(57)【要約】  本発明は、被験者における性的感染症病原体の検出のための方法に関する。前記検出は、サンプルを精製することなく、数種類の病原体について行うことができる。前記方法は、尿サンプルに理想的である。一つの病原体は、クラミジア・トラコマティスである。
2019507606.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを精製することなく被験者における性的感染症の病原体を検出するための方法であって、
ａ）前記被験者からの尿サンプルを準備するステップと、
ｂ）前記尿サンプルに抗菌ペプチドを付加するステップと、
ｃ）放出された核酸を前記性的感染症の病原体の核酸をターゲットとするプライマーを用いるループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）によって増幅させるステップと、
ｄ）前記性的感染症病原体有機体に由来する前記核酸からシグナルを検出するステップと、
ｅ）前記シグナルが所定の値を超えている場合には、前記被験者が性的感染症病原体に感染していることを示すステップと、
を有する方法。
【請求項２】
前記尿サンプルが緩衝液で５０％超希釈される、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
合計アッセイ時間は６０分未満である、
請求項１から２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
抗菌ペプチドベースの核酸の放出は、熱処理と組み合わせられる、
請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
抗菌ペプチドベースの核酸の放出は、表面活性剤と組み合わせられる、
請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＬＡＭＰ反応はラテラルフロー・ストリップで分析される、
請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記性的感染症の病原体の前記プライマーは、クラミジア・トラコマティスに特異的な核酸を検出するように設計される、
請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記抗菌ペプチドはセクロピンである、
請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記感度は６０％超である、
請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）はＢｓｍポリメラーゼを含む、
請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
サンプル精製を行うことなく被験者におけるクラミジア・トラコマティスおよび／または淋菌を検出するためのポイント・オブ・ケア法であって、
a)前記被験者からの５０％超希釈された尿サンプルを準備するステップと、
b)セクロピン・ペプチドを前記尿サンプルに加えるステップと、
c)放出された核酸を、Ｂｓｍポリメラーゼを用いるクラミジア・トラコマティスおよび／または淋菌の核酸をターゲットとしたプライマーを用いるループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）によって増幅させるステップと、
d)ラテラルフロー・ストリップによってクラミジア・トラコマティスおよび／または淋菌に由来する核酸からシグナルを検出するステップと、
e)前記シグナルが所定の値を超えている場合には、前記被験者がクラミジア・トラコマティスおよび／または淋菌に感染していることを示すステップとを有し、
前記ポイント・オブ・ケア法は、標準設定のCobasR4800 CT/NG検査(Roche)と比較して６０％超の検出感度を有する方法。
【請求項１２】
サンプル精製を行うことなく被験者におけるクラミジア・トラコマティスおよび／または淋菌を検出するためのポイント・オブ・ケア法であって、
a)尿サンプルを準備するステップと、
b)セクロピン・ペプチドを前記尿サンプルに加え、１５分未満の間、前記ペプチドに前記細胞を溶解させるステップと、
c)ステップb)で得られた前記尿サンプルを５０％超希釈するステップと、
c)放出された核酸をＢｓｍポリメラーゼを用いるクラミジア・トラコマティスおよび／または淋菌の核酸をターゲットとしたプライマーを用いるループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）によって増幅させるステップと、
d)ラテラルフロー・ストリップによってクラミジア・トラコマティスおよび／または淋菌に由来する核酸からシグナルを検出するステップと、
e)前記シグナルが所定の値を超えている場合には、前記被験者がクラミジア・トラコマティスおよび／または淋菌に感染していることを示すステップとを有し、
前記ポイント・オブ・ケア法は、標準設定のCobasR4800 CT/NG検査(Roche)と比較して６０％超の検出感度を有する方法。
【請求項１３】
前記抗菌ペプチドベースの核酸の放出は、界面活性剤と組み合わせられる、
請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記プライマーは、配列番号５〜２８からなる群から選択される、
請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
以下に限定されるものではないがクラミジア・トラコマティスおよび／または淋菌等の性的感染症の同時検出および定量化のための部品キットであって、
ａ）以下の範囲の溶解混合物と、
０．５〜５μＭのＡＭＰ（セクロピンＰ１）
５〜５０ｍＭのＥＤＴＡ
０．１〜１０％の非イオン界面活性剤
ｂ）配列番号５〜２８を含む群または配列番号５〜２８の任意の組み合わせから選択されたヌクレオチド配列をコードする複数のヌクレオチド配列、またはその一部、または前記配列番号５〜２８と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド、および／またはループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）を介在可能なポリメラーゼを含む混合物と、
ｃ）ラテラルフロー・ストリップを含む装置と、
を備えた部品キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、事前の核酸精製を要さず粗生体試料に対して直接効率のよい核酸増幅を行い、迅速に安定して簡単に性的感染症の病原体を検出するための組成物および方法に関する。
本発明は、特に被験者における性的感染症の病原体、とりわけクラミジア・トラコマティス、淋菌、尿ベースの大腸菌等の細菌病原体を検出するための方法に関する。当該検出にはサンプルの精製を要さない。当該方法は、尿サンプルから性的感染症の細菌を検出する方法として最適化される。
【背景技術】
【０００２】
性的感染症（ＳＴＤ）は、感染症を保持する者と性交渉を行うことによって感染する。ＳＴＤの原因となるのは、細菌や寄生虫、ウィルスである。クラミジアや、淋病、性器ヘルペス、ＨＩＶ／エイズ、梅毒、トリコモナス症等、２０種類以上のＳＴＤが知られている。
クラミジア・トラコマティスは、男と女のいずれにも感染可能な、最も一般的な性的感染症である。クラミジア・トラコマティス患者の半数以上が症状をまったくあるいはほとんど自覚しないため、患者はこの感染症の感染源として機能し続ける。クラミジア・トラコマティス用の迅速な高感度検査が存在しないため、効率的にクラミジアの感染を診断することは困難である。
偏性細胞内病原体であるため、クラミジア・トラコマティスを実験室で培養することは困難である。クラミジア・トラコマティスの治療は、感染場所だけでなく、患者の年齢や症例の複雑さにも依存する。従って、さらなる長期の合併症の発生を防ぎ、淋菌やヒト免疫不全ウィルス等の他の感染症に感染する可能性を減らすためには、感染の早期の段階でクラミジア・トラコマティスを同定し、なるべく早く迅速な治療を開始することが非常に重要である。
従来の性的感染によるクラミジアの診断方法においては、以下のようなサンプル収集が行われる。即ち、男性からは、定期的に収集された尿道の標本または尿検体、女性からは頸管内の標本または膣の標本が収集される。スクリーニングを成功させ、クラミジアのさらなる感染や合併症の発生を防ぐことができるかどうかは、どれだけ感染の診断を精度よくかつ迅速に低コストで行うことができるかにかかっている。現代の実験室では、いまだに細胞培養や抗原ベースの検出などの従来の検査方法が用いられている。細胞培養法は、特異性が高いものの、感度が非常に低く、高コストで、遅く（結果が３日後でなければ得られない）、特殊なサンプル収集・収容・移送を要する。酵素免疫測定法アッセイや直接蛍光抗体法（ＤＦＡ）アッセイなどのような免疫アッセイは、細胞培養法と同様、感度および特異性が低い。したがって、診断分野におけるこれらの検査方法の使用が限定されている。
上記従来の実験室方法に代わるものとして、抗原に特有のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の検出を可能にする複数の核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）が開発された。これらの検査は、ターゲットの核酸の複製を一つ検出するだけのものであり、クラミジアの性器感染のスクリーニングおよび診断において、はるかに高い感度を有する。
クラミジア・トラコマティス検出検査には、数種類の核酸増幅ベースの検査を用いることができる： Abbott RealTime CT/NGは、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）法を用いる；Aptima COMBOは転写増幅（ＴＭＡ）法を用いる；BD ProbeTec ETは鎖置換増幅（ＳＤＡ）法を用いる；Xpert CT/NG検査およびCobas CT/NG検査はリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いる。
これらの方法にはいくつかの欠点がある。例えば、当該分野の専門知識のない個人がこれらの方法を用いることはできず、また、例えばＰＣＲ機器やサンプルを準備することなしに用いることはできない。
従って、わずかのサンプルを準備するだけでよいかまたは全くサンプルを要さず、簡単な検査設定をするだけで技術分野の専門知識をほとんどまたは全く要しないような性的感染症用の検査が必要とされている。例えばそれは市販の個人実施用検査キットである。
WO98/11259は、クラミジア・トラコマティス、淋菌、マイコプラズマ・ジェニタリウム、ウレアプラズマ・ウレアリチクムを含む複数の性的感染症の病原体を検出するために核酸増幅技術（ＮＡＡＴ）を用い、泌尿生殖器体液のサンプルを検査することを開示している。
WO2011/09588は、迅速検査によりサンプルからターゲット分子を検出するための方法および装置に関する。
WO2014/060604は、粗生体試料溶解物から直接迅速なサンプル前処理および増幅を行う方法に関する。
WO2011/038197は、細胞に溶菌酵素を施すことによりクラミジアなどを等温増幅することによりターゲットの核酸種を検出するための方法に関する。この開示によると、当該酵素が触媒反応を介して細菌細胞壁を破壊する。WO2011/038197は、当業者に、前記溶解用の代替手段を何も提供していない。
【発明の概要】
【０００３】
本発明家らによって開示されるように、セクロピン等の抗菌ペプチドは、化学反応は引き起こさないが、膜電位を介して活動し、細胞壁を貫通し、それにより壁を害し、その中に複数の孔／穴を作る。ポイント・オブ・ケア装置にはサンプル精製のための手段がなく、増幅を粗サンプル材料に適用せざるを得ないが、ターゲットとなる核酸の種を検出するためのそのような代替方法は、ポイント・オブ・ケア装置に診断を適応させる上で大きな利点を提供する。
本発明は、サンプルを精製することなく被験者における性的感染症の病原体を検出するための方法であって、
前記被験者からの尿サンプルを準備するステップと、
前記尿サンプルに抗菌ペプチドを付加するステップと、
放出された核酸を前記性的感染症の病原体の核酸をターゲットとするプライマーを用いるループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）によって増幅させるステップと、
前記性的感染症病原体有機体に由来する前記核酸からシグナルを検出するステップと、
前記シグナルが所定の値を超えている場合には、前記被験者が性的感染症病原体に感染していることを示すステップと、
を有する方法に関する。
本発明の一つの実施形態においては、前記尿サンプルが５０％超希釈される。
本発明の他の実施形態においては、合計アッセイ時間は６０分未満である。
本発明のさらなる実施形態においては、前記抗菌ペプチドベースの核酸の放出は、熱処理と組み合わせられる。
本発明のさらに他の実施形態においては、前記ＬＡＭＰ反応はラテラルフロー・ストリップで分析または表示される。
本発明のさらなる実施形態においては、前記性的感染症の病原体の前記プライマーは、クラミジア・トラコマティスに特異的な核酸を検出するように設計される。
本発明のさらに他の実施形態においては、前記抗菌ペプチドはセクロピンである。
本発明のさらなる実施形態においては、前記感度は７０％超である。
【発明を実施するための形態】
【０００４】
その最も広い局面において、本発明は性的感染症の病原体を検出するためのポイント・オブ・ケア法に関する。分子生物学的診断プラットフォームを、非常に複雑な実験室のワークフローから微小流体装置等の簡単なポイント・オブ・ケア検査装置へと移行させることは、危険性の高いプロセスである。従って、本発明の一つの実施形態では、被験者が、実際に自分自身が感染しているか否かを示すことができるように、初期段階での表示（indication）を可能にする。
【０００５】
本発明の一つの実施形態では、前記表示（indication）は信頼のおける診断である。
【０００６】
本発明は、検査精度を改善し、標本管理を簡単なものにし、標本管理を便利なものにし、性的に活発な男女のスクリーニングを簡単なものにする手段を提供する。
【０００７】
本発明は、実験室の外で実施可能な、簡単な表示（indication）または診断を行うための手段を提供する。
【０００８】
本発明は、個人に対して医学的配慮を求めるべきか否かを示す、個人実施用検査キットである。
【０００９】
実施例の記載において、本発明者らは、２１分以内に、１反応につき少なくとも５つのクラミジア・トラコマティス病原体（２５個の潜在プラスミドコピー）を尿サンプルから検出可能な、ＬＡＭＰ（ループ介在等温増幅）に基づく迅速かつ精度の高いアッセイを提示する。また、側方流動（ＬＦ）片を用いて反応生成物を検出することが可能である。これはポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）設定への適用に非常に役立つものである。
【００１０】
臨床データによると、前記アッセイの特異性は１００％であり、感度は７３％であった。信頼のおける診断ポイント・オブ・ケア法を提供するためには、そのような高いパーセンテージのレベルが必要であり、それには重要な検査が必要であるため、当業者にとってそれは大きな課題となる。なぜなら、ＰＯＣ検査法は、例えば訓練されたスタッフや洗練された装置に頼ることはできないからである。
【００１１】
加えて、本アッセイは、尿サンプル内に存在する可能性のある３０種を超える病原体のＤＮＡとの交差反応を引き起こすことはない。
【００１２】
さらに、本アッセイは、増幅に先立つ臨床サンプルからのＤＮＡの精製および抽出を要さない。従って、専用装置の必要がなくなる。
【００１３】
本アッセイは、尿サンプルから直接クラミジア・トラコマティスを検出することを可能にするため、迅速で精度が高く、指示を与える必要がほとんどない診断法を提供する。プライマー以外全て同じであるアッセイ条件は、尿サンプルから直接淋菌を検出することを可能にするため、迅速で精度が高く、指示を与える必要がほとんどない診断法を提供する。
【００１４】
これにより、全体の手順は、著しく労力が省かれ、時間が節約され、その結果感染症の早期の検出および同定を低コストで行うことが可能になる。
【００１５】
上記の全ては、低コストのポイント・オブ・ケア法によってかかる診断アッセイを実行するために開発が必要なものであり、危険性が高くても必要なものである。
【００１６】
クラミジア・トラコマティスおよび淋菌に特化した本ＬＡＭＰアッセイは、そのユーザーインターフェースに対して、それが簡単に実行可能となるように最適化されるため、様々なポイント・オブ・ケア設定に適用することが可能となる。
【００１７】
従って、一つの局面において、本発明は、尿サンプル内の病原体から核酸を放出するために、病原体に特異的な抗菌薬によって尿サンプルを処理し、その後で病原体の存在を検出する方法に関する。
【００１８】
本発明の一つの局面は、以下に関する。即ち、サンプルを精製することなく被験者における性的感染症の病原体を検出するための方法であって、前記被験者からの尿サンプルを準備するステップと、前記尿サンプルに抗菌ペプチドを付加するステップと、放出された核酸を前記性的感染症の病原体の核酸をターゲットとするプライマーを用いるＬＡＭＰ（ループ介在等温増幅）によって増幅させるステップと、前記性的感染症病原体有機体に由来する前記核酸からシグナルを検出するステップと、前記シグナルが所定の値を超えている場合には、前記被験者が性的感染症病原体に感染していることを示すステップとを有する方法。この方法は、速度（６０分未満）、効率（感度６０％超、特異性９５％超）、有用性（洗練された機器や医学的訓練を要さない）などの装置要件が満たされているポイント・オブ・ケア検査装置であれば、簡単に適用可能である。
【００１９】
本発明の一つの実施形態は、以下に関する。即ち、被験者における性的感染症の病原体を検出するための方法であって、a)前記被験者から尿サンプルを準備することと、b)それ以上核酸の精製が適用されないという条件で前記尿サンプル内の前記細胞から核酸を放出するために前記尿サンプルに抗菌ペプチドを付加することと、c)放出された核酸を前記性的感染症の病原体の核酸をターゲットとするプライマーを用いるＬＡＭＰ（ループ介在等温増幅）によって増幅させることと、d)前記性的感染症病原体有機体に由来する前記量の核酸を検出することとを有し、それにより前記被験者が性的感染症病原体に感染している尤度を示す方法。
本発明の他の実施形態は、以下に関する。即ち、被験者における性的感染症の病原体の存在を判定するための方法であって、a)前記被験者から得られた尿サンプル内の細胞から核酸を放出するために前記尿サンプルに抗菌ペプチドを接触させることと、b)前記病原体の細胞から放出された非精製核酸を公知の性的感染症病原体の核酸からのプライマーを含むＬＡＭＰ（ループ介在等温増幅）によって増幅させることと、c)前記放出された核酸の増幅を検出することにより、前記尿サンプルにおける前記性的感染症病原体の存在を判定することとを有する方法。
【００２０】
本発明の他の実施形態は、以下に関する。即ち、被験者における性的感染症の病原体の存在を判定するための方法であって、a)前記被験者から得られた尿サンプルに抗菌ペプチドを接触させることと、b)前記病原体の細胞から放出された非精製核酸を無性的感染症の核酸をターゲットとしたプライマーを含むＬＡＭＰ（ループ介在等温増幅）によって増幅させることと、c)前記性的感染症の病原体からの前記核酸の増幅を検出することにより、前記尿における前記性的感染症病原体の存在を判定することとを有する方法。
【００２１】
本発明の現在好ましい局面は、以下に関する。即ち、サンプル精製を行うことなく被験者におけるクラミジア・トラコマティスを検出するためのポイント・オブ・ケア法であって、a)前記被験者からの５０％超希釈された尿サンプルを準備するステップと、b)セクロピン・ペプチドを前記尿サンプルに加えるステップと、c)放出された核酸をＢｓｍポリメラーゼを用いるクラミジア・トラコマティスの核酸をターゲットとしたプライマーを用いるＬＡＭＰ（ループ介在等温増幅）によって増幅させるステップと、d)ラテラルフロー・ストリップによってクラミジア・トラコマティスに由来する核酸からシグナルを検出するステップと、e)前記シグナルが所定の値を超えている場合には、前記被験者がクラミジア・トラコマティスに感染していることを示すステップとを有し、前記ポイント・オブ・ケア法は、標準設定のCobasR4800  CT/NG検査(Roche)と比較して６０％超の検出感度を有する方法。
【００２２】
本発明の他の現在好ましい局面は、以下に関する。即ち、サンプル精製を行うことなく被験者における淋菌を検出するためのポイント・オブ・ケア法であって、a)前記被験者からの５０％超希釈された尿サンプルを準備するステップと、b)セクロピン・ペプチドを前記尿サンプルに加えるステップと、c)放出された核酸をＢｓｍポリメラーゼを用いるクラミジア・トラコマティスの核酸をターゲットとしたプライマーを用いるＬＡＭＰ（ループ介在等温増幅）によって増幅させるステップと、d)ラテラルフロー・ストリップによってクラミジア・トラコマティスに由来する核酸からシグナルを検出するステップと、e)前記シグナルが所定の値を超えている場合には、前記被験者がクラミジア・トラコマティスに感染していることを示すステップとを有し、前記ポイント・オブ・ケア法は、ＰＣＲベースの標準設定と比較して６０％超の検出感度を有する方法。
【００２３】
本発明の他の現在好ましい局面は、以下に関する。即ち、サンプル精製を行うことなく被験者におけるクラミジア・トラコマティスおよび／または淋菌を検出するためのポイント・オブ・ケア法であって、a)尿サンプルを準備するステップと、b)セクロピン・ペプチドを前記尿サンプルに加え、１５分未満の間、前記ペプチドに前記細胞を溶解させるステップと、c)ステップb)で得られた前記尿サンプルを５０％超希釈するステップと、d)放出された核酸をＢｓｍポリメラーゼを用いるクラミジア・トラコマティスおよび／または淋菌の核酸をターゲットとしたプライマーを用いるＬＡＭＰ（ループ介在等温増幅）によって増幅させるステップと、e)ラテラルフロー・ストリップによってクラミジア・トラコマティスおよび／または淋菌に由来する核酸からシグナルを検出するステップと、f)前記シグナルが所定の値を超えている場合には、前記被験者がクラミジア・トラコマティスおよび／または淋菌に感染していることを示すステップとを有し、前記ポイント・オブ・ケア法は、標準設定のCobasR4800  CT/NG検査(Roche)と比較して６０％超の検出感度を有する方法。
【００２４】
・性的感染症の細菌
性的感染症(sexually  transmitted  infections:STI)は、sexually  transmitted  diseases  (STD)や梅毒(venereal  diseases:VD)とも呼ばれ、通常性行為によって広まる感染症である。
ほとんどのＳＴＩは、初期段階において症状が現れない。これにより、病気を他人に感染させるリスクがより高くなる。本発明は、簡単に迅速に確実に性的感染症の病原体を検出する検査を提供することによりＳＴＩを他人に感染させるリスクを減少させる。
【００２５】
本説明では、ＳＴＩ、ＳＴＤ、ＶＤ、性感染病原体（ＳＴＰ）という用語は置換可能に用いられ、これらは尿路感染（ＵＴＩ）も含む。
【００２６】
ＳＴＩを引き起こす可能性のある細菌やウィルス、寄生虫は、３０種類を超える。細菌性のＳＴＩにはクラミジア、淋菌、梅毒などがある。
【００２７】
文書化されていない、または研究の進んでいない細菌や原虫、菌類、ウィルスの種が数多く存在する。それにも関わらず、性交渉による病原菌の感染は、上記をはるかに超える。性交渉による感染経路は、通常の経路とはみなされず、かつ／または前記病原菌それ自体が疾患に関する大きな調査研究に含意されていないため、以下に示す病原体は、性感染症クリニックでスクリーニングすることはできない。
【００２８】
性感染することが知られている（が一般的にＳＴＤ／ＳＴＩとは考えられない）病原菌には、マールブルグ熱やＨＴＬＶ（タイプ１およびタイプ２）がある。
【００２９】
一つの実施形態において、本発明は、特定の時点において尿中に存在するおよび／または尿道を占拠する特定の病原体に関する。
【００３０】
現在好ましい実施形態において、前記病原体は細菌である。
【００３１】
他の実施形態において、前記病原体はグラム陰性菌である。
【００３２】
一つの実施形態において、前記細菌は、軟性下疳菌、クラミジア・トラコマティス、淋菌、クレブシエラ・グラニュロマティス、マイコプラズマ・ジェニタリウム、マイコプラズマ・ホミニス、梅毒トレポネーマ、ウレアプラズマ・パルバムからなる群から選択される。
【００３３】
他の実施形態において、前記細菌は、クラミジア・トラコマティス、淋菌、尿ベースの大腸菌、マイコプラズマ・ジェニタリウムからなる群から選択される。
【００３４】
・クラミジア
本発明の一つの実施形態において、前記性感染病原体は、クラミジア・トラコマティスである。
【００３５】
クラミジア感染は、人間における一般的な性的感染である。「クラミジア感染」という用語は、クラミジア科の細菌に属する特定の種によって引き起こされる感染を意味することもある。
【００３６】
クラミジア・トラコマティスは、人間の中にだけ発見される。クラミジアは、人間の性器と目に関する病気の感染における大きな要因となっている。
【００３７】
ほとんどの場合、クラミジア感染は無症状性であるため、長い間治療されずに放置される可能性がある。
【００３８】
クラミジア・トラコマティスは、人間のグラム陰性の偏性細胞病原体である。クラミジア・トラコマティス株は、主要な外膜タンパク質の抗原性変異に基づき、血清学上１５の血清型に分類される。血清型Ａ〜Ｃは、眼トラコーマを引き起こす眼病原体である。血清型Ｄ〜Ｋおよび性病性リンパ肉芽腫血清型Ｌ１〜Ｌ２は、生殖管の柱状上皮細胞に感染する性感染病原体である。
【００３９】
本発明の一つの実施形態において、前記性感染病原体は、血清型Ｄ〜Ｋおよび性病性リンパ肉芽腫血清型Ｌ１〜Ｌ２を有するクラミジア・トラコマティスである。
本発明は、感染を引き起こす前記血清学的株を検出することにより高精度の判定と診断、そしてそれに続く治療を可能にするものである。
【００４０】
本発明の他の実施形態において、前記性感染病原体は、クラミジア科に属する細菌である。
【００４１】
クラミジアは、女性の間に「密かに蔓延するもの」として知られている。クラミジアは、７０％〜８０％のケースで症状を発生させない可能性があり、発見されるまで何か月も何年も潜んでいることがある。本発明は、クラミジア菌に感染していることに気が付いておらず、従って医学的配慮を求めていない個人に、発見の手段を提供する。
【００４２】
・淋病
淋病は、淋菌感染症や、淋菌性尿道炎、淋毒（gonorrhoea、the  clap）としても知られ、淋菌によって引き起こされる性的感染症である。
【００４３】
淋菌は、コーヒー豆の形をした、グラム陰性の双球菌と呼ばれる細菌である。
【００４４】
本発明の一つの実施形態において、前記性感染病原体は、淋菌である。
【００４５】
淋菌に対するＰＣＲベースの検査の実施は、比較的高レベルの訓練と複雑な熱サイクルマシンを必要とするため、実験室の外で気軽に行うことのできるものではない。
【００４６】
しかし、上記の通り、本発明は、淋菌に感染していることに気が付いておらず、従って医学的配慮を求めていない個人に、淋病発見の手段を提供するものである。
【００４７】
しかし、淋病用の適切なプライマー・セットを選択することは簡単なことではない。検出に適したターゲット領域は、往々にして他の対象外のナイセリア種との交差反応を引き起こすことがある。このデータは実施例７に見ることができる。本実施例７においては、１６Ｓ  ｒＲＮＡ領域用に開発されたプライマー・セットが、ナイセリア・シネレア、ナイセリア・フラバ、髄膜炎菌（血清学的グループB）、髄膜炎菌（血清学的グループY）、ナイセリア・ラクタミカ、ナイセリア・ペルフラバ等の他のナイセリア種との交差反応（透視診断における偽陽性結果）を引き起こした。２０８６領域用に開発されたプライマー・セットは、尿中には滅多に発見されることのないナイセリア・ラクタミカとのみ交差反応を引き起こすが、それは口腔性交後の所定の時間枠においてのみであると推定される。
【００４８】
・尿ベースの大腸菌
本発明の一つの実施形態において、前記病原体は尿ベースの大腸菌である。
【００４９】
大腸菌は、温血器官（内温動物）のより低い腸によく発見される、グラム陰性で棒状の細菌である。腸管病原性大腸菌（enteropathogenic  E.  coli,  EPEC）、志賀毒素産生大腸菌（STEC,  Shigella/腸管侵入性大腸菌enteroinvasive  E.  coli,  EIEC)、腸管凝集接着性大腸菌（enteroaggregative  E.  coli,  EAEC）、分散接着性大腸菌（diffusely  adherent  E.  coli,  DAEC）、腸管毒素原性大腸菌（enterotoxigenic E. coli, ETEC）、および接着性侵入性大腸菌（adherent invasive E. coli, AIEC)は、病原性である。ただし、これらに限定されるものではない。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態の目的は、感染を引き起こす大腸菌種を尿サンプルから検出することができることである。本発明は、上記大腸菌のいずれかによって引き起こされた尿路感染症（ＵＴＩ）の種特異的な発生源を検出することができる。
【００５１】
老人および幼児に現れるＵＴＩの兆候は、あいまいであるかまたは非特異的である。両種類の主な起因物質は大腸菌であるが、ＵＴＩはクラミジアや淋菌等の他の細菌によっても引き起こされる。
【００５２】
一つの実施形態において、本発明の方法は、尿路感染症が、大腸菌とクラミジア・トラコマティスと淋菌とのいずれ（の組み合わせ）によって引き起こされたものであるかを識別可能である。上記３つの尿路感染症の主要因の迅速な識別は、本発明の利点である。
【００５３】
・尿サンプル
ここで用いられる「サンプル」は、尿サンプル（尿サンプルから抽出されたサンプルを含む）、頸管内の標本、膣の標本、尿道の標本、および直腸の標本を含む。
【００５４】
また、サンプルという用語は、例えば、標本がその中に浸された緩衝液、緩衝液が加えられた尿サンプル等の、上記サンプルを希釈したものまたは中和したものを含む。
【００５５】
現在好ましい実施形態において、上記サンプルは尿サンプルである。
【００５６】
サンプルの採取は、医療専門家の介入なしに被験者自身で行うことができる。本発明の方法に対応して採取される尿サンプルは、様々な時点に採取可能であり、様々なサイズとすることができる。
【００５７】
前記サンプルは、一番通過尿（一番取り尿とも言う）から採取されることが好ましい。なぜなら、被験者から排出される尿におけるこの部分の尿は、中間の尿によって薄められておらず、尿道から得られる中で最も濃度の高い病原体を含んでいる可能性があるからである。
【００５８】
通常、最良のサンプルは朝一番に排出される尿である。なぜならそれはより多くの病原体または細菌を含んでいるからである。
【００５９】
前記サンプルは、新鮮なものかまたは冷凍したものとすることができる。
【００６０】
新鮮な尿については、一番取り尿を採取して速やかに用いることが好ましい。
【００６１】
または、それらを保存することもできるが、室温で２時間を超えないことが好ましい、または＋４℃で２４時間を超えないことが好ましい。
【００６２】
保存された尿サンプルは、ヌクレアーゼによるＤＮＡ分解を避けるために、１０ｍＭのＥＤＴＡを用いて事前になるべく早く処理することが好ましい。
【００６３】
または、サンプルを後で使用するために冷凍サンプルとして、−２０℃以下で保存することもできる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、尿道の標本サンプルや、膣の標本サンプル、頸管内の標本サンプルについても同様の結果が得られる。
【００６５】
・尿サンプルの希釈
ここに提供されるいくつかの例は、増幅工程において特異なポリメラーゼにターゲットを増幅させるために、尿サンプルの希釈が重要となる可能性があることを示す。
【００６６】
本発明が提供するデータによると、例えば、ＬＡＭＰ法におけるＢｓｍポリメラーゼは、反応速度に影響を及ぼすことなく、従って感度に影響を及ぼすことなく、感度反応混合物における尿の２０％まで優に耐えることができる。
【００６７】
図５Ｂに示されるように、少量（５〜１０％）の尿は、純水と比較してポリメラーゼを活性化しさえする。これは、反応速度について、１０％の尿が絶対適正であることを示唆している。１５％を超える量の尿は、指数関数的に著しく重合反応を減少させ始める。提供されたデータを、ＴRが結果として得られる相対時間を表し、Ｕ%が尿中心量を表すときの検出力関数
【数１】
2019507606.tif 000003
にあてはめて外挿すると、尿濃度が５０％を超えると反応時間が２時間を超えるという結果が得られる。これはポイント・オブ・ケア法への適用にもはや適さない値である。一般的に、ポイント・オブ・ケア法の適用・装置においては、１時間未満の応答時間が期待される。
【００６８】
尿濃度が高くなるにつれて、増幅反応時間も長くなるはずである。そうでないと、反応の対数期にまだ達していないかまたは反応の対数期がまだ終わっていないという事実のために感度の鈍化が発生し、検出するのに十分な反応産物（単位複製配列）が得られなくなるであろう。
【００６９】
例えば、所定の反応時間が２５分で、尿の量が２０％である場合、反応は十分なレベルには達しない。その場合、単位複製配列が得られず、それは陰性のサンプルであると誤って解釈され、その結果は感度全体に影響を及ぼす。従って、現在好ましい実施形態において、増幅は、希釈尿、好ましくは５０％超希釈された尿、に耐えられるポリメラーゼによって提供される。
【００７０】
従って、本発明は、ターゲットとなる配列の増幅に先立ち緩衝液で５０％超希釈された、例えば５５％超希釈された、６０％超希釈された、６５％超希釈された、７０％超希釈された、７５％超希釈された、８０％超希釈された、８５％超希釈された、９０％超希釈された、または９５％超希釈された尿サンプルに関する。ただし、これらに限定されるものではない。
【００７１】
・増幅工程
ここに記載されるＬＡＭＰ（ループ介在等温増幅）は、その簡便な操作性や１時間でごく少量の病原体遺伝物質を診断できる能力の故に、新規で、高い感度を有し、特異性のある診断ツールとして際立っている。
【００７２】
本発明のＬＡＭＰ法は、広く用いられているＰＣＲ法に対していくつかの利点を有する。
【００７３】
本発明のＬＡＭＰ法は、定温（典型的には５５〜６５℃）で実行され、サーマルサイクラーを要さない。実施例に示されているように、典型的な温度は、５５〜６５℃や５８〜６３℃のように６０℃付近である。いくつかの実施形態において、前記温度は、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃および／または６５℃である。
【００７４】
本発明のＬＡＭＰ法は、４〜６種類のプライマー（innerプライマー２種類、outerプライマー２種類および／または追加のループ・プライマー２種類）と、ターゲットとなる遺伝子配列上の６つの明瞭な領域を識別するために鎖置換能を有するポリメラーゼとを用いる。これにより、ループ領域を含む増幅産物が生成され、温度変性を伴わないプライマーの結合が可能となる。ループ・プライマーを追加することにより、増幅は著しく加速され、それにより感度は高まり、反応時間は短縮される。
【００７５】
本発明のＬＡＭＰ反応の終了時点におけるＤＮＡ生産物の量は、ＰＣＲ法におけるそれよりはるかに多く、また、サイバーグリーン、臭化エチジウム、ピコグリーン、ヨウ化プロピジウム、ヒドロキシナフトールブルーなどのＤＮＡ結合色素またはカルセインを用いることにより簡単に視覚化することができる。
【００７６】
選択されるプライマーによっては、ＤＮＡばかりでなく、ＲＮＡも増幅することができる。従って、本発明では、抗原に特有のＲＮＡでさえもターゲットにすることが可能である。
【００７７】
・ポリメラーゼ
本発明のＬＡＭＰ法は、高い温度（通常５５〜６５℃の間）を用いるため、好熱性ＤＮＡポリメラーゼが必要とされる。これらのポリメラーゼは強い鎖置換能を有していなければならない。これらのポリメラーゼはＰＣＲ法での使用には適していない。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの全てが尿分析に適しているわけではない。
【００７８】
尿分析においては、尿マトリックス効果による活性喪失が最小限であるポリメラーゼを用いることが重要である。図９は、様々な種類のポリメラーゼ間の尿耐性の比較を示している。特に、ＯｍｉＡｍｐポリメラーゼ、Ｔｉｎポリメラーゼ、ＳＤポリメラーゼは、低レベルの尿で活性を完全に喪失してしまう。本研究における他のポリメラーゼは、１０％以上の尿レベルで著しく活性を喪失し始める。Ｂｓｍポリメラーゼが最も高い尿耐性を有する。
【００７９】
本発明家らは数多くのポリメラーゼを再検討した。図５ＡにＢｓｔポリメラーゼの尿耐性を示し、図５ＢにＢｓｍポリメラーゼの耐性を示す。
少量の尿はＢｓｍポリメラーゼの活性を強めさえするため、Ｂｓｍポリメラーゼは尿分析に非常に適している。
【００８０】
本発明の現在好ましい実施形態において、ＬＡＭＰ法に用いられるポリメラーゼはＢｓｍポリメラーゼである。この場合、Ｂｓｍポリメラーゼは、５’→３’ＤＮＡ合成に触媒作用を及ぼし、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性に欠けていて、バチルス・スミシイに属するＤＮＡポリメラーゼである。
【００８１】
他の実施形態において、Ｂｓｍポリメラーゼは、Ｂｓｍポリメラーゼ・ラージフラグメントである。この場合、Ｂｓｍポリメラーゼ・ラージフラグメントは、５’→３’ＤＮＡ合成に触媒作用を及ぼし、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性に欠けていて、バチルス・スミシイに属するＤＮＡポリメラーゼの一部である。Ｂｓｍポリメラーゼ・ラージフラグメントは、強い鎖置換能を有しており、３０℃〜６３℃という広い温度範囲で活発であり、最適な活性は６０℃である。Ｂｓｍポリメラーゼ・ラージフラグメントは、Ｂｓｔポリメラーゼ・ラージフラグメントと機能的に類似した酵素であり、ほとんどの適用においてそれと置換可能である。
【００８２】
・抗菌ペプチド
抗菌ペプチド（ＡＭＰ）は、独特かつ多様な分子群であり、アミノ酸組成および構造に基づいて亜群に分けられる。現在、ネブラスカ大学医療センターの抗菌ペプチドデータベースには、合成由来および天然由来の、様々な器官から分離された２５００を超えるＡＭＰの説明が入っている。
【００８３】
本発明の抗菌ペプチドの重要な特徴は、病原体から核酸を放出させ、サンプル・マトリックスによって引き起こされる抑制効果を抑圧する能力である。通常そのようなペプチドは、細胞膜を破壊し、溶解を引き起こす。この放出により、細菌または病原体の存在のよりよくより簡単な検出が可能になる。ほとんどのペプチドにおける効率的な溶解濃度は５〜１００μＭの範囲内にある。しかし、前記効率的な溶解濃度は、ペプチドおよびターゲットとなる病原体に対応して高くなっても低くなってもよい。
【００８４】
本発明の例に示されるように、抗菌ペプチドを用いた尿サンプルの前処理により、熱およびアルカリによるサンプルの準備に比べて６倍増量のターゲットＤＮＡが得られた（図６）。従って、本発明の新しいサンプル前処理法は、方法をＰＯＣに適応させるために必要な下流増幅アプリケーションによく適している。
【００８５】
高濃度のペプチドの使用により、例えば純水（ＭＱ）などの理想とする条件と比較し、ある程度まで増幅反応が抑制される（図８）。これはペプチドの使用に伴う欠点である。しかし、全てのペプチドが等しい効果を有しているわけではない。現在のペプチドの選択の中で、セクロピンＰ１は最も低い抑制効果を有しているため、ここに記載されるアプリケーションに対して最も高い潜在可能性を有する。正しい使用濃度は、サンプル・マトリックス効果を考慮に入れて平衡を保つ必要がある。図６に示されるように、尿サンプル型、特にセクロピンＰ１は、純尿サンプルに比較して増強効果さえも有する。この効果は、ペプチドの第２の性質である反抑制効果によって説明がつく。即ち、溶解効果に加え、ペプチドは、本物のサンプルにおいて、抑制物質を中和している。
【００８６】
ペプチドの中にはＬＡＭＰ反応などの下流アプリケーションに対する抑制効果を持つものも存在するため、本発明家は、高すぎるペプチド濃度を用いないことを推奨する。従って、現在好ましい実施形態において、ＡＭＰ濃度は、希釈されていない尿サンプルにおいて１〜１００μＭの抗菌ペプチドの範囲内にあり、例えば、１〜９０μＭの抗菌ペプチド、１０〜８０μＭの抗菌ペプチド、１５〜５０μＭの抗菌ペプチド、２０〜４０μＭの抗菌ペプチド、および／または３０〜４０μＭの抗菌ペプチドの範囲内にある。ただし、これらに限定されるものではない。
【００８７】
ほとんどのＡＭＰは、膜活性特性を有しており、細孔のような構造を形成して膜を浸透性にするもの（マストポラン、メリチン、ボンボリチン、マガイニン）またはカーペットモデルの中で活動して微生物膜を破壊するもの（セクロピン）などがある。
【００８８】
マガイニンは、トロイド状の細孔を形成することにより細胞膜を透過性にすると考えられる。推奨されるセクロピンの活性構造には、静電吸着によるペプチドの初期結合が含まれる。これらのＡＭＰは、細孔を形成する細胞膜の脂質部分と相互作用することが示唆される。
【００８９】
一つの実施形態において、本発明はリニアカチオン性αヘリックス・ペプチドを有するＡＭＰに関する。
【００９０】
他の実施形態において、本発明はシステインを欠くＡＭＰに関する。
【００９１】
本発明の方法で用いられる抗菌ペプチドは、天然抗菌ペプチドまたは合成抗菌ペプチドである。
【００９２】
一つの実施形態において、本発明の抗菌ペプチドは、セクロピン、マストポラン、マガイニン、メリチン、およびボンボリチンからなる群から選択される。
【００９３】
一つの実施形態において、前記抗菌ペプチドは、マストポラン、マガイニン、メリチン、およびボンボリチンからなる群から選択される。
現在好ましい実施形態において、前記抗菌ペプチドは、セクロピンである。関連性のある溶解効果を示す他のペプチドもあるものの（図４、ＡＭＰ５．０２はセクロピンＰ１を表す）、図６に示されるように、それらはＬＡＭＰ反応に対する著しい抑制効果も有する。
【００９４】
・セクロピン
セクロピンは、グラム陽性の細菌とグラム陰性の細菌の両方に対して活発な、典型的には約３１〜３７のアミノ酸残基の小さなタンパク質である。
【００９５】
セクロピアサン（Hyalophora cecropia：セクロピア蛾）以外の昆虫から分離されたセクロピアには、bactericidin, lepidopteran, sarcotoxin等の様々な名前が付けられている。これらのペプチドは全て構造的に関連性を有する。
【００９６】
Sus scrofa（豚）から分離される腸抗菌ペプチドであるセクロピンＰ１もまた、この科に属する。
【００９７】
セクロピン科はセクロピンＡおよびセクロピンＢも含む。
【００９８】
セクロピンは、膜透過性の損傷を通して幅広い種類の細菌に対する抗菌活性を有する。
【００９９】
本発明の一つの実施形態において、セクロピンは、変更が加えられたものであってもよく、または派生物であってもよい。
【０１００】
一つの現在好ましい実施形態において、ＡＭＰはセクロピンである。
【０１０１】
本発明家らは、２種類の抗菌ペプチドセクロピン（Ｐ１およびＳＢ−３７）について検査を行い、それらの両方においてＤＮＡレベルは著しく増加した。ＳＢ−３７はターゲットとなるＤＮＡに対して平均で２倍の増加が得られた。セクロピンＢ類似体ＳＢ−３７のペプチド配列は、
ＭＰＫＷＫＶＦＫＫＩＥＫＶＧＲＮＩＲＮＧＩＶＫＡＧＰＡＩＡＶＬＧＥＡＫＡＬＧ
である。
【０１０２】
セクロピンＰ１は、全ての検査処理の中で最も効率がよく、等温増幅法で生成されるＤＮＡにおいて平均で６倍の増加が得られた。従って、一つの特に好ましい実施形態において、前記セクロピンは、セクロピンＰ１である。セクロピンＰ１のペプチド配列は、
ＳＷＬＳＫＴＡＫＫＬＥＮＳＡＫＫＲＩＳＥＧＩＡＩＡＩＱＧＧＰＲ
である。
【０１０３】
他の抗菌ペプチドを用いたサンプル前処理では、等温増幅効率における著しい増加は見られなかったものの、まだ有効性は示している。等温増幅効率における増加の欠如は、メリチンおよびボンボリチンIIIにおける非効率的な溶解、またはマガイニングループのペプチド（ＭＳＩ−７８およびＭＳＩ−５８４）における増幅の抑制に帰することができると思われる。
配列番号１
ＭＰＫＷＫＶＦＫＫＩＥＫＶＧＲＮＩＲＮＧＩＶＫＡＧＰＡＩＡＶＬＧＥＡＫＡＬＧ
セクロピア蛾
セクロピンＳＢ３７
配列番号２
ＳＷＬＳＫＴＡＫＫＬＥＮＳＡＫＫＲＩＳＥＧＩＡＩＡＩＱＧＧＰＲ
豚回虫
セクロピンＰ１
【０１０４】
・メリチン
メリチンは、ミツバチ毒の主要なペプチド成分である。それは哺乳類の細胞に対する強力な溶血性活性および細胞溶解活性を示すだけでなく、広範な抗菌特性、抗真菌特性、抗ウィルス特性、および抗原虫特性を備えている。
【０１０５】
メリチンは、細孔構造を形成する細胞膜の中に入り込み、細胞の浸透性の深刻な損傷と、それに続く細胞死をもたらす。
【０１０６】
一つの実施形態において、前記ＡＭＰはメリチンである。
【０１０７】
・ボンボリチン
ボンボリチンは、ミツバチ毒に含まれる最も豊富な成分であり、その構造および生物学的特性をメリチンと共有している。ボンボリチンは、グラム陽性の細菌とグラム陰性の細菌に対して広範囲な活性を有するとともに、植物病原性真菌、赤血球、顆粒細胞およびリポソームに対しても広範囲な活性を有する。
一つの実施形態において、前記ＡＭＰはボンボリチンである。
【０１０８】
・マガイニン
マガイニンは、当初、アフリカツメガエルというカエルの皮膚から分離された。マガイニン類似体ＭＳＩ−７８およびＭＳＩ５９４は、従来の抗生物質に耐性を有する菌株を含む数多くの細菌菌株に対して活発な、非常に強力なＡＭＰである。
【０１０９】
一つの実施形態において、前記ＡＭＰはマガイニンである。
【０１１０】
・溶解混合物（カクテル）
（処理済み）尿の中に、以下に示す範囲で開発溶解混合物（カクテル）が含まれたものを用いる：
０．５〜５μＭのＡＭＰ（セクロピンＰ１など）
５〜５０ｍＭのＥＤＴＡ
０．１〜１０％の非イオン性界面活性剤
【０１１１】
前記溶解カクテルは、グラム陰性の細菌（特にクラミジア・トラコマティスおよび淋菌）を溶解する抗菌ペプチド（好ましくはセクロピンＰ１）と、エンドヌクレアーゼの抑制のために重要なＥＤＴＡと、哺乳類の宿主細胞の溶解のために重要な、特に細胞内寄生であるクラミジア・トラコマティスの溶解のために重要な非イオン性界面活性剤とからなる。前記例において、本発明家はTriton X-100を用いた。しかし、親水性のポリエチレンオキシド鎖と、芳香族炭化水素親油性グループまたは芳香族炭化水素親水性グループとを有する他の非イオン性界面活性剤でもよい。
【０１１２】
上記の濃度は、本発明の希釈尿サンプルについて計算されたものである。
【０１１３】
各成分の濃度は、サンプルタイプおよび希釈率ごとに変更することで平衡を保つことができる。例えば、細胞物質の接触が高いサンプルでは、高い溶解率と抑制抑圧成分とが必要であり、従って、高い希釈率が必要となる可能性がある。
【０１１４】
・核酸精製
本発明の方法は、核酸精製を必要としない。ここに開示される方法が、増幅に先立つ精製や臨床サンプルからのＤＮＡの抽出を必要としないという事実により、専用装置は不要になる。これにより、全体の手順は、著しく労力が省かれ、時間が節約され、その結果早期の検出および同定を低コストで行うことが可能になる。
【０１１５】
従って、本発明の一つの実施形態において、核酸精製は実施されない。
【０１１６】
しかし、ろ過または濃度の増加は、簡単な手段で行うことができ、所定の実施形態において、ろ過または濃度の増加は感度の増加に関わっている。そのような実施形態では、ターゲットとなるＤＮＡの量の事前濃縮を介して感度が高められるため、アッセイＬＯＤ（limit of detection:検出限界）未満のＤＮＡを有するサンプルが検出され、偽陰性とは判定されない。
【０１１７】
・プライマー
本発明の方法に用いられるプライマーは、検査対象の細菌に特異的な種となるように設計される。プライマーは、例えば、どのような結果が望まれるかに応じて、細菌の種または属に特異的なものとすることができる。
【０１１８】
一つの実施形態において、プライマーは、クラミジア属に特異的な核酸を検出するように設計される。
【０１１９】
他の実施形態において、プライマーは、クラミジア・トラコマティス種に特異的な核酸を検出するように設計される。
【０１２０】
現在好ましい実施形態において、クラミジア・トラコマティス・プライマーは、表Ｓ１に列挙されたＬＡＭＰプライマーである。
【０１２１】
一つの実施形態において、プライマーは、表１〜３に示される淋菌に特異的な核酸を検出するように設計される。
【０１２２】
さらなる実施形態において、プライマーは、大腸に特異的な核酸を検出するように設計される。
【０１２３】
また、多病原体プライマー・セットを用いる同じサンプルにおいて、数種類の細菌を同時に検出することも可能である。この場合、前記アッセイは多重アッセイである。
【０１２４】
プライマー・セットの中には、事前の増幅を行うことなしにラテラルフロー・ストリップに非特異的シグナルを付与することができるものもある（おそらくはヘテロ二量体の形成の故に）。これらのプライマー・セットは、ラテラルフロー・ストリップの検出が増幅の後に行われる場合には、使用を避ける必要がある。
【０１２５】
本発明の現在好ましいプライマーは以下の通りである。
配列番号５
ＡＡＴＡＴＣＡＴＣＴＴＴＧＣＧＧＴＴＧＣ
クラミジア・トラコマティス
ＣＴ・ＬＡＭＰプライマーＦ３
配列番号６
ＴＣＴＡＣＡＡＧＡＧＴＡＣＡＴＣＧＧＴＣＡ
クラミジア・トラコマティス
ＣＴ・ＬＡＭＰプライマーＢ３
配列番号７
ＴＣＧＡＧＣＡＡＣＣＧＣＴＧＴＧＡＣＧＡＣＣＴＴＣＡＴＴＡＴＧＴＣＧＧＡＧＴＣ
クラミジア・トラコマティス
ＣＴ・ＬＡＭＰプライマーＦＩＰ
配列番号８
ＧＣＡＧＣＴＴＧＴＡＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＡＧＴＣＴＴＣＧＴＡＡＣＴＣＧＣＴＣＣ
クラミジア・トラコマティス
ＣＴ・ＬＡＭＰプライマーＢＩＰ
配列番号９
ＴＡＣＡＡＡＣＧＣＣＴＡＧＧＧＴＧＣ
クラミジア・トラコマティス
ＣＴ・ＬＡＭＰプライマーＬＦ
配列番号１０
ＣＧＧＧＣＧＡＴＴＴＧＣＣＴＴＡＡＣ
クラミジア・トラコマティス
ＣＴ・ＬＡＭＰプライマーＬＢ
配列番号１１
ＧＣＴＣＴＧＡＣＴＣＣＡＴＴＡＴＣＣＴＡＴＧ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー２０８６ ＬＤ３９ Ｆ３
配列番号１２
ＧＣＡＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＣＴＴＣＴＡ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー２０８６ ＬＤ３９ Ｂ３
配列番号１３
ＴＴＧＣＣＧＣＣＴＡＡＧＧＴＴＣＣＧＡＧＣＴＡＴＧＧＣＡＴＴＡＧＧＡＴＴＧＴＣ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー２０８６ ＬＤ３９ ＦＩＰ
配列番号１４
ＴＧＧＡＡＣＧＡＧＣＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＴＣＡＡＣＴＧＴＴＣＣＡＴ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー２０８６ ＬＤ３９ ＢＩＰ
配列番号１５
ＧＣＧＧＴＣＡＴＴＧＡＣＧＡＡＡＴＧＧ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー２０８６ ＬＤ３９ ＬＦ
配列番号１６
ＧＧＣＴＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＧＧＴＧＣＴ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー２０８６ ＬＤ３９ ＬＢ
配列番号１７
ＡＡＴＣＡＡＧＡＡＴＡＣＣＧＣＣＴＣＡＣ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー１４３０ ＬＤ３１ Ｆ３
配列番号１８
ＡＧＴＴＣＴＡＣＧＡＡＣＡＣＴＴＧＣＴＧ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー１４３０ ＬＤ３１ Ｂ３
配列番号１９
ＴＴＧＧＡＧＡＴＧＴＧＧＣＧＴＴＣＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＣ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー１４３０ ＬＤ３１ ＦＩＰ
配列番号２０
ＣＧＧＡＡＧＣＡＧＧＣＧＴＣＡＴＣＡＧＴＴＧＴＴＴＧＧＴＣＧＣＡＡＧＧＡ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー１４３０ ＬＤ３１ ＢＩＰ
配列番号２１
ＴＧＴＣＣＡＡＴＧＣＧＴＣＧＴＴＧＡ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー１４３０ ＬＤ３１ ＬＦ
配列番号２２
ＣＧＣＣＡＴＧＣＣＧＡＣＡＡＴＴＡＣ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー１４３０ ＬＤ３１ ＬＢ
配列番号２３
ＧＡＣＧＴＣＡＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＧ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー１６Ｓ ｉｄ０７ Ｆ３
配列番号２４
ＣＧＧＴＴＡＣＣＣＴＡＣＣＴＡＣＴＴＣＴ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー１６Ｓ ｉｄ０７ Ｂ３
配列番号２５
ＴＴＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＣＴＣＣＧＣＴＣＴＣＡＣＡＣＧＴＣＡＴＡＣＡＡＴＧＧＴＣ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー１６Ｓ ｉｄ０７ ＦＩＰ
配列番号２６
ＴＣＧＡＧＴＧＣＡＴＧＡＡＧＴＣＧＧＡＡＴＣＧＡＡＣＧＴＡＴＴＣＡＣＣＧＣＡＧＴ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー１６Ｓ ｉｄ０７ ＢＩＰ
配列番号２７
ＧＣＴＴＧＧＣＴＡＣＣＣＴＣＴＧＴＡＣ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー１６Ｓ ｉｄ０７ ＬＦ
配列番号２８
ＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＡＧＧＴＣＡＧＣＡＴ
淋菌
ＮＧ・ＬＡＭＰプライマー１６Ｓ ｉｄ０７ ＬＢ
【０１２６】
・プライマー変異
特異的ターゲット領域に加え、増幅用の適切なプライマーを設計するためには、いくつかの重要な要素がある。各領域のＴmは、Ｆ１ｃおよびＢ１ｃに対しては６５℃（６４〜６６℃）となるように、Ｆ２、Ｂ２，Ｆ３、Ｂ３に対しては６０℃（５９〜６１℃）となるように、ループ・プライマーに対しては６５℃（６４〜６６℃）となるように設計される。
【０１２７】
プライマーの末端は、ＤＮＡ合成の開始点としての役割を果たすため、ある程度の安定性がなければならない。Ｆ２／Ｂ２、Ｆ３／Ｂ３、ＬＦ／ＬＢの３’末端とＦ１ｃ／Ｂ１ｃの５’末端とは、自由エネルギーが−４ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下となるように設計される。増幅後のＦ１ｃの５’末端は、Ｆ１の３’末端に対応する。安定性が重要である。
【０１２８】
プライマーは、ＧＣ含有量が約４０％から６５％の間になるように設計される。特にInnerプライマーについては、プライマーが２次的な構造を形成しないように設計されることが重要である。
【０１２９】
プライマーは、Ｆ２末端とＢ２末端との間（ＬＡＭＰ法で増幅された領域）の距離が１２０塩基と１６０塩基の間になるように設計される。また、プライマーは、Ｆ２の５’末端とＦ１の５’末端との間（ループを形成する部分）の距離が４０塩基と６０塩基の間になるように設計される。また、プライマーは、Ｆ２とＦ３の距離が０塩基と６０塩基の間になるように設計される。
【０１３０】
プライマーは、それらがプライマーダイマーを形成しないように設計される。ここで、プライマーダイマーは、増幅効率の低下および／または検出手順や視覚化手順における偽陽性シグナルを生じさせるものである。
【０１３１】
本発明においては、上記プライマーのターゲット領域は以下の通りである。
クラミジア・トラコマティス・プラスミドのＣＤＳ２領域
淋菌のゲノム領域１６Ｓ ｒＲＮＡおよび仮定上のタンパク質領域２０８６、１４３０
【０１３２】
従って、一つの実施形態において、本発明は、サンプルにおける例えばクラミジアおよび／または淋病などの性的感染症の発見用のプライマーであって、配列番号５〜２８を含む群から選択された複数のヌクレオチド配列のいずれかをコードする核酸分子、またはその一部、または前記配列番号５〜２８と少なくとも９０％の配列同一性を有する核酸を含むプライマーに関する。ただし、これらに限定されるものではない。
【０１３３】
・検出工程
・ラテラルフロー・ストリップ
ラテラルフロー・ストリップは、高価な専用機器を必要とせず、サンプル（マトリックス）におけるターゲットとなる検体の存在（または不在）を検出するための簡単な装置である。
【０１３４】
通常、これらの検査は、家庭検査や、ポイント・オブ・ケア検査、実験室での使用のための医療診断のために用いられる。広く行き渡り、よく知られたアプリケーションは家庭妊娠検査である。
【０１３５】
この技術は、多孔性紙や高分子焼結体などの一連の毛細血管床に基づいている。これらの要素のそれぞれは、自発的に流体（例えば尿）を輸送する能力を持っている。第１の要素（サンプルパッド）は、スポンジのような役割を果たし、過剰なサンプル流体を保持する。一度浸されると、前記流体は、製造者によっていわゆる複合体が格納された第２の要素（コンジュゲートパッド）に移動する。ここで、前記複合体とは、ターゲットとなる分子と粒子の表面上に固定された当該分子の化学的パートナーとの間の最適化化学反応を保証する全てのものを含んでいる塩−砂糖マトリックスにおける生物学的に活性な粒子（下記を参照のこと）の乾燥した形態である。
【０１３６】
前記サンプル流体は前記塩−砂糖マトリックスを溶解させるが、それはまた前記粒子をも溶解させる。そして一緒に輸送され多孔構造の中を流れる間に、前記サンプルと前記複合体とは混ざり合う。
【０１３７】
このように、前記検体は、さらに第３の毛細血管床を移動する間に前記粒子に結合する。この物体は、製造者によって第３の分子が固定された一以上の領域（よくストライプと呼ばれる）を有する。前記サンプルと複合体との混合物がこれらのストリップに到達するまでに、検体は粒子上に結合し、前記第３の「捕捉」分子は前記合成物を化学結合させる。しばらくしてかなりの量の流体が前記ストライプを通過した後に、複数の粒子が蓄積し、通常前記ストライプ領域の色が変わる。
【０１３８】
通常、少なくとも２種類のストライプが存在する。その一つ（コントロール）は、どんな粒子も捕捉することにより、反応条件および技術が良好に機能したことを示すストライプであり、第２のストライプは、特異的捕捉分子を含み、検体分子が固定された粒子のみを捕捉する。これらの反応ゾーンを通過した後に、前記流体は、最後の多孔物体であり単に廃棄物容器として機能するウィックの中に入る。ラテラルフロー検査は、競合的アッセイまたはサンドイッチ・アッセイとして動作することが可能である。
【０１３９】
一つの実施形態において、ＬＡＭＰ反応はラテラルフロー・ストリップで分析される。これらのストリップは、「yes」または「no」の答えを目的とした定性的シグナル発生に用いられる。多くのポイント・オブ・ケア迅速検査装置には、妊娠検査、麻薬乱用検査、アレルギー検査等に広く用いられているラテラルフロー塩基や、例えば金のナノ粒子を用いたプラズモンシグナル増強が用いられている。
【０１４０】
ラテラルフロー・ストリップ・ベースのシグナル視覚化およびシグナル増強は、コスト面で有益であり、ポイント・オブ・ケア装置に適用可能な簡単な光読み出しを形成するための最も安い解決法である。
【０１４１】
単位複製配列およびシグナル視覚化のためにラテラルフロー・ストリップを用いる際には、サンプル・マトリックスに由来するものも含んだ上流成分は、ラテラルフロー上の結合反応を抑制するものではないということを頭の中に入れておく必要がある。また、これには通常、ラテラルフロー緩衝材と、接合された必要な金のナノ粒子の量との間の平衡を保つことが必要とされる。成分間の平衡がうまく保たれない場合、シグナル損失および非特異的シグナルが発生する。従って、ラテラルフロー・ストリップ・ベースのシグナル視覚化を用いたポイント・オブ・ケアを提供することができる。
【０１４２】
ラテラルフロー・ストリップで増幅産物を検出するために、ＦＡＭ、ビオチン、ＤＩＧ等様々な種類のハプテンを用いてプライマーをラベリングすることができる。また、様々な種類のハプテンの組み合わせを用いることで、多生産物検出（一度に数種類の病原体を検出する多重反応）が実現される。
【０１４３】
・アッセイ時間
本発明の一つの実施形態において、合計アッセイ時間は６０分未満である。アッセイ応答時間は、アッセイを強化するものと抑制するものとの間の平衡の保ち具合により決定される。とりわけ、全ての成分の最適な濃度の平衡を保つことが重要である。プロセスは本来ダイナミックな原理に従う。濃度が低過ぎると効果が出ず、濃度が高過ぎると全体のプロセスが抑圧・抑制され、アッセイが失敗に終わる。従って、本発明では、アッセイ応答時間が６０分を超えないように、それぞれの成分の平衡が保たれる。これは申請者による市場分析から得られたユーザーが指定するベンチマークである。かかるポイント・オブ・ケア装置のユーザーは６０分未満の応答時間を期待しているということが報告されている。ただし、もちろん、より長いアッセイ時間も可能である。
【０１４４】
現在好ましい実施形態において、前記アッセイ時間は以下に示すステップにおいて分割される。
サンプル前処理時間（ペプチド使用）―――通常１〜１５分、または少なくとも効率的な溶解および核酸の分離を行うのに十分な時間。
増幅時間―――通常２１〜４０分；これより少ない時間では、低いテンプレート濃度で増幅は検出されないであろう；これより多い時間では、非特異的増幅シグナル（偽陽性）が得られる可能性がある。
検出時間―――通常２〜５分、ラテラルフロー・ストリップによって決まる（ＬＦシグナルの読み出しが早すぎた場合には偽陰性で、ＬＦシグナルの読み出しが遅すぎた場合には偽陽性）。
【０１４５】
当業者であれば理解するものと思われるが、アッセイ時間は変化する可能性があり、上記の分割は主として個々のステップ間の配分を示すためのものである。用いられる成分によって個々のステップが長くなったり短くなったりする。重要なことは、アッセイ全体の応答時間が、大局的なポイント・オブ・ケア装置のユーザーが期待する合理的な時間を超えてはならないということである。本発明では、これは好ましくは６０分未満に制限される。
【０１４６】
・感染尤度
本発明の方法で検出されるシグナルは、特異的病原体への感染を示すための所定の値に対応付けられる。
【０１４７】
かかる所定の値は、ＲＯＣ曲線特性を含む多数のパラメーターや、用いられる染料や例えば検出されるべき細菌によって決まる特異的設定の値によって決めることが可能である。
【０１４８】
本発明の他の実施形態において、前記シグナルは、感染尤度を示すための標準値や、感染が急性期の段階にあるのかまたは（慢性）潜伏期の段階にあるのかを示すための標準値、連続的感染の影響を示すための標準値と対応付けられる。このことは、文献にも記載されている（「Correlating Chlamydia trachomatis infectious load with urogenital ecological success and disease pathogenesis（クラミジア・トラコマティス感染の遺伝荷重と尿生殖器の生態学的成功および発症との対応付け）」、Joao P. Gomes、Maria J. Borrego、Berna Atik、Irene Santo、Jacinta Azevedo、Armando Brito de Sa、Paulo Nogueira、Deborah Dean、Microbes and Infection 8 (2006) １６−２６）。
【０１４９】
・定量的シグナル
定量的シグナルは、サンプル内に存在する細菌の量やレベル、数を示す。定量的ポリメラーゼ連鎖反応と同様、例えば蛍光染料を付加することにより、定量的ＬＡＭＰ（ｑＬＡＭＰ）法における反応生成物の形成を、リアルタイムで定量的に監視することができる。
【０１５０】
これらの種類のシグナルは、感染の重症度を評価する上で非常に重要となる可能性がある。
【０１５１】
従って、本発明の一つの実施形態において、前記方法は、核酸の存在用の定量的シグナルまたは絶対シグナルを含む。
【０１５２】
・絶対シグナル
絶対シグナルは、選択された核酸の存在を検出する「ｏｎまたはｏｆｆ」シグナルである。従って、絶対シグナルの検出は病原体の存在を示す。
通常これらの種類のシグナルは、上記の通り、所定の値またはＲＯＣ曲線のような標準値に対応付けられる。
【０１５３】
・感度および特異性
本発明の一つの実施形態において、前記感度は、７０％よりも高い。
【０１５４】
一つの実施形態において、前記感度は、取扱説明書に規定されている標準設定のCobasR4800 CT/NG検査(Roche)と比較して計算される。アッセイ内で用いられるサンプルの体積を増大することにより、またはサンプル濃縮技術を用いることにより感度は高められる。ＮＡＡＴ法は非常に特異的であるため、全体の特異性は１００％に近いが、失敗の可能性を考慮に入れると９５〜１００％となる。
【０１５５】
特定の診断検査の感度は、当該検査によって正しく認識されたまたは診断された、陽性反応の個人の比率を定義する。例えば、特定の状態にある全ての個人が陽性であるとき、前記感度は１００％である。特定のスクリーニング検査の特異性は、当該検査によって正しく認識されたまたは診断された、前記の状態にない個人の比率を反映する。例えば、１００％の特異性は、前記の状態にない全ての個人に陰性の検査結果が出た場合である。
【０１５６】
感度は、本発明の記載方法によって正しく認識された（例えば、陽性のＬＡＭＰ検査結果が出た）、特定の状態（例えば、活動性感染症）にある個人の比率、と定義される。
【０１５７】
ここでの特異性は、本発明の記載方法によって正しく認識された（例えば、陰性の検査結果が出た）、前記の状態（例えば、活動性感染症）にない個人の比率、と定義される。
【０１５８】
・受信者動作特性
診断検査の精度は、受信者動作特性（ＲＯＣ）によって最もよく示される（特にZweig, M. H., and Campbell, G., Clin. Chem. 39 (1993) 561-577を参照のこと）。ＲＯＣグラフは、観察された全範囲のデータに対して判定閾値を連続的に変化させることで得られる感度／特異性の組の全てのプロットである。
【０１５９】
診断検査の臨床成績は、その診断精度、即ち被験者を臨床的に関係のある亜群に正確に分類する能力に依存する。診断精度は、調査対象の被験者の２種類の状態を正確に区別する検査の能力を測定する。かかる状態は、例えば健康および疾患、潜伏期の感染や最近の感染対非感染、または良性対悪性の病気である。
【０１６０】
それぞれの場合において、ＲＯＣプロットは、判定閾値の完全範囲について感度対１−特異度をプロットすることにより、２つの分布間での重複を示す。ｙ軸は、感度即ち真の陽性率[(真陽性検査結果の数)(真陽性の数＋偽陰性数検査結果の数]として定義される]である。また、これは疾患または状態の存在の陽性とも呼ばれている。これは罹患亜群からのみ計算される。ｘ軸は、偽陽性率、即ち１−特異度[(偽陽性結果の数)／(真陰性の数＋偽陽性結果の数]として定義される]である。それは特異性の指標であり、非罹患亜群から全体的に計算される。
【０１６１】
真陽性率と偽陽性率は、２種類の亜群の検査結果に基づいて全体的に別々に計算されるため、ＲＯＣプロットは、サンプルにおける疾患の罹患とは独立している。ＲＯＣプロット上の各点は、特定の判定閾値に対応する感度／特異性対を表す。
【０１６２】
完全な区別を有する検査（２つの分布結果における重複はない）は、真陽性率が１．０即ち１００％であり（完全感度）、偽陽性率が０である（完全特異性）場合に左上隅を通過するＲＯＣプロットを有する。区別のない（２つの群の同じ分布結果）検査の理論上のプロットは、左下隅から右上隅への４５°の対角線である。ほとんどのプロットはこれら２つの両端に入る。（ＲＯＣプロットが完全に４５度対角線の下に位置するときは、「陽性」の尺度を「より大きい」から「より小さい」またはその逆に変更することで、容易に修正することができる。）定性的にプロットが左上隅に近づくほど、検査の全体精度は高くなる。
【０１６３】
実験室検査の診断精度を定量化するための簡便な目標は１つの数でその結果を表すことである。最も一般的な世界的基準はＲＯＣプロット下面積（ＡＵＣ）である。約束ごとで、この面積は常に０．５以上である（０．５以上でない場合、そうなるように判定規則を逆転し得る）。値は１．０（２つの群の検査値の完全な分離）〜０．５（２つの群の検査値間での分布差が明白でない）である。面積は、対角線に最も近い点または９０％特異性での感度のようなプロットの特定の部分だけではなく、プロット全体にも依存する。これは、ＲＯＣプロットが完全なプロット（面積＝１．０）にどれだけ近いかを定量的に記述する表現である。
本発明の臨床的利便性は、特定の感染症に対する他の診断ツールとの比較および組み合わせによって評価することができる。
【０１６４】
クラミジアおよび／または淋病への感染の場合、本発明の臨床的利便性は、例えばCobasR4800 CT/NG検査(Roche)や他の比較可能なゴールドスタンダードＰＣＲ法などの、確立された診断ツールとの比較によって評価することができる。実施例１および６を参照のこと。実施例１および６では、臨床サンプルに対する本発明の発明アッセイが、参考方法としてのCobasR4800 CT/NG検査と比較され、特定の感度値が結果として得られている。
【０１６５】
従って、本発明の好ましい実施形態の目的は、以下に述べる方法を提供することである。即ち、
人が性的感染症の病原体に遭遇したか否かを検出する方法であって、
ａ）前記ヒトの尿サンプルにおけるＬＡＭＰ法増幅産物のレベルを判定することと、
ｂ）健康人集団から得られた前記ＬＡＭＰ法増幅産物のレベルのパーセンタイル・プロットを構築することと、
ｃ）前記健康人集団において判定されたＬＡＭＰ法増幅産物のレベルと、問題となっている前記性的感染症の病原体と診断された集団において判定された前記ＬＡＭＰ法増幅産物のレベルとに基づきＲＯＣ（受信者動作特性）曲線を構築することと、
ｄ）所望の特異性を選択することと、
ｅ）前記ＲＯＣ曲線から、前記所望の特異性に対応する前記感度を判定することと、
ｆ）前記パーセンタイル・プロットから、前記判定された感度に対応する前記ＬＡＭＰ法増幅産物のレベルを判定することと、
ｇ）前記サンプルにおける前記ＬＡＭＰ法増幅産物のレベルが前記判定された特異性に対応する前記ＬＡＭＰ法増幅産物のレベルと等しいかまたはそれより高いとき、前記個人が性的感染症の病原体を保有していると予測し、前記サンプルにおける前記ＬＡＭＰ法増幅産物のレベルが前記判定された特異性に対応する前記ＬＡＭＰ法増幅産物のレベルより低いとき、前記個人が性的感染症の病原体を保有している可能性が低いかまたは保有していないと予測する方法。
【０１６６】
本発明に係る前記方法の前記特異性は、７０％から１００％、さらに好ましくは８０％から１００％、さらに好ましくは９０％から１００％であってよい。従って、本発明の一つの実施形態において、本発明の前記特異性は、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。
【０１６７】
本発明に係る前記方法の前記感度は、６０％から１００％、好ましくは７０％から１００％、さらに好ましくは８０％から１００％、さらに好ましくは９０％から１００％であってよい。
【０１６８】
従って、本発明の一つの実施形態において、本発明の前記感度は、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％である。
【０１６９】
前記ＬＡＭＰ法増幅産物のレベルは、一組の基準データまたはカットオフ値などの基準値と比較され、前記被験者の例えば感染の危険性または可能性が高いか否かが判定される。
【０１７０】
検出の効率を高めるために、前記ＬＡＭＰ法増幅産物が一組の基準データと比較され、前記被験者が感染している可能性が高いか否かまたは例えば感染が成長している危険性が高いか否かが判定されてもよい。
【０１７１】
検出の効率を高めるために、前記ＬＡＭＰ法増幅産物が一組の基準データと比較され、前記被験者が感染している可能性が高いか否かまたは例えば感染または病気が成長している危険性が高いか否かが判定されてもよい。
【０１７２】
前記被験者において例えば感染が成長している危険性が高いか否かを判定するためには、カットオフを確立する必要がある。このカットオフは、前記ラテラルフロー・ストリップや、医師、又は個別に各被験者によって確立され得る。
【０１７３】
他の方法として、陰性対照群（（例えば、非感染、感染されておらず健康、感染されていない患者）  ＋／−  一以上の標準偏差または標準偏差から導き出された値）の平均、中央値、または幾何平均をカット点として定めることができる。
【０１７４】
・リスク評価
カットオフ点は、罹患の危険性、職業、地理上の住居または露出等の被験者の特異的条件に基づいて変動し得る。ただし、これらに限定されるものではない。
【０１７５】
カットオフ点は、以下に限定されるものではないが、年齢、性別、遺伝的背景（即ち、ＨＬＡタイプ）、後天的または遺伝による免疫機能低下（例えば、ＨＩＶ感染、糖尿病、腎不全または肝不全患者、以下に限定されるものではないがコルチコステロイド剤や化学療法、ＴＮＦ−α遮断薬、有糸分裂阻害薬等の免疫修飾薬で治療中の患者）に基づいて変動し得る。
【０１７６】
判定や限界の調整を行うことにより、感染していた場合にその感染を検出する検査感度を決定したり、この限界を下回っている場合に感染や疾患を除外することのできる特異性を決定することができるであろう。その原理は、前記カットオフ点を超える値は高い危険性を示し、前記カットオフ点未満の値は低い危険性を示すということである。
【０１７７】
・カットオフ・レベル
一般的に当業者には理解可能と思われることであるが、本発明の方法は比較による意思決定の過程である。どのような意思決定の過程であれ、関心のある疾患や状態を有する被験者および／または関心のある疾患や感染、状態を有さない被験者に基づく基準値が必要である。
【０１７８】
カットオフ・レベル（またはカットオフ点）は、さらなる診断検査を受ける必要のある被験者の数や、例えば感染を保有するおよび／またはさらなる診断検査を受ける必要のある被験者の全てに感染させる危険性の平均値、潜在的特異的危険性が（スクリーニング機関または個々の被験者が定義する）４００につき１または１：２５０などの特定の患者危険レベルを超えている被験者はさらなる診断検査を受けなければならないという決定、または当業者に知られている他の基準を含む、いくつかの基準に基づいたものとすることができる。
【０１７９】
カットオフ・レベルは、検査を受けた個人の群などのいくつかの基準に基づいて調整することができる。ただし、これらに限定されるものではない。例えば、カットオフ・レベルは、免疫不全患者や活動性疾患に発展する危険性の高い患者においては低く設定することができ、活動性疾患に発展する危険性の低い他の健康な個人の群においては高く設定することができる。
【０１８０】
識別値は、健康人対照集団および公知の感染を有する集団の両方におけるパラメーターを計測することにより決定された値である。そのように決定された前記識別値は、前記パラメーター値と、前記健康人対照集団と感染患者集団の公知の臨床データとの間の関係性の分析に基づき、所定の特異性又は感度を有する感染集団を識別する。それは、ここに挙げた例に関する詳細な検討からも明らかである。
【０１８１】
このように決定される前記識別値は、将来の個別検査において同様の実験設定がなされた場合に有効となる。他の実験設定、他のサンプル、他の抗原、及び他のパラメーターからは、もちろん他のカットオフ値が得られるであろう。かかるカットオフ値は、ここに提供される教示に従って、通常の設計手順または日常の実験により当業者により決定される。
【０１８２】
・交差反応
他の病原体ＤＮＡとの交差反応は、ＰＯＣ診断にとって巨大な閾値である。少なくとも３０の病原体のＤＮＡが尿サンプル内に潜在的に存在する可能性がある。アッセイの高い特異性を確保するためには、ある病原体の検出に特異性を有するプライマーは、他の種のＤＮＡを検出するものであってはならない。本発明のプライマーについては、交差反応のない十分な感度および特異性のための検査が行われる。それによりＰＯＣ検査における使用が狭められる。
【０１８３】
・熱処理
本発明のさらなる実施形態において、抗菌ペプチドベースの核酸の放出は、熱処理と組み合わせられる。
【０１８４】
高温は、真核性細胞および原核細胞の溶解を促進する。組み合わせて使用されることで、核酸放出に要する時間が増えるか、又は減少する。温度が高くなるにつれ、細胞膜は効率的に化学分解され、それにより診断アッセイのターゲットとなる核酸の放出が促進される。
【０１８５】
・界面活性剤の使用
本発明の他の実施形態において、前記抗菌ペプチドベースの核酸の放出は、界面活性剤と組み合わせられる。界面活性剤（例えば、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＰ−４０、ＣＨＡＰＳ、ＣＴＡＢ、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、オクチルベータチオグルコシド、オクチルベータグルコシド等）の使用は、宿主細胞の破壊を助ける細胞内の寄生虫を溶解させるのに非常に有益である。
【０１８６】
図４は、界面活性剤の使用により溶解効率が少し上昇することを示している。
【０１８７】
・部品キット
本発明の方法を用いた病原体検出用のキットは、非常に関連性がある。
【０１８８】
かかるキットは、選択された細菌をターゲットとする抗菌薬を含む緩衝液と、同じ細菌をターゲットとするプライマーを含む緩衝液とを備える。これらは同じ緩衝液内に含まれてもよく、また、染料、ポリメラーゼ、塩、および細菌の増幅および検出に必要な他の成分を含んでもよい。
【０１８９】
一つの実施形態において、前記キットは、以下に限定されるものではないがクラミジア・トラコマティスおよび／または淋菌のような性的感染症の同時検出および定量化のためのＬＡＭＰ法に基づくものであり、
ａ）以下の範囲の溶解混合物と、
０．５〜５μＭのＡＭＰ（セクロピンＰ１）
５〜５０ｍＭのＥＤＴＡ
０．１〜１０％の非イオン界面活性剤
ｂ）配列番号５〜２８を含む群または配列番号５〜２８の任意の組み合わせから選択されたヌクレオチド配列をコードする複数のヌクレオチド配列、またはその一部、または前記配列番号５〜２８と少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド、および／またはLoop-mediated isothermal amplification：ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）を介在可能なポリメラーゼを含む混合物と、
ｃ）ラテラルフロー・ストリップを含む装置とを備える。
【０１９０】
・一般事項
ここでは、「患者」と「被験者」は、人を表す用語として交換可能に用いられる。
【０１９１】
以下のような図および例が、本発明の理解を助けるために提供される。それらは理解の助けを意図したものであって、如何なる意味においても限定するものではない。
【０１９２】
本明細書の全体を通して、様々な刊行物が引用されている。これらの刊行物の開示は全て、この参照により本明細書の開示に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】ＬＡＭＰ法の尿耐性。０％、５％、１０％、１５％、および２０％の患者の蓄尿の存在下でＬＡＭＰ法の尿耐性が試験された。結果は定量的に分析され（Ａ）、その分析にはＬＦストリップが用いられた（Ｂ）。定量分析では、１反応につき標準ＤＮＡ希釈液１０７，１０５、および１０４のターゲットコピーにおける０％の尿反応との比較により、残りの増幅時間が平均時間として計算された。ＬＦストリップの検出では、５パラレルにおける１００個のテンプレート・コピーの存在下で反応が実行された。２つのバンドによってＤＮＡ増幅の成果が確認される。また、検査ストリップ上の単一の黒いバンドの存在によって否定的な結果が示されている。
【図２】水および蓄尿内のクラミジア・トラコマティス−ＬＡＭＰアッセイＬＯＤのプロビット曲線
【図３】大腸菌の細胞統合性に対する熱（９０℃５分間）および抗菌ペプチド（５０μＭ）の溶解効果。ＳＹＴＯ９／ＰＩ組み合わせによる二重染色溶解細胞を用いてフローサイトメトリー分析が行われた。溶解反応が１０％人口尿状態で実行された。ＡＭＰ６が陰性対照（上記実験において成長阻害効果が見られない）として用いられた。
【図４】ＡＭＰと洗剤Triton-X-100の組み合わせの溶解効果。大腸菌の溶菌がフローサイトメトリー法によって分析された。溶解混合物におけるＡＭＰ濃度およびTriton-X-100濃度は、それぞれ５０μＭおよび２％であった。註）ＡＭＰ５は、発明者による自己精製バッチを用いる代わりにＰｅｐＳｃａnから取得された。従って、以前に示された結果と比較すると、ＡＭＰ５の溶解効果に違いが見受けられる。
【図５】１０７から１０４までのテンプレートＤＮＡ濃度での０％、５％、１０％、１５％、および２０％の（ＣＴ陰性の男性５名および女性５名から得られた）患者の蓄尿の存在下で、ｑＬＡＭＰ法（６３℃で）を用いて、Ｂｓｔ（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼおよびＢｓｍ（Ｂ）ＤＮＡポリメラーゼについて尿耐性が分析された。尿耐性の結果は、結果に対する相対時間として表された。
【図６】直接大腸菌細胞溶解物からのループ介在等温増幅。様々な種類の溶解物準備技術を用いた尿入り大腸菌の前処理後の等温増幅。生物学的サンプル処理のためにリゾチームが１ｍｇ／ｍｌ濃度で、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテルが１％で、ペプチドが５０μＭ濃度で用いられた。全てのサンプル前処理は、室温で５分間実施された（９５℃で培養された熱処理を除く）。
【図７】様々な種類の細胞融解物質の存在下におけるループ介在等温増幅活動度。０．１％ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（０．１％ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテルまたは１ｍＭのＥＤＴＡが存在する場合と存在しない場合）、またはアルカリ溶解成分の存在下における増幅活動度のパーセンテージ。
【図８】様々な種類の溶解ペプチドの存在下におけるループ介在等温増幅活動度。５μＭ抗菌ペプチドの存在下における増幅活動度のパーセンテージ。
【図９】結果までが分単位の想定増幅時間で計測された、様々な種類のポリメラーゼ（Ｂｓｍ、ＧｓｐＭ２．０、ＧｓｐＭ、Ｂｓｔ、Ｂｓｔ２．０、ＧｓｐＳＳＤ、ＧｓｐＳＳＤ２．０、ＯｍｎｉＡｍｐ、Ｔｉｎ、ＳＤ）間の尿耐性の比較を示している。
【０１９４】
・実施例
【０１９５】
・実施例１  尿から直接クラミジア・トラコマティスを検出するための効率よく迅速なループ介在等温増幅に基づく方法。
【０１９６】
・序論および概論
クラミジア・トラコマティス検出用の感度試験がなければ、未処理の患者のサンプルから直接効率よくクラミジア感染の有無を診断することは難しい。
【０１９７】
ここに本発明者らは、２１分以内に、１反応につき少なくとも５つのクラミジア・トラコマティス病原体（２５個の潜在プラスミドコピー）を尿サンプルから検出可能な、ＬＡＭＰ（ループ介在等温増幅）に基づく迅速かつ精度の高い分析を提示する。我々の臨床データによると、前記分析の特異性は１００％であり、感度は７３％であった。加えて、我々は、本アッセイが、尿サンプル内に存在する可能性のある３０種を超える病原体のＤＮＡとの交差反応を引き起こすことはないということを実証する。さらに、アッセイによる新規な手法は、増幅に先立つ臨床サンプルからのＤＮＡの精製および抽出を要さない。従って、専用装置の必要がなくなる。これにより、全体の手順は、著しく労力が省かれ、時間が節約され、その結果感染症の早期の検出および同定を低コストで行うことが可能になる。クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイは比較的簡単に実施できるため、様々なポイント・オブ・ケア設定に適用することが可能となる。
【０１９８】
クラミジア・トラコマティスは、広範囲の性的感染偏性細胞内ヒト病原体である。ほとんどの場合、クラミジア・トラコマティスは、新たなまたは複数の性的パートナーを有する１５〜２５才の青少年の間に蔓延する。当該病原体は、膣から出産する際に、感染した母親からその赤ん坊へと感染され得る。男性においては、クラミジア・トラコマティスは、通常前立腺炎や精巣上体炎を引き起こし、ほとんどの場合軽度から中等度の、透明から白色の尿道分泌物を出し、排尿や排尿障害時に鋭く焼けるような感覚を覚えるという症状が起こる。しかし、女性の場合、感染しても症状がほとんどまたは全く出ないため、クラミジア感染との診断が遅くなる。クラミジア・トラコマティス感染の長期作用は、子宮管炎、骨盤感染症、子宮外妊娠、および急性または慢性の骨盤痛に代わる代わる関連している。
【０１９９】
クラミジアは、基本小体（ＥＢ）と網状体（ＲＢ）という２つのライフサイクル・ステージを有する。これらは形態学的および生物学的性質により識別可能である。細胞外のＥＢは、感染力が高く、分散し、胞子に似ている。一度ＥＢが上皮細胞に入ると、それは複製し細胞の細胞質内封入体内に蓄積することのできる、代謝的に活性なＲＢに変形する。その後、ＲＢはより抵抗力のあるＥＢに変換され、細胞から放出される。
【０２００】
偏性細胞内寄生体であるため、クラミジア・トラコマティスを実験室で培養することは困難である。クラミジア・トラコマティスの治療は、感染場所だけでなく、患者の年齢や症例の複雑さにも依存する。従って、さらなる長期の合併症の発生を防ぎ、淋菌やヒト免疫不全ウィルス等の他の感染症に感染する可能性を減らすためには、感染の早期の段階でクラミジア・トラコマティスを同定し、なるべく早く迅速な治療を開始することが非常に重要である。
【０２０１】
性的感染によるクラミジアの診断においてはサンプルが収集される。即ち、男性からは、定期的に収集された尿道の標本または尿検体、女性からは頸管内の標本または膣の標本が収集される。スクリーニングを成功させ、クラミジアのさらなる感染や合併症の発生を防ぐことができるかどうかは、どれだけ感染の診断を精度よくかつ迅速に低コストで行うことができるかにかかっている。現代の実験室では、いまだに細胞培養や抗原ベースの検出などの従来の検査方法が用いられている。細胞培養法は、特異性が高いものの、感度が非常に低く、高コストで、遅く（結果が３日後でなければ得られない）、特殊なサンプル収集・収容・移送を要する。酵素免疫測定法アッセイや直接蛍光抗体法（ＤＦＡ）アッセイなどのような免疫アッセイは、細胞培養法と同様、感度および特異性が低い。したがって、診断分野におけるこれらの検査方法の使用が限定されている。従来の実験室方法に代わるものとして、抗原に特有のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の検出を可能にする複数の核酸増幅検査（ＮＡＡＴ）が開発された。これらの検査は、ターゲットの核酸の複製を一つ検出するだけのものであり、クラミジアの性器感染のスクリーニングおよび診断において、はるかに高い感度を有する。クラミジア・トラコマティス検出検査には、数種類の核酸増幅ベースの検査を用いることができる：Abbott RealTime CT/NGは、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）法を用いる；Aptima COMBOは転写増幅（ＴＭＡ）法を用いる；BD ProbeTec ETは鎖置換増幅（ＳＤＡ）法を用いる；Xpert CT/NG検査およびCobas CT/NG検査はリアルタイムのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いる。
ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）は、その簡便な操作性や１時間でごく少量の病原体遺伝物質を診断できる能力の故に、新規で、高い感度を有し、特異性のある診断ツールとして際立っている。ＬＡＭＰ法は、広く用いられているＰＣＲ法に対していくつかの利点を有する。ＬＡＭＰ法は、定温（５５〜６５℃）で実行され、サーマルサイクラーを要さない。ＬＡＭＰ法は、４〜６種類のプライマー（innerプライマー２種類、outerプライマー２種類および／または追加のループ・プライマー２種類）と、ターゲットとなる遺伝子配列上の６つの明瞭な領域を識別するために鎖置換能を有するポリメラーゼとを用いる。これにより、一本鎖ループ領域を含む増幅産物が生成され、温度変性を伴わないプライマーの結合が可能となる。ループ・プライマーを追加することにより、増幅は著しく加速され、それにより感度は高まり、反応時間は短縮される。ＬＡＭＰ反応の終了時点におけるＤＮＡ生産物の量は、ＰＣＲ法におけるそれよりはるかに多く、また、サイバーグリーン、臭化エチジウム、ピコグリーン、ヨウ化プロピジウム、ヒドロキシナフトールブルーなどのＤＮＡ結合色素またはカルセインを用いることにより簡単に視覚化することができる。
【０２０２】
ここに本発明者らは、ヒトの尿から迅速かつ高感度に病原体を検出するための、最小限の処理工程からなる、クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイを開発した。開発されたアッセイは、尿サンプルから直接クラミジア・トラコマティスを検出することを可能にするため、迅速で精度が高く、訓練の必要がほとんどない診断法を提供する。臨床分析によると、前記クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイの感度は最高で７３％であり、特異性は１００％であった。前記アッセイは２１分を要するものであり、産物はラテラルフロー（ＬＦ）ストリップを用いて検出することができる。これはポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）検査法の設定への適用に非常に有益である。
【０２０３】
・材料および方法
・プライマーの設計と選択
クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイ・プライマー・セットは全て、コーディング配列２（ＣＤＳ２）内におけるクラミジア・トラコマティス潜在プラスミドの高度に保存された領域をターゲットとするように設計された。ＬＡＭＰ法プライマーは、ソフトウェアLAMP Designer 1.10 (PREMIER Biosoft USA)を用いて設計され、ＤＮＡターゲットに対する高い感度と、ラテラルフロー・ストリップの非特異的バックグラウンドの不在とがスクリーニングされた。最良のプライマー・セットの配列が補足表１に示されている。ラテラルフロー・ストリップ上で産物の検出が可能となるように、プライマーＦＩＰおよびＬＦはビオチンで５’ラベリングされ、プライマーＢＩＰおよびＬＢはＦＡＭでラベリングされた。プライマーはMicrosynth AG (スイス、Balgach)から得られた。
【０２０４】
・クラミジア・トラコマティスＡＴＣＣ  ＤＮＡサンプル
市販のクラミジア・トラコマティス菌株UW-36/Cx ゲノムDNA (ATCCRVR-886D？)は、ＡＴＣＣ（アメリカ培養細胞系統保存機関）から得られた。また、ＣＤＳ２ターゲット・コピー番号は、ｑＰＣＲ（アプライドバイオシステムズ）によって、ｐＧＬ３−ＣＤＳ２プラスミドおよび以下のプライマーを用いて決定された。
Ｆｗ５’−ＣＴＣＣＴＴＧＧＡＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＧ−３’
Ｒｗ５’−ＣＧＧＡＴＧＣＧＡＴＧＡＡＣＡＧＴＴＴＧ−３’
【０２０５】
・ＬＡＭＰ反応
クラミジア・トラコマティスに特異的なＬＡＭＰ反応は、栄研化学株式会社から提供されたＬＡＭＰ反応総量５０μｌのプロトコルに従って実施された。ＢｓｔポリメラーゼはＢｓｍポリメラーゼおよび１．２μｌのｇＤＮＡ（ＡＴＣＣ）／または５μｌの前処理後の尿サンプルに替えられた。全てのＬＡＭＰ反応は、製造者のプロトコルに従って指定された期間６３℃で実施され、ラテラルフロー・ストリップ（AMODIA Bioservice GmbH）上で分析された。反応生成物は、生成物の特異性を確認するためにPmlI restrictase (Thermo Fisher Scientific Inc. USA)で切断された。
【０２０６】
定量ＬＡＭＰ（ｑＬＡＭＰ）法については、EvaGreen (Biotium)蛍光染料およびROX (Thermo Fisher Scientific Inc. USA)参照染料が前記反応に加えられた。ビオチン／ＦＡＭでラベリングしていないプライマーが用いられ、Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCRを用いて生成物が検出された。BglII線形化pGL3-CDS2プラスミドの段階希釈を用いて標準曲線が構築された。ｑＬＡＭＰは、６３℃で４０サイクル実施された。各サイクルが１分間で３０秒後にデータ読み出しが行われた。
【０２０７】
・蓄尿
５人の男性と５人の女性からの、全てクラミジア・トラコマティス陰性の尿サンプルは、等量に混合された。蓄尿とも呼ばれるこれらのサンプルは、抑制およびアッセイ感度分析用のクラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイに用いられた。
【０２０８】
・サンプル前処理
臨床患者の尿サンプル（３０μｌ）は、溶解ペプチド（最終容量から１２％）を含んでいる、または９０℃で５分間予熱し、氷上で冷まされた1 x 溶解混合物（SelfD Technologie GmbH、ライプツィヒ、ドイツ）と一緒に５分間培養された。しかる後５μｌの各前処理された尿サンプルは、クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰ法増幅に適用された。
【０２０９】
・統計分析
クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイの検出限界に関する統計分析がXLSTATを用いて実施され、９５％信頼区間（ＣＩ）がロジスティック回帰モデルを用いて計算された。アッセイの感度および特異性が、MedCalc９５％信頼区間からのオンライン・ツールを用いて計算された。
【０２１０】
・臨床標本の収集および格納
朝一番に排出された尿のサンプルが、Sexual Health Clinique（Tartu、エストニア）に通う１８才から２５才の間の６５０人（女性３１６人、男性３３４人）から２０１３年１０月から２０１４年１２月の間に収集された。尿サンプルは、各自で清潔なポリプロピレン製容器の中に収集され（平均サンプル量は２５〜３５ｍｌ）、防腐剤は用いず、その日の内に患者によってSexual Health Cliniqueに持ち込まれた。当該研究に患者を組み入れる基準は、性的パートナーを最近替えた、複数の性的パートナー、避妊手段をとっていない性交、パートナーの性的感染または性的感染症の症状（多量の／異常な膣分泌物、尿道分泌物、腹痛、痛みを伴う尿排泄、排尿障害、生殖器部におけるかゆみや発赤等）、妊娠、または予防薬である。
【０２１１】
尿サンプルは、製造者の指示に従い、Tartu大学病院の統合実験室により、通常サンプル収集の２日目、遅くとも収集後７２時間経過前に、クラミジア・トラコマティスおよび淋菌の存在についてCobasR4800 CT/NG Test (Roche)によって検査された。
【０２１２】
９１個の尿サンプルは、収集後6時間以内に（収集から２４時間以内に）クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイによって検査された。７１個のクラミジア・トラコマティス陽性サンプルは、−２０℃で凍結され、別々に検査された。当該研究の承認は、Tartu大学の研究倫理委員会から得られた。患者情報が掲載された紙には守秘義務に注意が向けられている。
【０２１３】
・結果
・クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイの開発
ＬＡＭＰアッセイにはＤＮＡ精製工程は含まれていないため、開発された増幅方法は、反応混合物におけるより多量の尿に耐えなければならない。それにより、より多くのターゲットが反応に加えられるため、理論上は全体のアッセイ感度が高められる。従ってＬＡＭＰ法の尿耐性が、蓄尿サンプルを用いて検査された。我々の実験設定では、ＬＡＭＰ反応混合物は、最高で２０％の尿およびテンプレートＤＮＡを１００コピー含んでいた。その結果は、１５％の尿を含む反応は、ラテラルフロー（ＬＦ）・ストリップで分析したときにシグナルを発しなかった。それは２１分の増幅時間はターゲットを増幅するのに十分ではなかったということを示している。１５〜２０％の尿が存在するとき、増幅時間は３０分に延長しなければならない（図１Ｂ）。従ってこのデータに基づき、これ以降の全ての実験では、１０％の尿がＬＡＭＰアッセイにおけるサンプル材料として用いられた。必要最小限の増幅時間を決めるために、１００テンプレート・コピーが用いられ、反応は１５分、１８分、２１分、２４分、または２７分後に終了された。その結果、ＬＦストリップ上で産物が形成されるのに必要な最小限の増幅時間は２１分であることが分かった（補足表２）。これにより、反応感度を損なうことなしに、アッセイ増幅処理の時間を推奨された１時間から２１分に減らすことができた。
【０２１４】
・クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイの検出限界（ＬＯＤ）の評価
次に、一番小さいクラミジア・トラコマティス・プラスミドコピー番号が、開発されたクラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイによって決定された。この目的のために、ＬＡＭＰ増幅効率が、水または１０％蓄尿における異なる種類のクラミジア・トラコマティス・ゲノムＤＮＡ濃度について検査された。プロビット解析の結果、アッセイは水中における１反応につき２５のプラスミドコピー（値０．９５）を検出することができるほどの感度を有していることが分かった（図２）。開発アッセイは余分なＤＮＡ精製過程を含んでいないため、１０％の粗尿が感度に影響し得るか否かを評価することが重要であった。そのため、蓄尿サンプルに、異なる種類の量のクラミジア・トラコマティス・ゲノムＤＮＡが混入された。その結果、１０％尿の存在下で、ＬＡＭＰアッセイの感度は約３倍減少し、確立されたＬＯＤは１反応につき７０ターゲット・コピー（値０．９５）であった（表１）。これらの結果は、尿阻害実験と深い相互関係にある。尿阻害実験では、１０％尿が追加されると、ＬＡＭＰ増幅時間(図１)が延び、増幅活動が約３倍減少した（表１）。
【０２１５】
・表１−クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイに対するＬＯＤの決定
【表１】
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・クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイの特異性の判定
【０２１６】
クラミジア・トラコマティス・プライマーは病原体に特異的な領域をターゲットとするように設計されているが、それらの特異性を実験を通して証明する必要があった。クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイは、ヒトからの過剰量のゲノムＤＮＡおよびヒトの尿内に潜在的に存在する可能性がある３０種類の微生物（補足表Ｓ３に列挙）を用いて、さらに非特異的反応の可能性について分析された。その結果、クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイは、どの検査された病原体のＤＮＡとも交差反応性を示さなかった。従って、新たに開発されたＬＡＭＰアッセイは、ヒトの尿からクラミジア・トラコマティスを検出する際に非常に高い特異性を有するため、分子診断システムに適している。
【０２１７】
・開発されたクラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイの臨床検証
症状のある患者および無症状の患者におけるクラミジア・トラコマティスの有病率を判定するために、臨床研究にかけられた尿サンプル（Ｎ＝６５０）が追加で評価された。収集されたデータを分析するために、患者と医師から受け取った重要な情報が記述統計学を用いて提供された。症状のある群に含まれる患者は、医師の診断／制御を医師に求め、以下の症状を訴えた：異常な性器分泌物、排尿障害、腹痛、月経と月経の間の出血、生殖器部におけるかゆみや発赤。症状のない患者は無症状の群に含まれた。６５０人の患者の内１５７人（２４％）に性的感染症（ＳＴＩ）の症状が見られ、４９３人の患者（７６％）は無症状であった。患者の５１％が男性で、４９％が女性、平均年齢は２２才（１８〜２５才）であった。３９人の男性患者と４７人の女性患者がクラミジア・トラコマティスと診断され、そのうち男性１２人（３１％）と女性１３人（２８％）に症状が見られた。全ての収集され、分析された尿サンプルにおいて、淋菌の有病率は３％であった。淋菌／クラミジア・トラコマティスの重感染は極めて頻度が高いように思われ、全てのクラミジア・トラコマティス陽性サンプルの６〜８％であった。
臨床データにより、クラミジア・トラコマティスは主に無症状であり、そのことがヒト集団における実際の蔓延を診断し評価することを困難にしているということが確認された（表２および補足表４）。
【０２１８】
・表２−研究群（Ｎ＝６５０）の臨床特性
【表２】
2019507606.tif 000005
【０２１９】
*患者情報分析は、性別分布と、症状のある（ＳＹＭ）および無症状の（ＡＳＹＭ）クラミジア・トラコマティス（ＣＴ）患者の数およびパーセンテージとを提示する。
【０２２０】
クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイの臨床感度および特異性について、患者から収集された９１個の新鮮な尿サンプルを用いた研究により評価が行われた。朝一番に排出された尿のサンプルが、５６人の男性患者および３４人の女性患者によってそれぞれ各自で収集された。９１人のうちの１１人がクラミジア・トラコマティスに感染していた（Roche Cobas 4800 CT/NG検査によって判定された）。１人のクラミジア・トラコマティス陽性患者は、淋菌にも陽性であった。収集された尿サンプルは、クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイに、並列に供された。２種類の異なる前処理が施されたサンプルが検査され、前処理が施されなかったサンプルと比較された。即ち、２種類の異なる前処理が施されたサンプルとは、９０℃で５分間の熱処理にかけられたものと、ペプチド溶解混合物で培養されたものである。その結果、ペプチド／洗剤溶解混合物が用いられたものからは最高に高いアッセイ感度（７３％）が得られた。熱による前処理が施されたものは６４％のアッセイ感度を示した。そして前処理が施されなかった尿サンプルでは、感度は５５％という低さを示した（表３）。これらのデータは、増幅に先立つ尿サンプルの前処理は、病原体ＤＮＡ材料をよりよく利用できるようにすることを示している。
【０２２１】
・表３−Roche Cobas Amplicor CTアッセイおよびクラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイを用いた、朝一番に排出された尿のサンプル９１個におけるクラミジア・トラコマティスの検出
【表３】
2019507606.tif 000006
【０２２２】
*５μｌの新鮮な尿がＬＡＭＰ反応に加えられた。**５μｌの新鮮な尿が９０℃で５分間培養され、その後ＬＡＭＰ反応に加えられた。***３０μｌの尿が４μｌ（ペプチド溶解混合物）とともに５分間培養され、その後５μｌが取り出され、ＬＡＭＰ反応に加えられた。
【０２２３】
８０個のクラミジア・トラコマティス陰性サンプルの全てが、開発されたＬＡＭＰアッセイにより陰性として検出された。従って、臨床特異性は１００％と評価される。
【０２２４】
臨床研究の結果を確認するために、−２０度で凍結させていた７１個のクラミジア・トラコマティス陽性尿サンプルを、追加として分析した。上記と同様の前処理方法を用いてクラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイが実施された。当該サンプル・セットは、３１人の男性および４０人の女性からの凍結クラミジア・トラコマティス陽性尿サンプルを含んでいた。６人のクラミジア・トラコマティス陽性患者は淋菌でも陽性であり、９人の患者は淋菌のみに感染していた。７１個のクラミジア・トラコマティス陽性尿サンプルの内４８個は、熱処理またはペプチド溶解混合物を用いたクラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイによる検査の結果陽性と診断された。分析は、熱処理および溶解混合物がいずれも凍結サンプルに対する感度を６８％に高めたことを示している（表４）。冷凍庫に尿サンプルを格納したことが「新鮮な」尿サンプル、即ち凍結されていない尿サンプル（ペプチド／洗剤溶解混合物と尿の溶解物）の７３％から凍結尿サンプルの６８％（ペプチド／洗剤溶解混合物または熱処理と尿の溶解物）に感度が下がったことの理由かもしれない。なぜなら、凍結尿は、「新鮮な」尿に比べて大量の尿の「微細な沈殿物」を産出し、サンプルの前処理を困難にしたからである。同時に、反応温度および冷凍−解凍処理自体が病原体膜を破壊し、それによりゲノム物質が放出されると推定することもできる。それが我々のアッセイが、処理が施されなかった尿に対して５５％（「新鮮な」尿）および６３％（凍結尿）の感度を示した理由である。
【０２２５】
・表４−クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイを用いた７１個の凍結クラミジア・トラコマティス陽性尿サンプルの分析
【表４】
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【０２２６】
*５μｌの凍結尿が反応混合物に加えられた。**５μｌの凍結尿が９０℃で５分間培養され、その後反応に加えられた。***３０μｌの凍結尿が４μｌの１ｘ溶解混合物とともに５分間培養され、その後５μｌが取り出され、反応混合物に加えられた。
【０２２７】
・考察
クラミジア・トラコマティス等の性的感染症（ＳＴＩ）は、世界規模の公衆衛生問題において重要な位置を占めてきた問題である。クラミジア・トラコマティス感染において無症状である場合の比率は高く（我々の臨床研究では７６％）、それにより診断の遅れやさらなる深刻な複合問題が引き起こされる。クラミジア感染は有病率が高いものの、この性的感染症に関する知識は、公衆衛生のセッティングにおいて、病原体検出感度の低さ、速度の遅さ、時間がかかり、高価で特別な訓練を要することなどの診断方法の様々な制約により、非常に制限されていた。従って、この病原体の検出の成功と迅速な識別が、病気の早期の診断と処置にとって必要となっている。
【０２２８】
本文書は、尿サンプルからクラミジア・トラコマティスを検出するための簡単で迅速で費用対効果が高く、感度が高く特異的なＬＡＭＰアッセイを初めて示すものである。このために、１ゲノムにつき最高１０コピーの割合で存在するという理由から、クラミジア・トラコマティス潜在プラスミドが診断検査のターゲットとして選択された。潜在プラスミドは、ゲノムＤＮＡに比べてヌクレアーゼ損傷に対してより耐性のある、比較的安定した核酸ターゲットである。選択されたＣＤＳ２領域は、何種類かのクラミジア・トラコマティス血液型亜型と高い相同性を共有し、スウェーデン人の変異株の中に存在する。ＬＡＭＰ反応に６つのプライマー（Ｆ３、Ｂ３／ＦＩＰ、ＢＩＰ／ＬＦ、ＬＢ）を用いることで、他の増幅法よりも大きな特異性が提供されるだででなく、増幅時間が加速される。我々のデータは、新規な、クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイが、１反応につき２．５〜６個の病原体に対応する少なくとも２５コピーの潜在プラスミドを（特定の菌株次第で）検出可能であることを示した。従って、前記新規な、クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイは、クラミジア・トラコマティスの検出において１００％特異的であり、簡単にポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）設定に適用することができる。アッセイは全体で３０分もかからず、付加的な装置や訓練された職員を必要とせず、増幅産物はラテラルフロー・ディップスティックを用いて簡単に視覚化可能である。
【０２２９】
現在の調査の焦点は、最小限の処理工程で、直接尿サンプルから病原体を検出することで、ＰＯＣ検査にとって非常に有利な、簡単で便利な適用を可能にすることにもあった。尿それ自体は様々な抑制物質を含んでいる可能性があるので、増幅前にＤＮＡ精製工程を実施していない尿サンプルを用いることは非常に困難なことであった。上記の通り、我々の新規な方法は、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）に基づいており、粗尿から直接病原体を検出することができる。我々の知る限り、ＬＡＭＰ法を用いて直接生物学的サンプルから細菌を検出したというレポートは、ほんのわずかしかない。そこでここに我々は、粗尿において直接クラミジア・トラコマティスの検出を可能にする、初めて開発されたＬＡＭＰアッセイを提示した。従ってそれは、非常に低い病原体検出感度（１０〜４０％）を有する現在のＰＯＣ検査と入れ替わる可能性がある。
【０２３０】
１０％尿の付加により分析感度がわずかに減少する（最大で３倍）という事実にもかかわらず、前記アッセイは、最小限の処理が施された患者のサンプルからクラミジアを検出するのに十分な感度を有していた。ヒトの尿は異なる数のクラミジア細胞を含んでいる可能性があるため、細胞からＤＮＡ材料によりよくアクセスするために病原体細胞膜を成功裏に溶解させることは重要なことであった。そのため、細胞膜を溶解させるための方法が何種類か検査された。９０℃での加熱と溶解ペプチドの適用は、核酸増幅に先立つ尿溶解物の準備への適用可能性をもたらす。従って、我々の新規な方法は、ＬＡＭＰ増幅と迅速なサンプル準備技術（熱溶解またはペプチド溶解を直接臨床サンプルに適用すること）とを成功裏に結びつけた。その結果、前記新規な、クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイにより、全体の感度は、抗菌ペプチド溶解混合物を用いた場合は７３％に、サンプルを増幅反応の前に熱処理にかけた場合は６８％に増加した。シンプルであることと、サンプル前処理法を簡単に適用できることは、真の自己診断検査にとって主要な基準の一つである。従って、クラミジアのような困難な病原体を直接粗尿に溶解させ、遺伝子材料を放出させる最良の方策を見つけることは、非常に重要ことであり、それに続くＬＡＭＰ法による迅速な増幅に適していると思われる。我々のデータは、抗菌ペプチド溶解混合物の適用により、上記の全ての要件を満たした、最も効率的な、新たに開発されたサンプル前処理方法が提供されることを示している。従って、ＰＣＲベースのクラミジア検出アッセイにおけるように予めＤＮＡ精製および濃縮を行う必要がないため、全体の検出に要する労力と時間が減少する。他の等温増幅法またはＰＯＣ免疫測定法と比較し、病原体検出における感度の増加、制御性、簡単さ、迅速な応答時間、高い特異性などの特徴により、我々のクラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイは、ＰＯＣ検査用の最も信頼のおける分子診断ツールとして好ましいものとなっている。これまでの話をまとめると、我々は、粗尿サンプルから直接クラミジア・トラコマティスを特異的に検出する、迅速で高感度のＬＡＭＰアッセイベースの方法を、最初に開発することに成功した。それは様々なＰＯＣ設定における適用への大きな可能性を示す。
【０２３１】
・補足物
【０２３２】
・表Ｓ１−クラミジア・トラコマティスに特化した検出用に選択されたＬＡＭＰプライマー・セット
【表５】
2019507606.tif 000008
【０２３３】
・表Ｓ２−クラミジア・トラコマティスに特化したＬＡＭＰアッセイの増幅時間
【表６】
2019507606.tif 000009
【０２３４】
・表Ｓ３−クラミジア・トラコマティスＬＡＭＰアッセイの特異性の判定に用いられた生命体の一覧
【表７】
2019507606.tif 000010
【０２３５】
・表Ｓ４−淋菌との重感染患者のデータ
【表８】
2019507606.tif 000011
【０２３６】
＊クラミジア・トラコマティスと淋菌の重感染患者（CT&NG"+"）およびクラミジア・トラコマティス陰性と淋菌感染患者（CT"-"&NG"+"）の性別、数、症状有り（SYM）、症状なし（ASYM）
【０２３７】
・実施例２  ループ介在等温増幅を用いて尿サンプルから直接検出する効率よく迅速な大腸菌の検出。
【０２３８】
大腸菌の細菌を含む生物学的サンプル（図６の尿サンプル）は、以下に限定されるものではないがセクロピン群（図６のセクロピンまたはＳＢ−３７）に属する５０μＭの抗菌ペプチドを用いて室温℃で５分間処理される。５μｌの尿サンプルは、ループ介在増幅反応に直接付加され、最終反応体積は５０μｌで最終成分濃度は以下の通りである：０．２μＭのＦ３プライマー、０．２μＭのＢ３プライマー、１．６μＭのＢＩＰプライマー、１．６μＭのＦＩＰプライマー、０．８μＭのＬＦプライマー、０．８μＭのＬＢプライマー、８ｍＭのＭａＳＯ４、１．４ｍＭのｄＮＴＰ、０．８Ｍのｂｅｔａｉｎ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ  ｐＨ８．８、１０ｍＭのＫＣＩ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０および１６ユニットのＢｓｍポリメラーゼ。
【０２３９】
染料のＥｖａＧｒｅｅｎおよびＲＯＸを定量産物検出によるＬＡＭＰ反応に付加することができる、または、ＦＡＭでラベリングされたＢＩＰおよびＬＢプライマーと、ビオチンでラベリングされたＦＩＰおよびＬＦプライマーとをラテラルフロー・ストリップ上での定性的検出に用いることができる。
【０２４０】
図６に示される大腸菌検出の例では、抗菌ペプチドを用いた尿サンプルの前処理によりターゲットＤＮＡの量が６倍に増加した。従来広く用いられていた熱処理およびアルカリによるサンプル準備法では、ターゲットＤＮＡレベルが３倍および２倍に増加した（図６）。従って新たなサンプル前処理法は、ダウンストリーム増幅の適用に適している。数種類の検出方法を用いることができる―――等温によるもの（ＬＡＭＰ−ループ介在等温増幅、ＳＤＡ−鎖置換増幅、ＨＤＡ−ヘリカーゼ依存性増幅、ＲＰＡ−リコンビナーゼポリメラーゼ増幅、ＴＭＡ−転写媒介増幅、ＭＤＡ−複数置換増幅、ＮＡＳＢＡ−核酸配列に基づく増幅、ＮＥＡＲ−ニッキング酵素増幅反応）、および熱サイクリングを要するもの（ＰＣＲ、リアルタイムのＰＣＲ、等）。
【０２４１】
・実施例３−リコンビナーゼポリメラーゼ増幅を用いて患者の尿サンプルから直接検出する迅速かつ高感度のマイコプラズマ・ジェニタリウムの検出。
【０２４２】
朝一番に排出される尿が、５０μＭの抗菌ペプチドを用いて室温℃で５分間処理される。マイコプラズマ・ジェニタリウム・サンプルの前処理には、細胞内マイコプラズマ種に影響を与えるメリチンやグラミシジンペプチド等の抗菌ペプチドを用いることができる。
【０２４３】
抗菌性ペプチドの濃度は、ペプチドおよび生物学的サンプルタイプに応じて低いμＭ（０．１〜１μＭ）から高いμＭ（１００〜１０００μＭ）まで変化し得る。前処理時間は、ペプチド濃度や、ペプチドの種類、ターゲットの生命体、生物学的サンプルのタイプに応じて増減し得る。
生物学的サンプルは、必要であれば、ペプチド処理の前に濃縮または希釈することができる。サンプル前処理法に刺激を与えるために、必要であれば、洗剤、溶菌酵素、アルカリ等の付加的成分を用いることができる。
【０２４４】
ＲＰＡ酵素ペレットは、以下に示す成分を混合することにより準備される４７．５μｌの反応緩衝液を用いて再懸濁される：２．１μｌの１０ｍＭのフォワード・プライマー、２．１μｌの１０ｍＭのリバース・プライマー（反応における各プライマーの最終濃度は０．４２ｍＭ）、２９．５μｌの再水和バッファー（TwistDX）、８．８μｌの再蒸留水）およびマイコプラズマ・ジェニタリウムを潜在的に含んでいる５μｌの生物学的サンプル溶解物（上記の通り準備される）。ＲＰＡ反応は、２．５μｌの２８０ｍＭの酢酸マグネシウムを加えることで開始される。
【０２４５】
ＭＧＰＡおよび１６Ｓ ｒＲＮＡの保存特異領域をターゲットとする、マイコプラズマ・ジェニタリウムに特化したプライマーを用いることができる。適切な配列の例は、特許出願PCT/EP2013/071906に列挙されている。フォワード・プライマーは、ビオチンでラベリングされ、リバース・プライマーは6-カルボキシフルオセイン（ＦＡＭ）でラベリングされる。これにより、ラテラルフロー・ストリップ上で、ビオチン−ＦＡＭで二重にラベリングされた産物の検出が可能となる。ＤＩＧや他のオリゴヌクレオチド・リンカー等の異なる種類のオリゴヌクレオチド・ラベリングを用いることができる。
【０２４６】
反応は３８℃で１０〜３０分間培養される。４分間の培養の後、反応は試験管を振ることで混合される。マイコプラズマ・ジェニタリウム感染の定性ラテラルフロー・ストリップの結果を得るまで、全体の工程は１５〜３５分かかる。
【０２４７】
・実施例４−ループ介在等温増幅を用いて患者の尿サンプルから直接検出する迅速かつ高感度の淋菌の検出。
尿サンプルや、膣や、直腸、頸部、尿道の標本を含む生物学的サンプルが収集される。尿を用いる場合には、十分な数の病原体核酸が確実に存在しているように、朝一番に排出される尿が用いられる。必要な場合、ペプチド前処理に先立って、生物学的サンプルは濃縮または希釈される。サンプルは５０μＭの抗菌ペプチドを用いて室温℃で５分間処理される。ナイセリア種については、デルマセプチン、ＬＬ−３７、ＰＧ−１等の抗菌ペプチドを、これに限定されるものではないが用いることができる。抗菌ペプチドの濃度は変動する可能性があり、ペプチドの溶解効果を刺激するために洗剤（や他の成分）を付加することができる。前処理時間は、ペプチド濃度や生物学的サンプルのタイプに応じて増減し得る。
【０２４８】
最終反応体積が５０μｌで、最終成分濃度が以下の通りとなるように５μｌの生物学的サンプル溶解物が、ループ介在等温増幅反応に直接付加される：０．２μＭのＦ３プライマー、０．２μＭのＢ３プライマー、１．６μＭのビオチンでラベリングされたＢＩＰプライマー、１．６μＭのＦＡＭでラベリングされたＦＩＰプライマー、０．８μＭのＦＡＭでラベリングされたＬＦプライマー、０．８μＭのビオチンでラベリングされたＬＢプライマー、８ｍＭのＭｇＳＯ４、１．４ｍＭのｄＮＴＰ、０．８Ｍのｂｅｔａｉｎ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ  ｐＨ８．８、１０ｍＭのＫＣＩ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０および１６ユニットのＢｓｍポリメラーゼ。
【０２４９】
増幅反応ごとの生物学的サンプルの量は、サンプルタイプや必要とされる感度に応じて変わり得る。ＭｇＳＯ４、ｄＮＴＰおよびｂｅｔａｉｎの濃度は、前記反応に用いられる特異的ターゲットやポリメラーゼに応じて最適な感度を得るために変わり得る。ＤＩＧや他のオリゴヌクレオチド・リンカー等の何種類かのオリゴヌクレオチド・ラベリングを用いることができる。淋菌に特化した感度の検出には、Ｏｐａ、ＰｏｒＡ、ｐｉｌｉｎまたは１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとして、表８に列挙されたプライマー配列を用いることができる。
【０２５０】
６３℃で２０〜２５分間の培養後、淋菌に特異的な産物の形成がラテラルフロー・ストリップを用いて分析される。患者が淋菌陽性の場合、ラテラルフロー・ストリップ上に２本のストライプが、１本は「テスト」領域に、もう１本は「制御」領域に、現れる。患者が淋菌陰性の場合、ラテラルフロー・ストリップ上に１本のストライプのみが「制御」領域に現れる。淋菌試験は、全体で３０分要する。
【０２５１】
・実施例５−ダウンストリーム増幅効率に対する抗菌ペプチドの効果。
上記の方法では、増幅に先立ち溶解物準備成分を取り除く必要がない。従って、選択された膜活性ペプチドの効果は、ダウンストリーム増幅で評価されなければならない。
【０２５２】
いくつかの効果的なサンプル準備方法は、ＳＤＳやプロテイナーゼＫ等の、ダウンストリーム増幅反応に対して著明な抑制を示す成分を含んでいるため、生物学的サンプル溶解物からの直接の増幅には適用できず、核酸を精製する工程を追加する必要がある。
【０２５３】
ダウンストリーム適用効率に対する何種類かの溶解物準備方法（アルカリ、酵素、洗剤溶解物）および抗菌ペプチドの潜在的な抑制効果を評価するために、我々は様々な種類の細胞融解物質の存在下においてＬＡＭＰ等温増幅を実行した（図４〜５）。
【０２５４】
ＬＡＭＰ反応へのリゾチームの付加は、増幅効率に対して極めてささやかな影響を及ぼした。しかし、溶解増強剤（ポリエチレングリコールＰ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテルまたはＥＤＴＡ）と組み合わせることにより、等温増幅効果は著しく減少した。アルカリ溶解成分は、等温増幅に大きな影響を与え、ＬＡＭＰ活動を最大で２５倍減少させた（図４）。従って、数種類の溶解準備方法の成分は、著しくダウンストリーム適用を抑制し、それらの適用を制限する。
【０２５５】
抗菌ペプチドは、しばしばカチオン性両親媒性構造を形成し、負に帯電した脂質二重層と相互作用する。αヘリックス構造、βターン構造、逆平行βシート構造、およびβヘアピン構造は、しばしば天然のＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質の中に見出される。従って、抗菌タンパク質は、テンプレートＤＮＡの結合を介して増幅に干渉する可能性を潜在的に有している。マガイニン・アナログＭＳＩ−７８とＭＳＩ−５９４の付加は、実際に増幅効率に対して非常に厳しい抑制効果をもたらした（図５）。一方、セクロピン（Ｐ１およびＳＢ−３７）およびボンボリチンＩＩＩがＬＡＭＰ反応に対してほんの少しの抑制を示したのに対し、メリチンはアルカリ溶解成分に匹敵する抑制効果をもたらした（図５）。従って、特定の溶解ペプチドは、それらのダウンストリーム適用に対する効果のために、他の溶解ペプチドよりも溶解物の準備に適していると言えるであろう。しかし、ＡＭＰの細胞溶解活動を考慮に入れると、他の溶解物準備方法に比べ、それらのダウンストリーム適用に対する効果は極めて小さい。
【０２５６】
・実施例６−抑制データ。
サンプルの中には、アッセイ、特に増幅反応、の故障を引き起こし、偽陰性の診断結果を出すことでアッセイの感度に影響を与える抑制成分を含んだものがあってもよい。本発明は、サンプル前処理と、抗抑制行動も伴う溶解成分カクテルとをバランスよく含んでいる。（処理済みの）尿の中に
０．１μＭのＡＭＰ（セクロピンＰ１）
１０ｍＭのＥＤＴＡ
０．４％のＴＸ１００（界面活性剤）
が含まれた、この開発された溶解混合物（カクテル）を用いることにより、未処理の尿サンプルに比較して、抑制効果が著しく抑圧された、ここで前記サンプルには、特に１３％のサンプルにはＣＴ（クラミジア・トラコマティス）ＤＮＡが入れられた。従って、前処理過程においては、ホストと病原体細胞の溶解が重要であるだけではなく、サンプル・マトリックスによって引き起こされる抑制効果と、異なる患者間における高い変動性とを抑圧することも重要である。
【表９】
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【０２５７】
・実施例７−淋菌と反応性。
本発明家らは、実施例１に記載されたクラミジア・トラコマティス用の方法と同じ方法を用いて淋菌用のプライマー・セットをいくつか開発した。現在好ましいものを以下に列挙する。設定されたＬＯＤ（limit of detection:検出限界）は、２３０コピー／ｒｘｎ（１反応当たり）である。また、他のナイセリア株に対する交差反応（偽陽性の可能性を評価するために重要である）が評価された。その結果を以下に示す。
交差反応（ナイセリア株に焦点をおいて)
【表１０】
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【０２５８】
交差反応は、尿では滅多に見られない菌株であるナイセリア・ラクタミカについてのみ検出された。
【０２５９】
他のプライマーに対しても全く同じ交差反応が評価されたが、それらは高い交差反応率を示した。その結果を以下に示す。
【表１１】
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【０２６０】
ナイセリア・シネレア、ナイセリア・フラバ、ナイセリア・ラクタミカ、ナイセリアとの交差反応
【表１２】
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【０２６１】
このプライマー・セットは最良のＬＯＤ（７７コピー／ｒｘｎ）を示したが、検査された全てのナイセリア株との交差反応を示したため、診断用にはあまり適していない。
【０２６２】
表１  淋菌仮想タンパク質２０８６ターゲットを検出するプライマー
【表１３】
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【０２６３】
表２  淋菌仮想タンパク質１４３０ ＬＤ３１ターゲットを検出するプライマー
【表１４】
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【０２６４】
表３  淋菌１６Ｓ ｒＲＮＡ ｉｄ０７ターゲットを検出するプライマー
【表１５】
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【０２６５】
交差反応は、尿では滅多に見られない菌株であるナイセリア・ラクタミカについてのみ検出された。
【０２６６】
他のプライマーに対しても全く同じ交差反応が評価されたが、それらは高い交差反応率を示した。その結果を以下に示す。
【０２６７】
・淋菌検出用の全く同じ溶解混合物（即ち尿の中に０．１μＭのＡＭＰ／１０ｍＭのＥＤＴＡ／０．４％のＴＸ１００）を用いる場合、感度および特異性は以下の通りである。
【表１６】
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【０２６８】
淋菌検出用の全く同じ溶解混合物（即ち尿の中に０．１μＭのＡＭＰ／１０ｍＭのＥＤＴＡ／０．４％のＴＸ１００）を用いる場合、感度および特異性は以下の通りである。
【表１７】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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