(57)【要約】  リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）タンパク質欠損についてのリスク評価に基づき、心血管疾患、他の慢性炎症疾患、心血管および／または非心血管罹患率および死亡率についてのリスクがある患者を分類し、コンパニオン治療薬としての組換えリンパ球活性化遺伝子−３またはＬＡＧ３模倣体を単独で、またはスタチンおよび／もしくは抗高脂血症薬との組合せで使用してリスクを仲介する方法。リスク評価は二又式であり、対象がインフラマソームの異常発現、炎症についての高まったリスクおよび／または機能不全ＨＤＬを有するか否かまたは罹患しやすいか否かの定性的決定から開始し、次いでＬＡＧ３遺伝子のコード配列中で生じる多型についての定量的アッセイまたは遺伝子スクリーンを施与する。陽性の指標を考慮して、組換えＬＡＧ３および／もしくはＬＡＧ３模倣体を単独で、またはコレステロールを仲介する治療薬の治療的使用との組合せで使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト成人対象における慢性炎症および心血管疾患を治療する方法であって、
ＬＡＧ３タンパク質の潜在的欠損を示すＬＡＧ３欠損マーカーを検出するために前記対象の定性的プレスクリーンを施与するステップ；
前記ＬＡＧ３タンパク質欠損を確認するために前記対象に対して定量的試験を施与するステップ；
前記対象に、アジュバントとしてのｈＬＡＧ３−−Ｉｇと、少なくとも１つの化学療法剤との組合せを含む治療レジメンを施与するステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記対象の定性的プレスクリーンを施与する前記ステップが、ＬＡＧ３欠損マーカーについての医療記録をプレスクリーニングすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象の定性的プレスクリーンを施与する前記ステップが、ＬＡＧ欠損マーカーについての家族歴をプレスクリーニングすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
定量的試験を施与する前記ステップが、前記ＬＡＧ３タンパク質欠損を確認するために前記対象からの血液試料に対して定量的試験を施与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記血液試料に対する前記定量的試験が、アッセイである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記血液試料に対する前記定量的試験が、遺伝子試験である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記定量的試験が、ＬＡＧ３の低レベル発現の存在についての前記対象からの血漿試料の遺伝子試験およびアッセイの両方を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記定量的遺伝子試験が、ＳＣＡＲＢ１またはＬＡＧ３遺伝子のコード配列中の多型を検出するように構成される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記多型が、ＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４またはＬＡＧ３ｒｓ８７０８４９突然変異である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記血液試料に対する前記定量的試験が、ＳＣＡＲＢ１またはＬＡＧ３遺伝子の少なくとも一部を増幅させてからアレルバリアントを同定することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記アッセイが、３４００ｐｇ／ｍｌ未満の低ＬＡＧ３を計測するように構成される、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
前記アッセイが、ＥＬＩＳＡアッセイである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象に治療レジメンを施与する前記ステップが、組換えヒトＬＡＧ３を定期投与により投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象に治療レジメンを施与する前記ステップが、組換えＬＡＧ３模倣体を定期投与により投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象に治療レジメンを施与する前記ステップが、化学療法剤プロブコールを投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
プロブコールを投与する前記ステップが、３〜４ヵ月間の範囲内の定期投与を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
プロブコールを投与する前記ステップが、前記対象の余生にわたる定期投与を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
組換えヒトＬＡＧ３を定期投与により投与する前記ステップが、ヒトＬＡＧ３タンパク質を投与することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記コンパニオン治療薬が、抗炎症剤、前記対象におけるＨＤＬ−Ｃ機能、サイズ、および／または組成を改善する薬剤、前記対象における機能不全ＨＤＬ−Ｃを減少させる薬剤、ＰＣＳＫ９阻害剤、ならびにＬＡＧ３模倣体からなる群から選択される任意の１つ以上の薬剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象を前記定期投与の間モニタリングしてＬＤＬ酸化ならびに血漿ＨＤＬコレステロールおよび血漿／血清サイトカインに対する効果を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記モニタリングが、包括的プロファイリングを用いる月１回の安全性検査およびＥＫＧを含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年９月１２日に出願された米国特許出願第１５／２６２，６１８号明細書からの優先権を主張する。
本発明は、疾患検出および疾患、例えば、心血管および免疫疾患のための治療に関し、より具体的には、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）タンパク質欠損についてのリスク評価に基づき、心血管疾患、他の慢性炎症疾患、ならびに心血管および非心血管死亡率についてのリスクがある患者を分類し、コンパニオン治療薬としての組換えリンパ球活性化遺伝子−３を使用してリスクを仲介する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化症は、最終的に血管閉塞および臨床疾患をもたらす自然および適応免疫細胞ならびにコレステロールプラークにより冠動脈血管が浸潤される慢性炎症疾患であることが目下、十分に確立されている［Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ−ａ  ｍａｔｔｅｒ  ｏｆ  ｕｎｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｖｉｏｌａ  Ｊ，Ｓｏｅｈｎｌｅｉｎ  Ｏ．ｓ．ｌ．：Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１５，Ｖｏｌ．２７，ｐｐ．１８４−１９３］。患者におけるアテローム性動脈硬化リスクを評価するために多数の心血管疾患（ＣＶＤ）リスク因子、例として、高血圧、糖尿病、脂質、年齢、および性別が臨床使用されている［Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  Ｓｕｍｍａｒｙ．Ｔｈｉｒｄ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＣＥＰ）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔｓ．ｓ．ｌ．：ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．０１−３６７０，２００１］。このプレシジョンメディシンの時代において、遺伝子的原因もＣＶＤリスクに対して主な影響を与えることが理解される。目下、ＣＶＤ、特に、アテローム性動脈硬化症および心筋梗塞のような疾患と有意に関連する公知および新規の遺伝子座を同定した多数のゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）が存在する［Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｋａｔｈｉｒｅｓａｎ  Ｓ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｄ．ｓ．ｌ．：Ｃｅｌｌ，２０１２，Ｖｏｌ．１４８，ｐｐ．１２４２−１２５７］。
ＳＲ−ＢＩ遺伝子、ＳＣＡＲＢ１（第１２染色体：ｑ２４．３１上に位置）内のｒｓ１０８４６７４４単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が、無症候性アテローム性動脈硬化症およびＣＶＤと有意に関連することが示されている。発行された米国特許第９，３３４，５３８号明細書において、本発明者は、女性をゲノタイピングしてＳＣＡＲＢ１遺伝子（第１２染色体：ｑ２４．３１上に位置）のｒｓ１０８４６７４４突然変異の存在を同定する方法を開示した。これは、アテローム性動脈硬化症の多民族的研究（ＭＥＳＡ）の参加者における無症候性アテローム性動脈硬化症（ＳＣＡ）およびインシデント心血管疾患（ｉｎｃｉｄｅｎｔ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）（ＣＶＤ）と有意に関連した。特に、リスクＣアレルのキャリアは、インシデントＣＶＤについての有意に増加したオッズを有し、多変量回帰モデルにおいて、この関係は慣習的なＣＶＤリスク因子、例えば、年齢、ボディーマスインデックス、高血圧、喫煙、腎疾患、スタチン使用または脂質レベル（総コレステロールか、ＬＤＬ−コレステロール［ＬＤＬ−Ｃ］か、ＨＤＬ−Ｃか、トリグリセリドかを問わない）の包含により減衰されなかった。これらの知見は、他の因子または経路がこの遺伝子バリアントとインシデントＣＶＤとの関連における原因であり得ることを強力に示唆した。
興味深いことに、ｒｓ１０８４６７４４はＳＣＡＲＢ１の第１イントロン内に存在し、バイオインフォマティック分析は、このＳＮＰが調節領域内に存在することを明らかにした。データは、このＳＮＰが同一染色体（染色体内）上で、または染色体間で遺伝子を転写的に調節し得ることを示唆した。本発明者はこの可能性を調査し、多数の転写調節される遺伝子候補が出現した。特にその１つ、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）も第１２染色体上に位置し、それをさらに調査した。ＬＡＧ３は、Ｔリンパ球活性化における重要な調節因子である［Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３／ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ＣＤ４＋Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｈｕａｒｄ  Ｂ，Ｔｏｕｒｎｉｅｒ  Ｍ，Ｈｅｒｃｅｎｄ  Ｔ，Ｔｒｉｅｂｅｌ  Ｆ，Ｆａｕｒｅ  Ｆ．ｓ．ｌ．：Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９４，Ｖｏｌ．２４，ｐｐ．３２１６−３２２１］。ＬＡＧ３はＩｇスーパーファミリーに属し、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子に対するリガンドである［ＬＡＧ−３：ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ＤＣ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｆ．，Ｔｒｉｅｂｅｌ．ｓ．ｌ．：ＴＲＥＮＤＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３，Ｖｏｌ．２４，ｐｐ．６１９−６２２］。これは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫリンパ球、単球、および樹状細胞（ＤＣ）中で発現され、その主要機能は、エフェクターＴ細胞拡大およびホメオスタシスを制御することによる活性化Ｔ細胞の負の調節因子であると考えられる［ＬＡＧ−３  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．Ｗｏｒｋｍａｎ  ＣＪ，Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｅｌ  Ｋａｓｍｉ  ＫＣ，Ｐａｒｄｏｌｌ  ＤＭ，Ｍｕｒｒａｙ  ＰＪ，Ｄｒａｋｅ  ＣＧ，Ｖｉｇｎａｌｉ  ＤＡ．ｓ．ｌ．：Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００９，Ｖｏｌ．１８２，ｐｐ．１８８５−１８９１；Ｔｈｅ  ＣＤ４−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＬＡＧ−３（ＣＤ２２３），ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｗｏｒｋｍａｎ  ＣＪ，Ｖｉｇｎａｌｉ  ＤＡ．ｓ．ｌ．：Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３，Ｖｏｌ．３３，ｐｐ．９７０−９７９］。細胞表面ＬＡＧ３は、ＡＤＡＭ１０およびＡＤＡＭ１７メタロプロテアーゼによる開裂に供され、それが可溶性ＬＡＧ３（ｓＬＡＧ３）をもたらす［Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ＬＡＧ−３．Ｌｉ  Ｎ，Ｗａｎｇ  Ｙ，Ｆｏｒｂｅｓ  Ｋ，Ｖｉｇｎａｌｉ  ＫＭ，Ｈｅａｌｅ  ＢＳ，Ｓａｆｔｉｑ  Ｐ，Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ｄ，Ｂｌａｃｋ  ＲＡ，Ｒｏｓｓｉ  ＪＪ，Ｂｌｏｂｅｌ  ＣＰ，Ｄｅｍｐｓｅｙ  ＰＪ，Ｗｏｒｋｍａｎ  ＣＪ，Ｖｉｇｎａｌｉ  ＤＡ．ｓ．ｌ．：ＥＭＢＯ，２００７，Ｖｏｌ．２６，ｐｐ．４９４−５０４］。
インビトロおよびエクスビボアプローチは、高アルファリポタンパク質血症（ＨＡＬＰ）対象から単離された生物検体中のｒｓ１０８４６７４４とＬＡＧ３との関連を試験するために採用される。ｒｓ１０８４６７４４は、ＬＡＧ３、および細胞内インフラマソームのマーカー、例えば、ＮＬＲＰ３の発現および機能の変更と有意に関連することが見出された。
ＬＡＧ３は第１２染色体（ｃｈｒ１２：ｐ１３）上のＣＤ４遺伝子座の近傍に位置する一方、ｒｓ１０８４６７４４はｃｈｒ１２：ｑ２４．３２上に位置する。ＬＡＧ３は、ＣＤ４に対して競合するものでない場合、抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩに結合することにより類似の機能を有する［Ｓｉｅｒｒｏ  Ｓ，Ｒｏｍｅｒｏ  Ｐ，Ｓｐｅｉｓｅｒ  ＤＥ．Ｔｈｅ  ＣＤ４−ｌｉｋｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＬＡＧ−３，ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１１；１５：９１−１０１．］。
Ｇｏｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３４：Ａ３５９（２０１４）は、ＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４リスク（ＣＣ）アレルのヒトホモ接合性キャリアが、有意に低い血漿ＬＡＧ３タンパク質レベルを有したことを示している。インビトロ試験は、リスク（ＣＣ）リンパ球が基準（ＧＧ）リンパ球と比較して多くの炎症促進サイトカイン（ＴＮＦα）を分泌し、少ない抗炎症サイトカイン（ＩＬ−１０）を分泌することを明らかにした。結果的に、リスク（ＣＣ）アレルのこれらの同一キャリアは、ＣＶＤイベントリスクについての公知の代用物の増加した頸動脈内膜中膜厚度（ｃＩＭＴ）を有することが示された。
インビトロおよびインビボネズミ試験は、ｓＬＡＧ３が、ＭＨＣクラスＩＩシグナリング経路を調節してＴ細胞活性化およびホメオスタシスを制限することを示唆している一方、いくつかの臨床試験は、ｓＬＡＧ３と結核耐性［Ｌｉｅｎｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ，Ａｃｔｉｖｅ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｔｈ１  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｔｈ２  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，Ｇ．ｓ．ｌ．：Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００２，Ｖｏｌ．３２，ｐｐ．１６０５−１６１３］および乳癌予後［Ｔｒｉｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ−２（ｓＬａｇ−３）ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｏｒ  ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｍ−Ｆ．ｓ．ｌ．：Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００６，Ｖｏｌ．２３５，ｐｐ．１４７−１５３］との関連を示している。ネズミ細胞において、Ｋｉｓｉｅｌｏｗらは、活性化Ｔ細胞がＢ細胞上のＬＡＧ３発現を誘導することを報告した［Ｋｉｓｉｅｌｏｗ  Ｍ，Ｋｉｓｉｅｌｏｗ  Ｊ，Ｃａｐｏｆｅｒｒｉ−Ｓｏｌｌａｍｉ  ｇ，Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ  Ｋ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３（ＬＡＧ−３）ｏｎ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５；３５：２０８１−２０８８．］。Ｋｉｓｉｅｌｏｗらは、Ｂ細胞上のＬＡＧ３誘導がＴ細胞依存的であり、他の刺激、例えば、非メチル化ＣｐＧモチーフ１８２６、細菌ＬＰＳ、または抗Ｉｇ抗体の、抗ＣＤ４０およびＩＬ−４との組合せに依存的でないことを決定した。対照的に、ＬＡＧ３ＲＮＡおよびタンパク質はＥＢＶ形質転換Ｂ細胞中で検出され、リスクＣアレルを発現する細胞と比較して、基準ＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４Ｇアレルを発現するＥＢＶ形質転換細胞中では発現が有意に高かった。Ｂリンパ球のＥＢＶ形質転換は細胞を活性化させ得るが、ｒｓ１０８４６７４４ゲノタイプ層別化に基づくＬＡＧ３発現のレベルの有意差が存在した。重要なことに、他者らはＢ細胞、例えば、Ｒａｍｏｓ細胞中のＬＡＧ３発現の欠落を観察した［Ｂａｉｘｅｒａｓ  Ｅ，Ｈｕａｒｄ  Ｂ，Ｍｉｏｓｓｅｃ  Ｃ，Ｊｉｔｓｕｋａｗａ  Ｓ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｍ，Ｈｅｒｃｅｎｄ  Ｔ，Ａｕｆｆｒａｙ  Ｃ，Ｔｒｉｅｂｅｌ  Ｆ，Ｐｉａｔｉｅｒ−Ｔｏｎｎｅａｕ  Ｄ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ３−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａ  ｎｅｗ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９２；１７６：３２７−３３７．］。しかしながら、本発明者はそれらの細胞をゲノタイピングし、それらがｒｓ１０８４６７４４バリアントについてヘテロ接合性であることを見出した。より最近では、Ｍｏｒａｌｅｓらは、ホジキンリンパ腫におけるＥＢ���陽性がＬＡＧ３の増加した遺伝子発現と有意に関連することを示した［Ｍｏｒａｌｅｓ  Ｏ，Ｍｒｉｚａｋ  Ｄ，Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｖ，Ｍｕｓｔａｐｈａ  Ｒ，Ｍｉｒｏｕｘ  Ｃ，Ｄｅｐｉｌ  Ｓ，Ｄｅｃｏｕｖｅｌａｅｒｅ  ＡＶ，Ｌｉｏｎｎｅ−Ｈｕｙｇｈｅ  Ｐ，Ａｕｒｉａｕｌｔ  Ｃ，ｄｅ  Ｌａｕｎｏｉｔ  Ｙ，Ｐａｎｃｒｅ  Ｖ，Ｄｅｌｈｅｍ  Ｎ．Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｔｙｐｅ  １  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ２０１４  Ｊｕｌｙ  ９．Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］。
ネズミモデルを用いた試験は、アテローム性動脈硬化症病変サイズおよび炎症がＴ細胞活性化の阻害剤、例として、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２経路ならびに制御性Ｔ細胞が欠損する場合に増加することを示している［Ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｌｉｃｈｔｍａｎ  ＡＨ，Ｂｉｎｄｅｒ  ＣＪ，Ｔｓｉｍｉｋａｓ  Ｓ，Ｗｉｔｚｔｕｍ  ＪＬ．ｓ．ｌ．：Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，２０１３，Ｖｏｌ．１２３，ｐｐ．２７−３６］。
Ｂａｉｘｅｒａｓら、前掲は、多数の細胞系におけるＬＡＧ３の細胞分布を特徴付けし、ＬＡＧ３が脂質ラフト内に存在することを実証した。続いて、ＷｏｏらはＬＡＧ３の細胞内分布を報告し、ＬＡＧ３が細胞内コンパートメントおよび細胞膜間で等しく分布することを見出した［Ｗｏｏ  Ｓ−Ｒ，Ｌｉ  Ｎ，Ｂｒｕｎｏ  ＴＣ，Ｆｏｒｂｅｓ  Ｋ，Ｂｒｏｗｎ  Ｓ，Ｗｏｒｋｍａｎ  Ｃ，Ｄｒａｋｅ  ＣＧ，Ｖｉｇｎａｌｉ  ＤＡＡ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬＡＧ−３  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＤ４．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１０；４０：１７６８−１７７７］。
フローサイトメトリーを使用することにより、本発明者は、刺激条件にかかわらず低レベルのＬＡＧ３がｒｓ１０８４６７４４リスクＣ発現細胞の表面上で検出されることを確認した。しかしながら、ＬＡＧ３は非刺激ｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ細胞において細胞表面上で発現され、そのレベルは刺激後に有意に増加した。ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞におけるこれらの結果は、Ｗｏｏら、前掲により報告されたものとは、ＷｏｏらがＬＡＧ３が活性化Ｔ細胞の表面上でのみ発現されることを報告したという点で対照的である。
脂質ラフトシグナリングは、Ｂ細胞活性化に必須であることも公知である［Ｓｉｍｏｎｓ  Ｋ，Ｔｏｏｍｒｅ  Ｄ．Ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．［Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０００；１：３１−３９］。具体的には、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の刺激は、ＣＤ７９ＡおよびＣＤ７９Ｂ（Ｉｇ−アルファ／Ｉｇ−ベータヘテロ二量体と会合する膜貫通免疫グロブリン（Ｉｇ）受容体）の細胞質テール中で免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）のリン酸化を開始させる［Ｓｃｈａｍｅｌ  ＷＷ，Ｒｅｔｈ  Ｍ．Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０００；１３：５−１４］。ＩＴＡＭのリン酸化はＳｙｋについてのドッキング部位として機能し、それは様々なＳｒｃファミリーキナーゼ（ＳＦＫ）、例として、Ｆｙｎ、Ｂｌｋ、およびＬｙｎにより媒介される［Ｔａｋａｔａ  Ｍ，Ｓａｂｅ  Ｈ，Ｈａｔａ  Ａ，Ｉｎａｚｕ  Ｔ，Ｈｏｍｍａ  Ｙ，Ｎｕｋａｄａ  Ｔ，Ｙａｍａｍｕｒａ  Ｈ，Ｋｕｒｏｓａｋｉ  Ｔ．Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  Ｌｙｎ  ａｎｄ  Ｓｙｋ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｃａ２＋ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９４；１３：１３４１−９．］。Ｌｙｎは、Ｂ細胞活性化時に脂質ラフトシグナリングに関与する主要なタンパク質である［Ｓｉｍｏｎｓ、前掲］。この活性化は、種々の細胞内シグナリング分子から構成される「シグナロソーム」の協調的集合を開始させ、それとしては、Ｂｔｋ、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびＰＬＣγ２が挙げられる［Ｂｌｉｘ  ＥＳ，Ｉｒｉｓｈ  ＪＭ，Ｈｕｓｅｂｅｋｋ  Ａ，Ｄｅｌａｂｉｅ  Ｊ，Ｆｏｒｆａｎｇ  Ｌ，Ｔｉｅｒｅｎｓ  ＡＭ，Ｍｙｋｌｅｂｕｓｔ  ＪＨ，Ｋｏｌｓｔａｄ  Ａ．Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａｂｅｒｒａｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｉｎｄｏｌｅｎｔ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．ＢＭＣ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１２；１２：４７８．］。ＰＬＣγ２は、ヒトＢリンパ球中で発現される主なアイソフォームである［Ｃｏｇｇｅｓｈａｌｌ  ＫＭ，ＭｃＨｕｇｈ  ＪＣ，Ａｌｔｍａｎ  Ａ．Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ−ｇａｍｍａ  ２  ｉｎ  Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９２；８９：５６６０−４．］。これは、ＢＣＲ媒介ホスホイノシトール加水分解および後続の生化学的イベント、例として、ＰＫＣ活性化にも必要不可欠である［Ｓｕｇａｗａｒａ  Ｈ，Ｋｕｒｏｓａｋｉ  Ｍ，Ｔａｋａｔａ  Ｍ，Ｋｕｒｏｓａｋｉ  Ｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  １，ｔｙｐｅ  ２  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ３  ｉｎｏｓｉｔｏｌ  １，４，５−ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９７；１６：３０７８−８８］。
ＭＨＣクラスＩＩはＬＡＧ３に対する主なリガンドであり、ＬＡＧ３はＭＨＣクラスＩＩに、それがＴ細胞の細胞増殖、活性化、およびホメオスタシスを負に調節する場合に高い親和性で結合し、Ｔｒｅｇ抑制機能における役割を担うことが報告されている。対照的に、樹状細胞のサブセット上の脂質ラフトミクロドメイン中のＭＨＣクラスＩＩを介するシグナリングは、それが可溶性ＬＡＧ３（ｓＬＡＧ３）により結合された後、樹状細胞活性化をもたらす。本発明者は、目下、リンパ球中の細胞ＬＡＧ３がホスホシグナリングカスケードの調節の原因であることを発見した。このことは、その従来の公知のＭＨＣクラスＩＩ受容体への結合機能とは無関係のＬＡＧ３の区別される新規な機能である。
しかしながら、ＨＤＬ粒子と会合する主要なアポリポタンパク質、ａｐｏＡ−Ｉは、Ｔリンパ球による単球の活性化を阻害することにより炎症サイトカイン産生を阻害することが示されている［Ｈｙｋａ  Ｎ，Ｄａｙｅｒ  Ｊ−Ｍ，Ｍｏｄｏｕｘ  Ｃ，Ｋｏｈｎｏ  Ｔ，Ｅｄｗａｒｄｓ  ＩＩＩ  ＣＫ，Ｒｏｕｘ−Ｌｏｍｂａｒｄ  Ｐ，Ｂｕｒｇｅｒ  Ｄ．Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｉ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α  ｂｙ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｃｏｎｔａｃｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２００１；９７：２３８１−２３８９］。具体的には、Ｈｙｋａらは、ａｐｏＡ−Ｉが最初に表面因子に結合することにより、刺激単球からのサイトカイン産生を阻害することを観察し、それは、ａｐｏＡ−Ｉが表面ＬＡＧ３と相互作用し得る可能性を示唆する。
ＳＣＡＲＢ１バリアント、ｒｓ１０８４６７４４と冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）との有意な関連は、Ｍａｎｉｃｈａｉｋｕｌら（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２０１２；３２：１９９１−１９９９）に示された。しかしながら、従来の分析は、ｒｓ１０８４６７４４がＳＣＡおよびインシデントＣＶＤと直接関連することを示していない。これは、本発明者が見出したとおり、ＬＡＧ３が、ｒｓ１０８４６７４４とアテローム性動脈硬化疾患およびＣＶＤとの関連を媒介する重要な免疫調節因子であるためである。エフェクターおよび制御性Ｔ細胞上でのＬＡＧ３タンパク質発現はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）媒介活性化を、ＭＨＣクラスＩＩとのＴＣＲ相互作用を遮断することにより阻害し得、形質細胞様ＤＣ上のＬＡＧ３タンパク質は、他の機序によりエフェクターＴ細胞を間接的に抑制し得る。ＬＡＧ３タンパク質欠損は、ＤＣおよびマクロファージによる向上したインフラマソーム媒介ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８産生（特殊化サイトカイン潜在性を有する炎症表現型にＴ細胞分化を歪曲する２つのサイトカイン）をもたらし得る［Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｆａｍｉｌｙ：ｂａｃｋ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｕｔｕｒｅ．Ｇａｒｌａｎｄａ  Ｃ，Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ  ＣＡ，Ｍａｎｔｏｖａｎｉ  Ａ．ｓ．ｌ．：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１３，Ｖｏｌ．３９，ｐｐ．１００３−１０１８］。
したがって、マウス（Ｌａｇ３）およびヒト（ＬＡＧ３）におけるＬＡＧ３タンパク質欠損は、高コレステロール血症に対するアテローム生成促進Ｔ細胞応答を向上させ、増加したプラーク炎症および／または増加したプラーク発生をもたらすことが予測される。
遺伝子変異に起因するＬＡＧ−３タンパク質の欠損がヒトにおいて存在することならびにそれがアテローム性動脈硬化症、他の慢性炎症疾患、心血管および／または非心血管死亡率と有意に関連することは明らかではない。ＬＡＧ３がＣＶＤおよび他の慢性炎症疾患において担う媒介因子の役割に基づき、本発明は、あるＳＣＡＲＢ１およびＬＡＧ−３遺伝子変異ならびに臨床的に有意なアテローム性動脈硬化症、他の慢性炎症疾患、慢性炎症疾患、機能不全ＨＤＬ、心血管および／または非心血管罹患率および死亡率についてのリスクを増加させる他の遺伝子および非遺伝子的因子に基づきＣＶＤリスクがある患者を評価するためのバイオマーカーとしてのＬＡＧ３発現プロファイリングを使用し、新規組換えＬＡＧ３コンパニオン治療薬により前記リスクを改善する方法を開示する。
ＩＭＰ３２１（ＬＡＧ３のヒト二量体可溶性形態）の治療活性は、前臨床および臨床試験において周知である。アジュバントとしてのｈＬＡＧ３−−Ｉｇと化学療法剤の組合せはそれ自体でのいずれかの治療よりも優れていることが示されている。
さらに、ＬＡＧ３遮断は、他の阻害受容体、例えば、ＰＤ−１の遮断と組み合わせ、向上したＴ細胞活性および疾患からの保護をもたらすことができる。さらに、可溶性組換え二量体ＬＡＧ３タンパク質の治療活性は、いくつかの点で公知である。［Ｓｉｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ＣＤ４−ｌｉｋｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＬＡＧ−３，ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ３］。ヒトにおいて、組換えＬＡＧ３はＤＣ活性化を誘導し、免疫アジュバント活性を提供する（ＬＡＧ−３の膜結合形態の阻害活性とは対照的である）。Ａｎｄｒｅａｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ−３（ＣＤ２２３）”，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６８：３８７４−８０（２００２）。
２００２年６月２５日に発行されたＴｒｉｅｂｅｌ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｇｕｓｔａｖｅ−Ｒｏｕｓｓｙ）の米国特許第６，４１０，５０９号明細書は、ワクチン接種のための、および癌治療におけるアジュバントとしてのｈＬＡＧ３の使用を示しており、可溶性ｈＬＡＧ３の全身投与はインビボ腫瘍成長の阻害を直接誘導する（実施例ＩＶ参照）。同様に、２０１１年１月１３日に公開されたＴｒｉｅｂｅｌ（Ｉｍｍｕｔｅｐ）の米国特許出願第２０１１０００８３３１号明細書は、単球媒介免疫応答をブーストするため、特に、血中の単球数の増加を誘発させるための、組換えＬＡＧ３の定期的使用を示している。この出願は、ヒトＬＡＧ３またはその誘導体が、極めて悪性の腫瘍を有する患者中に接種された場合、単球依存的である強力な免疫を誘導したという「完全に予想外の」発見を記載している。誘導される免疫は、血液単球数の有意な増加によりそれ自体顕在化する。既知癌患者におけるＴ細胞数をブーストするためのワクチンアジュバントとしてのｈＬＡＧ３の使用にもかかわらず、ＬＡＧ３欠損マーカーを確定的にスクリーニングすること、およびそれが見出された場合、組換えヒトＬＡＧ３により異なる時点の定期投与により予測患者を治療することにより結果として生じるリスクを改善することが依然として動機付けられていない。本発明者は、特異的２点発現プロファイル（突然変異および／または非遺伝子的原因、例えば、ＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４突然変異および／もしくはＬＡＧ−３ｒｓ８７０８４９または他の遺伝的もしくは非遺伝子的原因および突然変異の組合せ）を使用して心血管疾患、他の慢性炎症疾患、心血管および／または非心血管罹患率および死亡率についてのリスクがある患者をプレスクリーニングし、次いでコンパニオン治療薬としての組換えヒトリンパ球活性化遺伝子−３を使用するテーラード治療レジメンを施与することにより、これを行う。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本革新の課題は、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）タンパク質欠損に基づき、心血管疾患、他の慢性炎症疾患、心血管および／または非心血管罹患率および死亡率についてのリスクがある患者を評価し、コンパニオン治療薬としての組換えヒトリンパ球活性化遺伝子−３の使用を含むテーラード治療レジメンにより前記リスクを仲介するための新規方針を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一実施形態において、本方法は、心血管疾患の発症についての１つ以上のリスク因子について対象を定性的にプレスクリーニングする第１のステップと、対象からの試料におけるＬＡＧ３タンパク質欠損を定量的に検出する第２のステップと、抗炎症剤、対象におけるＨＤＬ−Ｃ機能、サイズ、および／または組成を改善する薬剤、対象における機能不全ＨＤＬ−Ｃを減少させる薬剤、ＰＣＳＫ９阻害剤（ＬＤＬコレステロールレベルを大幅に降下させることが示されている新たなクラスの薬物）、または任意の他のコレステロール降下生物製剤、コレステロール変更小分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子への結合によりＬＡＧ３機能を模倣する薬剤、ＬＡＧ３ホスホシグナリング効果を模倣する薬剤、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、または結合しないＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、Ｂｒｅｇ、およびＴｒｅｇにおけるＬＡＧ３の役割を模倣する薬剤、ならびに細胞膜の脂質ラフトにおけるＬＡＧ３の役割を模倣する薬剤からなる群から選択される１つ以上の薬剤に対するコンパニオン治療薬としての組換えヒトリンパ球活性化遺伝子−３により対象を治療する第３のステップとを含む。ＬＡＧ３模倣体としては、小分子薬剤、マイクロＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、生物製剤、活性化抗体、ＬＡＧ３転写調節に影響を与えるＤＮＡまたはＲＮＡ構造またはフレキシビリティーに影響を与える薬剤、例として、細胞内カチオン、例えば、カリウム、ナトリウム、リチウム、およびカルシウムを調節する薬剤を挙げることができる。
本発明の他の課題、特徴、および利点は、好ましい実施形態およびそのある改変の以下の詳細な説明からより明らかになる。
本発明の他の課題、特徴、および利点は、添付の図面と一緒に解釈される場合、好ましい実施形態およびそのある改変の以下の詳細な説明からより明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】ＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４と有意に関連する血漿ｓＬＡＧ３レベルのグラフである。
【図２】ＮＭＲ分光法による小型ＨＤＬ粒子とのｓＬＡＧ３の関連のグラフである。
【図３】本診断方法の例示的実施形態のブロック図である。
【図４】単量体または二量体形態のいずれかであり得る好適な組換えヒトＬＡＧ３についての受託番号および配列表を列記する。
【図５】表２は、血漿ＬＡＧ−３（Ａ）およびＨＤＬ−Ｃ（Ｂ）：ＭＥＳＡについての独立予測因子の多変量回帰分析を示す。
【図６】フローサイトメトリーにより計測されたｒｓ１０８４６７４４基準Ｇおよびｒｓ１０８４６７４４リスクＣ発現細胞におけるＬＡＧ３の細胞表面発現のサイトグラムグラフである。
【図７】フローサイトメトリーにより計測されたＬＡＧ３＋ｒｓ１０８４６７４４基準ＧおよびリスクＣ発現細胞の細胞表面発現のグラフ分析である。
【図８】ｒｓ１０８４６７４４基準Ｇおよびｒｓ１０８４６７４４リスクＣ発現細胞からの活性化後の経時的な培地中のＬＡＧ３タンパク質レベルの変化のグラフである。
【図９】ｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ−００３およびｒｓ１０８４６７４４リスクＣ−００８発現細胞における活性化後の経時的な培地中の分泌サイトカイン（ＴＮＦαおよびＩＬ−１０）レベルの変化のグラフである。
【図１０】いかにＬＡＧ３タンパク質がＢＣＲシグナリングにおいて重要であり、ホスホシグナリングの影響における原因であるかを説明する。
【図１１】いかにＬＡＧ３タンパク質が脂質ラフトの特徴的なマーカーであるかを説明する。
【図１２】多変量回帰分析の表（表３〜６）の組合せである。
【図１３】高脂肪食給餌後のマウスにおけるＣＤ４＋Ｌａｇ３Ｔ細胞活性化のグラフである。
【図１４】ＬｄｌｒレシピエントマウスにおいてＬａｇ３ヌル細胞を骨髄移植し、次いで高脂肪食を給餌すると、大動脈基部においてＣＤ４+Ｔ細胞の有意に大きな浸潤がもたらされたことを示す。
【図１５】ＬｄｌｒレシピエントマウスにおけるＬａｇ３ヌル細胞の骨髄移植が、増加したアテローム性動脈硬化病変サイズおよび流入領域傍大動脈リンパ節中の増加したｅｘＴｒｅｇのパーセントと有意に関連したことを示す。
【図１６】ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するマウスＢ脾細胞に用量応答的に結合する組換えヒト可溶性単量体ＬＡＧ３のグラフの組合せである。
【図１７】マウスＴ細胞（ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない）と比較してマウスＢ細胞（ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する）に優先的に用量応答的に結合する組換えヒト可溶性単量体ＬＡＧ３を示すグラフである。
【図１８】例えば、ホルボールエステル、イオノマイシン、およびインターロイキン−４を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明は、対象がアテローム性動脈硬化症、慢性炎症疾患、インシデント心血管疾患（ＩＣＤ）、炎症応答により特徴付けされる他の病変、心血管および／または非心血管罹患率および／または死亡率を有するか否かまたは罹患しやすいか否かを決定し、抗炎症剤、対象におけるＨＤＬ−Ｃ機能、サイズ、および／もしくは組成を改善する薬剤ならびに対象における機能不全ＨＤＬ−Ｃを減少させる薬剤、ならびに／またはＬＡＧ３の全ての機能を模倣する薬剤からなる群から選択される１つ以上の薬剤とのコンパニオン治療薬としての組換えヒトリンパ球活性化遺伝子−３を使用するテーラード治療レジメンによりリスクを改善するための新規方法およびキットを提供する。
本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明記しない限り、複数の言及対象を含む。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は、１つ以上のタンパク質への言及であり、当業者に公知のその均等物を含む。「ｒｓ」表記によるＳＮＰへの任意のおよび全ての言及、例えば、ｒｓ１０８４６７４４は、本明細書において、公知の方法により容易に検索可能な関連ヌクレオチド配列を取り込む。具体的には、ｒｓ１０８４６７４４についてのヌクレオチド配列は、例えば、ＮＣＢＩのｄｂＳＮＰ  Ｅｎｔｒｅｚデータベースから検索可能である。ＳＣＡＲＢ１はＨＤＬ受容体遺伝子、スカベンジャー受容体クラスＢ１型（ＳＣＡＲＢ１）を指し、ＬＡＧ３は免疫チェックポイント阻害剤、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）を意味する。用語「アジュバント」は、本明細書において、抗原に対する身体の免疫応答を向上させる物質と定義される。
発見データ
ＬＡＧ３は、ＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４バリアントにより、ならびにＬＡＧ３ＳＮＰおよび細胞代謝変化により転写的に制御される。具体的には、ＳＣＡＲＢ１および／またはＬＡＧ３遺伝子のコード配列中で生じる多型を、病変、例えば、感染、炎症、慢性炎症疾患、冠動脈疾患、心血管および／または非心血管罹患率および死亡率の診断予測因子として使用することができる。本発明者は、ＲＮＡシーケンシングを使用して免疫モジュレーターＬＡＧ３が、ＳＣＡＲＢ１イントロン性バリアントｒｓ１０８４６７４４と、無症候性アテローム性動脈硬化症およびインシデントＣＶＤとの関連を結び付ける因果経路における主要な役割を担うことを同定した。検証実験は、ＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４とＬＡＧ３との有意な関連を裏付けた。実験は、ｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ細胞と比較してｒｓ１０８４６７４４リスクＣ発現細胞からの培養培地中で有意に低いレベルのｓＬＡＧ３を観察した。したがって、この異なる方法はＬＡＧ３タンパク質がｒｓ１０８４６７４４リスクＣ細胞中であまり発現されないことを裏付けた。次いで、本発明者は、ＬＡＧ３の欠落がある場合、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞における下流シグナリング経路に対してどのような効果を有し得るのかを試験した。結果は、ｒｓ１０８４６７４４リスクＣおよびｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ発現細胞間で脂質ラフトシグナリングの有意差を明確に示した。ｒｓ１０８４６７４４Ｃリスクアレル中のＣＤ７９Ａのリン酸化の不存在は、膜に対するＬＡＧ３の損傷が、近位および下流シグナリングを開始させる受容体間の相互作用を因果的に阻害することを示し、Ｂ細胞活性化におけるＬＡＧ３の重要な役割をさらに示す。重要なことに、ＬＡＧ３の過剰発現またはサイレンシングは下流シグナリングにおけるＬＡＧ−３の因果的役割を裏付け、これは本発明者により同定された新たな観察である。ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞からのＬＡＧ３のＲＮＡシーケンシングおよびインビトロ試験に由来するデータと、表面ＬＡＧ３が開裂されてｓＬＡＧ３を生成するという知識とを組み合わせることにより、本発明者は、血漿ｓＬＡＧ３レベルがｒｓ１０８４６７４４バリアントのキャリア間で有意に異なるか否かを探索した。
図１は、ＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４と有意に関連する血漿ｓＬＡＧ３レベルのグラフであり、ｒｓ１０８４６７４４基準ＧＧとｒｓ１０８４６７４４リスクＣＣアレルのＨＡＬＰキャリア間の血漿ｓＬＡＧ３レベルの有意差を示す。アテローム性動脈硬化症の分野において、ＨＤＬリポタンパク質および／またはサブフラクションとＬＡＧ３またはｓＬＡＧ３との関連はこれまで存在しなかった。
血漿ａｐｏＡ−Ｉとｒｓ１０８４６７４４またはｓＬＡＧ−３との関連は観察されなかったが、それらの変数と小型ＨＤＬ粒子との有意な関連が見出された。
図２は、ＮＭＲ分光法によりｓＬＡＧ３が小型ＨＤＬ粒子と有意に関連したことを示す。ｓＬＡＧ３レベルは、ＨＡＬＰ対象からの空腹時血漿試料において小型ＨＤＬ粒子と反比例して関連した。このデータは、ｒｓ１０８４６７４４についてのキャリア状態により層別化されなかった（Ｐ＝０．０１、ｒ＝０．２７、ｎ＝８１）。さらに、小型高密度ＨＤＬ粒子はａｐｏＡ−Ｉが濃縮しており、コレステロール不足であり、多数の大型臨床試験においてＣＨＤについての増加したリスクと正に関連した。細胞ＬＡＧ３発現および機能は、ｒｓ１０８４６７４４リスクＣアレルのキャリアから単離された細胞において有意に低減した。より重要なことに、循環ｓＬＡＧ３レベルは、ＨＡＬＰにおいて計測されたキャリアと同一のキャリアにおいて有意に低かった。まとめると、ＬＡＧ３は重要な免疫調節因子であり、ｒｓ１０８４６７４４バリアントにより、ならびにＬＡＧ３ｒｓ８７０８４９および非遺伝子的原因により転写的に制御されることが同定された。
診断方法
一般に、本方法は、対象がアテローム性動脈硬化症、慢性炎症疾患、インシデント心血管疾患（ＩＣＤ）、心血管および／または非心血管罹患率および死亡率、ならびに炎症応答により特徴付けされる他の病変を有するか否かまたは罹患しやすいか否かに関する、それらの症候的発現による、または非遺伝子的原因に基づく定性的プレスクリーニングから開始する二又式診断を必要とする。定性的指標を考慮して、診断は、血液試料に基づく定量的調査を続ける。試料は、アッセイにより、または遺伝子試験により分析することができる。より具体的には、ＬＡＧ３タンパク質欠損は、ＥＬＩＳＡアッセイまたは当業者により決定される他のタンパク質アッセイを使用する血漿、血清、または他の生物体液計測値により決定することができる。あるいは、ＬＡＧ３タンパク質欠損は、ＳＣＡＲＢ１突然変異、例えば、ｒｓ１０８４６７４４またはＬＡＧ３ｒｓ８７０８４９、ＬＡＧ３タンパク質の発現および機能に悪影響を与える他のＳＮＰ／挿入／欠失、または非遺伝子的原因の計測により決定することができる。ＳＲ−Ｂ１遺伝子の１つ以上の多型領域の特異的アレルバリアントの存在を決定するために対象からの生物試料の遺伝子スクリーニングが必要とされ、それを実施して潜在ＳＣＡＲＢ１突然変異ｒｓ１０８４６７４４の存在を決定する。ＳＲ−Ｂ１（ＳＣＡＲＢ１）はＨＤＬコレステロールについての主な受容体であり、リバースコレステロール輸送（肝臓を介する最終的な廃棄を伴う細胞からの除去）における重要な役割を担う。ＳＲ−Ｂ１は、肝臓およびステロイド生成組織、例えば、卵巣中で高度に発現される。ＳＲ−Ｂ１は、ステロイド産生のためのコレステロール蓄積の維持において重要であると考えられる。１）非遺伝子的原因と２）アッセイ／突然変異のマーカーの組合せを含む発現プロファイルを考慮して、陽性のプレスクリーニング指標の後に、コンパニオン治療薬としての組換えリンパ球活性化遺伝子−３を使用するテーラード治療レジメン（下記）が続く。
図３は本診断方法の例示的な実施形態のブロック図であり、アテローム性動脈硬化症、慢性炎症疾患、インシデント心血管疾患（ＩＣＤ）、心血管および／もしくは非心血管罹患率および死亡率、スタチンまたは他のコレステロール降下薬の服用を伴う心発作の経験、または炎症応答により特徴付けされる任意の他の病変、インフラマソームの異常な発現および／または機能不全ＨＤＬの症状および／または非遺伝子的原因の素因についての対象の初回プレスクリーニング／定性的診断を有するステップ１０を起点とする。
初回の陽性のプレスクリーニングを考慮して、ステップ２０において、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）の低レベル発現の存在について対象からの血漿または血清試料のベースラインタンパク質アッセイおよび／または遺伝子スクリーニングを実施する。ＬＡＧ３発現を計測し、低ＬＡＧ３についてのベースライン閾値と比較し、それは≦３４００ｐｇ／ｍｌの血漿レベルであるべきである。このＬＡＧ３発現プロファイリングは、インフラマソーム、慢性炎症疾患および機能不全ＨＤＬのさらなる評価についての陽性バイオマーカーを提供する。ＬＡＧ３欠損に起因する炎症促進状態は、慢性炎症と関連する疾患、例として、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症、２型糖尿病、加齢黄斑変性、およびアルツハイマー病についての新規なタンパク質バイオマーカーを提供する。ネズミおよびヒトリンパ球活性化遺伝子−３アッセイは、市販のネズミＬａｇ３およびヒトＬＡＧ３ＥＬＩＳＡキットにより実施することができる。
ステップ５０において、ＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４またはＬＡＧ３ｒｓ８７０８４９突然変異の疑われる存在の二重陽性指標を考慮して、患者の潜在ＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４またはＬＡＧ３ｒｓ８７０８４９突然変異を遺伝子診断により確定する。ＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４またはＬＡＧ３ｒｓ８７０８４９突然変異の存在は、種々の公知の方法、例として、ゲノタイピングにより確認することができる。ゲノタイピングは、標準的な血液試験のＤＮＡシーケンシングによる直接的な突然変異分析により実施することができる。ゲノムＤＮＡは、精製された全血試料から調製して血液試料からＤＮＡを単離する。ＤＮＡの純度および品質は、分光法により確認することができる。ＤＮＡをプレートに添加し、オリゴ−ライゲーションアッセイ（例えば、ＳＮＰｌｅｘ（登録商標）は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｏｆ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡにより販売されているＳＮＰゲノタイピング用の好適なプラットフォームである）により製造業者の指針に従ってゲノタイピングする。オリゴ−ライゲーションアッセイは、ＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４突然変異またはＬＡＧ３ｒｓ８７０８４９突然変異の存在を示すための蛍光色素標識プローブを使用する。ＳＲ−ＢＩ遺伝子の１つ以上の多型領域の特異的アレルバリアントの存在のスクリーニングにおける有用な他の方法としては、例えば、ＤＮＡシーケンシング、ハイブリダイゼーション技術、ＰＣＲベースアッセイ、蛍光色素および消光剤ベースＰＣＲアッセイ（Ｔａｑｍａｎ  ＰＣＲ検出システム）、ＲＦＬＰベース技術、一本鎖立体構造多型（ＳＳＣＰ）、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、化学的ミスマッチ開裂（ＣＭＣ）、ヘテロ二本鎖分析ベース系、質量分析をベースとする技術、侵入開裂アッセイ、多型比シーケンシング（ＰＲＳ）、マイクロアレイ、ローリングサークル伸長アッセイ、ＨＰＬＣベース技術、ＤＨＰＬＣベース技術、オリゴヌクレオチド伸長アッセイ（ＯＬＡ）、伸長ベースアッセイＡＲＭＳ（増幅不応性突然変異システム（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ））、ＡＬＥＸ（増幅不応性突然変異線形伸長（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ））、ＳＢＣＥ（一塩基鎖伸長）、モレキュラービーコンアッセイ、インベーダー（Ｔｈｉｒｄ  ｗａｖｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、リガーゼ連鎖反応アッセイ、ヌクレアーゼアッセイベース技術、ハイブリダイゼーションキャピラリーアレイ電気泳動（ＣＡＥ）、パイロシーケンシング、タンパク質トランケーションアッセイ（ＰＴＴ）、免疫アッセイ、ハプロタイプ分析、および固相ハイブリダイゼーション（ドットプロット、リバースドットプロット、チップ）などが挙げられる。スクリーニング方法の１つのタイプは、多型部位と重複し、多型領域周囲に約５、１０、２０、２５、または３０ヌクレオチドを有するプローブを使用するアレル特異的ハイブリダイゼーションである。本発明の一実施形態において、アレルバリアントに特異的にハイブリダイズし得��いくつかのプローブを、固相担体、例えば、「チップ」に付着させる。オリゴヌクレオチドは、種々のプロセス、例として、リソグラフィーにより固体担体に結合させることができる。実際、チップは、最大２５０，０００個のオリゴヌクレオチドを保持し得る（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標））。
一実施形態において、チップは、ＳＣＡＲＢ１および／またはＬＡＧ３遺伝子の少なくとも１つの多型領域の全てのアレルバリアントを含む。次いで、固相担体を試験核酸と接触させ、特異的プローブへのハイブリダイゼーションを検出する。したがって、１つ以上の遺伝子の多数のアレルバリアントのアイデンティティーを簡易なハイブリダイゼーション実験において同定することができる。
一部のスクリーニング方法において、ＳＣＡＲＢ１またはＬＡＧ３遺伝子の少なくとも一部を最初に増幅させてからアレルバリアントを同定することが必要である。増幅は、例えば、ＰＣＲにより、当業者に公知の方法に従って実施することができる。一実施形態において、細胞のゲノムＤＮＡを２つのＰＣＲプライマーおよび要求量の増幅ＤＮＡを産生するために十分な多数のサイクルのための増幅に曝露する。ＳＮＰは不変配列の領域によりフランキングされている変異の部位を構成するため、それらの分析は変異の部位に存在する単一ヌクレオチドのアイデンティティーの決定のみを要求し、それぞれの患者についての完全な遺伝子配列を決定することが不要である。このような単一ヌクレオチド多型の分析を容易にするいくつかの方法が開発されている。本明細書に記載の方法は、例えば、対象が特異的ＳＣＡＲＢ１および／またはＬＡＧ３アレルバリアントと関連する疾患を有するか否かまたはそれを発症する増加したリスクがあるか否かを決定するために簡便に使用することができる本明細書に記載の少なくとも１つのプローブまたはプライマー核酸を含むプレパッケージング診断キット、例えば、上記のものを利用することにより実施することができる。本発明の方法は、対象のＳＲ−ＢＩ遺伝子中のアレルバリアントまたはＳＮＰの存在を同定する方法を含め、当分野において周知の方法を使用して他の情報またはパラメータと組み合わせてＬＡＧ３タンパク質欠損の対象の同定を支援することができる。
確認を考慮して、ステップ９０において、本方法は、コレステロール医薬プロブコールの治療有効レジメンを、ステップ９５における組換えＬＡＧ３のレジメンとの組合せで同時に開始する。組換えＬＡＧ３は、下記の全長もしくは可溶性トランケート形態のいずれかである組換えヒトＬＡＧ３またはＬＡＧ模倣体である。コンパニオン治療薬として、ＬＡＧ３またはＬＡＧ３模倣体は、コレステロール医薬との相乗的に機能してＬＡＧ３タンパク質の欠損が見出された患者を治療する。ＬＡＧ３模倣体は、ＬＡＧ３機能を模倣する任意の好適な薬剤、例として、小分子薬剤、マイクロＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、生物剤、活性化抗体、ＤＮＡもしくはＲＮＡ構造もしくはフレキシビリティーに影響を与える薬剤、またはＬＡＧ３転写調節に影響を与える薬剤、例として、細胞内カチオン、例えば、カリウム、ナトリウム、リチウム、およびカルシウムを調節する薬剤であり得る。特異的天然存在ヒトＬＡＧ３配列からのＬＡＧ３配列を含む発現ベクターを構築することにより特異的天然存在ヒトＬＡＧ３タンパク質の特性を模倣する組換えタンパク質を発現させることにより、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）の機能を複製することが可能である。本詳細な説明の目的のため、用語「ＬＡＧ３模倣体」は、それらの合成ＬＡＧ３タンパク質ならびにＬＡＧ３ホスホシグナリング効果を模倣する任意の他の公知の分子または薬剤、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、または結合しないＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、単球、Ｂ細胞およびＮＫ細胞におけるＬＡＧ３の役割を模倣する薬剤、ならびに細胞膜の脂質ラフトにおけるＬＡＧ３の役割を模倣する薬剤を含む。プロブコール治療の例示的レジメンは、３〜４ヵ月間の低用量治療（２５０ｍｇ／日）を含み得、いっそうさらに好ましくは、１〜２ヵ月間の前記治療を含む。ＬＡＧ３診断試験との組合せで使用される治療方針としては、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化症、脂質異常症、心血管疾患、２型糖尿病、加齢黄斑変性およびアルツハイマー病に関する技術水準の治療法が挙げられる。例えば、本方法は、ステップ３０においてコレステロール医薬プロブコールの治療有効レジメンを開始する。プロブコール治療の例示的なレジメンは、３〜４ヵ月間の低用量治療（２５０ｍｇ／日）を含み得、いっそうさらに好ましくは、１〜２ヵ月間の前記治療を含む。
組換えＬＡＧ３は、ネズミＬａｇ３もしくはヒトＬＡＧ３タンパク質であり得、または全長インタクト５２１アミノ酸タンパク質として、もしくは血漿、血清、もしくは他の生物体液中で計測されるトランケート可溶性形態として化学合成されたＬＡＧ３模倣体であり得る。化学合成は、正常タンパク質の発現および機能に実質的に影響を与える挿入も、欠失も、未成熟終止コドンも、ミスセンス突然変異も導入されないように実施しなければならない。受託番号および配列表を図４に示す。ＬＡＧ３コンパニオン治療薬またはＬＡＧ３模倣体は、外部ポンプ、植込み型ポンプ（すなわち、腹腔インスリンポンプ）を介する静脈内注入、ＳＱ注射、ＳＱ注入、筋肉内、吸入、鼻腔内、脳室内、坐剤（膣および／または直腸）、局所クリーム剤、局所ゲル剤、局所パッチ剤、脊髄、舌下、経口、胃洗浄、肺洗浄により投与することができる。送達は、純粋形態であり得、または添加剤、例として、Ｉｇ、アルブミン、グリコシル化、ペグ化などを伴う。
最後に、ステップ１００において、モニタリングは、ＬＤＬ酸化に対する、ならびに血漿ＨＤＬコレステロールおよび血漿／血清サイトカインに対する効果を決定するための包括的プロファイルを用いる月１回の安全性検査およびＥＫＧを含む。当業者は、他の好適な治療方針、例として、限定されるものではないが、他の任意のコレステロールおよびトリグリセリド修正薬、黄体およびエストロゲンおよびエストロゲン様医薬、ならびにＨＤＬコレステロールレベルを降下させるためのプロブコールと類似し、酸化防止剤としての医薬を用いてそれらの遺伝子または非遺伝子スクリーニングされた個体を治療することができることを容易に理解する。他の治療剤を用いる、または用いない組換えヒトＬＡＧ３による治療は、生涯治療であることが予測される。
さらなる説明を用いずとも、当業者は、上記詳細な説明を使用して本発明を最大程度に利用することができることが考えられる。これを確保するため、以下に実施例を挙げる。
【実施例】
【０００７】
実施例１
材料および方法：
≧６０ｍｇ／ｄｌの空腹時血漿ＨＤＬ−Ｃレベル（ＨＡＬＰ）を有する年齢１８〜８０歳の地域在住成人を臨床試験に登録した。集団は中高年であり、主に白人女性であった。登録時点において、試験対象は処方されるか処方されないかにかかわらずコレステロール降下薬により治療されていなかった。対象は、脂質プロファイルの分析、ＳＣＡＲＢ１ゲノタイピングのためのＤＮＡ分析、および軟膜からのリンパ球単離のための一晩空腹時血液試料を提供することに同意した。カテゴリ型共変量の多重比較に一元配置分散分析を使用し、２つの試料分析にスチューデントのｔ検定を使用した。連続型変数としての時間の効果を評価するため、依存因子としての時間を用いて二次多項式回帰を実施した。≦０．０５の確率値を統計的に有意とみなした。ホモ接合性ｒｓ１０８４６７４４バリアントの頻度は、アテローム性動脈硬化症の多民族試験に既に記載されている割合と類似した。トランスクリプトーム分析は、ＬＡＧ３の示差的発現を明らかにした。ｒｓ１０８４６７４４は、ＥＮＣＯＤＥデータベース［ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／］のバイオインフォマティックスクリーンにより示されるとおり、ＳＣＡＲＢ１の調節領域内に存在するため、本発明者は、基底（非刺激）条件下で培養されたｒｓ１０８４６７４４基準ＧＧおよびリスクＣＣアレル発現Ｂ細胞間に転写差が存在するか否かを最初に試験した。ｒｓ１０８４６７４４は第１２染色体の長腕上に存在するため、本発明者らは、同様に第１２染色体上（シス）に存在する標的の転写差について試験した。ｒｓ１０８４６７４４基準ＧＧ細胞と比較してｒｓ１０８４６７４４リスクＣＣ細胞において、５つの遺伝子転写物が有意に下方調節され、３つの遺伝子転写物が上方調節された。第１２染色体上のトランスクリプトームの差に加え、本発明者らは、細胞内インフラマソームマーカー、例えば、ＮＬＲＰ３の有意な上方調節を含む染色体間転写差（）も観察した（トランス）。ＬＡＧ３発現は、ｒｓ１０８４６７４４リスクＣ発現細胞において有意に低い。活性化後の細胞表面ＬＡＧ３発現の変化を計測するため、細胞を最初に、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）／イオノマイシン＋インターロイキン−４（ＩＬ−４）を用いておよび用いずにインキュベートし、次いでＬＡＧ３をフローサイトメトリーにより計測した。
図６は、フローサイトメトリーを使用したｒｓ１０８４６７４４基準Ｇおよびｒｓ１０８４６７４４リスクＣ発現細胞におけるＬＡＧ３の示差的発現をプロットする。ｒｓ１０８４６７４４基準Ｇまたはｒｓ１０８４６７４４リスクＣアレルについてホモ接合性である形質転換Ｂリンパ球を基底または刺激カクテル（ホルボールエステル  ５００ｎｇ／ｍｌ、イオノマイシン  ２５０ｎｇ／ｍｌ、およびＩＬ−４  １００Ｕ／ｍｌ）条件下で０〜４時間インキュベートし、細胞表面ＬＡＧ３タンパク質の計測のためにアイソタイプ対照または抗ＬＡＧ３抗体により染色し、次いでフローサイトメトリーのために固定した。
パネルＩ：アイソタイプ対照またはＬＡＧ３抗体により染色された基底および刺激条件下のｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ−００３細胞；データは、３つの独立実験の代表物である；
パネルＩＩ：アイソタイプ対照またはＬＡＧ３抗体により染色された基底および刺激条件下のｒｓ１０８４６７４４リスクＣ−００８細胞；データは、３つの独立実験の代表物である。
図７は、フローサイトメトリーにより計測されたＬＡＧ３＋細胞の細胞表面発現のグラフ分析である。
パネルＩは、ｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ−００３細胞系からの３つの独立実験のプールデータ（平均±ＳＥ）を表し、それぞれの実験は３つ組で実施した（ｎ＝９、ベースラインと比較してｐ＜０．０００１）。
パネルＩＩは、全てのｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ細胞系からのプールデータ（平均±ＳＥ）を表す（ｎ＝１８、ベースラインと比較してｐ＜０．０００１）。
パネルＩＩＩは、ｒｓ１０８４６７４４リスクＣ−００８細胞系からの３つの独立実験のプールデータ（平均±ＳＥ）を表し、それぞれの実験は３つ組で実施した（ｎ＝９、ｐ＝０．０６）。パネルＩＶは、全てのリスクＣ細胞系からのプールデータ（平均±ＳＥ）を表す（ｎ＝１５、ｐ＝０．０４）。
図８は、ｒｓ１０８４６７４４基準Ｇおよびｒｓ１０８４６７４４リスクＣ発現細胞からの活性化後の経時的な培地中のＬＡＧ３タンパク質レベルの変化のグラフである。
パネルＩは、ｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ−００３細胞系からの３つの独立実験のプールデータ（平均±ＳＥ）を表し、それぞれの実験は３つ組で実施し（ｎ＝９、ベースラインと比較してｐ＜０．０００１）、ｒｓ１０８４６７４４リスクＣ−００８細胞系からの３つの独立実験のプールデータ（平均±ＳＥ）からのものを表し、それぞれの実験は３つ組で実施した（ｎ＝９、ｐ＝０．０６）。
パネルＩＩは、全てのｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ細胞系からのプールデータ（平均±ＳＥ）（ｎ＝１８、ベースラインと比較してｐ＜０．０００１）および全てのｒｓ１０８４６７４４リスクＣ細胞系からのプールデータ（平均±ＳＥ）（ｎ＝１５、ｐ＝０．０４）を表す。
図９は、ｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ−００３およびｒｓ１０８４６７４４リスクＣ−００８発現細胞における活性化後の経時的な培地中の分泌サイトカイン（ＴＮＦαおよびＩＬ−１０）レベルの変化のグラフである。
パネルＩは、ｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ−００３細胞系からの３つの独立実験のＴＮＦαプールデータ（平均±ＳＥ）を表し、それぞれの実験は２つ組で実施した（ｎ＝６、ベースラインと比較してｐ＜０．０００１）。
パネルＩＩは、ｒｓ１０８４６７４４リスクＣ−００８細胞系からの３つの独立実験のＴＮＦαプールデータ（平均±ＳＥ）を表し、それぞれの実験は２つ組で実施した（ｎ＝６、ベースラインと比較してｐ＜０．０００１）。パネルＩＩＩは、ｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ−００３細胞系からのＩｌ−１０プールデータ（平均±ＳＥ）を表し、それぞれの実験は２つ組で実施した（ｎ＝６、ベースラインと比較してｐ＝０．０２）一方、パネルＩＶは、ｒｓ１０８４６７４４リスクＣ−００８細胞系からの３つの独立実験のＩＬ−１０プールデータ（平均±ＳＥ）を表し、それぞれの実験は２つ組で実施した（ｎ＝６、ｐ＜０．０００１）。
図６〜９をまとめて参照すると、ベースラインにおいて、ＬＡＧ３の細胞表面発現は、ｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ細胞（２６．３±２．６、ｐ＜０．０００１）と比較してｒｓ１０８４６７４４リスクＣ発現細胞（２．０２±２．８）において９２％低かった。ＰＭＡ／イオノマイシン＋ＩＬ−４による刺激後、ベースラインレベルと比較して、経時的に、細胞表面ＬＡＧ３発現は、ｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ（ｐ＜０．０００１、００３細胞系および全ての組合せ）およびｒｓ１０８４６７４４リスクＣ発現細胞（００８細胞についてｐ＝０．０６および全ての組合せについてｐ＝０．０４）において有意に減少した（図７）。並行して、経時的に、ＬＡＧ３レベルは、ｒｓ１０８４６７４４リスクＣ−００８発現細胞において観察された変化なしと比較してｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ−００３細胞（ｐ＝０．０３、パネルＩ）からの培地中で増加した（図８）。しかしながら、組合せｒｓ１０８４６７４４基準Ｇとｒｓ１０８４６７４４リスクＣ組合せ発現細胞とを比較した場合、ＬＡＧ３培地レベルにおける統計的に有意な差は存在しなかった（図８、パネルＩＩ）。経時的に、培地中のＴＮＦαおよびＩＬ−１０レベルは、ｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ発現００３細胞と比較してｒｓ１０８４６７４４リスクＣ発現００８細胞において有意に高かった（図９）。
図１０は、いかにＬＡＧ３がＢＣＲシグナリングにおいて重要であるかを説明する。２時間の基底または刺激カクテル（ホルボールエステル  ５００ｎｇ／ｍｌ、イオノマイシン  ２５０ｎｇ／ｍｌ、およびＩＬ−４  １００Ｕ／ｍｌ）条件下でｒｓ１０８４６７４４基準Ｇまたはｒｓ１０８４６７４４リスクＣアレルを発現する形質転換Ｂ細胞から全細胞溶解物を単離した。等量の溶解緩衝液の添加により反応を終結させ、示される総抗体およびホスホ抗体によりブロットした。示される結果は、３つのレプリケートプール試料の１つの代表実験からのものである。
図１０（Ａ）：Ｒａｍｏｓ細胞系、ＧＧ（００３）またはＣＣ（００８）細胞：刺激Ｇアレル細胞、対応する総タンパク質に正規化されたホスホシグナリング、基準Ｇアレル細胞における非刺激条件と比較したｐ−ＣＤ７９Ａ（ｐ＝０．０４）、ｐ−ＣＤ１９（ｐ＝０．０４）、ｐ−Ｓｙｋ（ｐ＝０．００５）、ｐ−Ｌｙｎ（ｐ＝０．００１）、ｐ−ＰＬＣγ２（ｐ＝０．００４）およびｐ−ＰＫＣβ（ｐ＝０．００３）。
図１０（Ｂ）：非刺激細胞におけるレンチウイルスＬＡＧ３−ＧＦＰまたはｓｈＲＮＡ−ＬＡＧ３のＢＣＲシグナリングおよび過剰発現：それぞれのアレルにおけるモックベクターを発現する細胞と比較したＣＣ細胞のｐ−Ｌｙｎ（ｐ＝０．０４）；ｐ−ＰＫＣβ（ｐ＝０．０３）およびＧＧ細胞のｐ−Ｌｙｎ（ｐ＝０．０４）；ｐ−ＰＫＣβ（ｐ＝０．０１）。
図１０（Ｃ）：刺激細胞におけるレンチウイルスＬＡＧ３−ＧＦＰまたはｓｈＲＮＡ−ＬＡＧ３のＢＣＲシグナリングおよび過剰発現：リスクＣアレルにおけるモックベクターを発現する刺激細胞と比較した刺激細胞におけるＣＣ細胞のｐ−Ｌｙｎ（ｐ＝０．０１）；ｐ−ＰＫＣβ（ｐ＝０．０１）。ショートヘアピンＲＮＡによりＧＧ細胞におけるＬＡＧ３をノックダウン、基準Ｇアレルにおけるモックベクターを発現する刺激細胞と比較した刺激細胞におけるｐ−Ｌｙｎ（ｐ＝０．００２）；ｐ−ＰＫＣβ（ｐ＝０．００９）。示される結果は、３つのレプリケートプール試料の１つの代表実験からのものである。
刺激後、ｒｓ１０８４６７４４リスクＣ発現細胞においてリン酸化標的は検出されなかった一方、全ての標的は、非刺激条件と比較してｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ細胞において有意に発現されたｐ−ＣＤ７９Ａ（ｐ＝０．０４）、ｐ−ＣＤ１９（ｐ＝０．０４）、ｐ−Ｓｙｋ（ｐ＝０．００５）、ｐ−Ｌｙｎ（ｐ＝０．００１）、ｐ−ＰＬＣγ２（ｐ＝０．００４）およびｐ−ＰＫＣβ（ｐ＝０．００３）。
【０００８】
ＬＡＧ３の過剰発現またはサイレンシングは、下流シグナリング経路に影響を与える
下流シグナリング経路に対するＬＡＧ３の効果を直接評価するため、本発明者らは、ｒｓ１０８４６７４４リスクＣ発現細胞（減少したＬＡＧ３レベルを有する）中でＬＡＧ３を過剰発現させ、または内因性ＬＡＧ−３タンパク質を発現するｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ発現細胞中でＬＡＧ３をサイレンシングする実験を実施した。
図１０（Ｂ）に示されるとおり、基底または刺激ｒｓ１０８４６７４４リスクＣ細胞中のＬＡＧ３の過剰発現は、対照細胞（これらは、空ベクターにより形質移入させた細胞である）と比較してリン酸化標的の有意に増加したレベルと関連した（非刺激細胞においてｐ−Ｌｙｎについてｐ＝０．０４；ｐ−ＰＫＣβについてｐ＝０．０３および刺激細胞においてｐ−Ｌｙｎについてｐ＝０．０１；ｐ−ＰＫＣβについてｐ＝０．０１）。ＬＡＧ３のサイレンシングは、対照細胞と比較してｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ細胞中のリン酸化標的の有意に低いレベルと関連した（刺激細胞においてｐ−Ｌｙｎについてｐ＝０．００２；ｐ−ＰＫＣβについてｐ＝０．００９）（図８（Ｃ）。
ｒｓ１０８４６７４４リスクＣアレルのキャリアは、有意に低い血漿可溶性ＬＡＧ３（ｓＬＡＧ３）を有した。ＬＡＧ３発現および機能がｒｓ１０８４６７４４リスクＣ発現細胞中で低減したことを考慮して、本発明者らは、次に、ＬＡＧ３タンパク質レベルが、基準ＧおよびリスクＣアレルのＨＡＬＰキャリアから単離された血漿中で有意に異なるか否かを決定し；この試験群は発見コホートを構成した。
図１１は、ＬＡＧ３の発現が脂質ラフトにおいて低減し、ｒｓ１０８４６７４４リスクＣ発現細胞において下流シグナリングが損傷されることを示す。ＬＡＧ３は活性化細胞中の脂質ラフト中に位置し、下流ホスホシグナリングに影響を与えることが示されているため、本発明者は、このＬＡＧ３下方調節が下流シグナリング経路に影響を与えるか否かを試験した。ｒｓ１０８４６７４４リスク（ＣＣ）細胞において、ＬＡＧ３は、細胞が基底状態であるか、ＰＭＡ／イオノマイシン／ＩＬ−４により刺激されるかにかかわらず、脂質ラフト中で同定されなかった。脂質ラフトは、炭酸ナトリウム抽出均質化溶解物について改変３ステップスクロース密度勾配を使用して基底または刺激条件（ホルボールエステル、ＰＭＡ  ５００ｎｇ／ｍｌ、イオノマイシン  ２５０ｎｇ／ｍｌ、およびＩＬ−４  １００Ｕ／ｍｌ）下のエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換Ｂ細胞から単離した。免疫ブロッティングにより特異的抗体を使用して以下の標的の発現を決定した：ＬＡＧ３；ＬＹＮおよびＦＬＯＴ２（フロチリン）（全ての脂質ラフトマーカー）。基底条件（Ａ、レーン２〜３）と比較した刺激基準（ＧＧ）細胞（Ｂ、レーン２〜３）の脂質ラフト画分に位置するＬＡＧ３タンパク質の発現（ＦＬＯＴ２に正規化）、Ｎ＝３、ｐ＝０．０３。ＬＡＧ３タンパク質は、リスク（ＣＣ）細胞中で、基底（Ｃ、レーン２〜３）か、刺激条件（Ｄ、レーン２〜３）かにかかわらず検出されなかった。両側スチューデントｔ検定を使用して結果を分析し、ブロットは、３つの独立実験の１つの代表物である。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。
上記のとおり、図１は、血漿ｓＬＡＧ３レベルがＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４と有意に関連したことを示す。図１（Ａ）において確認されるとおり、血漿ｓＬＡＧ−３レベルは、基準Ｇアレルについてホモ接合性である対象（ＧＧ：１０，１６９±１１２０ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝９６）またはヘテロ接合性対象（ＧＣ：１１，１３９±２２８８ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝２３）と比較してリスクＣアレルについてホモ接合性である対象（ＣＣ：３４３０±２３３９ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝２２、ｐ＝０．０３）において有意に低かった。
【０００９】
Ｒｓ１０８４６７４４およびｓＬＡＧ３と脂質サブフラクションとの関連
次に、本発明者はｒｓ１０８４６７４４およびｓＬＡＧ３と、脂質レベルおよびＨＤＬサブフラクションとの関連を探索した。このＨＡＬＰ集団において、本発明者はｒｓ１０８４６７４４またはｓＬＡＧ−３と、総コレステロール、ＬＤＬ−Ｃ、トリグリセリド、またはＨＤＬ−Ｃとの関連を観察しなかった（データ示さず）。同様に、本発明者らは、ｒｓ１０８４６７４４またはｓＬＡＧ３と、血漿アポリポタンパク質（ａｐｏＡ−Ｉ、ａｐｏＡ−ＩＩ、ａｐｏＢ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣ−ＩＩＩ、およびａｐｏＥ）との関連を観察しなかった。ｒｓ１０８４６７４４とＨＤＬサブフラクションとの有意な関連は、ＮＭＲ分光法により計測された場合に観察された。
図２を再度参照すると、グラフは、ＮＭＲ分光法により計測してｒｓ１０８４６７４４が中型および小型ＨＤＬ粒子と有意に関連したことを示す。中型および小型ＨＤＬ粒子は、基準Ｇアレルについてホモ接合性であり、ｒｓ１０８４６７４４についてのリスクＣアレルについてホモ接合性であるキャリアから単離された空腹時血漿試料においてＮＭＲ分光法（Ｌｉｐｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒａｌｅｉｇｈ  ＮＣ）により計測した。示される値は、中型および小型ＨＤＬ粒子（μｍｏｌ／Ｌ）ならびにＨＤＬサイズ（ｎｍ）の平均±標準偏差である。
人種／民族性、ＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４および他の共変量は、ＭＥＳＡにおける血漿ＬＡＧ３レベルの独立予測因子である。多変量回帰モデルにおいて、人種（ｐ＝０．０００５）、年齢（ｐ＝０．００３）、脂質薬（ｐ＝０．０３）、ｒｓ１０８４６７４４ゲノタイプ（ｐ＝０．００２）、および喫煙状態（ｐ＜０．０００１）は、血漿ＬＡＧ３レベルの独立予測因子として保持された（図５、表２Ａ）。血漿ＬＡＧ−３（ｐ＜０．００７）は、年齢（ｐ＝０．００６）、性別（ｐ＜０．０００１）、ＢＭＩ（ｐ＜０．０００１）、ＴＧ（ｐ＜０．０００１）、アルコール飲用（ｐ＜０．０００１）、ＨｇｂA1c（ｐ＝０．０１）、および最高血圧（ｐ＝０．０３）により調整してもＨＤＬ−Ｃレベルの独立予測因子のままであった（図５、表２Ｂ）。
ロジスティック多変量回帰分析は、血漿ＬＡＧ３が無症候性アテローム性動脈硬化症（ｃＩＭＴ）（ｐ＝０．２５）とも、冠動脈カルシウムスコア（ＣＡＣ）（ｐ＝０．０６２）とも有意に関連しないことを明らかにした。図１２、表３は、ＭＥＳＡ参加者における血漿ＬＡＧ３とＣＨＤとの関連を示す多変量回帰分析である。共変量は、人種、系統のＰＣ、年齢、試験場所、性別、ＨｇｂA1c、ＢＭＩ、脂質薬、脂質（ＴＣおよびＬＤＬ−Ｃ）、喫煙パックイヤー、最高血圧、および最低血圧を含んだ。ＬＡＧ３の推定係数（ＳＥ）は、−０．０７８（０．０３４）であった。ＬＡＧ３について、オッズ比は変数の第１四分位数と第３四分位数とを比較することにより推定した。他の連続変数について、オッズ比は変数の第３四分位数と第１四分位数とを比較することにより推定した。*Ｎ＝４７０７、*ｐ＜０．０００１；**ｐ＝０．０２；+ｐ＝０．０００２；++ｐ＝０．０４；&ｐ＝０．００２；&&ｐ＝０．０３；#ｐ＝０．０５
ロジスティック多変量回帰分析は、慣習的なリスク因子、例えば、年齢（ｐ＜０．０００１）、性別（ｐ＜０．０００１）、最高血圧（ｐ＝０．０００２）、ＬＤＬ−Ｃ（ｐ＝０．０２）、ＴＣ（ｐ＝０．０４）、脂質薬（ｐ＝０．００２）、ＨｇｂA1c（ｐ＝０．０３）、および喫煙（ｐ＝０．０５）に加え、血漿ＬＡＧ３（ベータ−０．０７８、ＯＲ１．１５、ｐ＝０．０２）がＣＨＤの独立予測因子であることを明らかにした。
≧６０ｍｇ／ｄｌのＨＤＬ−Ｃを有するＭＥＳＡコホート内の参加者の有病率は２６％であり、この群内でＣＨＤの有病率は４％であり、人種／民族群間で有意でなかった。ＣＨＤを有する対象におけるＨＤＬ−Ｃレベル（ｎ＝５５、７２．４±１．６ｍｇ／ｄｌ）は、ＣＨＤを有さない対象（ｎ＝１３８７、７１．８±０．３ｍｇ／ｄｌ、ｐ＝０．７１）と比較して有意に異なることはなかった。しかしながら、血漿ＬＡＧ３レベルは、ＣＨＤを有さない対象（１８２８±１０７．６ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝１３８６、ｐ＝０．０４）と比較してＣＨＤを有する対象（８４３．３±５４０．１ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝５５）において２倍低かった。ロジスティック回帰分析において、血漿ＬＡＧ３（ベータ−０．２１２、ＯＲ１．４５、ｐ＝０．００４）、年齢（ｐ＝０．００６）、性別（ｐ＝０．００１）、および最低血圧（ｐ＝０．０３）は、ＣＨＤの独立予測因子として保持された。図１２、表４は、≧６０ｍｇ／ｄｌのＨＤＬ−Ｃを有するＭＥＳＡ参加者における血漿ＬＡＧ３とＣＨＤとの関連を示す回帰分析である。共変量は、人種、系統のＰＣ、年齢、試験場所、性別、ＨｇｂＡ１ｃ、ＢＭＩ、脂質薬、脂質（ＴＣおよびＬＤＬ−Ｃ）、喫煙パックイヤー、最高血圧、および最低血圧を含んだ。ＬＡＧ３の推定係数（ＳＥ）は、−０．２１２（０．０７３）であった。ＬＡＧ３について、オッズ比は変数の第１四分位数と第３四分位数とを比較することにより推定した。他の連続変数について、オッズ比は変数の第３四分位数と第１四分位数とを比較することにより推定した。*Ｎ＝１１３４、ｐ＝０．００４；**ｐ＝０．００６；＋ｐ＝０．００１；＋＋ｐ＝０．０３（表４）。
本発明者は、ＭＥＳＡコホートにおける血漿ＬＡＧ３が、フラミンガムリスクスコアと比較してＣＨＤリスク予測に有意に影響を与えるか否かも試験した。図１２、表５は、モデル２（対数変換血漿ＬＡＧ３）をモデル１（個人の１０年間の心血管リスクを推定するためのフラミンガムリスクスコア）と比較する尤度比検定である。表５は、血漿ＬＡＧ３の包含がＣＨＤリスクの予測における有意な追加情報を提供したことを示す（ｐ＝０．０３９）。モデル３および４を試験場所、人種、および系統のＰＣについて調整し；モデル４をモデル３を比較する尤度比検定は、ＬＡＧ３の包含がＣＨＤリスクの予測における有意な追加情報を提供することを裏付けた（ｐ＝０．０４４）。図１２、表５において、血漿ＬＡＧ３がフラミンガムリスクスコアと比較してＣＨＤリスク予測を増加させたことを確認することができる（ｐ＝０．０３９）。モデルが試験場所、人種、および系統のＰＣについての調整を含んだ場合、血漿ＬＡＧ３は、ＣＨＤリスク予測因子として有意のままであった（ｐ＝０．０４）。
培養Ｂ細胞からのＬＡＧ３と炎症マーカーとの間の有意な相関の観察を考慮して、本発明者は血漿ＬＡＧ３がＭＥＳＡデータセットにおいて利用可能な炎症マーカーと関連するか否かを調査した。図１２、表６は、ＭＥＳＡ参加者における血漿ＬＡＧ３と炎症マーカーとの関連を示す。回帰モデルを年齢、性別、試験場所、人種、および系統のＰＣについて調整した。全てのアウトカム変数および血漿ＬＡＧ３を対数変換した。ｓＴＮＦαＲ＝可溶性ＴＮＦα受容体；ｈｓ−ＣＰＲ＝高感度Ｃ反応性タンパク質。表６において確認されるとおり、多変量回帰分析後、血漿ＬＡＧ３はＩＬ−１０と正に関連した（ｐ＜０．０００１）。
まとめると、これは、心血管疾患の発症についての１つ以上のリスク因子について対象を定性的にプレスクリーニングし、第２のステップにおいてゲノタイピングしてＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４および／もしくはＬＡＧ３ｒｓ８７０８４９突然変異を存在についてプレスクリーニングし、または血漿／血清ＬＡＧ３を計測して３４００ｐｇ／ｍｌ未満のレベルを有する患者を同定することによりＬＡＧ３タンパク質欠損を定量的に検出し、次いで前記疾患を仲介するためのテーラード治療レジメンを施与するこの新規方針の利用性を確立する。
【００１０】
実施例２
材料および方法：
全ての実験において使用される培養培地は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補給されたＲＰＭＩ１６４０（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから購入した）であった。リンパ球刺激のため、ホルボール１２−ミリステートアセテート（ＰＭＡ）およびイオノマイシンカルシウム塩をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した一方、インターロイキン−４（ＩＬ−４）をＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（Ｏａｋ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）から購入した。ＬＡＧ３およびアイソタイプ対照フルオロフォアコンジュゲートモノクローナル抗体をＢｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。シグナリングに使用される抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した：抗ＣＤ７９Ａ（＃３３５１）、抗ホスホＣＤ７９Ａ（Ｙ１８２）（＃５１７３）、抗ＣＤ１９（＃３５７４）、抗ホスホＣＤ１９（Ｙ５３１）（＃３５７１）、抗Ｓｙｋ（＃２７１２）、抗ホスホ−Ｓｙｋ（Ｙ５２５／５２６）（＃２７１０）、抗−Ｌｙｎ（＃２７９６）、抗ホスホＬｙｎ（Ｙ５０７）（＃２７３１）、抗ＰＬＣγ２（＃３８７２）、抗ホスホ−ＰＬＣγ２（Ｙ７５９）（＃３８７４）、抗ホスホ−ＰＫＣα／βＩＩ（Ｔ６３８／６４１）（＃９３７５）。抗ＰＫＣβ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ  ｓｃ−２１０）および抗β−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を別個に購入した。
ＨＡＬＰ対象から単離されたリンパ球を、エプスタイン・バーウイルスを使用して不死化してＢリンパ球を生成した（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｌｉｎｅｂｅｒｇｅｒ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ，ＮＣ）。ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ球を、１０％のＦＢＳおよび１％のペニシリン−ストレプトマイシンが補給されたＬ−グルタミンを有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地の１ｍｌ当たり約１〜２×１０6個の細胞の密度において懸濁液中で成長させた。培地を必要に応じて週２回以上交換してから細胞を実験に使用した。
基準Ｇアレルについてホモ接合性である３人のＨＡＬＰ対象およびリスクＣアレルについてホモ接合性である３人のＨＡＬＰ対象から全ＲＮＡを単離し、次いでＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ次世代シーケンシングプラットフォーム（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ  ＣＴ）を使用する全長トランスクリプトームシーケンシングに供した。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｆｔｅｒソフトウェアプログラムを使用してバイオインフォマティクスを実施した。データは、完全マップリード、品質リード＞２０、対数変換を選択し、複合試験補正のためにＢｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｃｈｂｅｒｇを使用することにより調整した。目的のＲＮＡ標的は、標準的な方法を使用するリアルタイムＰＣＲおよびウエスタンブロッティングによりバリデートした。ＲＮＡ−Ｓｅｑは、別個の６つの細胞系に対して、細胞を血清（通常の培養条件）中で培養し、次いでホルボールエステル（ＰＭＡ  ５００ｎｇ／ｍｌ）、イオノマイシン（２５０ｎｇ／ｍｌ）、およびＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）により６時間刺激する条件下で実施した。
多数のアッセイを使用して６つのＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系におけるＬＡＧ３発現および機能を評価した。
フローサイトメトリー：フローサイトメトリーを１０レーザーフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）により実施した。死細胞をＢｌｕｅ死細胞染色キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）により染色した。刺激Ｂ細胞におけるＬＡＧ３の応答を計測するため、本発明者らは、Ｓｍｅｌａｎｄら（１）により既に公開されているプロトコルを最初に改変し、最適化した。ＰＭＡ（５００ｎｇ／ｍｌ）、イオノマイシン（２５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）を用いておよび用いずに細胞を種々の時間（０〜４時間）でインキュベートした。生存細胞画分のみを使用し、次いでモノクローナルＬＡＧ３抗体により処理された細胞についての染色パーセント値からアイソタイプ染色パーセント値を減算することにより細胞表面ＬＡＧ３発現の細胞表面変化パーセントを計算した。
培地中へのサイトカイン分泌：インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）のレベルを、基底および刺激条件下で培養された細胞から単離された培地アリコート中で、ＸＭＡＰ技術を使用するＬｕｍｉｎｅｘ２００によりマルチプレックス（Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）により種々の時間（０〜４時間）で計測した。
ウエスタンブロッティング：本発明者らは、ウエスタンブロッティングを使用して刺激Ｂ細胞における下流シグナリングに関与することが公知の以下のタンパク質の総発現およびリン酸化発現を計測した：ｐ−ＣＤ７９Ａ、ｐ−ＣＤ１９、ｐ−Ｓｙｋ、ｐ−Ｌｙｎ、ｐ−ＰＬＣγ２、およびｐ−ＰＫＣβ。一部の実験において、本発明者らはまた、細胞をＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）（２００ｎｇ／ｍＬ）により２時間刺激し、次いでウエスタンブロッティングのために全細胞溶解物を単離した（図Ｓ４およびＳ５）。細胞を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％のＮＰ−４０、０．２５％のデオキシコール酸Ｎａ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、５ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｍＭのβ−グリセロホスフェート、１０ｍＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７、２ｍＭのＥＤＴＡおよび完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）により可溶化した。３０分間の氷上インキュベーション後、溶解物を遠心分離（１０，０００ｇ）により４℃において１５分間澄明化し、上清を回収した。ＢＣＡアッセイを使用してタンパク質濃度を測定し、等量をＳＤＳ／線形勾配ＰＡＧＥに供し、次いでＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で可溶化させた。続いて、ゲル分解されたタンパク質をＰＶＤＦ膜にウェットタンク転写を介して電気的に転写し、それを抗体インキュベーション前に５％の無脂肪乳によりブロッキングした。次いで、膜を最初にホスホ−タンパク質に対する抗体、次いで総タンパク質に対する抗体と４℃において一晩インキュベートした。抗体−抗原複合体を化学発光（ＥＣＬ＋Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により同定した。抗β−アクチンをローディング対照として使用した。定量用Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｌｉｔｅ  ４．０（Ｌｉｃｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を使用してホスホ−タンパク質を対応する総タンパク質に正規化した。
脂質ラフト単離。細胞膜脂質ラフトコンパートメントにおけるＬＡＧ３の発現を評価するため、５００ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ１１．０）およびスクロース密度遠心分離を使用して脂質ラフト膜を単離した。スクロース勾配法を本質的には上記のとおり実施し（２）、改変した。細胞（１×１０8個）を氷冷ＰＢＳにより洗浄し、５００ｍＭの炭酸ナトリウム、ｐＨ１１．０（２）を含有するホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤（１ｍＭのＰＭＳＦ、５ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１ｍＭのβ−グリセロホスフェート、１０ｍＭのＮａ４Ｐ２Ｏ７、２ｍＭのＥＤＴＡおよび完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）と再懸濁させた。溶液を、Ｗｈｅａｔｏｎダウンス型ホモジナイザー中での１０回のストロークによりさらに均質化した。不連続スクロース勾配のため、３００μＬの澄明化上清を３００μＬの８５％のスクロースと混合し、２．２ｍＬのＢｅｃｋｍａｎ遠心分離管の底部に移した。希釈溶解物に１ｍｌの３５％のスクロースを重層し、最後に６００μＬの５％のスクロースを重層した。試料をＢｅｃｋｍａｎ卓上遠心分離機中で７０，０００ｇにおいて４℃において２０時間超遠心した。遠心分離後、勾配を１０個の２２０μＬ画分に分けた。画分１〜３をプールした（ブロット上の組合せ画分１）。脂質ラフトの位置を決定し、不連続スクロース勾配中でタンパク質を区別するため、４０μＬのラフト画分（スクロース勾配の４および５、ブロット上の２および３）および非ラフト画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、免疫ブロットした。
ＬＡＧ３の過剰発現およびサイレンシングアッセイ。本発明者らは、２つの実験アプローチを使用してＬＡＧ３の存在または不存在が下流シグナリング経路の変更の原因であるか否かを決定した。本発明者らは、最初にｒｓ１０８４６７４４リスクＣ発現細胞中で、それらにＧＦＰタグ付き全長ヒトＬＡＧ３ｃＤＮＡを発現するレンチウイルスベクターを形質移入することにより、ＬＡＧ３を過剰発現させた。本発明者らの第２のアプローチは、特異的ｓｈＲＮＡベクターを使用してｒｓ１０８４６７４４基準Ｇ発現細胞におけるＬＡＧ３発現をサイレンシングすることであった。
レンチウイルス形質移入および形質導入：ｐＲｅｃｅｉｖｅｒ−Ｌｖ１２２過剰発現ベクター中に挿入されたＬＡＧ３−ＧＦＰ、ｐｓｉ−ＬＶＲＨ１ＭＰ  ＲＮＡｉサイレンシングベクター中に挿入されたｓｈＲＮＡ−ＬＡＧ３、スクランブルｓｈＲＮＡ、およびレンチウイルスモックＧＦＰ対照ベクターを、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。最も効率的なノックダウンを有するプラスミドの選択のためにＬＡＧ３に対する４つのｓｈＲＮＡをスクリーニングした。Ｌｅｎｔｉ−Ｐａｃ  ＨＩＶ発現パッケージングキット（ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用することによりレンチウイルスを生成した。簡潔に述べると、２．５μｌのそれぞれの個々のレンチウイルスプラスミドおよび５．０μｌのＥｎｄｏＦｅｃｔｉｎ  Ｌｅｎｔｉ試薬をＯｐｔｉ−ＭＥＭＩ中に添加してＤＮＡ−ＥｎｄｏＦｅｃｔｉｎｅ複合体を形成した。複合体を室温においてインキュベートして２０分後、ＤＮＡ−ＥｎｄｏＦｅｃｔｉｎｅ複合体をディッシュに１０％のＦＢＳを有するＤＭＥＭ中のＨＥＫ２９３と添加し、５％のＣＯ2中で３７℃において一晩インキュベートした。培養培地を、５％のＦＢＳを有する新鮮ＤＭＥＭにより置き換え、インキュベートを継続した。ウイルス含有培養培地を形質移入の４８時間後に回収し、濾過後に濃縮した。レンチウイルスによる形質導入のため、１．５ｍｌの完全培地中の１×１０6個のＥＢＶ形質転換Ｂリンパ球を１２ウェルプレート中で播種し、５００μｌのウイルス懸濁液を添加した。細胞を３７℃において７２時間インキュベートした。下流シグナリング経路に対する、リスクＣアレルを有するリンパ球におけるＬＡＧ３の過剰発現または基準Ｇアレルを有するリンパ球におけるＬＡＧ３のサイレンシングのいずれかの効果を評価するため、形質移入細胞を、ホルボールエステル（５００ｎｇ／ｍｌ）、イオノマイシン（２５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）カクテルを用いておよび用いずに２時間刺激し、次いでウエスタンブロッティングのために処理して下流シグナリングタンパク質のリン酸化を評価した。
血漿または可溶性リンパ球活性化遺伝子３（ｓＬＡＧ３）アッセイ。ｓＬＡＧ３ＥＬＩＳＡキットをＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｃｒｏｓｓ  ＧＡ）から購入し、最初にキットを最適化することによりｓＬＡＧ３を計測した。１４３人のＨＡＬＰ対象からの−８０℃において貯蔵された空腹時血漿試料のアリコートを解凍し、３倍希釈し、次いで１００μｌをｓＬＡＧ３計測のために１試料当たり２つ組に使用した。標準曲線を２倍希釈し、線形関連データを生じさせた。線形回帰を標準曲線に対して実施して血漿試料を定量した。値を平均±標準誤差として表す。
【００１１】
実施例１
マウス
全てのアテローム性動脈硬化症試験のため、本発明者らは、病変区域計測値の予測される２５％の変動係数、および病変区域における２５％の差を検出する８０％の機会に基づく出力計算から計算された１群当たり１５匹のマウス（１試験当たり３０匹）を使用した。全ての実験において、マウスに規定の高コレステロール／高飽和脂肪食を１０週間給餌した。標準的比色アッセイおよびＨＰＬＣ画分におけるコレステロール測定の両方により、血漿脂質プロファイルを計測した（ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、トリグリセリド）。大動脈基部中および下行大動脈中のアテローム性動脈硬化病変の量を確立された方法により分析し、例として、病変容積を連続大動脈基部の断面の病変区域、および大動脈のエンフェースオイルレッドＯ染色調製物中の病変区域により評価した。壊死性コアサイズを、ＨＥ染色されなかった病変内の区域として計測した。マウスのそれぞれの実験群について、脾臓および傍大動脈リンパ節中のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の数を定量し、フローサイトメトリー（ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ６９、Ｌａｇ−３およびＰＤ−１について染色）によるＴ細胞の活性化表現型を決定した。
脾細胞をｌｄｌｒ-/-マウスから通常食と高脂肪食の１０週間後に回収し、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８によりエクスビボで２４時間刺激した場合、通常食給餌マウスからの３６．７±３．９％のＬａｇ３＋細胞と比較して４８．２±２．８％のＣＤ４＋細胞がＬａｇ３＋であった（３１％の増加、ｎ＝８〜１０、ｐ＜０．０２）。図１３は、高脂肪食給餌後のマウスにおけるＣＤ４＋Ｌａｇ３＋Ｔ細胞活性化のグラフである。このグラフは、高脂肪食が活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞をもたらしたことを示す。
アテローム性動脈硬化症に対する骨髄由来細胞（ＢＭＤＣ）の効果を試験するため、本発明者らは最初にＬａｇ３-/-またはＬａｇ３+/+ＢＭＤＣを放射線照射された１０週齢Ｌｄｌｒ-/-レシピエントマウス中に移植した。これらの移植マウスを４週間平衡化してから高脂肪／コレステロール食を１０週間給餌し、次いで屠殺し、大動脈病変および免疫パラメータについて分析した。Ｌａｇ３-/-骨髄レシピエントにおける大動脈基部病変Ｔ細胞の有意な増加が対照と比較して存在した（それぞれ４５．５±８．５と２１．１±３．４のＣＤ４＋細胞／ｍｍ２、ｎ＝１４および１２、ｐ＝０．０１、２倍増加）（図１４）。本発明者らは、Ｌａｇ３-/-骨髄レシピエントの傍大動脈リンパ節中で有意に増加した割合の活性化（ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４４＋）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞も対照と比較して見出した（４１．４±１．０と２８．１±１．５の活性化ＣＤ４＋細胞、ｎ＝１４、ｐ＜０．０００１；１２．９±０．７と８．２±０．５の活性化ＣＤ８＋細胞；ｎ＝１４、ｐ＜０．００１）。これらの結果は、高コレステロール血症の状況におけるＬａｇ−３タンパク質についての抗炎症、アテローム保護的役割を強力に支持する。
Ｔｒｅｇは、アテローム生成促進Ｔ細胞応答を抑制する。Ｆｏｋｓ  ＡＣ，Ｌｉｃｈｔｍａｎ  ＡＨ，Ｋｕｉｐｅｒ  Ｊ．ｓ．ｌ．，“Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  Ｗｉｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ”，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ，ｖｏｌ．３５，ｐｐ．２８０−２８７（２０１５）参照。しかしながら、この保護機能におけるＬａｇ−３の役割は不明である。予想外に、傍大動脈リンパ節中のＴｒｅｇの数は、Ｌａｇ３-/-における病変区域と正に相関したが、野生型骨髄レシピエントとは相関しなかった（図１５）。このことは、Ｌａｇ−３タンパク質欠損がＴｒｅｇ機能を損傷させるが、拡大を損傷させないことを示唆する。特筆すべきことに、近年の研究は、ＦｏｘＰ３＋発現細胞上のＣＴＬＡ−４の選択的欠失がＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの拡大をもたらすが、それらの細胞は損傷した抑制活性を有する（ｅｘＴｒｅｇと称される）ことを示した。Ｔｒｅｇ上のＣＴＬＡ−４およびＬａｇ３は両方ともエフェクターＴ細胞上の分子（それぞれＢ７およびクラスＩＩＭＨＣ）に結合し、それを遮断するように機能し得るため、Ｌａｇ３欠損Ｔｒｅｇも欠陥抑制活性を有し得るという可能性が高い。
Ｌａｇ３がＣＤ４＋Ｔ細胞応答を阻害する機序を考慮して、Ｌａｇ３欠損マウスが有意に多い病変炎症を示すことが観察された。Ｌａｇ３タンパク質欠損の状況においてリンパ性Ｔｒｅｇの拡大が観察されたが、その機能は欠落し、適合移植Ｌａｇ３欠損Ｔｒｅｇは野生型Ｔｒｅｇに対してアテローム性動脈硬化症を制御し得なかった。
ここでも、これは、インフラマソーム、慢性炎症疾患および機能不全ＨＤＬを評価するためのバイオマーカーとしてのＬＡＧ３発現プロファイリングと、それに続く前記疾患を仲介するためのテーラード治療レジメンを使用するための新規方針を確立した。さらなる有用性は、ＳＣＡＲＢ１および／もしくはＬＡＧ３バリアントのヒトキャリアまたは他の遺伝的もしくは非遺伝子的原因による低い血漿／血漿ＬＡＧ３タンパク質レベルを有すると同定されたキャリアにおけるアテローム性動脈硬化症リスクのための抗高脂血症薬および／またはスタチンとのコンパニオン治療薬としての組換えリンパ球活性化遺伝子−３のテーラード治療レジメンにより得られる。
【００１２】
実施例２
マウス
マウスにおけるＬＡＧ３欠損がアテローム性動脈硬化症マウスモデルにおいてＴｒｅｇ機能の変更および炎症細胞の増加と有意に関連したことを同定したら、次に、組換えヒト可溶性単量体ＬＡＧ３が、その結合標的ＭＨＣクラスＩＩ分子を高度に発現するマウスＢ細胞に結合するか否かを決定した。野生型マウスからのマウス脾細胞（約１００万個の細胞）を、９６ウェルプレートのウェルに播種した。細胞をスピンダウンさせ、Ｃａ2+／Ｍｇ2+を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中の組換えヒト可溶性単量体ＬＡＧ３溶液（０〜１６２μｇのタンパク質／ｍｌ）中で再懸濁させた。実験条件は、以下のとおりであった：条件１、１６２μｇ／ｍｌ（原液、希釈係数１）；条件２、３２．４μｇ／ｍｌ  希釈係数５；条件３、３．２４μｇ／ｍｌ  希釈係数５０；条件４、０．３２μｇ／ｍｌ  希釈係数５００；条件５、０μｇ／ｍｌ。３０分間のインキュベーション後、細胞をスピンダウンさせ、ＦＡＣＳ緩衝液（０．５％のウシ血清アルブミン、０．０５％のアジ化ナトリウムを有するＰＢＳ）により１回洗浄した。Ｆｃ−ブロック、抗ＣＤ３ＰｅｒＣＰ、抗Ｂ２２０ＦＩＴＣおよびＬＡＧ３／アイソタイプ対照（それぞれ、抗ヒトＬＡＧ−３およびマウスＩｇＧ１Ｋアイソタイプ対照ＡＰＣ）を含有する５０μｌの抗体カクテルを添加した。細胞を室温において２０分間インキュベートし、次いで、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加した。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液によりさらに１回洗浄し、次いで最後にＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁させ、フローサイトメトリーにより分析した。
図１６（第１頁）において示されるとおり、組換えヒト可溶性単量体ＬＡＧ３は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するマウスＢ脾細胞に用量応答的に結合した。図１７（第２頁）において、組換えヒト可溶性単量体ＬＡＧ−３は、マウスＴ細胞（ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない）と比較してマウスＢ細胞（ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する）に優先的に用量応答的に結合した。
図１８は、基底および刺激後条件下のリンパ球におけるＬＡＧ３エキソン３転写物の示差的発現を説明する。本発明者は、ＬＡＧ３遺伝子のエキソン３が、ホルボールエステル、イオノマイシン、およびＩＬ−４により刺激された細胞と比較して基底または休止条件下で培養されたヒトＢリンパ球の間で示差的に発現されることを独自に同定した。エキソン３転写は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するＬＡＧ３タンパク質のドメイン１のエキストラループへの翻訳に必須である。
ＬＡＧ−３転写調節
ＬＡＧ−３タンパク質構造は、４つのＩｇ様エクトドメイン、連結ペプチド、膜貫通および細胞質ドメインからなる。ＬＡＧ３タンパク質構造はＣＤ４のものと類似するが、アミノ酸配列相同性は２０％にすぎない。Ｃｒｅｇ？Ｊ．Ｗｏｒｋｍａｎ，Ｄａｒｉｏ Ａ．Ａ．Ｖｉｇｎａｌｉ，“Ｔｈｅ  ＣＤ４−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＬＡＧ−３（ＣＤ２２３），Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ，Ｅｕｒ．Ｊｌ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２４  Ｍａｒｃｈ（２００３）。ＣＤ４と比較して、ＬＡＧ３タンパク質は、ドメイン１の一部としての３０個のアミノ酸のエキストラループを独自に含有する。このエキストラループはエキソン３中でコードされ、ＭＨＣクラスＩＩ受容体に結合することが示されているのはこのループである。Ｈｕａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ  Ｏｎ  ＬＡＧ−３？Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．，９４（１１）：５７４４−５７４９（Ｍａｙ  １９９７）。
図１８において、エキソン３転写が、不存在である場合、基底休止細胞中で縮小され、細胞がホルボールエステル（ＰＭＡ）／イオノマイシン／ＩＬ−４を含有するカクテルにより刺激された場合に増加することが実証される。この新規観察の考察において、細胞が活性化される場合にのみエキストラループが転写される必要があることは道理にかなっている。組換えヒトＬＡＧ３の一実施形態は、ＬＡＧ３エキソン３の活性化を模倣してＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するエキストラループのＲＮＡおよびタンパク質発現を増加させる薬剤（ＬＡＧ３模倣体）であってもよい。ＬＡＧ３エキソン３活性化の模倣体としては、ＲＮＡ転写に影響を与える代替ＤＮＡまたはＲＮＡ構造の形成に影響を与える分子および／または薬剤、例として、代替ＤＮＡまたはＲＮＡ構造に影響を与える細胞内または細胞外カチオン、例えば、カリウム、ナトリウム、リチウムまたはカルシウムに影響を与える分子を挙げることができる。ＬＡＧ３エキソン３活性化の模倣体としては、ＬＡＧ３エキソン３の転写を含み、または除外する選択的スプライシングに影響を与える分子および／または薬剤を挙げることができる。
目下、好ましい実施形態を十分に記載してきたが、種々の他の実施形態ならびに本明細書に示され、記載される実施形態のある変更および改変が当業者に前記基礎概念の理解時に想起されるのは明らかである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に具体的に記載されるもの以外で実施することができることを理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００１３】
既知癌患者におけるＴ細胞数をブーストさせるためのワクチンアジュバントとしてのｈＬＡＧ３の使用にかかわらず、ＬＡＧ３欠損マーカーを確定的にスクリーニングすること、およびそれが見出された場合、組換えヒトＬＡＧ３により異なる時点の定期投与により予測患者を治療することにより結果として生じるリスクを改善するという大きな産業上の利用可能性が存在する。本発明者は、特異的２点発現プロファイル（突然変異および／または非遺伝子的原因、例えば、ＳＣＡＲＢ１ｒｓ１０８４６７４４突然変異および／もしくはＬＡＧ−３ｒｓ８７０８４９または他の遺伝的もしくは非遺伝子的原因および突然変異の組合せ）を使用して心血管疾患、他の慢性炎症疾患、心血管および／または非心血管罹患率および死亡率についてのリスクがある患者をプレスクリーニングし、次いでコンパニオン治療薬としての組換えヒトリンパ球活性化遺伝子−３を使用するテーラード治療レジメンを施与することにより、これを行う。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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