(57)【要約】  遠心分離機および光学部品を使用して、試料の特徴を測定する装置が、開示される。遠心分離機は、標準の卓上遠心分離機であってもよい。光学部品は、試料とともに、遠心分離機に収まるように大きさおよび寸法が合わされていてもよい。
2019512722.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の特徴を測定するための装置であって：
試料保持器；
試料を照らすよう構成されている光源；
試料からの光を受けるよう構成されている検出器、を含むモジュールを含み、
モジュールは、１Ｌ以下の容量を有する遠心分離容器内に収まるように大きさおよび寸法を決められている、前記装置。
【請求項２】
容量が４００ｍＬ以下である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
試料保持器、光源および検出器が物理的に整列していない、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
モジュールが、光源からの光を試料保持器または検出器へ向ける、少なくとも１枚の鏡をさらに含む、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
試料保持器および光源が１列に沿って並んでおり、検出器がその列に整列していない、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
モジュールが、第１脚および第２脚を有するＵ字形を形成している、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
試料保持器および光源が第１脚内に位置し，検出器が第２脚内に位置している、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
第１脚が第２脚より長い、請求項６に記載の装置。
【請求項９】
モジュールが、対物レンズをさらに含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
試料保持器、光源および対物レンズが１列に並んでおり、検出器がその列に整列していない、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
方法であって：
第１分子および第２分子に関連した、分子間相互作用を通して、粒子を表面に取りつけること；
遠心力を粒子に加えるために、回転軸周りに前記表面を回転させること、ここで遠心力は方向性を有する；
粒子を光源からの光に当てること；
前記表面の回転中に、検出器によって、粒子の像を検出すること、ここで、像は分子間相互作用の特徴を表す情報を含む；および
検出された像に基づいて分子間相互作用の特徴を決定すること；
を含み、撮像軸は遠心力の方向に対して偏角され、撮像軸は光源からの光が試料に当たる方向に沿って向きを合わせられている、前記方法。
【請求項１２】
前記表面が遠心分離バケツ内にあって、該バケツが回転軸に対して斜角にある、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
方法であって：
表面に核酸ナノスイッチを取り付けること、ここで、該核酸ナノスイッチは、粒子とその自由端上で共役する核酸、および、たがいに結合して分子間相互作用を形成している第１結合パートナーと第２結合パートナーとを含む；
粒子に力を加えるために前記表面の１回目の回転をすること；
前記表面の１回目の回転ののちに、該表面の回転を停止すること；および
前記表面の回転を停止したのちのに、前記粒子に力を加えるために該表面の２回目の回転をすること；
前記表面の１回目と２回目の回転の間に、検出器によって、前記粒子の像を、検出すること、ここで、像は分子間相互作用の特徴を表す情報を含む；
検出された像に基づいて分子間相互作用の特徴を決定すること；
を含む、前記方法。
【請求項１４】
方法であって：
第１分子および第２分子に関連した分子間相互作用を通して、表面に粒子を取り付けること；
前記表面を遠心分離機中に挿入すること；
前記遠心分離器に組み入れられている温度制御を使用して、遠心分離機の温度を選択すること；
前記粒子に力を加えるために前記表面の１回目の回転をすること；
前記表面の回転の間に、検出器によって、前記粒子の像を検出すること、ここで、像は分子間相互作用の特徴を表す情報を含む；
検出された像に基づいて分子間相互作用の特徴を決定すること；
を含む、前記方法。
【請求項１５】
遠心分離器に組み入れられている温度制御を使用して、遠心分離機の温度を変更することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は２０１６年２月２５日に出願された「分子に関連した特徴の測定のためのスピン装置」という題の米国仮出願番号６２／２９９、７１１による優先権を主張している。
この明細書は参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府によって資金提供を受けた研究
この発明は米国科学財団によって与えられた認可番号２０１１０８０９８３、および国立保健研究機構によって与えられた認可番号１Ｒ２１ＧＭ１０７９０７−０１Ａ１のもとに米政府に援助されている。政府は当該発明について一定の権利を有している。
分野
本明細書に記載された側面は、概ね、分子に関連している特徴を測定するためのスピン装置、およびそのような特徴を測定する方法に関連している。
【背景技術】
【０００２】
２．関連技術の検討
生体分子間相互作用を定量する能力は、科学研究および医学研究同様創薬においても多大な関心事になっている。生体分子間相互作用の測定可能な特徴の例は、相互作用の親和性（たとえば、どのくらい強く分子が結合／相互作用しているか）および動力学（たとえば、分子の会合（association）および解離（dissociation）の発生しているレート（rate））を包含する。
伝統的に、そのような特徴は、熱量測定、ストップフロー撮像、または表面プラズモン共鳴などの方法を使用して、溶液中で測定される。これらの大部分の測定は、以下を含みいろいろと制限されている１）それらの方法は平均的な挙動のみ報告しており、したがって準安定的な状態およびめったにない事象に関連した重要な詳細については欠失しているかもしれない、および２）それらの方法は外部から適用される力学的ストレスがなく、生体系の混みあった、動的な環境とは著しく異なり得る中で化学的に測定している。
【０００３】
単分子の測定方法に適用する力プローブは、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、光学トラップ、磁気ピンセット、生体膜力プローブ、およびフローチャンバーを包含する。技術的な複雑さのために、いくつかのシステムは多くの金銭と時間の投資を要求する（たとえば、光学トラップシステムは概ね１５０、０００ドル以上の費用がかかる）。加えて、分子間相互作用は、ほとんどの場合において、一度に１分子ずつ研究されている。これらの相互作用の統計学的な特徴づけは、概ね、連続したやり方で行われる、何百または何千の測定を要求し、それゆえにゆっくりとした骨を折るものとなっている。
【発明の概要】
【０００４】
実例となる態様において、試料デバイスの特徴を測定するための装置が提供されている。前記装置は、試料保持器、試料を照らすよう構成されている光源、および試料からの光を受けるよう構成されている検出器を包含するモジュールを包含している。前記モジュールは、１Ｌ以下の容量を有する、遠心分離容器内に収まるよう大きさおよび寸法が決められている。
【０００５】
別の実例となる態様において、方法は、第１分子および第２分子に関連した分子間相互作用を通して、粒子を表面に取り付けることを包含する。前記方法は前記表面を、遠心力を前記粒子に適用するために、軸の周りに回転することを包含し、ここで遠心力は方向性を有している。前記方法は、光源からの光を前記粒子に当てて、前記表面が回転している間に、検出器により前記粒子の像を検出することを、さらに包含する。ここで像は分子間相互作用の特徴を表している情報を含む。前記方法は、検出された像に基づいて分子間相互作用の特徴を決定することをもまた包含している。撮像軸は、遠心力の方向に対して偏角（angled）され、撮像軸は光源からの光が試料に当たる方向に沿って向きを合わせられる。
【０００６】
さらに別の実例となる態様において、方法は、表面にＤＮＡナノスイッチを取り付け、前記粒子に力を加えるために該表面に１回目の回転をさせることを包含する。前記表面に１回目の回転をさせた後に、前記方法は、前記表面の回転を止めることを包含する。前記表面を止めた後に、前記方法は前記粒子に力を加えるために前記表面に２回目の回転をさせることをさらに包含する。前記方法は、前記表面に１回目と２回目の回転をさせている間に検出器により前記粒子の像を検出することをもまた包含している。ここで像は分子間相互作用の特徴を表している情報を含む。前記方法は、検出された像に基づいて分子間相互作用の特徴を決定することをさらに包含している。
【０００７】
そのうえさらなる実例となる態様においては、方法は、第１分子と第２分子に関連した分子間相互作用を通して粒子を表面に取り付けることを包含する。前記方法は、前記表面を遠心分離機中に挿入し、遠心分離器に組み入れられている温度制御を使用して、遠心分離機の温度を選択することもまた包含する。前記方法は、前記粒子に力を加えるために、前記表面に１回目の回転をさせることおよび前記表面を、回転をさせている間に検出器により前記粒子の像を検出することをさらに包含する。ここで像は分子間相互作用の特徴を表している情報を含む。前記方法は、検出された像に基づいて分子間相互作用の特徴を決定することをもまた包含する。
【０００８】
多様な態様は一定の利点を提供している。本開示のすべての態様が同じ利点を共有しているわけではなく、すべての状況下でそれらを共有していなくともよい。
本開示のさらなる特色および利点と同じく多様な態様の構造も、添付図面に関して以下に詳しく記載している。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図面の簡単な記載
多様な態様が、例として、添付図面に関して、これから記載されるだろう：
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａは、試料の特徴を測定するための装置の簡易化した略図を表現している；    図１Ｂは、図１Ａの試料に加えられる遠心力を表している；
【図２】図２は、試料の特徴を測定するための装置の一態様の図式を表現している；
【図３】図３は、スピン力システムの遠心分離機を上から見下ろす視点を表現している；
【図４】図４は、スリップリングを通っているケーブルを伴う、図３の遠心分離機のスリップリングの詳細図を表現している；
【００１０】
【図５】図５は、遠心バケツ（左）内に保持されているモジュールおよび該モジュールが取り除かれた遠心バケツ（左）の断面図を表現している；
【図６】図６は、図４のモジュールの透視図を表現している；
【図７】図７は、図４のモジュールの立体分解図を表現している；
【図８】図８は、スピン力装置を使用した力分光法の実験中の典型的な視野を表現している；
【図９】図９は、一態様に従う、測定方法の図式を表現している；
【００１１】
【図１０】図１０は、図９に表された方法に関連したグラフであって、多様なバケツの角度に対するテザー伸長のトラッキング解像度を示しているグラフを表現している；
【図１１】図１１は、図９に表された方法に関連したグラフであって、バケツの機能として計算された、側方変位からのテザー伸長を測定するよう要求された、ビーズ半径によりスケーリングされた、最小テザー長を示したグラフを表現している；
【図１２】図１２は、異なる回転速度に関連したバケツ角度の測定方法の図式を表現している；
【００１２】
【図１３】図１３は、図９に表されている方法を使用したある実験からのデータを表現している；
【図１４Ａ−Ｅ】図１４Ａ−Ｅは、ループ状態および非ループ状態のＤＮＡナノスイッチ構成物の図式、およびそれに関連したデータを表現している；
【図１５Ａ−Ｂ】図１５Ａ−Ｂは、単分子ペアの繰り返される破断力の測定に関連したグラフを表現している；
【図１５Ｃ−Ｅ】図１５Ｃ−Ｅは、単分子ペアの繰り返される破断力の測定に関連したグラフを表現している；
【００１３】
【図１６Ａ−Ｂ】図１６Ａ−Ｂは、並列ＤＮＡ力−伸長およびスピン力装置にされた過伸展測定に関連したグラフを表現している；
【図１７Ａ−Ｃ】図１７Ａ−Ｃは、ＤＮＡ脱ジッピングナノスイッチ構成物の検証に関連した像を表現している；
【図１８Ａ−Ｂ】図１８Ａ−Ｂは、図９に示された方法の影響下にあるＤＮＡナノスイッチ構成物の図式を表現している；
【図１８Ｃ−Ｄ】図１８Ｃ−Ｄは、図９に示された方法の影響下にあるＤＮＡナノスイッチ構成物の図式を表現している；および
【図１９Ａ−Ｂ】図１９Ａ−Ｂは、スピン力システムの力および荷重レートを詳述している；
【００１４】
詳細な記載
本明細書にて検討されたシステムおよび作業方法は、大規模並列で高スループットな単分子力測定を低コストで提供することができる。より具体的には、回転−誘起力（たとえば、遠心力および粘性抗力）は単分子（たとえば、タンパク質またはＤＮＡ）、単分子間相互作用または分子複合体（complex）（たとえば。受容体−リガンドタンパク質ペア）などの事象を操作するために使用されることができ、多くの事象に同時におよび／または繰り返し力が加えられることを可能にする。
【００１５】
それぞれの事象（主題として本明細書に参照されもする）は真の単分子検出のために直接および独立して観察され得る。実験の効率は、実験を実施する時間を日単位から分単位に減らすほどに改善され得る。単に実験のスピードアップ以上に、この効率は、逐次収集される統計では実行不可能であるだろう、存続時間が一時間である相互作用を観察する平衡近傍での測定などの新たな実験をも可能にする。
【００１６】
さらに、統計学セットが大きくなれば、より詳しい特徴づけ、モデリングにより簡単に到達でき、不均一性の観察が可能になる。並列測定は相互作用の群を同時に検証することにも使用され得る（たとえば、複数の薬剤候補が同時に標的受容体に対して検証され得る）。
【００１７】
本明細書にて検討されたシステムおよび作業方法は、方向および大きさの広い範囲における正確な力の制御を提供し得る。力の制御を通して、前記システムおよび前記作業方法は、動力学のパラメーター（たとえばＫＯＮおよびＫＯＦＦ）および平均している群からは目に見えないであろう分子の微妙さの力依存性の測定を包含する、力依存の相互作用を定量することに使用され得る。このシステムを使用することで、生体分子複合体の力学的特性（たとえば、ＤＮＡおよびタンパク質のコンプライアンス）および細胞内標的（たとえば、ストレス化にある細胞の弾力性）が研究され、多様な情報をそれらの主題の構造および機能の両方に生み出し得る。
【００１８】
本明細書に記載されているシステムおよび作業方法の、いくつかの態様における、試料にかかる遠心力場は、巨視的に均一な、安定した、能動的フィードバックの必要性のない、校正不要な、および動的な、本質的に決定論的な手法で制御可能であるものである。したがって、望ましい力の変遷は、能動的フィードバックの必要性のない、単分子または事象（互いに同一であろうと異なっていようと）の全体（または複数）に適用され得る。力場は都合よく、質量密度に、放射ダメージの可能性の消去、力とともに研究されているシステム（たとえば、ビーズまたはいかなる物質から作られている物体が、自身の周囲とは異なる質量密度を有してさえいれば、使用され得る）の範囲の拡張に、結びついている。さらに、ビーズの種類、ビーズの大きさ、および回転速度を変えることによって、少なくともサブフェムトニュートンからナノニュートンまでに、力を広い範囲で達成させ得る。
【００１９】
本明細書に記載されたシステムおよび作業方法は、高い順応性をもった多次元の力を発生させる多様な種類の力プローブを都合よく統合することができる。例えば、前記システムは、光学トラップ、磁気ピンセットおよび／または力の組み合わせ（勾配および散乱力、磁力、流体力、および遠心力など）を発生させるマイクロ流体デバイスと連結して使用され得る。それぞれの力は、異なる方向で、異なる大きさで、および／または異なる試験工程で試料（または事象）に加えられる。
【００２０】
本明細書に記載されたシステムおよび作動方法は、都合よく、高い時間−空間分解能を有するリアルタイム観察を提供する多様な撮像技術ともまた統合され得る。例えば、干渉技術および回折分析を使用することで、試料中の個々の粒子の位置をサブナノメーターの正確さで確かめることができる。蛍光撮像もまた、実験中の微妙な分子の遷移を可視化することができ得る。さらに、ハイスピードＣＣＤカメラによるビデオトラッキングを使用することで、分子の事象を、マイクロ秒のスケールで検出することができる。
【００２１】
いくつかの態様において、本明細書に記載されたシステムおよび方法は、他の普及している分子分光法の方法よりも、よりコスト効率が良く、より単純に使用され得る。本明細書に記載されたモジュールの材料費は、一般的に、典型的な実験室の顕微鏡の費用よりも低い。いくつかの態様において、このシステムを使用している実験は、プリプログラムされた力のプロトコル、最小のセットアップを伴う、使用者の介入はほとんど、または全く必要性のないという簡単なものである。
【００２２】
発明者は、単分子または分子間相互作用を機械的に操作する能力が、複製および転写における分子モーターの活動から成長における力学的な力の役割まで、生物医学研究の全体にわたって洞察をもたらし得ることを高く認識している。前記発明者は、原則として、これらのアプローチが個々の分子複合体の十分な特徴づけおよび単分子レベルの不均一性の研究を可能にする一方、実際問題として、主要課題が存在していることを認識している。力分光学的研究の第１の課題は、ほとんどの単分子アプローチが低いスループットであることである。さらに、十分な量の統計は群のみからでなく、それぞれ個々の分子または相互作用または、結合破断などの大規模遷移の研究の課題であり得る複合体から収集されていなければならない。別の課題は、非特異性をこえた対象の単分子間相互作用および複数間相互作用の確実な同定である。最後に、同様な力特性を有する異なる分子群の区別を困難にする、熱および実験両方による、ノイズという微妙な課題がある。
【００２３】
発明者は、これらの課題に時空間的な多重の力分光法を用いて取り組んでいる。いくつかの態様において、システムは、繰り返される呼びかけ（interrogation）を伴う並行する空間の多重化を、成し遂げることができる。いくつかの態様では、繰り返される呼びかけは、自己組織化したナノスケールデバイスにより可能になる。発明者は、ハイスループットの、単分子（または単一相互作用）実験用の、いくつかの態様においては、市販の卓上遠心分離機を利用した実験用の、スピン力システムを開発した。
【００２４】
スピン力システムにおいて、顕微鏡撮像システム全体が、均一な遠心力（従来の「スピンディスク」遠心顕微鏡とは異なり）の影響下にある微小物体を観察するために回転している。このデザインは、いくつかの態様において、温度制御および高解像度の粒子のトラッキング（〜２ｎｍ）を可能にする。
【００２５】
ある実例となる態様および明細書において、公開された国際出願番号ＷＯ２０１３／０６７４８９に記載されているもののような、重要な新しい機能性を提供するための、力学的なナノスイッチを統合するハイスループットなアッセイを開発した。前記ナノスイッチは２つの役割を果たし得る、すなわち、１つは大きなデータセットを信頼できる自動化された分析を容易にするための分子署名（signature）として、および２つめはそれぞれの単分子ペア（または単分子間相互作用）の繰り返される呼びかけを可能にし，スループットを増加し、単分子（または単分子間相互作用）実験の不均一の新しい測定を可能にすることである。何百の単分子複合体（下記の通り、結合ペアの両方のメンバーを取り囲んでいるかもしれないナノスイッチなど）の力測定を繰り返させることにより、集合を含むそれぞれの分子（またはナノスイッチ、およびしたがって興味あるそれぞれの相互作用）の複数の統計が収集され得る。発明者はまた、分子基盤ごと（たとえば、ナノスイッチ基盤ごと）の複数の破断力の平均化によって，超解像度力分光法、すなわち、熱的力解像限界より下の分子の異なる集合（たとえば、ナノスイッチ）の同定が、可能になるほどノイズを減らすことができると認識している。平均化は、異なる分子（たとえば、ナノスイッチ）間についての情報の欠失なしに、力分布の広がりの縮小を可能にする（平均化は〜ｓｑｒｔ（Ｎ）の因子によりノイズを削減する）。さらに、この技術により提供された豊富で比較的大きなデータセットは、統計学的デコンボリューションのための他の分析技術を補完し得る。
【００２６】
図式の概要
図１Ａおよび１Ｂを参照すると、回転腕１２０が作動中であるとき、試料１４０は中心軸１０２から距離Ｒにおいて、角速度ωで回転している。この例における、実例となる目的に対して、試料１４０は、軸１０２に対して内表面１４０ａおよび外表面８を有するカバーガラス１４０‘を包含する。両表面は軸１０２と同時に整列する。粒子２４０（たとえば、ビーズ）は、分子Ａ２４２と分子Ｂ２４４の間で形成されている化学結合２４３を通して外表面８にくっついている。この例において、分子Ａは、化学的に外表面８に連接している受容体であり、分子Ｂは化学的に粒子２４０に連接しているリガンドである。（そのような連鎖を形成する技術および方法は以下により詳しく記述されるだろう）
【００２７】
粒子２４０が円の動きを経るとき、次の方程式で定義するように、遠心力Ｆが粒子におよぼされる。
【数１】
2019512722.tif 000003
【００２８】
ここで、Ｆは遠心力の正味量、ｍおよびｖは粒子の質量および直線速度、およびＲは回転軸１０２からの距離である。旋回している粒子２４０が静止してあらわれる回転基準系において、粒子２４０は、Ｆに等しい慣性による遠心力を、外表面１４０ｂと垂直で中心軸１０２から離れる方向に経験する（矢印２５０により示されている）。いくつかの粒子２４０が半径ｒおよび相対密度ρの溶液中の球形のビーズである例において、角速度ωに関して方程式（１）の書き換えがもたらされる：
【数２】
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【００２９】
試料１４０が軸１０２の周りをとてもゆっくりとした速度で回転しているとき、遠心力Ｆは、粒子２４０を表面８にくっつけさせ続けようとする、化学結合２４３の相互作用力で相殺される。角速度ωが上昇するにつれ、遠心力Ｆの大きさの増加は、ビーズ２４０を表面８に対して動かす原因となる。相対運動（たとえば、二乗平均平方根変位または運動方向）の特徴は、結合２４３の一定の化学的および／または力学的特性（たとえば、遷移状態および形態変化に関した特性）の定量により観察および分析され得る。Ｆの増加は、その時点で粒子２４０は表面８から離れる、化学結合２４３の破断の原因でもあるだろう。粒子が離れる際の遠心力Ｆの大きさは、化学結合２４３の破断力を指している。
【００３０】
作動中、遠心力Ｆの大きさは、例えば、回転腕１２０の角速度ωの調節により制御され得る。例として、試料１４０は、粒子２４０にかかる遠心力が角速度ωの段階変化をとおした増加および／または減少する加力の複数のサイクルの影響下にあり得る。
【００３１】
角速度ωの変化に加えて、回転半径Ｒを回転軸に対して試料の位置を変化されることで静的または動的のどちらかで変化させることもまた可能である。例えば、システム１００において、試料１４０は長さが伸縮可能である、調節可能な腕の上に乗っている、または中心軸１０２に対して径方向に移動させることのできるポジショナーの上に置かれている。
【００３２】
粒子２４０が球形のビーズである態様において、遠心力Ｆは方程式（２）中に示されている１以上の粒子特徴ρおよびｒの変化によってもまた変わってき得る。例えば、小球体は広範囲の原料および大きさ（以下の表１を参照する）で商業的に入手可能である。研究の主題（たとえば、分子、タンパク質、核酸、細胞など）を選択されたビーズ、小球体など、に共役させることによって、ビーズに加えられる（および主題を移動させる）遠心力は、ビーズの特性に基づいて変化し得る。加えて、ビーズの単分散の程度は、与えられたスピンに応じた力の範囲を制御し得る。例として、高単分散試料（たとえば、実質同じ大きさおよび特性のビーズを使用する）はすべてのビーズに同じ力を経験させる原因となるかもしれない、一方多分散試料（たとえば、多様な大きさおよび／または特性のビーズを使用する）は、加えられる力が広範囲になるだろう。さらに粒子２４０のρは、緩衝液の密度の変化によってもまた変更され得る。そのうえ、試料チャンバーの形状は、チャンバー内の粒子を動かないようにする流体力を加え得る、流量の影響を制御するために変化し得る。
【００３３】
【表１】
2019512722.tif 000005
【００３４】
適切なパラメーターを選択すると、粒子２４０に加えられる力は、マイクロニュートン（たとえば、ｒ＝１０μｍ、ρ＝１．５ｇ／ｃｍ３、Ｒ＝５００ｍｍ、ω＝１００Ｈｚ）からフェムトニュートン（たとえば、ｒ＝１μｍ、ρ＝０．０５ｇ／ｃｍ３、Ｒ＝２５０ｍｍ、ω＝２Ｈｚ）までの９等級の大きさに及び得る。
【００３５】
遠心力Ｆの方向もまた制御され得る。いくつかの例において、試料１４０は、回転軸１０２に対して垂直である、表面８（たとえば、カバーガラス、他のカバーガラス、または他の試料チャンバーまたは試料据付要素の）に結びつけられ、表面８に沿った遠心力Ｆをもたらすだろう。いくつかの態様において、試料１４０は、回転軸１０２と平行である、外表面８（すなわち、回転軸１０２から外側に向いた表面）に結びつけられ、図１Ｂに示された、結合２４３の引張力をもたらすであろう。特定の実施において、回転軸と平行である表面に試料を結びつけることは望ましいだろう。なぜなら粒子２４０を表面８から離すように引っ張ることは粒子が表面８上の分子Ａの空いている結合部位と新たな相互作用を形成する見込みを減らすからである。いくつかの態様において、試料が内表面１４０ａ（すなわち、回転軸１０２の方に表面を向けている）に結びつけられている場合には、（引張力よりもむしろ）圧縮力が結合２４０に加えられ得る。
【００３６】
いくつかの態様において、試料は回転軸に対して選択された角度を形成する表面に結びつけられ、遠心力Ｆはどの方向にでも加えられるであろう。いくつかの実施において、試料を回転軸に対して斜めの角度である表面に結びつけられることは望ましい。後のセクションで論じるように、この斜めの角度の配置は粒子の横方向の動き、すなわち、試料が結びついている表面に平行して発生する粒子の動きを追跡することを可能にするだろう。
【００３７】
遠心力Ｆに加えて、他の種類の力もまたスピンを通して粒子２４０に加えられ得る。例えば、粒子２４０が液状媒体で満たされたチャンバー内に含まれている場合、試料１４０の回転は、粒子２４０に粘性抗力を働かせる、局部的な流れを発生させ得る。抵抗力の方向はチャンバーの形状および試料の方向付けなどの要因に依存する。抵抗力の大きさは液状媒体の粘性および温度、粒子の大きさ、および試料の角速度および加速度などの要因に依存する。
【００３８】
試料（ナノスイッチなどの分子など）の特徴を測定する装置において、粒子２４０の動き（たとえば、分子の折り畳み、展開または結合２４３の破断により引き起こされる変位）はビデオトラッキング法（たとえば、高時間分解能で粒子の像を連続して取ることにより）により観察され得る。論じるように、光源、試料および対物レンズは同じ角速度ωでともに回転するであろう、そしてしたがってこれらの３構成要素は回転基準系において互いに止まっているものとしてあらわれる。それゆえに、粒子２４０の像は、透過光または反射光技術および蛍光技術を包含する伝統的な撮像技術を使用して形成され得る
【００３９】
システムの概要
一側面によれば、いくつかの態様において、試料の特徴を測定するための装置は、科学研究所の標準的な備品である、遠心分離機を使用する小型スピン力システムである。いくつかの態様において、遠心分離機はThermo Scientific社のHeraeus X1R Centrifugeなどの卓上遠心分離機である。標準的な備品の使用は、コストを下げ、分子特徴へアプローチするスピン力の利用しやすさを増加する。
【００４０】
スピン力システムは、いくつかの態様において、光学部品および調査される試料を保持するモジュールもまた包含する。当該モジュールは遠心分離機内に収まる、たとえば、遠心分離バケツまたは遠心分離機の穴またはスロットに収まる、大きさおよび形をし得る。いくつかの態様においては、当該モジュールは４００ｍＬバケツ容量以下に収まるように大きさおよび形が作られている。いくつかの態様において、当該モジュールはより小さく、１５ｍＬ、５０ｍＬ以下、１００ｍＬ以下または１Ｌ以下のチューブ／バケツ／容量に収まるように大きさおよび形が作られている。
【００４１】
図２のパネルＡを参照すると、スピン力システム１００は、分子間相互作用の研究のために回転力を提供する、標準的な研究所の遠心分離機３０を使用している。いくつかの態様において、光学部品３９０および試料４００を保持する、モジュール３００は、遠心分離機のスイングバケツ４０の１つ内に収まっていてもよい。光学部品３９０は検出器２１、対物レンズ１１、および光源２２を包含していてもよい。光学部品および／またはメディアコンバーターに動力を供給するバッテリー３４５を遠心分離バケツ４０の内側に包含してもよい。スピン力システム１００は検出器２１からの信号を受け取るコンピューター１４１９が包含されていてもよい。いくつかの態様において、検出器２１からの信号は最初にメディアコンバーターに送られ、次いで信号がコンピューター１４１９に送られる。いくつかの態様において、コンピューター１４１９または他の制御装置は、遠心分離機を制御するよう、たとえば、角速度、バケツの角度、回転持続時間、開始および停止時間などを制御するよう、配置されていてもよい。遠心分離機は、コンピューターまたは他の制御装置によって制御することを可能にする制御モジュールを使用してもよい。
【００４２】
モジュールの試料保持器は、試料または試料を保持している何かが差し込まれ、または他の方法で取り付けられ得る、チャンバー、スロットまたは他のスペースまたはモジュール内の取り付け点であってもよい。例えば、以下により詳細に述べるように、いくつかの態様において、試料チャンバー２６０は、縁部の内側に試料を収容するためのカバーガラスの間の隙間を残しながら、（たとえば、それらの縁部で）互いにくっついている２枚のガラスを含む。ナノスイッチの群などの試料は、表面の一つに結びつけられ、試料の位置は、遠心分離機からの遠心力の適用に応じて、結び付けられている表面の方へ向かってまたは離れて移動することができる。試料チャンバーは次いで、試料チャンバーがはめ込まれてもよい、滑り込んでもよい、または他の方法で結びついてもよい、スロットまたはスペースであってもよい、モジュールの試料保持器に差し込まれ得る。いくつかの態様において、試料が結びついている表面（たとえば、カバーガラスまたは他のカバーガラス）は、使い捨てであってもよい。
【００４３】
異なる種類の多様な試料は、試料保持器によって保持されていてもよい。いくつかの態様において、試料はＤＮＡナノスイッチなどのナノスイッチを包含する。図２のパネルＢは、モジュールの試料保持器（試料保持器の例は、図５および７に項目３４０として示されている）により順番に保持される試料チャンバー２６０の表面８に結びつけられた試料４００の拡大視野を表現している。いくつかの態様において、試料は試料チャンバーを必要としないように、直接モジュールの試料保持器に結びつけられてもよい。
【００４４】
図２の試料４００はＤＮＡナノスイッチなどのナノスイッチの複数を包含する。ｔ０、ｔ１およびｔ２に相当する像は、たとえば遠心分離機の角速度の増加によって、時間とともに加えられる力が増加していく際の、時間によるナノスイッチの外形を表現している。パネルｂの下側部分のグラフは、力がかかっているときの時間関数としてモニターされたテザー伸長を反映している。受容体（Ｒ）−リガンド（Ｌ）ペア間の結合破断などの分子遷移は、当該ペアはナノスイッチの一部をなしている、ナノスイッチのテザー伸長において明確な変化を引き起こしており、ともにナノスイッチに不可欠であるだろう、興味のある２分子間の相互作用を検出するための他と異なる署名を提供している。
【００４５】
したがって、当該方法およびデバイスは、相互作用強度または２つの分けられる、物理的に他と異なる結合パートナーであって、互いに結合しており次いで結合破断を介して互いに分離するものに関連する他のパラメーターを測ることに使用され得る。そのような結合パートナーの１つは、粒子などの検出可能部分に共役しており、２つの結合パートナー間の結合の状態についての情報を示す検出可能部分の所在となっている。
【００４６】
ナノスイッチの場合において、結合パートナーがともに同じ分子に共役または一部をなしている（たとえば、核酸など）場合を、ナノスイッチとして本明細書に参照した。結合パートナーは、互いに相互作用し、互いに結合できるように、ナノスイッチに沿って互いに十分に離れるよう間隔をあけている。当該ナノスイッチは自身の自由端またはその周辺に粒子などの検出可能部分を含む。ナノスイッチ上の力の増加（例えば、粒子を介して）は２つの結合パートナー間の結合を破断し、それによってナノスイッチの長さの変化を引き起こし（すなわち、典型的には増加する）、そのように変化していく中での粒子の位置もまた変化する。
【００４７】
図２のパネルＢは、開放または伸長形態および閉鎖またはループ状になった形態のいくつかのナノスイッチを表現している。開放または伸長形態のそれらは結合破断を経験しており、これは、２つの結合パートナーの間の結合力（またはエネルギー）よりもナノスイッチにかかる力の方が大きいことをエンドユーザーに知らせる。反対に、閉鎖またはループ状になった形態はいまだ結合破断を経験しておらず、これは、２つの結合パートナーの間の結合力（またはエネルギー）よりもナノスイッチにかかる力の方が小さいことをエンドユーザーに知らせる。
【００４８】
一度の測定における支持上の多様なナノスイッチは互いに全く等しくても異なっていてもよい。全く等しいナノスイッチは同じ主鎖分子および主鎖分子（たとえば、核酸）に沿って同じ位置にある同じ結合パートナーを含む。異なるナノ粒子は異なる結合パートナーを、任意には主鎖分子に沿って異なる位置に含んでもよい。異なる位置にある場合に、異なるナノスイッチ、およびしたがって異なる結合ペアはループ状から伸長形態へとそれらの長さにおける変化に基づいて同定されるだろう。
【００４９】
上記は、ナノスイッチが２つの結合パートナーを含み、２つの結合パートナーの互いに対する結合の特徴を研究するために使用されることを推測している。しかしながら、本開示は、互いに相互作用および／または潜在的に結合を競合しあう、２以上の結合ペアおよび／または３以上の結合パートナーを巻き込むより複雑なナノスイッチについて熟考することを理解するべきである。
【００５０】
スピン力システム１００のある例示的な例が、４つのバケツを有する遠心分離機の上から見下ろす視点を表現している、図３に示されている。当該遠心分離機は、科学研究所において一般的に見つけられる、標準的な卓上遠心分離機であってもよい（たとえば、Thermo Scientific社のHeraeus X1R Centrifuge）。最初のバケツ４０は光学部品と試料を含むモジュールを保持している。いくつかの態様において、遠心中の遠心分離機からのカメラデータの伝送は、カメラのギガビットイーサネット信号が光ファイバー信号に変換され、次いでこのデータが遠心分離機からファイバーロータリージョイントを通して伝わることによりなされる。隣のバケツ４１は、信号変換のための電子部品を保持している。一態様において、２つ目のバケツ４１は、カメラ信号をモジュールから光ファイバー信号へと変換する、メディアコンバーター５７を包含する。当該バケツはメディアコンバーター５７の動力となるバッテリーもまた包含する。最初のケーブル３７はモジュール３００とメディアコンバーター５７を接続する。いくつかの態様において、メディアコンバーターはモジュールの一部となっている。２つ目のケーブル３９は、光ファイバー信号をメディアコンバーターから出てコンピューターまたは遠心分離機外の他のデバイスに送る光ファイバーケーブルである。いくつかの態様において、光ファイバーケーブルは遠心分離機から出ていく前にスリップリング３８を通っている。図４は、スリップリング３８とそれを通っているケーブル３９の詳細図を示している。当技術分野で周知のように、スリップリングは動力および／または電気信号を動かないものから回転構造へと伝送させる電気機械デバイスである。スリップリング３８は、スリップリングのケーブル下流（すなわち、ケーブルが遠心分離機から出ていく部分）の部分は動かないものに残し、スリップリングのケーブル上流（すなわち、メディアコンバーターからスリップリングへと走っているケーブルの部分）を回転させている。
【００５１】
Thermo Scientific社のHeraeus X1R Centrifugeを使用している、一態様において、TX-400ローターは光ファイバーロータリージョイント（Princetel社MJX）を中心軸に沿って据え付けるよう変更することができる。これはローターのプッシュ−リリース機構を取り除き（ボタンの側にあるスクリューを緩めることにより）、４つある貫通孔に１０−３２ネジを受けてネジ付けすることによりなされることができる。アダプタはスリップリングを保持するためにローターに取り付けることができる。ある例示的な例において、図４はスリップリング３６を収容するために取り付けられたアダプタ３６を表現している。光ファイバーケーブルを遠心分離機のふたを通すことを可能にするために、遠心分離機の中央のプラスティックのぞき窓は取り除かれた。
【００５２】
いくつかの態様において、信号の変換のための電子部品は、モジュールに組み込まれていてもよく、完全に除外されてもよいことは認識されるべきである。例えば、いくつかの態様において、モジュールは光ファイバー信号への変換を要さず無線で信号を伝えてもよい。図３に戻ると、次の２つのバケツ４２、４３は、最初の２つのバケツと重さが釣り合う、バランス３５を保持している。
【００５３】
当該モジュールは次に詳細に記載されるであろう。図５の左側は遠心分離バケツ４０内に収まるように大きさを合わせられたモジュール３００を示している。図５の右側はモジュールの取り除かれた遠心分離バケツを示している。当該モジュールは試料４００だけでなく光学部品も保持していてもよい。当該モジュールの光学部品はＬＥＤの形で光源を、対物レンズを、カメラの形で検出器２１を、および光源２２からカメラへと光を向けなおす反射鏡を包含する。いくつかの態様において、モジュールを制限された容量内に収めるために、光路は２回直角に曲がることを包含してもよい。図５の例示的な態様において、反射鏡１８は２回直角に曲がることを可能にしている。結果として、光学部品のうちいくつかは、一直線に置かれるよりむしろ、互いに並んで置かれてもよい。このようにして、組立品全体の全長を減少させ、遠心分離バケツ内に収まるほど十分にモジュールを小型にすることを可能にしている。
【００５４】
図５−７に示されている１つの例示的な態様において、チューブマウント（Thorlabs社、S1LEDM）にネジ付けされた赤色ＬＥＤ（Thorlabs社、LED630E）が光源として供給された。ガラス拡散器はＬＥＤと視野にわたって均一の照度を提供されている試料チャンバーの間に位置している。直径２５ｍｍの試料チャンバーはＳＭ１レンズチューブと両立するよう設計された。試料は４０Ｘオリンパスプランアクロマート（Olympus Plan Achromat）対物レンズ（無限遠補正される、０．６５ＮＡ、０．６ｍｍＷＤのもの）およびfφ１、１００ｍｍのチューブレンズ（Thorlab社、AC254-100-A）にて拡大され、ＣＣＤカメラ（AVT社、Prosilica、GC2450）に映し出される。カメラは、ギガビットイーサネット信号としてデータを出力する、標準的なＧｉｇＥ Ｖｉｓｉｏｎのインターフェースを使用した。遠心分離中の生の撮像を可能とするために、光ファイバーロータリージョイント（PrinceTel社、MJX）が遠心分離ローターの中央に取り付けられ得る。カメラ信号は、ツイストペアイーサネットから光ファイバー信号へと、遠心分離機内の小さなメディアコンバーターによって変換され、ロータリージョイントを通って移動し、次いで収集コンピューターに接続された２つ目のメディアコンバーターによって標準イーサネット信号へ再変換され得る。１つの例示的な例において、IMC Network社から入手する。MiniMc Gigabit製品（たとえば、型番８５５−１０７３４および８５５−１０７３５）がメディアコンバーターとして供給し得る。検出器から集められた像は記録され得る。
【００５５】
試料温度を測るために、一態様において、携帯用無線熱電対コネクター（Omega Engineering社、MWTC-D-K-915）が、表面貼付型熱電対（Omega Engineering社、SA1XL-K）とともにモジュールを含有するバケツ内に埋め込まれてもよい。無線受信機（たとえば、Omega Engineering社、WTC-REC1-915）はリアルタイムに温度を記録している熱電対コネクターからの温度を取得するために使用され得る。
【００５６】
図６は遠心分離バケツなしの、モジュール単体での透視図の表示を表現している。図６から見ることができるように、当該モジュールはＵ字の配置を有している。Ｕ字の第１脚と第２脚は同じ長さである必要はない。図６に示された態様において、第１脚は第２脚より長い。図６の例示的な態様において、光源２２、対物レンズ１１および試料保持器３４０が第１脚３０１内に置かれており、検出器２１が第２脚内に置かれている。しかしながら、光学部品および試料保持器が任意の順番で配置し、どちらの脚に置かれていてもよいことを理解するべきである。
【００５７】
他の態様において、光源、対物レンズ、試料および検出器が一列に並んでおり、したがって反射鏡の必要性がないことは認識されるべきである。例えば、１Ｌのバケツのより大きなフロア用モデルなどのより大きな遠心分離器においては、より大きなバケツの深さは、光源、対物レンズ、試料および検出器を、光路を曲げる必要なく一直線に収めるだろう。
【００５８】
さらに他の態様において、光路は直角以外の角度で１回以上曲げてもよい、たとえば、光路が１５、３０、４５、６０または８５度で曲げられてもよい。そのように曲げることは１以上の鏡を使用してなされてもよい。
【００５９】
いくつかの態様において、モジュールは、モジュールの部品を守り、バケツまたは遠心分離機内の他の容量内にしっかりと固定するハウジング３０５を包含している。ハウジングは光源、検出器、および、いくつかの態様において、メディアコンバーターのための電源として役立つ、バッテリー（たとえば、SparkFun社、PRT-00339）および接続されたＤＣ−ＤＣ昇圧回路（たとえば、SparkFun社、PRT-08290）のための開放スロットを包含していてもよい。ハウジング３０５は３次元プリント、射出成型、ダイキャスト、または他のどのような好適な方法で形成されていてもよい。いくつかの態様において、ハウジングはアクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）製である。
【００６０】
図７は、モジュール３００の１つの例示的な態様の立体分解図を表現している。それぞれ照会番号に相当した部品のリストを以下の表２に掲載する。この部品のリストは１つの例示的な態様でしかなく、他の好適な部品をリスト上のそれらと交換してもよいことを認識すべきである。
【００６１】
【表２−１】
2019512722.tif 000006
【表２−２】
2019512722.tif 000007
【表２−３】
2019512722.tif 000008
【００６２】
図７の例示的な態様において、部品５および６は試料保持器３４０を形成するために組み合わせ、部品６−８は試料チャンバー２６０を形成するために組み合わせる。部品５は２つの機能を有する、すなわち試料保持器の一部を形成することおよび拡散器として働くことである。試料チャンバーは試料保持器内に保持される。反射鏡１８は、該鏡と組立品を接続し、該鏡を適切な角度で保持する、ハウジング１７によって保持される。ハウジング１７は、Ｕ字の第１脚と第２脚を接続するためにもまた供給してもよい。
【００６３】
図７の例示的な態様における検出器は、最大解像度において最大フレームレートが１５ｆｐｓである５メガピクセルのＣＣＤセンサーを備えている。  異なる解像度および取得レートの代替カメラが検出器として使用され得る、例えば、１５メガピクセルまたは２メガピクセルバージョンのBasler AceのＣＭＯＳカメラは４００ドル以下である（Edmund Optics, Inc）。撚線イーサネット接続を光信号に変換する、メディアコンバーター（項目２２）は、１０ＧｉｇＥ光ファイバー出力のカメラが使用されている場合は、省略されることができる。小型無線ルーターを使用したデータ出力は代替アプローチであるが、より遅い取得レートとなるであろう。反射鏡ハウジングなどの追加のカスタマイズ部品は、Thorlabs社の小型ケージキューブシステムに置き換えることができる。いくつかの場合において、固体アルミニウム構造は追加の撮像路の安定性を提供するであろう。
【００６４】
いくつかの態様において、検出器は、アクションカメラ（たとえば、GoPro HERO）または携帯電話などの無線ビデオカメラであってもよい。カメラは無線で制御され、無線で最大解像度のストリーミング配信および／または記録し得る。そのような配置は遠心分離機を通ってケーブルが走る必要性を避けるだろう。いくつかの場合において、そのような配置は、メディアコンバーターの必要性をもまた避けるであろう。
【００６５】
図８はスピン力装置を使用した力分光学実験の典型的な視野を表現しており、何千もの表面に繋ぎ止められたビーズが同時にモニターされることができることを示している。
【００６６】
試料チャンバーの構成
１つの例示的な態様において、試料チャンバーは、両面カプトンテープを使用して直径２５ｍｍの支持ガラスと直径１９ｍｍのカバーガラス（GOLD SEAL、３３４６）で挟み込むようにして構成される。溶液の入り口および出口として供給する、２つの直径１ｍｍの穴は、厚さ０．７ｍｍの支持ガラス（S.I.Howard Glass社（Ｄ２６３））にあけられる。カバーおよび支持ガラスは、１００ｍＬの１％（ｖ／ｖ）Hellmanex III溶液に浸し、１分間電子レンジにかけて、次いで３０分間超音波にかけることで洗浄されることができる。その後、スライドはミリポア（Millipore）水で徹底的にすすぎ、窒素流で乾燥させてもよい。１ｍｍｘ７ｍｍの長方形の流路は、両面カプトンテープを、カッティングプロッタ（Graphtec）を使用して刻み込まれた。ジゴキシゲニンの機能を持ったコンストラクトを伴うテザーを形成するために、カバーガラスは以前に開発されたプロトコル32の修正版を使用してアンチ−ジゴキシゲニンの機能を持つようにした。最初に、カバーガラスは、２μＬの酢酸アミル溶液を０．２％の（ｍ／ｖ）溶解ニトロセルロースに沈殿させることにより、ニトロセルロース溶液でおおわれる。次いで、チャネルは１００ｕｇ／ｍｌアンチ−ジゴキシゲニン（Roche社、１１３３３０８９００１）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）溶液で１５分間インキュベートされる。前記チャネルは次いで、洗浄され、表面安定化溶液（ＰＢＳに１０ｍｇ／ｍｌ  ロシュブロッキング溶液加えたもの）でさらに１時間インキュベートされる。表面安定化段階の後に、前記チャネルは、実験用緩衝液で洗い流し、次いで５ｐＭのコンストラクトで１５分間インキュベートされる。５ｐＭのコンストラクトの濃度では、表面上で平均間隔がおおよそ２μｍに制限されており、ダブルテザーの形成はめったにない出来事であるだろう。表面にコンストラクトをテザーでつないだ後に、流路は２０μＬの実験用緩衝液で洗浄され、次いで１５ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジンビーズ（Invitrogen社、M-270）でインキュベートする。それぞれの実験のために、ビーズは、それらを試料チャンバーにロードされる前に、実験用緩衝液にて過度に洗浄され得る。スピン力システムのモジュールに試料チャンバーをロードする前に、溶液の入り口および出口の穴は真空グリースで封をされている。トリス実験用緩衝液はｐＨ７．５で１０ｍＭ  トリス、３０ｍＭ  ＮａＣｌからなっており、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含んでいても含んでいなくてもよい。
【００６７】
過伸展実験のために、テザーをつけられた表面は、ジゴキシゲニン−アンチ−ジゴキシゲニンとビオチン−ストレプトアビジンに置き換えることにより、増強される、言い換えるとビオチン−ストレプトアビジン相互作用はそれぞれのテザーを固定するために使用された。ニトロセルロース表面は、１ｍｇ／１ｍｌのロシュブロッキング試薬を含む、ＰＢＳ溶液中の１ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンで１２時間インキュベートし、次に表面安定化溶液（ＰＢＳ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍｌロシュブロッキング試薬）で１時間インキュベートすることにより、機能を持つ。チャネルは、ストレプトアビジンに覆われたビーズがロードされる前に、ＰＢＳで洗い流され、５ｐＭのデュアルビオチンλＤＮＡで１５分間インキュベートされる。そのような状態の下で、表面上のストレプトアビジンの密度はビオチン標識λＤＮＡの１つの端のみが表面に結合するために十分に薄く、その他のビオチン化された端はストレプトアビジンに覆われたビーズと結合するために自由になったままでいる。
【００６８】
偏角測定の方法
一側面によると、発明者は、試料が結びついている表面のＸ−Ｙ平面（たとえば、カバーガラスまたは他のカバーガラス）上のテザー長の変化を算出することで、スピン力システムにおいてナノメーターレベルのテザーの伸長を測定する方法を開発し、これらの測定は比較的単純に、コンピューター的に効率的な手法を可能にしている。前記方法は遠心分離機による加力の方向が、遠心分離バケツの、またはバケツのない遠心分離器においては、試料を保持する遠心分離器中の保持器（たとえば、試験管または他の試料保持コンテナが差し込まれる穴）の角度を機械的に制限することにより制御されることができるという事実を活用する。前記方法において、遠心力および撮像軸の方向は意図的にずれている。
【００６９】
撮像軸は光源からの光が通過する方向に沿った方向を向きを合わせられて、またはそうでなければ試料に入射している。例えば、光学部品および試料が一直線上にある場合に、撮像軸はその線に沿った軸として定義される。光学部品と試料が一直線上になく、デバイス（たとえば、鏡）が光の向きを変えるように使用されている場合、撮像軸は光源からの光が試料に当たる方向に沿って向きを合わせられている。図４−６の態様のＵ字の外形においては、撮像軸は光源、試料、および対物レンズが沿って並んでいる線である。
【００７０】
いくつかの態様において、スピン力システムは力の方向および撮像軸が、粒子の横方向の動き、すなわち粒子の動きは撮像軸に垂直に発生している、をトラッキングすることによってテザー伸長の長さを追跡するために、意図的にずらされるように配置されている。力の方向および撮像軸が並んでいる場合、粒子は撮像軸に平行である方向にのみ動く。そのような状況において、テザー長の変化は追跡することが困難である。なぜなら検出器の見ているものは大きさが大きくなっていくまたは小さくなっていくテザーのついた粒子（たとえば、ビーズ）であるからである。
【００７１】
力の向きと撮像軸が意図的に並んでいない場合、検出器は粒子の横方向の運動を見ている。この情報はテザー伸長の長さの決定に使用され得る。
【００７２】
図９にて説明された形状に基づくと、分子テザーの伸長は、テザーのついた粒子２４０（たとえば、ビーズ）の試料が結びついている表面（たとえば、カバーガラスまたは他のカバーガラス）に平行な動きをトラッキングすることにより測定され得る。具体的に言うと、テザー伸長の変化は、ビーズの側方変位ΔＬｏｂｓとして検出器に現れるであろう。力に平行な向きにおけるテザー伸長の実際の変化ΔＬは、次の通り回転軸１０２に対するバケツの角度θに基づいて計算され得る。
【数３】
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【００７３】
この方法を使用してはかられ得る最小テザー長は、実験に使用されるビーズの大きさおよび遠心分離バケツの回転軸に対する角度両方に依存している。テザー長が、ビーズが表面８から離れることができるくらい十分に長くはない場合、ビーズは表面８に直接接触してしまい、不正確な測定という結果になるであろう。ビーズ半径Ｒｂｅａｄおよびバケツ角度θにおける最小テザー長Ｌｍｍは次式により与えられる。
【数４】
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【００７４】
図１１は、バケツ角度θの関数として計算される、側方変位からテザー伸長を測ることを要求された、ビーズ半径によりスケーリングされた、最小テザー長Ｌｍｉｎを示している。
回転軸に対するバケツの角度θは、使用される遠心分離機の種類に依存して、異なった手法においても決定されることができる。固定角ローター遠心分離機または垂直ローター遠心分離機などの単一の固定された角度を有する遠因分離機では、前記角度θは知られており、変わることがない。スイングバケツローターなどの回転速度を変えることに伴って角度を変える遠心分離機では、測定は異なる角速度に関連付けられたバケツの角度θを決定する必要があるだろう。
【００７５】
図１２で説明された、１つの模範的な方法において、マーカーまたは他のマーカーデバイスがバケツの底に取り付けられてもよい。前記マーカーは遠心分離機がスピンするにつれて、バケツの底の高さを壁にマークする。転心４９からマーク位置５０までの垂直距離ａおよび転心４９からマーク位置５０までの水平距離ｂが測られる。これらの知られた距離より、回転軸に対するバケツの角度は次式により与えられる。
【数５】
2019512722.tif 000011
【００７６】
図１２の配置を使用した１つの実験において、角度測定の不確かさは距離の測定の１ｍｍの誤差推定量に基づいている。３００ＲＰＭの角速度で、バケツが（８１．４±０．８）°の角度にスイングした。より高スピードの１８００ＲＰＭでは、角度は２．３％増加した。角速度をさらに増加しても測定誤差を超えて角度は増加しなかった。
図１０は、この方法を使用した１つの例からの、２０°から８５°の間のバケツ角度におけるテザー伸長のトラッキング解像度を示している。
【００７７】
偏角測定の方法を使用して、テザー長の解像度は、〜２ｎｍの側方のトラッキング解像度に基づいた、約２．５ｎｍ（２０°）から１２ｎｍ（８０°）の範囲の、バケツ／試料保持器の角度に基づいて、「調整」され得る。この偏角測定の方法を使用する１つの例から得たデータは図１３中に示されている。ドリフト補正された５ｕｍのシリカビーズの、２０００ＲＰＭの遠心分離スピンにおいて記録された時間関数としての、ＸおよびＹの位置は、ジグザグ線として示されている。１２の固定された参照ビーズの平均位置に基づいた、時間関数としてのＸおよびＹの位置のドリフトは、より滑らかな傾向の曲線として示されている。右のパネルは、正規分布に適合する位置のヒストグラムを示している。ｘおよびｙの位置の適合の標準偏差はともに〜２ｎｍである。ここに掲載された標準偏差が粒子のトラッキング解像度を表している一方、テザー長が測られ得る全体の正確性もまたこれらのビーズの固有の熱揺動に依存している。
【００７８】
この偏角測定の方法を確証および論証するために、１００以上の分子のＤＮＡ力−伸長は、１分未満の期間にわたって同時に測定され、標準的なミミズ鎖モデルにそれぞれ適合していた。もっともありそうな輪郭長および持続長は８．２±０．２μｍおよび４６±１ｎｍであり、おのおの、期待値２４と一致していた。加えて、多重化されたラムダＤＮＡの過伸展測定は、６３．５±１．７ｐＮ（平均±標準偏差）の過伸展力を得られ、前のこれらの状態２４の測定と一致して、行われた。
【００７９】
図１６は、スピン力システムによる並列ＤＮＡの力−伸長および過伸展測定を示している。図１６のパネルＡは、２０°に制限された遠心分離バケツを使用した１１３のＤＮＡテザーを伴う単一の試料から得た、半分のλＤＮＡ（２４ｋｂｐ）の力−伸長のデータを表現している。上段のパネルは、それぞれのテザー（ｎ＝１１３）において行われた、ミミズ鎖モデルの適合から得られた持続長と輪郭長の散布図を示している。ｘおよびｙ軸上のモデルの持続長および輪郭長を算出するヒストグラムは、それぞれ、期待値を示す直線で示されている。下段のパネルは、持続長および輪郭長でフィルターされた単一テザーのついたＤＮＡデータ（ｎ＝３０）の、力−伸長曲線を示す。範囲は、持続長および輪郭長をそれぞれ４３−４８ｎｍおよび７．８−８．６μｍの範囲でフィルターすることで得られたヒストグラムのピーク（片側の１瓶幅）から選択された。重ねられた曲線は、期待された力−伸長曲線を表す。
【００８０】
図１６のパネルＢはスピン力システムで測定された多重化されたＤＮＡ過伸展を表現している。上段のパネルは過伸展遷移付近での代表的な力―伸長曲線を示している。過伸展力は、２つの過伸展遷移力の中間点として抽出され、垂直一点鎖線の間の垂直線として示されている。下段のパネルは平均および標準偏差が６３．５±１．７ｐＮである単一試料（ｎ＝２９）から測られた過伸展力のヒストグラムを示している。
【００８１】
信頼できることを証明している単一分子データのためのナノスイッチ
一側面によると、核酸ナノスイッチなどのナノスイッチがスピン力システムに使用される。発明者は、ＤＮＡナノスイッチなどの、核酸ナノスイッチのスピン力システムへの使用が、強固で繰り返すことのできる破断実験を可能にする助けになり得ると認識している。いくつかの態様において、これらの分子スイッチは、図１４のパネルＡに見られるように、興味ある分子が相互作用する場合にループ状構造を、しない場合に直線構造を採用するように設計されている。結果として、ナノスイッチは、図１７のパネルＢに見られるように、破断事象に他と異なる「署名」（すなわち、テザー長の増加）を提供している。
【００８２】
１例において、ＤＮＡ脱ジッピング実験は２９ｂｐのＤＮＡの相互作用で行われ、ナノスイッチの非ループ状「署名」は、複数のテザーおよび非特異的相互作用から確かな単一分子を明確に同定し、区別するために使用される。
図１４のパネルＡはループ状態および非ループ状態におけるナノスイッチの略図を表現している。２つの相補的なオリゴがループ状ナノスイッチを形成するようにハイブリダイズする。力は２つの相補的な鎖を脱ジップさせることができ、結果としてテザー長の測定をもたらし、ＤＮＡの脱ジッピングの署名を提供する。
【００８３】
図１４のパネルＢはループ状態および非ループ状態を示すナノスイッチを介して表面にテザー付けされているビーズの像を表現している。スケールバーは１μｍ長である。
図１４のパネルＣは破断力測定の１つの例を表現している。３８１のテザーが、破断力を収集するためのナノスイッチ遷移の署名を同定された一方、ビーズの脱離および不適切な遷移に相当する残る６７３の遷移は、省かれた。
【００８４】
図１４のパネルＤは、２つの異なる緩衝液の状態下で測定された２９ｂｐｄｓＤＮＡの脱ジッピング力のヒストグラムを表現している。脱ジッピング力測定は、３０秒の遠心分離稼働時間下において収集されたそれぞれの状態での何百の破断の統計データの、マグネシウムイオンの存在および非存在によって実行された。マグネシウムは、マグネシウムの添加とともに脱ジッピング力の平均（±標準偏差）が１０．１±０．９ｐＮから１４．６±１．１ｐＮまでの増加とあわせて、二重化の安定に見受けられた
【００８５】
温度制御が可能な状態
発明者は異なる制御された温度において実験を実施することが望ましくあり得ると認識している。発明者はまた、多くの標準的な遠心分離機が、温度制御および／または低温（たとえば、４℃）または温（たとえば、３７℃）室への移行の軽便さを組み込んでいるとも認識している。発明者はこれらの種類の遠心分離機をスピン力システムとして使用することが、温度制御を伴った実験を可能にすることを認識している。
【００８６】
１例として、ＤＮＡ脱ジッピング実験は、４、１３、２３、および３７℃の４つの温度の温度制御を組み込んだ遠心分離機を有するスピン力システムを使用して行われた。図１４のパネルＥは、差し込みとして示された破断力のヒストグラムに伴う、ＰＢＳ緩衝液（合計ｎ＝３０６）における。異なる温度下の２９ｂｐｄｓＤＮＡの平均脱ジッピング力を表現している。理論上の線は、以前に記載した熱力学モデル２９を使用して計算される。
実験中の試料温度のリアルタイム測定は遠心分離バケツ内に埋め込まれた無線の熱電対によってされた。温度低下に伴う脱ジッピング力の増加が観察された。
【００８７】
繰り返される呼びかけおよび超解像度力分光法
スピン力システムおよびナノスイッチは、単一分子（または単一相互作用）レベルで、分子（または相互作用）の群を、繰り返して呼びかけるために使われ得る。１例において、図１５は繰り返された単一分子ペアの破断力測定に関連したグラフを表現している。
図１５のパネルＡは、加力の繰り返しサイクルのプロトコルを表現しており、それぞれのサイクルは、破断およびナノスイッチの非ループ状化を誘起している直線力傾斜（linear force ramp）、続く分子ペアに結合しなおさせる力の低い再会合期間からなる。
【００８８】
図１５のパネルＢは、１２サイクルの加力を伴う、合計５３８分子ペアから収集された１８６３の断絶事象のＤＮＡ脱ジッピング力のヒストグラムを表現している。最も暗い部分から最も明るい部分への勾配は、それぞれのサイクルから収集された統計データに相当する。このデータは、このアプローチにより蓄積することのできた膨大な量の単一分子力のデータを論証している。
【００８９】
ナノスイッチは、繰り返された測定から、試料中のそれぞれの分子の独特な特性を特徴づけることを可能にし、試料中のそれぞれの分子からの破断力のヒストグラムを決定することにより論証されるように、単一分子レベルでの不均一性を解明する。図１５のパネルＣは、個々の分子ペアより生成された模範的な破断力のヒストグラムを表現している。計算された破断力の平均はグラフの下部に示される。
【００９０】
さらに、同じ分子ペアの複数の引っ張りからのデータの平均をとることにより、それぞれの分子の独特な特徴を失うことなく力の広がりを減らされる。単群からのデータに適用される場合、この分子毎（相互作用毎）の力の平均は、生の全データのヒストグラムと比べて、予期された絞り込みを伴う、超解像度のヒストグラムを生成する。図１５のパネルＤは、それぞれの７サイクルの力の破断を伴う２７分子からの破断力のヒストグラム（上）および分子毎に平均化された破断力のヒストグラム（下）を組み合わせて表現しており、幅を減らして示している。
【００９１】
組合わされた２群のＤＮＡシッパー（より高い脱ジッピング力を伴う別のＧ−Ｃリッチジッパーを誘導している）からの統計データに適用すると、分子毎の平均から生成された超解像度のヒストグラムは、熱ノイズおよび機器ノイズに起因する本質的な力の広がりのため、生のヒストグラムからは容易に解決できない、２群を分割することができる。図１５のパネルＥは、２群のＤＮＡ脱ジッピング実験のヒストグラム（上）、および混合データから２つの分割した群へと取り戻した分子毎に平均化した超解像度ヒストグラム（下）を合わせて表現している。
【００９２】
複数の破断事象は、同じ試料を複数回繰り返しスピンすることにより、セット中のそれぞれの分子のために収集され得る。図１５パネルＢ中で呈されているデータについては、試料が、１ｐＮ／ｓから最大２２ｐＮ／ｓの力の荷重レートの効率的な力でスピンアップされた。次いで前記速度を、それぞれの分子ペアの間で結びなおさせるために、０ｒｐｍに向けて、約１時間かけて傾斜（ramped）させた。ビーズは、それぞれのサイクルに共通した基準のビーズのセットに応じた自身の位置によりサイクル毎に同定された。２群の分子の測定のために、１つは４８％ＧＣ含有の（ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＴＴＴＡＡＣＣＣＴＡＧ、配列番号＿）および１つが３１％ＧＣ含有の（ＣＴＣＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＴＣＡＡＴＡＴＣＴ、配列番号＿）、２つの異なるＤＮＡナノスイッチ脱ジッピング構成物が作られた。
【００９３】
ナノスイッチ構成方法の例
いくつかの態様において、ＤＮＡナノスイッチなどの、ループ状ナノスイッチは次の模範的な過程にしたがって作られ得る。環状Ｍ１３ｍｐ１８１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（New England Biolabs社、N4040S）は、ＢｔｓＣＩ酵素（New England Biolab社、R0647S）のための２本鎖制限サイトをつくる４０ｂｐのオリゴをハイブリダイズさせることにより直線化された。その後、相補的なオリゴのセット（Integrated DNA Technologies社）は、直線化されたｓｓＤＮＡにハイブリダイズされた。機能を持たされたオリゴ（ビオチン化およびジゴキシゲニン修飾）は、それぞれｓｓＤＮＡの３‘末端および５’末端にハイブリダイズされた。前記ハイブリダイゼーションは、１５ｎＭの直線化されたｓｓＤＮＡおよびサーモサイクラーによる９０から２０℃までの温度傾斜（−１℃／分）を伴った１ｘNEBuffer１０モル過剰の相補的なオリゴにより実行された。この最初のハイブリダイゼーションの後に、最終のループ状構成物を形成する、２つの部分的に相補的なオリゴによって架橋された、２つの特異的な１本鎖領域が残った。ループを形成する相補的な架橋オリゴの配列は、ＣＴＣＡＡＡＴＡＴＣＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＴＣＡＡＴＡＴＣＴ、配列番号＿であった。この2回目のハイブリダイゼーション段階は、最終構成物濃度が２５０ｐＭになるように、１ｘNEbuffer2における１．２５モル過剰の架橋オリゴを室温１時間で実行された。
【００９４】
構成物のループ状態は、図１７に見られるように、ゲルシフトアッセイ、単分子光学トラップ測定、およびＡＦＭ撮像を使用して確証された。図１７は、ＤＮＡ脱ジッピングナノスイッチ構成物の検証に関連した像を表現している。図１７のパネルＡは、ループ形成を示しているＤＮＡ脱ジッピングナノスイッチのゲル電気泳動を表現している。レーンｉは１ｋｂｐの自在ラダー（Invitrogen社、10511-012）であり、レーンｉｉは２つの相補的なオリゴがループ状に閉鎖していない直線構成物であり、およびレーンｉｉｉは２つの相補的なオリゴがループ状ナノスイッチを形成し得る、ナノスイッチ構成物である。ループ状ＤＮＡは直線状構成物に比べてよりゆっくりとゲルの中を移行していき、結果として、以前に観察された３６，３７ように明白により高分子が分離したバンドとなる。
【００９５】
図１７のパネルＢは、光ピンセットを使用して測られた、ＤＮＡ脱ジッピングナノスイッチ構成物の力−伸長曲線を表現している。左の線はループ状構成物に相当しており、右の線は非ループ状構成物に相当している。〜１２ｐＮより上の力がかかる場合に、脱ジップされてループ状を形成した２９ｂｐｄｓＤＮＡが、テザー長をＭ１３ｄｓＤＮＡの全長まで増加させている。
【００９６】
図１７のパネルＣは、ＤＮＡ脱ジッピングナノスイッチ構成物のＡＦＭの像を表現している。矢印はハイブリダイズされたＤＮＡジッパーの推定される位置を指し示している。スケールバーの長さは１００ｎｍである。
光学トラップ測定において、力は、レーザートラップされたストレプトアビジンおよびアンチ−ジゴキシゲニンの機能を持たされたシリカビーズとの間のテザーを介して、ループ状ＤＮＡ構成物にかけられた。
【００９７】
スピン力システムにおけるＤＮＡの過伸展測定のために、ラムダＤＮＡの両端は、ストレプトアビジンの機能を持たされカバーガラスおよびビーズの表面への強い固定を提供するための、ビオチンの機能を持たされた。はじめに、２０μＬのラムダＤＮＡ（０．２８ｕｇ／ｍｌ、Roche社、10745782001）が、ハイブリダイズしたオーバーハングを取り除くために６５℃で２０分間インキュベートされた。その後、それぞれ最終濃度が１００μＭのＢｉｏｔｉｎ−１４−ｄＡＴＰ、Ｂｉｏｔｉｎ−１４−ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰからなるヌクレオチド混合物が０．２５Ｕ／ｍｌのKlenow Fragment（New England Biolabs社、M0212S）を伴うラムダＤＮＡ溶液に加えられた。この混合物は３７℃で１時間インキュベートされた。両端がビオチンのラムダＤＮＡは、過剰なヌクレオチドおよび酵素から、Qiagen社のPCR Purification Kitを使用して精製された。
【００９８】
並列力―伸長測定のために、半分の長さのラムダＤＮＡがジゴキシゲニンおよびビオチンの機能を持たされ作られた。はじめに、ビオチン標識された全長のラムダＤＮＡ構成物が、Xbal制限酵素（New England Biolab社、R0145S）を使用して中央付近で切られた。その結果生じたオーバーハングが、片側がジゴキシゲニンで、他方がビオチンで標識されたヘテロ二機能性の２４ｋｂｐ構成物を生じるために、ジゴキシゲニンとともに機能を持たされた。
【００９９】
核酸ナノスイッチ構成物を伴う偏角測定の方法
ＤＮＡナノスイッチなどの核酸ナノスイッチ構成物が、上で検討した角度の測定方法に使用される場合、ループの開放署名はビーズのＸおよびＹの位置のトラッキングによって同定され得る。撮像軸および遠心力の方向がある角度に伴い、遠心力の構成要素が、図１８のパネルＡに見られるように、Ｘ−Ｙ平面上に方向づけられる。遠心分離機の回転速度が増加するにつれ、ループ状ＤＮＡのテザーが連続的に広がっていく。ループの開放は、拡張の断続的な変化として同定され得る。図１８のパネルＡは、ループ開放遷移の前（上）および後（下）のビーズの像を表現している。単一ＤＮＡナノスイッチとともに表面にテザーづけされているビーズは、明確な長さΔＬｏｂｓおよび方向φとともに断続的な位置の変化を経るであろう。
【０１００】
１つの模範的な例において、撮られた動画はそれぞれ約１０００のビーズを含んでいる。これらのビーズを追跡するために、それらははじめにMatlabのimfindcircles機能を使用して同定された。それぞれのビーズのテンプレートとなる像が蓄えられた。その次のフレーム内にあるビーズを同定するために、テンプレート像は、最大相関位置を見つけるためにＸ−Ｙ平面内に走査された。はじめに、像は前のフレームからビーズの位置を中心においてＸ方向に２５ピクセルを超える探索範囲を走査された。二次放物線は次いで位置の機能としての相関率にあわせられた。最大相関位置は次いで新しいＸの位置を中心におき、同じ手順がＹ方向になされた。それぞれの実験の過程中に、Ｘ−Ｙ平面においていくつかドリフトがあった。これはフレーム毎に追跡されているすべてのビーズについて、ＸおよびＹにおける中央値の変化を取ることにより訂正された。このドリフトの訂正はループ状から非ループ状への遷移の同定に十分であり得る。
【０１０１】
図１８のパネルＢは、全方向に検出された全輪郭長の変化の散布図を表現している。勾配はデータ密度を表している。閉ざされた領域内での遷移のみが、ナノスイッチ遷移として受け入れられる。３つの異なる種類の遷移のための遷移力のヒストグラム：表面から去るビーズ（「ビーズの切り離し」）、正確な方向と大きさを伴う断続的な遷移を表示しているビーズ（「ナノスイッチ遷移」）およびそれらを伴わないもの（「不完全な遷移」）が、はめ込まれる。図１８のパネルＣは対称比およびすべての追跡されたビーズの側方機能に基づいた二乗平均平方根変位の散布図を、データ密度を勾配で表し、表現している。上塗りされた黒いデータポイントは確証されたナノスイッチ遷移を経たテザー付けされたビーズである。
【０１０２】
図１８のパネルＢおよびＣに示されたように、遷移は、正しい大きさおよび方向両方の伸長における断続的な変化を含むそれらを除いたすべてのビーズの軌道を除去することにより同定された。これは、非特異的相互作用またはビーズおよび表面の間の複数の結合の形成によりもたらされるであろう偽の遷移を取り除いた。この自動フィルタリング手順に従い、遷移事象は、順不同に、位置の断続的な変化として現れる粒子トラッキング人工物（たとえば、粒子の誤標識、重複したビーズ、など）により発生するであろう、誤った遷移のいかなる残存も却下するために、視覚的に詳しく調べられた。
【０１０３】
ＤＮＡ脱ジッピング実験のために、時間関数としての遷移の数が、次のとおり、力の関数としての遷移の数に変換された。遠心分離機の回転速度はそれぞれの動画中、コンピューターでの通信および制御を可能にする、WinMessソフトウェア（Thermo Fisher Scientific, R&D社より提供された）を使用して記録された。次いで回転速度は次式を使用して時間関数としての力（Ｆ）へと変換された。
【数６】
2019512722.tif 000012
【０１０４】
ここでＲおよびωは、それぞれ回転半径および回転速度である。溶液中の有効なビーズの質量（ｍｂｅａｄ）を決定するために、Invitrogen社のM-270ビーズ濃度が、水性のポリタングステン酸ナトリウム溶液（Sigma-Aldrich社、71913）を使用した浮沈分析によりはかられた。１．６１±０．０２ｇ／ｃｍ３の密度が得られ、その値は製造業者（Life Technologies社）に報告された１．６ｇ／ｃｍ３という値により確認された。製造業者は、我々の特異的なロットのビーズ半径が＜１．６％ＣＶの平均２．８０ｕｍ（ロット番号１４４３１５６００）であることもまた提供した。ＤＮＡ力−伸長および過伸展実験に使用されたシリカビーズの密度はポリタングステン酸ナトリウム溶液を使用して、同様にはかられ、１．５０±０．０３ｇ／ｃｍ３という密度を得られた。シリカビーズの直径は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用してはかられ、平均および標準偏差が４２．７±０．１６ｕｍであると得られた。
【０１０５】
図１８は、上記の、力の向きおよび撮像軸が意図的に一列に並んでいない、偏角測定の方法の影響下にある、ＤＮＡナノスイッチなどの核酸ナノスイッチ構成物の略図を表現している。たとえば、遠心分離バケツは回転軸に対して斜角であり、試料が結びついている表面は回転軸に対して斜角であり、検出器は粒子の側方の動きを見ている。遠心分離バケツは回転軸に対してθの角度であり、したがって遠心力はＸ−Ｙ平面で定義されている試料表面２４０ｂに垂直平行両方の構成要素を有する。結合が破断する場合に、前記ナノスイッチは長さΔＬの変化を経験し、ループ状（左）から非ループ状（右）に進行する。これはＸ−Ｙ平面上でΔＬｏｂｓ＝ΔＬｃｏｓθと計算された長さの変化を測定することにより同定される。
【０１０６】
図１９のグラフは、力およびスピン力システムの荷重レートの範囲を表現しており、システムが生体関連動的外力の範囲を有していることを示している。図１９のパネルＡは、卓上遠心分離機を使用したスピン力システムによる、４つの異なる種類のビーズ（１および２．８ｕｍのDynabeads（登録商標）、および５および１０ｕｍのシリカビーズ）を使用して算出した回転速度の関数としての力のグラフを表現している。このビーズのセットを使用することで、スピン力システムは８等級の大きさに及ぶ範囲の力をかけることが可能になる（１０−４から１０４ｐＮ）。
【０１０７】
図１９のパネルＢは、Thermo Scientific社のHeraeus X1R Centrifugeを使用して測定されたスピン力システムの、もっとも速い、およびもっともゆっくりとした力―荷重レートを表現している。左の線において示されている、３１７ｇ／ｓというもっとも速い傾斜レートは、大きな１０ｕｍのシリカビーズを使用した、１３００ｐＮ／ｓの荷重レートに相当し得る。右の線において示されている、０．３７３ｇ／ｓというもっともゆっくりとした傾斜レートは、小さな１．０ｕｍのDynabead（登録商標）（Invitrogen社）を使用した、１．１５ｆＮ／ｓの荷重レートに相当し得る。
【０１０８】
ナノスイッチ一般
本開示のナノスイッチは、１以上、および典型的には２以上の結合パートナーを含む足場または主鎖核酸を最小限含んでいる。足場核酸は、結合パートナーの会合（すなわち、結合）および解離（すなわち、結合解除）が発生し、検出され、他の事象と識別することが十分できるのであればどのような長さであってもよい。いくつかの例において、足場核酸は少なくとも１０００ヌクレオチドの長さであり、２００００ヌクレオチドの長さと同じくらい長くてもよい（またはさらに長くてもよい）。足場核酸は、それゆえに１０００−２００００ヌクレオチドの長さ、２０００−１５０００ヌクレオチドの長さ、５０００−１２０００ヌクレオチドの長さ、またはどのような間の範囲にあってもよい。足場は天然に発生する核酸（たとえば、Ｍ１３ｍｐ１８などのＭ１３足場）であってもよい。Ｍ１３足場は、Rothemund 2006 Nature 440:297-302によって開示されており、その教示は参照により本明細書に組み込まれている。足場核酸は、他の態様にある、ラムダＤＮＡであってもよい。足場核酸はまた、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）にて生じた核酸、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）にて生じた核酸など、非天然に発生する核酸であってもよい。
【０１０９】
いくつかの態様において、結合パートナーは、検出可能なループおよびしたがって長さの変化を生み出すために、足場核酸に沿って配置されている。これらは、約４０−１００塩基対、または約１００−１０００塩基対、または約５００−５０００塩基対のループを包含してもよい。足場は、部分的にまたは全体が１本鎖または部分的または全体が２本鎖であってもよい。複合体は変化する長さの２本鎖領域を含んでもよい。
【０１１０】
足場核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ類似体、ＲＮＡ類似体またはそれらの組み合わせであってもよい。いくつかの例において、結合パートナーは、足場とのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを介して、足場核酸に共役しており、その中においてそのようなオリゴヌクレオチドは自身で結合パートナーと共役している。いくつかの例において、足場核酸はＤＮＡである。
【０１１１】
足場核酸は複数のオリゴヌクレオチドを包含する１つ、または２つ以上、とハイブリダイズされる。複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、足場核酸と配列特異的および非重複の仕方で、ハイブリダイズしてもよい（すなわち、それぞれのオリゴヌクレオチドが足場中の他と異なる配列にハイブリダイズする）。
特定の足場とハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドの数は適用によって変化してもよい。それに応じて、３つ、４つ、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを包含する、２以上のオリゴヌクレオチドが足場にハイブリダイズしてもよい。
【０１１２】
いくつかの例において、足場核酸にハイブリダイズしているいくつかのオリゴヌクレオチドは修飾されないであろう。未修飾のオリゴヌクレオチドには、試験されている結合パートナー（たとえば、抗体または抗原）などの結合パートナーと連接していないオリゴヌクレオチドを包含する。他の例において、足場にハイブリダイズされた、いくつかまたはすべてのオリゴヌクレオチドは修飾されていてもよい。修飾されたオリゴヌクレオチドには、試験されている結合パートナー（たとえば、受容体および／またはそのリガンド、抗体および／またはその抗原など）と連接したそれらを包含してもよい。修飾されたオリゴヌクレオチドは、修飾され、およびしたがって例えばビーズであるがそれに限定されない、固体支持体にナノスイッチを固定するために使用されるそれらを包含してもよい。ビオチン化オリゴヌクレオチドを包含しているそのような修飾されたオリゴヌクレオチド。修飾されたオリゴヌクレオチドは、これらのオリゴヌクレオチドは用途に応じて多様な結合パートナーと連接することにより修飾されるであろうため、「可変」オリゴヌクレオチドとして、本明細書に参照されてもよい。
【０１１３】
修飾されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた足場を含む領域は、「可変」領域として、本明細書に参照されてもよく、残りの足場の領域は「固定」領域として、参照されてもよい。
【０１１４】
結合パートナーの間隔は、およびしたがっていくつかの修飾された（または可変）オリゴヌクレオチドの例において、足場核酸の長さに沿って、変化してもよい。ナノスイッチは、いくつかの態様において、３つまたは４つの結合パートナーを、したがっていくつかの態様において、可変領域（たとえば、３つまたは４つの修飾がされたオリゴヌクレオチド）含んでもよい。１つの例として、核酸ナノスイッチは、２つの内側に修飾されたオリゴヌクレオチドと同じように片側または両側末端に修飾されたオリゴヌクレオチドを含んでもよい。ナノスイッチの末端に修飾されたオリゴヌクレオチドは、ビーズなどの固体支持体にナノスイッチを固定するために使用されてもよい。ナノスイッチの内側の修飾されたオリゴヌクレオチドは、個々の結合ペアの一員（すなわち、ナノスイッチが、それぞれ異なるオリゴヌクレオチドのペアの一員とともに結合ペアを含むように２個のオリゴヌクレオチドがそれぞれ結合ペアの一員と連接されている。）と連接されてもよい。内側を修飾されたオリゴヌクレオチドは対称的にまたは準対称的に足場の中央周辺に置かれてもよい。言い換えると、それらは足場の中央から等距離に置かれてもよい。
【０１１５】
いくつかの態様において、発明者はそれぞれ同じ結合ペアを含む複数のナノスイッチの使用について熟考する。複数のナノスイッチ間の違いは結合ペアの一員（すなわち、結合パートナー）間の距離である。例えば、複数は、結合ペアの一員間の距離が３００塩基対、２００塩基対、１５０塩基対、１００塩基対、８０塩基対、６０塩基対および４０塩基対であるナノスイッチを含む。次いでナノスイッチは結合パートナー間の相互作用に基づいたループ構造を形成する自身の能力について分析される。結合パートナー間の距離が減少するにつれて、より大きな内力が結合間相互作用に発生することが予期される。それに応じて、結合間相互作用は、内力が大きくなりすぎて、複合体が、よりエネルギー的に好都合な直線状態を呈するまで、続くであろう。２つの結合パートナー間での結合間相互作用の動力学および力は、このアプローチを使用して分析され得る。
【０１１６】
さらに重要なことには、結合パートナー間の距離は、ナノスイッチと連接している結合パートナー間の会合および解離を識別するために使用されるであろう。これは、結合パートナーが互いに会合する場合に、ループが結合パートナー間に存在する核酸配列を含み形成されるだろうためである。結合パートナーが互いに会合しない（すなわち、結合解除された）場合においては、次いでループは形成されず、複合体長は異なる（すなわち、より長くなっている）。ナノスイッチ長は、例えば、本明細書中に記載された様な、張力のもとでの直接的な測定により検出されてもよい。張力の下で測定した場合、結合パートナーの会合から解離への遷移はナノスイッチの長さの増加により指し示される。
【０１１７】
異なる大きさのループ（およびしたがって異なる大きさの長さの変化）を識別する能力は、ナノスイッチの１つまたはサブセット（すべて同じ大きさのループを有している）が、例えば試料中の特定の分析物と結合することを包含する、特定の分子間相互作用の特異的である単一の分析評価における複数のナノスイッチの使用を容易にする。これらの面において、ナノスイッチに結合された結合パートナーは、お互いには結合せずに、むしろ分析物に結合する。それに応じて、分析物の存在下において、ループが形成される一方、分析物の不在化においては、ループは形成されない。ループ状の（または閉鎖、または結合された）ナノスイッチは直線の（または開放、または結合されていない）ナノスイッチよりも短い長さを有する。加えて、異なる大きさのループは（およびしたがって長さの変わっている）、互いに識別され、結果として複数の分析物（それぞれ特定の大きさのループを有したナノスイッチにより検出される）の存在（または非存在）が、多重化した分析評価において同時に決定され得る。そのような方法が、単一のまたは複数の分析物の存在を検出するために使用されてもよく、診断検査の基礎を形成してもよい。
【０１１８】
いくつかの核酸ナノスイッチの変種が本明細書に記載されていることが理解されるべきである。典型的に、これらの変種はすべて共通して２以上の結合パートナーを有する核酸ナノスイッチを含む。結合パートナーは、互いに特異的に結合してもよく、またはそれらは共通の分析物における結合特異性を有していてもよい。前記方法のうちのいくつかは結合パートナーとの会合および／または解離に依拠している。ナノスイッチの長さの変化（たとえば、開放形態から閉鎖形態へと、または閉鎖形態から開放形態へと）は、結合間相互作用の動力学的および力についての情報を提供する。結合パートナーは非共有結合的または共有結合的に複合体に結合されていてもよい。典型的に、結合パートナーが互いに結合されていなくても、それらは関わらず核酸ナノスイッチに結合されている。
【０１１９】
したがって、最初の変種において、核酸ナノスイッチは互いに結合特異性を有している２つの結合パートナーを含む。結合パートナーは物理的に分離しており、したがって（互いに結合していない場合）ナノスイッチの主鎖の長さに沿って互いから離れて間隔をあけている。互いに結合している場合は、核酸ナノスイッチは、開放（または結合されていない）形態の核酸ナノスイッチと比較して、異なる長さを有するループ状（または閉鎖、または結合された）形態を呈する。
【０１２０】
別の変種において、核酸複合体は、共通の分析物に対する結合特異性を有する２つの結合パートナーを含む。結合パートナーは物理的に分離しており、したがって（共通の分析物に結合していない場合）互いに離れて間隔をあけている。共通の分析物に結合した場合は、核酸ナノスイッチは、開放（または結合されていない）形態の核酸ナノスイッチと比較して、異なる長さを有するループ状（または閉鎖、または結合された）形態を呈する。
【０１２１】
発明者はさらに、核のナノスイッチが２つより多い連接した結合パートナーを含んでもよいことを、熟考する。結合パートナーの数は２、３、４、５、またはそれ以上であってもよい。いくつかの態様において、結合パートナーのペアは、互いに結合特異性を有する（すなわち、共通の分析物に対する結合特異性よりむしろ）それぞれのペアとともに提供される。いくつかの態様において、２つの結合パートナーが残る結合パートナーと結合を競合するような、３つの結合パートナーが提供されてもよい。結合パートナーの位置または配置は変化してもよいし、連続的に置かれる結合ペア、または一か所に集まった結合ペア、またはそれらの組み合わせを包含してもよい。例として、Ａ１およびＡ２が結合ペア（たとえば、１番目および２番目の結合パートナー）、Ｂ１およびＢ２が結合ペア（たとえば、３番目および４番目の結合パートナー）と仮定すると、これらは５‘−Ａ１−Ａ２−Ｂ１−Ｂ２−３’と配列されてもよいし、５‘−Ａ１−Ｂ１−Ｂ２−Ａ２−３’と配列されてもよい。
【０１２２】
ナノスイッチは、例えば抗原または抗体などの結合パートナーを含む。核酸および結合パートナーの間の連接は、特定の適用に要求された結合の力による、共有結合的なものであっても、非共有結合的なものであってもよい。それらは、核酸内への反応基（または一部）の最初の組み込み、および次いでこの基（または一部）と興味ある結合パートナー、それらは修飾されていてもいなくてもよい、の反応により生成されてもよい。好適な反応基は当該技術分野において公知である。他の反応基と共有結合的に共役する（非逆行性の共役に至る）反応基の例は、これらに限定されないが、アミン基（例えば、アミドを生成するためにエステルと反応する）、カルボン酸、アミド、カルボニル（アルデヒド、ケトン、塩化アシル、カルボン酸、エステルおよびアミドなど）およびアルコールを包含する。当業者は他の「共有結合的な」反応基に精通しているだろう。他の分子に非共有結合的な共役する（逆行性共役に至る）反応基の例は、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン反応基（互いに反応する）、抗体（または抗体断片）反応基および抗原、受容体および受容体リガンド、アプタマーおよびアプタマーリガンド核酸およびその相補体、およびそのようなものを包含する。事実上いかなる反応基も、核酸ナノスイッチからの結合パートナーの解離を妨げることに十分な親和力のある相互作用に携わるものを提供している場合には、当該発明の方法を受けることができる。
【０１２３】
足場核酸および使用するのであればオリゴヌクレオチドは、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ、またはそれらのいくつかの組み合わせ、またはいくつかの類似体またはそれらに由来するものであってもよいことを理解すべきである。核酸という用語は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの類似体を包含する、ある長さのヌクレオチドの重合体の形を指す。いくつかの態様において、核酸は天然のＤＮＡであるだろうし、随意に自身の５‘末端および／または３’末端に修飾を含んでよい。
【０１２４】
いくつかの態様において、結合パートナーは、抗体（または抗体断片）および抗原、受容体およびリガンド、アプタマーおよびアプタマー受容体、核酸およびそれらの相補体、およびそのようなものと無制限に包含してもよい。このリストは、限定的または網羅的であることを意図されておらず、他の結合パートナーが存在していることは明白であり、本明細書に記載されたナノスイッチと併せて使用されてもよい。
【０１２５】
例
テザー付けされた粒子の動きの分析は、テザー付けされたビーズにおいて、破断力の測定に先駆けて実行された。それぞれのビーズの側方の変動が分析され、以前立証した方法３３にしたがい、ドリフト分が引かれた変位の二乗平均平方根および対称比を計算する。ここで、対称比は、特定位置の変位における共分散行列の固有値の最小および最大の比の平方根として計算された。それぞれのビーズの特定位置は１０Ｈｚの取得レートで１０秒間記録された。
【０１２６】
先の記載は単にそれらの実例となることを意図したものであり、他の態様、改変、および同等なものが、本明細書に添付された請求項に列挙された本開示の範囲内にあることを理解すべきである。さらに、上記のそれぞれの態様は一定の特色を含有しているが、本開示はこの点に限定されるものではない。したがって、１以上の上記または他の埋め込みデバイスの特色または使用の方法は、本開示および請求項が特定の態様に限定されないために、単独でまたはどのような好適な組み合わせにおいても採用されてもよい。
【０１２７】
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【図１Ａ−Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ−Ｅ】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１５Ｃ−Ｅ】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１７Ａ−Ｃ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１８Ｃ−Ｄ】
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【図１９Ａ−Ｂ】
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【国際調査報告】
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