(57)【要約】  本発明は、効率的にヒト多能性幹細胞の心筋細胞への分化に使用される小分子化合物組成物を公開し、具体的に、（i） mTORシグナル経路アンタゴニストと、（ii） Wnt経路アゴニストと、（iii） 任意に薬学的に許容される担体という成分を含む小分子化合物組成物を提供する。本発明の小分子化合物組成物は効率的に多能性幹細胞の心筋細胞への分化を誘導することができ、初期選別後の心筋細胞の分化率が86％に達し、最適化後の心筋細胞の分化率が98.3％と高い。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i） mTORシグナル経路アンタゴニストと、
（ii） Wnt経路アゴニストと、
（iii） 任意に薬学的に許容される担体と、
という成分を含むことを特徴とする小分子化合物組成物。
【請求項２】
前記mTORシグナル経路アンタゴニストは、ラパマイシン(Rapamycin)、エベロリムス(RAD001)、KU-0063794、AZD8055、テムシロリムス(Temsirolimus)、INK128、リダホロリムス(Ridaforolimus)、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項1に記載の小分子化合物組成物。
【請求項３】
前記Wnt経路アゴニストは、CHIR99021、BIO、またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする請求項1に記載の小分子化合物組成物。
【請求項４】
（i）幹細胞の心筋細胞への分化を促進することに使用されることを特徴とする小分子化合物組成物の使用。
【請求項５】
体外で非治療的に幹細胞の心筋細胞への分化を誘導する方法であって、
（a）（i）mTORシグナル経路アンタゴニストと、（ii）Wnt経路アゴニストとを含む、分化誘導化合物の組み合わせの存在下において、培養系で幹細胞系を培養することによって、前記の心筋細胞を得る工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
さらに、（b）工程（a）で得られた心筋細胞を濃縮して精製する工程を含むことを特徴とする請求項5に記載の方法。
【請求項７】
請求項5に記載の方法によって製造されることを特徴とする心筋細胞。
【請求項８】
請求項1に記載の小分子化合物組成物を含むことを特徴とする心筋細胞の分化を促進するキット。
【請求項９】
請求項7に記載の心筋細胞の使用であって、心臓疾患を予防および/または治療する薬物組成物の製造に使用されることを特徴とする使用。
【請求項１０】
請求項7に記載の心筋細胞を含むことを特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、生物技術の分野に関し、具体的に、効率的にヒト多能性幹細胞の心筋細胞への分化を誘導するための小分子化合物組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
心筋疾患は現代社会で発症率と致死率が最も高い重度の疾患の一つで、心筋虚血などの疾患による心筋損傷は不可逆的な細胞死で、まだ有効な治療手段が欠けている。ヒト胚性幹細胞（ESC）および人工多能性幹細胞（hiPS）（ヒト多能性幹細胞と総称される）が発見されて以来、ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞は心筋疾患治療の分野で新しい希望になってきた。細胞治療以外、幹細胞由来の心筋細胞は心筋疾患の治療性薬物の選別や薬物の心臓特異的毒性の検出などの重要な面に使用することができる。20年間で、ヒト多能性幹細胞の定方向性分化および応用の分野で飛躍的な発展が得られた。初期では心筋細胞を得る主な方法は、ヒト胚性幹細胞をマウス内臓内胚葉様細胞(Mouse visceral endoderm-like cell、END-2)と共培養する方法、または胚様体(Embryonic body、EB)による方法によって得られる。これらの誘導方法は、動物由来の血清が必要なだけではかく、分化効率が低下し、収量も非常に低い。2007年に、Charles Murry実験室は単層細胞分化系を確立し、RPMI1640とB27からなる基礎分化液に心筋分化促進サイトカインであるアクチビンAとBMP4を添加することによって、ヒト胚性幹細胞系H7では30％の分化效率に達したが、ヒト胚性幹細胞系H9では5％だけと満足できるものではない。後期は、最適化を経て、すなわち、分化初期でWnt3aを入れ、さらにDKK1を入れてWntシグナル経路の活性を調節し（促進後抑制）、分化効率をある程度向上させ、特にH9でも30％の分化效率に達した。
【０００３】
長年の発展を経て、ヒト胚性幹細胞の心筋への分化方法はずいぶん進展してきたが、分化効率はまだ向上する余地があり、分化の安定性および異なる細胞系における一致性もさらに向上させる必要があり、より重要なのは分化のコストと収量のような大規模生産に影響する要素がまだ更なる改善が必要であることである。
そのため、本分野では、大幅に心筋細胞の分化率を向上させることができる小分子化合物およびその方法の開発が切望されている。
【発明の概要】
【０００４】
発明の概要
本発明の目的は、大幅に心筋細胞の分化率を向上させることができる小分子化合物およびその方法を提供することである。
本発明の第一の側面では、
（i） mTORシグナル経路アンタゴニストと、
（ii） Wnt経路アゴニストと、
（iii） 任意に薬学的に許容される担体と、
という成分を含む小分子化合物組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記小分子化合物組成物は、
（i） mTORシグナル経路アンタゴニストと、
（ii） Wnt経路アゴニストと、
という成分を含む。
もう一つの好適な例において、前記成分（i）と成分（ii）のモル比は1〜5000：5000〜15000、好ましくは2〜500：10000〜12000、より好ましくは5〜100：10000〜12000、最も好ましくは8〜60：10000〜12000である。
もう一つの好適な例において、前記の組成物の使用濃度は、
成分（ii）のWnt経路アゴニストの使用濃度が1〜40μM、好ましくは5〜25μM、より好ましくは10〜20μMである。
【０００５】
もう一つの好適な例において、前記の組成物の使用濃度は、
成分（i）のmTORシグナル経路アンタゴニストの使用濃度が1〜200nM、好ましくは5〜100nM、より好ましくは10〜50nMである。
もう一つの好適な例において、前記mTORシグナル経路アンタゴニストは、ラパマイシン(Rapamycin)、エベロリムス(RAD001)、KU-0063794、AZD8055、テムシロリムス(Temsirolimus)、INK128、リダホロリムス(Ridaforolimus)、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記Wnt経路アゴニストは、CHIR99021、BIO、またはこれらの組み合わせを含む。
もう一つの好適な例において、前記小分子化合物組成物は、さらに、ほかの心筋細胞分化促進剤を含む。
もう一つの好適な例において、前記ほかの心筋細胞分化促進剤は、AKTシグナル経路アンタゴニストであるLY99021を含む。
【０００６】
もう一つの好適な例において、前記小分子化合物組成物は液状組成物で、各成分の有効濃度は、
mTORシグナル経路アンタゴニストでは、ラパマイシン(Rapamycin)は1nM〜0.2μM、好ましくは5nM〜0.1μM、より好ましくは10nM〜50nMで、エベロリムス(RAD001)は1nM〜0.2μM、好ましくは5nM〜0.1μM、より好ましくは10nM〜50nMで、KU-0063794は1nM〜0.2μM、好ましくは5nM〜0.1μM、より好ましくは10nM〜50nMで、AZD8055は1nM〜0.2μM、好ましくはは5nM〜0.1μM、より好ましくは10nM〜50nMで、
Wnt経路アゴニストでは、CHIR99021は1μM〜12μM、好ましくは3μ〜12μM、より好ましくは10μM〜12μMで、Bioは0.5μM〜2μM、より好ましくは1μM〜2μMである。
本発明の第二の側面では、（i）幹細胞の心筋細胞への分化を促進することにおける小分子化合物組成物の使用を提供する。
【０００７】
もう一つの好適な例において、前記小分子化合物組成物は、さらに、（ii）幹細胞の増殖レベルを向上させること、および/または（iii）幹細胞のアポトーシスを抑制することに使用されてもよい。
もう一つの好適な例において、前記増殖レベルは、幹細胞の増殖数および幹細胞の活性を含む。
もう一つの好適な例において、前記幹細胞は人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記幹細胞は、全能性幹細胞を含まない。
もう一つの好適な例において、前記幹細胞は、哺乳動物、好ましくはヒト、齧歯動物（たとえばマウス、ラット）由来のものである。
もう一つの好適な例において、前記幹細胞はヒト多能性幹細胞（human induced pluripotent stem cells、hiPSC）である。
【０００８】
もう一つの好適な例において、前記人多能性幹細胞は皮膚繊維芽細胞、尿細胞、末梢血細胞、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
本発明の第三の側面では、体外で幹細胞の心筋細胞への分化を誘導する方法であって、
（a）（i）mTORシグナル経路アンタゴニストと、（ii）Wnt経路アゴニストとを含む、分化誘導化合物の組み合わせの存在下において、培養系で幹細胞系を培養することによって、前記の心筋細胞を得る工程、
を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記培養系では、前記成分（i）と成分（ii）のモル比は1〜5000：5000〜15000、好ましくは2〜500：10000〜12000、より好ましくは5〜100：10000〜12000、最も好ましくは8〜60：10000〜12000である。
もう一つの好適な例において、前記幹細胞系は多能性幹細胞系または単能性幹細胞を含む。
もう一つの好適な例において、前記多能性幹細胞系はヒト多能性幹細胞系を含む。
もう一つの好適な例において、前記幹細胞系は胚性幹細胞系であるH9-cTnT-eGFP、H9、H7、ヒト多能性幹細胞系であるU-Q1、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【０００９】
もう一つの好適な例において、前記の培養は少なくとも10回、好ましくは少なくとも20回、より少なくとも30〜40回継代培養することである。
もう一つの好適な例において、内胚葉形成の初期段階（約3日目まで）で前記の分化誘導化合物の組み合わせを添加し、かつ維持する。
もう一つの好適な例において、前記の添加は前後で、同時に（i）mTORシグナル経路アンタゴニストと、（ii）Wnt経路アゴニストとを添加することを含む。
もう一つの好適な例において、前記の「添加」は（ii）Wnt経路アゴニストとを添加した後で、（i）mTORシグナル経路アンタゴニストを添加することを含む。
もう一つの好適な例において、前記の「添加」は前記培養系で、（i）mTORシグナル経路アンタゴニストの濃度が1〜200nM、好ましくは5〜100nM、より好ましくは10〜50nMに、かつ/または（ii）Wnt経路アゴニストの濃度が1〜40μM、好ましくは5〜25μM、より好ましくは10〜20μMになるようにさせる。
【００１０】
もう一つの好適な例において、前記方法は、
（i）心筋細胞の分化率が85〜99.9％、好ましくは90〜98.5％と高いこと、
（ii）培養の過程で、0.5mLあたりの培養液に105個の幹細胞を接種すると、24×105個の心筋細胞が生成すること、
からなる群から選ばれる1つまたは複数の特徴を有する。
もう一つの好適な例において、前記方法は、さらに、（b）工程（a）で得られた心筋細胞を濃縮して精製する工程を含む。
もう一つの好適な例において、前記精製条件は、
（a1）精製培養液は炭素源が基本的にまたは全部乳糖からなる基礎培地で、かつ2〜15％（w/w）の牛胎児血清を追加したものであること、
を含む。
もう一つの好適な例において、前記の培養液は0.1mM〜10mM（好ましくは0.5mM〜5mM、より好ましくは1mM〜4mM）の乳糖を含み、かつ2〜15％（w/w）の牛胎児血清を追加したDMEM/F12培地である。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記の培養液にブドウ糖が含まれなくて（すなわち培養液の総重量に対してブドウ糖の含有量が≦0.05wt％である）、
（a2）培養時間は5〜8日、好ましくは7〜8日である。
もう一つの好適な例において、精製で得られた心筋細胞は99.9％の純度を有する。
もう一つの好適な例において、前記方法は治療的なものおよび非治療的なものを含む。
もう一つの好適な例において、前記の培養系で、幹細胞系の密度が0.1〜10×105細胞/mL、好ましくは0.5〜2×105細胞/mLである。
もう一つの好適な例において、前記の培養系は、体積が0.1〜1000mL、好ましくは0.2〜100mL、より好ましくは0.3〜10mL、最も好ましくは0.4〜0.6mLである。
もう一つの好適な例において、前記の得られる心筋細胞の数M2と前記幹細胞の数M1の比M2/M1が8〜36、好ましくは12〜30、より好ましくは16〜28である。
本発明の第四の側面では、本発明の第三の側面に記載の方法によって製造される心筋細胞を提供する。
【００１２】
もう一つの好適な例において、前記の心筋細胞は、
（i）心筋細胞の特異的構造遺伝子が高度に発現されること、
（ii）イオンチャネル遺伝子が高度に発現されること、
からなる群から選ばれる1つまたは複数の特徴を有する。
本発明の第五の側面では、心筋細胞の分化を促進するキットであって、本発明の第一の側面に記載の小分子化合物組成物を含むキットを提供する。
もう一つの好適な例において、前記キットは、さらに、ほかの心筋細胞分化促進剤を含む。
もう一つの好適な例において、前記ほかの心筋細胞分化促進剤は、P38 MAPK シグナル経路のアンタゴニストであるSB203580、ビタミンC(アスコルビン酸、Ascorbic acid)、全トランスレチノイン酸(Retinoid acid) 、AKTシグナル経路アンタゴニストであるLY99021、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
本発明の第六の側面では、本発明の第四の側面に記載の心筋細胞の使用であって、心臓疾患を予防および/または治療する薬物組成物の製造における使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の心臓疾患は、虚血性心不全、心筋梗塞、またはこれらの組み合わせを含む。
【００１３】
本発明の第七の側面では、本発明の第四の側面に記載の心筋細胞を含む組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の組成物は、薬物組成物、食品組成物、健康食品組成物を含む。
本発明の第八の側面では、心臓疾患を治療する方法であって、必要な対象に安全有効量の本発明の第四の側面に記載の心筋細胞、および/または本発明の第七の側面に記載の組成物を施用する方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記の施用は局部注射による施用を含む。
もう一つの好適な例において、前記対象はヒトまたはヒト以外の哺乳動物を含む。
もう一つの好適な例において、前記ヒト以外の哺乳動物は齧歯動物、たとえばマウス、ラットを含む。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組合せ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
図面の説明
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図1は、ラパマイシンが幹細胞の心筋細胞への分化を促進したことを示す。ここで、（A）はそれぞれラパマイシン、CHIRの単独使用、ラパマイシンとCHIRの併用の心筋細胞分化率への影響を示す。具体的に、心筋に特異的な蛍光レポーター遺伝子を持つヒト胚性幹細胞系を使用し、サイトカインのない単層誘導の条件において、選別したところ、心筋分化の全過程でラパマイシン（Rapamycin、Rapaと略す）を入れると心筋細胞の分化効率を顕著に向上させることができることを見出した（左の図は蛍光顕微鏡で観察されたGFPを発現する細胞の比率図で、右の図はフローサイトメトリーによって統計されたGFP陽性細胞数の比率で、n=8、** P<0.01、縮尺は200μmである）。（B）所定の時点でラパマイシンによる処理を与えてまた除くことによってその作用を発揮する具体的な時間窓を検出した（n=4、** P<0.01）。（C）ラパマイシンによる処理の時間を延ばすと、幹細胞由来の心筋細胞の収量に影響を与えた（n=3、** P<0.01）。（D）ラパマイシンの心筋分化促進作用および当該小分子誘導方法の異なる多能性幹細胞系の間における普遍的適応性を検出するために、同様の培養方法および条件でほかの3株のヒト多能性幹細胞（ヒト胚性幹細胞H7、H9および人工多能性幹細胞U-Q1）において以上の分化を繰り返し、かつフローサイトメトリーによって心筋トロポニンT（cTnT）陽性細胞の比率を検出する方法で心筋の分化効率を確認した（n=7、** P＜0.01）。（E）分化方法の具体的な模式図である。
【図２】図2は、ラパマイシンによって分化を誘導された心筋細胞が成熟心筋細胞の特徴を有することを示す。ここで、（A）分化して得られた心筋細胞を乳糖が唯一の炭素源である培養液で7日培養し、フローサイトメトリーによってcTnT-eGFPを検出したところ、心筋細胞の純度が99.9％超で、示された結果は独立に4回繰り返した実験である。（B）αアクチニン(α-actinin)とcTnTの免疫蛍光検出では、分化して得られた心筋細胞が典型的なサルコメア構造を有することが示された（縮尺：10μm）。（C）透過型電子顕微鏡では、分化して得られた心筋細胞が正常の筋原線維、サルコメア、介在板および成熟ミトコンドリアの構造を有することが示された（MF、Z-band、IDおよびMt、縮尺：0.5μm）。（D）ラパマイシンによって単層分化を誘導して得られた心筋細胞が従来のEB分化による心筋細胞および正常ヒト成熟心筋細胞に似ている機能および構造遺伝子の発現を有する（n=3）。
【図３】図3は、ラパマイシンがヒト胚性幹細胞の高密度の培養条件における細胞数の増加を促進したことを示す。図において、ヒト胚性幹細胞を5×104/cm2で24ウェルプレートに接種し、異なる小分子化合物を入れて刺激し、1日おきに細胞数または細胞活性を検出し(CCK-8細胞活性検出法)、異なる小分子化合物の処理の幹細胞数および細胞活性に対する影響を記録した。
【図４】図4は、ラパマイシンがmTORによって幹細胞のアポトーシスを抑制したことを示す。ここで、図（AとB）は、細胞周期分析およびBrdU増殖検出実験によって異なる小分子の幹細胞の増殖速度に対する影響を判断したものである。図（C）は、ウエスタンブロットによって細胞内におけるParpタンパク質の切断を検出することによって細胞の異なる処理条件における死亡状況を判断したものである。図（D）は、ルシフェラーゼレポーターシステムによってラパマイシンの細胞内におけるアポトーシス実行タンパク質であるカスパーゼ3/7の活性に対する影響を検出したものである。図（E）は、それぞれ3日目と4日目の培養終了の時点で、アネキシンV/PIによって染色し、ラパマイシンによる処理のある条件とない条件における細胞死亡の比率を検出したものである。図（F）は、カスパーゼ阻害剤z-VAD-FMKを添加した条件において、アポトーシスが完全に抑制されたか検出したものである。以上の実験結果はいずれも少なくとも3回独立に繰り返した実験の統計結果である(* P＜0.05、** P＜0.01)。
【図５】図5は、ほかの小分子組成物の心筋細胞の分化に対する影響を示す。ここで、図5aはラパマイシン類似物であるRAD001、KU0063794およびAZD8055とCHIRの併用による心筋の分化効率に対する影響を、図5bはWntシグナル経路アゴニストBIOとラパマイシンまたはその類似物の併用による心筋細胞の分化効率に対する影響を示す。ここで、上記各図において、cTnT+％は陽性心筋細胞の分化率である。
【００１５】
具体的な実施形態
本発明者は幅広く深く研究し、大量の化合物の選別を行ったところ、初めて意外に、特定の小分子化合物の組み合わせは効率的に多能性幹細胞の心筋細胞への分化を誘導することができ、初期選別後の心筋細胞の分化率が86％に達し、最適化後の心筋細胞の分化率が98.3％と高く、かつ乳糖濃縮精製後の心筋細胞が99.9％と高い純度を有することを見出した。
実験では、mTORシグナル経路アンタゴニストとWnt経路アゴニストという2種類の化合物を多能性幹細胞（たとえばヒト多能性幹細胞）に併用する場合、多能性幹細胞を分化させて得られる心筋細胞の成熟度が高く、正常の心筋機能を発揮する構造の基礎を有し、すなわち、類似の心筋の特異的構造遺伝子とイオンチャネル遺伝子の発現レベルを有する。そして、本発明の心筋分化を促進する方法は、半分の培養液および添加剤を節約し、コストを大幅に低下させることもできる。これに基づき、発明者らが本発明を完成した。
【００１６】
mTORシグナル経路アンタゴニスト
mTORはセリン・スレオニンプロテインキナーゼで、調節する成分によって、mTORC1とmTORC2といった2つの複合体に分かれる。mTORC1は主にリボソームタンパク質S6キナーゼ1(S6K1またはp70s6K1)のリン酸化による活性化および4E-結合タンパク質(4E-BP)のリン酸化による抑制によって細胞内におけるタンパク質合成の速度を調節する。
mTORシグナル経路アンタゴニストは、通常、ラパマイシン(Rapamycin)、エベロリムス(RAD001)、KU-0063794、AZD8055、テムシロリムス(Temsirolimus)、INK128、リダホロリムス(Ridaforolimus)などを含む。
本発明において、ラパマイシン、エベロリムス（Everolimus/RAD001）、KU-0063794（Garcia-Martinez JMら、Biochem J. 2009、421(1):29-42）、AZD8055（Chresta CMら、Cancer Res、2010、70(1)、288-298.）などのmTORシグナル経路アンタゴニストの心筋細胞の分化に対する効果を検出した。
【００１７】
Wnt経路アゴニスト
Wntシグナル経路は既知の心臓発育を調節する最も重要なシグナル経路である。Wntタンパク質、たとえばWnt3は分泌型糖タンパク質に属し、傍分泌または自己分泌作用によって細胞膜にある受容体と結合し、細胞内における各段階のシグナル伝達分子、主にβ-カテニンの核内への移行を活性化し、標的遺伝子の発現を調節する。Wnt経路アゴニストは、通常、CHIR99021およびBIOを含む。
本発明において、CHIR99021（Bennett CNら、J Biol Chem、2002,277(34),30998-31004.）、Bio（6-ブロモインジルビン-3'-オキシム（6-bromoindirubin-3'-oxime））といった2つのWnt経路アゴニストの心筋細胞の分化に対する影響を検出した。
【００１８】
小分子化合物組成物
本明細書で用いられるように、用語「小分子化合物組成物」とは（i） mTORシグナル経路アンタゴニスト、および（ii） Wnt経路アゴニストという成分を含む組成物をいう。また、前記の小分子化合物組成物は薬学的に許容される担体を含んでもよいが、このような場合、前記の小分子化合物組成物は多能性幹細胞の心筋細胞への分化を誘導する活性を有する薬物組成物になる。
ここで、前記のmTORシグナル経路アンタゴニストは、通常、ラパマイシン(Rapamycin)、エベロリムス(RAD001)、KU-0063794、AZD8055、テムシロリムス(Temsirolimus)、INK128、リダホロリムス(Ridaforolimus)を含む。
前記Wnt経路アゴニストは、CHIR99021、BIO、またはこれらの組み合わせを含む。
本発明の小分子組成物に使用できる各成分の間の比率には何らの制限もない。通常、各成分はその最低の有効濃度を満足させなければならない。一つの好適な例において、前記小分子化合物組成物における各成分の最低有効濃度は以下の通りである。
【００１９】
mTORシグナル経路アンタゴニストでは、ラパマイシン(Rapamycin)は1nM〜0.2μM、好ましくは1nM〜0.1μM、より好ましくは10nM〜50nMで、エベロリムス(RAD001)は1nM〜0.2μM、好ましくは1nM〜0.1μM、より好ましくは10nM〜50nMで、KU-0063794は1nM〜0.2μM、好ましくは1nM〜0.1μM、より好ましくは10nM〜50nMで、AZD8055は1nM〜0.2μM、好ましくはは1nM〜0.1μM、より好ましくは10nM〜50nMで、
Wnt経路アゴニストでは、CHIR99021は1μM〜12μM、好ましくは3μ〜12μM、より好ましくは10μM〜12μMで、Bioは0.5μM〜2μM、より好ましくは1μM〜2μMである。
本発明において、ラパマイシン(Rapamycin)とCHIR99021の組み合わせは優れた人工多能性幹細胞の心筋細胞への分化を誘導する活性を有することが検証された。もちろん、当業者は本発明の啓示を受け、以上の2種類の阻害剤を任意に組み合わせ、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を誘導する活性を有する小分子化合物組成物を開発することもできる。
本明細書に用いられるように、用語「ヒト多能性幹細胞」、「多能性幹細胞」、「hiPSC」は入れ替えて使用することができ、いずれもヒト由来の単離された多能性幹細胞をいう。本発明において、本発明のhiPSCはヒト腎上皮細胞由来のものでもよい。
【００２０】
心筋細胞
心筋細胞（Cardiomyocyte）は成熟心筋細胞の基本特徴を有し、筋線維、サルコメア、細胞間連絡（介在板）、成熟ミトコンドリア、心筋特異的イオンチャネルを含む。
本発明において、ヒト多能性幹細胞は本発明の小分子化合物組成物（薬物組成物）によって誘導されて心筋細胞に分化し、分化して得られた心筋細胞はさらに心室筋細胞、心房筋細胞およびペースメーカーといった3つの細胞のサブタイプに分かれる。
【００２１】
心筋細胞の特異的構造遺伝子とイオンチャネル遺伝子
本明細書に用いられるように、用語「心筋細胞の特異的構造遺伝子」と「イオンチャネル遺伝子」とは非心筋細胞と比べ、心筋細胞で高度に発現される遺伝子（またはそのタンパク質）をいう。通常、前記の心筋細胞の特異的構造遺伝子とイオンチャネル遺伝子は、cTnT、αMHC、 Nkx2.5、HCN4、Nav1.5、Cav3.2やKCNQ1などを含む。
【００２２】
誘導方法
本発明の多能性幹細胞（たとえばヒト多能性幹細胞）の心筋細胞への分化を誘導する方法は、通常、体外における誘導方法をいうが、もちろん、体外誘導実験を参照してさらなる体内誘導を行ってもよく、それは本分野の通常の技術または方法を参照して研究することによって得ることができる。
通常、本発明の小分子化合物組成物が存在する条件において、多能性幹細胞を培養する。
また、本分野の通常の心筋細胞培地で前記の多能性幹細胞（たとえばヒト多能性幹細胞）に対してさらなる培養を行ってもよい。好ましくは、前記の心筋細胞培地にWntシグナル経路のアゴニストであるCHIR99021、mTORシグナル経路のアンタゴニストであるラパマイシン、またはこれらの組み合わせが含有されてもよい。
一つの好適な実施形態において、本発明の誘導方法はさらに心筋細胞の濃縮精製を含む。
【００２３】
薬物組成物
本発明は本発明に記載の心筋細胞を含む組成物を提供する。
好ましくは、前記の組成物は、薬物組成物、食品組成物、健康食品組成物などである。
本発明の薬物組成物は、薬学的に許容される担体と、有効量の活性成分、すなわち、本発明に記載の心筋細胞とを含む。
本明細書で用いられるように、用語「有効量」または「有効投与量」とは、ヒトおよび/または動物に機能や活性があり、かつヒトおよび/または動物にとって受けられる量である。
本明細書で用いられるように、「薬学的に許容される担体」の成分は、ヒトおよび/または哺乳動物に適用する場合、過度の不良な副反応（たとえば毒性、刺激とアレルギー反応）がない、すなわち、合理的なベネフィット/リスク比を持つ物質である。用語「薬学的に許容される担体」とは、治療剤の給与のための担体で、様々な賦形剤と希釈剤を含む。
【００２４】
本発明の薬物組成物は、安全有効量の本発明の活性成分と、薬学的に許容される担体とを含む。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合せを含むが、これらに限定されない。通常、薬物製剤は投与様態に応じ、本発明の薬物組成物の剤形は、注射剤、経口投与製剤（錠剤、カプセル、経口投与液）、経皮剤、徐放剤である。たとえば生理食塩水あるいはブドウ糖およびほかの助剤を含む水溶液で通常の方法によって製造することができる。前記の薬物組成物は、無菌条件で製造することが好ましい。
本発明に記載の活性成分の有効量は、投与の様態と治療しようとする疾患の重篤度などによって変更することができる。好適な有効量の選択は、当業者がいろいろな要素によって決めることができる（たとえば臨床試験による）。前記の要素は、前記の活性成分の薬物動態学のパラメーター、たとえば生物利用能、代謝、半減期など、患者の治療しようとする疾患の重篤度、患者の体重、患者の免疫状況、投与の経路などを含むが、これらに限定されない。通常、本発明の活性成分は、毎日0.00001 mg〜50 mg/kg動物体重（好ましくは0.0001 mg〜10 mg/kg動物体重）の投与量で投与する場合、満足できる効果が得られる。たとえば、治療状況の切望によって、毎日数回に分けた投与量、または比率的に減少する投与量で投与することができる。
本発明に記載の薬学的に許容される担体は、水、塩水、リポソーム、脂質、タンパク質、タンパク質-抗体複合体、ペプチド系物質、セルロース、ナノゲル、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。担体の選択は投与様態に応じ、これらはすべて当業者に熟知のことである。
また、本発明は、心臓疾患の予防および/または治療における前記薬物組成物の使用を提供する。
【００２５】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（1）本発明の方法は、特定のシグナル経路の阻害剤の組み合わせを利用し、多能性幹細胞の心筋細胞への分化を誘導し、分化して得られる心筋細胞の成熟度が高く、正常の心筋機能を発揮する構造の基礎を有し、すなわち、類似の心筋の特異的構造遺伝子とイオンチャネル遺伝子の発現レベルを有する。
（2）本発明の心筋分化を促進する方法は、半分の培養液および添加剤を節約し、コストを大幅に低下させることもできる。
（3）本分野の心筋分化を促進する方法は、高い心筋細胞分化率を有し、1個の幹細胞から24個の心筋細胞が生成し、初期選別後の心筋細胞の分化率が86％に達し、最適化後の心筋細胞の分化率が98.3％と高く（H7ヒト胚性幹細胞系）、心筋細胞を濃縮精製して得られる心筋細胞の純度がより高く、99.9％に達する。
そのため、本発明は関連する細胞治療により良い策略の候補を提供する。
【００２６】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に説明しない限り、百分率および部は重量百分率および重量部である。
【００２７】
共通の方法
ヒト多能性細胞の培養
3株のヒト胚性幹細胞系H9-cTnT-eGFP、H9およびH7は米国WiCell幹細胞バンクから購入された(H9-hTnnTZ-pGZ-D2、WA09和WA07)。人工多能性幹細胞系hiPS-U-Q1は本実験室で裴端卿実験によって報告された方法に従い、DOX(Sigma-Aldrich)誘導発現OKSM四因子レンチウイルス系でヒト尿細胞(腎上皮脱落細胞)をリプログラミングして得られた。ヒト多能性幹細胞系はいずれもCF1マウス胚胎繊維芽細胞からなる栄養膜で培養され、培地は標準のヒト胚性幹細胞培地で、DMEM/F12基礎培地に20％のノックアウト血清代替物、10ng/ml ヒトbFGF、1mM L-グルタミン、0.1mM NEAA(以上いずれもInvitrogenから)および0.1 mM β-メルカプトエタノール(Sigma-Aldrich)を添加したものであった。無栄養膜培養に関し、mTeSR1培地(STEMCELL Technologies)にヒトqualified Matrigel(BD Biosciences)を配合した組み合わせでヒト多能性幹細胞クローンおよび単層の生長を維持した。
【００２８】
幹細胞の心筋細胞への分化を促進する小分子の選別
Murry実験室によって確立された単層分化系に基づき、本発明は基礎培養液mTeSR1およびRPMI/B27のままで、液交換および誘導因子の添加の時点もそのままで、さらにWntシグナル経路の心筋分化における促進後抑制の機能を合わせ、Wnt3a、アクチビンAおよびBMP4の代わりにCHIR99021(Selleck)を使用し、さらにDKK1(PeproTech)の代わりにXAV939 (Enzo)およびKY02111(TOCRIS)を使用した。この元の分化方法によって、H9-cTnT-eGFPにおいて約10％の心筋分化効率を得た。それから、当該方法に基づき、心筋分化を促進する小分子化合物を選別した。H9-cTnT-eGFPを48ウェルプレートに接種し、小分子の候補を適切な濃度勾配で3日目から入れ、12日目に除去した。15日目に、各ウェルにおける緑色蛍光の強度を観察することによって分化効率を比較した。
本実験で選別される小分子化合物はいずれも幹細胞の基本のシグナル経路のアンタゴニストまたはアゴニストならびに報告された小分子と幹細胞分化に関連する小分子で、LiCl、HN4Cl、ラパマイシン、LY294002、ウォルトマンニン、PD98059、PD0325901、SB431542、SB203580、SP600125、レチノイン酸、アシアト酸.、Y27632、チアゾビビン、z-VAD-FMK、VPA、TSA、VO-OHpic、SF1670、KU-55933、レスベラトロール、STR1720、CX-4945、ABT-737、ニュートリン-3、ピフィスリン-α、ピフィスリン-μ、GSK1904529A、FG-4592を含む。
【００２９】
ヒト多能性幹細胞単層によって心筋細胞への分化を誘導する方法
分化の前に、幹細胞クローンは無栄養膜の条件で1回継代培養した後、酵素(Accutase)(Invitrogen)を分散させて単細胞に消化し、少なくとも1代単層培養した。分化を準備する時、単細胞に消化・分散したヒト多能性幹細胞を5x104/cm2の密度で事前に基底膜マトリックス(Matrigel)を被覆しておいた培養プレートに接種し、ヒト多能性幹細胞培地(mTeSR1)で2日培養し、それからの3日はヒト多能性幹細胞培地(mTeSR1)に10 nM ラパマイシン(Gene Operation)および12 μM CHIRを添加し、培養液の使用体積は24ウェルプレートに0.5mlで、12ウェルプレートに1mlでのようにし、毎日液交換を行った。それから、10 nM ラパマイシンおよび12 μM CHIRを添加したインスリンを含まないRPMI/B27培地(RPMI/B27 minus insulin)培養液に交換し、1日培養した後、10 μM XAV939および10 μM KY02111を添加したインスリンを含まないRPMI/B27培養液に交換し、連続4日培養してこの4日内で培養液を交換しなかった。何らの小分子も添加していないインスリンを含まないRPMI/培地(Invitrogen)基礎培養液を続いて2日培養した後、インスリンを含むRPMI/B27培地(Invitrogen)基礎培養液で維持培養を行い、3日に1回液交換を行った。模式図は図1Eに示す。
【００３０】
心筋細胞免疫蛍光
1．抗体
抗cTnT、抗αアクチニン(CST)抗体
Alexa-488-抗マウス、Alexa-555-抗マウス(Invitrogen)二次抗体
2．実験手順
（1）完全培地を除去し、PBSで細胞を1回洗浄した。
（2）4％のパラホルムアルデヒド(Sigma-Aldrich)で室温で15分間固定化した。
（3）PBSで室温で毎回5分間で3回洗浄した。
（4）0.1％ Triton-X-100(Sigma-Aldrich)を含むPBSで室温で15分間透過化処理した。
（5）PBSで室温で毎回10分間で3回洗浄した。
（6）5％ヤギ血清(Invitrogen)を含むPBSで室温で1時間ブロッキングした。
（7）1：250で抗cTnT、抗αアクチニン抗体を入れ、4℃で一晩インキュベートした。
（8）PBSで室温で毎回10分間で3回洗浄した。
（9）1：1000で相応する蛍光二次抗体を入れ、室温で光を避けて1時間インキュベートした。
（10）二次抗体を吸い取り、PBSで室温で毎回10分間で3回洗浄した。
（11）1：2000でDAPI染色液を入れて室温で5分間インキュベートし、PBSで室温で毎回10分間で1回洗浄した。
（12）封止剤で封じ、蛍光顕微鏡で結果を観察し、オリンパス蛍光顕微鏡で免疫蛍光写真を撮影した。
【００３１】
心筋細胞電子顕微鏡実験
（1）培養液を除去し、1mlの2％グルタルアルデヒドを入れ、細胞を剥がし、4℃で一晩固定化した。
（2）0.25％ オスミウム/0.25％ K4Fe(CN)6で4℃で15〜30分間固定化した。
（3）PBSで4℃で毎回10分間で3回洗浄した。
（4）一連のアセトンで室温で脱水させた。
50％アセトン溶液で1回10分間脱水させた。
70％アセトン溶液で1回10分間脱水させた。
90％アセトン溶液で毎回10分間で2回脱水させた。
100％アセトン溶液で毎回10分間で3回脱水させた。
（5）浸透：瓶における脱水剤を吸い取り、3mLのアセトン-EPON812包埋剤(体積比1:1)を入れ、室温で30分間置いた後、希釈した包埋剤を捨て、包埋剤だけを1mL入れ、室温で2時間または一晩置いた。
（6）包埋：混合包埋剤を吸い取ってカプセルモジュールウェルの底部にいっぱいまで滴下し、細胞団塊をカプセルの底部に両末端に近づくように移し、60℃のオーブンで2時間加熱し、硬いブロックに乾燥させた。
（7）ブロックの調整：包埋ブロックを特製の治具に取り付け、顕微鏡で片刃ナイフで表面の包埋剤を除去した。
（8）切片：まず包埋ブロックを超薄切片機に固定し、厚さ約1μmの準超薄切片を切り出し、ヘマトキシリン-エオジン染色法によって染色した。顕微鏡で細胞の画像を観察し、超薄切片を行う部位を確認し、標識をつけた。φ3mm、150〜200メッシュの銅網を用意し、洗浄液を洗浄し、かつ無水エタノールで脱水して乾燥した。支持膜を調製し、慎重に銅網に置いた。超薄切片機に三角形のガラスブレードを取り付け、包埋ブロックを固定し、厚さ50〜70nmの超薄切片を切り出し、まつげブラシで切片を取って鋼線リングで受け取り、銅網の支持膜側に貼り付け、乾燥容器で染色まで保存した。
（9）電子染色：きれいな歯科パラフィンプレートを置いたきれいな培養シャーレを用意した。パラフィンプレートに酢酸ナトリウム染色液を1〜数滴滴下し、ピンセットで網の縁を取り、切片を貼り付けた面が下に向くように、網を液滴に浮かばせ、培養シャーレに蓋をして5〜30分間染色し、染色後すぐ再蒸留水で3回洗浄した。ろ紙で網についた余分の水分を吸い取り、培養シャーレに置いて自然乾燥した。さらに、網をもう一つのパラフィンプレートを入れた培養シャーレに置いて同様の方法によってクエン酸鉛の染色および洗浄を行った。切片は染色後乾燥してから観察した。
（10）最後にライカFEI Tecnai G2 Spirit TEM透過型電子顕微鏡で観察して撮影した。
【００３２】
実施例1  ヒト幹細胞の心筋細胞への分化を促進する小分子化合物の選別
H9-cTnT-eGFPヒト胚性幹細胞系をレポーターシステムとして使用し、無サイトカインおよび高密度単層培養誘導の条件において、幹細胞の心筋細胞への効率的な分化を促進することができる小分子化合物を選別した。
大量の選別によって、mTORシグナル経路アンタゴニストであるラパマイシン（Rapamycin）とWnt経路アゴニストであるCHIR99021の組み合わせは顕著にヒト幹細胞の心筋細胞への分化を促進することができることが見出された。
【００３３】
実施例2  ラパマイシンとCHIR99021の併用によるヒト幹細胞の心筋細胞への分化に対する促進
初期選別の結果：
結果を図1Aに示す。結果から、mTORシグナル経路アンタゴニストであるラパマイシン（Rapamycin）とWnt経路アゴニストであるCHIR99021の併用は顕著にヒト幹細胞（H9細胞系）の心筋細胞への分化の効率を向上させ、86％に達したことが示された。一方、単独でCHIR99021を使用して得られた心筋細胞の分化率は約15％と低く、単独でラパマイシンを使用して得られた心筋細胞の分化効率はほとんど0であった。
【００３４】
最適化の結果：
CHIR（10nM）でヒト胚性幹細胞を処理した後、ラパマイシン（10nM）処理の時間窓の最適化によって、発明者は所定の時点でラパマイシンを添加・除去した。単層分化の特徴と心筋分化の段階性から、分化全体を3つの段階、すなわち-3から1日目の内胚葉形成段階(0日目を誘導分化の開始時間、すなわち多能性幹細胞培養液mTeSR1を誘導分化培養液RPMI1640-B27に換えた時点と定義した)、1〜5日目の心筋前駆細胞誘導段階、5日目以降の心筋細胞出現・増幅段階に分けた。30日目に、H9-cTnT-eGFPを分化させて得られた心筋細胞の比率を検出することによって、発明者は心筋分化開始段階でラパマイシンを入れると93.5±2.1％の心筋細胞が生成し(図1B)、前の全過程でラパマイシンを入れた場合の誘導効率よりも高かったことを見出した。同時に、ラパマイシンの処理時間を延ばすと最終の心筋細胞の比率を減少しただけではなく、顕著に心筋細胞の収量を低下させたことを見出した（図1C）。1〜5日目または5〜8日目だけでラパマイシンを入れると、生成した心筋細胞の比率が非常に低く、かつ多くの場合細胞が5日目に全部死亡し、心筋細胞を得ることができなかった。
ラパマイシン(Rapamycin)とCHIRの併用による心筋分化促進作用および当該方法の異なるヒト多能性幹細胞の間における普遍的適応性を検出するために、発明者は上記最適化の分化方法をほかの3株のヒト多能性幹細胞系（ヒト胚性幹細胞H7、H9およびヒトiPS幹細胞系U-Q1）に移植し、かつそれぞれH9、H7、U-Q1細胞系の心筋細胞の分化効率を検出した。
【００３５】
結果、この3株の幹細胞系の分化効率は非常に高いレベルに安定したことが見出された。ここで、H7細胞系は上記最適化された分化系で98.3 ± 0.76％の分化効率に達し、ヒト胚性幹細胞系H9は上記最適化された分化系における分化効率が93.3 ± 2.1％で、ヒトiPS細胞も上記最適化された分化系で90.6 ± 3.6％の高い分化効率に達した(図1D)。
そのほか、本発明の分化方法は有効に半分の培養液および添加剤の消耗を節約し、すなわち、24ウェルプレートの各ウェルに毎日必要な培養液が1mlから0.5mlに低下させる（0.5mlあたりの培養液に10万個の幹細胞を接種する）ことができ、同時に非常に高い心筋細胞の生成効率を維持し、1個の幹細胞から24個の心筋細胞が生成した(分化の15日目にカウントした)。0.5mLあたりの培養液に24×105個の心筋細胞が生成した。最終の最適化された分化方法は図1Eに示す。
【００３６】
実施例3 化合物によって誘導された心筋細胞の濃縮精製
分化15日の時、心筋細胞培養液をブドウ糖を含まないDMEM/F12培養液に換えて10％（v/v）の牛胎児血清(FBS)を入れ、培養途中で1mMの乳糖を唯一の炭素源として添加し、2日おきに液を交換し、連続7日培養した。ローサイトメトリーによってcTnT陽性細胞の比率を検出した。
結果から、幹細胞由来の心筋細胞を1mM乳糖（唯一の炭素源）培養液で7日培養し、心筋細胞の純度を99.9％にすることができ（図2A）、統計で1個の幹細胞の投入で24個の心筋細胞が生成し、かつ半分しかない培養液と添加因子が消耗されたことが示された。
【００３７】
実施例4 化合物によって誘導された心筋細胞の特異性指標の同定
免疫蛍光染色技術によって、本発明で分化して得られた心筋細胞のいずれもこの2種類のタンパク質が発現され、一部の細胞では顕著なサルコメア構造があったことが見出された（図2B）。得られた心筋細胞は心筋細胞のような成熟のミトコンドリアを有し（幹細胞のミトコンドリアは少なくて球形が多く、ミトコンドリア内膜のクリステ構造が顕著ではない）、豊富な筋フィラメント構造があり、顕著なZ線が見られ、心筋細胞の間に顕著な介在板のような細胞連絡があった（図2C）。
結果から、本発明の誘導方法による心筋細胞は、成熟度が高く、正常の心筋機能を発揮する構造基礎を有することが示された。
そのほか、心筋細胞の特異的遺伝子の発現プロファイルの検出で、本発明の方法によって分化した心筋細胞のcTnT、αMHC、 Nkx2.5、HCN4、Nav1.5、Cav3.2やKCNQ1などの心筋細胞の特異的構造遺伝子およびイオンチャネル遺伝子の発現レベルが従来のEB分化方法による心筋細胞および成人心筋組織と非常に類似することが見出された（図2D）。
【００３８】
実施例5  ラパマイシンのアポトーシスへの抑制によるヒト胚性幹細胞の高密度単層培養条件における生長に対する促進
ヒト胚性幹細胞の心筋細胞への分化は非常に複雑で脆弱な過程で、様々な環境要素の変化および細胞状態の変化に非常に敏感である。特に単層高密度分化方法は、EB分化法と比べ、より精確な調節に依存し、自己分泌サイトカインの濃度レベルにも依存し、どんな干渉も分化効率の低下、ひいては完全な失敗につながる可能性がある。
分化の過程において、ラパマイシンで処理された細胞はCHIR処理群に対して形態上はより緻密で酵素消化の時より長い時間が必要で、かつ長時間の培養過程で浮く死亡細胞がより少ない。この現象を確認するために、発明者は培養過程で細胞数および細胞活性の変化を検出した。
それぞれDMSO、CHIRおよびCHIR+ラパマイシンという3種類の処理条件で関連検出を行った。細胞計数から、DMSO溶媒で処理された対照細胞に対し、CHIRは最初の3日で幹細胞数の増加を早くすることができたが、4日目に細胞数の急激な低下を減少することができた（4日目に培養液を交換するため、幹細胞は培養環境の急激な変化によって大量に死亡する）。結果から、ラパマイシンはさらに細胞数を増加させ、かつ細胞数の低下を減少することができたことが見出された（図3A）。
CCK-8キットで細胞における脱水素酵素の活性を検出することによって細胞の増殖レベルと細胞活性を評価したところ、類似の結果が得られ、すなわち、ラパマイシンが顕著に細胞数と活性を向上させることができたことも示された(図3B)。
【００３９】
実施例6  ラパマイシンの幹細胞に対する影響
6.1  細胞周期分析およびBrdU細胞増殖検出実験による異なる小分子組成物で処理される場合の幹細胞の増殖速度の検出 
BrdU細胞増殖の検出：
細胞を収集する前に10μM BrdU(Sigma-Aldrich)を入れて1時間インキュベートした。細胞を消化し、300gで5分間遠心し、細胞を収集し、0.5％ BSAを含むPBS(洗浄液)で室温で1回洗浄し、1ml PBSで再懸濁させた。振とうしながら3mlの冷やしておいたエタノールを入れ、室温で20分間固定化し、遠心で上清を除去した。PBSで1回洗浄し、遠心で上清を除去し、沈殿がほぐれるように何回か軽く弾いた。1mlの新しく調製した変性液(2M HCl)をいれ、均一に混合し、室温で20分間置いた。1ml 0.1Mのホウ酸ナトリウム(pH8.5)を入れて室温で2分間中和した。1回洗浄し、抗BrdU抗体(BD Biosciences 1:50で希釈)をいれ、抗体は0.5％ Tween20/0.5％ BSA(Sigma-Aldrich)を含有するPBSで調製された。一次抗体を吸い取り、1mlの洗浄液で1回洗浄し、Alexa-488-抗マウス(1:1000)をいれ、室温で20分間インキュベートした。二次抗体を吸い取り、1回洗浄し、0.5mlの10μg/ml PI溶液で再懸濁させ、室温で30分間インキュベートした。遠心で上清を除去し、洗浄液で1回洗浄し、ローサイトメトリーを行った。
結果から、DMSO対照群に対し、CHIRは僅かにS期にある細胞の比率とBrdU陽性細胞の比率を増加させたが、ラパマイシンはこの促進作用を弱化し、幹細胞の増殖速度をDMSO群に類似するようにさせたことが示された(図4A、4B)。これはmTORが細胞増殖を支持するが、ラパマイシンが細胞増殖を抑制するという従来の観念と一致する。
【００４０】
6.2  ラパマイシンのアポトーシスレベルに対する影響の検出 
カスパーゼ3/7活性検出：本実験でカスパーゼ-Glo 3/7キット(Promega)が使用された。細胞を96ウェルプレートに接種し、相応する小分子で2日処理した後、事前に混合された反応液を入れ、十分に分解させた後、22℃で20分間インキュベートし、装置にセットして蛍光強度を検出したが、詳細は説明書を参照する。
アネキシンV/PI染色：本実験でアネキシンV/PIキット(Roche)が使用された。細胞を24ウェルプレートで培養し、所定の時点でaccutaseで単細胞に消化し、PBSで1回洗浄し、アネキシンVとPIの染色液を入れて10分間インキュベートし、光を避けるように注意し、5倍体積のインキュベート液を入れて希釈し、反応を停止させ、すぐローサイトメトリーを行ったが、励起光は488nmと518nmで、放出光は488〜540nmと617nmであった。
アポトーシスの一番下流の標識タンパク質Parpの切断から、最初の4日のCHIR処理過程で培養時間が長くなると、Parpの切断バンドが増加し、4日目にピーク値に達したことが示された。しかし、ラパマイシンによる処理は顕著にParpの切断を抑制し、最初の3日はほとんど検出されず、4日目だけに現れた（図4C）。カスパーゼ3、6、7はアポトーシスの実行タンパク質で、主に細胞核内、細胞質における構造タンパク質および調節タンパク質の切断を担当する。
【００４１】
カスパーゼ3/7ルシフェラーゼレポーターキットによって幹細胞の内在性カスパーゼ3/7の活性を検出したところ、ラパマイシンによる処理は細胞におけるカスパーゼ3/7の活性をCHIRによる単独処理の半分のレベルに低下させたことが示された(図4D)。
アネキシンV/PI二重染色実験では、3日目の培養終了時、DMSO処理群では平均31.4％のアネキシンV陽性のアポトーシス細胞があり、CHIR処理群では25.8％のアネキシンV陽性のアポトーシス細胞があったが、CHIR+ラパマイシン処理群では約15.5％しかないアネキシンV陽性細胞があったことが示された(図4E)。4日目に、RPMI/B27分化培地を交換して24時間培養した後、前のDMSOしか添加されなかった細胞群では大量の死亡が現れ、約80％の細胞が死亡した。CHIR処理群でも半分近くの死亡があったが、さらにラパマイシンが添加された場合同様に顕著に細胞死亡の比率を減少することができた(図4F)。
上記結果から、ラパマイシンは分化過程において幹細胞に対して保護作用を果たし、アポトーシスの効率的な分化に対する阻害を減少することができ、これはラパマイシンが心筋細胞の収量を向上させる原因でもあることが示された。
【００４２】
実施例7  ほかの化合物の組み合わせによる心筋細胞の誘導
それぞれmTORシグナル経路アンタゴニストであるラパマイシンの類似物のRAD001、KU0063794およびAZD8055をWntシグナル経路アゴニストであるCHIRと組み合わせ、Wntシグナル経路アゴニストであるBIOをラパマイシンまたはラパマイシンの類似物であるRAD001と組み合わせ、心筋細胞の分化状況を観察した。
方法は実施例2の誘導のプロトコールと同様で、その結果、同様の実験条件において、化合物の組み合わせであるCHIRとRAD001、CHIRとKU0063794、CHIRとAZD8055は心筋細胞を生成させ、心筋細胞の分化率はそれぞれ78.8％、68.75％、74.43％であったことが見出された(図5a)。
そして、化合物の組み合わせであるBIOとラパマイシン、BIOとRAD001も心筋細胞を生成させ、心筋細胞の分化率はそれぞれ83.47％、82.9％であった（図5b）。
これらの精製された化合物によって誘導される心筋細胞は、成熟の心筋細胞の形態を持ち、かつ正常の心筋機能を発揮する構造基礎を有する。
そのため、ほかのmTORシグナル経路アンタゴニストとWntシグナル経路アゴニスト（たとえばCHIR、BIO）の組み合わせも効率的に心筋細胞の分化を誘導し、かつ分化した心筋細胞は成熟の心筋細胞の特徴を有する。
【００４３】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
2019506157.tif 000002
【図２】
2019506157.tif 000003
【図３】
2019506157.tif 000004
【図４】
2019506157.tif 000005
【図５】
2019506157.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月18日(2018.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）mTORシグナル経路アンタゴニスト、
（ii）Wnt経路アゴニスト、および
（iii）任意に薬学的に許容される担体、
という成分を含むことを特徴とする、小分子化合物組成物。
【請求項２】
前記mTORシグナル経路アンタゴニストが、ラパマイシン(Rapamycin)、エベロリムス(RAD001)、KU-0063794、AZD8055、テムシロリムス(Temsirolimus)、INK128、リダホロリムス(Ridaforolimus)、およびこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載の小分子化合物組成物。
【請求項３】
前記Wnt経路アゴニストが、CHIR99021、BIO、またはこれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項１に記載の小分子化合物組成物。
【請求項４】
（i）幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための、小分子化合物組成物の使用。
【請求項５】
体外で非治療的に幹細胞の心筋細胞への分化を誘導する方法であって、（a）（i）mTORシグナル経路アンタゴニストと、（ii）Wnt経路アゴニストとを含む、分化誘導化合物の組み合わせの存在下において、培養系で幹細胞系を培養することによって、前記の心筋細胞を得る工程を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項６】
（b）工程（a）で得られた心筋細胞を濃縮して精製する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法によって製造されることを特徴とする、心筋細胞。
【請求項８】
請求項１に記載の小分子化合物組成物を含むことを特徴とする、心筋細胞の分化を促進するキット。
【請求項９】
心臓疾患を予防および／または治療する薬物組成物の製造のための、請求項７に記載の心筋細胞の使用。
【請求項１０】
請求項７に記載の心筋細胞を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項１１】
（i）mTORシグナル経路アンタゴニスト、および
（ii）Wnt経路アゴニスト、
という成分を含むことを特徴とする、幹細胞の心筋細胞への分化を促進するための、小分子化合物組成物。
【国際調査報告】
2019506157.tif 000007
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