(57)【要約】本発明は、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および一つ以上の延長ペプチドを含む融合タンパク質に関し、ここで、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列が、哺乳動物タンパク質またはその断片のアミノ酸配列と同一または類似であり、そして、前記延長ペプチドがＯ−グリコシル化アミノ酸のクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）を含む。延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、哺乳動物タンパク質の非反復配列（ｎｏｎ−ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と同一であり、および／または配列番号１と同一または類似する。メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、好ましくはＶＷＦである。融合タンパク質は、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と比較して、増加した半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を有し、そして、たとえば、ＦＶＩＩＩのような、結合パートナーの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を増加させるために使用され得る。 本発明はさらに、融合タンパク質によって形成される複合体、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と一つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含む融合タンパク質であって、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列が、哺乳動物のタンパク質またはその断片のアミノ酸配列と同一または類似であり、そして、前記延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）が、Ｏ−グリコシル化アミノ酸のクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）のないメインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と比較して、融合タンパク質が、増加した半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のアミノ酸配列が、前記メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）または断片の非反復アミノ酸配列の一部（ｎｏｎ−ｒｅｐｅａｔｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｅｃｔｉｏｎ９と同一または類似である、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
１またはそれ以上の延長ペプチドが、絨毛性ゴナドトロピン  β−サブユニット（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ  β−ｓｕｂｕｎｉｔ）（ＣＧ−β）由来ではない、特に、ＣＧ−βのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）と同一または類似していない、請求項１ないし３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【請求項５】
延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の、Ｏ−グリコシル化アミノ酸のクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）が、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは少なくとも４つのＯ−グリコシル化されたアミノ酸を含有する、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【請求項６】
Ｏ−グリコシル化部位のクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）が、少なくとも一つのスレオニンを、Ｏ−グリコシル化アミノ酸として含み、好ましくは、前記クラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）が、スレオニンとセリンの両方を、Ｏ−グリコシル化アミノ酸として含む、請求項１ないし５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【請求項７】
１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）が、１０個のアミノ酸中に少なくとも１つのＯ−グリコシル化部位、好ましくは、８個のアミノ酸に少なくとも１つのＯ−グリコシル化部位を含む、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【請求項８】
１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）が、２０〜６０個のアミノ酸、好ましくは２２〜４０個のアミノ酸、より好ましくは２６〜３６個のアミノ酸の範囲の長さを有する、請求項１ないし７のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【請求項９】
一つまたはそれ以上の延長ペプチドが、フォン・ヴィレブランド因子（ＶＷＦ）のＯ−グリコシル化ペプチドに対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１ないし８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
一つまたはそれ以上の延長ペプチドが、ＶＷＦのＯ−グリコシル化されたペプチド、特に配列番号１に対して、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、少なくとも１００％の配列同一性を有する、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
延長ペプチドの、少なくとも２個のコピー、好ましくは、少なくとも４つのコピーを含む、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）が、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のＣ末端に直接的または間接的に融合している、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）が、融合タンパク質のＣ末端を形成し、前記延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のＣ末端のアミノ酸が、所望により、親和性タグ融合ペプチドに、結合していてもよい、請求項１ないし１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が、Ｏ−グリコシル化アミノ酸の少なくとも１つのクラスターを含む、請求項９〜１３のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
融合タンパク質が、二量体化ドメインを含み、特に、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が二量体化ドメインを含む、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
哺乳類タンパク質が、ヒト血液タンパク質、好ましくは凝固因子またはプロテアーゼ阻害剤であり、より好ましくは、ＶＷＦ、プロトロンビン、フィブリノーゲン、ＦＩＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩおよびＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ、ＡＤＡＭＴＳ１３、アンチトロンビン、α−１  抗トリプシン、Ｃ１−インヒビター、抗キモトリプシン、ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−３、２−マクログロブリン、ＴＦＰＩ、ヘパリン補因子ＩＩプロテインＺ、プロテインＣおよびプロテインＳからなる群から選択される、請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６８に対して、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
融合タンパク質が、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と比較して、少なくとも４、好ましくは、少なくとも８、より好ましくは、少なくとも１２の追加のＯ−グリカンを含む、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
融合タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１から選択される配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、１００％の同一性を有する、請求項１ないし１８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
融合タンパク質が、哺乳動物細胞株、好ましくはヒト細胞株、より好ましくは、ヒト腎臓細胞株、最も好ましくは、ヒト胚性腎臓細胞株、特に、ＨＥＫ２９３ＦなどのＨＥＫ２９３細胞株における発現によって産生される、請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記第１のタンパク質が、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質であり、そして、前記第２のタンパク質に結合することが可能であり、そして、前記第２のタンパク質が、第２の哺乳動物のタンパク質またはその断片のアミノ酸配列と同一または類似であるアミノ酸配列を含む治療タンパク質である、第１のタンパク質および第２のタンパク質の組成物。
【請求項２２】
第１のタンパク質に結合された第２のタンパク質の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）が、前記第２のタンパク質の遊離の形態と比較して増加し、好ましくは、第１のタンパク質に結合された第２のタンパク質の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）が、融合ペプチドなしで、天然の哺乳動物のタンパク質またはメインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に結合した前記第２のタンパク質と比較して、増加する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
第２のタンパク質に対する第１のタンパク質のモル比が、０．１〜２５０の範囲、好ましくは、０．５〜５０の範囲、より好ましくは、１〜２５の範囲、最も好ましくは、２〜１０の範囲である、請求項２１または２２に記載の組成物。
【請求項２４】
第２のタンパク質に対する第１のタンパク質結合親和性が、０．０５〜３ｎＭの範囲である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
第２の哺乳動物のタンパク質が、血液タンパク質、より好ましくは、前記第２の哺乳動物のタンパク質が、血漿タンパク質、最も好ましくは、前記第２タンパク質が凝固因子である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
第２の哺乳動物のタンパク質がヒトタンパク質である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
第２のタンパク質が、ＦＶＩＩＩタンパク質であり、
全長ＦＶＩＩＩから選択され、
少なくとも、Ｂドメインの一部が欠落している、ＦＶＩＩＩタンパク質であり、および
少なくとも、Ｂドメインの一部が、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）で置換されている、ＦＶＩＩＩタンパク質であって、
延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、請求項５ないし１０のいずれか１項に記載されている、
請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）が、第１のタンパク質が第２のタンパク質に結合するのを妨害しない、第１のタンパク質の折りたたまれた状態の位置に位置する、請求項２１ないし２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
第１のタンパク質と第２のタンパク質のコンプレックスであって、
前記第１のタンパク質が、請求項１ないし２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質であり、そして、
前記第２のタンパク質は、第２の哺乳動物のタンパク質またはその断片のアミノ酸配列と同一または類似であるアミノ酸配列を有する。
【請求項３０】
第１のタンパク質が、第２のタンパク質に非共有結合で結合された、請求項２９のコンプレックス。
【請求項３１】
第１のタンパク質の２つのコピーが、二量体、好ましくは非共有結合で結合された、二量体を形成する、第１および第２のタンパク質の２つのコピーを含む、請求項２９または３０に記載のコンプレックス。
【請求項３２】
第１のタンパク質が、第２のタンパク質に共有結合している、請求項２９に記載のコンプレックスであって、リンカーが、ペプチド結合、化学リンカー、またはグリコシド結合から選択される、コンプレックス。
【請求項３３】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３４】
配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、および配列番号１４から選択される配列に、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは１００％の同一性を有する、アミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３５】
ベクターのバックボーン（ｖｅｃｔｏｒ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）が、好ましくは、ｐＣＤＮＡ３、ｐＣＤＮＡ３．１、ｐＣＤＮＡ４、ｐＣＤＮＡ５、ｐＣＤＮＡ６、ｐＣＥＰ４、ｐＣＥＰ−ｐｕｒｏ、ｐＣＥＴ１０１９、ｐＣＭＶ、ｐＥＦ１、ｐＥＦ４、ｐＥＦ５、ｐＥＦ６、ｐＥｘｃｈａｎｇｅ、ｐＥＸＰＲ、ｐＩＲＥＳ、およびｐＳＣＡＳから選択される、請求項３３または３４に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３６】
請求項３３または３４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項３５に記載のベクターを含む宿主細胞であって、
宿主細胞は、好ましくは哺乳動物の細胞、好ましくはヒト細胞、より好ましくはヒト腎臓細胞、最も好ましくはヒト胚性腎臓細胞株、特に、ＨＥＫ２９３ＦのようなＨＥＫ２９３細胞株である。
【請求項３７】
融合タンパク質が、第２のタンパク質に結合することができる、第２のタンパク質の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を増加させるための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項３８】
請求項１ないし２０のいずれか１項に記載の融合タンパク質、
請求項２１ないし２８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項２９ないし３２のいずれか１項に記載のコンプレックスを含む医薬組成物であって、好ましくは、ＰＵＰおよびＩＴＩの治療および／または関連する出血障害の治療から選択される、出血障害の治療または阻止において使用される、医薬組成物。
【請求項３９】
使用が、静脈内または非静脈内注射、好ましくは皮下注射を含む、請求項３５に記載の使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質、特に、フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）および第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）のようなヒト凝固因子の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の延長（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏｎ）に関する。
【０００２】
（発明の背景）
血友病（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ）は、血液の凝固（ｃｌｏｔｔｉｎｇ）または凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）を制御する身体の能力を損なう遺伝性遺伝子病（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）の一群である。その最も一般的な形態である、血友病Ａでは、凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）が不足している。血友病Ａは、５，０００〜１０，０００人の男性の出生の約１人に発生する。ＦＶＩＩＩタンパク質は、多機能性を有する血液凝固における必須の補因子である。
ＦＶＩＩＩの欠乏は、ＦＶＩＩＩの血漿由来濃縮物または組換え生産されたＦＶＩＩＩで治療することができる。
ＦＶＩＩＩの濃縮物での処置は、血友病患者の正常化した寿命をもたらす。
血友病Ａの患者は、必要に応じて、または週に数回投与される予防的治療として、ＦＶＩＩＩで治療される。予防的治療のために、ＦＶＩＩＩの、１５−２５  ＩＵ／ｋｇ体重を、週３回投与する。それは、ＦＶＩＩＩの一定の必要性、および、ヒトでは、たった約１１時間である、血液系におけるその短い半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）のために必須である（Ｅｗｅｎｓｔｅｉｎら、２００４年）。
血液中では、正常状態では、ＦＶＩＩＩ分子は、常に、その補因子であるフォン・ビルブラント因子（ＶＷＦ）に関連しており、分解の様々な異なる形態から、ＦＶＩＩＩ分子を安定化する。
ＦＶＩＩＩとＶＷＦの非共有結合複合体は、０．２〜０．３ｎＭと高い結合親和性を有する（Ｖｌｏｔら、１９９６年）。
歴史的に、血友病Ａは、ヒト血漿に由来するＦＶＩＩＩで治療されてきた。
しかし、１９９０年代以降、組換え生産された異なるＦＶＩＩＩタンパク質が市販された。しかし、プラズマ由来も、組換え生産されたＦＶＩＩＩタンパク質も、最適な薬物動態学的特性を持っていない。
他の多くの治療的タンパク質と同様に、それらは、ペプチダーゼによって代謝回転（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）に付され、それらのｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を有意に制限する。
Ｔｉｅｄｅら、によって検討されたように（２０１５）、ＦＶＩＩＩの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を延長させる試みは、Ｆｃ融合（Ｅｌｏｃｔａｔｅ、Ｅｌｏｃｔａ、ｅｆｍｏｒｃｔｏｃｏｇ  ａｌｆａ）、ポリエチレングリコールの付加（ｔｕｒｏｃｔｏｃｏｇ  ａｌｆａ  ｐｅｇｏｌ［Ｎ８−ＧＰ］、ＢＡＹ  ９４−９０２７、ＢＡＸ  ８５５）および短鎖の構築（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）（ＣＳＬ６２７）を含む。
これらの技術は全て、ＦＶＩＩＩ分子を変化させ、そして、およそ１．５倍に半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の延長されたＦＶＩＩＩを齎す。
【０００３】
ＦＶＩＩＩのさらなる半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の延長は、ＶＷＦ半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）に限定される。
Ｙｅｅらによって示されているように、ヒトＶＷＦ  Ｄ｀Ｄ３ドメインは、血漿中のＦＶＩＩＩを安定化するのに十分である。
しかし、Ｄ｀Ｄ３−Ｆｃ融合タンパク質は、ＶＷＦ−／−マウスでのみ、ＦＶＩＩＩの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を延長することができる。
血友病Ａのマウスにおいて、タンパク質断片の、ＦＶＩＩＩ結合に対する、内因性ＶＷＦとの、十分でない競争のために、Ｄ｀Ｄ３−Ｆｃの構築物は（Ｄ’Ｄ３−Ｆｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）、ＦＶＩＩＩの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の延長を齎さない。
【０００４】
ＷＯ２０１４／０１１８１９Ａ２は、ＶＷＦのＤ｀Ｄ３ドメイン、ＩｇＧのＦｃドメインおよびＸＴＥＮを含む、ＦＶＩＩＩ構築物（Ｄ’Ｄ３−Ｆｃ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の延長の成功を報告する。
この構築物は、内因性ＶＷＦに結合しないので、同じ半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の延長の効果は、ＶＷＦ／ＦＶＩＩＩ−ダブルノックアウト（ＤＫＯ）および血友病Ａマウスの両方に見られる。しかしながら、インビトロでは、完全に機能的であるが、生体内では、著しく低下した活性を示す。
【０００５】
治療用タンパク質の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を高めるための他のアプローチは、治療用タンパク質を、トランスフェリンおよびアルブミンのような、自然に長い半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を有するタンパク質に、または、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）のＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）などのタンパク質ドメインに、遺伝子融合することが含まれる。
ＣＧは、黄体形成ホルモン（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ、ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を含む糖タンパク質ホルモンファミリーに属する。
これらの糖ホルモン（ｇｌｙｃｏｈｏｒｍｏｎｅｓ）は、ヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ）であり、そして、共通のα−サブユニットと、様々な活性を与える、ユニークなβ−サブユニットからなる。
ヒトＣＧ（ｈＣＧ）の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）は、そのカウンターパートである、ＬＨ、ＦＳＨおよびＴＳＨの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）よりも、かなり長い。
ｈＣＧ−βの、Ｏ−グリコシル化ＣＴＰが、この半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の延長に関与することが示された。
【０００６】
ＣＴＰは、４つのＯ−グリコシル化部位（Ｓ＊で示される）を有する配列ＦＱＳＳＳＳ＊ＫＡＰＰＰＳ＊ＬＰＳＰＳ＊ＲＬＰＧＰＳ＊ＤＴＰＩＬＰＱ、と記載されている（Ｂｉｒｋｅｎら、１９７７年）。
Ｓｔｒｏｈｌら（２０１５年）に概説されているように、治療用タンパク質とＣＴＰの異なる融合タンパク質が開発され、そして、現在臨床試験中である。治療用タンパク質には、ＦＳＨ（Ｅｌｏｎｖａ（登録商標））、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸ、ＩＦＮ−βそしてオキシントモジュリンを含む。
【０００７】
発明の概要
本発明は、とりわけ、Ｏ−グリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）アミノ酸（全長のヒトＶＷＦに存在する）のクラスターを、ＶＷＦの断片に追加することによって、その半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の大幅な増加につながることを見出したことに基づく。
融合タンパク質の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）は、追加のＯ−グリカンクラスターを含まない、ＶＷＦ断片と比較して、延長される。
このように、第一の態様によれば、本発明は、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および少なくとも１つの延長ペプチドを含む融合タンパク質に関し、ここで、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列は、ＶＷＦのような哺乳動物のタンパク質、またはその断片のアミノ酸配列に同一または類似であり、そして、前記延長ペプチドは、Ｏ−グリコシル化アミノ酸のクラスターを含む。
興味深いことに、ＶＷＦの断片に添加した、Ｏ−グリコシル化アミノ酸のクラスターを含む延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、正にこのタンパク質、すなわちＶＷＦに由来する。したがって、本出願人は、タンパク質の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を延長するための一般原則を特定した。この一般原則は、タンパク質のＯ−グリコシル化アミノ酸の内因性クラスターを前記タンパク質またはその断片に付加することである。
従って、第１の局面における、融合タンパク質の好ましい実施形態によれば、１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のアミノ酸配列は、前記哺乳類タンパク質またはその断片、特に前記メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の非反復アミノ酸配列部分と同一または類似である。
発明者の知見からのさらなる結論は、配列番号１によって、特定されたＶＷＦのＯ−グリコシル化アミノ酸のクラスターは、半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）延長ペプチドとして有用である、ということである。
【０００８】
第１の態様のさらなる好ましい実施形態によれば、半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の延長特性は、ＶＷＦに限定されていないので、１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、ＶＷＦのＯ−グリコシル化ペプチド、特に、配列番号１のペプチドに、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも１００％の配列同一性を有する。
【０００９】
第２の態様において、本発明は、第１の態様による融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１０】
第３の態様によれば、本発明は、第２の態様による、ポリヌクレオチドを含有するベクターに関する。
【００１１】
第４の態様によれば、本発明は、第２の態様による、ポリヌクレオチド、または、第３の態様によるベクターを含有する宿主細胞に関する。ここで、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
本発明者らは、ＶＷＦの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）が増加するだけでなく、その結合パートナーである、ＦＶＩＩＩの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）も増加することを見出した。
【００１２】
このように、第５の態様では、本発明は、第２のタンパク質の半減期を増加させるための第１の態様の融合タンパク質の使用に関する。ここで、融合タンパク質は、前記第２のタンパク質に結合可能である。
したがって、融合タンパク質および第２のタンパク質の、得られたコンプレックスまたは組成物において、第２のタンパク質もまた、増加した半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を有する。
【００１３】
したがって、第６の態様では、本発明は、第１のタンパク質と第２のタンパク質との組成物に関し、ここで、前記第１のタンパク質は、第１の態様による融合タンパク質であり、そして、前記第２のタンパク質に結合することができ、そして、前記第２のタンパク質は、第２の哺乳動物のタンパク質またはその断片のアミノ酸配列と同一または類似である、アミノ酸配列を含む、治療用のタンパク質である。
【００１４】
そして、第７の態様によれば、本発明は、第１のタンパク質と第２のタンパク質とのコンプレックスに関する。ここで、前記第１のタンパク質が、第１の態様による融合タンパク質であり、そして、前記第２のタンパク質は、第２の哺乳動物のタンパク質またはその断片のアミノ酸配列と同一または類似のアミノ酸配列を有する。
【００１５】
最後に、第８の態様において、本発明はまた、第１の態様による融合タンパク質、第６の態様による組成物、または、第７の態様によるコンプレックスを含む医薬組成物に関し、好ましくは、ＰＵＰの治療、または、ＩＴＩの治療およびその他の関連する出血性疾患の治療から選択される、出血性疾患の治療または予防に使用するための、医薬組成物にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、Ａ）ＶＷＦ断片のＯＣＴＡ  １１、およびＢ）メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）として、ＶＷＦ断片を有する本発明による融合タンパク質：ＯＣＴＡ  １２Ｃ）メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）として、ＶＷＦ断片を有する本発明による融合タンパク質：ＯＣＴＡ  １４Ｄ）メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）として、ＶＷＦ断片を有する本発明による融合タンパク質：ＯＣＴＡ  １５、の概略図を示す。
【図２】図２は、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウス血漿における、異なるＶＷＦタンパク質または血漿由来の全長ＶＷＦと共配合されたＦＶＩＩＩの静脈内投与後のＦＶＩＩＩ活性のタイムコースを示す。データポイントおよびエラーバーは、５つの値の平均および標準偏差（ＳＤ）を表す。小さなサイズのため、エラーバーのいくつかは識別（ｄｉｓｃｅｒｎｉｂｌｅ）できない。
【図３】図３は、ミニブタ血漿中のＯＣＴＡ  １２と共配合した、１００Ｕ／ｋｇのＦＶＩＩＩの皮下投与後の濃度投与後のＯＣＴＡ  １２の抗原濃度のタイムコースを示す。
【図４】図４は、１００Ｕ／ｋｇのＦＶＩＩＩの皮下注射および静脈内注射、または、ミニブタ血漿中の、ＶＷＦ−タンパク質、ＯＣＴＡ  １２と共配合した、１００Ｕ／ｋｇのＦＶＩＩＩの皮下注射後の、ＦＶＩＩＩ抗原濃度のタイムコースを示す。
【００１７】
発明の詳細な説明
明細書および特許請求の範囲、およびそのような用語が与えられる範囲を明確かつ一貫して理解を提供するために、以下の定義が提供される。
【００１８】
定義
本明細書で使用される「ペプチド」は、任意の種類の任意の数のアミノ酸、好ましくは天然に存在するアミノ酸から構成され、好ましくはペプチド結合によって連結されていてもよい。特に、ペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは、少なくとも５個、少なくとも７個、少なくとも９個、少なくとも１２個、または少なくとも１５個のアミノ酸を含む。
さらに、ペプチドの長さの上限はない。しかし、好ましくは、本発明によるペプチドは、５００個のアミノ酸の長さを超えず、より好ましくは、３００個のアミノ酸の長さを超えない。さらにより好ましくは、２５０個のアミノ酸以下である。
したがって、用語「ペプチド」には、通常、２〜１０個のアミノ酸の長さを有するペプチドを意味する「オリゴペプチド」を含み、および、通常、１０個のアミノ酸を超える長さを有するペプチドを指す「ポリペプチド」が含まれる。
本明細書で使用される「タンパク質」は、１つまたはそれ以上のポリペプチド鎖を含み得る。１つ以上のポリペプチド鎖を有するタンパク質は、１つの遺伝子からの１つのポリペプチド鎖として発現され、そして、翻訳後に切断されることが多い。
このように、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は互換的に使用される。
本明細書で使用されるポリペプチドおよびタンパク質には、化学的に合成されたタンパク質ならびに遺伝子によってコードされる天然に合成されたタンパク質が含まれる。
ポリペプチドまたはタンパク質は、ヒトの血液のような天然の供給源から得られ得るか、または組換えタンパク質として細胞培養において産生され得る。
本明細書で使用する用語「治療用タンパク質」は、治療効果を有するタンパク質またはポリペプチド、すなわち、活性医薬成分として使用されるタンパク質に関する。
本発明によれば、用語「タンパク質前駆体」、「プロ−タンパク質」または「プロペプチド」は、翻訳後の修飾、アミノ酸配列の一部の、酵素的切断によって、活性型に変えることができる、不活性タンパク質（またはペプチド）に関する。
２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「配列同一性」によって記載される。
【００１９】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート、ライスら／２０００年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １６：  ２７６−２７７），  好ましくは、バージョンｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０．０またはそれ以降）で実施されているように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて決定される。
使用されるオプションのパラメーターは、１０のギャップオープンペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）０．５のギャップ延長ペナルティー（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）、およびＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョンの）置換マトリックスである。
「最長同一性（“ｌｏｎｇｅｓｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ”）」とラベル付けされたニードルの出力（簡単なオプションの使用することなく得られた）は、パーセント同一性として使用され、そして、以下のように計算される：
（同一残基ｘ１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）。
本発明の目的のために、２つのヌクレオチド配列の間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙＯｐｅｎＳｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ、Ｒｉｃｅら、２０００年、前記）、好ましくはバージョン３．０．０以降、で実施されているように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、１９７０年、前記）を用いて決定される。
【００２０】
使用されるオプションのパラメーターは、１０のギャップ  オープン  ペナルティー、０．５のギャップ延長ペナルティー、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＥＭＢＯＳＳバージョンのＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４）置換マトリックスである。
「最長同一性」とラベル付けされたＮｅｅｄｌｅの出力（ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得された）は、パーセント同一性として使用され、そして、次のように計算される。
【００２１】
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）
ペプチドまたはポリヌクレオチドの定義に関して、本明細書で使用される、用語の「類似性（Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」および「類似（ｓｉｍｉｌａｒ）」は、基準との、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の配列同一性の特定の程度に関連する。
【００２２】
類似のアミノ酸配列は、少なくとも、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、対象の配列と同一であるアミノ酸配列を含むと解釈される。
しかしながら、典型的には、類似の配列は、保存的アミノ酸置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）のいずれをも含むことができるがけれども、活性部位残基またはグリコシル化アミノ酸のような、ペプチドまたはポリヌクレオチドの機能に関連する位置においては、同じ残基を含むであろう。
類似のヌクレオチド配列は、少なくとも、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％でさえ、対象の配列と同一であるヌクレオチド配列を含むと解釈される。
本明細書中で使用される「同一の（Ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」は、対象の配列と、１００％の配列同一性の、アミノ酸またはヌクレオチド配列を指す。
「組換え」という用語は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種の核酸またはタンパク質の導入または天然型の核酸またはタンパク質の改変によって修飾されていること、または、細胞がそのように修飾された細胞に由来することを意味する。
【００２３】
したがって、たとえば、組換え細胞は、細胞の天然の（非組換えの）形態内には見出されない遺伝子を発現するか、または自然界に見出されるものとは、異なるレベルまたは異なる条件下で天然遺伝子を発現する。
本明細書で使用される用語「半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）」は、分布の擬似平衡に到達した後に、血漿／血液濃度が５０％減少するのに要する時間である（Ｔｏｕｔａｉｎら、２００５年の定義に従って）。
「半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）」という用語はまた、「循環半減期（ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）」、「終末半減期（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）」または「排出半減期（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）」とも呼ばれる。
【００２４】
本明細書で使用する場合、細胞を参照して使用される、用語「形質転換された」、「安定に形質転換された（ｓｔａｂｌｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ）」および「トランスジェニック」は、細胞が、そのゲノムに組み込まれているか、または複数の世代を通じて維持されているエピソーム（ｅｐｉｓｏｍｅ）として運ばれる、非天然の（たとえば、異種）核酸配列を、その細胞が含むことを意味する。
【００２５】
本明細書で使用する用語「断片」は、天然または野生型タンパク質と比較して一つ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドであって、残りのアミノ酸配列が完全長ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列中の対応する位置と同一である、ポリペプチドを意味する。断片は、典型的には少なくとも５０アミノ酸長である。
本明細書で使用される「グリコシル化」という用語は、分子、たとえば、タンパク質へのグリカンの結合を指す。グリコシル化は酵素反応であり得る。形成された結合は、共有結合を介してもよい。したがって、本明細書で使用する、グリコシル化ポリペプチドは、１つまたは複数のグリカンが結合しているポリペプチドである。
「高度にグリコシル化された」という語句は、利用可能なグリコシル化部位のすべてまたはほとんど全て、たとえば、Ｏ−結合型またはＮ−結合型グリコシル化部位でグリコシル化された酵素のような分子を指す。
本明細書で使用される「グリカン」という用語は、多糖またはオリゴ糖、または糖タンパク質またはグリコシル化ポリペプチドの炭水化物部分を指す。グリカンは、単糖残基のホモポリマーまたはヘテロポリマーであり得る。これらは、直鎖または分枝分子であってもよい。グリカンは、典型的には、少なくとも３つの糖を含み、そして、線状または分枝状であり得る。
グリカンは、天然の糖残基を含んでいてもよい（たとえば、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、マンノース、フコース、アラビノース、リボース、キシロースなど）および／または修飾された糖（たとえば、２｀−フルオロリボース、２｀−デオキシリボース、ホスホマンノース、６｀−スルホ−Ｎ−アセチルグルコサミンなど）。
本明細書で使用される「Ｏ−グリカン」という用語は、哺乳動物の糖タンパク質のセリンおよびスレオニン残基に、一般的に、共有結合で結合して見出されるグリカンを指す。Ｏ−グリカンは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を介して、Ｏ−グリコシド結合によって、セリンまたはスレオニンの−ＯＨに、α結合されていてもよい。
他の結合としては、α−結合Ｏ−フコース、β−結合Ｏ−キシロース、α−結合Ｏ−マンノース、β−結合Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチル−グルコサミン）、α−またはβ−結合Ｏ−ガラクトース、および、α−またはβ−結合Ｏ−グルコースグリカンである。
本発明によれば、用語「Ｏ−グリコシレーション  クラスター（Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｃｌｕｓｔｅｒ）」、「Ｏ−グリカンクラスター」および「Ｏ−グリコシル化アミノ酸のクラスター」は、互換的に使用され、そして、Ｏ−グリコシル化アミノ酸の２つまたはそれ以上と関連している。
本明細書で使用される「シアル化」という用語は、シアル酸またはその誘導体と反応した分子、特に、グリカンを指す。
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」または「によって特徴づけられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義語である「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」というトランジショナルな用語は、包括的またはオープンエンドであり、そして、追加の、列挙されていない要素または方法ステップを排除するものではない。
【００２６】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」というトランジショナルな語句は、請求項に特定されていない、いかなる要素、工程、または成分を、それらに通常付随する不純物を除いて、除外する。用語「からなる」が、プリアンブルの直後ではなく、請求項の本文の句に現れた場合、その句に記載されている要素のみを限定する。他の要素は、全体として請求項から除外されない。
「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」というトランジショナルな語句は、特許請求されている範囲を、特定の材料またはステップ、およびクレームされた発明の基本的かつ新規な特性に重大な影響を与えないそれらに、クレームの範囲を限定する。クレームの「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」形式で書かれたクローズド・クレームと、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」形式で起草された完全なオープンクレームの中間に位置している。
【００２７】
本発明の文脈において、実用的な理由のため、融合タンパク質のような用語「グリコシル化タンパク質」は、単数形で使用される。一般的に、実際（ｉｎ  ｐｒａｘｉｓ）、タンパク質は、同じタイプのタンパク質分子の組成物中に存在する。しかし、グリコシル化タンパク質の場合には、グリコシル化は、組成物の全ての分子において同一ではないであろう。たとえば、組成物の個々の分子の全てが、１００％で、グリコシル化されるわけではない。さらに、特定のＯ−グリコシル化部位に結合したグリカンにおいて、相違が生じることがある。
したがって、本出願において、「融合タンパク質」への言及は、また、同一のアミノ酸配列を有するが、Ｏ−グリカン構造において相違を有する融合タンパク質分子の組成物にも関する。
本明細書で使用される場合、「結合親和性」または「親和性」という用語は、２つの分子、特にリガンドとタンパク質標的との結合の強さを示す。結合親和性は、水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用およびファンデルワールス力のような、２つの分子間の非共有結合性分子間相互作用によって、影響される。
本明細書で使用される免疫応答は、適応性または自然免疫応答に関する。自然免疫応答は、抗原が体内に出現した直後または数時間以内に活性化される非特異的防御機構を指す。これらのメカニズムには、皮膚などの物理的障壁、血液中の化学物質、および、体内の外来細胞を攻撃する免疫系細胞が含まれる。自然免疫応答は、抗原の化学的性質によって活性化される。適応免疫応答は、抗原特異的免疫応答を指す。このためには、抗原は、まず、処理され、そして、認識しなければならない。抗原が一旦、認識されると、適応免疫系は、その抗原を攻撃するように特別に設計された多数の免疫細胞を作り出す。
【００２８】
融合タンパク質
第一の態様によれば、本発明は、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および少なくとも１つの延長ペプチドを含む融合タンパク質を提供する。ここで、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列は、哺乳動物のタンパク質またはその断片のアミノ酸配列と同一または類似し、そして、前記延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、Ｏ−グリコシル化アミノ酸のクラスターを含む。
本発明者らは、半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の増加、すなわちＯ−グリコシル化アミノ酸のクラスターを含む延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の添加をもたらすタンパク質の改変を特定した。
実施例に示されるように、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）として、ヒトＶＷＦのＯ−グリコシル化クラスター１のＶＷＦの断片に対する融合は、ＶＷＦ断片（ＯＣＴＡ  １１）単独と比較して、増加した半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を有する融合タンパク質（ＯＣＴＡ  １２）を齎す。
半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）（ｔ１／２）は、個々の血漿濃度−時間曲線の対数−直線部分の線形回帰分析により、または１相指数関数的減衰モデルを用いた非線形回帰によって計算することができる。計算のための例示的なソフトウェアプログラムは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．０７（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ９２０３７  米国）およびＷｉｎＮｏｎｌｉｎバージョン６．４（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ、米国）である。
計算は次の式に基づく。
2019522962.tif 000003
【００２９】
したがって、一実施形態によれば、融合タンパク質は、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を有さないメインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と比較して、増加した半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を有する。
ＶＷＦに由来するグリコシル化アミノ酸のクラスターを有するＶＷＦ断片の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を増加させることが可能であったので、本発明者らは、半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を延長するための新規な原理を特定した。
すなわち、天然に存在するタンパク質中にも存在する、Ｏ−グリコシル化アミノ酸のクラスターの添加による、タンパク質またはタンパク質の断片の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の増加である。
したがって、融合タンパク質の一実施形態によれば、１つまたそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のアミノ酸配列は、前記哺乳類タンパク質の一部と同一または類似である。
哺乳類タンパク質のこの一部（ｓｅｃｔｉｏｎ）は、特に、非反復アミノ酸配列である。
本明細書中で使用される、非反復アミノ酸配列は、本発明による天然に存在する哺乳類タンパク質において、１コピーにのみ見出される配列である。
したがって、非反復アミノ酸配列は、明示的に、天然のタンパク質において生じる任意の反復配列を除外する。
配列が２０を超えるアミノ酸、好ましくは１５を超えるアミノ酸、より好ましくは１０を超えるアミノ酸からなり、そして、哺乳動物タンパク質がこの配列の１つ以上を含む場合、特に、配列は、反復していると考えられる。反復配列は、いわゆる可変数（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ）タンデムリピートから得ることができる。可変数（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ）タンデムリピート（ＶＮＴＲ）は、短いヌクレオチド配列が「タンデムリピート」として編成されているゲノム内の場所である。
１つまたはそれ以上のヌクレオチドのパターンが繰り返され、その繰り返しが互いに直接隣接している場合、「タンデムリピート」がＤＮＡ中に生じる。ＶＮＴＲは、多くの染色体上に発見され、そして、多くの場合、個人間で、長さの変化を示す。
タンデムリピート配列が、ＤＮＡ配列をコードするタンパク質中に位置する場合、これらはアミノ酸配列の反復を齎す。
例は、ムチンタンパク質ファミリーの全てのメンバーに見られる縦列反復（ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔｓ）である。ムチンは、動物界のほとんどの生物の上皮組織によって産生される、高分子量の、高度にグリコシル化されたタンパク質のファミリーである。
【００３０】
本発明による非反復アミノ酸配列は、そのようなアミノ酸配列タンデムリピート、特にムチンタンデムリピートを明白に排除する。延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と同じ哺乳動物タンパク質に由来するだけでなく、より具体的には、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）にも存在する一部（ｓｅｃｔｉｏｎ）を含み得る。
したがって、一実施形態によれば、１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のアミノ酸配列は、前記メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の非反復アミノ酸配列の一部（ａ  ｎｏｎ−ｒｅｐｅａｔｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓａｉｄ  ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と同一または類似である。好ましくは、一つまたはそれ以上の延長ペプチドは、絨毛性（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ）ゴナドトロピンβ−サブユニット（ＣＧ−β）に由来しない。絨毛性ゴナドトロピンβ−サブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）は、ＦＳＨ、ＦＶＩＩａ、およびＦＩＸなどの他のタンパク質の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を増加させることが示された。
しかし、ｈＣＧが追加のＣＴＰと一緒に記載された場合、すなわち、１つ以上のＣＴＰコピーを有する場合、このタンパク質は本発明の主題から特に排除される。したがって、特に、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、ＣＧ−βのＣＴＰと同一でもなく類似もしない。
【００３１】
本発明によれば、アミノ酸配列のすぐ近くにある、２つまたはそれ以上のＯ−グリコシル化アミノ酸はクラスターと考えられる。したがって、融合タンパク質の一実施形態によれば、少なくとも１つの延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のＯ−グリコシル化アミノ酸のクラスターは、少なくとも２つＯ−グリコシル化アミノ酸を含む。クラスターは、たとえば、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４、または１５個のＯ−グリコシル化アミノ酸を含み得る。
理論によれば、半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）延長効果は、Ｏ−グリカンの負電荷に基づく。従って、半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）延長の効果は、クラスター中のＯ−グリコシル化アミノ酸の数とともに増加するはずである。したがって、クラスターは、好ましくは、少なくとも３つのＯ−グリコシル化アミノ酸を含有する。
実施例に示すように、顕著な半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）普及効果（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ）は、４つのＯ−グリコシル化アミノ酸のクラスターを有する延長ペプチドで達成された。したがって、好ましい実施形態によれば、クラスターは、少なくとも４つのＯ−グリコシル化アミノ酸を含む。
クラスターのＯ−グリコシル化アミノ酸に加えて、また、Ｎ−グリコシル化アミノ酸が存在してもよい。好ましくは、Ｏ−グリコシル化クラスター中に、Ｎ−グリコシル化アミノ酸は存在しない。複数の延長ペプチドが存在する場合には、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のクラスターは、異なる数のＯ−グリコシル化されたアミノ酸を有していても良い。たとえば、融合タンパク質は、２つのＯ−グリコシル化アミノ酸を有する１つのクラスターおよび４つのＯ−グリコシル化アミノ酸を有する第２のクラスターを含んでいてもよい。さらに、１つのクラスターは、３つのＯ−グリコシル化部位および他の４つのＯ−グリコシル化部位を含み得る。
【００３２】
延長ペプチドのＯ−グリコシル化アミノ酸は、ムチン型の、Ｏ−グリコシル化アミノ酸、セリン（Ｓｅｒ）およびスレオニン（Ｔｈｒ）であってよい。しかし、また、Ｏ−グリコシル化チロシン（Ｔｙｒ）、ヒドロキシリジン（Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｌｙｓ）またはヒドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙ−Ｐｒｏ）もまた当該分野で公知である。したがって、融合タンパク質中、特に、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）における、１つまたはそれ以上のＯ−グリコキシル化アミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ヒドロキシ−Ｌｙｓおよびヒドロキシ−Ｐｒｏから選択することができる。
前記断片の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の延長を齎す、ＯＣＴＡ  １２中のＶＷＦ断片に融合した延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、Ｏ−グリコシル化スレオニン残基およびセリン残基の両方を含む。したがって、第１の態様の１つの実施形態によれば、Ｏ−グリコシル化アミノ酸のクラスターは、少なくとも１つのＯ−グリコシル化スレオニンを含む。好適には、前記クラスターは、スレオニンとセリンの両方を、Ｏ−グリコシル化アミノ酸として含む。
興味深いことに、ＯＣＴＡ  １２の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、少なくとも、Ｏ−グリコシル化された２つの隣接するスレオニン残基を含む。従って、一実施形態では、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、少なくとも２つの隣接するＯ−グリコシル化スレオニン残基を含む。
以上説明したように、Ｏ−グリカンによって生成されたタンパク質表面の負の電荷は、半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の延長を齎すと考えられている。理論に拘束されることを望まないが、効果の発現のために、近接した二つまたはそれ以上のＯ−グリカンが必要と考えられている。
【００３３】
Ｏ−グリカン間のギャップが大きすぎる場合、すなわち、１５個のアミノ酸における１個未満のＯ−グリコシル化アミノ酸を有する場合、その効果は、弱体化または無効になる可能性がある。従って、融合タンパク質の一の実施形態では、少なくとも一つの延長ペプチドは、１５個のアミノ酸中に、少なくとも一つのＯ−グリコシル化アミノ酸を含む。より好ましくは、少なくとも一つの延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、１０個のアミノ酸中に、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を含む。
実施例に示されるように、試験された延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、８アミノ酸中に、１つのＯ−グリコシル化部位を有するクラスターを含む。したがって、好ましい実施形態によれば、１つまたは複数のクラスターは、８つのアミノ酸中に、少なくとも１つのグリコシル化部位を含む。
延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の長さは、２つの異なる局面によって定義される。
延長ペプチドは、Ｏ−グリコシル化アミノ酸のグリコシル化を促進する認識部位を含むのに十分な長さでなければならない。従って、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は少なくとも１０アミノ酸長でなければならない。
一方、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）が短いほど、構造的完全性または活性、したがってメインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の治療効果を妨害する可能性は低くなる。従って、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は１００アミノ酸を超えてはならない。
【００３４】
１つの実施形態によれば、１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、１５〜６０個のアミノ酸の範囲の長さを有する。
延長ペプチド内で、４つのアミノ酸を、Ｏ−グリコシル化することを可能にするために、長さが、２２から４０個のアミノ酸の範囲であることが好ましい。
より好ましくは、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の長さは、ＯＣＴＡ  １２の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の長さ程度、すなわち、２６〜３６個のアミノ酸の範囲である。
一実施形態によれば、１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、約３１個のアミノ酸の長さを有する。
タンパク質中に天然に存在するＯ−グリコシル化ペプチドの１つまたは複数のコピーを追加すると、その同じタンパク質またはその断片の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を増加するという、原理の結論を、本発明者らの発見は、導いただけではない。さらに、提示された結果は、ＶＷＦの特異的なＯ−グリコシル化ペプチドは、ＣＴＰと同様に、他のタンパク質、すなわち、一般的なタンパク質、の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を増加させることができるということを、信頼できるようにした。
【００３５】
したがって、一実施形態によれば、その一つまたはそれ以上の延長ペプチドは、ヒトＶＷＦのＯ−グリコシル化ペプチドに対して、少なくとも９０％の配列同一性を有する。
このヒトＶＷＦ由来の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、ＦＶＩＩＩのような、他の哺乳動物タンパク質またはその断片に融合され得る。
一つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の配列同一性は、好ましくは、ヒトＶＷＦのＯ−グリコシル化ペプチドに対して、少なくとも９５％である。より好ましくは、配列同一性は少なくとも９８％である。最も好ましくは、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の配列は、ヒトＶＷＦのＯ−グリコシル化ペプチドと同一である。
【００３６】
ヒトＶＷＦのＯ−グリコシル化ペプチドは、好ましくは、少なくとも部分的に、ＶＷＦのＯ−グリコシル化クラスター２（配列番号２のアミノ酸１２３８から１２６８）：ＱＥＰＧＧＬＶＶＰＰＴＤＡＰＶＳＰＴＴＬＹＶＥＤＩＳＥＰＰＬＨ（配列番号１）またはその変異体を含む。したがって、一の実施形態によれば、延長ペプチドは、少なくとも９０％の配列番号１との配列同一性を有する。配列番号１に対する配列同一性は、好ましくは少なくとも９５％である。より好ましくは、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の配列番号１に対する、配列同一性は、少なくとも９８％である。最も好ましくは、一つまたはそれ以上の延長ペプチドは、配列番号１に対して、１００％の配列同一性を有する。
【００３７】
メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、哺乳動物のタンパク質に基づく、すなわち、哺乳動物のタンパク質またはその断片と類似または同一のアミノ酸配列を含む。哺乳動物タンパク質は、特にヒトタンパク質である。
メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列が類似または同一である、哺乳類のタンパク質は、グリコシル化タンパク質であってよい。
融合タンパク質の一の実施形態によれば、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、哺乳動物のタンパク質のグリコシル化部分を含む。
別の実施形態によれば、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、Ｏ−グリコシル化アミノ酸の少なくとも１つのクラスターを含む。
【００３８】
Ｏ−グリコシル化アミノ酸のこのクラスターは、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）中のＯ−グリコシル化アミノ酸のクラスターと同一であってもよい。
メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が基づく、哺乳類タンパク質は、より好ましくは血液タンパク質である。
一実施形態によれば、哺乳動物タンパク質はヒト血液タンパク質である。
哺乳動物の血液タンパク質は、血液凝固因子、輸送タンパク質、プロテアーゼ阻害剤、免疫グロブリン、細胞関連血漿タンパク質、アポリポタンパク質、補因子、成長因子、抗血管新生タンパク質（ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、高グリコシル化タンパク質、血液因子または別の血液タンパク質とすることができる。
血液凝固因子は、特に、ヒト血液凝固因子は、好ましくは、フィブリノーゲン（ＦＩ）、プロトロンビン（ＦＩＩ）、組織因子（ＦＩＩＩ）、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、および、ＦＸＩＩＩ、ＶＷＦ、およびＡＤＡＭＴＳ１３からなる群から選択される。
凝固因子ＦＩ、ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩは、非活性または活性化形態であり得るがことが理解されている。
従って、本発明の文脈において、ＦＩ、ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩに対する参照は、それぞれ、特に他について明確な言及無き限り、または、活性化された形態は論理的に除外されるという、文脈がない限り、活性化された形態、ＦＩａ（フィブリン）、ＦＩＩａ（トロンビン）、ＦＶａ、ＦＩＸａ、ＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩＩａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａおよびＦＸＩＩＩａも含む。
したがって、この文脈では、ＦＩ、ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＩＸ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、およびＦＸＩＩＩは、ＦＩ／ＦＩａ、ＦＩＩ／ＦＩＩａ、ＦＶ／ＦＶａ、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ、ＦＶＩＩＩ／ＦＶＩＩＩａ、ＦＩＸ／ＦＩＸａ、ＦＸ／ＦＸａ、ＦＸＩ／ＦＸＩａ、ＦＸＩＩ／ＦＸＩＩａ、およびＦＸＩＩＩ／ＦＸＩＩＩａとして読むことができる。
【００３９】
輸送タンパク質、特にヒト輸送タンパク質は、アルブミン、トランスフェリン、セルロプラスミン、ハプトグロビン、ヘモグロビン、およびヘモペキシンから選択することができる。
１つの実施形態によれば、哺乳動物タンパク質は、プロテアーゼ阻害剤であり、特にヒトプロテアーゼ阻害剤である。
そのようなプロテアーゼ阻害剤の例をしては、β−アンチトロンビン、α−アンチトロンビン、プレラテントのアンチトロンビン（ｐｒｅ−ｌａｔｅｎｔ−ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ）、酸化アンチトロンビン、２−マクログロブリン、Ｃ１−阻害剤、組織因子経路阻害剤（ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（ＴＦＰＩ）、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ阻害剤（ＰＡＩ−３）、プロテインＣ、プロテインＳ、およびプロテインＺである。
免疫グロブリンの例は、ポリクローナル抗体（ＩｇＧ）、モノクローナル抗体、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、およびベンス・ジョーンズ蛋白質である。
細胞関連血漿タンパク質は、たとえば、フィブロネクチン、トロンボグロブリン、または血小板因子４である。
アポリポタンパク質の例は、アポＡ−Ｉ、アポＡ−ＩＩおよびアポＥである。
本発明の補因子は、たとえば、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｈ因子、Ｉ因子、Ｃ３ｂ不活性化因子、プロパージン（ｐｒｏｐｅｒｄｉｎ）、Ｃ４結合タンパク質などが挙げられる。
成長因子の例には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−α）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を含む。
血管新生抑制（Ａｎｔｉａｎｇｉｏｎｅｔｉｃ）タンパク質は、潜在（ｌａｔｅｎｔ）−アンチトロンビン、プレラテント（ｐｒｅｌａｔｅｎｔ）−アンチトロンビン、酸化アンチトロンビンおよびプラスミノーゲンを含む。
【００４０】
高度にグリコシル化されたタンパク質の例としては、α−１酸性  糖タンパク質（ａｌｆａ−１−ａｃｉｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）、アンチキモトリプシン、インターα−トリプシン阻害剤、α−２−ＨＳ糖タンパク質、Ｃ−反応性タンパク質である。
血液因子は、たとえば、エリスロポエチン、インターフェロン、腫瘍因子、ｔＰＡ、またはｇＣＳＦであり得る。
他のヒト血液タンパク質は、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、マンナン（ｍａｎｎａｎ）結合レクチン、Ｃ４−結合タンパク質、フィブロネクチン、ＧＣ−グロブリン、プラスミノーゲン／プラスミン、α−１マイクログロブリン、Ｃ−反応性蛋白質を含む。
【００４１】
哺乳動物のタンパク質は、特に、ヒトＶＷＦ、フィブリノゲン、プロトロンビン、ＦＩＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ、ＡＤＡＭＴＳ１３、アンチトロンビン、α−１  アンチトリプシン、Ｃ１−阻害剤、アンチキモトリプシン、ＰＡＩ−１、ＰＡＩ−３，２−マクログロブリン、ＴＦＰＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＺ、プロテインＣ、およびプロテインＳから選択された。
ヒトにおける第ＶＩＩＩ因子は、６つのエキソンに、１８７．０００塩基対を含むＦ８遺伝子によってコードされる。
転写されたｍＲＮＡは、９．０２９塩基対の長さを有し、そして、１９個のアミノ酸が除去された２．３５１個のアミノ酸を有するタンパク質に翻訳される。
【００４２】
ヒトにおけるＦＶＩＩＩ分子は、２５Ｎ−グリコシル化、および６  Ｏ−グリコシル化を用い、３１個のアミノ酸を、グリコシル化する（参照Ｋａｎｎｉｃｈｔら、２０１３年）。
翻訳後、アミノ酸鎖は、特異的プロテアーゼによって、約２００ｋＤａの重鎖と約８０ｋＤａの軽鎖の形成をもたらす位置で、切断される。
ドメイン組織は、通常、Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２と特徴付けられる。
軽鎖は、ドメインＡ３−Ｃ１−Ｃ２で構成されている。
重鎖は、主にドメインＡ１−Ａ２−Ｂからなる。
血漿中に見出される重鎖は、９０〜２００ｋＤａの分子量を有する不均一な組成を有する。
【００４３】
この理由は、そのグリコシル化の不均一性、スプライス変異体の存在およびＢドメインの枯渇した重鎖（Ｂ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）Ａ１−Ａ２のようなタンパク質分解産物の存在である。
【００４４】
全長のＦＶＩＩＩのアミノ酸配列は、１９８６年７月２１日の配列バージョン１（以下、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢＰ００４５１．１）のＵｎｉＰｒｏｔＫＢのＰ００４５１のアミノ酸２０〜２．３５１によって特定された。
一の実施形態によれば、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が類似または同一である哺乳動物のタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ００４５１．１のアミノ酸２０〜２，３５１によって特定されたヒト全長ＦＶＩＩＩである。
別の実施形態によれば、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、Ｂドメインの少なくとも一部が欠失している、ＦＶＩＩＩである。これに関して、Ｂドメイン全体が欠失していてもよい。
Ｂドメインの欠失している部分は、必要に応じてリンカーに置き換えられもよい。
リンカー配列は、特に、以下のアミノ酸配列ＳＦＳＱＮＳＲＨＱＡＹＲＹＲＲＧ（配列番号１２）を有する。
Ｂドメインが、リンカーによって置換された、ＦＶＩＩＩの一例は、Ｎｕｗｉｑ（登録商標）またはＶｉｈｕｍ（登録商標）の活性成分である、シモクトコグアルファ（Ｓｉｍｏｃｔｏｃｏｇ  ａｌｆａ）である。
【００４５】
シモクトコグアルファ（Ｓｉｍｏｃｔｏｃｏｇ  ａｌｆａ）は、以下の配列を有する：
2019522962.tif 000004
【００４６】
ＶＷＦは、複数の生理学的機能を有する、哺乳動物の血漿中に存在する多量体（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ）接着性糖タンパク質である。
一次止血（ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）の間、ＶＷＦは、血小板表面上の特異的受容体と、コラーゲンなどの細胞外マトリックスの成分との間のメディエーターとして働く。
さらに、ＶＷＦは、プロ凝固（ｐｒｏ−ｃｏａｇｕｌａｎｔ）第ＶＩＩＩ因子のための担体および安定化タンパク質として機能する。
ＶＷＦは、２８１３個のアミノ酸前駆体分子として、内皮細胞および巨核球で合成される。
ＶＷＦのドメイン構成は、典型的には、Ｔｉｌ３−Ｄ３−ＴＩＬ４−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４−Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−ＣＫとして特徴付けられる。
前駆体ポリペプチドである、プレプロＶＷＦ（ｐｒｅ−ｐｒｏ−ＶＷＦ）は、成熟血漿フォンビルブラント因子において見出された、２２残基のシグナルペプチド、７４１残基のプロペプチド（ドメインＤ１〜Ｄ２）および２０５０残基のポリペプチドからなる（Ｆｉｓｃｈｅｒら、１９９４年）。
【００４７】
全長ＶＷＦは、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢのエントリーＰ０４２７５によって特定された（２０１７年４月１２日のエントリバージョン２２４）。
本発明におけるヒトＶＷＦは、前記ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  Ｐ０４２７５の任意の配列のアミノ酸配列、特に、配列番号２（アイソフォーム１）を有する。
ＶＷＦは、Ｏ−グリコシル化アミノ酸の２つのクラスターを含む。
Ｏ−グリコシル化アミノ酸の第１のクラスターは、配列番号２のアミノ酸１２３８〜１２６８の間に見出される。
第２のクラスターは、配列番号２のアミノ酸１４６８〜１４８７を含む。
血漿中に分泌されると、ＶＷＦは、分子サイズの異なる種々の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）の形態で循環する。
これらのＶＷＦ分子は、２０５０アミノ酸残基の成熟サブユニットのオリゴマーおよびマルチマーからなる。
ＶＷＦは、通常、約５００〜２０，０００ｋＤａのサイズの範囲のマルチマー多量体として、血漿中に見出され得る（Ｆｕｒｌａｎら、１９９６年）。
【００４８】
一実施形態によれば、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ヒト成熟ＶＷＦの配列と同一または類似のアミノ酸配列を有する。
別の実施形態によれば、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、ヒトＶＷＦの断片の配列と類似または同一であるアミノ酸配列を有する。
たとえば、ヒトＶＷＦの断片において、ドメインＡ１、Ａ２、Ａ３、Ｄ４、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、ＣＫの一つまたはそれ以上が、ヒト成熟ＶＷＦとの比較で、欠失していてもよい（Ｔｉｌ３−Ｄ３−ＴＩＬ４−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４−Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−ＣＫ）。
ＶＷＦ断片は、たとえば、
Ｔｉｌ３−Ｄ３−ＴＩＬ４−Ａ１、
Ｔｉｌ３−Ｄ３−ＴＩＬ４−Ａ１−Ａ２、
Ｔｉｌ３−Ｄ３−ＴＩＬ４−Ａ１−Ａ２−Ａ３、
Ｔｉｌ３−Ｄ３−ＴＩＬ４−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４、
Ｔｉｌ３−Ｄ３−ＴＩＬ４−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４−Ｃ１、
Ｔｉｌ３−Ｄ３−ＴＩＬ４−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４−Ｃ１−Ｃ２、および
Ｔｉｌ３−Ｄ３−ＴＩＬ４−Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ｄ４−Ｃ１−Ｃ２−Ｃ３−ＣＫ
からなる以上の群から選択されるドメイン組織を有する。
【００４９】
これに関して、ヒトＶＷＦの断片は、特に、配列番号２のアミノ酸７６４で始まる断片である。
配列番号２のアミノ酸７６４〜１０３５は、ＶＷＦのＦＶＩＩＩ結合ドメインを含む。
メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、たとえば、ＷＯ２０１５／１８５７５８Ａ２に定義されているようなＶＷＦの断片を含むことができる。
国際公開第２０１５／１８５７５８号パンフレットに示されるように、それに定義されているＦＶＩＩＩとそのＶＷＦ断片との複合体は、ＦＶＩＩＩ単独と比較してリン脂質膜への結合が減少し、かつ、ＦＶＩＩＩと全長ＶＷＦの複合体と比較して、コラーゲンＩＩＩおよびヘパリンへの結合の減弱を示した。
好ましくは、配列番号２のアミノ酸７６４で始まるＶＷＦの断片は、好ましくは、配列番号２の１９０５から２１５３の範囲のアミノ酸で終わる。
【００５０】
一実施形態によれば、ＶＷＦ断片は、配列番号２の２０３０〜２１５３の範囲のＶＷＦのアミノ酸で終わる。
さらなる実施形態によれば、ＶＷＦ断片は、２１００〜２１５３の範囲の配列番号２のアミノ酸で終わる。
一実施形態によれば、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、配列番号２の７６４〜１２６８と、類似または同一であるアミノ酸配列を有する。
一実施形態によれば、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列主は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６８に対して、少なくとも９０％の同一性を有する。
メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列はまた、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６８に対して、少なくとも９５％の同一性を有する。
さらに、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列の、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６８に対する同一性は、少なくとも９８％である。
特に、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６８に対する１００％の同一性を有する。
一実施形態によれば、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１９０５と類似または同一のアミノ酸配列を有する。
【００５１】
一実施形態によれば、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１９０５に対して、少なくとも９０％の同一性を有する。
メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列はまた、配列番号２のアミノ酸７６４〜１９０５に対して、少なくとも９５％の同一性を有する。
さらに、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列の、配列番号２のアミノ酸７６４〜１９０５に対する同一性は、少なくとも９８％でよい。
特に、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１９０５と１００％の同一性を有していてもよい。
融合タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のような任意の数の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を含み得る。
融合タンパク質ＯＣＴＡ  １２は、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の２つのコピーを含有し、そして、ＶＷＦ断片のＯＣＴＡ  １１と比較して、半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の有意な増加を示す。
したがって、一実施形態によれば、融合タンパク質は、少なくとも２つの延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む。
【００５２】
現在のところ、半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の延長効果は、少なくとも部分的に、延長ペプチドのＯ−グリカンの負電荷に基づく、と理解される。
したがって、延長ペプチドのコピー数の増加は、半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の延長の効果のさらなる増加に繋がる。
これは、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の４つのコピーを含む、ＯＣＴＡ  １４によって確認される。
したがって、一実施形態によれば、融合タンパク質は、少なくとも４つの延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む。
【００５３】
他方、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のコピー数によって、延長ペプチドが構造的完全性または活性、そして、従って、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の治療効果に干渉する機会が増加する。
したがって、一実施形態によれば、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の数は１１未満である。
融合タンパク質は、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）に加えて、さらなるペプチド成分を含み得る。
【００５４】
特に、本発明による延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）に加えて、融合タンパク質は、ＣＴＰ、ＸＴＥＮ、トランスフェリンまたはその断片、アルブミンまたはその断片などの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の延長のため、さらなるペプチドを含み得る。
メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が哺乳類タンパク質の断片であり、そして、融合タンパク質が同じ哺乳類タンパク質のさらなる断片を含むこともまた、可能である。
特に、２つの断片は、１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）によって分離される。
そのようなタンパク質の例は、ＯＣＴＡ  １５であって、ＶＷＦの７６４〜１２６８のアミノ酸、配列番号１の配列を有する２つの延長ペプチドおよび、配列番号２のアミノ酸２７２１〜２８１３からなるＶＷＦの「システインノットドメイン（ｃｙｓｔｅｉｎ  ｋｎｏｔ  ｄｏｍａｉｎ）」を含む。
融合タンパク質において、１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のＮ末端またはＣ末端に連結され得る。
【００５５】
特に、融合タンパク質は、Ｎ末端に連結された１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）と、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のＣ末端に連結された１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）とを含むことができる。
融合タンパク質は、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および１つまたは複数の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）に加えて、さらにペプチドを含有していてもよい。
したがって、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に直接的または間接的に連結され得る。
【００５６】
これに関して、「直接連結している」とは、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のアミノ酸配列が直接隣接していることを意味する。
【００５７】
「間接的に連結された」とは、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）との間に、さらなるペプチドが配置されていることを意味する。
特に、リンカーペプチドは、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）との間に位置することができる。
リンカーは、切断部位を含み、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）から開裂可能にすることができる。
メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）および、所望によりさらなるペプチドは、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはそれらをコードする配列の接合によって産生され得る。
したがって、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）および所望によりさらなるペプチドは、ペプチド結合によって連結される。
【００５８】
本発明によれば、融合タンパク質のペプチドは、代わりに、化学的リンカーまたはグリコシド結合のような他のリンカーを介して接続することができる。
好ましくは、融合タンパク質のペプチドは、ペプチド結合によって連結される。
一実施形態によれば、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のＣ末端に直接連結される。
特に、融合タンパク質は、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のＣ末端に連結された、少なくとも２つの連続した延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を含む。
【００５９】
融合タンパク質は、２つまたはそれ以上の親和性タグに連結されていてもよい。
親和性タグの例は、ポリヒスチジン、プロテインＡ、グルタチオン  Ｓ  トランスフェラーゼ、サブスタンス  Ｐ、ＦＬＡＧ、ストレプトアビジン、および免疫グロブリン重鎖定常領域である。
親和性タグは、一般に、完全な構築物のアミノ酸配列の一部を形成するが、親和性タグは、融合タンパク質の一部として考慮されていない。
一つまたはそれ以上の親和性タグは、好ましくは、融合タンパク質のＣ末端またはＮ末端に連結される。
【００６０】
融合タンパク質が、１つまたは複数の親和性タグに連結されている場合、融合タンパク質は、好ましくは、親和性タグとタンパク質の残りの間に切断部位を含み、たとえば、プロテアーゼ切断による親和性タグの切断を可能にする。
一実施形態によれば、１つの延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、融合タンパク質のＮ末端を形成する。
上で説明したように、前記延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のＮ−末端アミノ酸は、所望により、親和性タグに連結される。
１つの実施形態によれば、１つの延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、融合タンパク質のＣ末端を形成する。
【００６１】
上で説明したように、前記延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）のＣ末端アミノ酸は、所望により、親和性タグに連結されていてもよい。
一実施形態によれば、前記請求項のいずれかに記載の融合タンパク質において、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）と比較して、少なくとも４、好ましくは少なくとも８、より好ましくは少なくとも１つの追加のＯ−グリカンを含む。
一実施形態によれば、融合タンパク質は、二量体化ドメインを含む。特に、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は二量体化ドメインを含む。
ＶＷＦでは、二量体は、ＣＫドメインの結合によって形成される。
【００６２】
したがって、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が、ＶＷＦ断片である場合、それは好ましくは、ＣＫ−ドメインを含む。
本発明による代表的な融合タンパク質は、ＯＣＴＡ１２である。
ＯＣＴＡ１２は、以下のアミノ酸配列（配列番号３）を有する：
2019522962.tif 000005
【００６３】
ＯＣＴＡ１２は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６８のＶＷＦ断片と、配列番号２のアミノ酸１２３８〜１２６８からなる、Ｃ末端に結合した延長ペプチド（extension peptide）（(bold太字）の２コピーとの融合タンパク質である。
一つの実施形態によれば、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３に対して少なくとも９０％の同一性を有する。
融合タンパク質のアミノ酸配列はまた、配列番号３と、少なくとも９５％の同一性を有していても良い。
また、融合タンパク質のアミノ酸配列の配列番号３との同一性は、少なくとも９８％であってもよい。特に、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３と１００％の同一性を有していてもよい。
以下の配列（配列番号４）は、追加の１２アミノ酸シグナルペプチド（太字および下線）を有するＯＣＴＡ１２を表す。
このペプチドの発現は、ＯＣＴＡ１２の単量体形態を提供する。
そのシグナルペプチドは切断される。
2019522962.tif 000006
【００６４】
一実施形態によれば、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４に対して少なくとも９０％の同一性を有する。融合タンパク質のアミノ酸配列はまた、配列番号４に対して、少なくとも９５％の同一性を有していても良い。
また、融合タンパク質のアミノ酸配列の、配列番号４に対する同一性は、少なくとも９８％であってよい。特に、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４に対して、１００％の同一性を有していてもよい。
本発明による、さらなる代表的な融合タンパク質は、ＯＣＴＡ１２およびシグナルペプチド（太字および下線）を有するプロペプチド（太字）を含む、Ｐｒｏ−ＯＣＴＡ  １２である。Ｐｒｏ−ＯＣＴＡ１２は、配列番号５によって特定される：
【００６５】
2019522962.tif 000007
【００６６】
Ｐｒｏ−ＯＣＴＡ  １２の発現は、二量体の形成をもたらす。そのペプチド二量体は、プロペプチドの切断後にも残る。一つの実施形態によれば、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５に対して、少なくとも９０％の同一性を有する。
融合タンパク質のアミノ酸配列はまた、配列番号５に対して、少なくとも９５％の同一性を有する必要があってよい。
また、融合タンパク質のアミノ酸配列の配列番号５との同一性は、少なくとも９８％であってもよい。特に、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５に対して、１００％の同一性を有していてもよい。
【００６７】
さらに、本発明に係る代表的な融合タンパク質は、ＯＣＴＡ  １４である。
ＯＣＴＡ  １４は以下のアミノ酸配列を有する：
2019522962.tif 000008
【００６８】
ＯＣＴＡ  １４は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６８のＶＷＦ断片と、配列番号２のアミノ酸１２３８〜１２６８からなるＣ末端に結合した、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（太字）の４コピーとの融合タンパク質である。
一つの実施形態によれば、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６に対して、少なくとも９０％の同一性を有する。融合タンパク質のアミノ酸配列はまた、配列番号６に対して、少なくとも９５％の同一性を有していても良い。
また、融合タンパク質のアミノ酸配列である、配列番号６に対する同一性は、少なくとも９８％であってよい。特に、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６と１００％の同一性を有することができる。
以下の配列（配列番号７）は、追加の１２アミノ酸シグナルペプチド（太字および下線）を有するＯＣＴＡ  １４を表す。
【００６９】
このペプチドの発現は、ＯＣＴＡ  １４の単量体形態を提供する。
シグナルペプチドは切断される。
2019522962.tif 000009
【００７０】
１つの実施形態によれば、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号７に対して、少なくとも９０％の同一性を有する。融合タンパク質のアミノ酸配列はまた、配列番号７に対して、少なくとも９５％の同一性を有しても良い。また、融合タンパク質のアミノ酸配列である、配列番号７と、９８％の同一性があってもよい。
特に、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号７に対して、１００％の同一性を有することができる。
本発明の更なる代表的な融合タンパク質は、ＯＣＴＡ  １４と、シグナルペプチド（太字および下線）を有するプロペプチド（太字）とを含む、Ｐｒｏ−ＯＣＴＡ  １４である。
Ｐｒｏ−ＯＣＴＡ  １４は、配列番号８によって特定される：
【００７１】
2019522962.tif 000010
【００７２】
一つの実施形態によれば、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８に対して少なくとも９０％の同一性を有する。融合タンパク質のアミノ酸配列はまた、配列番号８に対して、少なくとも９０％同一性を有しても良い。また、融合タンパク質のアミノ酸配列の配列番号８に対する同一性は、少なくとも９８％でもよい。
特に、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号８に対して１００％の同一性を有していてもよい。
【００７３】
さらに、本発明に係る代表的な融合タンパク質は、ＯＣＴＡ  １５である。
ＯＣＴＡ  １５は、以下のアミノ酸配列を有する：
2019522962.tif 000011
【００７４】
ＯＣＴＡ  １５は、配列番号２のアミノ酸７６４〜１２６８のＶＷＦ断片と、配列番号２のアミノ酸１２３８〜１２６８からなるＣ末端に結合した、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（太字）の２コピー、および、配列番号２のアミノ酸２７２１〜２８１３からなるＶＷＦの「システインノットドメイン」（“ｃｙｓｔｅｉｎ  ｋｎｏｔ  ｄｏｍａｉｎ”）との融合タンパク質である。一つの実施形態によれば、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号９に対して、少なくとも９０％の同一性を有する。融合タンパク質のアミノ酸配列はまた、配列番号９に対して、少なくとも９５％の同一性を有していても良い。また、融合タンパク質のアミノ酸配列である、配列番号９に対する同一性は、少なくとも９８％であってよい。
特に、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号９と１００％の同一性を有することができる。
【００７５】
以下の配列（配列番号１０）は、追加の１２アミノ酸シグナルペプチド（太字および下線）を有するＯＣＴＡ  １５を表す。このペプチドの発現は、ＯＣＴＡ  １５の二量体形態を提供する。シグナルペプチドは切断される。
2019522962.tif 000012
【００７６】
一つの実施形態によれば、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１０に対して少なくとも９０％の同一性を有する。融合タンパク質のアミノ酸配列はまた、配列番号１０に対して、少なくとも９５％同一性を有しても良い。また、融合タンパク質のアミノ酸配列の配列番号１０に対する同一性は、少なくとも９８％でもよい。特に、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１０に対して、１００％の同一性を有していてもよい。
本発明の更なる代表的な融合タンパク質は、ＯＣＴＡ  １５と、シグナルペプチド（太字および下線）を有するプロペプチド（太字）とを含むＰｒｏ−ＯＣＴＡ  １５である。
この配列の発現は、多量体の形成をもたらす。Ｐｒｏ−ＯＣＴＡ  １５は、配列番号１１によって特定される：
2019522962.tif 000013
【００７７】
一つの実施形態によれば、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１に対して、少なくとも９０％の同一性を有する。融合タンパク質のアミノ酸配列はまた、配列番号１１に対して、少なくとも９５％同一性を有しても良い。また、融合タンパク質のアミノ酸配列の配列番号１１に対する同一性は、少なくとも９８％でもよい。特に、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１に対して、１００％の同一性を有していてもよい。
本発明の一の実施形態では、融合タンパク質は、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の２つ以上のコピーを有する、Ｓｉｍｏｃｔｏｃｏｇアルファに基づく、修飾ＦＶＩＩＩタンパク質である。
【００７８】
本実施形態では、好適には、ＦＶＩＩＩの重鎖、特に、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  Ｐ００４５１．１のアミノ酸２０〜７５９、に同一または類似している。
ＦＶＩＩＩの重鎖（特に、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  Ｐ００４５１．１のアミノ酸２０〜７５９）と同一または類似のメインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を有する融合タンパク質は、好適には、さらに、配列番号１２と類似または同一のリンカー、および、さらに、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ  エントリーＰ００４５１．１のアミノ酸１６６８〜２３５１によって特定される軽鎖と類似または同一のアミノ酸配列を含む。
【００７９】
延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、軽鎖のＣ末端に融合していてもよい。あるいは、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、重鎖と軽鎖の間に位置する。
これに関して、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、リンカーのＣ末端またはＮ末端に連結され得る。
延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）はまた、リンカーに置き換えることができる。
さらに、リンカー配列は、１つ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）によって中断されてもよい。
また、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、重鎖と軽鎖の間および軽鎖のＣ末端の両方に位置することも可能である。
好ましくは、Ｓｉｍｏｃｔｏｃｏｇアルファに基づく、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＦＶＩＩＩの重鎖、リンカーの最初の部分、二つ以上の、好ましくは３つの延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（太字）、リンカーの第２の部分（下線および太字）および軽鎖を含む。
そのようなタンパク質の例は、配列番号１４によって特定されるタンパク質である：
2019522962.tif 000014
【００８０】
一つの実施形態によれば、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１４に対して、少なくとも９０％の同一性を有する。融合タンパク質のアミノ酸配列はまた、配列番号１４に対して、少なくとも９５％同一性を有しても良い。また、融合タンパク質のアミノ酸配列の配列番号１４に対する同一性は、少なくとも９８％でもよい。特に、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１４に対して、１００％の同一性を有していてもよい。
あるいは、Ｓｉｍｏｃｔｏｃｏｇ  ａｌｆａに基づく融合タンパク質は、Ｓｉｍｏｃｔｏｃｏｇ  ａｌｆａのＣ末端に連結された、２またはそれ以上の、好ましくは３つの延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（太字）を含む。そのようなタンパク質の例は、配列番号２１によって特定されるタンパク質である。
１つの実施形態によれば、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２１に対して少なくとも９０％の同一性を有する。融合タンパク質のアミノ酸配列はまた、配列番号２１に対して、少なくとも９５％同一性を有しても良い。また、融合タンパク質のアミノ酸配列の配列番号２１に対する同一性は、少なくとも９８％でもよい。特に、融合タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２１に対して、１００％の同一性を有していてもよい。
【００８１】
ポリヌクレオチド
第２の態様によれば、本発明は、本発明の第１の態様により、融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であってもよい。
単離されたポリヌクレオチドは、好ましくは、ＤＮＡ分子、特に、ｃＤＮＡ分子である。
ペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離またはクローニングするために使用される技術は、当技術分野で公知であり、そして、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、またはそれらの組み合わせを含む。
そのようなゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローニングは、たとえば、周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または発現ライブラリーの抗体スクリーニングを用いて、共通の構造的特徴を有するクローニングされたＤＮＡ断片を検出することによって行うことができる（たとえば、Ｉｎｎｉｓら、１９９０年）ＰＣＲ：方法と応用の指針（Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ライゲーション活性化転写（ＬＡＴ）およびポリヌクレオチドに基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）のような他の核酸増幅手順を用いてもよい。
特に、単離されたポリヌクレオチドの配列は、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および少なくとも１つの第２部分配列をコードする第１の部分を含み得る。
第１の部分は、好ましくは、配列番号１５と類似または同一である。
第１の部分は、好ましくは、配列番号１５と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性の程度を有する。
少なくとも１つの第２の部分は、好ましくは、配列番号１６と類似または同一である。
【００８２】
第２の部分は、好ましくは、配列番号１６と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性の程度を有する。
単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４および配列番号２１からなる群から選択される配列と、類似または同一のアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子であってもよい。
特に、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号４に対して、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは１００％のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子であってもよい。
あるいは、単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子であってもよい。
さらに、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号５に対して、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、１００％、の同一性を有するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子であってもよい。
一実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号７に対して、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、１００％、の同一性を有するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子である。
一実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号８に対して、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、１００％、の同一性を有するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子である。
一実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１０に対して、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、１００％、の同一性を有するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子である。
一実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１１に対して、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、１００％、の同一性を有するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子である。
一実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１４に対して、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、１００％、の同一性を有するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子である。
一実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２１に対して、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％、最も好ましくは、１００％、の同一性を有するアミノ酸配列を有する融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子である。
【００８３】
単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０および配列番号２２からなる群から選択される配列と類似または同一の配列を有するＤＮＡ分子であり得る。
一の実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドの１本鎖は、配列番号１７に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
さらなる実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１８に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
さらに別の実施形態によれば、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１９に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【００８４】
一の実施形態によると、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
一の実施形態によると、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
一の実施形態によると、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２０に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【００８５】
ポリヌクレオチド配列のリスト
配列番号１５：ＯＣＴＡ  １１をコードするＤＮＡ（配列番号２のＡＡ  １−１２６８）
配列番号１６：延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするＤＮＡ（配列番号１）
配列番号１７：Ｐｒｏ−ＯＣＴＡ  １２をコードするＤＮＡ（配列番号５）
配列番号１８：Ｐｒｏ−ＯＣＴＡ  １４をコードするＤＮＡ（配列番号８）
配列番号１９：Ｐｒｏ−ＯＣＴＡ  １５をコードするＤＮＡ（配列番号１１）
配列番号２０：リンカー領域に３つの延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を有するＳｉｍｏｃｔｏｃｏｇ  ａｌｆａをコードするＤＮＡ（配列番号１４）
配列番号２２：３つのＣ末端延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を有するＳｉｍｏｃｔｏｃｏｇ  ａｌｆａをコードするＤＮＡ配列（配列番号２１）
【００８６】
発現ベクター
第３の態様では、本発明はまた、第２の発明の態様による、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
発現ベクターはさらに、プロモーターのような制御エレメント、および、転写および翻訳停止シグナルを含むことが好ましい。
第２の態様によるポリヌクレオチドおよび制御エレメントのポリヌクレオチドは、一緒に連結して、そのような部位で、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入または置換を可能にする、１つまたは複数の制限部位を含んでいてもよい、組換え発現ベクターを産生することができる。
ポリヌクレオチドは、発現のために、適切な発現ベクターに挿入され得る。
発現ベクターの作製において、コードする配列は、コードする配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるように、発現ベクター内に位置する。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に供され得、そして、本発明の第４の態様のポリヌクレオチドの発現をもたらすことができる、任意のベクター（たとえば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。
発現ベクターの選択は、典型的には、発現ベクターが導入される宿主細胞との発現ベクターの適合性に依存する。
発現ベクターは、直鎖または閉環プラスミドであってもよい。
発現ベクターは、好ましくは、哺乳動物細胞における発現に適合される。
発現ベクターは、自律複製ベクター（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）、すなわち、染色体複製とは独立した染色体外存在物（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）、たとえば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体（ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）、または人工染色体、の複製、として存在するベクターであってもよい。
自律的複製のために、ベクターは、ベクターが、問題の宿主細胞において自律的に複製することを可能にする複製起点をさらに含み得る。
【００８７】
複製起点は、細胞内で機能する自律複製を媒介する任意のプラスミド複製物（ｐｌａｓｍｉｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ）であり得る。
用語「複製起点（ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」または「プラスミド複製物（ｐｌａｓｍｉｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｏｒ）」は、プラスミドまたはベクターが、インビボで複製することを可能にするポリヌクレオチドを意味する。
ベクターは、好ましくは、宿主細胞中に導入される場合、ゲノムに組み込まれ、そして、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものである。
宿主細胞のゲノムへの組み込みのために、発現ベクターは、相同組換えまたは非相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｏｒ  ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によるゲノムへの組込みのために、発現ベクターの任意の他の要素に依存し得る。
あるいは、ベクターは、相同組換えによって、染色体での正確な位置で、宿主細胞のゲノムに組込むために、追加のポリヌクレオチドを含有してもよい。
本発明のベクターは、好ましくは、形質転換、トランスフェクト、形質導入、細胞などの容易な選択を可能にする１つまたはそれ以上の（たとえば、いくつかの）選択可能なマーカーを含む。
【００８８】
選択可能なマーカーは、その産物が、殺生剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｓ）に対する栄養要求性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）などを提供する遺伝子である。
本発明の組換え発現ベクターを構築するために、上記のエレメントを連結するために使用される手順は、当業者に周知である（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、前掲参照）。
一実施形態によれば、第３の態様によるベクターのベクター・バックボーン（ｖｅｃｔｏｒ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）は、ｐＣＤＮＡ３、ｐＣＤＮＡ３．１、ｐＣＤＮＡ４、ｐＣＤＮＡ５、ｐＣＤＮＡ６、ｐＣＥＰ４、ｐＣＥＰ−ｐｕｒｏ、ｐＣＥＴ１０１９、ｐＣＭＶ、ｐＥＦ１、ｐＥＦ４、ｐＥＦ５、ｐＥＦ６、ｐＥｘｃｈａｎｇｅ、ｐＥＸＰＲ、ｐＩＲＥＳ、およびｐＳＣＡＳから選択される。
【００８９】
宿主細胞
第４の態様によれば、本発明は、第３の本発明の態様にしたがって、発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
前述のように、第３の態様による発現ベクターは、発現ベクターが、染色体組込み体（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）として、または、自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞に導入される。
用語「宿主細胞」は、複製中に生じる突然変異のために、親細胞と同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。
宿主細胞の選択は、ポリペプチドおよびその供給源をコードする遺伝子に大きく依存するであろう。
【００９０】
１つの実施形態によれば、融合タンパク質は、哺乳動物の宿主細胞株における発現によって産生される。
融合タンパク質は、好ましくは、ヒト宿主細胞株において産生される。
一般に、任意のヒト宿主細胞株は、融合タンパク質の発現に適している。
融合タンパク質の好ましいグリコシル化は、特に、ヒト腎臓細胞株を用いて、得られる。
好ましいヒト腎臓細胞株は、ＨＥＫ細胞株、特に、ＨＥＫ２９３細胞株である。
グリコシル化ポリペプチドの産生のための、ＨＥＫ細胞株の例は、ＨＥＫ  ２９３  Ｆ、Ｆｌｐ−Ｉｎ（商標）−２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｒ７５００７）、２９３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３）、２９３  ＥＢＮＡ、２９３  Ｈ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  １１６３１０１７）、２９３Ｓ、２９３Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−３２１６（商標））、２９３Ｔ／１７（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ１１２６８（商標）、２９３Ｔ／１７  ＳＦ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＡＣＳ４５００（商標）、ＨＥＫ  ２９３  ＳＴＦ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ３２４９（商標）、ＨＥＫ−２９３．２ｓｕｓ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３（商標）である。
ポリペプチドの産生のための好ましい細胞株は、ＨＥＫ  ２９３  Ｆ細胞株である。
発現のための宿主細胞として適切な他の細胞株には、ヒト骨髄性白血病細胞由来の細胞株が含まれる。
宿主細胞の特定の例は、Ｋ５６２、ＮＭ−Ｆ９、ＮＭ−Ｄ４、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８、ＮＭ−Ｈ９Ｄ８−Ｅ６、ＮＭ  Ｈ９Ｄ８−Ｅ６Ｑ１２、ＧＴ−２Ｘ、ＧＴ−５ｓ、および前記宿主細胞のいずれかに由来する細胞である。
Ｋ５６２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２４３）に存在する、ヒト骨髄性白血病細胞株である。
残りの細胞株は、Ｋ５６２細胞に由来し、そして、特異的なグリコシル化の特徴のために選択された。
【００９１】
融合タンパク質の使用
実施例に示すように、すなわち、たとえば、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、すなわち、ＶＷＦの断片と比較して、融合タンパク質ＯＣＴＡ  １２とＯＣＴＡ  １４における、配列番号１の延長ペプチドは、融合タンパク質の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の増加を導くだけではない。
融合タンパク質のＯＣＴＡ  １２とＯＣＴＡ  １４はまた、ＶＷＦの結合パートナーである、ＦＶＩＩＩと一緒に、患者に投与される場合には、ＦＶＩＩＩの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の増加につながる。
従って、第５の態様によれば、本発明は、第２のタンパク質の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を増加させるための第１の態様にしたがった、融合タンパク質の使用を提供する。ここで、融合タンパク質は、前記第２のタンパク質に結合することができる。
使用はまた、患者に、治療用タンパク質を投与する方法として記載される。ここで、その方法は、たとえば、第１の態様にしたがって、融合タンパク質と一緒にＦＶＩＩＩタンパク質のような、治療用タンパク質を投与することを含む。
【００９２】
組成物およびタンパク質複合体
したがって、本発明によるコンセプト、すなわち、延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）によって提供される半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の延長は、融合タンパク質に限定されるものではなく、追加で、融合タンパク質によって結合される第２のタンパク質の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）も拡張され得る。
したがって、第６の態様によれば、本発明は、第１のタンパク質および第２のタンパク質の組成物を提供する。ここで、前記第１のタンパク質は、第１の態様の融合タンパク質であり、そして、前記第２のタンパク質に結合することが可能であり、そして、前記第２のタンパク質は、第２の哺乳動物タンパク質またはその断片のアミノ酸配列と、同一または類似であるアミノ酸配列を含む治療用タンパク質である。
第１のタンパク質は、共有結合または非共有結合で、第２のタンパク質に結合して複合体を形成し得る。
したがって、本発明はまた、第１のタンパク質と第２のタンパク質の複合体に関する。ここで、前記第１のタンパク質は、第１の態様による融合タンパク質であり、そして、前記第２のタンパク質は、第２の哺乳動物タンパク質またはその断片のアミノ酸配列と同一または類似のアミノ酸配列を有する。
したがって、複合体は、第１のタンパク質を第２のタンパク質に、非共有結合によって、結合することによって形成される。
１つの実施形態によれば、第１のタンパク質は、共有結合的に第２のタンパク質に結合する。
第１および第２のタンパク質の結合を促進するリンカーは、ジスルフィド架橋、ペプチド結合、化学的リンカー、またはグリコシド結合から選択することができる。
あるいは、第１のタンパク質は、非共有結合的に、第２のタンパク質に結合する。
非共有結合について、第一のタンパク質は、特に、前記第２のタンパク質、すなわち、第２のタンパク質結合ドメインに結合することを可能にする特異的な結合ドメインを含む。
第１のタンパク質の配列における、一つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）の配置に依存して、第１のタンパク質の異なる位置に配置することができる。
好ましくは、１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、タンパク質の折り畳まれた状態で、表面に曝される位置に配置される。
一つまたはそれ以上の延長ペプチドは、たとえば、結合ドメインのような第２のタンパク質の結合部位に関連する、任意の位置に配置することができる。
組成物の一実施形態によれば、１つまたはそれ以上の延長ペプチド（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、第１のタンパク質が第２のタンパク質に結合するのを妨げない、第１のタンパク質の折り畳まれた状態の位置に配置される。
一の実施形態によれば、第１のタンパク質（たとえば、ＶＷＦの断片）に結合された、第２のタンパク質（たとえば、ＦＶＩＩＩ）の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）は、第２のタンパク質（たとえば、ＦＶＩＩＩのタンパク質）の遊離の形態と比較して増加される。
好ましくは、第１のタンパク質（たとえば、ＯＣＴＡ  １２）に結合された、第２のタンパク質（たとえば、ＦＶＩＩＩのタンパク質）の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）は、天然の哺乳動物のタンパク質（たとえば、成熟したＶＷＦ）に結合された、前記第２のタンパク質と比較して増加される。
より好ましくは、第１のタンパク質（たとえば、ＯＣＴＡ  １２）に結合された、第２のタンパク質（たとえば、ＦＶＩＩＩのタンパク質）は、融合タンパク質（たとえば、ＯＣＴＡ  １１）を有しないメインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に結合された、前記第２のタンパク質と比較して増加される。
第２の哺乳動物のタンパク質は、上記哺乳動物のタンパク質について同定されたのと同じリストから選択され得る。
しかしながら、組成物または複合体において、第２の哺乳動物のタンパク質は、第１の哺乳動物のタンパク質と同じではない。
【００９３】
一実施形態によれば、第２の哺乳動物のタンパク質は、血液タンパク質、特に、ヒト血液タンパク質である。
好ましくは、第２の哺乳動物のタンパク質は、凝固因子、特にヒト凝固因子である。
一の実施形態によれば、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が、類似または同一である、第２の哺乳類タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｐ００４５１．１の２０〜２３５１のアミノ酸によって特定されたヒト全長ＦＶＩＩＩである。
別の実施形態によれば、メインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）はＦＶＩＩＩであり、ここで、Ｂドメインの少なくとも一部が欠失している。
これに関して、Ｂドメイン全体が欠失していてもよい。
Ｂ領域の欠失部分は、必要に応じて、リンカーに置き換えられる。
リンカー配列は、特に、以下のアミノ酸配列ＳＦＳＱＮＳＲＨＱＡＹＲＹＲＲＧ（配列番号１２）を有する。
Ｂドメインが、リンカーによって置換された、ＦＶＩＩＩの例は、Ｎｕｗｉｑ（登録商標）またはＶｉｈｕｍａ（登録商標）の有効成分である、Ｓｉｍｏｃｔｏｃｏｇ  ａｌｆａ（配列番号１３）である。
【００９４】
一実施形態によれば、ＦＶＩＩＩタンパク質は、患者において免疫応答が低下したヒトＦＶＩＩＩタンパク質である。
ＦＶＩＩＩタンパク質の免疫応答の低下は、好ましくは、ＳＩＧＬＥＣｓ  ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８およびＳＩＧ−９への結合に基づく。
理論に束縛されることを望まないが、抗原提示細胞（たとえば、樹状細胞など）上のＳＩＧＬＥＣＳへの結合は、細胞表面上で、炎症誘発性のダウンレギュレーションおよびの免疫抑制受容体発現のアップレギュレーションを齎す、ということが信じられている。
また、結合は、抗炎症性サイトカインの増強された産生をもたらし、炎症誘発性のサイトカインの産生を低減し、およびその結果、Ｔ細胞増殖および抗体産生の阻害を齎す。
したがって、グリコシル化されたポリペプチドが患者に投与された場合、ＳＩＧＬＥＣｓ、ＳＩＧ−５、ＳＩＧ−７、ＳＩＧ−８およびＳＩＧ−９の結合は、免疫応答の低下または免疫寛容の増加を齎す。
【００９５】
ＳＩＧＬＥＣ結合、そして、その結果、減少した免疫応答は、天然に存在するヒトＦＶＩＩＩのシアリル化コア２および／または拡張コア１  Ｏ−グリカンの数と比較して、シアリル化コア２および／または拡張コア１  Ｏ−グリカンの増加した数またはパーセンテージに基づく。
したがって、一実施形態によれば、ＦＶＩＩＩタンパク質は、天然のヒトＦＶＩＩＩのシアリル化されたコア２および／または拡張されたコア１  Ｏ−グリカンの数と比較して、グリコシル化されたタンパク質において、シアリル化されたコア２および／または拡張されたコア１  Ｏ−グリカンの増加した数またはパーセンテージを示す。
第２のタンパク質がＦＶＩＩＩタンパク質である場合において、第１のタンパク質のメインプロテイン（ｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）は、好ましくは、ＦＶＩＩＩタンパク質に結合することができるようにする、ＦＶＩＩＩ結合ドメインを含む、ＶＷＦの断片である。
組成物の一実施形態によれば、第１のタンパク質は、配列番号３に対して、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９８％、より好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、そして、第２のタンパク質は、配列番号１３に対して、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９８％、より好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸を有する。
【００９６】
組成物の一実施形態によれば、第１のタンパク質は、配列番号６に対して、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９８％、より好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、そして、第２のタンパク質は、配列番号１３に対して、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９８％、より好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸を有する。
組成物の一実施形態によれば、第１のタンパク質は、配列番号９に対して、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９８％、より好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、そして、第２のタンパク質は、配列番号１３に対して、少なくとも９５％、好ましくは、少なくとも９８％、より好ましくは１００％の同一性を有するアミノ酸を有する。
患者の血液において、ＶＷＦの断片、特に、ＯＣＴＡ  １２を含む融合タンパク質は、ＦＶＩＩＩタンパク質への結合において、内因性ＶＷＦと競合するので、組成物は、ＶＷＦの断片、特に、ＯＣＴＡ  １２を、ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、モル過剰で、含む、融合タンパク質を含むことが好ましい。
好ましくは、第１のタンパク質対第２のタンパク質のモル比は、０．１〜２５０の範囲、好ましくは０．５〜５０の範囲、より好ましくは１〜２５の範囲、最も好ましくは２〜１０の範囲である。
安定な非共有結合した複合体形成するため、そして、従って、第２のタンパク質の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の延長を許容するため、平衡解離定数（ＫＤ）によって定義された、第一のタンパク質の、第２のタンパク質に対する、結合親和性は、１０μＭ未満であるべきである。
好ましくは、ＦＶＩＩＩタンパク質に対する、第１のタンパク質におけるＶＷＦ断片の平衡解離定数は、０．０５〜３ｎＭの範囲である。
【００９７】
第１および第２のタンパク質は、別々の組換え発現によって産生され得、そして、その後に結合され得る。
あるいは、第１および第２のタンパク質は、同じ細胞内で組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ）発現される。
このために、第１および第２のタンパク質は、同じベクターまたは２つの異なるベクターでコードされてもよい。
実施例で使用されるＶＷＦの構築物（ＶＷＦ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）、すなわち、ＯＣＴＡ  １２、ＯＣＴＡ  １４およびＯＣＴＡ  １５は、それらのプロタンパク質の形態で発現され、二量体形成に導くか、または、ＯＣＴＡ  １５の場合には、多量体形成に導く。
これらの二量体は、プロペプチドの切断後でさえ無傷のままであり、そして、その結果、二量体中のＶＷＦ構築物のコピーの各々が、ＦＶＩＩＩタンパク質に結合することができる。
したがって、一実施形態によれば、複合体は、第１および第２のタンパク質の２つのコピーを含み、ここで、第１タンパク質の２つのコピーは二量体を形成する。第１のタンパク質のこの二量体は、好ましくは非共有結合の二量体である。
【００９８】
医薬組成物および医薬用途
以上のように、本発明の第１の態様の融合タンパク質、第６の態様の組成物および第７の態様の複合体は、患者の血液中の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）が長くなり、そして、それゆえ、患者の治療効果が増大するという利点を有する。
したがって、第１の態様の融合タンパク質、第６の態様の組成物、および第７の態様の複合体は、特に、治療のための活性成分として有用である。
好ましくは、それらは出血障害の治療または予防に有用である。
本明細書に記載された、第１の態様の融合タンパク質、第６の態様の組成物、特にタンパク質複合体は、単独で、または医薬組成物の形態で投与することができる。
したがって、第８の態様によれば、本発明は、第１の態様の融合タンパク質の医薬組成物、第６の態様の組成物および、第７の態様に係る複合体を提供する。
本発明によれば、医薬組成物は、少なくとも一つの薬学的に許容される担体と共に製剤化された、第１の態様の融合タンパク質、第６の態様の組成物および、少なくとも１つの薬学的に許容される担体で製剤化された第７の態様の複合体の有効量を含んでいてもよい。
【００９９】
実施形態の医薬組成物は、薬学の分野において周知の任意の方法によって調製され、被験体に投与され得る。
たとえば、以下を参照してください。
グッドマン・アンド・ギルマン（Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ）の「ＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｈａｒｄｍａｎら編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（第１０版、２００１年）；
レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ薬学の科学と実践、ジェンナロ編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（第２０版、２００３年）；および
薬学的投薬形態および薬物送達システム Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｎｓｅｌら（編）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（７版、１９９９年）。
【０１００】
さらに、実施形態の医薬組成物は、他の医学的に有用な薬物または生物学的薬剤を含むように製剤化することもできる。
医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体と組み合わせて、治療上有効な量の融合タンパク質をまたはタンパク質複合体を含む。
薬学的に許容される担体は、当技術分野で公知または確立された任意の担体である。
例示的な薬学的に許容される担体は、無菌の発熱物質を含まない水および無菌の発熱物質を含まない生理食塩水を含む。
本実施形態に利用できる他の形態の薬学的に許容される担体には、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、吸収促進剤、保湿剤、吸収剤、潤滑剤、充填剤、増量剤、湿気付与剤、保存剤、安定剤、乳化剤、溶剤、浸透圧を制御する塩、緩衝剤のような希釈剤、および、製剤の使用形態に応じて通常使用される賦形剤を含む。
これらは、得られる製剤の単位用量に応じて、所望により選択して使用される。
したがって、本発明の第９の態様はまた、患者の出血性疾患の治療または予防の方法に関し、この方法は、第８の態様に係る医薬組成物を、前記患者に投与することを含む。
【０１０１】
本明細書で使用される「出血性障害」は、正常な止血を損なう疾患または状態を指す。出血性障害は、たとえば、血友病Ａ、血友病Ｂ、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠損症、フォン・ウィルブランド病、グランツマン症候群（Ｇｌａｎｚｍａｎｎ’ｓ  Ｔｈｒｏｍｂａｓｔｈｅｎｉａ）、バーナード・スーリエ症候群、特発性血小板減少性紫斑病（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ）、大脳内出血、外傷、外傷性脳損傷などであり得る。
本明細書で使用される「血友病」は、血友病のない健康な個体における血餅（ｂｌｏｏｄ  ｃｌｏｔ）形成時間と比較して血餅（ｂｌｏｏｄ  ｃｌｏｔ）形成時間の増加に関連する出血障害の群を指す。
【０１０２】
血友病は、欠陥第ＶＩＩＩ因子の産生をもたらす障害である血友病Ａ、欠陥第ＩＸ因子の産生をもたらす障害である血友病Ｂ、および、凝固因子（Ｆ）ＶＩＩＩに対する自己抗体によって引き起こされる稀な出血性疾患である後天性血友病Ａを含む。
出血性障害は、好ましくは、血友病ＡまたはＢである。
治療は、たとえば、ＰＵＰＳ（以前に未治療の患者）の血友病治療または免疫寛容誘導（ＩＴＩ）治療および／または血友病の他の関連治療であり得る。
インビボ用途では、医薬組成物は、たとえば、経口的に、非経口的に、または吸入のような、任意の慣用の投与経路によって、患者に投与することができる。
非経口投与は、静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射、筋肉内注射、液剤、懸濁剤、乳剤および滴下剤を含む。
非経口投与のためには、医薬組成物は、液剤または懸濁液などの注入可能な薬剤でなければならない。
他の実施形態では、医薬組成物は、患者に経口投与される。
これらの実施形態では、薬物の形態は、錠剤、被覆錠剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤および丸剤などの固体製剤、液剤（たとえば点眼剤、点鼻剤）、懸濁剤、乳剤およびシロップ剤などの液体製剤、エアロゾル剤、アトマイザーおよびネブライザーなどの吸入剤、およびリポソーム封入剤を含む。
さらにいくつかの他の実施形態では、グリコシル化ポリペプチド、タンパク質複合体または医薬組成物は、被験者の気管および／または肺を標的とするために、患者の気道への吸入によって投与される。
第８の態様の一の実施形態によれば、使用は、静脈内または非静脈内注射を含む。
非静脈内注射は、好ましくは皮下注射である。
この開示に引用されているすべての刊行物および特許は、その全体が参考として援用される。
参照により組み込まれる資料が、本明細書と矛盾するかまたは不一致である限り、本明細書はそのような資料よりも優先する。
【０１０３】
実施例
実施例１
ＶＷＦタンパク質の組換え発現
以下の組み換えＶＷＦタンパク質を、Ｃ末端Ｓｔｒｅｐタグを有するＨＥＫ細胞株２９３Ｆ中で一時的に発現させ、StrepTactinアフィニティークロマトグラフィー（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）によって精製した。
−  ＯＣＴＡ  １１
−  ＯＣＴＡ  １２
ＯＣＴＡ  １２は、本発明による融合タンパク質である。
ＯＣＴＡ  １１は、比較用のＶＷＦ断片である。
ＶＷＦタンパク質は、図１に、概略的に示されている。
Ｐｒｏ−タンパク質の発現は二量体の形成をもたらす。
ペプチド二量体は、プロペプチドの切断後にも残る。
【０１０４】
遺伝子の合成とクローニング
最初のステップとして、ＶＷＦタンパク質のプロタンパク質をコードする遺伝子は、ＧｅｎｅＡｒｔ（サーモ  フィッシャー  サイエンティフィック）によって合成された。
−      Ｐｒｏ−ＯＣＴＡ  １１
−      Ｐｒｏ−ＯＣＴＡ  １２
プロタンパク質をコードする遺伝子を、Ｔｗｉｎ−Ｓｔｒｅｐタグを含む、ｐＤＳＧ発現ベクター（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）にクローニングした。
ＴＯＰ１０大腸菌（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）の個々の培養物を、ベクター構築物で形質転換し、そして、アンピシリン含有ＬＢ寒天プレート上で、３７℃で、一晩インキュベートした後に、単一クローンを選択した。
プラスミドＤＮＡの調製は、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  ＭｉｎｉまたはＭａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造者の推奨に従って行った。
シーケンシングによって、ベクターの完全性が確認された。特に、Ｐｒｏ−ＯＣＴＡ  １１、Ｐｒｏ−ＯＣＴＡ  １２をコードする遺伝子の、正しいオリエンテーション（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）と完全性が検証された。
【０１０５】
タンパク質発現
ＶＷＦタンパク質の真核生物のおける発現のために、ＭＥＸｉ  トランスフェクション培地（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）で増殖させた、ＭＥＸｉ−２９３細胞（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）を、４．５ｍｇ／ｍｌの２５ｋＤａの直線状ポリエチレンイミンを用いた、構築物（constructs）１．５ｍｇ／ｌでトランスフェクトした。
３７℃で、５％ＣＯ２および１００−１５０ｒｐｍで、２〜４時間インキュベートした後、培養物を、ＭＥＸｉ  トランスフェクション培地で、１：２に希釈し、そして、細胞生存率が７５％に達するまで培養を続けた。
その後、上清を、４℃で、３００×ｇで遠心分離して細胞から分離した。
細胞培養培地中のビオチンの阻害効果を最小にし、そして、ｐＨを調整するために、０．１容量の緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）および０．０９％（ｖ／ｖ）ＢｉｏＬｏｃｋ溶液（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）を上清に加え、そして、４℃で、２０分間インキュベートした。
【０１０６】
タンパク質の精製
遠心分離後、上清を、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ  ＸＴカラム（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）にアプライし、洗浄緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で、５回洗浄し、そして、結合したＳｔｒｅｐ−タグ含有タンパク質を、溶出緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのデスチオビオチン、ｐＨ８．０）で溶出した。
【０１０７】
実施例２
ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦダブルノックアウト（ＤＫＯ）マウスに、ＦＶＩＩＩを、同時投与したときの、完全長ＶＷＦまたはＶＷＦタンパク質の、ＦＶＩＩＩの半減期（half-life）に対する影響
【０１０８】
２．１  背景
この実験で、実施例１にしたがって製造したＶＷＦタンパク質および完全長の、血漿由来のＶＷＦ（ｐｄＶＷＦ）のＦＶＩＩＩの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）に対する効果を試験した。
完全長ＶＷＦおよびＦＶＩＩＩは、非共有結合複合体を形成する結合パートナーであることが知られている。
循環中のＦＶＩＩＩの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）は、主に、ＶＷＦの循環半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）によって決定される。
血清において、内因性ＶＷＦは、投与されたＶＷＦタンパク質（断片）とＦＶＩＩＩとの結合において競合するので、この競合は、ＦＶＩＩＩの半減期（half-life）に対して、投与されたＶＷＦタンパク質の任意の影響を及ぼすであろう。
したがって、本実験では、ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦ（ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ−ＤＫＯ）のダブルノックアウトであるＣ５７Ｂｌ／６マウスを、ＦＶＩＩＩの半減期（half-life）に対するＶＷＦの影響を評価するためのモデル生物として使用した。
【０１０９】
２．２  実験手順
２．２．１  ＦＶＩＩＩを含む製品
以下のＦＶＩＩＩ含有製品が生産された：
１）ＦＶＩＩＩ単独
２）ＦＶＩＩＩおよびＯＣＴＡ  １１
３）ＦＶＩＩＩおよびＯＣＴＡ  １２
４）ＦＶＩＩＩとｐｄＶＷＦ
ＶＷＦのタンパク質ＯＣＴＡ  １１とＯＣＴＡ  １２は、実施例１に記載したように製造した。
ｐｄＶＷＦは、ＶＷＦ濃縮物、「Ｗｉｌａｔｅ」（オクタファルマ）であった。
ＦＶＩＩＩは、Ｂドメイン削除のヒト細胞株ＦＶＩＩＩ（Ｎｕｗｉｑ、オクタファルマＯｃｔａｐｈａｒｍａ）であった。
Ｎｕｗｉｑ製品は、以下の緩衝液組成物を含有する：
【０１１０】
アルギニン塩酸塩        ２５．６ｍＭ
スクロース              １５．８ｍＭ
ＮａＣｌ                ３０８ｍＭ
プルロニックＦ６８      ０．１４ｍＭ
クエン酸ナトリウム      ３．６ｍＭ
塩化カルシウム          ２．０ｍＭ
ＦＶＩＩＩを含む製品２）〜４）における、ＦＶＩＩＩに対する、ＶＷＦタンパク質のモル比は５：１であった。
ＶＷＦのタンパク質が、Ｎｕｗｉｑ製品（ＦＶＩＩＩ）に添加された。
【０１１１】
２．２．２  ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ−ＤＫＯマウス株
ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦがダブルノックアウト（ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ−ＤＫＯ）の、Ｃ５７Ｂｌ／６  マウスを使用した。
【０１１２】
２．２．３  製品の投与
４つのＦＶＩＩＩを含有する製品が、２０匹のＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ−ＤＫＯマウスに、尾静脈注によって、２４０  ＩＵ  ＦＶＩＩＩ／キログラム（〜６  ＩＵ／１匹のマウス）の用量で投与された。
【０１１３】
２．２．４  サンプリングと解析
マウスの血液試料を、ＦＶＩＩＩを含む製品で処理した後、５分および１、４、８、１２、２４、３６および４８時間で採取した。血液サンプルは、マウスの後眼窩叢から得た。
各時点について、ＦＶＩＩＩ含有製品あたり、５匹のマウスからの血液試料を得て、そして、個々に分析した。
各マウスを５分の時点、そして、最大で２つのさらなる時点で、サンプリングした。
各血液試料中の、ＦＶＩＩＩ活性を、発色アッセイ（クロモゲニックスＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＸ）を用いて分析した。
【０１１４】
２．３  結果
血液試料中のＦＶＩＩＩ活性値を用いて、ＦＶＩＩＩ含有製品の各々についてのＦＶＩＩＩ活性の時間経過を、図２に示すように決定した。
各時点およびＦＶＩＩＩ含有製品について、５匹の動物の血液試料を測定した。図２のダイヤグラムにおける各データポイントは５つの値の平均を表す。
さらに、個々の時点でのＦＶＩＩＩ活性は、処置の５分後の％ＦＶＩＩＩ活性として与えられ、これは、ＦＶＩＩＩ含有製品のそれぞれに対して１００％活性として定義された。
５つの製品におけるＦＶＩＩＩの半減期は、個々の血漿濃度−時間曲線の対数線形部分の線形回帰分析（ｌｉｎｅａｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｏｇ−ｌｉｎｅａｒ  ｐｏｒｔｉｏｎ）を用いて、カーブフィッティング（ｃｕｒｖｅ  ｆｉｔｔｉｎｇ）後に、または一相指数関数的減衰モデル（ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｏｎｅ−ｐｈａｓｅ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｄｅｃａｙ  ｍｏｄｅｌ）を用いて非線形回帰によって、計算された。
計算のために使用されるソフトウェアプログラムは、グラフパッド・プリズムバージョン６．０７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０７）（ラ・ホヤ、ＣＡ９２０３７、米国）とウィンノンリン（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ）、バージョン６．４（ファーサイト社（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ）、マウンテンビュー、ＣＡ、米国）である。
計算は次の式に基づく。
2019522962.tif 000015
その結果を表１にまとめる。
【０１１５】
2019522962.tif 000016
これらの数字から、ＦＶＩＩＩとＶＷＦタンパク質のいずれかとの共投与が半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の増加をもたらすことは明らかである。
ＦＶＩＩＩをｐｄＶＷＦと共に共投与すると、ＦＶＩＩＩの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）は、〜４．６倍の増加を齎す（０．３１）。
ＶＷＦのタンパク質ＯＣＴＡ  １１と同時投与したＦＶＩＩＩは、０．４５時間（約１．４倍増加）の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）に匹敵する増加を示した。
【０１１６】
驚くべきことに、ＶＷＦのタンパク質ＯＣＴＡ  １２との同時投与は、１．０３時間のＦＶＩＩＩ半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を与え、それは、ｆｌＶＷＦと比較して、約３．２倍の増加を表す。そのファクターは、ＦＶＩＩＩと比較したとき、１４．７倍である。
ＯＣＴＡ  １２に存在する、追加のＯ−グリカン反復は、ＶＷＦ断片と、次いでＶＷＦ／ＦＶＩＩＩ複合体に対して、顕著な半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を延長させる効果を齎すことを、この結果は示す。
また、この結果は、真性Ｏ−グリカンのクラスターのコピーの追加が、タンパク質の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を増加させることができることを示す。
【０１１７】
実施例３
ミニブタに、ＩＶおよび皮下注射（ＳＱ）した後の、ＦＶＩＩＩおよびＶＷＦ  ＯＣＴＡ  １２の薬物動態プロファイル
【０１１８】
３．１  背景
薬剤のＳＱ送達は、凝固因子の分野においてますます興味深くなってきている。
しかし、非常に低い回収のために、このルートは、ＦＶＩＩＩの投与のために、まだ適用可能ではなかった。
ミニブタは、表皮のヒトの構造に非常に類似しているため、薬物のＳＱ投与を試験するための最もよく知られた動物モデルである。
この実験の目的は、ＳＱルートを介して、ミニブタに、単独で、またはＯＣＴＡ１２を、５倍モル過剰に投与した場合に、ＶＷＦ  ＯＣＴＡ  １２およびＦＶＩＩＩの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）の評価であった。
さらに、従来のＩＶ経路を介して単独で投与された場合の、ＦＶＩＩＩの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を、ＶＷＦ  ＯＣＴＡ  １２を含むまたは含まない、ＳＱで投与されたＦＶＩＩＩと比較した。
【０１１９】
３．２  実験手順
１０〜１４ヵ月齢の９匹のメスのＡａｃｈｅｎｅｒミニブタをこの研究に使用した。
体重は、１３．７〜１９．５ｋｇであった。
ＩＶ注入は、側耳静脈（ｔｈｅ  ｌａｔｅｒａｌ  ｅａｒ  ｖｅｉｎ）で行われ、ＳＱ注入は、鼠径部（ｉｎｇｕｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）の皮膚下であった。
用量は、１００  Ｕ  ＦＶＩＩＩ／ｋｇ体重（ＢＷ）であり、１群あたり３匹の動物を各製品で処置した：
−グループ１：ＦＶＩＩＩ単独  ＳＱ
−グループ２：ＯＣＴＡ  １２とＦＶＩＩＩ  ＳＱ
−グループ３：ＦＶＩＩＩ単独  ＩＶ
動物およびサンプリング時間当たり、２×２００μＬのクエン酸ナトリウム血漿を得るために、それぞれ、以下の時点（０（投与前）、投与後、０．５、１、２、４、８、２４、３２、４８、７２、９６および１２０時間後）で、十分な血液を全ての動物の頸静脈（ｖｅｎａ  ｊｕｇｕｌａｒｉｓ）から採取した。
全血液を、抗凝固剤として、クエン酸ナトリウム（０．１５Ｍ）を含むチューブに採取し、そして、ＩｓｏＴｈｅｒｍ−Ｒａｃｋシステム（エッペンドルフ）を用いて直ちに冷却した。
採血から３０分以内に、遠心分離により血漿を分離した。
遠心分離の直後に、血漿サンプルを凍結させ、そして、運搬まで、−２０℃以下で保存した。
各試料を、Ａｓｓｅｒａｃｈｒｏｍアッセイキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ）を用いて、ＦＶＩＩＩ抗原について試験した。
ＯＣＴＡ  １２を、以下のように、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて定量した：Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）ＸＴ被覆マイクロプレート（ＩＢＡ  ＧｍｂＨ）をブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ）で、ＲＴで、２時間ブロックした。
血漿試料を、ブロッキングバッファー（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）１：１５で希釈し、そして、プレート上に適用した。
３７℃で２時間インキュベートした後、ＶＷＦ断片を、抗ＶＷＦ  ｐＡｂ（Ｄａｋｏ  Ｐ０２２６）で検出した。
各インキュベーションの後、プレートをＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。
分析データの薬物動態学的評価を、ウィンノンリン（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ）、バージョン６．４（ファーサイト社（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、マウンテンビュー（  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ）、ＣＡ、米国）を使用して行った。
【０１２０】
３．３  結果
図３は、ＦＶＩＩＩ／ＶＷＦ  ＯＣＴＡ１２混合物のＳＱ投与後、ミニブタ血漿中のＶＷＦ  ＯＣＴＡ１２の濃度の経時変化を示す。
表２にまとめたように、ＯＣＴＡ１２は、２１９．３１の半減期（half-life）で循環した。
半減期（half-life）は、実施例２に記載したように測定した。
【０１２１】
2019522962.tif 000017
【０１２２】
フォン・ヴィレブランド病（ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＶＷＤ）のブタにおいて、完全長の組換えヒト（ｒｈＶＷＦ）の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）は、〜１０から１６時間であり、そして、血漿由来のブタのＶＷＦの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）は、１０〜１８時間である（ニコルズら）。
ＦＶＩＩＩ結合ドメインのみを含むＶＷＦ断片の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）は、Ｙｅｅらによって示されるように、ＶＷＦ欠損マウスにおいて、ｆｌＶＷＦの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）より短い。
したがって、ＯＣＴＡ  １２の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）は、ブタにおける、ｒｈＶＷＦの半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）よりも、約１４〜２２倍長い
さらに、ＦＶＩＩＩ半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）に対する有意な延長効果もまた、観察された。
図４に示され、そして、表３に纏められたように、ＯＣＴＡ  １２と一緒に投与されたとき、ＦＶＩＩＩは、２５．３時間の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を有する。これは、同じルート（ＳＱ）を介して、単独で投与されたＦＶＩＩＩと比較した場合の半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）において、減期で６．７倍の増加、そして、従来のＩＶ経路を介して単独で投与されたＦＶＩＩＩと比較した場合の３．９倍の改善を示した。
【０１２３】
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【０１２４】
多くの改変および本明細書に記載された発明の他の実施形態は、前述の説明および関連する図面において提示された教示の利益を有することを、本発明が関係する当業者は理解するであろう。
したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、そして、修飾および他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることを理解されたい。
本明細書では特定の用語を使用しているが、それらは一般的かつ説明的な意味でのみ使用され、限定のためではない。
【０１２５】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019522962.tif 000024
2019522962.tif 000025