(57)【要約】  【解決手段】  本発明は生物医薬分野、特に抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体及び応用に関連する。本発明は、スクリーニングを通じて、良好特異性、高く親和性と安定性の抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体を得て、この抗体は特異性的に人ＰＤ−Ｌ１と結合でき、Ｂ７家族メンバーと結合しない、活性化のＴ細胞との結合を通じてＴ細胞の活性化作用を強化して、腫瘍の成長に顕著な抑制作用を発揮する。  【選択図】      なし
2019514853.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体或はその抗原結合部分であって、下記一組から選択されたＣＤＲ区を含み、（１）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８−２０の表示で、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４−３６の表示、（２）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８−２０の表示で、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、３５と３６の表示で、或は上記序列の結合と同じの抗原表位の序列であり、（３）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８−２０の表示で、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、３５と３６の表示で、或は上記序列の結合と同じの抗原表位の序列である、抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
請求項１記載の抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体またはその抗原結合部分において、下記の重鎖可変区フレーム区から選択された：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の序列、其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１−２４の表示で、または其々前記序列との同一性が７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の序列を含む、抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
請求項２記載の抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体またはその抗原結合部分において、重鎖の序列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の表示である、抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
請求項１記載の抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体またはその抗原結合部分において、前記軽鎖可変区フレーム区から選択された：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の序列、其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７−４０の表示で、または其々前記序列との同一性が７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の序列も含む、抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
請求項４記載の抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体或はそれの抗原結合部分において、軽鎖の序列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、４２と４８の表示である、抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
核酸分子であって、抗体重鎖可変区をコードできる核酸序列を含み、述べ重鎖可変区は下記一組から選択されたアミノ酸序列を含み、（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８−２０、（２）前記（１）序列と比較して、下記二者中の最低一つの序列を満足：ａ）同じの抗原表位と結合；ｂ）同一性は７０％、８０％、８５％、９０％、または９７％以上である、一種の核酸分子。
【請求項７】
請求項６記載の核酸分子、前記重鎖可変区は、下記一組から選択されたアミノ酸序列を含んである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、前述序列と比較すると下記三者中の最低一者の序列を満足：ａ）同じの抗原表の位置を結合、ｂ）同一性７０％、８０％、８５％、９０％或は９７％以上、ｃ）前述序列フレーム区中に１個〜数個ヌクレオチド酸の切替を含む、核酸分子。
【請求項８】
核酸分子であって、抗体軽鎖可変区をコードできる核酸序列を含み、述べ軽鎖可変区は下記一組から選択されたアミノ酸序列を含み、（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４−３６、（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、３５と３６、（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、３５和３６、（４）前記（１）〜（３）の序列と比較して、下記二者中の最低一つの序列を満足：ａ）同じの抗原表位と結合；ｂ）同一性は７０％、８０％、８５％、９０％或は９７％以上である、核酸分子。
【請求項９】
請求項８記載の核酸分子、前記軽鎖可変区は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、４５または５１の１つから選択されたアミノ酸序列を含み、前記序列と比較すると、下記三者中の最低一者の序列を満足：ａ）同じの抗原表の位置を結合、ｂ）同一性７０％、８０％、８５％、９０％または９７％以上、ｃ）前述序列フレーム区中に１個〜数個ヌクレオチド酸の切替を含む、核酸分子
【請求項１０】
キャリヤーであって、請求項６〜９のいずれか１項記載の核酸分子を含む、キャリヤー。
【請求項１１】
宿主細胞であって、請求項６〜９のいずれか１項記載の核酸分子、または請求項１０記載のキャリヤーを含む、宿主細胞。
【請求項１２】
偶聯物であって、請求項１〜５のいずれか１項記載の抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体またはその抗原結合部分、及び他の生物活性物質を含み、前記抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体またはその抗原結合部分は直接または断片との連接を通じて、他の生物活性物質と偶聯する、偶聯物。
【請求項１３】
組成物であって、請求項１〜５のいずれか１項記載の抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体またはその抗原結合部分、請求項６〜９記載の核酸分子、請求項１０記載のキャリヤー、請求項１１記載の宿主組織、または請求項１２記載の偶聯物、及び任意選択された薬学で受け入れるキャリヤーまたは造形剤、及び任意選択された他の生物活性物質を含む、組成物。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項の抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体またはその抗原結合部分、請求項６〜９記載の核酸分子、請求項１０記載のキャリヤー、請求項１１記載の宿主細胞、請求項１２記載の偶聯物、または請求項１３記載の組物は、腫瘍、免疫システム関係の病気（Ｔ細胞功能障害）、微生物またはウイルスが引き起こす感染の予防または治療に準備用途がある。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本申請には申請日が２０１６年５月２０日、「抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体及び応用」という発明の名称で出願された中国特許出願第２０１６１０３４０６７８．３に対する優先権の利益を主張し、その出願の全内容が本参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は生物医薬分野、特に抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体及び応用に関連する。
【０００３】
人体免疫システムの適応性の応答過程は主にＴ細胞とＢ細胞この２種の免疫細胞の活性化、分化と増殖を含んである。この内、Ｔ細胞功能の活性化は２種信号のコントロールを受ける。１種はＴ細胞受体（ＴＣＲ）が抗原提示細胞（ＡＰＣ）のＭＨＣ−抗原複合物を識別する時提供した抗原特異性信号である。もう１種はＡＰＣ細胞に表現した免疫検査点蛋白質とＴ細胞の間で形成した共刺激と抑制信号である。この種の共刺激或は抑制信号はしばしばＴ細胞の増殖、分化と活性化に重要な役割を発揮する。正常状態で、免疫検査点は機体自身の耐受性（自身免疫の防止）の維持、外界病原体から機体への感染を免れる事を保護する事に重要な役割を発揮する。
【０００４】
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ１信号通路は免疫反応中の非常に重要な共抑制信号のルートである。プログラム性死亡受体−１（ＰＤ−１はＣＤ２７９とも呼ぶ）は二つ細胞表面の糖蛋白配体が有り、其々ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４とも呼ぶ）とＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３とも呼ぶ）である。
【０００５】
人ＰＤ−Ｌ１遺伝子コードの２９０個アミノ酸（この内１−１８位のアミノ酸は信号ペプチド、１９−２３８位のアミノ酸は胞外段、２３９−２５９位のアミノ酸は外視膜、２６０−２９０位のアミノ酸は胞内段である。）あれはＩ型膜蛋白、一般的にＴ細胞、Ｂ細胞、木の突発状の細胞、大食い細胞及びたくさんの非造血細胞に表現している。研究表明、ＰＤ−Ｌ１はＰＤ−１と結合後、補足後ＳＨ２構造域付けた蛋白チチウムリン酸ゼＳＨＰ−１とＳＨＰ−２を通過する。この２種のリン酸ゼはＣＤ３ζ鏈の免疫受体チチウム酸の活性化基序（ＩＴＡＭ）のリン酸程度を低下でき、ＺＡＰ−７０の活性化を弱め、ＴＣＲ下流信号の伝達を抑制して、それによって、Ｔ細胞の活性化を共抑制の役割を果たす。こんな逆向調節効果を通じて、効果Ｔ細胞のオーバ活性化で自身免疫傷害の事を防止できる。
【０００６】
ところで、腫瘍組織にはＰＤ−Ｌ１を表現された、免疫細胞ＰＤ−１との結合を通じて免疫システムから腫瘍組織への殺傷作用を弱める。現在、ＰＤ−Ｌ１はたくさんの腫瘍組織（胃癌、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌と悪性黒色素腫等）と浸潤腫瘍微環境の骨髄細胞中で高く表現することを発見された。ＰＤ−Ｌ１の表現は黒色素腫、乳癌及び卵巣癌の不良予後とも密接な関係がある。若しＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の連接反応を遮断できると、Ｔ細胞の効果功能を回復できる。例の黒色素腫の種類の腫瘍は形成の初期にＰＤ−Ｌ１を表現でき、生まれつきの免疫逃避能力を持つ、ＰＤ−Ｌ１の表現レベルはしばしば病気の予後とも密接な関係がある。
【０００７】
だから、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１信号通路免疫療法に対して、ＰＤ−Ｌ１の表現レベルは非常に重要な生物標識物になり、どんな病人がこの種の免疫療法に更に応答が出るかを研究員の推測する事に援助できる。
【０００８】
現在、ＰＤ−Ｌ１を標的としての抗体薬物は臨床上に素晴らしい応用前途を展示してある。例えば羅氏の全人ＩｇＧ１単クローン抗体ＭＰＤＬ３２８０ＡはＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１とＣＤ８０との結合を遮断でき、それのＦｃ断片への工程化改造を通じて抗体介導の細胞毒作用を弱めて、安全性を向上させる。１期の臨床試験にはＰＤ−Ｌ１が陽性を表現された転移性膀胱癌患者は１２週間のＭＰＤＬ３２８０Ａ治療を受けてから、５２％の応答率を発生され、不良反応は全て低級別の疲労と悪心で、腎臓毒性があるという証拠がない。黒色素腫の患者の中に薬物への持続応答も観察できた。だから、ＦＤＡはＭＰＤＬ３２８０Ａに突破療法地位を授与された。それの晩期腎細胞癌と非小細胞肺癌の患者の臨床研究も同期的に推進している。もう一つのＰＤ−Ｌ１単クローン抗体、輝瑞と默克が共同開発されたＡｖｅｌμｍａｂも転移性默克尓細胞患者の中に有効性と安全性の評価を行っている。
【０００９】
こればかりでなく、研究の表明であるウィルス感染もＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１信号通路と密接な関係がある。例えば、慢性ＨＩＶ感染の中にＰＤ−１は特異性識別ＨＩＶのＣＤ８＋Ｔ細胞表面に高く表現し、ウィルスがＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１活性化の信号ルートを通じて、特異性識別ＨＩＶのＣＤ８＋Ｔ細胞活性が抑制を受け、細胞因子の分泌能力とＴ細胞自身の増殖能力が大幅に弱め、獲得性の免疫効能の欠陥を引き起こした。上記からＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１信号通路の遮断する事はこの種の病気の治療にも相当の応用価値があるとされている。
【００１０】
上記からＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１信号通路を遮断できる薬物の研究は腫瘍、ウイルス感染と多種の免疫システム関係の病気の治療に新しい方法があり、大きい応用潜在力と市場価値があるとされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の技術問題を解決ため、本発明の目的は良好特異性、高い親和性と安定性を持つ抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体を提供する。
【００１２】
本発明の第１面は抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体或はそれの抗原結合分を関連し、下記１組のＣＤＲ区を含む。
（１）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の序列は、其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８−２０の表示で、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の序列は、其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４−３６の表示で、または上記の序列結合と同様の抗原表位置の序列である。
（２）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の序列は其々例えＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８−２０の表示で、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の序列は、其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、３５と３６の表示で、または上記の序列結合と同様の抗原表位置の序列である。
（３）重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の序列は、其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８−２０の表示で、軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３の序列は、其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、３５と３６の表示で、または上記の序列結合と同様の抗原表位置の序列である。
【００１３】
更に、本発明中の抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体或はそれの抗原結合部分は又下記重鎖可変区フレーム区から選択された：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の序列は其々例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１−２４の表示で、或は別々に上記の序列の同一性７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の序列を含む。
【００１４】
更に、本発明中の抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体或はそれの抗原結合部分は又下記軽鎖可変区フレーム区から選択された：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４の序列は其々例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７−４０の表示で、或は別々に上記の序列の同一性７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の序列を含む。
【００１５】
更に、本発明中の抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体或はそれの抗原結合部分は下記の重鎖可変区から選択された：それの序列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の表示で、或は上記序列結合と同じの抗原表の位置の序列を含む。
【００１６】
更に、本発明中の抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体或はそれの抗原結合部分は下記の軽鎖可変区から選択され、その序列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、４５または５１の表示で、或は上記序列の同一性７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上の序列を含む。
【００１７】
具体的に、本発明中の抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体或はそれの抗原結合部分、それの重鎖の序列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の表示である。
【００１８】
具体的に、本発明中の抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体或はそれの抗原結合部分、それの軽鎖の序列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６、４２或は４８の表示である。
【００１９】
本発明の第２面によりいずれの核酸分子は抗体重鎖可変区をコードできる核酸序列を含んで、述べた重鎖可変区は下記一組から選択されたアミノ酸序列を含む。
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８−２０；
（２）前述（１）と比較すると下記二者中の最低一者の序列を満足：ａ）同じの抗原表の位置を結合；ｂ）同一性７０％、８０％、８５％、９０％或は９７％以上である。
【００２０】
更に、述べた重鎖可変区は下記一組から選択されたアミノ酸序列を含む。
【００２１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、前述序列と比較すると下記三者中の最低一者の序列を満足：ａ）  同じの抗原表の位置を結合；ｂ）同一性７０％、８０％、８５％、９０％或は９７％以上、ｃ）  前述序列フレーム区中に一個〜何個ヌクレオチド酸の切替を含む。
【００２２】
本発明の実施例中で述べた核酸分子は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５表示の序列を含む。
【００２３】
更に、前記核酸分子は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９表示の序列を含む。
【００２４】
本発明第３面によりいずれの核酸分子は抗体軽鎖可変区をコードできる核酸序列を含んで、述べた軽鎖可変区は選択された下記一組のアミノ酸序列を含んである。
（１）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４−３６、
（２）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、３５、及び３６、
（３）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、３５、及び３６、
（４）前述（１）−（３）序列と比較すると下記二者中の最低一者の序列を満足：ａ）同じの抗原表の位置を結合；ｂ）同一性７０％、８０％、８５％、９０％或は９７％以上。
【００２５】
更に、述べた軽鎖可変区は選択された下記一組のアミノ酸序列を含む。
【００２６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８、４５或は５１、前記序列と比較すると下記三者中の最低一者の序列を満足：ａ）同じの抗原表の位置を結合；ｂ）同一性７０％、８０％、８５％、９０％或は９７％以上、ｃ）  前述序列フレーム区中に一個〜何個ヌクレオチド酸の切替を含む。
【００２７】
本発明の実施方案中で述べた核酸分子は選択された例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、４３或は４９表示の序列を含む。
【００２８】
更に、述べた核酸分子は選択された例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５、４１或は４７表示の序列を含む。
【００２９】
本発明の第４面はキャリヤーの関係で、その中に本発明の第２或は第３面のいずれの核酸分子を含む。
【００３０】
更に、本発明で述べたキャリヤーは本発明の第２面のいずれの核酸分子と第３面のいずれの核酸分子を含む。
【００３１】
本発明の第５面は宿主細胞の関係で、この中には第２面或は第３面のいずれの核酸分子或は第４面のいずれのキャリヤーを含む。
【００３２】
本発明の第６面は偶聯物の関係で、この中には第１面のいずれの抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体或はそれの抗原結合部分、及び他の生物活性物質を含んである。述べた抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体或はそれの抗原結合部分は直接或は連接断片を通じて他の生物活性物質と偶聯する。
【００３３】
本発明の実施方案の中に述べた他の生物活性物質は直接或は間接的に細胞の生長の抑制或は細胞の殺滅、機体免疫反応の活性化を通じて細胞の抑制或は殺滅して、腫瘍治療の化学物質、毒素、ポリペプチド、酵素、同位素、細胞因子或は他の生物活性の単一物質或は混合物質から選択された。
【００３４】
本発明の第７面は組物（例えば薬物組物）の関係で、この中には本発明の第１面のいずれの抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体或はそれの抗原結合部分、第２面或は第３面のいずれの核酸分子、第４面のいずれのキャリヤー、第５面のいずれの宿主細胞、或は本発明の第６面のいずれの偶聯物、及び任意選択された薬学上に受けるキャリヤー或は造形剤、及び任意選択された他の生物活性物質を含む。
【００３５】
本発明の第７面により、いずれの組物（例えば薬物組物）、述べた他の生物活性物質にはその他の抗体、融合蛋白或は薬物（例えば抗腫瘍の薬物、例え放射線治療の薬物）を含むがこれに限らない。
【００３６】
本発明に診断剤或は試剤箱も関連で、この中には本発明の第１面のいずれの抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体或はそれの抗原結合部分、述べた診断剤或は試剤箱は体外（例えば細胞或は組織）或は体内（例えば人或は動物モデル）、ＰＤ−Ｌ１と関連の病気（例えば腫瘍或はウイルス感染、例えばＰＤ−Ｌ１で高く表現されたウイルス感染或はＰＤ−Ｌ１で高く表現された腫瘍）の診断に利用する。
【００３７】
本発明の実施方案の中に述べた腫瘍は肺癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、黒色素腫、腎癌、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、リンパ腫、悪性の血液病、首頸癌、膠腫、胃癌、鼻息癌、喉癌、子宮頸癌、子宮体癌、骨肉腫、甲状腺癌、前立腺癌を含むが限らない。述べたウイルス感染は急性、亜急性或は慢性ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶの感染を含むがこれに限らない。
【００３８】
本発明には本発明第１面のいずれの抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体或はそれの抗原結合部分、第２面或は第３面のいずれの核酸分子、第４面のいずれのキャリヤー、第５面のいずれの宿主細胞、第６面のいずれの偶聯物或は第７面のいずれの組物とも関係で、ＰＤ−Ｌ１関連の病気（例えば腫瘍、微生物或はウイルス感染、例えばＰＤ−Ｌ１で高く表現された腫瘍或はＰＤ−Ｌ１で高く表現されたウイルス感染）の予防或は治療用薬物の生産準備に用いる。
【００３９】
本発明の実施方案の中に述べた腫瘍は肺癌、卵巣癌、結腸癌、直腸癌、黒色素腫、腎癌、膀胱癌、乳癌、肝臓癌、リンパ腫、悪性の血液病、首頸癌、膠腫、胃癌、鼻息癌、喉癌、子宮頸癌、子宮体癌、骨肉腫、甲状腺癌、前立腺癌を含むが限らない。述べた微生物感染は細菌、真菌、原生動物感染を含むが限らない。述べたウイルス感染は急性、亜急性或は慢性ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶの感染を含むがこれに限らない。
【００４０】
下記は本発明に対して更に説明する。本発明には別に説明しない限り、本文で使っている科学と技術名詞は本分野の技術員が通常の理解意義である。それに、本文中で使っている蛋白質と核酸化学、分子生物学、細胞と組織培養、微生物学、免疫学の関連用語と実験室の操作ステップは相応分野で広く使っている用語と通用ステップである。同時に、更に本発明を理解するために、下記は関連用語の定義と説明を提供する。
【００４１】
本発明に、用語「抗体」は通常で２対同じの多ペブロイン鎖（１対は「軽」（Ｌ）鎖と「重」（Ｈ）鎖一つずつある）が構成された免疫球蛋白分子である。抗体軽鎖はκ軽鎖とλ軽鎖を分類する。重鎖はμ、δ、γ、α或はεを分類し、抗体の同種型を其々にＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡとＩｇＥを定義している。軽鎖と重鎖に、可変区と恒定区は約１２個或はもっと多くのアミノ酸の「Ｊ」区の連接を通過し、重鎖はまた約３個或はもっと多くのアミノ酸の「Ｄ」区も含んである。各重鎖は重鎖可変区（ＶＨ）と重鎖恒定区（ＣＨ）で構成している。重鎖恒定区は３個の構造領域（ＣＨ１、ＣＨ２とＣＨ３）で構成している。各軽鎖は軽鎖可変区（ＶＬ）と軽鎖恒定区（ＣＬ）で構成している。軽鎖恒定区は１個の構造領域ＣＬで構成している。抗体の恒定区は免疫球蛋白と宿主組織或は因子を介導でき、免疫システムの各種細胞（例えば、効果細胞）と経典補修体システムの第１組分（Ｃ１ｑ）の結合を含んである。ＶＨとＶＬ区も高変性を持つ区域（相互補完区域（ＣＤＲ）と呼ぶ）を細分されて、この間に比較的に保守のフレーム区（ＦＲ）の区域を散布している。各ＶＨとＶＬは下記の順序ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアンモニア末端からカルボ基末端まで並んでいる３個のＣＤＲと４個のＦＲで構成している。各重鎖／軽鎖対の可変区（ＶＨとＶＬ）は其々抗体結合部を形成している。アミノ酸から各区域或は構造区域への分配はＫａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７ａｎｄ  １９９１））、或はＣｈｏｔｈｉａ&Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ等の人（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３の定義を従っている。用語「抗体」は何もの特定抗体の発生方法の限定を受けられない。例えば、この中に、特別に再編抗体、単クローン抗体と多クローン抗体は違う型の抗体もできる、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３或はＩｇＧ４亜型）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ或はＩｇＭ抗体である。
【００４２】
本発明には用語抗体の「抗原結合部」は全長抗体の一つ或は複数の部分で、述べた部分は結合抗体が結合された同じの抗原（例えば、ＰＤ−Ｌ１）の能力を保持して、完全抗体と抗原の特異性に対しての結合を競争している。通常参照、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，第２版，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、それの全文が引用を通過して、本分に合併して、全部の目的に用いる。再編ＤＮＡ技術或は完全抗体の酵素促或は化学断裂を通じて抗原結合部を発生している。ある状態で抗原結合部はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂと相互補完決定区（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、組込抗体、双抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）とこんなのポリペプチドを含んである、それはポリペプチドに付与する特異性抗原結合能力の抗体の最低一部を含む。
【００４３】
上記方案を借りて、本発明は最低下記の長所を持ってある。本発明はスクリーニングを通じて、良好特異性、高く親和性と安定性の抗人ＰＤ−Ｌ１人源化単クローン抗体を得って、この抗体は特異性的に人ＰＤ−Ｌ１と結合出来て、Ｂ７家族メンバーと結合しない、活性化のＴ細胞との結合を通じてＴ細胞の活性化作用を強化して、腫瘍の成長に顕著な抑制作用を発揮する。
【００４４】
上記説明はただ本発明技術方案の概説で、もっとはっきり本発明の技術手段を理解する、説明書の内容により実施するために、下記は本発明のより良い実施例と添付図で詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、鼠源ＰＤ−Ｌ１抗体のＥＬＩＳＡ結合活性結果図である。
【図２】図２は、鼠源ＰＤ−Ｌ１抗体のＥＬＩＳＡ抑制活性結果図である。
【図３】図３は、鼠源ＰＤ−Ｌ１抗体の細胞結合活性結果図である。
【図４】図４は、鼠源ＰＤ−Ｌ１抗体の細胞抑制活性結果図である。
【図５】図５は、人源化ＰＤ−Ｌ１抗体の結合動力学曲線図である。
【図６】図６は、人源化ＰＤ−Ｌ１抗体が他のＢ７家族メンバーとの結合特異性及び違う物種ＰＤ−Ｌ１蛋白との結合結果図である。
【図７】図７は、人源化ＰＤ−Ｌ１抗体が表面でＰＤ−Ｌ１を表現するＣＨＯ細胞との結合特異性結果図である。
【図８】図８は、人源化ＰＤ−Ｌ１抗体が再編人ＰＤ−Ｌ１融合蛋白との結合特異性結果図である。
【図９】図９は、人源化ＰＤ−Ｌ１抗体がＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の結合に対しての遮断作用結果図である。
【図１０】図１０は、人源化ＰＤ−Ｌ１抗体が混合リンパ細胞反応中に細胞因子ＩＦＮ−γ分泌に対しての影響結果図である。
【図１１】図１１は、人源化ＰＤ−Ｌ１抗体が混合リンパ細胞反応中に細胞因子ＩＬ−２分泌に対しての影響結果図である。
【図１２】図１２は、人源化ＰＤ−Ｌ１抗体が血清中での安定性結果図である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
下記から添付図と実施例を結合して、本発明の具体的な実施方式を更に詳しく説明する。下記の実施例は本発明を説明するが、本発明の範囲を限らない。
【００４７】
実施例１  鼠源抗体のスクリーニング
１．１動物免疫
経典の免疫時間表を使って、ＢＡＬＢ／ｃ小鼠に免疫、免疫源はｈＰＤ−Ｌ１（人源ＰＤ−Ｌ１）蛋白（北京義翹神州生物技術有限会社から購入）、動物にｈＰＤ−Ｌ１を抵抗する抗体を発生させる。具体的な方案は表１の通りである。
【００４８】
【表１】
2019514853.tif 000003
【００４９】
１．２細胞融合及び雑交腫細胞のスクリーニング
融合前に小鼠の骨髄腫ＳＰ２／０の状態を調整して、それの生長密度は１．０×１０６個の細胞を超えない事を保証して、３日間前に終免を行って、終免は尾静脈注射の方式を採用、一日前に飼育細胞を準備して、敷く板数量は２．０×１０４個細胞／穴である。ＰＥＧ融合を通じて、脾臓の細胞とＳＰ２／０細胞の数量比は１０：１〜５：１の間で、穴ごとに敷く脾臓の細胞の数量は１．０×１０５個以下である。７日間融合後、上清液を収穫して、培養基を交換する。
【００５０】
収穫された上清液はまず直接ＥＬＩＳＡ結合方法を通じて初回のスクリーニングを行って、スクリーニングされた陽性クローンが拡増してから上清液を取って、再スクリーニングを行う。
【００５１】
再スクリーニングは細胞結合及び細胞抑制実験を採用して２回のスクリーニングを行って、スクリーニングされて取った陽性クローンが有限希釈法を採用して、亜クローンを行って、９６個の穴を敷いて、其々５個／穴、２個／穴と１個／穴である。７日間培養後、直接ＥＬＩＳＡ結合実験を採用してスクリーニングを行って、陽性亜クローンを選択して拡増してから種を保つ。
【００５２】
この中に関連する各実験方法の具体的なステップは下記の通りである。
Ａ．ＥＬＩＳＡ結合方法
バッグｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃは板にある、段差希釈の抗体を入れて、孵化洗浄後、羊抗鼠−ＨＲＰも入れて、色が出て、読数から反応曲線をまねて作成して、ＥＣ５０値を計算する。
Ｂ．細胞結合実験
１日前にｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ過剰発現細胞を検測、培養用の細胞板に敷いて、翌日閉鎖してから段差希釈の抗体を入れて、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＥＵも入れて、データを読み取って良い。
Ｃ．細胞抑制実験
１日前にｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ過剰発現細胞を検測、培養用の細胞板に敷いて、翌日閉鎖してから段差希釈の抗体を入れて、ＰＤ１−Ｆｃ−Ｂｉｏｔｉｎも入れて、Ｅｕｒｏｐｉｕｍ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎも入れて、データを読み取って良い。
【００５３】
１．３鼠源抗体の生産準備と活性鑑定
選択された陽性亜クローンハイブリドーマ細胞をＳＦＭ培養基に接種して、７日間頃培養後、上清を収集して、遠心で濾してからＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ精製カラムで精製して、精製抗体を其々ＥＬＩＳＡ結合活性、ＥＬＩＳＡ抑制活性、細胞結合活性、細胞抑制活性の検測を行う。スクリーニングして、活性が最高の鼠源抗ＰＤ−Ｌ１単クローン抗体を収穫して、ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１と命名する。
【００５４】
この中に関連する各実験方法の具体的なステップは下記の通りである。
Ａ．ＥＬＩＳＡ結合活性
バッグｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃは板にある、段差希釈の抗体を入れて、孵化洗浄後、羊抗鼠−ＨＲＰも入れて、色が出て、読数から反応曲線を作成して、結果が図１の通り、ＥＣ５０値を計算して、それとｈＰＤ−Ｌ１の結合活性ＥＣ５０は１．６７ｎｇ／ｍＬである。
Ｂ．ＥＬＩＳＡ抑制活性
段差希釈の抗体とある程度の濃度のｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ−Ｂｉｏｔｉｎを同時にバッグｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの板に入れて、孵化洗浄後ＳＡ−ＨＲＰも入れて、色が出て、読数から反応曲線を作成して、結果は図２の通り、ＩＣ５０値を計算して、それの抑制活性ＩＣ５０は０．８６ｎＭである。
Ｃ．細胞結合活性
１日前にｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ過剰発現細胞を検測、培養用の細胞板に敷いて、翌日閉鎖してから段差希釈の抗体を入れて、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＥＵも入れ、データを読み取って、反応曲線を作成して、結果は図３の通り、計算しました細胞結合活性ＥＣ５０は３０．２９ｎｇ／ｍＬである。
Ｄ．細胞抑制活性
１日前にｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ過剰発現細胞を検測、培養用の細胞板に敷いて、翌日閉鎖してから段差希釈の抗体を入れて、ＰＤ１−Ｆｃ−Ｂｉｏｔｉｎも入れて、Ｅｕｒｏｐｉｕｍ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎも入れて、データを読み取って、反応曲線を作成して、結果は図４の通り、計算した細胞抑制活性ＩＣ５０は６３７．８ｎｇ／ｍＬである。
【００５５】
実施例２  鼠源抗体人源化と親和力の成熟
２．１  鼠源抗体遺伝子の獲得
Ｐｕｒｅｌｉｎｋ  ＲＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  ｋｉｔを利用して、ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１雑交腫の総ＲＮＡを抽出して、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＴＭＩＩ  １ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ逆回転録ＲＮＡでｃＤＮＡを生産準備する。別々にＬｅａｄｅｒ  ｐｒｉｍｅｒを使って抗体の重鎖と軽鎖の可変区を拡増して、反応システムとＰＣＲ条件は其々表２と３の表示である。
【００５６】
【表２】
2019514853.tif 000004
【００５７】
【表３】
2019514853.tif 000005
【００５８】
電気泳動で分析したＰＣＲ結果、拡増産物の反応管に０．５μｌ  ＬＡ  Ｔａｑ酵素を入れて、７２℃で１０ｍｉｎ反応した。その後、酵素連接を行って、反応システムは表４の表示である。
【００５９】
【表４】
2019514853.tif 000006
【００６０】
酵素連接が終ってから、転化、クローンを選別、種を保護して、鼠源抗人ＰＤ−Ｌ１抗体を得る。順序を図ってから、獲得されたそれの重鎖可変区核酸の序列とアミノ酸序列の序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と２の表示、軽鎖可変区核酸の序列とアミノ酸の序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と４の表示である。
【００６１】
２．２人源化設計
スクリーニングして得た鼠源抗体序列を分析して、人の胚系（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）遺伝子と比較して、ＫＶ１−９＊０１は軽鎖人源化フレーム序列、ＨＶ１−４６＊０３は重鎖人源化フレーム序列と確定した。ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇを通じて、重鎖と軽鎖のＣＤＲを構造序列に並行して、人源化抗体を構築して、人源化抗体可変区の断片を遺伝子合成させる。得たそれの重鎖可変区核酸の序列とアミノ酸の序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と６の表示、軽鎖可変区核酸の序列とアミノ酸の序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７和８の表示である。
【００６２】
２．３抗体庫構築
鼠源抗体ＣＤＲのＤＮＡ序列を分析して、可変区ＣＤＲ中の突変位点を確定する。プライマーの序列を設計して、突変位点の位置をＮＮＳに設定して、任意のアミノ酸をコードさせる。人源化抗体ｓｃＦｖをテンプレートとして、ＰＣＲにｓｃＦｖ抗体庫を拡増し、ｓｃＦｖ抗体庫はｓｆｉＩ酵素の切位点を通じて、バクテリオファージの質粒に構築して、二級抗体庫を構築する。
【００６３】
２．４抗体庫スクリーニング
その後、バクテリオファージの展示を通じて、高く親和力の抗体スクリーニングを行う。具体的な方法は下記の通りである。
Ａ、電転化を通じて、ｓｃＦｖを含む抗体庫のバクテリオファージ質粒を大腸菌ＴＧ１に転化して、３７℃、２２０ｒｐｍ、１ｈの恢復を経って、補助バクテリオファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）を残りの菌液に入れて、別にアンモニアシリンを入れて、３７℃、２２０ｒｐｍ、１ｈ２５００ｒｐｍ×５ｍｉｎ遠心方法で上清を取り除いて、２×ＹＴ−ＡＫ培養基で菌泥を吹き、３７℃、２２０ｒｐｍ一晩置いて培養する。
Ｂ．バッグ抗原：バッグ緩衝液でｈＰＤ−Ｌ１−ＦＣを希釈して、均一に混合してから免疫管に入れて、４℃バッグで一晩置く。
Ｃ．再編バクテリオファージの収集：上記の一晩置いた培養菌液は２５００ｒｐｍ×５ｍｉｎ遠心して上清１０ｍｌを収集して、２ｍｌ  ＰＥＧ／ＮａＣｌを入れて、均一に混合してから氷に３０−６０ｍｉｎを置いて、１００００ｇ×２０ｍｉｎ遠心して、上清を取り除いて、２×ＹＴ培養基でバクテリオファージ庫を溶解する。
Ｄ．閉鎖：ＰＢＳで免疫管を２回洗浄して、閉鎖液を入れて、室温１ｈそれに、相同体積の閉鎖液とバクテリオファージ庫を混合して、室温で１０−１５ｍｉｎ閉鎖する。
Ｅ．バクテリオファージ庫の孵化：ＰＢＳで免疫管を２回洗浄して、閉鎖したバクテリオファージ庫を入れて、３７℃の培養箱  ２−３ｈ  
Ｆ．洗脱：１００μｌ  のＴＧ１菌液（前日の接種）を１０ｍｌ  ２×ＹＴの中に入れて、３７℃、２２０ｒｐｍでＡ６００値０．４−０．５まで培養する。ＰＢＳＴで免疫管を８回洗浄して、もう一回ＰＢＳで免疫管を２回洗浄して、５ｍｌの対数期生長の菌液を入れて、３７℃、２２０ｒｐｍ、１ｈ
Ｇ．ＯＵＴＰＵＴ：上記の菌液を１０−１、１０−２まで希釈してから別々に１００ｕｌを取って平板に塗り付ける。
Ｈ．次回のスクリーニング：２００μｌ  ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅを５ｍｌの洗脱後の菌液に入れて、同時に５μｌアンモニアシリンを入れて、３７℃、２２０ｒｐｍ、１ｈ２５００ｒｐｍ×５ｍｉｎ遠心して上清を取り除いて、１０ｍｌ  ２×ＹＴ−ＡＫで菌泥を吹き、３７℃、２２０ｒｐｍ一晩置いて培養する。
ステップＢ−Ｈを繰り返す。
【００６４】
三回のスクリーニングが終わったら、単クローンを選択して、再編バクテリオファージを生産準備して、Ｐｈａｇｅ  ＥＬＩＳＡ方法を使って、再編バクテリオファージの活性を検測する。具体は下記の通りである。
Ａ．バッグｈＰＤ−Ｌ１−ＦＣ、４℃一晩置く；
Ｂ．ＰＢＳＴで２回を洗浄して、ｐｈａｇｅ上清を入れて、２５℃、１ｈ；
Ｃ．ＰＢＳＴで３回を洗浄して、希釈のａｎｔｉ−Ｍ１３−ｂｉｏｔｉｎＡｂを入れて、２５℃、１ｈ；
Ｄ．ＰＢＳＴで３回を洗浄して、希釈のＨＲＰ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、２５℃、１ｈ；
Ｅ．ＰＢＳＴで３回を洗浄して、予熱したＴＭＢを入れて、２５℃、１０ｍｉｎ、１Ｍ  Ｈ．２ＳＯ  ４を入れ反応を中止になり、ＯＤ４５０で光熱値を検測する。陽性クローンを選択して、序列の測定に送って、ＰＣＲを通じて、重鎖可変区或は軽鎖可変区がそれの対応の人源抗体の恒定区の序列と連接して、拡増した抗体重鎖と軽鎖の全長断片（信号ペプチドが含む）は別々にｐｃＤＮＡ３．１ＧＳにクローンする。
【００６５】
上記実験を通じて、スクリーニングしてから３株の人源化抗体を得て、別々にａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１、ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−２、ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−３と命名させる。相応的に、ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１の重鎖と軽鎖の質粒は其々Ｐ３．１ＧＳ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１−ＨＣとＰ３．１ＧＳ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１−ＬＣと呼ぶ、ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−２の重鎖と軽鎖の質粒は其々Ｐ３．１ＧＳ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−２−ＨＣとＰ３．１ＧＳ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−２−ＬＣと呼ぶ、ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−３の重鎖と軽鎖の質粒は其々Ｐ３．１ＧＳ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−３−ＨＣとＰ３．１ＧＳ−ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−３−ＬＣと呼ぶ。序列の情報は具体的に下記の通りである。
【００６６】
１）ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１重鎖ヌクレオチド酸序列とアミノ酸序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９と１０の表示である。この中、重鎖可変区ヌクレオチド酸序列：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＴＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＴＡＣＣＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＧＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＧＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＴＡＧＧＣＡＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）
【００６７】
横線を引く部分は其々ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１−１３である。横線を引いてない部分は其々ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４−１７である。
【００６８】
対応的に、重鎖可変区のアミノ酸序列：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＫＹＩＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＦＹＰＧＳＧＮＩＲＹＮＥＫＩＫＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＥＬＧＧＧＹＦＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）
【００６９】
横線を引く部分は其々ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８−２０である。横線を引いてない部分は其々ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１−２４である。
【００７０】
ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１軽鎖ヌクレオチド酸序列とアミノ酸序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５と２６の表示である。この中、軽鎖可変区ヌクレオチド酸序列：
ＧＡＴＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＧＴＧＡＧＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）
【００７１】
横線を引く部分は其々ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７−２９である。横線を引いてない部分は其々ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０−３３である。
【００７２】
対応的に、軽鎖可変区のアミノ酸序列：
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＳＮＩＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）
【００７３】
横線を引く部分は其々ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４−３６である。横線を引いてない部分は其々ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７−４０である。
【００７４】
２）ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−２重鎖ヌクレオチド酸序列とアミノ酸序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９と１０の表示である。この中、重鎖可変区ヌクレオチド酸序列：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＴＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＴＡＣＣＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＧＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＧＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＴＡＧＧＣＡＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）
【００７５】
横線を引く部分は其々ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１−１３である。横線を引いてない部分は其々ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１４−１７である。
【００７６】
対応的に、重鎖可変区のアミノ酸序列：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＫＹＩＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＦＹＰＧＳＧＮＩＲＹＮＥＫＩＫＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＥＬＧＧＧＹＦＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）
【００７７】
横線を引く部分は其々ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８−２０である。横線を引いてない部分は其々ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１−２４である。
【００７８】
ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−２軽鎖ヌクレオチド酸序列とアミノ酸序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１と４２の表示である。この中、軽鎖可変区ヌクレオチド酸序列：
ＧＡＴＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＣＧＧＧＧＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣ  ＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４３）
【００７９】
横線を引く部分は其々ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４、２８、２９である。横線を引いてない部分は其々ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０−３３である。
【００８０】
対応的に、軽鎖可変区のアミノ酸序列：
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＳＫＴＧＮＩＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４５）
【００８１】
横線を引く部分は其々ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６、３５、３６である。横線を引いてない部分は其々ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７−４０である。
【００８２】
３）ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−３重鎖ヌクレオチド酸序列とアミノ酸序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９と１０の表示である。この中、重鎖可変区ヌクレオチド酸序列：
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＡＧＴＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＴＡＣＣＣＴＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＧＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧＧＧＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＧＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＴＧＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＧＣＴＡＧＧＣＡＣＧＧＡＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＧＧＣＴＡＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＡＡＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５）
【００８３】
横線を引く部分は其々ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１−１３である。横線を引いてない部分は其々ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４−１７である。
【００８４】
対応的に、重鎖可変区のアミノ酸序列：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＫＹＩＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＦＹＰＧＳＧＮＩＲＹＮＥＫＩＫＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＧＥＬＧＧＧＹＦＦＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６）
【００８５】
横線を引く部分は其々ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８−２０である。横線を引いてない部分は其々ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１−２４である。
【００８６】
ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−３軽鎖ヌクレオチド酸序列とアミノ酸序列は其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７と４８の表示である。この中、軽鎖可変区ヌクレオチド酸序列：
ＧＡＴＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＣＧＣＧＴＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＴＧＧＡＴＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＧＣＣＴＡＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＡＡＣＣＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣ  ＣＡＡＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４９）
【００８７】
横線を引く部分は其々ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０、２８、２９である。横線を引いてない部分は其々ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０−３３である。
【００８８】
対応的に、軽鎖可変区のアミノ酸序列：
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＳＧＡＳＮＩＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＷＩＹＡＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１）
【００８９】
横線を引く部分は其々ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２、３５、３６である。横線を引いてない部分は其々ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４、それの序列コードは其々ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７−４０である。
【００９０】
実施例３  人源化抗体の表現質粒の構築
３株の抗体が全部わりによい特異性を表示しているから、本実施例はただＰ３．１ＧＳ−ＰＤ−Ｌ１−１−ＨＣとＰ３．１ＧＳ−ＰＤ−Ｌ１−１−ＬＣをテンプレートとして更に説明する。ＰＣＲが全長抗体重鎖断片と軽鎖断片の拡増する事を通じて、人源化抗体の表現質粒を構築する。
【００９１】
軽鎖と重鎖の上下流のプライマー、反応システム及びＰＣＲ条件は表５、表６と表７の表示である。
【００９２】
【表５】
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【表６】
2019514853.tif 000008
【表７】
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【００９３】
ＰＣＲ産物を利用して、試剤ボックス、軽鎖と重鎖の全長序列を回収する。抗体断片軽鎖、重鎖及び質粒に対して別々に双酵素切りを行って、電気泳動後、抗体酵素切りと質粒酵素切り断片を回収してから、断片を酵素連接を行う。酵素連接後の人源化抗体の表現質粒はＰ３．１ＧＳ−ＰＤ−Ｌ１−１と命名させる。反応システムは表８〜表１０の表示である。
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【００９４】
上記酵素連接の産物を１００μＬ  ＸＬ１−１０の感受態に入れて、３０分間冷凍してから、４２℃  ９０秒熱打して、迅速に氷に２分間を置いて、５００μＬ  ＬＢの培養基を入れて、３７℃  振分盤で１ｈを培養して、菌液は４０００ｒｐｍ  ５分間を遠心して、銃で菌泥を吹き、５０μｇ／ｍＬ  ＡＭＰが含有するＬＢ固体平板に塗り付けて、３７℃一晩置いて培養する。選別菌を５ｍＬ  ＬＢ液体培養基（５０μｇ／ｍＬ  ＡＭＰ）に落ちて、３７℃２５０ｒｐｍ６ｈ培養して、ＰＣＲでクローンを検証して、１５％の除菌甘油で陽性菌種を保蔵して、毎クローンは２本、一本は保存管に冷凍して序列測定に送って、もう一本は−２０℃で保存する。
【００９５】
実施例４  安定表現細胞株の開発
【００９６】
人源化抗体表現質粒Ｐ３．１ＧＳ−ＰＤ−Ｌ１−１、転染め前にＰｖｕＩでリニア化を行う。電気転染めの方法で、人源化抗体軽鎖、重鎖遺伝子を含有するリニア化質粒をＣＨＯ−ＫＳＭ４に転染め、２回転染め。
【００９７】
転染め後、アンモニアを外して、加圧でスクリーニングして、転染め細胞が２日間恢復後、加圧で板を敷く。約３０−４０日間培養後、９６個の穴板にクローンが成長している事を観察できる。その時、生産量の鑑定を行って、高産量クローンを転移して培養も拡増する。細胞数量が２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ頃に達したら、接種と原料を追加していくつかのロットを分けて培養する。培養が終了後上清を収穫して、生産量の鑑定を行って、予備選親クローンを獲得する。高産量のクローンに対して亜クローンスクリーニングを行って、半固体敷く板、６穴板  穴ごとに３０００−５０００個の細胞がいる、培養基２．５ｍＬ、板を敷く後３７℃、５％ＣＯ２に静置培養、７−１２日間を培養して単クローンを選択できる。選択された単クローンに生産量の鑑定を行って、予備選クローンを獲得する。
【００９８】
獲得された９株の高産量細胞株に振瓶、補料の実験を行う。振瓶、補料の方案：ＣＤＭ４ＣＨＯを基礎培養基として接種して、接種の密度は５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、接種後、３７℃、５％ＣＯ２、１２０ｒｐｍで培養して、接種の当日は第０日、第３日から７０ｇ／Ｌのｃｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ５を補充して、細胞の収穫まで、毎日接種体積の６％を補充する。補料を経って、細胞株の最高産量は１．９７ｇ／Ｌを達し、表現された抗体はａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１と命名させる。
【００９９】
実施例５  抗体の結合特異性と結合動力学の比較
Ｂｉａｃｏｒｅを利用して実施例四中の細胞株の表現抗体の親和力と結合動力学を分析する。標準アミン偶聯化学とＢｉａｃｏｒｅから提供した試剤ボックスを利用して、バスタミン経由して、羊抗人ＩｇＧをＣＭ５チップと共価連接する。抗体が１０μＬ／ｍｉｎの流速でＨＢＳ  ＥＰ緩衝液の中に流動させて、結合を測定する。結合時間３００秒、解離時間１２００秒測定結合動力学曲線は図５の通り、計算で取ったｋａ、ｋｄとＫＤ値は表１１の通りである。
【表１１】
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【０１００】
実施例６  ＥＬＩＳＡが他のＢ７家族メンバーとの結合特異性及び違う物種のＰＤ−Ｌ１蛋白との結合を測定する。
【０１０１】
Ｂ７家族メンバーＢ７−１、Ｂ７−２とＰＤ−Ｌ２蛋白及び鼠、食い蟹の猿と人のＰＤ−Ｌ１蛋白と人源化抗体ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１の結合を測定する。違う蛋白は０．５μｇ／ｍＬの濃度でバッグ緩衝液の中に４℃一晩置く。翌日、穴中の溶液を捨てて、ＰＢＳＴで２回洗浄する。後、１％ＢＳＡを入れて、３７℃  １ｈ閉鎖後、ＰＢＳＴで２回洗浄する。０．５μｇ／ｍＬ抗体サンプルを入れて、１ｈ孵化して、ＰＢＳＴで３回洗浄する。羊抗人ＦＡＢ−ＨＲＰを使って、１：１００００希釈、３７℃  １ｈ孵化、ＰＢＳＴで３回洗浄する。ＴＭＢ入れて、１５ｍｉｎ顕色、０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を中止され、４５０ｎｍに吸光度を読み出す。
【０１０２】
結果は図６の通り、人源化抗体ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１はＢ７家族の他のメンバーと結合しない。人源化抗体ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１は類似の親和力で人或は食い蟹の猿のＰＤ−Ｌ１蛋白と結合する。
【０１０３】
実施例７  ＥＬＩＳＡは抗体が表面表現ＰＤ−Ｌ１のＣＨＯ細胞との結合特異性を測定する。
【０１０４】
細胞表面に再編人ＰＤ−Ｌ１の中国ハムスター卵巣（ＣＨＯ）を表現する細胞系を構築して、ＥＬＩＳＡで人源化抗体ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１の結合特異性を測定する。前日のＰＤ−Ｌ１過剰発現細胞敷く板を検測して、穴ごとにＴ７５瓶の満杯の１／２００を付ける。後、１％ＢＳＡを入れて、３７℃  １ｈ閉鎖する。抗体は５μｇ／ｍＬから順次に３倍希釈を行う、全部で８個の濃度段差、１００μＬ／穴、２５℃１ｈ孵化、ＰＢＳで１回洗浄する。穴ごとに入れた５０ｎｇ／ｍＬ  ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ−Ｅｕの体積は１００μＬ、２５℃  ０．５反応、ＰＢＳで１回洗浄する。蛍光増強液を入れて、激発光３３７ｎｍ／発射光６２０ｎｍの読数
【０１０５】
結果は図７の表示で、人源化抗体ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１はＰＤ−Ｌ１を経由で転染めのＣＨＯ細胞と有効的に結合できる、ＥＣ５０は９３．５０ｎｇ／ｍＬ達する。
【０１０６】
実施例８  ＥＬＩＳＡは抗体が再編人ＰＤ−Ｌ１融合蛋白との結合特異性を測定する。
【０１０７】
０．５μｇ／ｍＬの再編人ＰＤ−Ｌ１融合蛋白はバッグ緩衝液の中に４℃一晩置く。翌日、穴中の溶液を捨てて、ＰＢＳＴで２回洗浄する。後、１％ＢＳＡを入れて、３７℃  １ｈ閉鎖する。ＰＢＳＴで２回洗浄する。抗体は１μｇ／ｍＬから順次に３倍希釈を行う、全部で８個の濃度段差、１００μＬ／穴、２５℃１ｈ孵化、ＰＢＳで３回洗浄する。羊抗人ＦＡＢ−ＨＲＰを使って、１：１００００希釈、３７℃  １ｈ孵化、ＰＢＳＴで３回洗浄する。ＴＭＢ入れて、１５ｍｉｎ顕色、０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を中止され、４５０ｎｍに吸光度を読み出す。
【０１０８】
結果は図８の表示で、人源化抗体ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１は再編人ＰＤ−Ｌ１融合蛋白と有効的にお互いに作用できる、ＥＣ５０は１９．４７ｎｇ／ｍＬである。
【０１０９】
実施例９  抗体はＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１との結合に対しての遮断作用である。
【０１１０】
０．５μｇ／ｍＬの再編人ＰＤ−Ｌ１融合蛋白はバッグ緩衝液の中に４℃一晩置く。翌日、穴中の溶液を捨てて、ＰＢＳＴで２回洗浄する。後、１％ＢＳＡを入れて、３７℃  １ｈ閉鎖後、ＰＢＳＴで２回洗浄する。抗体は１０μｇ／ｍＬから順次に２．５倍希釈を行う、全部で８個の濃度段差、同じ体積の１μｇ／ｍＬの  ＰＤ１−Ｆｃ−Ｂｉｏｔｉｎを混合して、２５℃１ｈ孵化、ＰＢＳで３回洗浄する。鎖親和素−ＨＲＰで１：１００００、３７℃  １ｈ孵化、ＰＢＳＴで３回洗浄する。ＴＭＢ入れて、１５ｍｉｎ顕色、０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を中止され、４５０ｎｍに吸光度を読み出す。
【０１１１】
結果は図９の表示で、人源化抗体ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１は配体ＰＤ−Ｌ１がＰＤ−１との結合を遮断できる。ＩＣ５０は４３．１６ｎｇ／ｍＬである。
【０１１２】
実施例１０  抗体は混合リンパ細胞の反応中に細胞因子分泌への影響である。
【０１１３】
ＰＢＳ緩衝液１：１血液を希釈して、３ｍＬのＬＳＭを遠心管に移動して、希釈された血液４ｍＬを入れて、注意：入れる時、希釈後の血液はＬＳＭの上層にある、均一に混合する事が不可である。４００ｇ、ＲＴ  ３０−４０ｍｉｎ遠心最後、分離された上層のＰＢＭＣを吸出し、１００ｇ  １０ｍｉｎ遠心。ＢＤ公司のＣＤ４＋細胞分離磁珠を使って、ＣＤ４＋Ｔ細胞を分離する。ＢＤ公司のＤＣ細胞分離磁珠を使って、ＤＣ細胞を分離する。９６穴板の穴ごとにＣＤ４＋Ｔ細胞の数量は１×１０５、ＤＣ数量は１×１０４、体積合計１００μＬ  共培養する。段差希釈された抗体を入れて、５日間培養後、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２の濃度を検測する。
【０１１４】
結果は図１０と１１の表示、人源化抗体ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１は有効的に混合リンパ細胞がＩＦＮ−γとＩＬ−２を分泌する事を促進できる。
【０１１５】
実施例１１  抗体は血清中の安定性である。
【０１１６】
猿血清で人源化抗体ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１を希釈して、濃度は０．５ｍｇ／ｍＬである。３７℃で其々０日間、１日間、４日間、７日間置く。
【０１１７】
再編人ＰＤ−Ｌ１融合蛋白は０．５μｇ／ｍＬの濃度でバッグ緩衝液の中に４℃一晩置く。翌日、穴中の溶液を捨てて、ＰＢＳＴで２回洗浄する。後、１％ＢＳＡを入れて、３７℃  １ｈ閉鎖後、ＰＢＳＴで２回洗浄する。安定性抗体サンプルは１μｇ／ｍＬから順次に３倍希釈を行う、全部で８個の濃度段差、３７℃１ｈ孵化、ＰＢＳＴで３回洗浄する。羊抗人ＦＡＢ−ＨＲＰを使って、１：１００００希釈、３７℃  １ｈ孵化、ＰＢＳＴで３回洗浄する。ＴＭＢ入れて、１５ｍｉｎ顕色、０．５ＭのＨ２ＳＯ４で反応を中止され、４５０ｎｍに吸光度を読み出す。結果は図１２の表示、人源化抗体ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−１は良好の血清安定性を表して、７日間以内に明らかな活性減衰が表示されていない。
【０１１８】
上記はただ本発明の最好選択実施方式、本発明の制限に適用しない、指摘しないといけないのは、本技術分野の普通技術者に対して、本発明の技術原理を脱離しない前提で若干の改進と変型も行ける、こんなの改進と変型が本発明の保護範囲とも見なす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2019514853.tif 000022
【図１０】
2019514853.tif 000023
【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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