。熱シグナルは発光等級を表す。
【００５１】
【図２０】図２０は、対照ＰＢＳ対ＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）処理マウス（親Ｈ４６０腫瘍モデル）の体重のモニタリングを示すグラフ表示である。各動物は、試験経過中、週２回体重を計測された。グラフは、ＰＢＳ処理コホート（白抜きのドット）およびＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）処理コホート（黒色の三角形）について、処理初日と比較した体重変動の平均パーセンテージ（＋／−ｓｅｍ）を表す。
【００５２】
【図２１】図２１は、ＡＴＧＬＳＡオリゴマー化合物での処理後の親およびシスプラチン抵抗性肺Ｈ４６０癌細胞増殖を示すグラフ表示である。Ｈ４６０親（Ｈ４６０Ｐ、ドット）細胞およびシスプラチン抵抗性（Ｈ４６０Ｒ、正方形）細胞は、対照ＰＢＳ（白抜き記号）対１００ｎＭのＡＴＧＬＳＡ（塗りつぶし記号）で処理された。増殖比は、最初の細胞集密性（＋／−ｓｅｍ）に対する報告された２４および４８時間の細胞集密性によって計算される。
【００５３】
【図２２】図２２は、ＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）オリゴマー化合物がシスプラチン抵抗性肺癌異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を抑制することを示すグラフ表示である。皮下Ｈ４６０シスプラチン抵抗性腫瘍を担持する雄ＳＣＩＤマウスは、静脈内尾静脈／眼窩後方注射によって４週間にわたり週２回、８０ｍｇ／ｋｇにて溶媒対照ＰＢＳ（白抜きのドット、ｎ＝６）またはＡＴＧＬＳＡオリゴマー（ＡＴＧ、黒色の三角形、ｎ＝６）で処理された。グラフは、処理経過中の腫瘍体積の変化の平均パーセンテージ（＋／−ｓｅｍ）を示す、＊＊：二元ＡＮＯＶＡにおいてＰ値＜０．０１。
【００５４】
【図２３】図２３は、対照ＰＢＳまたはＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）オリゴマー化合物で処理されたシスプラチン抵抗性肺Ｈ４６０異種移植の生物発光画像を示す写真表示である。癌細胞ルシフェラーゼ活性からのマウス腫瘍生物発光シグナルは、処理前および処理１８日時点で計測された。雄ＳＣＩＤは、ＩＶＩＳシステムを用いたシグナル取得の１５分前に２００μＬのＤ−ルシフェリンの腹腔内注射を受けた。３匹の代表的なマウスが、処理前（上のパネル）および１６日の時点（下のパネル）の、ＰＢＳ処理群（Ａ、ＢおよびＣ）、およびＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）処理群（Ｄ、ＥおよびＦ）について示されている。熱シグナルは発光等級を表す。
【００５５】
【図２４】図２４は、シスプラチン抵抗性Ｈ４６０腫瘍モデルの対照ＰＢＳ対ＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）処理マウスの体重のモニタリングを示すグラフ表示である。各動物は、試験経過中、週２回体重を計測された。グラフは、ＰＢＳ処理コホート（白抜きのドット）およびＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）処理コホート（黒色の三角形）について、処理初日と比較した体重変動の平均パーセンテージ（＋／−ｓｅｍ）を表す。
【００５６】
【図２５】図２５は、シスプラチン感受性Ｈ４６０肺異種移植に対するＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）処理効果の長期評価を示すカプラン−マイヤーグラフである。雄ＳＣＩＤマウスは、ＡＴＧＬＳＡ（８０ｍｇ／ｋｇ）での処理開始からそれらの腫瘍が１０００ｍｍ３（カリパス測定によって測定）の最終的な最大体積に達するまで観察された。＊＊：ランク−ログ解析においてＰ値＜０．０１。
【００５７】
【図２６】図２６は、シスプラチン抵抗性Ｈ４６０肺異種移植に対するＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）処理効果の長期評価を示すカプラン−マイヤーグラフである。雄ＳＣＩＤマウスは、ＡＴＧＬＳＡ（８０ｍｇ／ｋｇ）での処理開始からそれらの腫瘍が１０００ｍｍ３（カリパス測定によって測定）の最終的な最大体積に達するまで観察された。
【００５８】
【図２７】図２７は、ＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）オリゴマー化合物が肺腫瘍異種移植モデルにおいて腫瘍増殖を低減することを示すグラフ表示である。皮下腫瘍を担持する雄ＳＣＩＤマウスは、３週間にわたってＡＴＧＬＳＡオリゴマー（ＡＴＧ、緑色の三角形、ｎ＝５）、シスプラチン（黒色の菱形）またはＡＴＧＬＳＡ＋シスプラチンの併用（赤色の正方形）で処理された（破線）。各群の処理は、４週目に切り換えられた：併用動物は対照ビヒクルＰＢＳで処理され、ＡＴＧＬＳＡ動物はシスプラチンで処理され、そして、シスプラチン動物はＡＴＧＬＳＡで処理された。グラフは、処理経過中の、腫瘍体積の変化の平均パーセンテージ（＋／−ｓｅｍ）を示す、＊＊＊＊：二元ＡＮＯＶＡにおいてＰ値＜０．０００１。
【００５９】
【図２８】図２８は、Ｈ４６０腫瘍モデルにおける対照ＰＢＳ、ＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）、シスプラチン、およびＡＴＧＬＳＡ＋シスプラチン併用（Ｃｏｍｂｏ）処理マウスの体重のモニタリングを示すグラフ表示である。各動物は、試験経過中、週２回体重を計測された。グラフは、ＰＢＳ処理コホート（白抜きの青色ドット）、ＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）その後シスプラチン処理コホート（緑色の三角形）、シスプラチンその後ＡＴＧＬＳＡ処理コホート（黒色の菱形）および併用ＡＴＧＬＳＡ＋シスプラチン（Ｃｏｍｂｏ）その後ＰＢＳ処理コホート（赤色の正方形）について、処理初日と比較した体重変動の平均パーセンテージ（＋／−ｓｅｍ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
発明の詳細な説明
１．定義
別段の定義がない限り、本明細書中に使用される技術および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載したものと類似または同等の任意の方法および材料が本発明の実施または試験に使用できるが、好ましい方法および材料が記載されている。本発明の目的に関して、次の用語は以下に規定される。
【００６１】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、１または複数（すなわち、少なくとも１）の冠詞の文法的対象を指すために本明細書中に使用される。一例として、「要素（an element）」とは１つの要素または複数の要素を意味する。
【００６２】
本明細書中に使用される場合「および／または」は、関連記載されたアイテムの１もしくは複数のありとあらゆる可能な組み合わせ、ならびに選択（ｏｒ）と解釈されるときには、組み合わせの欠如を指し、かつ、包含する。
【００６３】
さらに、用語「約」は、例えば、量、用量、時間、温度、活性、レベル、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、重さ、位置、長さなどの計測可能な値を指すときに本明細書中で使用される場合、特定の量、用量、時間、温度、活性、レベル、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重さ、位置、長さなどの±１５％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または±０．１％の変化であっても包含することを意味する。
【００６４】
値域が提供される場合、別段文脈が明確に命令しない限り、下限の単位の十分の一までの、その範囲の上限と下限の間、の途中に存在するそれぞれ値、ならびに述べられた範囲内のその他の述べられたまたは途中に存在する値が、本発明の中に包含されると理解される。これらのより小さい範囲の上下限はより小さい範囲内に独立に含まれてもよく、それもまた本発明中に包含され、述べられた範囲におけるあらゆる特定の除外制限の対象となる。述べられた範囲が制限のうちの一方またはその両方を含む場合には、これらの制限のいずれかまたはその両方を除く範囲もまた本発明の中に含まれる。
【００６５】
ある剤は、その剤が細胞膜を越える受動拡散以外の機構で細胞に入ることができるときに、「哺乳動物細胞によって能動的に取り込まれる」。その剤は、例えば、ＡＴＰ依存性輸送機構により哺乳動物細胞膜を越える剤の輸送を指す「能動輸送」によって、またはその後、膜を越える結合した剤の輸送を容易にする輸送タンパク質への剤の結合を必要とする輸送機構による細胞膜を越えるアンチセンス剤の輸送を指す「促進輸送」によって、輸送されてもよい。能動および促進輸送に関して、本発明のオリゴマーは、裸であっても、またはエンドサイトーシス機構によって細胞内に取り込まれることができるカチオン脂質またはリポソームと複合したアニオン骨格を有する剤などの、複合形態で処方されてもよい。該オリゴマーはまた、記載のように目標宿主細胞内への輸送を容易にするために、例えば、その５’または３’末端にて、高アルギニンペプチド、例えば、ＨＩＶ−ＴＡＴタンパク質、またはポリアルギニンの一部に結合されてもよい（Moulton et al., Bioconjug Chem, 2004, 15(2): 290-299; Nelson et al., Bioconjug Chem, 2005, 16(4): 959-966）。該化合物はまた、アンチセンス活性および／または細胞内取り込みを高めるために１若しくは複数のカチオン性連結を有してもよい。
【００６６】
「同時の投与」、「同時に投与すること」または「同時投与すること」などの用語は、２以上の活性成分を含む単一の組成物の投与、あるいは、斯かる活性成分すべてが単一の組成物として投与されたときに得られるものと有効な結果が同等であるのに十分な短期間内の、同時期に起こる、同時、または連続した、別々の組成物としてのおよび／または別々の経路によって送達されるそれぞれ活性成分の投与を指す。「同時」とは、活性物質が実質的に同時期に、そして好ましくは、同じ製剤で一緒に投与されることが意味されている。「同時期に起こる」ろは、活性物質が近い時間内に投与されることを意味する、例えば、一方の剤が他方の前後約１分以内〜約１日以内に投与される。あらゆる同時期の時間が有用である。しかしながら、同時に投与しない場合、剤は約１分以内〜約８時間以内、そして好適には、約１時間〜約４時間未満以内に投与されることが多い。同時期に投与されるとき、剤は好適には、対象の同じ部位に投与される。「同じ部位」という用語は、正確な位置を含むが、約０．５〜約１５センチメートル以内、好ましくは約０．５〜約５センチメートル以内であり得る。「別々」という用語は、本明細書中で使用される場合、剤が間隔、例えば、約１日〜数週間または数カ月の間隔をおいて投与されることを意味する。活性物質は、どちらの順で投与されてもよい。「連続して」という用語は、本明細書中で使用される場合、剤が連続して、例えば、数分、数、時間、数日または数週間の（単数もしくは複数の）間隔をおいて投与されることを意味する。適当であるなら、活性物質を一定の反復サイクルで投与してもよい。
【００６７】
本明細書中に使用される場合、「親和性」という用語は２つの分子の非ランダム相互作用を指す。親和性、または相互作用の強度は、解離定数（ＫＤ）として量的に表現される。結合親和性は、標準的な技術を使用して測定できる。特定の実施形態において、本願発明のオリゴマーは標的分子（例えば、ＴＨＯＣ４またはＳＳＢ１）に対して、対照オリゴマーより高い親和性を有し、そして、その結果、対照オリゴマーと比べて標的分子に優先的に結合する。例えば、本発明のオリゴマー化合物は、１０ｎＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭのＮａＣｌを含有する水溶液中、３７℃にて、約５０ｎＭ以下のＫＤにてＴＨＯＣ４（例えば、ｈＴＨＯＣ４）に結合し、および／または約３ｎＭ以下のＫＤにてＳＳＢ１（例えば、ｈＳＳＢ１）に結合する。
【００６８】
「アルキル」という用語、本明細書中に使用される場合、最大２４の炭素原子を含む、飽和直鎖または分岐炭化水素基を指す。アルキル基の例としては、これだけに限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｎ−ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシルなどが挙げられる。アルキル基は、より典型的には、１〜約６の炭素原子、より典型的には１〜約３の炭素原子を含み、そして、１〜約２の炭素原子であることがより好ましい。アルキル基とは、本明細書中で使用される場合、任意選択で、１若しくは複数のさらなる置換基を含んでもよい。
【００６９】
「補助剤」という用語は、所望の薬理学的および／または生理的作用を引き起こす化合物を含む。該用語はまた、これだけに限定されるものではないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、類似体などを含めた、本明細書中で特別に言及されたそれらの化合物の医薬的に許容され、かつ、薬理学的有効成分を包含する。上記用語が使用されるときには、これが活性物質そのもの、ならびに医薬的に許容される、薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝産物、類似体などを含むことを理解すべきである。「補助剤」という用語は、狭く解釈されるべきではないが、小分子、例えばペプチドや、ポリペプチドやタンパク質などのタンパク様分子、ならびにそれらを含む組成物および、例えば、ＲＮＡや、ＤＮＡや、その模倣体や化学類似体などの遺伝分子、ならびに細胞剤にまで広がる。「補助剤」という用語は、ポリペプチド、ならびにそのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを産生および分泌できる細胞を含む。例えば、該細胞は、構築物が導入された腫瘍細胞であってもよく、そしてそれは、例えば、Ｂ７．１または４−１ＢＢＬなどの免疫賦活分子を発現する。よって、「補助剤」という用語は、さまざまな細胞における発現および分泌のための、例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター、発現ベクターまたはプラスミドなどのベクターを含めた核酸構築物にまで広がる。
【００７０】
「アンチセンス」という用語は、そのヌクレオチド残基の配列が核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）二本鎖のセンス鎖のデオキシヌクレオチド残基の配列と関連して逆の５’から３’の方向で存在するヌクレオチド配列を指す。ＤＮＡ二本鎖の「センス鎖」とは、天然の状態にある細胞によって「センスｍＲＮＡ」に転写されるＤＮＡ二本鎖の鎖を指す。よって「アンチセンス」配列は、ＤＮＡ二本鎖のコード鎖に対して典型的には実質的に相補的であり、ＤＮＡ二本鎖に非コード鎖に対して相同性を有する。
【００７１】
「アンチセンスオリゴマー」および「アンチセンス化合物」という用語は、核酸塩基の標的化配列、およびアンチセンスオリゴマーがワトソン−クリック塩基対合を含めた塩基対合によって標的核酸配列にハイブリダイズして、標的核酸配列内にＲＮＡ：オリゴマーまたはＤＮＡ：オリゴマーヘテロ二量体を形成できるようにするサブユニット−対−サブユニット骨格を有する化合物を指すために、本明細書中で互換的に使用される。アンチセンスオリゴマーは、対応する標的核酸配列の隣接塩基への水素結合に有効な、骨格によって支持されたプリンおよびピリミジン複素環式塩基の配列を典型的に含む。該骨格は、斯かる水素結合を可能にする位置にてプリンおよびピリミジン複素環式塩基を支持するサブユニット骨格部分から典型的には構成される。これらの骨格部分は、１〜３原子の長さのリン含有連結によって結びつけられた長さが５〜７原子の環状部分である。アンチセンスオリゴマーは、典型的には、例えば、ｍＲＮＡやｍｉＲＮＡおよびポリペプチドなどの核酸発現産物を含めた遺伝子発現産物の合成を妨げる。一般的に、アンチセンスオリゴマーの標的化配列は、標的遺伝子（例えば、ＤＮＡなどのポリヌクレオチド、ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体を含む））分子の「センス」鎖に相当する標的配列に結合する。アンチセンスオリゴマーは、例えば、イントロン、エクソン、５’、または３’非翻訳領域を含めた標的遺伝子または核酸発現産物の任意の領域に結合する。例えば、立体障害遮断薬として動作するアンチセンスオリゴマーは、核酸標的分子のスプライス部位、５’非翻訳領域、または開始領域内に優先的に結合する。ＲＮａｓｅＨを活性化することによって動作するアンチセンスオリゴマーは、標的核酸のイントロン、エクソン、５’非翻訳領域、または３’非翻訳領域内に好ましくは結合する。
【００７２】
「キャップ構造」または「端末のキャップ部分」という用語は、本明細書中に使用される場合、オリゴマー化合物の一方またはその両方の末端に取り付けられ得る化学修飾を指す。
【００７３】
本明細書中に使用される場合、オリゴマー化合物（例えば、連結したヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、または核酸）に関する「相補的」および「相補性」は、核酸塩基相補性によって参照核酸配列にハイブリダイズする斯かるオリゴマー化合物またはその領域の能力を意味する。本明細書中に使用される場合、「核酸塩基相補性」または「相補性」は、核酸塩基に関するとき、典型的にはワトソン−クリック塩基対合によって、別の核酸塩基と塩基対合できる核酸塩基を意味する。例えば、オリゴマー化合物の特定の位置の核酸塩基が標的核酸の特定の位置にて核酸塩基と水素結合できるのであれば、そのとき、オリゴマー化合物と標的核酸との間を結合する水素の位置は、その核酸塩基対で相補的であると考えられる。よって、修飾核酸塩基は、対応核酸塩基と対合する能力を維持し、その結果、核酸塩基対合または核酸塩基相補性が依然として可能である。対照的に、「非相補的」または「ミスマッチ」核酸塩基は、互いに水素結合を形成しないか、またはそうでなければ「塩基対合できない」一対の核酸塩基を指す。「相補的」または「相補性」という用語はまた、塩基対合によって許容される塩および温度条件下での核酸の天然の結合を指す。２つの一本鎖分子（本明細書中では「核酸塩基ポリマー」とも呼ばれる）の間の相補性は、核酸塩基の塩基対の一部のみである「部分的」であってもよく、またはそれは全相補性が分子の完全長に沿って、または一本鎖分子の一部もしくは領域に沿って一本鎖分子間に存在するときには、「完全」であってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間にハイブリダイゼーションの効率および強度に顕著な影響を与える。「相補的」という用語は、「完全に相補的」、「実質的に相補的」または「部分的に相補的」である核酸配列をその範囲内に含む。本明細書中に使用される場合、「完全に相補的」という用語は、特定の核酸塩基のオリゴマーまたはポリマーの中の核酸塩基の１００％が、別の核酸塩基のオリゴマーまたはポリマーとの塩基対合を関与できることを示す。本明細書中に使用される場合、「実質的に相補的」という用語またはその文法的な同等物は、特定の核酸塩基のオリゴマーまたはポリマーの中の核酸塩基のうちの９５％、９６％、９７％、９８％または９９％超が、別の核酸塩基のオリゴマーまたはポリマーとの塩基対合に関与できることを示す。この用語はまた、２つの核酸配列が、例えば、本明細書中に規定されるような、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできることも意味する。本明細書中に使用される場合、「部分的に相補的」という用語またはその文法的な同等物は、特定の核酸塩基のオリゴマーまたはポリマーの核酸塩基のうちの約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下が別の核酸塩基のオリゴマーまたはポリマーとの塩基対合に関与できることを示す。この用語はまた、２つの核酸配列が、例えば、本明細書中に規定されるような、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズできないが、例えば、本明細書中に規定されるような、低または中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができるかまたはできないことも意味する。
【００７４】
この明細書をとおして、別段文脈で求められない限り、「含む（単数形）」「含む（複数形）」および「含むこと」という語は、述べられたステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の包含を意味するが、その他のステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の除外を意味するものではないと理解される。よって、「含むこと」などの用語の使用は、列挙された要素は必要とされるかまたは必須であるが、他の要素は任意選択であるので、存在してもしなくともよいことを示す。「から成る」とは、「から成る」という語句に続くものを含み、かつそれに限定することを意味する。よって、「から成る」という語句は、列挙された要素が必要とされるかまたは必須であり、他のどんな要素も存在してはいけないことを示す。「から実質的に成る」とは、その語句の後に列挙された任意の要素を含み、かつ、列挙された要素に関する開示で指定された活性または作用を妨げないかまたは貢献する他の要素に制限されることを意味する。よって、「から実質的に成る」という語句は、列挙された要素が必要とされるかまたは必須であるが、他の要素は任意選択であるので、それらが列挙された要素の活性または作用に影響するか否かによって、依存してもしなくてもよいことを示す。
【００７５】
本明細書中に使用される場合、核酸配列との関連において「隣接」という用語は、配列が単独の配列であり、（単数もしくは複数の）どんな介在配列によっても中断されていないことを意味する。
【００７６】
「対応する」または「対応すること」とは、参照核酸配列に対して実質的な配列同一性を（例えば、参照核酸配列の全部または一部に対して、少なくとも約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、９７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％または最大１００％の配列同一性）示す核酸配列を意味する。
【００７７】
「有効量」とは、病状の治療または予防との関連において、その病状に関して、症状を被ることの予防、斯かる症状の抑制、および／または既存の症状の治療に有効である斯かる治療または予防を必要とした個体に、ある量の剤または組成物を、単回投与または一連の一部として、投与することを意味する。有効量は、治療される個体の健康および身体の状態、治療されるべき個体の分類群、組成物の処方、医療的状況の評価、および他の関連要素に大きく依存する。その量が所定のトライアルによって決定できる比較的広範囲に収まると予想される。
【００７８】
「発現」という用語は遺伝子産物の生合成を指す。例えば、コード配列の場合では、発現は、ｍＲＮＡへのコード配列の転写および１若しくは複数のポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を伴う。逆に、非コード配列の発現は、転写産物への非コード配列の転写のみを伴う。
【００７９】
本明細書中に使用される場合、「ギャップマー」という用語は、中心領域（「ギャップ」）と中心領域のいずれかの端の領域（「ウイング」）を含むキメラオリゴマー化合物を指し、ここで、該ギャップはそれぞれのウイングのものと異なった少なくとも１つの修飾を含む。斯かる修飾としては、核酸塩基、単量体の連結、および糖修飾、ならびに修飾の不存在（無修飾）が挙げられる。よって、特定の実施形態において、それぞれのウイングのヌクレオシド連結はギャップのヌクレオシド連結と異なっている。特定の実施形態において、ギャップのヌクレオチドは無修飾であり、ウイングのヌクレオチドは修飾されている。特定の実施形態において、各ウイングの修飾は同じである。特定の実施形態において、あるウイングの修飾はもう片方のウイングの修飾と異なっている。
【００８０】
本明細書中に使用される場合、「遺伝子」という用語は、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを作り出すのに使用できる核酸分子を指す。遺伝子は、機能性タンパク質を作り出すのに使用できても、またはそうでなくてもよい。遺伝子は、コード領域および非コード領域（例えば、イントロン、調節要素（プロモーター、エンハンサー、終止配列、５’、および３’非翻訳領域を含む））の両方を含み得る。遺伝子が「単離」され得るとは、その自然状態で核酸分子と関連して通常見られる成分から実質的または本質的に遊離している核酸分子が意味される。斯かる成分としては、他の細胞物質、遺伝子組み換え製造からの培地、および／または核酸分子を化学合成する際に使用される様々な化学物質が挙げられる。「遺伝子」に対する言及はまた、連続した配列（よって、本明細書中に規定される隣接核酸自体を規定する）または非隣接配列（よって、本明細書中に規定される非隣接核酸自体を規定する）を有する遺伝子に対する言及もその範囲内に含む。特定の実施形態において、「遺伝子」という用語は、その範囲内にオープンリーディングフレームをコードする特定のポリペプチド、イントロン、発現調節に関与する隣接する５’および３’非コードヌクレオチド配列を含む。この点に関して、遺伝子は、例えば、所定の遺伝子に天然で関連しているプロモーター、エンハンサー、終止、および／またはポリアデニル化シグナルなどの制御配列、または異種制御配列をさらに含んでもよい。遺伝子配列は、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡまたはその断片であってもよい。遺伝子は、染色体外での維持または宿主への導入のために適当なベクターに導入されてもよい。
【００８１】
「ゲノム」は、本明細書中で使用される場合、遺伝子およびＤＮＡの非コード配列、例えば、組み立てられたおよび／または再結合された（単数もしくは複数の）遺伝子を含めた、直鎖ポリヌクレオチドなどの染色体または非染色体遺伝要素のいずれかによって表された、生物体の遺伝情報それ自体を指す。よって、「ゲノム」という用語は、核ＤＮＡ成分、染色体もしくは染色体外ＤＮＡ、ならびに細胞質領域（例えば、ミトコンドリアＤＮＡ）を含めた、生物体の全ＤＮＡ成分を含むことを意図する。
【００８２】
本明細書中で使用される場合、「複素環式塩基部分」という用語は、本発明によって包含されるヌクレオシドを形成するのに使用される核酸塩基および修飾または置換核酸塩基を指す。「複素環式塩基部分」という用語は、例えば、天然のプリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）などの無修飾の核酸塩基を含む。該用語はまた、これだけに限定されるものではないが、例えば、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチレニルシトシン、２−アミノおよび２−フルオロアデニン、２−プロピルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオシトシン、ウラシル、チミン、３−デアザグアニンおよびアデニン、４−チオウラシル、５−ウラシル（偽ウラシル）、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、ならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、６−メチルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、７−メチルアデニンおよびグアニン、７−デアザアデニンおよびグアニン、８−ハロ、８−アミノ、８−アザ、８−チオ、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、無差別塩基、サイズ拡張塩基、そして、本明細書中に規定されるフッ化塩基などの合成および天然核酸塩基を含めた、あらゆる様式の修飾または置換核酸塩基を含むことを意図する。さらなる修飾核酸塩基としては、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５、４−ｂ］［１、４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）およびフェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５、４−ｂ］［１、４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環式ピリミジンが挙げられる。
【００８３】
本明細書中で使用される場合、「相同体」または「相同の」という用語は、パーセントの配列同一性に関する２以上の核酸配列の間の類似性のレベルを指す。一般的に、相同体、相同性配列または相同性を有する配列とは、互いに９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超の配列同一性を示す核酸配列を指す。代わりにまたは加えて、相同体、相同性配列または相同性を有する配列は、互いに、例えば、本明細書中に規定される、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする核酸配列を指す。対照的に、「非相同体」、「非相同的配列」または「相同性を欠いている配列」などの用語は、互いに９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下の配列同一性を示す核酸配列を指す。代わりにまたは加えて、「非相同体」、「非相同的配列」または「相同性を欠いている配列」などは、本明細書中に規定される高ストリンジェンシー条件下で互いにハイブリダイズしないが、中程度または低ストリンジェンシー条件下で互いにハイブリダイズすることがある核酸配列を指す。
【００８４】
「ハイブリダイゼーション」は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを生じる相補的なヌクレオチド配列の対合を表すために本明細書中で使用される。相補的な核酸塩基配列は、塩基対合則によって関連づけられるそれらの配列である。ＤＮＡでは、ＡはＴと対合し、そして、ＣはＧと対合する。ＲＮＡでは、ＵはＡと対合し、そして、ＣはＧと対合する。これに関して、「マッチ」および「ミスマッチ」という用語は、本明細書中で使用される場合、相補的な核酸鎖の対合するヌクレオチドのハイブリダイゼーションの可能性を指す。マッチしたヌクレオチドは、例えば、前記のような古典的なＡ−ＴおよびＧ−Ｃ塩基対など、効率的にハイブリダイズする。ミスマッチは、効率的にハイブリダイズしないヌクレオチドの他の組み合わせである。本発明において、対合の好ましい機構は水素結合を伴い、そしてそれは、オリゴマー化合物の鎖の相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（核酸塩基）の間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であってもよい。例えば、アデニンとチミンは、水素結合の形成によって対合される相補的な核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、当業者に知られているように、異なった状況で起こり得る。
【００８５】
本明細書中に使用される場合、「インビトロ」という用語は、生物体（例えば、動物、植物、または微生物）内ではなく、人工環境、例えば、試験管または反応器内、細胞培養内、ペトリザラ内などで起こる事象を指す。
【００８６】
本明細書中に使用される場合、「インビボ」という用語は、生物体（例えば、動物、植物、微生物、細胞またはその組織）内で起こる事象を指す。
【００８７】
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオシド間結合」とは、隣接するヌクレオシドの間の共有結合を指す。ヌクレオシド間結合は、本発明のオリゴマーを含めた、核酸分子の骨格を構成する。
【００８８】
哺乳動物細胞、哺乳動物の部分、哺乳動物の器官、または哺乳動物全体を含めた宿主細胞との関連において、「導入すること」は、核酸分子（例えば、本明細書中に記載したオリゴヌクレオチド）を、該核酸分子が哺乳動物細胞、哺乳動物の部分、哺乳動物の器官、または哺乳動物全体の内部に近づくことができるような様式で、哺乳動物細胞、哺乳動物の部分、哺乳動物の器官、または哺乳動物全体と接触させることを意味する。
【００８９】
「修飾糖」という用語は、本明細書中に使用される場合、天然糖からの置換または変化を指し、本発明のヌクレオシドおよびオリゴマー化合物で使用される天然リボフラノースおよびデオキシリボフラノース糖の修飾を包含する。修飾糖は、複素環式塩基部分または修飾複素環式塩基部分が、通常、適当な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持されるヌクレオシドを含む。斯かる「修飾糖」は、例えば、高められた細胞内取り込みや、核酸標的に対する高められた親和性や、ヌクレアーゼ分解に対して増強された安定性など、それらがオリゴマー化合物に与えられる有利な特性のため、天然形態を超えることが所望されることが多い。「修飾糖」という用語は、これだけに限定されるものではないが、環状原子に対する修飾および／または置換基の付加を含めた当該技術分野で知られているあらゆる様式の修飾を含むことを意図する。
【００９０】
本明細書中に使用される場合、「核酸塩基」という用語はヌクレオシドの塩基部分を指す。核酸塩基は、典型的には複素環基であり、別の核酸の塩基と水素結合できる任意の原子または原子団も含んでもよい。「核酸塩基」という用語は、天然の核酸塩基と修飾核酸塩基を包含する。核酸塩基（または、塩基）修飾または置換は、天然または合成の非修飾核酸塩基と、構造的に区別できる、そのうえ、機能上交換可能である。天然および修飾核酸塩基の両方が水素結合に参加できる。斯かる核酸塩基修飾は、ヌクレアーゼ安定性、結合親和力または一部の他の有益な生物的性質をアンチセンス化合物に与え得る。修飾核酸塩基としては、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）などの合成および天然の核酸塩基が挙げられる。５−メチルシトシン置換を含めた特定の核酸塩基置換は、特に標的核酸に対するアンチセンス化合物の結合親和力を増強するのに有用である。例えば、５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２℃増強することが示された（Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278）。追加の無修飾核酸塩基としては、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルおよびアデニンとグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシルとシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンとチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンとグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルとシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンが挙げられる。複素環式塩基部分としては、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環化合物に置換されたもの、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンも挙げることができる。特にアンチセンス化合物の結合親和力を増強するのに有用な核酸塩基としては、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含めた、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンが挙げられる。
【００９１】
「ヌクレオシド」という用語は、本明細書中に使用される場合、塩基−糖の組み合わせを指す。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基部分である。斯かる複素環核酸塩基の２つの最も一般的なクラスはプリンとピリミジンである。「ヌクレオチド」は、そのヌクレオシドの糖部分に共有結合にて連結されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドに関しては、リン酸基が糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれかに連結され得る。オリゴヌクレオチド構造の中では、リン酸基は一般的にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間結合を形成するか、または糖環、オリゴヌクレオチドの骨格と連結しているといわれている。オリゴヌクレオチドを形成する際に、リン酸基は、隣接するヌクレオシドと互いに共有結合にて連結して、直鎖ポリマー化合物を形成する。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常のヌクレオシド間結合は、３’から５’へのホスホジエステル結合である。本願発明との関連において、「オリゴヌクレオシド」という用語は、リン原子を含まないヌクレオシド間結合によってつながれるヌクレオシドの配列を指す。
【００９２】
「ＯＢ折り畳みタンパク質」という用語は、例えば（Murzin, 1993, Embo J 12: 861-86）および（Arcus, 2002, Curr Opin Struct Biol 12: 794-801）で記載されたＯＢ折り畳み位相を有するドメインを含むかまたはそれらから成り、ｓｓＤＮＡへの結合を促進する任意のポリペプチドを指す。この位相は、５本鎖（両親媒性α−ヘリックスによって片端にてキャップされたβ−バレル）を含む構造に相当する。ＣＡＴＨタンパク質構造分類法（Pearl et al., 2003, Nucleic Acids Res 31: 452-455）を参照すると、ＯＢ折り畳み位相は２．４０．５０折り畳みファミリーに相当する（ＣＡＴＨデータベースバージョン３．０．０：２００６年５月リリース）。斯かるＯＢ折り畳みタンパク質は、天然のタンパク質（すなわち、天然タンパク質と同じ配列を有する単離、精製、または遺伝子組み換えタンパク質）であっても、または改変タンパク質（例えば、天然のタンパク質の断片、または第一のタンパク質からのＯＢ折り畳みドメイン、および別のタンパク質からの別の部分を含む融合タンパク質のようなもの）のいずれであってもよい。本発明に従って使用できるＯＢ折り畳みタンパク質の限定されることのない例としては、１つのポリペプチドにつき１つのＯＢ折り畳みを含む単純ＳＳＢを含めた、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、および（異なったポリペプチド上にあってもよい）複数のＯＢ折り畳みを含む高次ＳＳＢを包含する。代表的な単純ＳＳＢとしては、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質１と２（例えば、ｈＳＳＢ１と２）およびミトコンドリアＳＳＢ（ｍｔＳＳＢ）が挙げられるが、高次ＳＳＢは、ヘテロ三量体複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）によって代表される。加えて、他のタンパク質はまた、それらのポリペプチドの中にｓｓＤＮＡ結合ＯＢ折り畳み構造も採用しているので、ＳＳＢファミリーのメンバーと見なされ得る。例えば、セリン／トレオニンキナーゼ受容体関連タンパク質（Ｓｔｒａｐ）は、単純ＳＳＢのように１つのＤＮＡ結合ＯＢ折り畳みを構造的に含んでいるが、テロメア１（ＰＯＴ１）乳癌２のＴＰＰ１−保護、早発性（ＢＲＣＡ２）、およびＣＳＴ複合体は高次ＳＳＢによく似ている複合体を形成する。多数のＯＢ折り畳みタンパク質が当該技術分野で知られており、その例示的な例はAshtonら（2013, BMC Molecular Biology 14: 9）およびFlynnら（2010, Crit Rev Biochem Mol Biol. 45(4): 266-275）で開示されている。
【００９３】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、天然の核酸塩基、糖、およびホスホジエステルヌクレオシド間結合で構成されたリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマー〜ポリマーまたはポリマーを指す。
【００９４】
「オリゴマー」、「オリゴマー化合物」および「オリゴマーの化合物」という用語は、特定の配列でつながれて、ポリマー構造を形成する複数の天然および／または非天然ヌクレオシドを指すために本明細書中では互換的に使用される。オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド模倣体、オリゴヌクレオシドおよびこれらのキメラ組み合わせ物が、「オリゴマー」および「オリゴマー化合物」という用語に含まれ、よって、それは、「オリゴヌクレオチド」という用語より広くなることが意図され、これだけに限定されるものではないが、当該技術分野で知られているものを含めたすべての修飾様式を有するすべてのオリゴマーを含む。オリゴマー化合物は、典型的に、天然または合成の野生型オリゴヌクレオチドと構造的に区別でき、そのうえ、機能上交換可能である。よって、オリゴマー化合物は、例えば、標的にハイブリダイズすることによって、所望のＲＮＡまたはＤＮＡ鎖の構造および／または機能をまねるのに有効に機能する斯かる構造のすべてを含む。斯かる非天然オリゴヌクレオチドは、それらが、例えば、高い細胞内取り込み、核酸標的に対する高い親和性、ヌクレアーゼ存在下での高い安定性などの高い特性を有することが多いので、天然形態を超えることを所望されることが多い。
【００９５】
「患者」、「対象」、「宿主」または「個体」というという用語は、本明細書中では互換的に使用され、任意の対象、特に脊椎動物の対象、およびより一層特に哺乳動物の対象も指し、それらのための処理または予防が所望される。本発明の範囲内にある好適な脊椎動物としては、これだけに限定されるものではないが、霊長目動物（例えば、ヒト、猿および類人猿）を含めた脊索動物亜門の任意のメンバーが挙げられ、さらに、マカク属（例えば、マカク・ファシキュラリス（Macaca fascicularis）などのカニクイザルおよび／またはアカゲザル（マカク・ムラッタ（Macaca mulatta））などの）およびヒヒ（パピオ・ウルシヌス（Papio ursinus））、ならびにマーモセット（カリスリクス（Callithrix）属由来の種）、リスザル（サイミリ（Saimiri）属由来の種）およびタマリン（サグイヌス（Saguinus）属由来の種）、ならびに、例えば、チンパンジー（パン・トログロディテス（Pan troglodytes））などの類人猿の種、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、モルモット）、ウサギ目の動物（例えば、ウサギ、ノウサギ）、ウシ亜科の動物（例えば、ウシ）、ヒツジ属の動物（例えば、ヒツジ）、ヤギ亜科の動物（例えば、ヤギ）、ブタのような動物（例えば、ブタ）、ウマ科の動物（例えば、ウマ）、イヌ科の動物（例えば、イヌ）、ネコ科の動物（例えば、ネコ）、鳥類の動物（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、例えばカナリア、セキセイインコトリなどのペットのトリ）、海洋性哺乳動物（例えば、イルカ、クジラ）、爬虫類の動物（ヘビ、トカゲ、カエルなど）、ならびに魚類の動物が挙げられる。特定の実施形態において、対象はヒトなどの霊長目動物である。しかしながら、前述の用語が、症状が存在することを意味していないことが理解される。
【００９６】
パーセンテージは、該オリゴマーの全長にわたる核酸塩基の大体の割合またはヌクレオシド間結合を指すために本明細書中で使用され、そしてそれは、特定の特徴または性質を有する。これらの特徴または性質を有する核酸塩基の数は、オリゴマーの核酸塩基数に基づくこれらのパーセンテージから容易に計算できる。代表的な計算が以下の表１に提供されており、そこでは、列挙された値は四捨五入して整数にされている。
表１
【表１】
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【００９７】
「医薬的に許容し得る担体」とは、生物学的にまたはその他の形で好ましくないものではない材料から成る医薬ビヒクルを意味する、すなわち、斯かる材料は、有害反応をまったくまたは実質的に引き起こすことなく、選択された活性物質と共に対象に投与され得る。一般的に、医薬的に許容し得る担体は、対象において実質的に無毒性かつ非炎症性である。担体としては、例えば：抗付着剤、抗酸化剤、バインダー、コーティング、圧縮助剤、崩壊剤、染料(色)、軟化薬、乳化剤、充填剤(希釈剤)、皮膜形成剤若しくはコーティング、香味、芳香、流動促進剤(流れ増強剤)、滑沢剤、保存料、印刷インク、収着剤、懸濁剤若しくは分散剤、甘味料、および水和水が挙げられ得る。例示的な担体としては、これだけに限定されるものではないが：ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム(二塩基性の)、ステアリン酸カルシウム、クロスカルメロース、架橋ポリビニルピロリドン、クエン酸、クロスポビドン、システイン、エチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、マルチトール、マンニトール、メチオニン、メチルセルロース、メチルパラベン、微結晶性セルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポビドン、アルファ化デンプン、プロピルパラベン、パルミチン酸レチニル、セラック、二酸化ケイ素、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クエン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、ソルビトール、デンプン(コーン)、ステアリン酸、スクロース、タルク、二酸化チタン、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンC及びキシリトールが挙げられる。
【００９８】
「ポリヌクレオチド」、「遺伝子材料」、「遺伝子形態」、「核酸」、および「ヌクレオチド配列」という用語は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形態および混合ポリマー、一本鎖、二本鎖、センスおよびアンチセンス鎖の両方を含み、そして、当業者によって容易に理解されるように、化学的または生化学的に修飾されてもよく、または非天然または誘導化核酸塩基を含んでもよい。
【００９９】
腫瘍細胞によるオリゴマーの取り込みとの関連において、「優先的に」という用語は、オリゴマーが同じ条件下で非腫瘍または正常細胞によって取り込まれるより高いレベルで腫瘍細胞によって取り込まれることを意味し、そしてそれは、インビボであっても、またはインビトロであってもよい。あるいは、標的分子へのオリゴマーの結合との関連において、「優先的に」という用語は、オリゴマーが、関係ないかまたは非標的分子に結合するよりも高い親和性で標的分子に結合することを意味するか、または標的分子が、同じ条件下で対照オリゴマーより高い親和性でオリゴマーに結合することを意味し、そしてそれは、インビボであっても、またはビトロであってもよい。オリゴマー取り込みは、非腫瘍または正常細胞によるのと比べ、腫瘍細胞によって少なくとも１倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、１０倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも３０倍高い、少なくとも４０倍高い、少なくとも５０倍高い、少なくとも６０倍高い、少なくとも７０倍高い、少なくとも８０倍高い、少なくとも９０倍高い、少なくとも１００倍高い、または少なくとも１０００倍高い可能性がある。同様に、オリゴマー親和性は、関係ないかまたは非標的分子に対するオリゴマーの親和性に比べて、標的分子に対して少なくとも１倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、１０倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも３０倍高い、少なくとも４０倍高い、少なくとも５０倍高い、少なくとも６０倍高い、少なくとも７０倍高い、少なくとも８０倍高い、少なくとも９０倍高い、少なくとも１００倍高い、または少なくとも１０００倍高い可能性がある。あるいは、標的分子親和性は、対照オリゴマーに対する標的分子の親和性に比べて、オリゴマーに対して少なくとも１倍高い、少なくとも２倍高い、少なくとも３倍高い、少なくとも４倍高い、少なくとも５倍高い、少なくとも６倍高い、少なくとも７倍高い、少なくとも８倍高い、少なくとも９倍高い、１０倍高い、少なくとも２０倍高い、少なくとも３０倍高い、少なくとも４０倍高い、少なくとも５０倍高い、少なくとも６０倍高い、少なくとも７０倍高い、少なくとも８０倍高い、少なくとも９０倍高い、少なくとも１００倍高い、または少なくとも１０００倍高い可能性がある。オリゴマーの取り込みまたは親和性を計測するための一般的技術は当業者に知られている。計測された取り込みまたは親和性および他のオリゴマー結合パラメーターは、異なった条件、例えば、塩濃度、ｐＨなどの下で計測されたのであれば、異なる可能性がある。よって、取り込みまたは親和性および他のオリゴマー結合パラメーター、例えば、ＫＤ、ＩＣ５０、の計測は、オリゴマーおよび標的細胞または分子の標準液、ならびに標準バッファーを用いて好ましくはおこなわれる。
【０１００】
本明細書中に使用される場合、「予防」、「予防した」、または「予防すること」という用語は、疾患または病状が発症することに対する象の抵抗性を増強するか、または、言い換えれば、対象が疾患または病状を発症する可能性を減少させる予防的治療、ならびに疾患または病状が始まった後に、それを軽減するかもしくは完全に排除するか、またはそれがより悪くなることを予防するための処置を指す。これらの用語はまた、疾患または病状に罹患しやすい可能性があるが、まだそれに罹患したと診断されていない対象に疾患または病状が現れることを予防することもそれらの範囲内に含む。
【０１０１】
第二のサンプルに対して第一のサンプル中の物質および／または現象のレベルに関して使用されるとき、「低減」、「阻害」、「減少」という用語、および文法的同等物は、第一のサンプル中の物質および／または現象の量が、任意の技術分野で認められた統計的方法を使用して統計的に有意であるいずれかの量だけ第二のサンプルで少ないことを意味する。一実施形態において、例えば、患者が彼らの病徴の主観的知覚、例えば、疼痛、疲労感などについて言及するとき、低減は主観的に決定され得る。別の実施形態において、例えば、患者からのサンプル中の腫瘍細胞の数が該患者からの以前のサンプルより低いとき、低減は客観的に決定され得る。別の実施形態において、第一のサンプル中の物質および／または現象の数量は、第二のサンプル中の同じ物質および／または現象の数量より少なくとも１０％少ない。別の実施形態において、第一のサンプル中の物質および／または現象の数量は、第二のサンプル中の同じ物質および／または現象の数量より少なくとも２５％少ない。さらに別の実施形態において、第一のサンプル中の物質および／または現象の数量は、第二のサンプル中の同じ物質および／または現象の数量より少なくとも５０％少ない。さらなる実施形態において、第一のサンプル中の物質および／または現象の数量は、第二のサンプル中の同じ物質および／または現象の数量より少なくとも７５％少ない。さらに別の実施形態において、第一のサンプル中の物質および／または現象の数量は、第二のサンプル中の同じ物質および／または現象の数量より少なくとも９０％少ない。あるいは、差は「ｎ倍」の差と表現されてもよい。
【０１０２】
「配列同一性」という用語は、本明細書中で使用される場合、配列が同一であるか、または比較のウィンドウ全体にわたる核酸塩基ごとの塩基に対して同じ核酸塩基対合能力を有する程度を指す。よって、「配列同一性のパーセンテージ」または「パーセント同一性」は、比較のウィンドウ全体にわたり２つの最適にアラインされた配列を比較し、同一の核酸塩基または同等な塩基対合能力を有する核酸塩基両方の配列で生じる位置の数を決定して、一致している位置の数を得、一致する位置の数を比較ウィンドウ（すなわち、ウィンドウサイズ）内の位置の総数によって割り、そして、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。本発明の目的のために、「配列同一性」が、適当な方法によって計算された「マッチパーセンテージ」を意味することは理解される。例えば、配列同一性分析は、ソフトウェアに添付された解説書に使用されるような標準的なデフォルトを使用してＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（ウィンドウ用バージョン２．５；Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Francisco, California, USAから入手可能）を使用して実施され得る。よって、本発明のオリゴマー化合物、またはその一部が、参照配列に対して規定された同一性パーセントを有してもよい。本明細書中に使用される場合、オリゴマー核酸塩基配列は、それが同じ核酸塩基対合能力を有する場合、参照核酸塩基配列と同一である。例えば、参照配列のチミジンの位置にウラシルを含むオリゴマーは、それらの両方がアデニンと対合するので、同一であると見なされる。同様に、参照配列のグアニンの位置に６−メチルグアニンなどの修飾グアニン核酸塩基を含むオリゴマーは、それらの両方がシトシンと対合するので、同一と見なされる。同一性は、オリゴマー化合物の全長にわたって、またはオリゴマー化合物の一部に存在し得る（例えば、２７量体のうちの核酸塩基１−２０が２０量体と比較されて、参照配列に対するオリゴマー化合物の同一性パーセントを決定し得る）。いずれかの非同一塩基が、互いに隣接していても、オリゴマー全体にわたって分散していても、またはその両方であってもよい。例えば、２０量体の核酸塩基２−１７と同じ配列を有する１６量体は、２０量体に対して８０％同一である。あるいは、また、２０量体と同一でない４つの核酸塩基を含む２０量体は、２０量体に対して８０％同一である。１８量体の核酸塩基１−１４と同じ配列を有する１４量体は、１８量体に対して７８％同一である。斯かる計算は、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【０１０３】
２以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列相関を記載するのに使用される用語としては、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」および「実質的な同一性」が挙げられる。「参照配列」は、少なくとも１４かつ最大２９（例えば、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９）の核酸塩基である。２つの核酸はそれぞれ（１）２つの核酸の間で類似している配列、および（２）２つの核酸の間に不一致の配列、を含み得るので、２（超）の核酸の間の配列比較は、「比較ウィンドウ」全体にわたってその２つの核酸の配列を比較して、局所的な領域の配列類似性を同定し、比較することによって典型的に行われる。「比較ウィンドウ」とは、少なくとも１４かつ最大２９（例えば、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９）の隣接する核酸塩基位置の概念的なセグメントを指し、そしてそこで、２つの配列が最適にアラインされた後に、配列が同じ数の隣接する核酸塩基位置の参照配列と比較される。比較ウィンドウは、２つの配列の最適なアラインメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。比較ウィンドウをアラインするための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USAの中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）のコンピューター化された実施によって行われても、または選択された様々な方法のいずれかにより作り出される検査と（すなわち、比較ウィンドウを超える最高のパーセンテージ相同性をもたらす）最良のアラインメントによって行われてもよい。例えば、Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389によって開示されるＢＬＡＳＴファミリーのプログラムに関しても言及され得る。配列分析に関する詳細な論議は、Unit 19.3 of Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology,” John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15で見ることができる。
【０１０４】
「ストリンジェンシー」とは、本明細書中で使用される場合、ハイブリダイゼーション中の、温度とイオン強度条件、ならびに特定の有機溶媒の有無を指す。ストリンジェンシーが高ければ高いほど、配列間で観察される相補性の程度もより高くなる。「ストリンジェント条件」とは、本明細書中で使用される場合、その下で相補的な核酸塩基の高い割合を有する、好ましくは厳密な相補性を有するポリヌクレオチドだけがハイブリダイズする温度およびイオン条件を指す。求められるストリンジェンシーは、ヌクレオチド配列依存性であり、かつ、ハイブリダイゼーション中に存在する種々成分に依存し、そして、ヌクレオチド類似体が使用されるときに大きく変更される。一般的に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列の融解点より約１０℃〜２０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（規定するイオン強度およびｐＨの下で）標的配列の５０％が相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。当然のことながら、ポリヌクレオチドは、少なくとも低ストリンジェンシー条件下、好ましくは少なくとも中程度のストリンジェンシー条件下、そして、より好ましくは高ストリンジェンシー条件下で標的配列にハイブリダイズする。本明細書中での低ストリンジェンシー条件に対する言及としては、４２℃でのハイブリダイゼーションのための少なくとも約１％ｖ／ｖ〜少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩、ならびに４２℃にて洗浄するための少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩が挙げられ、かつ、包含する。低ストリンジェンシー条件としてはまた、６５℃でのハイブリダイゼーションのための１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％のＳＤＳ、および室温で洗浄するための（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ；または（ｉｉ）０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％のＳＤＳも挙げられ得る。中程度のストリンジェンシー条件としては、４２℃でのハイブリダイゼーションのための少なくとも約１６％ｖ／ｖ〜少なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩、ならびに４２℃にて洗浄するための少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩が挙げられ、かつ、包含する。中程度のストリンジェンシー条件としてはまた、６５℃でのハイブリダイゼーションのための１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％のＳＤＳ、ならびに４２℃にて洗浄するための（ｉ）２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、または（ｉｉ）０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、５％のＳＤＳも挙げられ得る。高ストリンジェンシー条件としては、４２℃でのハイブリダイゼーションのための少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩、ならびに４２℃にて洗浄するための少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩が挙げられ、かつ、包含する。高ストリンジェン��ー条件としてはまた、６５℃でのハイブリダイゼーションのための１％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、７％のＳＤＳ、ならびに６５℃を超える温度で洗浄するための（ｉ）０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ；または（ｉｉ）０．５％のＢＳＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）、１％のＳＤＳも挙げられ得る。高ストリンジェンシー条件の一実施形態としては、約４５℃にて６×ＳＳＣ中でハイブリダイズし、それに続いて６５℃にて０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で１若しくは複数回洗浄することが挙げられる。非常に高いストリンジェンシー条件の一実施形態としては、６５℃にて０．５Ｍのリン酸ナトリウム、７％のＳＤＳ中でハイブリダイズし、それに続いて６５℃にて０．２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ中での１若しくは複数回洗浄することが挙げられる。他のストリンジェント条件も当該技術分野で周知である。当業者は、様々な要因がハイブリダイゼーションの特異性を最適化するために操作されることを認識している。最後の洗浄のストリンジェンシーの最適化は、高度なハイブリダイゼーションを確実にする助けとなり得る。詳細な例に関しては、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY（前掲）の2.10.1〜2.10.16ページおよびMOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL (Sambrook, et al., eds.) (Cold Spring Harbor Press 1989)の1.101〜1.104項を参照。
【０１０５】
「置換基（substituentおよびsubstituent group）」という用語は、本明細書中に使用される場合、典型的には、所望の特性を高めるか、または所定の効果を与えるために他の群または親化合物に付加される基を含む。置換基は、保護されていても、または非保護であってもよく、そして、親化合物の１つの利用可能部位または多数の利用可能部位に付加され得る。置換基はまた、他の置換基でさらに置換されてもよく、そして、親化合物に直接、または、例えばアルキルもしくはヒドロカルビル基などの連結基を介して取り付けられ得る。斯かる基としては、これだけに限定されるものではないが、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル（−Ｃ（Ｏ）Ｒａ）、カルボキシル（−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ）、脂肪族、脂環式、アルコキシ、置換オキソ（−Ｏ−Ｒａ）、アリール、アラルキル、複素環式、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アミノ（−ＮＲｂＲｃ）、イミノ（＝ＮＲｂ）、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃまたは−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（Ｏ）Ｒａ）、アジド（−Ｎ３）、ニトロ（−ＮＯ２）、シアノ（−ＣＮ）、カルバミド（−ＯＣ（Ｏ）ＮＲｂＲｃまたは−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａ）、ウレイド（−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃ）、チオウレイド（−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（Ｓ）ＮＲｂＲｃ）、グアニジニル（−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（＝ＮＲｂ）ＮＲｂＲｃ）、アミジニル（−Ｃ（＝ＮＲｂ）ＮＲｂＲｃまたは−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（ＮＲｂ）Ｒａ）、チオール（−ＳＲｂ）、スルフィニル（−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ）、スルホニル（−Ｓ（Ｏ）２Ｒｂ）、およびスルホンアミジル（−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃまたは−Ｎ（ｂ）Ｓ（Ｏ）２Ｒｂ）、式中、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃはそれぞれ、これだけに限定されるものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂肪族、アルコキシ、アシル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、脂環式、複素環式およびヘテロアリールアルキルを含めた好ましい一覧を有するさらなる置換基である。
【０１０６】
「標的核酸配列」および「標的配列」という用語は、本発明のオリゴマー化合物の標的化配列がそれに向けられている標的ＲＮＡまたは標的ＤＮＡ分子の一部、すなわち、該オリゴマー化合物が相補的配列のワトソン−クリック塩基対合によってそこにハイブリダイズするところの配列、を指すために互換的に本明細書中で使用される。
【０１０７】
「標的化配列」という用語、本明細書中で使用される場合、標的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子内の標的配列に対して実質的に相補的な本発明のアンチセンスオリゴマー化合物内の配列を指す。オリゴマー化合物の全配列または一部だけが、実質的に、標的配列に対して相補的であり得る。例えば、１８の核酸塩基を有するオリゴマーにおいて、１２−１４だけが標的化配列であってもよい。典型的には、標的化配列は、オリゴマー化合物中の少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８またはそれより多い隣接塩基から形成されるが、あるいは、例えば、該オリゴマーの反対端から、一緒に配置されたときに、該標的配列におよぶ配列を構成する、非隣接配列から形成されてもよい。
【０１０８】
本明細書中に使用される場合、「トランスクリプトーム」という用語は、すべてのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子のセット、または１つの細胞または細胞集団において産生される「転写産物」を指す。該用語は、所定の生物体の転写産物の全体集合、または特定の細胞型に存在する転写産物の特定のサブセットに適用できる。（突然変異を除く）所定の細胞株に関しておおまかに固定されているゲノムと異なり、トランスクリプトームは外部環境条件により変化する可能性がある。それは（ｍＲＮＡ前駆体を含めた）細胞内のすべてのｍＲＮＡ転写産物を含むので、トランスクリプトームは、例えば転写減衰などのｍＲＮＡ分解現象を除いて、その時々で活発に発現される遺伝子を反映する。
【０１０９】
本明細書中に使用される場合、「処置」、「処置すること」の用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。該効果は、疾患または病状（例えば、血液悪性腫瘍）および／または疾患または病状に起因し得る不利な影響の部分的または完全な治癒に関して治療的であってもよい。これらの用語はまた、哺乳動物、特にヒトの病状または疾患のあらゆる処置を網羅し、そして：（ａ）疾患または病状を阻害すること、すなわち、その発生を抑えること；または（ｂ）疾患または病状を軽減すること、すなわち、疾患または病状の軽減を引き起こすこと、を含む。
【０１１０】
「腫瘍」という用語は、本明細書中に使用される場合、悪性であるかまたは良性であるかにかかわらず、あらゆる新生物細胞成長および増殖、ならびにすべての前癌および癌細胞および組織を指す。「癌」および「癌性」という用語は、哺乳動物における無秩序な細胞増殖によって典型的にはある程度特徴づけられる生理的条件を指すかまたは説明する。本明細書中に使用される場合、「癌」という用語は、初期および後期ステージの癌を含めた、非転移性癌および転移癌を指す。「前癌」という用語は、典型的には、より先に起こるかまたは癌に進行する状態または成長を指す。「非転移性」とは、良性であるかまたは原発性部位に留まっており、かつ、リンパ系もしくは血管系または原発性部位以外の組織に入り込んでいない癌を意味する。一般的に、非転移癌とは、ステージ０、Ｉ、ＩＩの癌、および時々ステージＩＩＩの癌であるいずれかの癌である。「初期ステージの癌」とは、侵襲性または転移性でないか、あるいはステージ０、Ｉ、もしくはＩＩの癌と分類される癌を意味する。「後期ステージの癌」という用語は、通常、ステージＩＩＩまたはステージＩＶの癌を指すが、ステージＩＩの癌またはステージＩＩの癌のサブステージを指すこともある。当業者は、初期ステージの癌または後期ステージの癌のいずれかとしてのステージＩＩの癌の分類法が特定のタイプの癌に依存していることを理解する。癌に関する例示的な例としては、これだけに限定されるものではないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、肺癌、肝細胞性癌、胃癌、肝臓癌、膀胱癌、尿管の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、脳癌、非小細胞肺癌、頭頚部の扁平上皮癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、直腸癌、および食道癌が挙げられる。代表的な実施形態において、癌は前立腺癌、肺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、および骨癌から選択される。
【０１１１】
「腫瘍調節」という用語は、腫瘍細胞の機能を阻害するかもしくは予防する、および／または腫瘍細胞の破壊を引き起こす物質を指す。腫瘍調節活性は、細胞毒性または細胞増殖抑制性であってもよい。細胞毒性薬は、腫瘍細胞にとって毒性であり、そして、その毒性作用は腫瘍細胞の死滅および／または溶解をもたらし得る。特定の事例において、毒性作用は、例えば、細胞増殖を減速するか、または止める、腫瘍細胞にとって亜致死性の破壊的効果であり得る。細胞増殖抑制剤は、腫瘍細胞の成長および／または増殖を阻害するかまたは停止させる。
【０１１２】
本明細書中に使用される場合、遺伝子の名称を強調またはイタリック体化することは、そのタンパク質産物とは対照的に、あらゆる強調またはイタリック体化の存在しない遺伝子の名称によって示されている遺伝子を示すことになっている。例えば「（イタリック体の）ｈＳＳＢ１」は、ｈＳＳＢ１遺伝子を意味することになっており、それに対して、「ｈＳＳＢ１」は「ｈＳＳＢ１」遺伝子の転写、翻訳、および選択的スプライシングから産生された（単数もしくは複数の）タンパク質産物を示すことになっている。
【０１１３】
本明細書中に記載した各実施形態は、別段特別に述べられない限り、必要な変更を加えてありとあらゆる実施形態に適用されるべきである。
【０１１４】
２．略語
以下の略語が当該出願中で使用される：
ｎｔ＝ヌクレオチド
ｎｔｓ＝（複数の）ヌクレオチド
Ｄａ＝（単数もしくは複数の）ダルトン
ｋＤａ＝（単数もしくは複数の）キロダルトン
ｍｉｎ＝（単数もしくは複数の）分
ｈｒ＝（単数もしくは複数の）時間
ｗｋ＝（単数もしくは複数の）週
ＰＤ＝ホスホジエステル
ＰＳ＝ホスホロチオアート
ＬＳＡ＝ＰＳオリゴマー化合物
ＡＳＯ＝アンチセンスオリゴヌクレオチド
ＧＣ＝グアノシン／シトシン
Ｔｍ＝融解温度
ＳＳＢ１＝一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質１、別名ＮＡＢＰ２、ＯＢＦＣ２Ｂ
ＳＳＢ２＝一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質２
ｈＳＳＢ１＝ヒトＳＳＢ１
ｈＳＳＢ２＝ヒトＳＳＢ２
ｍＳＳＢ１＝マウスＳＳＢ１
ＴＨＯＣ４＝ＡＬＹＲＥＦ、ＴＨＯ複合体サブユニット４
ｈＴＨＯＣ４＝ヒトＴＨＯＣ４
【０１１５】
３．腫瘍細胞を標的化するための核酸オリゴマー化合物
本発明は、ほとんどホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含んでいる骨格を有し、およびオリゴマー核酸塩基の少なくとも約半分がプリンである核酸オリゴマー化合物が、それぞれＤＮＡ修復および細胞のタンパク質合成機構へのＲＮＡ分子の核外輸送に関与するタンパク質であるＳＳＢ１およびＴＨＯＣ４の一方またはその両方に結合するという知見をある程度根拠としている。意外なことに、これらのオリゴマーはまた、トランスクリプトームに対して実質的な相補性を有するか否かにかかわらず、またはそれらがゲノムに対して相同性を有するか否かにかかわらず、腫瘍細胞の増殖を顕著に阻害するか、または死滅を刺激することもわかった。
【０１１６】
本発明者らは、タンパク質結合および腫瘍細胞調節活性の基礎となる特性を決定するために、３００超のオリゴマー配列を試験することによって、この知見をさらに調査した。これらの配列では、１９５個がＳＳＢ１およびＴＨＯＣ４のうちの一方またはその両方と結合し、そして、腫瘍細胞の増殖、生存または生存能力を阻害することがわかった。これらのオリゴマー化合物の配列および化学的性質は表２に示されている。
表２
【表２−１】
2019500431.tif 000003
【表２−２】
2019500431.tif 000004
【表２−３】
2019500431.tif 000005
【表２−４】
2019500431.tif 000006
【表２−５】
2019500431.tif 000007
【表２−６】
2019500431.tif 000008
【０１１７】
表２では、ｍは２’ＯＭｅ修飾ヌクレオシドを表し、そして、＊はホスホロチオアート（ＰＳ）ヌクレオシド間結合を表す。
【０１１８】
これらの知見に基づいて、本発明は、以下の：
ａ）少なくとも約７０％のホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む骨格；
ｂ）（ｉ）少なくとも約５０％のプリン含量、または（ｉｉ）少なくとも約５０％のグアノシンシトシン（ＧＣ）含量と共に少なくとも約４５％のプリン含量；
ｃ）少なくとも１４核酸塩基かつ２９核酸塩基以下の長さ；
ｄ）３７℃にて、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭのＮａＣｌを含有する水溶液中、ＴＨＯＣ４およびＳＳＢ１ｉｎのうちの一方またはその両方への結合；および
ｅ）インビボまたはインビトロにおいて腫瘍細胞のアポトーシスまたはネクローシスを引き起こすこと、
を特徴とするオリゴマー化合物に広く関する。
【０１１９】
ＳＳＢ１に加えて、本発明のオリゴマー化合物がまた、３７℃にて、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭのＮａＣｌを含有する水溶液中でＳＳＢ２にも結合することもまた測定された。この測定、およびＳＳＢ１（ｈＳＳＢ１とｍＳＳＢ１を含む）およびＳＳＢ２がそれぞれオリゴヌクレオチド／オリゴ糖結合（ＯＢ）折り畳みタンパク質であることに基づいて、概して、本明細書中に開示したオリゴマー化合物が、ＯＢ折り畳みタンパク質に結合することが提案される。
【０１２０】
本発明者らはまた、これらのオリゴマー化合物が、典型的には、以下の：
ｆ）４５℃〜８０℃の範囲内の融解温度（Ｔｍ）；
ｇ）腫瘍細胞による優先的取り込み；
ｈ）腫瘍細胞の核から細胞質へのｍＲＮＡの移行の阻害、
を特徴とすることも見出した。
【０１２１】
３．１  オリゴマーの化学的性質と設計
本発明のオリゴマー化合物は、概して、一本鎖であり、好ましくは少なくとも１４（例えば、１４、１５、１６、１７、１８、１９以上）核酸塩基の長さ（すなわち、少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９以上の連結されたヌクレオシド／単量体サブユニット）かつ２９以下（例えば、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１以下）核酸塩基の長さ（すなわち、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１以下の連結されたヌクレオシド／単量体サブユニット）である。特定の実施形態において、該オリゴマーは、１４〜２８、１４〜２７、１４〜２６、１４〜２５、１４〜２４、１４〜２３、１４〜２２、１４〜２１、１４〜２０、１５〜２９、１５〜２８、１５〜２７、１５〜２６、１５〜２５、１５〜２４、１５〜２３、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１６〜２９、１６〜２８、１６〜２７、１６〜２６、１６〜２５、１６〜２４、１６〜２３、１６〜２２、１６〜２１、１６〜２０、１７〜２９、１７〜２８、１７〜２７、１７〜２６、１７〜２５、１７〜２４、１７〜２３、１７〜２２、１７〜２１、１７〜２０、１８〜２９、１８〜２８、１８〜２７、１８〜２６、１８〜２５、１８〜２４、１８〜２３、１８〜２２、１８〜２１、１８〜２０、１９〜２９、１９〜２８、１９〜２７、１９〜２６、１９〜２５、１９〜２４、１９〜２３、１９〜２２、１９〜２１、または１９〜２０核酸塩基の長さである。当業者は、その結果、本発明が１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９核酸塩基の長さのオリゴマー化合物を包含することを理解する。
【０１２２】
３．２  骨格の化学的性質
３．２．１  ヌクレオシド間結合
オリゴマー骨格は、少なくとも約７０％のホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む。これに関して、すべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含むことを必要としているわけではないので、したがって、本発明はまた、例えば、ホスホジエステル、ホスホロジチオアート、ホスホナート、メチルホスホナート、アルキルホスホナート、３’−アルキレンホスホナート、５’−アルキレンホスホナート、キラルホスホナート、ホスホノアセタート、チオホスホノアセタート、ホスフィナート、ホスホルアミダート、３’−アミノホスホルアミダート、アミノアルキルホスホルアミダート、チオノホスホルアミダート、ホスホロチオアミダート、チオノアルキルホスホナート、ホスホトリエステル、チオノアルキルホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、チオノアルキルホスホトリエステルセレノホスファート、および／またはボラノホスファートヌクレオシド間結合などの代替のヌクレオシド間結合を含む混合性骨格を有するオリゴマー化合物を包含する。いくつかの実施形態において、オリゴマー骨格のヌクレオシド間結合の少なくとも約７０％、８０％、９０％または１００％さえ、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む。好ましい実施形態において、オリゴマー骨格のすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む。
【０１２３】
代表的な、少なくとも約７０％のホスホロチオアートヌクレオシド間結合（ＰＩＬ）を有するオリゴマー骨格は、１４核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１０ＰＩＬ、１５核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１０または１１ＰＩＬ、１６核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１１ＰＩＬ、１７核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１２ＰＩＬ、１８核酸塩基のオリゴマー少なくとも１２または１３ＰＩＬ、１９核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１３ＰＩＬ、２０核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１４ＰＩＬ、２１核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１４または１５ＰＩＬ、２２核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１５ＰＩＬ、２３核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１６ＰＩＬ、２４核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１７ＰＩＬ、２５核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１７または１８ＰＩＬ、２６核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１８ＰＩＬ、２７核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１９ＰＩＬ、２８核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１９または２０ＰＩＬ、および２９核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも２０ＰＩＬを包含する。
【０１２４】
８０％および９０％ＰＩＬを得るためのオリゴマーの長さに応じた代表的なＰＩＬ数は、前掲の表１から計算できる。
【０１２５】
あらゆる代替ヌクレオシド間結合（すなわち、ＰＩＬ以外のヌクレオシド間結合）が、オリゴマーの一方または両方の末端にあっても、該オリゴマーの中心部にあっても、互いに隣接していても、および／またはオリゴマー全体に分散されていてもよい。
【０１２６】
３．２．２  修飾糖部分
オリゴマーの骨格は、好適には、少なくとも１つの２’−Ｏ−アルキル修飾糖部分を含み、その例示的な例としては、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチルおよび２’−Ｏ−２−メトキシエチル修飾糖部分（例えば、２’−Ｏ−メチル糖部分）が挙げられる。具体例において、該オリゴマーは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチルリボース部分を含む。好適には、該オリゴマーの糖部分の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはすべてがそれぞれ、２’−Ｏ−アルキル修飾糖部分（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾糖部分）である。特定の実施形態において、該オリゴマーのすべての糖部分がそれぞれ、２’−Ｏ−アルキル修飾糖部分（例えば、２’−Ｏ−メチル修飾糖部分）である。
【０１２７】
代表的な、少なくとも約５０％のＭＳＭ含量は、１４核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも７のＭＳＭ核酸塩基、１５核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも７または８のＭＳＭ核酸塩基、１６核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも８のＭＳＭ核酸塩基、１７核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも８または９のＭＳＭ核酸塩基、１８核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも９のＭＳＭ核酸塩基、１９核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも９または１０のＭＳＭ核酸塩基、２０核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１０のＭＳＭ核酸塩基、２１核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１０または１１のＭＳＭ核酸塩基、２２核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１１のＭＳＭ核酸塩基、２３核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１１または１２のＭＳＭ核酸塩基、２４核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１２のＭＳＭ核酸塩基、２５核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１２または１３のＭＳＭ核酸塩基、２６核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１３のＭＳＭ核酸塩基、２７核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１３または１４のＭＳＭ核酸塩基、２８核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１４のＭＳＭ核酸塩基、および２９核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１４または１５のＭＳＭ核酸塩基を包含する。
【０１２８】
６０％、７０％、８０％または９０％のＭＳＭ含量を得るためのオリゴマーの長さに応じた代表的なＭＳＭ核酸塩基数は、前掲の表１から計算される。
【０１２９】
３．３  核酸塩基配列
核酸塩基配列は、例えば、以下に記載するように、プリンおよび／またはＧＣ含量および／またはＴｍを達成するように任意の好適な技術を使用して設計され得る。本発明の非標的化オリゴマーに関して、核酸塩基配列は、ランダム配列ジェネレイター（例えばSwiss Protウェブサイト:http://au.expasy.org/tools/randseq.htmlに設置されたランダム配列ジェネレイターツール）または合理的設計を使用して作り出され、そして、その核酸塩基が選択されたトランスクリプトームおよび／またはゲノムに対して適当な配列同一性を有するように、好適な配列分析手段（例えば、ＢＬＡＳＴ）によってスクリーニングされ得る。あるいは、アンチセンスオリゴマーに関して、着目の核酸配列は、好適な分析手段（例えば、OligoAnalyzer、Primer3、PrimerQuestなど）を使用して分析されて、適当なプリンおよび／またはＧＣ含量および／またはＴｍを有する標的配列が同定され得る。
【０１３０】
３．３．１  プリン含量
該オリゴマーの核酸塩基配列は、好適には、少なくとも約４５％かつ約９０％以下のプリン含量、例えば、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％のプリン含量を有する。特定の実施形態において、該オリゴマーは、約４５−９０％、約４５−８５％、約４５−８０％、約４５−７５％、約４５−７０％、約４５−６５％、約４５−６０％、約４５−５５％、約４５−５０％、約５０−９０％、約５０−８５％、約５０−８０％、約５０−７５％、約５０−７０％、約５０−６５％、約５０−６０％、約５０−５５％、約５５−９０％、約５５−８５％、約５５−８０％、約５５−７５％、約５５−７０％、約５５−６５％または約５５−６０％のプリン含量を有する。
【０１３１】
代表的な少なくとも約４５％のプリン含量とは、１４核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも６のプリン、１５核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも６または７のプリン、１６核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも７のプリン、１７核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも８７またはのプリン、１８核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも８のプリン、１９核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも８または９のプリン、２０核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも９のプリン、２１核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも９〜１０のプリン、２２核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１０のプリン、２３核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１０のプリン、２４核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１０または１１のプリン、２５核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１１のプリン、２６核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１１または１２のプリン、２７核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１２のプリン、２８核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１２または１３のプリン、および２９核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１３のプリンを包含する。
【０１３２】
５０％、６０％、７０％、８０％または９０％のプリン含量を得るためのオリゴマーの長さに応じた代表的なプリン核酸塩基数は、前掲の表１から計算される。
【０１３３】
３．３．２  ＧＣ含量
該オリゴマーの核酸塩基配列は、少なくとも約５０％かつ約９０％以下のＧＣ含量、例えば、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％または約９０％のＧＣ含量を有し得る。特定の実施形態において、該オリゴマーは、５０〜９０％、５０〜８５％、５０〜８０％、５０〜７５％、５０〜７０％、５０〜６５％、５０〜６０％、５０〜５５％、５５〜９０％、５５〜８５％、５５〜８０％、５５〜７５％、５５〜７０％、５５〜６５％または５５〜６０％のＧＣ含量を有する。
【０１３４】
代表的な、少なくとも約５０％のＧＣ含量とは、１４核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも７のＧ／Ｃ、１５核酸塩基のオリゴマーの少なくとも７または８のＧ／Ｃ、１６核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも８のＧ／Ｃ、１７核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも８または９のＧ／Ｃ、１８核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも９のＧ／Ｃ、１９核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも９または１０のＧ／Ｃ、２０核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１０のＧ／Ｃ、２１核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１０または１１のＧ／Ｃ、２２核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１１のＧ／Ｃ、２３核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１１または１２のＧ／Ｃ、２４核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１２のＧ／Ｃ、２５核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１２または１３のＧ／Ｃ、２６核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１３のＧ／Ｃ、２７核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１３または１４のＧ／Ｃ、２８核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１４のＧ／Ｃおよび２９核酸塩基のオリゴマー中に少なくとも１４または１５のＧ／Ｃを包含する。
【０１３５】
６０％、７０％、８０％または９０％のＧＣ含量を得るためのオリゴマーの長さに応じた代表的なＧ／Ｃ核酸塩基数は、前掲の表１から計算される。
【０１３６】
３．３．３  プリンとＧＣ含量の実施形態
特定の実施形態において、該オリゴマーの核酸塩基配列は、先に記載のとおり少なくとも約４５％かつ約９０％以下のプリン含量、および先に記載のとおり少なくとも約５０％かつ約９０％以下のＧＣ含量を有する。
【０１３７】
他の実施形態において、該オリゴマーの核酸塩基配列は、少なくとも約５０％かつ約９０％以下のプリン含量、および約５０％未満かつ１０％超、例えば、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％または約１０％のＧＣ含量を有する。こういったものに関する例示的な例では、該オリゴマーは、約４５〜９０％、約４５〜８５％、約４５〜８０％、約４５〜７５％、約４５〜７０％、約４５〜６５％、約４５〜６０％、約４５〜５５％または約４５〜５０％のプリン含量、および約１０〜５０％、約１５〜５０％、約２０〜５０％、約２５〜５０％、約３０〜５０％、約３５〜５０％、約４０〜５０％、約４５〜５０％、約１０〜４５％、約１５〜４５％、約２０〜４５％、約２５〜４５％、約３０〜４５％、約３５〜４５％、約４０〜４５％、約１０〜４０％、約１５〜４０％、約２０〜４０％、約２５〜４０％、約３０〜４０％または約３５〜４０％のＧＣ含量を有する。
【０１３８】
３．３．４  融解温度
該オリゴマーは、好適には、少なくとも約４５℃かつ概して８０℃以下（例えば、約４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃または８０℃）の融解温度（Ｔｍ）を有する。特定の実施形態において、該オリゴマーは、４５〜８０℃、４５〜７５℃、４５〜７０℃、４５〜６５℃、４５〜６０℃、４５〜５５℃、４５〜５０℃、５０〜８０℃、５０〜７５℃、５０〜７０℃、５０〜６５℃、５０〜６０℃または５０〜５５°のＴｍを有する。
【０１３９】
３．３．５  非標的化オリゴマー
表２に提示されたオリゴマーの大部分は、腫瘍細胞の増殖を顕著に阻害するか、または死滅を刺激するが、トランスクリプトームに対する相補性、および／または該ゲノムに対する相同性を実質的に欠いている。
【０１４０】
本発明のオリゴマー核酸塩基配列は、標的腫瘍細胞のトランスクリプトームに対する完全な相補性を欠いており、そしてまた、標的腫瘍細胞が好適にはそれから生じる哺乳動物のゲノムに対する完全な相補性を欠いていることも多い。いくつかの実施形態において、該オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列は、トランスクリプトームに対して実質的な相補性を欠いている。好適には、オリゴマーの核酸塩基の約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる。こういったものに関する例示的な例では、その核酸塩基の９５％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる１４〜２９核酸塩基のオリゴマーは、トランスクリプトームの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対できない少なくとも１の非相補的核酸塩基を有する。他の例示的な例では、その核酸塩基の９０％以下がトランスクリプトームとの塩基対合に関与できる１４〜２９核酸塩基のオリゴマーは、トランスクリプトームの参照核酸塩基配列の核酸塩基と塩基対合できない少なくとも２つの非相補的核酸塩基を有する。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、該オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列は、腫瘍細胞が好適にそれから生じる哺乳動物のゲノムに対して相同性を欠いている。好適には、該オリゴマーの全長にわたる核酸塩基配列は、ゲノムの参照核酸塩基配列を規定する任意の等長の隣接核酸塩基に対して約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％以下の配列同一性を有する。こういったものに関する例示的な例では、ゲノムの参照核酸塩基配列に対して９５％以下の配列同一性を有する１４〜２９核酸塩基のオリゴマーは、該参照核酸塩基配列の対応する位置の核酸塩基と同一でないか、またはそれらと同じであるかもしくは同等な核酸塩基対合能力を有していない少なくとも１の核酸塩基を有する。他の例示的な例では、ゲノムの参照核酸塩基に対して９０％以下の配列同一性を有する１４〜２９核酸塩基のオリゴマーは、該参照核酸塩基配列の対応する位置の核酸塩基と同一でないか、またはそれと同じであるかもしくは同等な核酸塩基対合能力を有していない少なくとも２つの核酸塩基を有する。
【０１４２】
オリゴマーの長さ、ならびに塩基対合に関与できるまたは配列同一性を有する核酸塩基のパーセンテージに応じた代表的な核酸塩基数は、前掲の表１から計算される。
【０１４３】
特定の実施形態において、該非標的化オリゴマー核酸塩基配列は、配列番号１、２、３、５、７、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４４、４５、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５９、６１、６２、６３、６４、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、９１、９２、９３、９４、９８、１００、１０３、１０４、１０５、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１３、１１４、１１５、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３７、１３８、１４３、１４４、１４５、１５２、１５３、１５５、１５６、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７７、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１９１、１９２、１９６、１９８、２０３、２０６、２０７、２０９、２１０、２１１、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５６、２５８、２５９、２６１、２６３、２６４、２６５、２６９、２７０、２７１、２７２、２７４、２７７、２８１、２８２、２８３、２８６、２８７、２９０、２９１、２９２、２９３、２９５、２９６、２９８、３００、３０１および３０３から選択されるいずれか１つのである。
【０１４４】
３．３．６  アンチセンスオリゴマー
特定の標的配列に対して特異性を有するアンチセンスオリゴマーもまた、先に記載の骨格の化学的性質および塩基含量をオリゴマー設計に含めることによってＳＳＢ１および／またはＴＨＯＣ４に結合するように適合させることができることもわかった。これらのオリゴマーはまた、該アンチセンスオリゴマーが標的化される遺伝子にかかわらずインビボまたはインビトロにおいて腫瘍細胞のアポトーシスまたはネクローシスを引き起こすこともわかった。さもなければ、アンチセンスオリゴマーの標的化配列は、標準的なアンチセンス設計プログラムおよび当該技術分野で知られている解析手段を使用して設計できる。
【０１４５】
よって、対象のアンチセンスオリゴマーの核酸塩基配列は、典型的には、選択された遺伝子のアンチセンス鎖に対する実質的な相補性を有する。これらの実施形態において、該核酸塩基配列は、高ストリンジェンシー条件下、選択された遺伝子の標的配列、あるいは選択された遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡ分子を含めた、その転写産物に対して好適に相補的であり、そしてハイブリダイズすることができる。該アンチセンスオリゴマーは、当該技術分野で知られているさまざまな技術を使用して有効性について試験されてもよい。
【０１４６】
例えば、アンチセンスオリゴマーは、ヘテロ二本鎖形成について試験されてもよい。標的核酸配列とヘテロ二量体を形成している所定のアンチセンスオリゴマーの有効性は、当該技術分野で知られているスクリーニング法によって決定され得る。例えば、該オリゴマーは、腫瘍細胞で優先的に発現されるｍＲＮＡを含む細胞培養物中でインキュベートされてもよく、そして、標的ｍＲＮＡに対する効果が、（１）当業者に知られている手順を用いた標的配列および非標的配列とのヘテロ二本鎖形成の存在または不存在、（２）例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットなどの標準的な技術によって測定される、腫瘍細胞によって発現された標的ｍＲＮＡの量、（３）例えば、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット法などの標準的な技術によって測定される、標的ｍＲＮＡから転写されたタンパク質の量、を観察することによって評価される。代わりにまたは加えて、アンチセンスオリゴマーの有効性は、該アンチセンスオリゴマーで処理された腫瘍細胞における標的化された遺伝子の発現を計測することによって決定できる。
【０１４７】
特定の実施形態において、アンチセンスオリゴマーは、ｅＩＦ−４ＥまたはＳＳＢ１を標的化する。例示的アンチセンスオリゴマー核酸塩基配列は、配列番号６、１０、１２、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、３５、１０１、２７８、２７９、２８０、２８４、２８５、２８８、２８９、２９７、および２９９から好適に選択されるいずれか１つである。
【０１４８】
３．４  オリゴマー調節
本発明はまた、１若しくは複数の残基またはコンジュゲートの付加を含めた、本発明のオリゴマー化合物の特性を高められるか、またはオリゴマー化合物またはその代謝産物の追跡に使用できる修飾を企図する。典型的には高められる特性としては、これだけに限定されるものではないが、活性、細胞分布、および細胞内取り込みが挙げられる。いくつかの実施形態において、斯かる修飾オリゴマー化合物は、オリゴマー化合物上の利用可能な官能基、例えばヒドロキシルまたはアミノ官能基などにコンジュゲート基を共有結合で取り付けることによって調製される。本発明のコンジュゲート基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬物力学的特性を高める基、およびオリゴマーの薬物動態学的特性を高める基が挙げられる。典型的なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォラート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が挙げられる。薬物力学的特性を高める基としては、本願発明との関連において、これだけに限定されるものではないが、オリゴマー取り込みを含む特性を改善する、および／またはオリゴマー耐崩壊性を高める基が挙げられる。薬物動態学的特性を高める基としては、本願発明との関連において、これだけに限定されるものではないが、オリゴマー取り込み、分布、代謝および排泄を含めた特性を改善する基が挙げられる。代表的なコンジュゲート基は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６に開示されている。
【０１４９】
コンジュゲート基としては、これだけに限定されるものではないが、コレステロール部分などの脂質部分（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556）、コール酸（Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770）、チオコレステロール（Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホナート（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973）またはアダマンタン酢酸（Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654）、パルミチル部分（Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237）、あるいは、オクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937）が挙げられる。
【０１５０】
本発明のオリゴマー化合物はまた、活性薬物物質、例えば、アスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾサイアジアザイド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌薬または抗生物質に結合させてもよい。オリゴヌクレオチド−薬剤コンジュゲートおよびその調製方法は、米国特許出願第０９／３３４，１３０号に記載されており、そしてその全体を参照により本明細書に援用する。
【０１５１】
本発明のオリゴマー化合物はまた、例えば、ヌクレアーゼ安定性などの特性を増強するために、通常、オリゴマー化合物の一方またはその両方の末端に取り付けられる１若しくは複数の安定化基を有するようにも修飾できる。キャップ構造は安定化基に含まれる。これらの末端修飾は、端末核酸残基を有するオリゴマー化合物をエキソヌクレアーゼ分解から保護するので、細胞内での送達および／または局在を助ける。該キャップは、５’末端（５’−キャップ）または、３′‐末端（３’−キャップ）に存在し得るか、または両末端に存在し得る。制限されることのない例では、５’−キャップとしては、反転脱塩基残基（部分）、４’、５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；１、５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオアート結合；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−反転ヌクレオチド部分；３’−３’−反転脱塩基部分；３’−２’−反転ヌクレオチド部分；３’−２’−反転脱塩基部分；１，４−ブタンジオールホスファート；３’−ホスホルアミダート；ヘキシルホスファート；アミノヘキシルホスファート；３’−ホスファート；３’−ホスホロチオアート；またはホスホロジチオアート；あるいは架橋または非架橋メチルホスホン酸エステル部分（より詳細には、Wincottらの国際ＰＣＴ公報ＷＯ９７／２６２７０を参照（参照により本明細書に援用する）。
【０１５２】
代表的な３’−キャップ構造としては、例えば、４’、５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスファート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスファート、３−アミノプロピルホスファート；６−アミノヘキシルホスファート；１，２−アミノドデシルホスファート；ヒドロキシプロピルホスファート；１、５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオアート；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−反転ヌクレオチド部分；５’−５’−反転脱塩基部分；５’−ホスホルアミダート；５’−ホスホロチオアート；１，４−ブタンジオールホスファート；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホルアミダート、ホスホロチオアートおよび／またはホスホロジチオアート、架橋または非架橋メチルホスホン酸エステルおよび５’−メルカプト残基（詳細については、Beaucage and Tyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925および２００５年１月２７日に公開された公開米国特許出願広報ＵＳ２００５／００２０５２５を参照）。
【０１５３】
本発明のオリゴマーは、ＤＮＡ様化合物（Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press）および／またはＲＮＡ様化合物（Scaringe, Methods, 2001, 23, 206-217. Gait et al., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA:Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo et al., Tetrahedron, 2001, 57, 5707-5713）を適宜合成するための文献手順を含めた、当業者に周知の方法を使用して調製できる。
【０１５４】
あるいは、本発明のオリゴマー化合物は、例えば、Sigma-Aldrich Inc.（Castle Hill, NSW, Australia）などの様々なオリゴヌクレオチド合成企業から購入してもよい。使用される特定のプロトコールの如何にかかわらず、対象のオリゴマー化合物は、固相合成法の周知の技術によって便利に、かつ、日常的に作製され得る。斯かる合成のための装置は、例えばApplied Biosystems（Foster City, Calif.）を含めたいくつかの業者によって販売されている。当該技術分野で知られている斯かる合成のためのその他の手段がさらにまたはその代わりに利用されてもよい（溶液相合成を含む）。オリゴマー化合物の精製および分析の方法は当業者に知られている。分析法としては、毛細管電気泳動（ＣＥ）およびエレクトロスプレー質量スペクトルが挙げられる。本発明の方法は、オリゴマー合成または精製方法に限定されない。
【０１５５】
３．５  オリゴマー特性
オリゴマー化合物は、遊離（非複合型）形態で投与されたときには、腫瘍細胞膜を越えて促進または能動輸送により、あるいは複合形態で投与されたときには、エンドサイトーシス機構により腫瘍細胞によって取り込まれ得る。該オリゴマーは、細胞膜を越える該オリゴマーの輸送または能動輸送を容易にできる、膜輸送システム（すなわち、（単数もしくは複数の）膜タンパク質）の基質であってもよい。この特性は、次のようにしてオリゴマー相互作用または細胞取り込みに関する多くの試験のうちの１つによって測定され得る。
【０１５６】
第一の試験では、細胞表面の選択された荷電オリゴマーを置き換えるか、またはそれらによって置き換えられるオリゴマー化合物の能力を調べることによって、細胞表面受容体の結合を評価する。細胞は、約１０〜３００ｎＭの最終オリゴマー濃度にて、典型的には蛍光標識された所定の数量の試験オリゴマーと一緒にインキュベートされる。そのすぐ後、例えば１０〜３０分後に（試験オリゴマーの顕著な内在化が起こり得る前に）、徐々に高くなる濃度にて、置換化合物が添加される。試験化合物が細胞表面受容体に結合することができるのであれば、置換化合物が試験化合物を置き換えるのが観察される。置換化合物が１０×試験化合物濃度以下の濃度にて５０％置換を生じることが示されるのであれば、試験化合物が置換化合物と同じ細胞輸送系の認識部位にて結合すると見なされる。
【０１５７】
第二の試験は、試験化合物が標識レポーター、例えば、蛍光レポーターを細胞内に輸送する能力を調べることによって細胞輸送を計測する。細胞は、約１０〜３００ｎＭの終濃度で加えられる標識試験化合物の存在下でインキュベートされる。３０〜１２０分間のインキュベーション後に、細胞は細胞内の標識について、例えば、顕微鏡法によって試験される。細胞内標識の顕著な存在は、試験化合物が促進または能動輸送によって輸送されことの証拠となる。
【０１５８】
該オリゴマー化合物はまた複合形態で投与されてもよく、ここで、複合化剤は、典型的には、該オリゴマーのあらゆる正味電荷に対する反対荷電を有するポリマー、例えば、カチオン脂質、ポリペプチド、または非生物学的カチオンポリマーである。アニオン系オリゴヌクレオチドとカチオン脂質または他のポリマーとの間の複層複合体を含めた複合体を形成する方法は周知である。例えば、カチオン脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシル）プロピル］−Ｎ，Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）および中性リン脂質ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）を含むリポソーム組成物Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（Felgner et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84(21): 7413-7417）が幅広く使用される。投与後、該複合体は、典型的には、エンドソーム本体内への粒子カプセル化に関与する、エンドサイトーシス機構を通して細胞によって取り込まれる。
【０１５９】
該オリゴマー化合物はまた、該オリゴマーの５’または３’末端への共有結合で連結した高アルギニンペプチドとの抱合型で投与されてもよい。該ペプチドは、典型的には、８〜１６アミノ酸であり、かつ、アルギニン混合物、およびフェニルアラニンとシステインを含む他のアミノ酸から成る。高アルギニンペプチド−ＰＭＯコンジュゲートの使用は、オリゴマーの細胞内取り込みを促進するのに使用できる（例えば、Moulton et al., Bioconjug Chem, 2004, 15(2): 290-299; Nelson et al., Bioconjug Chem, 2005, 16(4): 959-966を参照）
【０１６０】
場合によっては、リポソームが細胞内へのオリゴマーの取り込みを容易にするのに利用され得る（例えば、Williams, S. A., Leukemia 10(12): 1980-1989, 1996; Lappalainen et al., Antiviral Res., 1994, 23:119; Uhlmann et al., Chemical Reviews, 1990, 90(4): 544-584を参照）。ヒドロゲルはまた、例えば、ＷＯ９３／０１２８６に記載のとおり、オリゴマー投与のためのビヒクルとしても使用され得る。あるいは、該オリゴマーは、マイクロスフィアまたはマイクロ粒子で投与されてもよい（例えば、Wu, G. Y. and Wu, C. H., J. Biol. Chem. 1987, 262:4429-4432を参照）。あるいは、該アンチセンスオリゴマーと複合させたガス充填マイクロバブルの使用は、米国特許第６，２４５，７４７号に記載のとおり、標的組織への送達を促進できる。
【０１６１】
他の例では、本発明のオリゴマーの必要な取り込み特性は、標識化合物が動物（例えば、哺乳動物）に投与され、そして、該オリゴマーが投与された数時間後に動物から採取される体液サンプルがアッセイされるか、または該動物の全部または一部がその動物の腫瘍細胞内のオリゴマーの存在について画像化される、簡単なインビボ検査によって確認できる。
【０１６２】
特定の実施形態において、対象のオリゴマー化合物は、非腫瘍または正常細胞に比べて、哺乳動物の腫瘍細胞によって優先的に取り込まれる。
【０１６３】
本発明のオリゴマー化合物は、好適にＴＨＯＣ４および／またはＳＳＢ１に結合する。候補オリゴマーは、アフィニティーアッセイを含めた任意の好適なアッセイも使用して、一方または両方のタンパク質への結合に関して試験され得る。該アッセイは、ＴＨＯＣ４および／またはＳＳＢ１に関するオリゴマー化合物の解離速度定数（ｋｄ）、会合速度定数（ｋａ）または平衡結合定数（ＫＤ）のうちのいずれか１以上を計測できる。これらの定数は、いくつかの実施形態において、放射性標識または蛍光標識オリゴマー結合定量法によって計測した。このアッセイは、最小濃度の標識オリゴマーを用いて一連のＴＨＯＣ４またはＳＳＢ１の滴定を平衡化する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、ＴＨＯＣ４またはＳＳＢ１への結合の程度を測定するのに使用される。
【０１６４】
親和性測定は、核酸：タンパク質相互作用に関する標準的な方法論、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Rich and Myszka Curr. Opin. Biotechnol, 2000, 11: 54; Englebienne Analyst. 1998, 123: 1599）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）または当該技術分野で知られている他の動力学的相互作用アッセイによって測定できる。特定の実施形態において、該定数は、例えば、固定されたＴＨＯＣ４もしくはＳＳＢ１またはその領域と共にＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴法（BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.）を使用した、表面プラズモン共鳴法アッセイを使用することによっても計測される。代表的なＳＰＲ法が米国特許第７，２２９，６１９号に記載されている。
【０１６５】
特定の実施形態において、ＴＨＯＣ４は、同じ条件下（例えば、３７℃にて１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭのＮａＣｌを含有する水性条件下）で、陰性対照オリゴマーＮｅｇ＿ＣのＫＤより少なくとも２倍低いＫＤにて腫瘍調節オリゴマーに結合する。代表的な条件が実施例３に記載されている。代表的な例では、該オリゴマーは、ＫＤ≦約６０ｎＭ、≦約５０ｎＭ、≦約４０ｎＭ、≦約３０ｎＭ、≦約２０ｎＭまたは≦約１０ｎＭで、ｈＴＨＯＣ４を含めたＴＨＯＣ４に結合する。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、ＯＢ折り畳みタンパク質は、同じ条件下（例えば、３７℃にて１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭのＮａＣｌを含有する水性条件下）で、陰性対照オリゴマーＮｅｇ＿ＣのＫＤより少なくとも２倍低いＫＤにて腫瘍調節オリゴマーに結合する。代表的な条件が実施例３および７に記載されている。代表的な例では、該オリゴマーは、ＫＤ≦約１０ｎＭ、≦約５ｎＭ、≦約４ｎＭ、≦約３ｎＭまたは≦約２ｎＭで、ＳＳＢ１およびＳＳＢ２を含めたＯＢ折り畳みタンパク質に結合する。こういったものに関する例示的な例では、ＳＳＢ１は、同じ条件下（例えば、３７℃にて１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭのＮａＣｌを含有する水性条件下）で、陰性対照オリゴマーＮｅｇ＿ＣのＫＤより少なくとも２倍低いＫＤにて腫瘍調節オリゴマーに結合する。代表的な条件が実施例３に記載されている。代表的な例では、該オリゴマーは、ＫＤ≦約１０ｎＭ、≦約５ｎＭ、≦約４ｎＭ、≦約３ｎＭまたは≦約２ｎｍで、ｈＳＳＢ１およびｍＳＳＢ１を含めたＳＳＢ１に結合する。他の例示的な例では、ＳＳＢ２は、同じ条件下（例えば、３７℃にて１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１００ｍＭのＮａＣｌを含有する水性条件下）で、陰性対照オリゴマーＮｅｇ＿ＣのＫＤより少なくとも２倍低いＫＤにて腫瘍調節オリゴマーに結合する。代表的な条件が実施例７に記載されている。代表的な例では、該オリゴマーは、ＫＤ≦約１０ｎＭ、≦約５ｎＭ、≦約４ｎＭ、≦約３ｎＭまたは≦約２ｎＭで、ｈＳＳＢ２を含めたＳＳＢ２に結合する。代わりにまたは加えて、本発明のオリゴマー化合物は、インシリコでのモデリングを使用して設計および／または同定されてもよい。例えば、ＯＢ折り畳みタンパク質の三次元の二級、三級および／または四級アミノ酸残基構造の表示を提供する構造モデルが使用されてもよい。構造モデルは、Ｘ線結晶構造、ＮＭＲ構造、理論上のタンパク質構造、相同性モデリングから作り出された構造、タンパク質トモグラフィモデル、および電子顕微鏡研究から構築された原子モデルを包含する。特定の実施形態において、候補オリゴマーとのＯＢ折り畳みタンパク質複合体の原子論的分子動力学（ＭＤ）シミュレーションは、本明細書中に開示されるように、ＯＢ折り畳みタンパク質に関して有望な親和性および抗新生物活性を有する化合物を同定するのに使用できる。多数のＭＤシミュレーション技術が当該技術分野で知られており、その代表的な例は、例えば、Allison JR（2016, Curr Opin Struct Biol. 43:79-87）、Ganesanら（2016, Drug Discov Today S1359-6446(16)30414-7）およびKarplusら（2002, Nature Structural Biology 9: 646-652）によって開示されている。
【０１６７】
本発明のオリゴマーは、腫瘍細胞の核から細胞質へのＲＮＡ、典型的には、ｍＲＮＡの移行を遮断し得る。核へのＲＮＡの移行は、例えば、２以上の蛍光標識種の発光が同時に検出される核内移行アッセイによって計測できる。例えば、細胞核は、例えばＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２などのＤＮＡに特異的な公知のフルオロフォアで標識できる。ＲＮＡは、直接的にまたは間接的に標識できる、例えば、ＲＮＡに特異的な蛍光標識抗体。核にまたは核から移行するＲＮＡの量は、第２の蛍光標識された種、すなわち、米国特許第６，４００，４８７号に記載のＲＮＡ対して相関または非相関様式で分配される第１の蛍光標識された種、すなわち、核、の量を測定することによって決定できる（上記文献の内容を参照により本明細書に援用する）。
【０１６８】
本発明のオリゴマー化合物は、腫瘍細胞の増殖を阻害し、そして、腫瘍細胞のアポトーシスまたはネクローシスを引き起こすことが多い。細胞増殖は、増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）に結合するフルオレセイン標識された抗ＰＣＮＡ抗体（例えば、ＰＣ−１０、Santa Cruz Biotechnology）に細胞を晒すことによってアッセイされ得る。選択されたオリゴマーは、細胞株の増殖に対する効果について試験され得る。２×１０５〜２×１０８個の細胞が９６ウェルプレートの各ウェル内で平板培養され得る。次に、１μＭ〜１０μＭのそれぞれのオリゴマーを含有する培地が三連でウェルに添加され得る。最小限では、陰性（リガンドなし）および陽性対照も実施される。２時間後に、ＦＩＴＣ抗ＰＣＮＡがウェルに加えられ、１５分間細胞と共にインキュベートされ、そして、３回の洗浄ステップ後に、蛍光のレベルがプレートリーダを使用して測定され得る。ＰＣＮＡアッセイは、細胞および組織で既に使用された（Kulldorff et al. J. Clin Epidemiology, 2000, 53:875）。増殖を阻害するオリゴマー化合物は、乳癌または前立腺癌患者を含めた癌患者からの新しい腫瘍生検に対して試験され得る。腫瘍生検検体の小片が９６ウェルプレートのウェル内で平板培養され、そして、上記と同じアッセイを二連で各サンプルを用いて繰り返した。蛍光を読出した後で、該サンプルが蛍光顕微鏡で評価され、その増殖が実際に影響を受けている細胞が癌細胞であることを確認した。
【０１６９】
アポトーシスは、細胞膜ホスファチジルセリン結合色素（ＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ；例えばＣｙ５．５などの代替色素が使用されてもよい）を使用してアッセイされ得る。本発明のオリゴマー化合物は、様々な細胞株のアポトーシスに対する効果について試験され得る。２×１０５〜２×１０８個の細胞が９６ウェルプレートの各ウェル内で平板培養され、そして、１μＭ〜１０μＭのそれぞれのオリゴマーを含有する培地が三連でウェルに添加される。最小限では、陰性（オリゴマーなし）および陽性（ｂｃｌ２反応性リガンド）対照も実施される。１．５時間後に、ＦＩＴＣ Ａｎｎｅｘｉｎがウェルに加えられ、１５分間細胞と共にインキュベートされ、そして、３回の洗浄ステップ後に、蛍光のレベルがプレートリーダを使用して測定される。該アッセイは、ｂｃｌ−２発現細胞およびｂｃｌ−２トランスジェニックマウス（Charles River）由来の組織を使用することによって細胞から組織に移転可能であることが実証され得る。アポトーシスを引き起こすリガンドは、乳癌患者からの新鮮な腫瘍生検に対して試験され得る。原発性組織生検検体を使用する１つの利点は、アッセイが組織取得から２時間以内に、すなわち、組織が虚血に関連する変化を示し始める前に、実施され得ることである。腫瘍生検検体の小片が９６ウェルプレートのウェル内で平板培養され、そして、上記と同じアッセイが二連で各サンプルを用いて繰り返される。蛍光を読出した後で、該サンプルは、ＤＡＰＩ（Molecular Probes, Eugene Oreg.）染色で染色され、そして、核形態が核凝縮および確認のための断片化について蛍光顕微鏡で評価され得る。あるいは、ＤＮＡ鎖切断を標識する古典的なＴＵＮＥＬ（デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ媒介性ビオチン化デオキシウリジントリホスファターゼニック末端標識）法が使用されてもよい。
【０１７０】
ネクローシスを検出する技術としては、これだけに限定されるものではないが、例えば、ヨウ化プロピジウムまたはＴＯＴＯ−３などのＤＮＡ結合色素の古典的な技術が挙げられる。あるいは、ミトコンドリア酵素放出に関する比色メチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイもまた細胞生存性を測定するのに使用される。特定の実施形態において、細胞生存性は、ＤＮＡ結合色素ヨウ化プロピジウムおよびＴＯＴＯ−３を使用して決定される。細胞株においてこれらのアッセイを実施することは、当業者がネクローシスとアポトーシスを識別することを可能にし、そして、広く細胞毒性であるオリゴマーから特異的効果を有するオリゴマーを識別することを容易にし得る。この識別はまた、並行してネクローシスおよびアポトーシスアッセイを行うことによっても容易になり得る。選択されるオリゴマーは、細胞株のネクローシスに対する効果について試験され得る。２×１０５〜２×１０８個の細胞が９６ウェルプレートの各ウェル内で平板培養され、そして、１μＭ〜１０μＭのそれぞれのオリゴマーを含有する培地が三連でウェルに添加される。最小限では、陰性（オリゴマーなし）および陽性対照も実施される。８時間後に、ヨウ化プロピジウムまたはＴＯＴＯ−３がウェルに加えられ、１５分間細胞と共にインキュベートされ、そして、３回の洗浄ステップ後に、蛍光のレベルが蛍光プレートリーダを使用して測定される。ネクローシスは、それが一般的に少なくとも８時間後にアッセイされるので、こうした合間の後に組織生検の虚血により多くのネクローシスが存在して高いバックグラウンドを示すので、組織生検に移すのが難しいアッセイであり得る。この問題を克服するために、ヒト生検組織をヌードマウスに移植してもよく、その結果、８時間のアッセイ期間中の虚血誘発性ネクローシスを予防する。ヌードマウスにおける成長が腫瘍を変化させないことを保障するために、ヌードマウス内で１カ月間培養した腫瘍は、外植され、そして、短期アポトーシスおよび増殖について試験されてもよい。該腫瘍はまた、組織学的に観察され、そして、新鮮な腫瘍外植片と比較されて、違いを評価されてもよい。同じ標的に結合して、その５０％でネクローシスを引き起こすリガンドが、動物内の腫瘍に注入され、８時間後に回収され、そして、ヨウ化プロピジウムで染色され得る。組織学的検査は、生検検体の他の細胞がネクローシスを受けないのに対して、腫瘍細胞がネクローシスを受けることを明らかにし得る。
【０１７１】
４．オリゴマー組成物と適用
本発明のオリゴマー化合物の機能は、癌を腫瘍細胞の増殖、生存または生存能力を阻害するか、処置するか、または予防するための活性成分として有用である。該腫瘍細胞は、インビボまたはインビトロで処置できる。よって、対象のオリゴマーは、好適には、癌を処置するかまたは予防するための医薬組成物において有用である。このように、本発明は、癌の症状を処置、予防、および／または軽減するための医薬組成物を企図し、ここで、該組成物は、有効量の本発明のオリゴマーと医薬的に許容し得る担体を含む。
【０１７２】
本発明のオリゴマー化合物は、任意の医薬的に許容され得る塩、エステル、もしくは斯かるエステルの塩、または動物への投与時に、典型的にはヒトを含めた哺乳動物が生物活性代謝産物またはその残留物を（直接的または間接的に）提供できるその他の化合物も包含する。従って、例えば、開示はまた、本発明のオリゴマー化合物のプロドラッグおよび医薬的に許容され得る塩、斯かるプロドラッグの医薬的に許容され得る塩、ならびに他の生物学的同等物も明確にする。核酸オリゴマーに関しては、医薬的に許容され得る塩およびそれらの用途に関する例は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている（上記特許をその全体で本明細書に援用する）。
【０１７３】
本発明の組成物はまた、取り込み、分布、および／または吸収を助けるために、混合されても、カプセル化されても、抱合されても、または他の分子、分子構造もしくは、例えば、リポソーム、受容体標的化分子、経口、経直腸、局在または他の処方のような、化合物の混合物と関連した別の状態であってもよい。斯かる取り込み、分布、および／または吸収を促進する処方の調製について教示する代表的な特許文献としては、これだけに限定されるものではないが、米国特許第５，１０８，９２１号；同第５，３５４，８４４号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４５９，１２７号；同第５，５２１，２９１号；同第５，５４３，１５８号；同第５，５４７，９３２号；同第５，５８３，０２０号；同第５，５９１，７２１号；同第４，４２６，３３０号；同第４，５３４，８９９号；同第５，０１３，５５６号；同第５，１０８，９２１号；同第５，２１３，８０４号；同第５，２２７，１７０号；同第５，２６４，２２１号；同第５，３５６，６３３号；同第５，３９５，６１９号；同第５，４１６，０１６号；同第５，４１７，９７８号；同第５，４６２，８５４号；同第５，４６９，８５４号；同第５，５１２，２９５号；同第５，５２７，５２８号；同第５，５３４，２５９号；同第５，５４３，１５２号；同第５，５５６，９４８号；同第５，５８０，５７５号；同第５，５９５，７５６号が挙げられ、そのそれぞれを参照によって本明細書中に援用される。
【０１７４】
本発明の医薬組成物は、局所的または全身処置が所望されるか、および処置されるべき領域に依存して、多くの方法で投与され得る。投与は、局部的（眼科用および腟および直腸送達を含めた粘膜への投与を含む）、例えば、ネブライザによるものを含めた、粉末またはエアゾールの吸入または吹送による、肺；気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口または非経口であってもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射または輸液；または頭蓋内、例えば、膜下腔内もしくは脳室内の投与が挙げられる。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴマーは特に経口投与に有用であると考えられる。局所投与のための医薬組成物および処方としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液剤および粉剤が挙げられる。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが、必要とされても、または所望されてもよい。被覆コンドーム、手袋なども有用であり得る。
【０１７５】
本発明の医薬組成物としては、これだけに限定されるものではないが、溶液、乳濁液、フォームおよびリポソーム含有製剤が挙げられる。本発明の医薬組成物は、１若しくは複数の透過増強剤、担体、賦形剤または他の活性もしくは不活性成分を含んでもよい。
【０１７６】
当業者は、それらの意図された用途、すなわち、投与経路、に従って医薬組成物が規定どおりに設計されることを認識している。
【０１７７】
例えば、局所投与に好ましい処方としては、本発明のオリゴヌクレオチドが、例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤などの局所送達剤との混合物の状態で存在するものが挙げられる。好ましい脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、アニオン性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。透過増強剤およびそれらの用途は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている（上記特許をその全体で本明細書に援用する）。界面活性剤とそれらの用途は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている（上記特許をその全体で本明細書に援用する）。
【０１７８】
経口投与のための組成物としては、粉剤および顆粒剤、マイクロ粒子剤、ナノ粒子剤、水中または非水性溶媒中の懸濁液または溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤あるいはミニタブレットが挙げられる。増粘剤、着香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましくてもよい。好ましい経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが１若しくは複数の透過増強剤である界面活性剤およびキレート剤と共に投与されるものである。好ましい界面活性剤としては、脂肪酸および／またはそのエステルまたは塩、胆汁酸および／またはその塩が挙げられる。好ましい胆汁酸／塩および脂肪酸、ならびにそれらの用途は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている（上記特許をその全体で本明細書に援用する）。透過増強剤、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩の組み合わせもまた好まれる。特に好ましい組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる透過増強剤としては、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明のオリゴマー化合物は、スプレードライ粒子を含むか、またはマイクロもしくはナノ粒子を形成するように複合体を形成させた顆粒形態で経口的に送達されてもよい。核酸オリゴマー複合化剤とそれらの用途は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されている（上記特許をその全体で本明細書に援用する）。核酸オリゴマーの経口製剤およびその調製方法は、米国特許出願番号第０９／１０８，６７３号（１９９８年７月１日に出願）、同第０９／３１５，２９８号（１９９９年５月２０日に出願）、および同第１０／０７１，８２２号（２００２年２月８日に出願）に詳細に記載されている（上記特許をその全体で本明細書に援用する）。
【０１７９】
別の関連する実施形態において、処置的に有効な併用療法は、２以上の本発明の組成物の使用を含んでもよく、ここで、該複数の組成物は、単独または複数の核酸標的を標的化する。アンチセンスオリゴマー化合物の多数の例が当該技術分野で知られている。２以上の併用化合物は一緒にまたは連続して使用され得る。
【０１８０】
その化合物が医薬的に活性である限りあらゆるオリゴマー化合物を本発明の組成物と方法に用いることができる。「医薬的に活性な」オリゴマーは、腫瘍細胞の（ｉ）形成；（ｉｉ）増殖；（ｉｉｉ）生存率；（ｉｖ）生存能力；または（ｖ）維持の減少、障害、抑止、または予防、および／または、それを必要とする個体に投与したときの、症状の発生の予防、そのような症状の抑制、または存在する癌関連症状の治療といったような癌の治療および／または予防をもたらす形態である。
【０１８１】
本発明の方法に用いるための投与方法、投与したオリゴマーの量、およびオリゴマー製剤は、当該分野のルーチンおよび当業者の技術内である。癌を治療したか否かは、適切な対照に比べて疾患の経過を示す１またはそれ以上の診断パラメーターを測定することにより決定する。動物実験の場合において、「適切な対照」は、オリゴマー化合物で治療されていないか、またはオリゴマー化合物を含まない医薬組成物で治療した動物である。ヒト対象の場合は、「適切な対照」は、治療前の個体、またはプラセボで処置したヒト（例えば、年齢が適合するかまたは同様の対照）であり得る。本発明によれば、癌の治療は、限定されるものではないが、（１）患者の癌の（ｉ）形成；（ｉｉ）増殖；（ｉｉｉ）生存率；（ｉｖ）生存能力；または（ｖ）維持の進行を弱め、抑制し、減じ、予防し、または阻止し、および／または；（２）対象の癌（例えば、原発性または転移性癌）を治療し；（３）癌体質であるがまだ癌と診断されていない（すなわち、処置が、癌の予防的処置を構成する）対象の癌（例えば、原発性癌または転移性癌）を予防し；または（ｉｉｉ）癌（例えば、原発性癌または転移性癌）の退縮をもたらすことを含み、包含する。
【０１８２】
本発明の組成物と方法は、癌と診断されているか、癌があると疑われるか、癌に罹りやすいことがわかっており、癌が発生する可能性があると考えられるか、または以前に治療した癌の再発を生じる可能性があると考えられる個体を治療するのに適している。癌はホルモンレセプター陽性またはホルモンレセプター陰性であり得る。ある態様において、該癌（例えば、非転移性癌または転移性癌）はホルモンレセプター陰性であり、ホルモンまたはエンドクリン療法に抵抗性である。癌が乳癌である態様において、乳癌（例えば、非乳腺ＣＭＣ腫瘍細胞）はホルモンレセプター陰性（例えば、エストロゲンレセプター（ＥＲ）陰性および／またはプロゲステロンレセプター（ＰＲ）陰性）である。
【０１８３】
本発明はまた、オリゴマー化合物を非ＣＭＣ腫瘍細胞増殖、生存、または生存能力を阻害する少なくとも１の癌療法と同時に投与することも予期する。オリゴマー化合物は、該癌療法後に治療的に用いるか、または該療法を施す前または該療法と一緒に用いることができる。したがって、本発明は、本発明のオリゴマー化合物および癌療法（その非限定的例は、放射線療法、外科手術、化学療法、ホルモン除去療法、アポトーシス促進療法および免疫療法を含む）の同時投与を用いる併用療法を予期する。
【０１８４】
４．１  射線療法
放射線療法は、ＤＮＡ損傷、例えば、γ放射線治療、Ｘ線、ＵＶ放射線治療、マイクロ波、電子放出、ラジオアイソトープなどを誘導する放射腺照射および波を含む。療法は、上記の形の放射腺照射で局所腫瘍部位を照射することにより達成できる。おそらくこれらの因子のすべては、ＤＮＡ前駆体、ＤＮＡの複製と修復、および染色体の組み立てと維持における広範囲の損傷ＤＮＡをもたらす。
【０１８５】
Ｘ線の線量範囲は、５０〜２００レントゲンを長期間（３〜４週間）毎日から２０００〜６０００レントゲンの単一線量の範囲である。ラジオアイソトープの線量範囲は大きく変化し、アイソトープの半減期、放射した放射線の強さと種類、および新生物細胞による取り込みに依存する。
【０１８６】
放射線療法の非限定的例は、高精度放射線外部照射（５０〜１００グレイを４〜８週間にわたりフラクションとして照射）、単発または分割高線量率小線源射療法、永続的組織内小線源射療法、全身性ラジオアイソトープ（例えば、ストロンチウム８９）を含む。ある態様において、放射線療法は、放射線増感剤と組み合わせて投与することができる。放射線増感剤の実例は、限定されるものではないが、エファプロキシラル、エタニダゾール、フルオゾール、ミソニダゾール、ニモラゾール、テモポルフィン、およびチラパザミンを含む。
【０１８７】
４．２  化学療法
化学薬剤は、下記カテゴリーのいずれかまたはそれ以上から選ぶことができる：
【０１８８】
（ｉ）内科的腫瘍学に用いる抗増殖／抗新生物薬およびそれらの併用、例えばアルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、クロランブシル、ブスルファン、およびニトロソウレア）；代謝拮抗物質（例えば、抗葉酸薬、例えばフルオロピリジン、例えば５−フルオロウラシルおよびテガフル、ラルチトレキセド、メトトレキセート、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシウレア；抗腫瘍抗生物質（例えば、アントラサイクリン、例えばアドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ダクチノマイシン、およびミソラマイシン））；抗有糸分裂薬（例えば、ビンカアルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン、およびタキソイド、例えばパクリタキセルおよびドセタキセル；およびトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エピポドフィロトキシン、例えばエトポシドおよびテニポシド、アムサクリン、トポテカン、およびカンプトテシン）；
【０１８９】
（ｉｉ）細胞増殖抑制剤、例えば抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、およびヨードキシフェン）、エストロゲンレセプター下方調節剤（例えば、フルベストラント）、抗アンドロゲン（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、およびシプロテロンアセテート）、ＵＨアンタゴニストまたはＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、ロイプロレリン、およびブセレリン）、プロゲストーゲン（例えば、メゲストロールアセテート）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾール、およびエキセメスタン）、および５α−レダクターゼ阻害剤、例えばフィナステリド；
【０１９０】
（ｉｉｉ）癌細胞浸潤を阻害する薬剤（例えば、メタロプロテアーゼ阻害剤、例えばマリマスタット、およびウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子レセプター機能阻害剤）；
【０１９１】
（ｉｖ）増殖因子機能の阻害剤、例えば、そのような阻害剤は以下を含む：増殖因子抗体、増殖因子レセプター抗体（例えば、抗ｅｒｂｂ２抗体トラスツズマブ［Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）および抗ｅｒｂｂ１抗体セツキシマブ［Ｃ２２５］）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、およびセリン／トレオニンキナーゼ阻害剤、例えば上皮増殖因子ファミリーの他の阻害剤（例えば、他のＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、例えばＮ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−メトキシ−６−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリン−４−  −アミン（ゲフィチニブ、ＡＺＤ１８３９）、Ｎ−（３−エチニルフェニル）−６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）キナゾリン−４−アミン（エルロチニブ、ＯＳＩ−７７４）、および６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）キナゾリ−ｎ−４−アミン（ＣＩ １０３３））、例えば、血小板由来増殖因子ファミリーの阻害剤、例えば肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤；
【０１９２】
（ｖ）抗血管新生剤、例えば血管内皮増殖因子の効果を阻害するもの（例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ［Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）］、例えば、国際特許出願ＷＯ９７／２２５９６、ＷＯ９７／３００３５、ＷＯ９７／３２８５６およびＷＯ９８／１３３５４に記載の化合物）および他のメカニズムにより作用する化合物（例えば、リノミド、インテグリンαｖβ３機能の阻害剤、およびアンギオスタチン）；
【０１９３】
（ｖｉ）血管損傷剤、例えばコンブレスタチンＡ４および国際特許出願ＷＯ９９／０２１６６、ＷＯ００／４０５２９、ＷＯ００／４１６６９、ＷＯ０１／９２２２４、ＷＯ０２／０４４３４、およびＷＯ０２／０８２１３に記載の化合物；
【０１９４】
（ｖｉｉ）アンチセンス療法、例えば、上記標的を標的とするもの、例えばＩＳＩＳ ２５０３、抗ｒａｓアンチセンス；および
【０１９５】
（ｖｉｉｉ）以下を含む遺伝子療法アプローチ：例えば、異常遺伝子（例えば異常ｐ５３）置換アプローチ、または異常ＧＤＥＰＴ（遺伝子標的酵素プロドラッグ療法）アプローチ、例えば、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、または細菌ニトロレダクターゼ酵素を用いるもの、および化学療法または放射線療法に対する患者の耐容性を増加させるためのアプローチ、例えば多薬剤耐性遺伝子療法。
【０１９６】
４．３  免疫療法
免疫療法アプローチは、例えば、患者腫瘍細胞の免疫原性を増加させるエクスビボおよびインビボアプローチ、例えば、サイトカイン、例えば、インターロイキン２、インターロイキン４、または顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子によるトランスフェクション、Ｔ細胞アネルギーを減少させるアプローチ、トランスフェクションした免疫細胞、例えばサイトカインでトランスフェクションした樹状細胞を用いるアプローチ、サイトカインでトランスフェクション腫瘍細胞株を用いるアプローチ、および抗イデオタイプ抗体を用いるアプローチを含む。これらのアプローチは、一般的には、癌細胞を標的とし破壊する免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存する。免疫エフェクターは、例えば悪性細胞表面のあるマーカーに特異的な抗体であり得る。該抗体は単独で療法のエフェクターとして役立つか、細胞の殺滅を実際に促進する他の細胞を補充することができる。また、該抗体は、薬剤または毒素（化学薬剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）と結合し、単に標的物質として役立ちうる。あるいはまた、該エフェクターは、悪性細胞標的と直接または間接的に相互作用する表面分子を保持するリンパ球であり得る。種々のエフェクター細胞は細胞毒性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む。
【０１９７】
３．４  他の療法
他の癌療法の例は、光線療法、冷凍療法、毒素療法、またはアポトーシス促進療法を含む。当業者は、このリストは癌および他の過形成病変に利用可能な治療法の種類を網羅していないことがわかるだろう。
【０１９８】
化学療法および放射線療法が急速に分裂する細胞を標的とし、および／または細胞周期または細胞分裂を崩壊させることはよく知られている。これらの治療は、その進行を遅くし、または治癒的治療により疾患の症状を逆転させるために癌の種々の形の治療の部分として提供される。しかしながら、これらの癌治療は、免疫不全状態を生じ、それに続いて病原感染症をもたらすことがあり、したがって、本発明は、癌療法から生じる免疫不全状態から生じる感染症に有効であるかまたはそのリスクの増加がある本発明のオリゴマー化合物、癌療法、および高感染剤を用いる併用療法にも及ぶ。抗感染剤は、適切には、限定されるものではないが、微生物、例えば、ウイルス、細菌、酵母、真菌、原虫などを殺すかまたはその増殖を阻害する化合物を含む抗微生物薬から選ばれ、抗生物質、殺アメーバ薬、抗真菌剤、抗原虫薬、抗マラリア薬、抗結核薬、および抗ウイルス薬を含む。抗感染薬は、その範囲内に駆虫薬および抗線虫薬も含む。実例となる抗生物質は以下を含む：キノロン（例えば、アミフロキサシン、シノキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、フルメクイン、ロメフロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、オフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、オキソリニック酸、ペフロキサシン、ロソキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、スパルフロキサシン、クリナフロキサシン、ガチフロキサシン、モキシフロキサシン；ゲミフロキサシン；およびガレノキサシン）、テトラサイクリン、グリシルサイクリン、およびオキサゾリジノン（例えば、クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、チゲサイクリン；リネゾリド、エペロゾリド）、グリコペプチド、アミノグリコシド（例えば、アミカシン、アルベカシン、ブチロシン、ジベカシン、ホルチマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、メオマイシン、ネチルマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン）、β−ラクタム（例えば、イミペネム、メロペネム、ビアペネム、セファクロール、セファドロキシル、セファマンドール、セファトリジン、セファゼドン、セファゾリン、セフィキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォラニド、セフォタキシム、セフォチアム、セフピミゾール、セフピラミド、セフポドキシム、セフスロジン、セフタジジム、セフテラム、セフテゾール、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトリアゾン、セフロキシム、セフゾナム、セファアセトリル、セファレキシン、セファログリシン、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セファラジン、セフィネタゾール、セフォキシチン、セフォテタン、アズトレオナム、カルモナム、フロモキセフ、モキサラクタム、アミジノシリン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、ベンジルペニシリン、カルフェシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、メチシリン、メズロシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、ピペラシリン、スルベニシリン、テモシリ���、チカルシリン、セフジトレン、ＳＣ００４、ＫＹ−０２０、セフジニル、セフチブテン、ＦＫ−３１２、Ｓ−１０９０、ＣＰ−０４６７、ＢＫ−２１８、ＦＫ−０３７、ＤＱ−２５５６、ＦＫ−５１８、セフォゾプラン、ＭＥ１２２８、ＫＰ−７３６、ＣＰ−６２３２、Ｒｏ ０９−１２２７、ＯＰＣ−２００００、ＬＹ２０６７６３）、リファマイシン、マクロライド（例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、オレアンドロマイシン、ロキタマイシン、ロサラマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドロマイシン）、ケトリド（例えば、テリスロマイシン、セスロマイシン）、クメルマイシン、リンコサミド（例えば、クリンダマイシン、リンコマイシン）、およびクロラムフェニコール。
【０１９９】
実例となる抗ウイルス薬は、硫酸アバカビル、シクロビルナトリウム、塩酸アマンタジン、アンプレナビル、シドフォビル、デラビルジンメシラート、ジダノシン、エファビレンツ、ファンシクロビル、フォミビルセンナトリウム、フォスカルネトナトリウム、ガンシクロビル、硫酸インジナビル、ラミブジン、ラミブジン／ジドブヂン、ネルフィナビルメシラート、ネビラピン、リン酸オセルタミビル、リバビリン、塩酸リマンダジン、リトナビル、サキナビル、サキナビルメシラート、スタブジン、塩酸バラシクロビル、ザルシタビン、ザナミビル、およびジドブジンを含む。
【０２００】
殺アメーバ薬または抗原虫薬の非限定的例は、アトバクオン、塩酸クロロキン、リン酸クロロキン、メトロニダゾール、塩酸メトロニドゾール、およびペンタミジンイセチオネートを含む。駆虫薬は、メベンダゾール、ピランテルパモエート、アルベンダゾール、イベルメクチン、およびチアベンダゾールから選ばれる少なくとも１であり得る。実例となる抗真菌剤は、アンホテリシンＢ、アンホテリシンＢ硫酸コレステルイル複合体、アンホテリシンＢ脂質複合体、アンホテリシンＢリポソーマル、フルコナゾール、フルシトシン、グリセオフルビンミクロサイズ、グリセオフルビンウルトラミクロサイズ、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ナイスタチン、および塩酸テルビナフィンから選ぶことができる。抗マラリア薬の非限定的例は、塩酸クロロキン、リン酸クロロキン、ドシサイクリン、硫酸ヒドロキシクロロキン、メフロキンヒドロクロリド、リン酸プリマキン、ピリメタミン、およびピリメタミンとスルファドキシンから選ぶことができる。抗結核薬は、限定されるものではないが、クロファジミン、シクロセリン、ダプゾン、塩酸エタンブトール、イソニアジド、プラジナミド、リファブチン、リファンピン、リファペンチン、および硫酸ストレプトマイシンを含む。
【０２０１】
上記のように、本発明は、オリゴマー化合物とさらなる薬剤の同時投与を含む。オリゴマーを他の薬剤とともに投与することを含む態様において、該併用における活性物質の用量は、それら自体の有効量を含むことができ、さらなる薬剤はさらに患者に対する治療または予防的利益を増強し得る。あるいはまた、オリゴマーおよび該さらなる薬剤は、癌を予防または治療するための有効量を含みうる。有効量は、例えば投与のタイミングと回数、投与方法、製剤などを含む特定の治療管理の文脈において定義することができる。ある態様において、オリゴマーおよび所望により癌療法は、ルーチンスケジュールで投与する。あるいはまた、該癌療法は、症状が発生したときに投与することができる。本明細書で用いている「ルーチンスケジュール」は、予め決定した指定期間を表す。ルーチンスケジュールは、該スケジュールが予め決定されている限り長さが同じまたは異なる期間を含みうる。例えば、ルーチンスケジュールは、毎日、隔日、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、一週間毎、一月毎に、または２カ月毎、３カ月毎、４カ月毎、５カ月毎、６カ月毎、７カ月毎、８カ月毎、９カ月毎、１０カ月毎、１１カ月毎、１２カ月毎などにあらゆる日数または週数のセットでオリゴマー化合物を投与することを含みうる。あるいはまた、予め決定したルーチンスケジュールは、オリゴマー化合物と癌療法を、第１週は毎日、次いで数カ月間は毎月、その後３カ月毎に同時投与することを含む。適切なスケジュールがある日に投与することを含むことを予め決定している限り、あらゆる特定の併用がルーチンスケジュールでカバーされる。
【０２０２】
本発明の処置方法に用いるあらゆる化合物について、医薬的有効用量は、最初に細胞培養アッセイから推定することができる。例えば、細胞培養で決定したＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するように動物モデルで用量を処方することができる（例えば、腫瘍細胞の増殖を最大の半分の阻害を達成する活性剤の濃度）。そのような情報を用いてヒトで有用な用量をより正確に決定することができる。
【０２０３】
投薬は、処置されるべき疾患状態の重症度および応答性に依存し、そして、処置の経過は、数日〜数カ月、または療法が作用するか、もしくは疾患状態の縮退が達成されるまで持続する。最適な服薬スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積の測定値から計算できる。当業者は、最適用量、投薬方法および反復ペースを容易に決定できる。最適用量は、個々のオリゴマー化合物の相対力価によって異なる可能性があり、一般的に、インビトロおよびインビボ動物モデルにおいて有効であると認められるＥＣ５０に基づいて見積もることができる。通例、投薬量は、体重の１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇであり、毎日、毎週、毎月または年１回または複数回投与され得る。当業者は、計測された体液または組織中の薬剤の滞留時間および濃度に基づいて投与の反復ペースを容易に見積もることができる。成功的処置に続いて、患者は、疾患状態の再発を予防するための維持療法を受けることが望ましいこともあり、ここで、該オリゴヌクレオチドは、体重の１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇに及ぶ、毎日、毎週、毎月、または毎年１回もしくは複数回の維持用量が投与される。二本鎖の化合物に関して、用量は、（２本の別々の鎖を含む化合物を用いたように）第二の鎖または（二本鎖領域を有する自己相補的一本鎖を用いたように）追加の核酸の長さから成る増加した核酸添加を考慮して計算されなければならない。
【０２０４】
ある態様において、意図する投与方法に応じて、オリゴマー含有組成物は、一般的には約０．０００００１％〜９０％、約０．０００１％〜５０％、または約０．０１％〜約２５％（重量％）の該オリゴマーを含み、残りは適切な医薬的担体または希釈剤などである。オリゴマーの用量は、種々の因子、例えば投与方法、罹患対象の種、年齢、性別、体重、および一般健康状態に依存し得るし、標準的プロトコールを用いて当業者が容易に決定することができる。用量は、オリゴマーのその標的分子（例えば、ＴＨＯＣ４またはＳＳＢ１）に対する結合親和性、その生物学的利用能、およびそのインビボおよび薬物動態特性も考慮するだろう。その際、該薬剤の正確な投与量は、施術者の判断にも依存し得る。癌の治療または予防において投与する薬剤の有効量の決定において、医師または獣医師は、該疾患または病状の進行を経時的に評価することができる。とにかく、当業者は、過度な実験を行うことなくオリゴマー化合物の適切な用量を容易に決定することができる。患者に投与する活性物質の用量は、患者に経時的な有益な反応、例えば、腫瘍細胞の形成、増殖、生存、生存能力、または維持の障害、抑止、または予防、および／または癌の治療および／または予防をもたらすのに十分であるべきである。該用量を癌の症状を軽減するために適切な間隔で投与することができる。そのような間隔は、当業者に知られたルーチン手段を用いて確認することができ、用いる活性物質およびその製剤の種類に応じて変化し得る。例えば、該間隔は、毎日、隔日、毎週、隔週、毎月、隔月、年４回、年２回、または年１回であり得る。
【０２０５】
投与量と投与間隔は、オリゴマー効果を維持するのに充分な活性物質の血漿レベルをもたらすように個々に調整することができる。全身投与のための通常の患者への用量は、１〜２０００ｍｇ／日、通常１〜２５０ｍｇ／日、典型的には１０〜１５０ｍｇ／日、０．０２〜２５ｍｇ／ｋｇ／日、通常０．０２〜３ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には０．２〜１．５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。患者の体表面積では、０．５〜１２００ｍｇ／ｍ２／日、通常０．５〜１５０ｍｇ／ｍ２／日、典型的には５〜１００ｍｇ／ｍ２／日の範囲である。
【０２０６】
オリゴマー薬剤の毒性と治療効果は、ＬＤ５０（ポピュレーションの５０％致死用量）およびＥＤ５０（ポピュレーションの５０％治療的有効用量）を決定することにより、細胞培養または実験動物を用いる標準的医薬的方法により決定することができる。毒性作用と治療効果の用量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。治療指数が大きい化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から得られるデータはヒトで用いる用量範囲を処方するのに用いることができる。そのような化合物の用量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性がないＥＤ５０を含むある範囲の循環濃度内にある。用量は、用いた剤形と用いた投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。正確な処方、投与経路、および用量は、患者の病状を考慮して個々の医師が選ぶことができる（例えば、Fingl et al., 1975, in “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1 p1を参照）。
【０２０７】
あるいはまた、全身的より局所的に、しばしばデポーまたは持続放出製剤で、例えば組織（皮下組織または大網組織が好ましい）中にオリゴマー化合物を直接注射することにより投与することができる。
【０２０８】
さらに、標的とする薬剤送達システムで、例えば組織特異的抗体でコートしたリポソームでオリゴマー化合物を投与することができる。リポソームは該組織を標的とし、該組織に選択的に取り込まれるだろう。
【０２０９】
局所投与または選択的取り込みの場合、該オリゴマー化合物の有効局所濃度は、血漿濃度と関連しないかもしれない。
【０２１０】
本発明を容易に理解し、実用効果を示すために、特定の好ましい態様を下記の非限定的実施例により説明する。
【実施例】
【０２１１】
実施例１
非標的化オリゴマー化合物の腫瘍調節作用
腫瘍細胞のトランスクリプトームを標的と見なさない修飾ＲＮＡオリゴマー化合物を設計した。該修飾は、表３に示したとおり、ホスホロチオアート骨格（＊）および２−Ｏ’−メチル修飾（ｍ）を含み、そして、接頭語「ＬＳＡ」で示されている。すべての配列をSigma-Aldrich（Castle Hill, NSW, Australia）に注文した。
【０２１２】
該オリゴマー化合物を、１００ｎＭまたは５０ｎＭの終濃度にて癌細胞株ＨｅＬａ、Ｕ２ＯＳ、ＬＮＣＡＰ、ＭＣＦ７、Ａ５４９、およびＨ４６０にLipofectamine2000を使用してトランスフェクトした。この処理は、対照化合物によって処理した細胞と比較して、ＬＳＡ化合物によって処理した細胞のより低い細胞集密および密着性によって示されるように、２０〜３６時間までのほとんどの細胞の死滅をもたらした（図１を参照）。
【０２１３】
イムノブロット分析は、処理細胞のｈＳＳＢ１ポリペプチド産生における４０〜５０％の減少、ならびにＰＡＲＰ１切断および増強したＨ２ＡＸリン酸化を明らかにした（図２）。ＰＡＲＰ１はアポトーシス中に切断され、およびｙＨ２ＡＸはゲノム内のＤＮＡ破壊を特異的にマークし、そして、非標的化オリゴマーによって処理した細胞において、それぞれアポトーシスおよびＤＮＡ損傷の存在を立証した。
表３
【表３】
2019500431.tif 000009
配列の記号表示は以下のとおりである：ｍ＝２’ＯＭｅ修飾ヌクレオシド、＊＝ホスホロチオアート（ＰＳ）ヌクレオシド間結合。
実施例１に記載の実験のためのオリゴマー名（オリゴ名）を、表８で列挙したそれらの対応する統合オリゴＩＤおよび配列番号と一緒に示す。
【０２１４】
実施例２
腫瘍細胞の毒性に関する非標的化オリゴマー化合物とアンチセンス化合物との比較
実施例１に記載の非標的化オリゴマーを、腫瘍細胞毒性に関してアンチセンスオリゴマーと比較した。該アンチセンスオリゴマーを、非標的化オリゴマーと同じ骨格の化学的性質を用いて、かつ、標的化ｈＳＳＢ１配列に対する特異性を用いて設計した。この試験に使用したオリゴマーの配列を、非標的化化合物が接頭語「ＬＳＡ」で示され、およびアンチセンス化合物が接頭語「ＡＳＯ」で示されている、表４に示す。すべての配列をSigma-Aldrich（Castle Hill, NSW, Australia）に注文した。
【０２１５】
ＰＡＲＰ切断およびＨ２ＡＸ誘導によって示されているように、非標的化オリゴマー（ＬＳＡ）およびアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）の両方が細胞毒性を誘発した（図３）。特に、ｈＳＳＢ１タンパク質レベルもまた、非標的化オリゴマーおよびアンチセンスオリゴマーでトランスフェクトした細胞において低減した。
【０２１６】
追加の非標的化オリゴマーおよびアンチセンスオリゴマー化合物を設計し、そして、ＩｎｃｕＣｙｔｅ動的生細胞画像システムを使用して、癌細胞株のパネルにおける毒性についてスクリーニングした。これらのオリゴマーを表５に示す。
【０２１７】
簡単に言えば、細胞をマイクロウェルプレート内に播種し、２４時間後にＬＳＡまたはＡＳＯオリゴ（１００ｎＭ）でトランスフェクトし、そして、すぐに、IncuCyte ZOOMシステムに入れた。画像を７２時間にわたり、位相差顕微鏡によって１〜２時間毎に収集した。データを、IncuCyte ZOOMソフトウェアを使用して分析した。代表的なオリゴヌクレオチドについて図４に示したように、細胞増殖を、経時的にパーセンテージ細胞集密について観察することによって計測した。表５で列挙した４１のオリゴマー化合物を、３＝高い毒性、２＝中程度の毒性、１＝わずかな毒性および０＝無毒性としてスコア化し、そして、これはＬＳＡまたはＡＳＯ配向性に依存しているように見えなかった。
表４
【表４】
2019500431.tif 000010
配列の記号表示は以下のとおりである：ｍ＝２’ＯＭｅ修飾ヌクレオシド、＊＝ホスホロチオアート（ＰＳ）ヌクレオシド間結合。
実施例２に記載の実験のためのオリゴマー名（オリゴ名）を、表８で列挙したそれらの対応する統合オリゴＩＤおよび配列番号と一緒に示す。
表５
【表５−１】
2019500431.tif 000011
【表５−２】
2019500431.tif 000012
配列の記号表示は以下のとおりである：ｍ＝２’ＯＭｅ修飾ヌクレオシド、＊＝ホスホロチオアート（ＰＳ）ヌクレオシド間結合。
個々のオリゴマーのタイプ（例えば、ＬＳＡまたはＡＳＯ）、ならびに長さ（塩基数）、グアノシン−シトシン（ＧＣ）含量のパーセンテージ、融解温度（Ｔｍ）、およびプリン含量のパーセンテージ（ＡＧ）を示す。任意の検出可能な標識またはレポーター基（例えば、ビオチンＦＡＭ）をオリゴ名に示す。
実施例２に記載の実験のためのオリゴマー名（オリゴ名）を、表８で列挙したそれらの対応する統合オリゴＩＤおよび配列番号と一緒に示す。
【０２１８】
実施例３
オリゴマー化合物はＳＳＢ１およびＴＨＯＣ４に結合する
ビオチン化非標的化化合物あえあるＬＳＡ−ＩＮ３Ｅ３、および陰性対照オリゴマー化合物であるＮＥＧＣを細胞溶解物と共にインキュベートした。相互作用タンパク質を、ビオチン化化合物に結合するストレプトアビジンビーズを使用して抽出した。そのビーズを洗浄し、そして、相互作用タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Coomassie R250で染色し、そして、バンドはトリプシン消化断片のマススペクトル同定のために切り出した。マススペクトル分析により同定したタンパク質の中には、一本鎖ＤＮＡ修復タンパク質ｈＳＳＢ１、およびｍＲＮＡ輸送タンパク質ＴＨＯＣ４が存在した。ＴＨＯＣ４は、ｍＲＮＡの転写、プロセッシング、および核外輸送をつなぐＴＲＥＸ複合体の３２ｋＤａタンパク質の成分である。ＴＨＯＣ４は、本明細書中に記載したオリゴマー化合物への結合を潜在的は媒介する可能性があるＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）、一重鎖ＲＮＡ結合ドメインを含んでいる。
【０２１９】
この相互作用を確認するために、電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）を、細胞死を引き起こすのに有効であったオリゴマー化合物（ＬＳＡ＿Ｉｎ３Ｅ３、Ｏｐｅｎ＿Ａ＿１、ｃｄｃａ３＿Ｌ＿ＡＴＧ−３、およびＡＳＯ＿Ｅ３Ｅ４）および細胞において比較的無毒性であったオリゴマー化合物（Ｎｅｇ＿Ｃ、ＬＳＡ＿Ｉｎ３Ｅ３＿ＣＴ５＝Ｉｎ３ＬＳＡの変異バージョン、Ｏｐｅｎ＿Ｌ＿１、およびｃｄｃａ３＿Ａ＿ＡＴＧ−３）を使用しておこなった。該オリゴマー化合物を、ＦＡＭまたはＣｙ５で標識し、様々な量のｈＳＳＢ１またはＴＨＯＣ４と共にインキュベートし、そして、結合および遊離オリゴマーを天然ゲル電気泳動によって分離した。特に、ｈＳＳＢ１およびＴＨＯＣ４の両方が、無毒性オリゴマーに比べて有意に高い親和性で腫瘍調節オリゴマーの移動を遅らせ、これらの２つのタンパク質が観察した表現型に関与する可能性があることを示唆した（図５を参照）。ＴＨＯＣ４の解離定数（ＫＤ）を表６に示し、およびｈＳＳＢ１のものを表７に示す（ＫＤ値は、GraphPad Prismによる非線形回帰を使用して決定した）。精製したｈＳＳＢ１またはＴＨＯＣ４タンパク質を、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＩＧＥＰＡＬ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１００ｎｇ／μＬのＢＳＡから成るバッファー中で３７℃にて１０ｎｍｏｌの標識オリゴと１５分間インキュベートした。サンプルを、８０Ｖ、４℃にて６０分間、ＴＢＥバッファー中の１０％のＰＡＧＥゲルによる電気泳動で分離した。
表６
【表６】
2019500431.tif 000013
【０２２０】
表６には、ＴＨＯＣ４および８つの異なったオリゴマー化合物を用いて行われた三連のＥＭＳＡ実験の結果をまとめる。個々のＴＨＯＣ４：オリゴマー相互作用の解離定数（ＫＤ、５０％のオリゴヌクレオチドが平衡状態にてタンパク質に結合しているタンパク質濃度）を示す。以上のように、ＴＨＯＣ４は、約５０〜８０ｎＭのＫＤにて腫瘍調節オリゴマーに結合し、そして、１５０ｎＭのＫＤにて陰性対照オリゴマーに結合する。ＫＤ値を電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）によって決定した。精製したＴＨＯＣ４タンパク質を、３７℃にて１５分間、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０％のＩＧＥＰＡＬ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１００ｎｇ／μＬのＢＳＡから成るバッファー中で１０ｎｍｏｌの標識オリゴマーと共にインキュベートした。サンプルを、８０Ｖ、４℃にて６０分間、ＴＢＥバッファー中の１０％のＰＡＧＥゲルによる電気泳動で分離した。ＫＤ値を、タンパク質濃度に対する遊離非結合性オリゴの量をプロットすることによってGraphPad Prismによる非線形回帰を使用して決定した。
【０２２１】
別々の実験において、改善された溶解性を有するＧＳＴ ＴＨＯＣ４誘導体が、同じ条件下で約１１ｎＭのＫＤにてＴＨＯＣ４が腫瘍調節オリゴマーに結合することを見出した。
表７
【表７】
2019500431.tif 000014
【０２２２】
表７には、ｈＳＳＢ１および２つの異なったオリゴマー化合物を用いて行われた三連のＥＭＳＡ実験の結果をまとめる。個々のｈＳＳＢ１：オリゴマー相互作用の解離定数（ＫＤ、５０％のオリゴヌクレオチドが平衡状態にてタンパク質に結合しているタンパク質濃度）を示す。以上のように、ｈＳＳＢ１は、約３ｎＭのＫＤにて腫瘍調節オリゴマーに結合し、そして、９ｎＭのＫＤにて陰性対照オリゴマーに結合する。ＫＤ値を電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）によって決定した。精製したＴＨＯＣ４タンパク質を、３７℃にて１５分間、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．０％のＩＧＥＰＡＬ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１００ｎｇ／μＬのＢＳＡから成るバッファー中で１０ｎｍｏｌの標識オリゴマーと共にインキュベートした。サンプルを、８０Ｖ、４℃にて６０分間、ＴＢＥバッファー中の１０％のＰＡＧＥゲルによる電気泳動で分離した。ＫＤ値を、タンパク質濃度に対する遊離非結合性オリゴの量をプロットすることによってGraphPad Prismによる非線形回帰を使用して決定した。
【０２２３】
実施例４
オリゴマー化合物は、細胞の遺伝子発現およびｍＲＮＡ移行を阻害する
転写およびｍＲＮＡ輸送におけるＴＨＯＣ４の関与に基づいて、アポトーシス耐性ＨｅＬａ−ＢＣＬ２細胞を、Lipofectamine3000（Life Technologies）を使用して（アポトーシスの偏りを回避するために）１００ｎＭのＡＳＯ／ＬＳＡでトランスフェクトしたＧＦＰレポーター発現アッセイを実施した。５時間後、その細胞を、Fugene9（Roche）を使用してＧＦＰレポータープラスミドでトランスフェクトし、そして、ＧＦＰトランスフェクションの２０時間後に、蛍光シグナルをハイスループットＣｙｔｅｌｌ細胞画像システムを使用して分析した。ＧＦＰプラスミドのみでトランスフェクトした細胞を比較として使用した（ＧＦＰ）。図６に示しさように、細胞死を引き起こすのが知られている非標的化オリゴマー（ＬＳＡ）およびアンチセンスオリゴマー（ＡＳＯ）はまた、劇的に減少したＧＦＰ蛍光を示したのが、それに対して、無毒性ＡＳＯ／ＬＳＡはＧＦＰ発現に影響しなかった。この結果は、細胞死を引き起こすＡＳＯ／ＬＳＡが、全体的な転写との干渉につながるＴＲＥＸ複合体の成分を激減することによって、そうなることを示唆している。これが順にＤＮＡ損傷、そして、細胞死へとつながる。
【０２２４】
全体的なｍＲＮＡ輸送を、ｍＲＮＡ蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）実験によって、ＩＮ３ＬＳＡまたはＮＥＧＣでトランスフェクトした細胞において調査した。その結果は、ポリＡ ｍＲＮＡ（赤色で染色）の核外輸送が、ＮＥＧＣではなく、Ｉｎ３ＬＳＡでトランスフェクトした細胞において阻害されたことを示した（図７を参照）。これは、ＴＲＥＸ複合体がＩｎ３ＬＳＡオリゴマーによって阻害されることを裏づけている。
【０２２５】
実施例５
基本的特性の確認ための候補オリゴマーのハイコンテントスクリーン
本発明の腫瘍調節オリゴマー配列の効力およびＴＨＯＣ４および／またはｈＳＳＢ１への結合に関して、必要とされる最小限の長さ、化学的性質、ピリミジン／プリン含量を確認するために、ハイコンテントスクリーンを実施した。合計３０５の異なったオリゴマーを、蛍光染色Hoescht33342（細胞浸透性、生細胞および死細胞の染色）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ、細胞不透性、後期アポトーシス細胞および死細胞を染色）を組み合わせたLive-Deadプロトコールを使用した、ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ細胞におけるIncell 2200プラットフォームを使用してスクリーニングした。オリゴマー化合物で処理後２４時間の時点で計測したアポトーシス（断片化）核およびＰＩ陽性細胞（後期アポトーシス細胞または死細胞）のパーセンテージとして報告された結果を用いて、細胞を：総細胞数、アポトーシス核およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色、について分析した。
【０２２６】
ＴＨＯＣ４またはｈＳＳＢ１へのオリゴマーの結合を、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を使用して実施し、そこでは、精製組み換えＴＨＯＣ４またはｈＳＳＢ１タンパク質をＳＰＲチップ表面に連結し、そして、２０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、および０．０１％のＩＧＥＰＡＬから成るバッファー中の２ｎＭ〜１６μＭの範囲にわたる濃度にて、オリゴマーにその表面上を通過させた。
【０２２７】
このハイコンテントスクリーンの結果を表８にまとめる。
表８：オリゴマー配列、化学的性質、長さ、融解温度（Ｔｍ）、プリンおよびＧＣ含量、ハイコンテントスクリーン（ＨＣＳ）に基づく死滅率を含めた３０５のオリゴマーのスクリーンからの要約データ、ならびにＳＰＲ結合定量法からのオリゴマー−Ｔｈｏｃ４および−ｈＳＳＢ１の結果
アポトーシス細胞および死細胞のパーセンテージを計測し、各オリゴマーに対する死滅スコアを付与する、ハイコンテントスクリーン（ＨＣＳ）を実施した。付与した死滅スコアは：０＝無毒性、１＝わずかな毒性、２＝中程度の毒性、３＝高い毒性、であった。ＳＰＲは、オリゴとＴＨＯＣ４またはｈＳＳＢ１タンパク質のいずれかとの間の結合を計測するのに使用された。スコアは、各オリゴのＲｍａｘ（最大結合応答）を、陽性および陰性対照オリゴ、ＬＳＡ＿Ｉｎ３Ｅ３およびＮｅｇ＿ＣのＲｍａｘに対して正規化することによって計算した。配列の記号表示は、以下のとおりである：ｍ＝２’ＯＭｅ修飾ヌクレオシド、＊＝ホスホロチオアート（ＰＳ）ヌクレオシド間結合、Ｔｍ＝融解温度。
【表８−１】
2019500431.tif 000015
【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【表８−５】
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【表８−６】
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【表８−７】
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【表８−８】
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【表８−９】
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【表８−１０】
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【表８−１１】
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【０２２８】
オリゴマーの長さ
強力な腫瘍調節オリゴマー（例えば、ｏｐｅｎ＿ＡおよびＡＴＧ＿ＬＳＡ）のサイズを２０核酸塩基から３０核酸塩基まで増大することは、腫瘍調節表現型を低減したか、または完全に抑止した。サイズを１５または１０核酸塩基まで減少させることものまた、表現型を低減したか、または抑止した。５’または３’末端のいずれかから１核酸塩基を取り除くことによってサイズを徐々に削減したとき、いずれかの末端から４〜５核酸塩基が取り除かれている間、効力は維持され、それに続いて、その後の核酸塩基の除去の間、効力は徐々に減少した（表８を参照）。同様に、各末端から１核酸塩基を同時に取り除いたとき、６核酸塩基の除去後に効力を失った。腫瘍調節活性に対するオリゴマーの長さの影響について調査した結果を、図８にまとめる。これらの知見は、ＬＳＡオリゴマー化合物の維持された効力に必要とされる最小サイズが１４〜１６核酸塩基であり、最大サイズが２８〜２９核酸塩基であることを示唆している。
【０２２９】
化学的性質
オリゴマー化合物を、オリゴマーの末端および末端の近くに２つの内部ＺＥＮ（商標）修飾を有する、完全に２’−Ｏ−メチル修飾した糖核酸塩基骨格を含むＺＥＮの化学的性質（ＩＤＴに独占権）を使用して合成した。２’−Ｏ−メチル残基は、エンドヌクレアーゼ分解に対する抵抗性を与え、そして、ＲＮＡ標的に対する結合親和性を増大するが、それに対して、ＺＥＮ修飾は、エキソヌクレアーゼ分解を遮断し、さらに結合親和力を増強する。これらの化合物は、本明細書中でＺＥＮオリゴマーとも呼ばれる。細胞死を誘発するＬＳＡオリゴマー配列に対応するすべてのＺＥＮオリゴマーが、細胞死を誘導する能力を完全に失った。核酸塩基の他の修飾がないホスホジエステル（ＰＤ）骨格、または完全な２’−Ｏ−メチル修飾糖核酸塩基を有するＰＤ骨格もまた、殺滅効果を完全に抑止された。オリゴマーのそれぞれの末端の３つのホスホロチオアート（ＰＳ）残基だけであるが、完全な２’−Ｏ−メチル修飾を維持することは、そのオリゴマーの中間セクションに非修飾ＤＮＡを有するギャップマーがどうだったように、殺滅効果を弱めた。好ましくは全てＰＳ骨格を有し、そして、任意選択で他の修飾を有していないオリゴマーは、オリゴマーの維持された、さらには増強された殺滅効果、ならびにＴＨＯＣ４およびｈＳＳＢ１のいずれか一方またはその両方への結合に必要とされる好ましい化学的性質であったと結論づけられた（表８を参照）。
【０２３０】
ピリミジン／プリン含量
スクリーニングからの結果は、オリゴマー化合物が腫瘍調節活性のための５０％の最少プリン含量、または腫瘍調節活性のための５０％の最少ＧＣ含量を伴った４５％の最少プリン含量を必要としたこと、ならびに腫瘍調節活性と高いプリン含量との間の正の相関が存在することを明らかにした。しかしながら、高いプリン含量を有するいくつかのオリゴマー化合物が有効でないので、プリン含量のみが活性を予測するには十分でない。プリン（ＡおよびＧ）またはピリミジン（ＣおよびＵ）のみを含むように設計したオリゴマーもまた無効であり、核酸塩基の混合が活性に必要であることを示唆している（表８を参照）。腫瘍調節活性へのプリン含量の影響について調査した結果を図９にまとめる。
【０２３１】
現在、その一部が癌を含めた様々な条件について臨床実験中である（ＢＣＬ２ Ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎ、ＳＭＮ２−Ｎ１、ジストロフィン、クラステリン、サバイビン、ＥＩＦ４ＥＡＳＯ４、Ｈｓｐ２７、Ｓｔａｔ３）文献からの多くのアンチセンスオリゴマー化合物を、本明細書中に記載したオリゴマーの化学的性質に合致するように修飾し、そして、活性についてスクリーニングした。具体的には、これらの修飾文献オリゴマーを、完全なＰＳ骨格および完全な２’−Ｏ−メチル修飾核酸塩基を有するように設計し、そして、これらのオリゴマーを、試験した中で最も強力なＬＳＡオリゴマー、ＩＮ３ＬＳＡ、ＡＴＧ＿ＬＳＡまたはＯｐｅｎ＿Ａのいくつかと比較した。試験した修飾文献オリゴマー化合物の中で、１つオリゴマー、ジストロフィンおよび１つの対照オリゴマーＨＳＰ２７ｍｍだけが、本明細書中に開示したＩＮ３＿ＬＳＡ、ＡＴＧ＿ＬＳＡまたはＯｐｅｎ＿Ａと比較して、最高死滅率である３のスコアを得、そして、修飾文献オリゴマーの大部分が、オリゴマーＩＮ３＿ＬＳＡ、ＡＴＧ＿ＬＳＡまたはＯｐｅｎ＿Ａと比較して、より弱い細胞死誘発能力を示した（スコア２または１）（表８を参照）。
【０２３２】
実施例６
オリゴマー化合物は、インビボにおいて腫瘍細胞の成長を阻害する
インビボ試験
非標的化オリゴマーを、前立腺異種移植モデルによりインビボで試験した。具体的には、６週齢のＳＣＩＤ雄に、Ｃ４２Ｂ前立腺癌細胞を皮下注射した。腫瘍が５０ｍｍ３の体積に達すると、そのマウスを、２つの腫瘍調節非標的化オリゴマー、Ｉｎ３ＬＳＡおよびＡＴＧＬＳＡ、と共に非有効対照配列およびＰＢＳで処理した。オリゴマー薬剤を４週間にわたり週２回、８０ｍｇ／ｋｇの用量にて静脈内注射によって投与した。腫瘍増殖を、処理期間中、キャリパー測定によって観察した。腫瘍増殖の統計的に有意な遅延を、対照（ｃｔｒｌ）およびＰＢＳ処理マウスと比較して（図１１）、ＩＮ３ＬＳＡ（Ｉｎ３）およびＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）処理マウスに関して観察し（図１０を参照）、そしてそれは、これらの非標的化オリゴマーが処理マウスに対して有意な毒性を有していなかったことを実証した。
【０２３３】
処理期間中、マウスの体重を観察したが、対照（ｃｔｒｌ）およびＰＢＳ処理マウスと比較して、ＩＮ３ＬＳＡ（Ｉｎ３）およびＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）処理マウスの間で体重減少の有意差は観察されなかった。特に、ＩＮ３ＬＳＡおよびＡＴＧＬＳＡ処理群に関して大部分で腫瘍が減少したマウスについて体重減少は観察されず（図１２）、図１１で観察された体重減少が、恐らく全身腫瘍組織量のためであったことを示した。
【０２３４】
実施例７
オリゴマー化合物は、インビボにおいて腫瘍細胞によって取り込まれる
腫瘍部位におけるオリゴマー化合物の取り込みを、蛍光標識ＩＮ３ＬＳＡオリゴマーを注射することによって、腹腔内および静脈内送達に続いて、そのマウスを７日間観察することによって調査した。図１３に示したように、蛍光シグナルはｉ．ｐ．注射後には検出されなかった。しかしながら、ｉ．ｖ．注射後のシグナルは、腫瘍部位にて数ログスケール高く、そして、重要なことには、注射後７日間にわたって持続したシグナルは、ＬＳＡオリゴマーが腫瘍部位にて優先的に蓄積することを示唆した。これらの結果は、図１４に示したマウス全体の画像解析と一致する。
【０２３５】
実施例８
オリゴマー化合物は、タンパク質のオリゴヌクレオチド／オリゴ糖結合（ＯＢ）折り畳み含有ファミリーを通して作用する
ＦＡＭ標識非標的化ＰＳ化合物（ＬＳＡ＿Ｉｎ３Ｅ３、ＰＤ化合物、ＤＮＡ＿Ｉｎ３Ｅ３およびＲＮＡ＿Ｉｎ３Ｅ３、ならびに陰性対照オリゴマー化合物（ＮＥＧＣ）を別々に、精製マウスＳＳＢ１（ｍＳＳＢ１）、ｈＳＳＢ１およびヒトＳＳＢ２（ｈＳＳＢ２）タンパク質と共にインキュベートした。結合および遊離オリゴマーを、天然ゲル電気泳動によって分離し、図１５および１６、ならびに表９〜１０に示したように、ＯＢ折り畳みタンパク質（ｍＳＳＢ１、ｈＳＳＢ１、およびｈＳＳＢ２）は、無毒性オリゴマー（ＤＮＡ＿Ｉｎ３Ｅ３、ＲＮＡ＿Ｉｎ３Ｅ３およびＮＥＧＣ）よりはるかに高いレベルで腫瘍調節オリゴマー（ＬＳＡ＿Ｉｎ３Ｅ３）の遊走を遅らせ、腫瘍調節オリゴマーが、無毒性オリゴマーよりＯＢ折り畳みタンパク質に対して有意に高い親和性を有することを示した。
表９
【表９】
2019500431.tif 000026
【０２３６】
表９は、以下に示したとおり、ｍＳＳＢ１および３つの異なったオリゴマー化合物を用いて実施した三連のＥＭＳＡ実験の結果をまとめる。個々のｍＳＳＢ１：オリゴマー相互作用の解離定数（ＫＤ、５０％のオリゴヌクレオチドが平衡状態でタンパク質に結合するタンパク質濃度）を示す。
【０２３７】
表９に使用されるオリゴマー化合物は、以下のとおりであった：
ａ）ＬＳＡ＿ＩＮ３Ｅ３＝
【化１】
2019500431.tif 000027
［配列番号５］
式中、ｍは２’−Ｏメチル修飾塩基を表し、および＊はＰＳヌクレオシド間結合を表し；
ｂ）ＤＮＡ＿Ｉｎ３Ｅ３＝
【化２】
2019500431.tif 000028
［配列番号３０６］
式中、ｄはデオキシリボヌクレオシドを表し、および該オリゴマーはＰＤヌクレオシド間結合を含み；および
ｃ）ＮＥＧＣ＝
【化３】
2019500431.tif 000029
［配列番号４］
式中、ｍは２’−Ｏメチル修飾塩基を表し、および＊はＰＳヌクレオシド間結合を表す。
表１０
【表１０】
2019500431.tif 000030
【０２３８】
表１０は、以下に示したとおり、ｍＳＳＢ１および４つの異なったオリゴマー化合物を用いて実施した三連のＥＭＳＡ実験の結果をまとめる。個々のｍＳＳＢ１：オリゴマー相互作用の解離定数（ＫＤ、５０％のオリゴヌクレオチドが平衡状態でタンパク質に結合するタンパク質濃度）を示す。
【０２３９】
表１０に使用されるオリゴマー化合物は、以下のとおりであった：
ａ）ＬＳＡ＿Ｉｎ３Ｅ３＝
【化４】
2019500431.tif 000031
［配列番号５］
式中、ｍは２’−Ｏメチル修飾塩基を表し、および＊はＰＳヌクレオシド間結合を表し；
ｂ）ＤＮＡ＿Ｉｎ３Ｅ３＝
【化５】
2019500431.tif 000032
［配列番号３０６］
式中、ｄはデオキシリボヌクレオシドを表し、および該オリゴマーはＰＤヌクレオシド間結合を含み；
ｃ）ＲＮＡ＿Ｉｎ３Ｅ３＝
【化６】
2019500431.tif 000033
［配列番号３０７］
式中、ｒはリボヌクレオシドを表し、および該オリゴマーはＰＤヌクレオシド間結合を含み；
ｄ）ＮＥＧＣ＝
【化７】
2019500431.tif 000034
［配列番号４］
式中、ｍは２’−Ｏメチル修飾塩基を表し、および＊はＰＳヌクレオシド間結合を表す。
【０２４０】
実施例９
より高いｈＳＳＢ１結合親和性を有するオリゴマーをスクリーニングするための分子シミュレーション
ｈＳＳＢ１に対してより高い結合親和力を有するオリゴマー化合物はまた、例えば、Symbios製のOpenMMなどのソフトウェアを用いた原子論的分子動力学（ＡＭＤ）シミュレーションを使用して決定されてもよい。何百ものクエリー配列のシミュレーションを実施でき、そして、結合自由エネルギーをそれぞれについて決定した。図１７は、ＮｅｇＣ（非殺滅配列）のｈＳＳＢ１への結合より、ＡＴＧＬＳＡ（殺滅配列）がｈＳＳＢ１に低い結合の自由エネルギーで結合することを実証し、配列間の致死率の違いに関する洞察を提供し、さらに、さらなる医薬品開発のためのＡＭＤシミュレーションの適用を実証した。斯かるシミュレーションソフトウェアは、ｈＳＳＢ１へのより低い結合の自由エネルギー、よって、より大きい結合親和力を有するオリゴマー化合物のスクリーニングに使用されることができ、高い致死率および削減された標的効果を有する可能性がある改善された薬剤配列の候補リストを提供する。
【０２４１】
図１７ＡおよびＢは、ヒトｈＳＳＢ１がＮＥＧＣオリゴのホスホロチオアート骨格に対して、そのヌクレオチド自体より高い親和性を実証し、このことが、塩基を溶媒曝露されたままにすることを示す。ｈＳＳＢ１は、ヌクレオチドが溶媒曝露されたままになることが少ないＡＴＧＬＳＡとより好ましい相互作用を有する。溶媒曝露されたとき、これらのヌクレオチドは水と相互作用し、このことで結合溝が溶媒に対して開放されたままになり、オリゴマーとの相互作用を弱める。図１７ＣおよびＤは、それがＳＳＢ１の結合溝との相互作用を維持するのに、ＡＴＧＬＳＡに対してより少ないエネルギーしか必要としないことを示し、結合エネルギー５２１ＫＪ／ｍｏｌがＮＥＧＣより低いことを実証した。シミュレーションを通して、この結合エネルギー変化がどのように変化するか図１７Ｄで見られ、そしてそれは、そのヌクレオチド配列に比べて、ＡＴＧＬＳＡに対して一貫して低い結合エネルギーを実証する一方で、ＮＥＧＣは、その無修飾配列とほとんど合致する結合エネルギーを有する。
【０２４２】
実施例１０
オリゴマー化合物は、肺癌異種移植モデルにおいてインビボで腫瘍細胞増殖を阻害する
非標的化オリゴマーを、Ｈ４６０肺癌細胞株を使用した肺癌異種移植モデルにおいてインビボで試験した。具体的には、６週齢のＳＣＩＤ雄マウス（Animal Resources Centre - ARC, Canning Vale, WA）には、２００万個のルシフェラーゼ発現性Ｈ４６０肺癌細胞を脇腹に皮下注射した。それに続いて、マウスを、触診、キャリパー測定、およびＩＶＩＳ走査装置を用いた腫瘍生物発光シグナルの測定によって腫瘍増殖について観察した。腫瘍体積が平均５０ｍｍ３に達したとき、マウスを、ＰＢＳ（溶媒対照）群または腫瘍調節非標的化オリゴマーＡＴＧＬＳＡ群のいずれかに無作為に組み入れた（ｎ＝８匹のマウス／処理群）。オリゴマーＡＴＧＬＳＡをＰＢＳ（Life Technologies）で希釈し、４週間にわたって週２回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって８０ｍｇ／ｋｇの用量にて投与した（合計８回の注射に及ぶ）。処理の経過中、マウスを、体重について、およびキャリパー測定による腫瘍増殖（式Ｖ＝Ａ／２×Ｂ２、（式中、Ａ＝長さ＞Ｂ＝幅（ｍｍ単位）とする）から計算した体積）について、ならびにＩＶＩＳスキャンによって生物発光シグナルについて観察した。ＰＢＳ処理マウスと比較した場合に、ＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）処理マウスに関して、腫瘍増殖の統計的に有意な遅延が観察され（図１８を参照）、そしてそれは、これらの非標的化オリゴマーが肺癌異種移植モデルにおいて化学的に安定した効果を有することを実証した。
【０２４３】
腫瘍体積のこの差を腫瘍のルシフェラーゼ活性によって確認した。処理１４日目におけるＩＶＩＳスキャンは、対照ＰＢＳ群と比較して、ＡＴＧＬＳＡ処理群のより低い生物発光シグナルを示す（図１９）。
【０２４４】
処理の経過中、マウスの体重を週２回観察した。ＰＢＳまたはＡＴＧＬＳＡで処理した動物において、有意な体重減少、または健康状態の喪失は観察されず、これらの非標的化オリゴマーが処理マウスに有意な毒性を有していなかったことを実証している（図２０を参照）。
【０２４５】
実施例１１
オリゴマー化合物は、シスプラチン抵抗性肺癌においてインビトロで腫瘍細胞増殖を阻害する
シスプラチン抵抗性細胞株を作出するために、シスプラチン感受性Ｈ４６０肺癌細胞株を３カ月間にわたり段階的に増加する用量のシスプラチンに晒した。Incucyte zoomシステムを使用した、非標的化オリゴマーＡＴＧＬＳＡ（１００ｎＭ）の添加後４８時間にわたり細胞増殖を計測することによって、インビトロで試験したとき、ＡＴＧＬＳＡは、親Ｈ４６０細胞株に比べて、シスプラチン抵抗性Ｈ４６０細胞株の殺滅においてより効果的であった（図２１）。
【０２４６】
実施例１２
オリゴマー化合物は、シスプラチン抵抗性肺癌においてインビボで腫瘍細胞増殖を阻害する
オリゴマー化合物は、肺癌異種移植モデルにおいてインビボで腫瘍細胞増殖を阻害する
非標的化オリゴマーを、シスプラチン抵抗性Ｈ４６０肺癌細胞株を使用した肺癌異種移植モデルにおいてインビボで試験した。具体的には、６週齢のＳＣＩＤ雄マウス（Animal Resources Centre - ARC, Canning Vale, WA）には、２００万個のルシフェラーゼ発現性のシスプラチン抵抗性Ｈ４６０肺癌細胞を脇腹に皮下注射した。それに続いて、マウスを、触診、キャリパー測定、およびＩＶＩＳ走査装置を用いた腫瘍生物発光シグナルの測定によって腫瘍増殖について観察した。腫瘍体積が平均５０ｍｍ３に達したとき、マウスを、ＰＢＳ（溶媒対照）群または腫瘍調節非標的化オリゴマーＡＴＧＬＳＡ群のいずれかに無作為に組み入れた（ｎ＝８匹のマウス／処理群）。オリゴヌクレオチドＡＴＧＬＳＡをＰＢＳ（Life Technologies）で希釈し、４週間にわたって週２回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって８０ｍｇ／ｋｇの用量にて投与した（合計８回の注射に及ぶ）。処理の経過中、マウスを、体重について、およびキャリパー測定による腫瘍増殖（式Ｖ＝Ａ／２×Ｂ２、（式中、Ａ＝長さ＞Ｂ＝幅（ｍｍ単位）とする）から計算した体積）について、ならびにＩＶＩＳスキャンによって生物発光シグナルについて観察した。ＰＢＳ処理マウスと比較した場合に、ＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）処理マウスに関して、腫瘍増殖の統計的に有意な遅延が観察され（図２２を参照）、そしてそれは、これらの非標的化オリゴマーがシスプラチン抵抗性肺癌異種移植モデルにおいて化学的に安定した効果を有することを実証した。
【０２４７】
腫瘍体積の差はまた、ＩＶＩＳスキャンを用いた各腫瘍の生物発光シグナルによって計測される腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性によって妥当性を確認した（図２３）。
【０２４８】
本発明者らは、処理期間を通してＡＴＧＬＳＡ処理コホートにおいてあらゆる体重減少も観察しなかった、そして、彼らは、ＰＢＳまたはＡＴＧＬＳＡで処理した動物間での挙動または健康状態にいずれの変化も見つけることはなかった。これらの結果は、親Ｈ４６０異種移植実験と一致している（図２４）。
【０２４９】
実施例１３
インビボでのシスプラチン感受性およびシスプラチン抵抗性肺癌モデルにおけるＡＴＧＬＳＡの長期効果
ＡＴＧＬＳＡ処理の長期効果を評価するために、腫瘍増殖およびマウスの体重を、４週間の処理の休止後に、腫瘍が１０００ｍｍ３の最終的な体積に達するまで観察し、カプラン−マイヤーグラフを作成した。シスプラチン感受性Ｈ４６０モデルにおいて、４週間のＡＴＧＬＳＡ処理は、対照群と比較して、ＡＴＧＬＳＡ処理群におけるマウス生存率の中央値の統計的に有意な４１％（１４日間）の増大をもたらした（図２５および表１１）。
表１１
対照ＰＢＳ対ＡＴＧＬＳＡで処理した、シスプラチン感受性Ｈ４６０およびシスプラチン抵抗性肺Ｈ４６０腫瘍に罹患しているＳＣＩＤ雄の生存率の中央値
【表１１】
2019500431.tif 000035
【０２５０】
シスプラチン抵抗性Ｈ４６０モデルにおいて、ＡＴＧＬＳＡ処理コホートにおいて３７．５％（１８日間）増強された生存率の中央値が観察されたが（図２６）、しかしながら、ＡＴＧＬＳＡとＰＢＳ対照群との差は、ランク−ログ検定において統計的に有意でなかった（表１１）。
【０２５１】
実施例１４
インビボ肺癌異種移植モデルにおけるシスプラチン処理とＡＴＧＬＳＡの併用
オリゴマー化合物は、肺癌異種移植モデルにおいてインビボで腫瘍細胞増殖を阻害する
非標的化オリゴマーを、シスプラチン感受性Ｈ４６０肺癌細胞株を使用した肺癌異種移植モデルにおいてインビボで試験した。具体的には、６週齢のＳＣＩＤ雄マウス（Animal Resources Centre - ARC, Canning Vale, WA）には、２００万個のルシフェラーゼ発現性のシスプラチン抵抗性Ｈ４６０肺癌細胞を脇腹に皮下注射した。それに続いて、マウスを、触診、キャリパー測定、およびＩＶＩＳ走査装置を用いた腫瘍生物発光シグナルの測定によって腫瘍増殖について観察した。腫瘍体積が平均５０ｍｍ３（９２％の腫瘍取り込み）に達したとき、マウスを、ＰＢＳ対照群、ＡＴＧＬＳＡ群、シスプラチン群、または併用ＡＴＧＬＳＡ＋シスプラチン群のいずれかに無作為に組み入れた。オリゴヌクレオチドＡＴＧＬＳＡをＰＢＳ（Life Technologies）で希釈し、週２回の静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって８０ｍｇ／ｋｇの用量にて投与した。シスプラチン（生理的食塩水中の１ｍｇ／ｋｇの懸濁液、Hospira）を腹腔内注射（４ｍｇ／ｋｇ）によって週１回注射した。併用処理群には、１週間あたり２回のＡＴＧＬＳＡ（８０ｍｇ／ｋｇ）ｉ．ｖ．注射および１回のシスプラチン（４ｍｇ／ｋｇ）ｉ．ｐ注射を与えた。処理後３週間、すべて処理コホートでは、ＰＢＳと比較して、有意に低い腫瘍増殖があったが、しかしながら、ＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）、シスプラチン、および併用ＡＴＧＬＳＡ＋シスプラチン（Ｃｏｍｂｏ）処理コホートの間に腫瘍増殖の有意差がなかった（図２７）。処理後３週間の時点で、本発明者らは、群間で処理を切り換えた（図２８、破線）：ＡＴＧＬＳＡ処理マウスをシスプラチン（４ｍｇ／ｋｇ、週１回、ｉ．ｐ）に切り換え、シスプラチン処理マウスをＡＴＧＬＳＡ（８０ｍｇ／ｋｇ、週２回、ｉ．ｖ）に切り換え、および併用ＡＴＧＬＳＡ＋シスプラチンマウス（Ｃｏｍｂｏ）を対照ＰＢＳ群（１５０μＬのＰＢＳ、週２回、ｉ．ｖ）にした。我々は、処理初日に腫瘍増殖がない、「シスプラチン 第１／ＡＴＧＬＳＡ 第２」処理マウスにおける有意な腫瘍増殖遅延を観察した。
【０２５２】
その処理がインビボにおいて何らかの急性毒性を引き起こす場合がないかチェックするために、それぞれの動物の体重もまた観察した。ＡＴＧＬＳＡ（ＡＴＧ）化合物が、ＰＢＳと比較して、処理３週間の時点でマウスの体重減少に有意な影響を与えなかったことが観察されたのに対して、有意な体重減少がシスプラチン処理マウスで観察された。これは、ＡＴＧＬＳＡが、シスプラチンと同じ割合で腫瘍増殖を遅延する一方で、動物に対して明らかに不利な毒性を引き起こさなかったことを示唆している。そのうえ、シスプラチン処理をＡＴＧＬＳＡに切り換えるとき、統計的に有意なマウス体重の増大が、切り換えの直後に観察された。この増大は、処理の残り期間にわたって安定したままであった。全体的に見て、データは、ＡＴＧＬＳＡが、シスプラチンに対する抵抗性を発症した肺癌性腫瘍および肺癌性腫瘍に対して化学的に安定した効果を有することを示す。該データはまた、シスプラチン後のＡＴＧＬＳＡを用いた一連の処理が、同時に投与した両剤よりも効果的であることを示す。
【０２５３】
本明細書に記載のすべての特許、特許出願、および刊行物の開示を、全体として参照により本明細書に援用する。
【０２５４】
本明細書におけるあらゆる参考文献への言及は、そのような参考文献を本願に対する「先行技術」として利用可能であることを了承するものと解釈すべきでない。
【０２５５】
本明細書を通して、本発明をいずれかの態様または特定の特徴の集合に限定することなく本発明の好ましい態様を述べることを目的とした。したがって、当業者は、本開示に照らして、本発明の範囲から逸脱することなく例示した特定の態様に種々の修飾および変更をなすことができると認識するだろう。すべてのそのような修飾および変更は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることを意図する。
【図１】
2019500431.tif 000036
【図２】
2019500431.tif 000037
【図３】
2019500431.tif 000038
【図４】
2019500431.tif 000039
【図５】
2019500431.tif 000040
【図６】
2019500431.tif 000041
【図７】
2019500431.tif 000042
【図８】
2019500431.tif 000043
【図９】
2019500431.tif 000044
【図１０】
2019500431.tif 000045
【図１１】
2019500431.tif 000046
【図１２】
2019500431.tif 000047
【図１３】
2019500431.tif 000048
【図１４】
2019500431.tif 000049
【図１５】
2019500431.tif 000050
【図１６】
2019500431.tif 000051
【図１７】
2019500431.tif 000052
【図１８】
2019500431.tif 000053
【図１９】
2019500431.tif 000054
【図２０】
2019500431.tif 000055
【図２１】
2019500431.tif 000056
【図２２】
2019500431.tif 000057
【図２３】
2019500431.tif 000058
【図２４】
2019500431.tif 000059
【図２５】
2019500431.tif 000060
【図２６】
2019500431.tif 000061
【図２７】
2019500431.tif 000062
【図２８】
2019500431.tif 000063
【国際調査報告】
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