(57)【要約】本発明は、目的の異種遺伝子を含む安定な偽型化レンチウイルス粒子を得るための方法に関し、以下の工程を含む：ａ）適当な細胞株において少なくとも１つのプラスミドをトランスフェクトすることであって、前記の少なくとも１つのプラスミドは目的の異種遺伝子、ｒｅｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌ遺伝子、ならびにＥＲＶシンシチンをコードする核酸を含み、ｒｅｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌ遺伝子はレトロウイルスの遺伝子である；ｂ）上清中に安定な偽型化レンチウイルス粒子を産生するようにａ）において得られたトランスフェクト細胞をインキュベートすること；及びｃ）ｂ）において得られた安定なレンチウイルス粒子を収集し、濃縮すること。本発明はまた、ＥＲＶシンシチン糖タンパク質を用いて偽型化したレンチウイルスベクターを使用して免疫細胞を形質導入する方法に関する。この方法は、刺激されていない血液細胞又はＩＬ７を用いて短時間刺激された細胞で実施することができ、細胞を増殖することができる。得られた安定な偽型化レンチウイルス粒子は、遺伝子治療において特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内在性レトロウイルスのシンシチン（ＥＲＶシンシチン）を用いて偽型化され、目的の異種遺伝子をパッケージングし、高い物理的及び／又は感染力価を提示する、安定なレンチウイルス粒子。
【請求項２】
請求項１記載の安定な偽型化レンチウイルス粒子を得るための方法であって、以下の工程を含む：
ａ）適当な細胞株において少なくとも１つのプラスミドをトランスフェクトすることであって、前記の少なくとも１つのプラスミドは目的の異種遺伝子、レトロウイルスのｒｅｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌ遺伝子、ならびにＥＲＶシンシチンをコードする核酸を含む；
ｂ）ａ）において得られたトランスフェクト細胞をインキュベートし、ＥＲＶシンシチンを用いてそれぞれ偽型化された安定なレンチウイルス粒子を産生すること、及び目的の異種遺伝子をパッケージングすること；及び
ｃ）ｂ）において得られた安定なレンチウイルス粒子を収集し、濃縮すること、好ましくは、工程ｃ）の濃縮が、ｂ）において得られた、収集された安定なレンチウイルス粒子を遠心分離及び／又は精製することを含む。
【請求項３】
レトロウイルスのｒｅｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌ遺伝子が、レンチウイルスのｒｅｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌ遺伝子、  好ましくはＨＩＶ−１のｒｅｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌ遺伝子である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
請求項２又は３のいずれか一項記載の方法により得られた粒子。
【請求項５】
ＥＲＶシンシチンを、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、マウスシンシチンＡ、マウスシンシチンＢ、シンシチンＯｒｙ１、シンシチンＣａｒ１、及びシンシチンＲｕｍ１からなる群より選択し、好ましくは、ＥＲＶシンシチンを、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、及びマウスシンシチンＡからなる群より選択し、さらにより好ましくは、ＥＲＶシンシチンは、ＨＥＲＶ−Ｗ又はＨＥＲＶ−ＦＲＤである、請求項１又は４記載の粒子、あるいは請求項２〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
高い感染力価が、２Ｅ＋０４TU/mlより高い、好ましくは１Ｅ＋０５TU/mlより高い、好ましくは１Ｅ＋０６TU/mlより高い、好ましくは２Ｅ＋０６TU/mlより高い、工程ｃ）の終了時に産生された感染性粒子の力価であり、及び／又は高い物理力価が、０．７×１０５ng  ｐ２４/mLより高い、特に１×１０５ng  ｐ２４/mLより高い、好ましくは１．１×１０５ng  ｐ２４/mLより高い、より好ましくは１．５×１０５ng  ｐ２４/mLより高い、工程ｃ）の終了時に産生された粒子の力価である、請求項１又は５記載の粒子、あるいは請求項２〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
医薬としての使用のための、好ましくは遺伝子療法もしくは免疫療法における、又はワクチンとしての、又は免疫予防における使用のための、請求項１、５、又は６のいずれか一項記載の粒子。
【請求項８】
免疫細胞、好ましくはＢ細胞又は骨髄細胞の形質導入のための、請求項１、５、又は６のいずれか一項記載の粒子のインビトロでの使用。
【請求項９】
バイオテクノロジー工学のための、好ましくは免疫グロブリンを産生するための、請求項１、５、６、又は８のいずれか一項記載の粒子のインビトロでの使用。
【請求項１０】
免疫細胞を形質導入することによる治療のための使用のための、好ましくは免疫不全、自己免疫、感染性疾患、又はＢ細胞関連癌を処置するための使用のための、請求項１又は５〜７のいずれか一項記載の粒子。
【請求項１１】
医薬としての使用のための、又は診断目的のための、請求項１、５、又は６のいずれか一項記載の粒子を用いて感染させた免疫細胞のサンプル。
【請求項１２】
請求項１、５、又は６のいずれか一項記載の粒子を用いて、免疫細胞、好ましくは、場合により以前に刺激された、ナイーブ免疫細胞を感染させる工程を含む、改変され目的の異種遺伝子を発現する免疫細胞を得るためのエクスビボの方法。
【請求項１３】
ＬＡＨ４ペプチド又はその機能的誘導体、好ましくはＬＡＨ４−Ａ４ベクトフシン１の存在において実施する、及び／又は免疫細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、単球、及びマクロファージより選ばれる、好ましくはＢ細胞である、請求項１２記載のエクスビボでの方法。
【請求項１４】
請求項１２又は１３のいずれか一項記載のエクスビボの方法であって、以下の工程を含む：
−場合により、ＩＬ−７を含む培地中でナイーブ免疫細胞をインキュベートすることによりそれらを刺激すること、及び
−ＬＡＨ４ペプチド又はその機能的誘導体の存在において、請求項１、５、又は６のいずれか一項記載の前記粒子を用いて刺激されたか又はされていない、ナイーブ免疫細胞を感染させること。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか一項記載のエクスビボの方法により入手可能な、目的の前記異種遺伝子を含む免疫細胞、好ましくはＢ細胞、より好ましくはナイーブＢ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、安定な偽型化レンチウイルス粒子及び特に治療におけるその使用に関する。本発明はまた、そのような安定な偽型化レンチウイルス粒子を調製するための方法を指す。本発明はまた、ベクトフシンの存在において、そのような偽型化レンチウイルス粒子を使用し、好ましくは最小限又は無の予備活性化を用いてヒト末梢血ナイーブＢ細胞及び単球細胞に形質導入するインビトロの方法に関する。
【０００２】
発明の背景
遺伝子治療アプローチは、しばしば、組換えウイルスベクターによる標的細胞の低い形質導入効率により妨げられる。レトロウイルスベクター、特にヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）ベースのレンチウイルスベクター（ＬＶ）は、遺伝子治療のための有望な媒体である。これらのベクターは、種々の疾患、例えば免疫不全、神経変性疾患もしくは神経学的疾患、貧血、又はＨＩＶ感染などを処置するために臨床応用において現在使用されている。
【０００３】
レトロウイルスベクターの応用の一部は、エクスビボでの特定の標的細胞、例えばＣＤ３４マーカーを発現するリンパ球又は造血幹／前駆細胞などの形質導入に依存する。ＬＶを使用してＴリンパ球を形質導入し、癌、例えば難治性慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）などの処置のための長期生存ＣＡＲ−Ｔ細胞を生成する（Porter et al, Science Transl. Med. 7: 303ra139 2015）。ＬＶを使用し、遺伝的起源の種々の免疫疾患、血液疾患、代謝疾患、又は神経変性疾患の自己遺伝子治療のためにＣＤ３４＋細胞を形質導入する（Wagemaker G. Hum Gene Ther. 2014 Oct;25(10):862-5. doi: 10.1089/hum.2014）。レンチウイルスベクターは、種々のウイルスエンベロープ糖タンパク質を用いて偽型化し、それにより特異的な細胞指向性特性を粒子に付与することができる汎用ツールである（Buchholz et al. Trends Biotechnol. 2015 Dec; 33(12):777-90. doi: 10.1016/j.tibtech.2015.09.008.）。
【０００４】
組換えレンチウイルス粒子の使用に伴う制限因子は、組換えレンチウイルス粒子の産生の間に高度な感染力価を得る能力である。この制限を回避する１つの方法は、精製工程の間にウイルス上清を濃縮することである。しかし、精製プロトコールは、ウイルス粒子を偽型化するために使用されるエンベロープ糖タンパク質に依存し、一部のＬＶについて確立することは困難である。従って、多くのレンチウイルスベクター調製物は低力価を有し、形質導入の有効性は制限される。
【０００５】
別の制限因子は、初代細胞を形質導入することが困難であり、そのため、それらはしばしば形質導入するために活性化されなければならず、それによりそのナイーブ状態が失われることである。
【０００６】
最後に、別の制限因子は、レンチウイルスベクター自体が標的細胞に感染する能力である。いくつかのエンベロープ糖タンパク質（例えばＶＳＶ−Ｇ又はＲＤ１１４ＴＲなど）を使用してレンチウイルスベクターを偽型化し、標的細胞（例えばＣＤ３４＋細胞及び初代血液細胞など）上で可変性の感染性を有することができる。
シンシチンは、融合特性を有する内在性レトロイルスウイルス（ＥＲＶシンシチン）エンベロープ糖タンパク質である（Dupressoir et al., 2005; Lavialle et al., 2013）。
ＥＲＶＷ−１遺伝子（ＥＮＳＧ０００００２４２９５０；シンシチン  １又はＨＥＲＶ−Ｗとしても公知である）によりコードされるヒト内在性レトロイルスエンベロープ糖タンパク質は、特許出願ＥＰ２３８５０５８においてその融合特性について記載されている。前記出願には、合胞体の形成による、癌処置におけるその使用が記載されている。
一部の試験では、２９３Ｔ細胞を形質転換することが可能な感染性ウイルスを得るために、ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープを用いてＨＩＶ−１ビリオン（ＭＬＶ粒子ではない）を偽型化する可能性が示されている。しかし、そのようなＨＥＲＶ−Ｗ粒子は、濃縮、凍結、及び解凍によって力価がかなり低下したため、安定ではなかった（An et al, Journal of Virology, Apr 2001, p.3488-3489）。Ｒ細胞質内領域の欠失が、ＨＩＶ−１由来の遺伝子導入ベクターの融合及び偽型力価を増加させるために使用された（Lavillette et al 2002）。ＥＲＶＦＲＤ−１遺伝子（ＥＮＳＧ０００００２４４４７６；シンシチン２又はＨＥＲＶ−ＦＲＤとしても公知である）によりコードされる糖タンパク質が、ＳＩＶベクターを偽型化するために使用され、報告によれば、ＨＩＶ又はＭＬＶ偽型として作用するが、非常に低い力価であり、機能試験を妨げ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ  ＨＩＶ偽型に関する情報はほとんど入手できない（Blaise et al, Journal of Virology, Jan 2004, p.1050-1054）。
【０００７】
このように、例えば、特定の標的細胞への遺伝子の送達を改善するために、ウイルス又はウイルスベクター、特に安定なウイルス又はウイルスベクターの形質導入効率を改善するための手段が必要とされている。具体的には、安定であり、したがって工業的規模で得ることができるウイルス又はウイルスベクターについての必要性がある。新たな生物学的特性を提示するツールとして、インビトロ又はインビボで使用することができる安定なベクターについての必要性もある。
【０００８】
インビトロ又はインビボで特定の細胞のみを標的とするために、ウイルス又はウイルスベクターを用いて選択的に細胞に形質導入するプロセスについての必要性もある。そのようなウイルス又はウイルスベクターは、完全に寛容化され、標的細胞について特異的であり、複数回投与のために適当でなければならないであろう。
【０００９】
驚くべきことに、本発明者らは、安定であり、凍結させてもよい、特定のエンベロープ糖タンパク質を用いて偽型化されたレンチウイルス粒子を得るためのプロセスを精巧に作り上げた。前記レンチウイルス偽型化粒子によって、選択された標的細胞、特に免疫細胞の形質導入も改善される。これによって前記粒子の治療範囲が広がる。前記偽型化レンチウイルス粒子は、実際に免疫細胞、特にＢ細胞、Ｔ細胞、及び樹状細胞に形質導入するのに効率的であり、細胞欠損の機能的補正が可能になる。さらに、これらのレンチウイルス偽型化ベクターはインビボで投与することができ、ＣＤ１９＋脾臓Ｂ細胞形質導入の証拠を伴う脾臓及び骨髄において、検出可能で、安定で、耐容性良好な遺伝子導入に導く。
【００１０】
このように、前記偽型化レンチウイルス粒子の使用は、胎盤機能不全、癌、感染性疾患、免疫不全、自己免疫に苦しむ患者のための、又は遺伝子治療のための、又はワクチンとして、もしくはバイオテクノロジー工学ツールとして有望な戦略である。
【００１１】
発明の概要
本発明は、目的の異種遺伝子を含む安定な偽型化レンチウイルス粒子を得るための方法に関し、以下の工程を含む：
ａ）適当な細胞株において少なくとも１つのプラスミドをトランスフェクトすることであって、前記の少なくとも１つのプラスミドは目的の異種遺伝子、レトロウイルスのｒｅｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌ遺伝子、ならびにＥＲＶシンシチンをコードする核酸を含む；
ｂ）ＥＲＶシンシチンを用いてそれぞれ偽型化された安定なレンチウイルス粒子を産生するようにａ）において得られたトランスフェクト細胞をインキュベートすること、及び目的の異種遺伝子をパッケージングすること；及び
ｃ）ｂ）において得られた安定なレンチウイルス粒子を収集し、濃縮すること。
本発明に従った方法によって、目的の異種遺伝子を含む安定な偽型化レンチウイルス粒子の高い物理力価ならびに高い感染力価を得ることが可能になる。
【００１２】
また、ＥＲＶシンシチンを用いて偽型化し、目的の異種遺伝子をパッケージングする安定なレンチウイルス粒子を提供する。それらは、上記の段落に記載する方法により入手可能でありうる、又は得てもよい。前記の安定な偽型化レンチウイルス粒子は薬物として有用でありうる。特に、前記の安定な偽型化レンチウイルス粒子は、遺伝子治療において又は免疫療法において、特にワクチンとして又は免疫予防において有用でありうる。
【００１３】
本発明はまた、シンシチン１（ＨＥＲＶ−Ｗ）及びシンシチン２（ＨＥＲＶ−ＦＲＤ）のそれぞれについての同族受容体、例えばＡＳＣＴ２、ＡＳＣＴ１、又はＭＦＳＤ２ａなどを発現する細胞、例えばヒト絨毛癌細胞、ヒト上皮細胞、及びヒト免疫細胞、例えばＢ細胞、Ｔ細胞、又はＣＤ１１ｃ＋細胞など、例えば骨髄細胞など（例、顆粒球、単球、及びそれらの前駆細胞）に形質導入することによる治療のために使用するための、目的の異種遺伝子を含む、ＥＲＶシンシチンを用いて偽型化されたレンチウイルス粒子、好ましくは目的の異種遺伝子を含む、ＥＲＶシンシチンを用いて偽型化された安定なレンチウイルス粒子に関する。本発明はまた、マウスＢ細胞及びＴ細胞に効率的に形質導入するためにＥＲＶシンシチンを用いて偽型化されたレンチウイルス粒子を使用する能力に関する。
【００１４】
本発明はまた、自己免疫、感染性疾患、胎盤機能障害（例えば子癇前症など）、血液脳関門を含む疾患、もしくはＢ細胞関連癌を含む癌の治療のために、又はマウスにおいてこれらの疾患のモデルを作製するために使用される、目的の遺伝子を含む、ＥＲＶシンシチンを用いて偽型化されたレンチウイルス粒子、好ましくは目的の異種遺伝子を含む、ＥＲＶシンシチンを用いて偽型化された安定なレンチウイルス粒子に関する。
【００１５】
目的の異種遺伝子を含む、ＥＲＶシンシチンを用いて偽型化された安定なレンチウイルス粒子は、免疫細胞、好ましくはＢ細胞又はＣＤ１１ｃ＋細胞、例えば骨髄細胞（例、顆粒球、単球、及びそれらの前駆細胞）などのインビトロ形質導入にも有用でありうる。免疫細胞、好ましくはＢ細胞の形質導入は、バイオテクノロジー工学において、例えば免疫グロブリンの産生、又は免疫細胞、好ましくはＢ細胞工学において用途を見出しうる。
【００１６】
本発明はまた、好ましくはＬＡＨ４ペプチド又はその機能的誘導体の存在において、目的の異種遺伝子を含む、ＥＲＶシンシチンを用いて偽型化されたレンチウイルス粒子、好ましくは目的の異種遺伝子を含む、ＥＲＶシンシチンを用いて偽型化された安定なレンチウイルス粒子を用いて免疫細胞に感染させる工程を含む、目的の異種遺伝子を発現するように改変された免疫細胞を得るためのエクスビボのプロセスに関する。
【００１７】
本発明はまた、バイオテクノロジー工学のための、目的の異種遺伝子を含む、ＥＲＶシンシチンを用いて偽型化された安定なレンチウイルス粒子、好ましくは目的の異種遺伝子を含む、ＥＲＶシンシチンを用いて偽型化された安定なレンチウイルス粒子の使用に関する。特に、それらは、特定の産物、例えば免疫グロブリンなどを産生するために、細胞株、好ましくはＢ細胞株を作製するために使用されうる。本発明の安定な粒子はまた、特にマウスにおいて試験のモデルを作製するために（マウスモデルを得るために）使用されうる。これは、疾患機序、特にＢ細胞疾患又はＢ細胞媒介疾患の探索、ワクチン接種の目的のための産物を発現する樹状細胞及び／又は骨髄細胞の作製、あるいは特定の治療効果を伴う産物の産生のために有用でありうる。
【００１８】
本発明に従い、ＥＲＶシンシチンを、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、マウスシンシチンＡ、マウスシンシチンＢ、シンシチンＯｒｙ１、シンシチンＣａｒ１、及びシンシチンＲｕｍ１ならびにそれらの機能的オルソログからなる群より選択し、好ましくは、ＥＲＶシンシチンを、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、及びマウスシンシチンＡからなる群より選択し、さらにより好ましくは、ＥＲＶシンシチンはＨＥＲＶ−Ｗ又はＨＥＲＶ−ＦＲＤである。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明者らは驚くべきことに、高い融合特性を有するＥＲＶシンシチン、例えばヒトシンシチン１（ＨＥＲＶ−Ｗ）、ヒトシンシチン２（ＨＥＲＶ−ＦＲＤ）、及びマウスシンシチンＡなどを、組換えＨＩＶ−１由来レンチウイルスについての偽型を得るために使用してもよいことを発見した。実施例において明らかに実証するように、結果は、細胞株に対して選択的指向性を有する、目的の遺伝子を含む安定で感染性のレンチウイルス粒子を産生することが可能であることを示す。驚くべきことに、シンシチン偽型化レンチウイルス粒子によって、注目すべきことに、ベクトフシン１（カチオン性形質導入添加剤）の存在においてヒト初代Ｂリンパ球ならびにＣＤ１１ｃ＋骨髄細胞及び／又は樹状細胞を効率的に形質導入することができる。
【００２０】
このように、本発明者らは、安定で感染性であり、凍結させてもよい、ＥＲＶシンシチンを用いて偽型化されたレンチウイルス粒子を得るための方法を精巧に作り上げた。レンチウイルスの偽型化粒子によって、選択された標的細胞、特に免疫細胞、特にＢ細胞、Ｔ細胞、及び樹状細胞の形質導入が改善される。
【００２１】
本発明の詳細な実施形態を以下に記載する。
【００２２】
本発明は、目的の異種遺伝子を含む安定な偽型化レンチウイルス粒子を得るための方法に関し、以下の工程を含む：
ａ）適当な細胞株において少なくとも１つのプラスミドをトランスフェクトすることであって、前記の少なくとも１つのプラスミドは目的の異種遺伝子、レトロウイルスのｒｅｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌ遺伝子、ならびにＥＲＶシンシチンをコードする核酸を含む；
ｂ）ＥＲＶシンシチンを用いてそれぞれ偽型化されたレンチウイルス粒子を産生するようにａ）において得られたトランスフェクト細胞をインキュベートすること、及び目的の異種遺伝子をパッケージングすること；及び
ｃ）ｂ）において得られた安定なレンチウイルス粒子を収集し、濃縮すること。
【００２３】
好ましくは、本発明に従った方法の工程ｃ）は、工程ｂ）において産生される安定なレンチウイルス粒子を上清から収集、濃縮、及び／又は精製する工程を含む。このように、好ましくは、工程ｃ）の濃縮は、ｂ）において得られた、収集された安定なレンチウイルス粒子を遠心分離及び／又は精製することを含む。前記の収集は、当技術分野において周知の方法に従って実施してもよい。好ましくは、レンチウイルスベクターは、トランスフェクト細胞の融合前に、より好ましくはトランスフェクション後２０時間〜７２時間の間、好ましくは２４時間後に収集する。好ましくは、収集工程は、好ましくはトランスフェクション後２０〜７２時間の間、好ましくはトランスフェクション後２０〜３０時間の間、より好ましくは２４時間後に実施される、単一のレンチウイルス収集からなる。
【００２４】
本発明に従ったＥＲＶシンシチンは、内在性レトロウイルス（ＥＲＶ）の科に属する真獣類哺乳動物からの高度に融合性のエンベロープ糖タンパク質を指す。これらのタンパク質は、胎盤における優先的な発現を呈し、培養細胞中に導入された場合にシンシチン形成を誘導する遺伝子によりコードされる（Lavialle et al., 2013）。
【００２５】
本発明に従ったＥＲＶシンシチンは、ヒトシンシチン（例、ＨＥＲＶ−Ｗ及びＨＥＲＶ−ＦＲＤ）、マウスシンシチン（例、シンシチンＡ及びシンシチンＢ）、シンシチンＯｒｙ１、シンシチンＣａｒ１、シンシチンＲｕｍ１、又はそれらの機能的オルソログより選択することができる（Dupressoir et al., 2005; Lavialle et al., 2013）。
【００２６】
機能的オルソログは、オルソログ遺伝子によりコードされ、融合性を示すオルソログタンパク質を意図する。融合特性はDupressoirら（PNAS 2005）において記載されている融合アッセイで評価してもよい。簡単に説明すると、細胞を、例えば、リポフェクタミン（Invitrogen）及び５×１０５個細胞について約１〜２μgのＤＮＡ又はリン酸カルシウム沈殿（Invitrogen、５×１０５個細胞について５〜２０μgのＤＮＡ）を使用することによりトランスフェクションする。プレートは、一般的に、トランスフェクション後の２４〜４８時間に細胞融合について検証する。合胞体は、Ｍａｙ−Ｇｒuｎｗａｌｄ染色及びＧｉｅｍｓａ染色（Sigma）を使用して視覚化することができ、融合指数は［（Ｎ−Ｓ）／  Ｔ］×１００として算出することができ、式中、Ｎは合胞体中の核の数、Ｓは合胞体の数、Ｔは計数された核の総数である。
【００２７】
ヒトシンシチンはＨＥＲＶ−Ｗ及びＨＥＲＶ−ＦＲＤを包含する。これらのタンパク質の機能的オルソログはヒト科において見出すことができる。ＨＥＲＶ−Ｗは、ヒト内在性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）の科に属する高度に融合性の膜糖タンパク質を指す。ＨＥＲＶ−Ｗはエンベロープ糖タンパク質である。シンシチン１とも呼ばれる。それは、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース中に示す配列を有し、転写物ＥＲＶＷ−１−００１、ＥＮＳＴ０００００４９３４６３に対応する。対応するｃＤＮＡは、配列番号１に示す配列を有する。ＨＥＲＶ−ＦＲＤはまた、ヒト内在性レトロイルス（ＨＥＲＶ）の科に属する高度に融合性の膜糖タンパク質を指す。ＨＥＲＶ−ＦＲＤはエンベロープ糖タンパク質であり、シンシチン２とも呼ばれる。それは、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース中に示す配列を有し、転写物ＥＲＶＦＲＤ−１、ＥＮＳＧ０００００２４４４７６に対応する。対応するｃＤＮＡは、配列番号２に示す配列を有する。
【００２８】
マウスシンシチンはマウスシンシチンＡ（即ち、ハツカネズミシンシチンＡ、ｓｙｎＡ）及びマウスシンシチンＢ（即ち、ハツカネズミシンシチンＢ、ｓｙｎＢ）を包含する。これらのタンパク質の機能的オルソログはネズミ科において見出すことができる。マウスシンシチンＡはシンシチンＡ遺伝子によりコードされる。シンシチンＡは、ＥｎｓｅｍｂｌデータベースＳｙｎａ  ＥＮＳＭＵＳＧ００００００８５９５７中に示す配列を有する。対応するｃＤＮＡは、配列番号４０に示す配列を有する。マウスシンシチンＢはシンシチンＢ遺伝子によりコードされる。シンシチンＢは、ＥｎｓｅｍｂｌデータベースＳｙｎｂ  ＥＮＳＭＵＳＧ００００００４７９７７中に示す配列を有する。対応するｃＤＮＡは、配列番号４１に示す配列を有する。
【００２９】
シンシチンＯｒｙ１はシンシチンＯｒｙ１遺伝子によりコードされる。シンシチンＯｒｙ１の機能的オルソログはウサギ科（典型的にはウサギ及びノウサギ）において見出すことができる。
【００３０】
シンシチンＣａｒ１はシンシチンＣａｒ１遺伝子によりコードされる。シンシチンＣａｒ１の機能的オルソログはローラシア獣上目からの肉食哺乳動物において見出すことができる（Cornelis et al., 2012; Lavialle et al., 2013）。
【００３１】
シンシチンＲｕｍ１はシンシチンＲｕｍ１遺伝子によりコードされる。シンシチンＲｕｍ−１の機能的オルソログは反芻哺乳動物において見出すことができる。
【００３２】
本発明の種々の実施形態において、本発明に従ったＥＲＶシンシチンを、典型的には、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、シンシチンＡ、シンシチンＢ、シンシチンＯｒｙ１、シンシチンＣａｒ１、及びシンシチン  Ｒｕｍ１ならびにそれらの機能的オルソログからなる群より選択することができ；好ましくは、ＥＲＶシンシチンを、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、マウスシンシチンＡ、及びそれらの機能的オルソログからなる群より選択し、より好ましくは、ＥＲＶシンシチンを、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、及びマウスシンシチンＡからなる群より選択し、さらにより好ましくは、ＥＲＶシンシチンはＨＥＲＶ−Ｗ又はＨＥＲＶ−ＦＲＤである。
【００３３】
本発明に従った方法によって、目的の異種遺伝子を含む安定な偽型化レンチウイルス粒子の高い物理力価ならびに高い感染力価を得ることが可能になる。実際に、目的の異種遺伝子を含む安定な偽型化レンチウイルス粒子は、本発明の方法のおかげで高い物理力価で得られ、特にＢ細胞又は骨髄細胞を形質導入するために感染性であり、したがって効率的である。
【００３４】
「物理力価」は産生されるレンチウイルス粒子の数を意味する。物理力価は、当技術分野において公知の古典的な方法に従って測定してもよく、それらは、例えば、実施例に例証するｐ２４  ＥＬＩＳＡにより、自動カウンター、例えばMalvernからのNanosight NS300装置（製造者の説明書を使用）などを用いた直接粒子計数により、ＲＴ（逆転写酵素）ＥＬＩＳＡ（Cire et al, Plosone, July 2014, Vol.9, Issue 7, Immunization of mice with lentiviral vectors targeted to MHC class II+ cells is due to preferential transduction of dendritic cells in vivoに記載される通り）により、又はウイルスＲＮＡ  ＲＴ−ｑＰＣＲによりレンチウイルス粒子を定量するために一般に使用される。
「高い物理力価」は、２００ng  ｐ２４/mLより高い、好ましくは２１０ng  ｐ２４/mLより高い、さらにより好ましくは３００ng  ｐ２４/mLより高い、工程ｂ）の終了時に産生される粒子の力価を意味する。より好ましくは、工程ｂ）の終了時に産生される、ＥＲＶシンシチンを用いて偽型化された粒子（例えばＨＥＲＶ−Ｗなど）の物理力価は、３００ng  ｐ２４/mLより高く、好ましくは４００ng  ｐ２４/mLより高い。より好ましくは、工程ｂ）の終了時に産生される、ＥＲＶシンシチンを用いて偽型化された粒子（例えばＨＥＲＶ−ＦＲＤなど）の物理力価は、２１０ng  ｐ２４/mLより高く、好ましくは３００ng  ｐ２４/mLより高い。
「高い物理力価」はまた、１×１０５ng  ｐ２４/mLより高い、好ましくは１．１×１０５ng  ｐ２４/mLより高い、より好ましくは１．５×１０５ng  ｐ２４/mLより高い、工程ｃ）の終了時に産生される（即ち、濃縮される）  粒子の力価を意味する。より好ましくは、工程ｃ）の終了時に産生される、ＥＲＶシンシチンを用いて偽型化された粒子（例えばＨＥＲＶ−Ｗなど）の物理力価は、２．２×１０５ng  ｐ２４/mLより高い、好ましくは３．０×１０５ng  ｐ２４/mLより高い、さらにより好ましくは４、０×１０５ng  ｐ２４/mLより高い。より好ましくは、工程ｃ）の終了時に産生される、ＥＲＶシンシチンを用いて偽型化される粒子（例えばＨＥＲＶ−ＦＲＤなど）の物理力価は、１．１×１０５ng  ｐ２４/mLより高い、好ましくは１．５×１０５ng  ｐ２４/mLより高い。
【００３５】
Farsonら（Hum. Gene Ther. 2001）に従い、ｐ２４の１フェムトグラム（fg）はレンチウイルスの１２の物理的粒子（ｐｐ）に相当すると推定することができる。理論に拘泥することを望まないが、本発明者らは、ｐ２４に基づいて得られたこの算出された数の物理的粒子は、自動カウンター（例えばNanosight NS300装置）を用いた直接的な粒子計数により得られた値と比較してわずかに過大評価される。なぜなら、ｐ２４単独でも考慮されるからである。一般的に、ｐ２４  ＥＬＩＳＡを用いて算出した粒子が、自動カウンターを用いて測定した粒子よりも平均で約４倍多いと推定することができる（下記の実施例３における補足表Ｓ６を参照のこと）。このように、１×１０５ng  ｐ２４/mLより高い物理力価は、Nanosight計数により測定される通り、算出される物理粒子１．２×１０１２（pp）/mLより高い、又は約３×１０１１pp/mLより高い物理力価に相当する。
【００３６】
「感染力価」は機能的レンチウイルス粒子の数を意味する。感染力価は、当技術分野において公知の古典的方法に従って、例えば、形質導入単位力価（TU/ml）を算出するためのフローサイトメトリーにより、又は感染性ゲノム（ig/mL）を測定するためのｑＰＣＲ（実施例において例証する）により測定してもよい。そのような方法を記載した刊行物はKutner RH, Zhang XY, Reiser J (2009). Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature protocols 4: 495-505である。本発明のレンチウイルス粒子の感染力価は、許容細胞株、好ましくは２９３Ｔ細胞、又は別の許容細胞（例えばＡ２０細胞など）の感染時に、より好ましくは、本明細書に記載する滴定方法を本願の実験例のセクションに使用して測定する。
「高感染力価」は、２Ｅ＋０４TU/mlより高い、好ましくは１Ｅ＋０５TU/mlより高い、より好ましくは１Ｅ＋０６TU/mlより高い、さらにより好ましくは２＋０６TU/mlより高い、工程ｃ）の終了時に産生される感染性粒子の力価を意味する。より好ましくは、工程ｃ）の終了時に産生される、ＨＥＲＶ−Ｗを用いて偽型化された粒子の感染力価は、１，２Ｅ＋０５TU/mlより高く、好ましくは２Ｅ＋０５TU/mlより高く、より好ましくは  １Ｅ＋０６TU/mlより高く、さらにより好ましくは１．５Ｅ＋０６TU/mlより高い。より好ましくは、工程ｃ）の終了時に産生される、ＨＥＲＶ−ＦＲＤを用いて偽型化された粒子の感染力価は、２Ｅ＋０４TU/mlより高く、好ましくは２Ｅ＋０５TU/mlより高く、より好ましくは１Ｅ＋０６TU/mlより高く、さらにより好ましくは２．５Ｅ＋０６TU/mlより高い。好ましくは、そのような高感染力価は、２９３Ｔ細胞感染及び本明細書中の実施例に記載する滴定方法を使用して測定する。
【００３７】
本発明はまた、ＨＥＲＶ−Ｗ又はＨＥＲＶ−ＦＲＤを用いて偽型化し、目的の異種遺伝子をパッケージングする安定なレンチウイルス粒子に関する。これは、上記の方法により入手可能でありうる、又は得てもよい。
【００３８】
「安定」は、ＥＲＶシンシチン（例えば以前に定義したＥＲＶシンシチンなど）を用いて偽型化され、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、より優先的には、マウスシンシチンＡを用いて偽型化され、そして本発明の目的の異種遺伝子をパッケージングし、２９３Ｔ細胞又は別の許容細胞株、例えばＡ２０細胞を感染させた、安定なレンチウイルス粒子の感染力価を、２つの連続する時点の間で最大１０により分割したことを意味する。２つの連続する時点は、数週間（例えば１〜３週間など）の期間を表しうる。２つの連続する時点はまた、数ヶ月、例えば１、２、もしくは３ヶ月、又は６、９、１０ヶ月、又はさらに１２もしくは１８ヶ月などの期間を表しうる。本発明に従ったレンチウイルス偽型化粒子は凍結してもよく、それらはその安定性特性を保持する。それらは実際に、非常に低温の処理、例えば凍結又は凍結保存などに耐性である。それらはまた、中温処理に耐性でありうる：それらが上記の安定性特性を提示するや否や、それらは本発明に相当する。
そのようなレンチウイルス偽型化粒子は、このように、それらの融合特性及び感染特性、ならびに特にインビボで目的の遺伝子を送達するその能力を維持しながら、遠心分離及び／又は凍結することができる。ここでも、本発明に従った目的の異種遺伝子をパッケージングする安定な偽型化レンチウイルス粒子は、高い物理力価ならびに高い感染力価を提示する。
【００３９】
「異種」遺伝子は、レトロウイルスのｒｅｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌ遺伝子の１つと異なる生物から由来する遺伝子を意味する。
「目的の遺伝子」は遺伝子の機能的なバージョンを意味する。機能的バージョンとは、前記遺伝子の野生型バージョン、同じ科に属する変異型遺伝子、又はコードされたタンパク質の機能性を保存する切断型バージョンを意味する。
目的の遺伝子は、患者において欠損している又は非機能的である遺伝子、あるいは免疫原性タンパク質（例えばウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は腫瘍抗原など）をコードする遺伝子から由来しうる。目的の異種遺伝子はまた、レポーター遺伝子（診断目的のため、及び標的タンパク質のリガンドを同定するために有用）、自殺遺伝子、又は治療用ＲＮＡをコードする（即ち、標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列に相補的なアンチセンスＲＮＡ、又はｇＲＮＡ、ＲＮＡｉ、例えばｓｈＲＮＡなどをコードする）遺伝子でありうる。目的の遺伝子は、コードされたタンパク質、ペプチド、又はＲＮＡを産生することができる。
「偽型」は、以下を含むレンチウイルス粒子を意味する：
−ウイルスから由来するエンベロープ糖タンパク質であって、前記ウイルスは前記レンチウイルス粒子が由来するウイルスとは異なる；
−修飾されたエンベロープ糖タンパク質。そのような場合において、天然ウイルスエンベロープ糖タンパク質は、変異により又は任意の他のアミノ酸修飾により修飾されうる；又は
−キメラ糖タンパク質。そのような糖タンパク質は、ウイルス糖タンパク質の少なくとも一部と別の配列の間での融合タンパク質である。
【００４０】
工程ａ）において、適当な細胞株を、少なくとも１つのプラスミドを用いてトランスフェクトする。好ましくは、トランスフェクションは一過性トランスフェクションである。
【００４１】
好ましくは、適当な細胞株を、少なくとも１、２、３、又は４つのプラスミドを用いてトランスフェクトする。これらの細胞型には、レンチウイルスのライフサイクルを支持する任意の真核細胞が含まれる。
【００４２】
好ましくは、適当な細胞株は、シンシチンの融合効果の破局的な結果に抵抗性の安定した細胞株又は細胞株であり、粒子を産生する間に増殖を継続するようにする。前記の適当な細胞株は哺乳動物細胞株、好ましくはヒト細胞株である。そのような細胞の代表的な例には、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３細胞及びその誘導体、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ならびに接着細胞として増殖するその能力について選択された、又は無血清条件下で浮遊状態において増殖するように適合された細胞のサブセットが含まれる。そのような細胞は高度にトランスフェクション可能である。
一実施形態において、適当な細胞株は、目的の異種遺伝子、レトロウイルスのｒｅｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌ遺伝子、ならびに好ましくは誘導型でＥＲＶシンシチン（例えばＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡなど）をコードする核酸である５つの配列の少なくとも１つ、最大４つを既に発現している。そのような場合において、工程ａ）は、前記細胞株においてまだ発現されていない少なくとも１つの配列を含む少なくとも１つのプラスミドを用いて前記細胞株をトランスフェクトする工程を含む。プラスミド混合物、又は単一プラスミド（１つだけのプラスミドが使用される場合）は、工程ａ）において前記細胞株中にトランスフェクトされた場合、前記細胞株が上記の５つの全ての配列を発現するように選ぶ。
例えば、適当な細胞株がレトロウイルスのｒｅｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌ遺伝子を発現する場合、トランスフェクトされるプラスミド又はプラスミドの混合物は、発現される残りの配列、即ち、目的の異種遺伝子及びＥＲＶシンシチン（例えばＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡなど）をコードする核酸を含む。
【００４３】
１つの単一プラスミドを使用する場合、それは目的の５つの全ての配列、即ち：
−目的の異種遺伝子、
−ｒｅｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌ遺伝子、ならびに
−以前に記載したＥＲＶシンシチンをコードする、特にＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡをコードする核酸を含む。
【００４４】
２又は３のプラスミドを使用する場合（プラスミド混合物）、それらの各々が、前の段落に記載する目的の配列の一部を含み、プラスミド混合物が、上で引用する全ての目的の配列を含むようにする。
【００４５】
好ましくは、４つのプラスミドを使用し、四重トランスフェクションは以下を含む：
−第１のプラスミドは目的の遺伝子を含み、
−第２のプラスミドはｒｅｖ遺伝子を含み、
−第３のプラスミドはｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を含み、ならびに
−第４のプラスミドは、以前に記載したＥＲＶシンシチンをコードする、特にＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡをコードする核酸を含む。
前記四重トランスフェクションは、好ましくは、４つのプラスミド間の特定の比率で実施する。異なるプラスミド間のモル比は、産生のスケールアップを最適化するために適合させることができる。当業者であれば、目的のレンチウイルスを産生するために使用する特定のプラスミドにこのパラメータを適応することができる。特に、第１、第２、第３、第４のプラスミドの重量比は、好ましくは、（０．８−１．２）：（０．１−０．４）；（０．５−０．８）：（０．８−１．２）、より好ましくは約１：０．２５；０．６５：１である。
【００４６】
ｒｅｖ、ｇａｇ、及びｐｏｌ遺伝子はレトロウイルス性であり、好ましくはレンチウイルス性である。好ましくは、それらはＨＩＶ遺伝子、好ましくはＨＩＶ−１遺伝子であるが、ＥＩＡＶ（馬伝染性貧血ウイルス）、ＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）、Ｆｏａｍｙウイルス、又はＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）ウイルス遺伝子でもよい。
ＥＲＶシンシチン（例えば以前に定義したＥＲＶシンシチンなど）をコードし、より好ましくはＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡをより優先的にコードする核酸は、ＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列である。好ましくは、それは、配列番号１、２、又は４０にそれぞれ列挙するｃＤＮＡ配列、あるいは、そのような配列番号１、２、又は４０と少なくとも８０%、好ましくは少なくとも９０%、より好ましくは少なくとも９５%、より好ましくは少なくとも９９%の同一性をそれぞれ提示する配列に対応する。好ましくは、工程ａ）は、少なくとも配列番号３又は４に列挙するｃＤＮＡ配列を含む、好ましくはそれからなる、少なくともプラスミドのトランスフェクションを含む。
用語「同一性」は、２つのポリペプチド分子間又は２つの核酸分子間の配列類似性を指す。両方の比較配列中の位置が同じ塩基又は同じアミノ酸残基により占められる場合、それぞれの分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性のパーセンテージは、２つの配列により共有されるマッチング位置の数を、比較位置の数で除し、１００を掛けた数に対応する。一般的に、２つの配列を整列させて最大の同一性を与える場合に比較を行う。同一性は、例えば、ＧＣＧ（Genetics Computer Group、GCG Package、Version 7（ウィスコンシン州マジソン）用のプログラムマニュアル）パイルアッププログラム、又は配列比較アルゴリズム（例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、又はＣＬＵＳＴＡＬＷなど）のいずれかを使用したアラインメントにより算出してもよい。
【００４７】
使用されうるエンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドは、当業者に公知であり、例えば市販のｐＣＤＮＡ３、バックボーン、又は類似の発現系を使用した、例えばＣＭＶプロモーターを使用した任意の他のプラスミドカセット、例えばMertenら（Hum Gene Ther., 2011）に記載されるｐＫＧプラスミドなどである。
【００４８】
工程ａ）に従い、当技術分野において公知の種々の技術を、核酸分子を細胞中に導入するために用いてもよい。そのような技術には、化合物、例えばリン酸カルシウム、カチオン性脂質、カチオン性ポリマーを使用した化学促進トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、例えばリポフェクタミン（Lipofectamine 2000又は3000）などのカチオン性リポソームなど、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、非化学的方法、例えばエレクトロポレーション、粒子衝撃、又はマイクロインジェクションなどが含まれる。
本発明の好ましい実施形態に従い、工程ａ）のトランスフェクションは、リン酸カルシウムを使用して行う。
【００４９】
典型的には、工程ａ）は、リン酸カルシウムの存在において、４つのプラスミドを用いた２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクション（四重トランスフェクション）により実施してもよい。４つのプラスミドは、好ましくは以下である：ＨＩＶ−１  ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を発現するｐＫＬプラスミド、ＨＩＶ−１  ｒｅｖ遺伝子を発現するｐＫプラスミド、細胞プロモーター、例えばヒトホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなどの制御下で目的の異種遺伝子を発現するｐＣＣＬプラスミド  及びＥＲＶシンシチン（例えば以前に定義したＥＲＶシンシチウムなど）を発現し、ＣＭＶプロモーターからＨＥＲＶ−Ｗ（シンシチン１）、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ（シンシチン２）、又はマウスシンシチンＡ糖タンパク質をより優先的に発現するｐＣＤＮＡ３プラスミド。
【００５０】
次に、工程ａ）の後、本発明に従った方法は、ａ）において得られたトランスフェクト細胞をインキュベートする工程ｂ）を含み、それらは、好ましくは上清中にＥＲＶシンシチン（例えば以前に定義したＥＲＶシンシチンなど）を用いて偽型化され、目的の異種遺伝子を含む、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡを用いてより優先的に偽型化されたレンチウイルス粒子を産生するようにする。実際、一度、工程ａ）が実施されると、得られた細胞のインキュベーションが実施される。これは、ＥＲＶシンシチン（例えば以前に定義したＥＲＶシンシチンなど）を用いて偽型化され、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡを用いてより優先的に偽型化され、目的の異種遺伝子を含む安定なレンチウイルス粒子の上清中での産生に導く。
トランスフェクション後、トランスフェクト細胞は、このように、トランスフェクション後２０〜７２時間、特に２４時間後に含まれる時間にわたり増殖させる。
特定の実施形態において、細胞を培養するために使用される培地は、糖（例えばグルコースなど）を含む古典的培地（例えばＤＭＥＭなど）である。好ましくは、培地は無血清培地である。培養は、懸濁液中の細胞の培養に適応させた多数の培養装置（例えばマルチスタックシステム又はバイオリアクターなど）で行ってもよい。バイオリアクターは、使い捨て（ディスポーザブル）又は再利用可能なバイオリアクターでありうる。バイオリアクターは、例えば、培養容器又はバッグ及びタンクリアクターより選択してもよい。非限定的な代表的なバイオリアクターには、ガラスバイオリアクター（例、B-DCU（登録商標）2L-10L、Sartorius）、ロッキング運動撹拌機、例えばウェーブバイオリアクター（例、Cultibag RM10L-25L、Sartorius）などを利用した使い捨てバイオリアクター、使い捨て撹拌タンクバイオリアクター（Cultibag STR（登録商標）50L、Sartorius）、又はステンレス鋼タンクバイオリアクターが含まれる。
【００５１】
インキュベーション後、得られた安定なレンチウイルス粒子を収集し、濃縮する。これは工程ｃ）である。好ましくは、ｂ）において得られた安定なレンチウイルス粒子は、トランスフェクト細胞の融合前に、より好ましくはトランスフェクション後２４時間で収集する。好ましくは、ｂ）において得られた上清中に存在する安定なレンチウイルス粒子を遠心分離及び／又は精製する。前記濃縮工程ｃ）は、当技術分野における任意の公知の方法、例えば遠心分離、限外濾過／ダイアフィルトレーション、及び／又はクロマトグラフィーなどにより実施してもよい。
【００５２】
一実施形態に従い、上清は、４００００〜６００００gの間で、１時間〜３時間１℃〜５℃の温度で遠心分離し、安定な偽型化ウイルス粒子の遠心分離を得るようにする。
好ましくは、遠心分離は、１時間３０分〜２時間３０分間２℃〜５℃、好ましくは約４℃の温度で４５０００〜５５０００gの間のスピードで実施する。この工程の終了時に、粒子を遠心分離物の形態で濃縮し、これを使用してもよい。
【００５３】
別の実施形態に従い、工程ｃ）はクロマトグラフィー（例えば陰イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーなど）である。陰イオン交換クロマトグラフィーを、限外ろ過の工程、特にタンジェンシャルフローフィルトレーションを含む限外ろ過／ダイアフィルトレーションの前又は後に行ってもよい。陰イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、弱陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥ（Ｄ）−ジエチルアミノエチル、ＰＩ−ポリエチレンイミンを含む）である。
【００５４】
この方法によって、ＥＲＶシンシチン（例えば以前に定義したＥＲＶシンシチンなど）を用いて偽型化され、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡを用いてより優先的に偽型化されたレンチウイルス粒子を得ることが可能になる。前記粒子は、上記の方法のおかげで、それらは、実施例に示すように、分解されることなく濃縮することができるため安定である。さらに、前記粒子は目的の異種遺伝子を含む。
【００５５】
好ましくは、ＥＲＶシンシチウム（例えば以前に定義したＥＲＶシンシチウムなど）を用いて偽型化され、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡを用いてより優先的に偽型過され、本発明に従った目的の遺伝子をパッケージングする安定なレンチウイルス粒子は、医薬的に許容可能な担体中に懸濁し、医薬組成物を得るようにする。
「医薬的に許容可能な担体」は、適宜、哺乳動物、特にヒトに投与した場合、有害な、アレルギー性の、又は他の都合の悪い反応を産生しない賦形剤を指す。医薬的に許容可能な担体又は賦形剤は、任意の型の非毒性固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料、又は製剤補助剤を指す。
好ましくは、医薬組成物は賦形剤を含み、それは、注射することが可能な製剤用に医薬的に許容可能である。これらは、特に、等張性の無菌生理食塩水（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、もしくは塩化マグネシウムなど、又はそれらの塩の混合物）又は乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であってもよく、それによって、場合に依存し、滅菌水又は生理食塩水の添加時に注射溶液の構成が可能になる。
注射可能な使用のために適切な医薬形態には、滅菌水溶液又は懸濁液が含まれる。この溶液又は懸濁液は、エンベロープを有するウイルスに適合し、標的細胞中へのウイルスの侵入を妨げない添加剤を含みうる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、簡単な注射可能性が存在する程度まで流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば細菌及び真菌など）の混入作用に対して保存されなければならない。適当な溶液の例は、緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などである。
【００５６】
本発明の安定な偽型化レンチウイルス粒子は、目的の異種遺伝子をパッケージングするため、医薬品として使用してもよい。
実際に、本願において提供する結果は、本発明のシンシチン偽型化レンチウイルスベクターがヒトにおける免疫療法において使用することができ、ヒト疾患におけるＢ細胞を機能的に補正することができることを明らかに実証する。さらに、本発明のシンシチン偽型化ベクターは、インビボでＢ細胞を標的とすることができる。本明細書において示すデータは、遺伝子導入が長期間にわたり観察されるため、これらの新たなツールがインビボで非常に良好に許容されることを例証した。インビボでの適用のために、標的細胞（例えばＢ細胞など）の効率的な形質導入を、ベクトフシン１を必要とすることなく得ることができる。
このように、安定な偽型化レンチウイルス粒子は、遺伝子治療もしくは免疫療法において、又はワクチンとして、又は免疫予防において使用されうる。
遺伝子治療は、遺伝子導入、遺伝子編集、エキソンスキッピング、ＲＮＡ干渉、トランススプライシング、又は核、ミトコンドリア、もしくは共存ＤＮＡ（細胞中に含まれるウイルス配列）中に含まれるものを含む、細胞中の任意のコード配列又は調節配列の任意の他の遺伝子改変により実施することができる。
遺伝子治療の主な２つの型は以下である：
−欠損／異常遺伝子の置換を目的とした治療：これは置換遺伝子治療である；
−遺伝子編集を目的とした治療：そのような場合において、目的は、目的とする遺伝子が発現されるように必要なツールを細胞に提供することである：これは遺伝子編集治療である。
【００５７】
置換遺伝子治療において、目的の遺伝子は、例えば遺伝病での場合のように、患者において欠損又は変異している遺伝子の補正バージョンでありうる。そのような場合において、目的の遺伝子によって、欠損又は変異した遺伝子の発現が回復されうる。免疫細胞において、好ましくはＢ細胞、Ｔ細胞、単球、又は樹状細胞において、より好ましくはＢ細胞において一度補正されると、患者の疾患又は症状を改善する疾患を示す患者における欠損又は変異遺伝子が特に興味深い。遺伝的に欠損したＢ細胞中での変異遺伝子の例は以下の通りである：
−Ｘ連鎖性重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ−Ｘ１）（患者はＴ−ＮＫ−Ｂ  ＋表現型を有する）において、又は遺伝子治療により既に処置されているが、Ｂ細胞補正が誘発されなかったＳＣＩＤ−Ｘ１患者についてガンマ鎖をコードする遺伝子；
−共通の可変免疫不全症（ＣＶＩＤ）において変異しているＴＡＣＩ（膜貫通アクチベーター及びカルシウムモジュレーター及びシクロフィリンリガンド相互作用因子）をコードする遺伝子ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ；
−共通の可変免疫不全症（ＣＶＩＤ）において変異しうるＣＤ１９又はＢＡＦＦＲ遺伝子；
−特にＣＤ４０をコードする遺伝子の変異により起こされる高免疫グロブリンＭに関与する遺伝子のいずれか；
−幹細胞ベースの遺伝子治療により既に処置され、Ｂ細胞補正が不完全であるＷＡＳ患者を含むＷｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群において変異したＷＡＳ遺伝子；
−ファンコニ貧血サブタイプのいずれか、例えばＦａｎｃＡ又はＦａｎｃＣにおいて変異しているＦａｎｃ遺伝子；
−高免疫グロブリンＥに関与する遺伝子のいずれか。
このように、これらの遺伝子は目的の遺伝子として使用することができた。
【００５８】
食細胞機能の遺伝性疾患、特に非機能性又は異常な単球又は樹状細胞の産生に導き、前記単球又は樹状細胞中の原因遺伝子を発現又は補正することにより処置することができる遺伝性疾患における変異遺伝子の例は以下である：ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ遺伝子）、肉芽腫性疾患（ＣＧＤ、ＣＹＢＢ、又はＰ４７遺伝子）、白血球接着欠損症（ＬＡＤ）、ＩＬ１２／２３欠損症（ＩＬ１２  Ｐ４０、Ｐ７０、ＩＬ２３鎖）、ＨＬＡに非存在に起因する裸リンパ球症候群、自己炎症性障害、例えば家族性地中海熱（ピリン遺伝子）又はクリオピリン関連疾患（ＮＡＬＰ３変異）など。
【００５９】
置換遺伝子治療はまた、癌を処置するために使用することができうる。癌における目的の遺伝子は、腫瘍細胞の細胞周期又は代謝及び遊走を調節する、あるいは腫瘍細胞死を誘導することができうる。例えば、誘導性カスパーゼ９をＢ細胞白血病又はＢ細胞リンパ腫において発現させ、好ましくは持続的な抗腫瘍免疫応答を誘発するための併用治療において細胞死をトリガーすることができうる。
【００６０】
ＥＲＶシンシチン（例えばシンシチン１又はシンシチン２など）の受容体を発現する細胞を含む疾患も、これらの細胞中への遺伝子導入により処置することができうる。例えば、胎盤細胞を処置することができうる妊娠病理を引用することができる：癌、例えば悪性細胞を処置することができうる白血病、リンパ腫、又は固形腫瘍細胞（ＡＳＣＴ２又はＭＦＳＤ２ａを発現することが公知である乳房又は肺腫瘍細胞を含む）など；血液脳関門の内皮細胞を処置することができうる神経学的状態；又はこれらの細胞が関与する任意の遺伝的もしくは後天的状態。
【００６１】
遺伝子治療において、免疫細胞工学、好ましくはＢ細胞工学のための治療において、前記免疫細胞を形質導入することにより、本発明の安定な偽型化レンチウイルス粒子を使用することが可能でありうる。Ｂ細胞において免疫抑制タンパク質（例えばＩＬ−１０）を発現させることにより調節性Ｂ細胞を生成すること、又は免疫調節タンパク質（例えば抗体又は融合タンパク質など）の産生を誘導することが可能でありうる。
【００６２】
遺伝子スプライシング、発現、もしくは調節又は遺伝子編集に有利な配列を挿入することも可能でありうる。ツール（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９など）をこの目的のために使用してもよい。これは、自己免疫又は癌の場合においてＢ細胞中での遺伝子発現を改変するために、又はＢ細胞中でのウイルスの周期を撹乱させるために使用することができうる。そのような場合において、好ましくは、目的の異種遺伝子は、ｇＲＮＡ、ヌクレアーゼ、ＤＮＡ鋳型、及びＲＮＡｉ成分（例えばｓｈＲＮＡなど）より選択する。
遺伝子編集の特定の例は、ワルデンストレームマクログロブリン血症の処置であろう：そのような疾患において、（ＭＹＤ８８）の点変異（Ｌ２６５Ｐ）が患者の８０〜８８%のＢ細胞中で観察されており、これらの腫瘍細胞の生存及び持続性に寄与する。このように、罹患患者においてこの遺伝子の補正バージョンを遺伝子編集することにより、これは、この疾患に対する効果的な治療に寄与しうる。
【００６３】
本発明の安定な偽型化レンチウイルス粒子は、異なる受容体を通じて同じ細胞を標的とするために一緒に又は連続的に使用することができうる。これは、遺伝子編集プラットフォームの複数の成分を細胞に加える必要がある戦略（例えば遺伝子編集など）において利点となりうる。
【００６４】
遺伝子編集治療において、本発明の安定な偽型化レンチウイルス粒子を用いて免疫細胞、好ましくはＢ細胞を形質導入することも可能でありうる。好ましくは次に、目的の異種遺伝子が免疫グロブリンをコードする場合、次に形質導入されたＢ細胞は対応する免疫グロブリンを産生することができる。例は、病原体、例えばウイルス（狂犬病、ＨＩＶ、エボラ、インフルエンザ、ＣＭＶ、Ｚｉｋａ）又は寄生虫（Ｔ．クルーズ、Ｐ．ファルシパルム）などの特異的認識を付与する可変免疫グロブリン領域の公知の配列を操作することでありうるが、それは、予防的もしくは治療的使用のために又は診断のために使用することができうる。
形質導入された免疫細胞がマクロファージである場合、次に治療は、抗炎症治療、寛容誘導、又はワクチン接種でありうる。
形質導入された免疫細胞がＢ細胞である場合、次に治療は、自己免疫疾患を処置するためでありうる。
形質導入された免疫細胞が樹状細胞である場合、次に治療はワクチンとしてでありうる。
例えば、同種異系の臓器ドナーに特異的な主要又は副組織適合抗原を用いて形質導入されたレシピエントの未成熟樹状細胞を使用し、レシピエントにおいて同種異系の臓器移植寛容を誘導してもよい。
また、抗原提示細胞（例えばヒトＢ細胞、ヒト骨髄性樹状細胞、又は単球など）の遺伝子操作を介した免疫療法の適用は、感染性疾患に対して防御するためのワクチン接種の目的のための抗原提示のために；癌を処置するために；あるいは炎症性免疫成分を用いて疾患（例えば糖尿病又はアルツハイマー病など）を処置するため、又は臓器もしくは骨髄移植を促進するために、細胞特異的又は抗原特異的免疫寛容を誘導する目的のために、これらの細胞中に、免疫調節配列と関連する又はしない抗原性配列を含む組換え遺伝子発現カセットを導入することにより見出されうる。
【００６５】
遺伝子治療において、標的組織は免疫細胞だけでなく、胎盤ならびにシンシチン媒介性異種融合が生じる任意の組織、又はシンシチンの受容体を発現する任意の組織もしくは任意の細胞でもありうる。例として、子癇前症を予防するために胎盤を処置する可能性が含まれる。子癇前症は妊産婦死亡率の主要な原因であり、一部の試験では、子癇前症の胎盤において、異なって発現されたマイクロＲＮＡによってＴＧＦ−β２応答が脱調節されることが検出されている（Zhou et al Sci Rep. 2016 Jan 29;6:19910. doi: 10.1038/srep19910.）。恐らくは、シンシチン偽型化ベクターの使用を通じた胎盤細胞における遺伝子導入又は遺伝子編集によって、この問題が補正されうる。恐らくは、標的組織は骨格筋でありうる。なぜなら、シンシチンが筋芽細胞中で発現されて、筋芽細胞間の融合に寄与しうることが最近示されたためである（Frese et al., 2015）。恐らくは、骨格筋細胞上の受容体を認識しうるシンシチン偽型化ベクターが、筋肉遺伝子治療のために使用されうる。
【００６６】
本明細書で使用するように、用語「患者」は哺乳動物を意味する。好ましくは、本発明に従った患者はヒトである。
免疫細胞は、免疫系に含まれる細胞である。それは、特にＢ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、及び樹状細胞を含む。
Ｂ細胞（又はＢリンパ球）は、抗体の産生に関与する免疫細胞であり、体液性免疫応答に含まれる。
樹状細胞は免疫細胞であり、それはアクセサリーである：それは抗原提示細胞である。その主な機能は、抗原材料を処理し、それをその細胞表面上でＴ細胞に提示することである。
Ｔ細胞（又はＴリンパ球）は、細胞媒介性免疫応答に含まれる免疫細胞である。それは、キラーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、及びガンマデルタＴ細胞より選んでもよい。
【００６７】
安定な偽型化レンチウイルス粒子は、免疫療法において、又はワクチンとして、又は免疫予防において使用してもよい。そのような場合において、目的の異種遺伝子は、免疫原性タンパク質、例えばウイルスタンパク質、細菌タンパク質、又は腫瘍抗原などをコードしてもよい。そのような場合において、遺伝子の発現によって免疫応答が刺激されて、免疫化が可能になる。これはワクチンに相当する。免疫予防において、目的の異種遺伝子は、免疫不全患者において悪性形質転換を起こしうるＢ細胞ウイルス感染（例えばＥＢＶ感染など）を予防するタンパク質をコードしてもよい。
このように、本発明はまた、免疫細胞、好ましくはＢ細胞を形質導入することによる治療のための、ＥＲＶシンシチン（例えば以前に定義したＥＲＶシンシチンなど）を用いて偽型化され、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡを用いてより優先的に偽型化され、目的の異種遺伝子をパッケージングする安定なレンチウイルス粒子の使用に関する。
【００６８】
本発明はまた、ヒトＢ細胞における生物工学のための、ＥＲＶシンシチン（例えば以前に定義したＥＲＶシンシチンなど）を用いて偽型化され、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡを用いてより優先的に偽型化され、目的の異種遺伝子をパッケージングする安定なレンチウイルス粒子の使用に関する。例えば、病原体（例えばＨＩＶ−１など）又は寄生虫（例えばプラスモジウムなど）に対して向けられた組換え抗体をヒトＢ細胞中での遺伝子導入により発現させて、これらの病原体の迅速な認識及び中和毒素を促進することからなる、ベクター化抗体のＢ細胞中での産生を引用することができる。異なる系においてマウス中でベクター化された組換え抗体の例が、「Balazs AB, et al. Nat Med. 2014 Mar;20(3): 296-300. doi: 10.1038/nm」又は「Deal C et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Aug 26; 111(34): 12528-32. doi: 10.1073/pnas.1407362111」に記載されている。
ヒトＢ細胞における生物工学はまた、遺伝子、例えば抗アポトーシス遺伝子又はＢ細胞癌遺伝子（例えばＢｃｌ６又はＢｃｌＸなど）などを用いて抗原応答性ヒトＢ細胞（例えば、ＣＤ２７  ＋胚中心Ｂ細胞）を、「Kwakkenbos MJ et al. Nat Med. 2010 Jan;16(1):123-8. doi: 10.1038/nm.2071. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming」に記載されているように、病原体に応答するそのような細胞を増殖させ、それらの抗体配列を選択する目的のために、不死化させるための遺伝子導入を使用することからなりうる。
【００６９】
ＥＲＶシンシチン（例えば以前に定義したＥＲＶシンシチンなど）を用いて偽型化され、より優先的には、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡを用いて偽型化され、目的の異種遺伝子をパッケージングする前記レンチウイルス粒子は、例えば注射により患者自体に投与してもよい。そのような場合において、免疫細胞の形質導入はインビボで行われる。別の代替法では、患者の免疫細胞、好ましくはＢ細胞又はそれらの前駆細胞のサンプルを先に採取し、次に前記レンチウイルス粒子をサンプルの免疫細胞又はそれらの前駆細胞中に注入し（即ち、インビトロ）、処理サンプルを最終的に患者に再投与する。この後者の場合において、前記レンチウイルス粒子を用いて感染させ、このように目的の異種遺伝子を含む免疫細胞又はそれらの前駆細胞のサンプルが医薬品である。このように、本発明はまた、治療において、又は（目的の異種遺伝子がレポーター遺伝子である場合に）診断目的のために、前記レンチウイルス粒子を用いて感染させた免疫細胞又はそれらの前駆細胞のサンプルの使用を目的とする。
【００７０】
本発明はまた、免疫不全、自己免疫、感染性疾患、又はＢ細胞関連癌を処置するための、異種遺伝子を含むＨＥＲＶ−Ｗ又はＨＥＲＶ−ＦＲＤを用いて偽型化されたレンチウイルス粒子の使用に関する。
「免疫不全」は、微生物（細菌性、ウイルス性、寄生虫性）感染の数もしくは重症度の増加又は抗腫瘍サーベイランスの低下及び癌の頻度の増加に導く状態を意味する。
この目的のために、目的の異種遺伝子は、自殺遺伝子、「ドミナントネガティブ」遺伝子、標的細胞活性化をブロックする抗体をコードする遺伝子、癌遺伝子の発現を補正するタンパク質をコードする遺伝子、又は  Ｂ細胞の形質転換体ウイルス（例えばバーキット症候群の場合におけるＥＢＶなど）のウイルスサイクルを低下又は変化させるタンパク質をコードする遺伝子でありうる。
【００７１】
「自己免疫」は自己免疫疾患を意味する。それらは、前記身体の健常細胞に対する身体の異常な免疫応答を含む状態に相当する。自己免疫は臓器又は組織に限定されうる。自己免疫疾患、特にＢ細胞枯渇戦略（即ち、リツキシマブ）による処置に感受性であり、それらを死滅させる意図で（例えばカスパーゼ９又は誘導性カスパーゼ９  、チミジンキナーゼ、又は任意の他の「自殺遺伝子」など）、又は免疫調節遺伝子（例えばＩＬ−１０など）を発現することによりそれらの機能を免疫調節する意図で、病的Ｂ細胞において遺伝子を発現させることにより処置することができうる自己免疫疾患は、例えば以下である：関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、特発性血小板減少性紫斑病、抗好中球細胞質抗体関連血管炎（ＡＮＣＡ血管炎）、グレーブス病、全身性硬化症、自己免疫性溶血性貧血、尋常性天疱瘡、寒冷凝集素疾患、シェーグレン症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、クリオグロブリン血症、ＩｇＭ媒介性ニューロパチー、多発性硬化症、視神経脊髄炎、特発性膜性腎症、皮膚筋炎、自己免疫性神経障害、血友病Ａ、又は臓器拒絶による臓器移植（腎臓）合併症もしくは移植片対宿主病により起こされる骨髄移植合併症。
【００７２】
「感染性疾患」は、病原性微生物（例えば細菌、ウイルス、寄生虫、又は真菌など）により起こされる疾患を意味する；この疾患は、直接的又は間接的に、ある人から別の人に伝染しうる。細菌感染症は、連鎖球菌、ブドウ球菌、及び大腸菌に起因しうる。ウイルス感染症は、パピローマウイルス科、ポリオーマウイルス科（ＢＫウイルス、ＪＣウイルス）、ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス１型又は２型、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バールウイルス、サイトメガロウイルス）、ポックスウイルス科（天然痘）、ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎）パルボウイルス科（パルボウイルスＢ１９）、カリシウイルス科（ノルウォークウイルス）、ピコルナウイルス科（コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（重症急性呼吸器症候群ウイルス）、フラビウイルス科（Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、ＴＢＥウイルス、ジカウイルス、レトロウイルス科（ＨＩＶ）、フィロウイルス科（エボラウイルス、マールブルクウイルス）、オルトミクソウイルス科（インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス科（麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）、及びラブドウイルス科（狂犬病ウイルス）に起因しうる。寄生虫感染症は、原生生物（例えばプラスモジウム属など）、蠕虫生物、又は外部寄生虫に起因しうる。真菌感染症は、癜風、皮膚糸状菌（ミクロスポルム、トリコフィトン、エピデルモフィトン）、又はカンジダ・アルビカンスに起因しうる。
【００７３】
本明細書中で使用するように、用語「Ｂ細胞関連癌」は、Ｂ細胞の無秩序な細胞増殖により典型的に特徴付けられる哺乳動物における病理学的状態を指す。Ｂ細胞悪性腫瘍は、急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、ワルデンスレームマクログロブリン血症、又は任意の型のＢ細胞リンパ腫（プソクローヌス・ミオクローヌスを含む）、及び任意の型のウイルス誘発Ｂ細胞病理、例えばエプスタイン・バーウイルスによるものなどでありうるが、それにおいて、治療効果は、細胞周期モジュレーター又は抗発癌遺伝子配列（例えば、ｐ５３、癌遺伝子に対するアンチセンス配列、癌遺伝子に対するｓｈＲＮＡなど）又は自殺遺伝子（例えばｉｃａｓｐ９、チミジンキナーゼなど）又は抗ウイルス配列又は腫瘍細胞による病的分子の増殖、拡散、もしくは産生を停止させるために感受性である任意の遺伝子配列（特定の遺伝子変異、例えばワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症の場合におけるＭｙＤ８８中の変異などが存在する場合での遺伝子編集のための配列、又は重要なウイルスライフサイクル遺伝子を編集するための配列、又は抗腫瘍免疫応答を活性化する配列を含む）の遺伝子導入、あるいはこれらのアプローチの任意の組み合わせにより得ることができうる。
【００７４】
本発明の文脈において、用語「処置する」又は「処置」は、本明細書で使用するように、そのような用語が適用される障害又は状態の進行を逆転、軽減、又は阻害すること、又はそのような用語が適用される障害又は状態の１つ又は複数の症状の進行を逆転、軽減、又は阻害することを意味する。
【００７５】
最後に、本発明は、ＬＡＨ４ペプチド又はその機能的誘導体、好ましくはベクトフシン１の存在において、ＥＲＶシンシチン（例えば以前に記載したＥＲＶシンシチンなど）を用いて偽型化され、特にＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡを用いて偽型化され、目的の異種遺伝子をパッケージングする安定なレンチウイルス粒子を用いて免疫細胞を感染させる工程を含む、目的の異種遺伝子を発現するように改変された免疫細胞を得るためのエクスビボのプロセスに関する。
好ましくは、免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、及びマクロファージより選ぶ。
好ましくは、免疫細胞はナイーブである。好ましい実施形態に従い、ナイーブ免疫細胞は以前に刺激されていない。
別の実施形態に従い、刺激が使用される場合、刺激工程は最小であり、ナイーブＢ細胞の生存を保つように、ナイーブ免疫細胞を、ＩＬ−７を含む培地中でインキュベートすることにより実施する。
【００７６】
このように、好ましくは、本発明に従った目的の異種遺伝子を発現するように改変された免疫細胞を得るためのエクスビボのプロセスは、ＬＡＨ４ペプチド又はその機能的誘導体の存在において、ＥＲＶシンシチン（例えば以前に記載したＥＲＶシンシチンなど）を用いて偽型化され、特にＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡを用いて偽型化され、目的の異種遺伝子をパッケージングする安定なレンチウイルス粒子を用いて、ナイーブ免疫細胞、特にナイーブＢ細胞を直接感染させる工程を含む。前記のナイーブ免疫細胞は以前に刺激していない。本発明はまた、前記のエキソビボのプロセスにより入手可能な、目的の異種遺伝子を含むナイーブ免疫細胞、好ましくはナイーブＢ細胞に関する。
別の実施形態に従い、本発明に従った目的の異種遺伝子を発現するように改変された免疫細胞を得るためのエクスビボのプロセスは、以下の工程も含みうる：
−場合により、ＩＬ−７を含む培地中でナイーブ免疫細胞をインキュベートすることによりそれらを刺激し、次に
−ＬＡＨ４ペプチド又はその機能的誘導体の存在において、以前に記載したＥＲＶシンシチンを用いて偽型化され、特に、目的の遺伝子を含む、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡを用いて偽型化されたレンチウイルス粒子を用いて刺激された、又はされていないナイーブ免疫細胞を感染させる。本発明はまた、前記のエキソビボのプロセスにより入手可能な、以前に刺激されたナイーブ免疫細胞に関する。
好ましくは、ＬＡＨ４ペプチド又はその機能的誘導体、好ましくはベクトフシン１が、特に７〜２０μg/ml、より好ましくは１０〜１５μg/mlの濃度で存在する。
【００７７】
本発明の文脈において、「ＬＡＨ４ペプチド」は、配列番号５からなるアミノ酸配列を伴うペプチドを指す。本明細書で使用するように、用語「ＬＡＨ４機能的誘導体」は、その配列が、  ＬＡＨ４ペプチドの一次構造に基づいて設計されており、ウイルス又はウイルスベクターの形質導入効率を改善する能力を有する任意のペプチドを意味する。特定の実施形態において、ＬＡＨ４機能的誘導体は、真核細胞、特にヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、又はハムスターの細胞、特にヒトＣＤ３４＋細胞において、以前に記載したＥＲＶシンシチンを用いてキャプシド化され、特にＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡエンベロープを用いてキャプシド化されたウイルスの形質導入効率を改善する能力を有するペプチドである。
ＬＡＨ４ペプチド又はその機能的誘導体は、配列番号５〜３１に示す配列の間で選択してもよい：
【化１】
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好ましくは、ＬＡＨ４ペプチドの機能的誘導体を使用する。好ましくは、前記の機能的誘導体はＬＡＨ４−Ａ４であり、ベクトフシン１とも呼ばれ、配列番号１８を有する。
【００７８】
本発明はまた、本発明の安定な偽型化レンチウイルス粒子、又は前記の安定な粒子でトランスフェクトされた免疫細胞を薬理学的に許容可能な媒質中に含む医薬組成物に関する。「薬理学的に許容可能な媒質」は患者への投与に適合する賦形剤を意味する。
【００７９】
本発明はまた、特にマウスにおいて（マウスモデルを得るように）動物モデルを作製するための、以前に記載したＥＲＶシンシチンを用いて偽型化され、特に、目的の異種遺伝子を含む、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡを用いて偽型化された安定なレンチウイルス粒子、好ましくは以前に記載したＥＲＶシンシチンを用いて偽型化され、特に、目的の異種遺伝子を含む、ＨＥＲＶ−Ｗ、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ、又はマウスシンシチンＡを用いて偽型化された安定なレンチウイルス粒子の使用に関する。これは、疾患機序、特にＢ細胞疾患を探索するのに有用でありうる。
【００８０】
本発明を、本明細書で以下の実施例を用いて例示するが、それらは限定的ではない。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１：種々の形質導入添加剤の存在におけるシンシチン  偽型化ベクターを用いたＢｅＷＯ細胞の形質導入。ＢｅＷＯ細胞を、添加剤である硫酸プロタミン（ＰＳ）、ポリブレン（ＰＢ）、又はベクトフシン１（ＶＦ１）の非存在又は存在において、ＬＶ−ＶＳＶｇ（１０８TU/ml）又はＬＶ−Ｓｙｎ２（１０５TU/ml）のいずれかと、ＧＦＰコードベクターを用いて感染させ、導入遺伝子の発現を、３日後にＦＡＣＳにより測定した。ゲート中の生存ＧＦＰ  ＋細胞のパーセンテージを示す。１つの実験からの結果。
【図２】図２：シンシチン偽型化ベクター及びベクトフシン１（ＶＦ−１）を用いた２９３Ｔ細胞の形質導入。Ａ．Ｂ．ＶＦ１の存在におけるシンシチン偽型化ベクターの用量依存的効果を示す３つのうちの１つの代表的な実験。２９３Ｔ細胞を、ＶＦ１の非存在又は存在において、１０４〜１０５TU/mlの範囲のベクター濃度を使用して、ＧＦＰをコードするＬＶ−Ｓｙｎ１（Ａ）又はＬＶ−Ｓｙｎ２（Ｂ）と培養した。ＧＦＰ発現を、３日後にＦＡＣＳにより測定した。Ｃ．ＶＦ１の増強効果は、マンホイットニー検定を使用した５〜６の実験において示すように、統計的に有意である。Ｄ．ＦＡＣＳにより測定したＧＦＰの発現とｑＰＣＲにより測定した細胞１個当たりのベクターコピー数（ＶＣＮ）との相関を、異なるベクター濃度を試験する３つの別々の実験から得た。
【図３】図３：シンシチン偽型化ベクターを用いた初代血球サブセットの形質導入。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（４〜９の別々の血液ドナー）を、ＶＦ１の非存在又は存在において、細胞（活性化なし）の単離直後、又はＩＬ−７（１０ng/mL）を用いた細胞の一晩培養に続いて、ＧＦＰをコードするＬＶ−Ｓｙｎ１又はＬＶ−Ｓｙｎ２ベクター（１０５TU/ml）を用いて感染させた。３日後、ＧＦＰを、生細胞（ＣＤ３＋ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｃ−Ｔ細胞；ＣＤ３＋ＣＤ１９＋ＣＤ１１ｃ−Ｂ細胞；ＣＤ３−ＣＤ１９−ＣＤ１１ｃ＋骨髄樹状細胞）、ナイーブ（ＣＤ２７−）又は記憶（ＣＤ２７＋）Ｂ細胞の異なるサブセットにおいてＦＡＣＳにより測定した。
【図４】図４：血液細胞サブセットに対するシンシチン偽型化ベクターの用量依存的効果。ＩＬ−７と一晩インキュベートし、次にＶＦ１の存在において濃度１０５ng/mL及び１０６TU/mlでΔＮＧＦＲ  をコードするＬＮＧ−Ｓｙｎ１及びＬＶ−Ｓｙｎ２を用いて形質導入したＰＢＭＣの３名のドナーでの代表的な結果。導入遺伝子発現を、３日後にＦＡＣＳにより測定した。
【図５】図５：シンシチン偽型化ベクターを用いたＣＤ１１ｃ＋血液細胞の形質導入。全ＰＢＭＣ（２つの別々の実験において試験した２名のドナー）又はプラスチック付着ＰＢＭＣ（別の実験において試験した１名のドナー）を、ＶＦ１（１２μg/ml）の存在において、ＧＦＰをコードするＬＶ−Ｓｙｎ１もしくはＬＶ−Ｓｙｎ２（２×１０５TU/ml）又はＬＶ−ＶＳＶｇ（１０８TU/ml）ベクターを用いて形質導入した。細胞を洗浄し、ＸＶｉｖｏ２０＋１０%ＦＣＳ＋ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４中で３〜７日間にわたりさらに培養した。Ａ．ＣＤ１１ｃ＋ＨＬＤ−ＤＲ＋骨髄細胞の分析のためのゲーティング戦略。Ｂ．異なる条件において３日後に得られたＣＤ１１ｃ＋ＨＬＤ−ＤＲ＋細胞の形質導入を示す３つのうちの代表的な実験。
【図６−１】図６：血液細胞上でのＡＳＣＴ２及びＭＦＳＤ２ａ受容体の発現。Ａ．３つ（各々１名の血液ドナー）のうちの１つの代表的な実験におけるＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、及びＣＤ１１ｃ＋骨髄樹状細胞中でのＡＳＣＴ２及びＭＦＳＤ２ａ発現についてのマルチカラーＦＡＣＳ分析。Ｂ．ウサギ免疫グロブリン対照を用いて得られたバックグラウンドのサブトラクション後の、５つの実験における示した受容体を発現する細胞のパーセンテージの平均及び標準偏差。Ｃ．ＰＢＭＣ細胞サブセットでのＭＦＳＤ２ａ及びＡＳＣＴ２  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析（平均２つの実験）。
【図６−２】図６：血液細胞上でのＡＳＣＴ２及びＭＦＳＤ２ａ受容体の発現。Ａ．３つ（各々１名の血液ドナー）のうちの１つの代表的な実験におけるＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞、及びＣＤ１１ｃ＋骨髄樹状細胞中でのＡＳＣＴ２及びＭＦＳＤ２ａ発現についてのマルチカラーＦＡＣＳ分析。Ｂ．ウサギ免疫グロブリン対照を用いて得られたバックグラウンドのサブトラクション後の、５つの実験における示した受容体を発現する細胞のパーセンテージの平均及び標準偏差。Ｃ．ＰＢＭＣ細胞サブセットでのＭＦＳＤ２ａ及びＡＳＣＴ２  ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析（平均２つの実験）。
【図７】図７：遺伝子治療により処置されたＳＣＩＤＸ１患者の血液単核細胞の表現型。フローサイトメトリー分析を実施した：（Ａ）健常なドナーＰＢＭＣを用いた比較、（Ｂ）患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の解凍後での比較。
【図８】図８−９：Ｓｙｎ  Ａベクターを用いたマウス脾臓細胞（図８）及び骨髄細胞（図９）のＬＶ−形質導入。ｄＮＧＦＲをコードするＬＶ−ＳｙｎＡベクターを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから得た赤血球枯渇脾臓細胞に加えた。３日後、細胞の表現型及び導入遺伝子発現をフローサイトメトリーにより測定した。
【図９】図８−９：Ｓｙｎ  Ａベクターを用いたマウス脾臓細胞（図８）及び骨髄細胞（図９）のＬＶ−形質導入。ｄＮＧＦＲをコードするＬＶ−ＳｙｎＡベクターを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから得た赤血球枯渇脾臓細胞に加えた。３日後、細胞の表現型及び導入遺伝子発現をフローサイトメトリーにより測定した。
【図１０】図１０：ＬＶ−ＳｙｎＡを用いたＬｕｃＩＩ導入遺伝子のインビボ送達。ＬｕｃＩＩをコードするＬＶ−ＳＹｎ  Ａの単一ボーラス（Ｃ、ｎ＝７、流束：１，８．１０８光子/秒）をアルビノースＣ５７Ｂｌ／６マウス中に静脈注射した（５×１０５TU/マウスｎ＝３）。対照として、同じ導入遺伝子をコードするＬＶ−ＶＳＶｇ（Ｂ、ｎ＝４、流束：７．１０８光子／秒）ならびにＰＢＳ（Ａ、ｎ＝７、流束：１．５．１０４光子／秒）を使用した。導入遺伝子発現の生物発光検出を、ＬＶのＩＶ注入後１６日に実施した。麻酔マウスの１匹を開腹して、脾臓の生物発光を確認した（Ｄ）。
【図Ｓ１】補足図Ｓ１  Ａ．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における一過性トランスフェクションによるＬＶ産生のためのプラスミド比の最適化。Ｘ軸上に示すように、各々のＴ１７５ｃｍ２フラスコ中の種々の量のｐｃＤＮＡ３Ｓｙｎ２プラスミドを使用したＧＦＰをコードするＬＶ−Ｓｙｎ２ベクターの産生。培地を、トランスフェクションの２４時間後に回収し、ｐ２４をＥＬＩＳＡにより測定した。４つの測定値の平均±ＳＤの結果。Ｂ．形質導入における用量依存的な増加及び経時的な形質導入の安定性。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＧＦＰをコードするＬＶ−Ｓｙｎ１を増加濃度で形質導入した。細胞を、ＧＦＰ発現をＦＡＣＳにより測定した、示した時間（ｄ＝日）にわたり培養した。結果を、培養物中のＧＦＰ＋細胞のパーセンテージとして表す。４つを代表する１つの実験の結果。Ｃ．シンシチン偽型化ＬＶを用いた異なる細胞系の比較形質導入。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＢｅＷＯ細胞、又はＨＣＴ１１６細胞に、ＧＦＰをコードするＬＶ−Ｓｙｎ１（１０５TU/ml）、ＬＶ−Ｓｙｎ２（１０５TU/ml）、又はＬＶ−ＶＳＶｇ（１０６TU/ml）ベクターを用いて形質導入した。ＧＦＰの発現を、３日後にＦＡＣＳにより測定した。２９３Ｔ細胞での５つ及び６つの別々の実験でそれぞれＬＶ−Ｓｙｎ１及びＬＶ−Ｓｙｎ１を用いて得られた結果；ＢｅＷＯ細胞での１つ及び３つの実験ならびにＨＣＴ１１６細胞での２つ及び４つの実験。
【図Ｓ２】補足図Ｓ２  Ａ．ベクターを用いたＰＢＭＣの処理スキーム。Ｂ．種々のＢ細胞亜集団の形質導入を分析するためのＦＡＣＳゲーティング戦略。
【図Ｓ３】補足図Ｓ３  Ａ．ＣＤ３−ＣＤ１９−、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ１ａ＋であり、ＧＦＰ及びＣＤ８６又はＣＤ８０を発現する、又はしない樹状細胞の形質導入を分析するためのＦＡＣＳゲーティング戦略。図５と同じ条件におけるＬＶ−Ｓｙｎ１、ＬＶ−Ｓｙｎ２、又はＬＶ−ＶＳＶＧベクターを用いたＰＢＭＣの形質導入及び７日後のＣＤ３−ＣＤ１９−ＣＤ１ａ＋ＧＦＰ＋細胞のサブセットでのＣＤ８０及びＣＤ８６の発現（四分円において示すパーセンテージ）  。Ｂ．Ａと同じであり、及び７日後のＣＤ３−ＣＤ１９＋ＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞のサブセットでのＧＦＰの発現（ヒストグラムにおいて示すパーセンテージ）。
【図Ｓ４】補足図Ｓ４：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＨＣＴ１１６細胞でのＡＳＣＴ２及びＭＦＳＤ２ａについての免疫染色。ヒストグラムは、未染色陰性対照細胞（２９３Ｔ：５%；ＨＣＴ１１６：３%）、無関係のＩｇＧ及びＡｌｅｘａ６４７コンジュゲート二次抗体を用いて染色した細胞（２９３Ｔ：及びＨＣＴ１１６：１%）、抗ＡＳＣＴ２及び二次抗体を用いて染色した細胞（２９３Ｔ：１２%、ＨＣＴ１１６：４%）、ならびに抗ＭＦＳＤ２ａ及び二次抗体を用いて染色した細胞（２９３Ｔ：９９%、ＨＣＴ１１６：６５%）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を表す。
【図Ｓ５】補足図Ｓ５：１０６TU/mlベクターを使用した、ＧＦＰをコードするＬＶ−Ｓｙｎ１及びＬＶ−Ｓｙｎ２ベクターを用いたＲａｊｉ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞の形質導入。細胞を、感染後８日目にＦＡＣＳにより分析した。
【図Ｓ６】補足図Ｓ６：ＬＶ−Ｓｙｎ１ベクターを用いたインビボ形質導入。チャールズリバーから購入した７週齢の雌ＮＳＧマウス（Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄ／ｇｃ−／−）に、１００μL容量中の１０７個のＰＢＭＣを眼窩後洞に注射した。２４時間後、マウスに、１５０μLの未希釈のＬＶ−Ｓｙｎ１ベクターを用いて尾静脈に静脈注射した。７日後、マウスを屠殺し、脾臓を回収し、ＡＣＫで溶解し、赤血球枯渇画分をＦＡＣＳにより分析し、ＣＤ４５＋ヒト細胞画分でＧＦＰを測定した。結果は、ヒトＧＦＰ＋細胞が見出された２匹のマウスでのＦＡＣＳプロットを示す。
【図Ｓ７】補足図Ｓ７：ＬＶ−Ｓｙｎ１又はＬＶ−Ｓｙｎ２ベクターを用いたマウス細胞のエクスビボ形質導入。脾臓細胞は、ＡＣＫを用いた赤血球溶解に続いて、６週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから得た。細胞は、１又は５×１０５TU/mlのΔＮＧＦＲをコードするＬＶ−ＳＹｎ１又はＬＶ−Ｓｙｎ２及びＶＦ１（１２μg/ml）の存在において、１００μL中１０６細胞/mLの濃度で、１０%ＦＣＳ及びベータ２メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ中で培養した。３日後、ΔＮＧＦＲの発現を、生存細胞でのＦＡＣＳにより測定した。
【図Ｓ８】補足図Ｓ８：マウスＢ細胞リンパ腫細胞株Ａ２０でのＬＶ−ＳｙｎＡの感染力滴定。Ａ２０細胞に、ＶＦ１（赤色）を伴う、ＶＦ１を伴わない（１２μg/mlまで）、異なる量のＬＶ−ＳｙｎＡベクター（０、０．２、０．６、１．８、３．２、５．２、及び１６．２μL）を用いて形質導入した。細胞を完全培地中で７日間にわたり培養する。ｑＰＣＲによるシンシチンＡのコピー数の評価。
【００８２】
実施例１：ヒト内在性レトロウイルスエンベロープ糖タンパク質シンシチン１及びシンシチン２によって、ヒト初代Ｂ細胞及び樹状細胞の効果的なレンチウイルス形質導入が可能になる。
【００８３】
材料及び方法
【００８４】
細胞株
ヒト胚性腎臓２９３Ｔ細胞及びヒト結腸直腸癌ＨＣＴ１１６細胞（ＣＣＬ−２４７；ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス）を、１０%の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Life Technologies）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ＋グルタマックス）（Life Technologies、フランス、サントーバン）中で３７℃、５%ＣＯ２で培養した。ヒト絨毛癌ＢｅＷＯ細胞（ＣＣＬ−９８；ＡＴＣＣ）を、１０%ＦＣＳを添加したＨａｍ’ｓ  Ｆ１２Ｋ培地（Life technologies）中で培養した。Ｒａｊｉ細胞及びＪｕｒｋａｔ細胞をＸＶｉｖｏ  ２０培地中で感染させた。
【００８５】
シンシチン発現プラスミドのクローニング及びベクターの産生。
ヒトシンシチン１（ＥＲＶＷ−１−００１）又はヒトシンシチン２（ＥＲＶＦＲＤ−１）をコードするプラスミドｐＣＤＮＡ３シンシチン１及びｐＣＤＮＡ３シンシチン２を、ＮＨｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素を使用し、ＥｎｓｅｍｂｌゲノムブラウザＥＮＳＴ０００００４９３４６３及びＥＮＳＧ０００００２４４４７６転写物配列に対応するそれぞれの合成ＤＮＡ配列（Gencust、ルクセンブルク、デュドランジュ）をｐＣＤＮＡ３プラスミド（Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド）中にクローニングすることにより構築した。プラスミド配列は、２本鎖配列決定により確認した。シンシチン２プラスミド機能性は、シンシチン２であると予想される６５〜７０Kdのタンパク質を検出する抗ＨＥＲＶ−ＦＲＤ抗体（LS-BIO、フランス、ナンテール）を使用し、２９３Ｔ細胞のトランスフェクションに続いてタンパク質抽出物をイムノブロッティングすることにより確認した。プラスミドを、ＤＮＡ  ＲＮＡ精製Nucleobondキット（Macherey-Nagel、ドイツ、デューレン）を使用してエンドトキシンフリーで産生した。シンシチン１又はシンシチン２のいずれかを用いて偽型化したレンチウイルス粒子は、リン酸カルシウムを使用し、４つのプラスミドを用いた２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより産生した。各々のＴ１７５ｃｍ２のフラスコに、ＨＩＶ−１  ｇａｇｐｏｌ遺伝子を発現する１４．６μgのｐＫＬｇａｇｐｏｌ、ＨＩＶ−１  ｒｅｖ配列を発現する５．６μgのｐＫＲｅｖ、２２．５μgの遺伝子導入カセット（ヒトホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下で増強緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するｐＣＣＬ  ＰＧＫ  ＧＦＰ（Charrier et al, 2011）又はヒトＰＧＫプロモーターの制御下で切断型の神経成長因子受容体（ＮＧＦＲ）を発現するｐＣＣＬ  ＰＧＫデルタＮＧＦＲ）、及び２２μgのｐＣＤＮＡ３シンシチン１プラスミド又はｐＣＤＮＡ３シンシチン２プラスミドのいずれかを用いてトランスフェクトした。培地を翌日に交換し、ペニシリン及びストレプトマイシンならびに１０%ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ  ４．５g/Lグルコースにより置換した。２４時間後、ウイルス粒子を含む培地を回収し、低速で遠心分離し、滅菌濾過し（０．２２μm）、４℃で２時間にわたり５０，０００gの超遠心分離（１９００ＲＰＭ、ローターＳＷ２８を用いたBeckman超遠心分離機を使用）により濃縮した。ペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、分注し、−８０℃で保存した。ＶＳＶｇ偽型化粒子は、報告されているように（Merten et al, 2011）、一過性トランスフェクションによっても産生した。
【００８６】
形質導入添加剤
ベクトフシン１（ＶＦ１）ペプチドは、標準的なフルオレニル−メチルオキシ−塩化カルボニル固相ペプチド合成、それに続くＨＰＬＣ及び質量分析（Gencust）により合成した。ペプチドをＨ２Ｏ中に可溶化し、分注し、使用まで−８０℃で保存した。形質導入実験のために必要である場合、ＶＦ１を解凍し、培地中に再懸濁し、ベクター及び細胞に最終濃度１２μg/mlで加えた。硫酸プロタミン（ＰＳ）（Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）及びポリブレン（ＰＢ）（Sigma-Aldrich）も即時にベクター及び細胞と希釈し、形質導入培養中でそれぞれ８μg/ml及び６μg/mlの最終濃度で使用した。
【００８７】
ベクターのタイトレーション
濃縮して凍結保存したベクターを使用前にタイトレーションした。物理的粒子力価を、以前に報告されたように（Charrier et al, 2011）、ｐ２４  ＥＬＩＳＡ（Alliance(c)HIV-1 Elisaキット、Perkin-Elmer、フランス、ヴィルボン＝シュル＝イヴェット）により決定した。感染力価は、１２μg/mlのＶＦ１の存在においてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にベクターの連続希釈液を加えることにより決定し、３日後、２９３Ｔ細胞をフローサイトメトリーにより分析し、形質導入単位力価（TU/ml）を算出し、又はｑＰＣＲにより、標準的な計算を使用して感染性ゲノム（ig/mL）を測定した（Kutner et al, 2009）。
【００８８】
末梢血単核細胞の培養及び形質導入。
ＥＤＴＡを用いて回収した末梢血は、Etablissement Francaisdu Sang（フランス、エヴリー）から購入した。Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離（Eurobio、フランス、レ・ジュリス）により精製した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、形質導入のために、無血清培地Ｘ−ＶＩＶＯ  ２０（Lonza、フランス、ルヴァロワ＝ペレ）中に懸濁した。一部の実験において、サイトカインＩＬ−７（１０ng/μL）（Miltenyi Biotech、ドイツ、ベルギッシュ・グラートバッハ）を形質導入に先立ち一晩培地に加えた。形質導入のために、ＬＶ−Ｓｙｎ１もしくはＬＶ−Ｓｙｎ２ベクター（１．１０５TU/ml）又はＬＶ−ＶＳＶｇ（１．１０８TU/ml）を、ＶＦ１（１２μg/ml）の存在において細胞に加えた。６時間後、培地を、１０%ＦＣＳ及びＩＬ−７（１０ng/mL）を添加したＸＶｉｖｏ２０に交換し、細胞を７日間まで培養した。形質導入したＢ細胞を増殖させるために、ＣＤ４０Ｌ（２μg/ml）及びＩＬ−４（２０ng/mL）を培地に加え、細胞をこれらの条件において２週間まで培養した。骨髄性樹状細胞を増殖させるために、ｈＧＭ−ＣＳＦ（５０ng/mL）及びＩＬ−４（２０ng/mL）を培地に加えた。
【００８９】
ＥＢＶ不死化
ＰＢＭＣをＩＬ−７と一晩培養し、次にベクターを用いて感染させた。６時間後、細胞を洗浄し、Ｂ９５．８マーモセット細胞上清の存在において、ＥＢＶ不死化のための標準手順を使用してシクロスポリンと培養した。培地は週２回交換した。
【００９０】
ＳＣＩＤ−Ｘ１患者細胞の形質導入
遺伝子治療により処置されたＳＣＩＤ−Ｘ１患者のＰＢＭＣを  ３７℃で迅速に解凍し、次にＰＢＳで２回洗浄した。トリパンブルー計数後、細胞を２μMのＣＦＳＥ（Molecular Probes、英国ケンブリッジ）で標識し、Ｌｖ−Ｓｙｎ１  ＩＬ２ｒｇベクターを用いて形質導入し、９６ウェル丸底プレート中でＣＤ４０リガンド  ［２μg/ml］（Miltenyi Biotec）及びＩＬ−２１［５０ng/mL］（Miltenyi Biotec）の非存在又は存在において培養する（３．１０５／２００μL）。３、６、及び７日間の培養後、Ｂ細胞形質導入（即ち、ＮＧＦＲ又はＩＬ２Ｒｇ発現）、Ｂ細胞増殖（即ち、ＣＦＳＥ希釈）、及びＣＤ１９＋ＣＤ２７＋細胞の頻度をフローサイトメトリーにより決定した。培地中のヒトＩｇＧ分泌をＥＬＩＳＡ（Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）により決定した。
【００９１】
インビトロでのＢ細胞活性化
ＰＢＭＣを、２μMＣＦＳＥ（Molecular Probes、英国ケンブリッジ）を用いて標識し、９６ウェル丸底プレート中でＣＤ４０リガンド［２μg/ml］（Miltenyi Biotec）及びＩＬ−２１［５０ng/mL］（Miltenyi Biotec）の非存在又は存在において培養した（３．１０５／２００μL）。３、６、及び７日間の培養後、Ｂ細胞形質導入（即ち、ＮＧＦＲ又はＩＬ２Ｒｇ発現）、Ｂ細胞増殖（即ち、ＣＦＳＥ希釈）、及びＣＤ１９＋ＣＤ２７＋＋形質芽細胞の頻度をフローサイトメトリーにより決定した。ヒトＩｇＧ分泌をＥＬＩＳＡ（Sigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイス）により決定した。
【００９２】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーのために使用した抗体は、BD-Biosciences（フランス、ル・ポン＝ド＝クレ）から購入し、ＰＥコンジュゲート抗ＣＤ３及び抗ＣＤ１ａ、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ７００コンジュゲート抗ＣＤ１９、ＡＰＣ−Ｈ７コンジュゲート抗ＣＤ４５及び抗ＩｇＤ、ＣＦ５９４コンジュゲート抗ＩｇＭ、ＰｅＣｙ７コンジュゲート抗ＣＤ２７及び抗ＨＬＡ−ＤＲ、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ１４、Ｖ４５０コンジュゲート抗ＣＤ１１ｃを含む。細胞に抗体を加える前に、Ｆｃ受容体を、細胞をガンマグロブリン（１mg/mL）（Sigma Aldrich）と４℃で１５分間にわたりインキュベートすることによりブロックした。飽和量の抗体を次に、０．１%ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma Aldrich）を伴うＰＢＳ中で、４℃で３０分間にわたり加えて、細胞を２回洗浄した。手順の終了時に、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（０．３mg/mL）（Sigma-Aldrich）を加えて、死細胞を排除した。受容体試験のために、ウサギポリクローナル抗ＳＬＣ１Ａ５（ＡＳＣＴ２）（Abcam、フランス、パリ）、抗ＭＦＳＤ２ａ（Origene、メリーランド州ロックビル）、又はウサギ免疫グロブリン対照（Origene）を使用し、Alexa647コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体（Thermo Fisher Scientific、メリーランド州ウォルサム）により明らかにした。取得は、Divaソフトウェア（BD-Biosciences）を使用してＬＳＲＩＩで行い、分析は、Kaluzaソフトウェア（Beckman-Coulter、Villepinte、France）を用いて行った。
ヒトＩＬ２Ｒｇの検出は、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ１３２抗体（BD bioscience）を使用して実施した。
【００９３】
ＲＴ−ｑＰＣＲによるＡＳＣＴ２及びＭＦＳＤ２Ａ発現の測定。
全ＲＮＡを、ＳＶ全ＲＮＡ単離物（Promega、フランス、シャルボニエール＝レ＝バン）を使用して精製細胞から抽出した。残留ＤＮＡを、遊離ＤＮＡキット（Ambion、フランス、クールタブフ）を使用してサンプルから除去した。ｃＤＮＡは、逆転写ＰＣＲ（Invitrogen）用のプロトコールSuperscript II第一鎖合成システムに従って、ランダムヘキサマーを使用して１μgのＲＮＡから合成した。リアルタイムＰＣＲは、プロトコールSybr Green PCR Master Mix（Applied Biosystem、米国カリフォルニア州フォスターシティ）に従い、０．１μMの各々のプライマーを用いて、LightCycler 480システム（Roche、スイス、バーゼル）を使用して実施した。ＡＳＣＴ２又はＭＦＳＤ２Ａのいずれかの増幅のために使用したプライマー対は、以前に記載されている（Cornelis et al, PNAS, 2008及びToufailly et al, placenta, 2013）。ＡＳＣＴ２プライマーの配列は（センス、５’−ＧＧＣＴＴＧＧＴＡＧＴＧＴＴＴＧＣＣＡＴ−３’；アンチセンス、５’−ＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＴＡＡＡＣＣＣＡＣＡ−３’）、及びＭＦＳＤ２Ａプライマーの配列は（センス、５’−ＣＴＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＴＧＣＴＣＴＣ−３’；アンチセンス、５’−ＧＧＣＣＡＣＣＡＡＧＡＴＧＡＧＡＡＡ−３’）である。本発明者らはまた、ＴＦＩＩＤ（転写最終ＩＩ  Ｄ）プライマーを標準化として使用した。ＴＦＩＩＤプライマー配列は（センス、５’−ＡＣＧＧＡＣＡＡＣＴＧＣＧＴＴＧＡＴＴＴＴ−３’；アンチセンス、５’−ＡＣＴＴＡＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＡＣ−３’）である。結果は、以下の式を使用し、倍率変化で表す：相対存在量＝ΔＣｔを伴う２＾−ΔΔＣｔ＝Ｃｔ  ＡＳＣＴ２又はＭＦＳＤ２Ａ−Ｃｔ  ＴＦＩＩＤ及びΔΔＣｔ＝ΔＣｔｓａｍｐｌｅ−ΔＣｔｃａｌｉｂｒａｔｏｒ。
【００９４】
ＬＶ−Ｓｙｎ１ベクターを用いたインビボでの形質導入。
チャールズリバーから購入した７週齢の雌ＮＳＧマウス（Ｎｏｄ／Ｓｃｉｄ／ｇｃ−／−）に、１００μL容量中の１０７個のＰＢＭＣを眼窩後洞に注射した。２４時間後、マウスに、１５０μLの未希釈のＬＶ−Ｓｙｎ１ベクターを尾静脈に静脈注射した。７日後、マウスを屠殺し、脾臓を回収し、ＡＣＫを用いて溶解し、赤血球枯渇画分をＦＡＣＳにより分析した。
【００９５】
ＬＶ−Ｓｙｎ１又はＬＶ−Ｓｙｎ２ベクターを用いたマウス細胞のエクスビボでの形質導入。
脾臓細胞は、ＡＣＫを用いた赤血球溶解に続いて６週齢の雌Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから得た。細胞を、１又は５×１０５TU/mlのΔＮＧＦＲをコードするＬＶ−ＳＹｎ１又はＬＶ−Ｓｙｎ２及びＶＦ１（１２μg/ml）の存在において、１００μL中１０６細胞/mLの濃度で、１０%ＦＣＳ及びベータ２メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ中で培養した。３日後、ΔＮＧＦＲの発現を、生存細胞でのＦＡＣＳにより測定した。
【００９６】
統計分析
統計的有意性を、GraphPad Prismソフトウェア（GraphPad Inc、カリフォルニア州ラホヤ）を使用して、一元配置ＡＮＯＶＡ分析、マンホイットニー又はスチューデントのｔ検定により指定通りに評価した。
【００９７】
結果
【００９８】
シンシチン１及びシンシチン２偽型化ＬＶは、安定な感染性粒子として産生することができる。
２つのヒト内在性レトロイルスエンベロープ糖タンパク質であるシンシチン１及びシンシチン２を、組換えＨＩＶ−１由来のＬＶについての可能性のある新たな偽型として探索した。これらの糖タンパク質の全長ｃＤＮＡを、２９３Ｔ細胞中の一過性ＬＶ産生系において発現させた。トランスフェクション工程のためのシンシチン１及びシンシチン２プラスミドの量の最適化によって、培地中のｐ２４レベルに基づくＬＶ粒子の産生が増加した（補足図Ｓ１Ａ）。定められた条件（材料及び方法を参照のこと）において、これらのエンベロープのいずれかを用いて偽型化された安定な感染性粒子を産生することが可能であった。異なる導入遺伝子（ＧＦＰ及びｄＮＧＦＲ）を使用して、平均７０５ng  ｐ２４/mL（ｎ＝７産生）で滴定されたＬＶ−Ｓｙｎ−１及び平均４９６ng  ｐ２４/mL（ｎ＝４産生）で滴定されたＬＶ−Ｓｙｎ−２のローストックを収集した（表１）。これらのエンベロープのいずれかを用いて偽型化したレンチウイルス粒子は、ＶＳＶｇ−偽型化粒子に使用したのと同じ条件を使用した超遠心分離により成功裏に濃縮することができた（Charrier et al, 2011）。濃縮ストックを−８０℃で凍結保存し、数ヶ月にわたり安定であった。ＬＶストックの解凍時に、４．１±１．７Ｅ＋０５ng  ｐ２４/mLの力価がＬＶ−Ｓｙｎ１（ｎ＝６産生）について、及び１．７±０．６Ｅ＋０５ng  ｐ２４/mL  がＬＶ−Ｓｙｎ２（ｎ＝６産生）について得られ、ベクターを、異なる導入遺伝子（ＧＦＰ又はΔＮＧＦＲ）をコードするように産生することができた（表１）。
【００９９】
【表１】
2019514369.tif 000003
【０１００】
これらの粒子の感染特性を決定するために、本発明者らは、シンシチン１についてのＡＳＣＴ２受容体及びシンシチン２についての制限されたＭＦＳＤ２ａ受容体の両方を発現することが公知であるヒトＢｅＷｏ絨毛癌細胞株を最初に感染させた（Esnault et al, 2008）。ＢｅＷｏ細胞は、ＬＶ−Ｓｙｎ１又はＬＶ−Ｓｙｎ２を用いて効果的に形質導入されなかったのに対し、それらは、ＶＳＶｇ偽型化ＬＶを用いて十分に形質導入された。しかし、カチオン性薬剤、例えば硫酸プロタミン（ＰＳ）、ポリブレン（ＰＢ）、又はベクトフシン１（ＶＦ１）などを加えることによって、ＬＶ−Ｓｙｎ２で示されるようにＢｅＷｏ細胞の形質導入が増強された（図１）。これらの薬剤のうち、最大レベルの形質導入増強がＶＦ１を用いて得られた。ベクトフシン１は、ＲＤ１１４−ＴＲを含む種々のエンベロープ糖タンパク質を用いて偽型化されたレンチウイルスベクター及びγレトロウイルスベクターの感染力を増強する短いヒスチジンに富む両親媒性ペプチドである（Fenard et al, 2015 et Majdoul et al, 2015）。ベクトフシン１の効果は、シンシチンを用いて以前に試験されておらず、この短いペプチドによってシンシチン偽型化ＬＶ粒子の遺伝子伝達能が明らかになる。
ＶＦ１の存在において、２９３Ｔ細胞を用量依存的にシンシチン偽型化ベクターのいずれかで形質導入し、ＢｅＷｏ細胞において得られたレベルと同程度のレベルに達することが可能であった（図２Ａ、Ｂ）。対照的に、２９３Ｔ細胞のわずか約１〜２%を、この添加剤を用いることなく形質導入した。ＶＦ１の増強効果は、ＬＶ−Ｓｙｎ１又はＬＶ−Ｓｙｎ２を使用した２９３Ｔ細胞における反復実験にわたり統計的に有意であった（図２Ｃ）。シンシチン偽型化ベクターを用いた２９３Ｔ細胞の形質導入によって、２週間続く連続培養において検証したように、経時的な導入遺伝子の安定したゲノム組込みに導かれた（補足図Ｓ１Ｂ）。遺伝子発現のレベルは、細胞１個当たりのコピー数と一致し、経時的な導入遺伝子のサイレンシングの証拠は示さなかった（図２Ｄ）。
ＬＶ−Ｓｙｎ１及びＬＶ−Ｓｙｎ２感染性に対するＶＦ１ペプチドの増強効果の発見によって、２９３Ｔ細胞を使用した頑強な感染力滴定アッセイの開発が可能になった。２９３Ｔ細胞株の選択は、実験室においてＶＳＶｇ偽型化ＬＶを力価測定するために日常的に使用されるＨＣＴ１１６結腸癌細胞の形質導入の失敗により促された。ＨＣＴ１１６は、試験した任意の濃度で、及びベクトフシン１の存在においてでさえ、ＬＶ−Ｓｙｎ１又はＬＶ−Ｓｙｎ２を用いて形質導入できなかった（補足図Ｓ１Ｃ）。また、２９３Ｔ細胞が、より一貫した増殖パターン及び反復実験におけるより高い形質導入レベルの傾向のために、この感染力価アッセイについてはＢｅＷｏ細胞よりも好まれた（補足図Ｓ１Ｃ）。アッセイのために定められた条件（材料及び方法を参照のこと）において、ＧＦＰをコードするＬＶ−Ｓｙｎ１及びＬＶ−Ｓｙｎ２の濃縮及び凍結保存バッチの感染力価は、それぞれＧＦＰ導入遺伝子については２．８±６×Ｅ＋０６TU/ml（ｎ＝６バッチ）及び２．７±６×Ｅ＋０６TU/ml（ｎ＝６バッチ）、ならびにｄＮＧＦＲ導入遺伝子については６．３±７．５×Ｅ＋０６TU/ml（ｎ＝３バッチ）及び４．４±１．５×Ｅ＋０６TU/ml（ｎ＝２バッチ）であった（表１）。このように、シンシチン１及びシンシチン２糖タンパク質によって、ｒＨＩＶベクターを偽型化し、感染性であり、安定した遺伝子導入のために有用な安定な粒子を得ることができる。それらの感染性には補因子が要求され、細胞レベルで選択的である。
【０１０１】
ＬＶ−Ｓｙｎ１及びＬＶ−Ｓｙｎ２ベクターによって、ナイーブの血液細胞が効率的に形質導入される。
【０１０２】
シンシチンは細胞性タンパク質であり、インビボでの適用のための免疫学的に許容可能なベクターを誘導するのに有用でありうる。このように、シンシチン偽型化ベクターが血液細胞と相互作用しうるか否かを評価するために、本発明者らは、ベクターをインビトロで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に加えた。ＰＢＭＣは、それらのインビトロでの単離直後に、又はナイーブリンパ球の生存率を維持することを目的としたＩＬ−７の存在における一晩培養に続いて感染させた（補足図Ｓ２Ａ）。感染工程後、細胞をＩＬ−７の存在において培養し、少なくとも３日間にわたり細胞生存率を支持した。全体的に、導入遺伝子の発現は、ＣＤ４５を発現する全有核細胞集団では低かった（補足表Ｓ１）。しかし、ベクターを伴わない偽対照と比較して、有意により高い量の細胞が、ＶＦ１の存在において形質導入された（補足表Ｓ１）。ＬＶ−Ｓｙｎ１の効果はＶＳＶｇの効果と同程度であった。ＩＬ−７で予備活性化した細胞は、単離直後に感染させた細胞よりも良好に形質導入された。
【表Ｓ１】
2019514369.tif 000004
【０１０３】
ＰＢＭＣには、異なる割合で細胞の複数のサブセットが含まれる。図３及び表２に示すように、導入遺伝子の発現は、ＣＤ１９＋Ｂリンパ球及びＣＤ１１ｃ＋骨髄／樹状細胞（ＰＢＭＣ中では少数である）の大部分で見出されたのに対し、ＣＤ３＋Ｔ細胞（ＰＢＭＣ中で多い）のわずかな割合が、ＣＤ４５＋細胞中で得られた全体的に低い形質導入の結果と一致してマークされた。ＣＤ１９＋細胞又はＣＤ１１ｃ＋細胞の各々の平均５９%が、ＩＬ−７による予備活性化に続いてＬＶ−Ｓｙｎ１により形質導入された（表２）。２９３Ｔ細胞及びＢｅＷｏ細胞で観察されたように、ＶＦ１を加えることは、この添加剤の非存在において形質導入された細胞がほとんどないため、ＰＢＭＣ形質導入を達成するために必要であった。ＶＦ１ペプチドはまた、ＬＶ−ＶＳＶｇによるＰＢＭＣの形質導入を増強した。
【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
注目すべきことに、非活性化ＣＤ１９＋細胞を形質導入することが可能であったが、真のナイーブ細胞がシンシチンにより標的化されうることを示唆する。ＣＤ１９＋Ｂ細胞の種々のサブセットが特徴付けられており、以下を含む（Kaminski et al, 2012）：ナイーブＣＤ１９＋ＣＤ２７−ＩｇＤ＋細胞（集団の５０〜７０%）；記憶非スイッチＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩｇＤ＋細胞（集団の１５〜２０%）；記憶スイッチＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩｇＤ−ＩｇＭ−細胞（集団の２〜５%）；記憶スイッチＩｇＭのみのＣＤ１９＋ＣＤ２７＋ＩｇＤ−ＩｇＭ＋細胞（集団の２〜５%）、及び形質芽細胞ＣＤ１９＋ＣＤ２７ｈｉ（集団の１〜２%）。ＰＢＭＣの感染に続くＦＡＣＳゲーティング戦略を補足図Ｓ２Ｂに示す。全体的に、ナイーブ及び記憶Ｂ細胞サブセットのいずれも、事前の活性化にもかかわらず、シンシチン偽型化ベクターを用いて効果的に形質導入された（図３）。より詳細には、全ての記憶Ｂ細胞サブセットが、事前の活性化の非存在において形質導入されることが見出された（表３）。そのような非活性化条件において、シンシチン偽型化ベクターは、ＬＶ−ＶＳＶｇよりも効果的にＢ細胞に形質導入されて、これらの細胞についてのシンシチンの特異的指向性を示唆した。ＬＶ−Ｓｙｎ１及びＬＶ−Ｓｙｎ２のＢ細胞形質導入効果はベクター濃度に依存性であり（図４）、導入遺伝子非依存性であることが見出された。ほとんど全ての末梢血ＣＤ１９＋細胞は、ＧＦＰ又はΔＮＧＦＲのいずれかをコードする１０６TU/mlのＬＶ−Ｓｙｎ１又はＬＶ−Ｓｙｎ２ベクターを使用して形質導入することができ、それにより、これらの細胞において種々の型の異種タンパク質を発現させる非常に効果的なシステムを提供する。
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
機能的Ｂ細胞を、シンシチン  偽型化ベクターを用いて安定に形質導入する。
観察された効果が、非特異的であり、偽形質導入又は凝集時に生じうるベクトフシン１の人為的自己蛍光により起こされることを排除するために（Fenard et al 2013）、本発明者らは、ベクターを用いて処理し、経時的に培養した細胞中での前ウイルス組込みを確認した。ベクターを細胞に加えた後、本発明者らはＣＤ４０Ｌ及びＩＬ−４を加えて８〜１４日間にわたり培養物を活性化及び増殖させた。そのような培養において、本発明者らは、条件が全ての細胞の生存を確実にするのに最適ではないにもかかわらず、ベクターがベクトフシン１と一緒に加えられた場合に（表４）、特異的にベクターコピーを検出した。また、記憶Ｂ細胞の発生のために必須であると以前に報告されたＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）及びＩＬ−２１などのＢ細胞活性化シグナルを使用して、本発明者らは、形質導入されたＢ細胞が効率的に活性化されうることを確認した（表５）。ＣＦＳＥマーキング及びフローサイトメトリーを使用してＢ細胞分裂及び導入遺伝子発現を検出することにより、本発明者らは、ＣＤ４０Ｌ及びＩＬ−２１に応答することが可能な細胞のマーキングならびに活性化Ｂ細胞（形質芽細胞腫を含む）表現型を確認した（表５）。機能的Ｂ細胞の形質導入をさらに確認するために、本発明者らは、ＬＶ−Ｓｙｎ１ベクターを用いて感染させた直後にＥＢＶを使用してＰＢＭＣを形質転換し、安定に組込まれたベクター配列を含むリンパ芽球細胞を得た（表４）。これらの結果によって、シンシチンベクターが、機能的な増殖能を保持して増殖する初代Ｂ細胞を安定的に形質導入できることが確認される。
【０１０８】
【表４】
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【０１０９】
【表５】
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【０１１０】
マウス初代Ｂ細胞の形質導入
新たに単離したマウス脾臓細胞を、ΔＮＧＦＲをコードするＬＶ−Ｓｙｎ１又はＬＶ−ＳＹｎ２ベクターを用いて３日間にわたり培養した。補足図Ｓ７に示すように、これは、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の非常に効率的な形質導入をもたらした。これらの培養物中では、ずっと少ないＣＤ１９細胞が比例して形質導入され、このように、ヒトと同様にマウスにおいてＢ細胞についてのシンシチン偽型化ベクターの特定の指向性が確認された。このデータはまた、シンシチン１及びシンシチン２糖タンパク質がマウスの対応物を認識することを示しており、これらの知見によって、これらのベクターを用いた将来の前臨床試験が促進されるであろう。
【０１１１】
ＣＤ１１ｃ＋細胞の形質導入
図３に示すように、ＣＤ１９−ＣＤ３＋ＣＤ１１ｃ＋細胞の大きな割合が、事前の活性化を伴わず、ベクトフシン１の存在においてＰＢＭＣ由来のＬＶ−Ｓｙｎ１及びＬＶ−Ｓｙｎ２で形質導入された。さらなる表現型分析により、そのようなＣＤ１１ｃ細胞も高レベルのＨＬＡ−ＤＲを発現し、シンシチン偽型化ベクターを用いて効果的に形質導入されることが示された（図５）。細胞はＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４において増殖し、ＣＤ１ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８６を発現し、ＣＤ１４を欠き、それらが未成熟樹状細胞であることを示唆した（補足図Ｓ３Ａ）。また、単球細胞の表現型を有するＣＤ１４＋ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞もまた形質導入される（補足図Ｓ３Ｂ）。このように、ＬＶ−Ｓｙｎ１及びＬＶ−Ｓｙｎ２の両方を、抗原提示細胞において導入遺伝子を発現させるために効果的に使用することができる。
【０１１２】
ＬＶ−Ｓｙｎ１及びＬＶ−Ｓｙｎ２ベクターによって、初代ヒトＴ細胞は効率的に形質導入されない。
末梢血Ｔ細胞は、シンシチン偽型化ＬＶにより効率的に形質導入されなかったが、一部の細胞は、活性化時に形質導入されうる。ＩＬ−７を用いた事前の活性化に続き、少量の末梢血Ｔ細胞が、ＬＶ−Ｓｙｎ１又はＬＶ−Ｓｙｎ２ベクターを用いて形質導入されたが、しかし、これらの効果は実験から実験まで一貫していなかった（図３及び表２）。事前の活性化がなければ、形質導入レベルは常に低かった。
このように、血球サブセットの異なる形質導入が、シンシチン偽型化ベクターを用いて観察される。
【０１１３】
血液細胞サブセット及び細胞株でのＡＳＣＴ２及びＭＦＳＤ２ａ受容体の発現。
それぞれシンシチン１及びシンシチン２のエントリー受容体であるＡＳＣＴ２及びＭＦＳＤ２ａは、間接免疫蛍光検出を使用し、血液細胞サブセットの細胞表面上で検出した（図６Ａ）。これらのマーカーを発現する細胞の最も高いパーセンテージはＣＤ１９＋及びＣＤ１１ｃ＋細胞であったのに対し、Ｔ細胞はこれらの受容体の低レベルを発現した（図６Ｂ）。これらの結果はｑＲＴ−ＰＣＲにより確認し、ヒトＢ細胞がＭＦＳＤ２ａ及びＡＳＣＴ２を発現することを初めて示す（図６−Ｃ）。ＡＳＣＴ２及びＭＦＳＤ２ａの発現は２９３Ｔ細胞でも見出されたのに対し、ベクターを用いて形質導入されていないＨＣＴ１１６細胞のずっと低いレベルであった（補足図Ｓ４）。試験した細胞では、受容体の発現は、達成された形質導入レベルと十分に相関した。
【０１１４】
ヒトＢ及びＴ細胞株は、シンシチン偽型化ベクターを用いて形質導入する。
初代細胞で得られた結果を延長し、シンシチン偽型化ベクターの細胞特異性をさらに評価するために、本発明者らはヒト細胞株のパネルを形質導入しようと試みた。バーキットリンパ腫Ｒａｊｉ  Ｂ細胞及びＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞を試験した。Ｒａｊｉ  Ｂ細胞は、シンシチン偽型化ベクターくぉ用いて形質導入することができた（補足図Ｓ５）。２×１０６TU/mlのＬＶ−Ｓｙｎ２ベクターを使用してＲａｊｉ細胞において得られた最高レベルは１６%に達した（図４に見られるように、初代Ｂ細胞において１０６TU/mlで＞９０%に達したのに対し）。本発明者らは、Ｒａｊｉ細胞がＬＶを用いた形質導入に許容性であることを確認したが、なぜなら、Ｒａｊｉ細胞の８８%形質導入が１０８TU/mlのＬＶ−ＶＳＶｇを用いて形質導入されたためである（補足図Ｓ５の対照、示さず）。１つの実験では、形質導入されたＲａｊｉ細胞をフローサイトメトリーにより選別し、４９日間にわたり培養し、長期間にわたる導入遺伝子の安定な組込みを実証した（補足表Ｓ２）。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞は、シンシチン偽型化ベクターを用いて部分的に形質導入した（補足図Ｓ５）。このように、シンシチン偽型化ＬＶは、一部の細胞株用の遺伝子導入ツールとして使用することができる。Ｂ細胞において、形質導入は、確立されたＢ細胞株よりも初代細胞においてより効果的であるように見える。
【０１１５】
【表Ｓ２】
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【０１１６】
原発性免疫不全における機能的補正。
重症複合免疫不全症１型（ＳＣＩＤＸ１）は、インターロイキン２受容体ガンマ鎖（ＩＬ２Ｒｇ）遺伝子中の変異により起こされるＸ連鎖性原発性免疫不全症である。同種異系骨髄移植によりこの疾患を治癒することができるが、しかし、一部の患者はＢ細胞における部分的キメラ化のみを伴い不完全に補正されたままである（Recher et al 2011）。５%未満のＢ細胞キメラ性を伴う患者は、免疫グロブリンを成熟させ、産生することが不可能なままである。それらのＢ細胞は、成熟した記憶ＩｇＧ分泌Ｂ細胞になることが不可能なままである。実際に、ＩＬ２ＲｇもＢ細胞の成熟のための必須シグナルを提供するＩＬ−２１のための受容体であることが最近発見された（Recher et al 2011）。いくつかの遺伝子治療治験が、造血幹細胞及び前駆細胞におけるＩＬ２Ｒｇ遺伝子導入を使用してこの疾患を処置するために試みられている。しかし、患者の条件付けなしでは、遺伝子補正された細胞は、最新の遺伝子治療の治験（Hacein-Bey-Abina et al 2014）において示されるように、補正されたＴ細胞のみを産生し、Ｂ細胞は未補正のままである。結果として、そのような患者のＢ細胞は非機能的であり、患者は感染を予防するために免疫グロブリン注入に依存したままである。これにより、本発明者らは、遺伝子治療により完全に補正されていない患者において末梢Ｂ細胞にＩＬ２Ｒｇを移入するためにシンシチン偽型化ベクターを使用できるか否かを問うた。患者からの細胞を得た。患者の血液単核細胞はＣＤ３＋ＩＬ２Ｒｇ＋Ｔ細胞を含むが、健常な個体とは対照的に、患者の血液ＣＤ１９＋Ｂ細胞は成熟マーカーＣＤ２７を発現せず、ＩＬ２Ｒｇを発現せず（図７Ａ及びＢ）、ＩｇＧを産生しなかった（表６）。ＩＬ２ＲｇをコードするＬＶシンシチン１ベクターを用いた遺伝子導入時に、患者細胞は、恐らくは、培養中でのこれらの脆弱な細胞の高レベルの死亡率のために、活性化マーカーが細胞上で検出されなかったにもかかわらず、培地中でＩｇＧを産生することによりＣＤ４０Ｌ＋ＩＬ−２１に応答することができた。これらの結果によって、末梢血Ｂ細胞が遺伝子導入により標的化され、ＳＣＩＤＸ１において何らかの機能的補正を提供することができること、及びシンシチン偽型化ＬＶがこの適用のための有用なツールであることが実証される。
【０１１７】
インビボ実験
ＬＶ−Ｓｙｎ１による初代ヒトＢ細胞の効率的な形質導入によって、このベクターがインビボで機能するか否かを試験することが促された。免疫不全のＮＳＧマウスを、最初にマウス１匹当たり１０７のＰＢＭＣを用いて移植し、翌日にＬＶ−Ｓｙｎ１の単回ボーラスを静脈内投与した。７日後、マウスを屠殺し、異なる組織を検証した。３匹中２匹のマウスにおいて、本発明者らは、ＧＦＰを少量（３〜１５%）発現した脾臓中でのＣＤ４５＋ＣＤ１９＋ヒトＢ細胞の存在を見出し、それらがインビボで形質導入されたことを示唆する（補足図Ｓ６）。これらの予備的結果は、インビボでヒトＢ細胞を標的化するためにシンシチン偽型化ベクターを使用する可能性を示唆する。
【０１１８】
実施例２：ＬＶ−ＳｙｎＡを伴うマウスにおけるマウスシンシチンＡ及びインビボ遺伝子送達。安定な感染性ＬＶ−ＳｙｎＡ粒子の産生。
【０１１９】
材料及び方法（実施例１のための材料及び方法も参照のこと）
【０１２０】
シンシチンＡのクローニング及びＬＶ−Ｓｙｎ  Ａの産生。
ａ．マウスシンシチンＡを発現するプラスミドの生成。
ｐｃＤＮＡ３．１真核生物発現プラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ部位中へのマウスシンシチンＡ  ｃＤＮＡのクローニングは、Genecust（ルクセンブルク、エランジュ）により生成され、以下のプライマーを使用してＳｙｎ−Ａマウス遺伝子全長ｃＤＮＡ（ＥｎｓｅｍｂｌレファレンスＥＮＳＭＵＳＧ００００００８５９５７）（配列番号３３）（Ｔｍ＝６５℃；ＧＣ%＝５４%；Sigma）を含み、ライゲーションによりｐＵＣ−ＳｙｎＡプラスミドからのＰＣＲ増幅断片を挿入することによって実施した：フォワード５’ＡＧＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＴＴＣＧＴＣＣＴＴＧＧ３’（配列番号３２）（Ｔｍ＝６９，８℃；%ＧＣ＝５０%；Ｓｉｇｍａ、米国セントルイス）及びリバース５’ＡＧＣＴＣＴＡＧＡＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＴＣＣＴＣ３’（配列番号３３）（Ｔｍ＝６５℃；%ＧＣ＝５４%；Sigma）。プラスミドを配列決定（Beckman Coulter Genomics、英国テイクリー）により確認した。
ｂ．Ｓｙｎ−Ａ偽型化レンチウイルスベクターの産生。
ＤＭＥＭ＋１０%ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）においてＴ１７５ｃｍ２フラスコ中に播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を以下の４つのプラスミド（フラスコ当たりの量）で同時トランスフェクトした：ｐＫＬｇａｇｐｏｌ（１４．６μg）、ｐＫＲｅｖ（５．６μg）、ｐｃＤＮＡ３．１−ＳｙｎＡ（２０μg）、及び導入プラスミドＰＲＲＬ−ＳＦＦＶ  ＬｕｃＩＩ又はｐＲＲＬ−ＳＦＦＶ−ＬｕｃＩＩ−２Ａ−ΔＮＧＦＲ−ＷＰＲＥ（２２．５μg）。２４時間後、細胞を洗浄し、新鮮な培地を加える。翌日、培地を収集し、１５００rpmで５分間にわたり遠心分離して清澄化し、０．４５μmでろ過し、次に５００００gの超遠心分離により１２℃で２時間にわたり濃縮し、使用するまで−８０℃で保存する。
ｃ．シンシチンＡ偽型化ＬＶの滴定。
物理力価を、他の型のＬＶと同様に、ｐ２４  ＥＬＩＳＡにより決定した。感染力価を、マウスリンパ腫細胞系Ａ２０を使用して感染性ゲノム力価（IG/mL）として決定した。ベクターの連続希釈液を、ベクトフシン１（登録商標）（１２μg/μL）の存在においてＡ２０細胞に６時間にわたり加える。培地を新しくし、細胞を７日間にわたりインキュベートし、ゲノムＤＮＡを得て、プライマー：ＰＳＩフォワード５’ＣＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＧ３’（配列番号３４）、ＰＳＩリバース５’ＴＣＣＣＣＣＧＣＴＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＧ３’（配列番号３５）、ＦＡＭ（６カルボキシフルオレセイン）（配列番号３６）を用いて標識されたＰＳＩプローブ５’ＣＧＣＡＣＧＧＣＡＡＧＡＧＧＣＧＡＧＧ３’、Ｔｉｔｉｎフォワード５’ＡＡＡＡＣＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＧＴＧＡＧＣ３’（配列番号３７）、Ｔｉｔｉｎリバース５’ＴＴＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＡＧＣＧＣ３’（配列番号３８）、及びＶＩＣを用いて標識されたＴｉｔｉｎプローブ５’ＴＧＣＡＣＧＧＡＡＧＣＧＴＣＴＣＧＴＣＴＣＡＧＴＣ３’（配列番号３９）を用いて、iCycler 7900HT（Applied Biosystems）で二本鎖ｑＰＣＲを使用して細胞１個当たりのベクターコピー数を測定する。
【０１２１】
マウスにおけるインビボ生物発光遺伝子導入。
ＬＶ−ＳｙｎＡをコードするＬｕｃＩＩベクターを産生し、５×１０５TUのベクターをアルビノースＣ５７Ｂｌ／６マウス中に静脈注射した。対照には、ＬＶ−ＶＳＶｇをコードするＬｕｃＩＩ及びＰＢＳが含まれた。生物発光の検出のために、マウスをケタミン（１００mg/kg）／キシラシン（１０mg/kg）を用いて麻酔し、１００μLの１５０μg/ml  Ｄルシフェリンを腹腔内投与し、１０分後にＣＣＤカメラISO14N4191（IVISルミナ、Xenogen、米国マサチューセッツ州）を用いて撮影した。３分間の生物発光画像を、１５ｃｍの視野、ビニング（分解能）係数４、１／ｆストップ及びオープンフィルターを使用して得た。目的の領域（ＲＯＩ）を手作業で（各々の場合における標準領域を使用して）定義し、シグナル強度を、リビングイメージ３．０ソフトウェア（Xenogen）を使用して算出し、１秒当たりの光子として表した。バックグラウンドの光子束を、ベクターが投与されていない対照マウス又は対照筋肉上に描かれたＲＯＩから定義した。
【０１２２】
結果
マウスシンキチンをインビボ適用のために探索した。シンシチンＡは非オルソログであるが、ヒトシンシチン１及び２に対する機能的に類似したマウスの対応物である（Dupressoir et al 2005）。本発明者らは、マウスＳｙｎＡを発現プラスミド中にクローニングし、それを使用してレンチウイルスベクター粒子を産生した。本発明者らは、シンシチンＡが、ｒＨＩＶ由来ＬＶを成功裏に偽型化できることを見出した。本発明者らは、安定したＬＶ−ＳｙｎＡを生成するためにヒトシンシチン偽型化ＬＶ（プレート当たり２２μgのＤＮＡ、１回の収集のみ）の産生のために既に定められたのと同じ条件を使用した。ＬＶ−Ｓｙｎ  Ａは、ＶＦ１の存在においてマウスＡ２０  Ｂリンパ腫細胞株を形質導入することにおいて非常に効率的であった（図Ｓ８）（補足表Ｓ４）。本発明者らは、ＳｙｎＡが、ヒト初代非活性化マウスＢ細胞をインビトロで形質導入するために、そのヒト対応物と同様に効率的であることを見出した。図８及び図９に見られるように、ＬＶ−ＳｙｎＡは、脾臓からの（図８）及び骨髄（図９）からの前処理マウスＢ細胞なしで形質導入することが可能であった。これらの実験はまた、マウスＴ細胞もまた形質導入することができることを示す。Ｂ２２０低細胞の形質導入によって、未成熟Ｂ細胞が形質導入され、生物学的適用のための標的となりうることが示唆される。
興味深いことに、マウスシンシチンＡで偽型化されたＬＶを用いてヒトＣＤ１９＋Ｂ細胞を形質導入することが可能であった（補足表Ｓ５）
【０１２３】
ＬＶ−Ｓｙｎ  Ａは、マウスにおけるインビボでの遺伝子送達のために効率的であることが判明した。図１０は、ＬｕｃＩＩをコードするＬＶ−ＳｙｎＡベクターの注入後１６日目の導入遺伝子の生物発光検出を示す。ベクターをマウスの尾静脈から注射し、本発明者らは、このためにベクトフシンを使用しなかった。脾臓ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋細胞におけるベクターの存在は、フローサイトメトリー細胞選別により脾臓細胞を精製し、ｑ−ＰＣＲによる形質導入のレベルを測定することにより確認した（補足表Ｓ３）。このように、シンシチンは、インビトロ及びインビボでヒト及びマウスＢ細胞中への侵入を媒介する特有のツールである。
【０１２４】
【表Ｓ３】
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【０１２５】
【表Ｓ４】
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【０１２６】
【表Ｓ５】
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【０１２７】
実施例３：物理力価の決定：ｐ２４  ＲＴ  ＥＬＩＳＡにより得られた物理力価と自動カウンターを用いた直接的粒子カウンティングにより得られた物理力価の間の対応。
【０１２８】
物理力価を、シンシチン１（Ｓ１）、シンシチン２（Ｓ２）、シンシチンＡ（ＳＡ）を用いて、又はＶＳＶｇを用いて偽型化され、切断型の神経成長因子受容体（ΔＮＧＦＲ）又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のいずれかをコードするＨＩＶ−１由来レンチウイルスベクター（ＬＶ）のための２つの異なる方法により決定した。ＬＶを一過性トランスフェクションにより産生し、超遠心分離により濃縮し、滴定前に−８０℃で凍結保存した。
【０１２９】
この方法は、（ａ）サンプル中のｐ２４濃度を測定するＥＬＩＳＡ、それに続く、１fgのｐ２４が１２ｐｐのＬＶに対応する（Farson et al, 2001）と仮定した物理的粒子（ｐｐ）としての力価の計算、又は（ｂ）自動顕微鏡検査法を使用してサンプル中の粒子濃度を直接測定するMalvern Instruments（ＵＫ）からのNS300 Nanosight粒子計数器の使用のいずれかからなった。
【０１３０】
【表Ｓ６】
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【０１３１】
平均で、［（平均力価ＥＬＩＳＡ  Ｐ２４）／（平均力価Nanosight）として得られた力価pp/mL（ＥＬＩＳＡ  Ｐ２４）と力価pp/mL（Nanosight）の間の変換係数は約３．７、即ち、約４である。
【０１３２】
参考文献
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図Ｓ１】
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【図Ｓ２】
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【図Ｓ３Ａ】
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【図Ｓ３Ｂ】
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【図Ｓ４】
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【図Ｓ５】
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【図Ｓ６】
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【図Ｓ７】
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【図Ｓ８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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