(57)【要約】本発明は、被験者に由来する試料中のヒトミトコンドリアコード１２Ｓ  ＲＮＡ（ＭＴＲＮＲ１）遺伝子における１５５５Ａ＞Ｇ及び１４９４Ｃ＞Ｔからなる群から選択される突然変異の存在を判定するための方法及びキットに関し、特に、ＭＴＲＮＲ１遺伝子の少なくとも一部を増幅するステップと、モルホリノオリゴヌクレオチドプローブに共有結合したプラズモン金ナノ粒子を用いて、増幅されたＤＮＡを検出するステップとを含む。前記方法は、アミノ配糖体誘導性失聴に対する被験者のリスクの判定のために使用することができる。
2019506870.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のヒトミトコンドリアコード１２Ｓ  ＲＮＡ（ＭＴＲＮＲ１）遺伝子（配列番号１）における突然変異の存在を判定するため方法であって、前記突然変異は、１５５５Ａ＞Ｇ及び１４９４Ｃ＞Ｔからなる群から選択され、前記方法は、
ａ）  前記ＭＴＲＮＲ１遺伝子の少なくとも一部を増幅するステップであって、前記一部は、そのような増幅がＰＣＲ増幅産物（アンプリコン）を生成する条件下で１対のプライマーを用いて突然変異ステータスがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において分析される遺伝子座を含む、ステップと、
ｂ）  前記アンプリコンを異なる試験管中でそれぞれ野生型アンプリコン又は突然変異型アンプリコンに特異的なプラズモンナノプローブと接触させるステップであって、前記プラズモンナノプローブは、プラズモンナノ粒子及びそれに共有結合した非イオン性のオリゴヌクレオチド類似体プローブを含み、前記オリゴヌクレオチド類似体プローブは、前記オリゴヌクレオチド類似体プローブと前記アンプリコンが互いにハイブリダイズする条件下で前記野生型アンプリコン又は前記突然変異型アンプリコンに相補的である塩基配列を含み、前記プローブは、前記アンプリコンにハイブリダイズすると、ハイブリダイズされていないプローブのシグナルと区別することができる検出可能なシグナルを発生する、ステップと、
ｃ）前記ナノプローブと前記アンプリコンのハイブリッドの融解温度Ｔｍの決定に基づいて前記突然変異の存在を判定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記方法のステップａ）で使用されるＰＣＲは非対称ＰＣＲ（ａＰＣＲ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法のステップｂ）で使用されるプラズモンナノプローブに含まれる前記プラズモンナノ粒子はプラズモン金ナノ粒子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法のステップｂ）で使用されるプラズモンナノプローブに含まれる前記非イオン性のオリゴヌクレオチド類似体プローブはモルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯＲ）プローブである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法のステップｂ）で発生する前記検出可能なシグナルは、前記プローブが前記アンプリコンにハイブリダイズされているか否かを示すアッセイ溶液の色である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｃ）で決定される前記融解温度は、ナノプローブの解離とその後の凝集により引き起こされる色変化により示される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法のステップ（ａ）に先立って、前記試料からゲノムＤＮＡを単離するステップを更に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記１５５５Ａ＞Ｇ及び１４９４Ｃ＞Ｔの突然変異を有するＭＴＲＮＲ１遺伝子の少なくとも一部を含んだ核酸分子を陽性対照として使用することと、
前記突然変異を有していないＭＴＲＮＲ１遺伝子の少なくとも一部を含んだ核酸分子を陰性対照として使用することと
のうちの少なくとも一方を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記方法で使用されるＰＣＲプライマーは、５’−ＧＡＧＴＧＣＴＴＡＧＴＴＧＡＡＣＡＧＧＧＣ−３’（配列番号２）及び５’−ＧＧＧＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＧＧＴＴＴＡＧ−３’（配列番号３）の核酸配列を有し、前記オリゴヌクレオチド類似体プローブは、５’−ＣＧＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号４）（１５５５Ａ＞Ｇ  ＷＴに特異的）、５’−ＣＧＡＣＴＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号５）（１５５５Ａ＞Ｇ  ＭＵＴに特異的）、５’−ＴＴＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号６）（１４９４Ｃ＞Ｔ  ＷＴに特異的）、又は５’−ＴＴＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号７）（１４９４Ｃ＞Ｔ  ＭＵＴに特異的）の核酸配列を有するモルホリノオリゴヌクレオチドが使用される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記モルホリノオリゴヌクレオチドは、ジスルフィドアミドで３’末端が修飾されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
アミノ配糖体誘導性失聴に対する被験者のリスクの判定のようなＭＴＲＮＲ１遺伝子の前記突然変異に関連した疾患又は障害に対する前記被験者の素因の判定のために使用される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
試料中のＭＴＲＮＲ１遺伝子（配列番号１）における突然変異の存在を判定するためキットであって、前記突然変異は、１５５５Ａ＞Ｇ及び１４９４Ｃ＞Ｔからなる群から選択され、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法で使用される１対のＰＣＲプライマーと１対のプラズモンナノプローブとを含むキット。
【請求項１３】
前記１５５５Ａ＞Ｇと１４９４Ｃ＞Ｔの突然変異の両方を判定するように設計されており、したがって４つのプラズモンナノプローブを含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記キットは、５’−ＧＡＧＴＧＣＴＴＡＧＴＴＧＡＡＣＡＧＧＧＣ−３’（配列番号２）及び５’−ＧＧＧＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＧＧＴＴＴＡＧ−３’（配列番号３）の核酸配列を有する１対のＰＣＲプライマーと、モルホリノオリゴヌクレオチドでそれぞれ官能化された４つのプラズモン金ナノ粒子とを含み、前記モルホリノオリゴヌクレオチドは、５’−ＣＧＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号４）（１５５５Ａ＞Ｇ  ＷＴに特異的）、５’−ＣＧＡＣＴＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号５）（１５５５Ａ＞Ｇ  ＭＵＴに特異的）、５’−ＴＴＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号６）（１４９４Ｃ＞Ｔ  ＷＴに特異的）、又は５’−ＴＴＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号７）（１４９４Ｃ＞Ｔ  ＭＵＴに特異的）の核酸配列を有し、ジスルフィドアミドで３’末端が修飾されている、請求項１２又は１３に記載のキット。
【請求項１５】
アミノ配糖体誘導性失聴に対する被験者のリスクの判定のようなＭＴＲＮＲ１遺伝子の前記突然変異に関連した疾患又は障害に対する前記被験者の素因の判定のために使用される、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ヒトミトコンドリアコード１２Ｓ  ＲＮＡ（ＭＴＲＮＲ１）遺伝子（配列番号１）における突然変異の存在を判定するための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子突然変異は、幼児期失聴の主な原因である。ヒトミトコンドリア遺伝子ＭＴＲＮＲ１（１２Ｓ  ｒＲＮＡ）の２つの病原性バリアント、すなわち１５５５Ａ＞Ｇ及び１４９４Ｃ＞Ｔは、アミノ配糖体との接触により誘導される聴覚消失と密接に関連することが知られている。また、そのような突然変異は、女性からその女性の子孫全てに母系遺伝する。
【０００３】
ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、及びネオマイシンを含むアミノ配糖体は、細菌性感染症の治療のために一般的に使用される抗生物質である。しかしながら、これら抗生物質には聴覚毒性があることもよく知られている。ｍｔＤＮＡの１５５５Ａ＞Ｇ又は１４９４Ｃ＞Ｔの突然変異を保持する個体は、アミノ配糖体抗生物質が投与されると、薬物濃度が正常範囲内にあっても、急速に進行する深刻な恒久的聴力損失を罹患する場合がある。
【０００４】
したがって、アミノ配糖体による治療の前に病原性ｍｔＤＮＡバリアントの遺伝学的スクリーニングをすれば、アミノ配糖体誘導性失聴のリスクに関する情報を提供することができる。代替療法を選択することにより、素因を有する個体の失聴を予防することができる。
【０００５】
遺伝子突然変異を決定するための種々の技術が従来存在している。しかしながら、既存の技術の欠点を克服した新技術に対する大きな必要性が依然として存在している。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ヒトＭＴＲＮＲ１遺伝子（配列番号１）における突然変異の存在を判定するための新しい方法及びキットを提供することにより、当該技術分野における前述した必要性を満たすものである。
【０００７】
１つの態様において、本発明は、試料中のヒトＭＴＲＮＲ１遺伝子（配列番号１）における突然変異の存在を判定するため方法を提供し、前記突然変異は、１５５５Ａ＞Ｇ及び１４９４Ｃ＞Ｔからなる群から選択され、前記方法は、
ａ）  前記ＭＴＲＮＲ１遺伝子の少なくとも一部を増幅するステップであって、前記一部は、そのような増幅がＰＣＲ増幅産物（アンプリコン）を生成する条件下で１対のプライマーを用いて突然変異ステータスがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において分析される遺伝子座を含む、ステップと、
ｂ）  前記アンプリコンを異なる試験管中でそれぞれ野生型アンプリコン又は突然変異型アンプリコンに特異的なプラズモンナノプローブと接触させるステップであって、前記プラズモンナノプローブは、プラズモンナノ粒子及びそれに共有結合した非イオン性のオリゴヌクレオチド類似体プローブを含み、前記オリゴヌクレオチド類似体プローブは、前記オリゴヌクレオチド類似体プローブと前記アンプリコンが互いにハイブリダイズする条件下で前記野生型アンプリコン又は前記突然変異型アンプリコンに相補的である塩基配列を含み、前記プローブは、前記アンプリコンにハイブリダイズすると、ハイブリダイズされていないプローブのシグナルと区別することができる検出可能なシグナルを発生する、ステップと、
ｃ）  前記ナノプローブと前記アンプリコンのハイブリッドの融解温度Ｔｍの決定に基づいて前記突然変異の存在を判定するステップと
を含む。
【０００８】
種々の実施形態において、前記方法のステップａ）で使用されるＰＣＲは非対称ＰＣＲ（ａＰＣＲ）である。
種々の実施形態において、前記方法のステップｂ）で使用されるプラズモンナノプローブに含まれる前記プラズモンナノ粒子はプラズモン金ナノ粒子である。
【０００９】
種々の実施形態において、前記方法のステップｂ）で使用されるプラズモンナノプローブに含まれる前記非イオン性のオリゴヌクレオチド類似体プローブは、モルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯＲ）プローブである。
【００１０】
種々の実施形態において、前記方法のステップｂ）で発生する前記検出可能なシグナルは、前記プローブが前記アンプリコンにハイブリダイズされているか否かを示すアッセイ溶液の色である。
【００１１】
種々の実施形態において、ステップｃ）で決定される融解温度は、ナノプローブの解離とその後の凝集により引き起こされる色変化により示される。
種々の実施形態において、前記方法は、前記方法のステップ（ａ）に先立って、前記試料からゲノムＤＮＡを単離するステップを更に含む。
【００１２】
種々の実施形態において、前記方法は、前記１５５５Ａ＞Ｇ及び１４９４Ｃ＞Ｔの突然変異を有するＭＴＲＮＲ１遺伝子の少なくとも一部を含んだ核酸分子を陽性対照として使用すること、及び／又は、前記突然変異を有していないＭＴＲＮＲ１遺伝子の少なくとも一部を含んだ核酸分子を陰性対照として使用することを含む。
【００１３】
種々の実施形態において、前記方法で使用されるＰＣＲプライマーは、５’−ＧＡＧＴＧＣＴＴＡＧＴＴＧＡＡＣＡＧＧＧＣ−３’（配列番号２）及び５’−ＧＧＧＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＧＧＴＴＴＡＧ−３’（配列番号３）の核酸配列を有し、前記オリゴヌクレオチド類似体プローブは、５’−ＣＧＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号４）（１５５５Ａ＞Ｇ  ＷＴに特異的）、５’−ＣＧＡＣＴＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号５）（１５５５Ａ＞Ｇ  ＭＵＴに特異的）、５’−ＴＴＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号６）（１４９４Ｃ＞Ｔ  ＷＴに特異的）、又は５’−ＴＴＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号７）（１４９４Ｃ＞Ｔ  ＭＵＴに特異的）の核酸配列を有するモルホリノオリゴヌクレオチドが使用される。
【００１４】
種々の実施形態において、モルホリノオリゴヌクレオチドは、ジスルフィドアミドで３’末端が修飾されている。
種々の実施形態において、前記方法は、アミノ配糖体誘導性失聴に対する被験者のリスクの判定などのＭＴＲＮＲ１遺伝子の前記突然変異に関連した疾患又は障害に対する前記被験者の素因の判定のために使用される。
【００１５】
別の態様において、本発明は、試料中のＭＴＲＮＲ１遺伝子（配列番号１）における突然変異の存在を判定するためキットを提供し、前記突然変異は、１５５５Ａ＞Ｇ及び１４９４Ｃ＞Ｔからなる群から選択され、前記キットは、本明細書に開示の方法で使用される１対のＰＣＲプライマーと１対のプラズモンナノプローブとを含む。
【００１６】
種々の実施形態において、前記キットは、１５５５Ａ＞Ｇと１４９４Ｃ＞Ｔの突然変異の両方を判定するように設計されており、したがって４つのプラズモンナノプローブを含む。
【００１７】
種々の実施形態において、前記キットは、５’−ＧＡＧＴＧＣＴＴＡＧＴＴＧＡＡＣＡＧＧＧＣ−３’（配列番号２）及び５’−ＧＧＧＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＧＧＴＴＴＡＧ−３’（配列番号３）の核酸配列を有する１対のＰＣＲプライマーと、モルホリノオリゴヌクレオチドでそれぞれ官能化された４つのプラズモン金ナノ粒子とを含み、前記モルホリノオリゴヌクレオチドは、５’−ＣＧＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号４）（１５５５Ａ＞Ｇ  ＷＴに特異的）、５’−ＣＧＡＣＴＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号５）（１５５５Ａ＞Ｇ  ＭＵＴに特異的）、５’−ＴＴＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号６）（１４９４Ｃ＞Ｔ  ＷＴに特異的）、又は５’−ＴＴＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号７）（１４９４Ｃ＞Ｔ  ＭＵＴに特異的）の核酸配列を有し、ジスルフィドアミドで３’末端が修飾されている。
【００１８】
種々の実施形態において、前記キットは、アミノ配糖体誘導性失聴に対する被験者のリスクの判定などのＭＴＲＮＲ１遺伝子の前記突然変異に関連した疾患又は障害に対する前記被験者の素因の判定のために使用される。
【００１９】
本発明は、非限定的な例及び添付の図面を共に考慮して、詳細な記載を参照するとより良好に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、ｍｔＤＮＡの１５５５Ａ＞Ｇを標的とする（ａ）ＷＴプローブ及び（ｂ）ＭＵＴプローブについて、融解温度を標的濃度の関数として示している。試料は、合成一本鎖ＷＴ  ＤＮＡ（配列番号８）及びＭＵＴ  ＤＮＡ（配列番号９）である。Ｔｍ測定の誤差＝±１℃。
【図２】図２は、ｍｔＤＮＡの１４９４Ｃ＞Ｔを標的とする（ａ）ＷＴプローブ及び（ｂ）ＭＵＴプローブについて、融解温度を標的濃度の関数として示している。試料は、合成一本鎖ＷＴ  ＤＮＡ（配列番号８）及びＭＵＴ  ＤＮＡ（配列番号１０）である。Ｔｍ測定の誤差＝±１℃。
【図３】図３は、（ａ）ｍｔＤＮＡの１５５５Ａ＞Ｇ及び（ｂ）ｍｔＤＮＡの１４９４Ｃ＞Ｔの遺伝子型を決定するためのＴｍＷＴ及びＴｍＭＵＴの散布図を示している。Ｔｍ測定の誤差＝±１℃。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下の詳細な記載は、本発明を実施することができる具体的な詳細及び実施形態を実例として参照する。こうした実施形態は、当業者による本発明の実施を可能にするのに十分な程度に詳述されている。他の実施形態を使用することができ、本発明の範囲から逸脱せずに、構造的及び論理的な変更をなすことができる。幾つかの実施形態を１つ又は複数の他の実施形態と組み合わせて、新しい実施形態を形成することができるため、種々の実施形態は、必ずしも相互に排他的ではない。
【００２２】
本発明の目的は、ヒトＭＴＲＮＲ１遺伝子（配列番号１）における突然変異の存在を判定するための方法を提供する。
この目的のために、本発明の発明者らは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びプラズモンナノプローブに基づく検出を使用した方法を提供する。
【００２３】
１つの態様において、本明細書では、試料中のヒトＭＴＲＮＲ１遺伝子（配列番号１）における突然変異の存在を判定するため方法が開示され、前記突然変異は、１５５５Ａ＞Ｇ及び１４９４Ｃ＞Ｔからなる群から選択され、前記方法は、
ａ）  前記ＭＴＲＮＲ１遺伝子の少なくとも一部を増幅するステップであって、前記一部は、そのような増幅がＰＣＲ増幅産物（アンプリコン）を生成する条件下で１対のプライマーを用いて突然変異ステータスがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、好ましくは非対称ＰＣＲ（ａＰＣＲ）において分析される遺伝子座を含む、ステップと、
ｂ）  前記アンプリコンを異なる試験管中でそれぞれ野生型（ＷＴ）アンプリコン又は突然変異型（ＭＵＴ）アンプリコンに特異的なプラズモンナノプローブと接触させるステップであって、前記プラズモンナノプローブは、プラズモンナノ粒子、好ましくはプラズモン金ナノ粒子と、それに共有結合した非イオン性のオリゴヌクレオチド類似体プローブ、好ましくはモルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯＲ）プローブとを含み、前記オリゴヌクレオチド類似体プローブは、前記オリゴヌクレオチド類似体プローブと前記アンプリコンが互いにハイブリダイズする条件下で前記野生型アンプリコン又は前記突然変異型アンプリコンに相補的である塩基配列を含み、前記プローブは、前記アンプリコンにハイブリダイズすると、ハイブリダイズされていないプローブのシグナルと区別することができる検出可能なシグナルを発生し、前記検出可能なシグナルは、好ましくは、前記プローブが前記アンプリコンにハイブリダイズされているか否かを示すアッセイ溶液の色である、ステップと、
（ｃ）  前記ナノプローブと前記アンプリコンのハイブリッドの融解温度Ｔｍの決定に基づいて前記突然変異の存在を判定するステップであって、前記融解温度は、好ましくは、ナノプローブの解離とその後の凝集により引き起こされる色変化により示される、ステップと
を含む。
【００２４】
ヒトＭＴＲＮＲ１遺伝子の全配列は、配列番号１に示されており、ヒトミトコンドリアゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＣ＿０１２９２０．１）の６４８位から１６０１位にわたる配列である。用語「突然変異」又は「遺伝子突然変異」は、本明細書中で使用される場合、野生型の基準鎖と比較したＤＮＡ鎖の塩基配列における変更を指す。より具体的には、１５５５Ａ＞Ｇは、ヒトミトコンドリアゲノムの１５５５位におけるＡからＧへの突然変異を指し、１４９４Ｃ＞Ｔは、ヒトミトコンドリアゲノムの１４９４位におけるＣからＴへの突然変異を指す。本発明の状況では、上記用語は、用語「遺伝子多型」又は当該技術分野における任意の他の類義語若しくは同義語を含むことが理解されるべきである。
【００２５】
用語「試料」は、本明細書中で使用される場合、本明細書に記載の方法により分析されることが可能なあらゆるものを指す。試料としては、例えば、精製されたＤＮＡ、細胞、血液、精液、唾液、尿、糞便、及び直腸スワブ等を挙げることができる。
【００２６】
ある実施形態において、本方法は、ステップ（ａ）に先立って、試料からゲノムＤＮＡを単離するステップを更に含んでもよい。
本明細書に記載の方法は、突然変異ステータスが分析される遺伝子座を含んだＭＴＲＮＲ１遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅するためのＰＣＲを行い、その結果得られるアンプリコンをプラズモンナノプローブに基づいて検出し、したがって、ＭＴＲＮＲ１遺伝子の突然変異ステータスの決定に使用することができる。
【００２７】
本方法では、プラズモンナノプローブのうちのオリゴヌクレオチド類似体プローブにハイブリダイズする一本鎖アンプリコンを生成することができる任意のＰＣＲを使用することができる。そのような種類のＰＣＲ技術としては、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、アッセンブリＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ダイヤルアウトＰＣＲ（ｄｉａｌ−ｏｕｔ  ＰＣＲ）、デジタルＰＣＲ、ヘリカーゼ依存増幅法、ホットスタートＰＣＲ、インターシーケンス特異的ＰＣＲ（ＩＳＳＲ、ｉｎｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ）、インバースＰＣＲ、ライゲーション媒介ＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、ミニプライマーＰＣＲ、多重ライゲーション依存プローブ増幅法（ＭＬＰＡ）、多重ＰＣＲ、ナノ粒子支援ＰＣＲ（ｎａｎｏＰＣＲ）、ネステッドＰＣＲ、オーバーラップ伸長ＰＣＲ又はオーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥｉｎｇ）、ＰＡＮ−ＡＣ、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、固相ＰＣＲ、熱非対称インターレースＰＣＲ（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ、ｔｈｅｒｍａｌ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ  ＰＣＲ）、タッチダウンＰＣＲ（ステップダウンＰＣＲ）、ユニバーサルファストウォーク（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｆａｓｔ  ｗａｌｋｉｎｇ）、又は転写媒介増幅法（ＴＭＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの技術は、当該技術分野で周知である（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，ＭＪ及びＭｏｌｌｅｒ，ＳＧ（２０００年）ＰＣＲ（Ｂａｓｉｃｓ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｅｌｏｓ社；第１版）。
【００２８】
好ましい実施形態では、非対称ＰＣＲ（ａＰＣＲ）が使用される。ａＰＣＲは、２つのプライマーの量が等しくないＰＣＲである。多量に存在する方のプライマーは過剰プライマーと呼ばれ、過剰プライマーの伸長から生じる鎖は過剰に蓄積され、その後、本発明のプラズモンナノプローブのオリゴヌクレオチド類似体プローブにハイブリダイズされる。
【００２９】
ＰＣＲアンプリコンは、それぞれ野生型アンプリコン又は突然変異型アンプリコンに特異的なプラズモンナノプローブと更に接触させられるが、前記プラズモンナノプローブは、プラズモンナノ粒子及びそれに共有結合した非イオン性のオリゴヌクレオチド類似体プローブを含み、前記オリゴヌクレオチド類似体プローブは、前記オリゴヌクレオチド類似体プローブと前記アンプリコンが互いにハイブリダイズする条件下で前記野生型アンプリコン又は前記突然変異型アンプリコンに相補的である塩基配列を含む。
【００３０】
いかなる特定の理論に束縛されることを望まないが、本発明によるプローブは、前記アンプリコンにハイブリダイズされると、ハイブリダイズされていないプローブのシグナルと区別することができる検出可能なシグナルを発生する。前記シグナルは、任意の手段により検出可能な任意のシグナルであってもよい。
【００３１】
好ましい実施形態において、これらプローブは、ハイブリダイズした状態においてある色（例えば、赤色）を示し、ハイブリダイズされていない凝集状態において別の色（例えば、明灰色）を示すことにより、標的が存在しているか否かを示す。ハイブリダイズされていないナノプローブの凝集は、一般的に、アッセイ溶液のイオン強度を制御することにより、例えば塩濃度を制御することにより達成することができる。ナノプローブのこの特定の挙動、つまり、標的にハイブリダイズされている限りは非凝集形態のままであって、標的にハイブリダイズされていないと凝集するという挙動は、ナノプローブが非イオン性であるという特徴に帰すことができる。
【００３２】
本方法のステップｂ）のプラズモンナノプローブ及びアンプリコンのハイブリダイゼーションは、完全な相補性を有するナノプローブ及びアンプリコンの二本鎖の融解温度未満の温度と、不完全な相補性を有するナノプローブ及びアンプリコンの二本鎖の融解温度を超える温度とで実施することにより、これらの２つのグループの間の相違を最大化することを可能にしてもよい。また、これらの実施形態において、ステップｃ）は、ハイブリッドが形成されたか否かを示すアッセイ溶液の色を単に判定することにより、上述の温度で実施してもよい。したがって、これらの実施形態では、形成されたハイブリッドがアッセイ温度を超える融解温度を有し、プラズモンナノプローブに完全に相補的なアンプリコンが存在することを示すか、あるいは、アッセイ温度未満の融解温度を有し、プラズモンナノプローブに完全に相補的なアンプリコンが存在しないことを示すかが判定される限り、ハイブリッドの融解温度が単に決定されるのみである。
【００３３】
用語「ナノ粒子」は、本明細書中で使用される場合、約１ｎｍから約２５０ｎｍまでのサイズを有する任意の粒子を指し、本明細書に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド類似体に共有結合する能力を有する。ある実施態様において、ナノ粒子は金属ナノ粒子である。他の実施形態において、ナノ粒子はコロイド金属である。
【００３４】
一部の実施形態において、金属は貴金属である。使用可能な貴金属の非限定的な例としては、銀、金、白金、パラジウム、ルテニウム、オスミウム、イリジウム、又はそれらの混合物などを挙げることができる。ナノ粒子の形成にも使用可能な他の金属としては、アルミニウム、銅、コバルト、インジウム、ニッケル、又はナノ粒子形成に使用し易い任意の他の金属を挙げることができるが、これらに限定されない。また、本明細書に記載のナノ粒子は、半導体（例えば、限定ではないが、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、及びＺｎＳでコーティングされたＣｄＳ又はＣｄＳｅ）又は磁性（例えば、強磁性（ｆｅｒｒｏｍａｇｎｅｔｉｔｅ））コロイド物質を含むことができる。また、本発明の実施に有用な他のナノ粒子としては、限定ではないが、ＺｎＳ、ＺｎＯ、Ｔｉ、ＴｉＯ２、Ｓｎ、ＳｎＯ２、Ｓｉ、ＳｉＯ２、Ｆｅ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ａｌ、鋼、コバルト−クロム合金、Ｃｄ、チタン合金、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓ、及びＧａＡｓが挙げられる。
【００３５】
本発明のコンジュゲートに使用されるナノ粒子のサイズは、所望の場合、ナノ粒子が光学的特性を提供することが可能である限り、例えば、ハイブリダイゼーション反応に感受性の光学的シグナルを発生させることが可能である限り、任意のサイズに変更することができる。本明細書に記載のナノ粒子の直径は、約１ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約１４０ｎｍ、約１ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約１ｎｍ〜約８０ｎｍ、約１ｎｍ〜約６０ｎｍ、約１ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約８ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約８５ｎｍ〜約２５０ｎｍ、約１００ｎｍ〜約２５０ｎｍ、又は約１５０ｎｍ〜約２５０ｎｍのサイズの範囲であってもよい。一部の実施形態において、ナノ粒子の直径の直径は、約１ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲である。
【００３６】
ある実施態様において、ナノ粒子は界面活性剤を含む。本明細書中で使用される場合、「界面活性剤」は、分子中に親水性部分と疎水性部分の両方を有する表面活性剤を指す。界面活性剤は、例えば、ナノ粒子を安定させるために使用することができる。また、界面活性剤を使用して、ナノ粒子の表面へのオリゴヌクレオチド類似体の非特異的な吸着を防止することができる。一部の実施形態において、界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。使用可能な他の種類の界面活性剤としては、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、又は両性イオン性界面活性剤を挙げることができるが、これらに限定されない。特定の界面活性剤を単独で、あるいは他の界面活性剤と組み合わせて使用してもよい。１つの種類の界面活性剤は、親水性頭部基及び疎水性尾部を含む。陰イオン性界面活性剤に伴う親水性頭部基としては、カルボキシレート、スルホネート、サルフェート、ホスフェート、及びホスホネートが挙げられる。陽イオン性界面活性剤に関する親水性頭部基としては、第四級アミン、スルホニウム、及びホスホニウムが挙げられる。第四級アミンとしては、第四級アンモニウム、ピリジニウム、ビピリジニウム、及びイミダゾリウムが挙げられる。非イオン性界面活性剤に関する親水性頭部基としては、アルコール及びアミドが挙げられる。両性イオン性界面活性剤に関する親水性頭部基としてはベタインが挙げられる。疎水性尾部は、典型的には炭化水素鎖を含む。炭化水素鎖は、典型的には約６〜約２４個の炭素原子、より典型的には約８〜約１６個の炭素原子を含む。
【００３７】
本方法で使用されるプラズモンナノ粒子は、好ましくは、分析しようとするアンプリコンを認識する非イオン性のオリゴヌクレオチド類似体プローブで官能化されている。本発明を実施する場合、合計４つのプラズモンナノ粒子を同時に使用して、２つの突然変異の存在を判定することができる。
【００３８】
一部の実施形態において、本開示の方法で使用される非イオン性のオリゴヌクレオチド類似体プローブは、モルホリノオリゴヌクレオチドプローブ又はその誘導体である。用語「オリゴヌクレオチド類似体」は、（ｉ）修飾された骨格構造、例えば天然オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドに見出される標準的なリン酸ジエステル連結以外の骨格と、（ｉｉ）オプションとして、修飾された糖部分、例えば、リボース又はデオキシリボース部分ではないモルホリノ部分とを有するオリゴヌクレオチドを指す。類似体は、ワトソン−クリック型塩基対合により標準的なポリヌクレオチド塩基と水素結合が可能である塩基を支持しており、類似体の骨格は、オリゴヌクレオチド類似体分子と標準的なポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ）の塩基との間に、配列特異的な様式でそのような水素結合を可能にする塩基を提示する。類似体としては、例えば、実質的に非荷電のリン含有骨格を有するものが挙げられる。
【００３９】
オリゴヌクレオチド類似体の実質的に非荷電のリン含有骨格は、例えば、サブユニット連結の大多数、例えば６０〜１００％が生理学的なｐＨで非荷電であり、単一のリン原子を含む。オリゴヌクレオチド類似体は、下記に定義されているような、標的アンプリコンに相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。好ましい実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴであり、糖及びリン酸骨格は、ホスホルアミデートにより連結されているモルホリン基により置換されており、シトシン、グアニン、アデニン、チミン、及びウラシル等の核酸塩基は、モルホリン環又はその誘導体と結合されている。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「相補的」又は「相補性」は、塩基が対合している（例えば、ワトソン−クリック型塩基対合によるグアニンとシトシン、アデニンとチミン（ＤＮＡ）又はウラシル（ＲＮＡ））ＤＮＡ又はＲＮＡの２つの異なる鎖におけるヌクレオチド／塩基の関係性、あるいはオリゴヌクレオチド類似体プローブ及びＤＮＡ／ＲＮＡ鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド／塩基の関係性に関するものである。したがって、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド類似体プローブは、従来のワトソン−クリック型塩基対合、又は相補的ヌクレオシド若しくはヌクレオチド間のフーグスティーン水素結合又は逆フーグスティーン水素結合等の他の非通常型の対合のいずれかにより、別のヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ配列と水素結合を形成することができるヌクレオチド配列を含むことができる。この文脈において、用語「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン−クリック型ＤＮＡ相補性、フーグスティーン結合、又は当該技術分野で知られている他の配列特異的結合の規則に従った水素結合による、ＤＮＡ又はＲＮＡの２つの異なる鎖間、又はオリゴヌクレオチド類似体プローブ及びＤＮＡ／ＲＮＡ配列のヌクレオチド配列のヌクレオチド／塩基間の相互作用を指す。この文脈において、当該技術分野では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド類似体のヌクレオチド配列は、特異的に又は選択的にハイブリダイズ可能であるために、標的核酸配列と１００％相補的である必要のないことが理解される。
【００４１】
相補性は、第２の核酸分子と水素結合を形成することができる核酸分子の隣接する残基のパーセントにより示される。例えば、幾つかを言及するまでもなく、第１の核酸分子が１０個のヌクレオチドを有し、第２の核酸分子が１０個のヌクレオチドを有する場合、第１及び第２の核酸分子間の５、６、７、８、９、又は１０個のヌクレオチドの塩基対合は、それぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の相補性を表す。
【００４２】
したがって、一部の実施形態において、本明細書中で使用されるオリゴヌクレオチド類似体は、標的アンプリコンと１００％相補的（つまり、完全一致）であってもよい。他の実施形態において、オリゴヌクレオチド類似体プローブは、標的アンプリコンと少なくとも約９５％相補的、少なくとも約８５％相補的、少なくとも約７０％相補的、少なくとも約６５％相補的、少なくとも約５５％相補的、少なくとも約４５％相補的、又は少なくとも約３０％相補的であってもよいが、ただし、目的とするものではないアンプリコンよりも、目的とする標的アンプリコンを特異的に認識することができる。
【００４３】
本明細書に記載のオリゴヌクレオチド類似体プローブの長さは、約５個の単量体単位〜約４０個の単量体単位、約１０個の単量体単位〜約３５個の単量体単位、又は約１５個の単量体単位〜約３５個の単量体単位を含むことができる。オリゴヌクレオチド類似体プローブの「単量体単位」という用語は、本明細書中で使用される場合、オリゴヌクレオチド類似体の１つのヌクレオチド単位を指す。
【００４４】
ある実施態様において、オリゴヌクレオチド類似体プローブは、官能基を介してナノ粒子と共有結合している。官能基は、典型的には、ナノ粒子と共有結合するためのオリゴヌクレオチド類似体プローブのスペーサー部分に含まれている。一部の実施形態において、官能基は、チオール（ＳＨ）基を含んでいてもよく、チオール（ＳＨ）基は、例えば、ナノ粒子の表面に共有結合するのに使用することができる。ただし、他の官能基も使用することができる。３’末端又は５’末端がチオールで官能化されたオリゴヌクレオチドは、金ナノ粒子に容易に付着することができる。例えば、Ｍｕｃｉｃら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５５５〜５５７頁（１９９６年）を参照されたい。この文献には、３’チオールＤＮＡを平坦な金表面に付着させるための方法が記載されている。また、チオール部分は、オリゴヌクレオチドを他の金属、半導体及び磁性コロイドや、本明細書に記載の他の種類のナノ粒子に付着させるために使用することができる。オリゴヌクレオチドを固体表面に付着させるための他の官能基としては、ホスホロチオエート基（例えば、オリゴヌクレオチド−ホスホロチオエートの金表面への結合は、米国特許第５，４７２，８８１号明細書を参照）、置換アルキルシロキサン（例えば、Ｇｒａｂａｒら、Ａｎａｌ．Ｇｈｅｎｔ．、６７巻、７３５〜７４３頁を参照）が挙げられる。また、５’チオヌクレオシド又は３’チオヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを使用して、オリゴヌクレオチドを固体表面に付着させることができる。オリゴヌクレオチド類似体プローブをナノ粒子に付着させるために使用することができる当業者に知られている他の官能基としては、ジスルフィドアミド等のジスルフィド、カルボン酸、芳香族環化合物、スルフォラン、スルホキシド、シランなどを挙げることができ、これらに限定されない。
【００４５】
本方法を実施するためのプラズモンナノ粒子及びナノプローブのより詳細な説明は、プローブ配列が目的の標的のために構成されている国際公開第２０１１／０８７４５６号（Ａ１）に見出すことができる。この文献は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【００４６】
本発明の発明者らにより開発されたプラズモンナノプローブは、核酸配列の認識が高度に特異的である。好ましい実施形態において、プラズモン金ナノ粒子は、非イオン性のモルホリノオリゴヌクレオチドで官能化されている。塩溶液に安定分散するＤＮＡ修飾金ナノ粒子とは異なり、モルホリノオリゴヌクレオチド修飾ナノ粒子は、モルホリノオリゴヌクレオチドの性質が非イオン性であるため、非常に不安定であり、低イオン強度（例えば、［ＮａＣｌ］＜１０ｍｍｏｌ／Ｌ）の溶液に分散可能であるに過ぎない。溶液イオン強度が増加すると、ナノ粒子凝集により、溶液の色が赤色から明灰色／無色に変化することになる。しかしながら、ナノプローブは、負に荷電したＤＮＡ分子とハイブリダイゼーションすると、表面電荷の増加により非常に安定化され、高イオン強度（例えば、［ＮａＣｌ］約１００ｍｍｏｌ／Ｌ）では、溶液は依然として赤色のままである。温度を上昇させると、融解温度（Ｔｍ）で鋭い融解転移が生じ、それによりＤＮＡ分子がナノプローブから放出され、溶液の色が急速に変化する。ナノプローブはＤＮＡ標的の認識が高度に特異的であり、単一塩基ミスマッチはＴｍを５〜１２℃減少させる場合がある。この技術は、標準的な装置及び単純な作業手順により正確な終点検出を可能にする。比色定量シグナルは、容易に視覚化及び記録することができる。
【００４７】
ある実施形態において、本方法は、１５５５Ａ＞Ｇ及び１４９４Ｃ＞Ｔの突然変異を有するＭＴＲＮＲ１遺伝子の少なくとも一部を含んだ核酸分子を陽性対照として使用すること、及び／又は、前記突然変異を有していないＭＴＲＮＲ１遺伝子の少なくとも一部を含んだ核酸分子を陰性対照として使用することを含む。試料中のＭＴＲＮＲ１遺伝子の突然変異ステータスは、そのＴｍデータ又は色情報を対照と比較することにより容易に決定することができる。
【００４８】
好ましい実施形態において、本方法で使用されるＰＣＲプライマーは、５’−ＧＡＧＴＧＣＴＴＡＧＴＴＧＡＡＣＡＧＧＧＣ−３’（配列番号２）及び５’−ＧＧＧＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＧＧＴＴＴＡＧ−３’（配列番号３）の核酸配列を有し、前記オリゴヌクレオチド類似体プローブは、５’−ＣＧＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号４）（１５５５Ａ＞Ｇ  ＷＴに特異的）、５’−ＣＧＡＣＴＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号５）（１５５５Ａ＞Ｇ  ＭＵＴに特異的）、５’−ＴＴＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号６）（１４９４Ｃ＞Ｔ  ＷＴに特異的）、又は５’−ＴＴＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号７）（１４９４Ｃ＞Ｔ  ＭＵＴに特異的）の核酸配列を有するモルホリノオリゴヌクレオチドが使用される。好ましい実施形態において、これらのモルホリノオリゴヌクレオチドは、ジスルフィドアミドで３’末端が修飾されている。
【００４９】
本明細書には、試料中のＭＴＲＮＲ１遺伝子（配列番号１）における突然変異の存在を判定するためキットがさらに開示されており、前記突然変異は、１５５５Ａ＞Ｇ及び１４９４Ｃ＞Ｔからなる群から選択され、前記キットは、上記したような１対のＰＣＲプライマー及び１対のプラズモンナノプローブを含む。好ましい実施形態において、前記キットは、前記突然変異の両方を判定するように設計されており、したがって上記したように４つのプラズモンナノプローブを含む。
【００５０】
ある実施形態において、前記キットは、５’−ＧＡＧＴＧＣＴＴＡＧＴＴＧＡＡＣＡＧＧＧＣ−３’（配列番号２）及び５’−ＧＧＧＴＴＴＧＧＧＧＣＴＡＧＧＴＴＴＡＧ−３’（配列番号３）の核酸配列を有する１対のＰＣＲプライマーと、モルホリノオリゴヌクレオチドでそれぞれ官能化された４つのプラズモン金ナノ粒子とを含み、前記モルホリノオリゴヌクレオチドは、５’−ＣＧＡＣＴＴＧＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号４）（１５５５Ａ＞Ｇ  ＷＴに特異的）、５’−ＣＧＡＣＴＴＧＣＣＴＣＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号５）（１５５５Ａ＞Ｇ  ＭＵＴに特異的）、５’−ＴＴＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号６）（１４９４Ｃ＞Ｔ  ＷＴに特異的）、又は５’−ＴＴＧＡＧＧＡＧＡＧＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’（配列番号７）（１４９４Ｃ＞Ｔ  ＭＵＴに特異的）の核酸配列を有し、ジスルフィドアミドで３’末端が修飾されている。
【００５１】
本発明の範囲内には、アミノ配糖体誘導性失聴に対する被験者のリスクを判定することが含まれるが、それには限定されず、ＭＴＲＮＲ１遺伝子（配列番号１）の前記突然変異に関連した疾患又は障害に対する被験者の素因の判定のために使用される上述の方法及びキットが更に包含される。
【００５２】
別に定義されていない限り、本明細書中で使用されている技術用語及び科学用語は全て、当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本書類が優先されることになる。
【００５３】
本発明を以下の例により更に説明する。しかしながら、本発明は、例示されている実施形態に限定されないことが理解されるべきである。
実施例
物質及び方法
Ａ．  ナノプローブの調製
本明細書中で使用されるナノプローブの調製は、以前に報告されているものと同様である（Ｚｕ  Ｙら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１年６月１日；８３巻（１１号）：４０９０〜４頁、Ｚｕ  Ｙら、Ｓｍａｌｌ．２０１１年２月７日；７巻（３号）：３０６〜１０頁）。手短に言えば、ジスルフィドアミドで３’末端が修飾されているＭＯＲ（Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ，ＬＬＣ社）をジチオトレイトールで処理してジスルフィド結合を還元し、その後、ＮＡＰ−５カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して精製した。金ＮＰ（直径４０ｎｍ、０．１ｎＭ以下、Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．社）を２μＭ以下のチオール化ＭＯＲ及び１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）と混合し、室温で一晩インキュベートした。次に、ＭＯＲ−ＮＰコンジュゲートをリン酸緩衝溶液（５ｍＭ、ｐＨ７．５）で少なくとも５回遠心分離により洗浄して、未反応ＭＯＲを除去した。コンジュゲートは、ナノプローブとして直ちに使用することができたか、あるいは使用まで４℃の冷蔵庫で保管することができた。ナノプローブは、４℃で保管すると少なくとも６か月間は安定していた。ナノプローブ溶液は、使用前にボルテックスにより均一に分散させるべきである。
【００５４】
Ｂ．  ｇＤＮＡ抽出
ヒトｇＤＮＡ試料は、全血、頬スワブ、又は唾液から抽出することができた。抽出は、市販のキットであるＧｅｎｔｒａ  Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を製造業者の説明書に従って使用することで実施することができた。ｇＤＮＡ試料の量（ｎｇ／μｌ）及び品質は、Ｎａｎｏｄｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した吸光度測定により測定することができた。試料の品質を２６０ｎｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度の比（Ａ２６０／Ａ２８０比）で特徴付けた。この比は、典型的には１．６から２．０まで変動した。
【００５５】
Ｃ．  ａＰＣＲ
ａＰＣＲを使用して、一本鎖ＤＮＡ標的を生成した。２５μＬの最終体積を有するＰＣＲ溶液は、ｇＤＮＡ、１２．５μＬのＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社又はＰｒｏｍｅｇａ社、２×）、１０００ｎＭの順方向プライマー、及び１００ｎＭの逆方向プライマーを含有していた。ＰＣＲサイクル（表３）をＰＴＣ−２００ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で実施した。ＰＣＲで特定サイズのアンプリコンの生成に成功したことは、５μＬ分割量のＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルに流してＳａｆｅＶｉｅｗ（商標）色素で染色することにより検証した。
【００５６】
Ｄ．  Ｔｍ測定
合成標的すなわちＰＣＲアンプリコンを、特異的なＷＴナノプローブ及びＭＵＴナノプローブと単純に混合した。次に、標的−プローブハイブリッドのＴｍ値をサーマルサイクラーで測定した。温度を３２℃から１．０℃間隔で上昇させた。各温度で溶液を１分間インキュベートしてから、色視覚化すなわちカメラによる記録を行った。赤色から明灰色への明瞭な色変化が観察された場合、その温度をＴｍとして記録した。
【００５７】
Ｅ．  遺伝子型帰属
合成ＤＮＡ標的を用いて得られたＴｍＷＴ−ＴｍＭＵＴ散布図（図３）を基準遺伝子型決定ダイヤグラムとして使用した。試料の実験データ点（ＴｍＷＴ、ＴｍＭＵＴ）をこのダイヤグラムにプロットすることができた。データポイントがどの領域にあるかにより、遺伝子型を容易に決定することができた。
【００５８】
実施例：  ヒトＭＴＲＮＲ１遺伝子突然変異の検出
本明細書には、アミノ配糖体誘導性失聴に関連するＭＴＲＮＲ１遺伝子の２つのｍｔＤＮＡ突然変異（１５５５Ａ＞Ｇ及び１４９４Ｃ＞Ｔ）を決定するための方法及びアッセイキットが開示されている。遺伝子検査は、本発明の発明者らの実験室で最近開発された二重ナノプローブ法を使用して実施した（Ｚｕら、Ｓｍａｌｌ、７巻（２０１１年）３０６〜３１０頁、Ｚｕら、Ｎａｎｏ  Ｔｏｄａｙ、９巻（２０１４年）１６６〜１７１頁）。使用したナノプローブは高度に特異的であり、それらのプラズモン特性は比色定量検出を可能にした。
【００５９】
各突然変異アッセイでは、２組のナノプローブ、つまり野生型（ＷＴ）プローブ及び突然変異型（ＭＵＴ）プローブを使用した。ナノプローブは、金ナノ粒子をモルホリノオリゴヌクレオチド（ＭＯＲ）で官能化することにより用意した。オリゴ配列は表１に示されている。ＷＴナノプローブのオリゴ配列は、ＷＴ遺伝子セグメントと完全に一致しており、ＭＵＴナノプローブのオリゴ配列は、突然変異対立遺伝子と完全に一致していた。ナノプローブは、５ｍＭリン酸緩衝液中で赤色溶液（約ｐＨ８）として少なくとも６か月間安定的に分散していた。しかしながら、１００ｍＭのＮａＣｌを添加すると、ナノ粒子の不可逆的凝集に至り、溶液の色は１分以内に無色になった。
【００６０】
【表１】
2019506870.tif 000003
溶液中に標的ＤＮＡが存在すると、ＤＮＡ付着時にナノ粒子の表面負電荷が増加するため、ナノプローブの安定性を増加させることができた。付着したＤＮＡの面密度が十分に高ければ、ナノ粒子は、１００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下でさえ安定的に分散した。ＤＮＡ−ナノプローブハイブリッドの熱力学的特性を明らかにするために、融解温度（Ｔｍ）を測定した。Ｔｍでは、ナノ粒子表面からのＤＮＡ配列の解離が生じ、ナノ粒子が不安定になり、赤色から明灰色への溶液の色変化が生じることになる。その後、Ｔｍデータを使用して、試料の遺伝子型を決定した。
【００６１】
ナノプローブを特徴付けるために、１００ｍＭのＮａＣｌ（終濃度）及び５ｎＭ〜５００ｎＭの広範な濃度範囲にわたる合成ＤＮＡ試料の存在下で、Ｔｍデータを測定した（図１及び図２並びに表２）。標的とプローブとの間の単一塩基ミスマッチにより誘導されるＴｍ差異は約６〜１５℃であり、明確な差別化が可能であった。
【００６２】
【表２】
2019506870.tif 000004
図１及び図２に示されているデータは、ＴｍＷＴ−ＴｍＭＵＴ散布図（図３）として示すことができた。これを、試料遺伝子型を決定するための基準ダイヤグラムとして使用した。未知試料は、ＴｍＷＴ及びＴｍＭＵＴのデータが得られたら、データ点が基準遺伝子型決定ダイヤグラムのどの領域に位置するかに基づいて、遺伝子型を帰属させることができた。
【００６３】
ヒトゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）試料は、ＰＣＲ増幅を実施して、十分な量のｍｔＤＮＡ遺伝子の特異的標的配列を生成することができた。２つの突然変異部位を隣接するようにプライマー対を設計した。表３及び表４には、ＰＣＲプライマー及び熱サイクルのパラメータが示されている。ＰＣＲ後、ＰＣＲ産物の２つの分割量を、それぞれＷＴナノプローブ及びＭＵＴナノプローブと直接混合することができた。ＷＴプローブ／アンプリコン及びＭＵＴプローブ／アンプリコンのハイブリッドのＴｍ値を測定することができた。得られたデータ点（ＴｍＷＴ、ＴｍＭＵＴ）を基準遺伝子型決定ダイヤグラムにプロットして、試料の遺伝子型を決定することができた。
【００６４】
【表３】
2019506870.tif 000005
【００６５】
【表４】
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要約すると、本発明者らは、アミノ配糖体誘導性失聴に関連する２つのｍｔＤＮＡ突然変異を判定するための二重ナノ粒子アッセイキットを開発した。使用した唯一の装置は、標準的なサーマルサイクラーであった。そのため、費用対効果の高い検出が可能になった。高度に特異的なプラズモンナノプローブは、比色定量シグナルに基づく正確な遺伝子型決定を保証した。
【００６６】
本発明は、本明細書では幅広く包括的に説明されている。包括的な開示の範疇に入るより狭義の種及び亜属グループもそれぞれ本発明の一部を構成する。これは、除外された物質が本明細書で具体的に記載されているか否かに関わらず、その属から任意の主題を取り除く条件付きで又は否定的な限定付きで、本発明の包括的記載を含む。以下の特許請求の範囲内に入る実施形態は他にも存在する。加えて、本発明の特徴又は態様が、マーカッシュ群の観点で記載されている場合、当業者であれば、本発明は、それによりマーカッシュ群の任意の個々の要素又は要素の亜群の観点でも記載されていることを認識するであろう。
【００６７】
当業者であれば、本発明は、目的を達成し、言及されている目的及び利点並びにそれらに本来備わるものを得るために良好に構成されていることを容易に認識するであろう。更に、当業者であれば、本発明の範囲及び趣旨から逸脱せずに、本明細書に開示の発明に様々な置換及び改変をなすことができることは、直ちに明らかであろう。本明細書に記載の組成物、方法、手順、処理、分子、及び特定の化合物は、好ましい実施形態をここで代表するものであって、例示であり、本発明の範囲を限定するものとして意図されていない。当業者であれば、それに対する変更及び他の使用を思い付くであろう。それらは、本発明の趣旨内に包含され、請求項の範囲により定義される。本明細書における以前に発表されている文献の列挙又は考察は、本書類が、技術水準の一部であるか又は一般的な常識的知識であることを認めるものとして必ずしも理解されるべきでない。
【００６８】
本明細書中で例示的に記載されている本発明は、本明細書中に具体的に開示されていない任意の１つ若しくは複数の要素又は１つ若しくは複数の限定が存在しない場合に適切に実施することができる。したがって、例えば、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「備える（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」等は、拡張的及び非限定的に解釈されるべきである。したがって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の活用形は、言及されている整数又は整数の群を含むが、任意の他の整数又は整数の群を除外しないことを示唆することが理解されるであろう。加えて、本明細書中で使用されている用語及び表現は、説明のための用語として使用されており、限定するための用語としては使用されていない。そのような用語及び表現を、図示又は記載されている特徴又はそれらの部分の任意の等価物を除外するために使用することは意図されておらず、むしろ、特許請求されている本発明の範囲内で種々の改変をなすことが可能であることが理解される。したがって、本発明は、例示的な実施形態により具体的に開示されており、本明細書に開示されており、そこに具現化されている本発明の任意選択的な特徴、改変、及び変異は、当業者により実施することができ、そのような改変及び変異は、本発明の範囲内であるとみなされることが理解されるべきである。
【００６９】
本明細書中で引用されている全ての文献及び特許文献の内容は、それらの全体が参照により組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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