(57)【要約】  本発明で開示するのは、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートである。このコンジュゲートは、ターゲティング部分と、１つ以上のポリマーと、１つ以上の治療剤を含む。本明細書に記載されているのは、そのコンジュゲートを含む組成物と、その調製方法と、そのコンジュゲートまたはその組成物で様々な疾患を治療する方法でもある。この要約書は、特定の技術分野で研究を行うための選別手段として意図されており、本発明を限定するようには意図されていない。【選択図】図１
2019534889.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲティング抗体と、
前記ターゲティング抗体に結合しているセミテレケリックポリマーと、
前記セミテレケリックポリマーに結合している治療剤と、
を含む抗体−ポリマー−薬物コンジュゲート。
【請求項２】
前記ターゲティング抗体の分子量が１００ｋＤａ超である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記ターゲティング抗体が、ウサギモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体または完全ヒトモノクローナル抗体である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記ターゲティング抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記ターゲティング抗体が、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、モタビズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、ＯＶ−ＴＬ−１６、パリビズマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブまたはウステキヌマブである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記ターゲティング抗体がＢリンパ球抗原と特異的に結合する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記Ｂリンパ球抗原がＣＤ２０である、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記ターゲティング抗体が抗ＣＤ２０モノクローナル抗体である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記抗ＣＤ２０モノクローナル抗体が、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブまたはその生物活性バリアントである、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
前記抗ＣＤ２０モノクローナル抗体がリツキシマブである、請求項８に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
前記ターゲティング抗体がＯＡ−３抗原と特異的に結合する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
前記ターゲティング抗体が抗ＯＡ−３モノクローナル抗体である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
前記抗ＯＡ−３モノクローナル抗体が、ＯＶＴＬ−１６またはその生物活性バリアントである、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
前記ターゲティング抗体がＨＥＲ２レセプターと特異的に結合する、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
前記ターゲティング抗体が抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
前記抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体が、トラスツズマブもしくはペルツズマブ、またはその生物活性バリアントである、請求項１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
前記抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体がトラスツズマブである、請求項１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
前記ターゲティング抗体の重量平均分子量（Ｍｗ）が約４０，０００ｇ／モル〜約１６０，０００ｇ／モルである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
前記１つ以上の治療剤が、治療剤連結基を介して、前記１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれに連結している、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
前記治療剤連結基が、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ、Ｎ−アミノカプロイル−Ｖａｌ−シトルリンまたはこれらを組み合わせたものである、請求項１９に記載の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲート。
【請求項２１】
前記１つ以上の治療剤が抗がん剤である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
前記抗がん剤が、タキサン、アントラサイクリン、化学療法剤、チューブリン重合インヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、これらのアナログまたはこれらを組み合わせたものである、請求項２１に記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
前記１つ以上の治療剤がエピルビシンである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
前記１つ以上の治療剤がパクリタキセルである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
前記１つ以上の治療剤のそれぞれが独立して、タキサン、アントラサイクリン、化学療法剤、チューブリン重合インヒビター、トポイソメラーゼインヒビターまたはこれらのアナログからなる群から選択した抗がん剤である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
前記１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれが、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）モノマーの残基、下記の式Ｉによる構造を有するモノマーの残基であって、
2019534889.tif 000029
式中、
Ｒ1が、水素またはメチルであり、
Ｘが、酸素またはＮＲ1’であり、
そのＲ1’が、水素またはアルキル基であり、
Ｌが、アルキル基またはアリール基であり、
Ｙが親水性基である残基、
またはＨＰＭＡの残基と、式Ｉによる構造を有するモノマーの残基を組み合わせたものを少なくとも４５モル％含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
前記１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれの分子量が約２ｋＤａ〜約６０ｋＤａの範囲である、１に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
前記１つ以上の治療剤のそれぞれの分子量が５ｋＤａ以下である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
分子量が約２０ｋＤａ〜約６０ｋＤａの範囲であるＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）を前記セミテレケリックポリマーのそれぞれが含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
前記セミテレケリックポリマーのそれぞれが、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ジエチレングリコールモノメタクリレート、トリエチレングリコールモノメタクリレート、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、Ｎ−アルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、アクリル酸のエステル、メタクリル酸のエステル、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、ノルボルネン及びこれらを組み合わせたものから選択した構成要素であるモノマーの残基を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
前記１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれが、２つ以上の治療剤にコンジュゲーションされている、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
前記１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれが、２〜１２個の治療剤にコンジュゲーションされている、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
前記１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれがさらに、その官能性末端に抗体連結末端基を含む、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
前記抗体連結末端基が、
2019534889.tif 000030
またはこれらを組み合わせたものであり、
式中、Ｒ2とＲ3が独立して、Ｈ、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｃ6Ｈ5Ｓ、ＣＨ3Ｃ6Ｈ5ＳまたはＴｓから選択されていることができ、
ＸとＹが独立して、ＮＨ、Ｏ、ＳまたはＳｅから選択されていることができ、
ＺがＮまたはＣを含むことができ、
「ポリマー」が、前記抗体連結末端基の結合先である前記セミテレケリックポリマーを表している、請求項３１に記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
前記抗体連結末端基がマレイミドである、請求項３３に記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
前記抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの多分散性が、１．８以下である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３７】
前記抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの多分散性が１．１〜１．８である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３８】
前記１つ以上のセミテレケリックポリマーの多分散性が１．４５以下である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３９】
請求項１に記載のコンジュゲートと、製薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項４０】
静脈内投与または腫瘍内注射用に調合されている、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記１つ以上の治療剤が抗がん剤であり、前記医薬組成物が、静脈内投与用に調合されている、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記ターゲティング抗体がリツキシマブであり、前記セミテレケリックポリマーがＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドであり、前記治療剤がエピルビシンである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４３】
前記ターゲティング抗体がハーセプチンであり、前記セミテレケリックポリマーがＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドであり、前記治療剤がエピルビシンである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４４】
前記ターゲティング抗体がＯＶ−ＴＬ１６であり、前記セミテレケリックポリマーがＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドであり、前記治療剤がエピルビシンである、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項４５】
対象のがんの治療方法であって、
（ａ）治療が必要な患者を特定することと、
（ｂ）前記対象に、請求項３９に記載の医薬組成物を治療有効量投与することと、
を含む前記方法。
【請求項４６】
前記対象がヒト対象である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記がんが、原発腫瘍、二次性腫瘍、難治性腫瘍または再発腫瘍である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記原発腫瘍、二次性腫瘍、難治性腫瘍または再発腫瘍が血液細胞腫瘍である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記血液細胞腫瘍がリンパ腫である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記リンパ腫が非ホジキンリンパ腫である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記非ホジキンリンパ腫が、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫またはバーキットリンパ腫である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記がんが、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、胃癌、肺癌、子宮癌または胆嚢である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記がんが、ＨＥＲ２、ＣＤ２０またはＯＡ−３の発現と関連している、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの一部として、前記抗がん剤を投与すると、前記抗がん剤を単独で投与するか、または抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの一部として投与しないときと比べて、前記抗がん剤の有効性が向上するか、または副作用が軽減する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記ターゲティング抗体が結合できる標的細胞に、前記１つ以上の治療剤を局所送達する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
標的細胞のリソソーム内で、前記１つ以上の治療剤を放出する、請求項３８に記載の方法。
【請求項５７】
請求項１に記載のコンジュゲートと、検出可能な標識とを含む分子プローブ。
【請求項５８】
前記標識が前記ターゲティング抗体に結合されている、請求項５７に記載の分子プローブ。
【請求項５９】
前記抗体の遊離チオールと、ポリマー−薬物コンジュゲートの求電子基とを反応させることによって、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートを形成する工程を含む、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの作製方法。
【請求項６０】
前記反応工程の前に、前記抗体を還元剤で処理することによって、前記遊離チオールをもたらす、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポリマー−薬物コンジュゲートが、治療剤連結基を介してセミテレケリックポリマーに連結している治療剤を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記求電子基がマレイミド官能基である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記セミテレケリックポリマーが、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ジエチレングリコールモノメタクリレート、トリエチレングリコールモノメタクリレート、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、Ｎ−アルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、アクリル酸のエステル、メタクリル酸のエステル、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ−ビニルピロリドンもしくはノルボルネン、またはこれらを組み合わせたもののコポリマーである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記セミテレケリックポリマーが、治療剤連結基を介して治療剤に連結しているアクリルアミドのモノマーの残基を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記治療剤連結基がオリゴペプチドである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記治療剤連結基が、生理的条件下で安定しており、リソソーム区画内で切断される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記治療剤連結基がグリシルフェニルアラニルロイシルグリシンである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
治療剤連結基を介して治療剤に連結している前記アクリルアミドが、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＥＰＩであり、下記の構造を有する、請求項６４に記載の方法。
2019534889.tif 000031
【請求項６９】
前記セミテレケリックポリマーを可逆的付加開裂連鎖移動剤重合（ＲＡＦＴ）または原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）によって作製する、請求項５９に記載の方法。
【請求項７０】
前記セミテレケリックポリマーが、下記の構造を有する、請求項５９に記載の方法。
2019534889.tif 000032
【請求項７１】
前記治療剤がアントラサイクリンである、請求項５９に記載の方法。
【請求項７２】
前記治療剤が、エピルビシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン及びイダルビシンから選択されている、請求項５９に記載の方法。
【請求項７３】
前記治療剤が、アミン担持薬物の残基である、請求項５９に記載の方法。
【請求項７４】
前記治療剤が、パクリタキセル、ナブパクリタキセル、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、バッカチンＩＩＩ、パクリタキセルＣ及び７−エピパクリタキセルから選択されている、請求項５９に記載の方法。
【請求項７５】
前記治療剤が、ヒドロキシ担持薬物の残基である、請求項５９に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗体がリツキシマブである、請求項５９に記載の方法。
【請求項７７】
前記抗体が、ＣＤ２０、ＨＥＲ２及び／またはＯＡ−３と結合する、請求項５９に記載の方法。
【請求項７８】
前記抗体が、がん細胞と関連するタンパク質と結合する、請求項５９に記載の方法。
【請求項７９】
ポリマー−薬物コンジュゲートを求電子基で官能化する工程を含む、セミテレケリックポリマーの作製方法。
【請求項８０】
前記求電子基がマイケルアクセプターである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記求電子基がマレイミドである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記ポリマー−薬物コンジュゲートをＮ−（アミノアルキル）マレイミドで官能化する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記ポリマー−薬物コンジュゲートが、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）モノマーと、治療剤連結基を介して治療剤に連結しているアクリルアミドのモノマーのコポリマーである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
前記治療剤連結基がオリゴペプチドである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記治療剤連結基が、生理的条件下で安定しており、リソソーム区画内で切断される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記治療剤連結基がグリシルフェニルアラニルロイシルグリシンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記治療剤がアントラサイクリンである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
前記治療剤が、エピルビシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン及びイダルビシンから選択されている、請求項８３に記載の方法。
【請求項８９】
前記治療剤が、アミン担持薬物の残基である、請求項８３に記載の方法。
【請求項９０】
前記治療剤が、パクリタキセル、ナブパクリタキセル、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、バッカチンＩＩＩ、パクリタキセルＣ及び７−エピパクリタキセルから選択されている、請求項８３に記載の方法。
【請求項９１】
前記治療剤が、ヒドロキシ担持薬物の残基である、請求項８３に記載の方法。
【請求項９２】
前記抗体がリツキシマブである、請求項８３に記載の方法。
【請求項９３】
前記抗体が、ＣＤ２０、ＨＥＲ２及び／またはＯＡ−３と結合する、請求項８３に記載の方法。
【請求項９４】
前記抗体が、がん細胞と関連するタンパク質と結合する、請求項８３に記載の方法。
【請求項９５】
そのターゲティング抗体のシステイン残基を介してポリマーに結合しているターゲティング抗体と、
生理的条件下で安定しており、リソソーム区画内で切断されるオリゴペプチドを介して、前記ポリマーに結合している治療剤と、
を含む抗体−ポリマー−薬物コンジュゲート。
【請求項９６】
遊離チオールと、前記ポリマーの求電子基との反応を介して、前記抗体が前記ポリマーに結合されている、請求項９５に記載のコンジュゲート。
【請求項９７】
前記ポリマーが、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ジエチレングリコールモノメタクリレート、トリエチレングリコールモノメタクリレート、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、Ｎ−アルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、アクリル酸のエステル、メタクリル酸のエステル、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ−ビニルピロリドンもしくはノルボルネン、またはこれらを組み合わせたもののコポリマーである、請求項９５に記載のコンジュゲート。
【請求項９８】
前記ポリマーが、前記オリゴペプチドを介して前記治療剤に連結しているアクリルアミドモノマーの残基を含む、請求項９５に記載のコンジュゲート。
【請求項９９】
前記オリゴペプチドがグリシルフェニルアラニルロイシルグリシンである、請求項９８に記載のコンジュゲート。
【請求項１００】
前記オリゴペプチドを介して前記治療剤に連結している前記アクリルアミドが、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＥＰＩであり、下記の構造を有する、請求項９８に記載のコンジュゲート。
2019534889.tif 000033
【請求項１０１】
前記ポリマーが、下記の構造を有する、請求項９５に記載のコンジュゲート。
2019534889.tif 000034
【請求項１０２】
前記治療剤がアントラサイクリンである、請求項９５に記載のコンジュゲート。
【請求項１０３】
前記治療剤が、エピルビシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン及びイダルビシンから選択されている、請求項９５に記載のコンジュゲート。
【請求項１０４】
前記治療剤が、パクリタキセル、ナブパクリタキセル、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、バッカチンＩＩＩ、パクリタキセルＣ及び７−エピパクリタキセルから選択されている、請求項９５に記載のコンジュゲート。
【請求項１０５】
前記抗体がリツキシマブである、請求項９５に記載のコンジュゲート。
【請求項１０６】
前記抗体がＣＤ２０、ＨＥＲ２及び／またはＯＡ−３と結合する、請求項９５に記載のコンジュゲート。
【請求項１０７】
下記の構造を有し、
2019534889.tif 000035
式中、Ａｂがターゲティング抗体であり、
ｐが、前記抗体にコンジュゲーションしているポリマーの平均数である、
請求項９５に記載のコンジュゲート。
【請求項１０８】
前記ポリマーが、前記オリゴペプチドを介して前記治療剤に連結しているアクリルアミドのモノマーの残基を含む、請求項１０７に記載のコンジュゲート。
【請求項１０９】
前記ポリマーが、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）の残基を含む、請求項１０７に記載のコンジュゲート。
【請求項１１０】
前記オリゴペプチドがグリシルフェニルアラニルロイシルグリシンである、請求項１０７に記載のコンジュゲート。
【請求項１１１】
前記治療剤が、エピルビシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、パクリタキセル、ナブパクリタキセル、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、バッカチンＩＩＩ、パクリタキセルＣ及び７−エピパクリタキセルから選択されている、請求項１０７に記載のコンジュゲート。
【請求項１１２】
下記の構造を有し、
2019534889.tif 000036
式中、Ａｂがターゲティング抗体であり、
ｍが、前記ポリマーにおけるＨＭＰＡ残基の平均数であり、
ｎが、前記ポリマーにおけるＭＡ−ＧＦＬＧ−ＥＰＩ残基の平均数であり、
ｐが、前記抗体にコンジュゲーションしているポリマーの平均数である、
請求項９５に記載のコンジュゲート。
【請求項１１３】
下記の構造を有し、
2019534889.tif 000037
式中、Ａｂがターゲティング抗体であり、
Ｚが、前記治療剤であり、
ｍが、前記ポリマーにおけるＨＭＰＡ残基の平均数であり、
ｎが、前記ポリマーにおけるＭＡ−ＧＦＬＧ−治療剤残基の平均数であり、
ｐが、前記抗体にコンジュゲーションしているポリマーの平均数である、
請求項９５に記載のコンジュゲート。
【請求項１１４】
下記の構造を有し、
2019534889.tif 000038
式中、Ａｂがターゲティング抗体であり、
ＴＡＬＧが前記治療剤連結基であり、
Ｚが前記治療剤であり、
ｍが、前記ポリマーにおけるＨＭＰＡ残基の平均数であり、
ｎが、前記ポリマーにおける治療剤連結基−治療剤残基の平均数であり、
ｐが、前記抗体にコンジュゲーションしているポリマーの平均数である、
請求項９５に記載のコンジュゲート。
【請求項１１５】
前記Ａｂが、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブまたはその生物活性バリアントである、請求項１１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１１６】
前記Ａｂが、トラスツズマブもしくはペルツズマブ、または生物活性バリアントである、請求項１１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１１７】
前記Ａｂが、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、モタビズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、ＯＶ−ＴＬ−１６、パリビズマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブまたはウステキヌマブである、請求項１１４に記載のコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年１０月１４日に提出した米国特許仮出願第６２／４０８，５１２号と、２０１７年１月２３日に提出した同第６２／４４９，２０９号の提出日に基づく利益を主張するものである。これらの先願の内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＧＭ０９５６０６の下、米国政府からの援助によって行われたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の参照
２０１７年１０月１２日に作成したとともに、４，０９６バイトのサイズである「２１１０１＿０３５５Ｐ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルとして、２０１７年１０月１３日に提出した配列表は、米国特許法施行規則§１．５２（ｅ）（５）に従い、参照により、本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００４】
がんは、世界において、主な死亡原因の１つである。標的療法は、患者が利用できる治療選択肢の１つであり、がん細胞に対して選択的であり、正常細胞に比較的損傷を与えないようにする薬物（抗体など）の投与を伴う。毒性の薬物を用いることと関連する有害作用を主な理由として、がんに対する従来の抗体−薬物コンジュゲート技術は限られている。疾患に対する標的療法のための抗体−薬物複合体の構造を改善するために、代替的なアプローチが必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書で開示するのは、ターゲティング抗体と、そのターゲティング抗体に結合しているセミテレケリックポリマーと、そのセミテレケリックポリマーに結合している治療剤とを含む抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートである。
【０００６】
本明細書で開示するのは、ターゲティング抗体と、そのターゲティング抗体に結合しているセミテレケリックポリマーと、そのセミテレケリックポリマーに結合している治療剤とを含む抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートであって、そのターゲティング抗体がリツキシマブであり、そのセミテレケリックポリマーが、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドであり、その治療剤がエピルビシンである抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートである。
【０００７】
本明細書で開示するのは、ターゲティング抗体と、そのターゲティング抗体に結合しているセミテレケリックポリマーと、そのセミテレケリックポリマーに結合している治療剤とを含む抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートであって、そのターゲティング抗体がハーセプチンであり、そのセミテレケリックポリマーが、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドであり、その治療剤がエピルビシンである抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートである。
【０００８】
本明細書で開示するのは、ターゲティング抗体と、そのターゲティング抗体に結合しているセミテレケリックポリマーと、そのセミテレケリックポリマーに結合している治療剤とを含む抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートであって、そのターゲティング抗体がＯＶ−ＴＬ１６であり、そのセミテレケリックポリマーが、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドであり、その治療剤がエピルビシンである抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートである。
【０００９】
本明細書で開示するのは、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートであって、そのターゲティング抗体のシステイン残基を介して、そのポリマーに結合しているターゲティング抗体と、生理的条件下で安定しており、リソソーム区画内で切断されるオリゴペプチドを介して、そのポリマーに結合している治療剤とを含む抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートである。
【００１０】
本明細書で開示するのは、ターゲティング抗体と、そのターゲティング抗体に結合しているセミテレケリックポリマーと、そのセミテレケリックポリマーに結合している治療剤と、製薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物である。
【００１１】
本明細書で開示するのは、対象のがんの治療方法であって、（ａ）治療が必要な患者を特定することと、（ｂ）ターゲティング抗体と、そのターゲティング抗体に結合しているセミテレケリックポリマーと、そのセミテレケリックポリマーに結合している治療剤と、製薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を治療有効量、その対象に投与することを含む方法である。
【００１２】
本明細書で開示するのは、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの作製方法であって、その抗体の遊離チオールと、ポリマー−薬物コンジュゲートの求電子基を反応させることによって、その抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートを形成させる工程を含む方法である。
【００１３】
本明細書で開示するのは、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートであって、そのターゲティング抗体のシステイン残基を介して、そのポリマーに結合しているターゲティング抗体と、生理的条件下で安定しており、リソソーム区画内で切断されるオリゴペプチドを介して、そのポリマーに結合している治療剤とを含む抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートである。
【００１４】
本明細書で開示するのは、下記の構造を有する抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートであって、
2019534889.tif 000003
式中、Ａｂがターゲティング抗体であり、ｐが、その抗体にコンジュゲーションしているポリマーの平均数である抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートである。
【００１５】
本明細書で開示するのは、下記の構造を有する抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートであって、
2019534889.tif 000004
式中、Ａｂがターゲティング抗体であり、ｍが、そのポリマーにおけるＨＭＰＡ残基の平均数であり、ｎが、そのポリマーにおけるＭＡ−ＧＦＬＧ−ＥＰＩ残基の平均数であり、ｐが、その抗体にコンジュゲーションしているポリマーの平均数である抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートである。
【００１６】
本明細書で開示するのは、下記の構造を有する抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートであって、
2019534889.tif 000005
式中、Ａｂがターゲティング抗体であり、Ｚが治療剤であり、ｍが、そのポリマーにおけるＨＭＰＡ残基の平均数であり、ｎが、そのポリマーにおけるＭＡ−ＧＦＬＧ−治療剤残基の平均数であり、ｐが、その抗体にコンジュゲーションしているポリマーの平均数である抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートである。
【００１７】
本明細書で開示するのは、下記の構造を有する抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートであって、
2019534889.tif 000006
式中、Ａｂがターゲティング抗体であり、ＴＡＬＧが、治療剤連結基であり、Ｚが治療剤であり、ｍが、そのポリマーにおけるＨＭＰＡ残基の平均数であり、ｎが、そのポリマーにおける治療剤連結基−治療剤残基の平均数であり、ｐが、その抗体にコンジュゲーションしているポリマーの平均数である抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートである。
【００１８】
本発明の組成物と方法のその他の特徴と利点は、下記の説明、図面及び請求項に例示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１Ａ〜図１Ｃは、マレイミドで官能化されたセミテレケリックＨＰＭＡコポリマー−エピルビシンコンジュゲート（ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−Ｍａｌ）の合成と、そのコンジュゲートのリツキシマブへの還元チオール基を介した結合を示している。図１Ａは、連鎖移動剤ＣＴＡ−ＴＴの作製を示している概略図である。図１Ｂは、マレイミドで官能化されたセミテレケリックＨＰＭＡコポリマー−エピルビシンコンジュゲート（ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−Ｍａｌ）の合成と、そのサイズ排除クロマトグラムを示している。図１Ｃは、還元リツキシマブへのＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−Ｍａｌの結合を示している。
【図２】図２Ａは、マレイミド修飾エピルビシンの合成を示している。図２Ｂは、還元チオール基を介したリツキシマブへの結合を示している。
【図３】図３Ａ〜図３Ｂは、コンジュゲートのＳＥＣ解析とＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示している。図３Ａは、ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ、ＲＴＸ及びＲＴＸ−（Ｐ−ＥＰＩ）6.5のＳＥＣ解析を示している。図３Ｂは、クーマシーブルーによるコンジュゲート染色のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示しており、レーン１はＲＴＸ−ＥＰＩ（ＤＴＴ＋）であり、レーン２はＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩであり、レーン３はマーカーであり、レーン４はＩｇＧであり、レーン５はＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩである。
【図４】置換度の異なる抗体−薬物コンジュゲートのＳＥＣ解析を示している。
【図５】様々な量のＲＴＸ単独または抗体−薬物コンジュゲートに暴露後のＲａｍｏｓ細胞の平均蛍光強度を示している。５０μｌの培地中の２×１０5個のＲａｍｏｓ細胞を様々な試料（２０μｌのＰＢＳ中に１μｇ、０．２μｇまたは０．０４μｇ）と混合し、４℃で３０分インキュベートした。その混合物を２回、培地によって洗浄して、未結合の試料を除去した。１００μｌの二次抗体（ＧＡＨ−４８８、１：２００の希釈率）を加え、４℃で３０分インキュベートした。ＰＢＳによって洗浄後、細胞をフローサイトメトリーによって解析した。すべてのデータは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示されている。
【図６】Ｒａｍｏｓ細胞に対するＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩのインビトロでの細胞傷害性を示している。
【図７】図７Ａは、Ｒａｍｏｓ細胞に対するコンジュゲートのインビトロでの細胞傷害性を示している。図７Ｂは、Ｒａｊｉ細胞に対するコンジュゲートのインビトロでの細胞傷害性を示している。
【図８】図８Ａは、フローサイトメトリー解析を用いた、Ｒａｍｏｓ細胞への抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートのインターナリゼーションを示している。図８Ｂは、共焦点顕微鏡解析を用いた、Ｒａｍｏｓ細胞への抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートのインターナリゼーションを示している。
【図９】Ｂ細胞リンパ腫モデルにおけるＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの抗腫瘍活性を示している。
【図１０】125Ｉ標識したコンジュゲートＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩ、ＲＴＸ及びＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの、雄のＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスにおける薬物動態プロファイルを示している。放射活性計数法を用いて得たデータを、組織１ｇ当たりの注射用量の割合（％ＩＤ／ｇ）としてプロットした。すべてのデータは、平均±標準偏差（ｎ＝３）として表されている。
【図１１】図１１Ａは、125Ｉ標識したＲＴＸ、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ及び非特異的なＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩの、静脈内投与の７２時間後のＲａｍｏｓリンパ腫担持ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスにおける体内分布を示している。図１１Ｂは、125Ｉ標識したＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの、静脈内投与の７２時間後と９６時間後のＲａｍｏｓリンパ腫担持ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスにおける体内分布を示している。放射活性計数法を用いて得たデータを、組織１ｇ当たりの注射用量の割合（％ＩＤ／ｇ）としてプロットした。すべてのデータは、平均±標準偏差（ｎ＝３）として表されている。
【図１２】精製前と後のＲＴＸ−（Ｐ−ＥＰＩ）6.5の高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）解析を示している。
【図１３】Ｒａｍｏｓ細胞の表面でのＲＴＸ−Ｃｙ５の結合を示している。「未処理」は、培養培地中の細胞であり、「ＲＴＸ−Ｃｙ５」は、Ｒａｍｏｓ細胞（２×１０5個）を１μｇのＲＴＸ−Ｃｙ５で、４℃において３０分処理したものであり、「ＲＴＸによるブロック＋ＲＴＸ−Ｃｙ５」は、１０μｇのＲＴＸによって４℃で３０分、事前にブロックした後、１μｇのＲＴＸ−Ｃｙ５を加え、４℃で３０分インキュベートしたものである。細胞は、フローサイトメトリーによって解析した。データは、ＭＦＩ（平均蛍光強度）として報告されている。
【図１４】Ｒａｍｏｓ  Ｂ細胞を右側腹部に皮下接種して、それぞれ異なる処置に暴露したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの体重グラフを示している。体重は、平均±ＳＤ（ｎ＝４〜５）として表されている。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｂは、既存の抗体−薬物コンジュゲートと、本発明の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートとの比較の概略図であり、図１５Ａは、既存の抗体−薬物コンジュゲートである。図１５Ｂは、本発明の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートである。
【図１６】図１６Ａは、コンジュゲーション方法が、リシン残基（複数可）を介した抗体への薬物の付加に及ぼす影響を示している。図１６Ｂは、コンジュゲーション方法が、還元鎖間ジスルフィド結合を介した抗体への薬物の付加に及ぼす影響を示している。Ｓ．Ｐａｎｏｗｓｋｉ，Ｓ．Ｂｈａｋｔａ，Ｈ．Ｒａａｂ，Ｐａｕｌ  Ｐｏｌａｋｉｓ  ａｎｄ  Ｊａｇａｔｈ  Ｒ  Ｊｕｎｕｔｕｌａ，Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．ＭＡｂｓ．６，３４−４５（２０１４）から改変した。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｂは、ポリＨＰＭＡベースの抗体−ｐＨＰＭＡ−薬物コンジュゲートの合成を示している。図１７Ａは、一方の鎖末端にマレイミドを有するセミテレケリックな水溶性ＨＰＭＡコポリマー（ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ）の合成を示している。図１７Ｂは、ＴＣＥＰでリツキシマブを制御可能に還元した後、ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩのコンジュゲーションを行うのを示している。
【図１８】マウス（ｎ＝３）の血液１ｇ当たりの注射用量の割合（％）として表した平均放射活性を示している。
【図１９】細胞内輸送試験とＰＫ／体内分布試験を行うのに使用できる、アイソトープ（125Ｉ）標識したコンジュゲートと、フルオロフォア（Ｃｙ５）標識したコンジュゲートの合成を示している。
【図２０】ＡＰＤＣのインターナリゼーションと細胞内運命を追跡するツールとして使用できる蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の概略図である。
【図２１】図２１Ａは、様々な細胞株におけるＣＤ２０の発現を示しており、図２１Ｂは、Ｒａｊｉ細胞成長の抑止とアポトーシスを示している。
【図２２】図２２Ａ〜図２２Ｄは、ＯＶ−ＴＬ１６抗体−ＳＴ−ＨＰＭＡコポリマー−薬物コンジュゲートの特徴と生物学的活性の評価を示している。図２２Ａは、ＯＶ−ＴＬ１６  ｍＡｂ、ＳＴ−Ｐ−ＦＩＴＣ及びそれらのコンジュゲートのＳＥＣプロファイルを示している。図２２Ｂは、Ａｂ−ポリマーコンジュゲートのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示している。図２２Ｃは、ＦＩＴＣ標識したコンジュゲートで処理したＳＫＯＶ−３細胞におけるターゲティング作用のフローサイトメトリー解析の結果を示している。図２２Ｄは、ＰＴＸを付加したコンジュゲートで処理したＳＫＯＶ−３細胞におけるアポトーシス誘導のフローサイトメトリー解析を示している。
【図２３】ハーセプチン−Ｐ−ＥＰＩコンジュゲートのＦＰＬＣ解析を示している。
【図２４】ＯＶＴＬ−１６単独またはＯＶＴＬ−１６−Ｐ−ＥＰＩに暴露後のＳＫＯＶ−３細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示は、本発明に関する下記の詳細な説明と、本明細書に含まれている図面及び実施例を参照することによって、さらに容易に理解できる。
【００２１】
本発明の組成物と方法を開示及び説明する前に、本発明の組成物と方法が、別段の定めのない限り、特定の合成方法に、または別段の定めのない限り、特定の試薬に限定されず、当然ながら、多様であってよいことを理解されたい。本明細書で用いられている専門用語が、特定の態様を説明するためのものに過ぎず、限定するようには意図されていないことも理解されたい。本発明を実施または試験する際には、本明細書に記載されている方法と材料と類似または同等のいずれかの方法と材料を用いることができるが、以下では、方法と材料の例が説明されている。
【００２２】
さらに、別段の明示的な定めがない限り、本明細書に示されている方法のいずれも、その工程を特定の順序で行う必要があるものとして解釈するようには意図されていないことを理解されたい。したがって、方法クレームに、その工程で従うべき順序が実際に示されていないか、その工程を特定の順序に限定すべき旨が、別段にクレームまたは明細書に具体的に定められていない場合、いかなる点においても、順序を暗示するようには意図されていない。これは、工程または操作フローの配列に関する論理事項、文法構成または句読法に由来する一般的意味、及び本明細書に記載されている態様の数または種類を含め、いずれかの考え得る非明示的な解釈基準にも適用される。
【００２３】
本明細書で言及されているいずれの文献も、その文献が引用されている事項と関連させて方法及び／または材料を開示及び説明する目的で、参照により、本明細書に援用される。本明細書で論じられている文献は、本願の提出日前のその開示内容について示されているに過ぎない。本明細書中のいかなる記載も、本発明が、先行発明によるそのような文献に先行する権利を与えられないことを認めるものとして解釈すべきではない。さらに、本明細書に示されている、文献の日付は、実際の刊行日とは異なることがあり、別途確認する必要がある場合がある。
【００２４】
定義
本明細書及び添付の請求項で使用する場合、文脈によって明らかに別段に示されている場合を除き、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、複数の言及物が含まれる。
【００２５】
「または」という語句は、本明細書で使用する場合、特定のリストのうちのいずれかの１つの項目を意味し、そのリストの項目をいずれかに組み合わせたものも含まれる。
【００２６】
範囲は、本明細書では、１つの特定の値に「約」もしくは「およそ」を付した値から、及び／または別の特定の値に「約」もしくは「およそ」を付した値までで表すことができる。更なる態様には、このような範囲を表すときには、１つの特定の値から、及び／または別の特定の値までが含まれる。同様に、「約」または「およそ」という前置語を用いることによって、値を近似値として表すときには、その特定の値が、さらなる態様を形成することは分かるであろう。各範囲の最小値と最大値は、その互いの値に対して、かつその互いの値から独立して有意であることがさらに分かるであろう。本明細書には、数多くの値が開示されており、本明細書では、各値は、その値自体に加えて、その値に「約」が付された特定の値として開示されていることも分かる。例えば、「１０」という値が開示されている場合には、「約１０」も開示されている。２つの特定の値の間の各値も開示されていることも分かる。例えば、１０と１５が開示されている場合には、１１、１２、１３及び１４も開示されている。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「任意の」または「任意に」という用語は、その後に記載されている事象または状況が生じても生じなくてもよいことを意味し、その記載には、前記事象または状況が生じる場合と、前記事象または状況が生じない場合が含まれる。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「隣接する」とは、２つの構造または要素が近接していることを指す。具体的には、「隣接する」ものとして特定されている要素は、境界を接しているか、または連結されているかのいずれかであってよい。このような要素は、互いに連結している必要はなく、互いに近かったり、または接近したりしていてもよい。場合によっては、厳密な近接度は、具体的な状況に左右されることがある。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「〜の少なくとも１つ」という用語は、「〜の１つ以上」と同義であるように意図されている。例えば、「Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも１つ」には、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ及びそれぞれを組み合わせたものが明示的に含まれる。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「試料」という用語は、対象の組織または器官、細胞（対象の体内細胞、対象から直接採取した細胞、培養液に維持されている細胞もしくは培養細胞株から得られる細胞のいずれか）、細胞溶解液（もしくは溶解液画分）、または細胞抽出物、あるいは細胞または細胞物質（例えばポリペプチドまたは核酸）に由来する１つ以上の分子を含む溶液であって、本明細書に記載されているようにアッセイするものを意味する。試料は、細胞または細胞成分を含むいずれかの体液または排泄物（例えば、これらに限らないが、血液、尿、便、唾液、涙、胆汁）であってもよい。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、投与の標的、例えばヒトを指す。すなわち、開示されている方法の対象は、脊椎動物（哺乳類動物、魚、鳥、爬虫類動物または両生類動物など）であることができる。「対象」という用語には、飼育動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエなど）も含まれる。一態様では、対象は、哺乳類動物である。別の態様では、対象は、ヒトである。この用語は、特定の年齢または性別を示さない。したがって、男か女かを問わず、成人、小児、青年及び新生児の対象と、胎児を網羅するように意図されている。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「患者」という用語は、疾患または障害に罹患した対象を指す。「患者」という用語には、ヒト及び動物の対象が含まれる。開示されている方法のいくつかの態様では、「患者」は、例えば投与工程の前などに、がんの治療の必要があると診断されている。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「ポリマー」という用語は、天然または合成の比較的高分子量の有機化合物であって、小単位（モノマー）の繰り返しによって構造を表すことができる化合物を指す（例えば、ポリエチレン、ゴム、セルロース）。合成ポリマーは典型的には、モノマーを付加または縮合重合することによって形成する。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「コポリマー」という用語は、２種類以上の異なる繰り返し単位（モノマー残基）から形成されているポリマーを指す。例としては、下記のものに限定されるものではないが、コポリマーは、交互コポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマーまたはグラフトコポリマーであることができる。特定の態様では、ブロックコポリマーの様々なブロックセグメント自体がコポリマーを含むことができることも想定されている。
【００３５】
様々な態様では、ポリマーまたはコポリマーは、１つ以上のモノマーの重合生成物として説明できる。例えば、コポリマーは、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）と２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）を５：１の比率で共重合した生成物として説明できる。当業者であれば容易に分かるように、得られるコポリマーには、ＨＥＭＡ残基１つごとにＨＰＭＡ残基が平均で５個存在することになる。上記と同様に、反対の定めのない限り、コポリマーは、交互コポリマー、ランダムコポリマー及び／またはブロックコポリマーとして存在できる。
2019534889.tif 000007
【００３６】
様々なさらなる態様では、ポリマーまたはコポリマーは、１つ以上のモノマーの残基を含むものとしても説明できる。例えば、コポリマーは、ＨＰＭＡとＨＥＭＡの残基を５：１の比率で含むものとして説明できる。当業者であれば容易に分かるように、ｍ＝５であり、ｎ＝１である。上記と同様に、反対の定めのない限り、コポリマーは、交互コポリマー、ランダムコポリマー及び／またはブロックコポリマーとして存在できる。
2019534889.tif 000008
【００３７】
追加のさらなる態様では、ポリマーまたはコポリマーは、１つ以上のモノマーの残基を有する構造として説明できる。例えば、コポリマーは、ＨＰＭＡとＨＥＭＡの残基を５：１の比率で有する構造として説明できる。当業者であれば容易に分かるように、ｍ＝５であり、ｎ＝１である。
2019534889.tif 000009
【００３８】
この構造において、ひとまとまりになっているＨＰＭＡ残基が示されているとともに、ひとまとまりになっているＨＥＭＡ残基が示されているが、示されている構造は必ずしも、ブロック状のコポリマーであるわけではないことは、当業者には容易に分かるであろう。ブロックコポリマーであることが定められていない限りは、上記と同様に、コポリマーは、交互コポリマー、ランダムコポリマー及び／またはブロックコポリマーとして存在できる。
【００３９】
コポリマーの具体例が、以下に示されている。この例では、コポリマーは、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）とＭＡ−ＧＦＬＧ−ＥＰＩを１０：１の比率で共重合した生成物である。当業者であれば容易に分かるように、ｍ＝１０であり、ｎ＝１である。
2019534889.tif 000010
【００４０】
本明細書で使用する場合、「オリゴマー」という用語は、繰り返し単位の数が２〜１０個、例えば、２〜８個、２〜６個または２〜４個である比較的低分子量のポリマーを指す。一態様では、一連のオリゴマーの繰り返し単位数の平均は、約２〜約１０個、例えば、約２〜約８個、約２〜約６個または約２〜約４個であることができる。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「数平均分子量」（Ｍn）という用語は、個々のポリマーの分子量の一般的な平均（ｍｅａｎ）、すなわち平均（ａｖｅｒａｇｅ）を指す。Ｍnは、ｎ個のポリマー分子の分子量を測定し、それらの分子量を合計し、ｎで除することによって求めることができる。Ｍnは、下記の式によって算出する。
2019534889.tif 000011
式中、Ｎiは、分子量Ｍiの分子の数である。ポリマーの数平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー、粘度測定法（マーク・ホーインクの式）、光散乱、分析的超遠心分離、蒸気圧オスモメトリー、末端基滴定及び束一性によって求めることができる。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「重量平均分子量」（Ｍw）という用語は、ポリマーの分子量の代替的な測定値を指す。Ｍwは、下記の式によって算出する。
2019534889.tif 000012
式中、Ｎiは、分子量Ｍiの分子の数である。直感的には、重量平均分子量がｗであり、ランダムモノマーを選択する場合、そのモノマーが属するポリマーの分子量は、平均でｗとなる。重量平均分子量は、光散乱、小角中性子散乱（ＳＡＮＳ）、Ｘ線散乱及び沈降速度によって求めることができる。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「多分散性」及び「多分散性指数」（ＰＤＩ）という用語は、数平均に対する重量平均の比率（Ｍw／Ｍn）を指す。
【００４４】
本明細書で使用する場合、有機化合物を含む化合物の名称は、一般的な名称、ＩＵＰＡＣ、ＩＵＢＭＢまたはＣＡＳの命名法に関する勧告を用いて付けることができる。１つ以上の立体化学的特徴が存在するときには、立体化学に関するカーン・インゴルド・プレローグ順位則を用いて、立体化学的特性、Ｅ／Ｚ指定などを示すことができる。当業者は、命名法を用いて化合物の構造を体系的にまとめることによるか、またはＣＨＥＭＤＲＡＷ（商標）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のような市販のソフトウェアによるかのいずれかによって、化合物に名称が付けられている場合、その化合物の構造を容易に確認できる。
【００４５】
「アルキル」という用語は、本明細書で使用する場合、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｓ−ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなど、１〜２４個の炭素原子を持つ分岐または非分岐の飽和炭化水素基である。アルキル基は、環状であることも、非環状であることもできる。アルキル基は、分岐状であることも、非分岐状であることもできる。アルキル基は、置換されていることも、非置換であることもできる。例えば、アルキル基は、１つ以上の基（本明細書で説明されているようなアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、シリル、スルホ−オキソまたはチオールが挙げられるが、これらに限らない）で置換されていることができる。「低級アルキル」基は、１〜６個（例えば、１〜４個）の炭素原子を含むアルキル基である。アルキル基という用語は、Ｃ１アルキル、Ｃ１−Ｃ２アルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ７アルキル、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ９アルキル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルなどであることができる（Ｃ１−Ｃ２４アルキルまでを含む）。
【００４６】
本明細書全体を通じて、「アルキル」は概して、非置換アルキル基と置換アルキル基の両方を指す目的で用いられているが、置換アルキル基は、本明細書では、アルキル基における具体的な置換基（複数可）を明確にすることによっても具体的に言及されている。例えば、「ハロゲン化アルキル」または「ハロアルキル」という用語は、１つ以上のハライド、例えば、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素で置換されているアルキル基を具体的に指す。あるいは、「モノハロアルキル」という用語は、単一のハライド、例えば、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素で置換されているアルキル基を具体的に指す。「ポリハロアルキル」という用語は、２つ以上のハライドで独立して置換されているアルキル基を具体的に指し、すなわち、それぞれのハライド置換基は、別のハライド置換基と同じハライドである必要はなく、複数のケースのハライド置換基が、同じ炭素上に存在する必要もない。「アルコキシアルキル」という用語は、下に説明されているような１つ以上のアルコキシ基で置換されているアルキル基を具体的に指す。「アミノアルキル」という用語は、１つ以上のアミノ基で置換されているアルキル基を具体的に指す。「ヒドロキシアルキル」という用語は、１つ以上のヒドロキシ基で置換されているアルキル基を具体的に指す。一方のケースでは、「アルキル」が使用されており、他方のケースでは、「ヒドロキシアルキル」のような具体的な用語が使用されているときには、「アルキル」という用語が、「ヒドロキシアルキル」などのような具体的な用語を指さないことを暗示するようには意図されていない。「芳香族基」という用語は、本明細書で使用する場合、その分子の面の上下に非局在化π電子の環状雲を有する環構造を指し、そのπ雲は、（４ｎ＋２）個のπ電子を含む。芳香族性のさらなる考察は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂｏｙｄ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（５ｔｈ  Ｅｄ．，１９８７），Ｃｈａｐｔｅｒ  １３， タイトル“Ａｒｏｍａｔｉｃｉｔｙ，”４７７−４９７ページに見られ、この文献は、参照により、本明細書に援用される。「芳香族基」という用語には、アリール基とヘテロアリール基の両方が含まれる。
【００４７】
「アリール」という用語は、本明細書で使用する場合、いずれかの炭素ベースの芳香族基（ベンゼン、ナフタレン、フェニル、ビフェニル、アントラセンなどが挙げられるが、これらに限らない）を含む基である。アリール基は、置換されていることも、非置換であることもできる。アリール基は、１つ以上の基（本明細書で説明されているようなアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、─ＮＨ2、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、アジド、ニトロ、シリル、スルホ−オキソまたはチオールが挙げられるが、これらに限らない）で置換されていることができる。「ビアリール」という用語は、特殊なタイプのアリール基であり、「アリール」の定義に含まれる。加えて、アリール基は、単環構造であることもできるし、あるいは、縮合環構造であるか、または炭素炭素結合のような１つ以上の架橋基を介して結合しているかのいずれかである複数の環構造を含むこともできる。例えば、ビアリールは、ナフタレンのように、縮合環構造を介して結合しているか、またはビフェニルのように、１つ以上の炭素炭素結合を介して結合している２つのアリール基であることができる。
【００４８】
「ヘテロアリール」という用語は、本明細書で使用する場合、その芳香族基の環に少なくとも１つのヘテロ原子が含まれている芳香族基を指す。ヘテロ原子の例としては、窒素、酸素、硫黄及びリンが挙げられるが、これらに限らず、酸化窒素、二酸化窒素、酸化硫黄及び二酸化硫黄は、許容可能なヘテロ原子置換基である。ヘテロアリール基は、置換されていることも、非置換であることもできる。ヘテロアリール基は、１つ以上の基（本明細書で説明されているようなアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ニトロ、シリル、スルホ−オキソまたはチオールが挙げられるが、これらに限らない）で置換されていることができる。ヘテロアリール基は、単環系であることもできるし、あるいは、縮合環系であることもできる。ヘテロアリール基としては、フリル、イミダゾリル、ピリミジニル、テトラゾリル、チエニル、ピリジニル、ピロリル、Ｎ−メチルピロリル、キノリニル、イソキノリニル、ピラゾリル、トリアゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピラジニル、ベンゾフラニル、ベンゾジオキソリル、ベンゾチオフェニル、インドリル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、イミダゾピリジニル、ピラゾロピリジニル及びピラゾロピリミジニルが挙げられるが、これらに限らない。ヘテロアリール基のさらなる非限定的な例としては、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、チオフェニル、ピラゾリル、イミダゾリル、ベンゾ［ｄ］オキサゾリル、ベンゾ［ｄ］チアゾリル、キノリニル、キナゾリニル、インダゾリル、イミダゾ［１，２−ｂ］ピリダジニル、イミダゾ［１，２−ａ］ピラジニル、ベンゾ［ｃ］［１，２，５］チアジアゾリル、ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾリル及びピリド［２，３−ｂ］ピラジニルが挙げられるが、これらに限らない。
【００４９】
本明細書に記載されている化合物は、１つ以上の二重結合を含むことができるので、シス／トランス（Ｅ／Ｚ）異性体と、その他の立体配座異性体が生じる可能性がある。反対の記載のない限り、本発明には、このようなすべての考え得る異性体と、このような異性体の混合物が含まれる。
【００５０】
反対の記載のない限り、楔形または点線としてではなく、実線として示されているに過ぎない化学結合のある式では、考え得る各異性体、例えば、各エナンチオマー及びジアステレオマーと、異性体の混合物（ラセミ混合物またはスケールミック混合物など）が想定されている。本明細書に記載されている化合物は、１つ以上の不斉中心を含むことができるので、ジアステレオマーと光学異性体が生じる可能性がある。反対の記載のない限り、本発明には、このようなすべての考え得るジアステレオマーとそのラセミ混合物と、その実質的に純粋な分割エナンチオマー、すべての考え得る幾何異性体と、それらの製薬学的に許容可能な塩が含まれる。立体異性体の混合物と、単離した特定の立体異性体も含まれる。このような化合物を調製するのに使用する合成手順の最中、または当業者に知られているラセミ化またはエピ化手順を用いる際、そのような手順の生成物は、立体異性体の混合物である場合がある。
【００５１】
多くの有機化合物は、平面偏光の面を回転させる能力を有する光学活性形態で存在する。光学活性化合物を説明する際には、Ｄ及びＬ、またはＲ及びＳという接頭文字を用いて、その分子のキラル中心（複数可）の絶対配置を示す。ｄ及びｌ、または（＋）及び（−）という接頭文字を用いて、化合物による平面偏光の回転方向を示し、（−）またはｌは、その化合物が左旋性であることを意味する。（＋）またはｄという接頭文字が付された化合物は、右旋性である。所定の化学構造では、立体異性体と呼ばれるそれらの化合物は、互いの鏡像を重ね合わせることのできない場合を除き、同一である。特定の立体異性体は、エナンチオマーと称することもでき、このような異性体の混合物は、エナンチオマー混合物という場合が多い。エナンチオマーの５０：５０混合物は、ラセミ混合物という。本明細書に記載されている化合物の多くは、１つ以上のキラル中心を有することができるので、様々なエナンチオマー形態で存在できる。所望の場合、キラル炭素は、アステリスク（*）を付して示すことができる。開示されている式において、キラル炭素への結合が直線で示されているときには、キラル炭素の（Ｒ）配置と（Ｓ）配置の両方、すなわち、エナンチオマーとその混合物の両方が、その式に含まれることが分かる。当該技術分野で用いられているように、キラル炭素の絶対配置を明示するのが望ましいときには、キラル炭素への一方の結合は、楔形として示すことができ（平面よりも上の原子への結合）、他方の結合は、短い平行な一連の線または短い平行な線からなる楔形として示すことができる（平面よりも下の原子への結合）。カーン・インゴルド・プレローグ順位則を用いて、キラル炭素の（Ｒ）配置または（Ｓ）配置を割り当てることができる。
【００５２】
開示されている化合物が、１つのキラル中心を含むときには、その化合物は、２つのエナンチオマー形態で存在する。具体的な反対の記載がない限り、開示されている化合物は、エナンチオマーと、エナンチオマーの混合物（ラセミ混合物という特殊な５０：５０混合物など）の両方を含む。エナンチオマーは、当業者に知られている方法（ジアステレオマー塩を形成して、例えば結晶化によって、そのジアステレオマー塩を分離してよい方法（ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  Ｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ  Ｓａｌｔ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｚｍａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）を参照されたい）、ジアステレオマー誘導体もしくは複合体を形成して、例えば結晶化、ガス液体クロマトグラフィーまたは液体クロマトグラフィーによって、その誘導体もしくは複合体を分離してよい方法、一方のエナンチオマーとエナンチオマー特異的試薬との選択反応、例えば、酵素的エステル化、またはキラル環境、例えばキラル担体、例えばキラルリガンドが結合したシリカにおけるか、もしくはキラル溶媒の存在下でのガス液体クロマトグラフィーもしくは液体クロマトグラフィーなど）によって分割できる。上記の分離手順の１つによって、所望のエナンチオマーが別の化学物質に変換される場合には、さらなる工程によって、所望のエナンチオマー形態を得ることができるのは明らかであろう。あるいは、特定のエナンチオマーは、光学活性の試薬、基質、触媒もしくは溶媒を用いる不斉合成によって、または不斉転換によって一方のエナンチオマーを他方のエナンチオマーに変換することによって合成できる。
【００５３】
開示されている化合物におけるキラル炭素で特定の絶対配置が指定されていることは、化合物の、指定のエナンチオマー形態をエナンチオマー過剰状態（ｅ．ｅ．）でもたらすことができることを意味するものと理解する。エナンチオマー過剰状態は、本明細書で使用する場合、特定のエナンチオマーが５０％超、例えば、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９８％または９９％超で存在することである。一態様では、指定のエナンチオマーは、もう一方のエナンチオマーから実質的に遊離している。例えば、本発明の化合物の「Ｒ」体は、その化合物の「Ｓ」体から実質的に遊離していることができ、すなわち、「Ｓ」体のエナンチオマー過剰状態である。対照的に、本発明の化合物の「Ｓ」体は、その化合物の「Ｒ」体から実質的に遊離していることができ、すなわち、「Ｒ」体のエナンチオマー過剰状態である。
【００５４】
開示されている化合物が、２つ以上のキラル炭素を有するときには、その化合物は、３つ以上の光学異性体を有することができ、ジアステレオマー形態で存在することができる。例えば、２つのキラル炭素があるときには、その化合物は、最大で４つの光学異性体、ならびに２対のエナンチオマー（（Ｓ，Ｓ）／（Ｒ，Ｒ）及び（Ｒ，Ｓ）／（Ｓ，Ｒ））を有することができる。エナンチオマーの対（例えば、（Ｓ，Ｓ）／（Ｒ，Ｒ））は、互いの鏡像立体異性体である。鏡像ではない立体異性体（例えば、（Ｓ，Ｓ）及び（Ｒ，Ｓ））は、ジアステレオマーである。ジアステレオマー対は、当業者に知られている方法、例えば、クロマトグラフィーまたは結晶化によって分離でき、各対における個々のエナンチオマーは、上記のように分離してよい。別段に具体的に除外されている場合を除き、開示されている化合物には、その化合物の各ジアステレオマーとその混合物が含まれる。
【００５５】
本開示による化合物は、アルコキシ、アミノ酸などの基をプロドラッグ形成部分として用いて、ヒドロキシルまたはアミノ官能基でプロドラッグを形成してもよい。例えば、ヒドロキシメチル位によって、モノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートを形成してよく、そして、これらのホスフェートがプロドラッグを形成してよい。このようなプロドラッグ誘導体の調製物は、様々な文献資料で論じられている（例は、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９８８，３１，３１８、Ａｌｉｇａｓ−Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ  ＷＯ２０００／０４１５３１，ｐ．３０である）。これらの誘導体の調製の際に変換される窒素官能基は、本開示の化合物の窒素原子の１つ（または２つ以上）である。
【００５６】
抗体−薬物コンジュゲート
頻発する血液悪性腫瘍である非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）は、米国において、６番目に多いがんであり、がんによる死亡原因として９番目に多いものである（Ｓｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＮＨＬの治療は困難である。この疾患には、３５種類を超えるサブタイプが含まれるからであり、特に多く見られるタイプは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫及びマントル細胞リンパ腫である（Ｃｈｕ  ａｎｄ  Ｐｏｌｓｏｎ，２０１３）。ＮＨＬの８５パーセントは、Ｂ細胞由来であり、Ｂ細胞リンパ腫の９５％超は、細胞表面抗原のＣＤ２０を有する（Ｃｈｅｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｅｏｎａｒｄ，２００８）。ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体として初めてＦＤＡに承認されたリツキシマブ（ＲＴＸ）の発見により、Ｂ細胞ＮＨＬ治療の新しい時代が幕開けした（Ｌｅｇｅｔ  ａｎｄ  Ｃｚｕｃｚｍａｎ，１９９８）。ＲＴＸを化学療法と組み合わせると、治療活性をさらに増強でき、この組み合わせは、臨床におけるゴールデンスタンダードとしての役割も果たしている（Ｚｅｌｅｎｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。活性の向上した新しい先進的な化学療法プロトコールと標的療法の開発により、この２０年間で、飛躍的な進歩を遂げた（Ｍｅｈｔａ  ａｎｄ  Ｆｏｒｅｒｏ−Ｔｏｒｒｅｓ，２０１５、Ｒｉｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｓｅｙｆｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。残念ながら、有害な副作用に加えて、疾患の再発または難治性が依然として、治療失敗の主原因となっている。非応答性及び／または耐性は、免疫エフェクター細胞が、結合しているｍＡｂを超架橋できないことと、Ｆｃレセプターの媒介による、ＣＤ２０抗原のエンドサイトーシスまたは「トロゴサイトシス」が行えないことに起因している（Ｃｈｕ  ａｎｄ  Ｋｏｐｅｃｅｋ，２０１５）。したがって、高レベルの有効性と、向上した忍容性を兼ね備える新たな治療策に対するニーズが明らかに認められる。
【００５７】
方策の１つは、全身毒性を示さずに、腫瘍細胞に蓄積し、その腫瘍細胞を殺傷して、腫瘍を根絶させる高度に「特異的な」薬物の開発である。抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞傷害剤を抗原発現腫瘍細胞に標的送達可能にする上記アプローチである（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｊａｇａｄｅｅｓｈ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，２０１６）。ＡＤＣは、抗体（Ａｂ）とリンカーと薬物／毒素という３つの成分を有する（Ｄｕｃｒｙ  ａｎｄ  Ｓｔｕｍｐ，２０１０）。Ａｂを薬物送達に用いる概念は、新しいものではないが、ＡＤＣの設計は依然として難しいものである。複数の要因、例えば、抗体の選択、リンカーの安定性、ペイロード及びその切断動態などが関与するからである。その中でも重要なパラメーターは、単一抗体へのペイロード数（薬物抗体比またはＤＡＲ）である。過結合は、ｍＡｂの免疫親和性を阻害することになるからである。概して、１つのＡｂ分子には、限られた数の毒素部分しか結合できない（通常、ＤＡＲは４〜６）。その結果、標的細胞を死傷するのに充分な有効性を得るには、ＩＣ50が１ｎＭ未満である非常に毒性の高い薬剤（カリケアミシンまたはオーリスタチンモノメチルエステル（ＭＭＡＥ）など）を使用しなければならない（Ｃａｓｉ  ａｎｄ  Ｎｅｒｉ，２０１２、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｔｅｒ，２００５）。したがって、コンジュゲートのほんの一部がオフターゲットとなっても、重大な有害作用が現れることになる。
【００５８】
Ｂ細胞ＮＨＬに対するＡＤＣの開発は、合理的である。ＮＨＬは、臨床において、化学療法もしくは免疫療法（例えばＲＴＸ）、またはこれらを組み合わせた療法によって治療が行われており、その腫瘍細胞は、ＡＤＣによって送達される細胞傷害剤に応答すると考えられているからである。ＲＴＸが、２０年超にわたって臨床の現場で用いられていることから、その抗体と標的は、有効性が立証されている。さらに、化学療法と併用することで、ＲＴＸの有効性は向上しているので、ＲＴＸベースのＡＤＣによって、相乗作用が得られる可能性がある。しかしながら、Ａｂに直接コンジュゲーションした従来の化学療法薬（ドキソルビシン（ＤＯＸ）など）は、その細胞傷害能の欠如が原因で、有効でないことが報告されている（Ｂｒａｓｌａｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９１、Ｔｏｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＨＰＭＡコポリマー−ＤＯＸコンジュゲートをＲＴＸに結合したが、インビボでの治療活性は、コントロールと比べたところ、上昇しなかった（Ｌｉｄｉｃｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【００５９】
構造・機能の観点からは、抗体−薬物コンジュゲートは、「標的化学療法」の分野の抗がん薬に属する。歴史的には、治療転帰を改善するとともに、抗がん剤の毒性を低下させるために、抗体及び／または抗体Ｆａｂ’断片が、ターゲティング部分として、水溶性ポリマー−抗がん薬コンジュゲートに組み込まれてきた（Ｒｉｈｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，１９８８，２００２、Ｐｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３、Ｏｍｅｌｙａｎｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｈｏｎｇｒａｐｉｐａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，２００３、Ｓｈｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｊｅｌｉｎｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｋｏｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｃｈｙｔｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｐｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。例えば、非標的型ＨＰＭＡコポリマー−メソクロリンｅ6コンジュゲートとＯＶ−ＴＬ１６  ｍＡｂ断片−標的型ＨＰＭＡコポリマー−メソクロリンｅ6コンジュゲート（Ｐ−Ｍｃｅ6とＰ−Ｆａｂ’−Ｍｃｅ6）の間で、ヌードマウスのＯＶＣＡＲ−３異種移植片を治療する有効性の比較が行われている。結果によって、標的型治療の利点が明らかに示されている（Ｌｕ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，２００３）。Ｏｍｅｌｙａｎｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）では、コンジュゲーション化学が、改変抗体コンジュゲートの結合親和性に及ぼす影響を調べるための詳細な試験が行われた。Ｋａ（親和性定数）の差から、アミド結合を介したリシン残基のランダムな改変では、コンジュゲートが不均一になり、抗原への結合が損なわれ、部位特異的な改変では、優れた特性が得られることが示唆された。しかしながら、モノクローナル抗体自体が、がん細胞の死滅を誘導できる古典的なＡＤＣとは異なり、上記の過去の試験における抗体（または抗体断片）は、ターゲティング部分として機能し、治療機能を有してはいなかった。
【００６０】
臨床試験または臨床前開発で現在用いられているＡＤＣが増加しているにもかかわらず、血液悪性腫瘍の治療のための新たなアプローチを模索する余地は依然として存在する。例えば、高い有効性と、向上した忍容性を兼ね備える新たな療法が必要とされている。２つの大きな問題は、有効性と安全性である。現在のＡＤＣでは、結合部位が限られているので、ＤＡＲ２にするために（１つのｍＡｂに２つの毒素がコンジュゲーションされた状態にするために）、毒素の強力化（ナノモルからピコモルのＩＣ50）が図られている。このような方策では、毒性に関する懸念が生じる。臨床試験において、６人の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者で肝臓毒性が認められ、そのうちの４人が死亡したことが最近報告された。
【００６１】
抗体−ポリマー−薬物コンジュゲート
本明細書に記載されているのは、セミテレケリックＨＰＭＡコポリマー−エピルビシンコンジュゲートをＲＴＸに結合したものを用いることで、複数の薬物または治療剤がＡｂに結合したものをもたらして、結合部位を追加せずに、ＡＤＣの全体的な細胞傷害性と治療有効性を高めることによって、治療効率のよいＡＤＣを作製する方法である。ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩのような抗体−ポリマー−薬物コンジュゲート（ＡＰＤＣ）の抗原ターゲティング能と薬物動態は維持されている。本明細書に記載されているＡＰＤＣは、高い特異性と、巨大分子治療剤の利点を持つ抗体−薬物コンジュゲートの両方の特徴を有する。本明細書に記載されているのは、本明細書に開示されているＡＰＤＣの治療活性のうち、インビトロアッセイとインビボアッセイを用いた治療活性である。
【００６２】
セミテレケリック（ＳＴ）ポリマーは、そのポリマー鎖の一端に反応性官能基を有する直鎖状の巨大分子である（Ｋａｍｅｉ  ａｎｄ  Ｋｏｐｅｃｅｋ，１９９５）。その単一の官能基によって、その巨大分子を他の種または表面にコンジュゲーションまたはグラフトする機会をもたらす（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＳＴ−ＨＰＭＡコポリマーは、例えばデンドリマーのアミノ基に結合することによって、星型コポリマーを合成する際（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）または抗体を改変するのに用いられている。抗体の改変に用いる化学物質は様々であることができる。いくつかの結合点を含むポリマー前駆体との反応によって、抗体ポリマーコンジュゲートを合成すると、抗体分子と数本のポリマー鎖を含む部分架橋コンジュゲートが得られる（Ｒｉｈｏｖａ  ａｎｄ  Ｋｏｐｅｃｅｋ，１９８５、Ｔａｐｐｅｒｔｚｈｏｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｋｏｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。ＳＴコポリマーを用いると、１つの抗体分子が数本のポリマー鎖で修飾されている明瞭なコンジュゲートが得られる（Ｋｏｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２、Ｅｔｒｙｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｔａｐｐｅｒｔｚｈｏｆｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｌｉｄｉｃｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ポリマー鎖の結合は、ＳＴポリマーと、リシンの接触可能なアミノ基との反応によって非特異的に行うか（Ｋｏｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２）、または抗体のジスルフィド結合の還元と、チオールエン反応を介したＳＴコポリマーの結合によって、より特異的に行うか（Ｅｔｒｙｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｌｉｄｉｃｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）のいずれかである。あるいは、２−イミノチオランと、チオールエン反応を介して結合したＳＴポリマーによって、リシンのアミノ基を（非特異的に）改変してよい（Ｅｔｒｙｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，２００９）。
【００６３】
本明細書で開示するのは、２つの従来のアプローチ（抗体によるターゲティングとポリマー治療剤）を１つの「ハイブリッド」製品に統合した新世代の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）であって、患者、例えばＢ細胞リンパ腫患者に対する治療有効性を高め、忍容性を向上させる可能性があるＡＤＣである。例えば、制御されたリビング重合技法によって、従来の細胞傷害剤エピルビシンをＨＰＭＡポリマー担体に組み込んで、マレイミドで官能化された明瞭なセミテレケリックポリマー−薬物コンジュゲートを得た。この前駆体をＲＴＸ（キメラ抗ＣＤ２０ｍＡｂ）に結合して、新たなタイプのＡＤＣであるＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ（ＡＰＤＣという）を作製した。以前は、ＲＴＸは、遊離な薬物のドキソルビシン（ＤＯＸ）（Ｂｒａｓｌａｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９１）、リポソーマルＤｏｘ（Ｓａｐｒａ  ａｎｄ  Ａｌｌｅｎ，２００２）及びＨＰＭＡコポリマー−ＤＯＸコンジュゲート（Ｌｉｄｉｃｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）とコンジュゲーションされていた。残念ながら、これらの抗体−薬物コンジュゲートには、追加的な治療作用がないことが分かった。当初、その失敗は、ＣＤ２０非インターナリゼーション特性によって説明された。しかしながら、Ｌａｗ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）において、ＩＣ50がＤＯＸの５０〜２００分の１であるＭＭＡＥを用いて、ＲＴＸベースのＡＤＣの評価が行われた。興味深いことに、そのコンジュゲートのインターナリゼーションが認められ、ＣＤ２０陽性リンパ腫の異種移植モデルにおいて、そのコンジュゲート（ＲＴＸ−ｖｃＭＭＡＥ）の抗腫瘍効力が証明された。ＭＣ１２６  Ｂリンパ腫細胞株においても、ＣＤ２０＋一本鎖可変断片抗体−ストレプトアビジン融合タンパク質でターゲティングした酸化鉄ナノ粒子のインターナリゼーションも観察された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。本明細書に開示されているように、コンジュゲートのＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩのインターナリゼーションと抗腫瘍効力が確立されたが、これらについては、本明細書で詳細に説明されている。
【００６４】
ＲＴＸを臨床に適用する際の障壁の１つは、耐性である。リツキシマブの耐性経路は依然として不明である。耐性発現の重要な要因の１つは、比較的高用量を頻繁に繰り返すことである。力学的な関与要因は、シグナル伝達の変化であり、この変化により、Ｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシスタンパク質が過剰発現し、アポトーシスに対する耐性が生じる。本明細書で開示するのは、ＲＴＸの混合物とポリマー−薬物コンジュゲート（Ｐ−ＥＰＩ）を比較した結果であり、ＡＰＤＣのＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの方が、インビトロでの細胞傷害性が１．５倍高く、腫瘍の成長が有意に遅延した。このインビトロでの細胞傷害性の向上と、インビボでの抗腫瘍効力から、相乗作用が示された。ＥＰＩは、ＢａｘとＢａｋ（アポトーシス促進性のＢｃｌ−２ファミリータンパク質）をアップレギュレートすることが報告されており、これにより、リツキシマブの媒介によるアポトーシスに対して、耐性細胞を再感作し得る。したがって、本明細書に記載されている結果によって、本明細書に開示されているＡＰＤＣが、確立されている巨大分子療法と組み合わせた免疫療法の相乗潜在能を有することが示唆されている。さらに、従来の化学療法剤を用いて、有効性の高いＡＰＤＣを作製すると同時に、オフターゲット毒性のリスクを低減することができた。
【００６５】
組成物
本明細書で説明するのは、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲート（ＡＰＤＣ）である。この抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートは、ターゲティング抗体と、１つ以上の治療剤と、１つ以上のポリマーを含むことができる。その１つ以上のポリマーは、１つ以上のセミテレケリックポリマーであることができる。そのセミテレケリックポリマーのそれぞれは、官能性末端に抗体連結末端基を有することができ、その抗体連結末端基を介して、その１つ以上のセミテレケリックポリマーをターゲティング抗体に連結、コンジュゲーションまたは結合できるようになっている。１つ以上の治療剤は、治療剤連結基を介して、１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれにコンジュゲーション、連結または結合できる。ある態様では、本発明の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートは、ターゲティング抗体と、セミテレケリックポリマーと、治療剤を含む。ある態様では、そのセミテレケリックポリマーは、ターゲティング抗体に結合できる。ある態様では、治療剤は、セミテレケリックポリマーに結合できる。
【００６６】
特定の態様では、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートは、そのターゲティング抗体のシステイン残基を介してポリマーに結合しているターゲティング抗体と、生理的条件下で安定しており、リソソーム区画内で切断されるオリゴペプチドを介して、そのポリマーに結合している治療剤を含む。一態様では、その抗体は、遊離チオールと、そのポリマーの求電子基との反応を介して、ポリマーに結合する。いくつかの態様では、そのポリマーは、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ジエチレングリコールモノメタクリレート、トリエチレングリコールモノメタクリレート、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、Ｎ−アルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、アクリル酸のエステル、メタクリル酸のエステル、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ−ビニルピロリドンもしくはノルボルネン、またはこれらを組み合わせたもののコポリマーである。例えば、このポリマーは、オリゴペプチド（例えば、グリシルフェニルアラニルロイシルグリシン）を介して治療剤に連結しているアクリルアミドのモノマーの残基を含むことができる。
【００６７】
さらなる態様では、アクリルアミドがオリゴペプチドを介して治療剤に連結しているものは、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＥＰＩであり、下記の構造を有する。
2019534889.tif 000013
【００６８】
追加のさらなる態様では、ポリマーは、下記の構造を有する。
2019534889.tif 000014
【００６９】
さらなる態様では、コンジュゲートは、下記の構造を有し、
2019534889.tif 000015
式中、Ａｂはターゲティング抗体であり、ｐは、その抗体にコンジュゲーションしているポリマーの平均数である。いくつかの態様では、ポリマーは、治療剤連結基（例えば、オリゴペプチド）を介して治療剤に連結しているアクリルアミドのモノマーの残基を含むことができる。いくつかの態様では、ポリマーは、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）の残基を含む。いくつかの態様では、治療剤は、エピルビシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、パクリタキセル、ナブパクリタキセル、１０−デアセチルバッカチンＩＩＩ、バッカチンＩＩＩ、パクリタキセルＣ及び７−エピパクリタキセルから選択されている。
【００７０】
特定の態様では、コンジュゲートは、下記の構造を有し、
2019534889.tif 000016
式中、Ａｂはターゲティング抗体であり、ｍは、そのポリマーにおけるＨＭＰＡ残基の平均数であり、ｎは、そのポリマーにおけるＭＡ−ＧＦＬＧ−ＥＰＩ残基の平均数であり、ｐは、その抗体にコンジュゲーションしているポリマーの平均数である。
【００７１】
さらなる態様では、コンジュゲートは、下記の構造を有し、
2019534889.tif 000017
式中、Ａｂはターゲティング抗体であり、Ｚは治療剤であり、ｍは、そのポリマーにおけるＨＭＰＡ残基の平均数であり、ｎは、そのポリマーにおけるＭＡ−ＧＦＬＧ−治療剤残基の平均数であり、ｐは、その抗体にコンジュゲーションしているポリマーの平均数である。
【００７２】
さらなる態様では、コンジュゲートは、下記の構造を有し、
2019534889.tif 000018
式中、Ａｂはターゲティング抗体であり、ＴＡＬＧは治療剤連結基であり、Ｚは治療剤であり、ｍは、そのポリマーにおけるＨＭＰＡ残基の平均数であり、ｎは、そのポリマーにおける治療剤連結基−治療剤残基の平均数であり、ｐは、その抗体にコンジュゲーションしているポリマーの平均数である。
【００７３】
ターゲティング抗体：いくつかの態様では、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートのターゲティング抗体は、抗体またはその生物活性バリアントであることができる。いくつかの態様では、ターゲティング抗体は、１つ以上の鎖間ジスルフィド結合を有するいずれかの抗体であることができる。いくつかの態様では、ターゲティング抗体は、抗体ヒンジ領域に１つ以上の鎖間ジスルフィド結合を含むいずれかの抗体であることができる。そのジスルフィド結合の１つ以上は、１つ以上のポリマー（例えばセミテレケリックポリマー）に対する結合点として機能できるスルフヒドリル基に還元できる。いくつかの態様では、そのスルフヒドリル基を介して、本明細書に記載されているポリマー（例えばセミテレケリックポリマー）をターゲティング抗体に結合すると、比較的均質なＡＰＤＣを作製できる。
【００７４】
いくつかの態様では、ターゲティング抗体の分子量は、１００ｋＤａ超であることができる。いくつかの態様では、ターゲティング抗体の重量平均分子量（Ｍｗ）は、約４０，０００ｇ／モル〜約１６０，０００ｇ／モルであることができる。別の態様では、ターゲティング抗体のＭｗは、約１４０，０００ｇ／モル〜約１５５，０００ｇ／モルであることができる。いくつかの態様では、ターゲティング抗体のＭｗは、約５０，０００〜１７０，０００ｇ／モルであることができる。
【００７５】
いくつかの態様では、ターゲティング抗体は、ウサギモノクローナル抗体、マウスモノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、完全ヒトモノクローナル抗体またはこれらの生物活性バリアントであることができる。抗体は、天然の状態で発現する抗体（例えば四量体の抗体）またはその生物活性バリアントであることができる。いくつかの態様では、ターゲティング抗体は、天然に存在しない抗体（例えばダイアボディ）またはその生物活性バリアントであることができる。抗体は、さらに操作することもできる。
【００７６】
いくつかの態様では、ターゲティング抗体は、ＩｇＧ抗体であることができる。ＷＯ／２０１６／０６４７４９には、本願のターゲティング抗体として有用であり得るＩｇＧ抗体が開示されている。ＷＯ／２０１６／０６４７４９の内容は、本開示の組成物で使用できるＩｇＧ抗体の教示に関して、参照により、本明細書に援用される。ある態様では、ターゲティング抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプであることができる。別の態様では、ターゲティング抗体は、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプであることができる。
【００７７】
いくつかの態様では、本明細書に記載されている抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートは、ターゲティング抗体を含み、そのターゲティング抗体は、Ｂリンパ球抗原に結合する。したがって、いくつかの実施形態では、ターゲティング抗体は、ＣＤ２０抗原に結合する。ある態様では、ターゲティング抗体は、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であることができる。抗ＣＤ２０モノクローナル抗体の例としては、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、オビヌツズマブ、イブリツモマブまたはそれらの生物活性バリアントが挙げられるが、これらに限らない。ある態様では、ターゲティング抗体は、リツキシマブであることができる。
【００７８】
いくつかの態様では、本明細書に記載されている抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートは、ターゲティング抗体を含み、そのターゲティング抗体は、上皮細胞成長因子レセプターに結合する。したがって、いくつかの実施形態では、ターゲティング抗体は、ＨＥＲ２（ヒト上皮細胞成長因子レセプター２）というレセプターに結合する。ある態様では、ターゲティング抗体は、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体であることができる。抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体の例としては、トラスツズマブもしくはペルツズマブ、またはそれらの生物活性バリアントが挙げられるが、これらに限らない。ある態様では、ターゲティング抗体は、トラスツズマブであることができる。
【００７９】
いくつかの態様では、本明細書に記載されている抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートは、ターゲティング抗体を含み、そのターゲティング抗体は、ＯＡ−３抗原に結合する。ある態様では、ターゲティング抗体は、抗ＯＡ−３モノクローナル抗体であることができる。抗ＯＡ−３モノクローナル抗体の例としては、ＯＶＴＬ−１６またはその生物活性バリアントが挙げられるが、これらに限らない。ある態様では、ターゲティング抗体は、ＯＶＴＬ−１６であることができる。
【００８０】
本発明のターゲティング抗体は、特定の病態または有害な健康状態において存在する抗原を標的とするか、またはその抗原に結合するように選択できる。したがって、対象を治療する際の条件に応じて、用いることができる好適なターゲティング抗体は、数多く存在する。より広くは、ターゲティング抗体は、抗がん剤のような治療剤であることができる。いくつかの態様では、ターゲティング抗体には、治療作用があることができる。
【００８１】
いくつかの態様では、ターゲティング抗体は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ、カナキヌマブ、セツキシマブ、ダクリズマブ、エファリズマブ、ゲムツズマブ、ゴリムマブ、イブリツモマブ、インフリキシマブ、イピリムマブ、モタビズマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、ＯＶ−ＴＬ−１６、パリビズマブ、ペルツズマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、リツキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブまたはウステキヌマブであることができる。
【００８２】
ポリマー：本明細書で開示するのは、ターゲティング抗体と、１つ以上の治療剤と、１つ以上のポリマーとを含む抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートである。この抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートには、多種多様なポリマーを組み込むことができる。いくつかの態様では、その１つ以上のポリマーは、セミテレケリックポリマーであることができる。セミテレケリックポリマーの例は、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ジエチレングリコールモノメタクリレート、トリエチレングリコールモノメタクリレート、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、Ｎ−アルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、アクリル酸のエステル、メタクリル酸のエステル、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、ノルボルネンまたはこれらを組み合わせたもののモノマーを含むことができる（そのアルキル基は、１〜６個の炭素原子を含むことができ、任意に、１〜３個のＯＨ基を含むことができる）。いくつかの追加的な例では、その複数のセミテレケリックポリマーのそれぞれは、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）モノマー、下記の式Ｉによる構造を有するモノマーであって、
2019534889.tif 000019
式中、Ｒ1が、水素またはメチルであり、Ｘが、酸素またはＮＲ1’（そのＲ1’は、水素もしくはアルキル基である）であり、Ｌが、アルキル基またはアリール基であり、Ｙが、親水性基（例えば、−ＯＨ、−ＮＨＲ1’、−ＮＨ２もしくは−ＳＨ）であるモノマー、あるいはＨＰＭＡと、式Ｉによる構造を有するモノマーとを組み合わせたものを少なくとも４５モル％含むことができる。様々なその他のモノマーを用いて、セミテレケリックポリマーを調製することもできる。ある態様では、セミテレケリックポリマーは、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）であることができる。ある態様では、各セミテレケリックポリマーは、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）を含む。
【００８３】
本発明の１つ以上のポリマーはそれぞれ、１つ以上のセミテレケリックポリマーであることができる。ある態様では、１つ以上のセミテレケリックポリマーは、ターゲティング抗体と１つ以上の治療剤の両方に連結していることができる。ある態様では、１つ以上の治療剤のそれぞれは独立して、１つ以上のセミテレケリックポリマーを介して、ターゲティング抗体に連結していることができる。
【００８４】
いくつかの態様では、１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれは、官能性末端に抗体連結末端基を含むことができる。セミテレケリックポリマーの２つの末端のうち、１つの末端が官能性であることができる。したがって、抗体連結末端基は、セミテレケリックポリマーの唯一の官能性末端で連結していることができる。様々な抗体連結末端基を用いることができる。抗体連結末端基の例としては、
2019534889.tif 000020
またはこれらを組み合わせたものが挙げられ、式中、Ｒ2とＲ3は独立して、Ｈ、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｃ6Ｈ5Ｓ、ＣＨ3Ｃ6Ｈ5ＳまたはＴｓから選択でき、ＸとＹは独立して、ＮＨ、Ｏ、ＳまたはＳｅから選択でき、Ｚは、ＮまたはＣを含むことができ、「ポリマー」は、抗体連結末端基が連結、コンジュゲーションまたは結合できるセミテレケリックポリマーを表す。ある態様では、抗体連結末端基は、マレイミドであることができる。
【００８５】
上記のように、ターゲティング抗体に存在する１つ以上のジスルフィド結合は、スルフヒドリル基に還元して、１つ以上のポリマー（例えばセミテレケリックポリマー）に対する結合点として機能することができる。いくつかの態様では、ターゲティング抗体は、平均で約２〜約８個のポリマーを含むことができる。いくつかの態様では、ターゲティング抗体は、平均で約３〜約７個のポリマーを含むことができる。いくつかの態様では、ターゲティング抗体は、平均で約２〜約４個、約３〜約５個、約４〜約６個または約５〜約７個のポリマーを含むことができる。いくつかの態様では、１つ以上のポリマーのそれぞれは、セミテレケリックポリマーであることができる。
【００８６】
いくつかの態様では、１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれは、１つ以上の治療剤を含むことができる。ある態様では、１つ以上の治療剤は、治療剤連結基を介して、１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれに接続、連結、コンジュゲーションまたは結合できる。いくつかの態様では、１つ以上の治療剤は、１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれに共重合を介して組み込まれている治療剤担持モノマーに、治療剤連結基を介して連結できる。その治療剤担持モノマーは、上記のような様々な好適なモノマーを含むことができる。ある態様では、治療剤担持モノマーは、メタクリルアミドまたはその誘導体（例えばＮ−アルキルメタクリルアミドなど）を含むことができる。治療剤連結基の例としては、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ、Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（配列番号２）、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号３）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ（配列番号４）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号５）、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ（配列番号６）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ（配列番号７）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号８）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号９）、Ｎ−アミノカプロイル−Ｖａｌ−シトルリンまたはこれらを組み合わせたものが挙げられるが、これらに限らない。
【００８７】
いくつかの態様では、１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれは、平均で２〜１２個の治療剤を含むことができる。いくつかの態様では、１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれは、平均で４〜８個の治療剤を含むことができる。いくつかの態様では、１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれは、平均で３〜５個、４〜６個または５〜７個の治療剤を含むことができる。いくつかの態様では、ターゲティング抗体に結合または連結されている１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれは、同じ治療剤または異なる治療剤を含むことができる。例えば、単一のターゲティング抗体を複数（または１つ以上）のセミテレケリックポリマーに結合でき、それらのセミテレケリックポリマーのそれぞれは、同じ治療剤または異なる治療剤を含む。
【００８８】
本明細書に記載されているＡＰＤＣの均質性をさらに高めるために、例えばセミテレケリックポリマーを調製するのに用いる重合技法は、均一なポリマー生成物をもたらす技法であることができる。高い均一性または均質性の、例えばセミテレケリックポリマーを生成させるいずれかの重合技法を用いることができ、その技法は、本開示の範囲内とみなす。ある態様では、可逆的付加開裂連鎖移動剤（ＲＡＦＴ）重合技法を用いて、均一または均質なセミテレケリックポリマーを作製できる。ある態様では、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）を用いて、均一または均質なセミテレケリックポリマーを作製できる。さらなる態様では、ニトロキシド媒介重合（ＮＭＰ）を用いて、均一または均質なセミテレケリックポリマーを作製できる。これらは、リビング重合技法または制御されたラジカル重合技法であり、連鎖移動剤を利用して、フリーラジカル重合の際に、得られる分子量と多分散性を制御可能にする。実際には、これらの重合は、低分散度（分子量分布）と所定の分子量を促す条件下で行うことができる。
【００８９】
いくつかの態様では、セミテレケリックポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、約２５，０００ｇ／モル〜約４５，０００ｇ／モルであることができる。いくつかの態様では、セミテレケリックポリマーのＭｎは、約３０，０００ｇ／モル〜約４０，０００ｇ／モルであることができる。いくつかの態様では、１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれの分子量は、約２ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲である。いくつかの態様では、１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれは、分子量が約２０ｋＤａ〜約５０ｋＤａの範囲であるＮ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）を含む。いくつかの態様では、１つ以上のセミテレケリックポリマーのそれぞれの分子量は、約２ｋＤａ〜約６０ｋＤａの範囲である。
【００９０】
したがって、ターゲティング抗体に対するセミテレケリックポリマーの結合部位を制御することによって、またセミテレケリックポリマー自体の多分散性を制御することによって、本明細書に記載されているような均質なＡＰＤＣを作製できる。いくつかの態様では、セミテレケリックポリマーの多分散性は、１．４５以下、１．４０以下、１．３５以下、１．３０以下、１．２５以下、１．２０以下、１．１９以下、１．１８以下、１．１７以下、１．１６以下、１．１５以下またはこれを下回る値であることができる。ある態様では、１つ以上のセミテレケリックポリマーの多分散性は、１．４５以下であることができる。いくつかの態様では、ＡＰＤＣの多分散性は、１．４５以下、１．４０以下、１．３５以下、１．３０以下、１．２５以下またはこれを下回る値であることができる。ある態様では、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの多分散性は、１．４５以下であることができる。ある態様では、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの多分散性は、１．８以下であることができる。ある態様では、１つ以上のセミテレケリックポリマーの多分散性は、１．４５以下であることができる。ある態様では、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの多分散性は、１．１０〜１．４５であることができる。ある態様では、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの多分散性は、１．１０〜１．８であることができる。
【００９１】
本開示はさらに、本明細書に記載されているような抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートであって、２種類以上のポリマーを含む抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートを特徴とする（すなわち、単一抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートのポリマーは、２種類以上のポリマーを組み合わせたものであることができる）。２種類以上のポリマーを含むこのような抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートは、単一の製剤において、異なる種類の治療剤を取り込むことができるので、異なる治療剤を送達できる。いくつかの態様では、それらのポリマーの２つ以上は、同じであることができるが、異なる治療剤に結合するように、異なる治療剤連結基を有する。また、同じであるが、異なる治療剤に結合できる２つ以上のポリマーを、本明細書に記載されている抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートは含むことができる。いくつかの態様では、異なるが、同じ治療剤または異なる治療剤に結合できる２つ以上のポリマーを、本明細書に記載されている抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートは含むことができる。選択したポリマーにかかわらず、単一抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの各ポリマーは、同じ治療剤または異なる治療剤に結合するのに使用できる同じ治療剤連結基または異なる治療剤連結基を有することができる。
【００９２】
治療剤：多種多様な治療剤または細胞傷害剤を本発明の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートに組み込むことができる。典型的には、水溶性ポリマー担体に共有結合できるいずれかの生物活性剤を用いることができる。治療剤または細胞傷害剤は、化学化合物（例えばペプチド）またはタンパク質であることができる。いくつかの態様では、治療剤の１つ以上は、抗がん剤であることができる。その抗がん剤は、抗がん特性を有する薬剤または薬物であることができる。いくつかの実施形態では、抗がん剤は、タキサン、化学療法剤、チューブリン重合インヒビター、そのトポイソメラーゼインヒビターアナログまたはこれらを組み合わせたものであることができる。いくつかの態様では、１つ以上の治療剤のそれぞれは独立して、抗がん剤、タキサン、アントラサイクリン、化学療法剤、チューブリン重合インヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、これらのアナログまたはこれらを組み合わせたものの１つ以上であることができる。
【００９３】
タキサンの例としては、パクリタキセル及びドセタキセル、これらのいずれかのアナログ、ならびに、これらをいずれかに組み合わせたものが挙げられるが、これらに限らない。アントラサイクリンの例としては、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン及びバルルビシン、これらのいずれかのアナログ、ならびに、これらをいずれかに組み合わせたものが挙げられるが、これらに限らない。化学療法剤の例としては、メトトレキセート、ドキソルビシン、エピルビシン、プレドニゾロン、ビンクリスチン、プロカルバジン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、エトポシド、カペシタビン、フォリン酸、パクリタキセル、ゲムシタビン、メルファラン、シタラビン、シクロシチジン、アクチノマイシンダウノルビシン、ハリングトニン、コルチコステロイド、これらのいずれかの類縁体またはこれらをいずれかに組み合わせたものが挙げられるが、これらに限らない。追加的な治療剤としては、チューブリン重合インヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、これらのいずれかの類縁体またはこれらをいずれかに組み合わせたものも挙げることができる。当業者であれば認識するように、本発明のＡＰＤＣでは、様々な他の治療剤を用いることもできる。
【００９４】
ある態様では、治療剤は、エピルビシンであることができる。ある態様では、治療剤は、パクリタキセルであることができる。
【００９５】
抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの作製方法
特定の態様では、開示されている抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートは、その抗体の遊離チオールと、ポリマー−薬物コンジュゲートの求電子基とを反応させることによって、その抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートを形成させる工程を含む方法によってもたらすことができる。このような遊離チオールは例えば、上記の反応工程の前に、その抗体を還元剤で処理することによってもたらすことができる。その抗体のジスルフィド結合の還元によって、開示されているポリマー−薬物コンジュゲートの求電子官能基（例えばマレイミド官能基）とのその後の反応において、求核試薬として機能できる遊離チオールが得られる。このようなポリマー−薬物コンジュゲートは、治療剤連結基を介してセミテレケリックポリマーに連結している治療剤を含むことができる。
【００９６】
いくつかの態様では、このセミテレケリックポリマーは、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ジエチレングリコールモノメタクリレート、トリエチレングリコールモノメタクリレート、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アルキルメタクリルアミド、Ｎ−アルキルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、メタクリル酸、アクリル酸、アクリル酸のエステル、メタクリル酸のエステル、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ−ビニルピロリドンもしくはノルボルネン、またはこれらを組み合わせたもののコポリマーである。さらなる態様では、セミテレケリックポリマーは、治療剤連結基を介して治療剤に連結しているアクリルアミドのモノマーの残基を含む。
【００９７】
いくつかの態様では、治療剤連結基は、オリゴペプチド、例えば、グリシルフェニルアラニルロイシルグリシンである。特定の態様では、治療剤連結基は、生理的条件下で安定しており、リソソーム区画内で切断される。
【００９８】
一態様では、治療剤連結基を介して治療剤に連結しているアクリルアミドは、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＥＰＩであり、下記の構造を有する。
2019534889.tif 000021
【００９９】
特定の態様では、セミテレケリックポリマーは、可逆的付加開裂連鎖移動剤重合（ＲＡＦＴ）または原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）によって作製する。ある態様では、セミテレケリックポリマーは、下記の構造を有する。
2019534889.tif 000022
【０１００】
一態様では、治療剤は、アミン担持薬物の残基である。さらなる態様では、治療剤は、ヒドロキシ担持薬物の残基である。
【０１０１】
特定の態様では、開示されているセミテレケリックポリマーは、ポリマー−薬物コンジュゲートを求電子基、例えば、マレイミドのようなマイケルアクセプターで官能化する工程を含む方法によってもたらすことができる。セミテレケリックポリマーは、ポリマーをＮ−（アミノアルキル）マレイミドで官能化することによってもたらすことができる。
【０１０２】
特定の態様では、本発明のポリマー−薬物コンジュゲートは、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）モノマーと、生理的条件下で安定しているとともに、リソソーム区画内で切断される治療剤連結基、例えばオリゴペプチド（例えばグリシルフェニルアラニルロイシルグリシン）を介して治療剤に連結しているアクリルアミドのモノマーとのコポリマーである。
【０１０３】
抗体：上記のように、本明細書に開示されているような抗体−ポリマー−薬物分子は、抗体またはその生物活性バリアントを含むことができる。当該技術分野において周知であるように、モノクローナル抗体は、組み換えＤＮＡによって作製できる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離及びシークエンシングできる。ファージディスプレイ技法を用いて、抗体または活性抗体断片のライブラリーを作製及びスクリーニングすることもできる。
【０１０４】
本明細書で使用する場合、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」または「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、ヒト抗体及び／またはヒト化抗体も指すことができる。非ヒト抗体（例えば、マウス、ラットまたはウサギ由来の抗体）の多くは、ヒトにおいて、天然の状態では抗原性を有するので、ヒトに投与すると、望ましくない免疫応答をもたらすことがある。したがって、本発明の方法においてヒト抗体またはヒト化抗体を使用することは、ヒトに投与した抗体によって、望ましくない免疫応答が誘発される可能性を低下させる役割を果たす。
【０１０５】
抗体のヒト化技法には概して、組み換えＤＮＡ技術を用いて、抗体分子の１本以上のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作することが伴う。したがって、非ヒト抗体（またはその断片）のヒト化形態は、非ヒト（ドナー）抗体の抗原結合部位の一部がヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに組み込まれているキメラ抗体もしくはキメラ抗体鎖（またはその断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくは抗体のその他の抗原結合部分など））である。
【０１０６】
ヒト化抗体を作製するために、所望の抗原結合特性（例えば、標的抗原に対する特定のレベルの特異性と親和性）を有することが知られている、ドナー（非ヒト）抗体分子の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基に、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つ以上のＣＤＲに由来する残基を置き換える。場合によっては、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基を、対応する非ヒト残基に置き換える。ヒト化抗体は、レシピエント抗体でも、導入するＣＤＲ配列もしくはフレームワーク配列でも見られない残基を含むこともできる。概して、ヒト化抗体には、ヒト以外の供給源から、１つ以上のアミノ酸残基が導入されている。実際には、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのＣＤＲ残基と、場合によってはいくつかのＦＲ残基が、齧歯類動物抗体の同様の部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体は概して、抗体定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト抗体のＦｃの少なくとも一部を含む。
【０１０７】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、ヒト化抗体は、齧歯類動物ＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することによって作製できる。ヒト化抗体の作製に使用できる方法も、当該技術分野において周知である。
【０１０８】
標識：本明細書に記載されているような組成物は、検出可能な標識も含むことができる。例えば、本明細書で開示するのは、抗体−ポリマーコンジュゲートまたは抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートを含む分子プローブである。「検出標識」という語句は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載されている組成物と直接または間接的に関連付けることができ、その結果、測定可能で検出可能なシグナルを直接または間接的にもたらすいずれかの分子を指す。例えば、標識は、治療剤の１つ以上に結合できる。ある態様では、標識は、ターゲティング抗体に結合できる。ある態様では、本明細書に記載されている組成物を含む分子プローブはさらに、検出可能な標識を含む。
【０１０９】
検出可能な標識の例としては、蛍光、放射性同位体、蛍光分子、リン光分子、酵素、抗体及びリガンドが挙げられる。蛍光標識の例としては、ＳＹＢＲグリーンＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロリド、ローダミン、アミノ−メチルクマリン（ＡＭＣＡ）、エオシン、エリトロシン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（登録商標）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリトリン、ランタニドイオンの大環状キレート（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｙｅ（商標）など）、蛍光エネルギー移動色素（チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体など）、ならびにシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７が挙げられるが、これらに限らない。他の具体的な蛍光標識の例としては、３−ヒドロキシピレン５，８，１０−トリスルホン酸、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）、酸性フクシン、アリザリンコンプレクソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、アントリルステアレート、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ、アストラゾンオレンジＲ、アストラゾンレッド６Ｂ、アストラゾンイエロー７  ＧＬＬ、アタブリン、オーラミン、オーロホスフィン、オーロホスフィンＧ、ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ、ベルベリンサルフェート、ビスベンズアミド、ブランコフォアＦＦＧ溶液、ブランコフォアＳＶ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｆ１、ブリリアントスルホフラビンＦＦ、カルセインブルー、カルシウムグリーン、カルコフロールＲＷ溶液、カルコフロールホワイト、カルコフォアホワイトＡＢＴ溶液、カルコフォアホワイト標準溶液、カルボスチリル、カスケードイエロー、カテコールアミン、キナクリン、コリホスフィンＯ、クマリン−ファロイジン、ＣＹ３．１  ８、ＣＹ５．１  ８、ＣＹ７、ＤＡＮＳ（１−ジメチルアミノナフタレン５スルホン酸）、ＤＡＮＳＡ（ジアミノナフチルスルホン酸）、ダンシルＮＨ−ＣＨ３、ジアミノフェニルオキシジアゾール（ＤＡＯ）、ジメチルアミノ−５−スルホン酸、ジピロメテンボロンジフルオリド、ジフェニルブリリアントフラビン７ＧＦＦ、ドーパミン、エリトロシンＩＴＣ、オイクリシン、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光）、フラゾオレンジ、フルオ３、フルオレサミン、Ｆｕｒａ−２、ゲナクリルブリリアントレッドＢ、ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ゲナクリルピンク３Ｇ、ゲナクリルイエロー５ＧＦ、グロキサン酸、グラニュラーブルー、ヘマトポルフィリン、Ｉｎｄｏ−１、イントラホワイトＣｆ液、リューコフォアＰＡＦ、リューコフォアＳＦ、リューコフォアＷＳ、リサミンローダミンＢ２００（ＲＤ２００）、ルシファーイエローＣＨ、ルシファーイエローＶＳ、マグダラレッド、マリーナブルー、マキシロンブリリアントフラビン１０ＧＦＦ、マキシロンブリリアントフラビン８ＧＦＦ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）、ミトラマイシン、ＮＢＤアミン、���トロベンゾオキサジアゾール、ノルアドレナリン、ニュークリアファストレッド、ニュークリアイエロー、ニロサンブリリアントフラビンＥ８Ｇ、オキサジアゾール、パシフィックブルー、パラロサニリン（フォイルゲン）、ホルワイトＡＲ溶液、ホルワイトＢＫＬ、ホルワイトＲｅｖ、ホルワイトＲＰＡ、ホスフィン３Ｒ、フタロシアニン、フィコエリトリンＲ、ポリアザインダセンポントクロムブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオンイエロー、ピロニン、ピロニンＢ、ピロザールブリリアントフラビン７ＧＦ、キナクリンマスタード、ローダミン１２３、ローダミン５ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ２００、ローダミンＢエクストラ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミンＷＴ、セロトニン、セブロンブリリアントレッド２Ｂ、セブロンブリリアントレッド４Ｇ、セブロンブリリアントレッドＢ、セブロンオレンジ、セブロンイエローＬ、ＳＩＴＳ（プリムリン）、ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）、スチルベン、ＳＮＡＲＦ１、スルホローダミンＢ  Ｃａｎ  Ｃ、スルホローダミンＧエクストラ、テトラサイクリン、チアジンレッドＲ、チオフラビンＳ、チオフラビンＴＣＮ、チオフラビン５、チオライト、チアゾールオレンジ、チノポールＣＢＳ、トゥルーブルー、ウルトラライト、ウラニンＢ、ユービテックスＳＦＣ、キシレンオレンジ及びＸＲＩＴＣが挙げられる。蛍光標識は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ及びＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏを含む様々な供給業者から得ることができる。
【０１１０】
評価：本発明の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲート自体またはその抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの一部は、いずれかの数の方法で評価できる。例えば、（磁気ビーズベースのプルダウンアッセイを用いることによって、）治療剤とポリマーとの結合を確認でき、（蛍光技法を用いて、）治療剤の細胞取り込みまたは速度論的取り込みを評価でき、（ゲル分離及びウエスタンブロットによって、）未結合の抗体のレベルと、低レベルの遊離薬物を確認でき、（ＦＡＣＳを用いてＬｉｖｅ／Ｄｅａｄアッセイを行うことによって、）アポトーシスの誘導剤としての治療剤の機能を評価でき、（例えば、イメージングアッセイによって経時的な血漿中レベルと組織分布を測定することによって、）インビボにおいて安定性と組織分布を評価できる。
【０１１１】
構成：ターゲティング抗体と、１つ以上のポリマーと、１つ以上の治療剤を含め、所定の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの各部分は、独立して選択できる。当業者であれば、成分部分は、適合し合う状態で結び付ける必要があることを理解するであろう。本発明の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートを用いて、がん治療のために、抗体部分と治療剤を患者に送達できる。ターゲティング抗体は、「第１の薬剤」と称することができ、１つ以上のポリマーは、「第２の薬剤」と称することができ、１つ以上の治療剤は、「第３の薬剤」と称することができる。したがって、本発明の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートは、疾患（例えば、がん）に対する併用療法であることができる。それぞれ異なるポリマー及び／またはそれぞれ異なる治療剤連結基は、それぞれ異なる治療剤を担持できる。したがって、本発明の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートは、２種類以上の治療剤を送達できる。検出可能なマーカーを含めることによって、本明細書に記載されているような抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートまたは抗体−ポリマーコンジュゲートを用いて、ターゲティング抗体が結合する標的の分布をマッピングできる。抗体−ポリマー−薬物コンジュゲート１つ当たりの治療剤の数は、例えば、さらなるポリマー及び／またはさらなる治療剤連結基を加えることによって制御できる。
【０１１２】
したがって、いくつかの態様では、治療剤（複数可）とターゲティング抗体は、例えば、５：１の比率で存在できる。治療剤（複数可）とターゲティング抗体の比率は、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、１００：１またはこれらの間のいずれかの値であることができる。治療剤とポリマーは、例えば８：１の比率で存在できる。治療剤とポリマーの比率は、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１またはこれらの間のいずれかの値であることもできる。いくつかの態様では、本明細書に記載されている抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートは、約１〜８個のポリマーを含むことができる。いくつかの態様では、本明細書に記載されている抗体−薬物コンジュゲートは、ポリマー１個当たり約１〜１０個の治療剤を含むことができる。
【０１１３】
特定の態様では、この比率は、抗体にコンジュゲーションしている治療剤の平均数と同じであり、そのポリマーにおけるＭＡ−ＧＦＬＧ−ＥＰＩ残基の平均数（「ｎ」）と、その抗体にコンジュゲーションしているポリマーの平均数（「ｐ」）の積と同じであることができる。
【０１１４】
いくつかの態様では、ｍは、約０〜約１００であることができる。ｍは、特定のポリマーに関しては整数であるが、ポリマー群（例えば、特定の抗体に結合しているポリマーまたは記載されているコンジュゲートを含む組成物中のポリマーのすべて）の平均では、整数以外で表すことができることが分かる。例えば、ｍは、約０〜約５、約０〜約１０、約０〜約２０、約０〜約５０、約１〜約５、約１〜約１０、約１〜約２０または約１〜約５０であることができる。
【０１１５】
いくつかの態様では、ｎは、約１〜約１０であることができる。ｎは、特定のポリマーに関しては整数であるが、ポリマー群（例えば、特定の抗体に結合しているポリマーまたは記載されているコンジュゲートを含む組成物中のポリマーのすべて）の平均では、整数以外で表すことができることが分かる。例えば、ｎは、約１〜約１０、約１〜約８、約１〜約６、約１〜約４、約１〜約３、約１〜約２、約２〜約５または約２〜約８であることができる。
【０１１６】
いくつかの態様では、ｐは、約１〜約８であることができる。ｐは、特定の抗体に関しては整数であるが、抗体群（例えば、記載されているコンジュゲートを含む組成物中の抗体）の平均では、整数以外で表すことができることが分かる。例えば、ｐは、約１〜約８、約１〜約６、約１〜約４、約１〜約３、約１〜約２、約２〜約５または約２〜約８であることができる。
【０１１７】
したがって、特定の態様では、本明細書に記載されている抗体−薬物コンジュゲートは、１個のターゲティング抗体当たり約１〜約８０個の治療剤を含むことができる。
【０１１８】
本明細書に記載されている方法であって、開示されているような抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートを作製するプロセスに関連する方法は、その抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの製薬学的に許容可能な塩を作製するために、容易に修正できる。したがって、このような塩を含む医薬組成物と、それらの投与方法は、本開示の範囲内である。
【０１１９】
医薬組成物
本明細書に開示されているのは、上記の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートと製薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物である。いくつかの態様では、治療剤は、抗がん剤であることができ、医薬組成物は、静脈内投与用に調合できる。いくつかの態様では、医薬組成物は、静脈内投与または腫瘍内注射用に調合できる。また、本開示の組成物は、本明細書に記載されているような抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートを治療有効量含む。本発明の組成物は、様々な投与経路のいずれかによる投与用に調合でき、１つ以上の生理学的に許容可能な賦形剤を含むことができ、その賦形剤は、投与経路に応じて変動し得る。本明細書で使用する場合、「賦形剤」という用語は、「担体」または「希釈剤」と称することもできるものを含むいずれかの化合物または物質を意味する。医薬組成物と生理学的に許容可能な組成物の調製は、当該技術分野において常法的なものとみなされているので、当業者は、必要な場合、多くの専門家に相談できる。
【０１２０】
本明細書に開示されているような医薬組成物は、経口または非経口投与用に調製できる。非経口投与用に調製した医薬組成物としては、静脈内（もしくは動脈内）投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、経粘膜（例えば、鼻腔内、膣内もしくは直腸）投与、または経皮（例えば局所）投与用に調製した医薬組成物が挙げられる。エアゾール吸入を用いて、本発明の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートを送達することもできる。したがって、組成物は、許容可能な担体（水、緩衝用水、生理食塩水、緩衝生理食塩水（例えばＰＢＳ）のような水性担体などが挙げられるが、これらに限らない）に溶解または懸濁した抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートを含む非経口投与用に調製できる。含まれている賦形剤の１つ以上は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、洗浄剤などのように、生理的条件に近づくように助けることができる。本発明の組成物は、（経口投与用であってよい場合のように、）固体成分を含む場合には、賦形剤の１つ以上は、（例えば、錠剤、カプセル剤などの調合用に、）結合剤または充填剤としての役割を果たすことができる。本発明の組成物が、皮膚または粘膜表面への塗布用に調合されている場合には、賦形剤の１つ以上は、クリーム、軟膏剤などの調合用の溶媒または乳化剤であることができる。
【０１２１】
本発明の医薬組成物は、無菌であることができ、従来の滅菌技法によって滅菌するか、または滅菌ろ過することができる。水性液剤をそのまま使用するものとしてパッケージングすることも、凍結乾燥することもでき、凍結乾燥調製物（本開示に含まれる）は、投与前に、滅菌水性担体と組み合わせることができる。本発明の医薬組成物のｐＨは典型的には、３〜１１（例えば約５〜９）または６〜８（例えば約７〜８）になる。固体形態で得られる組成物は、複数の単回投与単位でパッケージングでき、その各単位には、密封パッケージの錠剤またはカプセル剤におけるように、上記薬剤の１つまたは複数が一定量含まれている。固体形態の本発明の組成物は、局所塗布可能なクリームまたは軟膏剤用に設計されている搾り出し可能なチューブのように、柔軟な量をもたらすために、容器にパッケージングすることもできる。
【０１２２】
治療方法
本明細書で開示するのは、がんの対象の治療方法であって、（ａ）治療が必要な患者を特定することと、（ｂ）その対象に、ターゲティング抗体と、１つ以上のポリマー（例えばセミテレケリックポリマー）と、１つ以上の治療剤とを含む抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートと、製薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を治療有効量投与することを含む方法である。いくつかの態様では、２つ以上、３つ以上または４つ以上のポリマー（例えばセミテレケリックポリマー）が存在することができる。いくつかの態様では、２つ以上、３つ以上または４つ以上の治療剤が存在することができる。
【０１２３】
いくつかの態様では、１つ以上の治療剤は、ターゲティング抗体が結合できるかまたは結合する能力のある標的細胞に局所送達できる。いくつかの態様では、１つ以上の治療剤は、標的細胞のリソソーム内で放出できる。
【０１２４】
上記の医薬組成物は、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートを治療有効量含むように調合できる。治療投与には、予防的用途が含まれる。遺伝子検査とその他の予測方法に基づき、患者において、あるタイプのがんに対して、臨床的に判断した素因または感受性の増大（場合によっては、感受性の著しい増大）が見られる場合、患者の診察医は、予防的投与を選択できる。
【０１２５】
本明細書に記載されている医薬組成物は、臨床疾患の発症を遅延、低減または好ましくは予防するのに充分な量で、対象（例えばヒト患者）に投与できる。したがって、いくつかの態様では、対象は、ヒト対象であることができる。治療用途では、組成物は、すでにがんであるかまたはがんと診断された対象（例えばヒト患者）に、その状態の徴候もしくは症状を少なくとも部分的に改善するか、またはその状態の症状、その合併症及び帰結の進行を妨げる（かつ、好ましくは抑止する）のに充分な量で、投与できる。上記を実現するのに充分な量は、「治療有効量」として定義する。医薬組成物の治療有効量は、治癒させる量であることができるが、その帰結は、達成できるいくつかの帰結のうちの１つに過ぎない。上述のように、治療有効量には、がんの発症または進行を遅延、妨害もしくは予防するか、またはがんもしくはがんの症状を改善する治療をもたらす量が含まれる。その症状の１つ以上は、それほど重篤でないことができる。治療した個体において、回復を速めることができる。
【０１２６】
いくつかの態様では、がんは、原発または二次性腫瘍、難治性または再発腫瘍であることができる。別の態様では、原発もしくは二次性腫瘍、または難治性もしくは再発腫瘍は、患者の乳房、リンパ系、膀胱、胃、肺（複数可）、子宮、胆嚢または１つ以上の卵巣内にあることができる。いくつかの態様では、原発もしくは二次性腫瘍、または難治性もしくは再発腫瘍は、血液細胞腫瘍であることができる。ある態様では、血液細胞腫瘍は、リンパ腫であることができる。ある態様では、リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫であることができる。いくつかの態様では、非ホジキンリンパ腫は、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫またはバーキットリンパ腫であることができる。さらに別の態様では、がんは、ＨＥＲ２、ＣＤ２０またはＯＡ−３の発現と関連していることができる。いくつかの態様では、がんは、上皮細胞成長因子レセプター（例えばＨＥＲ２）の発現と関連していることができる。いくつかの態様では、がんは、Ｂリンパ球関連抗原（例えばＣＤ２０）の発現と関連していることができる。いくつかの態様では、がんは、卵巣癌抗原（例えばＯＡ−３）の発現と関連していることができる。ある態様では、がんは、ＨＥＲ２の発現（または過剰発現）と関連していることができる。ある態様では、がんは、ＣＤ２０の発現（または過剰発現）と関連していることができる。ある態様では、がんは、ＯＡ−３の発現（または過剰発現）と関連していることができる。
【０１２７】
本明細書で開示するのは、がんの対象または患者の治療方法である。そのがんは、いずれかのがんであることができる。いくつかの態様では、がんは、乳癌、膀胱癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、肺癌、非小細胞肺癌、子宮癌、子宮体癌、胆嚢、卵巣癌またはリンパ腫であることができる。いくつかの態様では、そのがんは、血液、骨髄、リンパまたはリンパ系に影響を及ぼすものである。また、血液の腫瘍は、循環系及び／または免疫系に影響を及ぼすことがある。血液癌は、液性癌ということもでき、赤血球、白血球またはこれらの両方が合わさったものに影響を及ぼすことがある。血液の癌は、血液悪性腫瘍ということもでき、さらに、白血病、リンパ腫及び骨髄腫として分類できる。リンパ腫の例としては、ホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫が挙げられる。さらに、古典的ホジキンリンパ腫は、結節硬化型ホジキンリンパ腫、混合細胞型、リンパ球豊富型またはリンパ球優位型及びリンパ球減少型というサブタイプに分類できる。結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫は、ＣＤ２０を発現する場合がある。非ホジキンリンパ腫には、ホジキンリンパ腫以外のすべてのサブタイプのリンパ腫が含まれる。ホジキンリンパ腫細胞は、ＣＤ３０を発現する。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫は、ＣＤ２０を発現する。Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の例としては、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病／小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾臓辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（±絨毛リンパ球）、有毛細胞白血病、形質細胞性骨髄腫／形質細胞腫、ＭＡＬＴ型の節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（±単球様Ｂ細胞）、濾胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫と原発性滲出液リンパ腫を含む）及びバーキットリンパ腫が挙げられる。ある態様では、血液細胞腫瘍は、リンパ腫であることができる。ある態様では、リンパ腫は、非ホジキンリンパ腫であることができる。
【０１２８】
本明細書に開示されている治療方法は、特定のタイプの細胞（例えば、ＣＤ２０発現Ｂ細胞、ＨＥＲ２発現細胞またはＯＡ−３発現細胞）を殺傷する工程も含むことができる。本発明の治療方法は、細胞と、本明細書に記載されている組成物及び／またはＡＰＤＣとを接触させる工程をさらに含むことができる。
【０１２９】
ある態様では、本明細書に記載されている方法は、乳癌、膀胱癌、胆嚢癌及び／または卵巣癌であるか、その癌になる素因を有するかまたはその癌の疑いのある対象を治療するために、ターゲティング抗体としてハーセプチンを選択することを含むことができる。ある態様では、本明細書に開示されている方法は、卵巣癌であるか、卵巣癌になる素因を有するかまたは卵巣癌の疑いのある対象を治療するために、ターゲティング抗体としてＯＶ−ＴＬ１６を選択することを含むことができる。
【０１３０】
ある態様では、本明細書に開示されている治療方法は、治療有効量の放射線療法、免疫療法、化学療法、幹細胞移植またはこれらを組み合わせたものを行うことを含むことができる。
【０１３１】
この用途における有効量は、そのがんの重症度と、対象の体重、全身状態及び健康状態に左右され得る。初回投与とブースター投与に適するレジメンは、初回投与の後に、その後の投与を１時間、１日、１週間または１カ月に１回以上の間隔で反復投与することを特徴とする。例えば、対象に、１回用量以上の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートを１週間に１回以上（例えば、１週間に２回、３回、４回、５回、６回もしくは７回以上）投与できる。
【０１３２】
本明細書に開示されている医薬組成物中の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの総有効量を哺乳類動物に単回用量として、ボーラスとしてか、注入によるかのいずれかで、比較的短い期間で投与でき、あるいは、より長い期間をかけて複数回用量を投与する（例えば、４〜６時間、８〜１２時間、１４〜１６時間、１８〜２４時間、２〜４日、１〜２週間、または１カ月ごとに１回用量）分割治療プロトコールを用いて投与できる。あるいは、治療上有効な血中濃度を維持するのに充分な持続静脈内注入も、本開示の範囲内である。
【０１３３】
本明細書に記載されている組成物に存在するとともに、本明細書に開示されているような方法であって、哺乳類動物（例えばヒト）に適用する方法で使用する治療剤の１つ以上の治療有効量は、年齢、体重及びその他の一般的条件（上記のようなもの）の個体差を考慮して、当業者が定めることができる。本開示の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートは、血清と血流において安定していることができるので、より具体的ないくつかのケースでは、いずれかの個別成分を含む抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの用量は、未結合のときのその個別成分のいずれかの有効量よりも少ない（または高い）ことができる。したがって、いくつかの態様では、投与する抗がん剤は、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの一部として投与すると、その抗がん剤を単独でまたは抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの一部ではない状態で投与する場合と比較して、有効性が高くなるか、または副作用が軽減される。
【０１３４】
キット
本発明のキットは、ターゲティング抗体と、１つ以上のポリマー（例えばセミテレケリックポリマー）と、１つ以上の治療剤とを含む組成物と、好適な説明（例えば、書面資料及び／または聴覚的資料、視覚的資料もしくは視聴覚的資料）とを含むことができる。ある態様では、キットはさらに、本明細書に開示されている１つ以上の連結基を含むことができる。その組成物はさらに、製薬学的に許容可能な担体を含むことができる。ある態様では、本発明のキットは、本明細書に記載されているような医薬組成物であって、使用説明とともにパッケージングされている医薬組成物を含む。本発明のキットは、希釈剤、無菌液、シリンジ、滅菌容器、グローブ、バイアルまたはその他の容器、ピペット、針などのうちの１つ以上も含むことができる。
【実施例】
【０１３５】
フローサイトメトリーを用いて、コンジュゲートの前と後に、Ｒａｍｏｓ細胞に対するＲＴＸの結合親和性を解析した。皮下Ｒａｍｏｓ  Ｂ細胞リンパ腫腫瘍を有する雄のＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスにおいて、新規なＡＤＣであるＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの抗腫瘍効力を評価した。
【０１３６】
材料と方法
化学物質：いずれの溶媒も、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から最高グレードを購入し、受領した状態で使用した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）及びＨＡＴＵ（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロ−ホスフェート）は、ＡＡＰＰＴＥＣ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）から購入した。ヨウ素−１２５［125Ｉ］は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒから購入した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイキットとトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から得た。チアゾリジン−２−チオン（ＴＴ）、Ｎ−２−アミノエチルマレイミドトリフルオロアセテート及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。Ｃｙ５−ＮＨＳエステルは、Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ（Ｈａｌｌａｎｄａｌｅ  Ｂｅａｃｈ，ＦＬ）から得た。２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ６５）、２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ７０）は、Ｗａｋｏ  ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）から得た。エピルビシンヒドロクロリドは、ＤＫＹ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗｕｈａｎ，Ｃｈｉｎａ）から購入した。Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）（Ｋｏｐｅｃｅｋ  ａｎｄ  Ｂａｚｉｌｏｖａ，１９７３）、Ｎ−メタクリロイルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシン（ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＯＨ）（Ｕｌｂｒｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）、Ｎ−メタクリロイルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシン−エピルビシン（ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＥＰＩ）（Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０１５）及び４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエート（ＣＰＤＢ）（Ｍｉｔｓｕｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）は、文献に従って合成した。
【０１３７】
細胞と試薬：バーキットリンパ腫細胞株のＲａｍｏｓ及びＲａｊｉは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得て、３７℃で、５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気において、１０％ＦＢＳと抗生物質混合物（１００ユニット／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）で維持した。リツキシマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、Ｈｕｎｓｔｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈから、１０ｍｇ／ｍｌのストック濃度で得た。ヒトＩｇＧは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から得た。Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８）は、Ｄｏｊｉｎｄｏ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｋｉｔは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から購入した。
【０１３８】
動物：約７〜９週齢の雄のＮＯＤＳＣＩＤマウス（２５〜３０ｇ）は、大学内で飼育した（最初はＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した）。動物は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＵｔａｈのＡｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｃｅｎｔｅｒで、標準的な条件において飼育した。動物とその飼育に関わる手順は、承認されたＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）プロトコールに従って行った。
【０１３９】
統計：この調査におけるすべての実験は、少なくとも３回反復した。定量分析は、平均±標準偏差（ＳＤ）で表した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）をＴｕｋｅｙの事後分析と組み合わせたものを用いて、３つ以上の群を比較した（０．０５未満のｐ値によって、統計的に有意な差が示される）。
【０１４０】
実施例１：抗体−薬物コンジュゲートの合成
２−シアノ−５−オキソ−５−（２−チオキソチアゾリジン−３−イル）ペンタル−２−イルベンゾジチオエート（ＣＴＡ−ＴＴ）の合成：以前に説明されたようにして（Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、ＣＴＡ−ＴＴを合成した。簡潔に述べると、０．８４ｇのＣＰＤＢと、０．３６ｇのＴＴと、０．０２５ｇのＤＭＡＰを１０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解し、氷浴で予冷した。そのフラスコに、３０分以内で、１０ｍｌのＤＣＭ中のＤＣＣを滴下してから、攪拌を６時間、遮光下において室温（ｒ．ｔ．）で続けた。ワークアップ後、ろ過（沈殿した塩を除去するため）によって、赤色のろ液を得た。その液をロータリーエバポレーターによって濃縮した。エチルアセテート／ヘキサングラジエント（ステップグラジエント、１：３〜１：１、ｖ／ｖ）を溶離液として用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（７０〜２３０メッシュ、６０Å）によって、ＣＴＡ−ＴＴを精製する。その画分を減圧下で蒸発させた。ＣＴＡ−ＴＴ剤は、赤色油として得た。1Ｈ ＮＭＲ ＣＤＣｌ3 （ｐｐｍ）: ７．６０ − ７．３０ （ベンゼン）， ４．６０ − ４．５０ （ＮＣＨ2ＣＨ2）， ３．４０ − ３．２０ （ＳＣＨ2ＣＨ2）， ２．７０ − ２．６０ （ＣＣＨ2ＣＨ2）， ２．６０ − ２．５０ （ＣＣＨ2ＣＨ2）， ２．２０ − ２．１０ （ＣＣＨ2ＣＨ2）， ２．００ − １．９０ （ＣＨ3）
【０１４１】
マレイミドで官能化されたセミテレケリックＨＰＭＡコポリマー−エピルビシンコンジュゲート（ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−Ｍａｌ）の合成：ＲＡＦＴ共重合の後、２段階の末端変性を行うことによって、末端にマレイミド基を有するセミテレケリック（ＳＴ）ＨＰＭＡコポリマーを調製した。典型的な重合プロセスを簡潔にまとめると、以下のようになる。ＨＰＭＡ（１３９ｍｇ、０．９７ミリモル）とＭＡ−ＧＦＬＧ−ＥＰＩ（３０ｍｇ、０．０３ミリモル）の入ったアンプルをシュレンクラインに接続した。真空−窒素サイクルを３回行って、酸素を取り除いた後、シリンジを介して、ＣＴＡ−ＴＴ（４ｍｇ／ｍｌ×１７０μｌ、脱気ＭｅＯＨ／Ｈ+  ０．３％酢酸中）及びＶ７０（１ｍｇ／ｍｌ×１８４μｌ、脱気ＭｅＯＨ／Ｈ+  ０．３％酢酸）を電磁攪拌下で加え、Ｎ2で１０分、氷浴でバブリングした。そのアンプルを密閉し、重合を３０℃で２２時間行った。アセトン／エチルエーテルに沈殿することによっコポリマーを得、メタノールに再溶解して、２回以上、アセトン／エチルエーテル中で沈殿することによって精製した。そのコポリマーを赤色粉末として単離し、真空下で乾燥した。このコンジュゲートの平均分子量（Ｍｗ）と多分散性（ＰＤＩ）は、ＵＶ検出器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ｍｉｎｉ  ＤＡＷＮ  ＴＲＥＯＳ及びＯｐｔｉｌａｂｒＥＸ（屈折率）検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を備えたＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムで、３０％アセトニトリル（ｐＨ６．５）を含むナトリウムアセテート緩衝液を移動相として用いたＳｕｐｅｒｏｓｅ６  ＨＲ１０／３０カラムを用いて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて求めた。０．３ｍｌ  ＭｅＯＨ／Ｈ+中の４０倍過剰のＶ−６５と、５５℃で２時間、さらに反応させることによって、ジチオベンゾエート基を除去し、２回、アセトン／エチルエーテルに沈殿して、ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−ＴＴを得た（７０ｍｇ、４１％）。ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−ＴＴをメタノールに溶解することによって（約２ｍｇ／１０ｍｌ）、コポリマーにおけるＥＰＩの含有率を分光光度法で求め（λmax＝４９５ｎｍ）、メタノールにおけるＥＰＩ検量線に従って算出した。
【０１４２】
末端鎖の反応性マレイミド（ｍａｌ）基は、ＴＴ基をＮ−（２−アミノエチル）マレイミドと反応させることによって組み込んだ。例えば、１８ｍｇのＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−ＴＴを５００μｌのＤＭＳＯに溶解してから、１０μｌのＤＩＰＥＡと５ｍｇのＮ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロアセテートとを含む０．１ｍｌのＤＭＳＯに、その溶液を加えた。室温で２４時間攪拌後、３回、アセトン／エーテル中で沈殿することによってポリマーを単離して、１６．５ｍｇのＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−ｍａｌを得た。エルマンアッセイを修正したものによって、マレイミド基の存在を確認した。
【０１４３】
抗体−ポリマー−ＥＰＩコンジュゲートの合成：１３ｍｇのリツキシマブをトリス−ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で緩衝液交換して、最終量２．５ｍｌにし、ＴＣＥＰ（１００ｍＭ×３００μｌ、トリス−ＨＣｌ緩衝液において８０倍過剰、ｐＨ７．４）と混合した。３７℃で３時間インキュベート後、トリス緩衝液によって４回、限外ろ過することによって（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ（商標）、ＭＷＣＯ３０，０００）、過剰なＴＣＥＰを除去して、ＲＴＸ−ＳＨを得た。ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−Ｍａｌ（１６．５ｍｇ、４００μｌのトリス・ＨＣｌ緩衝液中）をＲＴＸ−ＳＨ溶液に加え、３７℃で６時間インキュベートした。ワークアップ後、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で溶出するＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲ１６／６０カラムを備えたＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でＳＥＣを用いて、コンジュゲートを精製して、コンジュゲーションしなかった遊離ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩを除去した。
【０１４４】
同じ手順に従って、非特異的なＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩを調製した。最終溶液におけるタンパク質濃度（ＲＴＸまたはＩｇＧ）をＢＣＡタンパク質アッセイで求め、その一方で、ＥＰＩ含有率に基づき、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法を用いて、ポリマー含有率を評価した。その結果、置換度（Ｐ−ＥＰＩ／ｍＡｂ）と、薬物抗体比（ＤＡＲ）を算出した。
【０１４５】
ＲＴＸ−ＥＰＩコンジュゲートの合成：マレイミド修飾エピルビシンを合成するために、６−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル）ヘキサン酸（１２ｍｇ、０．０６ミリモル）を２００μｌのＤＭＦに溶解し、ＨＡＴＵ（０．０５ミリモル）とＤＩＰＥＡ（２０μｌ）を加え、室温で３０分攪拌した。その混合物を１００μｌのＤＭＦ中の１５μｌのＤＩＰＥＡとともに、ＥＰＩ（２７ｍｇ、０．０５ミリモル）溶液中に移した。その反応混合物を室温で一晩攪拌して、ＥＰＩ−ｍａｌを得た。この生成物をＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ、５μｍ、３００ＳＢ−Ｃ１８カラム（９．４×２５０ｍｍ）、流速２．５ｍｌ／分と、３０分以内で２％〜９０％の緩衝液Ｂというグラジエント溶出を使用、緩衝液Ａ：ＤＩ  Ｈ2Ｏ、緩衝液Ｂ：アセトニトリル）によって精製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳとＨＰＬＣ解析によって、その生成物の構造と純度を確認した。ＭＳ （ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ） ｍ／ｚ： ７５９．２１ ［Ｍ＋Ｎａ］＋， ７７５．１８  ［Ｍ＋Ｋ］＋
【０１４６】
上記のようにして、ＲＴＸ−ＳＨを調製した。ＥＰＩ−ｍａｌ（１０ｍＭ×ＤＭＳＯ中に３５μｌ）をＲＴＸ−ＳＨ溶液に加え、室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳを用いて４回、限外ろ過（カットオフ３０，０００Ｄａ）によって精製した。ＵＶ−ｖｉｓ吸光度によってＥＰＩ／ＲＴＸのモル比を算出したところ、３．１であった。
【０１４７】
Ｃｙ５で標識したＲＴＸ：ＰＢＳ中のリツキシマブ（１０ｍｇ／ｍｌ×３００μｌ）をＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）の添加によって３回緩衝液交換した。Ｃｙ５−ＮＨＳ（５ｍｇ／ｍｌ×８μｌ、ＤＭＳＯ中、ＲＴＸ：Ｃｙ５＝１：３）を加え、室温で２時間インキュベートして、ＲＴＸ−Ｃｙ５を得た。ＰＤ−１０カラムと、３回の限外ろ過（カットオフ３０，０００Ｄａ）によって、遊離Ｃｙ５−ＮＨＳを除去した。ＢＣＡアッセイによって、最終ＲＴＸ−Ｃｙ５溶液におけるＲＴＸ濃度を求め、ＵＶ−可視分光法（モル吸光係数：ＰＢＳ中、６４５ｎｍにおいて１２５，０００Ｍ-1ｃｍ-1）によって、Ｃｙ５含有率を求めた。Ｃｙ５／ＲＴＸの比率は０．８であった。
【０１４８】
ナトリウムドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）：ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中で試料を調製した。試料を（６〜１０％）アクリルアミドゲルに入れ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮというゲル装置で、１×ランニングバッファー（２５ｍＭのトリス・ＨＣｌ、２５０ｍＭのグリシン及び０．１％ＳＤＳ）において、１１０Ｖ及び３０ｍＡで１．５時間印加した。
【０１４９】
抗体−薬物コンジュゲートＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの設計、調製及び特徴付け：抗体への薬物のコンジュゲーションは通常、溶媒に接触可能なリシンまたはシステインにおいて行う。ヒトＩｇＧは、約１００個のリシン残基を含む。その約２分の１（重鎖と軽鎖の両方に位置する）は、接触可能であり、改変して、ＤＡＲが０〜８の不均一なコンジュゲート混合物をもたらすことができる。これにより、この非特異的なアプローチによって、インビボでの広範な薬物動態特性をもたらすことになることが暗示されている。システインのコンジュゲーションは、４つの鎖間ジスルフィド結合の還元（８個以内の曝露スルフヒドリル基が得られる）の後に行う。その結果、得られるＡＤＣの不均一度は低下する。したがって、システイン残基を介したコンジュゲーションを選択したが、設計したこの合成アプローチは、図１に示されている。すなわち、まず、マレイミド修飾セミテレケリックＨＰＭＡコポリマー−エピルビシンコンジュゲートを調製してから、チオールエン反応によって、チオエーテル結合を介して、ＲＴＸに結合した。
【０１５０】
コポリマー前駆体は、ＨＰＭＡとＭＡ−ＧＦＬＧ−ＥＰＩとのＲＡＦＴ共重合によって調製した。連鎖移動剤ＣＴＡ−ＴＴの使用により、一方の鎖（巨大分子）末端に反応性ＴＴ基を有するコポリマーの調製が可能になる。そのポリマー担体を最終的に除去できるように、ポリマー前駆体の平均分子量を腎閾値未満（約５０ｋＤａ未満）に制御した。ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−ＴＴには、ポリマー末端に０．８９個の末端ＴＴ基が含まれていた（ＭｅＯＨ中での３０５ｎｍにおけるモノマーのモル吸光係数１０  ８００Ｌ・ｍｏｌ-1ｃｍ-1を用いて、３０５ｎｍにおけるＥＰＩのＵＶ分光測定値をベースラインとして、ＵＶ分光測光法によって求めた）。ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−ｍａｌには、ポリマー１個当たり０．８６個のマレイミド基が含まれていた（これは、エルマンのアッセイ（Ｇｅｒｇｅｌ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｂａｕｍ，１９９６）を修正したものによって求めた）。同じ手順に従って、ＥＰＩ前駆体を合成した。その特徴は、表１にまとめられている。
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【０１５１】
活性なコポリマー前駆体をＲＴＸに結合するために、ＲＴＸをトリス・ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）中のＴＣＥＰで処理した。このような穏和な条件下で、溶媒に接触可能な４つの鎖間ジスルフィド結合をチオール基に還元した（ＲＴＸ−ＳＨ）。エルマンアッセイ（Ｇｅｒｇｅｌ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｂａｕｍ，１９９６）によって、ＲＴＸ−ＳＨのチオール／ｍＡｂ比が７．９であることことが示された。ＳＥＣ解析によって、ＲＴＸと同じ溶出体積が示され（過去の報告（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）と一致している）、ＲＴＸと同じ分子量が示された。ＲＴＸ−ＳＨと、トリス・ＨＣｌ緩衝液中の過剰のＳＴ−Ｐ−ＥＰＩとを反応させた。ＳＥＣ解析によって、結合後、ＲＴＸに対応するピークが完全に消失し、それに伴い、コンジュゲートのＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩに対応する新たなピークが見られることが示された（図１２）。純粋なＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ、ＲＴＸ及びポリマー前駆体のＳＴ−Ｐ−ＥＰＩのＳＥＣプロファイルは、図３Ａに示されている。
【０１５２】
（生物学的評価用の）コントロールとして、非特異的なヒトＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩとコンジュゲートＲＴＸ−ＥＰＩ（ＥＰＩをＲＴＸに直接結合したもの）を調製した（図２）。
【０１５３】
ナトリウムドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）解析によって、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの合成の成功をさらに確認した。すなわち、非変性生成物（図３Ｂ、レーン５）によって、遊離抗体バンドの消失と、それに伴い、コンジュゲートＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩに対応する高い見かけ分子量のスミアの出現が確認された。
【０１５４】
ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩの置換度と、担持されるＲＴＸの結合能との関係を明らかにするために、［ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−ｍａｌ］／［ＲＴＸ−ＳＨ］の仕込み比率と反応時間を変更することによって、ＤＡＲが様々である４つのＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩコンジュゲートを調製した。それらの特徴は、表２にまとめられている。
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【０１５５】
高いペイロードが原因で、会合するとともに、溶解性が損なわれる古典的なＡＤＣとは異なり、本明細書に記載されている系では、ＤＡＲが４０超に達しても（５番目のＲＴＸ−（Ｐ−ＥＰＩ）6.5）、コンジュゲートは依然として水溶性であったとともに、検出可能な凝集も見られなかった（図４）。
【０１５６】
実施例２：結合親和性評価
抗体と、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの細胞結合を評価するために、ＣＤ２０の発現が高いＲａｍｏｓ細胞株を標的として選択した。細胞（４００μｌの培地中に２×１０5個）を２０００ＲＰＭによって５分、遠心分離し、その上清を除去したところ、最終量は約５０μｌであった。コンジュゲートを漸増濃度で（２０μｌのＰＢＳ中に０．０４μｇ、０．２μｇまたは１μｇ）加えた。比較用には、ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩとＲＴＸを用いた。細胞を４℃で２０分インキュベートし、培地で２回洗浄して、未結合のコンジュゲートを除去した。続いて、細胞を１００μｌの二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、１：２００の希釈率）で染色し、４℃で再び２０分インキュベートした。ＰＢＳによって２回洗浄後、標識した細胞をフローサイトメトリーによって解析した。
【０１５７】
Ｒａｍｏｓ  Ｂ細胞に対する各種コンジュゲートの結合親和性：使用するＲａｍｏｓ細胞の表面でのＣＤ−２０抗原の発現を確かめるために、Ｃｙ５で標識したＲＴＸ（ＲＴＸ−Ｃｙ５）に、そのＲａｍｏｓ細胞を暴露した。フローサイトメトリー解析によって、インキュベートしたＲａｍｏｓ細胞で、高いＣｙ５シグナルが見られた。しかしその一方で、ＣＤ２０レセプターを過飽和用量のＲＴＸでブロックしたところ、細胞をＲＴＸ−Ｃｙ５とともにインキュベート後、検出可能なＣｙ５シグナルは見られなかった（図１３）。これにより、Ｒａｍｏｓ細胞の表面でのＣＤ２０の発現と、ＲＴＸに対するその特異的結合親和性が確認された。
【０１５８】
抗体−薬物コンジュゲートの結合特性を評価するために、３つの異なる量のＲＴＸまたは同等のＲＴＸ−薬物コンジュゲートでＲａｍｏｓ細胞を処理し、４℃でインキュベートして、抗原のモジュレーションをブロックし、洗浄して、未結合の物質を除去した。蛍光標識二次抗体のヤギ抗ヒトＩｇＧを用いて、各コンジュゲート試料の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を求めた。ＭＦＩが高いほど、結合したコンジュゲートが多いことを示す。さらに具体的には、５０μｌの培地中の２×１０5個のＲａｍｏｓ細胞を、それぞれ異なる試料（２０μｌのＰＢＳ中に１μｇ、０．２μｇまたは０．０４μｇ）と混合し、４℃で３０分インキュベートした。その混合物を培地によって２回洗浄して、未結合の試料を除去した。１００μｌの二次抗体（ＧＡＨ−４８８、１：２００の希釈率）を加え、４℃で３０分インキュベートした。ＰＢＳによって洗浄後、その細胞をフローサイトメトリーによって解析した。すべてのデータは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示されている。
【０１５９】
図５には、使用した３つのすべての濃度において、結合親和性が、抗体に対するポリマーの比率から影響を受けたことが示されている。予測したように、ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩがＲａｍｏｓ細胞にあまり結合せず、Ｐ−ＥＰＩでＲＴＸを修飾した場合には、結合親和性は、「結合価」に依存する形で部分的に低下し、ポリマー前駆体の結合率が高いほと、コンジュゲートの結合の低下度が大きくなった。所定の濃度（１μｇのＡｂ）では、ＲＴＸの鎖間ジスルフィド結合部位で、３本のポリマー鎖を結合したところ、コンジュゲート（ＲＴＸ−（Ｐ−ＥＰＩ）3.1）では、コンジュゲーションしなかったＲＴＸと比べて、結合親和性維持率は５０％超であったのに対して、ポリマー鎖が４．５本のコンジュゲート（ＲＴＸ−（Ｐ−ＥＰＩ）4.5）では、結合親和性維持率は約４０％、５．６本のコンジュゲート（ＲＴＸ−（Ｐ−ＥＰＩ）5.6）では３０％であった。ＲＴＸ−（Ｐ−ＥＰＩ）6.5では、ＲＴＸ−（Ｐ−ＥＰＩ）5.6と同程度の結合親和性が見られた。したがって、インビトロでの細胞傷害性とインビボでの有効性のさらなる評価のために、コンジュゲートＲＴＸ−（Ｐ−ＥＰＩ）3.1を用い、それを簡潔にＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩとした。
【０１６０】
実施例３：インビトロでの細胞成長の阻害とアポトーシス
細胞成長の阻害：ＣＣＫ−８アッセイ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）によって、Ｒａｍｏｓ細胞に対する抗体と抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの細胞傷害性を測定した。９６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり１０，０００細胞（２００μｌ）の密度で、１０％ＦＢＳを含むＲＭＰＩ−１６４０培地中に、Ｒａｍｏｓ細胞を播種した。２４時間後、培地中のＲＴＸ、ＲＴＸ−ＥＰＩ、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ、ＲＴＸとＰ−ＥＰＩとの混合物及びＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩ（抗体に関して０．３ｍｇ／ｍｌ×１５μｌ）を加え、３７℃で４８時間インキュベートした。メーカーのプロトコールに従って、ＣＣＫ−８キットを用いて、生細胞の数を推定した。簡潔に述べると、５０μｌの５倍希釈ＣＣＫ−８溶液を加え、３７℃、５％ＣＯ2で４時間インキュベートし、４５０ｎｍ（対照として６３０ｎｍ）において、マイクロプレートリーダーを用いて、その吸光度を測定した。未処理のコントロール細胞を１００％生存と設定した。
【０１６１】
アポトーシス：メーカーによって提供されているＲＡＰＩＤ（商標）プロトコールに従って、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ及びＰＩ染色を行った。０．２μＭ（抗体）のＲＴＸ、ＲＴＸ−ＥＰＩ、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ、ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩまたはＲＴＸとＰ−ＥＰＩとの混合物（Ｐ−ＥＰＩの濃度は、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの含有率と同じであった）を含む０．４ｍｌの新鮮な成長培地に、２×１０5個のＲａｍｏｓ細胞を懸濁した。この細胞懸濁液を４８時間インキュベートした。すべての実験は、トリプリケートで行った。
【０１６２】
抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートのインビトロ毒性：まず、Ｒａｍｏｓ細胞に対するＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの細胞傷害性を０．１５μＭの濃度（ＲＴＸに関する濃度）で評価した。コンジュゲーションしなかったＲＴＸと、非特異的なコンジュゲートのＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩと、遊離薬物と直接コンジュゲーションしたもの（ＲＴＸ−ＥＰＩ）をコントロールとして用いた。Ｒａｍｏｓ細胞を試料とともに４８時間インキュベートし、ＣＣＫ−８アッセイによって評価した（図６）。所定の条件下において、新規な設計のコンジュゲートＲＴＸ−（Ｐ−ＥＰＩ）ｘ（ｘ＝３．１、４．４、５．６、６．５）では、様々な置換度にかかわらず、Ｒａｍｏｓ細胞の増殖を阻害する優れた能力（殺傷率約４０％）が見られた一方で、ＲＴＸ単独の細胞傷害性は、ほとんど検出不能であった。特に、抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの利点は、古典的な抗体−薬物コンジュゲートのＲＴＸ−ＥＰＩ（殺傷率１８％）と、ＲＴＸとＰ−ＥＰＩとの混合物（ＲＴＸ−（Ｐ−ＥＰＩ）3.1と等しい濃度のＲＴＸ及びＥＰＩ、殺傷率３０％）の比較で示された。非特異的なコンジュゲートのＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩ（殺傷率２２％）では、中程度の細胞傷害性が見られた。これらの結果から、抗体を従来の化学療法剤とコンジュゲーションしたものであるＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの潜在的な臨床用途が暗示されている。
【０１６３】
ＲＴＸ、ＲＴＸ−ＥＰＩ、ＲＴＸ＋Ｐ−ＥＰＩ及びＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩを対照として用いた。９６ウェルプレートの各ウェルにおいて、１０％ＦＢＳを含む２００μｌのＲＰＭＩ−１６４０培地に、１０4個のＲａｍｏｓ細胞を播種した。それぞれ異なる試料（０．３ｍｇ／ｍｌ×１５μｌ）を加え、３７℃で、５％ＣＯ2（ｖ／ｖ）の加湿雰囲気においてインキュベートした。４８時間後、４５０ｎｍ（対照として６３０ｎｍ）において、ＣＣＫ−８キットを用いて、生細胞数を推定した。未処理細胞を１００％生存と設定した。すべてのデータは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示されている。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって統計解析を行って、３つ以上の群を比較した（０．０５未満のｐ値によって、統計的に有意な差が示される。＊０．０５未満、＊＊＊０．０００１未満）。
【０１６４】
コンジュゲートのＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの抗腫瘍活性をさらに調べるために、Ｒａｍｏｓ細胞とＲａｊｉ細胞を用いて、そのコンジュゲートによって誘導されたアポトーシスレベルを検出した。細胞（２×１０5個／ウェル）を０．２μＭのＲＴＸ換算濃度で４８時間（Ｒａｍｏｓの場合）または２４時間（Ｒａｊｉの場合）インキュベートした。アネキシンＶ／ＰＩ染色を用いて、細胞のアポトーシスの誘導を解析した。コントロール試料においては、ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩの細胞傷害性が最低であった一方で、ＲＴＸ−ＥＰＩまたはＲＴＸ＋Ｐ−ＥＰＩでは、ＲＴＸ単独の場合と同様の細胞傷害性が見られた。対照的に、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩでは、３つのすべてのＲＴＸ含有群と比べて、細胞傷害性が著しく向上した（図７）。ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの優位性は、Ｒａｊｉ細胞でも観察された。細胞をＲＴＸのみで処理した場合には、抗体濃度を０．２μＭから２μＭまで上昇させても、アポトーシスレベルは有意に上昇しなかったことから、細胞への抗体の結合が飽和に達していたと見られることが示唆されている。しかしながら、最初に細胞を高濃度のＲＴＸ（２μＭ）で処理してから、１時間後に０．２μＭ換算のＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩに暴露したところ、アポトーシスを起こした細胞の割合は２倍ほどになったことから、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩが、ＲＴＸで前処理した細胞に対する活性を有し得ることが示されている。これにより、この系が、ＲＴＸ耐性疾患を１時間処置した場合に効果を発揮できる可能性が高くなる。
【０１６５】
アネキシンＶ／ＰＩ結合アッセイによって、Ｒａｍｏｓ細胞とＲａｊｉ細胞におけるアポトーシス誘導を解析した。インキュベート時間は４８時間であった。図７には、培養培地中の未処理細胞、ＲＴＸ（リツキシマブ）（０．２μＭ）、ＲＴＸ＋Ｐ−ＥＰＩ（リツキシマブとＰ−ＥＰＩとの混合物）（０．２μＭ（リツキシマブベース）、Ｐ−ＥＰＩの濃度は、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの含有率と等しかった）、ＲＴＸ−ＥＰＩ（リツキシマブ−ＥＰＩコンジュゲート）（０．２μＭ（リツキシマブベース））、
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（細胞をリツキシマブ（２μＭ）によってプレブロックし、その後（１時間後）に、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩコンジュゲート（０．２μＭ）によって処理した）、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ（ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩコンジュゲート（０．２μＭ（リツキシマブベース））、ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩ（ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩコンジュゲート（０．２μＭ（ＩｇＧベース））という表示が適用されている。アポトーシスを起こした細胞の割合をフローサイトメトリーによって定量した。すべてのデータは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示されている。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって統計解析を行って、３つ以上の群を比較した（０．０５未満のｐ値によって、統計的に有意な差が示される。＊０．０５未満、＊＊＊０．０００１未満、ｎ．ｓ．：有意差なし）。
【０１６６】
実施例４：インターナリゼーション
共焦点蛍光顕微鏡：１００μｌにおいて２×１０5個という密度のＲａｍｏｓ細胞を培養培地中のＲＴＸ−Ｃｙ５またはＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ（３ｍｇ／ｍｌ×２５μｌ）と３７℃で３時間インキュベートしてから、その細胞を２回、ＰＢＳで洗浄して、未結合のコンジュゲートを除去し、Ｏｌｙｍｐｕｓのレーザー走査共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００）を用いるイメージングのために、１４ｍｍのマイクロウェルを有する３５ｍｍの滅菌ガラスボトムディッシュ（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）に播種した。
【０１６７】
フローサイトメトリー：１００μｌの培養培地中の１０6個のＲａｍｏｓ細胞をＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ（６ｍｇ／ｍｌ×５μｌ）と混合し、４℃で３０分インキュベートした。培地において細胞を洗浄することによって、未結合のコンジュゲートを除去して、最終量５００μｌを得た。細胞を３７℃で培地においてか、または４℃でＮａＮ3（０．１％）と併せるかのいずれかでインキュベートした。示されている時点に、１００μｌの細胞を培養液から取り出してから、１００μｌの二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、１：２００の希釈率）で染色し、４℃で再び２０分インキュベートした。ＰＢＳによって２回洗浄後、標識した細胞をフローサイトメトリーによって解析した。
【０１６８】
抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートのインターナリゼーション：ＣＤ２０は、相補的な抗体、例えばＲＴＸに結合しても、インターナリゼーションが起きないかまたはインターナリゼーションがゆっくり行われ、細胞表面上に留まる抗原である（Ｐｒｅｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９、Ｌａｗ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）。ＲＴＸへのＰ−ＥＰＩのコンジュゲーションにより、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩのインターナリゼーションが促進されるかを調べるために、Ｒａｍｏｓ細胞を過飽和レベルでＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩにおいて４℃で３０分インキュベートした。細胞を４℃で洗浄してから、（ＮａＮ3の存在下、）３７℃（エンドサイトーシスのための許容温度）と４℃（エンドサイトーシスにおける非許容（＋インヒビター）温度）の両方に維持した。０分、３０分、１時間、２時間及び３時間の時点で、細胞を二次抗体のヤギ抗ヒトＩｇＧＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８で染色した。フローサイトメトリーを用いて、表面に残ったＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩを解析した。図８Ａには、４℃で維持したＲａｍｏｓ細胞において、３時間にわたって、検出可能な変化は示されていない。対照的に、Ｒａｍｏｓ細胞を３７℃に維持したところ、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの表面レベルは、有意に低下した。３時間以内に、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの約４０％が細胞表面から消えたことから、コンジュゲートのＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩが、Ｒａｍｏｓ細胞にインターナリゼーションされたことが示唆されている。この観察結果は、ＲＴＸへのモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）のコンジュゲーションにより、ＲＴＸ−ｖｃＭＭＡＥのインターナリゼーションが起こったというＬａｗ  ｅｔ  ａｌによる過去の報告（Ｌａｗ，ｅｔ  ａｌ．，２００４）と一致している。さらに、共焦点顕微鏡画像（図８Ｂ）によって、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩのインターナリゼーションが確認された。３７℃で３時間インキュベート後、（ＲＴＸ−Ｃｙ５と同様に）表面上と、Ｒａｍｏｓ細胞の細胞質内において、蛍光シグナルが検出されたことから、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩがＲａｍｏｓ細胞にインターナリゼーションされたことが示された。
【０１６９】
実施例５：抗腫瘍効力のインビボでの評価
ヒトＢリンパ腫の局在化異種移植モデルを用いて、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの有効性を評価した。２００μｌＰＢＳ中のＲａｍｏｓ細胞（５×１０6個）を７〜９週齢の雄のＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスの右側腹部に皮下接種した。腫瘍のサイズをノギスで測定し、腫瘍の体積（ｍｍ3）＝１／２×長さ×（幅）2という式（式中、長さ（ｍｍ）は一番長い長さであり、幅（ｍｍ）は、腫瘍の一番小さい寸法である）に従って、腫瘍の体積を算出した。腫瘍の平均サイズが１５０±５０ｍｍ3に達したら、処置を開始した（ｎ＝４〜５）。ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩと、一連の対照（コンジュゲーションしなかったＲＴＸ、非特異的なＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩ、遊離ＥＰＩに直接コンジュゲーションしたＲＴＸ−ＥＰＩ、及びＲＴＸをＥＰＩまたはＰ−ＥＰＩと組み合わせたものを含む）をマウスに尾静脈経由で静脈内（ｉ．ｖ．）投与した（腫瘍移植から１１日目、１４日目、１７日目及び２０日目）。変動＝（ＷDayn−ＷDay0）／ＷDay0×１００％という式によって、体重の変動を算出した。ＲＴＸを２０ｍｇ／ｋｇ含む用量（２０ｍｇ／ｋｇのＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ中に１．５ｍｇ／ｋｇ換算のＥＰＩ）を４回、１１日目、１４日目、１７日目及び２０日目（図９、矢印）において尾静脈経由で投与した。生理食塩水を未処置コントロールとして投与した。ＲＴＸ、ＲＴＸ−ＥＰＩ、ＲＴＸ＋Ｐ−ＥＰＩの混合物、ＲＴＸ＋ＥＰＩの混合物及びＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩも評価した。データは、平均±ＳＤとして示されている（ｎ＝４〜５）。
【０１７０】
ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩのインビボでの抗腫瘍効力：ヒトリンパ腫異種移植片を有する雄のＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスにおいて、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの治療潜在力を評価した。ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスに、Ｒａｍｏｓ細胞（５×１０6細胞／２００μｌ生理食塩水）を右側腹部に皮下移植した。腫瘍が１００〜２００ｍｍ3に達したら、マウスに２０ｍｇ／ｋｇのＲＴＸまたはＲＴＸ当量用量のＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ（その用量によって、１．５ｍｇ／ｋｇのＥＰＩ用量となる）を静脈内処置した。生理食塩水をコントロールとして注射した。比較のために、ＲＴＸ−ＥＰＩ、ＲＴＸ＋ＥＰＩ、ＲＴＸ＋Ｐ−ＥＰＩ及びＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩも投与した。マウスには、４回、３日間隔で処置を行った。生理食塩水を除く各種処置群において、２１日目までは、有意差は見られず、生理食塩水では、統計的に有意な差が見られた（ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩと生理食塩水との間のポストホックテストＰ値は、０．０５未満である）。しかしながら、ＲＴＸ単独、ＲＴＸ−ＥＰＩ及び非特異的なコンジュゲートＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩでは、限界効果が見られた。上記のレジメンで処置したマウスは、腫瘍の急速な成長により、ほどなくして殺処分した。残りの３つの処置では、３０日までに、有意差が見られた。ＡＮＯＶＡのＰ値は０．０１１６であり、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩとＲＴＸ＋Ｐ−ＥＰＩ及びＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩとＲＴＸ＋ＥＰＩとの両方のポストホックテストＰ値は、０．０５未満である（図９）。
【０１７１】
ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩと非特異的なコンジュゲートＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩとの比較によって（両方のコンジュゲートのＭｗは同程度であるので、血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果を除外できる）、ターゲティング作用が明らかに示された。重要なことに、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩと当量のＲＴＸ＋ＥＰＩ及びＲＴＸ＋Ｐ−ＥＰＩを比較することによって、コンジュゲートＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩでは、構造的な相乗作用が示された。
【０１７２】
これらの結果から、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩが、インビボにおいてＲＴＸ−ＥＰＩ（従来の設計のＡＤＣ）よりも有効であることが説得力のある形で示された。加えて、処置中及び処置後に、マウスの体重を綿密に記録した。ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩで処置したマウスの体重減少は、許容可能な限度内であったともに、退薬後も安定した状態を保ち、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの毒性がコントロールよりも増大したエビデンスは観察されなかった（図１４）。１１日目、１４日目、１７日目及び２０日目で４用量を投与した。
【０１７３】
実施例６：薬物動態と体内分布
過去に説明されたようなヨードゲン法（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）によって、本発明のコンジュゲートを放射性ヨウ素化した。７〜９週齢の健常な雄のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（ｎ＝３）に、125Ｉ標識したＲＴＸ、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩまたはＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩコンジュゲート（０．１ｍｇ、マウス１匹当たり２０μＣｉ）をそれぞれ静脈内注射した。所定の間隔で、血液試料（１０μｌ）を尾静脈から採取し、Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）で各試料の放射活性を測定した。
【０１７４】
体内分布試験では、皮下Ｒａｍｏｓ腫瘍を有する７〜９週齢の雄のＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスに、125Ｉ標識したＲＴＸ、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩまたはＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩ（０．１ｍｇ、マウス１匹当たり２０μＣｉ）を静脈内注射した。投与の７２時間後と９６時間後に、マウスを殺処分した。各種組織（心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、胃、腸、筋肉、骨、脳及び腫瘍）を摘出し、秤量し、Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）で放射活性を計数した。組織１グラム当たりの注射用量の割合（％  ＩＤ／ｇ）として、コンジュゲートの取り込み量を算出した。データは、平均±標準偏差（ｎ＝３）として示されている。
【０１７５】
125Ｉ標識した抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの薬物動態と体内分布：雄のＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスにおいて、125Ｉ標識したＲＴＸ、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ及びＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩの薬物動態特性を評価した。抗体を125Ｉによって放射性標識し、３．５ｍｇ／ｋｇ（ＲＴＸ、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ及びＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩにおける抗体ベース）の単回用量で静脈内注射した。125Ｉ標識したＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩとＲＴＸの血中放射活性・時間プロファイルによって、ａ）（複数の直鎖状のポリマー担体を介して）２０個超のエピルビシン分子がＲＴＸにコンジュゲーションすることによって、そのクリアランスが加速しなかったことと、ｂ）ポリマー前駆体のコンジュゲーションのために、ＲＴＸを還元したことによって、インビボでずり応力に暴露されたときに、重要なジスルフィド結合への結合を介して、ＲＴＸ構造が不安定化されなかったことが示された（図１０）。これらの結果から、本明細書に記載されているＡＰＤＣデザインが、抗体の薬物動態特性を弱めないことが強く示唆されている（表３）。
表３．125Ｉ標識したＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩとコントロールの、ＳＣＩＤマウスにおける薬物動態パラメーター
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Ｔ1/2,α＝初期半減期、Ｔ1/2,β＝終末相半減期、ＡＵＣ＝血中濃度・時間曲線下総面積、％ＩＤ＝注射用量の割合（％）、ＣＬ＝全身クリアランス、ＭＲＴ＝平均滞留時間、Ｖｓｓ＝定常状態分布体積、１Ｆ５＝マウス抗ＣＤ２０  ＩｇＧ２ａ抗体（コントロール）である。データは、平均±標準偏差（ｎ＝３）として示されている。放射性トレーサーに関する血中薬物動態パラメーターは、ＰＫＳｏｌｖｅｒとともに、２コンパートメントモデルを用いて解析した。
【０１７６】
皮下異種移植腫瘍モデルを有する雄のＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスにおいて、125Ｉによって標識したＲＴＸ、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ及びＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩの体内分布も比較した。静脈内注射の７２時間後に、腫瘍への125Ｉ−ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの取り込み量は、脾臓を除く主要器官における取り込み量よりも多かった。特に、標的型の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの、腫瘍におけるレベル（125Ｉ−ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ、組織１ｇ当たり０．７５％ＩＤ）は、ＲＴＸのレベル（組織１ｇ当たり０．７１％ＩＤ）に匹敵し、非標的型のコンジュゲート（125Ｉ−ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩ、組織１ｇ当たり０．２５％ＩＤ）よりも３倍高かった（図１１）。これらの結果から、ポリマー−薬物前駆体をＲＴＸに結合すると、結合親和性が部分的に失われるが、本明細書に開示されている抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートモデルでは、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの長期循環特性により、腫瘍への取り込み量をＲＴＸと同程度にできることが示唆されている。
【０１７７】
参照文献
Ａｌｌｅｙ，Ｓ．Ｃ．，Ｏｋｅｌｅｙ，Ｎ．Ｍ．，Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．，２０１０．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１４  （４），５２９−５３７
Ｂｒａｓｌａｗｓｋｙ  ＧＲ，Ｋａｄｏｗ  Ｋ，Ｋｎｉｐｅ  Ｊ，ＭｃＧｏｆｆ，Ｋ．，Ｅｄｓｏｎ，Ｍ．，Ｋａｎｅｋｏ，Ｔ．，Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｓ．，１９９１．Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（ｈｙｄｒａｚｏｎｅ）−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３３，３６７−３７４．
Ｃａｓｉ，Ｇ．，Ｎｅｒｉ，Ｄ．，２０１２．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｂａｓｉｃ  ｃｏｎｃｅｐｔｓ，ｅｘａｍｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １６１，４２２−４２８．
Ｃｈａｒｉ，Ｒ．Ｖ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．，Ｗｉｄｄｉｓｏｎ，Ｗ．Ｃ．，２０１４．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．５３，３７９６−３８２７．
Ｃｈｅｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．，Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊ．Ｐ．，２００８．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５９，６１３−６２６．
Ｃｈｕ，Ｔ．−Ｗ．，Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，２０１５．Ｄｒｕｇ−ｆｒｅｅ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ−ａ  ｎｅｗ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉ．３，９０８−９２２．
Ｃｈｕ，Ｙ．Ｗ．，Ｐｏｌｓｏｎ，Ａ．，２０１３．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｆｕｔｕｒｅ  Ｏｎｃｏｌ．９，３５５−３６８．
Ｃｈｙｔｉｌ，Ｐ．，Ｅｔｒｙｃｈ，Ｔ．，Ｋｒｉｚ，Ｊ．，Ｓｕｂｒ．Ｖ．，Ｕｌｂｒｉｃｈ，Ｋ．，２０１０．Ｎ−（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐＨ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｒ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｔｕｍｏｕｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  ＲＡＦＴ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ４１，４７３−４８２．
Ｄｕｃｒｙ，Ｌ．，Ｓｔｕｍｐ，Ｂ．，２０１０．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｌｉｎｋｉｎｇ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｐａｙｌｏａｄｓ  ｔｏ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２１，５−１３．
Ｅｔｒｙｃｈ，Ｔ．，Ｍｒｋｖａｎ，Ｔ．，Ｒｉｈｏｖａ，Ｂ．，Ｕｌｂｒｉｃｈ，Ｋ．，２００７．Ｓｔａｒ−ｓｈａｐｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＨＰＭＡ−ｂａｓｅｄ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２２，３１−３８．
Ｅｔｒｙｃｈ，Ｔ．，Ｓｔｒｏｈａｌｍ，Ｊ．，Ｋｏｖａｒ，Ｌ．，Ｋａｂｅｓｏｖａ，Ｍ．，Ｒｉｈｏｖａ，Ｂ．，Ｕｌｂｒｉｃｈ，Ｋ．，２００９．ＨＰＭＡ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｉ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １４０，１８−２６．
Ｇｅｒｇｅｌ，Ｄ．，Ｃｅｄｅｒｂａｕｍ，Ａ．−Ｉ．，１９９６．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｂｙ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｓ  ｎｉｔｒｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｚｉｎｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５，１６１８６−１６１９４．
Ｈｏｎｇｒａｐｉｐａｔ，Ｊ．，Ｋｏｐｅｃｋｏｖａ，Ｐ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｐｒａｋｏｎｇｐａｎ，Ｓ．，Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，２００８．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｂ’  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＨＰＭＡ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ５，６９６−７０９．
Ｊａｇａｄｅｅｓｈ，Ｄ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｒ．，２０１６．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（ＡＤＣｓ）：Ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｃｕｒｒ．Ｔｒｅａｔ．Ｏｐｔｉｏｎｓ  Ｏｎｃｏｌ．１７，５５．Ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１８６４−０１６−０４２８−ｙ．
Ｊｅｌｉｎｋｏｖａ，Ｍ．，Ｓｔｒｏｈａｌｍ，Ｊ．，Ｐｌｏｃｏｖａ，Ｄ．，Ｓｕｂｒ．Ｖ．，Ｓｔａｓｔｎｙ，Ｍ．，Ｕｌｂｒｉｃｈ，Ｋ．，Ｒｉｈｏｖａ，Ｂ．，１９９８．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＨＰＭＡ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５２，２５３−２７０．
Ｋａｍｅｉ，Ｓ．，Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，１９９５．Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ  ｏｆ  ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｓｕｒｆａｃｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｅｍｉｔｅｌｅｃｈｅｌｉｃ  ｐｏｌｙ［Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ］．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．１２，６６３−６６８．
Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，Ｂａｚｉｌｏｖａ，Ｈ．，１９７３．Ｐｏｌｙ［Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ］．１．Ｒａｄｉｃａｌ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．９，７−１４．
Ｋｏｖａｒ，Ｍ．，Ｓｔｒｏｈａｌｍ，Ｊ．，Ｅｔｒｙｃｈ，Ｔ．，Ｕｌｂｒｉｃｈ，Ｋ．，Ｒｉｈｏｖａ，Ｂ．，２００２．Ｓｔａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＨＰＭＡ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−ｂｏｕｎｄ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｙｐｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３，２０６−２１５．
Ｌａｗ，Ｃ．−Ｌ．，Ｃｅｒｖｅｎｙ，Ｃ．Ｇ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｋ．Ａ．，Ｋｌｕｓｓｍａｎ，Ｋ．，Ｍｉｘａｎ，Ｂ．Ｊ．，Ｃｈａｃｅ，Ｄ．Ｆ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｄｏｒｏｎｉｎａ，Ｓ．Ｏ．，Ｓｉｅｇａｌｌ，Ｃ．Ｂ．，Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｊ．Ａ．，Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．，Ｗａｈｌ，Ａ．Ｆ．，２００４．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ−ｌｉｎｅａｇｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０−ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０，７８４２−７８５１．
Ｌｉｄｉｃｋｙ，Ｏ．，Ｊａｎｏｕｓｋｏｖａ，Ｏ．，Ｓｔｒｏｈａｌｍ．Ｊ．，Ａｌａｍ，Ｍ．，Ｋｌｅｎｅｒ，Ｐ．，Ｅｔｒｙｃｈ，Ｔ．，２０１５．Ａｎｔｉ−ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｔａｒ−ｓｈａｐｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｐｒｏｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０，１９８４９−１９８６４．
Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｋｏｐｅｃｋｏｖａ，Ｐ．，Ｂｕｈｌｅｒ，Ｐ．，Ｗｏｌｆ，Ｐ．，Ｐａｎ，Ｈ．，Ｂａｕｅｒ，Ｈ．，Ｅｌｓａｓｓｅｒ−Ｂｅｉｌｅ，Ｕ．，Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，２００９．Ｂｉｏｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｏｆ  ＨＰＭＡ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−ａｎｔｉ−ＰＳＭＡ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｂｙ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ６，９５９−９７０．
Ｌｅｇｅｔ，Ｇ．Ａ．，Ｃｚｕｃｚｍａｎ，Ｍ．Ｓ．，１９９８．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ，ｔｈｅ  ｎｅｗ  ＦＤＡ−ａｐｐｒｏｖｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１０，５４８−５５１．
Ｌｕ，Ｚ．−Ｒ．，Ｋｏｐｅｃｋｏｖａ，Ｐ．，Ｗｕ，Ｚ．，Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，１９９８．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｓｅｍｉｔｅｌｅｃｈｅｌｉｃ  ｐｏｌｙ［Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ］ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．９，７９３−８０４．
Ｌｕ，Ｚ．−Ｒ．，Ｋｏｐｅｃｋｏｖａ，Ｐ．，Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，１９９９．Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｂｌｅ  Ｆａｂ’  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，１１０１−１１０４．
Ｌｕ，Ｚ．−Ｒ．，Ｓｈｉａｈ，Ｊ．−Ｇ．，Ｋｏｐｅｃｋｏｖａ，Ｐ．，Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，２００３．Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｂｌｅ  Ｆａｂ’  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ．ＳＴＰ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．１３，６９−７５．
Ｍｅｈｔａ，Ａ．，Ｆｏｒｅｒｏ−Ｔｏｒｒｅｓ，Ａ．，２０１５．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｉｎ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ，Ｒｅｐ．１７（９）：４１．Ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１１９１２−０１５−０４６６−９．
Ｍｉｔｓｕｋａｍｉ，Ｙ．，Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｌｏｗｅ，Ａ．Ｂ．，ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｃ．Ｌ．，２００１．Ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ．８１．Ｄｉｒｅｃｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｓｔｙｒｅｎｉｃ−ｂａｓｅｄ  ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｖｉａ  ＲＡＦＴ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ３４，２２４８−２２５６．
Ｏｍｅｌｙａｎｅｎｋｏ，Ｖ．，Ｋｏｐｅｃｋｏｖａ，Ｐ．，Ｇｅｎｔｒｙ，Ｃ．，Ｓｈｉａｈ，Ｊ．−Ｇ．，Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，１９９６．ＨＰＭＡ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ−ＯＶ−ＴＬ１６  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．１．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｏ  ＯＶＣＡＲ−３  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ３，３５７−３７３．
Ｐｉｍｍ，Ｍ．Ｖ．，Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ａ．Ｃ．，Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．，Ｕｌｂｒｉｃｈ，Ｋ，１９９３．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｎ−（２  ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｍｉｃｅ：ｖｉｓｕａｌｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｇａｍｍａ  ｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ  ａｓ  ａ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ｊ．ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔ．１，１２５−１３１．
Ｐｏｌａ，Ｒ．，Ｌａｇａ，Ｒ．，Ｕｌｂｒｉｃｈ，Ｋ．，Ｓｉｅｇｌｏｖａ，Ｉ．，Ｋｒａｌ，Ｖ．，Ｆａｂｒｙ，Ｍ．，Ｋａｂｅｓｏｖａ，Ｍ．，Ｋｏｖａｒ，Ｍ．，Ｐｅｃｈａｒ，Ｍ．，２０１３．Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｉｌｅｄ  ｃｏｉｌ  ｍｏｔｉｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ＢＣＬ１  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １４，８８１−８８９．
Ｐｒｅｓｓ，Ｏ．Ｗ．，Ｆａｒｒ，Ａ．Ｇ．，Ｂｏｒｒｏｚ，Ｋ．Ｉ．，Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｊ．，１９８９．Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４９，４９０６−４９１２．
Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｍ．，Ｙｕｍｕｌ，Ｒ．，Ｓａｙｄａｍｉｎｏｖａ，Ｋ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｇｏｕｇｈ，Ｍ．，Ｂａｌｄｅｓｓａｒｉ，Ａ．，Ｃａｔｔａｎｅｏ，Ｒ．，Ｌｅｅ，Ｆ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｈ．，Ｊａｎｇ，Ｈ．，Ａｓｔｉｅｒ，Ａ．，Ｇｏｐａｌ，Ａ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｄ．，Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．，２０１６．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ，ａｎｄ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ａｄ３５Ｋ＋＋ｐｒｏｔｅｉｎ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．５，１６０１３．
Ｒｉｈｏｖａ，Ｂ．，Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，１９８５．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔａｂｌｅ  ｐｏｌｙ［Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ］−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２，２８９−３１０．
Ｒｉｈｏｖａ，Ｂ．，Ｋｏｐｅｃｋｏｖａ，Ｐ．，Ｓｔｒｏｈａｌｍ，Ｊ．，Ｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｐ．，Ｖｅｔｖｉｃｋａ，Ｖ．，Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，１９８８．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｔｏ  ｈｐｍａ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．４６，１００−１１４．
Ｒｉｈｏｖａ，Ｂ．，Ｓｔｒｏｈａｌｍ，Ｊ．，Ｋｕｂａｃｋｏｖａ，Ｋ．，Ｊｅｌｉｎｋｏｖａ，Ｍ．，Ｈｏｖｏｒｋａ，Ｏ．，Ｋｏｖａｒ，Ｍ．，Ｐｌｏｃｏｖａ，Ｄ．，Ｓｉｒｏｖａ，Ｍ．，Ｓｔａｓｔｎｙ，Ｍ．，Ｒｏｚｐｒｉｍｏｖａ，Ｌ．，Ｕｌｂｒｉｃｈ，Ｋ．，２００２．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｃｏ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂｏｕｎｄ  ｄｒｕｇｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７８，９７−１１４．
Ｓａｐｒａ，Ｐ．，Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．，２００２．Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｒｅ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｒｕｇｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，７１９０−７１９４．
Ｓｅｙｆｉｚａｄｅｈ，Ｎ．，Ｓｅｙｆｉｚａｄｅｈ，Ｎ．，Ｈａｓｅｎｋａｍｐ，Ｊ．，Ｈｕｅｒｔａ−Ｙｅｐｅｚ，Ｓ．，２０１６．Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ：Ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ａｆｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．９７，２７５−２９０．
Ｓｈｉａｈ，Ｊ．−Ｇ．，Ｓｕｎ，Ｙ．，Ｋｏｐｅｃｋｏｖａ，Ｐ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｓｔｒａｉｇｈｔ，Ｒ．Ｃ．，Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，２００１．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔａｂｌｅ  Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ／ｍｅｓｏｃｈｌｏｒｉｎ  ｅ6−ＯＶ−ＴＬ１６  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７４，２４９−２５３．
Ｓｉｅｇｅｌ，Ｒ．，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｋ．Ｄ．，Ｊｅｍａｌ，Ａ．，２０１６．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１６．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．６６，７−３０
Ｔａｏ，Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｊ．，Ｘｕ，Ｊ．，Ｄａｖｉｓ，ＴＰ．，２００９．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ＨＰＭＡ）−ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅ−２−ｔｈｉｏｎｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．７，３４８１−３４８５
Ｔａｐｐｅｒｔｚｈｏｆｅｎ，Ｋ．，Ｍｅｔｚ，Ｖ．Ｖ．，Ｈｕｂｏ，Ｍ．，Ｂａｒｚ，Ｍ．，Ｐｏｓｔｉｎａ，Ｒ．，Ｊｏｎｕｌｅｆｔ，Ｈ．，Ｚｅｎｔｅｌ，Ｒ．，２０１３．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ＨＰＭＡ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａＲＡＧＥ−  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ｈｕＩｇＧ）−ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３，２０３−２１４．
Ｔａｐｐｅｒｔｚｈｏｆｅｎ，Ｋ．，Ｂｅｄｎａｒｃｚｙｋ，Ｍ．，Ｋｏｙｎｏｖ，Ｋ．，Ｂｒｏｓ，Ｍ．，Ｇｒａｂｂｅ，Ｓ．，Ｚｅｎｔｅｌ，Ｒ．，２０１４．Ｔｏｗａｒｄ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｗｅｌｌ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１４，１４４４−１４５７．
Ｔｏｌｃｈｅｒ，Ａ．Ｗ．，Ｓｕｇａｒｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｌｍｏｎ，Ｋ．Ａ．，１９９９．Ｒａｎｄｏｏｍｉｚｅｄ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＢＲ９６−ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１７，４７８−４８４．
Ｕｌｂｒｉｃｈ，Ｋ．，Ｓｕｂｒ．Ｖ．，Ｓｔｒｏｈａｌｍ，Ｊ．，Ｐｌｏｃｏｖａ，Ｄ．，Ｊｅｌｉｎｋｏｖａ，Ｍ．，Ｒｉｈｏｖａ，Ｂ．，２０００．Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｄｒｕｇｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｉ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ６４，６３−７９．
Ｗａｎｇ，Ｄ．，Ｋｏｐｅｃｋｏｖａ，Ｐ．，Ｍｉｎｋｏ，Ｔ．，Ｎａｎａｙａｋｋａｒａ，Ｖ．，Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，２０００．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔａｒ−ｌｉｋｅ  Ｎ−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ−ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｄｒｕｇ  ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １，３１３−３１９．
Ｗａｎｇ，Ｔ．，Ｋｉｅｖｉｔ，Ｆ．Ｍ．，Ｖｅｉｓｅｈ，Ｏ．，Ａｒａｍｉ，Ｈ．，Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ｚ．Ｒ．，Ｆａｎｇ，Ｃ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ，Ｒ．Ｇ．，Ｚｈａｎｇ，Ｍ．，２０１３．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  ｎｏｎｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｗｏｒｌｄ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．８０，１３４−１４１．
Ｗｕ，Ａ．Ｍ．，Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．，２００５．Ａｒｍｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１１３７−１１４６
Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｒ．，Ｒａｄｆｏｒｄ，Ｄ．Ｃ．，Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，２０１５．ＦＲＥＴ−ｔｒａｃｋａｂｌｅ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ＨＰＭＡ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２１８，３６−４４（２０１５）．
Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．，２０１６．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓｍａｒｔ  ＨＰＭＡ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２４０，９−２３．
Ｚｅｌｅｎｅｔｚ，Ａ．Ｄ．，Ｇｏｒｄｏｎ  Ｌ．Ｉ．，Ｗｉｅｒｄａ，Ｗ．Ｇ．，Ａｂｒａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ａｄｖａｎｉ，Ｒ．Ｈ．，Ａｎｄｒｅａｄｉｓ，Ｃ．Ｂ．，Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｎ．，Ｂｙｒｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｃｚｕｃｚｍａｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｆａｙａｄ，Ｌ．Ｅ．，Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒ．Ｉ．，Ｇｌｅｎｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ｎ．Ｌ．，Ｈｏｐｐｅ，Ｒ．Ｔ．，Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｓ．Ｍ．，Ｋｅｌｓｅｙ，Ｃ．Ｒ．，Ｋｉｍ，Ｙ．Ｈ．，Ｋｒｉｖａｃｉｃ，Ｓ．，ＬａＣａｓｃｅ，Ａ．Ｓ．，Ｎａｄｅｍａｎｅｅ，Ａ．，Ｐｏｒｃｕ，Ｐ．，Ｐｒｅｓｓ，Ｏ．，Ｒａｂｉｎｏｖｉｔｃｈ，Ｒ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｎ．，Ｒｅｉｄ，Ｅ．，Ｓａａｄ，Ａ．Ａ．，Ｓｏｋｏｌ，Ｌ．，Ｓｗｉｎｎｅｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｔｓｉｅｎ，Ｃ．，Ｖｏｓｅ，Ｊ．Ｍ．，Ｙａｈａｌｏｍ，Ｊ．，Ｚａｆａｒ，Ｎ．，Ｄｗｙｅｒ，Ｍ．，Ｓｕｎｄａｒ，Ｈ．，２０１４．Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．２０１４．Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｎｅｔｗｏｒｋ，１２，１２８２−１３０３．
Ｚｈａｎｇ，Ｌ．−Ｂ．，Ｚｈａｏ，Ｗ．−Ｇ．，Ｌｉｕ，Ｘ．−Ｙ．，Ｗａｎｇ，Ｇ．−Ｌ．，Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉ，Ｄ．，Ｘｉｅ，Ｌ．−Ｚ．，Ｇａｏ，Ｙ．，Ｄｅｎｇ，Ｈ．−Ｔ．，Ｇａｏ，Ｗ．−Ｐ．，２０１５．Ｓｉｔｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｏｌｙｍｅｒ−ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ６４，２−９．
【０１７８】
実施例７：Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫の治療用の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲート
本明細書に開示されている実験の目標は、リンパ腫患者における治療転帰が改善される新規種類の抗体−薬物コンジュゲートを開発することである。新規デザインの例は、図１５に示されている。すなわち、末端にマレイミド基を有する直鎖状の水溶性Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）ポリマー−薬物コンジュゲートをリツキシマブ（ＦＤＡに認可された初めてのリンパ腫治療用ｍＡｂ）に選択的に結合できる。現在の抗体−薬物コンジュゲートと比べて、この新規デザインの顕著な特徴としては、１）ペイロードを増大させるが、結合部位数を変えないこと、２）確立されている巨大分子療法と免疫療法とを組み合わせた相乗的潜在能、３）薬物動態と免疫原性の向上、４）好ましい治療指数の細胞傷害剤の使用による、オフターゲット毒性リスクの低減及び５）低リスクであるが、臨床開発に関する値が高いことが挙げられるが、これらに限らない。
【０１７９】
本発明の抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの意義は、リンパ腫とがんの治療有効性を向上させるための有効で安全な治療剤の開発である。
【０１８０】
２０１６年、米国では、リンパ腫と新たに診断される症例がおよそ８１，０８０件となり、そのうちの７２，５８０件が非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（最も多く見られる血液悪性腫瘍）であるとＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙが推定している。ＮＨＬは、６番目に多いがんであり、がんによる死亡原因として９番目に多いものである［２］。ＮＨＬの治療は困難である。この疾患には、３５種類を超えるサブタイプが含まれるからであり、最も多く見られるタイプは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）及びマントル細胞リンパ腫（ＭＬ）である［３］。ＮＨＬの８５パーセントは、Ｂ細胞由来である［４］。
【０１８１】
従来の化学療法と放射線療法は、重大な有害作用と関連付けられており、そのうち最も重大なのは、感染症と出血のリスクを上昇させる血球減少である。Ｂ細胞リンパ腫の９５％超で、細胞表面抗原ＣＤ２０が見られる［４］。抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のリツキシマブは、ＦＤＡに承認された初めてのＢ細胞ＮＨＬ治療用モノクローナル抗体である［５］。先進的な化学療法プロトコールと標的療法の開発により、この２０年間で、飛躍的な進歩を遂げた。リツキシマブを化学療法と併用することは依然として、ＮＨＬ治療の標準治療であり続けている［６］。ＮＨＬ治療の選択肢には、化学療法、放射線、生物療法及び幹細胞移植が含まれる［５］。残念ながら、深刻な副作用に加えて、再発性または耐性疾患は、治療が失敗する主因であり続けている。したがって、改善された新規の治療策に対するニーズが明らかに認められる。
【０１８２】
リツキシマブと、リツキシマブを組み合わせた化学療法：リツキシマブ（ＲＴＸ）は、ＣＤ２０を標的とするマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体である。ＲＴＸは、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介食作用及び直接的な細胞アポトーシスを通じて、細胞死を誘導する。ＲＴＸは、ＮＨＬと慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含むＣＤ２０陽性Ｂ細胞悪性腫瘍の治療において、単剤としても、化学療法と組み合わせても有効である。ＲＴＸは、関節リウマチを含むいくつかの自己免疫疾患の治療にも使われている。［７］。
【０１８３】
ＲＴＸは、第一治療では活性を有するが、再発リンパ腫患者では有効性が低下する。例えば、低悪性度ＮＨＬ患者では、以前にＲＴＸの投与を受けたことがある場合、疾患の進行または再発時に、ＲＴＸによる再治療に応答したのは４０％であった。したがって、これらの患者には、別の治療が必要になる場合が多い［８］。
【０１８４】
シクロホスファミド、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、ビンクリスチン及びプレドニゾンを組み合わせる標準的な第一治療（Ｒ−ＣＨＯＰ）にＲＴＸを加えると、ＣＨＯＰ単独よりも転帰が有意に改善するうえに、毒性も向上しない。数多くのインビトロデータとインビボデータから、プリンヌクレオシドアナログ（フルダラビン、クラドリビン及びペントスタチン）、ピリミジンヌクレオシドアナログ（ゲムシタビン）、ＤＮＡ傷害剤（シスプラチン、ＤＯＸ）、微小管阻害剤（パクリタキセル、ビンクリスチン）、アカデシン、デキサメタゾン、ならびにレチノイドを含む細胞傷害性薬に対して化学療法耐性腫瘍細胞を感作させることによって、ＲＴＸが、化学療法と相乗作用を見せることが示されている［９］。
【０１８５】
リツキシマブキメラ構造：元のマウス抗ヒトＣＤ２０由来の結合領域であって、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域からなる領域をヒトＩｇＧ１重鎖とヒトκ軽鎖の定常領域に融合する。ヒトＩｇＧ１に由来するＦｃ部分は、補体を固定して、抗体依存性細胞傷害性を活性化するその能力について選択した［８］。
【０１８６】
エピルビシンは、ＤＯＸの４’−エピマーであり、ＮＨＬの治療で最も頻繁に使用されるアントラサイクリンである。ＤＯＸは、核酸に結合することによって、ＤＮＡの複製、転写及び修復を阻害する［１０］。エピルビシンは、特に転移性疾患の治療において、最も活性の高いがん化学療法薬の１つとみなされている。エピルビシンでは、ヒト卵巣癌細胞において、ＤＯＸと同等の細胞傷害性が見られるが、等モル用量では、ＤＯＸよりも心臓毒性と骨髄毒性が低い。すなわち、エピルビシンの治療指数はＤＯＸよりも高いので、優れたＮＨＬ治療用候補薬である［１１、１２］。
【０１８７】
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、がんに対する最も有望な種類の標的療法剤の１つを構成する［１、１３〜１６］。これらのプロドラッグは、薬物または毒素に連結されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）からなる。これらは、毒性部分を腫瘍細胞に選択的に送達する。したがって、これらは、従来の化学療法剤と比べて、治療指数を大きく上昇させる。しかしながら、ＡＤＣの治療有効性と安全性は、リンカーの安定性とペイロードの毒性に大きく依存している。重要なパラメーターは、単一抗体上のペイロード数（薬物抗体比、すなわちＤＡＲ）である。過剰結合により、ｍＡｂの免疫親和性が損なわれることになるからである［１７、１８］。概して、１つのＡｂ分子には、限られた数の毒素部分を結合できる（通常ＤＡＲは４〜６）。そのため、標的細胞死をもたらすのに十分な有効性を得るためには、ＩＣ50が１ｎＭ未満のカリケアミシンまたはオーリスタチンモノメチルエステル（ＭＭＡＥ）のように、非常に毒性の高い薬剤を用いる必要がある。このようなＡＤＣは、臨床において、非常に有望な結果を示している。しかしながら、ＡＤＣ固有の不均質特性により、遊離ｍＡｂが依然として存在し、ＡＤＣの過剰標識が行われ、その結果、有効性が欠如し、毒性が増大する。このことが、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の治療用として初めてＦＤＡに承認されたＡＤＣである抗ＣＤ３３抗体−カリケアミシンコンジュゲート（ゲムツズマブ、オゾガマイシンまたはマイロターグ）の大きな問題であった。このＡＤＣは、２０１０年に市場から撤退された［１９、２０］。現在、３０個を超えるＡＤＣが臨床試験段階にある［１６］が、市場では、２つのＡＤＣ（ブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標））［２１］及びトラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））［２２］）が承認されている。
【０１８８】
上述のように、抗体への薬物のコンジュゲーションにより、得られる生成物の有効性、毒性及び安定性に影響が及ぶ可能性がある［２３］。典型的には、コンジュゲーションは、溶媒接触可能なリシンまたはシステインで行う。ヒトＩｇＧは、約１００個のリシン残基を含み、重鎖と軽鎖の両方に、その半数が位置し、改変できる可能性があり、その結果、図１６Ａに示されているように、ＤＡＲは０〜８となる。これにより、この非特異的なアプローチにより、広範なインビボ薬物動態特性が生じることになることが示唆されている。システインコンジュゲーションは、４つの鎖間ジスルフィド結合の還元（８個以内の曝露スルフヒドリル基が得られる）の後に行う。得られるＡＤＣの不均一度は低下する（図１６Ｂ）［２４］。ＦＤＡに承認された２つのＡＤＣ治療剤のうち、ブレンツキシマブベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標））は、リシンでのコンジュゲーションによって、アドトラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））は、システインでのコンジュゲーションによって作製する。
【０１８９】
ポリマー−薬物コンジュゲートと、ポリマーベース抗体−薬物コンジュゲート：受動的ターゲティング及び能動的ターゲティング：ポリマー−薬物コンジュゲートの概念は、低分子量薬物の準至適な生物活性と非特異性に対処するために開発された。ポリマー担体に薬物を結合することにより、血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果を通じて、固体腫瘍における薬物の薬物動態と蓄積が改善され（受動的ターゲティングともいう）、その結果、治療有効性が向上し、有害な副作用が低減する［２５］。さらに、ポリマー−薬物コンジュゲートの細胞侵入機序が遊離薬物とは異なることは周知である。したがって、ポリマー−薬物コンジュゲートには、ＡＴＰ駆動性のＰ−糖タンパク質と類似の排出ポンプによる、遊離薬物の排出を原因とする多剤耐性（ＭＤＲ）を解消する潜在力がある［２６］。
【０１９０】
ポリマー薬物送達系の使用は、がん化学療法を改善するためのものとして、確立されたアプローチである。例えば、第２世代のＨＰＭＡポリマー−エピルビシンコンジュゲートであるＫＴ−１（２Ｐ−ＥＰＩ）では、遊離薬物ＥＰＩの終末相半減期（９〜２０分）よりも、かなり長い終末相半減期（３３．２２時間）が見られた［２７］。臨床前評価において、ヒト卵巣癌異種移植片Ａ２７８０を有するマウス（皮下モデル）に、ＥＰＩとＫＴ−１の両方を５ｍｇ／ｋｇのＥＰＩ換算用量で投与した。ＫＴ−１は実質的に、ＥＰＩよりも活性が高かった。ＥＰＩ群では、腫瘍がベースラインの１７７２±８４０％に達したために、２０日目にマウスを殺処分しなければならなかったが、ＫＴ−１で処置したマウスでは、１００日目においても、観察可能な腫瘍は見られなかった［２７］。腫瘍の完全な退縮と、腫瘍形成の長期阻害は、ＥＰＲ効果を通じた、腫瘍部位でのコンジュゲートＫＴ−１の長い循環時間と充分な管外遊出に起因する。この結果から、ＫＴ−１コンジュゲート（長期循環ＥＰＩコンジュゲート）が、腫瘍前駆細胞と分化細胞の両方を抑止できる可能性のあることが示唆されている［２８］。
【０１９１】
抗がん剤の治療転帰を改善し、毒性を低減するために、抗体及び／または抗体Ｆａｂ’断片は、標的化部分としてもＨＰＭＡコポリマーに組み込まれてきた［２９〜３２］。例えば、ヌードマウスにおけるＯＶＣＡＲ−３異種移植片の治療に関して、非標的型ＨＰＭＡコポリマー−メソクロリンｅ6コンジュゲートとＯＶ−ＴＬ１６  ｍＡｂ断片−標的型ＨＰＭＡコポリマー−メソクロリンｅ6コンジュゲート（Ｐ−Ｍｃｅ6とＰ−Ｆａｂ’−Ｍｃｅ6）との有効性の比較を行った。結果によって、標的型治療の優位性が明確に示されている［３０］。
【０１９２】
コンジュゲーション化学が改変抗体コンジュゲートの結合親和性に及ぼす影響：ＯＶＣＡＲ−３細胞へのコンジュゲートの結合親和性に関して、様々なアプローチを介して、ＯＶ−ＴＬ１６抗体及びそのＦａｂ’断片をＨＰＭＡコポリマー−薬物（ＡＤＲ、Ｍｃｅ6）に結合することについて、詳しい試験を行った［３１］。Ｋａ（親和性定数）の違いから、アミド結合を介したリシン残基のランダムな改変により、コンジュゲートが不均一になり、抗原結合性が低下すること［３２］と、部位特異的な改変により、優れた特性が得られることが示唆されている。
【０１９３】
このようなポリマーベースのプラットフォームを用いてＡＤＣを通ることは、最近報告された。例えば、フレキシマー（中程度の強度のビンカ誘導体とペンダントチオール基を含むポリアセタールコポリマー）が合成された［３３］。トラスツズマブをターゲティング部分として選択し、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を用いて、そのリシン残基のアミノ基をマレイミド基に改変し、平均置換度は、ｍＡｂ１つ当たり５〜６とした。リシン残基を介して、フレキシマーをトラスツズマブに結合した。ヒト乳癌とヒト胃癌の臨床前モデルにおいて、ＤＡＲが２０のこのＡＤＣを評価した［３４］。その結果から、臨床開発におけるＡＤＣの薬物選択範囲を広げる強固な方策が示されているが、血中クリアランス有意な加速、結合親和性の半減及び薬物ペイロードの高すぎる毒性など、いくつかの問題が見られた。
【０１９４】
本明細書に記載されている抗体−ポリマー−薬物デザインには、簡潔な構造、ポリマーの安全性が証明されている点、現時点の有効薬物と市販の抗体を使用できる点を含む利点がある。また、本明細書に開示されている合成手順には汎用性があり、この手順によって、様々なｍＡｂ及び薬物組成物のように、テーラーメイド特性を持つ多様な抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートを調製するためのプラットフォームが得られる。
【０１９５】
本明細書に開示されているＡＰＤＣデザインでは、２つの従来のアプローチ（抗体ターゲティングとポリマー医薬）が１つの「ハイブリッド」製品に統合されている。その結果、制御可能に、ポリマー−薬物コンジュゲートを抗体に部位特異的に結合することによって、結合部位数を変えることなく、ペイロードの増大が実現する。ＡＤＣにおける高い薬物結合率を原因とする一般的な問題（例えば、凝集の増大、安定性の低下、全身クリアランスの加速、腫瘍への抗体の結合の喪失など）を最小限にできる。本明細書に開示されているこれらのコンジュゲートは、特異性の高い抗体−薬物コンジュゲートと巨大分子療法の両方の利点を持つことになり、その抗体の安定性が向上し、コンジュゲートの血中循環が長くなる。さらに、蛍光（Ｆｏｒｓｔｅｒ）共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のイメージング策を適用して、抗体と薬物が、身体レベル、組織レベル及び細胞レベルで、独立してどうなるかをモニタリングできる。これにより、ＡＰＤＣのインビボ挙動への理解が深まり、設計を助け、毒性の低下した効率的な治療剤が得られることになる。
【０１９６】
ポリマーベースのＲＴＸ−エピルビシンコンジュゲート（ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ）の開発：抗原標的の選択は、安全で有効である良好なＡＰＤＣに重要である。ＲＴＸは、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞リンパ腫の治療で、２０年超にわたって良好に使用されてきた。したがって、その抗体と標的はいずれも、臨床の現場で、広範囲にわたって実証されてきたものである。ＲＴＸの有効性は、化学療法と併用したときに向上している。ＥＰＩ（アントラサイクリン系抗腫瘍薬）は、ヒトの様々ながんの治療用として承認されている。その有効性と用量制限毒性は、充分に文書化されている。長期循環型のコンジュゲート２Ｐ−ＥＰＩでは、遊離薬物ＥＰＩよりも抗腫瘍活性が高くなる［２７］。１９９０年代後半以降、ＨＰＭＡコポリマーは、薬物担体として、数百人の患者（第Ｉ相／第ＩＩ相）に適用されてきたが、免疫原性も毒性も報告されなかった［３５〜３７］。さらに、臨床での結果から、ポリマー−薬物コンジュゲートが、強力な抗がん剤と、抗腫瘍免疫の誘導剤の両方であり得ることが示されている［３８］。ｍＡｂのリツキシマブと薬物のエピルビシンのいずれも市販されている。
【０１９７】
図１７には、末端にマレイミド基を有するセミテレケリック（ＳＴ）ＨＰＭＡコポリマーであって、まずＲＡＦＴ共重合を行ってから、２段階の末端変性を行うことによって調製するコポリマーが示されている。典型的な共重合プロセスを簡潔にまとめると、以下のようになる。シュレンクラインに接続したアンプルに、ＨＰＭＡとエピルビシン（ＥＰＩ）の重合性誘導体（Ｎ−メタクリロイルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシン−エピルビシン（ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＥＰＩ））を加えた。２−シアノ−５−オキソ−５−（２−チオキソチアゾリジン−３−イル）ペンタル−２−イルベンゾジチオエート（ＣＴＡ−ＴＴ）を連鎖移動剤（ＣＴＡ）として、Ｖ７０を開始剤として使用した。共重合を４０℃で、メタノール／ＤＭＳＯ（２：１、ｖ／ｖ）において２０時間進行させた。エーテル／アセトンに沈殿することによってポリマーを単離した。大過剰のＶ７０との反応によって、ジチオベンゾエート基を除去し、Ｎ−エチルアミノマレイミドと、ポリマー鎖末端のチアゾリジン−２−チオン（ＴＴ）との反応によって、マレイミドを導入した。ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、そのコンジュゲートの平均分子量と多分散性を求めた。エルマンアッセイを修正したものによって、マレイミド基の存在を確認し、４９５ｎｍにおいて、ＵＶ−ｖｉｓを用いて、ＥＰＩ含有率を測定した。
【０１９８】
ＲＴＸ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、２０ｍｇ／ｍＬのストック濃度で得た。そのＲＴＸを４ｍＬのトリス・ＨＣｌ（１０ｍＭ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）において濃度１ｍｇ／ｍＬに緩衝液交換した。ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、Ｈ2Ｏで１０倍）をその溶液に加え、３７℃で３時間インキュベートしてから、限外ろ過（３０，０００ＭＷＣＯ、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ）によって精製して、Ａｂ−ＳＨを得た。ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩをそのＡｂ−ＳＨ溶液に加え、３７℃でさらに２時間インキュベートした。ＳＥＣによる精製を用いて、未反応のポリマーを除去した後、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩを得た。ＲＴＸ（ＢＣＡアッセイ）とＥＰＩの比率に基づき、ＤＡＲを算出した。仕込み率と反応時間を変更することによって、抗体の置換度（ＤＡＲ）を調節できる。
【０１９９】
ＲＴＸ−ＥＰＩをコントロールとして合成し、非特異的なＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩを合成して、ターゲティング作用を確認した。ＲＴＸをヒトＩｇＧに置き換えたことを除き、上記手順と同様の手順に従って、ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩを得た。コンジュゲートの特徴は、表４にまとめられている。
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【０２００】
各種コンジュゲートの結合特性を評価するために、ＣＤ２０発現の多いＲａｍｏｓ細胞株を標的として選択した。細胞（４００μＬの培地中に２×１０5個）を２０００ｇで５分、遠心分離し、その上清を除去した。コンジュゲートを漸増濃度（２０μＬのＰＢＳ中に０．０４μｇ、０．２μｇまたは１μｇ）で加えた。比較のために、ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩとＲＴＸを使用した。細胞を４℃で２０分インキュベートし、培地で２回洗浄して、未結合のコンジュゲートを除去してから、１００μＬの二次抗体（ＧＡＨ−４８８、１：２００の希釈率）で染色し、４℃で再び２０分インキュベートした。フローサイトメトリーを用いて、各コンジュゲート試料の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を求めた。ＭＦＩが高いほど、結合したコンジュゲートが多いことを示す。その結果から、ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩがＲａｍｏｓ細胞にあまり結合せず、予測したように、Ｐ−ＥＰＩによるリツキシマブの改変によって、結合親和性が部分的に低下し（この低下は、「結合価」に依存的である）、ポリマー前駆体の結合量が多いほど、コンジュゲートの結合性の低下度が大きくなったことが示されている。
【０２０１】
Ｒａｍｏｓ細胞とＲａｊｉ細胞（いずれも、ＣＤ２０陽性バーキットリンパ腫細胞株である）に対する各種コンジュゲートの細胞傷害性をそれぞれ評価した。細胞（２×１０5個／ウェル）をＲＴＸと、０．２μＭのＲＴＸ換算濃度の対応するコンジュゲートともに、２４時間（Ｒａｊｉ）または４８時間（Ｒａｍｏｓ）インキュベートした。アネキシンＶ／ＰＩ染色を用いて、細胞のアポトーシス誘導を解析した。比較のために、ＲＴＸとＰ−ＥＰＩ（ＲＴＸ＋Ｐ−ＥＰＩ）の混合物も評価し、その際、ＥＰＩの濃度は、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩにおけるＥＰＩ量と当量であった（この試験では、［ＥＰＩ］＝４．１２μＭ）。ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩの細胞傷害性は最小限であったが、ＲＴＸ−ＥＰＩまたはＲＴＸ＋Ｐ−ＥＰＩの細胞傷害性は、ＲＴＸ単独の場合と同程度であった。対照的に、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの細胞傷害性は、残りの３つの変数よりも著しく向上した（図７Ａ）。
【０２０２】
抗体濃度を０．２μＭから２μＭまで上昇させたときに、アポトーシスを起こしたＲａｊｉ細胞の割合は、ＲＴＸ群では上昇しなかったことから、Ｒａｊｉ細胞への抗体の結合が飽和状態に達していたことが示唆されている（図７Ｂ）。しかしながら、まず、細胞を高濃度のＲＴＸ（２μＭ）で処理してから、１時間後に、０．２μＭ換算のＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩに暴露したところ、アポトーシスを起こした細胞は２倍ほどになった。このことから、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩが、ＲＴＸで前処理したが、耐性を持つ細胞に対する活性を有し得ることが示唆されている。これにより、この系が、ＲＴＸ耐性疾患の治療において効率的な系となる可能性が上昇する。
【０２０３】
図１８には、125Ｉ標識したＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩとＲＴＸの薬物動態挙動が示されている。血中放射活性−時間プロファイルによって、ａ）（複数の直鎖状のポリマー担体を介して）２０個超のエピルビシン分子をＲＴＸにコンジュゲーションしても、そのクリアランスが加速しなかったことと、ｂ）ポリマー前駆体のコンジュゲーションのために、ＲＴＸを還元しても、インビボでずり応力に暴露されたときに、重要なジスルフィド結合への結合を介して、ＲＴＸ構造が不安定化されなかったことことが示されている。これらの結果から、本明細書に開示されているＡＰＤＣデザインが、抗体の薬物動態特性を弱めないことが強く示唆されている。
【０２０４】
これらの結果から、本明細書に開示されているＡＰＤＣデザインが、抗体のターゲティング能力または薬物動態特性を損なわないことが示されている。さらに、インビトロ及びインビボ実験によって、本明細書に開示されているＡＰＤＣデザインによって、有効性の高い抗リンパ腫活性が得られることが示されている。このＡＰＤＣデザインは、他の悪性腫瘍に対する新規な抗体標的療法の開発のためのプラットフォームを構成する。
【０２０５】
リード最適化のためのＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩコンジュゲートの合成
この系では、ＡＰＤＣのターゲティング作用と治療潜在力は、コンジュゲートの一次構造、例えば、セミテレケリックポリマー前駆体のＭｗ、結合の部位／数及び薬物Ａｂ比（ＤＡＲ）と関連している。本明細書に記載されているように、１つのＲＴＸ分子を６個超のＰ−ＥＰＩと結合したところ、そのコンジュゲートの結合能力は、ネイティブなＲＴＸの１／３まで低下した。いくつかの態様では、ｍＡｂ１個当たり平均４個の結合をもたらすことになる。充分な細胞傷害性に到達するように（エピルビシン量に関連する）、様々な構造のポリマー前駆体を３つ合成することになる。
【０２０６】
ポリマー前駆体ＳＴ−Ｐm−ＥＰＩnの合成：薬物含有率と分子量作用を調べるために、ＳＴ−Ｐ40−ＥＰＩ6、ＳＴ−Ｐ40−ＥＰＩ8及びＳＴ−Ｐ60−ＥＰＩ8を合成する（ｍは、ポリマー前駆体のＭｗを指し、ｎは、１つのＨＰＭＡ巨大分子当たりのＥＰＩ含有量を指す）。ＲＡＦＴ重合法を用いて、初期の重合パラメーターを変更することによって、平均分子量と薬物含有率を調整できるようにする［４０〜４２］。重要なことに、分子量分布が狭く、一方の鎖末端に反応性マレイミド基を有するポリマー−ＥＰＩコンジュゲートが得られる。このプロセスによって、コンジュゲートの不均一性が最小限になる。
【０２０７】
リツキシマブへのＳＴ−Ｐ−ＥＰＩの結合：一方のポリマー鎖末端のマレイミド基と、抗体ジスルフィド結合の還元によって作製したチオール基との反応を介して、コンジュゲーションを得る。リツキシマブは、２本の重鎖と２本の軽鎖を含むＩｇＧ１アイソタイプである。ＴＣＥＰによる完全な還元によって、抗体１つ当たり８個のチオールが得られる［４３］。効能と生体適合性とのバランスをとるために、抗体１つ当たり平均で４本のポリマー鎖を結合するのが目標である。置換度が高いと、結合親和性が損なわれることがあるからである［１８］。幸運なことに、化学量論組成を有する部位選択的または部位特異的な結合をもたらすように、システイン残基間のネイティブなジスルフィドを、化学的に制御した状態で還元してから、チオールエン反応を行うことが開発されている［４４〜４８］。還元／再酸化／再形成の化学反応を行って、置換部位の位置と数を制御する。その結果、抗体の元々の活性が最大限維持されることになる。
【０２０８】
細胞内輸送とＰＫ／体内分布の試験を行うために、アイソトープ（125Ｉ）標識とフルオロフォア（Ｃｙ５）標識を行ったコンジュゲートを合成する。
【０２０９】
同様に、ヒトＩｇＧを用いて、コントロールとしての役割を果たす非ターゲティングコンジュゲートを合成する（表２、図２０）。
【０２１０】
コンジュゲートの物理化学的特徴：ＳＥＣによるＭｗ、ＨＰＬＣによる薬物含有率、及びＵＶ−ｖｉｓ分光測光法による薬物抗体比（ＤＡＲ）によって、コンジュゲートを特徴付ける。
【０２１１】
緩衝液中でのコンジュゲートの安定性：コンジュゲートをホスフェート緩衝液中で、生理的範囲のｐＨ（ｐＨ４〜８）と３７℃においてインキュベートする。培地を、異なる時間間隔（初期、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間及び４８時間）で、ＨＰＬＣによって解析する。遊離薬物と抗体をコントロールとする。
【０２１２】
血漿中、ヒト血清アルブミンの存在下、及びグルタチオン中でのコンジュゲートの安定性：いくつかの研究によって、非切断性のチオエーテルリンカーは、インビボにおいて、毒性の低下と抗腫瘍活性に関して、切断性リンカー（ジスルフィドまたはヒドラジンリンカー）よりも優位であることが示されているが［４９、５０］、非切断性のチオエーテルリンカーは、レトロマイケル反応を介して、細胞傷害性薬を、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはグルタチオンのシステインなどの遊離スルフヒドリルに移転し得る［１６、５１］。したがって、コンジュゲートをＨＳＡ／ＧＳＨとともにインキュベートし、ＨＰＬＣを介して、放出された遊離ＥＰＩまたはＰ−ＥＰＩを求めることになる。
【０２１３】
インビトロでの酵素分解：コンジュゲートをチオールプロテイナーゼカテプシンＢとともに、マッキルベイン緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＧＳＨ、ｐＨ５）でインキュベートする。所定の時間間隔で、少量のインキュベート溶液を回収する。ＨＰＬＣアッセイによって薬物の放出を求め、コンジュゲートの分解をＳＥＣによって求める。
【０２１４】
本明細書に記載されている実験によって、コンジュゲートの生物学的活性と、作製されるコンジュゲートの構造との相関関係が認められることになる。
【０２１５】
抗体コンジュゲートの評価と最適化
コンジュゲートＲＴＸ−Ｐm−ＥＰＩnのターゲティング効率と細胞傷害性を評価する。構成因子の最適化に関するインビトロ試験では、ＣＤ２０発現の高いＲａｊｉ細胞を使用する。加えて、細胞レベル、組織レベル及び生物全体レベルでのＡｂとペイロードに関する情報を得るために、薬物動態／体内分布試験と、インターナリゼーション及び細胞内運命のモニタリングにおいて、アイソトープ標識とフルオロフォア標識を行ったコンジュゲートを使用する。これらの結果から、重要な構成因子の特定と、本発明のデザインの最適化が可能になる。
【０２１６】
さらに、ＡＰＤＣの活性の大きさを求めるために、いくつかの異なる表現型のＢ細胞リンパ腫細胞株（ＲＴＸ感受性細胞とＲＴＸ耐性細胞を含む）に対する最適化コンジュゲートＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの有効性を評価する。
【０２１７】
Ｒａｊｉ細胞に対するコンジュゲートの結合性と細胞傷害性：まず、ターゲティング作用を可視化して、結合親和性を求めるために、実験を行う。各種ポリマー前駆体のコンジュゲーションによって、抗体媒介性の特異的ターゲティング作用が損なわれるかを評価するために、氷冷染色培地中のコンジュゲートの段階希釈液と、１×１０6個のＲａｊｉ細胞を３０分インキュベートしてから、２回、氷冷染色培地で洗浄して、未結合のコンジュゲートを除去する。続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５６８標識した１０μｇ／ｍＬの二次ｍＡｂの抗ヒトヤギＩｇＧとともに、細胞を氷上で３０分インキュベートし、上記のように洗浄する。標識した細胞をフローサイトメトリーによって解析する。バックグラウンド補正を行った平均蛍光強度を求める。リツキシマブとＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩをコントロールとする。
【０２１８】
細胞成長の阻害とアポトーシス解析：Ｒａｊｉ細胞を漸増濃度の各候補コンジュゲートとインキュベートする。インキュベートの１日目、２日目及び３日目に、ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存能を求める。各コンジュゲートの５０％成長阻害濃度（ＩＣ50）を成長曲線から導き出す。アネキシンＶ結合とヨウ化プロピジウム排除の解析のためのフローサイトメトリーを用いて、候補コンジュゲートによるアポトーシス誘導を判断する。フローサイトメトリーは、候補ＡＤＣが細胞周期に及ぼす作用の解析のために、ブロモデオキシウリジン標識ともにも用いる。
【０２１９】
コンジュゲートのインターナリゼーションと細胞内輸送：特に、ＣＤ２０を標的として、リソソーム内でＥＰＩを放出するＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩコンジュゲートに関して、抗体媒介性のインターナリゼーションと、リソソームへの輸送は、抗原発現細胞の効率的な細胞傷害性を誘発するのに重要である［５０、５４］。リツキシマブ−リポソーマルＤＯＸは、ＣＤ２０陽性細胞に対して有効ではなく、それは部分的には、ＣＤ２０がインターナリゼーションされない／インターナリゼーションされるのが遅いことに起因することが報告された［５５］。しかしながら、ＤＯＸよりも１０〜２００倍強力であるリツキシマブ結合オーリスタチンでは、インターナリゼーションと有意な抗腫瘍活性が見られた［５６］。本明細書に記載されているように、コンジュゲートのＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩは、アポトーシスを誘導し、腫瘍成長の阻害効率が、リツキシマブ単独またはＲＴＸ＋Ｐ−ＥＰＩよりも高かった。次に、リツキシマブ−Ｐ−ＥＰＩが、エンドサイトーシス経路を改善（変質、低下または増大）させ、インターナリゼーションを促進し、その結果、より効率的にリソソームに輸送されるか試験するための実験を行った。ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの機序を明らかにするために、下記の実験を設計した。
【０２２０】
能動的ターゲティングの調査：ポリマーをＲＴＸにコンジュゲーションすることにより、そのコンジュゲートのインターナリゼーションが促進されるのかを評価するために、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ、ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩ及びＲＴＸ−ＥＰＩを細胞に取り込ませ、フローサイトメトリーを用いて、その取り込みをＣＤ２０陽性Ｒａｊｉ細胞とＣＤ２０欠損細胞において比較した。リツキシマブと関連する能動的ターゲティングを確認するために、過剰な遊離ＲＴＸの存在下で、リガンド阻害競合実験を行う。エネルギー非依存性または非特異的な細胞透過性エンドサイトーシスを排除するために、ＮａＮ3の存在下または４℃で、細胞インターナリゼーションも行わせる。
【０２２１】
エンドサイトーシス経路の調査：ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩのインターナリゼーションの潜在的エンドサイトーシス経路を働かせて、各種インヒビター、例えばクロルプロマジン（１０μｇ／ｍＬ、クラスリンインヒビター）、フィリピン（１μｇ／ｍＬ、カベオラインヒビター）、アミロリド（０．３ｍｇ／ｍＬ、マクロピノサイトーシスインヒビター）による前処理後、ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩ及びＲＴＸ−ＥＰＩと比較する。阻害度は、インターナリゼーションされた未前処理細胞の割合（％）として表す。
【０２２２】
リツキシマブとリツキシマブ−薬物コンジュゲートの輸送と細胞局在化に関する共焦点顕微鏡解析：コンジュゲートの細胞内輸送と局在化を評価するために、Ｒａｊｉ細胞をＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ、Ｐ−ＥＰＩまたはＲＴＸ−ＥＰＩとともに、様々な時間間隔（０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間）で、３７℃においてインキュベートする。続いて、特定の細胞内コンパートメント（カベオラ−１、クラスリンタンパク質、ゴルジ体、ミトコンドリア、初期エンドソーム、後期エンドソーム、リソソーム及び核など）を対応する蛍光色素で染色する。共焦点顕微鏡を用いて、輸送プロセスと細胞内共局在化を生細胞においてモニタリング及びイメージングする。
【０２２３】
刺激応答性の細胞内でのＥＰＩの放出の可視化：細胞内でのＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩからの薬物放出の理解を深めるために、ＥＰＩに組み込まれた蛍光を利用して、ＦＲＥＴコンジュゲートのＣｙ５−ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ（図２０）を設計した。ＦＲＥＴは、エネルギーが、長距離双極子間結合によって、ドナーとして機能する電子励起状態のフルオロフォアから、別の発色団またはアクセプターに移動するプロセスである。このプロセスは、１０ｎｍ未満の距離での分子コンホメーション、会合及び分離に対する感受性を持つ蛍光シグナルを生成する。ＦＲＥＴイメージングを用いて、薬物送達系の開発を含め、機能と機序との関係への知見を得ることができる。
【０２２４】
ペンダントＣｙ５を含む水溶性ポリマー−エピルビシンコンジュゲートを合成した。蛍光分光計と共焦点顕微鏡を用いて、がん細胞におけるＦＲＥＴシグナルの変化を追跡する。この系では、テトラペプチドＧＦＬＧを介してポリマー前駆体に連結したＥＰＩがドナーとして機能する一方で、Ｃｙ５を用いて、ＲＴＸを標識し、Ｃｙ５がアクセプターとして機能する。ドナーのＥＰＩとアクセプターのＣｙ５との相対位置が重要である。ＥＰＩを含むポリマー前駆体が、チオエーテル結合を介してリツキシマブに結合すると、得られるＣｙ５−ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩは、ＦＲＥＴ特性を有することになる。換言すると、コンジュゲートが４４５ｎｍで励起すると、ＦＲＥＴスペクトルが放出される（ドナー−アクセプターの発光スペクトル（４００〜８００ｎｍ）では、６４５ｎｍにおいてＣｙ５の発光ピークが見られる）。インターナリゼーション後、抗体が異化分解され、リソソーム酵素に暴露されたＧＦＬＧリンカーが切断されると、ＥＰＩが放出され、それによって、フルオロフォア対が分離され、ＦＲＥＴシグナルが喪失する。
【０２２５】
125Ｉ−ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩコンジュゲートの薬物動態（ＰＫ）と体内分布の決定：インビトロ及びインビボでの活性に関するこれらの試験から、機序、有効性及び毒性に関する情報と、全体的な構造デザインと投与スケジュールが得られる。非標的型の薬物送達系とは異なり、本明細書に記載されているＡＰＤＣの作用機序の１つは、その特異的抗原標的を認識して、それに結合する能力であるので、ＡＰＤＣの全体的なＰＫ特性（例えば、遅いクリアランス、長い半減期及び限られた組織分布を含む）は、抗体成分によって駆動されるものであり得る。ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩとＲＴＸのＰＫ／体内分布実験と、特には、血中放射活性−時間プロファイル（図１９）によって、（直鎖状のポリマー担体を介して）２０個（または２０個以上）のＥＰＩをコンジュゲーションしても、抗体ＲＴＸの薬物動態特性が損なわれなかったことが示されている。使用した腫瘍モデルは、アグレッシブリンパ腫モデルであり、臨床的に関連するが、ＲＴＸの処理によっては、有効性に対する限界効果が示され、本明細書に記載されているＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩコンジュゲートは、臨床活性が向上すると予測されている。
【０２２６】
皮下Ｒａｊｉ腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおいて、125Ｉ標識したＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩがインビボでどうなるかを調べる。（ＲＴＸに関して）３〜４用量を投与して、ＰＫ用量依存性、飽和用量作用及びオフターゲット結合／取り込みを確認する。
【０２２７】
Ｒａｊｉ感受性細胞／Ｒａｊｉ耐性細胞に対する細胞傷害性の決定：ＲＴＸ感受性株（ＲＳＣＬ）とＲＴＸ耐性株（ＲＲＣＬ）を含むいくつかのリンパ腫細胞株を使用する。各細胞株において、表面ＣＤ２０発現を求めた。その結果は、表５と図２１Ａに示されている。Ｒａｊｉ細胞（バーキットリンパ腫）では、最も高いＣＤ２０発現が見られ、Ｒａｊｉ  ４ＲＨで、最もレベルが低かったが、ｕ２９３２（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株）とｕ２９３２  ４ＲＨでは、ＣＤ２０発現の有意差は見られなかったことから、リンパ腫を死滅させるのを担うＣＤ２０レベル以外に、いくつかの他の理由があることが示唆されている。リツキシマブ耐性経路は依然として不明である。機序の１つは、頻回反復投与と、比較的高い投与量であり得る。リツキシマブ耐性の別の寄与因子は、シグナル伝達の変化であり、この変化により、ＢＣＬ−２ファミリーの抗アポトーシスタンパク質が過剰発現し、アポトーシスに対する耐性が生じる。ＥＰＩは、Ｂａｘ及びＢａｋ（アポトーシス促進性のＢＣＬ−２ファミリータンパク質）をアップレギュレートすることが報告されているので、リツキシマブ媒介性アポトーシスに対して耐性細胞株を再感作し得る。次に、ｕ２９３２とｕ２９３２  ４ＲＨを用いて、本明細書に開示されているコンジュゲートが、ＲＴＸ耐性を解消するとともに、治療効力を向上させる能力について試験する。ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩを使用すると、受動的ターゲティング／能動的ターゲティングの連携と、ＲＴＸとＥＰＩとの相乗作用により、ＲＴＸの投与数／用量が減少し、ＥＰＩが、細胞を再感作して、ＲＲＣＬからＲＳＣＬにでき、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩが、インターナリゼーション経路の改変と関連する既存の耐性を置換し得るからである。
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【０２２８】
細胞成長の抑止とアポトーシス：細胞表面でのＣＤ２０発現は、細胞周期の段階によって異なることがあり、細胞周期の段階とシンクロしている可能性がある。したがって、細胞の成長を抑止できる化学療法を組み合わせたものは、ＲＴＸに対するＣＤ２０の応答を活性化し得る。図２１Ｂには、細胞表面へのアネキシンＶ結合とヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除によって、細胞周期と、血清、チミジン及びノコダゾールそれぞれとのシンクロ、細胞成長の抑止、ならびにアポトーシスを評価したことが示されている。アポトーシスレベルは、細胞外でのＣＤ２０発現と関係している（それぞれ異なる段階に従ってランク付けすると、Ｇ２／Ｍ＞Ｓ＞Ｇ０／Ｇ１となる）。
【０２２９】
データ解析：スチューデントｔ検定（試料間の独立変数と不等分散を仮定）を用いて、異なるコンジュゲート間での細胞結合、細胞取り込み、細胞傷害性、薬物動態パラメーター及び毒性の違いを検定する。一元ＡＮＯＶＡを用いて、群間比較を行う。有意レベルは０．０５に設定する。
【０２３０】
本明細書に記載されているコンジュゲート、例えばＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩは、ＲＴＸの治療を改善すると見られる。いくつかの態様では、ＥＰＩは、微小管の安定化を促す薬物、例えばドセタキセル（ＤＴＸ）に置き換えることができる。本明細書に開示されているＡＰＤＣの成分の１つ以上を変更することによって、アポトーシスを誘導する追加の機序をもたらすことができる。例えば、ＤＴＸは、線維形成性間質の成長も抑制し、それにより、腫瘍内の血管が拡張し、腫瘍の間質液圧が低下する。これらの追加の作用は、ＲＴＸ−Ｐ−ＤＴＸが標的細胞に到達するように、ＲＴＸ−Ｐ−ＤＴＸの透過を助けることがある。さらに、ＤＴＸは、有糸分裂（他の段階よりも弱く、アポトーシスに対して脆弱な段階）における細胞を停止する。加えて、ＤＴＸは、ＢＣＬ−２タンパク質をリン酸化させ、その後、カスパーゼ−３依存アポトーシスをもたらす。したがって、ＤＴＸは、アポトーシスに対する感作のためにＢＣＬ−２レベルを抑制する際に、ＲＴＸと相互作用して機能することもできる。
【０２３１】
齧歯類動物モデルにおける非ホジキンリンパ腫を治療する抗体−ポリマー−薬物コンジュゲートの評価
インビボ評価のために、ヒトＢリンパ腫の局所異種移植モデルと播種性異種移植モデルを用いて、標的化取り込み、治療有効性及び非特異的な毒性について検討する。重要なことに、本明細書に開示されているＡＰＤＣが、表現型の異なるＮＨＬのヒト患者分離株に及ぼす作用も試験する。これらの試験により、ＡＰＤＣの有効性が確認され、様々なサブタイプのＢ細胞悪性腫瘍に対する活性シグナルが得られる。
【０２３２】
最大耐用量（ＭＴＤ）と用量／レジメンの決定：有効性を評価する前に、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの用量作用と投与スケジュールを決定する。毒性試験には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用する。このマウスに、マウスの応答性に基づき、３種類の薬物換算濃度で、１つの漸増用量を静脈内投与する。注射から１４日後にマウスを殺処分し、組織病理学的な組織解析を行う。血液学的な解析のために、各マウスから血液を採取する。一般毒性の徴候として、１４日にわたる体重の増加／減少を評価する。その結果は、インビトロでの細胞傷害性と相関することになる。
【０２３３】
リンパ腫の局所モデルにおけるＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの評価：様々なリンパ腫細胞株を用いて、本発明のコンジュゲートの有効性についてスクリーニングするために、細胞（Ｍａｔｒｉｇｅｌに懸濁したもの）を５×１０6細胞／マウスで、６〜８週齢のＳＣＩＤマウスの後側腹部に皮下接種することによって、固体腫瘍モデルを作製する。腫瘍の体積をノギス測定によって、毎日求める［３９］。腫瘍の体積がおよそ２５０ｍｍ3に達したら、マウスを３つの群（コントロール、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ（３０ｍｇ／ｋｇ）またはＲＴＸ（３０ｍｇ／ｋｇ））に割り当てる。腫瘍の生着後、尾静脈を介して、コンジュゲートを０日目、３日目、７日目及び１０日目に静脈内投与する。腫瘍の体積を順次的なノギス測定によってモニタリングする。腫瘍の最大直径が２ｃｍ超のマウスを殺処分する。直径が２ｃｍ超の腫瘍をカプラン・マイヤー解析において生存エンドポイントとして使用する。ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩをアイソタイプコントロールとして使用する。
【０２３４】
組織病理学的な調査のために、殺処分直後に器官（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓）を摘出することによって、非特異的な毒性を評価する。処置マウスと非処置マウスを比較して、コンジュゲートのいずれかの非特異的な毒性を評価する。
【０２３５】
リンパ腫の播種性モデルにおけるＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの評価：播種性リンパ腫モデルを用いて、４×１０6個のＲａｊｉ細胞またはＬｕｃ＋Ｒａｊｉ細胞を免疫不全ＣＢ１７−ＳＣＩＤ／ベージュマウスに静脈内注射することによって、本明細書に記載されているコンジュゲートを評価した（図２３）。腫瘍細胞は遠位位置に播種され、成長し、最終的には後肢麻痺を引き起こした［５７〜５９］。処置を行わなかったマウスは、細胞注射の約１カ月後に後肢麻痺を発症した。麻痺は、骨髄における腫瘍の成長によるものであり、この成長により、脊髄に影響が及ぶ。Ｒａｊｉ腫瘍は、脾臓と、腋窩リンパ節及び腸間膜リンパ節にも形成される。したがって、このモデルは、Ｂ細胞悪性腫瘍患者における腫瘍細胞の成長を再現するものである。
【０２３６】
この試験では、ＲＴＸ感受性モデルに対するコンジュゲートＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩのインビボでの抗ＮＨＬ活性を評価するとともに、ＲＴＸ耐性モデルも評価する。６〜８週齢のＳＣＩＤマウスに、Ｌｕｃ＋Ｒａｊｉ細胞とＲａｊｉ４ＲＨ（ＲＴＸ耐性）細胞を５×１０6細胞／マウスで静脈内注射することによって、異種移植を行う。腫瘍細胞の注射から１週間後に、マウスを（ｉ）ＰＢＳ（コントロール）、（ｉｉ）アイソタイプコントロール（ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩ）、（ｉｉｉ）ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩ（３０ｍｇ／ｋｇ）、（ｉｖ）ＲＴＸ（３０ｍｇ／ｋｇ）＋Ｐ−ＥＰＩ及び（ｖ）ＲＴＸ（３０ｍｇ／ｋｇ）の５群に無作為に分ける。マウスは、週に１回、８週間にわたって処置を行う。（ｉｉ）及び（ｉｖ）の群のマウスには、（ｉｉｉ）の群のマウスと同じ用量のＥＰＩを投与する。インビボ生体発光イメージングと、エンドポイントとしての無麻痺生存期間を用いて、異種移植したマウスの腫瘍の退縮及び／または進行を週に１回モニタリングする。麻痺を発症したマウスは、殺処分する。発症しなければ、生存マウスは、ＮＨＬ細胞の接種から最長で１００日まで観察する。
【０２３７】
統計解析：結果の群間比較のために、試料間の独立変数と不等分散に関するｔ検定を用いる。分布が過度に歪んでいる場合には、ランクベースのウィルコクソン検定を使用する。差は、両側ｐ値が０．０５未満の際に、統計的に有意とみなす。正規検定力算出値を用いて、標本の大きさの予測値を求める。１群当たり７つの試料では、２標本ｔ検定を用いて、群間の２標準偏差分の差を検出する検定力は、９０％である。
【０２３８】
予測される結果：リツキシマブ感受性モデルにおいて、有意な抗ＮＨＬ活性が予測される。ＲＴＸ耐性モデルでは、ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩとＲＴＸ単独で異なる反応が予測される。最初の実験セットの結果に基づく治療効率評価の際に、投与スケジュールを修正することになる。
【０２３９】
本明細書に開示されているコンジュゲートの、各種表現型のＮＨＬ患者分離株に対する活性の評価：ＣＤ２０は、実質的にすべてのＢ細胞ＮＨＬによって発現する［５］。しかしながら、抗ＣＤ２０抗体（ＲＴＸなど）の活性は、ＮＨＬのサブタイプによって異なる。このばらつきは、少なくとも部分的には、Ｂ細胞悪性腫瘍の種々のサブタイプによって、ＣＤ２０の発現レベルが異なることによるものである。本明細書に記載されているＡＰＤＣが、これらの様々な種類のＮＨＬに及ぼす作用を調べるために、ＣＤ２０を発現する４つの主なＢ細胞悪性腫瘍、すなわち、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）に由来する細胞を使用する。
【０２４０】
細胞源は、上に列挙した疾患の患者から得た診断用の骨髄またはリンパ節生検標本のいずれかとなる。上記の作業に基づく濃度の候補ＡＰＤＣで細胞を処理する［２４］。２４時間、４８時間及び７２時間の時点に、細胞傷害性について解析を行う。アッセイには、トリパンブルー排除、アネキシンＶ陽性性、細胞周期解析（サブＧ０画分）に関するヨウ化プロピジウム染色及びアポトーシス経路タンパク質（カスパーゼ３、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質）の活性化を含めることになる。ＲＴＸをコントロールとして用いる。初期診断の時点に得た試料と、再発時点に得た細胞との間で、各疾患における応答性を比較する。また、ＡＰＤＣに対するインビトロ応答性は、患者に行った事前のＣＤ２０指向性療法と相関する。Ｂ細胞悪性腫瘍のサブタイプに関して、応答性を相関付けて、各疾患の臨床予後因子を確立する。加えて、診断用フローサイトメトリー解析によって求めるようなＣＤ２０発現レベルに、応答性を相関付ける。
【０２４１】
統計解析：アッセイは、トリプリケートで行う。結果の群間比較のために、試料間の独立変数と不等分散に関するｔ検定を用いる。分布が過度に歪んでいる場合には、ランクベースのウィルコクソン検定を使用する。差は、両側ｐ値が０．０５未満の際に、統計的に有意とみなす。試験は、異なる組織像から得た少なくとも４０種類の試料で行う。
【０２４２】
予測される結果：すべての試料において、有意な細胞傷害活性が予測される。しかしながら、Ｂ細胞悪性腫瘍のサブタイプによって、異なる応答を示す可能性がある。また、各サブタイプ内でも、予後群の違い（ＤＬＢＣＬにおける胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）と活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）など）によって、応答差が見られる可能性がある。応答性は、ＮＨＬのサブタイプによって、ＣＤ２０の発現が異なることと関係し得る可能性もある。
【０２４３】
本明細書に開示されている試験は、がん、さらに具体的にはＢ細胞悪性腫瘍に対して強力な活性を有するＡＰＤＣ、例えばＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩを同定して、それを作製することを目指すものである。生産規模の拡大と、治験に向けた試験（動物毒性を含む）を含む臨床開発プログラムを開始して、再発疾患／難治性疾患の患者における第Ｉ相臨床試験プログラムにつなげる。
【０２４４】
実施例８：ＯＶＴＬ−１６  ｍＡｂ−Ｐ−パクリタキセルコンジュゲート
ＯＶ−ＴＬ１６  ｍＡｂは、ＯＶＣＡＲ−３細胞の表面とヒト卵巣癌の９０％で発現するＯＡ−３抗原（ＣＤ４７）を認識する。最近では、新たな抗がんアプローチとして、抗ＣＤ４７抗体の使用が台頭している。ＣＤ４７が、食細胞に対する「食作用阻止」シグナルとして機能し、ほぼすべてのがん細胞においてＣＤ４７が過剰発現することにより、食細胞による自然免疫の監視機構と排除機能が抑制されることが分かった。ＣＤ４７をブロックすると、がんと、その他の疾患（循環器不全及び炎症を含む）に対する治療効果をもたらし得る。図２２には、ＯＶ−ＴＬ１６抗体−ＳＴ−ＨＰＭＡコポリマー−薬物コンジュゲートの特徴と、その生物学的活性の評価が示されている。
【０２４５】
セミテレケリックＨＰＭＡポリマー−パクリタキセルコンジュゲート（ＳＴ−Ｐ−ＰＴＸ）と蛍光コントロールＳＴ−Ｐ−ＦＩＴＣの合成：シュレンクラインに接続したアンプルに、２７６ｍｇのＨＰＭＡと３７ｍｇのＮ−メタクリロイルアミノプロピルフルオレセインチオ尿素（ＭＡ−ＦＩＴＣ）（または４５ｍｇのＮ−メタクリロイルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシン−ＰＴＸ、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＰＴＸ）を加えた。２−シアノ−５−オキソ−５−（２−チオキソチアゾリジン−３−イル）ペンタル−２−イルベンゾジチオエート（ＣＴＡ−ＴＴ）を連鎖移動剤（ＣＴＡ）として使用し、Ｖ７０を開始剤として加えた。共重合を４０℃で、メタノール／ＤＭＳＯ（２：１、ｖ／ｖ）において５時間行った。エーテル／アセトンに沈殿することによって、ポリマーを単離した。大過剰のＶ７０との反応によって、ジチオベンゾエート基を除去し、Ｎ−エチルアミノマレイミドと、ポリマー鎖末端のチアゾリジン−２−チオン（ＴＴ）との反応によって、マレイミドを導入した。ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、そのコンジュゲートの平均分子量と多分散性を求めた。エルマンアッセイを修正したものによって、マレイミド基の存在を確かめ、４９５ｎｍにおいて、ＵＶ−ｖｉｓを用いて、ナトリウムボレート緩衝液（ｐＨ９．０）において、ＦＩＴＣ含有率を測定し、パパインによる切断後、ＨＰＬＣによって、ＰＴＸ含有率を求めた。
【０２４６】
ＯＶＴＬ−１６抗体へのＳＴ−Ｐ−ＰＴＸの結合：ＯＶ−ＴＬ１６抗体（Ａｂ）を４ｍＬのトリス・ＨＣｌ（１０ｍＭ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）において終濃度１ｍｇ／ｍＬに緩衝液交換した。ＴＣＥＰ（Ｈ2Ｏにおいて１０倍）をその溶液に加え、３７℃で３時間インキュベートしてから、限外ろ過（３０，０００ＭＷＣＯ、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ）によって精製して、Ａｂ−ＳＨを得た。ＳＴ−Ｐ−ＰＴＸ（またはＳＴ−Ｐ−ＦＩＴＣ）（Ｈ2Ｏにおいて５０倍）をそのＡｂ−ＳＨ溶液に加え、３７℃で、さらに２時間インキュベートした。未反応のポリマーを限外ろ過（３０，０００ＭＷＣＯ、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ）で除去した後、Ａｂ−Ｐ−ＰＴＸ（またはＡｂ−Ｐ−ＦＩＴＣ）を得た。
【０２４７】
ターゲティング作用：ＳＫＯＶ−３細胞を１０μｇ／ｍＬのＡｂ−Ｐ−ＦＩＴＣとともに、３７℃で１時間インキュベートした。コントロールは、大過剰（５０倍）のＡｂに事前に暴露した後、Ａｂ−Ｐ−ＦＩＴＣに暴露したものと、ＳＴ−Ｐ−ＦＩＴＣに暴露したものと、未処理群である。フローサイトメトリーを用いて、結合活性を解析した。
【０２４８】
細胞傷害性：ＳＫＯＶ−３細胞をＡｂ−Ｐ−ＰＴＸコンジュゲートと、ＳＴ−Ｐ−ＰＴＸ（それぞれ、１０μＭのＰＴＸ換算量）で、３７℃において１時間処理した。その後、薬物を除去し、細胞をさらに２０時間培養した。細胞をアネキシンＶ−ＦＩＴＣとＰＩ（ヨウ化プロピジウム）で染色し、フローサイトメトリーを用いて解析した。未処理細胞をコントロールとした。
【０２４９】
実施例９：トラスツズマブ−Ｐ−エピルビシンコンジュゲート
トラスツズマブ（ハーセプチン）は、例えばＨＥＲ２陽性乳癌細胞において、ＨＥＲ２レセプターに結合する市販の抗体である。
【０２５０】
マレイミドで官能化されたセミテレケリックＨＰＭＡコポリマー−エピルビシンコンジュゲートの合成：ＲＡＦＴ共重合を行った後、２段階の末端変性を行うことによって、一方の鎖末端にマレイミド基を有するセミテレケリック（ＳＴ）ＨＰＭＡコポリマー−エピルビシンコンジュゲートを調製した。ＨＰＭＡ（１３９ｍｇ、０．９７ミリモル）とＮ−メタクリロイルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシン−エピルビシン（ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＥＰＩ、３０ｍｇ、０．０３ミリモル）の入ったアンプルをシュレンクラインに接続した。真空−窒素サイクルを３回行って、酸素を除去した後、２−シアノ−５−オキソ−５−（２−チオキソチアゾリジン−３−イル）ペンタル−２−イルベンゾジチオエート（ＣＴＡ−ＴＴ、４ｍｇ／ｍＬ×１７０μｌ、脱気ＭｅＯＨ／Ｈ＋０．３％酢酸中）と、２，２’−アゾビス（４−メトキシ−２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ７０、１ｍｇ／ｍＬ×１８４μｌ、脱気ＭｅＯＨ／Ｈ＋０．３％酢酸中）をシリンジによって、電磁攪拌下で加え、Ｎ2で１０分間、氷浴においてバブリングした。そのアンプルを密閉し、重合を３０℃で２２時間行った。アセトン／エチルエーテルに沈殿することによって、コポリマーを得て、メタノールに再溶解して、２回以上、アセトン／エチルエーテル中で沈殿することによって精製した。そのコポリマーを赤色粉末として単離し、真空下で乾燥した。ＵＶ検出器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ｍｉｎｉ  ＤＡＷＮ  ＴＲＥＯＳ及びＯｐｔｉｌａｂｒＥＸ（屈折率）検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を備えたＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステムで、３０％アセトニトリル（ｐＨ６．５）を含むナトリウムアセテート緩衝液を移動相として用いたＳｕｐｅｒｏｓｅ６  ＨＲ１０／３０カラムを用いて、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて、そのコンジュゲートの平均分子量（Ｍｗ）と多分散性（ＰＤＩ）を求めた。０．３ｍｌのＭｅＯＨ／Ｈ＋中の４０倍過剰の２，２’−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）（Ｖ−６５）と５５℃で２時間、さらに反応させることによって、ジチオベンゾエート末端基を除去し、２回、アセトン／エチルエーテルに沈殿することによって、その改変コンジュゲートを単離して、ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−ＴＴを得た（７０ｍｇ、４１％）。ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−ＴＴをメタノールに溶解することによって（約２ｍｇ／１０ｍｌ）、コポリマーにおけるＥＰＩの含有率を分光光度法で求め（λｍａｘ＝４９５ｎｍ）、メタノールにおけるＥＰＩ検量線に従って算出した。ＴＴ（チアゾリジン−２−チオン）基と、Ｎ−（２−アミノエチル）マレイミドとの反応によって、末端鎖の反応性マレイミド（ｍａｌ）基を導入した。例えば、１８ｍｇのＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−ＴＴを５００μｌのＤＭＳＯに溶解してから、１０μｌのＤＩＰＥＡと５ｍｇのＮ−（２−アミノエチル）マレイミドトリフルオロアセテートを含む０．１ｍＬのＤＭＳＯに、その溶液を加えた。室温で２４時間攪拌後、３回、アセトン／エーテルに沈殿することによって、そのポリマーを単離して、１６．５ｍｇのＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−Ｍａｌを得た。エルマンアッセイを修正したものによって、マレイミド基の存在を確認した（図１）。
【０２５１】
ハーセプチンへのＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−Ｍａｌのコンジュゲーション：ハーセプチン（１８ｍｇ）をトリス．ＨＣｌ（２０ｍＭ、１５０ｍＭのＮａＣｌと５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）緩衝液で、３回の限界ろ過（ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）３０，０００）によって、最終量４ｍＬまで緩衝液交換してから、０．４ｍＬのＴＣＥＰ（１００ｍＭ、トリス．ＨＣｌ緩衝液中、ｐＨ７．１）を加え、３７℃で３時間インキュベートした。４回、限外ろ過（ＭＷＣＯ３０，０００）によって、トリス．ＨＣｌ緩衝液で過剰なＴＣＥＰを除去して、ハーセプチン−ＳＨを得た。ハーセプチン−ＳＨ（４ｍＬのトリス．ＨＣｌ緩衝液中に１８ｍｇ）を、２ｍＬのトリス．ＨＣｌ緩衝液中の１．５ｍｇのＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−Ｍａｌと混合し、３７℃で６時間インキュベートした。ワークアップ後、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で溶出するＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲ１６／６０カラムを備えたＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で、ＳＥＣを用いて、ハーセプチン−Ｐ−ＥＰＩコンジュゲートを精製して、コンジュゲーションしなかった遊離なＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−Ｍａｌを除去した。ＦＰＬＣ解析によって、コンジュゲートの合成の成功を確認した（図２３）。最終溶液中のタンパク質濃度（ハーセプチン）をＢＣＡタンパク質アッセイで求めた一方で、ＥＰＩ含有率に基づき、ＵＶ−ｖｉｓ分光法を用いて、ポリマー含有率を評価した。そして、薬物抗体比（ＤＡＲ）を算出した。ＥＰＩ／ハーセプチン＝１６．０であった。
【０２５２】
実施例１０：ＩｇＧへのＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ−Ｍａｌのコンジュゲーション
本明細書に記載されているコンジュゲーション技法の汎用性を示すために、ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩコンジュゲートの合成に、非特異的なＩｇＧを用いた。ＩｇＧを上記のようにＴＣＥＰで還元し、４回、トリス．ＨＣｌ緩衝液で限外ろ過することによって、過剰なＴＣＥＰを除去した。ＩｇＧ−ＳＨ溶液にＳＴ−Ｐ−ＥＰＩを加え、６時間、３７℃でインキュベートした。ワークアップ後、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で溶出するＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲ１６／６０カラムを備えたＡＫＴＡ  ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でＳＥＣを用いて、ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩコンジュゲートを精製して、コンジュゲーションしなかった遊離なＳＴ−Ｐ−ＥＰＩを除去した。ＦＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって、ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩコンジュゲートの合成の成功を確認する。ＢＣＡタンパク質アッセイで最終溶液におけるタンパク質濃度を求めた一方で、ＥＰＩ含有率に基づき、ＵＶ−ｖｉｓ分光測光法を用いて、ポリマー含有率を評価した。そして、薬物抗体比（ＤＡＲ）を算出した。ＩｇＧ−Ｐ−ＥＰＩにおいて、ＥＰＩ／ＩｇＧは１６．９であった。
【０２５３】
実施例１１：ＯＶ−ＴＬ１６−Ｐ−エピルビシンコンジュゲート
セミテレケリックＨＰＭＡコポリマー−エピルビシンコンジュゲート（Ｐ−ＥＰＩ）との結合用に、ＯＶ−ＴＬ１６  ｍＡｂ（抗卵巣癌抗体）を選択した。
【０２５４】
ＯＶ−ＴＬ１６  ｍＡｂは、ＯＶＣＡＲ−３細胞の表面とヒト卵巣癌の９０％で発現するＯＡ−３抗原（ＣＤ４７）を認識する。ＲＴＸ−Ｐ−ＥＰＩの調製と同様に、セミテレケリックＨＰＭＡポリマー−エピルビシンコンジュゲート（ＳＴ−Ｐ−ＥＰＩ）を、還元したばかりのＯＶ−ＴＬ１６  Ａｂに、チオール−マレイミド反応経由で選択的に結合した。フローサイトメトリーを用いて、抗体−薬物コンジュゲート（ＯＶＴＬ−１６−Ｐ−ＥＰＩ）の結合親和性を求め、抗体単独の場合と比較した。その結果から、コンジュゲーション後、６０％超の結合親和性が維持されていることが示された（図２４）。
【０２５５】
５０μｌの培地中のＳＫＯＶ−３細胞（２×１０5個）を様々な試料と混合して、４℃で３０分インキュベートした。続いて、その細胞を２回、新鮮な培地で洗浄して、未結合の抗体または抗体−薬物コンジュゲートを除去した。その後、二次抗体のＧＡＭ−４８８（１００μｌ、１：２００の希釈率）を加え、細胞を４℃でさらに３０分インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、細胞をフローサイトメトリーによって解析した。図２４におけるすべてのデータは、平均±ＳＤ（ｎ＝３）として示されている。
【０２５６】
本発明の範囲または趣旨から逸脱せずに、本発明において、様々な修正と変形を行うことができることは当業者には明らかであろう。本発明の他の態様は、本明細書に開示されている本発明の明細の考察と実施から、当業者に明らかになるであろう。本発明の明細と実施例は、例示に過ぎないとみなすべきであり、本発明の真の範囲と趣旨は、下記の請求項によって示されていると意図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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