(57)【要約】  本発明は、栄養要求性応答システムまたは要素をコードする操作ゲノムを有する調節可能な細胞系およびそれらの使用方法を提供する。細胞系の増殖およびタンパク質産生は、細胞系を栄養要求性応答システムまたは要素を活性化する栄養要求性因子に曝露することによって制御される。栄養要求性因子の例には、栄養素、酵素、ｐＨを変化させる部分、温度を変化させる部分、非有機分子、非必須アミノ酸、部分の濃度の変化、および細胞のニッチ環境が含まれる。これらの調節可能な細胞系は再生医療および酵素補充療法に使用されてよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
調節可能なヒト細胞系であって、栄養要求性応答システムを含むかまたはコードするように操作された操作ゲノムを含み、遺伝子の発現または活性がノックアウトまたは下方制御されて栄養要求性が生じている、調節可能なヒト細胞系。
【請求項２】
前記栄養要求性応答システムまたは要素は、栄養素、酵素、ｐＨ変化、温度変化、非有機分子、非必須アミノ酸、部分の濃度変化、およびニッチ環境からなる群から選択される栄養要求性因子の存在に応答する、請求項１に記載の調節可能な細胞系。
【請求項３】
正常な生理的条件下では、前記栄養素または前記酵素は、細胞系毒性でも、ヒトにおいて前記調節可能な細胞系を維持するのに十分な濃度でバイオアベイラブルでもない、請求項２に記載の調節可能な細胞系。
【請求項４】
前記栄養素は、表１に列挙したものから選択される、請求項２または請求項３に記載の調節可能な細胞系。
【請求項５】
前記栄養素はウラシルまたはビオチンである、請求項２〜４のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系。
【請求項６】
ノックアウトまたは下方制御された前記遺伝子は、表１に列挙したものから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系。
【請求項７】
ノックアウトまたは下方制御された前記遺伝子は、ウリジン一リン酸合成酵素またはホロカルボキシラーゼ合成酵素である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系。
【請求項８】
前記細胞系は、リンパ球、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなる群から選択される少なくとも１つの細胞タイプを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系。
【請求項９】
前記細胞系は、Ｔ細胞系である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系。
【請求項１０】
前記操作ゲノムは治療用産物、任意選択でサイトカイン、抗原、および幹細胞からなる群から選択される少なくとも１つを標的とする治療用産物をさらに含むかまたはコードする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系。
【請求項１１】
前記操作ゲノムは、前記栄養要求性因子を産生または代謝するタンパク質をコードする遺伝子のノックアウトを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
無菌である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
栄養要求性因子をさらに含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
（ａ）ヒトへの投与、または（ｂ）疾患、障害もしくは状態の治療に使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
細胞系（ａ）ヒトへの投与、または（ｂ）疾患、障害もしくは状態の治療に使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の調節可能な細胞系または請求項１２もしくは請求項１３に記載の組成物であって、栄養要求性因子が前記細胞系または組成物と同時にまたは連続して投与される、細胞系または組成物。
【請求項１７】
対象における疾患、障害または状態を治療する方法であって、（ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の調節可能なヒト細胞系を前記対象に投与すること、および（ｂ）前記調節可能なヒト細胞系の増殖を促進するのに十分な量で栄養要求性因子を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１８】
対象における疾患、障害または状態を調節可能な細胞系で治療する方法であって、
（ｉ）前記対象には存在しない栄養素、酵素、ｐＨ変化、温度変化、部分の濃度変化、および／またはニッチ環境に対して栄養要求性であるヒト細胞系を生成すること、
（ｉｉ）前記対象を、得られたステップ（ｉ）の前記栄養要求性細胞系に接触させること、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の前記対象を、前記対象には以前に存在しなかった前記対象における栄養素、酵素、ｐＨおよび／または温度を変化させる部分、および細胞のニッチ環境から選択される栄養要求性因子に接触させることであって、前記栄養要求性因子が、前記栄養要求性システムまたは要素を活性化して、前記細胞系の増殖および／または前記対象のための１つまたは複数の治療物の発現をもたらすこと
を含む方法。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の調節可能なヒト細胞系を含む、ヒトへの投与に使用するための栄養素。
【請求項２０】
前記調節可能なヒト細胞系は治療用産物をコードする操作ゲノムを有し、および前記栄養素は、対象における疾患、障害、または状態を治療するための有効量の前記治療用産物の発現を誘導するのに十分な量で投与される、請求項１９に記載の使用のための栄養素。
【請求項２１】
（ａ）前記栄養素はウラシルであり、かつウリジン一リン酸合成酵素は前記調節可能なヒト細胞系においてノックアウトもしくは下方制御されている、または（ｂ）前記栄養素はビオチンであり、かつホロカルボキシラーゼ合成酵素は前記調節可能なヒト細胞系においてノックアウトもしくは下方制御されている、請求項１９または請求項２０に記載の使用のための栄養素。
【請求項２２】
前記疾患、前記障害、または前記状態は、がん、パーキンソン病、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫状態、過剰増殖性障害または状態、悪性転化、肝臓状態、遺伝性状態、若年発症糖尿病および眼コンパートメント状態からなる群から選択される、請求項１５もしくは請求項１６に記載の使用のための細胞系もしくは組成物、請求項１７もしくは請求項１８に記載の方法、または請求項２０もしくは請求項２１に記載の使用のための栄養素。
【請求項２３】
前記疾患、前記障害、または前記状態は、筋肉系、骨格系、循環器系、神経系、リンパ系、呼吸器系、内分泌系、消化系、排せつ系、および生殖系からなる群から選択される少なくとも１つの体の組織に影響を及ぼす、請求項１５もしくは請求項１６に記載の使用のための細胞系もしくは組成物、請求項１７もしくは請求項１８に記載の方法、または請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の使用のための栄養素。
【請求項２４】
前記細胞系は再生性である、請求項１５もしくは請求項１６に記載の使用のための細胞系もしくは組成物、請求項１７もしくは請求項１８に記載の方法、または請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の使用のための栄養素。
【請求項２５】
前記対象が複数の調節可能な細胞系に接触する、請求項１５もしくは請求項１６に記載の使用のための細胞系もしくは組成物、請求項１７もしくは請求項１８に記載の方法、または請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の使用のための栄養素。
【請求項２６】
前記対象が１つまたは複数の栄養要求性因子に接触する、請求項１５もしくは請求項１６に記載の使用のための細胞系もしくは組成物、請求項１７もしくは請求項１８に記載の方法、または請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の使用のための栄養素。
【請求項２７】
ステップ（ｉｉｉ）は前記栄養素または前記酵素の局所的な放出を含む、請求項１７、１８または請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記局所的な放出は生体適合性デバイスの利用を介して達成される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記生体適合性デバイスは前記対象における前記細胞系の拡散を制限する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象における前記調節可能な細胞系の治療効果を枯渇させるため、または前記調節可能な細胞系において細胞死を誘導するために前記栄養要求性因子を除去することをさらに含む、請求項１５もしくは請求項１６に記載の使用のための細胞系もしくは組成物、または請求項１７、１８もしくは２２〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療効果は、分子輸送、細胞死の誘導、追加の細胞の動員、および細胞増殖からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１５もしくは請求項１６に記載の使用のための細胞系もしくは組成物、または請求項１７、１８もしくは２２〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記栄養要求性因子は局所的に放出される栄養素または酵素であり、前記放出は、任意選択で生体適合性デバイスの利用を介して達成され、前記デバイスは任意選択で前記細胞系の拡散を制限する、請求項１６に記載の使用のための細胞系または組成物。
【請求項３３】
前記細胞系はステップ（ｉ）より前に前記対象から得たものである、請求項１８または２２〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞は、ヌクレアーゼを使用して標的遺伝子に１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失または置換を導入し、それによってその遺伝子の発現をノックアウトまたは下方制御することによって、ステップ（ｉ）において栄養要求性にされる、請求項１８または２２〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の調節可能なヒト細胞系を生成する方法であって、
（ａ）細胞のプールを得るステップと、
（ｂ）ヌクレアーゼを使用して標的遺伝子に付加、欠失または置換を導入し、それによってその遺伝子の発現をノックアウトまたは下方制御するステップと、
（ｃ）栄養要求性をスクリーニングするステップと
を含む方法。
【請求項３６】
前記標的遺伝子は表１から選択される、請求項３４または請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的遺伝子はウリジン一リン酸合成酵素またはホロカルボキシラーゼ合成酵素から選択される、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞はリンパ球（Ｔ細胞など）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞は表１に列挙した因子に対して栄養要求性である、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞はウラシルまたはビオチンに対して栄養要求性である、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞系が栄養要求性である因子の存在下でのみ、または栄養要求性因子を合成することができる酵素をコードする発現ベクター（染色体に組み込まれた、またはエピソーム）を添加する場合のみ、増殖することができる栄養要求性細胞系の生成に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞療法は有望な治療を提供することが示されている。それにもかかわらず、外来性の培養細胞をヒト宿主に再導入することは危険性を有する。例えば、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）療法は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の危険性を有し、幹細胞療法は、悪性転化（例えば奇形腫）の危険性を有する。
【０００３】
ある場合には、安全スイッチとして導入遺伝子を挿入することがある。導入遺伝子ベースのオフスイッチにも（１）細胞系の発がん性形質転換をもたらす腫瘍抑制因子への導入遺伝子の挿入、および（２）発現の欠如、したがって有効性の欠如をもたらす後成的にサイレンシングされた領域への導入遺伝子の挿入、のような多数の危険性がある。ゲノム不安定性は、細胞の発がん性形質転換における共通の表現型である。さらに、点突然変異または外来性自殺スイッチの遺伝的喪失は迅速に選択され、増幅される。
【０００４】
しかし、細胞のシグナル伝達経路を標的とすることに基づく安全スイッチは、細胞の生理学に依存する。例えば、「生存促進」モードにある細胞はカスパーゼ阻害剤を発現し、自殺スイッチ誘導時の細胞死を防ぐ場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
その結果、細胞療法で治療されている対象の外の因子によって調節可能であり、患者において発がん性形質転換または有効性の喪失の危険性が減少している細胞療法を開発することが当技術分野において長い間必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の様々な実施形態は、栄養要求性応答システムもしくは要素を含むかまたはコードする操作ゲノムを含む調節可能な細胞系を提供する。
【０００７】
ある実施形態は、栄養素、酵素、ｐＨ変化、温度変化、非有機分子、非必須アミノ酸、部分の濃度変化、およびニッチ環境からなる群から選択される栄養要求性因子の存在に応答するものとして、栄養要求性応答システムまたは要素を提供する。ある実施形態は、細胞系毒性でも、ヒトにおいて調節可能な細胞系を維持するのに十分な濃度でバイオアベイラブルでもないものとして栄養素または酵素を提供する。一般的にそのような濃度は正常な生理的条件と比較して測定される。例えば、一実施形態では栄養素はビオチンであり、別の実施形態では栄養素はウラシルである。ある実施形態は、細胞系を哺乳動物として提供する。例えば、哺乳動物細胞系はヒトである。ある実施形態は、細胞系がリンパ球（例えばＴ細胞）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなる群から選択される少なくとも１つの細胞タイプを含むことを提供する。ある特定の実施形態では、操作ゲノムは治療用産物をさらに含むかまたはコードする。そのような治療用産物は、サイトカイン、抗原、幹細胞、およびＴ細胞からなる群から選択される少なくとも１つの治療標的を標的とするものであってよい。ある態様は、栄養要求性因子を産生または代謝するタンパク質をコードする遺伝子のノックアウトを含むものとして操作ゲノムを提供する。あるいは、そのような遺伝子が栄養要求性因子を直接コードしてもよい。
【０００８】
本発明の様々な実施形態は、対象における疾患、障害または状態を調節可能な細胞系で治療する方法であって、（ｉ）対象には存在しないような栄養素、酵素、ｐＨ変化、温度変化、および／またはニッチ環境に対して栄養要求性である細胞系、例えば哺乳動物またはヒト細胞系を生成すること、（ｉｉ）対象を、得られたステップ（ｉ）の栄養要求性細胞系に接触させること、（ｉｉｉ）栄養要求性因子が、栄養要求性システムまたは要素を活性化して、細胞系の増殖および／または対象のための１つまたは複数の治療物の発現をもたらすように、（ｉｉ）の対象を、対象には以前に存在しなかった対象における栄養素、酵素、ｐＨを変化させる部分、温度を変化させる部分、および細胞のニッチ環境から選択される栄養要求性因子に接触させることを含む方法を提供する。対象の疾患、障害、または状態の治療における本発明による調節可能な細胞系の使用もまた本発明の範囲内に含まれる。
【０００９】
ある実施形態は、がん、パーキンソン病、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫状態（autoimmune condition）、過剰増殖性障害または状態、悪性転化、肝臓状態（liver condition）、遺伝性の遺伝的欠損を含む遺伝性状態（genetic condition）、若年発症糖尿病および眼コンパートメント状態（ocular compartment condition）からなる群から選択される、疾患、障害、または状態（condition）を提供する。
【００１０】
ある特定の実施形態では、疾患、障害、または状態は、筋肉系、骨格系、循環器系、神経系、リンパ系、呼吸器系、内分泌系、消化系、排せつ系、および生殖系からなる群から選択される少なくとも１つの体の組織に影響を及ぼす。ある実施形態は、細胞系を再生性のものとして提供する。本発明の一態様では、対象を複数の調節可能な細胞系におよび／または１つまたは複数の栄養要求性因子に接触させてよい。ある実施形態は、栄養素または酵素の局所的な放出を提供する。例えば、局所的な放出は生体適合性デバイスの利用を介して達成される。本発明の一態様では、生体適合性デバイスは対象における細胞系の拡散を制限する場合がある。本方法のある実施形態は、対象における調節可能な細胞系の治療効果を枯渇させるため、または調節可能な細胞系において細胞死を誘導するために栄養要求性因子を除去することを提供する。本方法のある実施形態は、分子輸送、細胞死の誘導、細胞死、および追加の細胞の動員からなる群から選択される少なくとも１つを含むものとして治療効果を提供する。本方法のある実施形態は、細胞系が、細胞系において栄養要求性応答または要素を生成するより前に対象から得ることを提供する。
【００１１】
また、本発明の栄養要求性細胞系を作製する方法が本明細書で提供される。対象における疾患、障害または状態を治療する方法であって、（ａ）本発明による調節可能な細胞系を対象に投与すること、および（ｂ）調節可能なヒト細胞系の増殖を促進するのに十分な量で栄養要求性因子を対象に投与することを含む方法がさらに提供される。また、患者への投与に使用するための栄養素であって、本発明による調節可能な細胞系を含む栄養素が提供される。ある特定の実施形態では、例えば対象から細胞を単離し、栄養要求性応答システムを含むかまたはコードするように前記細胞のゲノムを操作することによって、例えば前記細胞において遺伝子の発現または活性をノックアウトまたは下方制御しそれによって栄養要求性を生じさせることによって、調節可能な細胞系は、対象の細胞から得る。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
Ｉ．緒言
生物学的封じ込めは、細胞増殖、転写、および翻訳の調節を可能にする遺伝子技術である。Kato et al., PeerJ, 3:e1247; DOI 10.7717/peerj.1247 (2015)を参照。封じ込めは、細胞系を栄養要求性にするために必須の遺伝子を除去するように、細胞系を遺伝子操作することによって達成することができる。栄養要求性は、細胞が増殖および再生に必要な有機化合物を産生できないことを引き起こす細胞の状態である。ある特定の実施形態では、栄養要求性は、栄養要求性応答システムまたは要素をコードするゲノムを遺伝子操作することによって細胞に誘導されてよい。本明細書で使用される場合、「栄養要求性応答システムまたは要素」という用語は、栄養要求性因子の存在に応答する、本明細書に記載の調節可能な細胞系のゲノムの一部を表す。この調節は、細胞系が特定の因子に対して栄養要求性になるように、遺伝子のノックアウトまたは遺伝子の活性の下方制御のいずれかによって引き起こされる。
【００１３】
栄養要求性応答システムまたは要素は、栄養素、酵素、ｐＨ変化、温度変化、非有機分子、非必須アミノ酸、部分の濃度変化、およびニッチ環境のような栄養要求性因子の存在に応答してよい。ある特定の実施形態では、栄養要求性因子は、細胞系毒性でも、対象において調節可能な細胞系を維持するのに十分な濃度でバイオアベイラブルでもない栄養素または酵素である。一般的にそのような濃度は正常な生理的条件と比較して測定される。本明細書で使用される場合、「ニッチ環境」という用語は、治療物の増殖または産生に必要な因子を供給する、本明細書に記載の調節可能な細胞系の生息環境を表す。
【００１４】
管理区域外では、栄養要求性因子の欠如、または栄養要求性因子が存在しても栄養要求性応答システムもしくは要素を活性化するには濃度が低すぎるために細胞系は死滅するはずであり、このことは発がん性形質転換を含む他の細胞ベースの療法と関連する危険性を減らす。
【００１５】
ＩＩ．本発明の組成物
上記のように、外的に制御される因子によって活性化される栄養要求性応答システムまたは要素を含むように遺伝子操作された細胞系は、調節可能な細胞系のゲノムによってコードされている治療物の選択的増殖および産生を可能にする。この取り組み方は、細胞ベースの療法に関連した問題の多くを克服するのに有用である場合がある。
【００１６】
本明細書で、本発明の組成物は、栄養要求性応答システムまたは要素を含むように遺伝子操作された細胞系を含む。本明細書で使用される場合、「細胞系」は、同一細胞に由来する細胞集団を表し、集団の各細胞は類似の遺伝子構造を有する。
【００１７】
ある特定の実施形態では、栄養要求性応答システムまたは要素を含むように遺伝子操作された細胞系は、哺乳動物であってよい。具体的には、哺乳動物細胞系はヒトであってよい。あるいは、細胞系は哺乳動物ではない場合がある。
【００１８】
ある特定の実施形態では、栄養要求性応答システムまたは要素は遺伝子ノックアウトであってよい。本明細書で使用される場合、「遺伝子ノックアウト細胞系」は、当技術分野で公知の分子生物学的技術を使用して達成されている、完全な機能喪失をもたらす遺伝子の、標的化された破壊を有する細胞系である。あるいは、遺伝子は、内来性プロモーター、または一般に使用される強い／弱い、構成的／誘導性プロモーター（ＳＶ４０／ＣＭＶ／ｔｅｔその他）を用いてクローニングされ、そして細胞系のゲノムに挿入され得る。例えば、「ノックイン」調節可能な細胞系。
【００１９】
栄養要求性ヒト細胞系は、ヒト／哺乳動物細胞のゲノム編集に利用可能なポジティブ選択マーカーの待望の数の増加を提供する。
【００２０】
例えば遺伝子ノックアウトまたは下方制御される遺伝子の発現を引き起こすために、核酸を編集するための様々な方法が当技術分野において公知である。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはそれらの組合せのような様々なヌクレアーゼシステムは、当技術分野において公知であり、核酸を編集するために使用され、そして本発明において使用され得る。最近、クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステムが、ゲノム工学でより一般に使用されるようになった。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、例えば国際公開第２０１３／１７６７７２号、国際公開第２０１４／０９３６３５号および国際公開第２０１４／０８９２９０号に詳細に述べられている。Ｔ細胞におけるその使用は、国際公開第２０１４／１９１５１８号に示唆されている。
【００２１】
突然変異体（ノックアウト、ノックイン、または遺伝子置換）細胞系の生成の時間制限因子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォームの開発前のクローンのスクリーニングおよび選抜であった。本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォーム」という用語は、Ｃａｓ９に対する結合部位および修飾される領域に特異的な標的配列を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を含む遺伝工学ツールを表す。Ｃａｓ９はｇＲＮＡと結合して、標的領域と結合し切断するリボヌクレオタンパク質を形成する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の前に、哺乳動物のゲノム編集は多重化することができたが、特定の突然変異、導入遺伝子挿入、または遺伝子欠失の選抜には抗生物質耐性マーカーまたは手間のかかるＰＣＲベースのスクリーニング方法が必要であった。
【００２２】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォーム（タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムである）に加えて、タイプＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、タイプＩＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、およびタイプＶ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む代替システムが存在する。いくつか挙げると、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）Ｃａｓ９（ＳｔＣａｓ９）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）Ｃａｓ９（ＣｊＣａｓ９）およびナイセリア・シネレア（Neisseria cinerea）Ｃａｓ９（ＮｃＣａｓ９）を含む様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが開示された。Ｃａｓシステムに代わるものは、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）、アシダミノコッカス属種（Acidaminococcus sp.）Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）、およびラクノスピラセアエ・バクテリウム（Lachnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６  Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）システムを含む。上記のＣＲＩＳＰＲシステムのいずれも、本発明の細胞系を生成するための方法において使用してよい。一実施形態では、使用するＣＲＩＳＰＲシステムはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。一実施形態では、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが使用される。
【００２３】
標的遺伝子は、例えば上記の方法を使用して、前記標的遺伝子内の１つまたは複数のヌクレオチドを欠失、挿入または置換することによって編集されてよく、その遺伝子のノックアウト、またはその遺伝子の発現の下方制御をもたらす。
【００２４】
現在、５つの抗生物質、ブラストサイジン、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ピューロマイシン、およびゼオシンのみが一般に哺乳動物細胞のポジティブ選択に使用される。さらに、これらの抗生物質に対する異なる細胞系の応答が異種混合であるため、選抜が手間のかかるプロセスになる。したがって、代替の選抜方法が望まれる。
【００２５】
調節可能な細胞系のゲノムによってコードされる治療物は、分子輸送、細胞死の誘導、追加の細胞の動員、または細胞増殖のような治療効果を引き起こす場合がある。
【００２６】
調節可能な細胞系
対象に投与した場合、細胞の免疫拒絶を防止するために、調節可能な細胞系は対象自身の細胞から得てもよい。例えば、細胞は、上皮、軟骨、骨、平滑筋、横紋筋、神経性上皮、重層扁平上皮、および神経節のいずれかにおける再生医療に使用するために対象から単離された幹細胞であってよい。パーキンソン病および若年発症糖尿病のような１つまたは少数の細胞タイプの死や機能不全に起因する疾患も幹細胞を使用して治療されることが一般的である。Thomson et al., Science, 282:1145-1147 (1998)を参照。
【００２７】
本明細書に記載の調節可能な細胞系は、栄養要求性応答システムまたは要素を介して、細胞環境の外部の状態によって治療を制御することを可能にする。栄養要求性応答システムまたは要素は、遺伝子ノックアウトまたは発現の下方制御を含む場合がある。ある特定の実施形態では、栄養要求性応答システムまたは要素は、栄養要求性因子の遺伝子ノックアウトまたは栄養要求性因子の代謝に影響を及ぼす遺伝子である。
【００２８】
遺伝子操作されたゲノムを含む例となる調節可能な細胞系を開発するためのノックアウトのための遺伝子候補は、様々な供給源から同定され、以下を含む：（１）国立衛生研究所（ＮＩＨ）のＴｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）における代謝過程アノテーションを持つ決して突然変異していない遺伝子、（２）モデル生物において一般に使用される遺伝子欠失のヒトホモログを同定する、（３）公開されているヒト必須遺伝子スクリーニング（培養培地にはシンターゼの添加物が含まれている場合がある）、および（４）ヒトの遺伝性代謝疾患で突然変異した酵素。あるいは、細胞系は、Ｈｏｒｉｚｏｎ（登録商標）  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｇｒｏｕｐ、ＰＬＣからのＨＡＰ１細胞系のように、既に遺伝子ノックアウトがなされたものを、商業的販売業者から購入した。遺伝子操作されたゲノムにおけるノックアウトは、栄養要求性因子を発現する遺伝子のものであってよい。
【００２９】
本発明の調節可能な細胞系を創出するために、様々な遺伝子をノックアウトしてよい。一実施形態では、ノックアウトまたは下方制御される遺伝子は、ウリジン一リン酸合成酵素（ＵＭＰＳ）（ウラシルに対する栄養要求性の細胞系を創出する）およびホロカルボキシラーゼ合成酵素（ビオチンに対する栄養要求性の細胞系を創出する）から選択される。一実施形態では、ノックアウトまたは下方制御される遺伝子はウリジン一リン酸合成酵素である。表１は、ノックアウトされ得る遺伝子および細胞増殖を回復させるのに必要とされる栄養要求性因子のより完全なリストを示す。
【００３０】
【表１−１】
2019534050.tif 000002
【００３１】
【表１−２】
2019534050.tif 000003
【００３２】
【表１−３】
2019534050.tif 000004
【００３３】
【表１−４】
2019534050.tif 000005
【００３４】
表１の遺伝子は、サッカロマイセス属（Saccharomyces）ゲノムデータベース（ＳＧＤ）上の酵母表現型オントロジーデータベースからの「化学」データと共にダウンロードされた「栄養要求性」として注釈を付けられた表現型を有するＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）遺伝子を選択することによって照合された（Cherry et al. 2012, Nucleic Acids Res. 40:D700-D705）。これらの遺伝子はＹｅａｓｔＭｉｎｅ（ＳＧＤ上にも見られる）を用いてヒトホモログへ変換された。
【００３５】
細胞系は、リンパ球、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から選択されてよい。一実施形態では、細胞系はＴ細胞系である。一実施形態では、細胞系はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞系である。栄養要求性応答システムまたは要素に加えて、治療用産物は、ゲノムを遺伝子操作して治療用産物をコードすることによって細胞系に導入されてよい。そのような治療用産物は、サイトカイン、抗原、または幹細胞のうちの少なくとも１つを標的とする場合がある。
【００３６】
ある特定の実施形態では、栄養要求性応答システムまたは要素は栄養要求性因子によって活性化される翻訳スイッチを含む。スイッチは、転写産物の開始コドンの隣に挿入された終止コドンを用いて標的遺伝子転写産物を調節する場合がある。栄養要求性因子の存在で、翻訳は終止コドンを通って継続し、標的遺伝子が発現する。ある特定の実施形態では、栄養要求性因子が存在しないと、終止コドンで翻訳が終了し、標的遺伝子は発現しない。治療物の発現速度はまた、栄養要求性因子の濃度を調整することによって調節される場合がある。Chaveroux et al., Nature Biotechnology, 34, 746-751 (2016)を参照。本発明の一実施形態では、調節可能な細胞系は外来性誘導性プロモーターを含まない。
【００３７】
栄養要求性ベースの安全機構は、現在の細胞療法に関連した患者への危険性の多くを回避する。療法の過程で患者に規定の栄養要求性因子を補給し、そして療法の中止または他の何らかの安全性ベースの兆候の際にその因子を除去することによって、細胞増殖は物理的に制限される。細胞が必要な酵素を含まず、生合成に必要な栄養素を持たない場合、細胞は分裂を停止し、耐性の発生のための自明の機構を持たない。栄養要求性因子のレベルを操作することによって、インビボの細胞の増殖率が制御される。複数の細胞系は、別々の栄養要求性を使用することによってインビボで独立して制御され得る。位置特異的増殖は、栄養素を放出し細胞の漏出を防止する生体適合性デバイス内に投与された外来的に増殖した膵臓Ｂ細胞のような局所的な栄養素放出によって制御され得る。例えば、本発明は、インビボでのＣＡＲ−Ｔ細胞の活性に対するより明確な制御を可能にするために、ＣＡＲ−Ｔ細胞技術と組み合わせて使用してよい。上記のように、Ｔ細胞のＣＲＩＳＰＲ工学は欧州特許第３００４３４９号に論じられている。
【００３８】
細胞系は、その内容全体を参照により本明細書に組み込むものとする米国特許第８，９４５，８６２号に示されるように、以下の技術を用いて維持および分化された幹細胞を含む場合がある。一実施形態では、幹細胞はヒト胚性幹細胞ではない。さらに、細胞系は、国際公開第２００３／０４６１４１号またはChung et al. (Cell Stem Cell, February 2008, Vol. 2, pages 113-117）に開示された技術によって作製された幹細胞を含む場合がある。
【００３９】
細胞系の遺伝子操作されたゲノムは、治療用産物をコードする場合がある。そのような治療用産物は、サイトカイン、抗原、および幹細胞のうちの少なくとも１つを標的とする場合がある。
【００４０】
栄養要求性因子
調節可能な細胞系の栄養要求性応答システムまたは要素は、栄養素、酵素、ｐＨ変化、温度変化、非有機分子、非必須アミノ酸、部分の濃度変化、およびニッチ環境から選択される栄養要求性因子の存在に応答してよい。栄養要求性因子は、毒性でもなく、バイオアベイラブルでもなく、また調節可能な細胞系で治療される対象において栄養要求性応答システムまたは要素を活性化するのに十分な濃度で存在しなくてもよい。一般的にそのような濃度は、正常な生理的条件と比較して測定される。
【００４１】
例えば、栄養要求性因子は、増殖に必要な物質であるか、または調節可能な細胞系の代謝における補因子として機能する栄養素であってよい。様々な栄養要求性因子を表１に開示する。ある特定の実施形態では、栄養要求性因子は、ビオチン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタメート、セリン、ウラシルおよびコレステロールから選択される。ビタミンＢ７としても知られるビオチンは、細胞増殖に必要である。本発明の一実施形態では、調節可能な細胞系はビオチンまたはウラシルに対して栄養要求性である。
【００４２】
あるいは、栄養要求性因子は、細胞の代謝過程および／または調節可能な細胞系のゲノムによってコードされている治療用産物の発現を触媒する酵素である。酵素は、酸性アルファグルコシダーゼ、リソソームグルコセレブロシダーゼ、およびグロボトリアオシルセラミドから選択される場合がある。
【００４３】
ＩＩＩ．医薬組成物
調節可能な細胞系を対象へ直接、または栄養要求性因子と組み合わせて投与してよい。しかし、本明細書で提供される医薬組成物の説明は、原則としてヒトへの投与に適した医薬組成物を対象としているが、そのような組成物が任意の他の動物、例えば非ヒト動物または非ヒト哺乳動物への投与に一般的に適していることは当業者には理解されよう。組成物を様々な動物への投与に適したものにするための、ヒトへの投与に適した医薬組成物の改変はよく理解されおり、獣医薬理学者は、あるとしても通常の実験だけでそのような改変を設計および／または実行することができる。医薬組成物の投与が企図される対象は、これらに限定されないが、ヒトおよび／または他の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、ラットのような商業的に関連のある哺乳動物を含む哺乳動物、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウのような商業的に関連のある鳥を含む鳥が挙げられる。一部の実施形態では、組成物はヒト、ヒト患者、または対象へ投与される。
【００４４】
本明細書に記載の医薬組成物は、対象の疾患、障害または状態を治療する方法であって、（ｉ）対象には存在しないような栄養素、酵素、ｐＨ変化、温度変化、部分の濃度変化、および／またはニッチ環境に対して栄養要求性である細胞系を生成すること、（ｉｉ）対象を、得られたステップ（ｉ）の栄養要求性細胞系に接触させること、（ｉｉｉ）栄養要求性因子が、栄養要求性システムまたは要素を活性化して、細胞系の増殖および／または対象のための１つまたは複数の治療物の発現をもたらすように、（ｉｉ）の対象を、栄養素、酵素、ｐＨおよび／または温度を変化させる部分、および対象における細胞のニッチ環境から選択される栄養要求性因子に接触させることを含む方法に使用されてよい。
【００４５】
本発明の医薬組成物は、また、対象における疾患、障害または状態を治療する方法であって、（ａ）本発明による調節可能な細胞系を対象に投与すること、および（ｂ）調節可能な細胞系の増殖を促進するのに十分な量で栄養要求性因子を対象に投与することを含む方法に使用されてよい。
【００４６】
栄養素栄養要求性因子を含む組成物はまた、本発明の調節可能な細胞系を含むヒトへの投与にも使用されてよい。
【００４７】
疾患、障害、または状態は、筋肉系、骨格系、循環器系、神経系、リンパ系、呼吸器系、内分泌系、消化系、排せつ系、および生殖系からなる群から選択される少なくとも１つの体の組織に影響を及ぼす。例えば、本明細書に記載の医薬組成物によって治療される場合がある疾患、障害、または状態は、がん、パーキンソン病、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、自己免疫状態、過剰増殖性障害または状態、悪性転化、肝臓状態、遺伝性状態、若年発症糖尿病および眼コンパートメント状態からなる群から選択される。対象において複数の細胞タイプに影響を及ぼす状態は、各細胞系が異なる栄養要求性因子によって活性化されている、複数の調節可能な細胞系で治療され得る。ある場合には、対象は複数の栄養要求性因子を投与され得る。
【００４８】
治療終了時に、対象における調節可能な細胞系の治療効果を枯渇させるため、または調節可能な細胞系において細胞死を誘導するために栄養要求性因子は除去されてよい。
【００４９】
ＩＶ．製剤
細胞工学製剤
調節可能な細胞系は、栄養要求性応答システムまたは要素を含むように遺伝子操作されている。細胞系へのＣａｓ９タンパク質／ｇＲＮＡリボヌクレオタンパク質複合体（Ｃａｓ９  ＲＮＰ）の送達は、リポソームを介したトランスフェクション、エレクトロポレーション、または細胞系における栄養要求性応答システムまたは要素をもたらすインデルを生成するための核局所化によって実行され得る。
【００５０】
治療製剤
本発明の調節可能な細胞系または栄養要求性因子は、（１）安定性を高めるため、（２）生体内分布を変えるため（例えば、細胞系を特異的な組織または細胞タイプに標的化するため）、（３）コードされた治療用産物の放出プロファイルを変えるため、および／または（４）栄養要求性因子の取込みを改善するため、の１つまたは複数の賦形剤を用いて製剤化され得る。
【００５１】
本発明の製剤は、生理食塩水、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、ペプチド、タンパク質、およびそれらの組合せを含むことができるがこれらに限定されない。
【００５２】
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって調製されてよい。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、少なくとも１つの活性成分および任意選択で１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を表す。本発明の医薬組成物は無菌であってよい。
【００５３】
一般的に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つもしくは複数の他の副成分と会合させるステップを含む。本明細書で使用される場合、「活性成分」という語句は、一般に、本明細書に記載の栄養要求性応答システムまたは要素をコードする操作ゲノムを含む調節可能な細胞系を表す。
【００５４】
本明細書に記載の調節可能な細胞系または栄養要求性因子および医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって調製されてよい。一般的に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つもしくは複数の他の副成分と会合させ、次いで必要であるおよび／または望ましい場合、産物を所望の単回または複数回用量単位に分割、成形、および／または包装するステップを含む。
【００５５】
本開示による医薬組成物は、単一の単位用量として、および／または複数の単一の単位用量として、まとめて調製、包装、および／または販売してよい。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、所定の量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量を表す。活性成分の量は一般に、対象に投与されるであろう活性成分の投与量、および／または例えばそのような投与量の半分または３分の１のような好都合な部分投与量に等しい量である。
【００５６】
本開示による医薬組成物中の活性成分（例えば、調節可能な細胞系または栄養要求性因子）、薬学的に許容される賦形剤、および／または任意の追加の成分の相対量は、治療されている対象の正体、サイズおよび／または状態に応じて、さらに組成物が投与されるべき経路に応じて変えてよい。例えば、組成物は０．１％から９９％（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含んでよい。例えば、組成物は、０．１％から１００％の間、例えば、０．５から５０％の間、１〜３０％の間、５〜８０％の間、または少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分含んでよい。
【００５７】
賦形剤および希釈剤
一部の実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋であってよい。一部の実施形態では、賦形剤は、ヒトおよび獣医学的用途での使用が認可されている。一部の実施形態では、賦形剤は米国食品医薬品局によって認可されている場合がある。一部の実施形態では、賦形剤は医薬品グレードであってよい。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準を満たし得る。
【００５８】
本明細書で使用される場合、賦形剤は、これらに限定されないが、所望の特定の剤形に適した、あらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤などが挙げられる。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤および組成物を調製するための技術は、当技術分野で公知である。（Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006を参照。参照によってその内容全体を本明細書に組み込む）。従来の賦形剤媒体の使用は、何らかの望ましくない生物学的効果を生じさせることによって、またはそうでなければ医薬組成物の他の任意の構成要素と有害な方法で相互作用することによってなどの、任意の従来の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と不適合であり得るのでない限り、本開示の範囲内で企図され得る。
【００５９】
例となる希釈剤は、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉末糖、その他、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
【００６０】
不活性成分
一部の実施形態では、調節可能な細胞製剤は少なくとも１つの不活性成分を含んでよい。本明細書で使用される場合、「不活性成分」という用語は、製剤に含まれる医薬組成物の活性成分の活性に寄与しない１つまたは複数の薬剤を表す。一部の実施形態では、本発明の製剤で使用してよい不活性成分のすべてまたは一部は米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されているか、どれも認可されていない場合がある。
【００６１】
薬学的に許容される塩
本発明の製剤はまた、１つまたは複数の薬学的に許容される塩を含んでよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、親化合物が既存の酸または塩基部分をその塩の形態に変換されることによって（例えば、遊離塩基を適切な有機酸と反応させることによって）修飾されるような、開示された化合物の誘導体を表す。薬学的に許容される塩の例は、これらに限定されないが、ミネラルまたはアミンのような塩基性残基の有機酸塩、アルカリまたはカルボン酸のような酸性残基の有機塩、などが挙げられる。代表的な酸付加塩は、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコナート（digluconate）、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などを含む。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに非毒性のアンモニウム、第四級アンモニウム、およびアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどを含むがこれに限定されるものではないアミンカチオンを含む。本開示の薬学的に許容される塩は、例えば、非毒性の無機酸または有機酸から形成された親化合物の従来の非毒性塩を含む。
【００６２】
溶媒和物は、有機溶媒、水、またはそれらの混合物を含む溶液からの結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製され得る。適した溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物および三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒である場合、溶媒和物は「水和物」と呼ばれる。
【００６３】
Ｖ．投薬および投与
上記の医薬組成物に含まれる本発明の調節可能な細胞系または栄養要求性因子は、治療的に有効な転帰になる任意の送達経路によって投与されてよい。これらには、以下に限定されないが、経腸（腸の中へ）、経胃腸、硬膜外（硬膜の中へ）、経口（口を経由して）、経皮（transdermal）、脳内（大脳の中へ）、脳室内（脳室の中へ）、経皮（epicutaneous）（皮膚上に塗布）、皮内（皮膚自体の中へ）、皮下（皮膚の下に）、鼻投与（鼻から）、静脈内（静脈の中へ）、静脈内急速静注、静脈内注入、動脈内（動脈の中へ）、筋肉内（筋肉の中へ）、心臓内（心臓の中へ）、骨内の点滴（骨髄の中へ）、クモ膜下（intrathecal）（脊柱管の中へ）、実質内（脳組織の中へ）、腹腔内（腹膜の中へ点滴または注射）、膀胱内点滴、硝子体内（目から）、陰茎海綿体内注射（病的腔の中へ）、腔内（陰茎の基部の中へ）、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（transdermal）（全身分布のための無傷の皮膚を通した拡散）、経粘膜（粘膜を通した拡散）、経膣、通気（すする）、舌下腺、口唇下、かん腸、点眼液（結膜上に）、または点耳薬、経耳（耳の中または耳を経由して）、口腔（頬に向けて）、経結膜、皮膚、歯科用（歯へ）、電気浸透、頸管内、耳介、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質、腹腔内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、滑液包内、軟骨内（軟骨の中で）、尾内（馬尾の中で）、嚢内（大槽小脳延髄の中で）、角膜内（角膜の中で）、歯冠内、冠動脈内（冠状動脈の中で）、海綿体内（陰茎の海綿体の拡張可能なスペースの中で）、椎間板内（椎間板の中で）、導管内（腺の管の中で）、十二指腸内（十二指腸の中で）、硬膜内（硬膜内または硬膜下）、表皮内（表皮へ）、食道内（食道へ）、胃内（胃の中で）、歯肉内（歯肉の中で）、回腸内（小腸の遠位部の中で）、病巣内（局所病変内または直接その局所病変に導入される）、内腔内（管の内腔の中で）、リンパ管内（リンパ液の中で）、髄内（骨の骨髄腔の中で）、髄膜内（髄膜の中で）、心筋内（心筋の中で）、眼球内（目の中で）、卵巣内（卵巣の中で）、心膜内（心膜の中で）、胸膜内（胸膜の中で）、前立腺内（前立腺の中で）、肺内（肺またはその気管支の中で）、鼻腔内（鼻または眼窩周囲洞の中で）、髄腔内（脊柱の中で）、滑液嚢内（関節の滑液腔の中で）、腱内（腱の中で）、精巣内（睾丸の中で）、クモ膜下（intrathecal）（脳脊髄軸内の任意のレベルの脳脊髄液の中で）、胸郭内（胸郭の中で）、管内（臓器の細管の中で）、腫瘍内（腫瘍の中で）、鼓室内（中耳の中で）、血管内（血管の中で）、脳室内（脳室の中で）、イオン導入（可溶性塩のイオンが体の組織に移動する電流によって）、洗浄（開放創傷または体腔を浸すまたは洗い流すこと）、喉頭（喉頭上に直接）、経鼻胃（鼻から胃の中へ）、密封包帯法（局所的経路投与は、次いで、その領域を塞ぐ包帯で覆われる）、眼（外眼部へ）、口腔咽頭（口および咽頭へ直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器系（局所的または全身的な効果のために経口または鼻から吸入することによる気道内で）、球後（橋の後ろまたは眼球の後ろ）、軟部組織、クモ膜下（subarachnoid）、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を通り抜けるまたは横断して）、���気管（気管の壁を通り抜けて）、経鼓膜（鼓室を横断または通り抜けて）、尿管（尿管へ）、尿道（尿道へ）、膣、仙骨麻酔、診断、神経ブロック、胆管灌流、心筋灌流、フォトフェレーシス、および脊椎、が挙げられる。
【００６４】
非経口および注射投与
一部の実施形態では、本発明の、調節可能な細胞系または栄養要求性因子を含む医薬組成物を非経口的に投与してよい。経口および非経口投与のための液体剤形は、これらに限定されないが薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、溶液、懸濁液、シロップ剤、および／またはエリキシル剤が挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤、およびエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物のような乳化剤、などの当技術分野において一般に使用する不活性な希釈剤を含んでよい。不活性な希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味剤、香味料、および／または芳香剤のようなアジュバントを含んでよい。非経口投与のためのある特定の実施形態では、組成物は、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標）、アルコール、油、変性オイル、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはそれらの組合せ、のような可溶化剤と混合される。他の実施形態では、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤が含まれる。
【００６５】
注射用製剤、例えば、無菌の注射用水性または油性懸濁液を、適した分散剤、湿潤剤、および／または懸濁化剤を用いて、公知の技術にしたがって製剤化してよい。無菌の注射用製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、非毒性の非経口的に許容される希釈剤および／または溶媒中で、無菌の注射用溶液、懸濁液、および／またはエマルションであってよい。使用可能な許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張塩化ナトリウム溶液がある。無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁化媒体として従来から使用されている。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無刺激の不揮発性油を使用できる。オレイン酸のような脂肪酸を注射用製剤に使用できる。
【００６６】
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって、および／または使用前に無菌水または他の無菌注射用媒体に溶解または分散することができる無菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって滅菌してよい。
【００６７】
活性成分の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅らせることが多くの場合望ましい。これは、水溶性が低い、結晶性またはアモルファス材料の液体懸濁液を使用することによって達成され得る。活性成分の吸収速度は溶解速度に依存し、それはまた結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与された薬物形態の遅延吸収は、薬物を油ビヒクルに溶解または懸濁させることによって達成される。注射用デポ剤形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドのような生分解性ポリマー中で薬物のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。ポリマーに対する薬物の比率および使用される特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御できる。他の生分解性ポリマーの例は、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）を含む。デポ注射用製剤は、体組織と適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルション中に薬物を封入することによって調製される。
【００６８】
直腸および膣投与
一部の実施形態では、本発明の調節可能な細胞系または栄養要求性因子を含む医薬組成物は、直腸内および／または膣に投与されてよい。直腸または膣内投与用の組成物は一般的に坐薬であり、組成物をココアバター、ポリエチレングリコール、または坐薬用ワックスのような、適した非刺激性賦形剤と混合することによって調製でき、室温では固体であるが体温では液体であるので直腸または膣腔で溶けて活性成分を放出する。
【００６９】
経口投与
一部の実施形態では、本発明の調節可能な細胞系または栄養要求性因子を含む医薬組成物は、経口で投与されてよい。経口投与のための固体剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末、および顆粒を含む。そのような固体剤形では、活性成分は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムのような少なくとも１つの不活性な薬学的に許容される賦形剤、および／または充填剤もしくは増量剤（例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸）、結合剤（例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシア）、保湿剤（例えばグリセロール）、崩壊剤（例えばアガー、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある種のシリケート、および炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えばパラフィン）、吸収促進剤（例えば第四級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート）、吸収剤（例えばカオリンおよびベントナイトクレイ）、および潤滑剤（例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、およびそれらの混合物、と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形は緩衝剤を含んでよい。
【００７０】
デポ投与
本明細書に記載の一部の実施形態では、本発明の調節可能な細胞系を含む医薬組成物は、持続放出のためにデポで製剤化される。一般に、特異的な臓器または組織（「標的組織」）は、投与のために標的化される。一部の実施形態では、局所的な放出は、生体適合性デバイスの利用によって達成される。例えば、生体適合性デバイスは、対象において細胞系の拡散を制限してよい。
【００７１】
本発明の一部の態様では、本発明の調節可能な細胞系を含む医薬組成物は、標的組織内またはその近傍に空間的に保持されている。標的組織（１つまたは複数の標的細胞を含む）を、調節可能な細胞系または栄養要求性因子を含む医薬組成物と、それらが標的組織に実質的に保持されるような条件で接触させることによって、調節可能な細胞系または栄養要求性因子を含む医薬組成物を哺乳動物対象の標的組織に提供する方法が提供され、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９、９９．９９、または９９．９９％より大きい組成物が標的組織に保持されることを意味する。例えば、対象へ投与される調節可能な細胞系または栄養要求性因子を含む少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％または９９．９９％より大きい医薬組成物は、投与後の期間に存在する。
【００７２】
本発明のある態様は、標的組織を、調節可能な細胞系を含む医薬組成物と、それらがそのような標的組織に実質的に保持されるような条件で接触させることによって、本発明の調節可能な細胞系または栄養要求性因子を含む医薬組成物を哺乳動物対象の標的組織に提供する方法を対象にする。調節可能な細胞系を含む医薬組成物は、目的の効果が少なくとも１つの標的細胞において生じるように十分な活性成分を含む。一部の実施形態では、調節可能な細胞系を含む医薬組成物は一般に１つまたは複数の細胞浸透剤を含むが、「裸の」製剤（細胞浸透剤または他の薬剤を含まないような）もまた薬学的に許容される担体と共にまたはなしで企図される。
【００７３】
肺投与
一部の実施形態では、本発明の調節可能な細胞系または栄養要求性因子を含む医薬組成物は、肺投与に適した製剤で調製、包装、および／または販売してよい。一部の実施形態では、そのような投与は、口腔を介してである。一部の実施形態では、製剤は活性成分を含む乾燥粒子を含んでよい。そのような実施形態では、乾燥粒子は、約０．５ｎｍから約７ｎｍまで、または約１ｎｍから約６ｎｍまでの範囲の直径を有してよい。一部の実施形態では、製剤は、そのような粉末を分散させるように噴射剤の流れを向けることができる乾燥粉末リザーバを含むデバイスを用いて投与するための乾燥粉末の形態であってよい。一部の実施形態では、自己噴射溶媒／粉末分注容器を使用してよい。そのような実施形態では、活性成分を密封容器内の低沸点噴射剤に溶解および／または懸濁してよい。そのような粉末は、少なくとも９８重量％の粒子が０．５ｎｍより大きい直径を有し、粒子数の少なくとも９５％が７ｎｍ未満の直径を有するような粒子を含んでよい。あるいは、少なくとも９５重量％の粒子が１ｎｍより大きい直径を有し、粒子数の少なくとも９０％が６ｎｍ未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖のような固体微粉末希釈剤を含んでもよく、単位用量形態で都合よく提供される。
【００７４】
低沸点噴射剤は、一般に、大気圧で１８℃未満の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般に、噴射剤は組成物の５０％から９９．９％（ｗ／ｗ）を構成してよく、活性成分は組成物の０．１％から２０％（ｗ／ｗ）を構成してよい。噴射剤は、液体非イオン性および／または固体陰イオン性界面活性剤および／または固体希釈剤（活性成分を含む粒子と同程度の粒径を有してよい）のような追加の成分をさらに含んでよい。
【００７５】
肺送達用に製剤化された医薬組成物は、溶液および／または懸濁液の液滴の形態で活性成分を提供してよい。そのような製剤は、活性成分を含む任意選択で無菌の、水性および／または希アルコールの溶液および／または懸濁液として、調製、包装、および／または販売してよく、任意の噴霧および／または霧化デバイスを用いて都合よく投与され得る。そのような製剤は、これらに限定されないが、サッカリンナトリウムのような香味剤、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、および／またはヒドロキシ安息香酸メチルのような防腐剤を含む１つまたは複数の追加の成分をさらに含んでよい。この投与経路によって提供される液滴は、約０．１ｎｍから約２００ｎｍまでの範囲の平均直径を有してよい。
【００７６】
鼻腔内、鼻、および口腔投与
一部の実施形態では、本発明の調節可能な細胞系または栄養要求性因子を含む医薬組成物は、経鼻的および／または鼻腔内に投与されてよい。一部の実施形態では、肺送達に有用な本明細書に記載の製剤は、鼻腔内送達にも有用である場合がある。一部の実施形態では、鼻腔内投与のための製剤は、活性成分を含み、約０．２μｍから５００μｍまでの平均粒子を有する粗粉末を含む。そのような製剤は、鼻吸（snuff）、すなわち、鼻の近くに保持された粉末の容器からの鼻道を通した急速な吸入、によって投与される。
【００７７】
鼻投与に適した製剤は、例えば、わずか約０．１％（ｗ／ｗ）から最大１００％（ｗ／ｗ）までの有効成分を含んでよく、本明細書に記載の１つまたは複数の追加の成分を含んでよい。医薬組成物は、口腔投与に適した製剤に調製、包装、および／または販売してよい。そのような製剤は、例えば、従来の方法を用いて作製された、錠剤および／またはロゼンジの形態であってよく、例えば、０．１％〜２０％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み、残りは口腔内で溶解性および／または分解性の組成物、および任意選択で本明細書に記載の１つまたは複数の追加の成分を含んでいてもよい。あるいは、口腔投与に適した製剤は、活性成分を含む、粉末、ならびに／またはエアロゾル化および／もしくは霧化溶液および／もしくは懸濁液を含んでよい。そのような粉末化、エアロゾル化、および／またはエアロゾル化製剤は、分散時に、約０．１ｎｍから約２００ｎｍまでの範囲の平均粒子サイズおよび／または液滴サイズを含んでよく、さらに本明細書に記載の１つまたは複数の任意の追加の成分を含んでよい。
【００７８】
眼または耳投与
一部の実施形態では、本発明の調節可能な細胞系または栄養要求性因子を含む医薬組成物は、眼および／または耳投与に適した製剤で調製、包装、および／または販売してよい。そのような製剤は、例えば、水性および／または油性の液体賦形剤中に活性成分の０．１／１．０％（ｗ／ｗ）溶液および／または懸濁液を含む、点眼薬および／または点耳薬の形態であってよい。そのような点滴薬は、緩衝剤、塩、および／または本明細書に記載の１つもしくは複数の他の任意の追加の成分をさらに含んでよい。有用な他の眼科的投与可能製剤は、微結晶形態および／またはリポソーム製剤中に活性成分を含むものを含む。網膜下挿入も投与の形態として使用してよい。
【００７９】
細胞への送達
本開示は、対象の疾患、障害または状態を調節可能な細胞系で治療する方法であって、対象には存在しないような栄養素、酵素、ｐＨ変化、温度変化、部分の濃度変化および／またはニッチ環境に対して栄養要求性である細胞系を生成すること、対象を生成するステップの得られた栄養要求性細胞系に接触させること、栄養要求性因子が、栄養要求性システムまたは要素を活性化して、細胞系の増殖および／または対象のための１つまたは複数の治療物の発現をもたらすように、対象を、栄養素、酵素、ｐＨおよび／または温度を変化させる部分、部分の濃度の増加、および対象には以前に存在しなかった対象における細胞のニッチ環境から選択される栄養要求性因子に接触させることを含む方法を提供する。栄養要求性因子は、本明細書に記載の投与技術のいずれかによってこれらの調節可能な細胞系の細胞に送達され得る。
【００８０】
対象への送達
本開示はさらに、哺乳動物対象を含む対象に、上記の調節可能な細胞系または栄養要求性因子のいずれかを送達する方法であって、対象に調節可能な細胞系もしくは栄養要求性因子を投与すること、または対象に調節可能な細胞系もしくは栄養要求性因子を含む製剤を投与すること、または対象に医薬組成物を含む記載された組成物のいずれかを投与することを含む方法を提供する。
【００８１】
用量およびレジメン
本発明は、それを必要とする対象に、本発明による調節可能な細胞系または栄養要求性因子を投与する方法を提供する。本発明の調節可能な細胞系または栄養要求性因子および組成物を含む医薬組成物は、疾患、障害および／または状態を予防、治療、管理または診断するのに効果的な任意の量および任意の投与経路を用いて対象に投与し得る。必要な正確な量は、対象の種、年齢および全身状態、疾患の重症度、特定の組成物、その投与の様式、その活性の様式などに依存して対象の間で変化する。対象は、ヒト、哺乳動物、または動物であってよい。本発明による組成物は、一般的に投与の容易さおよび投与量の均一性のために単位剤形に製剤化される。しかし、本発明の組成物の総１日使用量が健全な医学的判断の範囲内で担当医により決定されることが理解されるであろう。特定の任意の個体に対する具体的な治療上有効、予防上有効、または適切な診断用量レベルは、治療されている障害およびその障害の重症度；用いられた特定のペイロードの活性；用いた特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食事；特定の調節可能な細胞系または栄養要求性因子の投与時間、投与経路、および排泄速度、治療期間；使用される特定の調節可能な細胞系または栄養要求性因子の粒子と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；および医学分野でよく知られている因子のようなものを含む様々な要因に依存する。
【００８２】
ある特定の実施形態では、本発明による調節可能な細胞系または栄養要求性因子の医薬組成物は、所望の治療的、診断的、または予防的効果を得るために、約０．０００１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇから約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇから約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇの対象体重に１日あたり、１日１回以上送達するのに十分な投与量レベルで投与され得る。
【００８３】
ある特定の実施形態では、本開示による調節可能な細胞系または栄養要求性因子の医薬組成物は、約１０から約６００μｌ／部位、５０から約５００μｌ／部位、１００から約４００μｌ／部位、１２０から約３００μｌ／部位、１４０から約２００μｌ／部位、約１６０μｌ／部位で投与され得る。非限定的な例として、調節可能な細胞系または栄養要求性因子は、５０μｌ／部位および／または１５０μｌ／部位で投与され得る。
【００８４】
本発明の調節可能な細胞系または栄養要求性因子の所望の投与量は、一度のみ、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、３日ごと、毎週、２週間ごと、３週間ごと、または４週間ごとに送達され得る。ある特定の実施形態では、所望の投与量は、複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４以上の投与）を用いて送達され得る。複数回投与を用いる場合、本明細書に記載のもののような分割投与レジメンを使用してよい。本明細書で使用される場合、「分割用量」とは、「単一単位用量」または総１日用量を２つ以上の用量、例えば、「単一単位用量」の２つ以上の投与に分けることである。本明細書で使用される場合、「単一単位用量」は、１回用量／一度に／単一経路／単一接触点、すなわち単一投与事象で投与される任意の治療薬の用量である。
【００８５】
本発明の調節可能な細胞系の所望の投与量は「パルス用量」または「連続流」として投与され得る。本明細書で使用される場合、「パルス用量」とは、一定期間にわたって一定の頻度で投与される任意の治療薬の一連の単一単位用量である。本明細書で使用される場合、「連続流」とは、単一経路／単一接触点で一定期間連続的に投与される治療薬の用量、すなわち連続投与事象である。総１日用量、２４時間で与えられるかまたは処方される量は、これらの方法のいずれかによって、またはこれらの方法の組合せとして、または医薬品投与に適した任意の他の方法によって投与され得る。
【００８６】
一実施形態では、本発明の調節可能な細胞系または栄養要求性因子の対象への送達は、対象に中和活性を提供する。中和活性は、少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１３カ月、１４カ月、１５カ月、１６カ月、１７カ月、１８カ月、１９カ月、２０カ月、２０カ月、２１カ月、２２カ月、２３カ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年または１０年を超える可能性がある。
【００８７】
組合せ
調節可能な細胞系は、１つまたは複数の他の治療薬、予防薬、研究薬または診断薬と組み合わせて使用してよい。「と組み合わせて」とは、これらの薬剤が同時に投与されなければならない、および／または一緒に送達するために製剤化されなければならないという意味を含むことを意図するものではないが、これらの送達方法は、本発明の範囲内である。組成物は、１つまたは複数の他の所望の治療または医療手順と同時に、その前に、またはその後に投与することができる。一般的に、各薬剤は、その薬剤について決定された用量および／またはタイムスケジュールで投与される。一部の実施形態では、本開示は、それらのバイオアベイラビリティを改善し、それらの代謝を低減および／または改変し、それらの排泄を阻害し、および／または体内でのそれらの分布を改変し得る薬剤と組み合わせた医薬組成物、予防組成物、研究組成物または診断組成物の送達を包含する。
【００８８】
バイオアベイラビリティ
本明細書に記載の組成物へ製剤化された場合、調節可能な細胞系または栄養要求性因子は、本明細書に記載の製剤化されていない組成物と比較して、バイオアベイラビリティの増加を示すことができる。本明細書で使用される場合、「バイオアベイラビリティ」という用語は、対象に投与される所与の量の調節可能な細胞系または栄養要求性因子の全身的利用可能性を表す。バイオアベイラビリティは、投与後の組成物の曲線下面積（ＡＵＣ）または最大血清もしくは血漿濃度（Ｃｍａｘ）を測定することによって評価することができる。ＡＵＣは、縦座標（ｙ軸）に化合物の血清または血漿濃度（例えば、調節可能な細胞系または栄養要求性因子）、それに対して横座標（ｘ軸）に時間をプロットすることによって、曲線下面積を決定する。一般に、特定の化合物のＡＵＣは、当業者に知られている方法を用いて、およびG. S. Banker, Modern Pharmaceutics, Drugs and the Pharmaceutical Sciences, v. 72, Marcel Dekker, New York, Inc., 1996に記載されるように計算することができ、その内容は、参照によりその内容全体を本明細書に組み込むものとする。
【００８９】
Ｃｍａｘ値は、調節可能な細胞系または栄養要求性因子の哺乳動物への投与後の、哺乳動物の血清または血漿中で達成される調節可能な細胞系または栄養要求性因子の最大濃度である。Ｃｍａｘ値は当業者に知られている方法を用いて測定することができる。「バイオアベイラビリティを増加すること」または「薬物動態を改善すること」という語句は、本明細書で使用される場合、哺乳動物でＡＵＣ、Ｃｍａｘ、またはＣｍｉｎとして測定される調節可能な細胞系または栄養要求性因子の全身的利用可能性が、本明細書に記載のように投与された場合に、投与前より大きいことを意味する。一部の実施形態では、バイオアベイラビリティは少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％増加できる。
【００９０】
例えば、医薬組成物は、治療のために標的化された領域におけるバイオアベイラビリティを増加するために、対象における調節可能な細胞系の拡散を制限する生体適合性デバイスとして投与される。バイオアベイラビリティはまた、栄養素または酵素のような栄養要求性因子の局所的な放出によっても変化し得る。
【００９１】
治療ウインドウ
本明細書で使用される場合、「治療ウインドウ」とは、治療効果を引き出す可能性が高い、血漿濃度の範囲、または作用部位における治療活性物質のレベルの範囲を表す。一部の実施形態では、本明細書に記載の調節可能な細胞系または栄養要求性因子の治療ウインドウは、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％増加できる。
【００９２】
分布容量
本明細書で使用される場合、「分布容量」という用語は、血中または血漿中と同じ濃度で体内の薬物の総量を含有するのに必要と思われる液量を表し、Ｖｄｉｓｔは、体内の薬物の量／血中または血漿中の薬物の濃度に等しい。例えば、１０ｍｇの用量および１０ｍｇ／Ｌの血漿濃度の場合、分布容量は１リットルになる。分布容量は、薬物が血管外組織に存在する程度を反映する。大量の分布は、血漿タンパク質結合と比較して、化合物が組織構成要素に結合する傾向を反映している。臨床的な設定の場合には、Ｖｄｉｓｔを使用して、定常状態濃度を達成するために負荷用量を決定することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の調節可能な細胞系または栄養要求性因子の分布容量は、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％減少させることができる。
【００９３】
生物学的効果
一実施形態では、動物に送達される調節可能な細胞系または栄養要求性因子の生物学的効果は、動物におけるペイロード発現を分析することによって分類され得る。
【００９４】
ＶＩ．本発明の調節可能な細胞系を創出する方法
上記のように、遺伝子編集の方法は当技術分野においてよく知られている。したがって、本発明は、調節可能なヒト細胞系を創出する方法であって、（ａ）細胞のプールを得るステップと、（ｂ）ヌクレアーゼを使用して標的遺伝子に１つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失または置換を導入し、それによってその遺伝子の発現をノックアウトまたは下方制御するステップと、および（ｃ）栄養要求性をスクリーニングするステップとを含む方法を提供する。
【００９５】
一実施形態では、標的遺伝子は表１に開示されたものから選択される。一実施形態では、標的遺伝子は、ウリジン一リン酸合成酵素（ＵＭＰＳ）（ウラシルに対する栄養要求性の細胞系を創出する）およびホロカルボキシラーゼ合成酵素（ビオチンに対する栄養要求性の細胞系を創出する）から選択される。スクリーニングステップは、表１に開示した栄養要求性因子のうちの１つを用いてまたは用いずに細胞を培養することによって実行してよい。一実施形態では、栄養要求性因子は、ビオチン、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタメート、セリン、ウラシルおよびコレステロールから選択される。一実施形態では、栄養要求性因子は、ビオチンおよびウラシルから選択される。
【００９６】
一実施形態では、細胞は、リンパ球（Ｔ細胞など）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性幹細胞、体性幹細胞、造血幹細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から選択される。
【００９７】
一実施形態では、ヌクレアーゼは、上記のもの、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。
【００９８】
ＶＩＩ．定義
数値ｘに関して「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「活性成分」という用語は、本明細書に記載の栄養要求性応答システムまたは要素をコードする操作ゲノムを含む調節可能な細胞系を表す。あるいは、その用語は、本明細書に記載の栄養要求性因子を表す。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「濃度変化」という用語は、本明細書に記載の医薬組成物を投与する前の対象における栄養要求性因子の濃度と比較した、栄養要求性因子の濃度の増加を表す。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「ｐＨ変化」という用語は、本明細書に記載の医薬組成物を投与する前の対象におけるｐＨと比較した、対象において誘導されるｐＨの変化を表す。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「温度変化」という用語は、本明細書に記載の医薬組成物を投与する前の対象における温度と比較した、対象において誘導される温度の変化を表す。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「栄養要求性」という用語は、細胞が増殖に必要な化合物を産生できないことを引き起こす細胞の状態を表す。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「栄養要求性細胞系」という用語は、栄養要求性応答システムまたは要素を含むように遺伝子操作され、そして栄養要求性因子の存在下でのみ増殖することができるゲノムを含む細胞系を表す。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「栄養要求性因子」という用語は、対象には以前に存在しなかった栄養素、酵素、ｐＨを変化させる部分、温度を変化させる部分、または対象における細胞のニッチ環境を表し、これは、栄養要求性システムまたは要素を活性化して、細胞系の増殖および／または１つもしくは複数の治療物の発現をもたらす。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「栄養要求性応答システムまたは要素」という用語は、栄養要求性因子の存在に応答する、本明細書に記載の調節可能な細胞系のゲノムの一部を表す。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「バイオアベイラビリティ」という用語は、対象に投与される所与の量の調節可能な細胞系または栄養要求性因子の全身的利用可能性を表す。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「細胞系」という用語は、同一細胞に由来する細胞集団を表し、集団の各細胞は類似の遺伝子構造を有する。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ９」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９を表し、ゲノム編集で使用されるエンドヌクレアーゼである。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」という用語は、侵入細胞のＲＮＡヌクレオチドを切断する酵素を展開するＤＮＡのクラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返しを表す。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォーム」という用語は、Ｃａｓ９に対する結合部位および修飾される領域に特異的な標的配列を有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を含む遺伝工学ツールを表す。Ｃａｓ９はｇＲＮＡと結合して、標的領域と結合し切断するリボヌクレオタンパク質を形成する。
【０１１２】
「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」ならびに「からなる（consisting）」を意味し、例えばＸを「含む（comprising）」組成物は、ただＸだけからなっていてもよく、または追加の何か、例えばＸ＋Ｙを含んでいてもよい。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「連続流」という用語は、単一経路／単一接触点で一定期間連続的に投与される治療薬の用量、すなわち連続投与事象を表す。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「操作ゲノム」という用語は、当技術分野で公知の分子生物学的技術を使用して改変されている細胞系のゲノムを表す。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「不活性成分」という用語は、製剤に含まれる医薬組成物の活性成分の活性に寄与しない１つまたは複数の薬剤を表す。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「遺伝子ノックアウト細胞系」は、当技術分野で公知の分子生物学的技術によって達成されている、完全な機能喪失をもたらす遺伝子の標的破壊を有する細胞系を表す。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、少なくとも１つの活性成分および任意選択で１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を表す。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、親化合物が既存の酸または塩基部分をその塩の形態に変換することによって（例えば、遊離塩基を適切な有機酸と反応させることによって）修飾されるような、開示された化合物の誘導体を表す。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「パルス用量」という用語は、一定期間にわたって一定の頻度で投与される任意の治療薬の一連の単一単位用量を表す。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「ニッチ環境」という用語は、治療物の増殖または産生に必要な因子を供給する、本明細書に記載の調節可能な細胞系の生息環境を表す。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「栄養素」という用語は、生物の代謝および同化に利用される化学元素または化合物である場合がある物質を表す。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「再生性」という用語は、対象の器官または組織の再生または回復を表す。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「調節可能な細胞系」という用語は、栄養要求性応答システムまたは要素を含むように遺伝子操作された細胞系を表す。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「治療用産物」または「治療物」という用語は、対象の疾患、障害、または状態の症状を治療および／または軽減する調節可能な細胞系によってコードされる産物を表す。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「治療ウインドウ」という用語は、治療効果を引き出す可能性が高い、血漿濃度の範囲、または作用部位における治療活性物質のレベルの範囲を表す。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「翻訳スイッチ」という用語は、栄養要求性因子に曝露されると、少なくとも１つの遺伝子転写物の翻訳を増加させる栄養要求性応答システムまたは要素の一部を表す。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「単位用量」という用語は、所定の量の活性成分を含む医薬組成物の個別の量を表す。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「分布容量」という用語は、血中または血漿中と同じ濃度で体内の薬物の総量を含有するのに必要と思われる液量を表し、Ｖｄｉｓｔは、体内の薬物の量／血中または血漿中の薬物の濃度に等しい。
【０１２９】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細を、以下に加えた説明において記載する。本明細書に記載したものと同様または同等のいかなる材料および方法も本発明を実施または試験するために使用できるが、ここでは好ましい材料および方法を記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明から明らかであろう。本明細書では、他で明確に示さない限り、単数形には複数形も含まれる。特記しない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。不一致の場合、本説明が支配するものとする。
【０１３０】
以下の非限定的な例により、本発明をさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】血清がエレクトロポレーション後の最適な回復に必要であることを示す図である。（Ａ）最適なエレクトロポレーション回復条件を決定するために使用するアッセイの概略図。エレクトロポレーション後、細胞に、血清、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）、または外来性ウラシル源（ウリジン）を供給した、または供給しなかった。（Ｂ）示された培地条件におけるエレクトロポレーション後４日間の回復後、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）フローサイトメーターによる細胞数。図は、血清を投与した細胞、血清を加えずに５−ＦＯＡあり／なしの処理を行ったモック編集細胞、および血清を加えずに５−ＦＯＡあり／なしの処理を行ったウリジン一リン酸合成酵素（ＵＭＰＳ）ノックアウト細胞を示す。
【図２−１】ＵＭＰＳインデル含有細胞の維持および増殖には、外来性ウラシル源が必要であることを示す図である。（Ａ）エレクトロポレーションおよび回復後のＵＭＰＳまたはモック編集Ｔ細胞の増殖についてアッセイするために使用した手順の概略図。（Ｂ）示された培養条件におけるＵＭＰＳインデルのＴＩＤＥ分析。ＴＩＤＥ分析は、オリゴヌクレオチドＵＭＰＳ−Ｏ−１およびＵＭＰＳ−Ｏ−２を用いたＵＭＰＳ遺伝子座のサンガー配列決定で行った。８日目に行った。（Ｃ）フレームシフトインデルを含むＴＩＤＥによって分析された対立遺伝子の割合。８日目に行った。（Ｄ）ＴＩＤＥによって同定された対立遺伝子を含む８日目の細胞の予測絶対数。
【図２−２】ＵＭＰＳインデル含有細胞の維持および増殖には、外来性ウラシル源が必要であることを示す図である。（Ｅ）ＵＭＰあり／なしの細胞数の経時変化。（Ｆ）ウリジンあり／なしの細胞数の経時変化。
【図３−１】ＵＭＰＳ標的化細胞系において５−ＦＯＡは毒性が低いことを示す図である。（Ａ）５−ＦＯＡ選抜手順の概略図。（Ｂ）示された培養条件における５−ＦＯＡ選抜の４日後の細胞数。
【図３−２】ＵＭＰＳ標的化細胞系において５−ＦＯＡは毒性が低いことを示す図である。（Ｃ）示された培養条件における５−ＦＯＡ選抜の４日後の細胞数。
【図４】５−ＦＯＡ選抜、ＵＭＰＳ標的化細胞系は、外来性ウラシル源の存在下でのみ最適な増殖を示す図である。（Ａ）ウラシル栄養要求性の実証のためのプロトコールの概略図。５−ＦＯＡ中で４日間選抜した後、細胞培養を試験培地に分割し、細胞計数の前にさらに４日間増殖させた。（Ｂ〜Ｄ）外来性ウラシル（ＵＭＰまたはウリジン）含有または欠乏培地における５−ＦＯＡ選抜細胞の細胞数。
【実施例】
【０１３２】
[実施例１]
一般的なＴ細胞培養方法
軟膜を入手し、Ｔ細胞をＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離とそれに続くＰａｎ  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いた磁気濃縮によって単離した。
細胞をＢａｍｂａｎｋｅｒ培地中で凍結保存した。融解後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２、５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１００ＩＵ／ｍｌヒト組換えＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１０ｎｇ／ｍｌヒト組換えＩＬ−７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の添加を含むまたは含まないＸ−Ｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ）で培養した。ＵＭＰまたはウリジンは、２５０μｇ／ｍｌで添加した。５−ＦＯＡは１００μｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌで添加した。培養の間、培地を２日ごとに新しくした。
エレクトロポレーションの前に３日間、固定化抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、Ｔｏｎｂｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および可溶性抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、Ｔｏｎｂｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてＴ細胞を活性化した。図１、図３および図４の実験では、１４０万個の活性化Ｔ細胞をエレクトロポレーションした。図２の実験では、１条件につき３０，０００個の活性化Ｔ細胞をエレクトロポレーションした。これらの細胞を予め複合体化したＲＮＰと混合したエレクトロポレーション溶液に再懸濁し、プログラムＥＯ−１１５を用いた４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いてエレクトロポレーションした。ＲＮＰは、３００μｇ／ｍｌのＣａｓ９タンパク質（Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）化膿レンサ球菌（S. pyogenes）、ＩＤＴ）および２．５のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９のモル比を用いたｓｇＲＮＡからなっていた。
ゲノムＤＮＡはＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を用いて採取した。細胞を、トリパンブルー染色を用いた自動細胞計測器または参照としてＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いたＣｙｔｏｆｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）フローサイトメーターで計数した。データをＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）およびＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて分析した。
ＵＭＰＳ遺伝子座のサンガー配列決定は、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  Ｆｌｅｘ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＮＥＢ）を用いて増幅された領域と共に、ＵＭＰＳ−Ｏ−１およびＵＭＰＳ−Ｏ−２を用いて行われた。編集後の挿入および欠失（インデル）を同定するために、サンガー配列決定トレースをＴＩＤＥ（Brinkman et al, 2014）によって分析した。
【０１３３】
ｇＲＮＡ配列（ＰＡＭを含む）
ＵＭＰＳ−７
ＧＣＣ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＡＵＣ  ＧＡＵ  ＧＵＡ  ＧＡＧ  ＵＵＵ  ＵＡＧ  ＡＧＣ  ＵＡＧ  ＡＡＡ  ＵＡＧ  ＣＡＡ  ＧＵＵ  ＡＡＡ  ＡＵＡ  ＡＧＧ  ＣＵＡ  ＧＵＣ  ＣＧＵ  ＵＡＵ  ＣＡＡ  ＣＵＵ  ＧＡＡ  ＡＡＡ  ＧＵＧ  ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＡＧＵ  ＣＧＧ  ＵＧＣ  ＵＵＵ  Ｕ
（配列番号１）
【０１３４】
ＵＭＰＳ遺伝子座ＴＩＤＥ分析のための配列決定オリゴ
ＵＭＰＳ−Ｏ−１：ＣＣＣＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＡＣＧＧＧＴＧＣ  （配列番号２）
ＵＭＰＳ−Ｏ−２：ＡＧＧＧＴＣＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＴＧＧＣＴ  （配列番号３）
【０１３５】
[実施例２]
ヒトＴ細胞におけるＣａｓ９−ｓｇＲＮＡエレクトロポレーションによるＵＭＰＳ編集
Ｔ細胞を融解し、培養し、続いて活性化し、その後上記のようにＣａｓ９−ＵＭＰＳ−７ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を、血清、５−ＦＯＡ、または外来性ウラシル源を含むまたは含まない培地中で回復させた（図１Ａ）。エレクトロポレーション後の細胞生存は、培地に血清が含まれた場合、著しく増加した（図１Ｂ）。
【０１３６】
[実施例３]
混合ＵＭＰＳ編集集団の最適増殖およびＵＭＰＳ突然変異の維持は外来性ウラシル源を必要とする
Ｔ細胞をエレクトロポレーションし、実施例２のように編集し、培地＋血清＋ウリジン＋ＵＭＰで２日間回復させた。０日目に、細胞をＵＭＰ、ウリジンまたは−ウラシル源培地に移した。この実験は選抜ステップを考慮せず、したがって得られた細胞集団は野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合変異体およびホモ接合変異体細胞の異種混合ミックスである。ホモ接合ＵＭＰＳ変異体細胞の増殖は外来性ウラシル源に依存し、これらは栄養要求性であるはずである（図２Ａ）。ＵＭＰＳを標的化した場合、インデルは細胞の約５５〜７５％に生成される（ＴＩＤＥによるアッセイ（Brinkman et al, 2014, Nucleic Acids Res. 42(22):e168））（図２Ｂ）。培地がウラシル欠乏の場合は、集団内でフレームシフトを生成するインデル頻度が減少する（図２Ｃ）。これは、非栄養要求性ヘテロ接合変異体およびＷＴ細胞が編集後に依然として存在することによって、集団において、ホモ接合栄養要求性ＵＭＰＳ変異体細胞が競合に負け、結果としてフレームシフトインデル含有細胞の予測数が減少するというモデルと一致する（図２Ｄ）。異種混合のＵＭＰＳ編集集団の最適な増殖は、外来性のウラシル源の存在にも依存する（図２Ｅ〜図Ｆ）。ＵＭＰおよびウリジンは、ＵＭＰＳ編集細胞の増殖を、モック編集およびＣＣＲ５標的化対照（対照編集遺伝子座）と同一レベルまで救済する。外来性ウラシルの非存在下でのこの低下した細胞増殖率は、ＵＭＰＳ編集に依存し、そしていずれの対照細胞にも見られず、このことは、編集ＵＭＰＳによって、最適な細胞増殖のために、ヒトＴ細胞は、ウラシル補給に特異的に依存するようになることを示す。
ＵＭＰＳ編集集団が栄養要求性であるとは期待されない未編集またはヘテロ接合細胞を含み、したがって、ウラシル欠乏培地中でのＵＭＰＳ編集細胞の増殖の完全な欠如は期待されない点は、再度指摘する価値がある。
【０１３７】
[実施例４]
ＵＭＰＳ標的化細胞を選抜するための５−ＦＯＡ処理
５−ＦＯＡは他の生物のウラシル栄養要求性細胞を選抜する（例えばBoeke et al. 1984, Mol. Gen. Genet. 197(2):345-6）。ヒト細胞におけるウラシル栄養要求性の選抜のための５−ＦＯＡの潜在的な有用性を研究するために、ＵＭＰＳ遺伝子は、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体エレクトロポレーション、それに続く回復（実施例２のように）、続いて５−ＦＯＡ処理に対する耐性のアッセイ（図３Ａ）によってヒトＴ細胞において標的化された（図３Ａ）。細胞計数を行う前に、細胞を５−ＦＯＡおよび血清およびウラシル源の様々な組合せで４日間増殖させた。血清は、エレクトロポレーション後の細胞の回復にとって重要であるが、５−ＦＯＡ中の細胞の生存率には影響を及ぼさなかった（図３Ｂ）。ウリジンおよびＵＭＰは、５−ＦＯＡ中のモック処理およびＵＭＰＳ標的化細胞の両方の生存を改善した。これは競合に基づく機構による可能性がある（ウリジンはヒトの５−フルオロウラシル毒性を元に戻すことができる（van Groeningen et al. 1992, Semin. Oncol. 19(2 Suppl 3):148-54)）（図３Ｂおよび図３Ｃ）。すべての場合において、ＵＭＰＳ標的化細胞は、モック標的化細胞に対して生存率の向上を示した。このデータは、ヒト細胞培養において、ウラシル栄養要求性細胞の選抜に５−ＦＯＡを使用できることを示す。
【０１３８】
[実施例５]
５−ＦＯＡ選抜ＵＭＰＳ標的化細胞はウラシル栄養要求性を示す
５−ＦＯＡ処理によって選抜された細胞がウラシル栄養要求性かどうかを調べるために、モックまたはＵＭＰＳ標的化Ｔ細胞を実施例４のように５−ＦＯＡに曝露した。５−ＦＯＡ選抜の４日後に、ウラシル含有培地（ＵＭＰ、ウリジンのいずれか、または両方）およびウラシル欠乏培地へ細胞集団を分割した。試験培地中で４日間インキュベートした後、細胞計数によって増殖アッセイを続けて行った（８日目）（図４Ａ）。すべての場合において、モック標的化細胞培養における細胞増殖はごくわずかであり、ウラシル源補給から独立しており、このことは、５−ＦＯＡ選抜ステップの間、非ＵＭＰＳ標的化細胞を死滅させることに成功したことを示す（図４Ｂ〜図４Ｄ）。ＵＭＰＳ標的化集団において、すべての条件で、細胞増殖はウラシルの添加により促進され、そしてそれが非存在の場合には細胞増殖不良が観察された（図４Ｂ〜図４Ｄ）。
【０１３９】
総合すると、実施例１〜５の結果は、ヒトＴ細胞におけるＣａｓ９によるＵＭＰＳ遺伝子座の編集が、最適な細胞増殖のために外来性ウラシル源に依存する細胞を生成することを示す。これらの結果は、操作されたヒト栄養要求性は、Ｔ細胞の増殖またはいくつかの他の細胞療法を制御するための機構として使用できることを実証する。さらに、ＵＭＰＳ編集細胞の５−ＦＯＡ選抜は、Ｔ細胞の真の栄養要求性集団の選抜に有用な機構を提供する。
【０１４０】
[実施例６]
幹細胞の培養
本明細書で、本発明の主題である調節可能な細胞系は、その内容全体を参照により本明細書に組み込むものとする米国特許第８，９４５，８６２号に示されるように、以下の技術を用いて維持および分化された幹細胞を含んでよい。
【０１４１】
未分化のｈＥＳ細胞（ＷｉＣｅｌｌ（登録商標）からのＨ９株、３５〜４５回継代）を不活性化されたマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層上で増殖させる（Stem Cells, 2007. 25(2): p. 392-401）。手短に言うと、細胞は、０．１％ゼラチンコーティングプレート上の照射された継代の少ないＭＥＦフィーダー層上で未分化のステージで維持される。培地は毎日交換する。培地は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ−１２、２０％ノックアウト血清代替物、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール、および４ｎｇ／ｍｌ  ｒｈＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）からなる。未分化のｈＥＳ細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２中、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼタイプＩＶで処理し、継代の日に機械的にかき取る。分化の前に、ｈＥＳ細胞を、以下のようにＭＥＦから調製した馴化培地（ＣＭ）中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティングプレート上に播種する（Nat Biotechnol, 2001. 19(10): p. 971-4）。ＭＥＦ細胞を採取し、５０Ｇｙで照射し、そしてｂＦＧＦを含まないｈＥＳ培地で培養する。ＣＭを毎日回収し、ｈＥＳ細胞を供給する前に追加の４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを添加する。
【０１４２】
[実施例７]
ｈＥＳＣ−ＥＣのインビトロ分化
ｈＥＳ細胞分化を誘導するために、未分化のｈＥＳ細胞を、Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ）および１５％定義されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、Ｕｔａｈ）、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、４５０μＭ  モノチオグリセロール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、および５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有する分化培地で、以前に記載されたように、浮遊胚芽体（ＥＢ）の形成のための超低接着プレートで培養する（Proc Natl Acad Sci USA, 2002. 99(7): p. 4391-6およびStem Cells, 2007. 25(2): p. 392-401）。手短に言うと、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティングプレート上に馴化培地で培養したｈＥＳ細胞を２ｍｇ／ｍｌディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）で１５分間、３７℃で処理し、コロニーをほぐす。次いでコロニーをかき取り、胚芽体形成のために超低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｎ．Ｙ．）へ移す。
【０１４３】
[実施例８]
栄養要求性調節可能な細胞系の選抜
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォームを使用して様々な遺伝子ノックアウト細胞系を生成した後。細胞を定義された血清フリー培地中で増殖させ、特定の栄養素添加物なしで培地中での増殖の欠如についてスクリーニングする。異なる濃度の添加物対対照の殺傷曲線を作成して、ノックアウト遺伝子の産物の外来的に供給されたバージョンが細胞系の栄養要求性表現型を救済することを実証する。最も有望な候補遺伝子ノックアウトを、他の一般的に使用されている細胞系において操作し、効果が普遍的であることを確認する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用してノックアウト細胞系を迅速に生成する。複数のノックアウトおよび突然変異を有する細胞系もまた、迅速な多重ゲノム工学および選抜を提供するために生成されてよい（例えば５つの栄養要求性突然変異および５つの抗生物質）。
【０１４４】
[実施例９]
インビボ分析
インビトロで検証された栄養要求性ノックアウト細胞系をインビボで分析してよい。これらの細胞系は、ヒトにおける栄養要求性因子の毒性およびバイオアベイラビリティの制約を受ける。遺伝子ノックアウト細胞系は、ヒトＴ細胞または任意の他のリンパ球から操作される。細胞系による条件付きインビトロ増殖は、栄養要求性因子の存在下で実証され、栄養要求性因子の非存在下では実証されない。因子に対して栄養要求性であることが確認された細胞系、例えば栄養要求性応答システムまたは要素を含むヒトリンパ球をマウスモデルに投与してよい。栄養要求性因子添加物を摂取するマウスのみが、栄養要求性応答システムまたは要素である栄養要求性遺伝子欠失を含むヒトリンパ球の増殖を維持すると仮定されている。さらに、マウス食物源から栄養素を除去すると、細胞増殖はインビボで停止する。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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