(57)【要約】本発明は、組織試料由来の生体分子を溶解させるための水性組成物の使用、および組織試料由来の生体分子を溶解させるための水性組成物の使用方法に関する。さらには、本発明は、動物の組織試料を調製するためのシステムに関する。一実施形態では、前記水性組成物は、好適な容器内に含有され、そのような容器は、好ましくは、組織サンプリングの前には前記組織サンプリングタグまたは前記組織サンプリング生検針の一部分を形成するが、そのような容器は、前記組織サンプリングタグまたは前記組織サンプリング生検針の取り外し可能な一部分であり、組織サンプリング後にそれらから取り外され得るかつ／または取り外される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の組織試料由来の核酸、好ましくはＤＮＡ、およびタンパク質から選択される生体分子を溶解させるため、および、その後の
ａ）前記生体分子の保存、または
ｂ）前記生体分子のさらなる処理
のための水性組成物の使用であって、前記使用は、以下：
−  動物の組織をサンプリングして、前記動物の組織試料を作製するステップ、
−  サンプリング後に直ちに、規定の期間、前記組織試料を水性組成物と接触させることによって、前記試料を前記組成物に曝露するステップであって、前記組成物は、
−  ２５℃において７〜９のｐＨ範囲に緩衝化することが可能であり、任意選択で、酸性化剤またはアルカリ化剤などのｐＨ調整剤を含む、緩衝剤と、
−  界面活性剤と、
−  ５〜１０重量％の濃度の塩と、
−  キレート剤および水と
を含み、
−  ここで、動物の前記組織は、組織サンプリングタグ、好ましくは耳札、または組織サンプリング生検針を使用してサンプリングされ、かつ前記試料は、前記試料を前記組成物中に導入することによって前記組成物と接触させられ、かつ前記試料を前記組成物に曝露することによって、前記組織試料由来の核酸およびタンパク質から選択される生体分子は、前記水性組成物中に溶解されて、生体分子溶液を生じる、ステップ、
−  前記生体分子の保存、または、前記生体分子のさらなる処理、例えば、病原体、例えばＢＶＤＶの検出、もしくは遺伝子型判定、シークエンシング、ハイブリダイゼーション解析、もしくは定量的リアルタイムＰＣＲのために前記生体分子溶液を使用するステップ、あるいは、マーカータンパク質、またはマーカー核酸、薬物、ホルモン、または代謝産物の検出のために前記生体分子溶液を使用するステップ、
−  任意選択で、後に使用するために前記組織試料を貯蔵するために前記水性組成物を使用するステップ
を含む、使用。
【請求項２】
前記塩が、１Ｍ〜２Ｍ、好ましくは１Ｍ〜１．５Ｍ、より好ましくは１．３Ｍ〜１．５Ｍ、よりいっそう好ましくは１．４Ｍの濃度で存在するＮａＣｌである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記水性組成物が、プロテイナーゼＫ、好ましくはいかなるプロテイナーゼも含有しない、請求項１または２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
前記組成物中の前記界面活性剤が、Ｎ−ラウロイルサルコシン、好ましくはＮ−ラウロイルサルコシンのナトリウム塩である、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記緩衝剤がトリスであり、かつ／または前記キレート剤がＥＤＴＡ、好ましくはＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物であり、かつ／または前記ｐＨ調整剤がアルカリ水酸化物、例えばＮａＯＨもしくはＫＯＨである、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記水性組成物が、以下の成分：
トリス  ５〜２０ｍＭ、好ましくは１０〜１５ｍＭ
ＮａＯＨ  ５〜２０ｍＭ、好ましくは８〜１０ｍＭ
Ｎ−ラウロイルサルコシンのナトリウム塩  ２〜１５ｍＭ、好ましくは５〜８ｍＭ、より好ましくは６〜７ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ  １〜５ｍＭ、好ましくは１〜３ｍＭ
ＮａＣｌ  １〜３Ｍ、好ましくは１〜２Ｍ、より好ましくは１〜１．５Ｍ、より好ましくは１．３〜１．５Ｍ
水
および、任意選択で、生体分子、好ましくは核酸の存在を指し示す色素
を含み、好ましくは前記成分からなる、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記水性組成物が、以下の成分：
トリス  １３ｍＭ
ＮａＯＨ  ８．５〜８．６ｍＭ、好ましくは８．５５ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ  １．９〜２．１ｍＭ、好ましくは１．９９〜２ｍＭ
Ｎ−ラウロイルサルコシンのナトリウム塩  ６〜７ｍＭ、好ましくは６．７〜６．９ｍＭ、より好ましくは６．８ｍＭ
ＮａＣｌ  １．３５〜１．４５Ｍ、好ましくは１．３８〜１．４２Ｍ、および
水
を含み、好ましくは前記成分からなる、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記生体分子溶液が、前記生体分子のさらなる処理のために使用され、前記さらなる処理は、前記生体分子溶液中、したがって前記組織試料中のＢＶＤＶの検出であり、好ましくは、ＢＶＤＶの前記検出は、核酸増幅および増幅された前記核酸の検出を介して、または、ＢＶＤＶタンパク質のＥＬＩＳＡなどのＢＶＤＶタンパク質の抗体に基づく検出を介して為される、上記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
動物の組織試料を、その後の
ａ）前記組織の遺伝子型判定、
ｂ）前記組織中の病原体の検出、または
ｃ）後に使用するための前記組織試料の貯蔵および保存
のために調製するためのシステムであって、
前記システムは、組織サンプリングタグ、好ましくは組織サンプリング耳札、または組織サンプリング生検針、および動物の組織試料由来の生体分子を溶解させるための水性組成物を含み、前記組成物は容器中に含有されており、前記組成物は、請求項１〜７のいずれかにおいて記載されるものである、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織試料由来の生体分子を溶解させるための水性組成物の使用、および組織試料由来の生体分子を溶解させるための水性組成物の使用方法に関する。さらには、本発明は、動物の組織試料を調製するためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
家畜動物をタグ付けし、それと同時に前記動物から試料を採取するために、組織サンプリングタグが今日一般に使用されている。そのような試料はその後、特定の遺伝形質、病原体の存在もしくは不在について、または前記動物の遺伝子型判定のために、試験室において分析される。あるいは、試料は、前記試料が採取された動物の起源を追跡するために、単に保持され、貯蔵される。組織試料は、組織サンプリングタグ、または生検針などの組織サンプリングユニットを使用することによって得られ得る。組織サンプリングタグは一般に公知であり、また例えば本出願人であるＡｌｌｆｌｅｘ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｓ．Ａ．から市販されている。
【０００３】
試料をさらに分析するために、それをさらに処理することが必要である。これは通常、動物から試料を得た後にそれを輸送した試験室において行われる。ＷＯ９９／１２４７５には、試料のさらなる処理用の不特定の試薬を含有する耳札の試料カプセルが開示されている。ＥＰ１０８８２１２には、組織試料のタンパク質部分を不活化するための材料が含有された試料受け入れ容器を含む耳札が開示されている。組織試料のタンパク質部分を不活化するためのそのような材料の例として、以下のものが言及されている：プロテイナーゼＫ、強アルカリ性溶液、モレキュラーシーブ、および試料中のタンパク質部分の不活化を支援するその他の成分。このアプローチによれば、組織試料は組織試料受け入れ容器中に含有され、そこでそのタンパク質部分が不活化される。試料は、試料の実際の分析が行われる試験室に輸送される。先行技術に開示されるような手順は、労力を要し、かつ時間を消費する。それは、試験室での多数のワークアップステップを必要とし、最終的に試料を全て失うことに繋がり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第９９／１２４７５号
【特許文献２】欧州特許出願公開第１０８８２１２号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、先行技術による処理を改善するために為されたものである。したがって、本発明の目的は、組織試料のより迅速な処理を可能とする方法論を提供することであった。さらには、本発明の目的は、より長い期間にわたって組織試料を貯蔵することを可能とするのと同時に、特定の遺伝形質（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒａｄｅ）、その遺伝子型、ＢＶＤＶなどのある特定の病原体の存在または不在に関して試料の即座の分析を実施できる方法論を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
全てのこれらの目的は、動物の組織試料由来の核酸、好ましくはＤＮＡ、およびタンパク質から選択される生体分子を溶解させるため、および、その後の
ａ）前記生体分子の保存、または
ｂ）前記生体分子のさらなる処理
のための水性組成物の使用であって、前記使用は、以下：
−  動物の組織をサンプリングして、前記動物の組織試料を作製するステップ、
−  サンプリング後に直ちに、規定の期間、前記組織試料を水性組成物と接触させることによって、前記試料を前記組成物に曝露するステップであって、前記組成物は、
−  ２５℃において７〜９のｐＨ範囲に緩衝化することが可能であり、任意選択で、酸性化剤またはアルカリ化剤などのｐＨ調整剤を含む、緩衝剤と、
−  界面活性剤と、
−  ５〜１０重量％の濃度の塩と、
−  キレート剤および水と
を含み、
−  ここで、動物の前記組織は、組織サンプリングタグ、好ましくは耳札、または組織サンプリング生検針を使用してサンプリングされ、かつ前記試料は、前記試料を前記組成物中に導入することによって前記組成物と接触させられ、かつ前記試料を前記組成物に曝露することによって、前記組織試料由来の核酸およびタンパク質から選択される生体分子は、前記水性組成物中に溶解されて、生体分子溶液を生じる、ステップ、
−  前記生体分子の保存、または、前記生体分子のさらなる処理、例えば、病原体、例えばＢＶＤＶの検出、もしくは遺伝子型判定、シークエンシング、ハイブリダイゼーション解析、もしくは定量的リアルタイムＰＣＲのために前記生体分子溶液を使用するステップ、あるいは、マーカータンパク質、またはマーカー核酸、薬物、ホルモン、または代謝産物の検出のために前記生体分子溶液を使用するステップ、
−  任意選択で、後に使用するために前記組織試料を貯蔵するために前記水性組成物の部分を使用するステップ
を含む、使用によって解決される。
【０００７】
一実施形態では、前記水性組成物は、好適な容器内に含有され、そのような容器は、好ましくは、組織サンプリングの前には前記組織サンプリングタグまたは前記組織サンプリング生検針の一部分を形成するが、そのような容器は、前記組織サンプリングタグまたは前記組織サンプリング生検針の取り外し可能な一部分であり、組織サンプリング後にそれらから取り外され得るかつ／または取り外される。
【０００８】
一実施形態では、前記曝露するステップは、サンプリングから０．１秒から１０秒後の期間内、好ましくはサンプリングから０．１秒から５秒後の期間内に行われる。
【０００９】
一実施形態では、前記水性組成物は、アルカリ水酸化物などのアルカリ化剤、より好ましくはＮａＯＨまたはＫＯＨも含む。
【００１０】
一実施形態では、前記塩は、１Ｍ〜２Ｍ、好ましくは１Ｍ〜１．５Ｍ、より好ましくは１．３Ｍ〜１．５Ｍ、よりいっそう好ましくは１．４Ｍの濃度で存在するＮａＣｌである。
【００１１】
一実施形態では、前記水性組成物は、プロテイナーゼＫ、好ましくはいかなるプロテイナーゼも含有しない。
【００１２】
一実施形態では、前記組成物中の前記界面活性剤は、Ｎ−ラウロイルサルコシン、好ましくはＮ−ラウロイルサルコシンのナトリウム塩である。
【００１３】
一実施形態では、前記緩衝剤はトリスであり、かつ／または前記キレート剤はＥＤＴＡ、好ましくはＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物である。
【００１４】
一実施形態では、前記水性組成物は、以下の成分：
トリス  ５〜２０ｍＭ、好ましくは１０〜１５ｍＭ
ＮａＯＨ  ５〜２０ｍＭ、好ましくは８〜１０ｍＭ
Ｎ−ラウロイルサルコシンのナトリウム塩  ２〜１５ｍＭ、好ましくは５〜８ｍＭ、より好ましくは６〜７ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ  １〜５ｍＭ、好ましくは１〜３ｍＭ
ＮａＣｌ  １〜３Ｍ、好ましくは１〜２Ｍ、より好ましくは１〜１．５Ｍ、より好ましくは１．３〜１．５Ｍ
水
および、任意選択で、生体分子、好ましくは核酸の存在を指し示す色素
を含み、好ましくは前記成分からなる。
【００１５】
一実施形態では、前記水性組成物は、以下の成分：
トリス  １３ｍＭ
ＮａＯＨ  ８．５〜８．６ｍＭ、好ましくは８．５５ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ  １．９〜２．１ｍＭ、好ましくは１．９９〜２ｍＭ
Ｎ−ラウロイルサルコシンのナトリウム塩  ６〜７ｍＭ、好ましくは６．７〜６．９ｍＭ、より好ましくは６．８ｍＭ
ＮａＣｌ  １．３５〜１．４５Ｍ、好ましくは１．３８〜１．４２Ｍ、および
水
を含み、好ましくは前記成分からなる。
【００１６】
一実施形態では、前記生体分子溶液は、前記生体分子のさらなる処理のために使用され、前記さらなる処理は、前記生体分子溶液中、したがって前記組織試料中のＢＶＤＶの検出であり、好ましくは、ＢＶＤＶの前記検出は、核酸増幅および増幅された前記核酸の検出を介して、または、ＢＶＤＶタンパク質のＥＬＩＳＡなどのＢＶＤＶタンパク質の抗体に基づく検出を介して為される。
【００１７】
本発明の目的は、また、動物の組織試料を、その後の
ａ）前記組織の遺伝子型判定、
ｂ）前記組織中の病原体の検出、または
ｃ）後に使用するための前記組織試料の貯蔵および保存
のために調製するためのシステムであって、
前記システムは、組織サンプリングタグ、好ましくは組織サンプリング耳札、または組織サンプリング生検針、および動物の組織試料由来の生体分子を溶解させるための水性組成物を含み、前記組成物は容器中に含有されており、前記組成物は、上で規定されるものである、システムによって解決される。
【００１８】
一実施形態では、前記水性組成物は、好適な容器内に含有され、そのような容器は、好ましくは、組織サンプリングの前には前記組織サンプリングタグまたは前記組織サンプリング生検針の一部分を形成するが、そのような容器は、前記組織サンプリングタグまたは前記組織サンプリング生検針の取り外し可能な一部分であり、組織サンプリング後にそれらから取り外され得るかつ／または取り外される。
【００１９】
本明細書中で使用する場合、「動物の組織試料を調製するためのシステム」という用語は、作動可能に互いに連結した製品の組み合わせを指すことを意図する。そのようなシステムに含まれる製品は、組織サンプリングタグ、好ましくは組織サンプリング耳札、または組織サンプリングタグの代わりに組織サンプリング生検針、および、それらと作動可能に連結した、本発明による組織試料由来の生体分子を溶解させるための水性組成物である。本明細書中で使用する場合、「作動可能に連結した」という用語は、一方では組織サンプリングタグまたは組織サンプリング生検針と、他方では水性組成物との間の物理的接続を指し得るか、あるいは、組織試料のサンプリング後に、本発明による水性組成物を組織サンプリングタグまたはその部分と物理的に接触させることなく、そのような組織試料がそのような組成物と直ちに接触され得るように、本発明による水性組成物が提供される構成を指し得る。例えば、一実施形態では、前記水性組成物は、好適な容器内に含有されてもよく、そのような容器は、好ましくは、組織サンプリングの前には前記システムの前記組織サンプリングタグまたは前記組織サンプリング生検針の一部分を形成するが、そのような容器は、前記組織サンプリングタグまたは前記組織サンプリング生検針または前記システムの取り外し可能な一部分であり、組織サンプリング後にそれらから取り外され得るかつ／または取り外される。試料を組成物と接触させるという文脈において本明細書中で使用される場合、「〜と接触させる」という用語は、組織試料が水性組成物と物理的に接続させられる行為を指し得る。そのような行為は、すすぐ、浸す、しみ込ませる、沈める、浴す、つける（ｄｕｎｋｉｎｇ）、軽く浸す（ｄｉｐｐｉｎｇ）、または組織試料を前記水性組成物で完全にもしくは部分的に被覆することであり得る。本明細書中で使用する場合、「組織サンプリングタグ」という用語は、動物に、（動物と共にあるまま、動物中にあるまま、動物上にあるまま、または任意のその他の様式で動物に取り付けられたままとなる）タグまたは目印を提供することができると共に、それと並行してその後の使用のためにその動物から組織試料を得ることができるデバイスを指す。本明細書中で使用する場合、「組織サンプリングユニット」、またはそれと同義の「組織サンプリング生検針」は、それを用いた例えば、こすり取る、穿孔する、裂く、またはその他の行為を通じて動物から組織試料を得ることができるが、前記動物にプラスチック、金属、または木から作られたタグなどのタグまたは目印を取り付けない器具を指すことを意図する。
【００２０】
本発明の目的は、また、動物の組織試料由来の核酸、好ましくはＤＮＡ、およびタンパク質から選択される生体分子を溶解させるため、および、その後の
ａ）前記生体分子の保存、または
ｂ）前記生体分子のさらなる処理
のための水性組成物を使用する方法であって、前記方法は、以下：
−  動物の組織をサンプリングして、前記動物の組織試料を作製するステップ、
−  サンプリング後に直ちに、規定の期間、前記組織試料を水性組成物と接触させることによって、前記試料を前記組成物に曝露するステップであって、前記組成物は、
−  ２５℃において７〜９のｐＨ範囲に緩衝化することが可能であり、任意選択で、酸性化剤またはアルカリ化剤などのｐＨ調整剤を含む、緩衝剤と、
−  界面活性剤と、
−  ５〜１０重量％の濃度の塩と、
−  キレート剤および水と
を含み、
−  ここで、動物の前記組織は、組織サンプリングタグ、好ましくは耳札、または組織サンプリング生検針を使用してサンプリングされ、かつ前記試料は、前記試料を前記組成物中に導入することによって前記水性組成物と接触させられ、かつ前記試料を前記水性組成物に曝露することによって、前記組織試料由来の核酸およびタンパク質から選択される生体分子は、前記水性組成物中に溶解されて、生体分子溶液を生じる、ステップ、
−  前記生体分子の保存、または、前記生体分子のさらなる処理、例えば、病原体、例えばＢＶＤＶの検出、もしくは遺伝子型判定、シークエンシング、ハイブリダイゼーション解析、もしくは定量的リアルタイムＰＣＲのために前記生体分子溶液を使用するステップ、あるいは、マーカータンパク質、またはマーカー核酸、薬物、ホルモン、または代謝産物の検出のために前記生体分子溶液を使用するステップ、
−  任意選択で、後に使用するために前記組織試料を貯蔵するために前記水性組成物を使用するステップ
を含む、方法によって解決される。
【００２１】
一実施形態では、前記水性組成物は、好適な容器内に含有され、そのような容器は、好ましくは、組織サンプリングの前には前記組織サンプリングタグまたは前記組織サンプリング生検針の一部分を形成するが、そのような容器は、前記組織サンプリングタグまたは前記組織サンプリング生検針の取り外し可能な一部分であり、組織サンプリング後にそれらから取り外され得るかつ／または取り外される。
【００２２】
本発明者らは、驚くべきことに、組織試料を直ちに本発明による好適な水性組成物に曝露することによって、組織試料を動物から得た後に直ちにその処理を開始することができることを見出した。本発明の実施形態によれば、そのような好適な水性組成物は、少なくとも５〜１０重量％または少なくとも１Ｍの高い塩濃度、界面活性剤、キレート剤、および緩衝剤の存在によって特徴付けられる。組織試料を動物から採取した後、それを直ちに本発明による水性組成物に曝露する。本明細書中で使用する場合、「直ちに」という用語は、０．５秒から２分、好ましくは０．５秒から２０秒、より好ましくは０．５秒から５秒に及ぶ期間を指すことを意図する。試料が前記水性組成物に曝露されるその後の曝露時間は、５分から数時間、例えば、１時間、２時間、３時間、・・・１２時間、・・・２４時間、・・・４８時間、・・・７２時間、・・・１２０時間、・・・１６８時間、・・・、３３６時間、・・・、７２０時間といった任意の期間であり得る。本発明の実施形態による水性組成物は、試料の貯蔵および／または保存を助けるだけでなく、そのような試料由来の核酸およびタンパク質から選択される生体分子を組成物中に溶解させるのも助け、したがってこの組成物を、いかなるさらなるワークアップステップも行うことなく、その後に直接使用することができる。本発明の実施形態によれば、水性組成物は、２５℃において７〜９のｐＨ範囲に緩衝化することが可能な緩衝剤、界面活性剤、少なくとも５〜１０重量％または少なくとも１Ｍの濃度の塩、キレート剤、および水、ならびに任意選択で、酸性化剤またはアルカリ化剤などのｐＨ調整剤（ｐＨ−ｓｅｔｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含む。一実施形態では、前記塩の濃度は、５〜１０重量％または１Ｍ〜３Ｍ、好ましくは１〜２Ｍ、より好ましくは１〜１．５Ｍの範囲内である。好適な緩衝剤は様々である。良好な例はトリスである。
【００２３】
本明細書中で使用する場合、「緩衝剤」という用語は、当業者によって理解される緩衝剤の概念を指すことを意図する。より具体的には、それは、弱酸とその共役塩基との組み合わせ、または弱塩基とその共役酸との組み合わせであって、水に溶解した時に、規定の範囲内にｐＨ値を保つことができるものを指す。そのような「緩衝剤」は、「緩衝系」とも呼称され得る。本発明の実施形態において使用され得る好適な緩衝剤としては、ＴＡＰＳ、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、トリス、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、およびＭＯＰＳが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
いかなる理論に縛られることも望まないが、本発明者らは、本発明による水性組成物が、動物の組織試料を前記水性組成物に曝露すると、前記組織試料を起源とする生体分子を取り込むことができることを見出したと考える。これらの生体分子は、穿孔する、裂く、またはこするなどの組織サンプリング行為に起因する組織試料中の一部の細胞の機械的溶解／破砕に起因して、組織試料から漏出することがあり得、または、生体分子の一部が、本発明による水性組成物中の界面活性剤の存在に起因して、組織試料から放出されることがあり得る。本発明による水性組成物中に組み込まれる、好ましくはその中に溶解される「生体分子」は、前記組織試料由来の核酸、タンパク質、またはその両方であり得る。同様にまたは代替的に、それらは、組織試料中に含有された、代謝産物または外来物質、例えば薬物であり得る。「生体分子」は、組織試料が採取された動物由来の生体分子であり得るか、または、それらは、その動物を冒す病原体に由来する生体分子であり得る。好ましい実施形態では、本発明による水性組成物中に取り込まれる生体分子は核酸である。別の実施形態では、そのような生体分子はタンパク質である。他のさらなる実施形態では、そのような生体分子は、核酸およびタンパク質の両方の組み合わせである。
【００２５】
本明細書中で使用する場合、「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方の混合物である。
【００２６】
前記組成物の界面活性剤として、種々の界面活性剤が使用され得る。好適な例としては、ＳＤＳまたはＮ−ラウロイルサルコシン、好ましくはそのナトリウム塩が挙げられる。キレート剤についても多くの例があり、好適なものとしては、ＥＤＴＡ、好ましくはＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏである。本発明者らは、驚くべきことに、水性組成物が、潜在的な将来の使用のために可能な限り組織をインタクトに保つことを可能にするのと同時に、組成物は試料を起源とする生体分子を溶解させるので、それを用いた試験室でのさらなる分析作業を促進することを見出した。これらの生体分子は、十分に高い濃度において水性組成物中に存在して、水性組成物中のそのような（液体の）生体分子溶液のさらなる処理を可能とする。そのため例えば、動物の核酸および／またはタンパク質、ならびにウイルス（例えば、ＢＶＤＶ）などの前記動物を冒す病原体は、試料を水性組成物に曝露すると、組織の外に染み出され得る。これは、数分間で、すなわち、試料が飼育場から試験室への輸送の途中にうちに済むほど速やかに起こり得る。本明細書中で使用する場合、「動物」という用語は、任意の家畜動物または農場動物、好ましくは、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、およびその他の好適な家畜動物を指すことを意図する。
【００２７】
本発明の実施形態による水性組成物は、その中に溶解された生体分子を保存するためにも好適である。したがって、本発明の実施形態による水性組成物は、その中に溶解された生体分子を直ちにさらに処理するために役立ち得るだけでなく、その中に浸されている組織試料または水性組成物中に溶解された生体分子のいずれかの長期間の貯蔵のためにも役立ち得る。本発明者らは、驚くべきことに、前記水性組成物中に溶解された生体分子は、数週間から数ヶ月間などの長期にわたってその中に貯蔵され得ることを見出した。同様に、組織試料は、数週間から数ヶ月間などの長期にわたって本発明による水性組成物中に貯蔵され得る。生体分子または組織試料のそのような貯蔵の例示的な期間は、１週間から１２ヶ月間、例えば、２週間、３週間、４週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、または１２ヶ月間である。
【００２８】
一実施形態では、水性組成物は、プロテイナーゼＫ、好ましくはいかなるプロテイナーゼも含有しない。本発明者らは、驚くべきことに、プロテイナーゼＫ、またはいかなるプロテイナーゼさえ存在しないにも関わらず、それでもなお、遺伝子型判定、またはＢＶＤＶなどの病原体の検出などのさらなる処理のために十分に高くかつ純粋な核酸濃度を得ることが可能であることを見出した。
【００２９】
一実施形態では、本発明の実施形態による水性組成物中の塩は、高濃度、好ましくは、１Ｍ〜３Ｍ、好ましくは１Ｍ〜２Ｍ、より好ましくは１〜１．５Ｍ、より好ましくは１．３Ｍ〜１．５Ｍ、よりいっそう好ましくは約１．４Ｍの範囲内の濃度において存在する。一実施形態では、そのような塩はＮａＣｌである。
【００３０】
本発明者らは、驚くべきことに、組織サンプリングタグまたは組織サンプリング生検針と組み合わせた水性組成物中の高濃度の塩の使用は、大きな困難なく、組織試料の処理、および所望であれば長期間の貯蔵／保存を可能とすることを見出した。具体的には、本発明による高濃度の塩を含有する水性組成物は、組織試料を一旦それに曝露したら、それ自体がさらなる分析のために使用され得る。多くの下流の処理適用のために、高濃度の塩の存在は、そのような高い塩の水性組成物中に含有される生体分子のさらなる分析に干渉しない。水性組成物中の高濃度の塩の存在がその後の適用に干渉する場合においては、そのような高い塩濃度は、組成物の生体分子含有量に影響することなく、単純な脱塩ステップまたは透析ステップによって容易に除去され得る。例えば、脱塩は、例えばＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＰＤ−１０脱塩カラムなどの市販の好適な脱塩カラムによって容易に達成することができる。
【００３１】
多くの異なる界面活性剤が、本発明による水性組成物中に存在し得る。好ましい界面活性剤は、Ｎ−ラウロイルサルコシン、好ましくはそのナトリウム塩である。Ｎ−ラウロイルサルコシンは、前記水性組成物中に存在する高濃度の塩にとって特に好適なようである。本発明の実施形態によれば、好ましい緩衝剤はトリスであり、好ましいキレート剤はＥＤＴＡ、好ましくはその二ナトリウム二水和物である。
【００３２】
本発明によれば、本発明による水性組成物は、長期にわたって生体分子または組織試料を保存するため、ならびに／あるいは前記生体分子および／または組織試料のさらなる処理のために使用され得る。そのようなさらなる処理は、動物由来の組織試料のゲノムＤＮＡに関する診断試験であり得、これは、そのような組織試料の遺伝子型判定、すなわち特定の遺伝形質の存在または不在の検出を伴い得る。そのような遺伝子型判定としては、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の同定、ゲノムＤＮＡのランダム増幅多型検出（ＲＡＰＤ）、増幅断片長多型検出（ＡＦＬＰＤ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡシークエンシング、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ、核酸マイクロアレイまたはビーズへのハイブリダイゼーションを挙げることができる。一部の実施形態では、さらなる処理は、同様にまたは代替的に、病原体の検出を含み得る。そのような病原体は、ウイルス、細菌、または、寄生生物などの単細胞もしくは多細胞真核生物であり得る。そのような病原体の検出は、それらの核酸またはタンパク質を介して為され得る。核酸の検出は、既に記載されている通り、適切な核酸技術、例えば、ハイブリダイゼーション実験、リアルタイムＰＣＲ、適切な核酸プローブが固定化されたマイクロアレイまたはチップまたはビーズ上でのハイブリダイゼーションなどの好適な増幅／検出方法論を使用して行われる。タンパク質の検出は、例えば、適切な抗体を伴う免疫吸着アッセイを介して行われ得る。そのような免疫吸着アッセイの典型例はＥＬＩＳＡである。ＢＶＤＶを一例とすると、それに典型的なその各々の核酸または特定のタンパク質を検出することによって、それを検出することができる。一実施形態では、ＢＶＤＶのタンパク質の検出は、ＢＶＤＶにおいて見られるそのような目的のために好適な任意のタンパク質、例えば、Ｎｐｏｒ、カプシドタンパク質、エンベロープ糖タンパク質、例えばＥＲＮＳ、Ｅ１またはＥ２、非構造タンパク質、例えばｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂなどから選択される任意のタンパク質を介するものである。
【００３３】
さらなる実施形態では、本発明による水性組成物中の生体分子溶液は、組織試料中、したがって動物中の、特定のマーカーの存在または不在、動物に以前に投与されたまたは投与されたことが推定される薬物の存在または不在、特定のホルモンの存在または不在、ならびに／あるいは代謝産物の存在または不在などの、その他の作用物質の検出のためにもさらに使用され得る。
【００３４】
本発明の一実施形態によれば、前記水性組成物の使用は、動物の組織試料中の病原体、特にはＢＶＤＶの検出用である。そのような検出は、前記組織試料から得られた生体分子溶液に対して任意の好適な手段を使用して、ハイブリダイゼーション実験、定量的リアルタイムＰＣＲ、適切な核酸プローブが固定化されたマイクロアレイまたはチップまたはビーズ上でのハイブリダイゼーション、フローサイトメトリー、免疫組織化学、およびその他の好適な方法論などの任意の好適な増幅／検出方法論をそれに対して実施することによって、実施され得る。好適な組織サンプリングタグまたは組織サンプリングユニット／生検針は、本出願人であるＡｌｌｆｌｅｘ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｓ．Ａ．を含む様々な製造業者から市販されている。本発明による水性組成物は、好適な容器中に含まれ得、得られた任意の組織試料は、そのような好適な容器中のそのような水性組成物に曝露される。一実施形態では、そのような好適な容器は、組織サンプリングタグもしくは組織サンプリング生検針または組織サンプリングシステムと作動可能に連結され得る。例えば、容器は、前記組織サンプリングタグもしくは組織サンプリング生検針または組織サンプリングシステムの取り外し可能な一部分であり得、そのような容器は、組織試料を取得／サンプリングした後にそれを前記容器に直ちに導入することを可能とし、次いで、前記組織試料のその後のさらなる処理もしくは取扱いまたは貯蔵のために、前記組織サンプリングタグもしくは組織サンプリング生検針または前記システムからその容器を取り外し、またはその接続を解除し、または解放し、または除去し得る。水性組成物の使用の際、上記に概要を述べたように、サンプリング後に直ちに組織試料を前記水性組成物に曝露する。
さらに、以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ウシから得られた組織試料の本発明による水性組成物への曝露、およびゲル電気泳動でのその後のその分析の結果を示す。
【００３６】
【図２】図２は、ウシから得られた組織試料を抽出し、この試料を２週間本発明による水性組成物中に保持し（すなわち、試料保管）、次いでこの試料を本発明の実施例１による新たに作製された水性組成物を使用して再曝露し、次いでこの再曝露により生じた溶液を分析した結果を示す。図１と同様、図２の結果は、溶解された核酸のゲルの写真として示している。
【００３７】
【図３】図３は、実施例１にしたがって調製された組成物中に１２ヶ月間貯蔵された試料のゲノムＤＮＡのゲル電気泳動分離の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
さらに、本発明を限定するためでなく、その実例を示すために与える以下の実施例を参照する。
【実施例】
【００３９】
（実施例１：本発明の実施形態による水性組成物）
以下を混合することによって、１リットルの本発明の実施形態による水性組成物を製造する。
１．５７６グラムのトリス
０．３４２グラムのＮａＯＨのペレット
０．７４４グラムのＥＤＴＡ．２Ｎａ．２Ｈ２Ｏ
２グラムのＮ−ラウロイルサルコシン（Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｎｓｉｎｅ）のナトリウム塩
８１．８２グラムのＮａＣｌ
超純水を用いて１リットルとする
モル濃度では、
トリス  ＭＳ１２１．１４  −  １．５７６ｇ／ｌ≡１３ｍＭ
ＮａＯＨ  ＭＷ３９．９９７  −  ０．３４２ｇ／ｌ≡８．５５ｍＭ
ＥＤＴＡ２Ｎａ２Ｈ２Ｏ  ＭＷ３７２．２４  −  ０．７４４ｇ／ｌ≡１．９９９ｍＭ
Ｎ−ラウロイルサルコシンのナトリウム塩  ＭＷ２９３．３８  −  ２ｇ／ｌ≡６．８１ｍＭ
ＮａＣｌ  ＭＷ５８．４４  ８１．８２ｇ／ｌ≡１．４Ｍ
超純水を用いて１ｌとする
【００４０】
（実施例２：Ａｌｌｆｌｅｘの組織サンプルタグ（ＴＳＴ）および組織サンプルユニット（ＴＳＵ）を用いた実施例１による水性組成物の試験）
組織サンプリングタグ（ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｔａｇ；ＴＳＴ）および組織サンプリングユニット（ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｍｐｌｉｎｇ  ｕｎｉｔ；ＴＳＵ）は、本出願人であるＡｌｌｆｌｅｘ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｓ．Ａ．より市販されている。
【００４１】
本実施例の研究の目的は、Ａｌｌｆｌｅｘの組織サンプルタグ（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｔａｇ；ＴＳＴ）および組織サンプルユニット（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｕｎｉｔ；ＴＳＵ）（＝組織サンプリング生検針）が、組織試料それ自体の代わりに、試料がその中に保存された実施例１の水性組成物のみを使用することによって、ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）分析のために十分なＤＮＡを生じさせることができるかどうかを試験することである。
【００４２】
材料および方法
６つのインタクトな耳を試験用に屠殺場から受領した。全ての試料を数回穿孔し、また試験結果の確認用に陽性対照および陰性対照を含めた。ＴＳＴおよびＴＳＵの両方は本研究の一部分であり、独立して試験した。
【００４３】
本発明による組成物（実施例１）のアリコートを０時間後、３時間後、１９時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、１６８時間後、３３６時間後、７２０時間後に試料から採取した。組成物の安定性を試験するために、５週続けて新たな水性組成物を６つの試料に加え、チューブ内に残っていた緩衝液は廃棄する補充研究を実施した。
【００４４】
全ての試料をＧＧＰ  ＬＤ  Ｂｏｖｉｎｅ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（ＧｅｎｅＳｅｅｋ、Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥ、ＵＳＡ）を用いて試験した。生成されたコール率（ｃａｌｌ  ｒａｔｅ）をデータの質を決定するために使用した。０．８５より大きいコール率を有効な試験結果と認める。
【００４５】
結果
計１５６の試料の遺伝子型判定に成功した。３つの試料は、０．８５より大きいコール率を生じるという基準を満たさなかった。試料の再試験は行わなかった。失敗した試料を除いて、観察されたコール率の平均は０．９８５であった。
【００４６】
安定性研究の結果は、ＴＳＵシステムについて０．９９３、ＴＳＴ試料について０．９５３という平均コール率を与える。補充研究は、ＴＳＵおよびＴＳＴ試料について、４度目の組成物の補充後にコール率がわずかに低下したことを明らかにした。しかしながら、全ての試料はそれでもなお、０．８５より大きいコール率という包含基準を満たしている。
【００４７】
結論
本研究は、Ａｌｌｆｌｅｘのサンプリングにおいて本発明による水性組成物を使用することにより、ＤＮＡの供給源としての組織サンプリング技術（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＴＳＵおよびＴＳＴ）を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＣｈｉｐによる遺伝子型判定の成功裡の実施において使用できることを示す。ＴＳＵおよびＴＳＴの両システムは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ解析のために使用された時に、匹敵するコール率を生じる。
【００４８】
０〜７２０時間後に解析した試料間で注目すべき有意差はなかった。耳をサンプリングした直後に、下流の適用のために本発明の水性組成物を使用することができる。これにより、このシステムは、直接的な遺伝形質および疾患の試験のために大いに適用可能となる。
【００４９】
（実施例３：核酸の抽出、保管、および遺伝子型判定の試験）
組織試料由来の核酸の溶解および／または抽出および／または保存のための好適性について、本発明による水性組成物を評価した。Ａｌｌｆｌｅｘの組織サンプリングユニット（＝組織サンプリング生検針）（ＴＳＵ）を使用してウシから得られた、選ばれた組織試料を、サンプリング後に直ちに各々の組織試料を実施例１による水性組成物（「ＴＳＵ緩衝液」）中に置くことによって、そのような組成物に曝露した。以下の結果が得られた。
【表Ａ】
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【００５０】
十分に高濃度の核酸が得られることがこの表および図１から分かる。「Ｑｕｂｉｔ濃度」とは、Ｑｕｂｉｔ（登録商標）定量（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することによって決定される核酸濃度を指す。曝露の結果も添付の図１に見ることができ、ゲル上に試料の（ゲノム）核酸のバンドをはっきりと示している（Ｍ＝マーカーＤＮＡ）。レーン上の数字は試料番号を指し示す。
【００５１】
さらには、組織サンプリングユニット（ＴＳＵ）を使用して得られた、選ばれた組織試料を実施例１による水性組成物中に２週間貯蔵した。その後、組成物を交換した後に、新たに作製した実施例１による組成物にこれらの組織を再曝露した。そのような再曝露の結果は、以下の表および図２に要約することができる。
【表Ｂ】
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【００５２】
したがって、本発明による水性組成物は、サンプリング後に直ちに試料由来の核酸を溶解させるために好適であるだけでなく、その中に組織試料を貯蔵した後、新鮮な本発明の水性組成物中でのさらなる再曝露のためにそのような試料を使用するためにも好適であることがこれらのデータから明らかである。
【００５３】
（実施例４：本発明による水性組成物中での組織試料の長期貯蔵）
Ａｌｌｆｌｅｘの鉗子システムおよびＡｌｌｆｌｅｘの組織サンプリング生検針（ＴＳＵ）を使用して、新たに屠殺されたウシの両耳から１００個の耳のパンチ試料を収集した。実施例１による水性組成物で満たしたプラスチックの受容器（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）中に試料を押し入れた。本実施例４では、そのような本発明による水性組成物を「Ｄ液」または「保存剤Ｄ液」と呼ぶこともある（さらに下記を参照）。試料の収集、試料容器のラベリング、およびクーリエサービスによる即座の配送は、Ａｌｌｆｌｅｘが実行した。１日後、試料は見たところ全く欠点のない状態で試験室に到着した。受領の際に、これらの試料を試料のラベリングおよび表１の情報を反映して選別し、実施例１の水性組成物中に暗所で貯蔵した。
【表１】
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【００５４】
表１に表されるように、５つの試料の第１ラウンドの調製および検査の処理を試料の受領の翌日に行い（時間表「０ヶ月」）、全てのその後の検査を３ヶ月間隔の後で行った（時間表「３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月、および１２ヶ月」）。
【００５５】
組織試料からのＤＮＡの抽出、ならびに質および量の決定
全ての日常的実験手順および検査は、標準化されたプロトコールにしたがって行った。
【００５６】
５つの試料をＤＮＡ抽出の約３０分前に貯蔵容器（２４℃、４℃、−２０℃）から取り出し、室温で平衡化した。一般に、耳の各パンチ試料の一部分（約１／３）をＤＮＡ抽出のために使用した。
【００５７】
組織試料からのゲノムＤＮＡの単離は、ＮａＯＨおよび／またはプロテイナーゼ溶解を使用する中等度の溶解条件の下で伝統的なプロトコールにしたがって行った。単離されたＤＮＡを１００μｌのトリス緩衝液（１０ｍＭ）中に可溶化した。
【００５８】
適用する試料材料の量
本プロジェクトの初めに、日常的実験手順のための試料の量の２つの変形例を比較した。
【００５９】
変形例１は、耳のパンチ試料全体を利用し、変形例２は、耳のパンチ試料の一部分（耳のパンチ試料の約３分の１）に基づくものであった。日常的手順の間の試料の処理は常に連続的かつ再現性があるべきであることは必須事項であるので、この比較は重要であると思われた。耳のパンチ試料全体は、一度に実行することができ、よってより迅速に処理することができると同時に、より狭い濃度範囲内にＤＮＡ濃度を保ち、それにより主観的影響を排除できると想像できる。それとは対照的に、本実施例において使用する日常的手順の間、予備に保持するために、元々のプローブの一部分のみを使用した。
【００６０】
ＤＮＡの濃度および純度の光度測定による評価
全ての試料をＮａｎｏｄｒｏｐ光度測定によって測定した。各試料は、２６０ｎｍに最大吸収を有するきれいなＤＮＡのスペクトルを示し、またタンパク質、溶媒、および塩によって引き起こされる希薄な不純物を示した（２３０ｎｍ、２８０ｎｍ）。表２は、２つの貯蔵変形条件下での時間表「０ヶ月」の量変形例２についてのＮａｎｏｄｒｏｐ値の概要を与える。
【表２】
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【００６１】
耳のパンチ試料全体を使用する量変形例１のＤＮＡ濃度は、１９１〜８２９ｎｇ／μμｌ（データ示さず）の範囲であり、耳のパンチ試料の約１／３を使用する量変形例２のＤＮＡ濃度は、５５〜３２３ｎｇ／μｌの範囲であった。これは、全試料を使用することで有意により高いＤＮＡの収量を示すが、測定値の広がりもより大きいことを示す。したがって、全てのさらなる分析のために試料の一部分（１／３）のみを使用することに決めた。
【００６２】
表３〜６は、組織試料の貯蔵の３ヶ月後、６ヶ月後、９ヶ月後、および１２ヶ月後に対応するデータを示す。各試料は、十分な量のゲノムＤＮＡを生成した。ＤＮＡの濃度は、それぞれ以下の範囲を示した：５９〜２１３ｎｇ／μｌ（３ヶ月）、２０４〜６６３ｎｇ／μｌ（６ヶ月）、９８〜５２４ｎｇ／μｌ（９ヶ月）、および７０〜６５４ｎｇ／μｌ（１２ヶ月）。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【００６３】
０ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後、９ヶ月後、および１２ヶ月後に得られた試料を上記の通りに処理（すなわち溶解）し、ゲル電気泳動で分離し、分析した。そのようなゲル電気泳動分析の例示的な結果を図３に示す。図３は、本発明の水性組成物中に１２ヶ月間貯蔵した試料についてのゲノムＤＮＡのゲル電気泳動分離を示している。これらの試料は、はっきりと観察できる、ゲノムＤＮＡを指し示す高分子のＤＮＡバンドを示しており、試験したいずれの貯蔵変形例中での試料貯蔵についても、１２ヶ月の貯蔵期間後においてさえ、その後の分子遺伝学的診断のために非常に良好なＤＮＡの質を生じたという結論に繋がることは明らかとなっている。したがって、本発明による水性組成物は、組織試料の長期間の貯蔵のためにも好適であり、そしてこの試料は、貯蔵後にその後のさらなる処理および分析のために使用できる。
【００６４】
明細書、特許請求の範囲、および／または添付の図面中に開示した本発明の特徴は、個別におよびこれらの任意の組み合わせの両方において、本発明をその様々な形態で実現するための材料であり得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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