(57)【要約】  本発明はウォールナットオリゴペプチド粉、その調製方法及び使用に関する。前記オリゴペプチド粉のペプチド含有量が80wt%以上であり、そのうち95%以上のウォールナットペプチドは、分子量が1500Dalton未満である。前記方法は、高効率向流抽出法でウォールナットタンパク質を抽出し、濾過及び酵素分解を行い、得られたタンパク質酵素分解液を順次に精密濾過膜と限外濾過膜を通じて高効率分離と精製を行い、その後濃縮噴霧して、オリゴペプチド粉を得ることを含む。前記ウォールナットオリゴペプチド粉は良好な耐酸化活性を有し、記憶力の衰退を著しく改善又は治療し、ニューロン細胞に対して良好な保護作用を有し、有効に運動疲労又は脳疲労を緩和する。
2019506451.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウォールナットオリゴペプチド粉であって、GB/T 22492-2008付録Aと付録Bに記載された検出方法により得られたペプチド含有量が80wt%以上であり、そのうち95%以上のウォールナットペプチドは、分子量が1500Dalton未満であり、
下記の分子量分布を有し、
【数１】
2019506451.tif 000020
好ましくは、前記ペプチド含有量が81wt%以上であり、分子量が1500Dalton未満のウォールナットペプチドが97％以上であり、より好ましくは、ペプチド含有量が81.3wt%以上であり、分子量が1500Dalton未満のウォールナットペプチドが96％以上であり、さらに好ましくは、ペプチド含有量が85wt%以上であり、分子量が1500Dalton未満のウォールナットペプチドが97％以上であり、最も好ましくは、ペプチド含有量が85wt%以上であり、分子量が1500Dalton未満のウォールナットペプチドが96％以上であることを特徴とする、ウォールナットオリゴペプチド粉。
【請求項２】
コールドプレスにより脱脂されたウォールナット粕に対して高効率向流抽出法でそのタンパク質を抽出し、濾過及び酵素分解を行い、タンパク質の酵素分解液を順次に精密濾過膜と限外濾過膜を通じて高効率分離と精製を行い、その後、濃縮噴霧してウォールナットオリゴペプチド粉を得る工程を含むことを特徴とする、請求項1に記載のウォールナットオリゴペプチド粉の調製方法。
【請求項３】
ウォールナットのシェルを除去し、コールドプレスで脱油し、脱脂されたウォールナット粕を得る、ウォールナット粕の前処理工程と、
Aで表記される一定量の脱脂されたウォールナット粕と、水とを質量比1:5~1:15で混合し、pHを9〜11に調整して室温で1〜2時間抽出し、抽出終了後、濾過し、残渣を2回抽出し、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ、Bで表記し、pHを9〜11に調整して室温で1〜2時間抽出し、Bの一回目の抽出が終了した後、濾液を一旦置き、残渣を2回抽出し、その後、Aの二回目の抽出が終了した後、濾過残渣を捨て、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ、Cで表記し、pHを9〜11に調整して室温で1〜2時間抽出し、Bの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液をCの一回目抽出後の残渣に注ぎ1〜2時間抽出し、Cの一回目抽出後の濾液を一旦置き、Cの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を一旦置き、最後に、上記置かれた各濾液を合わせて、pHを3〜5に調整して0.5〜2時間静置して、上澄み液を捨て、その後、沈殿物に体積比1:10~1:20で水を注ぎ、均一に攪拌して、ウォールナットタンパク液を得る、高効率向流抽出法によるタンパク質抽出工程と、
前記ウォールナットタンパク液を40〜55℃まで加熱し、pHを中性とし、ウォールナット粕の質量の0.5〜2％の生物酵素を添加し、攪拌しながら酵素分解を3〜6時間行い、沸騰まで加熱し、30分不活性化させ、遠心分離し、上澄み液としてタンパク質酵素分解液を得る、タンパクの酵素分解工程と、
タンパク質酵素分解液を細孔径0.1〜0.5μmの精密濾過膜で濾過し、得られら濾液を2000〜20000 Daltonの限外濾過膜で処理した後、分画液を50〜80℃で固体含有量3〜5wt%に濃縮し、入口温度140〜160℃かつ出口温度55〜65℃の噴霧乾燥を行い、収率20〜30wt%でウォールナットペプチド粉を得る、分離精製工程と
を含むことを特徴とする、請求項2に記載の調製方法。
【請求項４】
前記生物酵素は食品グレードの中性プロティナーゼ（酵素活性≧30万u/g）、パパイン（酵素活性≧40万u/g）、ブロメライン（酵素活性≧30万u/g）、アルカリプロテアーゼ（酵素活性≧20万u/g）、ペプシン（酵素活性≧50万u/g）、トリプシン（酵素活性≧3000u/g）からなる群より選ばれた一種又はこれらの混合物であり、中性プロティナーゼ又は複合酵素を用いることが好ましく、前記複合酵素における中性プロティナーゼとパパインとの質量比が1:1であり、中性プロティナーゼの活性は30万u/gであり、パパインの活性は50万u/gであることを特徴とする、請求項3に記載の調製方法。
【請求項５】
請求項1に記載のウォールナットオリゴペプチド粉と、薬物、食品、保健品又は化粧品において許容される助剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項６】
その剤型は、裸錠、フィルムコーティング錠、糖衣錠、腸衣錠、分散錠、カプセル、顆粒剤、経口溶液又は経口懸濁液、及び液体、エマルション、クリーム、粉、塊などの化粧品の剤型であることを特徴とする、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
請求項1に記載のウォールナットオリゴペプチド粉の、ラジカルの過剰による症状を治療・予防する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、記憶力の衰退を改善又は治療する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、パーキンソン病とアルツハイマー病を治療又は予防し、脳疲労又は運動疲労を緩和する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、免疫力を強化する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、好ましくは記憶力の衰退を改善又は治療する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用。
【請求項８】
請求項1に記載のウォールナットオリゴペプチド粉の、中枢神経を保護する薬物、食品又は保健品の調製における使用、運動能力を改善する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、体内乳酸代謝に対する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、Aβ1-42アミロイド凝集に対する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、細胞内炎症免疫因子を調節する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、胎児神経突起成長の薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用、ヒト野生型tauタンパクの胎児における神経細胞に対する毒性作用を低減する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチド含有量が80wt%以上であり、分子量が1500Dalton未満のウォールナットオリゴペプチドが95%以上である高純度、低分子量を有するウォールナットオリゴペプチド製品に関する。さらに、本発明はウォールナットタンパク質を調製し、触媒酵素分解を行うことによりオリゴペプチド粉を生成させる調製方法にも関する。当該ペプチド粉は薬物、食品、保健品または化粧品に用いられる。本願は中国特許出願CN201610043952.0に基づく優先権を主張し、当該中国特許出願の内容のすべてを参考として本願に援用する。
【背景技術】
【０００２】
ウォールナット（Juglans regia L）は、胡桃とも呼ばれ、有名な4種ナットの一つとして、高い栄養価値や薬用価値を有する。中国の古い医学書類には、明確に記載されている。李時珍「本草綱目」によると、「補気養血、潤燥化痰、益命門、利三焦、温肺潤腸。治虚寒喘咳、腰脚重疼，心腹疝痛，血痢腸風，散腫毒」と記載され、宋劉翰「開寶本草」において、「胡桃（すなわちウォールナット）味甘、平、無毒。食べると肥健し、潤肌黒髮、実を黒く焼き、未斷煙時に松脂と混合し、研傅瘰癧(るいれき)瘡」と記載されている。唐Mengshen「食療本草」によると，ウォールナット実が「通經脈、黒鬚髮、常に食べると肌潤い」と記載されている。崔禹錫の「食經」には、「多く食べると小便に利し、五痔も去る」と記載され、「醫林纂要」により“補腎、潤命門、固精，潤大腸、通熱秘、止寒瀉虚瀉」と評価された。
【０００３】
ウォールナットはタンパク質、脂肪などの栄養成分に富み、その含有量が比較的均衡であり、望ましい高タンパク、高脂肪の食物に属する。ウォールナットの実には油脂（ほとんど不飽和脂肪酸）が52%〜70%と多く含まれており、さらに約24%のタンパク質、12%〜16%の炭水化物、1.5%〜2%のセルロース及び1.7%〜2%の鉱物質が含まれると報告されている。ウォールナットには、人体に必要とするアミノ酸が多く含まれ、その割合も適切であり、そのうち、人体の生理作用に重要な役割を果たすグルタミン酸、アスパラギン酸及びアルギニンの含有量はいずれも高いであり、なかでも、グルタミン酸は人体に、特に青少年の知力及び記憶の発育に影響を与える重要な機能物質である。
【０００４】
ウォールナットプロタンパクよりも栄養、機能かつ生物学的活性において優れたオリゴペプチド粉を調製するために、多くの調製方法が試みられていた。特許CN101228918Aでは、ウォールナット粕を粉砕し、超音波法でウォールナットタンパクを抽出し、真空乾燥してからプロティナーゼで酵素分解を行い、遠心分離し、透析バッグで上澄み液を透析し、透析液を濃縮して真空乾燥させた後、含有量が60％〜80％であるペプチドを得た。この方法は操作が複雑であり、ペプチド含有量が低く、ペプチドの分子量分布も不明確であるとともに、超音波でウォールナットタンパクを抽出し、透析バッグで精製するため、大規模な調製はできない。特許出願CN102406050Aでは、アルカリ抽出酸沈殿の方法でタンパク質を抽出し、凍結乾燥によってウォールナットタンパク粉を得、該ウォールナットタンパク粉を酵素分解した後、300MPaの高圧で10分間処理し、凍結乾燥によってウォールナットペプチド粉を得た。当該調製方法では、超高圧設備と凍結乾燥装置が必要であるため、コストが高く、大規模な生産に適していない。当該特許出願はかかる方法により調製されるウォールナットペプチド粉の分子量分布を提供したが、その製品におけるペプチド含有量は不明確である。特許CN103103244Bでは、アルカリ抽出酸沈殿の方法でタンパク質を抽出し、マイクロ波と超音波とを併用して処理した後、酵素分解によりポリペプチド粉を得た。当該方法もまだ大規模な生産に適せず、且つ酵素分解による製品中のペプチド含有量を測定しなかった。特許出願CN104293870Aでは、まずCO2超臨界抽出装置で油脂を除去して、得られたウォールナット粕をアルカリ抽出酸沈殿した後、噴霧によりウォールナットタンパク粉を得た。次に、このタンパク粉を懸濁液とし、沸騰まで加熱することによりタンパク質の構造を破壊し、アルカリプロテアーゼ、パパイン、中性プロティナーゼとブロメラインを用いて4ステップでウォールナットタンパク液を酵素分解し、5000Daltonまたは8000Daltonの限外濾過膜により精製した後、イオン交換樹脂で脱塩を行い、最後に噴霧乾燥してウォールナットペプチド粉を得た。当該特許出願では、油脂を除去するために超臨界抽出装置を使用する必要があり、コストが高くなり、大規模に生産しにくい。また、四種の酵素を用いて4ステップで酵素分解を行うため、煩雑なプロセスとなり、コストも高い。また、酵素分解を行った後、精密濾過膜により不純物の除去がなく、そのまま限外濾過膜の濾過に供するため、限外濾過膜が塞がれやすく、限外濾過時間が長くなり、ポリペプチドの収率を低減するとともに、限外濾過膜の寿命が短縮される。当該特許はポリペプチドの製品におけるペプチドの百分含有量とペプチドの分子量分布に関しない。
【０００５】
上記によって、上記のウォールナットポリペプチドの調製方法は、調製条件が厳しく、プロセスも煩雑であるため、大規模な生産を実現するのは難しい。従って、プロセスが簡単で、コストが低く、含有量が高く、活性が比較的高いウォールナットポリペプチドの調製方法を求めることは、大規模な生産の検討焦点の一つとなっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、高純度、低分子量のウォールナットオリゴペプチド粉を提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、高純度、低分子量のウォールナットオリゴペプチド粉の調製方法を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、本発明のウォールナットオリゴペプチド粉の、ラジカルの過剰による症状を治療又は予防する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用を提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、本発明のウォールナットオリゴペプチド粉の、記憶力の衰退を改善・治療する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、本発明のウォールナットオリゴペプチド粉の、パーキンソン病とアルツハイマー病を治療又は予防し、脳疲労又は運動疲労を緩和する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、本発明のウォールナットオリゴペプチド粉の、免疫力を強化する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製における使用を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、本発明のウォールナットオリゴペプチド粉を含む薬物、食品、保健品又は化粧品組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は下記の発明により実現される。
ウォールナットオリゴペプチド粉であって、GB/T 22492-2008付録Aと付録Bに記載された検出方法により得られたペプチド含有量が80wt%以上であり、そのうち95%以上のウォールナットペプチドは、分子量が1500Dalton未満であり、下記の分子量分布を有し、
【数１】
2019506451.tif 000003
好ましくは、ペプチド含有量が81wt%以上であり、分子量が1500Dalton未満のウォールナットオリゴペプチドが97％以上であり、より好ましくは、ペプチド含有量が81.3wt%以上であり、分子量が1500Dalton未満のウォールナットオリゴペプチドが96％以上であり、さらに好ましくは、ペプチド含有量が85wt%以上であり、分子量が1500Dalton未満のウォールナットオリゴペプチドが97％以上であり、最も好ましくは、ペプチド含有量が85wt%以上であり、分子量が1500Dalton未満のウォールナットオリゴペプチドが96％以上である。
【００１４】
前記ウォールナットオリゴペプチド粉は下記の方法により調製されるものである。
（1）ウォールナット粕の前処理
ウォールナットのシェルを除去し、コールドプレスで脱油し、脱脂されたウォールナット粕を得る。
（2）向流抽出法によるタンパク質抽出
一定量の脱脂されたウォールナット粕（Aで表記される）と水とを質量比1:5~1:15で混合し、pHを9〜11に調整して室温で1〜2時間抽出する。抽出終了後、濾過し、残渣を2回抽出し、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ（Bで表記される）、pHを9〜11に調整して室温で1〜2時間抽出する。Bの一回目の抽出が終了した後、濾液を一旦置き、残渣を二回目の抽出に供する。Aの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ（Cで表記される）、pHを9〜11に調整して室温で1〜2時間抽出する。Bの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を、Cの一回目抽出後の残渣に注ぎ、1〜2時間抽出し、Cの一回目抽出後の濾液を一旦置く。Cの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を一旦置く。最後に、上記置かれた各濾液を合わせ、pHを3〜5に調製して0.5〜2時間静置し、上澄み液を捨てる。最後に、沈殿物に体積比1:10~1:20で水を注ぎ、均一に攪拌する。
（3）タンパクの酵素分解
前記ウォールナットタンパク液を40〜55℃まで加熱し、pHを中性とし、ウォールナット粕の質量の0.5〜2％の生物酵素を添加し、攪拌しながら酵素分解を3〜6時間行い、沸騰まで加熱し、30分間不活性化させ、遠心分離し、上澄液としてタンパク質酵素分解液を得る。
（4）分離精製
タンパク質酵素分解液を細孔径が0.1〜0.5μmの精密濾過膜で濾過し、得られた濾液を2000〜20000 Daltonの限外濾過膜で処理した後、分画液を50〜80℃で固体含有量3〜5wt%に濃縮し、入口温度140〜160℃且つ出口温度55〜65℃の噴霧乾燥を行い、高純度、低分子量を有する淡黄色のウォールナットペプチド粉を得る。収率は20〜30wt%であり得る。
（5）ペプチド含有量と分子量分布の測定
GB/T 22492-2008付録Aと付録Bに記載された検出方法により測定したところ、ペプチド含有量が80wt%以上であり、そのうち95%以上のウォールナットペプチドは、分子量が1500Dalton未満である。
【００１５】
前記生物酵素は食品グレードの中性プロティナーゼ（酵素活性≧30万u/g）、パパイン（酵素活性≧40万u/g）、ブロメライン（酵素活性≧30万u/g）、アルカリプロテアーゼ（酵素活性≧20万u/g）、ペプシン（酵素活性≧50万u/g）、トリプシン（酵素活性≧3000u/g）からなる群から選ばれる一種又はこれらの混合物であり、中性プロティナーゼ又は複合酵素を用いることが好ましい。前記複合酵素における中性プロティナーゼとパパインとの質量比が1:1であり、中性プロティナーゼの活性は30万u/gであり、パパインの活性は50万u/gである。
【００１６】
本発明のウォールナットオリゴペプチド粉と、薬物、食品、保健品又は化粧品において許容される助剤とを含む組成物。
【００１７】
従来技術によれば、本発明は、前記組成物を任意な剤型、例えば、裸錠、フィルムコーティング錠、糖衣錠、腸衣錠、分散錠、カプセル、顆粒剤、経口溶液又は経口懸濁液、及び液体、エマルション、クリーム、粉、塊などの化粧品の剤型に調製できる。
【００１８】
本発明の前記ウォールナットオリゴペプチド粉は、ラジカルの過剰による症状を治療又は予防する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製に用いることができ、記憶力の衰退を改善又は治療する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製に用いることができ、パーキンソン病とアルツハイマー病を治療又は予防し、脳疲労又は運動疲労を緩和する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製に用いることができ、免疫力を強化する薬物、食品、保健品又は化粧品の調製に用いることができる。
【００１９】
発明の効果
【００２０】
従来の技術に比べて、本発明には以下のメリットがある。
（1）本発明において、ウォールナットのコールドプレスにより脱脂されたウォールナット粕を調製する。本発明者らは、この点について試験を行い、熱間プレスに比べて、コールドプレス後、タンパク質の抽出率は5wt%程度、含有量は20wt%程度向上する。
（2）本発明において、高効率向流抽出法でウォールナットタンパク質を抽出する。一般のアルカリ抽出酸沈殿の方法に比べて、タンパク質の抽出率は10％以上向上するとともに、水の使用量が低減され、生産コストも低減される。
（3）本発明において、タンパクを乾燥することなく、タンパク複性溶液のみを用いて酵素分解を行う。このようにして、タンパク質が乾燥する際の損失を減少するだけではなく、プロセスも簡単にする。
（4）本発明に用いられた生物酵素は含有量、分子量、収率、活性の上で保証を与え、酵素分解プロセスは安定し、二種の酵素はいずれも、入手源が広くかつコストが低い食用酵素であり、酵素分解を行う際の添加量はウォールナット粕の質量の0.5〜2％のみである。
（5）本発明は精密濾過膜で濾過し、酵素分解液中の不溶物を一応除去してから2000〜20000Daltonの限外濾過膜で高分子のタンパクを除去する。
（6）本発明は冷凍乾燥や真空乾燥の代わりに噴霧乾燥を用いて製品を調製する。よって、乾燥時間を節約するだけではなく、製品のプラスミドも均一である。
（7）本発明において、GB/T 22492-2008付録Aによりポリペプチドの分子量分布を測定し、付録Bにより酸可溶性のタンパクと遊離アミノ酸を測定し、両方の差がペプチド含有量である。当該分子量とペプチド含有量の測定方法は高く認可されている。
【数２】
2019506451.tif 000004
（8）本発明で測定されたペプチド含有量は80wt％以上であり、そのうち95％以上のウォールナットペプチドは、分子量が1500Dalton未満であり、高純度と低分子量を有するオリゴペプチドである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】調製実施例1におけるウォールナットオリゴペプチドの液相クロマトグラムである。
【図２】調製実施例2におけるウォールナットオリゴペプチドの液相クロマトグラムである。
【図３】ウォールナットオリゴペプチドによるゼブラフィッシュマクロファージ抑制へ改善作用図である。
【図４】ウォールナットオリゴペプチドによるゼブラフィッシュマクロファージの食作用への促進作用図である。
【図５】ウォールナットオリゴペプチドによるゼブラフィッシュ中枢神経への影響の典型図である。
【図６】ウォールナットオリゴペプチドによるゼブラフィッシュの胎児神経突起生長への促進作用図である。
【図７】ウォールナットオリゴペプチドによりヒト野生型tauタンパクのゼブラフィッシュ胎児神経細胞に対する毒性を低減する作用図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、実施例により本発明をさらに説明する。本発明の実施例に記載された方法は、本発明を説明するためのものであり、本発明はこれらに制限されるものではない。本発明の技術構想を前提として本発明の調製方法への簡単な改善は、いずれも本発明の範囲内にある。特に説明がない限り、実施例に用いられた原料と溶媒は、いずれも市販製品である。
【００２３】
調製実施例1
コールドプレスにより脱脂したウォールナット粕（Aで表記される）100kgと水とを質量比1：10で混合し、pHを10に調整して室温で2時間抽出した。抽出終了後、濾過し、残渣を2回抽出し、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ（Bで表記される）、pHを10に調整して室温で2時間抽出した。Bの一回目の抽出が終了した後、濾液を一旦置き、残渣を二回目の抽出に供した。Aの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ（Cで表記される）、pHを10に調整して室温で2時間抽出した。Bの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液をCの一回目抽出後の残渣に注ぎ、2時間抽出し、Cの一回目抽出後の濾液を一旦置いた。Cの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を一旦置いた。最後に、上記置かれた各濾液を合わせ、pHを5に調整して6時間静置し、上澄み液を捨てた。最後に、沈殿物に体積比1:10で水を注ぎ、均一に攪拌した。上記ウォールナットタンパク液を45℃まで加熱し、pHを中性とし、中性プロティナーゼ（酵素活性30万u/g）1kgを添加し、攪拌しながら酵素分解を6時間行った後、沸騰まで加熱し、30分間不活性化させ、遠心分離し、上澄み液としてタンパク質酵素分解液が得られた。このタンパク質酵素分解液を細孔径0.1μmの精密濾過膜で濾過し、透過液を5000Daltonの限外濾過膜で処理した後、透過液を80℃で固体含有量3.4wt%に濃縮し、入口温度140℃且つ出口温度55〜65℃の噴霧乾燥を行い、高純度と低分子量を有する淡黄色のウォールナットペプチド粉を得た。収率は21wt%であった。GB/T 22492-2008付録Aと付録Bに記載された検出方法により測定したところ、ペプチド含有量が81wt%であり、そのうち分子量が1500Dalton未満のウォールナットオリゴペプチドが97%であることが分かった。分子量分布は前記のとおりであり、ペプチド含有量の結果は下表に示されている。
【数３】
2019506451.tif 000005
【００２４】
調製実施例2
コールドプレスにより脱脂したウォールナット粕（Aで表記される）100kgと水とを質量比1：10で混合し、pHを10に調整して室温で2時間抽出した。抽出終了後、濾過し、残渣を2回抽出し、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ（Bで表記される）、pHを10に調整して室温で2時間抽出した。Bの一回目の抽出が終了した後、濾液を一旦置き、残渣を二回目の抽出に供した。Aの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を等量のウォールナット粕に注ぎ（Cで表記される）、pHを10に調整して室温で2時間抽出した。Bの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液をCの一回目抽出後の残渣に注き、2時間抽出し、Cの一回目抽出後の濾液を一旦置いた。Cの二回目の抽出が終了した後、残渣を捨て、濾液を一旦置いた。最後に、上記置かれた各濾液を合わせて、pHを5に調整して6時間静置して、上澄み液を捨てた。最後に、沈殿物に体積比1:10で水を注ぎ、均一に攪拌した。上記ウォールナットタンパク液を45℃まで加熱し、pHを中性とし、複合プロティナーゼ（中性プロティナーゼとパパインとの質量比が1：1であり、中性プロティナーゼの酵素活性は30万u/gであり、パパインの酵素活性は50万u/gである）1kgを添加し、攪拌しながら酵素分解を6時間行った後、沸騰まで加熱し30分間不活性化させ、遠心分離し、上澄み液としてタンパク質酵素分解液が得られた。当該タンパク質酵素分解液を細孔径が0.1μmである精密濾過膜で濾過し、透過液を5000Daltonの限外濾過膜で処理した後、透過液を80℃で固体含有量4.1wt%に濃縮し、入口温度140℃且つ出口温度55〜65℃の噴霧乾燥を行い、高純度と低分子量を有する淡黄色のウォールナットペプチド粉を得た。収率は21wt%であった。GB/T 22492-2008付録Aと付録Bに記載された検出方法より測定したところ、ペプチド含有量が81.3wt%であり、そのうち分子量が1500Dalton未満のウォールナットオリゴペプチドが96%であることが分かった。分子量分布は前記のとおりであり、複合プロティナーゼによる酵素分解後のペプチド含有量の結果は下表に示されている。
【数４】
2019506451.tif 000006
【００２５】
調製実施例3  組成物の調製
薬物または食品において許容される助剤は、米国薬品・食品管理機関に認可された、人類又は動物に用いられる任意な補助剤、担体、賦形剤、滑剤、甘味剤、希釈剤、防腐剤、染料/着色剤、香味強化剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、安定剤、等張剤、溶媒又は乳化剤など、薬物組成物に対する副作用がない様々な担体を含むが、これらに限られない。
【００２６】
当業者は従来技術における任意な既知の方法に基づいて、本発明のウォールナットオリゴペプチド粉と上記助剤を混合することができ、調製された任意な剤型も従来技術における既知のものである。
【００２７】
生物活性実施例1
1．DPPHラジカルの除去実験
1.1  DPPHエタノール溶液の調製
DPPH4mgを正確に秤量し、100mLの褐色メスフラスコに入れ、エタノール50mLを加え、超音波で30s処理し、エタノールで目盛りまで希釈し、均一になるまで振って一旦置いた。当該溶液は調製直後に使用しなければならない。
1.2  サンプル溶液の調製
ウォールナットオリゴペプチド粉10mgを正確に秤量し、50mLの褐色メスフラスコに入れ、エタノール30mLを加え、超音波で5分処理し、エタノールで目盛りまで希釈し、均一になるまで振ることにより得た。
1.3  操作手順
サンプル溶液2mLとDPPH溶液2mLとを正確に取って均一に混合し、サンプル溶液2mLとエタノール2mLとを正確に取って均一に混合し、DPPH溶液2mLとエタノール2mLとを正確に取って均一に混合し、室温で30分置き、515nm波長において吸光度を測定し、下記の式によりラジカルの除去率を算出した。
IR%=[1-(Ai-Aj)/A0]*100%
式中、Aiはサンプル溶液とDPPHとを混合した溶液の吸光度を示し、Ajはサンプル溶液と溶媒とを混合した溶液の吸光度を示し、A0はDPPHと溶媒とを混合した溶液の吸光度を示す。
【００２８】
2．ABTS+ラジカルの除去実験
2.1  PBS緩衝液の調製
塩化ナトリウム8gと、塩化カリウム0.2gと、リン酸二水素カリウム0.24gと、リン酸水素二ナトリウム十二水和物3.62gとを秤量し、1000mLのビーカーに置き、蒸留水800mLを加え、攪拌しながら溶解させ、塩酸または水酸化ナトリウムでpHを7.4とし、1000mLのメスフラスコに移し、蒸留水を加えて目盛りまで希釈し、均一になるまで振って、一旦置いた。
2.2  ABTS+貯蔵溶液の調製
ABTS+78mg程度を正確に秤量し、20mLの褐色メスフラスコに入れ、蒸留水15mLを加え、超音波で5分処理し、蒸留水で目盛りまで希釈し、均一になるまで振った。過硫酸カリウム76mg程度を正確に秤量し、2mLの褐色メスフラスコに入れ、蒸留水1mLを加え、超音波で溶解させ、蒸留水で目盛りまで希釈し、均一になるまで振った。過硫酸カリウム溶液352μLを正確に取ってABTS溶液に加え、均一になるまで振って一晩静置した。
2.3  ABTS+標準溶液の調製
貯蔵溶液1mLを正確に取って65mL程度のPBS緩衝液を加え、均一になるまで振った。
2.4  サンプル溶液の調製
ウォールナットオリゴペプチド粉20mgを正確に秤量し、20mLの褐色メスフラスコに置き、PBS緩衝液15mLを加え、超音波で5分処理し、PBS緩衝液で目盛りまで希釈し、均一になるまで振ることにより得た。
2.5  操作手順
サンプル溶液0.5mLとABTS標準溶液5mLとを正確に取って均一に混合し、サンプル溶液0.5mLとPBS緩衝液5mLとを正確に取って均一に混合し、ABTS標準溶液5mLとPBS緩衝液0.5mLとを正確に取って均一に混合し、直ちに734nmにおいて吸光度を測定し、下記の公式によりラジカルの除去率を算出した。
IR%=[1-(Ai-Aj)/A0]*100%
式中、Aiはサンプル溶液とABTSとを混合した溶液の吸光度を示し、Ajはサンプル溶液と溶媒とを混合した溶液の吸光度を示し、A0はABTSと溶媒とを混合した溶液の吸光度を示す。
【００２９】
3．SRSAスーパーオキシドアニオンラジカルの除去実験
3.1  0.1moL/L PBS緩衝液（pH7.4）の調製
塩化ナトリウム80gと、塩化カリウム2gと、リン酸二水素カリウム2.4gと、リン酸水素二カリウム三水和物23.1gとを秤量し、1000mLのビーカーに置き、蒸留水600mLを加え、攪拌しながら溶解させ、塩酸または水酸化ナトリウムでpHを7.2とし、1000mLのメスフラスコに移し、蒸留水を加えて目盛りまで希釈し、均一になるまで振って一旦置いた。
3.2  150μmoL/L NBT溶液の調製
NBT 12.5mgを正確に秤量し、100mLの褐色メスフラスコに置き、蒸留水を加え、超音波で溶解させ、かつ蒸留水で目盛りまで希釈し、均一になるまで振ることにより得た。
3.3  60μmoL/L PMS溶液の調製
PMS 18.8mgを正確に秤量し、1000mLのメスフラスコに置き、蒸留水を加え、超音波で溶解させ、蒸留水で目盛りまで希釈し、均一になるまで振ることにより得た。
3.4  468μmoL/L NADH溶液の調製
NADH 33.9mgを正確に秤量し、100mLのメスフラスコに置き、蒸留水を加え、超音波で溶解させ、蒸留水で目盛りまで希釈し、均一になるまで振ることにより得た。
3.5  サンプル溶液の調製
1mg/mLのウォールナットオリゴペプチド粉を調製し、測定に供した。
3.6  標準液の調製
0.1moL/L PBS緩衝液（pH7.4）1mLを取ってメスフラスコに入れ、150μmoL/L NBT溶液を1mL加え、468μmoL/L NADHを2mL加え、60μmoL/L PMS溶液を1mL加え、均一に攪拌し、25℃で5分反応させ、560nmにおいて吸光度を測定した。
3.7 操作手順
サンプル溶液0.5mLと上記標準溶液5mLとを正確に取って均一に混合し、サンプル溶液0.5mLと蒸留水5mLとを正確に取って均一にし、前記標準溶液5mLと0.5mL蒸留水とを正確に取って均一に混合し、直ちに560nmにおいて吸光度を測定し、下記の公式によりラジカルの除去率を算出した。
IR%=[1-(Ai-Aj)/A0]*100%
式中、Aiはサンプル溶液とSRSAとを混合した溶液の吸光度を示し、Ajはサンプル溶液と溶媒とを混合した溶液の吸光度を示し、A0はSRSAと溶媒とを混合した溶液の吸光度を示す。
調製実施例1における中性プロティナーゼによる酵素分解製品濃度が100μg/mLとなるようにそれぞれ調製し、ビタミンCを陽性対照（濃度が100μg/mLである）とし、テスト結果は表1に示される。
【表１】
2019506451.tif 000007
【００３０】
表1から分かるように、本発明の方法により調製されたウォールナットオリゴペプチド粉はDPPHとABTSラジカルに対して強い除去活性を有し、スーパーオキシドアニオンに対して中等強度の除去活性を有するため、良好な抗酸化活性を表す。
【００３１】
生物活性実施例2
PC12  神経細胞保護モデル
PC12  神経細胞保護モデルは神経細胞の生理、病理及び薬理を研究する好適なモデルであり、パーキンソン病と神経疲労の最も使用される体外薬物選別モデルである。
【００３２】
1 PC12細胞の培養
10％ウシ胎児血清を含む高炭水化物DMEM培地を用いてPC12細胞を培養した。細胞が継代するときに、0.25%のトリプシンを用いて50s消化し、10%血清を含むDMEM培地を用いて消化を終え、新鮮な培地を加えて細胞を均一にした。105個/mLの細胞密度で継代した。細胞は、瓶ごとに細胞含有の培養液4mLを加えた。37℃、5%CO2の条件下で培養した。
【００３３】
2 細胞播種
PC12細胞は培養瓶で融合状態まで生長し、0.25％トリプシン溶液を用いて消化し、細胞懸濁液になるまで繰り返して処理し、10%FBSを含む高炭水化物DMEM培地を用いて1.0×105個/mLと希釈し、96ウェル培養プレートに対してウェル毎に100μL播種し、10個の複孔を1組とした。37℃、5%CO2の条件下で24時間培養して、融合状態となった。
【００３４】
3 薬物の正常なPC12細胞生長活性に対する影響
96ウェルプレートの各ウェルに一定の濃度勾配でウォールナットオリゴペプチド100μLをそれぞれ与え、24時間培養した後、MTT法により細胞生存率を測定した。MMT50mgを10mLのPBSに溶解させ、0.22μmのミリポアフィルターで濾過した。使用直前に0.5mg/mLに希釈した。各組細胞の培地を捨て、PBSで二回洗い、0.5mg/mL MTTを加え、37℃、5%CO2の条件下で3時間インキュベートした。MTT用液を除去し、ウェル毎にDMSO150μLを加えて結晶を溶解させ、10分間振り、ウェル毎にOD値（検出波長は570nmであり、参照波長は650nmである）を測定した。対照群OD値の平均値が100％細胞生存率とし、モデル組と投与組の細胞生存率を算出した。測定結果は表2に示される。
【表２】
2019506451.tif 000008
【００３５】
4  薬物の過酸化水素により損傷されるPC12細胞に対する保護作用の調べ（細胞生長を促進するために薬物が細胞中のラジカルを除去できるか否かを測定する）
A   空白群（1％血清のDMEM）
B   モデル群（1%血清DMEM培地で6時間培養してからH2O2を加えて最終濃度を100μMとし、12時間刺激した）
C  陽性薬物群（NAC）
一定の濃度の陽性薬物NACを含む1%血清DMEMを加えて6時間培養してからH2O2100μMを加えて12時間刺激した。
D  投与群
各濃度勾配のウォールナットオリゴペプチドの1％血清のDMEMを加えて6時間培養してからH2O2100μMを加えて12時間刺激した。
前記各群を同じ条件で培養してから後続実験を行った。96ウェルプレート中でMMT法により細胞生存率を測定した。測定結果は表3〜5に示される。
【表３】
2019506451.tif 000009
【００３６】
表2から分かるように、本発明で調製されたウォールナットオリゴペプチド粉はPC12細胞の増殖活性を低減することなく、濃度の向上に伴って、PC12細胞数が著しく増加した。表3から分かるように、モデル群は、H2O2により刺激した後、細胞生存率が57.2%であった。陽性対照薬NAC80μg/mLを加えて培養した後、細胞生存率は88.0%まで高められ、著しい保護作用を示した。ウォールナットオリゴペプチドを加えて培養した後、細胞生存率はペプチド粉の濃度向上に伴って高められ、濃度依存性を示し、著しい保護作用が現れた。濃度が500μg/mLである場合、細胞生存率は72.0%であり、モデル群に比べて細胞生存率は30％高められる。これによって、当該ペプチド粉はニューロン細胞に対して強い保護作用を有するため、パーキンソン病とアルツハイマー病などの疾病の予防又は治療に用いられ、脳疲労を緩和する薬品又は保健食品にも用いられる。
【００３７】
生物活性実施例3
ウォールナットオリゴペプチド粉によるゼブラフィッシュマクロファージ抑制への改善作用
受精させた二日後（2dpf）のゼブラフィッシュに対して、ビノレルビンを静脈注射し、ゼブラフィッシュマクロファージ抑制モデルを構築した。ウォールナットオリゴペプチド粉と陽性対照薬であるベルバミンを水に溶解させて投与し、オリゴペプチド粉の濃度はいずれも500μg/mLであり、ベルバミンの濃度は1.9μg/mLであった。同時に、毎実験群にゼブラフィッシュ30匹ずつモデル対照群と正常対照群（何も処理しない）を設置し、28℃の培養器の中で培養した。3dpfまで処理するとき、各実験組のゼブラフィッシュにニュートラルレッド染色を行い、4時間染色した後、各実験群からランダムに選択されたゼブラフィッシュ10匹を顕微鏡で観察し、写真を撮って保存した。画像処理ソフトウェアによりゼブラフィッシュマクロファージの数量について画像解析を行った。ウォールナットオリゴペプチド粉によるゼブラフィッシュマクロファージ抑制への改善作用をそれぞれ定量で評価した。
【表４】
2019506451.tif 000010
表4  ウォールナットオリゴペプチド粉によるゼブラフィッシュ頭部におけるマクロファージへの改善作用（n=10）
【００３８】
表4から分かるように、正常対照群におけるゼブラフィッシュマクロファージ数は平均で27個であり、モデル対照群（15個）に比べて、ゼブラフィッシュマクロファージ抑制モデルを成功に構築すると証明する。陽性薬物であるベルバミンの濃度が1.9μg/mLである場合、ゼブラフィッシュマクロファージ数は平均で20個であり、モデル対照群（15個）に比べて、ゼブラフィッシュマクロファージ抑制への改善作用は41.67％である。ベルバミンの濃度が1.9μg/mLである場合、ゼブラフィッシュマクロファージ抑制に対して著しい改善作用があることが証明された。ウォールナットオリゴペプチド粉の濃度は500μg/mLである場合、ゼブラフィッシュマクロファージ数は平均で25個であり、モデル対照群（15個）に比べて、ゼブラフィッシュマクロファージ抑制への改善作用は83.33％である。これは、本発明に調製されたウォールナットオリゴペプチド粉はゼブラフィッシュマクロファージ抑制に対して著しい改善作用があることを証明した。
【００３９】
2  ウォールナットオリゴペプチド粉のゼブラフィッシュマクロファージの食作用に対する促進作用
受精させた二日後（2dpf）のゼブラフィッシュに墨汁を静脈注射し、ゼブラフィッシュマクロファージ促進モデルを構築した。ウォールナットオリゴペプチド粉と陽性薬物であるピドチモドを水に溶解させて投与し、オリゴペプチド粉の濃度は2000μg/mLであり、ピドチモドの濃度は200μg/mLであった。同時に、毎実験群にゼブラフィッシュ30匹ずつモデル対照群を設置し、28℃の培養器の中で培養した。3dpfまで処理するとき、各実験群のゼブラフィッシュにニュートラルレッド染色を行い、4時間染色した後、毎実験群からランダムに選択されたゼブラフィッシュ10匹を顕微鏡で観察し、写真を撮って保存した。画像処理ソフトウェアによりゼブラフィッシュマクロファージにおける墨汁シグナル（N）について画像解析を行った。四種のサンプルによるゼブラフィッシュマクロファージの食作用への促進作用をそれぞれ定量的に評価した。
【表５】
2019506451.tif 000011
【００４０】
表5から分かるように、陽性薬物であるピドチモドの濃度が200μg/mLである場合、墨汁を食したマクロファージ数は平均で3.5個であり、モデル対照群（1.5個）に比べて、ゼブラフィッシュマクロファージの食作用に対する促進作用は2.3倍であった。ピドチモドの濃度が200μg/mLである場合、ゼブラフィッシュマクロファージの食作用に対して著しい促進作用があることが証明された。ウォールナットオリゴペプチドが2000μg/mLである場合、墨汁を食したマクロファージの数は平均で5.1個であり、モデル対照群（1.5個）に比べて、ゼブラフィッシュマクロファージの食作用に対する促進作用は3.4倍であった。これは、ウォールナットオリゴペプチド粉はゼブラフィッシュマクロファージの食作用に対して著しい促進作用があることが証明された。
【００４１】
生物活性実施例4
ウォールナットオリゴペプチド粉によるゼブラフィッシュ中枢神経への保護作用
受精させた16日後（1dpf）の野生型AB系のゼブラフィッシュ180匹をランダムに選択して6ウェルプレートに置き、毎ウェル（実験組）に30匹ゼブラフィッシュを処理し、ミコフェノール酸モフェチルによりゼブラフィッシュの中枢神経に損傷を誘発した。水でオリゴペプチド粉を溶解させて、濃度をそれぞれ222μg/mLと667μg/mLとする場合、陽性対照薬物であるグルタチオン（GSH）が154μg/mLであり、同時に毎孔（実験組）の容量が3mLである正常対照群（養魚用水処理ゼブラフィッシュ）とモデル対照群を設置した。オリゴペプチドとミコフェノール酸モフェチルとを共に24時間処理した後、アクリジンオレンジで染色した。染色した後、毎実験組からゼブラフィッシュ10匹をランダムに選択して蛍光顕微鏡で写真を撮ってデータを採集し、ゼブラフィッシュの中枢神経（脳と脊髄）におけるアポトーシス細胞の蛍光強度を分析し、蛍光強度によりウォールナットオリゴペプチド粉よるゼブラフィッシュ中枢神経への保護作用を評価した。
【表６】
2019506451.tif 000012
【００４２】
表6から分かるように、モデル対照群では、ゼブラフィッシュの中枢神経におけるアポトーシス細胞の蛍光強度（565783画素）は正常対照群（161976画素）に比べて、モデルを成功に構築すると証明した。陽性対照薬GSHの濃度が154μg/mLである群において、ゼブラフィッシュの中枢神経におけるアポトーシス細胞の蛍光強度は193900画素であり、モデル対照群に比べて、ゼブラフィッシュ中枢神経に対する保護作用は92％であった。GSHはゼブラフィッシュ中枢神経に対して著しい保護作用があると証明された。オリゴペプチドの濃度がそれぞれ222μg/mLと667μg/mLである群において、ゼブラフィッシュの中枢神経におけるアポトーシス細胞の蛍光強度はそれぞれ395025画素と451259画素であり、中枢神経に対する保護作用はそれぞれ42％と28％であった。モデル対照群に比べて、ウォールナットオリゴペプチドはゼブラフィッシュの中枢神経に対して著しい保護作用があると証明した。
【００４３】
生物活性実施例5
1  ウォールナットオリゴペプチドによるブフィッシュの運動能力への改善作用
4dpfの野生型AB系のゼブラフィッシュをランダムに選択し、ウェルごとに（つまり毎試験用群）に30匹で6ウェルプレートに置き、1.0mg／mLの水溶液としてウォールナットオリゴペプチドと陽性対照薬物である「中華跌打丸」を投与し、毎孔の容量が3mLである正常対照群とモデル対照群を配置した。サンプルを一定の時間で前処理した後、ゼブラフィッシュ疲労モデルを誘発するために、正常対照群以外の実験群に対し、水に溶解させた亜硫酸ナトリウムを同時に与えた。サンプルと亜硫酸ナトリウムとを併用してゼブラフィッシュを一定の時間で処理した後、毎実験群からゼブラフィッシュ10匹をランダムに選択し、挙動分析により、ゼブラフィッシュの運動総距離（S）を測定し、サンプルの亜硫酸ナトリウムによる疲労ゼブラフィッシュに対する運動改善作用を定量的に評価した。
【００４４】
2  ウォールナットオリゴペプチドによるブフィッシュ体内における乳酸代謝への影響
4dpfの野生型AB系のゼブラフィッシュをランダムに選択し、ウェルごとに（つまり毎試験用群）に30匹で6ウェルプレートに置き、1.0mg／mLの水溶液としてウォールナットオリゴペプチドと陽性対照薬物である「中華跌打丸」を投与し、毎孔の容量が3mLである正常対照群とモデル対照群を配置した。毎実験群に三つの平行実験を設置する。サンプルを一定の時間で前処理した後、ゼブラフィッシュ疲労モデルを誘発するために、正常対照群以外の実験群に対して、水に溶解させた亜硫酸ナトリウムを同時に与えた。サンプルと亜硫酸ナトリウムを併用してゼブラフィッシュを一定の時間で処理した後、毎実験群では、三つの平行実験群におけるゼブラフィッシュを集め（合わせて90匹）、NanoDrop2000超微量分光光度計を用いてゼブラフィッシュ体内の乳酸含有量を間接に測定し、濃度2000μg/mLのウォールナットオリゴペプチドの、亜硫酸ナトリウムによる疲労ゼブラフィッシュ体内の乳酸含有量に対する影響をそれぞれ定量的に評価した。
【表７】
2019506451.tif 000013
【表８】
2019506451.tif 000014
【００４５】
表7及び表8から分かるように、本発明で調製されたウォールナットオリゴペプチド粉はゼブラフィッシュの運動能力を著しく改善し、体内の乳酸代謝を向上させることができた。これによって、ウォールナットオリゴペプチド粉は顕著な抗疲労の効果を有し、疲労を予防又は緩和する食品、保健品又は薬品に用いられることが可能である。
【００４６】
生物活性実施例6
ウォールナットオリゴペプチドによるAβ1-42アミロイド凝集への抑制作用
DMSOでAβ1−42 アミロイドを2.5mg/mLに調合し、ウォールナットオリゴペプチドを適切な濃度に希釈した。その後、Aβ1−42アミロイド液（1μL）とウォールナットオリゴペプチド溶液（9μL）とを混合し、Aβ1−42アミロイドの最終濃度を0.25mg/mL、ウォールナットオリゴペプチの最終濃度をそれぞれ10μg/mL、100μg/mLとした。37℃で混合液を30分反応させた後、Thioflavin T 標準液200μLを加えて十分に混合し、200μLを取って、底が透明である黒い96ウェルプレートに置き、プレートの底からThT蛍光強度（Ex440/Em482）を測定してAβ1−42アミロイド液の重合度合いを判定した。何の薬物を加えないのは陰性対照群とした。
【表９】
2019506451.tif 000015
【００４７】
表9から分かるように、ウォールナットオリゴペプチドの濃度が10μg/mLである場合には、Aβ1−42 アミロイド凝集に対する抑制作用が著しくないのに対して、濃度が200μg/mLである場合には、Aβ1−42 アミロイド凝集に対して一定の抑制作用があった。これにより、ウォールナットオリゴペプチドは脳神経に対して保護作用を有し、記憶力を改善する潜在的な効果を有することが推測された。
【００４８】
生物活性実施例7
ウォールナットオリゴペプチドによる細胞内炎症免疫因子への影響
anti-CD3 10μg/mLを6ウェルプレート（200μg/ウェル）にコーティングし、4℃で18~24時間静置した。HPBMCを活性化させ、細胞懸濁液を用いて5×105セル／mLまで希釈し、最終体積を36mLとした。そのうち、anti-CD28（2μg/mL）、rhIL-2（10ng/mL）及びrhIL-4（50ng/mL）が含まれた。培地を用いてanti-CD3でコーティングされた6ウェルプレートを洗い、HPBMC希釈液を当該6ウェルプレートに移し、二酸化炭素培養器の中で培養した。二日後、再び6ウェルプレートのHPBMC希釈液を収集し、遠心分離を行い、上澄液を除去し、細胞濃度が5×105セル／mL となるように、再びrhIL-2（10ng/mL）及びrhIL-4（50ng/mL）を含む培地を加え、均一に分散混合し、再び細胞培養瓶に移し、再び二酸化炭素培養器の中で培養した。二日後、HPBMCを収集し、遠心分離により上澄み液を除去し、培地を用いて洗った後、再び遠心分離により上澄液を除去した。細胞濃度が5×105セル／mL、最終体積が36mLとなるように、PMA 5ng/mLを含む培地を加え、均一に分散混合し、二酸化炭素培養器に入れた。4時間後、遠心分離を行い、上澄液のCBA分析を行った。操作方法はBD CBA Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit Instruction Manual説明書に基づいて行われ、IL-10及びIL-17Aの変化を分析した。
【表１０】
2019506451.tif 000016
【００４９】
表10から分かるように、ウォールナットオリゴペプチドはIL-10の含有量を著しく低減させ、IL-17Aの含有量を高めることができた。これによって、ウォールナットオリゴペプチドは炎症因子を調節し、生体の免疫力を上げることができることが確認された。
【００５０】
生物活性実施例8
1 ウォールナットオリゴペプチドによるゼブラフィッシュ胎児神経突起の成長への促進作用
神経特異性HuCプロモーターを利用し、緑色蛍光融合タンパク（GFP）を検出シグナルとして使用した。まず、プラスミッドpHuC-GFPの緑色蛍光融合タンパクを1-細胞期に発育したゼブラフィッシュ胎児細胞に注射した。DMSOでウォールナットオリゴペプチド粉（調製実施例1）を溶解させ、水で一定の濃度まで希釈した。8時間後、それとDMSO（対照陰性）をゼブラフィッシュ胚細胞に注射し、40時間後、ゼブラフィッシュの神経突起の成長数に基づいて、サンプルがゼブラフィッシュ胎児に対して神経突起の成長に寄与するか否かを判断した。
【００５１】
実験の結果から分かるように、対照陰性DMSO群では、ゼブラフィッシュ胎児神経突起の成長への促進率は23％のみであるのに対して、濃度が1mg／mLのウォールナットオリゴペプチドを注射した後、神経突起の成長への促進率は51%に達した。これは、ウォールナットオリゴペプチドはゼブラフィッシュ胎児神経突起の成長を著しく促進できることが確認された。
【００５２】
2 ウォールナットオリゴペプチドによるヒト野生型tauタンパクのゼブラフィッシュ胎児内神経細胞に対する毒性作用への低減
神経組織特異性Hucプロモーターを利用し、hTau緑色蛍光融合タンパク（GFP）を用いて、野生型ヒトtauタンパクで誘導するゼブラフィッシュ胎児内神経細胞のアポトーシスの状況を測定した。表現作成物は、1-細胞期に発育したゼブラフィッシュ胎児細胞に注射された。DMSOでウォールナットオリゴペプチド粉（調製実施例1）を溶解させ、水で一定の濃度まで希釈した。8時間後、それとDMSO（対照陰性）をゼブラフィッシュ胎児細胞に注射した。蛍光顕微鏡を用いてGFPでマークされた24hpfと48hpfの細胞を観察した。ゼブラフィッシュ24hpfのニューロン細胞の中では、GFPシグナルの一部が観察されたのに対して、ゼブラフィッシュ48hpfのニューロン細胞の中では、一部が既に分解し、消失に至った。ゼブラフィッシュ48hpfのGFPニューロン細胞の百分率を3〜5個算出した。
【００５３】
実験の結果から分かるように、対照陰性DMSO群では、17.2%のみのGFPニューロン細胞があるのに対して、濃度1mg／mLでウォールナットオリゴペプチドを注射した後、GFPニューロン細胞が37.6%と高くなった。これにより、ウォールナットオリゴペプチドはヒト野生型tauタンパクによるゼブラフィッシュ胎児内神経細胞への毒性作用を著しく下げることが確認された。
【００５４】
上記二種の生物活性モデルから分かるように、ウォールナットオリゴペプチドは記憶力を促進または改善する効果を有する。
【００５５】
生物活性実施例9
ウォールナットオリゴペプチドの化学薬物によるマウスの学習記憶障害への作用
1 サンプル
サンプルは、南通大学から提供される、体重が18〜22gである清潔なICRマウスであり、3組で、合わせて300匹である。実験動物生産検案書はSCXK（蘇）2014-0001である。通常のマウス餌で飼い、自由飲水とした。実験の前に、マウスを静かな環境に置かせ、室温（22±1℃）を保ちながら自然な昼夜リズム照明下で自由に飲まさせたりするように一週間適応性飼った。
【００５６】
2 実験方法
2.1 スコポラミンによるマウスの記憶獲得障害への影響
マウスをランダムに組分けを行い、ウォールナットオリゴペプチド（調製実施例1）の低投与量群（30mg／kg）、中投与量群（100mg／kg）及び高投与量群（300mg／kg）を設置した。空白群とモデル群にそれぞれ等容積の蒸留水を与え、陽性対照群にニモジピン30mg／kgを与えた。各群では、日に一回カバージュし、七日連続して投与した。
【００５７】
飛び込み台訓練
XT−911型飛び込み台条件反射試験器の電圧を36Vにコントロールし、最後の投与から1時間を経た後、マウスの学習記憶機能に係るテストを行う。訓練の10分前に、モデル群と投与群では、臭化水素酸スコポラミン3mg／kgをそれぞれ腹腔に注射し、空白対照群では、等容量の生理食塩水を腹腔に注射した。毎群に5匹ずつで平行操作をして投与し、10分後2群目のマウスへ注射した。これによって以下同様である。訓練したときに毎群のマウス5匹を飛び込み台の5つの格子に置き、先にマウスを3分で環境に馴染ませ、その後通電し、電撃を受けたマウスは、多数で電撃を回避するために飛び込み台に飛び上げた。飛び込み台から飛び下げたときにマウスの両足が銅格子に接触することを感電とし、これを誤反応と見なした。5分間訓練させ、24時間後再度試験を行った。
【００５８】
試験を行う時、マウスを飛び込み台に置くとともに、計時を始めた。マウスが一回目飛び下げる時間を感電潜伏期（つまり誤潜伏期）として記録し、5分内で飛び下げる回数（つまり誤回数）を観察指標として記録した。
【００５９】
2.2 亜硝酸ナトリウムによるマウスの記憶固定障害に対する影響
組分け、投与及び訓練方法は上記2.1と同じである。訓練を終えた後、空白対照群において皮下注射で等量の生理食塩水を与えた以外に、他の各群において直ちに皮下注射により亜硝酸ナトリウム90mg／kgを与え、24時間後試験を行った。試験方法は上記2.1と同じである。
【００６０】
2.3  40%エタノールによるマウスの記憶再現障害に対する影響
組分け、投与及び訓練方法は上記2.1と同じである。試験の30分前に、モデル群と投与群におけるマウスに対して40%エタノール10mL／kgをそれぞれカバージュして、空白対照群のマウスに対して等容積の蒸留水を与えた。試験方法は上記2.1と同じである。
【００６１】
3  実験結果
3.1  ウォールナットオリゴペプチドのスコポラミンによるマウスの記憶獲得障害への影響
調製実施例1（30mg／kg、100mg／kg、300mg／kg）を連続して七日投与し、スコポラミンによる記憶獲得障害に罹るマウスの飛び込み台訓練の成績から分かるように、調製実施例1の中投与群及び高投与群はいずれも潜伏期を著しく延長させ、誤った回数を低減することができた。結果は表11に示される。
【表１１】
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【００６２】
3.2  ウォールナットオリゴペプチドの亜硝酸ナトリウムによるマウスの記憶固定障害への影響
調製実施例1（30mg／kg、100mg／kg、300mg／kg）を連続して七日投与し、亜硝酸ナトリウムによる記憶固定障害に罹るマウスの飛び込み台訓練の成績から分かるように、調製実施例1の各投与群は、いずれも潜伏期を著しく延長させ、誤った回数を低減することができた。結果は表12に示される。
【表１２】
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【００６３】
3.3  ウォールナットオリゴペプチドの40%エタノールによるマウスの記憶再現障害に対する影響
調製実施例1（30mg／kg、100mg／kg、300mg／kg）を連続して七日投与し、エタノールによる記憶再現障害に罹るマウスの飛び込み台訓練の成績から分かるように、調製実施例1の各投与群は、いずれも潜伏期を著しく延長させ、誤った回数を減少することができた。結果は表13に示される。
【表１３】
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【００６４】
学習記憶機能は空間学習記憶機能と非空間学習記憶機能を含む。記憶障害モデルは薬物による記憶過程への影響を評価する有効な手段であり、薬物により老人性痴呆への治療及びそのメカリズムを検討する際に常に採用されるモデルでもある。Mレセプター遮断薬であるスコポラミンは、アセチルコリンのMレセプターに対する激動作用を遮断することができ、アセチルコリン不足による学習記憶機能障害を模倣することができる。亜硝酸ナトリウムはヘモグロビンの変性を起こすことにより脳組織の乏血と乏酸素を招くため、学習と記憶過程を損ねる。エタノールは大脳皮質の神経機能活動を抑制し、動物の条件反射を抑制し、脳内タンパク質とRNAとの合成を妨げる。コリンはドパミンなどのシステムと反応でき、学習記憶機能を破壊し、学習記憶再現障害を引き起こす。本実験に採用されるモデルと投与量の範囲内において、ウォールナットオリゴペプチドの中投与量群と高投与量群は、いずれもある程度でスコポラミンによる学習記憶獲得障害モデルマウスの潜伏期を改善し、高投与量群はマウスが飛び込み台から飛び下げる誤った回数を減少することができる。亜硝酸ナトリウムによる記憶固定障害モデルについて、ウォールナットオリゴペプチドの各投与量はいずれも潜伏期を延長し、誤った回数を減少することができる。40％エタノールによるマウスの記憶獲得障害に係る飛び込み台実験について、ウォールナットオリゴペプチドの各投与群も誤った回数を著しく減少し、潜伏期を延長することができる。これから分かるように、ウォールナットオリゴペプチドの中投与量群と高投与量群はスコポラミンによる学習記憶獲得障害に罹るマウスの学習記憶能力に対して著しい改善作用を有する。その低投与量群、中投与量群及び高投与量群は、40%エタノールによるマウスの学習記憶再現障害及び亜硝酸ナトリウムによるマウスの学習記憶固定障害に罹るマウスの学習記憶能力に対して著しい改善作用を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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