(57)【要約】  プログラム細胞死リガンド１の腸管発現を含む、炎症性疾患の改善のための方法及び組成物が本明細書で提供される。【選択図】図９Ｃ
2019534300.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする患者において炎症性疾患を治療する方法であって、
プログラム細胞死−リガンド１（「ＰＤ−Ｌ１」）の核酸を含む発現ベクターを前記患者の消化管に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＰＤ−Ｌ１の核酸がヒトのＰＤ−Ｌ１ポリペプチドをコードする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドが、ヒトＰＤ−Ｌ１のＩｇＶドメイン及びＩｇＣドメインを含むまたはそれらから成る可溶性ヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチド（配列番号１のアミノ酸１９〜２３９）である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドが、ヒトＰＤ−Ｌ１のシグナルドメイン、ＩｇＶドメイン及びＩｇＣドメインを含むまたはそれらから成る可溶性ヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチド（配列番号１のアミノ酸１〜２３９）である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのＮ末端がヒトＩｇＧ１のＦｃ領域またはその一部に融合される請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）のアミノ酸配列を介してヒトＩｇＧ１のＦｃ領域またはその一部に融合される請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒトＩｇＧ１のＦｃを、Ｆｃドメインにおける以下のアミノ酸の１以上を変えること：Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓによって抗体依存性の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性の細胞傷害性（ＣＤＣＣ）を低くするように変異させる請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＤ−Ｌ１の核酸が配列番号４の配列を含む請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドが、ヒトＰＤ−Ｌ１のシグナル伝達配列、ＩｇＶドメイン、ＩｇＣドメイン及び膜貫通ドメインを含むまたはそれらから成る膜結合型ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド（配列番号１のアミノ酸１〜２５９）である請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドがさらに、ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞質ドメインを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＤ−Ｌ１の核酸が配列番号３の配列を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎またはクローン病である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記炎症性疾患が移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＤ−Ｌ１の核酸を含む発現ベクターであって
前記ＰＤ−Ｌ１の核酸の配列が、投与後の検出のために配列番号２と比べて少なくとも１つの同義置換、好ましくは複数の同義置換を含む、前記発現ベクター。
【請求項１５】
前記ＰＤ−Ｌ１の核酸配列が発現のためにコドンで最適化される請求項１４に記載の発現ベクター。
【請求項１６】
前記ＰＤ−Ｌ１の核酸配列がさらに異種配列を含む請求項１４に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
前記異種配列が、Ｆｃドメイン、タンパク質タグ、コンジュゲート治療剤、またはそれらの組み合わせを含む請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
前記ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１のＦｃ領域またはその一部を含む請求項１７に記載の発現ベクター。
【請求項１９】
前記ＰＤ−Ｌ１の核酸が配列番号４の配列を含む請求項１８に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
前記ＰＤ−Ｌ１の核酸が配列番号３の配列を含む請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
それを必要とする患者において炎症性疾患の治療における請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の発現ベクターの使用。
【請求項２２】
それを必要とする患者において炎症性疾患を治療するための薬物の調製における請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の発現ベクターの使用。
【請求項２３】
前記炎症性疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎またはクローン病である請求項２１または２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記炎症性疾患が移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である請求項２１または２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＰＤ−Ｌ１の遺伝子発現を採用する炎症性疾患の改善のための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的な免疫活性化、特にＴ細胞の活性化状態は、Ｔ細胞上での共刺激（たとえば、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０等）分子及び共抑制（たとえば、ＣＴＬＡ−４、プログラム細胞死−１（「ＰＤ−１」）等）分子の宿主が介在する複合重複調節メカニズムの影響下にある。プログラム細胞死リガンド−１（「ＰＤ−Ｌ１」、Ｂ７Ｈ１とも呼ばれる）は樹状細胞及び他の抗原提示細胞によって構成的に発現され、ＰＤ−１とのその相互作用を介してＴ細胞の下方調節に介在すると思われる。Ｐａｔｓｏｕｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＰＤ−１  ｏｎ  Ａｋｔ  ａｎｄ  Ｒａｓ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ  ５：ｒａ４６（２０１２）。
【０００３】
しかしながら、残念なことに、ＣＤ８０とのＰＤ−Ｌ１の相互作用の効果はこれら２つの経路の間での相互作用のようには明らかではない。一部の設定では、可溶性ＰＤ−Ｌ１によるＰＤ−１の遮断はＴ細胞応答を強く高めることができ、移植片対宿主病（「ＧｖＨＤ」）を増進する。Ｂｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−１  Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  Ｇｒａｆｔ−Ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ  Ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｂｙ  ａｎ  ＩＦＮ−γ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１２７２−７７（２００３）．逆に、他の研究者らは、ＰＤ−Ｌ１の可溶性形態によって、しかし、ＰＤ−Ｌ１ノックアウトの背景においてのみＧｖＨＤを改善することができた。Ｄｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｂ７Ｈ１／ＣＤ８０  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｕｇｍｅｎｔｓ  ＰＤ−１  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−Ｈｏｓｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９４：５６０−７４（２１０５）．さらに、Ｔ細胞応答における末梢樹状細胞の役割は、かつて考えられていたよりも複雑であると思われる。たとえば、未成熟の末梢樹状細胞は普通、Ｔ細胞分化を開始しない一方で、実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）のマウスモデルでは樹状細胞の集団は、中枢神経系（ＣＮＳ）に浸潤し、エピトープの広がりを促進することが観察されている。Ｓｐａｇｎｕｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ９：１−１０。
【０００４】
従って当該技術には、免疫防御の状況にてＴ細胞活性化におけるＰＤ−Ｌ１の役割をよりよく理解し、炎症性疾患におけるＰＤ−Ｌ１の治療可能性をよりよく活用する明瞭な必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、たとえば、炎症性腸疾患（たとえば、潰瘍性大腸炎、クローン病等）を含む種々の炎症性疾患と同様に臓器または骨髄の移植によって誘導される移植片対宿主病の治療のための免疫防御の状況で可溶性ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドを含むＰＤ−Ｌ１ポリペプチドの現局した腸管発現を上手く採用することによって従来技術における前述の科学的不確実性を解消する。従って態様の１つでは、本発明は、ＰＤ−Ｌ１の核酸を含む発現ベクターをそれを必要とする患者の腸管に投与することを含む、前記患者にて炎症性疾患を治療する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは膜結合型ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドである。好まれる実施形態では、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドはヒトＰＤ−Ｌ１またはそのスプライス変異体である。そのような一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の核酸は、配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＰＤ−Ｌ１ポリペプチドをコードする。
【０００７】
代わりの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは可溶性ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドであり、たとえば、ＰＤ−Ｌ１及び好ましくはヒトＰＤ−Ｌ１（すなわち、配列番号１のアミノ酸１〜２３９）のシグナル配列、ＩｇＶドメイン及びＩｇＣドメインを含む。一部の実施形態では、可溶性ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドはシグナル配列の全部または一部を欠いてもよい（たとえば、それは配列番号１のアミノ酸１９〜２３８を含んでもよい）。
【０００８】
一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の核酸は核酸送達媒体に被包された発現ベクターによって送達される。好まれる核酸送達媒体にはキトサンまたはキトサン誘導体ナノ粒子が挙げられる。そのような一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子はアルギニン及び／またはグルコン酸と結合したキトサンを含む。そのような別の実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子はアルギニン及び親水性ポリオールと結合したキトサンを含む。一実施形態では、親水性ポリオールはグルコースである。
【０００９】
別の態様では、本発明は、それを必要とする患者にて炎症性疾患を治療するためにＰＤ−Ｌ１の核酸を含む発現ベクターを提供し、その際、前記発現ベクターは前記対象の腸管に投与される。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の核酸は配列番号２を含む。好ましくは、ＰＤ−Ｌ１の核酸は配列番号２にて少なくとも１つの同義突然変異を含む。一層さらに好ましくは、ＰＤ−Ｌ１の核酸は複数のそのような突然変異を含んで分化及び任意で、改善された発現に役立つ。例となる実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の核酸は配列番号３を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の核酸はさらに異種配列を含む。異種配列は、Ｆｃドメイン、タンパク質タグ、コンジュゲート治療剤、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのＮ末端領域がヒトＩｇＧ１のＦｃ領域またはその一部に融合される。ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）のアミノ酸配列によってヒトＩｇＧ１のＦｃ領域またはその一部に融合されてもよい。一部の実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃを、Ｆｃドメインにおける以下のアミノ酸の１以上を変えること：Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓによって抗体依存性の細胞障害性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性の細胞障害性（ＣＤＣＣ）を低下させるように変異させる。例となる実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の核酸は配列番号４を含む。
【００１１】
本発明によって有利に治療することができる炎症性疾患には、感染に関連する炎症（たとえば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ））、虚血性再潅流傷害、エンドトキシン致死性、炎症性腸疾患、クローン病、大腸炎、またはサイトカイン（たとえば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰産生から生じるもの、と同様にＧｖＤＨを含む慢性及び急性の双方の状態が挙げられる。
【００１２】
参照による組み込み
本明細書で言及されている出版物、特許及び特許出願はすべて、各個々の出版物、特許または特許出願が具体的に且つ個々に参照によって組み入れられるように指示されたのと同じ程度に参照によって本明細書に組み入れられる。
【００１３】
本開示は添付の図面を参照して開示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｐＶａｘ−ｈＰＤ−Ｌ１ベクター（配列番号６）。膜結合型ヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチドをコードするベクターのプラスミド配列を示し、最適化したヒトＰＤ−Ｌ１のｃＤＮＡを強調する。
【００１５】
【図２】ｐＶａｘ−ｈＰＤ−Ｌ１  Ｆｃベクター（配列番号７）。可溶性ヒトＰＤ−Ｌ１  Ｆｃポリペプチドをコードするベクターのプラスミド配列を示し、最適化したヒトＰＤ−Ｌ１のｃＤＮＡを強調する。
【００１６】
【図３Ａ】ヒトＰＤ−Ｌ１プラスミド及び試験管内の発現を示す。（Ａ）カナマイシン耐性遺伝子を伴ってヒトサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモータ（ＣＭＶ；）の制御下でプラスミド複製開始点（ｐＵＣ  ｏｒｉ；）を含有するｐＶａｘ主鎖にクローニングした最適化ｈＰＤ−Ｌ１のＤＮＡ配列のプラスミドマップを示す図である。
【００１７】
【図３Ｂ】試験管内でのＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ１  Ｆｃの発現を示す図である。リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１μｇまたは２．５μｇのＦｃ対照（白色）、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（黒色）またはＰＤ−Ｌ１（灰色）のプラスミドＤＮＡでＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。細胞培養上清または細胞溶解物におけるＰＤ−Ｌ１タンパク質の含量は形質移入の４８時間後に定量した。
【００１８】
【図４】ポリプレックスの形質移入に由来するＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの試験管内発現を示す図である。（Ａ〜Ｂ）示したような漸増濃度のｐＶＡＸ−ｏｐｔ−ｈＰＤ−Ｌ１−ＦｃのＤＮＡを含有するＰＤ−Ｌ１−ＦｃポリプレックスでＨＥＫ−２９３Ｔに形質移入した。（Ａ）形質移入の４８時間後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃタンパク質についてアッセイした。データは細胞の総タンパク質に対して基準化した。（Ｂ）ＥＣ５０及び最大タンパク質発現の表である。
【００１９】
【図５−１】試験管内で生成したＦｃ融合構築物の精製及び発現を示す図である。（Ａ）クマシーゲル染色によって確認されたタンパク質の発現：リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＦｃ対照またはＰＤ−Ｌ１−ＦｃのプラスミドＤＮＡでＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。形質移入の２４時間後に細胞培養培地を無血清培地と交換した。形質移入の７２時間後に細胞培養上清を回収し、プロテインＧ  ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ）を用いてＦｃ融合タンパク質を精製した。ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いて緩衝液をＰＢＳに交換し、４つの等分画（溶出液１〜４）にてタンパク質を溶出した。（Ｂ）リポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、Ｆｃ対照またはＰＤ−Ｌ１−ＦｃのプラスミドＤＮＡでＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。形質移入の２４時間後に細胞培養培地を無血清培地と交換した。形質移入の７２時間後に細胞培養上清を回収し、プロテインＧ  ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ）を用いてＦｃ融合タンパク質を精製した。ＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いて緩衝液をＰＢＳに交換し、４つの等分画（Ｆ１〜４）にてタンパク質を溶出した。ＥＬＩＳＡによってＰＤ−Ｌ１タンパク質の濃度を決定した。
【００２０】
【図５−２】試験管内で生成したＦｃ融合構築物の精製及び発現を示す図である。（Ｃ）６穴プレートにてリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、野生型ＰＤ−Ｌ１プラスミドＤＮＡまたは対照（ｐＶａｘ）でＮＩＨ／３Ｔ３細胞に形質移入した。形質移入の２４時間後に細胞を洗浄し、９６穴平底プレートに再び播いた。翌日（２日目）及びその後３日間、細胞表面におけるＰＤ−Ｌ１の発現をフローサイトメトリーで解析した。（Ｄ）６穴プレートにてリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、野生型ＰＤ−Ｌ１プラスミドＤＮＡまたは対照（ｐＶａｘ）でＮＩＨ／３Ｔ３細胞に形質移入した。形質移入の２４時間後に細胞を洗浄し、９６穴平底プレートに再び播いた。翌日（２日目）及びその後３日間、細胞表面におけるＰＤ−Ｌ１の発現レベルをフローサイトメトリーで解析した。
【００２１】
【図６】ヒトＰＤ−１受容体を介して用量依存性に発現されるＰＤ−Ｌ１−Ｆｃのシグナルを示す図である。ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃで細胞に形質移入し、細胞培養上清から精製した。（Ａ）ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  ＰＤ−１シグナル伝達アッセイ。漸増濃度のＰＤ−Ｌ１−Ｆｃで細胞を刺激し（４０分）、シグナルの活性化を発光（ＲＬＵ：相対発光単位）によって測定した。（Ｂ）ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  ＰＤ−１シグナル伝達アッセイ。抗ＰＤ−１（低：０．１μｇ／ｍＬ、高：１．０μｇ／ｍＬ）の有無にて組換えＩｇＧ１−ＦｃまたはＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（５０μｇ／ｍＬ、４０分）と共に細胞をインキュベートし、シグナルの活性化を発光（ＲＬＵ：相対発光単位）によって測定した。細胞の活性化は３つ組でアッセイし、データは無刺激の対照に比べたＲＬＵとして提示する。データは平均値±標準偏差として提示し、４つの独立した実験の代表である。スチューデントのｔ検定を用いてデータを解析し、星印は統計的な有意差を表す（＊、ｐ≦０．０５；＊＊、ｐ≦０．０１；＊＊＊、ｐ≦０．００１）。
【００２２】
【図７Ａ】プラスミドＤＮＡで生成したＰＤ−Ｌ１−Ｆｃは試験管内でＴ細胞の活性化を抑制することを示す図である。（Ａ）精製したＣＤ４＋Ｔ細胞は３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスから単離し、プールした。抗ＣＤ３（０．２μｇ／ｍＬ）のみ、または５μｇ／ｍＬの無血清培地で生成したＰＤ−Ｌ１−Ｆｃで予めコーティングした９６穴平底プレートに細胞を播いた。組換えＩｇＧ１−Ｆｃ及び組換えＰＤ−Ｌ１−Ｆｃを対照として使用した。細胞を３日間刺激し、フローサイトメトリーによってＦＳＣ−ＳＳＣのゲート内での細胞のサイズを検出することにより細胞の活性化を測定した。図７Ａは配列番号５としての「ＧＧＧＧＳ」及び配列番号８としての「（ＧＧＧＧＳ）３」を開示している。
【００２３】
【図７Ｂ】プラスミドＤＮＡで生成したＰＤ−Ｌ１−Ｆｃは試験管内でＴ細胞の活性化を抑制することを示す図である。（Ｂ）６穴プレートにて野生型ＰＤ−Ｌ１プラスミドＤＮＡまたは対照（ｐＶａｘ）でＮＩＨ／３Ｔ３細胞に形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞を９６穴Ｖ底プレートに再び播き、種々の濃度の組換えヒトＰＤ−１と共にインキュベートした。細胞を洗浄し、ＡＰＣを結合した抗ヒトＰＤ−１またはアイソタイプ対照によって染色し、形質移入細胞にてＡＰＣの検出を評価することによりフローサイトメトリーによってＰＤ−１結合を解析した。ＰＥ共役抗ヒトＰＤ−Ｌ１またはアイソタイプ対照の結合も評価した。抗ヒトＰＤ−Ｌ１−ＰＥの結合での低下は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞上で発現されているＰＤ−Ｌ１に組換えＰＤ−１が結合していることを考えると抗体結合の立体障害の結果であると予測される。
【００２４】
【図８Ａ】疾患モデルの最適化を示す図である。（Ａ）オスＲａｇ１−／−マウスにＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢ高として定義されるナイーブＴ細胞を腹腔内注射した、またはそのマウスを未処理のままにした。ナイーブＴ細胞の移入は体重低下によって観察されるように疾患を誘導した。
【００２５】
【図８Ｂ】疾患モデルの最適化を示す図である。（Ｂ）急性移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を誘導するために、メスＢＡＬＢ／ｃマウスに７００ｃＧＹの放射線を照射し、同種Ｃ５７Ｂｌ６／Ｊの骨髄（１０Ｍの細胞）を２．５Ｍの脾細胞と合わせて移入した。最初の１０日間以内に観察される当初の体重減少によって観察されるようにこれらの条件を用いてＧｖＤＨは上手く誘導された。さらに、ほぼ２０日目に開始して二次的な体重低下が観察された。非移植群は上手く行った照射を確認した、ＢＭＴ対照は同種骨髄の上手く行った移入を確認している。
【００２６】
【図９Ａ】ＧｖＨＤにおけるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ１  Ｆｃのポリプレックスの治療上の有効性を示す図である。（Ａ）図８Ｂで前に明らかにしたようにＧｖＨＤを誘導した。マウスを未処理のままにした、またはｃ１０００の濃度にてｐＶＡＸ、ＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ１  Ｆｃのポリプレックスを７週間毎週浣腸によりマウスに注入した。当初の体重の７５％に達した動物を安楽死させた。動物の体重はＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ１  Ｆｃのポリプレックスの投与によって救済された。
【００２７】
【図９Ｂ】ＧｖＨＤにおけるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ１  Ｆｃのポリプレックスの治療上の有効性を示す図である。（Ｂ）疾患の臨床兆候はＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ１−Ｆｃで処理したマウスにて減少し、２１日目に観察された平均の臨床兆候もＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ１−Ｆｃで処理したマウスにて減少した。
【００２８】
【図９Ｃ】ＧｖＨＤにおけるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ１  Ｆｃのポリプレックスの治療上の有効性を示す図である。（Ｃ）ＧｖＨＤの誘導に続く生存曲線。未処理動物及びｐＶＡＸ処理動物はすべて病気で死亡したが、ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ処理動物のほぼ４０％及びＰＤ−Ｌ１処理動物の３０％（緑色）は７５日目まで生き残った。
【００２９】
【図１０−１】ＧｖＨＤにおけるＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ及びＰＤ−Ｌ１のポリプレックスの治療上の有効性を示す図である。（Ａ）図８Ｂで前に明らかにしたようにＧｖＨＤを誘導した。マウスを未処理のままにした、またはｃ１０００の濃度にてｐＶＡＸ、もしくはＰＤ−Ｌ１  Ｆｃのポリプレックスを７週間毎週浣腸によりマウスに注入した。当初の体重の７５％に達した動物を安楽死させた。動物の体重はＰＤ−Ｌ１  Ｆｃポリプレックスの投与によって救済された。
【００３０】
【図１０−２】ＧｖＨＤにおけるＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ及びＰＤ−Ｌ１のポリプレックスの治療上の有効性を示す図である。（Ｂ）図８Ｂで前に明らかにしたようにＧｖＨＤを誘導した。マウスを未処理のままにした、またはｃ１０００の濃度にてｐＶＡＸ、もしくはＰＤ−Ｌ１のポリプレックスを７週間毎週浣腸によりマウスに注入した。当初の体重の７５％に達した動物を安楽死させた。動物の体重はＰＤ−Ｌ１ポリプレックスの投与によって救済された。（Ｃ）ＧｖＨＤの誘導に続く生存曲線。ｐＶＡＸ処理動物はすべて病気で死亡したが、ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ処理動物のほぼ４０％及びＰＤ−Ｌ１処理動物の３０％は７５日目まで生き残った。
【００３１】
【図１１】ＧｖＨＤにおけるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ１  Ｆｃの治療効果を示す図である。（Ａ）図８Ｂで前に明らかにしたようにＧｖＨＤを誘導した。マウスを未処理のままにした、またはｃ１０００の濃度にてｐＶＡＸ、ＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ１  Ｆｃのポリプレックスを７週間毎週浣腸によりマウスに注入した。１８日目に開始して未処理またはｐＶＡＸ処理の動物に比べてＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ１  Ｆｃで処理した動物の体重は大きく改善した。（Ｂ）ＧｖＨＤの誘導に続く生存曲線。ｐＶＡＸ処理動物すべてと同様に未処理の動物は病気で死亡した。一方、ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃで処理した動物の５０％及びＰＤ−Ｌ１を投与した動物の２５％は４５日目まで生き残った。
【００３２】
【図１２】大腸炎のＤＳＳモデルにおける組換えＰＤ−Ｌ１  Ｆｃの投与を示す図である。（Ａ）Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｕｔ  ２０１５から得た図。Ｒａｇ１−／−マウスに飲水中で２％のＤＳＳを投与し、２日目に組換えＰＤ−Ｌ１  Ｆｃタンパク質またはＰＢＳを腹腔内注射した。組換えＰＤ−Ｌ１  Ｆｃの注射はＰＢＳを注射した動物に比べてあまり激しくない体重低下をもたらす。（Ｂ）Ｒａｇ１−／−マウスに飲水中で４％のＤＳＳを投与し、３日目及び６日目に組換えＰＤ−Ｌ１  ＦｃまたはＰＢＳを腹腔内注射した。動物の体重は試験全体を通して同等だった。しかしながら、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ可溶性タンパク質による治療効果は観察されず、従ってＳｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．の結果は再現性がなかった。
【００３３】
【図１３−１】Ｔ細胞大腸炎のモデルにおけるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ１  Ｆｃの治療有効性を示す図である。（Ａ〜Ｂ）Ｔ細胞大腸炎は図８Ａのように誘導した。移入後１５日目に開始して、マウスに浣腸を介してその後６週間毎週ｐＶＡＸまたはＰＤ−Ｌ１のｃ１０００のポリプレックスを注入した、またはマウスを未処理のままにした。病気で死亡した動物には当初の体重の７５％の固定スコアを与えた。ＰＤ−Ｌ１ポリプレックスの注入は、試験全体を通して不変の体重によって観察されるように疾患の進行を抑えた。（Ｂ）Ｔ細胞大腸炎の誘導に続くマウスの生存曲線は、ＰＤ−Ｌ１で処理した動物は病気で死亡しなかったことを明らかにしている。一方、１ｐＶＡＸ処理動物及び２匹の未処理動物は安楽死させる必要があった。
【００３４】
【図１３−２】Ｔ細胞大腸炎のモデルにおけるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ１  Ｆｃの治療有効性を示す図である。Ｔ細胞大腸炎は図８Ａのように誘導した。動物の体重（Ｃ）及び臨床兆候（Ｄ）は週に２〜３回モニターし、０日目の体重をベースライン体重（１００％；０日目は移入後１９日目に相当する結腸内点滴の初日である）として使用した。動物は移入後１９日目に開始して７週間毎週結腸内点滴を受けた。
【００３５】
【図１３−３】Ｔ細胞大腸炎のモデルにおけるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ１  Ｆｃの治療有効性を示す図である。（Ｅ）Ｔ細胞大腸炎の誘導に続くマウスの生存。当初の体重の７５％で、または活性が重度に低下すれば、動物を安楽死させた。グラフ作成の目的で、安楽死させたマウスの体重は実験の残りについては当初の体重の７５％として表した。同様に、安楽死させたマウスの臨床スコアは試験の終了まで８の最大スコアとして表した。（Ｃ〜Ｅ）について、スクロース、ｎ＝８；ｐＶＡＸ、ｎ＝９；ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ  ｎ＝９。
【００３６】
【図１４】ＰＤ−Ｌ１ポリプレックスの投与は調節性Ｔ細胞にてＦｏｘＰ３の発現を誘導する。腸間膜リンパ節及び脾臓にて終点でＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋細胞として定義される調節性Ｔ細胞においてＦｏｘＰ３の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を調べた。ＦｏｘＰ３の発現は、ｐＶａｘ群に比べて（Ａ）腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）及び（Ｂ）脾臓の双方にてＰＤ−Ｌ１処理した動物で高かった。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は炎症性疾患の治療のためのＰＤ−Ｌ１の核酸の腸管発現を熟考する。
【００３８】
ＰＤ−Ｌ１タンパク質及びポリヌクレオチド
本明細書で熟考されるＰＤ−Ｌ１ポリペプチドには完全長の配列、その可溶性断片及びその変異体が含まれる。
【００３９】
完全長のＰＤ−Ｌ１タンパク質は一般にシグナル配列、ＩｇＶドメイン、及びＩｇＣドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。ヒトの配列はＮＭ＿０１４１４３．３及びＮＰ＿０５４８６２．１のもとでＧｅｎＢａｎｋデータベースにて一般に利用可能である。ヒトＰＤ−Ｌ１転写物変異体１の配列は標準配列であり、既知のアイソフォームに関して記載されている位置情報はすべてこの配列から決定される。このアイソフォームでは、シグナル配列は、およそアミノ酸１からおよそアミノ酸１８までで示され、ＩｇＶドメインは、およそアミノ酸１９からおよそアミノ酸１３４までで示され、ＩｇＣドメインは、およそアミノ酸１３５からおよそアミノ酸２２７までで示され、膜貫通ドメインはおよそアミノ酸２３９からおよそアミノ酸２５９までで示され、細胞質ドメインは、およそアミノ酸２６０からおよそアミノ酸２９０までで示される。様々なヒトＰＤ−Ｌ１アイソフォームをコードする少なくとも５つの転写物（すなわち、スプライス）変異体が知られており、その開示が参照によって明白に本明細書に組み入れられる、たとえば、米国特許公開第２０１６／０１２２８２９号に記載されている。
【００４０】
複数の種におけるＰＤ−Ｌ１についての核酸及びアミノ酸の配列情報は当該技術で周知であり、たとえば、サルのＰＤ−Ｌ１（ＮＭ００１０８３８８９．１及びＮＰ＿００１０７７３５８．１）、チンパンジーのＰＤ−Ｌ１（ＸＭ＿００１１４０１７０５．２及びＸＰ＿００１１４０７０５．１）、マウスのＰＤ−Ｌ１（ＮＭ０２１８９３．３及びＮＰ＿０６８６９３．１）、ラットのＰＤ−Ｌ１（ＮＭ＿００１１９１９５４．１及びＮＰ＿００１１７８８８３．１）、ニワトリのＰＤ−Ｌ１（ＸＭ＿４２４８１１．３及びＸＰ＿４２４８１１．３）、ウシのＰＤ−Ｌ１（ＮＭ＿００１１６３４１２．１及びＮＰ＿００１１５６８８４．１）、ならびにイヌのＰＤ−Ｌ１（ＸＭ＿５４１３０２．３及びＸＰ＿５４１３０２．３）を含めて、公的なデータベースにて容易に入手できる。
【００４１】
本発明のＰＤ−Ｌ１の核酸は一般に、ヒトＰＤ−Ｌ１ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、その際、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは好ましくは配列番号１のアミノ酸配列または配列番号１に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列、またはそれらの断片を含む。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは膜結合型、すなわち、膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを含む完全長のＰＤ−Ｌ１である。代わりの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１の少なくともＩｇＶドメインとＩｇＣドメインとを含み、任意でさらにシグナル配列を含む可溶性ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドである。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸１〜２３９を含み、それは完全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１〜７１７に相当する。他の実施形態では、可溶性ＰＤ−Ｌ１ポリペプチドはシグナル配列の全部または一部を欠いてもよい（たとえば、それは配列番号１のアミノ酸１９〜２３９を含んでもよい）。たとえば、その開示が参照によって明白に本明細書に組み入れられる米国特許公開第２０１７／０１８９４７６号を参照のこと。
表１．ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列
ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴ（配列番号１）
【００４２】
一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の核酸はネイティブのＰＤ−Ｌ１の核酸配列（配列番号２）またはその断片と同一である。好ましくは、少なくとも１つの同義核酸置換を行って主題の核酸の投与に続いて内在性のヒトＰＤ−Ｌ１ヌクレオチドから生じる転写物の区別及び検出を可能にし、一層さらに好ましくは複数のそのような同義突然変異を行う。特に好まれる実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の核酸配列のコドンを最適化して発現を改善する。例となる実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の核酸は好ましくは、配列番号３の核酸配列または配列番号３に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を含む。
【００４３】
一部の実施形態では、本発明のＰＤ−Ｌ１ポリペプチドはＦｃ領域またはその一部に融合させてもよい。例となる実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の核酸は配列番号４の核酸配列または配列番号４に対して少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である核酸配列を含む。
【００４４】
本発明のＰＤ−Ｌ１の核酸はエキソン１〜４を全体として、と同様にエキソン５の最初の３５ヌクレオチドを含んでもよい。ＡＴＧ部位（開始コドン）はエキソン２の１３位で見いだされることが言及される。従って、本発明のＰＤ−Ｌ１の核酸は、エキソン２の最後の５２ヌクレオチド、エキソン３及び４のすべて、と同様にエキソン５の最初の３５ヌクレオチドを含んでもよい。
表２．ヒトＰＤ−Ｌ１の核酸配列
ＡＴＧＡＧＧＡＴＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＡＴＡＴＴＣＡＴＧＡＣＣＴＡＣＴＧＧＣＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡＣＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＴＣＡＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＧＧＡＣＣＴＡＴＡＴＧＴＧＧＴＡＧＡＧＴＡＴＧＧＴＡＧＣＡＡＴＡＴＧＡＣＡＡＴＴＧＡＡＴＧＣＡＡＡＴＴＣＣＣＡＧＴＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＴＴＡＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＴＡＡＴＴＧＴＣＴＡＴＴＧＧＧＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＴＡＡＧＡＡＣＡＴＴＡＴＴＣＡＡＴＴＴＧＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＧＧＡＡＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＡＴＡＧＴＡＧＣＴＡＣＡＧＡＣＡＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＧＡＡＡＴＧＣＴＧＣＡＣＴＴＣＡＧＡＴＣＡＣＡＧＡＴＧＴＧＡＡＡＴＴＧＣＡＧＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＴＧＴＡＣＣＧＣＴＧＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＴＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＣＧＡＡＴＴＡＣＴＧＴＧＡＡＡＧＴＣＡＡＴＧＣＣＣＣＡＴＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＣＡＧＴＣＡＣＣＴＣＴＧＡＡＣＡＴＧＡＡＣＴＧＡＣＡＴＧＴＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＧＣＴＡＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＡＧＴＣＡＴＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＡＧＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＧＧＴＡＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＴＴＣＡＡＴＧＴＧＡＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＡＧＡＡＴＣＡＡＣＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＡＴＧＡＧＡＴＴＴＴＣＴＡＣＴＧＣＡＣＴＴＴＴＡＧＧＡＧＡＴＴＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＧＡＡＡＡＣＣＡＴＡＣＡＧＣＴＧＡＡＴＴＧＧＴＣＡＴＣＣＣＡＧＡＡＣＴＡＣＣＴＣＴＧＧＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＧＧＡＣＴＣＡＣＴＴＧＧＴＡＡＴＴＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴＴＡＴＴＡＴＧＣＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＣＡＣＴＧＡＣＡＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＧＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＡＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＡＴＧＴＧＧＣＡＴＣＣＡＡＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＡＡＧＴＧＡＴＡＣＡＣＡＴＴＴＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＴＡＡ（配列番号２）
表３．膜結合型ＰＤ−Ｌ１のコドンを最適化した核酸配列
ＡＴＧＡＧＡＡＴＣＴＴＣＧＣＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＣＣＴＡＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＧＡＡＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＡＣＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＡＣＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＧＴＧＣＡＡＡＴＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＧＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＡＴＴＣＧＴＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＴＣＣＡＧＣＡＴＴＣＧＴＣＡＴＡＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＴＣＧＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＴＡＣＣＧＡＴＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＣＧＧＡＧＴＣＴＡＣＣＧＧＴＧＣＡＴＧＡＴＴＴＣＣＴＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＣＧＣＡＴＴＡＣＣＧＴＧＡＡＧＧＴＣＡＡＣＧＣＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣＣＡＧＣＧＧＡＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＣＧＡＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＡＡＧＣＣＧＡＡＧＧＴＴＡＣＣＣＧＡＡＡＧＣＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＴＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＴＡＡＣＡＧＣＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＴＡＡＣＧＴＧＡＣＣＡＧＣＡＣＴＣＴＴＣＧＧＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＡＣＧＡＧＡＴＴＴＴＣＴＡＣＴＧＴＡＣＣＴＴＴＣＧＣＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＣＴＡＡＣＧＡＡＡＧＡＡＣＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＴＴＧＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＣＣＴＴＣＡＴＴＴＴＴＡＧＧＣＴＣＣＧＡＡＡＧＧＧＣＣＧＣＡＴＧＡＴＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＣＧＧＡＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＣＴＡＡＣＴＣＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧＴＣＣＧＡＴＡＣＴＣＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＡＧ（配列番号３）
表４．Ｆｃ断片と融合させた可溶性ＰＤ−Ｌ１のコドンを最適化した核酸配列
ＡＴＧＡＧＡＡＴＣＴＴＣＧＣＧＧＴＧＴＴＣＡＴＣＴＴＣＡＴＧＡＣＣＴＡＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＧＡＡＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＧＴＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＡＡＧＧＡＣＣＴＣＴＡＣＧＴＣＧＴＧＧＡＡＴＡＣＧＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＧＡＣＣＡＴＣＧＡＧＴＧＣＡＡＡＴＴＣＣＣＡＧＴＧＧＡＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＴＧＣＣＣＴＧＡＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧＧＧＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＡＴＴＣＧＴＧＣＡＴＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＧＴＣＣＡＧＣＡＴＴＣＧＴＣＡＴＡＴＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＣＴＣＧＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣＡＣＴＧＣＡＧＡＴＴＡＣＣＧＡＴＧＴＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＣＧＧＡＧＴＣＴＡＣＣＧＧＴＧＣＡＴＧＡＴＴＴＣＣＴＡＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＣＧＣＡＴＴＡＣＣＧＴＧＡＡＧＧＴＣＡＡＣＧＣＴＣＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＣＣＡＧＣＧＧＡＴＴＣＴＧＧＴＧＧＴＣＧＡＣＣＣＴＧＴＧＡＣＣＴＣＣＧＡＧＣＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＡＡＧＣＣＧＡＡＧＧＴＴＡＣＣＣＧＡＡＡＧＣＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＴＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＣＧＡＣＣＡＣＣＡＧＧＴＣＴＴＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＴＡＡＣＡＧＣＡＡＧＣＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＴＡＡＣＧＴＧＡＣＣＡＧＣＡＣＴＣＴＴＣＧＧＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＡＣＧＡＧＡＴＴＴＴＣＴＡＣＴＧＴＡＣＣＴＴＴＣＧＣＣＧＧＣＴＴＧＡＣＣＣＧＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＴＣＣＣＣＧＡＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＧＣＣＣＡＣＣＣＴＣＣＴＡＡＣＧＡＡＡＧＡＡＣＴＣＣＣＡＡＧＴＣＴＴＧＣＧＡＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＣＧＣＣＣＧＴＧＧＣＧＧＧＣＣＣＣＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＣＧＣＣＧＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＴＣＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＧＡＡＧＴＣＡＣＴＴＧＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＣＧＴＣＡＧＣＣＡＣＧＡＡＧＡＴＣＣＧＧＡＡＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＧＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＡＡＣＡＧＴＡＣＡＡＣＴＣＡＡＣＧＴＡＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＡＣＴＧＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＣＣＡＴＴＴＣＧＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＧＣＡＧＣＣＴＡＧＧＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＣＴＡＴＡＣＣＣＴＣＣＣＧＣＣＣＴＣＡＣＧＡＧＡＴＧＡＡＣＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＴＴＧＡＣＴＴＧＣＣＴＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＡＣＧＧＡＣＡＧＣＣＧＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＴＡＣＴＣＣＧＣＣＣＧＴＧＣＴＴＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＴＴＣＧＴＴＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＴＧＧＣＡＡＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＣＴＣＴＣＧＴＴＧＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＴＡＧ（配列番号４）
【００４５】
遺伝子コードによって定義されているように、特定のタンパク質のアミノ酸配列とそのタンパク質をコードすることができるヌクレオチド配列との間には既知の且つ明確な対応がある。同様に、遺伝子コードによって定義されているように、特定の核酸のヌクレオチド配列とその核酸によってコードされるアミノ酸配列との間には既知の且つ明確な対応がある。
表３
遺伝子コード
アラニン（Ａｌａ、Ａ）ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＴ
アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）ＡＧＡ、ＡＣＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ
アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）ＡＡＣ、ＡＡＴ
アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）ＧＡＣ、ＧＡＴ
システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）ＴＧＣ、ＴＧＴ
グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）ＧＡＡ、ＧＡＧ
グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）ＣＡＡ、ＣＡＧ
グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＴ
ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）ＣＡＣ、ＣＡＴ
イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）ＡＴＡ、ＡＴＣ、ＡＴＴ
ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡ、ＴＴＧ
リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）ＡＡＡ、ＡＡＧ
メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）ＡＴＧ
フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）ＴＴＣ、ＴＴＴ
プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＴ
セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）ＡＧＣ、ＡＧＴ、ＴＣＡ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴ
スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＴ
トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）ＴＧＧ
チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）ＴＡＣ、ＴＡＴ
バリン（Ｖａｌ、Ｖ）ＧＴＡ、ＧＴＣ、ＧＴＧ、ＧＴＴ
【００４６】
遺伝子コードの重要で且つ周知の特徴は、その冗長性であり、それによって、タンパク質を作るのに使用されるアミノ酸のほとんどについて、１を超えるコーディングヌクレオチドのトリプレットが採用されてもよい。従って、多数の異なるヌクレオチド配列が１つの所与のアミノ酸配列をコードしてもよい。そのようなヌクレオチド配列は生物すべてにおいて同一のアミノ酸配列の生成を生じるので、それらは機能的に同等であると見なされる（特定の生物はそれらが他を行うよりも効率的に一部の配列を翻訳してもよいが）。さらに、時折、プリンまたはピリミジンのメチル化された変異体が所与の核酸配列で見いだされてもよい。そのようなメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸の間でのコーディング関係に影響を与えない。
【００４７】
前述の観点で、本発明の融合タンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列（またはその一部）を使用し、ＤＮＡまたはＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳する遺伝子コードを使用して融合タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列を導き出すことができる。同様に、融合タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列については、融合タンパク質またはポリペプチドをコードすることができる対応するヌクレオチド配列は、遺伝子コードから推定することができる（その冗長性のゆえに、所与のアミノ酸配列について複数の核酸配列を生じるであろう）。従って、融合タンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の本明細書での記載及び／または開示は、そのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の記載及び／または開示も含むと見なされるべきである。同様に、本明細書での融合タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列の記載及び／または開示は、そのアミノ酸配列をコードすることができる考えられるヌクレオチド配列すべての記載及び／または開示を含むとも見なされるべきである。
【００４８】
一部の実施形態では、本発明のＰＤ−Ｌ１タンパク質は、シグナル配列が細胞からのポリヌクレオチドの分泌に先立って普通切断されるので、そのようなシグナル配列を含有しない。他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１タンパク質は可溶性であり、すなわち、ＩｇＶドメイン及びＩｇＣドメイン（すなわち、完全長膜結合型ＰＤ−Ｌ１の細胞外部分）から成り、さらに、たとえば、Ｆｃドメイン、タンパク質タグ、コンジュゲート治療剤等のような異種配列を含むことができる。そのような可溶性ＰＤ−Ｌ１のアイソフォームは、当業者に周知の多数の方法における選択的スプライシングによって生成することができる。
【００４９】
好まれる実施形態では、可溶性ＰＤ−Ｌ１は本明細書の図２で説明しているように、完全長膜結合型ＰＤ−Ｌ１ｃＤＮＡのエキソン５の一部とエキソン６及び７の全体との排除を含む。可溶性ＰＤ−Ｌ１アイソフォームはヒトＩｇＧ１のＦｃにＰＤ−Ｌ１のＮ末端領域を融合することによって生成することができ、一部の実施形態では、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）によって連結することができる。好まれる実施形態では、ＩｇＧ１のＦｃを、Ｆｃドメインにおける以下のアミノ酸を変えること：Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３６の欠失、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓによって抗体依存性の細胞障害性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性の細胞障害性（ＣＤＣＣ）を低下させるように変異させることができる。Ｆｃドメインはヒト起源のものであってもよく、ヒトＩｇＧ１のＦｃにも由来してもよい。
【００５０】
核酸送達媒体
効果的な腸管発現を達成するためのＰＤ−Ｌ１の核酸を含む発現ベクターの投与は、当該技術で既知の方法を用いて達成することができる。好まれる実施形態では、主題の核酸送達媒体の投与は消化管に現局される（すなわち、全身性に投与されない）。一実施形態では、核酸送達媒体はウイルスベクターを含む。別の実施形態では、核酸送達媒体はカチオン性リポソームを含む。好まれる実施形態では、核酸送達媒体はキトサンを含む。代わりの実施形態では、たとえば、消化管細菌、バクテリオファージ、ウイルス様粒子、生物リポソーム等のような生物学的な遺伝子送達媒体（ＢＧＶ）を用いて消化管上皮にＰＤ−Ｌ１のポリヌクレオチドを送達する。現在検討中のＢＧＶの概説については、その内容が全体として本明細書に組み入れられるＳｅｏｗ及びＷｏｏｄ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｖｅｈｉｃｌｅｓ  Ｂｅｙｏｎｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７：７６７−７７７（２００９)を参照のこと。
【００５１】
特定の実施形態では、核酸送達媒体はキトサン誘導体、たとえば、追加の官能化を組み込むキトサン、たとえば、連結されたリガンドを伴うキトサンを含む。「キトサン」は本明細書で使用されるとき、共有結合で修飾されたＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン及び／またはＤ−グルコサミン単位を含むキトサン系ポリマー、と同様に他の単位を組み込んでいるまたは他の部分に連結されているキトサン系ポリマーの広いカテゴリーを含むように理解されるであろう。誘導体はグルコサミンのヒドロキシル基またはアミン基の修飾に基づくことが多く、たとえば、アルギニン官能化キトサンで間に合わせる。キトサン誘導体の例には、トリメチル化キトサン、ＰＥＧ化キトサン、チオール化キトサン、ガラクトシル化キトサン、アルキル化キトサン、ＰＥＩ組み込みキトサン、ウロン酸修飾のキトサン、グリコールキトサン、等が挙げられるが、これらに限定されない。キトサン誘導体に関するさらなる教示については、たとえば、「Ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」のｐｐ．６３−７４，Ｋ．Ｔａｉｒａ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｔ．Ｎｉｉｄｏｍｅ（編者），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｔｏｋｙｏ，２００５，ＩＳＢＮ４−４３１−２５１２２−７；Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００７，ｖｏｌ．５２（２３），ｐｐ．３２０７−３２１５；及びＶａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ５５（２００４）７７−９３を参照のこと。
【００５２】
５０％を超える脱アセチル化（ＤＤＡ）の程度のキトサンが本発明で使用され、１％〜５０％の間の官能化を伴う（官能化の百分率はキトサンポリマーにおける遊離のアミノ部分の数に対して決定される）。脱アセチル化及び官能化の程度は官能化キトサン誘導体に特定の電荷密度を付与する。得られる電荷密度は溶解度、核酸の結合及びその後の遊離、ならびに哺乳類の細胞膜との相互作用に影響を及ぼす。従って、本発明によれば、これらの特性は最適な有効性のために最適化されなければならない。例となるキトサン誘導体は、参照によって本明細書に組み入れられる２００７年１月２４日に出願されたＢａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ；１１／６５７，３８２に記載されている。一実施形態では、本明細書に記載されている二重誘導体化キトサンは少なくとも５０％の脱アセチル化の程度を有するキトサンを含む。一実施形態では、脱アセチル化の程度は少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である。好まれる実施形態では、本明細書に記載されている二重誘導体化キトサンは少なくとも９８％の脱アセチル化の程度を有するキトサンを含む。
【００５３】
本明細書に記載されているキトサン誘導体は、中性ｐＨ及び生理的ｐＨで可溶性である平均分子量の範囲を有し、本発明の目的では３〜１１０ｋＤａに及ぶ分子量を含む。本明細書に記載されている実施形態は、誘導体化キトサンの低い平均分子量（＜２５ｋＤａ、約５ｋＤａ〜約２５ｋＤａ）を特徴とし、それは望ましい送達及び形質移入特性を有することができ、サイズが小さく、好ましい溶解度を有する。低い平均分子量の誘導体化キトサンは一般に高い分子量のものよりも可溶性なので、前者は核酸をさらに容易に遊離し、細胞の高い形質移入を提供する核酸／キトサンの複合体を作りだす。
【００５４】
好まれる実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の核酸を含む発現ベクターの投与は、核酸送達媒体としてキトサンまたはキトサン誘導体を用いて達成される。本明細書に記載されているキトサン誘導体は、得られる遊離のアミノ基を正に荷電した及び／または親水性の部分によって官能化することによって生成される。その内容が全体として参照によって本明細書に組み入れられる国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０５０２１８号及びＰＣＴ／ＣＡ２０１４／０５０９２１に記載されている誘導体化されたキトサンは、それらが負に荷電した核酸を効果的に結合し、複合体形成すること、それらが制御可能なサイズのナノ粒子に成形され得ること、それらが細胞によって取り込まれ得ること及びそれらが細胞内で適当な時間に核酸を遊離し得ることを含む、核酸送達媒体にとって有利である多数の特性を有する。
【００５５】
好まれる実施形態では、二重に官能化されているキトサン（「二重官能化キトサン」または「ＤＦ−キトサン」）を指し、たとえば、双方ともキトサンに共有結合するＡｒｇ及び親水性ポリオールの双方と結合している「二重誘導体化キトサン」または「ＤＤ−キトサン」が使用される。Ａｒｇは単一アミノ酸としてまたはポリペプチドとしてキトサンに共有結合されてもよい。親水性ポリオールはたとえば、グルコースのような糖であってもよい。「ＤＤ−キトサン核酸ポリプレックス」またはその文法上の同等物によって、複数のＤＤ−キトサン分子と、ＰＤ−Ｌ１またはその断片をコードする複数の核酸分子とを含む複合体を意味する。好まれる実施形態では、二重誘導体化キトサンはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドをコードする前記核酸と複合体形成する。
【００５６】
ＤＤ−キトサンＰＤ−Ｌ１核酸ポリプレックスはＰＤ−Ｌ１の核酸成分とＤＤ−キトサンの成分とを含む。キトサン、及びＤＤ−キトサン核酸ポリプレックスは当該技術で既知の方法によって調製されてもよい。たとえば、官能化キトサン及びヌクレオチドの原料濃度は種々のアミン対リン酸塩の比（Ｎ／Ｐ）、混合比及び標的ヌクレオチドの濃度を受け入れるように調整されてもよい。ポリプレックス形成のための好まれる方法は、全体として参照によって明白に本明細書に組み入れられるＷＯ２００９／０３９６５７にて開示されている。
【００５７】
発現ベクター及び発現制御領域
本発明は、ＰＤ−Ｌ１の核酸と、プロモーターと、転写及び翻訳の停止シグナルとを含む発現ベクターに関する。種々のヌクレオチド配列及び制御配列を一緒に連結して、１以上の好都合な制限部位を含んでそのような部位でのＰＤ−Ｌ１をコードする核酸の挿入または置換を可能にしてもよい発現ベクターを作り出してもよい。或いは、ＰＤ−Ｌ１の核酸は、ＰＤ−Ｌ１の核酸を含むポリヌクレオチドまたは核酸の構築物を発現のための適当なベクターに挿入することによって発現させてもよい。発現ベクターを作り出すことにおいてＰＤ−Ｌ１のコーディング配列はそれが発現のための適当な制御配列と操作可能に連結されるようにベクターにて局在させる。
【００５８】
発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に供することができ、核酸の発現をもたらすことができる任意のベクター（たとえば、プラスミドまたはウイルス）であってもよい。ベクターの選択は通常、ベクターが導入されることになっている宿主細胞とのベクターの適合性に左右されるであろう。ベクターは線形プラスミドであってもよいし、または閉鎖型環状プラスミドであってもよい。ベクターは自己複製するベクター、すなわち、染色体外の実体として存在するベクターであってもよく、その複製は染色体の複製と無関係であり、たとえば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体または人工染色体であってもよい。ベクターは自己複製を保証する手段を含有してもよい。或いは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに統合されてそれが統合されている染色体（複数可）と一緒に複製されるものであってもよい。さらに、宿主細胞のゲノムまたはトランスポゾンに導入される核酸全体を一緒に含有する単一のベクターもしくはプラスミドまたは２以上のベクターもしくはプラスミドが使用されてもよい。
【００５９】
ベクターは任意で、形質転換された、形質移入された、形質導入された等の細胞の容易な選択を可能にする１以上の選択可能なマーカーを含んでもよい。選択可能なマーカーは、その産物が殺生物性またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する光合成栄養等を提供する遺伝子である。自己複製については、ベクターはさらに、当該宿主細胞にてベクターが自己複製するのを可能にする複製開始点を含んでもよい。複製開始点は細胞で機能する自己複製に介在するプラスミド複製子であってもよい。用語「複製開始点」または「プラスミド複製子」はプラスミドまたはベクターが生体内で複製するのを可能にするポリヌクレオチドを意味する。
【００６０】
好まれる実施形態では、本発明の発現ベクターは、本明細書に記載されているようなＰＤ−Ｌ１ポリペプチドのコーディング領域に操作可能に連結された発現制御領域を含む、ＰＤ−Ｌ１またはその断片をコードする核酸分子を含む。一部の実施形態では、核酸はＤＮＡまたはＲＮＡであり、たとえば、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の核酸は人工的な核酸である。好まれる人工的な核酸には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデートモルフォリノオリゴ（ＰＭＯ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、及びトレオース核酸（ＴＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
具体的な一実施形態では、発現ベクターは本明細書で例示されているようなｐＶＡＸ＿ｈＰＤ−Ｌ１である（図１）。具体的な別の実施形態では、発現ベクターはｐＶａｘ＿ｈＰＤ−Ｌ１  Ｆｃである（図２）。
【００６２】
一部の実施形態では、発現制御領域は構成的な活性を持つ。多数の好まれる実施形態では、発現制御領域は構成的な活性を有さない。これは、ＰＤ−Ｌ１の核酸の動的発現を提供する。「動的」発現によって経時的に変化する発現を意味する。動的発現は、検出可能な発現の期間によって分離される低発現または無発現の幾つかのそのような期間を含んでもよい。多数の好まれる実施形態では、ＰＤ−Ｌ１の核酸は調節可能なプロモーターに操作可能に連結される。これは、核酸分子の調節可能な発現を提供する。発現制御領域は、たとえば、プロモーター及びエンハンサーのような調節性ポリヌクレオチド（本明細書では時には要素とも呼ばれる）を含み、それは操作可能に連結されたＰＤ−Ｌ１の核酸の発現に影響を及ぼす。
【００６３】
本明細書に含まれる発現制御要素は、細菌、酵母、植物または動物（哺乳類または非哺乳類）に由来することができる。発現制御領域は、たとえば、ネイティブのプロモーター及びエンハンサーの要素のような完全長のプロモーター配列と同様に完全長または非変異体の機能の全部または一部を保持する（たとえば、若干量の栄養調節または細胞／組織に特異的な発現を保持する）部分配列またはポリヌクレオチド変異体を含む。本明細書で使用されるとき、用語「機能的な」及びその文法的な変形は核酸の配列、部分配列または断片に関連して使用される場合、その配列がネイティブの核酸配列（たとえば、非変異体または非修飾の配列）の１以上の機能を有することを意味する。本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、配列の置換、欠失もしくは付加、または他の修飾（たとえば、ヌクレアーゼに耐性の修飾された形態のような化学的誘導体）を意味する。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語「操作可能な連結」は、そのように記載されてそれらが意図された方法で機能するのを可能にする成分の物理的並置を指す。核酸との操作可能な連結における発現制御要素の例では、関係は制御要素が核酸の発現を調節するということである。通常、転写を調節する発現制御領域は、転写される核酸の５’末端の近傍（すなわち、「上流」）に並置される。発現制御領域はまた、転写される配列の３’末端（すなわち、「下流」）または転写物内（すなわち、イントロンにて）に局在させることもできる。発現制御要素は転写される配列から少し離れて（たとえば、核酸から１００〜５００、５００〜１０００、２０００〜５０００以上のヌクレオチド）局在させることができる。発現制御要素の具体例は、普通、転写される配列の５’に局在するプロモーターである。発現制御要素の別の例は転写される配列の５’もしくは３’または転写される配列内に局在することができるエンハンサーである。
【００６５】
一部の発現制御領域は操作可能に連結されたＰＤ−Ｌ１の核酸に調節可能な発現を付与する。シグナル（刺激と呼ばれることもある）はそのような発現制御領域に操作可能に連結されたＰＤ−Ｌ１の核酸の発現を増減させることができる。シグナルに応答して発現を増加させるそのような発現制御領域は誘導性と呼ばれることが多い。シグナルに応答して発現を低下させるそのような発現制御領域は抑制性と呼ばれることが多い。通常、そのような要素によって付与される増加または低下の量は存在するシグナルの量に比例し；シグナルの量が多ければ多いほど、発現における増加または低下が大きい。
【００６６】
多数の調節可能なプロモーターが当該技術で知られている。好まれる誘導性の発現制御領域には、小分子化合物によって刺激される誘導性プロモーターを含むものが挙げられる。一実施形態では、発現制御領域は、経口で送達できるが、普通、食物では見いだされない化学物質に応答性である。特定の例は、そのすべてが全体として参照によって本明細書に組み入れられる米国特許第５，９８９，９１０号；同第５，９３５，９３４号；同第６，０１５，７０９号；及び同第６，００４，９４１号にて見いだすことができる。
【００６７】
一実施形態では、発現ベクターはさらに、組み込み配列を含む。一実施形態では、発現ベクターは単一の組み込み配列を含む。別の実施形態では、発現ベクターはＰＤ−Ｌ１の核酸またはその一部を標的細胞のゲノムに組み込むための第１及び第２の組み込み配列を含む。好まれる実施形態では、組み込み配列（複数可）は、マリナー、スリーピングビューティ、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ФＣ３１、Ｒ、ラムダから成る群から選択される組み込みの手段、ならびに、たとえば、ＡＡＶ、レトロウイルス及びレンチウイルスのような組み込みウイルスに由来する組み込みの手段と組み合わせて機能的である。
【００６８】
一実施形態では、主題の組成物はさらに、ＰＤ−Ｌ１の構築物に加えて非治療用構築物を含み、その際、非治療用構築物は、第２の発現制御領域に操作可能に連結される組み込みの手段をコードする核酸配列を含む。この第２の発現制御領域及びＰＤ−Ｌ１の核酸に操作可能に連結される発現制御領域は同一であってもよいし、または異なっていてもよい。組み込みのためにコードされる手段は好ましくは、マリナー、スリーピングビューティ、ＦＬＰ、Ｃｒｅ、ФＣ３１、Ｒ、ラムダ、ならびにたとえば、ＡＡＶ、レトロウイルス及びレンチウイルスのような組み込みウイルスに由来する組み込みの手段から成る群から選択される。
【００６９】
上述されている要素をライゲーションして本発明の組換え発現ベクターを構築するのに使用される手順は当業者に周知であり、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、上記を参照のこと。）さらなる教示については、全体として参照によって本明細書に明白に組み入れられるＷＯ２００８０２０３１８を参照のこと。
【００７０】
医薬製剤
本発明はまた、本発明のＤＤ−キトサン核酸ポリプレックス組成物を含む「薬学上許容できる」または「生理学的に許容できる」製剤も提供する。そのような製剤は、治療方法を実践するために対象に生体内で投与することができる。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、用語「薬学上許容できる」及び「生理学的に許容できる」は、好ましくは過度の有害な副作用（たとえば、吐き気、腹痛、頭痛等）を生じることなく対象に投与することができるキャリア、希釈剤、賦形剤等を指す。投与のためのそのような製剤には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液及びエマルションが挙げられる。
【００７２】
医薬製剤は、対象への投与に適合性であるキャリア、希釈剤、賦形剤、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等から作製することができる。そのような製剤は、錠剤（被覆または非被覆）、カプセル剤（硬質または軟質）、マイクロビーズ、エマルション、粉剤、顆粒、結晶、懸濁液、シロップ剤またはエリキシル剤に含有され得る。追加の活性化合物及び保存剤、とりわけ、添加剤、たとえば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性気体等も存在してもよい。
【００７３】
賦形剤には、塩、等張剤、血清タンパク質、緩衝液または他のｐＨ制御剤、抗酸化剤、増粘剤、非荷電ポリマー、保存剤または凍結保護剤を挙げることができる。本発明の組成物で使用される賦形剤にはさらに、等張剤、及び緩衝液または他のｐＨ制御剤が含まれてもよい。これらの賦形剤は、ｐＨ（約６．０〜８．０）及び浸透圧（約５０〜４００ミリモル／Ｌ）の好まれる範囲の達成のために添加されてもよい。好適な緩衝液の例は、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、及びスルホン化有機分子緩衝液である。そのような緩衝液は０．０１〜１．０％（ｗ／ｖ）の濃度で組成物に存在してもよい。等張剤は、当該技術で既知のもののいずれか、たとえば、マンニトール、デキストロース、グルコース及び塩化ナトリウム、または他の電解質から選択されてもよい。好ましくは、等張剤はグルコースまたは塩化ナトリウムである。等張剤は、それが導入される生物環境のものと同一のまたは類似する浸透圧を組成物に付与する量で使用されてもよい。組成物における等張剤の濃度は、使用される特定の等張剤の性質に左右され、約０．１から１０％に及んでもよい。グルコースが使用される場合、それは好ましくは１〜５％ｗ／ｖ、より詳細には５％ｗ／ｖの濃度で使用される。等張剤が塩化ナトリウムである場合、それは好ましくは１％ｗ／ｖまでの量、特に０．９％ｗ／ｖの量で採用される。本発明の組成物はさらに保存剤を含有してもよい。保存剤の例は、ポリヘキサメチレン−ビグアニジン、塩化ベンザルコニウム、安定化オキシクロロ錯体（たとえば、Ｐｕｒｉｔｅ（登録商標）として知られるもの）、酢酸フェニル水銀、クロロブタノール、ソルビン酸、クロルヘキシジン、ベンジルアルコール、パラベン及びチメロサールである。通常、そのような保存剤は約０．００１〜１．０％の濃度で存在する。さらに、本発明の組成物は、凍結保存剤も含有してもよい。好まれる凍結保存剤は、グルコース、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、ソルビトール、コロイド状二酸化珪素、１００，０００ｇ／モルを下回る好ましい分子量のデキストラン、グリセロール、及び１００，０００ｇ／モルを下回る分子量のポリエチレングリコールまたはそれらの混合物である。最も好まれるのは、グルコース、トレハロース及びポリエチレングリコールである。通常、そのような凍結保存剤は約０．０１〜１０％の濃度で存在する。
【００７４】
医薬製剤は投与の意図される経路と適合性であるように製剤化することができる。たとえば、経口投与については、組成物は賦形剤と共に組み込むことができ、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、たとえば、ゼラチンカプセル剤、またはコーティング、たとえば、腸溶コーティング（ユードラジット（登録商標）またはスレテリック（登録商標））の形態で使用することができる。薬学上適合性の結合剤及び／または補助物質を経口製剤に含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ剤等は、以下の成分または類似の性質の化合物：たとえば、微細結晶性セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンのような結合剤；たとえば、デンプンまたはラクトースのような賦形剤；たとえば、アルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチのような崩壊剤；たとえば、ステアリン酸マグネシウムまたは他のステアリン酸塩のような潤滑剤；たとえば、コロイド状二酸化珪素のような流動促進剤；たとえば、スクロースまたはサッカリンのような甘味剤；または、たとえば、ペパーミント、サリチル酸メチルもしくは香味料のような風味剤のいずれかを含有することができる。
【００７５】
たとえば、埋め込み及び微細被包送達系を含む制御放出製剤のような製剤はまた、身体からの迅速な分解または排除に対して組成物を保護するためのキャリアも含むことができる。たとえば、モノステアリン酸グリセリルまたはステアリン酸グリセリルのような時間遅延物質は単独で、またはワックスと組み合わせて採用されてもよい。
【００７６】
坐薬及び他の直腸で投与できる製剤（たとえば、浣腸によって投与できるもの）も熟考される。さらに直腸送達に関しては、たとえば、Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｃｏｓａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ，  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，２１：１９５−２５６，２００４；Ｗｅａｒｌｅｙ，Ｒｅｃｅｎｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｒｏｕｔｅｓ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，８：３３１−３９４，１９９１を参照のこと。
【００７７】
投与に適した追加の医薬製剤は、当該技術で既知であり、本発明の方法及び組成物に適用できる（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（１９９０）１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２ｔｈ  ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｎ．Ｊ．；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．，（１９９３）を参照のこと）。
【００７８】
腸管投与
主題の組成物は経口で投与されてもよい。経口投与には嚥下が関与してもよいので、化合物は消化管に入る。本発明の組成物は直接消化管に投与されてもよい。注射器、内視鏡、カニューレ、挿管チューブ、カテーテル及び他の物品がそのような投与に使用されてもよい。
経口投与に好適な製剤には、たとえば、錠剤、カプセル剤、微粒子または被覆微粒子を含有する被覆カプセル剤のような固形製剤；液体または粉剤、のど飴（液体で満たしたものを含む）、ガム、多粒子及びナノ粒子、ゲル、フィルム、腔坐剤、及びスプレー剤が挙げられる。
液体製剤には、懸濁液、溶液、シロップ剤及びエリキシル剤が挙げられる。液体製剤は固形物の再構成によって調製されてもよい。
【００７９】
錠剤の剤形は一般に崩壊剤を含有する。崩壊剤の例には、デンプングリコール酸ナトリウム、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、カルシウムカルボキシメチルセルロース、クロスカメロースナトリウム、クロスポビドン、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、微細結晶性セルロース、低級アルキルで置換したヒドロキシプロピルセルロース、デンプン、アルファ化デンプン、及びアルギン酸ナトリウムが挙げられる。一般に、崩壊剤は、剤形の１重量％〜２５重量％、好ましくは５重量％〜２０重量％を構成するであろう。
【００８０】
結合剤は一般に使用されて錠剤製剤に粘着性の性質を付与する。好適な結合剤には、微細結晶性セルロース、ゼラチン、糖類、ポリエチレングリコール、天然ゴム及び合成ゴム、ポリビニルピロリドン、アルファ化デンプン、ヒドロキシプロピルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースが挙げられる。錠剤は、たとえば、ラクトース（一水和物、スプレー乾燥させた一水和物、無水物等）、マンニトール、キシリトール、デキストロース、スクロース、ソルビトール、微細結晶性セルロース、デンプン及び二塩基リン酸カルシウム二水和物のような希釈剤も含有してもよい。
【００８１】
錠剤は任意で、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム及びポリソルベート８０のような表面活性剤、ならびに二酸化珪素及びタルクのような流動促進剤を含んでもよい。存在する場合、表面活性剤は錠剤の０．２重量％〜５重量％を構成してもよく、流動促進剤は錠剤の０．２重量％〜１重量％を構成してもよい。
【００８２】
錠剤はまた一般に、たとえば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリルフマル酸ナトリウム、及びステアリン酸マグネシウムとラウリル硫酸ナトリウムの混合物のような潤滑剤も含有する。潤滑剤は一般に錠剤の０．２５重量％〜１０重量％、好ましくは０．５重量％〜３重量％を構成する。
【００８３】
他の考えられる成分には、抗酸化剤、着色剤、風味剤、保存剤及び味覚マスキング剤が挙げられる。
錠剤ブレンドを直接、またはローラーによって圧縮して錠剤を形成してもよい。打錠する前に、錠剤ブレンドまたはブレンドの一部を代わりに湿式、乾式もしくは融解で造粒してもよく、融解凝結してもよく、または押し出してもよい。最終製剤は１以上の層を含んでもよく、被覆されてもよく、または被覆されなくてもよく；それはさらに被包されてもよい。
【００８４】
錠剤の製剤化は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｖｏｌ．１，ｂｙ  Ｈ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ及びＬ．Ｌａｃｈｍａｎ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）にて議論されている。
【００８５】
ヒト用途または獣医用途のための消耗品の経口フィルムは、速溶性または粘膜接着性であってもよい、通常、成膜ポリマー、結合剤、溶媒、保湿剤、可塑剤、安定剤または乳化剤、粘性改変剤及び溶媒を含む、通常成形しやすい、水溶性または水膨潤性の薄膜剤形である。製剤の一部の成分は１を超える機能を実施してもよい。
【００８６】
本発明に含まれるのはまた、本発明の組成物を含む多粒子ビーズである。
【００８７】
他の考えられる成分には、抗酸化剤、着色剤、風味剤、及び風味向上剤、保存剤、唾液腺刺激剤、冷却剤、共溶媒（油を含む）、皮膚軟化剤、増量剤、消泡剤、界面活性剤及び味覚マスキング剤が挙げられる。
【００８８】
本発明に係るフィルムは通常、剥離できる裏当ての支持体または紙の上に被覆された水性薄膜の蒸発乾燥によって調製される。これは、乾燥オーブンまたは乾燥トンネル、通常、複合コーター乾燥機にて、または凍結乾燥もしくは真空化によって行われてもよい。
経口投与用の固形製剤は即時放出及び／または改変放出であるように製剤化されてもよい。改変放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的化放出、及びプログラム化放出が挙げられる。
【００８９】
たとえば、高エネルギー分散及び浸透圧コーティング粒子のような他の好適な放出技術が知られている。
【００９０】
直腸／膣内の投与
本発明の化合物は、たとえば、坐薬、ペッサリーまたは浣腸の形態で直腸または膣に投与されてもよい。ココアバターは従来の坐薬基剤であるが、種々の代替物が適宜使用されてもよい。
【００９１】
直腸／膣投与用の製剤は即時放出及び／または改変放出であるように製剤化されてもよい。改変放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的化放出、及びプログラム化放出が挙げられる。
【００９２】
炎症性の疾患もしくは状態または症状の進行または悪化を防ぐことまたは抑えることが満足のいく転帰ではあるが、対象を治療するための用量または「有効量」は好ましくは、その状態の症状の１つ、幾つかまたはすべてを測定できるまたは検出できる程度に改善するのに十分である。従って、本発明の方法によって治療できる状態を改善するのに生成されるＰＤ−Ｌ１タンパク質の量はその状態及び所望の転帰に左右されるであろうが、当業者によって容易に確認することができる。適当な量は、治療される状態、所望の治療効果と同様に個々の対象（たとえば、対象内での生体利用効率、性別、年齢等）に左右されるであろう。有効量は関連する生理的な効果を測定することによって確認することができる。
【００９３】
獣医での応用も本発明によって熟考される。従って、一実施形態では、本発明は、治療を必要とする非ヒト哺乳類に本発明のキトサンに基づくナノ粒子を投与することが関与する非ヒト哺乳類を治療する方法を提供する。
【００９４】
治療の方法
主題の組成物及び方法は炎症を調節することにおいて有利に使用される。たとえば、治療用のポリペプチドは炎症反応に関与する細胞の増殖及び分化を抑制してもよい。これらの分子を用いて、感染に関連する炎症（たとえば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ））、虚血性再潅流傷害、エンドトキシン致死性、炎症性腸疾患）ＩＢＤ）、クローン病、大腸炎、またはサイトカイン（たとえば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰産生から生じるものを含む炎症状態、慢性及び急性の状態を治療することができる。本発明における治療について特に関心のある炎症性疾患には、クローン病及び炎症性腸疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
本発明の治療用組成物を用いて臓器拒絶または移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を治療してもよく及び／または予防してもよい。臓器拒絶は、免疫応答を介した移植組織の宿主免疫細胞による破壊によって生じる。同様に、免疫応答はＧｖＨＤにも関与するが、この場合、外来性の移植された免疫細胞が宿主組織を破壊する。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化性を抑制する本発明の治療用組成物の投与は、臓器拒絶またはＧｖＨＤを防ぐことにおいて有効な治療法であってもよい。
【００９６】
本明細書で設定された実施例は、本開示の幾つかの実施形態を説明しているが、いかなる方法でも本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９７】
実施例１
プラスミドの構築及び生産
【００９８】
最適化したＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ１−ＦｃのＤＮＡ配列双方をｐＶＡＸ主鎖のクローニングベクターにクローニングした。プラスミドは、ヒトのサイトメガロウイルス前初期遺伝子のプロモーター（ＣＭＶ）の制御下で、カナマイシン耐性遺伝子（ＫＡＮ）を伴ってプラスミド複製開始点（ｐＵＣ  ｏｒｉ）を含有する。設計したプラスミドはＤＮＡ２．０（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）によって特注合成された。受け取るとすぐに、製造元の推奨に従ってＤＮＡを再構成した。手短には、ＤＮＡを含有する吸収紙を孔あき底（２３Ｇの針で実施した）の０．２ｍＬの小試験管に入れた。次いで小試験管を１．５ｍＬのさらに大きな試験管に入れた。２００μＬの水を吸収紙に加え、ＲＴにて１分間インキュベートした後、試験管を最大速度で１分間遠心分離した。可溶化したＤＮＡを１．５ｍＬの試験管に回収した。次いでＤＮＡを用いて、化学的に適格性がある細菌であるＥ．ｃｏｌｉのＤＨ５αを形質転換した。手短には、無菌条件にて１００μＬの解凍したＥ．ｃｏｌｉのＤＨ５α細胞に１０μＬの溶出したＤＮＡを加えた。氷上での３０分間のインキュベートの後、細胞に４２℃で３０秒間の熱ショックを与え、氷上で２分間インキュベートした。ＤＨ５α形質転換細胞に３０μＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地を加え、８０ｒｐｍの振盪のもとで３７℃にて１時間インキュベートした。次いで、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天プレートに培養物を播き、３７℃で１６時間インキュベートした。翌日、単離した単一のコロニーを用いて、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する６ｍＬのＬＢブロスに植菌した。培養物を振盪器（１８０ｒｐｍ）上で３７℃にて５〜６時間インキュベートした。それに続いて培養物を用いて２．５ＬのＬＢ培地に植菌し、それを振盪器上で３７℃にて１６時間インキュベートした。製造元の指示に従ってＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミドＧｉｇａキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてこの大きな細菌培養物からプラスミドＤＮＡを単離した。単離の際、制限酵素を用いてプラスミド内のＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ１−ＦｃのＤＮＡ挿入物を検証し、断片のサイズをアガロースゲルによって確認した。
【００９９】
実施例２
試験管内でのＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの発現
【０１００】
ポリプレックスに由来する試験管内での発現を評価するために、高グルコースＤＭＥＭ完全培地（１０％のウシ胎児血清、５０単位／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）にてウェル当たり８００，０００個の細胞の密度で６穴組織培養プレートにＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を播き、３７℃及び５％ＣＯ２にて一晩インキュベートした。翌日、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃポリプレックスを３７℃の水槽にて手短に解凍した。各ポリプレックスを、ウェル当たり０．５〜８μｇのＤＮＡに相当する１２．５〜２００μｇ／ｍＬのＤＮＡの濃度に無菌水で希釈し、形質移入まで氷上で保持した。各ウェルからＨＥＫ−２９３Ｔの上清を取り除き、２ｍＬの予め温めたＯｐｔｉＭＥＭで細胞を穏やかに洗浄した。１ｍＬの予め温めたＯｐｔｉＭＥＭを各ウェルに穏やかに加えた。４０μＬの希釈したポリプレックスをウェルに加え、プレートを穏やかに回して適正な混合を確保した。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２にて３時間インキュベートした。インキュベートに続いて、細胞の培養培地をピペッティングで取り除き、２ｍＬの予め温めたＤＭＥＭ完全培地で置き換え、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２にて４８時間インキュベートした。形質移入の４８時間後、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃポリプレックスで形質移入したウェルまたは対照としての形質移入しなかった細胞から細胞培養培地を取り出した。遠心分離（１５００ｒｐｍ、４℃で５分間）によって上清から細胞残渣を取り除き、上清を分析まで−８０℃で保存した。
細胞の総タンパク質を定量するために、ウェルから細胞培養上清を取り除き、形質移入した細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、５００μＬの溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．０、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロールに加えて完全プロテアーゼ阻害剤カクテル）をウェルに加えた。プレートを氷上で２〜３分放置し、細胞スクレーパーを用いて細胞を回収し、１．５ｍＬの微量遠心管に移し、３０分間氷上で放置した。遠心分離（１３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間）によって溶解物から細胞残渣を取り除き、総タンパク質をＬｏｗｒｙアッセイによって測定した。
【０１０１】
ＰＤ−Ｌ１タンパク質の濃度は製造元のプロトコールのようにＥＬＩＳＡによって測定した。手短には、９６穴プレートを抗ヒトＰＤ−Ｌ１捕捉抗体で被覆し、２５℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）２０で洗浄し、ＰＢＳ中１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によって１時間ブロックし、続いて追加の洗浄工程を行った。試料または標準をプレートに加え、２５℃で２時間インキュベートした。ビオチン化ヤギ抗ヒトＰＤ−Ｌ１検出抗体を２時間ウェルに加え、続いて洗浄し及びストレプトアビジン−ＨＲＰを２０分間添加した。ウェルを洗浄し、テトラメチルベンジジン溶液を２０分間加え、ＨＲＰを検出した。２Ｎの硫酸の添加によって反応を終了させ、４５０ｎｍにてＳｏｆｔＭａｘＰｒｏソフトウェアを用いてＳｐｅｃｔｒａＭＡＸＰｌｕｓ（ＥＮＧ０２１４）にてプレートを読み取った。製造元から提供された凍結乾燥した標準タンパク質を用いてＰＤ−Ｌ１タンパク質のレベルを算出した。タンパク質試料は標準４パラメーターのロジスティック曲線に適合させた。ある場合には、ＰＤ−Ｌ１タンパク質のレベルは形質移入した細胞における総タンパク質に対して基準化し、細胞の総タンパク質のｍｇ当たりのＰＤ−Ｌ１−Ｆｃのｎｇとして表した。
【０１０２】
ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃポリプレックスの形質移入能力を評価するために、ＤＤ−Ｘポリマー内に含有された、漸増量のＤＮＡによってＨＥＫ−２９３Ｔに形質移入した。ＰＤ−Ｌ１タンパク質の定量は、漸増量のｐＶＡＸ−ｏｐｔ−ｈＰＤ−Ｌ１−ＦｃプラスミドＤＮＡによるｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの発現の用量依存性の増加を示した（図４Ａ）。ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（ｎｇ／ｍｇ）の最大発現は形質移入間にて若干の変動を示したが、ＥＣ５０は独立した形質移入間で類似した（図４Ｂ）。
【０１０３】
実施例３
Ｆｃ融合タンパク質（ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ）の精製
ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ，Ｍｕｌｔｉｃｅｌｌ）にて５×１０６個の細胞／フラスコでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＴ７５フラスコに入れ、３７℃でインキュベートした。翌日、製造元によって推奨されたようにリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＤ−Ｌ１−ＦｃプラスミドＤＮＡ（９μｇ／フラスコ、フラスコ当たり３ｍＬ）で細胞に形質移入し、３７℃でインキュベートした。２４時間後、ＤＭＥＭを１２ｍＬのＥＸＣＥＬＬ無血清培地（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と交換した。４８時間後（形質移入の７２時間後）、上清を回収し、精製まで−２０℃で保存した。製造元によって推奨されたようにプロテインＧ  ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ）を用いてＦｃ融合タンパク質を精製した。次いでＰＤ−１０脱塩カラムを用いて緩衝液を交換し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）の４つの分画でタンパク質を溶出した。タンパク質の存在はクマシー染色によって検出した。分画のそれぞれにおけるＰＤＬ１の濃度は製造元によって推奨されたようにＥＬＩＳＡ（Ｄｕｏｓｅｔ、Ｒ＆Ｄ）によって測定した。
【０１０４】
実施例４
試験管内でのＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの機能性アッセイ
【０１０５】
Ｆｃ融合したＰＤ−Ｌ１構築物の機能性を評価するために、５μｇ／ｍｌの試験管内の無血清培地で産生されたＰＤＬ１−Ｆｃまたは市販のｒｈＰＤＬ１−Ｆｃ（Ａｄｉｐｏｇｅｎ）の有無にて抗マウスＣＤ３（０．２μｇ／ｍＬ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び／または抗マウスＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、９６穴平底プレートのウェルにおけるＰＢＳ（５０μｌ／ウェル）に加えた。ｒｈＩｇＧ１−Ｆｃ（Ａｄｉｐｏｇｅｎ）を陰性対照として使用した。
【０１０６】
プレートを中程度の速度でのプレート振盪器に１時間載せ、次いで４℃で一晩インキュベートした。翌日、３匹のマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から脾臓を取り出した。顕微鏡スライドのすりガラス末端で脾臓を粉砕することによって脾細胞を単離した。５ｍＬの手製のＡＣＫ溶解緩衝液にて１分間で赤血球を溶解し、４５ｍＬのＰＢＳ（１０％ＦＢＳ）を加えることによって溶解を止めた。遠心分離及びデカントの後、補完したＲＰＭＩ培地（１０％ＦＢＳ、ＮＥＡＡ、Ｌ−グルタミン、２−ＭＥ；Ｍｕｌｔｉｃｅｌｌ）に３匹のマウスに由来する細胞を再懸濁させ、プールし、計数し、適当な濃度に調整した。細胞の一部を製造元によって推奨されたようにＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって染色した。ピペッティングによってａＣＤ３／ａＣＤ２８の９６穴プレートからＰＢＳを慎重に取り除いた。次いでウェルのＲＰＭＩ培地に細胞を播き（２００，０００個の細胞／ウェル）、３７℃で３または４日間インキュベートした。いずれかの時点で細胞を新しい９６穴Ｖ底プレートに移し、暗所にて氷上で固定できる生細胞識別色素（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で３０分間染色した。細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ２％ＦＢＳ）で２回洗浄し、フローサイトメーターで（ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩ）取得した。細胞の増殖は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレットチャンネルで細胞分裂のピークをモニターすることによって測定した。細胞の活性化はＦＳＣ−ＳＳＣのゲートで細胞のサイズを検出することによって測定した。
【０１０７】
ｏｐｔ−ｈＰＤ−Ｌ１−ＦｃがヒトのＰＤ−１受容体に結合し、細胞内シグナルを活性化するかどうかを判定するために、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  Ｊｕｒｋａｔ  ＰＤ−１（ＳＨＰ２）シグナル伝達アッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を使用した。このアッセイを試してみる前に、精製したＰＤ−Ｌ１−Ｆｃタンパク質の大規模バッチを生成した。手短には、ＰＤ−Ｌ１−ＦｃプラスミドＤＮＡによってＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に形質移入することによって構築物からＰＤ−Ｌ１−Ｆｃを発現させた。手短には、Ｔ１７５フラスコにおける３０ｍｌのＤＭＥＭ（Ｍｕｌｔｉｃｅｌｌ）完全培地（１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍlのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）に３．９×１０５個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を入れ、３７℃及び５％ＣＯ２にて一晩インキュベートした。翌日、培地をフラスコから吸引し、細胞を１０ｍlのＰＢＳ（Ｍｕｌｔｉｃｅｌｌ）で１回洗浄した。５．５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）にてリポフェクトアミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；フラスコ当たり１００μｌ）を用いて４９μｇのＰＤ−Ｌ１−Ｆｃプラスミドによって細胞に形質移入した。細胞を２時間インキュベートし（３７℃及び５％ＣＯ２）、次いで４０ｍｌのＤＭＥＭ完全培地をフラスコに加えた。細胞を２４時間インキュベートし、培地を吸引し、細胞を１０ｍＬのＰＢＳで洗浄した。ＥＸＣＥＬＬ無血清培地（４５ｍＬ；Ｓｉｇｍａ）をフラスコに加え、３７℃及び５％ＣＯ２にてインキュベートした。２４時間後（形質移入の４８時間後）、上清を取り出し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞残渣を取り除いた。上清を新しい５０ｍＬの試験管に移し、−８０℃で保存した。ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃは製造元によって推奨されたようにプロテインＧ  ＨｉＴｒａｐカラム（ＧＥ）を用いて精製した。製造元によって推奨されたようにＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いて緩衝液をＰＢＳと交換した。タンパク質が濃縮され、定量されるまでＰＤ−Ｌ１−Ｆｃを−８０℃で保存した。製造元によって推奨されたようにＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ）を用いてＰＤ−Ｌ１−Ｆｃタンパク質を濃縮した。ＰＤ−Ｌ１  ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）によって速やかにタンパク質を定量した。場合によっては、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの濃縮物をＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに希釈し、−８０℃で保存した。
【０１０８】
ヒトＰＤ−Ｌ１受容体を介した細胞内の活性化を評価するために、製造元によって推奨されたようにＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ細胞を培養した。細胞を遠心分離し、予め温めたＡｓｓａｙ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｌａｔｉｎｇ試薬に再懸濁させた。細胞を白色９６穴平底組織培養プレートのウェルに播き（５０μｌ／ウェル；２０，０００個の細胞／ウェル）、室温で１５分間インキュベートした。抗ＰＤ−１（クローンＮＡＴ１０５、Ａｂｃａｍ）の有無にてＡｓｓａｙＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｌａｔｉｎｇ試薬（１０μｌ／ウェル）をウェルに加えた。精製したＰＤ−Ｌ１−Ｆｃタンパク質または組換えの非溶解性ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ（Ａｄｉｐｏｇｅｎ）をＡｓｓａｙＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｌａｔｉｎｇ試薬にて調製し、細胞に加えた（５０μｌ／ウェル）。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２にて４０分間インキュベートした。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒバイオアッセイ試薬１を細胞に加え（１０μｌ／ウェル）、プレートを３５０ｒｐｍで１分間、プレート振盪器の上に置いた。細胞を室温で暗所にて１５分間インキュベートした。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒバイオアッセイ試薬２（４０μｌ）を各ウェルに加え、細胞を室温で暗所にて１時間インキュベートした。ルミノメーター（ｅｎＳｐｉｒｅ−Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）にて発光を読み取った。データは無刺激の対照と比べた発光（ＲＬＵ；相対蛍光単位）として解析した。データは平均値±標準偏差として提示した。スチューデントのｔ検定を用いてデータを解析し、星印は統計的な有意差を表す（＊、ｐ≦０．０５；＊＊、ｐ≦０．０１；＊＊＊、ｐ≦０．００１）。
【０１０９】
前述の結果をここで要約する。ｐＶＡＸ−ｏｐｔ−ｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃプラスミドから発現させたタンパク質がヒトＰＤ−１受容体に結合し、細胞内シグナル伝達を開始するかどうかを判定するために、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  Ｊｕｒｋａｔ  ＰＤ−１（ＳＨＰ２）シグナル伝達アッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を使用した。ＰＤ−１受容体を介したシグナル伝達は、精製ＰＤＬ１−Ｆｃの用量の増加に伴って上昇し、１４．７μＭ（７８３μｇ／ｍｌ；図６Ａ）の最大用量でプラトーに達すると思われた。この用量依存性の発光の誘導がＰＤＬ１とＰＤ−１の特異的な相互作用のせいであったことを確かにするために、競合アッセイを利用した（図６Ｂ）。組換えＩｇＧ１−Ｆｃではなく精製ＰＤＬ１−ＦｃによるＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ細胞の刺激が発光の上昇を生じたということは、シグナルの誘導がＰＤ−Ｌ１タンパク質に融合させたＦｃ断片へのＰＤ−１の結合が原因で生じるのではないことを示している。さらに、ＰＤＬ１−Ｆｃが誘導する発光は、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃによる刺激に先立って細胞が抗ヒトＰＤ−１と共にインキュベートされる場合に抑制されるということは、ＰＤ−１受容体を介した結合及びシグナル伝達はＰＤＬ１とＰＤ−１の特異的な相互作用のせいであったことを示している。
【０１１０】
実施例５
野生型膜結合型のＰＤ−Ｌ１の試験管内発現及び機能性アッセイ
【０１１１】
細胞表面でのｈＰＤ−Ｌ１発現の動態を究明するために、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を６穴プレートに播き（４００，０００個の細胞／ウェル；２ｍＬ；ＤＭＥＭ１０％ＦＢＳ）、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、製造元によって推奨されたようにリポフェクトアミン２０００によって野生型ＰＤ−Ｌ１構築物プラスミドまたはｐＶＡＸ対照で細胞に形質移入した。形質移入の２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、酵素を含まない解離緩衝液（ＥＦＤＢ、Ｇｉｂｃｏ；２ｍｌ／ウェル）を加え、３７℃で５分間インキュベートし、プレートから離して細胞を穏やかにピペッティングすることによって再懸濁させた。細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）にて再懸濁させた。９６穴平底プレートにて細胞を再び播き（１０，０００個の細胞／ウェル）、２〜５日間培養した。各時点で上清を取り出し、上述されているようなＥＦＤＢにて細胞を再懸濁させ、ＦＡＣＳ染色のために細胞を９６穴Ｖ底プレートに分配した。細胞を氷上にて暗所で３０分間、０．２ｎｇ／ウェルでの抗ヒトＰＤ−Ｌ１−ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）及び供給業者によって推奨されたような固定できる生細胞識別色素、ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）によって細胞を染色した。細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、フローサイトメーターで取得した。
【０１１２】
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の表面で発現されたｈＰＤ−Ｌ１の機能性を調べるために、ＰＤ−１結合アッセイを採用した。上述されているように６穴プレートにてＮＩＨ／３Ｔ３細胞に形質移入した。形質移入の４８時間後、細胞を上記に記載されているようにＥＦＤＢに再懸濁させ、遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、９６穴Ｖ底プレートに播いた。細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、デカントし、種々な濃度のｒｈＰＤ−１（Ｒ＆Ｄ）を用いて、または用いずに再懸濁させ（５０ｕｌ）、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、氷上で暗所にて３０分間、抗ヒトＰＤＬ１−ＰＥ（０．２ｎｇ／ウェル）またはアイソタイプ対照、０．８ｎｇ／ウェルの抗ヒトＰＤ−１−ＡＰＣ（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）またはアイソタイプ対照、及び生細胞識別色素で染色した。次いで、細胞を２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターを用いて取得した。データはＦｌｏｗＪｏ  １０．２［ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｏｒ．ＣＡ）を用いて解析した。
【０１１３】
実施例６
生体内での有効性試験
【０１１４】
ＧｖＨＤのモデル
【０１１５】
１０週齢のメスＢＡＬＢ／ｃＳＰＦマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）は、１回目の照射を−１日目の午後に行い、２回目の照射を０日目の午前に行った２×３５０ｃＧｙの分割線量で７００ｃＧｙの合計全身照射（ＲＳ２０００  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＲｅｓｅａｒｃＸ線源）を受けた。８〜１０週齢のオスＣ５７Ｂｌ６／ｊマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）をドナー細胞に使用した。
【０１１６】
試験には、３つの対照群（ｎ＝５）：非照射群、非移植群、１０００万個のＢＭＴのみの群；及び１０００万個のＢＭＴ及び２５０万個の脾細胞を受け取った４つの処理群（ｎ＝８）が含まれる。１日目に開始して、マウスはその後６週間（合計７回投与）週に１回浣腸によって処理され、または未処理のままにした。体重および臨床兆候について動物を毎日モニターした。２５％を超える体重減少及び８以上の臨床得点を持つ動物は終了させた。
【０１１７】
ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ１−Ｆｃのポリプレックスの毎週の結腸内投与は、ｐＶＡＸによる対照処理動物に比べて体重減少を減らした（図９Ａ、１０Ａ、１０Ｂ及び１１Ａ）。ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ１−Ｆｃを受け取ったマウスは、ＧｖＨＤに関連する臨床兆候での軽減も示し（図９Ｂ）、未処理及びｐＶＡＸ対照処理の動物に比べて生存を改善した（図９Ｃ、１０Ｃ及び１１Ｂ）。理論に束縛されないで、Ｔ細胞が消化管を通るとき、それらはＰＤ−Ｌ１ポリペプチドにさらされ、「寛容化」されることが本明細書で熟考される。消化管を離れる際、Ｔ細胞は循環に入り、エフェクターＴ細胞の機能を抑制することができる。寛容化されたＴ細胞は調節性Ｔ細胞のサブセットの上方調節を生じてもよく、及び／または病原性のエフェクター細胞の減少または抑制を生じてもよい。さらに、ＰＤ−Ｌ１は上皮の修復に重要である分子を上方調節することが示されている。理論に束縛されないで、照射及び疾患に続いて消化管のバリア機能に損傷があることを考えると、上皮修復の増加をもたらすＰＤ−Ｌ１の増加は腸管のバリア機能の回復にも役立ってもよいという結果になることも本明細書で熟考される。
【０１１８】
実施例７
Ｔ細胞大腸炎モデル
【０１１９】
磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用い陰性選択を介して６〜８週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から全ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。続いて、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＡｒｉａＴＭ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、ＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢ高ナイーブＴ細胞について濃縮細胞を選別した。５×１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ４５ＲＢ高細胞をレシピエントの６〜８週齢のメスＢ１０−ＲＡＧ２欠損マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ）に腹腔内（ＩＰ）で移入した。
【０１２０】
動物の体重および臨床兆候を週に２〜３回モニターした。１４日目に、ＣＤ４について染色したフローサイトメトリーによってＣＤ４Ｔ細胞の存在を確認した。Ｔ細胞の移入後、１５または１９日目に毎週の浣腸処理を開始した（合計６または７回の処理）。体重および臨床兆候について週２回動物をモニターした。２５％を超える体重減少及び重篤な臨床兆候を持つ動物は終了させた。
【０１２１】
結腸内点滴によるＰＤ−Ｌ１−Ｆｃポリプレックスの毎週の投与は、ｐＶＡＸ及びスクロースの対照マウスと比べてＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ処理マウスにて体重減少及び疾患の臨床兆候を減らした（図１３Ｃ−Ｄ）。さらに、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃポリプレックスによる処理は対照群と比べてマウスの生存を改善した（図１３Ｅ）。
【０１２２】
本開示は好まれる実施形態を参照して記載されてきた一方で、本開示の範囲から逸脱することなく種々の変更を行い、同等物がその要素に置き換えられて特定の状況に適合させてもよいことが当業者によって理解されるであろう。従って、本開示は、本開示を実施するために熟考された最良の形態として開示されている特定の実施形態に限定されないが、本開示は添付のクレームの範囲及び精神の範囲内に入る実施形態すべてを含むであろうことが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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