(57)【要約】  本発明は一般に、好ましくない標的細胞及び/又は微生物に対してEBV現存免疫応答を再命令するのに有用な免疫原性構築物、前記コンジュゲートを調製するための方法、前記コンジュゲートを含む薬学的適用、並びにその医学的適用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)標的細胞及び/又は微生物と結合する部分、並びに
ii)エプスタイン・バーウイルス(EBV)B細胞抗原
を含む、免疫原性コンジュゲート。
【請求項２】
前記標的結合性部分が、前記エプスタイン・バーウイルスB細胞抗原と共有結合性に連結されている、請求項1に記載の免疫原性コンジュゲート。
【請求項３】
前記部分が、抗体、その結合断片、抗体模倣体、細胞表面受容体、細胞表面リガンド、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択されるリガンド結合性タンパク質である、請求項1又は2に記載の免疫原性コンジュゲート。
【請求項４】
前記抗体断片が、Fab抗体、Fab'抗体、F(ab')2抗体、Fv抗体、一本鎖抗体(scFv)、及び単一ドメイン抗体、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項3に記載の免疫原性コンジュゲート。
【請求項５】
前記部分が、ビタミン、炭水化物、グリコサミノグリカン、低分子核酸、低分子化学物質、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される非タンパク質性部分である、請求項1又は2に記載の免疫原性コンジュゲート。
【請求項６】
前記エプスタイン・バーウイルスB細胞抗原が、配列番号15の配列のP18抗原、配列番号16の配列のP23抗原、それらの機能的バリアント及び機能的断片、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲート。
【請求項７】
前記部分がチオール基を含む場合、P18及び/又はP23抗原の機能的バリアント及び機能的断片が全くシステイン残基を含まないという条件での、請求項6に記載の免疫原性コンジュゲート。
【請求項８】
前記機能的バリアントが、配列番号39の配列のP18抗原機能的バリアント、及び配列番号40の配列のP23抗原機能的バリアントからなる群から選択される、請求項7に記載の免疫原性コンジュゲート。
【請求項９】
前記機能的断片が、前記抗原の約10個のアミノ酸残基〜約150個のアミノ酸残基を含む、請求項6又は7に記載の免疫原性コンジュゲート。
【請求項１０】
前記機能的断片が、配列番号75及び配列番号43〜配列番号49からなる群から選択される配列を少なくとも含むP18抗原機能的断片、並びに/又は配列番号50及び配列番号51からなる群から選択される配列を少なくとも含むP19抗原機能的断片である、請求項9に記載の免疫原性コンジュゲート。
【請求項１１】
前記P18抗原機能的断片が、配列番号76及び配列番号52〜配列番号58からなる群から選択される配列を含み、若しくはそれからなり、並びに/又は前記P23抗原機能的断片が、配列番号59及び配列番号60からなる群から選択される配列を含み、若しくはそれからなる、請求項10に記載の免疫原性コンジュゲート。
【請求項１２】
標的細胞が、罹患細胞、好ましくは、癌細胞、又はウイルス、細菌、真菌、及び/若しくは寄生虫等の病原体に感染した細胞であり、並びに/或いは、標的微生物が、病原性微生物、好ましくは、ウイルス、細菌、真菌、及び/又は寄生虫である、請求項1から11のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲート。
【請求項１３】
-  前記罹患細胞が、マラリアに感染した赤血球であり、及び/若しくは前記病原性微生物が熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)であり、又は
-  前記罹患細胞が癌細胞である、
請求項12に記載の免疫原性コンジュゲート。
【請求項１４】
請求項1から13のいずれか一項に記載の少なくとも1つの免疫原性コンジュゲート、及び少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１５】
薬物として使用される、請求項1から13のいずれか一項に記載の免疫原性コンジュゲート、又は請求項14に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、好ましくない標的細胞及び/又は微生物に対してエプスタイン・バーウイルス(EBV)現存免疫応答を再命令するのに有用な免疫原性構築物、前記コンジュゲートを調製するための方法、前記コンジュゲートを含む薬学的適用、並びにその医学的適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法は、癌、感染性疾患、及び神経変性障害等の病態と戦うよう身体の免疫応答を調節する(すなわち、誘導し、増強し、又は抑制する)ことを意図された一種の処置である。罹患細胞及び/又は病原体を特異的に認識し、前記望まれない要素の排除を、より良い免疫応答を誘発することによるか、又は直接的細胞傷害によるかのいずれかで引き起こすことができる免疫原性物質を設計するために、過去25年間、多くの努力がなされてきた。タンパク質及び抗体等の多数の標的結合性物質が、そのような目的のために開発されており、微生物毒素又は放射性化合物等の他の活性物質とコンジュゲートすることができる。
【０００３】
前記物質の利点の一つは、潜在的な副作用を最小限にすることができるだけでなく、標的の排除を最大限にすることができるように、それらの標的に対するそれらの特異性である。この点において、抗体、特にモノクローナル抗体(mAb)、及びVHH、Fab、又はscFv等の抗体断片は、それらが、標的細胞上の単一分子部位又はエピトープを認識する能力を有するため、ここ数年、多くの関心を集めている。
【０００４】
多くの治療用モノクローナル抗体の一つの主な作用様式は、抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)に頼っている。残念なことに、治療用mAbに対する異なる応答が文献において報告されており、Fc受容体遺伝子配列における特定の多型と、少なくとも一部、相関すると考えられる。これは、Fc受容体に対する親和性が効果的な細胞応答を促進するのに重大であるため、臨床状況においてそれらの使用を大いに制限する。
【０００５】
対照的に、VHH、Fab、及びscFvは、それらが正確にはFc領域を欠損するため、ADCC、オプソニン食作用、及び/又は補体活性化等のいかなるFcエフェクター機能も媒介する能力がない。したがって、Fcエフェクター機能を得るために、それらの一本鎖抗体におけるFc鎖の操作が必要とされるだろう。しかしながら、そのような操作は厄介であり、小さい細胞の空洞及び間隙に存在する潜在的な隠れたエピトープのアクセス性を減少させる可能性が高い。
【０００６】
したがって、上記で論じられた制限を克服することができる、代替の免疫原性物質を同定することの必要性が当技術分野において存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Molecular cloning: A laboratory manual、第4版、Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、Cold Spring Harbor、NY、USA、2012
【非特許文献２】Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第22版、Mack Publishing Co.社、Easton、Pa.、2012
【非特許文献３】Kuby Immunology、Owenら、第7版、Macmillan Education社、2013
【非特許文献４】Immunology Methods Manual、1〜4巻、Lefkovits、Academic Press社、1996
【非特許文献５】Chemistry of Protein and Nucleic Acid Cross-linking and Conjugation、Wong及びJameson、第2版、CRC Press社、2011
【非特許文献６】The Immunoassay Handbook、Wildら、第4版、Elsevier社、2013
【非特許文献７】Bioconjugate techniques、Hermanson、第3版、Elsevier社、2013
【非特許文献８】Thermo Scientific: Crosslinking Technical Handbook (2015)
【非特許文献９】Immunobiology、Janewayら、第5版、Garland publishing社、2001
【非特許文献１０】Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic、Anら、Wiley editions、2009
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、特定の細胞及び/又は微生物をターゲティングする抗体とコンジュゲートされた、EBV B細胞抗原が、より具体的には、オプソニン食作用を通して、前記望まれない標的を排除する免疫応答をインビボで引き起こす能力があることを、本明細書において予想外にも発見している。驚くべきことに、そのような応答は、抗体がFc領域を欠損している場合でさえも達成することができる。これは、ほとんど確実には、前記EBV抗原により発揮される間接的エフェクター機能のおかげで可能になっている。標的結合性抗体にコンジュゲートされた場合、上記の能力を示す特定のEBV B細胞抗原、より具体的には、前記抗原のC末端内の特定の領域が、本発明者らによって更に同定されている。
【０００９】
したがって、本明細書に開示された所見に基づいて、本発明は、標的細胞及び/又は微生物と結合する部分(moiety)並びにエプスタイン・バーウイルス(EBV)B細胞抗原を含む免疫原性コンジュゲート、前記コンジュゲートを調製するための方法、前記コンジュゲートを含む薬学的組成物、並びに関係した治療的適用を初めて、提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】コンジュゲートDARCVHH-EBV P18抗原及びDARCVHH-EBV P23抗原のIMAC精製を示す図である。天然条件下でのDARCVHH-P23のNi-NTA精製(A〜B)、又は変性条件下でのDARCVHH-P18及びDARCVHH-P23のNi-NTA精製(C〜D)。SDS PAGE後、タンパク質ゲルを、クーマシーブルーで染色し(A及びC)、又は探索抗体として抗Hisを使用するウェスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜上へ転写した(B及びD)。
【図１Ｂ】コンジュゲートDARCVHH-EBV P18抗原及びDARCVHH-EBV P23抗原のIMAC精製を示す図である。天然条件下でのDARCVHH-P23のNi-NTA精製(A〜B)、又は変性条件下でのDARCVHH-P18及びDARCVHH-P23のNi-NTA精製(C〜D)。SDS PAGE後、タンパク質ゲルを、クーマシーブルーで染色し(A及びC)、又は探索抗体として抗Hisを使用するウェスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜上へ転写した(B及びD)。
【図１Ｃ】コンジュゲートDARCVHH-EBV P18抗原及びDARCVHH-EBV P23抗原のIMAC精製を示す図である。天然条件下でのDARCVHH-P23のNi-NTA精製(A〜B)、又は変性条件下でのDARCVHH-P18及びDARCVHH-P23のNi-NTA精製(C〜D)。SDS PAGE後、タンパク質ゲルを、クーマシーブルーで染色し(A及びC)、又は探索抗体として抗Hisを使用するウェスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜上へ転写した(B及びD)。
【図１Ｄ】コンジュゲートDARCVHH-EBV P18抗原及びDARCVHH-EBV P23抗原のIMAC精製を示す図である。天然条件下でのDARCVHH-P23のNi-NTA精製(A〜B)、又は変性条件下でのDARCVHH-P18及びDARCVHH-P23のNi-NTA精製(C〜D)。SDS PAGE後、タンパク質ゲルを、クーマシーブルーで染色し(A及びC)、又は探索抗体として抗Hisを使用するウェスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜上へ転写した(B及びD)。
【図２】コンジュゲートDARCVHH-EBV変異型P18抗原及びDARCVHH-EBV変異型P23抗原のIMAC精製を示す図である。天然条件下での変異型コンジュゲートDARCVHH-P18(C56S)*及びDARCVHH-P23(C46S)*のNi-NTA精製。SDS PAGE後、タンパク質ゲルを、クーマシーブルーで染色した。
【図３】コンジュゲートDARCVHH-EBV変異型P18抗原及びDARCVHH-EBV P18抗原断片、加えて、抗DARC VHH単独のゲル濾過クロマトグラフィを示す図である。IMAC精製後、DARCVHH-P18(C56S)*(A)、DARCVHH-P18F2(B)、DARCVHH-P18F3(C)、DARCVHH-P18F4(D)、及びDARCVHH(E)をサイズ排除クロマトグラフィに供した。
【図４】コンジュゲートDARCVHH-EBV P18及びVAR2CSAVHH-EBV P18(変異型及び断片)のIMAC精製及びゲル濾過クロマトグラフィ精製を示す図である。IMAC精製後、DARCVHH-P18(C56S)*を、サイズ排除クロマトグラフィに供した(A)。精製されたコンジュゲートDARCVHH-P18断片及びVAR2CSAVHH-P18F2断片、加えて、それらの精製されたそれぞれの分子標的DARC及びVAR2CSAのクーマシーブルー染色(B)。組換えDARC325タンパク質は、DARCVHHによりターゲティングされるエピトープを含有するが、組換えDARC403はそのエピトープ配列を欠く。VAR2CSAの完全長細胞外部は、6つのDBLドメイン(DBL1〜DBL6ε)を含み、VAR2CSAVHHはDBL4εドメインをターゲティングする。
【図５】コンジュゲートされていない対コンジュゲートされた、DARCVHH及びVAR2CSAVHHの、それらのそれぞれの分子標的、すなわち、DARC及びVAR2CSAに対する親和性の比較分析を示す図である。完全長組換えDARC325及びVAR2CSA(3D7-DBL1X-6ε)をCM5チップ上に固定化し、分析物を、異なる濃度で注入した。DARCVHH-P18F2、DARCVHH-P18F3、DARCVHH-P18F4、DARCVHHのDARC325に対する親和定数及びVAR2CSAVHH-P18F2、VAR2CSAVHH-P18F3、VAR2CSAVHHのVAR2CSAに対する親和定数は、EBV抗原コンジュゲーションによって有意には変化しなかった。
【図６Ａ】DARCVHH-EBV P18及びVAR2CSAVHH-EBV P18コンジュゲート(断片)の免疫認識を示す図である。DARCVHH-EBV P18F2に対する抗体価(IgG)決定の例。ドナー20120617についての抗体価は、最大ODシグナルの50%に達した時点での血漿希釈度としてみなされた。
【図６Ｂ】DARCVHH-EBV P18及びVAR2CSAVHH-EBV P18コンジュゲート(断片)の免疫認識を示す図である。DARCVHH-P18F2、DARCVHH-P18F3、DARCVHH-P18F4、DARCVHH、VAR2CSAVHH-P18F2、VAR2CSAVHH-P18F3、VAR2CSAVHH、並びにMBP EBV-P18及びMBP P23の22個の異なる血漿試料による比較による免疫認識(IgG)。BSA及びMBPを対照として使用した。
【図７】コンジュゲートDARCVHH-EBV P18抗原断片F2のその天然標的、すなわち、DARC+ドナーの赤血球表面上に発現したDARCとの結合を示す図である。DARC+赤血球を、DARCVHH-P18F2の段階希釈溶液とインキュベートした。膜結合型タンパク質を、抗His PEコンジュゲート化抗体を使用するフローサイトメトリによりモニタリングした。
【図８Ａ】DARCVHH-EBV P18コンジュゲート(変異型)により媒介される赤血球オプソニン化を示す図である。赤血球オプソニン化を実証するために、DARC+赤血球を、DARCVHH-P18(C56S)*とインキュベートし、その後、ヒト血漿の段階希釈溶液とインキュベートした(左パネル)。膜会合型IgGを、抗hIgG PEコンジュゲート化抗体を使用するフローサイトメトリにより検出した(右パネル)。蛍光強度(PE)のシフトは、赤血球細胞表面における免疫複合体の存在を反映する(右パネル)。
【図８Ｂ】DARCVHH-EBV P18コンジュゲート(断片)により媒介される赤血球オプソニン化を示す図である。コンジュゲートDARCVHH-EBV P18抗原断片F3により媒介される赤血球凝集。DARC+赤血球を、DARCVHH-P18F3とインキュベートし、その後、ヒト血漿の段階希釈溶液とインキュベートした。プレートの遠心分離後、対照条件(ヒト血漿無し)からの赤血球は、明確に画定された細胞ペレットを形成したが(a、b、c)、DARCVHH-P18F3及びヒト血漿の存在下でインキュベートされた赤血球は、拡散した凝集物を形成した(d、e、f)。
【図９Ａ】DARCVHH-EBV P18コンジュゲート(変異型)により媒介されるオプソニン食作用を示す図である。赤血球オプソニン化が食作用へと導くことを実証するために、THP1由来マクロファージを、DARCVHH-P18(C56S)*であらかじめオプソニン化されたCFSE染色DARC+赤血球、及びヒトIgGとインキュベートした。3時間後、THP1細胞を、フローサイトメトリにより分析した。CFSE陽性THP1細胞を、少なくとも1個の赤血球を貪食している細胞とみなした。
【図９Ｂ】DARCVHH-EBV P18コンジュゲート(断片)により媒介されるオプソニン食作用を示す図である。THP1細胞を、DARCVHH-P18F3であらかじめオプソニン化されたCFSE染色DARC+赤血球、及びヒトIgGとインキュベートした。3時間後、THP1細胞を、フローサイトメトリにより分析した。CFSE陽性THP1細胞を、少なくとも1個の赤血球を貪食している細胞とみなした。
【図９Ｃ】DARCVHH-EBV P18コンジュゲートにより媒介されるオプソニン食作用を示す図である。DARC+赤血球の、異なるDARCVHH-EBV P18コンジュゲートでの処理が、細胞オプソニン化、及びその後のTHP1細胞による食作用を媒介することを実証するために、CFSE染色赤血球を、等モル濃度(10nM)のDARCVHH、DARCVHH-EBV P18F2、DARCVHH-EBV P18F3、DARCVHH-EBV P18F4と、及び10%ヒト血漿とインキュベートした。ヒト血漿試料を、P18に対するそれらの反応性についてスクリーニングし、EBV抗原を認識するそれらの能力により3グループ:P18に対する高い反応性(高)、P18に対する中程度の反応性(中)、又は低い反応性(低)においてプールした。3時間の共インキュベーション後、THP1細胞を、フローサイトメトリにより分析した。CFSE陽性THP1細胞を、少なくとも1個の赤血球を貪食している細胞とみなした。結果は、いかなるコンジュゲートも含まない、赤血球(RBC)のみの実験条件と比較した、倍数増加として表されている。
【図１０】hCD20ScFv-P18F3及びVAR2CSA-P18F3コンジュゲートのIMAC精製及びゲル濾過クロマトグラフィを示す図である。IMAC精製後、hCD20ScFv-P18F3及びVAR2CSA-P18F3を、サイズ排除クロマトグラフィに供した。hCD20ScFv-P18F3、VAR2CSA-P18F3、並びに「裸の(naked)」タンパク質hCD20ScFv及びVAR2CSAのクーマシーブルー染色。
【図１１】hCD20ScFv-P18F3及びVAR2CSA-P18F3コンジュゲートのそれらの天然標的、すなわち、それぞれ、B細胞の表面に発現したCD20、及び癌細胞の表面に発現したCSAとの結合を示す図である。CD20発現RAJI細胞及びCSA発現RAJI細胞を、50μg/mlのhCD20ScFv、hCD20ScFv-P18F3と、又は50μg/mlのVAR2CSA、VAR2CSA-P18F3とインキュベートした。膜結合型タンパク質を、マウス抗His抗体及び抗マウスIgG-PEコンジュゲート化抗体を使用するフローサイトメトリによりモニタリングした。
【図１２】hCD20ScFv-P18F3コンジュゲートにより媒介されるCD20+ RAJI細胞のオプソニン化を示す図である。B細胞オプソニン化を実証するために、CD20+ RAJI細胞を、hCD20ScFv又はhCD20ScFv-P18F3の段階希釈溶液とインキュベートし、その後、一定のヒト血漿希釈溶液(1:100)とインキュベートした。(A)膜会合型IgGを、抗hIgG PEコンジュゲート化抗体を使用するフローサイトメトリにより検出した。蛍光強度(PE)のシフトは、細胞表面の免疫複合体の存在を反映する。(B)フローサイトメトリ分析により生じたデータのグラフ表示。
【図１３】VAR2CSA-P18F3コンジュゲートにより媒介されるCSA+ RAJI細胞のオプソニン化を示す図である。B細胞オプソニン化を実証するために、CSA+ RAJI細胞を、VAR2CSA又はVAR2CSA-P18F3の段階希釈溶液とインキュベートし、その後、一定のヒト血漿希釈溶液(1:100)とインキュベートした。(A)膜会合型IgGを、抗hIgG PEコンジュゲート化抗体を使用するフローサイトメトリにより検出した。蛍光強度(PE)のシフトは、細胞表面の免疫複合体の存在を反映する。(B)フローサイトメトリ分析により生じたデータのグラフ表示。
【図１４】hCD20ScFv-P18F3により媒介される補体活性化を示す図である。hCD20ScFv-P18F3により媒介されるB細胞オプソニン化が、膜侵襲複合体の形成への補体カスケードを活性化することができることを実証するために、CD20+ RAJI細胞を、5μg/mlのhCD20ScFv又はhCD20ScFv-P18F3とインキュベートし、その後、活性型又は熱失活型の10%EBV+ヒト血漿とインキュベートした。膜侵襲複合体の構成的エレメントC5-b9の沈着を、マウスモノクローナル抗C5-b9抗体及び抗マウスIgG-PEコンジュゲート化抗体を使用する1時間のインキュベーション後、細胞膜表面で検出した。活性ヒト血漿単独に関して観察されたRAJI細胞表面でのわずかなC5-b9沈着は、癌細胞株による補体の代替(抗体非依存性)経路の活性化による可能性が最も高い。
【図１５】hCD20ScFv-P18F3 (A)及びVAR2CSA-P18F3 (B)により媒介される抗体依存性細胞傷害(ADCC)を示す図である。エフェクター細胞におけるNFAT経路による遺伝子転写の活性化は、ADCCにおけるコンジュゲートの生物学的活性を反映し、産生されたルシフェラーゼ(発光読み取り)を通して定量化される。RAJI細胞を、飽和濃度のコンジュゲートとインキュベートし、その後、EBV+ヒト血漿の段階希釈溶液とインキュベートした。コンピテントエフェクター細胞との6時間の共インキュベーション後、NFAT経路活性化を、各プレートウェルの発光(CPS:カウント毎秒で表されている)を読むことによりモニタリングした。
【図１６】コンジュゲートEPCR-P18F3のIMAC精製及びゲル濾過クロマトグラフィ精製を示す図である。IMAC精製後、EPCR-P18F3をサイズ排除クロマトグラフィに供した。(A)EPCR-P18F3のクーマシーブルー染色、及び(B)抗His抗体を使用するウェスタンブロット分析。精製されたEPCR-P18F3を含有するゲル濾過(GF)画分をプールし、機能アッセイに使用した。
【図１７】コンジュゲートEPCR-P18F3の、その天然標的、すなわち、Pf.に感染した赤血球の表面に発現したVAR19との結合を示す図である。VAR19を発現する感染した赤血球(iRBC)を、EPCR-P18F3の段階希釈溶液(100μg/mlから0.19μg/mlまでの範囲)とインキュベートした。膜結合型タンパク質を、マウス抗His抗体及び抗マウスIgG-PEコンジュゲート化抗体を使用するフローサイトメトリによりモニタリングした。(A)細胞の形態学的ゲーティング。(B)感染した赤血球(iRBC)と感染していない赤血球(RBC)との識別を可能にするTOPRO3染色。(C)iRBC集団及び(D)RBC集団における膜結合型EPCR-P18F3の検出。
【図１８】EPCR-P18F3により媒介されるオプソニン食作用を示す図である。EPCR-P18F3により媒介される、VAR19を発現する感染した赤血球(iRBC)オプソニン化が食作用を誘導することを実証するために、THP1由来マクロファージを、EPCR-P18F3であらかじめオプソニン化されたCFSE染色VAR19発現iRBC、及びhIgGとインキュベートした。3時間後、THP1細胞を、フローサイトメトリにより分析した。CFSE陽性THP1細胞を、少なくとも1個のiRBCを貪食している細胞とみなした。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において他に規定がない限り、本発明と関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者により一般的に理解されている意味を有するものとする。更に、文脈により他に要求されない限り、本明細書で使用される命名法、並びに分子生物学、生化学、化学、免疫学、及び薬理学の技術は、当技術分野においてよく知られ、かつ一般的に使用されるものである。そのような技術は、文献において十分に説明されている(特に、Molecular cloning: A laboratory manual、第4版、Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、Cold Spring Harbor、NY、USA、2012; Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第22版、Mack Publishing Co.社、Easton、Pa.、2012; Kuby Immunology、Owenら、第7版、Macmillan Education社、2013; Immunology Methods Manual、1〜4巻、Lefkovits、Academic Press社、1996; Chemistry of Protein and Nucleic Acid Cross-linking and Conjugation、Wong及びJameson、第2版、CRC Press社、2011; The Immunoassay Handbook、Wildら、第4版、Elsevier社、2013; Bioconjugate techniques、Hermanson、第3版、Elsevier社、2013参照)。
【００１２】
本発明により提案された免疫原性コンジュゲートは、EBVに対する体液性免疫応答を示す、それを必要としている対象において、特定の望まれない標的細胞又は微生物のクリアランスに向けての免疫応答を、再命令するために使用することができる。EBVに対する体液性免疫応答の中で、EBVに対する現存の体液性応答は、典型的には、対象のEBV初感染時に観察することができ、一方、EBVに対する既存の体液性応答は、典型的には、対象の前記ウイルスでの初感染後のEBV潜伏慢性感染について観察することができる。
【００１３】
ゆえに、第1の態様において、本発明は、以下を含む免疫原性コンジュゲートに向けられる:
i)標的細胞及び/又は微生物と結合する部分;並びに
ii)エプスタイン・バーウイルス(EBV)B細胞抗原。
【００１４】
本明細書において、用語「免疫原性の」は、対象に投与されたとき、インビボで免疫応答を誘発する能力を指す。本発明の関連において、このように、本発明のコンジュゲートにより対象におけるその投与で直接的に引き起こされる前記免疫応答は、より具体的には、標的細胞若しくは微生物のオプソニン食作用、並びに/又は抗体依存性細胞媒介細胞傷害(ADCC)及び/若しくは抗体依存性補体活性化(及びその後の補体依存性細胞傷害(CDC))による標的の溶解によって特徴づけられる。好ましくは、本明細書において、前記免疫応答は、標的細胞及び/又は微生物のオプソニン食作用により特徴づけられる。前記免疫応答は、より具体的には、i)対象に存在する望まれない標的細胞及び/又は微生物との前記部分の結合、並びにii)EBVに対する体液性免疫応答を示す対象の抗体によるEBV B細胞抗原の免疫認識(すなわち、結合)のおかげで起こる。下記で更に説明されているように、本明細書において、前記免疫応答は、MHC分子にも、いかなるTCR(T細胞受容体)の会合にも直接的には関与しない体液性応答(すなわち、B細胞応答)である。
【００１５】
本明細書において、用語「オプソニン食作用」は、対象において、望まれない要素(本明細書において、標的細胞及び/又は微生物)がマクロファージ等の天然貪食細胞により摂取され、かつ排除される過程を指す。そのような過程は、典型的には、望まれない要素と複合体化(すなわち、結合)している対象抗体と貪食細胞Fc受容体が結合及び架橋し、それにより免疫複合体を形成することにより惹起され、その複合体が、次に、前記望まれない要素の食作用を生じるシグナル伝達経路を作動させる。
【００１６】
本明細書において、用語「抗体依存性細胞媒介細胞傷害」又は「ADCC」は、対象において、望まれない要素(本明細書において、標的細胞及び/又は微生物)が、ナチュラルキラー、好中球、マクロファージ、及び/又は好酸球等のFc受容体を発現する非特異的細胞傷害性細胞(エフェクター細胞としても知られている)により排除される過程に関係する。そのような過程は、典型的には、望まれない要素と複合体化(すなわち、結合)している対象抗体との前記細胞Fc受容体の結合により惹起され、その結合が、次に、前記望まれない要素の溶解を引き起こす。
【００１７】
本明細書において、用語「抗体依存性補体活性化」又は「古典的補体経路」は、対象において、望まれない要素(本明細書において、標的細胞及び/又は微生物)が、膜侵襲複合体(MAC)(終末補体複合体又はTCCとしても知られている)により排除される過程に関係する。そのような過程は、典型的には、血漿中に存在するC1補体と、望まれない要素と複合体化(すなわち、結合)している対象抗体との結合により惹起され、その結合が、次に、前記C1補体を活性化し、分子カスケードを引き起こし、最終的には、望まれない要素の膜に大きな穴を形成し、それによりその溶解を生じる膜侵襲複合体の形成をもたらす。
【００１８】
本発明によるコンジュゲートが免疫原性であるかどうかを試験することは、当業者の能力の範囲内である。
【００１９】
実際、EBV B細胞抗原のii)対象の抗体との結合、及び本部分のi)標的細胞/微生物との結合それぞれは、特に、当技術分野における通常の技術を使用してEBV B細胞抗原結合アッセイ及び部分結合アッセイを設計することにより評価することができ、そのアッセイには、非限定的に、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、ウェスタンブロット、免疫蛍光アッセイ、フローサイトメトリ、又は表面プラズモン共鳴(The Immunoassay Handbook、Wildら、第4版、Elsevier社、2013)が挙げられる。
【００２０】
それ以外に、オプソニン食作用、ADCC、及び抗体依存性補体活性化は、特にChanら(2012)、Jianら(2011)、及びHarboeら(2011)による文献において記載されているように、当技術分野において通常使用される免疫学的アッセイにより評価することができる。以下の実施例は、標的と抗原の結合、加えて、オプソニン食作用、ADCC、及び抗体依存性補体活性化を評価するための詳細なプロトコールを更に提供する。
【００２１】
本明細書において、用語「コンジュゲート」は、本部分とEBV B細胞抗原がお互いに、直接的にか又は間接的にかのいずれかで結合又は連結されていることを意味する。そのような連結は、任意の生物学的又は生理化学的手段によって実施することができる。
【００２２】
そうは言うものの、本発明の関連において、そのような連結が、最も好ましくは、例えば、共有結合による、インビボ適用にとっての安定な連結であることは理解されているはずである。実際、コンジュゲートを対象へ送達するために使用される投与様式及び薬学的担体に依存して、いくつかの結合は、胃等のある特定の生理学的環境に耐えるのに他のものほど十分には適していない可能性がある。安定な連結は更に、オプソニン食作用、ADCC、及び/又は補体活性化が起こるのに重要であり、細胞及び/又は微生物をターゲティングする部分とEBV B細胞抗原が、例えば、前記部分及び/又は前記抗原の間の結合の切断のせいで、インビボでお互いに近傍にない場合には、これらは損なわれ得るためである。
【００２３】
したがって、前記標的結合性部分が前記エプスタイン・バーウイルスB細胞抗原と共有結合性に連結されている、本発明による免疫原性コンジュゲートを提供することが好ましい実施形態である。より好ましくは、前記標的結合性部分は、前記部分が、特にインビボで、前記抗原から切断不可能であるという条件付きで、前記エプスタイン・バーウイルスB細胞抗原と共有結合性に連結されている。例えば、前記部分と前記抗原を連結する共有結合は、プロテアーゼ切断部位等の切断部位を含まない。
【００２４】
より好ましくは、前記標的結合性部分は、前記エプスタイン・バーウイルスB細胞抗原と共有結合性に、かつ直接的に連結されている。言い換えれば、コンジュゲートのこれらの成分は、いかなるリンカーを介しても連結されていない。そのような場合、本発明による免疫原性コンジュゲートは、i)標的細胞及び/又は微生物と結合する部分;並びにii)エプスタイン・バーウイルス(EBV)B細胞抗原からなると言われる。例えば、コンジュゲートは、融合タンパク質を形成し得る。
【００２５】
或いは、前記標的結合性部分は、前記エプスタイン・バーウイルスB細胞抗原と共有結合性に、かつ間接的に連結され得る。言い換えれば、コンジュゲートのこれらの成分がリンカーを介して連結されている。実際、選択されたリンカーの性質に依存して、コンジュゲートの構造可動性、その安定性及び/又は可溶性が向上され得、両方の成分を連結するリンカーの存在が、コンジュゲートの免疫原性能力を変化させないことが本発明者らによって観察された。
【００２６】
本明細書において、「リンカー」又は「スペーサー」とは、2つの分子をお互いに連結
する能力がある、合成又は天然の化学的又は生物学的物質を意味する。化学的リンカーは当技術分野においてよく知られており、典型的には、同一又は非同一の反応基を有するホモ又はヘテロ二官能性であり得、かつ少なくとも1個の原子、好ましくは少なくとも1個の炭素原子を含み得る、様々な長さのポリマー鎖でできている。対照的に、生物学的リンカーは、典型的には、様々な長さの核酸及び/又はアミノ酸配列で構成され、少なくとも1個の核酸及び/又はアミノ酸を含む。上記で述べられているように、本明細書において、前記連結は、安定であり、すなわち、リンカーが、成分i)及びii)と共有結合しており、好ましくは、特にインビボで、(それ自体)切断不可能である。更により好ましくは、前記リンカーは、プロテアーゼ切断部位を含まない。そのようなリンカー、及び分子、特にタンパク質を連結する方法は、特にChenら(2013)による文献及びThermo Scientific: Crosslinking Technical Handbook (2015)に十分に記載されており、したがって、当業者により容易に選択され、設計され得る。リンカーはまた、典型的には2〜10個の構成する糖(例えば、単純な糖又は単糖)を含有する炭水化物ポリマーから選択することができる。
【００２７】
本発明による特に好ましい化学的リンカーには、非限定的に、二、三例を挙げると、アミン反応性リンカー(NHSエステル、イミドエステル)、カルボキシルからアミンへの反応性リンカー(カルボジイミド)、スルフィドリル反応性リンカー(マレイミド、チオスルホネート)、アルデヒド反応性リンカー(ヒドラジド、アリコキシアミン)、光反応性リンカー(ジアジリン、アリルアジド)、ヒドロキシル反応性リンカー(イソシアネート)、及びアジド反応性リンカー(ホスフィン)が挙げられる。
【００２８】
本発明による特に好ましい生物学的リンカーには、非限定的に、ポリプロリン(P)n(nは、典型的には、2から8の間に含まれる整数である)(配列番号1)、ポリグリシン(G)n(nは、典型的には、6から8の間に含まれる整数である)(配列番号2)、グリシン-セリンリンカー(GGGGS)n(nは、典型的には、2から10の間(配列番号84)、例えば、n=2〜6(配列番号85)又はn=2〜5(配列番号3)に含まれる整数である))、α-ヘリックス形成ペプチドリンカー、例えば、A(EAAAK)nA(nは、典型的には、2から5の間に含まれる整数である)(配列番号4)、及びプロリン-アラニンリンカーPAPAP(配列番号5)(Chenら、2013)が挙げられる。本発明による好ましい生物学的不可逆的リンカーはグリシン-セリンリンカー(GGGGS)n=2〜10(配列番号84)、例えば、(GGGGS)n=6(配列番号86)、(GGGGS)n=5(配列番号6)、又は有利には、(GGGGS)n=4(配列番号7)である。
【００２９】
本明細書において「標的結合性部分」又は「ターゲティング部分」と省略される、「標的細胞及び/又は微生物と結合する部分」とは、関心対象となる細胞及び/又は微生物に対する親和性を示し、したがって、それと、特にその表面上と結合する能力がある分子を意味する。関心対象となる標的に対する分子の親和性は、特にThe Immunoassay Handbook、Wildら、第4版、Elsevier社(2013)に記載されているように、解離定数Kd及び/又は会合定数Kaを測定することにより評価することができる。本発明の関連において、結合は、好ましくは、前記細胞及び/又は微生物に特異的であり、すなわち、部分は、別の標的と結合する能力がない(すなわち、他の標的に対する親和性がない、又はほとんどない)。
【００３０】
免疫原性コンジュゲートの部分は、タンパク質性又は非タンパク質性であり得る。
【００３１】
本明細書において、用語「タンパク質性の」、「ペプチド性の」、及び「ポリペプチド性の」は、天然に存在し、又は合成であり得、かつインビトロ及び/又はインビボで細胞において構造的及び/又は機能的役割を果たすことができる、長さ又は翻訳後修飾を問わず、ペプチド結合(-NHCO-)によって連結されたアミノ酸の配列を指す。
【００３２】
好ましい実施形態において、前記部分はリガンド結合性タンパク質である。
【００３３】
実際、リガンド結合性タンパク質は、それらがそれらの標的に対して高い親和性及び選択性を示し得るため、特に関心が高い。その上、無数のリガンド結合性タンパク質がすでに天然で入手可能であり、組換えテクノロジーにより容易に設計、製作、及び/又は産生することもできる。
【００３４】
本明細書において、用語「リガンド結合性タンパク質」は、分子(すなわち、リガンド)と結合する能力がある任意の天然又は合成タンパク質を包含する。言い換えれば、本発明の関連において、前記タンパク質は、標的細胞及び/又は微生物の表面上に発現するリガンドと結合する。
【００３５】
本発明による特に好ましいリガンド結合性タンパク質には、非限定的に、抗体、その結合断片、抗体模倣体、細胞表面受容体、細胞表面リガンド、及びそれらの任意の組合せが挙げられる。
【００３６】
リガンド結合性タンパク質の中で、抗体、その誘導体及び類似体が特に有利であり、それらが、とりわけ、それらの標的に対する非常に特異的な親和性(通常、ナノモーラー範囲)、長期安定性(最高数カ月間)を示し、通常の組換え操作技術により容易かつ迅速に作製することができるからである。
【００３７】
より正確には、本明細書において、用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、抗原を特異的に認識する能力があるタンパク質を指す。そのために、抗体のパラトープが、抗原のエピトープと相互作用する。抗体全体は、ジスルフィド結合でお互いに連結されて、Y形のタンパク質を形成する4つのポリペプチド  -  2つの完全長軽鎖及び2つの完全長重鎖からなる。各重鎖は、1つの可変(VH)ドメイン、続いて、定常ドメイン(CH1)、ヒンジ領域、及び2つ又は3つ以上の定常ドメイン(CH2、CH3、及び任意でCH4)を含有し、一方、各軽鎖は、1つの可変(VL)及び1つの定常(CL)ドメインを含有する。抗体は、その対応する抗原を「Y」の各先端に位置し、かつ各抗体に特異的であるいわゆる可変領域(それは、抗原結合部位を表す)を介して特異的に認識し、一方、抗体の免疫応答を引き起こす能力は、「Y」の基部に位置するFc領域により媒介される。哺乳類において、抗体は、IgA、IgD、IgE、IgM、及びIgGとして知られた5つの主要なアイソタイプへ分類され、IgGは4つのサブタイプ(ヒトにおいて、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4)へ更に分類される。本明細書において、用語「抗体」は、モノクローナル及びポリクローナル抗体(すなわち、B細胞の単一又は異なるクローンによって産生される)、単一特異性、二特異性、及び多特異性抗体(すなわち、1つ又は複数の抗原と結合する)、加えて、一価、二価、及び多価抗体(すなわち、1つ又は2つの抗原結合部位を有する)を包含することを意図される。本発明の目的のために、標的細胞及び/又は微生物と結合する抗体は、好ましくはモノクローナル及び単一特異性である。その上、前記抗体は、好ましくは、当技術分野において通常使用される方法によりヒト化される(Immunobiology、Janewayら、第5版、Garland publishing社、2001; Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic、Anら、Wiley editions、2009)。
【００３８】
本明細書において、抗体断片は、抗体全体より好ましく、それらが、それらのより小さいサイズのおかげで、より高い溶解性、組織浸透(特に、固形組織)、並びに熱及び/又は酵素に対する安定性を示し、加えて、より低い製造コストのためである。
【００３９】
用語「抗体断片」又は「抗体結合性断片」は、より具体的には、上記で定義されているような抗体の少なくとも抗原結合機能を保持する断片を指す。当技術分野においてよく知られた抗体断片の例には、非限定的に、Fab抗体、Fab'抗体、F(ab')2抗体、Fv抗体、一本鎖抗体(scFv)、重鎖抗体(HCAb)、特に単一ドメイン抗体(sdAb)、及びそれらの任意の組合せが挙げられる。
【００４０】
Fab(抗原に結合する断片(fragment antigen binding))抗体は、重鎖及び軽鎖のそれぞれの1つの可変領域、軽鎖の定常ドメイン、並びに重鎖の第1定常ドメイン(CH1)で構成され、抗原結合部位(パラトープ)を有する。Fab'は、それらが重鎖のCH1ドメインのC末端に少なくとも1つのシステイン残基を更に含む点でFabとは異なり、一方、F(ab')2は、ヒンジ領域のシステイン残基間のジスルフィド結合を有するFab'の2つの分子からなる。Fv(可変性断片)抗体は、重鎖及び軽鎖のそれぞれの1つの可変領域で構成され、一方、一本鎖Fv(scFv)抗体は、重鎖及び軽鎖のそれぞれの可変領域がペプチドリンカーによって共有結合性に接続されているFvからなる。最後に、ラクダ及びサメにおいて本来、同定された重鎖抗体(HCAb)に由来し、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、又はナノボディとしても知られている(及び、ラクダから産生される場合、VHH、サメ等軟骨魚から産生される場合、IgNAR又はVNARと省略される)単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖の可変領域だけに対応し、親抗体の最初の特異性及び結合親和性を含有する、今日まででは、最小の抗体断片である。
【００４１】
そのような断片を親抗体から、例えば、抗体全体をプロテアーゼで処理することにより(例えば、抗体全体のパパイン又はペプシンでの消化により、それぞれ、Fab又はF(ab')2を産生することができる)、又は遺伝子組換えテクノロジーによって(例えば、scFv又はVHHの分子設計及び精製により)、作製することは、当業者の能力の範囲内である。
【００４２】
上記で言及された抗体断片が、Fc領域を欠き得ることは更に留意されなければならない。以下の実施例に例証されているように、興味深いことに、それらのFc領域の欠損は、特にオプソニン食作用、ADCC、及び/又は抗体依存性補体活性化を通して、標的を排除する免疫応答をインビボで引き起こすコンジュゲートの能力を変化させない。
【００４３】
本発明による特に好ましい抗体は、単一ドメイン抗体である。
【００４４】
実際、単一ドメイン抗体は、他の抗体と比較してより優れた物理化学的性質を示し、その中には、それらのより小さいサイズ(15kDa)によるより速い組織浸透及び隠れたエピトープを認識する能力、単一遺伝子によりコードされる可能性(それらの操作を容易にし、かつscFvに関して観察されるように、部分的アンフォールディングのリスクを消失させる)、室温で保存されるそれらの能力、高い溶解性、及び低い免疫原性の可能性が挙げられる。
【００４５】
その上、以下の実施例に実証されているように、EBV B細胞抗原と連結された単一ドメイン抗体は、それらの完全な機能性及びそれらの標的に対する特異性を保持し、同時に、免疫原性コンジュゲートが、EBVに冒され、又は冒されたことがある対象のIgGにより高度に認識され、それにより、特にオプソニン食作用、ADCC、及び/又は抗体依存性補体活性化を通して、標的を排除する免疫応答をインビボで引き起こすことを可能にする。
【００４６】
本発明による代替のタンパク質性部分は、抗体模倣体により代表される。用語「抗体模倣体」、「抗体模倣体スキャフォールド」、「抗体様スキャフォールド」、「非抗体スキャフォールド」、及び「非免疫グロブリンスキャフォールド」は、抗体と構造的には関係しておらず、かつ一般的には、抗体全体より低い分子量を有する、人工的ペプチド又はタンパク質を指す。したがって、それらの小さいサイズのせいで、抗体模倣体は、抗体断片について上で記載されたものと類似した有利な性質を示す。本発明による適切な抗体模倣体の例には、非限定的に、ABD、アドヒロン(adhiron)、アドネクチン/モノボディ、アフィボディ、アフィリン(affilin)、アフィチン(affitin)/ナノフィチン(nanofitin)、アフィマー(affimer)、アルファボディ(alphabody)、アンチカリン(anticalin)、アルマジロリピートタンパク質、アトリマー(atrimer)/テトラネクチン(tetranectin)、アビマー(avimer)/マキシボディ(maxibody)、センチリン(centyrin)、DARPin、フィノマー(fynomer)、クニッツドメイン、オボディ(obody)/OB-フォールド(fold)、プロネクチン(pronectin)、レペボディ(repebody)、トランスボディ(transbody)、及びトリマーX(Skrlecら、2015)が挙げられる。
【００４７】
本発明による特に好ましい抗体は以下である:
-  赤血球のダッフィ抗原/ケモカイン受容体と結合する抗DARC抗体、及びより好ましくは、Smoralekら(2010)により記載されたもの等の抗DARC単一ドメイン抗体。最も好ましくは、本発明による前記抗DARC抗体は、配列番号8又は配列番号9、最も好ましくは配列番号9の配列を含み、又はそれからなる;
-  マラリア関連抗原VAR2CSAと結合する抗VAR2CSA抗体、及びより好ましくは、Nunesら(2014)により記載されたもの等の抗VAR2CSA単一ドメイン抗体。最も好ましくは、本発明による前記抗VAR2CSA抗体は、配列番号10又は配列番号11、最も好ましくは配列番号11の配列を含み、又はそれからなる;
-  典型的にはブルーストリパノソーマ(Trypanosoma brucei)等の感染性微生物の表面に発現する主要表面抗原である、変異表面糖タンパク質と結合する抗VSG抗体、及びより好ましくは、Conrathら(2005)により記載されたもの等の抗VSG単一ドメイン抗体。最も好ましくは、前記抗VSG抗体は、配列番号12又は配列番号13、最も好ましくは、配列番号13の配列を含み、又はそれからなる;並びに
-  典型的には癌細胞により過剰発現する表面抗原分類20と結合する抗CD20抗体、より好ましくは、Otzら(2009)、Liuら(1987)、又はOlafsenら(2009)により記載されたもの等の抗CD20 scFv。最も好ましくは、前記抗CD20抗体は、配列番号80の配列を含み、又はそれからなる。
【００４８】
本発明の関連において、抗VAR2CSA抗体を含む免疫原性コンジュゲートは、実際、マラリアを処置することを意図され、一方、抗VSG抗体を含むコンジュゲートは、トリパノソーマ症(睡眠病としても知られている)を処置することを意図され、抗CD20抗体を含むコンジュゲートは、癌を処置することを意図される。
【００４９】
或いは、細胞表面受容体は、本発明によるリガンド結合性タンパク質として使用することができる。例えば、標的細胞が、マラリアに感染した赤血球(すなわち、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)に感染した赤血球)であり、及び/又は標的微生物が熱帯熱マラリア原虫である場合、ターゲティング部分として使用される特に好ましい細胞表面受容体には、非限定的に、以下の内皮細胞受容体:プロテインC受容体(EPCR)(好ましくは配列番号14の配列を含み、又はそれかなる活性化プロテインC受容体又はAPC受容体としても知られている)、表面抗原分類36(CD36)、表面抗原分類31(CD31又はPECAM-1)、細胞間接着分子-1(ICAM-1)、及びE-セレクチンが挙げられる。実際、当技術分野においてよく知られているように、熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球の内皮細胞受容体への細胞接着は、重症マラリアと関連づけられる(Airdら、2014)。したがって、上記で言及された内皮細胞受容体のいずれかを含む本発明による免疫原性コンジュゲートは、マラリアに感染した赤血球と結合し、それらの排除を引き起こすだろう。
【００５０】
或いは、細胞表面リガンドは、本発明によるリガンド結合性タンパク質として使用することができる。例えば、標的細胞が癌細胞である場合、ターゲティング部分として使用される特に好ましい細胞表面リガンドには、非限定的に、コンドロイチン硫酸A(CSA)細胞表面受容体と結合することができる熱帯熱マラリア原虫由来VAR2CSA断片が挙げられる。実際、当技術分野においてよく知られているように、CSAは、典型的には、癌細胞によって過剰発現する。したがって、任意のVAR2CSA断片を含む本発明による免疫原性コンジュゲートは、癌細胞と結合し、それらの排除を引き起こすだろう。特に好ましいVAR2CSA断片は、Srivastavaら(2011)若しくはClausenら(2012)により記載されたもの等のCSA結合性領域を包含し、又はより好ましくは、配列番号82の配列を含み、若しくはそれからなる。
【００５１】
別の好ましい実施形態において、標的結合性部分は非タンパク質性である。実際、本発明による部分は、細胞の表面及び/又は微生物の表面と、例えば細胞表面受容体と結合することにより、結合する能力がある非タンパク質性リガンドであり得る。
【００５２】
本発明による特に好ましい非タンパク質性部分には、非限定的に、葉酸類等のビタミン(Zwickeら、2012)、ガラクトース誘導体等の炭水化物(Wuら、2002)、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、又はヘパラン硫酸等のグリコサミノグリカン(Vogtら、2003)、DNA又はRNAアプタマー等の低分子核酸(Estevezら、2010; Birchら、2015)、及び低分子化学物質が挙げられる。
【００５３】
特に、葉酸類は、多くの癌細胞の表面上に高度に発現する葉酸受容体と結合する能力があり、一方、いくつかのガラクトース誘導体は、肝細胞及び肝細胞腫細胞上に発現するアシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)と結合することができ、一方、コンドロイチン硫酸及びヘパラン硫酸は、熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球の表面と結合することができる。
【００５４】
DNA又はRNAアプタマー及び低分子化学物質に関して、それらは、試験管内進化法(SELEX)(Stoltenburgら、2007)等の当技術分野における通常の方法を使用して、標的細胞及び/又は微生物と特異的に結合するように、当業者により簡単に設計することができる。
【００５５】
とは言っても、タンパク質性及び非タンパク質性ターゲティング部分の上記の例は、実例を示すことのみを目的とし、したがって、限定的ではないことは、理解されるべきである。ゆえに、任意の他の適切なターゲティング部分が、それが、関心対象となる細胞及び/又は微生物と結合する能力を示す限り、本発明の関連において使用することができる。
【００５６】
上記で述べられているように、本発明の免疫原性コンジュゲートに使用される抗原は、エプスタイン・バーウイルスから単離されたB細胞抗原である。
【００５７】
本明細書において、用語「抗原」は、ある特定の状況下で、対象における投与による抗体の生成を促し、それにより免疫応答を発生させることができる任意の分子(例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、多糖等)を示す。分子レベルにおいて、抗原は、免疫系により、より具体的には、循環抗体、B細胞又はT細胞(B細胞受容体及びT細胞受容体は、独占的ではないが、膜結合型抗体で構成される)により認識される領域に対応する少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つのエピトープにより特徴づけられる。用語「B細胞抗原」は、B細胞応答、又は言い換えれば、前記抗原に対して特異的に方向づけられた抗体の、免疫系のB細胞による産生(体液性応答としても知られている)を誘発する能力がある上記で定義されているような抗原を指す。したがって、そのようなB細胞応答は、抗原が投与されている対象の血漿からIgG価等の抗体価を測定することにより検出することができる。B細胞抗原のエピトープは、抗体の対応するパラトープにより認識されるB-エピトープとして特徴づけられる。
【００５８】
本発明を目的として、B細胞抗原は、本発明のコンジュゲートが投与される対象において現存又は既存B細胞(すなわち、体液性)免疫応答を誘発することができる。すなわち、前記抗原は、対象のB細胞がすでに感作されている抗原である。より具体的には、前記B細胞抗原は、エプスタイン・バーウイルスを起源とし、それとして、「EBV B細胞抗原」又は「エプスタイン・バーウイルスB細胞抗原」と名付けられる。
【００５９】
「ヒトヘルペスウイルス-4」又は「HHV4」としても知られた「エプスタイン・バーウイルス」又は「EBV」は、ヘルペスウイルス科(Herpesviridae)に属するよく見られるウイルスであり、世界中のヒト集団の95%に感染し、二、三例を挙げると、感染性単核球症、バーキットリンパ腫、及びホジキンリンパ腫を含むいくつかの疾患に結びつけられる。一次感染後、EBVは、脱粒及び伝染を可能にする頻繁な軽いウイルス再活性化により特徴づけられる、生涯にわたる持続感染を確立する。一次EBV感染、加えてEBV再活性化は、高い抗体レベルを特徴とし、主に好細胞(cytophylic)型である。EBVは、EBV 1型及びEBV 2型である2つの主要なサブタイプへ分けることができる。感染した宿主におけるその複製中、前記ウイルスは、抗体が発生し得る無数の抗原(すなわち、B細胞抗原)を発現し、それらは、LYDMA(リンパ球決定膜抗原)、EBNA(エプスタイン・バー核内抗原)、EMA(早期膜抗原)、EA(早期抗原)、LMA(晩期膜抗原)、及びVCA(ウイルスキャプシド抗原)の抗原の中へ分類される。これらの抗原のクラスは、それら自体、複数の抗原を含む:例えば、EBNAクラスは、EBNA-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、及びEBNA-リーダータンパク質(EBNA-LP)を含み、一方、VCAクラスは、抗原のP18(すなわち、BFRF3)、P23(すなわち、BLRF2)、GP125(すなわち、BALF4)、P143(すなわち、BNRF1)、P150(すなわち、BcLF1)、及びP40(すなわち、BdRF1)を含む。
【００６０】
本発明者らは、エプスタイン・バーウイルスP18及びP23抗原、並びにより具体的には、前記抗原のC末端の近傍、及び/又はC末端内の特定の領域が、上記のような標的結合性部分にコンジュゲートされている場合、インビボで、免疫複合体の形成、並びにその後の、より具体的にはオプソニン食作用、ADCC、及び/又は抗体依存性補体活性化を通しての、前記標的の排除をもたらす体液性(すなわち、B細胞)免疫応答を引き起こすことができることを、本明細書において発見している。
【００６１】
したがって、好ましい実施形態において、前記エプスタイン・バーウイルスB細胞抗原は、配列番号15の配列のP18抗原、配列番号16の配列のP23抗原、それらの機能的バリアント及び機能的断片、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される;前記配列は、より具体的には、以下のように定義される:
-  配列番号15
【００６２】
【化１】
2019506372.tif 000002
【００６３】
式中、
X1はA又はSであり、
X2はA又はVであり、
X3はS又はNであり、
X4はA又は無しであり、
X5はS又は無しであり、及び
X6はQ又はHである;
並びに
-  配列番号16
【００６４】
【化２】
2019506372.tif 000003
【００６５】
式中、
X1はQ又はRであり、
X2はA又はVであり、
X3はP又はTであり、
X4はD又はEであり、
X5はM又はLであり、
X6はN又はKであり、
X7はT又はPであり、
X8はP、L、又はSであり、
X9はR、N、又は無しであり、
X10はE、D、又は無しであり、
X11はS、P、又は無しであり、
X12はN又はSであり、
N13はA、T、S、又はNであり、
X14はS又は無しであり、
X15はR又は無しであり、
X16はR又はCであり、及び
X17はA又はSである。
【００６６】
本発明による特に好ましいP18抗原には、非限定的に、配列番号17〜配列番号22の配列の抗原が挙げられ、一方、本発明による特に好ましいP23抗原には、非限定的に、配列番号23〜配列番号38の配列の抗原が挙げられる。
【００６７】
より好ましくは、本発明によるP18抗原は配列番号17の配列であり、及び/又は本発明によるP23抗原は配列番号23の配列である。
【００６８】
上記で述べられているように、本発明は、本明細書に記載されたP18及びP23抗原の機能的バリアント及び機能的断片を更に包含する。
【００６９】
この関連において、P18及びP23抗原内に含有されるシステイン残基が、標的結合性部分に含有されるチオール基とジスルフィド結合を形成し得、そのことが、以下の実施例に例証されているように、コンジュゲートの可溶性及び安定性を変化させ得る。したがって、全くチオール基を、すなわち、本明細書においては全くシステイン残基を含有しないように、機能的バリアント及び/又は機能的断片を設計することが望ましくあり得る。
【００７０】
したがって、上記で定義されているような免疫原性コンジュゲートを、前記部分が少なくとも1つのチオール基を含む場合、P18及び/又はP23抗原の機能的バリアント及び機能的断片が全くシステイン残基を含まない(すなわち、欠く)という条件で、提供することが本発明の好ましい実施形態である。前記部分がタンパク質性である場合には、チオール基はそれ自体、システイン残基に含有され得る。
【００７１】
そのようなEBV B細胞抗原の「機能的バリアント」は、B細胞応答、特にオプソニン食作用及び/又はADCC及び/又は補体活性化を誘発する能力を保持しながら、前記抗原の配列とは異なるアミノ酸配列を構造的に示す。バリアントは、天然に存在し得、又は天然に存在し得ない。天然に存在しないバリアントは、典型的には、変異誘発によって作製され、それとして、変異型バリアントと呼ぶことができる。後者は、参照のアミノ酸配列とバリアントのアミノ酸配列の間での置換、欠失、及び/又は付加等の保存的又は非保存的アミノ酸変異から生じることができる。機能的バリアントは、本明細書において、天然抗原のアミノ酸配列とのアラインメント後、少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む。これらのバリアントはまた、前記アミノ酸配列と90%、95%、96%、97%、98%、99%、及び99.999%配列同一性を有し得る。アミノ酸配列間の同一性は、典型的にはグローバル相同性アラインメントにより決定することができる。
【００７２】
システイン残基を全く欠く本発明による機能的バリアントは、好ましくは、配列番号39の配列のP18抗原機能的バリアント、及び配列番号40の配列のP23抗原機能的バリアントからなる群から選択され、前記配列がより具体的には、以下のように定義される:
-  配列番号39
【００７３】
【化３】
2019506372.tif 000004
【００７４】
式中、
X1はA又はSであり、
X2はA又はVであり、
X3はS又はNであり、
X4はA又は無しであり、
X5はS又は無しであり、及び
X6はQ又はHである;
並びに
-配列番号40
【００７５】
【化４】
2019506372.tif 000005
【００７６】
式中、
X1はQ又はRであり、
X2はA又はVであり、
X3はP又はTであり、
X4はD又はEであり、
X5はM又はLであり、
X6はN又はKであり、
X7はT又はPであり、
X8はP、L、又はSであり、
X9はR、N、又は無しであり、
X10はE、D、又は無しであり、
X11はS、P、又は無しであり、
X12はN又はSであり、
N13はA、T、S、又はNであり、
X14はS又は無しであり、
X15はR又は無しであり、
X16はR又はCであり、及び
X17はA又はSである。
【００７７】
本発明による特に好ましい機能的バリアントには、非限定的に、配列番号41の配列のP18抗原機能的バリアント、及び/又は配列番号42の配列のP23抗原機能的バリアントが挙げられる。
【００７８】
そのようなB細胞抗原の「機能的断片」は、前記抗原のアミノ酸配列の部分配列のみを含有し、その部分配列は、前記抗原のものと同じ生物学的機能、すなわち、抗体媒介性免疫応答、並びに特に、上記のように評価することができる、オプソニン食作用及び/又はADCC及び/又は補体活性化の誘発を示すための必須領域又はエピトープの全部を含む。これらの部分配列は、前記応答が保持されるとの条件で、様々な長さであり得る。
【００７９】
例えば、本発明による機能的断片は、前記抗原の少なくとも5個のアミノ酸残基、又は前記抗原の少なくとも10個のアミノ酸残基、又は前記抗原の少なくとも15個のアミノ酸残基、好ましくは、前記抗原の少なくとも20個のアミノ酸残基を含み得る。
【００８０】
好ましくは、本発明による機能的断片は、約5個のアミノ酸残基〜約150個のアミノ酸残基、より好ましくは、約10個のアミノ酸残基〜約150個のアミノ酸残基、更により好ましくは、約15個のアミノ酸残基〜約100個のアミノ酸残基、最も好ましくは約20個のアミノ酸残基〜約100個のアミノ酸残基を含む。
【００８１】
なお更に、好ましくは、本発明による機能的断片は、約5個の連続したアミノ酸残基〜約150個の連続したアミノ酸残基、より好ましくは、約10個の連続したアミノ酸残基〜約150個の連続したアミノ酸残基、更により好ましくは、約15個の連続したアミノ酸残基〜約100個の連続したアミノ酸残基、最も好ましくは約20個の連続したアミノ酸残基〜約100個の連続したアミノ酸残基を含む。
【００８２】
まだなお好ましくは、本発明による機能的断片は、配列番号43〜配列番号49及び配列番号75からなる群から選択される配列を少なくとも含み、若しくはそれからなるP18抗原機能的断片、並びに/又は配列番号50及び配列番号51からなる群から選択される配列を少なくとも含み、若しくはそれからなるP23抗原機能的断片であり、前記配列が、より具体的には、以下のように定義される:
-  配列番号43
【００８３】
【化５】
2019506372.tif 000006
【００８４】
式中、X6はQ又はHである;
-  配列番号44
【００８５】
【化６】
2019506372.tif 000007
【００８６】
式中、
X2はA又はVであり、
X3はS又はNであり、
X4はA又は無しであり、
X5はS又は無しであり、及び
X6はQ又はHである;
-  配列番号75
【００８７】
【化７】
2019506372.tif 000008
【００８８】
式中、
X2はA又はVであり、
X3はS又はNであり、
X4はA又は無しであり、
X5はS又は無しであり、及び
X6はQ又はHである;
-  配列番号45
【００８９】
【化８】
2019506372.tif 000009
【００９０】
式中、
X2はA又はVであり、
X3はS又はNであり、
X4はA又は無しであり、及び
X5はS又は無しである;
-  配列番号46
【００９１】
【化９】
2019506372.tif 000010
【００９２】
式中、
X2はA又はVであり、
X3はS又はNであり、
X4はA又は無しであり、及び
X5はS又は無しである;
-  配列番号47
【００９３】
【化１０】
2019506372.tif 000011
【００９４】
式中、
X2はA又はVであり、及び
X3はS又はNである;
-  配列番号48
SVSSSISX3LR
式中、X3はS又はNである;
-  配列番号49
【００９５】
【化１１】
2019506372.tif 000012
【００９６】
式中、
X2はA又はVであり、
X3はS又はNであり、
X4はA又は無しであり、
X5はS又は無しであり、及び
X6はQ又はHである;
-  配列番号50
【００９７】
【化１２】
2019506372.tif 000013
【００９８】
式中、
X5はM又はLであり、
X6はN又はKであり、
X7はT又はPであり、
X8はP、L、又はSであり、
X9はR、N、又は無しであり、
X10はE、D、又は無しであり、
X11はS、P、又は無しであり、
X12はN又はSであり、
N13はA、T、S、又はNであり、
X14はS又は無しであり、
X15はR又は無しであり、
X16はR又はCであり、及び
X17はA又はSである;
並びに
-配列番号51
【００９９】
【化１３】
2019506372.tif 000014
【０１００】
式中、
X4はD又はEであり、
X5はM又はLであり、
X6はN又はKであり、
X7はT又はPであり、
X8はP、L、又はSであり、
X9はR、N、又は無しであり、
X10はE、D、又は無しであり、
X11はS、P、又は無しであり、
X12はN又はSであり、
N13はA、T、S、又はNであり、
X14はS又は無しであり、
X15はR又は無しであり、
X16はR又はCであり、及び
X17はA又はSである。
【０１０１】
好ましい実施形態によれば、本発明による機能的断片は、配列番号43〜配列番号49からなる群から選択される配列を少なくとも含み、若しくはそれからなるP18抗原機能的断片、並びに/又は配列番号50及び配列番号51からなる群から選択される配列を少なくとも含み、若しくはそれからなるP23抗原機能的断片である。
【０１０２】
別の好ましい実施形態によれば、本発明による機能的断片は、配列番号43、配列番号75、及び配列番号45〜配列番号49からなる群から選択される配列を少なくとも含み、若しくはそれからなるP18抗原機能的断片、並びに/又は配列番号50及び配列番号51からなる群から選択される配列を少なくとも含み、若しくはそれからなるP23抗原機能的断片である。
【０１０３】
より好ましい実施形態によれば、本発明による機能的断片は、配列番号43、配列番号49、及び配列番号75からなる群から選択される配列を少なくとも含み、若しくはそれからなるP18抗原機能的断片、並びに/又は配列番号50及び配列番号51からなる群から選択される配列を少なくとも含み、若しくはそれからなるP23抗原機能的断片である。
【０１０４】
特に、P18抗原機能的断片の中での優先順に、少なくとも配列番号75の配列、続いて配列番号49、最後に配列番号43を含み、又はそれからなる断片を選択すべきである。言い換えれば、本発明による最も好ましいP18抗原機能的断片は、少なくとも配列番号75の配列を含み、又はそれからなるものである。実際、以下の実施例に実証されているように、この断片は、試験されたP18機能的抗原断片の中で最も良い免疫応答を示した。
【０１０５】
本発明による特に好ましい機能的断片の例には、非限定的に、配列番号52〜配列番号58及び配列番号76からなる群から選択される配列を含み、若しくはそれからなるP18抗原機能的断片、並びに/又は配列番号59及び配列番号60からなる群から選択される配列を含み、若しくはそれからなるP23抗原機能的断片が挙げられる。より好ましくは、前記機能的断片には、非限定的に、配列番号52〜配列番号58からなる群から選択される配列を含み、若しくはそれからなるP18抗原機能的断片、並びに/又は配列番号59及び配列番号60からなる群から選択される配列を含み、若しくはそれからなるP23抗原機能的断片が挙げられる。なお、更により好ましくは、前記機能的断片には、非限定的に、配列番号52、配列番号76、及び配列番号54〜配列番号58からなる群から選択される配列を含み、若しくはそれからなるP18抗原機能的断片、並びに/又は配列番号59及び配列番号60からなる群から選択される配列を含み、若しくはそれからなるP23抗原機能的断片が挙げられる。前記断片は、それらが、対象におけるIgG認識に必要な、及びしたがって、インビボで免疫複合体を生成して、関心対象となる標的を排除する免疫応答を引き起こすのに必要な最小エピトープを含有するため、本発明による最も好ましいEBV B細胞抗原である。
【０１０６】
より好ましい実施形態によれば、本発明による機能的断片の例は、配列番号52、配列番号58、及び配列番号76からなる群から選択される配列を含み、若しくはそれからなるP18抗原機能的断片、並びに/又は少なくとも、配列番号59及び配列番号60からなる群から選択される配列を含み、若しくはそれからなるP23抗原機能的断片である。
【０１０７】
特に、P18抗原機能的断片の中での優先順に、配列番号76の配列、続いて配列番号58、最後に配列番号52を含み、又はそれからなる断片を選択すべきである。言い換えれば、本発明による最も好ましいP18抗原機能的断片は、少なくとも配列番号76の配列を含み、又はそれからなるものである。実際、以下の実施例に実証されているように、この断片は、試験されたP18機能的抗原断片の中で最も良い免疫応答を示した。
【０１０８】
上記で述べられているように、上記断片は、好ましくは、システイン残基を全く欠き得る。
【０１０９】
重要なことには、コンジュゲートの結合性部分によりターゲティングされる細胞及び/又は微生物は、それを必要としている対象に存在する前記細胞及び/又は微生物を排除することを望むということであれば、任意の起源であり得る。
【０１１０】
したがって、好ましい実施形態において、標的細胞は、罹患細胞、好ましくは、癌細胞、又はウイルス、細菌、真菌、及び/若しくは寄生虫等の病原体に感染した細胞であり、並びに/或いは、標的微生物は、病原性微生物、好ましくは、ウイルス、細菌、真菌、及び/又は寄生虫である。
【０１１１】
以下の実施例で実証されているように、本発明者らは、より具体的には、マラリアを処置するために熱帯熱マラリア原虫をターゲティングすることを意図された2つの異なる免疫原性コンジュゲート、加えて、癌を処置するために、CD20発現又はCSA発現細胞をターゲティングすることを意図された2つの異なる免疫原性コンジュゲートを設計している。
【０１１２】
したがって、特に好ましい実施形態において、前記罹患細胞は、マラリアに感染した赤血球であり、及び/又は前記病原性微生物は熱帯熱マラリア原虫である。
【０１１３】
ターゲティングされる罹患細胞が、マラリアに感染した赤血球である場合には、前記部分は、好ましくは、前記細胞の表面上に発現したマラリア関連抗原、好ましくは、VAR2CSA又はVAR19抗原等の熱帯熱マラリア原虫赤血球膜タンパク質1(PfEMP1)バリアントと結合することができる。VAR19と結合する部分の例は、プロテインC受容体(EPCR、配列番号14を含み、又はそれからなり得る)である。
【０１１４】
別の特に好ましい実施形態において、前記罹患細胞は癌細胞である。
【０１１５】
罹患細胞が癌細胞である場合には、前記部分は、好ましくは、前記細胞の表面上に発現するCSA、又はB細胞起源からの癌(Bリンパ腫)の場合、前記細胞の表面上に発現する表面抗原分類20(CD20)と結合することができる。
【０１１６】
本発明によるコンジュゲートは、標的結合性部分の性質、及び/又は化学物質若しくはペプチドリンカーが前記部分をEBV B細胞抗原と連結するために使用されるかどうかに依存して異なり得る様々な方法により調製することができる。
【０１１７】
したがって、別の態様において、本発明は、
i)上記のような、標的細胞及び/又は微生物と結合する部分を;
ii)上記のようなエプスタイン・バーウイルス(EBV)B細胞抗原と
連結させる工程を含む、本発明のコンジュゲートを調製するための方法に関する。
【０１１８】
そのためには、前記連結は、好ましくは、本部分とEBV B細胞抗原が密接に近くに留まって、インビボで、特にオプソニン食作用、ADCC、及び/又は抗体依存性補体活性化を通して、標的を排除する免疫応答を達成するように、上記のように共有結合性である。
【０１１９】
より好ましくは、前記連結は、共有結合性であり、かつ、特にインビボで、切断不可能である。
【０１２０】
好ましい実施形態によれば、連結は化学的連結である。
【０１２１】
上記のようなリンカーの有無に関わらず、そのような連結を実施することは、当業者の能力の範囲内である。分子を連結する通常の方法は、特に、Bioconjugate techniques、Hermanson、第3版、Elsevier社(2013)、並びにChemistry of Protein and Nucleic Acid Cross-linking and Conjugation、Wong及びJameson、第2版、CRC Press社 (2011)に記載されている。
【０１２２】
例えば、本発明によるEBV B細胞抗原は、そのリジン残基(一級アミン基)を通して標的結合性部分と、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHSエステル)反応化学作用を使用することにより化学的に連結することができ、その反応化学作用は、そのコンジュゲートのインビボでの使用のための安定な結合の形成を提供することができる。
【０１２３】
とは言うものの、免疫原性コンジュゲートが完全なタンパク質性である場合、化学的連結が必ずしも好ましいとは限らない可能性があることを当業者は理解しているだろう。実際、そのような場合、適切な微生物内での組換え操作及び発現技術に直接的に頼ることができる(Molecular cloning: A laboratory manual、Sambrookら、第4版、Cold Spring Harbor Laboratory Press社 - Cold Spring Harbor、NY、USA、2012)。
【０１２４】
したがって、別の態様において、コンジュゲートが融合タンパク質である場合、本発明のコンジュゲートを調製するための方法は、好ましくは、以下の工程を含む:
a)本発明の免疫原性コンジュゲートをコードする核酸を発現するベクターで宿主細胞を形質転換する工程;
b)前記宿主細胞を培地中で増殖する工程;及び
c)前記培地から免疫原性コンジュゲートを回収する工程。
【０１２５】
好ましい実施形態によれば、前記方法は更に、d)工程c)で得られた免疫原性コンジュゲートを精製する工程を含む。
【０１２６】
そのようなコンジュゲートを調製するための完全な詳細は、下記で更に記載された実施例で提供される。
【０１２７】
前述と関連して、本発明は更に、本発明の免疫原性コンジュゲートをコードする核酸、前記核酸を含むベクター(例えば、プラスミド、細菌及びウイルスのベクター)、及び前記ベクターで形質転換された宿主細胞(原核細胞又は真核細胞)に関する。
【０１２８】
上記で定義されているような少なくとも1つの免疫原性コンジュゲート、及び少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供することは、本発明の更なる態様である。
【０１２９】
本明細書に使用される場合、用語「薬学的に許容される賦形剤」は、有効期間、適用部位における保持時間、消費者許容性等の組成物の性質を改善するために使用することができる、そのままでは薬理作用をもたない、不活性又は化学作用を起こさない、及びしたがって、無毒性の成分を意味する。それには、非限定的に、生理学的に適合性である、表面活性剤(陽イオン性、陰イオン性、又は中性);表面安定剤;保存剤、湿潤剤、又は乳化剤等の他の賦活剤;バッファー;塩溶液;分散媒;等張性吸収遅延剤等が挙げられる。本発明による好ましい賦形剤には、医薬品に一般的に使用される賦形剤のいずれか、例えば、結晶セルロース、ラクトース、デンプン、及びダイズ粉末が挙げられる。
【０１３０】
前記免疫原性コンジュゲートは、好ましくは、前記組成物中に、特に、オプソニン食作用、ADCC、及び/又は抗体依存性補体活性化を通して、インビボで関心対象となる標的を排除する免疫応答を引き起こすのに十分な量で、言い換えれば、有効量で存在する。送達するコンジュゲートの望ましい有効量を、当技術分野における日常的な方法により、例えば、様々な用量を標的細胞又は動物に投与する用量反応実験を実施することにより、決定することは、当業者の能力の範囲内である。
【０１３１】
この関連において、本発明の薬学的組成物は、好ましくは、約0.000001重量%〜約10重量%、好ましくは約0.000002重量%〜約5重量%、更により好ましくは約0.000005重量%〜約1重量%の、本発明による1つ又は複数の免疫原性コンジュゲート由来の組成を含む。
【０１３２】
本発明の薬学的組成物は、本発明の目的に適した任意の形をとり得る。例えば、前記組成物は、液体懸濁液、固体剤形(顆粒、丸剤、カプセル、又は錠剤)、又はペースト若しくはゲル等の、非経口、経口、又は局所的投与に適した形をとり得る。本明細書に使用される場合の非経口という用語は、皮下注射、静脈内注射、又は筋肉内注射を含む。
【０１３３】
薬学的組成物はまた、標的細胞及び/又は微生物の排除を促進することができる他の活性物質を含むことができる。
【０１３４】
好ましい実施形態によれば、前記薬学的組成物は更に、本コンジュゲートにより媒介される免疫応答を増強するために、少なくとも1つのアジュバントを含む。実際、あるアジュバントは、抗原と免疫系との間の相互作用に助力し、かつその相互作用の持続時間を長くする能力があり、一方、あるものは、適応応答を誘導するために自然免疫の細胞をリクルートし、活性化する能力がある。前者のカテゴリーに属するアジュバントには、非限定的に、ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸三カルシウム(calcium phosphate hydroxide)等のミネラル化合物;パラフィン油、デンプン油、フロイント完全/不完全アジュバント(FCA/FIA)、サポニン(例えば、植物キラヤ属(Quillaja)、ダイズ、ヒロハセネガ(Polygala senega)由来)等の油性乳濁液が挙げられる。後者のカテゴリーに属するアジュバントには、非限定的に、サイトカイン(例えば、GM-CSF、Il-1、IL-2、IL6、IL8、IL12、TNF-、IFN-等)の免疫賦活性複合体(ISCOM);熱ショックタンパク質(HSP)、病原体関連分子パターン(PAMP)、トレハロースジミコール酸(TDM)、ムラミルジペプチド(MDP)、リポ多糖(PLS)等の細菌産物が挙げられる。
【０１３５】
好ましい実施形態によれば、薬学的組成物は更に、標的細胞及び/又は微生物に対して方向づけられた少なくとも1つの治療剤を含み得る。したがって、前記治療剤は、好ましくは、望まれない細胞及び/又は微生物の存在によって特徴づけられる状態又は疾患を、それを必要としている対象において防止し、及び/又は処置することができる。例えば、治療剤は、抗癌剤、並びに抗ウイルス剤、抗生物質、抗真菌剤、及び/又は抗寄生虫剤であり得る。好ましくは、前記治療剤は抗マラリア剤又は抗癌剤である。
【０１３６】
意図された目的のために適切なアジュバント及び/又は治療剤を選択することは当業者の能力の範囲内である。
【０１３７】
アジュバント又は治療剤はまた、本発明の免疫原性コンジュゲートと関連して、同時にか、別個にか、又は逐次的にかのいずれかで投与することができる。コンジュゲート、アジュバント、及び/又は治療剤が別個的又は逐次的な様式で投与されるならば、それらは異なる医薬品形態で投与され得る。
【０１３８】
したがって、別の態様において、本発明は、それを必要としている対象における同時的、別個的、又は逐次的投与のための組み合わされた調製物としての、本発明の免疫原性コンジュゲート並びに上記のようなアジュバント及び/又は治療剤に関する。言い換えれば、本発明は、それを必要としている対象における同時的、別個的、又は逐次的投与のための本発明の免疫原性コンジュゲート並びにアジュバント及び/又は治療剤の併用を提案する。
【０１３９】
本発明の免疫原性コンジュゲート、又は前記コンジュゲートを含む薬学的組成物は、それを必要としている対象において望まれない細胞及び/又は微生物を特異的様式で排除する前記コンジュゲートの能力から恩恵を受けることができる医学的適用に使用され得る。
【０１４０】
したがって、別の態様において、本発明は、薬剤として使用される、上記のような免疫原性コンジュゲート又は薬学的組成物に関する。
【０１４１】
好ましくは、前記薬物は、それを必要としている対象において標的細胞及び/又は微生物のオプソニン食作用、及び/又はADCCによる溶解、及び/又は抗体依存性補体活性化による溶解を引き起こすことを目的とする。より好ましくは、前記薬物は、それを必要としている対象において標的細胞及び/又は微生物のオプソニン食作用を引き起こすことを目的とする。
【０１４２】
例えば、免疫原性コンジュゲート又は薬学的組成物は、特に癌細胞、又はウイルス、細菌、真菌、及び/若しくは寄生虫等の病原体に感染した細胞を含む罹患細胞を破壊するために、並びに/或いは細菌、真菌、及び/又は寄生虫等の病原性微生物を破壊するために使用することができる。
【０１４３】
したがって、好ましい実施形態において、本発明は、それを必要としている対象における癌、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、及び/又は寄生虫病の処置に使用される、本発明の免疫原性コンジュゲート又は薬学的組成物に関する。より正確には、本発明は、それを必要としている対象において癌、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、及び/又は寄生虫病を処置するための薬物を製造するための本発明の免疫原性コンジュゲート又は薬学的組成物の使用に関する。言い換えれば、本発明は、それを必要としている対象において癌、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、及び/又は寄生虫病を処置するための、本発明の免疫原性コンジュゲート又は薬学的組成物を前記対象に投与する工程を含む方法に関する。薬物の投与の方法は、当業者によく知られており、本明細書において更に詳述する必要はない。
【０１４４】
本発明による好ましい寄生虫病はマラリアである。本発明による別の好ましい疾患は癌である。
【０１４５】
本明細書に使用される場合、用語「処置すること」、「処置」、又は「処置する」は、とりわけ、欠乏、機能障害、疾患、又は、治療に干渉し、及び/若しくは治療に起因するものを含む他の有害な過程を防止し、寛解させ、抑制し、又は治癒させることを包含する。
【０１４６】
用語「対象」は、本明細書を通して、人間又は動物、好ましくは人間を指す。加えて、本発明の関連において、対象は、EBVに対する現存又は既存の体液性免疫応答を示している。
【０１４７】
本発明は、実施例を含む、実験の以下の詳細な説明を鑑みれば、より良く理解されるだろう。とは言うものの、この詳細な説明が限定的ではないこと、及び様々な改変、置換、省略、及び変化が、本発明の範囲から逸脱することなく、なされ得ることを当業者は認識しているだろう。
【実施例】
【０１４８】
1.  材料及び方法
1.1.  本発明による免疫原性コンジュゲートの構築
EBV(B95-8株)P18及びP23タンパク質をコードするBFRF3及びBLRF2のDNA配列を、大腸菌(E. coli)におけるそれらの発現を最大限にするためにコドン最適化した(Integrated DNA Technology社)。完全長のP18及びP23を再コード化されたヌクレオチド配列、加えてそれらの切り詰め型断片を、精製のためにC末端Hisタグ付きタンパク質を発現するように、pET28a plasmid(Novagen社)へクローニングした。
【０１４９】
いくつかのコンジュゲートにおいて、20アミノ酸(GGGGS)4(配列番号7)の可動性リンカーが、結合性部分(VHH、scFv、細胞表面受容体、又は細胞表面リガンド)とEBV-B細胞P18又はP23抗原との間に、その2つの異なるモジュール(すなわち、標的細胞及び/又は微生物と結合する部分、並びにEBV-B細胞抗原)の適切な機能的特質を維持し、可能なら、増強するために付加されている(Huら、2004; Chenら、2013)。その後、結合性部分の配列(EPCRを除く)を、改変型pET28aプラスミドのNcoI制限部位とNheI制限部位の間に挿入した。EPCRコンジュゲートについて、可溶性EPCRをコードする遺伝子(残基S18〜S210;Uniprot:Q9UNN8;配列番号14)を、ヒト肺内皮cDNAライブラリーからPCRにより増幅し、P18F3をコードする再コード化遺伝子断片と融合させた。EPCR-P18F3配列を、ヘキサHis C末端タグと共にpTT3ベクターへクローニングした。
【０１５０】
したがって、本研究において、以下のコンジュゲートを設計した:
-  リンカー有りの、DARCVHHとインフレームで融合したEBV P18完全長抗原;
-  リンカー有りの、DARCVHHとインフレームで融合したEBV P23完全長抗原;
-  リンカー有り及び無しの、DARCVHHとインフレームで融合したEBV P18変異型抗原;
-  リンカー有り及び無しの、DARCVHHとインフレームで融合したEBV P23変異型抗原;
-  リンカー無しの、DARCVHH、VAR2CSAVHH、VAR2CSA、hCD20scFv、又はEPCRとインフレームで融合した様々なEBV P18断片;及び
-  リンカー無しの、DARCVHHとインフレームで融合した様々なEBV P23断片。
【０１５１】
これらのリンカーは、以下のTable 1(表1)に要約することができる。
【０１５２】
【表１】
2019506372.tif 000015
【０１５３】
1.2.  コンジュゲートの発現及び精製
タンパク質発現について、細胞質内のジスルフィド結合形成を可能にするSHuffle(登録商標)大腸菌(New England Biolabs社)を、異なるpET28aに基づいたコンジュゲートで形質転換した。細菌培養物を、OD600nm 0.5において0.2mM IPTGで誘導し、タンパク質発現を20℃で16時間、行った。タンパク質精製について、細菌懸濁液を、氷上で解凍し、細胞懸濁液をEmulsiFlex-C5高圧ホモジナイザに通すことにより溶解を達成させた。可溶性タンパク質を、2段階精製過程に供した。Hisタグ付きタンパク質をまず、Ni-NTA Superflow (Qiagen社)において精製し、その後、Superdex 200 10/300 GLゲル濾過カラム(GE Healthcare社)に通過させた。
【０１５４】
特に、EPCRコンジュゲートについて、FreeStyle 293-F細胞(Invitrogen社)を、Freestyle 293無血清発現培地中で増殖させ、Invitrogen社の推奨に従って、それらに、EPCR-P18F3配列を含有するpTT3ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションから72時間後、細胞を遠心分離し、培養培地を採取した。0.22μmのフィルター上での濾過後、上清を、10kDaカットオフVivaflow 200システム(Vivasciences社)を使用して、5回、濃縮した。可溶性タンパク質を、2段階精製過程に供した。Hisタグ付きタンパク質をまず、Ni-NTA Superflow (Qiagen社)において精製し、その後、Superdex 200 10/300 GLゲル濾過カラム(GE Healthcare社)に通過させた。
【０１５５】
1.3.  表面プラズモン共鳴による親和性決定
コンジュゲートとそれらのそれぞれの分子標的との間の相互作用を、Biacore X100装置(GE Healthcare社)を使用して、表面プラズモン共鳴(SPR)により研究した。全ての実験を、HBSEPバッファー(GE Healthcare社)中、25℃で実施した。組換え完全長DARC325又はVAR2CSAタンパク質を、CM5チップ(GE Healthcare社)の分析Fc2チャネル上にアミン連結により、800RUの総負荷量まで固定化した。参照チャネルFc1を、同じ化学作用を使用して1M  エタノールアミン-HCl、pH8.5でブロッキングした。コンジュゲートを、コーティングされたチップの上に、希釈系列において30μL/分で注入した。コンジュゲートの最高濃度は1mMであり、10個の2倍段階希釈溶液もまた注入した。注入と注入の間に、チップ表面を、10mM HCl pH2の15mlの2回の注入で再生させた。特異的結合応答は、Fc2上の分析物により示された応答からFc1上の応答を引き算することにより、得られた。動態学的センサーグラム(kinetic sensorgram)を、製造会社のソフトウェアを使用して、グローバル1:1相互作用Langmuirモデルにフィッティングさせた。
【０１５６】
1.4.  コンジュゲートの免疫認識
ELISAプレート(Nunc社)を、PBS中1μg/mlで希釈されたコンジュゲートのウェルあたり100mlでコーティングし、4℃で一晩、インキュベートした。バックグラウンド測定のためにBSA(PBS中2%)をコーティングした。コーティング後、ウェルを、室温で1時間、PBS 2%BSAでブロッキングした。ブロッキング溶液を除去した後、PBS 2%BSA中のヒト血漿希釈溶液を加え、プレートを室温で1時間、インキュベートした。その後、ウェルを、150mlのPBS 0.05%Tween20(PBST)で3回洗浄した。ヒトIgG結合を、PBS 2%BSA中1:4000に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化(HRP)抗ヒトIgG(Jackson Immunoresearch社709-036-098)で検出し、室温で1時間、インキュベートした。PBSTで洗浄した後、プレートを、TMB(3,39,5,59-テトラメチルベンジジン)基質(Biorad社)のウェルあたり100mlで発色させ、吸光度を655nmで測定した。
【０１５７】
1.5.  コンジュゲートによる細胞表面認識
DARCVHH-EBVコンジュゲートの、赤血球の表面に発現する天然DARCを認識する能力、hCD20ScFv-P18F3コンジュゲートの、B細胞の表面に発現する天然CD20タンパク質を認識する能力、VAR2CSA-P18F3コンジュゲートの、癌細胞の表面に発現する天然グリコサミノグリカンコンドロイチン硫酸A(CSA)を認識する能力、及びEPCR-P18F3コンジュゲートの、熱帯熱マラリア原虫に感染した細胞の表面に発現する天然VAR19タンパク質を認識する能力を、フローサイトメトリにより試験した。
【０１５８】
そのために、DARC+赤血球(DARCVHH-EBVコンジュゲートについて)、CD20+ RAJI細胞(hCD20ScFv-P18F3コンジュゲートについて)、CSA+ RAJI細胞(VAR2CSA-P18F3コンジュゲートについて)、又はVAR19-発現赤血球(EPCR-P18F3コンジュゲートについて)を、PBS 2%BSA中のコンジュゲートの段階希釈溶液と、室温で1時間、インキュベートした。その後、細胞を、PBS 2%BSAで2回、洗浄し、PBS 2%BSA中に希釈された5mg/mlでのマウス抗ペンタHis IgG(Qiagen社、カタログ番号34660)と室温で30分間、インキュベートした。30分後、細胞を、PBS 2%BSAで2回、洗浄し、PEコンジュゲート化ヤギF(ab')2抗マウスIgG (Beckman Coulter社、IM0855、PBS 2%BSA中に1:100に希釈)と室温で30分間、インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、フローサイトメトリ分析に供した。データは、BD FACScanto IIフローサイトメーター(Becton-Dickinson社、San Jose、CA)を使用して取得し、分析は、FLOWJO 8.1ソフトウェア(Tree Star Inc.社)を使用して実施した。細胞片は、前方散乱及び側方散乱を使用する割り当てられたゲーティングにより、分析から排除した。
【０１５９】
試験されたコンジュゲートの、表面発現DARC(DARCVHH-EBVコンジュゲートについて)、RAJI細胞の表面(hCD20ScFv-P18F3及びVAR2CSA-P18F3コンジュゲートについて)、又は表面発現VAR19(EPCR-P18コンジュゲートについて)に対する反応性は、PEチャネルにおける蛍光強度の幾何平均(幾何平均PE)の増加によって反映された。
【０１６０】
1.6.  オプソニン化アッセイ
オプソニン化アッセイについて、DARC+赤血球を、一定の濃度の、PBS 2%BSA中のDARCVHH-EBVと、室温で1時間、インキュベートした。その後、細胞をPBS 2%BSAで2回、洗浄し、PBS 2%BSA中のヒト血漿の段階希釈溶液とインキュベートした。その後、細胞を、PBS 2%BSAで2回、洗浄し、PEコンジュゲート化ロバF(ab')2抗ヒトIgG (Jackson Immunoresearch社  709-116-098、PBS 2%BSA中1:100に希釈)と室温で30分間、インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、フローサイトメトリ分析に供した。
【０１６１】
一方、RAJI細胞を、PBS 2%BSA中のhCD20ScFv-P18F3又はVAR2CSA-P18F3コンジュゲートの段階希釈溶液と、室温で1時間、インキュベートした。その後、これらの細胞を、PBS 2%BSAで2回、洗浄し、一定のPBS 2%BSA中ヒト血漿希釈溶液(1:100)と、室温で1時間、インキュベートした。その後、前記細胞を、DARC+赤血球について適用されたのと同じプロトコールに従って洗浄した。
【０１６２】
1.7.  オプソニン食作用アッセイ
非接着性ヒト単球細胞株THP-1(Sigma社)を、10%(v/v)ウシ胎仔血清(Gibco社、Grand Island、NY)、2mM L-グルタミン、100ユニット/mlペニシリン、及び100ug/mlストレプトマイシンを追加したRPMI 1640培地(THP-1培養培地)を含む150cm2フラスコにおいて維持した。細胞を、3日間ごとに継代し、密度を1mlあたり2×105細胞未満に維持した;培養物を、5%(v/v)CO2及び95%(v/v)空気での加湿された37℃インキュベータ内に保持した。
【０１６３】
THP-1細胞を、6ウェルプレート内のウェルあたり2.5×105細胞で播種し、各ウェルの体積を、THP-1培地で3mlにした。マクロファージを得るために、前記細胞を、10ng/mlホルボール12-ミリステート13-アセテートを使用して、37℃で5%(v/v)CO2中、24時間、分化させた。上清及び接着していない細胞を、吸引により除去し、接着性マクロファージを、THP-1培地で2回、洗浄し、その後、ウェルを3mlの新鮮なTHP-1培地で満たした。これらを更に、48時間、インキュベートし、その後、食作用アッセイを実施した。
【０１６４】
赤血球を、製造会社の使用説明書に従ってCellTrace(商標)CFSEで標識し、上記のようにコンジュゲート及びヒト血漿でオプソニン化した。標識され、かつオプソニン化された赤血球を、THP-1由来マクロファージと3時間、共インキュベートした。赤血球をウェルから洗い出し、その後、マクロファージをトリプシン処理により脱離させ、フローサイトメトリ分析に供した。CFSE陽性THP-1細胞を、少なくとも1個の赤血球を貪食している細胞とみなした。
【０１６５】
1.8.  補体活性化アッセイ
補体活性化アッセイについて、RAJI細胞を、PBS 1%BSA中5μg/mlのhCD20ScFv又はhCD20ScFv-P18F3と、4℃で1時間、インキュベートした。その後、その細胞を、PBS 1%BSAで2回、洗浄し、その活性型の、又は熱処理(56℃で45分間)によりあらかじめ不活化された、10%EBV+ヒト血漿と、37℃、5% CO2で1時間、インキュベートした。その後、その細胞を、PBSで3回、洗浄し、室温で15分間、4% PFAで固定した。その後、その細胞を、PBS 5%BSAで3回、洗浄し、室温で1時間、PBS 5%BSAでブロッキングし、その後、マウスモノクローナル抗体抗C5b9(Abeam社  ab66768、PBS 1%BSA中1:100)とインキュベートした。その後、その細胞を、PBS 1%BSAで3回、洗浄し、PEコンジュゲート化ヤギF(ab')2抗マウスIgG(Beckman Coulter社、IM0855、PBS 1%BSA中1:100希釈)と、室温で30分間、インキュベートした。細胞を、PBSで洗浄し、フローサイトメトリ分析に供した。データは、BD FACScanto IIフローサイトメーター(Becton-Dickinson社、San Jose、CA)を使用して取得し、分析は、FLOWJO 8.1ソフトウェア(Tree Star Inc.社)を使用して実施した。細胞片は、前方散乱及び側方散乱を使用する割り当てられたゲーティングにより、分析から排除した。RAJI細胞の表面でのC5-b9沈着は、PEチャネルにおける蛍光強度の増加により反映された。
【０１６６】
1.9.  抗体依存性細胞傷害(ADCC)アッセイ
ADCCアッセイについて、RAJI細胞を、37℃、5% CO2において、10% FCS及び1×抗真菌性抗生物質溶液(Gibco社)を追加したRPMI(Glutamax(商標)-I)中に2.5×105〜106細胞/mlの密度で維持した。ADCCアッセイを、ADCCレポーターバイオアッセイ(Promega社)を使用して、製造会社の使用説明書に従い、本発明者らの系に適合するようにわずかに改変を加えて、実施した。300000個のRAJI細胞を、まず、PBS 2%BSAで2回、洗浄し、飽和濃度のコンジュゲート(25μg/ml hCD20ScFv、hCD20ScFv-P18F3又は50μg/ml VAR2CSA、VAR2CSA-P18F3)と、4℃で1時間、インキュベートした。その後、細胞を、PBS 2%BSAで1回、洗浄し、12500個の細胞(25μl中)を、白色の平底96ウェルプレートのウェルへ入れた。EBV+ヒト血漿を、56℃で45分間、不活化/補体除去した。ADCCアッセイ培地(RPMI 1640、4%低IgG FCS)中に段階希釈溶液を調製し、25μlの希釈された血漿を、RAJI標的細胞と共にウェルへ入れた。エフェクター細胞を解凍し、75000個の細胞(25μl中)をすぐに、ウェルへ分配した。プレートを37℃、5% CO2でインキュベートした。6時間のインキュベーション後、プレートをインキュベータから取り出し、室温で15分間、放置し、その後、75μlのBio-Glo(商標)試薬を各ウェルへ添加した。発光を、VICTORプレートリーダープラットフォーム(PerkinElmer社)を使用して測定した。
【０１６７】
2.  結果
2.1.  コンジュゲートの発現及び精製
コンジュゲートDARCVHH-EBV P18及びDARCVHH-EBV P23(EBV P18又はEBV P23抗原、それぞれに融合した抗DARCVHH、前記抗原のそれぞれは、C末端にポリヒスチジン配列でタグ付けされている)の天然条件におけるIMAC(固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ)精製は成功しなかった(図1A〜図1B)。実際、C末端Hisタグは、変性条件下でのIMACによるこれらのコンジュゲートの精製の成功(図1C〜図1D)により実証されているように、天然条件においてはアクセス不可能であった。N末端Hisタグ付き融合体を精製する試みは、より良い結果をもたらさなかった。
【０１６８】
EBV P18 Cys(アミノ酸位置56)及びEBV P23 Cys(アミノ酸位置46)をセリンに置換する部位特異的変異誘発を実施した。新しいコンジュゲートDARCVHH-EBV P18(C56S)*及びDARC-EBV P23(C46S)*を、IMACにより成功裏に精製した(図2)。とは言うものの、その精製過程(クロマトグラフィ)の第2段階により、その融合タンパク質の大部分が高塩バッファーにおいてさえも凝集物を形成しやすいことが明らかにされた(図3A及び図4A)。
【０１６９】
この問題を克服するために、より短いバリアントpf P18及びP23を設計した。生じた融合タンパク質DARCVHH-EBV P18F2、DARCVHH-EBV P18F3、DARCVHH-EBV P18F4は、DARCVHH-EBV P18(C56S)*と比較してかなり溶解性が増し、ゲル濾過精製段階中にほとんど凝集物を形成しなかった(図3B〜図3E)。DARCVHH-EBV P23(C46S)*溶解性を向上させるために同じようなアプローチを実施した(データ未呈示)。
【０１７０】
概念実証を別のコンジュゲーション系に拡大するために、熱帯熱マラリア原虫に感染した胎盤起源の赤血球の表面に存在する熱帯熱マラリア原虫タンパク質を認識することができるVHH配列(VAR2CSAVHH)もまた、EBV P18及びEBV P23抗原と融合させた。DARCVHHコンジュゲートと同様に、EBVP18及びEBV P23のN末端クラスターの除去は、溶液中のコンジュゲート溶解性及び安定性を劇的に向上させた。作製された構築物の全てのゲル電気泳動分析により、本研究に使用された組換えタンパク質の高い純度が明らかにされた(図4B)。
【０１７１】
DARCVHH-EBV P18抗原コンジュゲート及びVAR2CSAVHH-EBV P18抗原コンジュゲートの、それらのそれぞれの分子標的に対する親和性を、表面プラズモン共鳴によって評価した。コンジュゲートのそれらの標的に対する特異性及び親和性は、VHH単独の親和性と比較して有意には変化しなかった(図5)。
【０１７２】
本発明の概念実証は、3つの他のコンジュゲーション系に関して更に確認された:
・EBV P18F3抗原と融合したCD20(典型的には癌細胞により過剰発現しているマーカー)を認識することができるscFv配列、その精製は成功した(図10);及び
・EBV P18F3抗原と融合したEPCR受容体、その精製もまた成功した(図16);
・EBV P18F3抗原と融合したVARバリアントタンパク質、その精製もまた成功した(図10)。
【０１７３】
2.2.  コンジュゲートの免疫認識
コンジュゲートの免疫認識を反映する免疫グロブリンG価を、EBV感染が陽性である12人の健康なドナー由来の血漿の段階希釈溶液により決定した。DARCVHH-EBV P18F2が、前記血漿に存在するIgGにより高度に認識された(Table 2(表2)及び図6A)。同様のデータが、コンジュゲートDARCVHH-EBV P18(C56S)*及びDARCVHH-EBV P23(C46S)*に関して得られた。
【０１７４】
【表２】
2019506372.tif 000016
【０１７５】
22個の血漿試料(希釈度1/200)に関して実施された比較による免疫認識研究は、P18のC末端部分が免疫優性エピトープを有することを示した。EBV P18F2を含むコンジュゲートとEBV P18F3を含むコンジュゲートの間に、認識における有意な差は観察されなかった。
【０１７６】
2.3.  コンジュゲートの細胞表面認識
コンジュゲートによる天然標的の認識を、フローサイトメトリにより評価した。
【０１７７】
DARCVHH-EBV P18F2は、FY+(DARC+)赤血球の表面を用量依存的様式でコーティングすることができた(図7)。250ng未満のDARCVHH-EBV P18F2は、1,000,000個の赤血球上に存在するVHH特異的DARCエピトープの全てを飽和するのに十分であった。同じような様式で、VAR2CSAVHH-EBV P18F2は、表面にVAR2CSAを発現する熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球をコーティングすることができた。
【０１７８】
hCD20ScFv-P18F3コンジュゲートは、CD20+ RAJI細胞をコーティングすることができた(図11)。
【０１７９】
VAR2CSA-P18F3コンジュゲートは、CSA+ RAJI細胞をコーティングすることができた(図11)。
【０１８０】
EPCR-P18F3コンジュゲートは、VAR19発現赤血球の表面を用量依存的様式でコーティングすることができた(図17)。
【０１８１】
2.4.  前記細胞をターゲティングするコンジュゲートによる赤血球オプソニン化
更に、細胞に結合したコンジュゲートの、EBV+ドナーの血漿試料とのインキュベーションは、FY+(DARC+)赤血球オプソニン化、すなわち、細胞のドナー血漿IgGでのコーティングをもたらした(図8A)。これはまた、FY+赤血球のDARCVHH-EBV P18F3及びヒト血漿(EBV陽性)との連続的インキュベーションが細胞凝集をもたらす凝集アッセイにおいても例証された(図8B)。
【０１８２】
2.5.  オプソニン食作用アッセイ
食作用アッセイにより、DARCVHH-EBV P18及びDARCVHH-EBV P23抗原融合体での処理による、赤血球のTHP1単球によるオプソニン食作用の増加が明らかにされた。実際、コンジュゲートDARCVHH-EBV P18(C56S)*は、FY+赤血球のTHP1由来マクロファージによるオプソニン食作用を媒介した(図9A)。DARCVHH-EBV P18F3(図9B)での処理、及びまたEPCR-P18F3コンジュゲートでの処理(VAR19を発現する感染した赤血球を使用する)(図18)で、同じような観察がなされた。
【０１８３】
細胞に結合したhCD20ScFv-P18F3及びVAR2CSA-P18F3コンジュゲートの、EBV+ドナーの血漿試料とのインキュベーションもまた、RAJIオプソニン化、すなわち、細胞のドナー血漿IgGでのコーティングをもたらした(図12及び図13)。
【０１８４】
興味深いことに、FY+赤血球の、異なるEBV P18断片と融合したDARCVHHでの処理により、前記断片のIgGをリクルートする能力と、誘発された細胞応答の強度との間の関連が明らかにされた(図9C)。特に、図9Cの結果は、(i)細胞応答(食作用)と、オプソニン化に使用される血漿由来の抗体価(抗P18)との間の相関、及び(ii)異なるP18断片の間で異なるP18に対する血漿反応性(P18F3抗原がより良い応答を示す)を示した。
【０１８５】
これらの結果は、確定された標的細胞の免疫クリアランスが、結合性部分-EBV P18又は結合性部分-EBV P23融合タンパク質での処理後に達成され得ることを実証する最初の有望なインビトロデータである。
【０１８６】
2.6.  補体活性化
補体活性化アッセイにより、hCD20ScFv-P18F3コンジュゲートでの処理による補体カスケードの活性化(古典的抗体依存性経路の可能性が最も高い)の増加が明らかにされた。これは、標的細胞溶解を生じるだろう細胞表面での膜侵襲複合体の形成により例証されている(図14)。
【０１８７】
2.7. ADCC
ADCCアッセイにより、hCD20ScFv-P18F3か又はVAR2CSA-P18F3のいずれかで前処理された標的細胞(RAJI)によるコンピテントエフェクター細胞におけるNFAT経路の活性化の増加が明らかにされた。これは、EBV+血漿の存在下で生じる標的細胞のオプソニン化が、エフェクター細胞上の表面Fc受容体の会合、及びその後の、最終的に標的細胞溶解をもたらすだろう細胞内経路の活性化へ導いていることを反映する(図15)。
【０１８８】
3.  結論
免疫療法は、癌細胞、感染性疾患、及びアルツハイマー病に対して使用されている。興味深いことに、最近の研究により、マクロファージが、モノクローナル抗体治療後、依存性FcγRI及びFcγRIV食作用を通して循環腫瘍細胞を排除することが示された。非限定的に、Fab抗体、Fab'抗体、F(ab')2抗体、Fv抗体、scFv抗体、ラクダ科単一ドメイン抗体(VHH)、及びサメ単一ドメイン抗体(VNAR)を含む、「抗体断片」又は「抗体結合性断片」又は代替の「タンパク質性及び非タンパク質性」部分により、細胞媒介性Fcエフェクター機能は作動されない。Fc鎖をそれらのターゲティング部分と融合することは一つの可能性である。しかしながら、Fc鎖を付加することは、結果として、組換え発現の困難さ、加えて、小さい空洞及び間隙に存在するエピトープへのアクセス性の減少を生じるだろう。
【０１８９】
本発明は、好ましくない標的細胞及び/又は微生物に対するEBV現存(又は既存)免疫応答を再命令する能力がある新しく、かつ革新的な免疫原性構築物を用いて、これらの問題を克服することを提案する。EBV抗原と融合したターゲティング部分が、確定された標的のオプソニン化、及び免疫複合体の形成、及びその後の前記標的のクリアランスを促進する能力があるという概念実証を提供するために、本明細書において、3つのインビトロモデルを使用した。第1のモデルにおいて、赤血球の表面に発現するタンパク質をターゲティングする単一ドメイン抗体(DARCVHH)を、2つの異なるEBV抗原(EBV P18又はEBV P23のいずれか)にコンジュゲートした。第2のモデルにおいて、単一ドメイン抗体(VAR2CSAVHH)及び抗体に由来しないタンパク質性結合性部分(EPCR)(どちらも、熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球の表面に発現するマラリアタンパク質(それぞれ、VAR2CSAPfEMP1及びVAR19PfEMP1)をターゲティングする)をEBV P18にコンジュゲートした。第3のモデルにおいて、表面抗原分類CD20へ方向づけられたscFv抗体(hCD20ScFv)及び抗体に由来しないタンパク質性結合性部分(VAR2CSA)(それぞれ、(Bリンパ腫を含む)B細胞の表面に存在するCD20分子、又は癌細胞の表面に過剰発現するCSAをターゲティングする)を、EBV P18にコンジュゲートした。
【０１９０】
本研究は、設計されたコンジュゲートの、標的細胞、それぞれ、赤血球、熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球、癌細胞をオプソニン化し、免疫エフェクター機構、すなわち、オプソニン食作用、ADCC、及びCDCによるそれらのクリアランスを促進する能力を実証する。
【０１９１】
EBV P18及びEBV P23のN末端領域が、タンパク質溶解性及び安定性をかなり減少させる、タンパク質発現にとっての障壁であることを突き止めた。EBV P18及びEBV P23のN末端セグメントの欠失は、コンジュゲートの可溶性発現及び精製を可能にした(図1〜図4)。VHHとEBV抗原との間のタンパク質リンカーの存在は、正しいタンパク質産生にとって必須ではなかった。
【０１９２】
重要なことには、表面プラズモン共鳴実験により、結合性部分(DARCVHH及びVAR2CSAVHH)のそれらの確定された標的に対する親和性及び特異性が、それらのEBV抗原との融合により影響されなかったことが示された(図5)。
【０１９３】
EBV陽性個体由来の血漿に関して実施された免疫認識実験により、EBV P18か又はEBV P23のいずれかを含むコンジュゲートが、循環IgGにより高度に認識されることが明らかにされた(図6)。F4は、IgGをリクルートするのにまだ効率的であったが、EBV P18断片EBV P18F3(8.4kDa)を含むコンジュゲートが、最大IgG反応性を示すEBV P18の最も短い断片であるように思われた。EBV P18F3は、多様な結合性部分と融合するのに十分なEBV抗原と思われ、様々な免疫エフェクターの標的部位へのリクルートメントを可能にするだろう。これは、i)DARCVHH-EBV P18F3が、EBV+ヒト血漿の存在下で赤血球の凝集を媒介することが示された凝集アッセイ(図8)、及びii)EPCR-EBV P18F3、hCD20ScFv-EBV P18F3、及びVAR2CSA-EBV P18F3が、感染した赤血球の表面へ(EPCR-EBV P18F3について)、及びRAJI癌細胞の表面へ(hCD20ScFv-EBV P18F3及びVAR2CSA-EBV P18F3について)血漿IgGをリクルートし、免疫複合体の形成へと導くことが示されたオプソニン化アッセイ(図12、図13、及び図17)により、更に確認された。
【０１９４】
大きな関心事として、コンジュゲートにより媒介される免疫複合体の形成は、免疫エフェクター応答をもたらした。DARC+赤血球のDARCVHH-EBV P18F3処理は、マクロファージによるそれらの排除を促進した(図9)。EBV断片免疫認識の結果と一致して、DARCVHH-EBV P18F3は、DARCVHH-EBV P18F4よりオプソニン食作用を誘導することがより強力であった(図9)。
【０１９５】
更に、標的細胞のP18F3コンジュゲートでの処理はまた、i)コンピテントエフェクター細胞によるADCC(図15)及びii)補体カスケードの活性化(図15)及び標的細胞の表面でのMAC(膜侵襲複合体)の形成をもたらした。
【０１９６】
総合すれば、これらの結果は、DARCVHH-EBV P18F3、EPCR-EBV P18F3、hCD20ScFv-EBV P18F3、及びVAR2CSA-EBV P18F3等の免疫原性構築物が、特異的標的に対する現存のEBV免疫応答を再命令することができ、連続的に、免疫複合体の形成、並びにその後の、オプソニン食作用、ADCC、及びCDC等の免疫エフェクター機構のリクルートメントへと導き、それが最終的に標的排除をもたらすことを実証している。
【０１９７】
安定で、製造するのが容易で、かつ標的エレメントをオプソニン化するのに非常に効率的なその種の作用物質は、単独でか、又は病原体及び癌と戦う既存の治療と併用してかのいずれかで、臨床的介入に極めて有用である。
【０１９８】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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