(57)【要約】ポリリンゴ酸ベースの分子足場、ターゲティングリガンド、抗腫瘍免疫応答刺激因子および抗がん剤を含むナノ免疫複合体を、提供する。全身性および局所性免疫応答の両方、ならびに相乗的抗がん効果を提供するナノ免疫複合体を投与することによる対象におけるがんを処置する方法を、記載する。【選択図】  図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のもの：
ポリリンゴ酸ベースの分子足場、
少なくとも１種のターゲティングリガンド、
少なくとも１種の抗腫瘍免疫応答刺激因子、および
少なくとも１種の抗がん剤
を含むナノ免疫複合体であって、
ターゲティングリガンド、抗腫瘍免疫応答刺激因子および抗がん剤がポリリンゴ酸ベースの分子足場に共有結合している、前記ナノ免疫複合体。
【請求項２】
抗腫瘍免疫応答刺激因子が以下のもの：アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドおよび低分子量薬物からなる群から選択される、請求項１に記載のナノ免疫複合体。
【請求項３】
抗腫瘍免疫応答刺激因子が抗体である、請求項２に記載のナノ免疫複合体。
【請求項４】
抗腫瘍免疫応答刺激因子が以下のもの：ＰＤ−１に対する抗体、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体、ＰＤ−Ｌ２に対する抗体、ＣＴＬＡ−４に対する抗体、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載のナノ免疫複合体。
【請求項５】
抗腫瘍免疫応答刺激因子が免疫チェックポイントタンパク質のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである、請求項２に記載のナノ免疫複合体。
【請求項６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５に記載のナノ免疫複合体。
【請求項７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号：４〜７からなる群から選択された配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項５に記載のナノ免疫複合体。
【請求項８】
抗腫瘍免疫応答刺激因子が免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤である、請求項１に記載のナノ免疫複合体。
【請求項９】
抗腫瘍免疫応答刺激因子が免疫刺激性サイトカインである、請求項１に記載のナノ免疫複合体。
【請求項１０】
サイトカインがＩＬ−２またはＩＬ−１２である、請求項９に記載のナノ免疫複合体。
【請求項１１】
抗がん剤が以下のもの：アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドおよび低分子量薬物からなる群から選択される、請求項１に記載のナノ免疫複合体。
【請求項１２】
抗がん剤が配列番号：１、２および８からなる群から選択された配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１１に記載のナノ免疫複合体。
【請求項１３】
抗がん剤がヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）またはセリン−トレオニンプロテインキナーゼ（ＣＫ２）のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである、請求項１１に記載のナノ免疫複合体。
【請求項１４】
抗がん剤が配列番号：３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１１に記載のナノ免疫複合体。
【請求項１５】
抗がん剤が抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である、請求項１１に記載のナノ免疫複合体。
【請求項１６】
抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体がＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）である、請求項１５に記載のナノ免疫複合体。
【請求項１７】
ナノ免疫複合体がポリリンゴ酸ベースの分子足場に共有結合した少なくとも２種の異なる抗がん剤を含む、請求項１に記載のナノ免疫複合体。
【請求項１８】
ターゲティングリガンドが腫瘍原性細胞またはがん細胞中の脈管構造タンパク質に特異的に結合する、請求項１に記載のナノ免疫複合体。
【請求項１９】
脈管構造タンパク質がトランスフェリン受容体タンパク質を含む、請求項１８に記載のナノ免疫複合体。
【請求項２０】
ターゲティングリガンドが抗体である、請求項１に記載のナノ免疫複合体。
【請求項２１】
ナノ免疫複合体がさらにポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合したＰＫ調節リガンドを含む、請求項１に記載のナノ免疫複合体。
【請求項２２】
ＰＫ調節リガンドがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２１に記載のナノ免疫複合体。
【請求項２３】
ナノ免疫複合体がさらにポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合したエンドソーム分解リガンドを含む、請求項１に記載のナノ免疫複合体。
【請求項２４】
エンドソーム分解リガンドが複数のロイシンまたはバリン残基を含む、請求項２３に記載のナノ免疫複合体。
【請求項２５】
エンドソーム分解リガンドがＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（ＬＬＬ）である、請求項２４に記載のナノ免疫複合体。
【請求項２６】
ナノ免疫複合体がさらにポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合した造影剤を含む、請求項１に記載のナノ免疫複合体。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載のナノ免疫複合体および薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む、薬学的に許容し得る組成物。
【請求項２８】
対象におけるがんを処置する方法であって、以下のこと：
以下のもの：
ポリリンゴ酸ベースの分子足場、
少なくとも１種のターゲティングリガンド、
少なくとも１種の抗腫瘍免疫応答刺激因子、および
少なくとも１種の抗がん剤
を含み、
ここでターゲティングリガンド、抗腫瘍免疫応答刺激因子および抗がん剤がポリリンゴ酸ベースの分子足場に共有結合している
ナノ免疫複合体を提供すること、ならびに
治療有効量のナノ免疫複合体を対象に投与すること
を含む、前記方法。
【請求項２９】
抗腫瘍免疫応答刺激因子が以下のもの：アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドおよび低分子量薬物からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
抗腫瘍免疫応答刺激因子が以下のもの：ＰＤ−１抗体に対する抗体、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体、ＰＤ−Ｌ２に対する抗体、ＣＴＬＡ−４に対する抗体、またはそれらの組み合わせからなる群から選択された少なくとも１種の抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
抗腫瘍免疫応答刺激因子が免疫チェックポイントタンパク質のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号：４〜７からなる群から選択された配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
抗腫瘍免疫応答刺激因子が免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
抗腫瘍免疫応答刺激因子がＩＬ−２およびＩＬ−１２からなる群から選択された免疫刺激性サイトカインである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
抗がん剤が以下のもの：アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドおよび低分子量薬物からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
抗がん剤が配列番号：１、２および８からなる群から選択された配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
抗がん剤がヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡ、またはセリン−トレオニンプロテインキナーゼ（ＣＫ２）である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
抗がん剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、配列番号：３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列に相補的な配列を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
抗がん剤が抗体であり、ここで抗体がＨＥＲ２／ｎｅｕに対する抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
ナノ免疫複合体がポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合した少なくとも２種の異なる抗がん剤を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
ターゲティングリガンドが腫瘍原性細胞またはがん細胞中の脈管構造タンパク質に特異的に結合する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
ナノ免疫複合体がさらにポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合したＰＫ調節リガンドを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
ナノ免疫複合体がさらにポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合したエンドソーム分解リガンドを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４４】
投与のステップの結果対象におけるがんの処置、重症度の低下または進行の遅延がもたらされる、請求項２８記載の方法。
【請求項４５】
がんが原発がん、転移がんまたは両方である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
がんが原発性ＨＥＲ２＋乳がん、三種陰性乳がん（ＴＮＢＣ）またはそれらの脳への転移である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
がんが神経膠腫または神経膠芽腫である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
対象におけるがんを処置するための方法であって、以下のこと：
ポリリンゴ酸ベースの分子足場および少なくとも１種のターゲティングリガンドおよび足場に共有結合した少なくとも１種の抗がん剤を含むナノ複合体を提供すること；ならびに
治療有効量の抗腫瘍免疫応答刺激因子および治療有効量のナノ複合体を対象に同時投与すること
を含む、前記方法。
【請求項４９】
抗腫瘍免疫応答刺激因子が以下のもの：アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドおよび低分子量薬物からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
抗腫瘍免疫応答刺激因子が抗体であり、ここで抗体が以下のもの：ＰＤ−１抗体に対する抗体、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体、ＰＤ−Ｌ２に対する抗体、ＣＴＬＡ−４に対する抗体、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
抗腫瘍免疫応答刺激因子が免疫チェックポイントタンパク質のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
抗腫瘍免疫応答刺激因子がアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、配列番号：４〜７からなる群から選択された配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
抗腫瘍免疫応答刺激因子が免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
抗腫瘍免疫応答刺激因子が免疫刺激性サイトカインであり、免疫刺激性サイトカインがＩＬ−２またはＩＬ−１２の１種である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
抗がん剤が以下のもの：アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドおよび低分子量薬物からなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
抗がん剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、配列番号：１、２および８からなる群から選択された配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
抗がん剤がヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡ、またはセリン−トレオニンプロテインキナーゼ（ＣＫ２）である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
抗がん剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、配列番号：３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列に相補的な配列を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
抗がん剤が抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
ターゲティングリガンドが腫瘍原性細胞またはがん細胞中の脈管構造タンパク質に特異的に結合する、請求項４８に記載の方法。
【請求項６１】
ナノ複合体がさらにポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合したＰＫ調節リガンドを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項６２】
ナノ複合体がさらにポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合したエンドソーム分解リガンドを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項６３】
がんが原発がん、転移がんまたは両方である、請求項４８に記載の方法。
【請求項６４】
がんが原発性ＨＥＲ２＋乳がん、三種陰性乳がん（ＴＮＢＣ）またはそれらの脳への転移である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
方法がさらに追加的な治療薬を対象に同時投与することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項６６】
方法がさらに１種以上の追加的な抗がん療法を対象に同時投与することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項６７】
追加的な抗がん療法が手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、免疫療法、ホルモン療法、レーザー療法、抗血管新生療法、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
対象が哺乳動物である、請求項４８に記載の方法。
【請求項６９】
哺乳動物が以下のもの：げっ歯類、実験的ヒト乳房腫瘍保有ヌードマウスおよびヒトからなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１６年３月４日に出願された米国仮出願第６２／３０３，８４５号の利益を主張し、それを、完全に述べられているかのように参照により組み入れる。
【０００２】
２０１７年３月３日に作成し、１，８８９バイトのサイズを有する「配列リスト」と題する本出願と共に電子的に出願した配列リストを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる。
【０００３】
連邦支援の研究または開発に関する著述
本発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号ＣＡ２０６２２０−０１のもとで政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００４】
本開示は、一般に、全身性および局所性免疫応答の両方を提供し、相乗的抗がん効果を提供することができる、細胞増殖性障害を有する患者をポリリンゴ酸ベースのナノ免疫複合体（ｎａｎｏｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）で処置するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
乳がんは、米国における女性において、最も多く診断される悪性腫瘍であり、がんによる死亡の第２の原因である。２０１５年において、米国において、２３３，０００を超える乳がんの新たな症例が診断され、約４０，０００人の女性が乳がんで死亡すると推定されている。早期診断および新たな療法の進歩にもかかわらず、再発は、乳がん患者において尚主要な問題であり、一旦疾患が転移することとなると、治癒することは極めて困難である。乳がんは、主に所属リンパ節、骨、肺、肝臓および脳に転移する。脳転移は、乳がん患者の１０〜１５％において観察され、処置するのは特に困難である。不都合なことに、かなりの数の乳がん患者は、この療法に対して決して応答せず、応答した患者は、耐性を獲得し、死亡する。したがって、乳がん患者のために新たな療法が、尚緊急に必要とされている。
【０００６】
国立がん研究所は、２２，８５０例の悪性の脳および脊髄の腫瘍が２０１５年に米国において診断されると見積もっている。神経膠腫が、最も一般的な脳悪性腫瘍であり、極めて高悪性度の腫瘍である神経膠芽腫階級ＩＶ（多形神経膠芽腫、またはＧＢＭ）は、最も頻度が高い。神経膠腫生物学に関する膨大な努力および豊富な新たなデータにもかかわらず、患者の生存率は、過去２５年間で有意に変化しなかった。したがって、神経膠腫分子マーカーを発見し、特異的に脳腫瘍中への標的された薬物送達を介してそれらの発現を調節する効率的な方法を開発する上で、満たされていない臨床的必要性がある。
【０００７】
原発がんの処置における進歩により、増大した患者の長寿がもたらされているが、残存腫瘍細胞が特に脳に転移する可能性もまた、高まっている。薬理学的な脳腫瘍処置の進歩がほとんどないのは、大いに、多くの薬物が脳血管内皮によって形成された血液脳関門（ＢＢＢ）を横断することができないためである。例えば、臨床的に使用されている治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、原発腫瘍処置には有効であるが、ＢＢＢを透過して脳腫瘍に到達することはできない。脳腫瘍処置における他の障害は、効果的な免疫療法を妨げる脳免疫特権である。
【０００８】
黒色腫、肺がんおよび前立腺がんなどの腫瘍の免疫療法における進歩にもかかわらず、ヒト乳がんおよび脳がんの発症における免疫系の役割については、他のがんと比較して驚くべきことにほとんど知られていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
１つの態様において、本発明は、ポリリンゴ酸ベースの分子足場、少なくとも１種のターゲティングリガンド、少なくとも１種の抗腫瘍免疫応答刺激因子および少なくとも１種の抗がん剤を含むナノ免疫複合体に関する。ターゲティングリガンド、抗腫瘍免疫応答刺激因子および抗がん剤は、ポリリンゴ酸ベースの分子足場に共有結合している。
【００１０】
１つの態様において、本発明は、対象におけるがんを処置する方法に関する。当該方法は、本明細書中に記載したナノ免疫複合体のいずれか１種を提供することを含む。当該方法はまた、治療有効量のナノ免疫複合体を対象に投与することを含む。
【００１１】
１つの態様において、本発明は、本明細書中に記載したナノ免疫複合体のいずれか１種および薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む薬学的に許容し得る組成物に関する。
【００１２】
１つの態様において、本発明は、対象におけるがんを処置する方法に関する。当該方法は、ポリリンゴ酸ベースの分子足場および少なくとも１種のターゲティングリガンドおよび足場に共有結合した少なくとも１種の抗がん剤を含むナノ複合体を提供することを含む。本方法はまた、治療有効量の抗腫瘍免疫応答刺激因子および治療有効量のナノ複合体を対象に同時投与することを含む。
【００１３】
好ましい態様の以下の詳細な説明は、添付した図面と併せて読んだ際により良好に理解されるであろう。説明の目的のために、図面において、現在好ましい態様が示されている。しかしながら、本発明は、示す正確な配置および手段に限定されないことが、理解される。図面において：
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＰＭＬＡ骨格（Ｐ）、安定性のためのｍＰＥＧ５０００、エンドソームのエスケープ単位（ＬＬＬ）、ＢＢＢおよび乳房腫瘍ターゲティングのための抗ＴｆＲ  ｍＡｂ、ならびに乳がんの状況におけるナノ免疫複合体（ＮＩＣ）の腫瘍細胞毒性および作用の機構を誘導するためのＣＫ２に対するＡＯＮを含む、例示的なナノ免疫複合体（ＮＩＣ）を例示する概略図である。
【図２】図２は、ヒト異種移植乳がん（ＢＴ−４７４）モデルにおけるＮＩＣ（Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／ｍＴｆＲ／ＩＬ−２；ｘマーク）の抗腫瘍活性を、ＰＢＳ（閉じたひし形）およびＰ／ＩＬ−２（閉じた正方形）での対照処置と比較して例示する一組の線グラフである。
【図３】図３は、ｓ．ｃ．Ｄ２Ｆ２同系乳房腫瘍を保有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるナノ免疫複合体Ｐ／ＣＴＬＡ−４／ＩｇＧ（閉じた三角形）およびＰ／ＣＴＬＡ−４／ＭｓＴｆＲ（ｘマーク）の抗腫瘍活性を、ＰＢＳ（閉じたひし形）およびＣＴＬＡ−４ｍＡｂ（閉じた正方形）での対照処置と比較して例示する一組の線グラフである。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、ｓ．ｃ．Ｄ２Ｆ２同系乳房腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて抗ＣＴＬＡ−４によって誘発された優先的ＩＬ−１２（図４Ａ）およびＩＬ−１０（図４Ｂ）活性化を例示する棒グラフのセットである。図４Ａは、Ｐ／ＩｇＧ／ＣＴＬＡ−４、Ｐ／ｍＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４によって誘発されたＩＬ−１２活性化を、血清およびＰＢＳでの対照処理と比較して例示する。図４Ｂは、Ｐ／ＩｇＧ／ＣＴＬＡ−４、Ｐ／ｍＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４によって誘発されたＩＬ−１０活性化を、血清およびＰＢＳによる対照処理と比較して例示する。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、頭蓋内Ｄ２Ｆ２腫瘍を有する動物（脳転移モデル）における免疫刺激を例示する棒グラフのセットである。図５Ａは、Ｐ／ＩｇＧ／ＣＴＬＡ−４、Ｐ／ｍＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４によって誘発されたＩＬ−１２活性化を、血清およびＰＢＳでの対照処理と比較して例示する。図５Ｂは、Ｐ／ＩｇＧ／ＣＴＬＡ−４、Ｐ／ｍＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４、ＣＴＬＡ−４によって誘発されたＩＬ−１０活性化を、血清およびＰＢＳでの対照処理と比較して例示する。
【図６】図６は、Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／ｍＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４、抗ＣＴＬＡ−４ＡｂおよびＰＢＳでの処置後の頭蓋内乳房Ｄ２Ｆ２腫瘍を保有するＢＡＬＢ／ｃマウス（脳転移モデル）についてのカプラン・マイヤー生存曲線のセットである。
【図７】図７は、４０％のＬＬＬ、２％のｍＰＥＧ、０．２％のｍＴｆＲ  Ａｂ、０．２％のＣＴＬＡ４  ｍＡｂ、０．４％のＩＬ−２、および２％のＭｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  ＡＯＮ−ＨＥＲ２／ｎｅｕを含む例示的なＰＭＬＡ  ＮＩＣの合成を例示する。
【図８】図８は、ヒト乳がんＢＴ−４７４、マウス乳がんＤ２Ｆ２および正常なヒト乳房組織におけるＣＫ２αおよびβ−チューブリン発現を示すウエスタンブロットの写真である。
【図９】図９は、異種動物モデルにおけるＢＢＢを横断し、ＣＫ２αを遮断するナノ複合体Ｐ／Ｃｅｔｕ／ＣＫ２２αによるヒト脳神経膠腫ＬＮ２２９成長阻害を、ＰＢＳでの対照処置と比較して例示するカプラン・マイヤー生存曲線のセットである。
【図１０】図１０は、Ｐ／トラスツズマブ／ＭｓＴｆＲ−ｍＡｂ／ＨＥＲ２−ＡＯＮおよびＰＢＳで処理したＢＴ−４７４  ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性ｉ．ｃ．腫瘍（脳転移モデル）におけるがん幹細胞マーカーＣＤ１３３およびｃ−Ｍｙｃの発現を例示する写真のセットである。
【図１１】図１１は、ＰＭＬＡ骨格、ＬＬＬ、ＴｆＲ  ｍＡｂ、ａ−ＣＴＬＡ−４（ＰＤ−１）、ＡＯＮ−ＣＫ２、およびＡＯＮ−ＥＧＦＲを含むナノ免疫複合体の脳腫瘍に対する効果を例示する概略図である。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、同系マウスモデルのために設計されたＰＭＬＡベースのナノ免疫複合体の概略図である。図１２Ａは、ＰＭＬＡ骨格、ＬＬＬ、ｍＰＥＧ、ＣＴＬＡ−４（ＰＤ−１）ｍＡＢ、ｍｓＴｆＲ  ｍＡｂ、ＡＯＮ−ＥＧＦＲ、ＡＯＮ−ＣＫ２、ならびに任意に、ＥＧＦＲおよびＣＫ２をＡＯＮで遮断することによって腫瘍細胞成長を抑制するように設計されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０色素を含むナノ免疫複合体を例示する。図１２Ｂは、ＰＭＬＡ骨格、ＬＬＬ、ｍＰＥＧ、ＣＴＬＡ−４（ＰＤ−１）ｍＡＢ、付加的な免疫刺激のための結合した活性サイトカイン（ＩＬ−２）を有するｍｓＴｆＲ  ｍＡｂ、および任意にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素を含有する免疫刺激性ナノ免疫複合体を例示する。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、ＧＢＭにおけるＥＧＦＲおよびＣＫ２α発現、ならびにナノ薬物結合ＡＯＮによるそれらの阻害を示すウエスタンブロットの写真である。図１３Ａは、ＥＧＦＲおよびＣＫ２αの両方が３種の細胞株Ｕ８７ＭＧ、ＬＮ２２９、およびＧＬ２６において発現されることを例示する。図１３Ｂは、ＰＢＳと比較して、ＥＧＦＲおよびＣＫ２αの発現が、細胞取り込みのために抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂセツキシマブ（Ｃｅｔｕ）を用いたＰ／Ｃｅｔｕ／ＡＯＮ−ＥＧＦＲ（左パネル）およびＰ／Ｃｅｔｕ／ＡＯＮ−ＣＫ２α（右パネル）での細胞処理の際に顕著に減少することを例示する。
【図１４】図１４は、ＰＭＬＡ骨格、４０％のＬＬＬ、２％のｍＰＥＧ、０．２％のＴｆＲ  Ａｂ、０．２％のＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１  Ａｂ、１％のＡＯＮ−ＥＧＦＲ、および１％のＡＯＮ−ＣＫ２αを含有する例示的なナノ免疫複合体の合成を例示する。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｄは、ＰＭＬＡナノ免疫複合体の選択的切断を示す。図１５Ａは、アンモニアによるＰＭＬＡナノ複合体の選択的切断の概略図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、切断前（上側曲線）および切断後（下側曲線）のＰＭＬＡナノ免疫複合体のＨＰＬＣプロフィールである。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、第１のピークを２８０ｎｍの最大スペクトル波長を有するｍＡｂとして同定するグラフである。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、第２のピークを２６０ｎｍでのＡＯＮとして同定するグラフである。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、ＥＧＦＲおよび／またはＣＫ２αに特異的なＡＯＮを含むナノ免疫複合体がＬＮ２２９  ＧＢＭ成長を阻害し、腫瘍保有動物生存を延長することを例示する。図１６Ａ（左）は、ナノ免疫複合体Ｐ／Ｃｅｔｕ／ＡＯＮ−ＣＫ２α（閉じた正方形）、Ｐ／Ｃｅｔｕ／ＡＯＮ−ＥＧＦＲおよびＰ／Ｃｅｔｕ／ＡＯＮ−ＣＫ２α／ＡＯＮ−ＥＧＦＲでの処理の際の、ＰＢＳ（ｘマーク）での対照処理と比較しての有意に増加した生存率を示すカプラン・マイヤー曲線のセットであり、（右）は、生存期間中央値の定量を示す表である。図１６Ｂは、ナノ免疫複合体およびＰＢＳでの処理に続く腫瘍形態の写真である。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜１７Ｅは、頭蓋内ＬＮ２２９異種腫瘍における生存促進性および増殖性シグナリングに対するナノ免疫複合体Ｐ／Ｃｅｔｕ／ＡＯＮ−ＣＫ２α、Ｐ／Ｃｅｔｕ／ＡＯＮ−ＥＧＦＲ、およびＰ／Ｃｅｔｕ／ＡＯＮ−ＥＧＦＲ／ＡＯＮ−ＣＫ２αの、ＰＢＳでの対照処理と比較しての効果を例示する。図１７Ａは、処理した腫瘍におけるＥＧＦＲ、ＣＫ２αの、ならびにリン酸化／活性化Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）およびｃ−Ｍｙｃの減少を示すウエスタンブロットの写真のセットである。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、処理した腫瘍におけるＥＧＦＲの相対的発現レベルを示す棒グラフのセットである。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、処理した腫瘍におけるＣＫ２αの相対的発現レベルを示す棒グラフのセットである。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、処理した腫瘍におけるｐＡｋｔ／Ａｋｔの相対的発現レベルを示す棒グラフのセットである。
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、処理した腫瘍におけるｃＭｙｃの相対的発現レベルを示す棒グラフのセットである。
【図１８】図１８は、Ｐ／ＡＯＮ−ＣＫ２α、Ｐ／ＡＯＮ−ＥＧＦＲ、Ｐ／ＡＯＮ−ＥＧＦＲ／ＡＯＮ−ＣＫ２αおよびＰＢＳでの処理に続くＧＬ２６脳腫瘍におけるがん幹細胞マーカーＣＤ１３３、ｃＭｙｃおよびネスチンの発現を例示する写真のセットである。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜１９Ｂは、ナノ免疫複合体で処理した後の動物生存を例示するカプラン・マイヤー曲線のセットである。図１９Ａは、ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ、Ｐ／ＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ、およびＰ／ＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４とＰ／ＴｆＲ／ＰＤ−１との組み合わせでの処理後の動物生存を例示する。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ＰＤ−１  ｍＡＢ、Ｐ／ＴｆＲ／ＰＤ−１  ｍＡｂ、およびＰ／ＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４とＰ／ＴｆＲ／ＰＤ−１との組み合わせでの処理後の動物生存を例示する。
【図２０】図２０は、Ｉ．Ｖ．投与後の動物脳へのＢＢＢを介したナノ免疫複合体Ｐ／ａ−ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１／ＴｆＲの送達を例示する写真である。
【図２１】図２１は、ＣＴＬＡ−４ｍＡｂ、Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４およびＰ／ｍｓＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４＋Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＰＤ−１での動物の処理に続くＩＦＮγ／ＣＤ８＋細胞の分析を例示する散布図である。
【図２２】図２２は、ＣＴＬＡ−４ｍＡｂ、Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４およびＰ／ｍｓＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４＋Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＰＤ−１での動物の処理に続くＣＤ６９＋／ＣＤ８＋細胞の分析を例示する散布図である。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｃは、Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４、Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＰＤ−１およびＰ／ｍｓＴｆＲＣＴＬＡ−４＋Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＰＤ−１での処理に続く、ＧＬ２６神経膠腫を保有するＣ５７／ＢＩ６マウスからの血清中のサイトカインレベルを例示する棒グラフである。図２３Ａは、ＩＬ−１２（ｐ７０）レベルを例示する。図２３Ｂは、ＩＦＮγレベルを例示する。図２３Ｃは、ＴＮＦαレベルを例示する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
好適な実施形態の詳細な記載
特定の専門用語を、以下の記載において好都合のみのために使用するが、限定的ではない。別段述べない限り、または文脈から暗黙のうちに、以下の用語および語句は、以下に提供する意味を含む。別段明示的に述べない限り、または文脈から明らかでない限り、以下の用語および語句は、当該用語または、それが関連する分野において獲得した意味を除外しない。本発明の範囲が特許請求の範囲によってのみ限定されるため、定義を、特定の実施形態を記載するのを補助するために提供し、クレームした発明を限定することを意図しない。さらに、文脈によって別段要求しない限り、単数形用語は複数形を含むものとし、複数形用語は単数形を含むものとする。
【００１６】
単数形用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明確に示さない限り複数の指示対象を含む。同様に、語「または」は、文脈が別段明確に示さない限り「および」を含むことを意図する。
【００１７】
「Ａ、Ｂ、またはＣ」などの２つ以上の項目のリストが後続する語句「少なくとも１つの」は、Ａ、Ｂ、またはＣの任意の個々の１つ、ならびにそれらの任意の組み合わせを意味する。
【００１８】
語「右」、「左」、「上」および「下」は、参照する図面中の方向を表示する。
【００１９】
本明細書中に記載したものと同様の、または同等の方法および材料を、本開示の実行または試験において使用することができるが、好適な方法および材料を、以下に記載する。
【００２０】
用語「増殖性障害」および「増殖性疾患」は、異常な細胞増殖と関連する障害、例えばがんを指す。
【００２１】
本明細書中で使用する用語「腫瘍」および「新生物」は、前がん病変を含む良性（非がん性）または悪性（がん性）のいずれかの過剰な細胞成長または増殖から生じる組織の任意の塊を指す。
【００２２】
用語「原発がん」は、がんが由来する元の部位を指す。例えば、乳房に由来するがんは、原発性乳がんと称される。それが転移する、すなわち脳に拡散する場合、当該がんは、脳に転移性の原発性乳がんと称される。
【００２３】
本明細書で用いる用語「転移」は、がんが身体の出現部位から他の領域へ、同様のがん性病変の発症を伴って、すなわち新たな位置で同一の、または実質的に同一の生化学的マーカーを有して拡散するかまたは移行するプロセスを指す。「転移性」または「転移する」細胞は、隣接する細胞との接着的接触についての低下した活性を有し、血流によって、またはリンパ内で、疾患の原発部位から追加的な遠位部位へと移動して、例えば隣接する身体構造または遠位構造に侵入するものである。
【００２４】
用語「がん細胞」、「腫瘍細胞」および文法的に等価なものは、非腫瘍形成性細胞および腫瘍形成性細胞、すなわちがん幹細胞の両方を含む、腫瘍または前がん病変から誘導された細胞を指す。
【００２５】
本明細書中で使用する「腫瘍原性の」は、自己再生の、すなわち追加的な腫瘍形成性がん細胞を生じる特性、および他の腫瘍細胞を生成するための増殖、すなわちがん細胞が腫瘍を形成するように、分化した、およびしたがって非腫瘍形成性腫瘍細胞を生じさせる特性を含む、固形腫瘍幹細胞の機能的特徴を指す。
【００２６】
用語「抗体」を、本明細書中で、標的、例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前記のものの組み合わせを、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して、認識し、特異的に結合する能力について、本明細書中の組成物中に含まれる機能的モジュールである免疫グロブリン分子を意味するために用いる。一実施形態において、本明細書中の組成物の機能的モジュールとして含まれる抗体は、アンタゴニスト抗体として記載されるクラスを含んでもよく、それは、がん幹細胞マーカータンパク質に特異的に結合し、例えばリガンド結合、受容体二量体化、がん幹細胞マーカータンパク質の発現、および／またはがん幹細胞マーカータンパク質の下流シグナリングを妨害する。代替の実施形態において、本明細書中の組成物中の機能的モジュールとしての抗体は、がん幹細胞マーカータンパク質に特異的に結合し、例えばリガンド結合、受容体二量体化、および／またはがん幹細胞マーカータンパク質によるシグナリングを促進するアゴニスト抗体を含む。代替の実施形態において、がん幹細胞マーカータンパク質の生物学的活性を妨害または促進しない抗体は、代わりに、例えば抗体内部移行および／または免疫系による認識によって、腫瘍増殖を阻害するように機能する。
【００２７】
本明細書中で使用する用語「抗体」は、未変化のポリクローナル抗体、未変化のモノクローナル抗体、抗体フラグメント（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、多特異性抗体、例えば少なくとも２種の未変化の抗体から発生した二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗体が所望の生物学的活性を示す限り、抗原認識部位を含む任意の他の修飾された免疫グロブリン分子を包含する。抗体には、それぞれアルファ、デルタ、エプシロン、ガンマ、およびミューと称されるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、任意の５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、またはそれらのサブクラス（イソタイプ）（例えばＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌ、およびＩｇＡ２）が含まれる。抗体は、裸であるか、または他の分子、例えば毒素、放射性同位体などに抱合され得る。他の実施形態において、抗体は、融合抗体である。
【００２８】
本明細書中で使用する用語「抗体断片」は、未変化の抗体の一部を指し、未変化の抗体の抗原決定性可変領域を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、直線状抗体、一本鎖抗体、および抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
「Ｆｖ抗体」は、１つの重鎖および１つの軽鎖可変領域が非共有結合二量体を形成する２本鎖、または１つの重鎖および１つの軽鎖可変領域がフレキシブルなペプチドリンカーによって共有結合し、したがって２つの鎖が同様の二量体構造において会合する単鎖（ｓｃＦｖ）のいずれかとして、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体断片を指す。この構成において、各可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、相互作用して、Ｆｖ二量体の抗原結合特異性を規定する。あるいはまた、単一の可変領域（またはＦｖの半分）を用いて、抗原を認識および結合することができるが、一般に低い親和性を伴ってである。
【００３０】
本明細書で使用する「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基またはエピトープの特異的な認識および結合に関与する均質な抗体集団を指す。ポリクローナル抗体には、各々異なる抗原決定基に向けられる抗体種の集団が含まれる。用語「モノクローナル抗体」は、両方および完全長モノクローナル抗体および抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、一本鎖（ｓｃＦｖ）突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、限定されずに、ハイブリドーマ発現、ファージ選択、組換え発現を含むがそれらには限定されない方法によって、およびトランスジェニック動物によって得られるものを指す。
【００３１】
本明細書で用いる用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「寛解」は、目的が疾患または障害、例えばがんと関連する症状の進行または重症度を逆転、軽減、寛解、阻害、緩徐化または停止することにある治療的処置を指す。用語「処置すること」は、がんと関連する状態、疾患または障害の少なくとも１つの有害な効果または症状を低減または軽減することを含む。処置は、１種以上の症状または臨床的マーカーが低減した場合に一般に「有効」である。あるいはまた、処置は、疾患の進行が低減または停止した場合に「有効」である。すなわち、「処置」は、症状またはマーカーの改善のみならず、処置の欠如において予想されるものと比較して、症状の進行または悪化の中止、または少なくとも緩徐化をも含む。有益な、または所望の臨床結果には、１以上の症状（単数または複数）の緩和、疾患の範囲の縮小、疾患の安定化された（すなわち悪化しない）状態の、疾患進行の遅延または緩和、疾患状態の寛解または緩和、緩解（部分的または全体的のいずれか）、および／または検出可能な、もしくは検出不能のいずれかの低下した死亡率が含まれるが、これらに限定されない。疾患の「処置」の用語にはまた、疾患の症状または副作用からの緩和を提供すること（緩和的処置を含む）が含まれる。
【００３２】
本明細書で使用する「管理（ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）」または「管理すること（ｍａｎａｇｉｎｇ）」とは、疾患または障害が対象において発生するのを防止すること、疾患または障害による死亡のリスクを低下させること、疾患または障害の発症を遅延させること、疾患または障害の進行を阻害すること、疾患もしくは障害および／または前記疾患もしくは障害に起因する有害な効果の部分的または完全な治癒、所望の薬理学的および／または生理学的作用を得ること（この効果は、障害もしくは疾患もしくは状態、またはその症状を完全に、または部分的に防止する観点において予防的であり得、かつ／あるいは疾患もしくは障害および／または疾患もしくは障害に起因する有害な効果についての部分的な、または完全な治癒の観点において治療的であり得る）、疾患または障害を緩和すること（すなわち疾患または障害の退縮を引き起こすこと）を指す。さらに、本開示はまた、前記疾患を本開示の治療用組成物を投与することによって処置することを想定する。
【００３３】
用語「対象」および「個体」を、本明細書中で互換的に使用し、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、脊椎動物、例えば霊長類、げっ歯動物、家畜または狩猟動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザルが含まれる。げっ歯動物には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、スイギュウ、ネコ科の種、例えばイエネコ、イヌ科の種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、鳥類、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚類、例えばマス、ナマズおよびサケが含まれる。患者または対象は、上記のあらゆる小集団、例えば上記のすべてであるが１つ以上の群または種、例えばヒト、霊長類またはげっ歯動物を除外するものを含む。一実施形態において、対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトであり得る。用語「患者」および「対象」を、本明細書中で互換的に使用する。用語「患者」および「対象」を、本明細書中で互換的に使用する。
【００３４】
好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物を、がんの動物モデルを表す対象として有利に使用してもよい。さらに、本明細書中に記載した方法を使用して、家畜動物および／またはペットを処置してもよい。被験者は、男性でも女性でもよい。対象は、以前にがんを罹患していると診断されたか、または同定されている対象であってもよいが、すでに処置を受けている必要はない。
【００３５】
本明細書中で使用する用語「同時投与すること（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」、「同時投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」または「同時投与する（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」は、少なくとも２種の異なる化合物および／または組成物の投与を指し、ここで化合物および／または組成物を、それらががんを処置するために相加的に、または相乗的に作用する限り同時に、または異なる時間で投与してもよい。限定せずに、２種の異なる化合物および／または組成物を、同一の処方において、または別個の処方において投与してもよい。別個の処方において投与する場合、化合物および／または組成物を、互いに任意の時間内で投与してもよい。例えば、化合物および／または組成物を、互いに２４時間、１２時間、６時間、５時間、４時間、３時間、２時間、１時間、４５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、５分またはそれより短時間以内に投与してもよい。さらに、別個の処方において投与する場合、化合物および／または組成物を、任意の順序において投与してもよい。
さらに、同時投与は、同時投与する化合物および／または組成物を同一の経路によって投与することを必要としない。したがって、各々を、独立して、または共通の投薬形態として投与してもよい。さらに、２種の化合物を、互いに対して重量またはモルによる任意の比率において投与してもよい。例えば、２種の化合物を、約５０：１、４０：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、３：１、２：１、１：１．７５、１．５：１、または１．２５：１〜１：１．２５、１：１．５、１．７５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：４０、または１：５０からの比において投与してもよい。当該比は、いずれかの化合物の有効量に基づいていてもよい。
【００３６】
実施形態は、特定のがん細胞死滅および抗腫瘍免疫応答の刺激を同時に行い、抗腫瘍効能を有意に増加させることが可能であるナノ免疫複合体を提供する。ナノ免疫複合体は、ポリリンゴ酸ベースの分子足場、少なくとも１種のターゲティングリガンド、少なくとも１種の抗腫瘍免疫応答刺激因子および少なくとも１種の抗がん剤を含んでもよい。ターゲティングリガンド、抗腫瘍免疫応答刺激因子および抗がん剤の各々を、ポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有的に抱合させるかまたは連結してもよい。
【００３７】
本明細書で使用する用語「ポリリンゴ酸」は、主鎖エステル結合を含むポリマー、例えばホモポリマー、コポリマーまたはブロックポリマーを指す。ポリリンゴ酸は、生分解性の、および高分子フレキシビリティー、水（イオン化した場合）および有機溶媒（その酸形態）への可溶性、無毒性、または非免疫原性（Ｌｅｅ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，水溶性脂肪族ポリエステル：ポリ（リンゴ酸）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，ｖｏｌ．  ３ａ  （Ｄｏｉ  Ｙ，Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ  Ａ編、ｐｐ  ７５−１０３，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２００２中、それを、完全に述べているかのように参照によって本明細書中に組み入れる）の少なくとも１種であり得る。一実施形態において、ポリリンゴ酸は、ポリ（β−Ｌ−リンゴ酸）であってもよく、本明細書中でポリ−β−Ｌ−リンゴ酸またはＰＭＬＡと称する。
【００３８】
限定せずに、ポリリンゴ酸は、任意の長さおよび任意の分子量であってもよい。ポリリンゴ酸は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または１００ｋＤａまたはそれ以上の分子量を有してもよい。一実施形態において、ポリリンゴ酸は、以下の分子量のいずれか２つの間の範囲内の分子量を有してもよい：１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、または１００ｋＤａ。
【００３９】
本明細書中に開示したナノ免疫複合体に適している例示的なポリリンゴ酸ベースの分子足場は、例えばＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／４０６６０、２００４年１２月３日出願、ＰＣＴ／ＵＳ０９／４０２５２、２００９年４月１０日出願、およびＰＣＴ／ＵＳ１０／５９９１９、２０１０年１２月１０日出願、ＰＣＴ／ＵＳ１０／６２５１５、２０１０年１２月３０日出願；ならびに米国特許出願第１０／５８０，９９９号、２００７年３月１２日出願、および出願第１２／９３５，１１０号、２０１０年９月２８日出願に記載されており、すべてのその内容を、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる。
【００４０】
本明細書で使用する用語「抗腫瘍免疫応答刺激因子」は、抗腫瘍免疫応答を誘発することが可能である剤を指す。本明細書中で使用する用語「抗腫瘍免疫応答」は、腫瘍、腫瘍細胞、がん細胞、および／または腫瘍／がん細胞によって発現される抗原に対して向けられる免疫応答を意味する。免疫応答は、Ｔ細胞媒介性および／またはＢ細胞媒介性免疫応答であり得る。例示的な免疫応答には、Ｔ細胞応答、例えばサイトカイン産生および細胞性細胞傷害性が含まれる。さらに、免疫応答は、Ｔ細胞活性化、例えば抗体産生（液性応答）およびサイトカイン応答性細胞、例えばマクロファージの活性化によって間接的に影響を受ける免疫応答を含むことができる。したがって、免疫応答は、生得的、液性、細胞性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００４１】
一実施形態において、抗腫瘍免疫応答刺激因子は、１種以上の免疫チェックポイントタンパク質の活性または合成を完全に、または部分的に減少、阻害、妨害または調節する剤であり得る。一実施形態において、抗腫瘍免疫応答刺激因子は、１種以上の免疫チェックポイントタンパク質の活性または合成を阻害し得る。かかる剤はまた、本開示において「免疫チェックポイントインヒビター」と称される。理論によって束縛されることを望まずに、１種以上の免疫チェックポイントタンパク質の阻害によって、阻害シグナリングが遮断されるかまたは他の方法で中和されて、それによってがんをより効果的に処置するために免疫応答がアップレギュレートされ得る。
【００４２】
本明細書中で使用する用語「免疫チェックポイントタンパク質」は、抗腫瘍免疫応答をダウンモジュレートまたは阻害することによって免疫応答を微調整する、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面上の分子の群を意味する。免疫チェックポイントタンパク質は、当該分野において周知であり、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰα（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、およびＡ２ａＲを含むが、これらに限定されない。例えばＷＯ  ２０１２／１７７６２４を参照。その内容を、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる。
【００４３】
免疫チェックポイントタンパク質を阻害するのに有用な例示的な剤は、抗体、低分子量薬物、ペプチド、ペプチド模倣薬、天然リガンド、または天然リガンドの誘導体であってもよく、それらは、免疫チェックポイントインヒビタータンパク質、またはその断片を結合および／または不活性化または阻害することができ；ならびに免疫チェックポイントインヒビター核酸、またはその断片の発現および／または活性をダウンレギュレートすることができる干渉的ＲＮＡ干渉、アンチセンスオリゴヌクレオチド、核酸アプタマーなどであり得る。免疫応答をアップレギュレートするための例示的な剤は、タンパク質とその天然レセプター（単数または複数）との間の相互作用を遮断する１種以上の免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体；１種以上の免疫チェックポイントタンパク質の非活性化形態（例えばドミナントネガティブポリペプチド）；１種以上の免疫チェックポイントタンパク質とその天然レセプター（単数または複数）との間の相互作用を遮断する小分子またはペプチド；その天然レセプター（単数または複数）に結合する融合タンパク質（例えば抗体または免疫グロブリンのＦｃ部分に融合した免疫チェックポイントタンパク質の細胞外部分）；核酸転写または翻訳をコードする免疫チェックポイントタンパク質を遮断する核酸分子などであり得る。かかる薬剤は、１種以上の免疫チェックポイントタンパク質とその天然レセプター（単数または複数）（例えば抗体）との間の相互作用を直接遮断して、阻害性シグナリングを防止し、免疫応答をアップレギュレートすることができる。例えば、免疫チェックポイントタンパク質リガンド、例えば安定化された細胞外ドメインは、そのレセプターに結合して、適切なリガンドに結合するためのレセプターの有効濃度を間接的に低下させることができる。
【００４４】
一実施形態において、抗腫瘍免疫応答刺激因子は、抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４抗体であり得る。限定されずに、抗ＰＤ−１および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。さらに、抗体は、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。一実施形態において、抗ＰＤ−１および／または抗ＣＴＬＡ−４抗体は、ＩｇＧｌであり得る。
【００４５】
一実施形態において、抗腫瘍免疫応答刺激因子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）またはｓｉＲＮＡであり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは、免疫チェックポイントタンパク質のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含んでもよい。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＴＬＡ−４をコードする核酸のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：４または５の配列に対して少なくとも７０、７２、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する配列を含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＤ−１をコードする核酸のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：６または７の配列に対して少なくとも７０、７２、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する配列を含んでもよい。
【００４６】
一実施形態において、抗腫瘍免疫応答刺激因子は、免疫刺激性サイトカインであり得る。本明細書中で使用する用語「免疫刺激性サイトカイン」は、細胞媒介性免疫応答、体液媒介性免疫応答および補体系の部分を形成するか、またはそれらに関与する当該成分を含む、免疫系の任意の成分の活性の増加を促進する任意の化合物を指す。免疫刺激性サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγまたはその機能的に等価な変種であり得るが、これらに限定されない。一実施形態において、免疫刺激性サイトカインは、ＩＬ−２であり得る。
【００４７】
一実施形態において、ナノ免疫複合体は、各々がポリリンゴ酸ベースの分子足場と独立して共有結合した、免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤および免疫刺激性サイトカインの両方を含んでもよい。
【００４８】
本明細書中で使用する用語「抗がん剤」は、がんを処置するために使用することができる任意の化合物（その類似体、誘導体、プロドラッグおよび薬学的塩を含む）または組成物を指す。抗がん剤は、トポイソメラーゼＩおよびＩＩの阻害剤、アルキル化剤、微小管阻害剤または血管新生阻害剤であり得るが、これらに限定されない。
【００４９】
一実施形態において、抗がん剤は、ヒト上皮成長因子受容体（Ｅ  ＧＦＲ／Ｅ  ＧＦＲｖＩＩＩおよびＨＥＲ２）またはセリン−トレオニンプロテインキナーゼＣＫ２（ＣＫ２）、細胞増殖のための主要シグナル制御因子の合成または活性を阻害または低下させ得る。限定されずに、ＨＥＲタンパク質は、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４からなる群から選択された少なくとも１種のタンパク質であり得る。ＨＥＲおよび／またはＣＫ２タンパク質の合成または活性を阻害する抗がん剤は、以下のものからなる群から選択され得る：アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドまたは低分子量薬物。
【００５０】
一実施形態において、ＨＥＲ、ＥＧＦＲおよび／またはＣＫ２の合成または活性を阻害する抗がん剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡは、ＨＥＲ２／ｎｅｕのｍＲＮＡ転写物またはＣＫ２タンパク質中に含まれる配列に相補的な配列を含んでもよい。一実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＥＲ２／ｎｅｕをコードする核酸のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：１の配列に対して少なくとも７０、７２、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する配列を含んでもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＫ２をコードする核酸のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：３の配列に対して少なくとも７０、７２、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する配列に相補的な配列を含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：２の配列に対して少なくとも７０、７２、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する配列を含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＥＧＦＲをコードする核酸のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含んでもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：８の配列に対して少なくとも７０、７２、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有する配列を含んでもよい。
【００５１】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定することは、２つの配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを整列させ、比較することを含んでもよい。２つの配列中のすべての位置が同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、配列は、１００％同一であると言われる。パーセント同一性を、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ＴＦ，Ｗａｔｅｒｍａｎ  ＭＳ  １９８１  ”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４７：  １９５  −１９７、これを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）により測定する。
【００５２】
実施形態は、合成核酸、合成ポリヌクレオチド、または本明細書中に列挙した核酸のいずれか１種において述べた配列の一部を有する合成オリゴヌクレオチド、またはその補体を含む。これらの合成核酸、合成ポリヌクレオチド、または合成オリゴヌクレオチドは、１０〜全長、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２１、１０〜２２、１０〜２３、１０〜２４、もしくは１０〜２５、または１０、１５、２０、もしくは２５ヌクレオチドの範囲内の長さを有し得る。上記の範囲の１つ内の長さを有する合成核酸、合成ポリヌクレオチド、または合成オリゴヌクレオチドは、終点を含む列挙した範囲内の任意の特定の長さを有してもよい。ヌクレオチドの列挙した長さは、参照配列（すなわち本明細書中の核酸のいずれか１つ）内の任意の単一の位置で開始し得、ここで十分なヌクレオチドが、単一の位置に後続して、列挙した長さを収容する。列挙した長さは、参照配列の全長であり得る。
【００５３】
一実施形態において、ＨＥＲの合成または活性を阻害する抗がん剤は、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体であり得る。一実施形態において、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体は、トラスツズマブハーセプチン（登録商標）であってもよい。抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得ることが注目される。さらに、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体は、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【００５４】
本発明に適している追加的な例示的な抗がん剤は、パクリタキセル（タキソール）；ドセタキセル；ゲルミシチビン（ｇｅｒｍｉｃｉｔｉｂｉｎｅ）；アルデスロイキン；アレムツズマブ；アリトレチノイン；アロプリノール；アルトレタミン；アミホスチン；アナストロゾール；三酸化ヒ素；アスパラギナーゼ；ＢＣＧライブ；ベキサロテンカプセル；ベキサロテンゲル；ブレオマイシン；ブスルファン静脈内；ブスルファノール；カラステロン；カペシタビン；プラチナート；カルムスチン；ポリフェプロサン移植を有するカルムスチン；セレコキシブ；クロラムブシル；クラドリビン；シクロホスファミド；シタラビン；シタラビンリポソーム；ダカルバジン；ダクチノマイシン；アクチノマイシンＤ；ダルベポエチンアルファ；ダウノルビシンリポソーム；ダウノルビシン、ダウノマイシン；デニロキン・ジフチトックス、デキスラゾキサン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシンリポソーム；プロピオン酸ドロモスタノロン；エリオットＢ溶液；エピルビシン；エポエチンアルファエストラムスチン；リン酸エトポシド；エトポシド（ＶＰ１６）；エキセメスタン；フィルグラスチム；フロクスウリジン（動脈内）；フルダラビン；フルオロウラシル（５−ＦＵ）；フルベストラント；ゲムツズマブオゾガマイシン；酢酸ゴセレリン；ヒドロキシ尿素；イブリツモマブチウキセタン；イダルビシン；イホスファミド；イマチニブメシレート；インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；イリノテカン；レトロゾール；ロイコボリン；レバミゾール；ロムスチン（ＣＣＮＵ）；メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）；メゲストロールアセテート；メルファラン（Ｌ−ＰＡＭ）；メルカプトプリン（６−ＭＰ）；メスナ；メトトレキサート；メトキサレン；マイトマイシンＣ；ミトタン；ミトキサントロン；ナンドロロンフェンプロピオネート；ノフェツモマブ；ＬＯｄｄＣ；オプレルベキン；パミドロネート；ペガデマーゼ；ペグアスパルガーゼ；ペグフィルグラスチム；ペントスタチン；ピポブロマン；プリカマイシン；ミスラマイシン；ポルフィマーナトリウム；プロカルバジン；キナクリン；ラスブリカーゼ；リツキシマブ；サルグラモスチム；ストレプトゾシン；タルブビジン（ＬＤＴ）；タルク；タモキシフェン；テモゾロマイド；テニポシド（ＶＭ−２６）；テストラクトン；チオグアニン（６−ＴＧ）；チオテパ；トポテカン；トレミフェン；トシツモマブ；トラスツズマブ；トレチノイン（ＡＴＲＡ）；ウラシルマスタード；バルビシン；バルトシタビン（一価ＬＤＣ）；ビンブラスチン；ビノレルビン；ゾレドロネート；またはこれらの任意の混合物であり得るが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書で使用する用語「ターゲティングリガンド」は、選択された標的、例えば細胞、細胞タイプ、組織、器官、身体の領域、または区画、例えば細胞、組織または器官区画に対して増強された親和性を提供する任意の分子を指す。ターゲティングリガンドは、抗体、抗原、葉酸塩、受容体リガンド、炭水化物、アプタマー、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬまたはＨＤＬリガンドであってもよいが、これらに限定されない。
【００５６】
一実施形態において、ターゲティングリガンドは、腫瘍原性細胞またはがん細胞を標的し得る。本明細書で使用する語句「腫瘍原性細胞またはがん細胞を標的する」は、ナノ免疫複合体の腫瘍内の腫瘍形成細胞の集団、すなわち腫瘍形成細胞への送達を指す。
【００５７】
一実施形態において、ターゲティングリガンドは、細胞中の少なくとも脈管構造タンパク質に特異的な抗体であり得る。一実施形態において、脈管構造タンパク質は、トランスフェリン受容体タンパク質であってもよい。抗体ターゲティングモジュール（ＴｆＲ−Ａｂ）は、トランスフェリン受容体タンパク質に結合し、それによってＢＢＢと会合した内皮を介して経細胞輸送を達成し得る。限定されずに、脈管構造タンパク質に特異的な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。さらに、抗体は、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。
【００５８】
トランスフェリン（Ｔｆ）受容体（ＴｆＲ／ＣＤ７１）は、鉄取り込みおよび細胞成長調節に関与する膜貫通ホモ二量体タンパク質である。がん細胞は、ＴｆＲを、正常な細胞よりも数倍高い（１００倍まで高い）レベルで発現する。ＴｆＲ過剰発現は、乳がんを含む各種がんにおけるステージおよび予後と相関する。がん細胞における高いＴｆＲ発現レベル、内部移行するその能力、およびがん病理学におけるその役割によって、それが、がん療法のための魅力的な標的になる。さらに、ＴｆＲは、Ｔｆまたは抗ＴｆＲ  ｍＡｂに結合した広範囲の細胞傷害性分子の、レセプター媒介エンドサイトーシスによる、乳房を含む種々のがん細胞中への送達のために使用されている。
【００５９】
血液脳関門は、毛細血管内皮細胞膜が密着して接合することにより形成する高抵抗性関門であり、それは、脳ホメオスタシスを維持し、がんを標的する治療的Ａｂを含む複数の分子の脳への接近を制限する。しかしながら、ＢＢＢは、ＴｆＲをその内皮細胞上に発現し、抗ＴｆＲ  ｍＡｂは、ＢＢＢを、がんを標的するものを含む治療薬の脳送達のために用いるプロセスであるトランスサイトーシスによって有効に横断することができる。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ、前臨床、および臨床研究によって、ＴｆＲを標的して治療薬をがん細胞中に送達することの有効性および安全性が示され、致死的な乳がん脳転移を処置するためにＢＢＢを横断する薬物送達に特に関連する。
【００６０】
一実施形態において、ターゲティングリガンドは、レクチンまたはトランスフェリン受容体に特異的な別のリガンドであり得る。一実施形態において、ターゲティングリガンドは、任意の数の細胞表面レセプターまたは抗原の１つに対するリガンドであり得る。
【００６１】
分子足場およびポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合した成分は、リンカーを介して互いに結合してもよい。本明細書で用いる用語「リンカー」は、化合物の２つの部分を連結する有機部分を意味する。リンカーは、典型的には、直接結合または原子、例えば酸素または硫黄、単位、例えばＮＲ１、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨまたは分子の鎖、例えば置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘテロシクリルアルキニル、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘテロアリールを含み、ここで１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ１）２、Ｃ（Ｏ）、切断可能な結合基、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環によって中断または終了し得；ここでＲ１は、水素、アシル、脂肪族または置換脂肪族である。
【００６２】
一実施形態において、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含んでもよい。限定されずに、ＰＥＧは、任意の所望の分子量のものであってもよい。一実施形態において、ＰＥＧは、約１，０００Ｄａ、約１，５００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、約２，５００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約３，５００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約４，５００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、または約３０，０００Ｄａの分子量を有してもよい。一実施形態において、ＰＥＧは、約３，４００Ｄａの分子量を有してもよい。
【００６３】
一実施形態において、ナノ免疫複合体は、さらに、ポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合したＰＫ調節リガンドを含んでもよい。本明細書中で使用する用語「ＰＫ調節リガンド」および「ＰＫモジュレーター」は、ナノ免疫複合体の薬物動態を調節することができる分子を指す。例えば、ＰＫモジュレーターは、細網内皮系（ＲＥＳ）および／または酵素分解によるナノ免疫複合体の再吸収を阻害または減少させることができる。
【００６４】
ＰＥＧ化を、一般に、薬物設計において、結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させ、循環時間を延長し、標的した固形腫瘍中への血管外漏出を増強するために用いる（Ａｒｐｉｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １３：７５７およびＭａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，１９９７  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１３：１７７１、それを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）。したがって、一実施形態において、ＰＫモジュレーターは、ＰＥＧであってもよい。限定されずに、ＰＥＧは、任意の所望の分子量のものであってもよい。一実施形態において、ＰＥＧは、約１，０００Ｄａ、約１，５００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、約２，５００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約３，５００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約４，５００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約１５，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約２５，０００Ｄａ、または約３０，０００Ｄａの分子量を有してもよい。一実施形態において、ＰＫモジュレーターは、約５，０００ＤａのＰＥＧであってもよい。半減期を増加させることが知られている他の分子もまた、ＰＫモジュレーターとして使用してもよい。
【００６５】
一実施形態において、ナノ免疫複合体は、さらに、ポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合したエンドソーム分解（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）リガンドを含んでもよい。本明細書中で使用する用語「エンドソーム分解リガンド」は、エンドソーム分解特性を有する分子を指す。エンドソーム分解リガンドは、本発明の組成物またはその成分の、細胞区画、例えばエンドソーム、リソソーム、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ装置、微小管、ペルオキシソーム、または細胞内の他の小胞の体から細胞の細胞質への溶解および／または輸送を促進する。エンドソーム分解リガンドは、イミダゾール、ポリまたはオリゴイミダゾール、直鎖状または分枝状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖状または分枝状ポリアミン、例えばスペルミン、カチオン性直鎖状または分枝状ポリアミン、ポリカルボキシレート、ポリカチオン、遮蔽されたオリゴまたはポリカチオンまたはアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケタール、オルトエステル、遮蔽された、または遮蔽されていないカチオン性またはアニオン性電荷を有する直鎖状または分枝状ポリマー、遮蔽された、または遮蔽されていないカチオン性またはアニオン性電荷を有するデンドリマー、ポリアニオン性ペプチド、ポリアニオン性ペプチド模倣薬、ｐＨ感受性ペプチド、天然の、または合成の融合性脂質、天然の、または合成のカチオン性脂質であってもよいが、これらに限定されない。
【００６６】
一実施形態において、エンドソーム分解リガンドは、複数のロイシンまたはバリン残基を含んでもよい。エンドソーム分解リガンドは、ポリロイシンであってもよい。一実施形態において、エンドソーム分解リガンドは、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（ＬＬＬ）であってもよい。
【００６７】
一実施形態において、ナノ免疫複合体は、さらに、ポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合した造影剤を含んでもよい。本明細書中で使用する用語「造影剤」は、状態（単数もしくは複数）、病理学的障害（単数もしくは複数）、および／または疾患（単数もしくは複数）の存在および／または進行の検出、造影、および／またはモニタリングを可能にする分子中の元素または官能基を指す。造影剤は、音波発生物質（液体またはガスのいずれか）、非金属同位体、光学レポーター、ホウ素中性子吸収体、常磁性金属イオン、強磁性金属、ガンマ線放出放射性同位体、陽電子放出放射性同位体、またはＸ線吸収体であってもよい。
【００６８】
好適な光学レポーターは、蛍光レポーターまたは化学発光基であってもよいが、これらに限定されない。広範囲の蛍光レポーター色素、例えばフルオロフォアが、当該分野において知られている。典型的には、フルオロフォアは、芳香族または複素芳香族化合物であり、ピレン、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール、ベンズインドール、オキサゾール、チアゾール、ベンゾチアゾール、シアニン、カルボシアニン、サリチル酸塩、アントラニル酸塩、クマリン、フルオレセイン、ローダミンまたは他の同様の化合物であり得る。好適な蛍光レポーターは、キサンテン色素、例えばフルオレセインまたはローダミン色素を含んでもよい。フルオロフォアは、１，５  ＩＡＥＤＡＮＳ；１，８−ＡＮＳ；４−メチルウンベリフェロン；５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン；５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）；５−カルボキシナフトフルオレセイン（ｐＨ１０）；５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）；５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）；５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＡＴ）；５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）；５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）；６−カルボキシローダミン６Ｇ；６−ＣＲ  ６Ｇ；６−ＪＯＥ；７−アミノ−４−メチルクマリン；７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）；７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン；９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン；ＡＢＱ；酸性フクシン；ＡＣＭＡ（９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン）；アクリジンオレンジ；アクリジンレッド；アクリジンイエロー；アクリフラビン；アクリフラビンフォイルゲンＳＩＴＳＡ；エクオリン（発光タンパク質）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０（商標）；アリザリンコンプレクソン；アリザリンレッド；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）；ＡＭＣ、ＡＭＣＡ−Ｓ；ＡＭＣＡ（アミノメチルクマリン）；ＡＭＣＡ−Ｘ；アミノアクチノマイシンＤ；アミノクマリン；アニリンブルー；アントラシルステアレート；ＡＰＣ−Ｃｙ７；ＡＰＴＳ；アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ；アストラゾンオレンジＲ；アストラゾンレッド６Ｂ；アストラゾンイエロー７ＧＬＬ；アタブリン；ＡＴＴＯ−ＴＡＧ（商標）ＣＢＱＣＡ；ＡＴＴＯ−ＴＡＧ（商標）ＦＱ；オーラミン；オーロホスフィン（Ａｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）Ｇ；オーロホスフィン；ＢＡＯ  ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）；ＢＣＥＣＦ（高ｐＨ）；ＢＣＥＣＦ（低ｐＨ）；硫酸ベルベリン；ベータラクタマーゼ；ＢＦＰブルーシフトＧＦＰ（Ｙ６６Ｈ）；ＢＧ−６４７；ビーマン；ビスベンズアミド；Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ  ＦＦＧ；Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ  ＳＶ；ＢＯＢＯ（商標）−１；ＢＯＢＯ（商標）−３；ボディパイ４９２／５１５；ボディパイ４９３／５０３；ボディパイ５００／５１０；ボディパイ５０５／５１５；ボディパイ５３０／５５０；ボディパイ５４２／５６３；ボディパイ５５８／５６８；ボディパイ５６４／５７０；ボディパイ５７６／５８９；ボディパイ５８１／５９１；ボディパイ６３０／６５０−Ｘ；ボディパイ６５０／６６５−Ｘ；ボディパイ６６５／６７６；ボディパイＦｌ；ボディパイＦＬ  ＡＴＰ；ボディパイＦｌ−セラミド；ボディパイＲ６Ｇ  ＳＥ；ボディパイＴＭＲ；ボディパイＴＭＲ−Ｘ複合体；ボディパイＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ；ボディパイＴＲ；ボディパイＴＲ  ＡＴＰ；ボディパイＴＲ−Ｘ  ＳＥ；ＢＯ−ＰＲＯ（商標）−１；ＢＯ−ＰＲＯ（商標）−３；ブリリアントスルホフラビンＦＦ；カルセイン；カルセインブルー；Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｃｒｉｍｓｏｎ（商標）；カルシウムグリーン；カルシウムグリーン−１  Ｃａ２＋色素；カルシウムグリーン−２  Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−５Ｎ  Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−Ｃ  ｌ８  Ｃａ２＋；カルシウムオレンジ；Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ；カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ；カテコールアミン；ＣＦＤＡ；ＣＦＰ−シアン蛍光タンパク質；クロロフィル；クロモマイシンＡ；クロモマイシンＡ；ＣＭＦＤＡ；セレンテラジン；セレンテラジンｃｐ；セレンテラジンｆ；セレンテラジンｆｃｐ；セレンテラジンｈ；セレンテラジンｈｅｐ；セレンテラジンｉｐ；セレンテラジンＯ；クマリンファロイジン；ＣＰＭメチルクマリン；ＣＴＣ；Ｃｙ２（商標）；Ｃｙ３．１  ８；Ｃｙ３．５（商標）；Ｃｙ３（商標）；Ｃｙ５．１  ８；Ｃｙ５．５（商標）；Ｃｙ５（商標）；Ｃｙ７（商標）；シアンＧＦＰ；サイクリックＡＭＰフルオロセンサー（ＦｉＣＲｈＲ）；ｄ２；Ｄａｂｃｙｌ；ダンシル；ダンシルアミン；ダンシルカダベリン；ダンシルクロリド；ダンシルＤＨＰＥ；ダンシルフルオリド；ＤＡＰＩ；Ｄａｐｏｘｙｌ；Ｄａｐｏｘｙｌ  ２；Ｄａｐｏｘｙｌ  ３；ＤＣＦＤＡ；ＤＣＦＨ（ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート）；ＤＤＡＯ；ＤＨＲ（ジヒドロローダミン１２３）；ジ−４−ＡＮＥＰＰＳ；ジ−８−ＡＮＥＰＰＳ（非放射性）；ＤｉＡ（４−ジ−１６−ＡＳＰ）；ＤＩＤＳ；ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）；ＤｉＯ（ＤｉＯＣｌ８（３））；ＤｉＲ；ＤｉＲ（ＤｉＩＣｌ８（７））；ドーパミン；ＤｓＲｅｄ；ＤＴＡＦ；ＤＹ−６３０−ＮＨＳ；ＤＹ−６３５−ＮＨＳ；ＥＢＦＰ；ＥＣＦＰ；ＥＧＦＰ；ＥＬＦ９７；エオシン；エリスロシン；エリスロシンＩＴＣ；エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）；ユークリシン；塩化ユーロピウム（ＩＩＩ）；ユーロピウム；ＥＹＦＰ；ファストブルー；ＦＤＡ；フォイルゲン（パラローザニリン）；ＦＩＴＣ；ＦＬ−６４５；Ｆｌａｚｏ  Ｏｒａｎｇｅ；Ｆｌｕｏ−３；Ｆｌｕｏ−４；フルオレセインジアセテート；フルオロ−エメラルド；フルオロ−ゴールド（ヒドロキシスチルバミジン）；フルオロ−ルビー；ＦｌｕｏｒＸ；ＦＭ  １−４３（商標）；ＦＭ  ４−４６；Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ（商標）（高ｐＨ）；Ｆｕｒａ−２、高カルシウム；Ｆｕｒａ−２、低カルシウム；Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  Ｂ；Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ  １０ＧＦ；Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｐｉｎｋ  ３Ｇ；Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｙｅｌｌｏｗ  ５ＧＦ；ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）；ＧＦＰ赤色シフト（ｒｓＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型、非ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰ野生型、ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）；ＧＦＰｕｖ；グロキサリック酸（Ｇｌｏｘａｌｉｃ  Ａｃｉｄ）；Ｇｒａｎｕｌａｒ  Ｂｌｕｅ；ヘマトポルフィリン；ヘキスト３３２５８；ヘキスト３３３４２；ヘキスト３４５８０；ＨＰＴＳ；ヒドロキシクマリン；ヒドロキシスチルバニジン（フルオロゴールド）；ヒドロキシトリプタミン；インドジカルボシアニン（ＤｉＤ）；インドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）；イントラホワイトＣｆ；ＪＣ−１；ＪＯ−ＪＯ−１；ＪＯ−ＰＲＯ−１；ＬａｓｅｒＰｒｏ；Ｌａｕｒｏｄａｎ；ＬＤＳ  ７５１；Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＰＡＦ；Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＳＦ；Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＷＳ；リサミンローダミン；リサミンローダミンＢ；ＬＯＬＯ−１；ＬＯ−ＰＲＯ−１；ルシファーイエロー；マググリーン；マグダラレッド（Ｐｈｌｏｘｉｎ  Ｂ）；マグネシウムグリーン；マグネシウムオレンジ；マラカイトグリーン；マリーナブルー；マキシロンブリリアントフラビン１０ＧＦＦ；マキシロンブリリアントフラビン８ＧＦＦ；メロシアニン；メトキシクマリン；Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ；Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ；Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ；ミトラマイシン；モノブロモビマン；モノブロモビマン（ｍＢＢｒ−ＧＳＨ）；モノクロロビマン；ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）；ＮＢＤ；ＮＢＤアミン；ナイルレッド；ニトロベンゾキサジドール；ノルアドレナリン；Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ；Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｙｅｌｌｏｗ；Ｎｙｌｏｓａｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｉａｖｉｎ  Ｅ８Ｇ；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８−Ｘ；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）４８８；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）５００；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）５１４；Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ；Ｐａｒａｒｏｓａｎｉｌｉｎｅ（Ｆｅｕｌｇｅｎ）；ＰＥ−Ｃｙ５；ＰＥ−Ｃｙ７；ＰｅｒＣＰ；ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５；ＰＥ−ＴｅｘａｓＲｅｄ（赤色６１３）；Ｐｈｌｏｘｉｎ  Ｂ（マグダラレッド）；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＡＲ；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＢＫＬ；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  Ｒｅｖ；  Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＲＰＡ；ホスフィン３Ｒ；ＰｈｏｔｏＲｅｓｉｓｔ；フィコエリトリンＢ［ＰＥ］；フィコエリトリンＲ［ＰＥ］；ＰＫＨ２６；ＰＫＨ６７；ＰＭＩＡ；ポントクロムブルーブラック；ＰＯＰＯ−１；ＰＯＰＯ−３；ＰＯ−ＰＲＯ−１；ＰＯ−ＰＲＯ−３；プリムリン；Ｐｒｏｃｉｏｎ  Ｙｅｌｌｏｗ；Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｌｏｄｉｄ（ＰＩ）；ＰｙＭＰＯ；ピレン；ピロニン；ピロニンＢ；パイロザールブリリアントフラビン７ＧＦ；ＱＳＹ  ７；キナクリンマスタード；レゾルフィン；ＲＨ  ４１４；Ｒｈｏｄ−２；ローダミン；ローダミン１１０；ローダミン１２３；ローダミン５ＧＬＤ；ローダミン６Ｇ；ローダミンＢ５��０；ローダミンＢ２００；ローダミンＢエキストラ；ローダミンＢＢ；ローダミンＢＧ；ローダミングリーン；ローダミンファリシジン；ローダミンファロイジン；ローダミンレッド；ローダミンＷＴ；ローズベンガル；Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）；赤色シフトＧＦＰ（ｒｓＧＦＰ、Ｓ６５Ｔ）；Ｓ６５Ａ；Ｓ６５Ｃ；Ｓ６５Ｌ；Ｓ６５Ｔ；サファイアＧＦＰ；セロトニン；セブロンブリリアントレッド２Ｂ；セブロンブリリアントレッド４  Ｇ；セブロンブリリアントレッドＢ；セブロンオレンジ；セブロンイエローＬ；ｓｇＢＦＰ（商標）；ｓｇＢＦＰ（商標）（スーパーグローＢＦＰ）；ｓｇＧＦＰ（商標）；ｓｇＧＦＰ（商標）（スーパーグローＧＦＰ）；ＳＩＴＳ；ＳＩＴＳ（プリムリン）；ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）；ＳＰＱ（６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）−キノリニウム）；スチルベン；スルホローダミンＢ  ｃａｎ  Ｃ；スルフォローダミンＧエキストラ；テトラサイクリン；テトラメチルローダミン；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ（商標）抱合体；チアジカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）；チアジンレッドＲ；チアゾールオレンジ；チオフラビン５；チオフラビンＳ；チオフラビンＴＣＮ；Ｔｈｉｏｌｙｔｅ；チオゾールオレンジ；Ｔｉｎｏｐｏｌ  ＣＢＳ（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ）；ＴＭＲ；ＴＯ−ＰＲＯ−１；ＴＯ−ＰＲＯ−３；ＴＯ−ＰＲＯ−５；ＴＯＴＯ−１；ＴＯＴＯ−３；ＴｒｉＣｏｌｏｒ（ＰＥ−Ｃｙ５）；ＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンソイソチオシアネート）；Ｔｒｕｅ  Ｂｌｕｅ；ＴｒｕＲｅｄ；ウルトラライト；ウラニンＢ；Ｕｖｉｔｅｘ  ＳＦＣ；ｗｔ  ＧＦＰ；ＷＷ  ７８１；ＸＬ６６５；Ｘ−ローダミン；ＸＲＩＴＣ；キシレンオレンジ；Ｙ６６Ｆ；Ｙ６６Ｈ；Ｙ６６Ｗ；イエローＧＦＰ；ＹＦＰ；ＹＯ−ＰＲＯ−１；ＹＯ−ＰＲＯ−３；ＹＯＹＯ−１；またはＹＯＹＯ−３であってもよいが、これらに限定されない。これらの蛍光化合物の多くの好適な形態が利用可能であり、使用され得る。
【００６９】
造影剤としての使用に適した蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質（例えばＤｓＲｅｄ）、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、およびそれらの変種が含まれるが、これらに限定されない（例えば米国特許第６，４０３，３７４号、６，８００，７３３号、および７，１５７，５６６号を参照、その内容を、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる。ＧＦＰ変種の具体的な例には、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、不安定化ＥＧＦＰ、Ｄｏａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，５５：１７６７−１７８１（２００５）に記載されているＧＦＰ変種、Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３１５３１９（１９９６）に記載されているＧＦＰ変種、Ｒｉｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：４４５（２００４）およびＴｓｉｅｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：５０９（１９９８）に記載されている空色蛍光タンパク質、ならびにＮａｇａｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０：８７−９０（２００２）に記載されている黄色蛍光タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。ＤｓＲｅｄ変種は、例えばＳｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：１５６７−１５７２（２００４）に記載されており、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、およびｍＴａｎｇｅｒｉｎｅが含まれる。追加的なＤｓＲｅｄ変種は、例えばＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０１：１６７４５−１６７４９（２００４）に記載されており、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙおよびｍＰｌｕｍを含む。ＤｓＲｅｄ変種のさらなる例は、Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５７７：２２７−２３２（２００４）に記載されているｍＲＦＰｍａｒｓおよびＦｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，５８０：２４９５−２５０２（２００６）に記載されているｍＲＦＰｒｕｂｙを含む。
【００７０】
好適な音波発生ガスには、六フッ化硫黄またはパーフルオロカーボンガス、例えばパーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン、パーフルオロブタン、パーフルオロシクロブタン、パーフルオロペンタン、またはパーフルオロヘキサンが含まれるが、これらに限定されない。好適な非金属同位体には、１１Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１８Ｆ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、および１３１Ｉが含まれるが、これらに限定されない。好適な放射性同位体には、９９ｍＴｃ、９５Ｔｃ、１１１Ｉｎ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、Ｇａ、６８Ｇａ、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８９Ｓｒ、８６Ｙ、８７Ｙ、９０Ｙ、１０５Ｒｈ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１７ｍＳｎ、１４９Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、および１５３Ｇｄが含まれるが、これらに限定されない。好適な常磁性金属イオンには、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｄｙ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、およびＭｎ（ＩＩ）が含まれるが、これらに限定されない。好適なＸ線吸収剤には、Ｒｅ、Ｓｍ、Ｈｏ、Ｌｕ、Ｐｍ、Ｙ、Ｂｉ、Ｐｄ、Ｇｄ、Ｌａ、Ａｕ、Ａｕ、Ｙｂ、Ｄｙ、Ｃｕ、Ｒｈ、Ａｇ、およびＩｒが含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
一実施形態において、造影剤は、キレート化分子を含んでもよい。好適なキレート剤には、１，４，７，１０−テトラアゾシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）；ジベンゾ−ＤＯＴＡ、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７．１０−テトラキス（２−プロピオン酸）（ＤＯＴＭＡ）；１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−四酢酸（ＴＥＴＡ）；１，４，７，−トリカルボキシメチル１，４，７，１０  テトラアザシクロドデカン三酢酸（ＤＯ３Ａ）；１，４，７，１０−テトラアザシクロ−ドデカン−１−（２−ヒドロキシプロピル）−４，７，１０−三酢酸（ＨＰ−ＤＯ３Ａ）；エチレンジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）；ビス−２（ヒドロキシベンジル）−エチレン−ジアミン二酢酸（ＨＢＥＤ）；１，４，７−トリアザシクロ−ノナン  １，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）；ＢＡＤ、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＨＤＴＡ、それらのホスホネート類似体、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、造影剤は、ｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０ＴＭであってもよい。
【００７２】
限定されずに、ナノ免疫複合体は、任意の所望のサイズであり得る。例えば、ナノ免疫複合体は、ナノ免疫複合体が血液脳関門を経細胞輸送を介して横断することを可能にするサイズであり得る。一実施形態において、ナノ免疫複合体は、サイズが約１ｎｍ〜約１００ｎｍ；約１ｎｍ〜約１０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約２０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約３０ｎｍ、約３０ｎｍ〜約４０ｎｍ、約４０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約６０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約７０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約８０ｎｍ〜約９０ｎｍ、約９０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約５ｎｍ〜約９０ｎｍ、約１０ｎｍ〜約８５ｎｍ、約２０ｎｍ〜約８０ｎｍ、約２５ｎｍ〜約７５ｎｍの範囲内であり得る。一実施形態において、ナノ免疫複合体は、サイズが約５０ｎｍ〜約７０ｎｍであり得る。一実施形態において、ナノ免疫複合体は、サイズが５０ｎｍ以下であり得る。
【００７３】
ナノ免疫複合体が示した「サイズ」の周辺のサイズの分布を示し得ることは、当業者によって理解される。したがって、別段述べない限り、本明細書中で使用する用語「サイズ」は、ナノ免疫複合体のサイズ分布の様式、すなわちサイズ分布において最も頻繁に生じる値を指す。サイズを測定する方法は、例えば動的光散乱（例えば光子相関分光法、レーザー回折、低角度レーザー光散乱（ＬＡＬＬＳ）、および中角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ））、光不明瞭化法（例えばＣｏｕｌｔｅｒ分析法）、または他の手法（例えばレオロジー、および光学もしくは電子顕微鏡）によって、当業者に知られている。
【００７４】
実施形態は、がんを処置する方法を提供する。当該方法は、治療有効量の本明細書中に記載したナノ免疫複合体のいずれか１種を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含んでもよい。
【００７５】
一実施形態において、がんを処置する方法は、さらに、本明細書中に記載したナノ免疫複合体のいずれか１種を含む組成物を、それを必要とする対象に提供することを含んでもよい。
【００７６】
一実施形態において、がんを処置する方法は、治療有効量の本明細書中に記載したナノ免疫複合体のいずれか１種を、それを必要とする対象に投与することを含んでもよい。
【００７７】
一実施形態において、がんを処置する方法は、治療有効量の抗腫瘍免疫応答刺激因子および治療有効量のナノ複合体を、それを必要とする対象に同時投与することを含んでもよく、ここでナノ複合体は、ポリリンゴ酸ベースの分子足場および少なくとも１種の標的化リガンドおよび足場に共有的に結合または連結された少なくとも１種の抗がん剤を含む。
【００７８】
一実施形態において、当該方法は、さらに、腫瘍成長の阻害を分析することを含んでもよい。分析のステップは、対象における腫瘍成長の約６０％、７０％、８０％または約９０％を超える阻害を観察することを含んでもよい。一実施形態において、分析のステップは、Ａｋｔリン酸化の抑制によるＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体シグナリングの阻害を観察することを含んでもよい。
【００７９】
本明細書で使用する語句「治療有効量」は、任意の医学的処置に適用可能な妥当な利益／リスク比で、動物における細胞の少なくとも亜集団において何らかの所望の治療的効果をもたらすのに有効である化合物、材料、または組成物の当該量を意味する。がんの処置に関連して、「治療有効量」は、がんのさらなる発達または形質転換した成長を防止するのに、かつさらにがんまたは固形腫瘍の退縮をもたらすのに有効な当該量である。
【００８０】
治療有効量の決定は、一般に十分に当業者の能力の範囲内である。一般に、治療有効量は、対象の病歴、年齢、状態、性別、ならびに対象における医学的状態の重症度およびタイプに伴って変化し得、他の薬剤の投与によって、治療するべき疾患または障害が軽減される。
【００８１】
毒性および治療効果を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定してもよい。毒性と治療的効果との間の用量比は、治療指数であり、それを、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す組成物が、好ましい。本明細書で使用する用語「ＥＤ」は、有効な用量を示し、動物モデルと関連して用いる。用語ＥＣは、有効濃度を意味し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルと関連して用いる。
【００８２】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトにおける使用のための投与量の範囲を処方するにあたって用いてもよい。かかる化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんど、または全く有しないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用する投与形態および利用する投与の経路に依存して、この範囲内で変化し得る。
【００８３】
治療有効量を、最初に細胞培養アッセイから見積もってもよい。用量を、細胞培養において決定するＩＣ５０（すなわち症状の最大抑制の半分を達成する治療薬の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて処方してもよい。血漿中のレベルを、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定してもよい。任意の特定の投与量の効果を、好適なバイオアッセイによってモニタリングしてもよい。
【００８４】
投与量は、医師によって決定され、所要に応じて処置の観察された効果に適合するように調整され得る。一般に、組成物を、活性剤が１μｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの用量で施与されるように投与してもよい。本明細書中に示す範囲は、すべての中間の範囲を含み、例えば範囲１ｔｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇは、１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜９ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇなどを含むことを、理解するべきである。さらに、上に示したものに対する中間の範囲、例えば１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内で、２ｍｇ／ｋｇ〜８ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ〜７ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇなどの用量範囲もまた本発明の範囲内であることを、理解するべきである。
【００８５】
一実施形態において、組成物を、活性剤が、１５分後、３０分後、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間またはそれ以上の投与の時間の後に、５００ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．０５未満、０．０１ｎＭ未満、０．００５ｎＭ未満、０．００１ｎＭ未満のｉｎ  ｖｉｖｏ濃度を有するような投与量で投与してもよい。
【００８６】
処置の継続期間および頻度に関して、熟練した臨床医は、処置が治療的利益を提供している時点を決定するために、および投与量を増加させるか減少させるか、投与頻度を増加させるか減少させるか、処置を中止するか、処置を再開するか、または処置レジメンに他の変更を加えるかを決定するために対象をモニタリングすることが、典型的である。投与スケジュールは、多数の臨床的因子、例えばポリペプチドに対する対象の感受性に依存して、週１回から毎日まで変動し得る。所望の用量を、毎日または３日、４日、５日もしくは６日毎に投与してもよい。所望の用量を、１回で投与するか、またはサブ用量（ｓｕｂｄｏｓｅ）、例えば２〜４のサブ用量に分割し、一定期間にわたって、例えば１日中または他の適切なスケジュールを通じて適切な間隔で投与してもよい。かかるサブ用量を、単位投薬形態として投与してもよい。一実施形態において、投与は、慢性的、例えば数週間または数か月の期間にわたって毎日１以上の用量であってもよい。投与スケジュールの例には、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、または６ヵ月以上の期間にわたって毎日、１日２回、１日３回または１日４回以上の投与が含まれ得る。
【００８７】
本明細書中で使用する用語「投与する」は、所望の効果が生じるように、所望の部位における組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による、対象への組成物の配置を指す。本明細書中に記載した化合物または組成物を、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、鼻腔内、直腸内、または局所的（頬側および舌下を含む）投与を含む、経口または非経口経路を含むがこれらに限定されない、当該分野において知られている任意の適切な経路によって投与してもよい。
【００８８】
例示的な投与の様式には、注射、注入、点滴、吸入、または摂取が含まれるが、これらに限定されない。「注射」には、限定されずに静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏ  ｓｐｉｎａｌ）、およびステム内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）注射および注入が含まれる。一実施形態において、組成物を、静脈内注入または静脈内注射によって投与してもよい。
【００８９】
対象への投与のために、ナノ免疫複合体および／または抗腫瘍免疫応答刺激因子を、薬学的に許容し得る組成物において提供してもよい。したがって、実施形態はまた、本明細書中に開示したナノ免疫複合体を含む医薬組成物を提供する。これらの薬学的に許容し得る組成物は、１種以上の薬学的に許容し得る担体（添加剤）および／または希釈剤と一緒に処方された、治療有効量の１種以上のナノ免疫複合体を含んでもよい。医薬組成物を、固体または液体形態において投与するために特別に処方してもよく、これには、以下に適合するものが含まれる。（１）経口投与、例えば水薬（水性または非水性溶液または懸濁液）、薬用キャンディー、糖衣錠、カプセル剤、丸剤（例えば頬側、舌下、および全身吸収を標的としたもの）、巨丸剤、散剤、顆粒剤、舌への適用のためのペースト；（２）非経口投与、例えば皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による、例えば滅菌溶液もしくは懸濁液、または持続放出製剤；３）局所的適用、例えば皮膚に適用するクリーム、軟膏、または徐放性パッチもしくはスプレーとして；４）膣内または直腸内、例えばペッサリー、クリームまたは発泡体として；５）舌下；６）眼；７）経皮；８）経粘膜；あるいは９）鼻腔内。さらに、ナノ免疫複合体を、患者中に移植するか、または薬物送達系を使用して注射してもよい。
【００９０】
種々の知られている徐放性または延長された放出の投薬形態、処方物、および装置を、本開示のナノ免疫複合体および組成物との使用に適合させてもよい。例には、限定するものではないが、米国特許第：３，８４５，７７０；３，９１６，８９９；３，５３６，８０９；３，５９８，１２３；４，００８，７１９；５６７４，５３３；５，０５９，５９５；５，５９１，７６７；５，１２０，５４８；５，０７３，５４３；５，６３９，４７６；５，３５４，５５６；５，７３３，５６６；および６，３６５，１８５  Ｂｌに記載されているものが含まれるが、これらに限定されず、このすべてを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる。これらの投薬形態を用いて、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧系（例えばＯＲＯＳ（登録商標）（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡ））、またはそれらの組み合わせを用いて１種以上の活性成分の徐放性または制御放出を提供して、変動する割合における所望の放出プロフィールを提供してもよい。
【００９１】
一実施形態において、薬学的に許容し得る組成物を、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、投薬単位形態において処方してもよい。本明細書で使用する表現「投薬単位形態」は、処置するべき対象に適した活性剤の物理的に別々の単位を指す。
【００９２】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容し得る」は、健全な医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、合理的な利益／リスク比に相応して、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した当該化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【００９３】
本明細書中で使用する用語「薬学的に許容し得る担体」は、薬学的に許容し得る材料、組成物またはビヒクル、例えば液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば潤滑剤、タルクマグネシウム、カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸（steric acid））、あるいは溶媒カプセル封入材料を意味し、これは、対象化合物を、１つの器官または身体の一部から別の器官または身体の一部に運搬または輸送することに関与する。各担体は、処方物の他の成分と適合性であり、患者にとって有害でないという意味において、「許容し得」なければならない。
薬学的に許容し得る担体として役立ち得る材料のいくつかの例には、以下のものが含まれる：（１）糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えばコムデンプン（ｃｏｍ  ｓｔａｒｃｈ）およびジャガイモデンプン；（３）セルロース、ならびにその誘導体、例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（Ｓ）賦形剤、例えばココアバターおよび座剤ワックス；（９）油、例えば落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、コム油（ｃｏｍ  ｏｉｌ）および大豆油；（１０）グリコール、例えばプロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（１２）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張性生理食塩水；（ＩＳ）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）増量剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸；（２３）血清成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬ；（２２）Ｃ２−Ｃ１２アルコール、例えばエタノール；ならびに（２３）医薬製剤において用いる他の無毒性適合性物質。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、香料、防腐剤および酸化防止剤もまた、処方物中に存在してもよい。用語、例えば「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容し得る担体」などを、本明細書中で互換的に使用する。
【００９４】
本明細書中で使用する用語「がん」は、身体の器官および系の正常な機能を妨害し得る細胞の制御されない成長を指す。がんは、原発性がん、もしくは転移性がん、または両方であってもよい。初期の位置から移動し、重要臓器に播種するがんによって、最終的には、罹患した器官の機能的悪化を通じて対象の死がもたらされ得る。転移は、がん細胞の原発性腫瘍から身体の他の部分への散布から生じる原発性腫瘍の位置とは異なるがん細胞またはがん細胞の群である。原発性腫瘍塊の診断の時点で、対象を、例えば散布のプロセスにおけるがん細胞の遷移的な転移の存在についてモニタリングしてもよい。
【００９５】
本明細書中で使用する用語「がん」はまた、固形腫瘍および血液由来腫瘍を含むが、これらに限定されない。用語がんは、皮膚、組織、器官、骨、軟骨、血管および血管の疾患を指す。用語「がん」は、さらに原発性および転移性がんを包含する。本発明の方法で処置することができるがんの例には、固形腫瘍；神経膠腫、神経膠芽腫、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、乏突起神経膠腫、原始神経外胚葉性腫瘍、低、中および高悪性度星状細胞腫、上衣腫（例えば粘液乳頭状上衣腫乳頭状上衣腫、上衣下腫、未分化の上衣腫）、乏突起神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、下垂体腺腫、神経芽腫および頭蓋咽頭腫が含まれるがこれらに限定されない脳がん；乳管内上皮内癌、浸潤性（ｉｎｖａｓｉｖｅ）（または浸潤性（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ））腺管がん、浸潤性（または浸潤性）小葉癌、腺様嚢胞（またはアデノシスティック（ａｄｅｎｏｃｙｓｔｉｃ））がん、低悪性度腺扁平上皮がん、髄様がん、粘液性（またはコロイド）カルシノーマ乳頭がん、管状がん、炎症性乳がん、乳頭のパジェット病、葉状腫瘍、三種陰性乳癌、転移性乳癌が含まれるがこれらに限定されない乳がん；膀胱、乳房、結腸、腎臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺、および皮膚のものを含むカルシノーマ、扁平上皮がんを含む；メラノーマ、セミノーマ、奇形がんを含む他の腫瘍；中枢および末梢神経系の腫瘍；ならびに色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、濾胞性甲状腺がん、および奇形がんを含むがこれらに限定されない他の腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
本明細書中に開示した方法は、以前にがんについて処置された患者、および以前にがんについて処置されていない患者を処置するために有用である。実際、本明細書中に記載した方法および組成物を、第一選択および第二選択のがん処置において使用してもよい。
【００９７】
本明細書中で使用する用語「前がん状態」は、その通常の意味、すなわち転移を伴わない未制御の成長を有し、様々な形態の過形成および良性肥大を含む。したがって、「前がん状態」とは、未処置で放置した場合にがんに至り得る疾患、症候群または所見である。それは、がんのリスクの有意な増加と関連する一般化された状態である。前悪性病変は、形態学的に変化した組織であり、ここでがんは、その見かけ上正常な対応物よりも発生しやすい。前悪性状態の例には、口腔白板症、光線角化症（ａｃｔｉｎｉｃ  ｋｅｒａｔｏｓｉｓ）（日光角化症（ｓｏｌａｒ  ｋｅｒａｔｏｓｉｓ））、バレット食道、萎縮性胃炎、前立腺の良性過形成、結腸または直腸の前がん性ポリープ、胃上皮異形成、腺腫性異形成、遺伝性非ポリポーシス結腸がん症候群（ＨＮＰＣＣ）、バレット食道、膀胱異形成、前がん子宮頸部状態、および子宮頸部異形成が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
一実施形態において、がんは、以下のものからなる群から選択され得る：乳がん；卵巣がん；脳がん；消化管がん；前立腺がん；カルシノーマ、肺がん、肝細胞がん、精巣がん；子宮頸がん；子宮内膜がん；膀胱がん；頭頸部がん；肺がん；胃食道がん、および婦人科がん。
【００９９】
一実施形態において、がんは、乳管内上皮内がん、浸潤性（または浸潤性）腺管がん、浸潤性（または浸潤性）小葉がん、腺様のう胞（またはアデノシスティック（ａｄｅｎｏｃｙｓｔｉｃ））がん、低悪性度腺扁平上皮がん、髄様がん、粘液性（またはコロイド）がん乳頭がん、管状がん、炎症性乳がん、乳頭のパジェット病、葉状腫瘍、三種陰性乳がん、転移性乳がんを含むがこれらに限定されない乳がんであり得る。
【０１００】
一実施形態において、がんは、原発性ＨＥＲ２＋乳がん、三種陰性乳がん（ＴＮＢＣ）、または脳へのそれらの転移であり得る。
【０１０１】
一実施形態において、がんは、神経膠腫、神経膠芽腫、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、乏突起神経膠腫、原始神経外胚葉性腫瘍、低、中および高悪性度星状細胞腫、上衣腫（例えば粘液乳頭状上衣腫乳頭状上衣腫、上衣下腫、未分化の上衣腫）、乏突起神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、下垂体腺腫、神経芽細胞腫、および頭蓋咽頭腫を含むがこれらに限定されない脳がんであり得る。一実施形態において、脳がんは、神経膠腫、神経膠芽腫、または多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）であり得る。
【０１０２】
一実施形態において、本明細書中に記載した方法は、がんを有するかまたはがんを有すると診断された対象を処置することに関し得る。がんを有する対象は、がんを診断する現行の方法を用いて医師によって同定され得る。これらの状態を特徴づけ、診断において補助するがんの症状および／または合併症は、当該分野において周知であり、腫瘍の成長、がん細胞を保有する器官または組織の機能障害などであり得るが、これらに限定されない。例えばがんの診断において補助し得る試験には、組織生検および組織学的検査が含まれるが、これらに限定されない。がんの家族歴、またはがんについての危険因子（例えばタバコ製品、放射線など）への曝露はまた、対象ががんを有しやすいか否かを決定するにあたって、またはがんの診断を下すにあたって補助し得る。
【０１０３】
一実施形態において、当該方法はさらに、追加的な治療薬を同時投与することを含んでもよい。追加的な治療剤は、以下のものからなる群から選択され得る：抗体、酵素阻害剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、ステロイド、非ステロイド炎症剤、代謝拮抗薬、サイトカイン、サイトカイン遮断薬、接着分子遮断薬、および可溶性サイトカイン受容体。
【０１０４】
一実施形態において、当該方法はさらに、１種以上の追加的な抗がん療法を患者に同時投与することを含んでもよい。一実施形態において、追加的な療法は、手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、免疫療法、ホルモン療法、レーザー療法、抗血管新生療法、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。一実施形態において、追加的な療法は、抗がん剤を患者に投与することを含んでもよい。
【０１０５】
一実施形態において、当該方法は、ナノ免疫複合体および抗がん剤または化学療法剤を対象に同時投与することを含んでもよい。
【０１０６】
一実施形態において、当該方法は、抗悪性腫瘍薬を同時投与することを含んでもよい。抗悪性腫瘍薬には、トラスツズマブ耐性を克服するための剤が含まれ得る。モノクローナル抗体、組換えタンパク質、および薬物を含む種々の剤は、乳がんを処置するにあたって活性を有することが知られており、本明細書中で、本明細書中に記載した組成物との組み合わせにおいて有用な薬剤であると予期される。
【０１０７】
具体例において、当該方法は、パクリタキセル（タキソール、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ドセタキセル（タキソテール、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、小分子チロシンキナーゼ阻害剤；ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ、Ａｓｔｒａ  ＺｅｎｅｃａおよびＴｅｖａ）、ＥＧＦＲ阻害剤；トラスツズマブ；リン酸化ＨＥＲ２およびリン酸化ＨＥＭのレベルを低下させる剤、カスパーゼ阻害剤のアポトーシスに対する効果の欠如により決定されるカスパーゼ非依存性アポトーシスを誘発する剤；ＤＮＡ修復機構に影響し、二本鎖切断（ＤＳＢ）の蓄積をもたらす剤；エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ，Ｒｏｃｈｅ）、ＥＧＦＲの阻害剤；Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群と関連する転写因子（ＷＳＴＦ、またＢＡＺ１Ｂとして知られている）に影響する剤、Ｈ２ＡＸのＴｙｒ１４２のリン酸化によるＤＮＡ損傷応答を調節するＷＩＣＨ複合体のチロシンキナーゼ成分（ＷＳＴＦ−ＩＳＷＩ  ＡＴＰ依存性クロマチンリモデリング複合体）；ラパチニブ（Ｔｙｖｅｒｂ（登録商標）、ＧＳＫ）、二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤；ペルツズマブ（２ｃ４，ｏｍｎｉｔａｒｇ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＨＥＲ２タンパク質の細胞外ドメインに特異的なモノクローナル抗体；トラスツズマブおよびＤＭ１から構成されるトラスツズマブ−ＤＭ１、メイタンシンから誘導されるチューブリン重合の阻害剤である剤；ＰＩ３Ｋ経路阻害剤；ＨＥＲ２細胞外ドメインを標的するＨＥＲ２ワクチンおよび養子免疫療法；エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）（Ｒｅｘｏｍｕｍ，Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）、Ｔ細胞上のＨＥＲ２およびＣＤ３を標的する二重特異性抗体；脱フコシル化（ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）トラスツズマブ；またはそれらの任意の組み合わせを同時投与することを含んでもよい。
【０１０８】
以下のリストは、本発明の特定の実施形態を含む。しかし、当該リストは、限定的ではなく、代替の実施形態、または本明細書中に別段に記載した実施形態を排除しない。以下の実施形態リストに記載したパーセント同一性は、参照配列の全長に沿った列挙した配列の同一性を指す。
実施形態
１．ポリリンゴ酸ベースの分子足場、少なくとも１種のターゲティングリガンド、少なくとも１種の抗腫瘍免疫応答刺激因子および少なくとも１種の抗がん剤を含むナノ免疫複合体であって、ターゲティングリガンド、抗腫瘍免疫応答刺激因子および抗がん剤がポリリンゴ酸ベースの分子足場に共有結合している、ナノ免疫複合体。
２．抗腫瘍免疫応答刺激因子が、以下のもの：アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドおよび低分子量薬物からなる群から選択される、実施形態１に記載のナノ免疫複合体。
３．抗腫瘍免疫応答刺激因子が抗体である、実施形態１および２の一方または両方に記載のナノ免疫複合体。
４．抗腫瘍免疫応答刺激因子が以下のもの：ＰＤ−１に対する抗体、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体、ＰＤ−Ｌ２に対する抗体、ＣＴＬＡ−４に対する抗体、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態１〜３のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体。
５．抗腫瘍免疫応答刺激因子が免疫チェックポイントタンパク質のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである、実施形態２に記載のナノ免疫複合体。
６．アンチセンスオリゴヌクレオチドがモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態５に記載のナノ免疫複合体。
７．アンチセンスオリゴヌクレオチドが配列番号：４〜７からなる群から選択された配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、実施形態６に記載のナノ免疫複合体。
８．抗腫瘍免疫応答刺激因子が免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤である、実施形態１に記載のナノ免疫複合体。
９．抗腫瘍免疫応答刺激因子が免疫刺激性サイトカインである、実施形態１および８のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体。
１０．サイトカインがＩＬ−２またはＩＬ−１２である、実施形態９に記載のナノ免疫複合体。
１１．抗がん剤が以下のもの：アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドおよび低分子量薬物からなる群から選択される、実施形態１〜１０のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体。
１２．抗がん剤が配列番号：１、２および８からなる群から選択された配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態１〜１１のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体。
１３．抗がん剤がヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）またはセリン−トレオニンプロテインキナーゼ（ＣＫ２）のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである、実施形態１〜１１のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体。
１４．抗がん剤が配列番号：３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態１〜１１および１３のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体。
１５．抗がん剤が抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である、実施形態１〜１１のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体。
１６．抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体がＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）である、実施形態１〜１１および１５のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体。
１７．ナノ免疫複合体がポリリンゴ酸ベースの分子足場に共有結合した少なくとも２種の異なる抗がん剤を含む、実施形態１〜１６のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体。
１８．ターゲティングリガンドが腫瘍形成性細胞またはがん細胞中の脈管構造タンパク質に特異的に結合する、実施形態１〜１７のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体。
１９．脈管構造タンパク質がトランスフェリン受容体タンパク質を含む、実施形態１〜１８のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体。
２０．ターゲティングリガンドが抗体である、実施形態１〜１９のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体。
２１．ナノ免疫複合体がさらにポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合したＰＫ調節リガンドを含む、実施形態１〜２０のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体。
２２．ＰＫ調節リガンドがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、実施形態２１に記載のナノ免疫複合体。
２３．ナノ免疫複合体がさらにポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合したエンドソーム分解（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）リガンドを含む、実施形態１〜２２のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体。
２４．エンドソーム分解リガンドが複数のロイシンまたはバリン残基を含む、実施形態２３に記載のナノ免疫複合体。
２５．エンドソーム分解リガンドがＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（ＬＬＬ）である、実施形態２４に記載のナノ免疫複合体。
２６．前記ナノ免疫複合体がさらにポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合した造影剤を含む、実施形態１〜２５のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体。
２７．実施形態１〜２６のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体および薬学的に許容し得る担体または賦形剤を含む、薬学的に許容し得る組成物。
２８．対象におけるがんを処置する方法であって、以下のこと：実施形態１〜２６のいずれか１つ以上に記載のナノ免疫複合体を提供し、治療有効量のナノ免疫複合体を対象に投与することを含む、前記方法。
２９．投与のステップの結果、対象におけるがんの処置、重症度の低下または進行の遅延がもたらされる、実施形態２８に記載の方法。
３０．がんが原発がん、転移がん、または両方である、実施形態２８および２９の一方または両方に記載の方法。
３１．がんが、原発性ＨＥＲ２＋乳がん、三種陰性乳がん（ＴＮＢＣ）または脳へのそれらの転移である、実施形態２８〜３０のいずれか１つ以上に記載の方法。
３２．がんが神経膠腫または神経膠芽腫である、実施形態２８〜３０のいずれか１つ以上に記載の方法。
３３．対象におけるがんを処置する方法であって、以下のこと：ポリリンゴ酸ベースの分子足場および少なくとも１種のターゲティングリガンドおよび足場に共有結合した少なくとも１種の抗がん剤を含むナノ複合体を提供し；ならびに治療有効量の抗腫瘍免疫応答刺激因子および治療有効量のナノ複合体を対象に同時投与することを含む、前記方法。
３４．抗腫瘍免疫応答刺激因子が以下のもの：アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドおよび低分子量薬物からなる群から選択される、実施形態３３に記載の方法。
３５．抗腫瘍免疫応答刺激因子が抗体であり、ここで抗体が以下のもの：ＰＤ−１抗体に対する抗体、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体、ＰＤ−Ｌ２に対する抗体、ＣＴＬＡ−４に対する抗体、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、実施形態３３および３４の一方または両方に記載の方法。
３６．抗腫瘍免疫応答刺激因子が免疫チェックポイントタンパク質のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである、実施形態３３および３４の一方または両方に記載の方法。
３７．抗腫瘍免疫応答刺激因子がアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、配列番号：４〜７からなる群から選択された配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、実施形態３３および３４の一方または両方に記載の方法。
３８．抗腫瘍免疫応答刺激因子が免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤である、実施形態３３および３４の一方または両方に記載の方法。
３９．抗腫瘍免疫応答刺激因子が免疫刺激性サイトカインであり、サイトカインがＩＬ−２またはＩＬ−１２から選択される、実施形態３３、３４および３８のいずれか１つ以上に記載の方法。
４０．抗がん剤が以下のもの：アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、抗体、ポリペプチド、オリゴペプチドおよび低分子量薬物からなる群から選択される、実施形態３３〜３９のいずれか１つ以上に記載の方法。
４１．抗がん剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、配列番号：１、２および８からなる群から選択された配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、実施形態３３〜４０のいずれか１つ以上に記載の方法。
４２．抗がん剤がヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）のｍＲＮＡ転写物中に含まれる配列に相補的な配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはｓｉＲＮＡ、またはセリン−トレオニンプロテインキナーゼ（ＣＫ２）である、実施形態３３〜４０のいずれか１つ以上に記載の方法。
４３．抗がん剤がアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、配列番号：３の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列に相補的な配列を含む、実施形態３３〜４０および４２のいずれか１つ以上に記載の方法。
４４．抗がん剤が抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である、実施形態３３〜４０のいずれか１つ以上に記載の方法。
４５．抗がん剤がＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）である、実施形態３３〜４０および４４のいずれか１つ以上に記載の方法。
４６．ターゲティングリガンドが腫瘍原性細胞またはがん細胞中の脈管構造タンパク質に特異的に結合する、実施形態３３〜４５のいずれか１つ以上に記載の方法。
４７．脈管構造タンパク質がトランスフェリン受容体タンパク質を含む、実施形態３３〜４６のいずれか１つ以上に記載の方法。
４８．ターゲティングリガンドが抗体である、実施形態３３〜４７のいずれか１つ以上に記載の方法。
４９．ナノ複合体がさらにポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合したＰＫ調節リガンドを含む、実施形態３３〜４８のいずれか１つ以上に記載の方法。
５０．ＰＫ調節リガンドがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、実施形態４９に記載の方法。
５１．ナノ複合体がさらにポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合したエンドソーム分解リガンドを含む、実施形態３３〜５０のいずれか１つ以上に記載の方法。
５２．エンドソーム分解リガンドが複数のロイシンまたはバリン残基を含む、実施形態３３〜５１のいずれか１つ以上に記載の方法。
５３．エンドソーム分解リガンドがＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（ＬＬＬ）である、実施形態３３〜５１のいずれか１つ以上に記載の方法。
５４．ナノ免疫複合体がさらにポリリンゴ酸ベースの分子足場と共有結合した造影剤を含む、実施形態３３〜５３のいずれか１つ以上に記載の方法。
５５．がんが原発がん、転移がんまたは両方である、実施形態３３〜５４のいずれか１つ以上に記載の方法。
５６．がんが原発性ＨＥＲ２＋乳がん、三種陰性乳がん（ＴＮＢＣ）またはそれらの脳への転移である、実施形態３３〜５５のいずれか１つ以上に記載の方法。
５７．がんが神経膠腫または神経膠芽腫である、実施形態３３〜５５のいずれか１つ以上に記載の方法。
５８．方法がさらに追加的な治療薬を対象に同時投与することを含む、実施形態３３〜５７のいずれか１つ以上に記載の方法。
５９．方法がさらに前記１種以上の追加的な抗がん療法を対象に同時投与することを含む、実施形態３３〜５８のいずれか１つ以上に記載の方法。
６０．追加的な抗がん療法が手術、化学療法、放射線療法、温熱療法、免疫療法、ホルモン療法、レーザー療法、抗血管新生療法、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、実施形態５９に記載の方法。
６１．対象が哺乳動物である、実施形態３３〜６０のいずれか１つ以上に記載の方法。
６２．哺乳動物が以下のもの：げっ歯類、実験的ヒト乳房腫瘍保有ヌードマウスおよびヒトからなる群から選択される、実施形態６１に記載の方法。
【０１０９】
当該開示の実施形態の説明は、徹底的であること、または開示を開示した正確な形態に限定することを意図しない。開示の特定の実施形態および開示についての実施例を本明細書中に例示的目的のために記載する一方、種々の等価な修正が、関連する当業者が認識するように開示の範囲内で可能である。例えば、方法ステップまたは機能を所与の順序において提示した一方、代替の実施形態は、種々の順序において機能を発揮してもよく、または機能を、実質的に同時に発揮してもよい。本明細書中に提供する開示の教示を、適切なように他の手順または方法に適用することができる。本明細書中に記載した様々な実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。開示の態様を、所要に応じて修正して、上記の参考文献および適用の組成、機能および概念を使用して、開示の尚さらなる実施形態を提供することができる。これらの、および他の変更を、詳細な説明を考慮して開示に対して行うことができる。すべてのかかる修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０１１０】
本明細書中のさらなる実施形態は、実施形態に、本明細書中の任意の１つ以上の他の実施形態からの１つ以上の要素を補足することによって、および／または１つの実施形態からの１つ以上の要素を本明細書中の１つ以上の他の実施形態からの１つ以上の要素で置換することによって形成され得る。
【実施例】
【０１１１】
以下の非限定的な実施例を提供して、特定の実施形態を例示する。実施形態全体に、以下の１以上の例からの１以上の詳細を補足し、および／または実施形態からの１以上の要素を、以下の１以上の実施例からの１以上の詳細で置換してもよい。
【０１１２】
実施例１−乳がん処置設計
多発がんを処置するにあたってのＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１遮断での成功は、乳がんの発症および進行における免疫および炎症系の複雑性を理解することが尚より重要であることを強調している。乳がんの微小環境免疫系は、調節不全である。正常な免疫系は、刺激成分および阻害成分の両方と均衡している。がん細胞は、末梢性寛容の機序を利用することによって、および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を不活性化することによって、免疫監視を回避する能力を獲得する。以下のものが、特に興味深い２つのアプローチである。
【０１１３】
アンタゴニストｍＡｂ  イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））を用いたＣＴＬ関連抗原４（ＣＴＬＡ−４）の遮断は、後期（ステージＩＶ）メラノーマ患者について２件の第ＩＩＩ相臨床試験において有意な臨床的利益を達成した最初の戦略であり、２０１３年における腫瘍学についてのブレークスルー戦略である免疫療法の見解を刺激する。免疫系応答モジュレーター（チェックポイント阻害剤、例えばＣＴＬＡ−４  ｍＡｂイピリムマブ、およびＰＤ−１  ｍＡｂペンブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標）））に対するヒト化モノクローナル抗体は、メラノーマ治療薬としてＦＤＡの認可を受けた。これらの効果は、ＣＴＬによる免疫応答を弱めるＴｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋）の抑制に関する。全身性ＣＴＬＡ−４またはプログラム細胞死−１（ＰＤ−１）ｍＡｂは、数種の腫瘍の抑制に寄与するが、それらは、脳腫瘍および乳房腫瘍に対する低い効能を有し、当該効果が現れるためには放射線との同時処置が必要である。
【０１１４】
現在、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の両方が免疫応答を誘導または抑制する第２のシグナルを提供することによってＴ細胞活性化を調節することが、知られている。ＣＤ２８は、Ｔ細胞レセプター／主要な組織適合性複合体（ＴＣＲ／ＭＨＣ）相互作用の同時刺激因子であり、免疫応答の誘発をもたらす。ＣＴＬＡ−４は、免疫抑制をもたらす同時阻害剤である。ＣＴＬＡ−４とそのリガンドとの相互作用は、ＣＤ２８のものよりも高い親和性であり、したがってＣＴＬＡ−４は、刺激シグナルを打ち負かし、減少したＴ細胞増殖およびＩＬ−２産生、ならびに最終的にはがん細胞に対するＣＴＬ活性を含むＴ細胞免疫応答の抑制をもたらす。したがって、ＣＴＬＡ−４に結合するリガンドのアンタゴニストＡｂの使用による遮断は、ＣＤ２８の免疫活性化をもたらすリガンドとの相互作用に有利に働く。
【０１１５】
ＰＤ−１（ＣＤ２７９）は、免疫グロブリンスーパーファミリーのＩ型膜貫通受容体メンバーであり、活性化Ｔ細胞によって表現され、２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）に結合し、その両方は、Ｂ７免疫グロブリンスーパーファミリーの一部である。がんによって送達される選択的免疫抑制シグナルを考慮すると、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の遮断は、ＣＴＬＡ−４遮断と比較して、より大きな抗腫瘍活性およびより少ない副作用を有するであろうことが、予測された。抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１  ｍＡｂは、ＣＴＬががん細胞を排除することを可能にする阻害機構をオフにするが、抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂの抗腫瘍活性の正確な機構は、依然として議論の的になっており、ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１  ｍＡｂについての第２の機構が、提唱されている。
【０１１６】
その後、多くの試験で、悪性腫瘍における様々な免疫チェックポイントモジュレーターが試験された。特に乳がんにおいて、Ｔｒｅｇの増加した数およびＣＤ８  Ｔ細胞／Ｔｒｅｇの低下した比は、予後不良と相関している。タンパク質およびｍＲＮＡレベルの両方でのＣＴＬＡ−４のより高い発現が、乳房腫瘍患者の全標本において見出され、ＣＴＬＡ−４のより高いｍＲＮＡレベルは、明らかな腋窩リンパ節転移およびより高い臨床病期と相関する。したがって、ＣＴＬＡ−４遮断は、乳がん療法のための有意義な方法である。
【０１１７】
しかしながら、がんの処置のためのＣＴＬＡ−４  Ａｂ単独療法には、自己免疫効果の結果としてのＴｒｅｇの抑制後に続く重大な毒性および腫瘍特異的免疫の欠如を含むいくつかの欠点があり、それによってｍＡｂ治療学の適用が大きく制限される。
【０１１８】
本明細書中に記載したように、乳がん処置免疫調節剤のために、チェックポイント阻害剤ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ１および／またはサイトカインＩＬ−２および／またはＩＬ−１２を、ＡＯＮを用いるプロテインキナーゼＣＫ２およびＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩの抑制と組み合わせて使用した。
【０１１９】
細胞傷害性ＡＯＮおよびチェックポイント阻害剤の組み合わせた力は、脳転移であるその最も破壊的なステージを含む乳がんを標的することができるナノ免疫複合体（ＮＩＣ）の一部として利用された。このアプローチは、がん細胞を直接排除し、また局所的な、および全身的な長期間広域スペクトル免疫応答を誘発するように設計された。図１は、乳がんの状況におけるナノ免疫複合体（ＮＩＣ）の例示的な構造および機構を例示する。図１を参照して、［１］は、単独で、または組み合わせて使用することができるＮＩＣの一般的な構造を示す。それは、ＰＭＬＡ骨格、安定性のためのｍＰＥＧ５０００、エンドソームエスケープ単位（ＬＬＬ）、ＢＢＢおよび乳房腫瘍ターゲティングのための抗ＴｆＲ  ｍＡｂ、ならびに腫瘍細胞傷害性を誘導するためのＣＫ２に対するＡＯＮを有する。後者を、ＨＥＲ２／ｎｅｕに対するＡＯＮによって置き換えるか、またはそれと組み合わせることができる。ＮＩＣはまた、チェックポイント阻害剤ｍＡｂ抗ＰＤ−１または−ＣＴＬＡ−４を含み、それを、腫瘍ターゲティングおよび免疫刺激のために抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡｂおよびＩＬ−２によって置き換えることができる。遊離のサイトカインをまた、ＮＩＣに直接抱合させることができる。好ましいのは、ＩＬ−２であり、それは、ＩＬ−１２がチェックポイント阻害剤によって良好に誘発されるためである。タンパク質（ｍＡｂおよび誘導体）は、ＰＭＬＡにＰＥＧ３４００リンカーを介して結合する。図１において、［２〜４］は、提案された作用の機構に言及する。全身静脈内（ｉ．ｖ．）投与の後、［２］ＮＩＣは、腫瘍にＴｆＲまたはＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍関連抗原（Ａｇ）を介して到達し、細胞中に受容体媒介エンドサイトーシスによって送達される。ＬＬＬによって、エンドソームエスケープが可能になり、ＡＯＮ（例えばＣＫ２へ）は、細胞質グルタチオンによって切断されて、標的ｍＲＮＡを遮断する。チェックポイントタンパク質に付着したｍＡｂは、腫瘍中で、および循環中でＴｒｅｇと相互作用し、ＣＴＬ応答を引き起こす。乳がん脳転移の場合において、血液脳関門（ＢＢＢ）は、ＴｆＲ媒介経細胞輸送によって横断される［３］。脳中に入った後、ＡｂＦＰ上のＮＩＣサイトカインは、ＮＫおよびＣＴＬ細胞を直接活性化し、先天性を適応免疫と連結させることが可能であり、一方ＮＩＣのチェックポイント阻害剤は、Ｔｒｅｇ「ブレーキ」をＣＴＬから取り除き、それらの腫瘍致死能を最大にする［４］。
【０１２０】
図１を参照して、ＰＭＬＡを、抗腫瘍免疫応答刺激因子、抗がん薬、および腫瘍ターゲティングＡｂとの抱合のための足場として使用する。強力な免疫刺激物質として、（１）ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４を標的する拮抗性Ａｂ（チェックポイント阻害剤ｍＡｂ）を使用して、阻害機構をオフにし、ＣＴＬががん細胞を排除するのを可能にする；ならびに（２）強力な免疫刺激性サイトカインＩＬ−２および／またはＩＬ−１２に遺伝的に融合したＨＥＲ２／ｎｅｕに特異的なｍＡｂで構成されるＡｂＦＰは、ＮＫ細胞およびＣＴＬ細胞の両方を活性化し、チェックポイント阻害剤ｍＡｂの活性を増強する。細胞傷害性抗がん薬として、ＡＯＮを使用して、ＨＥＲ２／ｎｅｕおよび／またはマスターシグナリングレギュレーターＣＫ２、乳がん細胞の重要な生存エフェクターの発現を抑制する。この細胞傷害性効果によって、腫瘍細胞のアポトーシスが増加し、Ａｇ提示細胞（ＡＰＣ）、例えば樹状細胞（ＤＣ）によるそれらの食作用が促進され、適合性ＣＴＬ抗腫瘍免疫応答におけるその後の増加がもたらされる。この効果によって、腫瘍Ａｇに対する適応免疫応答を伴う抗原拡散がもたらされ、腫瘍エスケープおよび再発の変化が最小限になり、長期間広域スペクトル免疫が増加する。強力なエフェクターの組み合わせによって、抗腫瘍活性が最大化される（相乗効果）。
【０１２１】
このアプローチの利点は、以下の通りである。ＮＩＣによって、ナノ薬物の、内皮系、がん細胞およびエンドソーム膜を含む多くの生体膜、ならびにＢＢＢを通しての乳がん腫瘍への同時の送達が可能になり、脳における乳がん転移が処置される。ＮＩＣは、ＣＴＬ活性化ｍＡｂ（ＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４）を保有して、全身性の、および局所的な抗腫瘍応答を増強する。チェックポイントタンパク質ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１を抗ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１ＡＯＮを用いた遺伝子ノックダウンによって遮断することによって、治療的Ａｂの既知の毒性を低下させることが可能になる。サイトカイン（ＩＬ−２またはＩＬ−１２）に融合したＡｂをチェックポイント阻害戦略と共に包含させることを設計して、強力な先天性および適応免疫応答を結集する。プロテインキナーゼＣＫ２またはＨＥＲ２／ｎｅｕを阻害することによる免疫系活性化の抗がん細胞傷害性薬物との組み合わせを設計して、乳房腫瘍塊を直接的に、および免疫細胞傷害性応答を介して全滅させる。本明細書中に記載したプロセスは、２つのアプローチの組み合わせである：最も有効な処置レジメンを選択するための、最大負荷ＮＩＣの単独薬物としての使用、ならびにいくらかの部分を部分的に負荷したＮＩＣと遊離の免疫刺激因子との同時投与。全体として、ＮＩＣを設計して、特異的ながん細胞致死（内部攻撃）および抗腫瘍免疫応答の刺激（外部攻撃）を同時に提供し、それによって抗腫瘍効能が有意に増加する。
【０１２２】
実施例２：動物モデルにおいて乳がんを効率的に処置するナノ免疫複合体
ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕを発現する同系乳房腫瘍Ｄ２Ｆ２／Ｅ２を保有する免疫応答性マウスにおける抗腫瘍研究によって、ＮＩＣのみが生存を有意に改善し、良好に耐容されることが示された。この効果は、２回のみの低用量を使用したという事実にもかかわらず観察された。重要なことに、ＮＩＣによって、マウス抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの血清レベルが有意に増加し、それは、マウスにおいて、体液性（ＴＨ２）および細胞媒介（ＴＨ１）免疫応答に関連し、観察された抗腫瘍保護と一致する。優れたＮＩＣ抗腫瘍活性を、免疫適格性マウスにおける免疫エフェクター細胞（ＮＫおよびＣＴＬ細胞）の活性化によって、ならびにまたＡＯＮ細胞毒性によって説明することができる。腫瘍ターゲティングは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ結合を通して、ならびに部分的に増強された透過性および保持（ＥＰＲ）効果を通して生じた。しかしながら、このＮＩＣは、マウス腫瘍ターゲティングおよびひいては抗腫瘍活性を増強する抗マウスＴｆＲ  ｍＡｂを有しなかった。
【０１２３】
ＬＬＬ、ｍＰＥＧ、ＩＬ−２、および抗マウスＴｆＲ  ｍＡｂを含むＰＭＬＡを有するＮＩＣを、開発した。すべての抱合した成分は、完全に生理活性であった。
【０１２４】
図２は、ヒト異種移植乳がん（ＢＴ−４７４）モデルにおけるＮＩＣ（Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／ｍＴｆＲ／ＩＬ−２；ｘマーク）の抗腫瘍活性を、ＰＢＳ（閉じたひし形）およびＰ／ＩＬ−２（閉じた四角形）での対照処置と比較して例示する一組の線グラフである。図２は、ヒト異種移植乳がん（ＢＴ−４７４）モデルにおけるＮＩＣの抗腫瘍活性を例示する。図２を参照して、１０７のＢＴ−４７４細胞を、雌ヌードマウスにおいて０日目に皮下（ｓ．ｃ．）注射した（右側腹部）。療法を、腫瘍が平均１６０ｍｍ３に達した時点（２０日目）で開始した。マウスを、３つの群（各々ｎ＝６）に分け、ＰＢＳ、Ｐ／ＩＬ−２、またはＮＩＣをｉ．ｖ．で週２回施与した。Ｐ／ＩＬ−２についての用量は、２ｍｇ／ｋｇ（約５０μｇ、遊離またはＮＩＣに結合）であり、処置を、８回行った。平均腫瘍体積は、マウスを安楽死させた３７日目で、ＮＩＣ群においてのみＰＢＳと比較して有意に低い（＊ｐ＜０．０１、二元配置ＡＮＯＶＡ、ＳＤで示す）。図２を参照して、ＮＩＣは、ＢＴ−４７４ヒト乳がんを保有するヌードマウスにおいて有意に改善された生存を示し、良好に耐容された。
【０１２５】
抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂを含むナノイムノドラッグ（ｎａｎｏｉｍｍｕｎｏｄｒｕｇ）：ＬＬＬ、ｍＰＥＧ、抗マウスＴｆＲ  ｍＡｂ、および抗マウスＣＴＬＡ−４  ｍＡｂを含むＰＭＬＡのバージョン（ＢｉｏＸｃｅｌｌ）が、開発された。抗体は、他社からもまた入手され得る。このＮＩＣの活性を、ｓ．ｃ．同系マウス乳がん細胞Ｄ２Ｆ２を保有するＢＡＬＢ／ｃマウスで試験した。この細胞株は、上記のヒトＨＥＲ２／ｎｅｕを発現しないＤ２Ｆ２／Ｅ２の親株であった。
【０１２６】
図３は、ｓ．ｃ．Ｄ２Ｆ２同系乳房腫瘍を保有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＮＩＣの抗腫瘍活性を例示する。図３を参照して、１０６のＤ２Ｆ２細胞を、０日目にｓ．ｃ．注射した（右側腹部）。療法を、腫瘍が約１６０ｍｍ３の平均の大きさに達した時点（８日目）で開始した。マウスを、ＰＢＳ（ｎ＝５）、５ｍｇ／ｋｇの遊離抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ（ｎ＝６）、抗ＣＴＬＡ−４  ＡｂおよびＩｇＧ陰性対照ｍＡｂと抱合したＮＩＣ（ｎ＝６）または抗ＣＴＬＡ−４および抗ＴｆＲ  ｍＡｂと抱合したＮＩＣ（ｎ＝７）で、８、１１、１５、１８および２２日目にｉ．ｖ．処置した。２３日目にマウスを安楽死させ、血清を採取した。平均腫瘍体積を、ＳＤ．で示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００１（二元配置ＡＮＯＶＡ）。図３を参照して、腫瘍成長は、抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂを含有するＮＩＣで処置した動物において、遊離の抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂと比較して有意に阻害され、それを、ＥＰＲ効果に起因する優れた腫瘍ターゲッティングおよび腫瘍浸潤性Ｔ細胞のターゲッティングによって説明することができる。しかしながら、腫瘍成長は、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＴｆＲ  Ａｂの両方を含有するＮＩＣで処置したマウスにおいて、より大きな程度まで阻害された。
【０１２７】
図４Ａ〜４Ｂは、ｓ．ｃ．Ｄ２Ｆ２同系乳房腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて抗ＣＴＬＡ−４によって誘発される選択的ＩＬ−１２（図４Ａ）およびＩＬ−１０（図４Ｂ）活性化を例示する。これらの図面を参照して、各ｉ．ｖ．処置群における４匹の無作為に選択した動物からのプールした血清試料を、１：２に希釈し、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ａｓｓａｙにおいて試験した。マウスＩＬ−１２およびＩＬ−１０についてのデータは、二通りにおける２回の独立した実験の平均である。エラーバーは、ＳＥＭを示す。未処置のマウスおよびＰＢＳで処置したマウスからの対照血清に対して＊ｐ＜０．０５（スチューデントｔ−検定）。図４Ａを参照して、抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂでのすべての処置によって、有意なＩＬ−１２増加が誘発された。図４Ｂを参照して、ＩＬ−１０増加は、遊離の抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂでのみ認められた。ＩＬ−１２応答はＩＬ−１０よりも２０倍超高いことが、観察された。図４Ａを参照して、血清マウスＩＬ−１２の増加したレベルが、両方のＮＩＣ群において観察され、ＴＨＩ細胞媒介免疫応答の優先的誘発と整合した。これらのデータは、ＰＭＬＡに結合した抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂが活性であり、抗がん活性がＣＴＬによって媒介されたことを示唆する。高い血清ＩＬ−１２およびＩＬ−１０（ＩＬ−１２よりはるかに低いが）レベルが、抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ単独で処置した動物において観察された。ＩＬ−１０は、ＴＨ２クローンによって産生される。したがって、これらのデータは、ＴＨ１細胞媒介性およびＴＨ２液性免疫応答の両方の誘発と整合する。抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂのＮＩＣ上の存在の結果、ＩＬ−１２およびＩＬ−１０の両方のレベルの小幅であるが有意な増加がもたらされた。ＮＩＣとは対照的に、抗がん活性が遊離の抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂで処置したマウスにおいて観察されなかったという事実を、腫瘍ターゲティングの結果としての腫瘍微小環境における局所的ＣＴＬ応答のＮＩＣの有効な誘発によって説明することができる。さらに、ＮＩＣおよび遊離の抗ＣＴＬＡ−４Ａｂは、異なる薬物動態を有し、血清試料を、最後の処置の１日後に採取した。したがって、より高いレベルのＩＬ−１２およびＩＬ−１０（早期活性化マーカー）が、ＮＩＣ群においてより早期の時点で検出されている可能性がある。事実、Ｄ２Ｆ２細胞に対するマウスＡｂ（後期活性化マーカー）を測定して、ＩｇＧａレベル（ＴＨ２応答と関連する）は、異なる群における抗腫瘍活性のレベルと整合し、抗ＣＴＬＡ−４および抗ｍＴｆＲ  ｍＡｂと抱合したＮＩＣの場合において最も高いことが見出された。
【０１２８】
上記の戦略を用いて、Ｄ２Ｆ２細胞を頭蓋内で成長させる初期研究を実施して、乳がん脳転移を模擬した。この研究を、１２日目に終了し、マウスは、５回の代わりに２回の処置を受けた。マウスを、１２日目に安楽死させなければならなかった。なぜなら、初期の高い用量の脳中でのこれらの侵攻性細胞（１０５）では、当該マウスは神経学的症状を示していたからである。
【０１２９】
図５Ａ〜５Ｂは、頭蓋内Ｄ２Ｆ２腫瘍を有する動物（脳転移モデル）における免疫刺激を例示する。マウス（群あたりｎ＝４）に、１０５のＤ２Ｆ２細胞をｉ．ｃ．で接種し（０日目）、５日目および８日目にＰＢＳまたは５ｍｇ／ｋｇの遊離抗ＣＴＬＡ−４Ａｂまたは対照のＩｇＧ  ＡｂもしくはｍＴｆＲ  Ａｂのいずれかと抱合した同一のＡｂでｉ．ｖ．処置した。１２日目にマウスを安楽死させ、血清を採取し、プールし、マウスＩＬ１２（図５Ａ）およびＩＬ１０（図５Ｂ）レベルについて試験した。これらの図面を参照して、ＢＢＢを通過する腫瘍標的ＮＩＣのみが高いサイトカイン応答を誘発することが、観察された。ＩＬ１２応答は、ＩＬ−１０よりも２０倍超高かった。この初期の時点で、高いＩＬ−１２レベルが抗ＣＴＬＡ−４および抗ｍＴｆＲ  ｍＡｂを負荷したＮＣＩで処置したマウスにおいて見出され、優れた腫瘍ターゲティングおよびＣＴＬ活性化と整合することが、観察された。図５Ｂを参照して、この群はまた、早期のＩＬ−１０シグナルを示したが、ＩＬ−１２と比較してはるかに低いレベルであった（例えば図面のＹ軸目盛りにおける差異）。この初期の経験に基づき、第２の予備研究を実施し、最初に動物に比較的少ない腫瘍細胞（１０５の代わりに１０４）を接種し、より多くの治療的投与およびより長い生存が可能になった。
【０１３０】
図６は、頭蓋内乳房Ｄ２Ｆ２腫瘍を保有するＢＡＬＢ／ｃマウス（脳転移モデル）についてのカプラン・マイヤー生存曲線を例示する。１０４のＤ２Ｆ２細胞を、０日目に頭蓋内に注射した。Ｄ２Ｆ２細胞が脳腫瘍生存に対して極めて侵攻性であるため、全身療法を、３、７、１０、１４日目に実施した。マウスを、ＰＢＳ、（ｎ＝５）、５ｍｇ／ｋｇまたは遊離の抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂ（ｎ＝６）または抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂおよび抗ＴｆＲ  Ａｂに抱合したＮＩＣ（ｎ＝７）で処理した。ＰＢＳおよび遊離のＣＴＬＡ−４  Ａｂ群における生存率は同等であったが、抗ＣＴＬＡ−４および抗ＴｆＲ  Ａｂを保有するＮＩＣでの生存率は有意に長かった（ｐ＜０．００６、ログランク検定）。ＮＩＣの一部としてのＣＴＬＡ−４  Ａｂの腫瘍局所的送達は、脳腫瘍に対する免疫系応答に極めて重要である。
【０１３１】
図６を参照して、この特に侵攻性の腫瘍を有するマウスの有意な生存は、抗ＣＴＬＡ−４Ａｂおよび抗ＴｆＲ  ｍＡｂに抱合したＮＩＣでの処置後に観察された。
【０１３２】
本明細書中に記載したすべてのデータを、部分的に（単一の抗がん成分）負荷し、単独で使用したＮＩＣで得た。はるかにより強い抗腫瘍活性が、完全に負荷したＮＩＣおよび部分的に負荷し、遊離の免疫刺激因子と同時投与したＮＩＣで観察される。
【０１３３】
実施例３−乳がんの処置のためのナノ免疫複合体の合成およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性評価
乳がんを標的する能力を有する多面的な抗がん機能を含むＮＩＣバージョンが、開発された。複数の官能基を含むＮＩＣを、制御された方法において高い再現性で合成した。設計したＮＩＣを、２つの異なる種類の抗がん剤を送達するように設計する：免疫刺激物質（ＡｂＦＰおよび／またはチェックポイント阻害剤ｍＡｂ）ならびに細胞傷害性ＡＯＮ。ＡＯＮは、がん細胞細胞質に進入して、エンドソームエスケープ機構を介して機能する必要がある。十分な研究において、ＰＭＬＡコポリマーによる有効なエンドソーム膜溶解（ｍｅｍｂｒａｎｏｌｙｓｉｓ）は、ｐＨ感受性ＬＬＬを用いた場合に確認された。Ｐ／ＬＬＬは「たる−たる板」機構を介して生体膜に浸透し、それによって細胞質中へのより効率的なエンドソーム放出が可能になることが、見出された。
【０１３４】
方法
ＰＭＬＡの産生：ＮＩＣは複数の成分を含むため、合成の成功およびその再現性を、モニタリングした。各成分の制御された抱合を有する合成を、開発した。抱合の各段階を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣで確認した。ＮＩＣ合成のための粘菌真正粘菌からのＰＭＬＡの製造および精製を、記載したように行った。ＰＭＬＡを、高度に精製し、ＮＩＣの再現可能な合成について特性評価した。ＰＭＬＡベースのナノ薬物合成は、十分に確立されており、高度に再現可能である。ＮＩＣ変異体を、本明細書に記載したものと同様に合成することができる。ｍ．ｗ．（重量平均分子量）＝５０，０００Ｄａ（多分散性Ｐ＝１．１）のＰＭＬＡを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５微粒子上での分別により調製した。
【０１３５】
図７は、４０％のＬＬＬ、２％のｍＰＥＧ、０．２％のｍＴｆＲ  Ａｂ、０．２％のＣＴＬＡ４  ｍＡｂ、０．４％のＩＬ−２、および２％のＭｏｒｐｈｏｈｎｏ  ＡＯＮ−ＨＥＲ２／ｎｅｕを含有する例示的なＰＭＬＡ  ＮＩＣの合成を例示する。最初に、４０％のＬＬＬ、２％のｍＰＥＧおよび１０％のＭＥＡを含むプレコンジュゲート（ｐｒｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を、合成した（上部構造）。このプレコンジュゲートを、（ａ）Ｍａｌ−ＰＥＧ３４００−ＴｆＲ  ＡｂおよびＭａｌ−ＰＥＧ３４００−ＣＴＬＡ４  ｍＡｂの混合物、（ｂ）Ｍａｌ−ＰＥＧ３４００−［Ａｂ−（ＩＬ−２）］、（ｃ）Ｍｏｒｐｈｏｈｎｏ  ＡＯＮ−ＨＥＲ２／ｎｅｕ（またはＣＫ２）、および（ｄ）ＰＤＰと連続的に抱合して、残存する遊離チオール基を遮断して、最終生成物（下部構造）を得た。
【０１３６】
図７を参照して、上部構造、プレコンジュゲート（Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／ＭＥＡ）を、ワンポット反応において合成した。ＰＭＬＡを、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下で２時間において、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で完全に活性化した。ｍＰＥＧ５０００−ＮＨ２、Ｈ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＯＨ（ＬＬＬ）、およびＭＥＡを含む官能基を、それぞれの事前のアミド化の完了後に連続的に添加した。反応の完了を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ；ニンヒドリン試験）によって確認した。すべての反応（ＴＬＣ、ニンヒドリン試験）の完了の後、未反応のポリマー結合ＮＨＳ基を、水で分解した。プレコンジュゲートを次にＰＤ−１０カラム上で精製して、小分子を除去し、凍結乾燥し、−２０℃で保存した。
【０１３７】
ＮＩＣの合成
ＡＯＮ、Ａｂｓ、およびＡｂＦＰとの抱合。３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルモルホリノＡＯＮ（ＰＤＰ−Ｍｏｒｐｈ−ＡＯＮ）の合成。図７を参照して、モルホリノ−ＡＯＮ５’−ＣＡＴＧＧＴＧＣＴＣＡＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＣ−３’［配列番号１］（ＧｅｎｅＴｏｏｌｓ）を、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕの阻害のために設計し、５’−ＣＧＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＴＧＡＴＧＴＴＴ−３’［配列番号２］を、ヒトおよびマウスＣＫ２の阻害のために設計した。ＡＯＮの３’−モルホリノ−ＮＨ２残基を、−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）と抱合させ、ＡＯＮ−ＰＤＰを、メタノールを溶離剤としてＬＨ−２０カラムを用いて精製した。Ｓ−スクシンイミジル−ＰＥＧ３４００−マレイミドｍＡｂ抱合体を、合成した。
ｍＡｂ（１ｍｇ／ｍｌで）のリン酸緩衝液中での感受性ジスルフィド結合を、５ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で還元し、続いてＰＤ−１０カラム上で精製して、遊離のＴＣＥＰを除去した。還元したｍＡｂｓを、マレイミド−ＰＥＧ３４００−マレイミドと抱合させ、続いてサイズ排除Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ７５カラムを用いた。精製したｍＡｂ（Ｓ−スクシンイミジル−ＰＥＧ３４００−マレイミド）を、プレコンジュゲートへの結合の前にダイアフィルトレーション（３０ｋＤａカットオフ）により濃縮した。マレイミド−ＰＥＧ３４００−マレイミドのｍＡｂｓへの成功した抱合を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより検証した。合成したＡｂ−ＰＥＧ３４００−Ｍａｌを、同日に使用する。ナノ免疫複合体ＰＭＬＡ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／ＣＴＬＡ−４（ＰＤ１）  ｍＡｂ／ＴｆＲｍＡｂ／ＡＯＮを、以下のように合成した。リン酸緩衝液（ｐＨ６．３、１００ｍＭ）に溶解したプレコンジュゲートＰ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／ＭＥＡを、リン酸緩衝液（ｐＨ６．３）中のｍＡｂ−ＰＥＧ３４００−Ｍａｌ（通常、１ＰＭＬＡ分子あたり各々の種類のｍＡｂの１個または２個の分子）の混合物に、室温で添加し、所望の化学量論、通常、ＰＭＬＡ鎖あたり各々の種類のｍＡｂの１個または２個の分子を得た。完全なｍＡｂ抱合を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより確認した。最後に、ＡＯＮ−ＰＤＰの混合物（各々等モル比で）に、ＰＭＬＡ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／ＣＴＬＡ−４（ＰＤ１）  ｍＡｂ／ＴｆＲ  ｍＡｂ／ＭＥＡを、複合体ＡＯＮに、グルタチオンにより切断可能なジスルフィド結合を介して添加した。未反応の遊離のスルフヒドリル基を、ＰＤＰで遮断した。最終生成物ＰＭＬＡ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／ＣＴＬＡ−４（ＰＤ１）  ｍＡｂ／ＴｆＲ  ｍＡｂ／ＡＯＮを、サイズ排除Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ７５カラム上で精製した。
【０１３８】
チェックポイント阻害剤Ａｂｓ、ＡｂＦＰ、およびＡＯＮ間の相乗効果を理解するために、完全に、および部分的に負荷した種々のＮＩＣの２つのサブセットを、設計した。サブセット１のＮＩＣバージョンを、同系マウスのマウス腫瘍を処置するために用い、すべてのＮＩＣバージョンに応答することができる免疫細胞の完全なレパートリーを標的した。抗マウスＴｆＲ（ｍＴｆＲ）を、ＢＢＢ経細胞輸送（転移）ならびに腫瘍細胞および腫瘍脈管構造の両方（原発性乳房腫瘍）を標的するために使用した。サブセット２のＮＩＣバージョンを、ヌードマウスにおけるヒト異種移植腫瘍を標的するために用いた。このモデルはＴ細胞を有しないので、チェックポイント阻害剤ｍＡｂの使用は、正当化されなかった。しかしながら、このモデルは、ＩＬ−１２のＮＫ活性化および抗血管新生特性、ならびに投薬を介して、ＩＬ−２およびＩＬ−１２の抗腫瘍活性を試験するのに有用であった。抗ＴｆＲ抗体の種特異性を考慮して、抗マウスＴｆＲ（ｍＴｆＲ）および抗ヒトＴｆＲ（ｈＴｆＲ）ｍＡｂを組み合わせて、マウス（ＢＢＢおよび腫瘍脈管構造）ならびにヒト（がん細胞）ＴｆＲの両方を、標的した。マウスＣＴＬＡ−４およびＴｆＲを標的するｍＡｂは、本明細書中に記載したものであった。ヒトＴｆＲを標的するために、ｃｈｌ２８．１マウス／ヒトキメラＩｇＧ３  Ａｂが開発され、ウイルス粒子を含む様々な化合物をがん細胞中に送達するために成功に使用された。ＡＯＮをまた使用して、ＨＥＲ２／ｎｅｕ受容体について記載したように、ｍＲＮＡレベルでのそれらの合成を抑制することによって、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１を遮断した。ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性がん成長を防止するための薬物のリストを、以下のように表１および２中に提示する。
【０１３９】
表１：同系マウス処置のための例示的薬物
【表１】
2019507157.tif 000003
【０１４０】
表２：異種マウス処置のための例示的な薬物
【表２】
2019507157.tif 000004
【０１４１】
任意に、ＰＭＬＡの骨格を、インビボ画像化または蛍光顕微鏡のために、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６８０または他の色素で標識することができる。推定された平均ＭＷは、５０ｋＤａのＰＭＬＡ、２個のｍＡｂ分子、１８個のＡＯＮ分子、３４４個のＬＬＬ分子および１８個のＰＥＧ分子からなるナノドラッグについて９７３ｋＤａであった（約２０ｎｍのサイズ）。
【０１４２】
ＮＩＣの物理化学的特性評価
合成モニタリング：プレコンジュゲート（Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／ＭＥＡ）の調製を、各アミド化の完了をモニタリングするためにＴＬＣにより確認した。プレコンジュゲートの各バッチを、リポソーム漏出アッセイ（Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０７：１８１４３−１８１４８、それを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）を用いてｐＨ感受性について検証した。ｍＡｂおよびＡＯＮ抱合に利用可能なチオール残基を、Ｅｌｌｍａｎアッセイによりアッセイした。ｍＡｂおよびＡＯＮの成功した共役を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣでモニタリングした。各最終的なＮＩＣを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて、それらのサイズおよびゼータ電位に関して溶液中で特性評価した。ナノ免疫複合体の大きさは、平均で２０ｎｍであった。
【０１４３】
溶液中のナノ免疫複合体の各成分の定量分析：リンゴ酸の総量を、６ＮのＨＣｌ中のナノコンジュゲートの密封アンプル中での１１６℃での１６時間にわたる完全な加水分解の後に、リンゴ酸デヒドロゲナーゼアッセイで評価した（Ｍｏｓｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｆｆｍａｎ，１９８９，Ａｄｖ  Ｉｍｕｎｏｌ  ４６：１１−１４７、それを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）。ＰＥＧの総量を、特定のアッセイにより決定した（Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ，１６：８６０７−８６２０、それを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）。総ｍＡｂおよびＡＯＮ量を、ＢＣＡ方法よりもタンパク質について信頼性の高いＰＭＬＡ骨格の選択的切断によるＡｂおよびＡＯＮの同時の決定のための方法で分析した。ＮＩＣ合成プロセスを、ＡＯＮおよびｍＡｂの再現可能な負荷のために最適化した。
【０１４４】
ＮＩＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性
結合特異性：ｍＡｂおよびＡｂＦＰのそれらの抗原への結合を、記載されたように、可溶性ｍＴｆＲまたはｈＴｆＲ、ならびにＨＥＲ２／ｎｅｕ（ＥＣＤＨＥＲ２）の細胞外ドメインで被覆したプレートを用いたＥＬＩＳＡによって確認した（Ｈｅｌｇｕｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ，２４：３０４−３１６；Ｄｅｌ  Ｐｒｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５０：３５３−３６０、その両方を、完全に述べられているかのように参照により組み入れる）。組換えマウスＣＴＬＡ−４−Ｆｃ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはＰＤ−１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１の結合活性を測定した。結合をまた、抗原を発現する細胞を用いるフローサイトメトリーまたは細胞ベースのＥＬＩＳＡによって確認した。
【０１４５】
ｍＡｂの生物活性アッセイ：ヒトＩＬ−２の生物活性を、マウスＣＴＬＬ−２細胞株およびマウスＩＬ−１２のものを用いる増殖アッセイにおいて、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いて、報告されているように決定した（Ｈｅｌｇｕｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ，２４：３０４−３１６；Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，３２２−３３９、これらの両方を、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）。この後者は、ヒトＩＬ−１２がマウスＴ細胞において活性ではないが、マウスＩＬ−１２がヒトＴ細胞において活性であるために可能であった。マウスＮＫ細胞株ＫＹ１を用いて、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌を誘発するＩＬ−１２の能力を試験し、基質としてのリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性化ヒトＰＢＭＣ、およびＬＡＫ細胞についての好ましい標的としてのヒトＫ５６２またはＤａｕｄｉ細胞を誘発するＩＬ−１２の能力。遊離の（非抱合）ＡｂＦＰを、対照として用いた。マウスＴ細胞に対する抗マウス抗ＣＴＬＡ−４  Ａｂの効果を、ウエスタンブロット上でのリン酸化ＳＴＡＴ５およびＥＲＫ１／２の低下した発現によって確認した。
【０１４６】
がん細胞における標的タンパク質阻害および細胞傷害性：ＨＥＲ２／ｎｅｕＢＴ−４７４（ヒト）およびＤ２Ｆ２／Ｅ２（マウス）を発現する細胞株を、ＡＯＮ−ＨＥＲ２／ｎｅｕ（ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ阻害）についての、およびＡＯＮ−ＣＫ２、ＡＯＮ−ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ（ヒトまたはマウスＣＫ２阻害）についての標的細胞として用いた。
【０１４７】
図８は、ヒト乳がんＢＴ−４７４、マウス乳がんＤ２Ｆ２および正常ヒト乳房組織におけるＣＫ２αおよびβ−チューブリンについてのウエスタンブロットを例示する。強いＣＫ２α発現が、ヒト乳がんＢＴ−４７４、マウス乳がんＤ２Ｆ２において観察され、低い発現が、正常なヒト乳房組織において観察された。
【０１４８】
図８を参照して、ＡＯＮ−ＣＫ２は、ヒトおよびマウスＣＫ２の両方のコンセンサス配列５’−ＣＧＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＴＧＡＴＧ  ＴＴＴ−３’［配列番号：３］を標的し、Ｄ２Ｆ２細胞（ＨＥＲ２／ｎｅｕの低い発現によりＤ２Ｆ２／Ｅ２と異なるに過ぎない）がヒト乳がん細胞、例えばＢＴ−４７４と同様にＣＫ２を高いレベルで発現することが、見出された。ＡＯＮ−ＨＥＲ２／ｎｅｕまたはＡＯＮ−ＣＫ２を負荷したＮＩＣの種々のバージョンの、上に述べた標的細胞において増殖を阻害し、アポトーシスを誘発する能力を、試験した（Ａｐｏｐｎｅｘｉｎキット、ＥＭＤ  Ｍｉｌｈｐｏｒｅ）。ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＣＫ２細胞傷害性の細胞生存役割を考慮して、すべての細胞株において観察され、可能な例外は、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕが以前の悪性細胞（Ｄ２Ｆ２）において人工的に発現されたＤ２Ｆ２／Ｅ２である。
【０１４９】
統計：すべての研究において、試料を、（特定の試験に依存して）三通りに、または四通りに試験し、実験を３回繰り返す。統計的解析を、Ｐｒｉｓｍ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いてスチューデントｔ−検定またはＡＮＯＶＡにより実施する。ｐ＜０．０５を、有意とみなす。
【０１５０】
実施例４−同系腫瘍を保有する免疫応答性マウスにおける、およびヒト腫瘍異種移植片を保有するヌードマウスにおけるナノ免疫複合体の有効性の決定
同系腫瘍を保有する免疫適格性マウス：このモデルは、すべての提案されている免疫刺激物質に応答することができる免疫細胞の完全なレパートリーを提供する。トラスツズマブ可変領域を有するＡｂＦＰの種特異性を考慮して、それらは、マウスＨＥＲ２／ｎｅｕと交差反応しない。この限界を克服するために、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ（Ｄ２Ｆ２／Ｅ２）を発現するＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７同系マウス乳がん細胞株Ｄ２Ｆ２を、用いた。Ｄ２Ｆ２／Ｅ２は、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ（マウス対応物に高度に相同）、ワクチン接種および受動的Ａｂ免疫療法を含む様々な免疫療法を研究するために用いられているモデルの発現にもかかわらず免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて成長する。実際、ＡＯＮを有するＮＩＣは、Ｄ２Ｆ２／Ｅ２を有するマウスに保護を付与し、抗マウスＣＴＬＡ−４および抗マウスＴｆＲ  Ａｂを負荷したＮＩＣもまた、親細胞株Ｄ２Ｆ２に対する保護を付与する。
【０１５１】
ヒト腫瘍異種移植片を保有するヌードマウス：ヌード（胸腺欠損）マウスは機能性Ｔ細胞を有せず、したがって適応免疫応答を欠いているが、このモデルによって、ＡＯＮ−ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＡＯＮ−ＣＫ２送達に応答するＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するヒトがん細胞の使用が可能になる。
【０１５２】
異種マウスモデルを用いて、脳転移がＣＫ２またはＨＥＲ−２阻害剤を送達するナノ薬物を用いて遮断されることが、観察された。
【０１５３】
図９は、異種動物モデルにおけるＢＢＢを横断し、ＣＫ２αを遮断するナノコンジュゲートによるヒト脳神経膠腫ＬＮ２２９成長阻害を例示する。カプラン・マイヤー曲線は、ＡＯＮとのＣＫ２αに対するナノコンジュゲート対ＰＢＳでの処置の際の有意に増加した（ｐ＜０．００９、ログランク検定）動物生存を示す。腫瘍ターゲティングを、セツキシマブ（Ｃｅｔｕ）、ＥＧＦＲ抗体によって達成した。生存期間中央値は、ＰＢＳ群において７０日対３７日であった。図９を参照して、マウスの寿命はＣＫ２を遮断した場合に有意に延長されることが観察され、がんに対するこの処置についての驚くべき機構を示す。
【０１５４】
臨床的に重要な問題の１つは、腫瘍幹細胞である。それらは、腫瘍成長に寄与するのみならず、また分化したがん細胞よりも療法に対して耐性であり、それらの生存は、腫瘍再発の重要な因子である。この理由のため、成功したがん療法を、がん幹細胞の効率的な除去の方向に向けることができる。
【０１５５】
図１０は、Ｐ／トラスツズマブ／ＭｓＴｆＲ−ｍＡｂ／ＨＥＲ２−ＡＯＮおよびＰＢＳで処置したＢＴ−４７４  ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性ｉ．ｃ．腫瘍（脳転移モデル）におけるがん幹細胞マーカーＣＤ１３３およびｃ−Ｍｙｃの発現を例示する写真のセットである。
ＣＤ１３３およびｃ−Ｍｙｃの高い発現は、ＰＢＳで処置した腫瘍において観察され、その有意な減少は、ＣＫ２αを阻害するナノドラッグでの処置の際に観察された。核を、ＤＡＰＩで対比染色した。組織切片の免疫蛍光染色を、実施した。処置した異種ＬＮ２２９脳腫瘍の免疫組織化学的研究を、数種のがん幹細胞マーカー、ＣＤ１３３、ｃ−Ｍｙｃ、およびネスチンを用いて行った。すべての３種のマーカーは、ＰＢＳで処置した腫瘍において良好に発現された。ＣＫ２αに対するＡＯＮを保有するナノドラッグでの処置によってすべてのマーカーの発現における劇的な減少が生じることが、観察された。
【０１５６】
チェックポイント阻害剤ｍＡｂは、ヌードマウスにおいて活性でないが、当該モデルは、ＩＬ−１２のナチュラルキラー（ＮＫ）活性化ならびに抗血管新生特性を介してＩＬ−２およびＩＬ−１２の抗腫瘍活性を試験するのに有用である。ヌードマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片は、ヒト腫瘍に対するＡｂ効能に取り組むためにＦＤＡにより推奨されている。標的細胞として、ＡＴＣＣから得たヒト乳がん細胞株：ＢＴ−４７４（高いレベルのＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（低ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＨＥＲ２／ｎｅｕなし、陰性対照、ＥＧＦＲについて陽性）を、使用することができる。ＨＥＲ２／ｎｅｕ陰性細胞株を含めることは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陰性腫瘍におけるがん幹細胞上のＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現の知見を考えると特に魅力的である。
【０１５７】
皮下腫瘍：免疫適格性マウスにおいて、およびヌードマウスにおいて広く使用されているＤ２Ｆ２／Ｅ２またはＢＴ−４７４を用いるこのモデルの利点は、キャリパー測定による、および画像化による腫瘍潜伏期間および成長の容易なモニタリングである。このモデルはまた、乳がんのｓ．ｃ．転移を模擬する。乳房脂肪体における細胞の同所性移植の際に発見された腫瘍もまた、研究した。
【０１５８】
脳中の腫瘍：脳は、ＢＢＢによる多くの全身性免疫細胞の限られたアクセスを有する免疫特権部位であるが、免疫応答は、尚起こり得る。末梢リンパ節に移動し、Ｔ細胞を刺激し、次に脳に戻って移動することができる脳常在性ＡＰＣ。小グリア細胞は、脳常在性免疫調節細胞であり、刺激の際にＩＬ−２受容体を発現するＡＰＣとして作用し、したがってＴ細胞と一緒にＡｂＦＰ刺激に対して潜在的に応答することができる。ＩＬ−２、ＩＬ−１２、およびＡＯＮは、ヌードマウスにおいて抗腫瘍活性を有するように設計された。したがって、転移モデルとしての脳腫瘍は、両方の動物モデルについて関連性があった。腫瘍細胞を、頭蓋内に接種した。脳転移（ＢＭ）処置についての数種のマウスモデルがある：１．トランスジェニック突然変異マウスを含む環境的に誘発され、遺伝子操作されたもの。２．大きな、および小さな（ミクロ）転移の両方を生じる心臓内／頸動脈内腫瘍細胞注入。３．最も一般的な頭蓋内がん細胞接種。造影剤および処理剤のＢＭ処理およびＢＢＢ送達のために、がん細胞接種後２〜３週間において１００％転移形成を有するＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性乳がんのための信頼できるＢＭモデルを、開発した。他のモデルはＢＭ形成の低い発生率（３〜１５％）を有するため、これを達成するモデルは、頭蓋内注射によるものであった。
【０１５９】
すべての研究において、それらの異なる生理学およびエフェクターおよび標的細胞集団が薬物動態学、毒性および治療効果に影響を及ぼすであろうことから、両方の動物モデルを使用した。両方のモデルは、互いに相補的である。腫瘍に関しては、すべての研究においてｓ．ｃ．および頭蓋内腫瘍の両方を、用いた。
【０１６０】
方法
ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７マウスについては、完全に負荷したＮＩＣ［抗ＣＴＬＡ−４（ＰＤ１）  ｍＡｂ、ＡＯＮ−ＨＥＲ２／ｎｅｕまたはＡＯＮ−ＣＫ２、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  Ａｂ−（ＩＬ−２）または−（ＩＬ−１２）および抗ＴｆＲ  ｍＡｂ］ならびに部分的に負荷したＮＩＣ［抗ＣＴＬＡ−４（ＰＤ−１）  ｍＡｂ、ＡＯＮ−ＨＥＲ２／ｎｅｕまたはＡＯＮ−ＣＫ２、および抗ＴｆＲ  Ａｂ］を、用いた。いくつかの実験において、遊離の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  Ａｂ−（ＩＬ−２）または−（ＩＬ−１２）を、同時投与した。ヌードマウスについて、［ＡＯＮ−ＨＥＲ２／ｎｅｕまたはＡＯＮ−ＣＫ２、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  Ａｂ−（ＩＬ−２）またはＡｂ−（ＩＬ−１２）および抗ＴｆＲ  ｍＡｂ］単独またはＡＯＮおよび抗ＴｆＲ  ｍＡｂの両方を有するＮＩＣを、遊離の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  Ａｂ−（ＩＬ−２）またはＡｂ−（ＩＬ−１２）との可能な同時投与と共に用いた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで使用するべき実験的なＮＩＣおよび対象の構築における詳細は、本明細書中に述べた通りである（ＡＯＮ、ｍＡｂ、およびＡｂＦＰの結合；ＮＩＣサブセット１および２を参照）。
【０１６１】
薬物動態、腫瘍標的、および毒性に関する研究を、新たなＮＩＣバージョンでのみ実施した。なぜなら、この情報は、以前のバージョンについて、および遊離のＡｂＦＰについて入手可能であったからである。遊離ＡｂＦＰの使用は、ｓ．ｃ．および脳腫瘍に関連性があった。ＢＢＢは脳腫瘍のＡｂ療法についての障害であるが、脳腫瘍はＢＢＢ密着結合においていくつかの変化を示し、増加した透過性をもたらす。したがって、遊離のＡｂＦＰを使用して、また脳転移性乳がんを標的し、抗腫瘍免疫応答を引き起こし、同時投与したＮＩＣの効果を増強した。重要なことに、活性化Ｔ細胞はＢＢＢを横断することができるので、チェックポイント阻害剤ｍＡｂの全身投与によって末梢において活性化されたＴ細胞はまた、頭蓋内腫瘍を標的することができる。
【０１６２】
新たなＮＩＣの作用の機構を試験するために、下流シグナリング経路および細胞死の免疫組織化学的およびウエスタン分析を、行った。焦点は、生存促進性シグナリング（ＡＯＮ作用についてはリン酸化Ａｋｔ対総Ａｋｔ）、活性化ＳＴＡＴ５およびＥＲＫ（チェックポイント阻害効果について）、ならびに腫瘍細胞死（Ａｐｏｐｎｅｘｉｎキット染色、および／または切断ＰＡＲＰウエスタンブロットアッセイ）に関してであった。幹細胞マーカー染色を、図１０に示すように実施した。処置の結果、それぞれのシグナリングの阻害および幹細胞を含む腫瘍細胞の増大した死がもたらされることが、観察された。
【０１６３】
抗腫瘍効能および薬物作用の機構を、両方の動物モデルにおいて８匹のマウス／群を用いることによって研究した。
【０１６４】
同系腫瘍を保有する免疫応答性マウス：マウスに、０．１５ｍｌのハンクス液中の５×１０５のＤ２Ｆ２／Ｅ２ｓ．ｃ．または他の乳がん細胞株（ＴＮＢＣ）を、右側腹部において接種した（０日目）。１、２および３日目（微小転移性ｓ．ｃ．条件を模擬するため）または６、７および８日目（十分に確立された腫瘍を模擬するため）のいずれかに、マウスを、ＮＩＣもしくは対照単独のｉ．ｖ．注射で処置したか、または遊離のＡｂＦＰと同時投与した。しかしながら、他の用量および／またはスケジュールを、考慮してもよい。腫瘍成長（ｓ．ｃ．）を、キャリパーで二次元においてモニタリングし、容積を、次式に従って計算した：腫瘍体積＝（長さ×幅２）／２。生存期間を、腫瘍攻撃から、マウスを安楽死させたときに腫瘍直径が１．５ｃｍに達するまでの期間とみなした。並行研究を、同一の条件下であるが１０４の腫瘍細胞を頭蓋内に注射して実施して、脳転移を模擬した。
【０１６５】
腫瘍浸潤細胞、例えばＮＫ、ＣＤ４  ＴおよびＣＤ８  Ｔ細胞のための腫瘍切片を、さらに染色した。腫瘍試料をまた、標的タンパク質ＡＯＮ阻害（ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＣＫ２）について、ウエスタンブロットにより試験した。さらに、脾臓細胞を単離し、ＥＬＩＳＰＯＴにおいて、およびＡｇ特異的ＣＴＬについて、Ｄ２Ｆ２／Ｅ２およびＤ２Ｆ２腫瘍に対するカルセインＡＭ放出アッセイを用いて試験した。血液試料を、マウス抗ＨＥＲ２／ｎｅｕアイソタイプ（ＩｇＧｌ／ＩｇＧ２ａ）プロファイリングについてＥＬＩＳＡにより、ならびにマウスサイトカインプロファイリングについてＬｕｍｉｎｅｘ技術を用いて分析して、ＴＨ１およびＴＨ２免疫応答の存在を決定した（予備データ中に記載）。ＣＴＬＡ−４／ＰＤ１を抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ１抗体なしで、しかしＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１  ＡＯＮモルホリノアンチセンスで阻害するアプローチを、同系マウスモデルにおいて用いた。各チェックポイント阻害剤についての２つのＡＯＮセットが、ＧｅｎｅＴｏｏｌｓによって作成された。
ＣＴＬＡ−４、５’から３’：
１．ＧＴＣＣＴＣＡＧＧＧＡＧＣＡＧＡＧＴＡＡＡＡＣＣＣ［配列番号４］；および２．ＴＣＣＡＧＡＡＧＣＣＴＴＧＡＧＡＴＧＴＧＴＴＴＧＡ［配列番号５］。
ＰＤ−１、５’から３’：
１．ＴＡＣＣＴＧＣＣＧＧＡＣＣＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＧＡ［配列番号６］；および２．ＣＣＴＧＧＣＡＧＴＧＴＣＧＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＣＡ［配列番号７］。
【０１６６】
ヒト腫瘍異種移植片を保有するヌードマウス：ＣＫ２およびＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡＯＮの効果を研究するために、ＢＴ−４７４を選択した。マウスは免疫抑制されていたため、適応免疫の誘発は、研究することが実行可能ではなかった。しかしながら、腫瘍における組織学的および免疫組織化学的研究を実施して、アポトーシス／壊死腫瘍細胞をモニタリングし、腫瘍浸潤細胞、例えばＮＫ．ＡＯＮ  ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＣＫ２阻害を、腫瘍においてウエスタンブロットにより評価する。原発性および転移性乳がんについて知られている幹細胞を、処置後に、図１１に示すように、ＣＫ２  ΑＯＮを有する原発性脳がんについて示したように、処置効果の模範として評価した。ＰＤ−１発現レベルは、乳がんの間葉性特徴と関連していた。間葉細胞は、ＣＤ４４高／ＣＤ２４低、ビメンチン＋およびＥ−カドヘリン−表現型を有し、一方上皮細胞は通常、ＣＤ２４高、ビメンチン−、およびＥ−カドヘリン＋表現型を有する。ＮＩＣ作用の機構を理解するために、幹細胞マーカー、ＣＤ４４、ＣＤ２４、ＣＤ１３３、Ｃ−ｍｙｃ、ｎｏｔｃｈ１および３、ならびにネスチンの発現を、腫瘍切片上での免疫組織化学および新鮮な腫瘍細胞を用いたＦＡＣＳ分析により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏで、ＨＥＲ２／ｎｅｕおよびＣＫ２についてのチェックポイント阻害剤および細胞傷害性阻害剤での処置の後に決定した。
【０１６７】
統計：血液試験および腫瘍体積の差異の有意性を、３つ以上の群について両側スチューデントｔ−検定またはＡＮＯＶＡを用いて決定し、生存率におけるもの（カプラン・マイヤープロット）を、ノンパラメトリックログランク検定により分析した。
【０１６８】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの蛍光画像化分析の代替法は、ＰＥＴ走査、マウスにおける腫瘍細胞を標的する１２４Ｉで標識したＡｂの体内分布を研究するために用いる高度に感受性の、かつ定量的なアプローチである。小動物のためのＭＲＩおよびマイクロＰＥＴ／ＣＴスキャナー設備を、使用することができる。
【０１６９】
Ｄ２Ｆ２／Ｅ２に加えて、ヒトＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＣＴ２６（ＣＴ２６−ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＢＡＬＢ／ｃと同系のカルシノーマを発現するマウス細胞株を用いることが、可能であった。このモデルを用いて、トラスツズマブを含め、Ａｂ単独またはサイトカインおよびＡｂＦＰ標的ＨＥＲ２／ｎｅｕとの併用の効能を試験した。同様に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと同系のマウスカルシノーマ細胞ＭＣ３８−ＨＥＲ２／ｎｅｕを、用いた。
【０１７０】
ＩＬ−２を保有するＡｂＦＰ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２を有する抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡｂＦＰを、ナノ医療において用いた。他の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＡｂＦＰ、例えばＩｇＧ３−（ＧＭ−ＣＳＦ）ならびに二官能性ＡｂＦＰ（ＩＬ−１２）−ＩｇＧ３−（ＩＬ−２）および（ＩＬ−１２）−ＩｇＧ３−（ＧＭ−ＣＳＦ）もまた、処置のために用いた。ＡｂＦＰを、ｓｃＦｖ  Ｃ６ＭＨ３−Ｂ１に基づいて作製した。ｓｃＦｖ  Ｃ６ＭＨ３−Ｂ１可変領域を有する抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＩｇＥ  Ａｂが、開発されている。強い免疫賦活活性を有するこのＩｇＥ  Ａｂを、添加した。
【０１７１】
ＮＩＣの薬物動態学的および毒性試験
方法
薬物動態学および腫瘍ターゲティングを、両方の動物モデルにおいて８匹のマウス／群を用いて研究した。
【０１７２】
血漿中薬物濃度、半減期測定：各々のＮＩＣ変異体についての腫瘍を保有しないマウスの群に、１２５Ｉで標識したナノ免疫薬物をｉ．ｖ．注射し、指定した時間に血液試料を採取して、１２５Ｉで標識したＮＩＣを検出するシンチレーション計数を用いて関連する放射能を測定した。半減期を、クリアランス（ＣＬ）および分布の容積（Ｖｄ）によって決定し、当該関係を、以下の式によって記載する：ｔ１／２＝ｌｏｇｅ０．５Ｖｄ／ＣＬ。薬物クリアランス／半減期ならびに組織および体液中の分布を評価するための臨床的な生化学試験を、標準的手順に従って実施した。ｉｎ  ｖｉｖｏでの蛍光画像化分析：ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０抱合薬物分布および腫瘍ターゲティングを、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  ２００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて研究した。
【０１７３】
毒性試験を、両方の動物モデルにおいて８匹のマウス／群を用いて行った。マウスに、１６０μｌにおいて、ＮＩＣを尾静脈中にｉ．ｖ．注射した。負荷したＡｂに相当する２〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内の用量を、試験した。５〜２５ｍｇ／ｋｇ体重の用量範囲内のＮＩＣを、試験した。これらの用量は、臨床においてほとんどのＡｂおよびそれらの誘導体について一般的に使用する範囲を網羅する。目標は、無毒性であっても強力かつ有効なＮＣＩ処置用量を見出すことであり、それを、両方のマウスモデルにおける腫瘍有効性試験において用いることができる。動物を、以下のもの：活動性（過剰または低）；ゆっくりとした運動；興味の喪失；栄養；神経学的スコア：（階級１：尾部脱力または尾部麻痺；階級２：後肢／肢不全麻痺または不全片麻痺；階級３：後肢／肢片麻痺（ｈｅｍｉｐａｒａｌｙｓｉｓ）；階級４：完全な麻痺（四肢麻痺）、瀕死ステージまたは死）を含む毒性効果の臨床症状について定期的にチェックした。血液生化学的分析を、以下のように常習的に行った：トランスアミナーゼ（ＡＳＴ、ＡＬＴ）−肝機能；ビリルビン（直接的、間接的）；クレアチニン；血中尿素窒素；血液：白血球；赤血球；血小板；ヘモグロビン；および炎症：Ｃ反応性ペプチド。実験の終了時に、動物を安楽死させ、器官を巨視的および顕微鏡試験に供した。
【０１７４】
処置データを、５ｍｇ／ｋｇのＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１Ａｂ濃度で展開させ、それによって、３、５および１０ｍｇ／ｋｇの増量する投与量を使用することが可能になる。しかしながら、１ｍｇ／ｋｇでの抗ＰＤ−１および３ｍｇ／ｋｇでのＣＴＬＡ−４の濃度をまた、比較的高い毒性のために用いた。ＮＩＣの一部としてのＴｒｅｇ  ｍＡｂの低下した濃度をまた、すべての適切な評価を伴って調査した。より低い濃度によって、抗腫瘍効果を損なわずに臨床使用から知られる毒性を減少させることが可能になった。
【０１７５】
実施例５−脳腫瘍についての処置設計
実施例１に記載した乳がんを処置するためのこれらの標的に対する抗体の使用を含む、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１を遮断するための方略はまた、脳がんを処置するために適用可能である。
さらに、これらの抗体の併用での神経膠腫の処置は、他の抗体と同様にそれらがＢＢＢを横断しないため成功しなかった。この処理により、全身性免疫応答のみが活性化された。
本開示は、部分的に、内皮系およびＢＢＢを通過し、薬物および免疫刺激抗体を腫瘍およびその微小環境中の免疫細胞に直接送達し、それによって一般的な免疫応答を脳腫瘍局所免疫応答と一緒に活性化することができるナノ免疫治療薬を提供する。
【０１７６】
脳がん処置のための効率的なアプローチは、（１）抗腫瘍免疫応答の二通りの（全身的および局所的）刺激、ならびに（２）共通のＧＢＭ標的ＣＫ２およびＥＧＦＲの合成を遮断することによる腫瘍細胞増殖の阻害のために、ナノ免疫複合体を用いて開発された。局所的な免疫刺激は、脳免疫特権および、それらがＢＢＢを通過することができないため脳がんに対するＣＴＬ活性化ｍＡｂの効力の欠如のために、ＧＢＭにとって重要である（Ｍｕｌｄｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ，３３：１３−２１およびＯｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，１２：  １０７、これらの両方を、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）。この方略は、ＢＢＢ横断ナノ免疫複合体が抗腫瘍応答を、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ１に対するｍＡｂを用いるＴｒｅｇによってＣＴＬに対して課せられる機能的制約を解消することによって増強することを利用する。標的したがん処置は、複数種の治療剤を１種のナノ免疫複合体において併用する。主な利点は、以下のとおりである。がん処置は、免疫特権脳腫瘍における局所的な、および全身の抗がん免疫を増強するナノ免疫複合体の能力によって達成された。ＢＢＢ横断ナノ免疫複合体を、腫瘍を標的するためのポリマー直線状プラットフォームによって操作する。ナノ免疫複合体は、局所的な、および全身の抗腫瘍応答を増強するためのＣＴＬＡ−４またはＰＤ１に対するＣＴＬ活性化ｍＡｂｓを、ＣＫ２を阻害することによってＧＢＭ増殖を遮断する薬物、ならびに野生型ＥＧＦＲおよび変異型ＥＧＦＲｖＩＩＩの両方、神経膠腫の２種の主要ながんマーカーと一緒に保有する。その結果、脳腫瘍を直接的に、および免疫細胞傷害性応答を介して根絶することが可能である。局所的なＣＴＬ抗腫瘍応答を刺激する活性サイトカイン（例えばＩＬ−２）ならびに１種のナノ免疫複合体上で全身的な、および局所的な抗腫瘍免疫性を刺激するｍＡｂを組み合わせることは、ＧＢＭ療法のために有利である。
【０１７７】
図１１は、ＰＭＬＡ骨格、ＬＬＬ、ＴｆＲ  ｍＡｂ、ａ−ＣＴＬＡ−４（ＰＤ１）、ＡＯＮ−ＣＫ２、およびＡＯＮ−ＥＧＦＲを含むナノ免疫複合体の脳腫瘍に対する効果（抗腫瘍免疫応答が活性化される場合の併用療法の作用の機構、それと共に腫瘍特異的分子マーカー、ＥＧＦＲおよびＣＫ２の阻害）を例示する概略図である。図１１を参照して、ステップ（１）において、ナノ免疫複合体は、腫瘍細胞および内皮に富むマウストランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に結合し、ＢＢＢを介して腫瘍間質に経細胞輸送される。ステップ（２）において、ナノ免疫複合体は、マウスＧＢＭ上のＴｆＲに結合し、内在化する。それはエンドソームに進行し、その膜を破壊し、薬物が細胞質中で放出され、ＡＯＮが細胞質グルタチオンによって切断される。ステップ（３）において、遊離のＡＯＮは、標的（ＥＧＦＲおよび／またはＣＫ２）翻訳を阻害し、がん細胞死を引き起こす。ステップ（４）において、がん細胞に進入することができないナノ免疫複合体は、ＴｒｅｇにＣＴＬＡ−４（ＰＤ１）抗体を介して結合し、不活性化され、ＣＴＬに対するそれらの遮断を除去し、それによって、ＣＴＬががん細胞を攻撃し、死滅させることが可能になる。
【０１７８】
ナノ免疫複合体は、能動的ターゲティングによってＢＢＢを通過し、同時の特異的な脳がん細胞死滅（内部攻撃）および抗腫瘍免疫応答の刺激（外部攻撃）を提供し、それによって抗腫瘍効能が有意に増加することが観察された。
【０１７９】
実施例６−脳がんの処置のためのナノ免疫複合体の合成およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性評価
頭蓋内脳腫瘍保有マウスを、脳腫瘍処置のためのＰＭＬＡベースのナノ免疫複合体の効率を試験するためのモデルとして使用した。図１２Ａ〜１２Ｂは、同系マウスモデルのために設計されたＰＭＬＡベースのナノ免疫複合体の概略図である。図１２Ａは、ＰＭＬＡ骨格、ＬＬＬ、ｍＰＥＧ、ＣＴＬＡ−４（ＰＤ−１）ｍＡＢ、ｍｓＴｆＲ  ｍＡｂ、ＡＯＮ−ＥＧＦＲ、ＡＯＮ−ＣＫ２、ならびに任意にＥＧＦＲおよびＣＫ２をＡＯＮで遮断することによる腫瘍細胞成長の抑制のために設計されたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０色素を含むナノ免疫複合体を例示する。腫瘍ターゲティングを、抗ｍｓＴｆＲ  ｍＡｂによって達成した。Ｔｒｅｇターゲティングを、抗ＣＴＬＡ４またはＰＤ−１  ｍＡｂによって達成した。任意の蛍光色素によって、生の画像化を含む細胞および組織における抱合体検出が可能になった。図１２Ｂは、ＰＭＬＡ骨格、ＬＬＬ、ｍＰＥＧ、ＣＴＬＡ−４（ＰＤ−１）ｍＡＢ、付加的な免疫刺激のための付着した活性サイトカイン（ＩＬ−２）を有するｍｓＴｆＲ  ｍＡｂ、および任意にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０色素を含有する免疫刺激性ナノ免疫複合体を例示する。異種マウスモデルについて、抗リンパ球ｍＡｂを、抗ヒトＴｆＲによって置換して、腫瘍細胞を標的した。
【０１８０】
ＡＯＮを有するポリセフィンのラミニン−４１１への製剤化によって腫瘍血管新生が阻害されることが、観察された。高頻度のＧＢＭマーカーＥＧＦＲおよびＣＫ２を標的するＰＭＬＡベースの薬物送達系を、ナノ免疫複合体において利用した。これらの化合物は、脳腫瘍細胞に対して二重の攻撃を与え、すなわちＡＯＮによるそれらの成長を遮断し、抗腫瘍免疫応答を増強する。別の進歩は、ＡＯＮをナノプラットフォーム上の活性抗腫瘍サイトカイン（例えばＩＬ−２）と組み合わせて抗腫瘍効果を増大させることであった。ポリリンゴ酸ベースの薬物送達系は、それが（１）ＢＢＢを横断することができ、（２）ＡＯＮおよびｍＡｂを含む追加的な薬物部分を付着させるように修飾可能であり得、ならびに（３）脳腫瘍を特異的に標的することができるため、足場として有利である。ＰＭＬＡベースのナノ免疫複合体は、ＡＯＮを種々の腫瘍標的（ＣＫ２およびＥＧＦＲ）ならびに機能的抗体に同時に運搬し、それによって腫瘍抑制の効力を増加させることができた。同時に神経膠腫に対するＣＴＬ応答を増加させ、ＥＧＦＲおよびＣＫ２を標的することによって腫瘍細胞を死滅させることにより、あるとしても低い全身毒性を有する脳腫瘍に対する驚くほど有効なナノ療法を開発することが、可能であった。ナノ免疫共役変異体を合成し、徹底的な物理化学的特性評価および合成最適化を提供した。変異体を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞において試験した。
【０１８１】
ナノ免疫複合体を、純度（エンドトキシンまたは汚染する他の物質を含まない）について、およびＨＰＬＣ、分光光度法、ＥＬＩＳＡ、ならびに新たな詳細な定量的化学的および画像分析（Ｌｊｕｂｉｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ，４５：４５８３−４５９１、それを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）により特性評価した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞生存率を試験して、毒性ナノ複合体を選択した。標的タンパク質（ＣＫ２、ＥＧＦＲ）の阻害のｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定、ならびに抗ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１抗体ならびにサイトカインの機能的アッセイを、ウエスタンブロット分析、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、およびアポトーシスアッセイによって行った。
【０１８２】
ＧＢＭ細胞は、ＣＫ２およびＥＧＦＲを発現し、それは、ナノドラッグによってダウンレギュレートされた。図１３Ａ〜１３Ｂは、ＧＢＭにおけるＥＧＦＲおよびＣＫ２α発現、ならびにナノドラッグ結合ＡＯＮによるそれらの阻害を示すウエスタンブロットの写真である。図１３Ａは、ＥＧＦＲおよびＣＫ２αの両方が３つの細胞株Ｕ８７ＭＧ、ＬＮ２２９、およびＧＬ２６において発現されたことを例示する。図１３Ｂは、ＰＢＳと比較して、ＥＧＦＲおよびＣＫ２αの発現が細胞取り込みのために抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂセツキシマブ（Ｃｅｔｕ）を用いるＰ／Ｃｅｔｕ／ＥＧＦＲ−ＡＯＮ（左パネル）およびＰ／Ｃｅｔｕ／ＣＫ２α−ＡＯＮ（右パネル）での細胞処理の際に顕著に減少したことを例示する。ＧＡＰＤＨをハウスキーパーとして用いて、ウエスタンブロットのためのゲル負荷を正常化した。図１３Ａを参照して、両方のタンパク質がヒト（Ｕ８７ＭＧおよびＬＮ２２９）ならびにマウス（ＧＬ２６）のＧＢＭにおいて発現されることが、観察された。図１３Ｂを参照して、抗ＥＧＦＲセツキシマブｍＡｂ標的がん細胞を有するＰＭＬＡベースのナノ薬物が、配列番号：２および８の配列を有するそれぞれのＡＯＮで、ＣＫ２およびＥＧＦＲ発現の両方を効果的に阻害することが、観察された。
【０１８３】
実験的設計  ナノ免疫複合体を、本明細書に記載したように合成した。ヒトおよびマウスと交差反応するあらかじめ選択したＡＯＮのｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能を、ヒトＵ８７ＭＧ、ＬＮ２２９、およびマウスＧＬ２６／Ｇｌ２６１  ＧＢＭ培養物において試験し、正常なＨＡＳＴ４０星状膠細胞と比較した。ＣＫ２およびＥＧＦＲ阻害を、ウエスタン分析により確認した。ＥＬＩＳＡ、結合／ＦＡＣＳおよび増殖アッセイにより、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１に対する機能遮断ｍＡｂ、ならびにＩＬ２および／またはＩＬ−１２の活性を、記載されているように試験した（Ｐｅｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０６：１７１７−１７２５、それを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）。処置後の細胞死を、Ａｐｏｐｎｅｘｉｎアッセイ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により評価した。化学的および機能的複雑性を、特異的な定量的アッセイによって試験した（Ｌｊｕｂｉｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ，８８およびＤｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１５，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ，１６：８６０７−８６２０、それらの両方を、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）。データを、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓコアにおいて統計的に分析した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を、関連する特異性対照と共に常習的に３通りで行った。
【０１８４】
プレ複合体（ｐｒｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の調製  ナノ免疫複合体が複数種の成分を含むので、合成の成功および再現性を、モニタリングした。各成分の制御された結合を伴う逐次的合成手順を開発し、各ステップのＳＥＣ−ＨＰＬＣによる検証を行った（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ，１７：３１７−３２６、およびＦｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ，２００７，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１２２：３５６−３６３、その両方を、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）。薬剤合成のためのＰＭＬＡを、粘菌真正粘菌から製造し、精製した。精製したＰＭＬＡを、ナノ免疫複合体の合成前に特性評価した。ｍ．ｗ．（重量平均分子量）＝１００ＫＤａ（多分散度Ｐ＝１．１）のＰＭＬＡを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５微粒子上での分別により調製した。
【０１８５】
図１４は、ＰＭＬＡ骨格、４０％ＬＬＬ、２％ｍＰＥＧ、０．２％ＴｆＲ  Ａｂ、０．２％ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１  Ａｂ、１％ＡＯＮ−ＥＧＦＲ、および１％ＡＯＮ−ＣＫ２αを含有する例示的なナノ免疫複合体の合成を例示する。最初に、プレ複合体を、４０％ＬＬＬ、２％ｍＰＥＧおよび１０％ＭＥＡで合成した（上部構造）。それを、（ａ）Ｍａｌ−ＰＥＧ３４００−抗ＴｆＲ  ｍＡｂおよびＭａｌ−ＰＥＧ３４００−抗ＣＴＬＡ−４または抗ＰＤ−１  ｍＡｂの混合物、（ｂ）ＰＤＰ−ＡＯＮ−ＣＫ２、ＰＤＰ−ＡＯＮ−ＥＧＦＲの混合物、および（ｃ）ＰＤＰと順次抱合させて、残存する遊離チオール基を遮断して、最終生成物（下部構造）を得た。図１４の上部構造を参照して、まずプレ複合体（Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／ＭＥＡ）を、ワンポット反応において合成した。ＰＭＬＡを、ＤＣＣの存在下で２時間、ＮＨＳで完全に活性化した。ｍＰＥＧ５０００−ＮＨ２、Ｈ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＯＨ、およびＭＥＡ（２−メルカプト−１−エチルアミン）を含む官能基を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ；ニンヒドリン試験）によって確認されたそれぞれの事前のアミド化の完了後に連続的に添加した。未反応のポリマー結合ＮＨＳ基を、水で分解した。プレ複合体をＰＤ−１０カラム上で精製して、小分子を除去し、凍結乾燥し、−２０℃で保存した。
【０１８６】
ナノ免疫複合体（Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／抗ｍｓＴｆＲ  ｍＡｂ／抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂまたは抗ＰＤ−１  ｍＡｂ／ＡＯＮ（ＣＫ２、ＥＧＦＲ））の合成。３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニルモルホリノＡＯＮ（ＰＤＰ−Ｍｏｒｐｈ−ＡＯＮ）の合成を、例として本明細書中に記載する。モルホリノ−ＥＧＦＲ−ＡＯＮ：５’−ＴＣＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＡＡＴＡＣ−３’［配列番号：８］およびＣＫ２α−ＡＯＮ：５’−ＣＧＧＡＣＡＡＡＧＣＴＧＧＡＣＴＴＧＡＴＧ  ＴＴＴ−３’［配列番号：３］は、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓからであり、図１３Ｂに示すようにナノ免疫複合体を用いて有効性について機能的に検証した。３’−ＮＨ２ＡＯＮ末端を、スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）と抱合させ、ＰＤＰ−ＡＯＮを、メタノールを溶離剤としてＬＨ−２０カラム上で精製した。ＰＤＰ−ＡＯＮを、−２０℃で保存した。ＩＬ−２を、ＡＯＮと同様にＳＰＤＰと抱合させ、ＰＤ−１０カラムで精製して、ＩＬ−２−ＰＤＰを得た。
【０１８７】
Ｓ−スクシンイミジル−ＰＥＧ３４００−マレイミドｍＡｂ複合体の合成。感受性ｍＡｂ  Ｓ−Ｓ結合を、５ｍＭのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を含むリン酸緩衝液中で、室温（ＲＴ）で３０分間還元し、遊離のＴＣＥＰを、ＰＤ−１０カラム上で除去した。ｍＡｂを、マレイミド−ＰＥＧ３４００−マレイミド（ｍＰＥＧｍ）と、ＲＴで３０分間抱合させ、続いてＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ７５カラム上でサイズ排除して、未反応のｍＰＥＧｍを除去した。精製したｍＡｂ（Ｓ−スクシンイミジル−ＰＥＧ３４００−マレイミド）を、プレ複合体への抱合の前にダイアフィルトレーション（３０ｋＤａカットオフ）により濃縮した。ｍＰＥＧｍのｍＡｂへの抱合を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより確認した。合成したｍＡｂ−ＰＥＧ３４００−Ｍａｌを、同日使用した。
【０１８８】
完全なナノ複合体Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／抗ｍｓＴｆＲ  ｍＡｂ／抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂまたは抗ＰＤ−１  ｍＡｂ／ＡＯＮ（ＣＫ２、ＥＧＦＲ／ＥＧＦＲｖＩＩＩ）の合成。リン酸緩衝液（ｐＨ６．３、１００ｍＭ）中のプレ複合体Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／ＭＥＡを、ＰＭＬＡ分子当たり２分子の各ｍＡｂの当量を含有するｍＡｂ−ＰＥＧ３４００−Ｍａｌの混合物に、リン酸緩衝液ｐＨ６．３中、ＲＴで添加した。ｍＡｂの結合を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより確認した。次いで、ＰＭＬＡ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／抗ｍｓＴｆＲ  ｍＡｂ／抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂまたは抗ＰＤ−１  ｍＡｂ／ＭＥＡを、ＰＤＰ−ＡＯＮの等モル混合物に、Ｓ−Ｓ結合を形成することによって添加した。同様に、ＩＬ−２−ＰＤＰを、ナノ複合体に付着させた。未反応の遊離のスルフヒドリル基を、ＰＤＰで遮断した。最終的な薬物Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／抗ｍｓＴｆＲ  ｍＡｂ／抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂまたは抗ＰＤ−１  ｍＡｂ／ＡＯＮ（ＣＫ２，ＥＧＦＲ）を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ７５カラム上で精製した。
【０１８９】
ＩｇＧおよびスクランブルしたＡＯＮを、標準の陰性対照とした。抗マウスＴｆＲ  ｍＡｂを、ＢＢＢ経細胞輸送および腫瘍細胞ターゲティングのために使用した。表３および４に示すヌードマウスにおけるヒト異種移植腫瘍を処置するためのナノ免疫複合体は、このモデルがＴ細胞を有しないため、抗ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂまたは抗ＰＤ−１  ｍＡｂを有しない。しかしながら、このモデルを用いて、ＮＫの活性化およびＩＬ−１２の抗血管新生特性を介してＩＬ−２またはＩＬ−１２抗腫瘍活性を試験した。種特異性を考慮して、標的マウスＢＢＢに対する抗ｍｓＴｆＲを、標的ヒトがん細胞に対する抗ｈｕＴｆＲと組み合わせた。ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＴｆＲ  ｍＡｂｓは、本明細書中に記載した。画像化のために、ＰＭＬＡを、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０色素で標識した（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，７：ｅ３１０７０、それを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）。１００ｋＤａのＰＭＬＡ、２個のｍＡｂ分子、１８個のＡＯＮ分子、３４４個のＬＬＬ分子および１８個のＰＥＧ分子からなるナノドラッグについての推定された平均ＭＷは、９７３ｋＤａである。
【０１９０】
表３。同系マウス処置のためのナノ免疫複合体
【表３】
2019507157.tif 000005
【０１９１】
表４。投薬および毒性研究のための異種マウス処置のためのナノ免疫複合体
【表４】
2019507157.tif 000006
【０１９２】
ナノ免疫複合体の物理化学的特性評価
合成モニタリング  プレ複合体（Ｐ／ｍＰＥＧ／ＬＬＬ／ＭＥＡ）の調製を、ＴＬＣにより確認して、各アミド化の完了をモニタリングした。プレ複合体の各バッチを、リポソーム漏出アッセイを用いてｐＨ感受性について検証した。成功したｍＡｂおよびＡＯＮ抱合を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによってモニタリングした。各ナノ免疫複合体のサイズおよびゼータ電位を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ）を用いて溶液中で特性評価した。図１２Ａ〜１２Ｂにおいて示したようなナノ免疫複合体のサイズは、平均で２０ｎｍであった。
【０１９３】
溶液中の各ナノ免疫複合体成分の定量分析  全リンゴ酸を、６Ｎ  ＨＣｌ中での完全なナノ薬物加水分解の後のリンゴ酸デヒドロゲナーゼアッセイで、密封アンプル中、１１６℃で１６時間評価した。ＰＥＧの量を、特異的なフェロチオシアン酸アンモニウムアッセイにより決定した。ｍＡｂおよびＡＯＮ含量を、ＰＭＬＡ骨格を水酸化アンモニウムで選択的に切断した後にｍＡｂおよびＡＯＮを同時に決定する方法により分析した。
【０１９４】
この方法によって、ナノ複合体中のｍＡｂおよびＡＯＮを一緒に、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて定量することが可能になる。図１５Ａ〜１５Ｄは、ＰＭＬＡナノ免疫複合体の選択的切断を例示する。図１５Ａは、アンモニアによるＰＭＬＡナノ複合体の選択的切断の概略図である。図１５Ｂは、切断前（上側曲線）および切断後（下側曲線）のＰＭＬＡナノ免疫複合体のＨＰＬＣプロフィールである。この図面を参照して、ＰＭＬＡナノ免疫複合体を、単一の広いピークとして示すＳＥＣ−ＨＰＬＣで切断前（上側曲線）に、および２つの分離したピークとして示す切断後（下側曲線）に、最初に分析した。図１５Ｃは、２８０ｎｍの最大スペクトル波長を有するｍＡｂとして同定した第１のピークのプロフィールである。図１５Ｄは、２６０ｎｍにおけるＡＯＮとして同定した第２のピークのプロフィールである。切断がｍＡｂおよびＡＯＮ完全性および生物学的活性に影響を及ぼさないことが、報告された（Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ，１６：８６０７−８６２０、それを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）。抗体量を評価するためのビシンコニン酸（ＢＣＡ）法とは対照的に、本明細書中に記載した方法により、一貫して信頼可能な結果が得られた。ＥＬＩＳＡデータによって、ｍＡｂ機能がＰＭＬＡプラットフォームへの抱合中に感知可能な程度に影響を受けないことが例証された。リポソーム／カルセイン蛍光分析を実施して、ナノ免疫薬物免疫薬物の膜破壊活性を評価した。結果がナノ免疫複合体の赤血球タンパク質との相互作用によって不明瞭にならないため、このアッセイが以前に行った溶血試験よりも信頼可能であることが、観察された。
【０１９５】
ナノ免疫複合体のＡＯＮ放出モジュールの試験  定性的対照において、ＡＯＮ放出モジュールの活性およびナノ免疫薬物へのＡＯＮ結合量を、評価した。ナノ免疫結合体（０．２５ｍＭ結合ＡＯＮ）を、５ｍＭのＧＳＨ（γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システイニルグリシン）と共に、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中で３７℃でインキュベートし、完了までの様々な時間での反応を、２０ｍＭのＮ−エチルマレイミドで停止した。遊離した還元されたＡＯＮを、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、Α２６０によりＮ−エチルマレイミジル誘導体として検出した。完全な放出が、５０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下で得られ、３７℃で６０分までに１００％完全であった。
【０１９６】
機能の分析およびｍＡｂのナノ免疫複合体変異体への抱合  反応混合物を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより注意深く精製し、抗体の付着を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。ＩｇＧ比の定量試験を、利用可能な抗体を用いたＥＬＩＳＡによって行った。ナノ免疫薬物に対する２種のｍＡｂの抗体活性および存在を、１種のｍＡｂを有するナノ免疫薬物の固定化および別種のｍＡｂまたはＩＬタンパク質（単数もしくは複数）についての特異的な抗体での試験を用いたプルダウンＥＬＩＳＡによって決定した。細胞における薬物蓄積の時間経過を、共焦点顕微鏡およびウエスタンブロット法による標的阻害によりモニタリングした。ＩＬ−２の生物活性を、マウスＣＴＬＬ−２細胞株を用いた増殖アッセイにおいて決定し、マウスＩＬ−１２の生物活性を、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）でのＴ細胞増殖アッセイにおいて決定した。これは、マウスＩＬ−１２がヒトＴ細胞において活性であったために可能であった。マウスＮＫ細胞株ＫＹ−１においてインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）分泌を誘発するＩＬ−１２の能力、ならびに基質としてのヒトＰＢＭＣおよびＬＡＫ細胞のための標的としてのヒトＫ５６２またはＤａｕｄｉ細胞においてリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性化を誘発するＩＬ−１２の能力を、試験した。マウスＰＢＭＣに対する抗マウス抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１  ｍＡｂの効果を、増殖アッセイにより確認し、記載されているようにウエスタンブロットに対するＳＴＡＴ５およびＥＲＫ１／２のリン酸化を減少させた（Ｈａｒｖｉｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：９５−１０５；Ｃｏｍｉｎ−Ａｎｄｕｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，５：ｅ１２７１１；  Ｌｉｓｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｉｍ，２００９，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，８７：４４３−４４４；およびＫｒａｍｅｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，３４９：１２５−１３７、これらのすべてを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）。血清ＩＬ−２およびＩＬ−１２レベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイにより測定した。ＧＬ２６脳腫瘍を有するマウスを、裸のｍＡｂ、ナノ免疫複合体上のｍＡｂ、またはナノ免疫複合体の組み合わせで５回Ｉ．Ｖ．処置した。図１１に示すように、（１）ナノ免疫薬物がＢＢＢを横断することができ、および（２）ナノ免疫薬物が腫瘍局所的免疫応答を活性化し、それによって抗ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１  ｍＡｂｓがＴｒｅｇがＣＴＬが腫瘍の内側の脳がん細胞を攻撃するのを防止するのを遮断するため、重合体付着ｍＡｂのみが動物生存を延長することが、観察された。
【０１９７】
分析方法  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）残基の置換に続いて、反応混合物のＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行った。チオール残基を、遊離２−ＭＥＡのダイアフィルトレーション（５ｋＤａカットオフ）による除去の後にＥｌｍａｎ方法によりアッセイした。マレイミド基の量を、２−ＭＥＡとのそれらの反応およびＥｌｍａｎ方法を用いた逆滴定によって定量した。アミノ酸を、抱合体の１００℃での６ＭのＨＣ１中での加水分解および標準プロトコルに従うトリニトロフルオロベンゼン（ＴＮＢＳ）での比色分析の後に、ＲＰ−ＨＰＬＣにより定量した。１０％ポリアクリルアミドゲル上での還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン分析を、記載されているように行った（Ｌｊｕｂｉｍｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ，２１：９５６−９６７、それを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）。
【０１９８】
神経膠腫細胞の培養  ヒトＧＢＭ細胞株Ｕ８７ＭＧおよびＬＮ２２９（ＡＴＣＣから）、ならびにマウスＧＬ２６およびＧＬ２６１株を、用いた。細胞を、記載されているように成長させた（Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０７：１８１４３−１８１４８、それを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）。ナノ免疫薬物変異体での処置を、実施した。ＡＯＮスクランブル変異体およびＰＢＳ（薬物溶媒）を、対照とした。実験を３通りに行い、少なくとも３回繰り返し、本明細書中に記載したように適切な統計的分析を伴った。
【０１９９】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞生存率試験  生存細胞を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  ＡＱｕｅｏｕｓ  ＭＴＳ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により定量した。細胞死を、Ａｐｏｐｎｅｘｉｎキット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、製造業者により推奨されている通りにアッセイした。
【０２００】
統計学  適切な場合は常に、各群からの定量的データを、Ｐｒｉｓｍ５プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて統計的に比較した。２つの群について、スチューデントｔ−検定を用い、３つおよびそれ以上の群について、適切な事後試験を伴う二元配置ＡＮＯＶＡを、用いた。
【０２０１】
実施例７：脳腫瘍成長に対するナノ免疫複合体の阻害効果の試験
前臨床ｉｎ  ｖｉｖｏ効能を評価して、リードナノ免疫複合体および処置レジメンを選択した。ＧＬ２６およびＧＬ２６１頭蓋内神経膠腫の同系マウスモデル、ならびにヌードマウスにおけるヒト頭蓋内Ｕ８７ＭＧおよびＬＮ２２９  ＧＢＭの異種モデルを、用いた。データにより、ナノドラッグの治療効果を評価するためのこれらのモデルの実行可能性が示された。これらの頭蓋内モデルにおいて、ＢＢＢは強く機能し、遊離の抗体および他の薬物が脳腫瘍に到達するのを不可能にした（Ａｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ，４１：３３−３９、それを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）。この系の重要な利点は、ＡＯＮ薬物の腫瘍細胞に対する同時の作用およびナノ医療において以前は使用されていなかったオールインワンナノ免疫薬により提供される免疫系刺激である。この系の別の利点は、局所的免疫刺激が脳腫瘍処置に重要であると見られるため、ＢＢＢを通過するその能力である。データによって、ＣＫ２およびＥＧＦＲを遮断する標的されたナノドラッグが脳神経膠腫を処置するために有望であることが示された。腫瘍細胞中のＥＧＦＲおよびＣＫ２を遮断するナノ免疫複合体は、脳腫瘍成長を有意に抑制し、動物の生存を増加させることが観察され、この効果は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１に対するｍＡｂ、ならびに／または追加的な腫瘍免疫調節のためのナノ免疫薬物付着活性サイトカインＩＬ２での局所的な、および全身的な抗腫瘍免疫応答の同時の刺激によって顕著に増強された。
【０２０２】
ＥＧＦＲおよび／またはＣＫ２を標的するナノドラッグによるＧＢＭ抑制。図１３Ａ〜１３Ｂを参照して、ヒト頭蓋内ＧＢＭｓ  ＬＮ２２９およびＵ８７ＭＧを有するヌードマウスを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで有効なナノ薬物で６回Ｉ．Ｖ．処置した。処置の結果ＰＢＳ注射と比較して動物生存のほぼ倍増がもたらされたことが、観察された。
【０２０３】
図１６Ａ〜１６Ｂは、ＥＧＦＲおよび／またはＣＫ２αに特異的なＡＯＮを含むナノ免疫複合体がＬＮ２２９  ＧＢＭ成長を阻害し、腫瘍保有動物生存を延長したことを例示する。図１６Ａ（左）は、ＰＢＳでの対照処置（ｘマーク）と比較しての、ナノ免疫複合体Ｐ／Ｃｅｔｕ／ＡＯＮ−ＣＫ２α（閉じた正方形）、Ｐ／Ｃｅｔｕ／ＡＯＮ−ＥＧＦＲおよびＰ／Ｃｅｔｕ／ＡＯＮ−ＣＫ２α／ＡＯＮ−ＥＧＦＲでの処置による動物生存を示すカプラン・マイヤー曲線のセットであり、（右）は、生存期間中央値の定量を示す表である。セツキシマブ（Ｃｅｔｕ）により腫瘍を標的する１種のナノ免疫複合体上でのＣＫ２α、ＥＧＦＲ、およびそれらの組み合わせに対するＡＯＮでの動物の処置によってＰＢＳでの処置と比較して動物の生存が有意に増加することが、観察された。図１６Ｂは、ナノ免疫複合体およびＰＢＳでの処置後の腫瘍形態の写真である。ＰＢＳで処置した腫瘍は十分に発達し；ナノ薬物で処置した腫瘍は大きな壊死領域を有することが、観察された。図１６Ａを参照して、ＣＫ２またはＥＧＦＲの阻害が同様に有効であることが、観察された。１種のナノ薬物に対するそれらの併用によって、ＬＮ２２９について示した生存率の小幅な増加が生じた。同様の結果が、Ｕ８７ＭＧ  ＧＢＭについて得られた。組織学的Ｈ＆Ｅ分析によりＰＢＳで処置した動物における盛んな腫瘍成長が明らかになり、一方ナノ薬物で処置した腫瘍は広範囲の壊死を有していた。標識したナノ薬物は、ＢＢＢを横断するその能力を証明する腫瘍細胞内で検出された。
【０２０４】
図１７Ａ〜１７Ｅは、ＰＢＳでの対照処置と比較した、頭蓋内ＬＮ２２９異種腫瘍における生存促進性および増殖性シグナリングに対するナノ免疫複合体Ｐ／Ｃｅｔｕ／ＡＯＮ−ＣＫ２α、Ｐ／Ｃｅｔｕ／ＡＯＮ−ＥＧＦＲ、およびＰ／Ｃｅｔｕ／ＡＯＮ−ＥＧＦＲ／ＡＯＮ−ＣＫ２αの効果を例示する。図１７Ａは、処置した腫瘍におけるＥＧＦＲ、ＣＫ２α、ならびにリン酸化／活性化Ａｋｔ（ｐＡｋｔ）およびｃ−Ｍｙｃの減少を示すウエスタンブロットの写真のセットである。図１７Ｂは、処置した腫瘍におけるＥＧＦＲの相対的発現レベルを示す棒グラフのセットである。図１７Ｃは、処置した腫瘍におけるＣＫ２αの相対的発現レベルを示す棒グラフのセットである。図１７Ｄは、処置した腫瘍におけるｐＡｋｔ／Ａｋｔの相対的発現レベルを示す棒グラフのセットである。図１７Ｅは、処置した腫瘍におけるｃＭｙｃの相対的発現レベルを示す棒グラフのセットである。図１７Ａ〜１７Ｅを参照して、有意な変化が、ＰＢＳと比較して、ＮＩＣでの処置の後にＥＧＦＲ、ＣＫ２α、ｐＡｋｔ／Ａｋｔ、およびｃＭｙｃの相対的発現レベルにおいて観察された。最も強い効果は、ＡＯＮ組み合わせで観察された。図１７Ａを参照して、脳腫瘍細胞に対するナノ薬物の作用の機構は、Ａｋｔリン酸化およびｃ−Ｍｙｃ発現を阻害することを含むと見られる。腫瘍ターゲティングナノ免疫複合体によるＣＫ２阻害は、経口阻害剤処置よりも優れていると見られる。なぜなら、それにより、経口小分子ＣＫ２阻害剤についての５９％に対して、ナノ免疫複合体（ＣＫ２α  ＡＯＮについて８９％およびＣＫ２α＋ＥＧＦＲについて１０３％）でより大きいマウス生存率増加が得られたからである。
【０２０５】
臨床的に重要な問題の１つは、腫瘍幹細胞である。それらは、腫瘍成長に寄与するのみならず、また分化したがん細胞よりも療法に対して耐性であり、それらの生存は、腫瘍再発の重要な因子である。この理由のため、成功したがん療法は、がん幹細胞の効率的な除去に向けられるべきである。処置した異種ＬＮ２２９腫瘍の免疫組織化学的研究を、数種のがん幹細胞マーカー、ＣＤ１３３、ｃ−Ｍｙｃおよびネスチンを用いて行った。すべての３種のマーカーは、ＰＢＳで処置した腫瘍において良好に発現した。図１８は、Ｐ／ＡＯＮ−ＣＫ２α、Ｐ／ＡＯＮ−ＥＧＦＲ、Ｐ／ＡＯＮ−ＥＧＦＲ／ＡＯＮ−ＣＫ２αおよびＰＢＳでの処置の後のＧＬ２６脳腫瘍におけるがん幹細胞マーカーＣＤ１３３、ｃＭｙｃおよびネスチンの発現を例示する写真のセットである。この図面を参照して、ＣＤ１３３、ｃ−Ｍｙｃおよびネスチンの高い発現が、ＰＢＳで処置した腫瘍において観察され、ＣＫ２αおよびＥＧＦＲを阻害するナノ薬物での処置の際のその有意な減少が観察された。両方の標的の併用された阻害によって、染色が消失した。核を、ＤＡＰＩで対比染色した。組織切片の免疫蛍光染色の後、ＣＫ２αまたはＥＧＦＲまたは特にそれらの組み合わせに対するＡＯＮを保有するナノ薬物での処置によってすべてのマーカー発現において劇的な減少が生じることが、観察された。
【０２０６】
当該データは、ＥＧＦＲおよび／またはＣＫ２の合成を阻害するナノ薬物によるＧＢＭ成長およびがん幹細胞を遮断するアプローチの能力を明確に証明している。
【０２０７】
ナノ免疫複合体によるＧＢＭ抑制
ＢＢＢを通過するナノ免疫複合体を、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１に対するｍＡｂで操作し、頭蓋内神経膠腫ＧＬ２６を有するマウスを処置するために使用した。脳腫瘍に対抗するにあたっての全身性免疫対局所的免疫のそれぞれの役割を、試験した。マウスを、裸のｍＡｂまたは腫瘍ターゲティングＴｆＲ  ｍＡｂを有するナノ複合体付着ｍＡｂで５回全身的に処置した。裸のｍＡｂは、ＰＢＳに対して動物の生存を延長しなかった。しかしながら、ナノプラットフォーム上の両方の脳腫瘍標的ｍＡｂによって、有意な動物生存率増加が生じた。
データは、Ｔｒｅｇ調節ｍＡｂによる局所的免疫の刺激が全身性免疫刺激と比較して抗脳腫瘍応答を増強するためにより重要であるという仮定を裏付け、このアプローチの実行可能性を証明する。同一の実験において、マウスＭａｇｎｅｔｉｃ  Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ａｓｓａｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた処置した動物の血清中の関連するサイトカインの濃度を、決定した。ナノポリマー付着および腫瘍送達免疫調節性ｍＡｂのみがＩＬ−１２発現を劇的に増加させることができ（抗腫瘍応答と整合）、一方裸のｍＡｂは増加させなかったことが、観察された。驚くべきことに、ＩＬ−２レベルは有意に増加しなかった。この理由のために、ＩＬ−１２が処置によって既に高度に増加しているので、図１２Ｂに示すＣＴＬ刺激ｍＡｂと一緒にＩＬ−２が付着したナノ免疫薬物を、使用した。
【０２０８】
次の決定を、腫瘍内ＣＤ８＋細胞がＣＴＬ活性化と整合して脳腫瘍処置の際に増加するか否かに関して行った。これらの細胞は、未処置の腫瘍においては極めて稀少であり、抗ＣＴＬＡ−４または抗ＰＤ−１での全身的処置の後に有意な変化はなかった。しかしながら、これらの免疫調節性ｍＡｂのナノ免疫薬物を有する腫瘍への送達の結果ＣＤ８＋細胞の増加した数がもたらされることが、観察された。ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂによって一般にＰＤ１  ｍＡｂよりも顕著な効果が生じることに、留意すべきである。
【０２０９】
本明細書中に記載したデータは、神経膠腫成長を抑制するにあたってのＣＫ２およびＥＧＦＲ  ＡＯＮとのナノ免疫複合体の、ならびに局所的および全身的免疫を増強するにあたってのナノ免疫薬物の有効性を示す。両方の処置によって、腫瘍保有動物の生存期間が延長され、それらがさらなる前臨床開発のための魅力的な候補となった。
【０２１０】
実験設計  頭蓋内腫瘍を、確立した。１日目に、マウスに、あらかじめ最適化した用量での神経膠腫細胞を頭蓋内に定位的に注射した。Ｕ８７ＭＧは、最適な成長のために２５×ｌ０３細胞／マウス、ＬＮ２２９、１×１０５個の細胞、ならびにＧＬ２６およびＧＬ２６１、２５×１０３個の細胞を必要とした。ＧＬ２６およびＧＬ２６１細胞の使用は、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ抗原のそれらの異なる発現によって導かれた：ＧＬ２６は非免疫原性であり、クラスＩ  ＭＨＣを発現したが、クラスＩＩ  ＭＨＣを発現せず、一方ＧＬ２６１は部分的に免疫原性であり、高いレベルのＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩ、Ｂ７−１および−２を発現し、それは、Ｔ細胞活性化に必要な分子の同時刺激であった。
【０２１１】
腫瘍を、３日間成長させた。３日目、７日目、１０日目、１４日目、１７日目、および２１日目（過去の研究において有効であった通りの６回の処置）に、動物に、表１〜４に示したナノ免疫複合体および対照の剤を静脈内注射した。ナノ免疫複合体用量の標準的用量は、ＡＯＮによって５．０ｍｇ／ｋｇ、ならびにＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１の３〜１０ｍｇ／ｋｇであった。各群は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｃｏｒｅにより承認された８匹のマウスからなっていた。動物を、それらに神経学的異常が発生した時点で絶命させた。一般的な対照は、以下のとおりであった：１）８匹のマウスを、３０日目にいかなる処置をもせずに安楽死させて、正常な対照組織を得；２）処置群あたり８匹のマウスに、裸のＰＭＬＡもしくはＰＢＳ、またはスクランブルＡＯＮとのナノ複合体を注射し；ナノ免疫薬物上のアイソタイプ対照ＩｇＧを、免疫刺激抗体での実験において使用した；全身性対局所性免疫刺激についての対照には、標準のケア裸抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１抗体が含まれて、ＢＢＢ通過ナノ免疫薬物と有効性を比較した。裸のＡＯＮは、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞膜を通過せず、対照として使用しなかった。結果判定法  切除した腫瘍を、Ｈ＆Ｅ染色、標的およびリンパ球マーカー（ＣＤ８およびＣＤ４）のサイズおよび発現のウエスタンブロット法および免疫組織化学による測定により分析した。薬物作用および免疫刺激の機構を試験するために、Ａｋｔ、ＳＴＡＴ５、ＥＲＫ１／２のリン酸化、および切断されたＰＡＲＰによるアポトーシスの程度を、記載されているように評価した（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，７：ｅ３１０７０、それを、完全に述べられているかのように参照により本明細書中に組み入れる）。サイトカインレベル（ＩＬ−２およびＩＬ−１２）を、動物血清において決定した。
【０２１２】
がん幹細胞を、ナノ免疫複合体処置の後に免疫染色およびＦＡＣＳ分析（Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉコアにおいて）により検出し、それらのマーカー発現を、神経膠腫保有動物の腫瘍サイズおよび生存率と相関させた。がん幹細胞は、プログラム細胞死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１）およびＴＧＦ−β１を発現することにより、ならびにＴ細胞増殖を阻害し、Ｔ細胞アポトーシスを誘発し、Ｔｒｅｇ機能を増強することにより、免疫抑制を誘発した。
【０２１３】
ＥＧＦＲおよびＣＫ２に対するＡＯＮの免疫刺激抗体または抗腫瘍サイトカインとの併用によって、相乗効果が生じた。
【０２１４】
腫瘍サイズの評価  Ｈ＆Ｅ染色を行い、腫瘍直径を腫瘍の表面において、および腫瘍の中心において測定した。腫瘍体積（Ｖ）を、式Ｖ＝π／６×ａ２×ｂにより評価し、式中ａは短軸であり、ｂは長軸である。
【０２１５】
分子標的の発現  特異的抗体を用いて、スクランブルＡＯＮ−ナノ薬物またはＰＢＳを施与された対照動物との比較において、処置後の腫瘍におけるＣＫ２、ＥＧＦＲ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＣＤ８、およびＣＤ４の発現を検出した。切片化後、２〜８ｍｍの距離における腫瘍組織および隣接する組織の残りを、タンパク質抽出のためにＯＣＴブロックからすくい集めた。その後のウエスタン分析により、Ａｋｔ、ＳＴＡＴ５、ＥＲＫ１／２、およびアポトーシスのための切断したＰＡＲＰの半定量的なリン酸化状態を決定した。
【０２１６】
サイトカイン測定  サイトカインレベル（例えばＩＬ−２およびＩＬ−１２）を、図２０に記載し、例示したように、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイを用いて動物血清において決定した。
【０２１７】
統計的分析を、ＡＮＯＶＡにより複数の群について行った。
【０２１８】
ナノ複合体の薬物動態的および毒物学的研究
免疫原性試験のために、ヒト抗原と反応する承認されたＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１抗体を用いて、それらの作用による場合によっては増大された動物における免疫応答を解消した。
【０２１９】
実験設計  薬物半減期および組織分布を評価するために、放射性標識したナノ免疫複合体を、用いた。様々な時点での血液試料および組織ホモジネートを調製して、分子量にわたる放射能分布をナノ免疫薬物分解を示すｓｅｃ−ＨＰＬＣにより、およびシンチレーション計数により測定した。尿試料をまた、分析した。ＰＢＳおよびヒト血漿における質および安定性、ならびに可能な毒性指標としての臨床的生化学を、測定した。マウスにおける急性毒性、リード化合物の特異的薬物動態ならびにＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝および排泄）、ならびに最大耐量（ＭＴＤ）を、実験室において行った。
【０２２０】
薬物半減期および組織分布研究  これを、ポリマー抱合放射活性トレーサーを用いて行った。実験の群および対照の腫瘍保有の群（ｎ＝５／群）に、ＣＫ２およびＥＧＦＲに対するＡＯＮおよび関連するｍＡｂを含む１２５Ｉ標識ナノ免疫薬物を、１５０μｌ容量にて、上記から決定した用量で静脈内注射した。半減期を、クリアランス（ＣＬ）および分布容積（Ｖｄ）によって決定し、当該関係は、以下の等式によって表される：ｔ１／２＝ｌｏｇｅ０．５Ｖｄ／ＣＬ。血液および尿試料、ならびに組織ホモジネート時間を、１０分、３、１２、２４、４８、および７２時間に、分子量にわたる関連した標識分布について、ｓｅｃ−ＨＰＬＣにより評価し、ナノ免疫薬物分解を示した。標識したナノ免疫複合体を、器官においてシンチレーション計数を用いて検出した。微視的画像化を行って、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０で標識したナノ免疫薬物を検出した。当該研究を、３回繰り返した。
【０２２１】
ナノ免疫薬物品質および安定性の制御（１）品質制御：ヒト血漿において、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、３７℃で２４時間インキュベートした後の種々のｍＡｂの活性を検出した。（２）安定性制御：ＰＭＬＡのエステル結合は、貯蔵中にほとんど切断された。ナノ免疫複合体の溶液を、−２０℃で保存した。それらは、３ヵ月、６ヵ月、１２ヵ月、１５ヵ月の保存後に活性を維持した。凍結乾燥したナノ免疫薬物は、−２０℃で２年間安定であった。
【０２２２】
免疫学的特性評価  標準的なアッセイ試験が開発され、確立され、ナノ免疫複合体を特性評価するために使用されている。エンドトキシン除去を、ＧＬＰ認定実験室においてウサギ発熱性試験により評価した。臨床的な生化学的試験を、実験動物および対照動物における生化学的臨床試験についての標準的手順に従って実施した：臨床的症状：遅い移動、興味の喪失、活動（高／低）。栄養。神経学的スコア：階級１：尾部脱力または尾部麻痺；階級２：後肢／肢不全麻痺または不全片麻痺；階級３：後肢／肢片麻痺；階級４：完全な麻痺（四肢麻痺）、瀕死ステージまたは死。血液生化学：トランスアミナーゼ（ＡＳＴ、ＡＬＴ）−肝機能；ビリルビン（直接的、間接的）；クレアチニン；血中尿素窒素；血液：白血球、赤血球、血小板、ヘモグロビン、炎症：Ｃ反応性ペプチド。
【０２２３】
マウスにおける急性毒性研究および反復されたＩ．Ｖ．投与毒性研究  ３０匹の合計数について５匹の動物／性別／用量で３種の用量レベル（高、中および低）があった。すべての動物に、単回静脈内投与を施与した。体重を週１回測定し；臨床的徴候を投与日に２回およびその後１日１回測定し、死亡率チェックを少なくとも６時間間隔で１日２回行った。剖検を、１５日目に行った。何らかの肉眼的病変が見出された場合、これらの組織をホルマリン中に採取し、病理組織学を行った。サルについて、２種の用量レベル＋対照群とした。合計６匹の動物について１匹の動物／性別／用量があり（ＦＤＡ許容可能）、それに、１、４、８および１１日目にＩ．Ｖ．用量を投与した。体重を、１週目後半において開始し、終了時に週２回測定した。食物の消費を、半定量的に測定した。死亡率チェックを、１日２回、少なくとも６時間間隔で行った。臨床的徴候を、毎日投薬後〜１〜２時間にチェックした。臨床所見（身体的試験）を、１週目から開始して毎週行った。臨床的病理学を、全動物について予備試験の間および１５日目の終了時に１回行った。ＰＫ試料を、１日目および１１日目（第４の投与後）に採集した。剖検を、１５日目に全生存者について、およびすべての見出された死亡動物について行った。臓器重量を、主要臓器について測定し；骨髄塗抹を、肋骨から調製し、評価した。臨床的病理学および組織病理学的試験を、実施した。
【０２２４】
統計分析  毒性研究のために、ＡＮＯＶＡ試験を、体重変化、食物消費、血液学、臨床病理学、心臓病学測定、および臓器重量データに関して行った。有意なＦ比が得られた場合（ｐ≦０．０５）、Ｄｕｎｎｅｔｔのｔ検定を、対照群との一対比較のために用いた。一対比較のためのＤｕｎｃａｎの多重範囲検定を、代替的に用いた。臨床化学および血液学パラメータは年齢の関数として変化するため、測定値を、Ｊｏｉｎｔ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｈｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙによって推奨されている通り、別個の時点において統計学的に分析した。頻度データ、例えば死亡数の発生率、肉眼的剖検および組織形態観察を、フィッシャーの直接確率検定またはカイ二乗分析により比較した。ＳＡＳ、ＳＰＳＳおよびＢＭＰＤ統計分析プログラムもまた、利用可能であった。
【０２２５】
ＧＬ２６１細胞を接種したマウスの処置
２０，０００のマウス神経膠腫細胞ＧＬ２６１を、頭蓋内に接種した。神経膠腫細胞接種後５日において、１群のマウスを、遊離抗体ＣＴＬＡ−４（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｐ−ＣＴＬＡ−４／ｍｓＴｆＲ、Ｐ−ＰＤ−１／ｍＴｆＲで処置し、Ｐ−ＣＴＬＡ−４／ｍｓＴｆＲ＋Ｐ−ＰＤ−１／ｍｓＴｆＲの組み合わせを、合計５回Ｉ．Ｖ．注射で週２回投与した。
【０２２６】
２０，０００のマウス神経膠腫細胞ＧＬ２６１を、頭蓋内に接種した。神経膠腫細胞接種後５日において、マウスの群を、遊離抗体ＣＴＬＡ−４（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｐ−ＣＴＬＡ−４／ｍｓＴｆＲ、Ｐ−ＰＤ−１／ｍＴｆＲで処置し、Ｐ−ＣＴＬＡ−４／ｍｓＴｆＲ＋Ｐ−ＰＤ−１／ｍｓＴｆＲの組み合わせを、合計５回Ｉ．Ｖ．注射で週２回投与した。図１９Ａ〜１９Ｂは、ナノ免疫複合体で処置した後の動物生存を例示するカプラン・マイヤー曲線である。図１９Ａは、ＣＴＬＡ−４  ｍＡＢ、Ｐ／ＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂならびにＰ／ＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４およびＰ／ＴｆＲ／ＰＤ−１の組合せで処置した後の動物生存を例示する。図１９Ｂは、ＰＤ−１  ｍＡＢ、Ｐ／ＴｆＲ／ＰＤ−１  ｍＡｂならびにＰ／ＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４およびＰ／ＴｆＲ／ＰＤ−１の組合せで処置した後の動物生存を例示する。Ｐは、ポリマーを指す。図面は、遊離ｍＡｂと比較したナノ免疫複合体での処置の後の全身および腫瘍局所的免疫系の活性化に続く動物生存を例示する。脳腫瘍ＧＬ．２６１を保有するマウスを、ナノ免疫複合体の一部として脳腫瘍中に送達したチェックポイント阻害剤ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂおよびＰＤ−１  ｍＡｂに対するＡｂ、またはＩｇＧ１抗体としての遊離ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１で処置した。ＩｇＧ１抗体としての遊離ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−１はＢＢＢを横断しないことが、観察された。対照的に、ナノ免疫複合体は、ＢＢＢおよび活性化された脳腫瘍免疫系を横断していた。図１９Ａを参照して、動物生存率は、１種のみのナノ免疫複合体Ｐ／ＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ、またはＣＴＬＡ−４  ｍＡＢでの処置と比較して、Ｐ＜０．０２でＰ／ＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ＋Ｐ／ＴｆＲ／ＰＤ−１  ｍＡＢの組み合わせでの処置の後により高いことが、観察された。図１９Ｂを参照して、動物生存率は、Ｐ／ＴｆＲ／ＰＤ−１またはＰＤ−１  ｍＡＢのみでの処置と比較して、Ｐ＜０．０２でＰ／ＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４  ｍＡｂ＋Ｐ／ＴｆＲ／ＰＤ−１  ｍＡＢの組み合わせ、Ｐ＜０．００８でＰ／ＴｆＲ／ＰＤ−１  ｍＡＢでの処置の後により高いことが、観察された。
図２０は、ＢＢＢを横断するナノ免疫複合体Ｐ／ａ−ＣＴＬＡ−４／ＰＤ−１／ＴｆＲ（白矢印）を例示する写真である。この図面を参照して、血管輪郭を概説する。矢印によってマークした白色の点は、ＢＢＢ横断の証拠を提供するナノ免疫複合体蓄積である。ナノ免疫複合体を、赤外色素であるローダミンを用いて合成した。
【０２２７】
フローサイトメトリーマーカーを研究した：
マウスがヒトエンドポイントに達した際に、それらを安楽死させ、腫瘍を収穫し、Ｔ細胞集団をフローサイトメトリーにより分析するために使用した。ＣＤ３を用いて、Ｔ細胞を同定し；ＣＤ４、ＣＤ８、およびＦＯＸＰ３を用いて、Ｔ細胞集団内のＴエフェクターおよびＴレギュレーター細胞を同定し；ＣＤ６９およびＩＦＮＹを用いて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を測定し；ＰＤ１およびＣＴＬＡ４を用いて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞による治療的標的の発現を測定した。
【０２２８】
腫瘍組織におけるフローサイトメトリー分析結果
ＣＤ４＋Ｔ細胞の総数は、遊離抗体抗ＰＤｌと比較して、ポリマー／抗ＰＤｌおよび併用処置で処置した動物において減少した。統計的有意性は認められなかったが、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋）の割合もまた、遊離抗体処置と比較してすべてのポリマー抱合処置によって減少した。同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、遊離抗体と比較して、ポリマー抱合抗体で処置したマウスにおいて数が増加したが、差異は、統計的有意差に達しなかった。
【０２２９】
図２１は、動物のＣＴＬＡ−４ｍＡｂ、Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４およびＰ／ｍｓＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４＋Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＰＤ−１での処置の後のＩＦＮＹ／ＣＤ８＋細胞の分析を例示する散布図である。この図面を参照して、ナノ免疫複合体Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４およびＰ／ｍｓＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４＋Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＰＤ−１での処置の後に観察されたような腫瘍局所免疫系の活性化。図２２は、動物のＣＴＬＡ−４ｍＡｂ、Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４およびＰ／ｍｓＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４＋Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＰＤ−１での処置の後のＣＤ６９＋／ＣＤ８＋細胞の分析を例示する散布図である。ポリマー抱合抗体によってＣＤ４＋Ｔ細胞においてＣＤ６９およびＩＦＮＹ発現の有意な増加が生じないことが、観察された。代わりに、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、遊離ＣＴＬＡ４抗体療法と比較して、ポリマー抱合抗ＣＴＬＡ４抗体および併用療法（２つの抱合体：Ｐ／ＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４＋Ｐ／ＴｆＲ／ＰＤ−ｌの同時注射）により有意に増加した。
【０２３０】
ポリマー抱合抗ＰＤｌ抗体および併用処置によって、遊離の抗ＰＤｌ抗体と比較して、統計的に有意ではないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＰＤ１発現の減少が生じた。さらに、ポリマー結合抗ＰＤ１抗体および併用処置で処置した動物は、抗ＰＤ１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体処置の両方と比較して、ＰＤ１発現のＣＤ８＋細胞による有意な減少を示す。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方上のＣＴＬＡ４発現は、遊離の抗体処置と比較して、ポリマー抱合処置によって影響を受けないと見られる。
【０２３１】
多重サイトカインアッセイ
脳中にＧＬ２６１神経膠芽腫を保有するＣ５７／Ｂ１６マウスからの血清を用いて、ＢｉｏＲａｄ  Ｂｉｏｐｌｅｘアッセイを用いてサイトカインレベルを測定した。マウスに、ＰＢＳ、ポリマー抱合抗ＰＤｌ抗体、ポリマー抱合抗ＣＴＬＡ４抗体、または最後の２種の組み合わせで交互に３回のＩ．Ｖ．注射を投与した。血清を、第３の処置の２４時間後に収穫した。図２３Ａ〜２３Ｃは、Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＣＴＬＡ−４、Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＰＤ−１およびＰ／ｍｓＴｆＲＣＴＬＡ−４＋Ｐ／ｍｓＴｆＲ／ＰＤ−１での処置後の、ＧＬ２６神経膠腫を保有するＣ５７／ＢＩ６マウスからの血清中のサイトカインレベルを例示する棒グラフである。図２３Ａは、ＩＬ−１２（ｐ７０）レベルを例示する。図２３Ｂは、ＩＦＮＹレベルを例示する。図２３Ｃは、ＴＮＦαレベルを例示する。
【０２３２】
明らかな傾向が、サイトカイン発現がＰＢＳ処置マウスと比較してポリマー抱合抗体で、および特に併用療法で処置した動物において増加した処置において視認可能であった。特に、併用療法によって、他の処置と比較して、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαの発現において統計的に有意な増加が生じた。サイトカインレベルの上昇は、免疫系および特にＴ細胞集団の活性化を示す。
【０２３３】
結果は、ポリマー結合抗体抗ＰＤｌおよび抗ＣＴＬＡ４で処置した後の脳中の腫瘍レベルでの局所的なＴ細胞集団の活性化を示した。同一の活性化は、ＰＭＬＡポリマーに抱合していない場合、同一の抗体によって誘発されなかった。さらに、データは、血清中の全身レベルおよび脳の内側の腫瘍中の局所的の両方においてサイトカインレベルの増加の形態における免疫系の活性化を示す。
【０２３４】
ナノ免疫複合体の利点
既存のナノ医薬、実験的および臨床においてすでに使用されているもの（ドキシル、アブラキサンなど）と比較して、本明細書中に開示したナノ免疫複合体は、特に乳がんおよび脳腫瘍の処置についていくつかの著しい利点を有する。それらは、血液脳関門（ＢＢＢ）および血液組織関門（ＢＴＢ）を、ゆっくりであり、非効率的なＥＰＲ効果によってではなく、それらのペイロードを失わずに腫瘍血管系を介した活性トランスサイトーシスによって通過することができる。ポリリンゴ酸ベースの分子足場へのすべての部分の共有結合によって、ナノ粒子およびリポソームに共通の漏出を伴わずに腫瘍部位への送達が確実になる。腫瘍血管系およびがん細胞の二重ターゲティングによって、隣接する正常組織に対する感知可能な効果を伴わずに、その意図する標的への特異的な薬物送達が確実になる。それらは、動物において完全に生分解され、無毒性である。それらは、局所腫瘍免疫性を刺激することができるナノ薬物である。これらの著しい利点によって、本明細書中に開示したナノ免疫複合体が、脳がんおよび乳がんを処置するための極めて魅力的な薬物になる。
【０２３５】
仮説は、全身免疫系を局所的な腫瘍免疫系と一緒に、これらの抗体抗ＣＴＬＡ−４および／または抗ＰＤ−１を複合体の一部として送達することによって活性化するというものであった。ナノ免疫複合体は、脳および乳房についての腫瘍内皮系を横断することができた。実験データにより、原発性脳および乳がん、ならびに乳がんの脳への転移の処置は、遊離の抗ＣＴＬＡ−４および抗ＰＤ−１での処置よりも著しく良好であることが、確認された。脳腫瘍について、処置は、これらの抗体が血液脳関門を横断しないため臨床において有効ではない。したがって、一般的な免疫応答の活性化は、脳腫瘍処置のためには十分でない。乳がんは、全身的に投与されたナノ免疫複合体ではるかにより良好に処置され、それは、ｉｎ  ｖｉｖｏ処置データによって示される。
【０２３６】
本出願を通じて引用した参考文献を、本明細書中で明らかなすべての目的のために、および参考文献それら自体の中に、完全に述べられているかのように組み入れる。提示のために、これらの参考文献の特定のものを、本明細書中の特定の場所で引用する。特定の場所での参考文献の引用は、参考文献の教示を組み入れる方式（単数または複数）を示す。しかしながら、特定の場所での参考文献の引用によって、引用した参考文献の教示のすべてをすべての目的のために組み入れる方式は限定されない。
【０２３７】
したがって、本発明は、開示した特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲；上記の説明によって定義した；および／または添付の図面中に示した本発明の精神および範囲内にあるすべての修正を網羅することを意図することが、理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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