(57)【要約】  本発明は特異的にTRB3に結合するポリペプチドならびに肺線維化を治療および/または予防する薬物の製造におけるその使用を提供する。前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列表の配列番号12、あるいは配列表の配列番号12で示されるアミノ酸配列における2個または2個以上のアミノ酸を側鎖が連結可能な非天然アミノ酸に置き換えたもので示される。前記ポリペプチドまたはその誘導体が特異的にTRB3に結合することで、TRB3とMDM2タンパク質の相互作用を遮断する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体であって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列表の配列番号12、あるいは配列表の配列番号12で示されるアミノ酸配列における2個または2個以上のアミノ酸を側鎖が連結可能な非天然アミノ酸に置き換えたもので示され、前記誘導体は前記ポリペプチドと細胞膜透過性ペプチドが連結してなるキメラペプチド、前記ポリペプチドとウイルスからなる融合ペプチド、メチル化した前記ポリペプチド、グリコシル化した前記ポリペプチドおよびポリエチレングリコール化した前記ポリペプチドを含む、ポリペプチド。
【請求項２】
前記側鎖が連結可能な非天然アミノ酸はS-ペンテニルアラニンであり、好ましくは、前記置き換えられたアミノ酸の数は二つで前記置き換えられたアミノ酸の位置はそれぞれi番目およびi+3番目、あるいは、i番目およびi+4番目で、ここで、1≦i≦11であることを特徴とする請求項1に記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体。
【請求項３】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11のうちのいずれかで示されることを特徴とする請求項2に記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体。
【請求項４】
前記細胞膜透過性ペプチドはHIV-1ウイルス逆転写活性化因子タンパク質のTATペプチド、キイロショウジョウバエ触角ホメオタンパク質の転写因子であるAntpペプチド、Pep-1ペプチド、Pep-2ペプチド、MPGペプチドおよびRGDペプチドからなる群より選ばれる任意の1種または複数種であり、好ましくは、前記細胞膜透過性ペプチドは前記ポリペプチドのN末端またはC末端に連結しており、
より好ましくは、細胞膜透過性ペプチドがPep-2ペプチドである場合、前記ポリペプチドの誘導体のアミノ酸配列は配列表の配列番号19で示され、
細胞膜透過性ペプチドがTATペプチドである場合、前記ポリペプチドの誘導体のアミノ酸配列は配列表の配列番号20で示され、
細胞膜透過性ペプチドがAntpペプチドである場合、前記ポリペプチドの誘導体のアミノ酸配列は配列表の配列番号21で示される、
ことを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体。
【請求項５】
肺線維化を治療および/または予防する薬物の製造における請求項1〜4のいずれか一項に記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体の使用。
【請求項６】
前記肺線維化は原発性肺線維化または続発性肺線維化であることを特徴とする請求項5に記載の使用。
【請求項７】
前記肺線維化はブレオマイシンによる肺線維化であることを特徴とする請求項5に記載の使用。
【請求項８】
請求項1〜4のいずれか一項に記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体を含有することを特徴とする抗肺線維化の薬物組成物。
【請求項９】
さらに1種または複数種の薬用担体を含むことを特徴とする請求項8に記載の薬物組成物。
【請求項１０】
請求項1〜4のいずれか一項に記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体を抗肺線維化活性を有する化合物とともに活性成分として含有することを特徴とする請求項8または9に記載の薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は出願日が2016年2月26日の中国特許出願CN201610108248.9の優先権を要求する。本願は上記中国特許出願の全文を引用する。
（技術分野）
本発明は、生物技術の分野に属し、具体的に、ポリペプチド、その誘導体ならびに肺線維化を治療および/または予防する薬物の製造におけるその使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
肺線維化は肺部の最も重篤な病理状態で、その病理的変化の大半は最初の下気道炎症、および肺胞上皮細胞と血管内皮細胞の損傷として現れ、線維芽細胞とII型肺胞細胞の増殖、サイトカインの放出が伴い、細胞外基質のタンパク質とコラーゲンが蓄積し、最終的に肺部の変化につながる。肺線維化患者の肺部の肺胞は段々線維性物質に代わり、肺組織が硬く厚くなり、肺ガス交換能力が段々なくなり、患者が異なる程度で酸欠になって呼吸困難が現れ、最終的に呼吸不全で死亡する。肺線維化は呼吸病の四大疾患の一つで、病因が複雑で、発症機序が不明で、現在既存の肺線維化を治療する薬物と方法が非常に限られ、治療効果が満足できるものではなく、予後が悪く、5年生存率がわずか50％しかない。
【０００３】
TRB3（Tribbles Homologue 3）は人体における偽キナーゼTribbles相同性タンパク質ファミリーのメンバーの一つで、アダプタータンパク質様の機能を有し、複数のタンパク質複合体のアセンブリに関与する。多くの研究では、TRB3が複数の転写因子、ユビキチンリガーゼ、細胞膜受容体およびMAPK、PI3Kシグナル経路のメンバーであるタンパク質と相互作用し、細胞の分化、アポトーシス、自食、代謝の調節に関与するとされている。最近、多くの証拠によって、TRB3が肺線維化組織で高発現され、かつ肺線維化の進展過程で重要な促進作用を果たすことが示された。MDM2はユビキチンプロテアソーム系におけるE3ユビキチンリガーゼである。
【０００４】
（発明内容）
本発明が解決しようとする技術課題は、現在の安全性と有効性が欠けている抗肺線維化薬の現状に対し、ポリペプチド、その誘導体ならびに肺線維化を予防および/または治療する薬物の製造におけるその使用を提供することである。前記ポリペプチドはTRB3とMDM2の間の相互作用を標的とし、高活性で、高選択性で肺線維化を予防および/または治療する薬物の製造に使用することができる。
【０００５】
本発明の発明者は深い研究と繰り返した試験によって、TRB3がMDM2と相互作用し、上皮間葉転換を促進するタンパク質であるSLUGの分解を抑制することで、肺線維化を促進するため、TRB3とMDM2の間の相互作用が肺線維化を予防および/または治療する潜在的な標的であることを見出した。このように、TRB3とMDM2の相互作用に対する遮断は肺線維化を予防および/または治療する潜在的な手段で、TRB3とMDM2の相互作用を遮断する薬物の研究開発が必要である。発明者はTRB3とMDM2タンパク質の相互作用を標的とするポリペプチドMR2（そのアミノ酸配列は配列表の配列番号12で示される）を獲得した。同時に、発明者は、ポリペプチドMR2における特定の位置のアミノ酸残基を側鎖が連結可能な非天然アミノ酸、たとえばS-ペンテニルアラニン（S5）に置き換えると、改造されたポリペプチドが安定したαヘリックスの二次構造を有することで、非常に高い親和力、抗酵素分解安定性および細胞透過性を有することを見出した。そのため、改造されたポリペプチドのαヘリックスの安定性、TRB3結合能力および代謝安定性はいずれも高く、肺線維化を治療および/または予防する薬物の製造に使用することができる。発明者の研究に基づき、本発明は下記の技術方案を提供する。
【０００６】
本発明によって提供される技術方案の一つ目は、特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体であって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列表の配列番号12、あるいは配列表の配列番号12で示されるアミノ酸配列における2個または2個以上のアミノ酸を側鎖が連結可能な非天然アミノ酸に置き換えたもので示され、前記誘導体は前記ポリペプチドと細胞膜透過性ペプチドが連結してなるキメラペプチド、前記ポリペプチドとウイルスからなる融合ペプチド、メチル化した前記ポリペプチド、グリコシル化した前記ポリペプチドおよびポリエチレングリコール化した前記ポリペプチドを含む、ポリペプチドである。
【０００７】
前記アミノ酸配列が配列表の配列番号12で示されるポリペプチドはMR2ポリペプチドと呼ばれる。
前記ほかの側鎖を連結させる非天然アミノ酸は本分野の通常の非天然アミノ酸で、好ましくはS-ペンテニルアラニン（S5）である。
【０００８】
ここで、本発明に記載の細胞膜透過性ペプチドは本分野の通常の細胞膜透過性ペプチドで、前記ポリペプチドを細胞に入れることを補助する作用を発揮するものであればよい。一般的に、前記細胞膜透過性ペプチドは10〜30個のアミノ酸からなる短鎖ペプチド分子である。好ましくは、前記細胞膜透過性ペプチドは前記ポリペプチドのN末端またはC末端に、より好ましくは前記ポリペプチドのN末端に連結している。前記細胞膜透過性ペプチドと特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたはポリペプチド誘導体の間は好ましくは2個のグリシン（Gly-Gly）で連結している。
【０００９】
好ましくは、前記細胞膜透過性ペプチドはHIV-1ウイルス逆転写活性化因子（Trans-activator transcription、Tat）タンパク質のTATペプチド（そのアミノ酸配列は配列表の配列番号13で示される）、キイロショウジョウバエ触角ホメオタンパク質の転写因子であるAntpペプチド（そのアミノ酸配列は配列表の配列番号14で示される）、Pep-1ペプチド（そのアミノ酸配列は配列表の配列番号15で示される）、MPGペプチド（そのアミノ酸配列は配列表の配列番号16で示される）およびRGDペプチド（そのアミノ酸配列は配列表の配列番号17で示される）のうちの任意の1種または複数種である。より好ましくは、前記細胞膜透過性ペプチドはPepペプチド（そのアミノ酸配列は配列表の配列番号18で示される）である。
【００１０】
好ましくは、前記キメラペプチドは前記pep2ペプチドを前記MR2ポリペプチドに連結してなるキメラポリペプチドPep2-MR2（そのアミノ酸配列は配列表の配列番号19で示される）、前記TATポリペプチドを前記MR2ポリペプチドに連結してなるキメラポリペプチドTAT-MR2（そのアミノ酸配列は配列表の配列番号20で示される）または前記Antpペプチドを前記MR2ポリペプチドに連結してなるキメラポリペプチドAntp-MR2（そのアミノ酸配列は配列表の配列番号21で示される）である。
【００１１】
好ましくは、前記側鎖が連結可能な非天然アミノ酸はS-ペンテニルアラニンであり、前記ポリペプチドにおいて、前記置き換えられたアミノ酸の数は二つで、前記置き換えられたアミノ酸の位置はそれぞれi番目およびi+3番目、あるいは、i番目およびi+4番目で、ここで、1≦i≦11で、iは正整数である。ここで、i+3およびi+4はいずれもポリペプチドのヘリシティーを増加させることで、ポリペプチドの安定性を向上させる。
【００１２】
より好ましくは、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11のうちのいずれかで示される。
【００１３】
ここで、上記配列番号1〜配列番号11で示されるアミノ酸配列に適切にアミノ酸の置換、欠失または添加を行うことができ、改造されたアミノ酸配列が依然としてTRB3に特異的に結合することができ、かつ改造される前の活性を保つものであればよい。
【００１４】
本発明によって提供される技術方案の二つ目は、肺線維化を治療および/または予防する薬物の製造における特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体の使用である。
【００１５】
本発明に記載の「肺線維化」は本分野の通常の肺線維化である。好ましくは特発性肺線維化の病理的変化を特徴とし、様々な異なる要素による肺線維化をいう。ここで、前記肺線維化はヒトまたは動物の肺線維化が好ましい。より好ましくは、前記肺線維化の症状は、肺線維化による肺部炎症および肺機能減退を含む。好ましくは、前記肺線維化の病因は肺損傷、粉塵または薬物を含む。ここで、前記薬物は本分野の通常の薬物で、肺線維化を引き起こすものであればよい。ブレオマイシンが好ましい。
【００１６】
ここで、前記肺線維化は、原発性（特異性）肺線維化、すなわち原因不明の肺線維化が好ましく、あるいは続発性肺線維化、すなわち元の疾患から続発する肺線維化も好ましい。より好ましくは、肺線維化における肺機能減退、肺部炎症および肺損傷である。前記肺線維化の疾患は慢性閉塞性肺疾患（COPD）、特発性肺線維症または間質性肺炎を含むことが好ましい。
【００１７】
本発明に記載の「予防」とは可能な肺線維化の要素の存在下において、使用後肺線維化の発生を防止または低減することをいう。本発明に記載の「治療」とは肺線維化の程度を軽減すること、あるいは肺線維化を治癒して正常化させること、あるいは肺線維化の進展を緩和することをいう。
【００１８】
本発明によって提供される技術方案の三つ目は、抗肺線維化の薬物組成物であって、前記特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体を活性成分として含有する組成物である。
【００１９】
前記活性成分とは肺線維化を予防または治療する機能を有する化合物をいう。前記薬物組成物において、前記特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体は単独で活性成分として、あるいはほかの抗肺線維化活性を有する化合物とともに活性成分として含有してもよい。
【００２０】
本発明に記載の薬物組成物の投与経路は注射投与または経口投与が好ましい。前記注射投与は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射または皮下注射などの経路を含むことが好ましい。前記薬物組成物は本分野の通常の様々な剤形で、好ましくは固体、半固体または液体の様態で、水溶液、非水溶液または懸濁液でもよく、より好ましくは錠剤、カプセル、顆粒剤、注射剤または輸液剤などである。
【００２１】
好ましくは、本発明に記載の薬物組成物はさらに1種または複数種の薬用担体を含む。前記薬用担体は本分野の通常の薬用担体で、前記薬用担体は任意の適切な生理学的にまたは薬学的に許容される薬物助剤でもよい。前記薬物助剤は本分野の通常の薬物助剤で、好ましくは薬学的に許容される賦形剤、充填剤または希釈剤などを含む。より好ましくは、前記薬物組成物は0.01〜99.99％の上記タンパク質および0.01〜99.99％の薬用担体を含み、前記百分率は前記薬物組成物で占める質量百分率である。
【００２２】
好ましくは、前記薬物組成物の施用量は有効量で、前記有効量は疾患、退行性または損傷性病症の進展を緩和または遅延させることができる量である。前記有効量は個体に基づいて測定し、かつ一部として治療しようとする症状および求められる結果を考慮するものでもよい。
【００２３】
本分野の常識に合うことを前提に、上記各好適な条件を任意に組み合わせれば、本発明の各好適な実例が得られる。
本発明で用いられる試薬および原料はいずれも市販品として得られる。
【００２４】
本発明の積極的な進歩である効果は、本発明のポリペプチドまたはポリペプチド誘導体が特異的にTRB3に結合して、TRB3とMDM2タンパク質の相互作用を遮断することで、肺線維化を治療および予防する薬物の製造に使用することができることにある。製造される薬物は肺線維化疾患の治療において、治療効果が顕著で、毒性・副作用が少なく、使用が安全であるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図1は肺線維化マウスの肺組織におけるTRB3およびMDM2、SLUGの発現増加のスペクトルである。
【図２】図2は肺線維化マウスの肺組織におけるTRB3とMDM2の相互作用のスペクトルである。ここで、出力は肺組織分解液のMDM2抗体または対照抗体IgG沈殿を経た後含まれるTRB3タンパク質とMDM2タンパク質のタンパク質量を示し、入力は最初の肺組織分解液に含まれるTRB3タンパク質とMDM2タンパク質のタンパク質含有量を示す。
【図３】図3はヒト肺上皮細胞の過剰発現のTRB3によるSLUGタンパク質の発現増加の図である。
【図４−１】図4-1は表面プラスモン共鳴方法によってポリペプチドMR2、S1、S2、S3、S4、S5とTRB3タンパク質の結合能力を検証したものである。AはポリペプチドMR2とTRB3タンパク質の動態学曲線で、BはポリペプチドS1とTRB3タンパク質の結合の動態学曲線で、CはポリペプチドS2とTRB3タンパク質の結合の動態学曲線で、DはポリペプチドS3とTRB3タンパク質の結合の動態学曲線で、EはポリペプチドS4とTRB3タンパク質の結合の動態学曲線で、FはポリペプチドS5とTRB3タンパク質の結合の動態学曲線である。ここで、横座標は反応時間で、単位は秒である。縦座標は反応チップの表面とポリペプチドの反応強度で、単位はRUである。
【図４−２】図4-2は表面プラスモン共鳴方法によってポリペプチドS6、S7、S8、S9、S10およびS11とTRB3タンパク質の結合能力を検証したものである。GはポリペプチドS6とTRB3タンパク質の結合の動態学曲線で、HはポリペプチドS7とTRB3タンパク質の結合の動態学曲線で、IはポリペプチドS8とTRB3タンパク質の結合の動態学曲線で、JはポリペプチドS9とTRB3タンパク質の結合の動態学曲線で、KはポリペプチドS10とTRB3タンパク質の結合の動態学曲線で、LはポリペプチドS11とTRB3タンパク質の結合の動態学曲線である。ここで、横座標は反応時間で、単位は秒である。縦座標は反応チップの表面とポリペプチドの反応強度で、単位はRUである。
【図５】はポリペプチドMR2、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10およびS11がTRB3とMDM2タンパク質の相互作用を干渉するスペクトルである。ここで、出力は細胞分解液のMDM2抗体または対照抗体IgG沈殿を経た後含まれるTRB3タンパク質とMDM2タンパク質のタンパク質量を、入力は最初の細胞分解液に含まれるTRB3タンパク質とMDM2タンパク質のタンパク質含有量を示す。
【図６−１】図6-1はポリペプチドMR2、S1、S2、S3、S4、およびS5がブレオマイシンによる肺線維化マウスの生存率を低下させる検出結果の図である。
【図６−２】図6-2はポリペプチドS6、S7、S8、S9、S10およびS11がブレオマイシンによる肺線維化マウスの生存率を低下させる検出結果の図である。
【図７】図7はポリペプチドMR2、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10およびS11がブレオマイシンによる肺線維化マウスの肺重量指数を低下させる結果の図である。
【図８】図8はポリペプチドMR2、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10およびS11がブレオマイシンによる肺線維化を低下させる病理学的検査（HE）の図である。ここで、Aは偽手術群で、Bはブレオマイシンモデル群で、Cはブレオマイシン+MR2群で、Dはブレオマイシン+S1群で、Eはブレオマイシン+S2群で、Fはブレオマイシン+S3群で、Gはブレオマイシン+S4群で、Hはブレオマイシン+S5群で、Iはブレオマイシン+S6群で、Jはブレオマイシン+S7群で、Kはブレオマイシン+S8群で、Lはブレオマイシン+S9群で、Mはブレオマイシン+S10群で、Nはブレオマイシン+S11群である。
【図９】図9はポリペプチドMR2、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10およびS11がブレオマイシンによる肺線維化を低下させる病理学的検査の採点結果の図である。
【図１０】図10はポリペプチドMR2、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10およびS11がブレオマイシンによる肺線維化マウスの肺組織のヒドロキシプロリン含有量の結果の図である。
【図１１】図11はポリペプチドMR2、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10およびS11が肺線維化マウスの肺機能を改善する検出結果である。ここで、Aは深吸気量、Bは動的抵抗力、Cは動的弾性で、Dは動的適応性である。
【図１２】図12はポリペプチドS19、S20、S21がブレオマイシンによる肺線維化マウスの生存を低下させる検出結果の図である。
【図１３】図13はポリペプチドS19、S20、S21がブレオマイシンによる肺線維化マウスの肺重量指数を低下させる結果の図である。
【図１４】図14はポリペプチドS19、S20、S21がブレオマイシンによる肺線維化を低下させる病理学的検査（HE）の図である。ここで、Aは偽手術群で、Bはブレオマイシンモデル群で、Cはブレオマイシン+S19群で、Dはブレオマイシン+S20群で、Eはブレオマイシン+S21群である。
【図１５】図15はポリペプチドS19、S20、S21がブレオマイシンによる肺線維化を低下させる病理学的検査の採点結果の図である。
【図１６】図16はポリペプチドS19、S20、S21がブレオマイシンによる肺線維化マウスの肺組織のヒドロキシプロリン含有量を低下させる結果の図である。
【図１７】図17はポリペプチドS19、S20、S21が肺線維化マウスの肺機能を改善する検出結果である。ここで、Aは深吸気量、Bは動的抵抗力、Cは動的弾性で、Dは動的適応性である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
具体的な実施形態
以下、実施例の形によってさらに本発明を説明するが、これによって本発明を記載された実施例の範囲内に限定するわけではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法および条件、あるいは商品の説明書に従って選ばれた。
【００２７】
実施例に記載のPBS溶液は、濃度が0.1Mで、pH値が7.2のリン酸塩緩衝液をいう。
実施例に記載の室温は本分野の通常の室温で、好ましくは15〜30℃である。
実験結果は平均値±標準偏差で表示され、パラメトリックまたはノンパラメトリック分散検定によって、比較でp＜0.05は有意な差があると、p＜0.01は非常に有意な差があるとする。
【００２８】
実施例1  ポリペプチドの合成
ポリペプチドMR2のアミノ酸配列は配列表の配列番号12を参照する。ポリペプチドMR2は北京賽百盛遺伝子技術有限公司によって合成して精製された。
【００２９】
2個の非天然アミノ酸であるS-ペンテニルアラニン（S5）を導入してポリペプチド鎖の固相合成を行った。ポリペプチド鎖の固相合成が完成された後、ルテニウムを触媒としてオレフィンメタセシス反応（RCM）を行って環化させて、目的ポリペプチドを得た。最後に、目的ポリペプチドを樹脂から切り出して精製した。上記ポリペプチド鎖の固相合成および精製の工程はChinese Peptide Company社によって完成された。ここで、2個のS-ペンテニルアラニンがポリペプチドMR2のアミノ酸配列におけるi番目、i+4番目に挿入され、これによって異なる配列の改造されたポリペプチドが得られ（アミノ酸配列は配列表の配列番号1〜配列番号11を参照する）、その具体的な挿入部位は以下の通りである。
【００３０】
S1：S5-Leu-Met-Ala-S5-Phe-Thr-Cys-Ala-Lys-Lys-Leu-Lys-Lys-Arg
S2：His-S5-Met-Ala-Cys-S5-Thr-Cys-Ala-Lys-Lys-Leu-Lys-Lys-Arg
S3：His-Leu-S5-Ala-Cys-Phe-S5-Cys-Ala-Lys-Lys-Leu-Lys-Lys-Arg
S4：His-Leu-Met-S5-Cys-Phe-Thr-S5-Ala-Lys-Lys-Leu-Lys-Lys-Arg
S5：His-Leu-Met-Ala-S5-Phe-Thr-Cys-S5-Lys-Lys-Leu-Lys-Lys-Arg
S6：His-Leu-Met-Ala-Cys-S5-Thr-Cys-Ala-S5-Lys-Leu-Lys-Lys-Arg
S7：His-Leu-Met-Ala-Cys-Phe-S5-Cys-Ala-Lys-S5-Leu-Lys-Lys-Arg
S8：His-Leu-Met-Ala-Cys-Phe-Thr-S5-Ala-Lys-Lys-S5-Lys-Lys-Arg
S9：His-Leu-Met-Ala-Cys-Phe-Thr-Cys-S5-Lys-Lys-Leu-S5-Lys-Arg
S10：His-Leu-Met-Ala-Cys-Phe-Thr-Cys-Ala-S5-Lys-Leu-Lys-S5-Arg
S11：His-Leu-Met-Ala-Cys-Phe-Thr-Cys-Ala-Lys-S5-Leu-Lys-Lys-S5
実施例2  ウエスタンブロットによる肺線維化マウスの肺組織におけるTRB3、MDM2、SLUGタンパク質の発現の検出
1、動物モデルの構築
ブレオマイシンは日本化薬株式会社から購入され、ロット番号は640412である。
【００３１】
実施例2で使用された化合物は、特に説明しない限り、いずれもSigma社から購入された。
SPF級C57BL/6マウス（雄、6〜8週齢、16〜18g）は、北京VITAL RIVER実験動物有限公司から購入された。
【００３２】
雄C57BL/6マウスを一晩断食させ、45mg/kgのペントバルビタールトンナトリウムを腹腔内注射して（i.p.）麻酔し、ブレオマイシンを気管内注射し、投与量は3U/kgであった。具体的な操作手順は以下の通りである。なるべく小さい創傷でマウスの頸部皮膚を切り開け、反型眼科ピンセットで気管を露出させ、微量サンプラーで気管に差し込み、気管に約50μLのブレオマイシンを注入し、迅速に回転させて5分間直立させ、ブレオマイシンが均一に左右の肺葉に入るようにすることによって、動物モデルを構築した。全部の操作は約60℃程度の手術操作台で行われた。偽手術群ではマウスの気管に等量の注射用生理食塩水を注射した。
【００３３】
上記で構築された動物モデルにおけるマウスをSPF級動物室で飼育し、10日目にマウスの肺部に線維化の病理変化が現れた後マウスを殺処分し、マウスの肺組織を取って後の実験を行った。偽手術群におけるマウスもSPF級動物室で飼育し、10日目に殺処分し、肺組織を取って後の実験を行った。
【００３４】
2、ウエスタンブロットによる肺線維化マウスの肺組織におけるTRB3、MDM2、SLUGタンパク質の発現の検出
工程1で構築された動物モデルから適量の肺組織を取り、分解緩衝液[0.1mM エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、0.1mM グリコールエーテルジアミン四酢酸（EGTA）、10mM KCl、10mM 4-ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸（HEPEs）、50mM NaF、0.1M Na3VO4、0.1M Na3PO4、1mM/L アプロチニン（Aprotinin）、1mM/L トリプターゼ阻害剤（Trypsin inhibitor）、1mM/L フッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）、1mM/L ロイペプチン（Leupeptins）および1mM/L ジチオトレイトール（DTT）を含有する]を入れて均質化した後、氷の上に15min置き、時折振とうした。迅速に10％（v/v）のポリオキエチレンノニルフェニルエーテル（NP-40）を入れて均一に混合し、4℃、12000 rpmで5min遠心分離した。上清を取り、クマシーブリリアントブルー法でタンパク質濃度を測定し、ウエスタンブロット分析に使用できるように、タンパク質濃度を同様に調整した。
【００３５】
ウエスタンブロット分析によってTRB3、MDM2およびSLUGを検出した。Amersham呈色液（NBT/BCIP染色キットIK5030、Cusabio Technology社から購入）で呈色させ、ウエスタンブロット分析ソフト（gelPro32）によって各バンドの光密度値を測定して分析し、結果を図1に示す。図1では、肺線維化マウスの肺組織におけるTRB3、MDM2、SLUGタンパク質が高発現状態にあったことが示された。
【００３６】
実施例3  免疫共沈法による肺線維化組織におけるMDM2とTRB3タンパク質の結合の検証
免疫共沈法で使用された試薬は以下の通りである。
分解液A液：0.6057g Tris塩基、1.7532g NaCl、0.1017 g MgCl2・6H2O、0.0742g EDTA、10mLグリセリンおよび10 mL 10％（v/v）NP40を量り、150mLになるまで脱イオン水を入れ、HClでpH値を7.6に調整し、容量を191mLにし、十分に均一に混合し、0.45μmのろ過膜でろ過し、4℃で保存した。
【００３７】
分解液B液：200μL 2M β-ホスホグリセリン酸、4 mL 2.5M NaF、2mL 100mM NaVO3、2mL 100mM PMSF、200μL 1M DTT、200μL 1 mg/mL Leu、200μL 1mg/mL Pepおよび200μL 1mg/mL Aprを量り、合計体積は9 mLである。-20℃で保存した。使用時、分解液B液を解凍し、分解液B液:分解液A液の体積比1:100の比率で、分解液B液を分解液A液に入れて均一に混合し、細胞分解液を得た。
【００３８】
免疫共沈洗浄液：1％（v/v）NP40、150mM NaCl、20mM HEPES、10％（v/v）pH7.5のグリセリンおよび1mM EDTAを含む。
Protein A/G Plus-Agaroseは米国Santa cruz社から購入された。
【００３９】
具体的な操作工程は、以下の通りである。
（1）実施例2の工程1で構築された動物モデルから適量の肺組織の大葉を取り、肺組織を量った。
【００４０】
（2）免疫共沈分解液で工程（1）で量った肺組織を分解させ、細胞の全タンパク質を約10mg収集し、動物モデルおよび偽手術群の肺組織のタンパク質をいずれも10μg/mLの濃度に調整した。それぞれ動物モデルおよび偽手術群の肺組織のタンパク質を200μg取って入力群とし、そして上記入力群を対照とした。
【００４１】
（3）等量の各群の残りの9800μgのタンパク質にそれぞれ2μg MDM2抗体（Abcamから購入、番号ab16895）およびMDM2抗体と同じ種の通常のIgG抗体（Cell Signalingから購入、商品番号2729）を入れ、同時に10μLのProtein A/G Plus-Agarose（Santa Cruzから購入、番号SC-2003）を入れて十分に懸濁させ、4℃でゆっくり回転させて一晩振とうした。4℃、3000rpmで5min遠心分離し、慎重に上清を吸い捨てた。0.5mLの免疫共沈分解液を入れ、均一に混合し、氷浴で1min静置し、4℃、3000rpmで30秒遠心分離し、慎重に上清を吸い捨てた。5回洗浄を繰り返し、最後の遠心分離の前に5min静置した。慎重に上清を吸い捨て、30μLの2×SDSゲル仕込み緩衝液を入れ、均一に混合し、95℃で3min変性させ、迅速に氷浴に移して冷却した。12000rpm、室温で2min遠心分離し、上清は沈殿したタンパク質サンプルで、一部のタンパク質サンプルを取ってSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。
【００４２】
得られた結果は図2に示すが、図2から、肺線維化組織におけるTRB3タンパク質とMDM2タンパク質に互いに結合する現象があることがわかる。ここで、「入力」は上記の細胞分解液を使用した。「入力」はタンパク質サンプルにおける最初のTRB3とMDM2の含有量、すなわちタンパク質サンプルのMDM2抗体または対照抗体IgG（MDM2抗体がIgG型抗体であるため、IgG抗体を対照とした）による沈殿の前のタンパク質サンプルにおけるTRB3とMDM2の含有量を表す。結果から、入力群の細胞分解液におけるTRB3タンパク質とMDM2タンパク質の含有量が一致したことが示された。
【００４３】
「出力」はタンパク質サンプルのMDM2抗体または対照抗体IgGによる沈殿の後のタンパク質サンプルにおけるTRB3とMDM2の含有量を表す。IgG抗体はMDM2抗体の対照抗体として、MDM2タンパク質を沈殿させることができないため、IgG抗体で処理されたタンパク質サンプルにおけるMDM2ウエスタンブロットレーンが空白を示したが、MDM2抗体は実験群の抗体として、MDM2タンパク質に結合して沈殿させることができるため、MDM2抗体で処理されたタンパク質サンプルの結果は、MDM2ウエスタンブロットレーンが黒色を示した。MDM2タンパク質とTRB3タンパク質の間に相互作用が存在するから、MDM2抗体でMDM2タンパク質を沈殿させる場合TRB3タンパク質も沈殿させるため、MDM2抗体で処理された細胞分解液のTRB3ウエスタンブロットレーンが黒色を示した。IgG抗体がMDM2タンパク質を沈殿させることができないから、MDM2と相互作用するタンパク質TRB3も沈殿させることができないため、IgG抗体で処理された細胞分解液のTRB3ウエスタンブロットレーンが空白を示した。上記結果から、TRB3タンパク質とMDM2タンパク質が直接相互作用することができることが十分に証明された。
【００４４】
実施例4  TRB3による肺上皮細胞SLUGの増加
（1）400μLの脱ヌクレアーゼ水を管に入れ、10秒振とうし、形質移入試薬を希釈した（Invitrogenから購入、型番lipofectamine 2000）。
【００４５】
（2）形質移入試薬をプラスミドDNA[対照プラスミド（OriGene Technologies社から購入、型番PS100001）、TRB3過剰発現プラスミド（OriGene Technologies社から購入、型番RC206687）]と1：2の比率で混合し、前記比率は形質移入試薬の使用量（mL）とDNA質量（mg）の比で、室温で15分間静置し、混合液を得た。
【００４６】
（3）BEAS-2B細胞（中国医学科学院基礎医学研究所から購入）培養プレートにおけるM199培地を吸い取り、PBSで1回洗浄した。
（4）400μLの混合液を入れ、細胞をインキュベーターに戻して37℃で24時間培養した。
【００４７】
（5）RIPA分解液（Beyotime Biotechnology社から購入、型番P0013B）で形質移入後のBEAS-2B細胞を分解させ、実施例3におけるウエスタンブロット方法によって細胞におけるSLUGタンパク質の発現を検出した。
【００４８】
結果を図3に示す。図3から、TRB3を過剰発現するBEAS-2B細胞におけるSlugの発現が顕著に増加したことが示された。
実施例5  表面プラスモン共鳴方法によるポリペプチドS1〜S11とTRB3タンパク質の結合能力の検出
表面プラスモン共鳴実験は表面プラスモン共鳴装置Biacore T200によって行われ、操作手順は表面プラスモン共鳴装置Biacore T200の説明書に従って行われた。具体的な工程は以下の通りである。 
【００４９】
1．精製されたTRB3タンパク質（RD社から購入）をアミノ基を通してCM5チップ（GE社から購入）にカップリングさせ、10μL/minの流速で結合しなかったタンパク質を溶離させて除去し、そしてチップの表面を2時間平衡化させた。ここで、アミノ基のカップリング、溶離および平衡化の具体的な手順はGE社のCM5チップの関連説明書を参照する。
【００５０】
2．自動的に250μLの異なる濃度（800、400、200、50、12.5、6.25および3.125 nM）の実施例1で調製されたS1〜S11およびMR2のポリペプチド断片を仕込み、表面プラスモン共鳴実験は全部25℃で行われた。使用された緩衝液はHBS-EP緩衝液[0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTAおよび0.005％（w/w）界面活性剤TWEEN20]であった。Biacore T200に付いた分析ソフトによって異なる濃度のポリペプチドとTRB3の結合曲線をシミュレートし、結果は図4-1、4-2および表1に示す。図4-1、4-2および表1から、ペプチド断片MR2、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10およびS11がいずれもTRB3タンパク質と相互作用することができることが示された。
【００５１】
【表１】
2019512539.tif 000002
【００５２】
実施例6  円二色性スペクトル法によるポリペプチドS1〜S11のαヘリシティーの検出
円二色性スペクトル装置（日本Jasco社から購入）によってポリペプチドのαヘリシティーを検出した。実施例1で調製されたポリペプチドMR2、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10およびS11をPBS溶液に溶解させ、円二色性スペクトル装置の仕込み濃度を1mg/mLに調整し、結果を表2に示す。表2から、ポリペプチドS1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10およびS11のαヘリシティーが顕著にポリペプチドMR2よりも高いことが示された。ここで、αヘリシティーとは二次構造のαヘリックスを保つポリペプチドのペプチド断片の数が占める全ポリペプチドのペプチド断片の数における百分率をいう。
【００５３】
【表２】
2019512539.tif 000003
【００５４】
実施例7  免疫共沈法によるS1〜S11およびMR2ポリペプチドの細胞レベルでのタンパク質MDM2とTRB3の結合に対する抑制の検証 
1．ヒト肺上皮BEAS-2B細胞（中国医学科学院基礎医学研究所から購入）を90mm2培養シャーレに敷き、細胞が付着したら実施例5に記載の方法によって細胞にTRB3発現プラスミドを導入し、24時間後それぞれ1mg/mLの実施例1で調製されたポリペプチドMR2、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10またはS11を入れ、37℃のインキュベーターで12時間インキュベートした後細胞を収集した。
【００５５】
2．実施例3に記載の方法によってMDM2抗体で免疫共沈を行った後、TRB3抗体で検出した。
結果を図5に示す。図5の結果から、ポリペプチドS1〜S11がTRB3/MDM2タンパク質の相互作用に対する干渉はMR2よりも顕著に強かったことが示された。
【００５６】
実施例8  肺線維化マウスの死亡率に対するポリペプチドS1〜S11の影響の測定
実施例2に記載の方法によって肺線維化動物モデルの構築を行い、モデル構築後10日目からポリペプチドを投与して治療し（治療群分けは表3に示す）、モデル構築後10日目から時間を記録して死亡率を統計した。毎日各群の実験動物の死亡状況を統計して計算し、ある群で動物に死亡が現れなかった場合、その生存率を100％とし、ある群で動物が全部死亡した場合、その生存率を0％とした。前記生存率は生存したマウスの数が占める当該群のマウスの数における百分率である。結果は図6-1、図6-2、表4に示すが、図6-1、図6-2から、偽手術群と比べ、モデル群で生存率が顕著に低下したことが示された。薬物治療後、S1〜S11投与群のいずれでも線維化マウスの生存率を顕著に向上させることができた。図6-1、図6-2において、##は偽手術群と比べる場合で、p＜0.01で、*はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.05で、**はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.01で、i.p.とは腹腔内注射をいう。上記結果から、本発明に係るポリペプチドが有効に肺線維化モデルのマウスの死亡率を低下させることができ、毒性・副作用が少なく、使用がより安全という利点を有することが示された。
【００５７】
【表３】
2019512539.tif 000004
【００５８】
【表４】
2019512539.tif 000005
【００５９】
実施例9  肺線維化マウスの肺重量指数に対するポリペプチドS1〜S11の影響の検出
実施例2に記載の方法によって肺線維化モデルを構築し、表3に従って群分け投与を行った。28日後気をつけてマウスの肺を剥離して湿重量を測定し、肺重量（mg）をマウスの体重（g）で割って肺重量指数を得たが、結果は図7および表5に示す。図7から、偽手術群と比べ、ブレオマイシンを投与した後マウスの肺重量指数が顕著に向上したことがわかる。そのため、ポリペプチドS1〜S11を投与した後いずれも顕著に線維化マウスの肺重量指数を低下させることができた。図7において、##は偽手術群と比べる場合で、p＜0.01で、*はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.05で、**はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.01である。
【００６０】
【表５】
2019512539.tif 000006
【００６１】
実施例10  ブレオマイシンによる肺線維化の病理形態学に対するポリペプチドS1〜S11の影響の測定
一般的な組織変化および組織産物はいずれもHE染色法、すなわちヘマトキシリン-エオジン染色法によって示すことができ、これは形態学で最も使用される染色方法である。ここで、ヘマトキシリン染液は塩基性染液で、主に細胞核内における染色質と細胞質内におけるリボソームを紫藍色に着色させ、エオジンは酸性染料で、主に細胞質および細胞外基質における成分を赤色に着色させる。実施例2に記載の方法によって肺線維化モデルを構築し、表3に従って群分け投与を行った。28日後実験動物の右側下葉の肺組織を取り、4％（v/v）パラホルムアルデヒドで固定化させた後パラフィンで包埋した。肺組織を包埋したパラフィン塊の最大断面で切片を取り、HE染色して基本の病理変化を観察した。結果を図8に示す。図8では、偽手術のマウスの肺部のHE染色組織がはっきり見え、肺胞の構造が完全で、炎症や線維化の病理変化が見られなかったことが示された。ブレオマイシン群では、マウスの肺部に顕著な炎症が現れ、炎症性細胞が大量に浸潤し、肺組織の構造がずいぶん破壊された。ポリペプチドS1〜S11を投与した後いずれもブレオマイシンによる肺部炎症を軽減することができ、かつ有効に肺損傷を改善し、肺部の正常構造を回復させた。
【００６２】
HE染色の結果によって炎症性の分級の観察を行ったが、基準は以下の通りである（0〜5級）。0級：正常組織。1級：非常に小さい炎症の変化。2級：軽度から中等の炎症の変化で、顕著な肺組織構造の破壊がない。3級：中等程度の炎症損傷（肺胞隔膜肥厚）。4級：中等程度から重度の炎症損傷で、組織の団塊が形成するか、あるいは局在性肺炎領域が肺組織の正常構造を破壊する。5級：重篤な炎症損傷で、局部の肺組織の構造が深刻に破壊されて管腔閉塞などが起こる。
【００６３】
結果を図9および表6に示す。結果から、偽手術群と比べ、ブレオマイシンを投与した後マウスの肺部に顕著な炎症が現れたことが示された。ポリペプチドS1〜S11の投与はいずれもブレオマイシンによる肺部炎症を顕著に軽減することができた。図9において、##は偽手術群と比べる場合で、p＜0.01で、*はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.05で、**はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.01である。
【００６４】
【表６】
2019512539.tif 000007
【００６５】
実施例11  肺線維化マウスのヒドロキシプロリン含有量に対する  ポリペプチドS1〜S11の影響の測定
ヒドロキシプロリンはコラーゲンで13.4％（w/w）を占め、エラスチンで極少量を占め、ほかのタンパク質のいずれにも存在しないため、ヒドロキシプロリンによってコラーゲンの含有量を検出した。実施例2に記載の方法によって肺線維化モデルを構築し、表3に従って群分け投与を行った。28日後動物の左肺全葉のヒドロキシプロリンの含有量を検出し、肺線維化の状況を評価した。
【００６６】
具体的な方法は以下の通りである。実施例2で構築された動物モデルにおけるマウスをSPF級動物室内で飼育し、かつ表3の投与プロトコールに従ってポリペプチドを投与して治療し、動物モデルの構築後の21日目に実験動物の左肺全葉を取り、湿質量を記録し、生理食塩水で超音波で均質化して10％（w/w）の組織均質液にし、約150μLの均質液の上清液を取り、500μLの塩基加水分解液（南京建成生物工程技術有限公司のヒドロキシプロリン塩基加水分解キットによって提供された）を入れ、ボルテックスで均一に混合した後、120℃、0.1kPaの条件で塩基加水分解法によって40min処理し、pH値を調整した後一定の容量にし、活性炭素で処理した後上清を取った。クロラミンT法によってヒドロキシプロリンの測定を行った（本実施例の操作方法は南京建成生物工程技術有限公司のキットの説明書を参照する）。結果を図10および表7に示す。図10から、偽手術群と比べ、ブレオマイシン群ではヒドロキシプロリン含有量が顕著に向上したことがわかるが、これは線維化の病理変化が深刻であったことを説明した。S1〜S11を投与した後顕著に線維化マウスの肺部のヒドロキシプロリン含有量を低下させることができた。図10において、##は偽手術群と比べる場合で、p＜0.01で、*はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.05で、**はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.01である。
【００６７】
【表７】
2019512539.tif 000008
【００６８】
実施例12  肺線維化マウスの肺機能に対するポリペプチドS1〜S11の影響の測定
肺機能は臨床で患者の肺線維化を検出する重要な指標である。肺機能の低下はよく線維化の深刻化が伴い、肺機能の改善も一般的に肺部組織の構造の回復を表す。実施例2に記載の方法によって肺線維化モデルを構築し、表3に従って群分け投与を行った。動物モデル構築後の28日目に、マウスをペントバルビタールトンナトリウム（45mg/kg，i.p.）で麻酔し、Flexivent小動物肺機能装置で肺機能を検出し、検出方法はTLC、SnapShotsであった（検出方法はLv X, Wang X, Li Kら、Rupatadine Protects against Pulmonary Fibrosis by Attenuating PAF-Mediated Senescence in Rodents[J]. PloS one, 2013, 8(7): e68631.を参照する）。
【００６９】
結果は図11および表8に示すが、ここで、Aは深吸気量、Bは動的抵抗力、Cは動的弾性で、Dは動的適応性である。図11では、偽手術群と比べ、ブレオマイシンによって誘導された肺線維化マウスの深吸気量が顕著に低下し、肺部の動的抵抗力および動的弾性が向上し、適応性が顕著に低下したことが示された。ポリペプチドS1〜S11による治療後肺機能が顕著に回復した。図11において、##は偽手術群と比べる場合で、p＜0.01で、*はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.05で、**はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.01である。
【００７０】
【表８】
2019512539.tif 000009
【００７１】
上記実施例の結果から、本発明のポリペプチドが顕著な抗肺線維化作用を有し、活性成分として抗肺線維化薬の製造に使用することができることが示された。
実施例13  ポリペプチド誘導体S19〜S21（ポリペプチドMR2+細胞膜透過性ペプチドのキメラポリペプチド）の合成
S19：キメラポリペプチドPep2-MR2（そのアミノ酸配列は配列表の配列番号19で示される）、S20：キメラポリペプチドTAT-MR2（そのアミノ酸配列は配列表の配列番号20で示される）、S21：キメラポリペプチドAntp-MR2（そのアミノ酸配列は配列表の配列番号21で示される）は北京賽百盛遺伝子技術有限公司によって合成して精製された。
【００７２】
実施例14  肺線維化マウスの死亡率に対するS19〜S21の影響の測定
実施例2に記載の方法によって肺線維化動物モデルの構築を行い、モデル構築後10日目からポリペプチドを投与して治療し（治療群分けは表9に示す）、モデル構築後10日目から時間を記録して死亡率を統計した。毎日各群の実験動物の死亡状況を統計して計算し、ある群で動物に死亡が現れなかった場合、その生存率を100％とし、ある群で動物が全部死亡した場合、その生存率を0％とした。結果は図12および表10に示す。図12から、偽手術群と比べ、モデル群で生存率が顕著に低下したことが示された。薬物治療後、S19〜S21投与群のいずれでも線維化マウスの生存率を顕著に向上させることができた。図12において、##は偽手術群と比べる場合で、p＜0.01で、*はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.05で、**はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.01である。上記結果から、本発明に係るポリペプチド誘導体が有効に肺線維化モデルのマウスの死亡率を低下させることができ、毒性・副作用が少なく、使用がより安全という利点を有することが示された。
【００７３】
【表９】
2019512539.tif 000010
【００７４】
【表１０】
2019512539.tif 000011
【００７５】
実施例15  肺線維化マウスの肺重量指数に対するS19〜S21の影響の検出
実施例2に記載の方法によって肺線維化モデルを構築し、表9に従って群分け投与を行った。28日後気をつけてマウスの肺を剥離して湿重量を測定し、肺重量（mg）をマウスの体重（g）で割って肺重量指数を得たが、結果は図13および表11に示す。図13から、偽手術群と比べて、ブレオマイシンを投与した後マウスの肺重量指数が顕著に向上したことがわかる。そのため、S19〜S21を投与した後いずれも線維化マウスの肺重量指数を顕著に低下させることができた。図13において、##は偽手術群と比べる場合で、p＜0.01で、*はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.05で、**はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.01である。
【００７６】
【表１１】
2019512539.tif 000012
【００７７】
実施例16  ブレオマイシンによる肺線維化の病理形態学に対するS19〜S21の影響の測定
実施例2に記載の方法によって肺線維化モデルを構築し、表9のように群分け投与を行った。28日後実験動物の右側下葉の肺組織を取り、4％（v/v）パラホルムアルデヒドで固定化させた後パラフィンで包埋した。肺組織を包埋したパラフィン塊の最大断面で切片を取り、HE染色して基本の病理変化を観察した。結果を図14に示す。図14から、S19〜S21を投与した後いずれもブレオマイシンによる肺部炎症を軽減することができ、かつ有効に肺損傷を改善し、肺部の正常構造を回復させたことが示された。
【００７８】
HE染色の結果によって炎症性の分級の観察を行ったが、基準は以下の通りである（0〜5級）。0級：正常組織。1級：非常に小さい炎症の変化。2級：軽度から中等の炎症の変化で、顕著な肺組織構造の破壊がない。3級：中等程度の炎症損傷（肺胞隔膜肥厚）。4級：中等程度から重度の炎症損傷で、組織の団塊が形成するか、あるいは局在性肺炎領域が肺組織の正常構造を破壊する。5級：重篤な炎症損傷で、局部の肺組織の構造が深刻に破壊されて管腔閉塞などが起こる。
【００７９】
結果を図15および表12に示す。結果から、偽手術群と比べ、ブレオマイシンを投与した後マウスの肺部に顕著な炎症が現れたことが示された。S19〜S21の投与はいずれもブレオマイシンによる肺部炎症を顕著に軽減することができた。図15において、##は偽手術群と比べる場合で、p＜0.01で、*はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.05で、**はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.01である。
【００８０】
【表１２】
2019512539.tif 000013
【００８１】
実施例17  肺線維化マウスのヒドロキシプロリン含有量に対するS19〜S21の影響の測定
ヒドロキシプロリンはコラーゲンで13.4％（w/w）を占め、エラスチンで極少量を占め、ほかのタンパク質のいずれにも存在しないため、ヒドロキシプロリンによってコラーゲンの含有量を検出した。実施例2に記載の方法によって肺線維化モデルを構築し、表9のように群分け投与を行った。28日後動物の左肺全葉のヒドロキシプロリンの含有量を検出し、肺線維化の状況を評価した。
【００８２】
具体的な方法は以下の通りである。実施例2で構築された動物モデルにおけるマウスをSPF級動物室内で飼育し、かつ表9の投与プロトコールに従ってポリペプチドを投与して治療し、動物モデルの構築後の21日目に実験動物の左肺全葉を取り、湿質量を記録し、生理食塩水で超音波で均質化して10％（w/w）の組織均質液にし、約150μLの均質液の上清液を取り、500μLの塩基加水分解液（南京建成生物工程技術有限公司のヒドロキシプロリン塩基加水分解キットによって提供された）を入れ、ボルテックスで均一に混合した後、120℃、0.1kPaの条件で塩基加水分解法によって40min処理し、pH値を調整した後一定の容量にし、活性炭素で処理した後上清を取った。クロラミンT法によってヒドロキシプロリンの測定を行った（本実施例の操作方法は南京建成生物工程技術有限公司のキットの説明書を参照する）。結果を図16および表13に示す。図16から、偽手術群と比べ、ブレオマイシン群ではヒドロキシプロリン含有量が顕著に向上したことがわかるが、これは線維化の病理変化が深刻であったことを説明した。S19〜S21を投与した後顕著に線維化マウスの肺部のヒドロキシプロリン含有量を低下させることができた。図16において、##は偽手術群と比べる場合で、p＜0.01で、*はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.05で、**はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.01である。
【００８３】
【表１３】
2019512539.tif 000014
【００８４】
実施例18  肺線維化マウスの肺機能に対するS19〜S21の影響の測定
肺機能は臨床で患者の肺線維化を検出する重要な指標である。肺機能の低下はよく線維化の深刻化が伴い、肺機能の改善も一般的に肺部組織の構造の回復を表す。実施例2に記載の方法によって肺線維化モデルを構築し、表9に従って群分け投与を行った。28日後、マウスをペントバルビタールトンナトリウム（45mg/kg，i.p.）で麻酔し、Flexivent小動物肺機能装置で肺機能を検出し、検出方法はTLC、SnapShotsであった（検出方法はLv X, Wang X, Li Kら、Rupatadine Protects against Pulmonary Fibrosis by Attenuating PAF-Mediated Senescence in Rodents[J]. PloS one, 2013, 8(7): e68631.を参照する）。
【００８５】
結果は図17および表14に示すが、ここで、Aは深吸気量、Bは動的抵抗力、Cは動的弾性で、Dは動的適応性である。図17では、偽手術群と比べ、ブレオマイシンによって誘導された肺線維化マウスの深吸気量が顕著に低下し、肺部の動的抵抗力および動的弾性が向上し、適応性が顕著に低下したことが示された。ポリペプチドS19〜S21による治療後肺機能が顕著に回復した。図17において、##は偽手術群と比べる場合で、p＜0.01で、*はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.05で、**はブレオマイシン群と比べる場合で、p＜0.01である。
【００８６】
【表１４】
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【００８７】
上記実施例の結果から、本発明のポリペプチド誘導体も顕著な抗肺線維化作用を有し、活性成分として抗肺線維化薬の製造に使用することができることが示された。
以上、本発明の具体的な実施形態を記述したが、当業者にとって、これらは例示の説明だけで、本発明の原理と実質に反しないという前提下において、これらの実施形態に対して様々な変更や修正をすることができるが、それらの等価の様態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年8月31日(2018.8.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体であって、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列表の配列番号12、あるいは配列表の配列番号12で示されるアミノ酸配列における2個または2個以上のアミノ酸を側鎖が連結可能な非天然アミノ酸に置き換えたもので示され、前記誘導体は前記ポリペプチドと細胞膜透過性ペプチドが連結してなるキメラペプチド、前記ポリペプチドとウイルスからなる融合ペプチド、メチル化した前記ポリペプチド、グリコシル化した前記ポリペプチドおよびポリエチレングリコール化した前記ポリペプチドを含む、ポリペプチド。
【請求項２】
前記側鎖が連結可能な非天然アミノ酸はS-ペンテニルアラニンであることを特徴とする請求項1に記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体。
【請求項３】
前記置き換えられたアミノ酸の数は二つで前記置き換えられたアミノ酸の位置はそれぞれi番目およびi+3番目、あるいは、i番目およびi+4番目で、ここで、1≦i≦11であることを特徴とする請求項2に記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体。
【請求項４】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列表の配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10および配列番号11のうちのいずれかで示されることを特徴とする請求項３に記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体。
【請求項５】
前記細胞膜透過性ペプチドはHIV-1ウイルス逆転写活性化因子タンパク質のTATペプチド、キイロショウジョウバエ触角ホメオタンパク質の転写因子であるAntpペプチド、Pep-1ペプチド、Pep-2ペプチド、MPGペプチドおよびRGDペプチドからなる群より選ばれる任意の1種または複数種であることを特徴とする請求項1〜４のいずれかに記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体。
【請求項６】
前記細胞膜透過性ペプチドは前記ポリペプチドのN末端またはC末端に連結していることを特徴とする請求項５に記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体。
【請求項７】
前記細胞膜透過性ペプチドがPep-2ペプチドである場合、前記ポリペプチドの誘導体のアミノ酸配列は配列表の配列番号19で示され、
細胞膜透過性ペプチドがTATペプチドである場合、前記ポリペプチドの誘導体のアミノ酸配列は配列表の配列番号20で示され、
細胞膜透過性ペプチドがAntpペプチドである場合、前記ポリペプチドの誘導体のアミノ酸配列は配列表の配列番号21で示される、
ことを特徴とする請求項６のいずれかに記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体。
【請求項８】
肺線維化の治療および/または予防に用いられる請求項1〜７のいずれか一項に記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体。
【請求項９】
前記肺線維化は原発性肺線維化または続発性肺線維化であることを特徴とする請求項８に記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体。
【請求項１０】
前記肺線維化はブレオマイシンによる肺線維化であることを特徴とする請求項８に記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体。
【請求項１１】
請求項1〜７のいずれか一項に記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体を含有することを特徴とする抗肺線維化の薬物組成物。
【請求項１２】
さらに1種または複数種の薬用担体を含むことを特徴とする請求項１１に記載の薬物組成物。
【請求項１３】
請求項1〜７のいずれか一項に記載の特異的にTRB3に結合するポリペプチドまたは前記ポリペプチドの誘導体を抗肺線維化活性を有する化合物とともに活性成分として含有することを特徴とする請求項１１または１２に記載の薬物組成物。
【国際調査報告】
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