(57)【要約】ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）抗原を含むリステリアベースの免疫原性組成物ならびに対象においてがんを処置する、及びがんに対してワクチン接種する、及びがんに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。ウィルムス腫瘍タンパク質抗原を含む組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチド、そのようなキメラポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸、そのようなキメラポリペプチドもしくは融合ポリペプチドまたはそのような核酸を含む組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株、ならびにそのような組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む細胞バンクも本明細書で提供する。そのようなキメラポリペプチドまたは融合ポリペプチド、そのような核酸、及びそのような組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を生成する方法も本明細書で提供する。そのようなキメラポリペプチドもしくは融合ポリペプチド、そのような核酸、またはそのような組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物、医薬組成物、及びワクチンも提供する。そのような組換えキメラポリペプチドもしくは融合ポリペプチド、核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを使用して、対象において抗ＷＴ１免疫応答を誘導する方法、対象において抗ＷＴ１発現腫瘍または抗ＷＴ１発現がん免疫応答を誘導する方法、対象においてＷＴ１発現またはＷＴ１関連腫瘍またはがんを処置する方法、対象においてＷＴ１発現またはＷＴ１関連腫瘍またはがんを予防する方法、及びＷＴ１発現またはＷＴ１関連腫瘍またはがんに対して対象を保護する方法も提供する。
2019522991.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含むミニ遺伝子構築物であって、前記キメラポリペプチドが、
（ａ）細菌分泌シグナル配列；
（ｂ）ユビキチンタンパク質；及び
（ｃ）抗原性ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）ペプチド
を含み、前記細菌分泌シグナル配列、前記ユビキチン、及び前記抗原性ＷＴ１ペプチドが、前記キメラポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へと直列で配列されている、前記ミニ遺伝子構築物。
【請求項２】
前記抗原性ＷＴ１ペプチドがヘテロクリティック変異ＷＴ１ペプチドを含む、請求項１に記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項３】
前記ヘテロクリティック変異ＷＴ１ペプチドが、配列番号１１４〜１３７、１５９、１６０、１６２、及び１６３のいずれか１つに記載の配列を含む、請求項２に記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項４】
前記ヘテロクリティック変異ＷＴ１ペプチドが、配列番号１１４、１１５、１６２、または１６３に記載の配列を含む、請求項３に記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項５】
前記キメラポリペプチドが配列番号１５６、１５７、１６５、または１６６に記載の配列を含む、請求項４に記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項６】
前記抗原性ＷＴ１ペプチドが天然ＷＴ１ペプチドを含む、請求項１に記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項７】
前記天然ＷＴ１ペプチドが配列番号９５または１５８に記載の配列を含む、請求項６に記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項８】
前記キメラポリペプチドが配列番号１６４に記載の配列を含む、請求項７に記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項９】
前記キメラポリペプチドがさらに、前記細菌シグナル配列と前記ユビキチンタンパク質との間に１つまたは複数の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドを含む、請求項１〜４、６、及び７のいずれか１項に記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項１０】
前記１つまたは複数の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドが２つ以上の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドを含む、請求項９に記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項１１】
前記２つ以上の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドが、介在配列を伴わずに相互に直接融合している、請求項１０に記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項１２】
前記２つ以上の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドがペプチドリンカーを介して相互に連結している、請求項１０に記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項１３】
前記１つまたは複数の追加の抗原性ペプチドが、配列番号１５４に記載の配列を含む第１の追加の抗原性ＷＴ１ペプチド、配列番号１５５に記載の配列を含む第２の追加の抗原性ＷＴ１ペプチド、及び配列番号１３６に記載の配列を含む第３の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドを含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の追加の抗原性ペプチドが、配列番号１５４に記載の配列を含む第１の追加の抗原性ＷＴ１ペプチド、配列番号１５５に記載の配列を含む第２の追加の抗原性ＷＴ１ペプチド、及び配列番号１３７に記載の配列を含む第３の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドを含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項１５】
前記キメラポリペプチドが配列番号１５３に記載の配列を含む、請求項１４に記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項１６】
前記細菌分泌シグナル配列がリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）分泌シグナル配列である、先行請求項のいずれかに記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項１７】
前記ＬＬＯ分泌シグナル配列が配列番号５９または配列番号１５０に記載の配列を含む、請求項１６のミニ遺伝子構築物。
【請求項１８】
前記ユビキチンタンパク質が配列番号１００に記載の配列を含む、先行請求項のいずれかに記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項１９】
前記抗原性ＷＴ１ペプチドが配列番号９５、１１４〜１３７、１５８、１６２、及び１６３のいずれか１つに記載の配列を含み、前記細菌分泌シグナル配列が配列番号５９に記載の配列を含み、前記ユビキチンタンパク質が配列番号１００に記載の配列を含む、先行請求項のいずれかに記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項２０】
前記ミニ遺伝子構築物が、
（ａ）細菌分泌シグナル配列；
（ｂ）ユビキチンタンパク質；及び
（ｃ）抗原性ＷＴ１ペプチド
を含むキメラポリペプチドをそれぞれコードする２つ以上のオープンリーディングフレームを含み、
前記細菌分泌シグナル配列、前記ユビキチン、及び前記抗原性ＷＴ１ペプチドがそれぞれのキメラポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へと直列で配列されていて、
前記抗原性ＷＴ１ペプチドが、各キメラポリペプチドで異なり、
前記ミニ遺伝子構築物が、オープンリーディングフレームの各対の間にシャイン−ダルガノリボソーム結合部位核酸配列を含む、先行請求項のいずれかに記載のミニ遺伝子構築物。
【請求項２１】
先行請求項のいずれかに記載のミニ遺伝子構築物によってコードされるキメラポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のミニ遺伝子構築物を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２３】
融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、前記融合ポリペプチドが天然ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、天然ＷＴ１の免疫原性断片、及び配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含むＷＴ１ペプチドから選択される抗原性ＷＴ１ペプチドに融合しているＰＥＳＴ含有ペプチドを含む、前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２４】
前記融合ポリペプチドが前記天然ＷＴ１を含む、請求項２３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２５】
前記融合ポリペプチドが前記天然ＷＴ１の免疫原性の断片を含む、請求項２３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２６】
前記天然ＷＴ１の免疫原性の断片が、配列番号９５または配列番号１３９に記載の配列を含む、請求項２５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２７】
前記融合ポリペプチドが、配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含むＷＴ１ペプチドを含む、請求項２３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２８】
前記融合ポリペプチドが、２つ以上の抗原性ＷＴ１ペプチドに融合しているＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、前記２つ以上の抗原性ＷＴ１ペプチドの少なくとも１つが、前記天然ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、前記天然ＷＴ１の免疫原性の断片、及び配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含む前記ＷＴ１ペプチドから選択され、前記２つ以上の抗原性ＷＴ１ペプチドが同じか、または異なる、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項２９】
前記２つ以上の抗原性ＷＴ１ペプチドが、介在配列を伴わずに相互に直接融合している、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３０】
前記２つ以上の抗原性ＷＴ１ペプチドが、ペプチドリンカーを介して相互に連結している、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３１】
前記融合ポリペプチドがさらに、前記天然ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、前記天然ＷＴ１の免疫原性の断片、及び配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含む前記ＷＴ１ペプチドのうちの１つまたは複数のＮ末端側及び／またはＣ末端側に１つまたは複数のペプチドタグを含む、請求項２３〜３０のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３２】
前記１つまたは複数のペプチドタグが次の：３ｘＦＬＡＧタグ；６ｘＨｉｓタグ；ＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、及び配列番号９９に記載のＦＬＡＧタグうちの１つまたは複数を含む、請求項３１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３３】
前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが前記融合ポリペプチドの前記Ｎ末端側にある、請求項２３〜３２のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３４】
前記ＰＥＳＴ含有ペプチドがＬＬＯのＮ末端側断片である、請求項２３〜３３のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３５】
ＬＬＯの前記Ｎ末端側断片が配列番号５９に記載の配列を含む、請求項３４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３６】
前記核酸が、リステリアゲノムに作動可能に組み込まれている、請求項２２〜３５のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３７】
前記核酸がエピソームプラスミド中にある、請求項２２〜３５のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３８】
前記核酸が前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株に抗生物質抵抗性を付与しない、請求項２２〜３７のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項３９】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が弱毒化栄養素要求Ｌｉｓｔｅｒｉａ株である、請求項２２〜３８のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４０】
前記弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が１つまたは複数の内因性遺伝子において変異を含み、その変異が前記１つまたは複数の内因性遺伝子を不活性化させている、請求項３９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４１】
前記１つまたは複数の内因性遺伝子がｐｒｆＡを含む、請求項４０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４２】
前記１つまたは複数の内因性遺伝子がａｃｔＡを含む、請求項４０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４３】
前記１つまたは複数の内因性遺伝子がａｃｔＡ及びｉｎｌＢを含む、請求項４０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４４】
前記１つまたは複数の内因性遺伝子がａｃｔＡ、ｄａｌ、及びｄａｔを含む、請求項４０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４５】
前記核酸が、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、請求項２２〜４４のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４６】
前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素である、請求項４５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４７】
前記融合ポリペプチドがｈｌｙプロモーターから発現される、請求項２２〜４６のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４８】
組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、請求項２２〜４７のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項４９】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株がｐｒｆＡにおいて欠失または不活性化変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、Ｄ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ変異タンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５０】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌ、及びｄａｔにおいて欠失または不活性化変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端側断片である、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５１】
組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ及びｉｎｌＢにおいて欠失または不活性化変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓであり、前記核酸がゲノムに組み込まれており、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドがＡｃｔＡタンパク質またはその断片である、請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【請求項５２】
請求項２２〜５１のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株及びアジュバントを含む、免疫原性組成物。
【請求項５３】
前記アジュバントが、解毒リステリオリシンＯ（ｄｔＬＬＯ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、請求項５２に記載の免疫原性組成物。
【請求項５４】
対象においてＷＴ１発現腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、請求項２２〜５１のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または請求項５２〜５３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項５５】
対象においてＷＴ１発現腫瘍またはがんを予防または処置する方法であって、請求項２２〜５１のいずれか１項に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または請求項５２〜５３のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる２０１６年７月５日出願の米国特許仮出願第６２／３５８，５３９号の利益を請求する。
【０００２】
ＥＦＳ  Ｗｅｂによりテキストファイルとして送信された配列表の参照
ファイル４９９３３５ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記載の配列表は、１７１キロバイトであり、２０１７年６月３０日に作成され、参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）は、多くのがんで過剰発現され、白血病、乳癌、卵巣癌、神経膠芽細胞腫、軟部組織肉腫、及び他のがんを含む血液悪性病変及び様々な固形腫瘍において腫瘍学的役割を果たし得る。ＷＴ１は、免疫療法のための、及びＷＴ１の発現と関連するがんを有する患者を処置するために免疫系を利用するための有望な標的であり得る。
【０００４】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）はグラム陽性通性細胞内細菌であり、大部分はリステリオリシン−Ｏ（ＬＬＯ）の膜孔形成活性によって、マクロファージ及び樹状細胞などの抗原提示細胞の細胞質への直接アクセスを有する。ＬＬＯは、細胞による貪食後にＬｍによって分泌され、ファゴリソソーム膜に孔を開けて、細菌が小胞から脱出し、かつ細胞質に進入することを可能にする。ＬＬＯは非常に効率的に、ＭＨＣクラスＩ分子を介して免疫系に提示される。さらに、Ｌｍ由来ペプチドも、ファゴリソソームを介してのＭＨＣクラスＩＩ提示へのアクセスを有する。
【発明の概要】
【０００５】
ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）発現またはＷＴ１関連腫瘍を処置または予防する、がん免疫療法のための方法及び組成物を提供する。一態様では、キメラポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含むミニ遺伝子構築物であって、キメラポリペプチドが：（ａ）細菌分泌シグナル配列；（ｂ）ユビキチンタンパク質；及び（ｃ）１つまたは複数の抗原性ＷＴ１ペプチドを含み、細菌分泌シグナル配列、ユビキチン、及び１つまたは複数の抗原性ＷＴ１ペプチドが、キメラポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へと直列で配列されているミニ遺伝子構築物を本明細書で提供する。抗原性ＷＴ１ペプチドは、天然ＷＴ１ペプチド及び／またはヘテロクリティック変異ＷＴ１ペプチドであり得る。そのようなミニ遺伝子構築物によってコードされるキメラポリペプチド及びそのようなミニ遺伝子構築物を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株も提供する。
【０００６】
別の態様では、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、融合ポリペプチドが天然ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、天然ＷＴ１の免疫原性断片、及び配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含むＷＴ１ペプチドから選択される抗原性ＷＴ１ペプチドに融合しているＰＥＳＴ含有ペプチドを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を提供する。そのような融合ポリペプチド及びそのような融合ポリペプチドをコードする核酸も提供する。
【０００７】
別の態様では、キメラポリペプチドが：（ａ）細菌分泌シグナル配列；（ｂ）ユビキチンタンパク質；及び（ｃ）１つまたは複数の抗原性ＷＴ１ペプチドを含み、細菌分泌シグナル配列、ユビキチン、及び１つまたは複数の抗原性ＷＴ１ペプチドが、キメラポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へと直列で配列されているキメラポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含むか、あるいは融合ポリペプチドが天然ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、天然ＷＴ１の免疫原性断片、及び配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含むＷＴ１ペプチドから選択される抗原性ＷＴ１ペプチドに融合しているＰＥＳＴ含有ペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む、ミニ遺伝子構築物を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを本明細書で提供する。キメラポリペプチドもしくは融合ポリペプチド、またはキメラポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードする核酸を含む免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンも提供する。
【０００８】
別の態様では、対象においてＷＴ１発現またはＷＴ１関連腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、キメラポリペプチドが：（ａ）細菌分泌シグナル配列；（ｂ）ユビキチンタンパク質；及び（ｃ）１つまたは複数の抗原性ＷＴ１ペプチドを含み、細菌分泌シグナル配列、ユビキチン、及び１つまたは複数の抗原性ＷＴ１ペプチドが、キメラポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へと直列で配列されているキメラポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含むか、あるいは融合ポリペプチドが天然ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、天然ＷＴ１の免疫原性断片、及び配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含むＷＴ１ペプチドから選択される抗原性ＷＴ１ペプチドに融合しているＰＥＳＴ含有ペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む、ミニ遺伝子構築物を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を対象に投与することを含む方法を本明細書で提供する。対象においてＷＴ１発現またはＷＴ１関連腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、そのような組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを対象に投与することを含む方法も提供する。対象においてＷＴ１発現またはＷＴ１関連腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、キメラポリペプチドもしくは融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチド（例えば、ミニ遺伝子構築物）もしくは融合ポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドもしくは融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチド（例えば、ミニ遺伝子構築物）もしくは融合ポリペプチドをコードする核酸を含む免疫原性組成物、キメラポリペプチドもしくは融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチド（例えば、ミニ遺伝子構築物）もしくは融合ポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物、あるいはキメラポリペプチドもしくは融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチド（例えば、ミニ遺伝子構築物）もしくは融合ポリペプチドをコードする核酸を含むワクチンを対象に投与することを含む方法も提供する。
【０００９】
別の態様では、対象においてＷＴ１発現またはＷＴ１関連腫瘍またはがんを予防または処置する方法であって、キメラポリペプチドが：（ａ）細菌分泌シグナル配列；（ｂ）ユビキチンタンパク質；及び（ｃ）１つまたは複数の抗原性ＷＴ１ペプチドを含み、細菌分泌シグナル配列、ユビキチン、及び１つまたは複数の抗原性ＷＴ１ペプチドが、キメラポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へと直列で配列されているキメラポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含むか、あるいは融合ポリペプチドが天然ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、天然ＷＴ１の免疫原性断片、及び配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含むＷＴ１ペプチドから選択される抗原性ＷＴ１ペプチドに融合しているＰＥＳＴ含有ペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む、ミニ遺伝子構築物を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を対象に投与することを含む方法を本明細書で提供する。対象においてＷＴ１発現またはＷＴ１関連腫瘍またはがんを予防または処置する方法であって、そのような組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを対象に投与すること含む方法も提供する。対象においてＷＴ１発現またはＷＴ１関連腫瘍またはがんを予防または処置する方法であって、キメラポリペプチドもしくは融合ポリペプチド、キメラポリペプチド（例えば、ミニ遺伝子構築物）もしくは融合ポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドもしくは融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチド（例えば、ミニ遺伝子構築物）もしくは融合ポリペプチドをコードする核酸を含む免疫原性組成物、キメラポリペプチドもしくは融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチド（例えば、ミニ遺伝子構築物）もしくは融合ポリペプチドをコードする核酸を含む医薬組成物、あるいはキメラポリペプチドもしくは融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチド（例えば、ミニ遺伝子構築物）もしくは融合ポリペプチドをコードする核酸を含むワクチンを対象に投与することを含む方法も提供する。
【００１０】
別の態様では、キメラポリペプチドが：（ａ）細菌分泌シグナル配列；（ｂ）ユビキチンタンパク質；及び（ｃ）１つまたは複数の抗原性ＷＴ１ペプチドを含み、細菌分泌シグナル配列、ユビキチン、及び１つまたは複数の抗原性ＷＴ１ペプチドが、キメラポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へと直列で配列されているキメラポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含むか、あるいは融合ポリペプチドが天然ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、天然ＷＴ１の免疫原性断片、及び配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含むＷＴ１ペプチドから選択される抗原性ＷＴ１ペプチドに融合しているＰＥＳＴ含有ペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む、ミニ遺伝子構築物を含む１つまたは複数の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む細胞バンクを本明細書で提供する。
【００１１】
別の態様では、組換えポリペプチドをコードする核酸を含む組換え弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物であって、組換えポリペプチドがウィルムス腫瘍タンパク質またはその免疫原性断片に融合している短縮化リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮化ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む免疫原性組成物を提供する。
【００１２】
別の態様では、そのような免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象においてがんを処置する方法を提供する。
【００１３】
別の態様では、そのような免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象において抗がんＴ細胞応答の増強を誘発する方法を提供する。
【００１４】
別の態様では、そのような免疫原性組成物を対象に投与することを含む、対象においてがんに対する免疫応答の増強を誘発する方法を提供する。
【００１５】
発明とみなされる本発明の主題は、本明細書に含まれる部分で特に示され、明確に請求される。しかしながら、添付の図面と共に読むと、本発明は、構成及び操作方法の両方に関して、その目的、特徴、及び利点と共に、次の詳細な説明を参照することによって最も良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ〜図１Ｃは、ＬｍｄｄＡ３２３（ＷＴ１）及びＬｍｄｄＡ３２４（Ｏｖａ）で免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＷＴ１及びＯｖａペプチドに対するＩＦＮ−γ応答を示している。図１Ａは、ＷＴ１（マウス＃の１＆２）またはＯｖａ（マウス＃の３＆４）ミニ遺伝子構築物で免疫化されたマウスにおけるＷＴ１及びＯｖａペプチド刺激に対する一次応答を示している。図１Ｂ〜１Ｃは、ＷＴ１（図１Ｂ）またはＯｖａミニ遺伝子発現Ｌｍ（図１Ｃ）で免疫化されたマウスにおけるＷＴ１及びＯｖａペプチド刺激に対する二次応答を示している。
【図１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｃは、ＬｍｄｄＡ３２３（ＷＴ１）及びＬｍｄｄＡ３２４（Ｏｖａ）で免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＷＴ１及びＯｖａペプチドに対するＩＦＮ−γ応答を示している。図１Ａは、ＷＴ１（マウス＃の１＆２）またはＯｖａ（マウス＃の３＆４）ミニ遺伝子構築物で免疫化されたマウスにおけるＷＴ１及びＯｖａペプチド刺激に対する一次応答を示している。図１Ｂ〜１Ｃは、ＷＴ１（図１Ｂ）またはＯｖａミニ遺伝子発現Ｌｍ（図１Ｃ）で免疫化されたマウスにおけるＷＴ１及びＯｖａペプチド刺激に対する二次応答を示している。
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ〜図２Ｃは、マウス樹状ＤＣ２．４細胞における陽性対照（図２Ａ）、陰性対照（図２Ｂ）、及びＷＴ１（図２Ｃ）の発現及び分泌レベルを示している。
【図２Ｃ】図２Ａ〜図２Ｃは、マウス樹状ＤＣ２．４細胞における陽性対照（図２Ａ）、陰性対照（図２Ｂ）、及びＷＴ１（図２Ｃ）の発現及び分泌レベルを示している。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、ＷＴ１ミニ遺伝子構築物の図を示している。図３Ａは、単一のＷＴ１キメラポリペプチド抗原を発現するように設計されたＷＴ１ミニ遺伝子構築物を示している。図３Ｂは、３つの別々のＷＴ１キメラポリペプチド抗原を発現するように設計されたＷＴ１ミニ遺伝子構築物を示している。
【図４】ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１０１）及びＦＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１１４）でｅｘ  ｖｉｖｏで刺激された脾細胞におけるＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示している。脾細胞は、ＷＴ１−Ｆミニ遺伝子構築物で免疫化されたＨＬＡ２遺伝子導入マウスからのものである。ＰＢＳ及びＬｍｄｄＡ２７４を陰性対照として使用した。
【図５】ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１０１）及びＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１１５）でｅｘ  ｖｉｖｏで刺激された脾細胞におけるＥＬＩＳＰＯＴアッセイを示している。脾細胞は、ＷＴ１−ＡＨ１−Ｔｙｒミニ遺伝子構築物で免疫化されたＨＬＡ２遺伝子導入マウスからのものである。ＰＢＳ及びＬｍｄｄＡ２７４を陰性対照として使用した。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１０１；図６Ａ）及びＦＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１１４；図６Ｂ）でｅｘ  ｖｉｖｏで刺激された１００万の脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）を示している。脾細胞は、ＷＴ１−Ｆミニ遺伝子構築物で免疫化されたＨＬＡ２遺伝子導入マウスからのものである。ＰＢＳ及びＬｍｄｄＡ２７４を陰性対照として使用した。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、ＷＴ１ペプチドＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１０１；図７Ａ）及びＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１１５；図７Ｂ）でｅｘ  ｖｉｖｏで刺激された１００万の脾細胞当たりのＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）を示している。脾細胞は、ＷＴ１−ＡＨ１−Ｔｙｒミニ遺伝子構築物で免疫化されたＨＬＡ２遺伝子導入マウスからのものである。ＰＢＳ及びＬｍｄｄＡ２７４を陰性対照として使用した。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、Ｌｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックフェニルアラニンミニ遺伝子構築物（図８Ａ）及びＬｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物（図８Ｂ）のウェスタンブロットを示している。図８Ａでは、レーン１はラダーであり、レーン２はＬｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物（６８ｋＤａ）であり、レーン３は陰性対照である。図８Ｂでは、レーン１はラダーであり、レーン２は陰性対照であり、レーン３はＷＴ１−ｔＬＬＯ−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックフェニルアラニンミニ遺伝子構築物（構築物＃１）である。
【図９】ヘテロクリティック変異ＷＴ１ペプチドを発現するいくつかのＬｍ−ミニ遺伝子構築物でのコロニーＰＣＲの結果を示している。変異残基は、太字で下線を引かれている。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
本明細書で互換的に使用する「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、コード化及び非コード化アミノ酸ならびに化学的または生化学に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含む任意の長さのアミノ酸の高分子形態を指す。これらの用語は、修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドなどの、修飾されているポリマーを含む。
【００１８】
タンパク質は、「Ｎ末端」及び「Ｃ末端」を有すると述べられる。「Ｎ末端」という用語は、遊離アミン基（−ＮＨ２）を有するアミノ酸によって停止しているタンパク質またはポリペプチドの開始部を指す。「Ｃ末端」という用語は、遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）によって停止しているアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の末端部を指す。
【００１９】
「融合タンパク質」という用語は、ペプチド結合または他の化学結合によって一緒に連結している２つ以上のペプチドを含むタンパク質を指す。ペプチドは、ペプチドまたは他の化学結合によって直接一緒に連結し得る。例えば、キメラ分子は、一本鎖融合タンパク質として組換え発現され得る。別法では、ペプチドは、２つ以上のペプチドの間の１つまたは複数のアミノ酸などの「リンカー」または別の適切なリンカーによって一緒に連結し得る。
【００２０】
本明細書で互換的に使用する「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその類似体もしくは修飾バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドの高分子形態を指す。これらには、一本鎖、二本鎖、及び多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学修飾、生化学修飾、非天然、もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。
【００２１】
１個のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がホスホジエステル結合によって一方向で、その隣の３’酸素に結合する手法でオリゴヌクレオチドを作製するように、モノヌクレオチドは反応するので、核酸は、「５’末端」及び「３’末端」を有すると述べられる。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結していない場合に、「５’末端」と言及される。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結していない場合に、「３’末端」と言及される。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部にある場合であっても、５’及び３’末端を有すると述べられ得る。線状または環状ＤＮＡ分子のいずれでも、個別の要素は、「下流」または３’側の要素の「上流」または５’側にあると言及される。
【００２２】
「コドン最適化」は、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に、または最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、特定の宿主細胞における発現の増強のために核酸配列を修飾するプロセスを指す。例えば、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、天然に存在する核酸配列と比較すると、所与のＬｉｓｔｅｒｉａ細胞または任意の他の宿主細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを代わりに用いるように修飾することができる。コドン使用頻度表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能である。各アミノ酸についてＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが利用する最適なコドンは、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０２０７１７０号に示されている。これらの表は、任意の方法で適応させることができる。あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＮａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：２９２を参照されたい。特定の宿主における発現について特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも利用可能である（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅを参照されたい）。
【００２３】
「プラスミド」または「ベクター」という用語は、細菌送達ベクター、ウイルスベクター送達ベクター、ペプチド免疫療法薬送達ベクター、ＤＮＡ免疫療法薬送達ベクター、エピソームプラスミド、組み込み型プラスミド、またはファージベクターを含む、任意の既知の送達ベクターを含む。「ベクター」という用語は、１つまたは複数の融合ポリペプチドを送達し、かつ任意選択でそれを宿主細胞において発現することができる構築物を指す。
【００２４】
「エピソームプラスミド」または「染色体外プラスミド」という用語は、染色体ＤＮＡとは物理的に離れていて（すなわち、エピソームまたは染色体外で、宿主細胞のゲノムに組み込まれない）、染色体ＤＮＡとは独立して自己複製する核酸ベクターを指す。プラスミドは、線状または環状であってよく、一本鎖または二本鎖であってよい。エピソームプラスミドは任意選択で、宿主細胞の細胞質（例えば、ＬｉｓｔｅｒｉａＬｉｓｔｅｒｉａ）で多数のコピーで存在して、エピソームプラスミド内で目的の任意の遺伝子の増幅をもたらし得る。
【００２５】
「ゲノム組み込みされている」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれ、その後代によって引き継がれ得るように、細胞に導入されている核酸を指す。細胞のゲノムに核酸を安定的に導入するために、任意のプロトコルを使用してよい。
【００２６】
「安定的に維持される」という用語は、選択（例えば、抗生物質選択）の非存在下で、検出可能な喪失を伴わずに少なくとも１０世代にわたる核酸分子またはプラスミドの維持を指す。例えば、その期間は、少なくとも１５世代、２０世代、少なくとも２５世代、少なくとも３０世代、少なくとも４０世代、少なくとも５０世代、少なくとも６０世代、少なくとも８０世代、少なくとも１００世代、少なくとも１５０世代、少なくとも２００世代、少なくとも３００世代、または少なくとも５００世代であり得る。安定的に維持されるとは、核酸分子またはプラスミドがｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、培養中）で細胞において安定的に維持されること、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定的に維持されること、またはその両方を指す。
【００２７】
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、タンパク質を潜在的にコードし得る塩基の配列を含有するＤＮＡの部分である。例として、ＯＲＦは、遺伝子の開始コード配列（開始コドン）と停止コドン配列（終止コドン）との間に位置し得る。
【００２８】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが特定のポリヌクレオチド配列のための適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始することを指示することができるＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは加えて、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域を含んでもよい。本明細書で開示するプロモーター配列は、作動可能に連結したポリヌクレオチドの転写をモジュレートする。プロモーターは、本明細書で開示する細胞種の１つまたは複数（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳類細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、多能性細胞、１細胞期胚、分化細胞、またはその組み合わせ）において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的活性型プロモーター、条件プロモーター（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、誘導性プロモーター、一時制限プロモーター（例えば、発生調節プロモーター）、または空間制限プロモーター（ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、その全体で参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７６７７２において見い出すことができる。
【００２９】
「作動可能な連結」または「作動可能に連結されている」は、その両方の成分が正常に機能し、かつ成分の少なくとも１つが他の成分の少なくとも１つに及ぶ機能を媒介し得る可能性を許すような、２つ以上の成分（例えば、プロモーター及び別の配列要素）の並列を指す。例えば、プロモーターが、１つまたは複数の転写制御因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写のレベルを制御する場合、そのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、そのような配列が相互に近接していること、またはトランスに作用する（例えば、制御配列が、コード配列の転写を制御するために離れて作用し得る）ことを含み得る。
【００３０】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、規定の比較ウィンドウにわたる最大対応のためにアラインさせた場合に同じである２つの配列における残基に関する。タンパク質に関して、配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は多くの場合に、保存的アミノ酸置換によって異なることが認められ、その保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントを、置換の保存的性質について補正するために、上方調整してもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると述べられる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、それによって、配列同一性パーセンテージを上昇させることを伴う。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換がゼロのスコアを与えられる場合に、保存的置換は、ゼロから１の間のスコアを与えられる。例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）において実行されるように、保存的置換のスコアリングを計算する。
【００３１】
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインさせた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較することによって決定される値を指し、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最良のアラインメントのための基準配列（付加また欠失を含まない）と比較すると付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある。両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じている位置の数を決定してマッチした位置の数を得ること、比較のウィンドウ内の合計位置数でマッチした位置の数を割ること、及び結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって、パーセンテージを計算する。別段に指定しない限り（例えば、短い方の配列が、連結された非相同配列を含む）、比較ウィンドウは、比較される２つの配列の短い方の全長である。
【００３２】
別段に述べない限り、配列同一性／類似性値は、次のパラメーターを使用してＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０を使用して得られた値を指す：ヌクレオチド配列では、５０のＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔ及び３のＬｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ、及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用する同一性％及び類似性％；アミノ酸配列では８のＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔ及び２のＬｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する同一性％及び類似性％；またはその任意の同等プログラム。「同等プログラム」には、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０によって生成される対応するアラインメントと比較した場合に、該当する任意の２つの配列について、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチ率及び同一の配列同一性パーセントを有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムが含まれる。
【００３３】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、同様のサイズ、電荷、または極性である異なるアミノ酸での、配列に通常存在するアミノ酸の置換を指す。保存的置換の例には、非極性（疎水性）残基、例えば、イソロイシン、バリン、またはロイシンから別の非極性残基への置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニン及びリシンの間、グルタミン及びアスパラギンの間、またはグリシン及びセリンの間など、ある極性（親水性）残基から別のものへの置換が含まれる。加えて、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基から別のものへの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのある酸性残基から別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、またはメチオニンから極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸またはリシンへの、及び／または極性残基から非極性残基への置換が含まれる。典型的なアミノ酸カテゴリー化を下にまとめる。
【表６】
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【００３４】
「相同」配列（例えば、核酸配列）は、例えば、既知の基準配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるような、既知の基準配列と同一か、または実質的に同様である配列を指す。
【００３５】
「野生型」という用語は、正常な（変異体、罹患体、改変体などと対比させると）状態または状況において見い出されるとおりの構造及び／または活性を有するものを指す。野生型遺伝子及びポリペプチドは多くの場合に、多数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
【００３６】
タンパク質及び核酸に関する「単離（された）」という用語は、ｉｎ  ｓｉｔｕで通常存在し得る他の細菌、ウイルスまたは細胞成分に関して、タンパク質及びポリヌクレオチドの実質的に純粋な調製物にまで、及びそれを含めて、比較的精製されているタンパク質及び核酸を指す。「単離（された）」という用語はまた、天然に存在するカウンターパートを含まない、化学的に合成されている、したがって、他のタンパク質または核酸によって実質的に汚染されていない、または天然には随伴する多くの他の細胞成分（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、または細胞成分）から分離または精製されているタンパク質及び核酸を含む。
【００３７】
「外因性」または「非相同」分子または配列は、細胞で通常発現されないか、またはその形態の細胞には通常存在しない分子または配列である。通常の存在には、細胞の特定の発生段階及び環境条件に関する存在が含まれる。外因性または非相同分子または配列には例えば、細胞内の対応する内因性配列の変異バージョンが含まれ得るか、または細胞内であるが、異なる形態の（すなわち、染色体内ではない）内因性配列に対応する配列が含まれ得る。特定の細胞における外因性または非相同分子または配列はまた、細胞の基準種とは異なる種に、または同じ種内の異なる生体に由来する分子または配列であり得る。例えば、非相同ポリペプチドを発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合、その非相同ポリペプチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に天然または内因性ではない、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株によって通常発現されない、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株以外の他の源に由来する、同じ種内の異なる生体に由来するポリペプチドであり得る。
【００３８】
対照的に、「内因性」分子もしくは配列または「天然」分子もしくは配列は、その形態で、特定の細胞において、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在する分子または配列である。
【００３９】
「バリアント」という用語は、大部分の集団とは異なるが、共通様式に対してまだ十分に相似していて、それらのうちの１つ（例えば、スプライスバリアント）であると考えられるアミノ酸または核酸配列（または生体または組織）を指す。
【００４０】
「アイソフォーム」という用語は、（例えば、同じタンパク質の）別のアイソフォーム、またはバージョンと比較して僅かな相違のみを有する分子（例えば、タンパク質）の１つのバージョンを指す。例えば、タンパク質アイソフォームは、異なるが、関連する遺伝子から生成され得て、それらは、選択的スプライシングによって同じ遺伝子から生じ得るか、またはそれらは、一塩基多型から生じ得る。
【００４１】
「断片」という用語は、タンパク質に関する場合、全長タンパク質よりも短いか、または少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。「断片」という用語は、核酸に関する場合、全長核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端側断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端側断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、または内部断片であり得る。断片はまた、例えば、機能性断片または免疫原性断片であり得る。
【００４２】
「類似体」という用語は、タンパク質に関する場合、保存的アミノ酸相違によって、アミノ酸配列に影響を及ぼさない修飾によって、またはそれら両方によって、天然に存在するタンパク質とは異なるタンパク質を意味する。
【００４３】
「機能性」という用語は、生物学的活性または機能を示すタンパク質または核酸（またはその断片、アイソフォーム、もしくはバリアント）の生来の能力を指す。そのような生物学的活性または機能には、例えば、対象に投与された場合に免疫応答を誘発する能力が含まれ得る。そのような生物学的活性または機能にはまた、例えば、相互作用パートナーへの結合が含まれ得る。機能性断片、アイソフォーム、またはバリアントの場合、これらの生物学的機能は実際は、変化してもよいが（例えば、それらの特異性または選択性に関して）、基本的な生物学的機能は維持される。
【００４４】
「免疫原性」または「免疫原性の」という用語は、対象に投与した場合に対象において免疫応答を誘発する分子（例えば、タンパク質、核酸、抗原、または生体）の生来の能力を指す。例えば、その分子に対する比較的多数の抗体、その分子に対する抗体の比較的大きな多様性、その分子について特異的な比較的多数のＴ細胞、その分子に対する比較的大きな細胞傷害性またはヘルパーＴ細胞応答などによって、免疫原性を測定することができる。
【００４５】
「抗原」という用語は、対象または生体と接触させた場合に（例えば、対象または生体中に存在する場合に、またはそれによって検出された場合に）、対象または生体から検出可能な免疫応答が生じる物質を指すために本明細書で使用される。抗原は、例えば、脂質、タンパク質、炭水化物、核酸、またはそれらの組合せ及び変形形態であってよい。例えば、「抗原ペプチド」は、対象または生体中に存在する場合に、またはそれによって検出された場合に対象または生体において免疫応答の実行をもたらすペプチドを指す。例えば、そのような「抗原ペプチド」は、宿主細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ及び／またはクラスＩＩ分子上に負荷され、そこで提示され、宿主の免疫細胞によって認識または検出され得、それによって、そのタンパク質に対する免疫応答の実行をもたらすタンパク質を包含し得る。そのような免疫応答はまた、同じタンパク質を発現する宿主内の他の細胞、例えば、罹患細胞（例えば、腫瘍またはがん細胞）にも広がり得る。
【００４６】
「エピトープ」という用語は、免疫系によって認識される抗原上の部位（例えば、そこに抗体が結合する）を指す。エピトープは、１つまたは複数のタンパク質の三次フォールディングによって並置された連続アミノ酸または非連続アミノ酸から形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープ（線状エピトープとしても公知）は典型的には、変性溶媒に対する曝露で保持されるが、三次フォールディングによって形成されたエピトープ（配座異性エピトープとしても公知）は典型的には、変性溶媒での処置で失われる。エピトープは典型的には、少なくとも３、さらに通常は、少なくとも５または８〜１０のアミノ酸を特有の空間配座で含む。エピトープの空間配座を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学及び２次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい。
【００４７】
「変異」という用語は、遺伝子またはタンパク質の構造のいずれかの変化を指す。例えば、変異は、染色体またはタンパク質の欠失、挿入、置換または再編成から生じ得る。「挿入」は、１つまたは複数の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸を付加することによって、遺伝子におけるヌクレオチドの数またはタンパク質におけるアミノ酸の数を変える。「欠失」は、１つまたは複数の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸を減らすことによって、遺伝子におけるヌクレオチドの数またはタンパク質におけるアミノ酸の数を変える。
【００４８】
ヌクレオチドの付加または喪失が遺伝子リーディングフレームを変える場合に、ＤＮＡにおける「フレームシフト」変異は生じる。リーディングフレームは、１つのアミノ酸をそれぞれコードする３塩基の群からなる。フレームシフト変異は、これらの塩基の組み分けをシフトさせて、アミノ酸のためのコードを変化させる。生じるタンパク質は通常、非機能性である。挿入及び欠失はそれぞれ、フレームシフト変異であり得る。
【００４９】
「ミスセンス」変異または置換は、コードされるアミノ酸に変化をもたらす、タンパク質の１つのアミノ酸の変化または単一のヌクレオチドにおける点変異を指す。１つのアミノ酸において変化をもたらす単一ヌクレオチドにおける点変異は、ＤＮＡ配列における「非同義」置換である。非同義置換はまた、コドンが未成熟終止コドンに変化して、生じるタンパク質の短縮化をもたらす「ナンセンス」変異をもたらし得る。対照的に、ＤＮＡにおける「同義」変異は、（コドンの縮退によって）タンパク質のアミノ酸配列を変化させないものである。
【００５０】
「体細胞変異」という用語は、生殖細胞（例えば、精子または卵子）以外の細胞が獲得した遺伝子変異を含む。そのような変異は、細胞分裂の過程で変異細胞の後代に伝えられ得るが、遺伝性ではない。対照的に、性細胞変異は、生殖細胞系で生じ、次の世代の子孫に伝えられ得る。
【００５１】
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工環境、人工環境（例えば、試験管）内で生じるプロセスまたは反応を指す。
【００５２】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、天然環境（例えば、細胞または生体または身体）、及び天然環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。
【００５３】
１つまたは複数の列挙された要素を「含む」または「包含する」組成物または方法が、具体的に列挙されていない他の要素を含むこともある。例えば、タンパク質を「含む」または「包含する」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分との組み合わせで含有してよい。
【００５４】
値の範囲の指定は、その範囲内の、またはその範囲を規定するすべての整数、及びその範囲内の整数によって規定されるすべての副範囲を含む。
【００５５】
文脈から別段に明確ではない限り、「約」という用語は、規定の値の標準的な測定誤差限界（例えば、ＳＥＭ）内、または指定の値から±０．５％、１％、５％、または１０％の変化内の値を包含する。
【００５６】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が別段に明確に規定していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ（１つの抗原）」または「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（少なくとも１つの抗原）」という用語は、その混合物を含めて、複数の抗原を含み得る。
【００５７】
統計的に有意な、は、ｐ≦０．０５を意味する。
【００５８】
詳細な説明
Ｉ．概観
ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）抗原を含む免疫原性組成物、ならびに対象において、ＷＴ１発現またはＷＴ１関連腫瘍またはがんに対して処置及び予防接種し、それらに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。一例として、キメラポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含むミニ遺伝子構築物であって、キメラポリペプチドが：（ａ）細菌分泌シグナル配列；（ｂ）ユビキチンタンパク質；及び（ｃ）１つまたは複数の抗原性ＷＴ１ペプチドを含み、細菌分泌シグナル配列、ユビキチン、及び１つまたは複数の抗原性ＷＴ１ペプチドが、キメラポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へと直列で配列されているミニ遺伝子構築物を本明細書で提供する。コードされるキメラポリペプチド、及びそのようなミニ遺伝子構築物またはキメラポリペプチドを含む組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株も本明細書で提供する。別の例として、天然ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、天然ＷＴ１の免疫原性断片、及び配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含むＷＴ１ペプチドから選択される抗原性ＷＴ１ペプチドに融合しているＰＥＳＴ含有ペプチドを含む組換え融合ポリペプチドを本明細書で提供する。そのような融合ポリペプチドをコードする核酸、及びそのような融合ポリペプチドまたはそのような核酸を含む組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株も本明細書で提供する。
【００５９】
そのような組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む細胞バンク；そのようなキメラポリペプチドもしくは融合ポリペプチド、そのような核酸、またはそのような組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物、医薬組成物、及びワクチン；ならびにそのようなキメラポリペプチドまたは融合ポリペプチド、そのような核酸、及びそのような組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を生成する方法も提供する。そのような組換えキメラポリペプチドもしくは融合ポリペプチド、核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを使用して、対象において抗ＷＴ１免疫応答を誘導する方法、対象において抗ＷＴ１発現腫瘍または抗ＷＴ１発現がん免疫応答を誘導する方法、対象においてＷＴ１発現またはＷＴ１関連腫瘍またはがんを処置する方法、対象においてＷＴ１発現またはＷＴ１関連腫瘍またはがんを予防する方法、及び対象をＷＴ１発現またはＷＴ１関連腫瘍またはがんに対して防御する方法も提供する。
【００６０】
具体的な一実施例では、ウィルムス腫瘍タンパク質またはその免疫原性断片に融合している短縮化リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮化ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列の融合タンパク質を含む生弱毒化組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物を本明細書で開示する。がんを有する対象において抗ＷＴ１発現腫瘍Ｔ細胞応答の増強を誘発する方法であって、そのような組成物の有効量を対象に投与することを含む方法も開示する。対象において、がんに対する免疫応答の増強を誘発するためにそのような組成物を使用する方法であって、そのような組成物を、がんを有する対象に投与することを含む方法も本明細書で開示する。対象において、がんを処置するためにそのような組成物を使用する方法であって、そのような組成物を対象に投与することを含む方法も本明細書で開示する。対象において抗がんＴ細胞応答の増強を誘発するためにそのような組成物を使用する方法であって、そのような組成物を、がんを有する対象に投与することを含む方法も開示する。
【００６１】
本明細書で開示する方法におけるがんの種類の例には、ウィルムス腫瘍タンパク質の発現と関連していることが公知の任意の種類のがんが含まれる。例示的ながんには、乳癌、例えば、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）及び胃腸癌、例えば、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、結腸直腸癌、肛門癌、及び胃腸類癌腫が含まれる。三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、またはＨｅｒ２／ｎｅｕのための遺伝子を発現しない任意の乳癌を指す。多くの化学療法がこれら３つの受容体の１つを標的とするので、これによって、処置することがより困難になっている。
【００６２】
ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１、ＡＥＷＳ−ＧＵＤ、ＮＰＨＳ４、ＷＡＧＲ、ＷＩＴ−２、ＷＴ３３、ウィルムス腫瘍１）は、ヒトでは、染色体１１ｐ上のＷＴ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。この遺伝子は、Ｃ末端に４つの亜鉛フィンガーモチーフを、及びＮ末端にプロリン／グルタミンリッチなＤＮＡ結合ドメインを含有する転写因子をコードする。ＷＴ１抗原は、正常な成人細胞では一般に発現されないが、多数のがん、さらには特定のがん幹細胞で出現する転写因子である。例として、全長ウィルムス腫瘍タンパク質を本明細書で開示する方法及び組成物で使用することができ、ウィルムス腫瘍タンパク質の免疫原性断片、例えば、配列番号９５（ＲＭＦＰＮＡＰＹ）に記載の断片を、本明細書で開示する方法及び組成物において使用することができる。
【００６３】
好ましくは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である。そのような弱毒化株の例は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。そのような弱毒化株の別の例は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１４２７９１号を参照されたい。ＬｍｄｄＡは、内因性病原性遺伝子ａｃｔＡの欠失によって弱毒化されているＬｉｓｔｅｒｉａワクチンベクターに基づく。そのような株は、ｄａｌ遺伝子の相補によってｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗原を発現するプラスミドを保持し得る。別法では、ＬｍｄｄＡは、内因性ｄａｌ、ｄａｔ、及びａｃｔＡ遺伝子に変異を有するｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡＬｉｓｔｅｒｉａであり得る。そのような変異は例えば、変異遺伝子の欠失、短縮化、または不活性化であり得る。
【００６４】
好ましくは、ウィルムス腫瘍タンパク質またはその免疫原性断片は、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）またはその断片に融合している。好ましくは、ＬＬＯは、短縮化ＬＬＯ（ｔＬＬＯ）である。好ましくは、ｔＬＬＯは、ＰＥＳＴ様配列を含む。真核タンパク質におけるＰＥＳＴ配列は、以前から同定されている。例えば、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）がリッチなアミノ酸配列（ＰＥＳＴ）を含有し、一般に、常にではないが、いくつかの正電荷アミノ酸を含有するクラスターの横に配置されているタンパク質は、急速な細胞内半減期を有する（あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＲｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：３６４−３６９）。さらに、これらの配列は、タンパク質を、分解のためのユビキチン−プロテオソーム経路へと向けることが報告されている（あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１）。この経路はまた、ＭＨＣクラスＩに結合する免疫原性ペプチドを生成するために、真核細胞によって使用され、ＰＥＳＴ配列は、免疫原性ペプチドをもたらす真核タンパク質において豊富であると仮定されている（あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＲｅａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４８：１０９−１１３）。この酵素経路を有さないので、原核タンパク質はＰＥＳＴ配列を通常含有しない。しかしながら、アミノ酸プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）リッチなＰＥＳＴ様配列が、ＬＬＯのアミノ末端で報告されており、かつＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ病原性に必須であると報告されている（あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＤｅｃａｔｕｒ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｎｏｙ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：９９２−９９５）。ＬＬＯにおけるこのＰＥＳＴ様配列の存在によって、タンパク質は、宿主細胞のタンパク質分解機構による分解のための標的となるので、ＬＬＯがその機能を果たし、ファゴリソソーム小胞からのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの脱出を促進すると、細胞を損傷し得る前に、これは破壊される。
【００６５】
好ましくは、ｔＬＬＯは、非溶血性であるＬＬＯの断片を指す。例えば、ＬＬＯ断片は、活性化ドメインの欠失または変異によって非溶血性になり得る。別法では、ＬＬＯ断片は、システイン４８４を含む領域の欠失または変異によって、非溶血性になり得る。別法では、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７１，７０２号に詳述されているとおり、ＬＬＯ断片は、コレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の欠失または変異によって非溶血性になり得る。
【００６６】
本発明の組成物及び方法で利用するＬＬＯタンパク質の例示的なＮ末端側断片は、（配列番号５７）に記載の配列セットを有する。本発明の組成物及び方法で利用するＬＬＯタンパク質の別の例示的なＮ末端側断片は、配列番号５９に記載の配列セットを有する。
【００６７】
Ｌｍ技術は、効力のある先天免疫刺激、樹状細胞及び抗原提示細胞のサイトゾルへの直接的な標的ペプチドの送達、標的Ｔ細胞応答の生成、ならびに腫瘍微小環境における制御性Ｔ細胞及び骨髄系由来サプレッサー細胞による免疫抑制の低下を組み込む作用機序を有する。中和抗体を用いずに、多数の処置を与える、及び／または組み合わせることができる。腫瘍細胞を潜在的細菌感染細胞とみなすように免疫系を刺激し、それらを除去の標的とするために、Ｌｍ技術は、例えば、生、弱毒化、遺伝子操作Ｌｍ細菌を使用することができる。技術プロセスは、リステリアの生、弱毒化株で開始することができ、例えば、目的の抗原に結合している例えばＬＬＯ（リステリオリシンＯ）分子の断片を含む融合タンパク質配列をコードするプラスミドの多数のコピーを加えることができる。この融合タンパク質は、リステリアによって抗原提示細胞の内部で分泌される。これは、免疫系の先天及び適応アームの両方の刺激をもたらし、腫瘍防御機構を低下させ、免疫系ががん細胞を攻撃及び破壊することをより容易にする。
【００６８】
ワクチン接種しても、ＷＴ１ペプチドのみでは十分に免疫原性ではなく、急速に分解される。例えば、これらは、免疫原性を増強するために、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅとして公知のスクアレンオイルアジュバント中で製剤化される必要がある。さらに、局所炎症を誘導し、その領域に抗原提示細胞を誘引するために、注射する領域を、薬物のフィルグラスチムの注射剤で事前処置する必要がある。この併用処置は、硬変領域の拡張をもたらし、Ｔ細胞応答の最適なレベルを達成するためには、多数回の注射、ときには１２回超の注射が必要とされる。注射部位反応及び遅延型過敏症の残存によって、毎回、別の身体領域に注射する必要がある。注射された患者は遅延型過敏症を発症し、これは、処置を複雑にし得て、早期終了の原因となることもある。さらに、ペプチドを含有するオイルがＨＭＣクラス１システムよりもＭＨＣクラス２システムによってより多く獲得され、提示されるので、アジュバント（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成するよりも、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を多く生成する傾向がある。本明細書で開示するＬｍをベースとするベクターは、フィルグラスチム注射剤と組み合わせたＭｏｎｔａｎｉｄｅ中のペプチドエマルジョンを上回る、有意な免疫学的、臨床的、実用的、及び製造上の改善を提供する。
【００６９】
免疫学的に、Ｌｍをベースとするベクターは、ＣＤ８＋ドミナントＴ細胞応答を生じさせるための非常に優れたプラットフォームである。第一に、フィルグラスチム注射のアジュバントを添加する必要がない。これは、生の弱毒化細菌ベクターがいくつかのＴＬＲ、ＰＡＭＰ、及びＤＡＭＰ受容体を含む多数の先天免疫活性化トリガーを生来的に誘発し、抗原提示細胞のサイトゾル内でＳＴＩＮＧ受容体をアゴナイズする強力な能力を有するためである。これは、適応免疫応答のために患者の免疫系をプライミングする、免疫微小環境のかなり広範な変化である。第二に、Ｌｍベクターは、静脈内注入される。このことは、皮下組織の有限領域に滞留し得るよりも、かなり多い抗原提示細胞に到達することを可能にする。これによって、皮下注射のための要件、フィルグラスチムの使用、及び遅延型過敏症のリスクも除去される。また、最適なＣＤ８＋Ｔ細胞数が典型的には、１０回以下の３回の処置後にピークに達するので、高いＴ細胞力価が早く生じるようである。第三に、Ｌｍは、Ｔ細胞ヘルプについてＣＤ４＋交差反応性を有するプレドミナントＣＤ８＋Ｔ細胞応答を促進する。ＣＤ８＋Ｔ細胞が、がん細胞の死滅で最も有効であるが、Ｌｍベクターがそれらの抗原をＡＰＣの細胞質で提示し、それらのペプチドが、プロセシングのためにプロテアソームに急速にシャントされ、ＭＨＣクラス１と共に複合体形成し、主にＣＤ８＋Ｔ細胞への提示のためにＡＰＣ表面に輸送されるためである。これは、抗原ペプチドの皮下Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ提示よりも多いＣＤ８＋Ｔ細胞を生成する利点をもたらすはずである。第四に、Ｌｍベクターは、腫瘍及び周囲リンパ節でのケモカイン及びケモカイン受容体の発現を増加させる。これは、固形腫瘍の近辺への活性化Ｔ細胞の誘引を促進する。第五に、Ｌｍベクターは、腫瘍をＴ細胞攻撃から防御し得る免疫抑制細胞の相対数及び抑制機能を低下させて、Ｔ細胞によるがん細胞の死滅をより良好に可能にする。制御性Ｔ細胞及び骨髄系由来サプレッサー細胞の免疫抑制能のこの低下は、これらのペプチドに対して生成されたＴ細胞が固形腫瘍においてより良好な活性を有することをより良好に可能にする。第六に、Ｌｍベクターは、中和抗体を生成しない。このため、中和抗体による有効性の喪失及び遅延型過敏症またはアナフィラキシーを含み得る急性過敏症の発症を伴うことなく、これらのベクターを、長期間にわたって繰り返し投与することができる。
【００７０】
Ｌｍベクターは、いくつかの臨床上の利点を有する。患者がまだ院内にいる間に、注入直後の数時間内に現れる処置に随伴する何らかの副作用は、ほぼ専ら軽度から中程度であり、処置に容易に応答し、投与日に、遅発型発症、蓄積毒性、または持続する後遺症の証拠を伴わずに解消する。実用的な利点は、多数の薬剤を投与し、その後の投与のために代替の投与部位に変える必要がないという事実を含む。
【００７１】
製造の観点から、いくつかの利点が存在する。第一に、個別のペプチドを高濃度及び高純度で製造する必要がない。Ｌｍ細菌は、細菌内部でＤＮＡプラスミドの多数のコピーで同時にＤＮＡを転写し、これらのペプチドを直接、ＡＰＣの細胞質に分泌し、そこで、それらの多くは直接、プロセシングのためにプロテアソームに輸送される。本質的に、ペプチドは、抗原プロセシングのために、まさに使用時に細菌によって製造される。第二に、Ｌｍベクターは、高度に規模拡大が可能である。遺伝子操作が完了したら、細菌は、肉汁培養で自己複製する。培養を規模拡大して、物資の経費を大幅に減少させることができる。第三に、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅなどの複雑な担体中で製剤化する、またはエマルジョンを作製する必要がない。第四に、ほぼ５年超にわたって、細菌は非常に安定していて、ペプチド製剤の効力の低下をもたらし得るペプチド分解または分解生成物による汚染の心配はない。
【００７２】
本明細書で開示するＬｍミニ遺伝子構築物の一部は、ＷＴ１−１２２Ａ１ロング、ＷＴ１−４２７ロング、及び／またはＷＴ１−３３１ロングペプチドを融合タンパク質として発現する。これらのペプチドは、患者の大部分がこれらのペプチドのうちの１種または複数に対してＴ細胞応答を生じることが判明している血液悪性病変または固形腫瘍を有する患者において免疫原性である。臨床的有用性と、これらのペプチドに対するＴ細胞応答の発生との間には、有意な相関作用が存在する。これらのペプチドの組合せは、北米に存在する主なＭＨＣクラス１  ＨＬＡハプロタイプ、ＨＬＡ＊Ａ０２、ＨＬＡ＊Ａ０３、ＨＬＡ＊Ｂ０７に有意な交差反応性をもたらす。
【００７３】
本明細書で開示するＬｍミニ遺伝子構築物の一部は、Ａ−２４−天然、Ａ−２４−ｈｅｔ−１、及び／またはＡ−２４−ｈｅｔ−２ペプチドを融合タンパク質として発現する。これらは、ＨＬＡ＊Ａ２４クラス１ハプロタイプに追加の補てんを加えている。このハプロタイプは、北米の個体群の約１０％を表しているが、アジアの個体群では、かなりより高度に表される。例えば、いくつかの報告は、日本での人口の９０％もの高いＨＬＡ＊Ａ２４の頻度に言及している。これは、中国、韓国、及び他のアジア諸国においても全く共通している。ＨＬＡ＊Ａ２４ペプチドの追加は、ＷＴ１−１２２Ａ１ロング、ＷＴ１−４２７ロング、及びＷＴ１−３３１ロングペプチドによってカバーされない、これらのアジアの個体群及び北米患者の１０％において、ＷＴ１に対するＴ細胞を生成する免疫原性ＷＴ１ペプチドをもたらす。
【００７４】
特異的なＭＨＣクラスＩ結合抗原決定基を発現させるための本明細書で開示するミニ遺伝子構築物アプローチの使用は、短鎖ペプチド配列をプロフェッショナル抗原提示細胞（ｐＡＰＣ）の抗原提示経路に高度に効率的に送達することを可能にする。ミニ遺伝子技術の特異的な利点は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合し、そこで提示され得る短鎖ペプチド配列を遊離するための、より大きなタンパク質をプロテアソーム媒介性分解するための要件を回避することである。これは、ｐＡＰＣの表面で、ペプチド−ＭＨＣクラスＩ抗原提示のかなり高い効率をもたらし、したがって、抗原特異的Ｔ細胞応答をプライミングするためのかなり高いレベルの抗原発現をもたらす。
【００７５】
ＩＩ．組換えＰＥＳＴ含有融合ポリペプチド
天然（すなわち、天然に存在する、または未修飾）ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）（すなわち、全長天然ＷＴ１タンパク質）またはその免疫原性（すなわち、抗原性）断片に融合しているＰＥＳＴ含有ペプチドを含む組換え融合ポリペプチドを本明細書で開示する。配列番号１１４または１３６に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる、免疫原性（すなわち、抗原性）ＷＴ１ペプチドに融合しているＰＥＳＴ含有ペプチドを含む組換え融合ポリペプチドも本明細書で開示する。配列番号１１４または１３６に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる、天然ＷＴ１タンパク質、天然ＷＴ１タンパク質の免疫原性断片、及びＷＴ１ペプチドのうちの１つまたは複数に融合しているＰＥＳＴ含有ペプチドを含む組換え融合ポリペプチドも本明細書で開示する。ＰＥＳＴ含有ペプチドは、天然ＷＴ１、その断片、または配列番号１１４もしくは１３６に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるＷＴ１ペプチドに直接融合し得るか、あるいはそれらは、ペプチドリンカーを介して、または１つもしくは複数の他の抗原性ＷＴ１ペプチドを介して連結し得る。
【００７６】
融合ポリペプチド内の免疫原性（すなわち、抗原性）ペプチドの選択、変化、及び配置は、本明細書の他の箇所で詳細に論述し、天然ＷＴ１ペプチド及びその免疫原性断片は、本明細書の他の箇所でより詳細に論述する。
【００７７】
組換え融合ポリペプチドは、１つまたは複数のタグを含み得る。例えば、組換え融合ポリペプチドは、天然ＷＴ１タンパク質、天然ＷＴ１タンパク質の免疫原性断片、または配列番号１１４もしくは１３６に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、もしくはそれからなるＷＴ１ペプチドのうちの１つまたは複数のＮ末端側及び／またはＣ末端側に、１つまたは複数のペプチドタグを含み得る。タグを、抗原性ペプチドに直接融合させることができるか、またはリンカー（その例は本明細書の他の箇所で開示する）を介して抗原性ペプチドに連結させることができる。タグの例には、次のものが含まれる：ＦＬＡＧタグ；２ｘＦＬＡＧタグ；３ｘＦＬＡＧタグ；Ｈｉｓタグ、６ｘＨｉｓタグ；及びＳＩＩＮＦＥＫＬタグ。例示的なＳＩＩＮＦＥＫＬタグを配列番号１６に記載する（配列番号１〜１５に記載の核酸のいずれか１つによってコードされる）。例示的な３ｘＦＬＡＧタグを配列番号３２に記載する（配列番号１７〜３１に記載の核酸のいずれか１つによってコードされる）。例示的なバリアント３ｘＦＬＡＧタグを配列番号９９に記載する。２つ以上のタグ、例えば、２ｘＦＬＡＧタグ及びＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、３ｘＦＬＡＧタグ及びＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、または６ｘＨｉｓタグ及びＳＩＩＮＦＥＫＬタグを一緒に使用することができる。２つ以上のタグを使用する場合、それらは、組換え融合ポリペプチド内のどこにでも、任意の順序で位置し得る。例えば、２つのタグが組換え融合ポリペプチドのＣ末端にあり得、２つのタグが組換え融合ポリペプチドのＮ末端にあり得、２つのタグが組換え融合ポリペプチド内の内部に位置し得、１つのタグが組換え融合ポリペプチドのＣ末端にあり得、かつ１つのタグがＮ末端にあり得、１つのタグがＣ末端にあり得、かつ１つのタグが組換え融合ポリペプチド内の内部にあり得、または１つのタグがＮ末端にあり得、１つが組換え融合ポリペプチド内の内部にあり得る。他のタグには、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、及びポリ（ＮＡＮＰ）が含まれる。特定の組換え融合ポリペプチドは、Ｃ末端側のＳＩＩＮＦＥＫＬタグを含む。そのようなタグは、組換え融合タンパク質の容易な検出、組換え融合タンパク質の分泌の確認、またはこれらの「タグ」配列ペプチドに対する免疫応答を追跡することによる分泌された融合ポリペプチドの免疫原性の追跡を可能にし得る。例えば、これらのタグに特異的なモノクローナル抗体及びＤＮＡまたはＲＮＡプローブを含むいくつかの試薬を使用して、そのような免疫応答をモニターすることができる。
【００７８】
本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株によって発現され得るか、またはタンパク質発現及び単離のために使用される他のベクター及び細胞系から発現及び単離され得る。そのような抗原性ペプチドを含み発現する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を、例えば、そのような組換えリステリアを含む免疫原性組成物で、ならびに組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株及びアジュバントを含むワクチンで使用することができる。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の宿主細胞系及びリステリア以外の宿主細胞系でのＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列の非溶血性短縮化形態を有する融合ポリペプチドとしての１つまたは複数の抗原性ペプチドの発現は、抗原性ペプチドの免疫原性の増強をもたらし得る。
【００７９】
そのような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸も開示する。核酸は、任意の形態であり得る。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むか、またはそれからなり得、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸は、プラスミド、例えば、エピソームプラスミド、マルチコピーエピソームプラスミド、または組み込みプラスミドの形態であり得る。別法では、核酸は、ウイルスベクター、ファージベクターの形態で、または細菌人工染色体であり得る。そのような核酸は、１つのオープンリーディングフレームを有し得るか、または２つ以上のオープンリーディングフレーム（例えば、組換え融合ポリペプチドをコードする１つのオープンリーディングフレーム、及び代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレーム）を有し得る。一例では、そのような核酸は、各オープンリーディングフレームの間にあるシャイン−ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つ以上のオープンリーディングフレームを含み得る。例えば、核酸は、各オープンリーディングフレームの間にあるシャイン−ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームを含み得る。各オープンリーディングフレームは、異なるポリペプチドをコードし得る。一部の核酸では、融合ポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンには、タンパク質合成の終了を保証するために、２つの停止コドンが続く。
【００８０】
Ａ．天然ＷＴ１タンパク質及びその免疫原性断片
ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１、ＡＥＷＳ−ＧＵＤ、ＮＰＨＳ４、ＷＡＧＲ、ＷＩＴ−２、ＷＴ３３、ウィルムス腫瘍１）は、ヒトでは染色体１１ｐ上のＷＴ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。この遺伝子は、Ｃ末端に４つの亜鉛フィンガーモチーフを、及びＮ末端にプロリン／グルタミンリッチなＤＮＡ結合ドメインを含有する転写因子をコードする。ＷＴ１抗原は、正常な成人細胞では一般に発現されないが、多数のがん、さらには特定のがん幹細胞で出現する転写因子である。
【００８１】
例示的なヒトＷＴ遺伝子は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＹ２４５１０５．１に割り当てられている。例示的なヒトＷＴ１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１９５４４（配列番号１３８）、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１１８５４８１．１（配列番号１４０）、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１１８５４８０．１（配列番号１４１）、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０７７７４４．３（配列番号１４２）、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０７７７４２．２（配列番号１４３）、及びＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００３６９．３（配列番号１４４）に割り当てられている。ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ１９５４４に記載されているＷＴ１タンパク質を含み、残基５４〜６８が除去されている例示的なＷＴ１断片は、配列番号１３９に記載されている。他の例示的なヒトＷＴ１タンパク質またはその断片は、配列番号１４５〜１４８に記載されている。他の種からの例示的なＷＴ１タンパク質ホモログには、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２２５６１（マウス）、Ｐ４９９５２（ウサギ）、Ｏ６２６５１（ブタ）、及びＢ７ＺＳＧ３（アフリカツメガエル）が含まれる。
【００８２】
天然ＷＴ１タンパク質は、天然に存在する（例えば、ヘテロクリティック変異が生じていない）ＷＴ１タンパク質である。全長天然ＷＴ１タンパク質または天然ＷＴ１タンパク質の免疫原性／抗原性断片をコードする核酸を使用することができる。天然ＷＴ１タンパク質の断片には、Ｃ末端セグメントの１つまたは複数が除去されている、Ｎ末端のセグメントが除去されている、または１つまたは複数の内部断片が除去されている天然ＷＴ１タンパク質配列が含まれる。例えば、断片は、ＷＴ１のＮ末端側断片、ＷＴ１のＣ末端側断片、ＷＴ１の内部断片、１つまたは複数の内部断片が除去されているＷＴ１タンパク質などであり得る。内部断片が除去されているＷＴ１タンパク質断片の例は、配列番号１３９に記載されている。天然ＷＴ１タンパク質の内部断片の例（すなわち、Ｃ末端側及びＮ末端側配列が除去されている天然ＷＴ１タンパク質の断片）は、配列番号９５に記載されている。一例では、融合ポリペプチドに含まれる天然ＷＴ１タンパク質の断片は、配列番号９５または配列番号１３９に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。適切な天然ＷＴ１ペプチドのまた他の例を、本明細書の他の箇所で開示する。
【００８３】
融合ポリペプチドは、天然ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、天然ＷＴ１の免疫原性断片、及び配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＷＴ１ペプチドから選択される１つの抗原性または免疫原性ＷＴ１ペプチドに融合しているＰＥＳＴ含有ペプチドを含み得る。別法では、融合ポリペプチは、天然ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、天然ＷＴ１の免疫原性断片、及び配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるＷＴ１ペプチドから選択される２つ以上の抗原性または免疫原性ＷＴ１ペプチドに融合しているＰＥＳＴ含有ペプチドを含み得る。例えば、融合ポリペプチドは、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、２〜４、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１８、または２０の抗原性ＷＴ１ペプチドを含み得る。抗原性ＷＴ１ペプチドの２つ以上またはすべてが、同じであり得るか、または抗原性ＷＴ１ペプチドの２つ以上またはすべてが、異なり得る（例えば、各抗原性ＷＴ１ペプチドが異なり得る）。第２の抗原性ペプチドにはない単一のアミノ酸を含む場合、第１の抗原性ペプチドは、第２の抗原性ペプチドとは異なる。各抗原性ＷＴ１ペプチドは、免疫応答を誘導するために十分な任意の長さを有し得るか、各抗原性ＷＴ１ペプチドは、同じ長さであり得るか、または抗原性ペプチドは、異なる長さを有し得る。例えば、本明細書で開示する抗原性ＷＴ１ペプチドは、約８〜６００、８〜５００、８〜４５０、８〜４００、８〜３５０、８〜３００、８〜２５０、８〜２００、８〜１５０、８〜１００、８〜９０、８〜８０、８〜７０、８〜６０、８〜５０、８〜４０、８〜３０、８〜２０、８〜１５、８〜１２、または８〜１０の間のアミノ酸長であり得る。別法では、抗原性ＷＴ１ペプチドは、例えば、約８、９、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または６００以下のアミノ酸長であり得るか、または抗原性ＷＴ１ペプチドは、例えば、少なくとも約８、９、１０、１２、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または６００のアミノ酸長であり得る。
【００８４】
各抗原性ペプチドは、親水性であり得るか、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたは目的の別の細菌における分泌可能性を予測し得る特定のハイドロパシー閾値までの、またはそれ未満のスコアを示し得る。例えば、抗原性ペプチドは、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数によって２１アミノ酸ウィンドウでスコアリングすることができ、カットオフ（約１．６）を超えるすべてのスコアリングは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによっておそらく分泌され得ないので、排除することができる。同様に、抗原性ペプチドの組合せまたは融合ポリペプチドは、親水性であり得るか、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたは目的の別の細菌における分泌可能性を予測し得る特定のハイドロパシー閾値までの、またはそれ未満のスコアを示し得る。
【００８５】
融合ポリペプチドが２つ以上の抗原性ペプチドを含む場合、抗原性ペプチドを、任意の手法で一緒に連結させることができる。例えば、抗原性ペプチドを、介在配列を用いずに相互に直接融合させることができる。別法では、抗原性ペプチドを、１つまたは複数のリンカー、例えば、ペプチドリンカーを介して間接的に相互に連結させることができる。場合によっては、隣接する抗原性ペプチドのいくつかの対を相互に直接融合させることができ、抗原性ペプチドの他の対を１つまたは複数のリンカーを介して間接的に相互に連結させることができる。同じリンカーを、隣接する抗原性ペプチドの各対の間で使用することができるか、または任意の数の異なるリンカーを、隣接する抗原性ペプチドの異なる対の間で使用することができる。加えて、１つのリンカーを、隣接する抗原性ペプチドの対の間で使用することができるか、または多数のリンカーを、隣接する抗原性ペプチドの対の間で使用することができる。
【００８６】
任意の適切な配列を、ペプチドリンカーのために使用することができる。例として、リンカー配列は、例えば、１〜約５０アミノ酸長であってよい。一部のリンカーは、親水性であってよい。リンカーは、様々な目的に役立ち得る。例えば、リンカーは、細菌分泌を増加させるために、抗原プロセシングを促進するために、融合ポリペプチドの柔軟性を上昇させるために、融合ポリペプチドの剛性を上昇させるために、または任意の他の目的のために役立ち得る。場合によっては、種々のアミノ酸リンカー配列を抗原性ペプチドの間に分布させるか、または同じアミノ酸リンカー配列をコードする異なる核酸を抗原性ペプチドの間に分布させて（例えば、配列番号８４〜９４）、繰り返しを最小限にするようにする。これはまた、二次構造を縮小させて、それによって、Ｌｍ組換えベクター株集団内で融合ポリペプチドをコードする核酸（例えば、プラスミド）の効率的な転写、翻訳、分泌、維持、または安定化を可能にするために役立ち得る。他の適切なペプチドリンカー配列を、例えば、次の因子のうちの１つまたは複数に基づき選択してもよい：（１）柔軟な延長配座を取るそれらの能力；（２）抗原性ペプチド上の機能性エピトープと相互作用し得る二次構造を取る能力がそれらにないこと；及び（３）機能性エピトープと反応し得る疎水性または荷電残基の欠如。例えば、ペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒ残基を含有してもよい。他の中性付近のアミノ酸、例えば、Ｔｈｒ及びＡｌａも、リンカー配列において使用してもよい。リンカーとして通常使用され得るアミノ酸配列には、それぞれあらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＭａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６；Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２；米国特許第４，９３５，２３３号；及び米国特許第４，７５１，１８０号に開示されているものが含まれる。リンカーの具体例には、次の表のものが含まれるが（それぞれ、そのままリンカーとして、配列の繰り返しを含むリンカーで、または表内の他の配列のうちの１つまたは複数をさらに含むリンカーで使用することができる）、他のものも、考えられ得る（例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＲｅｄｄｙ  Ｃｈｉｃｈｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２：１５３−１６７を参照されたい）。指定がない限り、「ｎ」は、挙げられているリンカーにおける繰り返しの未定数を表す。
【表７】
2019522991.tif 000004
【００８７】
Ｂ．ＰＥＳＴ含有ペプチド
本明細書で開示する組換え融合タンパク質は、ＰＥＳＴ含有ペプチドを含む。ＰＥＳＴ含有ペプチドは、融合ポリペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）にあってもよいか（すなわち、抗原性ペプチドに対してＮ末端側）、融合ポリペプチドのカルボキシ末端（Ｃ末端）にあってもよいか（すなわち、抗原性ペプチドに対してＣ末端側）、または抗原性ペプチド内に埋め込まれていてもよい。一部の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株及び方法では、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、融合ポリペプチドの一部ではなく、それから離れている。ＰＥＳＴ様配列、例えばＬＬＯペプチドへの抗原性ペプチドの融合は、抗原性ペプチドの免疫原性を増強することができ、細胞媒介性及び抗腫瘍免疫応答を増加させることができる（すなわち、細胞媒介性及び抗腫瘍免疫を増加させる）。例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５（６）：３６６３−３６７３を参照されたい。
【００８８】
ＰＥＳＴ含有ペプチドは、ＰＥＳＴ配列またはＰＥＳＴ様配列を含むものである。真核タンパク質におけるＰＥＳＴ配列は、以前から同定されている。例えば、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）（ＰＥＳＴ）がリッチなアミノ酸配列を含有し、一般に、常にではないが、いくつかの正電荷アミノ酸を含有するクラスターの横に配置されているタンパク質は、急速な細胞内半減期を有する（あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＲｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：３６４−３６９）。さらに、これらの配列は、タンパク質を、分解のためのユビキチン−プロテオソーム経路へと向けることが報告されている（あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１）。この経路はまた、ＭＨＣクラスＩに結合する免疫原性ペプチドを生成するために、真核細胞によって使用され、ＰＥＳＴ配列は、免疫原性ペプチドをもたらす真核タンパク質において豊富であると仮定されている（あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＲｅａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４８：１０９−１１３）。この酵素経路を有さないので、原核タンパク質はＰＥＳＴ配列を通常含有しない。しかしながら、アミノ酸プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）リッチなＰＥＳＴ様配列が、ＬＬＯのアミノ末端で報告されており、かつＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ病原性に必須であると報告されている（あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＤｅｃａｔｕｒ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｎｏｙ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：９９２−９９５）。ＬＬＯにおけるこのＰＥＳＴ様配列の存在によって、タンパク質は、宿主細胞のタンパク質分解機構による分解のための標的となるので、ＬＬＯがその機能を果たし、ファゴソームまたはファゴリソソーム小胞からのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの脱出を促進すると、細胞を損傷し得る前に、これは破壊される。
【００８９】
ＰＥＳＴ及びＰＥＳＴ様配列の同定は、当技術分野で周知であり、例えば、それぞれあらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＲｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４（４７７４）：３６４−３７８及びＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１に記載されている。ＰＥＳＴまたはＰＥＳＴ様配列は、ＰＥＳＴファインドプログラムを使用して同定され得る。例えば、ＰＥＳＴ様配列は、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、及びトレオニン（Ｔ）残基のリッチな領域であり得る。任意選択で、ＰＥＳＴ様配列は、いくつかの正電荷アミノ酸を含有する１つまたは複数のクラスターの横に配置され得る。例えば、ＰＥＳＴ様配列は、プロリン（Ｐ）、アスパルタート（Ｄ）、グルタマート（Ｅ）、セリン（Ｓ）、及び／またはトレオニン（Ｔ）残基の高い局所濃度を有する少なくとも１２のアミノ酸長の親水性区間として定義され得る。場合によっては、ＰＥＳＴ様配列は、正電荷アミノ酸、すなわちアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、及びリシン（Ｋ）を含有しない。一部のＰＥＳＴ様配列は、１つまたは複数の内部リン酸化部位を含有し得て、これらの部位でのリン酸化がタンパク質分解の前に起こる。
【００９０】
一例では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．に開示されているアルゴリズムと適合する。別の例では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ及びＲｏｇｅｒｓに開示されているアルゴリズムと適合する。ＰＥＳＴ様配列はまた、規定のタンパク質配列内の正電荷アミノ酸Ｒ、Ｈ、及びＫについての当初スキャンによって同定することができる。正電荷隣接部の間のすべてのアミノ酸をカウントし、いくつかのウィンドウサイズパラメーターに等しいか、またはそれ以上のアミノ酸の数を含有するモチーフのみをさらに検討する。任意選択で、ＰＥＳＴ様配列は、少なくとも１個のＰ、少なくとも１個のＤまたはＥ、及び少なくとも１個のＳまたはＴを含有する必要がある。
【００９１】
ＰＥＳＴモチーフの品質を、重要なアミノ酸の局所富化、さらには疎水性のモチーフに基づくスコアリングパラメーターによって精密化することができる。Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｓ、及びＴの富化は、重量パーセント（ｗ／ｗ）で表され、１当量のＤまたはＥ、１当量のＰ、及び１当量のＳまたはＴについて補正される。疎水性の計算はまた、原則として、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＫｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５の方法に従うことができる。簡略化された計算では、本来はアルギニンでの−４．５からイソロイシンでの＋４．５の範囲であるＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数を、アルギニンでの０から、イソロイシンでの９０までの値をもたらす次の線型変換を使用して正の整数に変換する：ハイドロパシー指数＝１０×Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数＋４５。
【００９２】
潜在的なＰＥＳＴモチーフの疎水性はまた、各アミノ酸種でのモルパーセント及び疎水性指数の積の合計として計算することができる。所望のＰＥＳＴスコアは、次の式：ＰＥＳＴスコア＝０．５５×ＤＥＰＳＴ−０．５×疎水性指数によって表される局所富化の項及び疎水性の項の組合せとして得られる。
【００９３】
したがって、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、上記のアルゴリズムを使用して少なくとも＋５のスコアを有するペプチドを指し得る。別法では、これは、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３２、少なくとも３５、少なくとも３８、少なくとも４０、または少なくとも４５のスコアを有するペプチドを指し得る。
【００９４】
当技術分野で公知の任意の他の利用可能な方法またはアルゴリズムも、ＰＥＳＴ様配列を同定するために使用することができる。例えば、ＣａＳ予測因子（あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＧａｒａｙ−Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１  Ｓｕｐｐｌ  １：ｉ１６９−７６）を参照されたい。使用することができる別の方法は、次である：ＰＥＳＴ指数は、１の値をアミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに割り当てることによって、適切な長さの各区間（例えば、３０〜３５アミノ酸区間）について計算される。ＰＥＳＴ残基のそれぞれでの係数値（ＣＶ）は１であり、他のＡＡ（非ＰＥＳＴ）のそれぞれでのＣＶはゼロである。
【００９５】
ＰＥＳＴ様アミノ酸配列の例は、配列番号４３〜５１に記載されているものである。ＰＥＳＴ様配列の一例は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号４３）である。ＰＥＳＴ様配列の別の例は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫ（配列番号４４）である。しかしながら、任意のＰＥＳＴまたはＰＥＳＴ様アミノ酸配列を使用することができる。ＰＥＳＴ配列ペプチドは公知であり、例えば、それぞれあらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，６３５，４７９号；米国特許第７，６６５，２３８号；及び米国特許出願公開第２０１４／０１８６３８７号に記載されている。
【００９６】
ＰＥＳＴ様配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどのリステリア種に由来し得る。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＡｃｔＡタンパク質は、少なくとも４つのそのような配列（配列番号４５〜４８）を含有し、そのいずれかは、本明細書で開示する組成物及び方法で使用するために適している。他の同様のＰＥＳＴ様配列には、配列番号５２〜５４が含まれる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種に由来するストレプトリジンＯタンパク質も、ＰＥＳＴ配列を含有する。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ストレプトリジンＯは、アミノ酸３５〜５１にＰＥＳＴ配列ＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号４９）を含み、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓストレプトリジンＯは、アミノ酸３８〜５４にＰＥＳＴ様配列ＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号５０）を含む。ＰＥＳＴ様配列の別の例は、リステリア・ゼーリゲリ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ）細胞溶解素に由来し、ｌｓｏ遺伝子：ＲＳＥＶＴＩＳＰＡＥＴＰＥＳＰＰＡＴＰ（例えば、配列番号５１）によってコードされる。
【００９７】
別法では、ＰＥＳＴ様配列は、他の原核生物に由来し得る。ＰＥＳＴ様アミノ酸配列が予測される他の原核生物には、例えば、他のリステリア種が含まれる。
【００９８】
（１）リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）
本明細書で開示する組成物及び方法で利用することができるＰＥＳＴ含有ペプチドの一例は、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ペプチドである。ＬＬＯタンパク質の例は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ１３１２８（配列番号５５；核酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ１５１２７に記載されている）に割り当てられているタンパク質である。配列番号５５は、シグナル配列を含むプロタンパク質である。プロタンパク質の最初の２５アミノ酸はシグナル配列であり、細菌によって分泌されるとＬＬＯから切断され、それによって、シグナル配列を含まない５０４アミノ酸の全長活性ＬＬＯタンパク質が生じる。本明細書で開示するＬＬＯペプチドは、シグナル配列を含み得るか、またはシグナル配列を含まないペプチドを含み得る。使用することができる例示的なＬＬＯタンパク質は、配列番号５５に記載の配列または配列番号５５のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、及びアイソフォームの断片を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＬＬＯタンパク質の断片またはＬＬＯタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、ホモログの断片、バリアントの断片、もしくは類似体の断片をコードする任意の配列を使用することができる。相同ＬＬＯタンパク質は、基準ＬＬＯタンパク質と、例えば、７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の配列同一性を有し得る。
【００９９】
ＬＬＯタンパク質の別の例を配列番号５６に記載する。使用することができるＬＬＯタンパク質は、配列番号５６に記載の配列または配列番号５６のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、及びアイソフォームの断片を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【０１００】
ＬＬＯタンパク質の別の例は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＺＰ＿０１９４２３３０またはＥＢＡ２１８３３に記載されているとおりか、またはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＺ＿ＡＡＲＺ０１００００１５またはＡＡＲＺ０１００００１５．１に記載のとおりの核酸配列によってコードされるとおりのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ１０４０３Ｓ株に由来するＬＬＯタンパク質である。ＬＬＯタンパク質の別の例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ４ｂ  Ｆ２３６５株（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＹＰ＿０１２８２３を参照されたい）、ＥＧＤ−ｅ株（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿４６３７３３を参照されたい）、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの任意の他の株に由来するＬＬＯタンパク質である。ＬＬＯタンパク質のまた別の例は、フラボバクテリウム目細菌ＨＴＣＣ２１７０に由来するＬＬＯタンパク質（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＺＰ＿０１１０６７４７またはＥＡＲ０１４３３を参照されたい、またはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＺ＿ＡＡＯＣ０１０００００３によってコードされる）である。使用することができるＬＬＯタンパク質は、上記のＬＬＯタンパク質または上記のＬＬＯタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、及びアイソフォームの断片のいずれかを含み得るか、本質的にそれからなり得るか、またはそれからなり得る。
【０１０１】
ＬＬＯ、またはそのホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、及びアイソフォームの断片と相同なタンパク質も使用することができる。そのような一例は、例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉにおいて見い出され得るアルベオリジン（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｐ２３５６４またはＡＡＡ２２２２４を参照されたい、またはＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：Ｍ６２７０９によってコードされる）である。他のそのような相同タンパク質が公知である。
【０１０２】
ＬＬＯペプチドは、全長ＬＬＯタンパク質または短縮化ＬＬＯタンパク質またはＬＬＯ断片であり得る。同様に、ＬＬＯペプチドは、天然ＬＬＯタンパク質の１つまたは複数の機能性を維持しているか、または天然ＬＬＯタンパク質の１つまたは複数の機能性が欠如しているものであり得る。例えば、維持されるＬＬＯ機能性は、細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）がファゴソームまたはファゴリソソームから脱出することを可能にする機能性、または融合するペプチドの免疫原性を増強する機能性であり得る。維持される機能性はまた、溶血機能または抗原機能であり得る。別法では、ＬＬＯペプチドは、非溶血性ＬＬＯであり得る。ＬＬＯの他の機能は公知であり、ＬＬＯ機能性を評価するための方法及びアッセイも公知である。
【０１０３】
ＬＬＯ断片は、ＰＥＳＴ様配列であり得るか、またはＰＥＳＴ様配列を含み得る。ＬＬＯ断片は、内部欠失、Ｃ末端からの短縮化、及びＮ末端からの短縮化のうちの１つまたは複数を含み得る。場合によっては、ＬＬＯ断片は、１つよりも多い内部欠失を含み得る。他のＬＬＯペプチドは、１つまたは複数の変異を含む全長ＬＬＯタンパク質であり得る。
【０１０４】
一部のＬＬＯタンパク質または断片は、野生型ＬＬＯに対して低下した溶血活性を有するか、または非溶血性断片である。例えば、ＬＬＯタンパク質は、カルボキシ末端での活性化ドメインの欠失もしくは変異によって、システイン４８４の欠失もしくは変異によって、または別の位置での欠失もしくは変異によって非溶血性になり得る。
【０１０５】
他のＬＬＯタンパク質は、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，７７１，７０２号に詳述されているとおり、コレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の欠失または変異によって非溶血性になっている。変異は、例えば、置換または欠失を含み得る。ＣＢＤ全体が変異し得る、ＣＢＤの一部が変異し得るか、またはＣＢＤ内の特定の残基が変異し得る。例えば、ＬＬＯタンパク質は、配列番号５５の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、及びＷ４９２の１つもしくは複数（例えば、Ｃ４８４、Ｗ４９１、Ｗ４９２、Ｃ４８４及びＷ４９１、Ｃ４８４及びＷ４９２、Ｗ４９１及びＷ４９２、または３つの残基すべて）または配列番号５５と最適にアラインさせた場合の対応する残基（例えば、対応するシステインまたはトリプトファン残基）の変異を含み得る。例として、ＬＬＯの残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、及びＷ４９２がアラニン残基で置換されていて、そのことが、野生型ＬＬＯに対して溶血活性をかなり低下させるであろう変異ＬＬＯタンパク質を作製することができる。Ｃ４８４Ａ、Ｗ４９１Ａ、及びＷ４９２Ａ変異を有する変異ＬＬＯタンパク質は「ｍｕｔＬＬＯ」と名付けられる。
【０１０６】
別の例として、変異ＬＬＯタンパク質を、コレステロール結合ドメインを含む内部欠失で作製することができる。配列番号５５のコレステロール結合ドメインの配列は、配列番号７４に記載されている。例えば、内部欠失は、１〜１１アミノ酸欠失、１１〜５０アミノ酸欠失であり得るか、またはそれより長くあり得る。同様に、変異領域は、１〜１１アミノ酸、１１〜５０アミノ酸、またはそれより長くり得る（例えば、１〜５０、１〜１１、２〜１１、３〜１１、４〜１１、５〜１１、６〜１１、７〜１１、８〜１１、９〜１１、１０〜１１、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、３〜４、３〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、１２〜５０、１１〜１５、１１〜２０、１１〜２５、１１〜３０、１１〜３５、１１〜４０、１１〜５０、１１〜６０、１１〜７０、１１〜８０、１１〜９０、１１〜１００、１１〜１５０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、１５〜４０、１５〜５０、１５〜６０、１５〜７０、１５〜８０、１５〜９０、１５〜１００、１５〜１５０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、２０〜１００、２０〜１５０、３０〜３５、３０〜４０、３０〜６０、３０〜７０、３０〜８０、３０〜９０、３０〜１００、または３０〜１５０アミノ酸）。例えば、配列番号５５の残基４７０〜５００、４７０〜５１０、または４８０〜５００からなる変異領域は、ＣＢＤ（配列番号５５の残基４８３〜４９３）を含む欠失配列をもたらす。しかしながら、変異領域は、ＣＢＤの断片であり得るか、またはＣＢＤの一部と重複し得る。例えば、変異領域は、配列番号５５の残基４７０〜４９０、４８０〜４８８、４８５〜４９０、４８６〜４８８、４９０〜５００、または４８６〜５１０からなってもよい。例えば、ＣＢＤ（残基４８４〜４９２）の断片は、野生型ＬＬＯに対して溶血活性をかなり低下させるであろう非相同配列で置き換えられ得る。例えば、ＣＢＤ（ＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲ；配列番号７４）は、ＮＹ−ＥＳＯ−１からのＨＬＡ−Ａ２制限エピトープ１５７〜１６５を含有する抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＥＳＬＬＭＷＩＴＱＣＲ；配列番号７５）からのＣＴＬエピトープと置き換えられ得る。得られるＬＬＯは、「ｃｔＬＬＯ」と名付けられる。
【０１０７】
一部の変異ＬＬＯタンパク質では、変異領域は、非相同配列によって置き換えられ得る。例えば、変異領域は、同数の非相同アミノ酸、より少ない数の非相同アミノ酸、またはより多い数のアミノ酸によって置き換えられ得る（例えば、１〜５０、１〜１１、２〜１１、３〜１１、４〜１１、５〜１１、６〜１１、７〜１１、８〜１１、９〜１１、１０〜１１、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、３〜４、３〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、１２〜５０、１１〜１５、１１〜２０、１１〜２５、１１〜３０、１１〜３５、１１〜４０、１１〜５０、１１〜６０、１１〜７０、１１〜８０、１１〜９０、１１〜１００、１１〜１５０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、１５〜４０、１５〜５０、１５〜６０、１５〜７０、１５〜８０、１５〜９０、１５〜１００、１５〜１５０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、２０〜１００、２０〜１５０、３０〜３５、３０〜４０、３０〜６０、３０〜７０、３０〜８０、３０〜９０、３０〜１００、または３０〜１５０アミノ酸）。他の変異ＬＬＯタンパク質は、１つまたは複数の点変異（例えば、１残基、２残基、３残基、またはそれ以上の点変異）を有する。変異残基は、連続し得るか、または連続し得ない。
【０１０８】
実施形態の一例では、ＬＬＯペプチドは、シグナル配列において欠失を、及びＣＢＤにおいて変異または置換を有してもよい。
【０１０９】
一部のＬＬＯペプチドは、Ｎ末端側ＬＬＯ断片（すなわち、Ｃ末端側が欠失しているＬＬＯタンパク質）である。一部のＬＬＯペプチドは、少なくとも４９４、４８９、４９２、４９３、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、または５２５アミノ酸長または４９２〜５２８アミノ酸長である。例えば、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４４０または４４１アミノ酸からなり得る（例えば、配列番号５５もしくは５６の最初の４４１アミノ酸、または配列番号５５もしくは５６と最適にアラインさせた場合の別のＬＬＯタンパク質の対応する断片）。他のＮ末端側ＬＬＯ断片は、第１のＬＬＯタンパク質の最初の４２０アミノ酸からなり得る（例えば、配列番号５５もしくは５６の最初の４２０アミノ酸、または配列番号５５もしくは５６と最適にアラインさせた場合の別のＬＬＯタンパク質の対応する断片）。他のＮ末端側断片は、ＬＬＯタンパク質のほぼアミノ酸２０〜４４２からなり得る（例えば、配列番号５５もしくは５６のアミノ酸２０〜４４２、または配列番号５５もしくは５６と最適にアラインさせた場合の別のＬＬＯタンパク質の対応する断片）。他のＮ末端側ＬＬＯ断片は、システイン４８４を含む活性化ドメインを含まない、特にシステイン４８４を含まない任意のΔＬＬＯを含む。例えば、Ｎ末端側ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、または２５アミノ酸（例えば、配列番号５５もしくは５６の最初の４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、または２５アミノ酸、または配列番号５５もしくは５６と最適にアラインさせた場合の別のＬＬＯタンパク質の対応する断片）に対応し得る。好ましくは、断片は、１つまたは複数のＰＥＳＴ様配列を含む。ＬＬＯ断片及び短縮化ＬＬＯタンパク質は、上記の具体的なアミノ酸範囲のいずれか１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有し得る。残基数は、上記で挙げた残基数と正確に対応する必要はない（例えば、相同ＬＬＯタンパク質が、本明細書で開示する具体的なＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合）。Ｎ末端側ＬＬＯ断片の例には、配列番号５７、５８、及び５９が含まれる。使用することができるＬＬＯタンパク質は、配列番号５７、５８、もしくは５９に記載の配列または配列番号５７、５８、もしくは５９のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、及びアイソフォームの断片を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。一部の組成物及び方法では、配列番号５９に記載のＮ末端側ＬＬＯ断片を使用する。配列番号５９に記載のＮ末端側ＬＬＯ断片をコードする核酸の例は、配列番号６０である。
【０１１０】
（２）ＡｃｔＡ
本明細書で開示する組成物及び方法で利用することができるＰＥＳＴ含有ペプチドの別の例は、ＡｃｔＡペプチドである。ＡｃｔＡは、表面結合タンパク質であり、細胞質全体にＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを推進することができるように、感染宿主細胞においてスキャフォールドとして作用して、宿主アクチンポリマーの重合、構築、及び活性化を促進する。哺乳類細胞サイトゾルへの侵入後すぐに、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、宿主アクチンフィラメントの重合を誘導し、アクチン重合によって生じる力を使用して、初めは細胞内に、次いで細胞から細胞へと移動する。ＡｃｔＡは、アクチン核形成及びアクチンをベースとする運動性の媒介を担う。ＡｃｔＡタンパク質は、多数の結合部位を宿主細胞骨格成分に提供し、それによって、細胞のアクチン重合機構を構築するためのスキャフォールドとして作用する。ＡｃｔＡのＮ末端は、モノマーのアクチンに結合し、固有のアクチン核形成活性を刺激することによって、構成的活性型核形成促進因子として作用する。ａｃｔＡ及びｈｌｙ遺伝子は両方とも、転写活性化因子ＰｒｆＡによって調節される１０ｋｂ遺伝子クラスターのメンバーであり、ａｃｔＡは、哺乳類サイトゾルにおいて約２２６倍に上方制御される。ＡｃｔＡタンパク質またはＡｃｔＡタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、ホモログの断片、バリアントの断片、もしくは類似体の断片をコードする任意の配列を使用することができる。相同ＡｃｔＡタンパク質は、基準ＡｃｔＡタンパク質と、例えば、７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の配列同一性を有し得る。
【０１１１】
ＡｃｔＡタンパク質の一例は、配列番号６１に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＡｃｔＡタンパク質の別の例は、配列番号６２に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。これらの配列のいずれかに対応するプロタンパク質の最初の２９アミノ酸はシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときに、ＡｃｔＡタンパク質から切断される。ＡｃｔＡペプチドは、シグナル配列（例えば、配列番号６１または６２のアミノ酸１〜２９）を含み得るか、またはシグナル配列を含まないペプチドを含み得る。ＡｃｔＡタンパク質の他の例は、配列番号６１または６２のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、アイソフォームの断片、または類似体の断片を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【０１１２】
ＡｃｔＡタンパク質の別の例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ１０４０３Ｓ株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＤＱ０５４５８５）、ＮＩＣＰＢＰ５４００２株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＥＵ３９４９５９）、Ｓ３株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＥＵ３９４９６０）、ＮＣＴＣ５３４８株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＥＵ３９４９６１）、ＮＩＣＰＢＰ５４００６株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＥＵ３９４９６２）、Ｍ７株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＥＵ３９４９６３）、Ｓ１９株（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＥＵ３９４９６４）、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの任意の他の株からのＡｃｔＡタンパク質である。使用することができるＬＬＯタンパク質は、上記ＬＬＯタンパク質または上記ＬＬＯタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、及びアイソフォームの断片のいずれかを含み得るか、本質的にそれからなり得るか、またはそれからなり得る。
【０１１３】
ＡｃｔＡペプチドは、全長ＡｃｔＡタンパク質または短縮化ＡｃｔＡタンパク質またはＡｃｔＡ断片（例えば、Ｃ末端部分が除去されているＮ末端側ＡｃｔＡ断片）であり得る。好ましくは、短縮化ＡｃｔＡタンパク質は、少なくとも１つのＰＥＳＴ配列（例えば、１つより多いＰＥＳＴ配列）を含む。加えて、短縮化ＡｃｔＡタンパク質は任意選択で、ＡｃｔＡシグナルペプチドを含み得る。短縮化ＡｃｔＡタンパク質に含まれるＰＥＳＴ様配列の例には、配列番号４５〜４８が含まれる。一部のそのような短縮化ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号４５〜４８に記載のＰＥＳＴ様配列またはそのホモログのうちの少なくとも２つ、配列番号４５〜４８に記載のＰＥＳＴ様配列またはそのホモログのうちの少なくとも３つ、または配列番号４５〜４８に記載のＰＥＳＴ様配列またはそのホモログの４つすべてを含む。短縮化ＡｃｔＡタンパク質の例には、全長ＡｃｔＡタンパク質配列（例えば、配列番号６２）のおよそ残基３０〜１２２、およそ残基３０〜２２９、およそ残基３０〜３３２、およそ残基３０〜２００、またはおよそ残基３０〜３９９を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるものが含まれる。短縮化ＡｃｔＡタンパク質の他の例には、全長ＡｃｔＡタンパク質配列（例えば、配列番号６２）のほぼ最初の５０、１００、１５０、２００、２３３、２５０、３００、３９０、４００、または４１８残基を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるものが含まれる。短縮化ＡｃｔＡタンパク質の他の例には、全長ＡｃｔＡタンパク質配列（例えば、配列番号６２）のほぼ残基２００〜３００または残基３００〜４００を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるものが含まれる。例えば、短縮化ＡｃｔＡは、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，６５５，２３８号に記載のとおりの野生型ＡｃｔＡタンパク質の最初の３９０アミノ酸からなる。別の例としては、短縮化ＡｃｔＡは、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０１８６３８７号に記載されているとおりの、ＰＥＳＴモチーフが欠失していて、非保存的ＱＤＮＫＲ（配列番号７３）置換を含有するＡｃｔＡ−Ｎ１００またはその修飾バージョン（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と称される）であり得る。別法では、短縮化ＡｃｔＡタンパク質は、上記アミノ酸範囲または本明細書で開示するＡｃｔＡペプチドのいずれかのアミノ酸範囲のいずれかに対応する相同ＡｃｔＡタンパク質の残基を含有し得る。残基数は、上記で挙げた残基数と正確に対応する必要はない（例えば、相同ＡｃｔＡタンパク質が、本明細書で利用するＡｃｔＡタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合、それに応じて残基数は調節され得る）。
【０１１４】
短縮化ＡｃｔＡタンパク質の例には、例えば、配列番号６３、６４、６５、もしくは６６に記載の配列または配列番号６３、６４、６５、もしくは６６のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、バリアントの断片、アイソフォームの断片、もしくは類似体の断片を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるタンパク質が含まれる。配列番号６３は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ１と称され、配列番号６２に記載の全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜１２２からなる。配列番号６４は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２またはＬＡ２２９と称され、配列番号６２に記載の全長ＡｃｔＡ配列に記載の全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜２２９からなる。配列番号６５は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３と称され、配列番号６２に記載の全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜３３２からなる。配列番号６６は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ４と称され、配列番号６２に記載の全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜３９９からなる。具体的な例として、配列番号６４に記載の配列からなる短縮化ＡｃｔＡタンパク質を使用することができる。
【０１１５】
短縮化ＡｃｔＡタンパク質の例には、例えば、配列番号６７、６９、７０、もしくは７２に記載の配列または配列番号６７、６９、７０、もしくは７２のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、バリアントの断片、アイソフォームの断片、もしくは類似体の断片を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるタンパク質が含まれる。具体的な例として、配列番号６７に記載の配列からなる短縮化ＡｃｔＡタンパク質（配列番号６８に記載の核酸によってコードされる）を使用することができる。別の具体的な例として、配列番号７０に記載の配列からなる短縮化ＡｃｔＡタンパク質（配列番号７１に記載の核酸によってコードされる）を使用することができる。配列番号７１は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ１０４０３Ｓ株においてＡｃｔＡをコードする最初の１１７０ヌクレオチドである。場合によっては、ＡｃｔＡ断片を、非相同シグナルペプチドに融合させることができる。例えば、配列番号７２は、Ｈｌｙシグナルペプチドに融合しているＡｃｔＡ断片を記載している。
【０１１６】
Ｃ．組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物の生成
本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物またはそれを含む組成物を生成するための方法も本明細書で提供する。例えば、そのような方法は、免疫療法構築物に含まれるべき抗原性または免疫原性ペプチドを選択及び設計すること（及び、例えば、各抗原性ペプチドのハイドロパシーを試験すること、及び選択されたハイドロパシー指数の閾値を越えるスコアを示す場合、抗原性ペプチドを修飾または排除すること）、選択された抗原性ペプチドのそれぞれを含む１つまたは複数の融合ポリペプチドを設計すること、ならびに融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成することを含み得る。
【０１１７】
抗原性ペプチドを、疎水性または親水性についてスクリーニングすることができる。抗原性ペプチドを、例えば、それらが親水性である場合、またはそれらが、目的の特定の細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）における分泌可能性を予期させ得る特定のハイドロパシー閾値までの、またはそれ未満のスコアを示す場合、選択することができる。例えば、抗原性ペプチドは、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数によって２１アミノ酸ウィンドウでスコアリングすることができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによっておそらく分泌され得ないので、カットオフ（約１．６）を超えるすべてのスコアリングを排除する。例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５７（１）：１０５−１３２を参照されたい。別法では、選択されたカットオフを超えるスコアを示す抗原性ペプチドを変化させることができる（例えば、抗原性ペプチドの長さを変える）。使用することができる他のスライディングウィンドウサイズは、例えば、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７またはそれ以上のアミノ酸を含む。例えば、スライディングウィンドウサイズは、９〜１１アミノ酸、１１〜１３アミノ酸、１３〜１５アミノ酸、１５〜１７アミノ酸、１７〜１９アミノ酸、１９〜２１アミノ酸、２１〜２３アミノ酸、２３〜２５アミノ酸、または２５〜２７アミノ酸であり得る。使用することができる他のカットオフには、例えば、次の範囲１．２〜１．４、１．４〜１．６、１．６〜１．８、１．８〜２．０、２．０〜２．２、２．２〜２．５、２．５〜３．０、３．０〜３．５、３．５〜４．０、または４．０〜４．５が含まれるか、またはカットオフは、１．４、１．５、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．３、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、または４．５であり得る。カットオフは、例えば、融合ポリペプチドを送達するために使用される細菌の属または種に応じて変動し得る。
【０１１８】
他の適切なハイドロパシープロットまたは他の適切なスケールには、例えば、それぞれあらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＲｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  ２２：３８１−４１５；Ｂｉｓｗａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  １０００：６３７−６５５；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５３：５９５−６２３；Ａｂｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｌｅｏ（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：１３０−１５２；Ｓｗｅｅｔ  ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７１：４７９−４８８；Ｂｕｌｌ  ａｎｄ  Ｂｒｅｅｓｅ（１９７４）Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  １６１：６６５−６７０；Ｇｕｙ（１９８５）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ４７：６１−７０；Ｍｉｙａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １８：５３４−５５２；Ｒｏｓｅｍａｎ（１９８８）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００：５１３−５２２；Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：８４９−８５５；Ｗｉｌｓｏｎ（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９：３１−４１；Ｃｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ（１９９０）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：７５−８０；Ａｂｏｄｅｒｉｎ（１９７１）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２：５３７−５４４；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７９：１２５−１４２；Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ（１９８１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８；Ｍａｎａｖａｌａｎ  ａｎｄ  Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６７３−６７４；Ｂｌａｃｋ  ａｎｄ  Ｍｏｕｌｄ（１９９１）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９３：７２−８２；Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ａｎｄ  Ｐｌｉｓｋａ（１９８３）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １８：３６９−３７５；Ｊａｎｉｎ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：４９１−４９２；Ｒａｏ  ａｎｄ  Ａｒｇｏｓ（１９８６）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ８６９：１９７−２１４；Ｔａｎｆｏｒｄ（１９６２）Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ８４：４２４０−４２７４；Ｗｅｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １８８：２１５−２１８；Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５４２５−５４３１；及びＣｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ（１９９０）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：７５−８０に報告されているものが含まれる。
【０１１９】
任意選択で、抗原性ペプチドを、対象のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型に結合するそれらの能力についてスコアリングし（例えば、ｎｅｔＭＨＣｐａｎ、ＡＮＮ、ＳＭＭＰＭＢＥＣ．ＳＭＭ、ＣｏｍｂＬｉｂ＿Ｓｉｄｎｅｙ２００８、ＰｉｃｋＰｏｃｋｅｔ、及びｎｅｔＭＨＣｃｏｎｓを含む、ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇで利用可能なＩｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＥＤ）を使用することによって）、各抗原性ペプチドからの最良のＭＨＣ結合スコアによって、ランキングすることができる。他の情報源には、ＴＥｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｐｒｅｄｉｃｔ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）または他の利用可能なＭＨＣ結合測定スケールが含まれる。カットオフは、異なる発現ベクター、例えば、サルモネラでは異なってもよい。
【０１２０】
任意選択で、抗原性ペプチドを排除するか、または免疫抑制の影響を回避するために、抗原性ペプチドを、免疫抑制エピトープ（例えば、Ｔ−ｒｅｇエピトープ、ＩＬ−１０誘導Ｔヘルパーエピトープなど）についてスクリーニングすることができる。
【０１２１】
任意選択で、抗原性ペプチドをスクリーニングするために、エピトープの免疫原性についての予測アルゴリズムを使用することができる。しかしながら、これらのアルゴリズムは、どのペプチドがＴ細胞応答をもたらすかの予測において、最良でも２０％の正確性である。別法では、スクリーニング／予測アルゴリズムを使用しない。別法では、抗原性ペプチドを、免疫原性についてスクリーニングすることができる。例えば、これは、１つまたは複数のＴ細胞を抗原性ペプチドと接触させること、及びペプチドを免疫原性ペプチドとして同定する免疫原性Ｔ細胞応答を分析することを含み得る。これはまた、１つまたは複数のＴ細胞をペプチドと接触させた場合の、ＣＤ２５、ＣＤ４４、またはＣＤ６９のうちの少なくとも１つの分泌を測定するか、またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、及びＩＬ−２を含む群から選択されるサイトカインの分泌を測定するために免疫原性アッセイを使用することを含み得、その際、分泌の増加によって、そのペプチドは１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含むと同定される。
【０１２２】
選択された抗原性ペプチドを、可能性のある融合ポリペプチドのための１つまたは複数の順序候補に配置することができる。単一プラスミドに収め得るよりも、より有効な抗原性ペプチドが存在する場合、種々の抗原性ペプチドに、必要／所望に応じて優先順位を割り当てることができるか、及び／またはそれらを異なる融合ポリペプチドに分割することができる（例えば、異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株に含ませるために）。優先順序を、相対サイズ、転写の優先、及び／または翻訳されるポリペプチドの全体疎水性などの因子によって決定することができる。本明細書の他の箇所でより詳細に開示するとおり、リンカーなしで直接一緒に、または任意の数の抗原性ペプチド対の間にあるリンカーの任意の組合せで結合しているように、抗原性ペプチドを配置することができる。変異負荷に対して必要とされる構築物の数、単一プラスミドからの多数のエピトープの翻訳及び分泌の効率、ならびにプラスミドを含む各細菌またはＬｍに必要なＭＯＩの検討に基づき、含まれる線状抗原性ペプチドの数を決定することができる。
【０１２３】
抗原性ペプチドの組合せまたは全融合ポリペプチド（すなわち、抗原性ペプチド及びＰＥＳＴ含有ペプチド及び任意のタグを含む）も、疎水性についてスコアリングすることができる。例えば、融合抗原性ペプチドの全体または全融合ポリペプチドをＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数によって２１アミノ酸ウィンドウでスコアリングすることができる。いずれかの領域がカットオフ（例えば、約１．６）を超えるスコアを示す場合、抗原性ペプチドの許容される順序（すなわち、カットオフを越えるスコアを示す領域がないもの）が見出されるまで、抗原性ペプチドを再整理するか、または融合ポリペプチド内でシャッフルすることができる。別法では、いずれかの問題のある抗原性ペプチドを除去するか、または異なるサイズに再設計することができる。別法では、またはそれに加えて、本明細書の他の箇所で開示するとおり抗原性ペプチド間にある１つまたは複数のリンカーを付加するか、または修飾して、疎水性を変えることができる。個々の抗原性ペプチドについてのハイドロパシー試験の場合と同様に、他のウィンドウサイズを使用してもよいし、または他のカットオフを使用してもよい（例えば、融合ポリペプチドを送達するために使用される細菌の属または種に応じて）。加えて、他の適切なハイドロパシープロットまたは他の適切なスケールを使用してもよい。
【０１２４】
任意選択で、抗原性ペプチドを除去するか、または免疫抑制の影響を回避するために、抗原性ペプチドの組合せまたは全融合ポリペプチドを、免疫抑制エピトープ（例えば、Ｔ−ｒｅｇエピトープ、ＩＬ−１０誘導Ｔヘルパーエピトープなど）についてさらにスクリーニングすることができる。
【０１２５】
次いで、抗原性ペプチドまたは融合ポリペプチドの組合せ候補をコードする核酸を設計及び最適化することができる。例えば、配列を、翻訳レベル、発現期間、分泌レベル、転写レベル、及びその任意の組合せを増加させるために最適化することができる。例えば、増加は、対照の非最適化配列に対して２倍〜１０００倍、２倍〜５００倍、２倍〜１００倍、２倍〜５０倍、２倍〜２０倍、２倍〜１０倍、または３倍〜５倍であり得る。
【０１２６】
例えば、融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸を、オリゴヌクレオチド配列で形成され得る二次構造のレベルを低下させるために最適化してもよいし、または別法では配列を修飾し得る任意の酵素の結合を防ぐために最適化してもよい。細菌細胞における発現は、例えば、転写サイレンシング、短いｍＲＮＡ半減期、二次構造形成、オリゴヌクレオチド結合分子、例えば、リプレッサー及びインヒビターの結合部位、ならびにレアｔＲＮＡプールの利用可能性によって妨害され得る。細菌発現における多くの問題の原因は、元の配列内で見い出される。ＲＮＡの最適化は、シス作用エレメントの修飾、そのＧＣ含有率の適合、細菌細胞の非限定的ｔＲＮＡプールに関するコドンバイアスの変更、及び内部相同領域の回避を含んでもよい。したがって、配列を最適化することは、例えば、非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含有率の領域を調節することを伴い得る。配列を最適化することはまた、例えば、次のシス作用配列モチーフのうちの１つまたは複数を回避することを伴い得る：内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位、及びリボソーム侵入部位；ＡＴリッチまたはＧＣリッチ配列区間；繰り返し配列及びＲＮＡ二次構造；（潜在）スプライスドナー及びアクセプター部位；分岐点；またはその組み合わせ。発現を最適化することはまた、配列要素を遺伝子の隣接領域に、及び／またはプラスミド内の他の箇所に付加することを伴い得る。
【０１２７】
配列を最適化することはまた、例えば、コドン利用率を宿主遺伝子（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ遺伝子）のコドンバイアスに適合させることを伴い得る。例えば、下のコドンを、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓでは使用することができる。
【表８】
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【０１２８】
融合ポリペプチドをコードする核酸を生成し、送達ビヒクル、例えば、菌株またはＬｉｓｔｅｒｉａ株に導入することができる。ワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子などの他の送達ビヒクルも、ＤＮＡ免疫療法またはペプチド免疫療法に適することがある。融合ポリペプチドをコードするプラスミドを生成し、菌株またはＬｉｓｔｅｒｉａ株に導入したら、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を培養し、抗原性ペプチドを含む融合ポリペプチドの発現及び分泌を確認するために特徴づけることができる。
【０１２９】
ＩＩＩ．ミニ遺伝子構築物によってコードされる組換えキメラポリペプチド
Ｎ末端からＣ末端まで、細菌分泌シグナル配列、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、及び抗原性ＷＴ１ペプチド（または１つまたは複数の抗原性ＷＴ１ペプチド）を含む組換えキメラポリペプチドを本明細書で開示する。２つ以上の抗原性ペプチドが含まれている場合、抗原性ペプチドは、直列であり得る（例えば、Ｕｂ−ペプチド１−ペプチド２）。別法では、各抗原性ＷＴ１ペプチドがそれ自身の分泌配列及びＵｂタンパク質に融合している別々のキメラポリペプチドの組合せを使用することができる（例えば、Ｕｂ１−ペプチド１；Ｕｂ２−ペプチド２）。適切な抗原性ＷＴ１ペプチドの例は、本明細書の他の箇所に開示する。
【０１３０】
そのような組換えキメラポリペプチドをコードする核酸（ミニ遺伝子構築物と名付けられる）も開示する。そのようなミニ遺伝子核酸構築物は、各オープンリーディングフレームの間にあるシャイン−ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つ以上のオープンリーディングフレームをさらに含み得る。例えば、ミニ遺伝子核酸構築物は、各オープンリーディングフレームの間にあるシャイン−ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームをさらに含み得る。各オープンリーディングフレームは、Ｎ末端からＣ末端まで、細菌分泌配列、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、及び１つまたは複数の抗原性ＷＴ１ペプチドを含む異なるキメラポリペプチドをコードし得る。タンパク質合成の終了を保証するために、キメラポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンには、２つの停止コドンが続き得る。
【０１３１】
ミニ遺伝子構築物によってコードされる一部のキメラポリペプチドでは、１つまたは複数の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドが細菌分泌配列とユビキチンタンパク質との間に存在する。例えば、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、１〜４、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１８、または２０の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドが細菌分泌配列とユビキチンタンパク質との間に存在し得る。２つ以上の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドが存在する場合、それらは、ペプチドリンカーを介して連結して相互に直接融合していてよい。例示的なリンカーを本明細書の他の箇所で開示する。追加の抗原性ＷＴ１ペプチドは、１つまたは複数の天然ＷＴ１ペプチド及び／または１つまたは複数のヘテロクリティック変異ＷＴ１ペプチドを含み得る。天然ＷＴ１ペプチドの例には、配列番号９５、１０１〜１１３、１５２、１５４、１５５、１５８、及び１６１のうちのいずれか１つの配列を含むペプチドが含まれる。適切な天然ＷＴ１ペプチドの他の例を本明細書の他の箇所で開示する。ヘテロクリティックＷＴ１変異ペプチドの例には、配列番号１１４〜１３７、１５９、１６０、１６２、及び１６３のうちのいずれか１つの配列を含むペプチドが含まれる。適切なヘテロクリティック変異ＷＴ１ペプチドの他の例を本明細書の他の箇所で開示する。一例では、１つまたは複数の追加の抗原性ペプチドは、配列番号１５４に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる第１の追加の抗原性ＷＴ１ペプチド、配列番号１５５に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる第２の追加の抗原性ＷＴ１ペプチド、及び配列番号１３６に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる第３の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。別の例では、１つまたは複数の追加の抗原性ペプチドは、配列番号１５４に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる第１の追加の抗原性ＷＴ１ペプチド、配列番号１５５に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる第２の追加の抗原性ＷＴ１ペプチド、及び配列番号１３７に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる第３の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。これらの例のいずれかにおけるユビキチンの後のＷＴ１抗原性ペプチドは、例えば、配列番号１１４または１１５に記載の配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、またはそれからなり得る。得られるキメラポリペプチドは、配列番号１５３に記載の配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、またはそれからなり得る。
【０１３２】
細菌分泌シグナル配列の例を本明細書の他の箇所でより詳細に開示する。ユビキチンは、例えば、全長タンパク質であり得る。ミニ遺伝子構築物によってコードされる例示的なユビキチンペプチドは、配列番号１００に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本明細書で提供する核酸構築物から発現されるユビキチンは、宿主細胞サイトゾルに侵入すると、ヒドロラーゼの作用によって、ユビキチンのカルボキシ末端で、核酸構築物から発現される組換え融合ポリペプチドの残りの部分から切断され得る。これにより、融合ポリペプチドの残りの部分は遊離して、宿主細胞サイトゾルにおいてペプチドを生じる。
【０１３３】
融合ポリペプチド内でのＷＴ１抗原性ペプチドの選択、変更、及び配置を本明細書の他の箇所でより詳細に論述し、ヘテロクリティック変異ＷＴ１抗原性ペプチドを生成する方法を本明細書の他の箇所でより詳細に論述する。
【０１３４】
組換えキメラポリペプチドは、１つまたは複数のタグを含み得る。例えば、組換えキメラポリペプチドは、１つまたは複数の抗原性ＷＴ１ペプチドのＮ末端側及び／またはＣ末端側に１つまたは複数のペプチドタグを含み得る。タグを、抗原性ペプチドに直接融合させ得るか、またはリンカー（その例を本明細書の他の箇所で開示する）によって抗原性ペプチドに連結し得る。タグの例には、次が含まれる：ＦＬＡＧタグ；２ｘＦＬＡＧタグ；３ｘＦＬＡＧタグ；Ｈｉｓタグ、６ｘＨｉｓタグ；及びＳＩＩＮＦＥＫＬタグ。例示的なＳＩＩＮＦＥＫＬタグは、配列番号１６に記載されている（配列番号１〜１５に記載の核酸のいずれか１つによってコードされる）。例示的な３ｘＦＬＡＧタグは、配列番号３２に記載されている（配列番号１７〜３１に記載の核酸のいずれか１つによってコードされる）。例示的なバリアント３ｘＦＬＡＧタグは、配列番号９９に記載されている。２つ以上のタグ、例えば、２ｘＦＬＡＧタグ及びＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、３ｘＦＬＡＧタグ及びＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、または６ｘＨｉｓタグ及びＳＩＩＮＦＥＫＬタグを一緒に使用することができる。２つ以上のタグを使用する場合、それらは、組換え融合ポリペプチドのどこにも、及び任意の順序で位置し得る。例えば、２つのタグを組換え融合ポリペプチドのＣ末端で使用することができ、２つのタグを組換え融合ポリペプチドのＮ末端で使用することができるか、２つのタグを組換え融合ポリペプチド内で内部に位置させることができるか、１つのタグが組換え融合ポリペプチドのＣ末端に、及び１つのタグがＮ末端にあり得るか、１つのタグが組換え融合ポリペプチドのＣ末端に、及び１つが内部にあり得るか、または１つのタグが組換え融合ポリペプチドのＮ末端に、及び１つが内部にあり得る。他のタグには、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、及びポリ（ＮＡＮＰ）が含まれる。特定の組換え融合ポリペプチドは、Ｃ末端側のＳＩＩＮＦＥＫＬタグを含む。そのようなタグは、組換え融合タンパク質の容易な検出、組換え融合タンパク質の分泌の確認、またはこれらの「タグ」配列ペプチドに対する免疫応答を追跡することによる分泌された融合ポリペプチドの免疫原性の追跡を可能にし得る。例えば、これらのタグに特異的なモノクローナル抗体及びＤＮＡまたはＲＮＡプローブを含むいくつかの試薬を使用して、そのような免疫応答をモニターすることができる。
【０１３５】
本明細書で開示する組換えキメラポリペプチドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株によって発現され得るか、またはタンパク質発現及び単離のために使用される他のベクター及び細胞系から発現及び単離され得る。そのような抗原性ペプチドを含み発現する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を、例えば、そのような組換えリステリアを含む免疫原性組成物で、ならびに組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株及びアジュバントを含むワクチンで使用することができる。
【０１３６】
そのような組換えキメラポリペプチドをコードする核酸（ミニ遺伝子構築物）も開示する。核酸は、任意の形態であり得る。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むか、またはそれからなり得、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸は、プラスミド、例えば、エピソームプラスミド、マルチコピーエピソームプラスミド、または組み込みプラスミドの形態であり得る。別法では、核酸は、ウイルスベクター、ファージベクターの形態で、または細菌人工染色体であり得る。そのような核酸は、１つのオープンリーディングフレームを有し得るか、または２つ以上のオープンリーディングフレーム（例えば、組換えキメラポリペプチドをコードする１つのオープンリーディングフレーム、及び代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレーム）を有し得る。一例では、そのような核酸は、各オープンリーディングフレームの間にあるシャイン−ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つ以上のオープンリーディングフレームを含み得る。例えば、核酸は、各オープンリーディングフレームの間にあるシャイン−ダルガノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームを含み得る。各オープンリーディングフレームは、異なるポリペプチドをコードし得る。キメラポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンには、タンパク質合成の終了を保証するために、２つの停止コドンが続き得る。
【０１３７】
一部の例示的な組換えキメラポリペプチドには、配列番号１５３、１５６、１５７、及び１６４〜１６６のいずれか１つに記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる配列を有するものが含まれる。
【０１３８】
Ａ．ミニ遺伝子構築物によってコードされる抗原性ＷＴ１ペプチド
本明細書で開示するミニ遺伝子構築物によってコードされるＷＴ１ペプチドは、天然（すなわち、未変化、天然に存在する）ＷＴ１ペプチドまたはヘテロクリティックＷＴ１ペプチド（例えば、ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩヘテロクリティックペプチド）であり得る。天然ＷＴ１ペプチドの例には、配列番号９５、１０１〜１１３、１５２、１５４、１５５、１５８、及び１６１のうちのいずれか１つの配列を含むペプチドが含まれる。ヘテロクリティックＷＴ１ペプチドの例には、配列番号１１４〜１３７、１５９、１６０、１６２、及び１６３のうちのいずれか１つの配列を含むペプチドが含まれる。「ヘテロクリティック」という用語は、ヘテロクリティックペプチドが由来する天然ペプチドを認識する免疫応答をもたらすペプチド（例えば、アンカー残基変異を含有しないペプチド）を指す。例えば、ＦＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１１４）は、フェニルアラニンへの残基１の変異によって、ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１０１）から生成された。ヘテロクリティックペプチドは、ヘテロクリティックペプチドが由来した天然ペプチドを認識する免疫応答をもたらし得る。例えば、ヘテロクリティックペプチドを含むワクチン接種によって生じる、天然ペプチドに対する免疫応答は、規模において、天然ペプチドのワクチン接種によって生じる免疫応答の同等以上であり得る。免疫応答は、例えば、２倍、３倍、５倍、７倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍、５００倍、１０００倍以上増加し得る。
【０１３９】
本明細書で開示する天然またはヘテロクリティックＷＴ１ペプチドは、１つまたは複数のＨＬＡ分子に結合し得る。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子としても公知のＨＬＡ分子は、ペプチドに結合し、それを免疫細胞に提示する。ペプチドの免疫原性は、ＨＬＡ分子についてのその親和性によって部分的に決定され得る。ＨＬＡクラスＩ分子は、一般に細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）上に存在するＣＤ８分子と相互作用する。ＨＬＡクラスＩＩ分子は、一般にヘルパーＴリンパ球上に存在するＣＤ４分子と相互作用する。例えば、本明細書で開示するＷＴ１ペプチドは、Ｔ細胞前駆体を活性化するために十分な親和性を有するか、またはＴ細胞による認識を媒介する十分な親和性を有するＨＬＡ分子に結合し得る。
【０１４０】
本明細書で開示する天然またはヘテロクリティックＷＴ１ペプチドは、１つまたは複数のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合し得る。例えば、ＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲＢ分子、ＨＬＡ−ＤＲＡ分子、ＨＬＡ−ＤＱＡ１分子、ＨＬＡ−ＤＱＢ１分子、ＨＬＡ−ＤＰＡ１分子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１分子、ＨＬＡ−ＤＭＡ分子、ＨＬＡ−ＤＭＢ分子、ＨＬＡ−ＤＯＡ分子、またはＨＬＡ−ＤＯＢ分子に結合し得る。
【０１４１】
本明細書で開示する天然またはヘテロクリティックＷＴ１ペプチドは、１つまたは複数のＨＬＡクラスＩ分子に結合し得る。例えば、ＷＴ１ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ分子、ＨＬＡ−Ｂ分子、ＨＬＡ−Ｃ分子、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子、ＨＬＡ  Ａ１、ＨＬＡ  Ａ２、ＨＬＡ  Ａ２．１、ＨＬＡ  Ａ３、ＨＬＡ  Ａ３．２、ＨＬＡ  Ａ１１、ＨＬＡ  Ａ２４、ＨＬＡ  Ｂ７、ＨＬＡ  Ｂ２７、またはＨＬＡ  Ｂ８に結合し得る。同様に、ＷＴ−１ペプチドは、ＨＬＡクラスＩ分子のスーパーファミリー、例えば、Ａ２スーパーファミリー、Ａ３スーパーファミリー、Ａ２４スーパーファミリー、Ｂ７スーパーファミリー、Ｂ２７スーパーファミリー、Ｂ４４スーパーファミリー、Ｃ１スーパーファミリー、またはＣ４スーパーファミリーに結合し得る。
【０１４２】
ヘテロクリティックＷＴ１ペプチドは、対応する天然ＷＴ１ペプチドに対して、ＨＬＡクラスＩＩ分子へのペプチドの結合を増強する変異を含み得る。別法では、または加えて、ヘテロクリティックＷＴ１ペプチドは、対応する天然ＷＴ１ペプチドに対して、ＨＬＡクラスＩ分子へのペプチドの結合を増強する変異を含み得る。例えば、変異残基は、ＨＬＡクラスＩＩモチーフアンカー残基であり得る。「アンカーモチーフ」または「アンカー残基」は、別の実施形態では、ＨＬＡ結合配列（例えば、ＨＬＡクラスＩＩ結合配列またはＨＬＡクラスＩ結合配列）の特定の位置にある１つの好ましい残基またはそのセットを指す。
【０１４３】
野生型エピトープに対する交差反応性免疫原性応答を誘発する可能性を有する予測ヘテロクリティックエピトープを生成するために、様々な方法が周知である。例えば、野生型エピトープに対する交差反応性免疫原性応答を誘発する可能性を有するヘテロクリティックエピトープを設計するために、野生型エピトープの基線予測ペプチド−ＭＨＣ結合親和性を、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ  ３．０Ｓｅｒｖｅｒ（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＭＨＣｐａｎ／）を使用して決定することができる。１．０以下のペプチド−ＭＨＣ結合親和性パーセントランクが、免疫応答を誘発するであろう強いバインダーと判断される。これに限定されないが、強力なバインダーであると予測される野生型エピトープの１、２、３位、またはＣ末端位での１個以上のアミノ酸の無作為の置換によって、有望なヘテロクリティックエピトープを生成する。次いで、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ  ３．０  Ｓｅｒｖｅｒを使用して、有望なヘテロクリティックエピトープのペプチド−ＭＨＣ結合親和性を推定する。野生型エピトープと同様、及び１．０パーセントランク以下のパーセンテージランキングの結合親和性を有するヘテロクリティックエピトープを、将来評価するための有望な抗原と判断することができる。
【０１４４】
ＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ残基を同定するための、ならびに残基を変異させることによってＨＬＡ結合を改善するための他の方法は周知である。例えば、それぞれあらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，７６５，６８７号、米国特許第７，４８８，７１８号、米国特許第９，２３３，１４９号、及び米国特許第７，５９８，２２１号を参照されたい。例えば、ＭＨＣクラスＩＩエピトープを予測する方法は周知である。一例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＴＥＰＩＴＯＰＥ（あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＭｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：５８１−５９１）を使用して予測することができる。別の例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＤｅ  Ｇｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １３：５２９−５３１）を使用して予測することができる。また別の例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、Ｐｒｅｄｉｃｔ  Ｍｅｔｈｏｄ（あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＹｕ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８：１３７−１４８）を使用して予測することができる。また別の例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープは、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩエピトープ予測アルゴリズムを使用して予測することができる。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩは、クラスＩ及びクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に結合することが公知の４５００超のペプチド配列を含むデータベースである。ＳＹＦＰＥＩＴＨＩは、ＭＨＣ結合グルーブに沿った特定の位置における特定のアミノ酸の存在に基づくスコアを提供する。理想的なアミノ酸アンカーは、１０ポイントと評価され、稀なアンカーは６〜８ポイントの値を有し、補助アンカーは４〜６ポイントの値を有し、好ましい残基は、１〜４ポイントの値を有する；−１から−３の間の結合スコアに対するマイナスのアミノ酸作用。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１での最大スコアは３６である。また別の例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープを、Ｒａｎｋｐｅｐを使用して予測することができる。Ｒａｎｋｐｅｐは、ＭＨＣ−ペプチド結合の予測因子として、所与のＭＨＣ分子に結合することが公知であるアラインさせたペプチドのセットからの位置特異的スコアリングマトリックス（ＰＳＳＭ）またはプロファイルを使用する。Ｒａｎｋｐｅｐは、選択されたプロファイルで、最大スコアをもたらすコンセンサス配列のものに対する、ペプチドのスコア及び予測ペプチドの最適％またはパーセンタイルスコアについての情報を含む。Ｒａｎｋｐｅｐは、それぞれＭＨＣＩ及びＭＨＣＩＩ分子へのペプチド結合を予測するために、１０２及び８０ＰＳＳＭの選択を含む。種々のサイズのペプチドバインダーを予測するためのいくつかのＰＳＳＭが通常、各ＭＨＣ  Ｉ分子のために利用可能である。別の例として、ＭＨＣクラスＩＩエピトープを、ＳＶＭＨＣを使用して同定することができる（あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＤｏｎｎｅｓ  ａｎｄ  Ｅｌｏｆｓｓｏｎ（２���０２）ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １１；３：２５）。
【０１４５】
ＭＨＣクラスＩエピトープを同定するための方法も周知である。一例として、ＭＨＣクラスＩエピトープを、ＢＩＭＡＳソフトウェアを使用して予測することができる。ＢＩＭＡＳスコアは、ペプチド結合親和性の尺度であるＭＨＣ−Ｉ／β２−ミクログロブリン／ペプチド複合体の理論半減期の計算に基づく。このプログラムは、約８〜１０アミノ酸長のＨＬＡ−Ｉペプチドについての情報を利用する。ＭＨＣに対するペプチドの結合親和性が高いほど、このペプチドがエピトープである可能性が高い。ＢＩＭＡＳアルゴリズムによって、ペプチド中の各アミノ酸がクラスＩ分子への結合に独立に寄与すると推測される。結合に重要である有力なアンカー残基は、表において１よりもかなり高い係数を有する。好ましくないアミノ酸は、１未満であるプラスの係数を有する。アミノ酸が、結合に対して好ましい、または好ましくない寄与を成すかが分かっていない場合、これに値１を割り当てる。アミノ酸に割り当てられたすべての値を掛け、得られたランニングスコア（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｓｃｏｒｅ）に定数を掛けて、解離の半減期の推定値を得る。別の例として、ＭＨＣクラスＩエピトープを、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩを使用して同定することができる。また別の例として、ＭＨＣクラスＩエピトープを、ＳＶＭＨＣを使用して同定することができる。また別の例として、ＭＨＣクラスＩエピトープを、ＮｅｔＭＨＣ−２．０（あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＢｕｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ６２：３７８−３８４）を使用して同定することができる。
【０１４６】
ＨＬＡ結合モチーフ中の種々の残基を変異させて、ＭＨＣ結合を増強することができる。一例では、ＭＨＣ結合を増強する変異は、ＨＬＡクラスＩ結合モチーフの１位の残基においてである（例えば、チロシン、グリシン、トレオニン、またはフェニルアラニンへの変異）。別の例として、変異は、ＨＬＡクラスＩ結合モチーフの２位においてであり得る（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシン、またはメチオニンへの変異）。別の例として、変異は、ＨＬＡクラスＩ結合モチーフの６位においてであり得る（例えば、バリン、システイン、グルタミン、またはヒスチジンへ）。別の例として、変異は、ＨＬＡクラスＩ結合モチーフの９位において、またはＣ末端位においてであり得る（例えば、バリン、トレオニン、イソロイシン、ロイシン、アラニン、またはシステインへ）。変異は、第１のアンカー残基において、または第２のアンカー残基においてであり得る。例えば、ＨＬＡクラスＩの第１のアンカー残基は、２及び９位であり得、第２のアンカー残基は、１及び８位または１、３、６、７、及び８位であり得る。別の例では、点変異は、４、５、及び８位から選択される位置においてであり得る。
【０１４７】
同様に、ＨＬＡクラスＩＩ結合部位内の種々の残基を変異させることができる。例えば、ＨＬＡクラスＩＩモチーフアンカー残基を修飾することができる。例えば、Ｐ１位、Ｐ２位、Ｐ６位、またはＰ９位を変異させることができる。別法では、Ｐ４位、Ｐ５位、Ｐ１０位、Ｐ１１位、Ｐ１２位、またはＰ１３位を変異させることができる。
【０１４８】
ミニ遺伝子構築物によってコードされるキメラポリペプチドは、単一の抗原性ＷＴ１ペプチドを含み得るか、または２つ以上の抗原性ペプチドを含み得る。各抗原性ペプチドは、免疫応答を誘導するために十分な任意の長さであり得、各抗原性ペプチドは、同じ長さであり得るか、または抗原性ペプチドは異なる長さを有し得る。例えば、ミニ遺伝子構築物によってコードされる抗原性ペプチドは、８〜１００、８〜５０、８〜３０、８〜２５、８〜２２、８〜２０、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、８〜１１、または８〜１０アミノ酸長であり得る。一例では、抗原性ＷＴ１ペプチドは、９アミノ酸長であり得る。
【０１４９】
各抗原性ペプチドはまた、親水性であり得るか、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたは目的の別の細菌における分泌可能性を予測し得る特定のハイドロパシー閾値までの、またはそれ未満のスコアを示し得る。例えば、抗原性ペプチドは、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数によって２１アミノ酸ウィンドウでスコアリングすることができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって分泌され得ないので、カットオフ（約１．６）を超えるすべてのスコアリングを排除することができる。同様に、抗原性ペプチドの組合せまたはキメラポリペプチドは、親水性であり得るか、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたは目的の別の細菌における分泌可能性を予測し得る特定のハイドロパシー閾値までの、またはそれ未満のスコアを示し得る。
【０１５０】
キメラポリペプチドが２つ以上の抗原性ペプチドを含む場合、抗原性ペプチドを、任意の手法で一緒に連結させることができる。例えば、抗原性ペプチドを、介在配列を用いずに相互に直接融合させることができる。別法では、抗原性ペプチドを、１つまたは複数のリンカー、例えば、ペプチドリンカーを介して間接的に相互に連結させることができる。場合によっては、隣接する抗原性ペプチドのいくつかの対を相互に直接融合させることができ、抗原性ペプチドの他の対を１つまたは複数のリンカーを介して間接的に相互に連結させることができる。同じリンカーを、隣接する抗原性ペプチドの各対の間で使用することができるか、または任意の数の異なるリンカーを、隣接する抗原性ペプチドの異なる対の間で使用することができる。加えて、１つのリンカーを隣接する抗原性ペプチドの対の間で使用することができるか、または多数のリンカーを、隣接する抗原性ペプチドの対の間で使用することができる。
【０１５１】
任意の適切な配列を、ペプチドリンカーのために使用することができる。適切なリンカーの例を、本明細書の他の箇所で開示する。
【０１５２】
例示的な天然、及びミニ遺伝子構築物によってコードされる対応するヘテロクリティック変異ＷＴ１ペプチドを次の表に示す。ヘテロクリティックペプチド中の変異残基は、太字で、下線が引かれている。他の例示的な天然ＷＴ１ペプチドには、配列番号９５及び１５２が含まれる。
【表９−１】
2019522991.tif 000006
【表９−２】
2019522991.tif 000007
【０１５３】
ミニ遺伝子構築物によってコードされる他の例示的な天然ＷＴ１ペプチド及び対応するヘテロクリティック変異ＷＴ１ペプチドを下の表に示す。ヘテロクリティックペプチド中の変異残基は、太字で、下線が引かれている。
【表１０】
2019522991.tif 000008
【０１５４】
Ｂ．細菌分泌シグナル配列
細菌分泌シグナル配列は、リステリアシグナル配列、例えば、ＨｌｙまたはＡｃｔＡシグナル配列、または任意の他の既知のシグナル配列であり得る。他の場合では、シグナル配列は、ＬＬＯシグナル配列であり得る。例示的なＬＬＯシグナル配列は、配列番号１５０に記載されている。例えば、本明細書のミニ遺伝子構築物によってコードされる細菌分泌シグナル配列は、ＬＬＯのＮ末端側断片、例えば、配列番号５９に記載のものであり得る。シグナル配列は、細菌性であり得るか、宿主細菌に対して天然であり得るか（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、例えば、ｓｅｃＡ１シグナルペプチド）、または宿主細菌に対して外来であり得る。シグナルペプチドの具体的な例には、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓからのＵｓｐ４５シグナルペプチド、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓからの防御抗原シグナルペプチド、ｓｅｃＡ２シグナルペプチド、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチド、及びＴａｔシグナルペプチド、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＴａｔシグナルペプチド（例えば、ＰｈｏＤ）が含まれる。具体的な例では、分泌シグナル配列は、リステリアタンパク質からのもの、例えば、ＡｃｔＡ３００分泌シグナルまたはＡｃｔＡ１００分泌シグナル（ＡｃｔＡ分泌シグナル配列の最初の１００アミノ酸を含む）である。例示的なＡｃｔＡシグナル配列を配列番号１５１に示す。
【０１５５】
Ｃ．ミニ遺伝子構築物によってコードされる組換えキメラポリペプチドをコードする免疫療法構築物の生成
本明細書で開示する組換えキメラポリペプチドをコードする免疫療法構築物またはそれを含む組成物を生成する方法も本明細書で提供する。例えば、そのような方法は、免疫療法構築物に含まれるべき抗原性または免疫原性ペプチドを選択及び設計すること（及び、例えば、各抗原性ペプチドのハイドロパシーを試験すること、及び選択されたハイドロパシー指数の閾値を越えるスコアを示す場合、抗原性ペプチドを修飾または排除すること）、選択された抗原性ペプチドのそれぞれを含む１つまたは複数の融合ポリペプチドを設計すること、ならびに融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成することを含み得る。そのような方法を、本明細書の他の箇所でより詳細に開示する。加えて、野生型エピトープに対して交差反応性免疫原性応答を誘発する可能性を有する予測ヘテロクリティックエピトープを生成するための方法を、本明細書の他の箇所でより詳細に開示する。
【０１５６】
ＩＶ．組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株
本明細書の他の箇所で開示するとおりの、本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドまたは組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）を含む組換え菌株、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株も本明細書で提供する。好ましくは、菌株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）株である。Ｌｍは、ワクチンベクターとして、いくつかの固有の利点を有する。この細菌は、特別な要求なしで非常に効率的にｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長し、グラム陰性菌、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａにおいて主要な毒性因子であるＬＰＳが欠如している。抗生物質で容易に除去され得、重篤な有害作用の場合、一部のウイルス性ベクターと異なり、宿主ゲノムへの遺伝物質の組み込みが起こらないので、遺伝子操作で弱毒化されたＬｍベクターも追加の安全性を示す。
【０１５７】
組換えリステリア株は、任意のＬｉｓｔｅｒｉａ株であり得る。適切なＬｉｓｔｅｒｉａ株の例には、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｕｒｒａｙｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）、または当技術分野で公知の任意の他のリステリア種が含まれる。好ましくは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ種の株である。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株の例には、次が含まれる：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ１０４０３Ｓ野生型（例えば、Ｂｉｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｈｉｎｒｉｃｈｓ（１９８７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３９：２００５−２００９；Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−４１８６を参照されたい）；ファージキュアリングされているＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤＰ−Ｌ４０５６（例えば、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−４１８６を参照されたい）；ファージキュアリングされていて、かつｈｌｙ遺伝子欠失が欠失しているＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤＰ−Ｌ４０２７（例えば、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−４１８６；Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｎｏｙ（１９９４）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：５６０８−５６１３を参照されたい）；ファージキュアリングされていて、かつａｃｔＡ遺伝子が欠失しているＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤＰ−Ｌ４０２９（例えば、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−４１８６；Ｓｋｏｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５０：５２７−５３８を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤＰ−Ｌ４０４２（ΔＰＥＳＴ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７及び補足情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤＰ−Ｌ４０９７（ＬＬＯ−Ｓ４４Ａ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７及び補足情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤＰ−Ｌ４３６４（ΔｌｐｌＡ；リポアートタンパク質リガーゼ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７及び補足情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤＰ−Ｌ４４０５（ΔｉｎｌＡ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７及び補足情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤＰ−Ｌ４４０６（ΔｉｎｌＢ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７及び補足情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＣＳ−ＬＯＯＯｌ（ΔａｃｔＡ；ΔｉｎｌＢ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７及び補足情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＣＳ−Ｌ０００２（ΔａｃｔＡ；ΔｌｐｌＡ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７及び補足情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＣＳ−Ｌ０００３（ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ；ΔｌｐｌＡ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７及び補足情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤＰ−Ｌ４０３８（ΔａｃｔＡ；ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７及び補足情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤＰ−Ｌ４３８４（ＬＬＯ  Ｓ４４Ａ；ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７及び補足情報を参照されたい）；ｌｐｌＡ１欠失を有するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株（リポアートタンパク質リガーゼＬｐｌＡ１をコード）（例えば、Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：４６２−４６４を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤＰ−Ｌ４０１７（ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔを含む１０４０３Ｓ）（例えば、米国特許第７，６９１，３９３号を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＥＧＤ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＬ５９１８２４を参照されたい）。別の実施形態では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＥＧＤ−ｅ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３２１０；ＡＴＣＣアクセッション番号ＢＡＡ−６７９を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＤＰ−Ｌ４０２９（ａｃｔＡ欠失、任意選択で、ｕｖｒＡＢ欠失との組合せ（ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ）（例えば、米国特許第７，６９１，３９３号を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓａｃｔＡ−／ｉｎｌＢ−二重変異体（例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５５６２を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｌｐｌＡ変異またはｈｌｙ変異体（例えば、米国特許出願公開第２００４／００１３６９０号を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｄａｌ／ｄａｔ二重変異体（例えば、米国特許出願公開第２００５／００４８０８１号を参照されたい）である。他のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株には、次の遺伝子のうちの１つ、またはそれらの任意の組合せをコードする核酸：ｈｌｙ（ＬＬＯ；リステリオリシン）；ｉａｐ（ｐ６０）；ｉｎｌＡ；ｉｎｌＢ；ｉｎｌＣ；ｄａｌ（アラニンラセマーゼ）；ｄａｔ（Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）；ｐｌｃＡ；ｐｌｃＢ；ａｃｔＡ；または成長、発生、単壁ベシクルの分解、二重壁ベ��クルの分解、宿主細胞への結合、もしくは宿主細胞による取込みを媒介する任意の核酸を含有するように、（例えば、プラスミドによって、及び／またはゲノム組み込みによって）修飾されているものが含まれる。上記の参照文献はそれぞれあらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
組換え細菌またはリステリアは、野生型菌力を有し得るか、弱毒化菌力を有し得るか、または無毒性であり得る。例えば、組換えリステリアは、ファゴソームまたはファゴリソソームを免れて、サイトゾルに進入するために十分に毒性であり得る。そのようなＬｉｓｔｅｒｉａ株はまた、本明細書の他の箇所で開示するとおり、少なくとも１つの弱毒化変異、欠失、または不活性化を含む生弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株であり得る。好ましくは、組換えリステリアは、弱毒化栄養素要求性株である。栄養素要求性株は、その成長に必要とされる特定の有機化合物を合成することができないものである。そのような株の例は、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，１１４，４１４号に記載されている。
【０１５９】
好ましくは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質抵抗性遺伝子が欠如している。例えば、そのような組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質抵抗性遺伝子をコードしないプラスミドを含み得る。しかしながら、本明細書で提供する一部の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質抵抗性遺伝子をコードする核酸を含むプラスミドを含む。抗生物質抵抗性遺伝子を、分子生物学及びワクチン製剤で一般に使用される従来の選択及びクローニングプロセスで使用してもよい。例示的な抗生物質抵抗性遺伝子には、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシン、及びゲンタマイシンに対する抵抗性を付与する遺伝子産物が含まれる。
【０１６０】
Ａ．組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドを含む細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株または組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸
本明細書で開示する組換え菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）は、本明細書の他の箇所で開示するとおりの本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドまたは組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）を含む。
【０１６１】
組換え融合タンパク質をコードする核酸を含む細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株では、核酸をコドン最適化することができる。各アミノ酸のためにＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって利用される最適なコドンの例は、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０２０７１７０号に示されている。核酸中の少なくとも１つのコドンが、本来の配列中のコドンよりも、そのアミノ酸についてＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによってより頻繁に使用されるコドンで置き換えられている場合、核酸はコドン最適化されている。
【０１６２】
核酸は、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株内のエピソームプラスミド中に存在し得る、及び／または核酸は、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株に遺伝子操作により組み込まれ得る。一部の組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、本明細書に開示のとおりの２つの組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする２つの別々の核酸を含む：エピソームプラスミド中に１つの核酸、及び細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株中に遺伝子操作により組み込まれた１つの核酸。
【０１６３】
エピソームプラスミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（細胞培養で）、ｉｎ  ｖｉｖｏ（宿主で）、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方で安定的に維持されるものであり得る。エピソームプラスミドにおいての場合、組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを、プラスミド中のプロモーター／制御配列に作動可能に連結することができる。細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株に遺伝子操作により組み込まれている場合、組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを、外因性プロモーター／制御配列に、または内因性プロモーター／制御配列に作動可能に連結することができる。遺伝子の構成的発現を駆動するために有用なプロモーター／制御配列の例は周知であり、それには例えば、リステリアのｈｌｙ、ｈｌｙＡ、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、及びｐ６０プロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｃプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｇｉＡプロモーター、及びＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｐｈａＺプロモーターが含まれる。場合によっては、目的の挿入遺伝子は、中断されないか、またはゲノムＤＮＡへの組み込みから多くの場合に起こる制御拘束を受けず、場合によっては、挿入された非相同遺伝子の存在は、細胞自体の重要な領域の再編成または中断をもたらさない。
【０１６４】
そのような組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、本明細書の他の箇所に記載する細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株または弱毒化細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸を含むプラスミドまたはベクターで形質転換することによって作製することができる。プラスミドは、宿主染色体に組み込まれないエピソームプラスミドであり得る。別法では、プラスミドは、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の染色体に組み込まれる組み込みプラスミドであり得る。本明細書で使用するプラスミドはまた、マルチコピープラスミドであり得る。細菌を形質転換するための方法は周知であり、それには、塩化カルシウムコンピテント細胞に基づく方法、電気穿孔法、バクテリオファージ媒介形質導入、化学的転換技法、及び物理的形質転換技法が含まれる。例えば、それぞれあらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５６：６４１−６４９；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１９０−１９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；及びＭｉｌｌｅｒ，１９９２，Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。
【０１６５】
遺伝子工学により組み込まれた非相同核酸を含む細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、部位特異的組み込みベクターを使用することによって作製することができ、それによって、相同組換えを使用して、組み込み遺伝子を含む細菌またはリステリアが作製される。組み込みベクターは、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株に感染し得る任意の部位特異的組み込みベクターであり得る。そのような組み込みベクターは、例えば、ＰＳＡ  ａｔｔＰＰ’部位、ＰＳＡインテグラーゼをコードする遺伝子、Ｕ１５３ａｔｔＰＰ’部位、Ｕ１５３インテグラーゼをコードする遺伝子、Ａ１１８  ａｔｔＰＰ’部位、Ａ１１８インテグラーゼをコードする遺伝子、または任意の他の既知のａｔｔＰＰ’部位または任意の他のファージインテグラーゼを含み得る。
【０１６６】
非相同核酸を細菌またはリステリア染色体に組み込むための任意の他の公知の方法を使用して、組み込み遺伝子を含むそのような細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を作製することもできる。相同組換えのための技法は周知であり、例えば、それぞれあらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＢａｌｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０９（１−２）：１１−１７）；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５）Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）３７（１）：１９−２４）、及び米国特許第６，８５５，３２０号に記載されている。
【０１６７】
細菌またはリステリア染色体への組み込みはまた、トランスポゾン挿入を使用して達成することができる。トランスポゾン挿入のための技法は周知であり、例えば、ＤＰ−Ｌ９６７の構築について、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５８：  ３７７０−３７７８によって記載されている。トランスポゾン変異誘発は、安定なゲノム挿入を達成することができるが、非相同核酸が挿入されているゲノム中の位置は分かっていない。
【０１６８】
細菌またはリステリア染色体への組み込みはまた、ファージ組み込み部位を使用して達成することができる（例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＬａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４（１５）：４１７７−４１８６を参照されたい）。例えば、非相同遺伝子を、ゲノム内の任意の適切な部位であってよい対応する結合部位（例えば、ａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子のｃｏｍＫまたは３’末端）に挿入するために、バクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）のインテグラーゼ遺伝子及び結合部位を使用することができる。非相同核酸の組み込み前に、内因性プロファージを、利用される結合部位からキュアリングすることができる。そのような方法は、例えば、単一コピー組み込み体をもたらし得る。「ファージキュアリングステップ」を回避するために、ＰＳＡファージに基づくファージ組み込み系を使用することができる（例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＬａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４：４１７７−４１８６を参照されたい）。組み込まれた遺伝子の維持は、例えば、抗生物質による継続的な選択を必要とし得る。別法では、抗生物質での選択を必要としないファージベースの染色体組み込み系を確立することができる。代わりに、栄養素要求宿主株を相補することができる。例えば、臨床適用のための、ファージに基づく染色体組み込み系を使用することができ、その際、例えば、Ｄ−アラニンを含む必須酵素について栄養素要求性である宿主株を使用する（例えば、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−））。
【０１６９】
遺伝物質及び／またはプラスミドを細菌に導入するために、コンジュゲーションも使用することができる。コンジュゲーションのための方法は周知であり、例えば、それぞれあらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＮｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｌａｓｍｉｄ  ５６（３）：２２３−２２７及びＡｕｃｈｔｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２（３５）：１２５５４−１２５５９に記載されている。
【０１７０】
具体的な一例では、組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性ａｃｔＡ配列（ＡｃｔＡタンパク質をコード）または内因性ｈｌｙ配列（ＬＬＯタンパク質をコード）を含むオープンリーディングフレームとして、細菌またはリステリアゲノムに遺伝子操作により組み込まれた組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸を含み得る。例えば、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドの発現及び分泌は、内因性ａｃｔＡプロモーター及びＡｃｔＡシグナル配列の制御下にあり得るか、または内因性ｈｌｙプロモーター及びＬＬＯシグナル配列の制御下にあり得る。別の例として、組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸は、ＡｃｔＡタンパク質をコードするａｃｔＡ配列またはＬＬＯタンパク質をコードするｈｌｙ配列を設け得る。
【０１７１】
組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の選択は、任意の手段によって達成することができる。例えば、抗生物質選択を使用することができる。抗生物質抵抗性遺伝子を、分子生物学及びワクチン製剤で一般に使用される従来の選択及びクローニングプロセスにおいて使用してもよい。例示的な抗生物質抵抗性遺伝子には、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシン、及びゲンタマイシンに対する抵抗性を付与する遺伝子産物が含まれる。別法では、抗生物質抵抗性遺伝子の代わりに、またはそれに加えて、選択のために、栄養素要求株を使用することができ、外因性代謝遺伝子を使用することができる。例として、本明細書で提供する代謝酵素または相補的遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養素要求細菌を選択するために、形質転換された栄養素要求細菌を、代謝酵素（例えば、アミノ酸代謝遺伝子）をコードする遺伝子または相補的遺伝子の発現を選択する培地において成長させることができる。別法では、組換え体を選択するために、温度不安定なプラスミドを、または組み換え体を選択するために、任意の他の公知の手段を使用することができる。
【０１７２】
Ｂ．細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の弱毒化
本明細書で開示する組換え菌株（例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株）を弱毒化することができる。「弱毒化」という用語は、宿主動物において疾患をもたらす細菌の能力の減退を包含する。例えば、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の病原特性は、野生型リステリアと比較して低下していてもよいが、弱毒化リステリアを、培養において成長及び維持することができる。例として、弱毒化リステリアでのＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈内接種を用いると、接種動物の５０％が生き残る致死量（ＬＤ５０）が好ましくは、野生型リステリアのＬＤ５０を超えて、少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、より好ましくは少なくとも約１，０００倍、なおより好ましくは少なくとも約１０，０００倍、及び最も好ましくは少なくとも約１００，０００倍増加する。したがって、リステリアの弱毒化株は、投与される動物を死滅させないものであるか、または投与される細菌数が同じ動物を死滅させるために必要であろう野生型非弱毒化細菌の数よりもかなり多い場合にのみ、動物を死滅させるものである。弱毒化細菌はまた、その成長に必要とされる栄養素がそこに存在しないので、一般の環境では自己複製することができないものを意味すると解釈されるべきである。したがって、細菌は、必要な栄養素が供給される制御環境での自己複製に限定される。弱毒化株は、無制御に自己複製することができないという点において、環境的に安全である。
【０１７３】
（１）細菌及びＬｉｓｔｅｒｉａ株を弱毒化する方法
弱毒化を、任意の公知の手段によって達成することができる。例えば、そのような弱毒化株は、１つもしくは複数の内因性病原性遺伝子または１つもしくは複数の内因性代謝遺伝子を欠損し得る。そのような遺伝子の例を本明細書で開示し、弱毒化を、本明細書で開示する遺伝子のいずれか１つまたは任意の組合せの不活性化によって達成することができる。例えば、欠失によって、または変異（例えば、不活性化変異）によって、不活性化を達成することができる。「変異」という用語は、配列（核酸またはアミノ酸配列）に対する任意の種類の変異または修飾を含み、欠失、短縮化、挿入、置換、分解、または転座を包含し得る。例えば、変異には、フレームシフト変異、タンパク質の中途終止をもたらす変異、または遺伝子発現に影響を及ぼす制御配列の変異が含まれ得る。組換えＤＮＡ技法を使用するか、または変異誘発薬品または放射線を使用し、その後に変異を選択する従来の変異誘発技術を使用して、変異誘発を達成することができる。復帰変異の低い確率を伴うので、欠失変異が好ましいことがある。「代謝遺伝子」という用語は、宿主細菌によって利用されるか、または必要とされる栄養素の合成に関係するか、またはそのために必要とされる酵素をコードする遺伝子を指す。例えば、酵素は、宿主細菌の持続的成長に必要とされる栄養素の合成に関係し得るか、またはそれに必要とされ得る。「病原性」遺伝子という用語は、生体のゲノムにおけるその存在または活性が生体の病原性（例えば、生体が宿主においてニッチのコロニー形成を達成することができること（細胞への結合を含む））、免疫回避（宿主の免疫応答の回避）、免疫抑制（宿主の免疫応答の阻害）、細胞への侵入及びそこからの脱出、または宿主からの栄養取得）に寄与する遺伝子を含む。
【０１７４】
そのような弱毒化株の具体的な例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。そのような弱毒化株の別の例は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１４２７９１号を参照されたい。ＬｍｄｄＡは、内因性病原性遺伝子ａｃｔＡの欠失によって弱毒化されているＬｉｓｔｅｒｉａ株に基づく。そのような株は、ｄａｌ遺伝子の相補によってｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗原発現のためのプラスミドを保持し得る。別法では、ＬｍｄｄＡは、内因性ｄａｌ、ｄａｔ、及びａｃｔＡ遺伝子に変異を有するｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡリステリアであり得る。そのような変異は、例えば、欠失または他の不活性化変異であり得る。
【０１７５】
弱毒化株の別の具体例は、Ｌｍ  ｐｒｆＡ（−）またはｐｒｆＡ遺伝子に部分的欠失または不活性化変異を有する株である。ＰｒｆＡタンパク質は、その脊椎動物宿主でコロニー形成するためにＬｍが必要とする必須病原性遺伝子を含むレギュロンの発現を制御する；したがって、ｐｒｆＡ変異は、ＰｒｆＡ依存性病原性遺伝子の発現を活性化させるＰｒｆＡの能力を著しく損なう。
【０１７６】
弱毒化株のまた別の具体的な例は、細菌の天然菌力に重要な２つの遺伝子、すなわち、インターナリンＢ及びａｃｔ  Ａが欠失しているＬｍ  ｉｎｌＢ（−）ａｃｔＡ（−）である。
【０１７７】
弱毒化細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の他の例には、１つまたは複数の内因性病原性遺伝子が欠損している細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株が含まれる。そのような遺伝子の例には、リステリアでは、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＢ、ｐｌｃＡ、ｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｉｎｌＪ、及びｂｓｈが含まれる。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はまた、上述の株のいずれかの二重変異体または三重変異体であり得る。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、遺伝子のそれぞれ１つの変異または欠失を含み得るか、または本明細書で提示する遺伝子（例えば、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、及びｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む）のいずれかの例えば最高１０の変異または欠失を含み得る。例えば、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性インターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子の変異もしくは欠失及び／または内因性ａｃｔＡ遺伝子の変異もしくは欠失を含み得る。別法では、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性インターナリンＢ（ｉｎｌＢ）遺伝子の変異もしくは欠失及び／または内因性ａｃｔＡ遺伝子の変異もしくは欠失を含み得る。別法では、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、及びａｃｔＡ遺伝子の変異または欠失を含み得る。隣接細胞へのリステリアの移行は、プロセスに関係する内因性ａｃｔＡ遺伝子及び／または内因性ｉｎｌＣ遺伝子または内因性ｉｎｌＢ遺伝子の欠失によって阻害され、それによって、株バックボーン主鎖として免疫原性及び有用性の上昇を伴う、高レベルの弱毒化が生じる。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はまた、ｐｌｃＡ及びｐｌｃＢの両方の変異または欠失を含む二重変異体であり得る。場合によっては、株を、ＥＧＤリステリアバックボーンから構築することができる。
【０１７８】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株はまた、代謝遺伝子に変異を有する栄養素要求株であり得る。一例として、株は、１つまたは複数の内因性アミノ酸代謝遺伝子を欠損し得る。例えば、Ｄ−アラニンを欠損しているリステリアの栄養素要求株の生成は例えば、欠失変異、挿入変異、フレームシフト変異、タンパク質の中途終止をもたらす変異、または遺伝子発現に影響を及ぼす制御配列の変異を含む、周知の多くの様式で達成され得る。栄養素要求表現型の復帰変異の低い確率を伴うので、欠失変異が好ましいことがある。例として、本明細書で提示するプロトコルに従って生成されるＤ−アラニンの変異を、単純な実験室培養アッセイにおいて、Ｄ−アラニンの非存在下で成長する能力について試験してもよい。この化合物の非存在下で成長し得ない変異を選択することができる。
【０１７９】
内因性アミノ酸代謝遺伝子の例には、ビタミン合成遺伝子、パントテン酸シンターゼをコードする遺伝子、Ｄ−グルタミン酸シンターゼ遺伝子、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子、Ｄ−アラニンラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子、ｄｇａ、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成に関係する遺伝子、システインシンターゼＡ（ｃｙｓＫ）、ビタミン−Ｂ１２非依存性メチオニンシンターゼの合成に関係する遺伝子、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＥ、ａｓｎＢ、ｇｌｔＤ、ｇｌｔＢ、ｌｅｕＡ、ａｒｇＧ、及びｔｈｒＣが含まれる。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、２つ以上のそのような遺伝子（例えば、ｄａｔ及びｄａｌ）を欠損し得る。Ｄ−グルタミン酸合成は部分的に、アルファ−ケトグルタラート＋Ｄ−ａｌａへのＤ−ｇｌｕ＋ｐｙｒの変換、及び逆反応に関係するｄａｌ遺伝子によって制御される。
【０１８０】
別の例として、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性シンターゼ遺伝子、例えば、アミノ酸合成遺伝子を欠損し得る。そのような遺伝子の例には、ｆｏｌＰ、ジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質をコードする遺伝子、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子、ｈｉｓＦ、ｈｉｓＨ、ｆｌｉＩ、リボソームラージサブユニットシュードウリジンシンターゼをコードする遺伝子、ｉｓｐＤ、二官能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子、ｃｏｂＳ、ｃｏｂＢ、ｃｂｉＤ、ウロポルフィリン−ＩＩＩ  Ｃ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノーゲン−ＩＩＩシンターゼをコードする遺伝子、ｃｏｂＱ、ｕｐｐＳ、ｔｒｕＢ、ｄｘｓ、ｍｖａＳ、ｄａｐＡ、ｉｓｐＧ、ｆｏｌＣ、クエン酸シンターゼをコードする遺伝子、ａｒｇＪ、３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼをコードする遺伝子、インドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼをコードする遺伝子、アントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ成分をコードする遺伝子、ｍｅｎＢ、メナキノン特異的イソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩをコードする遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼをコードする遺伝子、ｃａｒＢ、ｃａｒＡ、ｔｈｙＡ、ｍｇｓＡ、ａｒｏＢ、ｈｅｐＢ、ｒｌｕＢ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ａｌｓＳ、ｆａｂＦ、ｆａｂＨ、シュードウリジンシンターゼをコードする遺伝子、ｐｙｒＧ、ｔｒｕＡ、ｐａｂＢ、及びａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２など）が含まれる。
【０１８１】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性ｐｈｏＰ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤ、またはｐｌｃＢを欠損し得る。また別の例として、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性ペプチドトランスポーターを欠損し得る。例には、ＡＢＣトランスポーター／ＡＴＰ結合／ペルメアーゼタンパク質、オリゴペプチド  ＡＢＣトランスポーター／オリゴペプチド結合タンパク質、オリゴペプチドＡＢＣトランスポーター／ペルメアーゼタンパク質、亜鉛ＡＢＣトランスポーター／亜鉛結合タンパク質、糖ＡＢＣトランスポーター、リン酸トランスポーター、ＺＩＰ亜鉛トランスポーター、ＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬物抵抗性トランスポーター、硫酸トランスポーター、プロトン依存性オリゴペプチドトランスポーター、マグネシウムトランスポーター、ギ酸／亜硝酸トランスポーター、スペルミジン／プトレシンＡＢＣトランスポーター、Ｎａ／Ｐｉ−コトランスポーター、糖リン酸トランスポーター、グルタミンＡＢＣトランスポーター、メジャーファシリテーターファミリートランスポーター、グリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣトランスポーター、モリブデンＡＢＣトランスポーター、タイコ酸ＡＢＣトランスポーター、コバルトＡＢＣトランスポーター、アンモニウムトランスポーター、アミノ酸ＡＢＣトランスポーター、細胞分裂ＡＢＣトランスポーター、マンガンＡＢＣトランスポーター、鉄化合物ＡＢＣトランスポーター、マルトース／マルトデキストリンＡＢＣトランスポーター、Ｂｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬物抵抗性トランスポーター、及び上記タンパク質の１つのサブユニットをコードする遺伝子が含まれる。
【０１８２】
他の弱毒化細菌及びＬｉｓｔｅｒｉａ株は、細菌の成長プロセス、複製プロセス、細胞壁合成、タンパク質合成、脂肪酸の代謝に、または任意の他の成長もしくは複製プロセスに使用されるアミノ酸を代謝する内因性代謝酵素を欠損し得る。同様に、弱毒化株は、細胞壁の合成で使用されるアミノ酸の形成を触媒し得るか、細胞壁の合成で使用されるアミノ酸の合成を触媒し得るか、または細胞壁の合成で使用されるアミノ酸の合成に関係し得る内因性代謝酵素を欠損し得る。別法では、アミノ酸が、細胞壁の生合成で使用され得る。別法では、代謝酵素は、細胞壁成分であるＤ−グルタミン酸のための合成酵素である。
【０１８３】
他の弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｄ−グルタミン酸合成遺伝子、ｄｇａ、ａｌｒ（アラニンラセマーゼ）遺伝子によってコードされる代謝酵素、またはアラニン合成に関係する任意の他の酵素を欠損し得る。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が欠損し得る代謝酵素のまた他の例には、ｓｅｒＣ（ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ）、ａｓｄ（アスパラギン酸ベータセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；細胞壁成分のジアミノピメリン酸の合成に関係する）、ｇｓａＢ−グルタミン酸−１−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子（（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタノアートからの５−アミノレブリナートの形成を触媒）、ｈｅｍＬ（（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタノアートからの５−アミノレブリナートの形成を触媒）、ａｓｐＢ（Ｌ−アスパルタート及び２−オキソグルタラートからのオキサロアセタート及びＬ−グルタマートの形成を触媒するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ａｒｇＦ−１（アルギニン生合成に関係）、ａｒｏＥ（アミノ酸生合成に関係）、ａｒｏＢ（３−デヒドロキナート生合成に関係）、ａｒｏＤ（アミノ酸生合成に関係）、ａｒｏＣ（アミノ酸生合成に関係）、ｈｉｓＢ（ヒスチジン生合成に関係）、ｈｉｓＤ（ヒスチジン生合成に関係）、ｈｉｓＧ（ヒスチジン生合成に関係）、ｍｅｔＸ（メチオニン生合成に関係）、ｐｒｏＢ（プロリン生合成に関係）、ａｒｇＲ（アルギニン生合成に関係）、ａｒｇＪ（アルギニン生合成に関係）、ｔｈｉｌ（チアミン生合成に関係）、ＬＭＯｆ２３６５＿１６５２（トリプトファン生合成に関係）、ａｒｏＡ（トリプトファン生合成に関係）、ｉｌｖＤ（バリン及びイソロイシン生合成に関係）、ｉｌｖＣ（バリン及びイソロイシン生合成に関係）、ｌｅｕＡ（ロイシン生合成に関係）、ｄａｐＦ（リシン生合成に関係）、及びｔｈｒＢ（トレオニン生合成に関係）（すべてＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２９７３）によってコードされる酵素が含まれる。
【０１８４】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、他の代謝酵素、例えば、ｔＲＮＡシンテターゼの変異によって生成され得る。例えば、代謝酵素は、トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼをコードするｔｒｐＳ遺伝子によってコードされ得る。例えば、宿主株細菌は、Δ（ｔｒｐＳ  ａｒｏＡ）であり得、両方のマーカーが、組み込みベクターに含まれ得る。
【０１８５】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を生成するために変異させることができる代謝酵素の他の例には、ｍｕｒＥ（ジアミノピメリン酸の合成に関係；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３４８５）、ＬＭＯｆ２３６５＿２４９４（テイコ酸生合成に関係）、ＷｅｃＥ（リポ多糖生合成タンパク質ｒｆｆＡ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ０１４０７５．１）、またはａｍｉＡ（Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ）によってコードされる酵素が含まれる。代謝酵素のまた他の例には、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ヒスチジノール−リン酸アミノトランスフェラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿４６６３４７）、または細胞壁テイコ酸グリコシル化タンパク質ＧｔｃＡが含まれる。
【０１８６】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を生成するために変異させることができる代謝酵素の他の例には、ペプチドグリカン成分または前駆体のための合成酵素が含まれる。成分は、例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチド、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＭｕｒＮＡｃ−（ペンタペプチド）−ピロホスホリル−ウンデカプレノール、ＧｌｃＮＡｃ−ｐ−（１，４）−ＭｕｒＮＡｃ−（ペンタペプチド）−ピロホスホリルウンデカプレノール、または任意の他のペプチドグリカン成分もしくは前駆体であり得る。
【０１８７】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を生成するために変異させることができる代謝酵素のまた他の例には、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＤ、ｍｕｒＡ−１、またはｍｕｒＡ−２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２９７３にすべて記載）によってコードされる代謝酵素が含まれる。別法では、代謝酵素は、ペプチドグリカン成分または前駆体のための任意の他の合成酵素であり得る。代謝酵素はまた、ｔｒａｎｓ−グリコシラーゼ、ｔｒａｎｓ−ぺプチダーゼ、カルボキシ−ぺプチダーゼ、任意の他のクラスの代謝酵素、または任意の他の代謝酵素であり得る。例えば、代謝酵素は、任意の他のリステリア代謝酵素または任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ代謝酵素であり得る。
【０１８８】
他の菌株は、リステリアについて上記したとおり、他の菌株における対応するオルソロガスな遺伝子を変異させることによって弱毒化させることができる。
【０１８９】
（２）弱毒化細菌及びＬｉｓｔｅｒｉａ株を相補する方法
本明細書で開示する弱毒化細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株はさらに、弱毒化変異を相補する（例えば、栄養素要求Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の栄養素要求性を相補する）相補的遺伝子を含むか、または代謝酵素をコードする核酸を含み得る。例えば、本明細書に開示のとおりの融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを有する核酸はさらに、相補的遺伝子を含むか、または相補的代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含むことができる。別法では、第１の核酸が、融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードし得、かつ別の第２の核酸が、相補的遺伝子を含むか、または相補的代謝酵素をコードし得る。
【０１９０】
相補的遺伝子は、染色体外であり得るか、または細菌またはリステリアゲノムに組み込まれ得る。例えば、栄養素要求Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、代謝酵素をコードする核酸を含むエピソームプラスミドを含み得る。そのようなプラスミドは、エピソームまたは染色体外の様式でリステリアに含まれるであろう。別法では、栄養素要求Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、代謝酵素をコードする核酸を含む組み込みプラスミド（すなわち、組み込みベクター）を含み得る。そのような組み込みプラスミドを、リステリア染色体に組み込むために使用することができる。好ましくは、エピソームプラスミドまたは組み込みプラスミドは、抗生物質抵抗性マーカーを欠如している。
【０１９１】
抗生物質抵抗性遺伝子の代わりに、またはそれに加えて、代謝遺伝子を選択のために使用することができる。例として、本明細書で提供する代謝酵素または相補的遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養素要求細菌を選択するために、形質転換された栄養素要求細菌を、代謝酵素（例えば、アミノ酸代謝遺伝子）または相補的遺伝子をコードする遺伝子の発現を選択する培地中で成長させることができる。例えば、Ｄ−グルタミン酸合成について栄養素要求性である細菌をＤ−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドで形質転換することができ、その栄養素要求細菌はＤ−グルタミン酸の非存在下で成長するが、プラスミドで形質転換されていないか、またはＤ−グルタミン酸合成のためのタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養素要求細菌は成長しない。同様に、Ｄ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする核酸を含むプラスミドで形質転換され、それを発現する場合、Ｄ−アラニン合成について栄養素要求性である細菌はＤ−アラニンの非存在下で成長する。必須の成長因子、サプリメント、アミノ酸、ビタミン、抗生物質などを含むか、または含まない適切な培地を作製するためのそのような方法は周知であり、商業的に利用可能である。
【０１９２】
本明細書で提供する代謝酵素または相補的遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養素要求細菌が適切な培地中で選択されたら、その細菌を選択的圧力の存在下で成長させることができる。そのような成長は、栄養素要求因子を含まない培地中で細菌を成長させることを含み得る。栄養素要求細菌における代謝酵素または相補的遺伝子を発現するプラスミドの存在は、プラスミドが細菌と共に自己複製し、したがって、プラスミドを持つ細菌を継続的に選択することを保証する。プラスミドを含む栄養素要求細菌が成長している培地の体積を調節することによって、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の生成を容易に規模拡大することができる。
【０１９３】
具体的な一例では、弱毒化株は、ｉｎｄａｌ及びｄａｔの欠失またはそこに不活性化変異を有する株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）またはＬｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ））であり、相補的遺伝子は、アラニンラセマーゼ酵素（例えば、ｄａｌ遺伝子によってコードされる）またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素（例えば、ｄａｔ遺伝子によってコードされる）をコードする。例示的なアラニンラセマーゼタンパク質は、配列番号７６に記載の配列（配列番号７８によってコードされる；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３８４３８）を有し得るか、または配列番号７６のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、またはアイソフォームの断片であり得る。アラニンラセマーゼタンパク質はまた、任意の他のリステリアアラニンラセマーゼタンパク質であり得る。別法では、アラニンラセマーゼタンパク質は、任意の他のグラム陽性アラニンラセマーゼタンパク質または任意の他のアラニンラセマーゼタンパク質であり得る。例示的なＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号７７に記載の配列（配列番号７９によってコードされる；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３８４３９）を有し得るか、または配列番号７７のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、またはアイソフォームの断片であり得る。Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質はまた、任意の他のリステリアＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質であり得る。別法では、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質は、任意の他のグラム陽性Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質または任意の他のＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質であり得る。
【０１９４】
別の具体例では、弱毒化株は、ｐｒｆＡの欠失またはそこにおける不活性化変異を有する株（例えば、Ｌｍ  ｐｒｆＡ（−））であり、相補的遺伝子は、ＰｒｆＡタンパク質をコードする。例えば、相補的遺伝子は、部分的なＰｒｆＡ機能を再生する変異ＰｒｆＡ（Ｄ１３３Ｖ）タンパク質をコードし得る。野生型ＰｒｆＡタンパク質の例は、配列番号８０に記載されており（配列番号８１に記載の核酸によってコードされる）、Ｄ１３３Ｖ変異ＰｒｆＡタンパク質の例は、配列番号８２に記載されている（配列番号８３に記載の核酸によってコードされる）。相補的ＰｒｆＡタンパク質は、配列番号８０または８２のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、またはアイソフォームの断片であり得る。ＰｒｆＡタンパク質はまた、任意の他のリステリアＰｒｆＡタンパク質であり得る。別法では、ＰｒｆＡタンパク質は、任意の他のグラム陽性ＰｒｆＡタンパク質または任意の他のＰｒｆＡタンパク質であり得る。
【０１９５】
別の例では、菌株またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、ａｃｔＡ遺伝子の欠失またはそこに不活性化変異を含み得、相補的遺伝子は、変異を相補し、かつＬｉｓｔｅｒｉａ株の機能を再生するａｃｔＡ遺伝子を含み得る。
【０１９６】
他の栄養素要求株及び相補系を、本明細書で提供する方法及び組成物と共に使用するために採用することもできる。
【０１９７】
Ｃ．細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の調製及び貯蔵
組換え菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）は任意選択で、動物宿主によって継代されている。そのような継代は、ワクチンベクターとしてのＬｉｓｔｅｒｉａ株の有効性を最大化し得るか、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の免疫原性を安定化し得るか、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の菌力を安定化し得るか、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の免疫原性を上昇させ得るか、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の菌力を上昇させ得るか、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の不安定な亜系を除去し得るか、またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の不安定な亜系の有病率を低下させ得る。動物宿主によって組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を継代させるための方法は当技術分野で周知であり、例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０２３３８３５に記載されている。
【０１９８】
組換え菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）を、凍結細胞バンクで貯蔵することができるか、または凍結乾燥細胞バンクで貯蔵することができる。そのような細胞バンクは、例えば、マスター細胞バンク、ワーキング細胞バンク、または適性製造基準（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ；ＧＭＰ）細胞バンクであり得る。「適性製造基準」の例には、米国連邦規則集の２１  ＣＦＲ  ２１０−２１１によって定義されているものが含まれる。しかしながら、「適性製造基準」はまた、臨床グレードの物質を生成するための、またはヒトによる消費のための他の基準、例えば、米国以外の国の基準によって定義され得る。そのような細胞バンクは、臨床グレードの物質を生成するために意図され得るか、またはヒトで使用するための規制慣行に合致し得る。
【０１９９】
組換え菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）はまた、ワクチン投与のバッチから、凍結ストックから、または凍結乾燥ストックからであり得る。
【０２００】
そのような細胞バンク、凍結ストック、またはワクチン投与のバッチは、例えば、解凍すると９０％超の生存率を示し得る。解凍は、例えば、凍結保存または凍結貯蔵では２４時間にわたる貯蔵の後であり得る。別法では、貯蔵は、例えば、２日間、３日間、４日間、１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、５カ月、６カ月、９カ月、または１年にわたって続き得る。
【０２０１】
細胞バンク、凍結ストック、またはワクチン投与のバッチを、例えば、栄養素培地中で菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）の培養物を成長させること、グリセロールを含む溶液中で培養物を凍結させること、及び−２０℃未満でＬｉｓｔｅｒｉａ株を貯蔵することを含む方法によって凍結保存することができる。温度は、例えば、約−７０℃または約−７０から約−８０℃の間であり得る。別法では、細胞バンク、凍結ストック、またはワクチン投与のバッチを、規定培地中でＬｉｓｔｅｒｉａ株の培養物を成長させること、グリセロールを含む溶液中で培養物を凍結させること、及び−２０℃未満でＬｉｓｔｅｒｉａ株を貯蔵することを含む方法によって凍結保存することができる。温度は、例えば、約−７０℃または約−７０から約−８０℃の間であり得る。任意の規定の微生物培地をこの方法で使用してもよい。
【０２０２】
培養物（例えば、リステリアワクチン投与のバッチを生成するために使用されるリステリアワクチン株の培養物）に、例えば、細胞バンクから、凍結ストックから、種培養から、またはコロニーから接種することができる。培養物に、例えば、対数中期成長相で、ほぼ対数中期成長相で、または別の成長相で接種することができる。
【０２０３】
凍結のために使用される溶液は任意選択で、別の総括的添加剤、またはグリセロールの代わりに、もしくはグリセロールに加えて、抗凍結特性を有する添加剤を含有する。そのような添加剤の例には、例えば、マンニトール、ＤＭＳＯ、スクロース、または任意の他の総括的添加剤または抗凍結特性を有する添加剤が含まれる。
【０２０４】
菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）の培養物を成長させるために利用される栄養培地は、任意の適切な栄養培地であり得る。適切な培地の例には、例えば、ＬＢ；ＴＢ；改変動物産物非含有テリフィックブロス；または規定培地が含まれる。
【０２０５】
成長のステップは、細菌を成長させる任意の公知の手段によって行うことができる。例えば、成長のステップを、振盪フラスコ（例えば、バッフル付き振盪フラスコ）、バッチ発酵槽、撹拌タンクまたはフラスコ、エアリフト発酵槽、供給バッチ、連続細胞反応器、固定細胞反応器、または細菌を成長させる任意の他の手段で行うことができる。
【０２０６】
任意選択で、一定のｐＨを、培養物の成長中に維持する（例えば、バッチ発酵槽で）。例えば、ｐＨを、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、または約８．０で維持することができる。同様に、ｐＨは、例えば、約６．５〜約７．５、約６．０〜約８．０、約６．０〜約７．０、約６．０〜約７．０、または約６．５〜約７．５であり得る。
【０２０７】
任意選択で、一定温度を培養物の成長中に維持することができる。例えば、温度を、約３７℃または３７℃に維持することができる。別法では、温度を２５℃、２７℃、２８℃、３０℃、３２℃、３４℃、３５℃、３６℃、３８℃、または３９℃に維持することができる。
【０２０８】
任意選択で、一定の溶解酸素濃度を培養物の成長中に維持することができる。例えば、溶解酸素濃度を、飽和の２０％、飽和の１５％、飽和の１６％、飽和の１８％、飽和の２２％、飽和の２５％、飽和の３０％、飽和の３５％、飽和の４０％、飽和の４５％、飽和の５０％、飽和の５５％、飽和の６０％、飽和の６５％、飽和の７０％、飽和の７５％、飽和の８０％、飽和の８５％、飽和の９０％、飽和の９５％、飽和の１００％、または飽和の１００％近くに維持することができる。
【０２０９】
組換え菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）を凍結乾燥及び凍結保存するための方法は公知である。例えば、リステリア培養物を液体窒素でフラッシュ凍結し、続いて、最終凍結温度で貯蔵することができる。別法では、培養物を、より段階的な手法で（例えば、培養物のバイアルを最終貯蔵温度に置くことによって）凍結させることができる。培養物をまた、細菌培養物を凍結するための任意の他の公知の方法によって凍結させることができる。
【０２１０】
培養物の貯蔵温度は、例えば、−２０から−８０℃の間であり得る。例えば、温度は、−２０℃をかなり下回るか、または−７０℃よりも温かくなければよい。別法では、温度は、約−７０℃、−２０℃、−３０℃、−４０℃、−５０℃、−６０℃、−８０℃、−３０〜−７０℃、−４０〜−７０℃、−５０〜−７０℃、−６０〜−７０℃、−３０〜−８０℃、−４０〜−８０℃、−５０〜−８０℃、−６０〜−８０℃、または−７０〜−８０℃であり得る。別法では、温度は、７０℃より低いか、または−８０℃より低くあり得る。
【０２１１】
Ｖ．免疫原性組成物、医薬組成物、及びワクチン
本明細書に開示のとおりの組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、本明細書に開示のとおりの組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、または本明細書に開示のとおりの組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンも提供する。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株をそれが含むことによって、生来的に免疫原性であり得る、及び／または組成物はまたさらに、アジュバントを含み得る。他の免疫原性組成物は、ＤＮＡ免疫療法薬またはペプチド免疫療法組成物を含む。
【０２１２】
「免疫原性組成物」という用語は、その組成物に曝露すると、対象において、抗原に対する免疫応答を誘発する抗原を含有する任意の組成物を指す。免疫原性組成物によって誘発される免疫応答は、特定の抗原に対するもの、または抗原上の特定のエピトープに対するものであり得る。
【０２１３】
免疫原性組成物は、本明細書に開示のとおりの単一の組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、本明細書に開示のとおりの組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、または本明細書に開示のとおりの組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含み得るか、または本明細書に開示のとおりの多数の異なる組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、本明細書に開示のとおりの組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、または本明細書に開示のとおりの組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含み得る。例えば、第２の組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドが含まない１つの抗原性ペプチドを含む場合、第１の組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、第２の組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドとは異なる。２つの組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドは、いくつかの同じ抗原性ペプチドを含んでもよく、それでも、異なるものと考えられる。そのような異なる組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸、または組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を対象に同時に、または対象に連続して投与することができる。本明細書で開示する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株（あるいは組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドまたは核酸）を含む薬物物質が異なる剤形である場合（例えば、一方の薬剤が錠剤またはカプセル剤であり、他方の薬剤が滅菌液剤である）、及び／または異なる投与スケジュールで投与される場合（例えば、混合物からの一方の組成物が少なくとも毎日投与され、他方がより低い頻度で、例えば、週１回、２週毎に１回、または３週毎に１回投与される）、連続投与は特に有用であり得る。多数の組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸、または組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株はそれぞれ、異なるセットの抗原性ペプチドを含むことができる。別法では、２種以上の組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸、または組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、同じセットの抗原性ペプチドを含み得る（例えば、異なる順序で同じセットの抗原性ペプチド）。
【０２１４】
免疫原性組成物は追加的に、アジュバント（例えば、２種以上のアジュバント）、サイトカイン、ケモカイン、またはその組み合わせを含み得る。任意選択で、免疫原性組成物は追加的に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含み得、その抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、対象にとって自己由来であり得るか、または同種であり得る。
【０２１５】
アジュバントという用語は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を含む。例えば、アジュバントは、免疫応答の非特異的刺激物質または本明細書で開示する免疫原性組成物と組み合わされた場合にさらに大きな増強された、及び／または長時間の免疫応答をもたらすデポの生成を対象において可能にする物質であり得る。アジュバントは、例えば、主にＴｈ１媒介性免疫応答、Ｔｈ１型免疫応答、またはＴｈ１媒介性免疫応答を促進し得る。同様に、アジュバントは、抗体媒介性応答よりも、細胞媒介性免疫応答を促進し得る。別法では、アジュバントは、抗体媒介性応答を促進し得る。一部のアジュバントは、抗原をゆっくり放出することによって、免疫応答を増強し得るが、他のアジュバントは、次の機構のいずれかによってそれらの作用を媒介し得る：細胞浸潤、炎症、及び注射部位、特に抗原提示細胞（ＡＰＣ）への輸送を増加させること；共刺激シグナルもしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）発現を上方制御することによってＡＰＣの活性化状態を促進すること；抗原提示を増強すること；または間接的な作用のためにサイトカイン放出を誘導すること。
【０２１６】
アジュバントの例には、サポニンＱＳ２１、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＭＰＬ、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（登録商標）、イミキモド、サイトカインまたはそれをコードする核酸、ケモカインまたはそれをコードする核酸、ＩＬ−１２またはそれをコードする核酸、ＩＬ−６またはそれをコードする核酸、及びリポ多糖が含まれる。適切なアジュバントの別の例は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１である。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１は、天然の代謝可能な油及び精製乳化剤を含有する。適切なアジュバントの他の例には、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはそれをコードする核酸及びキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質またはそれをコードする核酸が含まれる。ＧＭ−ＣＳＦは、例えば、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ベクター中で成長させたヒトタンパク質であり得る。ＧＭ−ＣＳＦは、造血前駆細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞、及びＴ細胞のクローン展開及び分化を促進する。適切なアジュバントのまた別の例は、解毒リステリオリシンＯ（ｄｔＬＬＯ）タンパク質である。アジュバントとして使用するために適したｄｔＬＬＯの一例は、配列番号１４９によってコードされる。配列番号１４９に対して少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な配列によってコードされるｄｔＬＬＯも、アジュバントとして使用するために適している。アジュバントのまた他の例には、成長因子またはそれをコードする核酸、細胞集団、フロイント不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、ミョウバン、インターロイキンまたはそれをコードする核酸、クイルグリコシド（ｑｕｉｌｌ  ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）、モノホスホリルリピドＡ、リポソーム、細菌マイトジェン、細菌毒素、または公知のアジュバントの任意の他の種類が含まれる（例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄ．（Ａｕｇｕｓｔ  ２００３）：  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．Ｐａｕｌ（Ｅｄｉｔｏｒ）；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ４３：  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＧＪＶ  Ｎｏｓｓａｌを参照されたい）。
【０２１７】
免疫原性組成物はさらに、１つまたは複数の免疫調節分子を含み得る。例には、インターフェロンガンマ、サイトカイン、ケモカイン、及びＴ細胞刺激薬が含まれる。
【０２１８】
免疫原性組成物は、ワクチンまたは医薬組成物の形態であり得る。「ワクチン」及び「医薬組成物」という用語は互換的であり、対象にｉｎ  ｖｉｖｏ投与するために薬学的に許容される担体中の免疫原性組成物を指す。ワクチンは、例えば、ペプチドワクチン（例えば、本明細書に開示のとおりの組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドを含む）、ＤＮＡワクチン（例えば、本明細書に開示のとおりの組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸を含む）、または細胞内に含まれ、細胞によって送達されるワクチン（例えば、本明細書に開示のとおりの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ）であってもよい。ワクチンは、対象が疾患または状態に罹患する、またはそれを発症することを予防し得る、及び／またはワクチンは、疾患または状態を有する対象に対して治療的であり得る。ペプチドワクチンを調製する方法は周知であり、例えば、それぞれあらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる欧州特許第１４０８０４８号、米国特許出願公開第２００７／０１５４９５３号、及びＯｇａｓａｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：８９９５−８９９９に記載されている。任意選択で、ペプチド生成技法を使用して、より高度な免疫原性を有する抗原を作製することができる。ペプチド生成のための技法は周知であり、例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，７７３，９００号に記載されている。
【０２１９】
「薬学的に許容される担体」は、重大な有害作用を伴うことなく、及び免疫原性組成物に対して有害作用を伴うことなく、対象に導入することができる、免疫原性組成物を含有するためのビヒクルを指す。すなわち、「薬学的に許容される」は、安全であり、かつ本明細書で開示する方法で使用するための少なくとも１つの免疫原性組成物の有効量の所望の投与経路のために、適切な送達をもたらす任意の製剤を指す。薬学的に許容される担体またはビヒクルまたは添加剤は周知である。適切な薬学的に許容される担体、及びその選択に関係する因子は、様々な容易に利用可能な情報源、例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  ｅｄ．、１９９０などにおいて見い出される。そのような担体は、任意の投与経路（例えば、非経口、腸内（例えば、経口）、または局所適用）に適し得る。そのような医薬組成物を緩衝することができ、例えば、ｐＨを、免疫原性組成物及び投与経路の安定性に従って、ｐＨ４．０〜ｐＨ９．０の範囲の特定の所望の値に維持する。
【０２２０】
適切な薬学的に許容される担体には、例えば、滅菌水、塩溶液、例えば、生理食塩水、グルコース、緩衝溶液、例えば、リン酸緩衝液または炭酸水素緩衝液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロースまたはデンプン）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘稠性パラフィン、白色パラフィン、グリセロール、アルギナート、ヒアルロン酸、コラーゲン、香油、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれる。医薬組成物またはワクチンは、例えば、免疫原性組成物と有害に反応することのない希釈剤、安定剤（例えば、糖及びアミノ酸）、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、粘度増加添加剤、滑沢剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、ビタミン、着色剤、香味剤、芳香物質などを含む補助剤を含んでもよい。
【０２２１】
液体製剤では、例えば、薬学的に許容される担体は、水性または非水性溶液、懸濁液、エマルジョン、または油であってもよい。非水性溶媒には、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及び注射用有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが含まれる。水性担体には、例えば、生理食塩水及び緩衝培地を含む、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれる。油の例には、石油、動物、植物性、または合成由来のもの、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、オリブ油、ヒマワリ油、及び魚肝油が含まれる。固体担体／希釈剤には、例えば、ゴム、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、事前ゲル化（ｐｒｅｇｅｌｅｔａｎｉｚｅｄ）デンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース、またはデキストロース）、セルロース系物質（例えば、微結晶性セルロース）、アクリラート（例えば、ポリメチルアクリラート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはその混合物が含まれる。
【０２２２】
任意選択で、持続性または指向性放出医薬組成物またはワクチンを製剤化することができる。これは、例えば、活性化合物が（例えば、マイクロカプセル化、多重コーティングなどによって）段階的分解性コーティングで保護されているリポソームまたは組成物の使用によって達成することができる。そのような組成物を、即時または遅効放出のために製剤化してもよい。組成物を凍結乾燥させ、得られた凍結乾燥物を（例えば、注射用の製品を調製するために）使用することも可能である。
【０２２３】
本明細書で開示する免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンはまた、がんを予防または処置する際に有効な１つまたは複数の追加の化合物を含んでもよい。例えば、追加の化合物は、化学療法において有用な化合物、例えば、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロフォスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、グリアデルインプラント、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル（タキソール）、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはその組み合わせを含んでもよい。追加の化合物はまた、ＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、またはＥＧＦ受容体に対する抗体、例えばＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）、及びＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）を含む他の生物製剤を含み得る。追加の化合物はまた、例えば、追加の免疫療法を含み得る。
【０２２４】
追加の化合物はまた、免疫チェックポイント阻害因子アンタゴニスト、例えば、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害因子、ＣＤ−８０／８６及びＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路阻害因子、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）シグナル伝達経路阻害因子、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）シグナル伝達経路阻害因子、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）シグナル伝達経路阻害因子、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）シグナル伝達経路阻害因子、ＣＤ４０シグナル伝達経路阻害因子、または任意の他の抗原提示細胞／Ｔ細胞シグナル伝達経路阻害因子を含み得る。免疫チェックポイント阻害因子アンタゴニストの例には、抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体またはその断片、抗ＰＤ−１抗体またはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体またはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体またはその断片が含まれる。追加の化合物はまた、Ｔ細胞刺激薬、例えば、Ｔ細胞受容体共刺激分子に結合する抗体またはその機能性断片、抗原提示細胞受容体結合共刺激分子、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーを含み得る。Ｔ細胞受容体共刺激分子は、例えば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳを含み得る。抗原提示細胞受容体結合共刺激分子は、例えば、ＣＤ８０受容体、ＣＤ８６受容体、またはＣＤ４６受容体を含み得る。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、例えば、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）、またはＴＮＦＲ２５を含み得る。例えば、それぞれあらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６１００９２９、ＷＯ２０１６０１１３６２、及びＷＯ２０１６０１１３５７を参照されたい。
【０２２５】
ＶＩ．治療方法
本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、及びワクチンを様々な方法で使用することができる。例えば、これらを、対象において抗ＷＴ１免疫応答を誘導もしくは増強する方法、対象において抗ＷＴ１発現腫瘍もしくは抗ＷＴ１発現がん免疫応答を誘導もしくは増強する方法、対象において腫瘍もしくはがんを処置する方法、対象において腫瘍もしくはがんを予防する方法、または腫瘍もしくはがんに対して対象を保護する方法で使用することができる。これらをまた、対象の脾臓及び腫瘍において制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＴエフェクター細胞の比を増加させる方法において使用することができ、その際、Ｔエフェクター細胞は、ＷＴ１抗原に向けられる。これらはまた、対象においてＷＴ１Ｔ細胞を増加させる、腫瘍もしくはがんを有する対象の生存時間を増加させる、対象においてがんの発生を遅延させる、または対象において腫瘍もしくは転移のサイズを縮小させる方法において使用することができる。
【０２２６】
対象において抗ウィルムス腫瘍タンパク質免疫応答を誘導する方法は、例えば、本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチン（例えば、本明細書の他の箇所で開示する組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドまたは組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸を含む）を対象に投与することを含み得る。それによって、抗ウィルムス腫瘍タンパク質免疫応答が、対象において誘導され得る。例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドを発現し、それによって、対象において免疫応答を誘導し得る。免疫応答は、例えば、Ｔ細胞応答、例えば、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含み得る。そのような方法はまた、対象の脾臓及び腫瘍微小環境において、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対するＴエフェクター細胞の比を増加させて、対象におけるより顕著な抗腫瘍応答を可能にし得る。
【０２２７】
対象において抗ＷＴ１発現腫瘍または抗ＷＴ１発現がん免疫応答を誘導する方法は、例えば、本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを対象に投与することを含み得る。それによって、抗腫瘍または抗がん免疫応答が対象において誘導され得る。例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドを発現し、それによって、対象において抗腫瘍または抗がん応答を誘導し得る。
【０２２８】
対象において腫瘍またはがんを処置する方法（例えば、その際、腫瘍またはがんはウィルムス腫瘍タンパク質を発現する）は、例えば、本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを対象に投与することを含み得る。次いで、対象は、ウィルムス腫瘍タンパク質を発現する腫瘍またはがんに対する免疫応答を開始し、それによって、対象において腫瘍またはがんを処置し得る。
【０２２９】
対象において腫瘍もしくはがんを予防する、または腫瘍もしくはがんの発生に対して対象を防御する方法（例えば、この際、腫瘍またはがんは、ウィルムス腫瘍タンパク質の発現と関連する）は、例えば、本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを対象に投与することを含み得る。次いで、対象は、ウィルムス腫瘍タンパク質に対する免疫応答を開始し、それによって、腫瘍もしくはがんを予防する、または腫瘍もしくはがんの発生に対して対象を防御し得る。
【０２３０】
上記の方法の一部では、２つ以上の組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを投与する。複数の組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを連続的に任意の順序で、または組み合わせで投与することができるか、または同時に任意の組み合わせで投与することができる。例として、４つの異なるＬｉｓｔｅｒｉａ株を投与する場合、それらを連続して投与することができるか、同時に投与することができるか、または任意の組合せで投与することができる（例えば、第１及び第２の株を同時に投与し、続いて、第３及び第４の株を同時に投与する）。任意選択で、連続投与の場合、組成物を同じ免疫応答中に、好ましくは相互に０〜１０または３〜７日以内に投与することができる。複数の組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンはそれぞれ、抗原性ペプチドの異なるセットを含み得る。別法では、２つ以上が、抗原性ペプチドの同じセットを含み得る（例えば、同じセットの抗原性ペプチドを異なる順序で）。
【０２３１】
がんは、未制御の細胞成長及び増殖によって典型的に特徴づけられる、哺乳類における生理学的状態である。ＷＴ１発現を発現するか、またはそれと関連する任意のがんまたは前悪性状態が、本明細書で開示する治療または予防方法の対象であり得る（すなわち、任意の血液学的または固形腫瘍悪性病変、さらに、任意の前悪性形成異常組織または状態）。がんは、造血性悪性病変または固形腫瘍（すなわち、前癌性病変を含む、過剰な細胞成長または増殖から生じる細胞の塊）であり得る。転移癌は、身体において、初めに始まった場所から別の場所へと展開しているがんを指す。転移癌細胞によって形成される腫瘍は、転移性腫瘍または転移と呼ばれ、これは、がん細胞が身体の他の部分に展開するプロセスを指すために使用される用語でもある。一般に、転移癌は、元の、または原発癌と、がん細胞の同じ名称及び同じ種類を有する。固形腫瘍の例には、黒色腫、癌腫、芽細胞腫、及び肉腫が含まれる。血液悪性病変には、例えば、白血病またはリンパ悪性病変、例えば、リンパ腫が含まれる。がんの例示的な分類には、脳、乳房、胃腸、尿生殖器、婦人科、頭頚部、血液（ｈｅｍｅ）、皮膚及び胸部が含まれる。脳悪性病変には、例えば、神経膠芽細胞腫、高位（ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ）橋部膠腫、低位膠腫、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫、及び毛様細胞性神経膠星状細胞腫が含まれる。胃腸癌には、例えば、結腸直腸癌、胆嚢癌、肝細胞癌、膵臓癌、ＰＮＥＴ、胃癌、及び食道癌が含まれる。尿生殖器癌には、例えば、副腎皮質癌、膀胱癌、腎臓色素嫌性癌、腎臓（明細胞）癌、腎臓（乳頭状）癌、横紋筋肉腫様癌、及び前立腺癌が含まれる。婦人科癌には、例えば、子宮癌肉腫、子宮内膜癌、漿液性卵巣癌、及び子宮頸部癌が含まれる。頭頚部癌には、例えば、甲状腺癌、鼻咽頭癌、頭頚部癌、及び腺様嚢胞癌が含まれる。血液がんには、例えば、多発性骨髄腫、骨髄異形成、外套細胞リンパ腫、急性リンパ芽急性白血病（ＡＬＬ）、非リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が含まれる。皮膚癌には、例えば、皮膚黒色腫及び扁平上皮細胞癌が含まれる。胸部癌には、例えば、扁平上皮肺癌、小細胞肺癌、及び肺腺癌が含まれる。
【０２３２】
そのようながんのより具体的な例には、扁平上皮細胞癌または癌腫（例えば、口腔扁平上皮細胞癌腫）、骨髄腫、口腔癌、若年性鼻咽頭血管線維腫、神経内分泌腫瘍、肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃ）または胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵臓癌、膠腫、神経膠芽細胞腫、グリア腫瘍、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、肝細胞癌、乳癌、三種陰性乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌または癌腫、唾液腺癌腫、腎臓または腎癌（例えば、腎細胞癌）、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、線維肉腫、胆嚢癌、骨肉腫、中皮腫、さらには頭頚部癌が含まれる。がんはまた、脳癌または別の種類のＣＮＳもしくは頭蓋内腫瘍であり得る。例えば、対象は、神経膠星状腫瘍（例えば、神経膠星状細胞腫、未分化神経膠星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、毛様細胞性神経膠星状細胞腫、上衣下巨細胞神経膠星状細胞腫、多形黄色神経膠星状細胞腫）、乏突起膠腫瘍（例えば、乏突起神経膠腫、未分化乏突起神経膠腫）、上衣細胞腫瘍（例えば、脳室上衣細胞腫、未分化脳室上衣細胞腫、粘液乳頭状上衣腫、上衣下細胞腫）、混合膠腫（例えば、混合乏突起星細胞腫、未分化乏突起星細胞腫）、起源不明の神経上皮腫瘍（例えば、極性海綿芽細胞腫、星状芽細胞腫、脳神経膠腫症）、脈絡叢の腫瘍（例えば、脈絡叢乳頭腫、脈絡叢癌）、ニューロンまたは混合ニューロン−膠腫瘍（例えば、神経節嚢胞腫、小脳異形成性神経節細胞腫、神経節膠腫、未分化神経節膠腫、硬線維性乳児神経節腫、中枢性神経細胞腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、嗅神経芽芽細胞腫）、松果体実質腫瘍（例えば、松果体腫、松果体芽細胞腫、混合松果体腫／松果体芽細胞腫）、または混合された神経芽細胞または膠芽細胞要素を有する腫瘍（例えば、髄様上皮腫、髄芽細胞腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、上衣芽細胞種）を有し得る。
【０２３３】
ウィルムス腫瘍タンパク質の発現と関連していることが公知のがんの種類のいくつかの具体的な例には、ウィルムス腫瘍（小児腎芽細胞腫）、乳癌、例えば、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）及び胃腸癌、例えば、食道癌、胃癌（ｓｔｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、結腸直腸癌、肛門癌、及び胃腸類癌腫が含まれる。三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、またはＨｅｒ２／ｎｅｕのための遺伝子を発現しない任意の乳癌を指す。ＷＴ１を発現し得るがんの他の例には、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、ＭＤＳと関連するがん、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、白血病、血液学的癌、リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、中皮腫、悪性中皮腫、胃癌、結腸癌、肺癌、乳癌、生殖細胞腫瘍、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、肝細胞癌腫、肝臓癌、腎臓癌、カポジ肉腫、または任意の他の癌腫または肉腫が含まれる。ＷＴ１を発現するがんは、固形腫瘍、例えば、ＭＤＳと関連する固形腫瘍、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、卵巣癌、腎臓癌、膵臓癌、脳癌、胃腸癌、皮膚癌、または黒色腫であり得る。
【０２３４】
「処置する」または「処置すること」という用語は、その目的が標的腫瘍またはがんを予防する、または縮小することである、治療的処置及び予防または防止的手段の両方を指す。処置することには、直接的に影響を及ぼす、もしくは治癒させること、抑制すること、阻害すること、予防すること、その重症度を低下させること、その発症を遅延させること、その進行を減速させること、その進行を安定化すること、その寛解を誘導すること、その転移を予防する、もしくは遅延させること、腫瘍もしくはがんに関連する症状を軽減／寛解すること、またはそれらの組合せのうちの１つもしくは複数が含まれ得る。例えば、処置することには、予測生存時間を増加させること、または腫瘍もしくは転移サイズを縮小させることが含まれ得る。効果（例えば、抑制すること、阻害すること、予防すること、その重症度を低下させること、その発症を遅延させること、その進行を減速させること、その進行を安定化すること、その寛解を誘導すること、その転移を予防する、もしくは遅延させること、その症状を軽減／寛解することなどは、処置を受けていない、またはプラセボ処置を受けている対照の対象に対してであり得る。用語「処置する」または「処置すること」はまた、腫瘍またはがんを有する対象での生存の可能性のパーセントを上昇させること、または予測生存時間を増加させることを指し得る（例えば、処置を受けていない、またはプラセボ処置を受けている対照の対象に対して）。一例では、「処置すること」は、進行を遅延させること、寛解を促進すること、寛解を誘導すること、寛解を増強すること、回復のスピードを上昇させること、代替治療薬の有効性を上昇させること、代替治療薬に対する抵抗性を低下させること、またはその組み合わせを指す（例えば、処置を受けていない、またはプラセボ処置を受けている対照の対象に対して）。「予防すること」または「防止すること」という用語は、例えば、症状の発生を遅延させること、腫瘍もしくはがんの再発を予防すること、再発エピソードの回数もしくは頻度を減少させること、症候性エピソードの間の潜伏期を増加させること、腫瘍もしくはがんの転移を予防すること、またはその組み合わせを指し得る。「抑制すること」または「阻害すること」という用語は、例えば、症状の重症度を低下させること、急性エピソードの重症度を低下させること、症状の数を減少させること、疾患関連症状の発生率を低下させること、症状の潜伏期を減少させること、症状を寛解させること、続発症状を減少させること、二次感染を減少させること、患者の生存を延長すること、またはその組み合わせを指し得る。
【０２３５】
「対象」という用語は、腫瘍もしくはがんの治療を必要とするか、またはそれらを発症しやすい哺乳類（例えば、ヒト）を指す。対象という用語はまた、予防的または治療的処置のいずれかを受ける哺乳類（例えば、ヒト）を指す。対象には、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、マウス、非ヒト哺乳類、及びヒトが含まれ得る。「対象」という用語は、すべての点において健康であり、がんまたは腫瘍の兆候を有さない、または示していない個体を必ずしも除外するものではない。
【０２３６】
リスク因子を有する個体がリスク因子を有さない個体よりも腫瘍またはがんを発症するリスクが統計的に有意に高いとされる既知のリスク因子（例えば、遺伝的、生化学、家族歴、及び状況曝露）を少なくとも１つ、対象が有する場合、その個体は、腫瘍またはがんを発症するリスクが高い。
【０２３７】
「症状」または「兆候」は、医師によって観察されるような疾患の客観的証拠または対象によって認識されるような疾患の主観的証拠、例えば、歩行の変化を指す。症状または徴候は、疾患の任意の症状発現であってもよい。症状は、原発性または続発性であり得る。「原発性」という用語が、特定の疾患または障害（例えば、腫瘍またはがん）の直接的な結果である症状を指す一方で、「続発性」という用語は、原発の原因に由来するか、またはそれに続く症状を指す。本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドまたはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、免疫原性組成物、医薬組成物、及びワクチンは、原発性もしくは続発性の症状または続発性の合併症を処置することができる。
【０２３８】
腫瘍またはがんの発症を遅延させ、重症度を低下させ、さらなる悪化を阻害し、及び／または少なくとも１つの兆候または症状を寛解させる投薬量、投与経路、及び投与頻度を意味する有効なレジームで、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを投与する。別法では、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチン中の非相同抗原に対する免疫応答を誘導するか、または組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合には、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株自体に対する免疫応答を誘導する投薬量、投与経路、及び投与頻度を意味する有効なレジームで、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを投与する。対象が腫瘍またはがんにすでに罹患している場合、レジームは、治療上有効なレジームと称され得る。対象が、一般個体群に対して腫瘍またはがんを発症するリスクが高いが、まだ症状を経験していない場合、そのレジームは、予防上有効なレジームと称され得る。一部の例では、治療上または予防上の有効性は、同じ患者における歴史的対照または過去の経験に対して個々の患者で観察され得る。他の例では、治療上または予防上の有効性を、未処置の患者の対照個体群に対する、処置された患者の個体群における前臨床または臨床試験で実証することができる。例えば、個々の処置患者が、本明細書に記載の方法によって処置されていない比較可能な患者の対照個体群における平均結果よりも有利な結果を達成する場合、または比較臨床試験（例えば、第ＩＩ相、第ＩＩ／ＩＩＩ相または第ＩＩＩ相試験）において、対照患者に対して処置患者において、ｐ＜０．０５もしくは０．０１またはさらに０．００１レベルで、より有利な結果が実証される場合、レジームを治療上または予防上有効と判断することができる。
【０２３９】
組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株での例示的な投薬量は、例えば、１×１０６〜１×１０７ＣＦＵ、１×１０７〜１×１０８ＣＦＵ、１×１０８〜３．３１×１０１０ＣＦＵ、１×１０９〜３．３１×１０１０ＣＦＵ、５〜５００×１０８ＣＦＵ、７〜５００×１０８ＣＦＵ、１０〜５００×１０８ＣＦＵ、２０〜５００×１０８ＣＦＵ、３０〜５００×１０８ＣＦＵ、５０〜５００×１０８ＣＦＵ、７０〜５００×１０８ＣＦＵ、１００〜５００×１０８ＣＦＵ、１５０〜５００×１０８ＣＦＵ、５〜３００×１０８ＣＦＵ、５〜２００×１０８ＣＦＵ、５〜１５×１０８ＣＦＵ、５〜１００×１０８ＣＦＵ、５〜７０×１０８ＣＦＵ、５〜５０×１０８ＣＦＵ、５〜３０×１０８ＣＦＵ、５〜２０×１０８ＣＦＵ、１〜３０×１０９ＣＦＵ、１〜２０×１０９ＣＦＵ、２〜３０×１０９ＣＦＵ、１〜１０×１０９ＣＦＵ、２〜１０×１０９ＣＦＵ、３〜１０×１０９ＣＦＵ、２〜７×１０９ＣＦＵ、２〜５×１０９ＣＦＵ、及び３〜５×１０９ＣＦＵである。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株での他の例示的な投薬量は、例えば、１×１０７生体、１．５×１０７生体、２×１０８生体、３×１０７生体、４×１０７生体、５×１０７生体、６×１０７生体、７×１０７生体、８×１０７生体、１０×１０７生体、１．５×１０８生体、２×１０８生体、２．５×１０８生体、３×１０８生体、３．３×１０８生体、４×１０８生体、５×１０８生体、１×１０９生体、１．５×１０９生体、２×１０９生体、３×１０９生体、４×１０９生体、５×１０９生体、６×１０９生体、７×１０９生体、８×１０９生体、１０×１０９生体、１．５×１０１０生体、２×１０１０生体、２．５×１０１０生体、３×１０１０生体、３．３×１０１０生体、４×１０１０生体、及び５×１０１０生体である。投薬量は、もしあるならば先行する処置に対する患者及び応答の状態、処置が予防的または治療的であるかどうか、及び他の因子に依存し得る。
【０２４０】
投与は、任意の適切な手段により得る。例えば、投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、脳室内、腹腔内、局所、鼻腔内、筋肉内、眼内、直腸内、結膜、経皮、皮内、膣内、直腸、腫瘍内、傍がん（ｐａｒｃａｎｃｅｒａｌ）、経粘膜、血管内、心室内、吸入（エアロゾル）、鼻吸引（スプレー）、舌下、エアロゾル、坐剤、またはその組み合わせであり得る。鼻腔内投与または吸入による適用では、適切な担体の存在下で混合されている、及びエアロゾル化されている、または噴霧化されている組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの液剤または懸濁剤が適している。そのようなエアロゾルは、本明細書に記載の任意の組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを含んでもよい。投与はまた、坐剤（例えば、直腸坐剤または尿道坐剤）の形態、皮下移植用のペレット剤の形態（例えば、ある期間にわたって制御放出するために提供）、またはカプセル剤の形態であってもよい。投与はまた、腫瘍部位への、または腫瘍への注射によってもよい。処置をする腫瘍またはがんの正確な性質及び種類、腫瘍またはがんの重症度、対象の年齢及び全身健康状態、対象の体重、個々の対象の応答などの因子に基づき、投与のレジームを容易に決定することができる。
【０２４１】
投与頻度は、他の因子のなかでも、対象における組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの半減期、対象の状態、及び投与経路に依存し得る。対象の状態の変化または処置される腫瘍もしくはがんの進行に応じて、頻度は、例えば、毎日、毎週、毎月、年４回、または不規則な間隔であり得る。処置期間は、対象の状態及び他の因子に依存し得る。例えば、処置期間は、数週間、数か月、または数年であり得る（例えば、最高２年）。例えば、腫瘍退縮または腫瘍成長の抑制を達成するために、繰り返し投与（用量）を第１の期間の直後に、または数日、数週間もしくは数か月の間隔の後に行ってもよい。診断方法、例えば、イメージング技法、血清腫瘍マーカーの分析、生検、または腫瘍関連症状の存在、非存在、もしくは寛解を含む、任意の公知の技法によって、評価を決定してもよい。具体的な例として、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを３週毎に最高２年間にわたって投与することができる。一例では、制御性Ｔ細胞に対するＴエフェクター細胞の比を上昇させ、より効力のある抗腫瘍免疫応答を生じさせるために、本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを漸増用量で投与する。例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及び細胞性免疫応答を増強することが公知の他のサイトカインを含むサイトカインを対象に与えることによって、抗腫瘍免疫応答をさらに強化することができる。例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，９９１，７８５号を参照されたい。
【０２４２】
一部の方法はさらに、追加の組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンで対象をブーストすること、あるいは組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンを複数回投与することを含んでもよい。「ブーストすること」は、追加用量を対象に投与することを指す。例えば、一部の方法では、２回のブースト（または合計３回の接種）を投与し、３回のブーストを投与し、４回のブーストを投与し、５回のブーストを投与し、または６回以上のブーストを投与する。投与される投薬の回数は、例えば、処置に対する腫瘍またはがんの応答に依存し得る。
【０２４３】
任意選択で、ブースター接種で使用される組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンは、当初の「プライミング」接種において使用される組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンと同じである。別法では、ブースター用組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンは、プライミング用組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンとは異なる。任意選択で、同じ投薬量を、プライミング及びブースティング接種で使用する。別法では、より多い量の投薬量をブースターで使用するか、またはより少ない投薬量をブースターで使用する。プライミング接種とブースティング接種との間の期間は、実験的に決定することができる。例えば、プライミング接種とブースティング接種との間の期間は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６〜８週間、または８〜１０週間であり得る。
【０２４４】
非相同のプライムブーストストラテジーは、多数の病原体に対する免疫応答及び保護を増強するために有効である。例えば、それぞれあらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＳｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１７０：２９−３８；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９−２５０；Ｇｏｎｚａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ワクチン  ２０：１２２６−１２３１；及びＴａｎｇｈｅ（２００１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：３０４１−３０４７を参照されたい。プライム及びブースト注射において異なる形態の抗原を提供することは、抗原に対する免疫応答を最大化し得る。ＤＮＡワクチンプライミング、続く、アジュバント中でのタンパク質でのブースティング、または抗原をコードするＤＮＡのウイルスベクター送達は、抗原特異的抗体及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を改善する有効な方法の１つである。例えば、それぞれあらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＳｈｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−３３５；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１０３９−１０４５；Ｂｉｌｌａｕｔ−Ｍｕｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：９５−１０２；及びＳｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：７７１−７７９を参照されたい。一例として、対象に、ＤＮＡプライムを、続いて、抗原を発現するアデノウイルスベクターを有するブーストをワクチン接種する場合、抗原をコードするＤＮＡへのＣＲＬ１００５ポロキサマー（１２ｋＤａ、５％ＰＯＥ）の添加はＴ細胞応答を増強し得る。例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＳｈｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−３３５を参照されたい。別の例として、抗原の免疫原性部分をコードするベクター構築物及び抗原の免疫原性部分を含むタンパク質を投与することができる。例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００２／０１６５１７２号を参照されたい。同様に、核酸ワクチン接種の免疫応答を、目的のポリヌクレオチド及びポリペプチドの同時投与（例えば、同じ免疫応答中に、好ましくは相互に０〜１０または３〜７日以内に）によって増強することができる。例えば、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，５００，４３２を参照されたい。
【０２４５】
本明細書で開示する治療方法はまた、がんの予防または処置において有効な１つまたは複数の追加の化合物を投与することを含み得る。例えば、追加の化合物は、化学療法において有用な化合物、例えば、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロフォスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、グリアデルインプラント、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル（タキソール）、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはその組み合わせを含んでもよい。別法では、追加の化合物はまた、ＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、またはＥＧＦ受容体に対する抗体、例えばＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）、及びＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）を含む他の生物製剤を含み得る。別法では、追加の化合物は、他の免疫療法を含むことができる。別法では、追加の化合物は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害薬、例えば、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、ネクロスタチン−１、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン、エブセレン、５−メチルインドール−３−カルボキサルデヒド、ＣＡＹ１０５８１、抗ＩＤＯ抗体、または小分子ＩＤＯ阻害薬であり得る。ＩＤＯ阻害は、化学療法薬の有効性を増強し得る。本明細書で開示する治療方法は、放射線、幹細胞処置、外科手術、または任意の他の処置と組み合わせることもできる。
【０２４６】
そのような追加の化合物または処置は、本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの投与に先行し得るか、本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの投与に続き得るか、または本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの投与と同時であり得る。
【０２４７】
標的免疫調節療法は主に、例えば、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、及びＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体関連）を含む腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーを標的とするアゴニスト抗体を使用することによって、共刺激受容体の活性化に焦点を当てている。ＧＩＴＲのモジュレーションは、抗腫瘍及びワクチン設定の両方において可能性を実証している。アゴニスト抗体の別の標的は、Ｔ細胞活性化での共刺激シグナル分子である。共刺激シグナル分子の標的化は、Ｔ細胞の活性化の増強及びより強力な免疫応答の促進をもたらし得る。共刺激はまた、チェックポイント阻害による阻害の影響を阻止し、かつ抗原特異的Ｔ細胞増殖を増加させるために役立ち得る。
【０２４８】
リステリアベースの免疫療法は、腫瘍に浸潤し、かつそれを破壊する腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のｄｅ  ｎｏｖｏ生成を誘導することによって、及び腫瘍微小環境における免疫抑制制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）及び骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数及び活性を低下させることによって作用する。Ｔ細胞同時阻害または共刺激受容体（例えば、チェックポイント阻害因子ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３及び共刺激因子ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、及びＣＤ４０）のための抗体（またはその機能性断片）は、リステリアベースの免疫療法と相乗作用を有し得る。
【０２４９】
したがって、一部の方法は、免疫チェックポイント阻害因子アンタゴニスト、例えば、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害因子、ＣＤ−８０／８６及びＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路阻害因子、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）シグナル伝達経路阻害因子、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）シグナル伝達経路阻害因子、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）シグナル伝達経路阻害因子、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）シグナル伝達経路阻害因子、ＣＤ４０シグナル伝達経路阻害因子、または任意の他の抗原提示細胞／Ｔ細胞シグナル伝達経路阻害因子を含む組成物をさらに投与することを含み得る。免疫チェックポイント阻害因子アンタゴニストの例には、抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体もしくはその断片、抗ＰＤ−１抗体もしくはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくはその断片が含まれる。例えば、抗ＰＤ１抗体を、２週ごとに５〜１０ｍｇ／ｋｇ、３週ごとに５〜１０ｍｇ／ｋｇ、３週毎に１〜２ｍｇ／ｋｇ、毎週１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２週ごとに１〜１０ｍｇ／ｋｇ、３週ごとに１〜１０ｍｇ／ｋｇ、または４週ごとに１〜１０ｍｇ／ｋｇで対象に投与することができる。
【０２５０】
同様に、一部の方法は、Ｔ細胞受容体共刺激分子に結合するＴ細胞刺激薬、例えば、抗体またはその機能性断片、抗原提示細胞受容体結合共刺激分子、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーを投与することをさらに含み得る。Ｔ細胞受容体共刺激分子は、例えば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳを含み得る。抗原提示細胞受容体結合共刺激分子は、例えば、ＣＤ８０受容体、ＣＤ８６受容体、またはＣＤ４６受容体を含み得る。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、例えば、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）、またはＴＮＦＲ２５を含み得る。
【０２５１】
例えば、一部の方法はさらに、Ｔ細胞受容体共刺激分子に結合する抗体もしくはその機能性断片または共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体に結合する抗体もしくはその機能性断片を含む組成物の有効量を投与することを含み得る。抗体は、例えば、抗ＴＮＦ受容体抗体もしくはその抗原結合性断片（例えば、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーグルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）、またはＴＮＦＲ２５）、抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗ＧＩＴＲ抗体もしくはその抗原結合性断片であり得る。別法では、他のアゴニスト分子を投与することができる（例えば、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性断片を含有する融合タンパク質、抗原提示細胞（ＡＰＣ）／Ｔ細胞アゴニスト、ＣＤ１３４またはそのリガンドもしくは断片、ＣＤ１３７またはそのリガンドもしくは断片、あるいは誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）またはそのリガンドもしくは断片、またはアゴニスト小分子）。
【０２５２】
具体的な一例では、一部の方法は、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその機能性断片及び／または抗ＣＤ１３７抗体もしくはその機能性断片を投与することをさらに含み得る。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその機能性断片または抗ＣＤ１３７抗体もしくはその機能性断片を、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの第１の投与から約７２時間後に、あるいは組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの第１の投与から約４８時間後に投与することができる。抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその機能性断片または抗ＣＤ１３７抗体もしくはその機能性断片を例えば、約０．０５ｍｇ／ｋｇ及び約５ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物を例えば、約１×１０９ＣＦＵの用量で投与することができる。一部のそのような方法は、抗ＰＤ−１抗体またはその機能性断片の有効量を投与することをさらに含み得る。
【０２５３】
がん免疫療法の有効性を評価する方法は、周知であり、例えば、それぞれあらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＤｚｏｊｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６６（８）：８３１−８３８；Ｎａｒｕｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３（７）：６５８−６６３、Ｓｅｈｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔ．６：２１）、及びＨｅｉｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５６（５）：７２５−７３０に記載されている。一例として、前立腺癌では、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２マウスモデル、１７８−２ＢＭＡ細胞モデル、ＰＡＩＩＩ腺癌細胞モデル、ＰＣ−３Ｍモデル、または任意の他の前立腺癌モデルなどの前立腺癌モデルが、本明細書で開示する方法及び組成物を試験するためのものであり得る。
【０２５４】
別法では、または加えて、免疫療法をヒト対象において試験することができ、有効性を、公知のものを使用してモニターすることができる。そのような方法には、例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を直接的に測定すること、または疾患進行を測定すること（例えば、腫瘍転移の数もしくはサイズを決定すること、または疾患症状、例えば、咳、胸部痛、体重減少などをモニターすることによって）が含まれ得る。ヒト対象においてがん免疫療法の有効性を評価する方法は周知であり、例えば、それぞれあらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれるＵｅｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．７：９及びＴｈｏｍａｓ−Ｋａｓｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１９（１０）：２４２８−２４３４に記載されている。
【０２５５】
ＶＩＩ．キット
本明細書で開示する方法を行う際に利用される試薬を含むキットまたは本明細書で開示する組成物、ツール、もしくは装置を含むキットも提供する。
【０２５６】
例えば、そのようなキットは、本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、本明細書で開示する組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、本明細書で開示するミニ遺伝子構築物）、本明細書で開示する組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、本明細書で開示する免疫原性組成物、本明細書で開示する医薬組成物、または本明細書で開示するワクチンを含み得る。加えて、そのようなキットは、本明細書で開示する方法を行うための組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチド、組換え融合ポリペプチドもしくはキメラポリペプチドをコードする核酸（例えば、ミニ遺伝子構築物）、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの使用を説明する指示書を含み得る。そのようなキットは任意選択で、アプリケーターをさらに含み得る。モデルキットを下に記載するが、他の有用なキットの内容物は、本開示を考慮すれば明らかであろう。
【０２５７】
上で、または下で引用するすべての特許書類、ウェブサイト、他の刊行物、受入番号などは、それぞれ個々のアイテムが具体的に、かつ個別にそのように参照によって組み込まれると示されている場合と同様に、あらゆる目的のためにその全体で参照によって本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが異なる時点で受入番号に関連している場合、本出願の有効出願日の受入番号に関連するバージョンを意味する。有効出願日は、実際の出願日か、または該当する場合、受託番号に言及する優先出願の出願日の早い方を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが異なる時点で公開されている場合、別段に示さない限り、本出願の出願日における最新公開のバージョンを意味する。本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様は、具体的に別段に示されない限り、他のいずれとも組み合わせて使用することができる。本発明を、明瞭化及び理解のために、実例及び例としてある程度詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲内で、ある程度の変更及び修正を実施してもよいことは明らかであろう。
【０２５８】
実施形態の列挙
本明細書で開示する発明の主題には、これに限定されないが、次の実施形態が含まれる。
【０２５９】
１．組換えポリペプチドをコードする核酸を含む組換え弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物であって、前記組換えポリペプチドが、ウィルムス腫瘍タンパク質またはその免疫原性断片に融合している短縮化リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮化ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む、前記免疫原性組成物。
【０２６０】
２．前記組換えポリペプチドが、全長ウィルムス腫瘍タンパク質に融合している短縮化リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮化ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の組成物。
【０２６１】
３．前記組換えポリペプチドが、配列番号９５に記載のウィルムス腫瘍タンパク質免疫原性断片に融合している短縮化リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質、短縮化ＡｃｔＡタンパク質、またはＰＥＳＴアミノ酸配列を含む、実施形態１に記載の組成物。
【０２６２】
４．前記ウィルムス腫瘍タンパク質またはその免疫原性断片が短縮化リステリオリシンＯ（ｔＬＬＯ）タンパク質に融合している、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【０２６３】
５．前記ｔＬＬＯが、配列番号５７に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態４に記載の組成物。
【０２６４】
６．前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株がＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、先行実施形態のいずれかに記載の組成物。
【０２６５】
７．前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株がＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）株である、実施形態６に記載の組成物。
【０２６６】
８．実施形態１〜７のいずれかに１つに記載の組成物を対象に投与すること含む、対象においてがんを処置する方法。
【０２６７】
９．実施形態１〜７のいずれか１つに記載の組成物を対象に投与することを含む、対象において抗がんＴ細胞応答の増強を誘発する方法。
【０２６８】
１０．実施形態１〜７のいずれか１つに記載の組成物を対象に投与することを含む、対象において、がんに対する免疫応答の増強を誘発する方法。
【０２６９】
１１．前記がんが乳癌である、実施形態８〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【０２７０】
１２．前記乳癌が三重陰性乳癌である、実施形態１１に記載の方法。
【０２７１】
１３．前記がんが胃腸癌である、実施形態８〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【０２７２】
本明細書で開示する発明の主題はまた、これに限定されないが、次の実施形態を含む。
【０２７３】
１．キメラポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を含むミニ遺伝子構築物であって、前記キメラポリペプチドが、（ａ）細菌分泌シグナル配列；（ｂ）ユビキチンタンパク質；及び（ｃ）抗原性ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）ペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記細菌分泌シグナル配列、前記ユビキチン、及び前記抗原性ＷＴ１ペプチドが、前記キメラポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へと直列で配列されている、前記ミニ遺伝子構築物。
【０２７４】
２．前記抗原性ＷＴ１ペプチドがヘテロクリティック変異ＷＴ１ペプチドを含む、実施形態１に記載のミニ遺伝子構築物。
【０２７５】
３．前記ヘテロクリティック変異ＷＴ１ペプチドが、配列番号１１４〜１３７、１５９、１６０、１６２、及び１６３のいずれか１つに記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態２に記載のミニ遺伝子構築物。
【０２７６】
４．前記ヘテロクリティック変異ＷＴ１ペプチドが、配列番号１１４、１１５、１６２、または１６３に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態３に記載のミニ遺伝子構築物。
【０２７７】
５．前記キメラポリペプチドが、配列番号１５６、１５７、１６５、または１６６に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態４に記載のミニ遺伝子構築物。
【０２７８】
６．前記抗原性ＷＴ１ペプチドが天然ＷＴ１ペプチドを含む、いずれかの実施形態１に記載のミニ遺伝子構築物。
【０２７９】
７．前記天然ＷＴ１ペプチドが、配列番号９５または１５８に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態６に記載のミニ遺伝子構築物。
【０２８０】
８．前記キメラポリペプチドが配列番号１６４に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態７に記載のミニ遺伝子構築物。
【０２８１】
９．前記キメラポリペプチドが、前記細菌シグナル配列と前記ユビキチンタンパク質との間に１つまたは複数の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドをさらに含む、実施形態１〜４、６、及び７のいずれか１つに記載のミニ遺伝子構築物。
【０２８２】
１０．前記１つまたは複数の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドが、２つ以上の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドを含む、実施形態９に記載のミニ遺伝子構築物。
【０２８３】
１１．前記２つ以上の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドが、介在配列を伴わずに相互に直接融合している、実施形態１０に記載のミニ遺伝子構築物。
【０２８４】
１２．前記２つ以上の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドが、ペプチドリンカーを介して相互に連結している、実施形態１０に記載のミニ遺伝子構築物。
【０２８５】
１３．前記１つまたは複数の追加の抗原性ペプチドが、配列番号１５４に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる第１の追加の抗原性ＷＴ１ペプチド、配列番号１５５に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる第２の追加の抗原性ＷＴ１ペプチド、及び配列番号１３６に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる第３の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態９〜１２のいずれか１つに記載のミニ遺伝子構築物。
【０２８６】
１４．前記１つまたは複数の追加の抗原性ペプチドが、配列番号１５４に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる第１の追加の抗原性ＷＴ１ペプチド、配列番号１５５に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる第２の追加の抗原性ＷＴ１ペプチド、及び配列番号１３７に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる第３の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態９〜１２のいずれか１つに記載のミニ遺伝子構築物。
【０２８７】
１５．前記キメラポリペプチドが配列番号１５３に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態１４に記載のミニ遺伝子構築物。
【０２８８】
１６．前記細菌分泌シグナル配列がリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）分泌シグナル配列である、先行実施形態のいずれかに記載のミニ遺伝子構築物。
【０２８９】
１７．前記ＬＬＯ分泌シグナル配列が配列番号５９または配列番号１５０に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態１６のミニ遺伝子構築物。
【０２９０】
１８．前記ユビキチンタンパク質が配列番号１００に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、先行実施形態のいずれかに記載のミニ遺伝子構築物。
【０２９１】
１９．前記抗原性ＷＴ１ペプチドが配列番号９５、１１４〜１３７、１５８、１６２、及び１６３のいずれか１つに記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記細菌分泌シグナル配列が配列番号５９に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり、前記ユビキチンタンパク質が配列番号１００に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、先行実施形態のいずれかに記載のミニ遺伝子構築物。
【０２９２】
２０．前記ミニ遺伝子構築物が、（ａ）細菌分泌シグナル配列；（ｂ）ユビキチンタンパク質；及び（ｃ）抗原性ＷＴ１ペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるキメラポリペプチドをそれぞれコードする２つ以上のオープンリーディングフレームを含み、前記細菌分泌シグナル配列、前記ユビキチン、及び前記抗原性ＷＴ１ペプチドがそれぞれのキメラポリペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端へと直列で配列されていて、前記抗原性ＷＴ１ペプチドが、各キメラポリペプチドで異なり、前記ミニ遺伝子構築物が、オープンリーディングフレームの各対の間にシャイン−ダルガノリボソーム結合部位核酸配列を含む、先行実施形態のいずれかに記載のミニ遺伝子構築物。
【０２９３】
２１．先行実施形態のいずれかに記載のミニ遺伝子構築物によってコードされるキメラポリペプチド。
【０２９４】
２２．実施形態１〜２０のいずれか１つに記載のミニ遺伝子構築物を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０２９５】
２３．融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であって、前記融合ポリペプチドが天然ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、天然ＷＴ１の免疫原性断片、及び配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含むＷＴ１ペプチドから選択される抗原性ＷＴ１ペプチドに融合しているＰＥＳＴ含有ペプチドを含む、前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０２９６】
２４．前記融合ポリペプチドが前記天然ＷＴ１を含む、実施形態２３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０２９７】
２５．前記融合ポリペプチドが前記天然ＷＴ１の免疫原性の断片を含む、実施形態２３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０２９８】
２６．前記天然ＷＴ１の免疫原性の断片が、配列番号９５または配列番号１３９に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態２５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０２９９】
２７．前記融合ポリペプチドが、配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるＷＴ１ペプチドを含む、実施形態２３に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３００】
２８．前記融合ポリペプチドが、２つ以上の抗原性ＷＴ１ペプチドに融合しているＰＥＳＴ含有ペプチドを含み、前記２つ以上の抗原性ＷＴ１ペプチドの少なくとも１つが、前記天然ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、前記天然ＷＴ１の免疫原性の断片、及び配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるＷＴ１ペプチドから選択され、前記２つ以上の抗原性ＷＴ１ペプチドが同じか、または異なる、実施形態２３〜２７のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３０１】
２９．前記２つ以上の抗原性ＷＴ１ペプチドが、介在配列を伴わずに相互に直接融合している、実施形態２３〜２８のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３０２】
３０．前記２つ以上の追加の抗原性ＷＴ１ペプチドが、ペプチドリンカーを介して相互に連結している、実施形態２３〜２８のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３０３】
３１．前記融合ポリペプチドが、天然ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、前記天然ＷＴ１の免疫原性の断片、及び配列番号１１４または配列番号１３６に記載の配列を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなるＷＴ１ペプチドのうちの１つまたは複数のＮ末端側及び／またはＣ末端側に１つまたは複数のペプチドタグをさらに含む、実施形態２３〜３０のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３０４】
３２．前記１つまたは複数のペプチドタグが次の：３ｘＦＬＡＧタグ；６ｘＨｉｓタグ；ＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、及び配列番号９９に記載のＦＬＡＧタグうちの１つまたは複数を含む、実施形態３１に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３０５】
３３．前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが前記融合ポリペプチドの前記Ｎ末端側にある、実施形態２３〜３２のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３０６】
３４．前記ＰＥＳＴ含有ペプチドがＬＬＯのＮ末端側断片である、実施形態２３〜３３のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３０７】
３５．ＬＬＯの前記Ｎ末端側断片が配列番号５９に記載の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態３４に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３０８】
３６．前記核酸が、リステリアゲノムに作動可能に組み込まれている、実施形態２２〜３５のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３０９】
３７．前記核酸がエピソームプラスミド中にある、実施形態２２〜３５のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３１０】
３８．前記核酸が前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株に抗生物質抵抗性を付与しない、実施形態２２〜３７のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３１１】
３９．前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が弱毒化栄養素要求Ｌｉｓｔｅｒｉａ株である、実施形態２２〜３８のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３１２】
４０．前記弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、１つまたは複数の内因性遺伝子において変異を含み、その変異が前記１つまたは複数の内因性遺伝子を不活性化させている、実施形態３９に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３１３】
４１．前記１つまたは複数の内因性遺伝子がｐｒｆＡを含む、実施形態４０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３１４】
４２．前記１つまたは複数の内因性遺伝子がａｃｔＡを含む、実施形態４０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３１５】
４３．前記１つまたは複数の内因性遺伝子がａｃｔＡ及びｉｎｌＢを含む、実施形態４０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３１６】
４４．前記１つまたは複数の内因性遺伝子がａｃｔＡ、ｄａｌ、及びｄａｔを含む、実施形態４０に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３１７】
４５．前記核酸が、代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、実施形態２２〜４４のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３１８】
４６．前記代謝酵素がアラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素である、実施形態４５に記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３１９】
４７．前記融合ポリペプチドがｈｌｙプロモーターから発現される、実施形態２２〜４６のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３２０】
４８．組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、実施形態２２〜４７のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３２１】
４９．前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株がｐｒｆＡにおいて欠失または不活性化変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、Ｄ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ変異タンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、実施形態２２〜３３のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３２２】
５０．前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌ、及びｄａｔにおいて欠失または不活性化変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端側断片である、実施形態２２〜３３のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３２３】
５１．組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ及びｉｎｌＢにおいて欠失または不活性化変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸がゲノムに組み込まれており、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドがＡｃｔＡタンパク質またはその断片である、実施形態２２〜３３のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株。
【０３２４】
５２．実施形態２２〜５１のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株及びアジュバントを含む、免疫原性組成物。
【０３２５】
５３．前記アジュバントが、解毒リステリオリシンＯ（ｄｔＬＬＯ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリルリピドＡ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、実施形態５２に記載の免疫原性組成物。
【０３２６】
５４．対象においてＷＴ１発現腫瘍またはがんに対する免疫応答を誘導する方法であって、実施形態２２〜５１のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または実施形態５２〜５３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【０３２７】
５５．対象においてＷＴ１発現腫瘍またはがんを予防または処置する方法であって、実施形態２２〜５１のいずれか１つに記載の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株または実施形態５２〜５３のいずれか１つに記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、前記方法。
【０３２８】
配列の簡単な説明
添付の配列表に列記されているヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、及びアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進み３’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１１−４】
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【表１１−５】
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【表１１−６】
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【表１１−７】
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【表１１−８】
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【実施例】
【０３２９】
実施例１．ＬｍｄｄＡ３２３（ＷＴ１）及びＬｍｄｄＡ３２４（Ｏｖａ）の調製。
ＷＴ１及びＯＶＡの配列を、所与の構築物（ｐｐｌ２−ａｃｔＡ−ユビキチン−ｓｉｎｃ  ｐｅｐｔプラスミド）から、新たなプライマーを用いて増幅し、精製し、ｐＣＲ２．１ベクターにライゲートした。ライゲーションミックスをＴｏｐ１０大腸菌細胞に形質転換した。コロニーＰＣＲによって、プラスミドの存在を確認した。プラスミド配列をＤＮＡ配列決定によって検証した。それらをｐＡｄｖ３１８、ｐＡｄｖ３１９、ｐＡｄｖ３２０、ｐＡｄｖ３２１、及びｐＡｄｖ３２２と名付けた。
【０３３０】
ＷＴ１及びＯＶＡの配列をｐＡｄｖ１３４にライゲートし、ＭＢ２１５９に形質転換した。ミニプレップを調製し、配列決定に送って正確なものを確認した。それらをｐＡｄｖ３２３、ｐＡｄｖ３２４と名付けた。プラスミドｐＡｄｖ３２３、ｐＡｄｖ３２４をＬｍｄｄＡで形質転換した。２回の継代を行い、ＬｍｄｄＡ３２３、ＬｍｄｄＡ３２４についてコロニーＰＣＲによって確認した。配列分析によって、ＬｍｄｄＡ３２３及びＬｍｄｄＡ３２４について正確な配列を確認した。ミニ遺伝子構築物から発現されたＷＴ１ペプチドのアミノ酸配列は：ＲＭＦＰＮＡＰＹ（配列番号９５）である。
【０３３１】
ＬｍｄｄＡ３２３（ＷＴ１）及びＬｍｄｄＡ３２４（Ｏｖａ）で免疫化されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＷＴ１及びＯｖａペプチドに対するＩＦＮ−γ応答が図１Ａ〜Ｃに示されている。図１Ａ及び１Ｃの最後のマウスにおける対照ペプチドに対する高い応答は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激中のペプチド交差汚染による。ＷＴ１及びＯｖａペプチドに対するＩＦＮ−γ応答を、一次（図１Ａ）及び二次（図１Ｂ及びＣ）免疫化の後にＩＣＳによって評価した。一次免疫後に、ＷＴ１ペプチドに対する応答は検出されなかったが；しかしながら、３匹のマウスのうちの２匹が、ブースト免疫化の後に、ＷＴ１ペプチドに対して測定可能な応答を示した。試験されたすべてのマウスにおいて、一次及びブースト免疫化の後に、Ｏｖａ特異的応答が検出された。
【０３３２】
実施例２。特異的リステリアベースの免疫療法／ミニ遺伝子構築物での免疫化後の、ＷＴ１−Ｈ−２Ｄｂエピトープに特異的なＴ細胞系／クローンの生成。
Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの６〜８週齢の雄及び雌のＣ５７ＢＬ／６マウスを、下の表１に従ってＡＤＸＳ１１−００１（ＤＰ、バッチ−２０１３）、ＡＤＸＳ３１−１４２（バッチ）、ＬｍｄｄＡ３２３（ミニ遺伝子−ＷＴ１）、ＡＤＸＳ３１−１６４を使用して免疫化した。
【表１】
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【０３３３】
各マウスからの脾臓を上の表１に従って採取した。各マウスからの脾臓を、ｃ−ＲＰＭＩ培地５ｍＬを含有する個別の管に収集した。ｃ−ＲＰＭＩ培地（完全培地）は、４５０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０、５０ｍＬのＦＣＳ、５ｍＬのＨＥＰＥＳ、５ｍＬのＮＥＡＡ、５ｍＬのＧｌｕｔａｍａｘ、５ｍＬのピルビン酸Ｎａ、５ｍＬのＰｅｎ／Ｓｔｅｐ、及び１２９μＬの２−ＭＥ（１４．６Ｍ）である。単離脾細胞を調製する詳細なステップは次のとおりである。
【０３３４】
脾臓を、滅菌鉗子及びはさみを使用して実験及び対照から採取し、１０ｍＬのＰＢＳを含有する１５ｍＬ管内で実験室に輸送した。次いで、脾臓を滅菌ペトリ皿に注ぎ入れた。脾臓を、２枚のガラススライドまたは３ｍＬシリンジからのプランジャーの裏を使用して洗浄培地（ＲＰＭＩのみ）中ですり潰した。培地中の細胞を、１または２つの脾臓では１５ｍＬ管に、または２つ以上の脾臓では５０ｍＬ管に移した。細胞を１，０００ＲＰＭで５分間にわたって室温でペレット化した。上清を廃棄し、細胞を残りの洗浄緩衝液中で穏やかに再懸濁させ、１つの脾臓当たり２ｍＬのＲＢＣ溶解緩衝液を細胞ペレットに添加した。管を軽くたたくことによって、細胞を溶解緩衝液と穏やかに混合した。１分間にわたって待った後に、１０ｍＬのｃ−ＲＰＭＩ培地を細胞懸濁液に直接添加し、溶解緩衝液を失活させた。細胞を１，０００で５分間にわたって室温で回転させた。細胞を細胞ストレーナに通過させ、もう１回、１０ｍＬのｃ−ＲＰＭＩで洗浄した。細胞を、血球計算板を使用してカウントし、生存率をトリパンブルー染色によってチェックした。各脾臓は、約１〜２×１０８細胞をもたらす。
【０３３５】
３〜４週間にわたって、ペプチドでパルスされたマイトマイシンＣ処理済みＥＬ４細胞で刺激した後に、Ｅ７、ＰＳＡ及びＷＴ１などの種々の抗原について特異的なＴ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで展開させる。展開したＴ細胞を、五量体染色及び／またはＩＦＮ−γ  ＩＣＳによって抗原特異的であると確認し、クローンを限定希釈によって選択した。各抗原について特異的なＴ細胞クローンを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイを開発するためのツールとしてさらに使用することとする。
【０３３６】
実施例３。ＷＴ１抗原構築物の生成ならびに抗原提示細胞における発現及び分泌。
Ｃ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬ−Ｓ−６ｘＨＩＳタグ（ＡＲＳＩＩＮＦＥＫＬＳＨＨＨＨＨＨ；配列番号９６）を有するＷＴ１抗原を含む構築物を生成した。具体的には、Ｃ末端タグを有するＷＴ１タンパク質を含む構築物を生成した。ＷＴ１一本鎖構築物は、配列番号９７で記載される。
【０３３７】
マウス樹状ＤＣ２．４細胞をＬｍｄｄａ−ＷＴ１タグ発現ベクターに感染させた。次いで、サンプルを２５Ｄ−ＡＰＣコンジュゲート抗体で染色し、２５Ｄ−ＡＰＣを検出するために、フローサイトメーター上で泳動させた。２５Ｄ−ＡＰＣコンジュゲート抗体でのＣ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬタグ（配列番号９８）の検出は、図２Ａ〜Ｃに示されている。図２Ｃに示されているとおり、ＷＴ１サンプルは、図２Ａにおける陽性対照に匹敵し、かつ図２Ｂにおける陰性対照よりも有意に高い高レベルの陽性染色を示したが、これによって、感染すると抗原提示細胞において、抗原が発現及び分泌されることが確認された。
【０３３８】
実施例４。ヘテロクリティックＷＴ１ミニ遺伝子融合タンパク質を発現するリステリアの能力の評価。
ペプチドミニ遺伝子発現系を使用して、ウィルムス腫瘍タンパク質を標的とする９種の特有のヘテロクリティックミニ遺伝子を評価した。この発現系を、カルボキシ末端に別個のペプチド部分を含有する一連の組換えタンパク質のクローニングを促進するように設計する。これは、テンプレートとして、シグナル配列（ＳＳ）−ユビキチン（Ｕｂ）−抗原性ペプチド構築物の１つをコードする配列を利用する単一のＰＣＲ反応によって達成される。Ｕｂ配列のカルボキシ末端領域に延びるプライマーを使用し、かつプライマーの３’末端に所望のペプチド配列のためのコドンを導入することによって、新たなＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列を単一ＰＣＲ反応で生成することができる。細菌プロモーター及びシグナル配列（例えば、ＬＬＯまたはＡｃｔＡ１−１００分泌シグナル）の最初のいくつかのヌクレオチドをコードする５’プライマーは、すべての構築物で同じであり得る。この戦略を使用して生成された構築物は図３Ａ及びＢに図示されている。
【０３３９】
ミニ遺伝子系の利点の１つは、単一のリステリアベクター構築物を使用して、細胞に多数のペプチドを負荷することが可能であることである。上記の単一ペプチド発現系の修飾を使用して、多数のペプチドを組換え弱毒化リステリア（例えば、Ｌｍｄｄａ）に導入することができる。連続ＳＳ−Ｕｂ−ペプチド配列から多数の別個のペプチドをコードするキメラタンパク質を、１つのインサートでコードすることができる。例えば、図３Ｂを参照されたい。それぞれのペプチド構築物の別々の翻訳が可能であるように、各ＳＳ−Ｕｂ−ペプチドコード配列の前に、シャイン−ダルガノリボソーム結合部位を導入することができる。図３Ｂは、組換えリステリアの１つの株から３つの別々のペプチド抗原を発現するように設計された構築物の略図を示している。
【０３４０】
ＡＤＸＳ  Ｌｍｄｄａリステリア構築物によるｔＬＬＯ−ＷＴ１−ヘテロクリティック融合タンパク質の発現を評価するために、ウィルムス腫瘍１タンパク質を標的とする１０の特有のヘテロクリティックミニ遺伝子をｐＡｄｖ１３４プラスミドにおいて生成し、Ｌｍｄｄａに形質転換した。ｐＡｄｖ１３４  ｔＬＬＯプラスミドは、配列番号５９に記載のＮ末端側ＬＬＯ断片をコードする。ｔＬＬＯ−ＷＴ１ヘテロクリティック融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで：配列番号５９に記載のＮ末端側ＬＬＯ断片、続いて、配列番号９９に記載のＦＬＡＧタグ、続いて、配列番号１００に記載のユビキチン配列、続いて、下の表２に列挙されているヘテロクリティックＷＴ１  ９マーを含む。
【０３４１】
【表２】
2019522991.tif 000018
【０３４２】
合わせたＷＴ１−ｔＬＬＯ−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックフェニルアラニン構築物（構築物＃１）は配列番号１５６に記載されている。３つのＷＴ１ペプチド（それぞれＰ１−Ｐ２−Ｐ３；配列番号１５４（ＲＳＤＥＬＶＲＨＨＮＭＨＱＲＮＭＴＫＬ）、１５５（ＰＧＣＮＫＲＹＦＫＬＳＨＬＱＭＨＳＲＫＨＴＧ）、及び１３７（ＳＧＱＡＹＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ））を標的とする、もう１つの構築物（Ｌｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−ＵＢ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物）を生成した。各「Ｐ」ペプチドは、追加のＣＤ４Ｔヘルパーエピトープを得るために長さが十分な１９〜２２アミノ酸から構成される。これら３つのペプチドは、リンカーによって分離されている。Ｐ３ペプチドは、ＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ（配列番号１５２）をＳＧＱＡＹＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥＳ（配列番号１３７）に変換するヘテロクリティック変異を含有する。ヘテロクリティックＰ３ペプチドに加えて、Ｌｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−ＵＢ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物は、Ｃ末端にユビキチン−ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１１５）部分を含有する。合わせたＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−ＵＢ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物は、配列番号１５３に記載されている。それぞれ個別のＬｍｄｄａ構築物を、特有のヘテロクリティックＷＴ１ミニ遺伝子産物のｔＬＬＯ−融合タンパク質発現についてウェスタンブロットによってアッセイした。
【０３４３】
構築物＃１（Ｌｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−ＦＬＡＧ−Ｕｂ−ヘテロクリティックフェニルアラニンミニ遺伝子構築物）及びＬｍｄｄａ−ＷＴ１−ｔＬＬＯ−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＦＬＡＧ−ＵＢ−ヘテロクリティックチロシンミニ遺伝子構築物を、特有のヘテロクリティックＷＴ１ミニ遺伝子産物のｔＬＬＯ−融合タンパク質発現についてウェスタンブロットによってアッセイした。Ｌｍ  ＷＴ１ミニ遺伝子構築物を含有するプレートからの単一コロニーを使用して、乾式振盪インキュベーター（ｄｒｙ  ｓｈａｋｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）内で、３７℃で、脳心臓浸出物（ＢＨＩ）ブロス６ｍＬ中の終夜培養物に接種した。翌日、元の終夜培養物の１：１０希釈物を新鮮なＢＨＩ９ｍＬに再懸濁させ、ＯＤ６００＝０．６に達するまで、乾式振盪インキュベーター内で、３７℃で成長させた。細胞を１３０００ＲＰＭでの２分間の遠心分離によってペレット化した。サンプル上清を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動させた。サンプルを、サンプル７５μＬを４倍ＬＤＳサンプル緩衝液（Ｃａｔ＃１６１−０７４７）２５μＬで希釈することによって調製し、９８℃で１０分間にわたって沸騰させ、氷上に置き、次いで、最高速度で１０分間にわたって４℃で遠心した。サンプル１３μＬを４〜１５％プレキャストタンパク質ゲル（ＢｉｏＲａｄ  Ｃａｔ＃４５６１０８６）上で泳動させた。Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ転写装置（Ｃａｔ＃１７０−４１５５）及びＰＶＤＦ  Ｍｉｄｉ転写パック（Ｂｉｏ−Ｒａｄ＃１７０−４１５７）を使用して、タンパク質ゲルを転写した。ブロットを一次抗体としての抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｆ１８０４）または抗ＬＬＯ（Ａｂｃａｍ  ａｂ２００５３８）及び二次抗体としてのヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート（ｓｃ２００５）と共にインキュベートした。次いで、ブロットをｉＢｉｎｄ  Ｆｌｅｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃１７７２８６６）上でインキュベートし、洗浄し、次いで、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ＃３４０７６）によって展開し；イメージをＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｍａｇｅｒ６００（ＧＥ）上で展開した。
【０３４４】
特有のｔＬＬＯ−ＷＴ１−ヘテロクリティックミニ遺伝子融合タンパク質の発現及び分泌が確認された。構築物＃１及びＬｍｄｄａ−ＷＴ１−Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−ＹＭＦＰＮＡＰＹＬヘテロクリティックチロシン＋ミニ遺伝子構築物からの培養上清の抗Ｆｌａｇタグ抗体ウェスタンブロットはそれぞれ、図８Ａ及びＢに示されている。本発明者らは、それぞれ個別のｔＬＬＯ−ＷＴ１−ヘテロクリティックミニ遺伝子融合タンパク質での正確なサイズ及びアイデンティティに対応するタンパク質バンドを検出することができた。これらのデータは、ＷＴ１タンパク質内の複数のペプチド断片を標的とするヘテロクリティックペプチドを、ｐＡｄｖ１３４プラスミド及びＬｍｄｄａＬｉｓｔｅｒｉａ株を使用して生成することができることを実証している。
【０３４５】
表２中の構築物＃２〜９について、ヘテロクリティックＷＴ１ミニ遺伝子を含有するそれぞれ特有のｔＬＬＯ−融合タンパク質からのプラスミドＤＮＡを検出するために、それぞれ個別のＬｍｄｄａ構築物をコロニーＰＣＲによってアッセイした。
物質
【表１２】
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【０３４６】
手順
使用した一般的なコロニーＰＣＲ手順は次のとおりである。大きなコロニーを有するプレートを得る（一般に、３７℃で２４時間にわたって成長させたプレートが、この手順でうまく機能する）。次のとおりに、ＰＣＲのためのマスターミックスを作製する。
【表１３】
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【０３４７】
マスターミックス２０μＬを各ＰＣＲ管に分取する。ピペットの先端（１０〜２０μＬ体積が最良に機能する）を使用して、１つのコロニーから十分な容量をすくい上げる。ピペットの先端をＰＣＲ管に複数回入れ、回転させて細菌を移動させる。次のＰＣＲプログラムを使用して、サーモサイクラー内でＰＣＲ反応（複数可）を実行する。
【表１４】
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【０３４８】
サーモサイクラーからＰＣＲ管を取り出し、６×ローディングダイ４μＬを添加する。１ｋｂ＋ＤＮＡラダー１０μＬと並んで、各ＰＣＲ反応物１０μＬを１％アガロースゲル上で泳動させる。プライマーは、産物に追加の１６３塩基対を加える。フォワードプライマーは、ｔＬＬＯの３’末端（ＸｈｏＩ部位を含む）の上流７０塩基対に結合する。リバースプライマーは、終結部位（ＸｍａＩ部位を含む）の下流９３塩基対に結合する。
【０３４９】
表２からのｐＡｄｖ１３４ＷＴ１−ヘテロクリティックプラスミド＃２〜９を含有するＬｍｄｄａ株を示す代表的なコロニーＰＣＲ結果は、図９に示されている。本発明者らは、それぞれ個別のｔＬＬＯ−ＷＴ１−ヘテロクリティックミニ遺伝子プラスミドでの正確なサイズ及びアイデンティティに対応するＤＮＡバンドを検出することができた。これらのデータは、ＷＴ１タンパク質内の複数のペプチド断片を標的とするヘテロクリティックペプチドを、ｐＡｄｖ１３４プラスミド及びＬｍｄｄａＬｉｓｔｅｒｉａ株を使用して生成することができることを実証しており、このことは、そのような構築物を、ＷＴ１を標的とし、ＷＴ１ならびにＷＴ１発現がん及び腫瘍に対する免疫応答を引き起こすか、または増強するための治療用組成物として使用することができることを示している。
【０３５０】
実施例５。ＷＴ１構築物の免疫原性の評価。
２つの異なるＷＴ１構築物を使用して、ＡＡＤマウスにおけるＷＴ１特異的Ｔ細胞応答の生成を評価するために、ＥＬＩＳｐｏｔを行って、所望のワクチン誘導性Ａｇ特異的応答を検出した。ＡＡＤマウス（Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＨＬＡ−Ａ／Ｈ２−Ｄ）２Ｅｎｇｅ／Ｊ；Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号００４１９１）は、ヒトＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子のアルファ−１及びアルファ−２ドメインならびにマウスＨ−２Ｄｄ遺伝子のアルファ−３膜貫通及び細胞質ドメインを含有する種間ハイブリッドクラスＩ  ＭＨＣ遺伝子ＡＡＤをヒトＨＬＡ−Ａ２．１プロモーターの指示下で発現する遺伝子導入マウスである。このトランスジェニック株は、ＨＬＡ−Ａ２提示抗原に対するヒトＴ細胞免疫応答のモデリングを可能にし、感染症またはがん治療のためのワクチンの試験において有用であり得る。免疫化スケジュールを表３に示す。使用したマウスは、８〜１０週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスであった。
【表３】
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【０３５１】
ワクチンの調製。簡単に述べると、各グリセロールストックを、必要な栄養素プレート（ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｐｌａｔｅ）に画線し、終夜成長させた。抗生物質選択下で脳心臓浸出物（ＢＨＩ）ブロスの終夜培養物中で成長させるために、単一コロニーを使用した。新鮮なＢＨＩブロスに接種するために、終夜培養物を１：１０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）希釈で使用した。細菌を、オービタルシェーカー内で１〜３時間にわたって３７℃で、対数中期、約０．６〜０．７のＯＤまでインキュベートした。ＰＢＳ中の腹腔内接種によって、マウスを１×１０９ＣＦＵ  Ｌｍで感染させた。
【０３５２】
ＥＬＩＳＰＯＴ。１８日目に、マウスを、ＩＡＣＵＣプロトコルに従ってＣＯ２窒息によってと殺し、脾臓を採取し、脾細胞単一細胞懸濁液を９６ウェルプレートで平板培養し、野生型またはヘテロクリティックペプチド（表４）のいずれかで刺激した。同様の実験を他の野生型及びヘテロクリティックペプチド対（表５）で行う。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、野生型またはヘテロクリティックペプチドのいずれかに対応する抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞を計数した。完全なＥＬＩＳＰＯＴプロトコルは、ＣＴＬ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ（ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ．ｃｏｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ＥＬＩＳＰＯＴ−ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍ）のとおりであった。
【０３５３】
【表４】
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【０３５４】
【表５】
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【０３５５】
一般的なＥＬＩＳＰＯＴプロトコルを下に示す。
【０３５６】
０日目（無菌状態）。あなたの特異的プロトコルに従って捕捉抗体を希釈することによって、捕捉溶液を調製する。ＰＶＤＦ膜を７０％エタノールで３０秒間にわたって事前に湿らせ、ＰＢＳ１５０μＬで３回洗浄し、その後、各ウェルに捕捉溶液８０μＬを添加することが、多くのサイトカインに有利である。プレートを終夜、４℃で、加湿チャンバー内でインキュベートする。
【０３５７】
１日目（無菌状態）。１％の新鮮なＬ−グルタミンを添加することによって、ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ（商標）培地を調製する。ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ（商標）培地中で抗原／マイトジェン溶液を２倍最終濃度で調製する。０日目からのコーティング抗体と共にプレートをデカントし、ＰＢＳ１５０μＬで１回洗浄する。抗原／マイトジェン溶液１００μＬ／ウェルをプレーティングする。ＰＢＭＣを解凍するか、または密度勾配で白血球を単離した後に、ＰＢＭＣを、ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ（商標）培地中で所望の濃度、例えば、３００，０００細胞／ウェルに対応する３００万／ｍＬに調節する（しかしながら、１００，０００〜８００，０００細胞／ウェルは直線状の結果をもたらすので、予測スポットカウントに従って細胞数を調節することができる）。ＰＢＭＣのプロセシングの間、及びプレーティングまで、細胞を３７℃で、加湿インキュベーター内で、５〜９％ＣＯ２で維持する。大きなオリフィスチップを使用して、ＰＢＭＣ、１００μＬ／ウェルをプレーティングする。完了したら、プレートの側面を穏やかに軽くたたき、直ちに３７℃加湿インキュベーター、５〜９％ＣＯ２内に入れる。あなたのサイトカインに応じて２４〜７２時間にわたってインキュベートする。プレートを積み重ねてはならない。インキュベーターのドアを慎重に開閉することによって、プレートの振盪を回避する。インキュベーション中に、プレートに触れてはならない。
【０３５８】
２日目。この日のために洗浄溶液を調製する：ＰＢＳ、蒸留水及びＴｗｅｅｎ−ＰＢＳ。あなたの特異的プロトコルに従って検出抗体を希釈することによって、希釈溶液を調製する。各回２００μＬ／ウェルで、プレートをＰＢＳで２回、次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで２回洗浄する。検出溶液８０μＬ／ウェルを添加する。室温で２時間インキュベートする。あなたの特異的プロトコルに従って三次抗体を希釈することによって、三次溶液を調製する。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ、２００μＬ／ウェルで３回洗浄する。Ｓｔｒｅｐ−ＡＰ溶液８０μＬ／ウェルを添加する。室温で３０分間にわたってインキュベートする。あなたの特異的プロトコルに従って、展開溶液を調製する。各回２００μＬ／ウェルで、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで２回、次いで、蒸留水で２回洗浄する。展開溶液８０μＬ／ウェルを添加する。室温で１０〜２０分間にわたってインキュベートする。水道水で膜を穏やかにすすぎ、デカントし、それを３回繰り返すことによって反応を停止させる。プレートの保護用アンダードレーンを取り外し、水道水でプレートの裏面をすすぐ。プレートを裏返してランニングフード内で２時間にわたって、またはペーパータオル上で２４時間にわたってベンチトップ上で空気乾燥させる。プレートを走査及び計数する。
【０３５９】
ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックＢ６マウスに、記載のとおりワクチン接種し、脾細胞を特異的なＷＴ１ペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１０１）、ＦＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１１４））でｅｘ  ｖｉｖｏで刺激し、ＩＦＮｇ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって分析した。ヘテロクリティックワクチン接種（ＷＴ１−Ｆミニ遺伝子：ＦＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１１４）は、免疫化ＨＬＡ２遺伝子導入マウスにおいてＡｇ特異的Ｔ細胞応答を誘導する。加えて、ヘテロクリティックワクチン接種は、天然ＷＴ１腫瘍抗原（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１０１）と交差反応するＴ細胞応答を誘発する。データは、ＷＴ１−Ｆヘテロクリティックミニ遺伝子ワクチンでワクチン接種が、ＷＴ１天然腫瘍抗原（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１０１）と交差反応するＴ細胞を誘発し得ることを実証している。総じて、データは、ヘテロクリティックミニ遺伝子ワクチンが、天然腫瘍抗原と交差反応するＴ細胞を誘発し得ることを実証している。
【０３６０】
ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックＢ６マウスに、記載のとおりワクチン接種し、脾細胞を採取した。ワクチン特異的ＹＭＦＰＮＡＰＹＬペプチド（配列番号１１５）または天然ＷＴ１ペプチド（ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１０１）に応じてＩＦＮｇを産生するＴ細胞の能力をＩＦＮｇ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって決定した。ヘテロクリティックワクチン接種（ＷＴ１−ＡＨ１−Ｔｙｒミニ遺伝子：ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ；配列番号１１５）は、免疫化ＨＬＡ２遺伝子導入マウスにおいてＡｇ特異的Ｔ細胞応答を誘導する。加えて、ヘテロクリティックワクチン接種は、天然ＷＴ１腫瘍抗原（ＲＭＦＰＡＰＹＬ；配列番号１０１）と交差反応するＴ細胞応答を誘発する。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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