(57)【要約】  本発明は、配列番号１又は配列番号２に示されたＴＮＦ−α結合ＲＮＡアプタマー及びその治療的用途を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は配列番号２を有し、ＴＮＦ−αに結合するＲＮＡアプタマー又はその変形体。
【請求項２】
前記ＴＮＦ−αがヒトＴＮＦ−α又はマウスＴＮＦ−αであることを特徴とする、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
前記ＲＮＡアプタマーは、変形されたアプタマーであり、その変形されたアプタマーは、リボヌクレオチドの糖位置、ホスフェート位置、塩基位置、５’末端位置及び３’末端位置のうちの少なくとも一つの位置で化学的に変形されたアプタマーであることを特徴とする、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項４】
前記変形されたアプタマーは、糖位置で変形されたアプタマーであり、そのアプタマーは、糖の一つ以上のヒドロキシル基がハロゲン基、脂肪族基、エーテル基及びアミン基のうちのいずれか一つに変形されたことを特徴とする、請求項３に記載のアプタマー。
【請求項５】
前記変形されたアプタマーは、糖位置で変形されたアプタマーであり、そのアプタマーは、糖の２’−ＯＨ基がＯＭｅ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリル及びハロゲンのうちの一つに変形されたことを特徴とする、請求項３に記載のアプタマー。
【請求項６】
前記ＲＮＡアプタマーは、変形されたアプタマーであり、その変形されたアプタマーは、配列番号１又は配列番号２にあるすべてのＣ及びＵが、それぞれ２’−Ｆが修飾されたＣ及び２’−Ｆが修飾されたＵであることを特徴とする、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項７】
前記ＲＮＡアプタマーは、ホスフェート位置で変形されたアプタマーであり、その変形されたアプタマーは、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（“ｔｈｉｏａｔｅ”）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（“ｄｉｔｈｉｏａｔｅ”）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（“ａｍｉｄａｔｅ”）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（“ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ”）に変形されたことを特徴とする、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項８】
前記ＲＮＡアプタマーは、塩基位置で変形されたアプタマーであり、その変形されたアプタマーは、ピリミジンの５位置、プリンの８位置、ウラシルの４位置、ウラシルの５位置又はシトシンの環外（ｅｘｏｃｌｙｃｌｉｃ）アミン位置で変形されたことを特徴とする、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項９】
前記ＲＮＡアプタマーは、５’末端位置で変形されたアプタマーであり、その変形されたアプタマーは、５’末端に−ＮＨ２が結合されて変形されたことを特徴とする、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項１０】
前記ＲＮＡアプタマーは、３’末端位置で変形されたアプタマーであり、その変形されたアプタマーは、逆相チミジンが３’−３’結合を形成して変形されたことを特徴とする、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項１１】
前記ＲＮＡアプタマーは、ポリアルキレングリコールがリンカーを介して又はリンカーなしに連結されて変形されたことを特徴とする、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項１２】
前記ＲＮＡアプタマーは、ポリエチレングリコールがリンカーを介して又はリンカーなしに連結されて変形されたことを特徴とする、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項１３】
前記ＲＮＡアプタマーは、ポリエチレングリコールがアミン（Ｒ−ＮＨ２）をリンカーとして５’末端位置で導入されて変形されたことを特徴とする、請求項１２に記載のアプタマー。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか一項に記載のアプタマーを含むＴＮＦ−α抑制用薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１乃至１３のいずれか一項に記載のアプタマーを含む、ＴＮＦ−αが媒介する疾患の治療又は予防用薬学的組成物。
【請求項１６】
前記ＴＮＦ−αが媒介する疾患は、呼吸器障害、喘息、アレルギー性及び非アレルギー性喘息、感染による喘息、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）の感染による喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気道の炎症性病状、好酸球増加症、線維症及び過剰粘液産生、嚢胞性線維症、肺線維症、アトピー性障害、アトピー性皮膚炎、じんましん、湿疹、アレルギー性鼻炎、アレルギー性胃腸炎、皮膚の炎症性及び／又は自己免疫病状、胃腸器官の炎症性及び／又は自己免疫病状、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、潰瘍性大腸炎、クローン病、肝臓の炎症性及び／又は自己免疫病状、肝硬変、肝線維症、Ｂ型及び／又はＣ型肝炎ウイルスにより引き起こされる肝線維症、強皮症、腫瘍又は癌、肝細胞癌腫、神経膠芽腫、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、ウイルス感染症、細菌感染、寄生虫感染、ＨＴＬＶ−１感染、及びワクチン接種による免疫反応であることを特徴とする、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＮＦ−αに特異的に結合するアプタマー及びその治療的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦ−αは、マクロファージ、単球を含む免疫系の細胞によって分泌され、免疫系の細胞と反応する炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインであって、その非正常的過剰発現が炎症反応だけでなく、敗血症、感染症、自己免疫疾患、移植拒絶症などの各種疾患を媒介する（非特許文献１〜２）。
【０００３】
このような理由から、ＴＮＦ−αを標的とした様々な抗体医薬品が開発されてきた。エタネルセプト（ＥｎｂｒｅｌＴＭ）、インフリキシマブ（ＲｅｍｉｃａｄｅＴＭ）、アダリムマブ（ＨｕｍｉｒａＴＭ）、セルトリズマブペゴル（ＣｉｍｚｉａＴＭ）などが、ＴＮＦ−αを標的とした代表的な抗体医薬品である。しかし、エタネルセプトは、ＬＰＳで処理されたＴＨＰ−１細胞からのＴＮＦ−αの分泌を抑制するが、細胞結合ＴＮＦ−αを６倍程度過剰発現させるため、副作用があり得ることが報告されており（非特許文献３）、インフリキシマブは、マウスの可変領域とヒトＩｇＧ１不変ドメインを有するキメラ抗体であるが、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒｃｙ  ｔｏ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）とＣＤＣ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を誘発する問題点があり、セルトリズマブペゴルは、ＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）されたヒト化抗体であるが、ＰＥＧ化されたタンパク質は、免疫反応を誘発する問題だけでなく、腎臓細胞に蓄積されて液胞（ｖａｃｕｏｌｅ）を形成することが動物実験で報告されている（非特許文献４）。
【０００４】
したがって、ＴＮＦ−αを標的とする、より良い特性の薬物の開発が依然として求められるといえる。
【０００５】
アプタマーは、抗体と同様に標的タンパク質に特異的に結合することができる核酸リガンドであって、２００４年に老人性黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）の治療薬として、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を標的とするマクジェン（Ｍａｃｕｇｅｎ）が米国ＦＤＡによって承認されて以来、アプタマーを用いた治療薬の開発が世界的に盛んに行われてきた（非特許文献５）。
【０００６】
アプタマー治療薬は、抗体治療薬と比較していろんな利点を持つが、抗体に比べて小さく単純な分子であるため、化学的合成が可能で、必要な化学的修飾が容易であり、ＳＥＬＥＸ技術（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ，非特許文献６〜８；特許文献１〜３）を用いてＩｎ  ｖｉｔｒｏでの選択性と親和度を高めることができ、タンパク質である抗体とは異なり熱に安定であるので、室温での長期保存が可能である。また、ポリクローナル抗体を作り難いトキシンなどに対してもアプタマーを作ることができ、抗体治療薬とは異なり、生体内の免疫反応をほとんど起こさず、抗体がＩｎ  ｖｉｖｏ又は細胞レベルで製造されなければならないのに対し、アプタマーはＩｎ  ｖｉｔｒｏレベルで製作が可能なので、化学的修飾などを介して薬動学的及び薬力学的性質の調節が容易であるという利点がある。
【０００７】
かかる点は、抗体よりもアプタマーを用いた方が、有効性及び安全性において有利な治療薬の開発につながる可能性があることを示唆する。
【０００８】
本発明は、ＴＮＦ−αに特異的に結合するアプタマー及びその治療的用途を開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，４７５，０９６号
【特許文献２】米国特許第５，２７０，１６３号
【特許文献３】国際特許公開ＷＯ９１／１９８１３
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４１１−４５２，１９９２
【非特許文献２】Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４５：４９１−５０３，１９９４
【非特許文献３】ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．８（５）：６７９−８７，２００８
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  １９；２４（６）：９１５−２５，  ２０１３
【非特許文献５】Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １４（４）：  ２８３−２９１，  ２００７
【非特許文献６】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９  （４９６８）：５０５−５１０，  １９９０
【非特許文献７】Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６７：２７５−３０１，  １９９６
【非特許文献８】Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３１８：１９３−２１４，  ２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ＴＮＦ−αに特異的に結合するアプタマーを提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記アプタマーの治療的用途を提供することにある。
【００１３】
本発明の別の目的や具体的な目的は、以下で提示されるだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、以下の実施例から確認されるように、ＤＮＡライブラリーから一本鎖ＲＮＡライブラリーを製造し、ＳＥＬＥＸ技術を用いて、各グループからＴＮＦ−αに結合する一本鎖ＲＮＡを分離してその配列を確認した後、これらのＲＮＡからプレートベース結合検査（ｐｌａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を介してＴＮＦ−αに対する結合親和力の高い配列番号１のＲＮＡアプタマー（「ＡＴＫ００１」）と配列番号２のＲＮＡ（「ＡＴＫ００７」）を選別し、これらのアプタマーのＴＮＦ−αに対する結合親和力をＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）方法とゲルレターデーション（Ｇｅｌ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）方法によって確認する一方、ＳＰＲ分析によってＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３とＩＧＦ−ＢＰ１に対する結合力をＴＮＦ−αに対する結合力と比較評価してＴＮＦ−αに対して結合特異性があることを確認したとともに、肝癌細胞株であるＳＫ−ＨＥＰ１細胞に、細胞の損傷を誘発する組換えヒトＴＮＦ−αの処理時に前記ＡＴＫ００１及びＡＴＫ００２アプタマーを一緒に処理する場合、細胞が損傷を受けるときに速く発現量が増加する急性期タンパク質（Ａｃｕｔｅ  ｐｈａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、Ｈｅｐａｔｏｇｌｏｂｉｎ、Ｆｉｂｒｏｇｅｎ−γ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎなど）、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ１−β及びＩＬ６）及び血管形成物質（ＶＥＧＦ）の発現が抑制されることを確認した。
【００１５】
上記において、Ｈｅｐａｔｏｇｌｏｂｉｎなどの急性期タンパク質や炎症性サイトカインなどは、細胞が損傷を受けるときにこれを防御するためにその発現が増加するタンパク質であるので、細胞の損傷を誘発するＴＮＦ−αの処理時に前記アプタマーを一緒に処理したとき、これらの急性期タンパク質や炎症性サイトカインの発現が阻害されたというのは、ＡＴＫ００１及びＡＴＫ００７アプタマーのＴＮＦ−αに対する効果的な阻害活性を示すものと言える。
【００１６】
このような本発明の実験結果に基づいて提供されるものは、一態様においては、ＴＮＦ−αに結合する下記配列番号１のＡＴＫ００１アプタマー又は配列番号２のＡＴＫ００７アプタマーに関するものであり、他の態様においては、これらのアプタマーの治療的用途として、前記アプタマーを有効成分として含むＴＮＦ−α抑制用薬学的組成物又はＴＮＦ−αの非正常的過剰発現による障害又は疾患の予防又は治療用薬学的組成物に関するものである。
【００１７】
＜配列番号１＞
Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｕ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｕ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｕ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｕ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｕ−Ａ−Ｃ−Ｕ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｕ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｕ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ
【００１８】
＜配列番号２＞
Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｕ−Ｇ−Ｃ−Ｕ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｕ−Ｕ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｕ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ａ−Ｕ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｕ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｕ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｕ
【発明の効果】
【００１９】
前述したように、本発明によれば、ＴＮＦ−αに結合するアプタマーとＴＮＦ−αが媒介される疾病に対する予防・治療的用途を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＴＮＦ−αアプタマーＡＴＫ００１（ａ）及びＡＴＫ００７（ｂ）の二次構造の模式図である。
【図２】プレートベース結合検査（ｐｌａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）でＴＮＦ−αアプタマーＡＴＫ００７とヒトＴＮＦ−α結合量を測定して示すグラフである。
【図３】ＳＰＲ方法によってＴＮＦ−αアプタマーＡＴＫ００１（ａ）及びＡＴＫ００７（ｂ）とヒトＴＮＦ−αのセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）及び解離定数を示すものである。
【図４】ＴＮＦ−αアプタマーであるＡＴＫ００１（ａ）とＡＴＫ００７（ｂ）をゲルレターデーション（Ｇｅｌ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）方法で分析した結果であり、ＴＮＦ−αと結合したアプタマーの量を百分率で表示したグラフ（ｃ）である。
【図５】ＳＰＲ方法によってＴＮＦ−αアプタマーＡＴＫ００１とヒトＴＮＦ−α、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３のセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）（ａ）、ＴＮＦ−αアプタマーＡＴＫ００７とヒトＴＮＦ−α、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３のセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）（ｂ）、ＴＮＦ−αアプタマーＡＴＫ００７とＩＧＦ−ＢＰ１のセンサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ）（ｃ）、並びに各解離定数を示すものである。
【図６】ＴＮＦ−αアプタマーが急性期タンパク質の転写レベルでその発現に及ぼす影響についての結果である。
【図７】ＴＮＦ−αアプタマーが前炎症サイトカイン及び血管形成物質の転写レベルでその発現に及ぼす影響についての結果である。
【図８】ＴＮＦ−αアプタマーＡＴＫ００１とＡＴＫ００７がＮＯ産生抑制に及ぼす影響についての結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書において、「ＴＮＦ−α」は、その機能とその配列においてＴＮＦ−αと見られる、ヒトとマウスなどの哺乳動物に存在する任意のＴＮＦ−αを意味する。好ましくはヒトＴＮＦ−αである。
【００２２】
また、本明細書において、「アプタマー」は、当業界に知られている意味そのまま標的分子に結合する核酸リガンド、好ましくは標的分子に「特異的に」結合する核酸リガンドをいう。ここで「特異的に」結合するというのは、試料や人体などの生体内で他の分子よりは標的分子と相対的にさらに高い親和度で結合するという意味である。
【００２３】
また、本明細書において、「有効成分」は、単独で目的とする薬学的活性を示すか、或いはそれ自体は活性がない担体と一緒に薬学的活性を示すことができる成分を意味する。
【００２４】
また、本明細書において、「ＴＮＦ−α抑制」は、本発明のアプタマーがＴＮＦ−αと結合してＴＮＦ−αの固有の生物学的活性を抑制することを意味する。このようなＴＮＦ−α固有の生物学的活性の抑制は、ＴＮＦ−αの非正常的過剰発現によってＴＮＦ−αが媒介する（又はＴＮＦ−αの非正常的過剰発現が有害な）障害又は疾患の予防又は治療効果につながることができる。
【００２５】
また、本明細書において、「ＴＮＦ−αの非正常的過剰発現による障害又は疾患」は、当業分野に多様に公知されており、当業分野に公知されている様々な障害及び疾患を意味する。具体的には、それらの障害及び疾患は、呼吸器障害；喘息；アレルギー性及び非アレルギー性喘息；感染による喘息；呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）の感染による喘息；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；気道の炎症性病状；好酸球増加症；線維症及び過剰粘液産生；嚢胞性線維症；肺線維症；アトピー性障害；アトピー性皮膚炎；じんましん；湿疹；アレルギー性鼻炎；アレルギー性胃腸炎；皮膚の炎症性及び／又は自己免疫病状；胃腸器官の炎症性及び／又は自己免疫病状；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；潰瘍性大腸炎；クローン病；肝臓の炎症性及び／又は自己免疫病状；肝硬変；肝線維症；Ｂ型及び／又はＣ型肝炎ウイルスにより引き起こされる肝線維症；強皮症；腫瘍又は癌；肝細胞癌腫；神経膠芽腫；リンパ腫；ホジキンリンパ腫；ウイルス感染症；細菌感染；寄生虫感染；ＨＴＬＶ−１感染；及びワクチン接種による免疫反応を意味する。
【００２６】
より具体的には、前記障害と疾患は、関節リウマチ、骨関節炎、若年性慢性関節炎、化膿性関節炎、ライム関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊椎関節症、全身性紅斑性狼瘡、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、強皮症、移植片対宿主病、臓器移植拒絶、臓器移植に関連する急性又は慢性免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化症、播種性血管内凝固、川崎病、バセドウ病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ヘノッホ・シェーライン紫斑症、腎臓の顕微鏡的血管炎、慢性活動性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒素性ショック症候群、敗血症症候群、悪液質、感染性疾患、寄生虫疾患、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病、散発性疾患、多内分泌腺機能低下症候群Ｉ型及び多内分泌腺機能低下症候群ＩＩ型、シュミット症候群、成人（急性）呼吸促迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節炎、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸炎性関節症、腸疾患性滑膜炎、クラミジア、エルシニア及びサルモネラ関連関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患／動脈硬化症、アトピー性アレルギー、自己免疫性水疱性疾患、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状ＩｇＡ病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳炎／ロイヤルフリー（Ｒｏｙａｌ  Ｆｒｅｅ）病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、原因不明自己免疫性肝炎、後天性免疫不全症候群、後天性免疫不全関連疾患、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、分類不能型免疫不全症（分類不能型低γグロブリン血症）、拡張型心筋症、女性不妊症、卵巣機能不全、早期卵巣機能不全、繊維性肺疾患、原因不明線維性肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、結合組織疾患関連間質性肺疾患、混合性結合組織疾患関連肺疾患、全身性硬化症関連間質性肺疾患、関節リウマチ関連間質性肺疾患、全身性紅斑性狼瘡関連肺疾患、皮膚筋炎／多発性筋炎関連肺疾患、シェーグレン病関連肺疾患、強直性脊椎炎関連肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、ヘモシデローシス関連肺疾患、薬物によって誘導された間質性肺疾患、繊維症、放射性繊維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、通風関節炎、自己免疫性肝炎、１型自己免疫性肝炎（古典的自己免疫性又はルポイド肝炎）、２型自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ抗体肝炎）、自己免疫媒介性低血糖症、黒色表皮腫を伴うＢ型インスリン抵抗性、副甲状腺機能低下症、臓器移植に関連する急性免疫疾患、臓器移植に関連する慢性免疫疾患、骨関節症、原発性硬化性胆管炎、１型乾癬、２型乾癬、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、腎臓病ＮＯＳ、糸球体腎炎、腎臓の顕微鏡的血管炎、ライム病、円板状紅斑性狼瘡、男性不妊症特発性又はＮＯＳ、精子自己免疫、多発性硬化症（すべてのサブタイプ）、交感性眼炎、結合組織疾患に続発する肺高血圧症、グッドパスチャー症候群、結節性多発動脈炎の肺症状、��性リウマチ熱、リウマチ性脊椎炎、スチル病、全身性硬化症、シェーグレン症候群、高安病／動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫自己免疫性甲状腺機能低下症（橋本病）、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑急性肝疾患、慢性肝疾患、アルコール性肝硬変、アルコール誘発性肝障害、胆汁うっ滞（ｃｈｏｌｅｏｓａｔａｔｉｓ）、特異体質性肝疾患、薬物誘発性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、アレルギー及び喘息、Ｂ群連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）（ＧＢＳ）感染、精神障害（例えば、うつ病及び統合失調症）、Ｔｈ２型及びＴｈ１型媒介性疾患、急性及び慢性疼痛（様々な形態の疼痛）、癌（例えば、肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、前立腺癌及び直腸癌）、造血性悪性腫瘍（白血病及びリンパ腫）、無βリポタンパク質血症、先端チアノーゼ、急性及び慢性寄生虫性又は感染性プロセス、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性又は慢性細菌感染、急性膵炎、急性腎不全、腺癌、心房異所性拍動、ＡＩＤＳ認知症複合、アルコール誘発性肝炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性接触性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、同種移植拒絶、α−１−アンチトリプシン欠乏症、筋萎縮性側索硬化症、貧血、狭心症、前角細胞変性、抗リン脂質症候群、抗受容体過敏症反応、大動脈及び末梢動脈瘤、大動脈解離、動脈性高血圧、動脈硬化症、動静脈痩、運動失調、心房細動（持続的又は発作性）、心房粗動、房室ブロック、Ｂ細胞リンパ腫、骨移植拒絶、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶、脚ブロック（ｂｕｎｄｌｅ  ｂｒａｎｃｈ  ｂｌｏｃｋ）、バーキットリンパ腫、火傷、心不整脈、心機能不全症候群、心臓腫瘍、心筋症、心肺バイパス炎症反応、軟骨移植拒絶、小脳皮質変性、小脳疾患、無秩序な又は多巣性心房頻脈、化学療法関連疾患、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性アルコール症、慢性炎症性病変、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性サリチル酸中毒、結腸直腸癌、うっ血性心不全、結膜炎、接触性皮膚炎、肺性心、冠動脈疾患、クロイツフェルト−ヤコブ（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ）病、培養陰性敗血症、嚢胞性繊維症、サイトカイン療法関連障害、ボクサー認知症、脱髄性疾患、デング出血熱、皮膚炎、皮膚科学的症状、糖尿病、真性糖尿病、糖尿病性動脈硬化疾患（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ａｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、瀰漫性レビー小体病、拡張型うっ血性心筋症、大脳基底核の障害、中年のダウン症候群、ＣＮＳドーパミン受容体を遮断する薬物によって誘発される薬物誘発性運動障害、薬物感受性、湿疹、脳脊髄炎、心内膜炎、内分泌疾患、喉頭蓋炎、エプスタイン−バーウイルス感染、紅痛症、錐体外路及び小脳の障害、家族性血球貪食性リンパ組織球症、胎児胸腺移植拒絶、フリードライヒ失調症、機能的末梢動脈障害、真菌性敗血症、ガス壊疸、胃潰瘍、糸球体腎炎、任意の器官又は組織の移植片拒絶、グラム陰性敗血症、グラム陽性敗血症、細胞内生物に起因する肉芽腫、有毛細胞白血病、ハラーホルデン・スパッツ病��Ｈａｌｌｅｒｖｏｒｄｅｎ−Ｓｐａｔｚ  ｄｉｓｅａｓｅ）、橋本甲状腺炎、枯草熱、心臓移植拒絶、血色素症、血液透析、溶血性尿毒症症候群／血栓溶解血小板減少紫斑病、出血、肝炎（Ａ型）、ヒス束不整脈、ＨＩＶ感染／ＨＩＶ神経障害、ホジキン病、過剰運動性運動障害、過敏症反応、過敏性肺炎、高血圧、視床下部−下垂体−副腎皮質系評価、特発性アジソン病、特発性肺繊維症、抗体媒介性細胞毒性、無力症、乳児脊髄性筋萎縮症、大動脈の炎症、Ａ型インフルエンザ、電離放射線曝露、虹彩毛様体炎、ブドウ膜炎、視神経炎、虚血再灌流損傷、虚血性脳卒中、若年性関節リウマチ（ＪＲＡ）、若年性脊髄性筋萎縮症、カポジ肉腫、腎移植拒絶、レジオネラ、リーシュマニア症、ハンセン病、皮質脊髄系の病変、脂肪浮腫、肝臓移植拒絶、リンパ浮腫（ｌｙｍｐｈｅｄｅｒｍａ）、マラリア、悪性リンパ腫、悪性組織球増殖症、悪性黒色腫、脳髄膜炎、髄膜炎菌血症、代謝性／特発性、偏頭痛、ミトコンドリア多系疾患、混合性結合組織病、モノクローナル高ガンマグロブリン血症、多発性骨髄腫、多系統変性（メンセル・デジェリーヌ−トーマス・シャイ−ドレーガー及びマシャド−ジョセフ）、重症筋無力症、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリア結核、骨髄形成異常、心筋梗塞、心筋虚血障害、鼻咽頭癌腫、新生児慢性肺疾患、腎炎、ネフローゼ、神経変性疾患、神経原性Ｉ筋萎縮、好中球減少性発熱、非ホジキンリンパ腫、腹部大動脈及びその分枝の閉塞、閉塞性動脈疾患、精巣炎、精巣上体炎、臓器肥大、骨粗鬆症、膵臓移植拒絶、膵癌、腫瘍随伴性症候群／悪性腫瘍の高カルシウム血症、副甲状腺移植拒絶、骨盤炎症性疾患、通年性鼻炎、心膜疾患、末梢アテローム硬化性疾患、末梢血管疾患、腹膜炎、悪性貧血、ニューモシスチス・カリニ肺炎、肺炎、ＰＯＥＭＳ症候群（多発神経炎、臓器肥大、内分泌疾患、単クローン性γグロブリン血症及び皮膚変化症候群）、灌流後症候群、ポンプ後症候群、心筋梗塞後開心術症候群、子癇前症、進行性核上性麻痺、原発性肺高血圧、放射線療法、レイノー現象及び病、レイノー病、レフサム病、規則的狭ＱＲＳ頻脈、腎血管性高血圧、再灌流障害、拘束型心筋症、肉腫、強皮症、老年性舞踏病、レビー小体型の老年性認知症、血清反応陰性関節炎、ショック、鎌形赤血球貧血症、皮膚同種異系移植拒絶、皮膚変化症候群、小腸移植拒絶、固形腫瘍、特異的不整脈、脊髄性運動失調、脊髄小脳変性、連鎖球菌性筋炎、小脳の構造的病変、亜急性硬化性全脳炎、失神、心血管系の梅毒、全身性アナフィラキシー、全身性炎症反応症候群、全身性発症若年性関節リウマチ、Ｔ細胞又はＦＡＢ  ＡＬＬ、毛細血管拡張症、閉塞性血栓血管炎、血小板減少症、毒性、移植、外傷、出血、アレルギー、不安定狭心症、尿毒症、尿路性敗血症、じんましん、心臓弁膜症、静脈瘤、血管炎、静脈疾患、静脈血栓症、心室細動、ウイルス及び真菌感染、ウイルス性脳炎／無菌性髄膜炎、ウイルス関連血球貪食症候群、ウェルニッケ−コルサコフ症候群、ウィルソン病、任意の器官又は組織の異種移植拒絶、急性冠症候群、急性特発性多発性神経炎、急性炎症性脱髄性多発神経根神経障害、急性虚血、成人スチル病、円形脱毛症、アナフィラキシー、��リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、動脈硬化症、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、自己免疫性皮膚炎、連鎖球菌感染に伴う自己免疫異常、自己免疫性腸症、自己免疫性難聴、自己免疫性リンパ増殖症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性早期卵巣不全、眼瞼炎、気管支拡張症、水疱性類天疱瘡、心血管疾患、劇症型抗リン脂質症候群、セリアック病（ｃｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、頚部脊椎症、慢性虚血、瘢痕性類天疱瘡、多発性硬化症のリスクを有する臨床的孤発症候群（ＣＩＳ）、結膜炎、小児発症精神障害、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、涙嚢炎、皮膚筋炎、糖尿病性網膜症、真性糖尿病、椎間板ヘルニア（ｈｅｒｎｉａｔｉｏｎ）、椎間板脱出（ｐｒｏｌａｐｓｅ）、薬物誘発免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜症、眼内炎、上強膜炎、多形性紅斑、重症型多形性紅斑、妊娠性類天疱瘡、ギラン・バレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＧＢＳ）、枯草熱、ヒューズ症候群（Ｈｕｇｈｅｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、特発性パーキンソン病、特発性間質性肺炎、ＩｇＥ媒介性アレルギー、免疫性溶血性貧血、封入体筋炎、感染性眼炎症疾患、炎症性脱髄疾患、炎症性心疾患、炎症性腎疾患、ＩＰＦ／ＵＩＰ、虹彩炎、角膜炎、乾性角結膜炎、クスマウル病又はクスマウル−マイヤー病、ランドリー麻痺、ランゲルハンス細胞性組織球症、網状皮斑（ｌｉｖｅｄｏ  ｒｅｔｉｃｕｌａｒｉｓ）、黄斑変性、顕微鏡的多発性血管炎、強直性脊椎炎、運動ニューロン障害、粘膜性類天疱瘡、多臓器不全、重症筋無力症、骨髄異形成症候群、心筋炎、神経根障害、神経障害、肝炎、視神経炎、骨溶解、卵巣癌、少関節性ＪＲＡ、末梢動脈閉塞疾患（ＰＡＯＤ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、静脈炎、結節性多発性動脈炎（又は結節性動脈周囲炎）、多発性軟骨炎、リウマチ性多発性筋痛、白毛症、多関節性ＪＲＡ、多内分泌欠損症候群、多発性筋炎、リウマチ性多発性筋痛（ＰＭＲ）、ポンプ後症候群、原発性パーキンソニズム、前立腺癌及び直腸癌及び造血性悪性癌腫（白血病及びリンパ腫）、前立腺炎、赤芽球癆、原発性副腎不全、再発性視神経脊髄炎、再狭窄、リウマチ性心疾患、ＳＡＰＨＯ（滑膜炎、アクネ、膿疱症、骨過形成及び骨炎）、強皮症、続発性アミロイドーシス、ショック肺、強膜炎、坐骨神経痛、続発性副腎不全、シリコーン関連結合組織病、スネドン−ウィ
ルキンソン（Ｓｎｅｄｄｏｎ−ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）皮膚症、強直性脊椎炎、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）、全身性炎症反応症候群、側頭動脈炎、トキソプラスマ性網膜炎、中毒性表皮剥離症、横断性脊髄炎、ＴＲＡＰＳ（腫瘍壊死因子受容体）、ＩＩ型糖尿病、じんましん、通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）、血管炎、春季結膜炎、ウイルス性網膜炎、フォークト・小柳・原田（Ｖｏｇｔ−Ｋｏｙａｎａｇｉ−Ｈａｒａｄａ）症候群（ＶＫＨ症候群）、滲出型黄斑変性、創傷治癒、エルシニア及びサルモネラ関連関節症を含む。
【００２７】
一般に、特定の標的分子に特異的に結合するアプタマーを選別するためにＳＥＬＥＸ技術が使用される。ＳＥＬＥＸ技術は、「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」の略語で名付けられた技術であって、該当技術は、文献［Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９  （４９６８）：５０５−５１０，  １９９０］、米国特許第５，４７５，０９６号、米国特許第５，２７０，１６３号、国際特許公開ＷＯ９１／１９８１３に開示されており、アプタマーの選別のための具体的な方法や適切な試薬、材料などの使用については、文献［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６７：２７５−３０１，  １９９６］、文献［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３１８：１９３−２１４，  ２０００］に開示されている。
【００２８】
このＳＥＬＥＸ技術は、一本鎖のＲＮＡ又はＤＡＮオリゴヌクレオチド核酸ライブラリーから出発するが、この時、この核酸ライブラリーのオリゴヌクレオチドは、一般に５’末端と３’末端との間にランダム配列を含み、５’末端と３’末端にはライブラリーのすべてのオリゴヌクレオチドの間に共通する既知の配列を含む。この既知の配列には、正方向／逆方向プライマーが結合する配列、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列、クローニングなどの操作のための制限酵素認識配列などが含まれる。前記ランダム配列は、通常、２０〜５０個のヌクレオチドからなるため、５’末端と３’末端を含むオリゴヌクレオチド全体の長さは、通常、３０〜８０個のヌクレオチド、好ましくは４０〜６０個のヌクレオチドとなる。このようなオリゴヌクレオチドの合成は当業分野に周知されており、そのような方法として、固相オリゴヌクレオチド合成技術、トリエステル合成方法などの溶液相合成技術などが挙げられる。具体的には、文献［Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １４：５３９９−５４６７，  １９８６］文献［Ｔｅｔ．  Ｌｅｔｔ．  ２７：５５７５−５５７８，  １９８６］、文献［Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ４：２５５７，  １９７７］、文献［Ｌｅｔｔ．，  ２８：２４４９，  １９７８］などを参照することができる。また、市販の自動化されたＤＮＡ合成装置を用いることもできる。このような装置を用いる場合、ＳＥＬＥＸ技術を適用するのに十分な１０１４〜１０１６個のオリゴヌクレオチドを含む核酸ライブラリーを得ることができる。また、核酸ライブラリーとしてＲＮＡライブラリーを使用する場合、ＤＮＡライブラリーをＴ３、Ｔ４、Ｔ７などのＲＮＡポリメラーゼで転写させてＲＮＡライブラリーを得ることができる。
【００２９】
このようにオリゴヌクレオチドの核酸ライブラリーが得られた後には、これを用いてＳＥＬＥＸ過程を行うが、このようなＳＥＬＥＸ過程は、基本的に、（ａ）その核酸ライブラリーを、標的分子との結合に適した条件の下で、標的分子と接触させる段階と、（ｂ）標的分子と特異的に結合した核酸（オリゴヌクレオチド）を非結合核酸から分離して標的分子−核酸複合体を得る段階と、（ｃ）標的分子−核酸複合体から核酸を増幅させる段階とを含む。このような接触段階、結合段階（標的分子−核酸複合体を得る段階）及び増幅段階を１サイクル以上、好ましくは５サイクル以上繰り返して標的分子との特異性及び結合力をさらに高めた核酸リガンドを選別することもできる。核酸ライブラリーがＲＮＡライブラリーである場合、前記（ｃ）段階の増幅前にｃＤＮＡ合成過程を経て増幅をし、増幅後には転写させてＲＮＡリガンドを得る。また、配列決定は、増幅後、各個別核酸リガンドをクローニングすることにより行われ得る。
【００３０】
本発明の実施例では、このようなＳＥＬＥＸ技術とプレートベース結合検査（ｐｌａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を共に用いて、配列番号１と配列番号２のＴＮＦ−αに特異的なＲＮＡアプタマーを選別した。
【００３１】
参考までに、前記ＳＥＬＥＸ技術は、その改良された幾つかの技術が当業分野に公知されている。例えば、標的分子との特異性を高めるためのＣｏｕｎｔｅｒ−ＳＥＬＥＸ技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３（５１５２）：１４２５−１４２９，  １９９）や、アプタマー治療薬の開発で非臨床動物実験を考慮したＴｏｇｇｌｅ  ＳＥＬＥＸ技術（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ４（６）：５６７−５７３，  ２００１）、標的分子とアプタマーの鏡像異性体を用いるＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ技術（Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ９（３）：３５１−３５９，  ２００２）などを挙げることができる。
【００３２】
本明細書には多くの文献が引用され、それらの引用された文献はいずれも、特に明示的に明らかにしなくても、すべて本明細書の一部としてみなされる。
【００３３】
一方、本発明において、アプタマーは、前記配列番号１又は２に示された一本鎖ＲＮＡそのものであり得るが、これらのＲＮＡアプタマーがリボヌクレオチドの糖位置、ホスフェート位置、塩基位置、５’末端及び／又は３’末端で化学的に変形された（修飾された）アプタマーであってもよい。
【００３４】
当業分野では、野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）のＲＮＡ又はＤＮＡが生体内エンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼによって容易に分解される特性があるというのが当業分野に周知されている。このような化学的に修飾されたアプタマーは、生体内での安定性を向上させることができ、それにより生体半減期を増やして薬力学的及び薬動学的性質を向上させることができるとともに、化学的・物理的分解に抵抗性を与えて保管安定性などを向上させることができる。
【００３５】
糖位置での変形は、本発明のＲＮＡアプタマーの１つ以上の任意のリボヌクレオチドの糖が、その糖の一つ以上のヒドロキシル基（ＯＨ  ｇｒｏｕｐ）がハロゲン基、脂肪族基、エーテル基、アミン基などに修飾されたことをいう。好ましくは、２’−ＯＨ基がＯＭｅ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリル及びハロゲンのうちのいずれかに修飾されたことをいい、より好ましくは、２’−デオキシ（２’ｄｅｏｘｙ）、２’−Ｆ、２’−ＮＨ２、２’−ＯＭｅ、又はこれらの組み合わせに修飾されたことをいう。
【００３６】
さらに好ましくは、下記の実施例において、配列番号１及び２の本発明のＲＮＡアプタマーを製造するために２’Ｆ−ＣＴＰと２’Ｆ−ＵＴＰを使用したという点で、配列番号１及び２の本発明のＲＮＡアプタマーのすべてのＣ及びＵがｆＣ（２’−Ｆが修飾されたＣ）及びｆＵ（２’−Ｆが修飾されたＵ）であることをいう。
【００３７】
２’位置で変形された糖は、その製造方法を含む具体的な事項が当業分野に公知されており、例えば、文献［Ｓｐｒｏａｔ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：７３３−７３８（１９９１）］、文献［Ｃｏｔｔｅｎ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：２６２９−２６３５（１９９１）］、文献［Ｈｏｂｂｓ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：５１３８−５１４５（１９７３）］などを参照することができる。
【００３８】
また、このような変形された糖を含むアプタマーのうち、標的分子に対して親和度が高いアプタマーをＳＥＬＥＸ技術によって選択することに関連しては、米国特許第５，６６０，９８５号、米国特許第５，７５６，７０３号、米国特許第５，５８０，７３７号などを参照することができる。特に、米国特許第５，５８０，７３７号は、２’−ＮＨ２、２’−Ｆ、２’−ＯＭｅに修飾されたヌクレオチドを含む、標的分子に特異的な核酸リガンドの線別方法について開示している。
【００３９】
また、糖位置での変形は、リボース（ｒｉｂｏｓｅ）の代わりに、これに代えることができる糖類似体を用いて行われてもよい。このような類似体としては、α−アノマー糖（α−ａｎｏｍｅｒｉｃ  ｓｕｇａｒｓ）、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）、キシロース（ｘｙｌｏｓｅｓ）又はリキソース（ｌｙｘｏｓｅｓ）などのエピマー糖（ｅｐｉｍｅｒｉｃ  ｓｕｇａｒｓ）、ピラノース糖（ｐｙｒａｎｏｓｅ  ｓｕｇａｒｓ）、フラノース糖（ｆｕｒａｎｏｓｅ  ｓｕｇａｒｓ）、セドヘプツロース（ｓｅｄｏｈｅｐｔｕｌｏｓｅｓ）、メチルリボシド（ｍｅｔｈｙｌｒｉｂｏｓｉｄｅ）などの脱塩基性ヌクレオシド類似体（ａｂａｓｉｃ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ）を例示することができ、さらに具体的なものは、国際特許公開ＷＯ２０１１／１３０１９５などを参照することができる。
【００４０】
ＲＮＡアプタマーは、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼまたは突然変異Ｔ７ポリメラーゼを用いて合成することができ、２’変形ヌクレオチドを含むＲＮＡアプタマーは、特に突然変異ポリメラーゼを用いて合成することができる。２’変形ヌクレオチドを含むＲＮＡアプタマーを製造することができる変異ポリメラーゼとして、突然変異Ｔ７ポリメラーゼＹ６３９Ｆ、突然変異Ｔ７ポリメラーゼＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ、突然変異Ｔ７ポリメラーゼＨ７８４Ａなどが当業分野に公知されている。Ｔ７ポリメラーゼＹ６３９Ｆは、６３９位置でチロシン残基がフェニルアラニンに変わった突然変異ポリメラーゼであって、２’−デオキシ、２’−ＮＨ２−又は２’−Ｆ−ＮＴＰを基質として用いて、２’変形ヌクレオチドを含むＲＮＡを合成することができることが当業分野で知られており（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８６：２３０５−２３０８，  １９９９）、実際の２’変形ヌクレオチドを含むＲＮＡを合成するために当業分野で広く使用されてきた。しかし、この突然変異Ｔ７ポリメラーゼＹ６３９Ｆは、２’−０Ｍｅ、２’−Ｎ３などを有する２’変形ＮＴＰ（特に２’変形ＧＴＰ）を基質として用いるには限界を持つ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２００２，  ３０（２４）：１３８）。突然変異Ｔ７ポリメラーゼＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａは、Ｙ６３９Ｆ変異体ＲＮＡポリメラーゼにさらに７８４位置でヒスチジンがアラニン残基に変わった二重突然変異ポリメラーゼであって、２’−０Ｍｅ、２’−Ｎ３などを有する２’変形ＮＴＰを基質として用いることができ、７８４位置でヒスチジンがアラニン残基に変わった単一突然変異Ｔ７ポリメラーゼＨ７８４Ａも、２’−０Ｍｅ、２’−Ｎ３などを有する２’変形ＮＴＰを基質として用いることができる。したがって、２’−０Ｍｅ、２’−Ｎ３などが導入されたＲＮＡアプタマーを合成しようとする場合は、突然変異Ｔ７ポリメラーゼＹ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ、突然変異Ｔ７ポリメラーゼＨ７８４Ａなどを用いることが好ましい（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（２４）：１３８，  ２００２）。
【００４１】
一方、ホスフェート位置での変形は、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（“ｔｈｉｏａｔｅ”）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（“ｄｉｔｈｉｏａｔｅ”）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（“ａｍｉｄａｔｅ”）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（“ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ”）に変形されたことを含む。ここで、前記Ｒ又はＲ’は、独立して、Ｈ又は置換もしくは無置換のアルキルであり、この置換もしくは無置換のアルキル（特に炭素数１〜２０のアルキル）は、エーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジルを含む。ホスフェート位置で変形される場合、その連結基は−Ｏ−、−Ｎ−、−Ｓ−又は−Ｃ−であり、これらの連結基を介して隣接のヌクレオチドが互いに結合する。
【００４２】
塩基位置での変形は、ピリミジンの５位置変形、プリンの８位置変形、ウラシルの４−位置又は５位置変形、シトシンの環外（ｅｘｏｃｌｙｃｌｉｃ）アミン変形などを含む。具体的には、ピリミジンの５位置変形の例としては、ベンジルカルボキシアミド（ｂｅｎｚｙｌｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｅ）、ベンジルアミノカルボニル（ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）、ナフチルメチルカルボキシアミド（ｎａｐｈｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｅ）、ナフチルメチルアミノカルボニル（ｎａｐｈｔｈｙｌｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）、トリプタミノカルボキシアミド（ｔｒｙｐｔａｍｉｎｏｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｅ）、トリプタミノカルボニル（ｔｒｙｐａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）などを例示することができ、ウラシルの４位置又は５位置変形の例としては、ウラシルの４位置への＝Ｓ導入（４−チオウラシル）、ウラシルの５位置への−Ｂｒ導入（５−ブロモウラシル）、ウラシルの５位置への−Ｉ導入（５−ヨードウラシル）の場合などを例示することができる。
【００４３】
塩基位置での変形に関連しては、米国特許第５，７１９，２７３号、米国特許第５，６６０，９８５号などを参照することができる。特に、米国特許第５，６６０，９８５号は、「Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」という名称で、標的分子に対して親和度が高く、塩基位置での変形されたヌクレオチドを含むアプタマーをＳＥＬＥＸ技術によって選択する方法を開示している。
【００４４】
本発明のＲＮＡアプタマーは、５’末端及び／又は３’末端で変形されてもよい。例えば、５’末端が５’−ヘキシルアミンリンカーホスホロアミダイト由来の−ＮＨ２に変形されてもよい。また、例えば、３’末端が、逆相チミジンが３’−３’結合を形成して（３’キャッピング）変形されてもよい。
【００４５】
本発明のＲＮＡアプタマーは、ポリアルキレングリコール（「ＰＡＧ」）がリンカーを介して又はリンカーなしに連結されて変形されてもよい。リンカーは、それがリンカーとしての機能を十分に果たすことができる限り、特別な制限がない。一般に、アミン（Ｒ−ＮＨ２）、活性化されたエステル（Ｒ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ”）、アンヒドリド（Ｒ’Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ”）、アミド（Ｒ’（Ｃ＝Ｏ）ＮＲ）などがリンカーとして使用できる。
【００４６】
このようなポリアルキレングリコールは、当業分野で腎臓ろ過（ｒｅｎａｌ  ｆｉｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を防止し、アプタマーの血中半減期を向上させることができると知られている。
【００４７】
本発明のＰＡＧは、通常、その分子量が５〜１００ｋＤａの範囲であるが、本発明のアプタマーの適用される適応症、剤形、投与経路などを考慮して、任意の大きさのものを選択して使用される。一般に、１０〜８０ｋＤの範囲、好ましくは３０〜５０ｋＤＡの範囲のものが使用される。
【００４８】
ＰＡＧとして典型的なものがポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）である。ＰＥＧは、腎臓ろ過を減少させるだけでなく、毒性や免疫原性がないことが知られている。ＰＥＧは線形、分枝型、多数分枝型など、その形態又は構造において特別な制限なく使用できる。
【００４９】
アプタマーなどの核酸に対するＰＥＧを含む「ＰＡＧ」の導入に関連して、具体的なことは、名称が「Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ａｐｔａｍｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ」である米国特許第２００４−０１８０３６０号などを参照することができる。
【００５０】
当業分野には、ＰＡＧ、ＰＥＧのようにアプタマーの血中半減期を増加させ、腎臓ろ過を減少させるなどの同様の作用をするＰＡＧ、ＰＥＧの代替剤が知られている。このような代替剤も、本発明のアプタマー変形に使用できる。このような代替剤としては、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）、ポリＰＥＧ、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、アルブミン、親油性化合物であるコレステロールなどが例示できる。このような代替剤も、リンカーなしに又はリンカーを介して本発明のアプタマーに結合できる。
【００５１】
本発明のアプタマー合成に関連しては、前述したように、当業分野に周知されており、例えば、固相オリゴヌクレオチド合成技術、トリエステル合成方法などの溶液相合成技術などを利用することができ、その具体的な事項は、文献［Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １４：５３９９−５４６７，  １９８６］、文献［Ｔｅｔ．  Ｌｅｔｔ．  ２７：５５７５−５５７８，  １９８６］、文献［Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ４：２５５７，  １９７７］、文献［Ｌｅｔｔ．，  ２８：２４４９，  １９７８］などを参照することができる。
【００５２】
本発明のアプタマーは、ＴＮＦ−αに結合してＴＮＦ−α抑制活性を有するので、これを有効成分としてＴＮＦ−αが媒介する障害及び疾病の予防・治療的用途の薬学的組成物に製造できる。
【００５３】
本発明の薬学的組成物において、その有効成分である本発明のアプタマーは、ＴＮＦ−α抑制活性、ＴＮＦ−αが媒介する障害及び疾病に対する予防・治療的有効性などを示すことができる限り、それが適用される疾患、剤形、投与経路などに応じて適正な任意の量（有効量）で含まれ得るが、通常の有効量は、組成物の全体重量を基準とするとき、０．００１重量％乃至２０．０重量％の範囲内で決定される。ここで、「有効量」とは、その適用対象である哺乳動物、好ましくはヒトに医療専門家などの提言による投与期間だけ本発明の組成物が投与されるとき、ＴＮＦ−αが媒介する疾患の改善効果など意図した医療的・薬理学的効果を示すことができる、本発明の組成物に含まれる有効成分の量をいう。このような有効量は、当業者の通常の能力の範囲内で実験的に決定できる。
【００５４】
本発明の薬学的組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容される担体を含むことで、当業分野に公知された通常の方法で投与経路に応じて経口用剤形又は非経口用剤形に製造できる。ここで、投与経路は、局所経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、及び粘膜組織を介した直接吸収を含む任意の適切な経路であり、二つ以上の経路を組み合わせて使用することもできる。二つ以上の経路の組み合わせの例は、投与経路に応じた２種以上の剤形の薬物が組み合わせられた場合であって、例えば、１次にいずれか１種類の薬物は静脈内経路で投与し、２次に他の種類の薬物は局所経路で投与する場合である。
【００５５】
薬学的に許容される担体は、投与経路又は剤形に応じて当業分野に周知されており、具体的には「大韓民国薬局方」を含む各国の薬局方を参照することができる。
【００５６】
本発明の薬学的組成物が経口用剤形に製造される場合、適切な担体と一緒に、当業分野に公知されている方法によって粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁液、ウエハーなどの剤形に製造できる。この時、適切な担体の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトールなどの糖類、トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉、小麦澱粉などの澱粉類、セルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース類、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油、麦芽、ゼラチン、タルク、ポリオール、植物油、エタノール、グリセロールなどを挙げることができる。製剤化する場合は、必要に応じて適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤、着色剤、希釈剤などを含むことができる。適切な結合剤としては、デンプン、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、グルコース、コーン甘味料、アルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ワックスなどが挙げることができ、潤滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウム塩とカルシウム塩、ポリエチレングリコールなどを挙げることができ、崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天（ａｇａｒ）、ベントナイト、キサンタンガム、デンプン、アルギン酸又はそのナトリウム塩などを挙げることができる。また、希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、グリシンなどを挙げることができる。
【００５７】
本発明の薬学的組成物が非経口用剤形に製造される場合、適切な担体と一緒に、当業分野に公知されている方法によって注射剤、経皮投与剤、鼻腔吸入剤及び坐剤の形で製剤化できる。注射剤として製剤化する場合、適切な担体としては、水性等張溶液又は懸濁液を使用することができ、具体的には、トリエタノールアミンが含有されたＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）や注射用滅菌水、５％デキストロースなどの等張溶液などを使用することができる。経皮投与剤として製剤化する場合、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、外用液剤、パスタ剤、リニアコメント剤、エアロール剤などの形で製剤化することができる。鼻腔吸入剤の場合、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素などの適切な推進剤を用いてエアゾールスプレーの形で製剤化することができ、坐剤として製剤化する場合、その担体としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、ポリエチレングリコール類、カカオ脂、ラウリン脂、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシエチレンステアレート類、ソルビタン脂肪酸エステル類などを使用することができる。
【００５８】
本発明の薬学的組成物は、また、リポソーム薬物送達システム、例えば小型単層ベシクル（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）、大型単層ベシクル及び多重層ベシクルの形で投与することができる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリンを含有する様々なリン脂質から製造することができる。リポソーム薬物送達システムは、当業分野に周知されており、例えば米国特許第５，２６２，５６４号を参照することができる。
【００５９】
その他の薬学的組成物の製剤化及びその製造に関連しては、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，  １９９５）］など、当業分野に周知されているところを一緒に参照することができる。
【００６０】
本発明の薬学的組成物の好ましい投与量は、患者の状態、体重、性別、年齢、患者の重症度、投与経路に応じて、１日０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇの範囲、好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば経口で投与される場合、１日約０．０５〜７，５００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。投与は、１日１回又は数回に分けて行われる。このような投与量は、あくまでも例示の目的のために記載されたものである。よって、いずれの側面においても本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。
【実施例】
【００６１】
以下、本発明を実施例によって説明する。しかし、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６２】
＜実施例１＞ＲＮＡアプタマーライブラリーの製造
ＳＥＬＥＸ過程を行うために必要な２グループのＲＮＡライブラリーを製造するために、まず、次のランダムな塩基配列を含む２種の一本鎖のＤＮＡオリゴヌクレオチドを製作した。
５’−ＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＣＧＧＣ−Ｎｎ−ＡＧＡＣＧＡＣＴＣＧＣＣＣＧＡ−３’
［オリゴヌクレオチド１］
５’−ＧＣＧＧＡＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＧ−Ｎｎ−ＣＡＣＡＴＡＡＣＣＣＡＧＡＧＧＴＣＧＡＴ−３’
［オリゴヌクレオチド２］
前記５’と３’の各下線領域は、固定領域であってそれぞれ正方向プライマーと逆方向プライマーが結合する部位であり、前記Ｎｎは、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃなどのｎ個の塩基がランダムに存在する配列である。前記正方向プライマーには、ＲＮＡ合成のためのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列が５’末端に結合されている。
【００６３】
前記２種の一本鎖のＤＮＡオリゴヌクレオチドそれぞれを鋳型としてＰＣＲを行い、２グループのＤＮＡライブラリーを製造した。
【００６４】
具体的には、１０００ｐＭのＤＮＡ一本鎖オリゴヌクレオチド、２，５００ｐＭのＰＣＲのプライマー、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．３）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を混合し、ここに０．１Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  Ｃａｌｉｆ．）を添加して９５℃の３０秒、５５℃の３０秒及び７２℃の１分の条件で３２サイクルを反応させてＰＣＲを行った後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ−ｓｐｉｎ  ＰＣＲ精製カラム（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ  Ｃａｌｉｆ．）で精製した。
【００６５】
前記製造された２グループのＤＮＡライブラリーそれぞれを鋳型としてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、次のとおり生体外転写を介して２グループのＲＮＡライブラリーを製造した。この時、ＲＮＡ分解酵素に抵抗性を与えるために、ＡＴＰ及びＧＴＰと２’−Ｆ−置換ピリミジンを含む２’Ｆ−ＣＴＰ、２’Ｆ−ＵＴＰを使用した。
【００６６】
具体的には、２００ｐＭのＤＮＡライブラリー、０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭスペルミジン、０．００２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、４％ＰＥＧ８０００、５Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、１ｍＭ  ＡＴＰとＧＴＰ、及び３ｍＭ  ２’Ｆ−ＣＴＰと２’Ｆ−ＵＴＰを混合し、３７℃で６時間反応させた。その後、ＤＮａｓｅＩ（ｐｒｏｍｅｇａ）を処理し、３７℃で３０分間反応させて、鋳型として使用されたＤＮＡを除去した後、Ｂｉｏ−Ｓｐｉｎ６クロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  Ｃａｌｉｆ．）で精製した。核酸の量及びその純粋度は、ＵＶスペクトロメーターを用いて検索した。
【００６７】
＜実施例２＞ヒトＴＮＦ−αに結合するアプタマーの分離及び配列決定
ＳＥＬＥＸ技術を活用して、ヒトＴＮＦ−αに結合するアプタマーを分離した。
【００６８】
上記で合成された一本鎖のＲＮＡライブラリー１０１４塩基配列／Ｌの濃度溶液を２００ｐＭ／２００μＬの濃度でＳＥＬＥＸバッファー（５０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％ＮａＮ３）を用いて８０℃で１０分間加熱した後、氷に１０分間放置した。使用した一本鎖核酸の５倍濃度の酵母ｔＲＮＡ（ｙｅａｓｔ  ｔＲＮＡ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）及び０．２％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ、Ｍｅｒｃｋ社製）を添加して反応溶液を準備した。
【００６９】
ヒトＴＮＦ−αのビオチン化は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ドイツ）のプロトコルに基づいて実施した。蒸留水を用いて１Ｍ重炭酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）溶液を製造し、ＤＭＦ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）を用いて１０ｍｇ／ｍｌのビオチン溶液を製造した。組換えヒトＴＮＦ−α（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ドイツ）に、前記製造された１Ｍ重炭酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）溶液を添加して、最終濃度を重炭酸ナトリウムの場合は１００ｍＭ、ヒトＴＮＦ−αの場合は１０ｍｇ／ｍｌにして、ヒトＴＮＦ−α溶液を製造した。製造されたヒトＴＮＦ−α溶液及び前記ビオチン溶液を同量で混合し、室温で１時間反応させた後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、ドイツ）に２．５ｍｌの反応溶液を添加して１０分反応させ、その後１０，０００×ｇ、１０分間遠心分離して上澄み液の遊離（ｆｒｅｅ）ビオチンを除去し、ビオチン化ヒトＴＮＦ−αを収穫した。
【００７０】
上記で準備された一本鎖ＲＮＡを含むＳＥＬＥＸバッファー反応溶液に、前記収穫したビオチン化ヒトＴＮＦ−αを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３０分間反応させて一本鎖ＲＮＡとＴＮＦ−αとの複合体を形成させた後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）のプロトコルに基づいて一本鎖ＲＮＡとＴＮＦ−αとの複合体を分離した。具体的には、ビオチン化ヒトＴＮＦ−αと一本鎖核酸とを反応させて得たビオチン化ヒトＴＮＦ−α−一本鎖核酸複合体にＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０ストレプトアビジンを添加して反応させ、前記複合体のビオチンとビーズのアビジンとの結合を用いてビオチン化ヒトＴＮＦ−α−一本鎖ＲＮＡ−ビーズ複合体を形成させ、ＳＥＬＥＸバッファー（１×ＰＢＳ、１ｍＭ酢酸マグネシウム、ｐＨ７．０）で洗浄した後、磁性物質を用いてビオチン化ヒトＴＮＦ−α−一本鎖ＲＮＡ−ビーズ複合体を収穫した。
【００７１】
前記収穫した複合体をそのまま用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、ヒトＴＮＦ−αに結合する一本鎖ＲＮＡからＤＮＡプールを増幅製作した。
【００７２】
具体的には、前記収穫した複合体に５００ｎＭのプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）を入れて６５℃で５分間変性させた後、常温で１０分間置いてＲＮＡとプライマーを結合させた。１ｍＭ  ｄＮＴＰ、５Ｘ  ＲＴバッファー、２５Ｕ  ＡＭＶ  ＲＴａｓｅ（ｐｒｏｍｅｇａ）を添加して３７℃で３０分間反応させた後、９５℃で５分間加熱し、４℃で冷まして逆転写酵素を不活性化させた。その合成されたｃＤＮＡに２５００ｐＭのＰＣＲのプライマー、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．３）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）を混合し、ここに０．１Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  Ｃａｌｉｆ．）を添加して９５℃の３０秒、５５℃の３０秒及び７２℃の１分の条件で３２サイクル反応させてＰＣＲを行うことによりＤＮＡを製造し、３％アガロースゲルを介して確認した。再び前記ＲＮＡライブラリーを作る過程と同様の過程で生体外転写を行うことによりＲＮＡを合成し、上述のように選択過程を３回繰り返し行った。
【００７３】
前記ＲＴ−ＰＣＲとＰＣＲで得られたＤＮＡをＴベクターにクローニングして単一クローンを確保し、これらの単一クローンを用いて塩基配列を分析することにより、［オリゴヌクレオチド１］に由来するＲＮＡライブラリーから配列番号１のＲＮＡ（「ＡＴＫ００１」）を含む２５種のＲＮＡの塩基配列を確保したとともに、［オリゴヌクレオチド２］に由来した配列番号２のＲＮＡ（「ＡＴＫ００７」）を含む３７種のＲＮＡの塩基配列を確保した。これらの配列が確認されたＤＡＮから上記と同様の方法で生体外転写を行うことにより、今後の実験に使用する各一本鎖ＲＮＡを準備した。
【００７４】
＜実施例３＞プレートベース結合検査（ｐｌａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を用いたＲＮＡアプタマーの結合親和度の測定
プレートベース結合検査（ｐｌａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を用いて、一本鎖ＲＮＡのヒトＴＮＦ−αに対する結合を測定した。
【００７５】
前記＜実施例２＞で配列が確認された一本鎖ＲＮＡのＴＮＦ−αとの結合親和力を調べるために、組換えヒトＴＮＦ−αタンパク質０．５ｍｇ／ｍＬをＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）に希釈して最終濃度１５μｇ／ｍＬを作り、１００μＬを９６ウェル（ｗｅｌｌ）マキシソルブプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ  ｐｌａｔｅ）に添加して４℃で一晩培養した。その後、前記ＴＮＦ−α溶液を除去した後、前記プレートを２００μＬの洗浄バッファー（ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ：ＤＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で、常温で３回洗浄した。その後、前記プレートを、ＤＰＢＳに溶けた１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）２００μＬにて常温で３０分間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。その後、前記ＢＳＡブロッキング溶液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を除去し、再び洗浄溶液２００μＬで３回洗浄した。ＤＰＢＳで０．１％ＢＳＡにて段階的に希釈（ｓｅｒｉａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）させた一本鎖ＲＮＡを前記プレートに添加し、常温で３時間培養した。２００μＬの洗浄バッファーで３回洗浄した後、ウサギ単一クローンＴＮＦ−α抗体（Ｅｐｕｔｏｍｉｃｓ、米国）０．５μｇ／ｍＬの１００μＬを前記プレートに添加し、常温で６０分間培養した。その後、前記ＴＮＦ−α抗体溶液を除去し、そのプレートを洗浄バッファー２００μＬで３回洗浄した。その後、検査バッファ（ａｓｓａｙ  ｂｕｆｆｅｒ）に１０００倍希釈された、抗−ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１００μＬをそれぞれのウェルに添加して３０分間培養した。洗浄バッファー２００μＬで３回洗浄し、ＴＭＢ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）の１００μＬを各ウェルに添加して２分間培養した後、１００μＬの停止液（ｓｔｏｐ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：２ＮＨ２ＳＯ４）を各ウェルに添加して反応を停止させた。その後、前記検査プレートを４５０ｎｍでＶｉｃｔｏｒ３Ｖ  １４２０マルチラベルカウンタ（ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて測定した。測定結果、前記＜実施例２＞で配列が分析された一本鎖ＲＮＡのうちのＡＴＫ００１又はＡＴＫ００７が組換えヒトＴＮＦ−αとの結合親和力に最も優れることを確認したとともに、ＡＴＫ００１又はＡＴＫ００７に対する５回の繰り返し実験を介してＡＴＫ００１及びＡＴＫ００７の組換えＴＮＦ−αに対する結合親和力の平均値がそれぞれ４３ｎＭ及び３０ｎＭであることを確認した。このような実験の一つから得たＡＴＫ００１に対するデータを図２に示した。
【００７６】
＜実施例４＞ＳＰＲ分析を用いたＲＮＡアプタマー結合親和度の測定
Ｂｉａｃｏｒｅ２０００機械（ＢＩＡＣＯＲＥ社製、米国）を用いてＳＰＲ（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）分析を行った。ＮＨＳ（０．１Ｍ  Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）とＤＥＣ（０．４Ｍ  Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）の同量（５０μＬ）混合物を作った後、５μＬ／ｍｉｎで４０秒流してＣＭ５センサーチップを活性化させた。１５０−２００ＲＵが現れると、固定化しようとするＴＮＦ−αタンパク質を酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）に入れて混ぜ、５０ｎｇ／Ｌとなるように流した。タンパク質の固定化が正常に行われたかを確認するために、５０ｍＭ  ＮａＯＨで５秒流した。８０℃でＲＮＡアプタマーＡＴＫ００１及びＡＴＫ００７を５分間変性させた後、常温で１５分間復元して分析対象物（ＲＮＡ）を準備した。
【００７７】
ｋｉｎｅｔｉｃｓを求めるために、流速を３０μＬ／ｍｉｎに変更した。前記準備された分析対象物を１×ＨＢＳに溶かして６．２５ｎＭ乃至５００ｎＭの濃度で準備した後、センサーチップに流して、前記選定されたＲＮＡアプタマーとＴＮＦ−αタンパク質間の結合親和度を平衡解離定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ：Ｋｄ）を用いて定量化した。
【００７８】
平衡解離定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ：Ｋｄ）は、前記選定されたＲＮＡアプタマーとＴＮＦ−αの１：１結合に設定した後、センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）から得られたＲｅｑ値のプロット曲線（ｐｌｏｔ  ｃｕｒｖｅ）から動力学Ｋａ／Ｋｄ同時プログラム（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｋａ／Ｋｄ  ｍｏｄｅｌ  ｐｒｏｇｒａｍ）を用いて求めた。
【００７９】
その結果、＜実施例２＞で選定されたＴＮＦ−αと結合する一本鎖核酸においてＡＴＫ００１とＡＴＫ００７アプタマーの計算されたＫｄは、図３に示すように４．０〜７．０ｎＭの範囲を示して強力な結合力を示した。
【００８０】
＜実施例５＞ゲルレターデーション（Ｇｅｌ  ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）を用いたＲＮＡアプタマー結合親和度の測定
放射線同位元素で内部が標識された、＜実施例２＞で選定されたＴＮＦ−αと結合する一本鎖核酸（５０ｐＭ）を、ＴＮＦ−αタンパク質の量（０〜３２０ｎＭ）を増加させながら反応させた。この時、アプタマーとＴＮＦ−αタンパク質、結合緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴ）、ｔＲＮＡ３ｇなどを合計４０μＬに合わせた後、常温で３０分間結合させた。６×ＢＰＢを添加して４℃で１２０Ｖにて６％天然ゲル（６％ポリアクリルアミド、１×ＴＢＥ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２％グリセロール）に電気泳動し、Ｘ線フィルムに露出させて現像した。トータルＲＮＡアプタマーに対するＴＮＦ−αに結合するＲＮＡアプタマーの量を計算して分離定数（Ｋｄ）を測定した。
【００８１】
このような実験を介して、ＴＮＦ−αタンパク質の量を増加させながら、放射線同位元素で標識されたＲＮＡが反応した後、４％非変性アクリルアミドゲル上に位置が変化した量を測定し、その結果を図４に示した。
【００８２】
図４のａ及びｂは、放射線同位元素で標識された５０ｐＭのＲＮＡアプタマーＡＴＫ００１（ａ）と５０ｐＭのＲＮＡアプタマーＡＴＫ００７（ｂ）に、ＴＮＦ−α（０〜３２０ｎＭ）の量を増加させながら反応させたもので、結果として得られたＴＮＦ−α−ＲＮＡアプタマー結合体（Ｃ）と結合していないＲＮＡアプタマー（Ｆ）を４％非変性アクリルアミドゲル中で分析した結果を示す写真であり、図４のｃは、ＴＮＦ−αに結合するＲＮＡの量の百分率を求めてグラフで示したもので、その結果は３回の反復実験の測定値の平均値である。
【００８３】
図４から確認できるように、ＲＮＡアプタマーＡＴＫ００１とＡＴＫ００７はいずれも、量に依存的な傾向でＴＮＦ−αと結合して効率よく位置変化を形成し、それぞれ約１８ｎＭ、５ｎＭの高い親和力を有する解離定数（Ｋｄ）を示した。特に選別されたＡＴＫ００１、ＡＴＫ００７は、標的タンパク質に１．２倍程度で強く結合することができるため、より効率的な結合力を示す。
【００８４】
＜実施例６＞ＳＰＲ分析を用いたＲＮＡアプタマーの結合特異性の測定
前記＜実施例４＞と同様の方法でＳＰＲ分析を介してＲＮＡアプタマーのＴＮＦ−αとの結合特異性を測定するために、ＴＮＦ−α以外のＥｒｂＢ２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製、米国）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．  ２０１１  Ｊｕｎ；  ２１（３）：１７３−１７８）、ＥｒｂＢ３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製、米国）（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  （２０１２），  １０９（３３）：１３２３７−４２）及びＩＧＦ−ＢＰ１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製、米国）（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１）（Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  （２００８），  ６６（２）：９１−９８）に対する結合力をＫｄで定量化して図５に示した（図５のａはＡＴＫ００１の結合力の測定結果であり、図５のｂはＡＴＫ００７の測定結果であり、図５のｃはＡＴＫ００１の結合力の測定結果である）。
【００８５】
図５から確認されるように、ＲＮＡアプタマーＡＴＫ００１とＡＴＫ００７は、ＴＮＦ−αについては１０−９Ｍ（ｎＭ）レベルであり、ＥｒｂＢ２及びＥｒｂＢ３ｄｐについては約１０４ｎＭレベルであり、ＩＧＦ−ＢＰ１（Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１）とはほぼ結合しないため、ＴＮＦ−αに対して高い結合力を有することを示す。
【００８６】
＜実施例７＞ＴＮＦ−αアプタマーが急性期タンパク質（Ａｃｕｔｅ  ｐｈａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、血管形成物質及び前炎症サイトカインの転写に及ぼす影響
実験の２４時間前に、肝臓がん細胞ＳＫ−ＨＥＰ１細胞（ＡＴＣＣ）を、１．０×１０４の密度で１０％ＦＢＳを含有したＤＭＥＭ培地がある９６ウェルフラット−ボトムマイクロタイタープレート（９６−ｗｅｌｌ  ｆｌａｔ−ｂｏｔｔｏｍ  ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ  ｐｌａｔｅｓ）に接種した。ＰＢＳでまず２μｇ／ｍＬのアプタマー（ＡＴＫ００１又はＡＴＫ００７）又は２０μｇ／ｍＬのａｎｔｉ−ＴＮＦ−αｍＡＢ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製）をヒトＴＮＦ−α（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、米国）と２時間反応させた後、形成された反応物を、細胞があるプレートのウェルに添加して、２時間培養した。次いで、細胞を温かいＰＢＳで洗浄した後、さらに４８時間完全培地で培養した。培養された細胞を収穫してＲＮＡを分離した後、急性期タンパク質（Ａｃｕｔｅ  ｐｈａｓｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、血管形成物質及び前炎症サイトカインを対象として、表１と表２のプライマーでＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲルに電気泳動して、ＴＮＦ−αアプタマーＡＴＫ００１及びＡＴＫ００７が急性期タンパク質、血管形成物質及び前炎症サイトカインの転写に及ぼす影響を評価した。
【００８７】
【表１】
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【００８８】
【表２】
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【００８９】
結果を図６に示したが、図６を参照すると、実験に使用されたＴＮＦ−αアプタマーにより、急性期タンパク質のうち、急性期反応の間に発現量が増加するタンパク質（Ｈｅｐａｔｏｇｌｏｂｉｎ、Ｆｉｂｒｏｇｅｎ−ｇａｍｍａ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ及びＴｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）は、転写レベルで発現量が抑制されたが、急性期反応の間に発現量が減少するタンパク質（Ｆｅｒｉｔｉｎ−Ｌ）は、影響が殆どなかった。
【００９０】
また、図７に示すように、実験に使用されたＴＮＦ−αアプタマーにより、急性期反応で発現量が増加する前炎症サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ６）及び血管形成物質（ＶＥＧＦ）は、転写レベルで発現量が抑制されることを観察することができた。
【００９１】
＜実施例８＞ＴＮＦ−αアプタマーがマクロファージのＮＯ産生に及ぼす影響
ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ）を１．０×１０５の密度でＲＰＭＩ１６４０と１０％ＦＢＳがある１２ウェルプレート（１２−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）のウェルに接種した。細胞に２Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−γ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＮＪ）を１時間予備処理した後、最終濃度２μｇ／ｍＬのＴＮＦ−αアプタマー（ＡＴＫ００１又はＡＴＫ００７）又は最終濃度２μｇ／ｍＬの対照物質であるＲＮＡライブラリー又は１０μｇ／ｍＬの抗ＴＮＦ−α  ｍＡＢがある１ｍＬの培地に、１００ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αが処理された実験溶液を添加した。各時点で１００μＬの培地を分取し、ＮＯ２分析は、Ｇｒｉｅｓｓの試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて決定した。すべての実験は三重で行い、３回繰り返した。
【００９２】
その結果を図８に示した。図８を参照すると、ＴＮＦ−αＲＮＡアプタマーＡＴＫ００１とＴＮＦ−αＲＮＡアプタマーＡＴＫ００７が処理された場合、ＮＯ産生が抑制されることが分かり、ＴＮＦ−αＲＮＡアプタマーＡＴＫ００７の場合は、抗ＴＮＦ−αｍＡＢと類似レベルの抑制活性を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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