(57)【要約】  間葉系幹細胞表現型及び筋細胞表現型を有する混合特性の単離細胞と、この細胞から分泌される細胞外小胞と、この細胞を含む医薬組成物と、この細胞を投与することを含む治療方法とが提供される。更に、この細胞を同時投与して外来細胞の生着を高める方法が提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合特性の単離細胞であって、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）表現型と筋細胞表現型を示す、細胞。
【請求項２】
前記ＭＳＣ表現型は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ１４６及びＣＤ４４から成る群から選択される複数の発現マーカーの発現を含み、ＭＨＣＩＩの発現が欠如している、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記ＭＳＣ表現型は免疫抑制能力を含む、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
前記ＭＳＣ表現型は抗炎症能力を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
前記ＭＳＣ表現型は炎症、傷害又は疾患の部位に帰着する能力を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
前記筋細胞表現型は、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ６、Ｍｙｆ５、ＭＲＦ４、ＩＴＧＡ７、オステオプロテゲリン、イリシン、ジストロフィン、ミオシン重鎖、ミオゲニン、ＰＡＸ７、ＴＡＬＮＥＣ２、Ｃ−ＭＥＴ、Ｇ−ＣＳＦ、オステオプロテゲリン、ＩＬ−１０及びＭＥＦ２Ａから成る群から選択される複数の発現マーカーの発現を含み、オステオカラシン、ＰＰＡＲＧ３及びＣＯＬ２Ａ１の発現が欠如している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記筋細胞表現型は筋シンシチウムと融合する能力を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項８】
前記筋細胞表現型は衛星細胞表現型を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
前記筋細胞表現型は筋芽細胞表現型を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞の生成は、
ａ．ＭＳＣを用意し、
ｂ．ＲＯＣＫ阻害剤、酸性培地及び５−ＡＺＡの内の少なくとも１種と前記ＭＳＣを接触させ、
ｃ．ＰＤＧＦＢＢ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦβ、ＰＤＧＦＡＡ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ及びＩＧＦ１の内の少なくとも１種を前記ＭＳＣに導入して行う、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞の生成は、ＰＣＡＴ１と、ＮＥＡＴ１又はＧＡＳ５と、ＰＴＥＮＰ１の発現阻害剤とを前記ＭＳＣに更に導入して行う、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記細胞の生成は、筋細胞、筋細胞の馴化培地、又は筋細胞の細胞外小胞とＭＳＣを共培養して行う、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
前記細胞の生成は、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４又はこれらの組み合わせの内のいずれか１種をＭＳＣに導入して行う、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記細胞の生成は、５−ＡＺＡを含む培地中で前記細胞を更にインキュベートして行う、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記細胞の生成は、
ａ．酸性培地、
ｂ．低酸素、
ｃ．低接着プレート、
ｄ．ＦＧＦ又はＥＧＦを補充した低血清培地、
ｅ．５−ＡＺＡを補充した培地、
ｆ．ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＴＡＴ３、ＮＦ−ＫＢ活性化剤、ＣＨＩＲ９９０２１、メトホルミン、トラニルシプロミン、Ｇｓｋ３阻害剤、３−デアザネプラノシンＡ、ｍＴｏｒ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、チアゾビビン、Ａ８３−０１、ＬｉＣｌ、ＳＢ４３１５４２、５−ＡＺＡ、ラパマイシン、ＥＲＫ活性化剤及びバルプロ酸から成る群から選択される小分子を含む培地、及び
ｇ．これらの組み合わせの内のいずれか１種でＭＳＣを培養して行う、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞の生成は、ＭＹＦ５、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ジストロフィン、マイクロジストロフィン、ユートロフィン、ＭｙｏＤとＰＡＸ３、ＭｙｏＤとＰＡＸ７、及びＭｙｏＤとＭＹＦ５から成る群から選択される少なくとも１種の転写因子をＭＳＣに導入して行う、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞の生成は、
ａ．ＭＳＣを用意し、
ｂ．酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤及び５−ＡＺＡの内の少なくとも１種と前記ＭＳＣを接触させ、
ｃ．ＢＩＬ、ＰＡＲ５、ＢＩＣ、ＤＩＳＣ２、ＧＡＳ５ＤＬＧ２ＡＳ、７ＳＫ、Ｙ１、ＬＩＮＣＲＮＡ、ＰＣＡＴ−１、ＳＦＭＢＴ２、Ｙ４、ＳＣＡ８、ＭＡＬＡＴ１、ＭＥＧ３、ＮＥＡＴ１、ＥＧＯ、ＧＡＳ５、ＫＲＡＳＰ１、ＬＯＣ２８５１９、ＢＣ２００及びＨ１９から成る群から選択される少なくとも１種の長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を前記ＭＳＣに導入して行う、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
前記少なくとも１種のｌｎｃＲＮＡは、ＰＡＲ５、ＤＩＳＣ２及びＰＣＡＴ１から選択される、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
前記細胞の生成は、ＭＡＬＡＴ１、ＭＥＧ３、ＮＥＡＴ１、ＥＧＯ、ＧＡＳ５、ＫＲＡＳＰ１、ＬＯＣ２８５１９、ＢＣ２００及びＨ１９から成る群から選択される少なくとも１種のｌｎｃＲＮＡを前記ＭＳＣに更に導入して行う、請求項１７に記載の細胞。
【請求項２０】
前記細胞の生成は、前記ＭＳＣでのＡＮＲＩＬ、ＰＴＥＮＰ１及びａＨＩＦの内の少なくとも１種の発現を更に下方制御して行う、請求項１７に記載の細胞。
【請求項２１】
前記細胞は衛星細胞表現型を示す、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２２】
前記細胞の生成は、
ａ．ＭＳＣを用意し、
ｂ．酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤及び５−ＡＺＡの内の少なくとも１種と前記ＭＳＣを接触させ、
ｃ．ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−５２０、ｍｉＲ−５２４、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−５５０、ｍｉＲ−５６１、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−５８２、ｍｉＲ−５８３、ｍｉＲ−５８７、ｍｉＲ−６１３、ｍｉＲ−６１４、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６３４、ｍｉＲ−６４５、ｍｉＲ−６４６、ｍｉＲ−６４９、ｍｉＲ−６６１、ｍｉＲ−６６２、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−６７１、ｍｉＲ−８８７、ｍｉＲ−１１８３、ｍｉＲ−１２２４、ｍｉＲ−１２２５、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２３４、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２４７、ｍｉＲ−１２５７、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１２６８、ｍｉＲ−１２６９、ｍｉＲ−１２８９、ｍｉＲ−１２８７、ｍｉＲ−１９０９、ｍｉＲ−１９１１、ｍｉＲ−７５９、ｍｉＲ−３１５０、ｍｉＲ−３１７４、ｍｉＲ−３１８０、ｍｉＲ−３１９１、ｍｉＲ−３１９７、ｍｉＲ−４２９２、ｍｉＲ−２１１５、ｍｉＲ−４３１２、ｍｉＲ−９２、９３及びｍｉＲ−９９から成る群から選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを前記ＭＳＣに導入して行う、請求項１〜９に記載の細胞。
【請求項２３】
前記少なくとも１種のｍｉＲは、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−６１４及びｍｉＲ−６６８から成る群から選択される、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
前記ＭＳＣは臍帯又は胎盤に由来する、請求項１０〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５】
前記細胞は、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧから成る群から選択される複数の幹細胞性マーカーを発現する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６】
前記細胞は、ＶＥＧＦ、ＧＤＮＦ及びＩＧＦ１から選択される少なくとも１種の栄養因子を分泌する、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
前記細胞は、前記細胞表面の筋細胞標的化部分又は前記細胞の細胞外小胞の表面を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８】
前記筋細胞標的化部分は、カベオリン３に対するリガンド、Ｍ−カドヘリン、ニコチン性アセチルコリン受容体に対するリガンド、ミオスタチンのドミナントネガティブ突然変異体、及び１型アンジオテンシンＩＩの内のいずれか１種を含む、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
前記筋細胞標的化部分はＭ−カドヘリンを含む、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
前記細胞は治療剤を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１】
前記治療剤は、薬物、リードスルー薬物、ＲＮＡ、ＤＮＡ分子、ベクター、エクソンスキリングオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンタゴミル、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）及びウイルスから成る群から選択される、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
前記ＲＮＡは修飾ＭｙｏＤ  ｍＲＮＡである、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３３】
前記薬物はジストロフィン又はマイクロジストロフィンである、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３４】
前記アンタゴミルは、抗ｍｉＲ−４２４、抗ｍｉＲ−１９５、抗ｍｉＲ−１６、抗ｍｉＲ−４９７、抗ｍｉＲ−１３５、抗ｍｉＲ−６７９３、抗ｍｉＲ−２１、抗ｌｅｔ７、抗ｍｉＲ−１３３ｂ、抗ｍｉＲ−２１４及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３５】
前記アンタゴミルは抗ｌｅｔ−７である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３６】
抗ｍｉＲ−２１４を更に含む、請求項３３に記載の細胞。
【請求項３７】
請求項１〜３６に記載の細胞のいずれかの単離細胞外小胞。
【請求項３８】
ａ．請求項１〜３６のいずれか一項に記載の混合特性の細胞、
ｂ．請求項３７に記載の細胞外小胞、及び
ｃ．これらの組み合わせの内のいずれか１種を含む、医薬組成物。
【請求項３９】
薬学的に許容し得る担体又はアジュバントを更に含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
筋肉関連疾患又は筋損傷の治療、予防又は改善を必要とする対象において筋肉関連疾患又は筋損傷を治療、予防又は改善する方法であって、請求項３８又は３９に記載の医薬組成物を前記対象に投与して前記筋肉関連疾患又は筋損傷を治療、予防又は改善する段階を含む、方法。
【請求項４１】
前記組成物は、前記対象に対して同種異系又は自家性であるＭＳＣに由来する細胞を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記筋肉関連疾患又は筋損傷は、運動ニューロン疾患、末梢ニューロン疾患、筋ジストロフィー、脊髄損傷、筋肉疲労、心筋傷害、炎症性筋疾患、重症筋無力症、筋肉減少症、悪液質、線維症、平滑筋傷害及び骨格筋傷害から成る群から選択される、請求項４０又は４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記筋肉関連疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、線維症、悪液質及び筋ジストロフィーから成る群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記筋ジストロフィーはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記線維症は心線維症である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記筋肉関連疾患はＡＬＳであり、この方法は、星状細胞表現型又は神経幹細胞（ＮＳＣ）表現型に分化した少なくとも１種のＭＳＣを投与する段階を更に含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
ａ．未分化ＭＳＣ、
ｂ．前記未分化ＭＳＣの細胞外小胞、及び
ｃ．これらの組み合わせの内のいずれか１種を投与する段階を更に含む、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１６年５月１６日出願の米国特許仮出願第６２／３３６，８５８号の優先権の利益を主張するものであり、この出願の全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の筋肉への分化と筋疾患及び運動ニューロン疾患の治療である。
【背景技術】
【０００３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、自己骨髄、歯髄又は脂肪組織、或いは同種異系羊水、胎盤及び臍帯から得ることができる中胚葉由来間質細胞の異種集団である。この最後の３種の源から得られるＭＳＣは非免疫原性であるため、既製の細胞として使用することができる。最近の報告では、これらの細胞が軟骨、骨及び脂肪細胞に分化する天然の能力を有すると共に、他の細胞型、例えば、肝細胞、筋細胞、内皮細胞、神経細胞及びインスリン産生細胞にトランス分化する可能性があることも示されている。
【０００４】
ＭＳＣは、実験動物モデルにおいて、最近ではパイロット臨床試験において様々な疾患及び機能不全に対して治療効果を発揮することが示されている（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，１６８：３１９１−３１９９、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，１０：１０６）。これらの細胞は炎症及び傷害の部位に移動して生着する能力を有し、常在組織に局所的効果を及ぼす。成体ＭＳＣは非免疫原性であることが報告されているが、これは、成体ＭＳＣの同種異系宿主への移植に免疫抑制が必要でないことを示す。
【０００５】
研究によって、ＭＳＣは免疫抑制性と免疫調節性を有することが示されている。ＭＳＣの有益な効果は主にこの免疫調節活性と栄養因子の分泌に起因する。実際、ＭＳＣは増殖因子、サイトカイン及びケモカイン等の様々な生理活性分子を分泌し、複数の組織に栄養支持をもたらすことができる。更に、最近の研究では、ＭＳＣが細胞間情報伝達の一部として様々なタンパク質に加えてＲＮＡ及びＤＮＡ分子を送達する細胞外小胞を分泌することが実証された。
【０００６】
最近の研究では、ＭＳＣは筋細胞にも分化することができ、イヌ及びマウスのデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）動物モデルにおいて、これらの細胞の筋原性分化が治療効果を増強することが実証された（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１６（５）：６９５−７０６、Ｇｏｕｄｅｎｅｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（６）：１０６４−７２）。従って、筋肉再生に関与する主細胞であるＭＳＣ由来衛星細胞（ＳＣ）、又は筋細胞自体の使用は、様々な筋変性疾患、例えば、ＤＭＤ、筋損傷、悪液質及び加齢、更には運動ニューロン疾患及び末梢ニューロン疾患における細胞置換療法のための自己細胞又は同種異系細胞の容易に入手可能な源としての大きな可能性を有する。
【０００７】
更に、筋芽細胞による治療は、虚血性四肢損傷の治療や運動ニューロンの損傷及び変性の疾患においても使用することができる。運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）は、運動ニューロンの変性及び死が生じる進行性の神経学的障害の群である。これらの疾患は筋疾患と同様に、徐々に起こる筋力低下や筋肉消耗、制御不能の痙攣、そして最終的には随意運動の制御の喪失を特徴とする。運動ニューロンは、神経支配の骨格筋によって分泌される標的由来因子に対する生存に依存する。従って、筋芽細胞の投与によって、損傷、傷害又は変性運動ニューロンの生存を支持する生理学的アプローチが得られる。
【０００８】
筋ジストロフィーや筋障害及び運動ニューロン障害は、遺伝的障害が体内の全ての筋肉／運動ニューロンに影響を及ぼすため、一般には治療が非常に困難である。更に、骨格筋は、有糸分裂後の核を有する大きな多核繊維で構成されているため、何らかの治療には数百万個の細胞を標的とする必要がある。しかし、以前の研究や我々の現在の技術では、ＭＳＣが炎症応答を低下させ、血管新生を増強させ、線維症を抑制し、ＳＣの増殖を高め、筋芽細胞及びＳＣに分化するよう誘導され得ることが示されている。このように、パラクリン作用を介して両組織に影響を及ぼす補足的方法、及び分化した細胞を用いる補充療法によって、ＭＳＣ治療は、変性炎症障害、傷害、悪液質及び老化に伴う様々な障害及び病態を理論的には標的とすることができる。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、混合特性の単離細胞と、この細胞によって分泌されるエキソソームと、この細胞を含む医薬組成物と、この細胞、エキソソーム又は組成物を投与する段階を含む、筋肉関連疾患及び損傷を治療する方法とを提供する。本発明は更に、本発明の組成物をこの細胞と同時投与する段階を含む、外来細胞の生着を高める方法を提供する。
【００１０】
第１の態様によると、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）表現型と筋細胞表現型を示す混合特性の単離細胞が提供される。
【００１１】
ある実施形態によると、ＭＳＣ表現型は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ１４６及びＣＤ４４から成る群から選択される複数の発現マーカーの発現を含み、ＭＨＣＩＩの発現が欠如している。ある実施形態によると、ＭＳＣ表現型は免疫抑制能力を含む。ある実施形態によると、ＭＳＣ表現型は抗炎症能力を含む。ある実施形態によると、ＭＳＣ表現型は炎症、傷害又は疾患の部位に帰着する能力を含む。
【００１２】
ある実施形態によると、筋細胞表現型は、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ６、Ｍｙｆ５、ＭＲＦ４、ＩＴＧＡ７、オステオプロテゲリン、イリシン、ジストロフィン、ミオシン重鎖、ミオゲニン、ＰＡＸ７、ＴＡＬＮＥＣ２、Ｃ−ＭＥＴ、Ｇ−ＣＳＦ、オステオプロテゲリン、ＩＬ−１０及びＭＥＦ２Ａから成る群から選択される複数の発現マーカーの発現を含み、オステオカラシン、ＰＰＡＲＧ３及びＣＯＬ２Ａ１の発現が欠如している。ある実施形態によると、筋細胞表現型は筋シンシチウムと融合する能力を含む。ある実施形態によると、筋細胞表現型は衛星細胞表現型を含む。ある実施形態によると、筋細胞表現型は筋芽細胞表現型を含む。
【００１３】
ある実施形態によると、細胞の生成は、ａ）ＭＳＣを用意し、ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤、酸性培地及び５−ＡＺＡの内の少なくとも１種とＭＳＣを接触させ、ｃ）ＰＤＧＦＢＢ、ＨＧＦ、ＰＤＧＦβ、ＰＤＧＦＡＡ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ及びＩＧＦ１の内の少なくとも１種をＭＳＣに導入して行う。
【００１４】
ある実施形態によると、細胞の生成は、ＰＣＡＴ１と、ＮＥＡＴ１又はＧＡＳ５と、ＰＴＥＮＰ１の発現阻害剤とをＭＳＣに更に導入して行う。
【００１５】
ある実施形態によると、細胞の生成は、筋細胞、筋細胞の馴化培地、又は筋細胞の細胞外小胞とＭＳＣを共培養して行う。
【００１６】
ある実施形態によると、細胞の生成は、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４又はこれらの組み合わせの内のいずれか１種をＭＳＣに導入して行う。ある実施形態によると、細胞の生成は、５−ＡＺＡを含む培地中でＭＳＣを更にインキュベートして行う。
【００１７】
ある実施形態によると、細胞の生成は、酸性培地、低酸素、低接着プレート、ＦＧＦ又はＥＧＦを補充した低血清培地、５−ＡＺＡを補充した培地、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＴＡＴ３、ＮＦ−ＫＢ活性化剤、ＣＨＩＲ９９０２１、メトホルミン、トラニルシプロミン、Ｇｓｋ３阻害剤、３−デアザネプラノシンＡ、ｍＴｏｒ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、チアゾビビン、Ａ８３−０１、ＬｉＣｌ、ＳＢ４３１５４２、５−ＡＺＡ、ラパマイシン、ＥＲＫ活性化剤及びバルプロ酸から成る群から選択される小分子を含む培地、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種でＭＳＣを培養して行う。
【００１８】
ある実施形態によると、細胞の生成は、ＭＹＦ５、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ジストロフィン、マイクロジストロフィン、ユートロフィン、ＭｙｏＤとＰＡＸ３、ＭｙｏＤとＰＡＸ７、及びＭｙｏＤとＭＹＦ５から成る群から選択される少なくとも１種の転写因子をＭＳＣに導入して行う。
【００１９】
ある実施形態によると、細胞の生成は、ａ）ＭＳＣを用意し、ｂ）酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤及び５−ＡＺＡの内の少なくとも１種とＭＳＣを接触させ、ｃ）ＢＩＬ、ＰＡＲ５、ＢＩＣ、ＤＩＳＣ２、ＧＡＳ５ＤＬＧ２ＡＳ、７ＳＫ、Ｙ１、ＬＩＮＣＲＮＡ、ＰＣＡＴ−１、ＳＦＭＢＴ２、Ｙ４、ＳＣＡ８、ＭＡＬＡＴ１、ＭＥＧ３、ＮＥＡＴ１、ＥＧＯ、ＧＡＳ５、ＫＲＡＳＰ１、ＬＯＣ２８５１９、ＢＣ２００及びＨ１９から成る群から選択される少なくとも１種の長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）をＭＳＣに導入して行う。ある実施形態によると、少なくとも１種のｌｎｃＲＮＡは、ＰＡＲ５、ＤＩＳＣ２及びＰＣＡＴ１から選択される。
【００２０】
ある実施形態によると、細胞の生成は、ＭＡＬＡＴ１、ＭＥＧ３、ＮＥＡＴ１、ＥＧＯ、ＧＡＳ５、ＫＲＡＳＰ１、ＬＯＣ２８５１９、ＢＣ２００及びＨ１９から成る群から選択される少なくとも１種のｌｎｃＲＮＡをＭＳＣに更に導入して行う。ある実施形態によると、細胞の生成は、前記ＭＳＣでのＡＮＲＩＬ、ＰＴＥＮＰ１及びａＨＩＦの内の少なくとも１種の発現を更に下方制御して行う。ある実施形態によると、細胞は衛星細胞表現型を示す。
【００２１】
ある実施形態によると、細胞の生成は、ａ）ＭＳＣを用意し、ｂ）酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤及び５−ＡＺＡの内の少なくとも１種とＭＳＣを接触させ、ｃ）ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−５２０、ｍｉＲ−５２４、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−５５０、ｍｉＲ−５６１、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−５８２、ｍｉＲ−５８３、ｍｉＲ−５８７、ｍｉＲ−６１３、ｍｉＲ−６１４、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６３４、ｍｉＲ−６４５、ｍｉＲ−６４６、ｍｉＲ−６４９、ｍｉＲ−６６１、ｍｉＲ−６６２、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−６７１、ｍｉＲ−８８７、ｍｉＲ−１１８３、ｍｉＲ−１２２４、ｍｉＲ−１２２５、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２３４、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２４７、ｍｉＲ−１２５７、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１２６８、ｍｉＲ−１２６９、ｍｉＲ−１２８９、ｍｉＲ−１２８７、ｍｉＲ−１９０９、ｍｉＲ−１９１１、ｍｉＲ−７５９、ｍｉＲ−３１５０、ｍｉＲ−３１７４、ｍｉＲ−３１８０、ｍｉＲ−３１９１、ｍｉＲ−３１９７、ｍｉＲ−４２９２、ｍｉＲ−２１１５、ｍｉＲ−４３１２、ｍｉＲ−９２、９３及びｍｉＲ−９９から成る群から選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡを前記ＭＳＣに導入して行う。
【００２２】
ある実施形態によると、少なくとも１種のｍｉＲは、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−６１４及びｍｉＲ−６６８から成る群から選択される。
【００２３】
ある実施形態によると、ＭＳＣは臍帯又は胎盤に由来する。
【００２４】
ある実施形態によると、細胞は、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧから成る群から選択される複数の幹細胞性マーカーを発現する。
【００２５】
ある実施形態によると、細胞は、ＶＥＧＦ、ＧＤＮＦ及びＩＧＦ１から選択される少なくとも１種の栄養因子を分泌する。
【００２６】
ある実施形態によると、細胞は、細胞表面の筋細胞標的化部分又は細胞の細胞外小胞の表面を含む。ある実施形態によると、筋細胞標的化部分は、カベオリン３に対するリガンド、Ｍ−カドヘリン、ニコチン性アセチルコリン受容体に対するリガンド、ミオスタチンのドミナントネガティブ突然変異体、及び１型アンジオテンシンＩＩの内のいずれか１種を含む。ある実施形態によると、筋細胞標的化部分はＭ−カドヘリンを含む。
【００２７】
ある実施形態によると、細胞は治療剤を含む。ある実施形態によると、治療剤は、薬物、リードスルー薬物、ＲＮＡ、ＤＮＡ分子、ベクター、エクソンスキリングオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンタゴミル、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）及びウイルスから成る群から選択される。ある実施形態によると、ＲＮＡは修飾ＭｙｏＤ  ｍＲＮＡである。ある実施形態によると、アンタゴミルは、抗ｍｉＲ−４２４、抗ｍｉＲ−１９５、抗ｍｉＲ−１６、抗ｍｉＲ−４９７、抗ｍｉＲ−１３５、抗ｍｉＲ−６７９３、抗ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３３ｂ及びこれらの組み合わせから成る群から選択される。ある実施形態によると、アンタゴミルは抗ｌｅｔ−７である。
【００２８】
他の態様によると、本発明の細胞のいずれかの単離細胞外小胞が提供される。
【００２９】
他の態様によると、本発明の混合特性の細胞、本発明の細胞外小胞、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種を含む医薬組成物が提供される。
【００３０】
ある実施形態によると、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容し得る担体又はアジュバントを更に含む。
【００３１】
他の態様によると、筋肉関連疾患又は筋損傷の治療、予防又は改善を必要とする対象において筋肉関連疾患又は筋損傷を治療、予防又は改善する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与して筋肉関連疾患又は筋損傷を治療、予防又は改善する段階を含む方法が提供される。
【００３２】
ある実施形態によると、組成物は、対象に対して同種異系又は自家性であるＭＳＣに由来する細胞を含む。
【００３３】
ある実施形態によると、筋肉関連疾患又は筋損傷は、運動ニューロン疾患、末梢ニューロン疾患、筋ジストロフィー、脊髄損傷、筋肉疲労、心筋傷害、炎症性筋疾患、重症筋無力症、筋肉減少症、悪液質及び骨格筋傷害から成る群から選択される。ある実施形態によると、筋肉関連疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、悪液質及び筋ジストロフィーから成る群から選択される。ある実施形態によると、筋ジストロフィーはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。
【００３４】
ある実施形態によると、筋肉関連疾患はＡＬＳであり、上述の方法は、星状細胞表現型又は神経幹細胞（ＮＳＣ）表現型に分化した少なくとも１種のＭＳＣを投与する段階を更に含む。
【００３５】
ある実施形態によると、本発明の方法は、未分化ＭＳＣ、未分化ＭＳＣの細胞外小胞、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種を投与する段階を更に含む。
【００３６】
本発明の更なる実施形態及び利用可能性の全範囲は、以下に記載の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、本発明の精神及び範囲内の様々な変更や改変は、この詳細な説明から当業者には明らかになるため、詳細な説明及び具体的な実施例は本発明の好ましい実施形態を示しているが、単なる例示として与えられていることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１−１】ＭＳＣは再生を増強し線維症を抑制する。（１Ａ）５×１０５個のＭＳＣ又はＣＤ３４＋細胞の注射から４週間後の野生型マウスの四頭筋におけるＶＥＧＦ、ＨＩＦ１α、ユートロフィン、コラーゲンＩ及びＮＣＡＭの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｂ）５×１０５個のＭＳＣ又はそのエキソソームの注射から４週間後のＭＤＸマウスの四頭筋におけるＴＮＦα、ユートロフィン、コラーゲンＩ及びＮＣＡＭの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｃ）各種組織由来の５×１０５個のＭＳＣの注射から４週間後のＭＤＸマウスの四頭筋におけるユートロフィンの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｄ）各種組織由来の５×１０５個のＭＳＣの注射から４週間後のＭＤＸマウスの四頭筋におけるコラーゲンＩの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｅ）５×１０５個のＭＳＣ由来のエキソソームの注射から４週間後のｍｄｘマウスの四頭筋においてＮＣＡＭ陽性細胞を計数して測定した再生率を示す棒グラフ。（１Ｆ）各種組織由来のＭＳＣと共培養したヒト筋細胞におけるユートロフィン発現の相対的レベルを示す棒グラフ。（１Ｇ）少なくとも４種の細胞の筋管に形成された筋芽細胞の％を示す棒グラフ。（１Ｈ）各種組織のＭＳＣと共培養した後の健常な筋芽細胞におけるＭＹＨ２タンパク質発現を示すウエスタンブロット画像。（１Ｉ）各種組織のＭＳＣと共培養したＤＭＤ患者由来の筋芽細胞において少なくとも４種の細胞の筋管に形成された筋芽細胞の％を示す棒グラフ。（１Ｊ）各種組織のＭＳＣ又はそのエキソソームと共培養した後の衛星細胞におけるＭｙｏＤタンパク質発現のウエスタンブロット画像。（１Ｋ）各種組織のＭＳＣ又はそのエキソソームと共培養した後のマウスＣ２Ｃ１２細胞におけるＭｙｏＤタンパク質発現のウエスタンブロット画像。ＢＭ−骨髄、ＡＤ−脂肪、ＡＭ−羊膜胎盤、ＣＨ−絨毛膜胎盤、ＵＣ−臍帯。
【図１−２】ＭＳＣは再生を増強し線維症を抑制する。（１Ａ）５×１０５個のＭＳＣ又はＣＤ３４＋細胞の注射から４週間後の野生型マウスの四頭筋におけるＶＥＧＦ、ＨＩＦ１α、ユートロフィン、コラーゲンＩ及びＮＣＡＭの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｂ）５×１０５個のＭＳＣ又はそのエキソソームの注射から４週間後のＭＤＸマウスの四頭筋におけるＴＮＦα、ユートロフィン、コラーゲンＩ及びＮＣＡＭの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｃ）各種組織由来の５×１０５個のＭＳＣの注射から４週間後のＭＤＸマウスの四頭筋におけるユートロフィンの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｄ）各種組織由来の５×１０５個のＭＳＣの注射から４週間後のＭＤＸマウスの四頭筋におけるコラーゲンＩの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｅ）５×１０５個のＭＳＣ由来のエキソソームの注射から４週間後のｍｄｘマウスの四頭筋においてＮＣＡＭ陽性細胞を計数して測定した再生率を示す棒グラフ。（１Ｆ）各種組織由来のＭＳＣと共培養したヒト筋細胞におけるユートロフィン発現の相対的レベルを示す棒グラフ。（１Ｇ）少なくとも４種の細胞の筋管に形成された筋芽細胞の％を示す棒グラフ。（１Ｈ）各種組織のＭＳＣと共培養した後の健常な筋芽細胞におけるＭＹＨ２タンパク質発現を示すウエスタンブロット画像。（１Ｉ）各種組織のＭＳＣと共培養したＤＭＤ患者由来の筋芽細胞において少なくとも４種の細胞の筋管に形成された筋芽細胞の％を示す棒グラフ。（１Ｊ）各種組織のＭＳＣ又はそのエキソソームと共培養した後の衛星細胞におけるＭｙｏＤタンパク質発現のウエスタンブロット画像。（１Ｋ）各種組織のＭＳＣ又はそのエキソソームと共培養した後のマウスＣ２Ｃ１２細胞におけるＭｙｏＤタンパク質発現のウエスタンブロット画像。ＢＭ−骨髄、ＡＤ−脂肪、ＡＭ−羊膜胎盤、ＣＨ−絨毛膜胎盤、ＵＣ−臍帯。
【図１−３】ＭＳＣは再生を増強し線維症を抑制する。（１Ａ）５×１０５個のＭＳＣ又はＣＤ３４＋細胞の注射から４週間後の野生型マウスの四頭筋におけるＶＥＧＦ、ＨＩＦ１α、ユートロフィン、コラーゲンＩ及びＮＣＡＭの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｂ）５×１０５個のＭＳＣ又はそのエキソソームの注射から４週間後のＭＤＸマウスの四頭筋におけるＴＮＦα、ユートロフィン、コラーゲンＩ及びＮＣＡＭの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｃ）各種組織由来の５×１０５個のＭＳＣの注射から４週間後のＭＤＸマウスの四頭筋におけるユートロフィンの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｄ）各種組織由来の５×１０５個のＭＳＣの注射から４週間後のＭＤＸマウスの四頭筋におけるコラーゲンＩの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｅ）５×１０５個のＭＳＣ由来のエキソソームの注射から４週間後のｍｄｘマウスの四頭筋においてＮＣＡＭ陽性細胞を計数して測定した再生率を示す棒グラフ。（１Ｆ）各種組織由来のＭＳＣと共培養したヒト筋細胞におけるユートロフィン発現の相対的レベルを示す棒グラフ。（１Ｇ）少なくとも４種の細胞の筋管に形成された筋芽細胞の％を示す棒グラフ。（１Ｈ）各種組織のＭＳＣと共培養した後の健常な筋芽細胞におけるＭＹＨ２タンパク質発現を示すウエスタンブロット画像。（１Ｉ）各種組織のＭＳＣと共培養したＤＭＤ患者由来の筋芽細胞において少なくとも４種の細胞の筋管に形成された筋芽細胞の％を示す棒グラフ。（１Ｊ）各種組織のＭＳＣ又はそのエキソソームと共培養した後の衛星細胞におけるＭｙｏＤタンパク質発現のウエスタンブロット画像。（１Ｋ）各種組織のＭＳＣ又はそのエキソソームと共培養した後のマウスＣ２Ｃ１２細胞におけるＭｙｏＤタンパク質発現のウエスタンブロット画像。ＢＭ−骨髄、ＡＤ−脂肪、ＡＭ−羊膜胎盤、ＣＨ−絨毛膜胎盤、ＵＣ−臍帯。
【図１−４】ＭＳＣは再生を増強し線維症を抑制する。（１Ａ）５×１０５個のＭＳＣ又はＣＤ３４＋細胞の注射から４週間後の野生型マウスの四頭筋におけるＶＥＧＦ、ＨＩＦ１α、ユートロフィン、コラーゲンＩ及びＮＣＡＭの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｂ）５×１０５個のＭＳＣ又はそのエキソソームの注射から４週間後のＭＤＸマウスの四頭筋におけるＴＮＦα、ユートロフィン、コラーゲンＩ及びＮＣＡＭの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｃ）各種組織由来の５×１０５個のＭＳＣの注射から４週間後のＭＤＸマウスの四頭筋におけるユートロフィンの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｄ）各種組織由来の５×１０５個のＭＳＣの注射から４週間後のＭＤＸマウスの四頭筋におけるコラーゲンＩの相対的発現レベルを示す棒グラフ。（１Ｅ）５×１０５個のＭＳＣ由来のエキソソームの注射から４週間後のｍｄｘマウスの四頭筋においてＮＣＡＭ陽性細胞を計数して測定した再生率を示す棒グラフ。（１Ｆ）各種組織由来のＭＳＣと共培養したヒト筋細胞におけるユートロフィン発現の相対的レベルを示す棒グラフ。（１Ｇ）少なくとも４種の細胞の筋管に形成された筋芽細胞の％を示す棒グラフ。（１Ｈ）各種組織のＭＳＣと共培養した後の健常な筋芽細胞におけるＭＹＨ２タンパク質発現を示すウエスタンブロット画像。（１Ｉ）各種組織のＭＳＣと共培養したＤＭＤ患者由来の筋芽細胞において少なくとも４種の細胞の筋管に形成された筋芽細胞の％を示す棒グラフ。（１Ｊ）各種組織のＭＳＣ又はそのエキソソームと共培養した後の衛星細胞におけるＭｙｏＤタンパク質発現のウエスタンブロット画像。（１Ｋ）各種組織のＭＳＣ又はそのエキソソームと共培養した後のマウスＣ２Ｃ１２細胞におけるＭｙｏＤタンパク質発現のウエスタンブロット画像。ＢＭ−骨髄、ＡＤ−脂肪、ＡＭ−羊膜胎盤、ＣＨ−絨毛膜胎盤、ＵＣ−臍帯。
【図２】ＭＳＣは筋細胞生着の有効性を高める。移植してから２週間後の移植ヒト筋芽細胞又は衛星細胞からの相対蛍光を示す棒グラフ。細胞は単独で移植するか又はＭＳＣと同時移植した。
【図３】プライムＭＳＣはＭｙｏＤを発現する。プライムＭＳＣにおけるＭｙｏＤ−ＧＦＰ発現を示す棒グラフ。
【図４】図４Ａ−図４Ｂ。プライム細胞は再生を増強し線維症を抑制する。（４Ａ）１×１０６個の非プライムＭＳＣとプライムＭＳＣの注射から４週間後の野生型マウスの四肢筋における線維症マーカーであるコラーゲンＩと再生マーカーであるＮＣＡＭの発現の変化率を示す棒グラフ。発現レベルの測定は疑似注射した対照四頭筋と比較して行う。（４Ｂ）カルジオトキシン処理から７日後の野生型マウスの腓腹筋における新生筋線維の数を示す棒グラフ。マウスにはＰＢＳ、ＭＳＣ又はプライムＭＳＣのいずれかを前注射した。
【図５−１】ＭＳＣ−筋細胞ハイブリッド細胞は筋マーカーと栄養因子を発現する。（５Ａ）プロトコル１でハイブリッド細胞に分化したＭＳＣと未処理ＭＳＣにおけるＭｙｏＤ発現を示す顕微鏡写真。（５Ｂ）ハイブリッド細胞に分化するようプロトコル１で処理した後の各種組織由来のＭＳＣにおけるＭｙｏＤ、ジストロフィン及びミオゲニンの相対的発現レベル示す棒グラフ。（５Ｃ）一緒に増殖させたハイブリッド細胞（赤色で表示）と筋細胞（緑色で表示）を示す顕微鏡写真。筋細胞とハイブリッド細胞の融合の位置を黄色（矢印）で表す。（５Ｄ）ハイブリッド細胞に分化するようプロトコル２で処理した後の各種組織由来のＭＳＣにおけるＭｙｏＤ、ジストロフィン及びミオゲニンの相対的発現レベル示す棒グラフ。（５Ｅ）ハイブリッド細胞に分化するようプロトコル１で処理した後の各種組織由来のＭＳＣにおけるＧＤＮＦ、ＩＧＦ１及びＶＥＧＦの相対的発現レベル示す棒グラフ。（５Ｆ）Ｎａｎｏｇ  ｍＲＮＡ又は対照ｍＲＮＡでプライムした後にプロトコル３でハイブリッド細胞に分化したＭＳＣにおける相対的ＭｙｏＤ発現を示す棒グラフ。（５Ｇ）記載されたｌｎｃＲＮＡを用いたプロトコル５による分化後にＰａｘ７及びＭｙｏＤに対して二重陽性である細胞によって測定された、衛星細胞表現型を有する細胞の相対的レベルを示す棒グラフ。（５Ｈ）ＡＮＲＩＬ、ＰＴＥＮＰ１及びａＨＩＦの下方制御とプロトコル５で生成したハイブリッド細胞と対照未処理ＭＳＣの形態を示す顕微鏡写真。（５Ｉ）酸性培地と低酸素でプライミングするか又は５−ＡＺＡでプライミングし、記載されたｍｉＲを使用してプロトコル６で分化した後のＭｙｏＤ陽性細胞の相対数を示す棒グラフ。
【図５−２】ＭＳＣ−筋細胞ハイブリッド細胞は筋マーカーと栄養因子を発現する。（５Ａ）プロトコル１でハイブリッド細胞に分化したＭＳＣと未処理ＭＳＣにおけるＭｙｏＤ発現を示す顕微鏡写真。（５Ｂ）ハイブリッド細胞に分化するようプロトコル１で処理した後の各種組織由来のＭＳＣにおけるＭｙｏＤ、ジストロフィン及びミオゲニンの相対的発現レベル示す棒グラフ。（５Ｃ）一緒に増殖させたハイブリッド細胞（赤色で表示）と筋細胞（緑色で表示）を示す顕微鏡写真。筋細胞とハイブリッド細胞の融合の位置を黄色（矢印）で表す。（５Ｄ）ハイブリッド細胞に分化するようプロトコル２で処理した後の各種組織由来のＭＳＣにおけるＭｙｏＤ、ジストロフィン及びミオゲニンの相対的発現レベル示す棒グラフ。（５Ｅ）ハイブリッド細胞に分化するようプロトコル１で処理した後の各種組織由来のＭＳＣにおけるＧＤＮＦ、ＩＧＦ１及びＶＥＧＦの相対的発現レベル示す棒グラフ。（５Ｆ）Ｎａｎｏｇ  ｍＲＮＡ又は対照ｍＲＮＡでプライムした後にプロトコル３でハイブリッド細胞に分化したＭＳＣにおける相対的ＭｙｏＤ発現を示す棒グラフ。（５Ｇ）記載されたｌｎｃＲＮＡを用いたプロトコル５による分化後にＰａｘ７及びＭｙｏＤに対して二重陽性である細胞によって測定された、衛星細胞表現型を有する細胞の相対的レベルを示す棒グラフ。（５Ｈ）ＡＮＲＩＬ、ＰＴＥＮＰ１及びａＨＩＦの下方制御とプロトコル５で生成したハイブリッド細胞と対照未処理ＭＳＣの形態を示す顕微鏡写真。（５Ｉ）酸性培地と低酸素でプライミングするか又は５−ＡＺＡでプライミングし、記載されたｍｉＲを使用してプロトコル６で分化した後のＭｙｏＤ陽性細胞の相対数を示す棒グラフ。
【図５−３】ＭＳＣ−筋細胞ハイブリッド細胞は筋マーカーと栄養因子を発現する。（５Ａ）プロトコル１でハイブリッド細胞に分化したＭＳＣと未処理ＭＳＣにおけるＭｙｏＤ発現を示す顕微鏡写真。（５Ｂ）ハイブリッド細胞に分化するようプロトコル１で処理した後の各種組織由来のＭＳＣにおけるＭｙｏＤ、ジストロフィン及びミオゲニンの相対的発現レベル示す棒グラフ。（５Ｃ）一緒に増殖させたハイブリッド細胞（赤色で表示）と筋細胞（緑色で表示）を示す顕微鏡写真。筋細胞とハイブリッド細胞の融合の位置を黄色（矢印）で表す。（５Ｄ）ハイブリッド細胞に分化するようプロトコル２で処理した後の各種組織由来のＭＳＣにおけるＭｙｏＤ、ジストロフィン及びミオゲニンの相対的発現レベル示す棒グラフ。（５Ｅ）ハイブリッド細胞に分化するようプロトコル１で処理した後の各種組織由来のＭＳＣにおけるＧＤＮＦ、ＩＧＦ１及びＶＥＧＦの相対的発現レベル示す棒グラフ。（５Ｆ）Ｎａｎｏｇ  ｍＲＮＡ又は対照ｍＲＮＡでプライムした後にプロトコル３でハイブリッド細胞に分化したＭＳＣにおける相対的ＭｙｏＤ発現を示す棒グラフ。（５Ｇ）記載されたｌｎｃＲＮＡを用いたプロトコル５による分化後にＰａｘ７及びＭｙｏＤに対して二重陽性である細胞によって測定された、衛星細胞表現型を有する細胞の相対的レベルを示す棒グラフ。（５Ｈ）ＡＮＲＩＬ、ＰＴＥＮＰ１及びａＨＩＦの下方制御とプロトコル５で生成したハイブリッド細胞と対照未処理ＭＳＣの形態を示す顕微鏡写真。（５Ｉ）酸性培地と低酸素でプライミングするか又は５−ＡＺＡでプライミングし、記載されたｍｉＲを使用してプロトコル６で分化した後のＭｙｏＤ陽性細胞の相対数を示す棒グラフ。
【図６−１】ＤＭＤ治療のためのＣＨ−ＭＳＣ、プライムＭＳＣ又はＭＳＣ−筋細胞ハイブリッド細胞の使用。（６Ａ）対照疑似注射と未修飾ＣＨ−ＭＳＣの注射から３週間後のｍｄｘマウス四頭筋におけるクレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）レベルを示す棒グラフ。（６Ｂ）各種組織由来の非修飾ＭＳＣとＰＢＳの注射から３週間後のＭＤＸマウス四頭筋におけるクレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）レベルを示す棒グラフ。（６Ｃ）各種組織由来のハイブリッド細胞とＰＢＳの注射から３週間後のＭＤＸマウス四頭筋におけるクレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）レベルを示す棒グラフ。（６Ｄ）対照未処理ＣＨ−ＭＳＣ、酸性培地と低酸素でプライムしたＣＨ−ＭＳＣ、筋共培養でプライムしたＣＨ−ＭＳＣ、及びプロトコル３で生成したハイブリッド細胞の注射から３週間後のｍｄｘマウス四頭筋における相対的ヒトジストロフィンｍＲＮＡ発現を示す棒グラフ。（６Ｅ）未修飾ＭＳＣ由来のエキソソーム、ハイブリッド細胞由来のエキソソーム、これら２種の混合物、及びＰＢＳの注射から３週間後のｍｄｘマウス四頭筋におけるクレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）レベルを示す棒グラフ。
【図６−２】ＤＭＤ治療のためのＣＨ−ＭＳＣ、プライムＭＳＣ又はＭＳＣ−筋細胞ハイブリッド細胞の使用。（６Ａ）対照疑似注射と未修飾ＣＨ−ＭＳＣの注射から３週間後のｍｄｘマウス四頭筋におけるクレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）レベルを示す棒グラフ。（６Ｂ）各種組織由来の非修飾ＭＳＣとＰＢＳの注射から３週間後のＭＤＸマウス四頭筋におけるクレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）レベルを示す棒グラフ。（６Ｃ）各種組織由来のハイブリッド細胞とＰＢＳの注射から３週間後のＭＤＸマウス四頭筋におけるクレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）レベルを示す棒グラフ。（６Ｄ）対照未処理ＣＨ−ＭＳＣ、酸性培地と低酸素でプライムしたＣＨ−ＭＳＣ、筋共培養でプライムしたＣＨ−ＭＳＣ、及びプロトコル３で生成したハイブリッド細胞の注射から３週間後のｍｄｘマウス四頭筋における相対的ヒトジストロフィンｍＲＮＡ発現を示す棒グラフ。（６Ｅ）未修飾ＭＳＣ由来のエキソソーム、ハイブリッド細胞由来のエキソソーム、これら２種の混合物、及びＰＢＳの注射から３週間後のｍｄｘマウス四頭筋におけるクレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）レベルを示す棒グラフ。
【図６−３】ＤＭＤ治療のためのＣＨ−ＭＳＣ、プライムＭＳＣ又はＭＳＣ−筋細胞ハイブリッド細胞の使用。（６Ａ）対照疑似注射と未修飾ＣＨ−ＭＳＣの注射から３週間後のｍｄｘマウス四頭筋におけるクレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）レベルを示す棒グラフ。（６Ｂ）各種組織由来の非修飾ＭＳＣとＰＢＳの注射から３週間後のＭＤＸマウス四頭筋におけるクレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）レベルを示す棒グラフ。（６Ｃ）各種組織由来のハイブリッド細胞とＰＢＳの注射から３週間後のＭＤＸマウス四頭筋におけるクレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）レベルを示す棒グラフ。（６Ｄ）対照未処理ＣＨ−ＭＳＣ、酸性培地と低酸素でプライムしたＣＨ−ＭＳＣ、筋共培養でプライムしたＣＨ−ＭＳＣ、及びプロトコル３で生成したハイブリッド細胞の注射から３週間後のｍｄｘマウス四頭筋における相対的ヒトジストロフィンｍＲＮＡ発現を示す棒グラフ。（６Ｅ）未修飾ＭＳＣ由来のエキソソーム、ハイブリッド細胞由来のエキソソーム、これら２種の混合物、及びＰＢＳの注射から３週間後のｍｄｘマウス四頭筋におけるクレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）レベルを示す棒グラフ。
【図７−１】ＡＬＳ治療のためのＭＳＣ−筋細胞ハイブリッド細胞の使用。（７Ａ）ハイブリッド細胞又はＰＢＳを筋肉内注射した発症前のＳＯＤラットのカプラン・マイヤー生存プロット。仰向けにしてから３０秒以内に直立姿勢を取り戻せなくなった場合にラットを屠殺した。（７Ｂ）星状細胞表現型に分化したＭＳＣ（ＭＳＣ−ＡＳ）又はＰＢＳを髄腔内注射した発症前のＳＯＤラットのカプラン・マイヤー生存プロット。仰向けにしてから３０秒以内に直立姿勢を取り戻せなくなった場合にラットを屠殺した。（７Ｃ）ＭＳＣ−ＡＳを髄腔内、ハイブリッド細胞、ＭＳＣ−ＡＳとハイブリッド細胞の両方又はＰＢＳを筋肉内注射した症候性ＳＯＤラットの生存期間（日数）を示す棒グラフ。仰向けにしてから３０秒以内に直立姿勢を取り戻せなくなった場合にラットを屠殺した。（７Ｄ）ハイブリッド細胞又はＰＢＳを筋肉内注射した発症前のＳＯＤラットのカプラン・マイヤー生存プロット。ロータロッドに１０分間立てなくなった場合にラットを屠殺した。（７Ｅ）神経幹細胞表現型に分化したＭＳＣ（ＭＳＣ−ＮＳＣ）又はＰＢＳを静脈内注射した発症前のＳＯＤラットのカプラン・マイヤー生存プロット。ロータロッドに１０分間立てなくなった場合にラットを屠殺した。
【図７−２】ＡＬＳ治療のためのＭＳＣ−筋細胞ハイブリッド細胞の使用。（７Ａ）ハイブリッド細胞又はＰＢＳを筋肉内注射した発症前のＳＯＤラットのカプラン・マイヤー生存プロット。仰向けにしてから３０秒以内に直立姿勢を取り戻せなくなった場合にラットを屠殺した。（７Ｂ）星状細胞表現型に分化したＭＳＣ（ＭＳＣ−ＡＳ）又はＰＢＳを髄腔内注射した発症前のＳＯＤラットのカプラン・マイヤー生存プロット。仰向けにしてから３０秒以内に直立姿勢を取り戻せなくなった場合にラットを屠殺した。（７Ｃ）ＭＳＣ−ＡＳを髄腔内、ハイブリッド細胞、ＭＳＣ−ＡＳとハイブリッド細胞の両方又はＰＢＳを筋肉内注射した症候性ＳＯＤラットの生存期間（日数）を示す棒グラフ。仰向けにしてから３０秒以内に直立姿勢を取り戻せなくなった場合にラットを屠殺した。（７Ｄ）ハイブリッド細胞又はＰＢＳを筋肉内注射した発症前のＳＯＤラットのカプラン・マイヤー生存プロット。ロータロッドに１０分間立てなくなった場合にラットを屠殺した。（７Ｅ）神経幹細胞表現型に分化したＭＳＣ（ＭＳＣ−ＮＳＣ）又はＰＢＳを静脈内注射した発症前のＳＯＤラットのカプラン・マイヤー生存プロット。ロータロッドに１０分間立てなくなった場合にラットを屠殺した。
【図８】悪液質治療のためのＭＳＣとそのエキソソームの使用。培地による疑似処理とＴＮＦα及びＩＦＮγによる処理後のＣＨ−ＭＳＣ、ＵＣ−ＭＳＣ及びそれらのエキソソームと共培養した筋細胞における相対的ミオシン重鎖発現を示す棒グラフ。
【図９−１】治療的送達系としてのＭＳＣの使用。（９Ａ）記載したアンタゴミルを負荷したＭＳＣ由来のエキソソームと共にインキュベートした後の筋芽細胞における相対的ユートロフィンｍＲＮＡ発現を示す棒グラフ。（９Ｂ）ｌｅｔ−７とｍｉＲ−１３３ｂに対するアンタゴミルを発現するＣＨ−ＭＳＣを注射した後のインビボでの筋細胞におけるユートロフィン発現を示すウエスタンブロット画像。（９Ｃ）ｌｅｔ−７に対するアンタゴミルを発現するＣＨ−ＭＳＣ由来の筋肉標的化エキソソームと非標的化エキソソームを注射した後のインビボでの筋細胞におけるユートロフィン発現を示すウエスタンブロット画像。（９Ｄ）ｌｅｔ−７に対するアンタゴミルを発現するＣＨ−ＭＳＣと共培養した後のミオシン重鎖陽性細胞の相対数を示す棒グラフ。（９Ｅ）トランスフェクションによる修飾ＭｙｏＤ  ｍＲＮＡの細胞への導入、ＭＳＣ由来の前負荷エキソソームとのインキュベーション、又は修飾ｍＲＮＡを発現するＭＳＣとのトランスウェル共培養後のＭｙｏＤタンパク質の核染色を示す筋芽細胞の数を示す棒グラフ。
【図９−２】治療的送達系としてのＭＳＣの使用。（９Ａ）記載したアンタゴミルを負荷したＭＳＣ由来のエキソソームと共にインキュベートした後の筋芽細胞における相対的ユートロフィンｍＲＮＡ発現を示す棒グラフ。（９Ｂ）ｌｅｔ−７とｍｉＲ−１３３ｂに対するアンタゴミルを発現するＣＨ−ＭＳＣを注射した後のインビボでの筋細胞におけるユートロフィン発現を示すウエスタンブロット画像。（９Ｃ）ｌｅｔ−７に対するアンタゴミルを発現するＣＨ−ＭＳＣ由来の筋肉標的化エキソソームと非標的化エキソソームを注射した後のインビボでの筋細胞におけるユートロフィン発現を示すウエスタンブロット画像。（９Ｄ）ｌｅｔ−７に対するアンタゴミルを発現するＣＨ−ＭＳＣと共培養した後のミオシン重鎖陽性細胞の相対数を示す棒グラフ。（９Ｅ）トランスフェクションによる修飾ＭｙｏＤ  ｍＲＮＡの細胞への導入、ＭＳＣ由来の前負荷エキソソームとのインキュベーション、又は修飾ｍＲＮＡを発現するＭＳＣとのトランスウェル共培養後のＭｙｏＤタンパク質の核染色を示す筋芽細胞の数を示す棒グラフ。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、間葉系幹細胞表現型及び筋細胞表現型を有する細胞と、この細胞から分泌される細胞外小胞と、この細胞を含む医薬組成物と、この細胞を投与することを含む治療方法とを提供する。
混合特性の細胞
【００３９】
一態様によると、本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）表現型と筋細胞表現型を示す混合特性の単離細胞に関する。
【００４０】
本明細書で使用される「間葉系幹細胞」又は「ＭＳＣ」という用語は、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨芽細胞、骨格筋細胞及び内皮細胞に分化する能力を有する多能性間質幹細胞を意味する。ＭＳＣは、組織の中でも特に、骨髄、脂肪組織、末梢血、絨毛膜胎盤、羊膜胎盤、臍帯血及び歯髄に存在する。「多能性」という用語は、多くの細胞型を生じさせることができる幹細胞を意味する。
【００４１】
ある実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。ある実施形態では、細胞はヒト細胞である。ある実施形態では、細胞は獣医学的動物細胞等の動物細胞である。ある実施形態では、獣医学的動物はネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ及びヤギから選択される。ある実施形態では、細胞は筋肉関連疾患又は筋損傷の治療を必要とする対象に対して同種異系である。ある実施形態では、細胞は筋疾患又は筋損傷の治療を必要とする対象に対して自家性である。
【００４２】
ある実施形態では、混合特性の細胞はプライム細胞である。本明細書中で使用される「プライム細胞」とは、筋細胞への分化プロセスを開始したが、そのプロセスにおいて非常に初期の細胞を意味する。このような細胞はＭｙｏＤを発現する。ある実施形態では、筋細胞は平滑筋細胞、骨格筋細胞又は衛星細胞である。
【００４３】
ある実施形態では、プライム細胞は脱分化ＭＳＣである。ある実施形態では、脱分化ＭＳＣはＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４及びＫＬＦ４の内の少なくとも１種を発現する。ある実施形態では、脱分化ＭＳＣは、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４及びＫＬＦ４の内の少なくとも１種を未処理ＭＳＣで発現されるレベルよりも高いレベルで発現する。ある実施形態では、脱分化ＭＳＣはＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４及びＫＬＦ４の複数を発現する。ある実施形態では、脱分化ＭＳＣは骨、脂肪又は腱に全く分化しないか、又は十分には分化しない。ある実施形態では、脱分化ＭＳＣは未処理ＭＳＣよりも低い割合で骨、脂肪又は腱に分化する。ある実施形態では、脱分化ＭＳＣは、未処理ＭＳＣの分化と比べて０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０５又は０．０１未満の割合で骨、脂肪又は腱に分化する。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。
【００４４】
ある実施形態では、混合特性の細胞はハイブリッド細胞である。本明細書で使用される「ハイブリッド細胞」とは、２種の異なる細胞型（例えば、ＭＳＣと筋細胞）の質、特性、発現プロファイル又は表現型を有する細胞を意味する。これは２個の別々の細胞が融合して生成した物理的ハイブリッドを意味するものではない。本明細書においては、ハイブリッド細胞は分化が完了していない筋細胞に分化したＭＳＣである。ある実施形態では、ハイブリッド細胞はプライム細胞よりも筋細胞に更に分化する。
【００４５】
ある実施形態では、ＭＳＣ表現型は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ４４及びＣＤ１４６から成る群から選択される少なくとも１種の表面マーカーの発現を含む。ある実施形態では、ＭＳＣ表現型は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ４４及びＣＤ１４６から成る群から選択される複数の表面マーカーの発現を含む。ある実施形態では、ＭＳＣ表現型はＩＬ−１０の発現を含む。ある実施形態では、ＭＳＣ表現型は主要組織適合遺伝子複合体タンパク質ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）の発現が欠如している。ある実施形態では、ＭＳＣ表現型は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ１４６及びＣＤ４４から成る群から選択される少なくとも１種の発現マーカーの発現を含み、ＭＨＣＩＩの発現が欠如している。ある実施形態では、ＭＳＣ表現型は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ１４６及びＣＤ４４から成る群から選択される複数の発現マーカーの発現を含み、ＭＨＣＩＩの発現が欠如している。
【００４６】
本明細書で使用される「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成、例えば、前記遺伝子産物の転写及び／又は翻訳を意味する。従って、核酸分子の発現とは、核酸断片の転写（例えば、ｍＲＮＡ又は他の機能性ＲＮＡをもたらす転写）及び／又はＲＮＡの前駆体又は成熟タンパク質（ポリペプチド）への翻訳を意味し得る。ある実施形態では、発現マーカーはＲＮＡの発現を意味する。ある実施形態では、発現マーカーはタンパク質の発現を意味する。ある実施形態では、表面発現マーカーは細胞表面又は細胞の細胞膜内でのタンパク質の発現を意味する。
【００４７】
ある実施形態では、ＭＳＣ表現型は抗炎症能力を含む。ある実施形態では、本明細書に記載のＭＳＣは抗炎症性細胞である。ある実施形態では、ＭＳＣ表現型は炎症を抑制する能力を含む。ある実施形態では、ＭＳＣ表現型は抗炎症性サイトカインの分泌を含む。抗炎症性サイトカインは当業者に周知であり、その例としてはＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１３、及びトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
ある実施形態では、ＭＳＣ表現型は炎症、傷害又は疾患の部位に帰着する能力を含む。
【００４９】
ある実施形態では、ＭＳＣ表現型は免疫調節能力を含む。ある実施形態では、ＭＳＣ表現型は対象の免疫系を調節する能力を含む。ある実施形態では、ＭＳＣ表現型は免疫抑制能力を含む。ある実施形態では、ＭＳＣ表現型は対象の免疫系を抑制する能力を含む。ある実施形態では、ＭＳＣ表現型はＴ細胞の活性化を抑制する能力を含む。
【００５０】
ある実施形態では、ＭＳＣ表現型は炎症、傷害又は疾患の部位に帰着する能力を含む。
【００５１】
ＭＳＣ表現型を検出及び決定する方法は当業者に既知である。その方法としては、ＦＡＣＳやウエスタンブロット等のアッセイによるＭＳＣ表面マーカーの染色が挙げられるが、これに限定されない。この検出及び決定を行うために数種の市販キットが利用可能であり、その例としては、ヒト及びマウス間葉系幹細胞ＩＤキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＳＣ表現型決定キット、ヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＢＤ  Ｓｔｅｍｆｌｏｗ  ｈＭＳＣ分析キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）が挙げられる。他の方法としては、分泌された炎症促進性サイトカイン及び抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＩＬ−１３及びＴＧＦβが挙げられるが、これらに限定されない）の測定、当技術分野で周知のホーミングアッセイを用いた細胞ホーミングの測定、ＭＳＣ転写因子のｍＲＮＡ発現の検出及び測定が挙げられる。
【００５２】
ある実施形態では、筋細胞表現型は、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ６、Ｍｙｆ５、ＭＲＦ４、ＩＴＧＡ７、ＧＦＦ１１、オステオプロテゲリン、イリシン、ジストロフィン、ミオシン重鎖、ミオゲニン、ＰＡＸ７、ＴＡＬＮＥＣ２、Ｃ−ＭＥＴ、Ｇ−ＣＳＦ、オステオプロテゲリン、ＩＬ−１０及びＭＥＦ２Ａの内の少なくとも１種の発現を含む。ある実施形態では、筋細胞表現型は、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ６、Ｍｙｆ５、ＭＲＦ４、ＩＴＧＡ７、オステオプロテゲリン、イリシン、ジストロフィン、ミオシン重鎖、ミオゲニン、ＰＡＸ７、ＴＡＬＮＥＣ２、Ｃ−ＭＥＴ、Ｇ−ＣＳＦ、オステオプロテゲリン、ＩＬ−１０及びＭＥＦ２Ａの内の複数種の発現を含む。ある実施形態では、筋細胞表現型は、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ６、Ｍｙｆ５、ＭＲＦ４、ＩＴＧＡ７、オステオプロテゲリン、イリシン、ジストロフィン、ミオシン重鎖、ミオゲニン、ＰＡＸ７、ＴＡＬＮＥＣ２、Ｃ−ＭＥＴ、Ｇ−ＣＳＦ、オステオプロテゲリン、ＩＬ−１０及びＭＥＦ２Ａから成る群から選択される少なくとも１種の発現マーカーの発現を含み、オステオカルシン、ＰＰＡＲＧ３及びＣＯＬ２Ａ１の発現が欠如している。ある実施形態では、筋細胞表現型は、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ６、Ｍｙｆ５、ＭＲＦ４、ＩＴＧＡ７、オステオプロテゲリン、イリシン、ジストロフィン、ミオシン重鎖、ミオゲニン、ＰＡＸ７、ＴＡＬＮＥＣ２、Ｃ−ＭＥＴ、Ｇ−ＣＳＦ、オステオプロテゲリン、ＩＬ−１０及びＭＥＦ２Ａから成る群から選択される複数種の発現マーカーの発現を含み、オステオカルシン、ＰＰＡＲＧ３及びＣＯＬ２Ａ１の発現が欠如している。
【００５３】
ある実施形態では、上述の筋肉発現マーカーは未分化ＭＳＣで発現するレベルよりも高いレベルで発現する。ある実施形態では、未分化ＭＳＣで発現するレベルより少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍高いレベルで発現する。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。
【００５４】
ある実施形態では、筋細胞表現型は筋シンシチウムと融合する能力を含む。ある実施形態では、筋細胞表現型は筋管のサイズ又は直径を増加させる能力を含む。ある実施形態では、筋細胞表現型は筋再生である。ある実施形態では、筋細胞表現型は傷害又は損傷後に筋組織を再生する能力である。ある実施形態では、筋細胞表現型は新しい筋線維を生成する能力である。
【００５５】
ある実施形態では、筋細胞表現型は衛星細胞表現型である。ある実施形態では、筋細胞表現型は平滑筋表現型である。ある実施形態では、筋細胞表現型は骨格筋表現型である。ある実施形態では、筋細胞表現型は心筋表現型である。
【００５６】
筋細胞表現型を検出及び決定する方法は当業者に既知である。その方法としては、筋タンパク質の染色、例えば、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ又はＥＬＩＳＡによる染色、筋細胞転写因子及びタンパク質を検出及び定量するための定量的ＰＣＲ、筋シンシチウムとの融合のアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。筋融合のアッセイは当技術分野で周知であり、２種の蛍光タグを用いて色の混合を探すことができる。
細胞の生成
【００５７】
プロトコルＡ：ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＭＳＣを筋細胞、筋細胞の馴化培地、又は筋細胞の細胞外小胞と共培養して行う。
【００５８】
プロトコルＢ：ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４又はこれらの組み合わせの内のいずれか１種をＭＳＣに導入して行う。ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＭＳＣにＮａｎｏｇを導入して行う。
【００５９】
プロトコルＣ：ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＭＳＣを５−アザシチジン（５−ＡＺＡ）と共にインキュベートして行う。
【００６０】
プロトコルＤ：ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＭＳＣをａ）ＲＯＣＫ阻害剤及びｂ）酸性培地又は低酸素と共にインキュベートして行う。
【００６１】
プロトコルＥ：ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、酸性培地、低酸素、低接着プレート、ＦＧＦ又はＥＧＦを補充した低血清培地、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＴＡＴ３活性化剤、ＮＦ−ＫＢ活性化剤、ＣＨＩＲ９９０２１、メトホルミン、トラニルシプロミン、Ｇｓｋ３阻害剤、３−デアザネプラノシンＡ、ｍＴｏｒ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、チアゾビビン、Ａ８３−０１、ＬｉＣｌ、ＳＢ４３１５４２、５−ＡＺＡ、ラパマイシン、ＥＲＫ活性化剤及びバルプロ酸から成る群から選択される小分子を含む培地、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種でＭＳＣを培養して行う。
【００６２】
プロトコル１：ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＭＳＣを用意し、酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤及び５−ＡＺＡの内の少なくとも１種とＭＳＣを接触させ、ＨＧＦ又はＰＤＧＦβをＭＳＣに導入し、ＰＣＡＴ１とＮＥＡＴ１をＭＳＣに導入して行うことができる。
【００６３】
プロトコル２：ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＭＳＣを用意し、酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤及び５−ＡＺＡの内の少なくとも１種とＭＳＣを接触させ、ＨＧＦ又はＰＤＧＦβをＭＳＣに導入し、ＧＡＳ５とＰＴＥＮＰ１の発現阻害剤をＭＳＣに導入して行うことができる。
【００６４】
プロトコル３：ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＭＳＣを用意し、酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤及び５−ＡＺＡの内の少なくとも１種とＭＳＣを接触させ、ＰＤＧＦＡＡ、ＰＤＧＦＢＢ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ及びＩＧＦ１から成る群から選択される少なくとも１種の増殖因子をＭＳＣに導入して行う。
【００６５】
プロトコル４：ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＭＹＦ５、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ジストロフィン、マイクロジストロフィン、ユートロフィン、ＭｙｏＤとＰＡＸ３、ＭｙｏＤとＰＡＸ７、及びＭｙｏＤとＭＹＦ５から成る群から選択される少なくとも１種の転写因子をＭＳＣに導入して行う。
【００６６】
プロトコル５：ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＭＳＣを用意し、酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤及び５−ＡＺＡの内の少なくとも１種とＭＳＣを接触させ、ＢＩＬ、ＰＡＲ５、ＢＩＣ、ＤＩＳＣ２、ＧＡＳ５ＤＬＧ２ＡＳ、７ＳＫ、Ｙ１、ＬＩＮＣＲＮＡ、ＰＣＡＴ−１、ＳＦＭＢＴ２、Ｙ４、ＳＣＡ８、ＭＡＬＡＴ１、ＭＥＧ３、ＮＥＡＴ１、ＥＧＯ、ＧＡＳ５、ＫＲＡＳＰ１、ＬＯＣ２８５１９、ＢＣ２００及びＨ１９から成る群から選択される少なくとも１種の長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）をＭＳＣに導入して行う。ある実施形態では、少なくとも１種のｌｎｃＲＮＡは、ＰＡＲ５、ＤＩＳＣ２及びＰＣＡＴ１から選択される。
【００６７】
プロトコル６：ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＭＳＣを用意し、酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤及び５−ＡＺＡの内の少なくとも１種とＭＳＣを接触させ、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−５２０、ｍｉＲ−５２４、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−５５０、ｍｉＲ−５６１、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−５８２、ｍｉＲ−５８３、ｍｉＲ−５８７、ｍｉＲ−６１３、ｍｉＲ−６１４、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６３４、ｍｉＲ−６４５、ｍｉＲ−６４６、ｍｉＲ−６４９、ｍｉＲ−６６１、ｍｉＲ−６６２、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−６７１、ｍｉＲ−８８７、ｍｉＲ−１１８３、ｍｉＲ−１２２４、ｍｉＲ−１２２５、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２３４、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２４７、ｍｉＲ−１２５７、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１２６８、ｍｉＲ−１２６９、ｍｉＲ−１２８９、ｍｉＲ−１２８７、ｍｉＲ−１９０９、ｍｉＲ−１９１１、ｍｉＲ−７５９、ｍｉＲ−３１５０、ｍｉＲ−３１７４、ｍｉＲ−３１８０、ｍｉＲ−３１９１、ｍｉＲ−３１９７、ｍｉＲ−４２９２、ｍｉＲ−２１１５、ｍｉＲ−４３１２、ｍｉＲ−９２、９３及びｍｉＲ−９９から成る群から選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ）をＭＳＣに導入して行う。ある実施形態では、少なくとも１種のｍｉＲは、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−６１４及びｍｉＲ−６６８から成る群から選択される。
【００６８】
ある実施形態では、ＭＳＣは骨髄、脂肪組織、羊膜胎盤、絨毛膜胎盤又は臍帯に由来する。ある実施形態では、ＭＳＣは絨毛膜胎盤又は臍帯に由来する。ある実施形態では、ＭＳＣは絨毛膜胎盤に由来する。
【００６９】
細胞の共培養は当業者に周知である。ある実施形態では、共培養を筋細胞培地で行う。ある実施形態では、共培養をＭＳＣ培地で行う。ある実施形態では、共培養をトランスウェルプレートで行って、細胞の混合は生じないが、細胞が分泌因子を交換するようにする。本明細書で使用される「馴化培地」とは、増殖細胞に少なくとも１日間接触していた古い培地を意味する。このような培地は増殖細胞からの分泌因子を含んでおり、分泌因子の例としては、可溶性因子、エキソソーム、ミクロソーム及び他の細胞外小胞等が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、馴化培地は、増殖細胞に少なくとも２４時間、４８時間、７２時間、９６時間又は１２０時間接触していたものである。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。
【００７０】
本明細書で使用される「細胞外小胞」という用語は、ＭＳＣから分泌される全ての細胞由来小胞を意味し、例えば、エキソソーム及び微小胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「エキソソーム」とは、サイズが５０〜１００ｎｍでＭＳＣから分泌される、エンドサイトーシス起源の細胞由来小胞を意味する。非限定的な実施形態としては、エキソソームを生成するために、エキソソームが枯渇した５％ＦＢＳ又はヒト血清アルブミンとＯｐｔｉ−ＭＥＭで細胞を維持する。
【００７１】
本明細書で使用される「微小胞」とは、サイズが１００〜１０００ｎｍでＭＳＣから分泌される、細胞膜起源の細胞由来小胞を意味する。
【００７２】
エキソソーム、細胞外小胞又は微小胞は、エキソソームが枯渇した血清を含む培地、又はＯｐｔｉＭｅＭ等の無血清培地でＭＳＣを増殖させた後、超遠心分離によってエキソソームを単離して得ることができる。ビーズ、カラム、フィルター及び抗体に関連する他の方法も用いられる。ある実施形態では、細胞を低酸素条件下で増殖させるか、又は低ｐＨの培地でインキュベートしてエキソソームの収量を増加させる。他の実施形態では、細胞を放射線に曝露してエキソソームの分泌及び収量を増加させる。ある実施形態では、エキソソームを投与用の適切な培地に懸濁させる。
【００７３】
ある実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤とのインキュベーションは、少なくとも８時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間又は４８時間行う。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、ＭＳＣをＲＯＣＫ阻害剤と共に約２４時間インキュベートする。
【００７４】
ある実施形態では、５−ＡＺＡとのインキュベーションは、少なくとも８時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間又は４８時間行う。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、ＭＳＣを５−ＡＺＡと共に約２４時間インキュベートする。
【００７５】
ある実施形態では、培地はＭＳＣ培地である。ある実施形態では、培地は筋細胞培地である。ある実施形態では、培地は幹細胞培地である。このような培地は当技術分野で周知であり、その例としては、骨格筋細胞培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）、血管平滑筋細胞増殖キット（ＡＴＣＣ）、平滑筋細胞培地（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）、平滑筋細胞培地補充キット（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ  ＲＳ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＳｔｅｍＰｒｏ  ＭＳＣ  ＳＦＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、及びＮｕｔｒｉＳｔｅｍ  ＭＳＣ  ＸＦ培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
遺伝子、ＲＮＡ、核酸又はタンパク質の生細胞への導入は当業者に周知である。本明細書で使用される「導入」とは、遺伝子、タンパク質又は化合物の細胞への外因性添加を意味する。これは遺伝子、タンパク質又は化合物の内因性発現の増加を意味しない。このような導入の例としては、トランスフェクション、レンチウイルス感染、ヌクレオフェクション又は形質導入が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、導入はエクスビボで生じる。ある実施形態では、導入はインビボで生じる。ある実施形態では、導入はインビボ又はエクスビボで生じる。ある実施形態では、導入は目的の遺伝子を含むベクターを導入することを含む。
【００７７】
ベクターは、非ウイルス方法又はウイルス方法を介して送達されるＤＮＡプラスミドとすることができる。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はポックスウイルスベクターとすることができる。プロモーターは哺乳動物細胞において活性であり得る。プロモーターはウイルスプロモーターとすることができる。
【００７８】
ある実施形態では、ベクターの細胞への導入は標準的な方法、例えば、電気穿孔法（例えば、Ｆｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，５８２４（１９８５）に記載）、熱ショック、ウイルスベクターによる感染、小型ビーズ又は粒子のマトリックス内又は表面上に核酸を有する小粒子による高速弾道侵入（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７．７０−７３（１９８７））、及び／又はそれと同様の方法によって行う。
【００７９】
ある実施形態では、哺乳動物発現ベクターとしては、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（±）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（±）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶ及びｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能なｐＴＲＥＳ、及びそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
ある実施形態では、レトロウイルス等の真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターが本発明によって使用される。ＳＶ４０ベクターとしてはｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２が挙げられる。ある実施形態では、ウシパピローマウイルス由来のベクターとしてはｐＢＶ−１ＭＴＨＡが挙げられ、エプスタイン・バーウイルス由来のベクターとしてはｐＨＥＢＯ及びｐ２Ｏ５が挙げられる。他の例示的なベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及びＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、又は真核細胞での発現に有効であることが示されている他のプロモーターの指示の下でタンパク質を発現させる他のベクターが挙げられる。
【００８１】
ある実施形態では、側方感染や標的特異性のような利点を提供する組換えウイルスベクターがインビボ発現用に使用される。一実施形態では、側方感染は、例えば、レトロウイルスの生活環に固有のものであり、１個の感染細胞が、分裂して近隣の細胞を感染させる多くの後代ビリオンを産生するプロセスである。一実施形態では、その結果、その殆どが元のウイルス粒子によって最初は感染されていなかった大きな領域が迅速に感染される。一実施形態では、側方に拡がり得ないウイルスベクターが生成する。一実施形態では、この特徴は、数が制限された標的細胞のみに特定遺伝子を導入することが所望の目的である場合に有用となり得る。
【００８２】
様々な方法を用いて本発明の発現ベクターを細胞に導入することができる。このような方法は一般にＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２）、ｉｎ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．（１９８９）、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｇａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）及びＧｉｌｂｏａ  ｅｔ  ａｌ．［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４−５１２，１９８６］に記載されており、このような方法としては、例えば、安定性又は一過性のトランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔法、及び組換えウイルスベクターを用いた感染が挙げられる。更に、ポジティブ−ネガティブ選択法については米国特許第５，４６４，７６４号及び第５，４８７，９９２号を参照のこと。
【００８３】
一実施形態では、植物発現ベクターを使用する。一実施形態では、ポリペプチドコード配列の発現を複数のプロモーターで駆動する。ある実施形態では、ＣａＭＶの３５ＳＲＮＡ及び１９ＳＲＮＡプロモーター［Ｂｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１１−５１４（１９８４）］等のウイルスプロモーター、又はＴＭＶに対するコートタンパク質プロモーター［Ｔａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１（１９８７）］を使用する。他の実施形態では、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット［Ｃｏｒｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０（１９８４）及びＢｒｏｇｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３（１９８４）］又は熱ショックプロモーター、例えば、大豆ｈｓｐ１７．５−Ｅ又はｈｓｐ１７．３−Ｂ［Ｇｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９−５６５（１９８６）］等の植物プロモーターを使用する。一実施形態では、構築物の植物細胞への導入は、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、微量注入法、電気穿孔法、及び当業者に周知の他の技法を用いて行う。例えば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ，ｐｐ４２１−４６３（１９８８）］を参照のこと。当技術分野で周知の昆虫及び哺乳動物宿主細胞系等の他の発現系も本発明によって使用することができる。
【００８４】
挿入されたコード配列（ポリペプチドをコードする）の転写及び翻訳に必要な要素を含む以外に、本発明の発現構築物は更に、発現されたポリペプチドの安定性、生成、精製、収量又は活性を最適化するように操作された配列も含み得ることは理解されよう。
【００８５】
ある実施形態では、目的の遺伝子の導入は誘導性ベクターの導入を含み、細胞への薬物の投与は目的の遺伝子の発現を誘導する。薬物誘発性ベクターは当技術分野で周知であり、非限定的な例としては、タモキシフェン誘導性、テトラサイクリン誘導性及びドキシサイクリン誘導性が挙げられる。ある実施形態では、誘導性ベクターをエクスビボでＭＳＣに導入し、ＭＳＣをインビボで誘導性薬物と接触させる。こうして、誘導された遺伝子の発現と、その結果としてのＭＳＣのプライミング又は分化はインビボでのみ生じる。ある実施形態では、ＭＳＣのプライミング又は分化はＭＳＣが対象の体内のある場所に帰着した後にのみ生じる。
【００８６】
ある実施形態では、導入は修飾ｍＲＮＡの導入を含む。「修飾ｍＲＮＡ」という用語は、細胞の細胞質に導入され、そこでタンパク質に翻訳される安定なｍＲＮＡを意味する。このようなｍＲＮＡはタンパク質発現のための転写を必要としないため、より迅速にタンパク質を生成し、調節されることは少ない。修飾ｍＲＮＡは当技術分野で周知である。
【００８７】
ある実施形態では、本発明の細胞の生成はプロトコルＢとＣを組み合わせて行う。ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４又はそれらの組み合わせの内のいずれか１種をＭＳＣに導入し、ＭＳＣを５−ＡＺＡと共にインキュベートして行う。ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＮａｎｏｇをＭＳＣに導入し、ＭＳＣを５−ＡＺＡと共にインキュベートして行う。
【００８８】
本明細書で使用される「酸性培地」という用語は、ｐＨが６．０以下の培地を意味する。酸性培地においては、増殖培地はｐＨが約６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５又は３．０となり得る。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、酸性培地を用いたインキュベーションは、少なくとも１５分間、３０分間、４５分間、６０分間、９０分間又は１２０分間行う。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、ＭＳＣのインキュベーションは酸性培地中で約１時間行う。ある実施形態では、酸性培地はｐＨが約６である。ある実施形態では、酸性培地はｐＨが５〜６である。
【００８９】
本明細書で使用される「低酸素」又は「低酸素条件」という用語は、身体、身体の領域又は細胞に酸素が十分に供給されていない状態を意味する。ある実施形態では、酸素レベルを厳密に制御することができる低酸素制御室内で細胞を培養増殖する。低酸素では、酸素レベルは５％未満、４．５％未満、４％未満、３．５％未満、３％未満、２．５％未満、２％未満、１．５％未満、１％未満、０．５％未満又は０．１未満％である。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、低酸素は２〜４％の酸素レベルを意味する。ある実施形態では、低酸素でのインキュベーションは、少なくとも８時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間又は４８時間行う。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、低酸素条件でＭＳＣを約２４時間インキュベートする。
【００９０】
ある実施形態では、本発明の細胞の生成はプロトコルＤの後にプロトコルＥを実施して行う。ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＮａｎｏｇをＭＳＣに導入した後に、プロトコルＤ、プロトコルＥ又はプロトコルＤとＥの両方を実施して行う。ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ａ）ＲＯＣＫ阻害剤、ｂ）酸性培地又は低酸素、及びｃ）低接着プレート、ＦＧＦ又はＥＧＦを補充した低血清培地、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＴＡＴ３、ＮＦ−ＫＢ活性化剤、ＣＨＩＲ９９０２１、メトホルミン、トラニルシプロミン、Ｇｓｋ３阻害剤、３−デアザネプラノシンＡ、ｍＴｏｒ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、チアゾビビン、Ａ８３−０１、ＬｉＣｌ、ＳＢ４３１５４２、５−ＡＺＡ、ラパマイシン、ＥＲＫ活性化剤及びバルプロ酸から成る群から選択される小分子を含む培地、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種と共にＭＳＣをインキュベートして行う。ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ａ）ＮａｎｏｇをＭＳＣに導入し、ｂ）ＲＯＣＫ阻害剤と共にインキュベートし、ｃ）酸性培地又は低酸素でインキュベートし、ｄ）低接着プレート、ＦＧＦ又はＥＧＦを補充した低血清培地、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＴＡＴ３活性化剤、ＮＦ−ＫＢ活性化剤、ＣＨＩＲ９９０２１、メトホルミン、トラニルシプロミン、Ｇｓｋ３阻害剤、３−デアザネプラノシンＡ、ｍＴｏｒ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、チアゾビビン、Ａ８３−０１、ＬｉＣｌ、ＳＢ４３１５４２、５−ＡＺＡ、ラパマイシン、ＥＲＫ活性化剤及びバルプロ酸から成る群から選択される小分子を含む培地、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種と共にインキュベートして行う。
【００９１】
ある実施形態では、低接着プレート上の細胞の増殖は３Ｄ細胞培養を含む。本明細書で使用される「３Ｄ細胞培養」という用語は、細胞が３次元全てにおいてその周囲と共に増殖又は相互作用することが可能な細胞培養を意味する。ある実施形態では、これは、低接着プレート、バイオリアクター又は小型カプセル上で細胞を増殖させて行うことができる。ある実施形態では、３Ｄ培養で増殖した細胞は増殖する際に球状をとるようになる。他の実施形態では、細胞はオルガノイドの形状をとる。本明細書で使用される「オルガノイド」という用語は、モデル化している器官に類似した現実的な微小解剖構造を示す、インビトロで成長した３次元器官原基を意味する。
【００９２】
本明細書で使用される「ＧＳＫ−３阻害剤」という用語は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３Ａ又はグリコーゲンシンターゼキナーゼＢのキナーゼ機能を妨害し、標的をリン酸化するその能力を抑制する任意の化合物、治療薬又は薬物を意味する。この抑制は、デアセチラーゼ活性の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の抑制とすることができる。十分に特徴づけられた多くのＧＳＫ−３阻害剤、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１又はＬｉＣｌが当技術分野で既知である。ある実施形態では、ＧＳＫ−３阻害剤を１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、０．５〜１、０．５〜５、０．５〜１０、０．５〜１５、０．５〜２０、０．１〜１、０．１〜５、０．１〜１０、０．１〜１５又は０．１〜２０μＭの濃度で投与する。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、ＣＨＩＲ９９０２１を１〜１０μＭの濃度で投与する。ある実施形態では、ＧＳＫ−３阻害剤を１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、１０〜１５又は１０〜２０ｍＭの濃度で投与する。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、ＬｉＣｌを５〜１０ｍＭの濃度で投与する。
【００９３】
ｍＴＯＲ阻害剤は当技術分野で周知であり、例えば、ＰＰ２４２が挙げられる。このような阻害剤による阻害は、ｍＴＯＲ経路の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の阻害とすることができる。ある実施形態では、ｍＴＯＲ阻害剤を１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、０．５〜１、０．５〜５、０．５〜１０、０．５〜１５、０．５〜２０、０．１〜１、０．１〜５、０．１〜１０、０．１〜１５又は０．１〜２０μＭの濃度で投与する。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、ＰＰ２４２を１〜１０μＭの濃度で投与する。
【００９４】
ＴＧＦβ阻害剤は当技術分野で周知であり、多数ある中でも特にＲｅｐＳｏｘ、ＳＢ４３１５４２及びＡ８３−０１が挙げられる。このような阻害剤による阻害は、ＴＧＦβ経路の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の阻害とすることができる。ある実施形態では、ＴＧＦβ阻害剤を１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、０．５〜１、０．５〜５、０．５〜１０、０．５〜１５、０．５〜２０、０．１〜１、０．１〜５、０．１〜１０、０．１〜１５又は０．１〜２０μＭの濃度で投与する。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、Ａ８３−０１を０．５〜１μＭの濃度で投与する。ある実施形態では、ＳＢ４３１５４２を約１０μＭの濃度で投与する。
【００９５】
ＲＯＣＫ阻害剤は当技術分野で周知であり、多数ある中でも特にチアゾビビンが挙げられる。このような阻害剤による阻害は、ＲＯＣＫ経路の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％の阻害とすることができる。ある実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤を１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、０．５〜１、０．５〜５、０．５〜１０、０．５〜１５、０．５〜２０、０．１〜１、０．１〜５、０．１〜１０、０．１〜１５又は０．１〜２０μＭの濃度で投与する。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、チアゾビビンを１〜１０μＭの濃度で投与する。
【００９６】
ＥＲＫ活性化剤は当技術分野で周知であり、例えば、レスベラトロール及びフィステインが挙げられる。
【００９７】
ある実施形態では、バルプロ酸を１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、０．５〜１、０．５〜２、０．５〜３、０．５〜４、０．５〜５、０．５〜１０、０．５〜１５、０．５〜２０、０．１〜１、０．１〜５、０．１〜１０、０．１〜１５又は０．１〜２０ｍＭの濃度で投与する。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、バルプロ酸を０．５〜２ｍＭの濃度で投与する。
【００９８】
ある実施形態では、ラパマイシンを１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、０．５〜１、０．５〜２、０．５〜３、０．５〜４、０．５〜５、０．５〜１０、０．５〜１５、０．５〜２０、０．１〜１、０．１〜５、０．１〜１０、０．１〜１５又は０．１〜２０ｎＭの濃度で投与する。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、ラパマイシンを１〜１０ｎＭの濃度で投与する。
【００９９】
ある実施形態では、メトホルミンを１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、０．５〜１、０．５〜５、０．５〜１０、０．５〜１５、０．５〜２０、０．１〜１、０．１〜５、０．１〜１０、０．１〜１５又は０．１〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で投与する。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、メトホルミンを約１０ｍｇ／ｍｌの濃度で投与する。
【０１００】
ある実施形態では、トラニルシプロミンを１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、０．５〜１、０．５〜５、０．５〜１０、０．５〜１５、０．５〜２０、０．１〜１、０．１〜５、０．１〜１０、０．１〜１５又は０．１〜２０μＭの濃度で投与する。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、トラニルシプロミンを１〜１０μＭの濃度で投与する。
【０１０１】
ある実施形態では、３−デアザネプラノシンＡを１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５、０．５〜１、０．５〜５、０．５〜１０、０．５〜１５、０．５〜２０、０．１〜１、０．１〜５、０．１〜１０、０．１〜１５又は０．１〜２０μＭの濃度で投与する。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。ある実施形態では、３−デアザネプラノシンＡを１〜１０μＭの濃度で投与する。
【０１０２】
ある実施形態では、プロトコルＥのインキュベーションを少なくとも３０分間、１時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間又は４８時間行う。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。
【０１０３】
ある実施形態では、本発明の細胞の生成はＧ−ＣＳＦ処理と組み合わせて行うことができる。本明細書で使用される「Ｇ−ＣＳＦ処理」という用語は、Ｇ−ＣＳＦの細胞又は対象への投与を意味し、この処理によってＭＳＣとＣＤ３４＋細胞を動員する。
【０１０４】
ある実施形態では、ＨＧＦ又はＰＤＧＦβとのインキュベーションを少なくとも３０分間、１時間、４時間、８時間、１２時間、１８時間、２４時間、３６時間又は４８時間行う。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。
【０１０５】
ＰＣＡＴ１とＮＥＡＴ１はｌｎｃＲＮＡであり、当技術分野で既知である。ｌｎｃＲＮＡの導入は、核酸分子を細胞に導入するための任意の方法で行うことができる。このような方法は上に記載されている。
【０１０６】
ある実施形態では、ｌｎｃＲＮＡの阻害剤はｓｉＲＮＡである。ある実施形態では、ｌｎｃＲＮＡの阻害剤はｍｉＲである。ある実施形態では、阻害剤の導入は、プレｍｉＲ又はプレｓｉＲＮＡの導入を含む。
【０１０７】
ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、プロトコル３を実施し、更にＭＳＣにＰＣＡＴ１とＮＥＡＴ１を導入して行う。ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、プロトコル３を実施し、更にＭＳＣにＧＡＳ５とＰＴＥＮＰ１の発現阻害剤を導入して行う。ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＭＳＣを用意し、酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤又は５−ＡＺＡの内の少なくとも１種とＭＳＣを接触させ、ＰＤＧＦＡＡ、ＰＤＧＦＢＢ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ及びＩＧＦ１から選択される少なくとも１種の増殖因子をＭＳＣに導入し、ＰＣＡＴ１と、ＮＥＡＴ１又はＧＡＳ５と、ＰＴＥＮＰ１の発現阻害剤とをＭＳＣに導入して行う。
【０１０８】
ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＭＳＣを酸性培地、低酸素、ＲＯＣＫ阻害剤又は５−ＡＺＡと共にインキュベートした後、プロトコル４を実施して行う。
【０１０９】
ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、プロトコル５を実施し、更にＭＡＬＡＴ１、ＭＥＧ３、ＮＥＡＴ１、ＥＧＯ、ＧＡＳ５、ＫＲＡＳＰ１、ＬＯＣ２８５１９、ＢＣ２００及びＨ１９から成る群から選択される少なくとも１種のｌｎｃＲＮＡを前記ＭＳＣに導入して行う。ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、プロトコル５を実施し、更に前記ＭＳＣでのＡＮＲＩＬ、ＰＴＥＮＰ１及びａＨＩＦの内の少なくとも１種の発現を下方制御して行う。ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、プロトコル５又はプロトコル５を含む任意のプロセスを実施し、更に前記ＭＳＣでのＡＮＲＩＬ、ＰＴＥＮＰ１及びαＨＩＦの内の少なくとも１種の発現を下方制御して行う。ある実施形態では、プロトコル５又はプロトコル５を含む手順によって生成した細胞は衛星細胞表現型を示す。
【０１１０】
ある実施形態では、発現の下方制御は細胞に発現の阻害剤を導入して行う。ある実施形態では、発現の阻害剤はｍｉＲ、プレｍｉＲ又はｓｉＲＮＡから選択される。ある実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ又はｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙ技術等のゲノム変化によって下方制御を行う。
【０１１１】
ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、プロトコルＡ〜Ｅの内の少なくとも１種を実施した後にプロトコル１〜６の内のいずれか１種を実施して行う。ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＭＳＣのプライミング後にプロトコル１〜６の内のいずれか１種を実施して行う。ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、ＭＳＣのプライミング後に前記ＭＳＣをハイブリッド細胞に分化して行う。
【０１１２】
ある実施形態では、本発明の細胞は、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧから成る群から選択される少なくとも１種の幹細胞性マーカーを発現する。ある実施形態では、本発明の細胞は、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧから成る群から選択される複数の幹細胞性マーカーを発現する。ある実施形態では、プロトコルＡ〜Ｅの内のいずれか１種を含む任意のプロセスによって生成した本発明の細胞は、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧから成る群から選択される少なくとも１種の幹細胞性マーカーを発現する。ある実施形態では、 プロトコルＡ〜Ｅの内のいずれか１種を含む任意のプロセスによって生成した本発明の細胞は、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧから成る群から選択される複数の幹細胞性マーカーを発現する。
【０１１３】
ある実施形態では、本発明の細胞は、ＶＥＧＦ、ＧＤＮＦ及びＩＧＦ１から選択される少なくとも１種の栄養因子を分泌する。ある実施形態では、プロトコル１〜６の内のいずれか１種を含む任意のプロセスによって生成した本発明の細胞は、ＶＥＧＦ、ＧＤＮＦ及びＩＧＦ１から選択される少なくとも１種の栄養因子を発現する。
【０１１４】
ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、本明細書に記載のプロトコルの内の少なくとも１種を実施し、更に細胞中でＭＳＣ表現型と筋細胞表現型の存在を確認又は検出して行う。ある実施形態では、検出はＭＳＣタンパク質マーカーの存在の検出を含む。ある実施形態では、検出は、筋タンパク質マーカーの存在の検出を含む。ある実施形態では、本発明の細胞の生成は、本明細書に記載のプロトコルの内の少なくとも１種を実施し、更にＭＳＣ表現型と筋細胞表現型を有することが確認された細胞を選択して行う。
【０１１５】
他の態様によると、本発明は本発明の細胞を生成する方法を提供し、この方法は本明細書に記載のプロトコルの内の少なくとも１種を実施する段階を含む。ある実施形態では、本発明は、ＭＳＣ表現型と筋細胞表現型を含む混合特性の細胞を生成する方法を提供し、この方法は、プロトコル１〜６及びＡ〜Ｅの内の少なくとも１種を実施する段階を含む。
細胞への添加
【０１１６】
ある実施形態では、本発明の細胞は、細胞表面の筋細胞標的化部分又は細胞の細胞外小胞の表面を含む。ある実施形態では、本発明の細胞は筋細胞標的化部分を含む。ある実施形態では、筋細胞標的化部分は、カベオリン３に対するリガンド、Ｍ−カドヘリン、ニコチン性アセチルコリン受容体に対するリガンド、ミオスタチンのドミナントネガティブ突然変異体、及び１型アンジオテンシンＩＩの内のいずれか１種を含む。ある実施形態では、ミオスタチンプロペプチドのドミナントネガティブ体はミオスタチンのＣ３１３Ｙ突然変異を含む。ある実施形態では、標的化部分は、ＣＤ６３又はＣＤ８１と融合した上述の分子のいずれか１種を含む融合タンパク質を含む。ある実施形態では、筋細胞標的化部分はＭ−カドヘリンを含む。
【０１１７】
ある実施形態では、筋細胞標的化部分をトランスフェクションによって細胞に導入する。ある実施形態では、標的化部分をベクター中の細胞に導入する。ある実施形態では、標的化部分を導入して細胞膜内での発現を可能にする。ある実施形態では、細胞膜内での発現は細胞膜の外表面の発現である。ある実施形態では、標的化部分を導入してエキソソーム及び他の細胞外小胞の膜内での発現を可能にする。
【０１１８】
ある実施形態では、本発明の細胞は治療剤を含む。ある実施形態では、治療剤は筋肉治療剤である。ある実施形態では、治療剤は、薬物、リードスルー薬物、ＲＮＡ、ＤＮＡ分子、ベクター、エクソンスキリングオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンタゴミル、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）及びウイルスから成る群から選択される。
【０１１９】
ある実施形態では、ＲＮＡは修飾ＭｙｏＤ  ｍＲＮＡである。ある実施形態では、治療剤は、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−６７９３、ｍｉＲ−２、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３ｂ及びこれらの組み合わせから選択されるｍｉＲの阻害剤である。ある実施形態では、アンタゴミルは、抗ｍｉＲ−４２４、抗ｍｉＲ−１９５、抗ｍｉＲ−１６、抗ｍｉＲ−４９７、抗ｍｉＲ−１３５、抗ｍｉＲ−６７９３、抗ｍｉＲ−２１、抗ｍｉＲ−１３３ｂ及びこれらの組み合わせから成る群から選択される。ある実施形態では、アンタゴミルは抗ｌｅｔ７及び抗ｍｉＲ−１３３ｂから選択される。ある実施形態では、アンタゴミルは抗ｌｅｔ７である。
【０１２０】
ある実施形態では、薬物はオキシトシン、メラトニン、Ｇ−ＣＳＦ、ボルテゾミブ及びメトホルミンから選択される。ある実施形態では、薬物はユートロフィンの発現を増加させる薬物である。
【０１２１】
ある実施形態では、アンタゴミルは、ジストロフィンを標的とするｍｉＲとハイブリダイズする。ある実施形態では、アンタゴミルは、ｍｉＲ−６０６、ｍｉＲ−６８９３、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−３６４６及びｍｉＲ−２１４から成る群から選択されるｍｉＲとハイブリダイズする。ある実施形態では、アンタゴミルは抗ｍｉＲ−２１４である。ある実施形態では、細胞は抗ｍｉＲ−２１４及びマイクロジストロフィン又はジストロフィンを含む。
【０１２２】
ある実施形態では、ウイルスは、ジストロフィン、ユートロフィン、ｌｎｃＲＮＡ、ＣＣＡＴ１、Ｈｕｒ及びＩＧＦＢＰ１２３の内の少なくとも１種をコードするＤＮＡを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ある実施形態では、ｓｉＲＮＡはＡＬＳに関連するＳＯＤ１の変異体に対するものである。ある実施形態では、ｓｉＲＮＡはＡＬＳに関連する他の変異遺伝子又はタンパク質に対するものである。
医薬組成物
【０１２３】
他の態様によると、本発明は、本発明の細胞のいずれかによって分泌される単離細胞外小胞を提供する。ある実施形態では、細胞外小胞はエキソソームである。細胞外小胞を単離する方法は当業者に既知であり、本明細書に記載されている。
【０１２４】
他の態様によると、本発明の混合特性の細胞、本発明の細胞外小胞及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種を含む医薬組成物が提供される。ある実施形態では、医薬組成物は薬学的に許容し得る担体又はアジュバントを更に含む。
【０１２５】
本明細書で使用される「担体」、「賦形剤」又は「アジュバント」という用語は、活性剤ではない医薬組成物の任意の成分を意味する。本明細書で使用される「薬学的に許容し得る担体」という用語は、無毒性の不活性固体、半固体の液状充填剤、希釈剤、カプセル化材料、任意の種類の製剤助剤、又は単に生理食塩水等の無菌水性媒体を意味する。薬学的に許容し得る担体となり得る材料の例としては、ラクトース、グルコース及びスクロース等の糖、コーンスターチ及びジャガイモデンプン等のデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース等のセルロース及びその誘導体、トラガカント粉末、麦芽、ゼラチン、タルク、ココアバター及び坐薬ワックス等の賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油及び大豆油等の油、プロピレングリコール等のグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール等のポリオール、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル等のエステル、寒天、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム等の緩衝剤、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、リン酸緩衝液、及び医薬製剤に使用される他の無毒性の適合性物質が挙げられる。ここで担体となり得る物質の非限定的な例としては、糖、デンプン、セルロース及びその誘導体、トラガカント粉末、麦芽、ゼラチン、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、植物油、ポリオール、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張食塩水、リン酸緩衝液、ココアバター（坐薬基剤）、乳化剤、及び他の医薬製剤に使用される他の無毒性の医薬適合性物質が挙げられる。湿潤剤及び潤滑剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）や、着色剤、香味剤、賦形剤、安定剤、酸化防止剤及び防腐剤が存在してもよい。任意の無毒性で不活性且つ有効な担体を用いて、本明細書で企図される組成物を処方することができる。この点に関して適切な薬学的に許容し得る担体、賦形剤及び希釈剤は、当業者に周知であり、例えば、メルクインデックス第１３版、Ｂｕｄａｖａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．（２００１）、Ｊ．ＣＴＦＡ（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ，ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）国際化粧品成分辞典及びハンドブック、第１０版（２００４）、及び米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の薬物評価研究センター（ＣＤＥＲ）管理局の「Ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅ」に記載されているが、これらの各々の全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。本組成物に有用な薬学的に許容し得る賦形剤、担体及び希釈剤の例としては、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液及びＤＭＳＯが挙げられる。これらの更なる不活性成分や、有効な製剤及び投与手順は当技術分野で周知であり、標準的な教科書、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｌｍａｎ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ第８版、Ｇｉｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ���ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０）、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２１版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（２００５）に記載されているが、これらの各々の全内容は参照によって本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の組成物は、リポソーム、ＩＳＣＯＭＳ、徐放性粒子、及び血清中のペプチド又はポリペプチドの半減期を増加させる他の媒体等の人工的に作出された構造物に含有させることもできる。リポソームとしては、乳濁液、泡、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層等が挙げられる。本明細書に記載のペプチドと共に使用するリポソームは、標準的な小胞形成脂質（一般には、中性及び負に帯電したリン脂質及びステロール、例えば、コレステロールが挙げられる）から形成される。脂質の選択は、一般にリポソームのサイズや血液中の安定性等を考慮して決定される。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋで評されたように、リポソームを調製するための様々な方法が利用可能である。更に、米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号及び第５，０１９，３６９号も参照のこと。
【０１２６】
担体は、本明細書中に記載の医薬組成物を合計で約０．１重量％〜約９９．９９９９９重量％を含むことができる。
混合特性の細胞を含む治療方法
【０１２７】
他の態様によると、筋肉関連疾患又は筋損傷の治療、予防又は改善を必要とする対象において筋肉関連疾患又は筋損傷を治療、予防又は改善する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与して筋肉関連疾患又は筋損傷を治療、予防又は改善する段階を含む方法が提供される。
【０１２８】
他の態様によると、筋肉関連疾患又は筋損傷を治療、予防又は改善するのに使用するための本発明の医薬組成物が提供される。他の態様によると、筋肉関連疾患又は筋損傷の治療、予防又は改善のための本発明の医薬組成物の使用が提供される。他の態様によると、筋肉関連疾患又は筋損傷の治療、予防又は改善に使用するための本発明の医薬組成物が提供される。
【０１２９】
ある実施形態では、組成物は対象に対して同種異系又は自家性であるＭＳＣに由来する細胞を含む。
【０１３０】
ある実施形態では、治療は筋再生を増強することを含む。ある実施形態では、治療は線維症を抑制することを含む。ある実施形態では、治療は筋肉でのユートロフィンの発現を増加させることを含む。ある実施形態では、治療は筋肉でのジストロフィンの発現を増加させることを含む。ある実施形態では、改善は対象における症状の発症を遅延させることを含む。
【０１３１】
他の態様によると、筋細胞でのユートロフィン又はジストロフィンの発現を増加させる方法であって、本発明の医薬組成物を筋細胞に投与して筋細胞でのユートロフィン又はジストロフィンの発現を増加させる段階を含む方法が提供される。他の態様によると、筋細胞でのユートロフィン又はジストロフィンの発現を増加させるのに使用するための本発明の医薬組成物が提供される。
【０１３２】
ある実施形態では、筋細胞は培養下にある。ある実施形態では、筋細胞は対象内にある。ある実施形態では、筋細胞はインビトロ又はインビボにある。
【０１３３】
他の態様によると、筋生成の増強を必要とする対象において筋生成を増強する方法であって、本発明の医薬組成物を対象に投与して筋再生の増強を必要とする対象において筋再生を増強する段階を含む方法が提供される。他の態様によると、筋生成を増強するのに使用するための本発明の医薬組成物が提供される。ある実施形態では、筋生成は筋再生である。ある実施形態では、筋肉は培養下にある。ある実施形態では、筋肉は対象内にある。ある実施形態では、筋肉はインビトロ又はインビボにある。
【０１３４】
本明細書で使用される「筋肉関連疾患」という用語は、筋成分を有するか、或いは筋肉の機能又は健康に影響を及ぼす任意の疾患又は障害を意味する。筋肉症状に関連する疾患は当技術分野で周知であり、数例を挙げると、筋肉自体の疾患、骨格の疾患、筋肉を衰弱させるニューロンの疾患、ミトコンドリア疾患及びエネルギー恒常性疾患がある。ある実施形態では、筋肉関連疾患又は筋損傷は、運動ニューロン疾患、末梢ニューロン疾患、筋ジストロフィー、脊髄損傷、筋肉疲労、心筋傷害、心線維症、炎症性筋障害、重症筋無力症、筋肉減少症、悪液質及び骨格筋傷害から成る群から選択される。ある実施形態では、筋肉関連疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、悪液質、心線維症及び筋ジストロフィーから成る群から選択される。ある実施形態では、筋ジストロフィーはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である。
【０１３５】
ある実施形態では、筋肉関連疾患はＡＬＳであり、上述の方法は、星状細胞表現型又は神経幹細胞（ＮＳＣ）表現型に分化した少なくとも１種のＭＳＣを投与する段階を更に含む。当業者に既知の多くの方法によってＭＳＣを分化させることができる。ある実施形態では、星状細胞表現型への分化は米国特許出願第２０１５００３７２９８号に記載のように行う。ある実施形態では、ＮＳＣ表現型への分化は米国特許出願第２０１５００３７２９９号に記載のように行う。
【０１３６】
ある実施形態では、筋肉関連疾患はＤＭＤであり、上述の方法は、未分化ＭＳＣ、未分化ＭＳＣの細胞外小胞、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種を投与する段階を更に含む。
【０１３７】
ある実施形態では、本発明の細胞又はその細胞外小胞は、対象の適切な身体領域を衝撃波、集束超音波又は低レーザー療法に曝露して骨格筋、心臓又は横隔膜を標的にする。
【０１３８】
他の態様によると、細胞の生着の増加を必要とする対象において細胞の生着を増加させる方法であって、本発明の医薬組成物、未修飾ＭＳＣを含む医薬組成物、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種を前記細胞と同時投与して細胞の生着を増加させる段階を含む方法が提供される。他の態様によると、細胞の生着を増加させるのに使用するための、本発明の混合特性の細胞、未修飾ＭＳＣ、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種を含む組成物が提供される。
【０１３９】
ある実施形態では、細胞は対象に対して同種異系又は自家性である。ある実施形態では、未修飾ＭＳＣは臍帯又は絨毛膜胎盤に由来する。ある実施形態では、未修飾ＭＳＣは絨毛膜胎盤に由来する。
【０１４０】
ある実施形態では、移植される細胞は、筋芽細胞、衛星細胞、メサンギウム芽細胞、心筋幹細胞、星状細胞及びニューロン幹細胞から成る群から選択される。ある実施形態では、移植される細胞は、筋芽細胞、衛星細胞、星状細胞及びニューロン幹細胞から成る群から選択される。ある実施形態では、投与されたＭＳＣ又は混合特性の細胞の生着細胞に対する比は１：１〜２：１である。
【０１４１】
他の態様によると、筋細胞でユートロフィン又はジストロフィンの発現を増加させる方法であって、本発明の医薬組成物、未修飾ＭＳＣ、未修飾ＭＳＣ由来のエキソソーム、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種を含む医薬組成物を筋細胞に投与して筋細胞でユートロフィン又はジストロフィンの発現を増加させる段階を含む方法が提供される。他の態様によると、筋細胞でユートロフィン又はジストロフィンの発現を増加させるのに使用するための、本発明の医薬組成物、未修飾ＭＳＣ、未修飾ＭＳＣ由来のエキソソーム、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種を含む組成物が提供される。
【０１４２】
ある実施形態では、筋細胞は培養下にある。ある実施形態では、筋細胞は対象内にある。ある実施形態では、筋細胞はインビトロ又はインビボにある。ある実施形態では、未修飾ＭＳＣは臍帯又は絨毛膜胎盤に由来する。ある実施形態では、未修飾ＭＳＣは絨毛膜胎盤に由来する。
本発明のキット
【０１４３】
他の態様によると、ＭＳＣ培地と少なくとも１種の分化剤を含むキットが提供される。他の態様によると、臍帯ＭＳＣ又は絨毛膜ＭＳＣと少なくとも１種の分化剤を含むキットが提供される。ある実施形態では、キットはＭＳＣ培地を更に含む。
【０１４４】
他の態様によると、本発明の混合特性の細胞、本発明の単離細胞外小胞、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種を含むキットが提供される。
【０１４５】
本明細書で使用される「分化剤」という用語は、プロトコルＡ〜Ｅ及び１〜６で使用するための本明細書に記載の物質のいずれかを意味する。ある実施形態では、キットは少なくとも１種、２種、３種、４種、５種又は６種の分化剤を含む。各々の可能性は本発明の別々の実施形態を示す。
【０１４６】
ある実施形態では、分化剤は、幹細胞性因子、ＲＯＣＫ阻害剤、ＳＴＡＴ３活性化剤、ＮＦ−ＫＢ活性化剤、ＣＨＩＲ９９０２１、メトホルミン、トラニルシプロミン、Ｇｓｋ３阻害剤、３−デアザネプラノシンＡ、ｍＴｏｒ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、チアゾビビン、Ａ８３−０１、ＬｉＣｌ、ＳＢ４３１５４２、５−ＡＺＡ、ラパマイシン、ＥＲＫ活性化剤、バルプロ酸から成る群から選択される。ある実施形態では、幹細胞性因子は、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＯＣＴ４及びこれらの組み合わせから成る群から選択される。ある実施形態では、分化剤は、増殖因子、ｌｎｃＲＮＡ、転写因子及びｍｉＲから成る群から選択される。ある実施形態では、増殖因子は、ＨＧＦ、ＰＤＧＦβ、ＰＤＧＦＡＡ、ＰＤＧＦＢＢ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＧＦ１及びこれらの組み合わせから成る群から選択される。ある実施形態では、転写因子は、ＭＹＦ５、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ＭｙｏＤとＰＡＸ３、ＭｙｏＤとＰＡＸ７、及びＭｙｏＤとＭＹＦ５から成る群から選択される。ある実施形態では、分化剤は、筋細胞、筋細胞エキソソーム、ジストロフィン、マイクロジストロフィン及びユートロフィンから選択される。ある実施形態では、ｌｎｃＲＮＡは、ＰＣＡＴ１、ＮＥＡＴ１、ＧＡＳ５、ＢＩＬ、ＰＡＲ５、ＢＩＣ、ＤＩＳＣ２、ＧＡＳ５ＤＬＧ２ＡＳ、７ＳＫ、Ｙ１、ＬＩＮＣＲＮＡ、ＳＦＭＢＴ２、Ｙ４、ＳＣＡ８、ＭＡＬＡＴ１、ＭＥＧ３、ＥＧＯ、ＫＲＡＳＰ１、ＬＯＣ２８５１９、ＢＣ２００及びＨ１９から成る群から選択される。ある実施形態では、ｌｎｃＲＮＡは、ＰＡＲ５、ＤＩＳＣ２及びＰＣＡＴ１から選択される。ある実施形態では、ｍｉＲは、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−５２０、ｍｉＲ−５２４、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−５５０、ｍｉＲ−５６１、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−５８２、ｍｉＲ−５８３、ｍｉＲ−５８７、ｍｉＲ−６１３、ｍｉＲ−６１４、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６３４、ｍｉＲ−６４５、ｍｉＲ−６４６、ｍｉＲ−６４９、ｍｉＲ−６６１、ｍｉＲ−６６２、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−６７１、ｍｉＲ−８８７、ｍｉＲ−１１８３、ｍｉＲ−１２２４、ｍｉＲ−１２２５、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２３４、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２４７、ｍｉＲ−１２５７、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１２６８、ｍｉＲ−１２６９、ｍｉＲ−１２８９、ｍｉＲ−１２８７、ｍｉＲ−１９０９、ｍｉＲ−１９１１、ｍｉＲ−７５９、ｍｉＲ−３１５０、ｍｉＲ−３１７４、ｍｉＲ−３１８０、ｍｉＲ−３１９１、ｍｉＲ−３１９７、ｍｉＲ−４２９２、ｍｉＲ−２１１５、ｍｉＲ−４３１２、ｍｉＲ−９２、９３及びｍｉＲ−９９から成る群から選択される。ある実施形態では、ｍｉＲは、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−６１４及びｍｉＲ−６６８から成る群から選択される。
【０１４７】
ある実施形態では、キットは筋細胞標的化部分を更に含む。ある実施形態では、筋細胞標的化部分は、カベオリン３に対するリガンド、Ｍ−カドヘリン、ニコチン性アセチルコリン受容体に対するリガンド、ミオスタチンのドミナントネガティブ突然変異体、及び１型アンジオテンシンＩＩの内のいずれか１種を含む。ある実施形態では、ミオスタチンプロペプチドのドミナントネガティブ体はミオスタチンのＣ３１３Ｙ突然変異を含む。ある実施形態では、標的化部分は、ＣＤ６３又はＣＤ８１と融合した上述の分子のいずれか１種を含む融合タンパク質を含む。ある実施形態では、筋細胞標的化部分はＭ−カドヘリンを含む。
【０１４８】
ある実施形態では、キットは治療剤を更に含む。ある実施形態では、治療剤は筋肉治療剤である。ある実施形態では、治療剤は、薬物、リードスルー薬物、ＲＮＡ、ＤＮＡ分子、ベクター、エクソンスキリングオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、アンタゴミル、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）及びウイルスから成る群から選択される。
【０１４９】
ある実施形態では、ＲＮＡは修飾ＭｙｏＤ  ｍＲＮＡである。ある実施形態では、治療剤は、ｍｉＲ−４２４、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−６７９３、ｍｉＲ−２、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３ｂ及びこれらの組み合わせから選択されるｍｉＲの阻害剤である。ある実施形態では、アンタゴミルは、抗ｍｉＲ−４２４、抗ｍｉＲ−１９５、抗ｍｉＲ−１６、抗ｍｉＲ−４９７、抗ｍｉＲ−１３５、抗ｍｉＲ−６７９３、抗ｍｉＲ−２１、抗ｍｉＲ−１３３ｂ及びこれらの組み合わせから成る群から選択される。ある実施形態では、アンタゴミルは抗ｌｅｔ７及び抗ｍｉＲ−１３３ｂから選択される。ある実施形態では、アンタゴミルは抗ｌｅｔ７である。
【０１５０】
ある実施形態では、薬物はオキシトシン、メラトニン、Ｇ−ＣＳＦ、ボルテゾミブ及びメトホルミンから選択される。ある実施形態では、薬物はユートロフィンの発現を増加させる薬物である。
【０１５１】
ある実施形態では、アンタゴミルは、ジストロフィンを標的とするｍｉＲとハイブリダイズする。ある実施形態では、アンタゴミルは、ｍｉＲ−６０６、ｍｉＲ−６８９３、ｍｉＲ−５２１、ｍｉＲ−３６４６及びｍｉＲ−２１４から成る群から選択されるｍｉＲとハイブリダイズする。ある実施形態では、アンタゴミルは抗ｍｉＲ−２１４である。ある実施形態では、細胞は、抗ｍｉＲ−２１４及びマイクロジストロフィン又はジストロフィンを含む。
【０１５２】
ある実施形態では、ウイルスは、ジストロフィン、ユートロフィン、ｌｎｃＲＮＡ、ＣＣＡＴ１、Ｈｕｒ及びＩＧＦＢＰ１２３の内の少なくとも１種をコードするＤＮＡを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。ある実施形態では、ｓｉＲＮＡはＡＬＳに関連するＳＯＤ１の変異体に対するものである。ある実施形態では、ｓｉＲＮＡはＡＬＳに関連する他の変異遺伝子又はタンパク質に対するものである。
未修飾ＭＳＣを含む治療方法
【０１５３】
他の態様によると、筋ジストロフィー、線維症又は悪液質を治療、予防又は改善する方法であって、未分化ＭＳＣ、未分化ＭＳＣの細胞外小胞又はこれらの組み合わせを投与する段階を含む方法が提供される。他の態様によると、筋ジストロフィー、線維症又は悪液質を治療、予防又は改善するのに使用するための、未分化ＭＳＣ、未分化ＭＳＣの細胞外小胞又はこれらの組み合わせの内のいずれか１種を含む組成物が提供される。他の態様によると、筋ジストロフィー、線維症又は悪液質の治療、予防又は改善に使用するための、未分化ＭＳＣ、未分化ＭＳＣの細胞外小胞又はこれらの組み合わせの内のいずれか１種を含む組成物が提供される。
【０１５４】
ある実施形態では、ＭＳＣは臍帯又は絨毛膜胎盤に由来する。ある実施形態では、ＭＳＣは絨毛膜胎盤に由来する。ある実施形態では、筋ジストロフィーはＤＭＤである。ある実施形態では、線維症は心線維症である。
【０１５５】
絨毛膜ＭＳＣは当技術分野で周知である。ある実施形態では、絨毛膜ＭＳＣ又はその分泌小胞の同定は、以下の記載のもののいずれかの発現を調べることによって行うことができる。即ち、ａ）ＳＣＡ８、ＴＵ００１７６、ＬＩＮＣ−ＶＬＤＬＲ及び必要に応じてＲＯＲから成る群から選択される１種以上の長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ｂ）ｍｉｒ−３１６３、ｍｉｒ−１２８、ｍｉｒ−２７ａ、ｍｉｒ−２７ｂ、ｍｉｒ−１４８ａ、ｍｉｒ−１４８ｂ、ｍｉｒ−１５２、ｍｉｒ−６５１、ｍｉｒ−９、ｍｉｒ−４６６、ｍｉｒ−５７７、ｍｉｒ−３８０、ｍｉｒ−２９０９、ｍｉｒ−４８０３、ｍｉｒ−５５６−３ｐ、ｍｉｒ−１８２、ｍｉｒ−４６７７−５ｐ、ｍｉｒ−４６７２、ｍｉｒ−３９４２−５ｐ、ｍｉｒ−４７０３−５ｐ、ｍｉｒ−４７６５、ｍｉｒ−４２９１、ｍｉｒ−１４４、ｍｉｒ−１２０６、ｍｉｒ−４４３５、ｍｉｒ−４５２、ｍｉｒ−４６７６−３ｐ、ｍｉｒ−２５、ｍｉｒ−３２、ｍｉｒ−３６３、ｍｉｒ−３６７、ｍｉｒ−９２ａ、ｍｉｒ−９２ｂ、ｍｉｒ−３４０、ｍｉｒ−３６２０、ｍｉｒ−４３２４、ｍｉｒ−４７８９−５ｐ、ｍｉｒ−３４６、ｍｉｒ−９４４、ｍｉｒ−３１８０−５ｐ、ｍｉｒ−２０２、ｍｉｒ−５１１、ｍｉｒ−４３２６、ｍｉｒ−５７８、ｍｉｒ−４３１２、ｍｉｒ−４２８２、ｍｉｒ−５９７、ｍｉｒ−３６８９ｄ、ｍｉｒ−２１１６、ｍｉｒ−４５１７、ｍｉｒ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉｒ−１９９ｂ−３ｐ、ｍｉｒ−３１２９−５ｐ、ｍｉｒ−５２０ｄ−５ｐ、ｍｉｒ−５２４−５ｐ、ｍｉｒ−２０３、ｍｉｒ−３９４２−３ｐ、ｍｉｒ−５０１−５ｐ、ｍｉｒ−１４３、ｍｉｒ−４７７０、ｍｉｒ−４４２２、ｍｉｒ−４４９５、ｍｉｒ−１２７１、ｍｉｒ−９６、ｍｉｒ−１２９７、ｍｉｒ−２６ａ、ｍｉｒ−２６ｂ、ｍｉｒ−４４６５、ｍｉｒ−４２７３、ｍｉｒ−１２９４、ｌｅｔ−７ａ、ｌｅｔ−７ｂ、ｌｅｔ−７ｃ、ｌｅｔ−７ｄ、ｌｅｔ−７ｅ、ｌｅｔ−７ｆ、ｌｅｔ−７ｇ、ｌｅｔ−７ｉ、ｍｉｒ−４４５８、ｍｉｒ−４５００、ｍｉｒ−９８、ｍｉｒ−４６５２−３ｐ、ｍｉｒ−４７１６−５ｐ、ｍｉｒ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉｒ−２２３、ｍｉｒ−４２８８、ｍｉｒ−４５５−５ｐ、ｍｉｒ−６３２、ｍｉｒ−４４７７ｂ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−５６１、ｍｉｒ−４６９８、ｍｉｒ−３１４０−３ｐ、ｍｉｒ−３６６２、ｍｉｒ−４１０、ｍｉｒ−３７６ａ、ｍｉｒ−３７６ｂ、ｍｉｒ−１２７０、ｍｉｒ−６２０、ｍｉｒ−５１５−５ｐ、ｍｉｒ−８７５−５ｐ、ｍｉｒ−１４０−５ｐ、ｍｉｒ−４２５６、ｍｉｒ−３０ａ、ｍｉｒ−３０ｂ、ｍｉｒ−３０ｃ、ｍｉｒ−３０ｄ、ｍｉｒ−３０ｅ、ｍｉｒ−４２５４、ｍｉｒ−５１５−３ｐ、ｍｉｒ−５１９ｅ、ｍｉｒ−２９６４ａ−５ｐ、ｍｉｒ−２１１５、ｍｉｒ−５２０ａ−５ｐ、ｍｉｒ−５２５−５ｐ、ｍｉｒ−１２４４、ｍｉｒ−３１９０、ｍｉｒ−５４８ａ−５ｐ、ｍｉｒ−５４８ａｂ、ｍｉｒ−５４８ａｋ、ｍｉｒ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉｒ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉｒ−５４８ｄ−５ｐ、ｍｉｒ−５４８ｈ、ｍｉｒ−５４８ｉ、ｍｉｒ−５４８ｊ、ｍｉｒ−５４８ｗ、ｍｉｒ−５４８ｙ、ｍｉｒ−５５９、ｍｉｒ−２６８１、ｍｉｒ−３６７１、ｍｉｒ−３７５、ｍｉｒ−４７８９−３ｐ、ｍｉｒ−３１４３、ｍｉｒ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉｒ−１２５ｂ、ｍｉｒ−４３１９、ｍｉｒ−５０９６、ｍｉｒ−３３８−５ｐ、ｍｉｒ−４９３、ｍｉｒ−３１５３、ｍｉｒ−８７５−３ｐ、ｍｉｒ−５１６ａ−３ｐ、ｍｉｒ−３２３−３ｐ、ｍｉｒ−３０６５−５ｐ、ｍｉｒ−４７６２−３ｐ、ｍｉｒ−３６１７、ｍｉｒ−６４１、ｍｉｒ−１２４、ｍｉｒ−５０６、ｍｉｒ−４５３１、ｍｉｒ−４５１２、ｍｉｒ−５７０、ｍｉｒ−４６７９、ｍｉｒ−３１４４−３ｐ、ｍｉｒ−４７７７−３ｐ、ｍｉｒ−４７３２−３ｐ、ｍｉｒ−３１７７−５ｐ、ｍｉｒ−５４８ｎ、ｍｉｒ−４３２８、ｍｉｒ−２３５５−３ｐ、ｍｉｒ−４３３０、ｍｉｒ−４５２４、ｍｉｒ−４７１９、ｍｉｒ−３９７６、ｍｉｒ−５４４、ｍｉｒ−３６０７−３ｐ、ｍｉｒ−５８１、ｍｉｒ−２０５、ｍｉｒ−４７３１−３ｐ、ｍｉｒ−４８０１、ｍｉｒ−３６６７−５ｐ、ｍｉｒ−１２４５ｂ−３ｐ、ｍｉｒ−４７６０−３ｐ、ｍｉｒ−１３７、ｍｉｒ−３１９４−３ｐ、ｍｉｒ−３４２−３ｐ、ｍｉｒ−２６８２、ｍｉｒ−４４９ｃ、ｍｉｒ−５３２−３ｐ、ｍｉｒ−４３０５、ｍｉｒ−１、ｍｉｒ−２０６、ｍｉｒ−６１３、ｍｉｒ−６７６、ｍｉｒ−１２９６、ｍｉｒ−１９６ａ、ｍｉｒ−１９６ｂ、ｍｉｒ−３９４１、ｍｉｒ−４７９５−３ｐ、ｍｉｒ−４３１、ｍｉｒ−６０７、ｍｉｒ−５４８ｋ、ｍｉｒ−４４６４、ｍｉｒ−４７４８、ｍｉｒ−６５４−３ｐ、ｍｉｒ−５４４ｂ、ｍｉｒ−３０７４−５ｐ、ｍｉｒ−３１１５、ｍｉｒ−４６３５、ｍｉｒ−４３２３、ｍｉｒ−５４８ｔ、ｍｉｒ−４６８０−５ｐ、ｍｉｒ−１３３ａ、ｍｉｒ−１３３ｂ、ｍｉｒ−６００、ｍｉｒ−１２０８、ｍｉｒ−４７０８−５ｐ、ｍｉｒ−３１２３、ｍｉｒ−４２５１、ｍｉｒ−４３０７、ｍｉｒ−３１８５、ｍｉｒ−５８２−５ｐ、ｍｉｒ−４４３６ｂ−３ｐ、ｍｉｒ−３７８、ｈａｓ、ｍｉｒ−３７８ｂ、ｍｉｒ−３７８ｃ、ｍｉｒ−３７８ｄ、ｍｉｒ−３７８ｅ、ｍｉｒ−３７８ｆ、ｍｉｒ−３７８ｈ、ｍｉｒ−３７８ｉ、ｍｉｒ−４２２ａ、ｍｉｒ−４４６０、ｍｉｒ−２００ｂ、ｍｉｒ−２００ｃ、ｍｉｒ−４２９、ｍｉｒ−４４７０、ｍｉｒ−１２４５ｂ−５ｐ、ｍｉｒ−３１４２、ｍｉｒ−５７６−３ｐ、ｍｉｒ−５４８ｍ、ｍｉｒ−４６６６−３ｐ、ｍｉｒ−３２５、ｍｉｒ−３３０−３ｐ、ｍｉｒ−３６９０、ｍｉｒ−５４８ａ−３ｐ、ｍｉｒ−５４８ｅ、ｍｉｒ−５４８ｆ、ｍｉｒ−４７０９−５ｐ、ｍｉｒ−５３２−５ｐ、ｍｉｒ−５３９、ｍｉｒ−４３０３、ｍｉｒ−４３０２、ｍｉｒ−３００、ｍｉｒ−３８１、ｍｉｒ−４６４５−３ｐ、ｍｉｒ−３９１０、ｍｉｒ−１３０１、ｍｉｒ−５０４７、ｍｉｒ−１８８−５ｐ、ｍｉｒ−３９７４、ｍｉｒ−３９２３、ｍｉｒ−３６８６、ｍｉｒ−６７０、ｍｉｒ−２０５２、ｍｉｒ−５４８ａｌ、ｍｉｒ−３２００−３ｐ、ｍｉｒ−４６８６、ｈａｓ、ｍｉｒ−３５４５−５ｐ、ｍｉｒ−１９４、ｍｉｒ−４９８、ｍｉｒ−３９１３−３ｐ、ｍｉｒ−３１６８、ｍｉｒ−４９９−３ｐ、ｍｉｒ−４９９ａ−３ｐ、ｍｉｒ−６５６、ｍｉｒ−４７６２−５ｐ、ｍｉｒ−４４９６、ｍｉｒ−１４１、ｍｉｒ−２００ａ、ｍｉｒ−３５２９、ｍｉｒ−３７９、ｍｉｒ−３６９１−３ｐ、ｍｉｒ−５２０ｆ、ｍｉｒ−５０３、ｍｉｒ−４４７７ａ、ｍｉｒ−５１３ａ−３ｐ、ｍｉｒ−３１４９、ｍｉｒ−３９２７、ｍｉｒ−１２８３、ｍｉｒ−４７６７、ｍｉｒ−４８７ｂ、ｍｉｒ−４６３７、ｍｉｒ−１９ａ、ｍｉｒ−１９ｂ、ｍｉｒ−４６８３、ｍｉｒ−５４８ａｎ、ｍｉｒ−１２００、ｍｉｒ−４６３８−３ｐ、ｍｉｒ−１８２５、ｍｉｒ−５２２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−９３から成る群から選択される１種以上のｍｉＲＮＡ、ｃ）ＨＧＦ、ｗｎｔ２、ＧＤＮＦ、オステオプロテゲリン、ＭＩＰ３α、ＮＴ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＦＧＦ７、ＮＴ−４、ＥＧＦＬ６及び必要に応じてＬＩＦ及びＢＤＮＦから成る群から選択される１種以上の分泌因子、ｄ）ＴＣＲα−β、ＣＤ５５、ＬＩＦＲ及びＳＴ６ＧＡＬＮＡＣＳから選択される１種以上の表面マーカー、ｅ）低ＹＫＬ４０及びＫＬＦ４から選択される１種以上の幹細胞性及び間葉系マーカー、ｆ）ＣＯＬ４Ａ２、ＬＧＡＬＳ３、ＳＣＵＢＥ１、ＬＧＡＳ３及びＳ１００Ａ１０から成る群から選択される１種以上のタンパク質のＭＳＣ由来小胞発現、ｇ）ＢＣＭＳ、ＢＩＣ及び必要に応じてＨＡＲ１Ｂから成る群から選択される１種以上のｌｎｃＲＮＡのＭＳＣ由来小胞発現、及びｈ）これらの組み合わせ。
【０１５６】
ある実施形態では、絨毛膜ＭＳＣの同定は、ＣＡＳＫ、ＣＯＬ３Ａ１、Ｂ２Ｍ、ＣＤＨ２、ＣＴＮＮＡ１、ＤＬＧ１、ＥＧＦＲ、Ｆ３、ＦＡＲＰ１、ＧＰＣ１、ＣＤＨ２、ＣＴＮＮＡ１、ＨＡＰＬＮ１、ＬＡＭＢ１、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＰＣ１、ＬＧＡＬＳ３ＢＰ、ＬＯＸＬ２、ＭＣＡＭ、ＮＩＤ１、ＯＬＸＮＢ２、Ｓ１００Ａ６、ＴＮＣ、ＷＮＴ５Ａ及びＰＬＸＮＢ２から成る群から選択される１種以上のタンパク質を含む細胞由来小胞によって行うこともできる。
【０１５７】
他の態様によると、ＡＬＳの治療、予防又は改善を必要とする対象においてＡＬＳを治療、予防又は改善する方法であって、星状細胞表現型に分化したＭＳＣ、神経幹細胞表現型に分化したＭＳＣ、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種を含む医薬組成物を投与する段階を含む方法が提供される。他の態様によると、ＡＬＳを治療、予防又は改善するのに使用するための、星状細胞表現型に分化したＭＳＣ、神経幹細胞表現型に分化したＭＳＣ、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種を含む組成物が提供される。他の態様によると、ＡＬＳの治療、予防又は改善に使用するための、星状細胞表現型に分化したＭＳＣ、神経幹細胞表現型に分化したＭＳＣ、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１種を含む組成物が提供される。
【０１５８】
ある実施形態では、ＭＳＣは臍帯又は絨毛膜胎盤に由来する。ある実施形態では、ＭＳＣは絨毛膜胎盤に由来する。
【０１５９】
ある実施形態では、治療は筋再生を増強することを含む。ある実施形態では、治療は線維症を抑制することを含む。ある実施形態では、治療は筋肉でのユートロフィンの発現を増加させることを含む。ある実施形態では、治療は筋肉でのジストロフィンの発現を増加させることを含む。ある実施形態では、改善は対象における症状の発症を遅延させることを含む。
【０１６０】
ある実施形態では、未処理ＭＳＣを含む方法は上述の筋細胞標的化部分を含むＭＳＣを用いて行う。ある実施形態では、未処理ＭＳＣを含む方法は上述の治療剤を含むＭＳＣを用いて行う。
【０１６１】
他の態様によると、悪液質の診断を必要とする対象において悪液質を診断する方法であって、対象の血清からエキソソームを用意する段階と、エキソソームをヒト不死化細胞株と共にインキュベートする段階と、細胞死及びミオシン重鎖発現の内の１つを測定する段階を含む方法が提供され、細胞死の増加又はミオシン重鎖発現の減少は対象が悪液質を有することを示す。
【０１６２】
他の態様によると、対象において悪液質エキソソームを検出する方法であって、対象の血清からエキソソームを用意する段階と、エキソソームをヒト不死化細胞株と共にインキュベートする段階と、細胞死及びミオシン重鎖発現の内の１つを測定する段階を含む方法が提供され、細胞死の増加又はミオシン重鎖発現の減少は対象に悪液質エキソソームが存在することを示す。
【０１６３】
本明細書で使用される特定の用語の定義は本明細書に記載されている。特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は一般に、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。当業者であれば、本発明の実施に使用され得る、本明細書に記載の方法及び材料と類似又は同等の多くの方法及び材料を認識されよう。実際、本発明は記載された方法及び材料に決して限定されない。
【０１６４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容が明確に指示されない限り、複数の指示対象を包含する。例えば、「核酸（ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」という記載は２種以上の核酸の組み合わせ等を包含する。
【０１６５】
本明細書で使用される「約」は当業者には理解されており、使用される状況に応じてある程度変化し得る。当業者には明らかでない用語の使用がある場合、それが使用されている文脈では、「約」は列挙値の±１０％以内を意味する。
【０１６６】
本発明の更なる目的、利点及び新規な特徴は以下の実施例を検討することによって当業者には明らかになるであろうが、これらの実施例に限定されることを意図するものではない。更に、上述され且つ下記の特許請求の範囲で請求される本発明の様々な実施形態及び態様の各々については、その実験的確証が以下の実施例に記載されている。
実施例
材料及び方法
胎盤由来ＭＳＣの調製
【０１６７】
胎盤ＭＳＣと臍帯ＭＳＣを以下のプロトコルによってヒト、イヌ及びウマから単離した。組織をＰＢＳで洗浄した。羊膜と絨毛膜を機械的に細片に断片化した後、２段階で酵素消化に供した。（１）上皮細胞を除去するために、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡと共に３７℃で３０分間インキュベーション。（２）０．１％コラゲナーゼＩＶを用いて３７℃で６０分間処理した後、ウシ胎仔血清で不活性化。次に細胞懸濁液を１００μＭフィルターで濾過し、遠心分離した細胞を７５ｃｍ２のＣｏｒｎｉｎｇフラスコ内の１５％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンで構成されたＤＭＥＤ培地／栄養混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に播種した。或いは、細胞を無血清ＭＳＣ培地で保持した。同様の手順を用いて臍帯からＭＳＣを調製した。２週間後、細胞をＲｏｃｋ阻害剤と共に１日間インキュベートした後、低酸素条件下で更に２４時間インキュベートした。エキソソームが欠乏した培地で細胞を保持した。
エキソソーム単離
【０１６８】
細胞培養培地からのエキソソーム単離は多段階遠心分離によって４℃で行った。即ち、培地を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して大きな細胞片を除去した後、０．２２μｍのフィルターで濾過して小さな細胞片を除去した。次に上清を１００，０００×ｇで１〜２時間遠心分離した。電子顕微鏡法とナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）を用い、ＣＤ６３、ＣＤ９及びＡＬＩＸの発現によってエキソソームを同定した。エキソソームの定量は、総タンパク質濃度を測定し、更にＣＤ６３  ＥＬＩＳＡ（ＳＢＩ）を行って分析した。
ｑＲＴ  ＰＣＲ
【０１６９】
製造業者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ）に従い、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉキットを用いて全ＲＮＡを抽出した。２μｇの全ＲＮＡを用いて逆転写反応を行った。各プライマーセットについてプライマー最適化段階を試験して最適プライマー濃度を決定した。プライマー、２５μＬの２ｘＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び３０〜１００ｎｇのｃＤＮＡ試料を総量５０μＬのＰＣＲ増幅溶液に再懸濁した。使用したプライマーを表１に示す。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスター市）で反応を行った。サイクル閾値（Ｃｔ）はＡＢＩ  ７０００ソフトウェアから得た。Ｓ１２又はβ−アクチンレベルも対照として各ＲＮＡサンプルについて測定した。
【表１】
2019514416.tif 000003
表面マーカー分析
【０１７０】
表面マーカー発現はＦＡＣＳ分析によって測定した。細胞を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて解離させるか又はプレートから収集し、カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝食塩水に再懸濁させて単一細胞懸濁液を得た。３×１０５個の細胞を使用し、陽性抗体（ＣＤ７３−ＡＰＣ、ＣＤ９０−ＦＩＴＣ、ＣＤ１０５−ＰＥ）と陰性抗体（ＣＤ３４／ＣＤ４５／ＣＤ１４／ＣＤ２０−ＰｅｒＣｐ）の両方を含むＭＳＣアイソタイプカクテル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）及びヒトＭＳＣ機能ＩＤキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて染色した。細胞を抗体と共に４℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄し、０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁させた。ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩ機器（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞を分析した。
新しい筋線維のカウント
【０１７１】
マウスに対してＴＡ筋にカルジオトキシンのＰＢＳ溶液を２５μｌ注射し、７日後に屠殺した。筋肉を解剖して胚性ミオシン重鎖（ＭＹＨ１）を染色し、核が中央に位置するＭＹＨ１に対して陽性の細胞を新たに生成した筋肉としてスコア化した。或いは、ＭｙｏＤ及びＰａｘ７に対して二重陽性の細胞は非対称に分割する衛星細胞と考えられ、ＮＣＡＭに対して陽性の細胞は再生細胞と考えられる。
エキソソーム負荷
【０１７２】
ＭＳＣは、レンチウイルス感染又はｓｉｌＭｐｏｒｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いたトランスフェクションのいずれかによって負荷される分子（ｍｉＲ、ｓｉＲＮＡ、プレｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ）で形質導入した。次にエキソソームを単離し（上述参照）、検査して負荷される分子の発現を確認する。
同時移植
【０１７３】
生着用ヒト細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙ又はＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入するか、又はＱｔｒａｃｋｅｒ  ６５５細胞標識キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてＱｄｏｔ  ６５５ナノ結晶を負荷した。次に標識した細胞をＭＳＣと１：１〜２：１の比（標識した細胞の方が多い）で混合した。１×１０５個のＭＳＣを常に使用した。
筋細胞標的化部分
【０１７４】
ＣＨ−ＭＳＣにＭ−カドヘリンをトランスフェクトし、これらの細胞からのエキソソームを採取し（上述参照）、蛍光色素で標識し、分析して蛍光を確認した。次にエキソソームを培養下のヒト筋細胞とヒト星状細胞に投与した。２８時間後、細胞を洗浄して未吸収エキソソームを除去し、（エキソソームを取り込んだ）蛍光細胞の数を測定した。
実施例１：ＭＳＣは再生を増強し線維症を抑制する
【０１７５】
筋ジストロフィーの可能な治療として、様々な組織由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の使用が示唆されている（Ｍａｒｋｅｒｔ  ＣＤ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ＰＭ＆Ｒ，１（６）：５４７−５５９；Ｒａｊｐｕｔ  ＢＳ．  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，１０（２）：１４１−１５６、Ｌｉ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３５（４）：１０５１−１０５７）が、ＭＳＣが筋肉の健康に影響を及ぼす基本的な機序は十分には理解されていない。Ｍｄｘマウスはデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の動物モデルとして広く使用されている。ｍｄｘマウスの筋肉機能に対して最適な治療効果を有するＭＳＣ源を同定するために、骨髄（ＢＭ）、脂肪組織（ＡＤ）、臍帯（ＵＣ）、胎盤の羊膜（ＡＭ）及び絨毛膜（ＣＨ）に由来するＭＳＣ、又はＣＤ３４＋造血前駆細胞をｍｄｘマウスの四頭筋に注射し（注射１回当たり５×１０５個の細胞）、再生及び線維症に関連する幾つかの重要な因子の発現を４週間後に調べた。
【０１７６】
試験した全ての細胞型は、四肢における２種の細胞再生マーカーのｍＲＮＡ発現の有意な増加（即ち、胚性ミオシン重鎖（ＭＹＨ１、約４倍の増加、データは示さず）及びＮＣＡＭ（図１Ａ及びＢ））を誘導した。更に、ＵＣ−ＭＳＣとＣＨ−ＭＳＣは、ジストロフィンを機能的に置換することができ、従って、ｍｄｘマウスと理論的にはＤＭＤ患者において治療効果を発揮するタンパク質であるユートロフィンの発現を有意に増加させた（図１Ａ〜Ｃ）。ＢＭ−ＭＳＣ、ＡＤ−ＭＳＣ及びＡＭ−ＭＳＣが引き起こしたユートロフィン発現の増加はごく僅かに過ぎず、統計的に有意ではなかった。ＶＥＧＦとＨＩＦ１αのレベルも上昇した（図１Ａ）。また、ＵＣ−ＭＳＣとＣＨ−ＭＳＣは横隔膜及び心臓における、線維症マーカーである、コラーゲンＩの発現を有意に減少させたが、ＢＭ−ＭＳＣ、ＡＤ−ＭＳＣ及びＡＭ−ＭＳＣは効果を示さなかった（図１Ａ〜Ｂ及びＤ）。最後に、ＵＣ−ＭＳＣとＨＣ−ＭＳＣのいずれもＴＮＦα及びＩＮＦγ等の炎症マーカーの発現を減少させたが（図１Ｂ）、ＢＭ及びＡＤ由来のＭＳＣで観察された効果は低かった。
【０１７７】
筋細胞は間葉系統の一部であるため、ＭＳＣの治療上の価値は、筋シンシチウムの一部となり、細胞置換として作用することから生じる可能性がある。しかし、ＭＳＣは筋肉へ影響を及ぼし得る大きなセクレトームも有する。ｍｄｘマウスで観察された遺伝子発現の変化が主にＭＳＣ融合に起因するか又は分泌因子に起因するか試験するために、５×１０５個のＵＣ−ＭＳＣ又はＣＨ−ＭＳＣからエキソソームを精製し、ＭＤＸマウスの四頭筋に注射した。エキソソームのみを注射した場合、試験した４種の遺伝子全てについて同様の（僅かに低下したが）遺伝子発現の変化が観察された（図１Ｂ）。更に四頭筋での再生量が有意に増加した（図１Ｅ）。これは細胞置換がＭＳＣによってもたらされる治療効果の主な原因ではないことを示す。
【０１７８】
マウス細胞株Ｃ２Ｃ１２とヒト筋細胞を用いたインビトロ実験によってＭＳＣに起因する発現の変化を確認した。トランスウェルプレートでヒト筋細胞をＭＳＣと共培養することによって、ＵＣ−ＭＳＣとＣＨ−ＭＳＣのみがユートロフィン発現を増加させることが示された（図１Ｆ）。これらの細胞由来のエキソソームも同様であった。筋細胞の分化はＡＤ−ＭＳＣ、ＣＨ−ＭＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣとこれらのエキソソームによっても増加し、これはそれぞれ筋管の形成（図１Ｇ）とミオシン重鎖２の発現（図１Ｈ）によって測定された。しかし、ＤＭＤ患者の筋細胞をＭＳＣと共培養した場合、ＣＨ−ＭＳＣとＵＣ−ＭＳＣのみが筋管の形成を増加させた（図１Ｉ）。ヒト衛星細胞をＵＣ−ＭＳＣ、ＣＨ−ＭＳＣ及びこれらのエキソソームと共培養させると、非対称分裂（ＭｙｏＤ発現）は増加したが、ＢＭ−ＭＳＣの場合は増加しなかった（図１Ｊ）。Ｃ２Ｃ１２マウス筋細胞との共培養も同様の結果を示した（図１Ｋ）。
実施例２：ＭＳＣは筋細胞生着の有効性を高める
【０１７９】
ＭＳＣはその細胞表面上にＭＨＣＩＩ分子を発現しないため、移植細胞として十分に忍容される。更に、ＭＳＣは移植対象に対して免疫調節効果を有し、その結果、耐性を更に改善する免疫抑制がもたらされる。多くの筋疾患、筋ジストロフィー及び筋損傷が筋細胞置換療法で治療され得ることが提案されているが、そのような療法は移植片の拒絶のために行うことが困難であることが分かっている。従って、ＭＳＣ（ＣＨ及びＵＣ）が移植片に含まれる場合、拒絶反応を減少させて外来細胞の生着を増加させることができるかどうか試験した。一般的に以下の実験を通じて、ＣＨ又はＵＣ  ＭＳＣは最大の治療可能性と筋電位を示したので常に使用した。絨毛組織及び羊膜組織以外の胎盤の他の領域（例えば、胎盤絨毛）を調べたが、どの領域にも絨毛膜が行った治療可能性は示されなかった。
【０１８０】
ＭＳＣを蛍光赤色細胞トラッカーで標識したヒト筋細胞と共に野生型マウスの前脛骨（ＴＡ）筋に同時移植した。２週間後、筋肉中の赤色蛍光のレベルを顕微鏡で測定し、筋芽細胞生着と衛星細胞生着の両方を調べた。どのＭＳＣも用いない移植と比較して、ＵＣ−ＭＳＣとＣＨ−ＭＳＣの両方が筋芽細胞と衛星細胞の生着を有意に増加させた（図２）。ＵＣ−ＭＳＣ同時移植によって筋芽細胞がより良好に生着し、ＣＨ−ＭＳＣ同時移植によって衛星細胞がより良好に生着したが、その差は統計的に有意ではないことが分かった。移植後４週間でも同様の結果が観察された。
【０１８１】
ヒト星状細胞と神経幹細胞（ＮＳＣ）の移植についても試験した。ＵＣ−ＭＳＣ又はＣＨ−ＭＳＣを蛍光赤色標識細胞と共に髄腔内に同時移植し、別々の実験で２週間後と４週間後に脊髄の赤色蛍光を測定した。星状細胞移植後の赤色蛍光のレベルは、ＵＣ−ＭＳＣの場合に４．５５（±０．６７）、ＣＨ−ＭＳＣの場合に３．８９（±０．５４）であり、ＮＳＣの移植についても同様の結果が見られた（対照蛍光を１に設定）。これらの実験をＭＤＸマウスと筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のラットモデルで繰り返し、全ての場合でＭＳＣとの同時移植によって筋細胞生着が改善することが分かった。
実施例３：筋分化のためにプライムされたＭＳＣ
【０１８２】
ＭＳＣが筋再生を誘導し、筋線維症を抑制し、パラクリン作用を介して生着を増加させる能力を考慮し、ＭＳＣの治療効果を補う方法が開発された。「筋原性プライミング」と称されるこの方法は、筋細胞に対する細胞のパラクリン作用を一方では増加させ、他方では筋細胞へのＭＳＣ自身の分化を促進した。このプライミングによって、非対称分裂を受ける衛星細胞へＭＳＣが分化する能力と共に、既存の筋線維と融合してジストロフィンを細胞に送達する筋芽細胞へＭＳＣが分化する能力が高まった。細胞におけるＭｙｏＤ発現の誘発はプライミングの１つの方法であると仮定された。これは、ＭｙｏＤ−ＧＦＰレポーターを含むＣＨ−ＭＳＣとＵＣ−ＭＳＣをトランスウェルプレートでヒト筋細胞と共に培養（プロトコルＡ）して試験した。こうして、筋細胞由来の細胞外小胞と分泌因子がＭＳＣに接触することができた。３日間のインキュベーションによって、筋細胞に曝露されなかった対照細胞と比較してＭｙｏＤ発現が２倍余り増加した（図３）。
【０１８３】
筋細胞との共培養に加え、様々な方法を用いてＭＳＣにおける一過性幹細胞特性を誘導し、後続因子に応答して筋分化能力を増加させた。共培養の前にＭＳＣに修飾Ｎａｎｏｇ  ｍＲＮＡ（そのようなｍＲＮＡは細胞質において安定であり、即座に翻訳され得る）をトランスフェクトすることによって、ＭＳＣを５−アザシチジン（５−ＡＺＡ）と共に１日間インキュベートした（プロトコルＣ）場合と同様にｍｙｏＤ発現が増加した（プロトコルＢ）。この効果は、２種の処理を組み合わせた場合、即ち、トランスフェクトした共培養細胞を５−ＡＺＡと共にインキュベートした場合に増強された。これによってＭｙｏＤ−ＧＦＰ発現は５．７倍に増加した。
【０１８４】
細胞をＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）と共に２４時間インキュベートした後、ｐＨが約６の培地中で１時間インキュベートするか、又は低酸素に２４時間曝露することによって、ＭＳＣでプライム幹細胞表現型が誘導された（プロトコルＤ）。更に、数種の小分子、例えば、ＳＴＡＴ３、ＮＦ−ＫＢ活性化剤、ＣＨＩＲ９９０２１（１〜１０ｍＭ）、メトホルミン（１０ｍｇ／ｍｌ）、トラニルシプロミン（Ｐａｒｎａｔｅ  １〜１０μＭ）、Ｇｓｋ３阻害剤、３−デアザネプラノシンＡ（１〜１０μＭ）、ｍＴＯＲ阻害剤（ＰＰ２４２、１〜１０μＭ）、ＴＧＦβ阻害剤（ＲｅｐＳｏｘ）、チアゾビビン（１〜１０μＭ）、Ａ８３−０１（０．５〜１μＭ）、ＬｉＣｌ（５〜１０ｍＭ）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、及びバルプロ酸（０．５〜２．０ｍＭ）、ラパマイシン（１〜１０Ｎｍ）、ＥＲＫ活性化剤（レスベラトロール又はフィステイン）と共に１〜６日間のインキュベーション、或いは、低ｐＨ、低酸素、及び／又は低レベルの血清又はヒトＢＳＡとＦＧＦ又はＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含む低接着培養プレートによる培養を行ったが、全てにおいてＭＳＣがある程度プライムされた（プロトコルＥ）。これらのインキュベーションは、最初に修飾Ｎａｎｏｇ  ｍＲＮＡをＭＳＣにトランスフェクトした後にも実施した。
【０１８５】
一過性の幹細胞表現型を発現するようにプライムされたＭＳＣは、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４及びＫＬＦ４を未処理ＭＳＣで観察されたよりも高いレベルで発現し、ＲＴＶＰ−１を低レベルで発現することが分かった。これらの幹細胞性マーカーは、筋細胞外小胞とのインキュベーションによってプライミングを行った場合には発現が低下した。幹細胞性が増加したため、細胞が脂肪、腱又は骨等の間葉系統の他の細胞に分化し得るかどうか試験した。このような分化は全てのプライム細胞で不十分であり、筋細胞外小胞でプライムされた細胞では不可能であった。
【０１８６】
プライム細胞の性質をより良く理解するために、様々なＭＳＣ、筋肉及び幹細胞性マーカーを調べた。全てのプライム細胞は、依然としてＭＳＣマーカーＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ１４６及びＣＤ４４を発現し、ＭＨＣＩＩを発現しなかった。更にＭｙｏＤ、ＭＹＦ６、ＭＹＦ５、ＩＴＧＡ７、オステオプロテゲリン、イリシン及びＰａｘ７を低〜中程度のレベルで発現した。筋細胞外小胞とのインキュベーションによって最も高い発現が引き起こされたが、これらの筋マーカーのレベルは、実際の筋細胞で観察されたレベルよりも低かった。５−ＡＺＡでプライムされた細胞は、運動ニューロンの生存及び神経筋接合部の維持に重要な栄養因子であるＶＥＧＦ及びＧＤＮＦも非常に高いレベルで発現した。
実施例４：プライム細胞は再生を増強し線維症を抑制する
【０１８７】
プライム細胞はＭＳＣの特性の多くを保持するが、筋分化の経路を下り始めてもいるので、再生を増強し、線維症を抑制する能力において未処理ＭＳＣとどのように比較するか試験した。未処理のＣＨ−ＭＳＣとＵＣ−ＭＳＣ（５×１０５個の細胞）を野生型マウスの左四頭筋に注射し、プライムされたＣＨ−ＭＳＣとＵＣ−ＭＳＣ（５−ＡＺＡ又は筋共培養によって分化した５×１０５個の細胞）を右四頭筋に注射した。上述のように、両方の組織由来のＭＳＣは、横隔膜と心臓における線維症を抑制し（コラーゲンＩ発現）、注射された筋肉の再生を増強した（ＮＣＡＭ発現）が、特に、プライムＭＳＣの場合、再生レベルはほぼ２倍になったが、線維症の抑制については変化しなかった（図４Ａ）。
【０１８８】
未処理ＭＳＣとプライムＭＳＣがインビボで新たな筋形成を誘導する能力について次に試験した。野生型マウスのＴＡ筋に、ＰＢＳ、ＣＨ−ＭＳＣ、ＵＣ−ＭＳＣ、プライムＣＨ−ＭＳＣ又はプライムＵＣ−ＭＳＣ（いずれも５×１０５個の細胞）のいずれかを注射した後、カルジオトキシンで処理して筋損傷を誘発した。７日目にマウスを屠殺し、核が中央に位置するＭＹＨ１染色に注目して腓腹筋で新たに生成した筋線維を計数した。ＵＣ−ＭＳＣでは新たな筋細胞の数が２倍余り増加し、ＣＨ−ＭＳＣでは３倍に増加した（図４Ｂ）。プライムＭＳＣは更に強い効果を示し、プライムされたＵＣ−ＭＳＣ又はＣＨ−ＭＳＣでは新たな筋細胞の数がそれぞれ３４４％及び３８７％増加した。
実施例５：ＭＳＣ−筋細胞ハイブリッド細胞の生成のための起源の組織の選択
【０１８９】
このデータから、筋シンシチウムに融合する能力、ＭＳＣ様のＭＨＣＩＩ欠如、及び組織拒絶を抑制する能力は、筋細胞移植／置換から利益を得ることができる疾患の治療において全て有用であることが強く示唆される。従って、正常な衛星細胞又は筋芽細胞を供給するために分化する能力と共に、ＭＳＣの両方のパラクリン作用を組み合わせた細胞を生成することは非常に興味深い。実験を行ってＭＳＣをこのようなハイブリッド細胞に分化させた。
【０１９０】
骨髄（ＢＭ）、脂肪組織（ＡＤ）、臍帯（ＵＣ）、絨毛膜胎盤（ＣＨ）及び羊膜胎盤（ＡＭ）由来のＭＳＣを全て標準的なＭＳＣ培養条件に従って単離し、培養した。次に、以下の分化プロトコル（プロトコル１）を５種の試料全てに対して試験した。細胞をｐＨが約６．０の培地に１時間載置した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ−２７６３２）を補充したＭＳＣ培地に戻し、２４時間培養した。続く２４時間に亘って、細胞を５−アザシチジン（５−ＡＺＡ）を補充した培地で培養した。この後、ＨＧＦ又はＰＤＧＦを補充した培地でインキュベーションを行うと共に、ＰＣＡＴ１とＮＥＡＴ１を過剰発現するレンチウイルスによる細胞の感染を行った。
【０１９１】
このプロトコルの終了後、ＲＮＡを細胞から抽出し、種々のＭＳＣと筋肉マーカーの発現をｑＲＴ−ＰＣＲによって調べた。全ての処理ＭＳＣは、同じ組織由来の未処理ＭＳＣと比較して、ＭｙｏＤ（図５Ａ）、ジストロフィン及びミオゲニンを高いレベルで発現することが分かったが、臍帯及び絨毛膜由来のＭＳＣが最も高い発現を示した（図５Ｂ）。脂肪及び羊膜のＭＳＣはＵＣ及びＣＨのＭＳＣと比較してやや低く、骨髄のＭＳＣはこれらの筋細胞マーカーの内で最も低い発現体であることが分かった。更に、全ての処理細胞はミオシン重鎖（ＭＹＨ）、α７インテグリン（ＩＴＧＡ７）、ＭＹＦ６、ＭＲＦ４、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＡＬＮＥＣ２及びＭＥＦ２Ａの筋肉マーカーを発現し、ＩＬ−１０を高レベルで発現することが分かった。興味深いことには、ＵＣ及びＣＨのＭＳＣもオステオプロテゲリンを発現したが、ＢＭ及びＡＤのＭＳＣは発現しなかった。更に、ＵＣ及びＣＨのＭＳＣはイリシンを高レベルで発現したが、他のＭＳＣでは低い発現が得られたに過ぎなかった。重要なことには、全てのハイブリッド細胞は、ヒト筋芽細胞と共に培養すると融合する能力を示した（図５Ｃ）が、このことから、ハイブリッド細胞は筋シンシチウムの一部となる能力を有し、潜在的に細胞置換療法に使用できることが示された。最後に、衛星細胞のマーカーであるＰＡＸ７が全てのＭＳＣによって発現されたが、ＣＨ−ＭＳＣは最も高い発現を示し、ＣＨ−ＭＳＣは衛星細胞表現型に分化する傾向が高いことが示唆された。
【０１９２】
重要なことには、処理後にこれらの細胞は依然としてＭＨＣＩＩを検出可能なレベルでは発現せず、従って依然として非免疫原性であった。従って、これらの細胞は筋原性表現型を有するが、依然としてヒト対象への投与用の「既製細胞」として使用することができる。これらの細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６及びＣＤ９０（これらのマーカーは全てＭＳＣ上に存在し、筋細胞には存在しない）の発現を保持していたので、まだ完全には筋細胞に分化していなかった。これらの細胞はＣＤ４４も発現したが、未処理細胞よりも低いレベルであった。しかし、オステオカルシン、ＰＰＡＲＧ３及びＣＯＬ２Ａ１（これらは全てＭＳＣによって高度に発現される）は分化プロトコルの終了後には全て存在しなかった。同様に、ＲＴＶＰ−１の発現も分化後に低下した。処理細胞の試験は、間葉系統（骨、腱、脂肪）の他の組織に分化する能力についても行った。この能力は有意に低下し、細胞のハイブリッド性を再度証明した。
【０１９３】
第２の同様の分化プロトコル（プロトコル２）も検討した。５種のＭＳＣ全てを再度試験し、酸性培地、ＲＯＣＫ阻害剤、５−ＡＺＡ及びＨＧＦ＋ＰＤＧＦによる処理を前述同様に行った。しかし、ＰＣＡＴ１及びＮＥＡＴ１を過剰発現する代わりに、ＧＡＳ５過剰発現プラスミド及びＰＴＥＮＰ１に対するｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクトした。再度、５種のＭＳＣ全てが処理プロトコルの終了後、ＭｙｏＤ、ジストロフィン及びミオゲニンを発現し、ＵＣとＣＨが最良の発現体であり、ＡＤとＡＭがそれに続き、ＢＭが最も弱い効果を示すという階層が再度見られた（図５Ｄ）。第１の処理後に観察された一般的な発現パターンも第２のプロトコル後に存在した。
【０１９４】
誘導筋細胞表現型のマーカーの測定に加え、栄養因子であるＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ、ＣＮＴＦ及びＩＧＦ１の発現も調べた。ＭＳＣは神経機能を支持する多くの栄養因子を発現することが知られている。そのような発現の欠如は筋細胞表現型への分化の望ましくない副作用となるであろう。驚くべきことには、これらの４種の栄養因子の発現はハイブリッド細胞（及びプライム細胞）で保持されただけでなく、実際には４種全ての発現が未処理ＭＳＣで観察されるものよりも大幅に増加した（図５Ｅ）。この増加は、ＵＣ−ＭＳＣ由来のハイブリッド細胞で最も高く、ＶＥＧＦ発現の増加が１０倍を超え、ＩＧＦ１発現の増加が６倍を超え、ＧＤＮＦ発現の増加が５倍を超え、ＣＮＴＦ発現の増加が４倍を超えた。ＣＨ−ＭＳＣも３種の因子全てについて４倍を超える増加をもたらした。第１又は第２の分化プロトコルが実施されたかどうかに関わらず、同様の結果が観察された。
実施例６： ＴＦ、ｍｉＲ及びｌｎｃＲＮＡによるＭＳＣ−筋細胞ハイブリッド細胞の生成
【０１９５】
最も良好な結果が臍帯と絨毛膜由来のＭＳＣで観察されたので、これら２種のＭＳＣ源をその後の分化全てに使用した。短縮化した第３のプロトコル（プロトコル３）を検討し、このプロトコルでＭＳＣ−筋細胞ハイブリッド細胞が生成することも分かった。ＭＳＣを通常のＭＳＣ培養条件下で培養した後、培地に５−ＡＺＡを２４時間補充した。２％ウマ血清、ＨＧＦ及びＰＤＧＦを補充した培地で細胞を２週間増殖させた。この短縮化した分化プロトコルでも同様の結果が観察された。次の増殖因子、即ち、ＥＧＦ、ＩＧＦ１、ＰＤＧＦＡＡ、ＰＤＧＦＢＢ、及びＶＥＧＦを代替として個々に及び組み合わせて試験し、或いはＨＧＦ及びＰＤＧＦと組み合わせて試験した。全てにおいてハイブリッド細胞が生成することが分かった。また、処理ＭＳＣを非補充のＭＳＣ培地に移してプロトコルを停止することができた。こうして、生成したハイブリッド細胞を更に分化させないようにすることができた。
【０１９６】
３種のプロトコルは全て、上述のように筋原性プライミングを最初に施したＭＳＣでも実施した。修飾Ｎａｎｏｇ  ｍＲＮＡでプライムした後、プロトコル３に記載のように５−ＡＺＡとＰＤＧＦＢＢで処理したＭＳＣは、例えば、ＭｙｏＤ発現においてほぼ６倍の増加を示した（図５Ｆ）。
【０１９７】
筋転写因子（ＴＦ）の直接発現の場合、特に、筋原性プライミング又は低ｐＨ、低酸素、ＲＯＣＫ阻害剤又は５−ＡＺＡとの組み合わせ（プロトコル４）で進められると、ハイブリッド細胞への分化も誘導された。レンチウイルスを用いて、未処理及びプライムＵＣ−ＭＳＣ及びＣＨ−ＭＳＣの両方において、ＭＹＦ５、ＰＡＸ３、ＰＡＸ７、ジストロフィン／マイクロジストロフィン、ユートロフィン、又はＭｙｏＤ＋ＰＡＸ３、ＭｙｏＤ＋ＰＡＸ７又はＭｙｏＤ＋ＭＹＦ５の組み合わせを発現させた。前述の３種のプロトコルで観察されたものと同様の発現プロファイルもこの方法を用いて見出された。
【０１９８】
タモキシフェンと４−ヒドロキシタモキシフェンに応答する修飾エストロゲン受容体を含むＡＡＶベクター又はレンチウイルスを用いてＴＦもＭＳＣに導入した。これによって、ＭＳＣのパラクリン作用とその後の置換能力を最初に利用して、特異的且つ最適な時点でＴＦをインビボで誘導することができる。タモキシフェンはＤＭＤにおいて治療効果を発揮することが報告されたので、このアプローチは二重に有益となり得る。タモキシフェン誘導性構築物を試験し、その構築物がＭＳＣで特異的ＴＦ発現を誘導する能力と、タモキシフェンに応答して筋原性分化を誘導する能力を確認した。
【０１９９】
非コードＲＮＡは様々な細胞の分化に関与している。筋原性分化の誘導において役割を果たす可能性のある非コードＲＮＡを同定するために、ヒト筋細胞とＭＳＣとを比較するｍｉＲＮＡ及びｌｎｃＲＮＡアレイを実施した。ＭｙｏＤ過剰発現を用いてＭＳＣも筋細胞に分化し、筋細胞と分化ＭＳＣには共通であるが未修飾ＭＳＣでは異なるｍｉＲＮＡとｌｎｃＲＮＡのクラスターを同定した。これらのＭＳＣが筋細胞へ分化する際のこのｍｉＲＮＡとｌｎｃＲＮＡの発現の変化をｒｔ−ＰＣＲによって確認した。
【０２００】
次に、以下のようにＭＳＣで分化を行った（プロトコル５）。ＭＳＣをｐＨが５〜６の酸性培地で１時間インキュベートした後、ＲＯＣＫ阻害剤又は５−ＡＺＡと共に２４時間インキュベートし、次にｌｎｃＲＮＡを細胞に導入した。サテライト特性を発現する細胞を生成するために、次のｌｎｃＲＮＡ、即ち、ＢＩＬ、ＰＡＲ５、ＢＩＣ、ＤＩＳＣ２、ＧＡＳ５ＤＬＧ２ＡＳ、７ＳＫ、Ｙ１、ＬＩＮＣＲＮＡ、ＰＣＡＴ−１、ＳＦＭＢＴ２、Ｙ４及びＳＣＡ８を使用した。この方法により生成したハイブリッド細胞は、ＭｙｏＤとＰＡＸ７に対して二重陽性であることが確認され、このことから、ハイブリッド細胞が衛星細胞として十分に機能し、非対称分裂が可能であることが示された（図５Ｇ）。より分化した衛星細胞と筋芽細胞を誘導するために、次の更なるｌｎｃＲＮＡ（即ち、ＭＡＬＡＴ１、ＭＥＧ３、ＮＥＡＴ１、ＥＧＯ、ＧＡＳ５、ＫＲＡＳＰ１、ＬＯＣ２８５１９、ＢＣ２００及びＨ１９）の導入が利用できる。ＡＮＲＩＬ、ＰＴＥＮＰ１及びａＨＩＦのサイレンシングによっても筋原性分化が誘導された。具体的には、上述の長いｌｎｃＲＮＡをＡＮＲＩＬ、ＰＴＥＮＰ１又はａＨＩＦ（単独又はその組み合わせ）に対するｓｉＲＮＡと組み合わせてＭＳＣにトランスフェクトすることによって、細胞の形態的外観が変化し（図５Ｈ）、特定の筋タンパク質の発現が変化した（例えば、衛星細胞におけるＰＡＸ７及びｍｙｏＤの発現と、より分化した筋原細胞についてのＭｙｏＤ、ミオゲニン、ミオシン重鎖及びジストロフィン）。
【０２０１】
同定されたｍｉＲを用いた分化も行った（プロトコル６）。以下のｍｉＲ、即ち、ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１２５ａ、ｍｉＲ−１４０−５ｐ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４８ｂ、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１ｂ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−２９６、ｍｉＲ−３３０、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−５２０、ｍｉＲ−５２４、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−５５０、ｍｉＲ−５６１、ｍｉＲ−５６４、ｍｉＲ−５８２、ｍｉＲ−５８３、ｍｉＲ−５８７、ｍｉＲ−６１３、ｍｉＲ−６１４、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−６３４、ｍｉＲ−６４５、ｍｉＲ−６４６、ｍｉＲ−６４９、ｍｉＲ−６６１、ｍｉＲ−６６２、ｍｉＲ−６６３、ｍｉＲ−６６５、ｍｉＲ−６６８、ｍｉＲ−６７１、ｍｉＲ−８８７、ｍｉＲ−１１８３、ｍｉＲ−１２２４、ｍｉＲ−１２２５、ｍｉＲ−１２２８、ｍｉＲ−１２３４、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２４７、ｍｉＲ−１２５７、ｍｉＲ−１２５８、ｍｉＲ−１２６８、ｍｉＲ−１２６９、ｍｉＲ−１２８９、ｍｉＲ−１２８７、ｍｉＲ−１９０９、ｍｉＲ−１９１１、ｍｉＲ−７５９、ｍｉＲ−３１５０、ｍｉＲ−３１７４、ｍｉＲ−３１８０、ｍｉＲ−３１９１、ｍｉＲ−３１９７、ｍｉＲ−４２９２、ｍｉＲ−２１１５及びｍｉＲ−４３１２、ｍｉＲ−９２、９３及びｍｉＲ−９９は全てＭＳＣが筋細胞へ分化する際に変化することが分かった。ＭＳＣの最初の筋原性プライミングは、ｐＨが５〜６の酸性培地で１時間インキュベートした後に低酸素で２４時間インキュベートするか、又は５−ＡＺＡと共に２４時間インキュベートして行った。次にトランスフェクションによって各種ｍｉＲ（ｍｉＲ−１０ｂ、ｍｉＲ−１３８、ｍｉＲ−１５４、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８１、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−６１４及びｍｉＲ−６６８）を細胞に導入し、ＭｙｏＤ発現をモニターした（図５Ｉ）。
実施例７：ＤＭＤ治療のためのＭＳＣ、プライムＭＳＣ及びＭＳＣ−筋細胞ハイブリッド細胞の使用
【０２０２】
上述のデータに基づき、未処理ＭＳＣ、プライムＭＳＣ及びハイブリッド細胞は全て、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療するための治療薬として使用できると理論付けられた。ＭｄｘマウスをＤＭＤモデルとして使用し、クレアチンキナーゼ（ＣＰＫ）レベルを測定して治療の有効性を評価した。マウスの四頭筋の１つに未修飾ＣＨ−ＭＳＣを注射し、他の四頭筋では疑似注射を行った。３週間後にＣＰＫレベルを測定し、未処理ＣＨ−ＭＳＣではＣＰＫレベルがほぼ７５％低下した（図６Ａ）。ＢＭ、ＡＤ、ＡＭ、ＣＨ及びＵＣ由来のＭＳＣを用いて同じ実験を繰り返した。ＢＭ、ＡＤ及びＡＭ由来のＭＳＣではＣＰＫ発現が３０〜４０％低下し、ＵＣ−ＭＳＣでは６０％低下し、ＣＨ−ＭＳＣでは再度７０％余り低下した（図６Ｂ）。
【０２０３】
未処理ＭＳＣと比較してハイブリッド細胞の有効性を試験するために、ｍｄｘマウスの四頭筋の１つにＰＢＳを注射し、他の四頭筋にはプロトコル１による同じＭＳＣ源由来のハイブリッド細胞を注射した。５組のハイブリッド細胞全てにおいて３週間後に四頭筋のＣＰＫレベルが有意に低下し、ＵＣ及びＣＨ由来の細胞では最大の効果が再度示された（図６Ｃ）。プロトコル２によって生成したハイブリッド細胞は同じ効果を示した。
【０２０４】
プライムＭＳＣも試験した。再度、上述のように治療効果を発揮する未処理ＣＨ−ＭＳＣをｍｄｘマウスの四頭筋の１つに注射し、他の四頭筋には、酸性培地とＲＯＣＫ阻害剤でプライムしたＣＨ−ＭＳＣ、筋細胞との共培養でプライムしたＣＨ−ＭＳＣ、又はプロトコル３によって生成されたＣＨ−ＭＳＣ由来のハイブリッド細胞を注射した。３週間後にマウス四頭筋でのヒトジストロフィンの発現によって測定されたように、３種の修飾細胞全てにおいて治療効果が高まった（図６Ｄ）。ヒトタンパク質に特有のプライマーを用いたｑＲＴ−ＰＣＲによってヒトジストロフィンを測定したため、測定されたジストロフィンの増加全体は注射した細胞に由来するものであった。
【０２０５】
ＭＳＣは多数の細胞外小胞及び特にエキソソームを分泌することが知られており、これらの小胞はＭＳＣのパラクリン作用を部分的に媒介することが知られている。ハイブリッド細胞の細胞外小胞もハイブリッド細胞の治療効果に部分的に関与するかどうか試験するために、５×１０５個の未処理又は分化ＣＨ−ＭＳＣ由来のエキソソームをＭＤＸマウス四頭筋に注射し、ＣＰＫレベルを測定した。図６Ｅに示すように、両方の組のエキソソームでＣＰＫレベルが低下したが、未処理ＣＨ−ＭＳＣのエキソソームはハイブリッド細胞のエキソソームよりも大きな効果を示した。興味深いことには、未処理ＣＨ−ＭＳＣとハイブリッド細胞由来のエキソソームの混合物は遥かに大きな治療効果を示した。
実施例８：ＡＬＳ治療のためのＭＳＣ−筋細胞ハイブリッド細胞の使用
【０２０６】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は運動ニューロン疾患であるが、筋力低下によって徐々に悪化する脱力感も伴う。ＭＳＣ−筋細胞ハイブリッド細胞は、ＡＬＳにおける筋肉症状の進行を遅らせるのに有効であると仮定された。これについて試験するため、プロトコル１を用いてＣＨ−ＭＳＣ由来のハイブリッド細胞を発症前のＳＯＤ１Ｇ９３Ａラットの四肢に筋肉内注射（ＩＭ）し、症状の出現に関してラットを毎日モニターした。具体的には、仰向けにしてから３０秒以内に直立姿勢を取り戻せなくなった場合にラットを屠殺した。ＰＢＳと比較してハイブリッド細胞の投与によってＳＯＤマウスの生存が有意に延長し、また換言すれば、ハイブリッド細胞はＡＬＳ症状の発症を有意に遅延させた（図７Ａ）。
【０２０７】
ＡＬＳは神経疾患であるので、同じ実験を星状細胞表現型に分化したＭＳＣで行った（米国特許出願第２０１５００３７２９８号参照、この出願は参照によって本明細書に組み込まれる）。ＭＳＣ−星状細胞の髄腔内投与（ＩＴ）は同様の効果を示し、またＡＬＳ症状の発症を有意に遅延させた（図７Ｂ）。これらの実験は、症状の発症後ではあるが、ラットが直立する能力を失う前に細胞を注射することによって繰り返した。発症前のラットで注射を行った場合と比較して、ハイブリッド細胞とＭＳＣ−星状細胞の両方で（低下はしたが）同様の効果が観察された。
【０２０８】
ハイブリッド細胞とＭＳＣ−星状細胞の両方が良好な治療効果を有し、様々な細胞標的に影響を及ぼす可能性が高いので、併用療法について検討した。発症前のラットにハイブリッド細胞をＩＭ投与すると共にＭＳＣ−星状細胞をＩＴ投与した。いずれの単独療法と比較しても、併用療法によって生存が延長（症状の発症が遅延）し、統計的に有意な量で相乗効果が観察された（図７Ｃ）。
【０２０９】
ＡＬＳ症状の発症を試験する複数の方法が存在するので、実験を繰り返したが、ラットがロータロッドに１０分間とどまる能力を分析することによって疾患の発症を確認した。この方法によってもハイブリッド細胞はＡＬＳ症状の発症を有意に遅延させた（図７Ｄ）。神経幹細胞（ＮＳＣ）に分化したＭＳＣの髄腔内投与（米国特許出願第２０１５００３７２９９号参照、この出願は参照によって本明細書に組み込まれる）でも同様の良好な結果が得られた（図７Ｅ）。再度ＩＭハイブリッド細胞とＩＶ  ＭＳＣ−ＮＳＣで構成される併用療法は相乗効果をもたらし、ＡＬＳ症状の発症の遅延を増加させた。
実施例９：悪液質治療のためのＭＳＣとそのエキソソームの使用
【０２１０】
悪液質、即ち、慢性疾患又は癌による体内の筋肉の衰弱又は消耗は、ＭＳＣの使用が検討された別の筋疾患であった。トランスウェルプレートでヒト筋細胞をＣＨ−ＭＳＣ又はＵＣ−ＭＳＣ又はそのエキソソームと共培養した。予想通り、細胞とエキソソームの両方がミオシン重鎖の発現を増加させ（図８）、筋成長の増加を示した。炎症性ＴＮＦα及びＩＦＮγによる細胞の処理は悪液質を模倣し、対照筋細胞でミオシン重鎖発現を６０％余り低下させた。この作用の有意な阻害は、程度は異なるがＵＣ−ＭＳＣ及びＣＨ−ＭＳＣと共培養した筋細胞で観察された。エキソソームの添加によってもミオシン重鎖の発現は改善されたが、ＭＳＣ自体のレベルまでには至らなかった（図８）。
【０２１１】
悪液質の第２のモデルも用いた。ヒト不死化筋細胞を悪液質に関連するヒト細胞株（例えば、原発性肺腫瘍細胞）由来のエキソソームと共にインキュベートした。悪液質エキソソームは筋細胞死を誘導し、分化を阻害し、不死化細胞におけるミオシン重鎖の発現を抑制した。しかし、ＵＣ−ＭＳＣ及びＣＨ−ＭＳＣ又はそのエキソソームとの共培養はこのような悪液質作用を抑制し、細胞死の減少や分化及びミオシン重鎖発現の増加が観察された。
実施例１０：治療的送達系としてのＭＳＣの使用
【０２１２】
筋肉、運動ニューロン及び末梢ニューロンの疾患や傷害に対しては、潜在的に有望な治療剤が幾つか存在する。しかし、損傷領域又は疾患領域に治療剤を直接且つ特異的に送達するのが困難なことが多い。ＭＳＣのホーミング能力と共にその分泌小胞の大きなレパートリーによって、ＭＳＣが筋肉とニューロンへの理想的な送達剤となり得ることが仮定された。
【０２１３】
この仮説を試験するため、ユートロフィン発現を抑制することが知られている幾つかのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）（即ち、抗ｍｉＲ−４２４、１９５、１６、４９７、１３５、６７９３及び２１）に対するアンタゴミルを未修飾ＣＨ−ＭＳＣ及びＵＣ−ＭＳＣに由来するエキソソームに負荷し、ヒト筋芽細胞と共にインキュベートした。これらのエキソソームとのインキュベーションによって筋芽細胞でのユートロフィンｍＲＮＡ発現が大幅に増加したが、これは、エキソソームがアンタゴミルを筋芽細胞にうまく導入させたことを示す（図９Ａ）。
【０２１４】
同様に、ｌｅｔ−７アンタゴミル又はｍｉＲ−１３３ｂアンタゴミルをトランスフェクトしたＣＨ−ＭＳＣはインビトロでアンタゴミルを筋細胞に導入させ、その結果、ユートロフィンタンパク質の発現が増加した（図９Ｂ）。この細胞由来のエキソソームでも、インビトロでのユートロフィンタンパク質の発現が十分に増加した（図９Ｃ）。次に、エキソソーム表面上のＭ−カドヘリンエピトープによって筋細胞を標的とするエキソソームを筋細胞／星状細胞混合培養物に投与した。抗ｌｅｔ−７を含む標的化エキソソームによって、培養物中の星状細胞の５５〜６８％においてユートロフィン発現が増加したが、培養物中の筋細胞の８５〜９２％においても同様に増加した（図９Ｃ、筋細胞溶解物を示す）。これによって、エキソソームがアンタゴミルを導入するだけでなく、エキソソーム（又はＭＳＣ）上の筋肉標的化部分が導入の有効性を高めることが示された。Ｌｅｔ−７はミオシン重鎖の発現を抑制するため、筋再生を阻害することも知られている。ｌｅｔ−７アンタゴミルはミオシン重鎖の発現も有意に増加させ（図９Ｄ）、従って二重の治療効果を示した。
【０２１５】
ジストロフィンタンパク質の送達もよく検討されている治療手段であるが、組換えジストロフィンは強い免疫原性応答を誘導するため、有効な送達系はまだ発見されていない。ＭＳＣは免疫抑制能力を有するので、免疫応答なしでジストロフィン発現を可能にすることを期待して、非修飾ＣＨ−ＭＳＣをジストロフィンとマイクロジストロフィンを発現するウイルスベクターに感染させた。これらのプラスミドの効果を更に増強するために、ジストロフィンを標的とするｍｉＲであるｍｉＲ−２１４に対するアンタゴミルを発現するＭＳＣも用いた。ジストロフィンプラスミドと抗ｍｉＲ−２１４の併用効果は顕著であり、ジストロフィンの発現が約４．５倍増加した。重要なことには、この処理によってユートロフィンの発現も増加した。こうして、抗ｍｉＲ−２１４送達はジストロフィンとユートロフィンの両方の発現を増加させるので、この送達も二重の治療効果を有する。
【０２１６】
エキソソームとＭＳＣが治療剤を送達する能力については、ＭＳＣとエキソソームに修飾ｍｙｏＤ  ｍＲＮＡを負荷して更に試験した。このようなｍＲＮＡは細胞の細胞質に入るとすぐにタンパク質に翻訳され得る。ｍｙｏＤを負荷したエキソソームを筋芽細胞に直接添加すると共に、負荷したＭＳＣと筋芽細胞をトランスウェルプレートで共培養した結果、ｍｙｏＤ陽性核の数によって測定される強いｍｙｏＤの発現が生じた（図９Ｅ）。修飾ｍｙｏＤ  ｍＲＮＡの細胞への直接的トランスフェクションを陽性対照として使用したが、実際にはエキソソーム又は共培養によるｍＲＮＡの伝達は、トランスフェクションによる直接投与とほぼ同等に有効であった。従って、ＭＳＣとそのエキソソームは、他のＲＮＡ分子と同様に修飾ｍＲＮＡを有効に送達することができる。
【０２１７】
本発明をその具体的な実施形態と併せて説明してきたが、当業者には多くの代替物、改変物及び変形物が明白なのは明らかである。従って、添付の特許請求の範囲の精神と広範な範囲内にあるそのような代替物、改変物及び変形物の全てを包含することが意図される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月11日(2019.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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