(57)【要約】光学的に検証されるｄｅ  ｎｏｖｏ  ＤＮＡ合成のための装置は、ヌクレオチドが結合されるＤＮＡの一本鎖を固定することができるその床に機能化領域を有する合成チャンバに入るチャネルおよび合成チャンバから出て行くチャネルを有する微小流体システムを備える。チャンバは、ＤＮＡ鎖に結合しているフルオロフォアにおける電子を励起する照射システムと、励起された電子がその基底状態に減衰するにつれて放出されるシグネチャ光子を検出する検出システムと光通信する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小流体システムと、検出システムと、励起システムとを備える装置であって、前記微小流体システムは第１の製造ユニットを備え、前記第１の製造ユニットは、チャンバと、第１のチャネルと、第２のチャネルと、機能化領域とを備え、前記機能化領域は、モノマーが結合している分子鎖を保持するように構成され、前記機能化領域は前記チャンバに配置され、前記チャンバは前記検出システムと光通信し、前記チャンバは前記励起システムと光通信し、前記第１のチャネルは前記チャンバと接続し、前記第２のチャネルは前記チャンバと接続し、前記検出システムは、一本鎖に結合しているフルオロフォアからシグネチャ光子を検出するように調整された検出器を備え、前記一本鎖は前記機能化領域に結合しており、前記励起システムは、前記フルオロフォアを照射するように配置される光源を備え、前記光源は特定の電子励起状態を刺激するように構成される、装置。
【請求項２】
前記微小流体システムは基板上に形成され、前記装置は前記第１の製造ユニットと同じ構造を有する第２の製造ユニットをさらに備え、前記第２の製造ユニットは前記基板上に形成される、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記第１の製造ユニットおよび前記第２の製造ユニットを制御するための制御装置をさらに備え、前記第１の製造ユニットおよび前記第２の製造ユニットの各々は、前記製造ユニットの対応するチャンバ内の溶液に電子を提供するように構成される電極を備え、前記制御装置は前記電極を独立して制御するように構成される、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記第１の製造ユニットおよび前記第２の製造ユニットを制御するための制御装置をさらに備え、前記制御装置は、前記第１の製造ユニットに第１のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ鎖を合成させるように構成され、前記制御装置は、前記第２の製造ユニットに第２のヌクレオチド配列を有するＤＮＡ鎖を合成させるように構成され、前記第１の配列および第２の配列は異なる、請求項２に記載の装置。
【請求項５】
前記チャンバは、床と、開口部と、傾斜した側壁とを有するウェルを備え、前記傾斜した側壁は前記床から前記開口部まで延在し、前記側壁は、前記床が前記開口部の領域よりも小さい領域を有するように傾斜される、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記ウェルが結晶基板に形成され、前記傾斜した側壁が前記基板の結晶面に適合する、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記傾斜した側壁は鏡面である、請求項５に記載の装置。
【請求項８】
第１の有孔領域を有するフォトニック結晶をさらに備え、前記第１の有孔領域は第１の組の孔によって貫通され、前記チャンバは前記孔のうちの１つを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
第１のコロネードを有するフォトニック結晶をさらに備え、前記第１のコロネードは第１の列のカラムを備え、前記チャンバは一対の前記カラムの間に配置される、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記フォトニック結晶は一次元フォトニック結晶である、請求項８または請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記フォトニック結晶は二次元フォトニック結晶である、請求項８または請求項９に記載の装置。
【請求項１２】
前記孔は、共振空洞を画定するように構成される、請求項８に記載の装置。
【請求項１３】
前記カラムは、共振空洞を画定するように構成される、請求項９に記載の装置。
【請求項１４】
前記第１の組の孔は、前記第１の有孔領域を第１の波長で共振させるように構成され、前記第１の波長は、前記シグネチャ光子の放射放出をもたらすように前記フルオロフォアにおける励起状態の減衰を促進するように選択される、請求項８に記載の装置。
【請求項１５】
第１の組のカラムが、前記第１のコロネードを第１の波長で共振させるように構成され、前記第１の波長は、前記シグネチャ光子の放射放出をもたらすように前記フルオロフォアにおける励起状態の減衰を促進するように選択される、請求項９に記載の装置。
【請求項１６】
前記第１の組の孔は、前記フォトニック結晶を通してその伝播を可能にする偏光を有するシグネチャ光子の放出を促進するように構成される、請求項８に記載の装置。
【請求項１７】
第１の組のカラムが、前記フォトニック結晶を通してその伝播を可能にする偏光を有するシグネチャ光子の放出を促進するように構成される、請求項９に記載の装置。
【請求項１８】
前記第１の有孔領域に隣接する第２の有孔領域をさらに備え、前記第２の有孔領域は第２の組の孔によって貫通され、前記第２の組の孔は前記第１の組の孔とは異なるように構成される、請求項８に記載の装置。
【請求項１９】
前記第２の組の孔は、前記シグネチャ光子が前記第２の有孔領域に入るときに、シグネチャ光子の反射を促進するように構成される、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記第１のコロネードに隣接する第２のコロネードをさらに備え、前記第２のコロネードは第２の組のカラムを備え、前記第２の組のカラムは第１の組のカラムとは異なるように構成される、請求項９に記載の装置。
【請求項２１】
前記第２の組のカラムは、前記シグネチャ光子が前記第２のコロネードに入るときに、シグネチャ光子の反射を促進するように構成される、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
検出器と、第１の有孔領域に隣接する無孔領域とをさらに備え、前記無孔領域は前記検出器と光通信する、請求項８または請求項９に記載の装置。
【請求項２３】
前記微小流体システムは、圧力下での変形に抵抗する基板上に形成される、請求項１、請求項５、請求項８または請求項９に記載の装置。
【請求項２４】
前記微小流体システムは、吸着に抵抗する基板上に形成される、請求項１、請求項５、請求項８または請求項９に記載の装置。
【請求項２５】
前記微小流体システムは、吸収に抵抗する基板上に形成される、請求項１、請求項５、請求項８または請求項９に記載の装置。
【請求項２６】
前記微小流体システムは、複数の溶液の供給源と、前記溶液のどれが前記チャンバに供給されるかを制御するための制御システムとを備える、請求項１、請求項５、請求項８または請求項９に記載の装置。
【請求項２７】
前記検出器は、単一光子検出器と、前記検出器と前記チャンバとの間の光通信を提供するように配置される光伝送システムとを備える、請求項１、請求項５、請求項８または請求項９に記載の装置。
【請求項２８】
前記チャンバと連絡する電極をさらに備え、前記電極は、前記チャンバ内の電子についての供給源およびシンクを提供して前記チャンバ内の電気化学反応を促進するように構成される、請求項１、請求項５、請求項８または請求項９に記載の装置。
【請求項２９】
前記チャンバと連絡する電極をさらに備え、前記電極は、前記チャンバ内の電子についての供給源およびシンクを提供して前記チャンバ内の電気化学反応を促進するように構成され、前記電極は、前記チャンバの床上に配置される第１の電極と、前記チャンバと励起源との間の経路に沿って配置される第２の電極とを備える、請求項１、請求項５、請求項８または請求項９に記載の装置。
【請求項３０】
少なくとも１つが透明であり、前記チャンバと連絡する電極をさらに備え、前記電極は、前記チャンバ内の電子についての供給源およびシンクを提供して前記チャンバ内の電気化学反応を促進するように構成される、請求項１、請求項５、請求項８または請求項９に記載の装置。
【請求項３１】
前記チャンバ上の透明カバーと、前記チャンバと連絡する電極とをさらに備え、前記電極は、前記チャンバ内の電子についての供給源およびシンクを提供して前記チャンバ内の電気化学反応を促進するように構成され、少なくとも１つの電極が前記透明カバー上に配置される、請求項１、請求項５、請求項８または請求項９に記載の装置。
【請求項３２】
検出器と、前記第１のコロネードに隣接する均質領域とをさらに備え、前記均質領域は前記検出器と光通信する、請求項９に記載の装置。
【請求項３３】
分子鎖構築が行われるウェルを形成することを含む方法であって、ウェルを形成することは、第１の直交結晶面および第２の直交結晶面を有する基板内に、前記基板の第３の結晶面を露出させ、それによって床を有するウェルの側壁を形成し、前記側壁を反射層でコーティングし、前記床を機能化し、それによって分子鎖が前記床に連結されることを可能にすることを含む、方法。
【請求項３４】
前記第３の結晶面を露出させることは、第１の速度で第１の方向に沿って、および第２の速度で第２の方向に沿って前記基板を同時にエッチングすることを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第３の結晶面を露出させることは、水酸化物アニオンおよびテトラメチルアンモニウムカチオンを含有する溶液に前記基板を曝露することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記溶液の表面張力を低下させることをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
オクチルフェノールエトキシレートを前記溶液に添加することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記反射層を誘電体スペーサで覆うことをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記チャンバを透明カバーで覆うことをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記チャンバを覆う透明カバー上に透明電極を形成することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
ペイロードを分子鎖に加えるための方法であって、前記ペイロードが結合される分子鎖を含むチャンバ内に担体を提供するステップであって、前記担体の各々は結合間隔後に前記ペイロードのインスタンスに結合される、ステップと、前記チャンバを洗い流し、それによって前記チャンバから前記担体のうちの１つを除く全てを除去するステップと、前記ペイロードのインスタンスが前記鎖に結合されたことを確認するステップとを含む、方法。
【請求項４２】
確認するステップは、前記チャンバを問い合わせ光子で照射するステップと、前記問い合わせ光子に応答して放出されるシグネチャ光子を検出するステップとを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
担体を提供するステップは、ブロッキング基に結合したシグナリング基を提供するステップを含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
担体を提供するステップは、問い合わせ光子による照射に応答してシグネチャ光子を放出する基を提供するステップを含み、前記基はブロッキング基に結合している、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ブロッキング基を提供するステップをさらに含み、前記ブロッキング基は、前記鎖に結合した場合、他の担体が前記鎖に結合することを阻止する、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記鎖は第１の末端および第２の末端を有し、前記ペイロードは前記第１の末端に結合され、前記方法は前記第２の末端を基板に連結するステップをさらに含む、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記鎖は第１の末端および第２の末端を有し、前記ペイロードは前記第１の末端に結合され、前記方法は前記第１の末端を基板に連結するステップをさらに含む、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記鎖をＤＮＡの一本鎖であるように選択し、前記ペイロードをヌクレオチドであるように選択するステップをさらに含む、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記ペイロードを前記担体から分離し、それによって前記ペイロードを前記分子鎖に残すステップをさらに含む、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項５０】
前記ペイロードを前記担体から電気化学的に分離し、それによって前記ペイロードを前記分子鎖に残すステップをさらに含む、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記ペイロードを前記担体から光学的に切断し、それによって前記ペイロードを前記分子鎖に残すステップをさらに含む、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
前記ペイロードを前記担体から化学的に切断し、それによって前記ペイロードを前記分子鎖に残すステップをさらに含む、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
さらなるペイロードを保持するさらなる担体を前記チャンバ内に導入するステップと、前記さらなるペイロードが前記鎖に結合されるのを阻止するステップとをさらに含む、請求項４１または請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮出願第６２／３５３，３１８号の２０１６年６月２２日の優先日および米国仮出願第６２／３９８，０３４号の２０１６年９月２２日の優先日の利益を主張し、これらの両方の内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は分子鎖の合成に関し、特に一本鎖ＤＮＡに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ鎖を取得し、塩基対の配列を同定することは、当該技術分野において公知である。「配列決定」として知られるこのプロセスは、遺伝学の理解を促進するのに役立っている。
【０００４】
天然に存在するＤＮＡにどんな塩基対が存在するかを知るだけでなく、塩基対について独自の選択で新しいＤＮＡ鎖を合成できることが望ましい。そのようにできる能力により、多くの商業的および医学的応用を生じさせる可能性がある。
【０００５】
ヌクレオチドを結合させる公知の方法としては、標準的なホスホロアミダイト固相合成が挙げられる。代替の方法は、エラーの修正を伴うチップベースの化学ＤＮＡ合成を可能にすることに関連して、印刷されたＤＮＡマイクロアレイの使用を含む。これらの方法は両方とも、ホスホロアミダイト化学に依存する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様では、本発明は、チャンバと、チャンバに接続される第１のチャネルおよび第２のチャネルと、モノマーが結合される分子鎖を保持するようにチャンバに配置される機能化領域とを備える第１の製造ユニットを有する微小流体システムを特徴とする。チャンバは検出システムおよび励起システムの両方と光通信する。検出システムは、機能化領域に結合している一本鎖に結合しているフルオロフォアからシグネチャ光子を検出するように調整された検出器を備える。励起システムは、フルオロフォアを照射し、その特定の電気励起状態を刺激するように配置される光源を備える。
【０００７】
実施形態は、微小流体システムが、第１の製造ユニットと同じ構造を有する１つまたは複数のさらなる製造ユニットを有する基板上に形成されるものを含む。これらのさらなる製造ユニットはまた、第１の製造ユニットと同様に基板上に形成される。これにより、多くのモノマー鎖が並行して構築されることを可能にする。これらの実施形態の中には、各製造ユニットに関連付けられた、独立して制御される電極を有するものがある。これらの電極は、対応するチャンバの各々にある溶液に電子を供給する。また、これらの実施形態の中には、製造ユニットを制御するための制御装置を有するものもある。このような制御装置は、１つの製造ユニットに第１のヌクレオチド配列を合成させ、一方、第２の製造ユニットに第１のヌクレオチド配列と同じか、または第１のヌクレオチド配列とは異なる第２のヌクレオチド配列を合成させる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、チャンバはウェルを有する。ウェルは、床と、開口部と、床から開口部まで延在する傾斜した側壁とを有する。これらの側壁は、床の領域が開口部の領域よりも小さくなるように傾斜している。これらの中には、ウェルが結晶性基板に形成され、傾斜した側壁が基板の結晶面のうちの１つまたは複数と適合する実施形態がある。これらの実施形態のうちのいくつかでは、傾斜した側壁は鏡面である（ｍｉｒｒｏｒｅｄ）か、または反射性表面でコーティングされる。
【０００９】
他の実施形態は、第１の有孔領域を画定する第１の組の孔を有するフォトニック結晶を特徴とする。これらの実施形態では、チャンバはこれらの孔のうちの１つである。これらの実施形態のいくつかでは、フォトニック結晶は一次元であり、他の実施形態では二次元である。他の実施形態では、孔は共振空洞を画定する。また、これらの実施形態の中には、第１の組の孔が第１の有孔領域を第１の波長で共振させるものもある。この第１の波長は、シグネチャ光子の放射放出をもたらすようにフルオロフォアにおける励起状態の減衰を促進するものである。さらに他の実施形態では、第１の組の孔は、フォトニック結晶を通るその伝播を可能にする偏光を有するシグネチャ光子の放出を促進する。
【００１０】
また、第１の有孔領域を有するフォトニック結晶を有する実施形態の中には、第１の有孔領域に隣接する第２の有孔領域が存在するものもある。第２の組の孔は第２の有孔領域を貫通する。この第２の組の孔は第１の組の孔とは異なるように構成される。これらの実施形態の中には、第２の組の孔が、シグネチャ光子が第２の有孔領域に入るときにシグネチャ光子の反射を促進するものがある。また、これらの実施形態の中には、検出器と、第１の有孔領域に隣接する無孔領域とを含むものもある。この無孔領域は検出器と光通信する。
【００１１】
また、フォトニック結晶を有する実施形態の中には、上述のパターンと相補的なパターンを有することによってフォトニックバンドギャップを生成するものがある。これらの実施形態では、孔を有する基板の代わりに、基板は孔と同様の寸法のカラム（ｃｏｌｕｍｎ）を有する。液体はカラムの周囲を容易に流れるので、このような実施形態は、機能化領域に迅速に到達する液体の能力を促進する。
【００１２】
これらの実施形態は、第１のコロネード（ｃｏｌｏｎｎａｄｅ）を画定する第１の列のカラムを有するフォトニック結晶を特徴とする。これらの実施形態では、チャンバは２つのカラムの間にある。これらの実施形態のいくつかでは、フォトニック結晶は一次元であり、他の実施形態では二次元である。他の実施形態では、カラムは共振空洞を画定する。また、これらの実施形態の中には、第１の列のカラムが、第１のコロネードを第１の波長で共振させるものもある。この第１の波長は、シグネチャ光子の放射放出をもたらすようにフルオロフォアにおける励起状態の減衰を促進するものである。さらに他の実施形態では、第１の列のカラムは、フォトニック結晶を通してその伝播を可能にする偏光を有するシグネチャ光子の放出を促進する。
【００１３】
また、第１の有孔領域を有するフォトニック結晶を有する実施形態の中には、第１の有孔領域に隣接する第２のコロネードが存在するものがある。第２の列のカラムは第２の有孔領域を貫通する。この第２の列のカラムは第１の列のカラムと異なるように構成される。これらの実施形態の中には、第２の列のカラムが、シグネチャ光子が第２のコロネードに入るときに、シグネチャ光子の反射を促進するものがある。また、これらの実施形態の中には、検出器と、第１のコロネードに隣接する均質領域とを含むものがある。この均質領域は検出器と光通信する。
【００１４】
微小流体システムが形成される基板は、いくつかの特性のうちの任意の１つまたは複数を有するものである。これらの特性には、圧力下での変形に対する抵抗、吸着に対する抵抗、および吸収に対する抵抗が含まれる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、微小流体システムは複数の溶液の供給源を含む。これらの実施形態は典型的に、溶液のどれがチャンバに供給されるかを制御するための制御システムを含む。
【００１６】
他の実施形態では、検出器は、単一光子検出器と、検出器とチャンバとの間の光通信を提供するように配置される光伝送システムとを含む。
【００１７】
さらに他の実施形態は、チャンバと連絡する電極を含み、これらの電極はチャンバ内の電子についての供給源およびシンクを提供し、それによりチャンバ内の電気化学反応を促進する。これらの実施形態の中には、透明電極を有するもの、電極がチャンバ上の透明カバー上に配置されるもの、および第１の電極がチャンバの床上にあり、第２の電極がチャンバと励起源との間の経路に沿って存在するものがある。
【００１８】
本発明の別の態様は、ペイロードを分子鎖に加えるための方法である。このような方法は、ペイロードが結合される分子鎖を含むチャンバ内に担体を提供するステップを含む。担体の各々はペイロードのインスタンスに結合される。その方法は、結合間隔を待った後にチャンバを洗い流し、それによってチャンバから担体のうちの１つを除く全てを除去するステップと、チャンバを洗い流した後、ペイロードのインスタンスが鎖に結合されたことを確認するステップとによって継続する。
【００１９】
本発明の実施の中には、ペイロードのインスタンスが鎖に結合されたことを確認するステップが、チャンバを問い合わせ光子で照射するステップと、問い合わせ光子に応答して放出されるシグネチャ光子を検出するステップとを含むものがある。
【００２０】
また、本発明の実施の中には、担体を提供するステップが、ブロッキング基に結合したシグナリング基を提供するステップを含むものがある。いくつかの実施において、シグナリング基は、問い合わせ光子による照射に応答してシグネチャ光子を放出する。他の実施において、ブロッキング基は、鎖に結合すると、別の担体が鎖に結合することを阻止する。
【００２１】
この方法の実施の中には、鎖が、ペイロードが結合される第１の末端を有するものがある。これらの実施のいくつかは、第１の末端を基板に連結するステップを含む。このような連結は、例えば、第１の末端に結合しているシグナリング基の配向を制御するために折りたたまれた分子鎖を使用することによって達成され得る。折りたたまれた分子鎖の例はＤＮＡオリガミである。これらの実施の他のものは、第１の末端の反対側の末端を基板に連結するステップを含む。
【００２２】
いくつかの実施はまた、ペイロードを担体から分離し、それによってペイロードを分子鎖に残すステップも含む。このような分離は、電気化学的、光学的、および化学的を含む種々の方法のいずれかで実施され得る。
【００２３】
他の実施は、さらなるペイロードをチャンバ内に保持するさらなる担体をチャンバ内に導入するステップと、さらなるペイロードが鎖に結合されるのを阻止するステップとを含む。
【００２４】
この方法は多くの種類の分子鎖の構築に適用可能である。例えば、いくつかの実施では、分子鎖はＤＮＡの一本鎖であり、この場合、ペイロードはヌクレオチドである。しかしながら、この方法でタンパク質を構築することも可能であり、この場合、ペイロードはアミノ酸である。より一般的には、この方法は、モノマーが特定の配列で結合される任意のポリマーの構築に適用可能である。このような場合、各々のペイロードはモノマーである。
【００２５】
別の態様では、本発明は、分子鎖構築が行われるウェルを形成することを特徴とする。このようなウェルを形成することは、第１の直交結晶面および第２の直交結晶面を有する基板内に、基板の第３の結晶面を露出させ、それによって床を有するウェルの側壁を形成し、側壁を反射層でコーティングし、床を機能化し、それによって分子鎖が床に連結されることを可能にすることを含む。
【００２６】
いくつかの実践では、第３の結晶面を露出させることは、第１の速度で第１の方向に沿って、および第２の速度で第２の方向に沿って基板を同時にエッチングすることを含む。
【００２７】
他の実施では、第３の結晶面を露出させることは、水酸化物アニオンおよびテトラメチルアンモニウムカチオンを含有する溶液に基板を曝露することを含む。これらの実施の中には、溶液の表面張力を低下させることも含み、また、実施には、オクチルフェノールエトキシレートを溶液に添加することも含む。
【００２８】
さらに他の実施には、反射層を誘電性スペーサで覆うこと、チャンバを透明カバーで覆うこと、およびチャンバの透明カバー上に透明電極を形成することをさらに含むものが含まれる。
【００２９】
本発明のこれらおよび他の特徴は、以下の詳細な説明および添付の図面から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】モノマーのオリゴマー鎖への結合の間に生じる特定の事象のスナップショットを示す。
【図２】図１に示される手順を実施するための合成装置の上面図を示す。
【図３】図１に示される手順を実施するための合成装置の側面図を示す。
【図４】大量生産で使用するための合成チャンバの複数の事例を有する実施形態を示す。
【図５】ヌクレオチドの構築を制御するための制御システムを示す。
【図６】合成装置の代替の実施形態を示す。
【図７】合成装置の代替の実施形態を示す。
【図８】図６および図９に示される両方の実施形態の断面図である。
【図９】図６に示される実施形態の断面図である。
【図１０】図２および図３に示される実施形態の製造に関連して使用されるステップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本明細書に記載される装置および方法は、各ステップにおいて、所望のヌクレオチドが実際に鎖に付加されたことを確認することを含むように、一度に１ステップずつヌクレオチドの鎖を構築するように構成される。この手順は、ヌクレオチドを伸長鎖に結合するための、ヌクレオチドおよび末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）などの適切な酵素の微小流体により制御された導入によって実施される。
【００３２】
図１は、単一のヌクレオチド１８を鎖１２に付加して実施されるステップを示す。このように、図１に示されるステップは、付加される各ヌクレオチド１８について繰り返される。
【００３３】
ステップ（ａ）において、図１は、第１の末端１４および第２の末端１６を有するＤＮＡ鎖１２を示し、その一方は表面に連結されている。第１の末端１４と第２の末端１６との間には、ヌクレオチド１８の伸長配列１９がある。
【００３４】
ＤＮＡ鎖１２を合成するプロセスは、所望の配列を有するヌクレオチド配列１９が得られるまで、さらなるヌクレオチド１８を第１の末端１４に繰り返し結合させることを含む。典型的な実施形態において、第１の末端１４は３’末端に対応し、この場合、第２の末端１６は５’末端に対応する。しかしながら、他の実施形態において、第１の末端１４は５’末端に対応し、その場合、第２の末端１６は３’末端に対応する。
【００３５】
典型的なヌクレオチド配列１９は数千のヌクレオチド１８を有することができる。合成手順は一度に１つのヌクレオチド１８を付加することを含むので、ヌクレオチド１８を迅速に付加することができることが重要である。ＤＮＡ鎖１２の機能性は、ヌクレオチド配列１９にいかなるエラーも存在しないことに大きく依存する。小さなエラーでさえ、ＤＮＡ分子の機能性を破壊しないまでも損なうのに十分である。したがって、実用的な合成装置は、高速で、信頼性が高く、エラーが発生したときにエラーを修正することができなければならない。
【００３６】
特定のヌクレオチド１８を第１の末端１４に結合させる手順は、ステップ（ｂ）に示されるように、第１の末端１４を、充填担体２０の多くの分子および酵素２２の多くの分子を含有する溶液に曝露することを含む。好適な酵素２２は、ＴｄＴなどの天然に存在する酵素、またはこのような酵素の修飾型である。
【００３７】
各担体２０は、シグナリング基２８に付加されたブロッキング基２６を含む。本明細書に記載される実施形態において、シグナリング基２８は１つのフルオロフォアを担持する。担体２０は２つの状態で存在する：充填された状態、および空の状態。充填された状態では、担体２０はそのペイロードに共有結合する。空の状態では、担体２０はもはやそのペイロードに結合せず、したがって新しいペイロードを受け入れることができる。例示した実施形態において、ペイロードは、天然に存在するヌクレオチド１８のいずれか１つである。
【００３８】
充填された状態から空の状態へ移行するために、担体２０は、それ自体とそのペイロードとの間の共有結合の切断を受ける。この共有結合は、他の結合を乱さないで残すようにしながら、切断機構がこの結合を切断するように構成される。切断は様々な方法で実施され得る。例えば、適切なエネルギーの光子で担体２０を照射し、それにより光学的切断を促進することができる。さらに、この結合を化学的に切断することも可能である。
【００３９】
担体２０は、天然に存在するヌクレオチド１８のいずれかを担持することができる。したがって、例えば、グアニンを伸長するＤＮＡ鎖１２に結合させるために、グアニンを担持する多くの充填担体２０で環境を満たす。次いで、例えば、ＤＮＡ鎖１２のグアニンの上部にシトシンを結合させるために、グアニンを担持するあらゆる充填担体２０を洗い流し、次いで、全く新しい組の充填担体２０（今回は代わりにシトシンを担持する）で環境を満たす。これにより、異なる種類のヌクレオチド１８の伸長するＤＮＡ鎖１２への連続的な結合が可能となる。
【００４０】
ＤＮＡ鎖１２への結合は即座には起こらない。したがって、次のステップは、所定の結合間隔を待つことである。この間隔は、酵素２２の１つおよび充填担体２０の１つが伸長ＤＮＡ鎖１２の第１の末端１４で互いに出合う可能性が高くなるように十分に長い。これが起こると、ステップ（ｃ）に示されるように、酵素２２は、充填担体２０を第１の末端１４に結合させる。
【００４１】
上述したように、充填担体２０はブロッキング基２６を備えている。この時点で、ブロッキング基２６が作用し始める。１つの充填担体２０がＤＮＡ鎖１２に結合すると、その関連するブロッキング基２６は、あらゆるさらなる充填担体２０がそれら自体に結合するのを防ぐ。
【００４２】
完全な結合間隔を待った後でも、第１の末端１４には何も結合することができなかった可能性が存在する。したがって、充填担体２０が実際に第１の末端１４に結合したことを確認することが重要である。
【００４３】
上述のように、担体２０はまた、シグナリング基２８も含む。この時点で、シグナリング基２８が必要となる。
【００４４】
シグナリング基のフルオロフォアは、問い合わせ光子（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｏｒｙ  ｐｈｏｔｏｎ）３０による照射に応答してシグネチャ光子（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｈｏｔｏｎ）３１を放出する。問い合わせ光子３０でフルオロフォアを照射するプロセスは、本明細書では「問い合わせ（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）」と称する。その結果生じるシグネチャ光子３１の放出は「応答」である。
【００４５】
溶液中の各担体２０は、独自のフルオロフォアを有する独自のシグナリング基２８を有する。疑似シグネチャ光子３１の検出を避けるために、これらは全て問い合わせ前に洗い流されるべきである。結合が成功した場合、１つのシグナリング基２８が残る、すなわち、いずれかの担体２０のシグナリング基２８に属するものが最終的にＤＮＡ鎖１２に結合し、新たに付加されるヌクレオチド１８をそのＤＮＡ鎖１２と一緒にする。
【００４６】
ステップ（ｄ）に示されるように、洗浄（フラッシング）ステップの後、問い合わせが行われる。これは、ステップ（ｅ）に示されるように、ＤＮＡ鎖１２を問い合わせ光子３０で照射して、フルオロフォアにおける電子をより高いエネルギーレベルまで励起し、次いで、この電子がその基底状態まで減衰するにつれて放出されるシグネチャ光子３１の検出を試みることを含む。１つのシグネチャ光子３１のみが放出され得るので、収集効率は非常に重要である。収集効率が高くても、しばしば繰り返し問い合わせる必要がある。
【００４７】
問い合わせを繰り返した後、シグネチャ光子３１が検出されなかった場合、第１の末端１４に何も結合できなかったと推測することができる。したがって、担体２０を結合させるために別の試みがなされなければならない。
【００４８】
他方で、シグネチャ光子３１が検出された場合、担体２０が現在、ＤＮＡ鎖１２の第１の末端１４に結合していると推測することができる。この時点で、シグナリング基２８およびブロッキング基２６の両方がそれらの役割を完了する。これらは、次に、３つの理由のために取り除かなければならない。第１に、完成品中のそれらの存在は、その機能を妨げる可能性がある。第２に、ブロッキング基２６が残っている場合、さらなる結合は起こり得ない。第３に、シグナリング基２８が残っている場合、そのフルオロフォアは、後続の問い合わせ段階の間にシグネチャ光子３１を放出し得る。これは、検出器が、光子がどこから来たかを知る方法がないので、混乱を引き起こす。
【００４９】
したがって、次のステップは、ステップ（ｆ）に示されるように、担体２０を分離することである。これは電気化学的に最適に実施される。シグナリング基２８とブロッキング基２６との間の結合の還元電位は、担体２０とそのペイロードであるヌクレオチド１８との間の結合のものとは異なる。これは、シグナリング基２８およびブロッキング基２６がユニットとして一緒に取り除かれることを確実にする。したがって、担体２０を除去すると、ヌクレオチド１８のみがＤＮＡ鎖１２の第１の末端１４に残る。
【００５０】
しかしながら、他の実施形態は、他の方法で担体２０を分離することを意図する。例えば、担体２０を分離するために、純粋に化学的または純粋に光学的な機構を使用することができる。
【００５１】
この電気化学的分離ステップの後、シグナリング基２８およびブロッキング基２６が実際に除去されたことを確認することが有用である。次に、ステップ（ｄ）に関連して上述したものと同じ問い合わせ手順を実施することができる。シグナリング基２８がもはや結合されていない場合、応答はない。したがって、いかなる応答も存在しないことから、鎖１２は現在、次の所望のヌクレオチド１８に対して準備ができていると推測することができる。他方で、シグネチャ光子３１が検出された場合、電気化学的分離ステップを単に繰り返す。シグナリング基２８はブロッキング基２６に共有結合している。したがって、シグナリング基２８が存在しない場合、ブロッキング基２６も、もはや存在しないことを合理的に推測することができる。
【００５２】
図２を参照すると、図１に関連して説明した手順を実施するのに適した合成装置３２は、微小流体システム３４、励起システム３６、および検出システム３８を特徴とする。これらのシステム３４、３６、３８の各々に接続されたプロセッサ４０は、合成装置３２の動作を制御する。
【００５３】
微小流体システム３４は、シリコン基板などの基板４２からエッチングされる。これは、このような基板４２が硬質であり、高圧に耐えることができるので有益である。高圧の使用は、より高速の液体流を可能にし、したがってより大きなスループットを可能にする。このより大きなスループットは、１日あたり１０４ヌクレオチドのオーダーの速度で、または１０秒ごとに約１ヌクレオチドの結合で、ＤＮＡ鎖１２の構築を可能にする。このような基板４２の顕著な多孔性が存在しないことは、処理の間に使用される種々の物質、例えばヌクレオチド１８の吸収または捕捉を抑制する可能性が高い。さらに、天然に存在する結晶面はほぼ完全な光学表面の製造を可能にし、それにより、より大きな収集効率を促進する。
【００５４】
エッチングはドライエッチング技術を使用して、例えば、基板を反応性イオンに曝露することによって実施され得る。しかしながら、この方法を使用して傾斜した側壁および平滑な表面を作製することは困難である。
【００５５】
別のエッチング方法は、エッチング速度が結晶の異なる方向に沿って異なるウェットエッチングである。このような異方性エッチングは、水酸化カリウム溶液を使用して実施され得る。この種類のエッチングにおいて、１１１ファセットが、最もエッチングが遅い。シリコンの場合、これにより、側壁７０は５４．７°の角度になる。
【００５６】
別のエッチング方法は、水酸化カリウムの代わりに、特に表面張力を低下させる薬剤である水酸化テトラメチルアンモニウムで置換する。これにより、装置の幾何学的形状に対して良好に制御することが可能となり、特に、結晶１１０の面に関連する表面などの結晶表面を露出させることが可能となる。結晶表面は、それらがほぼ完全な光学表面を形成するので、光子の収集に特に有益である。
【００５７】
微小流体システム３４は、第１の末端１４へのさらなるヌクレオチド２０の結合が行われる合成チャンバ４４を含む。第１のチャネル４６は入ってくる媒体を合成チャンバ４４に運び、第２のチャネル４８は廃棄またはリサイクルのために、出ていく媒体を合成チャンバから取り出す。
【００５８】
第１のチャネル４６は、合成チャンバ４４を複数の媒体供給源５４に接続する。それらは複数の充填担体源５６を含み、その各々は、複数の天然に存在するヌクレオチド１８の対応する１つが充填担体２０を供給する。また、洗浄媒体の供給源に接続する洗浄媒体供給源５８、および遺伝子工学的酵素供給源５９も含まれる。各媒体供給源５４は、その供給源５４を第１のチャネル４６に選択的に接続するための対応する弁５０を有する。
【００５９】
励起システム３６は、シグナリング基２８と光通信するように配置される光源６０を含む。フルオロフォア問い合わせの間、プロセッサ４０は、光源６０に、シグナリング基２８内のフルオロフォアを励起するようにする光のパルスを提供させる。励起パルスが完了すると、検出システム３８が引き継ぎ、フルオロフォアがそのシグネチャ光子３１で応答するのを待つ。
【００６０】
第１の実施形態において、合成チャンバ４４はガラスカバー６４を備えたウェル６２の形態をとる。ウェル６２は、ＤＮＡ鎖１２の第２の末端１６が結合する機能化スポット６８を有する床６６を有する。機能化スポット６８を形成するための適切な手段は、電子ビームまたはイオンビームを使用して、床６６上にナノパターン化カーボンドットを配置し、次いでイオン化アンモニアガスに曝露することによってカーボンドットのアミン官能化を実施することである。
【００６１】
第２の末端１６は機能化スポット６８に連結されており、ヌクレオチド１８が第１の末端１４に付加されているので、シグネチャ光子３１が検出器７４への移動を開始する位置は、付加されたヌクレオチド１８ごとに変化することになる。このことは、検出システム３８が、構築されるＤＮＡ鎖１２全体に適合するのに十分な大きさである体積から単一光子を効率的に検出できなければならないことを意味する。この体積は１立方マイクロメートルのオーダーである。
【００６２】
収集効率を促進するために、機能化スポット６８はウェル６２内の中心に配置されなければならない。しかしながら、ウェル６２が十分に深い場合、収集効率の損失は比較的小さい。例えば、その床６６で５ミクロンの幅である２０マイクロメートルの深さのウェル６２の場合、機能化スポット６８をウェルの床の縁部に配置すると、収集効率が９８％から９５％に低下する。
【００６３】
ガラスカバー６４と床６６との間の距離は、表面流れの影響を回避するのに十分である。ウェル６２を必要以上に深くすることは可能であるが、そのようなさらなる深さには特別な利点はない。幅が５マイクロメートル未満であるウェルについての適切な深さは、少なくとも０．９の開口数を有する集光光学系および５４．７度の側壁を有するデバイスに対して１０マイクロメートルである。ガラスカバー６４と出会う平面におけるウェル６２についての適切な直線寸法は、約５０マイクロメートルである。
【００６４】
側壁７０は放物面に近似しているだけであるが、それにもかかわらず、放物面と同様に機能するように十分に傾斜している。その結果、フルオロフォア２８によって放出された光は、ガラスカバー６４の上方に配置された顕微鏡レンズ７２に向かって反射される傾向がある。次いで顕微鏡レンズ７２は、光を検出器７４に中継する。放出された光を検出器７４に向かって誘導するこの傾向は、非常に効率的な検出システム３８をもたらす。
【００６５】
検出器７４は、単一光子を検出するために最適化されたものである。適切な検出器７４はアバランシェフォトダイオードに基づくものである。例示した実施形態において、顕微鏡レンズ７２は、受け取ったシグネチャ光子３１を検出器７４に向ける。しかしながら、他の実施形態において、ファイバプローブがシグネチャ光子３１を検出器７４に送達する。さらに他の実施形態において、ウェルのすぐ上に配置された単一光子検出器７４の活性領域がシグネチャ光子３１を受け取る。
【００６６】
合成装置３２はまた、ウェル６２を横切る電位を生成するための機構を含む。これは、担体２０の結合を確認した後に、鎖１２からブロッキング基２６を切断するのに役立つ。一実施形態において、床６６における第１の電極７６およびガラスカバー６４における第２の電極７８が電気化学的切断のための電子の供給源およびシンクを提供する。適切な第１の電極７６はアルミニウム接地面である。ガラスカバー６４上のその位置のために、第２の電極７８は透明である。適切な透明な第２の電極７８はインジウムスズ酸化物から作製されたものである。電極は、図２および３に関連して説明される電気化学的切断において使用される電子の豊富な供給を確実にするのに十分な印加電圧に維持される。この電圧は、結合しようとする次のヌクレオチド２０の導入の前に生じる、図１のステップ（ｆ）の間に印加される。それは、電気化学的切断が望まれない場合、止められる。これは、図１のステップ（ａ）〜（ｅ）に対応する。
【００６７】
チャネル４６、４８、ウェル６２、および関連する弁５０は、１つの製造ユニット８０を画定する。この製造ユニット８０はモジュール式であり、図４に示されるように、同じ基板上で複数回繰り返され得る。これにより、ＤＮＡ鎖の大量生産が可能となる。いくつかの実施形態において、各製造ユニット８０に関連する弁５０が独立して制御される。このことは、図４に示される製造ユニット８０のアレイにおいて、異なるウェルがＤＮＡ鎖１２に異なるヌクレオチド配列１９を配置することができることを意味する。
【００６８】
図２および３の合成装置３２は、その第２の末端１６によって連結され、新たなヌクレオチド１８が付加される自由に浮遊する第１の末端１４を有する、ＤＮＡ鎖１２と関連して記載されている。この欠点は、シグナリング基２８の位置が、ＤＮＡ鎖１２がさらに大きく伸長するにつれて変化することである。これは、付加され得るヌクレオチド１８の数に実際的な上限を課す。結局のところ、ある時点で、ＤＮＡ鎖１２の長さはチャンバのサイズのかなりの部分を占める。これは収集効率を損なう傾向がある。
【００６９】
この困難性を回避する１つの方法は、代わりに第１の末端１４を連結し、その基質を実際に放出することなく連続反応を触媒する能力を有する酵素２２を使用することである。この特性を有する酵素２２は、本明細書では「プロセッシブ酵素」と称される。連結した第１の末端１４へのヌクレオチド１８の付加を触媒するためにプロセッシブ酵素２２を使用する場合、たとえＤＮＡ鎖１２が非常に長くなったとしても、シグナリング基２８は常に同じ位置にある。
【００７０】
図５は、異なるウェルにおいて異なるヌクレオチド配列１９を製造するためのビュッフェ法（ｂｕｆｆｅｔ  ｍｅｔｈｏｄ）を実施するための装置を示す。図４の場合と同様に、基板は複数の製造ユニット８０を有する。しかしながら、その独自の供給源５４を制御するためのその独自の組の選択弁５０を有する各製造ユニット８０の代わりに、全てのウェル６２は同じ供給源５４を共有する。この場合、制御装置４０は代わりに、各製造ユニット８０において第１の電極７６および第２の電極７８を制御する。
【００７１】
ビュッフェ法において、制御装置４０は１つのコースにつき１つのヌクレオチド１８を供給する。したがって、これは、各ヌクレオチド２０について１つずつ、４つのコースを循環し、次いでこのサイクルを再び繰り返す。特定の製造ユニット８０に関して、供給すべき次のヌクレオチド２０が望まれないならば、制御装置４０は、その製造ユニットに対する第１の電極７６および第２の電極８０に切断電圧を印加することを単に回避する。その場合、ＤＮＡ鎖１２は図１のステップ（ｃ）〜（ｅ）に示される状態のままである。結果として、そのヌクレオチド１８を担持する充填担体２０がその製造ユニット８０に供給される場合、残存するブロッキング基２６は、充填担体２０が結合するのを阻止する。
【００７２】
この方法において、制御装置４０は、所望のヌクレオチド１８を有する充填担体２０をもたらす次のコースの直前の切断時間帯まで切断電圧を印加することを回避する。制御装置４０が、所望のヌクレオチド１８がその途中にあることを認識すると、制御装置４０は第１の電極７６および第２の電極７８に電圧を印加し、それにより担体２０をＤＮＡ鎖１２から取り除くことができ、こうしてそのＤＮＡ鎖１２を露出させ、所望のヌクレオチド１８を担持する充填担体２０を受容する準備をする。
【００７３】
前述の実施は、製造するのがより簡単である。しかしながら、各製造ユニット８０は、次のヌクレオチド１８が到着する間、数回のコースを待たなければならないので、スループットの損失がある。
【００７４】
図６〜８は、その軸に沿って延在するフォトニック結晶８２を有する基板４２上に形成された合成装置３２の実施形態を示す。いくつかの実施形態において、フォトニック結晶８２に使用される誘電体は、厚さ２００ｎｍの層内に形成される窒化ケイ素である。
【００７５】
窒化ケイ素は、高品質のフィルムを得ることができる容易さのため、および窒化ケイ素を処理する技術が周知であるため、部分的に適切な選択である。さらに、窒化ケイ素は比較的容易に機能化され、水の屈折率よりも大きい屈折率を有し、目的の波長において透過性である。これは、水性媒体と接触する導波路を通して光を導くための良好な選択である。
【００７６】
他方で、窒化ケイ素の屈折率は適切であるが、最も優れているわけではない。さらに、窒化ケイ素は、それ自体が蛍光を発する傾向がある。このバックグラウンド蛍光はシグネチャ光子３１の検出をいくらか妨げ得る。
【００７７】
示した実施形態は一次元フォトニック結晶８２を示す。このような結晶は、フォトニック結晶の軸に対して垂直に配向されたフルオロフォアに対して高い収集効率を有する。しかしながら、フルオロフォアの軸がこの方向から逸脱すると、収集効率は急速に低下する。したがって、一次元フォトニック結晶が使用される場合、フルオロフォアの配向を制御することがいくらか重要である。
【００７８】
フルオロフォアの配向を制御する必要性を回避する１つの方法は、二次元フォトニック結晶８２を使用することである。これは、未知の偏光方向を有する直線的な偏波を確実に捕捉するため、一対の公差双極子を使用することに類似している。このようなフォトニック結晶８２は、フルオロフォアがフォトニック結晶の縦軸に対して正確に垂直でない場合でも、収集効率を維持する傾向がある。
【００７９】
二次元フォトニック結晶８２の使用は材料に制約を課す。特に、屈折率は、一次元フォトニック結晶８２に必要な屈折率よりも大きいことが好ましい。二次元フォトニック結晶８２に適した材料としては、炭化ケイ素、ダイヤモンド、および窒化ガリウムが挙げられる。
【００８０】
しかしながら、フルオロフォアの配向を化学的に制御することも可能であり、それにより一次元フォトニック結晶８２でさえも良好な偏光適合を促進する。
【００８１】
フルオロフォアの配向に対して正確な制御を与える１つの方法は、塩基対が特定の様式で折りたたまれるように選択された別個のＤＮＡ分子を使用して基板を機能化することである。本明細書において「ＤＮＡオリガミ」と称されるこのような折りたたまれたＤＮＡ分子は、図１〜３に記載される装置および方法を使用して構築され得る。
【００８２】
得られたＤＮＡオリガミは基質に結合し、プロセッシブ酵素２２についての結合点を形成する。ＤＮＡオリガミは折りたたまれて、プロセッシブ酵素２２の位置を固定する方法を提供する。プロセッシブ酵素２２は、結合しているヌクレオチド１８と相互作用し、このヌクレオチド１８は、フルオロフォアも有する担体２０に結合しているので、ＤＮＡオリガミはまた、フルオロフォアの位置または配向を固定することができる。
【００８３】
リンカーは、フルオロフォアを充填担体２０の残りの部分に連結する。このリンカーの剛性は、シグナリング基２８、特にその基内のフルオロフォアの配向を制御するための基礎を提供する。リンカーを剛性にすることによって、フルオロフォアを特定の望ましい構造で凍結することが可能となる。より柔軟なリンカーは、電磁場などの外部刺激がフルオロフォアの配向に作用することを可能にする。
【００８４】
フォトニック結晶８２は、第１の有孔領域８４および第２の有孔領域８６ならびに無孔領域８８を含み、第１の有孔領域８４は、第２の有孔領域８６と無孔領域８８との間に配置される。無孔領域８８および第２の有孔領域８６は一定の幅を有する誘電材料の長さである。第１の有孔領域８４は、その中心がより広く、その端部に向かって先細になっており、それにより無孔領域８８および第２の有孔領域に滑らかに融合する誘電材料の長さである。第１の有孔領域８４は、その中心において、約７００ｎｍの幅を有する。縁部では、それは約５００ｎｍの幅を有する。先細は、式ｗ＝７００−ｘ２を有する放物線に従い、ここで、ｘは、無孔領域８８の２０ミクロンの長さに沿って−１から１の範囲に及ぶ。
【００８５】
一列に配置された第１の組の孔９２は第１の有孔領域８４を貫通する。第１の有孔領域８４は、フルオロフォアの自由空間放出範囲と重複する共振周波数を有する空洞を画定するように構成される。同様に、第２の組の孔９４は第２の有孔領域８６を貫通する。孔９２はほぼ楕円形であり、長軸はフォトニック結晶８２を横切って延び、短軸はフォトニック結晶８２の中心に沿って延びる。特定の実施形態において、孔９２の中心は２３０ｎｍ離れており、孔は３２０ｎｍの長軸および１２０ｎｍの短軸を有する楕円形の孔である。
【００８６】
孔９２は、中心孔９６が第１の有孔領域８４の中心に位置するように配置される。この中心穴９６は、ＤＮＡ鎖１２の第１の末端１４が結合する機能化スポット６８を有する床６６を有する。いくつかの実施形態において、機能化スポット６８はカルボキシシラン活性化結合スポットである。
【００８７】
図９は、代替実施形態の等角図を示す。断面は図７に示される実施形態と同様である。したがって、図８は、図９に示される実施形態の断面図でもある。
【００８８】
図９に示される実施形態は、第１の有孔領域８４を貫通する一列に配置された第１の列のカラム９２を有する第１のコロネード８４を特徴とする。第１のコロネード８４は、フルオロフォアの自由空間放出範囲と重複する共振周波数を有する空洞を画定するように構成される。同様に、第２のコロネード９４は第２の列のカラム９４を特徴とする。カラム９２はほぼ楕円断面であり、長軸はフォトニック結晶８２を横切って延び、短軸はフォトニック結晶８２の中心に沿って延びる。特定の実施形態において、カラム９２の中心は２３０ｎｍ離れており、各カラムの断面は３２０ｎｍの長軸および１２０ｎｍの短軸を有する。
【００８９】
カラム９２は、一対の隣接するカラム９６が第１のコロネード８４の中心に床領域６６を画定するように配置される。この床領域６６は、ＤＮＡ鎖１２の第１の末端１４が結合する機能化スポット６８を有する。いくつかの実施形態において、機能化スポット６８はカルボキシシラン活性化結合スポットである。
【００９０】
図９に示される構成の利点は、全ての側で囲まれる孔はもはや存在しないことである。代わりに、流体の流れに対して両側で開いている。流体がカラム９６の周りを流れることが比較的容易であるために、そのコロネード８４を有する代替の実施形態は、機能化スポット６８の周りの床領域６６への、および床領域６６からの流体の流れを促進するという利点を提供する。結果として、ヌクレオチドが床領域６６まで完全に拡散するのを待つ必要はなく、プロセッシブ酵素２２は機能化スポット６８で待つ。
【００９１】
図９に示される実施形態のさらに別の利点は、鎖１２はもはや垂直に伸長するように拘束されないことである。チャンバの側面は開いているので、鎖１２も水平に伸長することができる。
【００９２】
水平伸長は長い鎖１２にとって特に有用である。垂直に伸長する鎖１２は、より長く伸長するにつれて、より重くなる。これは、その独自の重量で曲がり、もつれることがあることを意味する。他方で、鎖１２が水平に伸長する場合、これは起こらない。鎖１２が流体の流れの方向に水平に伸長する場合、ヌクレオチドをプロセッシブ酵素２２にもたらすために既に必要な流体の流れが、鎖１２を取り除くためにも利用され得、それにより絡み合いのリスクを抑制するので、特別な相乗効果が起こる。第１の実施形態において、それは、機能化スポット６８に結合される第２の末端１６であった。結果として、ヌクレオチド１８はテザー末端（すなわち、第２の末端１６）の反対側の自由末端（すなわち、第１の末端１４）に付加された。ＤＮＡ鎖１２が長くなると、シグネチャ光子３１は、機能化スポット６８から次第に遠くに伸長する点から出現する。
【００９３】
第２の末端１６と機能化スポット６８との間の絶えず増大する距離は、チャンバ４４が非常に大きなＤＮＡ鎖１２を収容するのに十分な大きさであったので、第１の実施形態では重大な問題ではなかった。
【００９４】
しかしながら、第２の実施形態では、チャンバ４４は、これが問題となるほど十分に小さい。この第２の実施形態において、ＤＮＡ鎖１２は約５００ナノメートルを超えて伸長すると、それはチャンバのサイズのかなりの部分を占める。これは収集効率の顕著な低下をもたらす。結果として、ＤＮＡ鎖１２をあまり長くすることはできない。例えば、１０００個より多いヌクレオチド１８を有するＤＮＡ鎖１２は構築することが困難になり得る。
【００９５】
したがって、この第２の実施形態において、第１の末端１４を機能化スポット６８に結合させることが好ましい。結果として、シグネチャ光子３１が検出器７４へのその移動を開始する位置はほぼ同じままである。また、この相違の結果として、第２の実施形態は、ヌクレオチド１８をＤＮＡ鎖１２に結合させるために、ＴｄＴのプロセッシブ型などのプロセッシブ酵素２２の使用を必要とする。いくつかの実施形態において、このような酵素２２は機能化スポット６８に連結される。
【００９６】
第２の実施形態は、第１の実施形態に記載されるものと同様の微小流体システム３４を含む。第２の実施形態における励起システム３６はフォトニック結晶８２に結合した光源６０を含む。検出システム３８は無孔領域８８に結合した検出器７４を含む。これらは、第１の実施形態と同様であるため、示さない。
【００９７】
動作は第１の実施形態に記載されるものと同様に進行するので、詳細に記載する必要はない。相違は、光源６０がフォトニック結晶８２を通して光のパルスを伝送するときに始まる。この時点で、フルオロフォアは、より高いエネルギーレベルに上げられた電子を有する。したがって、検出器７４は、この電子が基底状態に下がるのを待ち、それによりシグネチャ光子３１を検出することができる。
【００９８】
フルオロフォアは、真空からの誘発光子の自然放出に応答してシグネチャ光子３１を放出する。フォトニック結晶８２は、自由空間発光スペクトルと重なる共鳴を有する光共鳴空洞を提供することによって、このような自然放出を促進するように構成される。次いでフルオロフォアがこの空洞内に配置される。
【００９９】
第２の実施形態において、シグネチャ光子３１の自然放出速度を高め、フルオロフォアの退色を抑制する試みがなされる。これは、トリガ波長を有する光子が合成チャンバ４４内にそれ自体で現れやすくなるように、第１の組の孔９２の幾何学的形状を選択することによって実施される。特に、第１の有孔領域８４内の孔の幾何学的形状および先細は、第１の有孔領域８４が自然放出を促進する共振空洞として作用するように選択される。
【０１００】
したがって、第２の実施形態は、自然放出を促すことによって、フルオロフォアの蛍光寿命ではなく、それが退色するまでの時間である寿命を延ばす。これにより、フルオロフォアの励起エネルギー状態が、退色などの非放射経路ではなく、シグネチャ光子３１をもたらすように減衰する可能性がより高くなる。
【０１０１】
しかしながら、フルオロフォアがそのシグネチャ光子３１を放出すると、それも検出器に向けられる問題が依然として存在する。結局、放出されると、シグネチャ光子３１は４πステラジアンに相当する進行方向を有し、そのうちのいくつかのみが検出器７４に導かれる。
【０１０２】
第１の実施形態において、側壁は放物面に近似するように成形された。したがって、それらはシグネチャ光子３１を適切な方向に反射することができた。類似の機能を実施するために、第２の実施形態は、その第２の有孔領域８６およびフォトニック結晶８２の幾何学的形状に依存する。
【０１０３】
シグネチャ光子３１は、放出されると、フォトニック結晶８２に入る。したがって、フォトニック結晶８２は、フォトニック結晶８２の軸に対して横断する方向に移動できないように、シグネチャ光子３１をトラップする。しかしながら、シグネチャ光子３１は依然としてフォトニック結晶８２の軸に沿って自由に移動する可能性がある。検出器７４は無孔領域８８の末端にあるので、シグネチャ光子３１が誤った方向に移動する確率は５０％である。
【０１０４】
第２の実施形態において採用される解決策は、第２の有孔領域８６を反射体として機能させることである。これは、第１の有孔領域８４の幅と一致し、第２の組の均一なサイズの孔９２を有する第２の有孔領域８６を提供することによって達成され、その孔９２の各々は、第２の有孔領域８６の始まりに最も近い第１の有孔領域８４における孔のサイズおよび形状と一致する。したがって、この第２の有孔領域８６内を伝播し始める光子は、方向転換し、反対方向、すなわち、最終的に検出器７４に至る無孔領域８８に向かうように促される。したがって、この配置は収集効率を促進する。
【０１０５】
次に図１０を参照すると、図２および図３に示される合成装置３２を製造するプロセスは、シリコン基板４２上で二酸化ケイ素層９８を成長させ（ステップ（ａ））、次いで二酸化ケイ素層９８上でフォトレジスト層１００をスピンコーティングする（ステップ（ｂ））ことによって開始する。次いで適切なマスクが、チャネル４６、４８およびウェル６２の将来の位置をマーキングするために作製される（ステップ（ｃ））。次にフォトレジスト１００を露光し、現像する。これに続いて、緩衝酸化物エッチング（フッ化物イオンエッチング）を使用するウェットエッチングステップ（ステップ（ｄ））が行われる。次にフォトレジスト１００が剥離され、二酸化ケイ素層９８が残され、その二酸化ケイ素層９８は選択的にエッチングされて、下にあるシリコン基板４２が露出される（ステップ（ｅ））。
【０１０６】
次のステップは、チャネル４６、４８およびウェル６２などの液体を含有する特徴部を実際に形成することである。これは、より深い異方性エッチング、典型的には、水酸化物アニオンおよびテトラメチルアンモニウムカチオンまたはカリウムカチオンのいずれかを有する溶液への曝露に依存するウェットエッチングプロセスを含む。アンダーカットを低減させるために、溶液の表面張力を低下させることが有用である。これを行う１つの方法は界面活性剤を添加することである。好適な界面活性剤は、オクチルフェノールエトキシレートなどの非イオン性界面活性剤である。得られたチャネル４６、４８およびウェル６２は、基板４２の１１１、１１０、および１００平面によって決定づけられる角度で側壁７０を有する（ステップ（ｆ））。基板４２がシリコンであるこれらの実施形態では、このプロセスは、露出された＜１１１＞平面に対して５４．７度の側壁７０、および露出された＜１１０＞平面に対して４５度の側壁７０をもたらす。
【０１０７】
このエッチング後、二酸化ケイ素層９８が完全に剥離される。そうすることで、裸基板４２が後に残され、次にその裸基板４２は、チャネル４６、４８およびウェル６２にエッチングされる（ステップ（ｇ））。
【０１０８】
最終的に、ウェル６２は、シグネチャ光子３１を検出器に反射することが予想される。裸のシリコン基板４２は特に反射されないので、この時点で、ウェル６２内に反射性金属層１０２を堆積させることが有用である（ステップ（ｈ））。適切な反射性金属層１０２はアルミニウム製のものおよび銅製のものを含む。次に、誘電体スペーサが反射性金属層１０２の上に配置される（ステップ（ｉ））。この誘電体スペーサは、フルオロフォアが金属表面と接触した場合にフルオロフォアの消光を回避するのに有用である。適切な誘電体スペーサはＡｌ２Ｏ３である。誘電体スペーサの機能は、反射性金属層１０２によるフルオロフォアの蛍光消光を抑制すること、ならびに反応物および洗浄液による反射性金属層１０２の腐食を抑制することである。
【０１０９】
次いで電子ビームまたはイオンビームを使用して、機能化スポット６８をウェルの床６６に配置する（ステップ（ｊ））。炭素は機能化スポット６８に適した材料であるが、二酸化ケイ素などの別の材料を使用することもできる。また、機能化スポット６８は、電子ビームリソグラフィを使用して、水素シルセスキオキサンなどのネガ型材料を直接的にパターン化し、それを機能化することによって、またはポジ型レジストを堆積させ、蒸着またはガス状機能化を使用して機能化を規定することによって、作り出すこともできる。
【０１１０】
次のステップは、液体を含有する特徴部が準備されると、流体が漏れるのを防ぎ、汚染物質が入るのを防ぐために、微小流体システム３４を覆うことである。これは、誘電体スペーサ上に接着スポット１０６のパターンを配置し、接着スポット１０６上にカバーガラス６４を配置することによって実施される（ステップ（ｋ））。このプロセスは、マイクロコンタクトリソグラフィまたはエアロゾルジェット印刷を使用して実施され得る。あるいは、陽極接合などのプロセスを使用してデバイスを封止することができる。
【０１１１】
本発明およびその好ましい実施形態を説明してきたが、新規で特許により保護されるものは特許請求の範囲に記載される通りである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月22日(2019.2.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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