(57)【要約】ＲＥＰ−１及びＲＥＰ−２の活性を測定するための方法が提供される。ある実施形態では、方法は、（ａ）内因性機能的ＲＥＰ−１又はＲＥＰ−２タンパク質を発現しない細胞を、ＲＥＰ−１タンパク質をコードするＣＨＭ遺伝子又はＲＥＰ−２タンパク質をコードするＣＨＭ様遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターと、細胞への形質導入を可能にする条件下で接触させるステップと、（ｂ）形質導入された細胞を、コードされたＲＥＰ−１又はＲＥＰ−２タンパク質の発現を可能にする条件下でインキュベートするステップと、（ｃ）形質導入された細胞を溶解して、コードされたＲＥＰ−１又はＲＥＰ−２タンパク質及びＲａｂ低分子ＧＴＰアーゼ（Ｒａｂ）を含む抽出物を産生するステップと、（ｄ）前記抽出物とＲａｂ基質とを、Ｒａｂのプレニル化を可能にする期間及び条件下でインキュベートして、それによりプレニル化Ｒａｂを形成するステップと、（ｅ）プレニル化Ｒａｂを検出及び／又は定量するステップであり、プレニル化Ｒａｂの量がＲＥＰ−１又はＲＥＰ−２の活性を反映し、それによりＲＥＰ−１又はＲＥＰ−２の活性を測定するステップとを含む。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＥＰ−１又は活性を測定するための方法であって、
（ａ）内因性機能的ＲＥＰ−１タンパク質を発現しない細胞を、ＲＥＰ−１タンパク質をコードするＣＨＭ遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターと、細胞への形質導入を可能にする条件下で接触させるステップと、
（ｂ）形質導入された細胞を、コードされた前記ＲＥＰ−１タンパク質の発現を可能にする条件下でインキュベートするステップと、
（ｃ）前記形質導入された細胞を溶解して、前記コードされたＲＥＰ−１タンパク質及びＲａｂ低分子ＧＴＰアーゼ（Ｒａｂ）を含む抽出物を産生するステップと、
（ｄ）前記抽出物とＲａｂ基質とを、前記Ｒａｂのプレニル化を可能にする期間及び条件下でインキュベートして、それによりプレニル化Ｒａｂを形成するステップと、
（ｅ）前記プレニル化Ｒａｂを検出及び／又は定量するステップであり、プレニル化Ｒａｂの量がＲＥＰ−１活性を反映し、それによりＲＥＰ−１活性を測定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記ＲＥＰ−１タンパク質が哺乳動物のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＥＰ−１タンパク質がヒトＲＥＰ−１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞がＲＥＰ−１陰性細胞（ＣＨＭｎｅｇ）を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞がＲＥＰ−１陰性ＲＰＥ細胞（ＣＨＭｎｅｇ）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞がヒトＲＥＰ−１陰性細胞（ＣＨＭｎｅｇ）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞がヒトＲＥＰ−１陰性ＲＰＥ細胞（ＣＨＭｎｅｇ）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、ＲＥＰ−１を安定的又は一過性に発現する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｒａｂ基質がゲラニル部分を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｒａｂ基質が、検出可能に標識されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｒａｂ基質が、非放射性に標識されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｒａｂ基質が、放射性に標識されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｒａｂ基質が、ＧＧＰＰである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｒａｂ基質が、ビオチニル化ゲラニル部分を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｒａｂ基質がＢＧＰＰを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｃ）が、前記抽出物からＲａｂを単離又は精製することをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｄ）又は（ｅ）が、前記プレニル化Ｒａｂを単離又は精製することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プレニル化Ｒａｂが、検出可能な標識により検出及び／又は定量される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記プレニル化Ｒａｂが、非放射性の検出可能な標識により検出及び／又は定量される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記プレニル化Ｒａｂが、ＥＬＩＳＡにより検出及び／又は定量される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記プレニル化Ｒａｂが、ウェスタンブロット又はウェスタンポリペプチドサイズに基づく（ＷＥＳ）アッセイにより検出及び／又は定量される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記プレニル化Ｒａｂが、質量分析法により検出及び／又は定量される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記プレニル化Ｒａｂが、放射性の検出可能な標識により検出及び／又は定量される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＲＥＰ−１活性を、対照のＲＥＰ−１陽性細胞（ＣＨＭｐｏｓ）のＲＥＰ−１活性と比較するステップをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＲＥＰ−１活性を、対照のＲＥＰ−１陽性ＲＰＥ細胞（ＣＨＭｐｏｓ）のＲＥＰ−１活性と比較するステップをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＲＥＰ−１陰性細胞（ＣＨＭｎｅｇ）が、コロイデレミアを有する患者に由来するか又は前記患者から得られる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＲＥＰ−１陰性細胞（ＣＨＭｎｅｇ）が、コロイデレミアを有する患者から得られるｉＰＳ細胞から誘導される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記対照のＲＥＰ−１陽性細胞（ＣＨＭｐｏｓ）が、コロイデレミアを有しない対象から得られるか又は前記対象に由来する、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記対照のＲＥＰ−１陽性細胞（ＣＨＭｐｏｓ）が、コロイデレミアを有しない対象から得られるｉＰＳ細胞から誘導される、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記対照のＲＥＰ−１陽性細胞（ＣＨＭｐｏｓ）が、コロイデレミアを有する対象から得られるか又は前記対象に由来し、前記対照細胞に、ＲＥＰ−１をコードするＣＨＭ遺伝子が安定的又は一過性に形質導入されている、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記対照のＲＥＰ−１陽性細胞（ＣＨＭｐｏｓ）が、コロイデレミアを有する対象から得られるｉＰＳ細胞から誘導され、前記対照細胞又はｉＰＳ細胞に、ＲＥＰ−１をコードするＣＨＭ遺伝子が安定的又は一過性に形質導入されている、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＲＥＰ−１陰性細胞（ＣＨＭｎｅｇ）及び／又は前記ＲＥＰ−１陽性（ＣＨＭｐｏｓ）細胞がＲＰＥ細胞を含む、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＰＥ細胞が、ｉＰＳ細胞から誘導されるか又は分化したものである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＲＥＰ−１陰性ＲＰＥ細胞が、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｎｅｇ細胞を含む、請求項５、７、２６、２７、３０及び３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＲＥＰ−１陽性ＲＰＥ細胞が、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｐｏｓ細胞を含む、請求項２４、２５及び２８〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、及びＡＡＶ１０から選択される任意の血清型のカプシドタンパク質配列又は逆位末端反復配列に対して７０％以上の配列同一性を有するカプシドタンパク質配列又は逆位末端反復配列を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０から選択される任意の血清型のカプシドタンパク質又は逆位末端反復を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0002]コロイデレミアは、ＣＨＭ遺伝子における突然変異により引き起こされるＸ連鎖性単一遺伝性疾患である。ＣＨＭ遺伝子は、６５３アミノ酸であるＲａｂエスコートタンパク質−１（ＲＥＰ−１）をコードする。
【０００２】
[0003]哺乳動物は、コロイデレミア患者の網膜以外の組織におけるＲＥＰ−１の非存在を補償するＲＥＰ−２をコードするＣＨＭ様遺伝子を有する。
【０００３】
[0004]Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ−１）は、細胞内輸送において役割を有する。ＲＥＰ−１は、低分子ＧＴＰアーゼであり、細胞内輸送において非常に重要な機能を果たすＲａｓスーパーファミリーのメンバーであるＲａｂタンパク質の翻訳後脂質改変（プレニル化）を容易にする。ＲＥＰ−１は、結合して新しく合成されるＲａｂとＲａｂＧＧＴアーゼの間の相互作用を整合して、Ｒａｂのプレニル化を触媒する。ＲＥＰ−１はプレニル化Ｒａｂをエスコートして膜を標的とする。Ｒａｂプレニル化サイクルを図１に例示する。
【０００４】
[0005]コロイデレミア疾患の病理生物学は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞におけるプレニル化されていないＲａｂの蓄積及び／又は網膜細胞輸送における関連する機能障害に基づくと考えられる。
【発明の概要】
【０００５】
[0006]本発明は、Ｒａｂ保護タンパク質−１（ＲＥＰ−１）の力価アッセイを提供する。一実施形態では、アッセイはインビトロアッセイである。一実施形態では、アッセイは細胞に基づくアッセイである。種々の実施形態では、細胞に基づくアッセイは培養におけるものである。
【０００６】
[0007]本発明は、Ｒａｂ保護タンパク質−２（ＲＥＰ−２）の力価アッセイも提供する。一実施形態では、アッセイはインビトロアッセイである。一実施形態では、アッセイは細胞に基づくアッセイである。種々の実施形態では、細胞に基づくアッセイは培養におけるものである。
【０００７】
[0008]アッセイのための適当な代表的な細胞は、ＲＥＰ−１陰性ＲＰＥ細胞（ＣＨＭｎｅｇ）を含む。アッセイのための適当な代表的な対照細胞は、ＲＥＰ−１陽性ＲＰＥ細胞（ＣＨＭｐｏｓ）を含む。ある実施形態では、ＲＥＰ−１陰性ＲＰＥ細胞（ＣＨＭｎｅｇ）は、ｉＰＳＣ誘導ＲＰＥ細胞（ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｎｅｇ）を含む。ある実施形態では、ＲＥＰ−１陽性ＲＰＥ細胞（ＣＨＭｐｏｓ）は、ｉＰＳＣ誘導ＲＰＥ細胞（ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｐｏｓ）を含む。
【０００８】
[0009]アッセイのための適当な細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｎｅｇ）は、コロイデレミア患者から得ることができる。加えて、陽性対照としてアッセイに適した細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｐｏｓ）は、コロイデレミアを有しない患者から得ることができる。そのような細胞は典型的にはヒト細胞である。
【０００９】
[0010]ある実施形態では、アッセイのための細胞は、アッセイに適したＲＥＰ−１陰性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｎｅｇ）及びＲＥＰ−１陽性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｐｏｓ）を有する細胞バンク又は細胞預託物から入手することができる。
【００１０】
[0011]他の実施形態では、アッセイに適した細胞は、ヒトの血液細胞などの血液細胞に由来する。コロイデレミア患者の血液細胞を使用して、ｉＰＳ細胞を生成し、さらにはｉＰＳ細胞はＲＥＰ−１陰性ＲＰＥ細胞（ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｎｅｇ）に分化することができる。対照のＲＥＰ−１陽性ＲＰＥ細胞（ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｐｏｓ）は、コロイデレミアを有しない供給源からの血液細胞に同様に由来し得、例えば、ｉＰＳ細胞は、コロイデレミアを有しないヒトからのヒト対象に由来し、さらにはｉＰＳ細胞は、ＲＥＰ−１陽性ＲＰＥ細胞（ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｐｏｓ）に分化する。
【００１１】
[0012]他の実施形態では、対照のＲＥＰ−１陽性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｐｏｓ）は、コロイデレミア患者に由来する（ＣＨＭｎｅｇ）。ＲＥＰ−１陰性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｎｅｇ）は、欠陥のある、非機能的な、又は欠失しているＣＨＭ遺伝子が、機能的ＲＥＰ−１（又はＲｅｐ−２）をコードする野生型又は他のＣＨＭ様遺伝子によって置換されるか又は補完することができ（一過性又は安定なトランスフェクションによる）、対照のＲＥＰ−１陽性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｐｏｓ）を生成することができる。そのような形質転換された細胞（ＣＨＭｎｅｇからＣＨＭｐｏｓへ）は、ＣＨＭ遺伝子（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｐｏｓ）だけがＲＥＰ−１陰性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｎｅｇ）と異なり、異なるヒトの間で天然に生ずる他の遺伝子／遺伝子座における不均一性により引き起こされる可能性のある人為結果をそれにより低下させる。そのような遺伝子の置き換え、修正又は補完は、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ−９などの遺伝子編集技法、操作された亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ベクターによる送達、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）、ナノ粒子などを含むが、これらに限定されない種々の手段によって実施することができる。ＣＨＭ遺伝子が修正されたｉＰＳ細胞（例えば、対照ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｐｏｓ細胞に分化し得るｉＰＳＣ−ＣＨＭｐｏｓ）又は分化したＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｐｏｓ）は、プレニル化における陽性の同質遺伝子型対照として使用され得る。
【００１２】
[0013]ＲＥＰ−１陰性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｎｅｇ）及び／又は対照のＲＥＰ−１陽性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｐｏｓ）は、本明細書で説明される力価アッセイのために使用することができる。加えて、ＲＥＰ−１陰性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｎｅｇ）及び／又は対照のＲＥＰ−１陽性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｐｏｓ）は、細胞預託物の供給源として又は細胞バンクを確立するために使用することができる。或いは、それらがＲＰＥ細胞に分化する前のＲＥＰ−１陰性ｉＰＳ細胞又はＲＥＰ−１陽性ｉＰＳ細胞は、細胞預託物の供給源として又は（凍結した）細胞バンクを確立するために使用することができ、その結果、ｉＰＳ細胞は、バンクから解凍されて、ＲＰＥ細胞に分化して力価アッセイに使用することができる。そのような預託された又は預けられた細胞株は、適当な温度（例えば、液体窒素、約−１９０℃の液体窒素貯蔵、又は超低温貯蔵（例えば、約−７０℃及び−８０℃）で貯蔵して、生存能力を保存することができ、任意選択で解凍され、本明細書に記載の本発明のアッセイのために提供された細胞の供給源として使用することができる。
【００１３】
[0014]ＲＥＰ−１陰性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｎｅｇ）には、Ｒａｂエスコートタンパク質−１（ＲＥＰ−１）をコードする試験ＣＨＭ遺伝子をトランスフェクトすることができ、コードされたＲＥＰ−１を活性について分析することができる。特定の実施形態で、ベクターは、細胞にＲａｂエスコートタンパク質−１（ＲＥＰ−１）をコードする試験ＣＨＭ遺伝子をトランスフェクトするために使用される。ある実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、ＲＥＰ−１陰性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｎｅｇ）にＲａｂエスコートタンパク質−１（ＲＥＰ−１）をコードする試験ＣＨＭ遺伝子をトランスフェクトするために使用される。
【００１４】
[0015]トランスフェクトされたＲＥＰ−１陰性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｎｅｇ）は、ＲＥＰ−１活性について分析される。特定の実施形態で、Ｒａｂプレニル化活性が分析される。活性は、任意選択で、標準又は閾値ＲＥＰ−１活性、又は対照のＲＥＰ−１陽性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｐｏｓ）におけるＲＥＰ−１活性と比較することができる。
【００１５】
[0016]ＲＥＰ−１陰性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｎｅｇ）には、ベクター（例えばＡＡＶ）のある範囲の用量でトランスフェクトすることができる。ベクターのそのような範囲の用量は、用量／活性としてプロットして、ベクター用量とＲＥＰ−１活性の間の相関関係を決定することができる。ＲＥＰ−１活性は、対照のＲＥＰ−１陽性ＲＰＥ細胞（例えば、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭｐｏｓ）のＲＥＰ−１活性と比較して、同程度のＲＥＰ−１活性を達成するベクター用量を同定することができる。これは、異なるＲＥＰ−１タンパク質の力価における差、ロット間変動性／類似性、及び力価標準に合っているかいないかを決定するために使用することができる。
【００１６】
[0017]Ｒａｂのプレニル化は、種々の手段によって検出することができる。例えば、標識された基質（例えば、標識されたゲラニルゲラニル二リン酸、又はＧＧＰＰ）は、Ｒａｂプレニル化を検出及び／又は定量するために使用することができる。標識されたＲａｂを含む細胞ライセート、標識されたＲａｂの抽出物、又は精製若しくは単離され、標識されたＲａｂは、検出及び／又は定量され得る。
【００１７】
[0018]Ｒａｂのプレニル化のための基質は、検出可能に標識されたゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）を含む。Ｒａｂ基質上のトリチウムなどの放射性標識（例えば、トリチル化された［３Ｈ］ＧＧＰＰ）は、例えばシンチレーションカウンターによって検出することができる。
【００１８】
[0019]Ｒａｂのプレニル化のための基質は、非放射性の検出可能な標識も含む。したがって、種々の実施形態では、検出可能な標識は放射能ではなく、例えば、トリチウム（３Ｈ）などの放射性同位体ではない。
【００１９】
[0020]基質はビオチニル化することができ、ＢＧＰＰなどは、ＥＬＩＳＡ、質量分析法及び／又は簡単な（例えば、自動化された）例えばウェスタンポリペプチドサイズに基づくアッセイにより、検出及び／又は定量することができる。したがって、特定の実施形態で、検出可能な標識は、放射能を使用しない検出及び／又は定量を、例えば、ウェスタンブロット、酵素免疫収着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのイムノアッセイ、質量分析法又は別のアッセイ、例えば、簡単な（例えば、自動化された）ウェスタンポリペプチドサイズに基づく（ＷＥＳ）アッセイなどにより容易にする。ビオチンの例で、検出及び／又は定量は、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＴＲ−ＨＲＰ）によることができる。
【００２０】
[0021]ある実施形態では、本明細書で開示された発明のアッセイは、定量可能で、再現性があり、それらは、分析された異なるＲａｂエスコートタンパク質−１間の交差比較を可能にする。ある実施形態では、本明細書で開示された発明のアッセイは、ロット間一致性、臨床的開発及びコロイデレミア療法の検証に関して厳格な規制の要求に合わせるために適する。
【００２１】
[0022]ＲＥＰ−１に適用可能な全ての前述の実施形態は、ＲＥＰ−２にも適用可能である。例えば、ＲＥＰ−２の力価アッセイのための適当な細胞は、ＲＥＰ−２陰性ＲＰＥ細胞（ＣＨＭ様ｎｅｇ）を含む。アッセイのための適当な代表的な対照細胞は、ＲＥＰ−２陽性ＲＰＥ細胞（ＣＨＭ様ｎｅｇ）を含む。ある実施形態では、ＲＥＰ−２陰性ＲＰＥ細胞（ＣＨＭ様ｎｅｇ）は、ｉＰＳＣ誘導ＲＰＥ細胞（ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭ様ｎｅｇ）を含む。ある実施形態では、ＲＥＰ−２陽性ＲＰＥ細胞（ＣＨＭ様ｐｏｓ）は、ｉＰＳＣ誘導ＲＰＥ細胞（ｉＰＳＣ−ＲＰＥ−ＣＨＭ様ｐｏｓ）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ｒａｂのプレニル化サイクルを示す図である。
【図２】ＲａｂのＮ末端のＣｙｓ残基とＧＧＰＰの間におけるＲａｂのプレニル化チオエステル結合形成を示す図である。
【図３】例示的な発明の力価アッセイの模式的表現を示す図である。
【図４】例示的な発明の力価アッセイの模式的表現を示す図である。
【図５Ａ】ビオチン−ゲラニルピロリン酸（Ｂ−ＧＰＰ）を脂質供与体として用いるインビトロプレニル化アッセイに続く未処理の（ａ）及び５μＭのコンパクチンで処理された（ｂ、ｃ）細胞からのＨＥＫ２９３細胞ライセートのウェスタンブロット分析を示す図である。ＲＥＰ１発現及びＲａｂのプレニル化を、非形質導入ＨＥＫ２９３細胞（レーン１、３、及び５）及びＲａｂエスコートタンパク質−１（ＲＥＰ−１又はＲｅｐ−１）をコードする試験ＣＨＭ遺伝子を担持する１００，０００ｖｇ／細胞のＡＡＶ２ベクターを形質導入後のＨＥＫ２９３細胞で分析した（レーン２、４、及び６）。
【図５Ｂ】ビオチン−ゲラニルピロリン酸（Ｂ−ＧＰＰ）の非存在下におけるインビトロプレニル化アッセイに続く未処理（ａ）及びコンパクチン（５μＭ）処理（ｂ、ｃ）細胞からのＨＥＫ２９３細胞ライセートのウェスタンブロット分析を示す図である（陰性対照）。
【図６Ａ】ｉＰＳＣ−ＣＨＭｐｏｓ（ａ）、フィーダー細胞（ＭＥＦ）上で増殖するｉＰＳＣ−ＣＨＭｎｅｇ細胞（ｂ）及びｉＰＳＣ−ＣＨＭｎｅｇフィーダーフリー細胞（ｃ）について、ビオチン−ゲラニルピロリン酸（Ｂ−ＧＰＰ）を脂質供与体として用いるインビトロプレニル化アッセイ後に実施されたＲＥＰ１発現及びＲａｂのプレニル化のウェスタンブロット分析を示す図である。アッセイは、非形質導入ｉＰＳＣ（レーン１、３及び５）及びＲａｂエスコートタンパク質−１（ＲＥＰ−１）をコードする試験ＣＨＭ遺伝子を担持するＡＡＶ２ベクターを形質導入されたｉＰＳＣで実施した。
【図６Ｂ】ｉＰＳＣ−ＣＨＭｐｏｓ（ａ）、フィーダー細胞（ＭＥＦ）上で増殖するｉＰＳＣ−ＣＨＭｎｅｇ細胞（ｂ）及びｉＰＳＣ−ＣＨＭｎｅｇフィーダーフリー細胞（ｃ）について、脂質供与体としてのビオチン−ゲラニルピロリン酸（Ｂ−ＧＰＰ）の非存在下でインビトロプレニル化アッセイ後に実施されたＲＥＰ１発現及びＲａｂのプレニル化のウェスタンブロット分析を示す図である（陰性対照）。
【図７】プレニル化タンパク質及び網膜におけるプレニル化プロセスに関与するタンパク質の模式的表現を示す図である。それらの対応する遺伝子の幾つかにおける突然変異は、コロイデレミア（ＣＨＭ）、コーン−ロッドジストロフィー（ＣＲＤ）、先天性停止性夜盲症（ＣＳＮＢ）、ジュベール症候群（ＪＳ）、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、メバロン酸キナーゼ欠損症（ＭＫＤ）、網膜疾患（ＲＤ）及び網膜色素変性症（ＲＰ）の原因となることが発見された。ノックアウトマウスが網膜疾患を呈することになるタンパク質をハッシュ（＃）で示す。異なる遺伝子によりコードされたプレニル化酵素のα及びβサブユニットは異なるグレイの影で表す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
[0032]本発明は、プレニル化活性及び／又は機能を測定及び／又は検出するための方法を提供する。種々の実施形態では、該方法は、特異的及び正確である。例えば、該方法は、遺伝子移動の有効性、遺伝子発現、タンパク質の活性又は機能などを測定するステップを含むが、これらに限定されない種々の目的のために、Ｒｅｐ−１及びＲｅｐ−２などのタンパク質の活性又は機能を決定するために使用することができる。本明細書で説明されるプレニル化タンパク質の活性及び／又は機能を測定及び／又は検出する発明の方法は、薬物物質（ＤＳ）及び薬物製品（ＤＰ）の両方を、遺伝子療法への適用で試験するために適した方法を含む。
【００２４】
[0033]本明細書における本発明の方法によりアッセイされるのに適したタンパク質は、６５３アミノ酸のＲａｂエスコートタンパク質−１（ＲＥＰ−１）及びコロイデレミア患者の網膜以外の組織においてＲＥＰ−１が存在しないことを補償することができるＲａｂエスコートタンパク質−２（ＲＥＰ−２）を含む。本明細書における本発明の方法による適した追加のタンパク質は、図７で説明し、実施例３で記載する。
【００２５】
[0034]ｉＰＳ誘導ＲＰＥ細胞は、Ｎｉｃｏｌａｓ  Ｃｅｒｅｓｏら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１４）１、１４０１１；doi：１０．１０３８／ｍｔｍ．２０１４．１１）；及びＳｉｍｏｎａ  Ｔｏｒｒｉａｎｏら（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２６（１８）：３５７３〜３５８４、２０１７年９月）に記載されているように産生することができる。ｉＰＳ細胞からＲＰＥ細胞を得るか又はＲＰＥ細胞を誘導する（分化させる）のに適した他の方法もある。
【００２６】
[0035]用語「ベクター」とは、小さい担体核酸分子、プラスミド、ウイルス（例えば、ＡＡＶベクター）、又は核酸の挿入若しくは組み込みにより操作され得る他のビヒクルを指す。ベクターは、ポリヌクレオチドを細胞中に導入／移動するために、及び挿入されたポリヌクレオチドを細胞中で転写又は翻訳するために、遺伝子操作（即ち、「ベクターをクローニング」）するために使用することができる。「発現ベクター」は、宿主細胞における発現のために必要な調節領域を有する遺伝子又は核酸配列を含有するベクターである。ベクター核酸配列は、少なくとも、細胞中における増殖のための複製の起点及び任意選択で追加の要素、例えば、Ｒｅｐ−１又はＲｅｐ−２核酸配列、発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー）、イントロン、逆位末端反復（ＩＴＲ）、任意選択の選択可能なマーカー、ポリアデニル化シグナルを一般的に含有する。
【００２７】
[0036]ＡＡＶベクターは、アデノ随伴ウイルスから誘導される。ＡＡＶベクターは、遺伝子療法ベクターとして有用であり、その理由は、ＡＡＶベクターが、細胞中に侵入して、核酸／遺伝子材料を導入することができて、その結果、核酸／遺伝子材料が細胞中で安定に維持され得るからである。加えて、これらのウイルスは、核酸／遺伝子材料を特定の部位、例えば、第１９染色体上の特定の部位などに導入することができる。ＡＡＶは、ヒトにおける病原性疾患と関連しないので、ＡＡＶベクターは、異種核酸配列（例えば、治療用タンパク質及び作用物質）をヒトの患者に、実質的なＡＡＶ病原性又は疾患を引き起こすことなく送達することができる。
【００２８】
[0037]ｒＡＡＶベクターなどのベクターの変更遺伝子として、並びに組換えポリヌクレオチド及びポリペプチドなどの変更遺伝子の配列としての用語「組換え」は、一般的に天然では起こらない様式で、組成が操作された（即ち、作り変えられた）ことを意味する。組換えＡＡＶベクターの特定の例は、野生型ＡＡＶゲノムには通常存在しない核酸、例えばＲｅｐ−１又はＲｅｐ−２が、ウイルスのゲノム内に挿入された場合であろう。本明細書では、用語「組換え」が、ＡＡＶベクター、並びにポリヌクレオチドなどの配列に関して使用されるとは限らないが、ＡＡＶベクター、ポリヌクレオチド、Ｒｅｐ−１、Ｒｅｐ−２等を含む組換え形態は、任意のそのような省略にも拘わらず明らかに含まれる。
【００２９】
[0038]「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶゲノムから野生型ゲノムを除去して、非天然の（異種）核酸、例えばＲｅｐ−１又はＲｅｐ−２をコードする核酸で置き換える分子法を使用することにより、ＡＡＶなどのウイルスの野生型ゲノムから誘導される。典型的には、ＡＡＶについて、ＡＡＶゲノムの片側又は両側の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列が、ｒＡＡＶベクターで保持される。ｒＡＡＶは、ＡＡＶゲノムの全部又は一部が、ＡＡＶゲノムの核酸に関して、非天然の配列で、例えば、Ｒｅｐ−１又はＲｅｐ−２をコードする異種核酸で置き換えられているので、ＡＡＶゲノムと明白に区別される。非天然の配列の組み込みは、それゆえに、ＡＡＶを「組換え」ＡＡＶベクターと定義し、「ｒＡＡＶベクター」と称することができる。
【００３０】
[0039]組換えＡＡＶベクター配列は、パッケージングすることができて、エクスビボ、インビトロ又はインビボにおける細胞のその後の感染（形質導入）について、本明細書では「粒子」と称する。組換えベクター配列が、ＡＡＶ粒子中にカプシド形成されているか又はパッケージングされている場合、粒子は、「ｒＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ粒子」又は「ｒＡＡＶビリオン」と称することもできる。そのようなｒＡＡＶ、ｒＡＡＶ粒子及びｒＡＡＶビリオンは、ベクターゲノムをカプシド形成するか又はパッケージングするタンパク質を含む。特定の例として、ＡＡＶの場合、カプシドタンパク質が含まれる。
【００３１】
[0040]ベクター「ゲノム」とは、最終的にパッケージングされるか又はカプシド形成されてｒＡＡＶ粒子を形成する組換えプラスミド配列の部分を指す。組換えプラスミドが組換えＡＡＶベクターを構築するか又は製造するために使用される場合に、ＡＡＶベクターゲノムは、組換えプラスミドのベクターゲノム配列に対応しない「プラスミド」の部分を含まない。この組換えプラスミドの非ベクターゲノム部分は、「プラスミド骨格」と称され、プラスミド骨格は、プラスミドのクローニング及び増幅、増殖及び組換えウイルス産生のために必要なプロセスのために重要であるが、それ自体はｒＡＡＶ粒子中にパッケージング又はカプシド形成されない。したがって、ベクター「ゲノム」とは、ｒＡＡＶによりパッケージングされているか又はカプシド形成された核酸を指す。
【００３２】
[0041]「ＡＡＶヘルパー機能」とは、ＡＡＶ由来のコード配列（タンパク質）を指し、そのコード配列は、発現されてＡＡＶ遺伝子生成物及びＡＡＶベクターを提供することができて、順送りで、ｔｒａｎｓの形態で増殖性ＡＡＶ複製及びパッケージングのために自動的に機能する。したがって、ＡＡＶヘルパー機能は、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｒｅｐ及びｃａｐの両方を含む。ｒｅｐ発現生成物は、とりわけ：ＤＮＡ複製のＡＡＶ起源の認識、結合及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；並びにＡＡＶ（又は他の異種）プロモーターからの転写の調整を含む多くの機能を有することが示されている。ｃａｐ発現生成物（カプシド）は必要なパッケージング機能を供給する。ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶベクターゲノムから消失しているＡＡＶ機能をｔｒａｎｓの形態で補うために使用される。
【００３３】
[0042]「ＡＡＶヘルパー構築物」とは、例えば、対象に対する遺伝子療法のために、目的の核酸配列を送達するための形質導入ＡＶＶベクターを製造するために使用されるべきＡＡＶベクターから欠失されたＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸配列を一般的に指す。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶベクター複製に必要な消失しているＡＡＶ機能を補うために、ＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を一過性で発現させるために、通常使用される。ヘルパー構築物は、ＡＡＶのＩＴＲを一般的に欠いて、それら自体で複製もパッケージングもできない。ＡＡＶヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、又はビリオンの形態にあることができる。幾つかのＡＡＶヘルパー構築物は、Ｒｅｐ及びＣａｐ発現生成物の両方をコードするプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐＩＭ２９＋４５などと記載されている（例えば、Ｓａｍｕｌｓｋら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８；及びＭｃＣａｒｔｙら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２９３６〜２９４５を参照されたい）。Ｒｅｐ及び／又はＣａｐ発現生成物をコードする多くの他のベクターが記載されている（例えば、米国特許第５，１３９，９４１号及び第６，３７６，２３７号を参照されたい）。
【００３４】
[0043]用語「補助機能」とは、ＡＡＶが複製のために依存する、ＡＡＶに由来しないウイルスの及び／又は細胞の機能を指す。用語は、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化、ステージ特異的なＡＡＶのｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶのＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現生成物の合成及びＡＡＶカプシドのパッケージングに関与する部分を含むＡＡＶ複製で必要とされるタンパク質及びＲＮＡを含む。ウイルスに基づく補助機能は、任意の公知のヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（１型単純ヘルペスウイルス以外）及びワクシニアウイルスから誘導することができる。
【００３５】
[0044]「補助機能ベクター」とは、補助機能を提供するポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を一般的に指す。そのような配列は、補助機能ベクター上にあり、適当な宿主細胞にトランスフェクトされ得る。補助機能ベクターは、宿主細胞中によるｒＡＡＶビリオン産生を支持することができる。補助機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン又はコスミドの形態にあることができる。加えて、全部のアデノウイルス遺伝子は、補助機能のために必要ではない。例えば、ＤＮＡ複製及び晩発の遺伝子合成ができないアデノウイルス突然変異体は、ＡＡＶ複製の複製を許容すると報告されている（Ｉｔｏら、（１９７０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．９：２４３；Ｉｓｈｉｂａｓｈｉら、（１９７１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４５：３１７）。同様に、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域内の突然変異体は、ＡＡＶ複製を支持することが示されており、Ｅ２Ｂ及びＥ３領域は、補助機能を提供することにおそらく関与しないことが示される（Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２６：５０５）。Ｅ１領域に欠陥があるか、又はＥ４領域が欠失しているアデノウイルスは、ＡＡＶ複製を支持することができない。したがって、Ｅ１Ａ及びＥ４領域は、直接又は間接的のいずれかで、ＡＡＶ複製のために必要であると思われる（Ｌａｕｇｈｌｉｎら、（１９８２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４１：８６８；Ｊａｎｉｋら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１９２５；Ｃａｒｔｅｒら、（１９８３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２６：５０５）。他のキャラクタライズされているアデノウイルス突然変異体には：Ｅ１Ｂ（Ｌａｕｇｈｌｉｎら（１９８２）、前出；Ｊａｎｉｋら（１９８１）、前出；Ｏｓｔｒｏｖｅら、（１９８０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １０４：５０２）；Ｅ２Ａ（Ｈａｎｄａら、（１９７５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．２９：２３９；Ｓｔｒａｕｓｓら、（１９７６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１７：１４０；Ｍｙｅｒｓら、（１９８０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３５：６６５；Ｊａｙら、（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２９２７；Ｍｙｅｒｓら、（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：５６７）；Ｅ２Ｂ（Ｉ  ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編、１９９０）におけるＣａｒｔｅｒ、Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  Ｈｅｌｐｅｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）；Ｅ３（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）、前出）；及びＥ４（Ｃａｒｔｅｒら（１９８３）、前出；Ｃａｒｔｅｒ（１９９５））が含まれる。Ｅ１Ｂコード領域における突然変異を有するアデノウイルスにより提供される補助機能の研究は、相反する結果を生じたが、Ｅ１Ｂ５５ｋはＡＡＶビリオン産生のために必要である可能性があり、一方、Ｅ１Ｂ１９ｋは必要ではない（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２０６〜２１０）。加えて、国際公開第９７／１７４５８号及びＭａｔｓｈｕｓｈｉｔａら、（１９９８）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：９３８〜９４５には、種々のアデノウイルス遺伝子をコードする補助機能ベクターが記載されている。例示的な補助機能ベクターは、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡコード領域���アデノウイルスＥ４  ＯＲＦ６コード領域、アデノウイルスＥ２Ａ  ７２ｋＤコード領域、アデノウイルスＥ１Ａコード領域、及び完全Ｅ１Ｂ５５ｋコード領域を欠くアデノウイルスＥ１Ｂ領域を含む。そのような補助機能ベクターは、例えば、国際公開第０１／８３７９７号に記載されている。
【００３６】
[0045]本明細書において使用する用語「血清型」は、他のＡＡＶ血清型と血清学的に区別されるカプシドを有するＡＡＶを指して使用される区別である。血清学的特殊性は、あるＡＡＶを別のＡＡＶと比較して抗体間の交差反応性の欠如を根拠に決定される。交差反応性の差は、カプシドタンパク質の配列／抗原決定基における差に通常起因する（例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列のＡＡＶ血清型の差に起因する）。
【００３７】
[0046]従来の定義に基づき、血清型は、目的ウイルスが、全ての既存の及びキャラクタライズされた血清型に対して特異的な血清に対して、中和活性について試験されて、目的ウイルスを中和する抗体が見出されなかったことを意味する。より多くの天然に生ずるウイルス単離体が発見されて及び／又はカプシド突然変異体が発生するので、現在存在する血清型のいずれかと血清学的差があることもあり、ないこともある。したがって、新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）が血清学的差を有しない場合、この新しいウイルス（例えば、ＡＡＶ）は、対応する血清型のサブグループ又は変異体である。多くの場合、カプシド配列が改変された突然変異体ウイルスについて、血清型の従来の定義による別の血清型のものであるかどうかを決定するために、中和活性についての血清学試験が、さらに実施されなければならない。したがって、便宜上及び繰り返しを避けるために、用語「血清型」とは、血清学的に区別されるウイルス（例えばＡＡＶ）並びに所与の血清型のサブグループ又は変異体の内であり得て血清学的に区別されないウイルス（例えば、ＡＡＶ）の両方を広く指す。
【００３８】
[0047]ｒＡＡＶベクターは、任意のウイルス株又は血清型を含む。非限定的な例として、ｒＡＡＶプラスミド又はベクターゲノム又は粒子（カプシドタンパク質）は、任意のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１などに基づき得る。そのようなベクターは、同じ株又は血清型に基づき得るか（又はサブグループ若しくは変異体）、又は互いに異なることもできる。非限定的な例として、１つの血清型のゲノムに基づくｒＡＡＶプラスミド又はベクターゲノム又は粒子（カプシド）は、ベクターをパッケージングするカプシドタンパク質の１種又は複数と同一であることができる。加えて、ｒＡＡＶプラスミド又はベクターゲノムは、ベクターゲノムをパッケージングするカプシドタンパク質の１種又は複数と区別されるＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２）の血清型ゲノムに基づき得、その場合、３種のカプシドタンパク質のうちの少なくとも１種が、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、又はそれらの変異体であることができる。ｒＡＡＶベクターは、それゆえに、特定の血清型、並びに混合血清型に対して特徴的な遺伝子／タンパク質配列と同一の遺伝子／タンパク質配列を含む。
【００３９】
[0048]種々の例示的な実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、１種又は複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はＡＡＶ１１のカプシドタンパク質と少なくとも７０％以上（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等）同一のカプシド配列を含むか又はそれらからなる。種々の例示的な実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、１種又は複数のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、又はＡＡＶ１１の逆位末端反復（ＩＴＲ）と少なくとも７０％以上（例えば、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％等）同一の配列を含むか又はそれらからなる。
【００４０】
[0049]ｒＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、及びＡＡＶ１１、並びに変異体、ハイブリッド及びキメラ配列は、当業者に公知の組換え技法を使用して、１種又は複数の機能的ＡＡＶのＩＴＲ配列が隣接する異種ポリヌクレオチド（例えば、Ｒｅｐ−１又はＲｅｐ−２配列）を含むように構築することができる。そのようなベクターは、全体又は一部が欠失した野生型のＡＡＶ遺伝子の１種又は複数を有するが、ｒＡＡＶベクター粒子中に組換えベクターをレスキュー、複製、及びパッケージングするために必要なので、少なくとも１種の機能的な隣接して存在するＩＴＲ配列（複数可）を保持する。ｒＡＡＶベクターゲノムは、それゆえに、複製及びパッケージングのために必要な配列（例えば、機能的ＩＴＲ配列）を、ｃｉｓの形態で含む。
【００４１】
[0050]ｒＡＡＶビリオンを発生させるための方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＡＡＶベクター及びＡＡＶヘルパー配列を、ＡＡＶヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はワクシニアウイルス）との共感染と併せて使用するトランスフェクション、又は組換えＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパーベクター、及び補助機能ベクターを用いるトランスフェクションが挙げられる。ｒＡＡＶビリオンを発生させるための方法は、例えば、米国特許第６，００１，６５０号及び第６，００４，７９７号に記載されているが、これらに限定されない。組換えｒＡＡＶベクターの産生（即ち、細胞培養系におけるベクターの発生）の後、ｒＡＡＶビリオンが宿主細胞及び細胞培養上清から得られ、任意選択で精製され得る。
【００４２】
[0051]用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む核酸、オリゴヌクレオチドの全て形態を指して互換的に使用される。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ、及びスプライスされた又はスプライスされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及び阻害ＤＮＡ又はＲＮＡ（ＲＮＡｉ、例えば、小さい若しくは短いヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小さい若しくは短い干渉（ｓｉ）ＲＮＡ、ｔｒａｎｓ−スプライシングＲＮＡ、又はアンチセンスＲＮＡ）を含む。核酸は、天然に生ずる、合成の、及び意図的に改変された又は変えられたポリヌクレオチドを含む。核酸は、一重、二重、又は三重、直鎖状又は環状であることができ、任意の長さのものであることができる。核酸を論ずる際に、本明細書では、特定のポリヌクレオチドの配列又は構造は、５’から３’方向で配列を提供する慣行に従って記載されることがある。
【００４３】
[0052]「宿主細胞」とは、ＡＡＶベクターのプラスミド、ＡＡＶヘルパー構造体、補助機能ベクター、又は他の転移ＤＮＡのレシピエントとして使用され得るか又は使用された、例えば、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、及び哺乳動物の細胞を指す。用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、「宿主細胞」とは、外来性ＤＮＡ配列をトランスフェクトされた細胞を一般的に指す。単一の親細胞の子孫は、自然の、偶発性の、又は故意の突然変異に起因して、形態又はゲノム又は全ＤＮＡの相補体が、元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよいと理解される。例示的な宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞などのヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞を含む。
【００４４】
[0053]「形質導入された細胞」は、導入遺伝子（例えば、ＣＨＭ又はＣＨＭ様配列）が導入されている細胞である。したがって、「形質導入された」細胞は、外来性分子、例えば、核酸（例えば、導入遺伝子）の細胞中への組み込み後の細胞における遺伝的変化を意味する。「形質導入された」はそれらの子孫も含む。細胞（複数可）は、増殖する（培養する）ことができ、細胞により、導入されたタンパク質（例えば、Ｒｅｐ−１又はＲｅｐ−２タンパク質）が発現され、又はｒＡＡＶなどのベクターが産生される。培養細胞の場合、染色体中に挿入された異種核酸配列などの核酸配列、又はプラスミド若しくはベクターは、複数の細胞継代の過程にわたり維持され得る。
【００４５】
[0054]「細胞株」とは、インビトロの適当な培養条件下で連続した又は長期の成長及び分裂が可能な細胞の集団を指す。細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローンの集団であり得るが、そうである必要はない。細胞株では、自発的な又は誘導された変化が、そのようなクローンの集団の貯蔵又は移動中、並びに組織培養における長期の継代中に核型で起こり得る。したがって、細胞株に由来する子孫細胞は、祖先細胞又は培養物と厳密には同一でないこともある。本発明の活性方法に適用可能な例示的な細胞株はＨＥＫ−ＬＲＡＴ細胞などのＨＥＫ２９３である。
【００４６】
[0055]「発現制御要素」とは、作動可能に連結した核酸の発現に影響する核酸配列（複数可）を指す。制御要素は、本明細書で説明されるプロモーター及びエンハンサーなどの発現制御要素を含む。ｒＡＡＶベクターは１種又は複数の「発現制御要素」を含むことができる。典型的には、そのような要素が含まれて、適当な異種ポリヌクレオチドの転写及び適当ならば翻訳を容易にする（例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロンのためのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡのフレーム内翻訳を可能にする遺伝子の正確な読み取りフレームの維持、及び停止コドン等）。そのような要素は、典型的には、ｃｉｓの形態で作用して、「ｃｉｓ作用性」要素と称されるが、ｔｒａｎｓの形態で作用することもある。
【００４７】
[0056]発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージの安定性等のレベルで影響され得る。典型的には、転写を調整する発現制御要素は、転写される核酸の５’末端付近（即ち、「上流」）に並置される。発現制御要素は、転写される配列の３’末端（即ち、「下流」）に又は転写物内（例えば、イントロン中）に配置することもできる。発現制御要素は、転写される配列に隣接して、又は距離をおいて（例えば、ポリヌクレオチドから１〜１０、１０〜２５、２５〜５０、５０〜１００、１００〜５００、又はそれを超えるヌクレオチド）、かなりの距離でも配置され得る。それにも拘わらず、ｒＡＡＶベクターの長さの制限があるので、発現制御要素は、典型的には、転写される核酸から１〜１０００ヌクレオチド以内である。
【００４８】
[0057]機能的に、作動可能に連結した核酸の発現は、要素（例えば、プロモーター）により少なくとも部分的に制御可能であり、その結果、要素が核酸の転写及び、適当な場合には、転写物の翻訳を調整する。発現制御要素の具体的な例は、プロモーターであり、プロモーターは転写される配列の５’に通常位置する。プロモーターは、典型的には、作動可能に連結した核酸から発現される量を、プロモーターが存在しない場合に発現される量と比較して増大させる。
【００４９】
[0058]本明細書において使用する「エンハンサー」は、選択可能なマーカーなどの核酸配列又は異種核酸配列に隣接して位置する配列を指すことができる。エンハンサー要素は、典型的には、プロモーター要素の上流に位置するが、機能しもする、そして配列の下流又は配列内部に位置することもできる。それゆえに、エンハンサー要素は、上流でも下流でも、例えば、選択可能なマーカー、及び／又は治療用タンパク質若しくはポリヌクレオチド配列をコードする異種核酸の１００塩基対、２００塩基対、又は３００以上の塩基対以内に位置することができる。エンハンサー要素は、典型的には、作動可能に連結した核酸の発現を、プロモーター要素により生ずる発現を超えて増大させる。
【００５０】
[0059]用語「作動可能に連結した」は、核酸配列の発現に必要な調節配列が、核酸配列の発現に効果をもたらすように、配列に対して適当な位置に置かれることを意味する。この同じ定義が、時には、発現ベクター、例えば、ｒＡＡＶベクターにおける核酸配列及び転写制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び停止要素）の配置に適用される。
【００５１】
[0060]核酸と作動可能に連結している発現制御要素の例では、関係は、制御要素が核酸の発現を調整するようになっている。より詳細には、例えば、作動可能に連結した２つのＤＮＡ配列は、２つのＤＮＡがＤＮＡ配列の少なくとも１つが他の配列に対して生理学的効果を及ぼすことができる、そのような関係で配置されている（ｃｉｓ又はｔｒａｎｓ）ことを意味する。
【００５２】
[0061]したがって、ベクターのための追加要素は、ＡＡＶのＩＴＲ配列、又はイントロンの１つ又は複数のコピーなどの配列に隣接して存在する、発現制御要素（例えば、プロモーター／エンハンサー）、転写停止シグナル又は停止コドン、５’又は３’の非翻訳領域（例えば、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）配列）を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
[0062]さらなる要素は、例えば、パッケージングを改善し、混入核酸の存在を減少させるための、例えば、フィラー又はスタッファーのポリヌクレオチド配列を含む。ＡＡＶベクターは、典型的には、一般的に約４ｋｂ〜約５．２ｋｂ、又は僅かにそれを超えるサイズ範囲を有するＤＮＡの挿入を受け入れる。したがって、より短い配列に対して、ｒＡＡＶ粒子中へのベクターのパッケージングのために許容されるウイルスゲノム配列の正常サイズ近くに又は正常サイズに、長さを調節するために、スタッファー又はフィラーが含まれる。種々の実施形態では、フィラー／スタッファーの核酸配列は、核酸の非翻訳（非タンパク質コード）セグメントである。４．７Ｋｂ未満の核酸配列に対して、フィラー又はスタッファーのポリヌクレオチド配列は、配列と組み合わされたときに（例えば、ベクター中に挿入）、約３．０〜５．５Ｋｂの間、又は約４．０〜５．０Ｋｂの間、又は約４．３〜４．８Ｋｂの間の全長を有する長さを有する。
【００５４】
[0063]特に断りのない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解される同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと同様な又は等価の方法及び材料が、本発明の実行又は試験で使用され得るが、適当な方法及び材料が本明細書に記載されている。
【００５５】
[0064]本明細書に挙げた全ての特許出願、出版物、特許及び他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋの引用及びＡＴＣＣの引用は、参照によりそれらの全体で組み込まれる。相容れない場合には、定義を含む本明細書が優先する。
【００５６】
[0065]本明細書で開示された特徴の全ては、任意の組合せで組み合わされてもよい。本明細書で開示された各特徴は、同じ、等価の、又は同様な目的に役立つ代替的特徴により置き換えることもできる。したがって、別段明確に述べられていない限り、開示された特徴（例えば、ＣＨＭ又はＣＨＭ様配列、ベクター、ｒＡＡＶベクター等）は、等価の又は同様な特徴の部類の例である。
【００５７】
[0066]本明細書において使用する、単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈上別段明確に示されていない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「あるＡＡＶベクター」、又は「ＡＡＶ粒子」への言及は、複数のそのようなＡＡＶベクター及びＡＡＶ粒子を含み、「ある細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」又は「宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の細胞及び宿主細胞を含む。
【００５８】
[0067]本明細書において使用する用語「約」は、基準値の１０％（プラス又はマイナス）以内にある値を意味する。
【００５９】
[0068]本明細書において使用する、全て数値又は数の範囲は、前後関係で他のように明確に示されない限り、そのような範囲内の整数及び範囲内の値の端数又は整数を含む。したがって、例示すると、８０％以上の同一性への言及は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％等、並びに８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％等、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％等を含む。
【００６０】
[0069]超又は未満を伴う整数への言及は、言及された数を超えるか又は未満の任意の数をそれぞれ含む。したがって、例えば、１００未満への言及は、９９、９８、９７等、ずっと下がって数１までの全てを含み；１０未満は、９、８、７等、ずっと下がって数１までの全てを含む。
【００６１】
[0070]本明細書において使用する、全て数値又は範囲は包括的である。さらに、全ての数値又は範囲は、文脈上別段明確に示されていない限り、そのような範囲内の値の端数及び整数、並びにそのような範囲内の整数の端数を含む。したがって、例示すると、１〜１０などの数の範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等を含む。それゆえに、１〜５０の範囲への言及は、５０を含め５０までを含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０等、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５等（以下同様）を含む。
【００６２】
[0071]一連の範囲への言及は、その一連の範囲内の異なる範囲の境界の値を組み合わせる範囲を含む。したがって、例示すると、一連の範囲、例えば、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１，０００、１，０００〜１，５００、１，５００〜２，０００、２，０００〜２，５００、２，５００〜３，０００、３，０００〜３，５００、３，５００〜４，０００、４，０００〜４，５００、４，５００〜５，０００、５，５００〜６，０００、６，０００〜７，０００、７，０００〜８，０００、又は８，０００〜９，０００への言及は、１０〜５０、５０〜１００、１００〜１，０００、１，０００〜３，０００、２，０００〜４，０００等の範囲を含む。
【００６３】
[0072]本発明は、本明細書で肯定的言語を使用して一般的に開示され、多数の実施形態及び態様が説明されている。本発明は、物質若しくは材料、方法ステップ及び条件、プロトコール、又は手順などの特定の対象事物が全部又は一部除外される実施形態も特定して含む。例えば、本発明のある実施形態又は態様では、材料及び／又は方法ステップが除外される。したがって、本発明が含まないことに関して、たとえ本発明が本明細書で一般的に表現されていなくても、それにも拘わらず、本発明で明白に除外されていない態様が、本明細書で開示されている。
【００６４】
[0073]本発明の幾つかの実施形態が記載されている。それにも拘わらず、当業者は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の種々の変更及び改変を行って、本発明を種々の用途及び条件に適合させることができる。したがって、以下の例は、例示することを意図するが、特許請求された本発明の範囲を限定することは意図しない。
【実施例】
【００６５】
実施例１
[0074]簡単なウェスタンアッセイは、適切化された定量的アッセイの例である（ＷＥＳ）。再現性、定量、結果までの時間及び全データの信頼性に影響する使用される手動のプロセスの変動性は排除される。
【００６６】
[0075]試料のロード、サイズに基づくタンパク質分離、イムノプロービング又は全タンパク質標識、洗浄、検出及びデータ分析を含む全てのアッセイステップは自動的に実施される。２ｋＤａのように小さい又は４４０ｋＤａのように大きいタンパク質の分離及び検出を、僅か３時間で実施することができる。
【００６７】
[0076]試料のデータは、アッセイが完了すると直ちに画像のような可視的ブロットでレーンにより示される。分子量などの定量的結果は、シグナル強度（面積）、面積％で、及び免疫的に検出された各タンパク質についてのシグナル対ノイズ比は、結果の表で自動的に提示される。
【００６８】
[0077]図４で例示されるように、４０ｎＬのように少量の試験細胞ライセートをＷＥＳ装置にロードする。タンパク質は、それらがスタッキング及び分離マトリックスを通して移送するにつれてサイズにより自動的に分離される。分離されたタンパク質は、次に、光で活性化された捕捉化学反応により毛細管壁に固定化される。標的ＲＥＰ−１タンパク質は、一次抗体を使用して同定し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲート二次抗体を使用して検出する。ビオチニル化Ｒａｂは、ストレプトアビジン−ＨＲＰを使用して化学発光により、検出される。生じる化学発光シグナルを検出して定量する。
【００６９】
実施例２
[0078]ビオチン組み込みは、ＤｙＬｉｇｈｔ８００を用いてストレプトアビジンコンジュゲートを使用することにより分析した。ＲＥＰ−１発現は、一次抗ＲＥＰ１−抗体、クローン２Ｆ１（ＭＡＢＮ５２）、及びＤｙＬｉｇｈｔ６８０とコンジュゲートさせた二次ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を用いて検出した。プレニル化されていないＲａｂだけが、インビトロプレニル化アッセイで標識されて、分子量約２０〜２５ｋＤａのバンドとして可視化された。イムノブロットをＯｄｙｓｓｅｙ赤外撮像装置（ＬｉＣＯＲ）を使用して走査した。
【００７０】
[0079]内因性ＲＥＰ−１の微かなバンド（約７５〜８０ｋＤａ、ＲＥＰ１矢印）が、未処理及び非形質導入ＨＥＫ２９３細胞のコンパクチンで処理されたライセートで検出された（図５Ａ、レーン１、３、及び５）。ＲＥＰ１発現のレベルは、ニワトリ−ベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターの制御下で、Ｒａｂエスコートタンパク質−１（ＲＥＰ−１）をコードする試験ＣＨＭ遺伝子を担持するＡＡＶ２ベクター（ＡＡＶ２−ＣＨＭベクター）を形質導入されたＨＥＫ２９３細胞で有意に高かった（図５Ａ、レーン２、４、及び６）。プレニル化されていないＲａｂ（他の矢印により示される）は、Ｒａｂエスコートタンパク質−１（ＲＥＰ−１）をコードする試験ＣＨＭ遺伝子を担持するＡＡＶ２ベクターを形質導入されていないか（図５Ａ、レーン５）、形質導入されて（図５Ａ、レーン６）コンパクチン処理された細胞で明瞭に観察された。プレニル化における差が、コンパクチン処置されていないＨＥＫ２９３細胞では観察されなかった（図５Ａ、レーン１及び２）。陰性対照については、インビトロでプレニル化されたＲａｂが観察された（図５Ｂ）。
【００７１】
[0080]同じプレニル化アッセイを、フィーダー細胞上で増殖したｉＰＳＣ−ＣＨＭｐｏｓ、ｉＰＳＣ−ＣＨＭｎｅｇ細胞で、及びフィーダー細胞なしのｉＰＳＣ−ＣＨＭｎｅｇ細胞で実施した。
【００７２】
[0081]図６Ａ、レーン１、３及び５は、非形質導入細胞からの細胞ライセートを表す。
【００７３】
[0082]図６Ａ、レーン２、４及び６は、Ｒａｂエスコートタンパク質−１（ＲＥＰ−１）をコードするＣＨＭ発現カセットを担持する１００，０００ｖｇ／細胞のＡＡＶ２ベクターを形質導入された細胞由来のライセートを表す。
【００７４】
[0083]ＲＥＰ１に対応する約７５〜８０ｋＤａのバンド（ＲＥＰ１、矢印）は、非形質導入ｉＰＳＣ−ＣＨＭｐｏｓ細胞（図６Ａ、レーン１）及び形質導入されたｉＰＳＣ−ＣＨＭｐｏｓ細胞（図６Ａ、レーン２）で明確に可視化されている。ＲＥＰ−１発現は、非形質導入ｉＰＳＣ−ＣＨＭｎｅｇ細胞では検出可能でない（図６Ａ、レーン３及び５）が、ＲＥＰ−１をコードするＣＨＭ発現カセットを担持するＡＡＶ２ベクターを形質導入されたｉＰＳＣ−ＣＨＭｎｅｇ細胞で観察することができる（図６Ａ、レーン４及び６）。プレニル化されていないＲａｂ（矢印）のレベルは、Ｒａｂエスコートタンパク質（ＲＥＰ−１）をコードするＣＨＭ発現カセットを担持するＡＡＶ２ベクターを形質導入されたｉＰＳＣ−ＣＨＭｎｅｇ細胞で低下している（図６Ａ、レーン４及び６）。陰性対照については、インビトロでプレニル化されたＲａｂが観察された（図６Ｂ）。
【００７５】
実施例３
[0084]ＲＰＥ細胞中のＲｅｐ−１及びＲａｂタンパク質について本明細書で例示したプレニル化の力価アッセイは、ＲＰＥ及び他のタイプの細胞において、プレニル化プロセスで決定的に重要な他のタンパク質（例えばＲｅｐ−２）、又はプレニル化のための主要な基質（記載された約７０種のＲａｂタンパク質）についても使用することができる。例えば、網膜における他の対応する遺伝子の突然変異が、コーン−ロッドジストロフィー（ＣＲＤ）、先天性停止性夜盲症（ＣＳＮＢ）、ジュベール症候群（ＪＳ）、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、メバロン酸キナーゼ欠損症（ＭＫＤ）、網膜疾患（ＲＤ）及び網膜色素変性症（ＲＰ）の原因となることが発見された。
【００７６】
【表１】
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【００７７】
〔関連出願の情報〕
[0001]本出願は、２０１６年１１月６日出願の米国特許仮出願第６２／４１８，６３７号に対する優先権を主張する。前述の出願の全内容は、本文、表、配列表及び図面の全てを含めて参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【国際調査報告】
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