(57)【要約】本発明は、抗菌効果と免疫細胞の活性調節機能とを共に有する新規なペプチド及びその用途に関するものである。本発明のペプチドは、兔疫細胞の活性を調節する一方、グラム陰性菌及びグラム陽性菌などの各種のバクテリアに対して抗菌活性も示しており、アトピー皮膚炎のような各種の免疫疾患の治療はもとより、病原性細菌の感染による疾患の治療に有用に用いられうる。
2019506362.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列で構成される新規な抗菌及び免疫調節ペプチド。
【請求項２】
Ｎ末端にオクタノイル基（ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＯ−）が付加された請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
Ｃ末端に１〜６個のアミノ酸が付加された請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
請求項１または２に記載のペプチドを有効成分として含む抗菌剤。
【請求項５】
請求項３に記載のペプチドを有効成分として含む抗菌剤。
【請求項６】
請求項１または２に記載のペプチドを有効成分として含むアトピー皮膚炎治療用薬学的組成物。
【請求項７】
請求項３に記載のペプチドを有効成分として含むアトピー皮膚炎治療用薬学的組成物。
【請求項８】
請求項１または２に記載のペプチドを有効成分として含むアトピー性皮膚改善用化粧料組成物。
【請求項９】
請求項３に記載のペプチドを有効成分として含むアトピー性皮膚改善用化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗菌ペプチド及びその用途に係り、さらに詳細には、抗菌効果と兔疫細胞の活性調節機能とを共に有する新規なペプチド及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗菌ペプチドは、自然界で発見されることもあり、合成ペプチドからその活性が見られることもある。このような抗菌ペプチドは、一般的なタンパク質に比べて、比較的短いアミノ酸配列（１０個余り〜１００個余り）からなっており、主に細胞膜に結合すれば、１）細胞膜にイオンチャネルを形成して、微生物のエネルギー生成を阻害するか、２）細胞膜に大きな穴を作るようになって、結果として細胞が死ぬ。このように物理的に微生物を破壊するので、微生物の細胞壁や細胞内高分子合成を阻害する既存の抗生剤とは異なって、微生物が抗菌ペプチドに対する耐性を有することは非常に難しく、現在までも耐性が生じないと報告された。現在まで知られた多くの抗菌ペプチドの間で配列上の類似性は、ほとんど表われないが、構造や活性の側面では、幾つかの一般的な傾向性を示す。代表的に、抗菌ペプチドは、リシン、アルギニン、ヒスチジンのような正電荷を帯びる部分と疎水性を有した部分とが存在するという点である。現在、抗菌ペプチドの作用機作に関連した仮説のうち、最も妥当性があるように提示されているＳｈａｉ−Ｍａｔｓｕｚａｋｉ−Ｈｕａｎｇ（ＳＭＨ）モデルでは、抗菌ペプチドの配列上の特徴と作用機転とを下記のように説明する：正電荷を帯びた新水性部分が負電荷を帯びたバクテリアの細胞膜と結合した後、細胞膜と結合されたペプチドの疎水性部分が細胞膜リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）の疎水性部分と相互作用して、細胞膜上に穴を形成して、細胞膜の透過度を変化させることによって、細胞を破砕する。好中球（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）及びモノサイトのような食細胞（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌ）から発現されるホルミルペプチド受容体族（ｆｏｒｍｙｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １：ＦＰＲ１）及びホルミルペプチド受容体（ｆｏｒｍｙｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２：ＦＰＲ２）は、病源菌感染に対する宿主の対抗（ｄｅｆｅｎｓｅ）で重要な役割を果たす（Ｍａｎｇｍｏｏｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｎｓ，３：８８４−８９９，２０１１）。前記受容体は、百日咳毒素−敏感性（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｔｏｘｉｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）Ｇｉタンパク質と結合すると知られている（Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２９０（２２）：１３６７８−９１，２０１５）。その中でも、ＦＰＲ２は、炎症性疾患で重要な役割を果たすと知られている。ＦＰＲ２の活性化は、ＧαｉサブユニットからＧβγサブユニットの分離を誘導し、βγサブユニットは、ホスホリパーゼＣβまたはホスホイノシタイド３−キナーゼの活性化を誘導する（Ｄｕｒｕ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．，１９５（２）：３９６−４０５，２０１５）。このような分子の活性化は、複雑な下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）信号伝逹を誘導して、走化性移動（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、脱顆粒化（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）、及びスーパーオキシド生成（ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）のような細胞反応を多様化して、生体内の免疫反応を調節する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、前記問題点を含んで多様な問題点を解決するためのものであって、より効率的な抗菌作用と免疫活性とを同時に有する新規なペプチドを提供することを目的とする。
【０００４】
本発明は、同時に、前記ペプチドを含む抗菌剤、アトピー皮膚炎治療用薬学的組成物、及びアトピー性皮膚改善用化粧料組成物など、前記ペプチドの多様な用途を提供することを目的とする。
【０００５】
しかし、このような課題は、例示的なものであって、これにより、本発明の範囲が限定されるものではない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一観点によれば、配列番号１のアミノ酸配列で構成される新規な抗菌及び免疫調節ペプチドが提供される。
【０００７】
本発明の他の一観点によれば、前記ペプチドを有効成分として含む抗菌剤が提供される。
【０００８】
本発明のさらに他の一観点によれば、前記ペプチドを有効成分として含むアトピー皮膚炎治療用薬学的組成物が提供される。
【０００９】
本発明のさらの他の一観点によれば、前記ペプチドを有効成分として含むアトピー性皮膚改善用化粧料組成物が提供される。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の一実施例による抗菌ペブタイは、グラム陽性菌及びグラム陰性菌など多様な細菌に対する非常に高い抗菌活性を有しているだけではなく、アトピー性皮膚炎に対する治療効果を有しているために、抗生剤はもとより、皮膚外用剤、またはアトピー性皮膚炎緩和用化粧料組成物など多様な用途として使われる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の一実施例による配列番号１で記載されるアミノ酸配列を有し、Ｎ末端にオクタノイル基が付加されたペプチドのグラム陽性菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）及びグラム陰性菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に対する抗菌活性を確認した結果を示すグラフである。
【図２】本発明の一実施例による配列番号１で記載されるアミノ酸配列を有するペプチドの兔疫細胞でＦＰＲ２依存的な細胞内カルシウムイオン増加活性を示したものであって、Ａは、ＲＢＬ細胞、ＲＢＬ細胞でＦＰＲ２とＦＰＲ１とをそれぞれ過発現させた細胞でペプチドのＦＬ比率を示すグラフであり、Ｂは、ＦＰＲ２が過発現されたＲＢＬ細胞で配列１ペプチドの濃度によるカルシウムイオン増加活性を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施例によるカプサイシン誘導アトピー皮膚炎モデルで、前記ペプチド処理時に、実験過程を図式化したものである。
【図４】本発明の一実施例による前記ペプチド処理時に、カプサイシン誘導アトピー皮膚炎モデルで真皮、真皮の適用部位で皮膚炎改善効果の確認結果を示すものであって、Ａは、カプサイシンを処理してアトピー皮膚炎を誘発させた新生家ネズミ（Ｎｅｏ−Ｃａｐ）での皮膚炎改善効果を示すグラフであり、Ｂは、カプサイシンを処理してアトピー皮膚炎を誘発させた２週齢家ネズミ（２Ｗ  Ｃａｐ）での皮膚炎改善効果を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施例による前記ペプチド（ＮＣＰ１１２）処理時に、新生モデル動物（Ｎｅｏ−Ｃａｐ、Ａ）及び２週齢モデル動物（２Ｗ  Ｃａｐ、Ｂ）のペプチド処理後、時間経過（３週〜５週）による皮膚状態を対照群と比較して撮影した一連の写真である。
【図６】本発明の一実施例による前記ペプチド（ＮＣＰ１１２）をそれぞれ新生モデル動物（Ｎｅｏ−Ｃａｐ、上段）及び２週齢モデル動物（２Ｗ  Ｃａｐ）に処理し、５週経過後の皮膚組織状態を顕微鏡を観察した組織染色写真（左側パネル）及び上皮の厚さを測定した結果を示すグラフ（右側パネル）である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
用語の定義：
本明細書で使われる用語を定義すれば、下記の通りである。
【００１３】
本明細書で使われる用語「免疫調節ペプチド」は、非兔疫グロブリンタンパク質形態を有していながら、直接または間接に抗菌及び抗ウイルス作用、炎症反応調節、ナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）刺激、抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）調節のような免疫強化作用を行うペプチドを意味する。他の意味としては、前記遺伝子によって解毒されたタンパク質は、好中球及びモノサイトのような食細胞から発現されるホルミルペプチド受容体族（ＦＰＲ１）及びホルミルペプチド受容体（ＦＰＲ２）は、病源菌感染に対する宿主の対抗で重要な役割を果たす。前記受容体は、百日咳毒素−敏感性Ｇｉタンパク質と結合すると知られている。ＦＰＲ１とＦＰＲ２との活性化は、ＧαｉサブユニットからＧβγサブユニットの分離を誘導し、βγサブユニットは、ホスホリパーゼＣβまたはホスホイノシタイド３−キナーゼの活性化を誘導する。このような分子の活性化は、複雑な下部シグナリングを誘導して、走化性移動、脱顆粒化、及びスーパーオキシド生成のような細胞反応を多様化する。
【００１４】
本明細書で使われる用語「抗菌ペプチド」は、一般的に比較的単純な構造からなる陽イオン性ペプチド（ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）化合物であって、グラム陽性菌（ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、グラム陰性菌（ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ）、真菌、ウイルスなどに対する幅広い抗菌スペクトルを有しており、その機転が完全に明らかにされていないが、一般的に微生物の細胞膜を破壊する作用機転を通じて抗菌力を示すと知られている。
【００１５】
本明細書で使われる用語「アトピー皮膚炎」は、乳児と小児とで最も平凡な炎症性皮膚疾患であって、激しいそう痒感、紅斑、浮腫、滲出、痂皮、隣屑、苔蘚化などを特徴とし、再発が多く、慢性に経過し、反復的な掻爬による擦傷と苔蘚化など２次的な病変が特徴的に表われる。
【００１６】
発明の詳細な説明：
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００１７】
本発明の一観点によれば、配列番号１のアミノ酸配列で構成される新規な抗菌及び免疫調節ペプチドが提供される。
【００１８】
前記ペプチドは、Ｎ末端にオクタノイル基（ｏｃｔａｎｏｙｌ  ｇｒｏｕｐ、ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＯ−、以下、‘Ｏｃｔ−’と略称する）が付着されたものであり、Ｃ末端に１〜６個のアミノ酸が付加されたものである。
【００１９】
本発明の他の一観点によれば、前記ペプチドを有効成分として含む抗菌剤が提供される。
【００２０】
前記抗菌剤は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌に対して抗菌活性を有し、前記グラム陰性菌は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．）または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）であり、前記グラム陽性菌は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ニキビ菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）または虫歯菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｔａｎｓ）であり得る。
【００２１】
本発明のさらに他の一観点によれば、前記ペプチドを有効成分として含むアトピー皮膚炎治療用薬学的組成物が提供される。
【００２２】
前記ペプチドを有効成分として含む薬学的組成物は、塩水、緩衝塩水、デキストロース、水、グリセロール、及びエタノールから選択される薬学的希釈剤のうち、１種以上含み、希釈剤は、これに限定されるものではない。
【００２３】
前記薬学組成物は、投与目的及び疾病によって異なるように適用可能である。実質的に投与される活性成分の量は、多様な関連要素、すなわち、治療しようとする疾病、患者状態の程度、他の薬剤（例えば、走化性薬剤）と共同投与有無、患者の年齢、性別、体重、食べ物、投与時間、投与経路、及び組成物の投与比率（ｒａｔｉｏ）を考慮して決定しなければならない。前記組成物は、投与量及び投与経路が疾病の形態及び深刻性によって調節されるが、一日に一回または１〜３回に分けて投与される。
【００２４】
本発明のペプチドまたは物質を含む組成物は、経口または非経口投与される。非経口投与は、経口以外の投与経路、すなわち、直腸、静脈、腹膜及び筋肉、動脈、経皮、鼻腔（ｎａｓａｌ）、吸入、眼球、及び皮下を通じる薬剤投与を意味する。前記ペプチドまたは物質を含む薬学組成物は、経口投与形態、注入可能な溶液または局所製剤のような如何なる形態でも製剤化される。製剤化は、経口及び注入可能な投与（真溶液（ｔｒｕｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、懸濁液またはエマルジョン）に適するように製造されることが望ましく、錠剤、カプセル、軟質カプセル、水性薬剤、丸剤、顆粒のような経口形態で製造されることが最も望ましい。前記製剤化で、本発明のペプチドは、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）なしに軟質カプセルに充填され、担持体と混合されるか、希釈された後に適当な製剤で作られる。適した担持体の例としては、澱粉、水、塩水、リンゲル液、デキストロースなどがある。
【００２５】
本発明のさらに他の一観点によれば、前記ペプチドを含むアトピー皮膚改善用化粧料組成物が提供される。
【００２６】
前記化粧料組成物は、化粧料組成物の剤型に使われる１つ以上の添加剤を含みうる。例えば、そのような添加剤には、１，３−ブチレングリコール、大豆リン脂質コリン、スフィンゴシン、コレステロール、ツイン８０、フィトスフィンゴシン、サリチル酸、皮膚保湿剤（湿潤剤）、柔軟剤、天然オイル、ケラチン、リポイド、吸収水溶性物質、角質層セラミド、表皮脂質酸性膜脂肪酸、コレステリルエステル、エタノール、蒸留水などが含まれうる。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明は、実施例及び実験例を通じてさらに詳しく説明される。しかし、本発明は、以下で開示される実施例及び実験例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態として具現可能なものであって、以下の実施例及び実験例は、本発明の開示を完全にし、当業者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものである。
【００２８】
実施例１：抗菌ペプチドの製造
本発明者らは、基礎スクリーニングを通じて抗菌活性を有する配列番号１で記載されるアミノ酸配列（ＫＦＫＷＲＹｍ）で構成されたペプチドを探索した。前記ペプチドのアミノ酸配列で、大文字は、通常のＬ型のアミノ酸を示し、小文字ｍは、Ｄ型のメチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）を示す。前記ペプチドは、通常のアミノ酸合成法（Ｕｍｂａｒｇｅｒ，Ｈ．Ｅ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：５３３−６０６，１９７８）を用いて製造可能である。
【００２９】
実施例２：抗菌ペプチドの修飾
本発明者らは、前記実施例１から基礎探索されたペプチドの抗菌活性をより向上させるために、パルミトイル基、オクタノイル基など多様な脂質成分を、前記ペプチドのＮ末端に付着させた修飾ペプチドを合成して、抗菌活性を調査した。その結果、オクタノイル基が付着された修飾ペプチドが最も活性が良いと確認されて、以後、実験例では、Ｏｃｔ−ＫＦＫＷＲＹｍペプチド（以下、‘ＮＣＰ１１２’と名付ける）を使用した。
【００３０】
実験例１：新規なペプチドの抗菌活性の実験
前記実施例２から製造されたペプチドの抗菌活性を測定するために、抗菌検査を行った。グラム陽性菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）とグラム陰性菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＥ．ｃｏｌｉ）とを準備して、寒天平板培地に４次塗抹して、３６℃培養器で一晩中培養した。翌日、寒天平板培地上に生成された菌株コロニーを３ｍｌ栄養培地に接種して、３６℃、２２０ｒｐｍの条件で撹拌培養器で一晩中培養した。翌日、各菌を希釈して、６００ｎｍで吸光度を測定して、０．５になるように調整した。その後、栄養培地に１：１００比率で希釈した。その後、前記実施例２から製造されたペプチドを栄養培地に０、１．２５、２．５、５、１０、及び２０μＭの濃度に順次希釈して、１ｍｌずつ製造した後、前記希釈された菌１ｍｌを接種した。引き続き、３６℃、２２０ｒｐｍの条件で撹拌培養１８時間培養した後、６００ｎｍでの吸光度を測定して、結果を分析した。
【００３１】
その結果、図１で示すように、本発明の一実施例によるペプチドは、濃度依存的に試験したあらゆる菌に対して抗菌活性を示した。特に、１０μＭの濃度では、４種の菌の生育を完全に抑制させた。４種の菌のうち、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の場合、抗菌効果が最も良いと表われた。
【００３２】
実験例２：ＦＰＲＬ１を通じる細胞内Ｃａイオン活性の分析
本発明者らは、引き続き、本発明の一実施例による前記ペプチドが、生体の免疫機能を活性化させるか否かを確認するために、カルシウムイオン透過性の変化を観察した。具体的に、前記ペプチドがＦＰＲ２を活性化させるかを確認するために、細胞内カルシウムイオンの濃度を測定した。このために、ＦＰＲ２を発現していないＲＢＬ細胞とＲＢＬ細胞でＦＰＲ１を過発現させた細胞（ＦＰＲ１−ＲＢＬ）とＦＰＲ２を過発現させた細胞（ＦＰＲ２−ＲＢＬ）とを使用し、細胞内カルシウムイオンの遊離を敏感に測定可能な方法としてカルシウムに結合力が強い染色物質であるＦｕｒａ−２／ＡＭを利用した。すなわち、細胞を１０％ウシ胎児血清が含有されたＲＰＭＩ培地に培養し、対数期状態である時（ｍｉｄ−ｌｏｇ  ｐｈａｓｅ、１−３×１０７細胞／ｍｌ）、遠心分離して収穫した後、ウシ胎児血清が含有されていないＲＰＭＩ培地で数回洗浄し、それを１×１０７細胞／ｍｌになるようにＲＰＭＩ培地に再懸濁した。引き続き、最終３μＭ濃度のＦｕｒａ−２／ＡＭを添加し、３７℃、５％  ＣＯ２培養器で４５分間撹拌し続けながら培養した。適正時間が経過した後、細胞を収穫して、再びＲＰＭＩ培地で数回洗浄した後、それを２５０μＭ濃度のスルフィンピラゾンが添加された適正量のＲＰＭＩ培地に懸濁して、細胞内に入ったＦｕｒａ−２の細胞外部への流失を防止した。約２×１０６個の細胞を毎回取って、急速遠心分離で収穫し、それをカルシウムイオンが添加されず、ＥＧＴＡが添加されたロック（Ｌｏｃｋｅ）溶液１ｍｌに再懸濁して、分光光度計上で３４０ｎｍ及び３８０ｎｍの２つの波長での吸光度比をモニタリングしたが、１分間隔で本発明の一実施例によるペプチドを濃度を異ならせて（１μＭ、０．１μＭ及び０．０１μＭ）処理した後、２つの波長での吸光度差を調査し、それを後でグリンキーウィックツ（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚ）の方法によって細胞内に遊離されたカルシウムイオンの濃度に換算した。その結果は、図２に示されたように、本発明の一実施例によるペプチドの処理時に、ＦＰＲ２−ＲＢＬ細胞のみで特異的に細胞内カルシウムイオンが急増し（Ａ）、ペプチド処理によるカルシウムイオンの細胞内濃度増加量は、濃度依存的な態様を示した（Ｂ）。これは、本発明の一実施例によるペプチドが、ＦＰＲ２への結合及び活性化を通じて個体の免疫機能を調節することができるという点を示唆するものである。
【００３３】
実験例３：アトピー皮膚炎モデルでの皮膚炎の改善効果
３−１：外形的変化の分析
これにより、本発明者らは、本発明の一実施例による前記ペプチドが実際生体内で免疫機能を活性化させることによって、免疫関連疾患を治療することができるか否かを確認するために、アトピー動物モデルに前記ペプチドを処理して、アトピー皮膚炎の症状を改善することができるか否かを調査した。具体的に、発明者は、カプサイシン誘導アトピー皮膚炎モデルで皮膚炎の改善効果があるか否かを確認するために、本発明の一実施例によるペプチド（ＮＣＰ１１２）をアトピーモデル動物で（Ｎｅｏ−Ｃａｐ及び２Ｗ  Ｃａｐ）のアトピー誘発皮膚組織の真皮、真皮適用部位及び掻いた部位に処理した後、皮膚改善程度を観察した。前記Ｎｅｏ−Ｃａｐは、生まれてから４８時間以内の新生家ネズミ（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔ）の背中の皮膚に５０ｍｇ／ｋｇのカプサイシンを皮下注射して、アトピー皮膚炎を誘発させたものであって、アトピー皮膚炎の代表的モデル動物である。２Ｗ  Ｃａｐは、２週齢家ネズミに２５ｍｇ／ｋｇのカプサイシンを２回皮下注射して、アトピー皮膚炎を誘発させたモデル動物であって、青少年期あるいは成人発病アトピー皮膚炎を模写するモデルである。
【００３４】
具体的な実験処置過程は、図３に示されている。Ｎｅｏ−Ｃａｐモデルでは、カプサイシン注射２週後に皮膚炎点数を測定した後、対照群（ＰＢＳ）とＮＣＰ１１２とを１０μＭの濃度で毎日背中（２００μｌ）と両耳（５０μｌ）とに塗布し、１週間間隔で３週間皮膚炎点数を測定した。皮膚炎点数は、顔、耳、背中（ｔｏｔａｌ）と耳、背中（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）で皮膚状態によって点数を測定し、開始点である２週目での点数を１にして標準化して、図４に示したが、その基準は、下記表１のようである。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
２Ｗ−Ｃａｐモデルでは、カプサイシン注射１週後に皮膚炎点数を測定した後、対照群（ＰＢＳ）とＮＣＰ１１２とを１０μＭの濃度で毎日背中（２００μｌ）と両耳（５０μｌ）とに塗布し、１週間間隔で２週間Ｎｅｏ−Ｃａｐモデルのような方式で皮膚炎点数を測定した。開始点である３週での点数を１にして標準化して、図４に示した。
【００３７】
３−２：アトピー皮膚炎の皮膚組織病理及び厚さの評価
前記実験例３−１で分析したマウスを、本発明の一実施例によるペプチド処理５週経過後、犠牲させた後、カプサイシン処理によって皮膚炎が誘発された部位の皮膚組織を３×３ｃｍ程度のサイズに摘出した後、該摘出された皮膚組織を２〜３日程度４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）溶液に固定した。該固定された組織は、再び１×０．５ｃｍのサイズに再び細分化して、組織用カセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）に入れて、Ｔｉｓｓｕｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｌｅｉｃａ  ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で脱水、透明、パラフィン化過程を経て−２０℃で保管した。薄切を行うために、Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ  ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でパラフィンブロックを５μｍの厚さに切った後、薄く切られた組織リボンは、恒温水槽に浮かべて平らにした後、スライドガラスに組織の切片を付着し、４０℃加熱板（ｈｅａｔｉｎｇ  ｐｌａｔｅ）で乾燥させた。マウス皮膚組織の病理学的評価を行うために、皮膚組織の切片をキシレン（ｘｙｌｅｎｅ）で３分ずつ３回脱パラフィンを行い、７０〜１００％エタノールにそれぞれ１分ず浸す順序で最後に蒸留水で水洗を行い、ヘマトキシリン溶液に浸して組織細胞の核部位を染色し、蒸留水で水洗した後、再びエオシンで細胞質を染色した。該染色された組織は、脱パラフィン過程の逆行で７０〜１００％エタノールからキシレン順に進行し、最後に包埋剤（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ）を塗布した後、カバーガラスを覆って封入した。光学顕微鏡観察を行うために、２００×の倍率で染色された組織を撮影して、病理学的評価を行った。図５は、経時的なアトピー皮膚炎が誘発された部位の皮膚組織の状態を撮影した写真であり、図６は、アトピー皮膚炎が誘発された部位の皮膚組織に対する組織染色結果を示す光学顕微鏡写真であって、Ｎｅｏ−Ｃａｐ及び２Ｗ  Ｃａｐ群いずれも対照群は、上皮が厚くなって、典型的なアトピー皮膚炎の症状を示したが、本発明の一実施例によるペプチド処理群（ＮＣＰ１１２）の場合、Ｎｅｏ−Ｃａｐでは、上皮層の厚さがやや減少し、２Ｗ  Ｃａｐ群では、顕著に減少して、ほぼ正常レベルを回復したことを確認した。したがって、本発明の一実施例によるペプチドは、動物実験の結果、Ｎｅｏ−Ｃａｐ及び２Ｗ  Ｃａｐモデルいずれもでアトピー皮膚炎症状を改善する効果があり、特に、２Ｗ  Ｃａｐモデル動物では、ほぼ正常状態と匹敵する皮膚状態を示して、非常に効率的であるということを確認することができた。
【００３８】
本発明は、前述した実施例及び実験例を参考にして説明されたが、これは例示的なものに過ぎず、当業者ならば、これより多様な変形及び均等な他実施例及び実験例が可能であるという点を理解できるであろう。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、添付の特許請求の範囲の技術的思想によって決定されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の一実施例による抗菌ペプチドは、グラム陽性菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）とグラム陰性菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ及びＥ．ｃｏｌｉ）のような多様な細菌に対する抗菌活性を示すだけではなく、アトピー性皮膚炎モデル動物に対するアトピー性皮膚炎症状改善効果が明らかなために、各種の抗生剤、特に、皮膚外用抗生剤はもとより、アトピー性皮膚炎改善用機能性化粧品などの原料として使用可能である。
【００４０】
［配列リストフリーテキスト］
配列番号１は、本発明の一実施例による抗菌ペプチドのアミノ酸配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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