(57)【要約】  本発明は、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含むレトロウイルス粒子であって、前記カプシド形成された非ウイルスＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識され、かつ、カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの前記目的の配列の少なくとも１つが、少なくとも１つのエピトープ及び／又はエピトープを特異的に認識する少なくとも１つの分子構造をコードする部分を含む、レトロウイルス粒子に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含むレトロウイルス粒子であって、前記カプシド形成された非ウイルスＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識され、かつ、カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの前記目的の配列の少なくとも１つが、少なくとも１つのエピトープ及び／又はエピトープを特異的に認識する少なくとも１つの分子構造をコードする部分を含む、レトロウイルス粒子。
【請求項２】
ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含むレトロウイルス粒子であって、前記カプシド形成された非ウイルスＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、ヌクレオカプシドタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識される、請求項１に記載のレトロウイルス粒子。
【請求項３】
前記少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡの目的の配列が同一である、請求項２に記載のレトロウイルス粒子。
【請求項４】
前記少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡが、そのＲＮＡ配列で異なっている、請求項２に記載のレトロウイルス粒子。
【請求項５】
他のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡの目的の配列が、免疫調節タンパク質をコードする、請求項４に記載の粒子。
【請求項６】
第３のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡをさらに含む、請求項３から５のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。
【請求項７】
前記少なくとも１つのエピトープ及び／又はエピトープを特異的に認識する少なくとも１つの分子構造が、免疫原性である、請求項１から６のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。
【請求項８】
前記結合ドメインが、ヌクレオカプシドタンパク質に導入され、かつ、第２の結合ドメインが、ヌクレオカプシドに及び／又はインテグラーゼに導入され得る、請求項２から７のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。
【請求項９】
前記結合ドメインが、インテグラーゼに導入され、かつ、第２の結合ドメインが、ヌクレオカプシドに及び／又はインテグラーゼに導入され得る、請求項１から７のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。
【請求項１０】
レンチウイルス粒子である、請求項２から９のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。
【請求項１１】
−前記結合ドメインが、ＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質配列であり、
−前記非ウイルスＲＮＡのカプシド形成配列が、ＭＳ２のステム−ループ配列であり、
−前記ヌクレオカプシドタンパク質が、Ｇａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）であり、前記ＮＣが、ＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質配列を挿入するために、第２のジンクフィンガーで突然変異している、
請求項１０に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１２】
−前記結合ドメインが、ＰＰ７ファージの「コート」タンパク質配列であり、
−前記非ウイルスＲＮＡのカプシド形成配列が、ＰＰ７のステム−ループ配列であり、
−前記ヌクレオカプシドタンパク質が、Ｇａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）であり、前記ＮＣが、ＰＰ７バクテリオファージの「コート」タンパク質配列を挿入するために、第２のジンクフィンガーで突然変異している、
請求項１０に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の粒子を含有する組成物。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の粒子を生産するためのキットであって、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、前記配列の上流又は下流に、カプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド
（ｉｉ）カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む、キット。
【請求項１５】
第２のカプシド形成プラスミドをさらに含む、請求項１４に記載の生産キットであって、前記第２のカプシド形成プラスミドは：
−第１のカプシド形成プラスミドが、キメラＧａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードする場合には、野生型Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードし、及び／又は
−第１のカプシド形成プラスミドが、キメラインテグラーゼをコードする場合には、野生型インテグラーゼをコードする、
生産キット。
【請求項１６】
請求項１４に記載のキットの製造方法であって、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、前記配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミドを調製し、
（ｉｉ）カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミドを調製し、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む、方法。
【請求項１７】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の粒子の製造方法であって、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
（ｉｉ）カプシド形成配列が認識されることを可能にする結合ドメインを含む、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
により、細胞をコトランスフェクトする（co-transfecting）ステップ、並びに
粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を回収するステップ、
を含む、方法。
【請求項１８】
請求項４から１２のいずれか一項に記載の粒子の製造方法であって、以下：
（ｉ）少なくとも２つの異なる非ウイルスＲＮＡ配列を含む発現プラスミドであって、各ＲＮＡ配列が目的の配列を含み、前記目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されているか、あるいは、第１及び第２の発現プラスミドがそれぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
により、細胞をコトランスフェクトするステップ、並びに
粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清を回収するステップ、
を含む、方法。
【請求項１９】
前記上清が、清澄化され、次いで任意により濃縮及び／又は精製される、請求項１７又は１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
前記コトランスフェクトするステップが、さらに、第２のカプシド形成プラスミドによって行われ、前記第２のカプシド形成プラスミドは：
−第１のカプシド形成プラスミドが、キメラＧａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードする場合には、野生型Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードし、及び／又は
−第１のカプシド形成プラスミドが、キメラインテグラーゼをコードする場合には、野生型インテグラーゼをコードする、
請求項１７から１９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２１】
請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法によって得られる組成物。
【請求項２２】
免疫系の細胞を形質導入するための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の粒子、あるいは請求項１３又は２１に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的細胞への非ウイルスＲＮＡの転移のためのレトロウイルスシステム、及びより具体的には複数のＲＮＡを送達することができるレトロウイルス粒子に関する。本発明はまた、これらレトロウイルス粒子を含有する組成物、レトロウイルスを生産するためのキット、関連する製造方法、並びに粒子及び組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的細胞への複数のＲＮＡの導入は、遺伝子治療における研究開発の主要な課題である。
【０００３】
ウイルスに由来するベクターの使用は、遺伝子導入のための重要な方法となっている。現在、ウイルスベクターは、以下の２つの主要なカテゴリーに分類することができる：
−受容者のゲノム中に組み込む、組み込みベクター、並びに
−通常染色体外遺伝エレメントを形成する、非組み込みベクター。
【０００４】
組み込みベクター、例えばガンマ−レトロウイルスベクター（ＲＶ）及びレンチウイルスベクター（ＬＶ）は安定に組み込まれる。非組み込みベクター、例えばアデノウイルスベクター（ＡＤＶ）及びアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）は、急速に分裂する細胞から迅速に排除される。特定のベクターの選択に影響を与える特定の要因は、そのカプシド形成能力、その標的又は宿主細胞の範囲、その遺伝子発現プロファイル、その形質導入効率、及び反復した形質導入が必要である場合に特に問題となるその免疫応答を誘導するための能力を含む。
【０００５】
遺伝子治療又は多くのインビトロ、エクスビボ及びインビボ用途におけるような特定の用途は、非組み込みベクターの使用を必要とする。例として、以下のものが挙げられる：
・多能性細胞に特殊化した細胞の再プログラミングの誘導、並びに特殊化細胞への幹細胞又は多能性細胞の分化の誘導，
・標的細胞における同時の、抗原又はタンパク質（毒性又は非毒性）の発現、
・ゲノム工学システムの発現、例えば、ＣＲＥ若しくはＴＡＬＥＮタンパク質又はＣＲＩＳＰＲシステム、あるいはタンパク質又はＲＮＡ発現を必要とする任意の他のシステムの発現。
【０００６】
標的細胞内にＲＮＡを導入する１つの方法は、レトロウイルス科（Retroviridae）（レトロウイルスファミリー又はＲＮＡウイルスとも称される）に属するウイルスに基づくウイルスベクターを用いる。実際に、その複製サイクル中に、レトロウイルス科のウイルスは、ＲＮＡによって構成されたそのゲノムを二本鎖ＤＮＡへと変換する能力を有し、この二本鎖ＤＮＡは、標的細胞のゲノムに組み込まれることになる。このレトロウイルスのファミリーの具体例は、ガンマレトロウイルス及びレンチウイルスである。
【０００７】
レトロウイルスの複製サイクルは、膜受容体への結合を介した標的（又は宿主）細胞の第１認識フェーズを含む。この認識フェーズは、膜融合後に、宿主細胞へのレトロウイルスの侵入をもたらす。次に、レトロウイルスＲＮＡは、レトロウイルスによってコードされた逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡへとコピーされ、次に宿主細胞のゲノムに組み込まれる。次に、このウイルスゲノムは、細胞の他の全ての遺伝子と同様に、宿主細胞によって転写される。このゲノムは、他のウイルスの産生を可能にするタンパク質及び配列の全てをコードしている。
【０００８】
より具体的には、３つの遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ、が全てのレトロウイルスに共通している。
【０００９】
Ｇａｇはポリタンパク質をコードする遺伝子であり、切断によってこのポリタンパク質に由来するタンパク質は、複製時にウイルスの構築に関与する構造タンパク質である。これら構造タンパク質は、より具体的には、マトリックスタンパク質（ＭＡ）、カプシドタンパク質（ＣＡ）及びヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）である。
【００１０】
Ｐｏｌは、酵素のインテグラーゼ、逆転写酵素及びプロテアーゼをコードする遺伝子である。
【００１１】
Ｅｎｖは、エンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子である。
【００１２】
したがって、これら３つの遺伝子は、レトロウイルスＲＮＡを二本鎖ＤＮＡへとコピーし、このＤＮＡを宿主細胞のゲノムに組み込み、次に、新たに合成されたレトロウイルスの構造：エンベロープ、カプシド及びヌクレオカプシドタンパク質、を生成することを可能にする。しかしながら、新たに合成されたレトロウイルスが完全であるためには、これら構造のそれぞれにおいてレトロウイルスＲＮＡの２つのコピーをカプシド形成することが必要である。この構造におけるレトロウイルスＲＮＡの２つのコピーのカプシド形成は、レトロウイルスＲＮＡのコピーによって運ばれるＰｓｉ（「パッケージングシグナル（Packaging Signal）」に関する）と呼ばれるカプシド形成配列のヌクレオカプシドタンパク質による認識によって行われる。
【００１３】
レトロウイルスに由来するウイルスベクターが遺伝子治療の目的で使用される場合、ｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖのコード領域の少なくとも１つの部分が、カプシド形成システムと目的の配列の発現システムとの間で解離する。コード配列ｇａｇ及びｐｏｌは、例えば、ウイルスベクターの産生に必要なタンパク質をｔｒａｎｓで提供するカプシド形成プラスミドによって運ばれる。カプシド形成配列及び目的の配列は、レトロウイルスを非複製にするために、独立したシステムによって運ばれる。
【００１４】
しかしながら、特定の場合には、宿主細胞のゲノムへのランダムな目的のＲＮＡ配列の組み込みは、オープンリーディングフレームを阻害し、かつ重要な遺伝子の発現をブロックし得る。また、特定の用途、例えば細胞の再プログラミング、ゲノム編集又は幹細胞分化のために、目的の配列の発現が一過性に行われることが推奨される。
【００１５】
国際公開第２００７／０７２０５６号の出願は、ウイルスベクターシステムについて記載しており、斯かるウイルスベクターシステムは、ｅｎｖ、ｇａｇ、任意によりｇａｇ／ｐｏｌ並びに、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｏｌと関連した対応するＲＮＡ結合ドメインによって認識される異種カプシド形成シグナルを含むＲＮＡ配列を含む。このシステムは、一過性発現を可能にする非組み込み型であるとして、当該出願に記載されている。
【００１６】
しかしながら、そのようなシステムの有効性は依然として限定されている。特に、標的細胞がこれらシステムによって運ばれる目的のＲＮＡを発現するためには、一般に、細胞にこの目的のＲＮＡのいくつかのコピーを導入し、その結果、高い感染多重度（multiplicities of infection）（ＭＯＩ）を使用することが必要である。ＭＯＩは、導入されるベクターシステムの数と、感染されることになる細胞の数との比に対応する。高いＭＯＩは実際に、細胞に目的のＲＮＡのいくつかのコピーを導入することを可能にし、１つの同じ細胞がいくつかの感染を受けることを可能にする。現在、運ばれる目的のＲＮＡの発現レベルを改善することは可能であるが、細胞が受ける複数の感染のために、高いＭＯＩの使用はいくらかの毒性も生じる。
【００１７】
ＲＮＡ転移のためのこのタイプのシステムはまた、免疫療法、特に抗腫瘍免疫療法に興味深い。
【００１８】
抗腫瘍免疫療法は、腫瘍細胞を根絶するための免疫系に基づく治療戦略である。新しいアプローチは、免疫応答を誘導し、標的化を改善するために患者の細胞を遺伝的に改変することからなる。これら新しい遺伝子療法が臨床診療で使用可能であるために、安全かつ有効である遺伝子導入の方法が必要とされている。ＲＮＡトランスフェクション及びレンチウイルスベクターの使用はそれぞれ、Ｔリンパ球の特異的受容体をリンパ球に、又は抗原を樹状細胞に転移させるための適切な技術として現れた。
【００１９】
ヒト腫瘍細胞の特異的抗原の分子同定は、標的抗原に特異的な免疫療法の開発において重要な要素である：
・１つのアプローチは、受動免疫療法として説明され、抗原の特異的Ｔ細胞をエクスビボで増幅し、それを患者に再移植することからなる（ＴＣＲ＆ＣＡＲ  Ｔ細胞）。癌の治療のための養子移入によって再移植する前に、これらＴ細胞に合成抗原のキメラ受容体（ＣＡＲ）又は新しいＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を導入するために遺伝子導入が使用される。ここでは、レンチウイルスベクターが広く用いられ、非常に有望な結果が臨床段階で得られている。
・能動免疫療法として説明される他のアプローチは、ワクチン接種である。樹状細胞（ＤＣ）は天然の抗原提示物質である。樹状細胞は、ナイーブＴ細胞を刺激するそれらの能力のために、多くの抗腫瘍治療戦略の中心にある。実際に、樹状細胞は、環境の「検出器（detectors）」であり、集めた情報を免疫系のＴ細胞及びＢ細胞に伝える。従って、これら細胞は、抗腫瘍治療免疫を発生させるための必須の標的であり、従って専門的抗原提示細胞（ＡＰＣ）として説明される。樹状細胞に基づくワクチン接種の目的は、腫瘍塊を特的に減少させるためにエフェクターＴ細胞のインビボ応答を誘導すること、並びに記憶応答を導入することの両方である。
【００２０】
これら２つの治療アプローチは、効果的かつ再現可能な抗腫瘍免疫応答を得るための２つの独特の特徴を含む。第一に、毒性を誘発することなく免疫応答を得るために、外因性配列の発現、例えば標的細胞における抗原の発現が制御されなければならない。同時にいくつかの抗原を共発現することは、抗腫瘍応答を増大し、かつ腫瘍細胞が逃れることを避けるための好機である。
【００２１】
ＡＰＣは、免疫系において本質的な役割を果たし、免疫療法戦略における決定的要素を構成する。ＡＰＣは、抗原性ペプチドを免疫系の細胞に提示する役割を有する。抗原又は抗原（複数）が免疫原性である場合、それ又はそれらを発現する細胞を排除するために、免疫系が特異的に活性化されることになる。従って、この応答は、ＡＰＣに対してだけでなく、抗原を発現することになる任意の細胞に対しても向けられることになり、これは腫瘍細胞の場合である。外来抗原と接触した任意の抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体（Major Histocompatibility Complex））の分子と外来抗原とを組み合わせるために外来抗原を処理することになり、ＭＨＣはその表面における抗原性ペプチドの提示を可能にすることになる。この集合体は、ＡＰＣが二次リンパ器官において接触することになるリンパ球の活性化を生じることを可能にするであろう。所与の腫瘍は一般に、いくつかの異なる抗原を発現し、腫瘍に対して免疫系の細胞を有効にするために、異なる抗原に対して免疫系の細胞を教育することが重要である。これらの腫瘍抗原はまた、腫瘍の発症の段階に応じて異なるレベルで発現され得る。従って、いくつかの抗原に対する応答を操作することは、改変された免疫細胞による治療の有効性にとって極めて重要であることを証明し得る。
【００２２】
第２のポイントは、このようにして改変された免疫細胞の成熟又は活性化を誘発する免疫調節剤の標的細胞における発現である。免疫細胞内でのこれら複数の共発現は、先天的かつ適応的免疫応答を模倣することを可能にするであろう。したがって、これら方法は、一方では、抗原を特異的に発現する細胞を供給し、他方では、完全かつ有効な免疫応答に必須なそれらの成熟又は分化を誘導することになる。これは、最も効果的な治療が、いくつかの腫瘍抗原に対する免疫応答の特異性と刺激応答とを制御された時間依存的方法で組み合わせることによって、治療結果を改善するための複数の遺伝子の投与から生じるであろうことを意味する。標的細胞内又は体内に抗原と免疫調節物質の両方を同時に送達することは、臨床上の利点を提供するはずである。
【００２３】
Ｔ細胞及び樹状細胞（ＡＰＣ）にそれぞれ基づくこれら２つのアプローチは、本発明によってより具体的に標的化される。
【００２４】
従って、より効率的で毒性が少なく、より具体的には免疫療法に適応したウイルスベクターシステムが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００２５】
本発明者らの研究は、いくつかの目的のＲＮＡを１つの同じ細胞内に単一の感染で送達することができるベクターシステムを作成することを可能にした。
【００２６】
従って、本発明は、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含むレトロウイルス粒子であって、前記カプシド形成された非ウイルスＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識され、かつ、カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの前記目的の配列の少なくとも１つが、少なくとも１つのエピトープ及び／又はエピトープを特異的に認識する少なくとも１つの分子構造をコードする部分を含む、レトロウイルス粒子に関する。
【００２７】
本発明に係るレトロウイルス粒子は、単一の感染により細胞に、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ、好ましくは３つの非ウイルスＲＮＡを導入することを可能にする。細胞へのそのような粒子の導入は、インビボ、インビトロ又はエクスビボの方法によって行われ得る。
【００２８】
「Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質」とは、Ｇａｇポリタンパク質の切断により生じる任意のタンパク質を意味する。より具体的には、それは、ヌクレオカプシドタンパク質、マトリックスタンパク質（例えば、ＭｏＭｕＬＶタイプのマウスウイルスに由来するレトロウイルス粒子における）又はガンマレトロウイルスに特異的なｐ１２タンパク質由来である。
【００２９】
「エンベロープタンパク質」とは、シュードタイピング（pseudotyping）エンベロープタンパク質を含む、任意のエンベロープタンパク質を意味する。例として、両性（Ａｍｐｈｏ）エンベロープタンパク質、同種指向性エンベロープタンパク質、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）のエンベロープタンパク質、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）のエンベロープタンパク質、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）のエンベロープタンパク質、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ）のエンベロープタンパク質、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma virus）（ＲＳＶ）のエンベロープタンパク質、麻疹ウイルス（ＭＶ）のエンベロープタンパク質、テナガザル白血病ウイルス（Gibbon ape leukaemia virus）のエンベロープタンパク質（ＧＡＬＶ）、ネコ内在性ウイルス（feline endogenous virus）（ＲＤ１１４）のタンパク質、又は水胞性口炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のエンベロープタンパク質、が挙げられる。より具体的には、エンベロープタンパク質は、両性エンベロープタンパク質、同種指向性エンベロープタンパク質、モロニーマウス白血病ウイルスウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）のエンベロープタンパク質、ネコ免疫不全ウイルスウイルス（ＦＩＶ）のエンベロープタンパク質、ハーベイマウス肉腫ウイルスウイルス（ＨａＭｕＳＶ）のエンベロープタンパク質、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ）のエンベロープタンパク質、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のエンベロープタンパク質、麻疹ウイルス（ＭＶ）のエンベロープタンパク質、テナガザル白血病ウイルスのエンベロープタンパク質（ＧＡＬＶ）又は水胞性口炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のエンベロープタンパク質である。したがって、エンベロープタンパク質は、特定の細胞型又は特定の用途（エンベロープタンパク質としての表面受容体の使用）を標的とするために改変されてもよい。
【００３０】
受容体及び／又は特定の細胞型を標的化するために、抗体、糖脂質及び／又は特定のリガンドによりエンベロープタンパク質を修飾することもできる。
【００３１】
好ましくは、エンベロープタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇタンパク質である。
【００３２】
「インテグラーゼ」とは、ｐｏｌ遺伝子によってコードされた酵素タンパク質を意味し、これは、当該レトロウイルスの複製時にレトロウイルスによって感染した細胞のＤＮＡ内へのレトロウイルスＤＮＡの組み込みを可能にする。
【００３３】
「カプシド形成配列」とは、結合ドメインによって特異的に認識されるＲＮＡモチーフ（配列及び三次元構造）を意味する。好ましくは、カプシド形成配列はステム−ループモチーフである。さらにより好ましくは、レトロウイルス粒子のカプシド形成配列は、ＭＳ２バクテリオファージ又はＰＰ７ファージのＲＮＡのステム−ループモチーフ、例えば、それぞれ、配列ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag（配列番号１）又はctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag（配列番号２）から生じるステム−ループモチーフである。ステム−ループモチーフ、より具体的にはＭＳ２バクテリオファージのＲＮＡのステム−ループモチーフ、又はＰＰ７ファージのＲＮＡのステム−ループモチーフは、単独で、又は数回、好ましくは２〜２５回、より好ましくは２〜１８回、例えば６〜１８回反復して使用され得る。
【００３４】
「結合ドメイン」とは、目的のＲＮＡ配列に連結されたカプシド形成配列に特異的に結合するタンパク質の全て又は一部を意味する。より具体的には、それは、カプシド形成配列に特異的に結合する三次元構造によって定義された、突然変異又は非突然変異タンパク質である。好ましくは、結合ドメインは、異種ドメインである。より好ましくは、結合ドメインは、ＭＳ２バクテリオファージ、ＰＰ７ファージ又はＱβファージのコートタンパク質、プロファージＨＫ０２２  Ｎｕｎタンパク質、Ｕ１Ａタンパク質、あるいはｈＰｕｍタンパク質である。
【００３５】
より好ましくは、結合ドメインは、ＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質又はＰＰ７ファージのコートタンパク質である。
【００３６】
さらにより好ましくは、結合ドメインがＰＰ７ファージのコートタンパク質である場合、アミノ酸６７から７５の欠失のために、その配列は自己構築に不十分である（ＰＣＰΔＦＧ）（Chaoら、2008）。好ましくは、ＰＰ７ファージのコートタンパク質の配列は、ヒト細胞のためにコドン最適化されており、すなわち、ＤＮＡの塩基が、好ましくはヒト種に存在するアミノ酸をコードするために選択されている。
【００３７】
「各配列」とは、これらカプシド形成配列が、同一又は異なる結合ドメインによって認識されるかどうかに応じて、カプシド形成配列が同一又は異なってもよいことを意味する。実際に、本発明に係るレトロウイルス粒子は、１つ又は複数の結合ドメインを含み得る。いくつかの結合ドメインが導入される場合、それらは、Ｇａｇポリタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入され得る。
【００３８】
結合ドメインは、カプシド形成配列の認識を可能にするだけでなく、粒子中にカプシド形成配列を有するＲＮＡの（又は本件の場合、カプシド形成配列に結合した非ウイルスＲＮＡの）カプシド形成も可能にする。
【００３９】
「カプシド形成」とは、ウイルス粒子のウイルスカプシドにおけるＲＮＡのパッケージングを意味する。本発明においては、非ウイルスＲＮＡのカプシド形成は、特にＰｓｉ以外の、非ウイルスカプシド形成シグナルの認識によって行われることに留意すべきである。
【００４０】
「目的の配列」とは、ユーザーの目的の機能をコードするか有する配列を意味する。より具体的には、２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡのそれぞれによって運ばれる目的の配列は、同一又は異なっていてもよい。
【００４１】
本発明に係る粒子を用いることで、同一又は異なる非ウイルスＲＮＡを標的細胞に転移させることができる。
【００４２】
カプシド形成されたＲＮＡが非ウイルスである場合、これらＲＮＡは、ｐｏｌ遺伝子によってコードされたタンパク質の認識部位を有さない。
【００４３】
実際に、これら非ウイルスＲＮＡは、レトロウイルスの複製サイクルの初期段階に関与しない、すなわち、以下：
−逆転写酵素による二本鎖ＤＮＡへの一本鎖ウイルスＲＮＡのコピー；
−インテグラーゼによるＬＴＲ末端の認識による二本鎖ウイルスＤＮＡの成熟、及び、細胞質プレインテグレーション複合体（pre-integration complex）の核プレインテグレーション複合体への成熟、
に関与しない。
【００４４】
従って、ｐｏｌ遺伝子によってコードされたこれらウイルスタンパク質（逆転写酵素、インテグラーゼ）は、粒子において任意であり、従ってｐｏｌ遺伝子は、存在するか、あるいは部分的又は完全に欠失しているかのいずれかであり得る。好ましくは、ｐｏｌ遺伝子は、存在するか、あるいは部分的に欠失しているかのいずれかである。
【００４５】
本発明に係るレトロウイルス粒子は、ウイルス及び非ウイルスの両方の遺伝物質を含むことに留意すべきである：
−ｇａｇ遺伝子、これはウイルス性又はキメラであってもよい。より具体的には、結合ドメイン（複数）が後者に導入される場合、ｇａｇ遺伝子はキメラである。
−任意により、ｐｏｌ遺伝子、これはウイルス性又はキメラであってもよい。ｐｏｌ遺伝子がいくつかの酵素をコードする場合、これら酵素に関連する配列は、完全に又は部分的に欠失しているか、存在しかつ非機能的であるか、あるいは存在しかつ機能的であり得る。より具体的には、結合ドメイン（複数）がインテグラーゼに導入される場合、ｐｏｌ遺伝子はキメラである。
−少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ、各非ウイルスＲＮＡは、目的の配列及びカプシド形成配列を有する。より具体的には、「非ウイルスＲＮＡ」とは、レトロウイルス配列を欠いたＲＮＡを意味する（「非レトロウイルスＲＮＡ」とも称される）。
【００４６】
より具体的には、本発明に係るレトロウイルス粒子は、標的細胞に、以下を誘導することができるＲＮＡを導入することを可能にする：
・標的細胞からの目的の１つ又は複数の内因性又は外因性コーディング配列の転移、
・例えばｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡによる、遺伝子発現に対する影響を誘導することができるＲＮＡのような、１つ又は複数の非コーディングＲＮＡの転移。
・細胞ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡタイプ又はその他（ｍｉＲＮＡ等）、ＲＮＡウイルスのサブゲノムレプリコン（ＨＣＶ等）あるいはＲＮＡウイルスの完全なゲノムの転移
・標的細胞の内因性及び外因性コーディング又は非コーディング配列の同時発現。
【００４７】
より具体的には、本発明に係るウイルス粒子は、標的細胞に、以下を誘導することができる核酸を導入することを可能にする：
−免疫応答に関与する細胞（樹状細胞又は他の抗原提示細胞）における、１つ又は複数のエピトープ（複数）の、特に１つ又は複数の抗原（複数）の発現；
−それらの成熟又はそれらの活性化を誘発するように形質導入された細胞の活性化、あるいは、それらが相互作用しかつ対抗することができるようになる、例えば多様で複雑なメカニズムによって誘導される免疫抑制のメカニズムによる細胞の活性化。そのような活性化は免疫調節剤によって行うことができる。このタイプのアプローチは、腫瘍細胞に対する免疫応答の誘発に好ましい微小環境を作り出すことができる。
【００４８】
この方法は、免疫応答を誘導するための他のタイプのシステムに適用できることに留意すべきである。
【００４９】
「エピトープ」とは、抗体又はリンパ球受容体によって特異的に認識され得る構造を意味する。
【００５０】
有利には、目的の配列は、特に抗原についての、いくつかのエピトープをコードする。
【００５１】
「抗原」とは、生物にとって外来性であり、かつそれを排除することを目的として免疫応答を誘発することができる物質を意味する。それらは天然又は合成であってもよい。抗原は一般に、天然又は合成分子、一般にタンパク質、多糖及びそれらの脂質誘導体である。直接又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）を介しての免疫適格細胞による抗原の認識は、特異的免疫を活性化する。１つの同じ抗原は、いくつかのエピトープ（これは同一でも異なってもよい）を含み、したがって様々な免疫応答を誘導し得る。リンパ球による抗原の認識は、エピトープの性質に依存する。Ｂリンパ球は、それらの膜の免疫グロブリンを介して立体構造エピトープに直接結合する。Ｔリンパ球は、抗原提示細胞によって提示されたアミノ酸配列に対応する配列エピトープを認識する。
【００５２】
好ましくは、エピトープ又は抗原は、病原体由来、特にウイルス、細菌、寄生虫、腫瘍細胞等由来である。
【００５３】
エピトープ又は抗原は、腫瘍細胞上で多量に発現されると同定されたバイオマーカーから、あるいはウイルス又は毒素から推定され得る。そのサイズは可変である。一般的に、最良のエピトープ又は抗原を選択するためにスクリーニングが行われる。デオキシリボ核酸及びリボ核酸の配列は、エピトープ又は抗原のタンパク質配列から推定され得る。
【００５４】
エピトープは、好ましくはペプチドから選択される。より好ましくは、エピトープは、１〜５０アミノ酸（ＡＡ）、好ましくは３０ＡＡ未満、好ましくは３〜１２アミノ酸を含むペプチドエピトープである。
【００５５】
抗原は好ましくは、ペプチド、タンパク質、及び糖タンパク質から選択される。実際に、細胞（宿主）の細胞機構はカプシド形成されたＲＮＡを翻訳することができるので、それは、グリコシル化のような翻訳後修飾の１つ又は複数の付加的なステップを行うこともできる。実際に、抗原の産生が樹状細胞で行われる場合、抗原は、それが得られることを可能にしたバイオマーカーのように成熟し得る。
【００５６】
ＲＮＡの導入を可能にする本発明に係る粒子は、最大で１０ｋｂのサイズを有するので、かなりのサイズの抗原配列をその中に導入することが可能である。しかしながら、抗原配列のサイズは可変である。一般に、分子が大きいほど、それはより免疫原性である。
【００５７】
「抗原配列」とは、エピトープ又は抗原をコードするＤＮＡ配列を意味する。
【００５８】
有利には、エピトープ又は抗原は免疫原性である、すなわち、それは免疫応答を開始することができる。
【００５９】
「免疫原性」とは、免疫応答を誘導する抗原の可能性を意味する。物質は免疫原性ではなく抗原性であり得る。この可能性は、種、抗原と宿主の分子との間の類似性の程度、抗原の物理化学的特徴（サイズ、形状、剛性）、及び受けた抗原の用量に依存する。
【００６０】
好ましくは、エピトープは、抗体又はＴリンパ球の膜受容体（ＴＣＲ）の可変部分によって認識されると同定されている分子によって構成されるリストから選択される。後者は、それらの免疫原性の可能性に従って同定及び選択される。
【００６１】
好ましくは、抗原は腫瘍抗原、すなわち、腫瘍細胞の表面上に特異的に存在するが、周囲の正常細胞には存在しないか又は存在量が少ない分子である。より好ましくは、抗原は、以下によって構成される群から選択される：「癌精巣」群の抗原（例えばＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＣＴ７／ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＣＴ１０、ＳＳＸ４、ＢＲＤＴ、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２、Ｘａｇｅ１ｂ、ＭＡＧＥ−Ａ４等）、これらは、胚細胞による異所性発現とは別に腫瘍組織によって特異的に発現する；分化抗原、これは、正常細胞によって及び対応する腫瘍細胞によっての両方で所与の組織において発現される；腫瘍細胞でのみ発現される抗原、これは、突然変異抗原に対応し得る（アルファ−アクチニン−４、ＮＹ−ＦＣ、Ｐ５３、伸長因子２、酵素リンゴ酸、ＥＧＦ−Ｒ、Ｋｒａｓ、Ｃａｓｐ８、ＡＣＹＮ４、ＡＬＫ−ＥＭＬ１４等）；染色体転座の結果として発生した新生抗原（Ｂｃｒ−Ａｂｌ）；腫瘍によって過剰発現され得る正常細胞によって発現される抗原（ＷＴ１、ＡＣＥ、Ｍｕｃ１、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ２Ｂ、テロメラーゼ触媒タンパク質、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ、ＴＧＦａｌｐｈａ、シクロフィンＢ等）；  病原体、特にウイルスに由来する抗原（パピローマウイルス及び子宮頸癌又は上気道及び消化管の癌、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス及び肝臓癌）；並びに、細菌に由来する抗原（ヘリコバクターピロリ（Helicobacter pylori）及び胃癌）又は、特にヒトにおける、寄生虫に由来する抗原（住血吸虫及び膀胱癌）。特に、メラノーマに関連する腫瘍抗原は、３つのカテゴリーに分類されており、斯かるカテゴリーは、組織特異的（ＭＡＲＴ−１、チロシナーゼＴＲＰ−１及びＴＲＰ−２、ｇｐ−１００）、多種多様な癌によって発現されている抗原について腫瘍特異的（ＭＡＧＥ−１、ＮＹ−ＥＳＯ−１）であるか、あるいはそれらが突然変異した独自の腫瘍抗原（β−ｃａｔｅｎｉｎ、ＣＤＣ２７）であるかに応じて分類される。
【００６２】
カプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含む本発明に係るレトロウイルス粒子であって、その目的の配列が少なくとも１つのエピトープをコードする部分を含む、レトロウイルス粒子は、抗原提示細胞、特に樹状細胞を形質導入するのに特に有利である。
【００６３】
「エピトープを特異的に認識する分子構造」又は「パラトープ」とは、エピトープ、及び特に抗原との特異的相互作用を確立することができる構造を意味する。一般にそれは、抗体の又はリンパ球の膜受容体の可変部分によって構成される免疫受容体である。好ましくは、それは、Ｔリンパ球の表面に存在するＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）又はＣＡＲ（キメラ受容体）型の免疫受容体である。
【００６４】
好ましくは、エピトープを特異的に認識する分子構造は、以下：Ｔリンパ球受容体（ＴＣＲ）、天然型、改変型又はキメラ型；Ｂリンパ球受容体、膜（ＢＣＲ）又は分泌型（免疫グロブリン）；及び免疫応答に関与する免疫系の他の細胞の受容体、例えばＮＫ又はＮＫＴリンパ球、からなる群から選択される。
【００６５】
カプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含む本発明に係るレトロウイルス粒子であって、  その目的の配列が抗原を特異的に認識する少なくとも１つの分子構造を含む、レトロウイルス粒子は、リンパ球を形質導入するのに特に有利である。
【００６６】
有利には、本発明に係るレトロウイルス粒子は、ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含み、前記カプシド形成された非ウイルスＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、ヌクレオカプシドタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識される。
【００６７】
「ヌクレオカプシドタンパク質」とは、ｇａｇ遺伝子によってコードされた構造タンパク質ＮＣを意味する。結合ドメインがヌクレオカプシドタンパク質に導入される場合、このタンパク質は、キメラｇａｇ遺伝子に由来するキメラタンパク質である。
【００６８】
結合ドメインがインテグラーゼに導入される場合、インテグラーゼは、キメラｐｏｌ遺伝子に由来するキメラタンパク質である。
【００６９】
「キメラタンパク質」とは、いくつかの異なる融合タンパク質配列を含む組み換えタンパク質を意味する。
【００７０】
第１の実施形態によれば、本発明に係るレトロウイルス粒子において、結合ドメインはヌクレオカプシドタンパク質に導入され、かつ少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡはそれらのＲＮＡ配列によって異なる。
【００７１】
この第１の実施形態は、標的細胞のゲノムにおける関連した組み込みイベントなしに、目的のＲＮＡの早期の一過性発現を可能にする。
【００７２】
実際に、この第１の実施形態に係る粒子と標的細胞とを接触させると、レトロウイルス粒子の膜と標的細胞の膜とが融合することになり、粒子の内容物が標的細胞中に放出される。次に、ＲＮＡが細胞質内に放出され、細胞機構によってこれらＲＮＡが直接タンパク質（複数）に翻訳される、すなわち、例えば逆転写、核内への移行、又は標的細胞のゲノムへの組み込みなどの付加的なステップ無しに翻訳される。
【００７３】
より具体的には、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡは、同じカプシド形成配列を有する。この場合、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、それらの目的のＲＮＡ配列によって異なる、すなわち、２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡに含まれる目的のＲＮＡ配列は異なっている。「異なる（different）」とは、同一ではないか、あるいは、自然突然変異から生じたものでないか、又は操作者によって意図的に選択されたものではない違いを有する、目的の配列を意味する。
【００７４】
あるいは、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡは、２つの異なるカプシド形成配列を有する。次に、これら少なくとも２つのカプシド形成配列は、少なくとも２つの異なる結合ドメインによって認識され、これらドメインの少なくとも１つが、ヌクレオカプシドタンパク質に導入される。この場合、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、同一又は異なる目的の配列を含んでもよい。
【００７５】
少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ、好ましくは３つの非ウイルスＲＮＡをカプシド形成することが可能である。
【００７６】
第１の実施形態の特定の実施形態によれば、第２の結合ドメインは、本発明に係るレトロウイルス粒子のヌクレオカプシドタンパク質に導入される。
【００７７】
例として、第１の結合ドメインがＰＰ７ファージの「コート」タンパク質である場合、第２の結合ドメインはＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質であり得る、あるいは、第１の結合ドメインがＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質である場合、第２の結合ドメインはＰＰ７ファージの「コート」タンパク質であり得る。
【００７８】
この場合、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、異なるカプシド形成配列を有し、各カプシド形成配列は、ヌクレオカプシドタンパク質に導入された第１及び第２の結合ドメインにそれぞれ対応する。
【００７９】
より具体的には、３つの非ウイルスＲＮＡがカプシド形成される場合：
−カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの少なくとも２つが、第１の結合ドメインに対応する同じカプシド形成配列を有し、かつそれらの目的のＲＮＡ配列によってのみ異なり、
−第３のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、同一又は異なるカプシド形成配列を有し得る。カプシド形成配列が異なっている場合、それはヌクレオカプシドタンパク質に導入された第２の結合ドメインに対応し得る。
【００８０】
他の結合ドメインがまた、ヌクレオカプシドタンパク質に導入されてもよい。
【００８１】
ヌクレオカプシドタンパク質に導入された結合ドメイン又はドメイン（複数）に加えて、結合ドメインをインテグラーゼに導入することも可能である。
【００８２】
次に、インテグラーゼは、キメラｐｏｌ遺伝子に由来するキメラタンパク質である。
【００８３】
好ましくは、結合ドメインがインテグラーゼに導入される場合、インテグラーゼの配列は、結合ドメインの配列を挿入するために、Ｃ−末端ドメインのレベルで突然変異している。さらにより好ましくは、インテグラーゼの配列は、ＭＳ２バクテリオファージ又はＰＰ７ファージの「コート」タンパク質の配列を導入するように、Ｃ−末端ドメインのレベルで突然変異している。
【００８４】
この場合、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、異なるカプシド形成配列を有してもよく、各カプシド形成配列は、それぞれヌクレオカプシドタンパク質及びインテグラーゼに導入された結合ドメインに対応する。
【００８５】
より具体的には、３つの非ウイルスＲＮＡがカプシド形成される場合：
−カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの少なくとも２つが、第１の結合ドメインに対応する同じカプシド形成配列を有し、かつそれらの目的のＲＮＡ配列によってのみ異なり
−第３のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、インテグラーゼに導入された第２の結合ドメインに対応する異なるカプシド形成配列を有する。
【００８６】
他の結合ドメインがまた、インテグラーゼに導入されてもよい。
【００８７】
有利には、本発明に係るレトロウイルス粒子はレンチウイルス粒子である。
【００８８】
好ましくは、そのようなレンチウイルス粒子において：
−結合ドメインは、ＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質であり、
−非ウイルスＲＮＡのカプシド形成配列は、ＭＳ２のステム−ループ配列であり、
−ヌクレオカプシドタンパク質は、キメラのＧａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）であり、ＮＣの配列は、ＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質配列を挿入するために、第２のジンクフィンガーのレベルで突然変異している。
【００８９】
有利には：
−エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇタンパク質である。
−カプシド形成配列は、ＭＳ２ステム−ループ配列の２〜２５回の反復、好ましくはステム−ループ配列の６〜１８回の反復、さらにより好ましくは１０〜１４回、例えば１２回の反復を含む。好ましくは、ステム−ループ配列は、以下のものである：ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag（配列番号１）。
【００９０】
あるいは、好ましくは、そのようなレンチウイルス粒子において：
−結合ドメインは、ＰＰ７ファージの「コート」タンパク質であり、
−非ウイルスＲＮＡのカプシド形成配列は、ＰＰ７のステム−ループ配列であり、
−ヌクレオカプシドタンパク質は、キメラのＧａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）であり、ＮＣの配列は、ＰＰ７ファージの「コート」タンパク質配列を挿入するために、第２のジンクフィンガーのレベルで突然変異している。
【００９１】
有利には：
−エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇタンパク質である。
−カプシド形成配列は、ＰＰ７のステム−ループ配列の２〜２５回の反復、好ましくはステム−ループ配列の２〜１８回の反復、さらにより好ましくは２〜１２回、例えば６回の反復を含む。好ましくは、ステム−ループ配列は以下のものである：ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag（配列番号２）。
【００９２】
有利には、配列番号２は、ステム−ループのフォールディングを促進するように最適化され得る。特に、配列番号２及び配列番号３（ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag）を連続して交互に挿入することが有利であり得ることが見出された。
【００９３】
任意により、第１の結合ドメインがＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質である場合、インテグラーゼに導入された第２の結合ドメインはＰＰ７ファージのコートタンパク質であってもよく、あるいは、第１の結合ドメインがＰＰ７ファージのコートタンパク質である場合、インテグラーゼに導入された第２の結合ドメインはＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質であってもよい。
【００９４】
第２の実施形態によれば、本発明は、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質、好ましくはヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、インテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含むレトロウイルス粒子であって、前記カプシド形成された非ウイルスＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、インテグラーゼに導入された結合ドメインによって、及び任意によりＧａｇポリタンパク質に由来するタンパク質、好ましくはヌクレオカプシドタンパク質に導入された結合ドメインによって認識される、レトロウイルス粒子に関する。
【００９５】
この第２の実施形態は、標的細胞のゲノムにおける関連した組み込みイベントなしに目的のＲＮＡの一過性発現を可能にする。
【００９６】
好ましくは、この第２の実施形態において、インテグラーゼの配列は、結合ドメインの配列を挿入するためにＣ−末端ドメインのレベルで突然変異している。
【００９７】
有利には、結合ドメインは異種ドメインである。より具体的には、結合ドメインは、ＭＳ２バクテリオファージ、ＰＰ７ファージ又はＱβファージのコートタンパク質、プロファージＨＫ０２２  Ｎｕｎタンパク質、Ｕ１Ａタンパク質、あるいはｈＰｕｍタンパク質である。
【００９８】
好ましくは、インテグラーゼの配列は、ＭＳ２バクテリオファージ又はＰＰ７ファージの「コート」タンパク質の配列を導入するように、Ｃ−末端ドメインのレベルで突然変異している。
【００９９】
少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡは、同じカプシド形成配列を有しても又は有さなくてもよい。
【０１００】
また、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、同じ目的のＲＮＡ配列を有しても又は有さなくてもよい。
【０１０１】
好ましくは、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、それらの目的のＲＮＡ配列で異なり、すなわち２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡに含まれる目的のＲＮＡ配列は、異なっている。
【０１０２】
より具体的には、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡは同じカプシド形成配列を有し、後者はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識される。
【０１０３】
少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ、好ましくは３つの非ウイルスＲＮＡをカプシド形成することが可能である。
【０１０４】
第２の実施形態の特定の実施形態によれば、第２の結合ドメインは、本発明に係るレトロウイルス粒子のインテグラーゼに導入される。
【０１０５】
例として、第１の結合ドメインがＰＰ７ファージの「コート」タンパク質である場合、第２の結合ドメインはＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質であり得る、あるいは、第１の結合ドメインがＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質である場合、第２の結合ドメインはＰＰ７ファージの「コート」タンパク質であり得る。
【０１０６】
この場合、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、異なるカプシド形成配列を有し、各カプシド形成配列は、インテグラーゼに導入された第１及び第２の結合ドメインにそれぞれ対応する。
【０１０７】
より具体的には、３つの非ウイルスＲＮＡがカプシド形成される場合：
−カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの少なくとも２つが、第１の結合ドメインに対応する同じカプシド形成配列を有し、これら２つの非ウイルスＲＮＡは、任意によりそれらの目的のＲＮＡ配列によって異なり得る、
−第３のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、同一又は異なるカプシド形成配列を有し得る。カプシド形成配列が異なっている場合、それは、インテグラーゼに導入された第２の結合ドメインに対応し得る。
【０１０８】
他の結合ドメインがまた、インテグラーゼに導入されてもよい。
【０１０９】
インテグラーゼに導入された結合ドメイン又はドメイン（複数）に加えて、ヌクレオカプシドタンパク質に結合ドメインを導入することも可能である。
【０１１０】
次に、ヌクレオカプシドタンパク質は、キメラｇａｇ遺伝子に由来するキメラタンパク質である。
【０１１１】
この場合、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、異なるカプシド形成配列を有してもよく、各カプシド形成配列は、それぞれインテグラーゼに及びヌクレオカプシドタンパク質に導入された結合ドメインに対応する。
【０１１２】
より具体的には、３つの非ウイルスＲＮＡがカプシド形成される場合：
−カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの少なくとも２つが、インテグラーゼに導入された第１の結合ドメインに対応する同じカプシド形成配列を有し、かつこれら非ウイルスＲＮＡは、任意により、それらの目的のＲＮＡ配列で異なり得る、
−第３のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、異なるカプシド形成配列を有し、斯かるカプシド形成配列は、ヌクレオカプシドタンパク質に導入された第２の結合ドメインに対応する。
【０１１３】
他の結合ドメインがまた、ヌクレオカプシドタンパク質に導入されてもよい。
【０１１４】
従って、本発明は、ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含むレトロウイルス粒子であって、前記カプシド形成された非ウイルスＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、ヌクレオカプシドタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識される、レトロウイルス粒子に関する。
【０１１５】
任意により、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡの目的の配列は、同一であり得る。
【０１１６】
代替的にかつ好ましくは、レトロウイルス粒子における少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、それらのＲＮＡ配列で異なる。
【０１１７】
この場合、カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの目的の配列が、第２のエピトープ又は抗原、あるいは免疫調節タンパク質をコードすることが有利である。
【０１１８】
他のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡの目的の配列が、第２のエピトープ又は抗原をコードする場合、したがって、いくつかのエピトープ及び／又は抗原を同時に発現し、組み合わされ協調した免疫応答を誘発することが可能である。例として、腫瘍免疫療法の分野において、腫瘍細胞はいくつかの独立した免疫応答の標的となる。
【０１１９】
多数の免疫調節剤、すなわち免疫系を制御し配向するために使用され得る分子が存在する。従って、本発明に係る粒子によるこれら免疫調節剤の導入は、特異的応答、活性化又は分化を調節することが望まれる免疫系の全ての細胞（リンパ球、単球）に関係し得る。樹状細胞の場合、これらの剤は２つの主要な機能を果たす。
【０１２０】
未熟状態では、樹状細胞は、標的組織又は感染組織のレベルで抗原を捕捉し、次に分化しながら最も近い二次リンパ器官に移動する。
【０１２１】
成熟状態では、樹状細胞は、Ｔリンパ球を特異的に活性化するために、抗原をＴリンパ球に提示する。
【０１２２】
この樹状細胞の特異的活性化は、免疫応答を確立し維持するために不可欠であるサイトカインの産生をもたらす。これらサイトカインは、非常に複雑なメカニズムによって、先天性システムを適応システムに結び付けることを可能にする。これは、インビトロ又はエクスビボでの細胞の活性化が一般に、培地へのサイトカイン又は因子の添加によってもらされるためである。
【０１２３】
微小環境だけでなく、種々の免疫調節剤もまた、樹状細胞の活性化を誘導するか又は活性化に寄与し得る。例えば、ＰＡＭＰ（病原体関連分子パターン（Pathogen Associated Molecular Patterns））、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）、ＤＡＭＰ（損傷関連分子パターン分子（Damage associated Molecular pattern Molecules））炎症分子は、樹状細胞の活性化をもたらし得る。多くの分子が樹状細胞を活性化することができる。ＭＣＭ（単球馴化培地）、サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＰＧＬ６）、プロスタグランジンＥ２、ＣＤ４０Ｌ又はＴＬＲのリガンド。樹状細胞の活性化経路に作用することができるタンパク質の全てが、それらの成熟に対する調節効果を有する可能性がある。同様にして、Ｔ又はＢリンパ球の免疫調節剤は、これら細胞の産生及び活性の強力な調節因子であり、従って免疫応答の種々の作用間の相互作用を刺激し、従って後者を改善し得る。
【０１２４】
「免疫調節タンパク質」とは、タンパク質の形態である免疫調節剤を意味する。
【０１２５】
この実施形態は、抗原提示細胞及び特に樹状細胞、又はリンパ球が形質導入されて、これら免疫調節剤を直接発現し、免疫応答を増幅する場合に特に有利である。
【０１２６】
したがって、抗原の発現と同時に起こる、抗原提示細胞、特に樹状細胞の成熟の誘導は、免疫応答を誘導するための特に有望な戦略である。この目的は、標的抗原（複数）に最もよく反応するように免疫系を刺激することである。免疫系を活性化することを目的としたこのプライミング戦略は、免疫応答の強化につながる可能性がある。
【０１２７】
好ましくは、免疫調節タンパク質は、サイトカイン、例えばＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＰＧＬ６、インターロイキン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、薬剤、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ（「誘導性共刺激分子（Inducible Costimulator）」）、ＯＸ４０、ＣＤ８０、ＩＣＯＳＬ又はＯＸ４０Ｌ、及び記載された活性化経路を調節するためのタンパク質、例えばＴＬＲのリガンド又はＮＬＲのリガンド（Ｎｏｄ様受容体）、例えばイミキモド（imiquimod）又はＣｐＧｓ、から選択される。
【０１２８】
有利には、レトロウイルス粒子は、第３のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含む。
【０１２９】
第３のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、第１の２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡの目的の配列の少なくとも１つと同一の目的の配列を有してもよく、あるいは、第１の２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡの目的の配列のそれぞれと異なっていてもよい。
【０１３０】
特に、レトロウイルス粒子は、３つを超えるカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含み得る。
【０１３１】
有利には、本発明に係る粒子がヌクレオカプシドタンパク質を含む場合、結合ドメインはヌクレオカプシドタンパク質に導入されてもよく、かつ、第２の結合ドメインは、ヌクレオカプシドに及び／又はインテグラーゼに導入されてもよい。
【０１３２】
あるいは、本発明に係るレトロウイルス粒子において、結合ドメインはインテグラーゼに導入されてもよく、かつ、第２の結合ドメインは、ヌクレオカプシドに及び／又はインテグラーゼに導入されてもよい。
【０１３３】
有利には、本発明に係るレトロウイルス粒子は、レンチウイルス粒子である。
【０１３４】
レトロウイルス粒子がレンチウイルス粒子である場合、標的細胞、特に静止細胞のゲノムにおける関連した組み込みイベントなしに、目的のＲＮＡを一過的に発現することが可能である。
【０１３５】
実際に、組み込み反応それ自体のその役割の他に、インテグラーゼ（ＩＮ）は、レトロウイルスの複製サイクルの様々な段階、例えばウイルス粒子の形態形成、逆転写及びプレインテグレーション複合体（ＰＩＣ）の核内輸送に関与する。
【０１３６】
より具体的には、レンチウイルスにおいて、インテグラーゼは、ＰＩＣによって核内にその局在を可能にする核局在配列（ＮＬＳ）を含む。結果として、非ウイルスＲＮＡのカプシド形成が、レンチウイルスのインテグラーゼが有する結合ドメインによって行われる場合、カプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、標的細胞の核内に輸送されることになる。実際に、第２の実施形態に係るレンチウイルス粒子と標的細胞とを接触させると、粒子の膜と標的細胞の膜とが融合することになり、標的細胞内へのカプシドの内容物の放出を可能にする。次に、ＲＮＡは、インテグラーゼによって引き受けられ、これはＰＩＣを介して、核内へのＲＮＡの取り込みを可能にすることになる。この引き受けは特に特定の用途、例えば静止細胞における発現に有利である。レンチウイルス以外のレトロウイルス粒子の場合、インテグラーゼはこれらＮＬＳを含まず、従って細胞質に局在することがわかる。しかしながら、インテグラーゼの核局在、結果としてこのインテグラーゼによって引き受けられるＲＮＡの核局在を誘導するために、このタイプのインテグラーゼに、ＮＬＳ配列を追加することが可能である。
【０１３７】
この引き受けはまた、標的細胞のゲノムに特異的にハイブリダイズすることになるガイドＲＮＡを使用する、ＣＲＩＳＰＲシステムに特に有用である。一度ハイブリダイズすると、これらガイドＲＮＡはエンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）をガイドし、それは標的細胞ゲノムの特定の遺伝子座の改変を可能にすることになる。
【０１３８】
免疫療法では、形質導入が特にレンチウイルス粒子によって行われるという事実が、形質導入されたＲＮＡの一過性発現を可能にする。
【０１３９】
結果として本発明に係る粒子は、一方では複数の異なる腫瘍抗原配列を発現し、例えば、他方では免疫応答メカニズムにおいて形質導入された細胞の活性化を誘発することができる免疫調節タンパク質を発現するために、宿主細胞のゲノムにおける組み込みイベントなしに、任意により遺伝的に異なる、複数のＲＮＡを送達することができる。
【０１４０】
より具体的には、そのようなレンチウイルス粒子において：
−結合ドメインは、ＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質であり、
−非ウイルスＲＮＡのカプシド形成配列は、ＭＳ２のステム−ループ配列であり、
−インテグラーゼは、酵素のキメラタンパク質であり、その配列は、ＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質配列を挿入するために、Ｃ−末端ドメインのレベルで突然変異している。
【０１４１】
あるいは、より具体的には、そのようなレンチウイルス粒子において：
−結合ドメインは、ＰＰ７ファージの「コート」タンパク質であり、
−非ウイルスＲＮＡのカプシド形成配列は、ＰＰ７のステム−ループ配列であり、
−インテグラーゼは、酵素のキメラタンパク質であり、その配列は、ＰＰ７ファージの「コート」タンパク質配列を挿入するために、Ｃ−末端ドメインのレベルで突然変異している。
【０１４２】
任意により、第１の結合ドメインがＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質である場合、ヌクレオカプシドに導入された第２の結合ドメインは、ＰＰ７ファージのコートタンパク質であってもよく、あるいは、第１の結合ドメインがＰＰ７ファージのコートタンパク質である場合、インテグラーゼに導入された第２の結合ドメインは、ＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質であってもよい。
【０１４３】
実際に、インテグラーゼ（ＩＮ）は、３つの別々の機能ドメインから構成され、それぞれが完全な組み込み反応を確実にするために不可欠である。Ｎ−末端ドメインは、ジンクフィンガー型のモチーフを含み、これはＩＮのフォールディング構造を安定化し、かつ酵素の触媒活性を増加させる。ＩＮの中央ドメインは、ＤＤＥアミノ酸モチーフを含み、酵素の触媒活性はこれに起因する。この中央ドメインはまた、レトロウイルスＤＮＡの各末端で保存されたヌクレオチド配列の認識にも関与する。Ｃ−末端ドメインは、レトロウイルスファミリーにおいて最も保存されていない。それは、ＤＮＡ結合活性を有し、鎖転移のための３’末端の成熟反応に不可欠である。組み込み反応それ自体におけるその役割の他に、ＩＮは、レトロウイルスの複製サイクルの様々な段階、例えばウイルス粒子の形態形成、逆転写及びプレインテグレーション複合体の核内輸送に関与する。
【０１４４】
Petitらによって記載されたように（1999；J.Virol.P5079-5088）、ＩＮのＣ−末端における外因性配列の挿入は、標的細胞の産生及び形質導入のステップを妨げないが、Ｎ−末端における同じ挿入は、形質導入イベントの検出を可能にしない。
【０１４５】
従ってレトロウイルス粒子は、インテグラーゼタンパク質と融合したＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質（図Ｉ）又はＰＰ７ファージの「コート」タンパク質（図ＸＸＸＶＩＩ）を含むように改変された。ｐ８．７４カプシド形成プラスミドは、インテグラーゼタンパク質をコードするｐｏｌ遺伝子を有し、斯かるプラスミドは、アセンブリＰＣＲによってインテグラーゼのＣ−末端にコートタンパク質をコードする配列を挿入するために改変される。ｐ８．７４プラスミドはＰＣＲによって線状化され、次にＰＣＲによって増幅されたＣｏａｔ配列が、末端から末端に直接、又はリンカーに加えてのいずれかで、インテグラーゼのＣ−末端レベルにクローニングされる。
【０１４６】
有利には：
−エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇタンパク質である。
−カプシド形成配列は、導入される結合ドメインに応じて、ＭＳ２の及び／又はＰＰ７のステム−ループ配列の２〜２５回の反復を含み、好ましくはステム−ループ配列の２〜１８回の反復、より好ましくは２〜１８回の反復、例えば６〜１８回の反復、さらにより好ましくはＭＳ２のステム−ループ配列について、１０〜１４回、例えば１２回の反復を含む。
−好ましくは、結合ドメインがＭＳ２のコートタンパク質である場合、ステム−ループ配列は、以下：ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag（配列番号１）であり、及び／又は、結合ドメインがＰＰ７のコートタンパク質である場合、ステム−ループ配列は、以下：ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag（配列番号２）、及び／又はステム−ループ配列の配列番号３と交互のステム−ループ配列の配列番号２である。
【０１４７】
本発明に係るレンチウイルス粒子のいくつかの例を以下に記載し、いくつかを以下に与えられた実施例でより詳細に説明する：
−ＲＬＰ又はＭＳ２ＲＬＰ又はＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ  １２Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドへのＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、１２回反復した、ＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ  ２Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドへのＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、２回反復した、ＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ  ６Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドへのＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、６回反復した、ＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰ  ２Ｘ粒子は、インテグラーゼへのＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、２回反復した、ＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰ  ６Ｘ粒子は、インテグラーゼへのＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、６回反復した、ＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰ  １２Ｘ粒子は、インテグラーゼへのＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、１２回反復した、ＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＰＰ７ＲＬＰ又はＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ  ２Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドへのＰＰ７ファージのコートタンパク質の挿入によって、２回反復した、ＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ  ６Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドへのＰＰ７ファージのコートタンパク質の挿入によって、６回反復した、ＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ  １２Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドへのＰＰ７ファージのコートタンパク質の挿入によって、１２回反復した、ＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ  ２Ｘ又はＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ粒子は、インテグラーゼへのＰＰ７ファージのコートタンパク質の挿入によって、２回反復した、ＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ  ６Ｘ粒子は、インテグラーゼへのＰＰ７ファージのコートタンパク質の挿入によって、６回反復した、ＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ  １２Ｘ粒子は、インテグラーゼへのＰＰ７ファージのコートタンパク質の挿入によって、１２回反復した、ＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＭＳ２／ＰＰ７ＲＬＰ又はＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ  １２Ｘ  ２Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドへのＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、１２回反復した、ＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡ、あるいは、ヌクレオカプシドへのＰＰ７ファージのコートタンパク質の挿入によって、２回反復した、ＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子である。
【０１４８】
好ましくは、ＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子は、２〜２５回、より好ましくは２、６又は１２回反復したＭＳ２バクテリオファージの又はＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有する。
【０１４９】
さらにより好ましくは、本発明に係る粒子は、ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ  １２Ｘ、ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ  ６Ｘ、ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ  ２Ｘ、ＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰ  １２Ｘ、ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ  ６Ｘ及びＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ  ２Ｘ、から選択される。
【０１５０】
本発明はまた、本発明に係る粒子を含有する組成物に関する。
【０１５１】
より具体的には、本発明に係る組成物は、濃縮された組成物である。有利には、組成物はまた、精製される。これら組成物は、国際公開第２０１３／０１４５３７号の出願に記載の方法によって濃縮及び精製されてもよい。
【０１５２】
典型的には、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、３０％未満のＤＮＡ夾雑物及び４５％未満のタンパク質夾雑物を含有する。より具体的には、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、３０％未満のＤＮＡ夾雑物及び２％未満のタンパク質夾雑物を含有する。
【０１５３】
「粗上清」とは、清澄化後の、本発明に係るレトロウイルス粒子を含む細胞培養物（複数）の上清を意味する。そのような清澄化ステップは、より具体的には、以下の本発明に係る粒子を製造するための方法に記載される。上清の回収が数回行われる場合、粗上清は、回収され、合わされ（又は「プールされ」）、次に清澄化された上清の全てに対応する。
【０１５４】
任意により、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、１％未満のＤＮＡ夾雑物及び１％未満のタンパク質夾雑物を含有する。
【０１５５】
本発明はまた、本発明に係る粒子を生産するためのキット、及びそれらキットの製造方法に関する。
【０１５６】
より具体的には、本発明は、本発明に係る粒子を生産するためのキットであって、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、前記配列の上流又は下流に、カプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むＧａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む、キットに関する。
【０１５７】
そのようなキットはまた、キットに含まれるプラスミドの使用のための指示書を含んでもよい。
【０１５８】
より具体的には、キットが、第１の実施形態に係る粒子を生産するためのキットである場合、このキットは、以下：
（ｉ）少なくとも２つの異なる非ウイルスＲＮＡ配列を含む発現プラスミドであって、各ＲＮＡ配列が目的の配列を含み、前記目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されているか、あるいは、第１及び第２の発現プラスミドがそれぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む。
【０１５９】
目的の配列が異なる、及び／又はカプシド形成配列が異なるために、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ配列は異なっている。
【０１６０】
プラスミドはＤＮＡ構造であるので、「少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ配列を含む発現プラスミド」とは、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ配列をコードする発現プラスミドを意味することがよく知られている。
【０１６１】
実際に、キットにおける発現プラスミドは、転写によって少なくとも１つの非ウイルスＲＮＡを得るのに必要な全てのＤＮＡ配列を含む。発現プラスミドは、少なくとも１つのプロモーター、次いで目的のＤＮＡ配列（非ウイルスＲＮＡに転写されることになるｃＤＮＡ又はＤＮＡ）及びカプシド形成配列（例えばＭＳ２又はＰＰ７反復モチーフをコードするＤＮＡ）及び任意によりＲＮＡ安定化配列、を含む。
【０１６２】
好ましくは、第１の実施形態に係る粒子を生産するためのキットは、以下：
（ｉ）少なくとも２つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、第１及び第２の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されており、当該目的の配列が異なっており、かつ当該カプシド形成配列は同一である、発現プラスミド、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む。
【０１６３】
有利には、キットは、レンチウイルス粒子を生産する。
【０１６４】
好ましくは：
−発現プラスミドにおいて、カプシド形成配列は、ＭＳ２のステム−ループ配列２〜２５回の反復を含み、好ましくはステム−ループ配列の６〜１８回の反復、さらにより好ましくは１０〜１４回、例えば１２回の反復を含む。有利には、ステム−ループ配列は、以下：ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag（配列番号１）である。
−カプシド形成プラスミドにおいて、ヌクレオカプシドタンパク質は、Ｇａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）であり、当該ＮＣは、ＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質の配列を挿入するために、第２のジンクフィンガーのレベルで突然変異している。
−エンベローププラスミドにおいて、エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇタンパク質である。
【０１６５】
あるいは、好ましくは：
−発現プラスミドにおいて、カプシド形成配列は、ＰＰ７のステム−ループ配列の２〜２５回の反復を含み、好ましくはステム−ループ配列の２〜１８回の反復、さらにより好ましくは２〜１２回、例えば６回の反復を含む。有利には、ステム−ループ配列は、以下：ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag（配列番号２）であり、及び／又は、ステム−ループ配列の配列番号３と交互のステム−ループ配列の配列番号２である。
−カプシド形成プラスミドにおいて、ヌクレオカプシドタンパク質は、Ｇａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ）であり、当該ＮＣは、ＰＰ７ファージの「コート」タンパク質の配列を挿入するために、第２のジンクフィンガーのレベルで突然変異している。
−エンベローププラスミドにおいて、エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇタンパク質である。
【０１６６】
任意により、キットは、キメラインテグラーゼをコードする第２のカプシド形成プラスミドを含み、斯かるキメラインテグラーゼは、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む。第２の結合ドメインは、キメラヌクレオカプシドタンパク質の結合ドメインと同一又は異なってもよい。
【０１６７】
種々の結合ドメインの例として：
−ヌクレオカプシドに導入された結合ドメインは、ＭＳ２のコートタンパク質であってもよく、かつインテグラーゼに導入された結合ドメインは、ＰＰ７のコートタンパク質であってもよい、あるいは
−ヌクレオカプシドに導入された結合ドメインは、ＰＰ７のコートタンパク質であってもよく、かつインテグラーゼに導入された結合ドメインは、ＭＳ２のコートタンパク質であってもよい。
【０１６８】
いくつかの結合ドメインが、キメラタンパク質のそれぞれに導入されてもよい。
【０１６９】
あるいは、キットが、第２の実施形態に係る粒子を生産するためのキットである場合、このキットは、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む。
【０１７０】
有利には、本発明に係る生産キットは、第２のカプシド形成プラスミドをさらに含んでもよく、斯かる第２のカプシド形成プラスミドは：
−第１のカプシド形成プラスミドが、キメラＧａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードする場合には、野生型Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードし、及び／又は
−第１のカプシド形成プラスミドが、キメラインテグラーゼをコードする場合には、野生型インテグラーゼをコードする。
【０１７１】
本発明に係るキットのための製造方法も提案される。典型的には、本発明に係るキットを製造するための方法は、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミドを調製し、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むＧａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミドを調製し、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
【０１７２】
より具体的には、方法が、第１の実施形態に係る粒子を生産するためのキットに関する場合、当該方法は、以下：
（ｉ）少なくとも２つの異なる非ウイルスＲＮＡ配列を含む発現プラスミドであって、各ＲＮＡ配列が目的の配列を含み、この目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、第１及び第２の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、を調製し、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミドを調製し、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
【０１７３】
目的の配列が異なる、及び／又はカプシド形成配列が異なるために、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ配列は異なっている。
【０１７４】
好ましくは、当該方法は、以下：
（ｉ）少なくとも２つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、第１及び第２の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入され、当該目的の配列が異なり、かつ当該カプシド形成配列が同一である、発現プラスミド、を調製し、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミドを調製し、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
【０１７５】
あるいは、方法が、第２の実施形態に係る粒子を生産するためのキットに関する場合、当該方法は、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミドを調製し、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミドを調製し、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。
【０１７６】
本発明はまた、本発明に係る粒子を製造するための方法に関する。
【０１７７】
そのような方法は、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド，
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むＧａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
による細胞のコトランスフェクションのステップ、並びに、
粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清の回収のステップ、
を含む。
【０１７８】
本発明に係る粒子のための製造方法に利用される細胞は、プロデューサー細胞であり、すなわち、レトロウイルス粒子の形成に必要な遺伝物質を有するプラスミドで一度トランスフェクトされた細胞が、当該粒子の形成を可能にする。プロデューサー細胞の例として、ＨＥＫ２９３Ｔが挙げられる。
【０１７９】
「コトランスフェクションのステップ」とは、粒子を製造するための方法のプラスミドの全てとプロデューサー細胞とを接触させることによってトランスフェクションが行われる、トランスフェクションのステップを意味する。
【０１８０】
より具体的には、製造方法の目的が、第１の実施形態に係る粒子を生産することである場合、当該方法は、以下：
（ｉ）少なくとも２つの異なる非ウイルスＲＮＡ配列を含む発現プラスミドであって、各ＲＮＡ配列が目的の配列を含み、この目的の配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されているか、あるいは、第１及び第２の発現プラスミドがそれぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
による細胞のコトランスフェクションのステップ、並びに、
粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清の回収のステップ、
を含む。
【０１８１】
目的の配列が異なる、及び／又はカプシド形成配列が異なるために、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ配列は異なっている。
【０１８２】
好ましくは、粒子のこの製造方法は、以下：
（ｉ）少なくとも２つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、これら配列のそれぞれの上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、第１及び第２の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入され、当該目的の配列が異なり、かつ当該カプシド形成配列が同一である、発現プラスミド
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
による細胞のコトランスフェクションのステップ、並びに、
粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清の回収のステップ、
を含む。
【０１８３】
あるいは、製造方法の目的が、第２の実施形態に係る粒子を生産することである場合、この方法は、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
（ｉｉ）カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含むキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
による細胞のコトランスフェクションのステップ、並びに、
粒子を含むトランスフェクトされた細胞の上清の回収のステップ、
を含む。
【０１８４】
好ましくは、本発明に係る粒子を製造するための方法の全ては、国際公開第２０１３／０１４５３７号の出願に記載の方法によって行われる。
【０１８５】
より具体的には、粒子のためのこれら製造方法は、血清を含まない培地で培養されたプロデューサー細胞に対して行われ、かつ酪酸ナトリウムによる誘導は行われない。
【０１８６】
有利には、上清は数回、例えば３〜６回、特定の時間間隔で、例えばレトロウイルス粒子の半減期のオーダーの時間間隔で、回収される。典型的には、上清の回収は、４〜５回、６〜１８時間、好ましくは８〜１６時間、例えば８時間、１２時間及び／又は１６時間のオーダーの時間間隔で行われる。好ましくは、この回収は、細胞の培養培地の交換後に行われ、この交換は好ましくは、トランスフェクション後２４時間で行われる。
【０１８７】
本発明に係る粒子のための製造方法はまた、上清が清澄化されるステップを含む。
【０１８８】
好ましくは、上清は、遠心分離によって清澄化される。
【０１８９】
さらにより好ましくは、本発明に係る粒子のためのこれら製造方法はさらに、上清が濃縮及び／又は精製されるステップを含む。
【０１９０】
好ましくは、濃縮及び精製は、遠心分離ユニットでの正面（frontal）限外濾過によって行われる。
【０１９１】
有利には、上清は、１つ又は複数の付加的な精製ステップを受ける。これら精製ステップは好ましくは、接線（tangential）限外濾過及び／又は透析濾過によって行われる。さらにより好ましくは、上清は、接線限外濾過のステップに次いで、透析濾過のステップを受ける。
【０１９２】
接線限外濾過は有利には、ポリスルホン中空カートリッジで行われる。
【０１９３】
任意により、組成物は次に、イオン交換クロマトグラフィー、特にイオン交換クロマトグラフィーのステップを受けてもよい。このクロマトグラフィーステップからの溶出液を回収し、次に中央遠心分離ユニットでの正面限外濾過によって再度濃縮する。そのような方法から得られた組成物は、粗上清に対して、１％未満のＤＮＡ夾雑物及び１％未満のタンパク質夾雑物を含有する。
【０１９４】
本発明に係る製造方法において、コトランスフェクションステップは、さらに、第２のカプシド形成プラスミドにより行われてもよく、斯かる第２のカプシド形成プラスミドは：
−第１のカプシド形成プラスミドが、キメラＧａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードする場合には、野生型Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードし、及び／又は
−第１のカプシド形成プラスミドが、キメラインテグラーゼをコードする場合には、野生型インテグラーゼをコードする。
【０１９５】
有利には、第２のカプシド形成プラスミドと第１のカプシド形成プラスミドとの比は、［１０：９０］〜［６０：４０］の範囲、好ましくは［２０：８０］〜［５０：５０］の範囲である。
【０１９６】
第２のカプシド形成プラスミドの使用に関する利点、及びより具体的には上記で定義した比に関する利点は、実施例８でより詳細に説明される。
【０１９７】
本発明はまた、本発明に係る粒子のための製造方法のいずれか１つによって得られる組成物に関する。
【０１９８】
典型的には、これら組成物は、粗上清に対して、３０％未満のＤＮＡ夾雑物及び４５％未満のタンパク質夾雑物を含有する。より具体的には、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、３０％未満のＤＮＡ夾雑物及び２％未満のタンパク質夾雑物を含有する。
【０１９９】
任意により、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、１％未満のＤＮＡ夾雑物及び１％未満のタンパク質夾雑物を含有する。
【０２００】
最後に、本発明は、細胞、特に免疫応答に関与する細胞の形質導入のための、本発明に係る粒子、又は本発明に係る組成物の使用に関する。
【０２０１】
本発明に係る粒子及び組成物の使用は、それらを一過的に改変するために、初代細胞及び不死化株の形質導入に特に有利である。細胞は、哺乳動物細胞であるか又は他の真核生物の細胞であってもよい。特に、これら細胞の形質導入は、インビボ、インビトロ又はエクスビボで行われ得る。
【０２０２】
免疫応答に関与する細胞は、特に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び免疫系の細胞である。より具体的には、それらは、単球（樹状細胞、マクロファージ）、Ｔ又はＢリンパ球、ナチュラルキラー及び造血幹細胞である。
【０２０３】
これら粒子又は組成物は、「ワクチン」と記載することができ、かつ、腫瘍のサイズを減少させるか又はウイルス発生を根絶するため、並びにメモリーＴ細胞を誘導するための癌又はウイルスに特異的なエフェクターＴ細胞を誘導することを目的とし、斯かるメモリーＴ細胞は、腫瘍又はウイルスの制御不能を防ぐことができるであろう。
【０２０４】
標的細胞への複数の異種核酸の導入は、研究開発、並びにインビトロ、エクスビボ及びインビボでの適用のための治療における主要な課題である。
【０２０５】
本発明は、以下にそれぞれ示す図面を参照して、例示により与えられた以下の実施例を踏まえて、よりよく理解されるであろう：
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】図Ｉは、目的のＲＮＡ配列として、蛍光レポーターを有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産のために使用される；
【図２】図ＩＩは、ｐ８．７４レンチウイルスカプシド形成プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図を示し、ここでは、結合ドメインＭＳ２  Ｃｏａｔはヌクレオカプシド配列に導入されており、このカプシド形成プラスミドは、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子を生産するために使用される；
【図３】図ＩＩＩは、エンベローププラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である；
【図４ａ】図ＩＶは、目的の配列として、ルシフェラーゼ（ＩＶａ）、蛍光遺伝子（ＩＶｂ）又はＣｒｅ（ＩＶｃ）を有する、組み込みレンチウイルス発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の３つの模式図を示す；
【図４ｂ】図ＩＶは、目的の配列として、ルシフェラーゼ（ＩＶａ）、蛍光遺伝子（ＩＶｂ）又はＣｒｅ（ＩＶｃ）を有する、組み込みレンチウイルス発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の３つの模式図を示す；
【図４ｃ】図ＩＶは、目的の配列として、ルシフェラーゼ（ＩＶａ）、蛍光遺伝子（ＩＶｂ）又はＣｒｅ（ＩＶｃ）を有する、組み込みレンチウイルス発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の３つの模式図を示す；
【図５】図Ｖは、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）を生産するために使用されるｐ８．７４カプシド形成プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である；
【図６ａ】図ＶＩａは、本発明に係る粒子によるヒトリンパ球の形質導入の有効性を示す図である；
【図６ｂ】図ＶＩｂは、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）によるヒトリンパ球の形質導入の有効性を示す図である；
【図７ａ】図ＶＩＩａは、本発明に係る粒子によるマウスリンパ球の形質導入の有効性を示す図である；
【図７ｂ】図ＶＩＩｂは、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）によるマウスリンパ球の形質導入の有効性を示す図である；
【図８ａ】図ＶＩＩＩａは、本発明に係る粒子による未熟ヒト樹状細胞の形質導入の有効性を示す図である；
【図８ｂ】図ＶＩＩＩｂは、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）による未熟ヒト樹状細胞の形質導入の有効性を示す図である；
【図８ｃ】図ＶＩＩＩｃは、本発明に係る粒子により形質導入された未熟ヒト樹状細胞におけるＺｓＧｒｅｅｎの発現動態を示す；
【図８ｄ】図ＶＩＩＩｄは、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）により形質導入された未熟ヒト樹状細胞におけるＺｓＧｒｅｅｎの発現動態を示す；
【図８ｅ】図ＶＩＩＩｅは、本発明に係る粒子により形質導入された未熟ヒト樹状細胞の表現型を示す図である；
【図８ｆ】図ＶＩＩＩｆは、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）により形質導入された未熟ヒト樹状細胞の表現型を示す図である；
【図９ａ】図ＩＸａは、本発明に係る粒子による成熟ヒト樹状細胞の形質導入の有効性を示す図である；
【図９ｂ】図ＩＸｂは、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）による成熟ヒト樹状細胞の形質導入の有効性を示す図である；
【図９ｃ】図ＩＸｃは、本発明に係る粒子により形質導入された成熟ヒト樹状細胞の表現型を示す図である；
【図９ｄ】図ＩＸｄは、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）により形質導入された成熟ヒト樹状細胞の表現型を示す図である；
【図１０ａ】図Ｘａは、本発明に係る粒子によるマウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の形質導入の有効性を示す図である；
【図１０ｂ】図Ｘｂは、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）によるＢＭＤＣ細胞の形質導入の有効性を示す図である；
【図１０ｃ】図Ｘｃは、本発明に係る粒子により形質導入されたＢＭＤＣ細胞におけるＺｓＧｒｅｅｎの発現動態を示す；
【図１０ｄ】図Ｘｄは、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）により形質導入されたＢＭＤＣ細胞におけるＺｓＧｒｅｅｎの発現動態を示す；
【図１０ｅ】図Ｘｅは、本発明に係る粒子により形質導入されたＢＭＤＣ細胞の表現型を示す図である；
【図１０ｆ】図Ｘｆは、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）により形質導入されたＢＭＤＣ細胞の表現型を示す図である；
【図１１ａ】図ＸＩａは、目的のＲＮＡ配列として、ＭＡＧＥ  Ａ３抗原をコードする完全な抗原配列を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産のために使用される；
【図１１ｂ】図ＸＩｂは、目的のＲＮＡ配列として、ＭＡＧＥ  Ａ３抗原をコードする部分抗原配列（ＰＳ−ＭａｇｅＡ３又はＰＳ−ＭＡＧＥＡ３）を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産のために使用される；
【図１１ｃ】図ＸＩｃは、目的のＲＮＡ配列として、ｇｐ１００抗原をコードする部分抗原配列（ＰＳ−ｇｐ１００又はＰＳ−ＧＰ１００）を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産のために使用される；
【図１１ｄ】図ＸＩｄは、目的のＲＮＡ配列として、チロシナーゼをコードする部分抗原配列（ＰＳ−Ｔｙｒ又はＰＳ−ＴＹＲ）を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産のために使用される；
【図１２ａ】図ＸＩＩａは、目的のＲＮＡ配列として、ＭＡＧＥ  Ａ３抗原をコードする完全な抗原配列を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）の生産に使用される；
【図１２ｂ】図ＸＩＩｂは、目的のＲＮＡ配列として、ＭＡＧＥ  Ａ３抗原をコードする部分抗原配列（ＰＳ−ＭａｇｅＡ３又はＰＳ−ＭＡＧＥＡ３）を有する発現プラスミドの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）の生産に使用される；
【図１２ｃ】図ＸＩＩｃは、目的のＲＮＡ配列として、ｇｐ１００抗原をコードする部分抗原配列（ＰＳ−ｇｐ１００又はＰＳ−ＧＰ１００）を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）の生産に使用される；
【図１２ｄ】図ＸＩＩｄは、目的のＲＮＡ配列として、チロシナーゼをコードする部分抗原配列（ＰＳ−Ｔｙｒ又はＰＳ−ＴＹＲ）を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図であり、この発現プラスミドは、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）の生産に使用される；
【図１３ａ】図ＸＩＩＩａは、ＭＡＧＥ  Ａ３抗原をコードするＲＮＡを含む本発明に係る粒子により形質導入されたＢＭＤＣ細胞の表現型を示す図である；
【図１３ｂ】図ＸＩＩＩｂは、ＭＡＧＥ  Ａ３抗原をコードするＲＮＡを含む組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）により形質導入されたＢＭＤＣ細胞の表現型を示す図である；
【図１４】図ＸＩＶは、マウスにおけるＭＡＧＥ  Ａ３を発現するＲｅｎｃａ細胞によって誘導された腫瘍増殖のモニタリングを示す図である；
【図１５】図ＸＶは、本発明に係る、２回反復したＰＰ７ステム−ループモチーフを含む、ＰＰ７ＲＬＰ  レンチウイルス粒子の生産のために使用される、目的のＲＮＡ配列としてルシフェラーゼを有する発現プラスミドに由来する発現カセットの模式図を示す；
【図１６】図ＸＶＩは、インテグラーゼの配列に結合ドメインを挿入するための、ｐ８．７４レンチウイルスカプシド形成プラスミドの改変の模式図を示す；
【図１７】図ＸＶＩＩは、図ＸＶＩに示されたｐ８．７４レンチウイルスカプシド形成プラスミドを改変することによって得られた、本発明に係るＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産に使用されるカプシド形成プラスミドに由来する発現カセットの模式図を示す；
【図１８】図ＸＶＩＩＩは、ＣＤ８発現についての磁気選別及びその後のＣＦＳＥ標識後の、野生型又は腫瘍を発症したＢＡＢＬ／ｃマウスの脾臓に由来する細胞に対するマウスＣＤ８マーカーの、並びにＣＦＳＥの発現プロファイルを示す；
【図１９】図ＸＩＸは、５日間単独で培養したＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋細胞により得られたマウスＣＤ８マーカーの及びＣＦＳＥの発現プロファイル（対照、下部）、並びに、野生型のＢＡＢＬ／ｃマウス（上部）、あるいは腫瘍を発症し（中央部）、ＣＦＳＥで標識し、次いで、ＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子を用いて形質導入されていないＢＭＤＣと（左側）又は形質導入されたＢＭＤＣと（右側）５日間共培養したＢＡＢＬ／ｃマウスの脾臓に由来するＣＤ８＋細胞により得られた発現プロファイルを示す；結果は、増殖した細胞のパーセンテージとして表される；
【図２０】図ＸＸは、ＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子で形質導入されていないか又は形質導入されたＢＭＤＣと共培養したＣＦＳＥ−標識ＣＤ８＋細胞の相対増殖応答を示す図である；１ＤＣ：２Ｔ及び１ＤＣ：４Ｔの比での共培養物の結果を示す；結果は、非形質導入ＢＭＤＣに非特異的に応答する細胞のパーセンテージに対する、ＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子により形質導入されたＢＭＤＣとの接触に応答して増殖する細胞のパーセンテージの比として与えられる（ｎ＝３実験）；
【図２１】図ＸＸＩは、ＲＬＰ．ＭＡＧＥ  Ａ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ粒子によって形質導入されたか又はＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子によって形質導入されたＢＭＤＣと１ＤＣ：２Ｔの比で共培養されたＣＤ８＋細胞の相対増殖応答を比較する実験の結果を示す図である；
【図２２】図ＸＸＩＩは、ＲＬＰ．ＺｓＧｒｅｅｎ１により形質導入されたＢＭＤＣの細胞生存率及びＺｓＧｒｅｅｎ１の発現の用量応答を示す図である；
【図２３】図ＸＸＩＩＩは、本発明に係るＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ及びＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産に使用される、目的のＲＮＡ配列として蛍光レポーターを有する発現プラスミドに由来する発現カセットの模式図を示す；
【図２４】図ＸＸＩＶは、１ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量でのＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ．ＺｓＧｒｅｅｎ１  により形質導入されたＢＭＤＣの細胞生存率及びＺｓＧｒｅｅｎ１の発現動態を示す図である；
【図２５】図ＸＸＶは、形質導入後５時間及び形質導入後２０時間における、ＲＬＰ  ＭＡＧＥＡ３により形質導入されたＵ９３７細胞へのＭＡＧＥＡ３をコードするＲＮＡの転移の実証を示す図である；
【図２６】図ＸＸＶＩは、形質導入後５時間における、ＲＬＰ  ＴＡＡｓ（腫瘍関連抗原又は腫瘍抗原）（ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３、ＰＳ−ＧＰ１００、ＰＳ−ＴＹＲ）により形質導入されたＵ９３７細胞への、３つのＴＡＡｓ（ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３、ＰＳ−ＧＰ１００、ＰＳ−ＴＹＲ）をコードするＲＮＡの転移の実証を示す図である；
【図２７】図ＸＸＶＩＩは、形質導入後２０時間における、ＲＬＰ  ＴＡＡｓ（ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３、ＰＳ−ＧＰ１００、ＰＳ−ＴＹＲ）により形質導入されたＵ９３７細胞への、３つのＴＡＡｓ（ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３、ＰＳ−ＧＰ１００、ＰＳ−ＴＹＲ）をコードするＲＮＡの転移の実証を示す図である；
【図２８】図ＸＸＶＩＩＩは、形質導入後５時間及び形質導入後２０時間における、ＲＬＰ  ＭＡＧＥＡ３により形質導入されたｈＤＣ細胞への、ＭＡＧＥＡ３をコードするＲＮＡの転移の実証を示す図である；
【図２９】図ＸＸＩＸは、形質導入後５時間における、ＲＬＰ  ＴＡＡｓ（ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３、ＰＳ−ＧＰ１００、ＰＳ−ＴＹＲ）により形質導入されたｈＤＣ細胞への、３つのＴＡＡｓ（ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３、ＰＳ−ＧＰ１００、ＰＳ−ＴＹＲ）をコードするＲＮＡの転移の実証を示す図である；
【図３０】図ＸＸＸは、形質導入後２０時間における、ＲＬＰ  ＴＡＡｓ（ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３、ＰＳ−ＧＰ１００、ＰＳ−ＴＹＲ）により形質導入されたｈＤＣ細胞への、３つのＴＡＡｓ（ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３、ＰＳ−ＧＰ１００、ＰＳ−ＴＹＲ）をコードするＲＮＡの転移の実証を示す図である；
【図３１】図ＸＸＸＩは、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子の生産に使用される、２つのサブユニットＩＬ１２ｂ（ｐ４０）及びＩＬ１２ａ（ｐ３５）によって形成された、目的のＲＮＡ配列として、免疫調節タンパク質ＩＬ１２を有する発現プラスミドに由来する発現カセットの模式図を示す；
【図３２】図ＸＸＸＩＩは、形質導入後５時間に、ＲＬＰ−ＩＬ−１２／ＰＳＭＡＧＥＡ３により形質導入されたＵ９３７細胞への、ＭＡＧＥＡ３及びＩＬ１２をコードするＲＮＡの転移の実証を示す図である；
【図３３】図ＸＸＸＩＩＩは、形質導入後２０時間に、ＲＬＰ−ＩＬ−１２／ＰＳＭＡＧＥＡ３により形質導入されたＵ９３７細胞への、ＭＡＧＥＡ３及びＩＬ１２をコードするＲＮＡの転移の実証を示す図である；
【図３４】図ＸＸＸＩＶは、形質導入後５時間に、ＲＬＰ−ＩＬ−１２／ＰＳＭＡＧＥＡ３により形質導入されたｈＤＣ細胞への、ＭＡＧＥＡ３及びＩＬ１２をコードするＲＮＡの転移の実証を示す図である；
【図３５】図ＸＸＸＶは、形質導入後２０時間に、ＲＬＰ−ＩＴ−１２／ＰＳＭＡＧＥＡ３により形質導入されたｈＤＣ細胞への、ＭＡＧＥＡ３及びＩＬ１２をコードするＲＮＡの転移の実証を示す図である；
【図３６】図ＸＸＸＶＩは、ＲＬＰ−ＩＬ１２／ＭＡＧＥＡ３で形質導入されたｈＤＣによって分泌された免疫調節タンパク質ＩＬ１２の定量化を示す図である（形質導入後４８時間）；
【図３７】図ＸＸＸＶＩＩは、ｐ８．７４レンチウイルスカプシド形成プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図を示し、ここでは、結合ドメインＰＰ７  Ｃｏａｔはヌクレオカプシド配列に導入されており、このカプシド形成プラスミドは、本発明に係るＰＰ７ＲＬＰ  レンチウイルス粒子の生産のために使用される；
【図３８】図ＸＸＸＶＩＩＩは、１ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量でのＲＬＰ−ＰＰ７（ＮＣ）．ＺｓＧｒｅｅｎ１により形質導入されたＢＭＤＣの細胞生存率及びＺｓＧｒｅｅｎ１の発現動態を示す図である；
【図３９】図ＸＸＸＩＸは、２ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量でのＪｕｒｋａｔ細胞へのＲＮＡの転移に対する、ＭＳ２ＲＬＰ  １２Ｘ粒子の生産のための野生型ＧＡＧ−ＰＯＬ前駆体の影響を示す図である；
【図４０】図ＸＸＸＸは、１０ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量でのＪｕｒｋａｔ細胞へのＲＮＡの転移に対する、ＭＳ２ＲＬＰ  １２Ｘ粒子の生産のための野生型ＧＡＧ−ＰＯＬ前駆体の影響を示す図である；
【図４１ａ】図ＸＸＸＸＩは、１５秒後（ＸＸＸＸＩｂ）及び１分後（ＸＸＸＸＩａ）の抗ｐ２４ウェスタンブロットによるＭＳ２ＲＬＰウイルス粒子の成熟の分析を示す；並びに
【図４１ｂ】図ＸＸＸＸＩは、１５秒後（ＸＸＸＸＩｂ）及び１分後（ＸＸＸＸＩａ）の抗ｐ２４ウェスタンブロットによるＭＳ２ＲＬＰウイルス粒子の成熟の分析を示す；並びに
【図４２】図ＸＸＸＸＩＩは、ＨＣＴ１１６細胞内に、ＭＳ２及びＰＰ７カプシド形成配列によってカプシド形成されたＲＮＡを転移させるための、ＭＳ２／ＰＰ７−（ＮＣ）ＲＬＰ  １２Ｘ  ２Ｘ粒子の有効性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０２０７】
以下の実施例において、形質導入アッセイの全ては、組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）を用いて、又は蛍光タンパク質をコードする遺伝物質を運ぶＲＮＡを有するレンチウイルス粒子（ＲＬＰ）を用いて行われる。ＲＬＰ粒子が非組み込み型である場合、バッチの力価は、１ミリリットル当たりの物理的粒子（ＰＰ／ｍｌ）として決定されるが、組み込みレンチウイルスベクターについては、力価は従来どおりに、１ミリリットル当たりの形質導入ユニット（transduction units）（ＴＵ／ｍｌ）で表される。したがって、ＲＬＰ粒子での感染多重度（multiplicity of infection）（ＭＯＩ）は、ＰＰ又は細胞当たりのｐｇのｐ２４タンパク質で表され、そして、ＩＬＶベクターでのＭＯＩは、ＴＵ／ｍｌで表される。形質導入アッセイは、飽和条件を回避するよう注意しながら、かつ粒子の各タイプについての用量効果を可視化することを可能にする条件を優先して、ベクターの各タイプについて行われる。ビリオンの逐次回収を優先することによって上清中の毒性タンパク質の産生を最小限に抑えるために、２つのタイプの産物ＲＬＰ及びＩＬＶは、無血清産物であることを覚えておくことが重要である。
一度清澄化されると、高い純度を得るために、上清は、接線限外濾過によって濃縮及び精製される。
【実施例】
【０２０８】
実施例１：本発明に係るウイルス粒子による免疫系の細胞の形質導入、及び他のシステムによる形質導入有効性の比較
Ｉ．本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
１．プラスミド構築
１．１  本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、イントロン配列又はＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない、プロモーター−目的の配列−ｐｏｌｙＡ発現カセットを有する。レンチウイルス粒子にｍＲＮＡを輸送するために、ＭＳ２  ＲＮＡのステム−ループモチーフの１２回の反復（ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号１）を、レポーター遺伝子の下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターは、ＣＭＶ又はＥＦ１プロモーターであり得るが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、レポータータンパク質、例えば天然ホタルルシフェラーゼ、緑色（ＺｓＧｒｅｅｎ１）、赤色（ｍＣｈｅｒｒｙ）又は青色（ｍｔＢＦＰ）蛍光タンパク質をコードするＤＮＡであり得る（その発現カセットは図Ｉに記載されている）。目的の配列は、タンパク質、例えば免疫原性タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードするｃＤＮＡであり得る。目的の配列はまた、ｃＤＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡの配列であり得る。
【０２０９】
・カプシド形成プラスミド：レンチウイルス粒子を、第２のＺｎ  ｆｉｎｇｅｒドメインの代わりに、ヌクレオカプシドタンパク質内にＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質配列を含むように改変した。ＭＳ２ＲＬＰ粒子の生産のために使用された、構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを、以下の戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドは、アセンブリＰＣＲによって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成するために使用される。第２のジンクフィンガーは、ＨｐａＩクローニングによってＭＳ２ファージのコートタンパク質により置換されて、プラスミドｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔを生成する（その発現カセットは図ＩＩに記載されている）。Ｐｏｌコーディング配列は、ＭＳ２ＲＬＰの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のような、特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。
【０２１０】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは例えば、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇ  遺伝子の配列であり得る（その発現カセットは図ＩＩＩに記載されている）。
【０２１１】
１．２  組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶを生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、プロモーター−目的の配列、の発現カセットを有する。目的の遺伝子の配列は、例えば、ルシフェラーゼ（図ＩＶａ）、蛍光レポーター（図ＩＶｂ）又はＣＲＥ  リコンビナーゼ（図ＩＶｃ）の配列であり得る。このプラスミドは、他のエレメント、例えば天然配列ＷＰＲＥ（Woodchuck Hepatitis Virus Post-transcriptional Regulatory Element）又は配列ｃＰＰＴ／ＣＴＳを含んでもよい。ウイルスの病原性は、導入遺伝子によるレトロウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムの領域の置換によって排除されている。
【０２１２】
・カプシド形成プラスミド：構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドが、組み込みレンチウイルスベクターを生産するために使用される（その発現カセットは図Ｖに記載されている）。
【０２１３】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは例えば、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶＧ  遺伝子の配列であり得る（その発現カセットは図ＩＩＩに記載されている）。
【０２１４】
２．バッチの生産
細胞に対するプラスミドのトランスフェクション後に、上清を採取し、粗生成物で使用するか、又は国際公開第２０１３／０１４５３７号の出願に記載の方法に従って濃縮／精製して使用した。
【０２１５】
２．１  レンチウイルスベクター及びレンチウイルス粒子の生産
５％のＣＯ2で湿潤雰囲気下、３７℃で、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のウルトラグルタミン（ＰＡＡ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Gibco、Paisley、ＵＫ）で培養した、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）を用いて１０−スタックの細胞ＴＡＣＫ（６３６０ｃｍ2、Corning）で、生産を行う。血清の影響を研究する実験のために、ＤＭＥＭを１０％のＦＣＳで補充する。特に、酪酸ナトリウムによる誘導は行わない。各バッチ（ＭＳ２ＲＬＰ及びＩＬＶ）について、トランスフェクション混合物は以下の３つのプラスミドからなる：
−粒子（ＭＳ２ＲＬＰ）又はベクターＩＬＶが形成されているかに応じて、上述の発現プラスミドの１つ、
−ｐ８．７４ΔＺＦ  Ｃｏａｔ（ＭＳ２ＲＬＰ）、ｐ８．７４（ＩＬＶ）並びに
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ。
【０２１６】
プラスミドのそれぞれの割合は、以下の通りである：４０％の発現プラスミド、３０％のｐ８．７４（又はｐ８．７４ΔＺＦ）プラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド。
【０２１７】
リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクションから２４時間後に、培養上清を新鮮な未補充ＤＭＥＭ培地で交換する。細胞を３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートする。培地の交換後に、上清を４回採取する（トランスフェクション後３２時間、４８時間、５６時間及び７２時間）。各収集物を、５分間の３０００ｇでの遠心分離によって清澄化した後に、０．４５μｍのフィルター（Stericup（登録商標）、Millipore）で精密ろ過する。全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。
【０２１８】
２．２  レンチウイルスベクター及びレンチウイルス粒子の濃縮及び精製
ベクター及び粒子を、以下の２つの方法の１つに従って濃縮及び精製する：
・方法Ｐ１は、中央遠心分離ユニットでの上清の正面限外濾過を行うことを意図する。
・方法Ｐ２は、上清の接線限外濾過、次いで透析濾過を行うことを意図する。粗上清を、ポリスルホン中空繊維カートリッジを用いた接線限外濾過によって濃縮及び精製する。上清を、ＤＭＥＭ又はＴＳＳＭ緩衝液に対して連続モードで２０ダイアボリューム（diavolumes）での透析濾過によって処理する。透析濾過後に、保持液を回収し、次に中央遠心分離ユニットでの正面限外濾過によって再度濃縮する。
【０２１９】
本実施例についてのバッチの生産／濃縮／精製は、方法Ｐ２に従って行う。
【０２２０】
３．滴定
３．１  ｑＰＣＲによる機能的粒子の滴定
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を、１０％のＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び２ｍＭのＬ−Ｇｌｎで補充した、１００μＬのＤＭＥＭ中の９６−ウェルプレートに播種し、次に、３７℃／５％ＣＯ2で２４時間インキュベートする。各ベクター並びに内部標準について六連希釈を行う。細胞を、Polybrene（登録商標）  ８μｇ／ｍＬ（Sigma）の存在下でこれら連続希釈液により形質導入し、次に、３７℃／５％ＣＯ2で３日間インキュベートする。一連の試料のそれぞれについて、非形質導入細胞の１つのウェルを対象として加える。次に、細胞をトリプシン処理し、Nucleospin tissue gDNA抽出キット（Macherey-Nagel）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した後に、力価（形質導入ユニット／ｍＬ）をｑＰＣＲによって決定する。ｑＰＣＲによって得られた力価（ＴＵ／ｍＬ）を、その力価がＦＡＣＳによって予め決定された内部標準によって正規化する。
【０２２１】
３．２  ＥＬＩＳＡ  Ｐ２４アッセイによる物理的粒子の定量化
ｐ２４カプシドタンパク質は、HIV-1 p24 ELISA kit（Perkin Elmer）を用いて、その推奨に従って、ウイルス上清で直接検出される。捕捉されたｐ２４タンパク質は、ビオチン化ポリクローナル抗体と複合化され、次にストレプトアビジン−ＨＲＰペルオキシダーゼコンジュゲートにより検出される。得られた複合体は、捕捉されたｐ２４タンパク質の量に正比例する黄色の着色を生じるオルトフェニレンジアミン−ＨＣｌ（ＯＰＤ）基質とのインキュベーション後に、分光光度法によって検出される。各ウェルの吸光度を、Synergy H1 Hybridプレートリーダー（Biotek）を用いて定量化し、標準範囲のｐ２４タンパク質の吸光度に対して較正する。１ｐｇのｐ２４タンパク質が１０4個の物理的粒子に対応することを知ることによって、１ｍｌあたりの物理的粒子として表されるウイルス力価を、得られたｐ２４タンパク質の濃度から計算する。
【０２２２】
ＩＩ．免疫系の細胞の形質導入
１．リンパ球
１．１  ヒトリンパ球細胞の調製
全ヒトリンパ球を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配で末梢単核細胞又はＰＢＭＣ（末梢血単核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cell））を単離することによって、全ヒト血液から調製する。血液試料を室温で採取し、適切なチューブ（１５又は５０ｍｌ）中でＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４で１／２に希釈する。
【０２２３】
１容量のＦｉｃｏｌｌ溶液（GE Healthcare）を、２容量の希釈血液の下に慎重に入れる。混合されない２つの分離相を得ることが重要である：下相はＦｉｃｏｌｌに対応し、上相は希釈血液に対応する。チューブを、３０分間４００ｇで室温で遠心分離する。遠心分離後に得られる異なる相を乱すのを避けるために、遠心分離機のブレーキを停止する。
【０２２４】
上相は血漿に対応し、下相はＦｉｃｏｌｌに対応し、そして、これら２つの相の間に環が形成され、これは目的の集団（ＰＢＭＣ）を含む。
【０２２５】
ＰＢＭＣの環を注意深くピペットで取り、新しいチューブに移す。次に、ＰＢＭＣを、少なくとも３容量のＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４の溶液で２回洗浄する。細胞を１０分間１００ｇで室温で遠心分離する。
【０２２６】
上清を除去したら、ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ培養培地、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンに再懸濁し、番号を付する。
【０２２７】
細胞を１．１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、プラスチック培養支持体上に３７℃／５％ＣＯ2で２時間置く。このステップは、単球がプラスチックに接着することを可能にし、一方で、リンパ球は懸濁液中に残り、従って、形質導入の準備として１．５６×１０5細胞／ｃｍ2で播種される前の培養上清中に回収され得る。
【０２２８】
１．２  マウスリンパ球細胞の調製
マウスリンパ球を脾臓から調製する。頸椎脱臼による動物の安楽死後に、脾臓をマウスから回収する。脾臓を、６−ウェル培養プレートのウェルに入れ、２６Ｇ  １／２針を装着した注射器での２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＤ（Roche diagnostics）の溶液の１ｍｌの注入によって膨潤させる。脾臓を、２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＤの溶液の１ｍｌ中で滅菌メスを用いてウェル内で小片に切断する。脾臓の小片を含む２ｍｌの溶液を、１５−ｍｌチューブに移し、＋３７℃の水浴中で３０分間インキュベートする。１５ｍｌの最終容量に１３ｍｌの冷ＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、０．５％ＦＣＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ）を添加することによって、酵素消化を停止させる。細胞懸濁液を、５０−ｍｌチューブ上に置いた７０−μｍ細胞篩で濾過する。容量を冷ＭＡＣＳ緩衝液で３０ｍｌにする。細胞懸濁液を、１０分間３００ｇで、＋４℃で遠心分離する。
【０２２９】
次に、ＣＤ８マーカーの発現についてのポジティブソーティングを行う。このために、上清を吸引により除去し、細胞ペレットを、９０μｌの冷ＭＡＣＳ緩衝液及び１０7細胞について１０μｌの抗ＣＤ８ビーズ（Miltenyi Biotec）に取る。  混合物を１５分間＋４℃でインキュベートする。インキュベーションの最後に、一定容量のＭＡＣＳ緩衝液ｑ．ｓ．１５ｍｌを懸濁液に加える。懸濁液を１０分間３００ｇで、＋４℃で遠心分離する。上清を除去し、細胞ペレットを、１０8細胞のための冷ＭＡＣＳ緩衝液の５００μｌに取る。懸濁液を、磁石を取り付けて冷ＭＡＣＳ緩衝液で予め平衡化したＭＳ型のカラム（Miltenyi Biotec）に入れる。カラムを３ｘ５００μｌの冷ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄する。ネガティブ画分（約２ｍｌ）を冷ＭＡＣＳ緩衝液で５ｍｌにし、次に細胞計数を実施する。細胞懸濁液を、１０分間３００ｇで、＋４℃で遠心分離し、細胞を、タイプＴＣＴ  ６−ウェルプレート（Corning）内で、１．１０6細胞／ｍｌの割合で、１０％のウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンで補充したＲＰＭＩ  １６４０培地内中に再懸濁し、形質導入する。
【０２３０】
ソーティング後に、得られた異なる画分を、選別された集団の純度をモニタリングするための抗ＣＤ８  抗体標識を用いたフローサイトメトリー（Miltenyi Biotec）によって分析する。
【０２３１】
１．３  リンパ球（ヒト及びマウス）の形質導入
形質導入の日に、リンパ球を、１ウェル当たり５０μｌの容量で細胞培養用に処理された平底９６−ウェルプレート中に０．５×１０6細胞／ｍｌの割合で再懸濁しする。４μｇ／ｍｌの最終Polybrene（登録商標）と、選択されたＭＯＩでの様々なベクター（すなわちＲＬＰの場合には１０、２０又は３０ｐｇ  ｐ２４／細胞、及びヒトＴリンパ球のためのＩＬＶの場合にはＭＯＩ  １０、２０、２５又は５０；ＲＬＰの場合には０．１、０．５、１、又は  ５ｐｇ  ｐ２４／細胞、並びに、マウスＣＤ８＋Ｔリンパ球のためのＩＬＶの場合にはＭＯＩ  ５、１０、２５、５０又は７５）とを含有する形質導入培地を調製し、１００μｌ／ウェルの最終容量のために、５０μｌの容量で細胞に添加する。次にプレートを７５分間１０００ｇで、３０℃で遠心分離する。形質導入培地を、遠心分離ステップの後に、３７℃、５％ＣＯ2で４時間細胞上に放置する。このインキュベーション後に、８０％の形質導入培地（８０μｌ）を抜き取り、１８０μｌのＲＰＭＩ培地、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを、各ウェルに添加する。細胞を３７℃、５％ＣＯ2で分析までインキュベートする。
【０２３２】
２．樹状細胞
２．１  ヒト樹状細胞の調製
２．１．１  ヒト全血からのヒト末梢単核細胞（peripheral mononuclear cell）（ＰＢＭＣ）の単離
ヒト樹状細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ勾配でＰＢＭＣを単離することによって全ヒト血液から調製する。血液試料を室温で採取し、適切なチューブ（１５又は５０ｍｌ）内でＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４で１／２に希釈する。
【０２３３】
１容量のＦｉｃｏｌｌ溶液（GE Healthcare）を、２容量の希釈血液の下に慎重に入れる。混合されない２つの分離相を得ることが重要である：下相はＦｉｃｏｌｌに対応し、上相は希釈血液に対応する。チューブを、３０分間４００ｇで室温で遠心分離する。遠心分離後に得られる異なる相を乱すのを避けるために、遠心分離機のブレーキを停止する。
【０２３４】
上相は血漿に対応し、下相はＦｉｃｏｌｌに対応し、そして、これら２つの相間に環が形成され、これは目的の集団（ＰＢＭＣ）を含む。
【０２３５】
ＰＢＭＣの環を注意深くピペットで取り、新しいチューブに移す。次に、ＰＢＭＣを、少なくとも３容量のＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４の溶液で２回洗浄する。細胞を１０分間１００ｇで室温で遠心分離する。
【０２３６】
上清を除去したら、ＰＢＭＣを、ＳＦＭ培養培地、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンに再懸濁し、番号を付する。
【０２３７】
細胞を１．１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し（２．５×１０6細胞／ｃｍ2）、３７℃／５％ＣＯ2で２時間、タイプＴＣＴ  ４８−ウェルプレート（Corning）に入れる。このステップは、単球がプラスチックに接着することを可能にし、一方で、リンパ球は懸濁液中に残る。２時間のインキュベーション後、単球のみが培養され続けるようにプレートをＰＢＳ１Ｘで洗浄し、これを形質導入することになる。
【０２３８】
２．１．２  樹状細胞への単球の集団の分化
樹状細胞を、タイプＴＣＴ  ４８−ウェルプレート（Corning）内で、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、２００ｎＭのヒトＩＬ４及び５０ｍＭのヒトＧＭ−ＣＳＦで補充したＳＦＭ培地中に、１．１０6細胞／ｍｌの割合で培養する。これら培養条件は、未熟表現型の樹状細胞（ｉＤＣ）を得ることを可能にする。樹状細胞を、３７℃／５％ＣＯ2で５日間培養し続け、３日目に培養培地を更新する。
【０２３９】
成熟樹状細胞（ｍＤＣ）を得るために、培養の３日目に、細胞を、０．１  μｇ／ｍｌのＬＰＳを含有する成熟培地に入れる。
【０２４０】
２．２  マウス樹状細胞の調製
マウス樹状細胞（ＤＣ）を、後肢から得られた骨髄から調製する（ＢＭＤＣ培養）。長骨、大腿骨及び脛骨を成体マウスから回収し、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地を含有する５０−ｍｌチューブに移す。２６Ｇ  １／２針を装着し、１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補充したＲＰＭＩ  １６４０培地を含有する注射器を用いて、骨から骨髄を取り除く。細胞懸濁液を、５分間３００ｇで、＋４℃で遠心分離する。上清を除去し、１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補充したＲＰＭＩ  １６４０培地の１ｍｌ＋Ｇｅｙ溶液（１５５ｍＭのＮＨ4Ｃｌ、１ｍＭのＫＨＣＯ3）の３ｍｌに、ペレットを取る。細胞懸濁液に含まれる赤血球を溶解するために、懸濁液を５分間室温でインキュベートする。インキュベーション後、１０％のウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンで補充したＲＰＭＩ  １６４０培地で、容量を１５ｍｌに調整し、反応を止め、細胞懸濁液を５分間３００ｇで、＋４℃で遠心分離する。上清を除去し、１０％のウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンで補充したＲＰＭＩ  １６４０培地の一定容量に、ペレットを取る。この細胞懸濁液を、５０−ｍｌ  チューブ上に置いた７０−μｍ  細胞篩で濾過する。約３０ｍｌの最終容量が得られるまで、篩をすすぐ。細胞を計数し、細胞懸濁液を５分間３００ｇで遠心分離する。上清を除去し、１０％のウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μＭの２−メルカプトエタノール、２５ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ４及び２５ｎｇ／ｍｌのマウスＧＭ−ＣＳＦで補充したＲＰＭＩ  １６４０培地の一定容量に、ペレットを取り、１．１０6細胞／ｍｌの細胞濃度を与える。樹状細胞を、タイプＵＬＡ  ６−ウェルプレート（Corning）内で１．１０6細胞／ｍｌの割合で培養する。樹状細胞を３７℃／５％ＣＯ2で５日間培養し続け、２〜３日毎に培養培地を交換する。３日目に、ＢＭＤＣを、培養に使用したプレートに依然として接着しているマクロファージ型の細胞からそれらを分離するために、新しい６−ウェルＵＬＡプレートに戻す。
【０２４１】
２．３  ヒト樹状細胞の形質導入
ＰＢＭＣの単離に対応する日に、細胞を、選択されたＭＯＩ（ＲＬＰの場合には１、２又は４ｐｇ  ｐ２４／細胞、及びＩＬＶの場合にはＭＯＩ  ２５、５０又は７５）でのＩＬＶ．ＥＦ１．ＺｓＧｒｅｅｎ１ベクターによって、ＳＦＭ培養培地、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で、以下のトランスフェクション剤：４μｇ／ｍＬでのPolybrene（登録商標）（Sigma）及びＢＸ７９５  ６μＭ（Invivogen）と共に、形質導入し、そして＋３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートする。形質導入から４時間後に、形質導入培地を、樹状細胞に特異的な分化培地（ＳＦＭ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２００  ｎＭ  ヒトＩＬ４及び５０ｍＭのヒトＧＭ−ＣＳＦ）で交換する。この培地は、未熟樹状細胞（ｉＤＣ）の培養を可能にする。ＥＦ１．ＺｓＧｒｅｅｎ１カセットでの形質導入を十分に行うために、細胞を播種後４時間に、種々のベクター（ＲＬＰ又はＩＬＶ）によって形質導入する。
【０２４２】
形質導入された細胞を異なる時点で分析する（形質導入後１、２、３及び４日）。
【０２４３】
成熟樹状細胞（ｍＤＣ）を得るために、細胞を、培養の３日目に０．１  μｇ／ｍｌのＬＰＳを含有する成熟培地に入れ、それらを４日目に分析する。
【０２４４】
２．３．１  ＲＬＰ．ＺｓＧｒｅｅｎ１によるヒト樹状細胞の形質導入
ＲＬＰ．ＺｓＧｒｅｅｎ１ベクターによって形質導入された樹状細胞は、１ｐｇ  ｐ２４〜４ｐｇ  ｐ２４／細胞のＲＬＰ粒子の増加する範囲に従って、かつ異なる分析時点での（ｉＤＣについて形質導入後１、２、３及び４日、並びにｍＤＣについて形質導入後４日）、フローサイトメトリーによって分析された蛍光の発現の特徴付けと関連した開発の主題であった。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である４μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）（Sigma）及びＢＸ７９５  ６μＭ（Invivogen）を含有する培地のみを用いて調製する。
【０２４５】
樹状細胞は、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ２０９  ＤＣ  ＳＩＧＮ、抗ＣＤ８６特異的抗体（Miltenyi Biotec）による免疫標識によって表現型が決定され、フローサイトメトリーにより特徴付けられる。
【０２４６】
２．３．２  ＩＬＶ．ＥＦ１．ＺｓＧｒｅｅｎ１によるヒト樹状細胞の形質導入
ＩＬＶ．ＥＦ１．ＺｓＧｒｅｅｎ１ベクターによって形質導入された樹状細胞は、感染多重度ＭＯＩ  ２５〜７５のＩＬＶレンチウイルス粒子の増加する範囲にわたって、かつ異なる分析時点での（ｉＤＣについて形質導入後１、２、３及び４日、並びにｍＤＣについて形質導入後４日）、フローサイトメトリーによって分析された蛍光の発現の特徴付けと関連した開発の主題であった。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である４μｇ／ｍＬでのPolybrene（登録商標）（Sigma）及びＢＸ７９５  ６μＭ（Invivogen）のみを含有する培地で調製する。
【０２４７】
樹状細胞は、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ２０９  ＤＣ  ＳＩＧＮ、抗ＣＤ８６特異的抗体（Miltenyi Biotec）による免疫標識によって表現型が決定され、フローサイトメトリーにより特徴づけられる。
【０２４８】
２．４  マウス樹状細胞（ＢＭＤＣ）の形質導入
培養開始から６日後に、樹状細胞を回収し、５分間３００ｇで遠心分離する。上清を除去し、細胞を、１０％のウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンで補充したＲＰＭＩ  １６４０の１ｍｌで洗浄し、５分間３００ｇで遠心分離する。樹状細胞を、９６−ウェル又は２４−ウェルプレート内、１０％のウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、２５ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ４及び２５ｎｇ／ｍｌのマウスＧＭ−ＣＳＦで補充したＲＰＭＩ  １６４０中に、０．５×１０6細胞／ｍｌで播種する。ＺｓＧｒｅｅｎ１蛍光の発現による形質導入を十分に行うために、細胞を播種後２４時間に、種々のベクター（ＲＬＰ又はＩＬＶ）によって形質導入する。形質導入はPolybrene（登録商標）  ４μｇ／ｍＬ（Sigma）の存在下で行い、１０００ｇで７５分間＋３０℃でのプレートの回転培養（spinoculation）に続く。次に、形質導入培地を４時間＋３７℃／５％ＣＯ2で放置する。
【０２４９】
インキュベーション後、８０％の形質導入培地をピペッティングにより除去し、１０％のウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、２５ｎＭ  マウス  ＩＬ４及び２５ｎｇ／ｍｌの予熱したマウスＧＭ−ＣＳＦで補充した等量のＲＰＭＩ  １６４０と交換する。次に、細胞を３７℃／５％ＣＯ2に戻す。
【０２５０】
２．４．１  ＲＬＰ．ＺｓＧｒｅｅｎ１によるマウス樹状細胞の形質導入
ＲＬＰ．ＺｓＧｒｅｅｎ１ベクターによって形質導入された樹状細胞は、０．１ｐｇ  ｐ２４〜５ｐｇ  ｐ２４／細胞のＲＬＰ粒子の増加する範囲にわたって、かつ異なる分析時点での（形質導入後１、２、３及び４日）、フローサイトメトリーによって分析された蛍光の発現の特徴付けと関連した開発の主題であった。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である４μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）（Sigma）を含有する培地のみで調製する。
【０２５１】
樹状細胞は、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ８０特異的抗体（Miltenyi Biotec）による免疫標識によって表現型が決定され、フローサイトメトリーにより特徴づけられる。
【０２５２】
２．４．２  ＩＬＶ．ＥＦ１．ＺｓＧｒｅｅｎ１によるマウス樹状細胞の形質導入
ＩＬＶ．ＥＦ１．ＺｓＧｒｅｅｎ１ベクターによって形質導入された樹状細胞は、感染多重度ＭＯＩ  ５〜７５のレンチウイルス粒子ＩＬＶの増加する範囲にわたって、かつ異なる分析時点での（形質導入後１、２、３及び４日）、フローサイトメトリーによって分析された蛍光の発現の特徴付けと関連した開発の主題であった。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である４μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）（Sigma）を含有する培地のみで調製する。
【０２５３】
樹状細胞は、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ８０特異的抗体（Miltenyi Biotec）による免疫標識によって表現型が決定され、フローサイトメトリーにより特徴づけられる。
【０２５４】
３．細胞の表現型決定及び特徴づけ
３．１  リンパ球の免疫標識
ソーティング後に、又は形質導入後の異なる分析時点で、リンパ球を、それらが懸濁している培養プレートから回収し、細胞を円錐底９６−ウェル培養プレートのウェルに移す。細胞を、ＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳの溶液で洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転によって除去する。
【０２５５】
リンパ球を、蛍光色素とコンジュゲートした以下の特異的抗体による免疫標識によって表現型決定する：抗ＣＤ８、抗ＣＤ４、抗ＣＤ３又は抗ＴＣＲ（Miltenyi Biotec）。このために、抗体の溶液の混合物を調製し、ウェル当たり５０μｌを細胞上に堆積させる。細胞を室温暗所で２０分間インキュベートする。５０μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳを添加し、細胞を３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、１００μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳに取る。細胞を３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、１００μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳに取り、フローサイトメトリーによって分析する。
【０２５６】
３．２  ヒト樹状細胞の免疫標識
各分析時点に、ウェルを、培養プレートのフォーマットに応じてピペットコーン又はスクレーパーで掻き取り、細胞を円錐底９６−ウェル培養プレートのウェルに移す。細胞をＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳの溶液で洗浄し、、３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。
【０２５７】
樹状細胞を、蛍光色素とコンジュゲートした以下の特異的抗体による免疫標識によって表現型決定する：抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ２０９  ＤＣ  ＳＩＧＮ、抗ＣＤ８６（Miltenyi Biotec）。このために、抗体の溶液の混合物を調製し、ウェル当たり５０μｌを回収した樹状細胞上に堆積させる。細胞を室温暗所で２０分間インキュベートする。５０μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳを添加し、細胞を３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、１００μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳに取る。細胞を３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、１００μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳに取り、フローサイトメトリーによって分析する。
【０２５８】
３．３  マウス樹状細胞の免疫標識
各分析時点に、細胞を、円錐底９６−ウェル培養プレートのウェルに移す。細胞を、ＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４の溶液で洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。
【０２５９】
樹状細胞の生存率を、「Viobility（商標）４８５／５２０」生存率マーカー（Miltenyi Biotec）での特異的免疫標識によって分析する。このために、ＤＭＳＯ溶液中のViobility（商標）の１μｌを、１００μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ７．４中の細胞の各ウェルに適用する。細胞を室温暗所で２０分間インキュベートする。細胞を３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、１００μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳに取り、再度３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、１００μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳに取り、表現型について後述するように特異的抗体で標識する。
【０２６０】
樹状細胞を、蛍光色素とコンジュゲートした以下の特異的抗体による免疫標識によって表現型決定する：抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ８０（Miltenyi Biotec）。このために、抗体の溶液の混合物を調製し、ウェル当たり５０μｌを回収した樹状細胞上に堆積させる。細胞を室温暗所で２０分間インキュベートする。５０μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳを添加し、細胞を３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、１００μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳに取る。細胞を３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、１００μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳに取り、フローサイトメトリーによって分析する。
【０２６１】
３．４  フローサイトメトリー
免疫標識した樹状細胞をフローサイトメトリー（Miltenyi Biotec）によって分析し、解析する。試料を、それらのサイズ（ＳＳＣ）及びそれらの粒度（ＦＳＣ）に従って較正した。Viobility（商標）で標識された細胞は、死んでいるか死にかけている、従って生細胞は陰性細胞である（除外による標識）。細胞は、MacsQuantVYB（Miltenyi Biotec）で特徴づけられ、MacsQuantソフトウェア（Miltenyi Biotec）で分析される。
【０２６２】
ＩＩＩ．結果：
１．ＲＬＰ及びＩＬＶによる免疫細胞の形質導入有効性の比較
１．１  Ｔリンパ球
ＲＬＰ粒子又はＩＬＶベクターによるＴリンパ球の形質導入は、ヒト（図ＶＩａ及びＶＩｂ）においてマウス（図ＶＩＩａ及びＶＩＩｂ）よりも優れた有効性を示している。実際に、ナイーブヒトＴリンパ球は、ＲＬＰにより７０％の有効性で形質導入され、これはＩＬＶベクターにより得られる有効性に匹敵する。同様に、陽性細胞の９０％超が、ＩＬＶによるように、ＲＬＰによる活性化後に得られる。しかしながら、マウスＴリンパ球は形質導入することがさらに困難であり、結果は、試験された感染多重度の条件下でＲＬＰについての２０％からＩＬＶによる７０％までの範囲である。感染多重度（ＭＯＩ）を高めることにより、マウスＴリンパ球に対してより高い有効性を得ることが可能であるが、細胞毒性を誘発する危険性がある。
【０２６３】
１．２  樹状細胞
樹状細胞（ＤＣ）の第１の形質導入アッセイを、健康なヒトドナーからの末梢血から調製したヒト細胞に対して行った。
【０２６４】
ＲＮＡを有するレンチウイルス粒子（ＲＬＰ）又は組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）による未熟ヒト樹状細胞（ＤＣ）の形質導入は、同等の有効性を示す。発現は、形質導入後４日まで安定なままである（図ＶＩＩＩｃ）。４ｐｇ  ｐ２４／細胞のＭＯＩでのＲＬＰ粒子によるヒトＤＣの形質導入は（図ＶＩＩＩａ）、４０％の陽性細胞をもたらす。この同じ４０％の有効性は、ＭＯＩ  ７５でのＩＬＶベクターにより得られる（図ＶＩＩＩｂ）。組み込みのために、ＩＬＶベクターによる形質導入から生じる発現は、経時的に安定なままである（図ＶＩＩＩｄ）。形質導入されたＤＣに対するヒトＤＣに特徴的な４つのバイオマーカーの分析は、これらバイオマーカーの発現がＲＬＰ粒子による形質導入によって有意に改変されないことを示し（図ＶＩＩＩｅ）、形質導入が標的細胞の表現型を改変しないことを実証する。ＣＤ２０９マーカーのわずかな増加のみを伴って、同じ結果が組み込みレンチウイルスベクターにより得られている（図ＶＩＩＩｆ）。これら結果は、ＩＬＶベクター及びＲＬＰ粒子による形質導入が、未熟ＤＣの未熟表現型を乱すことなく、かつそれらを活性化又は分化プロセス又は経路に関与させないことを示している。
【０２６５】
並行して、形質導入アッセイを、培養物にＬＰＳを添加することによって、成熟した樹状細胞に対して行った。結果は、４ｐｇ  ｐ２４／細胞のＭＯＩでの粒子により３０％の（図ＩＸａ）及び７５のＭＯＩでのＩＬＶベクターにより５０％の（図ＩＸｂ）成熟ＤＣの形質導入の有効性を示す。前述のように、ＲＬＰ粒子（図ＩＸｃ）及びＩＬＶベクター（図ＩＸｄ）による形質導入は、樹状細胞に特徴的なバイオマーカーの発現を有意に妨げない。
【０２６６】
同じ形質導入アッセイを、マウス骨髄に由来する樹状細胞（ＢＭＤＣ）に対して行った。得られた結果は、５ｐｇ  ｐ２４／細胞のＭＯＩでのＲＬＰ粒子により８０％の（図Ｘａ）及び７５のＭＯＩでのＩＬＶベクターにより９０％の（図Ｘｂ）ＢＭＤＣの形質導入を示す。いずれの場合にも、ＲＬＰ粒子又はＩＬＶベクターによる形質導入は、用量効果を示す。ＲＬＰ粒子によるＢＭＤＣの形質導入動態は、蛍光が形質導入後４日で安定なままであることを示している（図Ｘｃ）。ＩＬＶベクターにより形質導入されたＢＭＤＣにおける蛍光発現の動態は、３日目から開始して組み込みベクターについて古典的にのみ見られた（図Ｘｄ）。並行して、マウスＤＣの特異的バイオマーカーの発現は、ＲＬＰ粒子（図Ｘｅ）によるものであるか又はＩＬＶベクターによるものであっても（図Ｘｆ）、形質導入後に改変されない。
【０２６７】
２．マウス樹状細胞（ＢＭＤＣ）におけるＲＬＰ及びＩＬＶの用量増加により誘導された毒性の分析
形質導入アッセイを、上述したマウス骨髄に由来する樹状細胞（ＢＭＤＣ）に対して行ったが、ＩＬＶ又はＲＬＰの増加用量での形質導入によって毒性が誘導されたかを評価するために、死細胞の特異的標識を含んだ形質導入されたＢＭＤＣを、全生細胞のパーセンテージ、並びに樹状細胞の特異的ＣＤ１１ｃマーカーを発現する細胞のうちＺｓＧｒｅｅｎ１を発現する細胞のパーセンテージに基づいて、Ｄ２に分析した。得られた結果（図ＸＸＩＩ）は、形質導入後４８時間に、ＣＤ１１ｃを発現するＢＭＤＣにおけるＺｓＧｒｅｅｎ１の発現の特異的分析が、０．５ｐｇ  ｐ２４／細胞のＭＯＩから始まるＣＤ１１ｃ＋ＢＭＤＣの５０％のＲＬＰ粒子により、及び７５のＭＯＩでのＩＬＶベクターによる７５％の形質導入を示すことを示している。用量効果はまた、これら細胞によって発現された蛍光強度の分析において観察され、ＲＬＰについての同等のレベルは、ＩＬＶについてはＭＯＩ  １又はＲＬＰについては５ｐｇ  ｐ２４／細胞で使用される。最後に、ＢＭＤＣに適用されたＲＬＰ粒子の用量に関わらず（０．１〜５ｐｇ  ｐ２４／細胞）、有意な毒性は観察されない（生存率＞８０％）。いずれの場合にも、従って、ＲＬＰ粒子による又はＩＬＶベクターによる形質導入は、初代細胞に対して、及び特にＡＰＣに対してのレンチウイルス粒子の非毒性を実証する。
【０２６８】
実施例２：免疫細胞における受容体又は  抗原の発現の有効性
Ｉ．本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
１．プラスミド構築
１．１  本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、イントロン配列又はＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない、プロモーター−目的の配列−ｐｏｌｙＡ発現カセットを有する。レンチウイルス粒子にｍＲＮＡを輸送するために、ＭＳ２  ＲＮＡのステム−ループモチーフの１２回の反復（ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号１）を、レポーター遺伝子の下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターは、ＣＭＶ又はＥＦ１プロモーターであり得るが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、抗原又はエピトープをコードし得る。目的の配列は、タンパク質、例えば免疫原性タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードするｃＤＮＡであり得る。多くのバイオマーカーが腫瘍細胞上で同定されており、それらの完全な配列及び／又は部分配列が免疫療法に使用される。例えば、ＭＡＧＥＡ３抗原を発現するために使用される配列は、完全（図ＸＩａ）又は部分的（図ＸＩｂ）であり得る。腫瘍バイオマーカーの他の部分配列が使用されてもよく、例えばｇｐ１００（図ＸＩｃ）又はチロシナーゼ（図ＸＩｄ）の部分配列である。腫瘍バイオマーカーの完全又は部分配列の多くの他の例が使用されてもよい。
【０２６９】
・カプシド形成プラスミド：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットは図ＩＩに記載されている）。
【０２７０】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットは図ＩＩＩに記載されている）。
【０２７１】
１．２  組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶを生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、プロモーター−目的の配列、の発現カセットを有する（その発現カセットは図ＸＩＩに記載されている）。このプラスミドは、他のエレメント、例えば天然配列ＷＰＲＥ（Woodchuck Hepatitis Virus Post-transcriptional Regulatory Element）又は配列ｃＰＰＴ／ＣＴＳを含んでもよい。ウイルスの病原性は、導入遺伝子によるレトロウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムの領域の置換によって排除されている。前述のように、目的の配列は、完全な抗原性タンパク質、抗原又はエピトープをコードし得る。多くのバイオマーカーが腫瘍細胞上で同定されており、それらの完全な配列及び／又は部分配列が免疫療法に使用される。例えば、ＭＡＧＥＡ３を発現するために使用される配列は、完全（図ＸＩＩａ）又は部分的（図ＸＩＩｂ）であり得る。腫瘍バイオマーカーの他の部分配列が使用されてもよく、例えばｇｐ１００（図ＸＩＩｃ）又はチロシナーゼ（図ＸＩＩｄ）の部分配列である。腫瘍バイオマーカーの完全又は部分配列の多くの他の例が使用されてもよい。
【０２７２】
・カプシド形成プラスミド：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットは図Ｖに記載されている）。
【０２７３】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットは図ＩＩＩに記載されている）。
【０２７４】
２．バッチの生産及び滴定
バッチの生産及び滴定は、以下の発現プラスミドの１つを用いて、実施例１に記載したように方法Ｐ２に従って行われる：
−ｐｃＤＮＡ−ＥＦ１．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｇｅｎｅ．ＭＳ２  １２Ｘ（その発現カセットは図Ｉに記載されている）。
−ｐＩＬＶ−ＥＦ１．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｇｅｎｅ．ＷＰＲＥ（その発現カセットは図ＩＶｂに記載されている）。
−ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ＰＰＲＶ．ＭＡＧＥＡ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ＭＳ２  １２Ｘ（その発現カセットは図ＸＩａに記載されている）。
−ｐＩＬＶ．ＥＦ１．ＭＡＧＥＡ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ（その発現カセットは図ＸＩＩａに記載されている）。
【０２７５】
バッチの滴定は、実施例１に記載されたものと同一の方法によって行う。
【０２７６】
ＩＩ．マウス樹状細胞（ＢＭＤＣ）の形質導入
マウス樹状細胞を、実施例１に記載されたものと同一の方法によって調製する。
【０２７７】
１．ＲＬＰ−ＭＡＧＥ  Ａ３−ＩＲＥＳ−ＧＦＰによる単一腫瘍抗原でのマウス樹状細胞の形質導入
ＲＬＰ．ＭＡＧＥ  Ａ３−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ粒子により形質導入された樹状細胞は、０．１ｐｇ  ｐ２４〜５ｐｇ  ｐ２４のＲＬＰ粒子の増加する範囲にわたって、かつ異なる分析時点での（形質導入後１、２、３及び４日）、フローサイトメトリーによって分析された蛍光の発現の特徴付けと関連した開発の主題であった。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である４μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）（Sigma）のみを含有する培地で調製する。
【０２７８】
樹状細胞は、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ８０特異的抗体（Miltenyi Biotec）による免疫標識によって表現型が決定され、フローサイトメトリーにより特徴づけられる。
【０２７９】
２．ＩＬＶ−ＭＡＧＥ  Ａ３−ＩＲＥＳ−ＧＦＰによる単一腫瘍抗原でのマウス樹状細胞の形質導入
ＩＬＶ−ＭＡＧＥ  Ａ３−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターによって形質導入された樹状細胞は、感染多重度ＭＯＩ  ５〜７５のレンチウイルス粒子ＩＬＶの増加する範囲にわたって、かつ異なる分析時点での（形質導入後１、２、３及び４日）、フローサイトメトリーによって分析された蛍光の発現の特徴付けと関連した開発の主題であった。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である４μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）（Sigma）のみを含有する培地で調製する。
【０２８０】
樹状細胞は、抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ８０特異的抗体（Miltenyi Biotec）による免疫標識によって表現型が決定され、フローサイトメトリーにより特徴づけられる。
【０２８１】
３．細胞の表現型決定及び特徴づけ
３．１  マウス樹状細胞の免疫標識
各分析時点に、細胞を、円錐底９６−ウェル培養プレートのウェルに移す。細胞を、ＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４の溶液で洗浄し、５％ＦＣＳ、３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。
【０２８２】
樹状細胞を、蛍光色素とコンジュゲートした以下の特異的抗体による免疫標識によって表現型決定する：抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ８０（Miltenyi Biotec）。このために、抗体の溶液の混合物を調製し、ウェル当たり５０μｌを回収した樹状細胞上に堆積させる。細胞を室温暗所で２０分間インキュベートする。５０μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳを添加し、細胞を３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、１００μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳに取る。細胞を３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。細胞を、１００μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳに取り、フローサイトメトリーによって分析する。
【０２８３】
３．２  フローサイトメトリー
免疫標識した樹状細胞をフローサイトメトリー（Miltenyi Biotec）によって分析し、解析する。試料を、それらのサイズ（ＳＳＣ）及びそれらの粒度（ＦＳＣ）に従って較正した。細胞は、MacsQuantVYB（Miltenyi Biotec）で特徴づけられ、MacsQuantソフトウェア（Miltenyi Biotec）で分析される。
【０２８４】
ＩＩＩ．研究モデルの提示
１．Ｒｅｎｃａ腫瘍モデル
このモデルは、Ｒｅｎｃａタイプのマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）腎臓癌の腫瘍細胞を使用する。これらマウス細胞は、ヒト起源のＭＡＧＥ  Ａ３抗原を発現するようにＩＬＶ．ＥＦ１．ＭＡＧＥ  Ａ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰベクター（ＭＯＩ  １００）により予め形質導入される。次に、このモデルは、成体の同系のＢａｌｂ／ｃマウスの脇腹に、所定数のこれらの細胞（１．１０6細胞）を皮下に再移植することからなる。予備研究は、非常に早く限界点に達することなく、全ての動物で発達する腫瘍を発生させるための再移植する細胞の数を決定することを可能にする（腫瘍＞２ｍｍ3、動物の体重減少＞腫瘍の移植の日の体重の２０％）。動物は、登録されたブリーダー（Janvier Europe又はCharles River Labs）から入手し、これら実験の全てについて詳述したプロトコルは、地域の倫理委員会（ＣＥＥＡ−１２２倫理委員会）に提出され、承認された。
【０２８５】
２．改変された樹状細胞の再移植
ＢＭＤＣを、実施例１（２．４）に記載されたように、ＲＬＰタイプ（実施例１、段落２．４．１）又はＩＬＶタイプ（実施例１、段落２．４．２）の粒子により形質導入し、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける形質導入翌日に、腫瘍再移植と同じ側に位置する鼠径リンパ節のレベルで皮内に再移植する。異なる量の細胞を、このモデルにおける治療力を評価するために再移植することができる。
【０２８６】
３．腫瘍発生のモニタリング
全ての動物をその全身状態について毎日チェックする。１週間に３回、それらを秤量し、腫瘍の発生をキャリパーゲージを用いて手動で測定する。腫瘍体積は、以下の式に従ってｍｍ3で与えられる：Ｖ＝ａ＊（ｂ2／２）、ここで、ａ＝最大直径、及びｂ＝最小直径。倫理的な理由から、腫瘍の発生は２０００ｍｍ3の体積に制限され、この限界に達するか、又はその初期体重（＝腫瘍細胞の再移植の日における）の２０％超を失った動物は屠殺される。
【０２８７】
ＩＶ．結果：ＲＬＰ及びＩＬＶによる抗原の発現の有効性の比較
第１の実験は、マウス樹状細胞（ＢＭＤＣ）による腫瘍抗原（ＭＡＧＥ  Ａ３）の抗原提示の有効性を試験するために行った。ＢＭＤＣを、ＺｓＧｒｅｅｎ１  蛍光を用いた試験で決定された最適条件下で、ＲＬＰ．ＭＡＧＥ  Ａ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ粒子又はＩＬＶ．ＥＦ１．ＭＡＧＥ  Ａ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰベクターによって形質導入した。いずれの場合においても一定範囲のＭＯＩを行い、細胞を樹状細胞の特異的マーカーの発現について３日目に表現型決定した（図ＸＩＩＩａ及びＸＩＩＩｂ）。前述のように、これらの分析は、どのＭＯＩが適用されたとしても、形質導入により表現型は変更されないことを示している。
【０２８８】
ＲＬＰ．ＺｓＧｒｅｅｎ１又はＲＬＰ．ＭＡＧＥ  Ａ３粒子によって形質導入されたＢＭＤＣはまた、Ｂａｌｂ／ｃ  マウスにおいて、インビボでＭＡＧＥ  Ａ３を発現する腫瘍の発生を試験するために使用された。Ｒｅｎｃａタイプの同系腫瘍細胞を受けたマウスの２つの群は（０．７５×１０6細胞）、それ自体をヒト起源のＭＡＧＥ  Ａ３  腫瘍抗原を発現するように予め改変した。同日に、これらの動物は、皮内に、対応する鼠径リンパ節の近くに、対照群についてはＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１により、又は試験群についてはＲＬＰ．ＭＡＧＥ  Ａ３により改変されたＢＭＤＣの懸濁液（１×１０5細胞）を受けた。次に、腫瘍の発生のモニタリングは、ＢＭＤＣ．ＭＡＧＥ  Ａ３を受けた動物が、対照群における動物とは対照的に、腫瘍を発生しなかったことを示している（図ＸＩＶ）。
【０２８９】
実施例３：インテグラーゼの改変によるＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ  ２Ｘレンチウイルス粒子の有効性
Ｉ．本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
１．プラスミド構築
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、イントロン配列又はＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない、プロモーター−目的の配列−ｐｏｌｙＡ発現カセットを有する（図ＸＶ又はＸＸＩＩＩ）。レンチウイルス粒子にｍＲＮＡを輸送するために、ＰＰ７  ＲＮＡのステム−ループモチーフの２回の反復（ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag  配列番号２及びctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag  配列番号３）を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した（図ＸＶ又はＸＸＩＩＩ）。
【０２９０】
使用したプロモーターは、ＣＭＶ又はＥＦ１プロモーターであり得るが（図ＸＶ又はＸＸＩＩＩ）、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、レポータータンパク質、例えば天然ホタルルシフェラーゼ（図ＸＶ）、緑色（ＺｓＧｒｅｅｎ１）（図ＸＸＩＩＩ）、赤色（ｍＣｈｅｒｒｙ）又は青色（ｍｔＢＦＰ）蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいは、タンパク質、例えばタンパク質ＣＲＥをコードするｃＤＮＡであり得る。好ましくは、ｃＤＮＡは、免疫原性タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードする。目的の配列はまた、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡの配列であり得る。
【０２９１】
・カプシド形成プラスミド：レンチウイルス粒子を、インテグラーゼ内に、ＰＰ７バクテリオファージの「コート」タンパク質配列を含むように改変した。ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ  ２Ｘ粒子を生産するために使用した構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを、図ＸＶＩに示された戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドは、アセンブリＰＣＲによって、ＰＰ７ファージのコートタンパク質がインテグラーゼのＣ−末端ドメインに融合したプラスミドを生成するために使用される。ＨｐａＩクローニングによって得られるこの融合は、Ｐ８．７４−  ＰＯＬ−ＰＰ７  Ｃｏａｔプラスミドを生成することを可能にする。これにより、その発現カセットが図ＸＶＩＩに示されているコンストラクトが与えられる。Ｐｏｌコーディング配列は、例えば逆転写酵素（ＲＴ）をコードする配列のような特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。
【０２９２】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇであり得る（その発現カセットは図ＩＩＩに記載されている）。
【０２９３】
２．レンチウイルス粒子の生産、濃縮／精製及び滴定
レンチウイルス粒子を、実施例１に記載されたように生産し、方法Ｐ２に従って濃縮及び精製する。粒子を実施例１に記載されたように滴定する。
【０２９４】
ＩＩ．マウス樹状細胞（ＢＭＤＣ）の形質導入
マウス樹状細胞を、実施例１に記載されたものと同一の方法によって調製する。
【０２９５】
１．ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ  ２Ｘでのマウス樹状細胞の形質導入
樹状細胞を、１ｐｇ  ｐ２４／細胞のＭＯＩで、実施例１（段落２．４）に記載したようにＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ．ＺｓＧｒｅｅｎ１ベクターにより形質導入し、異なる分析時点（形質導入後１、２及び３日）でのフローサイトメトリーによる生存率及びＺｓＧｒｅｅｎ１蛍光の発現について分析する。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である４μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）（Sigma）を含有する培地のみで調製する。
【０２９６】
樹状細胞の生存率を、「Viobility（商標）４８５／５２０」（Miltenyi Biotec）での特異的免疫標識によって決定し、フローサイトメトリーによって分析する。
【０２９７】
２．細胞の表現型決定及び特徴づけ
２．１  マウス樹状細胞の免疫標識
各分析時点に、細胞を、円錐底９６−ウェル培養プレートのウェルに移す。細胞を、ＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４の溶液で洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。
【０２９８】
樹状細胞の生存率を、実施例１に記載されたものと同一の方法によって、「Viobility（商標）４８５／５２０」（Miltenyi Biotec）での特異的免疫標識によって決定する。
【０２９９】
２．２  フローサイトメトリー
免疫標識した樹状細胞をフローサイトメトリー（Miltenyi Biotec）によって分析し、解析する。試料を、それらのサイズ（ＳＳＣ）及びそれらの粒度（ＦＳＣ）に従って較正した。Viobility（商標）で標識された細胞は死んでおり、従って生細胞は陰性細胞である（除外による標識）。細胞は、MacsQuantVYB（Miltenyi Biotec）で特徴づけられ、MacsQuantソフトウェア（Miltenyi Biotec）で分析される。
【０３００】
ＩＩＩ．結果
図ＸＸＩＶは、１ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量でのＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ．ＺｓＧｒｅｅｎ１粒子により形質導入されたＢＭＤＣ（ＡＰＣ）の細胞生存率及びＺｓＧｒｅｅｎ１の発現動態の測定を示す。形質導入後２４時間から始まって安定して３日まで、ＺｓＧｒｅｅｎ１を発現するＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ粒子により形質導入されたマウスＢＭＤＣの割合は７０％である。細胞は、３日間の分析にわたって同じ生存率のレベルを維持し；発現の強度のみが経時的に減少する。従って、インテグラーゼにＰＰ７−Ｃｏａｔを有するレンチウイルス粒子内にＲＮＡを輸送することが可能である。好ましくは、ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ粒子は、ＡＰＣ、例えばＢＭＤＣ内に抗原配列を有するＲＮＡを輸送するために使用される。
【０３０１】
実施例４：免疫細胞内へのＲＬＰ粒子によるいくつかの抗原をコードするＲＮＡの転移の実証
Ｉ．本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
１．プラスミド構築
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、イントロン配列又はＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない、プロモーター−目的の配列−ｐｏｌｙＡ発現カセットを有する。レンチウイルス粒子にｍＲＮＡを輸送するために、ＭＳ２  ＲＮＡのステム−ループモチーフの１２回の反復（ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号１）を、レポーター遺伝子の下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターは、ＣＭＶ又はＥＦ１プロモーターであり得るが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、抗原又はエピトープをコードし得る。多くのバイオマーカーが腫瘍細胞上で同定されており、それらの完全な配列及び／又は部分配列が免疫療法に使用される。例えば、ＭＡＧＥＡ３抗原を発現するために使用される配列は、完全（図ＸＩａ）又は部分的（図ＸＩｂ）であり得る。バイオマーカーの他の部分配列が使用されてもよく、例えばｇｐ１００（図ＸＩｃ）又はチロシナーゼ（図ＸＩｄ）の部分配列である。腫瘍バイオマーカーの完全又は部分配列の多くの他の例が使用されてもよい。
【０３０２】
・カプシド形成プラスミド：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（図ＩＩ）。
【０３０３】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（図ＩＩＩ）。
【０３０４】
２．バッチの生産及び滴定
バッチの生産及び滴定は、以下の発現プラスミドの１つ又は複数を用いて、実施例１に記載したように方法Ｐ２に従って行われる：
−バッチＲＬＰ  ＭＡＧＥＡ３：ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ＰＰＲＶ．ＭＡＧＥＡ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ＭＳ２  １２Ｘ（図ＸＩａ）。
−バッチＲＬＰ  ＴＡＡｓ：ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１ｌｏｎｇ．ＰＰＲＶ．ＰＳ−ＡｇＭａｇｅＡ３．ＷＰＲＥ．ＭＳ２  １２Ｘ（図ＸＩｂ）＋ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１ｌｏｎｇ．ＰＰＲＶ．ＰＳ−Ａｇｇｐ１００．ＷＰＲＥ．ＭＳ２  １２Ｘ（図ＸＩｃ）＋ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１ｌｏｎｇ．ＰＰＲＶ．ＰＳ−ＡｇＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ．ＷＰＲＥ．ＭＳ２  １２Ｘ（図ＸＩｄ）。
−バッチＲＬＰ．ＺｓＧｒｅｅｎ１：ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｇｅｎｅ．ＭＳ２  １２Ｘ（図Ｉ）。
【０３０５】
プラスミドのそれぞれの割合は、以下の通りである：４０％の発現プラスミド又は発現プラスミド（ＲＬＰ−ＴＡＡｓの場合）、３０％のｐ８．７４（又はｐ８．７４ΔＺＦ）プラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド。
【０３０６】
ＩＩ．ＡＰＣの形質導入
１．Ｕ９３７株（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＲＬ−１５９３．２（商標））
Ｕ９３７細胞株は、単球の多数の特徴を有する３７歳の男性の組織球性リンパ腫から出発して確立された細胞株である。このモデルは、単球及びマクロファージの分化のインビトロ研究によく使用される。Ｕ９３７細胞を、超低接着表面（Ultra Low Attachment）（ＵＬＡ）培養フラスコで、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンの存在下でのＲＰＭＩ  １６４０培地（ＲＰＭＩ完全培地）の１００  ０００細胞／ｍｌで培養する。
【０３０７】
１．１  ＲＬＰ．ＭＡＧＥ  Ａ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ粒子、又は３つの腫瘍抗原の混合物を含む粒子（ＲＬＰ−ＴＡＡｓ）によるＵ９３７細胞の形質導入
形質導入の日に、細胞を回収し計数する。それらを、５００μｌの培地中に５００  ０００細胞／ｍｌでの細胞懸濁液を得るために、再懸濁する。形質導入の準備ができた播種を、２４−ウェルＵＬＡプレートに、ウェル当たり５００μｌの割合で、かつ三連で実施する。
【０３０８】
細胞を、以下のトランスフェクション剤：１６μｇ／ｍＬでのPolybrene（登録商標）、及びＢＸ７９５  １．２μＭで補充したＲＰＭＩ完全培養培地内で形質導入し、＋３７℃／５％ＣＯ2で４時間インキュベートする。形質導入培地の５００μｌをそれぞれ対応するウェルに添加し、斯かるウェルには、トランスフェクション剤が、８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）及び０．６μＭのＢＸ７９５の最終濃度で存在する。
【０３０９】
形質導入から５時間後に、８００μｌの形質導入培地（８０％）を抜き取り、８００μｌのＲＰＭＩ完全培養培地と交換する。
【０３１０】
１．２  細胞の回収
形質導入後５時間及び２０時間に、細胞を再懸濁し、試料を１５−ｍｌチューブに入れ、次に２００ｇで５分間遠心分離して、ペレットを得る。上清を捨て、細胞を１ｍｌのＰＢＳ  １Ｘで洗浄した後に、再度２００ｇで５分間遠心分離する。上清を捨て、細胞ペレットを、１ｍｌのトリプシン０．０５％−０．５３ｍＭのＥＤＴＡ（Corning）中に再懸濁する。細胞を５分間３７℃でインキュベートする。インキュベーションの最後に、２ｍｌのＲＰＭＩ完全培養培地を細胞懸濁液に添加する。細胞を２００ｇで５分間遠心分離し、次に上清を捨て、細胞を１ｍｌのＰＢＳ  １Ｘで洗浄した後に、最後に一度２００ｇで５分間遠心分離する。上清を捨て、細胞を乾燥ペレットの形態で−８０℃ですぐに凍結する。
【０３１１】
１．３  全ＲＮＡの抽出
各乾燥ペレットを氷上に置き、ゆっくり解凍する。１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ溶液を、各乾燥ペレットに室温で添加し、細胞を５分間インキュベートした後に、２００μｌのクロロホルムを添加する。試料を１０回反転することによってホモジナイズし、２〜３分間室温でインキュベートする。試料を１２０００ｇで１５分間、＋４℃で遠心分離する。遠心分離の最後に、試料を氷上に置く。上相を新しいチューブ（５００〜６００μｌ）に移す。等量の７０°エタノールを添加し、次に試料をボルテックスを用いてホモジナイズする。
【０３１２】
全ＲＮＡを、「ＲＮＡ精製ミニキット」（Ambion）のプロトコルに従って精製する。溶出を試料当たり３０μｌの純水溶液で行う。試料のＲＮＡを、Nanodropを用いてアッセイし、次いで試料を−８０℃で保存する。
【０３１３】
１．４  ＲＮＡの逆転写
相補的ＤＮＡへのＲＮＡの逆転写を、供給元の推奨に従って、「Maxima First Strand」酵素（ThermoFisher）を用いて各試料のＲＮＡの５００ｎｇに対して行う。
【０３１４】
１．５  ＲＴ−ｑＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅
増幅を、リアルタイムＰＣＲミックス、ＳＹＢＲ（登録商標）Premix Ex Taq（Takara - cat RR420L）を用いて、２０μｌの最終容量でのセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの２００ｎＭの存在下で、超純粋で１／１０希釈したｃＤＮＡの５μｌに対して行う。
【０３１５】
１／１０希釈したｃＤＮＡの５μｌを、各ウェルに添加する。
【０３１６】
リアルタイムＰＣＲを、以下のプロトコルに従ってＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ化学を用いたStepOnePlusサーモサイクラー（Applied Biosystems）で行う：９５．０℃での３０秒の１サイクル、次いで９５．０℃での５秒を含む４０サイクル、及び６０．０℃での３０秒。
【０３１７】
使用したセンスオリゴヌクレオチドは、以下のとおりである：
−Ｑ−ｈＧＡＰＤＨ−Ｓ（GACAAGCTTCCCGTTCTCAG）（配列番号４）
−Ｑ−ＭＡＧＥＡ３−Ｆ（CTGCCGACCACCATGAACTA）（配列番号５）
−Ｑ−ＰＳＭＡＧＥＤＣ−Ｆ（TCAGCACTCTTTGAGGATCTAATGA）（配列番号６）
−Ｑ−ＰＳＴｙｒＤＣ−Ｆ（ATGAGCCAGGTGCTTAACAACA）（配列番号７）
−Ｑ−ＰＳＧＰ１００ＤＣ−Ｆ（TGGCGCCTCAGCACTCTT）（配列番号８）
【０３１８】
使用したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の通りである：
−Ｑ−ｈＧＡＰＤＨ−ＡＳ（GAGTCAACGGATTTGGTCGT）（配列番号９）
−Ｑ−ＭＡＧＥＡ３−Ｒ（GGTTGCTGGAGTCCTCATAGGA）（配列番号１０）
−Ｑ−  ＰＳＭＡＧＥＴｙｒＤＣ−Ｒ（GGTAGGCAATGAGGACGATGA）（配列番号１１）
−Ｑ−ＰＳＧＰ１００ＤＣ−Ｒ（ACCTGGTCCATGATGGTGAAG）（配列番号１２）
【０３１９】
使用されることになるオリゴヌクレオチドの対の組み合わせは、標的に応じて、以下の通りである：
−Ｔａｒｇｅｔ  ｈＧＡＰＤＨと、Ｑ−ｈＧＡＰＤＨ−Ｓ及びＱ−ｈＧＡＰＤＨ−ＡＳ
−Ｔａｒｇｅｔ  ＭＡＧＥＡ３と、Ｑ−ＭＡＧＥＡ３−Ｆ及びＱ−ＭＡＧＥＡ３−Ｒ
−Ｔａｒｇｅｔ  ＰＳ−ＭＡＧＥＤＣと、Ｑ−ＰＳＭＡＧＥＤＣ−Ｆ及びＱ−ＰＳＭＡＧＥＴｙｒＤＣ−Ｒ
−Ｔａｒｇｅｔ  ＰＳ−ＴｙｒＤＣと、Ｑ−ＰＳＴｙｒＤＣ−Ｆ及びＱ−ＰＳＭＡＧＥＴｙｒＤＣ−Ｒ
−Ｔａｒｇｅｔ  ＰＳ−Ｇｐ１００ＤＣと、Ｑ−ＰＳＧＰ１００ＤＣ−Ｆ及びＱ−ＰＳＧＰ１００ＤＣ−Ｒ
オリゴヌクレオチドの特異性の検証のための実験は、予め行われた。
【０３２０】
２．未熟ヒト樹状細胞（ｉＤＣ、ｈＤＣとも称する）の調製
未熟ヒト樹状細胞（ｈＤＣ）を、実施例１に記載したものと同一の方法によって調製する（パートＩＩ、２．１）。
【０３２１】
２．１  ＲＬＰ．ＺｓＧｒｅｅｎ１粒子、ＲＬＰ．ＭＡＧＥ  Ａ３粒子、又は３つの腫瘍抗原混合物を含む粒子（ＲＬＰ−ＴＡＡｓ）によるヒト樹状細胞の形質導入
ｈＤＣの形質導入を、実施例１に記載したものと同一の方法によって行う（パートＩＩ、段落２．３）。細胞を４ｐｇのｐ２４／細胞で形質導入し、異なる時点で分析する（形質導入後５時間、２０時間）。
【０３２２】
形質導入の陰性対照を、形質導入剤である４μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）（Sigma）のみを含有する培地で調製する。
【０３２３】
樹状細胞を、形質導入された細胞のペレットから得られたＲＮＡに対してＲＴ−ｑＰＣＲによって、形質導入の日に及び異なる分析時点で分析する。
【０３２４】
２．２  細胞の回収
形質導入後５時間及び２０時間に、培養上清を、プラスチック培養プレートに接着したｈＤＣを含むウェルから抜き取る。それらを、０．５ｍｌのＰＢＳ  １Ｘで洗浄し、これを次に除去する。次に、細胞は、０．２５ｍｌのトリプシン０．０５％−０．５３ｍＭのＥＤＴＡ（Corning）を受け、２分間３７℃でインキュベートする。インキュベーションの最後に、０．２５ｍｌのＲＰＭＩ完全培養培地を添加し、ウェルをこすることによってｈＤＣを回収する。細胞を２００ｇで５分間遠心分離する。ウェルを０．５ｍｌのＰＢＳ  １Ｘで洗浄し、これを遠心分離後のｈＤＣのペレットを再懸濁するために使用する。このようにして回収したｈＤＣの全てを、再度５分間２００ｇで遠心分離する。上清を捨て、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ  １Ｘで最後に一度洗浄した後に、２００ｇで５分間遠心分離する。上清を捨て、細胞を、乾燥ペレットの形態で−８０℃ですぐに凍結する。
【０３２５】
２．３  全ＲＮＡの抽出
ＲＮＡを、ＡｍｂｉｏｎのＲＮＡ  精製ミニキットを用いて、この同実施例のＩＩ．１．３に記載されたものと同一の方法によって調製する。試料当たり３０μｌの純水溶液で溶出を行う。試料のＲＮＡのアッセイを、Nanodropを用いて行い、次に試料を−８０℃で保存する。
【０３２６】
２．４  ＲＮＡの逆転写
相補的ＤＮＡへのＲＮＡの逆転写を、この同実施例のＩＩ．１．４に記載された方法によって、５００ｎｇのＲＮＡに対して行う。
【０３２７】
２．５  ＲＴ−ｑＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅
ＲＴ−ｑＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅を、この同実施例の段落ＩＩ．１．５に記載された方法によって行う。
【０３２８】
ＩＩＩ．結果
ＲＴ−ｑＰＣＲによる特異的分析は、形質導入後５時間及び２０時間での、ＡＰＣへの、特にＵ９３７細胞への及びヒト樹状細胞へのＲＬＰ粒子による、３つの抗原をコードするＲＮＡ（ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３、ＰＳ−ＧＰ１００及びＰＳ−ＴＹＲ）の転移を実証することを可能にする（それぞれ図ＸＸＶＩ及びＸＸＶＩＩ、ＸＸＩＸ及びＸＸＸ）。得られた結果を分析し、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）中の有意な特異的増幅の存在又は非存在に従って解釈する。
【０３２９】
結果は、粒子に含まれる異なるＲＮＡが、それらがＲＬＰ−ＭＡＧＥ  Ａ３粒子の場合のように単一型であるか（図ＸＸＶ及びＸＸＶＩＩＩ）あるいはＲＬＰ−ＴＡＡｓ粒子の場合のように３つの異なるタイプのものであるか（図ＸＸＶＩ、ＸＸＶＩＩ及びＸＸＩＸ、ＸＸＸ）に関わらず、従ってＲＬＰ粒子によってＡＰＣに適切に転移されることを示している。Ｕ９３７細胞株の場合、異なるＲＮＡの相対量は、形質導入後５時間から開始して有意であり（図ＸＸＶＩ）及びそれらは形質導入後２０時間に増加する（図ＸＸＶＩＩ）。ｈＤＣ初代細胞の場合、特異的ＲＮＡの相対量は、それらが５時間であまり顕著でなくても（図ＸＸＩＸ）、２０時間で有意である（図ＸＸＸ）。従って、ＲＬＰ粒子は、ＡＰＣに異なる抗原性ペプチドをコードするＲＮＡの分子を転移させるために有効である（株及び初代細胞）。これは、改変された免疫細胞、及び特にＡＰＣによる治療の有効性において治療上の利点を構成する。従って、ＲＬＰ粒子は、免疫応答の特異性を調節することに基づいて、免疫療法戦略に含まれる。
【０３３０】
実施例５：複数の抗原の発現のためのＲＬＰ粒子の有効性の評価
Ｉ．本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
１．プラスミド構築
１．１  本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、図ＸＩＩｂ、ＸＩＩｃ及びＸＩＩｄに記載されたように、イントロン配列又はＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない、プロモーター−目的の配列−ｐｏｌｙＡ発現カセットを有する。レンチウイルス粒子にｍＲＮＡを輸送するために、ＭＳ２  ＲＮＡのステム−ループモチーフの１２回の反復（ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号１）を、レポーター遺伝子の下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターは、ＣＭＶ又はＥＦ１プロモーターであり得るが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、抗原又はエピトープをコードし得る。多くのバイオマーカーが腫瘍細胞上で同定されており、それらの完全な配列及び／又は部分配列が免疫療法に使用される。腫瘍バイオマーカーの完全又は部分配列の多くの他の例が使用されてもよい。
【０３３１】
・カプシド形成プラスミド：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットは図ＩＩに記載されている）。
【０３３２】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットは図ＩＩＩに記載されている）。
【０３３３】
１．２  組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶを生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、プロモーター−目的の配列、の発現カセットを有する。目的の遺伝子の配列は、例えば蛍光レポーターの配列（図ＩＶｂ）、あるいは抗原又はエピトープの配列であり得る。多くのバイオマーカーが腫瘍細胞上で同定されており、それらの完全な配列及び／又は部分配列が免疫療法に使用される。例えば、ＭＡＧＥＡ３を発現するために使用される配列は完全（図ＸＩＩａ）又は部分的（図ＸＩＩｂ）であり得る。腫瘍バイオマーカーの他の部分配列が使用されてもよく、例えばｇｐ１００（図ＸＩＩｃ）又はチロシナーゼ（図ＸＩＩｄ）の部分配列である。腫瘍バイオマーカーの完全又は部分配列の多くの他の例が使用されてもよい。このプラスミドは、他のエレメント、例えば天然配列ＷＰＲＥ（Woodchuck Hepatitis Virus Post-transcriptional Regulatory Element）又はｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列を含み得る。ウイルスの病原性は、導入遺伝子によるレトロウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムの領域の置換によって排除されている。
【０３３４】
・カプシド形成プラスミド：構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドが、組み込みレンチウイルスベクターを生産するために使用される（その発現カセットは図Ｖに記載されている）。
【０３３５】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは例えば、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇ  遺伝子の配列であり得る（その発現カセットは図ＩＩＩに記載されている）。
【０３３６】
２．バッチの生産及び滴定
バッチの生産を、以下の発現プラスミドの１つを用いて、実施例１に記載されたように、方法Ｐ２に従って行う：
−バッチＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ、これはＲＬＰ−ＴＡＡｓとも呼ばれる：ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１ｌｏｎｇ．ＰＰＲＶ．ＰＳ−ＡｇＭＡＧＥＡ３．ＷＰＲＥ．ＭＳ２  １２Ｘ（その発現カセットは図ＸＩｂに記載されている）＋ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１ｌｏｎｇ．ＰＰＲＶ．ＰＳ−Ａｇｇｐ１００．ＷＰＲＥ．ＭＳ２  １２Ｘ（その発現カセットは図ＸＩｃに記載されている）＋ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１ｌｏｎｇ．ＰＰＲＶ．ＰＳ−ＡｇＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ．ＷＰＲＥ．ＭＳ２  １２Ｘ（その発現カセットは図ＸＩｄに記載されている）。
−バッチＲＬＰ．ＭＡＧＥＡ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ、これはＲＬＰ−ＭＡＧＥＡ３とも呼ばれる：ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ＰＰＲＶ．ＭＡＧＥＡ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ＭＳ２  １２Ｘ（その発現カセットは図ＸＩａに記載されている）。
−バッチＩＬＶ．ＥＦ１．ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ、これはＩＬＶ−ＴＡＡｓとも呼ばれる：ｐＩＬＶ．ＥＦ１．ＰＳ−ＡｇＭＡＧＥＡ３．ＷＰＲＥ（図ＸＩＩｂ）＋ｐＩＬＶ．ＥＦ１．ＰＳ−Ａｇｇｐ１００．ＷＰＲＥ（その発現カセットは図ＸＩＩｃに記載されている）＋ｐＩＬＶ．ＥＦ１．ＰＳ−ＡｇＴｙｒｏｓｉｎａｓｅ．ＷＰＲＥ（その発現カセットは図ＸＩＩｄに記載されている）。
【０３３７】
プラスミドのそれぞれの割合は、以下の通りである：４０％の発現プラスミド又は発現プラスミド（ＲＬＰ−ＴＡＡｓ又はＩＬＶ−ＴＡＡｓの場合）、３０％のｐ８．７４（又はｐ８．７４ΔＺＦ）プラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド。
【０３３８】
バッチの滴定は、実施例１に記載されたものと同一の方法に従って行われる。
【０３３９】
ＩＩ．使用されたモデルの説明
１．細胞モデル
１．１  Ｒｅｎｃａ腫瘍モデル
このモデルは、Ｒｅｎｃａ腫瘍細胞が使用される実施例２に記載されたモデルであり、これは、３つの発現プラスミドの混合物を含むＩＬＶ．ＥＦ１．ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／ＴｙｒベクターによりＭＯＩ  １００で予め形質導入されており、斯かる発現プラスミドは、その発現カセットが、３つ全てがヒト起源の抗原性ペプチドＭＡＧＥ  Ａ３、ｇｐ１００及びチロシナーゼを安定して発現するように、図ＸＩＩｂ、ｃ及びｄに記載された発現カセットである。次に、このモデルは、成体同系ＢＡＬＢ／ｃマウスの脇腹の皮下に０．７５．１０6個のこれら細胞を再移植することからなる。動物は、登録されたブリーダー（Janvier Europe）から入手し、これら実験の全てについて詳述したプロトコルは、地域の倫理委員会（ＣＥＥＡ−１２２倫理委員会）に提出され、承認された。
【０３４０】
全ての動物をその全身状態について毎日チェックする。１週間に２回、それらを秤量し、腫瘍の発生をキャリパーを用いて手動で測定する。腫瘍体積は、以下の式に従ってｍｍ3で与えられる：Ｖ＝ａ＊（ｂ2／２）、ここでａ＝最大直径、及びｂ＝最小直径。
【０３４１】
１．２  マウスリンパ球の調製
マウスリンパ球を、野生型ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓、あるいはＲｅｎｃａタイプの腫瘍＞１ｍｍ3を発症したマウスの脾臓から調製する。脾臓は、頸椎脱臼による動物の安楽死後に回収する。それは、７０μｍの細胞篩で粉砕することにより機械的に解離される。細胞懸濁液を５分間３００ｇで＋４℃で遠心分離する。次に、細胞ペレットを１０ｍｌの冷ＭＡＣＳ緩衝液に取り、懸濁液を５０−ｍｌチューブ上に置いた４０−μｍ  細胞篩で濾過し、次に細胞計数を行う。細胞懸濁液を１０分間３００ｇで＋４℃で遠心分離した後に、実施例１に記載されたものと同一の方法によるＣＤ８マーカーの発現についてのポジティブソーティングに進む。ポジティブ画分を、磁石の使用ではなく、１ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液でソーティングカラムを洗浄することにより回収する。この画分を冷ＭＡＣＳ緩衝液で５ｍｌにし、次に細胞計数を行う。細胞懸濁液を、１０分間３００ｇで＋４℃で遠心分離し、細胞をＰＢＳ  １Ｘ中に１．１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁する。
【０３４２】
１．３  選別されたマウスＣＤ８＋脾細胞のＣＦＳＥ標識
マウス脾細胞のソーティングから得られたＣＤ８＋Ｔリンパ球を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CellTrace（商標) CFSE dye、Invitrogen/thermoFisher Scientific）で、以下の方法によって標識する：１．１０6細胞／ｍｌでの細胞懸濁液をＰＢＳ  １Ｘで調製する。ＣＦＳＥのストック溶液は、ＤＭＳＯ中の１ｍＭであり、細胞懸濁液の１ｍｌ当たりこの溶液の２μｌを添加し、２μＭで標識されたリンパ球を得る。次に、細胞を、２０分間３７℃で遮光してインキュベートする。１％のウシ胎児血清で補充したＲＰＭＩで細胞を５倍に希釈し、そして懸濁液を再度５分間インキュベートすることによって、反応を停止させる。次に、細胞懸濁液を５分間３００ｇで室温で遠心分離し、細胞を、１０％のウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンで補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中に１．６×１０6細胞／ｍｌの濃度で再懸濁し、ＵＬＡタイプの平底９６−ウェルプレート（Corning）内でマウスＢＭＤＣと異なる比で共培養する。標識後、このようにして得られたＣＤ８＋Ｔリンパ球を、選別された集団の純度及びＣＦＳＥ標識をモニタリングするために抗ＣＤ８抗体の存在下でフローサイトメトリー（Miltenyi Biotec）により分析する（図ＸＶＩＩＩ）。
【０３４３】
１．４  マウス樹状細胞の調製
マウス樹状細胞を、実施例１に記載されたものと同一の方法によって調製する。
【０３４４】
２．免疫細胞の形質導入及び増殖応答の分析
２．１  ＲＬＰ．ＭＡＧＥ  Ａ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ粒子、又は３つの腫瘍抗原混合物を含むＲＬＰ．ＴＡＡｓ粒子（ＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ）でのマウス樹状細胞（ＢＭＤＣ）の形質導入
培養の７日目に、ＢＭＤＣ  樹状細胞を、３ｐｇ  ｐ２４／細胞の比率で、ＲＬＰ．ＭＡＧＥ  Ａ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ粒子により、又はＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子（その発現カセットが図ＸＩｂ、ｃ及びｄに記載された発現カセットである、３つの発現プラスミドの混合物）により、形質導入する。形質導入の陰性対照を、形質導入剤である４μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）（Sigma）のみを含有する培地で調製する。
【０３４５】
樹状細胞を、形質導入の日、及び抗ＣＤ１１ｃ、抗ＣＤ８６、抗ＣＤ８０特異的抗体（Miltenyi Biotec）での免疫標識による２４時間後に表現型決定し、フローサイトメトリーにより特徴づけた。
【０３４６】
２．２  同系ＢＭＤＣとのＣＦＳＥ−標識ＣＤ８＋Ｔリンパ球の共培養
野生型又はＲｅｎｃａ  腫瘍を発症したＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＣＦＳＥ−標識ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、ＲＬＰ．ＭＡＧＥ  Ａ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ粒子、又はＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子のいずれかで形質導入した同系マウスＢＭＤＣの存在下で、あるいは非形質導入ＢＭＤＣと共に培養する。ＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３．／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子により形質導入されたＢＭＤＣとの共培養の場合には、２つの比を試験した：１のＢＭＤＣ、対、各２のＣＤ８＋Ｔリンパ球（１ＤＣ：２Ｔ）、又は１のＢＭＤＣ、対、各４のＣＤ８＋Ｔリンパ球（１ＤＣ：４Ｔ）。
【０３４７】
ＲＬＰ．ＭＡＧＥ  Ａ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ粒子により形質導入されたＢＭＤＣに対するＣＤ８＋Ｔリンパ球の比は、１  ＢＭＤＣ対各２  ＣＤ８＋Ｔリンパ球（１ＤＣ：２Ｔ）である。これら共培養は、ＵＬＡタイプの平底９６−ウェルプレート（Corning）内で、１０％のウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンで補充したＲＰＭＩ  １６４０培地の２００μｌの最終容量で行う。ＢＭＤＣを、４００００細胞／ウェルの比でインキュベートし、従ってＣＤ８＋Ｔリンパ球の数は８００００〜１６００００細胞／ウェルで変動する。
【０３４８】
２．３  ＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖応答の分析
培養開始から５日後、細胞の混合物を培養プレートから回収し、フローサイトメトリーによる分析用に標識するために円錐底９６−ウェル培養プレートのウェルに移す。細胞を、ＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４の溶液で洗浄し、５％ＦＣＳ、３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。リンパ球を、実施例１に上記した方法による、蛍光色素コンジュゲート抗ＣＤ８  抗体（Miltenyi Biotec）での免疫標識によって分析する。細胞を、１００μｌのＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４、５％ＦＣＳに取り、ＣＤ８マーカーについてのそれらの発現（懸濁液に依然として存在するＢＭＤＣからそれらを区別することを可能にする）及びＣＦＳＥの発現（その相対蛍光レベルは各細胞分裂で半分になり、従って細胞の増殖応答を定量化することを可能にする）の両方に従って、フローサイトメトリーによって分析する。
【０３４９】
図ＸＩＸは、単独で培養されたＣＤ８＋Ｔリンパ球により得られたＣＦＳＥの発現プロファイル、並びに、非形質導入又はＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子で形質導入されたＢＭＤＣとの共培養の５日後に得られたＣＦＳＥの発現プロファイルを示す。
【０３５０】
２．４  フローサイトメトリー
免疫標識されたリンパ球細胞をフローサイトメトリー（Miltenyi Biotec）により分析する。試料を、それらのサイズ（ＳＳＣ）及びそれらの粒度（ＦＳＣ）に従って較正した。細胞は、MacsQuantVYB（Miltenyi Biotec）で特徴づけられ、MacsQuantソフトウェア（Miltenyi Biotec）で分析される。
【０３５１】
ＩＩ．結果
これら実験において、非形質導入のＢＭＤＣ、ＲＬＰ．ＭＡＧＥ  Ａ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ粒子により形質導入された、又はＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子により形質導入されたＢＭＤＣを、サプレッサーＴリンパ球（腫瘍応答の発生に関与する）に特異的なＣＤ８マーカーのそれらの発現の機能として選別されたＴリンパ球と異なる比で共培養し、ＣＦＳＥで予め標識した。図ＸＶＩＩＩは、野生型及び腫瘍マウス脾臓から得られた細胞の純度（全集団におけるＣＤ８マーカーの発現）、並びにＤ０のＣＦＳＥによる標識を検証する。図ＸＩＸは、ＢＭＤＣと５日間共培養されたＣＦＳＥ−標識ＣＤ８＋Ｔリンパ球（比率ＤＣ：２Ｔ）が増殖によって応答することを示す。これは、１つ又は複数のピークに、左に向かうＣＦＳＥ標識の蛍光強度の減少によってサイトメトリーに反映されている。この分析は、これらピークにおける細胞のパーセンテージに関連する。示されたプロファイルは、３つの実験の代表である。野生型マウス由来のＣＤ８＋Ｔリンパ球の応答は、形質導入されたＢＭＤＣ又は非形質導入ＢＭＤＣと接触しているかどうかに関わらず、同様である。この現象は、樹状細胞と接触されたナイーブリンパ球が、抗原の非存在下であっても増殖することができるという事実によって説明される（Q.Geら、PNAS.2002 99(5):2983-2988）。対照的に、３つの腫瘍抗原（ＭＡＧＥ  Ａ３／ｇｐ１００／Ｔｙｒ）を発現するＲｅｎｃａ腫瘍を発症したマウス由来のＣＤ８＋Ｔリンパ球は、非形質導入ＢＭＤＣにほとんど応答を示さない。それらは、ＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子によって形質導入されたＢＭＤＣとの共培養中に、腫瘍により発現される抗原に対して曝露されている場合に特異的に応答する（この場合３１．４２％の細胞増殖に対して、非形質導入ＢＭＤＣの存在下ではわずか１４．９４％）。腫瘍によって産生される特定の因子（ＩＬ−１０、ＰＧＥ２）が、インビボでのＴリンパ球のアレルギー減少の発症をもたらし得ることが示された（M.Ahmadiら、Cancer Res.2008 September 15;68(18):7520-7529）。このことは、なぜこれらＣＤ８＋Ｔリンパ球が、非形質導入ＢＭＤＣに曝露された場合に、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球よりもはるかに少なく増殖するかを説明する。
【０３５２】
対照として、樹状細胞に曝露されることなく５日間単独で培養されたＣＦＳＥ標識ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、増殖せず、かつそれらのＣＦＳＥ  発現プロファイルはＤ０に観察されたものと同様である（図ＸＶＩＩＩ）。このプロファイルは、ＣＤ８  Ｔリンパ球の起源（野生型又は腫瘍マウス）に関係なく同一である。
【０３５３】
図ＸＸは、非形質導入ＢＭＤＣと共培養されたこれら同じＣＤ８＋Ｔリンパ球の応答に対する、ＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子により形質導入されたＢＭＤＣと共培養されたＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖応答の分析を示す。分析は３つの野生型マウスから、又はＲｅｎｃａ  腫瘍を発症した３つのマウスから得られたＣＤ８＋Ｔリンパ球との  ３つの異なる共培養物に対して行い、ＢＭＤＣも３つの異なる培養物に由来した。ＣＤ８＋Ｔリンパ球の応答を、１ＤＣ：２Ｔの比又は１ＤＣ：４Ｔの比での共培養物から分析した。相対増殖応答は、非形質導入ＢＭＤＣに非特異的に応答する細胞のパーセンテージに対する、ＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子により形質導入されたＢＭＤＣに対する応答における細胞増殖のパーセンテージの比によって与えられる。結果は、ヒト腫瘍に関連する３つの抗原（ＴＡＡｓ）を発現するＲｅｎｃａ腫瘍を発症したマウスからのＣＤ８＋Ｔリンパ球が、これらＴＡＡｓによる新たな刺激に特異的に応答することを示すが（１ＤＣ：２Ｔ共培養物について２．６７、及び１ＤＣ：４Ｔ共培養物について３．９０）、一方で、ナイーブマウスからのＣＤ８＋Ｔリンパ球は、ＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子により形質導入されたＢＭＤＣに対して同様に応答する（１ＤＣ：２Ｔ共培養物について１．５９、及び１ＤＣ：４Ｔ共培養物について１．７８）。
【０３５４】
最後に、図ＸＸＩは、ＲＬＰ．ＭＡＧＥＡ３．ＩＲＥＳ．ＧＦＰ粒子によって形質導入されたＢＭＤＣ又はＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子によって形質導入されたＢＭＤＣと、条件１ＤＣ：２Ｔの下で共培養されたＣＤ８＋Ｔリンパ球の相対増殖応答を比較する。図ＸＸに示されたように、これら分析は、３つのＴＡＡｓを有するＲｅｎｃａ  腫瘍を発症したマウスから得られたＣＤ８＋Ｔリンパ球が、ＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子により形質導入されたＢＭＤＣ野生型マウスから得られたＣＤ８＋Ｔリンパ球よりも顕著に応答することを示す。また、それらは、これら抗原のただ１つ（ＭＡＧＥ  Ａ３）を有する粒子により形質導入されたＢＭＤＣに特異的に応答する。
【０３５５】
まとめると、これら結果は、ＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／Ｇｐ１００／Ｔｙｒ粒子により形質導入されたＢＭＤＣが従って、３つのＴＡＡｓ（ＭＡＧＥ  Ａ３、ｇｐ１００及びチロシナーゼ）に対応する抗原性ペプチドを確実に提示することができることを示す。従って、３つのペプチドに対応するＲＮＡ分子は、十分に長期間かつ有効に表面にこれらペプチドを提示する抗原提示細胞に特異的な細胞機構によって引き受けられ、従って、それらに遭遇するＣＤ８＋Ｔリンパ球が活性化され得る。
【０３５６】
ＲＮＡ粒子により形質導入された樹状細胞を用いたワクチン接種法は、特に有利であると証明され、抗原又は抗原（複数）の定常発現は、メモリーＴ細胞の集団を誘導及び維持するために必要でない（M.J.Bevan及びA.W.Goldrath.Current Biology.2000、10:R338-R340）。
【０３５７】
実施例６：免疫細胞へのＲＬＰ粒子による抗原及び免疫調節タンパク質をコードするＲＮＡの転移、並びにＲＬＰ粒子の有効性の実証
Ｉ．本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
１．プラスミド構築
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、イントロン配列又はＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない、プロモーター−目的の配列−ｐｏｌｙＡ発現カセットを有する。レンチウイルス粒子にｍＲＮＡを輸送するために、ＭＳ２  ＲＮＡのステム−ループモチーフの１２回の反復（ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号１）を、レポーター遺伝子の下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターは、ＣＭＶ又はＥＦ１プロモーターであり得るが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、抗原又はエピトープをコードし得る。多くのバイオマーカーが腫瘍細胞上で同定されており、それらの完全な配列及び／又は部分配列が免疫療法に使用される。例えば、ＭＡＧＥＡ３抗原を発現するために使用される配列は、完全（図ＸＩａ）又は部分的（図ＸＩｂ）であり得る。目的の配列はまた、免疫調節タンパク質、例えばサイトカイン又はインターロイキン、例えばＩＬ−１２をコードし得る。
【０３５８】
・カプシド形成プラスミド：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットは図ＩＩに記載されている）。
【０３５９】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットは図ＩＩＩに記載されている）。
【０３６０】
２．バッチの生産及び滴定
バッチの生産及び滴定は、以下の発現プラスミドを用いて、実施例１に記載したように方法Ｐ２に従って行われる：
バッチＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／ＩＬ−１２：線状ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１ｌｏｎｇ．ＰＰＲＶ．ＰＳ−ＡｇＭＡＧＥＡ３．ＷＰＲＥ．ＭＳ２  １２Ｘ（その発現カセットは図ＸＩｂに記載されている）及びｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ＩＬ１２ｂ−ｌｉｎｋｅｒ−ＤｅｌｔａＩＬ１２ａ．ＭＳ２  １２Ｘ（その発現カセットは図ＸＸＸＩに記載されている）。
【０３６１】
プラスミドのそれぞれの割合は、以下の通りである：４０％の発現プラスミド、３０％のｐ８．７４（又はｐ８．７４ΔＺＦ）プラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド。
【０３６２】
ＩＩ．免疫系の細胞の形質導入
１．Ｕ９３７株（ＡＴＣＣ（登録商標）  ＣＲＬ−１５９３．２（商標））
Ｕ９３７細胞株を、実施例４（ＩＩ．段落１）に記載の条件下で培養した。
【０３６３】
１．１  腫瘍抗原及び免疫調節タンパク質の混合物を含む粒子（ＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／ＩＬ−１２）でのＵ９３７細胞の形質導入
Ｕ９３７細胞の形質導入を、実施例４（ＩＩ．段落１．１）に記載の方法によって行う。
【０３６４】
１．２  細胞の回収
形質導入後５時間及び２０時間に、細胞を回収し、実施例４（ＩＩ．段落１．２）に記載の方法によって処理する。
【０３６５】
１．３  全ＲＮＡの抽出
各乾燥ペレットを実施例４（ＩＩ．段落１．３）に記載の方法によって処理して、全ＲＮＡを抽出及び精製する。
【０３６６】
１．４  ＲＮＡの逆転写
相補的ＤＮＡへのＲＮＡの逆転写を、実施例４（ＩＩ．段落１．４）に記載の方法によって行う。
【０３６７】
１．５  ＲＴ−ｑＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅
２０μｌの最終容量でセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドの２００ｎＭの存在下で、リアルタイムＰＣＲミックス、ＳＹＢＲ（登録商標）Premix Ex Taq（Takara - cat RR420L）を用いて、超純水で１／１０希釈したｃＤＮＡの５μｌに対して、増幅を行う。１／１０希釈したｃＤＮＡの５μｌを各ウェルに添加する。
【０３６８】
以下のプロトコルに従って、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ化学を用いたStepOnePlusサーモサイクラー（AppliedBiosystems）でリアルタイムＰＣＲを行う：９５．０℃で３０秒の１サイクル、次いで９５．０℃での５秒及び６０．０℃での３０秒を含む４０サイクル。
【０３６９】
使用されるセンスオリゴヌクレオチドは、以下の通りである：
−Ｑ−ｈＧＡＰＤＨ−Ｓ（GACAAGCTTCCCGTTCTCAG）（配列番号４）
−Ｑ−ＰＳＭＡＧＥＤＣ−Ｆ（TCAGCACTCTTTGAGGATCTAATGA）（配列番号６）
−Ｑ−ＩＬ１２ａｐ３５−Ｆ（CGGATCTAGGGTCATTCCAGTCT）（配列番号１３）
【０３７０】
使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の通りである：
−Ｑ−ｈＧＡＰＤＨ−ＡＳ（GAGTCAACGGATTTGGTCGT）（配列番号９）
−Ｑ−  ＰＳＭＡＧＥＴｙｒＤＣ−Ｒ（GGTAGGCAATGAGGACGATGA）（配列番号１１）
−Ｑ−  ＩＬ１２ａｐ３５−Ｒ（GTTTTTCTCTGGCCGTCTTCA）（配列番号１４）
【０３７１】
使用されることになるオリゴヌクレオチドの対の組み合わせは、標的に応じて、以下のとおりである：
−Ｔａｒｇｅｔ  ｈＧＡＰＤＨと、Ｑ−ｈＧＡＰＤＨ−Ｓ及びＱ−ｈＧＡＰＤＨ−ＡＳ
−Ｔａｒｇｅｔ  ＰＳ−ＭＡＧＥＤＣと、Ｑ−ＰＳＭａｇｅＤＣ−Ｆ及びＱ−ＰＳＭＡＧＥＴｙｒＤＣ−Ｒ
−Ｔａｒｇｅｔ  ＩＬ１２ａｐ３５と、Ｑ−  ＩＬ１２ａｐ３５−Ｆ及びＱ−  ＩＬ１２ａｐ３５−Ｒ
オリゴヌクレオチドの特異性の検証のための実験は予め行われていた。
【０３７２】
２．未熟ヒト樹状細胞（ｈＤＣ）の調製
未熟ヒト樹状細胞を、実施例１に記載したものと同一の方法によって調製する（パートＩＩ、段落２．１）。
【０３７３】
２．１  腫瘍抗原及び免疫調節タンパク質の混合物を含む粒子（ＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／ＩＬ−１２）でのヒト樹状細胞の形質導入
ヒト樹状細胞の形質導入を、実施例１（パートＩＩ、段落２．３）に記載されたものと同一の方法によって行う。細胞を、４ｐｇのｐ２４／細胞で形質導入し、異なる時点で分析する（形質導入後５時間、２０時間）。
【０３７４】
形質導入の陰性対照を、形質導入剤である４μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）（Sigma）のみを含有する培地で調製する。樹状細胞を、形質導入された細胞のペレットから得られたＲＮＡに対するＲＴ−ｑＰＣＲによって、形質導入の日及び異なる分析時点で分析する。
【０３７５】
２．２  細胞の回収
ＲＮＡ発現の分析のために、ヒト樹状細胞を、実施例４（ＩＩ．段落２．２）に記載のプロトコルに従って、形質導入後の異なる時点で回収する。細胞を、乾燥ペレットの形態で−８０℃で凍結する。ＩＬ１２の分泌の分析のために、細胞培養上清の試料を、形質導入後２０時間及び４８時間の時点で採取する。上清を−２０℃で保存する。
【０３７６】
２．３  全ＲＮＡの抽出
ＲＮＡを、実施例４（ＩＩ．段落２．３）に記載のものと同一の方法によって調製する。
【０３７７】
２．４  ＲＮＡの逆転写
相補的ＤＮＡへのＲＮＡの逆転写を、実施例４（ＩＩ．段落２．４）に記載の方法によって、５００ｎｇのＲＮＡに対して行う。
【０３７８】
２．５  ＲＴ−ｑＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅
ＲＴ−ｑＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅を、実施例４（ＩＩ．段落２．５）に記載の方法によって行う。
【０３７９】
２．６  ＩＬ１２の分泌のためのＥＬＩＳＡアッセイ
細胞培養上清におけるＩＬ１２の分泌を定量化するためのＥＬＩＳＡアッセイを、「Human IL-12 Standard ABTS ELISA Development Kit」（Peprotech）を用いて供給されたプロトコルに従って行う。
【０３８０】
ＩＩＩ．結果：
ＲＴ−ｑＰＣＲによる特異的分析は、形質導入後５時間及び２０時間における、ＡＰＣへの、特にＵ９３７細胞及び未熟ヒト樹状細胞（ｈＤＣ）への、ＲＬＰ粒子による抗原及び免疫調節タンパク質をコードするＲＮＡの転移を実証することを可能にする（それぞれ図ＸＸＸＩＩ及びＸＸＸＩＩＩ、ＸＸＸＩＶ及びＸＸＸＶ）。得られた結果は、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）中の有意な特異的増幅の存在又は非存在に従って分析及び解釈される。結果は、非形質導入対照細胞（Ｕ９３７  ＮＴ及びｈＤＣ  ＮＴ）について得られた値に対して正規化される。これら対照は、ＩＬ１２をコードする内因性ＲＮＡを発現する（結果は示さず）。樹状細胞はＩＬ１２を産生し、これはインビボでＴリンパ球の応答における役割を果たすことが知られている。
【０３８１】
Ｕ９３７細胞株の場合、異なるＲＮＡの相対量は、形質導入後５時間に（図ＸＸＸＩＩ）及び形質導入後２０時間に（図ＸＸＸＩＩＩ）有意である。
【０３８２】
ｈＤＣ初代細胞の場合、相対特異的ＲＮＡレベルは、５時間であまり顕著でなくとも（図ＸＸＸＩＶ）、２０時間で有意である（図ＸＸＸＶ）。最後に、ＥＬＩＳＡによる培養上清の分析は（図ＸＸＸＶＩ）、ＲＬＰ−ＰＳ−ＭＡＧＥＡ３／ＩＬ−１２粒子による形質導入の４８時間後に、ｈＤＣによって分泌されたＩＬ１２のレベルの大幅な増加を実証する。
【０３８３】
従って、ＲＬＰ粒子は、ＡＰＣ（株及び初代細胞）への、抗原性ペプチド並びに免疫調節タンパク質、例えばＩＬ−１２をコードする異なるＲＮＡ分子の転移に有効である。従って、ＲＬＰ粒子は、ＡＰＣに抗原及び免疫調節タンパク質をコードするＲＮＡを転移することによって免疫応答の特異性を調節することに基づく免疫療法戦略に含まれる。
【０３８４】
従って、一方では、実施例４に示された異なる抗原をコードするＲＮＡを含むＲＬＰ粒子を用いることによって、その特異性のレベルで免疫応答の微調整が可能であり、他方では、この戦略と、免疫調節タンパク質による刺激応答の誘導とを組み合わせることによって、免疫応答の微調整が可能である。従って、単一の介入でエクスビボ又はインビボで標的細胞に抗原と免疫調節剤との両方を同時に送達することは、かなりの臨床上の利点を提供する。
【０３８５】
実施例７：免疫細胞におけるＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰレンチウイルス粒子の有効性
Ｉ．本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
１．プラスミド構築
・目的の配列のための発現プラスミド：発現プラスミドは、イントロン配列又はＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない、図ＸＸＩＩＩに記載された発現カセットを有する。レンチウイルス粒子にｍＲＮＡを輸送するために、ＰＰ７  ＲＮＡのステム−ループモチーフの２回の反復：配列  ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag（配列番号２）、次いで配列  ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag（配列番号３）を、レポーター遺伝子の下流の発現カセット内に挿入した（図ＸＸＩＩＩ）。
【０３８６】
使用されるプロモーターは、ＣＭＶ又はＥＦ１プロモーターであり得る（図ＸＸＩＩＩ）。目的の配列は、レポータータンパク質、例えば天然ホタルルシフェラーゼ（図ＸＶ）、緑色（ＺｓＧｒｅｅｎ１）、赤色（ｍＣｈｅｒｒｙ）又は青色（ｍｔＢＦＰ）蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ、あるいはタンパク質、例えばタンパク質ＣＲＥをコードするｃＤＮＡであり得る。好ましくは、ｃＤＮＡは、免疫原性タンパク質又は免疫調節タンパク質をコードする。目的の配列はまた、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡの配列であり得る。
【０３８７】
・カプシド形成プラスミド：レンチウイルス粒子を、第２のＺｎ  ｆｉｎｇｅｒドメインの代わりに、ヌクレオカプシドタンパク質内に、ＰＰ７バクテリオファージの「コート」タンパク質配列を含むように改変した（図ＸＸＸＶＩＩ）。ＰＰ７ＲＬＰ粒子を産生するために使用される構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを、以下の戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドを、アセンブリＰＣＲによって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成するために使用する。第２のジンクフィンガーは、ＨｐａＩクローニングによってＭＳ２ファージのコートタンパク質により置換されて、プラスミドｐ８．７４ΔＺＦ−ＰＰ７−Ｃｏａｔを生成する。Ｐｏｌコーディング配列は、ＰＰ７ＲＬＰｓの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のような特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。
【０３８８】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇであり得る（その発現カセットは図ＩＩＩに記載されている）。
【０３８９】
２．レンチウイルス粒子の生産、濃縮／精製及び滴定
レンチウイルス粒子を、図ＸＸＩＩＩに記載のｐｃＤＮＡ−ＥＦ１．ＲｅｐｏｒｔｅｒＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ．ＰＰ７  ２Ｘ発現プラスミドを用いて、実施例１に記載されたように、方法Ｐ２に従って生産する。
【０３９０】
ＩＩ．マウス樹状細胞（ＢＭＤＣ）の形質導入
マウス樹状細胞を、実施例１に記載されたものと同一の方法によって調製する。
【０３９１】
１．ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ．ＺｓＧｒｅｅｎ１でのマウス樹状細胞の形質導入
樹状細胞を、１ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量で、実施例１（ＩＩ、段落２．４）に記載のようにＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ．ＺｓＧｒｅｅｎ１ベクターによって形質導入し、異なる分析時点でフローサイトメトリーによりそれらの生存率及びＺｓＧｒｅｅｎ１  蛍光の発現について分析する（形質導入後１、２及び３日）。形質導入の陰性対照を、  形質導入剤である４μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）（Sigma）を含有する培地のみで調製する。
【０３９２】
樹状細胞の生存率を、「Viobility（商標）４８５／５２０」（Miltenyi Biotec）での特異的免疫標識によって決定し、フローサイトメトリーによって分析する。
【０３９３】
２．細胞の表現型決定及び特徴づけ
２．１  マウス樹状細胞の免疫標識
各分析時点に、細胞を、円錐底９６−ウェル培養プレートのウェルに移す。細胞を、ＰＢＳ  １Ｘ  ｐＨ  ７．４の溶液で洗浄し、３００ｇで５分間遠心分離する。上清を反転により除去する。
【０３９４】
樹状細胞の生存率を、実施例１の段落ＩＩ．３．３に記載されたものと同一の方法によって、「Viobility（商標）４８５／５２０」（Miltenyi Biotec）での特異的免疫標識によって決定する。
【０３９５】
２．２  フローサイトメトリー
免疫標識した樹状細胞をフローサイトメトリー（Miltenyi Biotec）によって分析し、解析する。試料を、それらのサイズ（ＳＳＣ）及びそれらの粒度（ＦＳＣ）に従って較正した。Viobility（商標）で標識された細胞は死んでおり、従って生細胞は陰性細胞である（除外による標識）。細胞は、MacsQuantVYB（Miltenyi Biotec）で特徴づけられ、MacsQuantソフトウェア（Miltenyi Biotec）で分析される。
【０３９６】
ＩＩＩ．結果：ＢＭＤＣのＺｓＧｒｅｅｎ１の発現動態及び生存率
図ＸＸＸＶＩＩＩは、ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ粒子の１ｐｇ  ｐ２４／細胞により形質導入されたマウスＢＭＤＣが、形質導入後２４時間から開始してその５０％についてＺｓＧｒｅｅｎ１を発現することを示す。形質導入後３日で、ＢＭＤＣは生存率が低下し、その２０％のみがより低い蛍光強度でＺｓＧｒｅｅｎ１を発現する。これについての説明は、ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ粒子が、ＭＳ２ＲＬＰ又はＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ粒子と比較して低い濃度で生産され、従って、等用量でのＢＭＤＣの形質導入はより大量のレンチウイルス懸濁液の使用を必要とし、これは細胞にとって不可欠な栄養素を含有する培養培地をさらに希釈することである。これは、マウスＢＭＤＣのような敏感な初代細胞を培養するためにさらに注目すべきことである。それにも関わらず、ヌクレオカプシド内にＰＰ７−Ｃｏａｔで改変されたレンチウイルス粒子にＲＮＡを輸送することが依然として可能である。
【０３９７】
実施例８：ＭＳ２ＲＬＰ、ＰＰ７ＲＬＰ及び／又はＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ粒子の最適化を目的としたＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  １２Ｘ粒子の生産のための野生型ＧＡＧ−ＰＯＬ前駆体の影響
Ｉ．本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
１．プラスミド構築
１．１  本発明に係るＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットが図Ｉに記載されている）。
・カプシド形成プラスミド：これらプラスミドは実施例１に記載されたものと同一である：ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ（その発現カセットは、図ＩＩに示されている）及びｐ８．７４プラスミド（その発現カセットは、図Ｖに示されている）
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットは図ＩＩＩに記載されている）。
【０３９８】
１．２  組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶを生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットは図ＩＶｂに記載されている）。
・カプシド形成プラスミド：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットは図Ｖに記載されている）。
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットは図ＩＩＩに記載されている）。
【０３９９】
２．バッチの生産
２．１  レンチウイルス粒子の生産及びレンチウイルスベクター
５％のＣＯ2で湿潤雰囲気下、３７℃で、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のウルトラグルタミン（ＰＡＡ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Gibco、Paisley、ＵＫ）で培養した、ＨＥＫ２９３Ｔプロデューサー細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）を用いて、１０−スタックの細胞ＴＡＣＫ（６３６０ｃｍ2、Corning）内で、生産を行う。
【０４００】
ＭＳ２ＲＬＰ粒子を、以下の４つのプラスミドのトランスフェクションにより行う：
−上述の発現プラスミド、その発現カセットは図Ｉに示されている；
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ（その発現カセットは、図ＩＩに示されている）及びｐ８．７４プラスミド（その発現カセットは、図Ｖに示されている）、２つのカプシド形成プラスミドの４つの異なる比を用いる、それぞれ［１００％−０％］；［９０％−１０％］；［８０％−２０％］及び［５０％−５０％］；
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ（その発現カセットは、図ＩＩＩに示されている）。
【０４０１】
ＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  １２Ｘレンチウイルス粒子を、実施例１に記載のように生産する、すなわちプラスミドのそれぞれの割合は以下の通りである：４０％の発現プラスミド、３０％のｐ８．７４（又はｐ８．７４ΔＺＦ）プラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド（比［１００％−０％］）。
【０４０２】
より具体的には、プラスミドのそれぞれの割合は以下の通りである：
−比［９０％−１０％］：４０％の発現プラスミド、２７％のｐ８．７４ΔＺＦプラスミド、３％のｐ８．７４プラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド；
−比［８０％−２０％］：４０％の発現プラスミド、２４％のｐ８．７４ΔＺＦプラスミド、６％のｐ８．７４プラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド
−比［５０％−５０％］：４０％の発現プラスミド、１５％のｐ８．７４ΔＺＦプラスミド、１５％のｐ８．７４プラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド。
【０４０３】
ＲＬＰ−ＴＡＡｓレンチウイルス粒子の生産の場合、上記のプラスミドの割合は変更されないままである。
【０４０４】
リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクションから２４時間後に、培養上清を新鮮な未補充ＤＭＥＭ培地で交換する。プロデューサー細胞を３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートする。培地の交換後に、上清を４回採取する（トランスフェクション後３２時間、４８時間、５６時間及び７２時間）。各収集物を、５分間の３０００ｇでの遠心分離によって清澄化した後に、０．４５μｍのフィルター（Stericup（登録商標）、Millipore）で精密ろ過する。全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。
【０４０５】
ＥＦ１−ＺｓＧｒｅｅｎ１発現カセットを含むＩＬＶ−ＺｓＧｒｅｅｎ１組み込みレンチウイルスベクターを、実施例１に記載のように、対照として生産する。
【０４０６】
２．２  レンチウイルス粒子の濃縮及び精製
レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを、実施例１に記載の方法Ｐ１に従って濃縮及び精製する。
【０４０７】
３．滴定
レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを、実施例１に記載のように滴定する。
【０４０８】
ＩＩ．形質導入
１．Ｊｕｒｋａｔ標的細胞の調製、及び本発明に係るＳ２ＲＬＰ  １２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入
Ｊｕｒｋａｔ標的細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）を、９６−ウェルプレートに２０００００細胞／ｍＬで播種し、４μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で、２つの用量（２及び１０ｐｇ  ｐ２４／細胞）でのＭＳ２ＲＬＰ粒子によって、又はＭＯＩ４０でのＩＬＶ−ＺｓＧｒｅｅｎ１対照レンチウイルスベクターによって形質導入し、次に、３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートする。細胞防御機構阻害剤ＢＸ７９５（Invivogen）を、ＭＳ２ＲＬＰ粒子の場合には６μＭの濃度で使用する。形質導入上清を５時間後に除去し、新鮮な補充培養培地と交換する。形質導入後２４時間に、標的細胞を回収し、ＺｓＧｒｅｅｎ１を発現する細胞のパーセンテージをサイトメトリー（Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec）によって定量する。
【０４０９】
２．抗ｐ２４ウェスタンブロットによるＭＳ２ＲＬＰウイルス粒子の成熟の分析
ＭＳ２ＲＬＰ粒子を生産するためのプラスミドによるプロデューサー細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）のトランスフェクションの４８時間後に、培養上清を回収し、次に実施例１に記載したように方法Ｐ１に従って濃縮し、実施例１に記載のようにｐ２４タンパク質の定量化によって滴定する。１５ｎｇのｐ２４の当量を、変性ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ４／１２％上にｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ／ｐ８．７４プラスミドの比の各条件について充填し、次に１時間２００ＶでＭＯＰＳ１Ｘ緩衝液中で移動させる。ナイロン膜上に移した後、タンパク質を抗ｐ２４抗体（clone 39/5.4A、Abcam）にハイブリダイズさせる。ウェスタンブロットをPierce（商標) Fast Western Blot Kit、ECL Substrate（Pierce）を用いて展開する。バンドをオートラジオグラフィーフィルム上での化学発光により可視化する。
【０４１０】
ＩＩＩ．結果
この実施例は、異なる抗原をコードするＲＮＡを転移させるため、あるいは抗原及び免疫調節タンパク質をコードするＲＮＡを転移させるために、ＭＳ２ＲＬＰ及びＰＰ７ＲＬＰ粒子の機能を改善することが可能であると示すことを目的とする。これは、粒子の生産中のＧＡＧ前駆体の成熟の改善を介して進行し、ＭＳ２ＲＬＰ粒子の生産に関する概念の証明によって実証される。ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２プラスミドは、ヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーの代わりに、バクテリオファージのコートタンパク質を含むＧＡＧ前駆体の発現を可能にする。このコートタンパク質は、３つのタンパク質：マトリックスタンパク質、カプシドタンパク質及びヌクレオカプシドタンパク質、に切断される際に、ＧＡＧ前駆体の成熟を妨げるようである。これら３つのタンパク質は、ウイルス粒子の構造に不可欠である。
【０４１１】
ＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  １２Ｘ粒子の生産中のｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミドに加えてｐ８．７４プラスミドによる野生型ＧＡＧ前駆体の供給は、それがｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２プラスミドに起因して発現される際に、ＧＡＧ前駆体の成熟を増加することを可能にし、従ってＭＳ２ＲＬＰ及びＰＰ７ＲＬＰ粒子の機能性を増大させ得る。
【０４１２】
この実験の目的は、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミドと同時に、ＭＳ２ＲＬＰ及びＰＰ７ＲＬＰ粒子のプロデューサー細胞において、コトランスフェクトされた場合のｐ８．７４プラスミドの影響を評価することであり、ＧＡＧ前駆体の成熟を改善し、従って標的細胞の形質導入のためにより機能的な最終粒子を作成することを可能にすることである。
【０４１３】
この実施例において、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ／ｐ８．７４カプシド形成プラスミドの４つの比を試験する：１００／０；９０／１０；８０／２０及び５０／５０。ＺｓＧｒｅｅｎ１を発現する組み込みベクターＩＬＶを対象として使用する。細胞を、２つの量のｐ２４／ｍｌで形質導入する：２ｐｇ  ｐ２４／細胞（図ＸＸＸＩＸ）及び１０ｐｇ  ｐ２４／細胞（図ＸＸＸＸ）。
【０４１４】
第一に、図ＸＸＸＩＸに示された結果は、非形質導入細胞について、蛍光細胞のパーセンテージが非常に０に近く、一方でＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  １２Ｘ粒子によって形質導入された細胞は、どのカプシド形成プラスミドの比が使用されても、９９％超が蛍光性であることを示している。ｐ８．７４プラスミドの量の増加の関数として、ＺｓＧｒｅｅｎ１の蛍光強度が増加することに注目することが重要である。５０％のｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミド及び５０％のｐ８．７４プラスミドで生産されたＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  １２Ｘ粒子により形質導入された細胞は、７．７６の蛍光強度を有するが、一方で、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミドのみで生産されたＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  １２Ｘ粒子により形質導入された細胞の蛍光強度は３．５である。
【０４１５】
図ＸＸＸＸは、形質導入された細胞のパーセンテージに関して同じ結果を示している。蛍光強度に関して、図ＸＸＸＩＸに示されるように、ｐ８．７４プラスミドの量が増えるほど、蛍光強度が増加する。５０％のｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミド及び５０％のｐ８．７４プラスミドで生産されたＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  １２Ｘ粒子により形質導入された細胞は、６０．６７の蛍光強度を有し、一方で、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミドのみで生産されたＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  １２Ｘ粒子により形質導入された細胞の蛍光強度は、１１．４８である。
【０４１６】
これは、２ｐｇ及び１０ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量で、得られた蛍光は、粒子が５０％のｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミド及び５０％のｐ８．７４プラスミドで生産されている場合に、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドのみで生産されている場合よりも、それぞれ２倍及び５倍大きいことを意味する。
【０４１７】
従って、ＭＳ２ＲＬＰ粒子の生産におけるｐ８．７４プラスミドの使用は、異なる抗原をコードするＲＮＡを転移するため、あるいは抗原及び免疫調節タンパク質をコードするＲＮＡを転移するためのＭＳ２ＲＬＰ粒子の最適化の観点から、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドでのコトランスフェクションにおいて、ＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  １２Ｘ粒子の機能性の改善の獲得を供給した。
【０４１８】
図ＸＸＸＸＩは、粒子を含む生産上清におけるｐ２４タンパク質を検出することによる、生化学的レベルでのＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  １２Ｘ粒子の成熟を示す。これは、オートラジオグラフィーフィルムの２つの曝露時間、１分（図ＸＸＸＸＩａ）及び１５秒（図ＸＸＸＸＩｂ）での、抗ｐ２４ウェスタンブロットによるウイルス上清に対応する。
【０４１９】
カプシド形成プラスミドとしてｐ８．７４プラスミドのみで生産されたＨＩＶに由来する組み込みレンチウイルス粒子の場合、ｐ２４タンパク質は、以下の４つのレベルで検出可能である：
−ｐ１６０タンパク質前駆体（ＧＡＧ−ＰＯＬ）で
−ｐ５５タンパク質前駆体（ＧＡＧ）で、
−成熟タンパク質の状態（ｐ２４）で、
−成熟の過程における他の中間タンパク質前駆体（ｐ１６０とｐ５５との間、及びｐ５５とｐ２４との間）で。
【０４２０】
成熟が正常に行われる場合、ｐ２４タンパク質は、成熟状態（ｐ２４）で、タンパク質前駆体の状態（ｐ１６０、ｐ５５）又はタンパク質前駆体の状態よりも、多量に検出されるはずである。実際に、ウイルス粒子の成熟は、プロデューサー細胞による粒子の放出後に起こる。換言すれば、それらの生産中に、粒子は、プロデューサー細胞の表面で出芽し、未熟粒子の状態で細胞から放出される。上清中の粒子の放出後にのみ、ＧＡＧ−ＰＯＬ及びＧＡＧタンパク質前駆体は最終的なタンパク質に成熟する。
【０４２１】
カプシド形成プラスミドとしてｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドのみで生産されたＨＩＶに由来するＭＳ２ＲＬＰ又はＰＰ７ＲＬＰ粒子の場合、ｐ２４タンパク質は、以下の４つのレベルで検出可能である：
−ｐ１７２タンパク質前駆体（ＧＡＧΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ−ＰＯＬ）で
−ｐ６７タンパク質前駆体（ＧＡＧΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ）で、
−成熟タンパク質の状態（ｐ２４）で、
−成熟の過程における他の中間タンパク質前駆体（ｐ１７２とｐ６７との間、及びｐ６７とｐ２４との間）で。
【０４２２】
このＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  １２Ｘ粒子において、各前駆体は１２ｋＤａにより重く、これはヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーに挿入されたＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質のサイズに対応する。
【０４２３】
図ＸＸＸＸＩは、ＩＬＶトラック上での、タンパク質前駆体の異なる形態、ｐ１６０（ＧＡＧ−ＰＯＬ）、ｐ５５（ＧＡＧ）並びに完全成熟ｐ２４タンパク質を示す。タンパク質前駆体形態と比較して、成熟ｐ２４タンパク質の有意性がある。トラック１００／０は、カプシド形成プラスミドとしてｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドでのみ生産されたＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  １２Ｘ粒子に対応し、前駆体／成熟ｐ２４タンパク質の割合は、ＩＬＶに対して増加し、ＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入が、ウイルス粒子の成熟を減少させることを示している。トラック９０／１０、８０／２０及び５０／５０上では、ｐ１７２及びｐ６７タンパク質前駆体の割合は、それぞれｐ１６０及びｐ５５タンパク質前駆体の利益のために減少し、トラック５０／５０についての１つの同じ発現レベルに達する。粒子を生産するためのカプシド形成プラスミドとしてのｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドへのｐ８．７４プラスミドの追加は、成熟ｐ２４タンパク質の割合の増加につながる（図ＸＸＸＸＩｂ、１５秒曝露）。この結果は、ＭＳ２ＲＬＰ粒子におけるタンパク質前駆体の成熟を促進するために、粒子を生産するためのカプシド形成プラスミドとしてのｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドに加えて、少なくとも１０％のｐ８．７４プラスミドを加えることが可能であることを示している。カプシド形成プラスミドとしてのｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドに加えて少なくとも１０％のｐ８．７４プラスミドを用いたＭＳ２ＲＬＰ粒子の生産は、成熟タンパク質への前駆体の成熟を増加させることを可能にするだけでなく、さらに、標的細胞の形質導入後の粒子の機能性を増加させることも可能にする。
【０４２４】
結露として、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドでのコトランスフェクションにおける、本発明に係る粒子の生産中のｐ８．７４プラスミドの使用は、異なる抗原をコードするＲＮＡを転移するため、あるいは抗原及び免疫調節タンパク質をコードするＲＮＡを転移するための本発明に係る粒子を最適化することを可能にする。
【０４２５】
実施例９：ＲＬＰ粒子による、異なる抗原をコードするＲＮＡの有効な転移、あるいは抗原及び免疫調節タンパク質をコードするＲＮＡの転移の最適化を目的とした、２つの異なるカプシド形成配列（ＭＳ２及びＰＰ７）によって指向された非ウイルスＲＮＡの動員（カプシド形成されたＲＮＡのタイプの調節）
Ｉ．本発明に係るウイルス粒子及び比較システムの調製
１．プラスミド構築
１．１  本発明に係るＭＳ２／ＰＰ７−（ＮＣ）ＲＬＰ  １２Ｘ  ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：これらプラスミドは、実施例１（その発現カセットが図Ｉに記載されている）及び実施例７（その発現カセットは図ＸＸＩＩＩに記載されている）に記載されたものと同一である。
【０４２６】
・カプシド形成プラスミド：これらプラスミドは、実施例１（その発現カセットは図ＩＩに記載されている）及び実施例７（その発現カセットは図ＸＸＸＶＩＩに記載されている）に記載されたものと同一である。
【０４２７】
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇであり得る（図ＩＩＩ）。
【０４２８】
好ましくは、これらプラスミドは、ＭＳ２／ＰＰ７−ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ  １２Ｘ−  ＺｓＧｒｅｅｎ１  ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。
【０４２９】
１．２  本発明に係る対照ＭＳ２−（ＮＣ）ＲＬＰ  １２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットが図Ｉに記載されている）。
・カプシド形成プラスミド：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットは図ＩＩに記載されている）。
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、実施例１に記載されたものと同一である（その発現カセットは図ＩＩＩに記載されている）。
【０４３０】
好ましくは、これらプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ  １２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。
【０４３１】
１．３  本発明に係る対照ＰＰ７−（ＮＣ）ＲＬＰ  ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：このプラスミドは、実施例７に記載されたものと同一である（その発現カセットは図ＸＸＩＩＩに記載されている）。
・カプシド形成プラスミド：このプラスミドは、実施例７に記載されたものと同一である（その発現カセットは図ＸＸＸＶＩＩに記載されている）。
・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇであり得る（図ＩＩＩ）。
【０４３２】
好ましくは、これらプラスミドは、ＰＰ７ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。
【０４３３】
２．バッチの生産
プロデューサー細胞に対するプラスミドのトランスフェクション後、上清を採取し、粗生成物で使用するか、あるいは、国際出願第２０１３／０１４５３７号の出願に記載の前述の方法Ｐ１又はＰ２の１つに従って濃縮／精製する。
【０４３４】
２．１  レンチウイルス粒子の生産
５％のＣＯ2で湿潤雰囲気下、３７℃で、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のウルトラグルタミン（ＰＡＡ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Gibco、Paisley、ＵＫ）で培養した、ＨＥＫ２９３Ｔ  プロデューサー細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）を用いて、１０−スタックの細胞ＴＡＣＫ（６３６０ｃｍ2、Corning）内で、生産を行う。
【０４３５】
レンチウイルス粒子ＭＳ２／ＰＰ７−（ＮＣ）ＲＬＰ  １２Ｘ  ２Ｘ、好ましくはＭＳ２／ＰＰ７−ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ  １２Ｘ−  ＺｓＧｒｅｅｎ１  ２Ｘの生産を、以下の５つのプラスミドのトランスフェクションによって行う：
−上述した２つの発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ｍＣｈｅｒｒｙ．ＭＳ２  １２Ｘプラスミド（その発現カセットは、図Ｉに示されている）及びｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ＺｓＧｒｅｅｎ１．ＰＰ７  ２Ｘプラスミド（その発現カセットは、図ＸＸＩＩＩに示されている）を単量又は倍量で使用する；
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＰＰ７−Ｃｏａｔ（５０％）、その発現カセットは図ＸＸＸＶＩＩに示されている、及びｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ（５０％）、その発現カセットは図ＩＩに示されている；
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ、その発現カセットは図ＩＩＩに示されている。
【０４３６】
対照レンチウイルス粒子ＭＳ２−（ＮＣ）ＲＬＰ  １２Ｘ、好ましくはＭＳ２−ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ  １２Ｘ、を、以下の３つのプラスミドのトランスフェクションによって生産する：
−上述したｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ｍＣｈｅｒｒｙ．ＭＳ２  １２Ｘ発現プラスミド（その発現カセットは、図Ｉに示されている）；
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ、その発現カセットは図ＩＩに示されている；
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ、その発現カセットは図ＩＩＩに示されている。
【０４３７】
対照レンチウイルス粒子ＰＰ７−（ＮＣ）ＲＬＰ  ２Ｘ、好ましくはＰＰ７−ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  ２Ｘを、以下の３つのプラスミドのトランスフェクションによって生産する：
−上述したｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ＺｓＧｒｅｅｎ１．ＰＰ７  ２Ｘ  発現プラスミド（その発現カセットは、図ＸＸＩＩＩに示されている）；
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＰＰ７−Ｃｏａｔ、その発現カセットは図ＸＸＸＶＩＩに示されている；
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ、その発現カセットは図ＩＩＩに示されている。
【０４３８】
リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクションから２４時間後に、培養上清を新鮮な未補充ＤＭＥＭ培地で交換する。プロデューサー細胞を３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートする。培地の交換後に、上清を４回採取する（トランスフェクション後３２時間、４８時間、５６時間及び７２時間）。各収集物を、５分間の３０００ｇでの遠心分離によって清澄化した後に、０．４５μｍのフィルター（Stericup（登録商標）、Millipore）で精密濾過する。全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。
【０４３９】
２．２  レンチウイルス粒子の濃縮及び精製
レンチウイルス粒子を、実施例１に記載された方法Ｐ１に従って濃縮及び精製する。
【０４４０】
３．レンチウイルス粒子のバッチの滴定
レンチウイルス粒子を実施例１に記載のように滴定する。
【０４４１】
４．本発明に係るＭＳ２／ＰＰ７−（ＮＣ）ＲＬＰ  １２Ｘ  ２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入
この実施例は、いくつかのタイプのＲＮＡの転移、従っていくつかの異なるタンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎ１＋ｍＣｈｅｒｒｙ）の発現を可能にするＭＳ２／ＰＰ７−（ＮＣ）ＲＬＰ  １２Ｘ  ２Ｘ粒子を用いて行う。
【０４４２】
ＨＣＴ１１６標的細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を、２４−ウェルプレートに播種し、２４時間３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートし、１０ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量でのＭＳ２／ＰＰ７−（ＮＣ）ＲＬＰ  １２Ｘ  ２Ｘ粒子により形質導入した。
【０４４３】
以下のチェックを行う：
−それぞれ１０ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量でのＭＳ２ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ  １２Ｘ及びＰＰ７ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  ２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入；
−１０ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量でのＭＳ２ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ  １２Ｘレンチウイルス粒子単独による形質導入；
−１０ｐｇ  ｐ２４／細胞の用量でのＰＰ７ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  ２Ｘレンチウイルス粒子単独による形質導入。
【０４４４】
レンチウイルス粒子による形質導入を、８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で行う。細胞防御機構阻害剤ＢＸ７９５（Invivogen）を、ＭＳ２／ＰＰ７−（ＮＣ）ＲＬＰ  １２Ｘ  ２Ｘ、ＭＳ２ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ  １２Ｘ及びＰＰ７ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  ２Ｘ粒子の場合には６μＭの濃度で使用する。標的細胞を形質導入後４８時間に回収し、ＺｓＧｒｅｅｎ１及びｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞のパーセンテージを、サイトメトリー（Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec）によって定量する。
【０４４５】
ＩＩ．結果
図ＸＸＸＸＩＩは、ＨＣＴ１１６標的細胞におけるＭＳ２及びＰＰ７バクテリオファージに由来するカプシド形成配列によってカプシド形成されたＲＮＡを転移するためのＭＳ２／ＰＰ７−（ＮＣ）ＲＬＰ  １２Ｘ  ２Ｘ粒子の有効性を示す。この図は、二重蛍光細胞の割合が、ＭＳ２／ＰＰ７−（ＮＣ）ＲＬＰ  １２Ｘ  ２Ｘ粒子の形質導入後に９７％であり、２０ｐｇ  ｐ２４／細胞でのＭＳ２ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ  １２Ｘ及びＰＰ７ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  ２Ｘ粒子の形質導入後に９８％であることを示す。従って、同程度の形質導入有効性が、ＭＳ２／ＰＰ７−（ＮＣ）ＲＬＰ  １２Ｘ  ２Ｘの半分の用量について、ＭＳ２／ＰＰ７−（ＮＣ）ＲＬＰ  １２Ｘ  ２Ｘ粒子で観察される。
【０４４６】
ＭＳ２ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ  １２Ｘ粒子単独で又はＰＰ７ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１  ２Ｘ粒子単独で形質導入された標的細胞は、単一蛍光タンパク質についてＭＳ２／ＰＰ７−（ＮＣ）ＲＬＰ  １２Ｘ  ２Ｘ粒子による標的細胞の形質導入後に得られたパーセンテージと同様の形質導入有効性パーセンテージを有する。従って、この結果は、ＲＬＰ粒子が、標的細胞の単一形質導入において２つの異なるシステム（ＰＰ７及びＭＳ２）によってカプシド形成された少なくとも２つのタイプのＲＮＡを輸送及び転移することができることを示す。
【０４４７】
ＲＬＰの１つの同じバッチの単一形質導入において２つの異なるカプシド形成配列、ＭＳ２及びＰＰ７によって指向された異なるタイプのＲＮＡを転移する能力の実証は、特に異なる抗原をコードするＲＮＡの有効な転移のため、あるいは抗原及び免疫調節タンパク質をコードするＲＮＡを転移するめに、カプシド形成されたＲＮＡのタイプの調節に対する顕著な利益を表す。
【図１】
2019514413.tif 000002
【図２】
2019514413.tif 000003
【図３】
2019514413.tif 000004
【図４ａ】
2019514413.tif 000005
【図４ｂ】
2019514413.tif 000006
【図４ｃ】
2019514413.tif 000007
【図５】
2019514413.tif 000008
【図６ａ】
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【図６ｂ】
2019514413.tif 000010
【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図８ｆ】
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【図９ａ】
2019514413.tif 000019
【図９ｂ】
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【図９ｃ】
2019514413.tif 000021
【図９ｄ】
2019514413.tif 000022
【図１０ａ】
2019514413.tif 000023
【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１０ｅ】
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【図１０ｆ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
2019514413.tif 000035
【図１２ｄ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
2019514413.tif 000040
【図１６】
2019514413.tif 000041
【図１７】
2019514413.tif 000042
【図１８】
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【図１９】
2019514413.tif 000044
【図２０】
2019514413.tif 000045
【図２１】
2019514413.tif 000046
【図２２】
2019514413.tif 000047
【図２３】
2019514413.tif 000048
【図２４】
2019514413.tif 000049
【図２５】
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【図２６】
2019514413.tif 000051
【図２７】
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【図２８】
2019514413.tif 000053
【図２９】
2019514413.tif 000054
【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
2019514413.tif 000057
【図３３】
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【図３４】
2019514413.tif 000059
【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１ａ】
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【図４１ｂ】
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【図４２】
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【国際調査報告】
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