(57)【要約】  本発明は、プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）を治療するための、プロホルモン転換酵素（ＰＣ１）を調節するための方法ならびにＰＣ１レベルを増加させる化合物および治療に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のホスホジエステラーゼ４阻害物質（ＰＤＥ４阻害物質またはＰＤＥ４ｉ）を投与すること、を含むプロホルモン転換酵素を調節するための方法。
【請求項２】
治療有効量のＰＤＥ４阻害物質を投与すること、を含むプロホルモン転換酵素の発現をアップレギュレートするための方法。
【請求項３】
前記ＰＤＥ４阻害物質がインビトロで細胞へ投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＤＥ４阻害物質がプラダー・ウィリー症候群に罹患した患者へ投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＤＥ４阻害物質が経口で投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＤＥ４阻害物質が静脈内または皮下に投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＤＥ４阻害物質が鞘内に投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＤＥ４阻害物質が局所的に投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＤＥ４阻害物質が鼻内に投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＤＥ４阻害物質が肺中で投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＤＥ４阻害物質がテオフィリン、ロフリミラスト（ｒｏｆｌｉｍｉｌａｓｔ）、アプレミラスト、イブドゥラスト（ｉｂｄｕｌａｓｔ）、ＧＳＫ３５６２７８、ＭＫ０９５２、ＩＢＭＸ、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
治療有効量のアデニル酸シクラーゼ活性化物質を投与することを含むプロホルモン転換酵素を調節するための方法。
【請求項１４】
前記アデニル酸シクラーゼ活性化物質がインビトロで細胞へ投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アデニル酸シクラーゼ活性化物質がプラダー・ウィリー症候群に罹患した患者へ投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記アデニル酸シクラーゼ活性化物質が経口で、静脈内に、皮下に、鞘内に、または鼻内に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記アデニル酸シクラーゼ活性化物質が局所的に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記アデニル酸シクラーゼ活性化物質が肺中で投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記アデニル酸シクラーゼ活性化物質がホルスコリン、ＦＤ１、ＦＤ２、ＦＤ３、ＦＤ４、ＦＤ５（ＮＫＨ４７７）、ＦＤ６、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
治療有効量のＰＤＥ４阻害物質およびアデニル酸シクラーゼ活性化物質を投与すること、を含むプロホルモン転換酵素を調節するための方法。
【請求項２１】
前記ＰＤＥ４阻害物質および前記アデニル酸シクラーゼ活性化物質がプラダー・ウィリー症候群に罹患した患者へ投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＤＥ４阻害物質が肥満の被験体へ投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記アデニル酸シクラーゼ活性化物質が肥満の被験体へ投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＤＥ４阻害物質および前記アデニル酸シクラーゼ活性化物質が肥満の被験体へ投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
治療有効量のＭＣ４Ｒアゴニストを投与することを含むプロホルモン転換酵素の発現をアップレギュレートするための方法。
【請求項２６】
前記ＭＣ４Ｒアゴニストがインビトロで細胞へ投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＭＣ４Ｒアゴニストがプラダー・ウィリー症候群に罹患した患者へ投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＭＣ４Ｒアゴニストが肥満の被験体へ投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＭＣ４Ｒアゴニストが経口で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＭＣ４Ｒアゴニストが静脈内または皮下に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＭＣ４Ｒアゴニストが鞘内に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＭＣ４Ｒアゴニストが局所的に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＭＣ４Ｒアゴニストが鼻内に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＭＣ４Ｒアゴニストが肺中で投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＭＣ４ＲアゴニストがＲＭ−４９３（セトメラノチド）、ＴＴＰ２５１５、２−アミノチアゾール誘導体、ＭＫ−０４９３、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
治療有効量のＭＣ４Ｒアゴニストを投与することをさらに含む、請求項１、２、１３または２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＭＣ４Ｒアゴニストがインビトロで細胞へ投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＭＣ４Ｒアゴニストがプラダー・ウィリー症候群に罹患した患者へ投与される。請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＭＣ４Ｒアゴニストが肥満の被験体へ投与される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＭＣ４ＲアゴニストがＲＭ−４９３（セトメラノチド）、ＴＴＰ２５１５、２−アミノチアゾール誘導体、ＭＫ−０４９３、およびその組み合わせからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記投与が患者において以下の改善：過食症を減少または寛解する；Ｐｃｓｋ１レベルを増加させる；ＰＣ１のレベルおよび／または活性を増加させる；プロインスリン対インスリンの血中循環比を減少させる；プログレリン対グレリンの血中循環比を減少させる；ＰＯＭＣ対ＡＣＴＨの血中循環比を減少させる；甲状腺機能低下症の寛解、プロオキシトシン対オキシトシンの血中循環比を減少させる；プロｂｄｎｆ対ｂｄｎｆの血中循環比を減少させる；およびプロホルモン：ホルモンの比を増加させる、の１つまたは複数をもたらし；症状、レベルまたは比が患者の疾患の症状、レベル、または比に関する、請求項４、１５、２１、２７、または２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
それを必要とする被験体へホスホジエステラーゼ４阻害物質（ＰＤＥ４ｉ）を投与すること、それによりＰＷＳの１つまたは複数の症状を緩和する、消失するまたは予防することを含むプラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）を治療するための方法。
【請求項４３】
前記ＰＤＥ４ｉを投与することが被験体中の環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の濃度または活性をアップレギュレートする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＰＷＳがＮｈｌｈ２の減少された発現によって特徴づけられる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
Ｎｈｌｈ２の減少された発現がＰｃｓｋ１の減少された発現をもたらす、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ｃＡＭＰの濃度または活性を増加させることがＰｃｓｋ１の発現をアップレギュレートする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＰＤＥ４ｉが選択的ＰＤＥ４ｉである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＰＤＥ４ｉが非選択的ＰＤＥ４ｉである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記選択的ＰＤＥ４ｉがＡＮ２７２８、アプレミラスト、シロミラスト、ジアゼパム、イブジラスト、ルテオリン、メセンブレノン、ピクラミラスト、ロフルミラスト、ロリプラム、Ｅ６００５、ＧＳＫ３５６２７８およびＭＫ０９５２から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記非選択的ＰＤＥ４ｉがメチル化キサンチンおよびその誘導体、カフェイン、アミノフィリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、パラキサンチン、ペントキシフィリン、テオブロミン、ならびにテオフィリンから選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記１つまたは複数の症状が過食症、低減した代謝速度、肥満、低下した性腺機能、減少した成長ホルモン産生、筋緊張の不良、睡眠障害、胃腸病、低減したスタミナ、低減した集中力、異常な認知力、行動障害、不安、成長不全、成熟形態および活性形態への未成熟ホルモンの低減した変換、ならびに糖尿病を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
ＰＷＳの１つまたは複数の症状を治療するまたは緩和するために有効な１つまたは複数の追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
前記未成熟ホルモンがインスリン、グレリン、ＧＨＲＨ、α−ＭＳＨ、オキシトシン、オレキシン、ＢＤＮＦ、バソプレッシン、ＮＰＹ、ＡＧＲＰ、およびゴナドトロピンの１つまたは複数を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＰＷＳを治療するまたは緩和するのに有効な１つまたは複数の追加の治療剤がインスリン、インスリン受容体アゴニスト、グレリン、グレリン受容体アゴニスト、ＧＨＲＨ、ＧＨＲＨ受容体アゴニスト、α−ＭＳＨ、α−ＭＳＨ受容体アゴニスト、オキシトシン、オキシトシン受容体アゴニスト、オレキシン、オレキシン受容体アゴニスト、ＢＤＮＦ、ＢＤＮＦ受容体アゴニスト、バソプレッシン、バソプレッシン受容体アゴニスト、ＮＰＹ、ＮＰＹ受容体アゴニスト、ＡＧＲＰ、ＡＧＲＰ受容体アゴニスト、ゴナドトロピン、ゴナドトロピン受容体アゴニスト（ａｇａｉｎｓｔ）、またはその組み合わせを含む、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年６月３日に出願された米国仮特許出願第６２／３４５，１３３号；２０１６年８月１６日に出願された米国仮出願第６２／３７５，６６２号の優先権を主張し、そのそれぞれはその全体を参照することにより本明細書に援用される。
【０００２】
政府助成
本研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの補助金Ｒ０１ＤＫ０５２４３１によって部分的に援助され；それゆえ、米国政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【０００３】
本発明は、プロホルモン転換酵素（ＰＣ１）を調節する方法ならびにＰＣ１レベルを増加させる化合物および治療に関する。
【背景技術】
【０００４】
プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）は、染色体１５ｑのインプリント領域中の父性発現遺伝子の損失によって引き起こされる。カノニカル表現型の中には、過食による肥満、中枢性性腺機能低下および低成長ホルモンがある。稀な微小欠失のＰＷＳ患者は、３つの遺伝子を包含する９１ｋｂの最小責任欠失領域（非コーディングＳＮＯＲＤ１１６を含む）を定義する。本発明者は、罹患していない対照に比較して、ＮＨＬＨ２およびＰＣ１がＰＷＳのｉＰＳＣ由来ニューロンにおいてダウンレギュレートされることを見出した。Ｎｈｌｈ２およびＰｃｓｋ１の転写量は、絶食させたＳｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウスの視床下部において低減される。
【０００５】
マウスにおけるＮｈｌｈ２の欠損は、肥満、性腺機能低下、および成長不全を引き起こす。Ｎｈｌｈ２は、プロホルモン転換酵素（ＰＣ１）の発現を促進する。ＰＣ１を欠損したヒトおよびマウスは、異常なプロホルモンプロセシングに起因して、過食による肥満、性腺機能低下、成長ホルモンの減少、および糖尿病を示す。例えば、Ｓｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウスは、ＰＣ１の低減と関連する、プロインスリン、プロＧＨＲＨおよびプログレリンのプロホルモンプロセシングにおける機能不良をインビボで示す。
【０００６】
現在、ＰＷＳ患者のための治療はなく、有効な治療およびモデル系が緊急に必要とされる。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の方法は、有効量のホスホジエステラーゼ４阻害物質（ＰＤＥ４阻害物質またはＰＤＥ４ｉ）の投与によるプロホルモン転換酵素の調節を提供する。プロホルモン転換酵素の発現は、治療有効量のＰＤＥ４阻害物質の投与によってアップレギュレートされ得る。ＰＤＥ４阻害物質は、プラダー・ウィリー症候群に罹患した細胞または患者へ投与され得る。ＰＤＥ４阻害物質は肥満の被験体へ投与され得る。これらの方法が、シャーフ・ヤング症候群および自閉症スペクトラム障害に罹患した患者を治療するためにも有用であろうことが予想される。
【０００８】
ＰＤＥ４阻害物質は、経口で、静脈内に、皮下に、鞘内に、局所的に、鼻内に、または肺へ投与され得る。
【０００９】
ＰＤＥ４阻害物質としては、テオフィリン、ロフルミラスト、アプレミラスト、イブドゥラスト（ｉｂｄｕｌａｓｔ）、ＧＳＫ３５６２７８、ＭＫ０９５２、ＩＢＭＸならびにこれらの薬物の組み合わせが挙げられる。
【００１０】
ある特定の実施形態において、ＰＤＥ４阻害物質としては、表１Ａまたは表１Ｂからの阻害物質の任意のものが挙げられ得る。
【００１１】
追加の実施形態において、ＰＤＥ４阻害物質の組み合わせが本方法において使用され得る。
【００１２】
本発明の方法は、治療有効量のアデニル酸シクラーゼ活性化物質を投与することも包含する。アデニル酸シクラーゼ活性化物質は、プラダー・ウィリー症候群に罹患した細胞または患者へ投与され得る。アデニル酸シクラーゼ活性化物質は肥満の被験体へ投与され得る。
【００１３】
アデニル酸シクラーゼ活性化物質は、経口で、静脈内に、鞘内に、鼻内に、局所的に、または肺へ投与され得る。アデニル酸シクラーゼ活性化物質としては、ホルスコリン、ＦＤ１、ＦＤ２、ＦＤ３、ＦＤ４、ＦＤ５（ＮＫＨ４７７）、ＦＤ６ならびにこれらの薬物の組み合わせが挙げられる。
【００１４】
ＰＤＥ４阻害物質はまた、アデニル酸シクラーゼ活性化物質と一緒に投与され得る。
【００１５】
本発明の方法は、治療有効量のＭＣ４Ｒアゴニストを投与することも包含する。ＭＣ４Ｒアゴニストは、プラダー・ウィリー症候群に罹患した細胞または患者へ投与され得る。ＭＣ４Ｒアゴニストは肥満の被験体へ投与され得る。
【００１６】
ＭＣ４Ｒアゴニストは、経口で、静脈内に、鞘内に、鼻内に、局所的に、または肺へ投与され得る。ＭＣ４Ｒアゴニストとしては、ＲＭ−４９３（セトメラノチド）、ＴＴＰ２５１５、２−アミノチアゾール誘導体、ＭＫ−０４９３、およびその組み合わせが挙げられ得る。ＭＣ４Ｒアゴニストは、本明細書において記載されるＰＤＥ４阻害物質および／またはアデニル酸シクラーゼ活性化物質と組み合わせて投与され得る。
【００１７】
本発明の方法は、投与が、患者において以下の改善：過食症を減少または寛解する；ＰＣＳＫ１レベルを増加させる；ＰＣ１のレベルおよび／または活性を増加させる；プロインスリン対インスリンの血中循環比を減少させ、したがってインスリン分泌を増加させる；プログレリン対グレリンの血中循環比を減少させる；ＰＯＭＣ対ＡＣＴＨの血中循環比を減少させる；甲状腺機能低下症を寛解し、プロオキシトシン対オキシトシンの血中循環比を減少させ、したがって脳中のオキシトシン産生を増加させ、脳中のα−ＭＳＨ産生を増加させる；プロＢＤＮＦ対ＢＤＮＦの血中循環比を減少させる（ＢＤＮＦの脳レベルを増加させる）；ならびにプロホルモン：ホルモンの比を増加させる（プロ成熟ホルモンを減少させる）、の１つまたは複数をもたらし；症状、レベル、または比が、患者の疾患の症状、レベルまたは比に関するものである、方法も包含する。
【００１８】
ある特定の実施形態において、方法は、ホスホジエステラーゼ４阻害物質（ＰＤＥ４ｉ）をそれを必要とする被験体へ投与し、それによってＰＷＳの１つまたは複数の症状を緩和、消失または予防することを含む、プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）の治療を提供する。
【００１９】
ある特定の実施形態において、ＰＤＥ４ｉの投与は、被験体における環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の濃度または活性をアップレギュレートする。
【００２０】
ある特定の実施形態において、ＰＷＳはＮＨＬＨ２の発現減少によって特徴づけられる。
【００２１】
追加の実施形態において、ＮＨＬＨ２の発現減少はＰＣＳＫ１の発現減少をもたらす。
【００２２】
ある特定の実施形態において、ｃＡＭＰの濃度または活性の増加は、Ｐｃｓｋ１の発現をアップレギュレートする。
【００２３】
追加の実施形態において、ＰＤＥ４ｉは選択的ＰＤＥ４ｉである。追加の実施形態において、ＰＤＥ４ｉは非選択的ＰＤＥ４ｉである。
【００２４】
ある特定の実施形態において、選択的ＰＤＥ４ｉは、ＡＮ２７２８、アプレミラスト、シロミラスト、ジアゼパム、イブジラスト、ルテオリン、メセンブレノン、ピクラミラスト、ロフルミラスト、ロリプラム、Ｅ６００５、ＧＳＫ３５６２７８およびＭＫ０９５２から選択される。
【００２５】
ある特定の実施形態において、非選択的ＰＤＥ４ｉは、メチル化キサンチンおよびその誘導体、カフェイン、アミノフィリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、パラキサンチン、ペントキシフィリン、テオブロミン、ならびにテオフィリンから選択される。
【００２６】
さらに追加の実施形態において、１つまたは複数の症状としては、過食症、代謝速度の低減、肥満、性腺機能低下、副腎機能不全症、成長ホルモン産生の減少、筋緊張の不良、睡眠障害、胃腸病、スタミナの低減、集中力の低減、異常な認知力、行動障害、不安、成長不全、成熟していないホルモンから成熟形態および活性形態への変換の低減、ならびに糖尿病および尿崩症が挙げられる。
【００２７】
ある特定の実施形態において、方法は、ＰＷＳの１つまたは複数の症状を治療するまたは緩和するために有効な１つまたは複数の追加の治療剤を投与することをさらに含む。
【００２８】
ある特定の実施形態において、成熟していないホルモンは、インスリン、グレリン、ＧＨＲＨ、α−ＭＳＨ、オキシトシン、オレキシン、ＢＤＮＦ、バソプレッシン、ＮＰＹ、ＡＧＲＰ、およびゴナドトロピン、ＡＣＴＨの１つまたは複数を含む。
【００２９】
ある特定の実施形態において、ＰＷＳを治療または緩和するのに有効な１つまたは複数の追加の治療剤としては、インスリン、インスリン受容体アゴニスト、グレリン、グレリン受容体アゴニスト、ＧＨＲＨ、ＧＨＲＨ受容体アゴニスト、α−ＭＳＨ、α−ＭＳＨ受容体アゴニスト、オキシトシン、オキシトシン受容体アゴニスト、オレキシン、オレキシン受容体アゴニスト、ＢＤＮＦ、ＢＤＮＦ受容体アゴニスト、バソプレッシン、バソプレッシン受容体アゴニスト、ＮＰＹ、ＮＰＹ受容体アゴニスト、ＡＧＲＰ、ＡＧＲＰ受容体アゴニスト、ゴナドトロピン、ゴナドトロピン受容体アゴニスト（ａｇａｉｎｓｔ）、またはその組み合わせが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】Ｎｈｌｈ２およびＰＣ１における欠損が、ＰＷＳの主な神経内分泌表現型をどのように駆動し得るかを示すモデルである。ＰＣ１およびＮｈｌｈ２の産生の欠乏に起因するプロホルモンプロセシングの欠損は、ＰＷＳの主な神経内分泌表現型の多くを説明し得る。ＳＮＯＲＤ１１６の父性由来の喪失が、Ｎｈｌｈ２およびＰＣ１の欠損を引き起こすのに十分であり、次にプロホルモンプロセシングの機能不良を引き起こし得るという仮説が立てられる。破線の矢印／線は理論上のつながりを示す。実線の矢印／株は研究された経路を示す。
【図２】細胞性ＰＣ１のレベルおよび／または活性を増加させ、かつプロホルモンプロセシングを増加させるために、細胞性ｃＡＭＰレベルを増加させる薬剤を利用する、ＰＷＳの治療についての論理的根拠を示す概略図である。
【図３Ａ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図３Ｂ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図３Ｃ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図３Ｄ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図３Ｅ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図３Ｆ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図３Ｇ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図３Ｈ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図３Ｉ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図３Ｊ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図３Ｋ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図３Ｌ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図３Ｍ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図３Ｎ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図３Ｏ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図３Ｐ】ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１のダウンレギュレーションは異常なプロホルモンプロセシングと関連し；ＰＣＳＫ１転写レベルはホルスコリンでの処理により罹患していない対照において増加し得ることを示すグラフである。
【図４】ＰＷＳおよびおそらく他のタイプの肥満（一般的な肥満を含む）に罹患した個体における、ホルスコリンおよび／またはテオフィリンと組み合わせたＭＣ４Ｒアゴニストおよび／またはＡｇＲＰ阻害物質の共投与についての治療法の論理的根拠を示す概略図である。
【図５Ａ】ホルスコリン（ＡＣアゴニスト）の適用が、初代マウスニューロン、ｉＰＳＣ由来ニューロン、および初代マウス膵島におけるＰＣＳＫ１／Ｐｃｓｋ１転写レベルを上昇させることを示すグラフである。
【図５Ｂ】ホルスコリン（ＡＣアゴニスト）の適用が、初代マウスニューロン、ｉＰＳＣ由来ニューロン、および初代マウス膵島におけるＰＣＳＫ１／Ｐｃｓｋ１転写レベルを上昇させることを示すグラフである。
【図５Ｃ】ホルスコリン（ＡＣアゴニスト）の適用が、初代マウスニューロン、ｉＰＳＣ由来ニューロン、および初代マウス膵島におけるＰＣＳＫ１／Ｐｃｓｋ１転写レベルを上昇させることを示すグラフである。
【図５Ｄ】ホルスコリン（ＡＣアゴニスト）の適用が、初代マウスニューロン、ｉＰＳＣ由来ニューロン、および初代マウス膵島におけるＰＣＳＫ１／Ｐｃｓｋ１転写レベルを上昇させることを示すグラフである。
【図５Ｅ】ホルスコリン（ＡＣアゴニスト）の適用が、初代マウスニューロン、ｉＰＳＣ由来ニューロン、および初代マウス膵島におけるＰＣＳＫ１／Ｐｃｓｋ１転写レベルを上昇させることを示すグラフである。
【図５Ｆ】ホルスコリン（ＡＣアゴニスト）の適用が、初代マウスニューロン、ｉＰＳＣ由来ニューロン、および初代マウス膵島におけるＰＣＳＫ１／Ｐｃｓｋ１転写レベルを上昇させることを示すグラフである。
【図５Ｇ】ホルスコリン（ＡＣアゴニスト）の適用が、初代マウスニューロン、ｉＰＳＣ由来ニューロン、および初代マウス膵島におけるＰＣＳＫ１／Ｐｃｓｋ１転写レベルを上昇させることを示すグラフである。
【図５Ｈ】ホルスコリン（ＡＣアゴニスト）の適用が、初代マウスニューロン、ｉＰＳＣ由来ニューロン、および初代マウス膵島におけるＰＣＳＫ１／Ｐｃｓｋ１転写レベルを上昇させることを示すグラフである。
【図６Ａ】ｉＰＳＣ由来ニューロンへのホスホジエステラーゼ阻害薬の適用が、ＰＣＳＫ１転写レベルおよびプロホルモンプロセシングを増加させることをを示すグラフである。図６Ａ：テオフィリンは、１０ｍＭの濃度で３４日目のｉＰＳＣ由来の視床下部ＡＲＣニューロン（１０２３Ａ株）におけるＰＣＳＫ１転写レベルを増加させる。
【図６Ｂ】ｉＰＳＣ由来ニューロンへのホスホジエステラーゼ阻害薬の適用が、ＰＣＳＫ１転写レベルおよびプロホルモンプロセシングを増加させることをを示すグラフである。図６Ｂ：ロフルミラストは、１ｍＭの濃度で分化の４０日目のｉＰＳＣ由来ニューロン（１０４３Ｄ３株）におけるＰＣＳＫ１転写レベルを増加させる。
【図６Ｃ】ｉＰＳＣ由来ニューロンへのホスホジエステラーゼ阻害薬の適用が、ＰＣＳＫ１転写レベルおよびプロホルモンプロセシングを増加させることをを示すグラフである。図６Ｃ：ロフルミラストは、１ｍＭの濃度で分化の４０日目のｉＰＳＣ由来ニューロン（１０４３Ｄ３株）におけるＰＣＳＫ１転写レベルを増加させる。
【図６Ｄ】ｉＰＳＣ由来ニューロンへのホスホジエステラーゼ阻害薬の適用が、ＰＣＳＫ１転写レベルおよびプロホルモンプロセシングを増加させることをを示すグラフである。図６Ｄ：ロフルミラスト（１００ｎＭ）およびホルスコリン（１μＭ）による組み合わせ治療は、いずれかの薬剤単独よりも低い濃度でＰＣＳＫ１転写レベルを増加させ、かつＰＯＭＣからＡＣＴＨへのプロセシングを増加させ、相加効果またはおそらく相乗効果を示唆する。
【図６Ｅ】ｉＰＳＣ由来ニューロンへのホスホジエステラーゼ阻害薬の適用が、ＰＣＳＫ１転写レベルおよびプロホルモンプロセシングを増加させることをを示すグラフである。図６Ｅ：ロフルミラスト（１００ｎＭ）およびホルスコリン（１μＭ）による組み合わせ治療は、いずれかの薬剤単独よりも低い濃度でＰＣＳＫ１転写レベルを増加させ、かつＰＯＭＣからＡＣＴＨへのプロセシングを増加させ、相加効果またはおそらく相乗効果を示唆する。
【図６Ｆ】ｉＰＳＣ由来ニューロンへのホスホジエステラーゼ阻害薬の適用が、ＰＣＳＫ１転写レベルおよびプロホルモンプロセシングを増加させることをを示すグラフである。図６Ｆ：１μＭのホルスコリンと組み合わせて１０μＭで適用されたＭＫ０９５２は、ｉＰＳＣ由来ニューロン（１０４３Ｄ３株）におけるＰＣＳＫ１転写レベルを約２倍増加させる。
【図７Ａ】ＭＫ０９５２による単一処理が、野生型マウスにおける視床下部のＰｃｓｋ１を増加させることを示すグラフである。図７Ａは、使用されるすべてのマウスの体重が同等であったことを示すグラフである。
【図７Ｂ】ＭＫ０９５２による単一処理が、野生型マウスにおける視床下部のＰｃｓｋ１を増加させることを示すグラフである。図７Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇの体重の用量で１０％のメチルセルロース中の経口強制投与によって投与されたＭＫ０９５２が、視床下部のＰｃｓｋ１レベルを約２５％増加させたことを示すグラフである。２５ｍｇ／ｋｇのホルスコリンによる処理は、視床下部のＰｃｓｋ１レベルの増加をもたらさなかった。ＭＫ０９５２（１０ｍｇ／ｋｇ）およびホルスコリン（２５ｍｇ／ｋｇ）による組み合わせ処理も、視床下部のＰｃｓｋ１転写レベルの２５％の増加をもたらし、おそらく大部分はＭＫ０９５２の効果に起因する。
【図８Ａ】臨床試験デザインの態様を示す概略図、表およびグラフである。
【図８Ｂ】臨床試験デザインの態様を示す概略図、表およびグラフである。
【図８Ｃ】臨床試験デザインの態様を示す概略図、表およびグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本開示は、ＰＣ１（プロホルモン転換酵素１）レベルをインビトロまたはインビボで調節する方法を提供する。本方法を使用して、ＰＣ１のレベルおよび／または活性をアップレギュレートする（発現を増加させる）か、または増加させることができる。プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）および他の肥満の形態を治療する方法も、本開示に包含される。方法は、治療有効量のＰＤＥ４阻害物質および／またはアデニル酸シクラーゼ活性化物質を投与するステップを含み得る。これらの方法が、シャーフ・ヤング症候群および自閉症スペクトラム障害に罹患した患者を治療するためにも有用であろうことが予想される（Ｆａｂｉｅｎｎｅ  Ｓｃｈａｌｌｅｒ  Ｆｒａｎｃｏｉｓｅ  Ｗａｔｒｉｎ  Ｒａｃｈｅｌ  Ｓｔｕｒｎｙ  Ａｎｎｉｃｋ  Ｍａｓｓａｃｒｉｅｒ  Ｐｉｅｒｒｅ  Ｓｚｅｐｅｔｏｗｓｋｉ  Ｆｒａｎｃｏｉｓｅ  Ｍｕｓｃａｔｅｌｌｉ；Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ（２０１０）１９  （２４）：４８９５−４９０５．ＤＯＩ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｈｍｇ／ｄｄｑ４２４；Ｇｒｅｅｎ  Ｌ，Ｆｅｉｎ  Ｄ，Ｍｏｄａｈｌ  Ｃ，Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｃ，Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  Ｌ，Ｍｏｒｒｉｓ  Ｍ．Ｏｘｙｔｏｃｉｎ  ａｎｄ  ａｕｔｉｓｔｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ：ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｒｍｓ．Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００１  Ｏｃｔ  １５；５０（８）：６０９−１３）。
【００３２】
細胞性プロホルモン転換酵素１のレベル／活性を増加させる理論上のメカニズムとしては、（１）内在性プロモーターが関与することによる転写レベルでのアップレギュレーション、（２）ＰＣ１の酵素活性を直接増加すること、（３）ＰＣＳＫ１のＰＣ１への翻訳率を増加すること、（４）ＰＣ１酵素／タンパク質の分解を減少すること（可能な１つのアプローチは、ＰＣ１の内在性阻害物質であるプロＳＡＡＳのレベルを減少させることによる（アンチセンスオリゴ「遺伝子ノックダウン」、従来の小分子阻害、または他のもの経由で））、（５）ＰＣＳＫ１転写物の分解（ｍｉＲＮＡによる標的化、ナンセンス媒介性崩壊、推定上のｍＲＮＡメチル化レベル）を減少すること、それによって翻訳を増加させること、（６）ＰＣ１それ自体は９２ｋＤａの酵素前駆体から６６ｋＤａの成熟した酵素へプロセシングされ、したがって、プレプロＰＣ１のプロセシングのレベルを増加することも治療的有用性を有し得る、ならびに（７）遺伝子療法の方法による追加のＰＣＳＫ１  ｃＤＮＡの細胞への送達、（８）遺伝子療法の方法によるＳＮＯＲＤ１１６  ＲＮＡの送達、ならびに（９）酵素補充療法による血中循環および／または組織へのＰＣ１酵素の直接送達、が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３３】
本結果は、ＰＷＳの主な神経内分泌特徴が機能的なＰＣ１欠損に起因する可能性が高いことを示唆する。図１を参照されたい。ＰＣ１をコードする遺伝子であるＰＣＳＫ１はＰＷＳにおいてインタクトなので、ＰＷＳ患者におけるＰＣ１の発現および／または活性のレベルを増加させることは、この機能的ＰＣ１欠損を補正するだろう。薬理学的に、ＰＣ１レベルのこの増加は、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルを増加させるかまたはｃＡＭＰ分解を遮断する薬剤の投与によって達成できる。
【００３４】
環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、環状ＡＭＰおよび環状ＧＭＰの加水分解を触媒し、それによって、これらの環状ヌクレオチドの細胞内濃度、それらのシグナル経路および、結果として、健康および疾患における無数の生物学的応答を調節する。Ｍａｕｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅｓ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．１３（４）：２９０−３１４（２０１４）。ＰＤＥ４アイソフォームは、免疫炎症性応答および組織再構築を調節する細胞において高発現される。同上。ＰＤＥ４の阻害は、細胞中のｃＡＭＰレベルの増加をもたらす。多数のＰＤＥ４阻害物質が利用可能である。ＰＤＥ４阻害物質の非限定例としては、テオフィリン、ロフルミラスト、アプレミラスト、イブジラスト、ＧＳＫ３５６２７８、ＭＫ０９５２、ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）、メセンブレノン、ロリプラム、ピクラミラスト、ルテオリン、ドロタベリン、ＡＮ２７２８、シロミラスト、ジアゼパム、ルテオリン、およびＥ６００５が挙げられる。他のホスホジエステラーゼ阻害薬としては、メチル化キサンチンおよび誘導体（カフェイン、アミノフィリン、パラキサンチン、ペントキシフィリン、テオブロミン、およびテオフィリン等）が挙げられる。
【００３５】
ｃＡＭＰのレベルは、アデニル酸シクラーゼを活性化する薬剤を使用して増加することもできる。アデニル酸シクラーゼ活性化物質の非限定例としては、ホルスコリン、ＦＤ１、ＦＤ２、ＦＤ３、ＦＤ４、ＦＤ５（ＮＫＨ４７７）およびＦＤ６が挙げられる。
【００３６】
ＰＤＥ４阻害物質およびアデニル酸シクラーゼ活性化物質は、単独でまたは組み合わせて、治療剤と称され得る。
【表１】
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【表２】
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【００３７】
略語
【００３８】
ＡＣＴＨ：副腎皮質刺激ホルモン。
【００３９】
ＡｇＲＰ：アグーチ関連タンパク質；弓状核においても産生されるタンパク質であり、ＭＣ４Ｒでのインバースアゴニストである。プロＡｇＲＰはＰＣ１によってＡｇＲＰへプロセシングされる。
【００４０】
ｃＡＭＰ：環状アデノシン一リン酸。
【００４１】
ＧＨ：グレリン（「空腹ホルモン」（レノモレリン（国際一般的名称）としても公知））は、中枢神経系においてニューロペプチドとして機能する、胃の基底部における腸内分泌細胞によって産生されるペプチドホルモンである。
【００４２】
プロＧＨＲＨ：プロ成長ホルモン放出ホルモン。
【００４３】
ＧＨＲＨ：成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）（ソマトリベリンとして、またはその内在性形態での他の複数の名称で、およびその医薬形態でソマトレリン（国際一般的名称）としても公知）は、成長ホルモン（ＧＨ）の放出ホルモンである。それは、視床下部の弓状核において産生される４４アミノ酸のペプチドホルモンである。
【００４４】
ＰＣ１：プロタンパク質転換酵素１（プロホルモン転換酵素１、プロホルモン転換酵素３、プロタンパク質転換酵素３、神経内分泌転換酵素１、または神経内分泌転換酵素３としても公知であり、多くの場合ＰＣ１／３として省略される）は、ヒトではＰＣＳＫ１遺伝子によってコードされる酵素である。ＰＣ１およびＰＣ２（ＰＣＳＫ１およびＰＣＳＫ２の遺伝子のタンパク質産物）は、プロオピオメラノコルチン、プロインスリン、およびプログルカゴンを含む、多くの神経内分泌ホルモンまたは内分泌ホルモンを差異的に切断する。
【００４５】
ＰＣ２：プロホルモン転換酵素２または神経内分泌転換酵素２（ＮＥＣ２）としても公知のプロタンパク質転換酵素２（ＰＣ２）は、セリンプロテアーゼであり、プロタンパク質転換酵素ＰＣ２は、プロタンパク質転換酵素１（ＰＣ１）と同様に、それらの前駆物質からの多くの神経内分泌ペプチドの成熟における第１のステップ（プロインスリンからインスリン中間体への変換等）に関与する酵素である。インスリン（および他の多くのペプチド）の生物活性形態を生成するために、Ｃ末端の塩基性残基の除去を包含する第２のステップが要求される。このステップはカルボキシペプチダーゼＥおよび／またはＤによって媒介される。ＰＣ２は、ＰＣ１に比較して、インスリン生合成の第１のステップにおいてマイナーな役割のみを果たすが、グルカゴン生合成の第１のステップにおいてより高い役割を果たす。ＰＣ２は７Ｂ２という名称の神経内分泌タンパク質へ結合し、このタンパク質が存在しないならば、プロＰＣ２は酵素的に活性になることができない。７Ｂ２は、プロＰＣ２が不活性化可能な形態へ凝集することを防止することによって、これを達成する。７Ｂ２のＣ末端のドメインはまたＰＣ２活性を、それがより小さな不活性形態へと切断されるまで阻害する。したがって、７Ｂ２はＰＣ２の活性化物質および阻害物質の両方である。ヒトにおいて、プロタンパク質転換酵素２はＰＣＳＫ２遺伝子によってコードされる。それは細菌酵素スブチリシンに関連し、哺乳動物においては、合計で９つの異なるスブチリシン様遺伝子：フューリン、ＰＡＣＥ４、ＰＣ４、ＰＣ５／６、ＰＣ７／８、ＰＣＳＫ９、およびＳＫＩ１／Ｓ１Ｐがある。
【００４６】
ＰＣＳＫ１：ＰＣ１をコードする遺伝子。
【００４７】
ＰＣＳＫ２：ＰＣ２をコードする遺伝子。
【００４８】
ＰＯＭＣ：プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）は、２４１のアミノ酸残基を有する前駆体ポリペプチドである。ＰＯＭＣは、翻訳中の４４アミノ酸長のシグナルペプチド配列の除去によって、２８５アミノ酸長のポリペプチド前駆物質のプレプロオピオメラノコルチン（プレＰＯＭＣ）から脳下垂体において合成される。
【００４９】
ＰＤＥ４：ホスホジエステラーゼ４。
【００５０】
ＰＷＳ：プラダー・ウィリー症候群。
【００５１】
ＳＮＯＲＤ１１６：ＳＮＯＲＤ１１６（ＨＢＩＩ−８５としても公知）は、他の核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）の修飾において機能する非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）分子である。このタイプの修飾ＲＮＡは通常、ｓｎＲＮＡ生合成の主要部位である真核生物細胞の核小体に所在する。それは核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）として公知であり、多くの場合ガイドＲＮＡとも称される。ＳＮＯＲＤ１１６は、Ｃボックス（ＵＧＡＵＧＡ）およびＤボックス（ＣＵＧＡ）として公知の保存配列モチーフを含有する、Ｃ／ＤボックスクラスのｓｎｏＲＮＡに属する。ボックスＣ／Ｄファミリーの大部分のメンバーは、基質ＲＮＡの部位特異的２’−Ｏメチル化の指令において機能する。ヒトゲノムには、染色体１５のＰＷＳ領域中に、ＳＮＯＲＤ１１６の２９のタンデム反復コピーがある。加えて、他の非コーディングＲＮＡ種がＳＮＯＲＤ１１６遺伝子座からコードされ、長いノンコーディングＲＮＡ、１１６ＨＧ、５つのｓｎｏ−ｌｎｃＲＮＡ、および２つのｓｐａ−ｌｎｃＲＮＡを含む。ＳＮＯＲＤ１１６は、明確に定義された標的を欠如くオーファン非コーディングＲＮＡ遺伝子座である。父性由来のＳｎｏｒｄ１１６を欠くマウスモデルは、過食症および成長不全を含むヒトＰＷＳに類似する症状を示す。
【００５２】
ＤＰＩデバイス／吸入器：乾燥粉末吸入器；典型的には携帯型である。
【００５３】
ＭＤＩデバイス：用量測定式吸入器；典型的には携帯型である。
【００５４】
αＭＳＨ：メラノコルチン４受容体の内在性リガンドである。
【００５５】
ＭＣ２Ｒ：メラノコルチン２受容体。
【００５６】
ＭＣ４Ｒ：メラノコルチン４受容体。
【００５７】
ＷＴ：野生型。
【００５８】
定義
「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書において使用される時、化学薬剤の保有または輸送に関与する、薬学的に許容される材料、組成物またはベヒクル（液体充填物質もしくは固体充填物質、希釈物質、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料等）を意味する。希釈物質または担体の成分は、活性化合物の治療有効性を減じるようであるべきでない。
【００５９】
「組成物」という用語は、本明細書において使用される時、２つ以上の要素または成分を混合するまたは組み合わせることから生じる産物を意味する。
【００６０】
状態、障害または病態の「治療すること」または「治療」は、
（１）状態、障害または病態に罹患するかまたはその素因があり得るが、状態、障害または病態の臨床症状をまだ経験しないかまたは提示しない人において発症する状態、障害または病態の臨床症状の出現を予防または遅延させること；または
（２）状態、障害もしくは病態を阻害すること、すなわち、疾患の発症もしくはその再発（維持治療の場合に）または少なくとも１つのその臨床症状、徴候、もしくは検定を阻止する、低減するまたは遅延させること；または
（３）疾患を軽減すること、すなわち、状態、障害もしくは病態またはその臨床上のもしくは準臨床的な症状もしくは徴候の少なくとも１つの退行を引き起こすこと、
を含む。
【００６１】
治療される被験体への利益は、統計的に有意であるか、または患者もしくは内科医に少なくとも知覚可能であるか、のいずれかである。
【００６２】
「患者」または「被験体」は哺乳動物を指し、ヒトおよび動物の被験体を含む。
【００６３】
「阻害物質」および「アンタゴニスト」、または「活性化物質」および「アゴニスト」は、例えば、リガンド、受容体、コファクター、遺伝子、細胞、組織、または器官の例えば活性化についての、阻害分子または活性化分子をそれぞれ指す。例えば、遺伝子、受容体、リガンド、または細胞の調節物質は、遺伝子、受容体、リガンド、または細胞の活性を変更する分子であり、そこで活性は、その調節特性において活性化され、阻害され、または変更され得る。調節物質は単独で作用し得るか、またはコファクター（例えばタンパク質、金属イオン、または小分子）を使用し得る。阻害物質は、活性化を減少する、遮断する、防止する、遅延する、例えば遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、または細胞を不活性化する、脱感作する、またはダウンレギュレートする化合物である。活性化物質は、活性化を増加する、活性化する、助長する、促進する、例えば遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体、または細胞を感作する、またはアップレギュレートする化合物である。阻害物質は、構成的活性を低減する、遮断する、または不活性化する化合物としても定義され得る。「アゴニスト」は、標的と相互作用して、標的の活性化の増加を引き起こすかまたは増進する化合物である。「アンタゴニスト」は、アゴニストの作用に対抗する化合物である。アンタゴニストは、アゴニストの活性を、防止、低減、阻害、または中和する。同定されたアゴニストがない場合でさえ、アンタゴニストは、標的（例えば標的受容体）の構成的活性を防止する、阻害する、または低減することもできる。
【００６４】
阻害の程度を検討するために、例えば、規定の例えばタンパク質、遺伝子、細胞、または生物体を含むサンプルまたはアッセイが、可能性のある活性化物質または阻害物質により処理され、阻害物質無しの対照サンプルに比較される。対照サンプル（すなわちアンタゴニストにより処理されないサンプル）は、１００％の相対的活性値をアサインされる。阻害は、対照に比べた活性値が約９０％以下、典型的には８５％以下、より典型的には８０％以下、最も典型的には７５％以下、一般的には７０％以下、より一般的には６５％以下、最も一般的には６０％以下、典型的には５５％以下、通常は５０以下％、より通常は４５％以下、最も通常は４０％以下、好ましくは３５％以下、より好ましくは３０％以下、さらにより好ましくは２５％以下、および最も好ましくは２５％未満である場合に、達成される。活性化は、対照に比べた活性値が約１１０％、一般的には少なくとも１２０％、より一般的には少なくとも１４０％、より一般的には少なくとも１６０％、多くの場合少なくとも１８０％、より多くの場合少なくとも２倍、最も多くの場合少なくとも２．５倍、通常は少なくとも５倍、より通常は少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも４０倍、および最も好ましくは４０倍を超えて高いある場合に、達成される。
【００６５】
治療製剤の投薬量は、疾患の性質、患者の病歴、投与の頻度、投与の様式、宿主からの薬剤のクリアランスなどに依存して、広く変動するだろう。初期用量はより多く、より少ない維持用量がそれに続き得る。用量は、週１回もしくは週２回の頻度で投与されるか、またはより低用量へと細分され毎日、半週で１回などで投与されて、有効な投薬量レベルを維持できる。いくつかの事例において、経口投与は、静脈内に投与されるよりも高い用量を要求するだろう。いくつかの事例において、局所投与は、有効な局所用用量を提供するために、数日または数週の間、必要に応じて１日数回の適用を包含するだろう。
【００６６】
「担体」という用語は、希釈物質、アジュバント、賦形剤またはベヒクルを指し、それと共に化合物が投与される。かかる医薬担体は、水および油などの滅菌液体であってよく、落花生油、大豆油、鉱物油、オリーブ油、ゴマ油などの、石油、動物、植物または合成起源のものを含む。水または水溶液、食塩溶液ならびにデキストロースおよびグリセリンの水溶液は、特に注射可能な溶液のための担体として好ましく用いられる。あるいは、担体は固体投薬形態の担体であり得、結合物質（圧縮ピルのための）、流動化物質、カプセル化剤、風味料、および着色物質の１つまたは複数を含むがこれらに限定されない。好適な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」中に記載される。
【００６７】
本明細書において記載される治療組成物は、鼻内投与、経口投与、経皮投与、眼内投与、腹腔内投与、吸入投与、静脈内投与、ＩＣＶ投与、大槽内の注射または点滴による投与、皮下投与、インプラント投与、膣内投与、舌下投与、尿道投与（例えば尿道坐剤）、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、直腸投与、舌下投与、粘膜投与、点眼投与、脊髄投与、髄腔内投与、関節内投与、動脈内投与、クモ膜下投与、気管支投与、またはリンパ投与を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の方法によって投与され得る。局所製剤は、ゲル、軟膏、クリーム、エアロゾルなどの形態であってよく；鼻内製剤は、スプレーとしてもしくは液滴で送達されてよく；経皮製剤は、経皮パッチもしくはイオントルフォレシス（ｉｏｎｔｏｒｐｈｏｒｅｓｉｓ）を介して投与されてよく；または吸入製剤は、ネブライザーもしくは類似するデバイスを使用して送達され得る。組成物は、錠剤、ピル、カプセル、半固体、粉末、持続放出製剤、溶液、懸濁物、エリキシル、エアロゾル、または他の適切な組成物の形態もとり得る。
【００６８】
かかる医薬組成物を調製するために、１つもしくは複数のＰＤＥ４阻害物質および／または１つもしくは複数のアデニル酸シクラーゼ活性化物質、および／または１つもしくは複数のＭＣ４Ｒアゴニストは、従来の医薬調合技法に従って、薬学的に許容される担体、アジュバントおよび／または賦形剤と一緒に混合され得る。本組成物中で使用され得る薬学的に許容される担体は、標準的な医薬担体（リン酸緩衝食塩水溶液、水、および油／水エマルションまたは水／油エマルション等のエマルション、ならびに様々なタイプの湿潤剤等）の任意のものを包含する。組成物は追加で、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、脱脂粉乳等の固体医薬賦形剤を含有してよい。液体および半固体の賦形剤は、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールおよび様々な油（石油、動物、植物または合成起源のものを含む、例えば落花生油、大豆油、鉱物油、ゴマ油など）から選択され得る。特に注射可能溶液のための、液体担体は、水、食塩水、水性デキストロース、およびグリコールを含む。担体、安定化物質およびアジュバントの例については、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ編、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、第１８版、１９９０年）を参照されたい。組成物は安定物質および保存物質も含んでよい。
【００６９】
本明細書において使用される時、「治療有効量」という用語は、特定の障害または疾患を治療するのに、またはあるいは、ヒト患者または非ヒト患者等の哺乳動物における障害もしくは疾患をインビトロもしくはインビボで治療して薬理学的応答を得るのに十分な量である。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、治療法のために使用される組成物、治療法の目的、治療される標的細胞、および治療される被験体により変動し得る。治療投薬量は一般的に、安全性および有効性を至適化するために力価測定され得る。単回投与または複数回投与は、治療する内科医によって選択される用量レベルおよびパターンで実行され得る。好適な投薬量製剤、および薬剤を投与する方法は、当業者によって容易に決定され得る。例えば、組成物は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇで投与される。本明細書において記載される化合物が他の薬剤または治療法と共投与される場合、有効量は、いずれかの薬剤が単独で使用される場合よりも少ないか、それに等しいか、またはそれより多いかもしれない。
【００７０】
経皮製剤は、チキソトロピー性またはゼラチン状の担体（セルロース系媒質等、例えばメチルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロース）中に活性薬剤を取り込み、生じた製剤が次いで、使用者の皮膚との皮膚接触が確実にされるように適合された経皮デバイス中に充填されることによって調製され得る。組成物がゲルの形態であるならば、組成物は、患者の皮膜（例えば、肩もしくは上腕および／または上半身の皮膚、好ましくはインタクトで清浄な乾燥した皮膚）の上へこすりつけられ、患者の血清へのＰＤＥ４阻害物質および／またはアデニル酸シクラーゼ活性化物質の送達のために十分な期間その上に維持され得る。ゲル形態での本発明の組成物は、チューブ、分包、または計量式ポンプ中に含有され得る。かかるチューブまたは分包は、組成物の１単位用量、または２単位以上の用量を含有し得る。計量式ポンプは、組成物の１つの計量された用量を分注できる。
【００７１】
本発明は、鼻内投与のための上記のような組成物も提供する。それゆえ、組成物は透過促進剤をさらに含み得る。Ｓｏｕｔｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｎａｓａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２０００。ＰＤＥ４阻害物質および／またはアデニル酸シクラーゼ活性化物質は、液体形態（溶液、エマルション、懸濁物、液滴等）で、または固体形態（粉末、ゲルまたは軟膏等）で鼻内に投与され得る。鼻内医薬物を送達するデバイスは、当技術分野において周知である。鼻への薬物送達は、鼻内吸入器、鼻内噴霧デバイス、アトマイザー、鼻用スプレーボトル、単位用量容器、ポンプ、ドロッパ、スクイーズボトル、ネブライザー、計量式吸入器（ＭＤＩ）、加圧用量吸入器、通気器、および双方向デバイスを含むがこれらに限定されないデバイスを使用して実行できる。鼻への送達デバイスは、正確な有効投薬量量を鼻腔へ投与するように計量され得る。鼻への送達デバイスは単一単位送達または多重単位送達のためであり得る。具体的な例において、Ｋｕｒｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｔｈｅｌｌ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）からのＶｉａＮａｓｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ａｔｏｍｉｚｅｒが、本発明において使用され得る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｕｒｖｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ）。本発明の化合物は、チューブ、カテーテル、シリンジ、パックテイル（ｐａｃｋｔａｉｌ）、ガーゼ、鼻用タンポンを介して、または粘膜下の点滴によっても送達され得る。米国特許公報第２００９０３２６２７５号、同第２００９０２９１８９４号、同第２００９０２８１５２２号および同第２００９０３１７３７７号。
【００７２】
ＰＤＥ４阻害物質および／またはアデニル酸シクラーゼ活性化物質は、標準的な手順を使用して、エアロゾルとして製剤化され得る。ＰＤＥ４阻害物質および／またはアデニル酸シクラーゼ活性化物質は、溶媒有りまたは無しで製剤化され、担体有りまたは無しで製剤化され得る。製剤は、溶液であり得るか、または１つもしくは複数の界面活性物質による水性エマルションであり得る。例えば、エアロゾルスプレーは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、炭化水素、圧縮空気、窒素、二酸化炭素、または他の好適な気体等の好適な噴射剤を備えた加圧容器から生成され得る。投薬量単位は、計量された量を送達する弁を提供することによって決定され得る。ポンプスプレーディスペンサーは、計量された用量、または特定の粒子もしくは液滴のサイズを有する用量を分注できる。本明細書において使用される時、「エアロゾル」という用語は、気体中の微小固形粒子または溶液液滴の懸濁物を指す。具体的には、エアロゾルは、任意の好適なデバイス（ＭＤＩまたはネブライザー、またはミスト噴霧器等）において産生され得るような、ＰＤＥ４阻害物質および／またはアデニル酸シクラーゼ活性化物質の液滴の気体中の懸濁物を包含する。エアロゾルはまた、空気または他のキャリアガス中で懸濁される本発明の組成物の乾燥粉末組成物も包含する。Ｇｏｎｄａ（１９９０）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ６：２７３−３１３。Ｒａｅｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７：１４３−１５９。
【００７３】
ＰＤＥ４阻害物質および／またはアデニル酸シクラーゼ活性化物質は、鼻用通気器によって送達されるマイクロスフェア等の形態で粉末として鼻腔へ送達され得る。ＰＤＥ４阻害物質および／またはアデニル酸シクラーゼ活性化物質は、固体表面、例えば担体、へ吸収され得る。粉末またはマイクロスフェアは、乾燥した、エア分配可能な形態で投与され得る。粉末またはマイクロスフェアは、通気器の容器中に貯蔵され得る。あるいは、粉末またはマイクロスフェアは、鼻への投与のために適合したゼラチンカプセル等のカプセル、または他の単回用量単位へと充填され得る。
【００７４】
医薬組成物は、例えば、ゲル、軟膏、鼻用エマルション、ローション、クリーム、鼻用タンポン、ドロッパ、または生体接着性ストリップの形態で、鼻腔中での組成物の直接配置によって鼻腔へ送達され得る。ある特定の実施形態において、例えば、吸収を促進するために、鼻腔中の医薬組成物の滞留時間を長くすることが所望され得る。したがって、医薬組成物は随意に、生体接着性ポリマー、ガム（例えばキサンタンガム）、キトサン（例えば高度に精製されたカチオン性多糖）、ペクチン（または鼻粘膜へ適用された場合にゲルの様に厚くなるかまたは乳化する任意の炭水化物）、マイクロスフェア（例えばデンプン、アルブミン、デキストラン、シクロデキストリン）、ゼラチン、リポソーム、カルバマー（ｃａｒｂａｍｅｒ）、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサンおよび／またはセルロース（例えばメチルまたはプロピル；ヒドロキシルまたはカルボキシ；カルボキシメチルまたはヒドロキシルプロピル）と共に製剤化され得る。
【００７５】
ＰＤＥ４阻害物質および／またはアデニル酸シクラーゼ活性化物質を含有する組成物は、気道、すなわち肺、の中への経口吸入によって投与され得る。
【００７６】
吸入可能な薬剤のための典型的な送達系としては、ネブライザー吸入器、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、および計量式吸入器（ＭＤＩ）が挙げられる。
【００７７】
ネブライザーデバイスは、液体の形態の治療剤をミストとして噴霧させる高速空気の流れを産生する。治療剤は、溶液または好適なサイズの粒子の懸濁物等の液体の形態で製剤化される。一実施形態において、粒子は微粉化される。「微粉化される」という用語は、約１０μｍ未満の直径を備えた粒子の約９０％以上を有すると定義される。好適なネブライザーデバイスは、例えばＰＡＲＩ  ＧｍｂＨ（Ｓｔａｒｎｂｅｒｇ、ドイツ）によって商業的に提供される。他のネブライザーデバイスとしては、Ｒｅｓｐｉｍａｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ならびに例えば米国特許第７，５６８，４８０号および同６，１２３，０６８号、およびＷＯ９７／１２６８７中で開示されるものが挙げられる。ＰＤＥ４阻害物質および／またはアデニル酸シクラーゼ活性化物質は、水溶液としてまたは液体懸濁液としてネブライザーデバイスにおける使用のために製剤化され得る。
【００７８】
ＤＰＩデバイスは典型的には、吸気の間に患者の気流中で分散され得る自由流動性粉末の形態で治療剤を投与する。外部エネルギー源を使用するＤＰＩデバイスも本発明において使用され得る。自由流動性粉末を達成するために、治療剤は好適な賦形剤（例えばラクトース）と共に製剤化され得る。乾燥粉末製剤は、例えば本化合物の微粉化された粒子と約１μｍ〜１００μｍの間の粒子サイズを有する乾燥ラクトースを組み合わせること、およびドライブレンドすることによって作製できる。あるいは、本化合物は賦形剤無しで製剤化され得る。製剤は、乾燥粉末送達デバイスによる使用のために、乾燥粉末ディスペンサー中へ、あるいは吸入カートリッジまたはカプセルの中へロードされる。商業的に提供されるＤＰＩデバイスの例としては、Ｄｉｓｋｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、Ｎ．Ｃ．）（例えば米国特許第５，０３５，２３７号を参照）；Ｄｉｓｋｕｓ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）（例えば米国特許第６，３７８，５１９号を参照）；Ｔｕｒｂｕｈａｌｅｒ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ｄｅｌ．）（例えば米国特許第４，５２４，７６９号を参照）；およびＲｏｔａｈａｌｅｒ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）（例えば米国特許第４，３５３，３６５号を参照）が挙げられる。好適なＤＰＩデバイスのさらなる例は、米国特許第５，４１５，１６２号、同第５，２３９，９９３号、同第５，７１５，８１０号およびその中の参照文献中で記載される。
【００７９】
ＭＤＩのデバイスは典型的に、圧縮した噴射気体を使用して、測定された量の治療剤を排出する。ＭＤＩ投与のための製剤は、液化された噴射剤中で活性成分の溶液または懸濁物を含む。噴射剤の例としては、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４ａ）および１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロ−ｎ−プロパン（ＨＦＡ  ２２７）等の、ヒドロフルオロアルクラン（ｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｏａｌｋｌａｎｅ）（ＨＦＡ）、およびＣＣｌ３Ｆ等の、クロロフルオロカーボンが挙げられる。ＭＤＩ投与のためのＨＦＡ製剤の追加の構成要素としては、エタノール、ペンタン、水等の共溶媒；およびトリオレイン酸ソルビタン、オレイン酸、レシチンおよびグリセリン等の界面活性物質が挙げられる（例えば米国特許第５，２２５，１８３号、ＥＰ０７１７９８７およびＷＯ９２／２２２８６を参照）。製剤は、エアロゾルキャニスターの中へロードされ、それはＭＤＩのデバイスの一部を形成する。ＨＦＡ噴射剤による使用のために特別に開発されたＭＤＩのデバイスの例は、米国特許第６，００６，７４５号および同第６，１４３，２２７号中で提供される。好適な製剤を調製するプロセスおよび吸入用量のために好適なデバイスの例については、米国特許第６，２６８，５３３号、同第５，９８３，９５６号、同第５，８７４，０６３号および同第６，２２１，３９８号、ならびにＷＯ９９／５３９０１、ＷＯ００／６１１０８、ＷＯ９９／５５３１９およびＷＯ００／３０６１４を参照されたい。
【００８０】
ＰＤＥ４阻害物質は、吸入を介する送達のためにリポソームまたはマイクロカプセル中でカプセル化され得る。リポソームは、脂質二重層膜および水性内部からなる小胞である。脂質膜はリン脂質から作製され得、その例としては、レシチンおよびリゾレシチン等のホスファチジルコリン；ホスファチジルセリンおよびホスファチジルグリセロール等の酸性リン脂質；およびホスファチジルエタノールアミンおよびスフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質が挙げられる。あるいは、コレステロールが添加され得る。マイクロカプセルは、コーティング材料でコーティングされた粒子である。例えば、コーティング材料は、フィルム形成ポリマー、疎水性可塑剤、界面活性剤または／および滑沢物質の窒素含有ポリマーの混合物からなり得る。米国特許第６，３１３，１７６号および同第７，５６３，７６８号。
【００８１】
ＰＤＥ４阻害物質および／またはアデニル酸シクラーゼ活性化物質は、短いまたは延長された期間の間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０もしくは６０日または１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２か月または患者の寿命にわたって継続的に、上記の疾患の治療のために単独でまたは他の薬物と組み合わせて与えることができる。本組成物は、哺乳動物、好ましくはヒト患者へ投与され得る。哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、家畜、スポーツ動物、ペット、ウマ、および霊長動物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８２】
以下は非限定的実施例である。
【００８３】
実施例１
ｉＰＳＣ由来視床下部ニューロンおよびβ細胞中のＰＣ１の発現および活性の操作
ホルスコリンによるシクラーゼ活性化および／またはホスホジエステラーゼの阻害（テオフィリン、ＩＢＭＸ）によるｃＡＭＰ異化作用の阻害は、ＰＷＳのインビトロモデルにおいてＰＣ１レベルを増加させ、プロホルモンプロセシングを結果的に増加させるだろう。ＰＷＳのインビボおよびインビトロのモデルにおけるＰＣＳＫ１の明らかな複数組織での欠損の同定は、ＰＷＳの主な神経内分泌症状を緩和し得る合理的な治療標的化を可能にする（図１）。
【００８４】
ＰＣＳＫ１遺伝子のプロモーター領域は、２つの環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）応答エレメントを含有する（Ｃｏｎｋｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｕｄｕｐｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。ｃＡＭＰの細胞中レベルを増加させる薬剤は、ＰＣＳＫ１  ｍＲＮＡを増加させ、ＰＣ１によってプロセシングされるプロホルモンの分泌を増加させる（図２）（Ｕｄｕｐｉ  １９９８）。ホルスコリンおよびテオフィリンは、小児集団において一般的に安全な治療プロファイルを備えた２つのＦＤＡ承認薬である。ホルスコリンは、疎水性相互作用および水素結合を介して、触媒ドメインの近くでアデニル酸シクラーゼへ結合する（Ｔａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｕｒｌｅｙ  １９９８、Ｔｅｓｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）。ホルスコリン結合は、アデニル酸シクラーゼ立体配座がその活性形態へ変化することを引き起こし、したがってＡＣ活性を増加させ、細胞性ｃＡＭＰレベルを増加させる（Ｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）。テオフィリンおよびＭＫ０９５２等の他のホスホジエステラーゼ４（ＰＤＥ４）阻害物質は、細胞性ｃＡＭＰレベルを、その分解を遮断することによって増加させる。
【００８５】
ＰＤＥ４阻害物質の非限定例としては、テオフィリン、ＭＫ０９５２、ならびに表１Ａ〜Ｂ中の他のＰＤＥ阻害物質が挙げられる。アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性化物質の非限定例としては、ホルスコリンおよび表２中の活性化物質が挙げられる。
【００８６】
本方法において使用できる薬剤としては、Ｇタンパク質活性を修飾できる薬剤（Ｇタンパク質活性化物質またはＧタンパク質阻害物質、ならびにＧタンパク質共役型受容体アゴニスト等）も挙げられる。
【００８７】
ＲＮＡシーケンスによって示されるように、ＮＨＬＨ２およびＰＣＳＫ１は、ＰＷＳ微小欠失および大きな欠失のｉＰＳＣ由来ニューロンにおいてダウンレギュレートされる（図３Ａ、３Ｃ）。図３Ａ：ＮＨＬＨ２は罹患していない対照に比較して、ＰＷＳ微小欠失および大きな欠失のｉＰＳＣ由来ニューロンにおいてダウンレギュレートされる。図３Ｂ：ＮＨＬＨ２タンパク質は、罹患していない対照に比較して、ＰＷＳ微小欠失および大きな欠失のｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて＞９０％ダウンレギュレートされる。図３Ｃ〜Ｄ：ＰＣＳＫ１転写物およびそのタンパク質産物ＰＣ１は、罹患していない対照に比較して、ＰＷＳ微小欠失および大きな欠失のｉＰＳＣ由来ニューロンにおいてそれぞれ＞５５％および＞８０％ダウンレギュレートされる。図３Ｅ〜Ｆ：Ｓｎｏｒｄ１１６の父性由来のコピーのみが欠失された（ＰＷＳ領域の残りはインタクトである）マウスは、単離された膵島におけるＰＣ１タンパク質およびＰＣ２タンパク質の＞４０％のダウンレギュレーションを示す。図３Ｇ：プロインスリンはその適切なプロセシングについてＰＣ１に依存する。グルコース注射３０分後で、Ｓｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウスにおいてＷＴ同腹仔に比較して、プロインスリンのプロセシングの機能欠陥がある。図３Ｈ：絶食時に年齢およびＢＭＩの一致した対照に比較して、ＰＷＳに罹患した個体の血漿中のプロインスリン対インスリンの比で６０％の増加があり、インスリンへのプロインスリンのプロセシングにおける欠陥を示唆する。この効果は、ＰＣ１突然変異のある患者において観察されるものよりも低く、ＰＷＳモデルにおけるＰＣ１の約５０％の低減と一致する。図３Ｉ：プログレリンもＰＣ１によってプロセシングされ；ＷＴ同腹仔に比較して、Ｓｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウスからの胃溶解物におけるプログレリンプロセシングは損なわれている。ＰＣ１ヌルマウスからの胃溶解物が、損なわれたプログレリンのプロセシングについての陽性対照として含まれる。図３Ｊ：プロＧＨＲＨプロセシングも、ＷＴ同腹仔に比較して、Ｓｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウスからの視床下部溶解物において損なわれ得る（ｐ＝０．０６）。損なわれたｐｒｏＧＨＲＨプロセシングは、ＰＣ１ヌルマウスにおける低血中循環ＧＨおよび小人症と関連する。Ｓｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋も低ＧＨおよび重症の発育不全を示す。図３Ｋ：予備データは、罹患していない対照の視床下部ｉＰＳＣ由来ニューロンのホルスコリン（ＦＳＫ）による処理が、用量依存的様式でＰＣＳＫ１の転写レベルを増加させ得ることを示唆する。ＰＯＭＣ転写レベルは影響されない。図３Ｌ：罹患していない対照のｉＰＳＣ由来β細胞のホルスコリンによる処理は、ＰＣＳＫ１転写レベルを増加させる。ＳＮＯＲＤ１１６およびＩＮＳの転写レベルは最小限に影響され得る。図３Ｍ：Ｐｃｓｋ１の転写レベルは、絶食時のＳｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋の視床下部において４１％減少し；再び餌をやった時に、Ｐｃｓｋ１レベルにおける差異はない。図３Ｎ：Ｎｈｌｈ２の転写レベルは、ＷＴ同腹仔に比較して、Ｓｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋視床下部において、絶食および再び餌をやった後の両方で減少される。図３Ｏ〜Ｐ：ＡｇｒｐおよびＮ���ｙの転写レベルは、ＷＴに比較して、再び餌をやった時にＳｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋視床下部において増加する。フォローアップの独立した実験は、これらの変化をＱＰＣＲ（遺伝子発現）およびウエスタンブロット（タンパク質レベル）によって確認した（図３Ｂ、３Ｄ）。ＰＷＳに罹患した個体は、年齢およびＢＭＩの一致した対照に比較して、絶食時インスリンレベルの減少を示す。このことは損なわれたプロインスリンのプロセシングに起因し得る、という仮説が立てられた。本データは、Ｓｎｏｒｄ１１６の父性由来のコピーのみが欠失されたＰＷＳのマウスモデルにおいて、ＰＣ１およびＰＣ２のタンパク質レベルは単離された膵島において減少し、インスリンへのプロインスリンのプロセシングの機能欠陥と関連することを例証する（図３Ｅ〜３Ｇ）。プロインスリンのプロセシングは、絶食時に年齢、ＢＭＩの一致した対照に比較して、ヒトＰＷＳ患者からの血漿でも損なわれる（ｐ＝０．０８９）（図３Ｈ）。ＰＣ１突然変異を保有する絶食した患者からの血漿は、損なわれたプロインスリンのプロセシングについての陽性対照として含まれた。
【００８８】
ＰＷＳ患者の高グレリン血症は、成熟したグレリンへのプログレリンの損なわれたプロセシングと関連し得るユニークな表現型である。実際に、本結果は、成熟したグレリンへのプログレリンのプロセシングが、ＷＴ同腹仔に比較して、Ｓｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウスの胃溶解物において損なわれたことを例証する（図３Ｉ）。ＰＣ１ヌルマウスからの胃溶解物は、損なわれたプログレリンのプロセシングについての陽性対照として含まれた。
【００８９】
ＰＷＳに罹患した個体と同様に、ＰＣ１突然変異を有する患者では血中循環ＧＨレベルが減少した。ＰＣ１についてのヌルマウスは重症の発育不全を有し、ＧＨＲＨへのプロＧＨＲＨの損なわれたプロセシングと関連して血中循環ＧＨが減少した。本発明者は、Ｓｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウス（発育不全であり、低血中循環ＧＨも有する）が、視床下部溶解物においてＧＨＲＨへのプロＧＨＲＨの損なわれたプロセシングの傾向を示すことを見出した（図３Ｊ）。
【００９０】
図２中で略述されるように、ＰＷＳにおけるＰＣ１の減少および損なわれたプロホルモンのプロセシングの同定は、疾患の神経内分泌特徴の多くを説明し得る、統一された分子的な理論を示唆する。したがって、ＰＣ１活性を増加させ、それによってプロホルモンのプロセシングを増加させる薬剤は、ＰＷＳの主な神経内分泌特徴に対する合理的な標的療法を表わす。
【００９１】
ホルスコリンは、細胞性Ｐｃｓｋ１レベルを増加させることが公知であり、プロホルモンプロセシングを増加させ得る。ホルスコリンを非ＰＷＳのｉＰＳＣ由来ニューロンおよびβ細胞へ適用し、結果は、ＰＣＳＫ１転写レベルが無処理細胞に比較して増加したことを例証する（図３Ｋ〜Ｌ）。ＰＷＳ由来ニューロンおよびβ細胞において研究が遂行されるだろう。
【００９２】
ＰＣＳＫ１転写レベル、ＰＣ１タンパク質レベル、および関連のプロホルモンプロセシングレベルの応答は、インビトロおよびインビボのモデル系において試験されるだろう。本発明者は、段階的なレベルのホルスコリン、テオフィリン、およびホルスコリン＋テオフィリンにより、罹患していない対照および視床下部ｉＰＳＣ由来のニューロンを処理し、ＰＣ１転写物およびタンパク質、ＰＯＭＣ転写物およびタンパク質、ならびにＰＯＭＣのプロセシングされた産物（αＭＳＨ、β−エンドルフィン、およびＡＣＴＨを含む）のタンパク質レベルを測定するだろう。これらのペプチドは、全細胞溶解物中ならびに細胞培地中へ分泌されたレベルにおいて定量されるだろう。ＰＣ１レベルが用量依存的様式で増加され得るかどうかを決定するために、ならびにＰＣ１レベルおよびＰＯＭＣプロセシングを増加させる至適の投薬量範囲を同定するために、細胞は異なる濃度のホルスコリンおよびテオフィリンにより処理されるだろう。他のＰＤＥ４およびアデニル酸シクラーゼの阻害物質もまた、これらのアッセイにおいて試験されるだろう（表１Ａ〜Ｂおよび２を参照）。
【００９３】
バッチＲＮＡシーケンシングおよび／または単一細胞ＲＮＡシーケンシングを実行して、薬理学的治療によって最も影響を受ける他の転写物が同定されるだろう。このアプローチは、インビボ治療でのオフターゲット効果を予測すると期待される。単一細胞ＲＮＡシーケンシングは、ＰＯＭＣ発現ニューロンの治療に続くＰＣＳＫ１転写物増加に関して特に情報を与えるであろう。他のアデニル酸シクラーゼ活性化物質およびＰＤＥ４阻害物質（表１Ａ〜Ｂ、２）が、上記のような同じ研究プロトコールに従って、ｉＰＳＣ由来視床下部ニューロンにおいて試験されるだろう。
【００９４】
本発明者は、罹患していない対照およびＰＷＳ（大きい欠失および最小の欠失）からのｉＰＳＣを、ｉＰＳＣ由来β細胞へ分化させるだろう。本発明者は、ｉＰＳＣ由来β細胞をホルスコリン、テオフィリン、およびホルスコリン＋テオフィリンで処理し、ＰＣ１のレベルを転写レベルおよびタンパク質レベルで測定するだろう。本発明者は、ＩＮＳ転写レベルならびに、全細胞溶解物からのプロインスリン、インスリン、およびｃ−ペプチドのタンパク質レベルならびに、β細胞によって培地の中へ分泌されたタンパク質の濃度も測定するだろう。これらの細胞をヌードマウスの中へ移植して、それらの成熟を可能にし；これらの細胞をインスリンプロセシングについてインビボで試験でき；切除された細胞を記載されるように試験するだろう。本発明者はまた、非糖尿病の非肥満の個体（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｄｏｎｏｒｓ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙを介して利用可能）からのヒトの単離された膵島を使用して、完全に成熟したヒト膵島中のＰＣ１レベルに対するホルスコリン、テオフィリン、およびホルスコリン＋テオフィリンの効果も試験するだろう。
【００９５】
実施例２
Ｓｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウス、Ｐｃ１−／−マウスおよびＰｃ１＋／−マウスにおけるＰＣ１代謝の分子生理学の確認。
アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性化および同時のＰＤＥ阻害によってｃＡＭＰレベルを増加させることは、ＰＷＳのエクスビボおよびインビボのモデルにおいてＰＣ１レベルを増加させ、結果としてＰＷＳのＳｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウスモデルにおけるプロホルモンプロセシングを増加させ得る。Ｓｎｏｒｄ１１６の父性由来の欠失のあるマウス（ＰＷＳのマウスモデル）はＰＣ１の転写物およびタンパク質の低減と関連するプロインスリンからインスリンへのプロセシングが損なわれるので、野生型（ＷＴ）マウスおよびＳｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウスから膵島を単離し、ホルスコリン、テオフィリン、およびホルスコリン＋テオフィリンへのこれらの細胞の応答が分析されるだろう。同じ操作および測定がｉＰＳＣ由来β細胞について実行されるだろう。単離された膵島でＳｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウスからのプロインスリンプロセシングが、ＷＴ同腹仔に比較して救済され得るならば、次いで、ホルスコリン、テオフィリン、およびホルスコリン＋テオフィリンで処理されたＳｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウスでのプロインスリンプロセシング救済の調査が、インビボで遂行されるだろう。
【００９６】
本結果は、Ｓｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウスが、膵島での低減されたＰＣ１およびＰＣ２の含有量と関連するインスリンへのプロインスリンのプロセシングの低減を有することを例証する（図３Ｅ〜Ｇ）。さらに、プログレリンのプロセシングも、ＷＴ同腹仔に比較して、Ｓｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウスの胃で損なわれ、Ｓｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウスの視床下部でのＧＨＲＨへのプロＧＨＲＨのプロセシングも同様である（図３Ｉ〜Ｊ）。さらに、プロインスリン対インスリンの比は、年齢およびＢＭＩの一致した対照に比較して、ＰＷＳに罹患した絶食個体で上昇し、インスリンへのプロインスリンのプロセシングにおける欠陥を示唆する（図３Ｈ）。
【００９７】
Ｐｃ１ヌルマウスおよびヘテロ接合マウスから単離された膵島は、損なわれたプロインスリンプロセシングについての対照ならびに薬理学的治療への予測される陰性応答として含まれるだろう。末梢レベルのグルコース、プロインスリン、インスリン、およびｃ−ペプチドは、絶食時に、ならびに腹腔内グルコース注射後１５、３０、６０および１２０分で測定されるだろう。プロインスリンのプロセシングの末梢測定の前のＳｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウスおよびＷＴマウスにおける薬理学的治療の至適の継続時間は、経験的に確立されるだろう。Ｐｃ１ヌルマウスおよびヘテロ接合マウスは、インビボ実験において、損なわれたプロインスリンプロセシングについての対照として同様に含まれるだろう。試験についての最初の期間は３日、１週間、および１か月であるだろう。薬物送達の複数の方法も試験されるだろう。
【００９８】
プログレリンおよび成熟したグレリンを識別でき、したがって血中循環におけるプログレリンのプロセシングの測定に使用され得るアッセイが、ヒトおよびマウスの両方について開発されるだろう。Ｓｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋動物、ＰＣ１ヌル動物、ＰＣ１ヘテロ接合動物、およびＷＴ動物において、上で記載されるインビボの薬理学的治療に続いて、プログレリンのプロセシングが測定されるだろう。
【００９９】
ホルスコリン、テオフィリン、およびホルスコリン＋テオフィリンで処理したＳｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウス、ＷＴマウス、ならびにＰｃ１ヌルマウスおよびＰｃ１のヘテロ接合マウスの視床下部、およびＰＣ１、ＰＯＭＣ、αＭＳＨ、β−エンドルフィン、およびＡＣＴＨのタンパク質レベルの測定は、インビボの処理がＰＣ１およびＰＯＭＣのプロセシングのレベルに影響し得るかどうかを評価するために分析されるだろう。
【０１００】
Ｓｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋動物は発育不全でありかつ肥満を発症しないので、ＰＯＭＣプロセシングが評価される主要なモデルは、そこでＮＨＬＨ２およびＰＣ１のより極端なダウンレギュレーションが観察される、ｉＰＳＣ由来ヒトニューロンである。しかしながら、これらの薬理作用剤へのＰＣ１およびＰＯＭＣの応答は、若いＷＴ  ＰＯＭＣ−ＧＦＰマウスからの初代ニューロンにおいても分析され得る。ＰＯＭＣを発現するニューロンは、ＰＯＭＣニューロンがＧＦＰを発現するマウスを使用して特異的に単離できる。本発明者は、損なわれたＰＯＭＣプロセシングについての対照としてＰｃｓｋ１をノックダウンするだろう。本発明者は、ｓｉＲＮＡまたは２−Ｏ−メチル修飾アンチセンスオリゴベースのアプローチを使用して、Ｓｎｏｒｄ１１６の特異的なアイソフォームをインビトロでノックダウンすることも試みるだろう。ｓｉＲＮＡは、細胞質ＲＮＡをノックダウンするのに一般的に使用される低分子二本鎖干渉ＲＮＡであり、一方で２−Ｏ−メチル修飾アンチセンスオリゴは、核小体中で典型的に見出されるｓｎｏＲＮＡｓをノックダウンするのに使用される（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。本発明者は次いで、ＰＣ１レベルおよびＰＯＭＣプロセシングレベルを測定し、Ｓｎｏｒｄ１１６がＷＴに比べてノックダウンされた初代マウスニューロンにおいて薬理学的治療がＰＣ１のレベルを増加させＰＯＭＣプロセシングを増加させることができるかどうかを調査するだろう。
【０１０１】
加えて、ＳＮＯＲＤ１１６のコンディショナルハイポモルフ対立遺伝子を備えたマウスが得られるかまたは作成されるだろう。かかる対立遺伝子を備えた成体動物は、特異的なプロモーター（例えばＰＯＭＣについての）によって駆動されるものを含む、好適なｃｒｅ発現コンストラクトの導入によって、特異的な視床下部核（例えば弓状核）においてＳｎｏｒｄ１１６を鋭敏に低減させるだろう。このアプローチは、マウスでのＳｎｏｒｄ１１６ハイポモルフィズムの体細胞発生効果（発育の妨げ）を回避するだろう。
【０１０２】
シクラーゼ活性化物質および／またはホスホジエステラーゼ阻害薬の効果＝試験された少なくとも１つのモデル：ＰＷＳのｉＰＳＣ由来ニューロン、ＰＷＳのｉＰＳＣ由来β細胞、Ｓｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋の単離された膵島、をＳｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋の血中循環プロホルモン、またはＳｎｏｒｄ１１６ノックダウン初代ニューロンでの関連のプロホルモンプロセシングにおける５０％以上の増加。これらの表現型は、影響される細胞での関連する転写物および／またはタンパク質における増加が付随するだろう。
【０１０３】
シクラーゼ活性化
ホルスコリンを様々な細胞モデルへ適用し、結果は、ホルスコリンがＰＣＳＫ１転写レベルおよびＰＣ１タンパク質レベルをしっかりと確実に増加させ、かつプロホルモンプロセシングを機能的に増加させることを例証する。ＰＣＳＫ１／Ｐｃｓｋ１転写レベルは、１０μＭのホルスコリンへ曝露されたｉＰＳＣ由来ニューロンおよび初代マウスニューロンにおいて２〜３倍の間に増加した（図５Ａ、Ｃ、Ｄ）。
【０１０４】
環状ＡＭＰ濃度は１０μＭのホルスコリンへ曝露されたｉＰＳＣ由来視床下部ＡＲＣニューロンにおいて約８．５倍増加し、このことは、ホルスコリンの適用が細胞性ｃＡＭＰレベルを上昇させることによってＰＣＳＫ１転写レベルを増加させ、それが今度はＰＣＳＫ１のｃＡＭＰ応答エレメントプロモーターを活性化するという推論を支持する。図５Ａは、初代前脳ニューロンを野生型マウスの妊娠日１９．５（Ｅ１９．５）胚から単離し、７２時間培養したことを示すグラフである。続いて、細胞を、１０μＭのホルスコリンまたはそのベヒクルであるジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のいずれかへ２０時間曝露した。Ｐｃｓｋ１転写物は、ホルスコリンへ曝露された初代ニューロンにおいて約２．５倍増加した。図５Ｂは、分化の３７日目（Ｄ３７）の罹患していない対照視床下部の弓様（ａｒｃｕａｔｅ−ｌｉｋｅ）（ＡＲＣ）ニューロン（Ｈｅｓ  Ｎｋｘ２−１  ｈＥＳＣ株）を１０μＭのホルスコリンまたはベヒクルにより３０分間処理したことを示すグラフである。環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）レベルは、ホルスコリンへ曝露された細胞において約８．５倍増加した。図５Ｃは、分化の３０日目の罹患していない対照視床下部のｉＰＳＣ由来ニューロン（１０２３Ａ株）の、段階的な濃度のホルスコリンへの曝露は、ＰＣＳＫ１転写レベルにおいて用量依存的応答を惹起することを示すグラフである。図５Ｄは、ｉＰＳＣ由来ニューロン（１０４３Ｄ３株）の、複数の時間間隔での１０μＭのホルスコリンへの曝露は、ＰＣＳＫ１が１時間の曝露のみの後では有意にアップレギュレートされないが、４および１８時間の曝露によって有意にアップレギュレートされることを明らかにすることを示すグラフである。４時間の曝露は、試験されたタイムポイントのアップレギュレーションにおいて最大の増加（約２．５倍）をもたらした。図５Ｅ〜Ｆは、分化の３０日目の罹患していない対照（１０２３Ａ）のｉＰＳＣ由来視床下部ＡＲＣニューロンの、段階的な濃度のホルスコリンによる処理は、β−エンドルフィン（βＥＰ）およびα−メラニン細胞刺激ホルモン（αＭＳＨ）の両方へのＰＯＭＣプロセシングにおける用量依存的増加を同定することを示すグラフである。図５Ｇ〜Ｈは、成体（８〜１２週齢）ＷＴマウスから単離された膵島の、複数の濃度のホルスコリンによる処理は、それぞれ２５および５０μＭのホルスコリン濃度でのＰＣ１（しかしＰＣ２ではない）タンパク質レベルのアップレギュレーションを示すことを示すグラフである。
【０１０５】
ホルスコリンによる処理は、転写レベルを上昇させただけでなく、β−エンドルフィンおよびαＭＳＨの両方へのＰＯＭＣプロセシングが増加されたという機能的結果も有した（図５Ｅ〜Ｆ）。さらに、野生型マウスから単離された膵島へのホルスコリンの適用は、ＰＣ１タンパク質レベルにおける約３倍の増加をもたらした（図５Ｇ）。ＰＣ２タンパク質レベルは影響されなかった（図５Ｈ）。総合すると、これらの結果は、３つの分離したモデル系：ｉＰＳＣ由来ニューロン、初代ニューロン、および単離された膵島において、ホルスコリンに応答してＰＣ１レベルが増加することを示す。さらに、ホルスコリン誘導性のＰＣ１の上昇は機能的に重要であり、プロホルモンプロセシングのレベルの増加を生じる。
【０１０６】
ホスホジエステラーゼ阻害
ＰＤＥ阻害物質もｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて試験され、ホスホジエステラーゼの阻害もまたＰＣＳＫ１の転写を増加させ得ることが見出された。しかしながら、ＰＣＳＫ１転写レベルに対するＰＤＥ阻害の効果量は、ホルスコリンによるＡＣアゴニズムによって誘導されたものよりも低い。テオフィリン（１０ｍＭ）およびロフルミラスト（１ｍＭ）の両方は、単一薬剤としてＰＣＳＫ１転写を増加させ、一方でＭＫ０９５２はこれまでに、インビトロでホルスコリンと組み合わせたときだけＰＣＳＫ１転写を増加させることが見出されている（図６Ａ〜Ｃ、Ｆ）。ホルスコリンおよびロフルミラストによる組み合わせ処理は、これらの薬剤が、いずれかの薬剤が単独で与えられる場合よりも低い濃度で（１μＭのホルスコリン、１００ｎＭのロフルミラスト）、ＰＣＳＫ１転写を誘導しおよび増加させる相加的な（おそらく相乗的な）様式で、一緒に作動し得ることを実証する（図６Ｄ）。この場合もまた、ホルスコリンおよびロフルミラストによる組み合わせ処理に起因するＰＣＳＫ１転写の増加が、ＰＯＭＣからＡＣＴＨへのプロホルモンのプロセシングも増加させる（図６Ｅ）。具体的には、単離されたマウス膵島における段階的な濃度のホルスコリンによる試験は、２５μＭおよび５０μＭの濃度で、ＰＣ１タンパク質の３倍のアップレギュレーションを示した。ＰＣ２タンパク質レベルにおける変化は、ホルスコリン適用に応答して観察されなかった。本発明者は、Ｅ１９．５マウスから単離された初代マウスニューロンへ適用された１０μＭのホルスコリンは、Ｐｃｓｋ１転写レベルを約２倍増加させることも見出した。
【０１０７】
ＭＫ０９５２
ＰＷＳ患者を最も限定する表現型は過食症であり、それは、中枢神経系、特に視床下部において起こるプロセスによって媒介される可能性が最も高い。したがって、過食症を寛解することを目的とする薬剤は、血液脳関門を透過できなければならない。ＭＫ０９５２は、限定的な全血液活性（ＩＣ５０＝５５５ｎＭ）を備えた、内因的に強力な（ＩＣ５０＝０．６ｎＭ）脳透過ＰＤＥ４阻害物質である（Ｍ．Ｇａｌｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。本明細書において記載されるように、ＭＫ０９５２は、現在のところＰＤＥ阻害リード候補である。
【０１０８】
ＭＫ０９５２の予備的なインビボ試験を野生型マウスにおいて遂行した。１０ｍｇ／ｋｇ体重でのＭＫ０９５２の単一投与は、視床下部のＰｃｓｋ１転写レベルの２５％の増加をもたらす（図７Ａ）。２５ｍｇ／ｋｇでのホルスコリンの投与は、視床下部のＰｃｓｋ１転写レベルの増加をもたらさなかった。１０ｍｇ／ｋｇでのＭＫ０９５２および２５ｍｇ／ｋｇでのホルスコリンの共投与は、この場合もやはり視床下部のＰｃｓｋ１レベルの約２５％の増加を誘導し、この増加が主としてＭＫ０９５２の作用に起因することを示唆した（図７Ｂ）。本発明者はまた、血中循環ｃＡＭＰレベル、皮質プロＢＤＮＦ／ＢＤＮＦ、小脳Ｐｃｓｋ１、胃Ｐｃｓｋ１および胃プログレリン／グレリン、血中循環プロインスリンおよびインスリン濃度（およびそれらの比）、ならびに最終的にこれらの動物からの肺Ｐｃｓｋ１転写物およびｃＡＭＰレベルも分析するだろう。
【０１０９】
第１のインビボ研究を、約４時間絶食した野生型マウスへＭＫ０９５２を経口強制投与によって投与し一方でホルスコリンを腹腔内に１回投与して、完了した。Ｐｃｓｋ１の視床下部の転写レベルは、単一の薬剤としての１０ｍｇ／ｋｇのＭＫ０９５２、または１０ｍｇ／ｋｇのＭＫ０９５２および２５ｍｇ／ｋｇのホルスコリンの両方のいずれかの投与に続いて、約２５％アップレギュレートされた。しかしながら、２５ｍｇ／ｋｇのホルスコリンのみの投与は視床下部のＰｃｓｋ１のアップレギュレーションをもたらさず、この用量でホルスコリンが、Ｐｃｓｋ１転写に影響するのに十分な量で視床下部にアクセスできないことを示唆する。これはまた、２５ｍｇ／ｋｇのホルスコリンおよび１０ｍｇ／ｋｇのＭＫ０９５２の両方の投与に続く視床下部でのＰｃｓｋ１の増加が主として、視床下部におけるＭＫ０９５２の作用に起因したことも示唆する。この差異は、ＭＫ０９５２のより高いＣＮＳ透過性を反映し、ＰＷＳの治療法とのシクラーゼ活性化物質の一般的な関連ではない可能性が高い。プロインシュリン：インシュリンの血中循環比における変化は、ＭＫ０９５２またはホルスコリンの投与に続いて検出されなかった。インスリンへのプロインスリンのプロセシングはＷＴ動物において既にかなり効率的であるので、それが絶食時にさらに増加することは結果的にありそうにない。しかしながら、これらの「ベースライン」データは、ＷＴマウスおよびＳｎｏｒｄ１１６ｐ−／ｍ＋マウスの両方において、３ｍｇ／ｋｇでのグルコースの腹腔内グルコース負荷試験の設定下でインスリンへのプロインスリンのプロセシングを評価するために依然として有益である。加えて、血中循環ｃＡＭＰレベル、皮質プロＢＤＮＦ／ＢＤＮＦ、小脳Ｐｃｓｋ１、胃Ｐｃｓｋ１および胃プログレリン／グレリン、ならびに最終的に肺Ｐｃｓｋ１転写物およびｃＡＭＰレベルの測定のために、サンプルを収集した。
【０１１０】
実施例３
プラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）に罹患した患者における化合物の臨床試験
ＰＷＳに罹患した個体について提案された臨床試験の予備的なデザインは、プロ転換酵素１（ＰＣ１）の発現が、ＰＷＳに罹患した個体のニューロンにおいて減少するという仮説に基づく（Ｂｕｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。アデニル酸シクラーゼアゴニストおよびＰＤＥ４阻害物質への実験的なインビトロおよびインビボでの曝露は、ヒト幹細胞由来ニューロンおよび齧歯類前脳ニューロンならびにヒト線維芽細胞において、ＰＣ１の発現および活性のアップレギュレーションを引き起こす。これらの薬物の投与は、活性なホルモンへの関与するプロホルモンの変換を増加するであろうことが予想される。
【０１１１】
臨床試験は、以下のように、ＰＣ１の活性の促進における薬物の有効性に焦点を当て、それを例証するだろう。
１．ＰＷＳの行動表現型および内分泌表現型に対する候補治療剤の効果を例証する。
２．かかる薬剤の臨床上の安全性プロファイルをモニタリングする。
【０１１２】
試験デザイン：
臨床試験はクロスオーバー試験デザインを利用するだろう（Ｃｌｅｏｐｈａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００６、Ｗｅｌｌｅｋ  ａｎｄ  Ｂｌｅｔｔｎｅｒ  ２０１２、およびＬｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８４）。このデザインは、小さなコホート中の被験体間の変動を考慮して治療効果を評価する検出力を提供する（図８Ａ）。２つの治療選択肢の間のウォッシュアウト期間はキャリーオーバー効果を軽減し；研究の短い継続期間は「時間効果」（経時的な疾患プロセスにおける変化に対する効果）を最小限にするだろう。
【０１１３】
包含基準＊：
１．遺伝的に証明されたＰＷの診断
２．年齢が＞１８歳
＊組み換え成長ホルモン療法は差し支えない。
【０１１４】
除外基準：
１．重症の精神障害
２．医薬物の服用に非協力的
３．全身疾患、例えば炎症性腸疾患のような重篤な胃腸病、心臓疾患、特に律動障害、糖尿病の診断、肝疾患もしくは肝不全、または腎疾患もしくは腎不全。
４．ヘモグロビン＜１０ｇｍ／ｄＬとして定義される貧血
５．標的薬物との相互作用の可能性がある薬物（例えばＰＤＥ４阻害物質は、抗痙攣医薬物、シメチジン、オメプラゾール、抗生物質などと相互作用する）を用いる患者。これらの薬物の多くは肝酵素活性を変更し、ＰＤＥ４阻害物質の代謝を妨害し得る。除外薬物の完全なリストは、同定された治療剤の薬物動態学的特性および薬物動力学的特性に基づくだろう。
【０１１５】
組入れ：被験体の組入れは、ＰＷＳ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＦＰＷＲおよびＰＷＳＡ）、患者サポートグループおよびＰＷＳに罹患した小児をケアする臨床医による協力によって容易にされるだろう。電話スクリーニングは、スクリーニングのための来院に招聘される可能性のある適格な被験体を同定するだろう。
【０１１６】
研究は４〜６週間の間続き、以下の来院からなるだろう。
【０１１７】
１．スクリーニングのための来院：この来院で、医療記録、医薬物および理学的検査の完全な精査が、研究室測定のスクリーニング（薬物レベルを除き安全性プロファイルと同じ、図８Ｂからの）と一緒に遂行されるだろう。被験体に馴らし期間の間に１週間偽薬を提供して、コンプライアンスを評価するだろう。これは短い外来患者の来院（約３時間）であるだろう。他のすべての試験来院は、６〜８時間の長さの短期入院患者の滞在であるだろう。
【０１１８】
２．ベースライン来院（図８Ａからのｔ１およびｔ３）：馴らし期間をうまく完了した被験体は、試験に参加するように招聘されるだろう。適格な被験体はＡＰ群またはＰＡ群のいずれかへの無作為化されるだろう（図８Ａ）。被験体は来院のために＞８時間絶食することが推奨されるだろう。身体的なプロファイリングとしては、身長、体重、体脂肪測定、バイタルサイン、安静時エネルギー消費量および全身理学的検査が挙げられるだろう。完全な脳下垂体プロファイル（ＡＣＴＨ、コルチゾール、ＦＳＨ／ＬＨ、エストロゲン／テストステロン、ＴＳＨ／遊離Ｔ４、ＧＨ、ＩＧＦ−１、ＩＧＦＢＰ３を含む）が実施されるだろう。被験体は標準化された食事による混合食負荷試験（ＭＭＴＴ）を受け、血液測定は、０、３０、６０、９０、１２０および１８０分間で留置静脈内カテーテルから得られるだろう（図８Ｂ）。
【０１１９】
第一監視者は、過食症に関連する質問票（Ｄｙｋｅｎｓまたは修飾Ｄｙｋｅｎｓ）を完了し、行動評価がオキシトシン試験質問票（２５〜２８）を使用して遂行されるだろう。これに加えて、彼らは、少なくとも１つの週末を含む別々の３日についての食事頻度質問票を完了するだろう。来院は６〜８時間続くと予想される。１週間の間の試験医薬物は介護者の指示により分配されるだろう。
【０１２０】
３．フォローアップ来院（図１からのｔ２およびｔ４）：被験体は、試験医薬物の開始後１週間でフォローアップ来院のために戻るだろう。上記の測定がこの来院で反復され、医薬物カウントが毒性の評価のために計画された質問票と共に得られるだろう。これらの来院の各々は６〜８時間であるだろう。１〜２週間のウォッシュアウト期間が試験の第２相の前に与えられるだろう。
【０１２１】
転帰尺度：
１．標準的な食事に応答するホルモンプロファイル：プロホルモンの変換（インスリンへのプロインスリンなど等）に対するＰＣ１の効果に基づいて、薬物の投与は、プロホルモン：ホルモン（例えばプロインスリン：インスリン）の比の増加を引き起こすだろうことが予想される（Ｂｕｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。これは標準的なＭＭＴＴへのホルモン応答性によって試験されるだろう。ＭＭＴＴは、流動食（６ｃｃ／ｋｇのブーストまたは等価物から最大３６０ｃｃへ）を投与し、続いてインスリン、プロインスリン、ＰＯＭＣプロホルモン、ＡＣＴＨ、ＡｇＲＰ、プログルカゴン、グルカゴン、ＧＬＰ１、オキシトシン（およびプロペプチド）、グレリン、プログレリン、遊離脂肪酸、およびグルコースを周期的に測定することによって遂行される。ＭＭＴＴはＰＷＳに罹患した被験体の臨床試験において検証されている（Ｐ．Ｇｕｍｕｓ  Ｂａｌｉｋｃｉｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。
【０１２２】
薬物の投与の前に得られた値に比べて、インスリン放出の絶対的な増加、プロインシュリン放出の減少およびインスリン／プロインスリン比の増加があるだろうことが予想される。すべては２５％の範囲である。グルコース濃度が１５〜２０減少しおよび遊離脂肪酸が同様に減少するであろうことも予想される。ＭＭＴの前に得られた血漿において、ＰＯＭＣが増加し、ＡｇＲＰが約２５％低減することが予想される。オキシトシンも１５〜２０％増加しているだろう。プログレリン／グレリン比が低減するであろうことも予想される。髄液も、これらの被験体において同様に検査研究され得るが、食事と関連して評価されないだろう。以下の構成要素：ｐｏｍｃプロホルモン、βエンドルフィン、αｍｓｈ、ＡｇＲＰおよびオキシトシンがアッセイされ、薬物が、無治療の被験体に比較して、ｐｏｍｃプロホルモンを低減し、βエンドルフィン、αｍｓｈおよびオキシトシンを増加し、ＡｇＲＰを低減するだろうと予想される。
【０１２３】
２．薬理メタボロミクスプロファイル：メタボロミクスプロファイリングは、代謝表現型に対する薬物の効果を理解する追加の機会を提供する。薬物による処理の前後で試験被験体のメタボロミクスプロファイルを実行して、ａ）目的の経路（すなわちインスリン代謝経路など）における治療への応答についてのバイオマーカーを同定する、ｂ）異なる個体で選択的にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる経路の同定によって、治療における個体差を同定する、およびｃ）確立されたより大きな分子プロファイリングの標準的な研究によって明らかでない、経路ベースの分析を使用して、副作用または毒性のプロファイルを同定するだろう（Ｒ．Ｋａｄｄｕｒａｈ−Ｄａｏｕｋ，Ｒ．Ｗｅｉｎｓｈｉｌｂｏｕｍ，Ｎ．２０１５；Ｒ．Ｄ．Ｂｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。
【０１２４】
３．過食症関連行動の変化：Ｄｙｋｅｎｓ（および修飾Ｄｙｋｅｎｓ）質問票は、空腹についての行動、重症度および衝動を評価する。これらの転帰に加えて、オキシトシン行動質問票は、摂食と関連する社会的行動および情動行動を評価するだろう。これらの転帰に食事頻度質問票の分析が補足されるだろう。治療が行動および／または感情状態も改善するであろうことが予想される。
【０１２５】
サンプルサイズ：パイロットサンプルサイズの６名の被験体がこの研究のために組入れられるだろう。目的の転帰を検出するこのサンプルサイズの検出力は、動物モデルにおけるインビボのホルモンプロファイリングまたは薬理メタボロミクスプロファイリングによって確認される効果量に依存するだろう。図８Ｃ中で反映されるように、６名の被験体のコホート中で有意な変化を検出するために約１．４７の効果量が要求されるだろう。効果量は、変化の標準偏差によって割った、活性薬物に比較した偽薬による観察の平均値の差として計算される。各々の被験体が彼／彼女自身の対照として供されるので、クロスオーバー試験デザインはばらつきを限定し、類似の並行群試験デザインについて被験体の１／４で検出力に達することを可能にする。
【０１２６】
追加の試験情報：
１．ＰＷＳに罹患した小児における以前の試験および高い効果量を達成する必要性に基づいて、標準的な混合食を試験のために選択した。
２．試験は、Ｉｒｖｉｎｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈの外来患者施設において遂行されるだろう。
３．試験についてのＩＲＢプロトコールは、適切なＰＤＥ阻害物質および／またはシクラーゼ活性化物質に関して準備されるだろう。
４．メタボロミクスプロファイリングは、もしこの予備的研究で得られるのであれば、Ｈｏｒｍｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  Ｃｏｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて遂行されるだろう。
【０１２７】
実施例４
プラダー・ウィリー症候群を治療する方法（内在性および外来性のＭＣ４Ｒアゴニズムの組み合わせ療法）。
ＰＷＳに罹患した個体は、細胞性ｃＡＭＰ産生のレベルを上昇させることおよび／またはその分解を遮断することを介してＰＣ１産生を増加することによりプロセシングされたホルモンの内在性レベルを増加する薬剤を使用して、治療されるだろう。
【０１２８】
弓状核において、ＰＯＭＣはプロ転換酵素１（ＰＣ１）によってαＭＳＨへプロセシングされる（Ｓ．Ｌ．Ｗａｒｄｌａｗ  ２０１１）。αＭＳＨはメラノコルチン４受容体（ＭＣ４Ｒ）の内在性リガンドである。ＰＯＭＣ、ＰＣＳＫ１（ＰＣＳＫ１の遺伝子産物はＰＣ１である）、またはＭＣ４Ｒで不活性化突然変異のあるヒトおよびマウスは、過食かつ肥満である（Ｃ．Ｖａｉｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。ＭＣ４Ｒ中の突然変異は、ヒトにおける肥満の最も一般的な単一遺伝子の原因である（Ｒ．Ｊ．Ｌｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。ＡｇＲＰも弓状核において産生され、ＭＣ４Ｒでのインバースアゴニストである。プロＡｇＲＰは、ＰＣ１によってＡｇＲＰへプロセシングされる（Ｓ．Ｌ．Ｗａｒｄｌａｗ  ２０１１）。
【０１２９】
ＰＣ１産生の増加が、ＭＣ４Ｒで逆の効果を有する、αＭＳＨおよびＡｇＲＰの両方の産生を増加する可能性がある（図４）。小分子またはペプチドベースのＭＣ４Ｒアゴニストの使用は、ＭＣ４Ｒをアゴナイズする薬剤の細胞外プールが、ＭＣ４Ｒをアンタゴナイズするものより多いことを保証することを支援し得る（図４、表３）。このことは、食欲不振誘発性の応答に向かってＭＣ４Ｒでのシグナリングを押し進めることが予想されるだろう（図４）。ＡｇＲＰへ結合しＭＣ４Ｒでのその効果を遮断する薬剤も、この設定における有用なストラテジーであり得る（表３）（Ｅ．Ｃ．Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ  Ｃａｒｐｉｎｏ  ２０１６）。表３中で言及されない同様に作用する化合物も有用であり得る。このストラテジーは、ＰＷＳを治療するためだけでなく、他の形態の単一遺伝子性／症候群性の肥満ならびに一般的な肥満の治療にも有効であり得る。
【表３】
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【０１３０】
要約／結論
ＰＣ１をコードする遺伝子（ＰＣＳＫ１）はＰＷＳの細胞ベースのモデルおよび動物モデルにおいてダウンレギュレートされるが、遺伝子自体はインタクトであり、したがって薬理学的操作を受け得る。本データは、ＰＣＳＫ１／ＰＣ１の細胞性レベルを薬理学的に操作するための進行中の前臨床試験の結果を提供する。インビトロ実験は、アデニリルシクラーゼアゴニストであるホルスコリンの適用がヒト幹細胞由来ニューロン、マウス初代神経細胞においてＰＣＳＫ１発現をしっかりと確実にアップレギュレートし、かつマウス単離膵島においてＰＣ１タンパク質レベルを増加させることを実証する。さらに、ホルスコリン治療は、幹細胞由来視床下部のニューロンにおけるＰＯＭＣプロホルモンプロセシングも増加させる。幹細胞ニューロンへのＰＤＥ阻害物質のテオフィリンおよびロフルミラストの適用は、単一薬剤として、およびホルスコリンと組み合わせて、いずれもＰＣＳＫ１転写レベルを増加させる。ロフルミラストおよびホルスコリンの組み合わせ治療は、幹細胞視床下部のニューロンにおいてＰＯＭＣプロホルモンプロセシング（食欲不振誘発性のペプチドへの）も相加的に増加させる。ホルスコリンおよびＭＫ０９５２（クラス４  ＰＤＥ阻害物質）の両方による幹細胞由来ニューロンの処理は、ＰＣＳＫ１  ｍＲＮＡを増加させる。最後に、１０ｍｇ／ｋｇのＭＫ０９５２の単一経口用量は、野生型マウスにおいて視床下部のＰｃｓｋ１転写レベルを２５％増加させる。インビボでのＭＫ０９５２のより長い適用は、野生型マウスおよび父性由来のＳｎｏｒｄ１１６についてのハイポモルフマウスの両方において、次に試験されるだろう。加えて、本発明者は、Ａｎｄｒｅａ  Ｈａｑｑおよび共同研究者と共同研究して、ＰＷＳに罹患した個体および一致する対照において血中循環プロホルモンおよびプロセシングされたホルモンレベル（例えばプロインスリン、ＰＯＭＣ、プロオキシトシン、プロＢＤＮＦ）を測定するだろう。
【０１３１】
ＰＷＳに罹患した個体における、ＭＫ０９５２および他の候補化合物の予備的臨床試験のためのプロトコールも提供される。この臨床試験の主な目的は、ＰＷＳ被験体においてこれらの薬剤の臨床上の安全性プロファイルをモニタリングすることならびに、行動および神経内分泌のエンドポイントを測定して予備的な有効性を評価することであろう。
【０１３２】
参照文献：
Ｃｏｎｋｒｉｇｈｔ，  Ｍ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＣＲＥＢ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｈｏｒｔ  Ａｒｔｉｃｌｅ  Ｇｅｎｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ａ  Ｃｏｒｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃＡＭＰ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １１，  １１０１−１１０８  （２００３）．
Ｕｄｕｐｉ，  Ｖ．，  Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，  Ｃ．  Ｍ．  ＆  Ｇｒｅｅｌｅｙ，  Ｇ．  Ｈ．  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅ  Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ−１  ｍＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．  ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＮＤ  ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡＬ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ  ２４６，  ４６３−４６５  （１９９８）．
Ｔａｎｇ，  Ｗ．−Ｊ．  ＆  Ｈｕｒｌｅｙ，  Ｊ．  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５４，  ２３１−２４０  （１９９８）．
Ｔｅｓｍｅｒ，  Ｊ．  Ｊ．  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｗｏ−Ｍｅｔａｌ−Ｉｏｎ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，  ７５６−７６０  （１９９９）．
Ｏｎｄａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，  ４７７８５−４７７９３，  ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１０７２３３２００  （２００１）．
Ｌｉａｎｇ，  Ｘ．  Ｈ．，  Ｖｉｃｋｅｒｓ，  Ｔ．  Ａ．，  Ｇｕｏ，  Ｓ．  ＆  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．  Ｔ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９，  ｅ１３，  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ１１２１  （２０１１）．
Ｓｕｎａｈａｒａ，  Ｒ．  Ｋ．  ＆  Ｔａｕｓｓｉｇ，  Ｒ．  Ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅ：  Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ  ２，  １６８−１８４  （２００２）．
Ｓ．  Ｌ．  Ｗａｒｄｌａｗ，  Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｐｒｏｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｅｒｇｙ  ｂａｌａｎｃｅ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ６６０，  ２１３−２１９  （２０１１）．
Ｃ．  Ｖａｉｓｓｅ，  Ｋ．  Ｃｌｅｍｅｎｔ，  Ｂ．  Ｇｕｙ−Ｇｒａｎｄ，  Ｐ．  Ｆｒｏｇｕｅｌ，  Ａ  ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＭＣ４Ｒ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０，  １１３−１１４  （１９９８）．
Ｒ．  Ｊ．  Ｌｏｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｍｏｎ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｎｅａｒ  ＭＣ４Ｒ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆａｔ  ｍａｓｓ，  ｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４０，  ７６８−７７５  （２００８）．
Ｅ．  Ｃ．  Ｌｅｅ，  Ｐ．  Ａ．  Ｃａｒｐｉｎｏ，  Ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ−４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ：  ａ  ｐａｔｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  （２００８−２０１４）．  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｔ  ４，  ９５−１０７  （２０１６）．
Ｆｉｍｉａ  ＧＭ，  Ｓａｓｓｏｎｅ−Ｃｏｒｓｉ  Ｐ．  ２００１．  Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１４：  １９７１−１９７２．
Ｌ．  Ｃ．  Ｂｕｒｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ＰＣ１  ｉｍｐａｉｒｓ  ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２７，  ２９３−３０５  （２０１７）．
Ｆ．  Ｄ．  Ｐ．  Ｄｅｂｏｒａｈ  Ｊ．  Ｇｏｏｄ，  Ｋａｔｈｌｅｅｎ  Ａ．  Ｍａｈｏｎ，  Ａｌｂｅｒｔ  Ｆ．  Ｐａｒｌｏｗ，  Ｈｅｉｎｅｒ  Ｗｅｓｔｐｈａｌ，  Ｉｌａｎ  Ｒ．  Ｋｉｒｓｃｈ，  Ｈｙｐｏｇｏｎａｄｉｓｍ  ａｎｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｈｌｈ２  ｇｅｎｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５，  ３９７−４０１  （１９９７）．
Ｄ．  Ｌ．  Ｆｏｘ，  Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ａｍｈｅｒｓｔ，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  ＭＩ  （２００７）．
Ｐ．  Ｓｔｉｊｎｅｎ，  Ｂ．  Ｒａｍｏｓ−Ｍｏｌｉｎａ，  Ｓ．  Ｏ’Ｒａｈｉｌｙ，  Ｊ．  Ｗ．  Ｍ．  Ｃｒｅｅｍｅｒｓ，  ＰＣＳＫ１  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ：  ｆｒｏｍ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｔｏ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １７，    （２０１６）．
Ｍ．  Ｄ．  Ｃｏｎｋｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＣＲＥＢ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｈｏｒｔ  Ａｒｔｉｃｌｅ  Ｇｅｎｅｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  Ａ  Ｃｏｒｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃＡＭＰ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １１，  １１０１−１１０８  （２００３）．
Ｖ．  Ｕｄｕｐｉ，  Ｃ．  Ｍ．  Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，  Ｇ．  Ｈ．  Ｇｒｅｅｌｅｙ，  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅ  Ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ−１  ｍＲＮＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２４６，  ４６３−４６５  （１９９８）．
Ｗ．−Ｊ．  Ｔａｎｇ，  Ｊ．  Ｈｕｒｌｅｙ，  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５４，  ２３１−２４０  （１９９８）．
Ｊ．  Ｊ．  Ｇ．  Ｔｅｓｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｗｏ−Ｍｅｔａｌ−Ｉｏｎ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ａｄｅｎｙｌｙｌ  Ｃｙｃｌａｓｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５，  ７５６−７６０  （１９９９）．
Ｔ．  Ｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｙｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６，  ４７７８５−４７７９３  （２００１）．
Ｍ．  Ｇａｌｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＭＫ−０９５２，  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＤＥ４  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｍｅｍｏｒｙ  ｌｏｓｓ  ａｎｄ  ｍｉｌｄ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ．  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０，  ６３８７−６３９３  （２０１０）．
Ｑ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｇ．  Ｊ．  Ｂｏｕｍａ，  Ｋ．  ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，  Ｓ．  Ｔｏｂｅｔ，  Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｎｏＲＮＡ  Ｓｎｏｒｄ１１６  ｉｓ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌｉｎｋ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ  ａｎｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｏｆ  Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｄｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３０，  ４７９−４８５  （２０１２）．
Ｙ．  Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｎｏｒｄ１１６  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｏｄ  ｉｎｔａｋｅ  ａｎｄ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ６，  １８６１４  （２０１６）．
Ｌ．  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ−ｌｉｋｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２５，  ７９６−８０８  （２０１５）．
Ｖ．  Ｇｒｉｎｅｖｉｃｈ，  Ｍ．  Ｇ．  Ｄｅｓａｒｍｅｎｉｅｎ，  Ｂ．  Ｃｈｉｎｉ，  Ｍ．  Ｔａｕｂｅｒ，  Ｆ．  Ｍｕｓｃａｔｅｌｌｉ，  Ｏｎｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｘｙｔｏｃｉｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｂｒａｉｎ：  ｌａｔｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｓｙｃｈｏｓｏｃｉａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｎｅｕｒｏａｎａｔ  ８，  １６４  （２０１４）．
Ｍ．  Ｔａｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｏｘｙｔｏｃｉｎ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  Ｆｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｓｋｉｌｌｓ  ｉｎ  Ｉｎｆａｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １３９，    （２０１７）．
Ｒ．  Ｊ．  Ｋｕｐｐｅｎｓ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｄｏｎｚｅ，  Ａ．  Ｃ．  Ｈｏｋｋｅｎ−Ｋｏｅｌｅｇａ，  Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘｙｔｏｃｉｎ  ｏｎ  ｓｏｃｉａｌ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｔｒｉａｌ．  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  （Ｏｘｆ）  ８５，  ９７９−９８７  （２０１６）．
Ｇ．  Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｏｌａｄｏ，  Ｆ．  Ａ．  Ｐａｕｌ，  Ｓ．  Ｂｌａｅｓｓ，  Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ：  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｔｏ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｒｅｇｉｏｎｓ．  Ｎｅｕｒａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ７，  ４  （２０１２）．
Ｓ．  Ｂｌａｅｓｓ，  Ｎ．  Ｓｚａｂｏ，  Ｒ．  Ｈａｄｄａｄ−Ｔｏｖｏｌｌｉ，  Ｘ．  Ｚｈｏｕ，  Ｇ．  Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｏｌａｄｏ，  Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｎｅｕｒｏａｎａｔ  ８，  １５６  （２０１４）．
Ｅ．  Ｏ．  Ｍａｚｚｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｔｏ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ．  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６，  １２１９−１２２７  （２０１３）．
Ｐ．  Ａｒｌｏｔｔａ，  Ｏ．  Ｈｏｂｅｒｔ，  Ｈｏｍｅｏｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３８，  ７５１−７６２  （２０１５）．
Ｅ．  Ｓ．  Ｄｅｎｅｒｉｓ，  Ｏ．  Ｈｏｂｅｒｔ，  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｏｓｔｍｉｔｏｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ．  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７，  ８９９−９０７  （２０１４）．
Ｔ．  Ｊ．  Ｃｌｅｏｐｈａｓ，  Ａ．  Ｈ．  Ｚｗｉｎｄｅｒｍａｎ，  Ｔ．  Ｆ．  Ｃｌｅｏｐｈａｓ，  ｉｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ．  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，  Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，  ２００６），  ｐｐ．  ２１９−２２８．
Ｓ．  Ｗｅｌｌｅｋ，  Ｍ．  Ｂｌｅｔｔｎｅｒ，  Ｏｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｐｅｒ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ：  Ｐａｒｔ  １８  ｏｆ  ａ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｏｎ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ  Ａｒｚｔｅｂｌａｔｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  １０９，  ２７６−２８１  （２０１２）．
Ｔ．  Ａ．  Ｌｏｕｉｓ  ，  Ｐ．  Ｗ．  Ｌａｖｏｒｉ  ，  Ｊ．  Ｃ．  Ｉ．  Ｂａｉｌａｒ  ，  Ｍ．  Ｐｏｌａｎｓｋｙ  Ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｓｅｌｆ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３１０，  ２４−３１  （１９８４）．
Ｅ．  Ｍ．  Ｄｙｋｅｎｓ，  Ｍ．  Ａ．  Ｍａｘｗｅｌｌ，  Ｅ．  Ｐａｎｔｉｎｏ，  Ｒ．  Ｋｏｓｓｌｅｒ，  Ｅ．  Ｒｏｏｆ，  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ  ｉｎ  Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｏｂｅｓｉｔｙ  １５，  １８１６−１８２６  （２００７）．
Ｓ．  Ｒ．  Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ．  Ｖａｌｕｅ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  １８，  Ａ７６１．
Ｊ．  Ｍ．  ＭＤ，  Ｄ．  Ｄ．  ＭＤ，  Ａ．  Ｃｈｅｎ，  Ｔ．  Ｅ．  Ｈｕｇｈｅｓ，  Ｄ．  Ｄ．  Ｋｉｍ，  ｐａｐｅｒ  ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｗｅｅｋ  ２０１４，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ，    ２０１４．
Ｒ．  Ｊ．  Ｋｕｐｐｅｎｓ，  Ｓ．  Ｈ．  Ｄｏｎｚｅ，  Ａ．  Ｃ．  Ｓ．  Ｈｏｋｋｅｎ−Ｋｏｅｌｅｇａ，  Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘｙｔｏｃｉｎ  ｏｎ  ｓｏｃｉａｌ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｔｒｉａｌ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ８５，  ９７９−９８７  （２０１６）．
Ｐ．  Ｇｕｍｕｓ  Ｂａｌｉｋｃｉｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｃｒｏｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｈｒｅｌｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＹＹ  ｉｎ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １００，  ３８２２−３８３１  （２０１５）．
Ｒ．  Ｋａｄｄｕｒａｈ−Ｄａｏｕｋ，  Ｒ．  Ｗｅｉｎｓｈｉｌｂｏｕｍ，  Ｎ．  ｏｎ  ｂｅｈａｌｆ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ：  Ｐｈａｒｍａｃｏｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  Ｅｎａｂｌｅｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ９８，  ７１−７５  （２０１５）．
Ｒ．  Ｄ．  Ｂｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ：  “Ａ  Ｗｈｉｔｅ  Ｐａｐｅｒ，  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ”．  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ  １２，  １４９  （２０１６）．
【０１３３】
本発明の範囲は、具体的に上で示され記載されたものによって限定されない。多数の参照文献（特許および様々な出版物を含む）は、本発明の記載中で引用および検討される。かかる参照文献の引用および考察は、単に本発明の記載を明確にするために提供され、任意の参照文献が本明細書において記載される発明の先行技術であるという承認ではない。この明細書中で引用および検討されるすべての参照文献は、それらの全体の参照により本明細書に援用される。変動、修飾、および本明細書において記載されるものの他の実装を、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに、当業者は考えつくだろう。本発明のある特定の実施形態が示され記載されたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに、様々な変化および修飾を行えることは当業者に明らかであろう。先の記載および添付の図面中で明記された素材は、限定としてではなく例示の目的だけに提供される。本発明の実際の範囲は、以下の請求項中で定義されることが意図される。
【図１】
2019522045.tif 000008
【図２】
2019522045.tif 000009
【図３Ａ】
2019522045.tif 000010
【図３Ｂ】
2019522045.tif 000011
【図３Ｃ】
2019522045.tif 000012
【図３Ｄ】
2019522045.tif 000013
【図３Ｅ】
2019522045.tif 000014
【図３Ｆ】
2019522045.tif 000015
【図３Ｇ】
2019522045.tif 000016
【図３Ｈ】
2019522045.tif 000017
【図３Ｉ】
2019522045.tif 000018
【図３Ｊ】
2019522045.tif 000019
【図３Ｋ】
2019522045.tif 000020
【図３Ｌ】
2019522045.tif 000021
【図３Ｍ】
2019522045.tif 000022
【図３Ｎ】
2019522045.tif 000023
【図３Ｏ】
2019522045.tif 000024
【図３Ｐ】
2019522045.tif 000025
【図４】
2019522045.tif 000026
【図５Ａ】
2019522045.tif 000027
【図５Ｂ】
2019522045.tif 000028
【図５Ｃ】
2019522045.tif 000029
【図５Ｄ】
2019522045.tif 000030
【図５Ｅ】
2019522045.tif 000031
【図５Ｆ】
2019522045.tif 000032
【図５Ｇ】
2019522045.tif 000033
【図５Ｈ】
2019522045.tif 000034
【図６Ａ】
2019522045.tif 000035
【図６Ｂ】
2019522045.tif 000036
【図６Ｃ】
2019522045.tif 000037
【図６Ｄ】
2019522045.tif 000038
【図６Ｅ】
2019522045.tif 000039
【図６Ｆ】
2019522045.tif 000040
【図７Ａ】
2019522045.tif 000041
【図７Ｂ】
2019522045.tif 000042
【図８Ａ】
2019522045.tif 000043
【図８Ｂ】
2019522045.tif 000044
【図８Ｃ】
2019522045.tif 000045
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月7日(2019.3.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする被験体でプラダー・ウィリー症候群（ＰＷＳ）を治療すること、それによりＰＷＳの１つまたは複数の症状を緩和する、消失する、または予防することにおける使用のためのホスホジエステラーゼ４阻害物質（ＰＤＥ４ｉ）。
【請求項２】
前記ＰＤＥ４ｉが被験体中の環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の濃度または活性をアップレギュレートする、請求項１に記載の使用のための阻害物質。
【請求項３】
ＰＷＳがＮｈｌｈ２の減少された発現によって特徴づけられる、請求項２に記載の使用のための阻害物質。
【請求項４】
Ｎｈｌｈ２の減少された発現がＰｃｓｋ１の減少された発現をもたらす、請求項３に記載の使用のための阻害物質。
【請求項５】
ｃＡＭＰの濃度または活性を増加させることがＰｃｓｋ１の発現をアップレギュレートする、請求項２に記載の使用のための阻害物質。
【請求項６】
前記ＰＤＥ４ｉが選択的ＰＤＥ４ｉである、請求項２に記載の使用のための阻害物質。
【請求項７】
前記ＰＤＥ４ｉが非選択的ＰＤＥ４ｉである、請求項２に記載の使用のための阻害物質。
【請求項８】
前記選択的ＰＤＥ４ｉがＡＮ２７２８、アプレミラスト、シロミラスト、ジアゼパム、イブジラスト、ルテオリン、メセンブレノン、ピクラミラスト、ロフルミラスト、ロリプラム、Ｅ６００５、ＧＳＫ３５６２７８およびＭＫ０９５２からなる群から選択される、請求項６に記載の使用のための阻害物質。
【請求項９】
前記非選択的ＰＤＥ４ｉがメチル化キサンチンおよびその誘導体、カフェイン、アミノフィリン、３−イソブチル−１−メチルキサンチン、パラキサンチン、ペントキシフィリン、テオブロミン、ならびにテオフィリンから選択される、請求項７に記載の使用のための阻害物質。
【請求項１０】
前記１つまたは複数の症状が過食症、低減した代謝速度、肥満、低下した性腺機能、減少した成長ホルモン産生、筋緊張の不良、睡眠障害、胃腸病、低減したスタミナ、低減した集中力、異常な認知力、行動障害、不安、成長不全、成熟形態および活性形態への未成熟ホルモンの低減した変換、ならびに糖尿病を含む、請求項１に記載の使用のための阻害物質。
【請求項１１】
ＰＷＳの１つまたは複数の症状を治療するまたは緩和するために有効な１つまたは複数の追加の治療剤が被験体へ投与可能であるように適合される、請求項１に記載の使用のための阻害物質。
【請求項１２】
前記未成熟ホルモンがインスリン、グレリン、ＧＨＲＨ、α−ＭＳＨ、オキシトシン、オレキシン、ＢＤＮＦ、バソプレッシン、ＮＰＹ、ＡＧＲＰ、およびゴナドトロピンの１つまたは複数を含む、請求項１０に記載の使用のための阻害物質。
【請求項１３】
前記ＰＷＳを治療するまたは緩和するのに有効な１つまたは複数の追加の治療剤がインスリン、インスリン受容体アゴニスト、グレリン、グレリン受容体アゴニスト、ＧＨＲＨ、ＧＨＲＨ受容体アゴニスト、α−ＭＳＨ、α−ＭＳＨ受容体アゴニスト、オキシトシン、オキシトシン受容体アゴニスト、オレキシン、オレキシン受容体アゴニスト、ＢＤＮＦ、ＢＤＮＦ受容体アゴニスト、バソプレッシン、バソプレッシン受容体アゴニスト、ＮＰＹ、ＮＰＹ受容体アゴニスト、ＡＧＲＰ、ＡＧＲＰ受容体アゴニスト、ゴナドトロピン、ゴナドトロピン受容体アゴニスト（ａｇａｉｎｓｔ）、またはその組み合わせを含む、請求項１１に記載の使用のための阻害物質。
【請求項１４】
前記ＰＤＥ４ｉがＭＫ０９５２である、請求項１に記載の使用のための阻害物質。
【請求項１５】
前記ＰＤＥ４ｉがＭＫ０９５２である、請求項８に記載の使用のための阻害物質。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
政府助成
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）からの補助金ＳＫ０５２４３１の下で政府の助成を受けてなされた。
【国際調査報告】
2019522045.tif 000046
2019522045.tif 000047