(57)【要約】  修飾された免疫優性領域を有し、修飾された成熟切断部位を有するものを含む、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の修飾型、並びにそれらを含有するウイルス及びウイルス様粒子が開示される。
2019506168.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザＡ又はＢの修飾ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質であって、前記ＨＡタンパク質の免疫優性領域が、保存された代替インフルエンザエピトープを、前記領域への挿入により含有するか、又は前記領域を前記インフルエンザの保存された代替エピトープで置換することにより含有する、修飾ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質。
【請求項２】
生ウイルス若しくは弱毒ウイルス中に、又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）中に含有される、請求項１に記載の修飾ＨＡタンパク質。
【請求項３】
生ウイルス中に含有され、動物のプロテアーゼによって切断されない修飾された成熟切断部位（ＭＣＳ）をさらに含む、請求項２に記載の修飾ＨＡタンパク質。
【請求項４】
前記修飾されたＭＣＳが、適切なプロテアーゼによって切断されている、請求項３に記載の修飾ＨＡタンパク質。
【請求項５】
前記インフルエンザの代替エピトープが、インフルエンザＨＡタンパク質のステムドメイン由来のエピトープであるか、又はＭ２インフルエンザタンパク質のエピトープである、請求項１〜４のいずれかに記載の修飾ＨＡタンパク質。
【請求項６】
前記ＨＡタンパク質の１つ以上の免疫優性領域が、代替インフルエンザエピトープを含有するように修飾されている、請求項１〜４のいずれかに記載の修飾ＨＡタンパク質。
【請求項７】
前記１つ以上の免疫優性領域の各々に含有される前記代替インフルエンザエピトープの少なくとも一部が互いに異なる、請求項６に記載の修飾ＨＡタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載の修飾ＨＡタンパク質を含むインフルワクチン。
【請求項９】
動物のプロテアーゼによって切断されないＭＣＳを含有するように修飾されているインフルエンザＨＡタンパク質を含む修飾インフルエンザウイルス。
【請求項１０】
前記ＭＣＳが、適切なプロテアーゼによって切断されている、請求項９に記載の修飾インフルエンザウイルス。
【請求項１１】
前記ＨＡタンパク質が、少なくとも１つの免疫優性領域中に異種免疫原エピトープをさらに含有する、請求項９に記載の修飾インフルエンザウイルス。
【請求項１２】
前記異種免疫原エピトープが、腫瘍関連抗原のものであるか、又はインフルエンザ以外のウイルスのエピトープ若しくは代替インフルエンザエピトープである、請求項１１に記載の修飾インフルエンザウイルス。
【請求項１３】
前記ＨＡタンパク質の１つ以上の免疫優性領域が、異種エピトープを含有するように修飾されている、請求項１１に記載の修飾インフルエンザウイルス。
【請求項１４】
前記１つ以上の免疫優性領域の各々に含有される前記異種エピトープの少なくとも一部が互いに異なる、請求項１３に記載の修飾インフルエンザウイルス。
【請求項１５】
動物のプロテアーゼによって切断されないＭＣＳを含有し、かつ、少なくとも１つの免疫優性領域に挿入されているか、又は当該領域を置換する異種免疫原エピトープをさらに含有するように修飾されている、修飾ＨＡタンパク質。
【請求項１６】
前記ＭＣＳが適切なプロテアーゼによって切断されており、かつ／又は前記異種免疫原エピトープが、腫瘍関連抗原のものであるか、又はインフルエンザ以外のウイルスのエピトープ若しくは代替インフルエンザエピトープである、請求項１５に記載の修飾ＨＡタンパク質。
【請求項１７】
インフルに対する抗体を生成する方法であって、非ヒト対象に請求項８に記載のインフルワクチンを投与することを含む方法。
【請求項１８】
前記ワクチンを対象に投与することを含む、対象をインフルに対して防御する方法において使用するための、請求項８に記載のインフルワクチン。
【請求項１９】
所望の抗原に対する抗体を生成する方法であって、請求項９〜１４のいずれかに記載の修飾インフルエンザウイルスを対象に投与することを含む方法。
【請求項２０】
インフルエンザＨＡタンパク質の少なくとも有効部分をコードする核酸であって、インフルエンザタンパク質の代替エピトープをコードするヌクレオチド配列が、前記ＨＡタンパク質の免疫優性領域をコードするヌクレオチド配列に挿入されているか、又は前記ＨＡタンパク質の免疫優性領域をコードするヌクレオチド配列を置換している、核酸。
【請求項２１】
前記ＭＣＳをコードするヌクレオチド配列が、動物のプロテアーゼによって切断されないＭＣＳをコードするように修飾されている、請求項２０に記載の核酸。
【請求項２２】
前記ＨＡタンパク質の免疫優性領域をコードする１つ以上の領域が、代替インフルエンザエピトープをコードするヌクレオチド配列を含有するように修飾されている、請求項２０に記載の核酸。
【請求項２３】
前記ＨＡタンパク質の免疫優性領域をコードする１つ以上の領域が、代替インフルエンザエピトープをコードするヌクレオチド配列を含有するように修飾されている、請求項２１に記載の核酸。
【請求項２４】
インフルエンザＨＡタンパク質の少なくとも有効部分をコードする核酸であって、ＭＣＳをコードするヌクレオチド配列が、動物のプロテアーゼによって切断されないＭＣＳをコードするように修飾されている、核酸。
【請求項２５】
異種エピトープをコードするヌクレオチド配列が、前記ＨＡタンパク質の免疫優性領域をコードするヌクレオチド配列に挿入されているか、又は前記ＨＡタンパク質の免疫優性領域をコードするヌクレオチド配列を置換している、請求項２４に記載の核酸。
【請求項２６】
前記ＨＡタンパク質の免疫優性領域をコードする１つ以上の領域が、異種エピトープをコードするヌクレオチド配列を含有するように修飾されている、請求項２５に記載の核酸。
【請求項２７】
請求項２０〜２６のいずれかに記載のヌクレオチド配列をコードし、組換え宿主細胞において発現する核酸。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸を含有する組換え宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１に記載の修飾ＨＡタンパク質を調製する方法であって、インフルエンザタンパク質の代替エピトープをコードするヌクレオチド配列が前記ＨＡタンパク質の免疫優性領域をコードするヌクレオチド配列に挿入されているか又は前記ＨＡタンパク質の免疫優性領域をコードするヌクレオチド配列を置換している、インフルエンザＨＡタンパク質の少なくとも有効部分をコードする核酸を含む組換え宿主細胞を、前記核酸が発現する条件下で培養することと、修飾ＨＡタンパク質を回収することとを含む方法。
【請求項３０】
請求項３に記載の修飾ＨＡタンパク質を調製する方法であって、インフルエンザタンパク質の代替エピトープをコードするヌクレオチド配列が前記ＨＡタンパク質の免疫優性領域をコードするヌクレオチド配列に挿入されているか又は前記ＨＡタンパク質の免疫優性領域をコードするヌクレオチド配列を置換しており、かつ、前記ＭＣＳをコードするヌクレオチド配列が動物のプロテアーゼによって切断されないＭＣＳをコードするように修飾されている、インフルエンザＨＡタンパク質の少なくとも有効部分をコードする核酸を含む組換え宿主細胞を、前記核酸が発現する条件下で培養することと、修飾ＨＡタンパク質を回収することとを含む方法。
【請求項３１】
請求項９に記載の修飾インフルエンザウイルスを調製する方法であって、前記ＭＣＳをコードするヌクレオチド配列が動物のプロテアーゼによって切断されないＭＣＳをコードするように修飾されている、インフルエンザＨＡタンパク質の少なくとも有効部分をコードする核酸を含む組換え宿主細胞を、前記核酸が発現する条件下で培養することと、修飾インフルエンザウイルスを回収することとを含む方法。
【請求項３２】
請求項１１に記載の修飾インフルエンザウイルスを調製する方法であって、前記ＭＣＳをコードするヌクレオチド配列が動物のプロテアーゼによって切断されないＭＣＳをコードするように修飾され、かつ、前記ＨＡタンパク質の免疫優性領域をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列が異種エピトープをコードするヌクレオチド配列を含有するように修飾されている、インフルエンザＨＡタンパク質の少なくとも有効部分をコードする核酸を含む組換え宿主細胞を、前記核酸が発現する条件下で培養することと、修飾インフルエンザウイルスを回収することとを含む方法。
【請求項３３】
インフルエンザに対する抗体を生成する方法であって、非ヒト対象に請求項２０〜２７のいずれかに記載の核酸を投与することを含む方法。
【請求項３４】
前記核酸を対象に投与することを含む、対象をインフルエンザに対して防御する方法において使用するための、請求項２０〜２７のいずれかに記載の核酸。
【請求項３５】
所望の抗原に対する抗体を生成する方法であって、請求項２０〜２７のいずれかに記載の核酸を対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年２月３日出願の「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｗｉｔｈ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題された米国仮特許出願第６２／２９０，８９４号の優先権を主張し、その内容はその全てが参照により組み込まれる。
【０００２】
配列表の参照による組み込み
本出願は、電子フォーマットでの配列表と共に出願される。配列表は、２０１７年１月３０日に作成された１７３，０６１バイトのサイズの７５８２５２０００１４０ＳｅｑＬｉｓｔ．ＴＸＴと題されるファイルとして提供される。配列表の電子フォーマット中の情報は、その全てが参照により組み込まれる。
【０００３】
本発明は、免疫学及びウイルス学の分野のものである。より詳細には、改変された異種エピトープ及び／又は改変された成熟切断部位を有する組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の組成物に関する。
（次の略語を適用する。ＨＡ、ヘマグルチニン；ＮＡ、ノイラミニダーゼ；ＮＡｂ、中和抗体；ｂＮＡｂ、広域中和抗体；ＴＥＶ、タバコエッチウイルス；ＤＮＡ、デオキシリボ核酸；ｃＤＮＡ、相補的ＤＮＡ；ＲＮＡ、リボ核酸；ｋｂ、キロベース；ｋＤａ、キロダルトン；ＣＨＯ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞；ＨＥＫ２９３細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞；ＶＬＰ、ウイルス様粒子；ＢＥＶＳ、バキュロウイルス発現ベクター系；ＡｃＮＰＶ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス；ＢｍＮＰＶ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ核多角体病ウイルス；ＴＩＰＳ、無力価感染細胞の保存及びスケールアップ（Ｔｉｔｅｒｌｅｓｓ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ−ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃａｌｅ  ｕｐ）；ＢＩＩＣ、バキュロウイルス感染昆虫細胞；ＰＣＲ、ポリメラーゼ連鎖反応；ＦＢＳ、ウシ胎仔血清；ＰＤＢ、蛋白質構造データバンク、ワールドワイドウェブ上の（ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏ）；ＭＯＩ、感染多重度；ＭＣＳ、成熟切断部位；ＨＰＡＩ、高病原性トリインフルエンザ；ＨＩ、ＨＡ阻害；ＷＴ、野生型；ＴＩＶ、三価不活化インフルエンザワクチン；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水。）
【背景技術】
【０００４】
インフルエンザは、「インフル（ｆｌｕ）」として一般に知られ、ヒト又は人畜共通のインフルエンザウイルスの感染によって引き起こされる感染性呼吸器疾患である。インフルエンザのアウトブレイクは、毎年、「インフルシーズン」として一般に知られる各年の寒い月に発生する。インフルエンザ感染のほとんどの症状は軽症であるが、これらの毎年のエピデミックは、世界中で３００万〜５００万件の重度の病気と５０万人までの死亡を引き起こす（ワールドワイドウェブ上のｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｅｄｉａｃｅｎｔｒｅ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔｓ／ｆｓ２１１／ｅｎ／の世界保健機関：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ（Ｓｅａｓｏｎａｌ））。各々の世紀において、インフルエンザウイルスが人口の大部分に感染し、世界中で顕著な罹患率と死亡率をもたらす、複数のインフルエンザパンデミックが存在する。世界人口の３〜５％を殺した１９１８年のスペインかぜパンデミックは、歴史上最も致命的なパンデミックである。
【０００５】
ステムドメイン反応性抗体を誘発する現在の戦略
全てのインフルエンザウイルスに対する広域中和抗体（ｂＮＡｂ）の誘発は、インフルワクチン設計の究極の目的であった。単離したｂＮＡｂの大部分は、ＨＡステムドメインの保存されたエピトープを認識する。しかしながら、自然のインフルエンザウイルス感染又は現在のインフルワクチンに誘発される抗体は、ＨＡ球状頭部ドメインの受容体結合部位を取り囲む抗原部位を、それらの抗原部位の免疫優性のために、主に認識する。それらの抗体は、インフルエンザウイルス系統間でのそれらの抗原部位の高変異性の結果、概して系統特異的である。したがって、現在のインフルワクチンは、インフルウイルスに対する普遍的な免疫を誘導しない。
【０００６】
ヘマグルチニン（ＨＡ）は、内在性膜糖タンパク質である。それは、インフルエンザウイルスの脂質二重層エンベロープ中の最も豊富なタンパク質である。ビリオン表面上にＨＡが約５００分子あると推定される。ＨＡは、ウイルスの宿主細胞への吸着及び侵入に必要とされる唯一のタンパク質である。それは宿主細胞受容体に結合し、ビリオン脂質エンベロープと宿主細胞膜との融合を可能にする。その宿主細胞受容体に結合する能力を通じて、ＨＡがインフルエンザ系統の宿主範囲を決定する。
【０００７】
ＨＡは、ＨＡ０と呼ばれる単鎖前駆体として小胞体中で合成される（Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）３１２：４０４〜４１０）。ＨＡ０前駆体は、そのＮ末端にシグナルペプチドを、そのＣ末端に膜アンカー配列を有する。Ｎ末端シグナルペプチドは、ＨＡが宿主細胞膜を横断して輸送され、宿主細胞膜に係留されるプロセスの最中に除去される。ＨＡは、小胞体中の同一のサブユニットの三量体に組み立てられ、次いで、ゴルジネットワークを介して細胞表面に移出される。ＨＡ０は、特異的な宿主のトリプシン様プロテアーゼによって成熟切断部位（ＭＣＳ）のＣ末端で切断され、２つのジスルフィド結合で連結されるポリペプチド、ＨＡ１及びＨＡ２からなる成熟型に変換される。ＨＡ１は、ＨＡ０のより大きなＮ末端部分であり、ＨＡ２は、より小さなＣ末端部分である。ＨＡ２は、短いＣ末端細胞内尾部を有する膜貫通領域を有し、ＨＡを膜に係留する。各々の成熟ＨＡは、約４５ｋＤａのＨＡ１と、約２５ｋＤａのＨＡ２を含む、全部で約７０ｋＤａの分子量を有する。多くのインフルエンザの系統由来のＨＡの細胞外部分の原子構造が決定されている。成熟ＨＡの構造モデルを図１に示す。ＨＡ０又は成熟型のいずれかとしての全てのＨＡは、幹上に球状頭部を有する同じ全体的な三量体構造を有する。各々のＨＡ単量体は、単一の短い親水性細胞質尾部を有するＣ末端膜貫通領域によって膜に係留される。
【０００８】
球状頭部ドメインは、全てＨＡ１から作製され、免疫優性エピトープを含有する。ステムドメインは、ほぼＨＡ２から作製され、免疫学的に亜優性である保存された領域を含有する。球状頭部ドメインは、そのコアにおいて、表面ループとヘリックスを含む８ストランドのβシート構造を有する。膜近位のステムドメインは、ＨＡ１とＨＡ２の両方からの残基の三重コイルドコイル構造の左手スーパーヘリックスからなる。各々のＨＡ単量体は、約１３ｋＤａの分子量の全炭水化物又はＨＡの全分子量の１９％を有する複数のグリコシル化部位を有する。多くのグリコシル化は、膜表面近辺のステムドメイン中にある。ＨＡはまた、細胞質尾部上のシステイン残基のパルミトイル化によっても修飾される（Ｖｅｉｔ，Ｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（１９９１）６５：２４９１〜２５００）。
【０００９】
球状頭部ドメインの免疫優性を回避するために、球状頭部ドメインを有さないＨＡステムドメインに基づいて免疫原が設計されている（除頭部ＨＡ）。これらの試みは、適切な三次元構造を有するそのような分子の産生の困難性のために大部分が失敗している（Ｋｒａｍｍｅｒ，Ｆ及びＰａｌｅｓｅ，Ｐ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｖｉｒｏｌ（２０１３）３：５２１〜５３０；Ｅｃｋｅｒｔ，Ｄ．Ｍ及びＫａｙ，Ｍ．Ｓ．、ＰＮＡＳ（２０１０）１０７：１３５６３〜１３５６４）。ＨＡ２それ自体は、その最も安定な融合後の低ｐＨ誘導立体構造へとフォールディングする可溶型として大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現されている（Ｃｈｅｎ，Ｊら、ＰＮＡＳ（１９９５）９２：１２２０５〜１２２０９）。ＨＡ２の低ｐＨ立体構造を不安定化させるよう設計された変異を組み込むことによって、Ｈ３のＨＡに基づいた別のＨＡ２コンストラクト（ＨＡ６）が大腸菌において発現され、所望の中性ｐＨ融合前立体構造へと再フォールディングした（Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ，Ｇら、ＰＮＡＳ（２０１０）１０７：１３７０１〜１３７０６）。ＨＡ６は、マウスにおいて非常に免疫原性であり、相同のインフルエンザＡウイルスの感染に対してマウスを防御した。しかしながら、ＨＡ６免疫化マウスからの血清は、インビトロにおいてウイルスを中和できず、これは球状頭部ドメインを認識する抗体のウイルス中和活性を検出するのみのアッセイの限界によるものであり得る。ＨＡ２とステムドメイン中のＨＡ１領域を有する別の「除頭部」ＨＡステムドメインコンストラクトが記載されている（Ｓｔｅｅｌ，Ｊら、ｍＢｉｏ（２０１０）１：ｅ０００１８〜１０）。免疫原は、相同のインフルエンザ接種に対してマウスを防御し、同じグループ由来の相同のＨＡに対して交差反応性である抗血清を誘発した。ＨＡ６と同様に、抗血清は、インビトロの中和活性を示さなかった。これらの設計は全て、免疫優性領域を排除することによるタンパク質最小化に基づく。
【００１０】
最近、構造に基づく合理的設計及びコンストラクトライブラリーの反復するｂＮＡｂ選択によって、安定な三量体であるＨ１のＨＡ幹のみの免疫原（除頭部ミニＨＡ）が作製された（Ｉｍｐａｇｌｉａｚｚｏ，Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５）３４９：１３０１〜１３０６；Ｙａｓｓｉｎｇ，Ｈ．，Ｍら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ（２０１５）２１：１０６５〜１０７０；特許出願ＷＯ２０１４／１９１４３５＿Ａ１）。これらの幹のみのミニＨＡ免疫原は、予想通りのＨＡステムドメインに対する抗体を誘発した。これらのミニＨＡ免疫原によって免疫されたマウス及びフェレットは、高病原性のＨ５ウイルスの致死性の接種から防御された。さらに、ミニＨＡ免疫原はカニクイザルにおいてＨ５中和抗体を誘発した。これらのミニＨＡ免疫原は、それらの特異的なｂＮＡｂｓへの結合によって選択された。長期の反復するｂＮＡｂ選択プロセスは、異なる型のｂＮＡｂに対して繰り返されることを必要とする。ｂＮＡｂエピトープの立体構造は、これらのミニＨＡ免疫原において保存されていたが、全体的な構造は天然ＨＡのステムドメインとは異なっていた。これらの構造変化により、これらの除頭部ミニＨＡ免疫原はインフルエンザウイルス又はインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）に組み立てられる可能性は低い。さらに、これらの除頭部ミニＨＡ免疫原は、宿主細胞結合のための受容体結合部位を有さない。
【００１１】
ステムドメインに対する宿主の免疫応答を導くためにキメラＨＡが設計されている。パンデミックのＨ１Ｎ１感染によって誘導された多くの中和抗体は、複数のインフルエンザ系統のＨＡステムドメイン及び球状頭部ドメインにおけるエピトープに対して広域で交差反応性であった（Ｗｒａｍｍｅｒｔ，Ｊら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（２０１１）２０８：１８１〜１９３）。ヒトの中で循環性でないＨ５Ｎ１インフルエンザ系統由来のＨＡ（グループ１のＨＡ）による免疫は、グループ１循環性季節性系統に対するＨＡ幹特異的応答を顕著に増加させた（Ｅｌｌｅｂｅｄｙ，Ａ．Ｈら、ＰＮＡＳ（２０１４）１１１：１３１３３〜１３１３８；Ｎａｃｈｂａｇａｕｅｒ，Ｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ（２０１４）８８：１３２６０〜１３２６８；Ｗｈｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｒ．Ｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２０１４）８８：４０４７〜４０５７）。１９５７年、１９６８年、及び２００９年におけるパンデミックのインフルエンザウイルス系統の各々の出現の後、ヒト集団において、既存の季節性ウイルス系統が新規のパンデミック系統によって置き換わった。
【００１２】
多様な球状頭部ドメインを有する新規のパンデミックのインフルエンザウイルス系統への曝露が、ステムドメインにおいて保存されたエピトープに対する親和性成熟したメモリー応答を導くと仮説が立てられた（Ｐａｌｅｓｅ，Ｐ及びＷａｎｇ，Ｔ．Ｔ．、ｍＢｉｏ（２０１１）２：ｅ００１５０〜１１）。この仮説を支持して、Ｈ６、Ｈ９、又はＨ５球状頭部ドメイン、及びＨ１ステムドメインの、操作された組換えキメラＨＡは、高力価の幹特異的中和抗体を生成した（Ｐｉｃａ，Ｎら、ＰＮＡＳ（２０１２）１０９：２５７３〜２５７８；Ｋｒａｍｍｅｒ，Ｆら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２０１３）８７：６５４２〜６５５０）。これらの場合において、Ｈ１のＨＡの球状頭部ドメインは、ヒト集団の大部分がナイーブである同じグループ１のＨＡ由来のＨ６、Ｈ９、又はＨ５の球状頭部ドメインによって置換された。これらの置換は、ＨＡ１のシステイン５２とシステイン２７７の間のＨ１のＨＡ配列を、Ｈ６、Ｈ９、又はＨ５の対応する配列と置換することによって作製された。システイン５２とシステイン２７７は、球状頭部ドメインとステムドメインの間のヒンジ領域においてジスルフィド結合を形成する。同様のキメラＨＡがＨ３ステムドメインを用いて作製され、グループ２インフルエンザ系統に対するワクチンを開発した（Ｋｒａｍｍｅｒ，Ｆら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２０１４）８８：２３４０〜２３４３；Ｍａｒｇｉｎｅ，Ｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２０１３）８７：１０４３５〜１０４４６）。これらのキメラＨＡによって動物を免疫することは、ウイルスのそれぞれのグループに対する広域中和活性を有する幹特異的抗体を誘導した。ヒト集団は、循環性Ｈ１（グループ１）、Ｈ３（グループ２）、及びインフルエンザＢウイルス系統に対する既存の免疫を有する。キメラＨＡによるワクチン接種は、循環性系統のＨＡ及びキメラＨＡに共通のステムドメインに対する抗体レベルをブーストする。ヒトがナイーブであるキメラＨＡ上の新規球状頭部ドメインに対して、一次応答のみが誘導された。それに続く、同じステムドメインを有するが、異なる頭部ドメインを有する第２のキメラＨＡによるブーストは、幹特異的抗体レベルをさらに増加した。結果は、球状頭部ドメインにおける免疫優性エピトープに対する宿主の曝露の変化が、ステムドメインにおける免疫亜優性エピトープに対する広域の防御的免疫応答を増加させることができることを示唆する。
【００１３】
Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）ヘマグルチニンの抗原部位Ｂの６個のアミノ酸ループは、Ａ／日本／５７（Ｈ２Ｎ２）及びＡ／香港／８／６８（Ｈ３Ｎ２）由来のＨＡの相同の抗原部位Ｂ残基によって置換することができる（Ｌｉ，Ｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（１９９２）６６：３９９〜４０４）。この置換は、ＨＡの受容体結合機能と干渉しない。これらのキメラＨＡを有する組換えインフルエンザウイルスは、ＭＤＣＫ（メイディン・ダービー・イヌ腎臓上皮細胞）細胞培養において複製された。Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）及びＡ／香港／８／６８（Ｈ３Ｎ２）のキメラＨＡを有するウイルスは、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）とＡ／香港／８／６８（Ｈ３Ｎ２）の両方に対する抗体を誘導した。これらの結果は、ＨＡの免疫優性抗原部位を、異なる系統由来の他のＨＡの相同の対応する免疫優性抗原部位によって置換することができることを示唆する。これらの置換は、生じるキメラＨＡの光源特異性を変化させる。
【００１４】
したがって、上述の段落において、１つのインフルエンザ系統における免疫優性エピトープは、別の系統由来の相同の免疫優性エピトープによって置換された。
【００１５】
別の戦略は、免疫優性エピトープを抑制し、宿主の免疫応答をステムドメインに向けさせることである。球状頭部ドメインにおける免疫優性抗原部位は、高グリコシル化のためのさらなるグリコシル化部位の導入によって、遮蔽することができる（Ｅｇｇｉｎｋ，Ｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２０１４）８８：６９９〜７０４、特許出願ＵＳ２０１４／０００４１４９＿Ａ１）。球状頭部ドメインの高グリコシル化は、幹反応性抗体の結合親和性を変化させなかった。高グリコシル化ＨＡによるマウスの免疫は、高力価の幹反応性抗体、並びに異なる季節性ウイルスの接種における罹患率及び死亡率に対する防御を誘導した。特許出願ＵＳ２０１３／０３１５９２９＿Ａ１は、球状頭部ドメインの免疫優性エピトープを、それらのエピトープのいくつかの残基をエピトープの一部である可能性の低い他のアミノ酸と置換することによって抑制する別の方法を開示した。結果は、球状頭部ドメインにおける免疫優性エピトープを遮蔽することが、ステムドメインにおける免疫亜優性エピトープに対する広域の防御的免疫応答を増加させることができることを示唆する。
【００１６】
外来エピトープを提示するための担体としてのＨＡ
インフルエンザＨＡは、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質のＶ３ループのエピトープのための担体として使用されている。ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質由来の１２〜２２の長さの残基の免疫優性エピトープペプチドの、部位Ａ又は部位ＢのいずれかのＨＡ免疫優性抗原部位への挿入は、球状頭部ドメイン中に個々のＨＩＶ−１エピトープを有するキメラＨＡを産生した。部位Ａ及び部位Ｂの残基は全く除去されなかった。免疫原性ＨＩＶ−１エピトープは、その部位に挿入された。キメラＨＡは、動物において、ＨＩＶ−１のＶ３−ループエピトープに対する免疫応答を誘導した（Ｋａｌｙａｎ，Ｎ．Ｋら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９４）１２：７５３〜７６０；米国特許Ｕ．Ｓ．５，５９１，８２３＿Ａ；Ｌｉ，Ｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（１９９３）６７：６６５９〜６６６６）。非常に低い用量のキメラＨＡが、挿入されたエピトープに対して特異的な抗体を誘導するのに十分であったため、挿入されたエピトープの免疫原性はＨＡによって増強されるように見えた。これらの結果は、ＨＡ以外のタンパク質由来の免疫優性の外来エピトープを、ＨＡの免疫優性抗原部位へと挿入できることを示唆する。挿入された外来の免疫優性エピトープを有するこれらのキメラＨＡ分子は、挿入された外来の免疫優性エピトープに対する免疫応答を誘導できる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質の修飾型、それを含有するワクチン、ウイルス様粒子、及びウイルス、並びにその産生のための組換え方法及び物質に関する。概して、これらの修飾は、抗体の生成及び／又はＨＡタンパク質のステムドメイン中の成熟切断部位（ＭＣＳ）の修飾のための、代替エピトープによる、ＨＡタンパク質の球状頭部ドメインの免疫優性領域の置換を含む。ＭＣＳと融合ペプチドの間でＨＡ０を切断してＨＡ２の遊離Ｎ末端を生成することは、細胞侵入のために必須である。動物のプロテアーゼによる切断を防ぐためにＭＣＳを改変することによって、ＭＣＳが既に切断されているウイルスのウイルスが増幅できる宿主細胞の感染を可能にするが、その子孫は感染しない。したがって、免疫優性部位を占めるものを含む任意のエピトープの存在は、子孫のウイルスによる宿主のさらなる感染なしに増幅する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
一態様において、本発明は、修飾ＨＡ又はそれを含有するウイルス若しくはウイルス様粒子を含むインフルワクチンであって、ＨＡタンパク質の免疫優性領域が、この領域に挿入されている、同じインフルエンザ系統又は別のインフルエンザ系統の保存された代替エピトープを含有する、インフルワクチンに関する。これは、その天然の位置において免疫亜優性である挿入された代替エピトープのより成功した免疫原性形態を提供する。代替エピトープは、他のＨＡの球状頭部ドメインに由来しないものである。典型的に、代替エピトープは、ＨＡステムドメイン、又はＭ２のような非ＨＡインフルエンザタンパク質に由来する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、動物のプロテアーゼによって切断されないＭＣＳを含有するように修飾されている修飾インフルエンザウイルス（ワクチンとしてもまた使用できる）に関する。上述のように、これは、ウイルスの感染型を生じることなくウイルスの増幅を可能にする。そのようなウイルスは、１つ以上の免疫優性領域を、インフルエンザエピトープ、又は、例えば他のウイルス、細菌、若しくは腫瘍関連抗原に特徴的なエピトープを含む外来エピトープであってよい代替又は異種のエピトープで置換することによってさらに修飾できる。
【００２０】
さらに他の態様において、本発明は、修飾ＨＡタンパク質のタンパク質、ウイルス又はウイルス様粒子を調製するための組換え物質及び方法、並びにそれらのタンパク質、ウイルス様粒子又は修飾ウイルスを使用する抗体を生成する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９、ブタ起源インフルエンザＡウイルスＨ１Ｎ１系統（ＰＤＢ：３ＬＺＧ）の成熟ＨＡの細胞外部分のＸ線結晶構造を示す。この構造は、本発明におけるコンストラクト設計を導くのに使用する。このＨＡのペプチド配列は、親の野生型（ＷＴ）Ｈ１のＨＡコンストラクトを作製するのに使用する。図１Ａは、１つのＨＡ単量体をリボン描画とし、他の２つを骨格描画とするＨＡ三量体を示す。膜に対する方向、球状頭部ドメインの位置、及びステムドメインが示される。ＨＡ１は明るい影のリボンとして示され、ＨＡ２は暗い影のリボンとして示される。図１Ｂは、ＨＡ１及びＨＡ２の位置、並びにＨＡ１及びＨＡ２のＮ末端及びＣ末端を有する単一のＨＡ単量体を示す。融合ペプチドは丸で囲まれる。
【図２】図２は、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９のＨ１のＨＡ単量体に対してマッピングして、Ｈ３のＨＡの免疫優性抗原部位のおよその位置を示す。図２Ａは、図１のようにリボン描画を示す。Ｈ３のＨＡ免疫優性抗原部位Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥを暗い影で示す。図２Ｂは、膜から遠位の球状頭部ドメインの上の図２Ａの上面図である。
【図３】図３は、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９のＨ１のＨＡ単量体に対してマッピングして、Ｈ１のＨＡの免疫優性抗原部位のおよその位置を示す。図３Ａは、図１のようにリボン描画を示す。Ｈ１のＨＡ免疫優性抗原部位Ｃａ１、Ｃａ２、Ｃｂ、Ｓａ、及びＳｂを暗い影で示す。図３Ｂは、膜から遠位の球状頭部ドメインの上部である図３Ａの上面図である。これらの免疫優性抗原部位の多くは、矢印で示す宿主細胞受容体結合部位を取り囲む。
【図４】図４は、Ｈ１のＨＡコンストラクトの模式的な設計を示す。図４Ａは、コンストラクトの核酸の特徴の模式図である。サブクローニングのための制限部位の位置は標識される。図４Ｂは、図４Ａに示す核酸に対する相対割合におけるコンストラクトのタンパク質の特徴の模式図である。ＧＰ６７ｓｓは、Ｎ末端におけるＧＰ６７分泌シグナル（シグナルペプチド）を表す。ＨＡ１は、ＨＡのＨＡ１を表す。ＭＣＳは、ＨＡ１の一部であるＨＡ成熟切断部位を表す。ＨＡ２は、ＨＡのＨＡ２を表す。ＴＥＶはＴＥＶ切断部位を表す。ＦｏｌｄｏｎはＦｏｌｄｏｎ配列を表す。Ｈｉｓは、Ｃ末端における１０−ヒスチジンタグ（１０×Ｈｉｓ−ｔａｇ）を表す。
【図５】図５は、ＨＡ球状頭部ドメインにおいて異種エピトープが配置される位置と改変された成熟切断部位が存在する位置を示す。親のコンストラクトペプチド配列（ＷＴ）を、Ｈ３（Ａ／愛知／２／１９６８  Ｈ３Ｎ２）及びＨ１（Ａ／プエルトリコ／８／１９３４  Ｈ１Ｎ１）のＨＡの配列とアラインする。各々の配列のアミノ酸の位置を、シグナル配列除去後の第１の残基を１位としてＨＡ０ナンバリングに基づいて右側に標識する。成熟切断部位（ＭＣＳ）を、矢印及び垂直線で示す。Ｈ３のＨＡの免疫優性抗原部位Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥをＨ３配列の上にマークする。免疫優性抗原部位Ｃａ１、Ｃａ２、Ｃｂ、Ｓａ、及びＳｂをＨ１配列の下にマークする。ＷＴ中の下線を付した配列は、配列の下に示す相同のエピトープによって置換される。改変された成熟切断部位は、成熟切断部位（ＭＣＳ）の下に示す。広域中和抗体（ｂＮＡｂ）に対する天然の免疫亜優性抗原部位、ＦＩ６、１Ｃ９、及びＣＲ８０２０を配列の上の線によってそれぞれマークする。
【図６】図６は、球状頭部ドメインの免疫優性抗原部位に配置される複合ＣＲ８０２０エピトープを有するＨＡ単量体のモデルを示す。ＨＡ単量体は図１のようにリボン描画で示す。複合ＣＲ８０２０エピトープによって置換される免疫優性抗原部位を暗い影で示す。ステムドメイン中の元の天然ＣＲ８０２０エピトープをまた暗い影で示す。図６Ａは、ＣＲ８０２０Ｓａ４のモデルを示す。図６Ｂは、ＣＲ８０２０Ｃａのモデルを示す。
【図７】図７は、本発明に記載されるＨＡコンストラクトの発現データを示す。示したコンストラクトの組換えバキュロウイルスを感染させたＳＦ９細胞の細胞培地を採集し、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｎｉプルダウン）によって捕捉した。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を１×ＰＢＳで洗浄して結合しないタンパク質を除去した。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に結合したタンパク質をＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図７Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）又は抗Ｈｉｓウェスタンブロット（図７Ｅ）で解析した。矢印は全長ＨＡ０を示す。
【図８】図８は、本発明で使用される精製ＨＡコンストラクトを示す。示したコンストラクトの組換えバキュロウイルスを感染させたＳＦ９細胞の細胞培地を採集し、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｎｉプルダウン）によって捕捉した。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を１×ＰＢＳで洗浄した。結合したタンパク質をイミダゾールで溶出し、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）染色を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。矢印は全長ＨＡ０を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、ＨＡタンパク質の修飾に関するため、上に提供されるものに加えてこのタンパク質及びその機能についてのさらなる記述は、有用であり得る。
【００２３】
ＨＡ０のプロテアーゼ切断は、インフルエンザＡウイルスの感染性に不可欠である。宿主におけるこれらのプロテアーゼの分布は、組織向性、及びそのために病原性の決定因子の一つである。単一の成熟切断部位を有するＨＡの大部分を切断するいくつかのトリプシン様プロテアーゼは、呼吸器系及び肺において同定されている（Ｋｉｄｏ，Ｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９２）２６７：１３５７３〜１３５７９；Ｐｅｉｔｓｃｈ，Ｃら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２０１４）８８：２８２〜２９１；Ｚｈｉｒｎｏｖ，Ｏ．，Ｐら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２００２）７６：８６８２〜８６８９）。これらのプロテアーゼはセリンプロテアーゼである。それらの１つは、ラット気管支上皮のＣｌａｒａ細胞において最初に単離されたトリプシン様プロテアーゼＣｌａｒａである。ＨＡ０を切断するこれらのプロテアーゼの狭い組織分布は、哺乳動物におけるインフルエンザウイルスの感染を呼吸器系及び肺に制限する。
【００２４】
ＨＡ成熟に関与するプロテアーゼは未だよく分析されていない。トリプシンのように、これらのタンパク質は、アルギニン（Ｒ）又はリシン（Ｋ）のような塩基性残基のＣ末端側のペプチド結合を切断する。成熟切断部位（ＭＣＳ）はＨＡ１のＣ末端に位置し、ＭＣＳのＣ末端における切断は感染性に必須である。
【００２５】
Ｈ５及びＨ７サブタイプの成熟切断部位における多塩基性配列は、フリン及びサブチリシン型プロテアーゼのような広範囲の細胞プロテアーゼによる切断感受性をもたらし、これは哺乳動物におけるこれらのウイルスの広範囲の組織向性及び高い病原性と相関する（Ｓｔｉｅｎｅｋｅ  Ｇｒｏｂｅｒ，Ａら、ＥＭＢＯ  Ｊ（１９９２）１１：２４０７〜２４１４；Ｍａｉｎｅｓ，Ｔ．Ｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２００５）７９：１１７８８〜１１８００）。多くの高病原性のトリインフルエンザ（ＨＰＡＩ）サブタイプは、Ｈ５及びＨ７である。ヒトにおけるＨＰＡＩアウトブレイクの際、報告された致死率は、パンデミック及び季節性のインフルエンザウイルスのものよりも高かった（Ｍｏｒｅｎｓ，Ｄ．Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）４８６：３３５〜３４０）。ＭＣＳにおけるこれらの多塩基性配列は、鳥類の複数の器官におけるウイルス複製ももたらし、これらの鳥類における高い死亡率を生じる。
【００２６】
季節性インフルウイルス及び非病原性鳥類インフルエンザウイルスのＨＡは、呼吸器及び肺における特異的なプロテアーゼによって細胞外で切断され、これはそれらの組織向性を限定する。一方で、高病原性のウイルスのＨＡは、遍在的に存在するプロテアーゼによって細胞内で切断される。これらの高病原性のウイルスは、全身感染を引き起こす様々な組織において多サイクル複製する（Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒ，Ｄ．Ａ．、Ｖｉｒｕｓ．Ｖｉｒｏｌ（１９９９）２５８：１〜２０；Ｔａｕｂｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．Ｋ．、ＰＮＡＳ（１９９８）９５：９７１３〜９７１５）。ヒトインフルエンザウイルスの１９１８年のパンデミック系統はまた、幅広い細胞プロテアーゼを利用し、そのノイラミニダーゼ（ＮＡ）を使用してＨＡ切断のためのプラスミノーゲンを動員する（Ｇｏｔｏ，Ｈ及びＫａｗａｏｋａ，Ｙ．ＰＮＡＳ（１９９８）９５：１０２２４〜１０２２８；Ｃｈａｉｐａｎ，Ｃら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２００９）８３：３２００〜３２１１）。
【００２７】
ＨＡ０の切断は、ビリオンの宿主細胞との融合に必須である、新規の遊離Ｎ末端を有するＨＡ２を生成する。切断型は、受容体結合及び膜融合の完全な機能を有するＨＡの成熟型である。ＨＡ０は受容体に結合する能力を有するが、膜融合を媒介しない。ＨＡの前駆体と成熟型の両方がビリオン表面に存在する。ＨＡ０のみを有するウイルスは、融合活性を有さず、感染を引き起こさない。
【００２８】
ＨＡ２のＮ末端１２残基は「融合ペプチド」と呼ばれる（Ｓｋｅｈｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ（２００１）２９：６２３〜６２６）。融合ペプチドは、疎水性配列を有する。ＨＡ０において、ＭＣＳ及び融合ペプチドは表面ループを形成する。切断後、新規に生成するＮ末端融合ペプチドは、ＨＡ三量体の境界面に挿入される。宿主細胞受容体への結合に続き、付着したインフルエンザビリオンは、宿主細胞によってエンドソームに取り込まれる。成熟ＨＡの融合能は、エンドソームのｐＨ、すなわち特定のインフルエンザウイルス系統に応じてｐＨ５〜６において活性化される。低ｐＨにおけるＨＡ構造の大規模な変化は、融合ペプチドの細胞膜に向かう追放をもたらす。宿主エンドソーム膜への融合ペプチドの挿入は、周りを囲む宿主エンドソーム膜とＨＡのＣ末端膜係留領域を含有するウイルス膜との融合をもたらす。融合は、ウイルスＲＮＡセグメントを宿主細胞の細胞質へと放出し、ウイルス複製が起きる宿主細胞核へと侵入させる。
【００２９】
ＨＡは、インフルエンザウイルス系統の宿主範囲を決定する。ＨＡは、宿主細胞表面の糖タンパク質及び糖脂質の末端のシアル酸に結合する。ヒトインフルエンザウイルス系統由来のＨＡは、ＳＡα２，６Ｇａｌを末端とするシアリルオリゴ糖へとほとんど排他的に結合するが、一方でトリ及びウマインフルエンザ系統由来のＨＡは、ＳＡα２，３Ｇａｌに結合する。ヒトは主にＳＡα２，６Ｇａｌシアリルオリゴ糖を有し、鳥類は主にＳＡα２，３Ｇａｌシアリルオリゴ糖を有する。図３に概略的に示すように、ＨＡ上の宿主受容体結合部位は、排他的にＨＡ１から作製される球状頭部ドメインに位置する。インフルエンザウイルスＨＡの受容体特異性は、良く分析されている。ＳＡα２，６Ｇａｌ又はＳＡα２，３Ｇａｌの認識に関与するアミノ酸残基はマッピングされている。受容体結合ポケットにおける単一のアミノ酸残基置換が受容体結合特異性を変化させることが示されている（Ｒｏｇｅｒｓ，Ｇ．Ｎら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０４：７６〜７８）。１９１８年のインフルエンザパンデミックウイルスの異なる単離系統は、ＨＡの受容体結合部位における単一のアミノ酸置換の結果として異なる受容体結合特異性を有した（Ｇｌａｓｅｒ，Ｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２００５）７９：１１５３３〜１１５３６）。系統Ａ／南カロライナ／１／１８のＨＡは、ヒト細胞受容体ＳＡα２，６Ｇａｌへと優先的に結合するが、一方で系統Ａ／ニューヨーク／１／１８のＨＡは、ヒト細胞受容体ＳＡα２，６Ｇａｌとトリ細胞受容体ＳＡα２，３Ｇａｌの両方に結合し、インフルエンザウイルスの宿主適応の動的性質を明らかにする。
【００３０】
ＨＡの受容体結合部位における単一の変異は、トリからヒトへと受容体結合特異性を変化させるが、ヒトにおけるＨ５トリインフルエンザウイルス系統の効率的な伝染は、受容体結合部位外のＨＡにおけるいくつかの他の変化及び他のインフルエンザタンパク質における変化を必要とする（Ｉｍａｉ，Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）４８６：４２０〜４２８；Ｈｅｒｆｓｔ，Ｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３６：１５３４〜１５４１；Ｃｈｅｎ，Ｌ−Ｍら、Ｖｉｒｏｌ（２０１２）４２２：１０５〜１１３；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃ．Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３６：１５４１〜１５４７）。他の変化と共に、Ｈ５のＨＡにおけるわずか４個のアミノ酸置換は、呼吸飛沫を介したフェレット間の変異トリＨ５ウイルスの伝染を可能にするのに十分である。種を超えるインフルエンザウイルスの伝染の理解に加えて、これらの研究は、ユニバーサルインフルエンザワクチン候補を評価するのに使用できるような、非哺乳動物インフルエンザウイルスの哺乳動物における伝染を研究する実験手順を確立した。
【００３１】
抗インフル抗体及びＨＡの抗原部位の説明
インフルエンザウイルスの脂質二重層エンベロープの最も豊富なタンパク質として、ＨＡはインフルエンザウイルスの主要な抗原であり、中和抗体の一次エピトープを保持する。ほとんどのヒト抗インフル抗体はＨＡ及びＮＡに対するものである。ワクチン接種により誘発される６０％のインフルエンザ反応性抗体は、ＨＡに反応する（Ｗｒａｍｍｅｒｔ，Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ（２００８）４５３：６６７〜６７１）。ＨＡ反応抗体の大部分は、球状頭部ドメイン中の受容体結合部位を取り囲む抗原部位を認識する。これらの抗体のいくつかはウイルス中和抗体である。概して、これらの中和抗体（ＮＡｂ）は、宿主細胞へのＨＡ結合と干渉し、ＨＡ阻害（ＨＩ）活性を示す。概して、これらは、これらの抗原部位の高変異性のために系統特異性であり、したがって、大いに所望される広域中和活性を欠いている（Ｗａｎｇ，Ｔ．Ｔ及びＰａｌｅｓｅ，Ｐ．、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２００９）１６：２３３〜２３４）。
【００３２】
インフルエンザウイルスの広範な感染は、ウイルスのその抗原特性を改変する能力の結果である。インフルエンザウイルスの抗原特性の変化は、エラーを起こしやすいウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ複合体によるウイルスゲノムの低忠実度複製の結果である。高い変異率は、抗原ドリフト、すなわちＨＡの抗原特性の漸進的変化をもたらす。抗原ドリフトは、全ての型のインフルエンザウイルスにおいて起きる。ＨＡ遺伝子の配列解析は、サイレント核酸配列変化はＨＡ遺伝子全体にわたって広がるが、アミノ酸配列の変化の大部分はＨＡ１に位置することを示す（Ｐａｌｅｓｅ，Ｐ及びＹｏｕｎｇ，Ｊ．Ｆ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１４６８〜１４７４）。ＨＡ２はＨＡ１よりも保存されている。
【００３３】
ウイルスゲノムのセグメント化された性質はまた、２種の異なる系統のウイルスが宿主に同時に共感染するときに、ウイルスゲノムセグメントの再構築をもたらす。ウイルスの新規系統は、抗原シフト、すなわちＨＡの抗原特性の突然の変化をもたらす、異なるウイルス表面タンパク質のこの再構築から出現する。抗原シフトは、インフルエンザＡウイルスにのみ起こる。抗原ドリフト及び抗原シフトは、インフルエンザウイルスが、既存の抗体による中和から逃れることを可能にする。
【００３４】
Ｈ３インフルエンザ
３５年以上前に決定されたインフルエンザＨＡの最初の詳細な構造は、ＨＡの抗体結合部位を明らかにし、抗原ドリフト及び抗原シフトの分子的な説明を提示する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２８９：３６６〜３７３；Ｗｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２８９：３７３〜３７８；Ｗｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ及びＳｋｅｈｅｌ，Ｊ．Ｊ．、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８７）６：３６５〜３９４）。
【００３５】
抗原的に異なるウイルスのＨＡ配列の比較は、Ｈ３のＨＡ、すなわちグループ２サブタイプＨＡの球状頭部ドメインにおける免疫優性抗原部位を同定した。Ｈ３のＨＡの免疫優性抗原部位の記載は、他者によって実証された（Ｂｏｔｈ，Ｇ．Ｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（１９８３）４８：５２〜６０）。ＨＡ構造におけるこれらの抗原部位のおよその位置は、図２に概略的に示す。これらの抗原部位の配列の位置は図５に示す。部位Ａは、Ａ／愛知／２／１９６８  Ｈ３Ｎ２系統のＨＡの１３３〜１４８の残基の表面ループに位置する（図５のＨ３のようにナンバリング）。１４０ループとして知られるこのループは、球状頭部ドメインから突出し、受容体結合ポケットの下部の縁上にある。部位Ｂは、球状頭部ドメインの頂部上に位置し、受容体結合ポケットの上部の縁に沿った１８７〜１９６の残基の表面αヘリックス及び１５５〜１６０の残基の近接表面ループを含む。部位ＣはＣｙｓ５２とＣｙｓ２７７の間のジスルフィド結合を取り囲む。Ｃｙｓ５２を中心とするループ（４６〜５５の残基）とＣｙｓ２７７を中心とするループ（２７１〜２８０の残基）の交差が、球状頭部ドメインとステムドメインの間のヒンジにおける隆起を形成する。部位Ｄは、ＨＡ三量体のＨＡ単量体サブユニット間の境界領域にある。それは、球状頭部ドメインのコアにおける８ストランドのβシート構造中の２００〜２１４の残基の２つのβストランドを中心とする。他のβストランドのターンにおける残基は、部位Ｄの一部でもあり得る。部位Ｄは、ＨＡ三量体境界面において最も埋め込まれている。部位Ｄがいかに抗原部位として機能するかは明らかではない。部位Ｅは、球状頭部ドメインの側面において部位Ａと部位Ｃの間に位置し、６２〜６３の残基の表面ループ、７８〜８３の残基、及び８ストランドβシートの端部上の１１９〜１２２の残基のβストランドから作製される。まとめると、部位Ｅのこれらの残基は、球状頭部ドメインの側部上の連続表面を形成する。１９６８年〜２００３年の期間中に出現したインフルエンザウイルスのアミノ酸置換及び抗原特性の比較は、主要な抗原変化に関与する置換は、部位Ａ及び部位Ｂに排他的に位置したことを示した（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｊら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）３０５：３７１〜３７６；Ｋｏｅｌ，Ｂ．Ｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１３）３４２：９７６〜９７９）。部位Ｃ、Ｄ、及びＥにおける置換は、小規模の抗原変化を引き起こすように見えた。結果は、ほとんどの系統特異的中和抗体が、球状頭部ドメインの受容体結合部位の辺縁にある部位Ａ及び部位Ｂに結合することを示唆する。
【００３６】
Ｈ１インフルエンザ
抗原的に異なる、ウイルス系統Ａ／ＰＲ／８／３４のグループ１のＨ１のＨＡの遺伝解析は、球状頭部ドメインにおける異なる抗原部位を同定し、Ｃａ１、Ｃａ２、Ｃｂ、Ｓａ、及びＳｂ部位と名付けた（Ｃａｔｏｎ，Ａ．Ｊら、Ｃｅｌｌ（１９８２）３１：４１７〜４２７；Ｇｅｒｈａｒｄ，Ｗら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９０：７１３〜７１７）。ＨＡ構造におけるこれらの抗原部位のおよその位置は、図３に概略的に示す。これらの抗原部位の配列の位置は図５に示す。Ｃａ１部位は、８ストランドのβシート構造のβストランドのターンに位置する。１６５〜１６９の残基のターンの１つ（図５のＨ１のようにナンバリング）は表面に露出する。Ｃａ１部位の２０７の残基は、Ｈ３のＨＡの部位Ｄに対応する２つのβストランドを接続するターンにある。Ｈ１のＨＡのＣａ１部位は、概してＨ３のＨＡの部位Ｄに対応する。Ｃａ２部位はまた、一次構造において分離するが三次構造において一緒になる２つのセグメントから作製される。Ｃａ２の１つのセグメントは、Ｈ３のＨＡの部位Ａの位置に対応する１３６〜１４１の残基の表面ループ中にある。Ｃａ２の別のセグメントは長い表面ループ上の２２０〜２２１の残基から作製される。Ｃａ２部位は、ＨＡ単量体の球状頭部ドメインにおけるＣａ１の逆側にあるが、ＨＡ三量体の別のＨＡ単量体のＣａ１部位に近接する。１つのＨＡ単量体のＣａ１部位は、三量体構造の別のＨＡ単量体のＣａ２部位と連続表面を形成する。Ｃｂ部位は、８ストランドのβシート構造に隣接する表面ループを形成する７０〜７５の残基の直鎖状エピトープである。それは、Ｈ３のＨＡの部位Ｅに対応する。部位Ｓａ及びＳｂは、Ｈ３のＨＡの部位Ｂに対応するサブサイトとみなすことができる。１５４〜１６３の残基の部位Ｓａは、Ｈ３のＨＡの部位Ｂループに対応するループと重複する。Ｓａ部位の別のセグメントは、１２４〜１２５の残基のターンに近接する。部位ＳｂはＨ３のＨＡの部位Ｂのαヘリックスに対応し、主としてαヘリックスの１８８〜１９４の残基を有する。
【００３７】
広域中和抗体及び保存エピトープ
天然インフルエンザウイルス感染又は三価不活化インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）によるワクチン接種もまた、膜近位のステムドメインに大部分が位置する保存ＨＡエピトープに対する低レベルの抗体を誘発する（Ｅｌｌｅｂｅｄｙ，Ａ．Ｈら、ＰＮＡＳ（２０１４）１１１：１３１３３〜１３１３８）。これらの抗体は、インフルエンザウイルスの多くの系統間で保存されたエピトープを認識する。いくつかの系統に対する防御を提供するものは、広域中和抗体と呼ばれる（ｂＮＡｂ）。概して、これらのｂＮＡｂは、ＨＡ阻害活性を有さず、宿主細胞表面受容体に対するＨＡの結合を防がない。最初の系統間抗体であるＣ１７９は、２０年以上前に分析されている（Ｏｋｕｎｏ，Ｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（１９９３）６７：２５５２〜２５５８）。それは、Ｈ１とＨ２系統の間で保存されている、ＨＡ１の３１８〜３２２の残基の立体構造エピトープ（ＴＧＬＲＮ）、及びＨＡ２の４７〜５８の残基のエピトープ（ＧＩＴＮＫＶＮＳＶＩＥＫ）を認識する。Ｃ１７９は、ＨＡの融合活性を阻害し、したがって、ウイルス中和をもたらす。
【００３８】
多くのｂＮＡｂが、インフルエンザウイルスに感染した患者において検出されるか、又は単離されている（Ｅｋｉｅｒｔ，Ｄ．Ｃ及びＷｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａ．、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｖｉｒｏｌ（２０１２）２：１３４〜１４１）。ｂＮＡｂは、グループ１、グループ２、又はグループ１とグループ２の両方のインフルエンザＡウイルスを中和することが実証されている。ｂＮＡｂによって認識される抗原エピトープの多くは、同定され、分析されている。これらのエピトープは、ＨＡ配列の直鎖状セグメントかＨＡ配列の複数の直鎖状セグメントを有する立体構造エピトープのいずれかである。ｂＮＡｂに対するエピトープの多くは、ＨＡタンパク質のより低変異性のステムドメインに位置する。これらのエピトープは、これに限定するものではないが、融合タンパク質及びＭＣＳ周辺のペプチド配列を含む。
【００３９】
多くのｂＮＡｂ及びそれらのエピトープは、構造的に分析されている。例えば、ｂＮＡｂであるＦＩ６は、ＭＣＳ及びＨＡ０中の融合ペプチドの残基を認識する（Ｃｏｒｔｉ，Ｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１１）３３３：８５０〜８５６）。ＨＡのペプチドマッピングは、ＦＩ６のエピトープとして、ＭＣＳ及び融合ペプチドの大部分からなるＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ、並びにＨＡ２におけるヘリックスコイルドコイルペプチドのＫＥＳＴＱＫＡＩＤＧＶＴＮＫＶＮＳである、２つのペプチドを同定した。提案されたＦＩ６の中和メカニズムは、膜融合の阻害すること、及びプロテアーゼのＨＡ０のＭＣＳへのアクセスを遮断することによりＨＡ成熟の防止することである。別のｂＮＡｂであるＦ１０は、ＨＡの成熟型における融合ペプチド近辺の立体構造エピトープを認識する（Ｓｕ，Ｊら、Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２００９）１６：２６５〜２７３）。Ｆ１０は、恐らく膜融合を防止することによって全てのグループ１インフルエンザＡウイルスを阻害する。
【００４０】
モノクローナルｂＮＡｂである１Ｃ９は、インビトロで細胞融合を阻害する（米国特許第８，５４０，９９５号；Ｐｒａｂｈｕ，Ｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２００９）８３：２５５３〜２５６２）。１Ｃ９は、ＧＬＦＧＡＩＡＧＦの直鎖状エピトープ、すなわちＨＰＡＩであるＨ５Ｎ１のＨ５のＨＡ２の融合ペプチドのＮ末端を認識する（免疫エピトープデータベースウェブアドレス：ｉｅｄｂ．ｏｒｇ／ａｓｓａｙ  ｄｅｔａｉｌｓ．ｐｈｐ？ａｓｓａｙＩｄ＝１５９９０７７）。１Ｃ９は、マウスにおいて高病原性トリインフルエンザ（ＨＰＡＩ）Ｈ５Ｎ１ウイルスによる感染に対する防御を示す。モノクローナルｂＮＡｂはまた、メモリーＢ細胞より単離されている（Ｈｕ，Ｗら、Ｖｉｒｏｌ（２０１３）４３５：３２０〜３２８）。これらのモノクローナル抗体のいくつかは、２００９年のパンデミックＨ１Ｎ１インフルエンザウイルス由来のＨＡ２のＦＩＥＧＧＷＴＧＭＶＤＧＷＹＧＹＨＨの直鎖状エピトープを認識する。このエピトープは、融合ペプチドの１Ｃ９エピトープに対してＣ末端側である。ＨＡ融合ペプチドの１４残基の配列は、インフルエンザＡ及びＢウイルスを超えて高度に保存されている。
【００４１】
ＨＡ融合ペプチドの保存された性質は、ユニバーサルインフルエンザワクチンを開発するために調査された。切断の結合の両側におけるＭＣＳ及びＨＡ２の融合ペプチドを含有し、ＨＡ１の最後の９アミノ酸残基を含むインフルエンザＢウイルスのＨＡ０の高度に保存された配列に基づいた、ペプチドコンジュゲートワクチンは、抗原的に異なる系統のインフルエンザＢウイルスのウイルス系統による致死性の接種に対して防御的な免疫応答を誘発した（Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２００５）７９：７３８０〜７３８８）。
【００４２】
モノクローナルｂＮＡｂであるＣＲ６２６１は、ＨＡ２ヘリックスＡ及びステムドメインのＨＡ１残基における高度に保存された領域を認識する（Ｅｋｉｅｒｔ，Ｄ．Ｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２４：２４６〜２５１）。ＣＲ６２６１は、融合後の立体構造へのＨＡの転換を防止することによってグループ１インフルエンザウイルスを中和する。ＣＲ６２６１は、同じＶＨ１−６９生殖細胞系列抗体重鎖を使用するｂＮＡｂに属する。別のＶＨ１−６９モノクローナル抗体であるＣＲ８０２０は、グループ２インフルエンザウイルスを中和する。ＣＲ８０２０は、膜に対して至近距離（約１５〜２０Å）のステムドメインの基部でＨＡに結合し、ＨＩＶのｇｐ４１サブユニット由来の膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）を認識するＨＩＶに対する抗体に類似する（Ｅｋｉｅｒｔ，Ｄ．Ｃら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１１）３３３：８４３〜８５０）。ＣＲ８０２０エピトープの２つの主な構成要素は、融合ペプチドのＣ末端部分（Ｈ３のＨＡ２の１５〜１９の残基、ＥＧＭＩＤ）、及びステムドメインの基部近辺の５ストランドβシートの最外部のストランド（Ｈ３のＨＡ２の３０〜３６の残基、ＥＧＴＧＱＡＡ）からなる。これら２つの構成要素は、Ｈ３の一次構造において１０残基離れている。ＨＡのステムドメインに結合する大部分のｂＮＡｂは、インフルエンザＡウイルスのＨＡのグループ１（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、及びＨ１６）又はグループ２（Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、及びＨ１５）のいずれかを中和する。これらの抗体は、宿主細胞へのＨＡの結合を阻害しないが、ウイルス膜と宿主細胞膜の融合を防止できる。
【００４３】
ＨＡ受容体結合部位は、球状頭部ドメインの頂部におけるポケットである（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．Ａら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２８９：３６６〜３７３；Ｗｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ及びＳｋｅｈｅｌ，Ｊ．Ｊ．、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８７）５６：３６５〜３９４）。このポケットは、多くのインフルエンザ系統を超えて高度に保存されているアミノ酸残基によって形成されている。ポケットの縁は、上述されるＨ３の部位Ａ及び部位Ｂのような免疫優性抗原部位によって形成される。健常ヒト対象からのヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）のクローニングは、Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３系統由来のＨＡの球状頭部ドメインにおける受容体結合部位の至近距離にある保存された残基を認識するｂＮＡｂを同定した（Ｋｒａｕｓｅ，Ｊ．Ｃら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２０１１）８５：１０９０５〜１０９０８；Ｋｒａｕｓｅ，Ｊ．Ｃら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２０１２）８６：６３３４〜６３４０）。構造研究は、これらのｂＮＡｂの少なくとも一部が受容体結合ポケットに対するシアル酸の相互作用を模倣することを明らかにした（Ｗｈｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｒ．Ｒら、ＰＮＡＳ（２０１１）１０８：１４２１６〜１４２２１；Ｅｋｉｅｒｔ，Ｄ．Ｃら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）４８９：５２６〜５３２）。
【００４４】
幹反応性抗体は、自然感染においてまれであり、現在の季節性インフルワクチンによる免疫においてさらに少ない。これらの抗体のサブセットのみが中和抗体である。ステムドメインの保存された性質のため、中和抗体の大部分はｂＮＡｂである。現在、ヒト対象から作製された抗体ライブラリーからのクローニングは、これらのまれな広域中和幹反応性抗体を日常的に同定することができる（Ｋａｓｈｙａｐ，Ａ．Ｋら、ＰＮＡＳ（２００８）１０５：５９８６〜５９９１；Ｗｒａｍｍｅｒｔ，Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ（２００８）４５３：６６７〜６７１）。これらの幹反応性抗体のまれな出現は、これらのステムドメインのエピトープが免疫亜優性である一方で、大部分の抗体が導かれる球状頭部ドメインのエピトープが免疫優性であるという仮説を導く（Ｋｒａｍｍｅｒ，Ｆ及びＰａｌｅｓｅ，Ｐ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ（２０１５）１４：１６７〜１８２）。流行している季節性インフルワクチンに対する繰り返される曝露又は季節性インフルワクチンによる免疫は、球状頭部ドメインの免疫優性抗原部位に対する抗体の産生をもたらす。球状頭部ドメインの免疫優性エピトープの存在が、二次応答をステムドメインから離れさせる傾向をもたらすことが示唆されている（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃ．Ｊ．、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ（２０１１）３６５：１５４１〜１５４２）。現在の系統に感染するか又はそれに対してワクチン接種した個体は、免疫学的にナイーブである者よりも、普遍的な応答を開始するのにより苦労する可能性がある。
【００４５】
Ｍ２タンパク質及びそのエピトープ
Ｍ２は、ウイルスエンベロープにホモ四量体のプロトンチャネルを形成する１回膜貫通タンパク質である（Ｌａｍｂ．Ｒ．Ａら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４０：６２７〜６３３；Ｐｉｅｌａｋ，Ｒ．Ｍ及びＣｈｏｕ，Ｊ．Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．（２０１１）１８０８：５２２〜５２９）。それは、ウイルスエンベロープにおいて、ＨＡと比べてはるかに低い存在量（１：１０〜１：１００の比のＭ２：ＨＡ）で存在する。Ｍ２プロトンチャネルの機能は、ウイルスタンパク質を宿主細胞のサイトゾルへと放出するためにウイルス内部のｐＨを調節すること、及び細胞表面へのＨＡの輸送のためにゴルジ体腔のｐＨを調節することに重要である。インフルエンザＡウイルスＭ２（ＡＭ２）タンパク質は、Ｍ２ｅとして知られる１〜２３の残基の細胞外Ｎ末端ドメイン、２４〜４６の残基の膜貫通（ＴＭ）ドメイン、及び４７〜９７の残基の細胞内Ｃ末端ドメインを含む９７残基を有する。４つのＭ２分子からのＴＭドメインは、細胞侵入の間のウイルス膜を横断するｐＨ、並びにウイルス構築及び退出の間の感染した細胞のトランスゴルジ膜を横断するｐＨを調節するｐＨ感受性プロトンチャネルとして機能する４ヘリックスバンドルを形成する。大きな細胞質ドメインは、ビリオン内殻のＭ１タンパク質との会合を介して安定な四量体形成のために重要であり、ウイルス構築における役割を果たす。プロトンチャネル機能に必須であるＴＭドメインにおけるＨＸＸＸＷ配列モチーフを除いて、インフルエンザＡ、Ｂ、及びＣウイルスのＭ２タンパク質は、配列相同性をほとんど全く共有しない。しかしながら、ＡＭ２の１０個のＮ末端細胞外残基は、全てのインフルエンザＡウイルスにおいて保存されている。
【００４６】
インフルエンザＡウイルスのＭ２（ＡＭ２）は、ＡＭ２プロトンチャネルを遮断する抗ウイルス薬アマンタジン及びリマンタジンの標的である。プロトンチャネルの閉状態を安定化させる薬物リマンタジンは、チャネルドメインのＣ末端近辺の脂質に面したポケットに結合する。アマンタジンは、インフルエンザＡウイルスに対するが、インフルエンザＢウイルスに対してではない活性を有する抗ウイルス薬である。これらのチャネル遮断薬の使用は、ＡＭ２のチャネルドメインにおける変異の結果としての広範な薬物耐性のために、中止されている。これらの変異の多くは、野生型（ＷＴ）ウイルスよりも伝染しにくいいくらか弱毒化したウイルスを生じる。これらの薬物耐性変異は、薬物選択圧の非存在下においてＷＴへと戻ることができる。
【００４７】
Ｍ２タンパク質は、インフルエンザウイルスに感染した宿主細胞表面に豊富に発現している内在性膜タンパク質である（Ｌａｍｂ，Ｒ．Ａら、Ｃｅｌｌ（１９８５）４０：６２７〜６３３）。Ｍ２が、インフルエンザウイルスに応答する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のための細胞表面抗原であることが示唆された。インフルエンザＡウイルスの感染は、Ｍ２に対する低力価の抗体を誘発するのみである（Ｆｅｎｇ，Ｊら、Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．（２００６）３：１０２〜１１５）。Ｍ２ｅの高度な構造保存は、部分的に不十分なＭ２ｅ特異的抗体応答の結果であり得、したがって、変化への圧力が存在しない可能性がある。抗Ｍ２抗体応答は、Ｍ２タンパク質に対する既存の抗体を有する個体の間でより強固であった（Ｚｈｏｎｇ，Ｗら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ（２０１４）２０９：９８６〜９９４）。２００９年パンデミックＨ１Ｎ１インフルエンザＡウイルスの感染の結果として誘導される抗Ｍ２抗体は、季節性インフルエンザＡウイルスのＭ２タンパク質に対して交差反応性であった。抗Ｍ２ｅ抗体によるマウスの処理は、疾患の進行を顕著に遅延させ、Ｍ２ｅエスケープ変異体の単離をもたらし、インフルエンザＡウイルス感染に対するワクチンとしてＭ２ｅを使用する可能性を示唆した（Ｚｈａｒｉｋｏｖａ，Ｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２００５）７９：６６４４〜６６５４）。
【００４８】
Ｍ２ｅとＨＡの融合に基づくＤＮＡワクチンが記載されている（Ｐａｒｋ，Ｋ．Ｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１１）２９：５４８１〜５４８７）。融合タンパク質は、互いの間の２０残基のリンカーを介してＨＡタンパク質のＮ末端に位置する、１つのヒトＭ２ｅペプチドと１つのトリＭ２ｅペプチドとを有する。コードされたＭ２ｅ−ＨＡ融合タンパク質の発現を確認した。Ｍ２ｅ−ＨＡ融合ＤＮＡワクチンにより免疫されたマウスは、Ｍ２ｅに対する増強したＴ細胞応答を示し、異種トリインフルエンザウイルスの致死性接種からの完全な防御を示した。
【００４９】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＨＳＰ７０（ｍＨＳＰ７０）タンパク質のＣ末端へと遺伝的に融合されたＭ２ｅの４つのタンデムリピートからなる組換え融合タンパク質は、マウスにおいて複数の系統のインフルエンザウイルスに対する防御を示した（Ｅｂｒａｈｉｍｉ，Ｓ．Ｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０１２）４３０：６３〜７２）。Ｍ２ｅペプチド、ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤは、ワクチンとしての他のインフルエンザタンパク質及びインフルエンザＢウイルスのＭ２ｅの相同体であるＢＭ２からのペプチドと共にカチオン性リポソーム送達ビヒクルへとコンジュゲートされた（特許出願ＵＳ２０１０／０８６５８４＿Ａ１）。ワクチンは、マウスにおいてＭ２ｅに対する免疫応答を誘発した。ワクチンを含有するＭ２ｅペプチドによりワクチン接種されたマウスは、致死性のインフルエンザウイルス接種から防御された。Ｍ２ｅのＶＬＰを補充した不活化インフルエンザワクチンは、マウスにおいて、抗原的に異なるインフルエンザＡウイルスに対する改善された、長期間にわたる交差防御を付与した（Ｓｏｎｇ，Ｊ−Ｍら、ＰＮＡＳ（２０１１）１０８：７５７〜７６１）。
【００５０】
免疫優性領域の修飾
本発明は、ＨＡの球状頭部ドメインの免疫優性領域を代替エピトープによって置換するか、又はそこに代替エピトープを挿入することにより生じる、宿主免疫応答をこれらのエピトープに導くための、遺伝的に修飾された組換えインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子及びタンパク質を含む。これらのエピトープのいくつかはＨＡに対するｂＮＡｂによって認識される。本発明はまた、修飾ＭＣＳを有する修飾ＨＡタンパク質及び遺伝子、並びにこれらの修飾の組合せに関する。
【００５１】
一実施形態において、修飾組換えＨＡは、Ｍ２タンパク質の細胞外ドメイン（Ｍ２ｅ）によって置換された球状頭部ドメインの免疫優性抗原部位を有するか、又はＭ２ｅが免疫優性抗原部位に挿入されている。
【００５２】
ＨＡタンパク質の三次元構造に導かれ、特定の表面ペプチド又は免疫優性領域のそのような表面ペプチドが、同じＨＡの他の領域の異種ペプチド若しくはいくつかの異種ペプチドによって、又は別のサブタイプ若しくは系統のインフルエンザウイルスのＨＡ由来の異種ペプチド若しくはいくつかの異種ペプチドによって置換される。これらの異種ペプチドは、免疫優性領域に挿入されてもよい。さらに、ＨＡの特定の表面ペプチド又は複数のペプチドは、ＨＡに関連しない他のタンパク質由来の異種ペプチドによって置換されるか、又はそのようなペプチドがその中に挿入される。これらの異種ペプチドは、天然タンパク質又は人工的に設計されたもののいずれかである。それらは、既知の抗体によって認識されないものであり得る。
【００５３】
ＨＡの免疫優性領域は、ＨＡの球状頭部ドメインの表面上にある。これらの修飾される表面領域は、表面露出ヘリックス、βストランド又はループである。これらの表面領域は、好ましくは、免疫優性抗原部位及びエピトープであるか、又はそのような抗原部位及びエピトープの一部であるか、又はそのような抗原部位及びエピトープに隣接する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ＨＡ球状頭部ドメインの免疫優性領域は、ＨＡに対するｂＮＡｂによって認識されるＨＡの免疫亜優性エピトープのペプチドによって置換される。他の実施形態において、ＨＡ球状頭部ドメインの免疫優性領域は、インフルエンザウイルスのグループを中和する抗体によって認識される免疫亜優性エピトープのペプチドによって置換される。これらの免疫亜優性エピトープは、ＨＡステムドメインから選択されるか、又はＨＡ融合ペプチド若しくはＨＡ成熟切断部位を含む。
【００５５】
本発明の組換え修飾ＨＡタンパク質は、組換え野生型ＨＡと同様のレベルで細胞培養において発現され、細胞培地へと分泌される。これらの設計は、これに限定されるものではないが、ヒトに感染するインフルエンザウイルス、並びに他の哺乳動物及び鳥類に感染するインフルエンザを含む、インフルエンザＡ、Ｂ、及びＣウイルスの全ての系統の任意のインフルエンザＨＡに適用可能である。一実施形態において、これらの修飾ＨＡタンパク質は、ヒト又は動物におけるインフルエンザウイルス感染に対するワクチンを作製するための免疫原として使用できる。
【００５６】
これらの免疫優性領域を部位特異的変異導入によって変更してもよい。抗原部位の溶媒露出残基は、ＨＡタンパク質の三次元構造によって同定される。抗原部位の溶媒露出残基又はいくつかの溶媒露出残基は、部位特異的変異導入によって変更するか、又はこれらの残基の特異的な変更を含有するペプチドと置換される。新規の部位は、元の部位と同じ二次構造を有する。
【００５７】
異種エピトープによって置換された抗原部位を有する例示的ＨＡ
図３に示すＨＡ構造に基づいて、ＨＡのいくつかの位置を選択して、球状頭部ドメインの免疫優性抗原部位を例えばＨＡのステムドメイン由来の異種ペプチドによって置換することの実現可能性を示す。
【００５８】
１１９〜１２２の残基のペプチドＫＴＳＳ（図５のＷＴのようにナンバリング）は、１２４〜１２５の残基のＳａ部位近辺の表面露出ヘリカル構造である。Ｓａ部位は、ＨＡ三量体の球状頭部ドメインの側面上にあり、受容体結合部位から離れている。この部位における修飾は、受容体結合部位の変化を起こしにくく、そのため修飾ＨＡによる宿主受容体結合に変化を起こしにくい。４残基ペプチドＫＴＳＳは、ステムドメインのｂＮＡｂエピトープによって置換される。Ｈ３のＨＡの部位Ａに対応するＣａ２部位の１３７〜１４２の残基のＨＡＧＡＫＳは、主要な免疫優性部位である。１５３〜１６４の残基のＫＫＧＮＳＹＰＫＬＳＫＳは、Ｈ３のＨＡの部位Ｂに対応するＳａ部位の表面ループである。このペプチドのＮ末端部分である１５３〜１５７の残基のＫＫＧＮＳは、いくつかのコンストラクトにおいて置換されている。Ｓｂ部位の１８４〜１９５の残基のＴＳＡＤＱＱＳＬＹＱＮＡは、ＨＡ球状頭部ドメインの頂部でヘリックスを形成する。
【００５９】
Ｓａ部位の表面ループ及びＳｂ部位のヘリックスは、ＨＡの球状頭部ドメインにおいて互いに近接し、Ｈ３の部位Ｂに対応する。Ｓａ部位とＳｂ部位は共に、ループ及びヘリックス構造を有する立体構造エピトープを提供できる。しかしながら、これらの部位が受容体結合部位近辺にあるため、これらのペプチドの置換は受容体結合部位を破壊する可能性がある。Ｃａ２部位の２１３〜２２４の残基のＥＩＡＩＲＰＫＶＲＤＱＥは、２つのＨＡ単量体間の境界面近辺のループである。このループは、Ｈ３のＨＡの部位Ｄに対応する、近接するＨＡ単量体のβストランドとの接点を有する。ループの一部は表面露出である。Ｃａ２部位はこのペプチド内に位置する。いくつかのコンストラクトにおいて、このペプチドは部分的に置換される。
【００６０】
さらに、異種ペプチドは、図５に示す任意の他の抗原部位に又はその近辺に、及び図１〜図３に示す表面ループ又はヘリックスに又はその近辺に配置することができる。さらに、異種ペプチドは、抗原部位の残基の欠失が全くなく、これらの任意の位置に挿入することができる。
【００６１】
ｂＮＡｂであるＣＲ８０２０エピトープはステムドメインに位置する。図５及び図６に示すように、ＣＲ８０２０エピトープは、ステムドメインの基部近辺の５ストランドβシートの最外部のβストランド（Ｈ３のＨＡのＨＡ２の３０〜３６の残基、ＥＧＴＧＱＡＡ、配列番号２６）、及び融合ペプチドのＣ末端部分（Ｈ３のＨＡのＨＡ２の１５〜１９の残基、ＥＧＭＩＤ、配列番号２５）からなる２つの主な構成要素を有する。これらの２つの構成要素は、一次構造において、１０アミノ酸残基によって分離されている。複合体ＣＲ８０２０エピトープＥＧＭＩＤＹＥＧＴＧＱＡＡ（配列番号２７）は、２つのエピトープの構成要素がチロシン（Ｙ）によって連結されるように設計される。この複合体ＣＲ８０２０エピトープは、免疫優性部位を置換するための異種ペプチドとして使用される。
【００６２】
別のｂＮＡｂ、１Ｃ９エピトープは、ステムドメインに存在するＨＡ２のＮ末端における融合ペプチドである。ＧＩＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧ（配列番号３６）の修飾１Ｃ９エピトープペプチドは、免疫優性部位において提示されるためのペプチドとして設計された。Ｉ１Ｃ９と表されるこの修飾１Ｃ９ペプチドは、ｂＮＡｂである１Ｃ９によって認識されるＨ５融合ペプチドの２位におけるロイシン（Ｌ）のイソロイシン（Ｉ）置換を有する。このＩ１Ｃ９融合ペプチドは、ブタＨ１のＨＡ並びにいくつかのＨ６及びＨ９ウイルスのＨＡに存在する。このＩ１Ｃ９ペプチドは、異なる免疫優性部位に配置する。抗原部位にＩ１Ｃ９を位置のシフトを伴って有する複数のコンストラクトが作製された。
【００６３】
ｂＮＡｂであるＦＩ６のエピトープは、ＨＡ前駆体ＨＡ０の三次元構造上の連続表面を形成するが、一次構造において分離している２つのペプチドを含有する立体構造エピトープである（図５）。１つのＦＩ６エピトープペプチドＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥは、ＨＡ０の成熟切断部位及び融合ペプチドである。別のＦＩ６ペプチドＫＥＳＴＱＫＡＩＤＧＶＴＮＫＶＮＳは、ＨＡ２におけるコイルドコイル構造を有する。これら２つのＦＩ６エピトープペプチドを球状頭部ドメインに配置するコンストラクトが作製されている。ＦＩ６エピトープペプチドＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥを、１５３〜１６４の残基のＳａ部位に配置し、コイルドコイルＦＩ６エピトープペプチドＫＥＳＴＱＫＡＩＤＧＶＴＮＫＶＮＳを、１８４〜１９５の残基のＳｂ部位に配置する。別のコンストラクトにおいてＦＩ６エピトープペプチドＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥをＳａ部位に配置するが、第２のＦＩ６エピトープペプチドを有さない。
【００６４】
多くのｂＮＡｂエピトープは分析されている。それらの任意のものは、上述のように、球状頭部ドメインの免疫優性抗原部位若しくは表面ループに、又はその近辺に配置することができる。
【００６５】
他の実施形態において、異種ペプチドは、Ｍ２タンパク質の細胞外ドメインのペプチド（Ｍ２ｅペプチド）である。Ｍ２ｅペプチドは、インフルエンザＡウイルスの間で保存され、低変異性である。インフルエンザＡウイルスとインフルエンザＢウイルスに由来するＭ２ｅペプチドは異なっているが、Ｍ２ｅペプチドはまた、インフルエンザＢウイルスの間で保存され、低変異性である。
【００６６】
いくつかの実施形態において、異種ペプチドは、部位特異的変異導入によって免疫優性抗原部位に特異的な変更をもたらす人工的に設計されたペプチドである。いくつかの実施形態において、人工ペプチドは、免疫優性抗原部位及び異種ペプチドの所望の特徴を組み合せる。いくつかの実施形態において、人工ペプチドは、ｂＮＡｂとの相互作用のための残基、及びＨＡ球状頭部ドメインの三次元構造の維持のための元の免疫優性抗原部位の残基を有する。これらの人工ペプチドは、ＨＡ三次元構造に基づいて合理的に設計されるか、又はランダムに生成したペプチドのライブラリーをスクリーニングをすることによるかのいずれかである。
【００６７】
バキュロウイルス発現系又は哺乳動物発現系を使用して発現するための、Ｍ２ｅペプチドＳＬＬＴＥＶＥＴＰＴＲＮＧＷＥＣＫＣＳＤＳをＣａ２部位又はＳｂ部位のいずれかに配置するコンストラクトを作製している。Ｍ２ｅペプチドは、異なるインフルエンザ系統由来の配列の一致に基づいてさらに最適化できる。
【００６８】
修飾された成熟切断部位を有するＨＡ
本発明は、ＨＡ成熟切断部位（ＭＣＳ）のプロテアーゼ感受性を変更して生じるＨＡを異なるクラスのプロテアーゼに感受性にし、かつ、インフルエンザウイルスの全ての系統の天然のＨＡ成熟切断部位を切断するそれらのトリプシン様プロテアーゼに耐性にする実施形態を含む。改変されたＭＣＳは、インフルエンザウイルスの既知の天然宿主に存在しない特異的なプロテアーゼによって認識されるように設計される。これは、生じるＨＡをインフルエンザウイルスの全ての天然宿主における成熟に耐性にする。この改変された成熟切断部位を認識するこの特異的プロテアーゼの存在において、これらの生じるＨＡは、切断されてＨＡ１及びＨＡ２を含有する成熟型になる。この特異的プロテーゼの存在下で生じるＨＡから作製される組換えインフルエンザウイルスは、成熟ＨＡを形成し、天然のインフルエンザ宿主に感染するようになる。しかしながら、感染した天然宿主において複製したウイルス子孫は、天然宿主における適切なプロテアーゼの欠損により感染性ではない。
【００６９】
Ｈ１のＨＡ分子はしばしば、ＭＣＳ中に単一の塩基性残基を有する。この単一の塩基性残基は通常、切断の結合に対してＮ末端側のアルギニン（Ｒ）残基である。Ｈ１のＨＡのＭＣＳにおけるアルギニン（Ｒ）又はリシン（Ｋ）のような複数の塩基性残基の付加は、修飾ＨＡを含有する組換えインフルエンザウイルスの感染性を増加する。多塩基性残基を含有するＨ５のＭＣＳによる天然のＨ１のＭＣＳの置換は、修飾ＨＡを含有する組換えインフルエンザウイルスの感染性を増加する（Ｋｏｎｇ，Ｗ−ｐら、ＰＮＡＳ（２００６）１０３：１５９８７〜１５９９１）。これらの多塩基性残基は、多くの細胞内トリプシン様プロテアーゼにより感受性である。いくつかの実施形態において、Ｈ１のＨＡのＭＣＳは、Ｈ５のＨＡのＭＣＳ又は多塩基性残基と置換することによって修飾される。Ｈ１のＨＡのＭＣＳはまた、ＨＡ１の最後の残基（アルギニン）とＨＡ２の最初の残基（グリシン）の間に多塩基性残基を挿入することによって修飾される。
【００７０】
改変されたＭＣＳ配列を有する遺伝的に修飾された組換えインフルエンザＨＡ遺伝子及びタンパク質もさらに開示される。天然ＭＣＳは、別のＨＡ由来のＭＣＳの配列によって置換される。前記変更は、恐らくは生じるＨＡを未同定の宿主プロテアーゼによる成熟切断に対してより感受性にすることによって、より感染性の組換えインフルエンザウイルスをもたらすことが知られている異なるＨＡ由来の別のＭＣＳとＨＡの天然ＭＣＳの置換を含む。好ましい実施形態において、Ｈ１のＨＡの天然のＭＣＳは、Ｈ５のＨＡのＭＣＳによって置換されるか、又はアルギニン（Ｒ）及びリシン（Ｋ）の多塩基残基によって置換される。
【００７１】
第Ｘａ因子及びエンテロキナーゼのようないくつかの哺乳動物プロテアーゼは、切断の結合のＮ末端側に完全に位置する、それらのそれぞれの対応する切断認識部位を有する。それらの切断認識部位はまた、天然のＨＡ成熟切断部位を置換するのに使用できる。天然ＨＡの場合のように、これらのプロテアーゼ切断部位の切断の結合のＣ末端側はグリシン（Ｇ）である。トロンビン切断部位もまた、切断の結合のＣ末端側にグリシン（Ｇ）を有する。トロンビン切断の後、新規のＮ末端のグリシン（Ｇ）が生成される。全てのこれらのプロテアーゼは、多くの天然のインフルエンザ宿主中に存在する。しかしながら、これらのプロテアーゼは通常、組換えＨＡ産生のために使用される細胞培地又は細胞株に存在しないか、又は痕跡量で存在するかのいずれかである。
【００７２】
タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）のＴＥＶプロテアーゼは、ＥＮＬＹＦＱＧの切断部位を認識し、グルタミン酸（Ｑ）とグリシン（Ｇ）の間を切断する。ＴＥＶプロテアーゼによって生成される遊離Ｎ末端はグリシン（Ｇ）であり、ＨＡ成熟後のＨＡ２のＮ末端の残基と同じである。天然ＨＡのＭＣＳと異なり、ＴＥＶ切断部位には塩基性残基が存在しない。いくつかの実施形態において、ＨＡのＭＣＳ全体が、ＴＥＶ切断部位によって置換されるか、又はＭＣＳのいくつかの残基がＴＥＶ切断部位によって置換されるか、又は例えば切断の結合のＮ末端側のアルギニン（Ｒ）のみがＴＥＶ切断部位によって置換される。ＴＥＶ切断部位によって置換されるＭＣＳを有するＨＡコンストラクトは、バキュロウイルス発現系又は哺乳動物発現系を使用して発現され、野生型ＨＡと同じレベルで発現するコンストラクトが同定されている。
【００７３】
修飾ＭＣＳを切断するＴＥＶプロテアーゼの存在において、前記修飾ＨＡは、成熟し、ＨＡ１及び融合ペプチドの天然Ｎ末端を有するＨＡ２へと変換される。成熟修飾組換えＨＡは、対応する宿主細胞受容体に結合する能力を有し、膜融合する。ＴＥＶプロテアーゼの非存在において、新規の合成された前記修飾ＨＡは、未切断のＨＡ０前駆体として残る。融合ペプチドの遊離Ｎ末端の欠損は、前記ＨＡの膜融合を防ぐ。感染した宿主細胞において産生される子孫のＨＡタンパク質は、宿主中のＴＥＶプロテアーゼの欠損のためにＨＡ０として残り、成熟機能型へとプロセシングされない。新規に作製されたＨＡ０を有するウイルスは、膜融合の能力を有さず、したがって非感染性である。
【００７４】
抗原部位と成熟切断部位の組合せ
ＨＡの球状ドメインの抗原部位の変更及びＨＡのステムドメインのＭＣＳの変更は、任意の種類の組合せであり得る。特定の異種ペプチドは、異なる改変された成熟切断部位を有するＨＡタンパク質の球状頭部ドメインの抗原部位へと導入できる。さらに、２つ以上の異種ペプチドを、異なる抗原部位で単一のＨＡタンパク質に導入することができる。一実施形態において、遺伝的に修飾された組換えインフルエンザＨＡは、ＨＡの球状頭部ドメインの抗原部位を置換するＭ２ｅペプチド及びＭＣＳとしてＴＥＶプロテアーゼ部位を有する。別の実施形態において、遺伝的に修飾された組換えインフルエンザＨ１のＨＡは、ＨＡの球状頭部ドメインの抗原部位を置換するＭ２ｅペプチド及びＨ１の天然のＭＣＳの代わりにＨ５のＭＣＳを有する。
【００７５】
産生方法
修飾ＨＡの産生のために、タンパク質は、内在性膜タンパク質ではなく、又は細胞膜若しくは細胞表面に付着せずに、細胞から細胞培地へと可溶型として分泌させる。いくつかの実施形態において、天然のＨＡシグナル配列を、昆虫細胞及び哺乳動物細胞における分泌のために使用する。他の実施形態において、天然のＨＡシグナル配列を、昆虫細胞における分泌のために昆虫細胞シグナル配列によって、又は哺乳動物細胞における分泌のために哺乳動物シグナル配列によって置換する。ＨＡ膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインの代わりに、プロテアーゼ切断部位をＨＡ細胞外ドメインのＣ末端に配置し、その後にＨＡ三量体の安定化のためのバクテリオファージＴ４フィブリチン由来の「ｆｏｌｄｏｎ」配列、及び精製を促進するためのＣ末端Ｈｉｓタグを配置する。組換えＨＡタンパク質は、シグナル配列の除去された全長の未切断の前駆体ＨＡ０として、又はＨＡ２のＮ末端に野生型融合ペプチドを有するＨＡ１及びＨＡ２サブユニットを含有する成熟型としてのいずれかで作製される。好ましい実施形態において、最終的に精製された遺伝的に修飾されたＨＡは、野生型ＨＡのように三量体を形成する。
【００７６】
設計された組換えインフルエンザＨＡの遺伝子は新規遺伝子合成によって作製される。遺伝子合成技術は、よく確立されており、広範囲にレビューされている（Ｋｏｓｕｒｉ，Ｓ及びＣｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．、Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１４）１１：４９９〜５０７）。１０ｋｂ超の長さの遺伝子は、商業的供給者によって日常的に作製されている。遺伝子合成は、特定のＨＡ配列を修飾する能力、及び発現宿主又は特定の遺伝的操作の必要性に応じたコドン最適化の機会を提供する。異なるコンストラクト間のＨＡ断片の交換を促進するために、合成されたＨＡ遺伝子の特定の位置に制限部位を設計する。シグナル配列並びにプロテーゼ部位、ｆｏｌｄｏｎ配列、及びＣ末端Ｈｉｓタグを有する合成されたＨＡ遺伝子は、よく確立されたプロトコールによってバキュロウイルスゲノムへと組み込まれ、修飾ＨＡタンパク質の発現がバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターによって導かれるようにする。他の実施形態において、ＨＡ遺伝子の同じセットは、哺乳動物細胞における発現のための哺乳動物発現ベクターにクローニングされる。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ＨＡコンストラクトは、バキュロウイルスベクターを使用する昆虫細胞における発現のためにコドン最適化される。他の実施形態において、ＨＡコンストラクトは、これに限定されるものではないが、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）及びＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓２９３細胞）を含む哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化される。任意の生物のためのコドン最適化は、ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（３８０１  Ｒｅｇｅｎｔ  Ｓｔｒｅｅｔ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ  ５３７０５  ＵＳＡ）からのＬａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージのような市販のソフトウェア、ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ（ワールドワイドウェブでｇｅｎｏｍｅｓ．ｕｒｖ．ｅｓ／ＯＰＴＩＭＩＺＥＲ／に位置する）のようなオンラインウェブサーバーを使用して、又はそれらの独自のアルゴリズムを使用する遺伝子合成サービス供給者によって日常的に実施される。コドン最適化は、Ｇ／Ｃ含量、潜在的なスプライス部位及びＲＮＡ不安定化配列要素の排除、並びに安定したＲＮＡ二次構造の回避を考慮する。コドンはまた、Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ワールドワイドウェブでｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／に位置する）に基づいて手動で調整される。コドンの縮退のために、遺伝子配列は、コードされるアミノ酸配列を変化させずに変更できる。制限部位は、アミノ酸配列を変化させずにコドンを変更することによって特定の位置に導入される。これらの方法のいずれかを使用して、特定の生物に対するコドン最適化を含むか、又は含まない遺伝子配列は、コンピューターアルゴリズムを使用して、又は手動でタンパク質配列の逆翻訳によって日常的に生成される。
【００７８】
他の実施形態は、ＴＥＶプロテアーゼ認識部位に変更したＭＣＳを有する遺伝的に修飾されたＨＡ遺伝子から組換え非感染性インフルエンザウイルスを、確立された細胞培養法を使用して作製する方法を含む。ヘルパーウイルスを使用することを含むか、又は含まずに、ＲＮＡセグメント又はクローニングされたｃＤＮＡを含むプラスミドからのインフルエンザウイルスの産生を可能にする逆遺伝学系が開発されている（Ｌｕｙｔｊｅｓ，Ｗら、Ｃｅｌｌ（１９８９）５９：１１０７〜１１１３；Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｇら、ＰＮＡＳ（１９９９）９６：９３４５〜９３５０；Ｆｏｄｏｒ，Ｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（１９９９）７３：９６７９〜９６８２；ｄｅ  Ｗｉｔ，Ｅら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ（２００７）８８：１２８１〜１２８７）。感染性インフルエンザウイルスは、インフルエンザＲＮＡセグメント又はインフルエンザＲＮＡのｃＤＮＡを有するプラスミドによる哺乳動物細胞の一過性トランスフェクションによって作製される。細胞培地より単離されるこれらのウイルスは、ワクチンを作製するための生感染性インフルエンザウイルスを産生するために発育鶏卵に感染させるために使用される。インフルエンザＲＮＡセグメントのいくつかは、外来遺伝子によって置換される。組換えインフルエンザＡウイルスは、ＨＡタンパク質を置換するインフルエンザＣウイルスＨＥＦタンパク質を使用して作製されている（Ｇａｏ，Ｑら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２００８）８２：６４１９〜６４２６）。これらの実施形態において、修飾ＨＡのｃＤＮＡ又はＲＮＡは、標準的な分子技法及び遺伝子合成によって作製される、他の７つのインフルエンザＲＮＡ又は他の７つのＲＮＡセグメントのｃＤＮＡと共に哺乳動物細胞へと共トランスフェクションされる。確立された方法又は同様の方法を使用して、複数の同一の又は異なるＨＡタンパク質を単一のビリオンにパッケージすることができる（Ｕｒａｋｉ，Ｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２０１３）８７：７８７４〜７８８１）。
【００７９】
遺伝的に修飾されたＨＡ遺伝子から組換え感染性インフルエンザウイルスを作製する方法は、上述のような確立された細胞培養法を使用する。これらの実施形態において、Ｈ５のＨＡのＭＣＳ又はＭＣＳにおける多塩基性配列によって遺伝的に修飾されたＨＡ遺伝子は、上述のような標準的な逆遺伝学系によって作製される、他の７つのインフルエンザＲＮＡ又は他の７つのＲＮＡセグメントのｃＤＮＡと共に哺乳動物細胞へと共トランスフェクションされる。これらの修飾された成熟切断部位は、インフルエンザの天然宿主又は細胞培養におけるＨＡ成熟の効率を高める（Ｋｏｎｇ，Ｗ−ｐら、ＰＮＡＳ（２００６）１０３：１５９８７〜１５９９１）。成熟機能性ＨＡタンパク質は、宿主細胞に結合して宿主細胞膜と融合する能力を有する。
【００８０】
他の実施形態は、哺乳動物細胞において、昆虫細胞において、及び植物細胞において確立された細胞培養法を使用して遺伝的に修飾されたＨＡ遺伝子から組換えインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を作製する方法を含む（Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｊら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２００７）８１：７１１１〜７１２３；Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１３）３１：４３０５〜４３１３；Ｄ’Ａｏｕｓｔ，Ｍ．Ａら、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２０１０）８：６０７〜６１９）。
【００８１】
他の実施形態は、確立された方法を使用して、遺伝的に修飾されたＨＡ遺伝子からＤＮＡワクチンを作製する方法を含む（Ｊｉａｎｇ，Ｙら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ（２００７）７５：２３４〜２４１；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊら、Ｖａｃｃｉｎｅ（２０１０）２８：６６４〜６７２；Ｒａｏ，Ｓ．Ｓら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２０１０）５：ｅ９８１２）。
【００８２】
本明細書において開示される発現結果は、Ｈ１のＨＡのＭＣＳは、生じるＨＡの発現に影響をもたらすことなく修飾できることを示す。Ｈ５のＨＡＭＣＳ又は多塩基性ＭＣＳを有するコンストラクトは、野生型のＨ１のＨＡと同じレベルで発現することを実証している。さらに、ＨＡのＭＣＳは、塩基性残基を全く含まないＴＥＶプロテアーゼ切断部位によって置換される。ＴＥＶプロテアーゼ切断部位の位置を変化させることによって、野生型Ｈ１のＨＡと同じレベルで発現する、ＭＣＳとしてＴＥＶ切断部位を有するコンストラクトが作製されている。
【００８３】
発現結果は、ＨＡ１の球状頭部ドメインにおける抗原部位の多くを、同じＨＡ又は異なるＨＡのステムドメイン由来の異種ペプチドによって置換できることをさらに示す。コンストラクトのいくつかが野生型ＨＡと同じレベルで発現する一方で、他のコンストラクトははるかに少なく発現する。異種ペプチドの性質及び球状頭部ドメインにおける異種ペプチドの位置が、各々の生じるＨＡコンストラクトの発現レベルに顕著な影響をもたらす。より多くのコンストラクトを作製して、最も最適な発現コンストラクトを同定するために同じ様式でそれらの発現について試験することができる。
【００８４】
さらに、組換えＨＡは、ＨＡ球状頭部ドメインのある一定の免疫優性抗原部位のインフルエンザＭ２タンパク質由来のＭ２ｅエピトープによる置換によって作製される。おそらく、他のインフルエンザタンパク質の任意のエピトープが、ＨＡ球状頭部ドメインの免疫優性抗原部位を置換するための置換ペプチドとして役立ち得る。さらに、異種置換ペプチドが、インフルエンザウイルスに関連しない別のタンパク質由来であり得る。置換ペプチドの天然の構造的特徴を維持し、かつ宿主免疫系に置換ペプチドを提示することが可能であるＨＡ球状頭部ドメインの特定の抗原部位が、置換ペプチドのために選択できる。
【００８５】
バキュロウイルス発現系
約３０年前のその導入（米国特許第４，７４５，０５１号；Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ及びＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．、（１９８７）Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．  Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５）から、バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）は、細胞内タンパク質、膜タンパク質、及び分泌タンパク質を含む、多くの異なる型のヒト及びウイルスタンパク質の発現に使用されている。ＢＥＶＳはウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生するのに使用されている。ＢＥＶＳは、真核生物発現系であり、哺乳動物細胞に類似したタンパク質の翻訳後修飾を提供する昆虫細胞を宿主として使用する（Ｔｈｅ  ＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓのＪａｒｖｉｓ，Ｄ．Ｌ．、「Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｋ編（１９９７）３８９〜４２０ページ  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に基づくＢＥＶＳはよく確立されている。組換えバキュロウイルスを産生するための多くの市販のキットが入手可能である。ＢＥＶＳは、米国において流通する組換えワクチンを産生するために成功裏に使用されている。２つのＦＤＡに承認されたワクチン、子宮頸がんに対する非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の形態の組換えヒトパピローマウイルス二価（タイプ１６及び１８）ワクチンであるＣｅｒｖａｒｉｘ（商標）（特許出願ＷＯ２０１０／０１２７８０  Ａ１）、並びにインフルエンザに対する、膜結合ヘマグルチニン前駆体（ＨＡ０）から作製される三価インフルエンザワクチンであるＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）（米国特許第５，７６２，９３９（Ａ）号及び米国特許第５，８５８，３６８（Ａ）号）がＢＥＶＳを使用して産生されている。
【００８６】
ＢＥＶＳを使用して標的タンパク質を発現するために、標的タンパク質をコードする目的の遺伝子を、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子に隣接するバキュロウイルス配列を含有する大腸菌プラスミドであるトランスファーベクターへと最初にサブクローニングする。ポリヘドリンは、細胞培養におけるバキュロウイルス増殖に必要ではない、野生型バキュロウイルスにおいて豊富なウイルスタンパク質である。トランスファーベクターは大腸菌において増殖し、標準的な分子生物学的技法を使用して単離する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）。目的の遺伝子を有するトランスファーベクターを、大腸菌又は昆虫細胞のいずれかにおいてバキュロウイルスゲノムＤＮＡと組み換えて、組換えバキュロウイルスゲノムを産生する。組換えバキュロウイルスゲノムは、組換えバキュロウイルスの産生及び標的タンパク質の発現を導く。元の方法は、トランスファーベクターのポリヘドリン遺伝子に隣接する同じ配列と昆虫細胞におけるウイルスゲノムＤＮＡとの間の相同組換えに依拠する。単離したトランスファーベクターＤＮＡは、バキュロウイルスゲノムＤＮＡと共に昆虫細胞に共トランスフェクションされる。組換えバキュロウイルスは、ポリヘドリンの欠損のために選択される。ＣｌｏｎｔｅｃｈからのＢａｃＰＡＫ（商標）Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅからのＢａｃＭａｇｉｃ（商標）Ｓｙｓｔｅｍのような現在の市販のキットは、組換えなしに生存可能なウイルスを産生しない直鎖状バキュロウイルスゲノムＤＮＡを使用する。これらのキットは高効率かつ非組換えウイルスの少ない混入での組換えバキュロウイルスの産生を可能にする。ウイルスゲノムに対する組換えもまた、Ｇｅｔｅｗａｙ組換え反応を使用してインビトロで作製できる（ＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔ（商標）Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。組換えウイルスを作製する別の方法は、大腸菌における部位特異的転移を介する（Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ｐＦａｓｔＢａｃに基づくトランスファーベクターは、大腸菌においてバクミド（バキュロウイルスのゲノムを含有する大きなプラスミド）を作製するトランスポゾンを含有する（米国特許第５，３４８，８８６号）。目的の遺伝子のバクミドへの組換えは、昆虫細胞へのバクミドのトランスフェクションの前に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって容易に確認できる。
【００８７】
組換えバキュロウイルスは昆虫細胞培養において増殖する。少量のウイルスを昆虫細胞に感染させるために使用する。数日後、増幅したウイルスを含有する馴化培地をウイルスストックとして採集する。この増幅プロセスは、しばしば、大量のウイルスストックを生成するために数回繰り返される。ウイルスストックは、日常的に、数ヶ月、さらには数年間、冷蔵庫で暗所に保管される。５〜１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）のウイルスストックへの補充は、ウイルスストックを保存するために使用され、保存期間を延ばすと考えられている。ウイルスストックはしばしば、長期間の保管のために−７０℃で凍結される。ウイルスはまた、増幅され、バキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）として保管されている（Ｗａｓｉｌｋｏ，Ｄ．Ｊら、Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐ  Ｐｕｒｉｆ（２００９）６５：１２２〜１３２）。感染昆虫細胞は、それらが溶解する前にＢＩＩＣストックとして採集され、標準的な細胞凍結手順に従って凍結される。ＢＩＩＣストックは、液体窒素中か、又は、−６０℃〜−８５℃の超低温で長期間保管され、タンパク質発現のために昆虫細胞に感染させるウイルスストックとして使用される。凍結ＢＩＩＣストックは、液体形態のウイルスストックよりもより長い保管期間を提供する。
【００８８】
ＢＥＶＳに一般的に使用される昆虫細胞株は、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来のＳＦ９及びＳＦ２１細胞、並びにイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）由来のＨｉ５又はＴ．ｎｉ細胞である。カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、ハチノスツヅリガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）、及びマイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ）の種由来の他の昆虫細胞もまた使用されている。ＳＦ９、ＳＦ２１、及びＨｉ５（又はＴ．ｎｉ）細胞は、無血清培地中の懸濁培養に適応している。これらの細胞株及び培地は、多くの商業的供給源より入手可能である。これらの細胞株の細胞培養は、２２〜２８℃の温度範囲でガスの補充のない周囲大気中の振とうインキュベーター内で１又は２リットルまでの小容量で振とうフラスコ中で日常的に維持される。細胞培養は、撹拌タンクバイオリアクター又は一回使用バイオリアクターでスケールアップされる。バイオリアクター中の大規模昆虫細胞培養のための条件は、よく確立されている（ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。大規模昆虫細胞培養において細胞密度を増加させるために酸素の補充もまた日常的に使用される。
【００８９】
標的タンパク質の発現を最適化するために特定の標的タンパク質の発現のための一連の条件が、ウイルス対細胞比及び感染後採集時間を変動させて異なる細胞株を使用して試験される。ＳＦ９、ＳＦ２１、及びＨｉ５（又はＴ．ｎｉ）細胞は、ＢＥＶＳタンパク質発現のために使用される最も一般的な細胞株である。標的タンパク質は、細胞株の１つにおいて他においてよりもよりよく発現する可能性がある。いくつかの報告は、Ｈｉ５（又はＴ．ｎｉ）細胞が、ある分泌タンパク質のより多い発現をもたらすことを示す。感染多重度（ＭＯＩ）として一般的に知られるウイルス対細胞比は、標的タンパク質発現のための最良の感染条件を決定するために試験される。培養サンプルは、感染後の様々な時点において採取される。細胞と馴化培地とは、遠心分離又はろ過によって分離される。タンパク質発現レベルは、標準的な方法によって決定される。培養は、細胞密度、細胞生存率、及び細胞サイズについてモニターされ、これらは、細胞増殖及び培養状態についての情報を提供する。グルコースレベル、溶存酸素、及び培養物のｐＨは、培地中の栄養素の消費に関してしばしばモニターされる。最良の標的タンパク質発現を導く条件は、タンパク質の大規模産生のために選択される。
【００９０】
ウイルスストックの力価及びＭＯＩの決定はウイルス増幅及びＢＥＶＳを使用するタンパク質発現のための感染条件を決定するために広く使用されるが、上述のＴＩＰＳ法は、ウイルス増幅及びタンパク質発現のための最良の感染条件を決定するより迅速な方法を提供する。昆虫細胞は組換えバキュロウイルスによる感染後にサイズを増大する。細胞分裂もまた感染後停止する。組換えバキュロウイルスは感染後約４８時間で細胞溶解を引き起こす。細胞分裂は、培養の細胞密度として細胞を計数することによりモニターされる。細胞溶解は、培養中の生細胞及び死細胞を計数することによる細胞生存率としてモニターされる。生存可能な細胞のサイズは細胞直径として測定される。細胞密度、細胞生存率、及び生存可能な細胞のサイズは、多数のモデルの細胞計数装置によって日常的に測定される。細胞密度及び細胞生存率はまた、血球計算板を使用して手動で測定できる。まとめると、細胞密度、細胞生存率、及び生存可能な細胞のサイズは、感染動態に関する情報を提供する。ＴＩＰＳ法は、特定のウイルスストックを使用する特定の標的タンパク質の発現のための最適な条件を決定するために感染動態を使用する。それは、ＭＯＩ計算のためのウイルス力価の時間のかかる測定を排除する。一定したウイルス増幅及びタンパク質発現は、ＴＩＰＳ法を使用して日常的に達成される。
【００９１】
昆虫細胞に加えて、組換えバキュロウイルスを感染した生昆虫が、多くの分泌タンパク質及び膜タンパク質を発現するのに使用されている。成熟ＨＡは、タバコスズメガ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）の幼虫において発現されている（Ｋｕｒｏｄａ，Ｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（１９８９）６３：１６７７〜１６８５）。
【００９２】
カイコ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）のような他の型のバキュロウイルスに基づく発現系もまた開発されている。ＢｍＮＰＶは、より狭い宿主範囲を有し、野外で害虫として増殖することはない点でＡｃＮＰＶより良好な生物学的安全性プロファイルを有し得る。ＢｍＮＰＶに基づくバキュロウイルス発現系は、細胞培養及びカイコの幼虫において機能性タンパク質を発現するのに使用されている（Ｍａｅｄａ，  Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５：５９２〜５９４）。
【００９３】
ＢＥＶＳは、タンパク質複合体及びＶＬＰを産生するために日常的に使用されている。複数のタンパク質の発現のために２つ以上の遺伝子が単一のベクターにクローニングされる。各々が単一のタンパク質の発現を導く２つ以上のウイルスストックが、タンパク質複合体又はＶＬＰを産生するために昆虫細胞を共感染するのに使用される。インフルエンザＶＬＰは、バキュロウイルス発現系を使用して作製されている（Ｂｒｉｇｈｔ，Ｒ．Ａら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２００８）３：ｅ１５０１）。
【００９４】
バキュロウイルス発現のためのＨＡトランスファーベクター
ＢＥＶＳを使用して発現される遺伝子は一般的に、バキュロウイルス誘導昆虫細胞死の前にタンパク質発現を導くバキュロウイルスの強力な後期のプロモーターであるポリヘドリンプロモーターの制御下にある。他の初期又は後期プロモーターもまたタンパク質発現のために使用される。細胞培地に組換え標的タンパク質を昆虫細胞によって分泌させるために、シグナルペプチドをコードするＤＮＡセグメントが目的の遺伝子の５’末端にインフレームで操作される。２つの昆虫細胞で一般的に使用されるシグナルペプチドは、ミツバチメリチンシグナル配列、又はＡｃＮＰＶエンベロープ表面糖タンパク質ＧＰ６７シグナル配列である。Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ワールドワイドウェブでｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐに位置する）は、多くの他の考慮し得るシグナルペプチドを列挙する。分泌後、シグナルペプチドはシグナルペプチドをプロセシングする細胞プロテアーゼによって除去される。インフルエンザウイルスは昆虫ウイルスではないが、ＨＡシグナルペプチドは、ＢＥＶＳにおいて、組換えタンパク質の分泌又は膜挿入のための分泌シグナルペプチドとして使用されている。ＭＫＴＩＩＡＬＳＹＩＦＣＬＶＦＡのＨＡシグナルペプチドは、昆虫細胞における組換え膜貫通Ｇプロテイン共役受容体（ＧＰＣＲ）の発現に一般的に使用される（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ，Ｄ．Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１２６６〜１２７３；Ｚｏｕ，Ｙら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１２）７：ｅ４６０３９）。ＨＡは、その天然のシグナルペプチドを使用して昆虫細胞で発現されている。その特定の場合において、全発現は昆虫細胞シグナルペプチドを使用するものよりも低いが、発現したＨＡは、ＨＡ１及びＨＡ２を含有する成熟型であった（米国特許第５，８５８，３６８（Ａ）号）。ＨＡシグナルペプチドは、ＨＡ間で保存されていない。例えば、上述のＨＡシグナルペプチドは、配列番号７のＨ１のＨＡシグナルペプチドとは異なる。ＨＡシグナルペプチドの実験に基づく選択は、昆虫細胞におけるＨＡ発現を改善する可能性がある。
【００９５】
Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム又はＧａｔｅｗａｙシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して相同組換えを介して組換えバキュロウイルスを作製するための市販のベクターは入手可能である。プロモーター及びシグナル配列のようなこれらのトランスファーベクターの特徴は、標準的な分子生物学的技法によってカスタマイズすることができる。現在では、トランスファーベクター全体を遺伝子合成によって完全に合成することができる。遺伝子合成は、特定の配列及び特徴を有するトランスファーベクターの設計を可能にする。
【００９６】
ＢＥＶＳを使用してインフルエンザＨＡを発現する方法は、実験室規模においてよく確立されている（Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００４）３０３：１８６６〜１８７０）。例えば、トランスファーベクターは、ポリヘドリンプロモーターの制御下に１９１８年インフルエンザウイルス由来のＨＡを含有する。１９１８年インフルエンザウイルスＨＡ発現コンストラクトは、分泌のために、Ｎ末端のＨＡシグナルペプチドの代わりにＧＰ６７シグナルペプチドを有する。膜貫通ドメインの代わりに、トロンビン切断部位をＨＡ細胞外ドメインのＣ末端に導入し、その後にＨＡ三量体の安定化のためのバクテリオファージＴ４フィブリチン由来の「ｆｏｌｄｏｎ」配列、及び精製を促進するためのＣ末端Ｈｉｓタグを導入する。ｆｏｌｄｏｎ配列及びＨｉｓタグは、トロンビン切断によって除去できる。ＨＡ発現トランスファーベクターの同様の設計が、インフルエンザの多くの系統に由来する異なるＨＡを発現するのに使用されている（Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）３１２：４０４〜４１０；Ｘｕ，Ｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１０）３２８：３５７〜３６０；Ｗｈｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｒ．Ｒら、ＰＮＡＳ（２０１１）１０８：１４２１６〜１４２２１）。
【００９７】
ｆｏｌｄｏｎに加えて、他の三量体化ドメインを組換えＨＡの三量体を安定化させるのに使用できる。例えば、熱安定性ＨＩＶ−１糖タンパク質４１（ｇｐ４１）三量体化ドメイン、又はＧＣＮ４ロイシンジッパー配列の３１残基の最初の１６残基が、短縮ＨＡコンストラクトの三量体化を助けるのに使用される（Ｉｍｐａｇｌｉａｚｚｏ，Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５）３４９：１３０１〜１３０６；Ｙａｓｓｉｎｇ，Ｈ．Ｍら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ（２０１５）２１：１０６５〜１０７０）。
【００９８】
米国特許第５，７６２，９３９（Ａ）号、米国特許第５，８５８，３６８（Ａ）号、及び米国特許第６，２４５，５３２（Ｂ１）号に開示されるように、膜貫通ドメイン及び細胞内部ドメインを有するインフルエンザＡとインフルエンザＢとの両方のウイルス由来の組換えＨＡ前駆体（ＨＡ０）が、商業的規模においてＢＥＶＳを使用して作製されている。これらの組換えＨＡタンパク質は、インフルエンザワクチンとしてＦＤＡの承認を取得しているＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標）における成分である。Ｆｌｕｂｌｏｋ（登録商標）中のＨＡ０は、ＨＡシグナルペプチドを置換するバキュロウイルスキチナーゼシグナルペプチド（６１Ｋシグナルペプチドと呼ばれる）を使用して作製されている。組換えＨＡは、昆虫細胞の膜周縁に会合する。それは、界面活性剤を使用して膜より抽出され、さらに精製される。
【００９９】
哺乳動物発現
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞が、組換えタンパク質の一過性トランスフェクション遺伝子発現のために一般的に使用される哺乳動物細胞宿主である。ＣＨＯ細胞とＨＥＫ２９３細胞の両方は、懸濁細胞株及び接着細胞株を有する。これらの細胞は、ＦＢＳを含むか又は含まない培地において日常的に培養される。ＦＢＳを含まずに細胞を培養するとき、既知組成培地がしばしば使用される。全ての懸濁及び接着細胞株をＨＡ又は他の分泌タンパク質を発現するのに使用できる。
【０１００】
一過性トランスフェクションは、タンパク質発現のためにＤＮＡを細胞に導入するためのよく確立された方法である。多くの市販のトランスフェクション試薬が入手可能である。バキュロウイルス発現のための発現最適化プロセスと同様に、標準的な方法を使用するタンパク質発現の解析のために、トランスフェクション後に培地サンプルを定期的に採取する。ＨＡタンパク質は、ＨＡコンストラクト中のＨｉｓタグ、又は多くが市販される抗ＨＡ抗体を使用するウェスタンブロットを介して、親和性捕捉によって容易に検出できる。タンパク質発現は通常、トランスフェクション後約４８時間で開始し、トランスフェクション後数日にわたって増加し得る。標的タンパク質の発現を増加するために、トランスフェクション後にサプリメントをしばしば添加する。アフリカミドリザル腎組織由来の線維芽細胞様細胞株であるＣＯＳ−１のような他の哺乳動物細胞株もまたＨＡ発現に使用されている。インフルエンザＶＬＰは、１０個のインフルエンザウイルスがコードするタンパク質の全てのｃＤＮＡを含有する複数のプラスミドの共トランスフェクションによって産生されている（Ｍｅｎａ，Ｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（１９９６）７０：５０１６〜５０２４；Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｊら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２００７）８１：７１１１〜７１２３）。
【０１０１】
哺乳動物細胞に遺伝子を送達する別の方法は、哺乳動物細胞へのバキュロウイルス遺伝子トランスファーのためのＢａｃＭａｍとして知られる組換えバキュロウイルスを使用する（Ｂｏｙｃｅ，Ｆ．Ｍ及びＢｕｃｈｅｒ，Ｎ．Ｌ．、ＰＮＡＳ（１９９６）９３：２３４８〜２３５２；Ｄｕｋｋｉｐａｔｉａ．Ａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ（２００８）６２：１６０〜１７０）。バキュロウイルスは、哺乳動物細胞におけるトランスジーン発現のためのバキュロウイルス発現ベクターに哺乳動物発現カセットを組み込むことによって修飾されている。組換えＢａｃＭａｍバキュロウイルスは、バキュロウイルス産生のための標準的な方法によって生成される。増幅した組換えＢａｃＭａｍバキュロウイルスウイルスストックは、タンパク質発現のためのＣＨＯ又はＨＥＫ２９３細胞に哺乳動物発現カセットの送達のために、ＣＨＯ又はＨＥＫ２９３培養へと添加される。ＢａｃＭａｍプラットフォームは、大量の哺乳動物細胞の形質導入を容易にする。
【０１０２】
哺乳動物細胞にトランスフェクトされた遺伝子発現ベクターは、標的タンパク質の発現のための安定細胞株を確立するために細胞染色体に組み込むことができる。安定なＣＨＯ細胞株は、モノクローナル抗体のような治療用生物製剤の産生のための最も一般的な宿主である。この技術は、治療用タンパク質及びワクチンの大規模産生によく適している。安定細胞株の確立のために、発現ベクターをトランスフェクションした細胞は、発現ベクター上の選択マーカーに基づいた選択に供される。標的遺伝子の複数のコピーがしばしば、安定細胞株のゲノムに組み込まれる。
【０１０３】
哺乳動物発現のためのＨＡベクター
哺乳動物発現のためのＨＡ発現コンストラクトは、バキュロウイルス発現のためのものと同じ設計及びアミノ酸配列を有する。コドンはＣＨＯ細胞発現又はＨＥＫ２９３細胞発現のために最適化される。バキュロウイルスコドンはまた、哺乳動物細胞においてよく機能し、逆もまた真である。ＨＡシグナルペプチドは、哺乳動物発現系において組換えタンパク質の分泌又は膜挿入のためのシグナルペプチドとして使用されている。他の一般的に使用される哺乳動物シグナルペプチドは、ヒトＩＬ２シグナルペプチド、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）シグナルペプチド、及びＳｉｇｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ワールドワイドウェブでｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐに位置する）に見られる他の多くのシグナルペプチドを含む。多くの哺乳動物発現ベクターが市販される。各々のベクターは通常、高レベル発現のためのエンハンサー−プロモーター、ｍＲＮＡ安定性のためのポリアデニル化シグナル及び転写終結配列、エピソーム複製のためのＳＶ４０起点、選択及び大腸菌における維持のための抗生剤耐性遺伝子及びｐＵＣ起点を有する。哺乳動物発現において一般的に使用されるプロモーターは、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ｈＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーター、伸長因子−１α（ＥＦ−１α）コアプロモーター、並びにヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）１型の長い末端反復のＲセグメント及びＵ５配列の一部（Ｒ−Ｕ５’）、又はＭＰｒｏｍＤｂ（ワールドワイドウェブでｍｐｒｏｍｄｂ．ｗｉｓｔａｒ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／に位置するＭａｍｍａｌｉａｎ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ）、又はＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ワールドワイドウェブでｅｐｄ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／に位置するＥＰＤ）に見られる他のプロモーターを含む複合プロモーターを含む。トランスファーベクターはしばしば、安定な細胞株を生成するために別の選択マーカーを有する。
【０１０４】
次の実施例は、これに限定されるものではないが、本発明を例示するために提供される。
【実施例１】
【０１０５】
組換えバキュロウイルス産生のためのＨ１のＨＡのトランスファーベクターの構築
この実施例において、本発明の修飾ＨＡタンパク質を調製するために修飾することができる親プラスミドが記載される。このプラスミドの基本的な概要は図４に示し、そこでは、バキュロウイルスにおける発現のための標準的なプラスミドへの挿入は、そのような挿入のための制限部位によって囲まれ、ＨＡタンパク質のＭＣＳの置換及びＨＡの球状頭部ドメインの免疫優性領域の置換を可能にする制限部位が存在する。コードされたタンパク質は、精製後に挿入されたプロテアーゼ切断部位のおかげで除去することのできる、精製のための１０個のヒスチジンの親和性タグ（１０×Ｈｉｓタグ）に融合する。このベクターはＨ１ＷＴと呼ばれる。
【０１０６】
２００９年インフルエンザワクチン産生としてＷＨＯによって推奨される（ワールドワイドウェブでｗｈｏ．ｉｎｔ／ｃｓｒ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｓｗｉｎｅｆｌｕ／ｖａｃｃｉｎｅ＿ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ／ｅｎ／において述べられるように）ブタ起源インフルエンザＡウイルスＨ１Ｎ１系統であるＡ／カリフォルニア／０７／２００９のＨＡ配列（配列番号１）を、異種ペプチドを組み込むための親配列として使用した。このＨＡ配列はＵｎｉＰｒｏｔ：Ｃ３Ｗ５Ｘ２の受託番号を有する。全てのコンストラクトは、図４に概略的に例示されるものと同じ設計を有する。Ｎ末端ＨＡシグナルペプチド（配列番号７）は、ＧＰ６７シグナルペプチドＭＶＳＡＩＶＬＹＶＬＬＡＡＡＡＨＳＡＦＡ（配列番号２）によって置換される。Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００６）３１２：４０４〜４１０によって最初に記載されたＨＡコンストラクトに基づいて、ＩＬＡＩＹＳＴＶＡＳＳＬＶＬＶＶＳＬＧＡＩＳＦＷＭＣＳの配列を有するＣ末端膜貫通（ＴＭ）ドメイン、及びＨＡのＮＧＳＬＱＣＲＩＣＩの配列を有する細胞内ドメインが、ＴＥＶ切断部位（配列番号４）、後に続くｆｏｌｄｏｎ（配列番号５）、及び１０×Ｈｉｓタグ（配列番号６）によって置換され、つまり、ＧＡＥＮＬＹＦＱＧＧＳＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号３）となった。ｆｏｌｄｏｎは、組換えＨＡを安定化し、一方で１０×Ｈｉｓタグは、細胞培地からのＨＡの精製を促進する。ｆｏｌｄｏｎ及び１０×Ｈｉｓタグは、ＨＡ配列とｆｏｌｄｏｎ配列との間に位置するＴＥＶ切断部位を認識するＴＥＶプロテアーゼによって除去できる。遺伝子は、バキュロウイルス発現のためにコドン最適化され、標準的な方法によって合成された（ＧＥＮＥＷＩＺ、Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ  ０７０８０、ＵＳＡ）。
【０１０７】
図４に概略的に示されるように、間隔を空けた特有の制限部位、ＣｌａＩ部位、ＮｓｉＩ部位、及びＢａｍＨＩ部位が、配列変更及びスワッピングを促進するためにＨＡ配列に導入された。生じるコンストラクト、「Ｈ１ＷＴ」と表されるＧＰ６７−Ｈ１ＷＴ−ＴＥＶ−ｆｏｌｄｏｎ−１０Ｈｉｓ（配列番号９）は、ＮｃｏＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の間でｐＦａｓｔＢａｃプラスミドにサブクローニングされた。ＣｌａＩとＮｓｉＩとの部位の間の配列は、球状頭部ドメインの免疫優性抗原部位の大部分をコードする。ＮｓｉＩとＢａｍＨＩとの部位の間の配列はＭＣＳをコードする。Ｈ１ＷＴコンストラクトの発現は、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターの制御下にある。生じるプラスミドは、Ａ／カリフォルニア／０７／２００９の組換え野生型ＨＡの発現のためのトランスファーベクターである。Ｈ１ＷＴコンストラクトは、そこから遺伝的に修飾されたＨＡコンストラクトが作製される親コンストラクトである。
【０１０８】
異種ペプチドを有する遺伝的に修飾されたＨＡを作製するために、Ｈ１ＷＴの野生型断片を、上述の制限部位を使用してＨＡに対する特定の変更をコードする合成ＤＮＡ断片と置換した。ＭＣＳを修飾するために、Ｈ１ＷＴのＮｓｉＩ−ＢａｍＨＩ断片を、改変された成熟切断部位をコードするＤＮＡ断片によって置換した。ＨＡ１球状頭部ドメインの抗原部位を変更するために、Ｈ１ＷＴのＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片を、異種ペプチドを有する改変抗原部位をコードするＤＮＡ断片によって置換した。成熟切断部位と抗原部位の異なる組合せを有するコンストラクトが、異なるプラスミドの制限断片の単純な交換によって作製された。生じるコンストラクトはＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【実施例２】
【０１０９】
修飾された成熟切断部位を有するＨ１のＨＡコンストラクトの設計及び構築
この実施例において、ＭＣＳを囲むＮｓｉＩとＢａｍＨＩとの制限部位の間のＨ１ＷＴのセグメントが、このＭＣＳを修飾する代替配列によって置換される。いくつかの例において、ＴＥＶ切断部位が修飾されたＭＣＳに含まれる。
【０１１０】
修飾された成熟切断部位は、実施例１に記載されるＨ１のＨＡのトランスファーベクターへと導入された。修飾された成熟切断部位を有するコンストラクトは表１に列挙する。
【０１１１】
【表１】
2019506168.tif 000003
【０１１２】
これらの修飾の位置は図５に例示する。
【０１１３】
コンストラクトＨ１Ｈ５ｃｓ（配列番号１１）は、野生型のＨ１のＨＡのＭＣＳ（配列番号９）をＨ５のＭＣＳ（配列番号１２）によって置換させる。コンストラクトＨ１Ｒ５ｃｓ（配列番号１４）は、野生型のＨ１のＭＣＳを５個のアルギニンによって置換させる。コンストラクトＨ１ＩＲ５ｃｓ（配列番号１６）は、全ての天然のＨＡ１残基を維持しつつＨＡ１とＨＡ２との配列の間に挿入された４個のアルギニンを有する。変更を有するＮｓｉＩ−ＢａｍＨＩ断片が合成され、野生型断片を置換するためにＨ１ＷＴのＮｓｉＩとＢａｍＨＩとの部位の間にサブクローニングされた。
【０１１４】
Ｈ１のＨＡのＭＣＳが塩基性残基を全く含有しないＴＥＶ切断部位へと修飾できるかどうかを試験するために、Ｈ１のＨＡのＭＣＳにおける残基の数を変更していくつかのコンストラクトが作製された。コンストラクトＨ１ＴＥＶ１（配列番号１８）は、Ｈ１のＨＡのＭＣＳにおける７残基ＰＳＩＱＳＲＧを、ＥＮＬＹＦＱＧの７残基のＴＥＶ切断部位（配列番号４）によって置換させる。コンストラクトＨ１ＴＥＶ２（配列番号２０）は、Ｈ１のＨＡのＭＣＳにおける８残基ＩＰＳＩＱＳＲＧを、ＴＥＶ切断部位を含有させるＳＰＥＮＬＹＦＱＧによって置換させる。コンストラクトＨ１ＴＥＶ３（配列番号２２）は、Ｈ１のＨＡのＭＣＳにおける最後の３残基（ＱＳＲ）を、ＴＥＶ切断部位によって置換させる。
【実施例３】
【０１１５】
球状頭部ドメインに異種エピトープを有するＨ１のＨＡコンストラクトの設計及び構築
この実施例において、基本プラスミド及び修飾ＭＣＳを有するプラスミドは、ＣｌａＩとＮｓｉＩとの部位の間で様々な免疫優性部位が異種エピトープと置換された代替ヌクレオチド配列によって修飾された。
【０１１６】
異種エピトープは実施例１及び実施例２に記載されるコンストラクトに導入された。異種エピトープは、ＨＡ球状頭部ドメインの免疫優性抗原部位近辺に挿入されるか、又はＨＡ球状頭部ドメインの免疫優性抗原部位を置換した。修飾抗原部位を有するコンストラクトは表２に列挙する。
【０１１７】
【表２】
2019506168.tif 000004
【０１１８】
これらの修飾の位置は図５に例示する。
【０１１９】
１３アミノ酸残基の複合ＣＲ８０２０エピトープペプチドは、抗原部位Ｃａ２近辺の１２残基ＥＩＡＩＲＰＫＶＲＤＱＥの表面ループを置換した。複合ＣＲ８０２０エピトープペプチド置換を有するＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片が合成され、Ｈ１Ｈ５ｃｓのＣｌａＩとＮｓｉＩとの部位の間にサブクローニングされ、Ｈ１Ｈ５ｃｓ−ＣＲ８０２０Ｃａ（配列番号２４）と表されるＨＡコンストラクトを生成した。Ｈ１ＴＥＶ２−ＣＲ８０２０Ｃａ（配列番号２９）を作製するために、Ｈ１Ｈ５ｃｓ−ＣＲ８０２０ＣａのＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片を単離して、Ｈ１ＴＥＶ２のＣｌａＩとＮｓｉＩとの部位の間にサブクローニングした。
【０１２０】
コンストラクトＨ１ＴＥＶ２−ＣＲ８０２０Ｓａ３（配列番号３１）は、球状頭部ドメインの頂部上のＨ３のＨＡの部位Ｂループに対応する、Ｓａ部位の１つの残基ＫＫＧＮＳを置換する複合ＣＲ８０２０エピトープペプチドを有する。ＣＲ８０２０修飾を有するＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片が合成され、Ｈ１ＴＥＶ２のＣｌａＩとＮｓｉＩとの部位の間にサブクローニングされ、Ｈ１ＴＥＶ２−ＣＲ８０２０Ｓａ３と表されるＨＡコンストラクトを生成した。
【０１２１】
コンストラクトＨ１ＴＥＶ２−ＣＲ８０２０Ｓａ４（配列番号３３）は、Ｓａ部位の１つの近辺の残基ＫＴＳＳのヘリカル構造を置換する複合ＣＲ８０２０エピトープペプチドを有する。この位置は、ＨＡ三量体の球状頭部ドメインの側面上にあり、受容体結合部位から離れている。そのような修飾は、受容体結合の変化を起こしにくい。ＣＲ８０２０修飾を有するＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片が合成され、Ｈ１ＴＥＶ２のＣｌａＩとＮｓｉＩとの部位の間にサブクローニングされ、Ｈ１ＴＥＶ２−ＣＲ８０２０Ｓａ４と表されるＨＡコンストラクトを生成した。
【０１２２】
コンストラクトＣＲ８０２０Ｓａ４及びＣＲ８０２０ＣａのＨＡ単量体のモデルを図６に示す。各々のＨＡ単量体は、球状頭部ドメインの複合ＣＲ８０２０エピトープペプチド及びステムドメインの天然ＣＲ８０２０エピトープを有する。
【０１２３】
ＧＩＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧのＩ１Ｃ９エピトープペプチド（配列番号３６）を有するいくつかのＨＡコンストラクトが作製された。１つのコンストラクトＨ１ＴＥＶ２−Ｉ１Ｃ９Ｃａ１（配列番号３５）は、Ｃａ２部位近辺の２１７〜２２４の残基のＲＰＫＶＲＤＱＥを置換するＩ１Ｃ９ペプチドを有する。別のコンストラクトＨ１Ｈ５ｃｓ−Ｉ１Ｃ９Ｃａ（配列番号４６）は、Ｃａ２の２１３〜２２４の残基のより長いペプチドＥＩＡＩＲＰＫＶＲＤＱＥを置換するＩ１Ｃ９ペプチドを有する。他のコンストラクトは、Ｈ３のＨＡの部位Ａに対応するＣａ２部位ＨＡＧＡＫＳ、Ｓａ部位ＫＫＧＮＳ、及びＳａ部位ＫＴＳＳを個別に置換するＩ１Ｃ９ペプチドを有する。変更を有するＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片の各々が合成され、Ｈ１ＴＥＶ２のＣｌａＩとＮｓｉＩとの部位の間にサブクローニングされ、それぞれＨ１ＴＥＶ２−Ｉ１Ｃ９Ｃａ１（配列番号３５）、Ｈ１ＴＥＶ２−Ｉ１Ｃ９Ｃａ２（配列番号３８）、Ｈ１ＴＥＶ２−１Ｃ９Ｓａ３（配列番号４０）、及びＨ１ＴＥＶ２−Ｉ１Ｃ９Ｓａ４（配列番号４２）と表されるＨＡコンストラクトを生成した。Ｉ１Ｃ９Ｃａの変更を有するＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片が合成され、Ｈ１Ｈ５ｃｓのＣｌａＩとＮｓｉＩとの部位の間にサブクローニングされ、ＨＡコンストラクトＨ１Ｈ５ｃｓ−Ｉ１Ｃ９Ｃａを生成した。Ｉ１Ｃ９ペプチドはまた、同じ方法によって、Ｈ１Ｈ５ｃｓ−Ｉ１Ｃ９Ｓｂ（配列番号４４）としてＨ１Ｈ５ｃｓコンストラクトのＳｂ部位の残基ＴＳＡＤＱＱＳＬＹＱＮＡを置換した。Ｓｂ部位はＨ３のＨＡの部位Ｂヘリックスに対応する。
【０１２４】
ＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片は、Ｓａ部位に配置されるＦＩ６エピトープペプチドＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ（配列番号４９）、及びＳｂ部位に配置されるコイルドコイルＦＩ６エピトープペプチドＫＥＳＴＱＫＡＩＤＧＶＴＮＫＶＮＳ（配列番号５０）によって合成された遺伝子であった。このＦＩ６置換を有するＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片は、Ｈ１Ｈ５ｃｓ及びＨ１ＷＴのＣｌａＩとＮｓｉＩとの部位の間にサブクローニングされ、それぞれコンストラクトＨ１Ｈ５ｃｓ−ＦＩ６Ｓａｂ（配列番号４８）、及びＨ１ＷＴ−ＦＩ６Ｓａｂ（配列番号５２）を生じた。別のＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片は、Ｓａ部位に配置されるＦＩ６エピトープペプチドＲＫＫＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ（配列番号４９）によって合成された遺伝子であった。この断片はＨ１ＴＥＶ１のＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片を置換して、コンストラクトＨ１ＴＥＶ１−ＦＩ６Ｓａ（配列番号５４）を生成した。
【実施例４】
【０１２５】
球状頭部ドメインの抗原部位にＭ２ｅペプチドを有するＨ１のＨＡコンストラクトの設計及び構築
この実施例において、同様に、ＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片のヌクレオチド配列が、Ｃａ２部位又はＳｂ部位の部分がＭｅ２ペプチドをコードするヌクレオチド配列によって置換されたヌクレオチド配列によって置換された。Ｍ２ｅペプチドを有するコンストラクトは表２に列挙する。これらの修飾の位置は図５に例示する。
【０１２６】
遺伝子合成は、Ｃａ２部位のＥＩＡＩＲＰＫＶＲＤＱＥを置換するか、又はＳｂ部位の残基ＴＳＡＤＱＱＳＬＹＱＮＡのヘリックスを置換する、Ｍ２ｅペプチド（配列番号５７）を有するＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片を生成した。Ｍ２ｅペプチドを有するＨＡコンストラクトは、Ｈ１Ｈ５ｃｓにおいて最初に作製され、そこでは、Ｈ１Ｈ５ｃｓのＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片が個々のＭ２ｅペプチドを含有するＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片と置換され、それぞれコンストラクトＨ１Ｈ５ｃｓ−Ｍ２ｅＣａ（配列番号５６）、及びＨ１Ｈ５ｃｓ−Ｍ２ｅＳｂ（配列番号５９）を生じた。Ｈ１Ｈ５ｃｓ−Ｍ２ｅＣａのＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片をＨ１ＴＥＶ２コンストラクトへと移送するために、Ｈ１Ｈ５ｃｓ−Ｍ２ｅＣａのＣｌａＩ−ＮｓｉＩ断片が単離され、Ｈ１ＴＥＶ２のＣｌａＩとＮｓｉＩとの部位の間にサブクローニングされ、Ｈ１ＴＥＶ２−Ｍ２ｅＣａ（配列番号６１）と名付けられるコンストラクトを生じた。
【実施例５】
【０１２７】
Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系を使用する組換えバキュロウイルスの生成
この実施例は、実施例１〜４で調製されるコンストラクトに含有される発現系を含む昆虫細胞を調製する技法を記載する。
【０１２８】
組換えバキュロウイルスは、製造者の取扱説明書に従って、コンストラクトのｐＦａｓｔＢａｃに基づくトランスファーベクターから生成した（Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）。簡潔に、トランスファーベクターは大腸菌ＤＨ１０Ｂａｃ化学的コンピテント細胞へと形質転換された。組換えバクミドを有する白いコロニーがＢｌｕｅ−ｇａｌを有するプレート上で選択された。バクミドＤＮＡを、製造者の取扱説明書に従って標準的なアルカリ溶解ミニプレップ法によって単離した。組換えバクミドは、Ｍ１３フォワード（−４０）プライマー（ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ）及びＭ１３リバースプライマー（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）を使用してＰＣＲによって同定された。組換えバクミドは、約４ｋｂのＰＣＲ産物をもたらした。
【０１２９】
１２ウェルプレートに付着したＳＦ９昆虫細胞に、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬、他の市販のトランスフェクション試薬、又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して組換えバクミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの４〜７日後、又はＳＦ９細胞がウイルス感染によって増大するとき、細胞培地をＰ０ウイルスストックとして採集した。各々のＰ０ウイルスストックは、ウイルスを増幅するために振とうフラスコ中で２×１０６細胞／ｍｌの密度の５０ｍｌのＳＦ９細胞を感染させるのに使用した。培養は、Ｃｅｄｅｘ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を使用してモニターした。採集時間は、平均生存可能細胞サイズ及び細胞生存率によって決定した。感染後４〜５日において、平均生存可能細胞サイズが、未感染細胞よりも４〜７μｍ大きく、生存率が５０〜７０％の範囲であったとき、細胞を遠心分離によって除去し、細胞培養上清を収集し、Ｐ１ウイルスストックとして暗所において４℃で保管した。しばしば、ウイルスストックは、滅菌を維持するために０．２μｍ滅菌フィルターによってろ過した。
【０１３０】
ウイルスストックのさらなる増幅のために、２×１０６細胞／ｍｌの密度の５００ｍｌのＳＦ９細胞を２５０μｌのＰ１ウイルスストックで感染させた。培養は、Ｃｅｄｅｘ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒを使用してモニターした。感染後４〜５日において、平均生存可能細胞サイズが、未感染細胞よりも４〜７μｍ大きく、生存率が５０〜７０％の範囲であったとき、細胞を遠心分離によって除去し、細胞培養上清を収集し、Ｐ２ウイルスストックとして暗所で４℃で保管した。しばしば、ウイルスストックは、滅菌を維持するために０．２μｍ滅菌フィルターによってろ過した。
【実施例６】
【０１３１】
組換えＨＡタンパク質の発現。
この実施例は、実施例１〜４に記載される様々なコンストラクトの昆虫細胞での発現を実証する。特定のコンストラクトに応じて、様々なレベルの標的タンパク質発現が得られた。
【０１３２】
組換えＨＡの発現を検出するために、通常は実施例５で記載されるようなＰ１又はＰ２ウイルスストックである組換えバキュロウイルスストックで感染させたＳＦ９細胞の細胞培地を収集して、組換えＨＡの１０×Ｈｉｓタグを介した親和性捕捉のためにＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ  ＵＳＡ）と共にインキュベートした。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂のリン酸緩衝生理食塩水（１×ＰＢＳ）による洗浄の後、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抗Ｈｉｓ抗体を使用するウェスタンブロットによる解析のために、還元剤の存在下又は非存在下でゲルローディング緩衝液によって煮沸した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）染色ゲル又は抗Ｈｉｓウェスタンブロット上の約６３ｋＤａのタンパク質バンドは、分泌した組換えＨＡ全長タンパク質の発現を示す。
【０１３３】
図７及び図８に示すように、親コンストラクトＨ１ＷＴのＨ１のＨＡタンパク質の発現が予測通りに検出された。多塩基性残基、Ｈ１Ｈ５ｃｓ、Ｈ１Ｒ５ｃｓ、及びＨ１Ｒ５ｃｓの改変された成熟切断部位を有するＨＡタンパク質は、Ｈ１ＷＴと同じレベルで発現した。Ｈ１のＨＡの成熟切断部位全体がＴＥＶ切断部位によって置換されたＨ１ＴＥＶ１は、Ｈ１ＷＴよりはるかに少なく発現した。成熟切断部位でより多くの天然残基を維持することによって、Ｈ１ＴＥＶ２及びＨ１ＴＥＶ３は、Ｈ１ＷＴと比較して非常によく発現した（図７及び図８）。全ての置換が同じレベルで発現しなかった。コンストラクト中のＴＥＶ切断部位の位置を調整することによって、野生型ＨＡのものの発現レベルを達成した。
【０１３４】
図７及び図８にさらに示すように、異なる免疫優性抗原部位における同じ免疫亜優性ｂＮＡｂエピトープの配置が、異なる発現レベルを生じた。Ｓａ部位（Ｈ１ＴＥＶ２−ＣＲ８０２０Ｓａ４）又はＣａ２部位（Ｈ１Ｈ５ｃｓ−ＣＲ８０２０Ｃａ）のいずれかに複合ＣＲ８０２０エピトープペプチドがあるコンストラクトは、野生型ＨＡと同じレベルで発現したが、一方でＨ１ＴＥＶ２−ＣＲ８０２０Ｓａ３コンストラクトは良好に発現しない。したがって、異種エピトープ配置の正確な位置が、生じるＨＡの発現に重要であり得る。免疫亜優性ｂＮＡｂエピトープの性質は、同様に生じるＨＡタンパク質の発現レベルにも影響をもたらし得る。
【０１３５】
いくつかの抗原部位におけるＩ１Ｃ９エピトープの個々の配置はまた、生じるＨＡタンパク質の異なるレベルの発現を示した（図７及び図８）。コンストラクトＨ１Ｈ５ｃｓ−Ｉ１Ｃ９Ｃａは、コンストラクトＨ１ＴＥＶ２−Ｉ１Ｃ９Ｃａ１よりも高い発現を示した。これら２つのコンストラクトにおけるＩ１Ｃ９エピトープペプチドによって置換される抗原部位におけるペプチド配列は少し異なる。ＭＣＳとしてＴＥＶ切断部位を有するこれらのコンストラクトと同様に、置換の位置が発現レベルに影響をもたらす。
【０１３６】
Ｃａ２部位にＭ２ｅペプチドを有するコンストラクト、つまりＨ１Ｈ５ｃｓ−Ｍ２ｅＣａ及びＨ１ＴＥＶ２−Ｍ２ｅＣａは、成熟切断部位にもかかわらずＨ１ＷＴと同様に良好な発現をもたらした（図７及び図８）。しかしながら、Ｓｂ部位にＭ２ｅペプチドを有するコンストラクトＨ１Ｈ５ｃｓ−Ｍ２ｅＳｂは良好に発現しなかった。Ｓｂ部位は、ＨＡの適切なフォールディングに必要とされる可能性のあるヘリカル構造にある。
【０１３７】
Ｈ１のＨＡコンストラクトの多くの成功した発現は、ＨＡ球状頭部ドメインの免疫優性抗原部位がステムドメイン由来の免疫亜優性ｂＮＡｂエピトープによって、又はＨＡに関連しない別のタンパク質由来のＭ２ｅペプチドによって置換することができることを実証した。これらの結果は、球状頭部ドメインの可塑性を明らかにし、その球状頭部ドメインで異種エピトープを提示する機能性ＨＡの作製の実現可能性を確証した。まとめると、実施例１〜６は、異種エピトープ及び／又は改変されたＭＣＳを有するＨＡを構築し、良好な発現を有する修飾ＨＡを選択する方法を実証した。
【実施例７】
【０１３８】
組換えＨＡタンパク質の精製
この実施例は、実施例１〜４に記載される様々なコンストラクトの精製を実証する。
【０１３９】
振とうフラスコ中で、２×１０６細胞／ｍｌの密度の５０ｍｌ〜１ＬのＳＦ９細胞に、１〜４ｍｌのＰ１又はＰ２ウイルスストック対１リットルの細胞の容量比で、バキュロウイルスストックを感染させた。培養は、Ｃｅｄｅｘ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒを使用してモニターした。採集時間は、平均生存可能細胞サイズ及び細胞生存率によって決定した。感染後２〜３日において、平均生存可能細胞サイズが、未感染細胞よりも４〜７μｍ大きく、生存率が約８０％であったとき、細胞を遠心分離によって除去し、細胞培養上清を収集し、４℃で保管した。細胞培養上清を、４℃で２〜４時間、ロティサリープラットフォーム上で揺らしつつＮｉ−ＮＴＡ樹脂とインキュベートした。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を、遠心分離によって収集し、１×ＰＢＳで洗浄した。洗浄したＮｉ−ＮＴＡ樹脂を、重力流動カラムに詰め、５０ｍＭイミダゾールを補充した１×ＰＢＳでさらに洗浄した。次いで、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を、１×ＰＢＳ中の４００ｍＭイミダゾールで重力流動により溶出した。溶出したＨＡタンパク質を１×ＰＢＳに緩衝液交換し、限外ろ過で濃縮した。精製したＨＡタンパク質を、図８に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。
【０１４０】
付録
インフルエンザウイルス、型及び宿主の説明
インフルエンザウイルスは、インフルエンザウイルスＡ、Ｂ、及びＣの３つの属のオルソミクソウイルス科のウイルスからなる。各々の属は、単一の種のウイルス、つまりそれぞれインフルエンザＡ、Ｂ、及びＣのウイルスのみを有する。インフルエンザＡ、Ｂ、及びＣのウイルスはまた、それぞれＡ型、Ｂ型、及びＣ型インフルエンザウイルスと呼ばれる。インフルエンザウイルスは、エンベロープを有するマイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスである。ウイルスゲノムは、分離したＲＮＡセグメントにコードされる。インフルエンザＡ及びＢウイルスの各々は、１０個のタンパク質をコードする８個のＲＮＡセグメントを有する。インフルエンザＣウイルスの各々は、９個のタンパク質をコードする７個のＲＮＡセグメントを有する。インフルエンザＡウイルスの１０個の分析されたタンパク質は、ＰＢ２、ＰＢ１、及びＰＡポリメラーゼ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリクスタンパク質Ｍ１及びＭ２、非構造タンパク質ＮＳ１及びＮＳ２である（Ｗｅｂｓｔｅｒ，  Ｒ．  Ｇら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ（１９９２）５６：１５２〜１７９）。インフルエンザＣウイルスは、ＨＡ及びＮＡの機能を組み合わせるヘマグルチニン−エステラーゼ−融合（ＨＥＦ）タンパク質を有する（Ｈｅｒｒｌｅｒ，  Ｇら、Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ（１９８８）６９：８３９〜８４６）。インフルエンザＡ、Ｂ、及びＣのウイルスの分類は、それらのＮＰ及びマトリクスタンパク質における抗原性の差異に基づく。
【０１４１】
インフルエンザＡウイルスは、ウイルスにコードされた膜タンパク質ＨＡ、ＮＡ、及びＭ２が点在する宿主由来脂質二重層エンベロープ、Ｍ１マトリクスタンパク質から作製される内殻、並びに中心の個々のＲＮＡセグメントのウイルスゲノムのヌクレオカプシドからなる直径８０〜１２０ｎｍの小粒子である（Ｗｅｂｓｔｅｒ，  Ｒ．  Ｇら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ（１９９２）５６：１５２〜１７９）。ＲＮＡセグメントは、複数のＮＰ分子によってゆるくキャプシドに包まれている。３つのウイルスポリメラーゼタンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２、及びＰＡ）の複合体は、ヌクレオカプシドの末端に位置する。全てのＲＮＡセグメントは、感染性ウイルス粒子を産生するのに必要である。
【０１４２】
ゲル電気泳動によって最も遅く移動するＲＮＡ種であるＲＮＡセグメント１は、ＰＢ２  ＲＮＡポリメラーゼをコードする。ＲＮＡセグメント２は、同じＲＮＡ配列からの異なる読み枠を使用することによって、ＰＢ１  ＲＮＡポリメラーゼ、さらにＰＢ１−Ｎ４０及びＰＢ１−Ｆ２タンパク質の２つの他の転写物をコードする。ＰＢ１−Ｎ４０及びＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、宿主細胞アポトーシスを誘導する。ＲＮＡセグメント３は、ＰＢ１及びＰＢ２と共にＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ複合体を形成するＰＡ  ＲＮＡポリメラーゼをコードする。ＲＮＡセグメント４は、インフルエンザビリオンの主要な表面抗原であるＨＡをコードする。各々のビリオンは、ビリオン表面上に均一に分布したスパイクとして現れる約５００のＨＡ分子を有する（Ｒｕｉｇｒｏｋ，  Ｒ．  Ｗ．  Ｈら、Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ（１９８４）６５：７９９〜９０２；Ｍｕｒｔｉ，  Ｋ．  Ｇ及びＷｅｂｓｔｅｒ，  Ｒ．  Ｇ．、Ｖｉｒｏｌ（１９８６）１４９：３６〜４３）。宿主受容体に結合して、ＨＡは宿主範囲を決定する。ＲＮＡセグメント５はＮＰ核タンパク質をコードする。ＮＰはウイルスＲＮＡをキャプシドで包み、宿主細胞核へと輸送される。ＮＰは、昆虫細胞において豊富に合成され、インフルエンザウイルスビリオンで２番目に豊富なタンパク質である。それは宿主の細胞傷害性Ｔ細胞免疫応答の主要な標的である。ＲＮＡセグメント６は、インフルエンザウイルスビリオンの２番目の主要な表面抗原であるノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする。ＮＡは、糖タンパク質又は糖脂質由来の末端シアル酸を切断して、宿主細胞受容体からウイルス粒子を放出する酵素である。その機能はウイルス拡散に必要である。各々のビリオンはその表面上に約１００個のＮＡ分子を有する。ＮＡは、四量体を形成し、ビリオンエンベロープの別個のパッチに位置する（Ｍｕｒｔｉ，  Ｋ．  Ｇ及びＷｅｂｓｔｅｒ，  Ｒ．  Ｇ．、Ｖｉｒｏｌ（１９８６）１４９：３６〜４３）。ＲＮＡセグメント７はバイシストロニックであり、Ｍ１とＭ２の両方のマトリクスタンパク質をコードする。Ｍ１は、ビリオンエンベロープのすぐ下にビリオンヌクレオカプシドを取り囲む殻を形成し、インフルエンザウイルスビリオンにおいて最も豊富なタンパク質である。Ｍ２は、Ｍ１と同じ転写物の異なるスプライシング型より作製される。Ｍ２は、内在性膜タンパク質であり、宿主細胞におけるインフルエンザウイルスの産生の間、ゴルジネットワークのｐＨを制御するプロトンチャネルとして機能する。Ｍ２は、選択的スプライシング変異体Ｍ４２によって部分的に置換できる。約３０００個のマトリクスタンパク質分子が１つのビリオンを作製するのに必要とされる。ＲＮＡセグメント８は、ウイルス複製のための２つの非構造タンパク質ＮＳ１及びＮＳ２をコードする。ＮＳ２は、ＮＳ１と異なる読み枠由来である。両方のタンパク質は、感染細胞において豊富であるが、子孫ビリオンに組み込まれない。
【０１４３】
３つの属のインフルエンザウイルスの間で、インフルエンザＡウイルスが最も悪性のヒト病原体であり、ヒトにおいて最も重度の疾患を引き起こす。インフルエンザＡウイルスは、それらの表面糖タンパク質ＨＡ及びＮＡの抗原特性に基づいてサブタイプに分類される。全部で１８のＨＡサブタイプ、つまりＨ１〜Ｈ１８と、１０のＮＡサブタイプ、つまりＮ１〜Ｎ１０が同定されている（Ｔｏｎｇ，  Ｓら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ（２０１３）９：ｅ１００３６５７）。インフルエンザＡサブタイプの共通の命名法は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、及びＨ７Ｎ９のようなＨＡサブタイプとＮＡサブタイプの異なる組合せに由来する（Ｂｕｌｌ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ（１９８０）５８：５８５〜５９１）。水鳥はサブタイプＨ１〜Ｈ１６とＮ１〜Ｎ９の自然の保有宿主である。サブタイプＨ１７Ｎ１０及びＨ１８Ｎ１０は、最近アメリカオオコウモリにおいて発見された。自然において、インフルエンザＡウイルスのセグメント化したゲノムは、宿主が２つのサブタイプのインフルエンザＡウイルスに共感染したときにＲＮＡセグメントの再集合を可能にする。２つの異なるサブタイプ由来のＲＮＡセグメントは、単一のビリオンにパッケージされ、新規サブタイプを産生することができる。インフルエンザＡウイルスのこれらの多くのサブタイプのうち、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、及びＨ３Ｎ２のみがヒトにおける効率的な伝染能力を発達させている。これら３つのサブタイプは、いわゆる季節性インフルウイルスの流行しているウイルスサブタイプである。したがって、ヒト集団は多くのインフルエンザＡウイルスに対して免疫学的にナイーブである。時に、他のサブタイプのインフルエンザＡウイルスが種を超えてヒトに感染して高い致死率のパンデミックなアウトブレイクを引き起こす。
【０１４４】
それらの系統学的関係に基づいて、インフルエンザＡのＨＡサブタイプは、２つの異なるグループにクラスター化される。グループ１は、１６のサブタイプのうち１０を含む：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、及びＨ１６。グループ２は、残りの６のサブタイプを占める：Ｈ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、及びＨ１５。
【０１４５】
インフルエンザＢウイルスはインフルエンザＡウイルスと抗原的に異なる。インフルエンザＢウイルスは、インフルエンザＡウイルスと共循環してヒトにおけるエピデミックを引き起こす。インフルエンザＢウイルスは、既知の動物保有宿主なしでヒトに安定して適応される。インフルエンザＡウイルスのＨＡの膨大な遺伝的変異と異なり、ＨＡ遺伝子の系統学的関係によって３つの系統が定義されているのにもかかわらず、ＨＡにおける単一の血清型のみがインフルエンザＢウイルスにおいて報告されている。インフルエンザＡとインフルエンザＢのウイルスの間でＲＮＡセグメントの再集合の報告が存在していないので、インフルエンザＢウイルスは、インフルエンザＡウイルスと組換えをするように見えない。
【０１４６】
インフルエンザＡとＢのウイルスの両方は、細胞受容体として宿主細胞表面上の末端シアル酸を使用する。両方の型のウイルスのＨＡは、同じ構造的特徴を共有し、宿主細胞への侵入のためにシアル酸受容体へと結合する。
【０１４７】
インフルエンザＡ及びインフルエンザＢウイルスのサブタイプを、系統に更に分類する。インフルエンザＡ及びインフルエンザＢのウイルスの多くの異なる系統が存在する。各々のインフルシーズンは、インフルエンザＡ及びＢのウイルスの少数の系統によって占められ、それらは通常、前のインフルシーズンの系統とは遺伝的に異なる。単離系統として知られる異なる地理的位置又はインフルシーズンに単離された１つの系統のウイルスは、しばしば遺伝的な変更を有する。
【０１４８】
インフルエンザＣウイルスの感染は、一般的に無症候性であるか、又はほとんどが小児若しくは若年成人について軽度の病気を引き起こす。インフルエンザＣウイルスは、散発的な症例と小規模の局所的なアウトブレイクと関連する。インフルエンザＣウイルスは、インフルエンザＡ及びＢウイルスよりもはるかに少ない疾患負荷を呈する。ヒト集団の大部分はセロコンバージョンを示し、ヒト集団におけるインフルエンザＣウイルスの広範囲の循環を示唆する。インフルエンザＣウイルスは、動物からも単離されている。インフルエンザＣウイルスのヘマグルチニン−エステラーゼ−融合（ＨＥＦ）タンパク質は、インフルエンザＡ及びＢウイルスのＨＡ及びＮＡの機能を組み合わせる。インフルエンザＡ及びＢウイルスのＨＡと異なり、インフルエンザＣウイルスのＨＥＦは、細胞受容体として、末端９−Ｏ−アセチル−Ｎ−アセチルノ  イラミン酸（９−Ｏ−Ａｃ−ＮｅｕＡｃ）を使用する（Ｈｅｒｒｌｅｒ，  Ｇら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：１５０３〜１５０６）。
【０１４９】
ウイルス感染プロセス及びライフサイクルの説明
インフルエンザウイルスは、呼吸飛沫又は胞子（感染性生物を運搬することのできる任意の対象又は物質）を介してヒトからヒトに拡散する。ウイルスは呼吸器の上皮細胞に感染する。細胞表面受容体に結合した後、付着したビリオンは、宿主細胞によってエンドソームに取り込まれ、そこでは低ｐＨがＨＡの立体構造変化を引き起こし、それは宿主細胞のその疎水性融合ペプチドの小胞膜への挿入をもたらし、ウイルスと小胞膜との融合を開始する。融合は、ビリオンの内容物を感染した細胞の細胞質に放出する。ウイルスのヌクレオキャプシドは宿主細胞の核に移動し、それらの会合したポリメラーゼ複合体が、ウイルスタンパク質の翻訳のためのｍＲＮＡの一次転写を開始する。同時に、宿主のｍＲＮＡの翻訳は遮断される。新規に合成されたウイルスＲＮＡは、キャプシドに包まれ、ウイルス構造タンパク質が合成されて宿主細胞表面に輸送され、そこでそれらは宿主細胞膜に組み込まれる。インフルエンザウイルスは、気管支上皮細胞のような極性上皮細胞の頂端表面から肺の管腔内に出芽し、したがって、通常は好気性である（Ｒｏｔｈ，  Ｍ．  Ｇら、ＰＮＡＳ（１９７９）７６：６４３０〜６４３４；Ｎａｙａｋ，  Ｄ．  Ｐら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ（２００９）１４３：１４７〜１６１）。ブタとヒトの間のインフルエンザウイルスの伝染は実証されている。個体が感染した後、免疫系はインフルエンザウイルスに対する抗体を作り出す。これは、生体の主な防御の源である。
SEQUENCE LISTING
SEQ ID NO:1: Peptide sequence of HA of A/California/07/2009, a swine-origin influenza A virus H1N1 strain (UniProt:C3W5X2)
MKAILVVLLYTFATANADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQILAIYSTVASSLVLVVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI
SEQ ID NO:2: Peptide sequence of GP67 secretion signal (GP67ss)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFA
SEQ ID NO:3: Peptide sequence of TEV cleavage site, foldon, and 10xHis-tag
GAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:4: Peptide sequence of TEV cleavage site
ENLYFQG
SEQ ID NO:5: Peptide sequence of foldon
GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
SEQ ID NO:6: Peptide sequence of 10xHis-tag
HHHHHHHHHH
SEQ ID NO:7: Peptide sequence of signal peptide of HA of A/California/07/2009 (UniProt:C3W5X2)
MKAILVVLLYTFATANA
SEQ ID NO:8: Peptide sequence of H1 HA maturation cleavage site (MCS)
IPSIQSR
SEQ ID NO:9: Peptide sequence of GP67ss-H1WT-TEV-foldon 10His (H1WT)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:10: Nucleotide sequence of GP67ss-H1WT-TEV-foldon 10His (H1WT)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATATCCCTAGCATCCAGAGCAGAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:11: Peptide sequence of GP67ss-H1H5cs-TEV-foldon 10His (H1H5cs)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNSPQRERRKKRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:12: Peptide sequence of H5 maturation cleavage site
QRERRKKR
SEQ ID NO:13: Nucleotide sequence of GP67ss-H1H5cs-TEV-foldon 10His (H1H5cs)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTCAGAGGGAGAGACGCAAGAAGAGAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:14: Peptide sequence of GP67ss-H1R5cs-TEV-foldon 10His (H1R5cs)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPRRRRRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:15: Nucleotide sequence of GP67ss-H1R5cs-TEV-foldon 10His (H1R5cs)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATATCCCTAGGAGACGCAGAAGAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:16: Peptide sequence of GP67ss-H1IR5cs-TEV-foldon 10His (H1IR5cs)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRRRRRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:17: Nucleotide sequence of GP67ss-H1IR5cs-TEV-foldon 10His (H1IR5cs)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATATCCCTAGCATCCAGAGCAGGAGACGCAGAAGAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:18: Peptide sequence of GP67ss-H1TEV1-TEV-foldon 10His (H1TEV1)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIENLYFQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:19: Nucleotide sequence of GP67ss-H1TEV1-TEV-foldon 10His (H1TEV1)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATATCGAAAACCTGTATTTTCAAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:20: Peptide sequence of GP67ss-H1TEV2-TEV-foldon 10His (H1TEV2)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNSPENLYFQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:21: Nucleotide sequence of GP67ss-H1TEV2-TEV-foldon 10His (H1TEV2)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTGAAAACCTGTATTTTCAAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:22: Peptide sequence of GP67ss-H1TEV3-TEV-foldon 10His (H1TEV3)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIENLYFQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:23: Nucleotide sequence of GP67ss-H1TEV3-TEV-foldon 10His (H1TEV3)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATATCCCTAGCATCGAAAACCTGTATTTTCAAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:24: Peptide sequence of GP67ss-H1H5cs-CR8020Ca-TEV-foldon 10His (H1H5cs-CR8020Ca)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEGMIDYEGTGQAAGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNSPQRERRKKRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:25: Peptide sequence of CR8020 epitope of HA2 residues 15 19
EGMID
SEQ ID NO:26: Peptide sequence of CR8020 epitope of HA2 residues 30-36
EGTGQAA
SEQ ID NO:27: Peptide sequence of composite C8020 epitope
EGMIDYEGTGQAA
SEQ ID NO:28: Nucleotide sequence of GP67ss-H1H5cs-CR8020Ca-TEV-foldon 10His (H1H5cs-CR8020Ca)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAGGCATGATTGATTACGAAGGCACAGGCCAGGCAGCCGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTCAGAGGGAGAGACGCAAGAAGAGAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAAaagctt
SEQ ID NO:29: Peptide sequence of GP67ss-H1TEV2-CR8020Ca-TEV-foldon 10His (H1TEV2-CR8020Ca)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEGMIDYEGTGQAAGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNSPENLYFQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:30: Nucleotide sequence of GP67ss-H1TEV2-CR8020Ca-TEV-foldon 10His (H1TEV2-CR8020Ca)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCcTCTGCAcCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCaCaAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAGGCATGATTGATTACGAAGGCACAGGCCAGGCAGCCGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTGAAAACCTGTATTTTCAAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGtGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:31: Peptide sequence of GP67ss-H1TEV2-CR8020Sa3-TEV-foldon 10His (H1TEV2-CR8020Sa3)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVEGMIDYEGTGQAAYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNSPENLYFQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:32: Nucleotide sequence of GP67ss-H1TEV2-CR8020Sa3-TEV-foldon 10His (H1TEV2-CR8020Sa3)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGGAAGGCATGATTGATTACGAAGGCACAGGCCAGGCAGCCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTGAAAACCTGTATTTTCAAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAAaagctt
SEQ ID NO:33: Peptide sequence of GP67ss-H1TEV2-CR8020Sa4-TEV-foldon 10His (H1TEV2-CR8020Sa4)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPEGMIDYEGTGQAAWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNSPENLYFQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:34: Nucleotide sequence of GP67ss-H1TEV2-CR8020Sa4-TEV-foldon 10His (H1TEV2-CR8020Sa4)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTGAAGGCATGATTGATTACGAAGGCACAGGCCAGGCAGCCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTGAAAACCTGTATTTTCAAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:35: Peptide sequence of GP67ss-H1TEV2-I1C9Ca1-TEV-foldon 10His (H1TEV2-I1C9Ca1)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIGIFGAIAGFIEGGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNSPENLYFQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:36: Peptide sequence of I1C9
GIFGAIAGFIEG
SEQ ID NO:37: Nucleotide sequence of GP67ss-H1TEV2-I1C9Ca1-TEV-foldon 10His (H1TEV2-I1C9Ca1)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTGGCATTTTCGGCGCTATCGCCGGCTTCATTGAGGGAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTGAAAACCTGTATTTTCAAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:38: Peptide sequence of GP67ss-H1TEV2-I1C9Ca2-TEV-foldon 10His (H1TEV2-I1C9Ca2)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPGIFGAIAGFIEGFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNSPENLYFQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:39: Nucleotide sequence of GP67ss-H1TEV2-I1C9Ca2-TEV-foldon 10His (H1TEV2-I1C9Ca2)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTGGCATTTTCGGCGCTATCGCCGGCTTCATTGAGGGATTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTGAAAACCTGTATTTTCAAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:40: Peptide sequence of GP67ss-H1TEV2-I1C9Sa3-TEV-foldon 10His (H1TEV2-I1C9Sa3)
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SEQ ID NO:41: Nucleotide sequence of GP67ss-H1TEV2-I1C9Sa3-TEV-foldon 10His (H1TEV2-I1C9Sa3)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGGGCATTTTCGGCGCTATCGCCGGCTTCATTGAGGGATACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTGAAAACCTGTATTTTCAAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:42: Peptide sequence of GP67ss-H1TEV2-I1C9Sa4-TEV-foldon 10His (H1TEV2-I1C9Sa4)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPGIFGAIAGFIEGWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNSPENLYFQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:43: Nucleotide sequence of GP67ss-H1TEV2-I1C9Sa4-TEV-foldon 10His (H1TEV2-I1C9Sa4)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTGGCATTTTCGGCGCTATCGCCGGCTTCATTGAGGGATGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTGAAAACCTGTATTTTCAAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:44: Peptide sequence of GP67ss-H1H5cs-I1C9Sb-TEV-foldon 10His (H1H5cs-I1C9Sb)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSGIFGAIAGFIEGDAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNSPQRERRKKRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:45: Nucleotide sequence of GP67ss-H1H5cs-I1C9Sb-TEV-foldon 10His (H1H5cs-I1C9Sb)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCGGCATTTTCGGCGCTATCGCCGGCTTCATtGAGGGAGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTCAGAGGGAGAGACGCAAGAAGAGAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:46: Peptide sequence of GP67ss-H1H5cs-I1C9Ca-TEV-foldon 10His (H1H5cs-I1C9Ca)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPGIFGAIAGFIEGGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNSPQRERRKKRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:47: Nucleotide sequence of GP67ss-H1H5cs-I1C9Ca-TEV-foldon 10His (H1H5cs- I1C9Ca)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGGCATTTTCGGCGCTATCGCCGGCTTCATTGAGGGAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTCAGAGGGAGAGACGCAAGAAGAGAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGcTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCtGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:48: Peptide sequence of GP67ss-H1H5cs-FI6Sab-TEV-foldon 10His (H1H5cs-FI6Sab)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVRKKRGLFGAIAGFIEYINDKGKEVLVLWGIHHPSKESTQKAIDGVTNKVNSDAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNSPQRERRKKRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:49: Peptide sequence of maturation cleavage site of FI6 epitope
RKKRGLFGAIAGFIE
SEQ ID NO:50: Peptide sequence of helix coiled-coil peptide of FI6 epitope
KESTQKAIDGVTNKVNS
SEQ ID NO:51: Nucleotide sequence of GP67ss-H1H5cs-FI6Sab-TEV-foldon 10His (H1H5cs-FI6Sab)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAGAAAGAAGAGAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCAAGGAGTCTACACAGAAGGCCATTGATGGCGTTACAAATAAGGTCAATtCTGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTCAGAGGGAGAGACGCAAGAAGAGAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:52: Peptide sequence of GP67ss-H1WT-FI6Sab-TEV-foldon 10His (H1WT-FI6Sab)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVRKKRGLFGAIAGFIEYINDKGKEVLVLWGIHHPSKESTQKAIDGVTNKVNSDAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:53: Nucleotide sequence of GP67ss-H1WT-FI6Sab-TEV-foldon 10His (H1WT-FI6Sab)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAGAAAGAAGAGAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCAAGGAGTCTACACAGAAGGCCATTGATGGCGTTACAAATAAGGTCAATTCTGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATATCCCTAGCATCCAGAGCAGAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:54: Peptide sequence of GP67ss-H1TEV1-FI6Sa-TEV-foldon 10His (H1TEV1-FI6Sa)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVRKKRGLFGAIAGFIEGYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNIENLYFQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:55: Nucleotide sequence of GP67ss-H1TEV1-FI6Sa-TEV-foldon 10His (H1TEV1-FI6Sa)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAGAAAGAAGAGAGGCCTGTTCGGCGCTATCGCCGGCTTCATTGAGGGATACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATATCGAAAACCTGTATTTTCAAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:56: Peptide sequence of GP67ss-H1H5cs-M2eCa2-TEV-foldon 10His (H1H5cs-M2eCa)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPSLLTEVETPTRNGWECKCSDSGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNSPQRERRKKRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:57: Peptide sequence of M2e peptide
SLLTEVETPTRNGWECKCSDS
SEQ ID NO:58: Nucleotide sequence of GP67ss-H1H5cs-M2eCa2-TEV-foldon 10His (H1H5cs-M2eCa)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTTCCCTGCTGACCGAGGTGGAGACCCCCACCAGGAACGGCTGGGAGTGCAAGTGCTCCGACTCCGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTCAGAGGGAGAGACGCAAGAAGAGAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:59: Peptide sequence of GP67ss-H1H5cs-M2eSb-TEV-foldon 10His (H1H5cs-M2eSb)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSSLLTEVETPTRNGWECKCSDSDAYVFVGSSRYSKKFKPEIAIRPKVRDQEGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNSPQRERRKKRGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:60: Nucleotide sequence of GP67ss-H1H5cs-M2eSb-TEV-foldon 10His (H1H5cs-M2eSb)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCTCCCTGCTGACCGAGGTGGAGACCCCCACCAGGAACGGCTGGGAGTGCAAGTGCTCCGACTCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTGAAATTGCCATTAGACCCAAAGTGAGAGATCAGGAAGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTCAGAGGGAGAGACGCAAGAAGAGAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
SEQ ID NO:61: Peptide sequence of GP67ss-H1TEV2-M2eCa2-TEV-foldon 10His (H1TEV2-M2eCa)
MVSAIVLYVLLAAAAHSAFADTLCIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDKHNGKLCKLRGVAPLHLGKCNIAGWILGNPECESLSTASSWSYIVETPSSDNGTCYPGDFIDYEELREQLSSVSSFERFEIFPKTSSWPNHDSNKGVTAACPHAGAKSFYKNLIWLVKKGNSYPKLSKSYINDKGKEVLVLWGIHHPSTSADQQSLYQNADAYVFVGSSRYSKKFKPSLLTEVETPTRNGWECKCSDSGRMNYYWTLVEPGDKITFEATGNLVVPRYAFAMERNAGSGIIISDTPVHDCNTTCQTPKGAINTSLPFQNIHPITIGKCPKYVKSTKLRLATGLRNSPENLYFQGLFGAIAGFIEGGWTGMVDGWYGYHHQNEQGSGYAADLKSTQNAIDEITNKVNSVIEKMNTQFTAVGKEFNHLEKRIENLNKKVDDGFLDIWTYNAELLVLLENERTLDYHDSNVKNLYEKVRSQLKNNAKEIGNGCFEFYHKCDNTCMESVKNGTYDYPKYSEEAKLNREEIDGVKLESTRIYQGAENLYFQGGSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGHHHHHHHHHH
SEQ ID NO:62: Nucleotide sequence of GP67ss-H1TEV2-M2eCa2-TEV-foldon 10His (H1TEV2-M2eCa)
ccATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGGATACACTGTGTATTGGCTACCACGCCAACAATAGCACCGATACCGTGGATACAGTGCTGGAGAAGAATGTGACCGTGACCCACTCTGTGAATCTGCTGGAGGATAAGCACAATGGCAAGCTGTGTAAGCTGAGAGGAGTTGCCCCTCTGCACCTGGGCAAATGTAATATTGCCGGCTGGATTCTGGGAAATCCTGAATGTGAAAGCCTGTCTACAGCCAGCAGCTGGTCTTATATCGTGGAAACCCCTAGCAGCGACAATGGCACCTGTTACCCTGGCGACTTCATCGATTACGAGGAGCTGAGAGAACAGCTGTCTAGCGTGTCCAGCTTCGAGAGATTCGAGATCTTCCCTAAGACAAGCAGCTGGCCTAATCACGATTCTAATAAGGGAGTGACAGCCGCCTGTCCTCATGCCGGAGCCAAGTCCTTTTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAACAGCTACCCTAAGCTGTCTAAGAGCTACATCAACGACAAGGGCAAAGAAGTGCTGGTGCTGTGGGGAATCCACCACCCTAGCACAAGCGCCGATCAGCAGAGCCTGTACCAGAATGCCGATGCCTATGTGTTTGTGGGCAGCAGCAGATACAGCAAAAAGTTCAAGCCTTCCCTGCTGACCGAGGTGGAGACCCCCACCAGGAACGGCTGGGAGTGCAAGTGCTCCGACTCCGGCAGAATGAATTACTACTGGACCCTGGTGGAACCTGGCGATAAGATCACATTTGAGGCCACCGGAAATCTGGTGGTGCCTAGATATGCATTTGCTATGGAGAGAAATGCTGGCTCTGGCATCATTATCTCTGATACCCCTGTGCACGACTGTAATACCACCTGTCAGACACCTAAGGGCGCCATTAATACCAGCCTGCCCTTCCAGAATATTCACCCTATCACCATCGGCAAGTGTCCTAAGTATGTGAAGAGCACCAAGCTGAGACTGGCTACCGGTCTGAGAAATAGCCCTGAAAACCTGTATTTTCAAGGCCTGTTTGGAGCCATCGCCGGCTTTATTGAGGGAGGATGGACCGGAATGGTGGATGGCTGGTACGGCTATCACCACCAGAATGAGCAGGGATCCGGATATGCCGCCGATCTGAAGTCTACACAGAACGCCATCGACGAGATCACAAACAAGGtGAACAGCGTGATCGAGAAGATGAACACCCAGTTTACAGCTGTGGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAAGTGGACGACGGCTTCCTGGATATTTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTCGTGCTCCTGGAGAATGAGAGAACCCTGGACTACCACGACAGCAATGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGAAGCCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTTGAGTTCTACCACAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCTGTGAAGAACGGCACCTACGACTACCCTAAGTATAGCGAGGAGGCCAAGCTGAATAGAGAGGAGATCGACGGCGTGAAACTGGAAAGCACAAGAATCTATCAGGGCGCTGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGGTTCTGGTTACATCCCGGAAGCTCCGCGTGACGGTCAGGCTTACGTTCGTAAAGACGGTGAATGGGTTCTGCTGTCTACCTTCCTGGGTCACCATCATCACCACCATCACCATCATCACTGATAAaagctt
【図１】
2019506168.tif 000005
【図２】
2019506168.tif 000006
【図３】
2019506168.tif 000007
【図４】
2019506168.tif 000008
【図５】
2019506168.tif 000009
【図６】
2019506168.tif 000010
【図７ＡＢ】
2019506168.tif 000011
【図７ＣＤ】
2019506168.tif 000012
【図７Ｅ】
2019506168.tif 000013
【図８】
2019506168.tif 000014
【配列表】
2019506168000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月17日(2018.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インフルエンザＡ又はＢの修飾ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質であって、前記ＨＡタンパク質の免疫優性領域が、保存された代替インフルエンザエピトープを、前記領域への前記エピトープの挿入により含有するか、又は前記領域を前記エピトープで置換することにより前記エピトープを含有する、修飾ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質。
【請求項２】
生ウイルス若しくは弱毒ウイルス中に、又はウイルス様粒子（ＶＬＰ）中に含有される、請求項１に記載の修飾ＨＡタンパク質。
【請求項３】
生ウイルス中に含有され、動物のプロテアーゼによって切断されない修飾された成熟切断部位（ＭＣＳ）をさらに含み、任意で前記修飾されたＭＣＳが、適切なプロテアーゼによって切断されていてもよい、請求項２に記載の修飾ＨＡタンパク質。
【請求項４】
前記インフルエンザの保存された代替エピトープが、インフルエンザＨＡタンパク質のステムドメイン由来のエピトープであるか、又はＭ２インフルエンザタンパク質のエピトープであり、かつ／又は
前記ＨＡタンパク質の１つ以上の免疫優性領域が、代替インフルエンザエピトープを含有するように修飾されており、ここで、任意で前記１つ以上の免疫優性領域の各々に含有される前記代替インフルエンザエピトープの少なくとも一部が互いに異なっていてもよい、請求項１〜３のいずれかに記載の修飾ＨＡタンパク質。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の修飾ＨＡタンパク質を含むインフルエンザワクチン。
【請求項６】
動物のプロテアーゼによって切断されないＭＣＳを含有するように修飾されているインフルエンザＨＡタンパク質を含む修飾インフルエンザウイルスであって、
ここで、任意で、前記ＭＣＳが、適切なプロテアーゼによって切断されていてもよく、かつ／あるいは、
任意で、前記ＨＡタンパク質が、少なくとも１つの免疫優性領域中に異種免疫原エピトープをさらに含有していてもよく、ここで、任意で、前記異種免疫原エピトープは、腫瘍関連抗原のものであるか、又はインフルエンザ以外のウイルスのエピトープ若しくは代替インフルエンザエピトープであり得、かつ／あるいは、
任意で、前記ＨＡタンパク質の１つ以上の免疫優性領域が、異種エピトープを含有するように修飾されていてもよく、ここで、任意で、前記１つ以上の免疫優性領域の各々に含有される前記異種エピトープの少なくとも一部が互いに異なっていてもよい、修飾インフルエンザウイルス。
【請求項７】
動物のプロテアーゼによって切断されないＭＣＳを含有し、かつ、少なくとも１つの免疫優性領域に挿入されているか、又は当該領域を置換する異種免疫原エピトープをさらに含有するように修飾されており、
任意で、前記ＭＣＳが適切なプロテアーゼによって切断されていてもよく、かつ／又は、任意で、前記異種免疫原エピトープが、腫瘍関連抗原のものであるか、又はインフルエンザ以外のウイルスのエピトープ若しくは代替インフルエンザエピトープであってもよい、修飾ＨＡタンパク質。
【請求項８】
前記ワクチンを対象に投与することを含む、対象をインフルエンザに対して防御する方法において使用するための、請求項５に記載のインフルエンザワクチン。
【請求項９】
所望の抗原に対する抗体を生成する方法であって、請求項５又は８に記載の修飾インフルエンザワクチン又は請求項６に記載の修飾インフルエンザウイルス又は請求項１〜４及び７のいずれかに記載の修飾ＨＡタンパク質を哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１０】
請求項１〜４及び７のいずれかに記載の修飾インフルエンザＨＡタンパク質、又は、前記タンパク質を含有するウイルス若しくはウイルス様微粒子の少なくとも有効部分をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含有する組換え宿主細胞であって、前記核酸が当該宿主細胞内で発現するための配列を有する、組換え宿主細胞。
【請求項１２】
修飾ＨＡタンパク質又は当該タンパク質を含むウイルスを調製する方法であって、請求項１１に記載の組換え宿主細胞を、前記核酸が発現する条件下で培養することと、前記修飾ＨＡタンパク質又は当該タンパク質を含むウイルスを培養物から回収することとを含む方法。
【請求項１３】
前記核酸を対象に投与することを含む、対象をインフルエンザに対して防御する方法において使用するための、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１４】
所望の抗原に対する抗体を生成する方法であって、請求項１０に記載の核酸を哺乳動物に投与することを含む方法。
【国際調査報告】
2019506168.tif 000015
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