(57)【要約】  本発明は、ジイソプロピルエーテルおよびアセトニトリルを含む逆溶媒と混合することによって、ペプチドまたは前駆体ペプチドを沈殿させることを含む、グルカゴン様ペプチドを製造するための方法に言及する。さらに、本発明は、固相にコンジュゲートされたペプチド、および本発明による方法から得ることができるリラグルチドペプチドを含む医薬組成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リラグルチドペプチドまたはその塩を製造するための方法であって：
（ｉ）式Ｉ：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｂ１−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
（式中、Ｂ１はＬｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯＨ）またはＬｙｓ（Ｈ−Ｇｌｕ−ＯＨ）である）
のペプチドを含む溶液Ｓを準備する工程と；
（ｉｉ）溶液Ｓをジイソプロピルエーテルおよびアセトニトリルを含む逆溶媒と混合することによって、工程（ｉ）のペプチドを沈殿させる工程であり、体積比（ジイソプロピルエーテル：アセトニトリル）が（３：１）から（１０：１）の範囲内にある、工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた沈殿物を、好ましくは濾過および／または遠心分離によって、単離する工程
とを含む前記方法。
【請求項２】
工程（ｉ）は：
（ｉ−ａ）固相：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｂ２−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−［樹脂］
（式中、Ｂ２はＬｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯＲ１）またはＢ２はＬｙｓ（Ｒ２−Ｇｌｕ−ＯＲ１）であり、Ｒ１はカルボン酸保護基であり、Ｒ２はアミノ保護基であり；少なくともＧｌｕ、ＡｓｐおよびＬｙｓの側鎖が保護基を保有する）
にコンジュゲートされた前駆体ペプチドを準備する工程と；
（ｉ−ｂ）前駆体ペプチドを樹脂から切断する工程
とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｉ−ａ）は、適切に保護されたアミノ酸誘導体またはジペプチド誘導体を使用するＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成を含み、前記保護されたアミノ酸誘導体またはジペプチド誘導体は、
（Ａ）  （ベンゾトリアゾリル）テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）／ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）；
（Ｂ）  ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）／シアノ−ヒドロキシイミノ−酢酸エチルエステル；
（Ｃ）  ３−（ジエトキシ−ホスホリルオキシ）−３Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアジン−４−オン（ＤＥＰＢＴ）／ＤＩＰＥＡ；および
（Ｄ）  ＤＩＣ／ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）
からなる群から各工程について独立して選択される１種またはそれ以上のカップリング試薬／添加剤混合物によって活性化される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１種またはそれ以上の擬プロリンジペプチドが、式ＩのペプチドのＧｌｙ４〜Ｔｈｒ５、Ｐｈｅ６〜Ｔｈｒ７、Ｔｈｒ７〜Ｓｅｒ８、Ｖａｌ１０〜Ｓｅｒ１１またはＳｅｒ１１〜Ｓｅｒ１２からなる群から選択される位置に導入され、好ましくは、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨからなる群から選択される１種またはそれ以上の擬プロリンジペプチド誘導体が使用される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
Ｎ末端ヒスチジン部分は、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（１−Ｔｒｔ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（１−Ｔｒｔ）−ＯＨからなる群から選択されるアミノ酸誘導体ならびにカップリング試薬／添加剤混合物であるＤＥＰＢＴ／ＤＩＰＥＡを使用して、固相にコンジュゲートされた前駆体ペプチドに導入される、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Ｆｍｏｃ保護基は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中５〜５０％（ｖ／ｖ）のピペリジンまたは４−メチルピペリジン、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中５〜５０％（ｖ／ｖ）のピペリジンまたは４−メチルピペリジン、ＤＭＦ中１〜５％（ｖ／ｖ）のジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、およびＤＭＦ中５０％（ｖ／ｖ）のモルホリンから選択される混合物を使用して、固相にコンジュゲートされた成長ペプチド鎖から切断される、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
パルミチン酸の活性化エステル、好ましくはＮ−スクシンイミジルパルミテートを、式ＩのペプチドのＬｙｓ（Ｈ−Ｇｌｕ−ＯＨ）部分と、または工程（ｉ−ａ）で準備した前駆体ペプチドからアミノ保護基Ｒ２を切断することによって得ることができるＬｙｓ（Ｈ−Ｇｌｕ−ＯＲ１）部分と反応させる工程をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉ）から得られた溶液Ｓは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および１種またはそれ以上の捕捉剤をさらに含み、好ましくは、捕捉剤は、チオール捕捉剤および／またはシラン捕捉剤から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉｉ）で使用される逆溶媒は、少なくとも５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも７５％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは１００％（ｖ／ｖ）の、ジイソプロピルエーテルおよびアセトニトリルからなる混合物Ｍを含み、前記混合物Ｍ中の体積比（ジイソプロピルエーテル：アセトニトリル）は、（３：１）から（５：１）の範囲内にある、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｉｉ）は：
（ｉｉ−ａ）ジイソプロピルエーテルおよびアセトニトリルを予め混合した後、それを工程（ｉ）から得られた溶液Ｓと混合する工程；または
（ｉｉ−ｂ）ジイソプロピルエーテルを工程（ｉ）から得られた溶液Ｓと最初に混合し、次に、アセトニトリルを、溶液Ｓおよびジイソプロピルエーテルを含む混合物と混合する工程；または
（ｉｉ−ｃ）アセトニトリルを工程（ｉ）から得られた溶液Ｓと最初に混合し、次に、ジイソプロピルエーテルを、溶液Ｓおよびアセトニトリルを含む混合物と混合する工程
によって、逆溶媒を工程（ｉ）から得られた溶液Ｓと混合することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉｉ）は、−５℃から１０℃、好ましくは０℃から１０℃の範囲の温度で行われ、工程（ｉｉ）は、古典的な沈殿プロトコルまたは逆沈殿プロトコルを使用して行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法から得ることができるリラグルチドペプチド沈殿物。
【請求項１３】
トランケートされたリラグルチド変異体を含有する、請求項１２に記載のリラグルチドペプチド沈殿物。
【請求項１４】
樹脂：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｂ２−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−［樹脂］
（式中、Ｂ２はＬｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯＲ１）またはＢ２はＬｙｓ（Ｒ２−Ｇｌｕ−ＯＲ１）であり、Ｒ１はカルボン酸保護基であり、Ｒ２はアミノ保護基であり、
少なくともＧｌｕ、ＡｓｐおよびＬｙｓの側鎖が保護基を保有し、
少なくとも１つの擬プロリンジペプチドが、Ｇｌｙ４〜Ｔｈｒ５、Ｐｈｅ６〜Ｔｈｒ７、Ｔｈｒ７〜Ｓｅｒ８、Ｖａｌ１０〜Ｓｅｒ１１またはＳｅｒ１１〜Ｓｅｒ１２からなる群から選択される位置に存在する）
にコンジュゲートされた前駆体ペプチド。
【請求項１５】
（Ａ）請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法から得ることができるリラグルチドペプチド、または請求項１４に記載の前駆体ペプチドを固相から切断して得ることができるリラグルチドペプチドと
（Ｂ）薬学的に許容される担体
とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、工業的規模または実験室規模でのペプチド合成の分野に関する。グルカゴン様ペプチドの製造のための、特に、リラグルチドのようなグルカゴン様ペプチド１類似体の製造のための改良法を開示する。本発明は、リラグルチドのようなグルカゴン様ペプチドを有効に製造する方法、および合成後に粗製ペプチドを単離する方法を対象とする。
【０００２】
好ましい実施形態では、本発明は、リラグルチドペプチドを製造するための方法であって、ジイソプロピルエーテルおよびアセトニトリルを含む逆溶媒と混合することによって、リラグルチドペプチドまたは前駆体ペプチドを沈殿させることを含む方法に言及する。さらに、本発明は、固相にコンジュゲートするリラグルチドペプチド前駆体、および本発明による方法から得ることができるリラグルチドペプチドを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトＧＣＧ遺伝子（ＨＧＮＣ：４１９１）は、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）およびグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ−２）を含む複数の関連するペプチドをコードする。これらは、かなりの配列相同性を共有し（図１を参照のこと）、血糖のホメオスタシス、腸の細胞増殖、および満腹を制御することに関わる。生物学的に活性であることが知られているＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１（７−３７）およびＧＬＰ−１（７−３６）アミドの形態は、ＧＬＰ−１受容体の活性を介してそれらの効果を発揮する。他の生理学的機能の中で、ＧＬＰ−１は、強力なグルコース依存性インスリン分泌刺激ホルモン（ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｔｒｏｐｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ）であり、グルカゴン分泌を強く阻害し、膵島のベータ細胞において保護および増殖作用を有し、かつ胃腸管の分泌および運動を阻害する。ＧＬＰ−１機能の異常は、肥満、食後の反応性低血糖、および２型糖尿病に関連付けられてきた。よって、ＧＬＰ−１類似体は、薬剤研究において非常に興味深い。
【０００４】
アメリカドクトカゲ（Ｈｅｌｏｄｅｒｍａ  ｓｕｓｐｅｃｔｕｍ）に見られるペプチドホルモンエクセンディン−４の変異体および誘導体ならびにＧＬＰ−１ペプチド自体の変異体および誘導体は、広範囲にわたって研究されている。
【０００５】
市販されている薬物化合物は、エクセナチドおよびリキシセナチドを含み、いずれもエクセンディン−４ペプチド、およびＧＬＰ−１由来のリラグルチドから導出される。
ＮＮ２２１１としても知られている、リラグルチドである（Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｎ−α−ヘキサデカノイル）））−Ｌｙｓ２６Ａｒｇ３４−ＧＬＰ−１（７−３７）は、２型糖尿病の処置に対してと、関連する共存症を有する成人の肥満の処置に対して承認されている。この化合物は、半合成技術によって工業的規模で生成されている。ＥＰ−Ｂ  ０
９４４  ６４８には、組換えにより発現されたペプチドをＮα−ヘキサデカノイル−Ｇｌｕ（ＯＮＳｕ）−ＯｔＢｕと反応させて、リラグルチドを得ることが記載されている（その実施例３５を参照のこと）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＥＰ−Ｂ  ０  ９４４  ６４８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、リラグルチドのようなグルカゴン様ペプチドの大規模製造、全化学合成のためのよりよい方法が提供されることが望ましい。
【０００８】
ペプチドの化学合成は、当技術分野において一般的に周知である（小冊子「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｂａｃｈｅｍ  −  Ｐｉｏｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｒｔｎｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｇｌｏｂａｌ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇにより出版、Ｂａｃｈｅｍ  ｇｒｏｕｐ、２０１４年６月を参照のこと）。合成の間、第１のアミノ酸のアルファアミノ基と第２のアミノ酸のアルファカルボキシル基の間のペプチド結合の形成が、意図しない副反応よりも好まれるはずである。これは、通常、「持続性の」および「一時的な」保護基の使用によって達成される。前者は、例えば、成長ペプチド鎖の反応性アミノ酸側鎖およびＣ末端カルボキシル基をブロックするために使用され、合成全体の終わりに除去されるだけである。後者は、カップリング工程の間、例えば、第２のアミノ酸のアルファアミノ基をブロックし、それによって、例えば、第２のアミノ酸の複数の複製の間のペプチド結合の形成を回避するために使用される。ペプチドの化学合成への２つの標準手法は区別することができ、すなわち液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）および固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）である。
【０００９】
溶液ペプチド合成とも称されるＬＰＰＳは、均質な反応媒体中で行う。連続的なカップリングにより、所望のペプチドが得られる。事実上、標準プロトコルは存在せず、様々な、可能な保護基の組合せ、カップリング方法、および溶媒から選択する、注意深い計画が必要とされる。ＬＰＰＳは、普通、各カップリング後の中間体の単離、特徴付け、および、所望の場合、精製に関する。より長いペプチドは、通常、収束的な手法によって合成され、ここで、いくつかの断片が並行してアセンブルされ、最終的に組み合わさって、最終生成物が得られる。
【００１０】
標準のＳＰＰＳでは、不溶性ポリマー樹脂に、そのＣ末端によって固定されたペプチドは、その配列を構成する保護されたアミノ酸の連続的付加によってアセンブルされ、すなわち、合成は、ペプチドのＣ末端からＮ末端へと進行する。アミノ酸付加の連続サイクルが起こり、それぞれ、ａ）樹脂結合ペプチドからのＮα保護基の切断、ｂ）洗浄工程、ｃ）保護されたアミノ酸のカップリング、およびｄ）洗浄工程からなる。成長する鎖は不溶性支持体に結合しているため、過剰な試薬および可溶性副生成物は簡単な濾過によって除去することができる。適当な溶媒を用いる洗浄工程により：脱保護工程ａ）の後の切断剤の完全な除去、ならびに過剰な試薬およびカップリング工程ｃ）から得られた可溶性副生成物の排除が保証される。合成の終わりに、ペプチドが樹脂から切断され、保護基が除去される（小冊子「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｂａｃｈｅｍ  −  Ｐｉｏｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｒｔｎｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｇｌｏｂａｌ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇにより出版、Ｂａｃｈｅｍ  ｇｒｏｕｐ、２０１４年６月を参照のこと）。いわゆるＦｍｏｃ  ＳＰＰＳは一時的なアミノ保護基としての９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の使用に依拠し、ＳＰＰＳの最もポピュラーな形態である。ＬＰＰＳとは逆に、ペプチドの精製は、樹脂からの切断後の、合成の終わりにのみ実施されうる。これは、特に、脱保護の間に、または分解によって形成された副生成物に加えて、種々の樹脂結合副生成物が蓄積する可能性のある、大きなペプチドの合成に対して不利である。結果として、最終生成物の精製は、非常に困難である場合がある。工業的製造のためのＳＰＰＳプロセスを開発する際には、したがって、粗製ペプチド生成物の精製を最適化することが不可避である。
【００１１】
ＬＰＰＳおよびＳＰＰＳに加えて、断片を、上記の技術の１つによって最初に合成し、次いで、他の手法を使用して一緒に接合する混成の手法を利用することができる。この戦略は、典型的に、非常に困難な配列を有する大きなペプチドに対して用いられる。上記手法は、通常、最終のおよび／または中間体のペプチド生成物が、溶液から取り出される必要がある。選択される合成戦略によって、前記ペプチド溶液のさらなる構成成分は様々であり、ＴＦＡおよび捕捉剤を含有する切断組成物を含むことが多い。
【００１２】
ＴＦＡによる切断の後のペプチドの単離のための標準法は、いわゆる冷却エーテルによるワークアップである：ペプチド溶液を逆溶媒としての冷却エーテルと混合し、ペプチドを沈殿させ、沈殿物を濾過および／または遠心分離によって回収する。
【００１３】
ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、またはメチルｔｅｒｔブチルエーテル（ＭＴＢＥ）は、日常的に、この目的のために使用される。逆溶媒がペプチド溶液に添加される場合、これは、「古典的な」沈殿プロトコルと称される；ペプチド溶液を逆溶媒に添加する場合、これを「逆」沈殿プロトコルと称す。沈殿物の性質は、粗製のペプチドの品質とさらなるプロセスに影響を与えるため、典型的に、実験室のおよび工業的製造においていくらかの影響を有する：理想的には、沈殿はほぼ完全であるが、関連する不純物が減少し、かつＴＦＡ含量が低い。さらに、効率的な濾過には、フィルターの詰まり、または容器に固着する物質の損失を避けるために適切な稠度と粒径の沈殿物が必要とされる。
【００１４】
沈殿スキームが粗製ペプチドの純度および取り扱いを改善する場合があるが（ＵＳ  ２００５／０１６５２１６）、驚くべきことに、この工程の詳細にはほとんど注目されていなかった。
【００１５】
文献ＣＮ−Ａ  １０３２７５２０９、ＣＮ−Ａ  １０３２７５２０８、ＣＮ−Ａ  １０４０４５７０６、ＣＮ−Ａ  １０４０４５７０５、ＣＮ−Ａ  １０３１４５８２８、ＣＮ−Ａ  １０３９８０３５８、およびＥＰ−Ａ  ２  ７５７  １０７には、リラグルチドの合成のためのＳＰＰＳまたは混成の手法が開示されている。それぞれの場合には、粗製のリラグルチドは、逆溶媒として冷却ジエチルエーテルを使用する、ＴＦＡおよび捕捉剤を含む溶液から沈殿する。
【００１６】
ＷＯ  ２０１４／１９９３９７およびＷＯ  ２０１６／００５９６０には、リラグルチドの合成に対するＳＰＰＳおよび／または混成の手法が開示されている。粗製のリラグルチドは、逆溶媒として冷却ＭＴＢＥまたはジイソプロピルエーテルを使用する、ＴＦＡおよび捕捉剤を含む溶液から沈殿する。
【００１７】
ＥＰ−Ｂ  １  ９８７  ０５２は、グルカゴン様ペプチドの合成のためのＳＰＰＳ手法について開示しており、ここで、粗製のペプチドは、冷却ＭＴＢＥを使用する、ＴＦＡおよび捕捉剤を含む溶液から沈殿する。
【００１８】
ＵＳ−Ａ  ２００５／０１６５２１６は、ペプチドの沈殿のための３つまたはそれ以上の炭素原子を有するアルコールの使用について教示している。
【００１９】
ＷＯ  ２０１２／１７１９８４、ＷＯ  ２０１２／１７１９８２、およびＷＯ  ２０１２／１７１９８７は、ＬＰＰＳによって製造されるペプチドの沈殿の間に直面する問題について論じている。
ＬＰＰＳにおいて使用される、極性の、非プロトン性溶媒からの直接の沈殿により、粘着性の、ガム様沈殿物を生じることが教示される。これは、最初に、目的のペプチドを、２−メチルテトラヒドロフランまたはトルエンに抽出し、続いて、この相からペプチドを沈殿させることによって回避することができる。アセトニトリル、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｎ−ヘプタンおよびトルエンは、抽出物からペプチドの沈殿を誘導するために適切な逆溶媒として示されている。
【００２０】
アセトニトリルとジイソプロピルエーテルの混合物を用いる沈殿は、短鎖ペプチドの製造のための稀な事例に記載されている。ＵＳ  ２０１０／０２８０２２１は、ＬＰＰＳによるオクタペプチド（長さ：８アミノ酸）の製造について記載している。手順は、周囲温度における、アセトニトリル／ジイソプロピルエーテルによる酢酸／ジオキサンからのペプチド沈殿に関する。ＷＯ  ２０１５／１５４０３１には、アセトニトリルとジイソプロピルエーテルの混合物によって、７つのＤ−アミノ酸およびジスルフィド結合した単一のＬ−Ｃｙｓからなる、極性の高い、人工のペプチド化合物である、ＡＭＧ６１４を沈殿させる方法が記載されている。
【００２１】
先行技術を考慮して、グルカゴン様ペプチド、例えば、リラグルチドのようなサイズの大きいペプチドの製造方法を改良するための必要性が依然として存在する。特に、粗製ペプチド生成物の合成および精製は、純度が改善され、巨視的特性の改善された粗製ペプチド生成物を得るために最適化される必要があった。本発明者らは、工業的規模で使用することができる、粗製リラグルチドペプチドの合成および沈殿のための改善された方法を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
驚くべきことに、グルカゴン様ペプチド、例えば、リラグルチドのようなサイズの大きいペプチドは、ジイソプロピルエーテルおよびアセトニトリルを含む逆溶媒によって、特に、体積比（ジイソプロピルエーテル：アセトニトリル）が（３：１）から（１０：１）で使用される場合に、特に良好に沈殿されうることが見出された。
【００２３】
一般的観点では、したがって、本発明の態様は、グルカゴン様ペプチドまたはその塩を製造するための方法であって：
（ｉ）粗製グルカゴン様ペプチドを含む溶液Ｓを準備する工程と
（ｉｉ）工程（ｉ）のペプチドをジイソプロピルエーテルおよびアセトニトリルを含む逆溶媒と混合することによって沈殿させる工程であり、体積比（ジイソプロピルエーテル：アセトニトリル）が（３：１）から（１０：１）の範囲内にある、工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた沈殿物を、濾過および／または遠心分離によって単離する工程
とを含む方法に関する。
【００２４】
本発明は、一態様では、グルカゴン様ペプチドを製造するための方法であって：
（ｉ）グルカゴン様ペプチドを含む溶液を得る工程と；
（ｉｉ）（３：１）ｖ／ｖから（１０：１）ｖ／ｖの範囲から選択される比で、ジイソプロピルエーテルおよびアセトニトリルを含む逆溶媒を使用して、グルカゴン様ペプチドを沈殿させる工程と；
（ｉｉｉ）沈殿物を分離する工程
とを含む方法を提供する。
【００２５】
本発明の一実施形態は、リラグルチドまたはその塩を製造するための方法であって：
（ｉ）式Ｉ：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｂ１−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
（式中、Ｂ１はＬｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯＨ）またはＬｙｓ（Ｈ−Ｇｌｕ−ＯＨ）である）
のペプチドを含む溶液Ｓを準備する工程と；
（ｉｉ）溶液Ｓをジイソプロピルエーテルおよびアセトニトリルを含む逆溶媒と混合することによって、工程（ｉ）のペプチドを沈殿させる工程であり、体積比（ジイソプロピルエーテル：アセトニトリル）が（３：１）から（１０：１）の範囲内にある、工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた沈殿物を、好ましくは濾過および／または遠心分離によって、単離する工程
とを含む方法を指す。
【００２６】
当業者であれば、式Ｉは、上記で示されたポリペプチド鎖の塩も包含することに気付くであろう。本明細書で使用する場合、ペプチドは、当技術分野で公知の任意の対イオン、例えば、陰イオンまたは陽イオン、例えば、塩化物イオン、酢酸イオン、炭酸イオン、重炭酸イオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、切断溶液の任意のイオン（例えば、ＴＦＡイオン、臭素イオン、過塩素酸イオン、アンモニウムイオン）および／または保護基の残基の陽イオンもしくは陰イオンなどを、場合により保有することが、当業者によって理解されるであろう。さらに、ペプチドは、場合により、微量の１種またはそれ以上の捕捉剤、例えば、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリトリオール（ＤＴＥ）、アニソール、チオアニソールまたは１，２−エタンジチオールに、共有結合または非共有結合により会合している。
【００２７】
本発明の方法は、特に大規模製造方法に対して、粗製グルカゴン様ペプチド、特にリラグルチドの取り扱い、収率、および／または純度を改良するために有利に使用されうる。グルカゴン様ペプチドの前駆体のＳＰＰＳ、前記前駆体を樹脂から切断して切断組成物中で粗製グルカゴン様ペプチドを得る工程と、切断された粗製グルカゴン様ペプチドを切断組成物から分離する工程を含む方法が、特に有益である。
【００２８】
概して、いくつかの略語および定義が、本発明全体を通して使用される：
略語：
Ｂｏｃ        ｔｅｒｔブチルオキシカルボニル
ＣＬＥＡＲ    架橋したエトキシレートアクリレート
ＤＢＵ        ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＤＥＰＢＴ    ３−（ジエトキシ−ホスホリルオキシ）−３Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアジン−４−オン
ＤＩＣ        ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ    ジイソプロピルエチルアミン
Ｄｍｂ        ２，４−ジメトキシベンジル
ＤＭＦ        Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＴＥ        １，４−ジチオエリトリオール
ＤＴＴ        １，４−ジチオトレイトール
ＥＤＴ        １，２−エタンジチオール
Ｆｍｏｃ      ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｈｍｂ        ２−ヒドロキシ−４−メトキシベンジル
ＨＯＢｔ      ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＨＰＬＣ      高速液体クロマトグラフィー
本明細書で使用する用語ＨＰＬＣは、ＵＨＰＬＣを含む。
ＩＰＥ        ジイソプロピルエーテル
ＬＰＰＳ      液相ペプチド合成
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ    マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法
ＭＴＢＥ      メチルｔｅｒｔブチルエーテル
ＭＴＴ        ４−メチルトリチル
ＮＭＰ        Ｎ−メチルピロリドン
ＯＭｐｅ      ３−メチルペンタ−３−イルエステル
ＯｔＢｕ      ｔｅｒｔブチルエステル
ＯＮＳｕ＝ＯＳｕ    Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＯｘｙｍａＰｕｒｅ（登録商標）    シアノ−ヒドロキシイミノ−酢酸エチルエステル
ＰＥＧ        ポリエチレングリコール
ＰＥＧＡ      アクリルアミド−ＰＥＧコポリマー
Ｐｂｆ        ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＲＴ          室温
ＳＰＰＳ      固相ペプチド合成
ｔＢｕ        ｔｅｒｔブチル
ＴＢＴＵ      （ベンゾトリアゾリル）テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートＴＥＳ        トリエチルシラン
ＴＨＦ        テトラヒドロフラン
ＴＩＰＳ      トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ        トリチル
ＴＦＡ        トリフルオロ酢酸
ＵＨＰＬＣ    超高速液体クロマトグラフィー
【００２９】
他に示されていなければ、液体混合物は、体積百分率および体積比で定義される。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」および「ポリペプチド」は互換的に理解されうる。
【００３１】
他に示されていなければ、ペプチド配列は、本明細書において、Ｎ末端（左）から始まってＣ末端（右）で終わるように示される。表１は、同等であり、この文書全体で互換的に使用される異なる表記を例示する。
【００３２】
アミノ酸は、その正式名称（例示：アラニン）、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５による３文字コード（例えば、Ａｌａ）、または１文字コード（例えば、Ａ）によって互換的に言及される。エナンチオマー型が明示的に特定されていなければ、一般的にＬ−アミノ酸に言及している。
【００３３】
しかし、本発明は、同様に、Ｄ−アミノ酸および他の立体異性体を使用して実践されうる。
【００３４】
【表１】
2019512273.tif 000002
【００３５】
以下、アミノ酸誘導体について、広く受け入れられた表記を使用する：アルファアミノ基における置換（Ｎα）は、アミノ酸記号の左に示され、ハイフンによって分離されており、アルファカルボキシ基における置換は、アミノ酸記号の右に示され、ハイフンによって分離されており、側鎖における置換は、アミノ酸記号の直ぐ右の括弧内に示されている。修飾されていないアルファアミノ酸では、アルファアミノ基（Ｎα）における置換はプロトン（Ｈ−）であり、アルファカルボキシ基における置換はヒドロキシ（−ＯＨ）である。
【００３６】
分枝状ジペプチドでは、この表記は、入れ子形式でつながっている。例えば、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−ＯＨは、Ｆｍｏｃで保護されたアルファアミノ基と遊離のアルファカルボキシル基を有するＬｙｓ誘導体であって、その側鎖がＢｏｃで保護されたアルファアミノ基とＯｔＢｕで保護されたカルボキシル基を有するグルタミル部分で置換されているＬｙｓ誘導体を指す。グルタミル部分は、そのガンマカルボキシル基を介してＬｙｓ側鎖にアミド結合を形成する。
【００３７】
ペプチドの一部である置換されたアミノ酸に対して、類似の表記が使用される。例えば、Ａａａ１−Ａａａ２−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−Ａａａ４−Ａａａ５は、分枝状のペンタペプチドを指し、ここで、３位のＬｙｓ側鎖は、Ｂｏｃ保護されたアルファアミノ基とＯｔＢｕ保護されたカルボキシル基を有する、アミド結合したグルタミル部分で置換されている。よって、前記アミド結合は、Ｌｙｓのイプシロンアミノ基とＧｌｕのガンマカルボキシル基の間にある。
【００３８】
ペプチドの一部である置換アミノ酸のさらなる例として、Ｌｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯＨ）という表現は、ペプチドに組み込まれており、そのイプシロンアミノ基（Ｎε）、すなわち、側鎖であるパルミトイル−Ｇｌｕ部分が、ガンマカルボキシル基（Ｃγ）を介して結合し、それによって、ＬｙｓのＮεとＧｌｕのＣγの間にアミド結合を形成するＬｙｓ部分を指す。パルミトイル−Ｇｌｕ部分では、パルミトイル残基が、Ｇｌｕのアルファアミノ基（Ｎα）に結合している。Ｌｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯＨ）という部分は、Ｌｙｓ（ヘキサデカノイル−Ｇｌｕ−ＯＨ）、Ｌｙｓ（Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ−（Ｎα−ヘキサデカノイル）））またはＬｙｓ（Ｎε−（γ−グルタミル−（Ｎα−ヘキサデカノイル）））として示されている。
【００３９】
また別の実施例として、Ｌｙｓ（Ｈ−Ｇｌｕ−ＯＨ）という部分は、ペプチド配列の文脈では、そのイプシロンアミノ基（Ｎε）に、保護されていないＧｌｕ部分が、そのガンマカルボキシル基（Ｃγ）を介して結合しており、それによって、ＬｙｓのＮεとＧｌｕのＣγの間にアミド結合を形成するＬｙｓ部分を指す。Ｇｌｕ部分では、アルファアミノ基（Ｎα）は遊離している。Ｌｙｓ（Ｈ−Ｇｌｕ−ＯＨ）という部分は、Ｌｙｓ（Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ（Ｈ）−ＯＨ）、Ｌｙｓ（Ｎ−ε−（γ−Ｇｌｕ−ＯＨ）またはＬｙｓ（Ｎε−（γ−グルタミル−ＯＨ）として示されている。
【００４０】
当業者であれば、式Ｉのペプチドが、１文字コード：
ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ  （配列番号４）（式中、アミノ酸配列の２０位のリシル部分（Ｌｙｓ２０、Ｋ２０）が修飾されている）で書かれた、簡単なリラグルチドのポリペプチド鎖の誘導体を指すことに直ぐに気付く。より詳細には、Ｌｙｓ２０のイプシロンアミノ基が、アミド結合を介して、グルタミル部分のガンマカルボキシル基（γ−Ｇｌｕ、γ−Ｅ）のガンマカルボキシル基にコンジュゲートしている。グルタミル部分は、そのアミノ基を介して、パルミチン酸＝ヘキサデカン酸部分にコンジュゲートしているか、または遊離ＮＨ２（アルファアミノ基、Ｎα）を保有する。
【００４１】
好ましくは、式Ｉのペプチドは、いずれの保護基も（本質的に）有さず、Ｌｙｓ２０の
部分を除いて、アミノ酸側鎖で他の修飾を有さない。したがって、式Ｉのペプチドは、好ましくは、十分に保護されていないペプチドであり、好ましくはさらに修飾されない。
【００４２】
あるいは、式ＩのペプチドのＮ末端は修飾（例えばアシル化（例えば、アセチル化））される。あるいはまたはさらに、Ｃ末端は修飾（例えば、アミド化）される。
【００４３】
あるいはまたはさらに、１つまたはそれ以上のアミノ酸部分の側鎖は、フルオロフォアを用いてコンジュゲートされる。場合により、式Ｉのペプチドは、放射線により（例えば、３Ｈ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、９９ｍＴｃまたはランタニド（例えば、６４Ｇｄ））標識され、またはスピン標識、例えば、１種またはそれ以上の重同位元素、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）で検出可能な１３Ｃを用いて標識される。
【００４４】
工程（ｉ）の溶液中に含まれるグルカゴン様ペプチドは、典型的に、天然のＬ−アミノ酸からなる。しかし、あるいは、ペプチドは、１種またはそれ以上の非天然アミノ酸、例えば、Ｄ−アミノ酸、ベータアミノ酸、メチル化アミノ酸（例えば、Ｎ−メチル化アミノ酸）を含み、またはそのようなものからなる場合さえある。
【００４５】
当業者であれば、極性の環境において、特に水性の環境において、式Ｉのペプチドまたは任意の他のグルカゴン様ペプチドのペプチド鎖が、例えば、プロトンもしくは他の陽イオンおよび／または陰イオンを結合することによって塩を形成し、アミノ酸側鎖の末端および／または一部において、プロトンもしくは他の陽イオンおよび／または陰イオンを放出する場合があることに気付くであろう。
【００４６】
用語「グルカゴン様ペプチド」またはＧＬＰは、本明細書で使用する場合、前述の任意の誘導体だけでなく、ＧＣＧ遺伝子（ＨＧＮＣ：４１９１）、エクセンディンおよびその類似体から導出される同族のペプチドを指す。図１は、プロトタイプのグルカゴン様ペプチドの配列アラインメントを示す。
【００４７】
用語「グルカゴン様ペプチド１類似体」および「ＧＬＰ−１類似体」は、本明細書で使用する場合、互換的に使用される。本明細書で使用する場合、これらは、ＧＬＰ−１受容体に結合することができるペプチドに関する。ＧＬＰ−１（７−３７）の誘導体および類似体ならびにエクセンディン−４（１−３９）の誘導体および類似体、例えば、エクセナチド、リキシセナチド、およびリラグルチドは、好ましいＧＬＰ−１類似体である。例示的に、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号４に対して少なくとも８０％の相同性を有するポリペプチド鎖、より好ましくは、配列番号４に対して少なくとも９０％の相同性を有するポリペプチド鎖、特に、配列番号４に対して少なくとも９５％の相同性を有するポリペプチド鎖を含み、場合により、配列番号４のＬｙｓ２０に対する相同体であるリシン部分における修飾も含む。相同性は、本明細書で使用する場合、好ましくは、配列番号４の全長にわたって決定される配列相同性である。
【００４８】
本明細書で使用する場合、配列相同性は、当技術分野で公知の配列相同性の任意の定義を指す。特に、配列相同性は、本出願の出願日のバージョンの国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）によって決定された配列相同性として理解される。
【００４９】
用語「類似体（複数可）」は、本明細書で使用する場合、その配列が、第１のペプチド配列の５０％までのアミノ酸部分の置き換えによって、および／もしくは１０％までのアミノ酸部分の欠失によって、ならびに／または１０アミノ酸部分までの付加によって、前記第１のペプチド配列から導出されるペプチドを指す。好ましい類似体は、第１のペプチド配列の２０％までのアミノ酸部分の置き換えによって、および／もしくは１０％までのアミノ酸部分の欠失によって、ならびに／または１０アミノ酸までの付加によって、前記第１のペプチド配列から導出される。
【００５０】
用語「誘導体（複数可）」は、本明細書で使用する場合、化学反応によって、第１の化合物から得ることのできる化合物を指す。結果として、誘導体は、置換基の存在または非存在によって、第１の化合物と異なる。例えば、ＳＰＰＳにおいて使用するためのアミノ酸誘導体は、普通、少なくともアミノ酸保護基の存在によって、導出されるアミノ酸と異なる。
【００５１】
用語「式Ｉのペプチドを含む溶液Ｓを準備する」は、式Ｉのペプチドを含有する任意の液体組成物を得ることとして最も広い意味で理解される。式Ｉのペプチドは、当技術分野で公知の任意の手段によって準備される。例示的に、式Ｉのペプチドは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）もしくは液相ペプチド合成（ＬＰＰＳ）またはその組合せから得ることができる。あるいは、簡単なポリペプチド鎖は、バイオテクノロジーによる方法から得ることもでき、得られたポリペプチド鎖は、次に、化学／合成手段によって修飾される。
好ましくは、式Ｉのペプチドは、ＳＰＰＳ、ＬＰＰＳまたはその組合せから得られる。より好ましくは、式Ｉのペプチドは、ＳＰＰＳを含むか、ＳＰＰＳからなる方法から得られる。
【００５２】
典型的に、ペプチド合成（ＳＰＰＳおよびＬＰＰＳに基づく）は、種々の保護基および活性化エステルの使用に関与する。したがって、式Ｉのペプチドの合成の間、種々の保護基および活性化エステルを使用する。
【００５３】
用語「保護基」は、本明細書で使用する場合、官能基の化学的修飾によって分子に導入され、次のプロセス工程において、前記基を反応からブロックする、例えば、アミノ酸側鎖の副反応を妨害する基として、最も広い意味で理解される。アミノ保護基の例は、ＢｏｃおよびＦｍｏｃ基であり、カルボン酸保護基の例は、メチルエステル、ベンジルエステル、またはｔｅｒｔブチルエステルのような未反応性エステルである。
【００５４】
本発明の文脈では、用語「活性化エステル」は、アミノ基と自発的に反応するのに適するエステルとして最も広い意味で理解される。活性化エステルの例は、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニルおよびスクシンイミドエステルである。
【００５５】
式Ｉのペプチドを得るための他の手段、特に他の合成方法は、本発明の範囲によっても包含されているが、式Ｉのペプチドは、好ましくは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって得られる。一方、本明細書で開示されているＳＰＰＳの方法は、様々なペプチド単離スキームと組み合わせて、リラグルチドの精製のために使用される。
【００５６】
ＳＰＰＳでは、式Ｉのペプチドの前駆体ペプチドは、樹脂上、すなわち「固相」、最も典型的に、濾過によって液相から容易に分離することのできるビーズ様構造上で合成される（本明細書において、工程（ｉ−ａ））。樹脂に結合したペプチドの合成の次に、ペプチドは樹脂から放出され、保護基は除去される。
したがって、本発明の工程（ｉ）は、以下の工程を含む
（ｉ−ａ）グルカゴン様ペプチドにコンジュゲートされた固相を準備する工程であって、少なくともＧｌｕ、ＡｓｐおよびＬｙｓの側鎖が保護基を有する、工程、
（ｉ−ｂ）樹脂からペプチドを切断し、場合により保護基を除去する、工程。
【００５７】
したがって、好ましい実施形態では、本発明の方法の工程（ｉ）は：
（ｉ−ａ）式：Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｂ２−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−［樹脂］
（式中、Ｂ２はＬｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯＲ１）またはＢ２はＬｙｓ（Ｒ２−Ｇｌｕ−ＯＲ１）であり、Ｒ１はカルボン酸保護基であり、Ｒ２はアミノ保護基であり；少なくともＧｌｕ、ＡｓｐおよびＬｙｓの側鎖が保護基を有する）の固相がコンジュゲートされたグルカゴン様ペプチドを準備する工程と；
（ｉ−ｂ）前駆体ペプチドを樹脂から切断する工程
とを含む。
【００５８】
好ましい実施形態では、Ｂ２はＬｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）またはＬｙｓ（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）である。Ｌｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）という部分は、Ｌｙｓ（ヘキサデカノイル−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）として設計される。
【００５９】
本明細書で使用する場合、用語「樹脂」および「［樹脂］」は、ＳＰＰＳのために使用可能なビーズ様構造として最も広い意味で理解される。用語「樹脂」、「固体相」および「支持体」は本明細書中で交換可能に使用される。
【００６０】
ＳＰＰＳは、通常、固相支持体よりもゲル相で行われる。適切な樹脂は、ポリスチレン、ポリスチレン−ＰＥＧ複合物、ＰＥＧ、ＰＥＧＡ、架橋したエトキシレートアクリレート（ＣＬＥＡＲ）、ポリアミド、ポリヂメチルアクリルアミド、または所望の物理的および化学的特性を有する任意の他の支持体をベースとする。１％のジビニルベンゼンでビーズ化されたポリスチレンをベースとする樹脂は、典型的に、２００〜４００メッシュまたは１００〜２００メッシュのサイズ分布を有する、日常に使用される支持体の中のものである。ポリスチレンをベースとする４−アルコキシベンジルアルコール（Ｗａｎｇ）樹脂、ジフェニルジアゾメタン（ＰＤＤＭ）樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシメチル−ポリスチレン（Ｒｉｎｋ）樹脂、２−メトキシ−４−アルコキシベンジルアルコール（Ｓａｓｒｉｎ）樹脂、および特に、２−クロロトリチルクロリド（ＣＴＣ）樹脂は、本発明の方法で使用するのに特に適しており、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＢａｃｈｅｍおよびＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅのような供給業者から市販されている。しかし、ＳＰＰＳに適する任意の他の樹脂を使用することができる。
【００６１】
Ｃ末端カルボキシル基を介する固定化に対する代替案として、ペプチドは、アミノ酸の側鎖（好ましくは末端）を介して樹脂にコンジュゲートされる。
【００６２】
さらなる代替案として、ペプチドは、Ｎ末端を介して樹脂にコンジュゲートされ、Ｎ末端からＣ末端へ合成される（ペプチドの逆向き合成）。
【００６３】
当業者は、多種類のＳＰＰＳ方法を認識している。概して、本発明の文脈では、任意の種類のＳＰＰＳを使用してもよい。種々の種類の機器をＳＰＰＳに対して使用することができる。バッチ式の、または連続フローのＳＰＰＳのための、手動、半自動化および自動化された合成機を利用できる。任意の所与の機器に対して、機器によって課された機械的要件に合致するように、樹脂を適当に選択してもよい。
【００６４】
当業者は、樹脂の負荷が、ＳＰＰＳ、特に工業的ＳＰＰＳの効率に影響を及ぼす場合があることを十分に認識している。これは、グルカゴン様ペプチドのような長い、凝集傾向のあるペプチド配列を扱う際に、特に影響を有する場合がある：一方では、樹脂の負荷が増加するに従って、プロセスの効率が増大する。他方では、樹脂の負荷を低減させることによって、樹脂上での沈殿を低減させることが必要である。したがって、微妙なバランスがとられ、最適な樹脂の負荷を、任意の所与のＳＰＰＳプロトコルについて、通常の実験によって確立することができる。樹脂の負荷は、様々な置換度で市販されている樹脂を使用することによって、またはモル数の不足する第２のアミノ酸を第１のアミノ酸に対してカップリングさせ、次にアセチル化させ、すなわち、未反応の第１のアミノ酸をブロックすることによって変化しうる。同様に、第１のアミノ酸は、モル数の不足する樹脂にカップリングされ、続いて、ブロッキング工程を行う。本発明の好ましい実施形態では、約０．２ｍｍｏｌ／ｇから約０．９ｍｍｏｌ／ｇの範囲、例えば、約０．２ｍｍｏｌ／ｇ、０．３ｍｍｏｌ／ｇ、０．４ｍｍｏｌ／ｇ、０．５ｍｏｌ／ｇ、０．６ｍｍｏｌ／ｇ、０．７ｍｍｏｌ／ｇ、０．８ｍｍｏｌ／ｇ、または０．９ｍｍｏｌ／ｇの樹脂の負荷が使用される。この文脈では、ＳＰＰＳの間、使用される種々の溶媒中の樹脂の膨潤および収縮によって、樹脂体積、したがって、樹脂上のペプチド濃度にかなりの変動をもたらしうることに留意されたい。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態では、グルカゴン様ペプチドはＦｍｏｃ−ＳＰＰＳによって製造される。適切な、保護されたアミノ酸誘導体（すなわち、１つまたはそれ以上の保護基にコンジュゲートされたアミノ酸部分）、例えば、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｍｔｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍｍｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｍｔｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（１−Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨは、種々の供給源から市販されている。同様に、グルカゴン様ペプチドの合成において、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸）、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、またはＯｒｎ（オルニチン）のような非天然アミノ酸誘導体の使用が、本発明の方法によって包含されていることに留意されたい。好ましい実施形態では、アミノ酸誘導体Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（１−Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨが使用される。Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨをＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨと一緒に使用することにより、樹脂からのペプチドの切断の間に、陽イオン種によるトリプトファン部分のスルホニル修飾を抑制することが可能となる。しかし、樹脂からのＴＦＡによる切断は、カルバメートのような副生成物を形成させる場合があるので、粗製ペプチドを脱炭酸反応に供することが有利である場合がある。例示的には、これは、粗製ペプチドを高ｐＨ処理、例えば、少なくとも７．２、少なくとも８．０、少なくとも８．５、少なくとも９、少なくとも９．５、少なくとも１０、少なくとも１０．５、少なくとも１１、または少なくとも１１．５のｐＨなどに供することによって達成することができる。あるいはまたはさらに、脱炭酸反応は、穏やかな酸性条件下、例えば、６．０から７．０のｐＨ、５．５．から６．５のｐＨ、または５．０から６．０のｐＨで実施される。場合により、前記処理は、例えば、３０〜７０℃の温度での、例えば、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃���または７０℃での熱処理を伴う場合がある。
【００６６】
当業者は、Ｆｍｏｃ合成プロトコルに基づくＳＰＰＳ法を十分に認識している。樹脂へのアミノ酸付加の各サイクルは、典型的に、Ｆｍｏｃ切断、すなわち、樹脂に結合したペプチド鎖からのＦｍｏｃ保護基の除去により開始する。これは、ペプチド樹脂を、樹脂を膨潤させて試薬を溶解することのできる溶媒中の塩基とインキュベートすることによって達成される。この目的のための一般的な塩基は、例えば、ピペリジンや４−メチルピペリジンのような第二級アミンを含む。適切な溶媒は、例えば、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、トルオール、およびこれらの混合物を含む。反応は、通常、周囲温度で、例えば、１５〜３０℃の温度範囲内で行われる。通常、塩基性不安定かつ酸性安定のＦｍｏｃは、ＤＭＦ中５〜５０％、好ましくは２０％のピペリジン（ｖ／ｖ）を用いる短時間の処理（２から１５分、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５分）によってスプリットされる。
【００６７】
必要であれば、この処理が繰り返され、および／または若干延長される（７から３０分、例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０分）。伸長部分を切断することが困難な大きいペプチドの合成のために、Ｆｍｏｃ切断の期間および反復数が徐々に増加される。例えば、切断時間は、１５〜７５分、例えば、１５、３０、４５、６０、または７５分であり、切断は、８回まで、例えば、２、３、４、５、６、７、または８回繰り返される。さらに、温度は、例えば、３０℃と４５℃の間の温度まで上昇される。これらの条件下で、多くの場合、完全なデブロックが達成される。さらにまたはあるいは、Ｆｍｏｃ切断に使用される試薬は様々である。
【００６８】
試薬の僅かな変化でさえ、切断をかなり加速させる場合がある（例えば、４５℃における、ＤＭＦ中１から５％のＤＢＵ、ＤＭＦ中２０％のピペリジンおよび１〜５％のＤＢＵ、ＮＭＰ中２０％のピペリジン、またはＤＭＦ中２０％のピペリジンの使用）ことが見出された。さらに、切断反応の加速は、マイクロ波処理によって達成される。一方、ペプチドの性質は、より穏やかな処理の使用が有利とされる場合がある。特に穏やかな切断条件は、例えば、ＤＭＦ中０．１ＭのＨＯＢｔと２０％のピペリジン、ＤＭＦ中５０％のモルホリン、ＮＭＰ中の５０％のＤＭＳＯ中２％のＨＯＢｔと２％のヘキサメチルエネイミンと２５％のＮ−メチルピロリジンである。当業者は、日常的に、合成の各工程でＦｍｏｃ切断条件を最適化し制御する。
【００６９】
好ましい実施形態では、Ｆｍｏｃ保護基は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中５〜５０％（ｖ／ｖ）のピペリジンまたは４−メチルピペリジン、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）中５〜５０％（ｖ／ｖ）のピペリジンまたは４−メチルピペリジン、ＤＭＦ中１〜５％（ｖ／ｖ）のジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、およびＤＭＦ中５０％（ｖ／ｖ）のモルホリンから選択される混合物を使用して、固相にコンジュゲートされた成長ペプチド鎖から切断される。
【００７０】
典型的に、切断試薬は、Ｆｍｏｃ除去後に注意深く洗浄される。ＤＭＦおよび場合によりＩＰＡを使用して、中性のｐＨまで洗浄する。完全な塩基の除去を確保するために、後の洗浄サイクルで、少量のＨＯＢｔを添加することが有利である場合がある。
【００７１】
アミノ酸のペプチド樹脂へのカップリング、すなわち、伸長工程は、ＳＰＰＳサイクルの中心的工程の１つである。
【００７２】
反応の速度および収率は、溶媒の選択、立体阻害、および活性化されたカルボン酸の反応性などの種々のパラメータによって影響を受ける場合がある。溶媒は、前駆体ペプチド樹脂の膨潤を決定するに過ぎず、したがって、反応部位の接触性に影響を及ぼす場合があり；これは、カップリング反応の動態にも直接影響を及ぼす場合がある。適切な溶媒は、樹脂を膨潤させ、試薬を溶解することができ、例えば、ＤＭＦ、ＮＭＰ、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、トルオール、およびこれらの混合物を含む。立体阻害は、アミノ酸側鎖およびその保護基の性質によって決定される。活性化されたカルボン酸の反応性によって、アシル化の速度、およびラセミ化のような副反応の程度が決定される。選択される合成戦略に応じて、擬プロリンジペプチド誘導体、ジペプチド誘導体もしくはトリペプチド誘導体、または分枝状ジペプチド誘導体のようなペプチド誘導体が、単一のアミノ酸誘導体の代わりに使用される。
【００７３】
本発明のある特定の実施形態では、アミノ酸の活性化は、溶媒としてのＤＭＦ中で行われ、すなわち、アミノ酸またはペプチド誘導体、カップリング試薬および場合により添加剤がＤＭＦ中に溶解され、混合される。ＤＩＣを、添加剤としてのＯｘｙｍａＰｕｒｅ（登録商標）またはＨＯＢｔと組み合わせて使用される。代替案では、ＴＢＴＵまたはＤＥＰＢＴを使用して、塩基、好ましくはＤＩＰＥＡの存在下で、Ｆｍｏｃアミノ酸を活性ＯＢｔまたはＯＤｈｂｔエステルに変換される。選択したアミノ酸誘導体は、樹脂に付加する前に、上記試薬を用いて、１〜３０分間、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、・・・、２８、２９、または３０分間インキュベーションすることによって予め活性化される。カップリング反応は、１から７４時間、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、・・・、７１、７２、７３、または７４時間、進行される。アミノ酸誘導体は、樹脂に結合したアミン基の量に対して、０．４〜３モルの比で、例えば、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０の比で使用される。完全なカップリングを達成するために、いくらかの時間の後、例えば、１０、２０、３０、４０、または６０分後に、反応混合物に、活性剤または塩基の第２の部分を添加することが有利である場合がある。予め活性化する工程およびカップリング工程は、通常、室温で行われるが、他の温度で実施してもよい。アミノ基の完全な変換に近づくために、１回またはそれ以上の再カップリング工程を実施することが有利である場合がある。
【００７４】
本発明の他の実施形態では、アミノ酸の活性化は、場合によりＤＭＦと共に、ＮＭＰ、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、トルオール、およびこれらの混合物からなる溶媒中で行われる。
【００７５】
好ましい実施形態では、本発明の工程（ｉ−ａ）は、適切に保護されたアミノ酸誘導体またはジペプチド誘導体を使用するＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を含み、前記保護されたアミノ酸誘導体またはジペプチド誘導体は、
（Ａ）  ＴＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ；
（Ｂ）  ＤＩＣ／ＯｘｉｍａＰｕｒｅ（登録商標）（シアノ−ヒドロキシイミノ−酢酸エチルエステル）；
（Ｃ）  ＤＥＰＢＴ／ＤＩＰＥＡ；および
（Ｄ）  ＤＩＣ／ＨＯＢｔ
からなる群から各工程について独立して選択される１種またはそれ以上のカップリング試薬／添加剤混合物によって活性化される。
【００７６】
Ｈｉｓ誘導体のカップリングは、好ましくは、ラセミ化を回避するために行われる。この副反応は、３つの異なる手法：１）イミダゾール環のＮ３のブロッキング、２）ＢｏｃまたはＴｏｓのような電子求引基によるイミダゾール環のＮ１のブロッキング、および３）Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（１−Ｔｒｉｔ）−ＯＨを使用する場合のカップリング条件の最適化によって低減されうる。したがって、Ｎ末端Ｈｉｓを導入するために、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（１−Ｔｒｉｔ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（１−Ｔｒｔ）−ＯＨ、またはＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、最も好ましくは、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを、ＤＥＰＢＴ／ＤＩＰＥＡと組み合わせて使用することが推奨される。
【００７７】
したがって、好ましい実施形態では、Ｎ末端ヒスチジン部分は、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（１−Ｔｒｔ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｈｉｓ（１−Ｔｒｔ）−ＯＨからなる群から選択されるアミノ酸誘導体ならびにカップリング試薬／添加剤混合物であるＤＥＰＢＴ／ＤＩＰＥＡを使用して、固相にコンジュゲートされた前駆体ペプチドに導入される。
【００７８】
キャッピングは、次の合成の工程におけるペプチド結合の形成から未反応のアミンをブロックするため、すなわち、合成される配列の欠失体の形成を回避するために実施される。これは、場合により、ＯｘｙｍａＰｕｒｅ（登録商標）またはＨＯＢｔのような添加剤の存在下で、ペプチド樹脂と、大過剰の高い反応性を阻害しない酸誘導体、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、無水酢酸または塩化ベンゾイル、および塩基、例えば、ピリジン、コリジン、またはＤＩＰＥＡとの短時間の処理によって達成することができる。典型的に、キャッピングによって、トランケート配列（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が得られ、これは、一般的に、最終ペプチドとかなり異なり、容易に分離することができる。好ましくは、計画的な二重カップリングの後にキャッピングされる。キャッピング工程の終わりに、典型的に、試薬が濾去され、樹脂が、例えばＤＭＦと場合によりＩＰＡを用いて注意深く洗浄された後、次の脱保護工程に進む。
【００７９】
好ましくは、グルカゴン様ペプチドの、例えば、リラグルチドの樹脂上での凝集は、ＳＰＰＳの間、妨げられる。
【００８０】
リラグルチドのようなグルカゴン様ペプチドは、本来、凝集する傾向があり、このことは、グルカゴン様ペプチドの効率的な合成にとってさらなる課題を表す。段階的に、Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳは、比較的困難になり、樹脂に結合したペプチドが凝集するとすぐにできなくなる場合さえある。
【００８１】
カップリング密度の制御による樹脂の負荷の制御、洗浄工程中の樹脂の収縮の制御、ＤＭＳＯのような溶媒の添加、カオトロピック塩の添加、非イオン性界面活性剤およびエチレンカーボネートの添加、高温で／マイクロ波処理下でカップリング反応を実施すること、ならびにカップリング反応混合物の超音波処理を含む、このような凝集を緩和するための多くの可能な選択肢が存在する。
【００８２】
さらなる可能な手段には、セリンまたはトレオニンへの少なくとも１つのＯ−イソアシルペプチド結合の導入、少なくとも１つの擬プロリンジペプチドの導入、または２−ヒドロキシ−４−メトキシベンジル（Ｈｍｂ）もしくは２，４−ジメトキシベンジル（Ｄｍｂ）部分による少なくとも１つのペプチド結合のＮアルキル化が含まれる。したがって、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｖａｌ−Ｆｍｏｃ）−ＯＨまたはＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｇｌｙ−Ｆｍｏｃ）−ＯＨのようなＯ−イソアシルペプチド結合を含む少なくとも１つのジペプチド誘導体を、この目的のために使用する。あるいはまたはさらに、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−（Ｄｍｂ）Ｇｌｙ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ａｌａ−（Ｄｍｂ）Ａｌａ−ＯＨのようなＮ−アルキル化ペプチド結合を有する少なくとも１つのジペプチドを使用する。
【００８３】
驚くべきことに、少なくとも１つのＦｍｏｃ擬プロリンジペプチドの使用によって、ペプチドの凝集、したがって、不十分な合成に起因する副生成物の形成が有利に抑制される。好ましくは、擬プロリンジペプチドは、式ＩのペプチドのＧｌｙ４〜Ｔｈｒ５、Ｐｈｅ６〜Ｔｈｒ７、Ｔｈｒ７〜Ｓｅｒ８、Ｖａｌ１０〜Ｓｅｒ１１またはＳｅｒ１１〜Ｓｅｒ
１２から選択される位置に対応するか、または同一の位置に導入される。
【００８４】
したがって、擬プロリン部位の導入により、固相にコンジュゲートされたグルカゴン様ペプチド、好ましくは固相にコンジュゲートされたリラグルチドが提供され、これは、関連する不純物の割合の低減によって特徴付けられる。様々な擬プロリンジペプチド誘導体が当業者に公知である（小冊子「Ｐｓｅｕｄｏｐｒｏｌｉｎｅ  Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｂａｃｈｅｍ−Ｐｉｏｎｅｅｒｉｎｇ  Ｐａｒｔｎｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｇｌｏｂａｌ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇにより出版、Ｂａｃｈｅｍ  Ｇｒｏｕｐ、２０１５年１１月を参照のこと）。したがって、好ましい実施形態では、１つまたはそれ以上の擬プロリンジペプチドが、式ＩのペプチドのＧｌｙ４〜Ｔｈｒ５、Ｐｈｅ６〜Ｔｈｒ７、Ｔｈｒ７〜Ｓｅｒ８、Ｖａｌ１０〜Ｓｅｒ１１またはＳｅｒ１１〜Ｓｅｒ１２からなる群から選択される位置に導入される。
【００８５】
特に好ましい実施形態では、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨからなる群から選択される１つまたはそれ以上の擬プロリンジペプチド誘導体が使用される。
【００８６】
好ましい実施形態によれば、１つまたはそれ以上の擬プロリンジペプチドは、式ＩのペプチドのＧｌｙ４〜Ｔｈｒ５、Ｐｈｅ６〜Ｔｈｒ７、またはＴｈｒ７〜Ｓｅｒ８からなる群から選択される位置と同一の、またはそれに対応する位置で導入される。好ましくは、単一の擬プロリンジペプチドが、式ＩのペプチドのＴｈｒ７〜Ｓｅｒ８に対応するか、または同一の位置で導入される。別の好ましい実施形態では、単一の擬プロリンジペプチドが、式ＩのペプチドのＰｈｅ６〜Ｔｈｒ７に対応するか、または同一の位置で導入される。特に好ましい実施形態では、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、またはＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨからなる群から選択される１つまたはそれ以上の擬プロリンジペプチドが使用される。
【００８７】
好ましい実施形態によれば、導入された唯一の擬プロリンジペプチドが、式ＩのペプチドのＧｌｙ４〜Ｔｈｒ５、Ｐｈｅ６〜Ｔｈｒ７、またはＴｈｒ７〜Ｓｅｒ８からなる群から選択される位置と同一の、またはそれに対応する位置に位置付けられている。特に好ましい実施形態では、導入された唯一の擬プロリンジペプチドが、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、またはＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨからなる群から選択される。
【００８８】
好ましい実施形態によれば、単一の擬プロリンジペプチドが、式ＩのペプチドのＧｌｙ４〜Ｔｈｒ５、Ｐｈｅ６〜Ｔｈｒ７、Ｔｈｒ７〜Ｓｅｒ８、Ｖａｌ１０〜Ｓｅｒ１１またはＳｅｒ１１〜Ｓｅｒ１２からなる群から選択される、好ましくは式ＩのペプチドのＧｌｙ４〜Ｔｈｒ５、Ｐｈｅ６〜Ｔｈｒ７、およびＴｈｒ７〜Ｓｅｒ８からなる群から選択される位置と同一の、またはそれに対応する位置で導入される。特に好ましい実施形態では、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、またはＦｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨからなる群から選択される単一の擬プロリンジペプチドが使用される。
【００８９】
用語「擬プロリンジペプチド」は、本明細書で使用する場合、オキサゾリジン形成によってＳｅｒおよびＴｈｒから、チアゾリジン形成によってＣｙｓから容易に得ることができる、一時的なプロリン模倣体を指す。当業者であれば、このような擬プロリンジペプチドについて十分に認識している。これらのジペプチドは、ＳＰＰＳの間の樹脂上での凝集を緩和するための１つの可能な選択肢である。２，２−ジメチルオキサゾリジンは、ＴＦＡによって平滑に切断され、したがって、Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳに特に適している。したがって、特に、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨが使用される。
【００９０】
用語「式ＩのペプチドのＧｌｙ４〜Ｔｈｒ５、Ｐｈｅ６〜Ｔｈｒ７、Ｔｈｒ７〜Ｓｅｒ８、Ｖａｌ１０〜Ｓｅｒ１１またはＳｅｒ１１〜Ｓｅｒ１２から選択される位置に対応する位置」は、本明細書で使用する場合、グルカゴン様ペプチドの主要な配列内の位置であって、その位置が、式Ｉのペプチドに関する前記グルカゴン様ペプチドの配列アラインメントに基づき、式ＩのペプチドのＧｌｙ４〜Ｔｈｒ５、Ｐｈｅ６〜Ｔｈｒ７、Ｔｈｒ７〜Ｓｅｒ８、Ｖａｌ１０〜Ｓｅｒ１１またはＳｅｒ１１〜Ｓｅｒ１２から選択される位置と相同であるとみなされる位置を指す。典型的に、そのようなアラインメントにおいて互いの先端に示される位置は、相同である、すなわち、互いに対応するとみなされる。ＢＬＡＳＴまたはＣｌｕｓｔａｌＷのような典型的な配列アラインメントツールは、同業者に周知である。
【００９１】
上記にレイアウトされるように、リラグルチドは、アミノ酸の２０位のリシル部分（Ｌｙｓ２０）のイプシロンアミノ基に結合したグルタミル部分にコンジュゲートされたパルミチン酸、すなわちＬｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯＨ）を含む。これは、任意の手段によって導入される。
【００９２】
種々のプロトコルを、（Ｎε−（γ−グルタミル（Ｎα脂肪酸エステル）））で置換されたＬｙｓ側鎖（例えば、ＵＳ−Ｂ  ６，４５１，９７４、ＥＰ−Ａ  ２  ７５７  １０７、ＷＯ  ２０１３／１７１１３５を参照のこと）の導入に使用することができる。本発明の文脈では、以下の式２（式中、Ｒ３はアミノ保護基であり、Ｒ１はカルボン酸保護基であり、Ｒ２はアミノ保護基または脂肪酸部位、特にパルミトイル［ＣＨ３（ＣＨ２）１４ＣＯ−］基である）の分枝状ジペプチド構築ブロックを使用して、ＳＰＰＳの間に、少なくとも部分的に、前記基を導入することが好ましい。
【００９３】
式２：
【化１】
2019512273.tif 000003
【００９４】
特に好ましくは、ＳＰＰＳは、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−ＯＨ構築ブロック（例えば、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨから、またはＰｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから市販されている）またはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−ＯＨ構築ブロック（例えば、Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅから市販されている）のいずれかを使用することによって実施される。
【００９５】
後者が使用される場合には、得られたペプチドは、グルタミル部分のアルファアミノ官能基でＮ−パルミトイル化される。パルミチン酸の種々の活性化エステル、例えば、ｐ−ニトロフェニルエステルおよびスクシンイミドエステルをこの目的のために使用することができる。好ましい実施形態では、Ｎ−スクシンイミジルパルミテートが使用される。
【００９６】
したがって、好ましい実施形態では、方法は、ペプチドを、パルミチン酸の活性化エステルと、好ましくはＮ−スクシンイミジルパルミテートと反応させる工程を含む。これは、典型的に、式Ｉのペプチドをもたらす。
【００９７】
より好ましい実施形態では、方法は、パルミチン酸の活性化エステル、好ましくはＮ−スクシンイミジルパルミテートを、式ＩのペプチドのＬｙｓ（Ｈ−Ｇｌｕ−ＯＨ）部分と、または工程（ｉ−ａ）で準備した前駆体ペプチドからアミノ保護基Ｒ２を切断することによって得ることができるＬｙｓ（Ｈ−Ｇｌｕ−ＯＲ１）部分と反応させる工程を含む。
【００９８】
さらにより好ましくは、方法は、パルミチン酸の活性化エステル、好ましくはＮ−スクシンイミジルパルミテートを、工程（ｉ−ａ）で準備した前駆体ペプチドからアミノ保護基Ｒ２を切断することによって得ることができるＬｙｓ（Ｈ−Ｇｌｕ−ＯＲ１）部分と反応させる工程を含み、特に、工程（ｉ−ａ）で準備した前駆体ペプチドは、Ｇｌｕ、ＡｓｐおよびＬｙｓの側鎖において少なくとも保護基を保有する。
【００９９】
場合により、ＳＰＰＳ反応の進行は、効率的なＦｍｏｃ除去、カップリング、および／またはキャッピング工程を確保するために、プロセス制御法を使用してモニタリングされる。一方でのＦｍｏｃ決定および多方での遊離アミンの決定により、相補的な情報が得られる場合がある。まとめると、これらの方法により、ＳＰＰＳプロセスの各工程の効率的なモニタリングが可能となる場合がある。本発明の文脈で有用な通常のモニタリング方法の一部が以下に例示される。
【０１００】
場合により、樹脂に結合したペプチドから切断されたＦｍｏｃの量は、例えば、分光測定による決定によって、容易に定量化されうる。樹脂から排出されるＦｍｏｃ切断試薬は回収され、その中のＦｍｏｃ濃度は、例えば、３０１ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。切断されたＦｍｏｃの量に基づき、樹脂の負荷、すなわち樹脂上のＦｍｏｃペプチドのもとの量が計算されうる。さらに、Ｆｍｏｃ除去の完全性を評価するために、おそらくＦｍｏｃが脱保護された樹脂の少量のサンプルを、この処理によって除去された残留Ｆｍｏｃの量を決定するために、さらなる厳しいＦｍｏｃ切断プロトコルに供する。代替案では、Ｆｍｏｃ除去の完全性を評価するために、樹脂サンプルからのペプチドの小規模の切断試験を行う。得られたペプチドは、Ｆｍｏｃ保護された、遊離のペプチド配列が、通常、十分に分離される、標準勾配を使用する分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析される。さらにまたはあるいは、ペプチドサンプルは、質量分析によって、例えば、ＬＣ−ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＭＳによって分析される。同様に、薄層クロマトグラフィーは、微量のＦｍｏｃペプチドの検出を可能にする場合がある。
【０１０１】
樹脂上の遊離アミンの量は、比色分析によるＫａｉｓｅｒ（すなわち、ニンヒドリン）テスト、ＴＮＢＳテスト、クロラニルテスト、およびブロモフェノールブルーテストを含む種々のアッセイによって評価される。これは、当業者に周知である。
【０１０２】
これらのテストは、Ｆｍｏｃ切断後の遊離アミノ官能基の生成、ならびに以下のＦｍｏｃ保護されたアミノ酸誘導体のカップリング後および／またはキャッピング工程後のそれらの消失を評価するために有利に使用されうる。好ましくは、ＫａｉｓｅｒテストおよびＴＮＢＳテストのような少なくとも２つの比色分析によるテストが並行して行われる。Ｋａｉｓｅｒテストは、ニンヒドリンのアミンとの反応に基づく。これは、第一級アミンに対する非常に感度の高いテストであり、強烈な青色で可視化され、第二級アミンに対してはそれほど適さず、褐色がかった赤色を呈する。色は、通常、主に、ビーズにおいて発色し、上清においても部分的に発色する。未反応のアミノ基の量の分光測定による定量化が意図される場合、色は、完全に溶液に移される。色の強度は、検出されるアミノ末端の性質に依存する。どちらかといえば非特異的な濃淡が、Ｎ末端の、側鎖が保護されたＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒで得られ、褐色がかった赤色のビーズは、Ｎ末端のＰｒｏで生じる。樹脂サンプルは、典型的に加熱されるため、「隠れた」ＮＨ２基が、より接触可能となり、したがって検出可能となる。
【０１０３】
しかし、加熱の延長および過熱は、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）の切断またはＦｍｏｃ除去（ピリジンによる）を引き起こす場合があるので、回避されるべきである。ＴＮＢＳ（２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）テストは、Ｋａｉｓｅｒテストとほぼ同程度に感受性が高いが、第一級アミノ基を検出するためにのみ使用することができる。ビーズが橙赤色に変わるだけで、色の強度はＮ末端の性質に依存しない。ビーズのコアの若干橙色の染色は、単なる目視検査によっては検出できないので、より感度の高い読み出しを使用すること、例えば、顕微鏡下でビーズを検査することが推奨される。
【０１０４】
ＳＰＰＳによる前駆体ペプチドの合成が完了しても、前駆体ペプチドは依然として樹脂にコンジュゲートされている。したがって、前駆体ペプチドは固相に結合されており、少なくとも部分的に側鎖が保護されている。式Ｉのペプチド、例えば、リラグルチドまたは本発明の任意の他のグルカゴン様ペプチドを得るために、ペプチドは樹脂から切断される。これは、本明細書において、樹脂から前駆体ペプチドを切断する工程（ｉ−ｂ）によって表される。
【０１０５】
最も好ましくは、この工程の間に、側鎖を保護する基のほとんどまたはすべても、付随してペプチドから切断され、すなわち、ペプチドは脱保護され、それにより、式Ｉのペプチドが提供される。
【０１０６】
したがって、好ましくは、ＴＦＡおよび１種またはそれ以上の捕捉剤を含む切断組成物を用いたインキュベーションによって、樹脂からの脱保護および切断（工程（ｉ−ｂ））が付随して行われる。
【０１０７】
樹脂からペプチドを切断するために、この目的のために適する任意の組成物を使用する。好ましくは、切断および脱保護は、５０％（ｖ／ｖ）超のＴＦＡ、より好ましくは７５％（ｖ／ｖ）超のＴＦＡ、特に、少なくとも８０％（ｖ／ｖ）またはさらに少なくとも９０％（ｖ／ｖ）のＴＦＡを含む組成物によって行われる。組成物は、水および／または１種もしくはそれ以上の捕捉剤を含む。好ましくは、組成物は、ＴＦＡ、水および１種もしくはそれ以上の捕捉剤を含む。特に有利な捕捉剤は、ＥＤＴのようなチオール捕捉剤および／または、例えば、ＴＩＰＳのようなシラン捕捉剤である。切断組成物は、少なくとも８０％のＴＦＡ、好ましくは少なくとも９０％のＴＦＡ、およびＥＤＴを含む。切断組成物は、少なくとも８０％のＴＦＡ、好ましくは少なくとも９０％のＴＦＡ、水、およびＥＤＴを含む。切断組成物は、少なくとも８０％のＴＦＡ、好ましくは少なくとも９０％のＴＦＡ、水、ＴＩＰＳおよびＥＤＴを含む。例示的に、本発明の文脈で使用するための組成物は、ＴＦＡ／水／ＴＩＰＳ（９０：５：５）ｖ／ｖ／ｖ、ＴＦＡ／水／フェノール（９０：５：５）ｖ／ｖ／ｖ、ＴＦＡ／水／ＥＤＴ／ＴＩＰＳ（９０：５：２．５：２．５）ｖ／ｖ／ｖ／ｖ、ＴＦＡ／水／ＥＤＴ／ＴＩＰＳ（９０：４：３：３）ｖ／ｖ／ｖ／ｖ、ＴＦＡ／水／ＥＤＴ（９０：５：５）ｖ／ｖ／ｖ、ＴＦＡ／チオアニソール／アニソール／ＥＤＴ（９０：５：３：２）ｖ／ｖ／ｖ／ｖおよびＴＦＡ／チオアニソール／水／フェノール／ＥＤＴ（８２．５：５：５：５：２．５）ｖ／ｖ／ｖ／ｖ／ｖからなる群から選択される。
【０１０８】
前駆体ペプチドを樹脂から切断する工程（工程（ｉ−ｂ））は、この目的のために適する任意の条件で行う。切断は、好ましくは、約１から４時間および／または０から３２℃の温度で、洗浄された樹脂を切断組成物とインキュベートすることによって行われる（好ましくは、不活性ガス下で）。
例示的に、切断は、１時間まで、１．５時間まで、２時間まで、２．５時間まで、３時間まで、３．５時間まで、もしくは４時間まで、または４時間超、約０から４℃、４から１０℃、１０〜１５℃、１５から２５℃、または２５から３５℃の温度で、洗浄された樹脂を切断組成物とインキュベートすることによって行われる（好ましくは、不活性ガス下で）。例示的に、切断は、１時間まで、１．５時間まで、２時間まで、２．５時間まで、３時間まで、３．５時間まで、もしくは４時間まで、または４時間超、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２℃の温度で、洗浄された樹脂を切断組成物とインキュベートすることによって行われる（好ましくは、不活性ガス下で）。
【０１０９】
あるいは、別の切断組成物が使用される。例えば、保護されたペプチド断片の２−クロロトリチル樹脂からの切断は、ＴＦＥ／ＡｃＯＨ／ＤＣＭ（１：１：３）、０．５％のＴＦＡ／ＤＣＭ、またはＨＦＩＰ／ＤＣＭを使用して達成する。
【０１１０】
当業者は、日常的に、問題のペプチドのアミノ酸組成に応じて、本発明の文脈で使用するための組成物を最適化し、１種またはそれ以上の捕捉剤、例えば、とりわけ、ＤＴＥ、ＥＤＴ、ＴＥＳ、ＴＩＰＳ、２−メルカプトエタノール、エチルメチルスルフィド、ｍ−クレゾールもしくはｐ−クレゾール、２−Ｍｅ−インドール、Ａｃ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ、またはトリプタミンの最適な使用を予想する。
【０１１１】
本出願の文脈では、用語「捕捉剤」は、ＳＰＰＳ後のペプチドの樹脂からの切断の間、および／または保護基の除去の間に、副反応を抑制するために反応混合物に添加される化合物を指すために使用される。切断組成物において使用される典型的な捕捉剤は、「チオール捕捉剤」（例えば、ＥＤＴ、ＤＴＥ、ＤＴＴ、およびベータ−メルカプトエタノール）および「シラン捕捉剤」（例えば、ＴＥＳおよびＴＩＰＳ）である。さらに、通常使用される捕捉剤は、エチルメチルスルフィド、チオアニソール、アニソール、ｍ−クレゾールもしくはｐ−クレゾール、２−Ｍｅ−インドール、Ａｃ−Ｔｒｐ−ＯＭｅ、またはトリプタミンを含む。当業者であれば、使用可能な非常に様々な捕捉剤を十分に認識している。
【０１１２】
上記によれば、工程（ｉ）から得られる溶液Ｓは、好ましくは、ＴＦＡ（典型的に、少なくとも８０％（ｖ／ｖ）または少なくとも９０％（ｖ／ｖ））、ペプチドから切断された保護基の残留物、および、より好ましくはまた、水、および１種またはそれ以上の捕捉剤も含む。
【０１１３】
次いで、樹脂は、通常、濾過によって、工程（ｉ）から得られた、すなわちペプチドを樹脂から切断することによって得られた溶液Ｓから分離される。本発明の実施形態では、工程（ｉ）から得られた前記溶液Ｓは、リラグルチドペプチドおよび切断のために使用された試薬（例えば、ＴＦＡ、水、捕捉剤、およびペプチドから切断された保護基の残留物）を含む。場合により、樹脂は、濾過後に、例えば、濃縮されたＴＦＡで、または濃縮されたＴＦＡと捕捉剤ですすがれる。
【０１１４】
場合により、さらなるすすぎ溶液が工程（ｉ）から得られた溶液Ｓの一部も形成し、すなわち、これらは、ペプチドの樹脂からの切断後に直接得られた溶液と共にプールされる。
【０１１５】
したがって、好ましい実施形態では、工程（ｉ）から得られた溶液Ｓは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水および１種もしくはそれ以上の捕捉剤をさらに含む。
【０１１６】
より好ましい実施形態では、工程（ｉ）から得られた溶液Ｓは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水ならびにチオール捕捉剤および／またはシラン捕捉剤から選択される１種またはそれ以上の捕捉剤を含む。
【０１１７】
捕捉剤は、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒのような感受性の高いアミノ酸との望ましくない副反応を妨げる役割を果たす場合がある。いずれの理論にも拘泥されることを望むものではないが、前記副反応は、切断反応の間に生じた反応性の高いカルボカチオンの捕捉によって抑制されると考えられる。
【０１１８】
当業者であれば、溶液Ｓから式Ｉのペプチドを単離し、それにより粗製ペプチド（典型的に、ＴＦＡ塩として存在する）を得ることが望ましいことに留意するであろう。本発明の特に好ましい実施形態では、これは、ジイソプロピルエーテル（ＩＰＥ）およびアセトニトリル（ＡＣＮ）を含む逆溶媒によって工程（ｉ）のペプチドを沈殿させ（体積比（ＩＰＥ：ＡＣＮ）は、（３：１）から（１０：１）の範囲内にある）；次に、得られた沈殿物を単離することによって実施される。
【０１１９】
本明細書において、ＩＰＥとＡＣＮの混合物は、逆溶媒としての役割を果たす。この用語は、当業者によって十分に理解されている。本明細書で使用する場合、用語「逆溶媒」は、ペプチド溶液と混合する際に、ペプチドの沈殿を誘導する任意の試薬として、最も広い意味で理解される。例示的に、逆溶媒は、ジエチルエーテル、ＩＰＥ，ＭＴＢＥ、およびＩＰＥとＡＣＮの混合物を含む。本発明によれば、逆溶媒は、（３：１）ｖ／ｖから（１０：１）ｖ／ｖの範囲から選択される比で、ＩＰＥとＡＣＮを含む。より好ましくは、逆溶媒は、ＩＰＥとＡＣＮを含み、体積比（ＩＰＥ：ＡＣＮ）は（３：１）から（５：１）の範囲内にある。驚くべきことに、切断組成物からの粗製ペプチドの取り出しは、ＩＰＥとＡＣＮを含む逆溶媒を（３：１）ｖ／ｖから（１０：１）ｖ／ｖの範囲から選択される比で、好ましくは（３：１）から（５：１）ｖ／ｖの比で、例えば、（３：１）、（３．５：１）、（４：１）、（４．５：１）、または（５：１）ｖ／ｖの比で用いる際に特に良好であることが見出された。
【０１２０】
前記逆溶媒の使用によって、沈殿物の純度および物理特性が改善され、それによって、ペプチド生成物の切断組成物からの効率的な分離が可能となる。
【０１２１】
有利には、本発明は、そのサイズ分布が素早い濾過を可能にする、粘着性のない沈殿物の形成を可能にすることによって、粗製ペプチドの素早い取り出しが可能となる。さらに、沈殿物の純度と低含量のＴＦＡについて有利である。
【０１２２】
好ましい実施形態では、工程（ｉｉ）で使用される逆溶媒は、少なくとも５０％ｖ／ｖのジイソプロピルエーテルおよびアセトニトリルからなる混合物Ｍを含み、好ましくは、逆溶媒は、少なくとも７５％（ｖ／ｖ）の前記混合物Ｍを含み、より好ましくは、逆溶媒は、ジイソプロピルエーテルおよびアセトニトリルの混合物から本質的になる。
【０１２３】
特に好ましい実施形態では、逆溶媒は、ジイソプロピルエーテルおよびアセトニトリルの混合物から本質的になり、体積比（ジイソプロピルエーテル：アセトニトリル）は、（３：１）から（５：１）の範囲内にある。
【０１２４】
逆溶媒は、任意の手段によって、溶液Ｓと混合される。好ましい実施形態では、工程（ｉｉ）は：
（ｉｉ−ａ）ジイソプロピルエーテルおよびアセトニトリルを予め混合した後、それを工程（ｉ）から得られた溶液Ｓと混合する工程；
（ｉｉ−ｂ）ジイソプロピルエーテルを工程（ｉ）から得られた溶液Ｓと最初に混合し、次に、アセトニトリルを、溶液Ｓおよびジイソプロピルエーテルを含む混合物と混合する工程；または
（ｉｉ−ｃ）アセトニトリルを工程（ｉ）から得られた溶液Ｓと最初に混合し、次に、ジイソプロピルエーテルを、溶液Ｓおよびアセトニトリルを含む混合物と混合する工程
によって、逆溶媒を工程（ｉ）から得られた溶液Ｓと混合することを含む。
【０１２５】
言い換えれば、逆溶媒は、アセトニトリルを含有する部分とジイソプロピルエーテルを含有する部分とに分割され、次に、前記部分を、ペプチドを含む溶液と接触させる。あるいは、逆溶媒は単一の液体混合物である。
まとめると、本発明の（ＩＰＥ：ＡＣＮ）の体積範囲が、最終的に得られる。当業者は、アセトニトリルとジイソプロピルエーテルのアリコートが、本発明の体積範囲に合計されるまで、溶液Ｓと交互に混合されることを理解する。
【０１２６】
好ましくは、溶液Ｓの逆溶媒に対する体積比は、１：５から１：１５の範囲内にあり、例えば、１：５、１：８、１：１０、１：１２、または１：１５である。言い換えれば：１体積の溶液Ｓは、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５体積に対応する量の逆溶媒と混合される。
【０１２７】
式Ｉのペプチドを溶液Ｓから沈殿させる工程（工程（ｉｉ））は、この目的のために適する任意の温度および任意の時間間隔で行われる。例示的に、工程（ｉｉ）は、−５℃から２５℃、例えば、約−５〜０℃、０〜１０℃、１０〜２０℃、または２０〜２５℃で行われる。
【０１２８】
本出願の文脈で使用する場合、用語「約」は、任意の所与の数値から１０％までの逸脱を示すために使用される。
【０１２９】
好ましい実施形態では、式Ｉのペプチドの沈殿（工程（ｉｉ））は、−５℃から１０℃、好ましくは０℃から１０℃の範囲の温度で行われる。適切な温度範囲は、−５〜０℃、−２．５〜２．５℃、０〜５℃、２．５〜７．５℃、または５〜１０℃である。
【０１３０】
例示的に、工程（ｉｉ）は、約３０から３６０分、例えば、約３０、６０、９０、１２０，１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３３０、または３６０分の時間間隔で行われる。
【０１３１】
したがって、好ましい沈殿条件は、約−５℃から２５℃、例えば、約−５〜０℃、０〜１０℃、１０〜２０℃、または２０〜２５℃の範囲の温度で、およそ３０から３６０分の範囲、例えば、約３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３３０、または３６０分の反応時間で特徴付けられる。
【０１３２】
特に好ましい実施形態では、リラグルチドペプチドまたはその塩を製造するための方法は：
（ｉ）式Ｉ：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｂ１−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ
（式中、Ｂ１はＬｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯＨ）またはＬｙｓ（Ｈ−Ｇｌｕ−ＯＨ）である）
のペプチドを含む溶液Ｓを準備する工程であり；
前記溶液Ｓの準備が：
（ｉ−ａ）固相：
Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｂ２−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−［樹脂］
（式中、Ｂ２はＬｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）またはＬｙｓ（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕであり、
Ｇｌｕ、ＡｓｐおよびＬｙｓの少なくとも側鎖が、保護基を保有する）
にコンジュゲートされた前駆体ペプチドを準備する、工程と；
（ｉ−ｂ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む切断組成物によって、前駆体ペプチドを樹脂から切断する工程
とを含み、
工程（ｉ）から得られた前記溶液Ｓが、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水ならびにチオール捕捉剤および／またはシラン捕捉剤から選択される１種またはそれ以上の捕捉剤を含み；
（ｉｉ）溶液Ｓをジイソプロピルエーテルおよびアセトニトリルからなる逆溶媒と混合することによって、工程（ｉ）のペプチドを沈殿させる工程であり、体積比（ジイソプロピルエーテル：アセトニトリル）が（３：１）から（５：１）の範囲内にある、工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）から得られた沈殿物を、好ましくは濾過および／または遠心分離によって、単離する工程
とを含む。
【０１３３】
工程（ｉ）から得られた溶液Ｓと逆溶媒は、当技術分野で公知の任意の手段によって混合される。工程（ｉ）から得られた溶液Ｓと逆溶媒は、任意の順序で混合される。
【０１３４】
好ましい実施形態によれば、工程（ｉｉ）は、古典的な沈殿プロトコルを使用して行われ、すなわち、逆溶媒は、工程（ｉ）から得られた溶液Ｓに添加される。これは、逆溶媒を一度に添加することによって、または逆溶媒を滴下添加することによって、および／もしくはスローフローによって達成される。
【０１３５】
別の好ましい実施形態によれば、工程（ｉｉ）は、逆沈殿プロトコルを使用して行われ、すなわち、工程（ｉ）から得られた溶液Ｓが逆溶媒に添加される。これは、逆溶媒を一度に添加することによって、または逆溶媒を滴下添加することによって、および／もしくはスローフローによって達成される。当業者であれば、このような沈殿工程を行う方法を十分に認識している。
【０１３６】
次いで、リラグルチドペプチドを含む沈殿物が、逆溶媒中の懸濁物として形成され、前記懸濁物は、切断組成物の試薬（例えば、ＴＦＡ、水、および捕捉剤）ならびにペプチドから切断された保護基の残留物を含む。次いで、リラグルチドペプチドを含む（またはそれから本質的になる）沈殿物は、当技術分野でこのような目的のために公知の任意の手段によって、粗製の懸濁物から単離されうる。
【０１３７】
したがって、本発明は、工程（ｉｉ）から得られた沈殿物を単離するための工程（ｉｉｉ）も含む。
【０１３８】
好ましい実施形態によれば、工程（ｉｉｉ）は、濾過および／または遠心分離によって成し遂げられる。
【０１３９】
本明細書で使用する場合、用語「単離」は、目的の生成物、例えば粗製のペプチド沈殿物をより複雑な組成物から得るための任意の手段として、最も広い意味で理解される。粗製のペプチド沈殿物は、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも４０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは少なくとも６０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、さらにより好ましくは少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、さらにより好ましくは少なくとも９０％（ｗ／ｗ）、特に少なくとも９５％（ｗ／ｗ）またはさらに１００％（ｗ／ｗ）のリラグルチドペプチドを乾燥状態で含む。典型的に、粗製のペプチド沈殿物は、４０〜７０％（ｗ／ｗ）の、乾燥状態のリラグルチドペプチドを含む。
【０１４０】
濾過は、例えば、全量濾過またはクロスフロー濾過のような、当技術分野で公知の任意の濾過方法である。本明細書で使用する場合、用語「クロスフロー濾過（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」、「クロスフロー濾過（ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」、「タンジェンシャルフロー濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」、「タンジェンシャル濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」は互換的に理解される。フィルターは、例えば、プラスチック（例えば、ナイロン、ポリスチレン）、金属、合金、ガラス、セラミック、セロファン、セルロース、または複合材料のような当技術分野における濾過の文脈で公知の任意の材料のものである。フィルターは、疎水性または親水性である。フィルターの表面は、中性または正に荷電、または負に荷電している。
【０１４１】
遠心分離は、懸濁された沈殿物の沈降が加速される任意の手段として、最も広い意味で理解される。例示的に、１００×ｇまで、少なくとも１００×ｇ、少なくとも１，０００×ｇ、少なくとも２，５００×ｇ、少なくとも５，０００×ｇ、少なくとも７，５００×ｇ、少なくとも１０，０００×ｇ、少なくとも１５，０００×ｇ、少なくとも２５，０００×ｇ、または少なくとも５０，０００×ｇの遠心力を使用する。遠心分離という手段によって、粗製リラグルチドペプチドを含む（または（本質的に）からなる）ケーキが形成される。場合により、ケーキは、上記で言及された逆溶媒と同一であっても異なる逆溶媒に再懸濁される。場合により、逆溶媒中でペレットを遠心分離して再懸濁することを数回繰り返し、粗製リラグルチドペプチドの純度をさらに上昇させる。
【０１４２】
好ましくは、本発明の方法によって得られた粗製ペプチドは、１回またはそれ以上の製造プロセス工程によるさらなる精製に供されうる。この文脈で、場合により使用される精製および分離のための手段は、例えば、１種もしくはそれ以上の電気泳動法（例えば、ゲル電気泳動もしくはキャピラリー（ＣＥ）電気泳動）、１種もしくはそれ以上のさらなる沈殿に基づく方法（例えば、塩溶もしくは塩析）、１種もしくはそれ以上の透析法（透析）、および／または１種またはそれ以上のクロマトグラフィー法（例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、フラッシュクロマトグラフィー（フラッシュ）、迅速分解能液体クロマトグラフィー（Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｆｌｕｉｄ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＲＲＬＣ）、高速分離液体クロマトグラフィー（ＲＳＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＦＬＣ）、逆相ＵＦＬＣ（ＲＰ−ＵＦＬＣ）、超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）または逆相ＵＰＬＣ（ＲＰ−ＵＰＬＣ）を含む。好ましくは、粗製ペプチドは、最初に、三次元逆相ＨＰＬＣ、続いて、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または限外濾過に供される。
【０１４３】
当業者であれば、本発明が、粒径および稠度が改善されたことに起因して、特に取り扱いやすい、純度の改善された粗製リラグルチドペプチドの沈殿も包含することに気付くであろう。
【０１４４】
したがって、本発明のさらなる態様は、本発明による方法によって得ることができる、または得られるリラグルチドペプチドの沈殿物を指す。
【０１４５】
好ましい実施形態では、本発明による方法から得ることができるリラグルチドペプチドの沈殿物は、２８０マイクロメーター超、３００マイクロメーター超、３５０マイクロメーター超、または４００マイクロメーター超の平均粒径によって特徴付けられる。
【０１４６】
さらに、本発明による方法から得ることができるリラグルチドペプチドの沈殿物は、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％のペプチド純度によって特徴付けられる。
【０１４７】
好ましい実施形態では、本発明による方法から得ることができるリラグルチドペプチドの沈殿物は、Ｎ末端および／またはＣ末端がトランケートされたリラグルチド変異体を含有することによって特徴付けられる。一部の実施形態では、本発明による方法から得ることができるリラグルチドペプチドの沈殿物は、Ｎ末端でアシル化、例えばアセチル化されているリラグルチド２１−３１−ＯＨのトランケートされた変異体を含有することによって特徴付けられる。他の実施形態では、本発明による方法から得ることができるリラグルチドペプチドの沈殿物は、トランケートされた変異体、リラグルチド１−３０を含有することによって特徴付けられる。
【０１４８】
用語「トランケートされた変異体」は、本明細書で使用する場合、ペプチド配列のＮ末端またはＣ末端で１つまたはそれ以上のアミノ酸を欠く、前記ペプチドの連続する断片、すなわち、ギャップのない配列を指す。Ｎ末端でトランケートされた変異体は、アシル化、例えばアセチル化されている。
【０１４９】
さらなる好ましい実施形態では、本発明によって得ることができるリラグルチドペプチドの沈殿物は、粘着性の低下もしくはさらに粘着性が欠如することによって、および／または２０％（ｗ／ｗ）未満のＴＦＡ含量によって特徴付けられる。特定の好ましい実施形態では、本発明によって得ることができるリラグルチドペプチドの沈殿物は、３５０マイクロメーター超の平均粒径および少なくとも５５％の純度によって特徴付けられる。別の好ましい実施形態では、本発明によって得ることができるリラグルチドペプチドの沈殿物は、４００マイクロメーター超の平均粒径および少なくとも５５％の純度によって特徴付けられる。別の好ましい実施形態では、本発明によって得ることができるリラグルチドペプチドの沈殿物は、３５０マイクロメーター超の平均粒径および少なくとも６０％の純度によって特徴付けられる。特に好ましい実施形態では、本発明によって得ることができるリラグルチドペプチドの沈殿物は、３５０マイクロメーター超の平均粒径、少なくとも５５％の純度、および非粘着性の稠度によって特徴付けられる。さらに別の好ましい実施形態では、本発明によって得ることができるリラグルチドペプチドの沈殿物は、３５０マイクロメーター超の平均粒径、少なくとも５５％の純度、および２０％（ｗ／ｗ）未満のＴＦＡ含量によって特徴付けられる。
【０１５０】
沈殿物の粒径は、当技術分野の任意の手段によって、例えば、以下に記載されている集束ビーム反射測定法（ＦＢＲＭ）の技術によって測定される。
【０１５１】
他に記載されていなければ、ペプチドの純度は、本明細書において、「ＨＰＬＣ純度」として、すなわち２０５から２３０ｎｍの間の波長での、すなわちペプチド結合の吸収極大でのＵＶ検出を用いる分析逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で実測される相対ピーク面積として示される。言い換えれば、値は、２０５から２３０ｎｍの間の波長でのＵＶ検出を用いる分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって得られるクロマトグラムにおいて、すべての実測されたピークの面積の合計で割った、所与のピーク面積の面積％として決定される。この尺度は、この分野での常識であり、当業者は、生成物に特異的なＲＰ−ＨＰＬＣプロトコルを日常的に考案し、米国薬局方で示される確立されたガイドラインに従った定量を実施する。ペプチドの夾雑物の検出に対するＲＰ−ＨＰＬＣプロトコルの適性は、日常的に、ＬＣ−ＭＳによってピーク純度を決定することによって評価される。それらの類似構造に起因して、すべてのペプチドの構成成分が同じ吸収を有するという仮定のもと、質量百分率［％（ｗ／ｗ）］として表現された純度に対するプロキシとして、ＲＰ−ＨＰＬＣ純度を使用することができる。
【０１５２】
前記リラグルチドペプチドの沈殿物の文脈では、上記に示されたすべての定義も適用する。当業者であれば、前記沈殿物中のリラグルチドペプチドが塩、特にＴＦＡ塩の形態であることに気付くであろう。
【０１５３】
場合により、本発明のリラグルチドペプチドの１つまたはそれ以上のアミノ酸部分は、ペプチドを得ることに続いて、脂質付加されるか、リン酸化されるか、硫酸化されるか、環化されるか、酸化されるか、還元されるか、脱炭酸されるか、アセチル化されるか、アシル化されるか、アミド化されるか、脱アミド化されるか、ビオチン化されるか、または１つもしくはそれ以上の他の小分子および／もしくはテルペンに結合される。場合により、本発明のリラグルチドペプチドは、１種またはそれ以上の小分子色素（例えば、Ｃｙ色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、Ａｌｅｘａ色素（複数可）（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０）、ＶｉｓＥｎ色素（例えば、ＶｉｖｏＴａｇ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ７５０）、Ｓ色素（例えば、Ｓ０３８７）、ＤｙＬｉｇｈｔフルオロフォア（例えば、ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ８００）、ＩＲＤｙｅｓ（例えば、ＩＲＤｙｅ  ６８０、ＩＲＤｙｅ  ８００）、フルオレセイン色素（例えば、フルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ローダミン色素（例えば、ローダミン、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））またはＨＯＥＣＨＳＴ色素）または１種もしくはそれ以上の量子ドットによって標識される。
【０１５４】
上記に示すように、本発明による方法の好ましい実施形態によれば、リラグルチドペプチドは、樹脂上でＳＰＰＳによって製造される。
【０１５５】
したがって、本発明のまたさらなる態様は、樹脂：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｂ２−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−［樹脂］
（式中、Ｂ２はＬｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯＲ１）またはＢ２はＬｙｓ（Ｒ２−Ｇｌｕ−ＯＲ１）であり、Ｒ１はカルボン酸保護基であり、Ｒ２はアミノ保護基であり、
少なくともＧｌｕ、ＡｓｐおよびＬｙｓの側鎖が保護基を保有し、
少なくとも１つの擬プロリンジペプチドが、Ｇｌｙ４〜Ｔｈｒ５、Ｐｈｅ６〜Ｔｈｒ７、Ｔｈｒ７〜Ｓｅｒ８、Ｖａｌ１０〜Ｓｅｒ１１またはＳｅｒ１１〜Ｓｅｒ１２からなる群
から選択される位置に存在する）
にコンジュゲートされた前駆体ペプチドに関する。
【０１５６】
前記前駆体ペプチドの文脈で、上記で示されたすべての定義も使用する。当業者であれば、前記前駆体ペプチドの塩も、特に薬学的に許容される塩も本発明によって包含されることに気付くであろう。好ましい実施形態では、少なくとも１つの擬プロリンジペプチドが、前駆体ペプチドのＧｌｙ４〜Ｔｈｒ５、Ｐｈｅ６〜Ｔｈｒ７、またはＴｈｒ７〜Ｓｅｒ８から選択される位置に存在する。これは、例示的に、本明細書に記載されている擬プロリン部位である。
【０１５７】
本明細書で使用する場合、用語「前駆体ペプチド」は、本発明の意味において、ペプチド、すなわちグルカゴン様ペプチド、特にリラグルチドに変換することができる化合物として、最も広い意味で理解される。典型的に、このような前駆体は、その側鎖において部分的に、または完全に保護されており、その樹脂にコンジュゲートされた、すなわち固相にコンジュゲートされた、ＳＰＰＳの精製物である。
【０１５８】
さらに、本発明は、固相にコンジュゲートされたグルカゴン様ペプチド（特に、リラグルチドの前駆体ペプチド）を提供し、少なくともＧｌｕ、ＡｓｐおよびＬｙｓの側鎖が保護基を有し、少なくとも１つのセリンもしくはトレオニンに結合したＯ−イソアシルペプチドが存在し、ならびに／または少なくとも１つの擬プロリンが、Ｇｌｙ４〜Ｔｈｒ５、Ｐｈｅ６〜Ｔｈｒ７、Ｔｈｒ７〜Ｓｅｒ８、Ｖａｌ１０〜Ｓｅｒ１１またはＳｅｒ１１〜Ｓｅｒ１２から選択される位置に存在し、ならびに／もしくは少なくとも１つのペプチド結合が、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンジル（Ｈｍｂ）または２，４−ジメトキシベンジル（Ｄｍｂ）部位によってＮアルキル化されている。
【０１５９】
特に好ましくは、前駆体ペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、および特に、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨから選択される少なくとも１つの擬プロリンジペプチドを含む。
【０１６０】
本発明は、さらに、式Ｉのペプチドを製造する方法に関し、前記ペプチドが、ＴＦＡ含有切断組成物とのインキュベーションによって、樹脂にコンジュゲートされた上記前駆体ペプチド（すなわち、固相に結合した、側鎖が保護されたリラグルチド誘導体）から得られる。このインキュベーションは、上記のように行われる。
【０１６１】
本発明は、前に記載されているように、樹脂から切断された前駆体ペプチドから得ることができるリラグルチドペプチドも指す。
【０１６２】
さらに、本発明は、本発明の方法に従って製造されたグルカゴン様ペプチドを含むか、または本発明の固相にコンジュゲートされたグルカゴン様ペプチドからの切断によって製造されたグルカゴン様ペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【０１６３】
したがって、本発明のさらなる態様は：
（Ａ）本発明による方法から得ることができるリラグルチドペプチド、または固相から本発明による前駆体ペプチドを切断することから得ることができるリラグルチドペプチドと（Ｂ）薬学的に許容される担体
とを含む医薬組成物を指す。
【０１６４】
薬学的に許容される担体は、この目的のために知られている任意の添加剤または添加剤の組成物である。このような添加剤は、例えば、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、植物油、パラフィン油またはこれらの組合せのような、非毒性溶媒である。さらに、担体は、１種もしくはそれ以上の界面活性剤、１種もしくはそれ以上の発泡剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）／ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｃｅｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ）（ＳＤＳ））、１種もしくはそれ以上の着色剤（例えば、ＴｉＯ２、着色料）、１種もしくはそれ以上のビタミン、１種もしくはそれ以上の塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、亜鉛塩）、１種もしくはそれ以上の湿潤剤（例えば、ソルビトール、グリセロール、マンニトール、プロピレングリコール、ポリデキストロース）、１種もしくはそれ以上の酵素、１種もしくはそれ以上の保存剤（例えば、安息香酸、メチルパラベン）、１種もしくはそれ以上のテクスチャリング剤（例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ソルビトール）、１種もしくはそれ以上の乳化剤、１種もしくはそれ以上の充填剤、１種もしくはそれ以上の艶出し剤、１種もしくはそれ以上の分離剤、１種もしくはそれ以上の抗酸化剤、１種もしくはそれ以上のハーブエキスおよび植物エキス、１種もしくはそれ以上の安定剤、１種もしくはそれ以上のポリマー（例えば、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、１種もしくはそれ以上の取り込みメディエーター（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、抗菌ペプチドなど）、１種もしくはそれ以上の抗体、１種もしくはそれ以上の甘味剤（例えば、スクロース、サッカリンＮａ、ステビア）、１種もしくはそれ以上の対比染色色素（例えば、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、Ｃｙ色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｓ色素、ローダミン、量子ドットなど）、１種もしくはそれ以上のホメオパシー成分、１種もしくはそれ以上の味覚物質ならびに／または１種もしくはそれ以上の芳香剤を含有する。
【０１６５】
行われた実験および達成された結果を含む、以下の図および実施例は、特許請求の範囲と一緒に、例示目的で提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】選択されたグルカゴン様ペプチドの配列アラインメント示す図である。ＧＬＰ−１配列と同一性を共有する部分を太字で記載する。
【図２】ＦＢＲＭ技術（以下の装置：ＰａｒｔｉｃｌｅＴｒａｃｋ  Ｇ６００Ｌ、Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ、設定：マクロＶ１．１．１１、ｃｕｂｅ  ｗｅｉｇｈｔ、正規化された、平均（ｃｕｂｅ  ｗｅｉｇｈｔ））によって測定されたペプチド沈殿物の粒径分布を示すグラフである。翼弦長さは、走査速度および後方散乱光の別個のパルスの数と期間に基づいて計算された各粒子を横切る距離である。得られたパーセンテージは、検出された粒子の数に関し、１回のスキャン内に所与のサイズの粒子の最大数が１００％であるように正規化される。本明細書において、実施例５の沈殿物ＥＯＰ２６ａ（逆溶媒：ジエチルエーテル  平均粒径：２６１μｍ）を実施例２の沈殿物ＥＯＰ２２ａ（逆溶媒：ＩＰＥ／ＡＣＮ  平均粒径：４２２μｍ）と比較する。
【発明を実施するための形態】
【０１６７】
〔実施例〕
実施例１：グルカゴン様ペプチドの固相ペプチド合成
段階的に、リラグルチドのＦｍｏｃ−ＳＰＰＳを、標準のＦｍｏｃアミノ酸誘導体、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＭｐｅ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（１−Ｔｒｔ）−ＯＨ  Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、ならびに以前に記載した構築ブロック、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｎε−（γ−グルタミル（ＯｔＢｕ）−（Ｎα−ヘキサデカノイル）））（＝Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（パルミトイル−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−ＯＨ、ＷＯ  ２０１３／１７１１３５を参照のこと）ならびにＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨ、およびＦｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（Ｐｓｉ（Ｍｅ，Ｍｅ）ｐｒｏ）−ＯＨから選択される少なくとも１つの擬プロリンジペプチドを使用して、１００〜２００または２００〜４００メッシュのＨ−Ｇｌｙ−２−クロロトリチル樹脂（Ｂａｃｈｅｍ  番号４０９２０９８または４０２６８２３）上で実施した。カップリング反応を、ＤＩＣ／ＯｘｙｍａＰｕｒｅ（登録商標）、ＴＢＴＵ／ＤＩＰＥＡまたはＤＥＰＢＴ／ＤＩＰＥＡのいずれかを用い、適当なカップリング時間（１．５〜２４．０時間）およびＦｍｏｃ脱保護時間（０．５〜４．０時間）で実行した。
【０１６８】
所望の場合、ＮＭＰ中２０％のピペリジンを、ＤＭＦ中２０％のピペリジンの代わりに使用して、脱保護速度を増大させた。カップリング工程後、場合により、無水酢酸を使用してアセチル化を実施した。アセチル化またはＦｍｏｃ脱保護後の洗浄工程のために、溶媒として、ＤＭＦとＩＰＡを使用した。典型的に、粗製のリラグルチドは、切断および約５０％のＵ−ＨＰＬＣ純度での沈殿後に得た。
【０１６９】
あるいは、構築ブロックとしてのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−ＯＨの使用を含む、段階的プロトコルを行い、次に、精製したペプチドのパルミトイル化を以下のように行った。
【０１７０】
第一級アミノ酸配列の完全に保護されたペプチド：
Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−［樹脂］
の段階的Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳを、Ｈ−Ｇｌｙ−２−クロロトリチル樹脂を使用して、自動合成機で行った。カップリング反応を、反応性の標準Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体、カップリング試薬としてのＤＩＣ／ＯｘｙｍａＰｕｒｅ（登録商標）またはＴＢＴＵ／ＤＩＰＥＡおよび溶媒としてのＤＭＦを使用して行った。例外として、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨのカップリングは、ＤＭＦ中のＤＥＰＢＴ／ＤＩＰＥＡを使用して行った。カップリング時間は１．５時間から４時間の間で変化した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕ）−ＯＨ構築ブロックの導入を手動で行い（ＤＩＣ／ＯｘｙｍａＰｕｒｅ（登録商標）、４時間のカップリング時間）、一方、合成の残りは、完全に自動化したペプチド合成により行った。Ｆｍｏｃ脱保護は、２０％のピペリジンのＤＭＦ中溶液（ｖ／ｖ）を使用して実施した。脱保護時間は、１５から９０分までの間で変化した。各カップリング後、計画的なキャッピング工程を無水酢酸を使用して実施した。
【０１７１】
Ｆｍｏｃ脱保護およびアセチル化の後に、ＤＭＦおよび／またはＩＰＡを洗浄工程のための溶媒として使用した。ペプチドを、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＥＤＴ（９０：５：５）ｖ／ｖ／ｖからなる切断組成物との２．５時間のインキュベーションによって、すべての側鎖保護基の除去に付随して、固相支持体から切断し、続いて沈殿させた。得られた粗製物質を、固定相としてのＣ８結合したシリカ、第１次元でＴＥＡＰ溶出系、および第２次元でＴＦＡ溶出系を使用する２次元分取逆相ＨＰＬＣに供した。精製した前駆体ペプチドは、典型的に、９５％のＵ−ＨＰＬＣ純度を有し、６６％のＴＨＦを含む水溶液中のＮ−スクシンイミジルパルミテートと反応させた。得られた生成物を溶媒の蒸発によって沈殿させ、１０％のＡＣＮ／Ｈ２Ｏ中の５０％のＡｃＯＨを添加することにより再度溶解させて濾過した。
【０１７２】
実施例２：グルカゴン様ペプチドの切断組成物からの沈殿
一般的手順：
ペプチド樹脂（５ｇ）を５０ｍＬの切断組成物に懸濁させ、室温で３時間撹拌した。次いで、樹脂を濾去し、ＴＦＡ（２×３．５ｍＬ）で洗浄した。切断組成物と洗浄画分をプールした。５７０ｍＬのそれぞれの逆溶媒を、沈殿を開始させるために添加した。得られた懸濁液を、濾過用漏斗または標準の加圧濾過装置（「ポケットフィルター」）のいずれかを使用することによるペプチド沈殿物の分離の前に、さらに２時間撹拌した。濾過時間およびペプチド樹脂に対する総収率を決定した。沈殿物をそれぞれのエーテル（３×１５ｍＬ）で洗浄し、真空下、室温で乾燥させて、粗製ペプチドを得た。
【０１７３】
あるいは、ペプチド樹脂（３ｇ）を３０ｍＬの切断組成物に懸濁させ、室温で３時間撹拌した。次いで、樹脂を濾去し、ＴＦＡ（２×２．１ｍＬ）で洗浄した。切断組成物と洗浄画分をプールした。溶液を３４２ｍＬの逆溶媒に添加し、沈殿を開始させた。得られた懸濁液を、濾過用漏斗または標準の加圧濾過装置（「ポケットフィルター」）のいずれかを使用することによるペプチド沈殿物の分離の前に、さらに２時間撹拌した。濾過時間およびペプチド樹脂に対する総収率を決定した。沈殿物をそれぞれのエーテル（３×１８ｍＬ）で洗浄し、真空下、室温で乾燥させて、粗製ペプチドを得た。
【０１７４】
結果：
乾燥させたペプチド沈殿物を、分析逆相ＵＨＰＬＣによって、純度およびＴＦＡ含量について分析し、凝集物含量を、分析サイズ排除ＵＨＰＬＣによって決定した。沈殿物の外観／粘着性を、目視検査によって評価した。
【０１７５】
表２に示すように、１：３〜１：１０の範囲内のＩＰＥ／ＡＣＮの混合物を用いる沈殿によって、許容される収率および濾過時間が得られるだけでなく、純粋なエーテル逆溶媒と比較して、沈殿の純度が改善された（５〜７行と１〜３行を比較）。
逆溶媒を予め混合しなかった場合、純度を、６３．１％までさらに改善することができたが、ＡＣＮ部分とＩＰＥ部分に分け、次に、前記部分をペプチド溶液と接触させた（データは示さず）。種々の沈殿方法の比較をさらに容易にするために、性能スコアＰを、Ｐ＝Ｐ濾過時間×Ｐ純度×Ｐ収率×Ｐ外観×Ｐ凝集含量として計算した。１〜３の範囲の各サブスコアとして、最大性能スコアは２４３であり、最小スコアは１である。このメートル法で評価する場合にも、ＩＰＥ／ＡＣＮの混合物は、テストされた他の逆溶媒と比較して明らかに有利であることが分かった。
【０１７６】
【表２】
2019512273.tif 000004
【０１７７】
実施例３：ペプチド溶液の組成
さらなる実験は、リラグルチドの製造についてＥＰ−Ａ２  ７５７  １０７に開示されているＴＦＡ／チオアニソール／アニソール／ＥＤＴ（９０：５：３：２）ｖ／ｖ／ｖ／ｖから構成される切断組成物を使用する以外は、上記実施例２におけるように行った。
性能スコアの実測値１０８（３×２×３×３×２）は、ＩＰＥ／ＡＣＮ逆溶媒の有利な効果が、１つの特定のペプチド含有溶液に制限されないことを例証する。
【０１７８】
実施例４：沈殿温度
沈殿のための好ましい温度範囲を分析するために、さらなる実験を上記実施例２におけるように行った。
【０１７９】
【表３】
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【０１８０】
実施例５：比較実験
ＥＰ−Ａ２  ７５７  １０７に記載されているように、リラグルチドを、ＴＦＡ／チオアニソール／アニソール／ＥＤＴ（９０：５：３：２）ｖ／ｖ／ｖ／ｖを用いたインキュベーションにより樹脂から切断し、氷冷したジエチルエーテルを使用して沈殿させた。沈殿物を、上記実施例２におけるように分析した。
【０１８１】
【表４】
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【０１８２】
実施例５から得られた代表的な懸濁液（実験番号ＥＯＰ２６ａ）、および実施例２のＥＯＰ２２ａを、ＰａｒｔｉｃｌｅＴｒａｃｋ  Ｇ６００Ｌを使用する集束ビーム反射測定法（ＦＢＲＭ）技術によって分析した。ＦＢＲＭ技術によって、後方散乱レーザー光の検出に基づく沈殿後の粒径分布の決定が可能となる。
【０１８３】
図２に示すように、本発明の沈殿物がより大きいサイズに粒径分布をシフトされることによって特徴付けられることが見出された。ＥＰ−Ａ２  ７５７  １０７のプロトコルに従って製造された沈殿物に対する平均粒径２６１μｍと比較して、本発明に従って製造された沈殿物に対する平均粒径は４２２μｍであった。このことにより、本発明によって得られた、かなり高速な濾過を伴う濾過速度の有意差について説明される。したがって、本発明により得られた沈殿物は、それらの純度および巨視的特性の改善によってだけではく、それらのサイズ分布の点でも、先行技術に開示されたものと異なると結論付けられる。
【０１８４】
実施例６：ペプチド沈殿物の組成
上記実施例２におけるように得られた粗製リラグルチドペプチド沈殿物を、トランケートされたリラグルチド変異体について、分析逆相ＵＨＰＬＣおよび質量分析によって分析した。とりわけ、アシル化されたリラグルチドを含む、Ｎ末端でトランケートされたリラグルチド変異体［２１〜３１］を検出することができた。さらに、Ｃ末端でトランケートされた変異体リラグルチド［１〜３０］が実測された。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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