(57)【要約】  本発明は、インビトロでウイルスを複製する方法に関する。語句に、本発明は、遺伝的に改変された細胞集合、及び／又は外因性化合物で処理された細胞に関しており、ここで細胞は、遺伝的改変を欠くか及び／又は外因性化合物での処理を欠く細胞よりも多くのウイルスを産生することができる。本発明は、そのような細胞を産生する方法、並びに得られたウイルスをワクチン組成物として調製することに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスの複製方法であって、
（１）遺伝子改変を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合、細胞における抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる遺伝子改変を有する細胞集合を取得し、並びに／又は、
（２）インビトロでウイルスを細胞に接種し、そして
（３）細胞を所定の期間培養してウイルスを複製させ、ここで当該細胞が、アイソジェニック細胞の集合よりも多くのウイルスを産生することができ、そして当該ウイルスがオルソミクソウイルス科である、前記方法。
【請求項２】
前記遺伝的改変が、細胞のゲノム内である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝的改変が、プログラム可能なヌクレアーゼによって導入された、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヌクレアーゼが、ＲＮＡ誘導操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼが、抗ウイルス遺伝子又はその制御領域に、欠失、置換、又は挿入を導入する、請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝的改変が、前記細胞における抗ウイルス遺伝子の前記発現を減少させるポリヌクレオチドをコードする導入遺伝子である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドが、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、マイクロRNA、前記抗ウイルス遺伝子によりコードされるタンパク質に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ分子、又はそれに由来するプロセッシングされたＲＮＡ分子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ウイルス複製方法であって、当該方法が、以下の：
（１）細胞集合を得ること、
（２）化合物を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合、抗ウイルス遺伝子の発現を減少させるか、及び／又は細胞における抗ウイルスタンパク質活性のレベルを減少させる外因性化合物を細胞に投与すること、
（３）細胞にインビトロでウイルスを播種すること、並びに、
（４）所定の時間、細胞をインキュベートして、ウイルスを複製すること、
を含み、ここで当該細胞は、アイソジェニック細胞の集合よりも多くのウイルスを産生することができ、そして当該ウイルスがオルソミクソウイルス科である、前記方法。
【請求項１０】
前記外因性化合物が、炭素系小分子、タンパク質結合剤、プログラム可能なヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、又はこれらのうち２つ以上の組合せである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質結合剤又は前記ポリヌクレオチドが、前記細胞へ投与される導入遺伝子から発現される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記導入遺伝子が、前記細胞において培養されるウイルス中に存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質が、以下の：
ＤＤＩ２、ＨＳＢＰ１、ＧＮＡＺ、ＮＰＲ２、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＬ−６、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、ＵＢＥ１ＤＣ１、ＣＤＸ２、ＬＯＣ１００８５９３３９、ＩＬ２８ＲＡ、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＮＡＳＥＩＬ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＧＡＰＤＨ、ＢＡＣＥ２、ＰＣＧＦ５、ＩＬ−１ＲＡ、ＣＡＰＮ１３、ＵＢＡ５、ＮＰＲ２、ＩＦＩＨ１、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＲＲＤＣ３、ＡＢＩ１、ＳＣＡＦ４、ＧＡＤＬ１、ＺＫＳＣＡＮ７、ＰＬＶＡＰ、ＲＰＵＳＤ１、ＣＹＹＲ１、ＵＰＦ３Ａ、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＴＯＰ１ＭＴ、ＲＡＬＧＡＰＢ、ＳＵＣＬＡ２、ＧＯＲＡＳＰ２、ＮＳＵＮ６、ＣＥＬＦ１、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＬＣ２６Ａ６、ＷＢＳＣＲ２７、ＳＩＬ１、ＨＴＴ、ＭＹＯＣ、ＴＭ９ＳＦ２，ＣＥＰ２５０、ＦＡＭ１８８Ａ、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＡＫＡＰ１０、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ４、ＣＲＫ、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＢＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＨＯＸＢ９、ＩＦＴ４３、ＩＭＰ４、ＩＳＹ１、ＫＩＡＡ０５８６、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＥＣＲ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＭＹＤ２、ＳＴＡＢ１、ＴＴＫ、ＷＮＴ３、ＸＰＯ１、ＡＨＨＲ、ＺＮＦ３３４、ＳＳＲ４、ＫＬＲＣ１、ＳＩＸ５、ＴＣＬ１Ｂ、ＺＮＦ２１１、ＭＡＧＥＬ２、ＳＢＮ０１、ＯＲ１Ｄ５、ＳＬＣ１７Ａ９、ＺＮＦ６０７、ＧＣＥＴ２、ＴＭＥＭ２２３、ＺＮＦ１４６、ＮＬＲＰ１３、ＲＬＮ２、ＮＣＲ２、ＯＲ４Ｂ１、ＧＬＵＤ２、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＮＦＧＲ２、ＩＬ−１０Ｒ２、ＩＦＮκ、ＩＦＮΩ、ＩＬ−１ＲＢ及びＨＴＲＡ４からなる群のうちの１、２、３、４、又はそれ以上から選ばれる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞は、
１）ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）由来の初代細胞由来であり；
２）ニワトリ組織由来の初代細胞由来であり；
３）ニワトリ由来の不死化細胞由来であり；
４）胚性由来幹細胞株ＥＢ１４由来であり；
５）胚性由来幹細胞株ＥＢ６６由来であり；
６）不死化ひよこ胚細胞株ＰＢＳ−１由来であり；
７）ニワトリ線維化細胞株ＤＦ−１由来であり；
８）マジン―ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓細胞；
９）アフリカミドリザル腎臓由来Ｖｅｒｏ細胞；  
１０）ヒト網膜由来ＰＥＲ．Ｃ６細胞；又は
１１）MRC-5二倍体細胞株由来である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ウイルスが、動物ウイルスである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記動物が、ヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記オルトミクソウイルス科ウイルスが、インフルエンザAウイルス、インフルエンザBウイルス、及びインフルエンザCウイルスから選ばれる、請求項1〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルスが、インフルエンザＡウイルスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記インフルエンザＡウイルスが、以下の：
Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ３、Ｈ１Ｎ４、Ｈ１Ｎ５、Ｈ１Ｎ６、Ｈ１Ｎ７、Ｈ１Ｎ９、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ４、Ｈ２Ｎ５、Ｈ２Ｎ７、Ｈ２Ｎ８、Ｈ２Ｎ９、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ３、Ｈ３Ｎ４、Ｈ３Ｎ５、Ｈ３Ｎ６、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ１、Ｈ４Ｎ２、Ｈ４Ｎ３、Ｈ４Ｎ４、Ｈ４Ｎ５、Ｈ４Ｎ６、Ｈ４Ｎ８、Ｈ４Ｎ９、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ６、Ｈ５Ｎ７、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ６Ｎ１、Ｈ６Ｎ２、Ｈ６Ｎ３、Ｈ６Ｎ４、Ｈ６Ｎ５、Ｈ６Ｎ６、Ｈ６Ｎ７、Ｈ６Ｎ８、Ｈ６Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ５、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ８、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ９Ｎ３、Ｈ９Ｎ５、Ｈ９Ｎ６、Ｈ９Ｎ７、Ｈ９Ｎ８、Ｈ１０Ｎ１、Ｈ１０Ｎ３、Ｈ１０Ｎ４、Ｈ１０Ｎ６、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ１０Ｎ９、Ｈ１１Ｎ２、Ｈ１１Ｎ３、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ１、Ｈ１２Ｎ４、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１２Ｎ９、Ｈ１３Ｎ２、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ１３Ｎ８、Ｈ１３Ｎ９、Ｈ１４Ｎ５、Ｈ１５Ｎ２、Ｈ１５Ｎ８、Ｈ１５Ｎ９  及びＨ１６Ｎ３から選ばれる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、複製されたウイルス又はその粒子を回収することを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、複製されたウイルスを細胞の分泌液から回収することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法を用いて産生されるウイルス。
【請求項２３】
ワクチン組成物を提供する方法であって、
（１）請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法を用いてウイルスを複製すること、
（２）細胞から複製されたウイルス、又はその粒子を回収すること、及び、
（３）回収されたウイルスからワクチン組成物を調製すること、
を含む、前記方法。
【請求項２４】
工程２）及び工程３）が、ウイルスを不活性化する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２３又は請求項２４に記載の方法を用いて産生されたワクチン組成物。
【請求項２６】
遺伝的改変を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合、細胞において抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる遺伝的改変を含むインビトロでの細胞集合であって、当該細胞が、アイソジェニック細胞の集合より多くのウイルスを産生することができ、そしてここでウイルスがオルソミクソウイルス科ウイルスである、前記細胞集合。
【請求項２７】
前記遺伝的改変が、プログラム可能なヌクレアーゼにより誘導された、請求項２６に記載の細胞集合。
【請求項２８】
請求項２６又は２７に記載の細胞集合の製造方法であって、以下の：
（１）遺伝子改変を１又は複数の細胞に導入すること、
（２）工程１）から産生された細胞を、遺伝的改変を欠くアイソジェニック細胞よりも多くのウイルスを産生する能力についてスクリーニングし、
（３）遺伝的改変を欠くアイソジェニック細胞よりも多くのウイルスを産生する遺伝的改変を有する１又は複数の細胞を選択し、そして
（４）場合により選択された細胞をクローン増幅すること
を含む、前記方法。
【請求項２９】
前記遺伝的改変が、前記細胞のゲノムにおいて行われる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝的改変が、プログラム可能なヌクレアーゼにより導入される、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法により産生される細胞集合。
【請求項３２】
化合物を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合に、細胞において抗ウイルス遺伝子の発現を低下させ、及び／又は抗ウイルスタンパク質活性のレベルを低下させる外因性化合物を含む、インビトロにおける細胞集合であって、ここで当該細胞が、アイソジェニック細胞の集合よりも多くのウイルスを産生することができ、そしてここで当該ウイルスがオルソミクソウイルス科である、前記細胞集合。
【請求項３３】
前記方法が、以下の：
（１）遺伝的改変を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合、細胞において抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる遺伝的改変を有する細胞集合を取得すること、
（２）細胞にインビトロでウイルスを播種すること、並びに、
（３）所定の時間、細胞を培養して、ウイルスを複製すること、
を含み、ここで当該細胞は、アイソジェニック細胞の集合よりも多くのウイルスを産生することができ、そしてウイルスがオルトミクソウイルス科である、前記方法。
【請求項３４】
前記パラミクソウイルス科のウイルスが、ニューキャッスル病ウイルスである、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロにおけるウイルス複製方法に関している。特に、本発明は、遺伝的に改変された細胞集合及び／又は外来性化合物で処理された細胞集合であって、当該細胞が、遺伝的改変を欠くか及び／又は外来性化合物での処理を欠いた細胞と比較して、より多くのウイルスを産生することができる、細胞集合に関しているウイルスレベルの増加に使用できる改変されたトリの卵に関する。本発明はまた、そのような細胞集合を生産する方法、並びに得られたウイルスのワクチン組成物を調製するための使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス感染は、ヒト及び経済に重要な家畜の両方において、経済的且つ社会的影響を及ぼす重要な健康問題である。
【０００３】
ウイルス性疾患から動物を守る主なアプローチの１つは、ワクチン接種である。充分な量のウイルスが利用可能であること、並びにウイルス生産に関連するコストがワクチンの生産の制限要因である。大量の卵の供給に依っていることが、インフルエンザワクチン、及び他のワクチン生産の現在の制限となっている。パンデミックの発生に対抗するために、又はパンデミックへの準備に対するワクチンを備蓄するために十分なワクチンを産生するにあたり直面する特定の問題である。さらに、幾つかのウイルスは、細胞培養系で産生され、これはパンデミックへの準備に対するより高い拡張性のオプションを提供する。しかしながら、すべてのウイルスが現存の細胞株において複製されるわけでなく、そうして費用対効果の高いワクチン生産のために十分なタイターで複製されないことも多い。さらに、同じウイルスの異なる下部は、同じ細胞株においても異なる複製効率を有しており、これは産生されるワクチンの量を制限する可能性があり、そしてウイルス複製が低い場合にワクチン生産のコストを増加させうる。
したがって、ワクチン生産のためウイルスを生産する改善された方法や、同ウイルスを産生するための細胞集合を開発する必要性が存在している。特に、現存の細胞株においてウイルス産生を増加させること、並びに高いウイルス収率をもたらし、かつパンデミックの出現並びにパンデミックへの準備のためのワクチン生産に対する要件にあったサイズの迅速なスケーリングに適した新たな細胞株を開発することについての必要性が存在する。このような背景に鑑み、本発明者らは、インビトロでウイルスを複製するための方法及び細胞集合を開発した。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、インビトロにおいて細胞中で抗ウイルス遺伝子の発現及び／又は抗ウイルスタンパク質活性のレベルを低減することが、細胞においてウイルス生産を増加することができるということを示した。
【０００５】
こうして、一の態様では、本発明は、ウイルスを複製する方法を提供する。この方法は、以下の：
（１）遺伝子改変を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合、細胞中の抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる遺伝子改変を有する細胞集合を取得し、
（２）インビトロで当該細胞にウイルスを播種し、そして
（３）所定の時間細胞を培養してウイルスを複製させる
を含み、ここで当該細胞が、アイソジェニック細胞の集合よりも多くのウイルスを産生することができる。
【０００６】
一実施形態において、遺伝子改変は細胞のゲノム中にある。一実施形態において、ゲノムは遺伝子改変についてホモ接合体である。一実施形態において、遺伝子改変は、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）又は核ＤＮＡに存在する。一実施形態では、遺伝子改変は、細胞集合の１００％に導入される。
【０００７】
遺伝子改変は、細胞集合において抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる所望の効果及び／又は抗ウイルスタンパク質活性のレベルを達成する天然細胞に対する任意の変化でありうる。
【０００８】
一実施形態において、遺伝子改変は、抗ウイルス遺伝子若しくはその調節領域に対する、欠失、置換、又は挿入である。例えば、遺伝子改変はプログラム可能なヌクレアーゼによって導入されてもよい。別の例において、遺伝子改変は、抗ウイルス遺伝子の一部若しくは全部を削除したり、外因性ポリヌクレオチドを抗ウイルス遺伝子に挿入したり、又は一部の抗ウイルス遺伝子（エキソン等のような）の向きを再配列したりすることによって、抗ウイルス活性を有するタンパク質をコードしないように、相同組換えによって導入され得る。別の実施形態において、遺伝子改変は非相同末端接合によって導入された。さらに別の実施形態において、遺伝子改変は化学的突然変異原によって導入された。
【０００９】
一実施形態において、遺伝子改変は点突然変異である。
【００１０】
一実施形態において、遺伝子改変は、細胞集合における抗ウイルス遺伝子の発現を減少させ、及び／又は抗ウイルスタンパク質活性のレベルを低減するポリヌクレオチドをコードする導入遺伝子により導入された。ポリヌクレオチドの例には、これらに限定されないが、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、抗ウイルス遺伝子によってコードされるタンパク質に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、トランスポゾン、アプタマー、二本鎖ＲＮＡ分子、又はそれに由来するプロセシングＲＮＡ分子が含まれる。
【００１１】
一実施形態において、導入遺伝子は、細胞集合におけるポリヌクレオチドの発現を指示するプロモーターに動作可能に連結されたポリヌクレオチドをコードする、オープンリーディングフレームを含む。
【００１２】
代替的な態様において、本発明は、ウイルスを複製する方法を提供し、本方法は、
（１）細胞集合を得ること、
（２）化合物を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合、抗ウイルス遺伝子の発現を減少させるか、及び／又は細胞における抗ウイルスタンパク質活性のレベルを減少させる外因性化合物を細胞に投与すること、
（３）細胞にインビトロでウイルスを播種すること、並びに、
（４）所定の時間、細胞をインキュベートして、ウイルスを複製すること、
を含み、ここで当該細胞は、アイソジェニック細胞の集合よりも多くのウイルスを産生することができる。
【００１３】
一実施形態において、化合物は、炭素系小分子、タンパク質結合剤、プログラム可能なヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、又はこれら２つ以上の組み合わせである。
【００１４】
一実施形態において、タンパク質結合剤又はポリヌクレオチドは、細胞に投与される導入遺伝子から発現される。
【００１５】
一実施形態において、導入遺伝子は、細胞で培養されるウイルスに存在する。
【００１６】
一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＤＤＩ２、ＨＳＢＰ１、ＧＮＡＺ、ＮＰＲ２、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＬ−６、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、ＵＢＥ１ＤＣ１、ＣＤＸ２、ＬＯＣ１００８５９３３９、ＩＬ２８ＲＡ、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＮＡＳＥＩＬ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＧＡＰＤＨ、ＢＡＣＥ２、ＰＣＧＦ５、ＩＬ−１ＲＡ、ＣＡＰＮ１３、ＵＢＡ５、ＩＦＩＨ１、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＲＲＤＣ３、ＡＢＩ１、ＳＣＡＦ４、ＧＡＤＬ１、ＺＫＳＣＡＮ７、ＰＬＶＡＰ、ＲＰＵＳＤ１、ＣＹＹＲ１、ＵＰＦ３Ａ、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＴＯＰ１ＭＴ、ＲＡＬＧＡＰＢ、ＳＵＣＬＡ２、ＧＯＲＡＳＰ２、ＮＳＵＮ６、ＣＥＬＦ１、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＬＣ２６Ａ６、ＷＢＳＣＲ２７、ＳＩＬ１、ＨＴＴ、ＭＹＯＣ、ＴＭ９ＳＦ２，ＣＥＰ２５０、ＦＡＭ１８８Ａ、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＡＫＡＰ１０、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ４、ＣＲＫ、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＢＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＨＯＸＢ９、ＩＦＴ４３、ＩＭＰ４、ＩＳＹ１、ＫＩＡＡ０５８６、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＥＣＲ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＭＹＤ２、ＳＴＡＢ１、ＴＴＫ、ＷＮＴ３、ＸＰＯ１、ＡＨＨＲ、ＺＮＦ３３４、ＳＳＲ４、ＫＬＲＣ１、ＳＩＸ５、ＴＣＬ１Ｂ、ＺＮＦ２１１、ＭＡＧＥＬ２、ＳＢＮ０１、ＯＲ１Ｄ５、ＳＬＣ１７Ａ９、ＺＮＦ６０７、ＧＣＥＴ２、ＴＭＥＭ２２３、ＺＮＦ１４６、ＮＬＲＰ１３、ＲＬＮ２、ＮＣＲ２、ＯＲ４Ｂ１、ＧＬＵＤ２、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＮＦＧＲ２、ＩＬ−１０Ｒ２、ＩＦＮκ、ＩＦＮΩ、ＩＬ−１ＲＢ及びＨＴＲＡ４のうち、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上から選択される。
【００１７】
一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＤＤＩ２、ＨＳＢＰ１、ＧＮＡＺ、ＮＰＲ２、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＬ−６、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλのうち、１つ、２つ、３つ、４つ、又は全てから選択される。
【００１８】
一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＤＤＩ２、ＨＳＢＰ１、ＧＮＡＺ、ＮＰＲ２のうち、１つ、２つ、３つ、又は全てから選択される。
【００１９】
一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＬ−６である。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＭＤＡ５である。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＣＮＯＴ４である。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮαである。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＤＤＩ２である。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＨＳＢＰ１である。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＧＮＡＺである。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＮＰＲ２である。
【００２０】
一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型インターフェロン経路に存在する。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、Ｉ型インターフェロン経路に存在する。
【００２１】
一実施形態において、細胞は、連続細胞株（continuous cell line）である。一実施形態において、細胞は接着細胞である。一実施形態において、細胞は非接着細胞（懸濁細胞）である。
【００２２】
一実施形態において、細胞は、
１）ニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）由来の初代細胞由来であり；
２）ニワトリ組織由来の初代細胞由来であり；
３）ニワトリ由来の不死化細胞由来であり；
４）胚性由来幹細胞株ＥＢ１４由来であり；
５）胚性由来幹細胞株ＥＢ６６由来であり；
６）不死化ひよこ胚細胞株ＰＢＳ−１由来であり；
７）ニワトリ線維化細胞株ＤＦ−１由来であり；
８）マジン―ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎臓細胞；
９）アフリカミドリザル腎臓由来Ｖｅｒｏ細胞；
１０）ヒト網膜由来ＰＥＲ．Ｃ６細胞；又は
１１）MRC-5二倍体細胞株由来である。
【００２３】
一実施形態において、細胞は血清の非存在下で培養される。
一実施形態において、ウイルスは、動物ウイルスである。一実施形態において、動物は、ヒト、ニワトリ、ブタ、魚、ヒツジ、又はウシである。一実施形態において、動物は、ヒトである。
【００２４】
一実施形態において、ウイルスは、オルトミクソウイルス科、ヘルペスウイルス科、パラミクソウイルス科、フラビウイルス科、及びコロナウイルス科から選択される科である。
【００２５】
一実施形態において、ウイルスは、インフルエンザウイルス、イヌジステンパーウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、鶏痘ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ムンプスウイルス、ウマ脳脊髄炎、風疹ウイルス、軟卵症候群ウイルス、トリ腫瘍退縮ウイルス、トリ感染性喉頭気管炎ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス、天然痘ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ウシイバラキウイルス、組換えポックスウイルス、トリアデノウイルスＩ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型、ブタ日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、ヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、感染性気管支炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、脳脊髄炎ウイルス、ベネズエラＥＥＶウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、マレック病ウイルス、パルボウイルス、口蹄疫ウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタコレラウイルス、ブルータングウイルス、カバネウイルス、伝染性サケ貧血ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、及び伝染性膵臓壊死症ウイルスから選択される。
【００２６】
好ましい一実施形態において、ウイルスは、オルトミクソウイルス科である。したがって一実施形態では、本発明はウイルスの複製方法であって、当該方法が、以下の
（１）遺伝的改変を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合、細胞において抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる遺伝的改変を有する細胞集合を取得すること、
（２）細胞にインビトロでウイルスを播種すること、並びに、
（３）所定の時間、細胞をインキュベートして、ウイルスを複製すること、
を含み、ここで当該細胞は、アイソジェニック細胞の集合よりも多くのウイルスを産生することができ、そしてウイルスがオルトミクソウイルス科である、方法を提供する。
【００２７】
一実施形態では、オルトミクソウイルス科のウイルスは、インフルエンザウイルスAウイルス、インフルエンザBウイルス、及びインフルエンザCウイルスから選ばれる。
【００２８】
一実施形態では、インフルエンザAウイルスは、以下の：
Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ３、Ｈ１Ｎ４、Ｈ１Ｎ５、Ｈ１Ｎ６、Ｈ１Ｎ７、Ｈ１Ｎ９、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ４、Ｈ２Ｎ５、Ｈ２Ｎ７、Ｈ２Ｎ８、Ｈ２Ｎ９、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ３、Ｈ３Ｎ４、Ｈ３Ｎ５、Ｈ３Ｎ６、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ１、Ｈ４Ｎ２、Ｈ４Ｎ３、Ｈ４Ｎ４、Ｈ４Ｎ５、Ｈ４Ｎ６、Ｈ４Ｎ８、Ｈ４Ｎ９、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ６、Ｈ５Ｎ７、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ６Ｎ１、Ｈ６Ｎ２、Ｈ６Ｎ３、Ｈ６Ｎ４、Ｈ６Ｎ５、Ｈ６Ｎ６、Ｈ６Ｎ７、Ｈ６Ｎ８、Ｈ６Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ５、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ８、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ９Ｎ３、Ｈ９Ｎ５、Ｈ９Ｎ６、Ｈ９Ｎ７、Ｈ９Ｎ８、Ｈ１０Ｎ１、Ｈ１０Ｎ３、Ｈ１０Ｎ４、Ｈ１０Ｎ６、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ１０Ｎ９、Ｈ１１Ｎ２、Ｈ１１Ｎ３、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ１、Ｈ１２Ｎ４、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１２Ｎ９、Ｈ１３Ｎ２、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ１３Ｎ８、Ｈ１３Ｎ９、Ｈ１４Ｎ５、Ｈ１５Ｎ２、Ｈ１５Ｎ８、Ｈ１５Ｎ９及びＨ１６Ｎ３から選ばれる。
【００２９】
代替の好ましい実施形態では、ウイルスは、パラミクソウイルス科である。こうして、本発明の実施形態は、ウイルスを複製する方法であって、当該方法が以下の：
（１）遺伝的改変を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合、細胞において抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる遺伝的改変を有する細胞集合を取得すること、
（２）細胞にインビトロでウイルスを播種すること、並びに、
（３）所定の時間、細胞をインキュベートして、ウイルスを複製すること、
を含み、ここで当該細胞は、アイソジェニック細胞の集合よりも多くのウイルスを産生することができ、そして当該ウイルスが、パラミクソウイルス科である、方法を提供する。
【００３０】
一実施形態では、パラミクソウイルス科のウイルスは、ニューキャッスル病ウイルスである。
【００３１】
一実施形態では、ウイルスは、インフルエンザAウイルスである。
【００３２】
一実施形態では、本方法は、さらに複製されたウイルス又はそのウイルス粒子を回収することを含む。一実施形態では、本方法は、さらに複製されたウイルス又はその粒子を、細胞の分泌物から回収することをさらに含む。一実施形態では、粒子は、スプリットウイルス粒子及びサブユニットウイルス粒子を含む。
【００３３】
一態様では、本発明は、本明細書に記載される方法を用いて産生されたウイルスを提供する。一実施形態では、ウイルスはインフルエンザウイルスである。
【００３４】
別の態様において、本発明は、ワクチン組成物を生産する方法を提供し、本方法は、
（１）本発明に記載の方法を用いてウイルスを複製すること、
（２）細胞に由来する複製されたウイルス、又はその粒子を回収すること、及び、
（３）回収されたウイルスからワクチン組成物を調製すること、を含む。
【００３５】
一実施形態において、ステップ（２）又はステップ（３）は、ウイルスを不活性化することを含む。一実施形態において、ウイルスを不活性化することは、ＵＶ、熱、又は化学的不活性化を含む。
【００３６】
一実施形態において、ステップ（２）又はステップ（３）は、ウイルスを分裂させて、スプリットウイルス粒子又はサブユニットウイルス粒子を産生することを含む。
【００３７】
当業者が理解するように、本発明のワクチン組成物を生産する方法は、当該技術分野における標準的な技術を用いて実施することができる。
【００３８】
一実施形態において、複製ウイルス又はその粒子の収穫は、（１）浄化、（２）濃縮、（３）不活性化、（４）ヌクレアーゼ処理、（５）分離／精製、（６）研磨、及び／又は（７）滅菌濾過を含む。
【００３９】
本明細書に記載される方法を用いて製造されたワクチン組成物もまた提供される。
【００４０】
さらに別の態様では、本発明は、遺伝的改変を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合、細胞において抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる遺伝的改変を含む細胞集合を、インビトロで提供し、ここで当該細胞は、アイソジェニック細胞の集合より多くのウイルスを産生することができる。
【００４１】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載される細胞集合を産生する方法を提供し、この方法は以下の：
（１）遺伝子改変を１又は複数の細胞に導入すること、
（２）工程１）から産生された細胞を、遺伝的改変を欠くアイソジェニック細胞よりも多くのウイルスを産生する能力についてスクリーニングし、
（３）遺伝的改変を欠くアイソジェニック細胞よりも多くのウイルスを産生する遺伝的改変を有する１又は複数の細胞を選択し、そして
（４）場合により選択された細胞をクローン増幅すること
を含む。
【００４２】
当業者が理解するように、本発明の細胞集合を産生する方法は、本技術分野の標準技術を用いて行うことができる。
【００４３】
一実施形態では、遺伝的改変は、細胞のゲノムにおいてなされる。
【００４４】
一実施形態では、遺伝的改変は、プログラム可能なヌクレアーゼにより導入される。
【００４５】
一の態様では、本発明は、本明細書に記載される方法により製造される細胞集合を提供する。
【００４６】
さらなる態様では、本発明は、インビトロで、化合物を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合に、細胞において抗ウイルス遺伝子の発現を低下させ、及び／又は抗ウイルスタンパク質活性のレベルを低下させる外因性化合物を含む細胞集合を提供し、ここで当該細胞は、アイソジェニック細胞の集合よりも多くのウイルスを産生することができる。
【００４７】
一実施形態では、外因性化合物は、炭素系小分子、タンパク質結合剤、プログラム可能なヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、又はこれら２つ以上の組み合わせである。
【００４８】
一実施形態において、タンパク質結合剤又はポリヌクレオチドは、細胞に投与される導入遺伝子から発現される。
【００４９】
一実施形態では、タンパク質結合剤は抗体である。
【００５０】
本明細書中のあらゆる実施形態は、特に断りのない限り、あらゆる他の実施形態に準用される。例えば、当業者が遺伝的改変を含む本発明の方法について上述したプログラム可能なヌクレアーゼの例を理解することは、本発明の外因性化合物を含む方法に等しく適用される。
【００５１】
本発明は、本明細書に記載された特定の実施形態によって限定されるものではなく、例示の目的にのみ意図される。機能的に等価な製品、組成物、及び方法は、本明細書に記載されるように、本発明の範囲内に明確にある。
【００５２】
本明細書中では、特に明記されていない限り、又は文脈によって求められない限り、単一のステップ、材料の組成、ステップの群、又は材料の組成物の群に対する参照は、これらのステップ、材料の組成物、ステップの群、又は材料の組成物の群の単数及び複数（すなわち、１つ以上）を包含するものと考えられるべきである。
【００５３】
以下、以下の非限定的な実施例及び添付の図を参照して本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、ウイルス中和アッセイにおける組換えニワトリ（ｒｃｈ）ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、及びＩＦＮλの抗ウイルス活性を示す。細胞生存率の増加はＯＤの増加に等しい。吸光度値は、平均±標準偏差であり、２つの独立した実験からの重複を意味する。細胞単独及び細胞＋ウイルス対照は、２４ウェルからの平均として示されている。
【図２】図２Ａは、間接ＥＬＩＳＡ分析が、精製抗ＩＦＮ（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、及びＩＦＮλ）血清が相同タンパク質を認識することを明らかにすることを示す。グラフは、硫酸アンモニウム沈降ポリクローナル抗ｃｈＩＦＮ抗血清がＥＬＩＳＡで相同タンパク質を検出することを示す。ＯＤは抗体レベルの尺度である。示されている吸光度値は、平均±標準偏差であり、２つの独立した実験からの重複を意味する。図２Ｂは、抗ｃｈＩＦＮ−α抗体が、卵におけるウイルス力価を増加させるものではないことを示す。卵においてインフルエンザワクチンウイルス（ＰＲ８又はＮＩＢＲＧ１４）を同時接種した抗ｃｈＩＦＮ−α抗体は、血球凝集反応（ＨＡ）アッセイで測定した赤血球凝集反応（ＨＡ）力価を増強しない。棒グラフは、４件の実験±標準偏差の平均値を表す。図２Ｃは、抗ｃｈＩＦＮ−β抗体が、卵においてウイルス力価が増加するようではないことを示す。精製抗ｃｈＩＦＮ‐β抗体とインフルエンザワクチンウイルス（ＰＲ８又はＮＩＢＲＧ１４）との同時投与は、ＨＡアッセイによって決定された卵中のウイルスＨＡ力価に影響を及ぼさない。棒グラフは、最大３件の実験±標準偏差の平均値を表す。
【図３】図３Ａは、抗ｃｈＩＦＮ−λ抗体が、ウイルス価を卵中で増加させることを示す。精製抗ｃｈＩＦＮ−λ抗体及びインフルエンザワクチンウイルス（ＰＲ８又はＮＩＢＲＧ１４）の接種は、ＨＡアッセイによって測定された卵におけるＨＡ力価の増加をもたらす。棒グラフは最大７件の実験±標準偏差の平均値である。統計学的有意差はアスタリスク１つ（＊）ｐ＜０．０５、アスタリスク２つ（＊＊）ｐ＜０．００５、アスタリスク３つ（＊＊＊）で表す。ｐ＝０．０００１。図３Ｂは、抗ｃｈＩＦＮ−γ抗体が、ウイルス力価を卵中で増加させることを示す。抗ｃｈＩＦＮ−γ抗体及びインフルエンザワクチンウイルス（ＰＲ８又はＮＩＢＲＧ１４）の同時投与は、ＨＡアッセイによって測定された卵におけるウイルスＨＡ力価の増加をもたらす。棒グラフは２件の実験±標準偏差の平均値を表す。統計学的有意差はアスタリスク１つ（＊）ｐ＜０．０５で表される。図３Ｃは、抗ｃｈＩＬ−６抗体が、ウイルス力価を卵中で増加させることを示す。精製した抗ｃｈＩＬ−６抗体及びインフルエンザワクチンウイルス（ＰＲ８又はＮＩＢＲＧ１４）の両方を卵に注入する効果は、ＨＡアッセイによって測定されるＨＡウイルス力価の増加をもたらす。棒グラフは、最大５件の実験±標準偏差の平均値を表す。統計学的有意差は、アスタリスク１つ（＊）ｐ＜０．０５、アスタリスク２つ（＊＊）ｐ＜０．００５で表される。
【図４】図４は、鳥インフルエンザのワクチン生産のための抗ウイルス遺伝子のスクリーニングと同定を示す。Ａ．陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ１）、又は２１の候補宿主遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＤＦ−１細胞の生存能。生存率は、ウイルス感染時、トランスフェクションから７２時間後に測定した。Ｂ．インフルエンザＡ／ＷＳＮの力価は、不死化ニワトリ線維芽細胞株、ＤＦ−１、対照細胞（ｓｉＮＴ１）、又はｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞内で、２１の宿主遺伝子の発現を沈黙させるために増殖した。ｓｉＲＮＡを用いてノックダウン（ＫＤ）後にＴＣＤＩ50として測定したウイルス力価の有意な増加が観察され、ＩＦＮＲＡ１はウイルス力価の最高の増加を示す。Ｃ．ＤＦ１細胞上のウイルス粒子の免疫染色は、ｓｉＲＮＡによるＩＦＮＡＲ１発現の阻害後のウイルス増殖の有意な増加を示す。
【図５−１】図５は、宿主の遺伝子発現のｓｉＲＮＡ下方制御が、インビトロでウイルス増殖を増加させることを示す。ＤＦ−１細胞は、陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ１）を取らすフェクトするか、又はＣＮＯＴ４、ＩＦＮＡＲ若しくはＭＤＡ５を標的とし、プールされた（スマートプール）４つのｓｉＲＮＡ二本鎖、若しくは個々のｓｉＲＮＡ二本鎖としてのいずれかを標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のｍＲＮＡレベルと比較して、ｐ＜０．０５。ｍＲＮＡレベルを、定量的リアルタイムＰＣＲ法によるトランスフェクションの７２時間後に、Ｔａｑｍａｎプローブを用いて定量した。ｓｉＲＮＡ複合体の各々を、標的遺伝子ＫＤに対する能力（左側に表示）、及びウイルス力価を増加させる能力（右側に表示する）で評価した。細胞を、インフルエンザＡ／ＷＳＮウイルス（ＭＯＩ０．１）に４８時間感染させた。細胞上清中のウイルスレベルを、ＴＣＩＤ50アッセイによって定量した。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のウイルスレベルと比較して、ｐ＜０．０５。
【図５−２】図５は、宿主の遺伝子発現のｓｉＲＮＡ下方制御が、インビトロでウイルス増殖を増加させることを示す。ＤＦ−１細胞は、陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ１）を取らすフェクトするか、又はＣＮＯＴ４、ＩＦＮＡＲ若しくはＭＤＡ５を標的とし、プールされた（スマートプール）４つのｓｉＲＮＡ二本鎖、若しくは個々のｓｉＲＮＡ二本鎖としてのいずれかを標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のｍＲＮＡレベルと比較して、ｐ＜０．０５。ｍＲＮＡレベルを、定量的リアルタイムＰＣＲ法によるトランスフェクションの７２時間後に、Ｔａｑｍａｎプローブを用いて定量した。ｓｉＲＮＡ複合体の各々を、標的遺伝子ＫＤに対する能力（左側に表示）、及びウイルス力価を増加させる能力（右側に表示する）で評価した。細胞を、インフルエンザＡ／ＷＳＮウイルス（ＭＯＩ０．１）に４８時間感染させた。細胞上清中のウイルスレベルを、ＴＣＩＤ50アッセイによって定量した。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のウイルスレベルと比較して、ｐ＜０．０５。
【図５−３】図５は、宿主の遺伝子発現のｓｉＲＮＡ下方制御が、インビトロでウイルス増殖を増加させることを示す。ＤＦ−１細胞は、陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ１）を取らすフェクトするか、又はＣＮＯＴ４、ＩＦＮＡＲ若しくはＭＤＡ５を標的とし、プールされた（スマートプール）４つのｓｉＲＮＡ二本鎖、若しくは個々のｓｉＲＮＡ二本鎖としてのいずれかを標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のｍＲＮＡレベルと比較して、ｐ＜０．０５。ｍＲＮＡレベルを、定量的リアルタイムＰＣＲ法によるトランスフェクションの７２時間後に、Ｔａｑｍａｎプローブを用いて定量した。ｓｉＲＮＡ複合体の各々を、標的遺伝子ＫＤに対する能力（左側に表示）、及びウイルス力価を増加させる能力（右側に表示する）で評価した。細胞を、インフルエンザＡ／ＷＳＮウイルス（ＭＯＩ０．１）に４８時間感染させた。細胞上清中のウイルスレベルを、ＴＣＩＤ50アッセイによって定量した。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のウイルスレベルと比較して、ｐ＜０．０５。
【図５−４】図５は、宿主の遺伝子発現のｓｉＲＮＡ下方制御が、インビトロでウイルス増殖を増加させることを示す。ＤＦ−１細胞は、陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＴ１）を取らすフェクトするか、又はＣＮＯＴ４、ＩＦＮＡＲ若しくはＭＤＡ５を標的とし、プールされた（スマートプール）４つのｓｉＲＮＡ二本鎖、若しくは個々のｓｉＲＮＡ二本鎖としてのいずれかを標的とするｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のｍＲＮＡレベルと比較して、ｐ＜０．０５。ｍＲＮＡレベルを、定量的リアルタイムＰＣＲ法によるトランスフェクションの７２時間後に、Ｔａｑｍａｎプローブを用いて定量した。ｓｉＲＮＡ複合体の各々を、標的遺伝子ＫＤに対する能力（左側に表示）、及びウイルス力価を増加させる能力（右側に表示する）で評価した。細胞を、インフルエンザＡ／ＷＳＮウイルス（ＭＯＩ０．１）に４８時間感染させた。細胞上清中のウイルスレベルを、ＴＣＩＤ50アッセイによって定量した。ｓｉＮＴ１でトランスフェクトされた細胞のウイルスレベルと比較して、ｐ＜０．０５。
【図６】図６は、卵由来のＴＣＩＤ50ＷＳＮを示す。Ａ．ＡＢＡ−２１／１１７Ｑ値を用いて送達されたｓｉＲＮＡによる下方制御後の卵由来のＴＣＩＤ50ＷＳＮは、単一複製として得られる。Ｂ．ＡＢＡ−２１／１１７Ｑを用いて送達されたｓｉＲＮＡによって下方制御された卵由来のＴＣＩＤ50ＷＳＮ。値は平均＋２標準偏差として得られる。
【図７Ａ−Ｂ】図７は、卵由来のＴＣＩＤ50ＷＳＮを示す。Ａ．ＡＢＡ−２１／１１７Ｑを用いて送達されたｓｉＲＮＡによる下方制御後の、卵由来のＴＣＩＤ50ＰＲ８ワクチン株。値は平均＋２標準偏差として得られる。Ｂ．ＴＣＩＤ50力価とＩＦＮＡＲ１のノックダウンとの相関。Ｃ．ＡＢＡ−２１／１１７Ｑを用いて送達されたｓｉＲＮＡによる下方制御によって得られたＨＡ及びＴＣＩＤ50最大値は、対照と比較して３ｌｏｇの増加に相当する。ｓｈＩＦＮＡＲ１は卵のインフルエンザ増殖を増加させる。Ｄ．ｓｈＩＦＮＡＲ１の発現及びインフルエンザＲＮＡのレベルを、０日目のＲＣＡＳ‐ｓｈＩＦＮＡ１注射後の１２胚の心臓、及び胚発生の１０日目のインフルエンザ（ＰＲ８株）への感染時にて、測定した。リアルタイムＰＣＲの生ＣＴ値は、ｓｈＩＦＮＡＲ１及びインフルエンザＲＮＡレベルの発現との相関を示す。ｓｈＩＦＮＡＲ１及びインフルエンザＲＮＡの発現が高いほど、ＣＴ値は低いことが示されている（Ｎ＝６）。
【図７Ｃ−Ｄ】図７は、卵由来のＴＣＩＤ50ＷＳＮを示す。Ａ．ＡＢＡ−２１／１１７Ｑを用いて送達されたｓｉＲＮＡによる下方制御後の、卵由来のＴＣＩＤ50ＰＲ８ワクチン株。値は平均＋２標準偏差として得られる。Ｂ．ＴＣＩＤ50力価とＩＦＮＡＲ１のノックダウンとの相関。Ｃ．ＡＢＡ−２１／１１７Ｑを用いて送達されたｓｉＲＮＡによる下方制御によって得られたＨＡ及びＴＣＩＤ50最大値は、対照と比較して３ｌｏｇの増加に相当する。ｓｈＩＦＮＡＲ１は卵のインフルエンザ増殖を増加させる。Ｄ．ｓｈＩＦＮＡＲ１の発現及びインフルエンザＲＮＡのレベルを、０日目のＲＣＡＳ‐ｓｈＩＦＮＡ１注射後の１２胚の心臓、及び胚発生の１０日目のインフルエンザ（ＰＲ８株）への感染時にて、測定した。リアルタイムＰＣＲの生ＣＴ値は、ｓｈＩＦＮＡＲ１及びインフルエンザＲＮＡレベルの発現との相関を示す。ｓｈＩＦＮＡＲ１及びインフルエンザＲＮＡの発現が高いほど、ＣＴ値は低いことが示されている（Ｎ＝６）。
【図８Ａ−Ｂ】図８は、ＩＦＮＡＲ１ＤＦ−１ＫＯ細胞株の生成を示す。Ａ．トランスフェクション後、親細胞株由来の細胞は、対立遺伝子の約３０％でＰＣＲスクリーニング中に代替アンプリコンを提示した。欠失は配列決定によって確認された。野生型（ＷＴ）と比較した場合、細胞を選別して、２対立遺伝子（Ａ１３６及びＡ１４２）、単一対立遺伝子（Ａ１３）、又は明確な欠失なし（Ａ１４３）を示す単一クローンを得た。Ｂ．ＩＦＮＡＲ１Ａ遺伝子発現をｑＰＣＲにより評価した。結果は、ＫＯ細胞株上で産生されるハウスキーピングＷＳＮウイルス粒子に対する、ΔΔｃｔ値＋／−２標準偏差（ＳＤ）の平均として表した。全ウイルス収率を示す指標として、異なる細胞株上のＨ１Ｎ１Ａ／ＷＳＮ／１９３３成長を用いてＭＤＣＫ細胞を感染させた後、Ｐｆｕ及びＴＣＩＤ50を確立した。Ｃ．遺伝子ＫＯは０時間と４８時間である。Ｄ．ＫＯ細胞株上で産生されるＷＳＮウイルス粒子。全ウイルス収率を示す指標として、異なる細胞株上のＨ１Ｎ１Ａ／ＷＳＮ／１９３３成長を用いてＭＤＣＫ細胞を感染させた後、Ｐｆｕ及びＴＣＩＤ50を確立した。
【図８Ｃ】図８は、ＩＦＮＡＲ１ＤＦ−１ＫＯ細胞株の生成を示す。Ａ．トランスフェクション後、親細胞株由来の細胞は、対立遺伝子の約３０％でＰＣＲスクリーニング中に代替アンプリコンを提示した。欠失は配列決定によって確認された。野生型（ＷＴ）と比較した場合、細胞を選別して、２対立遺伝子（Ａ１３６及びＡ１４２）、単一対立遺伝子（Ａ１３）、又は明確な欠失なし（Ａ１４３）を示す単一クローンを得た。Ｂ．ＩＦＮＡＲ１Ａ遺伝子発現をｑＰＣＲにより評価した。結果は、ＫＯ細胞株上で産生されるハウスキーピングＷＳＮウイルス粒子に対する、ΔΔｃｔ値＋／−２標準偏差（ＳＤ）の平均として表した。全ウイルス収率を示す指標として、異なる細胞株上のＨ１Ｎ１Ａ／ＷＳＮ／１９３３成長を用いてＭＤＣＫ細胞を感染させた後、Ｐｆｕ及びＴＣＩＤ50を確立した。Ｃ．遺伝子ＫＯは０時間と４８時間である。Ｄ．ＫＯ細胞株上で産生されるＷＳＮウイルス粒子。全ウイルス収率を示す指標として、異なる細胞株上のＨ１Ｎ１Ａ／ＷＳＮ／１９３３成長を用いてＭＤＣＫ細胞を感染させた後、Ｐｆｕ及びＴＣＩＤ50を確立した。
【図８Ｄ】図８は、ＩＦＮＡＲ１ＤＦ−１ＫＯ細胞株の生成を示す。Ａ．トランスフェクション後、親細胞株由来の細胞は、対立遺伝子の約３０％でＰＣＲスクリーニング中に代替アンプリコンを提示した。欠失は配列決定によって確認された。野生型（ＷＴ）と比較した場合、細胞を選別して、２対立遺伝子（Ａ１３６及びＡ１４２）、単一対立遺伝子（Ａ１３）、又は明確な欠失なし（Ａ１４３）を示す単一クローンを得た。Ｂ．ＩＦＮＡＲ１Ａ遺伝子発現をｑＰＣＲにより評価した。結果は、ＫＯ細胞株上で産生されるハウスキーピングＷＳＮウイルス粒子に対する、ΔΔｃｔ値＋／−２標準偏差（ＳＤ）の平均として表した。全ウイルス収率を示す指標として、異なる細胞株上のＨ１Ｎ１Ａ／ＷＳＮ／１９３３成長を用いてＭＤＣＫ細胞を感染させた後、Ｐｆｕ及びＴＣＩＤ50を確立した。Ｃ．遺伝子ＫＯは０時間と４８時間である。Ｄ．ＫＯ細胞株上で産生されるＷＳＮウイルス粒子。全ウイルス収率を示す指標として、異なる細胞株上のＨ１Ｎ１Ａ／ＷＳＮ／１９３３成長を用いてＭＤＣＫ細胞を感染させた後、Ｐｆｕ及びＴＣＩＤ50を確立した。
【図９】図９は、ヘンドラウイルスに対する抗ウイルス遺伝子のスクリーニング及び同定を示す。不死化ヒト細胞株ＨｅＬａ、対照細胞（ｓｉＮＴ１）、又はｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞中における、ヘンドラウイルス複製。ｓｉＲＮＡを用いたウイルス複製の有意な増加が観察された。ＬＡＭＰ１はウイルス力価の最大上昇を示した。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
一般的技術及び選択した定義
特に定義されていない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、精密ゲノム工学、タンパク質化学、生化学など）。
【００５６】
特に明記されない限り、本発明で利用される細胞培養及び免疫学的技術は、当業者によく知られている標準的な手順である。そのような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編集者）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編集者）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５及び１９９６）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編集者）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの全ての更新を含む）、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（編集者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、及びＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（編集者）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（現在までの全ての更新を含む）のような文献を通して記述され、説明されている。
【００５７】
用語「及び／又は」、例えば「Ｘ及び／又はＹ」とは、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味するものと解釈され、両方の意味又はいずれかの意味について明示的な支持を提供するために取られる。
【００５８】
本明細書全体を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のようなバリエーションは、指定された要素、整数若しくはステップ、又は要素の群、整数若しくはステップ、あらゆるその他の要素の除外をしないが、整数若しくはステップの群、又は要素の群、整数若しくはステップを包含することを意味するものと理解されたい。
【００５９】
本明細書に使用される場合に、「ウイルスを複製する」という語句は、宿主細胞複製機構を用いて、細胞及び／又は培地中の開始時のウイルスコピー数と比較して、細胞及び／又は培地中のウイルスコピー数を増加させることを指す。
【００６０】
本明細書に使用される場合、「細胞集合」という語句は、細胞培養方法を用いてインビトロで培養でき、かつその中でウイルスが複製できる任意の細胞集合である。一実施形態では、細胞は、哺乳動物、鳥又は節足動物でありうる。一実施形態では、細胞は、初代細胞株由来である。一実施形態では、細胞は不死化細胞株由来である。一実施形態では、細胞は接着細胞である。一実施形態では、細胞は非接着細胞（懸濁細胞）である。
【００６１】
本明細書で用いられる場合、用語「遺伝子改変」とは、細胞における遺伝物質に対するあらゆる人工的改変である。この組換えは、細胞集合の祖先、又は細胞集合に対して行われていてもよい。一の例では、遺伝的改変は、細胞集合の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％に対してなされる。一の例において、遺伝子改変は、プログラム可能なヌクレアーゼによって導入されたゲノム中の内因性遺伝子に対する突然変異である。例えば、変異は、もはや機能性タンパク質をコードしない遺伝子をもたらす、フレームシフト及び／又は欠失であってもよい。別の実施形態において、相同組換えが用いられて、抗ウイルスタンパク質が産生されないように標的抗ウイルス遺伝子全体の一部を削除する。代替的な実施形態において、遺伝子改変は、例えば、細胞集合に所望のポリヌクレオチドを発現する核酸構築物中の導入遺伝子の命令である。遺伝子改変は、染色体外であるか、又は細胞の核やミトコンドリアゲノムに組み込まれていてもよい。１の例では、遺伝的改変は、宿主から単離される前に、遺伝的改変が細胞に導入される。一の例では、遺伝的改変は、宿主から細胞が単離されたのちに細胞へと導入される。
【００６２】
本明細書で用いられる場合、「外因性化合物」は、所望の結果を生成するために細胞に投与される、炭素系小分子、タンパク質、又はポリヌクレオチドといったあらゆる物質であり得る。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、用語「アイソジェニック細胞の集合よりも多くのウイルスを産生する」やその類似の表現は、本明細書に記載されるように、遺伝的改変又は外因性化合物を欠くアイソジェニック細胞の集合よりも多くのウイルスを培養するために使用される細胞集合の能力を指す。アイソジェニック細胞は、遺伝的改変及び／又は外因性化合物の存在は別として、本発明の細胞集合と遺伝的には同一である。一実施形態では、本発明の細胞集合は、遺伝子改変及び／又は外因性化合物を欠くアイソジェニック細胞の集合と比べた場合、少なくとも０．５倍、又は少なくとも１倍、又は少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、又は少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍、又は少なくとも１５倍、又は少なくとも２０倍、又は少なくとも５０倍、又は少なくとも１００倍以上のウイルスを生成する。このようなウイルス生産の増加は、ルーチン技術を用いて熟練者によって容易に決定できる。例えば、遺伝的改変を有するか、又は外因性化合物を投与された細胞集合は、同一の量の同一のウイルスを接種することができ、並びに同一の期間に同一の条件下でインキュベートすることができ、そして細胞集合におけるウイルス粒子の量は、実施例にて概説するような技術といった一般的な技術を用いて決定することができる。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、用語「ウイルス又はその粒子」とは、不活性化されていても又はいなくてもよい全ウイルス、及びうそのようなウイルスの粒子に関する、ウイルス粒子は、スプリットウイルスワクチン又はサブユニットウイルスワクチンで使用するのに適したあらゆるサイズであり得る。全ウイルス又はウイルスの粒子は、細胞集合又はその分泌物（又は上清）から回収することができる。回収された全ウイルスは、ワクチン組成物の調製中に破壊されて、スプリットウイルスワクチン又はサブユニットウイルスワクチンに適当なサイズの粒子を形成することができる。
【００６５】
本明細書で用いられる場合、用語「抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる」とは、遺伝子改変及び／又は外因性化合物が、遺伝的改変や外因性の化合物を欠くアイソジェニック細胞のレベルと比較した場合、細胞集合においてＲＮＡ転写物のレベル及び／又はＲＮＡ転写物からの翻訳レベルを下方制御する能力を指す。一実施形態において、アイソジェニック細胞は、遺伝的改変及び／又は外因性化合物の存在以外は、本発明の細胞集合と遺伝的に同一である。一実施形態において、遺伝的改変及び／又は外因性化合物は、遺伝的改変及び／又は外因性化合物を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合に、細胞集合において抗ウイルス遺伝子の発現を、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％又は９５％以上、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％分減少する。このような減少は、標準的な手順を用いて同定することができる。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、用語「抗ウイルスタンパク質活性のレベルを低下させる」とは、遺伝的改変を欠くアイソジェニック細胞におけるレベルと比較した場合、遺伝子改変及び／又は外因性化合物が、細胞集合中の抗ウイルスタンパク質活性レベルを下方制御する能力を指す。一実施形態において、アイソジェニック細胞は、本発明の本発明の細胞集合とは、遺伝子改変及び／又は外因性化合物の存在を除いて、遺伝的に同一である。タンパク質の活性は、例えば、細胞集合中のタンパク質の量を減少させること、及び／又は細胞集合中のタンパク質の自然機能を果たす能力を低下させることによって（例えば、外因性化合物（例えば、抗体）を活性部位に結合させることによって）減少させることができる。一実施形態において、遺伝子改変及び／又は外因性化合物は、遺伝子改変及び／又は外因性化合物を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％以上、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は１００％分、細胞集合の抗ウイルスたんぱく活性レベルを低下させる。このような減少は、標準的な手順を用いて同定することができる。
【００６７】
本明細書に言及されている「導入遺伝子」とは、バイオテクノロジー分野における通常の意味を有し、組換えＤＮＡ又はＲＮＡ技術によって製造又は改変されていて、そして本発明の細胞集合に導入された、遺伝子配列を含む。一般に、導入遺伝子は、例えば形質転換によって、ヒトの操作により本発明の細胞集合に導入されているが、あらゆる方法を当業者は使用することができる。導入遺伝子には、染色体に導入される遺伝子配列及び染色体外の遺伝子配列が含まれる。この導入遺伝子は、典型的には、本発明の細胞集合にポリヌクレオチドを発現するために好適なプロモーターに作動可能に連結された目的のポリヌクレオチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。
【００６８】
本明細書に言及される用語「炭素系小分子」とは、分子量が、２０００ダルトン以下、好ましくは１５００ダルトン未満、さらに好ましくは１０００ダルトン未満、さらにより好ましくは７５０ダルトン未満、それ以上さらにより好ましくは５００ダルトン以下の、化学物質又は分子を指す。
【００６９】
「トリ」という語句は、本明細書中で、分類上鳥類に分類される任意の種、亜種、又はレースを指し、例えば非限定的に、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、及び走禽類、例えばオーストリッチ、エミュー及びヒクイドリを指す。この語句は、様々な既知のガルス  ガルス（Gallus gallus）（ニワトリ）、例えばWhite Leghorn, Brown Leghorn, Barred-Rock, Sussex, New Hampshire, Rhode Island, Australorp, Cornish, Minorca, Amrox, California Gray, Italian Partidge-coloured、並びに七面鳥、キジ、ウズラ、アヒル、ゲームヘン、ホロホロチョウ、ハト、オーストリッチ、及び商業上の量で一般に生産される家禽を含む。
【００７０】
抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質
本明細書で用いられる場合、「抗ウイルス遺伝子」とは、細胞集合に内因性であるあらゆる遺伝子であり、あらゆる手段によって細胞集合におけるウイルスの産生を制限する発現である。抗ウイルス遺伝子は、抗ウイルスタンパク質をコードすることができる。
【００７１】
本明細書で用いられる場合、「抗ウイルスタンパク質」とは、細胞集合に内在性の任意のタンパク質であり、その存在は、細胞集合におけるウイルスの産生を制限する。
【００７２】
抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ウイルス感染に対する応答をマウントする細胞の能力に関連していてもよい。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、インターフェロン（ＩＦＮ）経路の一部を形成する。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、Ｉ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ型インターフェロン経路に存在する。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、Ｉ型又はＩＩＩ型インターフェロン経路に存在する。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮ−α／β受容体１（ＩＦＮＡＲ１）鎖である。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＬ−６である。
【００７３】
代替的な実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ウイルス感染に対する免疫応答をマウントする細胞の能力に関与するか、又は関与することが既知であってもよい。このような遺伝子／タンパク質のいくつかの既知の機能の例として、細胞代謝、胚発生、細胞シグナル伝達、又は核酸合成に関与していることが挙げられる。
【００７４】
代替的な実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質の発現を減少させることにより、ウイルスに感染した細胞のアポトーシスが減少する。
【００７５】
一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＤＤＩ２、ＨＳＢＰ１、ＧＮＡＺ、ＮＰＲ２、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＬ−６、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、ＵＢＥ１ＤＣ１、ＣＤＸ２、ＬＯＣ１００８５９３３９、ＩＬ２８ＲＡ、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＮＡＳＥＩＬ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＧＡＰＤＨ、ＢＡＣＥ２、ＰＣＧＦ５、ＩＬ−１ＲＡ、ＣＡＰＮ１３、ＵＢＡ５、ＩＦＩＨ１、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＲＲＤＣ３、ＡＢＩ１、ＳＣＡＦ４、ＧＡＤＬ１、ＺＫＳＣＡＮ７、ＰＬＶＡＰ、ＲＰＵＳＤ１、ＣＹＹＲ１、ＵＰＦ３Ａ、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＴＯＰ１ＭＴ、ＲＡＬＧＡＰＢ、ＳＵＣＬＡ２、ＧＯＲＡＳＰ２、ＮＳＵＮ６、ＣＥＬＦ１、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＬＣ２６Ａ６、ＷＢＳＣＲ２７、ＳＩＬ１、ＨＴＴ、ＭＹＯＣ、ＴＭ９ＳＦ２，ＣＥＰ２５０、ＦＡＭ１８８Ａ、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＡＫＡＰ１０、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ４、ＣＲＫ、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＢＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＨＯＸＢ９、ＩＦＴ４３、ＩＭＰ４、ＩＳＹ１、ＫＩＡＡ０５８６、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＥＣＲ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＭＹＤ２、ＳＴＡＢ１、ＴＴＫ、ＷＮＴ３、ＸＰＯ１、ＡＨＨＲ、ＺＮＦ３３４、ＳＳＲ４、ＫＬＲＣ１、ＳＩＸ５、ＴＣＬ１Ｂ、ＺＮＦ２１１、ＭＡＧＥＬ２、  ＳＢＮ０１、ＯＲ１Ｄ５、ＳＬＣ１７Ａ９、ＺＮＦ６０７、ＧＣＥＴ２、ＴＭＥＭ２２３、ＺＮＦ１４６、ＮＬＲＰ１３、ＲＬＮ２、ＮＣＲ２、ＯＲ４Ｂ１、ＧＬＵＤ２、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＮＦＧＲ２、ＩＬ−１０Ｒ２、ＩＦＮκ、ＩＦＮΩ、ＩＬ−１ＲＢ及びＨＴＲＡ４又はその対応する受容体若しくはアゴニストのうち、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上から選択される。一実施形態において、ＩＦＮαは、次のアイソフォーム：ＩＦＮα１、ＩＦＮα２、ＩＦＮα４、ＩＦＮα５、ＩＦＮα６、ＩＦＮα７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮα１０、ＩＦＮα１３、ＩＦＮα１４、ＩＦＮα１６、ＩＦＮα１７、及びＩＦＮα２１の１つ以上である。一実施形態において、ＩＦＮλは、次のアイソフォーム：ＩＦＮλ１、ＩＦＮλ２、ＩＦＮλ３、ＩＦＮλ４の１つ以上である。
【００７６】
一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＤＤＩ２、ＨＳＢＰ１、ＧＮＡＺ、ＮＰＲ２、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＬ−６、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、ＵＢＥ１ＤＣ１、ＣＤＸ２、ＬＯＣ１００８５９３３９、ＩＬ２８ＲＡ、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＮＡＳＥＩＬ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＧＡＰＤＨ、ＢＡＣＥ２、ＰＣＧＦ５、ＩＬ−１ＲＡ、ＣＡＰＮ１３、ＵＢＡ５、ＩＦＩＨ１、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＲＲＤＣ３、ＡＢＩ１、ＳＣＡＦ４、ＧＡＤＬ１、ＺＫＳＣＡＮ７、ＰＬＶＡＰ、ＲＰＵＳＤ１、ＣＹＹＲ１、ＵＰＦ３Ａ、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＴＯＰ１ＭＴ、ＲＡＬＧＡＰＢ、ＳＵＣＬＡ２、ＧＯＲＡＳＰ２、ＮＳＵＮ６、ＣＥＬＦ１、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＬＣ２６Ａ６、ＷＢＳＣＲ２７、ＳＩＬ１、ＨＴＴ、ＭＹＯＣ、ＴＭ９ＳＦ２，ＣＥＰ２５０、ＦＡＭ１８８Ａ、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＡＫＡＰ１０、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ４、ＣＲＫ、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＢＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＨＯＸＢ９、ＩＦＴ４３、ＩＭＰ４、ＩＳＹ１、ＫＩＡＡ０５８６、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＥＣＲ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＭＹＤ２、ＳＴＡＢ１、ＴＴＫ、ＷＮＴ３、ＸＰＯ１、ＡＨＨＲ、ＺＮＦ３３４、ＳＳＲ４、ＫＬＲＣ１、ＳＩＸ５、ＴＣＬ１Ｂ、ＺＮＦ２１１、ＭＡＧＥＬ２、  ＳＢＮ０１、ＯＲ１Ｄ５、ＳＬＣ１７Ａ９、ＺＮＦ６０７、ＧＣＥＴ２、ＴＭＥＭ２２３、ＺＮＦ１４６、ＮＬＲＰ１３、ＲＬＮ２、ＮＣＲ２、ＯＲ４Ｂ１、ＧＬＵＤ２及びＨＴＲＡ４、又はその対応する受容体若しくはアゴニストのうち、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上から選択される。
【００７７】
一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、
ＤＤＩ２、ＨＳＢＰ１、ＧＮＡＺ、ＮＰＲ２、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＬ−６、ＵＢＥ１ＤＣ１、ＣＤＸ２、ＬＯＣ１００８５９３３９、ＩＬ２８ＲＡ、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＮＡＳＥＩＬ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＧＡＰＤＨ、ＢＡＣＥ２、ＰＣＧＦ５、ＩＬ−１ＲＡ、ＣＡＰＮ１３、ＵＢＡ５、ＩＦＩＨ１、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＲＲＤＣ３、ＡＢＩ１、ＳＣＡＦ４、ＧＡＤＬ１、ＺＫＳＣＡＮ７、ＰＬＶＡＰ、ＲＰＵＳＤ１、ＣＹＹＲ１、ＵＰＦ３Ａ、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＴＯＰ１ＭＴ、ＲＡＬＧＡＰＢ、ＳＵＣＬＡ２、ＧＯＲＡＳＰ２、ＮＳＵＮ６、ＣＥＬＦ１、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＬＣ２６Ａ６、ＷＢＳＣＲ２７、ＳＩＬ１、ＨＴＴ、ＭＹＯＣ、ＴＭ９ＳＦ２，ＣＥＰ２５０、ＦＡＭ１８８Ａ、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＡＫＡＰ１０、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ４、ＣＲＫ、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＢＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＨＯＸＢ９、ＩＦＴ４３、ＩＭＰ４、ＩＳＹ１、ＫＩＡＡ０５８６、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＥＣＲ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＭＹＤ２、ＳＴＡＢ１、ＴＴＫ、ＷＮＴ３、ＸＰＯ１、ＡＨＨＲ、ＺＮＦ３３４、ＳＳＲ４、ＫＬＲＣ１、ＳＩＸ５、ＴＣＬ１Ｂ、ＺＮＦ２１１、ＭＡＧＥＬ２、  ＳＢＮ０１、ＯＲ１Ｄ５、ＳＬＣ１７Ａ９、ＺＮＦ６０７、ＧＣＥＴ２、ＴＭＥＭ２２３、ＺＮＦ１４６、ＮＬＲＰ１３、ＲＬＮ２、ＮＣＲ２、ＯＲ４Ｂ１、ＧＬＵＤ２及びＨＴＲＡ４又はその対応する受容体若しくはアゴニストのうち、１つ、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上から選択される。
【００７８】
一実施態様において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＤＤＩ２、ＨＳＢＰ１、ＧＮＡＺ、ＮＰＲ２、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＬ−６、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ，  ＩＦＮλのうち、１つ、２つ、３つ、４つ、又は全てから選択される。
【００７９】
一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＭＤＡ５である。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＬ−６である。一実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＣＮＯＴ４である。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＩＦＮαである。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＤＤＩ２である。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＨＳＢＰ１である。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＧＮＡＺである。別の実施形態において、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＮＰＲ２である。
【００８０】
一実施形態では、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＡＨＨＲ、ＺＮＦ３３４、ＳＳＲ４、ＫＬＲＣ１、ＳＩＸ５、ＴＣＬ１Ｂ、ＺＮＦ２１１、ＭＡＧＥＬ２、ＳＢＮ０１、ＯＲ１Ｄ５、ＳＬＣ１７Ａ９、ＺＮＦ６０７、ＧＣＥＴ２、ＴＭＥＭ２２３、ＺＮＦ１４６、ＮＬＲＰ１３、ＲＬＮ２、ＮＣＲ２、ＯＲ４Ｂ１、ＧＬＵＤ２及びＨＴＲＡ４うち、１つ、２つ、３つ、４つ、又は全てから選択される。一実施形態では、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＡＨＨＲ、ＺＮＦ３３４、ＳＳＲ４、ＫＬＲＣ１、ＳＩＸ５、ＴＣＬ１Ｂ、ＺＮＦ２１１、ＭＡＧＥＬ２、ＳＢＮ０１、ＯＲ１Ｄ５、ＳＬＣ１７Ａ９、ＺＮＦ６０７、ＧＣＥＴ２、ＴＭＥＭ２２３、ＺＮＦ１４６、ＮＬＲＰ１３、ＲＬＮ２、ＮＣＲ２、ＯＲ４Ｂ１、ＧＬＵＤ２及びＨＴＲＡ４のうち１つ、２つ、３つ、４つ、又は全てから選択され、そして細胞集合が哺乳動物細胞である。一実施形態では、抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質は、ＡＨＨＲ、ＺＮＦ３３４、ＳＳＲ４、ＫＬＲＣ１、ＳＩＸ５、ＴＣＬ１Ｂ、ＺＮＦ２１１、ＭＡＧＥＬ２、ＳＢＮ０１、ＯＲ１Ｄ５、ＳＬＣ１７Ａ９、ＺＮＦ６０７、ＧＣＥＴ２、ＴＭＥＭ２２３、ＺＮＦ１４６、ＮＬＲＰ１３、ＲＬＮ２、ＮＣＲ２、ＯＲ４Ｂ１、ＧＬＵＤ２及びＨＴＲＡ４のうち１つ、２つ、３つ、４つ、又は全てから選択され、そして細胞集合が哺乳動物細胞であり、そしてウイルスガヘンドラウイルスである。
【００８１】
標的化可能な抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質に関するさらなる詳細は、以下の表１に示す。
【００８２】
【表１−１】
2019500860.tif 000002
【表１−２】
2019500860.tif 000003
【表１−３】
2019500860.tif 000004
【表１−４】
2019500860.tif 000005
【表１−５】
2019500860.tif 000006
【００８３】
細胞集合における抗ウイルス遺伝子の発現及び／又は抗ウイルスタンパク質活性レベルの減少
ウイルス生産の増加は、遺伝的に改変された細胞集合及び／又は本明細書に定義される外因性化合物で処理された処理された細胞集合を介して達成することができる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、細胞集合における抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質の発現は、遺伝子改変の導入によって減少する。一の例において、遺伝子改変は、細胞集合の少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は１００％の細胞に直接導入される。一実施形態では、遺伝的改変は、細胞集合の１００％に導入される。一実施形態では、遺伝的改変は、細胞集合の祖先に導入される。遺伝的改変の導入は、遺伝子改変細胞の創成をもたらす。
【００８５】
いくつかの実施形態において、細胞集合における抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質活性の発現は、外因性化合物によって減少する。外因性化合物の方法の例としては、炭素系小分子、タンパク質結合剤、プログラム可能なヌクレアーゼ、ポリヌクレオチド、又はこれらの２つ以上の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００８６】
遺伝的改変
遺伝的改変は、所望の効果、それは細胞集合における抗ウイルス遺伝子の発現低下及び／又は抗ウイルスタンパク質活性のレベルの低下である、をもたらす、天然細胞に対する人が行った任意の変更でありうる。細胞を遺伝的に改変する方法は、当技術分野において周知である。一実施形態において、遺伝子改変は、点突然変異、挿入、又は欠失（若しくは、これらの一つ以上の組み合わせ）といった、遺伝子を部分的又は完全に不活性化する内因性遺伝子の突然変異である。点突然変異は、早期停止コドン（ナンセンス変異）、スプライス部位突然変異、欠失、フレームシフト突然変異、又は遺伝子若しくはコードされたポリペプチドの活性を低下させるアミノ酸置換変異であってもよい。
【００８７】
一実施形態において、遺伝子改変は、プログラム可能なヌクレアーゼによって導入される。一実施形態において、遺伝子改変は、相同組換えによって導入される。一実施形態において、遺伝子改変は、非相同末端接合によって導入される。一実施形態において、遺伝子改変は、化学的変異原によって導入される。別の実施形態において、遺伝子改変は、外因性ポリヌクレオチドによってコードされる導入遺伝子によって導入される。一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子によってコードされる。内因性遺伝子の発現を減少させる外因性ポリヌクレオチドの例は、アンチセンスポリヌクレオチド、センスポリヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、内因性酵素を結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、トランスポゾン、アプタマー、二本鎖ＲＮＡ分子、及びこれらに由来するプロセシングＲＮＡ分子からなる群から選択される。一実施形態において、導入遺伝子は、細胞の集合におけるポリヌクレオチドの発現を指示するプロモーターに対し、動作可能に連結されたポリヌクレオチドをコードする、オープンリーディングフレームを含む。
【００８８】
プログラム可能なヌクレアーゼ
いくつかの実施形態において、遺伝子改変を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合、細胞集合における抗ウイルス遺伝子の発現を減少させる遺伝子改変は、プログラム可能なヌクレアーゼを介して導入される。いくつかの実施形態において、その化合物を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合に細胞集合において抗ウイルス遺伝子の発現を減少させ、及び／又は抗ウイルスタンパク質活性レベルを減少させる外因性化合物は、プログラム可能なヌクレアーゼである。
【００８９】
本明細書で用いられる場合、用語「プログラム可能なヌクレアーゼ」とは、細胞のゲノムにおいて、予め決定された部位を認識し編集するための、「標的化された」（「プログラムされた」）ヌクレアーゼを指す。
【００９０】
一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、ゲノム内の所定の部位において部位特異的ＤＮＡ切断を誘導することができる。一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、又はＤＮＡ結合タンパク質ドメインの組み合わせを有するゲノム位置を認識するようプログラムされてもよい。一実施形態において、ヌクレアーゼは、抗ウイルス遺伝子又はその調節領域へ、欠失、置換、又は挿入を導入する。
【００９１】
一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ジンクフィンガータンパク質（ＺＥＰ）ドメインの組み合わせによってゲノム位置を認識するようプログラムされてもよい。ＺＦＰはＤＮＡ配列中の特定の３塩基対を認識し、ＺＦＰの組み合わせは特異的なゲノム位置を認識するために使用できる。
【００９２】
一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインによってゲノム位置を認識するようプログラムされてもよい。
【００９３】
別の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、１つ以上のＲＮＡ配列によってゲノム位置を認識するようプログラムされてもよい。別の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、１つ以上のＤＮＡ配列によってプログラムされ得てもよい。別の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、１つ以上のハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ配列によってプログラムされてもよい。別の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、１つ以上のＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、及びハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ配列によってプログラムされてもよい。
【００９４】
別の実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、複数のサイレンシングに使用することができる。すなわち、２、３、４、５、又はそれ以上の抗ウイルス遺伝子を同時に標的化される２つ以上の「標的化」又は「プログラミングシーケンス」（すなわち、２、３、４、５又はそれ以上のプログラミングシーケンス）を有するプログラム可能なヌクレアーゼの送達に使用することができる（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００９５】
本開示に従って使用することのできるプログラム可能なヌクレアーゼは、細菌クラスタ化された定期挿入短パリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）系由来のＲＮＡ誘導操作ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＥＮ）、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びアルゴノートを含むが、これらに限定されない。
【００９６】
（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムは、侵入ファージ及びプラスミドに対する防御に関与する微生物ヌクレアーゼシステムである。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子と、ＣＲＩＳＰＲ媒介核酸開裂の特異性をプログラミングすることができる非コードＲＮＡ要素との組合せを含有する。３種（Ｉ〜ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲシステムが、ＩＩ型ＲＧＥＮクラスを有する広範囲の細菌宿主にわたって同定されている（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。各ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一つの重要な特徴は、反復配列（直反復）の配列の存在が、非反復配列（スペーサー）の短いストレッチによって間隔をあけていることである。非コードＣＲＩＳＰＲ配列は、個々のスペーサー配列を含有する短ｃｒＲＮＡに直接反復して転写及び開裂され、これによってＣａｓヌクレアーゼを標的部位（プロトパッカー）へ導く。
【００９７】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、標的化ＤＮＡ二本鎖切断を４つステップにて行う（例えば、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３を参照のこと）。第一に、２つの非コードＲＮＡ、前ｃｒＲＮＡ配列、及びｔｒａｃＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第二に、ｔｒａｃＲＮＡは前ｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、前ｃｒＲＮＡのプロセシングを、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへと媒介する。第三に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、プロトパッカサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトパッカーとの間のワトソン−クリック塩基対を介して、標的認識の追加要件であるＣａｓ９を標的ＤＮＡに導く。そして、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡの開裂を媒介して、プロトパッカー内において二本鎖切断を生む。ＣＲＩＳＰＲシステムはまた、ゲノム中の一本鎖切断を生成するためにも使用できる。したがって、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＲＮＡ誘導（又はプログラムされたＲＮＡ）部位特異的ゲノム編集に使用できる。
【００９８】
一実施形態において、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導操作ヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）である。一実施形態において、ＲＧＥＮは古細菌ゲノム由来であるか、又はその組換えバージョンである。一実施形態において、ＲＧＥＮは、細菌ゲノム由来であるか、又はその組換えバージョンである。一実施形態において、ＲＧＥＮは、Ｉ型（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムに由来する。一実施形態において、ＲＧＥＮは、ＩＩ型（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムに由来する。一実施形態において、ＲＧＥＮは、ＩＩＩ型（ＣＲＩＳＰＲ）−ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムに由来する。一実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｉ型ＲＧＥＮである。一実施形態において、ヌクレアーゼは、ＩＩ型ＲＧＥＮである。一実施形態において、ＲＧＥＮは、複数成分の酵素である。一実施形態において、ＲＧＥＮは、単一成分の酵素である。一実施形態において、ＲＧＥＮは、ＣＡＳ３である。一実施形態において、ＲＧＥＮは、ＣＡＳ１０である。一実施形態において、ＲＧＥＮは、ＣＡＳ９である。一実施形態において、ＲＧＥＮは、Ｃｐｆ１である（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。一実施形態において、ＲＧＥＮは、単一のＲＮＡ又はＤＮＡによって標的化される。一実施形態において、ＲＧＥＮは、２つ以上のＲＮＡ及び／又はＤＮＡによって標的化される。一実施形態において、ＣＡＳ９は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来である。
【００９９】
一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）ヌクレアーゼであってもよい（例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１を参照のこと）。ＴＡＬＥは植物病原体ザントモナス由来の転写因子であり、新規のＤＮＡ標的に結合するよう容易に操作できる。ＴＡＬＥ又はその切断されたバージョンは、Ｆｏｋｌなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインにリンクして、ＴＡＬＥヌクレアーゼ又はＴＡＬＥＮと呼ばれる標的エンドヌクレアーゼを生成する。
【０１００】
一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。一実施形態において、ＺＦＮの各モノマーは、３つ以上のジンクフィンガー系ＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガー系ＤＮＡ結合ドメインは３塩基対のサブサイトに結合する。その他の実施形態において、ＺＦＮは、独立ヌクレアーゼに動作可能に連結されたジンクフィンガー系ＤＮＡ結合ドメインを含む、キメラタンパク質である。一実施形態において、独立エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態において、ヌクレアーゼ剤は第１ＺＦＮ及び第２ＺＦＮを含み、第１ＺＦＮ及び第２ＺＦＮの各々は、約６塩基対〜約４０塩基対の切断部位、又は約５塩基対〜約６塩基対の切断部位によって分離した、標的ＤＮＡ配列の各鎖において、２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、そしてＦｏｋＩヌクレアーゼは二量体化し、二本鎖切断を行う（例えば、米国特許第２００６０２４６５６７号明細書、同第２００８０１８２３３２号明細書、同第２００２００８１６１４号明細書、同第２００３００２１７７６号明細書、国際公開第２００２／０５７３０８号パンフレット、米国特許第２０１３０１２３４８４号明細書、同第２０１００２９１０４８明細書、及び国際公開第１１／０１７２９３号パンフレットを参照のこと）。
【０１０１】
一実施形態において、プログラム可能なヌクレアーゼは、ＤＮＡプログラムされたアルゴノート（国際公開第１４／１８９６２８号パンフレット）であってもよい。原核生物及び真核生物のアルゴノートは、ＲＮＡ干渉経路に関与する酵素である。アルゴノートは、設計された核酸標的化酸と複合体を形成することによって、標的核酸を結合及び開裂することができる。開裂は、非相同末端結合機構によって修復できる標的核酸において、二本鎖切断を導入することができる。ＤＮＡ「誘導された」又は「プログラムされた」アルゴノートは、ＤＮＡの所定の位置に二本鎖ＤＮＡ切断を導入することができる。一実施形態において、アルゴノートは、ナトロノバクテリウムグレゴリイ（Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ）である。
【０１０２】
相同体組換え
一実施形態において、遺伝子改変は、相同組換えによって導入される。相同組換えとは、二本鎖切断修復（ＤＳＢＲ）経路及び合成依存鎖アニーリング（ＳＤＳＡ経路）の使用を関与させることができる、２つの類似又は同一分子のＤＮＡ間でヌクレオチド配列を交換する遺伝子改変の一種である（Ｌｏｄｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｗｅａｖｅｒ，２００２）。相同組換えは、遺伝子又はその部分を削除するか、又は抗ウイルス遺伝子又はその調節領域への置換又は挿入を導入するために用いることができる。さらに、相同組換えを用いて導入遺伝子を挿入することもできる。相同組換えを用いて、当業者に公知のあらゆる方法によって、宿主細胞のＤＮＡに遺伝子改変を導入することができる。一実施形態において、相同組換えは、プログラム可能なヌクレアーゼによってトリガーされ得る。
【０１０３】
二本鎖ＲＮＡ
一実施形態において、外因性ポリヌクレオチドはｄｓＲＮＡである。一実施形態において、遺伝子改変は、好ましくはトリのゲノムに統合された、ＲＮＡｉ用のｄｓＲＮＡ分子をコードする導入遺伝子である。別の実施形態において、外因性化合物は、ＲＮＡｉ用のｄｓＲＮＡ分子、又はｄｓＲＮＡをコードする導入遺伝子である（例えば、ウイルスなどの好適な発現ベクターに提供される）。
【０１０４】
用語「ＲＮＡ干渉」、「ＲＮＡｉ」、又は「遺伝子サイレンシング」とは一般に、ｄｓＲＮＡ分子が、二本鎖ＲＮＡ分子が実質的又は全相同性を共有する核酸配列の発現を減少させるプロセスを指す。しかしながら、ＲＮＡ干渉は、非ＲＮＡ二本鎖分子を用いて達成できることが示されている（例えば、米国特許第２００７０００４６６７号明細書を参照のこと）。
【０１０５】
本発明は、本発明において使用するＲＮＡ干渉のための二本鎖領域を含む及び／又はコードする、核酸分子を含む。核酸分子は典型的にはＲＮＡであるが、化学的に修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【０１０６】
二本鎖領域は、少なくとも１９個の連続ヌクレオチド、例えば約１９〜２３ヌクレオチド、又はより長くてもよく、例えば３０若しくは５０ヌクレオチド、又は１００ヌクレオチド以上でなければならない。遺伝子転写物全体に対応する全長配列を用いることができる。好ましくは、約１９〜約２３ヌクレオチド長である。
【０１０７】
標的転写物に対する核酸分子の二本鎖領域の識別度は、少なくとも９０％、より好ましくは９５〜１００％でなければならない。核酸分子は当然、分子の安定化に機能し得る、関連した配列を含むことができる。
【０１０８】
本明細書で用いられる場合、用語「短干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」とは、例えば配列特異的方法でＲＮＡｉを仲介することによって、遺伝子発現を阻害するか又は下方制御することのできるリボヌクレオチドを含む、核酸分子を指し、二本鎖部分は、５０ヌクレオチド長以下、好ましくは約１９〜約２３ヌクレオチド長である。例えば、ｓｉＲＮＡは、自己相補的センス及びアンチセンス領域を含む核酸分子であり得、アンチセンス領域は、標的核酸分子又はその標的核酸配列中のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列、及び標的核酸配列又はその一部と対応するヌクレオチド配列を有するセンス領域を含む。ｓｉＲＮＡは、１本の鎖がセンス鎖であり、もう一方がアンチセンス鎖である、２つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、アンチセンス及びセンス鎖は自己相補的である。
【０１０９】
本明細書で用いられる場合、ｓｉＲＮＡという用語は、配列特異的ＲＮＡｉ、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短干渉オリゴヌクレオチド、短干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）などを媒介することのできる核酸分子を描写するために使用されるその他の用語と、同等であることを意味する。さらに、本明細書で用いられる場合、ＲＮＡｉという用語は、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害、又はエピジェネティクスのような、配列特異的ＲＮＡ干渉を描写するために使用されるその他の用語と、同等であることを意味する。例えば、本発明のｓｉＲＮＡ分子を、転写後レベル又は転写前レベルの両方において、エピジェネティックに無音遺伝子へ用いることができる。非限定的な例において、本発明のｓｉＲＮＡ分子による遺伝子発現のエピジェネティック調節は、遺伝子発現を変化させるために、クロマチン構造のｓｉＲＮＡ媒介修飾によって生じてもよい。
【０１１０】
「ｓｈＲＮＡ」又は「短ヘアピンＲＮＡ」とは、約５０ヌクレオチド未満、好ましくは約１９〜約２３ヌクレオチドのＲＮＡ分子を意味し、同一のＲＮＡ分子上に位置する相補的配列と対合しており、この配列及び相補配列は、塩基相補性の２つの領域によって生成されるステム構造の上に一本鎖ループを形成する、少なくとも約４〜約１５ヌクレオチドの不対領域によって分離されている。一本鎖ループのシーケンスの例としては、５’ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ３’が挙げられる。
【０１１１】
包含されるｓｈＲＮＡは、二重又は二指及び多指のヘアピンｄｓＲＮＡであり、ＲＮＡ分子は、一本鎖スペーサー領域によって分離されたこのようなステム−ループ構造の２つ以上を含む。
【０１１２】
一旦設計されると、二本鎖領域を含む核酸分子は、当技術分野で公知のあらゆる方法、例えば、インビトロ転写、組換え体、又は合成手段によって生成され得る。
【０１１３】
ヌクレオチドの修飾又は類似体を導入して、本発明の核酸分子の特性を改善することができる。改良された性質には、ヌクレアーゼ耐性の増加及び／又は細胞膜透過能の増加が含まれる。したがって、用語「核酸分子」及び「二本鎖ＲＮＡ分子」は、シンシン、キサンチンキサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル−、２−プロピル−、及びその他のアルキル−アデニン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、６−アザシトシン、及び６−アザチミン、シュードウラシル、４−チウラシル、８−ハロアデニン、８−アミノアデニン、８−チオオールアデニン、８−チオールアルキルアデニン、８−ヒドロキシルアデニン、並びにその他の８−置換アデニン、８−ハログアニン、８−アミノグアニン、８−チオールグアニン、８−チオアルキルグアニン、８−ヒドロキシルグアニン、及びその他の置換グアニン、その他のアザ及びデアザアデニン、その他のアザ及びデアザグアニン、５−トリフルオロメチルウラシル及び５−トリフルオロシトシンなどの合成修飾塩基を含む。
【０１１４】
小分子
いくつかの実施形態において、外因性化合物は、小分子である。一実施形態において、小分子は抗ウイルスタンパク質に結合することによって、ウイルス感染した細胞において正常な機能を遂行するタンパク質の能力を低下させる。
【０１１５】
一実施形態において、投与される化合物は、不活性又は比較的低い活性である前駆体化合物であり得るが、化合物を欠くアイソジェニック細胞と比較した場合、投与後に、細胞集合中において抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質活性の発現を減少させる化合物へ変換される（例えば、代謝される）。これらの実施形態において、投与される化合物は、プロドラッグと称することができる。あるいは、又はその上、化合物を欠いたアイソジェニック細胞と比較した場合、投与される化合物は代謝されて、細胞集合中において抗ウイルス遺伝子及び／又はタンパク質活性の発現を減少させる活性を有する、活性代謝物を生成してもよい。このような活性代謝物の使用もまた、本開示の範囲内である。
【０１１６】
外因性化合物中に存在する置換基に応じて、化合物は、随意に塩の形で存在していてもよい。本発明における使用に好適な化合物の塩は、カウンターイオンが薬学的に許容されるものである。好適な塩として、有機酸若しくは無機酸、又は塩基で形成されたものが含まれる。薬学的に許容可能な酸添加塩として、塩酸、臭化水素、硝酸、窒素、クエン酸、酒石、酢酸、リン酸、乳酸、ピルビン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、コハク酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、オキサロ酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、イセチオン酸、アスコルビン酸、リンゴ酸、フタル酸、アスパラギン酸、及びグルタミン酸、リジン、並びにアルギニンから形成されるものが挙げられる。薬学的に様可能な塩基塩として、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばカリウム及びナトリウム、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウム及びマグネシウムなど、並びに有機塩基を有する塩、例えば、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルコミン、モルホリン、チオモルホリン、ピペリジン、ピロリジン、モノ−、ジ−、又はトリ−低級アルキルアミン、例えば、エチル−、ｔ−ブチル−、ジエチル−、ジイソプロピル−、トリエチル−、トリブチル−、若しくはジメチル−プロピルアミン、又はモノ−、ジ−、若しくはトリヒドロキシ低級アルキルアミン、例えばモノ−、ジ−、若しくはトリエタノールアミンが挙げられる。対応する内部塩もまた形成することができる。
【０１１７】
有機及び／又は医薬化学の当業者は、多くの有機化合物が反応される溶媒と錯体を形成することができるか、又はそれらが沈殿若しくは結晶化されることを理解するであろう。これらの複合体は「溶媒和物」と呼ばれる。例えば、水との複合体は「水和物」と呼ばれる。化学量論的又は非化学量論的量のいずれかでおける結晶格子中に原体が水などの溶媒と相互作用する場合、含水塩といった溶媒和化合物が存在する。薬物物質は、水和物のような溶媒和物の存在について日常的にスクリーニングされるが、これらはあらゆる段階において遭遇することがある。したがって、本発明に有用な化合物は、水和物のような溶媒和物の形態で存在することができることが理解されよう。本発明において使用するのに適した化合物の溶媒和形態は、関連する溶媒が薬学的に許容されるものである。例えば、水和物は、薬学的に許容される溶媒和物の一例である。
【０１１８】
本発明に有用な化合物は、非晶質形態又は結晶形で存在することができる。多くの化合物は多型形態で存在し、全てのこのような形態における化合物の使用は本開示によって包含される。
【０１１９】
本開示に有用な小分子は、本発明の抗ウイルス標的タンパク質に結合するための候補化合物のライブラリーをスクリーニングし、そしてタンパク質活性を低下させる化合物がいずれであるかを決定するような標準的な方法を用いて、同定することができる。例えば、ニワトリＩＦＮ−α／β受容体１の活性を低下させるために有用な小分子は、受容体に結合し、受容体（ＩＦＮなど）のリガンドが細胞シグナルを誘導する能力を阻害する。
【０１２０】
結合剤
一実施形態において、外因性化合物は、抗ウイルスタンパク質の活性を結合し、減少させるタンパク質である。一実施形態において、結合剤は、抗体又はその断片である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＤＤＩ２、ＨＳＢＰ１、ＧＮＡＺ、ＮＰＲ２、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＬ−６、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、ＵＢＥ１ＤＣ１、ＣＤＸ２、ＬＯＣ１００８５９３３９、ＩＬ２８ＲＡ、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＮＡＳＥＩＬ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＧＡＰＤＨ、ＢＡＣＥ２、ＰＣＧＦ５、ＩＬ−１ＲＡ、ＣＡＰＮ１３、ＵＢＡ５、ＩＦＩＨ１、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＲＲＤＣ３、ＡＢＩ１、ＳＣＡＦ４、ＧＡＤＬ１、ＺＫＳＣＡＮ７、ＰＬＶＡＰ、ＲＰＵＳＤ１、ＣＹＹＲ１、ＵＰＦ３Ａ、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＴＯＰ１ＭＴ、ＲＡＬＧＡＰＢ、ＳＵＣＬＡ２、ＧＯＲＡＳＰ２、ＮＳＵＮ６、ＣＥＬＦ１、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＬＣ２６Ａ６、ＷＢＳＣＲ２７、ＳＩＬ１、ＨＴＴ、ＭＹＯＣ、ＴＭ９ＳＦ２，ＣＥＰ２５０、ＦＡＭ１８８Ａ、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＡＫＡＰ１０、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ４、ＣＲＫ、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＢＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＨＯＸＢ９、ＩＦＴ４３、ＩＭＰ４、ＩＳＹ１、ＫＩＡＡ０５８６、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＥＣＲ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＭＹＤ２、ＳＴＡＢ１、ＴＴＫ、ＷＮＴ３、ＸＰＯ１、ＡＨＨＲ、ＺＮＦ３３４、ＳＳＲ４、ＫＬＲＣ１、ＳＩＸ５、ＴＣＬ１Ｂ、ＺＮＦ２１１、ＭＡＧＥＬ２、  ＳＢＮ０１、ＯＲ１Ｄ５、ＳＬＣ１７Ａ９、ＺＮＦ６０７、ＧＣＥＴ２、ＴＭＥＭ２２３、ＺＮＦ１４６、ＮＬＲＰ１３、ＲＬＮ２、ＮＣＲ２、ＯＲ４Ｂ１、ＧＬＵＤ２、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＮＦＧＲ２、ＩＬ−１０Ｒ２、ＩＦＮκ、ＩＦＮΩ、ＩＬ−１ＲＢ及びＨＴＲＡ４遺伝子、並びに／若しくはタンパク質、又はそれらの対応する受容体若しくはアゴニストの、発現又は活性を方向付けるか、及び／又は減少させる。いくつかの実施形態において、結合剤は、ＤＤＩ２、ＨＳＢＰ１、ＧＮＡＺ、ＮＰＲ２、ＣＮＯＴ４、ＭＤＡ５、ＩＦＮα、ＩＬ−６、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ、ＵＢＥ１ＤＣ１、ＣＤＸ２、ＬＯＣ１００８５９３３９、ＩＬ２８ＲＡ、ＺＦＰＭ２、ＴＲＩＭ５０、ＤＮＡＳＥＩＬ２、ＰＨＦ２１Ａ、ＧＡＰＤＨ、ＢＡＣＥ２、ＰＣＧＦ５、ＩＬ−１ＲＡ、ＣＡＰＮ１３、ＵＢＡ５、ＩＦＩＨ１、ＬＡＭＰ１、ＥＦＲ３Ａ、ＡＲＲＤＣ３、ＡＢＩ１、ＳＣＡＦ４、ＧＡＤＬ１、ＺＫＳＣＡＮ７、ＰＬＶＡＰ、ＲＰＵＳＤ１、ＣＹＹＲ１、ＵＰＦ３Ａ、ＡＳＡＰ１、ＮＸＦ１、ＴＯＰ１ＭＴ、ＲＡＬＧＡＰＢ、ＳＵＣＬＡ２、ＧＯＲＡＳＰ２、ＮＳＵＮ６、ＣＥＬＦ１、ＡＮＧＰＴＬ７、ＳＬＣ２６Ａ６、ＷＢＳＣＲ２７、ＳＩＬ１、ＨＴＴ、ＭＹＯＣ、ＴＭ９ＳＦ２，ＣＥＰ２５０、ＦＡＭ１８８Ａ、ＢＣＡＲ３、ＧＯＬＰＨ３Ｌ、ＨＮ１、ＡＤＣＹ７、ＡＫＡＰ１０、ＡＬＸ１、ＣＢＬＮ４、ＣＲＫ、ＣＸＯＲＦ５６、ＤＤＸ１０、ＥＩＦ２Ｓ３、ＥＳＦ１、ＧＢＦ１、ＧＣＯＭ１、ＧＴＰＢＰ４、ＨＯＸＢ��、ＩＦＴ４３、ＩＭＰ４、ＩＳＹ１、ＫＩＡＡ０５８６、ＫＰＮＡ３、ＬＲＲＩＱ１、ＬＵＣ７Ｌ、ＭＥＣＲ、ＭＲＰＬ１２、ＰＯＬＲ３Ｅ、ＰＷＰ２、ＲＰＬ７Ａ、ＳＥＲＰＩＮＨ１、ＳＬＣ４７Ａ２、ＳＭＹＤ２、ＳＴＡＢ１、ＴＴＫ、ＷＮＴ３、ＸＰＯ１、ＡＨＨＲ、ＺＮＦ３３４、ＳＳＲ４、ＫＬＲＣ１、ＳＩＸ５、ＴＣＬ１Ｂ、ＺＮＦ２１１、ＭＡＧＥＬ２、  ＳＢＮ０１、ＯＲ１Ｄ５、ＳＬＣ１７Ａ９、ＺＮＦ６０７、ＧＣＥＴ２、ＴＭＥＭ２２３、ＺＮＦ１４６、ＮＬＲＰ１３、ＲＬＮ２、ＮＣＲ２、ＯＲ４Ｂ１、ＧＬＵＤ２、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＮＦＧＲ２、ＩＬ−１０Ｒ２、ＩＦＮκ、ＩＦＮΩ、ＩＬ−１ＲＢ及びＨＴＲＡ４、又はこれらの受容体若しくはアゴニストのうち、２つ以上のあらゆる組み合わせに向けられた二重特異抗体である。一実施形態において、抗体は、細胞によって、（受動的又は積極的に）侵入又は取り込まれるように修飾された抗体である。一実施形態において、結合剤はＢ１８Ｒではない。
【０１２１】
本明細書で用いられる場合、用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異抗体、融合糖尿病、トリアボジン、ヘテロ結合体抗体、無傷分子を含むキメラ抗体、並びにこれらの断片、及びその他の抗体様分子を含む。抗体として、例えば、ＶＨ又はＶＬドメイン、重鎖可変領域（ラクダ科において記述されているような、ＶＨＨ）の二量体、軽鎖可変領域（ＶＬＬ）の二量体、直接若しくはリンカーを通じて接続し得る軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）可変領域のみを含有するＦｖ断片、又は重鎖可変領域及びＣＨ１ドメインを含有するＦｄ断片のいずれかを含む、ドメイン抗体を含む種々の形態における修飾が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
重鎖と軽鎖の可変領域からなるｓｃＦｖは、単鎖抗体（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８；  Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）を形成するために結合し、糖尿病やトリアボイズのようなｓｃＦｖのオリゴマーも用語「抗体」によって包含される。また、可変領域及び定常領域の一部を含むＦａｂ、（Ｆａｂ’）２、及びＦａｂＦｃ２フラグメントのような抗体の断片も包含される。相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト化抗体フラグメント及び抗体フラグメントのオリゴマーも包含される。Ｆｖの重鎖及び軽鎖成分は、同じ抗体又は異なる抗体から誘導されてもよく、それによってキメラＦｖ領域を生成する。抗体は動物（例えば、マウス、ウサギ、又はラット）であってもよいし、キメラ（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４）であってもよい。抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって製造することができる。
【０１２３】
本明細書に記載されたガイドライン及びこれらの方法は、上記文献に記載されている当業者に周知の方法で知られており、また、Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  （１９８８）は、本発明の方法に用いる抗体を容易に作成することができる。
【０１２４】
抗体は可変光（ＶＬ）と、光及び重鎖を直接又はリンカーを通して結合させる可変重鎖（ＶＨ）とを含むＦｖ領域とすることができる。本明細書で使用されるリンカーは、光及び重鎖に共有結合され、それらが方向づけられるエピトープを特異的に結合することができるコンホメーションを達成できるように、２つの鎖間の充分な間隔と柔軟性を提供する分子を指す。タンパク質リンカーは、融合ポリペプチドのＩｇ部分の固有成分として発現することができるので特に好ましい。
【０１２５】
一実施形態において、抗体は細胞内伝播能を有する。細胞内伝播の能力を有する抗体は、ラクダ及びラマ抗体、サメ抗体（イグナール）、ｓｃＦｖ抗体、イントラコード又はナノダイオードなどの抗体、例えばｓｃＦｖイントロン及びＶＨＨイントロンを含む。このような抗原結合剤は、Ｈａｒｍｓｅｎ  ａｎｄ  Ｄｅ  Ｈａａｒｄ  （２００７）、Ｔｉｂａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）、及びＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）によって記述される。酵母ＳＰＬＩＮＴ抗体ライブラリーは、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、Ｖｉｓｉｎｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）の製造方法について参照）を阻害することができるイントラダイズの検査に利用できる。このような薬剤は、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）に開示された細胞貫通ペプチド配列又は核局在化ペプチド配列を含むことができる。また、Ｄｅ  Ｃｏｕｐａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）及びＭｅｙｅｒ−Ｌｏｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）にて開示されているようなＶｅｃｔｏｃｅｌｌ又はＤｉａｔｏペプチドベクターが、インビボ送達に有用である。
【０１２６】
さらに、抗体は細胞貫通性ペプチド、例えば細胞貫通ペプチドに融合させることができる。細胞浸透ペプチドには、Ｔａｔペプチド、ペントラチン、Ｐｅｐｔ−及びＭＰＧファミリーからの短両親媒性ペプチド、オリゴアルギニン及びオリゴリシンが含まれる。一実施例において、細胞貫通ペプチドもまた、細胞内送達（Ｋｏｐｐｅｌｈｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）を改善するために脂質（Ｃ６−Ｃ１８脂肪酸）ドメインに結合される。細胞貫通ペプチドの例はＨｏｗｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）及びＤｅｓｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）に見出される。したがって、本発明はまた、共有結合（例えばペプチド結合）を介して、任意オプションでＮ末端又はＣ末端を細胞貫通ペプチド配列に融合させた抗体を使用する。
【０１２７】
核酸構築物
本発明の細胞集合への遺伝子改変の導入は、核酸構築物の使用を含むことができる。一実施形態において、核酸構築物は、導入遺伝子を含むことができる。本明細書で使用される場合、「ターゲット」「核酸構築物」は、例えば、本明細書に定義される二本鎖ＲＮＡ分子、プログラム可能なヌクレアーゼ又はベクター中の興味のあるポリヌクレオチド「ガイド」を含むＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列をコードする任意の核酸分子を指す。典型的には、核酸構築物は二本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ又はそれらの組合せであろう。さらに、核酸構築物は、典型的には、ポリヌクレオチドをコードするオープンリーディングフレームに動作可能に連結された適切なプロモーターを含む。核酸構築物は、例えば、二本鎖ＲＮＡ分子の第１の一本鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、相補的（２番目）鎖は、異なる、好ましくは同一の核酸構築物によって第２のオープンリーディングフレームによってコードされる。核酸構築物は、直線状の断片又は環状分子であってもよく、また、複製が可能であるか否かを問わない。熟練者は、本発明の核酸構築物が適当なベクター内に含まれ得ることを理解するであろう。核酸構築物を受容細胞にトランスフェクション又は変換することにより、核酸構築物によってコードされるＲＮＡ又はＤＮＡ分子を発現させることができる。
【０１２８】
別の実施例において、核酸構築物は、二本鎖領域、例えば短ヘアピンＲＮＡを含む、同一のＲＮＡ分子、及び／又は複数の異なるＲＮＡ分子を含む１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、若しくはそれ以上）の複数の複製を発現することができる。１の実施例において、核酸構築物は、騒動組換えに適した構築物である。
【０１２９】
核酸構築物はさらに、付加的な遺伝要素を含んでもよい。構成に含まれる可能性のある要素のタイプは、いかなる方法でも限定されず、当業者によって選択され得る。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、導入遺伝子として宿主細胞に挿入される。そのような場合、導入遺伝子挿入プロセスからＲＮＡ分子をコードする配列を保護し、外部転写のリスクを低減するために設計された構成に「スタッファー」フラグメントを含めることが望ましい。スタッファー断片は、例えばプロモーターとコード配列及び／又はターミネーター成分との間の距離を増加させるために構築物中に含まれ得る。スタッファー断片は、５〜５０００個以上のヌクレオチドから任意の長さであることができる。プロモーター間に１つ以上のスタッファー断片が存在することができる。複数のスタッフフラグメントの場合、それらは同じ又は異なる長さであり得る。スタッファーＤＮＡ断片は、好ましくは異なる配列である。好ましくは、スタッファー配列は、それらが挿入された細胞又はその子孫内に見出される配列と同一の配列を含む。さらなる実施形態では、核酸構築物は、二本鎖ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレームに隣接するスタッファー領域を含む。
【０１３０】
あるいは、核酸構築物は、例えば、二本鎖ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレームに隣接する末端反転配列を特徴とするトランスポゾン  （例えば、トランスポゾン）  を含むことができる。適切なトランスポゾンの例としては、Ｔｏｌ２、ｍｉｎｉ−Ｔｏｌ、Ｓｌｅｅｐ  Ｂｅａｕｔｙ、ＭａｒｉｎｅｒとＧａｌｌｕｈｏｐがある。
【０１３１】
核酸構築物中に含まれる追加遺伝要素の他の例は、ＧＦＰ又はＲＦＰのような蛍光マーカータンパク質の１つ以上の遺伝子のようなレポーター遺伝子を含む。；β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニルアセチル転移酵素、又は分泌された胚性アルカリホスファターゼなどの容易にアッセイされる酵素；ホルモンやサイトカインなどのイムノアッセイが容易に利用できるタンパク質。本発明の実施形態で使用される他の遺伝的要素は、アデノシンデアミナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、又は薬物耐性などの細胞上で選択的成長優位性を与えるタンパク質をコードするものを含む。
【０１３２】
核酸構築物を細胞にトランスフェクトする場合、プロモーター及び付加的な遺伝要素は、細胞のゲノム中に自然に生じるヌクレオチド配列からなることが望ましい。
【０１３３】
場合によっては、核酸構築物をベクターに挿入することが望ましい場合がある。ベクターは、例えば、バクテリオファージ、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス又はヘルペスウイルス由来のプラスミド、ウイルス又は人工染色体であってよい。このようなベクターには、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス由来ベクター、プラスミド及びバクテリオファージ遺伝要素、コスミド及びファージミド由来のベクターなどのベクター、バクテリオファージ、及びウイルス由来のベクターが含まれる。
【０１３４】
一実施形態において、核酸構築物はプロモーターを含む。当業者は、構成プロモーター又は誘導プロモーターなどのプロモーターを本発明において使用することができることを理解するであろう。一実施形態において、プロモーターはＰｏｌ  Ｉ、Ｐｏｌ  ＩＩ又はＰｏｌ  ＩＩプロモーターである。一じっつぃ態様では、プロモーターはトリプロモーターである。トリプロモーターの例としては、７ｓＫ  ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、Ｕ６ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７；  Ｍａｓｓｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）がある。
【０１３５】
ウイルス
本発明の細胞集合において産生されるウイルスは、細胞培養条件下で培養された細胞の集合中に新たなウイルス粒子を複製し、生成することができる任意のウイルスを含む。このようなウイルスにはＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれる。一実施形態において、ウイルスは動物ウイルスである。一実施形態において、動物ウイルスはヒトウイルスである。一実施形態において、ウイルスは非ヒトウイルスである。一実施形態において、ウイルスは鳥ウイルスである。
【０１３６】
本発明で使用するウイルスの例には、例えば、オルトミクソウイルス科、ヘルペスウイルス科、パラミクソウイルス科、フラビウイルス科、及びコロナウイルス科から選択されるウイルスが含まれる。
【０１３７】
オルソミックスウイルス科ウイルスは、例えばインフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、イイウイルス、ソゴウイルス及び／又はＱｕａｒａｒｊａｖｉｒｕｓである。インフルエンザウイルスはインフルエンザＡウイルスかもしれません。インフルエンザＡウイルスは、動物から分離されたインフルエンザＡウイルスから選択される。一実施形態において、動物はヒト又は鳥である。特に、インフルエンザＡウイルスは、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ１Ｎ３、Ｈ１Ｎ４、Ｈ１Ｎ５、Ｈ１Ｎ６、Ｈ１Ｎ７、Ｈ１Ｎ９、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ２Ｎ３、Ｈ２Ｎ４、Ｈ２Ｎ５、Ｈ２Ｎ７、Ｈ２Ｎ８、Ｈ２Ｎ９、Ｈ３Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ３、Ｈ３Ｎ４、Ｈ３Ｎ５、Ｈ３Ｎ６、Ｈ３Ｎ８、Ｈ４Ｎ１、Ｈ４Ｎ２、Ｈ４Ｎ３、Ｈ４Ｎ４、Ｈ４Ｎ５、Ｈ４Ｎ６、Ｈ４Ｎ８、Ｈ４Ｎ９、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３、Ｈ５Ｎ６、Ｈ５Ｎ７、Ｈ５Ｎ８、Ｈ５Ｎ９、Ｈ６Ｎ１、Ｈ６Ｎ２、Ｈ６Ｎ３、Ｈ６Ｎ４、Ｈ６Ｎ５、Ｈ６Ｎ６、Ｈ６Ｎ７、Ｈ６Ｎ８、Ｈ６Ｎ９、Ｈ７Ｎ１、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ７Ｎ４、Ｈ７Ｎ５、Ｈ７Ｎ７、Ｈ７Ｎ８、Ｈ７Ｎ９、Ｈ９Ｎ１、Ｈ９Ｎ２、Ｈ９Ｎ３、Ｈ９Ｎ５、Ｈ９Ｎ６、Ｈ９Ｎ７、Ｈ９Ｎ８、Ｈ１０Ｎ１、Ｈ１０Ｎ３、Ｈ１０Ｎ４、Ｈ１０Ｎ６、Ｈ１０Ｎ７、Ｈ１０Ｎ８、Ｈ１０Ｎ９、Ｈ１１Ｎ２、Ｈ１１Ｎ３、Ｈ１１Ｎ６、Ｈ１１Ｎ９、Ｈ１２Ｎ１、Ｈ１２Ｎ４、Ｈ１２Ｎ５、Ｈ１２Ｎ９、Ｈ１３Ｎ２、Ｈ１３Ｎ６、Ｈ１３Ｎ８、Ｈ１３Ｎ９、Ｈ１４Ｎ５、Ｈ１５Ｎ２、Ｈ１５Ｎ８、Ｈ１５Ｎ９、及びＨ１６Ｎ３から選択してもよい。一実施形態において、インフルエンザＡウイルスはＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、Ｈ７Ｎ７及び／又はＨ５Ｎ１から選択される。
【０１３８】
ヘルペスウイルス科ウイルスは、例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス又はサイトメガロウイルスである。
【０１３９】
パラミクソウイルス科ウイルスは、例えば、パラミクソウイルス亜科又は肺炎ウイルス亜科である。一実施形態において、パラミミクソウイルス科のウイルスはニューカッスル病ウイルスである。
【０１４０】
フラビウイルス科は、例えば、フラビウイルス、ヘパシウイルス、ペギーウイルス、ペスチウイルスである。一実施形態において、フラビウイルス科は、アポイウイルス、アロアウイルス、バガザウイルス、バンジウイルス、ブブイウイルス、ブカラサコウモリウイルス、カシパコーウイルス、カレー島ウイルス、カウボーンリッジウイルス、ダカールコウモリウイルス、デングウイルス、エッジヒルウイルス、エンテベコウモリウイルス、ガジェッツガリーウイルス、イルヘウスウイルス、イスラエルトルコ脳膜脳脊髄炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ジュグラウイルス、ジュチアパウイルス、カダムウイルス、ケロッグウイルス、ココベラウイルス、コウタンゴウイルス、キャサヌール森林病ウイルス、ランガットウイルス、跳躍病ウイルス、ミーバンウイルス、モドックウイルス、モンタナ筋炎白質脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、ウンタヤウイルス、オムスク出血熱ウイルス、フノンペンコウモリウイルス、ポワッサンウイルス、リオブラボーウイルス、ロイヤルファームウイルス、サボヤウイルス、サルビージャウイルス、サンペリータウイルス、サウマレズリーフウイルス、セピクウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、テンブスウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、チュレーニーウイルス、ウガンダＳウイルス、ウスツウイルス、ヴェッセルスブロンウイルス、ウエストナイルウイルス、ヤオンデウイルス、黄熱病ウイルス、ヨコセウイルス、ジカウイルスであってもよい。
【０１４１】
コロナウイルス科は、例えば、コロナウイルス又はコロウイルス亜科（Ｃｏｒｏｖｉｒｉｎａｅ）である。コロビリネーウイルスは、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、デルタコロナウイルス、又はガンマコロナウイルスである。トロウイルスは、アルファコロナイルス又はベータコロナウイルスである。実施例では、コロナウイルスはＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）コロナウイルスであってもよい。
【０１４２】
一実施形態において、ウイルスは、インフルエンザウイルス、イヌジステンパーウイルス、麻疹ウイルス、レオウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、鶏痘ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ムンプスウイルス、ウマ脳脊髄炎、風疹ウイルス、軟卵症候群ウイルス、トリ腫瘍退縮ウイルス、トリ感染性喉頭気管炎ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス、天然痘ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、ウシイバラキウイルス、組換えポックスウイルス、トリアデノウイルスＩ型、ＩＩ型、又はＩＩＩ、ブタ日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、ヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、感染性気管支炎ウイルス、セムリキ森林ウイルス、脳脊髄炎ウイルス、ベネズエラＥＥＶウイルス、ニワトリ貧血ウイルス、マレック病ウイルス、パルボウイルス、口蹄疫ウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、ブタコレラウイルス、ブルータングウイルス、カバネウイルス、伝染性サケ貧血ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、及び伝染性膵臓壊死症ウイルスから選択される。
【０１４３】
細胞及び細胞培養
当業者は、本発明の細胞が、その中でウイルスが複製可能なインビトロで培養されうる任意の細胞であることを理解するであろう。１の例では、細胞は哺乳動物、鳥、又は節足動物由来の細胞である。一の例では、細胞は哺乳動物細胞である。一の例では、細胞はトリの細胞である。一の例では、鳥の細胞は、ニワトリの細胞である。一の例では、細胞は連続細胞株（Josefsberg et al., 2012）由来である。一の例では、細胞は初代細胞株由来である。別の例では、細胞は不死化細胞株である。一の例では、細胞は接着細胞である。1の例では、細胞は非接着細胞（懸濁細胞）である。一の例では、細胞はニワトリ組織由来の初代細胞株に由来する。一の例では、細胞は卵由来の初代細胞株由来である。一実施形態では、卵は鳥類の卵である。
【０１４４】
一の例では、細胞は、ニワトリ胚線維芽細胞（CEF）由来の初代細胞株に由来する。一の例では、細胞は鳥類胚性幹細胞株EB14（ニワトリ）またはEB66（アヒル）由来である（WO2005042728）。一の例では、細胞は、ニワトリからの不死化細胞株に由来する。一の例では、細胞は不死化ニワトリ胚細胞株PBS-1由来である（Smithら、2008）。一の例では、細胞はニワトリ線維芽細胞株DF-1由来である（Himlyら、1998）。一の例では、細胞はMadin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞である。一の例では、細胞はMDCK 33016細胞である。一例では、細胞はMDCK CCL34細胞である。一例では、細胞アフリカミドリザル腎臓由来Vero細胞である。一の例では、細胞はヒト網膜由来PER.C6細胞である。一の例では、細胞はAGE1.CR細胞である。一の例では、細胞はMRC-5二倍体細胞株に由来する。一の例では、細胞はヒト胚腎臓細胞（HEK293）である。一の例では、細胞はHeLa細胞である。一の例では、細胞は昆虫細胞である。一の例では、昆虫細胞はTrichoplusia由来である。一の例では、細胞は血清の非存在下で培養することができる。一の例では、細胞は血清の存在下で培養される。
【０１４５】
本発明の細胞の集団は、インビトロでの細胞の増殖を可能にし、好ましくはウイルスによる細胞の感染を可能にする任意の細胞培養培地で培養することができる。そのような培地およびプロセスは、当業者に知られている（例えば、Genzelら、2009; Josefsbergら、2012; Wolfら、2011参照）。本発明の細胞集合を培養するための例示的な細胞培養培地としては、Iscove培地、UltraCHO、CDハイブリドーマ無血清培地、Episerf培地、MediV SF103（無血清培地）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、Eagles改変イーグル培地（EMEM）、グラスゴー改変イーグル培地（GMEM）、SMIP-8、改変イーグル培地（MEM）、VP-SFM、DMEMベースのSFM、DMEM/F12、DMEM/Ham's F12、VPSFM/ウィリアム培地E、ExCell 525（SFM）、アデノウイルス発現培地（AEM）およびExcell 65629（Genzelら、2009）を含む。そのような培地には、アミノ酸、ホルモン、ビタミンおよびミネラルなどの追加の成長因子が補充されてもよいことは、当業者には理解されるであろう。必要に応じて、このような培地に血清、例えばウシ胎仔血清を補充してもよい。
【０１４６】
一の例では、バッチ細胞培養プロセスを用いて細胞を培養する。一の例では、灌流細胞培養プロセスを用いて細胞を培養する。一の例では、細胞を種培地および生産培地中で培養する。一の例では、細胞を攪拌タンク反応器で培養する。一の例では、反応器の容積は約1L〜約2500Lである。 1つの例では、細胞を波型バイオリアクターで培養する。一例では、細胞は細胞工場システム、例えばNunc細胞工場システム（Genzel et al。、2009）で培養される。
【０１４７】
一の例では、ウイルスを細胞培養培地に添加して細胞にウイルスを感染させる。さらなる例では、細胞をウイルスで感染させるために、細胞培養培地を除去し、ウイルスを含む培地で置き換えることができる。付着細胞のウイルス感染のために、プロテアーゼを細胞培養培地に添加してもよく、または細胞培養培地を、プロテアーゼを含む培地と交換して、細胞のウイルス感染を可能にする/増強してもよい。一の例では、プロテアーゼはトリプシンまたはキモトリプシンである。
【０１４８】
一の例では、細胞は、所定の期間ウイルスの存在下で培養して、複製されたウイルス又はその粒子を回収する前に複製させる。一の例では、所定の期間は、少なくとも８時間、又は少なくとも１２時間、又は少なくとも１８時間、又は少なくとも２４時間、又は少なくとも４８時間、又は少なくとも３日間、又は少なくとも４日間、又は少なくとも５日間、又は少なくとも６日間、又は少なくとも７日間、又は少なくとも８日間、又は少なくとも９日間、又は少なくとも１０日間、又は少なくとも１１日間、又は少なくとも１２日間、又は少なくとも１３日間、又は少なくとも１４日間、又は少なくとも１５日間である。本明細書に記載されるように増殖されたウイルスは、例えば弱毒化全ウイルス、不活性化全ウイルス、スプリットウイルス、又はワクチン組成物に使用するのに適したサブユニットウイルス粒子を産生するために使用できる。
【０１４９】
複製されたウイルス又はその粒子の回収
複製されたウイルス又はその粒子（分裂ウイルス粒子やサブユニットウイルス粒子など）は、当業者に公知の任意の方法によって細胞集合、細胞分泌物（上清とも呼ばれる細胞培養培地）又はそれらの組み合わせから収穫することができる。例えば、複製されたウイルス又はその粒子の収穫は、明確化、濃度、不活性化、ヌクレアーゼ処理、分離／精製、研磨及び無菌濾過の１つ以上のステップを含むことができる（Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  Ｋａｌｂｆｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｊｏｓｅｆｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。一実施例において、遠心分離、微小濾過及び／又は深さ濾過によって明らかにする。一実施例において、濃縮は遠心分離、限外濾過、沈殿、モノ石及び／又は膜吸着器によって行われる。一実施例において、不活性化はＵＶ、熱又は化学処理によって行われる。不活性化の化学的形態としては、ホルマリン、バイナリーエチレンイミン、βプロピオラクトンなどが挙げられる。一実施形態において、ヌクレアーゼ処理はベンゾナーゼによる処理である。一実施例において、分離／精製は超遠心分離（密度勾配例）、ビーズクロマトグラフ（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィー）、及び／又は膜吸着器（例えばイオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィー）によって行われる。一実施例において、研磨は限外濾過及び／又は濾過によって行われる。一実施例において、ウイルス又はウイルス粒子は、アルコール又はポリエチレングリコール沈殿によって濃縮され得る。一実施例において、複製されたウイルス又はそれらの粒子の収穫は、Ｇｒｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）に記載されるように、膜の使用を含む。
【０１５０】
別の実施例において、複製されたウイルスの収穫は、分割ワクチン組成物又はサブユニットワクチン組成物（Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８；  Ｊｏｓｅｆｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）に対して適当なサイズのウイルス粒子を産生するウイルス破壊工程を含むことができる。このような工程は、分割ワクチン組成物又はサブユニットワクチン組成物に対して適当なサイズのウイルス粒子を製造する任意の方法であることができる。一実施例において、破壊工程は洗剤可溶化である。
【０１５１】
別の例では、複製されたウイルスを採取することは、スプリットワクチン組成物またはサブユニットワクチン組成物（Wolf et al。、2008; Josefsberg et al。、2012）に適したサイズのウイルス粒子を産生するウイルス破壊工程を含み得る。そのような工程は、スプリットワクチン組成物またはサブユニットワクチン組成物に適切なサイズのウイルス粒子を産生する任意の方法であり得る。一例では、破壊工程は界面活性剤の可溶化である。
別の例では、複製されたウイルスまたはその粒子の採取は、清澄化、濃縮分離、不活性化、ヌクレアーゼ処理および/または研磨（Wolf et al。、2008）の1つまたは複数の工程を含むことができる。一例では、ダイアフィルトレーションによって清澄化が行われる。一例では、親和性膜吸着器によって濃縮/分離が行われる。一例では、化学的処理によって不活性化が行われる。不活性化の化学的形態には、ホルマリン、バイナリーエチレンイミンおよびβ-プロピオラクトンが含まれる。一実施形態では、ヌクレアーゼ処理はベンゾナーゼ処理である。一実施形態では、研磨は、限外ろ過および/またはダイアフィルトレーションによって実施される。
【０１５２】
別の例では、複製されたウイルスまたはその粒子を採取することは、インフルエンザワクチンの調製に使用される工程を含み得る：細胞培養からの上清について、イオン交換クロマトグラフィー、プレろ過、濃縮/緩衝液交換ウルトラおよびダイアフィルトレーション、ヌクレアーゼ処理、およびホルムアルデヒド処理によるウイルス不活性化（Wolf et al。、2008）。
【０１５３】
別の例では、複製されたウイルスまたはその粒子の採取は、低速遠心分離による清澄化、限外ろ過による濃縮、（vero細胞培養由来の）インフルエンザワクチンの精製に用いられる細胞培養由来ショ糖勾配、ホルマリン処理による不活性化、ベンゾナーゼによるヌクレアーゼ処理およびホルマリン除去のためのダイアフィルトレーション（Wolf et al., 2008）。
【０１５４】
当業者は、収穫されたウイルス（全体の減衰又は不活性化）又は収穫されたウイルス粒子（例えばウイルス粒子又はサブユニットウイルス粒子を分割する）がワクチン組成物に処方され得ることを理解するであろう。このような組成物は、アジュバント、賦形剤、バインダー、保存剤、キャリアカップリング、緩衝剤、安定化剤、乳化剤、湿潤剤、湿潤剤、非ウイルスベクター及びトランスフェクション促進化合物の１つ以上を含むことができる（Ｊｏｓｅｆｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；  Ｊｏｎｅｓ，  ２００８）。当業者は、このようなワクチン組成物が凍結乾燥できることをさらに理解するであろう。一実施例において、製造されたワクチン組成物はヒトの使用に適している。一実施例において、製造されたワクチン組成物は獣医学的使用に適している。
【実施例】
【０１５５】
実施例１−中和抗体によるインターフェロン反応の中断が卵におけるウイルス収量を増加させる
ＣｈＩＦＮα、ＣｈＩＦＮβ、ＣｈＩＦＮγ、及びＣｈＩＦＮλのＯＲＦを、ｐＱＥ５０発現系を用いてＴｏｐ  Ｆ’１０エシェリキア・コリ（大腸菌）に発現させ、ＩＰＴＧを用いた誘導後に、Ｎｉ‐ＮＴＡ‐アガロースを用いて精製し精製した。ｒｃｈＩＦＮの生物活性をウイルス中和アッセイ（Ｌｏｗｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）を用いて測定した。ｒｃｈＩＦＮは、濃度範囲にわたって細胞を保護するため、生物学的に活性（図１）である。
【０１５６】
ｒｃｈＩＦＮを免疫原として用い、同種組換えタンパク質に対するウサギ抗血清を生成した。ニュージーランド雌白色ウサギにキラヤサポナリア（Ｑｕｉｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ、クイルＡ）カクテルアジュバントのｒｃｈＩＦＮタンパク質を７回まで皮下免疫した。ウサギ抗ｃｈＩＦＮ抗血清中の球状血清タンパク質を濃縮するために硫酸アンモニウムを用いた。濃縮された抗血清は、卵中注射用抗体の０．２μｍフィルター滅菌（サルトリウス）前の分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）ＮＤ−１０００、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国）を用いて定量した。血清の反応性とポリクローナル抗体認識を用い、間接ＥＬＩＳＡ分析を行った。簡単に言えば、精製されたｒｃｈＩＦＮを、Ｔｉｅｒｔｅｋ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  Ｐｌｕｓプレートリーダー上の４５０ｎｍで読み取られた９６ウェルＥＬＩＳＡプレート中のコーティング緩衝液中で５μｇ／ｍＬに希釈した。分析は、対応するタンパク質に対する血清の用量効果反応性を示した（図２Ａ）。
【０１５７】
次に、胎齢日１０〜１１日のＨｙｌｉｎｅ褐色卵（ハイライン（オーストラリア））について、抗体及び／又はウイルスを用いて尿中液を介して接種した。インフルエンザウイルス（ＣＳＬ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ．により提供）の株を、１％ネオマイシン／ポリミキシンを含むウイルス希釈液中で１０‐５に希釈した。卵のＰＲ８（Ｈ１Ｎ１型）又はＨ５Ｎ１ワクチンウイルス（ＮＩＢＲＧ−１４）（ＣＳＬ（オーストラリア））接種を別々に行った。精製抗ｃｈＩＦＮ及び抗ｃｈＩＬ−６抗体を、卵あたり１０００μｇ、２００μｇ又は２０μｇのいずれかの卵に接種するためのウイルス希釈液で希釈した。接種卵を３５℃で４８時間インキュベートした。
【０１５８】
卵をインキュベーション後にキャンドルを用いて、収穫に備えて４℃で冷却Ｏ／Ｎを冷却する前に生存性を確認した。さらに分析用に各卵から尿膜の流体（５ｍＬ）を除去した。ＨＡアッセイは収穫と同じ日に実施した。簡単に述べれば、漿液試料をＰＢＳ中で１／２５希釈し、丸底底部９６ウェルプレート（ＩＣＮバイオケミカル）の最後の行に複製した。洗浄したニワトリＲＢＣの０．５％μＬを全てのウェルに添加し、穏やかにタップし、ＲＴを少なくとも５０  ４０分間室温で放置し、ＨＡ末端点を決定した。インビボ実験では、全濃度における抗ｃｈＩＦＮ‐α抗体（図２Ｂ）及び抗ｃｈＩＦＮ‐β抗体（図２Ｃ）は、卵中のＰＲ８又はＮＩＢＲＧ‐１４ウイルスのＨＡ価に有意な影響を及ぼさないことを示した。しかしながら、抗ｃｈＩＦＮ‐λ抗体（図３Ａ）は、２００μｇ／卵（ｐ＝０．０４）で投与した場合、ＰＲ８ウイルスの滴定を統計的に改善することが示された。１０００μｇ／卵（ｐ＝０．００４５）及び２０μｇ／卵（ｐ＝０．０００１）で抗体を注入すると、Ｈ５Ｎ１ワクチンウイルスタイターは統計的に改善され、１．５倍になった。同様に、抗ｃｈＩＦＮ‐γ抗体（図３Ｂ）は１０００μｇ／卵（ｐ＝０．０１５）で接種するとＨ５Ｎ１ワクチンウイルスのＨＡ価を改善することができた。さらに、抗ｃｈＩＬ‐６抗体（図３Ｃ）は、卵中のＨ５Ｎ１ワクチンウイルス価も統計的に増強した。
【０１５９】
実施例２−インビトロでのｓｉＲＮＡによる多数の遺伝子の破壊が、イントロでのウイルス力価を増加させる
抗ウイルス機能をもつ遺伝子候補を同定するために、一連の遺伝子を小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）アッセイにより評価した。ＤＦ‐１細胞を、トリインフルエンザ（ＡＩ）ウイルスの感染前に、ｓｉＲＮＡの多重（スマートプール）をｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。結果は、ＫＤ後のウイルス価が細胞に対して明白な毒性効果を示さないことを示した（図４）。少なくともいくつかの例では明らかな影響は認められなかったが、これは、効率的なＫＤを産生するのに充分な早期にｓｉＲＮＡが投与されないためであろう（例えば、抗ＩＬ６抗体データを考えると、図４のＩＬ−６ｓｉＲＮＡデータを説明するであろう）。ＣＮＯＴ４、ＩＦＮＡＲ、又はＭＤＡ５に対して、個々のスマートプールｓｉＲＮＡの細胞生存性及び遺伝子サイレンシングに対する効果を評価した（図５）。
【０１６０】
実施例３−卵中のｓｈＲＮＡによる多数の遺伝子の下方制御がウイルス力価を増加させる
卵分析において、ｓｉＲＮＡを、合計２００μＬのポリマーの４：１のモル比で、２ｎｍｏｌのｓｉＲＮＡへＡＢＡ−２１／１１７Ｑ／ＰＦポリマー（ＡＢＡ−２１／１１７Ｑ；ＰｏｌｙＦｌｕｏｒ５７０染料ラベルのないポリマー）と複合体として送達した。錯体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の存在下にて水溶液中で形成された。水に再懸濁させた必要量のポリマー（３１６μｇ）をチューブに加え、ボルテックスにより混合した。次いで、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ３０μｇ又はｓｉＡｎｔＩＦＮＡＲ１  ２４．５μｇに相当する合計２ｎｍｏｌを試験管に加え、試料をボルテックスした。錯体を室温で１時間継続した。複合体を、皮質尿液中に直接注入した。４８時間後にウイルスを注射し、ウイルス感染後２４時間後に採取した。結果は、ＩＦＮＡＲ１（図６及び図７）のＫＤ後のウイルス増殖の増加を示した。
【０１６１】
実施例４−ニワトリにおけるＩＦＮＡＲ１遺伝子の欠失がインビトロにてウイルス力価を増加させる
ニワトリインターフェロン（アルファ、ベータ、オメガ）受容体１、ＩＦＮＡＲ１（遺伝子番号：３９５６６５）の永久的欠失がウイルス収量に及ぼす影響を調べる；ニワトリ胚線維芽細胞（ＤＦ−１）の連続細胞株からのＫＯ細胞株が発生した。微生物クラスタ化した周期的に間隔を置いた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）系からＲＮＡ誘導Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いて２つの異なる単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を、二本鎖切断を生成するために設計した。ｓｇＲＮＡは（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）に従ってクローニングされ、対応する構築物は、約２００ｂｐの欠失をコードするＤＦ−１細胞に、完全に転写開始部位（ＴＳＳ）及びＩＦＮＡＲ１前駆体のエキソン１を除去した。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩTM細胞ソーターを用いて選別後単離した。ゲノムＰＣＲスクリーニング後に各クローンの欠失を同定し、野生型と単アレル性及び対立遺伝子標的細胞株を区別した。
【０１６２】
約３０％の対立遺伝子のトランスフェクション後、２００ｂｐ以上の欠失が認められ、アンプリカムのクローニングと配列決定によって確認された。単一クローンへの細胞選別後、細胞をｇＤＮＡ  ＰＣＲによってスクリーニングし、単アレル性及び二アレル性細胞株を単離した。さらに、誘導欠失は遺伝子用量依存的に遺伝子の発現を阻害し、単アレル細胞株は野生型と比較して発現の半分レベルを示し、二対立形質細胞株はゼロに近いレベルを示した。この効果はウイルス又はポリ（Ｉ：Ｃ）に挑戦した後も持続し、自然応答の強い誘導子であった（図８Ａ、Ｂ、Ｃ）。
【０１６３】
ワクチン生産に及ぼす欠失の影響を評価するために、Ｈ１Ｎ１株Ａ／ＷＳＮ／１９３３を高い感染度と低い多重度（それぞれ１及び０．１  ＭＯＩ）で使用した。このアプローチを使用すると、１０時間の感染後の二アレル性細胞株において、プラーク形成単位（プフ）アッセイで測定した場合、野生型細胞株の約３倍のレベルでウイルス収量が著しく増加する。また、分離したウイルスは親細胞株（図８Ｄ）と比較して、両アレル細胞株から５倍高いＴＣＩＤ５０を示した。
【０１６４】
実施例５−ヘンドラウイルスに対する抗ウイルス遺伝子のスクリーニングと同定
ヒトＨｅＬａ細胞におけるヘンドラウイルス（ＨｅＶ）感染に必要なタンパク質を調べるｓｉＲＮＡスクリーニングにおいて、ウイルス産生に関連する多数の遺伝子が同定された。ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）（Ｅａｇｌｅｓ改良イーグル培地；ＥＭＥＭ）を、１０％  ｖ／ｖ胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した成長培地中で維持した。ＨｅＬａ細胞（７ｘ１０４）を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中のＤｈａｒｍａｆｅｃｔ−１（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、一晩逆トランスフェクトし、培地を除去し、トランスフェクション培地（増殖培地から抗生物質）及び細胞をさらに２４時間インキュベートした。培地をトランスフェクション後約６時間（ｈ．ｐ．ｔ．）交換し、さらに１８時間インキュベートした。次いで、細胞をヘンドラウイルス（ＨｅＶ）に感染させた（ヘンドラウイルス／オーストラリア／ウマ／１９９４／ヘンドラ）。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）について、組織培養上清の１０倍希釈を９６ウェル組織培養中にて培地中で作製した。プレートを３７℃及び５％  ＣＯ２で３日間（ハイブ）インキュベートし、細胞変性効果をスコア化した。感染力価はＲｅｅｄ  ａｎｄ  Ｍｕｅｎｃｈ（１９３８）法により計算した。サイレンシングされた遺伝子に対するウイルス複製を非標的ｓｉＲＮＡ制御（サイド）と比較した。ウイルス複製の有意な増加は多数の遺伝子（図９及び表２参照）のサイレンシングにより観察された。ＡＤＣＹ７のサイレンシングは、ウイルス量の最大増加を示した（表２参照）。
【０１６５】
多数の変形及び／又は修正が、広範に解説されるような本発明の主旨又は範囲から逸脱せずに、特定の実施形態において示される本発明に対して行われてもよいということは、当業者に理解されよう。本実施形態は、したがって、全ての点で例示的なものであり、限定的なものではないことが理解されよう。
【０１６６】
本出願は、２０１５年１１月２４日出願の「細胞培養におけるウイルスの生産」と題される豪州仮出願第２０１５９０４８５１号の優先権を主張するものであり、その出願の全内容を参照により本明細書に援用される。
【０１６７】
本明細書に記載及び／又は参照されるすべての刊行物は、本明細書に全体として援用される。
【０１６８】
本明細書中に含まれている文書、行為、材料、装置、物品等についてのあらゆる議論は、本発明の文脈を提供する目的のみで行われる。これらの事項のいずれか又は全てが、先行技術分野の基礎の一部を形作るか、又は本出願の各請求項の優先日以前に存在していたような本発明に関連する当該技術分野において一般的な知識であったということは、承認されるものではない。
【０１６９】
【表２】
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【０１７０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ−Ｄ】
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【図８Ａ−Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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