(57)【要約】（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患から対象を防御するための組成物が、本明細書において記載されている。この組成物は、（ｉ）真核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに作動可能に連結した感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを含有するベクターおよび担体を含むか、または（ｉｉ）（ｉ）のベクターをトランスフェクトされた真核細胞から得られた（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスおよび担体を含む。
2019535291.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞におけるＤＮＡの発現のために適切なプロモーターに作動可能に連結したＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを含むベクターであって、前記ＲＮＡ分子が感染性プラス一本鎖（（＋）ＳＳ）ＲＮＡウイルスをコードし、前記ＤＮＡが少なくとも３つのイントロンを含む、ベクター。
【請求項２】
前記（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスが、フラビウイルス、アルファウイルス、ピコルナウイルス、ルビウイルス、コロナウイルス、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、重症急性呼吸器（ＳＡＲ）ウイルス、およびレンチウイルスである、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記フラビウイルスが、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、デングウイルス、黄熱ウイルス、ウェストナイルウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびジカウイルスである、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
前記フラビウイルスがＪＥＶである、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
真核細胞におけるＤＮＡの発現のために適切なプロモーターに作動可能に連結したキメラＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを含むベクターであって、前記キメラＲＮＡ分子が感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードし、前記ＤＮＡが少なくとも３つのイントロンを含む、ベクター。
【請求項６】
前記（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスが、少なくとも２つの異なる（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＲＮＡを含むキメラＲＮＡ分子によってコードされる、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
前記少なくとも２つの異なる（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスが、ＪＥＶおよび少なくとも１つの他のウイルス、黄熱ウイルスおよび少なくとも１つの他のウイルス、またはデングウイルスおよび少なくとも１つの他のウイルスを含む、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
前記少なくとも１つの他のウイルスが、ジカウイルス、ウェストナイルウイルス、黄熱ウイルス、またはデングウイルスである、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
前記少なくとも２つの異なる（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスが、ＪＥＶおよびジカウイルスである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
少なくとも１つのイントロンが、非構造タンパク質をコードする領域内にあり、１つのイントロンが、構造タンパク質をコードする領域内にある、請求項１または５に記載のベクター。
【請求項１１】
前記イントロンが、１つの停止コドンまたはいくつかの停止コドンを含有する、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記ＤＮＡが３つのイントロンを含む、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記ＤＮＡが、少なくとも４つのイントロン、少なくとも５つのイントロン、または少なくとも６つのイントロンを含む、請求項１または５に記載のベクター。
【請求項１４】
前記感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスが、非病原性ウイルスである、請求項１または５に記載のベクター。
【請求項１５】
前記非病原性ウイルスが弱毒化ウイルスである、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶプロモーター、ヒトＰｏｌ  Ｉプロモーター、ヒトＰｏｌ  ＩＩプロモーター、またはヒトＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターである、請求項１または５に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１または５に記載のベクターおよび担体を含む組成物。
【請求項１８】
請求項１４または１５に記載のベクターおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
治療有効量の請求項１４または１５に記載のベクターを含むワクチン。
【請求項２０】
治療有効量の請求項１８に記載の医薬組成物を含むワクチン。
【請求項２１】
請求項１または５に記載のベクターをトランスフェクトされた真核細胞から得られるクローン精製された（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団。
【請求項２２】
請求項２１に記載のクローン精製された（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団および担体を含む組成物。
【請求項２３】
請求項２１に記載のクローン精製された（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２４】
治療有効量の、請求項１４または１５に記載のベクターをトランスフェクトされた細胞から得られる均質なクローン精製された生（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルス集団を含む、ワクチン。
【請求項２５】
請求項１または５に記載のベクターを真核細胞内にトランスフェクトすること、および（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスを単離することを含み、それによって、均質なクローン精製された生（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルス集団を得る、前記均質なクローン精製された生（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルス集団を調製する方法。
【請求項２６】
前記真核細胞が、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＭＤＣＫ細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１４または１５に記載のベクターを真核細胞内にトランスフェクトすること、および（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスを単離することを含み、それによってワクチンを得る、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患に対して対象を防御するためのワクチンを調製する方法。
【請求項２８】
前記真核細胞が、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＭＤＣＫ細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２０または２４に記載のワクチンを対象に投与することを含む、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患に対して対象を防御するための方法。
【請求項３０】
前記対象が哺乳動物である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記哺乳動物が、ヒトまたは獣医学的動物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
安定なプラスミドを調製する方法であって、前記方法が、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを含み、前記方法が、少なくとも３つのイントロンを前記ＤＮＡに導入することを含み、かつ、少なくとも１つのイントロンが、前記（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの構造タンパク質をコードする領域内にあり、少なくとも１つのイントロンが、前記（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質をコードする領域内にある、方法。
【請求項３３】
請求項１または５に記載のベクターを宿主細胞内にトランスフェクトすること、および前記ベクターを前記宿主細胞から単離することを含む、請求項１または５に記載のベクターを調製する方法。
【請求項３４】
請求項１または５に記載のベクターをトランスフェクトされた単離細胞。
【請求項３５】
請求項２５に記載の均質なクローン精製された生（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルス集団を含むワクチンを投与することを含む、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患に対して対象を防御する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年１１月２８日に出願された米国仮特許出願番号第６２／４２６，７０８号の利益を主張しており、この仮出願は、本明細書によってその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
分野
一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスによって生じる疾患に対して対象を防御するための組成物が記載される。
【背景技術】
【０００３】
背景
ウイルスは、遺伝物質およびタンパク質から構成される小さな非細胞生物である。異なるタイプのウイルスが存在する。例えば、ウイルスは、宿主の核内で複製するＤＮＡウイルス、または細胞の細胞質内で複製するＲＮＡウイルスであり得る。ウイルスは、二本鎖または一本鎖であり得る。さらに、一本鎖ＲＮＡウイルスは、プラス（＋、センス）鎖またはマイナス（−）鎖であり得る。これらの異なるタイプのウイルスは、様々なウイルス感染を引き起こす。
【０００４】
ウイルス感染は、病原性ウイルスが生物の体に侵入すると生じる。内部に入ると、ウイルスは細胞に付着し、そして、細胞がバーストし死亡するまで細胞が新たなウイルスを複製するように細胞をリプログラミングすることによって再生し、それによってウイルスが迅速に広がることを可能にし、それによってヒトおよび動物において様々な感染性疾患を生じさせる。ウイルスによって生じる感染性疾患には、風邪、インフルエンザ、および疣贅が含まれる。しかし、ウイルスはまた、ＡＩＤＳ、天然痘、ヘルペス、出血熱、ポリオ、麻疹、おたふく風邪、および風疹などの重度の疾患も生じさせる。
【０００５】
ワクチンが開発され、ポリオ、麻疹、おたふく風邪、および風疹のようなものの発生を成功裏に低減させている。従来のワクチンは、弱毒化されている生ウイルスを含有する。しかし、これらのウイルスは、より病原性の表現型に戻る可能性を有し、また、免疫不全宿主においては弱毒化が不十分であり得るため、広範なウイルス系において持続的な免疫性を誘発する安全な免疫原性ワクチンの開発が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、生弱毒化ウイルスをｉｎ  ｖｉｖｏで生成するｉＤＮＡ（登録商標）（Ｍｅｄｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．）ワクチンが開発されている。多くのＲＮＡウイルスの完全長ｃＤＮＡが、ｉＤＮＡ（登録商標）ワクチンを生産するために、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミド内にクローニングされている。しかし、多くのケースにおいて、完全長ウイルスｃＤＮＡはＥ．ｃｏｌｉにおいて毒性であることが多く、大量に調製することができないため、このようなプラスミドを調製することは困難であった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
細胞、特に真核細胞における発現のために適切なプロモーターに作動可能に連結した感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを含むベクターが、本明細書において記載される。感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスは、少なくとも２つの異なる（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＲＮＡ配列によってコードされるキメラウイルスであり得る。
【０００８】
上記のベクターを真核細胞内にトランスフェクトすることによって得られた、クローン精製された（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団もまた、本明細書において記載される。
【０００９】
ベクターまたはクローン精製された（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団および担体を含む組成物が、本明細書において記載される。ベクターおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物もまた記載される。
【００１０】
本開示はまた、ベクターを含むワクチン、およびクローン精製された（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団を含むワクチンもまた開示する。ワクチンのベクターは、非病原性および／または弱毒化（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを含む。ワクチンのクローン精製された（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団は、非病原性および／または弱毒化（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスである。さらに、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患に対して対象を免疫化するためおよび防御するためにワクチンを使用する方法もまた、本明細書において記載される。
【００１１】
さらに、本開示は、ワクチンを作製するため、およびクローン精製された（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団を得るために、本明細書において記載されるベクターを使用する方法を記載する。さらに、本開示は、本明細書において記載されるベクターをトランスフェクトされた宿主細胞を得るためにベクターを使用する方法を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、ＳＡ−１４−１４−２  ＪＥＶ株の合成ｃＤＮＡを含有するｐＭＧ８００９  ＪＥＶ  ＤＮＡワクチンの調製を示す。（Ａ）ＣＭＶプロモーター、完全長ＪＥＶ  ＳＡ１４−１４−２合成ｃＤＮＡ、および３つの合成イントロンを含むＤＮＡ構築物が、概略的に示される。ＣＭＶプロモーター、ＪＥＶ遺伝子、およびイントロン１〜３（アスタリスク）の位置が、ノンスケールで概略的に示される。（Ｂ）１０の独立したＥ．ｃｏｌｉコロニーから単離されたプラスミドＤＮＡの１％ゲル電気泳動の結果。ｐＭＧ８００９を化学的に有能なＥ．ｃｏｌｉ  Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上で成長させた。プレートから得た１０の独立したコロニーを２ｍｌのＬＢ培養物中で成長させ、ＤＮＡを単離し、５０μｌの滅菌水に再懸濁した。１μｌの得られたプラスミドＤＮＡを、１％ＴＡＥアガロースゲル上にロードした。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、ＳＡ−１４−１４−２  ＪＥＶ株の合成ｃＤＮＡを含有するｐＭＧ８００９  ＪＥＶ  ＤＮＡワクチンの調製を示す。（Ａ）ＣＭＶプロモーター、完全長ＪＥＶ  ＳＡ１４−１４−２合成ｃＤＮＡ、および３つの合成イントロンを含むＤＮＡ構築物が、概略的に示される。ＣＭＶプロモーター、ＪＥＶ遺伝子、およびイントロン１〜３（アスタリスク）の位置が、ノンスケールで概略的に示される。（Ｂ）１０の独立したＥ．ｃｏｌｉコロニーから単離されたプラスミドＤＮＡの１％ゲル電気泳動の結果。ｐＭＧ８００９を化学的に有能なＥ．ｃｏｌｉ  Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ寒天プレート上で成長させた。プレートから得た１０の独立したコロニーを２ｍｌのＬＢ培養物中で成長させ、ＤＮＡを単離し、５０μｌの滅菌水に再懸濁した。１μｌの得られたプラスミドＤＮＡを、１％ＴＡＥアガロースゲル上にロードした。
【００１３】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、ｐＭＧ８００９  ｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドをトランスフェクトしたＶｅｒｏ細胞におけるＪＥＶウイルスの発現を示す。（ａ）１μｇのｐＭＧ８００９  ｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドでのエレクトロポレーションによってトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞における感染性中心アッセイ（ＩＣＡ：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｅｎｔｅｒ  ａｓｓａｙ）。（ｂ）マウス抗ＪＥＶ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５９ＡＦ）抗体を使用するウェスタンブロット。レーンＭは、ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２タンパク質分子量マーカー（Ｔｈｅｒｍｏ）を示す。レーン１は、ｐＭＧ８００９をトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞におけるＪＥＶ抗原を示す。レーン２は、トランスフェクトされていないＶｅｒｏ細胞である。（ｃ）抗ＪＥＶマウスＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５９ＡＦを使用する間接ＩＦＡ。パネル１、２、３は、それぞれ、１７０倍の倍率でのｐＭＧ８００９をトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞、トランスフェクトされていないＶｅｒｏ細胞（１７０倍の倍率）、および４００倍の倍率でのトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞を示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｃは、ｐＭＧ８００９  ｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドをトランスフェクトしたＶｅｒｏ細胞におけるＪＥＶウイルスの発現を示す。（ａ）１μｇのｐＭＧ８００９  ｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドでのエレクトロポレーションによってトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞における感染性中心アッセイ（ＩＣＡ：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｅｎｔｅｒ  ａｓｓａｙ）。（ｂ）マウス抗ＪＥＶ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５９ＡＦ）抗体を使用するウェスタンブロット。レーンＭは、ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２タンパク質分子量マーカー（Ｔｈｅｒｍｏ）を示す。レーン１は、ｐＭＧ８００９をトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞におけるＪＥＶ抗原を示す。レーン２は、トランスフェクトされていないＶｅｒｏ細胞である。（ｃ）抗ＪＥＶマウスＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５９ＡＦを使用する間接ＩＦＡ。パネル１、２、３は、それぞれ、１７０倍の倍率でのｐＭＧ８００９をトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞、トランスフェクトされていないＶｅｒｏ細胞（１７０倍の倍率）、および４００倍の倍率でのトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞を示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、ｐＭＧ８００９  ｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドをトランスフェクトしたＶｅｒｏ細胞におけるＪＥＶウイルスの発現を示す。（ａ）１μｇのｐＭＧ８００９  ｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドでのエレクトロポレーションによってトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞における感染性中心アッセイ（ＩＣＡ：Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｃｅｎｔｅｒ  ａｓｓａｙ）。（ｂ）マウス抗ＪＥＶ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５９ＡＦ）抗体を使用するウェスタンブロット。レーンＭは、ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２タンパク質分子量マーカー（Ｔｈｅｒｍｏ）を示す。レーン１は、ｐＭＧ８００９をトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞におけるＪＥＶ抗原を示す。レーン２は、トランスフェクトされていないＶｅｒｏ細胞である。（ｃ）抗ＪＥＶマウスＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５９ＡＦを使用する間接ＩＦＡ。パネル１、２、３は、それぞれ、１７０倍の倍率でのｐＭＧ８００９をトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞、トランスフェクトされていないＶｅｒｏ細胞（１７０倍の倍率）、および４００倍の倍率でのトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞を示す。
【００１４】
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂは、ｐＭＧ８００９  ｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドをトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞の培地におけるＪＥＶウイルスの検出を示す。（Ａ）ＢＨＫ細胞におけるプラークアッセイ。上部のパネルは、ウイルスに感染したＶｅｒｏ細胞（エレクトロポレーションなし）の成長培地のプラークアッセイであり、試料は、１０００ＰＦＵでの感染後７日目に採取した（図３Ｂの試料番号６）。下部のパネルは、ｐＭＧ８００９をトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞（エレクトロポレーション後）の成長培地のプラークアッセイであり、試料は、１０ｎｇのＤＮＡでのトランスフェクション後７日目に採取した（図３Ｂの試料番号２）。（Ｂ）ｐＭＧ８００９  ｉＤＮＡ（登録商標）をトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞（試料２、３、４）またはｐＭＧ８００９由来のウイルスに感染したＶｅｒｏ細胞（試料５および６）の培地におけるＪＥＶウイルスの増殖曲線。試料５および６は、エレクトロポレーション手順がＶｅｒｏ細胞におけるウイルスの成長に影響するかどうかを検出するための、エレクトロポレーションされたＶｅｒｏ細胞およびエレクトロポレーションされていないＶｅｒｏ細胞の１０００ＰＦＵのｐＭＧ８００９由来のワクチンウイルスでの感染をそれぞれ示す。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂは、ｐＭＧ８００９  ｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドをトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞の培地におけるＪＥＶウイルスの検出を示す。（Ａ）ＢＨＫ細胞におけるプラークアッセイ。上部のパネルは、ウイルスに感染したＶｅｒｏ細胞（エレクトロポレーションなし）の成長培地のプラークアッセイであり、試料は、１０００ＰＦＵでの感染後７日目に採取した（図３Ｂの試料番号６）。下部のパネルは、ｐＭＧ８００９をトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞（エレクトロポレーション後）の成長培地のプラークアッセイであり、試料は、１０ｎｇのＤＮＡでのトランスフェクション後７日目に採取した（図３Ｂの試料番号２）。（Ｂ）ｐＭＧ８００９  ｉＤＮＡ（登録商標）をトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞（試料２、３、４）またはｐＭＧ８００９由来のウイルスに感染したＶｅｒｏ細胞（試料５および６）の培地におけるＪＥＶウイルスの増殖曲線。試料５および６は、エレクトロポレーション手順がＶｅｒｏ細胞におけるウイルスの成長に影響するかどうかを検出するための、エレクトロポレーションされたＶｅｒｏ細胞およびエレクトロポレーションされていないＶｅｒｏ細胞の１０００ＰＦＵのｐＭＧ８００９由来のワクチンウイルスでの感染をそれぞれ示す。
【００１５】
【図４】図４は、ＩＦＡによる、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｐＭＧ８００９  ＪＥＶワクチンの免疫原性を示す。マウスには、０日目に、５μｇのｐＭＧ８００９プラスミドを、エレクトロポレーションを使用して、筋肉内にワクチン接種した。抗体を検出するために、マウスを２１日目に採血した。ワクチン接種されたマウスの血清を、チャンバースライド内で、ＩＦＡにおいてＪＥＶに感染したＶｅｒｏ細胞をプローブするために、１：１０希釈で使用した。マウス血清とインキュベーションした後、Ｖｅｒｏ細胞をマウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するフルオレセイン標識抗体で処理して、ＪＥＶ抗原を発現する細胞を可視化した。スライドを、ヨウ化プロピジウム核対比染色を含有するマウンティング培地で被覆し、顕微鏡下で観察した。
【００１６】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｇは、ＣＭＶ最初期プロモーターに作動可能に連結しており、ｐＵＣ骨格プラスミド内に挿入されている、ＪＥＶ（株ＳＡ１４−１４−２）の完全長ゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを含むｐＭＧ８００９プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ｐＵＣプラスミドおよびイントロンのヌクレオチドは、大文字で表されている。ＣＭＶプロモーターはイタリック文字で表されている。ＪＥＶのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡは太字で表されている。イントロンには下線が引かれている。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｇは、ＣＭＶ最初期プロモーターに作動可能に連結しており、ｐＵＣ骨格プラスミド内に挿入されている、ＪＥＶ（株ＳＡ１４−１４−２）の完全長ゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを含むｐＭＧ８００９プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ｐＵＣプラスミドおよびイントロンのヌクレオチドは、大文字で表されている。ＣＭＶプロモーターはイタリック文字で表されている。ＪＥＶのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡは太字で表されている。イントロンには下線が引かれている。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｇは、ＣＭＶ最初期プロモーターに作動可能に連結しており、ｐＵＣ骨格プラスミド内に挿入されている、ＪＥＶ（株ＳＡ１４−１４−２）の完全長ゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを含むｐＭＧ８００９プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ｐＵＣプラスミドおよびイントロンのヌクレオチドは、大文字で表されている。ＣＭＶプロモーターはイタリック文字で表されている。ＪＥＶのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡは太字で表されている。イントロンには下線が引かれている。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｇは、ＣＭＶ最初期プロモーターに作動可能に連結しており、ｐＵＣ骨格プラスミド内に挿入されている、ＪＥＶ（株ＳＡ１４−１４−２）の完全長ゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを含むｐＭＧ８００９プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ｐＵＣプラスミドおよびイントロンのヌクレオチドは、大文字で表されている。ＣＭＶプロモーターはイタリック文字で表されている。ＪＥＶのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡは太字で表されている。イントロンには下線が引かれている。
【図５Ｅ】図５Ａ〜５Ｇは、ＣＭＶ最初期プロモーターに作動可能に連結しており、ｐＵＣ骨格プラスミド内に挿入されている、ＪＥＶ（株ＳＡ１４−１４−２）の完全長ゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを含むｐＭＧ８００９プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ｐＵＣプラスミドおよびイントロンのヌクレオチドは、大文字で表されている。ＣＭＶプロモーターはイタリック文字で表されている。ＪＥＶのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡは太字で表されている。イントロンには下線が引かれている。
【図５Ｆ】図５Ａ〜５Ｇは、ＣＭＶ最初期プロモーターに作動可能に連結しており、ｐＵＣ骨格プラスミド内に挿入されている、ＪＥＶ（株ＳＡ１４−１４−２）の完全長ゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを含むｐＭＧ８００９プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ｐＵＣプラスミドおよびイントロンのヌクレオチドは、大文字で表されている。ＣＭＶプロモーターはイタリック文字で表されている。ＪＥＶのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡは太字で表されている。イントロンには下線が引かれている。
【図５Ｇ】図５Ａ〜５Ｇは、ＣＭＶ最初期プロモーターに作動可能に連結しており、ｐＵＣ骨格プラスミド内に挿入されている、ＪＥＶ（株ＳＡ１４−１４−２）の完全長ゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡを含むｐＭＧ８００９プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。ｐＵＣプラスミドおよびイントロンのヌクレオチドは、大文字で表されている。ＣＭＶプロモーターはイタリック文字で表されている。ＪＥＶのゲノムＲＮＡをコードするｃＤＮＡは太字で表されている。イントロンには下線が引かれている。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
本開示は、ＲＮＡウイルス、特に、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患に対して防御するためのワクチンを提供する。（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの科には、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、ＣａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅおよびＰｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、ならびにＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅが含まれる。例えば、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科にはヒトアストロウイルスが含まれ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ科にはノーウォークウイルスが含まれ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科にはコクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、およびライノウイルスが含まれ、Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ科にはコロナウイルスおよびＳＡＲウイルスが含まれ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科にはアルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、デルタレトロウイルス、レンチウイルス、およびスプマウイルスが含まれ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科には風疹ウイルスおよびアルファウイルスが含まれ、ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科にはＣ型肝炎ウイルスおよびフラビウイルスが含まれる。
【００１８】
実施形態では、本明細書において記載されるワクチンは、アルファウイルスによって生じる疾患に対して防御する。アルファウイルスには、バーマフォレストウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、パナマウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、およびシンドビスウイルスが含まれる。
【００１９】
実施形態では、本明細書において記載されるワクチンは、フラビウイルスによって生じる疾患に対して防御する。フラビウイルスには、黄熱ウイルス、デングウイルス、ウェストナイルウイルス、ジカウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、および日本脳炎ウイルスが含まれる。
【００２０】
周知のように、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスは、ウイルス性胃腸炎、Ａ型肝炎、Ｃ型肝炎、デング熱、黄熱、ウェストナイル熱、ポリオ、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、脳炎、麻疹、おたふく風邪、風疹、および口蹄疫を含む様々な疾患を生じさせる。本明細書において使用する場合、用語「（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患」には、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる感染が含まれる。
【００２１】
実施形態では、本明細書において記載されるワクチンは、脳炎、例えば、ＪＥＶによって生じる脳炎に対して防御する。
【００２２】
本明細書において記載されるワクチンは、治療有効量の（ｉ）感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡなどの、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター、または（ｉｉ）（ｉ）のベクターをトランスフェクトされた細胞から得られた、クローン精製された感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団を含む。さらに、ベクター内に含有されるＤＮＡは、非病原性および／または弱毒化（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードし、このＤＮＡは、真核細胞において発現するための適切なプロモーターを含む。
【００２３】
本明細書において使用する場合、用語「感染性」ウイルスは、細胞に侵入し、再生（複製）し、および増殖し得るウイルスを指す。感染性ウイルスは、気付かれずに疾患を生じさせ得るかまたは増殖し得る。したがって、感染性（複製）ウイルスは、病原性または非病原性であり得る。実施形態では、感染性ウイルスは、ワクチンにおいて使用される場合、非病原性である、および／または弱毒化されている。感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスは、その完全長ＲＮＡゲノム配列によってコードされるウイルスを含む。特定の実施形態では、本開示は、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患に対して対象を防御するための生ウイルスを生成する感染性ＤＮＡ（ｉＤＮＡ（登録商標））ワクチンを提供する。
【００２４】
従来のＤＮＡワクチンとは対照的に、ｉＤＮＡ（登録商標）ワクチンは、ＤＮＡローンチ型の生弱毒化ウイルスをｉｎ  ｖｉｖｏで生成する。従来のＤＮＡワクチンは、目的の特定の遺伝子をコードするＤＮＡの配列を含有するのみであったが、その一方で、ｉＤＮＡ（登録商標）ワクチンは、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの機能的ゲノムＲＮＡ全体をコードするＤＮＡを含む。さらに、宿主細胞の細胞質内で複製し、宿主細胞の核には入らない（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスとは異なり、ｉＤＮＡ（登録商標）ワクチンのＤＮＡは、複製を開始するために宿主細胞の核に入る。ｉＤＮＡ（登録商標）ワクチンのＤＮＡが宿主細胞内に注入されると、ＤＮＡは、複製のために、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ全体を転写する核に入る。感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの転写された機能的ゲノムＲＮＡは、その後、ウイルスの子孫を得るための複製および増殖のために、宿主細胞の細胞質内に輸送される。このプロセスは、ワクチン生産で一般に見られる突然変異および復帰の可能性を低減させる。
【００２５】
従来のＤＮＡワクチンと同様に、ｉＤＮＡ（登録商標）ワクチンは安価であり、製造が簡単である。さらに、生弱毒化ウイルスは対象におけるワクチンの投与部位で生産され得るため、ｉＤＮＡ（登録商標）ワクチンは、免疫性を迅速に誘発する。また、生弱毒化ウイルスが生産されるため、免疫性を誘発するために必要なのは単回の低用量のみである。さらに、ｉＤＮＡ（登録商標）ワクチンは、クローン精製された弱毒化（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの遺伝的に安定かつ均質な集団をｉｎ  ｖｉｖｏで生成し、これがワクチンの安全性を向上させる。
【００２６】
さらに、ｉＤＮＡ（登録商標）技術は、ワクチンとして使用するための、クローン精製された弱毒化（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの遺伝的に安定かつ均質な集団を生成するために使用され得る。（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスは遺伝的に安定なｉＤＮＡ（登録商標）からローンチされるため、ｉＤＮＡ（登録商標）技術は、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＲＮＡの遺伝子突然変異生成の可能性を少なくとも約５０％、７０％、８０％、９０％、または９９％低減させ得る。実施形態では、本開示は、弱毒化（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団を含むワクチンを記載する。
【００２７】
ｉＤＮＡ（登録商標）技術は、ワクチンをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで生成するためにＤＮＡベクターを使用することに基づく。用語「ベクター」および「プラスミド」は、本明細書全体を通して区別せずに使用される。実施形態では、本開示は、真核細胞などの細胞における発現に適切なプロモーターに作動可能に連結したＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。実施形態では、ＤＮＡは、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの完全長（ゲノム）ＲＮＡをコードするｃＤＮＡ分子である。実施形態では、ＲＮＡ分子は、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードする。ＤＮＡ分子は、少なくとも３つのイントロンを含む。イントロンの少なくとも１つは、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質をコードする遺伝子（またはＤＮＡの領域）内に位置し、１つのイントロンは、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子（またはＤＮＡの領域）内に位置する。
【００２８】
本明細書において記載されるベクターは、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡに加えて、調節エレメントを含む。調節エレメントには、例えば、１つまたは複数のプロモーター、ポリＡテール、ターミネーター、エンハンサー、リボザイム、内部リボソーム進入部位、または核輸送エレメントが含まれる。プロモーターには、宿主細胞における発現に適切なものが含まれる。実施形態では、プロモーターは、真核細胞、例えば哺乳動物細胞における発現に適切である。このようなプロモーターの例は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターである。真核細胞におけるベクターの発現のためのプロモーターの他の例には、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０、ＨＳＶ、ヒトＰｏｌ  Ｉ、ヒトＰｏｌ  ＩＩ、およびヒトＰｏｌ  ＩＩＩが含まれる。特定の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターである。
【００２９】
ベクター内の転写開始部位に対するプロモーターの位置は、重要である。例えば、プロモーターは、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡの５’末端の約５から約１００、約１０から約５０、または約１０から約２０ヌクレオチド上流に配置され得る。実施形態では、本明細書において記載されるベクターは、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡの５’末端の約１２から約１８ヌクレオチド上流に位置するＣＭＶプロモーターを含む。特定の実施形態では、ＣＭＶプロモーターの最適な位置は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡの５’末端の約１５ヌクレオチド上流である。
【００３０】
実施形態では、ポリＡテールは、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡの３’末端から約０から５００ヌクレオチド下流に位置する。
【００３１】
実施形態では、ベクターはまた、転写されたＲＮＡ分子の合成および転写されたＲＮＡ分子の細胞の核から細胞質への輸送を確実にするエレメントも含む。
【００３２】
実施形態では、ベクター内に含有されるＤＮＡは、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードするＲＮＡ分子をコードする。特定の実施形態では、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスは、非病原性および／または弱毒化ウイルスである。
【００３３】
実施形態では、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスは、フラビウイルスである。フラビウイルスの例には、ＪＥＶ、デングウイルス、黄熱ウイルス、ウェストナイルウイルス、およびジカウイルスが含まれる。実施形態では、フラビウイルスは、ＪＥＶである。ＪＥＶは、非病原性ウイルスである。特定の実施形態では、ＪＥＶは、非病原性および／または弱毒化ウイルスである。弱毒化ＪＥＶの例は、ＳＡ１４−１４−２株、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３１５１１９である。
【００３４】
修飾を、株を弱毒化するため、または株の弱毒化をさらに向上させるために、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＲＮＡをコードするＤＮＡに対して行うことができる。ＤＮＡは、十分な弱毒化を確実にするように、および／または他の特徴を導入しながらも、感染性および所望の治療効果は依然として維持するように、修飾され得る。弱毒化の最適化は、ワクチンを向上させ得、ワクチン接種に関連する副作用を低減させ得る。実施形態では、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＲＮＡをコードするＤＮＡは、核酸の１つまたは複数の挿入、欠失、および／または置換によって修飾され得る。例えば、修飾されたＤＮＡは、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードする野生型配列と少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９７％、または９９％の配列同一性を有し得る。
【００３５】
さらに、ｉＤＮＡ技術の使用によって、天然に弱毒化されたウイルスが生成する。ｉＤＮＡ技術によって生成されるこれらのウイルスは、オリジナルの野生型ウイルスまたは天然のウイルスと比較して弱毒化されている。さらに、これらのウイルスは、このようなウイルス集団を注射した後の対象の数に基づいて判定したところ、従来の方法（Poirierら、２０１７年）によって調製された弱毒化ウイルスよりも少なくとも２０％高く弱毒化されている。本開示は、従来の方法によって調製された弱毒化ウイルスよりも少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％高く弱毒化されている、本明細書において記載されるｉＤＮＡ技術によって生成された（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスを記載する。
【００３６】
ベクター内に含有されるＤＮＡは、非病原性のおよび／または弱毒化された感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＲＮＡ分子をコードする。実施形態では、ベクター内に含有されるＤＮＡは、非病原性のおよび／または弱毒化された感染性のＪＥＶ、デング熱ウイルス、黄熱ウイルス、ウェストナイルウイルス、またはジカウイルスをコードする。
【００３７】
ベクター内に含有されるＤＮＡはまた、少なくとも２つの異なる（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＲＮＡを含むキメラＲＮＡ分子もコードし得る。第２の（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＲＮＡは、第１の（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードする完全長ＲＮＡの一部分を置き換える。したがって、キメラＲＮＡ分子は、感染性キメラ（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードし、非病原性であってよい、および／または弱毒化されていてよい。実施形態では、ベクター内に含有されるＤＮＡは、同一属の少なくとも２つの異なる（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＲＮＡを含むキメラ（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードする。例えば、第１の（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスはフラビウイルスであり、第２の（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスは別のフラビウイルスである。別の例として、第１の（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスはＪＥＶであり、その一方で、第２の（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスは、デングウイルス、黄熱ウイルス、ウェストナイルウイルス、またはジカウイルスである。実施形態では、ＤＮＡは、ＪＥＶおよびジカウイルスのＲＮＡを含むキメラＲＮＡ分子をコードする。他の例には、黄熱ウイルスおよびデング熱ウイルス、または黄熱ウイルスおよびジカウイルス、または黄熱ウイルスおよびジカウイルス、または黄熱ウイルスおよびウェストナイルウイルスのキメラＲＮＡ分子をコードするＤＮＡが含まれる。キメラウイルスをコードするこのようなＤＮＡベクターは免疫応答を誘発し、１つのフラビウイルス、または２つもしくはそれより多くのフラビウイルスでの感染から防御する。
【００３８】
キメラＲＮＡ分子は、第１の（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの核酸配列の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％を含有し得る。
【００３９】
本開示は、本明細書において記載される（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードするｉＤＮＡプラスミドの増殖に使用される宿主細胞、特にＥ．ｃｏｌｉでのＤＮＡの安定性を向上させるため、および前記宿主細胞内におけるＤＮＡの収量を向上させるための、（＋）ＳＳ  ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ内へのイントロンの挿入を記載する。実施形態では、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、３つのイントロンを含む。用語「イントロン」は、タンパク質をコードせず、遺伝子の配列を中断し、そして後に、遺伝子配列を回復させるためにスプライシングメカニズムによって除去され得るイントロンＲＮＡをコードするＤＮＡの断片を指す。イントロンは、１つの停止コドンまたはいくつかの停止コドンを含有し得る。ＤＮＡ内の停止コドンの例には、ＴＡＡ、ＴＡＧ、およびＴＧＡが含まれる。他の公知のイントロンもまた使用することができる。特定の実施形態では、本明細書において記載されるＤＮＡ内のイントロン配列は、マウス免疫グロブリンＨ鎖Ｖ領域前駆体遺伝子に由来する（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１２８８０）。
【００４０】
実施形態では、ＤＮＡは、少なくとも３つのイントロン、少なくとも４つのイントロン、少なくとも５つのイントロン、少なくとも６つのイントロン、少なくとも７つのイントロン、少なくとも８つのイントロン、少なくとも９つのイントロン、または少なくとも１０のイントロンを含有する。イントロンの配置は、経験的に、または当技術分野において公知の方法を使用してプロモーターを予測することによって、決定することができる（Shahmuradov、２０１７年）。イントロンの少なくとも１つは、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの非構造（ＮＳ）タンパク質をコードする遺伝子内に挿入され、イントロンの少なくとも１つは、構造タンパク質をコードする遺伝子内に挿入される。
【００４１】
（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスは、構造遺伝子および非構造遺伝子を含む。例えば、フラビウイルスの非構造タンパク質には、ＮＳ１タンパク質、ＮＳ２Ａタンパク質、ＮＳ２Ｂタンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、２Ｋタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、およびＮＳ５タンパク質が含まれる。フラビウイルスの構造タンパク質には、カプシド（Ｃａｐ）タンパク質、膜（ｐｒＭ／Ｍ）タンパク質、およびエンベロープ（Ｅｎｖ）タンパク質が含まれる。実施形態では、イントロンの少なくとも１つは、フラビウイルスのＮＳ１タンパク質、ＮＳ２Ａタンパク質、ＮＳ２Ｂタンパク質、ＮＳ３タンパク質、ＮＳ４Ａタンパク質、２Ｋタンパク質、ＮＳ４Ｂタンパク質、またはＮＳ５タンパク質をコードする遺伝子内に挿入され、イントロンの少なくとも１つは、フラビウイルスのＣａｐタンパク質、Ｅｎｖタンパク質、またはｐｒＭ／Ｍタンパク質をコードする遺伝子内に挿入される。フラビウイルスのこれらの構造タンパク質および非構造タンパク質は、フラビウイルスの構造遺伝子および非構造遺伝子によってコードされるポリタンパク質の一部である。
【００４２】
実施形態では、フラビウイルスは、弱毒化ＪＥＶ  ＳＡ１４−１４−２株であり、ＪＥＶ  ＳＡ１４−１４−２株のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号（ＧＢ  Ａｃｃ．）ＡＦ３１５１１９．１で提供される。以下の表１で示すように、ヌクレオチド９６から２４７７（ＧＢ  Ａｃｃ．ＡＦ３１５１１９．１の）は、構造タンパク質（Ｃａｐ、ｐｒＭ／Ｍ、およびＥｎｖ）をコードし、ヌクレオチド２４７８から１０３９１は、非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５）をコードする。他の実施形態では、イントロンの少なくとも１つは、ＧＢ  Ａｃｃ．ＡＦ３１５１１９．１のヌクレオチド９６〜２４７７の間に挿入され、少なくとも１つのイントロンは、ヌクレオチド２４７８から１０３９１の間に挿入される。特定の実施形態では、イントロンは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３１５１１９で提供されるＪＥＶ株ＳＡ１４−１４−２のヌクレオチド配列のヌクレオチド４１４（カプシド）、２２１３（エンベロープ）、および３１３４で挿入される。
【００４３】
実施形態では、フラビウイルスは、黄熱ＹＦ１７Ｄ株であり、ＹＦ１７Ｄ株のヌクレオチド配列は、ＧＢ  Ａｃｃ．Ｘ０３７００．１で提供される。以下の表１で示すように、ヌクレオチド１２２から２４５２（ＧＢ  Ａｃｃ．Ｘ０３７００．１の）は、構造タンパク質（Ｃａｐ、ｐｒＭ／Ｍ、およびＥｎｖ）をコードし、ヌクレオチド２４５３から１０３５４は、非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５）をコードする。特定の実施形態では、イントロンの少なくとも１つは、ＧＢ  Ａｃｃ．Ｘ０３７００．１のヌクレオチド１２２から２４５２の間に挿入され、少なくとも１つのイントロンは、ヌクレオチド２４５３から１０３５４の間に挿入される。
【００４４】
実施形態では、フラビウイルスは、ウェストナイルウイルス（ＷＮＶ）の株であり、ＷＮＶ株のヌクレオチド配列は、ＧＢ  Ａｃｃ．ＫＭ６５９８７６．１で提供される。以下の表１で示すように、ヌクレオチド９７から２４６９（ＧＢ  Ａｃｃ．ＫＭ６５９８７６．１の）は、構造タンパク質（Ｃａｐ、ｐｒＭ／Ｍ、およびＥｎｖ）をコードし、ヌクレオチド２４７０から１０３９８は、非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、２Ｋ、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５）をコードする。特定の実施形態では、イントロンの少なくとも１つは、ＧＢ  Ａｃｃ．ＫＭ６５９８７６．１のヌクレオチド９７から２４６９の間に挿入され、少なくとも１つのイントロンは、ヌクレオチド２４７０から１０３９８の間に挿入される。
【００４５】
実施形態では、フラビウイルスは、デング２  ＰＤＫ−５３株であり、デング２  ＰＤＫ−５３株のヌクレオチド配列は、ＧＢ  Ａｃｃ．Ｍ８４７２８．１で提供される。以下の表１で示すように、ヌクレオチド１００から２４２１（ＧＢ  Ａｃｃ．Ｍ８４７２８．１．の）は、構造タンパク質（Ｃａｐ、ｐｒＭ／Ｍ、およびＥｎｖ）をコードし、ヌクレオチド２４２２から１０２６９は、非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、２Ｋ、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５）をコードする。特定の実施形態では、イントロンの少なくとも１つは、ＧＢ  Ａｃｃ．Ｍ８４７２８．１のヌクレオチド１００から２４２１の間に挿入され、少なくとも１つのイントロンは、ヌクレオチド２４２２から１０２６９の間に挿入される。
【００４６】
実施形態では、フラビウイルスは、ジカウイルスの株であり、ジカ株のヌクレオチド配列は、ＧＢ  Ａｃｃ．ＮＣ＿０１２５３２で提供される。以下の表１で示すように、ヌクレオチド１０７から２４７６（ＧＢ  Ａｃｃ．ＮＣ＿０１２５３２．の）は、構造タンパク質（Ｃａｐ、ｐｒＭ／Ｍ、およびＥｎｖ）をコードし、ヌクレオチド２４７７から１０３６３は、非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、２Ｋ、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５）をコードする。特定の実施形態では、イントロンの少なくとも１つは、ＧＢ  Ａｃｃ．ＮＣ＿０１２５３２のヌクレオチド１０７から２４７６の間に挿入され、少なくとも１つのイントロンは、ヌクレオチド２４７７から１０３６３の間に挿入される。
【００４７】
別の例として、アルファウイルスの非構造タンパク質には、ｎｓＰ１タンパク質、ｎｓＰ２タンパク質、ｎｓＰ３タンパク質、およびｎｓＰ４タンパク質が含まれる。アルファウイルスの構造タンパク質には、カプシド（Ｃａｐ）タンパク質、Ｅ３タンパク質、Ｅ２タンパク質、６Ｋタンパク質、およびＥ１タンパク質が含まれる。実施形態では、イントロンの少なくとも１つは、アルファウイルスのｎｓＰ１タンパク質、ｎｓＰ２タンパク質、ｎｓＰ３タンパク質、またはｎｓＰ４タンパク質をコードする遺伝子内に挿入され、イントロンの少なくとも１つは、アルファウイルスのＣａｐタンパク質、Ｅ３タンパク質、Ｅ２タンパク質、６Ｋタンパク質、またはＥ１タンパク質をコードする遺伝子内に挿入される。アルファウイルスでは、非構造タンパク質および構造タンパク質は、分離したポリタンパク質の各部分であり、その結果、これら複数の非構造遺伝子が一緒になって１つのポリタンパク質をコードし、これら複数の構造遺伝子が一緒になって第２のポリタンパク質をコードする。
【００４８】
実施形態では、アルファウイルスは、ＶＥＥＶ  ＴＣ−８３株であり、ＶＥＥＶ株のヌクレオチド配列は、ＧＢ  Ａｃｃ．Ｌ０１４４３で提供される。以下の表２で示すように、ヌクレオチド４５から７５２３（ＧＢ  Ａｃｃ．Ｌ０１４４３の）は、非構造タンパク質（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４）をコードし、ヌクレオチド７５６２から１１３２６は、構造タンパク質（Ｃａｐ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ１）をコードする。他の実施形態では、イントロンの少なくとも１つは、ＧＢ  Ａｃｃ．Ｌ０１４４３のヌクレオチド４５〜７５２３の間に挿入され、少なくとも１つのイントロンは、ヌクレオチド７５６２から１１３２６の間に挿入される。
【００４９】
実施形態では、アルファウイルスは、ＣＨＩＫＶ  １８１／２５株であり、ＣＨＩＫＶ株のヌクレオチド配列は、ＧＢ  Ａｃｃ．Ｌ３７６６１．３で提供される。以下の表２で示すように、ヌクレオチド５０から７４７１（ＧＢ  Ａｃｃ．Ｌ３７６６１．３の）は、非構造タンパク質（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４）をコードし、ヌクレオチド７４５０から１１２８３は、構造タンパク質（ＣＡＰ、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ１）をコードする。他の実施形態では、イントロンの少なくとも１つは、ＧＢ  Ａｃｃ．Ｌ３７６６１．３のヌクレオチド５０〜７４７１の間に挿入され、少なくとも１つのイントロンは、ヌクレオチド７５４０から１１２８３の間に挿入される。
【００５０】
さらなる例として、ピコルナウイルスの非構造タンパク質には、Ｐ２−Ａタンパク質、Ｐ２−Ｂタンパク質、Ｐ２−Ｃタンパク質、Ｐ３−Ａタンパク質、Ｐ３−Ｂタンパク質、Ｐ３−Ｃタンパク質、およびＰ３−Ｄタンパク質が含まれる。ピコルナウイルスの構造タンパク質には、Ｐ１−Ａタンパク質、Ｐ１−Ｂタンパク質、Ｐ１−Ｃタンパク質、およびＰ１−Ｄタンパク質が含まれる。実施形態では、イントロンの少なくとも１つは、ピコルナウイルスのＰ２−Ａタンパク質、Ｐ２−Ｂタンパク質、Ｐ２−Ｃタンパク質、Ｐ３−Ａタンパク質、Ｐ３−Ｂタンパク質、Ｐ３−Ｃタンパク質、またはＰ３−Ｄタンパク質をコードする遺伝子内に挿入され、イントロンの少なくとも１つは、ピコルナウイルスのＰ１−Ａタンパク質、Ｐ１−Ｂタンパク質、Ｐ１−Ｃタンパク質、またはＰ１−Ｄタンパク質をコードする遺伝子内に挿入される。ピコルナウイルスのこれらの構造タンパク質および非構造タンパク質は、ピコルナウイルスの構造遺伝子および非構造遺伝子によってコードされるポリタンパク質の一部である。
【００５１】
実施形態では、ピコルナウイルスは、弱毒化ヒトポリオウイルス２株であり、ヒトポリオウイルス２株のヌクレオチド配列は、ＧＢ  Ａｃｃ．Ｄ００６２５．１で提供される。以下の表３で示すように、ヌクレオチド７４８から３３８４（ＧＢ  Ａｃｃ．Ｄ００６２５．１の）は、構造タンパク質（Ｐ１−Ａ、Ｐ１−Ｂ、Ｐ１−Ｃ、およびＰ１−Ｄ）をコードし、ヌクレオチド３３８５から７３６２は、非構造タンパク質（Ｐ２−Ａ、Ｐ２−Ｂ、Ｐ２−Ｃ、Ｐ３−Ａ、Ｐ３−Ｂ、Ｐ３−Ｃ、およびＰ３−Ｄ）をコードする。他の実施形態では、イントロンの少なくとも１つは、ＧＢ  Ａｃｃ．Ｄ００６２５．１のヌクレオチド７４８から３３８４の間に挿入され、少なくとも１つのイントロンは、ヌクレオチド３３８５から７３６２の間に挿入される。
【００５２】
実施形態では、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスは弱毒化ウイルスであるか、または、ｉＤＮＡ技術プロセスを介するその生産を経て弱毒化されている（もしくは弱毒化が増強されている）。表１、２、および３は、典型的な（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスを提供する。ここには、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの他の例が存在し、各タイプの（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの様々な株も存在する。
【表１】
2019535291.tif 000003
【表２】
2019535291.tif 000004
【表３】
2019535291.tif 000005
【００５３】
実施形態では、本明細書において記載されるベクター内に含有されるＤＮＡは、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードするＤＮＡを含む。他の実施形態では、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードするＤＮＡは、ＧＢ  Ａｃｃ．ＡＦ３１５１１９．１、Ｘ０３７００．１、ＫＭ６５９８７６．１、Ｍ８４７２８．１、ＮＣ＿０１２５３２、Ｌ０１４４３、Ｌ３７６６１．３、またはＤ００６２５．１で示され、少なくとも３つのイントロンを含むように修飾されている。イントロンの少なくとも１つは、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの構造タンパク質をコードするＤＮＡ領域内にあり、イントロンの少なくとも１つは、非構造タンパク質をコードするＤＮＡ領域内にある。
【００５４】
特定の実施形態では、本明細書において記載されるベクター内に含有されるＤＮＡは、配列番号１で示される。
【００５５】
実施形態では、ベクター内に含有される、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードするＤＮＡは、非常に低いストリンジェンシー条件下で、低いストリンジェンシー条件下で、中程度のストリンジェンシー条件下で、中程度〜高いストリンジェンシー条件下で、高いストリンジェンシー条件下で、または非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１またはその相補鎖とハイブリダイズする。実施形態では、（＋）ＳＳ  ＲＮＡをコードするＤＮＡは、本明細書において記載される様々なストリンジェンシー条件で、配列番号１またはその相補鎖の約１０１１から１２３２０でヌクレオチドにハイブリダイズする。ストリンジェンシー条件は、参照によってその全体が組み込まれる、Sambrookら（J．Sambrook,  E.  F.  FritschおよびT.  Maniatis、１９８９年、Molecular  Cloning、A  laboratory  Manual、第２版、Cold  Spring  Harbor、N.  Y.）において提供されている。
【００５６】
実施形態では、ベクター内に含有される（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードするＤＮＡは、非常に低いストリンジェンシー条件下で、低いストリンジェンシー条件下で、中程度のストリンジェンシー条件下で、中程度〜高いストリンジェンシー条件下で、高いストリンジェンシー条件下で、または非常に高いストリンジェンシー条件下で、ＧＢ  Ａｃｃ．ＡＦ３１５１１９．１、Ｘ０３７００．１、ＫＭ６５９８７６．１、Ｍ８４７２８．１、ＮＣ＿０１２５３２、Ｌ０１４４３、Ｌ３７６６１．３、またはＤ００６２５．１で示されるＤＮＡ、またはその相補鎖とハイブリダイズし、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードするＤＮＡは、少なくとも３つのイントロンを含み、その１つは、構造タンパク質をコードするＤＮＡ領域内にあり、１つは、非構造タンパク質をコードするＤＮＡ領域内にある。
【００５７】
実施形態では、ベクター内に含有される（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードするＤＮＡは、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。本開示の目的では、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージ、好ましくはバージョン３．０．０またはそれ以降のＮｅｅｄｌｅプログラムで実行されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用して判定される。
【００５８】
実施形態では、ベクター内に含有される（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードするＤＮＡは、ＧＢ  Ａｃｃ．ＡＦ３１５１１９．１、Ｘ０３７００．１、ＫＭ６５９８７６．１、Ｍ８４７２８．１、ＮＣ＿０１２５３２、Ｌ０１４４３、Ｌ３７６６１．３、またはＤ００６２５．１で示されるＤＮＡと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードするＤＮＡは、少なくとも３つのイントロンを含み、その１つは、構造タンパク質をコードするＤＮＡ領域内にあり、１つは、非構造タンパク質をコードするＤＮＡ領域内にある。
【００５９】
実施形態では、ベクター内に含有されるＤＮＡによってコードされる（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのアミノ酸配列は、ＧＢ  Ａｃｃ．ＡＦ３１５１１９．１、Ｘ０３７００．１、ＫＭ６５９８７６．１、Ｍ８４７２８．１、ＮＣ＿０１２５３２、Ｌ０１４４３、Ｌ３７６６１．３、またはＤ００６２５．１で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する。（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、少なくとも３つのイントロンを含み、その１つは、構造タンパク質をコードするＤＮＡ領域内にあり、１つは、非構造タンパク質をコードするＤＮＡ領域内にある。
【００６０】
本開示はまた、大量の本明細書において記載されるＤＮＡを調製する方法を提供する。ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、化学的に合成され得、複製のために所望のベクター内にクローニングされ得る。大量のＤＮＡを調製するための方法は、ＤＮＡを含有するベクターを宿主細胞内に形質転換すること、および、ＤＮＡを含有する大量のベクターの複製を可能にするための条件下で宿主細胞を培養することを含む。ＤＮＡを調製するための宿主細胞には、細菌細胞が含まれる。実施形態では、細菌細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉが含まれる。ＤＮＡを調製するための他の適切な宿主細胞または化学的手段もまた使用することができる。
【００６１】
加えて、本開示は、細菌宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉにおける感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡの安定性および収量を向上させる方法を提供する。黄熱ウイルスまたはＪＥＶを含むフラビウイルスなどの一部の（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＤＮＡ、具体的にはｃＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして増やすことが非常に困難であり、それは、目的のｃＤＮＡを含有するプラスミドの不安定性および／または毒性のためである。過去には、プラスミドの収量を向上させるために、フラビウイルスＤＮＡの毒性および収量を低減させる低コピープラスミドが使用されていた。さらに、プラスミドの安定性を向上させるために、イントロンが挿入されている。完全長クローンの安定性を向上させるために、２つのイントロンが低コピーＪＥＶのｃＤＮＡプラスミドに挿入されている（Yamashchikovら、２００１年）。しかし、特にワクチンを調製するために、高収量のプラスミドを生成することが望ましい。
【００６２】
本開示は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主細胞において（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードするｃＤＮＡを増やすために、標準的な高コピープラスミドを利用する方法を提供する。本方法は、３つまたはそれより多くのイントロンを（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのｃＤＮＡ内に組み込むことを含む。イントロンの少なくとも１つは、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの構造タンパク質をコードする領域内に位置し、イントロンの少なくとも１つは、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＮＳタンパク質をコードする領域内に位置する。
【００６３】
感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードするオリジナル配列を回復させるために、各イントロンが転写の間にＲＮＡから個別にスプライシングで除去されると想定されるので、安定性の増強および高収量の実現において複数のイントロンが有効であることは驚くべきことである。さらに、いくつかのイントロン、例えば、３つまたはそれより多くのイントロンが存在する場合、１つのイントロンが第２のイントロンまたは第３のイントロンと共にスプライシングで除去され、その結果、イントロン間の遺伝子（またはヌクレオチド）が欠失するという点で、選択的スプライシングの可能性が増大する。選択的スプライシングのこのプロセスによって欠失がもたらされ、その結果、非機能的なウイルスが生じる。本開示は、Ｅ．Ｃｏｌｉなどの細菌宿主細胞において安定なプラスミドを生産する方法を提供する。任意のプラスミドまたはウイルスベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢＲ３２２、ｐＣＩ、ｐＵＣ、ｐＣＲ、ｐＣＲ−ＴＯＰＯ、ワクシニアベクター、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、および細菌宿主細胞において増えることが当技術分野において公知である他のプラスミドまたはベクターを、ｃＤＮＡの挿入に使用することができる。細菌宿主に最適なプロモーターを予測するために、ソフトウェアプログラムおよび公知の方法を利用することができる。少なくとも３つのイントロンを含有するｃＤＮＡを含むプラスミドは、対照と比較して細菌宿主細胞において安定性が増強していることによって特徴付けされる。プラスミドの収量もまた、対照プラスミドと比較して増大している。対照プラスミドは、ｃＤＮＡと３つ未満のイントロンを含み、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡをコードするプラスミドである。
【００６４】
ｃＤＮＡはまた、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードするＤＮＡに作動可能に連結した、真核宿主細胞における発現に適切な調節エレメント、例えばプロモーターも含み得る。
【００６５】
本開示は、本明細書において記載されるベクターおよび担体を含む組成物を記載する。組成物は、ベクターおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であり得る。組成物は、有効量のベクターを含み得る。組成物は、疾患を防止および処置するための治療有効量のベクターを含み得る。治療目的では、ベクター内に含有されるＤＮＡは、非病原性のおよび／または弱毒化されたウイルスまたはキメラウイルスのＲＮＡ分子をコードする。特定の実施形態では、組成物は、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患に対して防御するためのワクチンとして使用される。
【００６６】
本開示は、本明細書において記載されるベクターをトランスフェクトされた宿主細胞を記載する。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞、例えば哺乳動物細胞であり得る。原核細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉが含まれる。真核細胞には、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＭＤＣＫが含まれる。
【００６７】
本開示はまた、本明細書において記載されるベクターから得られるウイルスおよび担体を含む組成物を記載する。本明細書において記載される組成物は、ｉＤＮＡ（登録商標）技術を使用して生産された、クローン精製されたウイルスの均質な集団を含む。ｉＤＮＡ（登録商標）技術は、ウイルスの均質な集団を生成する。例えば、ｉＤＮＡ（登録商標）技術によって生産されたウイルスの集団は、より高いパーセンテージの、同一のヌクレオチド配列を有するウイルスを含有する。実施形態では、本明細書において記載される（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団は、従来の方法によって生産される（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの集団よりも、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％多くの、同一のヌクレオチド配列によってコードされるウイルスを含有する。例えば、本明細書において記載されるＪＥＶウイルスの均質な集団は、従来の方法によって生産されるＪＥＶの集団よりも、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％多くの、配列番号１によってコードされるＪＥＶを含有する。
【００６８】
さらに、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％を超えるウイルスの疑似種を含有し得る。
【００６９】
組成物は、有効量のウイルスおよび担体を含み得る。組成物は医薬組成物であり得、疾患の処置および防止のための治療有効量のウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む。治療目的では、組成物の均質なウイルス集団は、非病原性ウイルス、弱毒化ウイルス、または非病原性の弱毒化ウイルスを含み、生の非病原性ウイルス、生の弱毒化ウイルス、または生の非病原性の弱毒化ウイルスも含み得る。特定の実施形態では、クローン精製されたウイルスの均質な集団を含む組成物は、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患に対して防御するためのワクチンとして使用される。
【００７０】
担体は、本明細書において記載されるベクターがそれと共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を含む。組成物はまた、必要に応じて、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末、持続放出製剤、その組合せなどの形態を取り得る。
【００７１】
薬学的に許容される担体は、副作用を伴わずに対象内に注射され得る、本明細書において記載されるベクターを含有する媒体を指す。薬学的に許容される担体には、無菌の液体、例えば水および油が含まれ、油には、石油由来、動物由来、植物由来、または合成由来の油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ごま油、その組合せなどが含まれる。適切な薬学的に許容される担体には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、その組合せなどが含まれる。適切な薬学的担体の他の例は、E.  W.  Martinによる「Remington's  Pharmaceutical  Sciences」において記載されている。
【００７２】
本開示はまた、クローン精製された生（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団を調製するための方法を提供する。本方法は、本明細書において記載されるベクターを真核宿主細胞内にトランスフェクトすること、生（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの生産を可能にする条件下で宿主細胞を培養すること、およびクローン精製された生（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団を得るために、生（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスを、宿主細胞を成長させるための培養培地から単離することを含む。クローン精製された生（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団を調製するための真核宿主細胞の例には、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、およびＭＤＣＫ細胞、および他の哺乳動物細胞が含まれる。
【００７３】
実施形態では、上記直前に記載した方法は、対象に免疫付与するためのワクチンとして使用するための治療有効量のクローン精製された生（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団を含む医薬組成物を調製するために使用され得る。
【００７４】
本明細書において記載される医薬組成物は、ワクチンに製剤化することができる。本明細書において記載されるワクチンは、適切に製剤化された、真核細胞における発現に適切なプロモーターに作動可能に連結した感染性の非病原性および／または弱毒化（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの完全長ゲノムＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを含む本明細書において記載されるベクターを含む。このようなＤＮＡは、対象に注射されると、弱毒化されたウイルスの限定的な複製を開始し、防御免疫応答を誘発する。
【００７５】
本開示は、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患から対象を防御するための、本明細書において記載されるワクチンおよび組成物を使用するための方法を記載する。対象には、ヒト、ならびに家畜（ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、ニワトリなど）および研究動物（サル、ラット、マウス、魚類など）を含む獣医学的動物（イヌ、ネコ、爬虫類、鳥類など）が含まれる。必要とする（それを必要とする）対象は、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患からのワクチン接種または免疫付与を必要とする対象である。本明細書において記載されるワクチンは、哺乳動物対象、特にヒトを疾患から防御するために特異的に製剤化され得る。
【００７６】
本明細書において使用する場合、用語「疾患に対して防御する」は、疾患の防止および処置を含む。用語「処置すること」、「処置」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指すために使用され、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患の症候を完全に取り除くかまたは任意の臨床的および／もしくは定量的に測定可能な程度まで改善させるプロセスを指す。用語「防止すること」は、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患を妨害する、および／または遅延させるプロセスを指す。実施形態では、本明細書において記載されるワクチンは、Ｔ細胞応答、抗原に対する抗体の血清レベルの増大、抗原に対する中和抗体の存在（（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスポリペプチドなど）、またはその組合せを含む「免疫応答」を誘発することによって、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患に対して防御する。用語「防御」または「防御免疫性」は、免疫付与の間に誘発された血清抗体またはＴ細胞応答が、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患または死亡に対して防御する（部分的にまたは全体的に）能力を含む。
【００７７】
本明細書において記載されるワクチンは、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患に対して防御するための様々な方法において利用され得る。本明細書において記載されるベクターを含有するワクチンは、エレクトロポレーション、リポフェクション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、微粒子、マイクロカプセル、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、または他の遺伝子移入方法を含む様々な手段によって対象に直接的に投与され得る。対象の組織内では、完全長感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡは転写によって生成され、これによって、生の弱毒化（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの生産がｉｎ  ｖｉｖｏで開始される。（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスは、対象の組織内でｉｎ  ｖｉｖｏで細胞から放出され、これによって、ワクチンに対する効果的な免疫応答の誘発が開始される。
【００７８】
さらに、ｉＤＮＡ（登録商標）技術を使用して、ベクターを、エレクトロポレーションまたはあらゆる他の許容される当技術分野において公知の手段によって、真核細胞内に導入することができる。遺伝的に安定なシーケンシングされたＤＮＡベクターの導入によって生産された生弱毒化ウイルスは、均質なウイルス集団であり、より少ない数の疑似種を含有し、したがって、従来の生弱毒化ワクチンに対する利点を呈する。したがって、本明細書において記載されるベクターから生成される生弱毒化ウイルスの均質な集団を、対象へのワクチン投与に適切な薬学的に許容される製剤に構成することができる。
【００７９】
ワクチンの投与は、局所経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、腹腔内経路、経口経路、吸入経路、またはその組合せを含む、ワクチン接種に典型的に使用される任意の経路によるものであり得る。
【００８０】
本明細書において記載されるワクチンは、治療有効量の、本明細書において記載されるベクター、またはクローン精製された本明細書において記載される（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団を含む。「治療有効量」は、組成物を投与する対象においてワクチンが過度に負の影響を生じさせることなくその免疫学的役割を行うために必要な量である。投与すべき正確な量は、使用する転写プロモーターおよび翻訳プロモーターの強度、処置対象の状態のタイプ、投与態様、ならびに組成物中の他の成分などの因子に従って変化する。実施形態では、ワクチンは、約１ｎｇから約１ｍｇのベクターを含む。
【００８１】
従来のＤＮＡワクチンとは異なり、本明細書において記載されるワクチンは、複数回の追加投与を伴わない単回のワクチン接種で、効果的な免疫性を誘発し得る。さらに、低用量のベクターまたはクローン精製された（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団のみが必要である。実施形態では、低用量の約１ｎｇから約１μｇ、約１０ｎｇから約１μｇ、または約１００ｎｇから約１μｇのベクターまたはウイルスの均質な集団が使用され得る。さらに、従来のＤＮＡワクチンと比較すると、使用するのは、約１／５から約１／１００のベクターもしくはウイルスの集団、約１／１０から約１／１００のベクターもしくはウイルスの集団、約１／２５から約１／１００のベクターもしくはウイルスの集団、または約１／５０から約１／１００のベクターもしくはウイルスの集団でよい。
【００８２】
実施形態では、ＤＮＡワクチンの免疫原性は、１つまたは複数の薬学的に許容されるアジュバントまたは免疫刺激剤、例えば、アルファ−インターフェロン、ベータ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、マクロファージコロニー刺激因子（「Ｍ−ＣＳＦ」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン１２（「ＩＬ−１２」）、およびＣｐＧオリゴヌクレオチドとの製剤化によって修飾され得る。このような組成物の調製では、当技術分野において周知の方法を使用することができる。ある特定の実施形態では、ＤＮＡは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含有し、ｔｏｌｌ様受容体を介して免疫系を活性化する免疫刺激分子をそれ自体が構成するベクターとしてＥ．ｃｏｌｉ細胞内で生成される。
【００８３】
当業者には理解されるように、本明細書において開示される各実施形態は、その特定の言及されたエレメント、ステップ、成分、または構成要素を含み得、それから本質的になり得、またはそれからなり得る。したがって、用語「含む（include）」または「含んでいる（including）」は、「それを含む、それからなる、またはそれから本質的になる」を指定すると解釈されるべきである。接続句（transition  term）「含む（comprise）」または「含む（comprises）」は、たとえ量が多くても、特定されていないエレメント、ステップ、成分、または構成要素を、それに限定はされないが意味し、そして含めることを認める。接続表現（transitional  phrase）「からなる」は、特定されていないあらゆるエレメント、ステップ、成分、または構成要素を排除する。接続表現「から本質的になる」は、実施形態の範囲を、特定されたエレメント、ステップ、成分、または構成要素に、および実施形態に実質的に影響しないエレメント、ステップ、成分、または構成要素に限定する。例えば、実質的影響がないことは、本明細書において記載されるワクチンによる、ウイルス感染に対する統計的に有意な防御がないことによって証明される。
【００８４】
別段の指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲において使用される、成分、分子量などの特性、反応条件などの量を表す全ての数は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されていると理解される。したがって、それとは逆であることが示されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲において示される数値パラメータは、本発明によって得ることを目的としている所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低でも、また、特許請求の範囲への均等論の適用を限定する意図なしに、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の桁数に照らして、また通常の端数処理技術を適用することによって、解釈されるべきである。さらに明らかにする必要があれば、用語「約」は、言及された数値または数値範囲と組み合わせて使用された場合に、当業者によってそれであると合理的に判断される意味を有し、すなわち、言及された値の±２０％、言及された値の±１９％、言及された値の±１８％、言及された値の±１７％、言及された値の±１６％、言及された値の±１５％、言及された値の±１４％、言及された値の±１３％、言及された値の±１２％、言及された値の±１１％、言及された値の±１０％、言及された値の±９％、言及された値の±８％、言及された値の±７％、言及された値の±６％、言及された値の±５％、言及された値の±４％、言及された値の±３％、言及された値の±２％、または言及された値の±１％の範囲内まで、言及された値または範囲よりもいくらか多いまたはいくらか少ないことを示す。
【００８５】
本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるものの、具体的な例で示される数値は、可能な限り正確に報告される。あらゆる数値が、しかし、それらのそれぞれの試験測定値で見られる標準偏差から必然的に生じるある一定の誤差を本質的に含有する。
【００８６】
用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および本発明を記載する文脈で（特に、以下の特許請求の範囲の文脈で）使用される類似の指示対象は、本明細書において別段の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈される。本明細書における値の範囲の指定は、範囲内にある分離した各値について個別に言及する簡単な方法として役立つことを意図したものにすぎない。本明細書において別段の指示がない限り、各個々の値は、それが本明細書において個別に指定されているかのように本明細書内に組み込まれる。本明細書において記載される全ての方法は、本明細書において別段の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書において記載される任意のおよび全ての例、または典型的な言い回し（例えば「などの」）の使用は、本発明をより明らかにするためのものにすぎず、限定がなかった場合に特許請求される本発明の範囲に、限定を加えるものではない。本明細書におけるいずれの言い回しも、本発明の実施に必須の、特許請求の範囲に記載されていない任意のエレメントを示すとして解釈されるべきではない。
【００８７】
以下の例は、典型的な実施形態および方法を説明する。これらは、本開示の範囲を限定するためのものではなく、また本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本方法が、本明細書において特に記載されるものとは異なるように実施され得ることは明らかとなろう。多くの修正および変型が、本明細書における教示に照らして可能であり、したがって、本開示の範囲内である。
【００８８】
典型的な実施形態
実施形態１。  真核細胞におけるベクターまたはＤＮＡの発現のために適切なプロモーターに作動可能に連結したＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを含むベクターであって、前記ＲＮＡ分子が感染性プラス一本鎖（（＋）ＳＳ）ＲＮＡウイルスをコードし、前記ＤＮＡが少なくとも３つのイントロンを含む、ベクター。
実施形態２。  前記（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスが、フラビウイルス、アルファウイルス、ピコルナウイルス、ルビウイルス、コロナウイルス、ノーウォークウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、重症急性呼吸器（ＳＡＲ）ウイルス、およびレンチウイルスである、実施形態１に記載のベクター。
実施形態３。  前記フラビウイルスが、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、デングウイルス、黄熱ウイルス、ウェストナイルウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、およびジカウイルスである、実施形態１または２に記載のベクター。
実施形態４。  前記フラビウイルスがＪＥＶである、実施形態１〜３のいずれか一つに記載のベクター。
実施形態５。  真核細胞におけるベクターまたはＤＮＡの発現のために適切なプロモーターに作動可能に連結したキメラＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを含むベクターであって、前記キメラＲＮＡ分子が感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスをコードし、前記ＤＮＡが少なくとも３つのイントロンを含む、ベクター。
実施形態６。  前記（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスが、少なくとも２つの異なる（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのＲＮＡを含むキメラＲＮＡ分子によってコードされる、実施形態５に記載のベクター。
実施形態７。  前記少なくとも２つの異なる（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスが、ＪＥＶおよび少なくとも１つの他のウイルス、黄熱ウイルスおよび少なくとも１つの他のウイルス、およびデングウイルスおよび少なくとも１つの他のウイルスを含む、実施形態５または６に記載のベクター。
実施形態８。  前記少なくとも１つの他のウイルスが、ジカウイルス、ウェストナイルウイルス、黄熱ウイルス、またはデングウイルスである、実施形態４〜７のいずれか一つに記載のベクター。
実施形態９。  前記少なくとも２つの（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスが、ＪＥＶおよびジカウイルスである、実施形態４〜８のいずれか一つに記載のベクター。
実施形態１０。  少なくとも１つのイントロンが、非構造タンパク質をコードする領域内にあり、１つのイントロンが、構造タンパク質をコードする領域内にある、実施形態１〜９のいずれか一つに記載のベクター。
実施形態１１。  前記イントロンが、１つの停止コドンまたはいくつかの停止コドンを含有する、実施形態１〜１０のいずれか一つに記載のベクター。
実施形態１２。  前記ＤＮＡが３つのイントロンを含む、実施形態１〜１１のいずれか一つに記載のベクター。
実施形態１３。  前記ＤＮＡが、少なくとも４つのイントロン、少なくとも５つのイントロン、または少なくとも６つのイントロンを含む、実施形態１〜１２のいずれか一つに記載のベクター。
実施形態１４。  前記感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスが、非病原性ウイルスである、実施形態１〜１３のいずれか一つに記載のベクター。
実施形態１５。  前記非病原性ウイルスが弱毒化ウイルスである、実施形態１〜１４のいずれか一つに記載のベクター。
実施形態１６。  前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶプロモーター、ヒトＰｏｌ  Ｉプロモーター、ヒトＰｏｌ  ＩＩプロモーター、またはヒトＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターである、請求項１〜１５のいずれか一つに記載のベクター。
実施形態１７。  前記プロモーターが転写開始部位の約１２から１８ヌクレオチド上流に位置する、実施形態１〜１６のいずれか一つに記載のベクター。
実施形態１８。  前記プロモーターが転写開始部位の約１５ヌクレオチド上流に位置する、実施形態１〜１７のいずれか一つに記載のベクター。
実施形態１９。  実施形態１〜１８のいずれか一つに記載のベクターおよび担体を含む組成物。
実施形態２０。  実施形態１〜２０のいずれか一つに記載のベクターおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
実施形態２１。  治療有効量の実施形態１〜２０のいずれか一つに記載のベクターを含むワクチン。
実施形態２２。  治療有効量の実施形態１〜２１のいずれか一つに記載のベクターを含む医薬組成物を含むワクチン。
実施形態２３。  実施形態１〜２３のいずれか一つに記載のベクターをトランスフェクトされた真核細胞から得られるクローン精製された（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団。
実施形態２４。  実施形態２３に記載のクローン精製された（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団および担体を含む組成物。
実施形態２５。  実施形態２３または２４に記載のクローン精製された（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの均質な集団および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
実施形態２６。  治療有効量の、実施形態１〜２５のいずれか一つに記載のベクターをトランスフェクトされた細胞から得られる均質なクローン精製された生（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルス集団を含む、ワクチン。
実施形態２７。  実施形態１〜２６のいずれか一つに記載のベクターを真核細胞内にトランスフェクトすること、および（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスを単離することを含み、それによって、均質なクローン精製された生（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルス集団を得る、前記均質なクローン精製された生（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルス集団を調製する方法。
実施形態２８。  前記真核細胞が、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＭＤＣＫ細胞である、実施形態１〜２７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２９。  実施形態１〜２９のいずれか一つに記載のベクターを真核細胞内にトランスフェクトすること、トランスフェクトされた真核細胞を培養すること、および（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスを単離することを含み、それによってワクチンを得る、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患に対して対象を防御するためのワクチンを調製する方法。
実施形態３０。  前記真核細胞が、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、またはＭＤＣＫ細胞である、実施形態１〜２９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３１。  実施形態１〜３０のいずれか一つに記載のワクチンを対象に投与することを含む、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患に対して対象を防御するための方法。
実施形態３２。  前記対象が哺乳動物である、実施形態１〜３１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３３。  前記哺乳動物が、ヒトまたは獣医学的動物である、実施形態１〜３２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３４。  感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡをコードするＤＮＡを含む安定なプラスミドを調製する方法であって、前記方法が、少なくとも３つのイントロンを前記ＤＮＡに導入することを含み、かつ、少なくとも１つのイントロンが、前記（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの構造タンパク質をコードする領域内にあり、少なくとも１つのイントロンが、前記（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスの非構造タンパク質をコードする領域内にある、方法。
実施形態３５。  実施形態１〜３４のいずれか一つに記載のベクターを宿主細胞内にトランスフェクトすること、および前記ベクターを前記宿主細胞から単離することを含む、実施形態１〜３４のいずれか一つに記載のベクターを調製する方法。
実施形態３６。  実施形態１〜３４のいずれか一つに記載のベクターをトランスフェクトされた単離細胞。
実施形態３７。  実施形態１〜３６のいずれか一つに記載の均質なクローン精製された生（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルス集団を含むワクチンを投与することを含む、感染性（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスによって生じる疾患に対して対象を防御する方法。
【実施例】
【００８９】
イントロダクション。日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）は、（＋）ＳＳ  ＲＮＡウイルスである。これは、小児および若年成人が主に罹患する、アジア太平洋地域における急性ウイルス脳炎の主な原因である。ＪＥＶは、アジア全体にわたる流行病を生じさせ、蚊であるＣｕｌｅｘ  ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓによって伝染する。４つのタイプのＪＥＶワクチンが、世界の異なる地域で認可されている（ＣＤＣ、２０１６年；ＷＨＯ、２０１５年）。ここ数十年で、死滅ウイルスワクチンが組織培養物またはマウス脳において調製され、風土病がある国における旅行者および居住者に免疫付与するために使用されている。これらのワクチンの費用、有効性、および安全性の特徴に関する懸念から、生弱毒化ワクチンＳＡ１４−１４−２、キメラワクチンＹＦ−ＪＥＶ、および精製された不活化された組織培養物由来のワクチン（HalsteadおよびThomas、２０１１年）を含む、代替的なワクチンが開発されている。現在のところ、その野生型親株ＳＡ１４に由来する弱毒化株ＳＡ１４−１４−２が、ワクチンの開発および生産において使用される最も一般的な株である。しかし、臨床用および実験用のＪＥＶワクチンが利用可能であるにもかかわらず、現在利用可能なワクチンには限界があるため、ＪＥＶワクチン接種の向上が必要とされている。実験的アプローチの中でも、構造ＪＥＶタンパク質または非構造ＪＥＶタンパク質を発現したプラスミドＤＮＡワクチンが開発されている。マウスモデルにおいて、ＤＮＡワクチンは、致死用量のＪＥＶでのチャレンジに対する検出可能な防御を引き起こした（Putnakら、２００３年）。
【００９０】
最近、ＤＮＡワクチンの化学的安定性および遺伝的安定性と伝統的な生弱毒化ワクチンの有効性とを組み合わせた、ＤＮＡローンチ型の生弱毒化ワクチンが記載されている（Pushkoら、２０１６年；Tretyakovaら、２０１４年ａ；Tretyakovaら、２０１３年；Tretyakovaら、２０１４年ｂ）。このプラットフォームは、感染性クローン技術に基づくものであり、生弱毒化ウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでローンチし得るプラスミドＤＮＡに相当する（Jiangら、２０１５年；Lukashevich、２０１４年；Tretyakovaら、２０１４年ａ；Tretyakovaら、２０１３年；Tretyakovaら、２０１４年ｂ）。ＤＮＡローンチ型の生弱毒化ワクチンは、標準的なＤＮＡワクチンからそれらを区別するために、ｉＤＮＡ（登録商標）ワクチンと呼ばれることがあった（Pushkoら、２０１６年；Tretyakovaら、２０１４年ａ；Tretyakovaら、２０１３年；Tretyakovaら、２０１４年ｂ）。以前の研究において、完全長ＪＥＶ感染性クローンが作製され、ＤＮＡローンチ型のウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製するために使用されており、また、ＪＥＶの複製が細胞培養物において研究された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＮＡローンチ型のＪＥＶフラビウイルスの複製が確認されている（Mishinら、２００１年；Yamshchikovら、２００１年）。しかし、ＤＮＡローンチ型の生弱毒化ＪＥＶワクチンは、ｉｎ  ｖｉｖｏではまだ評価されていない。その１つの考えられる理由は、安定な完全長ＪＥＶクローンを生成することが困難なことであった。プラスミドの安定性を向上させるために、２つのイントロンが低コピーＪＥＶ  ｃＤＮＡプラスミド内に挿入され、完全長クローンの安定性を向上させている（Yamshchikovら、２００１年）。
【００９１】
本研究では、ＤＮＡローンチ型の生弱毒化ＪＥＶワクチンは、ＳＡ１４−１４−２ワクチンの公開された配列に基づいて調製された。プラスミドは、ＳＡ１４−１４−２株の完全に合成されたｃＤＮＡを使用して調製した。Ｅ．ｃｏｌｉにおける完全長プラスミド生産の収量は、３つの合成イントロンをＪＥＶ  ｃＤＮＡの構造遺伝子および非構造遺伝子の両方に挿入することによって向上した。ワクチンプラスミドは最初、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＪＥＶワクチンのローンチについて確認された。さらに、この新規なｉＤＮＡ（登録商標）ワクチンを、免疫原性およびウイルス中和応答の誘発についてＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて評価した。中和抗体が、５００ｎｇまたは５μｇのプラスミドを単回用量ワクチン接種した後に検出され、このことは、ＤＮＡローンチ型の生弱毒化ワクチンアプローチが新規なＪＥＶワクチンの開発に利用され得ることを示唆する。
材料および方法
【００９２】
細胞系およびウイルス：アフリカミドリザル（Ｖｅｒｏ）細胞系およびベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞系を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、加湿インキュベーター内で、３７℃および５％ＣＯ２で、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および硫酸ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍｌ）を添加したαＭＥＭ培地内で維持した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。
【００９３】
プラスミドおよびｉＤＮＡ（登録商標）の調製：ＪＥＶ生弱毒化ワクチン株ＳＡ１４−１４−２（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ３１５１１９．１）のｃＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列を、合成生物学技術を使用して調製した（Wimmerら、２００９年）。得られた完全なＪＥＶ  ｃＤＮＡ配列を、ｐＭＢ１複製起点を有するカナマイシン耐性の高コピーｐＵＣ５７プラスミド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）内にクローニングした。あらゆる他の標準的なプラスミドまたはウイルスベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＢＲ３２２、ｐＣＩ、ｐＵＣ、ｐＣＲ、ｐＣＲ−ＴＯＰＯ、ワクシニアベクター、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、および当技術分野において公知の他のプラスミドまたはベクターを、ｃＤＮＡの挿入に使用することができる。ＣＭＶ主要最初期プロモーターを、完全長ＳＡ１４−１４−２ｃＤＮＡの上流に挿入した。加えて、３つの合成イントロンが、Ｅ．ｃｏｌｉにおける毒性である可能性があるタンパク質の合成を防止する目的で、予測される細菌性プロモーターの下流でＪＥＶ配列内に挿入されている。Ｅ．ｃｏｌｉのプロモーターは、イントロン挿入のための部位を同定するために、ＢＰＲＯＭソフトウェア（ＳｏｆｔＢｅｒｒｙ、Ｍｏｕｎｔ  Ｋｉｓｃｏ、ＮＹ）を使用することによって予測されている。他のソフトウェアまたは方法もまた、プロモーターを予測するために利用することができる。３つのキメライントロンを、標準的な分子生物学的方法を使用することによって、ＳＡ１４−１４−２のｃＤＮＡのカプシド遺伝子、エンベロープ遺伝子、およびＮＳ１遺伝子内に挿入した。イントロン配列は、マウス免疫グロブリンＨ鎖Ｖ領域前駆体遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ１２８８０）、またはイントロン配列の他の由来源に由来するものであった。結果として、ＣＭＶプロモーターの転写制御下でＳＡ１４−１４−２の完全長ゲノムＲＮＡをコードするプラスミドｐＭＧ８００９が生成された（図１）。このプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株Ｓｔｂｌ３（Ｔｈｅｒｍｏ）から単離し、ＤＮＡシーケンシングによって確認し、定量し、そして−２０℃で保管した。
【００９４】
トランスフェクションおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイ：Ｖｅｒｏ細胞を、１０ｎｇから１μｇの範囲の濃度のｐＭＧ８００９または対照プラスミドＤＮＡのエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。トランスフェクションは、本質的に、以前に記載されたように行った（Messerら、２０１２年；Tretyakovaら、２０１３年）。トランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞におけるウイルスの生産およびＳＡ１４−１４−２抗原の発現を、感染性中心アッセイ（ＩＣＡ）、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、およびウェスタンブロットによって判定した。トランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞の成長培地内の分泌されたＪＥＶワクチンウイルスを、ＢＨＫ細胞における標準的なプラークアッセイによって検出した。
【００９５】
感染性中心アッセイ（ＩＣＡ）を、ｐＭＧ８００９をトランスフェクトした、または生ウイルスに感染させたＶｅｒｏ細胞を使用して行った。Ｖｅｒｏ細胞を、１０％ＦＢＳを含有する完全αＭＥＭ中に１０倍希釈し、６ウェルプレート内で４時間接着させ、１％アガロースオーバーレイで被覆した。プレートを３７℃で、５％ＣＯ２中で３日間インキュベートしてプラークを形成させ、これを、ニュートラルレッドでの染色を使用して可視化した。
【００９６】
間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）では、ｐＭＧ８００９のＤＮＡをトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞を、８ウェルのチャンバースライド内で完全αＭＥＭ中に播種した。トランスフェクション後４８時間目に、細胞をＰＢＳですすぎ、乾燥させ、冷アセトンで固定し、そして、ＩＦＡを、以前に記載されたように（Pushkoら、２００１年；Tretyakovaら、２０１４年ｂ）、ＪＥＶ特異的なマウス抗血清ＶＲ−１２５９ＡＦ（ＡＴＣＣ）と、その後の、マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対する二次フルオレセイン標識抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して行った。ヨウ化プロピジウム対比染色（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を含有する封入剤が、細胞の核を可視化するために使用されている。
【００９７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットを使用して、ｉＤＮＡ（登録商標）をトランスフェクトしたＶｅｒｏ細胞中のＪＥＶ抗原を検出した。トランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞をトランスフェクション後９日目に採取し、２−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中に可溶化し、タンパク質を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、ＶＲ−１２５９ＡＦ  ＪＥＶ特異的抗血清と、その後のアルカリコンジュゲート型二次抗体でプローブし、１成分ＢＣＩＰ／ＮＢＴホスファターゼ基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して染色した。
【００９８】
最後に、成長培地におけるウイルスの存在を、ＢＨＫ細胞における標準的なプラークアッセイによって確認した。ウイルスの増殖曲線では、試料を２４時間の時間間隔で採取した。平均値および標準偏差値を判定した。各実験は、再現性を確実にするために、少なくとも２回行った。
【００９９】
トランスフェクトされた細胞から得たウイルスを、感染後９日目に採取した。採取した後、ワクチンウイルスを３０００×ｇで１０分間遠心分離することによって明瞭にし、−８０℃で凍結した。
【０１００】
免疫付与および血清学：ｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドをＥ．ｃｏｌｉから単離し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で製剤化して０．４ｍｇ／ｍｌの最終濃度とした。４週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウスをイソフルランで麻酔し、５μｇまたは５００ｎｇの用量のｐＭＧ８００９  ｉＤＮＡ（登録商標）ワクチン５０μｌで、内側大腿、前脛骨筋筋肉内に、筋肉内（ｉ．ｍ．）ワクチン接種した（Ｎｏｂｌｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｗｏｏｄｂｉｎｅ、ＭＤ）。ｉＤＮＡ（登録商標）を注射した後、動物に、他の文献で記載されているようにエレクトロポレーションした（Tretyakovaら、２０１３年）。ｉｎ  ｖｉｖｏでのトランスフェクションでは、弾道的なＤＮＡ送達（遺伝子銃またはそれに類するもの）、ｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクション試薬を使用する化学的トランスフェクション（ＰＥＩ、リポソーム、またはそれに類するもの）、エレクトロポレーション装置（ＢＴＸ（Ｇｅｎｔｒｏｎｉｃｓ）、ＴｒｉＧｒｉｄ（Ｉｃｈｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用する）、Ｉｎｏｖｉｏ、または当分野において許容される他の電極もしくは機器を含む、様々な方法を使用することができる。対照として、関連しない遺伝子を発現するプラスミドを同様に、注入−エレクトロポレーションした。ワクチン接種後、動物を１日に１回、感染の臨床的徴候について観察した。血清を、３日目および４日目に、ウイルス血症の検出のために回収し、２１日目（実験１）および２８日目（実験２）に抗体応答の評価のために回収した。ウイルス血症の検出では、血清を、直接プラークアッセイにおいて個別に試験した。あるいは、血清中のウイルスを増殖させるために、各血清をＶｅｒｏ細胞と共に１０日間インキュベートし、その後、採取した。採取の時点で、Ｖｅｒｏ細胞を細胞変性効果（ＣＰＥ）について観察し、その一方で、採取した培地をプラークアッセイによって試験した。
【０１０１】
抗体応答を判定するために、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）、ウェスタンブロット、およびＩＦＡを行った。ＰＲＮＴでは、等容積（０．１ｍｌ）の、５００ＰＦＵ／ｍｌを含有するウイルス懸濁液、および加熱不活化した血清の連続２倍希釈物を、１時間、３７℃でインキュベートし、血清−ウイルス混合物で１２ウェルプレート内のＢＨＫ細胞単層を覆った。αＭＥＭ中のアガロースオーバーレイを加え、プレートを３７℃で３日間インキュベートし、その後、ニュートラルレッド染色およびプラーク数判定を行った。エンドポイントＰＲＮＴ５０力価を、血清を有さないウェルと比較してプラークを５０％低減させる血清の最大希釈として表した。
【０１０２】
ＩＦＡによる抗体応答の判定では、Ｖｅｒｏ細胞単層をまず、チャンバースライド内で、１０２ＰＦＵ／ウェルのＪＥＶワクチンウイルスに２４時間、完全αＭＥＭ中で感染させた。次いで、感染したＶｅｒｏ細胞をアセトンで固定し、基本的に上記のように、固定された抗原として使用した。ＪＥＶに感染したＶｅｒｏ細胞の単層を、ワクチン接種した実験用マウスの血清でプローブして、血清中のＪＥＶ特異的抗体を検出した。対照として、ワクチン接種していないマウスの血清を使用した。
【０１０３】
（実施例１）
ＤＮＡローンチ型のＪＥＶワクチンの設計および調製：ＪＥＶ  ｐＭＧ８００９  ｉＤＮＡ（登録商標）ワクチンを、ＣＭＶ主要最初期プロモーターをｐＵＣ５７プラスミド内の完全長合成ＪＥＶ  ｃＤＮＡの上流に挿入することによって調製した。その結果、ｐＭＧ８００９プラスミドは、ＪＥＶ株ＳＡ−１４−１４−２のゲノムＲＮＡの完全長ｃＤＮＡコピーをＣＭＶプロモーターの下流に含有した。ｐＵＣファミリーは、ｐＭＢ１配列からの突然変異を有し、これによってコピー数が２０〜３５倍増大し、細胞当たりおよそ５００コピーとなった（WuおよびLiu、２０１０年）。ＲＮＡの真の５’末端がフラビウイルスの複製には重要であるため（Khromykhら、２００１年）、ＣＭＶプロモーターとＪＥＶ  ｃＤＮＡの５’との間の距離は、ＪＥＶゲノムＲＮＡの機能的５’末端の転写を確実にするために最適化されている。リボザイムは、ＪＥＶ配列の３’末端の下流に含まれた。以前の研究によると（Yamshchikovら、２００１年）、カプシド遺伝子およびＥ遺伝子内への２つのイントロンの挿入は、ｃＤＮＡクローンの安定性を向上させ、したがって、２つのイントロンは、以前に報告された方法と同様に、カプシド遺伝子およびＥ遺伝子内にまず挿入された（Yamshchikovら、２００１年）。しかし、得られた完全長ＪＥＶ  ｃＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αおよび株Ｓｔｂｌ３におけるｐＵＣ５７骨格の背景から、低いプラスミド生産量を示し、ＤＮＡは十分な量で単離され得なかった。他のフラビウイルスと同様に、ＪＥＶ  ｃＤＮＡは、毒性タンパク質の合成を駆動し、こうしてＥ．ｃｏｌｉにおける遺伝的安定性およびＤＮＡ収量に影響する、潜在性の細菌性プロモーターを含有すると仮定されている（Riceら、１９８９年；Tretyakovaら、２０１４年ｂ；Yamshchikovら、２００１年）。遺伝的安定性を向上させ、プラスミド生産を増大させる試みにおいて、第３のイントロン配列を完全長ＪＥＶ  ｃＤＮＡに挿入した。イントロン挿入のための部位は、突然変異生成によって、およびＪＥＶ配列内の細菌性プロモーターを予測することによって、選択した。ＮＳ１内のいくつかの推定上の細菌性プロモーターが同定されている。したがって、さらなる合成イントロンがＪＥＶ  ＮＳ１遺伝子に導入され、その結果、完全長ｃＤＮＡとＪＥＶ  ＳＡ−１４−１４−２  ｃＤＮＡのカプシド遺伝子、Ｅ遺伝子、およびＮＳ１遺伝子内の３つのイントロンとを含有するプラスミドｐＭＧ８００９が得られた（図１Ａ）。プラスミドｐＭＧ８００９をＥ．ｃｏｌｉ  Ｓｔｂｌ３細胞から単離した。得られたｐＭＧ８００９−ＪＥＶを、ＤＮＡシーケンシングによって確認した。
【０１０４】
（実施例２）
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｐＭＧ８００９の特徴付け：プラスミドｐＭＧ８００９を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、成長およびＤＮＡ収量について評価した。一実験では、ｐＭＧ８００９を化学的に有能なＥ．ｃｏｌｉ  Ｓｔｂｌ３細胞に形質転換し、ＤＮＡ収量を１０のランダムなコロニーから調べた（図１Ｂ）。プラスミドＤＮＡの収量、サイズ、および外見は、単離物の間で同様であり、親プラスミドに類似しており、このことは、ｐＭＧ８００９の均一性および遺伝的安定性を示唆している。Ｓｔｂｌ３細胞からのｐＭＧ８００９の収量は、およそ０．５ｍｇ／ｍｌであった（図１Ｂ）。ｐＭＧ８００９  ｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドをＥ．ｃｏｌｉ  Ｓｔｂｌ３細胞から単離し、９５％がスーパーコイル型の画分であり、Ａ２６０／Ａ２８０比が約１．８である、無菌の、エンドトキシンを有さないＤＮＡが得られた。
【０１０５】
（実施例３）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｉＤＮＡ（登録商標）からのＪＥＶワクチンウイルスの複製：生ＪＥＶワクチンウイルスの複製をｉｎ  ｖｉｔｒｏでローンチするために、Ｖｅｒｏ細胞にエレクトロポレーションによってｐＭＧ８００９プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞を、ＩＣＡ、ＩＦＡ、ウェスタンブロットによってＪＥＶワクチンウイルスの発現について分析し、その一方で、トランスフェクトされた細胞の培地をプラークアッセイによって試験した。ＩＣＡでは、エレクトロポレーションされたＶｅｒｏ細胞の懸濁液を６ウェルプレートに播種し、１％アガロースをオーバーレイした。７２時間目に、感染中心ＩＣからのウイルスの複製を示す、プラークを検出した（図２）。ｐＭＧ８００９−ＪＥＶの特異的感染性を約１０３ＩＣ／μｇで計算した。トランスフェクトされた細胞におけるＪＥＶ抗原の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによってさらに調べた。抗原バンドを、ｉＤＮＡ（登録商標）をトランスフェクトしたＶｅｒｏ細胞において検出した（図２Ｂ、レーン１）。ウェスタンブロットによって、ＪＥＶ抗原の存在が確認され、これは、Ｅタンパク質、ＮＳ１タンパク質、およびｐｒＭタンパク質の分子量と一致していた。予想した通り、未感染のＶｅｒｏ細胞ではバンドは検出されなかった（図２Ｂ、レーン２）。さらに、トランスフェクトされた細胞におけるＪＥＶ抗原の発現を、トランスフェクション後２４時間目に、マウス抗ＪＥＶ抗血清を使用するＩＦＡによって確認した（図２Ｃ）。ＪＥＶ陽性細胞の中心を検出したが（図２ｃ、パネル１）、陽性細胞または中心は、トランスフェクトされていないＶｅｒｏ対照では検出されなかった（図２ｃ、パネル２）。フラビウイルスで予想されたように、ＪＥＶ抗原の発現は、トランスフェクトされた細胞の細胞質で見られた（図２Ｃ、パネル１および３）。
【０１０６】
ｉＤＮＡ（登録商標）をトランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞の成長培地を、複製ウイルスの存在について、プラークアッセイによって調べた（図３）。増加用量のｐＭＧ８００９  ｉＤＮＡ（登録商標）を、生ＪＥＶをｉｎ  ｖｉｔｒｏでローンチする能力について評価した。Ｖｅｒｏ細胞にｐＭＧ８００９プラスミドを、１０ｎｇから１μｇの範囲の用量でトランスフェクトした。陽性対照として、Ｖｅｒｏ細胞（エレクトロポレーションされた、または未処理の）を１０００ＰＦＵのＪＥＶに感染させた。陰性対照をＰＢＳで処理した。予想した通り、ＰＢＳ処理したＶｅｒｏ細胞では、複製ウイルスは検出されなかった（データは示していない）。プラークを、様々な量（１０〜１０００ｎｇ）のｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドをトランスフェクトされた、または１０３ＰＦＵのＪＥＶウイルスに感染させたＶｅｒｏ細胞の上清試料において検出し、これは、ｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドが生ワクチンウイルスの複製をローンチしたこと、およびイントロンの挿入が、ｐＭＧ８００９が生ＪＥＶワクチンウイルスの複製を開始する能力に影響しなかったことを示唆する（図３Ａ）。ｉＤＮＡ（登録商標）でローンチされたＳＡ−１４−１４−２ワクチンが、古典的な生弱毒化ウイルスＳＡ−１４−１４−２と比較して優れた遺伝的安定性を有するということが示唆されると考えられる。トランスフェクトされた／感染した細胞からのウイルスの増殖曲線を図３Ｂに示す。ピークウイルス力価は、試験した全てのＤＮＡ用量で類似していた。１μｇのｐＭＧ８００９をトランスフェクトした細胞の培養培地において、ピーク力価は、１０００ＰＦＵのＪＥＶに感染した細胞と同様に、トランスフェクション後６日目に１０６〜１０７ＰＦＵ／ｍｌに達した。この実験は、ウイルス複製動態の観点で、１μｇのＤＮＡが１０００ＰＦＵのウイルスに等価であることを示唆する。しかし、１０ｎｇまたは１００ｎｇのＤＮＡを使用した場合には、複製の開始の遅延として、ＤＮＡ用量依存性は検出可能であった。Ｖｅｒｏ細胞に１０ｎｇまたは１００ｎｇのｐＭＧ８００９をトランスフェクトした場合、ピーク力価のおよそ４８〜７２時間の遅延が観察された。図３Ｂに示すように、わずか１０ｎｇのＤＮＡのトランスフェクションでは、ピークウイルス力価が９日目におよそ１０６〜１０７ＰＦＵ／ｍｌに達し、ピーク力価が、より大量のＤＮＡでのトランスフェクションで生じるものと類似している、ＪＥＶウイルスの複製が生じた（図３Ｂ）。
【０１０７】
これらの結果は、Ｖｅｒｏ細胞においてＪＥＶワクチンウイルスをローンチするための最小用量のｉＤＮＡ（登録商標）が１０ｎｇ未満であることを示唆し（図３Ｂ）、このことは、ＹＦフラビウイルス（Tretyakovaら、２０１４年ｂ）、ならびにＶＥＥＶアルファウイルスおよびＣＨＩＫＶアルファウイルス（Tretyakovaら、２０１４年ａ；Tretyakovaら、２０１３年）をコードするｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドでの本発明者らによる以前の知見と一致する。
【０１０８】
（実施例４）
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＪＥＶ  ｉＤＮＡ（登録商標）ワクチンの免疫原性：ｐＭＧ８００９  ｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドがｉｎ  ｖｉｖｏで免疫原性であるかを判定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、単回用量のｐＭＧ８００９プラスミドを注射−エレクトロポレーションすることによって、ワクチン接種した。ＪＥＶワクチンは抗体の誘発に基づくものであり、１：１０の中和力価は、防御的であると考えられる（Plotkin、２０１０年）。したがって、中和抗体を含む血清抗体応答を検出することを目的とした。マウスに、５００ｎｇまたは５μｇのｉＤＮＡ（登録商標）の単回ｉ．ｍ．注射と、その後のエレクトロポレーションで、ワクチン接種した。対照として、マウスに、関連しない遺伝子を発現する関連しないＤＮＡを注射することによってワクチン接種した。ワクチン接種後、全てのマウスは健康を維持し、注射部位での検出可能な病理またはワクチン接種に起因する副作用は見られなかった。ワクチン接種したマウスにおいて、直接プラークアッセイによると、または、各血清をＶｅｒｏ細胞と１０日間インキュベートし、その後にＣＰＥ分析およびプラークアッセイを行うことによる、ウイルス増幅の試みの後に、３日目および４日目ではウイルス血症は検出されなかった（表４）。この結果は、ｉＤＮＡ（登録商標）を注射した後３日目および４日目に、複製ワクチンウイルスがそれほど存在していなかったことを示す。血清抗体を検出するために、ＩＦＡ法およびＰＲＮＴ法を使用した。ＩＦＡでは、Ｖｅｒｏ細胞をまず、チャンバースライド内で１００ＰＦＵのＳＡ−１４−４１４−２ウイルスに感染させ、固定し、次いで、免疫付与したマウスの血清で、１：１０希釈でプローブした（図４）。図４および表Ｉに示すように、ＩＦＡによると、５μｇのｐＭＧ８００９をワクチン接種された全ての実験用マウスは血清転換していた。
【表４】
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【０１０９】
血清転換はまた、５００ｎｇのｐＭＧ８００９をワクチン接種した全てのマウスにおいて間接蛍光抗体（ＩＦＡ）によって検出した（表Ｉ）。ＩＦＡは定量的な方法ではないが、５００ｎｇ群と比較して増大した蛍光強度が、５μｇ用量をワクチン接種したマウスの血清で観察された（データは示していない）。中和抗体もまた、ｐＭＧ８００９をワクチン接種したマウスの血清においてＰＲＮＴによって検出した（表４）。５μｇワクチン接種群では、ほとんどのマウスは１０というＰＲＮＴ５０力価を有しており、これは、以前に記載された、ＪＥＶに対する防御力価に類似しており（Plotkin、２０１０年）、その一方で、１頭のマウスは４０という力価を有し、１頭のマウスは力価が検出不可能であった。５００ｎｇワクチン接種群では、全てのマウスが、１０から４０の範囲のＰＲＮＴ５０力価を有していた。
【０１１０】
（実施例５）
ＪＥＶ  ｉＤＮＡ（登録商標）は、ＪＥＶ  感染に対して防御する：無傷のＩＦＮ応答を欠くＡＧ１２９マウスが、病原性ＤＥＮＶおよびＷＮＶ、ならびにＶＥＥＶワクチン株およびＹＦＶワクチン株、ならびにＪＥＶワクチン株ＳＡ１４−１４−２ウイルスに感染しやすいことが公知である。インターフェロン欠損ＡＧ１２９マウスに、上記のようにまたは同様に、ＪＥＶ  ｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドをワクチン接種する。対照として、マウスにＰＢＳを注射する。ＪＥＶ生弱毒化ワクチンＳＡ１４−１４−２を、感染性チャレンジウイルスとして腹腔内（ｉ．ｐ．）注射する。罹患率または死亡率を観察および記録して、ｉＤＮＡ（登録商標）ワクチン接種の防御効果を判定する。チャレンジに対する防御が、ワクチン接種されたマウスで観察されるが、その一方で、ワクチン接種されていないマウスでは防御は観察されない。
【０１１１】
（実施例６）
獣医学的ワクチン接種：ブタに、上記のようにまたは同様に、ＪＥＶ  ｉＤＮＡ（登録商標）プラスミドをワクチン接種する。対照として、ブタにＰＢＳを注射する。野生型病原性ＪＥＶウイルスを、感染性チャレンジウイルスとして注射する。罹患率または死亡率をブタにおいて観察して、ｉＤＮＡ（登録商標）ワクチン接種の防御効果を判定する。チャレンジに対する防御が、ワクチン接種されたブタで観察されるが、その一方で、ワクチン接種されていない動物では防御は観察されない。
【０１１２】
結論：ＪＥＶは、フラビウイルス科のメンバーであり、蚊によって伝染する人畜共通感染性疾患である日本脳炎を生じさせ、ブタの中で増殖する。風土性のＪＥＶ伝染は、東南アジアおよび西太平洋における２４の国でヒトにおいて報告されており、３０億人を超える人がＪＥＶ感染のリスクに晒されている（ＷＨＯ、２０１５年）。この疾患のための特異的な処置はなく、現在の治療アプローチは、患者が感染を克服するためのサポートに焦点が当てられている。しかし、予防用ワクチンが世界中で利用可能である。不活化されたマウス脳由来のワクチン、不活化されたＶｅｒｏ細胞由来のワクチン、生弱毒化ワクチン、および生組換えワクチンを含む、４つの主なタイプのＪＥＶワクチンが存在する（ＷＨＯ、２０１５年）。過去数年で、中国において製造された生弱毒化ＳＡ１４−１４−２ワクチンが、流行国において最も広く使用されるワクチンとなってきている。細胞培養物に基づく不活化ワクチン、および黄熱ワクチン株に基づく生組換えワクチンもまた認可されており、ＷＨＯによって事前認証されている。米国では、ＪＥＶが伝染する季節の間に風土病地域に１ヶ月またはそれより長く滞在する計画のある旅行者には、ワクチン接種が推奨されている。不活化されたＶｅｒｏ細胞培養物由来のＩＸＩＡＲＯワクチンは、米国において認可されている唯一のワクチンであり（ＣＤＣ、２０１６年）、これは、２８日間の間隔をあけた２回の用量として投与される。ＪＥＶに対する獣医学的ワクチン接種もまた、ブタに利用可能な生弱毒化ワクチンおよび不活化ワクチンで行われている（Luttickenら、２００７年）。
【０１１３】
以前の結果によって、生ＪＥＶワクチンおよび不活化ＪＥＶワクチンの両方が安全でかつＪＥＶに対して効果的であり、関連するフラビウイルスであるデングに対する強力な交差免疫および防御も引き起こし得ることが示唆された（Liら、２０１６年）。しかし、成人において、ＪＥＶワクチンによって促進される、デングウイルス感染を増強させる抗体も示された（Saitoら、２０１６年）。したがって、さらなる調査が必要であり、ワクチンは存在するものの、現在のワクチンの限界に起因して、ＪＥＶワクチン接種の向上が必要であり得る。
【０１１４】
ＪＥＶに対するＤＮＡワクチンは、それらの安全である可能性および製剤化が安価であることから、伝統的なワクチンに対する代替物として研究されている。実験的ＤＮＡワクチンが、ＪＥＶタンパク質を発現するプラスミドを使用して開発されている（Putnakら、２００３年）。Ｅタンパク質を発現するプラスミドは、防御の重要な指標であるＪＥＶ中和抗体を誘発した（Konishiら、１９９９年）。ｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡワクチンは、Ｅタンパク質のみを発現する構築物と比較して、より効果的なワクチン接種を提供すると思われる（Konishiら、２００３年；Wuら、２００６年）。しかし、他の標準的なＤＮＡワクチンと同様に、ＪＥＶタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡの免疫原性は、不活化ワクチンと比較して比較的低かった（Bharatiら、２００５年；Kaurら、２００２年）。免疫応答は、進歩したアジュバントおよびエレクトロポレーションを使用することによって強めることができた。ＪＥＶのｐｒＭ−Ｅタンパク質を発現するＤＮＡワクチンは、ｉ．ｍ．注射後にマウスにおいて効果的であることが分かった。しかし、エレクトロポレーションが伴う場合、免疫応答はマウスモデルおよびブタモデルにおいて向上した（Shengら、２０１６年）。ｐｒＭ−Ｅ  ＤＮＡに基づくワクチンの免疫原性を増強させるための顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の使用が報告されている（Zhaiら、２０１５年）。
【０１１５】
ＤＮＡローンチ型の生弱毒化ワクチンを、ＪＥＶのための新規な実験用のＤＮＡに基づくワクチンを調製するために構成した。ｐＭＧ８００９において、ＳＡ−１４−１４−２株の完全長合成ｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターの下流に導入し、これによって、真核細胞内での「感染性」ゲノムウイルスＲＮＡの転写およびワクチンウイルスのローンチが生じた。ＤＮＡローンチ型のｉＤＮＡ（登録商標）ワクチンの利点には、ＤＮＡワクチンの遺伝的および物理的安定性、生産の容易性、ならびに高い純度、ならびに生弱毒化ワクチンの高い有効性が含まれる（Pushkoら、２０１６年）。ワクチン生産に使用される伝統的な細胞基質（ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）は、次世代（ＮＧＳ）シーケンシングおよび他の方法によって同定され得る潜在的ウイルスで汚染されていることが多い（Onionsら、２０１１年）。逆に、エンドトキシンを有さないＤＮＡは、細胞培養物の生産に伴う潜在的なウイルスまたは不純物を伴わずに単離され得る。しかし、完全長フラビウイルスｃＤＮＡの調製は、Ｅ．ｃｏｌｉ内での不安定性に起因して困難であることで有名である（Riceら、１９８９年；Tretyakovaら、２０１４年ｂ；Tsetsarkinら、２０１６年；Yamshchikovら、２００１年）。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて完全長ＪＥＶ  ｃＤＮＡクローンを調製するという課題は、３つの異なる合成イントロン配列を構造ＪＥＶ遺伝子および非構造ＪＥＶ遺伝子に挿入することによる本研究において解決された。これまでの研究において、２つのイントロンがＪＥＶ構造遺伝子に挿入され、これによって、完全長クローンの調製が容易になった（Yamshchikovら、２００１年）。構造遺伝子内の２つのイントロンに加えて、非構造遺伝子内に第３のイントロンを含めることは、ｃＤＮＡの調製およびカナマイシン耐性を有するｐＵＣ骨格の収量を格段に向上させることが分かった。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの第１の概念実証研究において、単回用量の５００ｎｇまたは５μｇのｐＭＧ８００９プラスミドが、ＪＥＶ中和抗体を含む、マウスにおけるＪＥＶに対する免疫応答を誘発したことが実証された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの本発明者らの知見と同様に、生弱毒化ウイルスがｉｎ  ｖｉｖｏでローンチされることが仮定された。しかし、マウスにおける生ウイルスは、ウイルス血症実験では検出されなかった。このことは、ウイルス血症レベルが低いことを示唆し、このことは、生ワクチンの安全性の利点となり得る。以前は、ＤＮＡローンチ型の実験用ワクチンはまた、フラビウイルス科の別のメンバーである黄熱ウイルス（Jiangら、２０１５年；Tretyakovaら、２０１４年ｂ）、ウェストナイルフラビウイルス（Hallら、２００３年；Yamshchikov、２０１５年；Yamshchikovら、２０１５年）、およびアルファウイルスのためのワクチン（Tretyakovaら、２０１４年ａ；Tretyakovaら、２０１３年）のためにも調製された。ＮＧＳによって、ｉＤＮＡ（登録商標）由来のチクングニヤウイルス（ＣＨＩＫＶ）が細胞培養物由来のＣＨＩＫＶウイルスと比較して高い遺伝的安定性を有することも示された（Hidajatら、２０１６年）。加えて、ＪＥＶ感染性クローンは、キメラの、黄熱に基づくワクチンについて以前に示されたように、ジカウイルス、デングウイルス、およびウェストナイルウイルスなどのフラビウイルスを含む他のウイルスのための、キメラの、ＪＥＶに基づくワクチンを調製するためのベクタープラットフォームとして役立ち得る（Guyら、２０１０年）。最後に、ＳＡ−１４−１４−２  ＪＥＶワクチンのための合成ＤＮＡは、古典的な生弱毒化ワクチンをＤＮＡワクチンフォーマットに変換するための合成生物学的方法（Wimmerら、２００９年）の成功裏の適用を示す。このＤＮＡワクチンは、サブユニットワクチンの発現のためだけではなく、生ワクチンの発現のためにも構成され得る（Pushkoら、２０１６年）。
【０１１６】
上記の主題は説明としてのみ記載されており、限定するものとして解釈されるべきではない。様々な修正および変更が、説明および記載される例としての実施形態および適用に従うことなく、また以下の特許請求の範囲で示される本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書において記載される主題に対してなされ得る。
【０１１７】
本明細書において引用される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、または特許出願が参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。先の記載は様々な実施形態に関して記載されているが、当業者には、様々な修正、置換、省略、および変更が、その趣旨から逸脱することなくなされ得ることが理解されよう。
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【図１Ａ】
2019535291.tif 000007
【図１Ｂ】
2019535291.tif 000008
【図２Ａ】
2019535291.tif 000009
【図２Ｂ】
2019535291.tif 000010
【図２Ｃ】
2019535291.tif 000011
【図３Ａ】
2019535291.tif 000012
【図３Ｂ】
2019535291.tif 000013
【図４】
2019535291.tif 000014
【図５Ａ】
2019535291.tif 000015
【図５Ｂ】
2019535291.tif 000016
【図５Ｃ】
2019535291.tif 000017
【図５Ｄ】
2019535291.tif 000018
【図５Ｅ】
2019535291.tif 000019
【図５Ｆ】
2019535291.tif 000020
【図５Ｇ】
2019535291.tif 000021
【配列表】
2019535291000001.app
【国際調査報告】
2019535291.tif 000022
2019535291.tif 000023
2019535291.tif 000024