(57)【要約】  本発明の一例は、菌体−担体含有混合液が収容された混合タンク；前記混合タンクから菌体−担体含有混合液の注入を受けて外部に排出するノズル部；および、前記ノズル部から排出された菌体−担体含有混合液と硬化剤水溶液の接触により菌体固定化ビーズが形成される反応タンクを含む微生物菌体固定化装置を提供する。本発明の微生物菌体固定化装置は、空気噴射式ノズル（ａｉｒ  ｓｐｒａｙ  ｎｏｚｚｌｅ）を通して菌体−担体含有混合液を噴射するため、高粘度の固定化担体溶液を使用する場合でも、大きさが小さく、全体的に球形であるか、または球形に近い微生物菌体固定化ビーズを大量製造することができる。
2019500037.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
菌体−担体含有混合液が収容された混合タンク；前記混合タンクから菌体−担体含有混合液の注入を受けて外部に排出するノズル部；および、前記ノズル部から排出された菌体−担体含有混合液と硬化剤水溶液の接触により菌体固定化ビーズが形成される反応タンクを含む装置であって、
前記菌体−担体含有混合液は、微生物の菌体懸濁液および担体水溶液が混合されて形成されたものであり、
前記ノズル部は、菌体−担体含有混合液排出部と空気排出部を備え、
前記空気排出部は、空気を菌体−担体含有混合液排出部から排出された菌体−担体含有混合液の方向に噴射することを特徴とする、微生物菌体固定化装置。
【請求項２】
前記ノズル部は、本体部；前記本体部の一側に備えられ、菌体−担体含有混合液が注入される第１注入部；一端が前記第１注入部と連結されるように備えられ、他端が第１注入部に注入される菌体−担体含有混合液を外部に排出できるように本体部の外部に所定間隔露出するように備えられる第１排出部；前記本体部の一側に備えられ、空気が注入される第２注入部；および、前記第２注入部を通して注入された空気を第１排出部から排出される菌体−担体含有混合液の方向に噴射する少なくとも一つ以上の第２排出部を含むことを特徴とする、請求項１に記載の微生物菌体固定化装置。
【請求項３】
前記微生物は、細胞内酵素（ｅｎｄｏｅｎｚｙｍｅ）を生産する菌株であることを特徴とする、請求項１に記載の微生物菌体固定化装置。
【請求項４】
前記細胞内酵素（ｅｎｄｏｅｎｚｙｍｅ）は、ケトース３−エピマー化酵素であることを特徴とする、請求項３に記載の微生物菌体固定化装置。
【請求項５】
前記菌株は、ケトース３−エピマー化酵素をコーディングする遺伝子の導入またはケトース３−エピマー化酵素をコーディングする遺伝子を含む組換えベクターの導入により形質転換された組換え菌株であることを特徴とする、請求項３に記載の微生物菌体固定化装置。
【請求項６】
前記組換え菌株の宿主菌株（Ｈｏｓｔ  ｓｔｒａｉｎ）は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、バチルス・サブチリス（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であることを特徴とする、請求項５に記載の微生物菌体固定化装置。
【請求項７】
前記担体は、アルジネートであり、前記硬化剤は、塩化カルシウムであることを特徴とする、請求項１に記載の微生物菌体固定化装置。
【請求項８】
前記第２注入部と連結される前記本体部の内部一側は、所定の空気が貯蔵され得るように中空部からなることを特徴とする、請求項２に記載の微生物菌体固定化装置。
【請求項９】
前記第２排出部は、第１排出部を中心に放射状に複数形成されることを特徴とする、請求項２に記載の微生物菌体固定化装置。
【請求項１０】
前記第２排出部は、第１排出部を中心とする長孔形状になされることを特徴とする、請求項２に記載の微生物菌体固定化装置。
【請求項１１】
微生物の菌体懸濁液および担体水溶液を混合して菌体−担体含有混合液を形成するステップ；および、前記菌体−担体含有混合液をノズル部を通して排出し、硬化剤水溶液と接触させて菌体固定化ビーズを形成するステップを含む方法であって、
前記ノズル部は、菌体−担体含有混合液排出部と空気排出部を備え、
前記空気排出部は、空気を菌体−担体含有混合液排出部から排出された菌体−担体含有混合液の方向に噴射することを特徴とする、微生物菌体固定化方法。
【請求項１２】
前記微生物は、アルロース３−エピマー化酵素を細胞内酵素で生産する組換え菌株であり、前記担体は、アルジネートであり、前記硬化剤は、塩化カルシウムであることを特徴とする、請求項１１に記載の微生物菌体固定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物菌体固定化装置および微生物菌体固定化方法に関し、さらに詳細には、高粘度の固定化担体溶液を使用する場合でも、大きさが小さく、形状が均一な微生物菌体固定化ビーズを製造できる装置およびそれを用いて微生物菌体固定化ビーズを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−アルロース（Ｄ−ａｌｌｕｌｏｓｅ）は、果糖（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）の３番炭素のエピマー（ｅｐｉｍｅｒ）であってＤ−アルロース（Ｄ−ｐｓｉｃｏｓｅ）とも呼ばれる。アルロースは、砂糖と比較したとき、７０％の甘味度を有するが（Ｏｓｈｉｍａ  ２００６）、エネルギーは０．３％しかないので、ダイエット食品の低カロリー甘味料に適用可能な機能性単糖類である（Ｍａｔｓｕｏ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。また、アルロースは、ブドウ糖の吸収を抑制して血糖抑制作用をする機能があり、糖尿病患者用飲食品、健康用飲食品等に応用することができ、肝臓における脂質合成に関与する酵素活性を抑制する機能があり、腹部脂肪の蓄積抑制ができるので、健康食品等の様々な機能性食品等に使用することができる（Ｍａｔｓｕｏ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｉｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｈａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１０；Ｈｏｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。前記のような特徴により、アルロースは、砂糖に代替できる良いソースであるが、自然界にごく稀に存在する単糖類である稀少糖に属するため、食品産業に適用するためには、アルロースを効率的に生産する方法が必要である。既存のアルロースの生産方法としては、主に化学的過程を経て生産された。ビリック（Ｂｉｌｉｋ）らは、モリブデン酸イオンの触媒作用を利用して果糖からアルロースに切り換える方法を提案した。マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）は、１，２：４，５−ジ−δ−イソプロピリデン−ベータ−Ｄ−フルクトピラノース（１，２：４，５−ｄｉ−δ−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｉｄｅｎｅ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ）から３段階の化学的処理過程でアルロースを生産した。また、ドナー（Ｄｏｎｅｒ）は、エタノールとトリメチルアミンと共に果糖を加熱してアルロースを生産した。しかし、これらの化学的生産方法は、多くのコストがかかるのに対し、その効率は低く、副産物が多く発生する短所がある。
【０００３】
アルロースを生産する代表的な生物学的方法としては、果糖をＤ−アルロース３−エピマー化酵素と直接反応させてアルロースに切り換える方法と、細胞内酵素でＤ−アルロース３−エピマー化酵素を生産する菌株の菌体と果糖を反応させてアルロースに切り換える方法がある。このうち、酵素との直接反応を用いたアルロース生産方法は、温度、ｐＨ等の変化により酵素の活性が大きく落ちることがあり、酵素の固定化が容易ではないという点で適用に限界がある。また、Ｄ−アルロース３−エピマー化酵素は、細胞内酵素（ｅｎｄｏｅｎｚｙｍｅ）であるため、精製のために多くのコストおよび時間が必要となる。一方、菌体との反応を用いたアルロース生産方法は、固定化方法が単純で、菌体の細胞壁により細胞内酵素であるＤ−アルロース３−エピマー化酵素が保護されて長時間の間アルロースを生産できる長所がある。細胞内酵素（ｅｎｄｏｅｎｚｙｍｅ）を生産する菌株の菌体の固定化のための担体として主にアルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｕｉｍ  ａｌｇｉｎａｔｅ）が使用される。アルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｕｉｍ  ａｌｇｉｎａｔｅ）を利用して菌株の菌体を固定化する方法は、菌株の菌体とアルギン酸ナトリウム水溶液を混合して菌体−アルギン酸ナトリウム混合液を準備するステップ、および前記菌体−アルギン酸ナトリウム混合液を注射器またはノズルを利用して塩化カルシウム水溶液に落とし、菌体がアルギン酸ナトリウムのビーズに捕集された菌体−アルジネート結合体を形成するステップで構成される。これと関連した先行技術を検討すると、大韓民国公開特許公報第１０−１９９５−００２５０９７号には、微生物培養液をＣａＣｌ２溶液に入れて微量の界面活性剤とキサンタンガムを加えた後、この溶液を注射器の中に入れて撹拌下のアルギン酸ナトリウム溶液上に一滴ずつ滴下してカプセルがアルギン酸ナトリウム溶液中で形成されれば、それを水洗して収縮させた後、完成されたカプセルを成長培地で培養するステップで構成されることを特徴とするカルシウムアルジネート微生物固定化カプセルの製造方法が開示されている。また、大韓民国登録特許公報第１０−１５０７０３１号には、ａ）酵素含有物および賦形剤を含有する混合液が仕込まれる第１タンク部；ｂ）前記第１タンク部の下端部に位置するノズル部であって、内径が０．１〜１ｍｍであり、下端部が円筒形状であり、前記下端部に、ノズルの縦軸に垂直な方向に切断された液体放出口を有するノズルを含むノズル部；および、ｃ）前記ノズル部の下に位置し、塩化カルシウム液を含有し、前記塩化カルシウム液内に空気が注入されるように空気注入口を含む第２タンク部；を含む、酵素固定化ビーズ製造装置が開示されている。しかし、従来のニードルや単純なノズルを利用する場合、高粘度のアルギン酸ナトリウム水溶液のため、アルギン酸ナトリウムのビーズが大きくなるか、または形状が球形から離れる問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、従来の技術的背景下で導き出されたものであって、本発明の目的は、高粘度の固定化担体溶液を使用する場合でも、大きさが小さく、全体的に球形であるか、または球形に近い微生物菌体固定化ビーズを大量製造できる装置およびそれを用いて微生物菌体固定化ビーズを製造する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を解決するために、本発明の一例は、菌体−担体含有混合液が収容された混合タンク；前記混合タンクから菌体−担体含有混合液の注入を受けて外部に排出するノズル部；および、前記ノズル部から排出された菌体−担体含有混合液と硬化剤水溶液の接触により菌体固定化ビーズが形成される反応タンクを含む装置であって、前記菌体−担体含有混合液は、微生物の菌体懸濁液および担体水溶液が混合されて形成されたものであり、前記ノズル部は、菌体−担体含有混合液排出部と空気排出部を備え、前記空気排出部は、空気を菌体−担体含有混合液排出部から排出された菌体−担体含有混合液の方向に噴射することを特徴とする微生物菌体固定化装置を提供する。
【０００６】
前記目的を解決するために、本発明の一例は、微生物の菌体懸濁液および担体水溶液を混合して菌体−担体含有混合液を形成するステップ；および、前記菌体−担体含有混合液をノズル部を通して排出し、硬化剤水溶液と接触させて菌体固定化ビーズを形成するステップを含む方法であって、前記ノズル部は、菌体−担体含有混合液排出部と空気排出部を備え、前記空気排出部は、空気を菌体−担体含有混合液排出部から排出された菌体−担体含有混合液の方向に噴射することを特徴とする微生物菌体固定化方法を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の微生物菌体固定化装置は、空気噴射式ノズル（ａｉｒ  ｓｐｒａｙ  ｎｏｚｚｌｅ）を通して菌体−担体含有混合液を噴射するため、高粘度の固定化担体溶液を使用する場合でも、大きさが小さく、全体的に球形であるか、または球形に近い微生物菌体固定化ビーズを大量製造することができる。本発明の微生物菌体固定化装置で製造された微生物菌体固定化ビーズを微生物の細胞内酵素（ｅｎｄｏｅｎｚｙｍｅ）に対応する基質と反応させる場合、基質とビーズの接触面積が顕著に増加するため、酵素反応効率が向上し、酵素反応生成物の生産性が増加する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本発明の好ましい一例に係る微生物菌体固定化装置および微生物菌体固定化方法を概略的に示したものである。
【図２】本発明の微生物菌体固定化装置を構成するノズル部の断面図である。
【図３】本発明の一例に係るノズル部の底面図である。
【図４】本発明の他の例に係るノズル部の底面図である。
【図５】本発明の実施例１によって排出部の断面が平面であるニードルを利用して製造した菌体固定化ビーズの形状を菌体−アルギン酸ナトリウム含有混合液内のアルギン酸ナトリウムの濃度別に示したものである。
【図６】本発明の実施例２によって空気噴射式ノズルを利用して製造した菌体固定化ビーズの形状を菌体−アルギン酸ナトリウム含有混合液内のアルギン酸ナトリウムの濃度別に示したものである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を添付の図面を参照して具体的に説明する。
【００１０】
本発明の一側面は、微生物菌体固定化装置に関するものである。図１は、本発明の好ましい一例に係る微生物菌体固定化装置および微生物菌体固定化方法を概略的に示したものである。図１に示されたように、本発明の微生物菌体固定化装置は、菌体−担体含有混合液が収容された混合タンク３０；前記混合タンクから菌体−担体含有混合液の注入を受けて外部に排出するノズル部４０；および、前記ノズル部から排出された菌体−担体含有混合液と硬化剤水溶液の接触により菌体固定化ビーズが形成される反応タンク６０を含む。以下、本発明に係る微生物菌体固定化装置を構成要素別に分けて説明する。
【００１１】
混合タンク３０
前記混合タンクは、微生物の菌体懸濁液および担体水溶液が混合されて形成された菌体−担体含有混合液が収容される空間であって、菌体懸濁液および担体水溶液の均一な混合または混合液内での菌体と担体の均一な分布のために、好ましくは、内部に所定の撹拌手段（例えば、インペラ）が備えられている。前記混合タンクに収容された菌体−担体含有混合液は、定量ポンプにより移送ラインに沿ってノズル部に移送される。前記混合タンク内に収容された菌体−担体含有混合液の菌体の濃度は大きく制限されないが、担体に捕集される菌体の最大量を考慮するとき、混合液の全体積を基準に５〜１５％（ｗ/ｖ）であることが好ましく、５〜１２％（ｗ/ｖ）であることがさらに好ましい。また、菌体−担体含有混合液の担体濃度は大きく制限されないが、担体の粘性による移送の問題、後述するノズル部からの排出問題、ビーズ形成問題等を考慮するとき、混合液の全体積を基準に１〜４％（ｗ/ｖ）であることが好ましく、１〜２．５％（ｗ/ｖ）であることがさらに好ましい。菌体−担体含有混合液の担体濃度が混合液の全体積を基準に１％（ｗ/ｖ）未満であれば、ビーズ形成が難しいことがあり、４％（ｗ/ｖ）を超えれば、ノズル部への移送またはノズル部からの排出が難しいことがある。
【００１２】
本発明において、前記微生物の菌体懸濁液は、培養後に回収された微生物の菌体を所定のバッファー溶液に懸濁したものである。前記バッファー溶液は、微生物の活性を維持できるものであれば、その種類が大きく制限されず、公知の様々なバッファー溶液から選択され得る。前記微生物は、細胞内酵素（ｅｎｄｏｅｎｚｙｍｅ）を生産する菌株であることが好ましく、ケトース３−エピマー化酵素をコーディングする遺伝子の導入またはケトース３−エピマー化酵素をコーディングする遺伝子を含む組換えベクターの導入により形質転換された組換え菌株であることが好ましい。また、前記組換え菌株の宿主菌株は、食品学的に安全な菌株であることが好ましい。前記食品学的に安全な菌株は、一般的に安全なものと認められるＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅ）級菌株を意味し、例えば、サッカロミケス属菌株（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、バシラス属菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、コリネバクテリウム属菌株（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）等から選択され得る。前記菌株は、飼料、医薬品および食品等の分野で様々な用途を有する化学物質を生産する産業用微生物である。このような菌株は、遺伝子操作および大量培養に容易であるか、または様々な工程条件で高い安定性を有する菌株である。また、このような菌株は、他の細菌に比べて相対的に固い細胞膜構造を保有しているため、高い糖濃度等による浸透圧の影響下でも菌体が安定した状態で存在する生物学的特性を示す。前記ＧＲＡＳ（ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔｅｄ  ａｓ  ｓａｆｅ）級菌株の具体的な例としては、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、バチルス・サブチリス（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等がある。また、前記細胞内酵素は、異性化酵素、エピマー化酵素等、その種類が大きく制限されず、酵素反応産物の有用性を考慮するとき、ケトース３−エピマー化酵素であることが好ましい。本発明において、ケトース３−エピマー化酵素は、Ｄ−またはＬ−ケトヘキソースの３位をエピマー化して、対応するＤ−またはＬ−ケトヘキソースを生成する活性を有し、Ｄ−またはＬ−フルクトースとＤ−またはＬ−アルロースの間の相互変換、Ｄ−またはＬ−タガトースとＤ−またはＬ−ソルボースの間の相互変換を触媒する。また、本発明において、ケトース３−エピマー化酵素は、Ｄ−またはＬ−ケトペントースの３位をエピマー化して、対応するＤ−またはＬ−ケトペントースを生成する活性を有し、Ｄ−またはＬ−キシロースとＤ−またはＬ−リブロースの間の相互変換を触媒する。前記ケトヘキソースは、ケトース構造を有する六炭糖であり、具体的には、フルクトース、アルロース、タガトース、ソルボースを意味し、Ｄ−またはＬ−ケトヘキソースは、これらのＤ−体およびＬ−体を意味する。また、前記ケトペントースは、ケトース構造を有する五炭糖であり、具体的には、キシロース（ｘｙｌｏｓｅ）およびリブロース（ｒｉｂｕｌｏｓｅ）を意味し、Ｄ−またはＬ−ケトペントースは、これらのＤ−体およびＬ−体を意味する。本発明の一例に係る方法において、ケトース３−エピマー化酵素は、アルロース３−エピマー化酵素またはタガトース３−エピマー化酵素であることが好ましく、アルロース３−エピマー化酵素であることがさらに好ましい。前記アルロース３−エピマー化酵素は、フルクトースとアルロースの間の相互変換を触媒し、具体的な例として、配列番号１のアミノ酸配列を有することができる。
【００１３】
本発明において、前記担体水溶液は、担体を水に溶かしたものであって、このとき、前記担体は、水溶性でありながら、同時に微生物を閉じ込めるためのマトリックス形態になされた内部構造を有するものであれば、その種類が大きく制限されず、例えば、アガー、アガロース、カラギーナン、アルジネートまたはキトサン等から選択され得、アルジネートであることが好ましい。また、前記アルジネートは、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム等から選択され得る。
【００１４】
ノズル部４０
混合タンクから移送された菌体−担体含有混合液はノズル部に注入され、所定の形態で排出される。前記ノズル部は、菌体−担体含有混合液排出部と空気排出部を備え、空気排出部は、空気を菌体−担体含有混合液排出部から排出された菌体−担体含有混合液の方向に噴射してノズル部から排出される菌体−担体含有混合液の大きさを調節し、菌体−担体含有混合液の形状を球形または球形に近く調節する。
【００１５】
図２は、本発明に係るノズル部の断面図である。本発明に係るノズル部４０は、図２に示されたように、大きく、本体部４１、第１注入部４２、第１排出部４３、第２注入部４４、第２排出部４５およびカバー４７で構成される。
【００１６】
本体部４１は、ノズル部から排出される菌体−担体含有混合液Ｌを使用様態に所定の大きさおよび形状に調節するために、第１注入部４２、第１排出部４３、第２注入部４４、第２排出部４５およびカバー４７が備えられ得る空間を提供する。
【００１７】
第１注入部４２は、本体部４１の一側に形成され、菌体−担体含有混合液Ｌが本体部４１の内部に注入され得るように連結部の役割を果たすものである。このような第１注入部４２は、菌体−担体含有混合液が収容された混合タンクとパイプまたはホース等により連結され得るように本体部４１の一側に外側に突出するか、または内側に挿入されるように備えられ得る。このとき、第１注入部４２は、図２に示されたように、本体部４１と一体に形成され得、使用様態によっては、別途の連結ブラケット等を通して本体部４１と結合されるように構成され得る。
【００１８】
第１排出部４３は、第１注入部４２を通して本体部４１の内部に流入した菌体−担体含有混合液Ｌを本体部４１の外部に排出させる役割を果たす。このような第１排出部４３の一端は、本体部４１の内部に菌体−担体含有混合液Ｌを注入する第１注入部４２と連結されるように備えられ、他端は、本体部４１の外部に菌体−担体含有混合液Ｌを排出できるように本体部４１の一側に所定間隔露出するように備えられる。このとき、第１排出部４３は、第１注入部４２を通して注入された菌体−担体含有混合液Ｌを本体部４１を通過して外部に排出または噴射することができれば、いかなる形状になされても構わないが、本体部４１の内部を貫通するパイプ形状になされることが好ましい。第１排出部の内径は、菌体固定化ビーズの大きさおよび形状を考慮するとき、０．５〜１．５ｍｍであることが好ましい。
【００１９】
第２注入部４４は、本体部４１の一側に形成され、本体部４１の内部を通過する空気Ａを注入する役割を果たす。このような第２注入部４４は、パイプまたはホースを通して空気Ａを供給するエアポンプ等の空気供給装置と連結され得るように本体部４１の一側に内側に挿入されるか、または外部に突出するように備えられ得る。このような第２注入部４４は、第１注入部４２と同様に本体部４１と一体に形成されるか、または、使用様態によっては、別途の連結ブラケット等を通して本体部４１と結合されるように構成され得る。
【００２０】
このとき、第２注入部４４と対応する本体部４１の内部一側は、所定の空気Ａを貯蔵できるように中空部４６が形成され得る。このような中空部４６は、第２排出部４５と連結される連結装置がなくても本体の内部に注入された空気Ａが円滑に排出され得るようにする。前記中空部４６は、本体部４１の内部に全体的に形成されるか、または、第２注入部４４と第２排出部４５の間の空間にのみ形成されても構わない。
【００２１】
図３は、本発明の一例に係るノズル部の底面図であり、図４は、本発明の他の例に係るノズル部の底面図である。第２排出部４５は、第１注入部４２が外部に露出された本体部４１の一側と対応するように形成され、第１排出部４３から排出される菌体−担体含有混合液Ｌの方向に第２注入部４４から供給されるか、または本体部４１の中空部４６に貯蔵された空気Ａを噴射または排出する役割を果たす。このような第２排出部４５は、本体部４１の一側壁面、好ましくは、第１排出部４３が露出された一側と対応する本体部４１の一側壁面を貫通するように少なくとも一つ以上形成され得る。このとき、第２排出部４５は、様々な形状を有してよく、様々な形態に配置され得る。一例として、図３に示されたように、第２排出部４５は、本体部４１の外部に露出する第１排出部４３を中心に放射状に複数個が備えられ得る。また、他の例として、図４に示されたように、第２排出部４５は、第１排出部４３を中心に円弧形状等のように長孔形状になされ得、使用様態によっては、閉ループをなすように形成され得る。第２排出部４５の内径は、菌体固定化ビーズの大きさおよび形状を考慮するとき、０．５〜１．５ｍｍであることが好ましい。
【００２２】
また、第２排出部４５から噴射される空気Ａが第１排出部４３から噴射される菌体−担体含有混合液Ｌの方向に円滑に噴射され得るように、第２排出部４５は、本体部４１の下部方向へ行くほど次第に内側に傾斜するように形成され得る。このように、第２排出部４５が傾斜するように形成されることで、第２排出部４５から噴射される空気Ａは、第１排出部４３から噴射または排出される菌体−担体含有混合液Ｌの方向に円滑に噴射され得る。
【００２３】
前述した構成では、第２排出部４５が本体部４１を貫通して貫通孔の形状になされるように説明したが、使用様態によって、図２に示されたように、製造しようとする菌体固定化ビーズの大きさまたは形状等によって第２排出部４５の大きさおよび形状等を変更できるようにカバー４７を利用することができる。このように、カバー４７を利用する場合を詳細に説明すれば、次のとおりである。取り替え可能なカバー４７を結合するためには、本体部４１の一側に開放部が形成される。このとき、本体部４１の開放部は、第１排出部４３が露出される本体部４１の一側に形成される。カバー４７は、第１排出部４３が露出される本体部４１の一側と対応する一側面に開放された開放部を密閉するように結合され得る。このとき、カバー４７の中心一側には、第１排出部４３が貫通され得る貫通孔が形成され、第１排出部４３が貫通される貫通孔を中心に少なくとも一つ以上の第２排出部４５が形成される。このとき、第２排出部４５の形状は、前述の構成と類似した構成でなされ得るため、詳細な説明は省略する。
【００２４】
前述の構成を有するノズル部４０の使用様態を詳細に説明すれば、次のとおりである。図２に示されたように、混合タンク３０から菌体−担体含有混合液Ｌが移送パイプまたはホース等を通して流動して第１注入部４２を通して本体部４１に供給される。このように、第１注入部４２を通して注入された菌体−担体含有混合液Ｌは、パイプ形状の第１排出部４３を通過して本体部４１の外部に噴射される。
【００２５】
これと同時に、第２注入部４４では、エアポンプ等の空気供給装置を通して高圧の空気Ａが注入され、本体部４１の内部の中空部４６および第２排出部４５を順次に通過して外部に噴射される。このとき、第２排出部４５から噴射される空気Ａは、第１排出部４３から噴射される菌体−担体含有混合液Ｌの方向に排出されるため、第１排出部４３から排出または噴射される高粘度の菌体−担体含有混合液Ｌは、第２排出部４５から高圧で噴射される空気Ａにより切断され、小さな大きさと球形または球形に近い形状を有するようになる。また、第２排出部４５から噴射される空気Ａの噴射圧力および噴射周期を調節して、排出される菌体−担体含有混合液Ｌの形状または大きさを調節することができる。ノズル部の第１排出部４３から排出または噴射された菌体−担体含有混合液は反応タンクの内部に落ちて反応タンクの内部に収容された硬化剤水溶液と反応して固いビーズ形態に硬化される。
【００２６】
反応タンク６０
ノズル部から所定の大きさおよび形状で排出された菌体−担体含有混合液は、反応タンク６０の内部に落ちて、反応タンクの内部に収容された硬化剤水溶液と接触すれば、硬化反応が起こって固い菌体固定化ビーズが形成される。反応タンクには、菌体−担体含有混合液と硬化剤水溶液の均一な接触のために、内部に所定の撹拌手段（例えば、インペラ）が備えられている。
【００２７】
前記硬化剤水溶液は、硬化剤を水に溶かしたものであって、このとき、前記硬化剤は、担体と硬化反応をして固いビーズを形成できるものであれば、その種類が大きく制限されない。前記硬化剤は、担体の種類によって多様に選択され得、例えば、担体がアルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸カリウムである場合、硬化剤は、担体とカルシウム置換反応ができるカルシウム化合物から選択され得、塩化カルシウムであることが好ましい。前記硬化剤水溶液の硬化剤濃度は大きく制限されないが、菌体−担体含有混合液との適切な硬化反応速度を担保する側面で２００〜６００ｍＭであることが好ましく、３００〜５００ｍＭであることがさらに好ましい。
【００２８】
その他の構成要素
本発明の好ましい例に係る微生物菌体固定化装置は、図１に示されたように、微生物培養タンク１０、微生物菌体回収部１５、担体水溶液貯蔵タンク２０、硬化剤水溶液貯蔵タンク５０または菌体固定化ビーズ洗浄／貯蔵タンク７０をさらに含むことができる。前記微生物培養タンク１０は、微生物を所定の培地で培養して微生物の菌体を増殖させる役割を果たす。前記微生物培養タンク１０の微生物培養液は、以後、微生物菌体回収部１５に移送される。前記微生物菌体回収部１５は、微生物培養液から微生物菌体を分離する役割を果たし、例えば、遠心分離装置であってよい。前記担体水溶液貯蔵タンク２０は、担体水溶液を貯蔵しながら、必要な場合、担体水溶液を混合タンク３０に供給する役割を果たす。前記硬化剤水溶液貯蔵タンク５０は、硬化剤水溶液を貯蔵しながら、必要な場合、硬化剤水溶液を反応タンク６０に供給する役割を果たす。前記菌体固定化ビーズ洗浄／貯蔵タンク７０は、反応タンクから移送される菌体固定化ビーズを所定の溶媒（例えば、水）で洗浄して不純物を除去し、不純物が除去された菌体固定化ビーズを適した条件で保管する役割を果たす。菌体固定化ビーズ洗浄／貯蔵タンク７０に貯蔵された菌体固定化ビーズは、菌体内に存在する細胞内酵素（ｅｎｄｏｅｎｚｙｍｅ）を通して異性化反応等の様々な酵素反応工程に使用され得る。
【００２９】
本発明の他の側面は、微生物菌体固定化方法に関する。本発明に係る微生物菌体固定化方法は、微生物の菌体懸濁液および担体水溶液を混合して菌体−担体含有混合液を形成するステップ；および、前記菌体−担体含有混合液をノズル部を通して排出し、硬化剤水溶液と接触させて菌体固定化ビーズを形成するステップを含む。このとき、前記ノズル部は、菌体−担体含有混合液排出部と空気排出部を備え、前記空気排出部は、空気を菌体−担体含有混合液排出部から排出された菌体−担体含有混合液の方向に噴射してノズル部から排出される菌体−担体含有混合液の大きさおよび形状を調節する。本発明に係る微生物菌体固定化方法は、好ましくは、菌体−担体含有混合液と硬化剤水溶液との反応により形成された菌体固定化ビーズを回収するステップをさらに含むことができる。また、前記微生物は、アルロース３−エピマー化酵素を細胞内酵素で生産する組換え菌株であることが好ましく、前記担体は、アルジネートであることが好ましく、前記硬化剤は、塩化カルシウムであることが好ましい。本発明に係る微生物菌体固定化方法は、前述の微生物菌体固定化装置の内容を全て含む。
【００３０】
以下、本発明を実施例を通してさらに具体的に説明する。ただし、下記実施例は、本発明の技術的特徴を明確に例示するためのものであるだけで、本発明の保護範囲を限定するものではない。
【００３１】
１．Ｄ−アルロース３−エピマー化酵素を生産する組換え菌株の製造
韓国微生物資源センターから分譲を受けたフラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ  ｐｌａｕｔｉｉ）ＫＣＴＣ  ５９７０から遺伝体ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）を抽出した後、それを鋳型として利用し、Ｄ−アルロース３−エピマー化酵素をコーディングする遺伝子（配列番号２のポリヌクレオチド）をクローニングするためのプライマーおよびＥｘ−Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）重合酵素を利用して重合連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）を遂行した。下記表１は、フラボニフラクター・プラウティ（Ｆｌａｖｏｎｉｆｒａｃｔｏｒ  ｐｌａｕｔｉｉ）の遺伝体ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ）からＤ−アルロース３−エピマー化酵素をコーディングする遺伝子をクローニングするために使用されたプライマーを示したものである。下記表１に示されたプライマーは、Ｂｉｏｎｅｅｒ  ｃｏ．，ＫＲに依頼して作製した。
【表１】
2019500037.tif 000003
【００３２】
以後、ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を利用してＰＣＲ産物から所望の目的ＤＮＡだけを分離した後、Ｅａｓｙ  Ｔ−ベクター（ｐｒｏｍｅｇａ）に結合し、分離した目的ＤＮＡの塩基配列分析をＢｉｏｎｅｅｒ  ｃｏ．，ＫＲに委託して測定した。その結果、ＰＣＲを通して増幅された目的ＤＮＡが配列番号２のポリヌクレオチドに該当することを確認した。以後、ＰＣＲ反応により増幅された目的ＤＮＡを制限酵素であるＰｓｔ  ＩとＢａｍＨ  Ｉを利用してコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）シャトルベクター（ｓｈｕｔｔｌｅ  ｖｅｃｔｏｒ）であるＰＤＳベクターの同一の制限酵素認識部位に挿入して組換えプラスミドｐＤＳＦＤＰＥを作製した。以後、電気穿孔法で組換えプラスミドｐＤＳＦＤＰＥをコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ  １３０３２菌株の菌体内に挿入して組換え菌株を製造した。組換えプラスミドｐＤＳＦＤＰＥが挿入されたコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ  １３０３２菌株をコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＤＳ００００１と命名し、韓国生命工学研究院微生物保存センターに２０１５年１０月７日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ  ８０１０１を与えられた。
【００３３】
以後、組換え菌株の単一コロニーを１５ｍｌのＬＢ−ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ培地（Ｄｉｆｃｏ）に接種した後、３７℃および２００ｒｐｍの条件で約６時間の間、前培養（ｐｒｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ）した。以後、前培養液を５００ｍｌのＬＢ−ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎｅ培地に接種し、３７℃および２００ｒｐｍの条件で振盪培養した。以後、培養液の吸光度（ａｔ  ６００ｎｍ）が０．５であるとき、ＩＰＴＧを０．１ｍＭの濃度となるように加えて目的酵素の過発現を誘導した。このとき、過発現誘導時点から培養は１６℃および１５０ｒｐｍの条件に転換して約１６時間の間維持した。以後、組換え菌株の培養液を１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離して上澄液を除去し、組換え菌株の菌体を回収した。
【００３４】
回収された組換え菌株の菌体をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＿ＨＣｌ  ３００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌ）に懸濁させた後、超音波で処理して細胞を破砕した。細胞破砕液を１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して上澄液だけを集めた後、予めｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで平衡させたＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｐｒｏｆｉｎｉａ）に適用させた後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＿ＨＣｌ  ３００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０に２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌと２００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌが含有された緩衝溶液を順次に流した。最後に、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＿ＨＣｌ  ３００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌを流して目的タンパク質を溶出した。溶出されたタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＤ−アルロース３−エピマー化酵素であるものと確認された。
【００３５】
２．菌体懸濁液、アルギン酸ナトリウム水溶液および塩化カルシウム水溶液の製造
（１）菌体懸濁液の製造
ＢＨＩ培地（Ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｂｒｏｔｈ）が入っている培養容器に先に製造した組換え菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＤＳ００００１の菌体を培地の全体積を基準に２体積％（ｖｏｌ％）の量で加えた後、培養容器を振盪培養器中に移して３０℃および２００ｒｐｍの条件で４８時間の間振盪培養した。以後、培養液を遠心分離して組換え菌株の菌体を回収した。以後、回収された組換え菌株の菌体を５０ｍＭ濃度のＰＩＰＥＳ［ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ，Ｎ’−ｂｉｓ（２−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）］バッファー溶液に懸濁して、ｐＨが約７．０であり、懸濁液の全体積を基準に菌体の濃度が１６％（ｄｒｙ  ｃｅｌｌ  ｗｅｉｇｈｔ／懸濁液ｖｌｏｕｍｅ）である菌体懸濁液を製造した。
【００３６】
（２）アルギン酸ナトリウム水溶液の製造
アルギン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ  ａｌｇｉｎａｔｅ）を水に溶かして、全溶液体積を基準にアルギン酸ナトリウムの濃度がそれぞれ２．０％（ｗ／ｖ）、３．０％（ｗ／ｖ）、４．０％（ｗ／ｖ）、５．０％（ｗ／ｖ）であるアルギン酸ナトリウム水溶液を製造した。
【００３７】
（３）塩化カルシウム水溶液の製造
塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を水に溶かして、塩化カルシウムの濃度が４００ｍＭである塩化カルシウム水溶液を製造した。
【００３８】
３．菌体固定化ビーズの製造
実施例１：排出部の断面が平面であるニードルを用いた菌体固定化ビーズの製造
先に準備した菌体懸濁液と所定の濃度を有するアルギン酸ナトリウム水溶液を第１混合タンクで１：１の体積比で混合し、菌体−アルギン酸ナトリウム含有混合液４種類を製造した。前記４種類の菌体−アルギン酸ナトリウム含有混合液は、混合液の全体積を基準に菌体の濃度が８％（ｗ／ｖ）であり、アルギン酸ナトリウムの濃度は、それぞれ１．０％（ｗ／ｖ）、１．５％（ｗ／ｖ）、２．０％（ｗ／ｖ）、２．５％（ｗ／ｖ）である。以後、第１混合タンクに収容された菌体−アルギン酸ナトリウム含有混合液を、定量ポンプを利用して６０ｍｌ／ｍｉｎの流量でニードル（排出部の断面形態が平面であり、排出部の内径が約１ｍｍである）に注入した。ニードルに注入された菌体−アルギン酸ナトリウム含有混合液は、ニードルの排出部を通して塩化カルシウム水溶液が収容された第２混合タンクに落ちて塩化カルシウムと反応して菌体が内部に捕集された形態のビーズが形成された。
【００３９】
図５は、排出部の断面が平面であるニードルを利用して製造した菌体固定化ビーズの形状を菌体−アルギン酸ナトリウム含有混合液内のアルギン酸ナトリウムの濃度別に示したものであり、菌体固定化ビーズの大きさを下記表２に示した。
【表２】
2019500037.tif 000004
【００４０】
図５および前記表２から見られるように、排出部の断面が平面であるニードルを利用して菌体固定化ビーズを製造する場合、菌体−アルギン酸ナトリウム含有混合液内のアルギン酸ナトリウムの濃度が２．０％（ｗ／ｖ）以上である場合には、球形のビーズの代わりに楕円形やペレット状のビーズが形成され、形状および大きさが一定ではなかった。また、全てのアルギン酸ナトリウムの濃度で菌体固定化ビーズの大きさがニードルの排出部の内径より大きく、ニードルの排出部の内径の約２倍〜３．５倍と示された。
【００４１】
実施例２：空気噴射式ノズル（ａｉｒ  ｓｐｒａｙ  ｎｏｚｚｌｅ）を用いた菌体固定化ビーズの製造
先に準備した菌体懸濁液と所定の濃度を有するアルギン酸ナトリウム水溶液を第１混合タンクで１：１の体積比で混合し、菌体−アルギン酸ナトリウム含有混合液４種類を製造した。前記４種類の菌体−アルギン酸ナトリウム含有混合液は、混合液の全体積を基準に菌体の濃度が８％（ｗ／ｖ）であり、アルギン酸ナトリウムの濃度は、それぞれ１．０％（ｗ／ｖ）、１．５％（ｗ／ｖ）、２．０％（ｗ／ｖ）、２．５％（ｗ／ｖ）である。以後、第１混合タンクに収容された菌体−アルギン酸ナトリウム含有混合液を定量ポンプを利用して６０ｍｌ／ｍｉｎの流量で空気噴射式ノズル（図２に示された断面および図３に示された底面を有するノズルであって、混合液が排出される第１排出部の内径が約１ｍｍであり、空気が噴射される第２排出部の内径が約１ｍｍである）に注入した。ノズルに注入された菌体−アルギン酸ナトリウム含有混合液は、ノズルの第１排出部を通して排出され、同時に排出された混合液の方向に第２排出部を通して空気が噴射された。ノズルから排出された菌体−アルギン酸ナトリウム含有混合液は、塩化カルシウム水溶液が収容された第２混合タンクに落ちて塩化カルシウムと反応して菌体が内部に捕集された形態のビーズが形成された。
【００４２】
図６は、空気噴射式ノズルを利用して製造した菌体固定化ビーズの形状を菌体−アルギン酸ナトリウム含有混合液内のアルギン酸ナトリウムの濃度別に示したものであり、菌体固定化ビーズの大きさを下記表３に示した。
【表３】
2019500037.tif 000005
【００４３】
図６および前記表３から見られるように、空気噴射式ノズルを利用して菌体固定化ビーズを製造する場合、菌体−アルギン酸ナトリウム含有混合液内のアルギン酸ナトリウムの濃度が２．０％（ｗ／ｖ）以上である場合にも、球形または球形に近い均一な形態のビーズが形成された。また、全てのアルギン酸ナトリウムの濃度で菌体固定化ビーズの大きさがノズルの第１排出部の内径より小さいか、または同一であった。
【００４４】
以上のように、本発明を前記の実施例を通して説明したが、本発明は、必ずしもこれにのみ限定されるものではなく、本発明の範疇と思想を外れない範囲内で様々な変形実施が可能であることはもちろんである。従って、本発明の保護範囲は、本発明に添付の特許請求の範囲に属する全ての実施形態を含むものと解釈されるべきである。
【符号の説明】
【００４５】
１０：微生物培養タンク
１５：微生物菌体回収部
２０：担体水溶液貯蔵タンク
３０：混合タンク
４０：ノズル部
５０：硬化剤水溶液貯蔵タンク
６０：反応タンク
７０：硬化剤水溶液貯蔵タンク
４１：本体部
４２：第１注入部
４３：第１排出部
４４：第２注入部
４５：第２排出部
４６：中空部
４７：カバー
Ｌ：混合液
Ａ：空気
【図１】
2019500037.tif 000006
【図２】
2019500037.tif 000007
【図３】
2019500037.tif 000008
【図４】
2019500037.tif 000009
【図５】
2019500037.tif 000010
【図６】
2019500037.tif 000011
【配列表】
2019500037000001.app
【国際調査報告】
2019500037.tif 000012
2019500037.tif 000013
2019500037.tif 000014
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