(57)【要約】疾患の特徴である哺乳動物の対象の血液からの１０個以上の選択された遺伝子、例えば、遺伝子発現プロファイルの使用により、前記対象における肺癌を診断するための方法及び組成物が提供される。前記発現プロファイルは、本明細書の表Ｉまたは表ＩＩの１０個以上の遺伝子を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の対象における肺癌の存在を診断または進行を評価するための組成物であって、
前記組成物は、少なくとも１０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、
各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表Ｉの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物または発現産物にハイブリダイズする、前記組成物。
【請求項２】
少なくとも１つのポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドまたはリガンドが検出可能な標識に結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドまたはリガンドが異なる検出可能な標識に結合している、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記捕捉オリゴヌクレオチドが各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記捕捉オリゴヌクレオチドが基質に結合する、請求項４または請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記捕捉オリゴヌクレオチドが結合する基質をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
少なくとも１５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
少なくとも２５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
少なくとも５０個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
少なくとも７５個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
少なくとも１００個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
少なくとも５００個のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
表Ｉに記載の各異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物または発現産物にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
哺乳動物の対象における肺癌の存在を診断または進行を評価するための組成物であって
、
前記組成物は、少なくとも１０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含み、
各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドまたはリガンドは、表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物または発現産物にハイブリダイズする、前記組成物。
【請求項１６】
少なくとも１つのポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドまたはリガンドが検出可能な標識に結合している、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドリガンドが、異なる検出可能な標識に結合している、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
基質をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
少なくとも１５個のリガンドを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
少なくとも２０個のリガンドを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
少なくとも３０個のリガンドを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２２】
表ＩＩに記載の各異なる遺伝子発現産物にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドまたはリガンドを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれかに記載の組成物及び試料採取のための装置を含むキット。
【請求項２４】
前記試料採取のための装置が、前記試料を安定化させる試薬を含む血液を保持するためのチューブを備える、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記試薬が前記試料における前記ｍＲＮＡを安定化させる、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
哺乳動物の対象における肺癌の存在を診断または評価するための方法であって、前記対象の試料において１０個以上の遺伝子の発現の変化を同定することであって、前記遺伝子は、表Ｉの遺伝子または表ＩＩの遺伝子から選択される、前記同定すること、及び
前記対象の遺伝子発現レベルと参照または対照における同じ遺伝子のレベルとを比較することを含み、前記参照のものからの前記対象の遺伝子の発現の変化は、肺癌の診断または評価と相関する、前記方法。
【請求項２７】
前記診断または評価が、肺癌の診断、良性結節の診断、肺癌のステージの診断、肺癌の種類もしくは分類の診断、肺癌の再発の診断もしくは検出、肺癌の退行の診断もしくは検出、肺癌の予後、または外科手術療法もしくは非外科手術療法に対する肺癌の応答の評価のうちの１つ以上を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記変化は、前記参照もしくは対照と比較した１つ以上の選択された遺伝子のアップレギュレーション、または前記参照もしくは対照と比較した１つ以上の選択された遺伝子のダウンレギュレーションを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象における肺結節のサイズを特定することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
特異性が約９０％の感度で約４６％である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
特異性が＜１０ｍｍの結節に対して約９０％の感度で約５４％である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
精度は、≦８ｍｍの結節に対して約８８％であり、＞８ｍｍ及び≦１２ｍｍの結節に対して約７５％であり、＞１２ｍｍ及び≦１６ｍｍの結節に対して約６８％であり、また、＞１６ｍｍの結節に対して約５３％である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記診断について請求項１〜２１のいずれかに記載の組成物を用いることをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記参照または対照が、少なくとも１つの参照対象の表Ｉの試料の３つ以上の遺伝子を含み、前記参照対象が、（ａ）悪性疾患を有する喫煙者、（ｂ）非悪性疾患を有する喫煙者、（ｃ）非悪性疾患を有する元喫煙者、（ｄ）疾患のない健康な非喫煙者、（ｅ）慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する非喫煙者、（ｆ）ＣＯＰＤを有する元喫煙者、（ｇ）固形肺腫瘍除去の外科手術前の、前記固形肺腫瘍を有する対象（ｈ）固形肺腫瘍の外科的除去後の、前記腫瘍を有する対象、（ｉ）固形肺腫瘍の治療の前の、前記固形肺腫瘍を有する対象、及び（ｊ）固形肺腫瘍の治療中または治療後の、前記固形肺腫瘍を有する対象からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記参照または対照対象（ａ）〜（ｊ）が時間的に早い時点で同じ試験対象である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料が末梢血である、請求項２６〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記試料における核酸が前記遺伝子発現レベルの変化を同定する前に安定化された、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
患者の肺癌を検出する方法であって、
ａ．前記患者から試料を採取すること、及び
ｂ．表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも１０個の遺伝子の各異なる遺伝子転写物または発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドを含む組成物と前記試料とを接触させることによって、対照と比較して前記患者試料における表Ｉまたは表ＩＩから選択される前記少なくとも１０個の遺伝子における発現の変化を検出し、前記オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドと前記遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出することを含む、前記方法。
【請求項３９】
患者の肺癌を診断する方法であって、
ａ．患者から血液試料を採取すること、
ｂ．表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも１００個の遺伝子の各異なる遺伝子転写物または発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドを含む組成物と前記試料とを接触させることによって、対照と比較して前記患者試料における表Ｉまたは表ＩＩから選択される前記少なくとも１０個の遺伝子における発現の変化を検出し、前記オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドと前記遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出すること、及び
ｃ．前記対象の遺伝子の発現と前記参照の発現との変化が検出された場合に前記対象をがんと診断することを含む、前記方法。
【請求項４０】
新生物増殖を有する対象における肺癌を診断及び治療する方法であって、
ａ．患者から血液試料を採取すること、
ｂ．表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも１０個の遺伝子の各異なる遺伝子転写物または発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドを含む組成物と前記試料とを接触させることによって、対照と比較して前記患者試料における表Ｉまたは表ＩＩから選択される前記少なくとも１０個の遺伝子における発現の変化を検出し、前記オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドと前記遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出すること、
ｃ．前記対象の遺伝子の発現と前記参照の発現との変化が検出された場合に前記対象をがんと診断すること、及び
ｄ．前記新生物増殖を除去することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦支援の研究または開発に関する声明
本発明は、国立衛生研究所により付与された助成金番号ＣＡ０１０８１５の下で、政府の支援によってなされた。前記政府は、本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、がんの死亡率の最も一般的な原因である。米国では、肺癌は、男女共に２番目に多いがんで、年間１７４，０００件以上の新症例と、１６２，０００件超のがんの死亡原因となる。実際に、肺癌は、乳癌、前立腺癌、及び結腸直腸癌を合わせたものより毎年より多くの死亡原因となる。
【０００３】
過去３０年間にほとんど改善が見られなかったまたは改善がなかった高い死亡率（５年で８０〜８５％）は、所属リンパ節に、または肺以外に転移する前に、早期診断を容易にする新しく効果的なツールが必要であるという事実を強調している。
【０００４】
高リスクの集団には、喫煙者、元喫煙者、及び遺伝的素因に関連するマーカーを有する個人が含まれる。早期腫瘍の外科的除去は、依然として肺癌の最も有効な治療であるため、低用量スパイラルＣＴ（ＬＤＣＴ）を有する高リスク患者のスクリーニングに大きな関心が寄せられている。この戦略は、高リスクの個体の約３０〜７０％において、非石灰化肺結節を同定するが、検出された結節のわずかな部分のみが最終的に肺癌と診断される（０．４〜２．７％）。現在、良性病因の肺結節を有する対象と悪性結節を有する対象とを区別する唯一の方法は、侵襲的な生検、手術、または反復スキャンによる長期観察である。最良の臨床アルゴリズムを使用しても、不確定な肺結節に対して、外科的肺生検を受けるよう選択された患者の２０〜５５％は良性疾患を有することが判明し、生検または切除をすぐに行わない患者は順次画像検査が必要である。この患者群での連続ＣＴの使用は、潜在的な治癒療法の遅延のリスクと、反復スキャンのコスト、無視できない放射線量、及び前記患者の不安を伴う。
【０００５】
理想的には、診断試験は、容易にアクセスでき、安価であり、高い感度及び特異性を示し、（医学的及び財政的に）患者の転帰が改善される。他のものは、上皮細胞を利用する分類指標が高い精度を有することを示している。しかしながら、これらの細胞を採取するには、侵襲性の気管支鏡検査を必要とする。Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１５  Ｊｕｌｙ  １６；３７３（３）：２４３−２５１を参照されたく、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【０００６】
喀痰、血液、または血清を用い、ならびに腫瘍細胞の産物、メチル化腫瘍ＤＮＡ、一塩基多型（ＳＮＰ）で発現するメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質について解析する非侵襲的な診断法の開発が進められている。肺癌の早期診断のための潜在的な有用性を有するこの幅広い数々の分子検査法は、文献において議論されている。これらのアプローチのそれぞれにはメリットがあるが、初期ステージの肺癌を有する患者（高リスク群でさえも）、または放射線学的及びその他の臨床的要因に基づいて予備診断を受けている患者を検出するための調査段階を超えるにはまだ至っていない。簡単な血液検査、定期的な診療所訪問に関連する日常的な事象は、理想的な診断検査であろう。
【０００７】
発明の概要
１つの態様において、哺乳動物の対象における肺癌を診断または評価するための組成物またはキットは、１０個またはそれ以上のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを
含み、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、患者試料における異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物または発現産物にハイブリダイズする。各遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写産物または発現産物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択される。１つの実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが検出可能な標識に結合される。１つの実施形態において、前記組成物またはキットは、表Ｉの５５９個の遺伝子のそれぞれの遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物または発現産物を検出するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態において、前記組成物またはキットは、表ＩＩの１００個の遺伝子それぞれの遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物または発現産物を検出するポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む。
【０００８】
別の態様において、哺乳動物の対象における肺癌を診断または評価するための組成物またはキットは、１０個またはそれ以上のリガンドを含み、各リガンドは、患者試料において異なる遺伝子発現産物にハイブリダイズする。各遺伝子発現産物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択される。１つの実施形態において、少なくとも１つのリガンドが検出可能な標識に結合される。１つの実施形態において、前記組成物またはキットは、表Ｉの５５９個の遺伝子それぞれの発現産物を検出するリガンドを含む。別の実施形態において、前記組成物またはキットは、表ＩＩの１００個の遺伝子それぞれの発現産物を検出するリガンドを含む。
【０００９】
本明細書に記載の組成物は、前記対象の遺伝子発現プロファイルの遺伝子における発現の変化を参照遺伝子発現プロファイルの発現の変化から検出することを可能にする。様々な参照遺伝子発現プロファイルを以下に記載する。１つの実施形態において、前記組成物は、がん性腫瘍を非がん性結節と区別する能力を提供する。
【００１０】
別の態様において、哺乳動物の対象における肺癌を診断または評価するための方法は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択される対象の試料中の３つ以上の遺伝子の発現の変化を同定すること、及びその対象の遺伝子発現レベルを参照または対照における同じ遺伝子のレベルと比較することを含み、前記遺伝子発現の発現の変化が肺癌の診断または評価と相関している。１つの実施形態において、前記遺伝子発現の発現の変化は、がん性腫瘍を非がん性結節と区別する能力を提供する。
【００１１】
別の態様において、哺乳動物の対象における肺癌を診断または評価する方法は、対象の血液において、本明細書に記載の１０個以上の有益な遺伝子の１０個以上の遺伝子発現産物を含む前記遺伝子発現プロファイルを同定することを含む。前記１０個以上の有益な遺伝子は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択される。１つの実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉの５５９個の遺伝子すべてを含む。別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表ＩＩの１００個の遺伝子すべてを含む。前記対象の遺伝子発現プロファイルを、以下に記載される様々な供給源からの参照遺伝子発現プロファイルと比較する。前記有益な遺伝子の発現の変化は、肺癌の診断または評価と相関する。１つの実施形態において、前記遺伝子発現の発現の変化は、がん性腫瘍を非がん性結節と区別する能力を提供する。
【００１２】
別の態様において、患者の肺癌を検出する方法が提供される。前記方法は、前記患者から試料を得ることと、及び表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも１０個の遺伝子の各異なる遺伝子転写物または発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドを含む組成物と前記試料とを接触させることによって、対照と比較して前記患者試料における表Ｉまたは表ＩＩから選択される少なくとも１０個の遺伝子における発現の変化を検出し、前記オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドと前記遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出することを含む。
【００１３】
さらに別の態様において、対象における肺癌を診断する方法が提供される。前記方法は、対象から血液試料を得ること、表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも１０個の遺伝子の各異なる遺伝子転写物または発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドを含む組成物と前記試料とを接触させることによって、対照と比較して前記患者試料における表Ｉまたは表ＩＩから選択される少なくとも１０個の遺伝子における発現の変化を検出し、前記オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドと前記遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出すること、及び前記対象の遺伝子の発現と前記参照の発現との変化が検出された場合に前記対象をがんと診断することを含む。
【００１４】
別の態様において、新生物増殖を有する対象における肺癌を診断及び治療する方法が提供される。前記方法は、対象から血液試料を得ること、表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも１０個の遺伝子の各異なる遺伝子転写物または発現産物に特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドを含む組成物と前記試料とを接触させることによって、対照と比較して前記患者試料における表Ｉまたは表ＩＩから選択される少なくとも１０個の遺伝子における発現の変化を検出し、前記オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドと前記遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出すること、前記対象の遺伝子の発現と前記参照の発現との変化が検出された場合に対象をがんと診断すること、及び新生物増殖を除去することを含む。他の適切な処置も提供され得る。
【００１５】
これらの組成物及び方法の他の態様及び利点は、その好ましい実施形態の以下の詳細な説明においてさらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、実施例１で用いた試料の患者の特性を示す表である。
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、５５９個の分類指標を用いて、６１０個の試料すべて（図２Ａ、精度＝０．７５、ＲＯＣ面積＝０．８１。曲線によれば、感度が０．９１の場合、特異性は０．４６であり、感度が０．７２の場合、特異性は０．７７である。）、及び平衡セットの５５６個の試料（図２Ｂ、精度＝０．７６、ＲＯＣ面積＝０．８１、曲線によれば、感度が０．９０の場合、特異度は０．４８、感度が０．７６の場合、特異度は０．７７である。）の交差検証されたサポートベクターマシン分類指標（ＣＶＳＶＭ）を示すグラフである。完全セットと平衡セットは、同様のパフォーマンスを示す。
【図３】図３は、結節のサイズの群（ｘ軸）による前記分類指標の感度を示す棒グラフである。データは、より大きな結節が誤分類される可能性がより高いことを示す（ｐ＝１．５４*１０-4）。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、病変のサイズによって層別化された試料群（がん、図４Ｂ、ｎ＝２０４、及び結節、図４Ｃ、ｎ＝３３１）の分類を示す。がん＞５ｍｍ以上にわたり、ｒ＝０．９５。すべてのサイズの結節に対して、ｒ＝０．９７である。図表（図４Ａ）は、病変サイズに基づくがん及び結節の分類の感度及び特異性を示す。これらの数値は、下の棒グラフ形態で示す。
【図５】図５Ａ及び５Ｂは、がん試料すべて（ｎ＝２７８）対小結節（＜１０ｍｍ）（ｎ＝２４４）の交差検証されたサポートベクターマシン分類指標（ＣＶＳＶＭ）（図５Ａ、精度＝０．７９、ＲＯＣ面積＝０．８５．曲線によれば、感度が０．９０の場合、特異性は０．５４であり、感度が０．７７の場合、特異性は０．８２である。）、がん試料すべて（ｎ＝２７８）対大結節（≧１０ｍｍ）（ｎ＝８８）を用いた１０倍のＣＶＳＶＭ（図５Ｂ、精度＝０．７６、ＲＯＣ面積＝０．７１、曲線によれば、感度が０．９０の場合、特異性は０．２４であり、感度が０．８７の場合、特異度は０．４２である。）を示すグラフである。
【図６】図６は、１００個の分類指標について試験セットとして使用される、５５９個の分類指標について使用されるデータセットの２５％の、交差検証されたサポートベクターマシン分類指標（ＣＶＳＶＭ）を示すグラフである。ＲＯＣ面積＝０．８２。曲線によれば、感度が０．９０の場合、特異性は０．６２であり、感度が０．７９の場合、特異性は０．６８であり、感度が０．７１の場合、特異性は０．７５である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書に記載の方法及び組成物は、肺癌の検出及び診断のための血液スクリーニングに遺伝子発現技術を適用する。本明細書に記載の組成物及び方法は、哺乳動物、好ましくは、ヒト対象の血液の遺伝子の特徴的なＲＮＡ発現プロファイルを決定することによって、がん性腫瘍を非がん性結節と区別する能力を提供する。前記プロファイルは、有用な診断を提供するために、同じクラスの１人以上の対象（例えば、肺癌または非がん性結節を有する患者）または対照のプロファイルと比較される。
【００１８】
これらの肺癌スクリーニング法は、前記患者及び医師に、胸部放射線写真またはＣＴスキャンなどのさらなる調査を得るよう警告することができる遺伝子発現プロファイリングを用いて、単純かつ費用効果が高く、非侵襲性の血液検査を行うのに適した組成物を使用し、前立腺特異抗原が前立腺癌を診断し、その進行を追跡するのに役立つのと同じ方法である。これらのプロファイルの適用は、悪性疾患対非悪性疾患についての初期試験から始まり、肺疾患の種類の重複した確認的診断を提供する。
【００１９】
本明細書で使用される「患者」または「対象」は、ヒト、獣医動物または家畜、飼育動物またはペット、及び臨床研究に通常使用される動物を含む哺乳類動物を意味する。１つの実施形態において、これらの方法及び組成物の対象はヒトである。
【００２０】
本明細書で使用される「対照」または「対照の対象」は、参照遺伝子発現プロファイルの供給源、及び本明細書に記載の対照の対象の特定のパネルのことをいう。１つの実施形態において、対照または参照レベルは、単一の対象由来である。別の実施形態において、前記対照または参照レベルは、特定の特性を共有する個体の集団由来である。さらに別の実施形態において、前記対照または参照レベルは、特定の対照の個体または集団のレベルと相関する帰属値であるが、必ずしも前記対象の試料を評価する時点では測定されない。１つの実施形態において、前記対照の対象または参照は、非がん性結節を有する患者（または集団）由来である。別の実施形態において、前記対照の対象または参照は、がん性腫瘍を有する患者（または集団）由来である。他の実施形態において、前記対照の対象は、悪性疾患を有する現在または過去の喫煙者である対象、固形肺腫瘍除去の外科手術の前に固形肺腫瘍を有する対象、前記腫瘍の外科的除去後の固形肺腫瘍を有する対象、その治療の前に固形肺腫瘍を有する対象、及びその治療中または治療後に固形肺腫瘍を有する対象などの肺癌を有する対象または集団であり得る。他の実施形態において、本明細書に記載の組成物及び方法の目的のための対照には、肺癌を有さない以下のクラスの参照ヒト対象のいずれかが含まれる。そのような非健常対照（ＮＨＣ）には、非悪性疾患を有する喫煙者、非悪性疾患を有する元喫煙者（肺結節を有する患者を含む）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する非喫煙者、及びＣＯＰＤを有する元喫煙者のクラスが含まれる。さらに他の実施形態において、前記対照の対象は、疾患のない健康な非喫煙者または疾患のない健康な喫煙者である。
【００２１】
本明細書で使用する「試料」は、免疫細胞及び／またはがん細胞を含む任意の生物学的液体または組織を意味する。本発明における使用に最も適した試料は、全血を含む。他の有用な生物学的試料は、限定されないが、末梢血単核細胞、血漿、唾液、尿、滑液、骨髄、脳脊髄液、膣粘液、頸管粘液、鼻分泌物、痰、精液、羊水、気管支鏡検査試料、気管支肺胞洗浄、及びがんを有する患者由来の他の細胞滲出物などを含む。このような試料は、生理食塩水、緩衝液または生理学的に許容される希釈剤でさらに希釈され得る。あるいは、このような試料は、従来の手段によって濃縮される。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、用語「がん」は、典型的には調節されていない細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態のことをいうか、または記載する。より具体的には、本明細書で使用される「がん」という用語は、任意の肺癌を意味する。１つの実施形態において、前記肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。より具体的な実施形態において、前記肺癌は、肺腺癌（ＡＣまたはＬＡＣ）である。別のより特定の実施形態において、前記肺癌は、肺扁平上皮癌（ＳＣＣまたはＬＳＣＣ）である。別の実施形態において、前記肺癌は、ステージＩまたはステージＩＩのＮＳＣＬＣである。さらに別の実施形態において、前記肺癌は、早期及び後期のステージ、ならびにＮＳＣＬＣ型の混ざったものである。
【００２３】
本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、悪性または良性のいずれの新生物細胞の成長及び増殖、ならびにすべての前がん性及びがん性の細胞及び組織のことをいう。用語「結節」は、良性である組織の異常な蓄積のことをいう。用語「がん性腫瘍」は、悪性腫瘍のことをいう。
【００２４】
「診断」または「評価」は、肺癌の診断、肺癌のステージの診断、肺癌の型または分類の診断、肺癌の再発の診断または検出、肺癌の退行の診断または検出、肺癌の予後、または外科的または非外科的治療に対する肺癌の応答の評価を意味する。１つの実施形態において、「診断」または「評価」とは、がん性腫瘍と良性肺結節とを区別することをいう。
【００２５】
本明細書で使用される「感受性」（真の陽性率ともいう。）は、そのように正確に同定された陽性の割合（例えば、前記状態を有すると正確に同定された病気の人々の割合）を測定する。
【００２６】
本明細書で使用される「特異性」（真の陰性率ともいう。）は、そのように正確に同定される陰性の割合（例えば、前記状態を有さないと正確に同定された健常者の割合）を測定する。
【００２７】
「発現の変化」は、参照または対照と比較して１つ以上の選択された遺伝子のアップレギュレーション、参照または対照と比較して１つ以上の選択された遺伝子のダウンレギュレーション、または特定のアップレギュレートされた遺伝子とダウンレギュレートされた遺伝子との組み合わせを意味する。
【００２８】
「治療試薬」または「レジメン」は、限定されないが、化学療法薬、生物学的反応修飾物質、放射線、食事、ビタミン療法、ホルモン療法、遺伝子療法、外科的切除などを含み、固形腫瘍を有するかまたは有さないがんの治療に用いられる任意の型の治療を意味する。
【００２９】
本明細書で使用される「有益な遺伝子」は、その発現が肺癌の存在下で特徴的に（アップレギュレートまたはダウンレギュレーションのいずれかの様式で）変化する遺伝子を意味する。したがって、このような有益な遺伝子の統計的に有意な数は、前記方法及び組成物における使用のための適切な遺伝子発現プロファイルを形成する。そのような遺伝子を以下の表Ｉ及び表ＩＩに示す。このような遺伝子は、前記「発現プロファイル」を構成する。
【００３０】
本発明の文脈における用語「統計的に有意な数の遺伝子」は、観察される遺伝子発現の変化の程度に応じて異なる。前記遺伝子発現の変化の程度は、がんの型、及び前記がんまたは固形腫瘍のサイズまたは広がりとともに変化する。前記変化の程度は、前記個体の免疫応答によっても異なり、個体ごとに変動する可能性がある。例えば、本発明の１つの実施形態において、少数の遺伝子、例えば、約１０〜２０個の遺伝子における大きな変化、
例えば２〜３倍の増加または減少が統計的に有意である。別の実施形態において、あと約１５個の遺伝子におけるより小さい相対変化が統計学的に有意である。
【００３１】
したがって、本明細書に記載の方法及び組成物は、単一のプロファイルにおいて、５〜約５５９個の遺伝子の範囲の「統計的に有意な数の遺伝子」の発現プロファイルの試験を企図する。１つの実施形態において、前記遺伝子は、表Ｉから選択される。別の実施形態において、前記遺伝子は、表ＩＩから選択される。１つの実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の５個以上の遺伝子によって形成される。１つの実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の１０個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の１５個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の２０個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の２５個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の３０個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の３５個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の４０個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロフィールは、統計学的に有意な数の４５個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計学的に有意な数の５０個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の６０個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の６５個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の７０個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の７５個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計学的に有意な数の８０個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の８５個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の９０個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の９５個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の１００個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の２００個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の３００個以上の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の３５０個以上の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、４００個以上の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、５３９個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、５５９個の遺伝子によって形成される。さらに他の実施形態において、これらの方法の一部として試験される前記遺伝子プロファイルは、統計的に有意な数の遺伝子として、１０〜５５９個の遺伝子、及びそれらの間の任意の数を含む。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、表Ｉの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１
１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、または５５９個の遺伝子すべてによって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子プロファイルは、表ＩＩの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５
６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個の遺伝子すべてによって形成される。
【００３２】
以下の表Ｉ及び表ＩＩは、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）を有する対象と良性（非悪性）肺結節を有する対象との間を区別するのに有用な既知の遺伝子のコレクションを指す。表Ｉ及び表ＩＩに同定された遺伝子の配列は、公的に入手可能である。当業者は、ＧｅｎＢａｎｋなどの従来の供給源から公的に入手可能な遺伝子の配列の使用によって、本明細書に記載の組成物及び方法を容易に再現し得る。各遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号が提供される。
【００３３】
用語「マイクロアレイ」は、基板上のハイブリダイズ可能なアレイ要素、好ましくは、ポリヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブの整然とした配列のことをいう。
【００３４】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形または複数形で使用される場合、一般に、非修飾ＲＮＡもしくは非修飾ＤＮＡ、または修飾ＲＮＡもしくは修飾ＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドのことをいう。したがって、例えば、本明細書で定義されるポリヌクレオチドは、限定されないが、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ、及び一本鎖及び二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖であってもよく、より典型的には二本鎖であってもよく、または一本鎖及び二本鎖領域を含んでいてもよいＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子を含む。さらに、本明細書で使用する「ポリヌクレオチド」という用語は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含む三本鎖領域のことをいう。そのような領域の鎖は、同じ分子由来であってもよいし、異なる分子由来であってもよい。前記領域は、１つ以上の分子のすべてを含み得るが、より典型的には、いくつかの前記分子の領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」は、具体的には、ｃＤＮＡを含む。前記用語は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）及び１つ以上の修飾塩基を含むＲＮＡを含む。したがって、安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書で意図されるような「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンなどの異常塩基、またはトリチウム化塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書で定義される「ポリヌクレオチド」という用語に含まれる。一般に、「ポリヌクレオチド」という用語は、未修飾ポリヌクレオチドの化学的、酵素的及び／または代謝的に修飾された形態、ならびに単純及び複雑な細胞を含むウイルス及び細胞に特徴的なＤＮＡ及びＲＮＡの化学的形態をすべて包含する。
【００３５】
用語「オリゴヌクレオチド」は、限定するものではないが、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、及び二本鎖ＤＮＡを含む比較的短いポリヌクレオチドのことをいう。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、化学的方法、例えば、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて合成されることが多い。しかしながら、オリゴヌクレオチドは、インビトロ組換えＤＮＡ媒介技術を含む様々な他の方法によって、また、細胞及び生物におけるＤＮＡの発現によって作製され得る。
【００３６】
用語「差次的発現遺伝子」、「差次的遺伝子発現」及びそれらの同義語は、互換的に使用され、良性結節を有する対象のような対照の対象における発現と比較して、疾患、具体的には、肺癌のようながんに罹患している対象において、発現がより高レベルまたはより低レベルに活性化される遺伝子のことをいう。前記用語は、同じ疾患の異なるステージで
、発現がより高いまたはより低いレベルに活性化される遺伝子も含む。差次的発現遺伝子は、核酸レベルまたはタンパク質レベルで活性化もしくは阻害され得るか、または選択的スプライシングを受けて異なるポリペプチド産物をもたらし得ることも理解される。そのような違いは、例えば、ポリペプチドのｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌または他の分配の変化によって証明され得る。差次的遺伝子発現は、２つ以上の遺伝子もしくはその遺伝子産物間の発現の比較、または２つ以上の遺伝子もしくはその遺伝子産物間の発現の比の比較、またはさらには、同じ遺伝子の２つの異なる処理された産物の比較を含み得て、それらは、正常な対象、非健康対照、及び疾患、特にがんを罹患する対象の間で、または同じ疾患の様々なステージの間で異なる。差次的発現は、例えば、正常細胞及び罹患細胞の間で、または異なる疾患事象もしくは疾患のステージを経た細胞の間で、遺伝子またはその発現産物における時間的発現または細胞発現パターンの量的及び質的両方の差異を含む。本発明の目的のためには、対象と対照試料との間に統計的に有意な（ｐ＜０．０５）遺伝子発現の差がある場合、「差次的遺伝子発現」が存在すると考えられる。
【００３７】
ＲＮＡ転写物に関する用語「過剰発現」は、参照ｍＲＮＡのレベルに対する正規化によって決定された前記転写物のレベルをいうために使用され、これは、前記試料中のすべての測定された転写物またはｍＲＮＡの特定の参照セットであり得る。
【００３８】
語句「遺伝子増幅」は、遺伝子または遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞または細胞株で形成されるプロセスのことをいう。複製された領域（ひと続きの増幅されたＤＮＡ）は、しばしば「アンプリコン」という。通常、産生されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、すなわち、遺伝子発現のレベルも、発現される特定の遺伝子のコピー数に比例して増加する。
【００３９】
本明細書中に記載される組成物及び方法の文脈において、表Ｉまたは表ＩＩに列挙される遺伝子の「１０個以上」、「少なくとも１０個」などへの言及は、列挙された遺伝子の任意の１つまたは任意の及びすべての組み合わせを意味する。例えば、適切な遺伝子発現プロファイルは、表Ｉからの少なくとも５〜５５９個の遺伝子の間の任意の数を含むプロファイルを含む。別の例において、適切な遺伝子発現プロファイルは、表ＩＩからの少なくとも５〜１００個の遺伝子の間の任意の数を含むプロファイルを含む。１つの実施形態において、表から選択された遺伝子によって形成された遺伝子プロファイルは、ランク順に使用され、例えば、前記リストの最上位にランクされた遺伝子は、前記試験においてより重要な差別的結果を示し、したがって、より低いランクの遺伝子よりもプロファイルにおいてより重要であり得る。しかしながら、他の実施形態では、有用な遺伝子プロファイルを形成する遺伝子は、順番である必要はなく、表の任意の遺伝子であってもよい。本明細書中で使用される場合、用語「１００個の分類指標」または「１００個のバイオマーカー分類指標」は、表ＩＩの１００個の遺伝子のことをいう。本明細書中で使用される場合、用語「５５９個の分類指標」または「５５９個のバイオマーカー分類指標」は、表Ｉの５５９個の遺伝子のことをいう。しかしながら、本明細書に記載の表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子のサブセットも有用であり、別の実施形態において、前記用語は、それらのサブセットのことをいってもよい。
【００４０】
本明細書で使用する「標識」または「レポーター分子」は、核酸（単一ヌクレオチドを含む）、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはタンパク質リガンド、例えば、アミノ酸または抗体を標識するのに有用な化学または生化学的な部分である。「標識」及び「レポーター分子」は、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、消光剤、放射性ヌクレオチド、酵素、基質、補因子、阻害剤、磁性粒子、及び当業者に公知の他の部分を含む。「標識」または「レポーター分子」は、測定可能なシグナルを生成することができ、共有結合もしくは非共有結合されてもよいし、オリゴヌクレオチドもしくはヌクレオチド（例えば、非天然ヌクレオチド）またはリガンドに結合されてもよい。
【００４１】
本明細書において他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により、また、公開された文を参照することにより、一般に理解されるのと同じ意味を有し、本出願で使用される多くの用語の一般的な説明を当業者に提供する。
【００４２】
Ｉ．遺伝子発現プロファイル
本発明者らは、肺癌患者の全血の遺伝子発現プロファイルが、非がん性肺結節を有する患者で見られるものと有意に異なることを示した。例えば、表Ｉ及び／または表ＩＩの遺伝子の遺伝子発現産物の変化は、初期ステージの固形肺腫瘍を有する患者の正常な循環血中において、本発明の方法によって観察及び検出され得る。
【００４３】
本明細書に記載の遺伝子発現プロファイルは、肺癌の早期発見のための新しい診断マーカーを提供し、患者が良性結節の手術または生検に関する不必要な処置を受けないようにし得る。リスクは非常に低いので、リスク対効果比は非常に高い。１つの実施形態において、本明細書に記載の方法及び組成物は、医師が肺結節を有する患者をどのように管理するかについて、より正確な決定をするのを助ける臨床リスク因子と併せて使用し得る。本発明の別の利点は、早期肺癌において消失する少数のみに存在する、循環腫瘍細胞の検出に診断が依存しないので、早期に診断を行い得ることである。
【００４４】
１つの態様において、哺乳動物の対象においてがん性または良性として結節を分類するための組成物が提供される。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択される試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも１０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。別の実施形態において、前記組成物は、表Ｉの遺伝子から選択される試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも１００個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドは、ｍＲＮＡにハイブリダイズする。
【００４５】
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【００４６】
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【００４７】
１つの実施形態において、新規な遺伝子発現プロファイルまたはシグネチャーは、がん性腫瘍を有する患者を同定し、良性結節を有する患者と区別し得る。例えば、適切な遺伝子発現プロファイルを形成し得る表Ｉ及び表ＩＩに同定される遺伝子を参照されたい。別の実施形態において、表Ｉの遺伝子の一部が適切なプロファイルを形成する。さらに別の実施形態において、表ＩＩの遺伝子の一部が適切なプロファイルを形成する。本明細書で論じるように、これらのプロファイルは、以下に例示されるような遺伝子発現プロファイルの差異に基づいて判別スコアを生成することにより、がん性腫瘍と非がん性腫瘍とを区別するために使用される。これらのシグネチャーの妥当性は、診断されていない肺結節を有する患者のコホートにおいて、異なるグループによって異なる場所で収集された試料について確立された。実施例７、ならびに図２Ａ〜２Ｂ及び図６を参照されたい。本明細書において同定された肺癌シグネチャーまたは遺伝子発現プロファイル（すなわち、表Ｉまたは表ＩＩ）は、必要な遺伝子発現産物の数を減少させ、診断の精度を高めるためにさらに最適化され得る。
【００４８】
１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする１０〜５５９個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。別の実施形態において、前記組成物は、表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする１０〜１００個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。別の実施形態において、前記組成物は、表Ｉの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする１０〜５５９個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。別の実施形態において、前記組成物は、表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする１０〜１００個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。別の実施形態において、前記組成物は、表Ｉの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌ
クレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５
２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、または５５９個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。別の実施形態において、前記組成物は、表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも３個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも５個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも１０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも１５個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも２０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも２５個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも３０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも３５個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも４０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも４５個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも５０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリ
ガンドがハイブリダイズする少なくとも５５個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも６０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも６５個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも７０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも７５個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも８０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも８５個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも９０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも９５個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも１００個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも１５０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも２００個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも２５０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも３００個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも３５０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも４００個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも４５０個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉの遺伝子から選択された試料において、異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物に、各ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドがハイブリダイズする少なくとも５００個のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、表Ｉに列挙された各異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。別の実施形態において、前記組成物は、表ＩＩに列挙された各異なる遺伝子、遺伝子断片、遺伝子転写物、または発現産物にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドを含む。
【００４９】
さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の３個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の５個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の１０個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の１５個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の２０個の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の２５個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の３０個の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の３５個の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の４０個の遺伝子
によって形成される。別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の４５個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の５０個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の５５個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の６０個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の６５個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の７０個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の７５個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の８０個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の８５個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の９０個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の９５個の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩのランク順に最初の１００個の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉのランク順に最初の１５０個の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉのランク順に最初の２００個の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉのランク順に最初の２５０個の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉのランク順に最初の３００個の遺伝子によって形成される。別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉのランク順に最初の３５０個の遺伝子によって形成される．別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉのランク順に最初の４００個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記発現プロファイルは、表Ｉのランク順に最初の５３９個の遺伝子によって形成される。
【００５０】
以下に論じるように、本明細書に記載の組成物は、当該分野で公知の遺伝子発現プロファイリング法と共に使用され得る。したがって、前記組成物は、それらが使用されることが意図されている方法に適するように適合させ得る。１つの実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドは、検出可能な標識に結合される。特定の実施形態では、各ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、それぞれが独立して検出され得る異なる検出可能な標識に結合される。このような試薬は、以下に記載されるようなｎＣｏｕｎｔｅｒのようなアッセイにおいて、また、本明細書に記載の診断方法で有用である。
【００５１】
別の実施形態において、前記組成物は、少なくとも１つのポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドにハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドまたはリガンドを含む。１つの実施形態において、そのような捕捉オリゴヌクレオチドまたはリガンドは、目的の遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、またはリガンドの一部に特異的な核酸配列を含み得る。前記捕捉リガンドは、目的の遺伝子に対するリガンドに特異的なペプチドまたはポリペプチドであってもよい。１つの実施形態において、前記捕捉リガンドは、サンドイッチＥＬＩＳＡにおけるような抗体である。
【００５２】
前記捕捉オリゴヌクレオチドはまた、基質との結合を可能にする部分を含む。そのような基質は、限定されないが、プレート、ビーズ、スライド、ウェル、チップ、またはチャンバーを含む。１つの実施形態において、前記組成物は、目的の遺伝子に特異的である異なるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドごとに捕捉オリゴヌクレオチドを含む。
各捕捉オリゴヌクレオチドは、前記同じ基質との結合を可能にする同じ部分を含有していてもよい。１つの実施形態において、前記結合部分は、ビオチンである。
【００５３】
したがって、本明細書に記載の哺乳動物の対象におけるそのような診断または評価のための組成物は、キットまたは試薬であり得る。例えば、組成物の一実施形態は、ｍＲＮＡを検出及び定量するために使用されるリガンドがその上に固定化されている基質を含む。前記試薬は、１つの実施形態において、ｍＲＮＡの核酸配列を増幅し検出する増幅核酸プライマー（ＲＮＡプライマーなど）またはプライマー対である。別の実施形態において、前記試薬は、標的配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドプローブである。別の実施形態において、前記標的配列は、表ＩＩＩに示される。別の実施形態において、前記試薬は、抗体または抗体の断片である。前記試薬は、それぞれ表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも１つの遺伝子、遺伝子断片、または発現産物に特異的な複数の前記プライマー、プローブまたは抗体を含み得る。場合により、前記試薬は、従来の検出可能な標識と結合させ得る。
【００５４】
別の実施形態において、前記組成物は、関連する複数のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドプローブ、またはリガンド、任意の検出可能なその標識、固定基質、酵素標識のための任意の基質、ならびに他の実験アイテムを含むキットである。さらに別の実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンドは、検出可能な標識と結合している。特定の実施形態において、前記試薬は、基質上に固定される。例示的な基質は、マイクロアレイ、チップ、マイクロ流体カード、またはチャンバーを含む。
【００５５】
１つの実施形態において、前記組成物は、以下にさらに論じるように、ｎＣｏｕｎｔｅｒナノストリングシステムと共に使用するように設計されたキットである。
【００５６】
ＩＩ．遺伝子発現プロファイリング法
本明細書に記載される組成物及び方法において有用なプロファイルを生成する際に、または本明細書に記載の組成物を用いて診断ステップを実施する際に使用された遺伝子発現プロファイリングの方法は、既知であり、米国特許第７，０８１，３４０号によく要約されている。遺伝子発現プロファイリングのそのような方法は、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション解析に基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法、及びプロテオミクスに基づく方法を含む。試料中のｍＲＮＡ発現の定量について、当該分野で公知の最も一般的に使用される方法は、ノーザンブロッティング及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）解析、及びＲＴ−ＰＣＲのようなＰＣＲに基づく方法を含む。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む特異的二重鎖を認識し得る抗体が使用され得る。配列決定に基づく遺伝子発現解析のための代表的な方法は、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）及び超並列サイン配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析を含む。
【００５７】
特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載の遺伝子発現プロファイリング及び／または診断の方法、ならびに当業者に公知の方法における使用に適応される。
【００５８】
Ａ．患者試料
本明細書で使用する「試料」または「生物学的試料」は、免疫細胞及び／またはがん細胞を含む任意の生物学的液体または組織を意味する。１つの実施形態において、適切な試料は、全血である。別の実施形態において、前記試料は、静脈血であり得る。別の実施形態において、前記試料は、動脈血であってもよい。別の実施形態において、本明細書に記
載の方法での使用に適した試料は、末梢血、より具体的には末梢血単核細胞を含む。他の有用な生物学的試料は、限定されないが、血漿または血清を含む。さらに他の実施形態において、前記試料は、唾液、尿、滑液、骨髄、脳脊髄液、膣粘液、頸管粘液、鼻分泌物、喀痰、精液、羊水、気管支肺胞洗浄液、及び肺疾患を有すると疑われる対象由来の他の細胞滲出物である。このような試料は、生理食塩水、緩衝液、または生理学的に許容される希釈剤でさらに希釈され得る。あるいは、このような試料は、従来の手段によって濃縮される。任意の１つの生物学的試料に対する本明細書を通しての使用または参照は単なる例示であることを理解されたい。例えば、本明細書中で試料が全血と呼ばれる場合、他の試料、例えば、血清、血漿などもまた、別の実施形態において使用され得ることが理解される。
【００５９】
１つの実施形態において、前記生物学的試料は、全血であり、前記方法は、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡワークフローシステム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する。このシステムは、採血（例えば、単回採血）及びＲＮＡ安定化、その後の輸送及び保存、続いて全ＲＮＡの精製及び分子ＲＮＡ試験を含む。このシステムは、即座のＲＮＡ安定化と一貫した血液採取量を提供する。血液は、医師の診療所で採取することができ、前記標本は、同じ管で輸送されて保管される。短期間のＲＮＡ安定性は、１８〜２５℃で３日間、または２〜８℃で５日間である。長期のＲＮＡ安定性は、−２０〜−７０℃で４年である。この試料収集システムは、ユーザーが全血における遺伝子発現に関するデータを確実に得ることを可能にする。１つの実施形態において、前記生物学的試料は、全血である。ＰＡＸｇｅｎｅシステムは、生物学的試料源としてのＰＢＭＣの使用よりも多くのノイズを有するが、ＰＡＸｇｅｎｅ試料収集の利点は、その問題を上回る。ノイズは、当業者によって生物情報科学的に減算され得る。
【００６０】
１つの実施形態において、前記生物学的試料は、独自のＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡシステム（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ、Ｑｉａｇｅｎ、ＢＤ社）を用いて収集され得る。前記ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡシステムは、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ
ＲＮＡチューブ及びＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキットの２つの統合コンポーネントで構成されている。血液試料は、標準的な静脈穿刺技術によって、ＰＡＸｇｅｎｅ
Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブに直接採取される。これらのチューブは、細胞内ＲＮＡを直ちに安定化させ、ｅｘ  ｖｉｖｏでの分解やＲＮＡ転写物のアップレギュレーションを最小限に抑える独自の試薬が含まれている。凍結、バッチ試料を排除し、収集後に試料を処理する緊急性を最小限に抑えることができるため、研究室の効率が大幅に向上し、コストが削減される。その後、ｍｉＲＮＡは、様々なアッセイを用いて検出及び／または測定される。
【００６１】
Ｂ．  ナノストリング解析
本明細書に記載の組成物及び方法と共に使用するのに適した繊細で柔軟な定量法は、ｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）解析システム（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ）である。前記ｎＣｏｕｎｔｅｒ解析システムは、遺伝子発現の直接多重化測定に基づいたデジタルカラーコード化バーコード技術を使用し、高い精度及び感度（１細胞あたり１コピー未満）を提供する。前記技術は、分子の「バーコード」、及び単一分子イメージングを使用して、１回の反応で何百ものユニークな転写物を検出してカウントする。各色分けされたバーコードは、目的の遺伝子、すなわち表Ｉの遺伝子に対応する単一の標的特異的プローブ（すなわち、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはリガンド）に結合される。対照と混在し、多重化されたコードセットを形成する。１つの実施形態において、前記コードセットは、表Ｉの５５９個の遺伝子すべてを含む。別の実施形態において、前記コードセットは、表ＩＩの１００個の遺伝子すべてを含む。別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも３個の遺伝子を含む。別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉまたは表
ＩＩの少なくとも５個の遺伝子を含む。別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも１０個の遺伝子を含む。別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも１５個の遺伝子を含む。別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも２０個の遺伝子を含む。別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも２５個の遺伝子を含む。別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも３０個の遺伝子を含む。さらに別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも４０個の遺伝子を含む。さらに別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも５０個の遺伝子を含む。別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも６０個の遺伝子を含む。別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも７０個の遺伝子を含む。さらに別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも８０個の遺伝子を含む。さらに別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも９０個の遺伝子を含む。別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉの少なくとも１００個の遺伝子を含む。別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉの少なくとも２００個の遺伝子を含む。別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉの少なくとも３００個の遺伝子を含む。さらに別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉの少なくとも４００個の遺伝子を含む。さらに別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉの少なくとも５００個の遺伝子を含む。さらに別の実施形態において、前記コードセットは、表Ｉのランク順に最初の５３９個の遺伝子によって形成される。さらに別の実施形態において、前記コードセットは、本明細書に記載の表Ｉの遺伝子の任意のサブセットを含む。別の実施形態において、前記コードセットは、本明細書に記載の表ＩＩの遺伝子の任意のサブセットを含む。
【００６２】
前記ナノストリングプラットフォームは、溶液中でハイブリダイズするｍＲＮＡあたり２〜５０塩基のプローブを用いる。レポータープローブは、シグナルを運ぶ。捕捉プローブは、データ収集のために、複合体を固定化することを可能にする。前記プローブは、患者試料と混合される。ハイブリダイゼーション後、過剰のプローブを除去し、前記プローブ／標的の複合体を基板に、例えば、ｎＣｏｕｎｔｅｒカートリッジに整列させて固定化する。
【００６３】
表Ｉ及び表ＩＩの各遺伝子について、以下の実施例で利用される標的配列を以下の表ＩＩＩに示し、配列表に再現される。これらの配列は、公開されたこれらの遺伝子の配列の一部である。適切な代替物は、当業者によって容易に設計され得る。
【００６４】
試料カートリッジは、データ収集のために、デジタルアナライザーに配置されている。前記カートリッジの表面上のカラーコードがカウントされ、各標的分子について集計される。
【００６５】
前記ナノストリングｎＣｏｕｎｔｅｒシステムを使用する利点は、検出及び定量を行うために、ｍＲＮＡの増幅が必要ないことである。しかしながら、代替的な実施形態において、他の適切な定量的方法が使用される。例えば、Ｇｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｉｒｅｃｔ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒ−ｃｏｄｅｄ  ｐｒｏｂｅ  ｐａｉｒｓ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８  Ｍａｒ；２６（３）：３１７−２５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ１３８５．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｆｅｂ  １７を参照されたく、それは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−４２】
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【表３−６９】
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【表３−７０】
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【００６７】
Ｃ．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術
別の適切な定量的方法は、異なる試料集団、正常及び腫瘍組織におけるｍＲＮＡレベルを比較し、遺伝子発現のパターンを特徴付けし、密接に関連するｍＲＮＡを識別し、ＲＮＡ構造を解析するために使用され得るＲＴ−ＰＣＲである。第１のステップは、標的試料（例えば、典型的には、ヒトＰＢＭＣから単離された全ＲＮＡ）からのｍＲＮＡの単離である。ｍＲＮＡは、例えば、凍結または保存されたパラフィン包埋され固定された（例えば、ホルマリン固定された）組織試料から抽出され得る。
【００６８】
ｍＲＮＡ抽出のための一般的な方法は、分子生物学の標準的な教科書のような当技術分野で周知である。特に、ＲＮＡの単離は、製造業者の指示にしたがって、市販の製造者か
らの精製キット、緩衝液セット、及びプロテアーゼを用いて行われ得る。例示的な市販品は、ＴＲＩ−ＲＥＡＧＥＮＴ、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラム、ＭＡＳＴＥＲＰＵＲＥ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ、及びＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、ならびにＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を含む。塩化セシウム密度勾配遠心分離のような従来の技術も使用され得る。
【００６９】
ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングの第１段階は、ＲＮＡ鋳型のｃＤＮＡへの逆転写であり、続いて、ＰＣＲ反応における指数関数的な増幅である。２つの最も一般的に使用される逆転写酵素は、アビロ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）及びモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。前記逆転写ステップは、典型的には、状況及び発現プロファイリングの目的に応じて、特異的プライマー、ランダムヘキサマー、またはオリゴｄＴプライマーを用いてプライミングされる。例えば、製品ＧＥＮＥＡＭＰ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）に添付の製造業者の指示書を参照されたい。次いで、得られたｃＤＮＡを、続くＲＴ−ＰＣＲ反応における鋳型として使用され得る。
【００７０】
ＰＣＲステップは、一般に、５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’プルーフリーディングエンドヌクレアーゼ活性を有さないＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用する。したがって、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲは、典型的には、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性を利用して、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素が使用され得る。２つのオリゴヌクレオチドプライマーが使用され、ＰＣＲ反応に典型的なアンプリコンが生成される。１つの実施形態において、標的配列は、表ＩＩＩに示される。第３のオリゴヌクレオチド、またはプローブは、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計される。前記プローブは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長不可能であり、レポーター蛍光色素及びクエンチャー蛍光色素で標識される。前記レポーター色素からのレーザー誘起発光は、前記２つの色素が前記プローブ上にあるように近接して位置する場合には、前記クエンチング色素によって消光される。前記増幅反応の間、前記ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素は、鋳型依存的な方法で前記プローブを切断する。得られたプローブ断片は、溶液中で解離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは、第２のフルオロフォアの消光効果がない。レポーター色素の１分子は、合成された新しい分子ごとに遊離され、非消光レポーター色素の検出は、データの定量的解釈の基礎を提供する。
【００７１】
市販の装置を使用して、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、実施され得る。好ましい実施形態において、５’ヌクレアーゼの手順は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００（登録商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のようなリアルタイム定量ＰＣＲ装置上で実行される。前記システムは、サーモサイクラー上で、９６ウェルのフォーマットの試料を増幅する。増幅中、レーザー誘起蛍光シグナルは、すべての９６ウェルについて、光ファイバーケーブルを介してリアルタイムで収集され、ＣＣＤで検出される。前記システムは、前記装置を動作させ、データを解析するためのソフトウェアを含む。５’−ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にＣｔまたは閾値サイクルとして表される。上記のように、蛍光値は、各サイクル中に記録され、前記増幅反応におけるその時点まで増幅された産物の量を表す。前記蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録される時点は、閾値サイクル（Ｃt）である。
【００７２】
誤差及び試料間の変動の影響を最小限に抑えるために、ＲＴ−ＰＣＲは、通常内部標準
を用いて行われる。理想的な内部標準は、異なる組織間において一定レベルで発現され、実験的治療の影響を受けない。遺伝子発現のパターンを正常化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子のグリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びβ−アクチンのｍＲＮＡである。
【００７３】
リアルタイムＰＣＲは、各標的配列の内部競合物質が正規化に使用される定量的競合ＰＣＲと、前記試料中に含まれる正規化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を用いる定量的比較ＰＣＲの両方と同等である。
【００７４】
別のＰＣＲ法、すなわち、ＭａｓｓＡＲＲＡＹベースの遺伝子発現プロファイリング法（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、ＲＮＡの単離及び逆転写の後、得られたｃＤＮＡを合成ＤＮＡ分子（競合剤）でスパイクし、これは、単一の塩基を除くすべての位置の標的とされたｃＤＮＡ領域と一致し、内部標準として働く。ｃＤＮＡ／競合物混合物は、ＰＣＲで増幅され、ＰＣＲ後、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素処理に供され、残りのヌクレオチドの脱リン酸化をもたらす。前記アルカリホスファターゼの不活性化の後、前記競合剤及びｃＤＮＡからのＰＣＲ産物は、プライマー伸長に供され、前記競合体及びｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物のための異なる質量シグナルを生成する。精製後、これらの生成物は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）の分析を用いて、分析に必要な成分を予め装填したチップアレイ上に分配される。次いで、反応中に存在するｃＤＮＡは、生成されたマススペクトルにおけるピーク領域の比を解析することによって定量される。
【００７５】
当該分野で公知であり、遺伝子発現プロファイリングに使用され得るＰＣＲに基づく技術のさらに他の実施形態は、例えば、差動ディスプレイ、増幅断片長多型（ｉＡＦＬＰ）、及び遺伝子発現の迅速アッセイにおいて、市販されているＬｕｍｉｎｅｘ１００  ＬａｂＭＡＰシステム及び複数の色分けされたマイクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いた、ＢｅａｄＡｒｒａｙ（商標）技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ならびにハイカバレージ発現プロファイリング（ＨｉＣＥＰ）解析を含む。
【００７６】
Ｄ．マイクロアレイ
差次的遺伝子発現も、マイクロアレイ技術を用いて、同定または確認され得る。したがって、肺癌関連遺伝子の発現プロファイルは、マイクロアレイ技術を用いて、新鮮またはパラフィン包埋組織のいずれかで測定され得る。この方法では、目的のポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドを含む）は、マイクロチップ基質上にプレーティングまたは配列される。次いで、配列された配列は、目的の細胞または組織由来の特定のＤＮＡプローブとハイブリダイズされる。本明細書中の他の方法及び組成物と同様に、ｍＲＮＡの供給源は、対照及び患者の対象の全血から単離された全ＲＮＡである。
【００７７】
前記マイクロアレイ技術の１つの実施形態において、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅挿入物は、高密度アレイの基質に適用される。１つの実施形態において、表ＩＩＩからの５５９個のヌクレオチド配列すべてが前記基質に適用される。前記マイクロチップ上に固定されたマイクロアレイ化遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適している。目的の組織から抽出されたＲＮＡの逆転写による蛍光ヌクレオチドの取り込みにより、蛍光標識されたｃＤＮＡプローブが生成され得る。前記チップに適用された標識ｃＤＮＡプローブは、前記アレイ上のＤＮＡの各スポットに特異性をもってハイブリダイズする。非特異的に結合したプローブを除去するために、ストリンジェントな洗浄を行った後、共焦点レーザー顕微鏡法またはＣＣＤカメラのような別の検出方法によって、前記チップは、スキャンされる。各配列された要素のハイブリダイゼーションの定量化は、対応するｍＲＮＡ存在量の評価を可能にする。二色蛍光を用いて、２つのＲＮＡ源か
ら生成された別々に標識されたｃＤＮＡプローブが、前記アレイに対して対にハイブリダイズされる。このようにして、特定化した各遺伝子に対応する２つの供給源からの転写物の相対的存在量が同時に決定される。前記ハイブリダイゼーションの小型化は、多数の遺伝子の発現パターンの簡便で迅速な評価を可能にする。そのような方法は、細胞当たり数コピーで発現する稀な転写物を検出するために必要な感受性を有し、前記発現レベルの少なくとも約２倍の差異を再現可能に検出することが示されている。マイクロアレイ解析は、製造者のプロトコルにしたがって、市販の装置によって行われ得る。
【００７８】
米国特許第７，０８１，３４０号によって要約され、参照により本明細書に組み込まれる他の有用な方法は、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）及び超並列サイン配列決定（ＭＰＳＳ）を含む。簡単に説明すると、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）は、各転写物に対して、個々のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要なく、多数の遺伝子転写物の同時及び定量解析を可能にする方法である。最初に、転写物を一意的に特定するのに十分な情報を含む短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）が生成されるが、前記タグは、各転写物内の独特な位置から得られる。次いで、多くの転写産物が一緒に連結されて長い連続分子を形成し、それは配列決定され得て、複数のタグの同一性が同時に明らかにされる。転写物の任意の集団の発現パターンは、個々のタグの存在量を決定し、各タグに対応する遺伝子を同定することによって、定量的に評価され得る。詳細については、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４  ４８７（１９９５）；及びＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８８：２４３  ５１（１９９７）を参照されたく、両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【００７９】
Ｂｒｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：６３０  ６３４（２０００）（これは参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている超並列サイン配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析は、非ゲルベースのシグネチャー配列決定と、独立した５μｍの直径マイクロビーズ上の何百万ものテンプレートのｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニングを組み合わせた配列決定のアプローチである。最初に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニングによって、ＤＮＡ鋳型のマイクロビーズライブラリーが構築される。これに続いて、高密度（典型的には、３×１０6個マイクロビーズ／ｃｍ2より大きい）で、フローセルにおける鋳型を含有しているマイクロビーズの平面アレイを組み立てる。ＤＮＡ断片分離を必要としない蛍光ベースのシグネチャー配列決定法を用いて、各マイクロビーズ上のクローン化された鋳型の遊離末端が同時に解析される。この方法は、酵母ｃＤＮＡライブラリー由来の数十万個の遺伝子サイン配列を、一回の操作で同時に正確に提供することが示されている。
【００８０】
Ｅ．免疫組織化学
免疫組織化学法はまた、本明細書の方法及び組成物において使用するために記載された、有益な遺伝子の遺伝子発現産物の発現レベルを検出するのに適している。発現を検出するために、抗体または抗血清、好ましくは、ポリクローナル抗血清、及び最も好ましくは、モノクローナル抗体、または各マーカーに特異的な他のタンパク質結合リガンドが使用される。前記抗体は、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識、または西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素による抗体自体の直接標識によって検出され得る。あるいは、標識されていない一次抗体は、抗血清、ポリクローナル抗血清、または一次抗体に特異的なモノクローナル抗体を含む標識された二次抗体と共に使用される。免疫組織化学的解析のためのプロトコル及びキットは、当技術分野で周知であり、市販されている。
【００８１】
ＩＩＩ．本発明の組成物
定義された遺伝子発現プロファイルを利用する本明細書に記載の肺癌を診断する方法は、肺癌、例えばＮＳＣＬＣ対非がん性結節を診断するための単純化された診断ツールの開
発を可能にする。したがって、本明細書に記載の哺乳動物の対象における肺癌を診断するための組成物は、キットまたは試薬であり得る。例えば、組成物の一実施形態は、前記ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドもしくはリガンドまたはリガンドが固定化された基質を含む。別の実施形態において、前記組成物は、関連する５個以上のポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはリガンド、任意の検出可能なその標識、固定基質、酵素標識のための任意の基質、ならびに他の実験アイテムを含むキットである。さらに別の実施形態において、少なくとも１つのポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドまたはリガンドが検出可能な標識と結合されている。
【００８２】
１つの実施形態において、哺乳動物の対象における肺癌を診断するための組成物は、５個以上のＰＣＲプライマー−プローブセットを含む。各プライマー−プローブセットは、前記対象の血液中に見出される５個以上の有益な遺伝子の遺伝子発現産物から、異なるポリヌクレオチド配列を増幅する。これらの有益な遺伝子は、肺癌を有する対象と非がん性結節を有する対象との間で、区別可能な遺伝子発現プロファイルまたは特徴を形成するように選択される。参照遺伝子発現プロファイルの遺伝子発現プロファイルにおける前記遺伝子の発現の変化は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のような肺癌と相関する。
【００８３】
この組成物の１つの実施形態において、前記有益な遺伝子は、表Ｉに同定された遺伝子の中から選択される。この組成物の別の実施形態において、前記有益な遺伝子は、表ＩＩに同定された遺伝子の中から選択される。この遺伝子の集合は、参照対照（すなわち、非がん性結節を有する患者）の血液中の遺伝子産物発現が、同じ遺伝子産物発現に対して、前記遺伝子産物の発現が変化する（すなわち、増加または減少する）ものである。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドまたはリガンド、すなわちプローブは、前記組成物（コードセット）における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩからの５個以上の有益な遺伝子に生成される。そのような組成物の例は、表Ｉの５５９個の遺伝子の標的部分に対するプローブを含む。別の実施形態において、プローブは、前記組成物における使用するために、表Ｉからの５５９個の遺伝子すべてに生成される。別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉの最初の５３９個の遺伝子に対してプローブが生成される。別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の３個の遺伝子に対してプローブが生成される。別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の５個の遺伝子に対してプローブが生成される。別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の１０個の遺伝子に対してプローブが生成される。別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の１５個の遺伝子に対してプローブが生成される。別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の２０個の遺伝子に対してプローブが生成される。別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の２５個の遺伝子に対してプローブが生成される。さらに別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の３０個の遺伝子に対してプローブが生成される。さらに別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の３５個の遺伝子に対してプローブが生成される。さらに別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の４０個の遺伝子に対してプローブが生成される。さらに別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の４５個の遺伝子に対してプローブが生成される。さらに別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の５０個の遺伝子に対してプローブが生成される。さらに別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の６０個の遺伝子に対してプローブが生成される。さらに別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の６５個の遺伝子に対してプローブが生成される。さらに別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の７０個の遺伝子に対してプ
ローブが生成される。さらに別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の７５個の遺伝子に対してプローブが生成される。さらに別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の８０個の遺伝子に対してプローブが生成される。さらに別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の８５個の遺伝子に対してプローブが生成される。さらに別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の９０個の遺伝子に対してプローブが生成される。さらに別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の９５個の遺伝子に対してプローブが生成される。別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉまたは表ＩＩの最初の１００個の遺伝子に対してプローブが生成される。別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉの最初の２００個の遺伝子に対してプローブが生成される。さらに別の実施形態において、前記組成物における使用のために、表Ｉの３００個の遺伝子に対してプローブが生成される。さらに他の実施形態は、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子の他の組み合わせの標的部分にプローブを用いる。前記表から選択された遺伝子は、順番である必要はなく、むしろ、罹患した患者に対する参照対照間の発現の差異を明らかに示す任意の組み合わせが、そのような組成物において有用である。
【００８４】
上記組成物の１つの実施形態において、前記参照対照は、上記のような非健常対照（ＮＨＣ）である。他の実施形態において、前記参照対照は、上記の「定義」に記載された任意のクラスの対照であり得る。
【００８５】
場合により検出可能な標識と関連する、本明細書に記載の表Ｉまたは表ＩＩから選択される遺伝子に基づく組成物は、マイクロ流体カード、チップもしくはチャンバー、または上記のナノストリング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、もしくはＱ  ＰＣＲ技術と共に使用するために適合させたキットの形式で提示され得る。１つの態様において、このようなフォーマットは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ低密度アレイを用いる診断アッセイである。別の態様において、このようなフォーマットは、前記ナノストリングｎＣｏｕｎｔｅｒプラットフォームを用いる診断アッセイである。
【００８６】
上記の組成物での使用のために、前記ＰＣＲプライマー及びプローブは、好ましくは、前記遺伝子発現プロファイルから選択される増幅されるべき遺伝子（複数可）に存在するイントロン配列に基づいて設計される。例示的な標的配列は、表ＩＩＩに示される。一旦特定の遺伝子標的が選択されると、前記プライマー及びプローブ配列の設計は、当業者の範囲内である。前記プライマー及びプローブ設計、ならびに特定のプライマー及びプローブ配列のために選択される特定の方法は、これらの組成物の特徴を限定するものではない。ＤＮＡ  ＢＬＡＳＴソフトウェア、Ｒｅｐｅａｔ  Ｍａｓｋｅｒプログラム（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＧＢアッセイによる設計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｐｒｉｍｅｒ３（Ｓｔｅｖｅ  Ｒｏｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈｅｌｅｎ  Ｊ．Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ（２０００）Ｐｒｉｍｅｒ３  ｏｎ  ｔｈｅ  ＷＷＷ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｕｓｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ  ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ）などの公的に利用可能なツールを参照して、当業者に利用可能なプライマー及びプローブ設計技術の容易な説明は、米国特許第７，０８１，３４０号に要約されている。
【００８７】
一般に、本明細書に記載の前記組成物に使用される最適なＰＣＲプライマー及びプローブは、一般に、１７〜３０塩基長であり、約２０〜８０％、例えば、約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基を含む。融解温度は、５０℃と８０℃との間であり、典型的には、約５０〜７０℃が好ましい。
【００８８】
別の態様において、哺乳動物の対象における肺癌を診断するための組成物は、基質上に固定化された複数のポリヌクレオチドを含み、前記複数のゲノムプローブは、前記対象の血液において、遺伝子発現プロファイルから選択される１００個以上の有益な遺伝子の１００個以上の遺伝子発現産物にハイブリダイズし、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉから選択される遺伝子を含む。別の実施形態において、哺乳動物の対象における肺癌を診断するための組成物は、基材上に固定化された複数のポリヌクレオチドを含み、前記複数のゲノムプローブは、前記対象の血液において、遺伝子発現プロファイルから選択される１０個以上の有益な遺伝子の１０個以上の遺伝子発現産物にハイブリダイズし、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩから選択される遺伝子を含む。このタイプの組成物は、ナノストリング組成物に関して上述したのと同じ遺伝子プロファイルの認識に依存するが、ｃＤＮＡアレイの技術を用いる。前記患者対象の血液中に存在する前記遺伝子発現産物への前記組成物中の固定化ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを用いて、表Ｉまたは表ＩＩに同定された遺伝子の中から選択された有益な遺伝子の発現を定量化し、前記患者の遺伝子発現プロファイルを生成し、次いで、これを参照試料の遺伝子発現プロファイルと比較する。上記のように、前記プロファイル（すなわち、表Ｉの遺伝子またはそのサブセットのもの、表ＩＩの遺伝子またはそのサブセットのもの）の同定に応じて、この組成物は、ＮＳＣＬＣ肺癌の診断及び予後を可能にする。この場合もまた、前記ポリヌクレオチド配列の選択、前記組成物において使用されるそれらの長さ及び標識は、肺癌の診断及び予後に適した遺伝子発現プロファイルを形成し得る教示を考慮すると、当業者によって行われる日常的な決定である。
【００８９】
さらに別の態様において、本明細書に記載の方法に有用な組成物またはキットは、前記対象の血液において、遺伝子発現プロファイルから選択される１００個以上の有益な遺伝子の１００個以上の遺伝子発現産物に結合する複数のリガンドを含む。別の実施形態において、本明細書に記載の方法に有用な組成物またはキットは、前記対象の血液において、遺伝子発現プロファイルから選択される１０個以上の有益な遺伝子の１０個以上の遺伝子発現産物に結合する複数のリガンドを含む。前記遺伝子発現プロファイルは、上記の他の組成物について記載したように、表Ｉまたは表ＩＩの遺伝子を含む。この組成物は、示された表の遺伝子によって発現されるタンパク質の検出を可能にする。好ましくは、前記リガンドは、前記プロファイルにおける遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体であるが、抗体の様々な形態、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ならびにフラグメント及び成分（例えば、ＣＤＲ、一本鎖可変領域など）が抗体の代わりに使用され得ることは、当業者には明らかであろう。そのようなリガンドは、前記対象の血液との接触のための適切な基質上に固定化され、従来の様式で解析され得る。特定の実施形態において、前記リガンドは、検出可能な標識と結合している。これらの組成物はまた、参照遺伝子発現プロファイルのタンパク質から、前記遺伝子発現プロファイルにおける遺伝子によってコードされるタンパク質の変化の検出を可能にする。このような変化は、上記のＰＣＲ及びポリヌクレオチドを含有する組成物の場合と同様の方法で、肺癌と相関する。
【００９０】
診断／予後組成物の上記の形態すべてについて、前記遺伝子発現プロファイルは、１つの実施形態において、表Ｉまたは表ＩＩの有益な遺伝子の少なくとも最初の２５個を含み得る。診断／予後組成物の上記の形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩの有益な遺伝子の１０個以上を含み得る。診断／予後組成物の上記形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩの有益な遺伝子の１５個以上を含み得る。診断／予後組成物の上記の形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩの有益な遺伝子の２０個以上を含み得る。診断／予後組成物の上記の形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩの有益な遺伝子の３０個以上を含み得る。診断／予後組成物の上記形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発
現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩの有益な遺伝子の４０個以上を含み得る。診断／予後組成物の上記の形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩの有益な遺伝子の５０個以上を含み得る。診断／予後組成物の上記の形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩの有益な遺伝子の６０個以上を含み得る。診断／予後組成物の上記の形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩの有益な遺伝子の７０個以上を含み得る。診断／予後組成物の上記の形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩの有益な遺伝子の８０個以上を含み得る。診断／予後組成物の上記の形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉまたは表ＩＩの有益な遺伝子の９０個以上を含み得る。診断／予後組成物の上記の形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表ＩＩの有益な遺伝子の１００個すべてを含み得る。１つの実施形態において、診断／予後組成物の上記の形態すべてについて、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉの有益な遺伝子の少なくとも最初の１００個を含み得る。診断／予後組成物の上記の形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉの有益な遺伝子の２００個以上を含み得る。診断／予後組成物の上記の形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉの有益な遺伝子の３００個以上を含み得る。診断／予後組成物の上記の形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉの有益な遺伝子の４００個以上を含み得る。診断／予後組成物の上記の形態すべての別の実施形態において、表Ｉの有益な遺伝子の５００個以上を含み得る。診断／予後組成物の上記の形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉの有益な遺伝子の５３９個以上を含み得る。診断／予後組成物の上記の形態すべての別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉの有益な遺伝子の５５９個すべてを含み得る。
【００９１】
これらの組成物は、肺癌、例えば、Ｉ期またはＩＩ期のＮＳＣＬＣを診断するために使用され得る。さらに、これらの組成物は、病因が分かっていない肺結節を有する対象において、補足的または元の診断を提供するために有用である。
【００９２】
ＩＶ．本発明の診断方法
上記の組成物はすべて、対象における病態の血液ベースの非侵襲的評価を可能にする様々な診断ツールを提供する。胸部Ｘ線またはＣＴスキャンなどの他のスクリーニング検査と組み合わせられ得る、診断検査におけるこれらの組成物の使用は、診断精度を高め、及び／または追加検査に向かわせる。
【００９３】
したがって、１つの態様において、哺乳動物の対象において肺癌を診断するための方法が提供される。この方法は、哺乳動物、好ましくは、ヒト対象の血液中の遺伝子発現プロファイルを同定することを含む。１つの実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、肺癌における発現の増加または減少を有する１００個以上の有益な遺伝子の１００個以上の遺伝子発現産物を含む。前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉの遺伝子からの１００個以上の有益な遺伝子の選択によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、肺癌における発現の増加または減少を有する１０個以上の有益な遺伝子の１０個以上の遺伝子発現産物を含む。前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉの遺伝子からの１０個以上の有益な遺伝子の選択によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表ＩＩの遺伝子からの１０個以上の有益な遺伝子の選択によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、肺癌における発現の増加または減少を有する５個以上の有益な遺伝子の１０個以上の遺伝子発現産物を含む。前記遺伝子発現プロファイルは、表Ｉの遺伝子からの５個以上の有益な遺伝子の選択によって形成される。別の実施形態において、前記遺伝子発現プロファイルは、表ＩＩの遺伝子からの５個以上の有益な遺伝子の選択によって形成される。対象の遺伝子発現プロファイルと参照遺伝子発現プロファイルとの比較は、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）
と相関する有益な遺伝子の発現の変化の同定を可能にする。この方法は、上記の組成物のいずれかを用いて行われ得る。１つの実施形態において、前記方法は、良性結節由来のがん性腫瘍の診断を可能にする。
【００９４】
別の態様において、本明細書に記載の組成物のいずれかの使用は、対象における肺癌を診断するために提供される。
【００９５】
本明細書に記載の診断組成物及び方法は、現在の診断方法よりも様々な利点を提供する。そのような利点の中には、以下のものがある。本明細書に例示されるように、がん性腫瘍を有する対象は、良性結節を有する対象と区別される。これらの方法及び組成物は、小さな結節を有する肺クリニックに存在する患者が悪性疾患を有するかどうかの、実用的な診断問題に対する解決策を提供する。中リスクの結節を有する患者は、前記患者を非常に低い可能性のある、または非常に高い可能性のある疾患リスクのカテゴリーに移動させる非侵襲的検査から明らかに恩恵を受けるであろう。ゲノムプロファイルに基づいた正確な悪性度の推定（すなわち、所望の患者を推定することは、がんを有する確率が９０％であり、前記患者を推定することはがんの可能性がわずか５％である）は、良性疾患の手術の減少、治癒可能なステージでの早期腫瘍の除去、経過観察のＣＴスキャンの減少、及び結節の心配のための心理的な重大な負担の削減につながる。肺癌のＣＴスクリーニングに関連する追加の健康管理の現在の推定コスト、すなわち、質調整生存年につき１１６，０００ドルを控除するなど、経済的影響もまた重要である。十分な感受性及び特異性を有する非侵襲的な血液ゲノミクス試験は、悪性腫瘍の検査後の確率、したがって、その後の臨床的ケアを有意に変えるであろう。
【００９６】
既存の方法よりもこれらの方法の望ましい利点は、それらが低侵襲処置から、すなわち、血液試料を採取することによって、疾患状態を特徴付けることができることである。対照的に、遺伝子発現プロファイルからのがん腫瘍の分類のための現行の実施は、組織試料、通常腫瘍由来の試料に依存する。非常に小さな腫瘍の場合、生検は問題があり、腫瘍が分かっていなくても目に見えるものがなければ、生検からの試料は不可能である。腫瘍試料が解析される場合のように、腫瘍の精製は必要とされない。最近公開された方法は、気管支鏡検査中に、肺由来の上皮細胞をブラッシングすることに依存し、これは血液試料を採取するよりもかなり侵襲的である。血液試料は、後の解析のために前記材料が容易に調製され安定化され、メッセンジャーＲＮＡが解析される場合に重要であるというさらなる利点を有する。
【００９７】
本明細書に記載の５５９個の分類指標は、すべての試験試料にわたってＲＯＣ−ＡＵＣが０．８１であることを示した。１つの実施形態において、前記感度が約９０％である場合、特異性は約４６％である。前記結節の分類精度が、感度に関して特定の閾値を使用せずにサイズによって評価される場合、結節サイズ及び前記がん危険因子が増加すると、がんとして分類される良性結節の数が増加する。１つの実施形態において、前記遺伝子分類指標の精度は、≦８ｍｍの結節に対して約８９％である。別の実施形態において、前記遺伝子分類指標の精度は、＞８〜約≦１２ｍｍの結節に対して約７５％である。さらに別の実施形態において、前記遺伝子分類指標の精度は、＞１２〜約≦１６ｍｍの結節に対して約６８％である。別の実施形態において、前記遺伝子分類指標の精度は、＞１６ｍｍで約５３％である。以下の例を参照されたい。
【００９８】
１つの実施形態において、約＜１０ｍｍの結節に対して、特異性は約５４％であり、ＲＯＣ−ＡＵＣは約９０％の感度で０．８５である。別の実施形態において、より大きい結節、約＞１０ｍｍについて、特異性は約２４％であり、ＲＯＣ−ＡＵＣは約９０％感度で約０．７１である。
【００９９】
本明細書に記載の１００個の分類指標は、試験したすべての試料にわたって０．８２のＲＯＣ−ＡＵＣを示した。１つの実施形態において、感度が約９０％である場合、特異性は約６２％である。別の実施形態において、感度が約７９％である場合、特異性は約６８％である。１つの実施形態において、感度が約７１％である場合、特異性は約７５％である。以下の例を参照されたい。
【０１００】
これらの組成物及び方法は、肺癌のより正確な診断及び治療を可能にする。したがって、１つの実施形態において、記載される方法は、肺癌の治療を含む。治療は、新生物増殖の除去、化学療法、及び／または当技術分野で公知であるか、または本明細書に記載される他の治療であり得る。
【０１０１】
１つの実施形態において、哺乳動物の対象における肺癌の存在を診断する方法または肺癌を評価する方法が提供され、前記対象の試料における５個、１０個、１５個またはそれ以上の遺伝子であって、表Ｉの遺伝子または表ＩＩの遺伝子から選択された遺伝子の発現の変化を同定することを含む。前記対象の遺伝子発現レベルは、参照または対照における同じ遺伝子のレベルと比較され、前記参照のものから前記対象の遺伝子の発現の変化が肺癌の診断または評価と相関する。
【０１０２】
１つの実施形態において、前記診断または評価は、肺癌の診断、良性結節の診断、肺癌のステージの診断、肺癌の種類もしくは分類の診断、肺癌の再発の診断もしくは検出、肺癌の退行の診断もしくは検出、肺癌の予後、または外科的または非外科的療法に対する肺癌の応答の評価のうちの１つ以上を含む。別の実施形態において、前記変化は、前記参照もしくは対照と比較した１つ以上の選択された遺伝子のアップレギュレーション、または前記参照もしくは対照と比較した１つ以上の選択された遺伝子のダウンレギュレーションを含む。
【０１０３】
１つの実施形態において、前記方法は、前記対象における肺結節のサイズを含む。特異性及び感受性は、前記結節のサイズに基づいて変化し得る。１つの実施形態において、特異性は、約９０％の感度で約４６％である。別の実施形態において、特異性は、＜１０ｍｍの結節に対して約９０％の感度で約５４％である。さらに別の実施形態において、精度は、≦８ｍｍの結節に対して約８８％であり、＞８ｍｍ及び≦１２ｍｍの結節に対して約７５％であり、＞１２ｍｍ及び≦１６ｍｍの結節に対して約６８％であり、＞１６ｍｍの結節に対して約５３％である。
【０１０４】
別の実施形態において、前記参照または対照は、少なくとも１つの参照対象の表Ｉの試料の３つ以上の遺伝子を含む。前記参照対象は、（ａ）悪性疾患を有する喫煙者、（ｂ）非悪性疾患を有する喫煙者、（ｃ）非悪性疾患を有する元喫煙者、（ｄ）病気のない健康な非喫煙者、（ｅ）慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有する非喫煙者、（ｆ）ＣＯＰＤを有する元喫煙者、（ｇ）固形肺腫瘍除去の外科手術前の、前記固形肺腫瘍を有する対象、（ｈ）固形肺腫瘍の外科的除去後の、前記腫瘍を有する対象、（ｉ）固形肺腫瘍の治療の前の、前記固形肺腫瘍を有する対象、及び（ｊ）固形肺腫瘍の治療中または治療後の、前記固形肺腫瘍を有する対象からなる群から選択され得る。１つの実施形態において、前記参照または対照の対象（ａ）〜（ｊ）は、時間的に早い時点で同じ試験の対象である。
【０１０５】
前記試料は、本明細書に記載のものから選択される。１つの実施形態において、前記試料は、末梢血である。前記試料における核酸は、いくつかの実施形態において、前記遺伝子発現レベルの変化を同定する前に安定化される。そのような安定化は、例えば、本明細書に記載されるＰａｘ  Ｇｅｎｅシステムを用いて達成され得る。
【０１０６】
１つの実施形態において、患者における肺癌を検出する方法は、
ａ．前記患者から試料を採取すること、ならびに
ｂ．表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも１０個の遺伝子の各異なる遺伝子転写物または発現産物に対して特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドを含む組成物と前記試料とを接触させることにより、対照と比較して、前記患者試料における表Ｉまたは表ＩＩから選択される少なくとも１０個の遺伝子における発現の変化を検出すること、及び前記オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドと前記遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出することを含む。
【０１０７】
別の実施形態において、対象における肺癌を診断する方法は、
ａ．患者から血液試料を採取すること、
ｂ．表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも１００個の遺伝子の各異なる遺伝子転写物または発現産物に対して特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドを含む組成物と前記試料とを接触させることにより、対照と比較して、前記患者試料における表Ｉまたは表ＩＩから選択される少なくとも１０個の遺伝子における発現の変化を検出すること、及び前記オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドと前記遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出すること、ならびに
ｃ．前記参照の遺伝子から前記対象の遺伝子の発現の変化が検出された場合に、前記対象をがんと診断することを含む。
【０１０８】
さらに別の実施形態において、前記方法は、
ａ．患者から血液試料を採取すること、
ｂ．表Ｉまたは表ＩＩの少なくとも１０個の遺伝子の各異なる遺伝子転写物または発現産物に対して特異的なオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドを含む組成物と前記試料とを接触させることにより、対照と比較して、前記患者試料における表Ｉまたは表ＩＩから選択される少なくとも１０個の遺伝子における発現の変化を検出すること、及び前記オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはリガンドと前記遺伝子産物または発現産物との間の結合を検出すること、
ｃ．前記参照の遺伝子から前記対象の遺伝子の発現の変化が検出された場合に、前記対象をがんと診断すること、ならびに
ｄ．新生物増殖を除去することを含む。
【実施例】
【０１０９】
Ｖ．実施例
本発明を以下の実施例を参照して説明する。これらの実施例は例示のみを目的として提供され、本発明は決してこれらの実施例に限定されるものではなく、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるあらゆるすべての変形を包含すると解釈されるべきである。
【０１１０】
実施例１：患者集団−解析Ａ
本明細書に記載された遺伝子分類指標の開発のために、１５０人の対象（肺癌の診断を有する７３人、良性結節の診断を有する７７人）から血液試料及び臨床情報を収集した。患者の特徴を図１に示す。
【０１１１】
肺癌を有する患者には、新たに診断された初期の肺癌の男性及び女性の患者が含まれていた。彼らは、病気ではあるものの、適度に良好な健康状態（歩行可能）であった。前にがん、化学療法、放射線、またはがん手術を受けていた者は除外した。６ヵ月以内に肺癌の診断を受け、組織学的確認がされ、ならびに、化学療法、放射線療法、がん手術などの全身療法は、バイオマーカーレベルが治療によって変化する可能性があるため、全身療法を行わなかったことが必要である。したがって、前記がん患者の大部分は、初期のステージ（すなわち、ステージＩ及びステージＩＩ）であった。
【０１１２】
「対照」コホートは、良性肺結節（例えば、基底ガラス不透明、単一結節、肉芽腫、または過誤腫）を有する患者由来であった。これらの患者は、肺クリニックで評価されたか、または肺結節に対する胸部外科手術を受けた。手術前にすべての試料を採取した。
【０１１３】
実施例２：患者集団−解析Ｂ
さらなる血液試料及び臨床情報を、１２０人の対象（肺癌の診断を有する６０人、及び良性結節の診断を有する６０人）から収集した。肺癌を有する患者には、新たに診断された初期のステージの肺癌を有する男性及び女性の患者が含まれていた。彼らは、病気ではあるものの、適度に良好な健康状態（歩行可能）であった。前にがん、化学療法、放射線、またはがん手術を受けていた者は除外した。６ヵ月以内に肺癌の診断を受け、組織学的確認がされ、ならびに、化学療法、放射線療法、がん手術などの全身療法は、バイオマーカーレベルが治療によって変化する可能性があるため、全身療法を行わなかったことが必要である。したがって、前記がん患者の大部分は、初期のステージ（すなわち、ステージＩ及びステージＩＩ）であった。
【０１１４】
「対照」コホートは、良性肺結節（例えば、肉芽腫または過誤腫）を有する患者由来であった。これらの患者は、肺クリニックで評価されたか、または肺結節に対する胸部外科手術を受けた。手術前にすべての試料を採取した。
【０１１５】
実施例３：試料収集のプロトコル及び処理
血液試料は、組織採取技術者により前記クリニックで採取した。標準的な静脈穿刺技術により、血液試料をＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブに直接採取した。これらのチューブには、細胞内ＲＮＡを直ちに安定化させ、ｅｘ  ｖｉｖｏでの分解やＲＮＡ転写物のアップレギュレーションを最小限に抑える独自の試薬が含まれている。凍結、バッチ試料を排除し、収集後に試料を処理する緊急性を最小限に抑えることができるため、研究室の効率が大幅に向上し、コストが削減される。
【０１１６】
実施例４：ＲＮＡの精製及び質の評価
ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡは、ｍＲＮＡの精製を可能にするＱｉａｇｅｎ（商標）からの標準的な市販のキットを用いて調製される。得られたＲＮＡは、ｍＲＮＡプロファイリングに使用される。前記ＲＮＡの品質は、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて測定する。ＲＮＡインテグリティ番号が＞３の試料のみが使用された。
【０１１７】
簡潔には、以下のようにしてＲＮＡを単離する。始める前に、振盪インキュベーターをオンにし、５５℃に設定する。特に指定がない限り、このプロトコルにおけるすべてのステップは、遠心分離のステップを含み、室温（１５〜２５℃）で行う必要がある。このプロトコルは、試料が−８０℃で保存されていることを前提とする。Ｑｉａｇｅｎプロトコルにつき、最低２時間ＲＴに放置した非凍結試料も、同じ方法で処理しなければならない。
【０１１８】
ＰＡＸｇｅｎｅチューブをプラスチックラックに直立させて解凍する。分離を開始する前に、チューブを少なくとも１０回反転させ混和する。必要なすべてのチューブを準備する。各試料について、以下：番号付き１．５ｍｌエッペンドルフチューブ２本、試料情報を有するエッペンドルフチューブ１本（これは最終チューブである）、Ｌｉｌａｃ  ＰＡＸｇｅｎｅスピンカラム１本、Ｒｅｄ  ＰＡＸｇｅｎｅスピンカラム１本、及び処理チューブ５本が必要である。
【０１１９】
Ｑｉａｇｅｎ遠心分離機のスイングアウトローターを用いて、５０００×ｇで１０分間ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブを遠心分離する。（シグマ４〜１５℃遠心
分離機、ローター：シグマＮｒ．１１１４０、７／０１、５５００／分、ホルダー：シグマ１３１１５、２８６ｇ  １４／Ｄ、チューブホルダー内径：１８０１０、１２５ｇ）。注：解凍後、血球の完全な溶解を達成するために、前記血液試料をＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブで室温（１５〜２５℃）で最低２時間インキュベートする。
【０１２０】
フードの下で、漂白剤にデカントして上清を除去する。前記上清がデカントされる際、ペレットを乱さないように注意し、きれいなペーパータオルで前記チューブの縁を乾燥させる。破砕された血液を袋に入れ、次いで、感染性の廃棄物に入れ、シンクに液体部分を捨て、たくさんの水で洗い流して、デカントされた上清を廃棄する。４ｍｌのＲＮＡｓｅがない水を前記ペレットに加え、新しい二次的なヘモガードクロージャーを用いて前記チューブを閉じる。
【０１２１】
前記ペレットが目に見えるくらいに溶解するまでボルテックスする。前記チューブを再び遠心分離機ホルダーに入れてバランスがとれていることを確認し、スイングアウトローターＱｉａｇｅｎ遠心分離機を使用して５０００×ｇで１０分間遠心分離する。ボルテックス後、遠心分離前に上清中に残っている小さな破片は、その操作に影響を与えない。
【０１２２】
上清全体を取り出して捨てる。チューブを逆さにして１分間放置し、すべての上清を排出する。前記上清の不完全な除去は溶解を阻害し、溶解産物を希釈し、したがって、ＲＮＡを前記ＰＡＸｇｅｎｅ膜に結合させる条件に影響を及ぼす。
【０１２３】
３５０μｌの緩衝液ＢＭ１を加え、前記ペレットを上下にピペットで溶解する。
【０１２４】
再懸濁した試料を標識した１．５ｍｌマイクロ遠心チューブにピペットで移す。３００μｌの緩衝液ＢＭ２を添加する。次いで、４０μｌのプロテイナーゼＫを添加する。５秒間ボルテックスして混合し、エッペンドルフサーモミキサーにおける最高可能速度８００ｒｐｍの振盪インキュベーターを用いて、５５℃で１０分間インキュベートする。（サーモミキサーの代わりに振盪水浴を使用する場合は、前記インキュベーション中に２〜３分ごとに試料をすばやくボルテックスする。前記インキュベーターの隣にボルテクサーを保つ）。
【０１２５】
前記溶解物を２ｍｌの処理チューブに入れたＰＡＸｇｅｎｅシュレッダースピンカラム（ライラックチューブ）に直接ピペットで入れ、１８，５００×ｇのＴＯＭＹ  Ｍｉｃｒｏｔｗｉｎ遠心機において、２４Ｃで３分間遠心分離する。前記溶解物を前記スピンカラムに慎重に分注し、前記溶解物が完全にスピンカラムに移されていることを目視で確認する。カラム及びチューブの損傷を防ぐために、２０，０００×ｇを超えてはならない。
【０１２６】
処理チューブ内のペレットを乱さずに、フロースルー画分の上清全体を、新しい１．５ｍｌの微量遠心分離チューブに注意深く移す。前記処理チューブ内のペレットを捨てる。
【０１２７】
前記上清に７００μｌのイソプロパノール（１００％）を加える。ボルテックスで混合する。
【０１２８】
２ｍｌの処理チューブに入れたＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラム（赤色）に、６９０μｌの試料をピペットで入れ、１０，０００×ｇで１分間遠心分離する。新しい２ｍｌ処理チューブにスピンカラムを置き、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てる。
【０１２９】
残りの試料をＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラム（赤色）にピペットで入れ、１８，５００×ｇで１分間遠心分離する。新しい２ｍｌの処理チューブにスピンカラムを置き、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てる。注意深く前記試料を前記スピンカラムに
ピペットで入れ、前記試料がスピンカラムに完全に移されていることを目視で確認する。
【０１３０】
３５０μｌの緩衝液ＢＭ３をＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れる。１０，０００×ｇで１５秒間遠心分離する。新しい２ｍｌの処理チューブにスピンカラムを置き、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てる。
【０１３１】
ステップ１３のために、ＤＮＡｓｅＩインキュベーションミックスを準備する。１０μｌのＤＮＡｓｅＩストック溶液を、１．５ｍｌの微量遠心管内の７０μｌの緩衝液ＲＤＤに加える。前記チューブを軽くたたきながら混合し、短時間遠心分離して、前記チューブの側面から残留液を集める。
【０１３２】
ＤＮＡｓｅＩインキュベーションミックス（８０μｌ）をＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラム膜に直接ピペットで入れ、ベンチトップ（２０〜３０℃）に１５分間放置する。前記ＤＮＡｓｅＩインキュベーションミックスが前記膜上に直接置かれていることを確認する。前記ミックスの一部が前記スピンカラムの壁またはＯリングに塗布されて残っている場合、ＤＮＡｓｅ消化が不完全になる。
【０１３３】
３５０μｌの緩衝液ＢＭ３をＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、１８，５００×ｇで１５秒間遠心分離する。新しい２ｍｌの処理チューブにスピンカラムを置き、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てる。
【０１３４】
５００μｌの緩衝液ＢＭ４をＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラムにピペットで入れ、１０，０００×ｇで１５秒間遠心分離する。新しい２ｍｌの処理チューブにスピンカラムを置き、フロースルーを含む古い処理チューブを捨てる。
【０１３５】
別の５００μｌの緩衝液ＢＭ４をＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラムに加える。１８，５００×ｇで２分間遠心分離する。
【０１３６】
フロースルーを含む前記チューブを捨て、前記ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラムを新しい２ｍｌの処理チューブに置く。１８，５００×ｇで１分間遠心分離する。
【０１３７】
フロースルーを含む前記チューブを捨てる。前記ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラムを標識された１．５ｍｌマイクロ遠心チューブ（最終チューブ）に置き、４０μｌの緩衝液ＢＲ５をＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡスピンカラム膜に直接ピペットで入れる。１０，０００×ｇで１分間遠心分離してＲＮＡを溶出する。最大溶出効率を達成するためには、緩衝液ＢＲ５で膜全体を濡らすことが重要である。
【０１３８】
４０μｌの緩衝液ＢＲ５と同じマイクロ遠心チューブを用いて、前述の溶出ステップを繰り返す。ＲＮＡを溶出するために、２０，０００×ｇで１分間遠心分離する。
【０１３９】
６５℃で５分間、振盪をしない振盪培養器で前記溶出液をインキュベートする。インキュベーション後、直ちに氷上で冷却する。この６５℃でのインキュベーションは、下流のアプリケーションでＲＮＡを変性させる。前記インキュベーションの時間または温度を超えてはならない。
【０１４０】
ＲＮＡ試料を直ちに使用しない場合は、−２０℃または−７０℃で保存する。反復凍結及び解凍後もＲＮＡは変性したままであるため、６５℃でのインキュベーションを繰り返す必要はない。
【０１４１】
実施例５：ＲＮＡレベルの測定
肺癌を診断するために、臨床診療で使用され得るバイオマーカーシグネチャーを提供するためには、満足できる精度を維持する遺伝子の数が最も少ない遺伝子発現プロファイルは、表Ｉに同定された遺伝子を１００個以上、ならびに表ＩＩに同定された遺伝子の１０個以上を使用することにより提供される。これらの遺伝子プロファイルまたはシグネチャーは、標準的な臨床検査室で使用するのが簡単であるよりシンプルで実用的な検査を可能にする。識別遺伝子の数が十分に少ないので、これらの遺伝子発現プロファイルを使用して、ナノストリングｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）プラットフォームが開発されている。
【０１４２】
Ａ．ナノストリングＮＣＯＵＮＴＥＲ（登録商標）プラットフォーム遺伝子発現アッセイのプロトコル
上記のように、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ｍｉＲＮＡキットを用いて、全血から全ＲＮＡを単離し、ＲＮＡ品質について試料を検査した。ＲＮＡ  Ｎａｎｏチップ上のＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて、試料の健全性を確認する指標として、ＲＩＮスコア及びエレクトロフェログラム画像を使用して、試料を解析した。また、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＮＤ−１０００分光光度計）で試料を定量し、２６０／２８０及び２６０／２３０の測定値を記録し、ナノストリング適合性について評価した。Ｎａｎｏｄｒｏｐにより得られた濃度から、ヌクレアーゼを含まない水を希釈剤として、ナノストリングが提供するチューブストリップに５μＬで１００ｎｇを含むように全ＲＮＡ試料を正規化した。ナノストリングｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  コードセット、及びハイブリダイゼーション緩衝液（７０μＬハイブリダイゼーション緩衝液、１２アッセイにつき４２μＬのレポーターコードセット）の混合物の８μＬアリコート、及び２μＬのＣａｐｔｕｒｅプローブセットを各５μＬのＲＮＡ試料に加えた。サーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）において、試料を６５℃で１９時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの間、ユーザーにとって関心のある各ｍＲＮＡに特異的な蛍光バーコードを有するレポータープローブ、及びビオチン化捕捉プローブは、それらの関連標的ｍＲＮＡに結合して、標的−プローブ複合体を生成する。ハイブリダイゼーションが完了した後、次いで、試料を標準プロトコル設定（実行時間：２時間３５分）を用いて、処理するためにｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｐｒｅｐステーションに移した。Ｐｒｅｐステーションロボットは、標準プロトコルの間に、試料を洗浄して、過剰なレポーター及び捕捉プローブを除去する。試料をストレプトアビジンでコートしたカートリッジに移し、ｎＣｏｕｎｔｅｒデジタルアナライザーによるイメージングの準備のために、精製された標的−プローブ複合体を固定化した。完了すると、前記カートリッジをシールし、５５５で視野（ＦＯＶ）設定を用いて、デジタルアナライザーに置いた。蛍光顕微鏡は、標的ｍＲＮＡに関連する各固有のバーコードの生カウントを集計した。収集されたデータは、．ｃｓｖファイルに保存され、製造元の指示にしたがって、解析のためにバイオインフォマティクス施設に転送された。
【０１４３】
実施例６：バイオマーカーの選定
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、遺伝子機能の発見及び分類のための遺伝子発現データセットに適用され得る。ＳＶＭは、より密接に関連する症例とそのマージンに存在する対照とを区別するのに最も効率的であることが判明している。主に、ＳＶＭ−ＲＦＥ（４８，５４）を用いて、臨床的に定義されたクラスの患者を、臨床的に定義されたクラスの対照（喫煙者、非喫煙者、ＣＯＰＤ、肉芽腫など）と区別する遺伝子発現分類指標を開発した。ＳＶＭ−ＲＦＥは、解析される２つのクラスの間の識別に貢献することに基づいて、遺伝子を再帰的に除去する、当該分野で利用されるＳＶＭベースのモデルである。係数加重による最も低い得点の遺伝子を除去し、残りの遺伝子を再度採点し、少数の遺伝子が残るまで手順を繰り返した。この方法は、分類及び遺伝子選択の作業を行うために、いくつかの研究で用いられてきた。しかしながら、アルゴリズムパラメータ（ペナルティパラメータ、カーネル関数など）の適切な値を選択することは、しばしば性能に影響を与える可能性がある。
【０１４４】
ＳＶＭ−ＲＣＥは、ＳＶＭ−ＲＦＥのように、前記分類指標への遺伝子の相対寄与を評価するという点で、関連するＳＶＭベースのモデルである。ＳＶＭ−ＲＣＥは、個々の遺伝子の代わりに、相関遺伝子のグループの寄与を評価する。さらに、両方の方法は、各ステップで最も重要でない遺伝子を除去するが、ＳＶＭ−ＲＣＥは、スコアリングして遺伝子クラスターを除去し、一方、ＳＶＭ−ＲＦＥは、前記アルゴリズムの各ラウンドで単一または少数の遺伝子をスコアリングして除去する。
【０１４５】
ここでは、ＳＶＭ−ＲＣＥ方式について簡単に説明する。低発現遺伝子（平均発現は、２倍未満のバックグラウンド）を除去し、分位正規化を実施し、次いで、発現値の中央値が前記データセットの中央値から３シグマ以上異なる「外れ値」アレイを除去した。残りの試料は、前記アルゴリズムの１０倍交差検証の１０回の反復を使用して、ＳＶＭ−ＲＣＥに供した。前記遺伝子は、ｔ検定（訓練セットに適用）により、最終的な結果において、最高精度を生じる実験的に決定された最適値まで減少させた。これらの開始遺伝子は、Ｋ平均により、平均サイズが３〜５の遺伝子である相関遺伝子のクラスターに集められた。３回の再サンプリングを５回繰り返して、各クラスターについてＳＶＭ分類スコアリングを行い、最悪のスコアリングクラスターを排除した。試料の残りの１０％（試験セット）を用いて、生存している遺伝子プールについて正確度を決定し、上位得点の１００の遺伝子を記録した。前記手順をクラスタリングステップから２クラスターの終点まで繰り返した。最適遺伝子パネルは、最も頻繁に選択された遺伝子から始まる、最大精度を与える遺伝子の最小数であると見なされた。このパネル内の個々の遺伝子の同一性が固定されていないのは、前記順序が、所望の遺伝子が上位１００個の有益な遺伝子の中で選択された回数を反映しており、この順序はある程度の変動を受けるからである。
【０１４６】
Ａ．バイオマーカーの選択
良性結節からがん性腫瘍を識別する際に最も高い（ＳＶＭによる）スコアの遺伝子を、臨床検査のためのそれらの有用性について試験した。考慮される要因には、クラス間の発現レベルのより高い差異、及びクラス内の低い変動性が含まれる。検証のためにバイオマーカーを選択する場合、相関遺伝子の選択を回避し、ＰＣＲ及び／または免疫組織化学を含む代替技術によって、堅牢な差次的発現レベルを有する遺伝子を同定するために、異なる発現プロファイルを有する遺伝子を選択する努力がなされた。
【０１４７】
Ｂ．検証
検証の３つの方法が検討された。
【０１４８】
相互検証：データセット内のオーバーフィットを最小限に抑えるために、前記データセットをＫ個のパートにランダムに分割し、Ｋ−１個のパートをトレーニング用に、試験用に１個使用する場合、Ｋ倍のクロスバリデーション（通常Ｋ＝１０）が使用された。したがって、Ｋ＝１０の場合、前記アルゴリズムは、前記患者の９０％と前記対照の９０％のランダム選択で訓練され、次いで、残りの１０％で試験された。すべての試料が試験対象として使用され、累積された分類指標がすべての試料を使用するまで繰り返されたが、それが一部であるトレーニングセットを用いて試料が試験されなかった。無作為化の影響を軽減するために、毎回Ｋ回の折り畳みのそれぞれにおいて、患者と対照との異なる組み合わせを生成するために、Ｋ倍分離をＭ回行った。したがって、個々のデータセットについて、トレーニングセット及び試験セットの順列選択のＭ*Ｋラウンドは、遺伝子の各セットについて使用された。
【０１４９】
独立した検証：前記データの再現性、及び前記分類指標の一般性を推定するには、１つのデータセットを使用して構築された分類指標を調べ、別のデータセットを使用して分類指標のパフォーマンスを評価する必要がある。前記パフォーマンスを評価するために、元
のデータセットで開発された分類指標を使用して、２番目のセットの検証を実行した。
【０１５０】
再サンプリング（順列）：前記分類指標の疾患状態への依存性を実証するために、前記データセットからの患者及び対照を無作為に選択し（順列）、前記分類を繰り返した。ランダム化された試料を使用する分類の精度は、前記分類指標のｐ値、すなわち、前記分類指標が偶然によって選択された可能性を決定するために、開発された分類指標の精度と比較された。このようにして開発された分類指標の一般性を試験するために、それは、前記分類指標の開発に使用されなかった独立した試料セットを分類するために使用された。順列の、及び元の分類指標の相互検証精度は、独立した試験セットで比較され、新しい試料の分類における妥当性が確認された。
【０１５１】
Ｃ．分類指標のパフォーマンス
各分類指標の性能は、異なる方法によって評価され、いくつかの性能測定が、分類指標を互いに比較するために使用された。これらの測定には、精度、ＲＯＣ曲線下面積、感度、特異性、真陽性率、及び真陰性率が含まれる。所望の分類の要求された特性に基づいて、異なる性能測定が、最適な分類指標を選択するために使用されることができ、例えば、集団全体のスクリーニングに使用する分類指標は、前記疾患のわずかな（約１％）有病率を補うためによりよい特異性を必要とし、したがって、多数の偽陽性ヒットを避け、一方で、病院内の患者の診断的分類指標はより敏感であるべきである。
【０１５２】
良性結節からがん性腫瘍を診断するには、前記患者が既に高リスクであるため、特異性より高い感度が望ましい。
【０１５３】
実施例７：分類指標の試験
末梢血試料はすべてＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡ安定化チューブに集められ、ＲＮＡは製造業者にしたがって抽出された。５５９個のプローブのカスタムパネル（表ＩＩＩ）に対して、（上記のような）ナノストリングｎＣｏｕｎｔｅｒ（商標）で試料を試験した。さらに、それらを５５９個マーカーパネルの１００個プローブサブセットに対して試験した。
【０１５４】
５５９個の分類指標については、以前のマイクロアレイデータに基づいて４３２個が選択され、ナノストリング試験から１０７個のプローブが選択され、ハウスキーピング遺伝子は２０個であった。本発明者らは、５つの収集場所から得られた６１０個のＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡ試料（２７８人のがん、３３２人の対照）を解析した。ＱＣのために、試験した３６個の試料の各バッチにユニバーサルＲＮＡ標準（Ａｇｉｌｅｎｔ）を含めた。プローブ発現値は、ナノハウスリング（分類指標に含まれる）によって供給されるスパイクイン陽性及び陰性対照と同様に、２０個のハウスキーピング遺伝子を用いて正規化した。プローブカウント値についてＺスコアを計算し、多項式カーネルを用いて、Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＳＶＭ）分類指標への入力として機能させた。分類性能は、前記試料の１０倍交差検定によって評価した。
【０１５５】
Ａ．５５９個の分類指標
図２Ａ〜２Ｂに示すように、すべての試料について開発された５５９個の分類指標は、０．８１のＲＯＣ−ＡＵＣを示した（図２Ａ）。感度を９０％に設定すると、特異度は４６％になる。平衡した５５６個の試料（２７８人のがん、２７８人の結節）のセットで実施した場合、同様の性能が示される（図２Ｂ）。両方のセットについて、ＵＨＲ対照、後試料、及び他のがんを有する患者は除外した。
【０１５６】
感受性に特定の閾値を用いることなく、結節の分類精度をサイズで評価すると、結節サイズ及びがんリスク因子が増加するにつれて、がんとして分類される良性結節の数が増加することが分かる（図３）。この解析では、≦８ｍｍの結節が８８．９％の割合で正確に
分類され、＞８、≦１２ｍｍの結節に対して精度は７５％、＞１２、≦１６ｍｍの結節に対して精度は６８％、＞１６ｍｍの結節に対して精度は５３．６％である。以下の表ＩＶを参照されたい。
【０１５７】
【表４】
2019522478.tif 000089
【０１５８】
第２セットの結節を試験し、サイズ群についての前記分類指標の精度を試料群（がん対良性結節）ごとに決定した。同様に、結節サイズ及び前記がんリスク因子が増加するにつれて、がんとして分類される良性結節の数が増加する（図４Ａ〜４Ｃ）。がんが＞５ｍｍ以上の場合、ｒ＝０．９５である。すべてのサイズの結節に対して、ｒ＝０．９７である。前記図表は、病変の大きさに基づいて、がん及び結節の分類の感度及び特異性を示す。これらの数値は、下に棒グラフの形態で示されている。
【０１５９】
分類の精度は、良性結節サイズと負の相関があることから、＜１０ｍｍ（ｎ＝２４４）の結節（図５Ａ）及び９０％に固定した感度のみを用いたデータを再解析し、この場合、特異性は５４％に上昇し、ＲＯＣ−ＡＵＣは０．８５であった。より大きい結節、＞１０ｍｍ（ｎ＝８８）について、特異性は２４％まで低下し、ＲＯＣ−ＡＵＣは０．７１に低下する（図５Ｂ）。以下の表Ｖを参照されたい。
【０１６０】
【表５】
2019522478.tif 000090
【０１６１】
Ｂ．１００個のマーカーの分類指標
パネル全体で達成された性能を維持するために必要なプローブの最小数を特定するために、ナノストリングプラットフォームでＷ５５９によって解析された６３３個の試料由来のデータを再解析した。上述したように、本発明者らは、プローブ選択のためにＳＶＭ−ＲＦＥを使用した。本発明者らは、ＳＶＭ−ＲＦＥを用いたトレーニングセットについて、７５％のデータを使用し、このプロセスによって選択された上位１００個のプローブ（表ＩＩ）の性能を、前記試料の２５％からなる独立した試験セットで試験した。トレーニング及び試験セットのために、試料を以下の表ＶＩにランダムに選択した。前記試験セットで得られた精度を図６に示す。この解析では、９０％の感度で特異性は６２％であり、７９％の感度で特異性は６８％であり、また、７１％の感度で特異性は７５％であった（図６）。要約すると、ＲＯＣ−ＡＵＣは０．８２であり、０．９０の感度で０．６２の特異性を達成する。
【０１６２】
【表６】
2019522478.tif 000091
【０１６３】
優先権の出願、米国仮特許出願第６２／３５２，８６５号（２０１６年６月２１日出願）、及び本開示全体を通して引用された公的に入手可能な遺伝子配列を含む各特許、特許出願、及び刊行物は、その全体が参照により明示的に本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の実施形態を参照して開示されたが、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく、他の実施形態及び本発明の変形形態が当業者によって案出されることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのような実施形態及び同等の変形を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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