(57)【要約】  本発明は、組換えグラム陰性菌株、及び異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインの真核細胞への送達のためのそれらの使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’から３’方向に、
プロモーター、
前記プロモーターに動作可能に連結されている、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合している、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードする第２のＤＮＡ配列
を含むベクターで形質転換された組換えグラム陰性菌株であって、異種タンパク質が、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター並びにウイルスタンパク質からなる群から選択される、組換えグラム陰性菌株。
【請求項２】
５’から３’方向に、
細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル又はその断片をコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合している、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードする第２のＤＮＡ配列
を含むベクターで形質転換された組換えグラム陰性菌株であって、異種タンパク質が、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター並びにウイルスタンパク質からなる群から選択される、組換えグラム陰性菌株。
【請求項３】
少なくとも１つのＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の産生を欠く、請求項１又は２に記載の組換えグラム陰性菌株。
【請求項４】
エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からなる群から選択される、請求項１から３の何れか一項に記載の組換えグラム陰性菌株。
【請求項５】
エルシニア属及びサルモネラ属からなる群から選択される、請求項１から３の何れか一項に記載の組換えグラム陰性菌株。
【請求項６】
組換えグラム陰性菌株が、エルシニア属株であり、第１のＤＮＡ配列によりコードされている細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルが、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質若しくはそのＮ末端断片を含むか、又は組換えグラム陰性菌株が、サルモネラ属株であり、第１のＤＮＡ配列によりコードされている細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルが、ＳｏｐＥ若しくはＳｔｅＡエフェクタータンパク質若しくはそのＮ末端断片を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の組換えグラム陰性菌株。
【請求項７】
組換えグラム陰性菌株が、エルシニア属株であり、前記エルシニア属株が野生型であるか、又は少なくとも１つのＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の産生を欠き、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルが、Ｙ．エンテロコリティカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端１３８アミノ酸を含む、或いは組換えグラム陰性菌株が、サルモネラ属株であり、前記サルモネラ属株が野生型であるか、又は少なくとも１つのＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の産生を欠き、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルが、サルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＳｔｅＡエフェクタータンパク質を含むか、又はサルモネラ菌ＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端８１若しくは１０５アミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の組換えグラム陰性菌株。
【請求項８】
５’から３’方向に、
プロモーター、
前記プロモーターに動作可能に連結されている、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合している、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードする第２のＤＮＡ配列
を含むベクターであって、異種タンパク質が、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター並びにウイルスタンパク質からなる群から選択される、ベクター。
【請求項９】
５’から３’方向に、
細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル又はその断片をコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合している、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードする第２のＤＮＡ配列
を含むベクターであって、異種タンパク質が、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター並びにウイルスタンパク質からなる群から選択される、ベクター。
【請求項１０】
異種タンパク質が、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質からなる群から選択される、請求項１から７の何れか一項に記載の組換えグラム陰性菌株又は請求項８若しくは９に記載のベクター。
【請求項１１】
アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質が、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質、カスパーゼ、及びアポトーシスの細胞死受容体調節の細胞内シグナル伝達タンパク質からなる群から選択される、請求項１０に記載の組換えグラム陰性菌株又はベクター。
【請求項１２】
反復ドメインが、同一であるか、又は８０％より高いアミノ酸配列同一性を有する、請求項１から７の何れか一項に記載の組換えグラム陰性菌株又は請求項８若しくは９に記載のベクター。
【請求項１３】
反復ドメインが、アポトーシス誘導因子ｔＢＩＤのＢＨ３ドメインである、請求項１から７の何れか一項に記載の組換えグラム陰性菌株又は請求項８又は９に記載のベクター。
【請求項１４】
異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインが、タンパク質の同じ機能クラスに属する異種タンパク質のドメインである、請求項１から７の何れか一項に記載の組換えグラム陰性菌株又は請求項８若しくは９に記載のベクター。
【請求項１５】
異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインが、アポトーシス誘導因子ｔＢＩＤのＢＨ３ドメイン、及びアポトーシス調節因子ＢＡＸのＢＨ３ドメインである、請求項１から７の何れか一項に記載の組換えグラム陰性菌株又は請求項８又は９に記載のベクター。
【請求項１６】
ベクターが、プロテアーゼ切断部位をコードする第３のＤＮＡ配列を含み、第３のＤＮＡ配列が、前記第１のＤＮＡ配列の３’末端と前記第２のＤＮＡ配列の５’末端の間に位置する、請求項１から７の何れか一項に記載の組換えグラム陰性菌株又は請求項８又は９に記載のベクター。
【請求項１７】
細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質が、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｔＰ、ＳｔｅＡ、ＥｘｏＳ、ＳｉｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＤ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ、ＳｏｐＤ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＳｉｐＣ、ＳｉｆＡ、ＳｓｅＪ、Ｓｓｅ、ＳｒｆＨ、ＳｓｐＨ１、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢｓＴ、ＹｏｐＴ、ＹｏｐＨ、ＹｐｋＡ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＦ、ＴｃｃＰ２、ＩｐｇＢ２、ＯｓｐＦ、Ｍａｐ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＶｉｒＡ、ＩｐａＡ、ＩｐａＨ、ＳｓｐＨ１、ＶｏｐＦ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＨｏｐＡＢ２、ＸｏｐＤ、ＡｖｒＲｐｔ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＵ１、ＧＡＬＡタンパク質ファミリー、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＤ１、ＡｖｒＢＳ３、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＴ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＶｉｒＡ、ＩｃｓＢ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ７．８、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＡｖｒＲｐｔ２、ＡｖｒＲｐｔ２、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＡｖｒＢｓ３、ＸｏｐＤ、及びＡｖｒＸｖ３からなる群から選択される、請求項１から７の何れか一項に記載の組換えグラム陰性菌株又は請求項８又は９に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えグラム陰性菌株、及び異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインの真核細胞への送達のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一過性トランスフェクション技術は、タンパク質の機能に取り組むために、長年にわたって細胞生物学研究に応用されてきた。これらの方法では、一般に、研究対象のタンパク質が大過剰に提示される結果となり、それにより、シグナル伝達の単純化しすぎたモデルがもたらされる可能性がある。持続時間の短いシグナル伝達プロセスを制御するタンパク質については、目的のタンパク質は、それが制御するシグナル伝達事象よりはるかに長く存在する。さらには、ＤＮＡトランスフェクションに基づく一過性過剰発現は、不均一な同調性のない細胞の集団をもたらし、それにより、機能研究は複雑になり、オミクス手法が妨げられる。これに加えて、そのようなアッセイのより大きな規模への拡大には非常に費用がかかる。上述の点の一部は、精製タンパク質のマイクロインジェクション若しくはプロテオフェクション、低分子量ＧＴＰａｓｅを有するプラスミドを細胞膜に迅速に標的化するための誘導性移行戦略、又は細胞透過性細菌毒素と融合させた精製タンパク質の付加のような、既存の技術によってカバーされる。しかし、これらの技術は、全て、時間がかかり、厄介であり、本発明者らの知るところによれば、言及されている全ての基準を満たすものはない。
【０００３】
細菌は、タンパク質を標的細胞に直接打ち込むための種々の機構を進化させてきた［１］。エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）及びサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）のような細菌により使用されるＩＩＩ型分泌系（Ｔ３ＳＳ）［２］は、宿主細胞にいわゆる細菌エフェクタータンパク質を打ち込むナノシリンジのように機能する。エフェクターと呼ばれる、Ｔ３ＳＳにより分泌されることになる細菌タンパク質は、短いＮ末端分泌シグナルを保有する［３］。細菌内では、一部のエフェクターにシャペロンが結合している。シャペロンは、毒性ドメインを隠蔽する可能性があり、それらは、分泌シグナルの提示に寄与し、分泌能を有する立体構造で基質を保持しており、したがって、分泌を助長する。分泌が誘導されると、Ｔ３ＳＳに隣接するＡＴＰａｓｅがシャペロンを除去し、エフェクターは、折り畳まれていない状態で又は部分的にしか折り畳まれていない状態でニードルを通って移動し、宿主細胞質内に入った時点で再び折り畳まれる。
【０００４】
Ｔ３Ｓは、ハイブリッドペプチド及びタンパク質を標的細胞に送達するために活用されてきた。研究対象の細菌が、遺伝学による利用が困難である（トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）のような）場合に、異種細菌Ｔ３ＳＳエフェクターが送達されてきた。多くの場合、レポータータンパク質、例えば、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）アデニル酸シクラーゼ、マウスＤＨＦＲ又はリン酸化可能なタグが、Ｔ３ＳＳ依存性タンパク質送達の研究要件に応じて、潜在的Ｔ３ＳＳ分泌シグナルに融合された。ペプチド送達は、主に、ワクチン接種を目的として行われた。これには、ウイルスエピトープ、細菌エピトープ（リステリオリジンＯ）、並びにヒトがん細胞のエピトープを表すペプチドが含まれる。少数の事例では、機能性真核生物タンパク質が、ナノボディ［４］、核タンパク質（Ｃｒｅ−リコンビナーゼ、ＭｙｏＤ）［５、６］又はＩｌ１０及びＩＬ１ｒａ［７］を用いてなされているように、宿主細胞を調節するために送達されている。上述の系の何れによっても単一のタンパク質を送達することはできない。何れの場合も１つ又は複数の内在性エフェクタータンパク質が依然としてコードされているからである。さらに、使用されたベクターは、最適なタンパク質をコードする他のＤＮＡ断片を簡単にクローニングできるようには設計されておらず、それがこの系の広範な応用を妨げている。驚くべきことに、真核細胞への異種タンパク質の反復ドメインの送達又は異なる異種タンパク質ドメインの組合せの送達は、所望の細胞経路に対する影響を増大させることを見出された。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、一般に、組換えグラム陰性菌株、及び異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインの真核細胞への送達のためのそれらの使用に関する。本発明は、様々なＩＩＩ型エフェクター、しかし同様にＩＶ型エフェクター、ウイルスタンパク質、及び最も重要には機能性真核生物タンパク質等の、異種タンパク質の反復ドメイン若しくは異なる異種タンパク質の２つ以上ドメインの移行を可能にする、グラム陰性菌株及びその使用を提供する。送達の蛍光追跡手段、核への再局在化手段、及び特に、宿主細胞への送達後の細菌付属物の除去手段を提供する。提示するＴ３ＳＳに基づく系は、目的の異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインのスケーラブルで、迅速で、同期化された、均一で、調整可能な送達をもたらす。
本発明の送達系は、生きている動物に真核生物タンパク質の反復ドメイン又は異なる真核生物タンパク質の２つ以上のドメインを注射するのに適しており、治療目的で使用することができる。
【０００６】
第１の態様では、本発明は、５’から３’方向に、
プロモーター、
前記プロモーターに動作可能に連結されている、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合している、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードする第２のＤＮＡ配列
を含むベクターで形質転換された組換えグラム陰性菌株であって、異種タンパク質が、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター並びにウイルスタンパク質からなる群から選択される、組換えグラム陰性菌株に関する。
【０００７】
さらなる態様では、本発明は、５’から３’方向に、
細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル又はその断片をコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合している、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードする第２のＤＮＡ配列
を含むベクターで形質転換された組換えグラム陰性菌株であって、異種タンパク質が、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター並びにウイルスタンパク質からなる群から選択される、組換えグラム陰性菌株に関する。
【０００８】
さらなる態様では、本発明は、５’から３’方向に、
細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル又はその断片をコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合している、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードする第２のＤＮＡ配列
を含むベクターであって、異種タンパク質が、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター並びにウイルスタンパク質からなる群から選択される、ベクターに関する。
【０００９】
さらなる態様では、本発明は、５’から３’方向に、
プロモーター、
前記プロモーターに動作可能に連結されている、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合している、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードする第２のＤＮＡ配列
を含むベクターであって、異種タンパク質が、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター並びにウイルスタンパク質からなる群から選択される、ベクターに関する。
【００１０】
本発明は、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインを真核細胞に送達する方法であって、
ｉ）グラム陰性菌株を培養する工程と、
ｉｉ）真核細胞をｉ）のグラム陰性菌株と接触させる工程であり、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルと異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインとを含む融合タンパク質が、グラム陰性菌株により発現され、真核細胞に移行される工程と
を含む方法に、さらに関する。
【００１１】
本発明は、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインを真核細胞に送達する方法であって、
ｉ）グラム陰性菌株を培養する工程と、
ｉｉ）真核細胞をｉ）のグラム陰性菌株と接触させる工程であり、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルと異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインとを含む融合タンパク質が、グラム陰性菌株により発現され、真核細胞に移行される工程と
ｉｉｉ）融合タンパク質を切断し、その結果、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインを細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルから切断する工程と
を含む方法に、さらに関する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、グラム陰性菌株のライブラリーであって、グラム陰性菌株の発現ベクターの第２のＤＮＡ配列によりコードされている、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインが、ヒト又はマウスタンパク質のドメインであり、グラム陰性菌株により発現されるヒト又はマウスタンパク質の各ドメインがアミノ酸配列の点で異なる、ライブラリーに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ−Ｂ】Ｔ３ＳＳタンパク質送達の特徴づけの図である。（Ａ）Ｔ３ＳＳ依存性タンパク質の周囲媒体への分泌（インビトロ分泌）（左側）又は真核細胞への分泌（右側）の模式図。Ｉ：３型分泌系を示す。ＩＩは、周囲媒体に分泌されたタンパク質を示し、ＩＩＩは、膜を通って真核細胞のサイトゾル（ＶＩＩ）に移行したタンパク質を示す。ＶＩは、Ｔ３ＳＳが挿入される及び下に細菌サイトゾルがある２つの細菌膜の伸張を示す。ＩＶは、ＹｏｐＥ１−１３８Ｎ末端断片（Ｖ）に結合している融合タンパク質である。（Ｂ）抗ＹｏｐＥ抗体を使用する全細胞溶解物（ＩＶ）及び沈殿培養上清（Ｖ）でのウェスタンブロット法によって明示された、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）Ｅ４０野生型、ＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ又はＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄＳｉ＿２のインビトロ分泌。
【図２Ａ−Ｃ】上皮細胞へのＴ３ＳＳタンパク質送達の特徴づけの図である。（Ａ）感染多重度１００で、１時間、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ又はＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２に感染させたＨｅＬａ細胞に関する抗Ｍｙｃ免疫蛍光染色。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞内の（Ａ）からの抗Ｍｙｃ免疫蛍光染色強度の定量。データは、ｎ＝２０部位から合わせたものであり、エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。Ｉ：未感染のもの、ＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ又はＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２。ｙ軸は、抗Ｍｙｃ染色強度［任意単位］を示し、ｘ軸は、分での感染時間を示す。（Ｃ）細胞内の抗Ｍｙｃ免疫染色強度の定量。ＨｅＬａ細胞を１時間、Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２に、ｘ軸に示されている感染多重度で感染された。データは、ｎ＝２０部位から合わせたものであり、示されているエラーバーは、平均値の標準誤差である。ｙ軸は、抗Ｍｙｃ染色強度［任意単位］を示す。
【図３】Ｔ３ＳＳに基づくタンパク質送達の改変がＹｏｐＥ１−１３８融合タンパク質（ＥＧＦＰ）の核局在化を可能にすることを示す図である。感染多重度１００で、Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄに感染させたＨｅＬａ細胞、又はＩＩ：プラスミドＩＩＩ：＋ＹｏｐＥ１−１３８−ＥＧＦＰを保有する若しくはプラスミドＩＶ：＋ＹｏｐＥ１−１３８−ＥＧＦＰ−ＮＬＳを保有するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ  ΔｙｏｐＢに感染させたＨｅＬａ細胞の、ＥＧＦＰシグナル。ＥＧＦＰシグナルを「ａ」に示し、局在化比較のために「ｂ」では核を染色した。
【図４Ａ−Ｃ】Ｔ３ＳＳに基づくタンパク質送達の改変がＹｏｐＥ１−１３８付属物の除去を可能にすることを示す図である。ＨｅＬａ細胞を同時に２つの異なるＹ．エンテロコリティカ株に感染させ、これは、２つの細菌懸濁液の単純混合により達成される。一方の株は、ＹｏｐＥ１−１３８と融合しているＴＥＶプロテアーゼを送達することになるが、他方の株は、二重ＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含有するリンカーでＹｏｐＥ１−１３８と融合している目的のタンパク質を送達する。真核細胞へのタンパク質送達後、ＴＥＶプロテアーゼは、目的のタンパク質からＹｏｐＥ１−１３８付属物を切断することになる。（Ａ）未感染のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞（ＩＩ）、又はＩ：ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄＳｉ＿２による２時間の感染（感染多重度１００）後の、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃによる２時間の感染（感染多重度１００）後の、Ｖ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃによる２時間の感染（感染多重度１００）及び精製ＴＥＶプロテアーゼでのさらなる一晩の処理後の、並びにＶＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ及び第２の株＋ＹｏｐＥ１−１３８−ＴＥＶによる２時間の感染（感染多重度１００）後の、ジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞を、抗ＩＮＫ４Ｃのウェスタンブロッティングにより、ＹｏｐＥ１−１３８−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ又はその切断形Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃの存在について分析した（「ａ」に示されている）。ローディングコントロールとして、抗アクチンのウェスタンブロッティングを行った（「ｂ」に示されている）。ある事例では、（Ｖ）溶解細胞を精製ＴＥＶプロテアーゼと共に一晩インキュベートした。（Ｂ）試料ＩＶを１００％に設定した場合の、完全長ＹｏｐＥ１−１３８−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃのサイズでの（Ａ）からの抗ＩＮＫ４Ｃ染色強度（ｙ軸に［任意単位］として示す）のアクチン正規化定量。Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ、並びにＩＶ：＋ＹｏｐＥ１−１３８−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ、Ｖ：＋ＹｏｐＥ１−１３８−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ、及び精製ＴＥＶプロテアーゼでのさらなる一晩の処理、並びにＶＩ：＋ＹｏｐＥ１−１３８−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ及び第２の株＋ＹｏｐＥ１−１３８−ＴＥＶ。データは、ｎ＝２の独立した実験から合わせたものであり、示されているエラーバーは、平均値の標準誤差である。（Ｃ）未感染のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞（ＩＩ）、又はＩ：ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄＳｉ＿２による２時間の感染（感染多重度１００）後の、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−２×ＴＥＶ切断部位−ＥＴ１−Ｍｙｃによる２時間の感染（感染多重度１００）後の、Ｖ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１���１３８−２×ＴＥＶ切断部位−ＥＴ１−Ｍｙｃによる２時間の感染（感染多重度１００）、及び精製ＴＥＶプロテアーゼでのさらなる一晩の処理後の、並びにＶＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−２×ＴＥＶ切断部位−ＥＴ１−Ｍｙｃ及び第２の株＋ＹｏｐＥ１−１３８−ＴＥＶによる２時間の感染（感染多重度１００）後の、ジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞を、抗Ｍｙｃのウェスタンブロッティングにより、ＹｏｐＥ１−１３８−２×ＴＥＶ切断部位−ＥＴ１−Ｍｙｃ又はその切断形ＥＴ１−Ｍｙｃの存在について分析した（「ａ」に示されている）。ローディングコントロールとして、抗アクチンのウェスタンブロッティングを行った（「ｂ」に示されている）。あるケースでは、（Ｖ）溶解細胞を精製ＴＥＶプロテアーゼと共に一晩インキュベートした。
【図５Ａ−Ｂ】真核細胞への細菌エフェクタータンパク質の送達の図である。（Ａ）ＨｅＬａ細胞を、Ｉ：ＩＩ：ｐＢａｄ＿Ｓｉ２を保有する又はＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ＳｏｐＥを保有するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄに、画像の上に示されている時間（２、１０又は６０分）、感染多重度１００で感染させた。固定後、細胞をアクチン細胞骨格について染色した。（Ｂ）ＨｅＬａ細胞を、未感染で放置した（ＩＩ）か、又はＩ：株の下に示されている感染多重度（感染多重度５０、感染多重度５０：感染多重度５０、若しくは感染多重度５０：感染多重度１００）で、１時間、ＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ＳｏｐＥ−Ｍｙｃを保有するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄに感染、及び一部の事例ではＩＩＩとＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−ＳｐｔＰに同時感染させた。固定後、細胞をアクチン細胞骨格について染色し（「ａ」に示されている）、その後、抗Ｍｙｃの染色によりＹｏｐＥ１−１３８−ＳｏｐＥ−Ｍｙｃ融合タンパク質の存在について染色した（「ｂ」に示されている）。
【図６Ａ−Ｃ】真核細胞への細菌エフェクタータンパク質の送達の図である。（Ａ）未処理で放置したＨｅＬａ細胞（ＩＩ）、又は７５分間、Ｉ：ＩＩＩ：ｐＢａｄ＿Ｓｉ２を保有する若しくはＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−ＯｓｐＦを保有するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄに感染多重度１００で感染させたＨｅＬａ細胞に関する、リン酸化ｐ３８（「ａ」）、全ｐ３８（「ｂ」）及びアクチン（「ｃ」）ウェスタンブロット分析。示した通りの感染の最後の３０分間、細胞をＴＮＦαで刺激した（＋は、ＴＮＦαの添加を表し、−は、ＴＮＦαで処理しなかったことを表す）。（Ｂ）未処理で放置したＨｅＬａ細胞（ＩＩ）、又は２２．５若しくは４５分間（ブロットの下に示されている）、Ｉ：ＩＩＩ：ｐＢａｄ＿Ｓｉ２を保有する、ＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−ＳｏｐＥを保有する若しくはＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−ＳｏｐＢを保有するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄに感染多重度１００で感染させたＨｅＬａ細胞に関する、リン酸化Ａｋｔ  Ｔ３０８（「ａ」）及びＳ４７３（「ｂ」）及びアクチン（「ｃ」）ウェスタンブロット分析。（Ｃ）未処理で放置したＨｅＬａ細胞（Ｉ）又は２．５時間、Ｖ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−ＢｅｐＡ、ＶＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−ＢｅｐＡＥ３０５−ｅｎｄ、ＶＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−ＢｅｐＧＢｉｄ又はＶＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２に感染多重度１００で感染させたＨｅＬａ細胞におけるｃＡＭＰレベル（ｆｍｏｌ／ウェルでｙ軸に示されている）。コレラ毒素（ＣＴ）をポジティブコントロールとして、１時間、試料ＩＩ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＩＩ（２５μｇ／ｍｌ）又はＩＶ（５０μｇ／ｍｌ）に添加した。データは、ｎ＝３の独立した実験から合わせたものであり、示されているエラーバーは、平均値の標準誤差である。対応のない両側ｔ検定を使用して統計解析を行った（ｎｓは、有意な変化がないことを示し、＊＊は、ｐ値＜０．０１を示し、＊＊＊は、ｐ値＜０．００１を示す）。
【図７Ａ−Ｃ】真核細胞へのヒトｔＢｉｄの送達は、大量のアポトーシスを誘導することを示す図である。（Ａ）未処理で放置したＨｅＬａ細胞（ＩＩ）、又はＩ：ＩＩＩ：ｐＢａｄ＿Ｓｉ２、ＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−Ｂｉｄを保有する若しくはＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−ｔ−Ｂｉｄを保有するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄに、６０分間、感染多重度１００で感染させたＨｅＬａ細胞に関する、切断カスパーゼ３  ｐ１７（「ａ」）及びアクチン（「ｂ」）ウェスタンブロット分析。一部の事例では、細胞をＶＩ：０．５μＭのスタウロスポリン又はＶＩＩ：１μＭのスタウロスポリンで処理した。（Ｂ）未処理のまま放置したジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞（ＩＩ）、又はＩ：ＩＩＩ：ｐＢａｄ＿Ｓｉ２を保有する、ＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−Ｂｉｄを保有する若しくはＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−ｔ−Ｂｉｄを保有するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄによる１時間の感染多重度１００での感染後のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞を、抗Ｂｉｄのウェスタンブロッティングにより分析し、内在性Ｂｉｄレベル（Ｚ印が付けられている）と、移行したＹｏｐＥ１−１３８−Ｂｉｄ（Ｘ印が付けられている）又はＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢｉｄ（Ｙ印が付けられている）レベルとの比較を可能にした。ローディングコントロールとして、抗アクチンのウェスタンブロッティングを行った（「ｂ」に示されている）。一部のケースでは、細胞をＶＩ：０．５μＭのスタウロスポリン又はＶＩＩ：１μＭのスタウロスポリンで処理した。（Ｃ）ＨｅＬａ細胞を未処理で放置したか、又はＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｂｉｄ、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢｉｄに、１時間、感染多重度１００で感染させた。一部の事例では、細胞をＶ：０．５μＭのスタウロスポリン又はＶＩ：１μＭのスタウロスポリンで処理した。固定後、細胞をアクチン細胞骨格について染色した（灰色）。
【図８Ａ−Ｂ】ゼブラフィッシュＢＩＭのＴ３ＳＳ依存性送達がゼブラフィッシュ胚においてアポトーシスを誘導することを示す図である。（Ａ）細菌約４００個を後脳領域に注射することにより、２ｄｐｆのゼブラフィッシュ胚を、ＥＧＦＰを発現するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ１コントロール株（Ｉ）又はｚＢＩＭを移行させる株（ＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−ｚＢＩＭ）に感染させた。５．５時間後、胚を固定し、活性化カスパーゼ３（切断カスパーゼ３、ｐ１７；「ｃ」に示されている）について染色し、細菌の存在（ＥＧＦＰシグナル、「ｂ」に示されている）について分析した。蛍光画像にはｚ軸方向の最大値投影が示されている。ｚ軸方向の明視野投影が「ａ」に示されている。（Ｂ）（Ａ）の記録ｚスタック画像のｚ軸方向の最大値投影に関する自動画像分析。簡単に述べると、細菌をＧＦＰチャネルにより検出した。細菌斑点の各エリアの周囲に半径１０画素の円を生成した。重複する領域を、接しているメンバー間で等分した。細菌を密接に取り囲んでいるこれらのエリア内のカスパーゼ３  ｐ１７染色強度を測定し、ｙ軸に（［ａ．ｕ．］として）プロットした。マン・ホイットニー検定を使用して統計解析を行った（＊＊＊はｐ値＜０．００１を示す）。Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ１コントロール株（Ｉ）に感染した動物についてのｎ＝１４又はＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−ｚＢＩＭに感染した動物についてのｎ＝１９からのデータを組み合わせた。示されているエラーバーは、平均値の標準誤差である。
【図９Ａ−Ｂ】ｔＢｉＤ依存性リン酸化プロテオームの図である。ＨｅＬａ細胞を、３０分間、Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−ｔ−Ｂｉｄに感染多重度１００で感染させ、コントロールとしてＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２に感染させた。（Ａ）ｔＢＩＤリン酸化プロテオームのグラフィック表示。ｔＢｉｄ依存的に有意に制御されたリン酸化ペプチドを含有するタンパク質（灰色）（ｑ値＜０．０１）、及び公知のアポトーシス関連タンパク質（暗灰色）が、既知及び予測タンパク質−タンパク質相互作用（高信頼度、スコア０．７）のＳＴＲＩＮＧネットワークで表示されている。ＳＴＲＩＮＧにおいて少なくとも１つのつながりのあったタンパク質のみが表示されている。（Ｂ）Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２（Ｉ）又はＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−ｔ−Ｂｉｄ（ＩＩ）のどちらかに感染させたＨｅＬａ細胞の共焦点像は、ｔＢｉｄ送達時のアポトーシス表現型の誘導を明示する。細胞を核についてＨｏｅｃｈｓｔで（「ａ」）、Ｆ−アクチンについてファロイジンで（「ｂ」）、チューブリンについて抗チューブリン抗体で（「ｃ」）及びミトコンドリアについてミトトラッカーで（「ｄ」）染色した。スケールバーは、４０μｍを表す。
【図１０Ａ−Ｂ】ＩＩＩ型分泌に基づく送達ツールボックスの説明の図である。（Ａ）ＹｏｐＥ１−１３８を有する融合構築物を生成するために使用したクローニングプラミドｐＢａｄ＿Ｓｉ１及びｐＢａｄ＿Ｓｉ２のベクターマップ。シャペロンＳｙｃＥ、及びＹｏｐＥ１−１３８融合体は、ネイティブＹ．エンテロコリティカプロモーターの下にある。２つのプラスミドは、ｐＢａｄ＿Ｓｉ１上に存在するアラビノース誘導性ＥＧＦＰの存在の点のみが異なる。（Ｂ）ｐＢａｄ＿Ｓｉ１及びｐＢａｄ＿Ｓｉ２プラスミド上のｙｏｐＥ１−１３８断片の直後の多重クローニング部位。
【図１１】様々な細胞株へのＴ３ＳＳタンパク質送達の特徴づけの図である。未処理で放置した（ＩＩ）、又はＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２（Ｉ）に、画像の上に示されている感染多重度（感染多重度２５、５０、１００、２００、及びＨＵＶＥＣについては４００）で１時間感染させた、Ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３線維芽細胞（「ａ」）、ジャーカット細胞（「ｂ」）及びＨＵＶＥＣ細胞（「ｃ」）に関する、抗Ｍｙｃ免疫蛍光染色。
【図１２】真核細胞への細菌エフェクタータンパク質の送達のＴ３ＳＳ依存性についての図である。感染多重度１００での、ブロットの上に示されている時間（０、５、１５、１０、６０及び１２０分）の、Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ  ΔｙｏｐＢ＋ＹｏｐＥ１−１３８−ＳｏｐＥ−Ｍｙｃ（Ｉ）又はＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−ＳｏｐＥ−Ｍｙｃ（ＩＩ）による感染後の、ジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞を、抗Ｍｙｃのウェスタンブロッティングにより分析した。ＹｏｐＥ１−１３８−ＳｏｐＥ−Ｍｙｃに対応するサイズには「ａ」印が付けられており、その一方で内在性ｃ−Ｍｙｃタンパク質のサイズには「ｂ」印が付けられている。
【図１３Ａ−Ｂ】培養上清への様々な他のタンパク質のＴ３ＳＳ依存性分泌の図である。Ｉ：示されている通りのタンパク質と融合しているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８の、インビトロ分泌実験。全細菌溶解物（「Ａ」）及び沈殿培養上清（「Ｂ」）のタンパク質含有量を、抗ＹｏｐＥ抗体を使用するウェスタンブロット法により分析した。記載の数字は、対応する高さの分子量をｋＤａで示すものである。
【図１４Ａ−Ｂ】培養上清への様々な他のタンパク質のＴ３ＳＳ依存性分泌の図である。Ｉ：示されている通りのタンパク質と融合しているＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８の、インビトロ分泌実験。全細菌溶解物（「Ａ」）及び沈殿培養上清（「Ｂ」）のタンパク質含有量を、抗ＹｏｐＥ抗体を使用するウェスタンブロット法により分析した。記載の数字は、対応する高さの分子量をｋＤａで示すものである。
【図１５Ａ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図１５Ｂ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図１５Ｃ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図１５Ｄ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図１５Ｅ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図１５Ｆ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図１５Ｇ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図１５Ｈ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図１５Ｉ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図１５Ｊ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図１５Ｋ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図１５Ｌ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図１５Ｍ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図１５Ｎ】この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）株の図である。バックグラウンド株、対応するプラスミド上にコードされたＴ３ＳＳ依存性送達のためのプラスミド及びタンパク質に関する情報を提供する、この研究に使用したＹ．エンテロコリティカ及びサルモネラ菌のリスト。さらに、対応するプラスミドの構築に使用したオリゴヌクレオチド、骨格プラスミド及び抗生物質耐性に関する情報を提供する。
【図１６】Ｂ１６Ｆ１０細胞へのマウスｔＢｉｄ、マウスＢｉｄ  ＢＨ３及びマウスＢａｘ  ＢＨ３の送達が大量のアポトーシスを誘導することを示す図である。未感染のＢ１６Ｆ１０細胞（Ｉ）、又はＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄＳｉ＿２、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｙ．エンテロコリティカコドン最適化マウスｔＢｉｄ、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｙ．エンテロコリティカコドン最適化マウスＢｉｄ  ＢＨ３、若しくはＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｙ．エンテロコリティカコドン最適化マウスＢａｘ  ＢＨ３による、２．５時間の感染（感染多重度５０）後のＢ１６Ｆ１０細胞。固定後、細胞をアクチン細胞骨格及び核について染色した（両方とも灰色で）。
【図１７】Ｄ２Ａ１細胞へのマウスｔＢｉｄ、マウスＢｉｄ  ＢＨ３及びマウスＢａｘ  ＢＨ３の送達が大量のアポトーシスを誘導することを示す図である。未感染のＤ２Ａ１細胞（Ｉ）、又はＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄＳｉ＿２、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｙ．エンテロコリティカコドン最適化マウスｔＢｉｄ、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｙ．エンテロコリティカコドン最適化マウスＢｉｄ  ＢＨ３、若しくはＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｙ．エンテロコリティカコドン最適化マウスＢａｘ  ＢＨ３による、２．５時間の感染（感染多重度５０）後のＤ２Ａ１細胞。固定後、細胞をアクチン細胞骨格及び核について染色した（両方とも灰色で）。
【図１８】ＨｅＬａ細胞へのマウスｔＢｉｄ、マウスＢｉｄ  ＢＨ３及びマウスＢａｘ  ＢＨ３の送達が大量のアポトーシスを誘導することを示す図である。未感染のＨｅＬａ細胞（Ｉ）、又はＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄＳｉ＿２、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｙ．エンテロコリティカコドン最適化マウスｔＢｉｄ、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｙ．エンテロコリティカコドン最適化マウスＢｉｄ  ＢＨ３、若しくはＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｙ．エンテロコリティカコドン最適化マウスＢａｘ  ＢＨ３による、２．５時間の感染（感染多重度５０）後のＨｅＬａ細胞。固定後、細胞をアクチン細胞骨格及び核について染色した（両方とも灰色で）。
【図１９】４Ｔ１細胞へのマウスｔＢｉｄ、マウスＢｉｄ  ＢＨ３及びマウスＢａｘ  ＢＨ３の送達が大量のアポトーシスを誘導することを示す図である。未感染の４Ｔ１細胞（Ｉ）、又はＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄＳｉ＿２、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｙ．エンテロコリティカコドン最適化マウスｔＢｉｄ、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｙ．エンテロコリティカコドン最適化マウスＢｉｄ  ＢＨ３、若しくはＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｙ．エンテロコリティカコドン最適化マウスＢａｘ  ＢＨ３による、２．５時間の感染（感染多重度５０）後の４Ｔ１細胞。固定後、細胞をアクチン細胞骨格及び核について染色した（両方とも灰色で）。
【図２０】ＳＰＩ−１  Ｔ３ＳＳ誘導条件下で増殖させたサルモネラ菌によるマウスｔＢｉｄの真核細胞への送達がアポトーシスを誘導することを示す図である。未処理のまま放置したＨｅＬａ細胞（Ｉ）、又はＩＩＩ：ＩＶ：ＳｔｅＡ１−２０−ｔ−Ｂｉｄを保有する、Ｖ：ＳｔｅＡＦＬ−Ｂｉｄを保有する、ＶＩ：ＳｏｐＥ１−８１−ｔ−Ｂｉｄを保有する若しくはＶＩＩ：ＳｏｐＥ１−１０５−ｔ−Ｂｉｄを保有するサルモネラ菌ａｒｏＡに４時間感染多重度１００で感染されたＨｅＬａ細胞に関する、切断カスパーゼ３  ｐ１７ウェスタンブロット分析。この実験については、全てのサルモネラ菌ａｒｏＡ株をＳＰＩ−１  Ｔ３ＳＳ誘導条件下で増殖させた。一部の事例では、細胞を、ＩＩ：１μＭのスタウロスポリンで処理した。記載の数字は、対応する高さの分子量をｋＤａで示すものである。
【図２１】ＳＰＩ−２  Ｔ３ＳＳ誘導条件下で増殖させたサルモネラ菌によるマウスｔＢｉｄの真核細胞への送達がアポトーシスを誘導することを示す図である。未処理のまま放置したＨｅＬａ細胞（Ｉ）、又はＩＩＩ：ＩＶ：ＳｔｅＡ１−２０−ｔ−Ｂｉｄを保有する、Ｖ：ＳｔｅＡＦＬ−Ｂｉｄを保有する、ＶＩ：ＳｏｐＥ１−８１−ｔ−Ｂｉｄを保有する若しくはＶＩＩ：ＳｏｐＥ１−１０５−ｔ−Ｂｉｄを保有するサルモネラ菌ａｒｏＡに４時間感染多重度１００で感染されたＨｅＬａ細胞に関する、切断カスパーゼ３  ｐ１７ウェスタンブロット分析。この実験については、全てのサルモネラ菌ａｒｏＡ株をＳＰＩ−２  Ｔ３ＳＳ誘導条件下で増殖させた。一部のケースでは、細胞を、ＩＩ：１μＭのスタウロスポリンで処理した。記載の数字は、対応する高さの分子量をｋＤａで示すものである。
【図２２Ａ−Ｂ】培養上清への様々な細胞周期タンパク質のサルモネラ菌Ｔ３ＳＳ依存性分泌の図である。サルモネラ菌ａｒｏＡ＋ＳｔｅＡＦＬ（Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ）又はＳｏｐＥ１−１０５（ＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＶＩＩＩ）のどちらかのインビトロ分泌実験であって、ＳｔｅＡＦＬ（Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ）又はＳｏｐＥ１−１０５（ＩＩ、ＩＶ、ＶＩ、ＶＩＩＩ）が次に列挙する通りのタンパク質と融合しているインビトロ分泌実験。Ｉ及びＩＩ：Ｉｎｋ４ａ−ＭｙｃＨｉｓ；ＩＩＩ及びＩＶ：Ｉｎｋ４ｃ−ＭｙｃＨｉｓ；Ｖ及びＶＩ：Ｍａｄ２−ＭｙｃＨｉｓ；ＶＩＩ及びＶＩＩＩ：Ｃｄｋ１−ＭｙｃＨｉｓ。沈殿培養上清（「Ａ」）及び全細菌溶解物（「Ｂ」）のタンパク質含有量を、抗ｍｙｃ抗体を使用するウェスタンブロット法により分析した。記載の数字は、対応する高さの分子量をｋＤａで示すものである。
【図２３Ａ−Ｂ】培養上清への様々な既知の細胞周期妨害ペプチドのＴ３ＳＳ依存性分泌を示す図である。Ｉ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２のインビトロ分泌実験。ＩＩ−ＶＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８であって、ＹｏｐＥ１−１３８が、次に列挙する通りのペプチドと融合しているもの：ＩＩ：Ｉｎｋ４Ａ８４−１０３、ＩＩＩ：ｐ１０７／ＲＢＬ１６５７−６６２、ＩＶ：ｐ２１１４１−１６０Ｄ１４９Ａ、Ｖ：ｐ２１１４５−１６０Ｄ１４９Ａ、ＶＩ：ｐ２１１７−３３、ＶＩＩ：サイクリンＤ２１３９−１４７。沈殿培養上清（「Ａ」）及び全細菌溶解物（「Ｂ」）のタンパク質含有量を、抗ＹｏｐＥ抗体を使用するウェスタンブロット法により分析した。記載の数字は、対応する高さの分子量をｋＤａで示すものである。
【図２４】Ｔ３ＳＳ送達タンパク質のユビキチンとの融合がＹｏｐＥ１−１３８付属物の除去を可能にすることを示す図である。ユビキチンと直接融合しているＹｏｐＥ１−１３８（ＹｏｐＥ１−１３８−Ｕｂｉ）と融合している目的のタンパク質を送達する株に、ＨｅＬａ細胞を感染させる。真核細胞へのタンパク質を送達後、内在性ユビキチン特異的プロテアーゼが目的のタンパク質からＹｏｐＥ１−１３８−Ｕｂｉ付属物を切断することになる。未感染のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞（Ｉ）、又はＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓ又はＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｆｌａｇ−ユビキチン−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓによる１時間の感染（感染多重度１００）後のジギトニン溶解ＨｅＬａ細胞を、抗ＩＮＫ４Ｃのウェスタンブロッティングにより、ＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−Ｆｌａｇ−ユビキチン−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓ又はＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓ、切断形ＶＩ：ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓ及びＶＩＩ：内在性ＩＮＫ４Ｃの存在について分析した。
【図２５】細菌Ｔ３ＳＳにより送達されることになる異種タンパク質及びそれらのドメインの模式図である。Ｉ：様々なグレースケールで彩色されたドメインを有するヒト／マウス完全長タンパク質、ＩＩ：様々なグレースケールで彩色されたドメインを有する切断型ヒト／マウスタンパク質、ＩＩＩ：ヒト／マウス完全長タンパク質のモチーフ／ドメインのみ、ＩＶ：ヒト／マウス完全長タンパク質の単なる反復モチーフ／ドメイン（左）又は２つの異なるモチーフ／ドメインの組合せ（右）。
【図２６】マウスｔＢｉＤ及びマウスＢａｘのＢＨ３ドメイン並びにそれらの融合リピートの真核細胞への送達ががん性細胞においてアポトーシスを誘導することを示す図である。Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞に、示されている通りの対応する細菌の感染多重度５、１０、２５及び５０（条件毎に左から右へ）で、４時間感染させた。細胞生存率に対する効果を核の計数による細胞数の計数によって評価した。Ｉ：核数。ＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｂｉｄ−ＢＨ３、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−（Ｂｉｄ−ＢＨ３）２及びＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−（Ｂｉｄ−ＢＨ３）−（Ｂａｘ−ＢＨ３）。核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。自動顕微鏡を使用して画像を取得し、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒを使用して細胞数を自動的に決定した。
【図２７】マウスｔＢｉＤ及びマウスＢａｘのＢＨ３ドメイン並びにそれらの融合リピートの真核細胞への送達ががん性細胞においてアポトーシスを誘導することを示す図である。４Ｔ１乳がん細胞に、示されている通りの対応する細菌の感染多重度５、１０、２５及び５０（条件毎に左から右へ）で、４時間感染させた。細胞生存率に対する効果を核の計数による細胞数の計数によって評価した。Ｉ：核数。ＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ｐＢａｄ＿Ｓｉ２、ＩＩＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｂｉｄ−ＢＨ３、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−（Ｂｉｄ−ＢＨ３）２及びＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−（Ｂｉｄ−ＢＨ３）−（Ｂａｘ−ＢＨ３）。核をＨｏｅｃｈｓｔで染色した。自動顕微鏡を使用して画像を取得し、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒを使用して細胞数を自動的に決定した。
【図２８】アポトーシス促進性が増した合成タンパク質の送達の図である。アポトーシス促進性タンパク質ｔ−ＢＩＤ又はＢＡＸ由来の単一ＢＨ３ドメイン又はＢＨ３のタンデムリピートからなる単一の合成タンパク質の送達は、４Ｔ１及びＢ１６Ｆ１０がん性細胞においてアポトーシス誘導増強をもたらす。ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ上にＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢＩＤ  ＢＨ３伸長ドメイン、Ｖ：ＹｏｐＥ１−１３８−リンカー−ｔＢＩＤ  ＢＨ３、ＶＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢＩＤ  ＢＨ３、ＶＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２、ＶＩＩＩ：ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢＩＤ  ＢＨ３−ＢＡＸ  ＢＨ３又はＩＶ：ＹｏｐＥ１−１３８−ＢＡＸ  ＢＨ３−ｔＢＩＤ  ＢＨ３をコードしているＹ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨＯＰＥＭＴに、４Ｔ１（Ｉ）又はＢ１６Ｆ１０（ＩＩ）細胞を感染させた。細胞に加えた細菌（感染多重度）の滴定を各株について行い、細胞数を決定し、非線形回帰を使用してＩＣ５０を算出した。ＩＣ５０感染多重度が示されている（ＩＩＩ）。
【図２９】ｐＹＶによりコードされた合成アポトーシス促進性タンパク質によるアポトーシスの誘導の図である。ｐＹＶ上にコードされた単一ＢＩＤ  ＢＨ３ドメイン又はＢＩＤ  Ｂ３ドメインのタンデムリピートの送達は、４Ｔ１及びＢ１６Ｆ１０がん性細胞においてアポトーシス誘導をもたらす。４Ｔ１（Ｉ）又はＢ１６Ｆ１０（ＩＩ）細胞を、ＩＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ＋ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−ＢＨ３−Ｂｉｄ、又はＶ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ＋ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ＢＨ３−Ｂｉｄ）２、又はＶＩ：Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ＢＨ３−Ｂｉｄ）２に、３時間、感染させた。細胞に加えた細菌（感染多重度）の滴定を各株について行い、細胞数を決定し、非線形回帰を使用してＩＣ５０（ＩＩＩ）を算出した。
【図３０】４Ｔ１乳がん同種移植モデルにおける静脈内注射したＹ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔの腫瘍定着の図である。腫瘍内の細菌数が組織１グラム当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）として示されている（ＩＩＩ）。感染後８日目（Ｉ）及び１４日目（ＩＩ）に腫瘍内の数を評価した。各点は、個々のマウスを表す。水平の破線は、検出限界を示す。
【図３１】４Ｔ１乳がん同種移植モデルにおける静脈内注射したＹ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔの生体内分布の図である。血液（Ｉ）、脾臓（ＩＩ）、肝臓（ＩＩＩ）、肺（ＩＶ）及び腫瘍（Ｖ）内の細菌数が、組織１グラム当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）、又は血液１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）（ＶＩ）として示されている。感染後１４日目に数を評価した。各点は、個々のマウスを表す。水平の破線は、検出限界を示す。＊は、肺に大きい転移が見られたマウスを示す。
【図３２】４Ｔ１乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行の遅延の図である。４Ｔ１乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、腫瘍が１５０−２５０ｍｍ３のサイズに達したら、Ｉ：ＰＢＳ又はＩＩ：１×１０７＊Ｙ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴ＋ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８（ＢＨ３−Ｂｉｄ）２を静脈内注射した。細菌の静脈内注射の日を０日目と定義した。その後数日（ＩＩＩ：細菌の静脈内注射後０日目から９日目）にわたって腫瘍体積をノギスで測定した。０日目の腫瘍体積に正規化した相対腫瘍体積が、ｍｍ３として示されている（ＩＶ）。平均値が記号で示されており、描かれているエラーバーは、平均値の標準誤差を示す。統計的有意性は、二元配置ＡＮＯＶＡで測定され、＊は、ｐ値＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ値＜０．００５を示す。
【図３３】４Ｔ１乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行の図である。４Ｔ１乳がん細胞を皮下に同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、腫瘍が１５０−２５０ｍｍ３のサイズに達したら、Ｉ：ＰＢＳ又はＩＩ：１×１０７＊Ｙ．エンテロコリティカｄＨＯＰＥＭＴを静脈内注射した。細菌の静脈内注射の日を０日目と定義した。その後数日（ＩＩＩ：細菌の静脈内注射後０日目から９日目）にわたって腫瘍体積をノギスで測定した。０日目の腫瘍体積に正規化した相対腫瘍体積が、ｍｍ３として示されている（ＩＶ）。平均値が記号で示されており、描かれているエラーバーは、平均値の標準誤差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、組換えグラム陰性菌株、及び異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインの真核細胞への送達のためのそれらの使用を提供する。
【００１５】
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用されることになり、適切な場合はいつでも、単数形で用いられる用語は複数系も含むことになり、また逆に複数形で使用される用語は単数形も含むことになる。本明細書において使用する用語法が特定の実施態様の説明を目的にしたものに過ぎず、限定を意図したものでないことは、理解されるはずである。
【００１６】
「グラム陰性菌株」という用語は、本明細書で使用される場合、次々の細菌を含む：エロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、エロモナス・ヒドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、エロモナス・ベロニ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ）、アナエロミクソバクター・デハロゲナンス（Ａｎａｅｒｏｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ  ｄｅｈａｌｏｇｅｎａｎｓ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、パラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ブラディリゾビウム・ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、バークホルデリア・セノセパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｎｏｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、クラミジア・ムリダルム（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｍｕｒｉｄａｒｕｍ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｍｏａｔｉｓ）、クラミドフィラ・アボルタス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、シトロバクター・ローデンチウム（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｒｏｄｅｎｔｉｕｍ）、デスルホビブリオ・ブルガリス（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、エドワージエラ・タルダ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ  ｔａｒｄａ）、エンドゾイコモナス・エリシコラ（Ｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓ  ｅｌｙｓｉｃｏｌａ）、火傷病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、エシェリキア・アルベルティイ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ａｌｂｅｒｔｉｉ）、大腸菌、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）、ミクソコッカス・キサンタス（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ  ｘａｎｔｈｕｓ）、パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、フォトバクテリウム・ダムセラエ（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄａｍｓｅｌａｅ）、フォトラブダス・ルミネッセンス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｓ）、フォトラブダス・テムペラタ（Ｐｈｏｔｏｒａｂｄｕｓ  ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）、シュードアルテロモナス・スポンギアエ（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｏｎｇｉａｅ）、緑膿菌、シュードモナス・プレコグロシシダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ）、シュードモナス・シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）、青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）、根粒菌属種（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ）、サルモネラ菌及び他のサルモネラ属種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）及び他のシゲラ属種（���ｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ）、ソーダリス・グロスシニディウス（Ｓｏｄａｌｉｓ  ｇｌｏｓｓｉｎｉｄｉｕｓ）、ビブリオ・アルギノリチカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・アズレウス（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｚｕｒｅｕｓ）、ビブリオ・キャンプベリイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃａｍｐｅｌｌｉｉ）、ビブリオ・カルベンティクス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃａｒｉｂｂｅｎｔｈｉｃｕｓ）、ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙ）、腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ビブリオ・タスマニエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ）、ビブリオ・ツビアシイ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｔｕｂｉａｓｈｉｉ）、キサントモナス・アキソノポディス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）、キサントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、イネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、偽結核菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。本発明の好ましいグラム陰性菌株は、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）及びシュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に含まれるグラム陰性菌株である。本発明のグラム陰性菌株は、インビトロ及び／又はインビボ、好ましくはインビボでの、細菌Ｔ３ＳＳによる異種タンパク質の真核細胞への送達に通常は使用される。
【００１７】
「組換えグラム陰性菌株」という用語は、本明細書で使用される場合、ベクターで遺伝的に形質転換されたグラム陰性菌株を意味する。本発明の有用なベクターは、例えば、発現ベクター、染色体若しくは毒性プラスミド挿入のためのベクター、又は染色体若しくは毒性プラスミド挿入若しくは改変のためのＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片である。
【００１８】
本明細書で使用される「少なくとも１つのＴ３ＳＳ機能性エフェクタータンパク質の産生を欠く組換えグラム陰性菌株」という用語は、少なくとも１つのＴ３ＳＳエフェクタータンパク質が変異を受け、そのため、結果として得られる組換えグラム陰性菌株が少なくとも１つのＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の機能的形態をもはや産生しない、すなわち、そのようなエフェクター遺伝子の発現が消失され、したがって、結果として得られる組換えグラム陰性菌株が、少なくとも１つのＴ３ＳＳエフェクタータンパク質を一切産生しない、又はコードされているエフェクタータンパク質の触媒活性が消失され、したがって、産生される少なくとも１つのＴ３ＳＳエフェクターがその触媒活性を有さない、例えば、そのエフェクター機能を発揮しない、組換えグラム陰性菌株を意味する。タンパク質を送達するために、少なくとも１つのＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の産生を欠く組換えグラム陰性菌株の分泌及び移行系は、インタクトである必要がある。「Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質」又は「細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、真核細胞のサイトゾルにＴ３Ｓ系により自然に打ち込まれるタンパク質、及び例えば真核生物の膜への移行孔を形成し得るＴ３Ｓ系により自然に分泌されるタンパク質（孔形成トランスロケーター（エルシニア属ＹｏｐＢ及びＹｏｐＤのようなもの）、並びにエルシニア属ＬｃｒＶのようなｔｉｐタンパク質）を意味する。好ましくは、Ｔ３Ｓ系により真核細胞のサイトゾルに自然に打ち込まれるタンパク質が使用される。これらの毒性因子は、病原体のために真核細胞を麻痺させる又は再プログラミングすることになる。Ｔ３Ｓエフェクターは、生化学的活性の幅広いレパートリーを示し、極めて重要な宿主調節分子の機能を調節し、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＢＳ３、ＡｖｒＢｓＴ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＤ１、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＡｖｒＲｐｔ２、ＡｖｒＸｖ３、ＣｉｇＲ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＧｏｇＢ、ＧｔｇＡ、ＧｔｇＥ、ＧＡＬＡタンパク質ファミリー、ＨｏｐＡＢ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＩ１、ＨｏｐＭ１、ＨｏｐＮ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＨｏｐＵ１、ＨｓｖＢ、ＩｃｓＢ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐａＨ、ＩｐａＨ７．８、ＩｐａＨ９．８、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＢ２、ＩｐｇＤ、ＬｃｒＶ、Ｍａｐ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＯｓｐＦ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＰｉｐＢ、ＰｉｐＢ２、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＰｔｈＸｏ１、ＰｔｈＸｏ６、ＰｔｈＸｏ７、ＳｉｆＡ、ＳｉｆＢ、ＳｉｐＡ／ＳｓｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＣ／ＳｓｐＣ、ＳｉｐＤ／ＳｓｐＤ、ＳｌｒＰ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｏｐＤ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｉＣ／ＳｓａＢ、ＳｐｔＰ、ＳｐｖＢ、ＳｐｖＣ、ＳｒｆＨ、ＳｒｆＪ、Ｓｓｅ、ＳｓｅＢ、ＳｓｅＣ、ＳｓｅＤ、ＳｓｅＦ、ＳｓｅＧ、ＳｓｅＩ／ＳｒｆＨ、ＳｓｅＪ、ＳｓｅＫ１、ＳｓｅＫ２、ＳｓｅＫ３、ＳｓｅＬ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＳｔｅＡ、ＳｔｅＢ、ＳｔｅＣ、ＳｔｅＤ、ＳｔｅＥ、ＴｃｃＰ２、Ｔｉｒ、ＶｉｒＡ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＶｏｐＦ、ＸｏｐＤ、ＹｏｐＢ、ＹｏｐＤ  ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＴ、ＹｐｋＡを含む。
【００１９】
「増殖に必須のアミノ酸を産生することが不十分なグラム陰性菌株」及び「栄養要求突然変異株」という用語は、本明細書では同義で使用され、外から供給される少なくとも１つの必須アミノ酸又はその前駆体の非存在下で増殖することができないグラム陰性菌株を意味する。株による生産が不十分であるアミノ酸は、例えば、アスパラギン酸塩、メソ−２，６−ジアミノピメリン酸、芳香族アミノ酸又はロイシン−アルギニンである［８］。そのような株を、例えば、アスパラギン酸−ベータ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失（Δａｓｄ）により、生じさせることができる。そのような栄養要求突然変異株は、外来メソ−２，６−ジアミノピメリン酸の非存在下では増殖することができない［９］。突然変異株、例えば、アスパラギン酸−ベータ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失は、本発明の増殖に必須のアミノ酸を産生することが不十分なグラム陰性菌株にとってここでは好ましい。
【００２０】
「真核細胞表面又は細胞外マトリックスと結合する接着タンパク質の生産が不十分なグラム陰性菌株」という用語は、対応する野生型株により発現される接着タンパク質と比較して少なくとも１つの接着タンパク質を発現しない突然変異型グラム陰性菌株を意味する。接着タンパク質は、例えば、線毛（ｐｉｌｉ）／線毛（ｆｉｍｂｒｉａｅ）又は非線毛アドヘシンのような伸長した高分子接着分子を含み得る。線毛アドヘシンは、１型線毛（例えば、ＦｉｍＨアドヘシンを有する大腸菌Ｆｉｍ線毛）、Ｐ線毛（例えば、大腸菌からのＰｇｐＧアドヘシンを有するＰａｐ線毛）、４型線毛（例えば、緑膿菌からのピリンタンパク質）又はｃｕｒｌｉ（サルモネラ菌からのＣｓｇＡアドヘシンを有するＣｓｇタンパク質）を含む。非線毛アドヘシンは、三量体自己輸送体アドヘシン、例えば、Ｙ．エンテロコリティカからのＹａｄＡ、ＢｐａＡ（類鼻疽菌（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ））、Ｈｉａ（インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ））、ＢａｄＡ（バルトネラ・ヘンセラ菌（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ））、ＮａｄＡ（髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）又はＵｓｐＡ１（モラクセラ・カタラーリス（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ））、並びに他の自己輸送体アドヘシン、例えばＡＩＤＡ−１（大腸菌）、並びに他のアドヘシン／インベイシン、例えば、Ｙ．エンテロコリティカからのＩｎｖＡ、又はインチミン（大腸菌）、又はＤｒファミリー若しくはＡｆａファミリーのメンバー（大腸菌）を含む。ＹａｄＡ及びＩｎｖＡという用語は、本明細書で使用される場合、Ｙ．エンテロコリティカからのタンパク質を意味する。自己輸送体ＹａｄＡ［１０、１１］は、フィブロネクチンはもちろん様々な形態のコラーゲンとも結合し、その一方で、インベイシンＩｎｖＡ［１２−１４］は、真核細胞膜中のβ−インテグリンと結合する。グラム陰性菌株がＹ．エンテロコリティカ株である場合、その株には、好ましくは、ＩｎｖＡ及び／又はＹａｄＡが欠損している。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「腸内細菌科」という用語は、脊椎動物において病原体として出現することが多い、土壌、水、植物及び動物中で見出されるグラム陰性、桿状、通性嫌気性細菌の科を含む。この科の細菌は、類似の生理機能を共有し、それぞれのゲノムの機能性エレメント及び遺伝子内の保存を示す。オキシダーゼ陰性であることはもちろん、この科の全てのメンバーは、グルコース発酵菌であり、大部分が硝酸還元菌である。
【００２２】
本発明の腸内細菌科細菌は、その科からの何れの細菌であってもよく、具体的には、次の属の細菌を、これらに限定されるものではないが、含む：大腸菌属、シゲラ属、エドワージエラ属（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ属、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属、エンテロバクター属、セラチア属、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、又はエルシニア属。より具体的な実施態様では、細菌は、大腸菌、エシェリキア・ブラタエ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｂｌａｔｔａｅ）、エシェリキア・ファグソニイ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ）、エシェリキア・ハーマンニイ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｈｅｒｍａｎｉｉ）、エシェリキア・ブルネリス（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｖｕｎｅｒｉｓ）、サルモネラ菌、サルモネラ・ボンゴリ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｂｏｎｇｏｒｉ）、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、フレクスナー赤痢菌、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｂｏｙｄｉｉ）、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロバクター・ジェルゴビアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｇｅｒｇｏｖｉａｅ）、エンテロバクター・サカザキ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｋａｚａｋｉｉ）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、霊菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、偽結核菌、ペスト菌、エルシニア・エンテロコリティカ、火傷病菌、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロテウス・ペンネリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｐｅｎｎｅｒｉ）、プロテウス・ハウセリ（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｈａｕｓｅｒｉ）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ａｌｃａｌｉｆａｃｉｅｎｓ）、又はモルガン菌（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｍｏｒｇａｎｉｉ）種のものである。好ましくは、グラム陰性菌株は、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属、シゲラ属、シュードモナス属、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、エルウィニア属、パントエア属、ビブリオ属、バークホリデリア属、ラルストニア属、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ソダリス属（Ｓｏｄａｌｉｓ）、シトロバクター属、エドワージエラ属、根粒菌属、エロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、フォトラブダス属（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）、ボルデテラ属及びデスルホビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）からなる群から、より好ましくは、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属及びシュードモナス属からなる群から、最も好ましくは、エルシニア属及びサルモネ���属からなる群から選択される。
【００２３】
「エルシニア（属）」という用語は、本明細書で使用される場合、エルシニア・エンテロコリティカ、偽結核菌及びペスト菌をはじめとする、エルシニア属の全ての種を含む。好ましいのは、エルシニア・エンテロコリティカである。
【００２４】
「サルモネラ（属）」という用語は、本明細書で使用される場合、サルモネラ菌及びサルモネラ・ボンゴリ（Ｓ．ｂｏｎｇｏｒｉ）をはじめとする、サルモネラ属の全ての種を含む。好ましいのは、サルモネラ菌である。
【００２５】
「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、転写単位の発現を制御する核酸配列を意味する。「プロモーター領域」は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、下流の（３’方向の）コード配列の転写を開始させることができる、調節領域である。プロモーター領域内には、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１を用いてマッピングすることにより簡便に定義される）、並びに推定−３５領域及びプリブノーボックス等の、ＲＮＡの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。２つのＲＮＡ領域間の関係を記載する際の「動作可能に連結されている」という用語は、単に、それらが互いに機能的に関連していること及びそれらが同じ核酸断片上に位置することを意味する。プロモーターが構造遺伝子の転写を調節する場合、及びプロモーターが構造遺伝子と同じ核酸断片状に位置する場合、プロモーターは、構造遺伝子に動作可能に連結されている。通常、プロモーターは、前記グラム陰性菌株内で機能性である、すなわち、プロモーターは、本発明の融合タンパク質を発現することができ、すなわち、プロモーターは、さらなる遺伝子操作も、さらなるタンパク質の発現も伴わずに、本発明の融合タンパク質を発現することができる。さらに、機能性プロモーターは、細菌Ｔ３ＳＳに対する対抗制御を自然に受けてはならない。
【００２６】
本明細書で使用される「送達する」という用語は、組換えグラム陰性菌株から真核細胞へのタンパク質の輸送であって、組換えグラム陰性菌株において異種タンパク質を発現させるステップ、発現されたタンパク質をそのようなグラム陰性菌株から分泌するステップ、及びそのようなグラム陰性菌株による分泌タンパク質を真核細胞のサイトゾルに移行させるステップを含む、輸送を意味する。したがって、本明細書では同義で使用される「送達シグナル」又は「分泌シグナル」という用語は、グラム陰性菌株の分泌及び移行系により認識され得るポリペプチド配列であって、グラム陰性菌株から真核細胞へのタンパク質の送達を指示するポリペプチド配列を意味する。
【００２７】
本明細書で使用される「細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル」という用語は、組換えグラム陰性菌株において機能する細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル、すなわち、組換えグラム陰性菌株において発現された異種タンパク質を、例えば、ＩＩＩ型分泌系等の分泌系によってそのような組換えグラム陰性菌株から分泌できるようにする、又は例えば、ＩＩＩ型分泌系等の分泌系によってそのような組換えグラム陰性菌株により真核細胞のサイトゾルに移行させることができるようにするシグナルを意味する。本明細書で使用される「細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル」という用語は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの断片、すなわち、送達シグナルのより短いバージョン、例えば、１０アミノ酸以下、好ましくは２０アミノ酸以下、より好ましくは５０アミノ酸以下、よりいっそう好ましくは１００アミノ酸以下、特に１４０アミノ酸以下の送達シグナル、例えば天然に存在する送達シグナルも含む。したがって、例えば、細菌エフェクタータンパク質から送達シグナルをコードするＤＮＡ配列等の、ヌクレオチド配列は、完全長送達シグナルをコードすることもあり、又はその断片であって、通常は３０以下、好ましくは６０以下、より好ましくは１５０以下、よりいっそう好ましくは３００以下、特に４２０以下の核酸を含む断片を含むこともある。
【００２８】
本明細書で使用される場合、タンパク質の「分泌」は、組換えグラム陰性菌株の細胞膜を横断して外側への異種タンパク質の移行を意味する。タンパク質の「移行」は、組換えグラム陰性菌株から真核細胞の原形質膜を横断してそのような真核細胞のサイトゾルへの異種タンパク質の輸送を意味する。
【００２９】
「真核細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、次の真核細胞を含む：Ｈｉ−５、ＨｅＬａ、Ｈｅｋ、ＨＵＶＥＣ、３Ｔ３、ＣＨＯ、ジャーカット、Ｓｆ−９、ＨｅｐＧ２、ベロ、ＭＤＣＫ、Ｍｅｆ、ＴＨＰ−１、Ｊ７７４、ＲＡＷ、Ｃａｃｏ２、ＮＣＩ６０、ＤＵ１４５、Ｌｎｃａｐ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４３８、ＰＣ３、Ｔ４７Ｄ、Ａ５４９、Ｕ８７、ＳＨＳＹ５Ｙ、Ｅａ．Ｈｙ９２６、Ｓａｏｓ−２、４Ｔ１、Ｄ２Ａ１、Ｂ１６Ｆ１０、及び初代培養ヒト肝細胞。「真核細胞」は、本明細書で使用される場合、「標的細胞」又は「標的真核細胞」とも呼ばれる。
【００３０】
「Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、真核細胞のサイトゾルにＴ３Ｓ系により自然に打ち込まれるタンパク質、又は例えば真核生物の膜への移行孔を形成し得るＴ３Ｓ系により自然に分泌されるタンパク質（孔形成トランスロケーター（エルシニアＹｏｐＢ及びＹｏｐＤのようなもの）、並びにエルシニアＬｃｒＶのようなｔｉｐタンパク質）を意味する。好ましくは、Ｔ３Ｓ系により真核細胞のサイトゾルに自然に打ち込まれるタンパク質が使用される。これらの毒性因子は、病原体のために真核細胞を麻痺させる又は再プログラミングすることになる。Ｔ３Ｓエフェクターは、生化学的活性の幅広いレパートリーを示し、極めて重要な宿主調節分子の機能を調節し［２、１５］、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＢＳ３、ＡｖｒＢｓＴ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＤ１、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＡｖｒＲｐｔ２、ＡｖｒＸｖ３、ＣｉｇＲ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＧｏｇＢ、ＧｔｇＡ、ＧｔｇＥ、ＧＡＬＡタンパク質ファミリー、ＨｏｐＡＢ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＩ１、ＨｏｐＭ１、ＨｏｐＮ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＨｏｐＵ１、ＨｓｖＢ、ＩｃｓＢ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐａＨ、ＩｐａＨ７．８、ＩｐａＨ９．８、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＢ２、ＩｐｇＤ、ＬｃｒＶ、Ｍａｐ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＯｓｐＦ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＰｉｐＢ、ＰｉｐＢ２、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＰｔｈＸｏ１、ＰｔｈＸｏ６、ＰｔｈＸｏ７、ＳｉｆＡ、ＳｉｆＢ、ＳｉｐＡ／ＳｓｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＣ／ＳｓｐＣ、ＳｉｐＤ／ＳｓｐＤ、ＳｌｒＰ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｏｐＤ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｉＣ／ＳｓａＢ、ＳｐｔＰ、ＳｐｖＢ、ＳｐｖＣ、ＳｒｆＨ、ＳｒｆＪ、Ｓｓｅ、ＳｓｅＢ、ＳｓｅＣ、ＳｓｅＤ、ＳｓｅＦ、ＳｓｅＧ、ＳｓｅＩ／ＳｒｆＨ、ＳｓｅＪ、ＳｓｅＫ１、ＳｓｅＫ２、ＳｓｅＫ３、ＳｓｅＬ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＳｔｅＡ、ＳｔｅＢ、ＳｔｅＣ、ＳｔｅＤ、ＳｔｅＥ、ＴｃｃＰ２、Ｔｉｒ、ＶｉｒＡ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＶｏｐＦ、ＸｏｐＤ、ＹｏｐＢ、ＹｏｐＤ  ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＴ、ＹｐｋＡを含む。
【００３１】
エルシニア属のＴ３ＳＳエフェクター遺伝子は、例えば、Ｙ．エンテロコリティカからクローニングされており、それらは、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ／ＹｏｐＪ、及びＹｏｐＴである［１６］。フレクスナー赤痢菌（例えば、ＯｓｐＦ、ＩｐｇＤ、ＩｐｇＢ１）、サルモネラ菌（例えば、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＢ、ＳｐｔＰ）、緑膿菌（例えば、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＵ、ＥｘｏＹ）又は大腸菌（例えば、Ｔｉｒ、Ｍａｐ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ）からそれぞれのエフェクター遺伝子をクローニングすることができる。これらの遺伝子の核酸配列を当業者は、例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋデータベースから（ＮＣ＿００２１２０  ＧＩ：１０９５５５３６からｙｏｐＨ、ｙｏｐＯ、ｙｏｐＥ、ｙｏｐＰ、ｙｏｐＭ、ｙｏｐＴ；ＡＦ３８６５２６．１  ＧＩ：１８４６２５１５からのフレクスナー赤痢菌エフェクタータンパク質；ＮＣ＿０１６８１０．１  ＧＩ：３７８６９７９８３又はＦＱ３１２００３．１  ＧＩ：３０１１５６６３１からのサルモネラ菌エフェクター；ＡＥ００４０９１．２  ＧＩ：１１０２２７０５４又はＣＰ０００４３８．１  ＧＩ：１１５５８３７９６からの緑膿菌エフェクター；及びＮＣ＿０１１６０１．１  ＧＩ：２１５４８５１６１からの大腸菌エフェクタータンパク質）入手することができる。
【００３２】
本発明では、遺伝子は、タンパク質と区別するために小文字の斜字により表示する。遺伝子（小文字の斜字により表示）が細菌種名（例えば、大腸菌）の後に続いている場合、それらは、対応する細菌種における対応する遺伝子の変異を意味する。例えば、ＹｏｐＥは、ｙｏｐＥ遺伝子によりコードされたエフェクタータンパク質を指す。Ｙ．エンテロコリティカｙｏｐＥは、ｙｏｐＥ遺伝子に変異があるＹ．エンテロコリティカを表す。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」、「ポリペプチドの」及び「ペプチドの」という用語は、隣接する残基のアルファ−アミノ基とカルボキシ基間のペプチド結合により互いに連結されている一連のアミノ酸残基を指定するために同義で使用される。好ましいのは、少なくとも１０のアミノ酸、より好ましくは少なくとも２０のアミノ酸、を含むアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００３４】
本発明によれば、「異種タンパク質のドメイン」は、天然に存在するタンパク質のドメインを含み、人工的に操作されたタンパク質のドメインも含む。本明細書で使用される場合、「異種タンパク質のドメイン」という用語は、Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質のドメイン以外の異種タンパク質のドメイン、又は融合タンパク質を獲得するために融合させることができるそのＮ末端断片を含むドメイン以外のドメインを意味する。特に、異種タンパク質のドメインは、本明細書で使用される場合、本発明により提供され、使用される特定の組換えグラム陰性菌株のプロテオーム、すなわち全天然タンパク質成分に属さない、例えば、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属又はシュードモナス属の特定の菌株のプロテオーム、すなわち、全天然タンパク質成分に属さない異種タンパク質のドメインを意味する。通常、異種タンパク質のドメインは、ヒト起源を含む、動物起源のものである。好ましくは、異種タンパク質のドメインは、ヒトタンパク質のドメインである。より好ましくは、異種タンパク質のドメインは、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター並びにウイルスタンパク質からなる群から選択されるタンパク質のドメインである。特に好ましくは、異種タンパク質のドメインは、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、レポータータンパク質、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター及びウイルスタンパク質からなる群から選択されるタンパク質のドメインである。よりいっそう特に好ましいのは、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、及びアンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される異種タンパク質のドメインである。最も好ましいのは、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与する動物タンパク質のような、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質のドメイン、好ましくは、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するヒト異種タンパク質のドメインである。
【００３５】
「異種タンパク質の反復ドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、異種タンパク質のドメインの数度の反復からなる融合タンパク質であって、これらのドメインが互いに直接融合していてもよく、又は可変リンカー、例えば、アミノ酸数１−３０の間、好ましくは２−１５の間、よりいっそう好ましくは３−１０の間のリンカーが、ドメイン間に導入されていてもよい、融合タンパク質を意味する。好ましくは、同一のドメイン、又は８０％より高い、通常は８５％より高い、好ましくは９０％より高い、よりいっそう好ましくは９５％より高い、特に９６％より高い、より特に９７％より高い、よりいっそう特に９８％より高い、最も特に９９％より高いアミノ酸配列同一性を有する反復ドメインが使用される。また、好ましいのは、１００％のアミノ酸同一性を有する同一のドメインである。好ましくは、２つの反復ドメイン、より好ましくは２つの同一の反復ドメイン、又は９０％より高い、好ましくは９５％より高い、最も好ましくは１００％のアミノ酸配列同一性を有する２つの反復ドメインは、本明細書で意味するところの融合タンパク質に含まれる。２つより多くの、例えば、３、４、５又は６つの反復ドメインも、本発明により企図されている。
【００３６】
「異なる異種タンパク質の２つ以上のドメイン」という用語は、本明細書で使用される場合、異なる異種タンパク質の少なくとも２つのドメイン、例えば、８０％以下のアミノ酸配列同一性を有する異種タンパク質の少なくとも２つのドメイン、の一度又は数度の反復からなる融合タンパク質であって、これらの異なるドメインが互いに直接融合していてもよく、又は可変リンカー、例えば、アミノ酸数１−３０の間、好ましくは２−１５の間、よりいっそう好ましくは３−１０の間のリンカーが、ドメイン間に導入されていてもよい、融合タンパク質を意味する。好ましくは、異なる異種タンパク質の２つのドメインは、本明細書で意味するところの融合タンパク質に含まれる。異なる異種タンパク質の２つより多くの、例えば、３、４、５又は６つのドメインも、本発明により企図されている。
【００３７】
「タンパク質の同じ機能クラスに属する異種タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、同じ機能を有する異種タンパク質、例えば、酵素活性を有する異種タンパク質、例えば細胞周期制御等の、同じ経路で作用する異種タンパク質、又は細菌エフェクタータンパク質の同じクラスに属していることのような、共通の特異的特徴を共有する異種タンパク質を意味する。タンパク質の機能クラスは、例えば、真核細胞に対する毒性を確立する生物学的プロセスにおいて一緒に作用する、アポトーシス若しくはアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子として作用するタンパク質、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター又はウイルスタンパク質である。
【００３８】
組換えグラム陰性菌株により発現される異種タンパク質のドメインは、通常、１−１５０ｋＤａの間、好ましくは１−３０ｋＤａの間、より好ましくは１−２０ｋＤａの間、最も好ましくは１−１０ｋＤａの間の分子量を有する。
【００３９】
本発明によれば、「アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質」又は「アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するヒト異種タンパク質」は、これらに限定されるものではないが、Ｂａｄ、Ｂｃｌ２、Ｂａｋ、Ｂｍｔ、Ｂａｘ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、Ｂｉｍ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ａｐａｆ１、カスパーゼ９、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ１０、ＤＦＦＡ、ＤＦＦＢ、ＲＯＣＫ１、ＡＰＰ、ＣＡＤ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＥｎｄｏＧ、ＡＩＦ、ＨｔｒＡ２、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、Ａｒｔｓ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、Ｂｏｋ／Ｍｔｄ、Ｂｍｆ、Ｍｃｌ−１（Ｓ）、ＩＡＰファミリー、ＬＣ８、ＰＰ２Ｂ、１４−３−３タンパク質、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、Ｅｒｋ１／２、ｐ９０ＲＳＫ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、Ｄａｘｘ、カスパーゼ８、カスパーゼ２、ＲＩＰ、ＲＡＩＤＤ、ＭＫＫ７、ＪＮＫ、ＦＬＩＰｓ、ＦＫＨＲ、ＧＳＫ３、ＣＤＫ及びそれらの阻害剤、例えばＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））、並びにＣｉｐ１／Ｗａｆ１／Ｋｉｐ１−２ファミリー（ｐ２１（Ｃｉｐ１／Ｗａｆ１）、ｐ２７（Ｋｉｐ１）、ｐ５７（Ｋｉｐ２））を含む。好ましくは、Ｂａｄ、Ｂｍｔ、Ｂｃｌ２、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、Ｂｉｍ、Ｂｃｌ−ｘＬ、カスパーゼ９、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｂｏｋ／Ｍｔｄ、Ｂｍｆ、Ｍｃｌ−１（Ｓ）、ＬＣ８、ＰＰ２Ｂ、ＴＲＡＤＤ、Ｄａｘｘ、カスパーゼ８、カスパーゼ２、ＲＩＰ、ＲＡＩＤＤ、ＦＫＨＲ、ＣＤＫ及びそれらの阻害剤、例えばＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））、最も好ましくは、ＢＩＭ、Ｂｉｄ、切断型Ｂｉｄ、ＦＡＤＤ、カスパーゼ３（及びそのサブユニット）、Ｂａｘ、Ｂａｄ、Ａｋｔ、ＣＤＫ及びそれらの阻害剤、例えばＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））が、使用される［１７−１９］。加えて、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質は、ＤＩＶＡ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｅｇｌ−１、Ｂｃｌ−Ｇｓ、シトクロムＣ、ベクリン、ＣＥＤ−１３、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｃｅｄ−９、Ａ１、ＮＲ１３、Ｂｆｌ−１、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ８を含む。アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質は、アポトーシス促進性タンパク質、抗アポトーシスタンパク質、アポトーシス阻止経路の阻害剤、及び生存促進性シグナル伝達又は経路の阻害剤からなる群から選択される。アポトーシス促進性タンパク質は、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ−Ｇｓ、ベクリン１、Ｅｇｌ−１及びＣＥＤ−１３、シトクロムＣ、ＦＡＤＤ、カスパーゼファミリー、並びにＣＤＫ及びそれらの阻害剤、例えばＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））からなる群から選択される、又はＢａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ｅｇｌ−１、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ−Ｇｓ、ベクリン１、Ｅｇｌ−１及びＣＥＤ−１３、シトクロムＣ、ＦＡＤＤ、並びにカスパーゼファミリーからなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましいのは、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ｅｇｌ−１、Ａｐａｆ１、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ−Ｇｓ、ベクリン１、Ｅｇｌ−１及びＣＥＤ−１３、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＦＡＤＤ、カスパーゼファミリー、ＣＤＫ及びそれらの阻害剤、例えばＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））である。同じく好ましいのは、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ａｐａｆ１、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ−Ｇｓ、ベクリン１、Ｅｇｌ−１及びＣＥＤ−１３、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＦＡＤＤ、カスパーゼファミリーである。
【００４０】
抗アポトーシスタンパク質は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｍｃｌ−１、Ｃｅｄ−９、Ａ１、ＮＲ１３、ＩＡＰファミリー及びＢｆｌ−１からなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましいのは、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、Ｂｃｌ−Ｂ、Ｂｃｌ−Ｗ、Ｍｃｌ−１、Ｃｅｄ−９、Ａ１、ＮＲ１３及びＢｆｌ−１である。
【００４１】
アポトーシス阻止経路の阻害剤は、Ｂａｄ、Ｎｏｘａ及びＣｄｃ２５Ａからなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましいのは、Ｂａｄ及びＮｏｘａである。
【００４２】
生存促進性シグナル伝達又は経路の阻害剤は、ＰＴＥＮ、ＲＯＣＫ、ＰＰ２Ａ、ＰＨＬＰＰ、ＪＮＫ、ｐ３８からなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましいのは、ＰＴＥＮ、ＲＯＣＫ、ＰＰ２Ａ及びＰＨＬＰＰである。
【００４３】
一部の実施態様では、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与する異種タンパク質は、ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質、カスパーゼ、及びアポトーシスの細胞死受容体調節の細胞内シグナル伝達タンパク質からなる群から選択される。
【００４４】
ＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質は、Ｂａｄ、ＢＩＭ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ、Ｂｏｄ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−Ｇｓ、ベクリン１、Ｅｇｌ−１並びにＣＥＤ−１３からなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましいのは、Ｂａｄ、ＢＩＭ、Ｂｉｄ及びｔＢｉｄである。
【００４５】
カスパーゼは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０からなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましいのは、カスパーゼ３、カスパーゼ８及びカスパーゼ９である。
【００４６】
アポトーシスの細胞死受容体調節の細胞内シグナル伝達タンパク質は、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ、ＡＳＣ、ＢＡＰ３１、ＧＵＬＰ１／ＣＥＤ−６、ＣＩＤＥＡ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＣＩＤＥＣ、ＲＩＰＫ１／ＲＩＰ１、ＣＲＡＤＤ、ＲＩＰＫ３／ＲＩＰ３、Ｃｒｋ、ＳＨＢ、ＣｒｋＬ、ＤＡＸＸ、１４−３−３ファミリー、ＦＬＩＰ、ＤＦＦ４０及び４５、ＰＥＡ−１５、ＳＯＤＤからなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましいのは、ＦＡＤＤ及びＴＲＡＤＤである。
【００４７】
一部の態様では、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与する異種タンパク質の２つのドメイン、好ましくは、アポトーシス若しくはアポトーシス調節に関与するタンパク質の２つの反復ドメイン、好ましくは同一の２つの反復ドメイン、又はアポトーシス若しくはアポトーシス調節に関与する異なるタンパク質の２つのドメインは、本発明のグラム陰性菌株及び／又はベクターに含まれる。一部の実施態様では、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与する異種タンパク質の２つのドメインであって、一方が、アポトーシス促進性タンパク質のドメインであり、他方が、アポトーシス阻止経路の阻害剤であるタンパク質のドメインであるか、又は一方が、アポトーシス促進性タンパク質のドメインであり、他方が、生存促進性シグナル伝達若しくは経路の阻害剤であるタンパク質のドメインである、２つのドメインは、本発明のグラム陰性菌株及び／又はベクターに含まれる。
【００４８】
本発明により包含されるアポトーシス促進性タンパク質は、通常、アルファヘリックス構造、好ましくは、両親媒性ヘリックスにより取り囲まれた疎水性ヘリックスを有し、通常は、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３又はＢＨ４ドメインのうちの少なくとも１つを含み、好ましくは、少なくとも１つのＢＨ３ドメインを有する。通常、本発明に包含されるアポトーシス促進性タンパク質は、酵素的活性を有さない。
【００４９】
本発明に包含される抗アポトーシスタンパク質は、通常、アルファヘリックス構造、好ましくは、両親媒性ヘリックスにより取り囲まれた疎水性ヘリックスを有し、異なるＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３及びＢＨ４ドメインの組合せ、好ましくは、ＢＨ１及びＢＨ２ドメインが存在する異なるＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３及びＢＨ４ドメインの組合せ、より好ましくは、ＢＨ４−ＢＨ３−ＢＨ１−ＢＨ２、ＢＨ１−ＢＨ２、ＢＨ４−ＢＨ１−ＢＨ２又はＢＨ３−ＢＨ１−ＢＨ２（Ｎ末端からＣ末端へ）を含む。加えて、少なくとも１つのＢＩＲドメインを含有するタンパク質も包含される。
【００５０】
本発明に包含されるアポトーシス阻止経路の阻害剤は、通常、アルファヘリックス構造、好ましくは、両親媒性ヘリックスにより取り囲まれた疎水性ヘリックスを有し、通常は１つのＢＨ３ドメインを含む。
【００５１】
ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３又はＢＨ４ドメインは、各々、通常は長さが約５−約５０アミノ酸の間である。したがって、一部の実施態様では、異種タンパク質のドメインは、長さが約５−約２００、好ましくは約５−約１５０、より好ましくは約５−約１００、最も好ましくは約５−約５０、特に、約５−約２５アミノ酸である、異種タンパク質のドメインからなる群から選択される。
【００５２】
特に好ましいドメインは、アポトーシス誘導因子ｔＢＩＤのＢＨ３ドメイン、より詳細には、配列番号２０９、２１０、２１１及び２１２、好ましくは、配列番号２１１又は配列番号２１２からなる群から選択される配列を含むＢＨ３ドメインである。同じく好ましいのは、アポトーシス調節因子ＢＡＸのＢＨ３ドメイン、より詳細には、配列番号２１３、２１４、２１５及び２１６、好ましくは配列番号２１５又は配列番号２１６からなる群から選択される配列を含むＢＡＸドメインである。ヒト及びマウス配列が配列番号２０９−２１６に与えられているが、全ての他の種のｔＢＩＤ及びＢＡＸ  ＢＨ３ドメインも同様に含まれる。
【００５３】
一部の実施態様では、異種タンパク質の反復ドメインは、ＢＨ３ドメイン、特にアポトーシス誘導因子ｔＢＩＤの反復ＢＨ３ドメイン、より特に、アポトーシス誘導因子ｔＢＩＤの２つの反復ＢＨ３ドメイン、最も特に、配列番号２０２の配列に含まれるアポトーシス誘導因子ｔＢＩＤの２つの反復ＢＨ３ドメインである。したがって、好ましい実施態様では、本発明のグラム陰性菌株のベクターは、ＢＨ３ドメインの２つの反復ドメイン、より好ましくはアポトーシス誘導因子ｔＢＩＤの２つの反復ＢＨ３ドメイン、をコードする第２のＤＮＡ配列を含む。２つの反復ドメインは、１−３０アミノ酸長、好ましくは２−１５アミノ酸、より好ましくは３−１０アミノ酸長のリンカーにより連結されていることが好ましい。
【００５４】
一部の実施態様では、異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインは、タンパク質の同じ機能クラスに属する異種タンパク質のドメインであり、好ましくは、２つ以上のドメインの異なる異種タンパク質は、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質のクラスとは異なる異種タンパク質である。好ましい実施態様では、異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインは、アポトーシス誘導因子ｔＢＩＤのＢＨ３ドメイン、及びアポトーシス調節因子ＢＡＸのＢＨ３ドメイン、特に、配列番号２０３の配列に含まれる、融合したＢＨ３ドメインである。異なる異種タンパク質の２つのドメインは、１−３０アミノ酸長、好ましくは２−１５アミノ酸、より好ましくは３−１０アミノ酸長のリンカーにより連結されていることが好ましい。
【００５５】
一部の実施態様では、異種タンパク質は、プロドラッグ変換酵素である。これらの実施態様では、組換え弱毒化グラム陰性菌株は、プロドラッグ変換酵素を発現する、好ましくは、発現し、分泌する。本明細書で意味するところのプロドラッグ変換酵素は、非毒性プロドラッグを毒性プロドラッグに変換する酵素、好ましくは、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、チミジンキナーゼ、ベータガラクトシダーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼ及びベータグルクロニダーゼからなる群から選択される酵素、より好ましくは、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、チミジンキナーゼ及びベータガラクトシダーゼからなる群から選択される酵素を含む。
【００５６】
「プロテアーゼ切断部位」という用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸モチーフを認識する特定のプロテアーゼにより切断される、アミノ酸配列内の、例えば、タンパク質又は融合タンパク質のアミノ酸配列内の特定のアミノ酸モチーフを意味する。総説については［２０］を参照されたい。プロテアーゼ切断部位の例は、エンテロキナーゼ（軽鎖）、エンテロペプチダーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、ヒトライノウイルスプロテアーゼ（ＨＲＶ  ３Ｃ）、ＴＥＶプロテアーゼ、ＴＶＭＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子プロテアーゼ及びトロンビンからなる群から選択されるプロテアーゼにより切断される、アミノ酸モチーフである。
【００５７】
以下のアミノ酸モチーフは、それぞれプロテアーゼにより認識される：
−  Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ：エンテロキナーゼ（軽鎖）／エンテロペプチダーゼ
−  Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ／Ｇｌｙ−Ｐｒｏ：ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ／ヒトライノウイルスプロテアーゼ（ＨＲＶ  ３Ｃ）
−  ＴＥＶプロテアーゼ（タバコエッチウイルス）により認識される、Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、及びＧｌｕ−Ｘ−Ｘ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（ここでのＸは任意のアミノ酸である）に基づく改変モチーフ
−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ：ＴＶＭＶプロテアーゼ
−  Ｉｌｅ−（Ｇｌｕ又はＡｓｐ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ：第Ｘａ因子プロテアーゼ
−  Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ／Ｇｌｙ−Ｓｅ：トロンビン。
【００５８】
本明細書で使用する場合のプロテアーゼ切断部位にはユビキチンが包含される。したがって、一部の好ましい実施態様では、ユビキチンがプロテアーゼ切断部位として使用される。すなわち、第３のＤＮＡ配列は、Ｎ末端部位で特異的ユビキチンプロセシングプロテアーゼにより切断され得る、例えば、融合タンパク質が送達される細胞において脱ユビキチン化酵素と呼ばれる特異的ユビキチンプロセシングプロテアーゼによりＮ末端部位で内因的に切断され得るプロテアーゼ切断部位として、ユビキチンをコードする。ユビキチンは、そのＣ末端で、内在性ユビキチン特異的Ｃ末端プロテアーゼ（脱ユビキチン化酵素、ＤＵＢ）群により、プロセシングされる。ＤＵＢによるユビキチンの切断は、ユビキチンのまさにＣ末端（Ｇ７６の後）で起こるはずである。
【００５９】
「個体」、「対象」又は「患者」は、脊椎動物である。ある特定の実施態様では、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物は、霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類）並びにげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【００６０】
「変異」という用語は、本明細書で使用される場合、一般用語であり、単一の塩基対と複数の塩基対の両方の変化を含む。そのような変異は、置換、フレームシフト変異、欠失、挿入及びトランケーションを含み得る。
【００６１】
「標識分子、又は標識分子の受容部位」という用語は、本明細書で使用される場合、結合している化合物の蛍光をもたらす、特異的アミノ酸配列と結合している小分子化合物、好ましくは、クマリンリガーゼ／クマリン受容部位（及びその誘導体）、レゾルフィンリガーゼ／レゾルフィン受容部位（及びその誘導体）、及びＦｌＡｓＨ／ＲｅＡｓＨ色素（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に使用されているテトラシステインモチーフ（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓのようなもの及びその誘導体）、又は高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のような蛍光タンパク質を意味する。
【００６２】
「核内移行シグナル」という用語は、本明細書で使用される場合、真核細胞の核への取り込みのためのタンパク質を知らせるアミノ酸配列を意味し、好ましくは、ＳＶ４０ラージＴ抗原由来のＮＬＳ（ＰＰＫＫＫＲＫＶ）等の、ウイルス核内移行シグナルを含む。
【００６３】
「多重クローニング部位」という用語は、本明細書で使用される場合、ＡｃｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、ＭｌｕＣＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＰｃｉＩ、ＡｇｅＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｆｕＡＩ、ＳｅｘＡＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃｅＡＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｆｅＩ、ＡｌｕＩ、ＳｔｕＩ、ＳｃａＩ、ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＮｓｉＩ、ＡｓｅＩ、ＳｗａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＭｆｅＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｍｇＢＩ、ＰｍｌＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＡｌｅＩ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＰｖｕＩＩ、ＡｌｗＮＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＴｓｐＲＩ、ＮｄｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｓｌＩ、ＦｓｐＥＩ、ＸｃｍＩ、ＢｓｔＸＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｃｃＩ、ＮｃｏＩ、ＢｓｅＹＩ、ＦａｕＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＴｓｐＭＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＬｐｎＰＩ、ＡｃｉＩ、ＳａｃＩＩ、ＢｓｒＢＩ、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＳｃｒＦＩ、ＢｓｓＫＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｌＩ、ＢｔｇＩ、ＮｃｉＩ、ＡｖｒＩＩ、ＭｎｌＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、ＳｂｆＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＥｃｏＮＩ、ＨｐｙＡＶ、ＢｓｔＮＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＩ、ＢｃｇＩ、ＰｖｕＩ、ＢｓｔＵＩ、ＥａｇＩ、ＲｓｒＩＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＪＩ、ＳｇｒＡＩ、ＢｆａＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＸｈｏＩ、ＥａｒＩ、ＡｃｕＩ、ＰｓｔＩ、ＢｐｍＩ、ＤｄｅＩ、ＳｆｃＩ、ＡｆｌＩＩ、ＢｐｕＥＩ、ＳｍｌＩ、ＡｖａＩ、ＢｓｏＢＩ、ＭｂｏＩＩ、ＢｂｓＩ、ＸｍｎＩ、ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｇａＩ、ＡａｔＩＩ、ＺｒａＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ  ＰｆｌＦＩ、ＰｓｈＡＩ、ＡｈｄＩ、ＤｒｄＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｅＲＩ、ＰｌｅＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、ＭｌｙＩ、ＨｉｎｆＩ、ＥｃｏＲＶ、ＭｂｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＤｐｎＩＩ  ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩ、ＢｓａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、ＢｂｖＩ、ＢｔｓＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｐｈＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮａｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＢｇｌＩ、ＡｓｉＳＩ、ＢｔｇＺＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｈａＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＮｏｔＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＭｗｏＩ、ＮｈｅＩ、ＢｍｔＩ、ＳａｐＩ、ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、ＢｌｐＩ、ＴｓｅＩ、ＡｐｅＫＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、ＢａｍＨＩ、ＦｏｋＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＰｈｏＩ、ＦｓｅＩ、ＳｆｉＩ、ＮａｒＩ、ＫａｓＩ、ＳｆｏＩ、ＰｌｕＴＩ、ＡｓｃＩ、ＥｃｉＩ、ＢｓｍＦＩ、ＡｐａＩ、ＰｓｐＯＭＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＮｌａＩＶ、ＫｐｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＢｓａＩ、ＨｐｈＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｎＩ、ＢａｅＧＩ、ＢｓａＨＩ、ＢａｎＩＩ、ＲｓａＩ、ＣｖｉＱＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢｃｉＶＩ、ＳａｌＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｃｏＤＩ、ＡｐａＬＩ、ＢｓｇＩ、ＡｃｃＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＨｐａＩ、ＰｍｅＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＡｐｏＩ、ＮｓｐＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹＩ、ＨａｅＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、��ｃｏＯ１０９Ｉ、ＰｐｕＭＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＳｎａＢＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＥＩ、ＭｍｅＩ、ＴａｑαＩ、ＮｒｕＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＦｓｐＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＭｓｃＩ、ＢｓｒＧＩ、ＭｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｉＩ、ＢｓｔＢＩ、ＤｒａＩ、ＰｓｐＸＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＡＩ、ＥａｅＩ、好ましくはＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＢｓｔＢＩ等の、制限エンドヌクレアーゼによる切断のためのいくつかの制限部位を含有する短いＤＮＡ配列を意味する。「多重クローニング部位」という用語は、本明細書で使用される場合、例えばＧａｔｅｗａｙクローニング戦略におけるような、組換え事象に使用される、又はギブソンアセンブリ又はＴＯＰＯクローニング等の方法に使用される、短いＤＮＡ配列をさらに意味する。
【００６４】
「エルシニア属野生型株」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在する変異株（Ｙ．エンテロコリティカＥ４０のようなもの）、又はベクターの使用を可能にする遺伝子改変、例えば、制限エンドヌクレアーゼ若しくは抗生物質耐性遺伝子の欠失変異を含有する天然に存在する変異株（Ｙ．エンテロコリティカＥ４０のアンピシリン感受性派生物である、Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０のようなものを意味する。これらの株は、染色体ＤＮＡはもちろん、未改変の毒性プラスミド（ｐＹＶと呼ばれる）も含有する。
【００６５】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）、すなわち、一又は複数の特徴又は成分の存在を可能にするという意味で、一般に使用される。
【００６６】
「約」という用語は、規定値の値範囲±１０％を意味する。例えば、「約２００」という句は、２００の±１０％、すなわち１８０−２２０を含む。
【００６７】
本発明の一態様では、組換えグラム陰性菌株は、５’から３’方向に、
細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル又はその断片をコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合している、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードする第２のＤＮＡ配列
を含むベクターで形質転換され、異種タンパク質は、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター並びにウイルスタンパク質からなる群から選択される。好ましくは、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードするＤＮＡ配列は、その３’末端で、染色体の若しくは内在性毒性プラスミドの細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの３’末端におけるＤＮＡ配列と相同な又はその断片と相同なＤＮＡ配列が隣接している。より好ましくは、相同タンパク質にその３’末端で隣接しているこのＤＮＡ配列は、染色体上の若しくは内在性毒性プラスミド上の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの３’末端において１０ｋｂｐ以内に位置するＤＮＡ配列と又はその断片と相同である。特に、相同タンパク質にその３’末端で隣接しているこのヌクレオチド配列は、上記ＤＮＡ配列と相同であり、染色体上の又は内在性毒性プラスミド上の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル又はその断片と同じオペロン内にある。この実施態様では、形質転換は、融合した第１及び第２のＤＮＡ配列が、組換え弱毒化グラム陰性菌株の内在性毒性プラスミド又は染色体、好ましくは内在性毒性プラスミドに対する相同組み換えにより挿入され、融合した第１及び第２のＤＮＡ配列が、内在性毒性プラスミドのプロモーターに、又は染色体の、例えば、染色体病原性アイランドのプロモーターに動作可能に連結されるように、通常は行われる。好ましくは、融合した第１及び第２のＤＮＡ配列は、内在性毒性プラスミドのプロモーターに動作可能に連結される。この実施態様では、第一のＤＮＡ配列は、第２のＤＮＡ配列が、内在性プロモーターに動作可能に連結されている染色体又は内在性毒性プラスミド送達シグナルの３’末端とインフレームで配置される結果となるような、染色体の又は内在性毒性プラスミドの相同部位での相同組換えをもたらす、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル又はその断片、好ましくはその断片を含む。
【００６８】
本発明のさらなる実施態様では、組換えグラム陰性菌株は、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードするヌクレオチド配列と、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列と相同若しくは同一であるか又は細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの断片をコードするヌクレオチド配列と相同若しくは同一であるヌクレオチド配列とを含むヌクレオチド分子、好ましくはＤＮＡヌクレオチド分子で形質転換され、この場合、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、組換え弱毒化グラム陰性菌株の染色体上に又は内在性毒性プラスミド上にコードされている。好ましくは、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルのヌクレオチド配列と又はその断片と相同又は同一であるヌクレオチド配列は、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードするヌクレオチド配列の５’末端に位置する。より好ましくは、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードするヌクレオチド配列には、その３’末端で、染色体のＤＮＡ配列若しくは内在性毒性プラスミドの細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの３’末端におけるＤＮＡ配列と相同な又はその断片と相同なヌクレオチド配列が隣接している。よりいっそう好ましくは、相同タンパク質にその３’末端で隣接しているこのヌクレオチド配列は、染色体上の若しくは内在性毒性プラスミド上の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの３’末端において１０ｋｂｐ以内に位置するＤＮＡ配列と又はその断片と相同である。特に、相同タンパク質にその３’末端で隣接しているこのヌクレオチド配列は、上記ＤＮＡ配列と相同であり、染色体上の又は内在性毒性プラスミド上の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル又はその断片と同じオペロン内にある。この実施態様では、形質転換は、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードするヌクレオチド配列が、組換え弱毒化グラム陰性菌株の内在性毒性プラスミド又は染色体の、該染色体又は該内在性毒性プラスミドによりコードされている細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの３’末端に、挿入され、そこで送達シグナルに融合している異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインが発現され、分泌されるように行われる。
【００６９】
組換え弱毒化グラム陰性菌株がエルシニア属株である場合、挿入のための内在性毒性プラスミドは、ｐＹＶ（エルシニア属毒性のプラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ  ｏｆ  Ｙｅｒｓｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ））である。組換え弱毒化グラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合、挿入のための内在位置は、ＳｐｉＩ又はＳｐｉＩＩと呼ばれる（サルモネラ属病原性アイランド（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｓｌａｎｄ）についての）遺伝子クラスターの１つ、エフェクタータンパク質が他の場所にコードされている位置であるか、或いはサルモネラ属毒性プラスミド（ＳＶＰ：Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ｐｌａｓｍｉｄ）の１つである。
【００７０】
好ましくは、第１及び第２のＤＮＡ配列又はヌクレオチド分子は、内在性毒性プラスミド上の細菌エフェクタータンパク質の天然部位に、例えば毒性因子の天然部位に、好ましくは、組換え弱毒化グラム陰性菌株がエルシニア属株である場合、ＹｏｐＥ若しくは別のＹｏｐ（ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴ）の天然部位に、好ましくはＹｏｐＥの天然部位に、又は組換え弱毒化グラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合、ＳｐｉＩ、ＳｐｉＩＩ内にコードされている若しくは他の場所にコードされているエフェクタータンパク質の天然部位に、好ましくは、ＳｉｐＩ若しくはＳｐｉＩＩ内にコードされているエフェクタータンパク質の天然部位に、より好ましくは、ＳｏｐＥ若しくはＳｔｅＡの天然部位に、挿入される。好ましくは、第１及び第２のＤＮＡ配列又はヌクレオチド配列は、内在性毒性プラスミド上に存在する細菌エフェクタータンパク質の天然プロモーターに、例えば、組換え弱毒化グラム陰性菌株がエルシニア属株である場合、下で概要を示すようなエルシニア属ビルロンからの天然プロモーターに、より好ましくは、天然ＹｏｐＥプロモーター又は別のＹｏｐ（ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴ）プロモーターに、好ましくは天然ＹｏｐＥプロモーターに、或いは組換え弱毒化グラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合、ＳｐｉＩ若しくはＳｐｉＩＩ病原性アイランドからの又は下で概要を示すような他の場所にコードされているエフェクタータンパク質からの天然プロモーターに、より好ましくは、天然ＳｏｐＥ、ＩｎｖＢ又はＳｔｅＡプロモーターに、動作可能に連結されている。
【００７１】
一実施態様では、本発明は、エルシニア属、大腸菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からなる群から選択される、組換えグラム陰性菌株を提供する。一実施態様では、本発明は、エルシニア属及びサルモネラ属からなる群から選択される、組換えグラム陰性菌株を提供する。好ましくは、グラム陰性菌株は、エルシニア属株、より好ましくはエルシニア・エンテロコリティカ株である。最も好ましいのは、Ｙ．エンテロコリティカＥ４０（Ｏ：９、生物型２）［２１］、又は［２２］に記載されているようなＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０（別名Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０）のような、そのアンピシリン感受性派生物である。［２２］に記載されているようなＹ．エンテロコリティカＥ４０及びその派生物Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０は、［２３−２５］に記載されているようなＹ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカＥ４０及びその派生物Ｙ．エンテロコリティカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０と同一である。また、好ましくは、グラム陰性菌株は、サルモネラ属株、より好ましくはサルモネラ菌株である。最も好ましいのは、ｔｈｅ  Ｐｕｂｌｉｃ  ｈｅａｌｔｈ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＣＴＣ  １３３４７）によって記載されているようなネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  Ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＳＬ１３４４である。
【００７２】
本発明の一実施態様では、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルは、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片を含み、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片は、シャペロン結合部位を含み得る。シャペロン結合部位を含む、Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片は、本発明の送達シグナルとして特に有用である。好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれらのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｔＰ、ＹｏｐＥ、ＥｘｏＳ、ＳｉｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＤ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ、ＳｏｐＤ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＳｉｐＣ、ＳｉｆＡ、ＳｓｅＪ、Ｓｓｅ、ＳｒｆＨ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢｓＴ、ＹｏｐＴ、ＹｏｐＨ、ＹｐｋＡ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＦ、ＴｃｃＰ２、ＩｐｇＢ２、ＯｓｐＦ、Ｍａｐ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＩｐａＨ、ＳｓｐＨ１、ＶｏｐＦ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＨｏｐＡＢ２、ＸｏｐＤ、ＡｖｒＲｐｔ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＵ１、ＧＡＬＡタンパク質ファミリー、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＤ１、ＡｖｒＢＳ３、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＶｉｒＡ、ＩｃｓＢ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ７．８、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＡｖｒＢｓ３、ＸｏｐＤ、及びＡｖｒＸｖ３からなる群から選択される。より好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれらのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＹｏｐＥ、ＥｘｏＳ、ＳｏｐＢ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＨ、ＥｓｐＦ、ＯｓｐＦ、ＥｘｏＳ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴからなる群から選択され、これらのうち最も好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれらのＮ末端断片は、ＩｐｇＢ１、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＢ、ＳｐｔＰ、ＯｓｐＦ、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴからなる群から選択され、特に、ＹｏｐＥ又はそのＮ末端断片である。
【００７３】
同じく好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれらのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｔＰ、ＳｔｅＡ、ＳｉｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＤ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ、ＳｏｐＤ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＳｉｐＣ、ＳｉｆＡ、ＳｉｆＢ、ＳｓｅＪ、Ｓｓｅ、ＳｒｆＨ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢｓＴ、ＹｏｐＨ、ＹｐｋＡ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＦ、ＴｃｃＰ２、ＩｐｇＢ２、ＯｓｐＦ、Ｍａｐ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＩｐａＨ、ＶｏｐＦ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＨｏｐＡＢ２、ＡｖｒＲｐｔ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＵ１、ＧＡＬＡタンパク質ファミリー、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＤ１、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＴ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＶｉｒＡ、ＩｃｓＢ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ７．８、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＡｖｒＢｓ３、ＸｏｐＤ、及びＡｖｒＸｖ３からなる群から選択される。同じくより好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれらのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＳｔｅＡ、ＳｉｆＢ、ＳｏｐＢ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＨ、ＥｓｐＦ、ＯｓｐＦ、ＥｘｏＳ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＴからなる群から選択され、これらのうち同じく最も好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれらのＮ末端断片は、ＩｐｇＢ１、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＢ、ＳｐｔＰ、ＳｔｅＡ、ＳｉｆＢ、ＯｓｐＦ、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ及びＹｏｐＴからなる群から選択され、特に、ＳｏｐＥ、ＳｔｅＡ、若しくはＹｏｐＥ又はそのＮ末端断片、より特にＳｔｅＡ若しくはＹｏｐＥ又はそのＮ末端断片、最も特にＹｏｐＥ又はそのＮ末端断片である。
【００７４】
一部の実施態様では、第１のＤＮＡ配列によりコードされている細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルは、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質を含むか、又はそのＮ末端断片であって、該細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質の少なくとも最初の１０アミノ酸、好ましくは少なくとも最初の２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも最初の１００アミノ酸を含む断片を含む。
【００７５】
一部の実施態様では、第１のＤＮＡ配列によりコードされている細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、シャペロン結合部位を含む、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそのＮ末端断片を含む。
【００７６】
シャペロン結合部位を含む、好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれらのＮ末端断片は、シャペロン結合部位とＴ３ＳＳエフェクタータンパク質又はそれのＮ末端断片との次の組合せを含む：ＳｙｃＥ−ＹｏｐＥ、ＩｎｖＢ−ＳｏｐＥ、ＳｉｃＰ−ＳｐｔＰ、ＳｙｃＴ−ＹｏｐＴ、ＳｙｃＯ−ＹｏｐＯ、ＳｙｃＮ／ＹｓｃＢ−ＹｏｐＮ、ＳｙｃＨ−ＹｏｐＨ、ＳｐｃＳ−ＥｘｏＳ、ＣｅｓＦ−ＥｓｐＦ、ＳｙｃＤ−ＹｏｐＢ、ＳｙｃＤ−ＹｏｐＤ。より好ましいのは、ＳｙｃＥ−ＹｏｐＥ、ＩｎｖＢ−ＳｏｐＥ、ＳｙｃＴ−ＹｏｐＴ、ＳｙｃＯ−ＹｏｐＯ、ＳｙｃＮ／ＹｓｃＢ−ＹｏｐＮ、ＳｙｃＨ−ＹｏｐＨ、ＳｐｃＳ−ＥｘｏＳ、ＣｅｓＦ−ＥｓｐＦである。最も好ましいのは、ＳｙｃＥシャペロン結合部位を含む、ＹｏｐＥ若しくはそのＮ末端断片、例えば、本明細書ではＹｏｐＥ１−１３８と表記され、配列番号２で示されるような、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端１３８アミノ酸を含有する、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片であるか、又はＩｎｖＢシャペロン結合部位を含む、ＳｏｐＥ若しくはそのＮ末端断片、例えば、本明細書ではＳｏｐＥ１−８１若しくはＳｏｐＥ１−１０５とそれぞれと表記され、配列番号１４２若しくは１４３で示されるような、ＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端８１又は１０５アミノ酸を含有する、ＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片である。
【００７７】
本発明の一実施態様では、組換えグラム陰性菌株はエルシニア属株であり、第１のＤＮＡ配列によりコードされている細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルは、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質又はＮ末端部、好ましくは、Ｙ．エンテロコリティカＹｏｐＥエフェクタータンパク質又はそのＮ末端部を含む。好ましくは、ＳｙｃＥ結合部位は、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端部内に含まれる。これに関連して、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片は、Ｎ末端１２、１６、１８、５２、５３、８０又は１３８アミノ酸を含み得る［２６−２８］。最も好ましいのは、例えば、本明細書ではＹｏｐＥ１−１３８と表記され、配列番号２で示される、Ｆｏｒｓｂｅｒｇ及びＷｏｌｆ−Ｗａｔｚ［２９］に記載されているような、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端１３８アミノ酸を含有するＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片である。
【００７８】
本発明の一実施態様では、組換えグラム陰性菌株はサルモネラ属株であり、第１のＤＮＡ配列によりコードされている細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルは、ＳｏｐＥ若しくはＳｔｅＡエフェクタータンパク質又はそのＮ末端部、好ましくは、サルモネラ菌ＳｏｐＥ若しくはＳｔｅＡエフェクタータンパク質又はそのＮ末端部を含む。好ましくは、シャペロン結合部位は、ＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端部内に含まれる。これに関連して、ＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片は、Ｎ末端８１又は１０５アミノ酸を含み得る。最も好ましいのは、例えば配列番号１４２若しくは１４３に記載されているような、完全長ＳｔｅＡ、及びエフェクタータンパク質のＮ末端１０５アミノ酸を含有するＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片である。
【００７９】
当業者は、タンパク質を送達することができるエフェクタータンパク質のポリペプチド配列を同定する方法に精通している。例えば、１つのそのような方法は、Ｓｏｒｙ等［２１］により記載されている。簡単に述べると、例えばＹｏｐタンパク質の様々な部分からの、ポリペプチド配列を、百日咳菌シクロリジンのカルモジュリン活性化アデニル酸シクラーゼドメイン（又はＣｙａ）等のレポーター酵素に、インフレームで融合させることができる。真核細胞のサイトゾルへのＹｏｐ−Ｃｙａハイブリッドタンパク質の送達は、ｃＡＭＰの蓄積につながる感染真核細胞におけるシクラーゼ活性の出現により示される。そのような手法を用いることにより、当業者は、タンパク質を送達することができる最小配列要件、すなわち、最も短い長さの連続アミノ酸配列を、必要に応じて決定することができる。例えば［２１］を参照されたい。したがって、本発明の好ましい送達シグナルは、少なくとも、タンパク質を送達することができるＴ３ＳＳエフェクタータンパク質のアミノ酸の最小配列からなる。
【００８０】
一実施態様では、本発明は突然変異型組換えグラム陰性菌株、特に、少なくとも１つのＴ３ＳＳ機能性エフェクタータンパク質の産生を欠く組換えグラム陰性菌株を提供する。
【００８１】
本発明によれば、そのような突然変異型グラム陰性菌株、例えば、そのような突然変異型エルシニア属株は、エフェクターをコードしている少なくとも１つの遺伝子に少なくとも１つの変異を導入することにより生じさせることができる。好ましくは、エフェクターをコードしているそのような遺伝子としては、エルシニア属株について言えば、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ／ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＰ／ＹｏｐＪ及びＹｏｐＴが挙げられる。好ましくは、エフェクターをコードしているそのような遺伝子としては、サルモネラ属株について言えば、ＡｖｒＡ、ＣｉｇＲ、ＧｏｇＢ、ＧｔｇＡ、ＧｔｇＥ、ＰｉｐＢ、ＳｉｆＢ、ＳｉｐＡ／ＳｓｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＣ／ＳｓｐＣ、ＳｉｐＤ／ＳｓｐＤ、ＳｌｒＰ、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｏｐＡ、ＳｐｉＣ／ＳｓａＢ、ＳｓｅＢ、ＳｓｅＣ、ＳｓｅＤ、ＳｓｅＦ、ＳｓｅＧ、ＳｓｅＩ／ＳｒｆＨ、ＳｏｐＤ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＰｉｐＢ２、ＳｉｆＡ、ＳｏｐＤ２、ＳｓｅＪ、ＳｓｅＫ１、ＳｓｅＫ２、ＳｓｅＫ３、ＳｓｅＬ、ＳｔｅＣ、ＳｔｅＡ、ＳｔｅＢ、ＳｔｅＤ、ＳｔｅＥ、ＳｐｖＢ、ＳｐｖＣ、ＳｐｖＤ、ＳｒｆＪ、ＳｐｔＰが挙げられる。最も好ましくは、エフェクターをコードしている全ての遺伝子が欠失している。当業者は、任意の数の標準技術を用いて、これらのＴ３ＳＳエフェクター遺伝子の変異を生じさせることができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ等は、一般にそのような技術を説明している。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等［３０］を参照されたい。
【００８２】
本発明によれば、エフェクターをコードする遺伝子のプロモーター領域において、そのようなエフェクター遺伝子の発現を消失させるように変異を生じさせることができる。
エフェクターをコードしている遺伝子のコード領域において、コードされているエフェクタータンパク質の触媒活性を消失させるような変異を生じさせることもできる。エフェクタータンパク質の「触媒活性」は、エフェクタータンパク質の抗標的細胞機能、すなわち毒性を通常は意味する。そのような活性は、エフェクタータンパク質の触媒ドメインにおける触媒モチーフにより支配される。エフェクタータンパク質の触媒ドメイン及び／又は触媒モチーフを同定する手法は、当業者に周知である。例えば、［３１、３２］を参照されたい。
【００８３】
したがって、本発明の１つの好ましい変異は、全触媒ドメインの欠失である。別の好ましい変異は、エフェクターをコードしている遺伝子のフレームシフト変異であり、したがって、触媒ドメインは、そのような「フレームシフトした」遺伝子から発現されるタンパク質産物中に存在しない。最も好ましい変異は、エフェクタータンパク質の全コード領域の欠失を伴う変異である。他の変異、例えば、エフェクタータンパク質の触媒モチーフにおいて生じて所与のエフェクタータンパク質の触媒活性の破壊につながる小欠失又は塩基対置換も、本発明により企図されている。
【００８４】
Ｔ３ＳＳ機能性エフェクタータンパク質の遺伝子において生じる変異を多数の方法により特定の株に導入することができる。１つのそのような方法は、変異配列をアレル交換により株に導入することができる「自殺」ベクターへの変異遺伝子のクローニングを含む。そのような「自殺」ベクターの例は、［３３］により記載されている。
【００８５】
このようにして、複数の遺伝子において生じる変異をグラム陰性菌株にうまく導入して、多重突然変異株、例えば、六重突然変異型組換え株を生じさせることができる。これらの変異配列を導入する順序は重要でない。一部の環境下では、エフェクター遺伝子の全てではなく一部のみを変異させることが所望されることもある。したがって、本発明は、六重突然変異型エルシニア以外の多重突然変異型エルシニア、例えば、二重突然変異型、三重突然変異型、四重突然変異型及び五十突然変異型株をさらに企図している。タンパク質を送達するために、本突然変異株の分泌及び移行系は、インタクトである必要がある。
【００８６】
本発明の好ましい組換えグラム陰性菌株は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、よりいっそう好ましくは少なくとも４つ、特に少なくとも５つ、より特に少なくとも６つ、最も特に全てのＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の産生を欠く、組換えグラム陰性菌株、例えば、エフェクターをコードする遺伝子全てが、結果として得られるグラム陰性菌株がもはやいかなる機能性エフェクタータンパク質も産生しないような変異を受ける、六重突然変異型グラム陰性菌株である。
【００８７】
本発明のより好ましい組換えグラム陰性菌株は、エフェクターをコードする全ての遺伝子が、結果として得られるエルシニア属が何れの機能性エフェクタータンパク質ももはや産生しないような変異を受ける、六重突然変異型エルシニア属株である。そのような六重突然変異型エルシニア属株は、Ｙ．エンテロコリティカについてはΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔと表記される。例として、そのような六重突然変異株をＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０株から産生させて、好ましいＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０  ΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔを生じさせることができる。
【００８８】
本発明のさらなる態様は、所望のタンパク質を真核細胞に送達するために組換えグラム陰性菌株と併用するためのベクターであって、５’から３’方向に、
プロモーター、
前記プロモーターに動作可能に連結されている、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合している、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードする第２のＤＮＡ配列
を含み、異種タンパク質が、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター並びにウイルスタンパク質からなる群から選択される、ベクターに関する。
【００８９】
上記のプロモーター、異種タンパク質及びプロテアーゼ切断部位を、グラム陰性菌株のベクターに使用することができる。
【００９０】
本発明のさらなる態様は、所望のタンパク質を真核細胞に送達するために組換えグラム陰性菌株と併用するためのベクターであって、５’から３’方向に、
細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル又はその断片をコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合している、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードする第２のＤＮＡ配列
を含み、異種タンパク質が、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター並びにウイルスタンパク質からなる群から選択される、ベクターに関する。
【００９１】
好ましくは、異種タンパク質の反復ドメイン又はベクターの異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードするＤＮＡ配列には、その３’末端で、染色体のＤＮＡ配列若しくは内在性毒性プラスミドの細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの３’末端におけるＤＮＡ配列と相同な又はその断片と相同なＤＮＡ配列が隣接している。より好ましくは、相同タンパク質にその３’末端で隣接しているこのＤＮＡ配列は、染色体上の若しくは内在性毒性プラスミド上の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの３’末端において１０ｋｂｐ以内に位置するＤＮＡ配列と又はその断片と相同である。特に、相同タンパク質にその３’末端で隣接しているこのヌクレオチド配列は、上記ＤＮＡ配列と相同であり、染色体上の又は内在性毒性プラスミド上の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル又はその断片と同じオペロン内にある。上記の異種タンパク質及びプロテアーゼ切断部位を、グラム陰性菌株のベクターに使用することができる。
【００９２】
本発明に従って使用することができるベクターは、当業者に公知であるように、使用されるグラム陰性菌株に依存する。本発明に従って使用することができるベクターとしては、発現ベクター（内在性毒性プラスミドの合成バージョン又は別様に生成された改変バージョンを含む）、染色体又は毒性プラスミド挿入用のベクター、及び染色体又は毒性プラスミド挿入用のＤＮＡ断片が挙げられる。例えばエルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属又はシュードモナス属株において有用である、発現ベクターは、例えば、ｐＵＣ、ｐＢａｄ、ｐＡＣＹＣ、ｐＵＣＰ２０及びｐＥＴプラスミドである。例えばエルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属又はシュードモナス属株において有用である、染色体又は毒性プラスミド挿入用のベクターは、例えば、ｐＫＮＧ１０１である。染色体又は毒性プラスミド挿入用のＤＮＡ断片は、例えばラムダレッド遺伝子操作のような、例えばエルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属又はシュードモナス属株において使用される方法を意味する。染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のベクター又は染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のＤＮＡ断片は、本発明の第１、第２及び／又は第３のＤＮＡ配列を、該第１、第２及び／又は第３の配列が、組換えグラム陰性菌株の内在性プロモーターに動作可能に連結されるように、挿入することができる。したがって、染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のベクター又は染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のＤＮＡ断片が使用される場合、内在性プロモーターは、内在性細菌ＤＮＡ（染色体又はプラスミドＤＮＡ）上にコードされていることがあり、第１及び第２のＤＮＡ配列のみが、染色体若しくは毒性プラスミド挿入用の操作ベクター又は染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のＤＮＡ断片により提供されることになる。或いは、染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のベクター、又は例えば染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のＤＮＡ配列等のヌクレオチド分子が使用される場合、内在性プロモーター、及び細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、内在性細菌ＤＮＡ（染色体又はプラスミドＤＮＡ）上にコードされていることがあり、例えば異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列等のヌクレオチド分子のみが、染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のベクターにより、又は例えば染色体若しくは毒性プラスミド挿入用のＤＮＡ配列などのヌクレオチド分子により、提供されることになる。したがって、プロモーターは、必ずしも、組換えグラム陰性菌株の形質転換に使用されるベクターに含まれている必要がなく、すなわち、本発明の組換えグラム陰性菌株は、プロモーターを含まないベクターで形質転換されることもある。本発明のベクターは、インビトロ及びはインビボでの細菌Ｔ３ＳＳによる異種タンパク質の真核細胞への送達に通常は使用される。
【００９３】
エルシニア属用の好ましいベクター、例えば、好ましい発現ベクターは、ｐＢａｄ＿Ｓｉ＿１及びｐＢａｄ＿Ｓｉ＿２からなる群から選択される。ｐＢａｄ＿Ｓｉ２は、精製ｐＹＶ４０からのＹｏｐＥ及びＳｙｃＥ用の内在性プロモーターを含有するＳｙｃＥ−ＹｏｐＥ１−１３８断片をｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることにより構築した。さらなる改変は、消化、クレノウ断片処理及び再ライゲーションによるｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡのＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ断片の除去を含む。さらに、ＹｏｐＥ１−１３８の３’末端に、次の切断部位を加えた：ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ−ＢｓｔＢＩ−（ＨｉｎｄＩＩＩ）。ｐＢａｄ＿Ｓｉ１は、ｐＢａｄ＿Ｓｉ２と同等であるが、アラビノース誘導性プロモーターの下でＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ部位においてｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅されたＥＧＦＰをコードする。同じく好ましいのは、Ｔ３ＳＳシグナル配列への融合体としての、異種タンパク質をコードする内在性エルシニア属毒性プラスミドｐＹＶの改変バージョンの使用である。サルモネラ属用の好ましいベクター、例えば、好ましい発現ベクターは、ｐＳｉ＿２６６、ｐＳｉ＿２６７、ｐＳｉ＿２６８及びｐＳｉ＿２６９からなる群から選択される。対応する内在性プロモーターとＳｔｅＡ１−２０断片（ｐＳｉ＿２６６）、完全長ＳｔｅＡ配列（ｐＳｉ＿２６７）、ＳｏｐＥ１−８１断片（ｐＳｉ＿２６８）又はＳｏｐＥ１−１０５断片（ｐＳｉ＿２６９）とを含むプラスミドｐＳｉ＿２６６、ｐＳｉ＿２６７、ｐＳｉ＿２６８及びｐＳｉ＿２６９を、サルモネラ菌ＳＬ１３４４ゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ部位にクローニングした。
【００９４】
本発明のベクターは、他の配列エレメント、例えば、３’終止配列（終止コドン及びポリＡ配列を含む）を含むこともあり、又は本ベクターを受け取った形質転換体の選択を可能にする薬物耐性を付与する遺伝子を含むこともある。
本発明のベクターを多数の公知の方法により組換えグラム陰性菌株内に形質転換することができる。本発明では、ベクターを導入するための形質転換方法は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介形質転換、接合伝達、又はそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。例えば、標準的なエレクトロポレーション手順によりベクターを第１の菌株内に形質転換することができる。その後、「可動化」とも呼ばれる方法である接合伝達によりそのようなベクターを第１の菌株から所望の株内に移入することができる。形質転換体（すなわち、ベクターを取り込んだグラム陰性菌株）は、例えば抗生物質で、選択することができる。これらの技術は、当該技術分野で周知である。例えば、［２１］を参照されたい。
【００９５】
本発明に従って、本発明の組換えグラム陰性菌株の発現ベクターのプロモーターは、それぞれの株若しくは匹敵する菌株のＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の天然プロモーターであってもよく、又は例えばエルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属若しくはシュードモナス属において有用である発現ベクターに使用されるプロモーター、例えば、ｐＵＣ及びｐＢａｄであってもよい。そのようなプロモーターは、Ｔ７プロモーター、Ｐｌａｃプロモーター、又はＡｒａ−ｂａｄプロモーターである。
【００９６】
組換えグラム陰性菌株がエルシニア属株である場合、プロモーターは、エルシニア属ビルロン遺伝子からのものであり得る。「エルシニア属ビルロン遺伝子」は、エルシニア属ｐＹＶプラスミド上の遺伝子であって、その発現が温度によっても、標的細胞との接触によっても調節される遺伝子を意味する。そのような遺伝子は、分泌機構のエレメントをコードする遺伝子（Ｙｓｃ遺伝子）、トランスロケーターをコードする遺伝子（ＹｏｐＢ、ＹｏｐＤ及びＬｃｒＶ）、調節エレメントをコードする遺伝子（ＹｏｐＮ、ＴｙｅＡ及びＬｃｒＧ）、Ｔ３ＳＳエフェクターシャペロンをコードする遺伝子（ＳｙｃＤ、ＳｙｃＥ、ＳｙｃＨ、ＳｙｃＮ、ＳｙｃＯ及びＳｙｃＴ）及びエフェクターをコードする遺伝子（ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ／ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴ及びＹｏｐＰ／ＹｏｐＪ）、並びにＶｉｒＦ及びＹａｄＡのような、他のｐＹＶにコードされているタンパク質を含む。
【００９７】
本発明の好ましい実施態様では、プロモーターは、Ｔ３ＳＳ機能性エフェクターをコードしている遺伝子の天然プロモーターである。組換えグラム陰性菌株がエルシニア属株である場合、プロモーターは、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ／ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ及びＹｏｐＰ／ＹｏｐＪの何れか１つから選択される。より好ましくは、プロモーターは、ＹｏｐＥ又はＳｙｃＥからのものである。
【００９８】
組換えグラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合、プロモーターは、ＳｐｉＩ若しくはＳｐｉＩＩ病原性アイランドからのものであってもよく、又は他の場所にコードされているエフェクタータンパク質からのものであってもよい。そのような遺伝子は、分泌機構のエレメントをコードする遺伝子、トランスロケーターをコードする遺伝子、調節エレメントをコードする遺伝子、Ｔ３ＳＳエフェクターシャペロンをコードする遺伝子、及びエフェクターをコードする遺伝子、並びにＳＰＩ−１又はＳＰＩ−２によりコードされている他のタンパク質を含む。本発明の好ましい実施態様では、プロモーターは、Ｔ３ＳＳ機能性エフェクターをコードしている遺伝子の天然プロモーターである。組換えグラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合、プロモーターは、エフェクタータンパク質の何れか１つからのものであり得る。より好ましくは、プロモーターは、ＳｏｐＥ、ＩｎｖＢ又はＳｔｅＡからのものである。
【００９９】
好ましい実施態様では、ベクター、例えば発現ベクターは、プロテアーゼ切断部位をコードするＤＮＡ配列を含む。機能的且つ一般に適用可能な切断部位の生成は、移行後の送達シグナルの切除を可能にする。送達シグナルは、標的細胞内に移行されるタンパク質の正しい位置及び／又は機能を妨害し得るので、送達シグナルと目的のタンパク質の間にプロテアーゼ切断部位を導入することにより初めて大部分の天然タンパク質が真核細胞内に送達される。好ましくは、プロテアーゼ切断部位は、エンテロキナーゼ（軽鎖）、エンテロペプチダーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、ヒトライノウイルスプロテアーゼ３Ｃ、ＴＥＶプロテアーゼ、ＴＶＭＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子プロテアーゼ及びトロンビンからなる群から選択されるプロテアーゼ又はその触媒ドメインにより切断されるアミノ酸モチーフ、より好ましくは、ＴＥＶプロテアーゼにより切断されるアミノ酸モチーフである。同じく好ましいプロテアーゼ切断部位は、エンテロキナーゼ（軽鎖）、エンテロペプチダーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、ヒトライノウイルスプロテアーゼ３Ｃ、ＴＥＶプロテアーゼ、ＴＶＭＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子プロテアーゼ、脱ユビキチン化酵素と呼ばれるユビキチンプロセシングプロテアーゼ、及びトロンビンからなる群から選択されるプロテアーゼ又はその触媒ドメインにより切断される、アミノ酸モチーフである。最も好ましいのは、ＴＥＶプロテアーゼにより、又はユビキチンプロセシングプロテアーゼにより切断される、アミノ酸モチーフである。
【０１００】
したがって、本発明のさらなる実施態様では、異種タンパク質は、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルからプロテアーゼにより切断される。好ましい切断方法は、
ａ）プロテアーゼが、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルと異種タンパク質としてのプロテアーゼとの融合タンパク質を発現する本明細書に記載の組換えグラム陰性菌株により真核細胞に移行される方法、又は
ｂ）プロテアーゼが、真核細胞において構成的に若しくは一過性に発現される方法
である。
【０１０１】
通常、真核細胞に所望のタンパク質を送達するために使用される組換えグラム陰性菌株と、真核細胞にプロテアーゼを移行させる組換えグラム陰性菌株は、異なる。
【０１０２】
本発明の一実施態様では、ベクターは、標識分子をコードするさらなるＤＮＡ配列を含むか、又は標識分子の受容部位を含む。標識分子をコードするさらなるＤＮＡ配列、又は標識分子の受容部位は、通常、第２のＤＮＡ配列の５’末端と又は３’末端と融合している。好ましい標識分子、又は標識分子の受容部位は、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、クマリン、クマリンリガーゼ受容部位、レゾルフィン、レゾルフィンリガーゼ受容部位、ＦｌＡｓＨ／ＲｅＡｓＨ色素（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に使用されているシータシステインモチーフからなる群から選択される。最も好ましいのは、レゾルフィン及びレゾルフィンリガーゼ受容部位又はＥＧＦＰである。標識分子、又は標識分子の受容部位を使用すると、標識分子が目的の異種タンパク質に結合することになり、次いで、真核細胞内等に送達されることになり、例えば細胞のライブ顕微鏡観察により、タンパク質の追跡が可能になる。
【０１０３】
本発明の一実施態様では、ベクターは、ペプチドタグをコードするさらなるＤＮＡ配列を含む。ペプチドタグをコードするさらなるＤＮＡ配列は、通常、第２のＤＮＡ配列の５’末端と又は３’末端と融合している。好ましいペプチドタグは、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、Ｓｔｒｅｐタグ若しくはＶ５タグからなる群から選択されるか、又はこれらの群外の２つ以上のタグの組合せである。最も好ましいのは、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、及び組み合わせたＭｙｃタグとＦｌａｇタグである。ペプチドタグを使用すると、例えば、抗タグ抗体を使用する免疫蛍光法又はウェスタンブロット法により、タグ付タンパク質の追跡が可能になる。さらに、ペプチドタグを使用することにより、培養上清への分泌後又は真核細胞への移行後に、どちらの場合も対応するタグに合う精製法（例えば、Ｈｉｓタグと共に使用されている金属キレートアフィニティー精製、又はＦｌａｇタブと共に使用されている抗Ｆｌａｇ抗体ベースの精製）を使用して、所望のタンパク質のアフィニティー精製が可能になる。
【０１０４】
本発明の一実施態様では、ベクターは、核内移行シグナル（ＮＬＳ）をコードするさらなるＤＮＡ配列を含む。核内移行シグナル（ＮＬＳ）をコードするさらなるＤＮＡ配列は、前記さらなるＤＮＡ配列が核内移行シグナル（ＮＬＳ）をコードする場合、通常、第２のＤＮＡ配列の５’末端と又は３’末端と融合している。好ましいＮＬＳは、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ及びその誘導体［３４］並びに他のウイルスＮＬＳからなる群から選択される。最も好ましいのは、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ及びその誘導体である。
【０１０５】
本発明の一実施態様では、ベクターは、多重クローニング部位を含む。多重クローニング部位は、通常、第１のＤＮＡ配列の３’末端に、及び／又は第２のＤＮＡ配列の５’末端若しくは３’末端に位置する。１つ又は１つより多くの多重クローニング部位がベクターに含まれることもある。好ましい多重クローニング部位は、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＢｓｔＢＩからなる制限酵素の群から選択される。最も好ましいのは、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＢｓｔＢＩ及びＨｉｎｄＩＩＩである。
【０１０６】
ベクターの第１及び第２の並びに任意選択の第３のＤＮＡ配列から発現される、融合しているタンパク質は、「融合タンパク質」又は「ハイブリッドタンパク質」（すなわち、送達シグナルと異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインの融合したタンパク質又はハイブリッドである）とも呼ばれる。融合タンパク質は、例えば、送達シグナル及び２つ以上の異なる異種タンパク質を含むこともできる。
【０１０７】
本発明は、真核細胞に、細胞培養中はもちろんインビボでも、本明細書において上で説明したように異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインを送達する方法を企図している。
【０１０８】
したがって、一実施態様では、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインを送達する方法は、
ｉ）本明細書に記載のグラム陰性菌株を培養する工程と、
ｉｉ）真核細胞をｉ）のグラム陰性菌株と接触させる工程であって、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルと異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインとを含む融合タンパク質が、グラム陰性菌株により発現され、真核細胞に移行される工程と、任意選択的に、
ｉｉｉ）融合タンパク質を切断し、その結果、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインを細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルから切断する工程と
を含む。
【０１０９】
一部の実施態様では、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルと異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインとを各々が含む少なくとも２つの融合タンパク質が、組換え弱毒化グラム陰性菌株により発現され、本発明の方法により真核細胞に移行される。
【０１１０】
組換えグラム陰性菌株を、当該技術分野で公知の方法（例えば、ＦＤＡ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（ＢＡＭ）、第８章：Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）に従って、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルと異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインとを含む融合タンパク質が発現されるように培養することができる。好ましくは、組換えグラム陰性菌株をブレインハートインフュージョン培地で、例えば２８℃で培養することができる。Ｔ３ＳＳ及び例えばＹｏｐＥ／ＳｙｃＥプロモーター依存性遺伝子の発現の誘導のために、細菌を３７℃で増殖させることができる。
【０１１１】
好ましい実施態様では、第１のグラム陰性菌株が、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルと異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインとを含む第１の融合タンパク質を発現し、第２のグラム陰性菌株が、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルと第２の異種タンパク質の反復ドメイン又は第２の異種タンパク質の異なる第２の異種タンパク質の２つ以上のドメインとを含む第２の融合タンパク質を発現する、ｉ）の２つのグラム陰性菌株と真核細胞を接触させ、これにより、第１及び第２の融合タンパク質を真核細胞に移行させる。この実施態様は、例えば、２つの異なるハイブリッドタンパク質をそれらの機能的相互作用に取り組むために単一細胞に送達するための有効な方法として、例えば、真核細胞の２つの菌株による同時感染を提供するものであった。
【０１１２】
当業者は、多数のアッセイを使用して、融合タンパク質の送達が成功したかどうかを判定することができる。例えば、融合したタグ（Ｍｙｃタグのような）を認識する抗体を使用する免疫蛍光法により、融合タンパク質を検出してもよい。その判定は、送達されることになるタンパク質の酵素的活性に基づくこともある。
【０１１３】
本発明は、インタクト組換えグラム陰性菌株により標的とされ得る広範な真核細胞、例えば、Ｈｉ−５（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４；ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｂ８５５−０２）、ＨｅＬａ細胞、例えば、ＨｅＬａ  Ｃｃｌ２（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２のようなもの）、線維芽細胞、例えば、３Ｔ３線維芽細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−９２のようなもの）又はＭｅｆ（ＡＴＣＣ番号ＳＣＲＣ−１０４０のようなもの）、Ｈｅｋ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３のようなもの）、ＨＵＶＥＣ（ＡＴＣＣ番号ＰＣＳ−１００−０１３のようなもの）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−６１のようなもの）、ジャーカット（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１５２のようなもの）、Ｓｆ−９（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７１１のようなもの）、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５のようなもの）、ベロ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１のようなもの）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−３４のようなもの）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−２０２のようなもの）、Ｊ７７４（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−６７のようなもの）、ＲＡＷ（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−７１のようなもの）、Ｃａｃｏ２（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３７のようなもの）、ＮＣＩ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１８２のようなもの）、ＤＵ１４５（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−８１のようなもの）、Ｌｎｃａｐ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７４０のようなもの）、ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２２のようなもの）、ＭＤＡ−ＭＢ細胞株（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１２８のようなもの）、ＰＣ３（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１４３５のようなもの）、Ｔ４７Ｄ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２８６５のようなもの）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８５のようなもの）、Ｕ８７（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−１４のようなもの）、ＳＨＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２２６６ｓのようなもの）、Ｅａ．Ｈｙ９２６（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２９２２のようなもの）、Ｓａｏｓ−２（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢＨ−８５のようなもの）、４Ｔ１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−２５３９のようなもの）、Ｂ１６Ｆ１０（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−６４７５のようなもの）、又は初代培養ヒト肝細胞（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＨＭＣＰＩＳのようなもの）、好ましくは、ＨｅＬａ、Ｈｅｋ、ＨＵＶＥＣ、３Ｔ３、ＣＨＯ、ジャーカット、Ｓｆ−９、ＨｅｐＧ２、ベロ、ＴＨＰ−１、Ｃａｃｏ２、Ｍｅｆ、Ａ５４９、４Ｔ１、Ｂ１６Ｆ１０及び初代培養ヒト肝細胞、並びに最も好ましくはＨｅＬａ、Ｈｅｋ、ＨＵＶＥＣ、３Ｔ３、ＣＨＯ、ジャーカット、ＴＨＰ−１、Ａ５４９及びＭｅｆを企図している。「標的」とは、真核細胞への組換えグラム陰性菌株の細胞外接着を意味する。
【０１１４】
本発明に従って、適切な条件下で真核細胞を組換えグラム陰性菌株と接触させることによりタンパク質の送達を果すことができる。所望の温度、Ｃａ＋＋濃度、コンゴレッドのような誘導因子の添加、組換えグラム陰性菌株と標的細胞を混合する方法などをはじめとする、ビルロン遺伝子の発現及び移行を誘導するための条件に関して、様々な参考文献及び技術を当業者は従来通り利用することができる。例えば、［３５］を参照されたい。条件は、標的とされることになる真核細胞の型、及び使用されることになる組換え菌株に依存して変わり得る。当業者は、従来の技術を使用してそのような変化に対処することができる。
【０１１５】
当業者は、多数のアッセイを使用して、融合タンパク質の送達が成功したかどうかを判定することもできる。例えば、融合したタグ（Ｍｙｃタグのような）を認識する抗体を使用する免疫蛍光法により、融合タンパク質を検出してもよい。その判定は、送達されることになるタンパク質の酵素的活性、例えば［２１］により記載されているアッセイに基づくこともある。
【０１１６】
一実施態様では、本発明は、医学に使用するための、本明細書に記載の組換えグラム陰性菌株を提供する。
【０１１７】
一実施態様では、本発明は、対象への医薬としての又はワクチンとしての異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインの送達に使用するための、本明細書に記載の組換えグラム陰性菌株を提供する。グラム陰性菌株を真核細胞と、例えば生きている動物とインビボで接触させることにより、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインを対象に送達することができ、その結果、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインは、生きている動物に移行され、その結果、動物が、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインに対する抗体を産生する。産生された抗体を、診断において、研究用途で、及び治療において直接使用することができ、又は単離し、精製し、使用することができる。抗体を産生するＢ細胞、又はその中に含有されるＤＮＡ配列は、診断において、研究用途で、及び治療において使用するための特異的抗体のさらなる産生に使用することができる。
【０１１８】
一実施態様では、本発明は、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインを送達する方法であって、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインがインビトロで真核細胞に送達される、方法を提供する。
【０１１９】
さらなる実施態様では、本発明は、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインを送達する方法であって、真核細胞が、生きている動物のものであり、生きている動物をグラム陰性菌株とインビボで接触させ、その結果、融合タンパク質が、生きている動物に移行される、方法を提供する。好ましい動物は、哺乳動物、より好ましくは人間である。
【０１２０】
さらなる実施態様では、本発明は、移行された異種タンパク質によって誘発される細胞経路又は事象の阻害剤についてのハイスループットスクリーニングのための、上記の組換えグラム陰性菌株の使用を提供する。
【０１２１】
さらなる態様では、本発明は、グラム陰性菌株のライブラリーであって、グラム陰性菌株の発現ベクターの第２のＤＮＡ配列によりコードされている、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインが、ヒト又はマウスタンパク質のドメイン、好ましくは、ヒトタンパク質のドメインであり、グラム陰性菌株により発現されるヒト又はマウスタンパク質の各ドメインがアミノ酸配列の点で異なる、ライブラリーを提供する。発現のためのクローニングベクターとして、上記発現ベクターを使用することができる。
【０１２２】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のベクターと、該ベクターに含まれるプロテアーゼ切断部位を切断することができるプロテアーゼを発現及び分泌する菌株とを含む、キットを提供する。特定の有用なベクターは、上で説明したように所望のタンパク質を真核細胞に送達するために菌株と併用するためのベクターであって、５’から３’方向に
プロモーター、
前記プロモーターに動作可能に連結されている、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードする第１のＤＮＡ配列、
前記第１のＤＮＡ配列の３’末端とインフレームで融合している、異種タンパク質の反復ドメイン又は異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードする第２のＤＮＡ配列
を含み、異種タンパク質が、アポトーシス又はアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期制御因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、低分子量ＧＴＰａｓｅ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合構築物及びナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター並びにウイルスタンパク質からなる群から選択される、ベクターである。
【実施例】
【０１２３】
実施例１：
Ａ）材料及び方法
菌株及び増殖条件。この研究で使用した株を図１５Ａ−Ｎに列挙する。プラスミド精製及びクローニングに使用した大腸菌Ｔｏｐ１０、及び接合伝達に使用した大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒ、並びにｐＫＮＧ１０１を伝播するために使用した大腸菌ＢＷ１９６１０［３６］を、ＬＢ寒天プレート上及びＬＢ培地中、３７℃で常套的に増殖させた。アンピシリンを２００μｇ／ｍｌ（エルシニア属）又は１００μｇ／ｍｌ（大腸菌）で使用して、発現ベクターについて選択した。ストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌの濃度で使用して、自殺ベクターについて選択した。Ｙ．エンテロコリティカＭＲＳ４０［２２］、非アンピシリン耐性Ｅ４０派生物［２１］及びそれに由来する株をブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ：Ｄｉｆｃｏ）上で、室温で常套的に増殖させた。Ｙ．エンテロコリティカ株に、ナリジクス酸酸（３５μｇ／ｍｌ）を添加し、全てのＹ．エンテロコリティカａｓｄ株に、さらに、１００μｇ／ｍｌのメソ−２，６−ジアミノピメリン酸（ｍＤＡＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した。サルモネラ菌ＳＬ１３４４をＬＢ寒天プレート上及びＬＢ培地中、３７℃で常套的に増殖させた。アンピシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で使用して、サルモネラ菌における発現ベクターについて選択した。
【０１２４】
Ｙ．エンテロコリティカの遺伝子操作。Ｙ．エンテロコリティカの遺伝子操作は、記載されている［３７、３８］。簡単に述べると、精製ｐＹＶ４０プラスミド又はゲノムＤＮＡを鋳型として使用して、２断片オーバーラップＰＣＲにより、それぞれの遺伝子の欠失又は修飾部分の両側に２００−２５０ｂｐの隣接配列をもたらす、ｐＹＶプラスミド内又は染色体上の遺伝子の修飾又は欠失のための変異誘発物を構築した。得られた断片を大腸菌ＢＷ１９６１０［３６］におけるｐＫＮＧ１０１［３３］にクローニングした。配列が検証されているプラスミドを大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒ内に形質転換し、そこからプラスミドを対応するＹ．エンテロコリティカ株内に移動させた。組込み型ベクターを保有する突然変異株を選択圧なしで数世代増殖させた。次いで、スクロースを使用して、ベクターを失ってしまったクローンについて選択した。最後に、突然変異株をコロニーＰＣＲにより同定した。特定の変異誘発物（ｐＳｉ＿４０８、ｐＳｉ＿４１９）を表ＩＩＩに収載する。
【０１２５】
プラスミドの構築。プラスミドｐＢａｄ＿Ｓｉ２又はｐＢａｄ＿Ｓｉ１（図１０）を、ＹｏｐＥのＮ末端１３８アミノ酸（配列番号２）を有する融合タンパク質のクローニングに使用した。ｐＢａｄ＿Ｓｉ２は、精製ｐＹＶ４０からのＹｏｐＥ及びＳｙｃＥ用の内在性プロモーターを含有するＳｙｃＥ−ＹｏｐＥ１−１３８断片をｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることにより構築した。さらなる改変は、消化、クレノウ断片処理及び再ライゲーションによるｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡのＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ断片の除去を含む。二方向転写ターミネーター（ＢＢａ＿Ｂ１００６；ｉＧＥＭ  ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）を、ＫｐｎＩ切断及びクレノウ処理（ｐＢａｄ＿Ｓｉ２）部位又はＢｇｌＩＩ切断部位（ｐＢａｄ＿Ｓｉ１）にクローニングした。さらに、ＹｏｐＥ１−１３８の３’末端に、次の切断部位を加えた：ＸｂａＩ−ＸｈｏＩ−ＢｓｔＢＩ−（ＨｉｎｄＩＩＩ）（図１０Ｂ）。ｐＢａｄ＿Ｓｉ１は、ｐＢａｄ＿Ｓｉ２と同等であるが、アラビノース誘導性プロモーターの下でＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ部位においてｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅されたＥＧＦＰをコードする。対応する内在性プロモーターとＳｔｅＡ１−２０断片（ｐＳｉ＿２６６）、完全長ＳｔｅＡ配列（ｐＳｉ＿２６７）、ＳｏｐＥ１−８１断片（ｐＳｉ＿２６８）又はＳｏｐＥ１−１０５断片（ｐＳｉ＿２６９）とを含むプラスミドｐＳｉ＿２６６、ｐＳｉ＿２６７、ｐＳｉ＿２６８及びｐＳｉ＿２６９を、サルモネラ菌ＳＬ１３４４ゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ部位にクローニングした。
【０１２６】
完全長遺伝子又はそれらの断片を、下の表Ｉに収載されている特定のプライマーで増幅し、ＹｏｐＥ１−１３８との融合体としてプラスミドｐＢａｄ＿Ｓｉ２に、又はｚ−ＢＩＭ（配列番号２１）の場合はｐＢａｄ＿Ｓｉ１にクローニングした（下の表ＩＩを参照されたい）。ＳｔｅＡ又はＳｏｐＥとの融合のために、合成ＤＮＡ構築物をＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩにより切断し、ｐＳｉ＿２６６、ｐＳｉ＿２６７、ｐＳｉ＿２６８又はｐＳｉ＿２６９にそれぞれクローニングした。細菌種の遺伝子の場合、精製ゲノムＤＮＡを鋳型として使用した（フレクスナー赤痢菌Ｍ９０Ｔ、サルモネラ菌亜種ネズミチフス菌ＳＬ１３４４、バルトネラ・ヘレンセラ菌ＡＴＣＣ  ４９８８２）。ヒト遺伝子については、別段の記述がない場合、汎用ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し（図１５Ａ−Ｎ）、ゼブラフィッシュ遺伝子をｃＤＮＡライブラリー（Ｍ．Ａｆｆｏｌｔｅｒからの親切な寄贈品）から増幅した。ライゲーションしたプラスミドを大腸菌Ｔｏｐ１０にクローニングした。シークエンシング済みプラスミドを、標準的な大腸菌エレクトロポレーションの場合と同様の設定を使用して所望のＹ．エンテロコリティカ又はサルモネラ菌株にエレクトロポレーションした。
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【０１２７】
Ｙｏｐ分泌。培養をＢＨＩ−Ｏｘ中３７℃（分泌許容条件）［３９］に変えることにより、Ｙｏｐレギュロンの導入を果たした。炭素源グルコース（４ｍｇ／ｍｌ）を添加した。
【０１２８】
細胞と上清画分を２０８００ｇで１０分間、４℃での遠心分離により分離した。細胞ペレットを全細胞画分と見なした。最終１０％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸を用いて、１時間、４℃で、上清中のタンパク質を沈殿させた。遠心分離（１５分間、２０８００ｇ）及び上清の除去後、得られたペレットを氷冷アセトンで一晩洗浄した。試料を再び遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを空気乾燥させ、１×ＳＤＳローディング色素に再懸濁させた。
【０１２９】
分泌されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析し、各場合、細菌３×１０８個により分泌されたタンパク質をレーン毎にローディングした。１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して、イムノブロット法による特定の分泌タンパク質の検出を行った。全細胞内のタンパク質を検出するために、別段の記述がない場合、細菌２×１０８個をレーン毎にローディングし、イムノブロット法による検出前に１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いてタンパク質を分離した。
【０１３０】
ＹｏｐＥに対するラットモノクローナル抗体（ＭＩＰＡ１９３−１３Ａ９；１：１０００、［４０］）を使用して、イムノブロッティングを行った。バックグラウンド染色を低減させるために、Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄに対する抗血清を一晩に２回、予備吸着させた。ラット抗体に対する二次抗体であって、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（１：５０００；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｉｏｔｅｃｈ）にコンジュゲートさせた二次抗体を用いて検出を行い、その後、ＥＣＬ化学発光基質（ＬｕｍｉＧｌｏ，ＫＰＭ）で現像した。
【０１３１】
細胞培養及び感染。１０％ＦＣＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（ｃＤＭＥＭ）を補充したダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）でＨｅＬａ  Ｃｃｌ２、ｓｗｉｓｓ  ３Ｔ３線維芽細胞、４Ｔ１、Ｂ１６Ｆ１０及びＤ２Ａ１を培養した。ＨＵＶＥＣを単離し、［４１］に記載されているように培養した。１０％ＦＣＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ  １６４０でジャーカット及び４Ｔ１細胞を培養した。添加剤を加えたＢＨＩでＹ．エンテロコリティカを一晩、室温で増殖させ、新たなＢＨＩで希釈して０．２のＯＤ６００にし、２時間、室温で増殖させた後、さらに３０分間、又はＥＧＦＰの送達の場合は１時間、３７℃水浴振盪機への温度シフトを行った。最後に、細菌を遠心分離（６０００ｒｃｆ、３０秒）により回収し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭで１回洗浄した。添加剤を加えたＬＢで一晩、３７℃でサルモネラ菌を増殖させ、新たなＬＢで１：４０希釈し、２．５時間、３７℃で増殖させた（ＳｐｉＩ  Ｔ３ＳＳ誘導条件）、又は一晩培養物を３７℃でさらにインキュベートした（ＳｐｉＩＩ  Ｔ３ＳＳ誘導条件）。最後に、細菌を遠心分離（６０００ｒｃｆ、３０秒）により収集し、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭで１回洗浄した。９６ウェルプレートに（免疫蛍光法のために）又は６ウェルプレートに（ウェスタンブロット法のために）播種した細胞を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中で、示されている感染多重度で感染させた。細菌を添加した後、プレートを１分間、１７５０ｒｐｍで遠心分離し、示されている期間、３７℃で置いておいた。細胞外細菌を、示されている場合にはゲンタマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）により殺滅した。免疫蛍光分析の場合、感染アッセイを４％ＰＦＡ固定により停止した。ウェスタンブロット分析のために、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓａｆｅ溶解バッファー（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加して細胞を溶解した。氷上でのインキュベーション後、細胞を遠心分離した（１６０００ｒｃｆ、２５分、４℃）。上清を回収し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により全タンパク質含有量について分析した後、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、そして抗リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３及びＴ３０８、両方ともＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗アクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、抗Ｂｉｄ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗Ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗ｐ３８（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗リン酸化ｐ−３８（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗カスパーゼ３  ｐ１７（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及び抗Ｉｎｋ４Ｃ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）抗体を使用するウェスタンブロッティングを行った。
【０１３２】
サルモネラ菌に関する分泌分析。サルモネラ菌によるタンパク質分泌の誘導のために、オービタルシェーカー（１５０ｒｐｍに設定した）を用いて、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含有するＬＢ中で一晩、サルモネラ菌を培養した。次いで、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含有する新たなＬＢでサルモネラ菌を１：５０希釈し、４時間、３７℃で、振盪せずに増殖させた。
【０１３３】
全細胞及び上清画分を２０８００ｇで２０分間、４℃での遠心分離により分離した。細胞ペレットを全細胞画分と見なした。最終１０％（ｗ／ｖ）のトリクロロ酢酸を用いて、１時間、４℃で、上清中のタンパク質を沈殿させた。遠心分離（１５分間、２０８００ｇ）及び上清の除去後、得られたペレットを氷冷アセトンで一晩洗浄した。試料を再び遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを空気乾燥させ、１×ＳＤＳローディング色素に再懸濁させた。
【０１３４】
分泌されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、各場合、細菌３×１０８個により分泌されたタンパク質をレーン毎にローディングした。１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して、イムノブロット法による特定の分泌タンパク質の検出を行った。全細胞内のタンパク質を検出するために、別段の記述がない場合、細菌２×１０８個をレーン毎にローディングし、イムノブロット法による検出前に１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いてタンパク質を分離した。イムノブロット法は、抗Ｍｙｃ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体を使用して行った。
【０１３５】
感染細胞からのＴ３ＳＳ移行タンパク質のウェスタンブロッティング。６ウェルプレート内のＨｅＬａ細胞を、感染多重度１００で、上で説明したように感染させた。ＴＥＶプロテアーゼ移行性Ｙ．エンテロコリティカ株を用いる同時感染の場合、株のＯＤ６００を設定し、２つの細胞懸濁液をチューブの中で（別段の指示がない限り）１：１で混合した後、細胞に添加した。感染の最後に、細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、小量の氷冷ＰＢＳ中にかき取ることにより回収した。遠心分離（１６０００ｒｃｆ、５分、４℃）後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ、Ｒｏｃｈｅ）を補充した０．００２％ジギトニンにペレットを溶解した。溶解したペレット氷上で５分間インキュベートし、次いで、遠心分離した（１６０００ｒｃｆ、２５分、４℃）。上清を回収し、全タンパク質含有量をＢｒａｄｆｏｒｄ  ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により分析した後、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、そして抗Ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、９Ｅ１１）又は抗Ｉｎｋ４Ｃ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用するウェスタンブロット法を行った。
【０１３６】
免疫蛍光。９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した細胞を、上で説明したように感染させ、４％ＰＦＡでの固定後、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中５％ヤギ血清を使用して室温で１時間にわたってウェルをブロッキングした。一次抗体（抗Ｍｙｃ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１：１００）を、１％ＢＳＡと０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで希釈し、細胞を４℃で一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで４回洗浄した後、１％ＢＳＡと０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで希釈した二次抗体（ＡＦ４８８抗マウス、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：２５０）を添加した。必要に応じて、ヘキストＤＮＡ染色（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１：２５００）及び／又はアクチン染色（Ｄｙ６４７−ファロイジン、ＤｙｅＯｍｉｃｓ）を含めた。一部の事例では、ＰＦＡを洗い流した直ぐ後にＤＮＡ及び／又はアクチン染色剤のみを適用した。細胞を室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、下で説明するような自動画像分析により分析した。
【０１３７】
自動顕微鏡観察及び画像分析。ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＵＳＡ）を用いて画像を自動で取得した。ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＵＳＡ）を使用して抗Ｍｙｃ染色強度の定量を行った。核領域及び細菌を含有する領域を除く細胞内の領域を手動で選択し（４０画素のエリアを有する円）、平均強度を記録した。
【０１３８】
リン酸化ｐ３８のＴＮＦα刺激及びウェスタンブロッティング。６ウェルプレートに播種したＨｅＬａ細胞を、感染多重度１００で、上で説明したように感染させた。感染の３０分後にゲンタマイシンを添加し、感染の４５分後にＴＮＦａを添加した（１０ｎｇ／ｍｌ）。感染の１時間１５分後に細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｓａｆｅ溶解バッファー（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加して細胞を溶解した。氷上でのインキュベーション後、細胞を遠心分離した（１６０００ｒｃｆ、２５分、４℃）。上清を回収し、全タンパク質含有量をＢｒａｄｆｏｒｄ  ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により分析した後、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、そして抗リン酸化ｐ３８、全ｐ３８抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）及び抗アクチン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用するウェスタンブロッティングを行った。
【０１３９】
感染ＨｅＬａ細胞のｃＡＭＰレベル決定。９６ウェルプレートに播種したＨｅＬａ細胞を、上で説明したように感染させた。感染の３０分前に、ｃＤＭＥＭを、１０ｍＭのＨＥＰＥＳと２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと及び１００ｕＭ  ３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）とを補充したＤＭＥＭに交換した。感染の６０分後、ゲンタマイシンを添加し、細胞を３７℃でさらに９０分インキュベートした。競合ＥＬＩＳＡを製造業者の説示（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ｃＡＭＰ  Ｂｉｏｔｒａｋ、ＲＰＮ２２５）に従って使用して、ｃＡＭＰの決定を行った。ポジティブコントロールとして、示されている量のコレラ毒素（Ｃ８０５２、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳと２ｍＭ  Ｌ−グルタミンと１００ｕＭ  ＩＢＭＸとを補充したＤＭＥＭ中の細胞に１時間にわたって添加した。
【０１４０】
ゼブラフィッシュ胚感染、イメージング及び自動画像定量。全ての動物実験は、認可されたガイドラインに従って行った。ゼブラフィッシュを標準条件で維持した［４２］。２８．５℃での受精後の時間（ｈｐｆ）により胚をステージ分類した［４３］。この研究では次のゼブラフィッシュ系統を使用した：野生型フィッシュ（ＡＢ／ＥＫ及びＥＫ／ＴＬ）。感染プロトコールは［４４］に与えられているガイドラインに従った。０．２ｍＭのＮ−フェニルチオ尿素（ＰＴＵ）を含有するＥ３培地中で１２ｈｐｆ胚を維持して、色素形成を防止した。受精後２日（ｄｐｆ）の胚に０．２ｍｇ／ｍｌのトリカインにより麻酔し、ヘアループツールを使用してそれらをＥ３中１％寒天プレート上に並べた［４４］。０．４％アラビノースと抗生物質とｍＤａｐとを補充したＢＨＩ中でＹ．エンテロコリティカを一晩、室温で増殖させ、０．５％アラビノースと他の添加剤とを含有する新たなＢＨＩで希釈して０．２のＯＤ６００にし、室温で２時間増殖させた後、さらに４５分間、３７℃水浴振盪機への温度シフトを行った。最後に、細菌を遠心分離（６０００ｒｃｆ、３０秒）により回収し、ＰＢＳで１回洗浄した。ｍＤＡＰを含有するＰＢＳ中でのＯＤ６００を２に設定した。１−２ｎＬのこの懸濁液を、並べたゼブラフィッシュ胚の後脳に、Ｆｅｍｔｏｊｅｔ  Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用し、針の先端を細いピンセットで取り除いたＦｅｍｔｏｔｉｐｓ  ＩＩ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して注射した。注射時間を０．２秒に設定し、補償圧力を１５ｈＰａに設定し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｆｅｍｔｏｊｅｔ）、注射圧力を６００−８００ｈＰａの間に調整した。液滴サイズ、したがって種菌を、顕微鏡により、及びコントロールプレーティングにより確認した。マイクロインジェクション後、トリカインとＰＴＵとを含有するＥ３中にフィッシュを回収し、３７℃で３０分インキュベートし、２８℃でさらに５時間インキュベートした。感染の１時間後に蛍光双眼顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を使用してゼブラフィッシュ後脳における細菌ＥＧＦＰ蛍光を観察し、適切に注射されなかった胚を廃棄した。感染の最後に、２％氷冷ＰＦＡを用いて氷上で１時間フィッシュを固定し、さらに新たな氷冷ＰＦＡを用いて４℃で一晩固定した。抗体染色を以前に記載されているように行った［４５、４６］。簡単に述べると、胚を、０．１％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳで４回、各洗浄について５分間、洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ＋０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で３０分間、室温で透過処理した。胚をブロッキング溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎと０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００と５％ヤギ血清と１％ＢＳＡとを含有するＰＢＳ）中、４℃で一晩ブロッキングした。抗体（切断カスパーゼ３（Ａｓｐ１７５）、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）をブロッキング溶液で１：１００希釈し、振盪しながら４℃で、暗所でインキュベートした。フィッシュを、７回、０．１％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢＳで３０分間洗浄した後、ブロッキング溶液で希釈した二次抗体（ヤギ抗ウサギＡＦ６４７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：５００）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。幼生を、０．１％Ｔｗｅｅｎを含有するＰＢ���で４回、３０分間、４℃で洗浄し、１回、一晩にわたって洗浄し、さらに３−４回洗浄した。４０×水浸対物レンズを使用してＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５共焦点顕微鏡で画像を撮影した。Ｉｍａｒｉｓ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）及びＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を使用して画像を分析した。
【０１４１】
画像分析（ｐＢａｄ＿Ｓｉ２についてのｎ＝１４又はｚ−ＢＩＭについてのｎ＝１９に関して）を、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ［４７］により、記録ｚスタック画像のｚ軸方向の最大値投影に関して行った。簡単に述べると、細菌をＧＦＰチャネルにより検出した。細菌斑点の各エリアの周囲に半径１０画素の円を生成した。重複する領域を、接しているメンバー間で等分した。細菌を密接に取り囲んでいるこれらのエリア内のカスパーゼ３  ｐ１７染色強度を測定した。
【０１４２】
リン酸化プロテオミクス用の試料調製。各条件について、６ウェルプレート２つのＨｅＬａ  ＣＣＬ−２細胞をコンフルエンスまで増殖させた。細胞を、３０分間、上で説明したように感染させた。示されている時点で、プレートを氷上に置き、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、試料を尿素溶液［８Ｍ尿素（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム（Ｓｉｇｍａ）、０．１％ＲａｐｉＧｅｓｔ（Ｗａｔｅｒｓ）、１×ＰｈｏｓＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ）］中に回収した。試料を短時間ボルテックスし、４℃で超音波処理し（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ）、サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で５分振盪し、４℃、１６０００ｇで２０分遠心分離した。上清を回収し、さらなる処理のために−８０℃で保管した。ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してタンパク質濃度を測定した。
【０１４３】
リン酸化ペプチド濃縮。ジスルフィド結合を、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを最終濃度１０ｍＭで用いて３７℃で１時間、還元した。２０ｍＭヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ）を用いて室温で３０分間、暗所で遊離チオールをアルキル化した。Ｎ−アセチルシステインを最終濃度２５ｍＭで用いて室温で１０分間、過剰ヨードアセトアミドを失活させた。Ｌｙｓ−Ｃエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社）を添加して１：２００の最終酵素／タンパク質比（ｗ／ｗ）にし、３７℃で４時間インキュベートした。その後、溶液を、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム（Ｓｉｇｍａ）で尿素２Ｍ未満の最終濃度に希釈し、シークエンシンググレードの修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を５０：１のタンパク質対酵素比で用いて３７℃で一晩消化した。ペプチドをＣ１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）で脱塩し、真空下で乾燥させた。以前に記載されている［４８］のようにＴｉＯ２を用いて全ペプチド質量２ｍｇからリン酸化ペプチドを単離した。簡単に述べると、乾燥させたペプチドを、フタル酸で飽和した８０％アセトニトリル（ＡＣＮ）−２．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液に溶解した。ペプチドを、ブロッキング済みＭｏｂｉｃｏｌスピンカラム（ＭｏＢｉＴｅｃ）内の同量の平衡ＴｉＯ２（ビーズ径５μｍ、ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に添加し、それを転倒回転させながら３０分間インキュベートした。カラムを飽和フタル酸酸性溶液で２回、８０％ＡＣＮ及び０．１％ＴＦＡで２回、最後に０．１％ＴＦＡで２回洗浄した。ペプチドを、０．３Ｍ  ＮＨ４ＯＨ溶液で溶出した。５％のＴＦＡ溶液及び２Ｍ  ＨＣｌで溶出液のｐＨを２．５未満に調整した。リン酸化ペプチドをｍｉｃｒｏｓｐｉｎ  Ｃ１８カートリッジ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）で再度脱塩した。
【０１４４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析。１．９μｍのＣ１８樹脂（Ｒｅｐｒｏｓｉｌ−ＡＱ  Ｐｕｒ、Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ）を施設内で充填した加熱したＲＰ−ＨＰＬＣカラム（７５μｍ×４５ｃｍ）を装着した、ＥＡＳＹ  ｎａｎｏ−ＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ペプチドのクロマトグラフ分離を行った。２００ｎｌ／分の流速で１２０分かけて９８％溶媒Ａ（０．１５％ギ酸）及び２％溶媒Ｂ（９８％アセトニトリル、２％水、０．１５％ギ酸）から３０％溶媒Ｂまで変動する直線勾配を使用して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ実行１回につき全リン酸化ペプチド試料１μｇのアリコートを分析した。質量分析は、ナノエレクトロスプレーイオン源を装備しているデュアルプレッシャーＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（どちらもＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行った。各ＭＳ１スキャン（Ｏｒｂｉｔｒａｐで取得）の後、３０秒間の動的排除を伴う、最も含有量の多い２０の前駆体イオンの衝突誘起解離（ＣＩＤ、ＬＴＱで取得）を行った。リン酸化ペプチド分析のために、最も含有量の多い１０の前駆体イオンを、使用可能な多段階の活性化を伴うＣＩＤに付した。全サイクル時間はおよそ２秒であった。ＭＳ１に関しては、最大時間３００ミリ秒にわたってイオン１０６個をＯｒｂｉｔｒａｐセルに蓄積し、分解能６０，０００ＦＷＨＭで（４００ｍ／ｚで）スキャンした。ＭＳ２スキャンは、通常のスキャンモード、目標設定イオン１０４個、及び蓄積時間２５ミリ秒を使用して取得した。一価イオン、及び電荷状態が未指定のイオンは、ＭＳ２事象の誘発から除外した。正規化衝突エネルギーを３２％に設定し、スペクトル毎に１つのマイクロスキャンを取得した。
【０１４５】
ラベルフリー定量及びデータベース検索。取得した生ファイルを、デフォルトパラメータを使用してラベルフリー定量用のＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓソフトウェアツール（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、バージョン４．０）にインポートした。ＭＳ２スペクトルをｍｇｆ形式でＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓから直接エクスポートし、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェア（バージョン１．０．１３．１３）からのＳｅｑｕｅｎｃｅＲｅｖｅｒｓｅｒツールを使用して生成した、ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）の予測ＳｗｉｓｓＰｏｒｔエントリー（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ、公表日２０１２年５月１６日）及びよく見られた夾雑物の順方向及び逆方向配列（合計で４１，２５０配列）を含むデコイデータベース［４９］を、ＭＡＳＣＯＴアルゴリズム（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、バージョン２．４）を使用して検索した。Ｙ．エンテロコリティカに由来するタンパク質を同定するために、非リン酸化ペプチドを多く含む試料について、Ｙ．エンテロコリティカの予測ＳｗｉｓｓＰｏｒｔエントリー（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ、公開日２０１３年８月１５日）を含む、上記の同じデータベースを検索した。前駆体イオン許容値を１０ｐｐｍに設定し、断片イオン許容値を０．６Ｄａに設定した。検索基準を次のように設定した：十分なトリプシン特異性を要求し（プロリンが続かない限り、リジン又はアルギニン残基の後で切断）、切断ミス２つを許容し、ＴｉＯ２濃縮又は非濃縮試料について、カルバミドメチル化（Ｃ）を固定修飾として、リン酸化（Ｓ、Ｔ、Ｙ）又は酸化（Ｍ）を可変修飾として、それぞれ設定した。最後に、データベース検索結果をｘｍｌファイルとしてエクスポートし、ＭＳ１特徴評価のためにＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓソフトウェアにインポートし直した。リン酸化ペプチド定量のために、検出された全特徴のＭＳ１ピーク存在量を収録しているｃｓｖファイルをエクスポートし、非濃縮試料については、タンパク質毎に同定された全てのペプチドの合計特徴強度に基づく全てのタンパク質測定値を収録しているｃｓｖファイルを作成した。重要なこととして、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓソフトウェアを、ペプチドの類似のセットにより同定されたタンパク質を一緒に分類するように、及びデータベース内の単一タンパク質についての特異的配列と矛盾しないペプチドのみをタンパク質同定に用いるように設定した。施設内で開発したＳａｆｅＱｕａｎｔ  ｖ１．０  Ｒスクリプト（データ未公表、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｅａｈｒｎｅ／ＳａｆｅＱｕａｎｔ／で入手可能）を使用して、両方のファイルをさらに処理した。簡単に述べると、このソフトウェアは、同定レベル偽発見率を（デコイタンパク質配列データベースヒット数に基づいて）１％に設定し、同定されたＭＳ１ピーク存在量（抽出イオンクロマトグラム、ＸＩＣ）を全試料にわたって正規化する、すなわち、確信的に同定された全てのペプチド特徴の合計ＸＩＣを、全てのＬＣ−ＭＳ実行について等しくなるように調整する。次に、定量された全てのリン酸化ペプチド／タンパク質に、時点当たりのＸＩＣ中央値に基づいて時点毎に存在比を割り当てる。各々の比の統計的有意性は、そのｑ値（偽発見率調整��値）によって得られ、このｑ値は、修正ｔ統計量ｐ値を算定すること［５０］及び多重検定用に調整すること［５１］によって得られる。リン酸化した残基の位置は、ＭＡＳＣＯＴ（スコア＞１０）により自動的に指定された。用いたＭＳ生ファイル及び検索パラメータのアノテーションが一緒に付与されている全てのスペクトルを、ＰＲＩＤＥパートナーレポジトリー［５２］経由でＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｅｏｍｅｃｅｎｔｒａｌ．ｐｒｏｔｅｏｍｅｘｃｈａｎｇｅ．ｏｒｇ）に寄託することになる。
【０１４６】
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／におけるＥＭＢＬ−ＥＢＩウェブに基づくＣｌｕｓｔａｌＷ２多重配列アライメントツールを使用して、配列アラインメントを行った。
【０１４７】
４Ｔ１同種移植マウスモデルにおける体内分布
全ての動物実験は、認可されたものであり（ｌｉｃｅｎｓｅ  １９０８；Ｋａｎｔｏｎａｌｅｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒａｍｔ  Ｂａｓｅｌ−Ｓｔａｄｔ）、地域のガイドライン（Ｔｉｅｒｓｃｈｕｔｚ−Ｖｅｒｏｒｄｎｕｎｇ；Ｂａｓｅｌ−Ｓｔａｄｔ）及びスイス動物保護法（Ｔｉｅｒｓｃｈｕｔｚ−Ｇｅｓｅｔｚ）に従って行った。６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスをＪａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓから取り寄せた。少なくとも１週間の馴化後、イソフルランを使用してマウスを麻酔し、１００ｕｌ  ４Ｔ１細胞（細胞１×１０５−１×１０６個）をＢＡＬＢ／ｃマウスの側副部に皮下注射した。この実験を通して、マウスの行動及び身体的外見についてのスコアを付け、体表温度並びに体重を測定した。
【０１４８】
腫瘍が発生したら、マウスに８ｍｇ／ｍｌ  デスフェラル溶液（１０ｍｌ／ｋｇ）を腹腔内注射により投与した。翌日、マウスを尾静脈への注射によりＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０又はＹ．エンテロコリティカＭＲＳ４０ΔＨＯＰＥＭＴ（細菌２×１０５、１×１０６又は１×１０７個）に感染させた。マウスに静脈内投与した種菌を希釈平板法により検証した。一部の実験では、腫瘍進行をデジタルノギスでの腫瘍長及び幅の毎日の測定により追跡した。腫瘍体積を０．５３２×長さ×幅２として決定した。注射後のそれぞれの日に、マウスをＣＯ２吸入により屠殺した。直ちに心臓からの吸引により血液試料を単離した。肝臓、脾臓、肺及び腫瘍を単離し、それらの重量を判定した。臓器及び腫瘍をホモジナイズした。ナリジクス酸（３５ｕｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天プレート上への段階希釈物のスポッティングにより、各試料におけるＣＦＵを判定した。
【０１４９】
Ｂ）結果
ＹｏｐＥ融合タンパク質の３型分泌に基づくタンパク質送達系
Ｙ．エンテロコリティカＴ３ＳＳエフェクターＹｏｐＥ（配列番号１）のまさにＮ末端は、異種タンパク質を移行させるのに十分な分泌シグナルを有する［２６］が、そのシャペロン（ＳｙｃＥ）についてはシャペロン結合部位（ＣＢＳ）を含まない［５３］。本発明者らは、ＹｏｐＥのＮ末端１３８アミノ酸（配列番号２）を選択して、送達すべきタンパク質と融合させた。このＹｏｐＥのＮ末端１３８アミノ酸は、他の異種Ｔ３Ｓ基質の移行について最良の結果をもたらすことが証明されていた［２８］からであった。ＹｏｐＥのこれらのＮ末端１３８アミノ酸はＣＢＳを含有するので、本発明者らは、さらに、ＳｙｃＥを共発現させることを決めた。精製Ｙ．エンテロコリティカｐＹＶ４０毒性プラスミドからクローニングしたＳｙｃＥ−ＹｏｐＥ１−１３８断片は、ＹｏｐＥの及びそのシャペロンＳｙｃＥの内在性プロモーターを含有する（図１０）。したがって、ＳｙｃＥと任意のＹｏｐＥ１−１３８の融合タンパク質は、室温での増殖から３７℃への急速な温度シフトにより誘導される。３７℃での培養時間は、細菌内に存在する融合タンパク質量に影響を与えることになる。多重クローニング部位（ＭＣＳ）をＹｏｐＥ１−１３８の３’末端に付加させ（図１０Ｂ）、その後、Ｍｙｃ及び６×Ｈｉｓタグ及び終止コドンを付加させた。
【０１５０】
バックグラウンド株を注意深く選択した。先ず、内在性エフェクターの移行を制限するために、本発明者らは、公知のエフェクター、Ｙｏｐ  Ｈ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ及びＴの全てが欠失したＹ．エンテロコリティカ株（名称ＨＯＰＥＭＴ）［５４］を使用した。加えて、本発明者らは、外来メソ−２，６−ジアミノピメリン酸の非存在下では増殖することができない栄養要求突然変異株［５５］を時には使用した。この株のアスパラギン酸−ベータ−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子が欠失したものであり（Δａｓｄ）、Ｓｗｉｓｓ  ｓａｆｅｔｙ  ａｇｅｎｃｙによりバイオセーフティレベル１に分類されている（Ａ０１００８８／２に対する補正）。加えて、本発明者らは、バックグラウンド株のより大規模な選択をもたらすために接着タンパク質ＹａｄＡ及び／又はＩｎｖＡを欠失させた。ｙａｄＡ又はｙａｄＡ／ｉｎｖＡ株を使用は、誘導されるバックグラウンドシグナルを低減させるが［５６］が、送達されるタンパク質量も同様に影響を受ける［５７］。
【０１５１】
真核細胞へのＹｏｐＥ融合タンパク質送達の特徴づけ
インビトロ分泌アッセイ（図１Ａを参照されたい）では、周囲の液体へのタンパク質分泌を人工的に誘導する。ＴＣＡに基づくタンパク質沈殿の後、抗ＹｏｐＥ抗体でのウェスタンブロット分析を使用して、分泌されたタンパク質量を決定した（図１Ｂ）。ｗｔ株は、完全長ＹｏｐＥを分泌したが、ΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ株は、分泌しなかった。ＹｏｐＥ１−１３８−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（さらなる名称ＹｏｐＥ１−１３８−Ｍｙｃ；配列番号３）が存在すると、より小さなＹｏｐＥバンドが目に見えるようになった（図１Ｂ）。したがって、ＹｏｐＥ１−１３８断片は本明細書に記載の設定で十分に分泌される。真核細胞へのタンパク質移行の均一性を分析するために、本発明者らは、ＹｏｐＥ１−１３８−Ｍｙｃをコードする株にＨｅＬａ細胞を感染させ、ＩＦによりＭｙｃタグを染色した（図２Ａ及びＢ）。最初は細菌のみが染色されたが、感染後（ｐ．ｉ．）３０分の時点では、細胞の輪郭が目に見え始め、これは感染時間を増加させると増強される（図２Ｂ）。この傾向は、ＨｅＬａ細胞の内部のＭｙｃタグ染色強度によく反映される（図２Ａ及びＢ）。ＹｏｐＥ１−１３８−Ｍｙｃは、核内を除いて［５８］、細胞のどこででも検出することができる（図２Ａ）。意外なことに、この手法により、全てではないが大多数の細胞に同等に到達した。Ｙ．エンテロコリティカに多くの異なる細胞型が感染することが公知であるので［５９］、本発明者らは、様々な細胞株へのＹｏｐＥ１−１３８−Ｍｙｃ送達を追跡した。感染したマウス線維芽細胞、ジャーカット細胞及びＨＵＶＥＣにおいて同じ同種抗Ｍｙｃ  ＩＦ染色が観察された（図１１）。さらに、感染多重度を高く又は低く調整することにより、なお大多数の細胞を標的としたまま、送達されるタンパク質量を調節することが可能になる（図２Ｃ）。細菌数を少なくすると、少数の細胞が大量の送達タンパク質を有することになるのではなく、大多数の細胞が少量の送達タンパク質を有することになる（図２Ｃ）。
【０１５２】
Ｔ３ＳＳ送達タンパク質の核への再指向
ＹｏｐＥ自体は細胞質に局在していたので（図２Ａ）、ＹｏｐＥ１−１３８断片が核融合タンパク質の局在化を妨げるかどうかを試験することは特に興味深い。したがって、本発明者らは、ＹｏｐＥ１−１３８−ＥＧＦＰのＣ末端（及びＮ末端、同様の結果）にＳＶ４０  ＮＬＳを付加させた（それぞれ配列番号３９及び配列番号３８）。感染させたＨｅＬａ細胞において、ＹｏｐＥ１−１３８−ＥＧＦＰ（配列番号３７）は、弱い細胞質染色をもたらしたが、ＹｏｐＥ１−１３８−ＥＧＦＰ−ＮＬＳは、より強力な核内ＥＧＦＰシグナルを生じさせた（図３）。これは、ＹｏｐＥ１−１３８断片がＮＬＳの使用と適合性であることを示す。ｍＣｈｅｒｒｙは、植物病原体において既に使用されているが［６０］、これは、Ｔ３ＳＳをコードするヒト又は動物病原性細菌を介したＧＦＰ様タンパク質の送達成功を意味する。これにより、ＳｙｃＥ及びＹｏｐＥ１−１３８依存性戦略は最適な多くのタンパク質の送達に非常に有望であることが検証される。
【０１５３】
真核細胞への融合タンパク質の移行後のＹｏｐＥ１−１３８付属物の除去
ＹｏｐＥ１−１３８断片は、細菌送達に大いに役立つものであるが、融合タンパク質の機能及び／又は局在化を妨げる可能性がある。したがって、タンパク質送達後にそれを除去することが最適であるだろう。この目的のために、本発明者らは、ＹｏｐＥ１−１３８と融合パートナー（転写制御因子ＥＴ１−Ｍｙｃ（配列番号３６及び４１）［６４］及びヒトＩＮＫ４Ｃ（配列番号４０及び配列番号４３））との間に２つのＴＥＶ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＳ）［６１−６３］を導入した。提供する方法の優位性を保持するために、本発明者らは、別のＹ．エンテロコリティカ株においてＴＥＶプロテアーゼ（Ｓ２１９Ｖバリアント；［６５］）をＹｏｐＥ１−１３８（配列番号４２）とさらに融合した。ＨｅＬａ細胞を一度に両方の株に感染させた。タンパク質の移行画分のみの分析を可能にするために、感染ＨｅＬａ細胞を、感染の２時間後に（図４）、細菌を溶解しないことが公知であるジギトニンを用いて溶解した（［６６］；コントロールについては図１２を参照されたい）。ウェスタンブロット分析は、細胞が対応する株に感染した場合にのみ、ＹｏｐＥ１−１３８−２×ＴＥＶ切断部位−ＥＴ１−Ｍｙｃ又はＹｏｐＥ１−１３８−２×ＴＥＶ切断部位−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−Ｍｙｃの存在を明示した（図４Ａ及びＣ）。この細胞溶解物を精製ＴＥＶプロテアーゼで一晩消化すると、シフトしたバンドを観察することができた（図４Ａ及びＣ）。このバンドは、ＴＥＶ切断部位のＮ末端に残存物がある、ＥＴ１−Ｍｙｃ（図４Ｃ）又はＦｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ（図４Ａ）に対応し、この残存物は、１つのセリンのみの可能性が最も高い。ＴＥＶプロテアーゼを送達する株に細胞を同時感染させると、同じ切断ＥＴ１−Ｍｙｃ又はＦｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ断片が目に見えるようになった。これは、Ｔ３ＳＳを介して送達されたＴＥＶプロテアーゼが機能性であること、及び単一細胞が両方の菌株に感染したことを示す（図４Ａ及びＣ）。切断は完全なものではないが、移行したタンパク質の大多数が、感染の２時間後に既に切断され、精製ＴＥＶプロテアーゼで一晩消化しても、より高い切断率は得られなかった（図４Ｂ）。報告されているように、ＴＥＶプロテアーゼ依存性切断は、融合タンパク質次第で最適化を必要とする可能性がある［６７、６８］。したがって、移行後のＹｏｐＥ１−１３８付属物のＴＥＶプロテアーゼ依存性除去は、アミノ酸組成をＮ末端アミノ酸１つだけしか変化させずに、殆どの天然異種タンパク質のＴ３ＳＳタンパク質送達をもたらす初めてのものである。
【０１５４】
ＹｏｐＥ断片のＴＥＶプロテアーゼ依存性切断の代替の手法は、目的の融合タンパク質にユビキチンを組み込むことに存した。実際、ユビキチンは、そのＣ末端で、内在性ユビキチン特異的Ｃ末端プロテアーゼ（脱ユビキチン化酵素、ＤＵＢ）群により、プロセシングされる。切断はユビキチンのまさにＣ末端（Ｇ７６の後ろ）で起こるはずであるので、目的のタンパク質には追加のアミノ酸配列がないはずである。この方法を、ＹｏｐＥ１−１３８−ユビキチン−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓ融合タンパク質を用いて試験した。ＹｏｐＥ１−１３８−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓを発現する細菌に感染させたコントロール細胞では、融合タンパク質の効率的移行を示す、ＹｏｐＥ１−１３８−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓに対応するバンドが見られた（図２４）。ＹｏｐＥ１−１３８−ユビキチン−Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓを発現する細菌に細胞を１時間感染させたとき、Ｆｌａｇ−ＩＮＫ４Ｃ−ＭｙｃＨｉｓのサイズに対応する追加のバンドが目に見えた。これは、融合タンパク質の一部が切断されたことが示す。この結果は、融合タンパク質へのユビキチンの導入により、外来プロテアーゼを必要とすることなくＹｏｐＥ１−１３８断片を切り離すことが可能になることを示す。
【０１５５】
ＩＩＩ型及びＩＶ型細菌エフェクターの移行
サルモネラ菌からのＳｏｐＥは、Ｃｄｃ４２と相互作用してアクチン細胞骨格リモデリングを促進する、よく特徴づけられているグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）である［６９］。ＨｅＬａ細胞へのＹｏｐＥ１−１３８−Ｍｙｃの移行の影響はなかったが、移行したＹｏｐＥ１−１３８−ＳｏｐＥ（配列番号５及び１３５）は、アクチンネットワークの劇的な変化を誘導した（図５Ａ）。別のＧＥＦエフェクタータンパク質である、フレクスナー赤痢菌からのＩｐｇＢ１（配列番号４）で、同様の結果が得られた。意外なことに、アクチン細胞骨格の最初の変化は、感染後２分という速さで観察された（図５Ａ）。したがって、Ｔ３ＳＳ依存性タンパク質送達は、遠心分離により感染を開始した直後に起こると、結論づけることができる。厳密なＴ３ＳＳ依存性輸送を証明するために、真核細胞膜への移行孔を形成するＴ３ＳＳタンパク質の１つを欠失させた（ＹｏｐＢ、［７０］を参照されたい）（図１２）。
【０１５６】
サルモネラ属感染中、ＳｏｐＥ移行後に、Ｃｄｃ４２に対するＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質（ＧＡＰ）として機能するＳｐｔＰが移行する［７１］。ＹｏｐＥ１−１３８−ＳｏｐＥ−Ｍｙｃ（配列番号１３５）単独での移行は、大規模なＦ−アクチン再構成を誘発したが、ＹｏｐＥ１−１３８−ＳｐｔＰ（配列番号８）を発現する細菌による同時感染は、この効果を用量依存的に消失させた（図５Ｂ）。抗Ｍｙｃ染色は、この阻害がＹｏｐＥ１−１３８−ＳｏｐＥ−Ｍｙｃ移行レベル低下に起因するものではないことを示した（図５Ｂ）。総じてこれらの結果は、２つの菌株による細胞の同時感染が、２つの異なるエフェクターをそれらの機能的相互作用に取り組むために単一細胞に送達するための有効な方法であることを示した。
【０１５７】
フレクスナー赤痢菌ＩＩＩ型エフェクターＯｓｐＦは、ＭＡＰキナーゼｐ３８及びＥＲＫを脱リン酸化させるリン酸化スレオニンリアーゼとして機能する［７２］。移行したＹｏｐＥ１−１３８−ＯｓｐＦ（配列番号７）の機能性を試験するために、本発明者らは、ＴＮＦαでの刺激後のｐ３８のリン酸化をモニターした。未感染細胞、又はＹｏｐＥ１−１３８−Ｍｙｃを発現する細菌に感染させた細胞では、ＴＮＦαは、ｐ３８リン酸化を誘導した。対照的に、ＹｏｐＥ１−１３８−ＯｓｐＦの移行後、ＴＮＦαにより誘導されたリン酸化が消失した。これは、送達されたＯｓｐＦがｐ３８に対して活性であることを示す（図６Ａ）。
【０１５８】
サルモネラ属感染中に、ＩＩＩ型エフェクターＳｏｐＢは、Ａｋｔの持続的活性化により上皮細胞をアポトーシスから保護する［７３］。ＹｏｐＥ１−１３８−Ｍｙｃ又はＹｏｐＥ１−１３８−ＳｏｐＥの移行はＡｋｔに影響を与えなかったが、ＹｏｐＥ１−１３８−ＳｏｐＢ（配列番号６）の移行は、活性形態を反映して、Ｔ３０８及びＳ４７３におけるＡｋｔの強力なリン酸化を誘導した（図６Ｂ）。同様の結果が、フレクスナー赤痢菌からのＳｏｐＢ−ホモログ（ＩｐｇＤ、配列番号９）で得られた。総じて、本発明者らの結果は、ＹｏｐＥ１−１３８に基づく送達系が、これまでに試験しれた全てのＴ３Ｓエフェクターに対して機能すること、並びに細胞骨格、炎症及び細胞生存をはじめとする中心的細胞機能の調節に関与するタンパク質の調査を可能にすることを示す。
【０１５９】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス、レジオネラ・ニューモフィラ及びバルトネラ・ヘレンセラ菌をはじめとする多数の細菌は、ＩＶ型分泌を使用してエフェクターを細胞に注入する。バルトネラ・ヘンセラ菌からのＩＶ型エフェクターＢｅｐＡを、本発明者らのツールを使用してＨｅＬａ細胞に移行することができるかどうかを試験した。完全長ＢｅｐＡ（配列番号１０）、及びＣ末端Ｂｉｄドメインを含有するＢｅｐＡＥ３０５−ｅｎｄ（配列番号１１）をクローニングし、細胞をそれぞれの株に感染させた。ＢｅｐＡはサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の産生を誘導することが証明されていたので［７４］、感染後にＨｅＬａ細胞におけるｃＡＭＰのレベルを測定した。バルトネラ・ヘンセラ菌エフェクターＢｅｐＧ（配列番号１３６）のＢｉｄドメインの移行は、ｃＡＭＰを誘導することができなかったが、完全長ＢｅｐＡ及びＢｅｐＡＥ３０５−ｅｎｄは、期待量［７４］のｃＡＭＰ産生を誘発した（図６Ｃ）。この結果は、ＩＶ型エフェクターもＹｏｐＥ１−１３８に基づく送達系によって宿主細胞標的に有効に送達することができること、及びそれらが機能性であることを示す。
【０１６０】
上皮細胞への真核生物タンパク質の移行
ヒトタンパク質がＩＩＩ型分泌によって移行できることを明らかにするために、本発明者らは、ヒトアポトーシス誘導因子を、Ｙ．エンテロコリティカによる送達のためにＹｏｐＥ１−１３８と、又はサルモネラ菌による送達のためにＳｔｅＡ１−２０、ＳｔｅＡ、ＳｏｐＥ１−８１若しくはＳｏｐＥ１−１０５と融合させた。次いで、本発明者らは、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーのアポトーシス促進性スメンバーであるヒトＢＨ３相互作用ドメインデスアゴニスト（ＢＩＤ、配列番号２４）の移行をモニターした。ＢＩＤは、カスパーゼ−８（ＣＡＳＰ８）により誘導されるミトコンドリア損傷のメディエーターである。ＣＡＳＰ８は、ＢＩＤを切断し、切断型ＢＩＤ（ｔＢＩＤ、配列番号２５）はミトコンドリアに移行し、そこでシトクロムＣ放出を誘発する。後述のトクロムＣ放出は、固有モードのカスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）活性化をもたらし、その間に、ＣＡＳＰ３は１７ｋＤａサブユニットと１２ｋＤａサブユニットに切断される［７５］。ＹｏｐＥ１−１３８−Ｍｙｃ又はＹｏｐＥ１−１３８−ＢＩＤを発現するＹ．エンテロコリティカによる１時間の感染は、アポトーシスを誘導することができなかったが、ヒトｔＢＩＤの移行は、よく特徴づけられているアポトーシス誘導因子スタウロスポリンよりも大きな程度で細胞死を誘発した（図７Ａ及びＣ）。予測通り、ｔＢＩＤの移行は、ＣＡＳＰ３  ｐ１７サブユニットの産生を、もっと言えば、スタウロスポリンを用いた場合より多い量での産生をもたらす（図７Ａ）。移行したタンパク質量と内在性Ｂｉｄを比較することができるように、ＨｅＬａ細胞をジギトニンで溶解し、抗Ｂｉｄ抗体を使用するウェスタンブロット法により分析した（図７Ｂ）。Ｔ３ＳＳにより送達されたＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢＩＤは、ＨｅＬａ細胞内でほぼ内在性Ｂｉｄレベルに達したが、送達されたＹｏｐＥ１−１３８−ＢＩＤのほうが多い量で存在した（２．５倍）（図７Ｂ）。ＨｅＬａ細胞のディーププロテオーム及びトランスクリプトームマッピングにより、単一細胞当たりＢＩＤコピー数１０５の４．４倍が推定された［７６］。したがって、Ｔ３ＳＳ依存性ヒトタンパク質送達は、１細胞当たり１０５−１０６タンパク質に達すると結論づけることができる。これらの数は、大腸菌Ｔ３ＳＳにより移行されるナノボディの細胞当たりのコピー数［４］と一致する。感染多重度が及び感染期間が１０倍、抗生物質添加の時点及び感染前の３７℃での培養時間が３．２倍のレベルになると仮定すると、送達されるタンパク質コピー／細胞を、数１０００コピー／細胞から数１０６コピー／細胞まで調整することができる。総じて、これらの結果は、移行したｔＢＩＤが機能性であり、有意味なレベルで送達されることを示した。これにより、細胞生物学の中心的側面である、アポトーシスの調節におけるタンパク質の役割を研究するための移行ツールが検証された。
【０１６１】
本発明者らは、さらに、Ｙ．エンテロコリティカによる送達のために、マウスｔＢＩＤ（Ｙ．エンテロコリティカに対してコドン最適化されたもの；配列番号１９４）又はマウスｔＢＩＤ若しくはマウスＢＡＸ（どちらの場合もＹ．エンテロコリティカに対してコドン最適化されたもの；配列番号１３８及び１３９）のＢＨ３ドメインを、ＹｏｐＥ１−１３８と融合させた。何れのタンパク質も送達しない又はＹｏｐＥ１−１３８−Ｍｙｃを送達するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄによる２．５時間の感染は、アポトーシスを誘導することができなかったが、マウスｔＢＩＤ（Ｙ．エンテロコリティカに対してコドン最適化されたもの、配列番号１９４）の移行は、Ｂ１６Ｆ１０細胞（図１６）、Ｄ２Ａ１細胞（図１７）、ＨｅＬａ細胞（図１８）及び４Ｔ１細胞（図１９）において細胞死を誘発した。Ｙ．エンテロコリティカに対してコドン最適化されたマウスＢＩＤ（配列番号１３８）又はＹ．エンテロコリティカに対してコドン最適化されたマウスＢＡＸ（配列番号１３９）のＢＨ３ドメインの移行も、Ｂ１６Ｆ１０細胞（図１６）、Ｄ２Ａ１細胞（図１７）、ＨｅＬａ細胞（図１８）及び４Ｔ１細胞（図１９）において大規模な細胞死を誘導することが判明した。
【０１６２】
サルモネラ菌ａｒｏＡ細菌による４時間の感染は、アポトーシスを誘導することができなかったが、マウスｔＢＩＤの移行は、マウスｔＢＩＤの移行がＣＡＳＰ３  ｐ１７サブユニットの産生をもたらすので、アポトーシスを誘発した（図２０及び２１）。ＳｏｐＥ融合タンパク質についてのアポトーシス誘導の程度は、ＳｐｉＩ  Ｔ３ＳＳ誘導条件を使用した場合のほうが大きかった（図２０）。これは、ＳｐｉＩ  Ｔ３ＳＳによるＳｏｐＥの排他的輸送を反映している。ＳｔｅＡ１−２０融合マウスｔＢＩＤは、アポトーシスを誘導することができなかった。これは、ＳｔｅＡの２０のＮ末端アミノ酸内の分泌シグナルが、融合タンパク質の送達を可能にするには十分でないことに起因する可能性が高い（図２０及び２１）。完全長ＳｔｅＡと融合しているマウスｔＢＩＤは、ＳｐｉＩ  Ｔ３ＳＳ誘導条件とＳｐｉＩＩ  Ｔ３ＳＳ誘導条件の両方でＨｅＬａ細胞においてアポトーシス誘導をもたらした（図２０及び２１）。これは、ＳｔｅＡが両方のＴ３ＳＳにより輸送され得ることを反映している。ＳｐｉＩＩ  Ｔ３ＳＳ誘導条件下であっても、ＳｐｉＩＩ  Ｔ３ＳＳ誘導条件でのＳｏｐＥ融合タンパク質の活性によって見られるようなＳｐｉＩ  Ｔ３ＳＳの部分的活性が予測されることに留意しなければならない（図２１）。
【０１６３】
ここで機能の点で詳述した、移行させる真核生物タンパク質に加えて、いくつかの他の真核生物タンパク質を本明細書に記載のツールを使用して分泌した。これは、Ｙ．エンテロコリティカのよる送達（図１３、１４及び２３）のために、細胞周制御からのタンパク質（Ｍａｄ２（配列番号１５）、ＣＤＫ１（配列番号１４）、ＩＮＫ４Ａ（配列番号１６）、ＩＮＫ４Ｂ（配列番号１７）及びＩＮＫ４Ｃ（配列番号１８））並びにそれらの部分（ＩＮＫ４Ａ  ８４−１０３（配列番号１５８）、ｐ１０７  ６５７−６６２（配列番号１５９）、ｐ２１  １４１−１６０（配列番号１６０）、ｐ２１  １４５−１６０（配列番号１６１）、ｐ２１  １７−３３（配列番号１６２）及びサイクリンＤ２  １３９−１４７（配列番号１６３））、アポトーシス関連タンパク質（Ｂａｄ（配列番号２９）、ＦＡＤＤ（配列番号２８）、及びカスパーゼ３  ｐ１７（配列番号２２）及びｐ１２（配列番号２３）、ゼブラフィッシュＢｉｄ（配列番号１９）及びｔ−Ｂｉｄ（配列番号２０））並びにそれらの部分（ｔＢｉｄ  ＢＨ３（配列番号１３８）、Ｂａｘ  ＢＨ３（配列番号１３９））、シグナル伝達タンパク質（マウスＴＲＡＦ６（配列番号１２）、ＴＩＦＡ（配列番号１３））、ＧＰＣＲ  Ｇαサブユニット（ＧＮＡ１２、最短アイソフォーム、（配列番号３０））、標的タンパク質分解のためのナノボディ（ｖｈｈＧＦＰ４、（配列番号３１））及びナノボディ融合構築物（Ｓｌｍｂ−ｖｈｈＧＦＰ４；（配列番号３２、３３、３４））［７７］）（図１３及び１４）、並びに低分子量ＧＴＰａｓｅ（Ｒａｃ１  Ｑ６１Ｅ（配列番号２６及び１３７）及びＲｈｏＡ  Ｑ６３Ｌ（配列番号２７））、及びヒトＡｋｔからのプレクストリン相同ドメイン（配列番号３５）を含む。機能の点で詳述したアポトーシス関連タンパク質（マウスｔＢｉｄ、配番号１４４−１４７）に加えて、これは、サルモネラ菌による送達（図２２）のために、細胞周期制御からのタンパク質（Ｍａｄ２（配列番号１６８−１６９）、ＣＤＫ１（配列番号１７０−１７１）、ＩＮＫ４Ａ（配列番号１６４−１６５）及びＩＮＫ４Ｃ（配列番号１６６−１６７））をさらに含む。これらのタンパク質は機能的の点で検証されていないが、ＹｏｐＥ付属物の可能な除去と併せて、多様な真核生物タンパク質のＴ３ＳＳ依存性分泌の可能性は、細胞生物学及び治療応用へのＴ３ＳＳの広範な適用性に関して新しい展望を開く。
【０１６４】
ゼブラフィッシュ胚内への切断型Ｂｉｄのインビボ移行はアポトーシスを誘導する
この細菌ツールの興味深い特徴は、生きている動物に使用できる可能性である。胚の状態のゼブラフィッシュを透明に保つことができ、それにより蛍光染色及び顕微鏡観察が可能になる［４４、７８、７９］。少数のゼブラフィッシュアポトーシス誘導因子が詳細に記載されており、そのうちｚ−ＢＩＭが最も強力である［８０］。したがって、本発明者らは、ｚ−ＢＩＭを本発明者らの系にクローニングすることを決めた。ヒトＢＩＭに対する相同性が例え弱くとも、本発明者らは、ヒト上皮細胞におけるＹｏｐＥ１−１３８−ｚ−ＢＩＭ（配列番号２１）のアポトーシス誘導の力価をアッセイした。ＹｏｐＥ１−１３８−ｚ−ＢＩＭを移行させる株に１時間感染させたＨｅＬａ細胞は、細胞死の明らかな徴候を示した。次いで、本発明者らは、後脳への細菌のマイクロインジェクションによる局在感染モデルを使用して、受精後２日（ｄｐｆ）のゼブラフィッシュ胚でのインビボ実験を行った［４４］。５．５時間の感染後、フィッシュを固定し、透過処理し、ＣＡＳＰ３  ｐ１７の存在について染色した。ＹｏｐＥ１−１３８−Ｍｙｃを発現する株に感染させると、後脳領域では細菌が目に見えたが（染色「ｂ」、図８Ａ  Ｉ）、細菌の周囲ではアポトーシスの誘導が検出されなかった（染色「ｃ」、図８Ａ  Ｉ）。対照的に、ＹｏｐＥ１−１３８−ｚ−ＢＩＭを送達する株に感染させると、細菌の周囲の領域において、切断されたＣＡＳＰ３の存在の強力な増加が観察された（図８Ａ  ＩＩ）。ｚ軸方向の最大値投影に関する自動画像分析により、ＹｏｐＥ１−１３８−ｚ−ＢＩＭを移行させる細菌が、近くの細胞のアポトーシスをコントロール細菌によるものよりもはるかに多く誘導することが確認される（図８Ｂ）。これは、ｚ−ＢＩＭが、細菌による移行時にゼブラフィッシュにおいて機能性であることを示す。これらの結果は、生きている動物における真核生物タンパク質送達のためのＴ３ＳＳの使用をさらに認証するものである。
【０１６５】
リン酸化プロテオミクスは、タンパク質リン酸化に対する移行タンパク質の広範囲の影響を明示する
リン酸化は、生物学的プロセスを活性化するか又は不活化することができる広範な翻訳後修飾であり、したがって、シグナル伝達事象を研究するための好適な標的である［８１、８２］。それにもかかわらず、現在利用できる、アポトーシスに関するリン酸化の系レベルの分析はない。ＨｅＬａ細胞に送達されたヒトｔＢｉｄの影響を分析するために、本発明者らは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるラベルフリーリン酸化プロテオミクス手法を使用した。３つの独立した実験において、細胞を未処理のまま放置するか、又はΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｍｙｃ若しくはΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢｉｄに３０分間感染させた。細胞を溶解し、その後、酵素的消化、リン酸化ペプチド濃縮、並びに個々のリン酸化ペプチドの定量及び同定を行った。本発明者らは、ΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−Ｍｙｃに感染させた細胞とΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄ＋ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢｉｄに感染させた細胞を比較し、それにより、３６３のｔＢｉｄ依存性リン酸化事象を同定することができた。本発明者らがｔＢｉｄリン酸化プロテオームと定義した、２４３の異なるタンパク質に対応する、ｔＢｉｄ送達時に、２８６のリン酸化ペプチドは、リン酸化の増加を示したが、７７は、然程リン酸化されなかった。ＳＴＲＩＮＧデータベースを使用して、ｔＢｉｄリン酸化プロテオームのタンパク質間相互作用ネットワークを生成した［８３］（図９Ａ）。さらに、ミトコンドリアでのアポトーシスに関係することが公知の２７のタンパク質をネットワークに追加して、中心クラスターを構築した。興味深いことに、ｔＢｉｄリン酸化プロテオームからのほんの少数のタンパク質しかこの中心クラスターにつながらず、これは、多くのタンパク質が、これまでアポトーシスタンパク質に直接関連づけられなかったリン酸化の変化を受けることを示す。ｔＢｉｄリン酸化プロテオームによりカバーされる生物学的機能を特徴づけるために、本発明者らは、Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ、ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／）［８４、８５］の機能アノテーションツールを使用して遺伝子オントロジー分析を行った。同定された生物学的機能は、多様な細胞プロセスがｔＢｉｄによる影響を受けることを示す。クロマチン再構成及び転写制御に関与する多くのタンパク質は、リン酸化の変化を受ける（すなわち、ＣＢＸ３、ＣＢＸ５、ＴＲＩＭ２８、ＨＤＡＣ１）。例えば、ＨＤＡＣ１は、転写制御に関与するヒストンデアセチラーゼである。ＨＤＡＣ１が、アポトーシスにも関与するタンパク質であるＮＦ−ｋＢの転写活性を調節することができることは、証明されている。本発明者らは、アポトーシスの調節に重要な役割を果たすことが以前に証明されている、ＲＮＡプロセシングに関与するタンパク質のクラスターをさらに同定した［８６］。例えば、ＨＮＲＰＫは、ＤＮＡ損傷に対するｐ５３／ＴＰ５３応答を媒介し、アポトーシスの誘導に不可欠なものである［８７］。さらに、タンパク質翻訳に関与するタンパク質のリン酸化も影響を受ける。いくつかの真核生物開始因子（すなわち、ＥＩＦ４Ｅ２、ＥＩＦ４Ｂ、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ｇ２）がリン酸化の変化を受け、これは、アポトーシス細胞においてタンパク質合成全体が減少するという観察と一致している。興味深いことに、細胞骨格リモデリングに関与する多くのタンパク質（例えば、ＰＸＮ、ＭＡＰ１Ｂ９）のリン酸化がｔＢｉｄ送達時に変更される。これは、細胞の形態がｔＢｉｄ送達時に劇的に変化するという観察と一致している（図９Ｂ）。細胞収縮、及び接触の喪失は、ＺＯ２及びパキシリンのような接着関連タンパク質のリン酸化が観察されるという事実に反映される。同様に、核の収縮には、ラミンＡ／Ｃ及びラミンＢ１のような層状タンパク質のリン酸化が伴う。総じて、ｔＢＩＤ送達は、ミトコンドリア完全性の破壊によっても示される迅速なアポトーシス応答を誘導する（図９Ｂ）。本発明者らは、ｔＢｉｄ誘導アポトーシスが、多様な細胞プロセスにおける何百ものリン酸化事象に影響を与えることを明らかにした。同定された多くのタンパク質がアポトーシスに関係しているが、アポトーシス誘導時にリン酸化されることが分かっているのはほんの少数であった。したがって、リン酸化プロテオミクス手法は、アポトーシスに関するさらなる研究のための有用な方策となる。
【０１６６】
反復した同一又は可変タンパク質ドメインからなる真核生物異種融合タンパク質の上皮細胞への移行
反復した同一又は可変タンパク質ドメインからなる異種融合タンパク質がＩＩＩ型分泌により移行することができることを証明するために、本発明者らは、Ｙ．エンテロコリティカによる送達のためのマウスアポトーシス誘導因子をＹｏｐＥ１−１３８と融合させた。コントロールとして、本発明者らは、Ｙ．エンテロコリティカによる送達のために、マウスｔＢＩＤ（Ｙ．エンテロコリティカに対してコドン最適化されたもの；配列番号１９４）又はマウスｔＢＩＤ若しくはマウスＢＡＸ（どちらの場合もＹ．エンテロコリティカに対してコドン最適化されたもの；配列番号２００及び２０１）のＢＨ３ドメインを、ＹｏｐＥ１−１３８と融合させた。異種融合タンパク質は、結果としてＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ−ＢＨ３）２（配列番号２０２）になるようにそれ自体と融合しているｔＢＩＤのマウスＢＨ３ドメインの１つの事例に存する。第２の事例では、異種融合タンパク質は、結果としてＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ−ＢＨ３）−（ＢＡＸ−ＢＨ３）（配列番号２０３）になる、ＢＡＸのマウスＢＨ３ドメインと融合しているｔＢＩＤのマウスＢＨ３ドメインからなる。マウスｔＢＩＤ及びマウスＢＡＸの事例では、コドンをＹ．エンテロコリティカに対して最適化した。反復した同一のドメイン、又は異なるタンパク質ドメインの組合せの模式図を図２５に示す。
【０１６７】
ＹｏｐＥ１−１３８−Ｍｙｃを送達するＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ａｓｄによる４時間の感染は、アポトーシスを誘導することができなかったが、ｔＢＩＤのマウスＢＨ３ドメイン（Ｙ．エンテロコリティカに対してコドン最適化されたもの、配列番号１９４）の移行は、Ｂ１６Ｆ１０及び４Ｔ１細胞において細胞死を誘発し（図２６及び２７）、感染多重度（ＭＯＩ）の増加に対して明確な用量反応効果があった。驚くべきことに、送達されたＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ−ＢＨ３）−（ＢＡＸ−ＢＨ３）又はＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ−ＢＨ３）２は、より低い感染多重度ではＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ−ＢＨ３）より活性が高いことが判明した（図２６及び２７）。これは、反復した同一のドメインの送達により又は異なるタンパク質ドメインの組合せの送達によりアポトーシスのような所望の細胞経路に対する効果を増大させることができることを示す。
【０１６８】
増強アポトーシス促進性細菌の生成
上述の実験において、アポトーシス促進性タンパク質（例えば、ｔ−ＢＩＤ（配列番号２５）又はＢＩＭ（配列番号２１））のＴ３ＳＳに基づく送達は、がん性細胞を含むマウス細胞及びヒト細胞両方において、細胞死を効率的に誘導したこと、並びに細菌のコドン使用頻度に対して最適化したマウスｔＢＩＤ（配列番号１３８）を使用したときこの効果を増大させることができたことが分かる。この細胞殺滅増加は、使用される最適なコドンに起因するタンパク質産生量の増加及びＴ３ＳＳによる後続の送達量の増加を反映する可能性が非常に高い。
【０１６９】
送達又はアポトーシス促進性タンパク質を最適化するために、様々なアポトーシス促進性タンパク質で形質転換された株が表ＩＶの通りに生成されている。
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【０１７０】
シグナル伝達に必要な必須ドメイン（配列番号１３８又は２００）に送達されるタンパク質の短縮は、細胞殺滅効率を増加させることができる（図２８）。理論に縛られることは望まないが、有効性のこの増加は、送達されるタンパク質のより小さいサイズに起因するタンパク質産生量の増加及びＴ３ＳＳによる後続の送達量の増加に関係する可能性が高い。ＹｏｐＥ部分とｔＢＩＤのＢＨ３ドメインの間へのリンカー（配列番号２１８）の導入は、さらなるアミノ酸４個分ＢＨ３ドメイン（配列番号２１７）を伸長するばかりでなく、有効性を低下させた（図２８）。
【０１７１】
加えて、そのような必須ドメイン（例えば、ｔ−ＢＩＤのＢＨ３ドメイン（配列番号２０２））のリピート又はそれらの必須ドメイン（例えば、ｔ−ＢＩＤのＢＨ３ドメインとＢＡＸのＢＨ３ドメイン（配列番号２０３及び２１９））の組合せを有する合成輸送基質を生成した。驚くべきことに、同じ又は異なるＢＨ３ドメインのタンデムリピートは、がん性細胞株（４Ｔ１及びＢ１６Ｆ１０細胞を含む）に対するアポトーシス誘導増強をもたらすことが判明した（図２８）。真核細胞１個当たりのそのような細胞の５０％を殺滅するために必要とされる細菌数（感染多重度）を指すＩＣ５０（半最大阻害濃度）は、単一ｔＢＩＤ  ＢＨ３ドメインと比較してｔＢＩＤ  ＢＨ３のタンデムリピートの送達時に減少することが判明した（図２８）。タンパク質サイズは、ｔＢＩＤの第２のＢＨ３ドメインとしての融合により増加されるので、この研究結果は、驚くべきものであった。このために、ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢＩＤ  ＢＨ３（配列番号１３８又は２００）と比較してＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２０２）の発現と送達レベル減少が予想され、最大で同等レベルに達する可能性があった。細胞殺滅活性の増加を達成するために、融合ｔＢＩＤ  ＢＨ３ドメインは、真核細胞へのＴ３ＳＳによる送達時に一緒に同時に作用しなければならない。ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２構築物中の１つのｔＢＩＤ  ＢＨ３ドメインしか機能しない場合、ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢＩＤ  ＢＨ３を用いた場合とせいぜい同じ効率しか期待できないだろう。
【０１７２】
インビボ研究のためにＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２０２）の遺伝的安定性を増加させるために、本発明者らは、ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２０２）をエルシニア属毒性プラスミドｐＹＶ上のＹｏｐＥの天然部位に、（変異誘発プラスミドｐＳＩ＿４０８及びｐＳＩ＿４１９を使用して）天然ＹｏｐＥプロモーターのもとで、相同組み替えによりクローニングした。そのような変異誘発物質は、組込みが起こるそれぞれの遺伝子の部位に応じて２００−２５０ｂｐの配列が両側に隣接している、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含有する。これらのプラスミドを大腸菌Ｓｍ１０λｐｉｒ内に形質転換し、そこからプラスミドを対応するＹ．エンテロコリティカ株内に移動させた。組み込み型ベクターを保有する突然変異株を選択圧なしで数世代増殖させた。次いで、スクロースを使用して、ベクターを失ってしまったクローンについて選択した。最後に、突然変異株をコロニーＰＣＲにより同定した。Ｔ３ＳＳによる輸送のための内在性タンパク質（「エルシニア属外部タンパク質」、Ｙｏｐ、と呼ばれる）は、エルシニア属毒性プラスミド（ｐＹＶ）という名称の、Ｙ．エンテロコリティカのこの７０ｋｂプラスミド上にコードされており、このプラスミドは、Ｔ３ＳＳ装置をさらにコードする。
【０１７３】
エルシニア毒性プラスミドｐＹＶ上のＹｏｐＥの天然部位に、天然ＹｏｐＥプロモーターのもとで、ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）（配列番号１３８若しくは２００）又はＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２０２）をコードする、エルシニア属株を、がん性細胞（４Ｔ１及びＢ１６Ｆ１０細胞を含む）においてアポトーシスを誘導する能力について評価した（図２９）。真核細胞１個当たりのそのような細胞の５０％を殺滅するために必要とされる細菌数（感染多重度）を指すＩＣ５０（半最大阻害濃度）は、単一ｔＢＩＤ  ＢＨ３ドメインと比較してｔＢＩＤ  ＢＨ３のタンデムリピートの送達時に、両方のタンパク質が、エルシニア属毒性プラスミドｐＹＶ上のＹｏｐＥの天然部位に、天然ＹｏｐＥプロモーターのもとでコードされている場合、減少することが判明した（図２９）。これは、これらのタンパク質の発現プラスミド媒介送達からの研究結果（図２８）と一致する。重ねて、タンパク質サイズは、ｔＢＩＤの第２のＢＨ３ドメインの融合により増加されるので、この研究結果は、驚くべきものであった。このために、ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢＩＤ  ＢＨ３（配列番号１３８又は２００）と比較してＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２０２）の発現と送達レベル減少が予想され、最大で同等レベルに達する可能性があった。細胞殺滅活性の増加を達成するために、融合ｔＢＩＤ  ＢＨ３ドメインは、真核細胞へのＴ３ＳＳによる送達時に一緒に同時に作用しなければならない。ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２構築物中の１つのｔＢＩＤ  ＢＨ３ドメインしか機能しない場合、ＹｏｐＥ１−１３８−ｔＢＩＤ  ＢＨ３を用いた場合とせいぜい同じ効率しか期待できないだろう。さらに、エルシニア毒性プラスミドｐＹＶ上のＹｏｐＥの天然部位に天然ＹｏｐＥプロモーターのもとでＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２０２）をコードするエルシニア株を、がん性細胞においてアポトーシスを誘導するそれらの能力について、ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２の発現ブラスミド（ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡに基づく）由来送達と比較した。ｐＹＶ（１−６コピーと報告される）と比較して高い、ｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡのコピー数（２０−２５コピー）と一致して、ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２０２）のｐＢａｄ−ＭｙｃＨｉｓＡに基づく送達は、４Ｔ１及びＢ１６Ｆ１０細胞のＩＣ５０値をわずかに低下させる結果となった（図２９）。
【０１７４】
細菌投与後１４日目までのインビトロでの腫瘍特異的増殖の検証
遺伝子改変Ｙ．エンテロコリティカによる腫瘍定着実験を同系マウス同種移植モデル（４Ｔ１乳がんモデル）において繰り返し、細菌の定着を２週間にわたって追跡した。このとき、マウスを１×１０６コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＹ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔに感染させた。感染後まだ間もない頃にＢ１６Ｆ１０モデルと同様の結果を得たが、本発明者らは、腫瘍定着が、感染後８日目に、そして１４日目まで一貫して認められることをさらに明らかにすることができた（図３０）。さらに、この定着は非常に特異的であり、評価した他の全ての臓器においてほんの少数の細菌しか検出されなかった（図３１）。これらの研究結果は、Ｙ．エンテロコリティカΔｙｏｐＨ、Ｏ、Ｐ、Ｅ、Ｍ、Ｔが、腫瘍の持続的定着を確立することによって、免疫系によるクリアランスを防止することができることを示す。
【０１７５】
腫瘍進行を遅らせる点でのＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴの有効性
インビボでの腫瘍細胞に送達されるＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２０２）の影響を評価するために、本発明者らは、４Ｔ１乳がん細胞を皮下同種移植した野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおいて研究を行った。本発明者は、エルシニア属毒性プラスミドｐＹＶ上のＹｏｐＥの天然部位に天然ＹｏｐＥプロモーターのもとでＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２（配列番号２０２）をコードする、Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ株を評価することを目標とした。腫瘍が１５０−２５０ｍｍ３のサイズに達したら、ＰＢＳ又は１×１０７のＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）をマウスに静脈内注射した。細菌の静脈内注射の日を０日目と定義した。その後数日（細菌の静脈内注射後０日目から９日目）にわたって腫瘍体積をノギスで測定した。腫瘍サイズの一切の初期均質性を補償するために、腫瘍体積を０日目の腫瘍体積に対して正規化した。Ｙ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴ  ｐＹＶ−ＹｏｐＥ１−１３８−（ｔＢＩＤ  ＢＨ３）２での治療は、腫瘍体積進行に対する影響を示し、細菌投与後８、９及び１０日目に統計的に有意な腫瘍低減があった（図３２）。重要なこととして、単独でのＹ．エンテロコリティカΔＨＯＰＥＭＴは、４Ｔ１マウスがんモデルにおいて腫瘍進行に影響を与えないことが判明した（図３３）。これらの実験結果は、そのような細菌及びそれらのＴ３ＳＳを腫瘍進行の妨害に用いることができることに光を当てるものである。
【０１７６】
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【図１Ａ−Ｂ】
2019500027.tif 000011
【図２Ａ−Ｃ】
2019500027.tif 000012
【図３】
2019500027.tif 000013
【図４Ａ−Ｃ】
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【図５Ａ−Ｂ】
2019500027.tif 000015
【図６Ａ−Ｃ】
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【図７Ａ−Ｃ】
2019500027.tif 000017
【図８Ａ−Ｂ】
2019500027.tif 000018
【図９Ａ−Ｂ】
2019500027.tif 000019
【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１１】
2019500027.tif 000021
【図１２】
2019500027.tif 000022
【図１３Ａ−Ｂ】
2019500027.tif 000023
【図１４Ａ−Ｂ】
2019500027.tif 000024
【図１５Ａ】
2019500027.tif 000025
【図１５Ｂ】
2019500027.tif 000026
【図１５Ｃ】
2019500027.tif 000027
【図１５Ｄ】
2019500027.tif 000028
【図１５Ｅ】
2019500027.tif 000029
【図１５Ｆ】
2019500027.tif 000030
【図１５Ｇ】
2019500027.tif 000031
【図１５Ｈ】
2019500027.tif 000032
【図１５Ｉ】
2019500027.tif 000033
【図１５Ｊ】
2019500027.tif 000034
【図１５Ｋ】
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【図１５Ｌ】
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【図１５Ｍ】
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【図１５Ｎ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ−Ｂ】
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【図２３Ａ−Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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