(57)【要約】本発明の技術は概して、パクリタキセル、ラパマイシン、セルメチニブ、及び他の抗がん薬のオリゴ乳酸複合体、このような複合体を含有するミセル組成物、ならびにこのような組成物を調製及び使用して、種々のがんを治療する方法に関する。具体的には、オリゴ乳酸が２〜２４個の乳酸サブユニットを含み、エステル結合を通じてパクリタキセルまたはパクリタキセル誘導体の７−ヒドロキシル、ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体の４０−ヒドロキシル、及びセルメチニブまたはセルメチニブ誘導体の２’−ヒドロキシルの酸素に付着するオリゴ乳酸複合体が提供される。水と、ポリ乳酸含有ポリマー及びオリゴ乳酸複合体を含むミセルとを含む組成物は容易に調製され得る。がん細胞を抑制または殺滅する方法、ならびにパクリタキセル、ラパマイシン、及び／またはセルメチニブ有効がんを治療する方法も提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
パクリタキセルまたはパクリタキセル誘導体の７−オリゴ乳酸複合体であって、前記オリゴ乳酸が、２〜２４個の乳酸サブユニットを含み、エステル結合を通じて、前記パクリタキセルまたはパクリタキセル誘導体の７−ヒドロキシルの酸素へ付着する、パクリタキセルまたはパクリタキセル誘導体の７−オリゴ乳酸複合体。
【請求項２】
前記オリゴ乳酸が４〜２０個の乳酸サブユニットを含む、請求項１に記載の７−オリゴ乳酸複合体。
【請求項３】
前記オリゴ乳酸が６〜１８個の乳酸サブユニットを含む、請求項１または請求項２に記載の７−オリゴ乳酸複合体。
【請求項４】
パクリタキセルまたはドセタキセルを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の７−オリゴ乳酸複合体。
【請求項５】
ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体の４０−オリゴ乳酸複合体であって、前記オリゴ乳酸が、２〜２４個の乳酸サブユニットを含み、エステル結合を通じて、前記ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体の４０−ヒドロキシルの酸素へ付着する、ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体の４０−オリゴ乳酸複合体。
【請求項６】
前記オリゴ乳酸が４〜２０個の乳酸サブユニットを含む、請求項５に記載の４０−オリゴ乳酸複合体。
【請求項７】
前記オリゴ乳酸が６〜１８個の乳酸サブユニットを含む、請求項５または請求項６に記載の４０−オリゴ乳酸複合体。
【請求項８】
ラパマイシンまたはエベロリムスを含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の４０−オリゴ乳酸複合体。
【請求項９】
セルメチニブまたはセルメチニブ誘導体の２’−オリゴ乳酸複合体であって、前記オリゴ乳酸が、２〜２４個の乳酸サブユニットを含み、エステル結合を通じて、前記セルメチニブまたはセルメチニブ誘導体の２’−ヒドロキシルの酸素へ付着する、セルメチニブまたはセルメチニブ誘導体の２’−オリゴ乳酸複合体。
【請求項１０】
前記オリゴ乳酸が４〜２０個の乳酸サブユニットを含む、請求項９に記載の２’−オリゴ乳酸複合体。
【請求項１１】
前記オリゴ乳酸が６〜１８個の乳酸サブユニットを含む、請求項９または請求項１０に記載の２’−オリゴ乳酸複合体。
【請求項１２】
セルメチニブ、ビニメチニブ、またはＧＤＣ−０６２３を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の２’−オリゴ乳酸複合体。
【請求項１３】
水と、ポリ乳酸含有ポリマーならびに、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の７−オリゴ乳酸複合体、４０−オリゴ乳酸複合体、及び２’−オリゴ乳酸複合体のうちの１つ以上を含むミセルと、を含む、組成物。
【請求項１４】
前記ミセルの質量に対して、前記７−オリゴ乳酸複合体の負荷が約５重量％〜約６０重量％であり、前記４０−オリゴ乳酸複合体の負荷が約５重量％〜約５０重量％であり、及び／または前記２’−オリゴ乳酸複合体の負荷が約２重量％〜約３０重量％である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物中の前記水の体積に対して、前記７−オリゴ乳酸複合体の濃度が約０．６ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬであり、前記４０−オリゴ乳酸複合体の濃度が約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬであり、及び／または前記２’−オリゴ乳酸複合体の濃度が約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬである、請求項１３または請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記７−オリゴ乳酸複合体と、前記４０−オリゴ乳酸複合体と、前記２’−オリゴ乳酸複合体と、を含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物の重量に基づき、約２重量％未満のエタノール、ジメチルスルホキシド、ひまし油、及びひまし油誘導体を含む、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ミセルがポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ乳酸（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ）を含む、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡのポリ（エチレングリコール）ブロックの分子量が約１，０００〜約３５，０００ｇ／モルであり、前記ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡのポリ（乳酸）ブロックの分子量が約１，０００〜約１５，０００ｇ／モルである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ポリ（エチレングリコール）ブロックの分子量が約１，５００〜約１４，０００ｇ／モルであり、前記ポリ（乳酸）ブロックの分子量が約１，５００〜約７，０００ｇ／モルである、請求項１８または１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
水と、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ及び、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の７−オリゴ乳酸複合体、４０−オリゴ乳酸複合体、２’−オリゴ乳酸複合体、またはこれらのうちの２つ以上の組み合わせを含むミセルと、を含む組成物であって、
前記ミセルの質量に対して、前記ミセル中の前記７−オリゴ乳酸複合体の負荷が約１重量％〜約６０重量％であり、前記４０−オリゴ乳酸複合体の負荷が約１重量％〜約５０重量％であり、前記２’−オリゴ乳酸複合体の負荷が約１重量％〜約３０重量％であり、またはこれらのうちの２つ以上の組み合わせであり、かつ
前記ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡの前記ポリ（エチレングリコール）ブロックの分子量が約１，５００〜約１４，０００ｇ／モルであり、前記ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡの前記ポリ（乳酸）ブロックの分子量が約１，５００〜約７，０００ｇ／モルである、組成物。
【請求項２２】
前記組成物が、前記７−オリゴ乳酸複合体と、前記４０−オリゴ乳酸複合体と、前記２’−オリゴ乳酸複合体と、を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
遊離７−ヒドロキシル基を有するパクリタキセルまたは前記パクリタキセルの誘導体を、カップリング剤、及び２〜２４個の乳酸サブユニットを有するモノ−Ｏ−シリル化オリゴ乳酸と接触させることを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の７−オリゴ乳酸複合体を作製する方法。
【請求項２４】
遊離４０−ヒドロキシル基を有するラパマイシンまたは前記ラパマイシンの誘導体を、カップリング剤、及び２〜２４個の乳酸サブユニットを有するモノ−Ｏ−シリル化オリゴ乳酸と接触させることを含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の４０−オリゴ乳酸複合体を作製する方法。
【請求項２５】
遊離２’−ヒドロキシル基を有するセルメチニブまたは前記セルメチニブの誘導体を、カップリング剤、及び２〜２４個の乳酸サブユニットを有するモノ−Ｏ−シリル化オリゴ乳酸と接触させることを含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の２’−オリゴ乳酸複合体を作製する方法。
【請求項２６】
請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の組成物を作製する方法であって、
前記７−オリゴ乳酸複合体、前記４０−オリゴ乳酸複合体、及び前記２’−オリゴ乳酸複合体のうちの１つ以上を組み込むミセルを形成するように、水を、
ポリ乳酸含有ポリマーと、前記７−オリゴ乳酸複合体、前記４０−オリゴ乳酸複合体、及び前記２’−オリゴ乳酸複合体のうちの１つ以上との混合物
と組み合わせることを含み、
前記オリゴ乳酸が２〜２４個の乳酸サブユニットを含む、方法。
【請求項２７】
前記ポリ乳酸含有ポリマーがＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
パクリタキセルもしくはパクリタキセル誘導体、ラパマイシンもしくはラパマイシン誘導体、及び／またはセルメチニブもしくはセルメチニブ誘導体に対して感受性のあるがん細胞を抑制するまたは殺滅する方法であって、前記細胞を、有効抑制量または有効致死量の請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項２９】
前記接触させることがインビトロである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
パクリタキセルもしくはパクリタキセル誘導体、ラパマイシンもしくはラパマイシン誘導体、及び／またはセルメチニブもしくはセルメチニブ誘導体に対して感受性のあるがんに罹患している哺乳類へ、有効量の請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、治療方法。
【請求項３１】
前記がんが、脳腫瘍、乳がん、結腸がん、頭頚部がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、神経芽腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、血管肉腫、または白血病から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記がんが、乳がんまたは肺がんである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物が注射によって投与される、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体的な内容が参照により本明細書に組み込まれる２０１６年３月１４日出願の米国仮特許出願第６２／３０７，８３０号に対する優先権を主張する。
【０００２】
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたＡＩ１０１１５７の下での政府の支援によってなされた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【０００３】
分野
本開示は概して、パクリタキセル及びその誘導体などのタキサンのオリゴ乳酸複合体、ラパマイシン及びその誘導体などのｍＴＯＲ阻害薬のオリゴ乳酸複合体、セルメチニブ及びその誘導体などのＭＥＫ阻害薬のオリゴ乳酸複合体、ならびにこれらの組み合わせに関する。これらの複合体は、パクリタキセル、ラパマイシン、及び／またはセルメチニブの標準製剤と比較して、優れた溶解度、低い毒性、及び／またはがんの治療における高い効能を提供するために、合成ミセル中に製剤され得る。
【背景技術】
【０００４】
背景
パクリタキセル、ラパマイシン、及びセルメチニブは、種々のがんの治療において有用な強力な化学療法薬であり、以下に示される構造を有する。
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【０００５】
当該化学療法薬の水溶解度が制限されていることにより、パクリタキセル、ラパマイシン、及びセルメチニブなどの抗がん薬は通常、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ（ＣｒＥＬ）、ＤＭＳＯ、及び／またはエタノールなどの溶剤を含む特化したビヒクルを用いて非経口投与用に製剤される。このような非水性溶剤はしばしば、患者の耐容性の観点から望ましくない。例えば、ＣｒＥＬは、過敏症反応及びアナフィラキシーを誘導することが知られており、投与前に抗ヒスタミン薬及びステロイドを用いた処置を患者に必要とする。ミセル組成物は、いくつかの水難溶性薬及び細胞毒性薬に対してより安全な代替送達ビヒクルとして提案されてきた。しかしながら、このような組成物はしばしば、薬剤負荷量が少なく、安定性に乏しいのが難点であり、広範な生体内分布、及び薬剤への少量の腫瘍曝露がインビボでもたらされる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の技術は、パクリタキセルのオリゴ乳酸複合体（ｏ（ＬＡ）ｎ−ＰＴＸ）及びパクリタキセル誘導体（例えば、ドセタキセル）のオリゴ乳酸複合体などのタキサンのオリゴ乳酸複合体、ラパマイシンのオリゴ乳酸複合体（ｏ（ＬＡ）ｎ−ＲＡＰ）及びラパマイシン誘導体（例えば、エベロリムス）のオリゴ乳酸複合体などのｍＴＯＲ阻害薬のオリゴ乳酸複合体、ならびにセルメチニブのオリゴ乳酸複合体（ｏ（ＬＡ）ｎ−ＳＥＬ）及びセルメチニブ誘導体（例えば、ビニメチニブ、ＧＤＣ−０６２３、及びＡＲＲＹ−３００）のオリゴ乳酸複合体などのＭＥＫ阻害薬のオリゴ乳酸複合体を提供する。このオリゴ乳酸は典型的には、エステル結合を通じて、２〜２４個の乳酸サブユニットを含み、パクリタキセルまたはパクリタキセル誘導体の７−ヒドロキシル、ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体の４０−ヒドロキシル、及びセルメチニブまたはセルメチニブ誘導体の２’−ヒドロキシルの酸素へ付着する。
【０００７】
種々の態様において、本発明の技術は、溶解度及び効能を高めた、オリゴ乳酸とパクリタキセルもしくはパクリタキセル誘導体との、オリゴ乳酸とラパマイシンもしくはラパマイシン誘導体との、及び／またはオリゴ乳酸とセルメチニブもしくはセルメチニブ誘導体との複合体を提供する。本明細書で提供される複合体は、がんの治療において有用な医薬組成物及び薬剤として、ミセル中へと製剤することができる。医薬製剤及び薬剤を調製する上でのこれらの複合体の使用も提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】本発明の技術のオリゴ（乳酸）ｎ−パクリタキセル複合体をポリ（エチレンオキシド）−ブロック−ポリ（乳酸）（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ）ミセルとともに使用することを示す概略図を示す：抗がん活性のための負荷、放出及びバックバイティング（ｂａｃｋｂｉｔｉｎｇ）転化。
【図１Ｂ】本複合体の実例となる実施形態について予想されるバックバイティングの分解機序を示す化学スキームを示す。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体（２Ａ）及びｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体（２Ｂ）ならびに１：１のＣＨ３ＣＮ／１０ｍＭ  ＰＢＳ中で３７℃、ｐＨ７．４で０、４、１２、９６及び１６８時間のインキュベーション後のこれらの複合体のバックバイティング転化産物の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図３】ｏ（ＬＡ）ｎ−ＰＴＸ複合体を製造するための実例となる合成スキームを提供する。
【図４】ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルからのＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸのインビトロ放出についての時間経過を示す（平均±標準偏差、ｎ＝３）。
【図５Ａ】ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体からｏ（ＬＡ）６−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）４−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）２−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）１−ＰＴＸ及びＰＴＸへの転化の時間経過を示すグラフ（平均±標準偏差、ｎ＝３）（５Ａ）を示す。
【図５Ｂ】ｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体からｏ（ＬＡ）１４−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）１２−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）１０−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）６−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）４−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）２−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）１−ＰＴＸ及びＰＴＸへの転化の時間経過を示すグラフ（平均±標準偏差、ｎ＝３）（５Ｂ）を示す。
【図６】ヒトＡ５４９非小肺がん細胞に対するＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）２−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ、及びｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体のインビトロでの細胞毒性を示す。円柱：四つ組複製物測定の平均値、バー：標準偏差、＊＊：遊離型及びミセル型についてＰＴＸと比較したｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸに対してｐ＜０．０１。
【図７Ａ】ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル中のｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体からｏ（ＬＡ）６−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）４−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）２−ＰＴＸ及びＰＴＸへの転化の時間経過を示す（平均±標準偏差、ｎ＝３）。
【図７Ｂ】ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル中のｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体からｏ（ＬＡ）１４−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）４−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）１２−ＰＴＸ及びｏ（ＬＡ）１０−ＰＴＸへの転化の時間経過を示す（平均±標準偏差、ｎ＝３）。
【図８Ａ】Ａ５４９異種移植腫瘍モデルにおけるＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル（９％負荷）としてのインビボ抗腫瘍効能であるＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体（２０ｍｇ／ｋｇ）を示す。マウスは、毎週の注射を３回受けた後、３回の周期について１週間休薬した（平均±平均の標準誤差、ｎ＝３〜４）。バー：平均の標準誤差、＊＊＊：ｐ＜０．００１、及び
【図８Ｂ】ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル（９％負荷）としてＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体（２０ｍｇ／ｋｇ）を用いて処置したマウスの相対的な体重を示す。バー：平均の標準誤差、＊＊：ｐ＜０．０１。
【図９】図９Ａは、ｏ（ＬＡ）ｎ−ＲＡＰ複合体を製造するための実例となる合成スキームを提供する。図９Ｂは、ｏ（ＬＡ）ｎ−ＳＥＬ複合体を製造するための実例となる合成スキームを提供する。
【図１０Ａ】ｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ複合体（１０Ａ）（０．５ｍｇ／ｍＬ）ならびに１：１でのＣＨ３ＣＮ／１０ｍＭ  ＰＢＳ中での３７℃、ｐＨ７．４で事前に決めておいた時間間隔で１６８時間までのインキュベーション後のこれらの複合体のバックバイティング転化産物の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１０Ｂ】ｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬ複合体（１０Ｂ）（０．５ｍｇ／ｍＬ）ならびに１：１でのＣＨ３ＣＮ／１０ｍＭ  ＰＢＳ中での３７℃、ｐＨ７．４で事前に決めておいた時間間隔で１６８時間までのインキュベーション後のこれらの複合体のバックバイティング転化産物の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１１Ａ】ｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ複合体からｏ（ＬＡ）６−ＲＡＰ、ｏ（ＬＡ）４−ＲＡＰ、ｏ（ＬＡ）２−ＲＡＰ及びＲＡＰへの転化の時間経過を示すグラフ（平均±標準偏差、ｎ＝３）（１１Ａ）を示す。
【図１１Ｂ】ｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬ複合体からｏ（ＬＡ）６−ＳＥＬ、ｏ（ＬＡ）４−ＳＥＬ、ｏ（ＬＡ）２−ＳＥＬ及びＳＥＬへの転化の時間経過を示すグラフ（平均±標準偏差、ｎ＝３）（１１Ｂ）を示す。
【図１２Ａ】Ａ５４９非小肺がん細胞に対するＲＡＰミセル及びｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ複合体ミセルのインビトロでの細胞毒性を示す（１２Ａ）。
【図１２Ｂ】ヒトＡ５４９非小肺がん細胞に対するＳＥＬミセル、ｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬ複合体ミセル及びｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ複合体ミセルのインビトロでの細胞毒性を示す（１２Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
詳細な説明
次の用語は、以下に定義されるように全体を通じて使用される。
【００１０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、「一つの（ａ）」及び「一つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」などの単数形冠詞ならびにこの要素を説明する脈絡における（特に後続の特許請求の範囲の脈絡における）類似の指示物は、本明細書において別段の記載がない限り、または脈絡によって明確に矛盾することがない限り、単数形及び複数形の両方を網羅するよう解釈されることになっている。本明細書の値の範囲の列挙は単に、本明細書において別段の記載がない限り、この範囲内に収まる各個別の値に対してそれぞれ参照する簡略表記法として機能するよう企図されており、各個別の値は、本明細書でそれぞれ列挙されているかのように本明細書へ組み込まれる。本明細書で説明される方法はすべて、本明細書において別段の記載がない限り、または脈絡によって明確に矛盾することがない限り、任意の適切な順序で実施されることができる。本明細書で提供されるいかなる及びすべての例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は単に、実施形態をより良好に明らかにするよう企図とされており、別段の記載がない限り、特許請求の範囲に制限を与えるものではない。本明細書におけるいかなる言語も、請求されていないあらゆる要素を不可欠なものとして示していると解釈されるべきではない。
【００１１】
本明細書で使用する場合、「約」は、当業者によって理解され、使用されている脈絡に応じてある程度変わることになっている。当業者に明確ではない用語が使用されている場合、使用されている脈絡を考慮して、「約」は、特定の用語のプラスまたはマイナス１０％までを意味することになっている。
【００１２】
本発明の技術は、本明細書に開示される化合物（薬剤及び／または薬剤複合体）及びミセルの実施形態のうちのいずれか１つと、医薬として許容され得る担体または１つ以上の賦形剤と、を含む、医薬組成物及び薬剤を提供する。この組成物は、本明細書で説明される方法及び治療において使用され得る。この医薬組成物は、有効量の本明細書に開示される本発明の技術の化合物の実施形態のうちのいずれか１つを含み得る。先の実施形態のうちのいずれかにおいて、有効量は、対象に関して判断され得る。「有効量」は、所望の効果を生じるのに必要な化合物、複合体、ミセルまたは組成物の量を指す。有効量の一例は、がんまたは再狭窄などの心血管疾患の治療を含むがこれらに限定されない治療（医薬）用途のために許容され得る毒性及び生物学的利用率レベルを生じる量または薬用量を含む。本明細書で使用する場合、「対象」または「患者」は、ネコ、イヌ、げっ歯類または霊長類などの哺乳類である。典型的には、対象はヒトであり、好ましくはパクリタキセルに対して感受性のあるがん、すなわち、有効量のパクリタキセルを用いた治療ができるがんに罹患しているヒトである。「対象」及び「患者」は、相互交換可能に使用されることができる。
【００１３】
一態様において、本発明の技術は、オリゴ乳酸とパクリタキセルとの及びパクリタキセル誘導体との複合体を提供する。本明細書で使用する場合、「パクリタキセル誘導体」とは、パクリタキセルの炭素環式／オキセタン骨格（すなわち、タキサン骨格）を保有しているが、７−ヒドロキシル以外の少なくとも１つの修飾された側鎖を含有する化合物である。本発明の技術のパクリタキセル誘導体は、抗がん活性を呈する。例えば、ドセタキセルとは、ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノが３’位でベンズアミドを置き換えるＣ−１３側鎖の修飾を含有する、パクリタキセル誘導体である。他のパクリタキセル誘導体は、当業者に既知であり、Ｆａｒｉｎａ，Ｖ．，「Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔａｘｏｌ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５（参照により本明細書に組み込まれる）において説明されるものを含むが、これらに限定されない。本発明の複合体及びミセルは、複合体形成していないパクリタキセル及びパクリタキセル誘導体と比較して、高い溶解度、安定性及び抗がん効能を呈する。図１Ａは、本発明の技術の一実施形態について、オリゴ乳酸複合体、ミセルへのこれらの複合体の負荷及びミセルからのこれらの複合体の放出、ならびにパクリタキセルを提供するためのこれらの複合体のその後の分解を概略的に示す。
【００１４】
一態様において、本発明の技術は、オリゴ乳酸とラパマイシンとの複合体及びラパマイシン誘導体を提供する。本明細書で使用する場合、「ラパマイシン誘導体」または「ラパログ」とは、ラパマイシンの大環状ラクトン環を保有するが、Ｃ−４０位における遊離ヒドロキシル基またはＣ−４０位へ結合した修飾された側鎖へ付着した遊離ヒドロキシルを保有しながら、少なくとも１つの修飾された側鎖を含有する化合物（例えば、エベロリムス）である。本発明の技術のラパマイシン誘導体は、抗がん活性を呈する。例えば、エベロリムスは、以下の構造を有するラパマイシン誘導体である。他のラパマイシン誘導体は、当業者に既知であり、Ｗａｎｄｅｒ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，「Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍＴＯＲ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｈｏｗ  ｐａｔｈｗａｙ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｉｎｆｏｒｍｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２１（４），１２３１−１２４１（２０１１）（参照により本明細書に組み込まれる）において説明されるものを含むがこれらに限定されない。本発明の複合体及びミセルは、複合体形成していないラパマイシン及びラパマイシン誘導体と比較して高い溶解度、安定性及び抗がん効能を呈する。オリゴ乳酸のＣ−７パクリタキセル複合体の挙動と類似して、ラパマイシンの及びその誘導体のＣ−４０オリゴ乳酸複合体は、ミセルへ負荷され及びミセルから放出され、分解してラパマイシンまたはラパマイシン誘導体を提供し得る。
2019512496.tif 000005
【００１５】
一態様において、本発明の技術は、オリゴ乳酸とセルメチニブとの及びセルメチニブ誘導体との複合体を提供する。本明細書で使用する場合、「セルメチニブ誘導体」とは、セルメチニブの６，５縮合環系を保有するが、Ｃ−２’位に遊離ヒドロキシル基を保有しながら少なくとも１つの修飾された側鎖を含有する、化合物（例えば、ビニメチニブ、ＧＤＣ−０６２３、及びＡＲＲＹ−３００）である。本発明の技術のセルメチニブ誘導体は、抗がん活性を呈する。例えば、ビニメチニブ及びＧＤＣ−０６２３は、以下の構造を有するセルメチニブ誘導体である。他のセルメチニブ誘導体は、当業者に既知であり、Ｊｏｋｉｎｅｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，「ＭＥＫ  ａｎｄ  ＰＩ３Ｋ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ：ｒａｔｉｏｎａｌｅ  ａｎｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｏ  ｄａｔｅ」，Ｔｈｅｒ．Ａｄｖ．Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ．，７（３），１７０−１８０（２０１５）（参照により本明細書に組み込まれる）において説明されるものを含むがこれらに限定されない。本発明の複合体及びミセルは、複合体形成していないセルメチニブ及びセルメチニブ誘導体と比較して高い溶解度、安定性及び抗がん効能を呈する。オリゴ乳酸のＣ−７パクリタキセル複合体の挙動と類似して、セルメチニブのＣ−２’オリゴ乳酸複合体及びその誘導体は、ミセルへ負荷され及びミセルから放出され、分解してセルメチニブまたはセルメチニブ誘導体を提供し得る。
2019512496.tif 000006
【００１６】
本複合体において、オリゴ乳酸は、乳酸の直鎖状ポリマーであり、エステル結合を通じて、パクリタキセルまたはパクリタキセル誘導体の７−ヒドロキシルの酸素へ付着し（本明細書では「７−オリゴ乳酸複合体」）、ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体の４０−ヒドロキシルの酸素へ付着し（本明細書では「４０−オリゴ乳酸複合体」）、及び／あるいはセルメチニブまたはセルメチニブ誘導体の２’−ヒドロキシルの酸素へ付着する（本明細書では「２’−オリゴ乳酸複合体」）。このようなオリゴ乳酸複合体において、オリゴ乳酸は典型的には、２〜２４の乳酸サブユニットを含む。本複合体が２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４の乳酸サブユニットまたは上述の値のうちのいずれか２つの間のサブユニット範囲を有し得ることは、当業者によって理解されることになっている。例えば、オリゴ乳酸は、４〜２０、６〜１８、または２〜１０の乳酸サブユニットを含み得る。いくつかの実施形態において、これらの複合体は、式Ｉ、式ＩＩ及び／または式ＩＩＩに示される構造：
2019512496.tif 000007
2019512496.tif 000008
を有し、式中、各場合におけるｎはそれぞれ、２〜２４の整数、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、及び２４から選択されるいずれか２つの値を含むこれら２つの値の間の範囲である。いくつかの実施形態において、各場合におけるｎはそれぞれ、４〜２０の整数である。いくつかの実施形態において、各場合におけるｎはそれぞれ、６〜１８の整数である。いくつかの実施形態において、オリゴ乳酸はＤ，Ｌ−オリゴ乳酸である。その他において、オリゴ乳酸はＬ−オリゴ乳酸であり、さらにその他において、オリゴ乳酸はＤ−オリゴ乳酸である。
【００１７】
本発明の技術の複合体は、パクリタキセル、ラパマイシン、及びセルメチニブのためのプロドラッグとしてインビボで有利に機能する。インビボでこれらのプロドラッグを模倣する条件、すなわち、ほぼ中性のｐＨの下で、このオリゴ乳酸側鎖は、ランダム加水分解によるよりもむしろ優勢的には制御された段階的な様式で自己分解し、例えば、エステラーゼとは無関係である。理論によって制限されたくはないが、図１Ｂに示されるように、これらの複合体の分解は、オリゴ乳酸の末端の遊離ヒドロキシル基が、隣接する乳酸サブユニットのカルボニルによって形成されたエステル結合を攻撃する「バックバイティング」機序によって生じると考えられる。このように、ラクトイル乳酸二量体は、１個または２個の乳酸サブユニットのみが薬剤／薬剤誘導体へ付着したままとなるまで放出され、この最後の２個のサブユニットは、緩徐なバックバイティングへ供され、経時的に緩徐に加水分解する。この段階的な機序は、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ及びｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ（図２Ａ及び図２Ｂを参照されたい）、ｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ（図１０Ａを参照されたい）、ならびにｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬ（図１０Ｂを参照されたい）のインビトロでの分解について経時的に観察されたＨＰＬＣ特性と一致している。
【００１８】
本明細書で開示される７−オリゴ乳酸複合体は、遊離７−ヒドロキシル基を有するパクリタキセルまたはパクリタキセル誘導体をカップリング剤及び２〜２４の乳酸サブユニットを有するモノ−Ｏ−シリル化オリゴ乳酸と接触させることによって調製され得る。同様に、４０−オリゴ乳酸及び２’−オリゴ乳酸は、遊離４０−ヒドロキシル基を有するラパマイシンまたはラパマイシン誘導体、あるいは遊離２’−ヒドロキシル基を有するセルメチニブまたはセルメチニブ誘導体をカップリング剤及び２〜２４の乳酸サブユニットを有するモノ−Ｏ−シリル化オリゴ乳酸と接触させることによって調製され得る。例としてであるに過ぎないが、図３、９Ａ、及び９Ｂは、本複合体を作製する方法の実例となる実施形態を示す。図３において、パクリタキセルの２’−ヒドロキシルは、パクリタキセルを、任意にＤＭＦなどの極性非プロトン溶媒中のイミダゾールなどの触媒の存在下で、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリドなどのシリル化剤と反応させることによって保護される。保護されたパクリタキセルは、適切な有機溶媒中でカップリング試薬を用いて、ヒドロキシルで保護されたオリゴ乳酸中間体へカップリングされる。同様に、図９Ａ及び図９Ｂにおいて、ラパマイシン及びセルメチニブは、適切な有機溶媒中のカップリング試薬を用いて、ヒドロキシルで保護されたオリゴ乳酸中間体へカップリングされる。適切なカップリング剤は、ＤＣＣ及びＥＤＣＩなどのカルボジイミドを含む。適切な有機溶媒は、ハロゲン化溶媒（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム）、酢酸アルキル（例えば、酢酸エチル）、または他の極性非プロトン溶媒（例えば、ＤＭＦ）を含む。カップリング反応は典型的には、４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムｐ−トルエンスルホナート（ＤＰＴＳ）または４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）などの触媒も含むことになっている。いくつかの実施形態において、ヒドロキシルで保護されたオリゴ乳酸は、Ｏ−シリル化オリゴ乳酸、例えば、Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル（ＯＴＢＳ）オリゴ乳酸またはＯ−トリエチルシリル（ＯＴＥＳ）オリゴ乳酸である。他の既知のヒドロキシル保護基が使用され得るが、パクリタキセル２’ヒドロキシル上及びオリゴラクチドヒドロキシル上のシリル基は、フルオリドで簡便に除去される。例えば、図３は、ＴＢＳ基を酢酸及びＴＨＦ中のテトラブチルアンモニウムフルオリドで脱保護すると、所望の複合体を提供することを示しており、図９Ａ及び９Ｂは、ＴＥＳ基をフッ化水素酸及びピリジンで脱保護すると、所望の複合体を提供することを示している。
【００１９】
単分散モノ−Ｏ−シリル化オリゴ乳酸は、環状ラクチド（環状Ｌ−ラクチドを含む）の開環に続く保護−カップリング−脱保護シーケンスなどの既知の方法を用いて調製され、例えば、ヒドロキシル基及びカルボン酸基のための保護基としてそれぞれＴＢＳエーテルまたはＴＥＳエーテル及びベンジルエステルを用いて単官能オリゴマーを得る。他の適切なトリオルガノシリルクロリド剤は、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド及びトリエチルクロロシランの代わりに使用され得、トリメチルシリルクロリド、ｉ−プロピル−ジメチルクロロシラン、クロロトリベンジルシラン、クロロトリブチルシラン、クロロトリイソプロピルシラン、クロロトリヘキシルシラン、クロロトリイソブチルシラン及びクロロトリフェニルシランなどであるがこれらに限定されない。または、ベンジルエステルに加えて、シリル基と直交する任意のエステルも使用され得る。あるいは、単分散オリゴ乳酸は、従来の重合技術に続いて、逆相カラムクロマトグラフィーまたはゲル濾過による分離によって調製され得る。
【００２０】
別の態様において、本発明の技術は、水から形成されたミセルと、ポリ乳酸含有ポリマーと、遊離パクリタキセル／パクリタキセル誘導体、遊離ラパマイシン／ラパマイシン誘導体、及び遊離セルメチニブ／セルメチニブ誘導体からなる３薬の組み合わせと、からなる水性組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「遊離」という用語は、複合体形成していない薬剤／薬剤誘導体を指す。このようなミセルは典型的には、遊離パクリタキセル／パクリタキセル誘導体、遊離ラパマイシン／ラパマイシン誘導体、または遊離セルメチニブ／セルメチニブ誘導体をそれぞれ負荷した対応するミセルよりも安定している（表２を参照されたい）。
【００２１】
遊離パクリタキセル／パクリタキセル誘導体、遊離ラパマイシン／ラパマイシン誘導体、及び遊離セルメチニブ／セルメチニブ誘導体からなる３薬の組み合わせを含むミセルは、これらの遊離薬剤／薬剤誘導体が単独で負荷される場合よりも多量の薬剤負荷が可能である（表１〜２を参照されたい）。例えば、遊離セルメチニブは、単独でミセル中にたった約１重量％が負荷され、短時間（約５分間）の後に沈殿する。対照的に、ミセル中に遊離パクリタキセル及び遊離ラパマイシンとともに負荷される遊離セルメチニブは、６重量％超の薬剤が負荷され、ミセルの安定性は高まる（表１及び表２を参照されたい）。いくつかの実施形態において、遊離パクリタキセル／パクリタキセル誘導体の負荷は、ミセルの質量に対して約２重量％〜約６重量％を含む約１重量％〜約１０重量％であり得る。いくつかの実施形態において、遊離ラパマイシン／ラパマイシン誘導体の負荷は、ミセルの質量に対して約１重量％〜約４重量％を含む約１重量％〜約１０重量％であり得る。いくつかの実施形態において、遊離セルメチニブ／セルメチニブ誘導体の負荷は、ミセルの質量に対して約４重量％〜約８重量％を含む約１重量％〜約１０重量％であり得る。ミセル中の総遊離薬剤負荷の例は、ミセルの質量に対して約７重量％、約１０重量％、約１３重量％、約１５重量％、約１８重量％を含む約５重量％〜約２０重量％、または上述の値のうちのいずれか２つを含むこれらの間の範囲であり得る。
【００２２】
別の態様において、本発明の技術は、水から形成されたミセルと、ポリ乳酸含有ポリマーと、本発明のオリゴ乳酸−薬剤／薬剤誘導体の複合体（すなわち、パクリタキセル／パクリタキセル誘導体の複合体、ラパマイシン／ラパマイシン誘導体の複合体、及び／あるいはセルメチニブまたはセルメチニブ誘導体の複合体）のうちのいずれかと、からなる水性組成物を提供する。このようなミセルは概して、遊離薬剤／薬剤誘導体を含有する対応するミセルよりも安定している。例えば、図４に示されるように、ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ乳酸とｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸのうちの１つとから形成されるミセルは、これらが遊離パクリタキセルを放出するよりも非常に緩徐に複合体を放出する。いくつかの実施形態において、本発明の技術は、水から形成されたミセルと、ポリ乳酸含有ポリマーと、パクリタキセル／パクリタキセル誘導体の複合体、ラパマイシン／ラパマイシン誘導体の複合体、及びセルメチニブ／セルメチニブ誘導体の複合体からなる３薬の組み合わせとからなる水性組成物を提供する。
【００２３】
本発明の技術のいくつかの実施形態において、ミセルは、ブロック共重合体ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ（ＰＥＧ−ＰＬＡとしても既知）を含む。ポリ（乳酸）ブロックは、（Ｄ−乳酸）、（Ｌ−乳酸）、（Ｄ，Ｌ−乳酸）、またはこれらの組み合わせを含むことができる。種々の形態のＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡは、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃなどから市販されており、またはこれらの形態は当業者に周知の方法により調製されることができる。ポリ（エチレングリコール）ブロックの分子量は、約１，０００〜約３５，０００ｇ／モル、またはこの範囲内の約５００ｇ／モルの任意の増分であり得る。（本明細書でいうポリマー分子量はすべて、重量平均分子量であると理解されることになっている。）例えば、ＰＥＧブロックの分子量は、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、２５，０００、２６，０００、２７，０００、２８，０００、２９，０００、３０，０００、３１，０００、３２，０００、３３，０００、３４，０００、３５，０００、または上述の値のうちのいずれか２つを含むこれらの値の間の範囲であり得る。ポリ（乳酸）の適切なブロックは、約１，０００〜約１５，０００ｇ／モルの分子量、またはこの範囲内の約５００ｇ／モルの任意の増分を有し得る。例えば、ＰＥＧブロックの分子量は、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、６，０００、６，５００、７，０００、７，５０００、８，０００、８，５００、９，０００、９，５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、または上述の値のうちのいずれか２つを含むこれらの間の範囲であり得る。ＰＥＧブロックは、メチル基（例えば、メトキシエーテル）などのアルキル基、あるいは任意の適切な保護基、キャッピング基、またはブロッキング基において終止し得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡのポリ（エチレングリコール）ブロックの分子量は約１，０００〜約３５，０００ｇ／モルであり、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡのポリ（乳酸）の分子量は約１，０００〜約１５，０００ｇ／モルである。いくつかの実施形態において、ポリ（エチレングリコール）ブロックの分子量は約１，５００〜約１４，０００ｇ／モルであり、ポリ（乳酸）ブロックの分子量は、約１，５００〜約７，０００ｇ／モルである。
【００２４】
本開示のミセルは、種々のブロックサイズ（例えば、先に説明した範囲内のブロックサイズ）及び種々の比率のＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡを用いて調製されることができる。例えば、ＰＥＧ：ＰＬＡ比は、約１：１０〜約１０：１、または１：５、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、及び５：１を含むがこれらに限定されないその範囲内のいずれかの整数比であり得る。例えば、ＰＥＧ−ＰＬＡの重量平均分子量（Ｍａ）は、２Ｋ−２Ｋ、３Ｋ−５Ｋ、５Ｋ−３Ｋ、５Ｋ−６Ｋ、６Ｋ−５Ｋ、６Ｋ−６Ｋ、８Ｋ−４Ｋ、４Ｋ−８Ｋ、１２Ｋ−３Ｋ、３Ｋ−１２Ｋ、１２Ｋ−６Ｋ、６Ｋ−１２Ｋ（それぞれ、ＰＥＧ−ＰＬＡ）または上述の値のうちのいずれか２つを含むこれらの間の範囲を含むが、それらに限定されない。
【００２５】
ある適切なＰＬＡ含有ポリマーとは、約１〜３ｋＤａ（例えば、約２Ｋダルトン）のブロックをおよそ５０：５０の比率で含むＰＥＧ−ＰＬＡである。この手順を使用した結果、ミセル中の薬剤−複合体の負荷が高レベルとなった。ＰＥＧ−ＰＬＡの分子量のさらに具体的な例としては、４．２Ｋ−ｂ−１．９Ｋ、５Ｋ−ｂ−１０Ｋ、１２Ｋ−ｂ−６Ｋ、２Ｋ−ｂ−１．８Ｋ、及び以下の実施例において説明されるものが挙げられる。使用され得る他の適切な両親媒性ブロック共重合体は、米国特許第４，７４５，１６０号（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌら）及び同第６，３２２，８０５号（Ｋｉｍら）において説明されている。薬剤：ポリマー比は、約１：２０〜約２：１、またはこの範囲内の任意の整数比であり得る。適切な薬剤−ポリマー比の具体例としては、約２：１、約３：２、約１．２：１、約１：１、約３：５、約２：５、約１：２、約１：５、約１：７．５、約１：１０、約１：２０または上述の値のうちのいずれかを含むこれらの間の範囲が挙げられる。
【００２６】
本発明の技術のミセルは、特に遊離薬剤／薬剤複合体を単独で含有する同じミセルと比較して、多量を含む広範な範囲の量の本明細書で説明する複合体を負荷され得る。例えば、複合体の負荷量は、ミセルの質量に対して約２重量％〜約６０重量％であり得る。ミセル中の複合体負荷量の例としては、ミセルの質量に対して約３重量％、約４重量％、約５重量％、約１０重量％、約１５重量％、約２０重量％、約２５重量％、約３０重量％、約３５重量％、約４０重量％、約４５重量％、約５０重量％、約５５重量％、または約６０重量％、あるいは上述の値のうちのいずれか２つを含むこれらの間の範囲が挙げられる。いくつかの実施形態において、（パクリタキセル／パクリタキセル誘導体の）７−オリゴ乳酸複合体の負荷量は、約８重量％〜約５５重量％を含む約５重量％〜約６０重量％であり得、（ラパマイシン／ラパマイシン誘導体の）４０−オリゴ乳酸複合体の負荷量は、約７重量％〜約４５重量％を含む約５重量％〜約５０重量％であり得、及び／または（セルメチニブまたはセルメチニブ誘導体の）２’−オリゴ乳酸複合体の負荷量は、約４重量％〜約２５重量％を含む約２重量％〜約３０重量％であり得る。
【００２７】
ミセル中の各複合体の負荷量は、濃度の点でも表され得る。例えば、各複合体の濃度は、組成物中の水の体積に対して、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬであり得る。本発明の技術を用いて得られ得る各複合体の濃度の例としては、組成物中の水の体積に対して約０．６、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、または約４０ｍｇ／ｍＬ、あるいは上述の値のうちのいずれか２つを含むこれらの間の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、７−オリゴ乳酸複合体の濃度は、約１〜約１５ｍｇ／ｍＬまたはさらには約２〜約１２ｍｇ／ｍＬであり得、４０−オリゴ乳酸複合体の濃度は、約１〜約２０ｍｇ／ｍＬまたはさらには約１．５〜約１０ｍｇ／ｍＬであり得、及び／あるいは２’−オリゴ乳酸複合体の濃度は、約０．５〜約１５ｍｇ／ｍＬまたはさらには約１〜約１０ｍｇ／ｍＬであり得る。
【００２８】
ミセル中の各複合体の負荷量は、負荷効率の点でも表され得る。例えば、各複合体の負荷効率は、ミセルの質量に対して約２５重量％〜約１００重量％であり得る。ミセル中の複合体の負荷効率の例としては、ミセルの質量に対して約３０重量％、約３５重量％、約４０重量％、約４５重量％、約５０重量％、約５５重量％、約６０重量％、約６５重量％、約７０重量％、約７５重量％、約８０重量％、約８５重量％、約９０重量％、約９５重量％、約９９重量％、または約１００重量％、あるいは上述の値のうちのいずれか２つを含むこれらの間の範囲が挙げられる。いくつかの実施形態において、７−オリゴ乳酸複合体の負荷効率は、少なくとも約９０重量％〜約１００重量％を含む少なくとも約８５重量％であり得、４０−オリゴ乳酸複合体の負荷効率は、約８０重量％〜約９０重量％を含む少なくとも約７５重量％であり得、及び／または２’−オリゴ乳酸複合体の負荷効率は、約３０重量％〜約５５重量％を含む少なくとも約２５重量％であり得る。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本発明の技術は、水と、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡならびに、本明細書で説明する７−オリゴ乳酸複合体、４０−オリゴ乳酸複合体、及び２’−オリゴ乳酸複合体のうちの少なくとも１つを含むミセルと、を含む組成物を提供し、ミセルの質量に対して、このミセル中での７−オリゴ乳酸複合体の負荷量は約１重量％〜約６０重量％であり、４０−オリゴ乳酸複合体の負荷量は約１重量％〜約５０重量％であり、及び／または２’−オリゴ乳酸複合体の負荷量は約１重量％〜約３０重量％であり、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡのポリ（エチレングリコール）ブロックの分子量は約１，５００〜約１４，０００ｇ／モルであり、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡのポリ（乳酸）ブロックの分子量は約１，５００〜約７，０００ｇ／モルである。このような組成物は、例えば、いずれかの７−オリゴ乳酸複合体約５重量％〜約６０重量％、または約１〜約１５ｍｇ／ｍＬまたはさらには約２〜約１２ｍｇ／ｍＬ、いずれかの４０−オリゴ乳酸複合体約５重量％〜約５０重量％、または約１〜約２０ｍｇ／ｍＬまたはさらには約２〜約１０ｍｇ／ｍＬ、及びいずれかの２’−オリゴ乳酸複合体約２重量％〜約３０重量％、または約１〜約１５ｍｇ／ｍＬまたはさらには約２〜約１５ｍｇ／ｍＬを含む、本明細書で説明する任意の薬剤負荷量を含み得る。いくつかの実施形態において、この組成物は、本明細書で説明する７−オリゴ乳酸複合体、４０−オリゴ乳酸複合体、及び２’−オリゴ乳酸複合体のうちのいずれかを含み得る。
【００３０】
臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を上回る量で溶媒中に存在する両親媒性ポリマーの両親媒性単鎖は、疎水性の内部、及び親水性の外部またはシェルを有するコア−冠状構造のミセルへと凝集する。薬剤または複合体を負荷したＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのプロトンＮＭＲ分光光度法による研究は、ミセルが水性環境中で容易に形成される一方で、ＤＭＳＯなどの有機溶媒中で分解することを示している。本発明のミセル組成物は典型的には、有機溶媒が実質的に非含有であり、例えば、組成物の重量に基づき、約２重量％未満のエタノール、ジメチルスルホキシド、ひまし油、及びひまし油誘導体（すなわち、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬなどのポリエトキシ化したショウノウ化合物）である。いくつかの実施形態において、有機溶媒の量は、約１重量％未満、約０．５重量％未満、約０．１重量％未満であり、または検出可能な量の有機溶媒が非含有である。
【００３１】
ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは、以下の実施例と同様、本節において以下に説明するとおり調製されることができる。本明細書で説明するミセルの組成物は、水を、ポリ乳酸含有ポリマーと、パクリタキセル、ラパマイシン、及びセルメチニブの３種の薬剤／薬剤誘導体の組み合わせと、からなる混合物と組み合わせることによって調製され得る。別の実施形態において、本明細書で説明するミセルの組成物は、水を、ポリ乳酸含有ポリマーと、本明細書で説明する薬剤／薬剤誘導体複合体のうちの少なくとも１つと、からなる混合物と組み合わせることによって調製され得る。いくつかの実施形態において、ポリ乳酸含有ポリマーはＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡである。
【００３２】
以下に与える手順は単に、実例である。各々は、当業者によって容易に認識されるであろうように、所望の調製規模により変えることができる。調製手順Ａ、Ｂ及びＤのある利点とは、手順Ｃのようにミセル溶液の透析を必要としない点である。使用することのできる他の手順は、水中油エマルション及びＧａｕｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１０９（２００５）１６９−１８８によって説明されるものを含む。
【００３３】
調製手順Ａ：単純平衡。一実施形態において、ミセル調整は、次のとおり実施することができる。ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ及び本明細書で説明する少なくとも１つのオリゴ乳酸複合体を、アセトニトリルまたはジメチルアセトアミドなどの適切な水混和溶媒中で、任意に混合及び／または超音波処理しながら溶解する。この複合体（複数可）は、オリゴ乳酸に関して単分散であり得、または異なる長さのある範囲のオリゴ乳酸を有し得る。次に、溶媒を例えば、減圧下で除去して、ポリマー−薬剤フィルムを提供する。温滅菌水（およそ５０℃〜約７０℃）をこのポリマー−薬剤複合体フィルムへ添加し、この混合物を冷却しておく。この複合体（複数可）を封入しているポリマーミセルは温水の添加の際に形成され、次に、例えば濾過によって単離することができる。
【００３４】
調製手順Ｂ：単純平衡。本明細書で説明する少なくとも１つの薬剤複合体及びＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ（例えば、１：７〜１：１０の比率）を２．５〜５ｍＬのアセトニトリル中に溶解する。この混合物を５分間混合及び超音波処理する。この溶媒を次に、およそ６０℃で回転蒸発させることによって除去して、フィルムを提供する。熱（約６０℃）脱イオン水をこの油へ添加し、この溶液を約２３℃まで冷却する。この溶液を次に、１．５ｍＬのマイクロチューブ中で約１５，０００ｒｐｍで約５分間遠心分離して沈降物を除去する。上清を回収して、０．２μｍのＰＴＦＥフィルタで濾過する。次に、この単離したミセルは、４℃で長い時間保存することができる。
【００３５】
調製手順Ｃ：透析。別の実施形態において、次の透析手順によってミセルを負荷及び形成することができる。所望の比率のＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ及び本明細書で説明する少なくとも１つの薬剤複合体（例えば、１：２０〜２０：１で変わる）をジメチルアセトアミドなどの水混和性溶媒中に溶解する。この混合物を次に、分子量３５００をカットオフするチューブ（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標））のついた透析バッグ中の０．９％塩類溶液などの水溶液へ添加し、その際、薬剤複合体（複数可）を組み込んでいるミセルが形成される。このミセル混合物を次に遠心分離して（例えば、約１６，０００ｒｐｍで５分間）、組み込まれていないいかなる薬剤複合体（複数可）も沈殿させる。この上清は次に、ナノフィルターで処理することができ、ＵＶ検出モード及びＲＩ検出モードなどを備えたＨＰＬＣを用いて分析を実施することができる（Ｙａｓｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９９，６２，９９−１００によって説明される技術を参照されたい）。
【００３６】
調製手順Ｄ：凍結乾燥。ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ中に負荷した本明細書で説明する少なくとも１つの薬剤複合体は、ｔｅｒｔ−ブタノール−水混合物から凍結乾燥させることによって調製することができる。例えば、２〜２０ｍｇのＰＥＧ４０００−ｂ−ＰＬＡ２２００（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）及び１．０ｍｇの本明細書で説明する複合体（複数可）を６０℃の１．０ｍＬのｔｅｒｔ−ブタノール中に溶解した後、激しく混合しながら、６０℃の１．０ｍＬの事前に加温しておいた２回蒸留水を添加することができる。この混合物を−７０℃のドライアイス／エタノール冷浴中で凍結させておく。次に、この実験の間中−２０℃の棚入口温度で、１００μＢａｒで７２時間、凍結乾燥棚において凍結乾燥を実施し得る。凍結乾燥したケークを次に、６０℃の１．０ｍＬの０．９％塩類溶液で再水和させ、遠心分離し、０．２２μｍの再生したセルロースフィルタで濾過し、ＨＰＬＣによって分析し得る。
【００３７】
同様に、遊離薬剤を負荷したＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは、調製手順Ａ〜Ｄのうちのいずれかに記載のとおり、これらの複合体（複数可）をパクリタキセル／パクリタキセル誘導体と、ラパマイシン／ラパマイシン誘導体と、セルメチニブ／セルメチニブ誘導体と、からなる３つの遊離薬剤の組み合わせと置換することによる以下の実施例と同様に調製することができる。
【００３８】
いったん調製すると、ミセル−複合体組成物またはミセル−薬剤組成物は、冷蔵下で、好ましくは約５℃未満の温度で長時間保存することができる。約−２０℃〜約４℃の温度は、たいていのミセル−複合体組成物及びミセル−薬剤組成物の保存に適した条件であることが認められている。例えば、本発明の複合体を負荷したミセルの水溶液は、約４℃で保存することができる。本明細書で説明する凍結乾燥したミセル組成物は、−２０℃で長時間保存した後に再水和させることができる。このミセル組成物を遮光するための褐色のガラスバイアルまたは他の不透明な容器の使用は、この組成物の有効寿命をさらに延長することができる。
【００３９】
別の態様において、本発明の技術は、パクリタキセルまたはパクリタキセル誘導体、ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体、及び／あるいはセルメチニブまたはセルメチニブ誘導体に対して感受性のあるがん細胞を抑制または殺滅する方法を提供し、本方法は、この細胞を有効抑制量あるいは有効致死量の本明細書で説明する組成物のうちのいずれかと接触させることを含む。いくつかのこのような方法において、接触させることは、インビトロまたはインビボで実施される。パクリタキセルまたはパクリタキセル誘導体、ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体、及び／あるいはセルメチニブまたはセルメチニブ誘導体に対して感受性のあるがんに罹患している哺乳類へ、有効量の本明細書で説明するミセル組成物のうちのいずれかを投与することを含む治療方法も提供される。パクリタキセル感受性がん、ラパマイシン感受性がん、及びセルメチニブ感受性がんの例としては、脳腫瘍、乳がん、結腸がん、頭頚部がん、肺がん、リンパ腫、黒色腫、神経芽腫、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、血管肉腫、及び白血病が挙げられる。いくつかの実施形態において、このがんは、乳がんまたは肺がんである。いくつかの実施形態において、有効量の本明細書に開示される２つまたは３つの薬剤／薬剤誘導体または薬剤／薬剤誘導体の複合体は相乗性であり、例えば、これらは、超相加的効果を有し、あるいは薬剤または薬剤複合体単独によっては生じることのできない効果を生じる。
【００４０】
本明細書で説明する本発明の技術の実施形態のうちのいずれかにおいて、医薬組成物は、単位剤形に抱合され得る。単位剤形は、がんまたは再狭窄を治療する上で有効である。概して、本発明の技術の組成物を含む単位剤形は、患者への配慮に応じて変わることになっている。このような配慮は、例えば、年齢、プロトコル、容態、性別、疾患の程度、禁忌、併用療法及びこれらに類するものを含む。これらの配慮に基づく例示的な単位剤形は、当該技術分野の医師によって調整または改変することもできる。例えば、本発明の技術の化合物を含む患者用単位剤形は、１×１０−４ｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０−３ｇ／ｋｇ〜１．０ｇ／ｋｇで変えることができる。本発明の技術の化合物の薬用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたは、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇで変えることができる。
【００４１】
パクリタキセルまたはパクリタキセル誘導体、ラパマイシンまたはラパマイシン誘導体、及び／あるいはセルメチニブまたはセルメチニブ誘導体の複合体を含有するミセル組成物は、本明細書で説明するとおり調製され得、がん及び心血管疾患を治療するために使用され得る。本明細書で説明する複合体及び組成物は、再狭窄あるいは、白血病、血管肉腫、乳がん、大腸がん、前立腺がん、肺がん、脳がん（グリオーマなど）、腺がん、または肝細胞がんなどのがんを治療する製剤及び医薬を調製するために使用され得る。このような組成物は、例えば、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、エマルション剤、エリキシル剤、懸濁液または液剤の形態であり得る。本発明の組成物は、例えば、非経口、直腸、鼻内、膣投与によって、あるいは植え込まれたマトリックスまたは貯蔵器を介して、あるいは再狭窄用には、薬剤をコーティングしたステントまたはバルーン系送達による種々の投与経路のために製剤することができる。非経口投与または全身投与は、皮下、静脈内、腹腔内、及び筋肉内への注射を含むが、これらに限定されない。以下の剤形は、例として与えられており、本発明の技術を制限するものとして解釈されるべきではない。
【００４２】
注射可能な剤形は概して、適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤を用いて調製され得る液剤または水性懸濁剤または水中油懸濁剤を含む。注射可能な形態は、溶媒または希釈剤とともに調製された液相または懸濁剤の形態であり得る。許容され得る溶剤またはビヒクルは、滅菌水、リンガー液、または等張性塩類水溶液を含む。
【００４３】
注射用に、医薬製剤及び／または医薬剤は、先に説明した適切な溶剤を用いた再構成に適したフィルム剤または散剤であり得る。これらの例としては、凍結乾燥、回転乾燥または噴霧乾燥した粉末、無定形粉末、顆粒、沈殿物、または粒子状物質が挙げられるが、これらに限定されない。注射用に、これらの製剤は、安定化剤、ｐＨ改質剤、界面活性剤、生物学的利用能改質剤及びこれらの組み合わせを任意に含有し得る。いくつかの実施形態において、注射可能な製剤は、等張剤（例えば、ＮａＣ１及び／またはデキストロース）、緩衝剤（例えば、リン酸塩）及び／または保存剤を含む。
【００４４】
先に説明したこれらの代表的な剤形の他に、医薬として許容され得る賦形剤及び担体は、当業者に概して既知であり、したがって、本発明の技術に含まれる。このような賦形剤及び担体は例えば、参照により本明細書に組み込まれる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎｅｗ  ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）において説明されている。
【００４５】
本発明の技術の製剤は、以下に説明するように、短時間作用型、即時放出型、長時間作用型、及び持続放出型であるよう設計され得る。したがって、医薬製剤は、徐放用または遅効性放出用にも製剤され得る。
【００４６】
具体的な薬用量は、対象の疾患の容態、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事内容、遊離薬剤／複合体の投与間隔、投与経路、排泄率、及び組み合わせに応じて調整され得る。有効量を含有する先の剤形のうちのいずれも十分、通例の実験法の制限内にあり、それゆえ十分、本発明の技術の範囲内にある。例としてであるに過ぎないが、このような薬用量は、有効量の遊離薬剤／複合体を患者へ投与するために使用され得、約１０ｍｇ／ｍ２、約２０ｍｇ／ｍ２、約３０ｍｇ／ｍ２、約４０ｍｇ／ｍ２、約５０ｍｇ／ｍ２、約７５ｍｇ／ｍ２、約１００ｍｇ／ｍ２、約１２５ｍｇ／ｍ２、約１５０ｍｇ／ｍ２、約２００ｍｇ／ｍ２、約２５０ｍｇ／ｍ２、約３００ｍｇ／ｍ２、または上述の値のうちのいずれか２つを含むこれらの間の範囲を含み得る。このような量は、本明細書で説明するとおり非経口投与され得、５分、１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、５時間、１０時間、１２時間、１５時間、２０時間、２４時間または上述の値のうちのいずれかを含むこれらの間の範囲を含むがそれらに限定されない時間にわたって行われ得る。投与の頻度は、例えば、１日１回、２日間に１回、３日間に１回、１週間に１回、１０日間に１回、２週間に１回、または上述の頻度のうちのいずれかを含むこれらの間の範囲で変わり得る。
【００４７】
本明細書で説明する示される容態の各々について、検査対象は、この対象における障害によって起因するまたはこの障害と関連した１つ以上の症状（複数可）において、偽薬処置した対象または他の適切な対照対象と比較して、１０％、２０％、３０％、５０％またはそれより大きな程度の低下、最高７５〜９０％、または９５％以上の低下を呈することになっている。
【００４８】
関連する態様において、本発明の技術の組成物の実施形態のうちのいずれか１つをがんまたは心血管疾患に罹患している対象へ投与することを包含する、対象を治療する方法が提供される。この方法において、がんとは、白血病、血管肉腫、乳がん、大腸がん、前立腺がん、肺がん、脳がん（グリオーマなど）、腺がん、または肝細胞がんであり得る。
【００４９】
この方法のいかなる実施形態においても、この方法は、遊離薬剤を含有する複合体の実施形態、または本発明の技術の複合体と医薬として許容され得る担体とを含有するミセルの実施形態のうちのいずれか１つを含む医薬組成物の投与を包含し得る。
【００５０】
本明細書の実施例は、本発明の技術の利点を説明するために、ならびに当業者が本発明の技術の複合体及びミセル組成物、その医薬組成物、誘導体、代謝産物、プロドラッグ、ラセミ混合物、または互変異性形態を調製または使用するのをさらに支援するために提供される。遊離薬剤／複合体が、イオン化可能なパクリタキセル、ラパマイシン、セルメチニブ、またはこれらの誘導体の遊離薬剤／複合体を含む程度まで、医薬として許容され得る塩などの塩も使用され得る。本明細書の実施例は、本発明の技術の好ましい態様をより完全に説明するためにも呈される。この実施例は、いかなる方法においても、添付の特許請求の範囲によって定義されるのと同じように本発明の技術の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。この実施例は、変法、態様または先に説明した本発明の技術の態様のいずれかを含むことができ、または組み込むことができる。この変法、態様または先に説明した態様はまた各々、他の変法、態様または本発明の技術の態様のいずれものまたはすべての変法もさらに含み得または組み込み得る。
【実施例】
【００５１】
材料。化学物質はすべて、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ミズーリ州セントルイス市）から購入し、受領したままを使用した。分析等級の有機溶媒及び他のすべての試薬は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ペンシルベニア州ピッツバーグ市）から購入した。ＰＴＸは、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州ウーバン市）から購入した。ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．（カナダ、モントリオール市）から購入した。ＰＥＧ及びＰＬＡのＭｎはそれぞれ４，０００ｇ／モル及び２，２００ｇ／モルであり、ＰＤＩは１．０５であった。Ａ５４９ヒト肺腺がん細胞は、ＡＴＣＣ（ヴァージニア州マナッサス市）から購入し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％ＣＯ２インキュベーターの中で、３７℃で生育させた。
【００５２】
計装。プロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）データは、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ−Ｉｎｏｖａ２チャンネル４００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計（カリフォルニア州パロアルト市）で、２５℃に調節された温度で記録した。化学シフト（δ）は、ＣＤＣｌ３に対して７．２６ｐｐｍでの残留プロトン化溶媒共鳴に対する百万分率（ｐｐｍ）で報告した。質量分析データは、ウィスコンシン大学マディソン校化学部における化学計装センターにあるＷａｔｅｒｓ  ＬＣＴ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）を用いて得た。試料は、１０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ／ＣＨ３ＣＮ溶液から噴霧した。逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析は、ＬＣ−２０ＡＴポンプ、ＳＩＬ−２０ＡＣ  ＨＴオートサンプラー、ＣＴＯ−２０ＡＣカラムオーブン、及びＳＰＤ−Ｍ２０Ａダイオードアレイ検出器を装備したＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣシステム（日本、島津製作所）を用いて実施した。試料は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｓｈｉｅｌｄ（商標）ＲＰ１８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ、１００Å）によって分離された。１０μＬの試料を流量０．８ｍＬ／分、カラム温度２５℃、及びＵＶ検出波長２２７ｎｍで注入した。ｏ（ＬＡ）ｎ−ＰＴＸ転化産物の分離は、１００％  ＣＨ３ＣＮを含有する有機相を溶媒Ａとして、１００％ｍｉｌｌｉＱ水を含有する水相を溶媒Ｂとして用いる勾配モードで行った。勾配溶出は、次のように採用した：０分、５０％溶媒Ａ及び５０％溶媒Ｂ；３５分、９５％溶媒Ａ及び５％溶媒Ｂ；ならびに平衡用に４０分。ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの水力学的直径は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．英国）を用いる動的光散乱（ＤＬＳ）によって、２５℃、検出角度１７３°及び光源としてＨｅ−Ｎｅイオンレーザ（４ｍＷ、６３３ｎｍ）を用いて測定した。測定に先立ち、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル溶液をｍｉｌｌｉＱ水またはＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で希釈して、約０．１ｍｇ／ｍＬのレベルのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡを得、各試料１ｍＬを使い捨てサイジングキュベット（ＢＲＡＮＤ  Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  Ｃｕｖｅｔｔｅｓ）へと入れた。キュムラント法を用いて、相関関数を曲線適合させ、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのＺ平均直径及び多分散指数（ＰＤＩ）をＳｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ式及び相関関数の傾斜からそれぞれ算出した。測定はすべて、３つ組で行われた。
【００５３】
ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）−ｏ（ＬＡ）ｎの合成。簡潔にいえば、環状Ｌ−ラクチドの開環によって単分散ＴＢＳ−ｏ（ＬＡ）８及びＴＢＳ−ｏ（ＬＡ）１６を合成したのに続いて、ヒドロキシル基及びカルボン酸基のためにそれぞれＴＢＳエーテル及びベンジルエステルを保護基として用いて保護−脱保護を行って、単官能オリゴマーを得た（Ｔａｋｉｚａｗａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ａ  Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．，４６，５９７７−５９９０（２００８）（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい））。単官能オリゴマーの選択的な段階式エステル結合に続く直交系脱保護により、ＴＢＳ−ｏ（ＬＡ）８及びＴＢＳ−ｏ（ＬＡ）１６をそれぞれ得た。ＴＢＳ−ｏ（ＬＡ）８の１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
2019512496.tif 000009
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【００５４】
トリエチルシリル（ＴＥＳ）−ｏ（ＬＡ）ｎの合成。簡潔にいえば、ＴＥＳエーテル及びベンジルエステルをそれぞれヒドロキシル基及びカルボン酸基のための保護基として用いて、単分散ＴＥＳ−ｏ（ＬＡ）８を保護−脱保護によって合成して、単官能オリゴマーを得た。単官能オリゴマーの選択的な段階式エステル結合に続く直交系脱保護でＴＥＳ−ｏ（ＬＡ）８を得た。（収率：９９％）。ＴＥＳ−ｏ（ＬＡ）８の１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
2019512496.tif 000011
【００５５】
ベンジルオリゴラクタートＢｎ−ｏ（ＬＡ）ｎの合成。多分散Ｂｎ−ｏ（ＬＡ）ｎの合成をスズ（ＩＩ）−エチルヘキサノアート（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２）で出発した。例えば、平均重合度８で、環状Ｌ−ラクチドをベンジルアルコールと４：１のモル比で混合した。この混合物を１３０℃で溶融するまで撹拌した。その後、トルエン中の０．０１ｗ／ｗ％のＳｎ（Ｏｃｔ）２（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加した。この混合物を１３０℃で４時間撹拌し、室温まで冷却させておき、単分散Ｂｎ−ｏ（ＬＡ）ｎを得た。Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィーを用いるＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｒｆ  ４ｘシステムを介して、単分散Ｂｎ−ｏ（ＬＡ）ｎを精製した。０．１％ギ酸中のアセトニトリル及び０．１％ギ酸中の水の勾配溶出を適用した。精製産物を減圧下で濃縮して、無色の液体を提供した。（収率：Ｂｎ−Ｏ（ＬＡ）８について約８〜１２％）。１Ｈ  ＮＭＲ及びＭＳのデータは、所望の産物と一致していると期待される。
【００５６】
２’−ＴＢＳ−ＰＴＸの合成。Ｆｏｒｒｅｓｔ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２５，１９４−２０６（２００８）、Ａｌｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ，１２，１１７−１２８（２００１）（いずれも参照により本明細書に組み込まれる）におけるわずかな改変を用いて、既に報告されているとおり、２’−ＴＢＳ−ＰＴＸを合成した。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＳＣｌ）（９０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）及びイミダゾール（Ｉｍ）（８２ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）をＰＴＸ（２５０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（２．０ｍＬ）溶液中に溶解した。この反応混合物を室温でアルゴン下、一晩撹拌した。過剰量の酢酸エチル（４０ｍＬ）をこの反応混合物へと注いだ後、Ｈ２Ｏ（１×４０ｍＬ）及び飽和ＮＨ４Ｃｌ（１×４０ｍＬ）溶液で洗浄した。次に、有機層を回収し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧下で除去し、結果として生じる濃縮物を、ヘキサン及び酢酸エチルエチルの勾配溶出を用いるＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｒｆ  ４ｘシステム（ネブラスカ州リンカーン市）を介して精製した。この精製産物を減圧下で濃縮して白色の固体を提供した（収率：８８％）。
2019512496.tif 000012
【００５７】
２’−ＴＢＳ−ＰＴＸ−ｏ（ＬＡ）ｎ−ＴＢＳの合成。１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（６０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）及び４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムｐ−トルエンスルホナート（ＤＰＴＳ）（１５ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）を、２’−ＴＢＳ−ＰＴＸ（２００ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）及びＴＢＳ−ｏ（ＬＡ）８（３００ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）またはＴＢＳ−ｏ（ＬＡ）１６（４２０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を含有する無水ＣＨ２Ｃｌ２（５．０ｍＬ）へ添加した。この反応混合物を室温でアルゴン下、一晩撹拌した。結果として生じる混合物を濾過し、Ｈ２Ｏ（１×１０ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３（１×１０ｍＬ）溶液で洗浄した。次に、有機層を回収し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧下で除去し、結果的に生じる濃縮物を、ヘキサン及び酢酸エチルの勾配溶出を用いるＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｒｆ  ４ｘシステムを介して精製した。この精製産物を減圧下で濃縮して、白色の固体を提供した（収率：２’−ＴＢＳ−ＰＴＸ−ｏ（ＬＡ）８−ＴＢＳについて２０％、及び２’−ＴＢＳ−ＰＴＸ−ｏ（ＬＡ）１６−ＴＢＳについて２４％）。２’−ＴＢＳ−ＰＴＸ−ｏ（ＬＡ）８−ＴＢＳの１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
2019512496.tif 000013
２’−ＴＢＳ−ＰＴＸ−ｏ（ＬＡ）１６−ＴＢＳ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）の１Ｈ  ＮＭＲ：
2019512496.tif 000014
【００５８】
ｏ（ＬＡ）ｎ−ＰＴＸ複合体の合成。無水ＴＨＦ（２ｍＬ）中の２’−ＴＢＳ−ＰＴＸ−ｏ（ＬＡ）８−ＴＢＳ（８５ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）または２’−ＴＢＳ−ＰＴＸ−ｏ（ＬＡ）１６−ＴＢＳ（１２０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の溶液に、酢酸（７２ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）及びテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）（１．０Ｍ  ＴＨＦ溶液）（６３ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。この反応混合物を室温でアルゴン下、一晩撹拌した。過剰量の酢酸エチル（４０ｍＬ）をこの反応混合物へ注ぎ、飽和ＮａＨＣＯ３（２×４０ｍＬ）溶液、５重量％のクエン酸水溶液（２×４０ｍＬ）、及びＨ２Ｏ（１×４０ｍＬ）で洗浄した。次に、有機層を回収し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧下で除去し、結果として生じる濃縮物を、ヘキサン及び酢酸エチルの勾配溶出を用いるＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｒｆ  ４ｘシステムを介して精製した。この精製産物を減圧下で濃縮して、白色の固体を提供した（収率：ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸについて７０％及びｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸについて７２％）。ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸの１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
2019512496.tif 000015
ＥＳＩ−ＴＯＦ：Ｃ７１Ｈ８３ＮＯ３０［Ｍ＋ＮＨ４］＋についてのｍ／ｚ計算値：１４４７．５；測定値１４４７．２。ｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸの１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
2019512496.tif 000016
ＥＳＩ−ＴＯＦ：Ｃ９５Ｈ１１５ＮＯ４６［Ｍ＋Ｎａ］＋のｍ／ｚ計算値：２０２９．３；測定値２０２９．４。
【００５９】
ｏ（ＬＡ）ｎ−ＲＡＰ−ＴＥＳ複合体の合成。１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１００ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を、ＲＡＰ（２９８ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）及びＴＥＳ−ｏ（ＬＡ）８（２５４ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を含有する無水ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）へ添加した。この反応混合物を室温でアルゴン下、一晩撹拌し、完了していることをＴＬＣによって判断した。この結果として生じた混合物を減圧下で濃縮して、ヘキサン及び酢酸エチルの勾配溶出を用いるＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｒｆ  ４ｘシステムを介して精製した。この精製産物を減圧下で濃縮して、ＲＡＰ−ｏ（ＬＡ）８−ＴＥＳを提供した（２９６ｍｇ、収率：５７％）。ＲＡＰ−４０−ｏ（ＬＡ）８−ＴＥＳの１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，主要な回転異性体）：
2019512496.tif 000017
【００６０】
ｏ（ＬＡ）ｎ−ＲＡＰ複合体の合成。ＴＨＦ（９ｍＬ）中のＲＡＰ−ｏ（ＬＡ）８−ＴＥＳ（２７２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液へ、ピリジン（０．４１ｍＬ、５．０８ｍｍｏｌ）及びＨＦ／Ｐｙｒ（０．１３ｍＬ、５．０８ｍｍｏｌ、７０％ＨＦ）を連続して添加した。この反応混合物を室温でアルゴン下、１時間撹拌した後、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液でクエンチした。この混合物をＥｔＯＡｃ（３×４０ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機相を鹹水で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して、粗混合物を得、これを、ヘキサン及び酢酸エチルの勾配溶出を用いるＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｒｆ  ４ｘシステムを介して精製して、純粋なｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ複合体を白色の固体として得た（２１９ｍｇ、８７％）。ｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰの１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，主要な回転異性体）：
2019512496.tif 000018
【００６１】
ｏ（ＬＡ）ｎ−ＳＥＬ複合体の合成。ＤＭＦ（３．３ｍＬ）中のＳＥＬ（１５３ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）及びＴＥＳ−ｏ（ＬＡ）８（２６０ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）の溶液へ、ＨＯＢＴ（７５ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、ＤＣＣ（１０３ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（１２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を室温でアルゴン下、連続して添加した。この反応物を一晩撹拌した後、減圧下で濃縮して、粗混合物を得、これをさらに、ヘキサン及び酢酸エチルの勾配溶出を用いるＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｒｆ  ４ｘシステムを介して精製して、純粋なｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬ複合体を得た（１７６ｍｇ、５１％）。ｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬの１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：
2019512496.tif 000019
ＨＲＭＳ（ＱＴＯＦ  ＭＳ  ＥＳＩ）Ｃ４１Ｈ４８ＢｒＣｌＦＮ４Ｏ１９［Ｍ＋Ｈ］＋についてのｍ／ｅ計算値１０３５．１７４９、測定値１０３５．１７５８。
【００６２】
ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体の還元的分解。Ｃ−１３位におけるｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸの還元的分解を、Ｍａｇｒｉ，Ｎ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，５１，３２３９−３２４２（１９８６）（参照により本明細書に組み込まれる）において既に報告されているたように達成した。簡潔にいえば、無水ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中のｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ（１０ｍｇ、７μｍｏｌ）またはＰＴＸ（６ｍｇ、７μｍｏｌ）をＢｕ４ＮＢＨ４（１．２ｍｇ、１４μｍｏｌ）でアルゴン下、２時間処理した。酢酸を１滴添加してこの反応を終止させた後、真空下で溶媒除去した。この残留固体をＣＨ３ＣＮ中に再溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。（１Ｓ，２Ｒ）−Ｎ−（２，３−ジヒドロキシ−１−フェニル−プロピル）−ベンズアミド（ＤＰＰＢ）及びｏ−ＬＡ８結合型バッカチンＩＩＩ（ＯＬＡ８Ｂａｃ）の所望の画分をｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸの分解産物から回収し、質量分析によって分析した。結果は、ＰＴＸの単に７−ＯＨ位でのｏ（ＬＡ）８のカップリングと一致していた。ＤＰＰＢのＥＳＩ−ＴＯＦ：Ｃ１６Ｈ１７ＮＯ３［Ｍ＋Ｎａ］＋についてのｍ／ｚ計算値：２９４．１；測定値２９４．１。ｏ（ＬＡ）８ＢａｃのＥＳＩ−ＴＯＦ：Ｃ５５Ｈ７０Ｏ２７［Ｍ＋ＮＨ４］＋についてのｍ／ｚ計算値：１１８０．４；測定値１１８０．６。
【００６３】
ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ及びｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの調製及び特徴付け。ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸを、Ｓｈｉｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．，８，１２５７−１２６５（２０１１）（参照により本明細書に組み込まれる）において既に報告されているように薄膜水和法を用いてＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルへと負荷した。簡潔にいえば、ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ（１．０ｍｇ）及びＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ（１０．０ｍｇ）を丸底フラスコ中の１．０ｍＬのＣＨ３ＣＮ中に溶解し、ＣＨ３ＣＮを６０℃の回転蒸発器を用いた減圧によって除去して、乾燥薄膜を得た。このポリマー薄膜を滅菌水またはＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）の添加によって溶解した後、１３，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離及び濾過滅菌（０．２２μｍ（Ｃｏｒｉｎｇ，ニューヨーク州））を行った。ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸの水中溶解度、薬剤負荷効率、及び薬剤負荷量をＲＰ−ＨＰＬＣによって定量化した。薬剤負荷効率は、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル中に負荷されたＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸのレベルを、薬剤負荷に使用した出発時の薬剤または複合体のレベルで除することによって算出した。薬剤負荷量は、ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸプラスＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの総重量によって除したＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸの重量に基づき算出した。同様に、ＲＡＰ、ｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ、ＳＥＬ、またはｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルを調製及び特徴付けた。
【００６４】
ＣＨ３ＣＮ／ＰＢＳ混合物中の、及びＰＢＳ中のＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル中のｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体またはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体の転化。ＣＨ３ＣＮ及びＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）の（１：１）の混合物中でのｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸの転化をＲＰ−ＨＰＬＣによって分析した。ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ（１．０ｍｇ／ｍＬ）の溶液を１．５ｍＬエッペンドルフチューブの中に入れ、温度調整した水浴（ＧＣＡ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、イリノイ州）中、３７℃でインキュベートした。事前に決めておいた時点で２０μＬの溶液を抜き取り、１８０μＬのＣＨ３ＣＮによって希釈した。同様に、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル（水中１．０ｍｇ／ｍＬ）中でのｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸの転化を測定した。事前に決めておいた時点で２０μＬの溶液を抜き取り、遠心分離し、濾過し（０．２２μｍ）、１８０μＬのＣＨ３ＣＮによって希釈した。試料調製直後にＲＰ−ＨＰＬＣ分析を実施した。一次定数は、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸの分解動態について算出された。ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸの転化は、標準偏差を用いて少なくとも３回評価された。同様に、ｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ及びｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬの転化を実施した。
【００６５】
インビトロでの放出試験。ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル中へのＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体またはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体の負荷の後、ＰＢＳ溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）を用いて試料を０．５ｍｇ／ｍＬへ希釈し、２．５ｍＬの希釈したミセル溶液をＭＷＣＯ  ２０ＫのＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州）へ負荷した。４つの透析カセットを３７℃のＣｏｒｎｉｎｇ  Ｈｏｔｐｌａｔｅ  Ｓｔｉｒｒｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ニューヨーク州）上の４ＬのＰＢＳ溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中に置いた。試料採取の時間間隔は、０、０．５、１、２、４、８、１２、２４、４８及び７２時間とした。各時点で、１００μＬの試料を抜き取り、カセットを１００μＬの新鮮なＰＢＳ溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で再度満たした。外側の培地は、２、４、８、１２、２４及び４８時間で４Ｌの新鮮緩衝液と交換して、シンク条件を近似させた。ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル中に残存しているＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸの量をＲＰ−ＨＰＬＣによって測定し、薬剤放出百分率を一次速度定数とともに経時的に算出した。
【００６６】
インビトロでの細胞毒性試験。Ａ５４９非小肺がん細胞株に対するＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ（遊離型及びミセル結合型）の細胞毒性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州）によって検討した。この細胞を９６穴プレート中に、１，５００個／１００μＬ／ウェルの播種密度で播種し、５％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃のＲＰＭＩ１６４０培地中で２４時間培養した。ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）２−ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸがＤＭＳＯ中に溶解したのに対し、ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸまたはＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡを含有しているｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸミセルは、ＰＢＳ溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中に存在した。各々をウェル中に添加して、０．１、１、１０、１００、及び１０００ｎＭの終濃度を得た。培地中のＤＭＳＯの最終レベルは、全薬剤レベルにおいて０．１％未満であった。培地中で希釈ＤＭＳＯまたはＰＢＳを用いて培養した細胞を対照として用いた。薬剤処理した細胞を３７℃の５％ＣＯ２のインキュベーターの中に７２時間入れておいた。各ウェル中の培地を吸引し、１００μＬの無血清ＲＰＭＩ培地中の２０％（ｖ／ｖ）ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬を添加した後、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で１．５時間インキュベートした。蛍光強度は、励起及び発光がそれぞれ５６０ｎｍ及び５９０ｎｍのＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，カリフォルニア州）によって測定した。半値阻害薬剤濃度（ＩＣ５０）は、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ第５．００版（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州）を用いることによって測定された。同様に、Ａ５４９非小肺がん細胞株に対するＲＡＰ、ｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ、ＳＥＬ、及びｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬ（遊離型及びミセル結合型）の細胞毒性を検討した。
【００６７】
インビボでの抗腫瘍効能。動物実験はすべて、ウィスコンシン大学マディソン校における制度的実験動物委員会によって認可されたプロトコルの下で、実験動物の取扱い及び使用のための制度的及びＮＩＨの指導に従って実施された。６〜８週齢の雌無胸腺ヌードマウス（各２０〜２５ｇ）をウィスコンシン大学マディソン校医学・公衆衛生学部にある実験動物資源から得た。マウスを水及び食餌へ自由にアクセスさせながら、換気したケージ中で飼育し、１週間の順化後に腫瘍細胞を注射した。Ａ５４９細胞（１００μＬの無血清ＲＰＭＩ１６４０培地中の２×１０６個）を、トリプシン処理した後のやや集密的な培養物から収集し、各マウスの右側腹へと皮下注射した。腫瘍体積がおよそ１５０ｍｍ３に到達したとき、マウスを３つの処理群（ｎ＝３〜４／群）：２０ｍｇ／ｋｇでＰＴＸを負荷したＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル、２０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸ等価物でｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸを負荷したＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル、及び空のＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルへと無作為に分けた。薬剤複合体を、尾静脈を介して３回ほど毎週注射して投与した後、１週間の休薬期を設け、合計３周期を１２週間とした。体重及び腫瘍体積を試験の経過にわたってモニターした。腫瘍体積は、式：Ｖ＝（ａ×ｂ２）／２（式中、Ｖは腫瘍体積であり、ａは腫瘍長であり、ｂは腫瘍幅である）を用いて算出した。
【００６８】
データ解析。５％の有意レベルのＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定または５％の有意レベルの一元配置ＡＮＯＶＡを統計分析のために行った。データ解析はすべて、ウィンドウズ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ第５．００版（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州）を用いて行った。
結果。
【００６９】
ＰＴＸ、ＲＡＰ、ＳＥＬ、及びこれらのｏ（ＬＡ）ｎ−複合体を含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの特徴付け。ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体、またはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体を含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの物理化学的特性を表１Ａに要約する。ＲＡＰまたはｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ複合体を含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの物理化学的特性を表１Ｂに要約する。ＳＥＬまたはｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬ複合体を含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの物理化学的特性を表１Ｃに要約する。
【００７０】
（表１Ａ）ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体またはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体を含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの物理化学的特性
2019512496.tif 000020
ａ）１０ｍｇのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡを各製剤に使用した。（平均±ＳＤ、ｎ＝３）
【００７１】
ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは、ＰＴＸの水中溶解度を約１０ｍｇ／Ｌから０．９ｍｇ／ｍＬまで高め、３０．５ｎｍの平均水力学的直径及び８．６％の薬剤負荷のミセルを形成した。しかしながら、ＰＴＸの水中溶解度の上昇は、薬剤負荷に使用したＰＴＸの出発レベルの６倍増によって実現されなかった。その代わり、ＰＴＸの負荷効率は約２１％と低く、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルに対する薬剤負荷は、１１．２％の薬剤負荷で頭打ちとなった。特筆すべきことに、ＰＴＸを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは室温で不安定であり、２時間も経たないうちに沈殿した。対照的に、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルに対するｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体の薬剤負荷は、複合体の出発レベルのそれぞれ６倍増及び１２倍増で８．７％から３７．１％及び５４．５％まで増加し、負荷効率は約１００％であった。３７．１％及び５４．５％のｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体を含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの水力学的直径はそれぞれ、５８．８ｎｍ及び１００ｎｍまで伸びた。ｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体の薬剤負荷はまた、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルに対してＰＴＸよりも多く、水中で約３９％及び６．２ｍｇ／ｍＬであった。特筆すべきことに、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体またはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体を含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは、３７℃で７２時間を超えても安定しており、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体またはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体の可溶化に対する熱力学的安定性を示していた。９％の薬剤負荷及び３０ｎｍの粒径では、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは、インビトロでＰＴＸを迅速に放出し、結果的に４時間も経たずにＰＴＸの沈殿を生じた（図４）。対照的に、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルからのｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体またはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体のインビトロでの放出（図４）は徐々にであり、それぞれｔ１／２＝１４．２時間及び２６．５時間であり、ｏ（ＬＡ）ｎ鎖長の調整による複合体の放出の制御を示した。これらの結果は、オリゴ乳酸が本発明の複合体とＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの間の相溶剤として作用し、結果的に、ＰＴＸと比較して薬剤負荷、物理的安定性及び薬剤放出が改善されることを示している。
【００７２】
（表１Ｂ）ＲＡＰまたはｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ複合体を含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの物理化学的特性
2019512496.tif 000021
【００７３】
ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルに対するＲＡＰ薬剤負荷は６．４％であり、２３％という低い薬剤負荷効率で１１．５％の薬剤負荷で頭打ちとなった。対照的に、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルに対するｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ複合体の薬剤負荷はより多く、７．３％〜１３．６％及び４３．９％まで増加し、負荷効率は８０％を超えた。１３．６％及び４３．９％のｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ複合体を含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの水力学的直径はそれぞれ、６０．８ｎｍ及び９６ｎｍまで伸びた。特筆すべきことに、７．３％及び１３．６％のｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは、３７℃で２４時間を超えても安定しており、インビトロでのｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ複合体可溶化に対する熱力学的安定性を示した。対照的に、非結合型ＲＡＰを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルはすべて、２４時間も経たないうちにＲＡＰを放出した。これらの結果は、オリゴ乳酸が、本発明の複合体とＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの間の相溶剤として作用し、結果的に、ＲＡＰと比較して薬剤負荷及び物理的安定性が改善されることを示している。
【００７４】
（表１Ｃ）ＳＥＬまたはｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬ複合体を含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの物理化学的特性
2019512496.tif 000022
【００７５】
ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルに対するＳＥＬ薬剤負荷は１％であり、薬剤負荷効率は５％と非常に低かった。対照的に、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルに対するｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬ複合体の薬剤負荷はより多く、４．１％から９．９％及び２３．５％まで増加し、負荷効率は３０％よりも高かった。９．９％及び２．５％のｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬ複合体を含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの水力学的直径はそれぞれ、１２６ｎｍ及び１０１ｎｍまで伸びた。特筆すべきことに、４．１％のｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは、３７℃で２４時間を超えても安定しており、インビトロでのｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬ複合体の可溶化に対する熱力学的安定性を示した。対照的に、非結合型ＳＥＬを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは不安定であり、約５分以内でＳＥＬは沈殿した。これらの結果は、オリゴ乳酸が、本発明の複合体とＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの間の相溶剤として作用し、結果的に、ＳＥＬと比較して薬剤負荷及び物理的安定性が改善されることを示している。
【００７６】
非結合型ＰＴＸ、ＳＥＬ、及びＲＡＰの３薬の組み合わせを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの特徴付け。ＰＴＸ、ＳＥＬ、及びＲＡＰを３イン１ミセルとして含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの物理化学的特性を表２に要約する。表１Ｃに提供されるように、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルに対するＳＥＬ薬剤負荷は１％と非常に低く、薬剤負荷効率は５％と低かった。さらに、非結合型ＳＥＬを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは不安定であり、約５分以内でＳＥＬは沈殿した。対照的に、ＳＥＬは、ＰＴＸ及びＲＡＰと同時負荷したときにＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル中で６．３％負荷することに成功した。驚くべきことに、同時に負荷したとき、ＰＴＸ、ＲＡＰ、及びＳＥＬはすべて、１００％という薬剤負荷効率を達成した。これらの結果は、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルを用いた３薬の同時負荷が、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルにおける個々の薬剤負荷と比較して、薬剤負荷及び物理的安定性の改善を提供することを示している。
【００７７】
（表２）３イン１ミセルとしてＰＴＸ、ＳＥＬ、及びＲＡＰを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの物理化学的特性
2019512496.tif 000023
ａ）２１ｍｇのＰＥＧ４０００−ｂ−ＰＬＡ２２００ポリマーを使用した。
【００７８】
ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体、ｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体、ｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ複合体及びｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬ複合体の転化。溶解度を上げるために使用されるアセトニトリル及びＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、１０ｍＭ）の１：１の混合物において、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体は、約２３分で溶出し、転化の際により短い溶出時間で、十分に定義された一連のピークを生じ、約１２分のＰＴＸの溶出時間に迫った（図２Ａ）。主要ピークは、バックバイティングの際のラクトイルラクタートの喪失の際のｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸの偶数の分解産物：ｏ（ＬＡ）６−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）４−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）２−ＰＴＸ及びＰＴＸへと割り当てられたのに対し、顕著により小さなピークは、ランダム加水分解からの奇数の分解産物に対応していた。ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体、偶数の分解産物及びｏ（ＬＡ）１−ＰＴＸの相対面積（％）を時間に対してプロットした（図５Ａ）。ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体の転化のためのｔ１／２は約７．３時間であり、ｏ（ＬＡ）２−ＰＴＸを主要な種として、及びそれより少ない程度までのｏ（ＬＡ）１−ＰＴＸ及びＰＴＸを３００時間にわたって生じた。同様に、ｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体は、逆相ＨＰＬＣ分析に基づくバックバイティング分解特性を生じた（図２Ｂ、５Ｂ）：ｔ１／２＝７．４時間及び偶数の分解産物、そのほとんどがｏ（ＬＡ）２−ＰＴＸ。その一方で、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル中でのｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体またはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体の転化はかなり緩徐であった：それぞれｔ１／２＝１５７時間及び３１５時間（図７Ａ及び７Ｂ）、非極性環境（ＰＬＡコア）における隠れバックバイティング反応と一致。水溶液中でのｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体またはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体の転化は、バックバイティング反応によって迅速であるが、水中のＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルにおいては緩徐に進行するように見える。したがって、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体またはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体を安定して運搬することができ、放出の際に、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体またはｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体は、迅速なバックバイティングを受け、ｏ（ＬＡ）２−ＰＴＸを主として生じ、それより少ない程度までのｏ（ＬＡ）１−ＰＴＸ及びＰＴＸを生じる。同様に、図１０Ａ及び１１Ａは、ｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰの転化を提供し、図１０Ｂ及び１１Ｂは、ｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬの転化を提供する。
【００７９】
ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体、ｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸ複合体、ｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰ複合体、及びｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬ複合体のインビトロ及びインビボでの抗がん活性。ＰＴＸは、微小管安定化剤として有力な抗がん薬であり、非小細胞肺がんの治療において中心的な役割を担っている。したがって、ヒトＡ５４９非小がん細胞株に対するＰＴＸのＩＣ５０値は２．０ｎＭと低かった（図６）。遊離型のｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸのＩＣ５０値は、８．９ｎＭというわずかに高値を有し、転化に必要とされる時間を反映している。ミセルとしてのｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ及びｏ（ＬＡ）１６−ＰＴＸのＩＣ５０値は、約１５ｎＭと約７倍高く、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルからの放出に必要とされる時間を反映していた（７２時間超）。特筆すべきことに、バックバイティングから主として生じる種であるｏ（ＬＡ）２−ＰＴＸは、インビトロでＰＴＸと等価であった。したがって、パクリタキセルの７−ＯＨ位での２乳酸単位は、微小管の安定化に干渉せず、ｏ（ＬＡ）２−ＰＴＸ、ｏ（ＬＡ）１−ＰＴＸ及びＰＴＸを生物活性種として定義する。対照的に、２’−ＯＨエステル結合体は、細胞毒性のためにＰＴＸへと完全に転化し戻す必要がある。要約すると、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体のバックバイティングは、転化するエステラーゼに左右されることなく、細胞毒性種、主としてｏ（ＬＡ）２−ＰＴＸを生じ、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのための新規のプロドラッグ戦略を可能にする。同様に、図１２Ａ及び１２Ｂは、ＲＡＰミセル組成物、ｏ（ＬＡ）８−ＲＡＰミセル組成物、ＳＥＬ組成物、ｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬ組成物、及びｏ（ＬＡ）８−ＳＥＬミセル組成物の細胞毒性を提供する。
【００８０】
ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸプロドラッグを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのインビボでの抗がん効能を、２０ｍｇ／ｋｇの用量での毎週の尾静脈注射後のＡ５４９異種移植モデルにおいて評価した（図８）。臨床的関連性のため、ＰＴＸまたはｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体についての毎週の静脈内注射スケジュールを評価した（３回の毎週の注射及び１回の休薬×３周期）。２０ｍｇ／ｋｇのＰＴＸを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルを用いると、Ａ５４９腫瘍の成長は約２週間、ビヒクル対照の腫瘍成長と併行していたのに続いて、７１日間にわたる治療の間、腫瘍成長が抑制され、腫瘍成長を遅延させた。対照的に、２０ｍｇ／ｋｇのｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体を含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは、７１日間にわたる毎週の治療の間、腫瘍体積を減少させ、最長１２０日間再発させなかった（図８）。驚くべきことに、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸ複合体は、体重変化の点においてもＰＴＸよりも毒性が低かった（図８）。
【００８１】
ＰＴＸエステルプロドラッグは、しばしば水溶性であり、毒性はあまりないが抗がん薬として活性がほとんどない。しかしながら、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡとの本発明の複合体は、Ａ５４９異種移植モデルにおけるバックバイティング転化、物理的安定性、より低い毒性及びより高い抗腫瘍効能の点で、独特な抗がん組成物である。ＰＴＸに対する本発明の複合体のインビトロでの緩徐な放出を考慮に入れると、これらの複合体は、非標的組織へのＰＴＸの分布を低下させ、腫瘍曝露を（ＥＰＲ効果を通じて）高め、バックバイティングによる腫瘍内転化を受けることが期待される。本発明の複合体を含有する小さなサイズのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル（例えば、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸに対して約３０ｎｍ）がＥＰＲ効果に好ましく、特にＰＴＸを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルとの比較において、複合体からもたらされるＰＴＸの低いＣｍａｘは、低い宿主毒性を好む（Ｃａｂｒａｌ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．，６，８１５−８２３（２０１１）を参照されたい）。
【００８２】
ＰＴＸ、ＳＥＬ、及びＲＡＰの単独及び組み合わせにおけるインビトロでの抗がん活性。表３は、組み合わせにおけるＰＴＸ、ＲＡＰ、及びＳＥＬのＩＣ５０値が、これらの薬剤単独よりも低く、３薬の併用がインビトロでの相乗性を達成するようであることを示していることを表している。
【００８３】
（表３）Ａ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞株に対する、単独、２薬併用、及び３薬併用としてのＰＴＸ、ＳＥＬ、及びＲＡＰのＩＣ５０値及び併用指数解析
2019512496.tif 000024
【００８４】
等価物
ある特定の実施形態が図解及び説明されているが、当業者は、上述の明細書を読んだ後、本明細書に示されるような本発明の技術の複合体及びミセルまたはその誘導体、プロドラッグ、もしくは医薬組成物に対する等価物に変化、置換及び他のタイプの変更をもたらすことができる。先に説明した各態様及び実施形態は、それらとともに、他の態様及び実施形態のうちのいずれかまたはすべてに関して開示されているような変法または態様を含んでいることができ、または組み込んでいることができる。
【００８５】
本発明の技術は、本明細書に説明される特定の態様の点で制限されないことにもなっており、このことは、本発明の技術の個々の態様の単一の図解として意図されている。本発明の技術の多くの変更及び変化は、当業者に明らかになることになっているように、本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく行うことができる。本発明の技術の範囲内の機能的に等価の方法は、本明細書において列挙されたものに加えて、上述の説明から当業者に明らかとなることになっている。このような変更及び変化は、添付の特許請求の範囲内に収まるよう意図される。本発明の技術が、もちろん変わり得る特定の方法、複合体、試薬、化合物、組成物、標識した化合物または生物学的な系に制限されないことは理解されることになっている。本明細書で使用される用語は、特定の態様のみを説明する目的のためにあるのであって、制限するよう意図するものではないということも理解されることになっている。したがって、本明細書は、添付の特許請求の範囲、この範囲にある定義及びこれらのいずれの等価物によってのみ示される本発明の技術の幅、範囲及び主旨を用いてのみ、例示的とみなされるべきであることが意図される。
【００８６】
本明細書で実例として説明される実施形態は、本明細書に具体的には開示されていないいかなる要素または複数の要素、制限または複数の制限の不在下でも適切に実施され得る。したがって、例えば、「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含有している」などの用語は、広範にかつ制限なしで読まれることになっている。さらに、本明細書で採用される用語及び表現は、説明の用語として使用されており、制限の用語として使用されてはおらず、このような用語及び表現の使用において、示され及び説明される特徴またはその部分のいかなる等価物も除外することを意図するものではなく、特許請求された技術の範囲内で種々の変更が可能であることが認識される。さらに、「から本質的になる」という句は、具体的に引用される複数の要素、及び特許請求される技術の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響しない追加の要素を含むよう理解されることになっている。「からなる」という句は、指定されていないいかなる要素も除外する。
【００８７】
さらに、本開示の特徴または態様が、マーカッシュ群の点で説明されている場合、当業者は、本開示が、マーカッシュ群のいかなる個々のメンバーまたは下位群の点においてもこれにより説明されることを認識することになっている。一般的な開示内に収まる狭めの種及びあまり一般的ではないグループ化の各々も、本発明の一部を形成する。このことは、この種類からいかなる対象物も除去する条件または負の制限をともなって、この除外される材料が本明細書で具体的に列挙されているかどうかにかかわらず、本発明の一般的な説明を含む。
【００８８】
当業者によって理解されることになっているように、いかなる及びすべての目的のために。特に、記載された説明を提供する点で、本明細書で開示された範囲はすべて、その起こり得るいかなる及びすべての下位範囲及びその下位範囲の組み合わせも包含する。いかなる列挙された範囲も、少なくとも等しい半分、１／３、１／４、１／５、１／１０などへと分解される同じ範囲を十分に説明及び可能にするものとして容易に認識することができる。非限定例として、本明細書で考察される各範囲は、下位の１／３、中間の１／３及び上位の１／３などへと容易に分解されることができる。また、当業者によって理解されることになっているように、「最高」、「少なくとも」、「より大きな」、「より小さな」及びこれらに類するものなどの言葉はすべて、列挙された数を含み、先に考察した下位範囲へと後に分解することができる範囲を指す。最後に、当業者によって理解されることになっているように、範囲は、各個々のメンバーを含む。
【００８９】
本明細書において引用される公開物、特許出願、発行済みの特許、及び他の文書（例えば、雑誌、論文及び／または教科書）はすべて、各個々の公開物、特許出願、発行済みの特許、または他の文書がその全体が参照により組み込まれるよう具体的に及び個々に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれる本文中に含まれる定義は、これらの定義が本開示における定義と矛盾しない程度まで除外される。
【００９０】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に与えられる等価物の完全な範囲とともに、この範囲の中に示されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【国際調査報告】
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