(57)【要約】  本発明は、（ａ）試験される個体からの試料を提供するステップと、（ｂ）表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量を測定することによって、試験試料のバイオマーカーシグネチャーを判断するステップとを含むか、またはそれからなる、膵臓癌に関連した病態を診断または判断するための方法であって、表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量が、個体における膵臓癌に関連した病態を示す、方法、膵臓癌に関連した病態を判断する使用および方法、ならびに膵臓癌を治療する方法を、それらにおいて使用するためのアレイおよびキットと共に提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓癌に関連した病態を診断または判断するための方法であって、
（ａ）試験される個体からの試料を提供するステップと、
（ｂ）表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの前記試験試料中の存在および／または量を測定することによって、前記試験試料のバイオマーカーシグネチャーを判断するステップと、
を含むか、またはそれからなり、
表Ａに定義される群から選択される前記１つ以上のバイオマーカーの前記試験試料中の存在および／または量が、前記個体における前記膵臓癌に関連した病態を示す、方法。
【請求項２】
前記膵臓癌に関連した病態が、
（ｉ）早期膵臓癌の診断および／または病期分類、
（ｉｉ）膵臓癌の診断および／または病期分類、からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）が、表Ａに列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａに列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５個の存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記膵臓癌に関連した病態が早期膵臓癌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、病期Ｉ期または病期ＩＩ期の膵臓癌の診断のためのものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）が、
（ｉ）表Ａ（Ｉ）、例えば、表Ａ（Ｉ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、または５個、
（ｉｉ）表Ａ（ＩＩＩ）、例えば、表Ａ（ＩＩＩ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、または６個、
（ｉｉｉ）表Ａ（Ｖ）、例えば、表Ａ（Ｖ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、または６個、および
（ｉｖ）表Ａ（ＸＩ）、例えば、表Ａ（ＸＩ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２または３個、
に列挙される１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）が、
（ｉ）表Ａ（ＩＩ）、例えば、表Ａ（ＩＩ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個、
（ｉｉ）表Ａ（ＩＶ）、例えば、表Ａ（ＩＶ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個、
（ｉｉｉ）表Ａ（ＶＩ）、例えば、表Ａ（ＶＩ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個、および
（ｉｖ）表Ａ（ＸＩＩ）、例えば、表Ａ（ＸＩＩ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、または６個、
に列挙される１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、病期Ｉ期の膵臓癌の診断のためのものである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）が、
（ｉ）表Ａ（Ｉ）、例えば、表Ａ（Ｉ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、または５個、
（ｉｉ）表Ａ（ＩＩＩ）、例えば、表Ａ（ＩＩＩ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、または６個、
（ｉｉｉ）表Ａ（ＶＩＩ）、
に列挙される１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）が、
（ｉ）表Ａ（ＩＩ）、例えば、表Ａ（ＩＩ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個、
（ｉｉ）表Ａ（ＩＶ）、例えば、表Ａ（ＩＶ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個、および
（ｉｉｉ）表Ａ（ＶＩＩＩ）、例えば、表Ａ（ＶＩＩＩ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、または６個、
に列挙される１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、病期ＩＩ期の膵臓癌の診断のためのものである、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）が、
（ｉｖ）表Ａ（Ｉ）、例えば、表Ａ（Ｉ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、または５個、
（ｖ）表Ａ（Ｖ）、例えば、表Ａ（Ｖ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、または６個、
（ｖｉ）表Ａ（ＩＸ）、
に列挙される１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）が、
（ｉｖ）表Ａ（ＩＩ）、例えば、表Ａ（ＩＩ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個、
（ｖ）表Ａ（ＶＩ）、例えば、表Ａ（ＶＩ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個、および
（ｖｉ）表Ａ（Ｘ）、例えば、表Ａ（Ｘ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、または４個、
に列挙される１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記膵臓癌に関連した病態が膵臓癌である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）が、ＣＨＰ−１、ＭＡＰＫＫ２、ＵＢＰ７、ＰＲＤ１４、ＳＴＡＴ１、ＡＧＡＰ−２、ＰＧＡＭ５、ＬＵＭ、ＰＴＰＲＯおよびＵＳＰ０７からなる群から選択される１つ以上のバイオマーカー、例えば、これらのバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）が、Ａｐｏ−Ａ１、ＢＴＫ、Ｃ１ｑ、Ｃ５、ＣＤＫ−２、ＩｇＭ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＪＡＫ３、ＭＡＰＫ８、ＭＣＰ−１、ＭＵＣ−１、プロパージン、ＶＥＧＦ、Ｃ３、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１３、ＡＴＰ−５Ｂ、Ｃ４、Ｈｅｒ２／ＥｒＢ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−９、ＬＤＬ、およびＯＲＰ３からなる群から選択される１つ以上のバイオマーカー、例えば、これらのバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個の存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）が、表Ａに列挙される前記バイオマーカーのうちの全ての存在および／または量を測定することを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ｃ）ｉ．膵臓癌に罹患していない個体、および／または
ｉｉ．膵臓癌に罹患している個体
から、１つ以上の対照試料を提供するステップであって、前記試料が、前記試験試料とは異なる病期のものであった、ステップと、
ｄ）ステップ（ｂ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記対照試料中の存在および／または量を測定することによって、前記１つ以上の対照試料のバイオマーカーシグネチャーを判断するステップと、
をさらに含むか、またはそれらからなり、
ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量が、ステップ（ｄ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および／または量と異なる場合に、膵臓癌に関連した病態が同定される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ｅ）ｉ．膵臓癌に罹患している個体（すなわち、陽性対照）、および／または
ｉｉ．膵臓癌に罹患している個体
から、１つ以上の対照試料を提供するステップであって、前記試料が、前記試験試料と同じ病期のものであった、ステップと、
ｆ）ステップ（ｂ）で測定された前記１つ以上のバイオマーカーの前記対照試料中の存在および／または量を測定することによって、前記対照試料のバイオマーカーシグネチャーを判断するステップと、
をさらに含むか、またはそれらからなり、
ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量が、ステップ（ｆ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および／または量に対応する場合に、膵臓癌に関連した病態が同定される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の対照試料が得られた前記個体が、前記試料が得られた時点で、非癌性膵臓疾患または病状、例えば、急性膵炎、慢性膵炎および自己免疫性膵炎、ならびに膵臓の膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）に罹患していなかった、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の対照試料が得られた前記個体が、前記試料が得られた時点で、膵臓のいかなる疾患または病状にも罹患していなかった、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
膵臓癌に罹患していない前記個体が、前記試料が得られた時点で、いかなる疾患または病状にも罹患していなかった、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
膵臓癌に罹患していない前記個体が、健康な個体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
膵臓癌に罹患している前記１人以上の個体が、腺癌（例えば、膵管腺癌または管状乳頭状膵臓腺癌）、膵臓肉腫、悪性漿液性嚢腺腫、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、および破骨細胞様巨細胞を有する未分化癌からなる群から選択される膵臓癌に罹患している、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記膵臓癌が、膵臓腺癌（例えば、膵管腺癌）である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が反復される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が反復され、ステップ（ａ）において、試験される前記試料が、前の方法の反復とは異なる時間に採取される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が、使用された前の試験試料（複数可）とは異なる期間に採取された試験試料を使用して反復される、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法が、使用された前の試験試料（複数可）に対して１日〜１０４週間、例えば、１週間〜１００週間、１週間〜９０週間、１週間〜８０週間、１週間〜７０週間、１週間〜６０週間、１週間〜５０週間、１週間〜４０週間、１週間〜３０週間、１週間〜２０週間、１週間〜１０週間、１週間〜９週間、１週間〜８週間、１週間〜７週間、１週間〜６週間、１週間〜５週間、１週間〜４週間、１週間〜３週間、または１週間〜２週間の間に採取された試験試料を使用して反復される、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法が、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１５週間、２０週間、２５週間、３０週間、３５週間、４０週間、４５週間、５０週間、５５週間、６０週間、６５週間、７０週間、７５週間、８０週間、８５週間、９０週間、９５週間、１００週間、１０４週間、１０５週間、１１０週間、１１５週間、１２０週間、１２５週間、および１３０週間からなる群からの期間毎に採取された試験試料を使用して反復される、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、少なくとも１回、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３、２４回、または２５回反復される、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、連続的に反復される、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
膵臓癌が従来の臨床的方法を使用して個体において診断されるまで、前記方法が反復される、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
各反復が、同じ個体から採取された試験試料を使用する、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｂ）が、前記１つ以上のバイオマーカー（複数可）のタンパク質またはポリペプチドの発現を測定することを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／またはステップ（ｆ）が、表Ａに列挙されるバイオマーカーに結合することが可能な１つ以上の第１の結合剤を使用して実施される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の結合剤が、抗体またはその抗原結合フラグメントを含むか、またはそれからなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、組み換え抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、免疫グロブリン分子の結合ドメインからなる群から選択される、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の結合剤が、表面上に固定化されている、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記試験試料中の前記１つ以上のバイオマーカーが、検出可能な部分で標識される、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記対照試料（複数可）中の前記１つ以上のバイオマーカーが、検出可能な部分で標識される、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記検出可能な部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分、および酵素部分からなる群から選択される、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記検出可能な部分が、ビオチンである、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／またはステップ（ｆ）が、前記１つ以上のバイオマーカーに結合することが可能な第２の結合剤を含むアッセイを使用して実施され、前記第２の結合剤が、検出可能な部分を含む、請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記第２の結合剤が、抗体またはその抗原結合フラグメントを含むか、またはそれからなる、請求項４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、組み換え抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、免疫グロブリン分子の結合ドメインからなる群から選択される、請求項４６または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記検出可能な部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分、および酵素部分からなる群から選択される、請求項４６〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記検出可能な部分が、蛍光部分（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、例えば、Ａｌｅｘａ６４７）である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記方法が、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を含むか、またはそれからなる、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／またはステップ（ｆ）が、アレイを使用して実施される、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記アレイが、ビーズ系アレイである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記アレイが、表面系アレイである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記アレイが、マクロアレイ、マイクロアレイ、ナノアレイからなる群から選択される、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記方法が、
（ｉ）前記試料中に存在するバイオマーカーをビオチンで標識することと、
（ｉｉ）前記ビオチン標識タンパク質を、その表面上の別々の位置に固定化された複数のｓｃＦｖを含むアレイと接触させることであって、ｓｃＦｖが、表Ａのタンパク質のうちの１つ以上に対する特異性を有する、接触させることと、
（ｉｉｉ）前記固定化されたｓｃＦｖを、蛍光色素を含むストレプトアビジン抱合体と接触させることと、
（ｉｖ）前記アレイ表面上の別々の位置における前記色素の存在を検出することと、
を含み、
前記アレイ表面上の前記色素の発現が、前記試料中の表ＩＩＩからのバイオマーカーの発現を示す、請求項１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／またはステップ（ｆ）が、前記１つ以上のバイオマーカーをコードする核酸分子の発現を測定することを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記核酸分子が、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記核酸分子が、ｍＲＮＡ分子である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／または（ｆ）において前記１つ以上のバイオマーカー（複数可）の前記発現を測定することが、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィ、および原位置ハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法を使用して実施される、請求項５７、５８、または５９に記載の方法。
【請求項６１】
ステップ（ｂ）において前記１つ以上のバイオマーカー（複数可）の前記発現を測定することが、ＤＮＡマイクロアレイを使用して判断される、請求項５７〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／または（ｆ）において前記１つ以上のバイオマーカー（複数可）の前記発現を測定することが、１つ以上の結合部分を使用して実施され、各々が表Ａで特定される前記バイオマーカーのうちの１つをコードする核酸分子に選択的に結合することが個々に可能である、請求項５７〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記１つ以上の結合部分がそれぞれ、核酸分子を含むか、またはそれからなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記１つ以上の結合部分がそれぞれ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、またはＰＭＯを含むか、またはそれからなる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記１つ以上の結合部分がそれぞれ、ＤＮＡを含むか、またはそれからなる、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記１つ以上の結合部分が、５〜１００ヌクレオチド長である、請求項６３〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記１つ以上の核酸分子が、１５〜３５ヌクレオチド長である、請求項６３〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記結合部分が、検出可能な部分を含む、請求項６３〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記検出可能な部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分（例えば、放射性原子）、および酵素部分からなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記検出可能な部分が、放射性原子を含むか、またはそれからなる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記放射性原子が、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、リン−３２、硫黄−３５、重水素、トリチウム、レニウム−１８６、レニウム−１８８、およびイットリウム−９０からなる群から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記結合部分の前記検出可能な部分が、蛍光部分である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
ステップ（ａ）、（ｃ）、および／または（ｅ）で提供される前記試料が、未分画血液、血漿、血清、組織液、膵臓組織、乳、胆汁、および尿からなる群から選択される、請求項１〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
ステップ（ａ）、（ｃ）、および／または（ｅ）で提供される前記試料が、未分画血液、血漿、および血清からなる群から選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ステップ（ａ）、（ｃ）、および／または（ｅ）で提供される試料が、血清である、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記方法の予測精度は、ＲＯＣ  ＡＵＣ値によって決定される場合、少なくとも０．５０、例えば、少なくとも０．５５、少なくとも０．６０、少なくとも０．６５、少なくとも０．７０、少なくとも０．７５、少なくとも０．８０、少なくとも０．８５、少なくとも０．９０、少なくとも０．９５、少なくとも０．９６、少なくとも０．９７、少なくとも０．９８または少なくとも０．９９である、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記方法の前記予測精度が、ＲＯＣ  ＡＵＣ値によって決定される場合、少なくとも０．７０である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記個体が膵臓癌と診断された場合、前記方法が、
（ｇ）前記個体に膵臓癌療法を提供するステップ
を含む、請求項１〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記膵臓癌療法が、外科手術、化学療法、免疫療法、化学免疫療法、および温熱化学療法からなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
請求項３６〜５１および６４〜７２のいずれか１項に定義される１つ以上の結合剤を含む、個体における膵臓癌の存在を判断するためのアレイ。
【請求項８１】
前記１つ以上の結合剤が、表Ａに定義される前記タンパク質のうちの全てに結合することが可能である、請求項８０に記載のアレイ。
【請求項８２】
個体における膵臓癌の存在を判断するためのバイオマーカーとしての、表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの使用。
【請求項８３】
表Ａに定義される前記タンパク質のうちの全てが、個体における膵臓癌の存在を判断するための診断マーカーとして使用される、請求項８２に記載の使用。
【請求項８４】
個体における膵臓癌の存在を判断するための、請求項３６〜５１および６４〜７２のいずれか１項に定義される１つ以上の結合部分の使用。
【請求項８５】
表Ａに定義される前記タンパク質のうちの全てに対するバイオマーカーが使用される、請求項８４に記載の使用。
【請求項８６】
膵臓癌の存在を判断するためのキットであって、
Ａ）請求項３６〜５１および６４〜７２のいずれか１項に定義される１つ以上の結合剤、または請求項８０〜８１に記載のアレイと、
Ｂ）請求項１〜７９のいずれか１項に定義される方法を実施するための説明書と、
を含む、キット。
【請求項８７】
個体における膵臓癌を治療する方法であって、
（ａ）請求項１〜７９のいずれか１項に定義される方法に従って、膵臓癌を診断するステップと、
（ｂ）前記個体に膵臓癌療法を提供するステップと、
を含む、方法。
【請求項８８】
前記膵臓癌療法が、外科手術（例えば、切除）、化学療法、免疫療法、化学免疫療法、および温熱化学療法からなる群から選択される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
実質的に本明細書に記載されるような、個体における膵臓癌の存在を判断するための方法または使用。
【請求項９０】
実質的に本明細書に記載されるような、個体における膵臓癌の存在を判断するためのアレイまたはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓癌に関連した病態（早期膵臓癌の存在、膵臓癌の病期および／または膵臓癌の存在）を判断するための方法、ならびにそのような方法で使用するためのアレイおよびキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、３〜４％の５年生存率を有する最も致命的な癌の１つである。この予後不良の背後にある主な要因は、早期に患者を診断することが現在できないことである。データは、腫瘍の開始から転移能の取得まで５年以上かかることを裏付けて（Ｙａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、それは、正確なマーカーが利用可能な場合に、早期検出のための絶好の機会を明確に実証している。診断時に、患者はしばしば後期疾患を発症しており、患者のわずか約１５％が切除可能な腫瘍を有する（Ｃｏｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。大きな切除腫瘍を呈するこれらの患者の５年生存率は、わずか１０〜２０％である（Ｃｏｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。しかしながら、２０ｍｍ以下の腫瘍（病期Ｉ〜ＩＩ期）が切除され得る場合、５年生存率は、３０〜６０％まで増加する（Ｆｕｒｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。後期診断（病期ＩＩＩ〜ＩＶ期）は、早期診断のためのマーカーの欠如と組み合わせた非特異的な臨床症状によるものであり、これは、本研究で対処されるものである。興味深いことに、研究は、膵臓腫瘍が、無症候期において臨床診断の早ければ６ヶ月も前に切除可能であり得ることを示唆する（Ｇａｎｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｐｅｌａｅｚ−Ｌｕｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０００３】
これまでに最も評価されているＰＤＡＣのためのマーカーであるＣＡ１９−９は、いくつかの他の兆候のレベルは高いが、不十分な特異性、ならびに遺伝子型的にＬｅｗｉｓ  ａ−ｂ−である患者（人口の５％）における完全な欠如に悩まされている。その結果、膵臓癌のスクリーニングのためのＣＡ１９−９の使用は推奨されない（Ｌｏｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。今日、ＰＤＡＣを正確に診断することが示されている他の単一バイオマーカーはないが、最近の発見研究は、エキソソームおよびヌクレオソームの両方が膵臓癌に関連する情報を含むことを実証している（Ｂａｕｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｍｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。しかしながら、改善された感度および特異性を有するバイオマーカーおよびバイオマーカーパネルを提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
したがって、本発明の第１の態様は、膵臓癌に関連した病態を診断または判断するための方法を提供し、
（ａ）試験される個体からの試料を提供するステップと、
（ｂ）表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量を測定することによって、試験試料のバイオマーカーシグネチャーを判断するステップと、を含むか、またはそれからなり、
表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量が、個体における膵臓癌に関連した病態を示す。
【０００５】
したがって、一実施形態では、方法は、試料が得られた個体に関して診断が達成されることを可能にする、試験試料のバイオマーカーシグネチャーを判断することを含む。
【０００６】
「膵臓癌に関連した病態」とは、膵臓癌自体の存在、膵臓癌の病期および／または膵管内乳頭粘液性腫瘍（以下を参照）などの関連病変の存在を含む。特に、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の存在および／または病期を含む。
【０００７】
特定の実施形態では、本発明の方法は、
（ｉ）早期膵臓癌の診断および／もしくは病期分類、ならびに／または
（ｉｉ）膵臓癌の診断および／もしくは病期分類（すなわち、早期または後期）、を可能にする。
【０００８】
「バイオマーカー」とは、自然に存在する生物学的分子、またはその構成成分またはフラグメントを意味し、その測定は、膵臓癌の診断および／または予後に有用な情報を提供することができる。したがって、表Ａとの関連で、バイオマーカーは、自然に存在するタンパク質、またはそのポリペプチドフラグメントもしくは炭水化物部分（またはＬｅｗｉｓ  ｘおよびシアリルＬｅｗｉｓ  ｘの場合、炭水化物部分自体）であってもよい。あるいは、バイオマーカーは、タンパク質またはその一部をコードするｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または循環腫瘍ＤＮＡ分子などの核酸分子であってもよい。
【０００９】
「診断」とは、個体における病態の存在または非存在を判断すること（例えば、個体が早期膵臓癌または膵臓癌（早期もしくは後期）に罹患しているか否かを判断することと）を意味するか、またはそれを含む。
【００１０】
「病期分類」とは、膵臓癌の病期を判断すること、例えば、膵臓癌が病期Ｉ期、病期ＩＩ期、病期ＩＩＩ期、または病期ＩＶ期（例えば、病期Ｉ期、病期ＩＩ期、病期Ｉ〜ＩＩ期、病期ＩＩＩ〜ＩＶ期、または病期Ｉ〜ＩＶ期）であるかどうかを判断することを意味するか、またはそれを含む。
【００１１】
「早期膵臓癌」とは、病期Ｉ期および／または病期ＩＩ期の膵臓癌を含むか、またはそれからなる膵臓癌を含むか、またはそれを意味する。
【００１２】
あるいは、または加えて、「早期膵臓癌」とは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）ＴＮＭシステム（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ／ｄｅｔａｉｌｅｄｇｕｉｄｅ／ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ−ｃａｎｃｅｒ−ｓｔａｇｉｎｇ、およびＡＪＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ（７ｔｈｅｄ）２０１１，Ｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒを参照されたい）によって決定されるような病期Ｉ期および／または病期ＩＩ期の膵臓癌を含むか、またはそれを意味する。
【００１３】
ＴＮＭ癌病期分類システムは、３つの重要な情報に基づく。
-Ｔは、主（原発）腫瘍の大きさ、およびそれが膵臓の外側および隣接器官内へと成長したかどうかを記述する。
-Ｎは、隣接（所属）リンパ節への広がりを記述する。
-Ｍは、癌が身体の他の器官に転移した（広がった）かどうかを記述する。（膵臓癌が広がる最も一般的な部位は、肝臓、肺、および腹膜（消化器官の周囲の空間）である。）
Ｔ、Ｎ、Ｍの後ろに数字または文字が表示されて、これらの要因の各々に関するさらなる詳細を提供する。
Ｔ分類
ＴＸ：主腫瘍は、評価できない。
Ｔ０：原発腫瘍の兆候なし。
Ｔｉｓ：上皮内癌（その腫瘍は膵管細胞の最上層に限定される）。（この病期で見られる膵臓腫瘍はごくわずかである。）
Ｔ１：癌は、膵臓内にまだあり、直径２センチメートル（ｃｍ）（約３／４インチ）以下である。
Ｔ２：癌は、膵臓内にまだあるが、直径２ｃｍよりも大きい。
Ｔ３：癌は、膵臓の外側で隣接する周囲組織内へと成長したが、主要な血管または神経内へは成長していない。
Ｔ４：癌は、膵臓を越えて隣接する大きい血管または神経内へと成長している。
Ｎ分類
ＮＸ：隣接（所属）リンパ節は、評価できない。
Ｎ０：癌は、隣接リンパ節に広がっていない。
Ｎ１：癌は、隣接リンパ節に広がっている。
Ｍ分類
Ｍ０：癌は、離れたリンパ節（膵臓に近いもの以外）または肝臓、肺、脳などの離れた器官に広がっていない。
Ｍ１：癌は、離れたリンパ節または離れた器官に広がっている。
膵臓癌の病期グループ化
いったんＴ、Ｎ、およびＭ分類が判断されると、この情報は組み合わされて、全体的な病期０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ期（時に文字が後に続く）を割り当てる。このプロセスは、病期グループ化と呼ばれる。
病期０（ＴＩＳ、Ｎ０、Ｍ０）：腫瘍は、膵管細胞の最上層に限定され、より深い組織に浸潤していない。腫瘍は、膵臓の外側に広がっていない。これらの腫瘍はしばしば、膵上皮内癌または膵上皮内腫瘍性病変ＩＩＩ（ＰａｎＩｎ  ＩＩＩ）と称される。
病期ＩＡ期（Ｔ１、Ｎ０、Ｍ０）：腫瘍は、膵臓に限定され、直径２ｃｍ以下である（Ｔ１）。腫瘍は、隣接リンパ節（Ｎ０）または離れた部位（Ｍ０）に広がっていない。
病期ＩＢ（Ｔ２、Ｎ０、Ｍ０）：腫瘍は、膵臓に限定され、直径２ｃｍよりも大きい（Ｔ２）。腫瘍は、隣接リンパ節（Ｎ０）または離れた部位（Ｍ０）に広がっていない。
病期ＩＩＡ期（Ｔ３、Ｎ０、Ｍ０）：腫瘍は、膵臓の外側で成長しているが、主要な血管または神経内へは成長していない（Ｔ３）。腫瘍は、隣接リンパ節（Ｎ０）または離れた部位（Ｍ０）に広がっていない。
病期ＩＩＢ期（Ｔ１〜３、Ｎ１、Ｍ０）：腫瘍は、膵臓に限定されているか、または膵臓の外側で成長しているかのいずれかであるが、主要な血管または神経内へは成長していない（Ｔ１〜Ｔ３）。腫瘍は、隣接リンパ節（Ｎ１）に広がっているが、離れた部位（Ｍ０）には広がっていない。
病期ＩＩＩ（Ｔ４、任意のＮ、Ｍ０）：腫瘍は、膵臓の外側で隣接する主要な血管または神経内へと成長している（Ｔ４）。腫瘍は、隣接リンパ節に広がっている可能性があるか、または広がっている可能性がない（任意のＮ）。腫瘍は、離れた部位に広がっていない（Ｍ０）。
病期ＩＶ期（任意のＴ、任意のＮ、Ｍ１）：癌は、離れた部位に広がっている（Ｍ１）。
【００１４】
あるいは、または加えて、「早期膵臓癌」とは、無症候性膵臓癌を含むか、またはそれを意味する。膵臓癌の一般的な主症状としては、黄疸（膵頭部腫瘍に関して）、腹痛、体重減少、脂肪便症、および初発糖尿病が挙げられる。例えば、症状（例えば、一般的な症状）が観察されるか、または観察可能である少なくとも１週間前に、例えば、症状が観察されるか、または観察可能である２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、７週間以上、８週間以上、３ヶ月以上、４ヶ月以上、５ヶ月以上、６ヶ月以上、７ヶ月以上、８ヶ月以上、９ヶ月以上、１０ヶ月以上、１１ヶ月以上、１２ヶ月以上、１８ヶ月以上、２年以上、３年以上、４年以上、または５年以上前に、膵臓癌が現れる場合がある。
【００１５】
あるいは、かつ／または加えて、「早期膵臓癌」とは、従来の臨床的方法によって診断される、不十分なサイズおよび／または発生段階を有する膵臓癌を含む。
【００１６】
あるいは、または加えて、「早期膵臓癌」とは、膵臓癌が従来の臨床的方法によって診断されるか、または診断可能である少なくとも１週間前、例えば、膵臓癌が従来の臨床的方法によって診断されるか、または診断可能である２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、７週間以上、８週間以上、３ヶ月以上、４ヶ月以上、５ヶ月以上、６ヶ月以上、７ヶ月以上、８ヶ月以上、９ヶ月以上、１０ヶ月以上、１１ヶ月以上、１２ヶ月以上、１８ヶ月以上、２年以上、３年以上、４年以上、または５年以上前に現れる膵臓癌を含むか、またはそれを意味する。
【００１７】
臨床的な膵臓癌診断のための現代の最良実施例は、当業者には周知であるが、詳細なレビューに関しては、Ｄｕｃｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，‘Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ：ＥＳＭＯ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ’Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２６（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ５）：ｖ５６−ｖ６８を参照されたく、それは、参照により本明細書に組み込まれ、以下で得られる。
ｈｔｔｐｓ：／／ａｎｎｏｎｃ．ｏｘｆｏｒｄｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２６／ｓｕｐｐｌ＿５／ｖ５６．ｆｕｌｌ．ｐｄｆ＋ｈｔｍｌ。
【００１８】
あるいは、または加えて、「従来の臨床診断」（および同様のもの（例えば、「従来の臨床的方法によって診断される」））とは、ＣＴスキャン、超音波、内視鏡超音波、生検（組織病理学）、ならびに／または身体検査（例えば、腹部、およびおそらく局所リンパ節の検査）を含む。「従来の臨床診断」（および同様のもの）による一実施形態では、参照により本明細に組み込まれる、Ｄｕｃｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，‘Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ：ＥＳＭＯ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ’Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２６（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ５）：ｖ５６−ｖ６８に提示される膵臓癌診断手順を含む。
【００１９】
あるいは、または加えて、「従来の臨床診断」（および同様のもの）とは、体液（血液、血清、間質液、リンパ、尿、粘液、唾液、痰、汗など）または組織中に存在する分子バイオマーカーの使用を含んでもよく、または除外してもよい。
【００２０】
あるいは、または加えて、「早期膵臓癌」とは、切除可能な膵臓癌を含むか、またはそれを意味する。
【００２１】
「切除可能な膵臓癌」とは、膵臓癌が、外科手術によって除去されることが可能（すなわち、切除可能）である腫瘍を含むか、またはそれらからなることを含むか、またはそれを意味する。
【００２２】
あるいは、または加えて、膵臓に限定される（すなわち、膵臓を越えて延在しない、かつ／または転移していない）膵臓癌を含む。
【００２３】
あるいは、または加えて、「早期膵臓癌」とは、全寸法において３０ｍｍ以下（すなわち、本実施形態では、早期膵臓癌を有する個体は、いかなる寸法においても３０ｍｍよりも大きい膵臓癌腫瘍を含まない）、例えば、全ての寸法において２９ｍｍ、２８ｍｍ、２７ｍｍ、２６ｍｍ、２５ｍｍ、２４ｍｍ、２２ｍｍ、２１ｍｍ、２０ｍｍ、１９ｍｍ、１８ｍｍ、１７ｍｍ、１６ｍｍ、１５ｍｍ、１４ｍｍ、１３ｍｍ、１２ｍｍ、１１ｍｍ、１０ｍｍ、９ｍｍ、８ｍｍ、７ｍｍ、６ｍｍ、５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ以下、または０．１ｍｍに等しい腫瘍を含む膵臓癌を含む。あるいは、または加えて、全寸法において３０ｍｍ以下の膵臓癌腫瘍は、一寸法において少なくとも２ｍｍである。あるいは、または加えて、全寸法において３０ｍｍ以下の膵臓癌腫瘍は、全寸法において少なくとも２ｍｍである。
【００２４】
あるいは、または加えて、「病期Ｉ期の膵臓癌」とは、ＡＪＣＣ病期ＩＡ期および／またはＩＢ期を含むか、またはそれを意味する。
【００２５】
あるいは、または加えて、「病期ＩＩ期の膵臓癌」とは、ＡＪＣＣス病期ＩＩＡ期および／またはＩＩＢ期を含むか、またはそれを意味する。
【００２６】
あるいは、または加えて、「後期膵臓癌」とは、病期ＩＩＩ期および／またはＩＶ期の膵臓癌を含むか、またはそれからなる膵臓癌を含むか、またはそれを意味する。
【００２７】
あるいは、または加えて、「病期ＩＩＩ期の膵臓癌」とは、ＡＪＣＣ病期ＩＩＩ期を含むか、またはそれを意味する。
【００２８】
あるいは、または加えて、「病期ＩＶ期の膵臓癌」は、ＡＪＣＣ病期ＩＶ期を含むか、またはそれを意味する。
【００２９】
「膵臓癌」の膵臓癌に関連した病態とは、任意の病期の膵臓癌を含むか、またはそれからなる膵臓癌を含む。
【００３０】
「試験される試料」、「試験試料」、または「対照試料」とは、個体から採取または抽出された組織または体液試料を含む。好ましくは、試験される試料は、哺乳動物から提供される。哺乳動物は、家畜または農場動物であってもよい。好ましくは、哺乳動物は、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウマまたは霊長類である。最も好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００３１】
好ましくは、試料は、血液（分画もしくは未分画）、血漿、形質細胞、血清、組織細胞、または同様に好ましい細胞もしくは組織試料から得られるタンパク質もしくは核酸を含むか、またはそれらからなる細胞、組織、または体液試料（またはその誘導体）である。好ましくは、試験試料および対照試料は、同じ種から得られる。好ましくは、試験試料および対照試料は、年齢、性別、および／またはライフスタイルに関して一致される。
【００３２】
代替または追加の実施形態では、組織試料は、膵臓組織である。代替または追加の実施形態では、細胞試料は、膵臓細胞の試料である。
【００３３】
あるいは、または加えて、膵臓癌は、当該技術分野で既知の従来の臨床的方法を使用して診断され得る。例えば、それらの方法は、参照により本明細に組み込まれる、Ｄｕｃｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，‘Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ：ＥＳＭＯ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ’Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２６（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ５）：ｖ５６−ｖ６８、および／またはＦｒｅｅｌｏｖｅ  ＆  Ｗａｌｌｉｎｇ，２００６，‘Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ’Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ，７３（３）：４８５−４９２に記載される。
【００３４】
したがって、膵臓癌は、
コンピュータ断層撮影（好ましくは、２相性ヘリカルコンピュータ断層撮影）、経腹超音波検査、超音波内視鏡下穿刺吸引、内視鏡的逆行性胆道膵管造影、陽電子放出断層撮影、磁気共鳴画映像、身体検査、および生検からなる群から選択される１つ以上の方法を使用して診断され得る。
【００３５】
あるいは、かつ／または加えて、膵臓癌は、膵臓癌の診断のためのバイオマーカーの検出を使用して診断され得る。例えば、膵臓癌は、ＷＯ  ２００８／１１７０６７  Ａ９、ＷＯ  ２０１２／１２０２８８  Ａ２、およびＷＯ  ２０１５／０６７９６９  Ａ２からなる群に記載される１つ以上のバイオマーカーまたは診断方法で診断され得る。
【００３６】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、表Ａに列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａに列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５個の存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる。
【００３７】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＣＨＰ−１の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＭＡＰＫＫ２の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＭＡＰＫＫ６の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、Ｒ−ＰＴＰ−Ｏの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＵＢＰ７の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、Ａｐｏ−Ａ１の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＢＴＫの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、Ｃ１ｑの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、Ｃ５の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＣＤＫ−２の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＩｇＭの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＩＬ−１１の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＩＬ−１２の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＩＬ−６の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＪＡＫ３の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＭＡＰＫ８の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＭＣＰ−１の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＭＵＣ−１の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、プロパージンの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＶＥＧＦの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＧＲＩＰ−２の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＭＡＰＫ９の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＰＫＢγの発現を測定することを含むか、それからなるか、または���れを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＰＲＤ１４の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、Ｒ−ＰＴＰ−ηの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＴｏｐＢＰ１の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、Ｃ３の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＣＤ４０Ｌの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＥＧＦＲの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＨＡＤＨ２の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＩＣＡＭ−１の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＩＬ−１３の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＩＬ−１８の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ミオメシン−２の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、Ｐ８５Ａの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＲＡＮＴＥＳの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＴＧＦ−ｂ１の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＩＬ−４の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＣＩＭＳ（１３）の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＧＮＡＩ３の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＨｓＭＡＤ２の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ｈＳｐｉｎｄｌｙの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、Ｒ−ＰＴＰ−κの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＳＴＡＴ１の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＡＴＰ−５Ｂの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、Ｃ４の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＣＨＸ１０の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、Ｂ因子の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、Ｈｅｒ２  ／  ＥｒｂＢ−２の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＩＬ−１ｂの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＩＬ−７の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、Ｌｅｗｉｓ  Ｘの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＭＣＰ−３の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、シアリルＬｅｗｉｓ  Ｘの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＴＢＣ１Ｄ９の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＴＮＦＲＳＦ３の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＡＧＡＰ−２の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、Ｃ１−ＩＮＨの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、Ｃ１ｓの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＧＬＰ−１Ｒの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＩＬ−２の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＫＳＹＫの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＭＡＰＫ１の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＴＥＮＳ４の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＦＡＳＮの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＩＬ−１０の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＩＬ−３の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＩＬ−８の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるい���、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＳＴＡＰ２の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＣＴ１７の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ジゴキシンの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＨｓＨｅｃ１の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＰＡＲ−６Ｂの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＰＧＡＭ５の発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＩＦＮ−γの発現を測定することを含むか、それからなるか、またはそれを除外する。
【００３８】
あるいは、または加えて、膵臓癌に関連した病態は、早期膵臓癌である。
【００３９】
あるいは、または加えて、方法は、病期Ｉ期または病期ＩＩ期の膵臓癌の診断および／または病期分類（すなわち、膵臓癌と診断すること、および／または必ずしもどちらかを判断することなく、その膵臓癌を病期Ｉ期もしくは病期ＩＩ期と特徴付けること）のためのものである。あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、
表Ａ（Ｉ）、例えば、表Ａ（Ｉ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、または５個、
表Ａ（ＩＩＩ）、例えば、表Ａ（ＩＩＩ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、または６個、
表Ａ（Ｖ）、例えば、表Ａ（Ｖ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、または６個、および
表Ａ（ＸＩ）、例えば、表Ａ（ＸＩ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２または３個、に列挙される１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる。
【００４０】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、
表Ａ（ＩＩ）、例えば、表Ａ（ＩＩ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個、
表Ａ（ＩＶ）、例えば、表Ａ（ＩＶ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個、
表Ａ（ＶＩ）、例えば、表Ａ（ＶＩ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個、および
表Ａ（ＸＩＩ）、例えば、表Ａ（ＸＩＩ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、または６個、に列挙される１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる。
【００４１】
あるいは、または加えて、方法は、病期Ｉ期の膵臓癌の診断および／または病期分類（すなわち、膵臓癌と診断すること、および／またはその膵臓癌を病期Ｉ期と特徴付けること）のためのものである。
【００４２】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、
表Ａ（Ｉ）、例えば、表Ａ（Ｉ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、または５個、
表Ａ（ＩＩＩ）、例えば、表Ａ（ＩＩＩ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、または６個、
表Ａ（ＶＩＩ）、に列挙される１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる。
【００４３】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、
表Ａ（ＩＩ）、例えば、表Ａ（ＩＩ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個、
表Ａ（ＩＶ）、例えば、表Ａ（ＩＶ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個、および
表Ａ（ＶＩＩＩ）、例えば、表Ａ（ＶＩＩＩ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、または６個、に列挙される１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる。
【００４４】
あるいは、または加えて、本方法は、病期ＩＩ期の膵臓癌の診断および／または病期分類のためである。
【００４５】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、
表Ａ（Ｉ）、例えば、表Ａ（Ｉ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、または５個、
表Ａ（Ｖ）、例えば、表Ａ（Ｖ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、または６個、
表Ａ（ＩＸ）、に列挙される１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる。
【００４６】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、
表Ａ（ＩＩ）、例えば、表Ａ（ＩＩ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６個、
表Ａ（ＶＩ）、例えば、表Ａ（ＶＩ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個、および
表Ａ（Ｘ）、例えば、表Ａ（Ｘ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、または４個、に列挙される１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる。
【００４７】
あるいは、または加えて、方法は、病期ＩＩＩ期またはＩＶ期の膵臓癌と診断するか、または特徴付ける（すなわち、膵臓癌と診断し、かつ／またはその膵臓癌を病期ＩＩＩ期もしくはＩＶ期と特徴付ける）ためのものであり、上記に定義されるような病期Ｉ期またはＩＩ期の膵臓癌と診断するか、またはそれを特徴付けるための１つ以上のバイオマーカーの存在または量を測定することと、上記に定義されるような病期Ｉ〜ＩＶ期の膵臓癌と診断するか、またはそれを特徴付けるための１つ以上のバイオマーカーの存在または量を測定することとを含むか、またはそれらからなる。あるいは、または加えて、病期「Ｉ期またはＩＩ期」のバイオマーカーのうちの１つ以上は、「病期Ｉ〜ＩＶ期のバイオマーカー」のうちの１つ以上とは異なる。あるいは、または加えて、病期「Ｉ期またはＩＩ期」のバイオマーカーのうちの全てが、「病期Ｉ〜ＩＶ期のバイオマーカー」のうちの１つ以上とは異なる。
【００４８】
あるいは、または加えて、膵臓癌に関連した病態は、膵臓癌である（すなわち、方法は、膵臓癌の存在を診断するためのものである）。
【００４９】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、ＣＨＰ−１、ＭＡＰＫＫ２、ＵＢＰ７、ＰＲＤ１４、ＳＴＡＴ１、ＡＧＡＰ−２、ＰＧＡＭ５、ＬＵＭ、ＰＴＰＲＯおよびＵＳＰ０７からなる群から選択される１つ以上のバイオマーカー、例えば、これらのバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる。
【００５０】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、Ａｐｏ−Ａ１、ＢＴＫ、Ｃ１ｑ、Ｃ５、ＣＤＫ−２、ＩｇＭ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＪＡＫ３、ＭＡＰＫ８、ＭＣＰ−１、ＭＵＣ−１、プロパージン、ＶＥＧＦ、Ｃ３、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１３、ＡＴＰ−５Ｂ、Ｃ４、Ｈｅｒ２／ＥｒＢ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−３、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−９、ＬＤＬ、およびＯＲＰ３からなる群から選択される１つ以上のバイオマーカー、例えば、これらのバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個の存在および／または量を測定することを含むか、またはそれからなる。
【００５１】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、図４に列挙されるバイオマーカーのうちの１つ以上、例えば、図４に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１個を測定することを含む。
【００５２】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、表Ａに列挙されるバイオマーカーのうちの全ての存在および／または量を測定することを含む。
【００５３】
あるいは、または加えて、方法は、
（ｃ）
（ｉ）膵臓癌に罹患していない個体、および／または
（ｉｉ）膵臓癌に罹患している個体から、１つ以上の対照試料を提供するステップであって、試料が、試験試料とは異なる病期のものであった、ステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および／または量を測定することによって、１つ以上の対照試料のバイオマーカーシグネチャーを判断するステップと、をさらに含むか、またはそれらからなり、
ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量が、ステップ（ｄ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および／または量と異なる場合に、膵臓癌に関連した病態が同定される。
【００５４】
「対照試料中の存在および／または量とは異なる」とは、試験試料中の１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量が、１つ以上の対照試料中の１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量（または、それを表す所定の基準値）とは異なることを意味するか、またはそれを含む。好ましくは、試験試料中の存在および／または量は、少なくとも１つの対照試料中の存在または量（または対照試料の平均）とは少なくとも±５％、例えば、１つ以上の対照試料（例えば、陰性対照試料）の少なくとも±６％、±７％、±８％、±９％、±１０％、±１１％、±１２％、±１３％、±１４％、±１５％、±１６％、±１７％、±１８％、±１９％、±２０％、±２１％、±２２％、±２３％、±２４％、±２５％、±２６％、±２７％、±２８％、±２９％、±３０％、±３１％、±３２％、±３３％、±３４％、±３５％、±３６％、±３７％、±３８％、±３９％、±４０％、±４１％、±４２％、±４３％、±４４％、±４５％、±４１％、±４２％、±４３％、±４４％、±５５％、±６０％、±６５％、±６６％、±６７％、±６８％、±６９％、±７０％、±７１％、±７２％、±７３％、±７４％、±７５％、±７６％、±７７％、±７８％、±７９％、±８０％、±８１％、±８２％、±８３％、±８４％、±８５％、±８６％、±８７％、±８８％、±８９％、±９０％、±９１％、±９２％、±９３％、±９４％、±９５％、±９６％、±９７％、±９８％、±９９％、±１００％、±１２５％、±１５０％、±１７５％、±２００％、±２２５％、±２５０％、±２７５％、±３００％、±３５０％、±４００％、±５００％、または少なくとも±１０００％異なる。
【００５５】
あるいは、または加えて、試験試料中の存在または量は、対照試料中の平均の存在または量とは、対照試料中の平均の存在または量から少なくとも１超の標準偏差、例えば、対照試料中の平均の存在または量から１．５以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、または１５以上の標準偏差異なる。標準偏差を決定するために任意の好適な手段（例えば、直接、平方和、Ｗｅｌｆｏｒｄ’ｓ）が使用され得るが、一実施形態では、標準偏差は、直接法（すなわち、［試料−平均の平方和÷試料数］の平方根）を使用して決定される。
【００５６】
あるいは、または加えて、「対照試料中の存在および／または量とは異なる」とは、試験試料中の存在または量が、統計的に有意な方法で対照試料中の量と相関しないことを意味するか、またはそれを含む。「統計的に有意な方法で対照試料中の量と相関しない」とは、試験試料中の存在または量が、０．００１超、例えば、０．００２超、０．００３超、０．００４超、０．００５超、０．０１超、０．０２超、０．０３超、０．０４超、０．０５超、０．０６超、０．０７超、０．０８超、０．０９超、または０．１超のｐ値で、対照試料中の存在または量と相関することを意味するか、またはそれを含む。ｚ検定、ｔ検定、スチューデントｔ検定、ｆ検定、マン・ホイットニーＵ検定、ウィルコクソンの符号順位検定、およびピアソンのカイ二乗検定を含む、当業者に既知のｐ値を決定するための任意の好適な手段が使用され得る。
【００５７】
あるいは、または加えて、方法は、
（ｅ）膵臓癌に罹患している個体（すなわち、陽性対照）、および／または
（ｆ）膵臓癌に罹患している個体から、１つ以上の対照試料を提供するステップであって、試料が、試験試料と同じ病期のものであった、ステップと、
ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および／または量を測定することによって、対照試料のバイオマーカーシグネチャーを判断するステップと、をさらに含むか、またはそれらからなり、
ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量が、ステップ（ｆ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および／または量に対応する場合に、膵臓癌に関連した病態が同定される。
【００５８】
「対照試料中の存在および／または量に対応する」とは、存在および／もしくは量が陽性対照試料中の存在および／もしくは量と同一であるか、または１つ以上の陰性対照試料（もしくはそれを表す所定の基準値）よりも１つ以上の陽性対照試料中の存在および／もしくは量に近いことを意味するか、またはそれを含む。好ましくは、存在および／または量は、１つ以上の対照試料中の存在および／または量（または対照試料の平均）の±４０％以内、例えば、１つ以上の対照試料（例えば、陽性対照試料）の±３９％、±３８％、±３７％、±３６％、±３５％、±３４％、±３３％、±３２％、±３１％、±３０％、±２９％、±２８％、±２７％、±２６％、±２５％、±２４％、±２３％、±２２％、±２１％、±２０％、±１９％、±１８％、±１７％、±１６％、±１５％、±１４％、±１３％、±１２％、±１１％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±０．０５％以内、または０％以内である。
【００５９】
あるいは、または加えて、試験試料中の存在または量の差は、対照試料中の平均の存在または量から５以下の標準偏差、例えば、対照試料中の平均の存在または量から４．５以下、４以下、３．５以下、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１．４以下、１．３以下、１．２以下、１．１以下、１以下、０．９以下、０．８以下、０．７以下、０．６以下、０．５以下、０．４以下、０．３以下、０．２以下、０．１以下、または０の標準偏差であるが、ただし、異なる、および対応するバイオマーカー発現に対する標準偏差範囲が、重複しない（例えば、隣接するが、重複しない）ことを条件とする。
【００６０】
あるいは、または加えて、「対照試料中の存在および／または量に対応する」とは、試験試料中の存在または量が、統計的に有意な方法で対照試料中の量と相関することを意味するか、またはそれを含む。「統計的に有意な方法で対照試料中の量と相関する」とは、試験試料中の存在または量が、０．０５以下、例えば、０．０４以下、０．０３以下、０．０２以下、０．０１以下、０．００５以下、０．００４以下、０．００３以下、０．００２以下、０．００１以下、０．０００５以下、または０．０００１以下のｐ値で、対照試料中の存在または量と相関することを意味するか、またはそれを含む。
【００６１】
バイオマーカーの差次的発現（上方制御もしくは下方制御）、またはその欠如は、当業者に既知の任意の好適な手段によって決定され得る。差次的発現は、少なくとも０．０５未満のｐ値（ｐ＝＜０．０５）、例えば、少なくとも０．０４未満、０．０３未満、０．０２未満、０．０１未満、０．００９未満、０．００５未満、０．００１未満、０．０００１未満、０．００００１未満、または少なくとも０．０００００１未満であることが決定される。あるいは、または加えて、差次的発現は、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して決定される。あるいは、または加えて、ＳＶＭは、以下に記載されるＳＶＭである。最も好ましくは、ＳＶＭは、以下の表５に記載されるＳＶＭであるか、またはそれから得られる。
【００６２】
差次的発現が、単一のバイオマーカー、または組み合わせて（すなわち、バイオマーカーシグネチャーとして）考慮される複数のバイオマーカーに関連し得ることは、当業者に理解されるであろう。したがって、ｐ値は、単一のバイオマーカーまたはバイオマーカーの群と関連し得る。実際、個々に考慮した場合、０．０５よりも大きい差次的発現ｐ値を有するタンパク質は、それでもなお、それらの発現レベルが１つ以上の他のバイオマーカーと組み合わされて考慮された場合に、本発明に従ったバイオマーカーとして有用であり得る。
【００６３】
添付の実施例で例示されるように、組織、血液、血清、または血漿試験試料中のある特定のタンパク質の発現は、個体における膵臓癌を示し得る。例えば、単一の試験試料中のある特定の血清タンパク質の相対的発現は、個体における膵臓癌の存在を示し得る。
【００６４】
代替または追加の実施形態では、ステップ（ｂ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量は、ステップ（ｄ）および／または（ｆ）での測定を表す所定の基準値と比較される。
【００６５】
あるいは、または加えて、１つ以上の対照試料が得られた個体は、試料が得られた時点で、非癌性膵臓疾患または病状、例えば、急性膵炎、慢性膵炎および自己免疫性膵炎、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）に罹患していなかった。
【００６６】
あるいは、または加えて、１つ以上の対照試料が得られた個体は、試料が得られた時点で、膵臓のいかなる疾患または病状にも罹患していなかった。
【００６７】
あるいは、または加えて、膵臓癌に罹患していない個体は、試料が得られた時点で、いかなる疾患または病状にも罹患していなかった。
【００６８】
あるいは、または加えて、膵臓癌に罹患していない個体は、健康な個体である。
【００６９】
あるいは、または加えて、膵臓癌に罹患している１人以上の個体は、腺癌（例えば、膵管腺癌または管状乳頭状膵臓腺癌）、膵臓肉腫、悪性漿液性嚢腺腫、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、および破骨細胞様巨細胞を有する未分化癌からなる群から選択される膵臓癌に罹患している。
【００７０】
あるいは、または加えて、膵臓癌は、膵臓腺癌（例えば、膵管腺癌）である。
【００７１】
あるいは、または加えて、膵臓癌に罹患している１人以上の個体は、腺癌（例えば、膵管腺癌または管状乳頭状膵臓腺癌）、膵臓肉腫、悪性漿液性嚢腺腫、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、および破骨細胞様巨細胞を有する未分化癌からなる群から選択される１つ以上の膵臓癌に罹患していない。
【００７２】
あるいは、または加えて、方法は、反復される。
【００７３】
あるいは、またはそれに加えて、方法は、反復され、ステップ（ａ）において、試験される試料は、前の方法の反復とは異なる時間に採取される。
【００７４】
あるいは、または加えて、方法は、使用された前の試験試料（複数可）とは異なる期間に採取された試験試料を使用して反復される。
【００７５】
あるいは、または加えて、方法は、使用された前の試験試料（複数可）に対して１日〜１０４週間、例えば、１週間〜１００週間、１週間〜９０週間、１週間〜８０週間、１週間〜７０週間、１週間〜６０週間、１週間〜５０週間、１週間〜４０週間、１週間〜３０週間、１週間〜２０週間、１週間〜１０週間、１週間〜９週間、１週間〜８週間、１週間〜７週間、１週間〜６週間、１週間〜５週間、１週間〜４週間、１週間〜３週間、または１週間〜２週間の間に採取された試験試料を使用して反復される。
【００７６】
あるいは、または加えて、方法は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、１０日間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１５週間、２０週間、２５週間、３０週間、３５週間、４０週間、４５週間、５０週間、５５週間、６０週間、６５週間、７０週間、７５週間、８０週間、８５週間、９０週間、９５週間、１００週間、１０４週間、１０５週間、１１０週間、１１５週間、１２０週間、１２５週間、および１３０週間からなる群からの期間毎に採取された試験試料を使用して反復される。
【００７７】
あるいは、または加えて、方法は、少なくとも１回、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３、２４回、または２５回反復される。
【００７８】
あるいは、または加えて、方法は、連続的に反復される。
【００７９】
あるいは、または加えて、方法は、本発明の方法および／または従来の臨床的方法を使用して、膵臓癌が個体において診断および／または病期分類されるまで反復される。
【００８０】
あるいは、または加えて、各反復は、同じ個体から採取された試験試料を使用する。
【００８１】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、１つ以上のバイオマーカー（複数可）のタンパク質またはポリペプチドの発現を測定することを含む。
【００８２】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／またはステップ（ｆ）は、表Ａに列挙されるバイオマーカーに結合することが可能な１つ以上の第１の結合剤を使用して実施される。第１の結合剤が、タンパク質バイオマーカーのうちの１つに対する特異性を有する単一種、または各々が異なるタンパク質バイオマーカーに対する特異性を有する、複数の異なる種を含み得るか、またはそれらからなり得ることは、当業者に理解されるであろう。
【００８３】
好適な結合剤（結合分子とも称される）は、後述されるように、それらが所与のモチーフに結合する能力に基づき、ライブラリから選択され得る。
【００８４】
少なくとも１つのタイプの結合剤、より典型的には全てのタイプが、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはその変異体を含み得るか、またはそれからなり得る。
【００８５】
抗体の産生および使用のための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８８，Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８７９６９３１４５、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９９８，Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８７９６９５４４６、およびＭａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２００６，Ｈｏｗａｒｄ  ＆  Ｋａｓｅｒ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８４９３３５２８０（それらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００８６】
したがって、フラグメントは、可変重鎖（ＶＨ）または可変軽鎖（ＶＬ）ドメインのうちの１つ以上を含み得る。例えば、抗体フラグメントという用語は、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，１０４１）、Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，１０３８）、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して結合している単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，５８７９）、ならびに単離されたＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４）を含む。
【００８７】
「抗体変異体」という用語は、任意の合成抗体、組み換え抗体、または抗体ハイブリッド、例えば、限定されないが、免疫グロブリン軽鎖および／もしくは重鎖の可変領域および／もしくは定常領域のファージディスプレイによって産生された単鎖抗体分子、または当業者に既知であるイムノアッセイ形式で抗原に結合することが可能な他の免疫相互作用分子を含む。
【００８８】
それらの特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関与する技術の一般的な総説は、Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２９３−２９９に見られる。
【００８９】
分子ライブラリ、例えば、抗体ライブラリ（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，６２４−６２８、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２（３）：５８１−９７）、ペプチドライブラリ（Ｓｍｉｔｈ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８（４７０５）：１３１５−７）、発現ｃＤＮＡライブラリ（Ｓａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６（２）：４９７−５０８）、抗体フレームワーク以外の骨格に対するライブラリ（例えば、アフィボディ）（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６５（９）：４１３４−４０）、またはアプタマーに基づくライブラリ（Ｋｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１８，２１７−３１）は、所与のモチーフに特異的である結合分子が本発明の方法で使用するために選択される供給源として使用されてもよい。
【００９０】
分子ライブラリは、原核細胞（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１、前掲、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９１、前掲）、もしくは真核細胞（Ｋｉｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９６（１０）：５６５１−６）においてインビボで発現されてもよく、または細胞の関与なしで、インビトロで発現されてもよい（Ｈａｎｅｓ  ＆  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４（１０）：４９３７−４２、Ｈｅ  ＆  Ｔａｕｓｓｉｇ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５（２４）：５１３２−４、Ｎｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４１４（２）：４０５−８）。
【００９１】
タンパク質に基づくライブラリが使用される場合、多くの場合は、潜在的な結合分子のライブラリをコードする遺伝子は、ウイルス中に封入され、潜在的な結合分子は、ウイルスの表面において提示される（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１、前掲、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９１、前  掲、Ｓｍｉｔｈ，１９８５、前掲）。
【００９２】
今日最も一般的に使用されるそのような系は、それらの表面において抗体フラグメントを提示する糸状バクテリオファージであり、抗体フラグメントは、バクテリオファージのマイナーコートタンパク質との融合体として発現される（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１、前掲、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９１、前掲）。しかしながら、他のウイルス（ＥＰ  ３９５７８）、細菌（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９、前掲、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１（９）：８２５−３２、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １２（７）：６１３−２１）、および酵母（Ｓｈｕｓｔａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９２（５）：９４９−５６）を使用した提示のための他の系も使用されている。
【００９３】
加えて、提示系は、ポリペプチド産物のいわゆるリボソーム提示系におけるそのコードｍＲＮＡへの結合（Ｈａｎｅｓ  ＆  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７、前掲、Ｈｅ  ＆  Ｔａｕｓｓｉｇ，１９９７、前掲、Ｎｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９７、前掲）、あるいは、ポリペプチド産物のコードＤＮＡへの結合を利用して開発されている（米国特許第５，８５６，０９０号およびＷＯ  ９８／３７１８６号を参照されたい）。
【００９４】
潜在的な結合分子がライブラリから選択される場合、定義されたモチーフを有する１つまたは少数のセレクターペプチドが通常用いられる。結合分子との相互作用を可能にするペプチドまたは帯電した極性または疎水性の側鎖における柔軟性を下げる構造を与えるアミノ酸残基を、セレクターペプチドのモチーフの設計に使用してもよい。
【００９５】
例えば、
（ｉ）プロリンは、その側鎖が、α炭素ならびに窒素の両方に結合しているため、ペプチド構造を安定化し得る。
（ｉｉ）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンは、芳香族側鎖を有し、高度に疎水性であり、一方でロイシンおよびイソロイシンは、脂肪族側鎖を有し、同様に疎水性である。
（ｉｉｉ）リシン、アルギニン、およびヒスチジンは、塩基性側鎖を有し、中性ｐＨで正に帯電し、一方でアスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩は、酸性側鎖を有し、中性ｐＨで負に帯電する。
（ｉｖ）アスパラギンおよびグルタミンは、中性ｐＨで中性であるが、水素結合に関与し得るアミド基を含有する。
（ｖ）セリン、スレオニン、およびチロシン側鎖は、ヒドロキシル基を含有し、これは、水素結合に関与し得る。
【００９６】
典型的には、結合分子の選択は、結合分子のタイプに対応するスポットへの結合を分析するためのアレイ技術およびシステムの使用を伴ってもよい。
【００９７】
代替または追加の実施形態では、第１の結合剤（複数可）は、表面上（例えば、マルチウェルプレートまたはアレイ上）に固定化される。
【００９８】
抗体の可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインは、抗原認識に関与しており、この事実は、早期プロテアーゼ消化実験によって最初に認識されたものである。げっ歯類抗体の「ヒト化」により、さらなる確認が行われた。げっ歯類由来の可変ドメインは、得られた抗体がげっ歯類親抗体の抗原特異性を保持するように、ヒト由来の定常ドメインに融合され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，６８５１−６８５５）。
【００９９】
その抗原特異性は、可変ドメインによって与えられ、定常ドメインとは無関係であることが、全てが１つ以上の可変ドメインを含む抗体フラグメントの細菌発現を含む実験から知られている。これらの分子は、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，１０４１），Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，１０３８）、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して結合している単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，５８７９）、ならびに単離されたＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４）を含む。それらの特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関与する技術の一般的な総説は、Ｗｉｎｔｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２９３−２９９に見られる。
【０１００】
「ｓｃＦｖ分子」とは、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが、柔軟なオリゴペプチドを介して結合している分子を意味する。
【０１０１】
全抗体ではなく、抗体フラグメントを使用する利点は、数倍にも及ぶ。フラグメントのサイズが小さいほど、改善された薬理学的特性（例えば、固形組織へのより良好な浸透）がもたらされるだろう。補体結合のような全抗体のエフェクター機能が除去される。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、およびｄＡｂ抗体フラグメントは全て、Ｅ．Ｃｏｌｉで発現され、かつそれから分泌され、したがって大量の前述のフラグメントの容易な産生を可能にする。
【０１０２】
全抗体およびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、「二価」である。「二価」とは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）２フラグメントが２つの抗原結合部位を有することを意味する。これとは対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂフラグメントは一価であり、１つの抗原結合部位のみを有する。
【０１０３】
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。好適なモノクローナル抗体は、既知の技術、例えば、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｈ  Ｚｏｌａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）、および“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｊ  Ｇ  Ｒ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２）（両方とも参照により本明細に組み込まれる）に開示される技術によって調製されてもよい。
【０１０４】
あるいは、または加えて、第１の結合剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントを含むか、またはそれからなる。
【０１０５】
あるいは、または加えて、抗体またはその抗原結合フラグメントは、組み換え抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【０１０６】
あるいは、または加えて、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、免疫グロブリン分子の結合ドメインからなる群から選択される。
【０１０７】
あるいは、または加えて、抗体または抗原結合フラグメントは、表８に定義されるバイオマーカーに対する抗体と、表Ａで特定されるバイオマーカーへの結合を競合することが可能である。
【０１０８】
本明細書に定義される抗体分子（または必要とされるバイオマーカーに対する結合特異性を保持する、前述の抗体もしくは抗原結合フラグメントの変異体、融合体、もしくは誘導体、または前述の変異体もしくはその誘導体の融合体）と、表Ａで特定されるバイオマーカーへの結合を「競合することが可能」とは、試験される抗体または抗原結合フラグメントが、本明細書に定義される抗体分子の結合を、少なくとも部分的に阻害するか、または別様に妨害することが可能であることを意味するか、またはそれを含む。
【０１０９】
例えば、抗体または抗原結合フラグメントは、本明細書に定義される抗体分子の結合を、少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、３５％、さらには１００％阻害することが可能であり得る。
【０１１０】
競合結合は、ＥＬＩＳＡ（本明細書中に記載されるような）および／またはＳＰＲ（添付の実施例に記載されるような）などの当業者に周知の方法によって決定され得る。
【０１１１】
あるいは、または加えて、抗体または抗原結合フラグメントは、表８に定義される抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはその変異体である。
【０１１２】
あるいは、または加えて、抗体、抗体、または抗原結合フラグメントは、表８で特定されるＶＨおよびＶＬドメイン、またはその変異体を含む。
【０１１３】
本発明の抗体または抗原結合フラグメントの「変異体」は、保存的または非保存的のいずれかの挿入、欠失、および置換を含む。特に、そのような変異体が抗体または抗原結合フラグメントの活性を実質的に変化させない、抗体または抗原結合フラグメントの配列の変異体を含む。特に、そのような変化が表８で特定されるそれぞれのバイオマーカーに対する結合特異性を実質的に変化させない、抗体または抗原結合フラグメントの変異体を含む。
【０１１４】
ポリペプチド変異体は、本明細書に定義される本発明の抗体または抗原結合フラグメントのアミノ酸配列のうちの１つ以上と少なくとも７０％の同一性、例えば、本明細書に定義される本発明の抗体または抗原結合のアミノ酸配列のうちの１つ以上と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する、アミノ酸配列を有し得る。
【０１１５】
２つのポリペプチド間の配列同一性パーセントは、好適なコンピュータプログラム、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＧｒｏｕｐのＧＡＰプログラムを使用して決定され得、同一性パーセントが、その配列が最適にアライメントされたポリペプチドに関して計算されることが理解されるであろう。
【０１１６】
あるいは、アライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラム（参照により本明細書に組み込まれるＴｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０に記載されるような）を使用して実施されてもよい。
【０１１７】
使用されるパラメータは、以下のとおりであってもよい。
−高速ペアワイズアライメントパラメータ：Ｋタプル（ワード）サイズ；１、ウィンドウサイズ；５、ギャップペナルティ；３、トップダイアゴナル数；５。スコアリング方法：ｘパーセント。
−複数のアライメントパラメータ：ギャップオープンペナルティ；１０、ギャップ伸長ペナルティ；０．０５。
スコアリングマトリクス：ＢＬＯＳＵＭ。
【０１１８】
あるいは、局所配列アライメントを決定するために、ＢＥＳＴＦＩＴプログラムが使用されてもよい。
【０１１９】
抗体は、ＣＤＲ（例えば、１、２、３、４、５、または６個）のＣＤＲを、表８に定義される抗体のうちの１つ以上と共有してもよい。
【０１２０】
ＣＤＲは、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して定義され得る。一般に使用される方法としては、Ｐａｒａｔｏｍｅ（Ｋｕｎｉｋ，Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ａｎｄ  Ｏｆｒａｎ，２０１２，‘Ｐａｒａｔｏｍｅ：ａｎ  ｏｎｌｉｎｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ‘Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４０：Ｗ５２１−Ｗ５２４、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｆｒａｎｌａｂ．ｏｒｇ／ｐａｒａｔｏｍｅ／）、Ｋａｂａｔ（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，１９７０，‘Ａｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｂｅｎｃｅ  Ｊｏｎｅｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ．’Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１３２：２１１−２５０）、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，１９８７‘Ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ‘Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９‘Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ‘Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３）、およびＩＭＧＴ（Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３‘ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｖ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ．Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：５５−７７、Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００５‘ＩＭＧＴ  ｕｎｉｑｕｅ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｉｇ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  Ｃ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎｓ’Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９：１８５−２０３、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）が挙げられる。例えば、使用される方法は、ＩＭＧＴ法であってもよい。
【０１２１】
あるいは、または加えて、第１の結合剤は、表面上（例えば、マルチウェルプレートまたはアレイ上）に固定化される。
【０１２２】
あるいは、または加えて、試験試料中の１つ以上のバイオマーカーは、検出可能な部分で標識される。
【０１２３】
あるいは、または加えて、対照試料（複数可）中の１つ以上のバイオマーカーは、検出可能な部分で標識される。
【０１２４】
「検出可能な部分」とは、その部分が検出され得る部分であり、その部分の相対量および／または位置（例えば、アレイ上の位置）が決定されるという意味を含む。
【０１２５】
適切な検出可能な部分は、当技術分野において周知である。
【０１２６】
例えば、検出可能な部分は、特定の条件に曝露されたときに検出され得る蛍光部分および／または発光部分および／または化学発光部分であってもよい。例えば、蛍光部分は、蛍光部分の励起を引き起こすための特定の波長および強度で放射線（すなわち、光）に曝露される必要があり、それにより、経口部分が、検出され得る特定の波長で検出可能な蛍光を発することを可能にする。
【０１２７】
または、検出可能な部分は、基質（好ましくは検出不可能なもの）を、可視化および／または検出することができる検出可能な生成物に変換することができる酵素であってもよい。適切な酵素の例は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに関連して以下により詳細に議論される。
【０１２８】
あるいは、検出可能な部分は、撮像において有用である放射性原子であってもよい。好適な放射性原子としては、シンチグラフィ研究のための９９ｍＴｃおよび１２３Ｉが挙げられる。他の容易に検出可能な部分としては、例えば、再び１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１９Ｆ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、ガドリニウム、マンガン、または鉄などの磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）用のスピン標識が挙げられる。明らかに、検出される薬剤（例えば、本明細書に記載の試験サンプル中および／またはコントロールサンプル中の１つ以上のバイオマーカー、および／または選択されたタンパク質を検出する際に使用するための抗体分子）は、検出可能な部分を容易に検出可能にするために、十分な適切な同位体原子を含んでいなければならない。
【０１２９】
放射性標識または他の標識が、既知の方法で、本発明の薬剤（すなわち、本発明の方法の試料および／または本発明の結合剤中に存在するタンパク質）に組み込まれてもよい。例えば、結合部分がポリペプチドである場合、結合部分は、生合成されてもよく、または例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む好適なアミノ酸前駆体を使用した化学的アミノ酸合成によって合成されてもよい。９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、および１１１Ｉｎなどの標識は、例えば、結合部分のシステイン残基を介して結合され得る。イットリウム−９０は、リジン残基を介して結合することができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．８０，４９−５７）を使用して、１２３Ｉを組み込むことができる。参考文献（「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」，Ｊ−Ｆ  Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）は、他の方法を詳細に記載している。他の検出可能な部分（例えば、酵素、蛍光、発光、化学発光または放射性部分）をタンパク質に接合させる方法は、当技術分野で周知である。
【０１３０】
好ましくは、対照試料（複数可）中の１つ以上のバイオマーカーは、検出可能な部分で標識される。検出可能な部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分、および酵素部分からなる群から選択されてもよい。しかしながら、検出可能な部分は、ビオチンであることが好ましい。
【０１３１】
あるいは、または加えて、検出可能な部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分、および酵素部分からなる群から選択される。
【０１３２】
あるいは、または加えて、検出可能な部分は、ビオチンである。
【０１３３】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／またはステップ（ｆ）は、１つ以上のバイオマーカーに結合することが可能な第２の結合剤を含むアッセイを使用して実施され、第２の結合剤は、検出可能な部分を含む。
【０１３４】
あるいは、または加えて、第２の結合剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントを含むか、またはそれからなる。
【０１３５】
あるいは、または加えて、抗体またはその抗原結合フラグメントは、組み換え抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【０１３６】
あるいは、または加えて、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、免疫グロブリン分子の結合ドメインからなる群から選択される。
【０１３７】
あるいは、または加えて、検出可能な部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分、および酵素部分からなる群から選択される。
【０１３８】
あるいは、または加えて、検出可能な部分は、蛍光部分（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、例えば、Ａｌｅｘａ６４７）である。
【０１３９】
あるいは、または加えて、検出方法は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を含むか、またはそれからなる。
【０１４０】
血清または血漿タンパク質を検出するための好ましいアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫ラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）（モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチアッセイを含む）が挙げられる。例示的なサンドイッチアッセイは、参照により本明細に組み込まれる、Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌによる米国特許第４，３７６，１１０号および第４，４８６，５３０号に記載されている。スライド上での細胞の抗体染色は、当業者によく知られているように、細胞研究室の診断試験で周知の方法で使用することができる。
【０１４１】
典型的には、アッセイは、通常は固相アッセイにおいて有色反応生成物をもたらす酵素の使用を典型的に伴う、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）である。西洋ワサビペルオキシダーゼおよびホスファターゼなどの酵素が広く使用されている。ホスファターゼ反応を増幅する方法は、ＮＡＤＰを基質として使用し、第２の酵素系の補酵素として作用するＮＡＤを生成することである。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のピロホスファターゼは、酵素が組織中に存在せず、安定であり、良好な反応色をもたらすため、良好な共役を提供する。ルシフェラーゼなどの酵素に基づく化学発光システムも使用することができる。
【０１４２】
ＥＬＩＳＡ法は、当該技術分野で周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），２０００，Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８９６０３７２８１（その開示は参照により本明細に組み込まれる）を参照されたい。
【０１４３】
ビタミンであるビオチンとのコンジュゲート化は、酵素によって結合したアビジンまたはストレプトアビジンとの反応によって容易に検出することができ、大きな特異性およびアフィニティで結合するので、頻繁に使用される。
【０１４４】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／またはステップ（ｆ）は、アレイを使用して実施される。
【０１４５】
アレイそれ自体は、当技術分野において周知である。典型的には、アレイは、固体支持体の表面上に形成された、各々が有限範囲を有する離間した（すなわち、分離した）領域（「スポット」）を有する線形または二次元構造から形成される。アレイは、ビーズ構造であってもよく、各ビーズは、分子コードまたはカラーコードによって特定され得るか、または連続フローで特定され得る。解析は、サンプルが溶液からその分子群を吸着する一連のスポットの上を通過する場合に、順次実行することもできる。固体支持体は、典型的にはガラスまたはポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、ディスク、シリコンチップ、マイクロプレート、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、他の多孔質膜、非多孔質膜（例えば、特にプラスチック、ポリマー、パースペックス、シリコン）、複数のポリマーピン、もしくは複数のマイクロタイターウェル、またはタンパク質、ポリヌクレオチド、および他の適切な分子を固定化し、かつ／もしくはイムノアッセイを実施するのに好適な任意の他の表面の形態であってもよい。結合プロセスは当該技術分野において周知であり、一般にタンパク質分子、ポリヌクレオチドなどを固体支持体に共有結合または物理吸着によって架橋することからなる。接触印刷または非接触印刷、マスキングまたはフォトリソグラフィのような周知の技術を使用することによって、各スポットの位置を定義することができる。レビューについては、Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．Ｒ．（２００１，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２，１３−２９）、およびＬａｌ  ｅｔ  ａｌ（２００２，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １５；７（１８  Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１４３−９）を参照されたい。
【０１４６】
典型的には、アレイは、マイクロアレイである。「マイクロアレイ」とは、少なくとも約１００／ｃｍ２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２の離間した領域の密度を有する領域のアレイの意味を含む。マイクロアレイ中の領域は、約１０〜２５０μｍの範囲内の典型的な寸法、例えば、直径を有し、アレイ中の他の領域からほぼ同じ距離離れている。アレイはまた、マクロアレイまたはナノアレイであってもよい。
【０１４７】
適切な結合分子（上述）が同定され、単離されると、当業者は、分子生物学の分野で周知の方法を用いてアレイを製造することができる。
【０１４８】
あるいは、または加えて、アレイは、ビーズ系アレイである。
【０１４９】
あるいは、または加えて、アレイは、表面系アレイである。
【０１５０】
あるいは、または加えて、アレイは、マクロアレイ、マイクロアレイ、ナノアレイからなる群から選択される。
【０１５１】
あるいは、または加えて、方法は、
（ｉ）試料中に存在するバイオマーカーをビオチンで標識することと、
（ｉｉ）ビオチン標識タンパク質を、その表面上の別々の位置に固定化された複数のｓｃＦｖを含むアレイと接触させることであって、ｓｃＦｖが、表Ａのタンパク質のうちの１つ以上に対する特異性を有する、接触させることと、
（ｉｉｉ）固定化されたｓｃＦｖを、蛍光色素を含むストレプトアビジン抱合体と接触させることと、
（ｉｖ）アレイ表面上の別々の位置における色素の存在を検出することと、を含み、
アレイ表面上の色素の発現は、試料中の表ＩＩＩからのバイオマーカーの発現を示す。
【０１５２】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／またはステップ（ｆ）は、１つ以上のバイオマーカーをコードする核酸分子の発現を測定することを含む。
【０１５３】
あるいは、または加えて、核酸分子は、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子である。
【０１５４】
あるいは、または加えて、核酸分子は、ｍＲＮＡ分子である。
【０１５５】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／または（ｆ）において１つ以上のバイオマーカー（複数可）の発現を測定することは、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィ、および原位置ハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法を使用して実施される。
【０１５６】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）において１つ以上のバイオマーカー（複数可）の発現を測定することは、ＤＮＡマイクロアレイを使用して判断される。
【０１５７】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／または（ｆ）において１つ以上のバイオマーカー（複数可）の発現を測定することは、１つ以上の結合部分を使用して実施され、各々が表Ａで特定されるバイオマーカーのうちの１つをコードする核酸分子に選択的に結合することが個々に可能である。
【０１５８】
あるいは、または加えて、１つ以上の結合部分はそれぞれ、核酸分子を含むか、またはそれからなる。
【０１５９】
あるいは、または加えて、１つ以上の結合部分はそれぞれ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、またはＰＭＯを含むか、またはそれからなる。
【０１６０】
あるいは、または加えて、１つ以上の結合部分はそれぞれ、ＤＮＡを含むか、またはそれからなる。
【０１６１】
あるいは、または加えて、１つ以上の結合部分は、５〜１００ヌクレオチド長である。
【０１６２】
あるいは、または加えて、１つ以上の核酸分子は、１５〜３５ヌクレオチド長である。
【０１６３】
あるいは、または加えて、結合部分は、検出可能な部分を含む。
【０１６４】
あるいは、または加えて、検出可能な部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分（例えば、放射性原子）、または酵素部分からなる群から選択される。
【０１６５】
あるいは、または加えて、検出可能な部分は、放射性原子を含むか、またはそれからなる。
【０１６６】
あるいは、または加えて、放射性原子は、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、リン−３２、硫黄−３５、重水素、トリチウム、レニウム−１８６、レニウム−１８８、およびイットリウム−９０からなる群から選択される。
【０１６７】
あるいは、または加えて、結合部分の検出可能な部分は、蛍光部分である。
【０１６８】
あるいは、または加えて、ステップ（ａ）、（ｃ）、および／または（ｅ）で提供される試料は、未分画血液、血漿、血清、組織液、膵臓組織、乳、胆汁、および尿からなる群から選択される。
【０１６９】
あるいは、または加えて、ステップ（ａ）、（ｃ）、および／または（ｅ）で提供される試料は、未分画血液、血漿、および血清からなる群から選択される。
【０１７０】
あるいは、または加えて、ステップ（ａ）、（ｃ）、および／または（ｅ）で提供される試料は、血清である。
【０１７１】
あるいは、または加えて、方法の予測精度は、ＲＯＣ  ＡＵＣ値によって決定される場合、少なくとも０．５０、例えば、少なくとも０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、または少なくとも０．９９である。
【０１７２】
あるいは、または加えて、方法の予測精度は、ＲＯＣ  ＡＵＣ値によって決定される場合、少なくとも０．７０である。
【０１７３】
典型的には、診断は、ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｅ１０７１／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ（例えば、ｅ１０７１  １．５−２４）から入手可能なものなどのサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して実施される。しかしながら、任意の他の好適な手段も使用され得る。
【０１７４】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、分類および回帰のために使用される関連した教師あり学習法のセットである。２つのカテゴリのうちの１つに属するものと各々がマークされたトレーニング例のセットを所与として、ＳＶＭ訓練アルゴリズムは、新しい例がどちらの分類に入るかを予測するモデルを構築する。直感的に、ＳＶＭモデルは、別々の分類の例が可能な限り広い明確なギャップによって分割されるようにマッピングされた、空間の点としての例の表現である。次いで、新しい例は、同じ空間にマッピングされ、例がギャップのどちらの側に入るかに基づき、分類に属すると予測される。
【０１７５】
より形式的に、サポートベクターマシンは、分類、回帰、または他のタスクのために使用され得る、高次元または無限次元の空間中に超平面または超平面のセットを構築する。直感的に、良好な分離は、一般にマージンが大きいほど分類子の汎化誤差が小さくなるため、任意のクラスの最も近い訓練データポイントに対して最大の距離（いわゆる関数マージン）を有する超平面によって達成される。ＳＶＭに関するさらなる情報については、例えば、Ｂｕｒｇｅｓ，１９９８，Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２：１２１−１６７を参照されたい。
【０１７６】
本発明の代替または追加の実施形態では、ＳＶＭは、既知の病態を有する個体（例えば、膵臓癌を有することが既知の個体、急性炎症性膵炎を有することが既知の個体、慢性膵炎を有することが既知の個体、または健康であることが既知の個体）からのバイオマーカープロファイルを使用して本発明の方法を実施する前に、「訓練」される。そのような訓練試料を実行することによって、ＳＶＭは、何のバイオマーカープロファイルが膵臓癌と関連するのかを学習することが可能である。いったん訓練プロセスが完了すると、ＳＶＭは次いで、試験されたバイオマーカー試料が膵臓癌の個体からであるか否かにかかわらず、有能である。
【０１７７】
しかしながら、この訓練手順は、ＳＶＭに必要な訓練パラメータを予めプログラミングすることによって回避され得る。例えば、診断は、表Ａに列挙されるバイオマーカーのうちのいずれかまたは全ての測定に基づき、表５に詳述されるＳＶＭアルゴリズムを使用して、既知のＳＶＭパラメータに従って実施され得る。
【０１７８】
好適なＳＶＭパラメータが、適切なデータの選択（すなわち、既知の膵臓癌の状態を有する個体からのバイオマーカー測定）を用いてＳＶＭ機械を訓練することによって、表Ａに列挙されるバイオマーカーの任意の組み合わせについて判断され得ることは、当業者によって理解されるであろう。あるいは、当該技術分野で既知の任意の他の好適な統計学的方法に従って、特定の膵臓癌に関連した病態を判断するために、実施例および図のデータが使用され得る。
【０１７９】
好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６０％、例えば、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の精度を有する。
【０１８０】
好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６０％、例えば、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の感度を有する。
【０１８１】
好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６０％、例えば、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の特異性を有する。
【０１８２】
「精度」とは、ある方法の正確な結果の割合を意味し、「感度」とは、陽性と正しく分類される全てのＰａＣ陽性試料の割合を意味し、「特異性」とは、陰性と正しく分類される全てのＰａＣ陰性試料の割合を意味する。
【０１８３】
シグナル強度は、当業者に既知の任意の好適な手段を使用して定量化され得る。あるいは、または加えて、シグナル強度は、ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアバージョン４．０を使用して定量化される。シグナル強度データは、正規化されてもよい（すなわち、技術的変動を調整するために）。正規化は、当業者に既知の任意の好適な方法を使用して実施されてもよい。あるいは、または加えて、データは、経験的ＢａｙｅｓアルゴリズムＣｏｍＢａｔ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）を使用して正規化される。
【０１８４】
あるいは、または加えて、試験される個体（複数可）は、遺伝子型的にＬｅｗｉｓ  ａ−ｂ−である。
【０１８５】
試験される個体（複数可）は、任意の民族性を有してもよい。あるいは、または加えて、試験される個体（複数可）は、白人および／または中国人（例えば、漢民族）である。
【０１８６】
あるいは、または加えて、ステップ（ａ）、（ｃ）、および／または（ｅ）で提供される試料（複数可）は、膵臓癌の治療（例えば、切除、化学療法、放射線療法）の前に提供される。
【０１８７】
あるいは、または加えて、試験される個体（複数可）は、慢性膵炎、遺伝性膵管腺癌、およびポイツ−ジェガース症候群からなる群から選択される１つ以上の病状に罹患している。
【０１８８】
代替または追加の実施形態では、膵臓癌は、腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌、および破骨細胞様巨細胞を有する未分化癌からなる群から選択される。好ましくは、膵臓癌は、膵臓腺癌である。より好ましくは、膵臓癌は、外分泌性膵臓癌としても既知の膵管腺癌である。
【０１８９】
あるいは、または加えて、方法は、本発明の膵臓癌に関連した病態の存在または非存在を判断する能動的なステップを含む。
【０１９０】
あるいは、または加えて、個体が膵臓癌と診断された場合、方法は、
（ｇ）個体に膵臓癌療法を提供するステップを含む。
【０１９１】
したがって、本発明の関連する態様は、以下のステップを含む、膵臓癌を有する個体の治療方法を提供する。
（ａ）本発明の第１の態様に従った方法を使用して、個体を、膵臓癌を有するものとして診断するステップ、および
（ｂ）そのように診断された個体を、膵臓癌療法で治療するステップ（例えば、Ｔｈｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２８（１）：７０−４その開示は参照により本明細に組み込まれる）を参照されたい）。
【０１９２】
あるいは、または加えて、膵臓癌療法は、外科手術、化学療法、免疫療法、化学免疫療法、および温熱化学療法からなる群から選択される。
【０１９３】
代替または追加の実施形態では、膵臓癌療法は、外科手術、化学療法、免疫療法、化学免疫療法、および温熱化学療法（例えば、ＡＣ化学療法、カペシタビンおよびドセタキセル化学療法（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ＣＭＦ化学療法、シクロホスファミド、ＥＣ化学療法、ＥＣＦ化学療法、Ｅ−ＣＭＦ化学療法（Ｅｐｉ−ＣＭＦ）、エリブリン（Ｈａｌａｖｅｎ（登録商標））、ＦＥＣ化学療法、ＦＥＣ−Ｔ化学療法、フルオロウラシル（５ＦＵ）、ＧｅｍＣａｒｂｏ化学療法、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、ゲムシタビンおよびシスプラチン化学療法（ＧｅｍＣｉｓまたはＧｅｍＣｉｓｐｌａｔ）、ＧｅｍＴａｘｏｌ化学療法、イダルビシン（Ｚａｖｅｄｏｓ（登録商標））、リポソームドキソルビシン（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、マイトマイシン（マイトマイシンＣ  Ｋｙｏｗａ（登録商標））、ミトキサントロン、ＭＭ化学療法、ＭＭＭ化学療法、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ＴＡＣ化学療法、タキソテールおよびシクロホスファミド（ＴＣ）化学療法、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂｅ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、ビンデシン（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標））、ならびにビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））からなる群から選択される。
【０１９４】
したがって、本発明は、投与計画が本発明の第１の態様の方法の結果に基づき決定される、膵臓癌の治療で使用するための抗腫瘍薬を含む。
【０１９５】
本発明は、投与計画が本発明の第１の態様の方法の結果に基づき決定される、膵臓癌の治療における抗腫瘍薬の使用を含む。
【０１９６】
本発明は、投与計画が本発明の第１の態様の方法の結果に基づき決定される、膵臓癌を治療するための薬剤の製造における抗腫瘍薬の使用を含む。
【０１９７】
本発明は、膵臓癌を治療するのに十分な抗腫瘍薬の量が本発明の第１の態様の方法の結果に基づき決定される、十分な量の抗腫瘍薬を提供することを含む膵臓癌の治療方法を含む。
【０１９８】
一実施形態では、抗腫瘍薬は、アルキル化剤（ＡＴＣコードＬ０１ａ）、代謝拮抗薬（ＡＴＣコードＬ０１ｂ）、植物アルカロイドもしくは他の天然産物（ＡＴＣコードＬ０１ｃ）、細胞毒性抗生物質もしくは関連物質（ＡＴＣコードＬ０１ｂ）、または別の抗腫瘍薬（ＡＴＣコードＬ０１ｘ）を含むか、またはそれからなる。
【０１９９】
したがって、一実施形態では、抗腫瘍薬は、窒素マスタード類似体（例えば、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、クロルメチン、イホスファミド、トロホスファミド、プレドニムスチン、もしくはベンダムスチン）、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン、トレオスルファン、もしくはマンノスルファン）、エチレンイミン（例えば、チオテパ、トリアジクオン、もしくはカルボクオン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、フォテムスチン、ニムスチン、もしくはラニムスチン）、エポキシド（例えば、エトグルシド）、または別のアルキル化剤（ＡＴＣコードＬ０１ａｘ、例えば、ミトブロニトール、ピポブロマン、テモゾロマイド、もしくはダカルバジン）からなる群から選択されるアルキル化剤を含むか、またはそれからなる。
【０２００】
別の実施形態では、抗腫瘍薬は、葉酸類似体（例えば、メトトレキサート、ラルチトレキセド、ペメトレキセド、もしくはプララトレキサート）、プリン類似体（例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、フルダラビン、クロファラビン、もしくはネララビン）、またはピリミジン類似体（例えば、シタラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、テガフール、カルモフール、ゲムシタビン、カペシタビン、アザシチジン、もしくはデシタビン）からなる群から選択される代謝拮抗薬を含むか、またはそれからなる。
【０２０１】
なおさらなる実施形態では、抗腫瘍薬は、ビンカアルカロイドもしくはビンカアルカロイド類似体（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、もしくはビンフルニン）、ポドフィロトキシン誘導体（例えば、エトポシドもしくはテニポシド）、コルヒチン誘導体（例えば、デメコルシン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、もしくはパクリタキセルポリグルメックス）、または別の植物アルカロイドもしくは天然産物（ＡＴＣコードＬ０１ｃｘ、例えば、トラベクテジン）からなる群から選択される植物アルカロイドまたは他の天然産物を含むか、またはそれからなる。
【０２０２】
一実施形態では、抗腫瘍薬は、アクチノマイシン（例えば、ダクチノマイシン）、アントラサイクリンまたは関連物質（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、ゾルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ピラルビシン、バルルビシン、アムルビシン、もしくはピクサントロン）、または別（ＡＴＣコードＬ０１ｄｃ、例えば、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、もしくはイクサベピロン）からなる群から選択される細胞毒性抗生物質もしくは関連物質を含むか、またはそれからなる。
【０２０３】
さらなる実施形態では、抗腫瘍薬は、白金化合物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、もしくはポリプラチレン）、メチルヒドラジン（例えば、プロカルバジン）、モノクローナル抗体（例えば、エドレコロマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、カツマキソマブ、もしくはオファツムマブ）、光線力学的／放射線療法で使用される増感剤（例えば、ポルフィマーナトリウム、アミノレブリン酸メチル、アミノレブリン酸、テモポルフィン、もしくはエファプロキシラル）、またはタンパク質キナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、テムシロリムス、エベロリムス、パゾパニブ、バンデタニブ、アファチニブ、マシチニブ、もしくはトセラニブ）からなる群から選択される別の抗腫瘍薬を含むか、またはそれからなる。
【０２０４】
さらに別の実施形態では、抗腫瘍薬は、アムサクリン、アスパラギナーゼ、アルトレタミン、ヒドロキシカルバミド、ロニダミン、ペントスタチン、ミルテホシン、マソプロコール、エストラムスチン、トレチノイン、ミトグアゾン、トポテカン、チアゾフリン、イリノテカン（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、アリトレチノイン、ミトタン、ペグアスパラガーゼ、ベキサロテン、三酸化ヒ素、デニロイキンディフティトックス、ボルテゾミブ、セレコキシブ、アナグレリド、オブリメルセン、シチマジーンセラデノベック、ボリノスタット、ロミデプシン、オマセタキシンメペスクシナート、エリブリン、もしくはフォリン酸からなる群から選択される別の抗腫瘍薬を含むか、またはそれからなる。
【０２０５】
一実施形態では、抗腫瘍薬は、１つ以上の抗腫瘍薬、例えば、本明細書に定義される１つ以上の抗腫瘍薬の組み合わせを含むか、またはそれからなる。膵臓癌の治療で使用される併用療法の一例は、以下の４つの薬物からなるＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸである。
-ＦＯＬ−フォリン酸（ロイコボリン）、
-Ｆ−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、
-ＩＲＩＮ−イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、および
-ＯＸ−オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）。
【０２０６】
したがって、本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に定義される１つ以上の結合剤を含む、個体における膵臓癌に関連した病態を診断または判断するためのアレイを提供する。
【０２０７】
あるいは、または加えて、１つ以上の結合剤は、表Ａに定義されるタンパク質のうちの全てに結合することが可能である。
【０２０８】
本発明の第３の態様は、個体における膵臓癌に関連した病態を判断するためのバイオマーカーとしての、表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの使用を提供する。
【０２０９】
あるいは、または加えて、表Ａに定義されるタンパク質のうちの全てが、個体における膵臓癌に関連した病態を判断するためのマーカーとして使用される。
【０２１０】
本発明の第４の態様は、個体における膵臓癌に関連した病態を判断するための、本発明の第１の態様に定義される１つ以上の結合部分の使用を提供する。
【０２１１】
あるいは、または加えて、表Ａに定義されるタンパク質のうちの全てに対するバイオマーカーが使用される。
【０２１２】
本発明の第５の態様は、個体における膵臓癌に関連した病態を診断または判断するためのキットを提供し、
（ａ）本発明の第１の態様に定義される１つ以上の結合剤、または本発明の第２の態様に従ったアレイと、
（ｂ）上記に（例えば、本発明の第１の態様に）定義される方法を実施するための説明書と、を備える。
【０２１３】
本発明の第６の態様は、個体における膵臓癌を治療する方法であって、
（ａ）本発明の第１の態様のいずれかに定義される方法に従って、膵臓癌に関連した病態を判断するステップと、
（ｂ）個体に膵臓癌療法を提供するステップと、を含む。
【０２１４】
あるいは、または加えて、膵臓癌療法は、外科手術（例えば、切除）、化学療法、免疫療法、化学免疫療法、および温熱化学療法からなる群から選択される。
【０２１５】
本発明の第８の態様は、本発明の方法を実施するための、例えば、ステップ（ｃ）（および後続の発現測定ステップ）の発現データを解釈し、それにより膵臓癌に関連した病態を診断または判断するための、コンピュータプログラムを提供する。コンピュータプログラムは、プログラム化されたＳＶＭであってもよい。コンピュータプログラムは、当業者に既知の好適なコンピュータ可読媒体に記録されてもよい。適切なコンピュータ可読媒体は、コンパクトディスク（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ブルーレイなどを含む）、フロッピーディスク、フラッシュメモリドライブ、ＲＯＭまたはハードディスクドライブを含んでいてもよい。コンピュータプログラムは、コンピュータプログラムを実行するのに適したコンピュータにインストールされていてもよい。
【０２１６】
ここで、本発明のある特定の態様を具体化する好ましい非限定的な実施例が、以下の表および図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【０２１７】
【図１】膵臓癌（ＰＤＡＣ）対正常対照（ＮＣ）の区別。  （Ａ）ＰＤＡＣ（灰色）およびＮＣ（黒色）の主成分分析（ＰＣＡ）。ＡＮＯＶＡを使用してデータをｑ＜０．１にフィルタリングした。（Ｂ）ＰＣＡプロット中のフィルタリング後に残った１１個の抗体に対応する相対的タンパク質レベルは、Ａ）のものと同期した。灰色＝上方制御レベル、黒色＝ＰＤＡＣ対ＮＣにおける下方制御レベル。（Ｃ）フィルタリングされていないデータに基づく（全ての抗体からのフィルタリングされていないデータを使用した）、ＰＤＡＣ対ＮＣの一個抜き（ＬＯＯ）交差検証を用いたサポートベクターマシン分析（ＳＶＭ）からの、０．８８のＡＵＣを有するＲＯＣ曲線。
【図２】ＰＤＡＣに対する血漿タンパク質シグネチャーの同定。  各群（ＰＤＡＣおよびＮＣ）からの試料の２／３を訓練セットに、試料の残りの１／３を試験セットに無作為に選択することによって、訓練セットおよび試験セットを生成した。訓練セットを使用して、ＮＣとＰＤＡＣを区別するための凝縮シグネチャーを定義した。（Ａ）訓練セット中の抗体のＳＶＭベースの段階的後退消去によって、変数のフィルタリングを実施した。各反復ステップで、分類のカルバック−ライブラー（ＫＬ）エラーを決定およびプロットした。分類誤差がその最小値に達したときに消去プロセスで残った抗体を、訓練セット中の新しいモデルを構築するための独特なシグネチャーとして使用した。（Ｂ）訓練セットからのシグネチャーモデルから得られ、「凍結」され、以前に見られなかった試験セット試料に直接適用される、ＲＯＣ曲線。（Ｃ）無作為に作成した訓練セットおよび試験セットの１０組の異なるセットにおいて、この手順を合計１０回反復した。対応する各試験セット中の凍結バイオマーカーシグネチャーモデルによって生成されたＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ値）をプロットした。（Ｄ）後退消去（ＢＥ）プロセスにおける総合ランキングから得られた抗体スコア（白丸）を、Ｔ検定（Ｗ）の試験ランキングに基づくスコア（黒円）と比較した。
【図３】ＰＤＡＣ病期対対照の区別。  Ａ）ＮＣを患者のＰＤＡＣ病期に従って群分けされた患者と比較する、フィルタリングされていないデータ（全ての抗体）を使用したＳＶＭ分析からのＡＵＣ値。Ｂ）１つ以上のＰＤＡＣ病期対ＮＣにおける、ウィルコクソンｐ＜０．０５を有する抗体。「ＵＰ」＝上方制御、「ＤＯＷＮ」＝ＰＤＡＣ対ＮＣにおける下方制御、白色＝有意差なし。
【図４】血清中の原発腫瘍の位置の差別化および以前の研究との比較（Ｇｅｒｄｔｓｓｏｎ，２０１５）。  ＰＡＮＫＲＡＳ  ＩＩ［Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｐｏｒｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９］研究（Ｇｅｒｄｔｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｍｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．１０（８）：１３０５−１６）のために、１５６人のＰＤＡＣ患者からの血清をスペインの５つの異なる現場で採取した。「ＵＰ」＝上方制御、「ＤＯＷＮ」＝頭部対胴体／尾部腫瘍において下方制御された、Ｎ／Ａ＝研究に含まれない抗体。
【図５】以前のコホートとの比較。  Ａ）比較される３つの研究の詳細。Ｂ）病期ＩＩＩ〜ＩＶ期のＰＤＡＣ対対照の白人コホート、（ｉｉ）慢性膵炎患者対対照、および現在の（ｉｉｉ）病期ＰＤＡＣ対対照の中国コホートにおいて分析された、重複マーカーから得られたベン図。比較の理由で、病期ＩＩＩ＋ＩＶ期の試料のみを現在のコホートに含んだ。数字は、有意に（ウィルコクソンｐ＜０．０５）差次的に発現したマーカーを示す。［１］Ｗｉｎｇｒｅｎ  Ｃ，Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ  Ａ，Ｓｅｇｅｒｓｖａｒｄ  Ｒ，Ｃａｒｌｓｓｏｎ  Ａ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｒ，Ｌｏｈｒ  Ｍ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ＣＡ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２；７２：２４８１−９０、［２］Ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｅａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｐｌ．２０１２；６：４８６−９６。
【実施例】
【０２１８】
要約
この研究では、組み換え抗体マイクロアレイプラットフォームを使用して、膵臓癌患者および正常対照個体からの２１３個の血漿試料を分析した。コホートを、病期、すなわち切除可能な疾病（病期Ｉ／ＩＩ期）、局所進行（病期ＩＩＩ期）、および転移性疾患（病期ＩＶ期）に従って階層化した。ＳＶＭ分析は、全てのＰＤＡＣ病期が対照と区別され得ることを示した。血漿タンパク質シグネチャーに基づき、病期Ｉ／ＩＩ期ＰＤＡＣ腫瘍を有する患者を高精度で対照と区別することができるのは初めてであり、これは、早期診断の可能性および外科的切除可能な腫瘍の割合の増加を示す。
【０２１９】
序論
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、３〜４％の５年生存率を有する最も致命的な癌の１つである。この予後不良の背後にある主な要因は、早期に患者を診断することが現在できないことである。データは、腫瘍の開始から転移能の取得まで５年以上かかることを裏付けて（Ｙａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、それは、正確なマーカーが利用可能な場合に、早期検出のための絶好の機会を明確に実証している。診断時に、患者はしばしば後期疾患を発症しており、患者のわずか約１５％が切除可能な腫瘍を有する（Ｃｏｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。大きな切除腫瘍を呈するこれらの患者の５年生存率は、わずか１０〜２０％である（Ｃｏｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｓｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。しかしながら、２０ｍｍ以下の腫瘍（病期Ｉ〜ＩＩ期）が切除され得る場合、５年生存率は、３０〜６０％まで増加する（Ｆｕｒｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。後期診断（病期ＩＩＩ〜ＩＶ期）は、早期診断のためのマーカーの欠如と組み合わせた非特異的な臨床症状によるものであり、これは、本研究で対処されるものである。興味深いことに、研究は、膵臓腫瘍が、無症候期において臨床診断の早ければ６ヶ月も前に切除可能であり得ることを示唆する（Ｇａｎｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｐｅｌａｅｚ−Ｌｕｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０２２０】
これまでに最も評価されているＰＤＡＣのためのマーカーであるＣＡ１９−９は、いくつかの他の兆候のレベルは高いが、不十分な特異性、ならびに遺伝子型的にＬｅｗｉｓ  ａ−ｂ−である患者（人口の５％）における完全な欠如に悩まされている。その結果、膵臓癌のスクリーニングのためのＣＡ１９−９の使用は推奨されない（Ｌｏｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。今日、ＰＤＡＣを正確に診断することが示されている他の単一バイオマーカーはないが、最近の発見研究は、エキソソームおよびヌクレオソームの両方が膵臓癌に関連する情報を含むことを実証している（Ｂａｕｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、Ｍｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。しかしながら、癌診断の分野は、今日、この分野が感度および特異性の増加をもたらすため、マーカーのパネルに向けて動いている（Ｂｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｂｕｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０２２１】
炎症は、腫瘍進行の重要な要素であるように思われ（Ｃｏｕｓｓｅｎｓ  ａｎｄ  Ｗｅｒｂ，２００２）、免疫調節血漿プロテオームは、その結果として潜在的な癌バイオマーカーの源であり得る。
【０２２２】
これまでの研究はまた、免疫調節タンパク質の数の増加（ｎ＝２０〜２５）が、疾病に特異的なシグネチャーをもたらし、疾病に対する全身応答を反映することを実証している（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ｂ、Ｉｎｇｖａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｗｉｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。しかしながら、免疫調節プロテオームの分析は、（ｉ）血漿タンパク質が、広範な動的濃度範囲を呈すること、（ｉｉ）癌マーカーが、ほとんどの微量タンパク質に見られる可能性が高いこと（Ｈａａｂ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｓｕｒｉｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、（ｉｉｉ）微量マーカーの血漿レベルの疾病に関連した変化が小さく、適切な統計のためにかなりの数の試料を必要とすることが予測されること（Ａｌｏｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）など、いくつかの課題に関連している。
【０２２３】
これらの課題を解決するために、我々は、本研究において、高感度抗体マイクロアレイプラットフォームを使用して、膵臓癌病期Ｉ〜ＩＶ期および正常対照の中国人患者からの２１３個の血漿試料を分析した。目的は、対照試料を病期Ｉ〜ＩＶ期と比較することによって、病期関連ＰＤＡＣマーカーを同定することであり、その結果は、単純な血液試料中の情報量が、より早期の病期さえも見つけるのに十分であるという概念を裏付けている。その結果として、特に慢性膵炎、遺伝性ＰＤＡＣ、およびポイツ−ジェガース症候群患者などの高リスクの患者のために、ＰＤＡＣの早期診断を可能にする。
【０２２４】
材料および方法
血症試料
この後向き研究は、Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ａｎｄ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＴＭＵＣＩＨ）によって承認された。インフォームドコンセントの後、ＴＭＵＣＩＨで血液を採取し、血漿を分離し、−８０℃で保存した。２０１２年１月１日から２０１３年１２月１３日に採取した合計２１３個の血漿試料を使用した（表１）。登録されたＰＤＡＣ患者（ｎ＝１１８）は全て中国の漢民族であり、ＴＭＵＣＩＨで治療された。採血時に化学療法または放射線療法を受けた患者はいなかった。全てのＰＤＡＣ試料を、経験豊富な病理学者によって細胞診で確認した。患者を、以下：悪性漿液性嚢腺腫（ｎ＝１）、膵臓肉腫（ｎ＝２）、管状乳頭状膵臓腺癌（ｎ＝１）を例外として、膵管腺癌と診断した。５人の患者を、肝転移を伴うＰＤＡＣと診断した。診断時の腫瘍病期およびサイズ、ならびに膵臓内の腫瘍位置に関するデータは、臨床病理に基づいた。病期分類をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙのガイドライン（表１）に従って実施し、切除範囲をＲ０と分類した。正常対照（ＮＣ）試料（ｎ＝９５）は、天津の健康な住人から、ＴＭＵＣＩＨでの彼らの日常的な身体検査において採取され、ＰＤＡＣ患者とは遺伝的に無関係であった（表１）。試料ＩＤを、標識化時に記録および無作為化し、試料の注釈および臨床データを、全ての下流の実験手順において操作者に対して盲検化した。以前に最適化されたプロトコル（Ｗｉｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）を使用して、全ての試料を一度に標識化した。
【０２２５】
抗体マイクロアレイの生成
抗体マイクロアレイは、社内設計のファージディスプレイ抗体ライブラリから選択および生成され、以前に記載されたように（Ｐａｕｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、Ｅ．ｃｏｌｉ中で産生され、１４個のアレイ／スライドおよび３個の複製スポット／アレイでスライド上に印刷された、３５０個のヒト組み換えｓｃＦｖ抗体を含んだ。この研究のために使用した全てのスライドを一度に印刷し、中国のＴＭＵＣＩＨに出荷し、印刷後４週間以内に分析のために使用した。
【０２２６】
抗体マイクロアレイ分析
無作為化された試料の順序で、１日あたり１０個のスライド（１４０の個々のサブアレイ）を処理した。簡潔に、アレイをＰＢＳＭＴで遮断し、ＰＢＳＴで洗浄し、室温で２時間、ビオチン化血漿試料と共にインキュベートした。未結合タンパク質を洗い流し、結合したタンパク質を、１μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７−ストレプトアビジンを使用して検出した（室温で１時間）。過剰な試薬を洗い流し、スライドを乾燥させ、６３５ｎｍおよび５３２ｎｍの励起レーザーを使用して、１０μｍの分解能のＬｕｘＳｃａｎ  １０Ｋマイクロアレイスキャナ（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ）において直ちに走査した。
【０２２７】
データ取得、品質管理、および前処理
シグナル強度を、定円オプションを有するＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアバージョン４．０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、患者ＩＤおよび臨床データを盲検化された、２人の訓練された分析者（ＡＳＧおよびＭＮ）によって定量化した。各マイクロアレイに対して、マイクロアレイ印刷からのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５シグナルを使用してグリッドを位置付け、結合タンパク質の相対レベルに対応するＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７シグナルを定量するために使用した。高いバックグラウンドシグナルおよび／または低い全体的なシグナルに起因する低品質画像のため、１１個の試料（１０ＰＤＡＣ、１ＮＣ）を定量化しなかった。定量化されたアレイに対して、各スポットのスポット飽和度、平均強度、およびシグナル対ノイズ比を評価した。（ｉ）平均シグナル強度が、バックグラウンド（平均ＰＢＳシグナル）＋２標準偏差として定義されるカットオフ限界を下回っていたこと（ｎ＝８）、（ｉｉ）５０％を超える試料中、最低スキャナ強度設定における飽和シグナル（ｎ＝１）、および（ｉｉｉ）不十分な抗体印刷（ｎ＝５）のため、１４個の抗体を除外した。残りの２０２個の試料および３３６個の抗体に基づき、ローカルバックグラウンド除去後の平均スポット強度を使用して、データセットを組み立てた。任意の複製ＣＶが平均値から１５％を超えた場合（その場合、それを廃棄し、残りの２つの複製の平均を代わりに使用した）を除き、各データポイントは、３個の複製スポットの平均を表した。複製の平均ＣＶは、７．９％（±４．１％）であった。１５％のカットオフＣＶを適用して、データ値の７９％を３つ全ての複製から、かつ残りの２１％を２つの複製から計算した。さらに、黄疸患者（ｎ＝２７）を、黄疸のない患者（ｎ＝８１）と比較して、ビリルビンレベルが抗体マイクロアレイ分析における交絡因子であったかどうかを分析した。同様に、性別調整データセットを生成して、性別が交絡因子であったかどうかを評価した。技術的変動を調整するために、記録されたデータを、経験的ＢａｙｅｓアルゴリズムＣｏｍＢａｔ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）を使用して正規化し、続いて各アレイからのデータの線形スケーリングによって、試料バックグラウンドレベルの変動を調整した。スケーリング係数は、全ての試料にわたって最低の標準偏差を有する抗体の２０％に基づき、全てのアレイにわたる平均合計で、各アレイ上のこれらの抗体の強度合計を割ることによって計算した（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｉｎｇｖａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０２２８】
データ分析
主成分分析に基づくプログラム（Ｑｌｕｃｏｒｅ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、試料および変数分布を分析および視覚化した。ＡＮＯＶＡをデータの初期フィルタリングに適用した。ウィルコクソンまたはスチューデントのｔ検定、偽発見率制御のためのベンジャミーニ−ホッホベルク手順、および倍率変化を使用して、個々のマーカーの性能を評価した。制約のコストを１に設定した線形カーネルを適用するサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して、異なるサブグループの分離を評価した。２つの群を区別するためのモデルを、一個抜き交差検証手順を使用して作成した。
【０２２９】
過大解釈を最小限に抑え、かつデータセットの堅牢性を実証するために、データセットを訓練セットおよび試験セットに無作為に分割し、ＳＶＭベースの後退消去アルゴリズムを訓練セットに適用した。その結果として、バイオマーカーシグネチャーを、各サブグループからの全試料の２／３からなるデータの訓練セットにおいて生成し、試料の残りの１／３を含む試験セットにおいて評価した。訓練セットでは、以前に記載されたように（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ａ）、ＳＶＭベースの後退消去アルゴリズムを使用して、フィルタリングを実施し、得られた抗体シグネチャーに基づくモデルを、対応する試験セットにおいて試験した。訓練セットおよび試験セット１０個の異なる組をこの目的で使用し、１０個の訓練セットにおけるその消去の中央値の順序に対応する消去スコアを各抗体に与えたコンセンサスリストを得た。性能を、受診者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して評価し、曲線下面積（ＡＵＣ）値として報告した。そのそれぞれの試験セットにおける各シグネチャーの正および負の予測値である、感度および特異性を、感度および特異性の最大合計に対応するＳＶＭ決定値閾値に対して記述した。
【０２３０】
結果
症例と対照との間の区別、および膵臓癌に関連する血漿タンパク質シグネチャーの同定
最初に、我々は、ＰＣＡ、ｑ値フィルタリング、および一個抜き交差検証を用いたＳＶＭ分析を使用して、ＰＤＡＣ症例が正常対照と区別され得ることを示す。主成分分析は、ＰＤＡＣおよびＮＣ試料の中程度の分離を明らかにし（図１Ａ）、ｑ値カットオフが０．１の差異分析は、ＰＤＡＣ対ＮＣにおいて有意な異なる発現レベルを呈する１１個の抗体をもたらした（図１Ｂ）。これらのうちの３つを、アポリポタンパク質Ａ１（Ａｐｏ−Ａ１）を標的化し、ＮＣと比較してＰＤＡＣにおけるタンパク質レベルの低下を示した。プロパージン、Ｃ１ｑ、Ｃ３、ＩｇＭ、およびＩＬ−８もまた、ＰＤＡＣにおけるレベルの低下を示したが、一方でＶＥＧＦ、ＭＡＰＫ−８、およびＣＨＰ−１は、癌群で上昇した。さらに、３３６個全ての抗体からのデータを使用した一個抜き交差検証を用いたＳＶＭは、ＰＤＡＣおよびＮＣが０．８８のＡＵＣ値で分離されたことを実証した（ｐ値＝６．４×１０−２１、図１Ｃ）。注目すべきことに、黄疸患者を黄疸のない患者と有意に区別することができず、高ビリルビン血症が交絡因子ではなかったことを実証する（データは図示せず）。性別調整データセットにおける有意な（ウィルコクソンｐ＜０．０５）マーカーの比較は、いずれの性別も交絡因子ではなかったことを示した（表４）。
【０２３１】
フィルタリングされていないデータ（ＡＵＣ  ０．８８）を使用したＰＤＡＣとＮＣとの間の高レベルの差別化は、凝縮ＰＤＡＣ関連タンパク質シグネチャーを同定するための徹底的なデータフィルタリングを促した。モデルをデータに過剰適合することを回避するために、最初に試料を、抗体シグネチャーモデルを生成するための訓練セットに分離し、次いで、それを別々の試験セットで評価した。訓練セットにおいて、ＳＶＭベースの後退消去を使用して、抗体をフィルタリングし、分類におけるカルバック−ライブラー（ＫＬ）誤差を、消去した抗体の数に対してプロットした。図２Ａは、第１の訓練セットにおける消去プロセスを示し、３１３回の反復後に、最終的な２４個の抗体シグネチャーに対応する誤差の明確な最小値が観察された。このシグネチャーに基づき、ＳＶＭモデルを訓練セットにおいて構築し、別の試験セットにおいて評価し、それは、０．８７のＡＵＣ値を生成した（図２Ｂ）。データセットの堅牢性を試験するために、この消去手順を、訓練セットおよび試験セットの合計１０個の無作為に生成した組で反復し、癌対対照の最適な分離に対して同定された１０個のシグネチャーを生成した。シグネチャーの長さは、１７〜２９個の抗体（中央値２３．５）の範囲であった。試験セットにおけるＡＵＣ値は、０．７７〜０．８７の範囲であり、平均は０．８３であった（図２Ｃ）。感度および特異性は、それぞれ０．７７（０．５６〜０．９４の範囲）および０．８６（０．５５〜０．９７の範囲）の平均値を有し、対応する平均の正の予測値は、０．８６（０．７１〜０．９７の範囲）であり、平均の負の予測値は、０．７７（０．６４〜０．８９の範囲）であった。
【０２３２】
消去の逆順に基づき、各抗体をスコアリングし、番号１は、消去される最後の抗体であり、１０回の順次消去からのそれらの消去スコアの中央値の順にランク付けした。表２は、２５個の最上位にランク付けされた抗体を、それらのｐ値およびｑ値、ｐ値ランキング、およびＰＤＡＣ対ＮＣに対する倍率変化と共に列挙する。消去スコアの中央値がそれぞれ１および２の上位２個の抗体プロパージンおよびＶＥＧＦは、９／１０（プロパージン）訓練セットで最後に消去された抗体、および８／１０（ＶＥＧＦ）訓練セットで最後から２番目に消去された抗体であった。上位２５位にランク付けされた抗体は共に、２０個の異なる特異性を示した。
【０２３３】
個々の抗体に基づくデータの１次元分離を考慮せず、抗体の最適な組み合わせを同定するために後退消去手順を設計し、表２に示されたコンセンサスシグネチャーは、後退消去ランキングのみに基づく。注目すべきことに、上位２個の抗体はまた、ｐ値およびｑ値に基づき最上位にランク付けされた２個でもあった。実際、５個の最上位にランク付けされた抗体の全てが、ＰＤＡＣ対ＮＣに対して非常に有意なｐ値およびｑ値を示した（ｐ＜４．４７Ｅ−０６およびｑ＜５．００Ｅ−０４）。コンセンサスシグネチャー抗体に対する後退消去ランク（ＢＥスコア）およびｔ検定ランク（Ｗスコア）を、図２Ｄに一緒にプロットした。Ｗスコアは、上位５個の抗体の後にＢＥスコアから逸脱し始め、次いで相関を失った。したがって、５個の最上位にランク付けされた抗体（プロパージン、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、Ｃ３、およびＣＨＰ−１）は、後退消去手順および一変量差次的発現分析の両方によって示されるように、コンセンサスシグネチャーの非常に安定したコアを作り出す。しかしながら、現在のデータは、同様のアプローチで分析された以前のデータセットと一致して、シグネチャーコアが、ＰＤＡＣ対ＮＣを区別するために、感度、特に特異性の点で臨床的に関連する精度レベルに達するために、直交マーカーによって補完される必要があることを示す。
【０２３４】
膵臓癌の病期Ｉ期〜ＩＶ期の間の区別
異なる病期間の区別は、これが非侵襲的な病期において膵臓癌を診断する能力に関連するため、高い関心がある。早期診断のために同定されたマーカーの重要性を評価するために、ＰＤＡＣ試料を病期に従って階層化した。一個抜き交差検証を用いたＳＶＭは、全てのＰＤＡＣ病期がＮＣから分離し、分類の精度が疾病の進行に伴って増加し、病期Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ期とＮＣを区別するためのＡＵＣ値が、それぞれ０．７１、０．８６、０．９０、および０．９３であったことを示した（図３ａ）。病期へのサブグループ化は、病期Ｉ期患者に対するｎ＝１１から病期ＩＩＩ期患者に対するｎ＝３４の範囲の、より小さい試料数をもたらした。統計的検出力を高めるために、早期限局疾患（病期Ｉ／ＩＩ期）および後期侵襲性疾患（病期ＩＩＩ／ＩＶ期）へのグループ分けも実施した。これらの群は、０．８０（早期）および０．９６（後期）のＡＵＣ値でＮＣと区別された。
【０２３５】
図３ｂは、ＮＣと比較して、病期群のうちの少なくとも１つにおいて有意な（ウィルコクソンｐ＜０．０５）差次的タンパク質レベルを呈する全ての抗体を示す。記載された５個のコア候補マーカー（プロパージン、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、Ｃ３、およびＣＨＰ−１）のうち、プロパージンは全病期で下方制御され、ＣＨＰ−１は全病期で上方制御され、ＩＬ−８は、病期ＩＩＩ／ＩＶ期の疾病においてのみ下方制御された。
【０２３６】
注目すべきは、病期ＩＩＩ／ＩＶ期の白人ＰＤＡＣ患者における血清マーカーに関する以前の研究では、Ｃ５が後退消去フィルタリング分析において最も顕著なマーカーとしてランク付けされた一方で、本研究は、同じ抗体を番号１４としてランク付けしたことである（表２）。しかしながら、病期特異的分析を実施したとき、Ｃ５は後期疾病においてのみ上昇し、それが前の研究（Ｗｉｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）と一貫していることが明らかであった。注目すべきことに、病期特異的分析は、病期Ｉ／ＩＩ期の疾病においてすでに測定可能ないくつかの早期マーカー候補タンパク質、例えば、ＢＫＴ、ＣＤＫ２、ＭＡＰＫ−８、ＡＧＡＰ−２、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＰＴＰＲＯ、ＵＳＰ−７、ＭＵＣ−１のレベルの上昇、ならびにＡｐｏ−Ａ１およびＣ１ｑのレベルの低下を指摘した。
【０２３７】
腫瘍の位置に関連するマーカー
膵臓内の原発腫瘍位置によっても試料をグループ分けし、膵頭部に位置する腫瘍由来の血漿を、膵体および／または膵尾に位置するものと比較した。他の位置（膵頸部＝４、膵頸部＋膵体＝１、膵頭部＋膵尾＝１）における腫瘍を有する試料をこの分析から除外した。ウィルコクソンｐ＜０．０５のカットオフを適用すると、３７個の抗体は、膵頭部対膵体／膵尾において有意に異なる強度レベルを示した（図４）。膵頭部（ｎ＝６３）対膵体／膵尾（ｎ＝３９）の限局性腫瘍に対するＡＵＣは、０．６４（ｐ＝５．４ｅ−３）であった。群は、ＳＶＭ分析では明確に分離されなかったが、試料形式（血清／血漿）、民族性（白人／アジア人）、技術的プロセス（アッセイプロトコルおよび計装）、ならびにデータ処理（正規化手順）（Ｇｅｒｄｔｓｓｏｎ，  ２０１５）に関する違いにもかかわらず、３７個の有意な抗体が、以前の研究において同定された抗体とかなり重複した（図４）。前の研究と相関しない唯一のタンパク質は、Ｃ３であり、これは血漿中で上昇することがわかったが、膵頭部対膵体／膵尾の限局性腫瘍では血清中で低下した。注目すべきことに、膵頭部／膵体／膵尾の限局性腫瘍（図４）を区別したタンパク質もまた、ＰＤＡＣ対ＮＣに対するタンパク質シグネチャーとは明らかに異なった（表２）。
【０２３８】
白人および中国人の集団から得られたマーカー間の相関
我々は、次に、健常対照ならびに膵炎患者との関連で分析された（Ｗｉｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、後期ＰＤＡＣ白人コホートにおいてすでに同定された血清タンパク質シグネチャーを有する中国人の膵臓癌対照における、血漿タンパク質シグネチャーの一致を評価した。注目すべきことに、抗体マイクロアレイ含有量は、前の研究以来有意に拡大しており、２つの研究の相関測定を困難にする。前の研究は、現在使用されている抗体の３６％のみを含み、例えば、コアマーカーＣＨＰ−１を含まなかった。しかしながら、他の４つのコアシグネチャータンパク質（プロパージン、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、およびＣ３）は全て、以前に公開された血清ＰＤＡＣシグネチャーの一部であった。コアパネルに加えて、２つの研究における２５個の最上位にランク付けされた抗体（表２）を比較すると、２つの民族コホート間に明確な重複があり、血液ベースのプロテオミクス分析が、試料ドナー（白人／アジア人）の遺伝子構造、または試料形式（血清／血漿）による影響が少ないことを実証する。
【０２３９】
以前の白人コホートにおいて、ＰＤＡＣを対照および膵炎の両方と区別することができたことも示された（Ｗｉｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。我々アジア人のコホートが慢性膵炎試料を含まなかったため、我々は代わりに、本研究と以前の研究において存在する有意な（ウィルコクソンＰ＜０．０５）マーカーを比較した（Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｗｉｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。５つのマーカー（Ｃ３、Ｃ５、ＩＬ−１２、ＩＬ−８、プロパージン）は、血清および血漿ＰＤＡＣ試料の両方において、ならびに膵炎試料において共通して発現した。この重複にもかかわらず、ＰＤＡＣ関連タンパク質は、慢性膵炎と比較して顕著に異なった。さらに、現在および以前の研究は、マーカーのサブセットが炎症性または非関連性の指標と重複しているかどうかにかかわらず、最も正確な精度をもたらすのは多重化シグネチャーにおけるマーカーの組み合わせであることが実証している。
【０２４０】
考察
血漿マーカーシグネチャーの同定のために、最初に、２つの相補的な戦略、（ｉ）アッセイにおける各抗体に対する複数試験の補正されたｑ値を生成する、一変量差次的発現分析、ならびに（ｉｉ）症例および対照を区別するための直交情報で寄与する、マーカーの最適な組み合わせを指摘するように設計された、後退消去アプローチを使用した（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１ａ）。２つの戦略は、プロパージン、ＶＥＧＦ、ＩＬ−８、Ｃ３、およびＣＨＰ−１の５つのタンパク質の堅牢なコアシグネチャーの同定をもたらした。プロパージンまたは補体因子Ｐは、血清（Ｗｉｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）および血漿（Ｇｅｒｄｔｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、未公開の観察）中で強力に下方制御されたものとして、２つの独立した研究においてすでに同定されたが、それは別として、我々の知る限り、以前にはＰＤＡＣに関連していなかった。対照的に、腫瘍成長の血管新生依存に関連したＶＥＧＦは、ＰＤＡＣを含む多くの癌における既知の上方制御マーカーである（Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。特異性が質量分析によって検証されているＶＥＧＦ抗体は、以前の研究でも、ＰＤＡＣにおいて有意に上昇したＶＥＧＦレベルを実証している（Ｇｅｒｄｔｓｓｏｎ，２０１５、Ｗｉｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。また、ＩＬ−８および補体因子Ｃ３は、後期膵臓癌に関連することがすでに示されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｗｉｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。対照的に、ＣＨＰ−１、カルシニューリン相同タンパク質−１は、以前に測定されておらず、我々は、そのＰＤＡＣとの関連が本研究に新規であると考える。ＣＨＰ−１は、Ｃａ２＋結合ファミリーの一部であり、複数の細胞内コンパートメントに局在する広く発現されたタンパク質である。原形質膜にわたる輸送に関与することは別として、この推定上多能性のタンパク質の機能は、ほとんど知られていない（Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ｖｉｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０２４１】
結果は、可能な限り高い感度および特異性を達成するために、コアシグネチャーが追加のタンパク質で補完される必要があったことを示した。ここで、約２３個のマーカーが、ＰＤＡＣ対ＮＣの最適な区別をもたらすことが示された。５タンパク質コアに加えて、対象のいくつかの潜在的なマーカーを同定した。Ａｐｏ−Ａ１は、３つ全てのＡｐｏ−Ａ１特異的抗体（ｑ値０．００３〜０．０２）によって示されるように、最も強力な差次的発現タンパク質のうちの１つであった。ＰＤＡＣ患者からの血漿中の有意な下方制御は、以前に見られている（Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）（Ｇｅｒｄｔｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、未公開の観察）。Ａｐｏ−Ａ１は、血漿中の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主成分であり、ＨＤＬレベルの低下は、心血管の健康不良に関連する。したがって、本研究で観察されたＡｐｏ−Ａ１レベルの低下は、ＰＤＡＣの喫煙および肥満との関連性を反映する可能性がある。別の強力に下方制御されたマーカーは、我々の以前の研究（Ｗｉｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）に従って、補体因子Ｃ１ｑであった。Ａｐｏ−Ａ１およびＣ１ｑの両方が一変量分析に基づくトップマーカーのうちの１つであったが、それらは後退消去分析から得られたコンセンサスシグネチャーには含まれておらず、それは、その中の個々のマーカーではなく、組み合わされたシグネチャーの性能のみを考慮に入れる。対照的に、ＭＡＰＫ−８は、両方のアプローチによって高スコアマーカーとして同定された。いくつかの細胞プロセスおよびシグナル伝達経路に関与するセリン／スレオニンタンパク質キナーゼであるＭＡＰＫ−８は、以前にマルチパラメータアッセイで分析されておらず、そのＰＤＡＣにおける区別能力および役割は、将来の研究において確認される必要がある。注目すべきことに、試料のサブグループは、年齢がよく一致していたが、ＰＤＡＣおよびＮＣ群は、歪んだ性別分布を有した。ＰＤＡＣ対ＮＣに対する分類子が性別の偏りの影響を受けるかを調査するために、追加のＣｏｍＢａｔ正規化ステップによって、性別調整データセットを作成した。結果は、性別調整データセットにおけるＰＤＡＣ対ＮＣに対する有意な抗体のリストが、元のデータセットのものと非常に類似していたことを明確に実証した。さらに、ＳＶＭベースの分析はまた、ＰＤＡＣ対ＮＣと比較して、男性対女性が不十分に分離されたことも実証し、この場合もやはり、性別がＰＤＡＣ対ＮＣ分類子に対する交絡因子ではなかったことを示す。
【０２４２】
我々が知る限り、これは、血漿中の病期特異的ＰＤＡＣマーカーを同定する最初のプロテオミクス研究である。早期診断がＰＤＡＣ患者の平均余命を有意に増加させるため（Ｆｕｒｕｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）、病期Ｉ／ＩＩ期に関連する定義されたマーカーは、臨床的に関連する試験を設計する際に特に重要である。ＰＤＡＣ対ＮＣの区別は、ＰＤＡＣの病期と共に増加したが、我々はまだなお、正常個体と病期Ｉ／ＩＩ期の患者を区別することが可能であった。結果は、マイクロアレイ分析からの全てのデータを使用することに基づくが、高性能のシグネチャーに凝縮され得る。ＡＧＡＰ−２、ＢＴＫ、ＣＤＫ−２、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＭＵＣ−１、ＰＴＰＲＯ、ＵＳＰ−７を含むいくつかのタンパク質は、レベルが限局性早期癌において特異的に上昇したことが示された。これらのうちの４つ、ＡＧＡＰ−２、ＣＤＫ−２、ＰＴＰＲＯ、およびＵＳＰ７は、我々のマイクロアレイアッセイで以前に測定されていない。ＣＤＫ−２、またはサイクリン依存性キナーゼ２は、細胞周期の制御に関与し、ＣＤＫの異常活性化は、ＰＤＡＣを含む多くの癌のよく知られた特徴である（Ｆｅｌｄｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。残りの新規マーカーは、以前にＰＤＡＣに特異的に関連付けられていない。以前に同定されている他のＰＤＡＣマーカー（Ｉｎｇｖａｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｗｉｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）は、ＰＤＡＣ症例の９０％において過剰発現されるＭＵＣ−１（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、サイトカインＩＬ−６（Ｂｅｌｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、およびＩＬ−１３（Ｇａｂｉｔａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、ならびにチロシンキナーゼＢＴＫを含む。
【０２４３】
本研究の焦点は、実際には、病期特異的血漿タンパク質の同定、および切除可能な膵臓癌と播種性疾患とを区別する能力であった。しかしながら、癌対膵炎の鑑別診断は時に困難であり、特に膵臓の炎症に焦点を当てた最近の研究において解明される問題であり、我々は、急性、慢性、および自己免疫性膵炎と正常対照とを明確に区別したタンパク質シグネチャーを同定することができたことを示した（Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。重要なことに、炎症関連タンパク質シグネチャーはまた、本研究における病期Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ期に関連するマーカーシグネチャーとは異なった。これらの研究結果は、膵臓癌患者と、膵臓の異なる炎症兆候を有する患者、ならびに健康な個体を含む対照の組み合わせとを区別するシグネチャーを同定する以前の研究によって、さらに裏付けられた（Ｗｉｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０２４４】
膵臓内の局在化に起因する腫瘍の生物学的多様性は、以前に実証されている（Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。膵体および膵尾における腫瘍は、膵頭部における腫瘍（ＰＤＡＣの７７％）よりもまれである（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。例えば、血液供給ならびにリンパ逆流および静脈逆流の差により、黄疸が少なく、痛みが増し、アルブミンおよびＣＥＡ値が高くなり、ＣＡ１９−９レベルが低下する膵体および膵尾腫瘍を伴う症状にも差がある（Ｅｙｉｇｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。膵体および膵尾腫瘍は、後期に膵頭部腫瘍よりも頻繁に検出されることが多く、転移率がより高い。生物学的変動が異なる治療効率をもたらし得るため（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、腫瘍局在化を区別することができるマーカーは、臨床的関連性があり、個別治療戦略を補助し得る。しかしながら、遺伝子レベルで発見されている差はほとんどなく、突然変異、欠失および増幅の全体的な数、またはＫ−ｒａｓ点突然変異の有意な変動はない（Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ここで、３７個の抗体が、膵頭部と膵体／膵尾腫瘍との間の差次的タンパク質発現レベルで明らかになったマーカーを同定し、この発現パターンは、以前の研究とかなり相関した。その結果として、これらの結果は、早期病期における膵体／膵尾および膵頭部腫瘍を区別する血液タンパク質バイオマーカーシグネチャーの将来の開発にとって有望である。
【０２４５】
民族の遺伝的多様性は、十分に説明され、環境要因に加えて、例えば、世界の異なる地域における癌の発生および進行に関連付けられている（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｒａｓｔｏｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。対照的に、我々はここで、アジア人系および白人系のＰＤＡＣ患者が、同様の疾病関連タンパク質シグネチャーを発現することを示す。生物学的多様性は、実際には、遺伝的バイオマーカーの探求において障害であるが（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、我々の研究結果は、遺伝子突然変異と比較して、全タンパク質レベル上での多様性がより少ないため、プロテオームバイオマーカーが、異なる民族間でより堅牢かつ伝達性であり得ることを示す。
【０２４６】
要約すると、我々は、切除可能な膵臓癌（病期Ｉ／ＩＩ期）、ならびに局所進行（病期ＩＩＩ期）および遠隔転移（病期ＩＶ期）疾患を初めて正確に区別することができたことを実証し、それは膵臓癌の早期診断に重点を置いた試験の必須条件である。さらに、我々は、膵臓内の異なる腫瘍位置に関連する血漿タンパク質マーカーが同定され得るという情報を提供する。
【０２４７】
【表Ａ】
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【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【０２４８】
[参考文献]
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【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
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【図１（ｃ）】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図２（Ｃ）】
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【図２（Ｄ）】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図４】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年3月25日(2019.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１（ａ）】
2019516981.tif 000108
【図１（ｂ）】
2019516981.tif 000109
【図１（ｃ）】
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【図２（Ａ）】
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【図２（Ｂ）】
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【図２（Ｃ）】
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【図２（Ｄ）】
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【図３（Ａ）】
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【図３（Ｂ）】
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【図４】
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【図５（Ａ）】
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【図５（Ｂ）】
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【国際調査報告】
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