(57)【要約】  本発明は、ポリエチレングリコール修飾エンドスタチン類似体およびその適用を提供する。エンドスタチン類似体は、ヌクレオリン結合ドメインから離れたリシンでポリエチレングリコールに結合させるか、またはヌクレオリン結合ドメインおよびＮ末端のアミドゲンから離れたリシンでポリエチレングリコールに結合させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドスタチン類似体が天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列の９６番に相当する位置にリシン残基を有し、他のいずれの位置にもリシン残基はなく、かつ、前記エンドスタチン類似体はそのリシン残基でのみＰＥＧに結合している、エンドスタチン類似体−ＰＥＧ結合複合体。
【請求項２】
エンドスタチン類似体が天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列の９６番に相当する位置にリシン残基を有し、他のいずれの位置にもリシン残基はなく、かつ、前記エンドスタチン類似体はＮ末端およびそのリシン残基でＰＥＧに結合している、エンドスタチン類似体−ＰＥＧ結合複合体。
【請求項３】
エンドスタチン類似体が天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列の７６、１０７、１１８および１８４番のリシン残基の突然変異によって形成される、請求項１または２に記載の結合複合体。
【請求項４】
エンドスタチン類似体が天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列の９６番に相当する位置にリシン残基を有し、他のいずれの位置にもリシン残基はなく、かつ、前記エンドスタチン類似体は、そのＮ末端にアミノ酸配列が挿入されたエンドスタチンの機能的変異体であり、かつ、前記エンドスタチン類似体はそのリシン残基でのみＰＥＧに結合している、エンドスタチン類似体−ＰＥＧ結合複合体。
【請求項５】
エンドスタチン類似体が天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列の９６番に相当する位置にリシン残基を有し、他のいずれの位置にもリシン残基はなく、かつ、前記エンドスタチン類似体はそのＮ末端にアミノ酸配列が挿入され、かつ、前記エンドスタチン類似体はＮ末端およびリシン残基でＰＥＧに結合している、エンドスタチン類似体−ＰＥＧ結合複合体。
【請求項６】
前記エンドスタチン類似体が天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列の７６、１０７、１１８および１８４番のリシン残基の突然変異、ならびにそのＮ末端のメチオニンＭとヒスチジンＨの間へのＧＧＳＨＨＨＨＨの挿入によって形成される、請求項４または５に記載の結合複合体。
【請求項７】
Ｎ末端に挿入されたアミノ酸配列がＭＧＧＳＨＨＨＨＨである、請求項１、２、４または５に記載の結合複合体。
【請求項８】
天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列の７６、１０７、１１８および１８４番のリシン残基がそれぞれＸ１、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５に変異しており、ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４またはＸ５は独立してリシン以外の任意の天然アミノ酸である、請求項３または６に記載の結合複合体。
【請求項９】
Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４またはＸ５が独立して水溶性アミノ酸である、請求項８に記載の結合複合体。
【請求項１０】
Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４またはＸ５が独立してアルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸のいずれか１つである、請求項９に記載の結合複合体。
【請求項１１】
Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４またはＸ５が独立してアルギニンおよびヒスチジンのいずれか１つである、請求項１０に記載の結合複合体。
【請求項１２】
Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４またはＸ５がアルギニンである、請求項１１に記載の結合複合体。
【請求項１３】
エンドスタチン類似体が共有結合によってＰＥＧに結合している、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項１４】
前記ＰＥＧが５，０００〜４０，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項１５】
前記ＰＥＧが２０，０００〜４０，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項１４に記載の結合複合体。
【請求項１６】
前記ＰＥＧがモノメトキシポリエチレングリコール、モノグルコースポリエチレングリコールまたはモノガラクトースポリエチレングリコールである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項１７】
前記ＰＥＧがモノメトキシポリエチレングリコールである、請求項１６に記載の結合複合体。
【請求項１８】
前記ＰＥＧが直鎖型または分岐型である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項１９】
ＰＥＧとエンドスタチン類似体のアミノ基との間のカップリング反応がモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）、モノメトキシポリエチレングリコールブチルアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルカルボナート（ｍＰＥＧ−ＳＣ）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルアセタート（ｍＰＥＧ−ＳＣＭ）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルブチラート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルα−メチルブチラート（ｍＰＥＧ−ＳＭＡ）、モノメトキシポリエチレングリコールＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）を使用することにより行われる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の結合複合体。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の結合複合体と所望により薬学上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の結合複合体または請求項２０に記載の医薬組成物を患者に投与することを含んでなる、血管新生またはリンパ管新生により引き起こされる疾患の治療方法。
【請求項２２】
血管新生またはリンパ管新生により引き起こされる疾患の治療のための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の結合複合体または請求項２０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２３】
イン・ビボまたはイン・ビトロにおいて血管新生またはリンパ管新生を阻害するための医薬の製造のための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の結合複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な組換えタンパク質薬に関する。特に、本発明は、ペグ化エンドスタチン類似体およびそれらの適用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、元の血管への新たな毛細血管の形成を指す。腫瘍の増殖および遊走は新たな血管の形成に依存し、癌治療の標的として腫瘍内の微小血管内皮細胞を使用することにより、腫瘍の治療に治療的手段が提供される(Folkman J. N Engl J Med 1971; 285:1182-1186)。
【０００３】
エンドスタチンは、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端に由来する分子量２０ｋＤａの酵素消化産物である。１９９７年にハーバード大学のユダ・フォークマン教授らは、血管内皮腫細胞の培養液中でこのタンパク質を発見し、このタンパク質は、血管内皮細胞の増殖、遊走およびｉｎ  ｖｉｖｏ（イン・ビボ）血管新生を阻害する活性を有していた。さらなる実験によれば、組換えエンドスタチンは、マウスにおいて様々な腫瘍の増殖および遊走を阻害することができ、腫瘍を完全に治癒させることさえ可能であり、しかも薬剤耐性を生じなかったことが見出された。エンドスタチンがどのように働くかに関する機序は、血管内皮細胞の増殖を阻害することによって腫瘍組織周囲の新たな血管の形成を阻害し、これが腫瘍組織に増殖に必要とされる多量の栄養素および酸素を得ることを不能とし、最終的に増殖の停止または壊死に至るというものである(Folkman J. et al. Cell 1997; 88:277-285; Folkman J.et al. Nature 1997; 390: 404-407)。２０１０年、精華大学のＬｕｏ  Ｙｏｎｇｚｈａｎｇ教授らは、エンドスタチンがまた腫瘍関連のリンパ管新生を有意に阻害し得ることも見出した(Yongzhang Luo. et al., Journal of Pathology 2010; 222: 249-260; Yongzhang Luo. Front. Med. 2011, 5: 336-340)。遺伝子工学によって製造された組換えヒトエンドスタチンは腫瘍治療の薬物として使用することができ、その臨床試験は、組換えヒトエンドスタチンが腫瘍増殖を効果的に阻害し得ることを示す。中国では、主要適応として非小細胞肺癌を対象とした臨床試験において腫瘍に対するその有望な治療効果が示された。
【０００４】
長年、腫瘍治療は主として小分子化合物療法（化学療法）および放射線療法に依存している。どちらの方法も極めて有効であるが、いくつかの有害な副作用もある。これとは対照的に、タンパク質薬は有害な副作用が少なく、薬剤耐性が生じないものの、消化管投与の使用は重大な初回通過効果をもたらすと思われる。イン・ビボにおいて最高の活性を達成し、バイオアベイラビリティを改善し、イン・ビボにおける薬物分解を軽減するためには、タンパク質薬は通常、静脈内注射または皮下注射によって投与される。分子量の小さいタンパク質では、静脈内投与後のそれらの半減期は一般に短い。重要な理由の一つは、小分子タンパク質は腎臓の濾過によって急速に除去されるということである。血中の動水半径がアルブミンよりも大きいタンパク質、または分子量が６６，０００ダルトン（６６ｋＤａ）よりも大きいタンパク質は一般に、循環系に安定に保持され得るが、小分子タンパク質薬は糸球体濾過によって急速に除去される。従って、血中で有効治療濃度を維持するためには、患者は頻繁に注射または点滴を受ける必要がある。この治療手段は治療目的を達成することはできるが、患者に著しい不便と痛みをもたらし、薬物治療に関する患者のコンプライアンスにも重大な影響を与え、投薬コストも引き上げる。さらに、いくつかの薬物の長期にわたる頻用により免疫応答などのいくつかの副作用が発現する可能性もある。
【０００５】
タンパク質薬としてのエンドスタチンもまた、イン・ビボにおいて短い半減期と高いクリアランスという欠点を持つ。現在のところ、投薬の主要な臨床的手段は、有効血中濃度を維持するための頻繁な投与（一般に毎日の投与）であり、長期投薬が必要とされ、これは患者に大きな精神的および経済的負担をかける。本発明の目的は、前記タンパク質がイン・ビボにおいてより高い安定性およびより長い半減期、より高い治療効果を有し、それにより、投与頻度の低減、投薬コストの低減、および患者の経済的負担の軽減という目的を達成するようにそのタンパク質のイン・ビボ代謝の特徴を改善することである。
【０００６】
高分子量ポリマーによるタンパク質の修飾は、半減期などの動態特性、免疫学的特徴および毒物学的特性を変更および制御する一般的な方法である。それらの中でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、最も広く使用されている両親媒性の高分子量ポリマーである。ＰＥＧは、良好な溶解度、良好な生体適合性、非毒性および非免疫原性の特徴を有し、米国のＦＤＡおよび中国のＳＦＤＡを含め、多くの国および地域で薬物管理機関によって承認されているので、薬物製造に使用可能なポリマーである。タンパク質をＰＥＧなどの親水性ポリマーと結合させると、タンパク質分解が低減され、タンパク質の安定性が高まり、非特異的吸着および抗原性を低減することができ、結合生成物の動水半径が糸球体濾過の下限に達した際に、腎クリアランス効率は大幅に低下する可能性があり、これはイン・ビボにおいてタンパク質薬の半減期を延長するための効果的な方法である(Gianfranco Pasut et al. Advanced Drug Delivery Reviews 60 (2008) 69-78; F.M. Veronese et al. Milestones in Drug Therapy 2009, 11-31)。ＰＥＧ修飾技術の開発をもってすれば、タンパク質分子上の種々の基が、様々な要求を満たすようにＰＥＧで修飾され得る。例えば、タンパク質またはポリペプチドは、多部位でのタンパク質修飾を達成するために、Ｎ末端α−アミノ基またはリシン側鎖ε−アミノ基において、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジル活性エステル（例えば、ｍＰＥＧ−ＳＣ、ｍＰＥＧ−ＳＣＭ、ｍＰＥＧ−ＳＰＡ、およびｍＰＥＧ−ＮＨＳ）の修飾剤で無作為に修飾することができる。モノメトキシポリエチレングリコールアルデヒド（ｍＰＥＧ−アルデヒド）は、弱酸性条件下でタンパク質またはポリペプチドのＮ末端α−アミノ基と特異的に反応して不安定なシッフ塩基を形成し、これはシアノ水素化ホウ素ナトリウムによりさらに還元されて安定な第二級アミンを生成し、それにより、Ｎ末端における部位指定修飾を達成する。タンパク質またはポリペプチドの遊離システインは、モノメトキシポリエチレングリコールマレイミド（例えば、ｍＰＥＧ−ＭＡＬおよびｍＰＥＧ２−ＭＡＬ）の修飾剤で選択的に修飾される。これまでに、ＰＥＧ修飾技術は、様々なタンパク質に上手く適用されてきた。ＦＤＡに承認されている市販のＰＥＧ修飾タンパク質薬としては、ＰＥＧ−アデノシンデイミナーゼ（１９９０）、ＰＥＧ−アスパラギナーゼ（１９９４）、ＰＥＧ−α２ｂインターフェロン（２００１）、ＰＥＧ−顆粒球コロニー刺激因子（２００２）、ＰＥＧ−α２ａインターフェロン（２００２）、ＰＥＧ−α２ａインターフェロン−リバビリン混合製剤（２００４）、ＰＥＧ−エリスロポエチン（２００７）、ＰＥＧ−ＴＮＦα抗体（２００８）、ＰＥＧ−α２ｂインターフェロンリバビリン混合製剤（２００８）、ＰＥＧ−尿酸オキシダーゼ（２０１０）が挙げられる。臨床研究下の代表的なＰＥＧ修飾タンパク質薬としては、ＰＥＧ−アルギニンデイミナーゼ（Ｐｏｌａｒｉｓ  Ｇｒｏｕｐ、第ＩＩＩ相）、ＰＥＧ−成長ホルモン（Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ  Ｇｅｎｓｃｉ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．、第ＩＩＩ相）、ＰＥＧ−β１ａインターフェロン（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ、第ＩＩＩ相）などが挙げられる。
【０００７】
薬物の半減期を延長するようにタンパク質を修飾するために使用可能なＰＥＧに加え、例えば、デキストラン、ポリスクロース、デンプン、ポリアラニン、シュウ酸とマロン酸の共重合体、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−アルコキシ−１，３−プロパンジオール）、エチレンとマレイン酸ヒドラジドの共重合体、ポリシアル酸、シクロデキストリンなどの他のポリマー修飾剤も使用可能である。
【０００８】
本発明者らは、カップリングＰＥＧをヌクレオリン結合ドメインから離れたリシンでエンドスタチンと結合させることによってタンパク質活性が有意に向上し得ることを発見し、よって、本発明は、ヌクレオリン結合ドメインから離れたリシンでＰＥＧに結合され、それにより、腫瘍細胞の遊走を阻害するその生物活性を向上されたＰＥＧ修飾エンドスタチン類似体を提供する。本発明によるＰＥＧ修飾エンドスタチン類似体は、イン・ビボで非修飾エンドスタチンよりも高い安定性および長い半減期を有し、血管新生を阻害する活性が有意に向上している。
【０００９】
第１の側面において、本発明は、エンドスタチン類似体が天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列の９６番に相当する位置にリシン残基を有し、他のいずれの位置にもリシン残基はなく、かつ、前記エンドスタチン類似体はそのリシン残基でのみＰＥＧに結合している、エンドスタチン類似体−ＰＥＧ結合複合体を提供する。
【００１０】
第２の側面において、本発明は、エンドスタチン類似体が天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列の９６番に相当する位置にリシン残基を有し、他のいずれの位置にもリシン残基はなく、かつ、前記エンドスタチン類似体はＮ末端とリシン残基でＰＥＧに結合している、エンドスタチン類似体−ＰＥＧ結合複合体を提供する。
【００１１】
好ましい態様では、第１の側面および第２の側面による複合体において、エンドスタチン類似体は、天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列の７６、１０７、１１８および１８４番のリシン残基の突然変異により形成される。特定の態様では、エンドスタチン類似体の配列は、配列番号３で示される。
【００１２】
第３の側面において、本発明は、エンドスタチン類似体が天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列の９６番に相当する位置にリシン残基を有し、他のいずれの位置にもリシン残基はなく、かつ、前記エンドスタチン類似体はそのＮ末端にアミノ酸配列が挿入され、かつ、前記エンドスタチン類似体はそのリシン残基でのみＰＥＧに結合している、エンドスタチン類似体−ＰＥＧ結合複合体を提供する。
【００１３】
第４の側面において、本発明は、エンドスタチン類似体が天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列の９６番に相当する位置にリシン残基を有し、他のいずれの位置にもリシン残基はなく、かつ、前記エンドスタチン類似体はそのＮ末端にアミノ酸配列が挿入され、かつ、前記エンドスタチン類似体はＮ末端とリシン残基でＰＥＧに結合している、エンドスタチン類似体−ＰＥＧ結合複合体を提供する。
【００１４】
好ましい態様では、第３の側面および第４の側面による複合体において、エンドスタチン類似体は、天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列の７６、１０７、１１８および１８４番のリシン残基の突然変異、ならびにそのＮ末端におけるアミノ酸配列の挿入によって形成される。より好ましい態様では、挿入されるアミノ酸配列は、Ｎ末端においてメチオニンＭとヒスチジンＨの間に挿入されるＧＧＳＨＨＨＨＨである。より好ましい態様では、エンドスタチン類似体の配列は、配列番号８で示される。
【００１５】
好ましい態様では、本発明による結合複合体のエンドスタチン類似体において、天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列の７６、１０７、１１８および１８４番のリシン残基は、それぞれＸ１、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５に変異され、ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４またはＸ５は独立して、リシン以外の任意の天然アミノ酸である。Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４またはＸ５は独立して好ましくは水溶性アミノ酸であり、さらに好ましくは、荷電アミノ酸：アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸のいずれか１つであり、さらに好ましくは、正荷電アミノ酸：アルギニンおよびヒスチジンのいずれか１つであり、最も好ましくはアルギニンである。
【００１６】
好ましい態様では、本発明の複合体において、エンドスタチン類似体のＮ末端に挿入されるアミノ酸配列は、ＭＧＧＳＨＨＨＨＨである。
【００１７】
好ましい態様では、本発明による複合体において、エンドスタチン類似体は、共有結合によってＰＥＧに結合している。
【００１８】
好ましい態様では、ＰＥＧは、５，０００〜４０，０００ダルトンの平均分子量を有する。
【００１９】
より好ましい態様では、ＰＥＧは、２０，０００〜４０，０００ダルトンの平均分子量を有する。
【００２０】
好ましい態様では、ＰＥＧは、モノメトキシポリエチレングリコール、モノグルコースポリエチレングリコールまたはモノガラクトースポリエチレングリコールである。
【００２１】
好ましい態様では、ＰＥＧは、直鎖型または分岐型である。
【００２２】
好ましい態様では、ＰＥＧは、モノメトキシポリエチレングリコールである。
【００２３】
いくつかの態様では、ＰＥＧは、アミノ基でエンドスタチン類似体に結合している。
【００２４】
いくつかの態様では、ＰＥＧは、リシン側鎖ε−アミノ基でエンドスタチン類似体に結合している。
【００２５】
いくつかの態様では、ＰＥＧは、Ｎ末端α−アミノ基およびリシン残基のε−アミノ基でエンドスタチン類似体に結合している。
【００２６】
より好ましい態様では、ＰＥＧとエンドスタチン類似体のアミノ基との間のカップリング反応は、モノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）、モノメトキシポリエチレングリコールブチルアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルカルボナート（ｍＰＥＧ−ＳＣ）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルアセタート（ｍＰＥＧ−ＳＣＭ）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルブチラート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルα−メチルブチラート（ｍＰＥＧ−ＳＭＡ）、モノメトキシポリエチレングリコールＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）を使用することによって行われる。
【００２７】
本発明はさらに、本発明によるエンドスタチン類似体−ＰＥＧ結合複合体と薬学上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００２８】
本発明はさらに、患者に本発明によるエンドスタチン類似体−ＰＥＧ結合複合体または医薬組成物を投与すること含んでなる、血管新生またはリンパ管新生により引き起こされる疾患の治療方法を提供する。
【００２９】
本発明はさらに、血管新生またはリンパ管新生により引き起こされる疾患の治療のための、本発明によるエンドスタチン類似体−ＰＥＧ結合複合体または医薬組成物の使用を提供する。
【００３０】
好ましい態様では、血管新生またはリンパ管新生により引き起こされる疾患は腫瘍である。
【００３１】
本発明はさらに、イン・ビボまたはイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において血管新生またはリンパ管新生を阻害するための医薬の製造のための、本発明による結合複合体の使用も提供する。
【００３２】
本発明による複合体は、イン・ビボにおいて血管新生またはリンパ管新生を阻害するために使用され、その半減期はエンドスタチンに比べて有意に延長され、その阻害率は同じ投与条件下でエンドスタチンに比べて有意に促進される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１：エンドスタチンがＮ末端において２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＡＬＤで単一修飾された修飾サンプル、およびクロマトグラフィー精製後の次サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析の結果。レーン１は、上から下へ１１６、６６、４５、３０、２５、１８．４、１４．４ｋＤａの低分子量標準を表し、レーン２は、エンドスタチンが２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＡＬＤで修飾されたサンプルを表し、レーン３〜７は、それぞれクロマトグラフィー精製において１００、１５０、２００、３５０および５００ｍＭ  ＮａＣｌでの溶出により得られた画分１、２、３、４および５を表し、ここで、レーン５の２００ｍＭ  ＮａＣｌ溶出画分（画分３）は、Ｎ末端単一修飾生成物の画分である。
【図２】図２：エンドスタチンＫ１類似体がＮ末端において２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＡＬＤで単一修飾された修飾サンプル、およびクロマトグラフィー精製後の次サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析結果。レーン１は、上から下へ１１６、６６、４５、３０、２５、１８．４、１４．４ｋＤａの低分子量標準を表し、レーン２は、エンドスタチンＫ１類似体が２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＡＬＤで修飾されたサンプルを表し、レーン３〜７は、それぞれクロマトグラフィー精製において１００、１５０、１５０、３５０および５００ｍＭ  ＮａＣｌでの溶出により得られた画分１、２、３、４および５を表し、ここで、レーン４、５の１５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶出画分（画分２、３）は、Ｎ末端において２０ｋＤａのＰＥＧで単一修飾されたエンドスタチンＫ１類似体である。
【図３】図３：エンドスタチンＫ１類似体がリシン側鎖アミノ基とＮ末端アミノ基において２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＳＰＡで二重修飾された修飾サンプル、および精製サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析の結果。レーン１は、上から下へ１１６、６６、４５、３０、２５、１８．４、１４．４ｋＤａの低分子量標準を表し、レーン２は、エンドスタチンが２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＳＰＡで修飾されたサンプルを表し、レーン３〜８はそれぞれ、クロマトグラフィー精製において２５、５０、７５、１００、２００および５００ｍＭ  ＮａＣｌでの溶出により得られた画分１、２、３、４、５および６を表し、ここで、レーン６の１００ｍＭ  ＮａＣｌ溶出画分（画分４）は、Ｋ１類似体が二重修飾された生成物の画分である。
【図４】図４：エンドスタチンＥＳＣ類似体がチオール基において２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＭＡＬで修飾された修飾サンプル、およびクロマトグラフィー精製後の次サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析の結果。レーン１は、エンドスタチンＥＳＣ類似体が２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＭＡＬで修飾されたサンプルを表し、レーン２〜５は、クロマトグラフィー精製において１００、１５０、２００および５００ｍＭ  ＮａＣｌでの溶出により得られた画分を表し、レーン６は、上から下へ１１６、６６、４５、３０、２５、１８．４、１４．４ｋＤａの低分子量標準を表し、ここで、レーン４の２００ｍＭ  ＮａＣｌ溶出画分（画分３）は、ＥＳＣ類似体がチオール基において単一修飾された生成物の画分である。
【図５】図５：エンドスタチンＫ１類似体がリシン側鎖アミノ基において２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＡＬＤで修飾された修飾サンプル、およびクロマトグラフィー精製後の次サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動分析の結果。レーン１は、上から下へ１１６、６６、４５、３０、２５、１８．４、１４．４ｋＤａの低分子量標準を表し、レーン２は、エンドスタチンが２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＡＬＤで修飾されたサンプルを表し、レーン３〜７は、クロマトグラフィー精製において５０、１００、１２５、２００および５００ｍＭ  ＮａＣｌでの溶出により得られた画分を表し、ここで、レーン４、５は、２０ｋＤａのＰＥＧで単一修飾されたエンドスタチン類似体を表し、これらの２つのサンプルの修飾部位を分析することによって、レーン４のサンプルは、Ｎ末端におけるＰＥＧでの単一修飾から得られた生成物とリシン側鎖アミノ基における単一修飾から得られた少量の生成物であり、レーン５のサンプルは、エンドスタチンＫ１類似体がリシン側鎖アミノ基において単一修飾された生成物であることが確認される。
【図６】図６： ヒトエンドスタチンの三次構造図であり、ヒトエンドスタチンタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および７６番のリシン残基Ｋ１、９６番のリシン残基Ｋ２、１０７番のリシン残基Ｋ３、１１８番のリシン残基Ｋ４、ならびに受容体ヌクレオリンに対するタンパク質の結合ドメインが示される。
【図７】図７：ヒトエンドスタチンの三次構造図であり、ヒトエンドスタチンタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、７６番のリシン残基Ｋ１、９６番のリシン残基Ｋ２、１０７番のリシン残基Ｋ３、１１８番のリシン残基Ｋ４、および１２７番のアスパラギン残基が示される。
【図８】図８：本発明に関わるエンドスタチン類似体の配列。
【発明の概要】
【００３４】
用語「エンドスタチン（ＥＳ）」は、本明細書で使用する場合、限定されるものではないが、例えば配列番号１の配列を有する天然エンドスタチン、好ましくは、ヒトエンドスタチンを指し得、例えば、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコなどの他の哺乳動物由来の天然エンドスタチンであってもよい。「エンドスタチン」はまた、エンドスタチンの機能的変異体、例えば、操作された機能的変異体も指し得、これらは１以上のアミノ酸の置換、欠失または付加によって天然エンドスタチンとは異なり、実質的に同じ生物学的機能、例えば、血管内皮細胞のイン・ビボ増殖、遊走および血管新生を阻害する活性を有する。「エンドスタチン」はまた、天然エンドスタチンまたはその機能的変異体の誘導体または修飾生成物、例えば、ＰＥＧ修飾生成物も指し得る。
【００３５】
用語「機能的変異体」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸配列に１以上の（例えば、１〜５、１〜１０または１〜１５、特に、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２またはさらにそれを超える）アミノ酸の置換、欠失または付加を含んでなるエンドスタチンの突然変異体を含み、これらの突然変異体は、血管内皮細胞のイン・ビボ増殖、遊走および血管新生の阻害においてエンドスタチンと類似の生物活性を有する。エンドスタチンの「機能的変異体」の生物活性は、天然エンドスタチン、例えば、天然ヒトエンドスタチンの生物活性の例えば、３０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、または９０％以上であり得る。「機能的変異体」は、天然突然変異体であり得、または人工突然変異体、例えば、部位特異的突然変異誘発によって得られる突然変異体、もしくは遺伝子組換え法によって作出される突然変異体であってもよい。
【００３６】
「機能的変異体」の生物活性は、当技術分野で周知のエンドスタチン活性を検出するための方法によって決定することができる。ＨＭＥＣ遊走に関する機能的変異体の阻害率を分析するために、例えば、ＨＭＥＣ（ヒト乳房上皮細胞）を選択することができ、遊走アッセイ（Ｔｒａｎｗｅｌｌ  Ａｓｓａｙ）が使用され、タンパク質活性を表すために細胞の数が計数される（Luo yongzhang et al., Endostatin inhibits tumour lymphangiogenesis and lymphatic metastasis via cell surface nucleolin on lymphangiogenic endothelial cells, J Pathol 2010; 222: 249-260参照）。
【００３７】
本発明において、「エンドスタチン類似体」および「エンドスタチン機能的変異体」は、互換的に使用可能である。いくつかの態様では、本発明による「エンドスタチン類似体」は、ＰＥＧがリシン残基でのみエンドスタチン類似体と結合され得るように、または他のアミノ酸残基と結合せずにＮ末端とリシン残基で同時に結合され得るように、天然ヒトエンドスタチン（例えば、配列番号１）の９６番に相当する位置にリシン残基を有し、他のいずれの位置にもリシン残基はない。よって、得られる結合複合体は、天然ヒトエンドスタチンまたは天然ヒトエンドスタチンがＮ末端で単一のＰＥＧに結合している複合体に比べて、イン・ビボにおいてより高い安定性およびより長い半減期を有し、かつ、その血管新生阻害活性が有意に向上している。
【００３８】
本発明によるエンドスタチン類似体は、天然エンドスタチン（例えば、天然ヒトエンドスタチンまたは天然哺乳動物エンドスタチン）を操作することによって得ることができ、特に、天然ヒトエンドスタチン（例えば、配列番号１）において、７６、１０７、１１８および１８４番のリシン残基を変異させ、９６番のリシン残基のみを保存することによって得られたエンドスタチン類似体、または天然の他の哺乳動物のエンドスタチンにおいて、天然ヒトエンドスタチン（例えば、配列番号１）の７６、１０７、１１８、１８４番に相当する位置のリシン残基を変異させ、天然ヒトエンドスタチン（例えば、配列番号１）の９６番に相当する位置のリシン残基のみを保存することによって得られたエンドスタチン類似体である。本発明によるエンドスタチン類似体はまた、既知のように、天然のエンドスタチンまたはエンドスタチンの人工的に合成された機能的変異体を操作することによって得ることもでき、特に、エンドスタチンの機能的変異体が天然エンドスタチンの９６番に相当する位置にリシン残基を有する場合には、そのリシン残基は変化させずに維持し、エンドスタチンの機能的変異体の他の総てのリシン残基は変異させ、エンドスタチンの機能的変異体が天然エンドスタチンの９６番に相当する位置にリシン残基を有さない場合には、その位置のアミノ酸はリシン残基に変異させ、エンドスタチンの機能的変異体の他の総てのリシン残基を変異させる。
【００３９】
本発明によるエンドスタチン類似体を得るために操作することができるエンドスタチンの機能的変異体としては、ヒトＥＳが大腸菌(E. coli)で組換え発現される場合には、最初のアミノ酸Ｍのランダム欠失により作出されるＥＳ変異体が含まれる。本発明によるエンドスタチン類似体を得るために操作することができるエンドスタチンの機能的変異体にはまた、ＥＳが酵母で組換え発現される場合には、Ｎ末端のランダム切断によって作出される、Ｎ末端において４つのアミノ酸が欠失されたＥＳ変異体も含まれる。本発明によるエンドスタチン類似体を得るために操作することができるエンドスタチンの機能的変異体としては、可溶型発現を促進し、精製を容易にするという利便性のために、ＥＳのＮ末端に９つの付加的アミノ酸（ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ）を付加することによって得られるＥＳ変異体であるＹＨ−１６が含まれる（引用することによりその全内容が本明細書の一部とされるFu Y et al. IUBMB Life 2009; 61: 613-626; Wang J et al. Zhongguo fei ai za zhi 2005; 8: 283-290; Han B et al. J Thorac Oncol 2011; 6(6): 1104-1109参照）。本発明によるエンドスタチン類似体を得るために操作することができるエンドスタチンの機能的変異体にはまた、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１２／０８１２１０に開示されているエンドスタチン突然変異体、例えば、ＥＳ００６、ＥＳ００８、ＥＳ０１１、Ｓ０２、Ｓ０９、Ｚ００６、Ｚ００８、ＺＮ１なども含まれる（引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる）。本発明によるエンドスタチン類似体を得るために操作することができるエンドスタチンの機能的変異体にはさらに、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１６／０７０７９８に開示されているエンドスタチン突然変異体、例えば、００３、００７、Ｚ１０１、００９、Ｓ０３、３６、２４９、３８１、５７、１１４、１２４、１２５、１６０、１６３、１１９も含まれる（引用することによりその全内容が本明細書の一部とされる）。
【００４０】
本発明に記載されるような「天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列に相当する位置」という表現は、当技術分野で周知のソフトウェアまたはアルゴリズムを使用することにより、エンドスタチンの機能的変異体と天然エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列をアラインした後の、エンドスタチンの機能的変異体における、配列番号１の対応するアミノ酸残基に相当する位置を指す。ソフトウェアまたはアルゴリズムとしては、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡが含まれる。
【００４１】
用語「ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）」は、本発明で使用される場合、モノメトキシポリエチレングリコール、モノグルコースポリエチレングリコールまたはモノガラクトースポリエチレングリコールであり得る。使用されるＰＥＧは直鎖型または分岐型であってよく、例えば、約５ｋＤ〜約５０ｋＤ、約２０ｋＤ〜約４０ｋＤまたは例えば約２０ｋＤの分子量を有してよい。
【００４２】
用語「ＰＥＧ修飾」または「ＰＥＧ結合」は、本明細書で使用する場合、カップリングＰＥＧ修飾剤分子をタンパク質分子に化学的に結合させることを指し得、カップリング反応に関与するＰＥＧ修飾剤の基は、その活性化の際に導入される活性基であり、タンパク質のこの基は主としてその中の遊離アミノ基、またはチオール基などであり、好ましくはアミノ基である。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との結合は、イン・ビボにおける結合複合体の半減期を延長し、プロテアーゼによる分解を回避し、または溶解度を高めることができる。タンパク質をＰＥＧで修飾するための方法は当業者に周知である。
【００４３】
用語「ＰＥＧ修飾剤」としては、限定されるものではないが、モノメトキシＰＥＧ修飾剤が挙げられ、これは、一末端のＰＥＧ分子のヒドロキシル基をメトキシ基で遮断し、他の末端のヒドロキシル基を好適な活性化法で活性化することによって得られる活性化されたＰＥＧである。ヒドロキシル基自体の反応性は極めて低いことから、活性化されたＰＥＧ分子の反応性は大幅に改善され、「ＰＥＧ修飾剤」と呼ばれる。活性化基の選択、活性化に関する機構、および活性化により得られるＰＥＧ修飾剤の修飾反応に関する機構については、それらは当技術分野で周知であり、多くの文献で報告されている。ＰＥＧ修飾剤は市販されている。有用なＰＥＧ修飾剤としては、限定されるものではないが、モノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）、モノメトキシポリエチレングリコールブチルアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＢｕｔｙｒＡＬＤ）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルカルボナート（ｍＰＥＧ−ＳＣ）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルアセタート（ｍＰＥＧ−ＳＣＭ）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナート（ｍＰＥＧ−ＳＰＡ）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルブチラート（ｍＰＥＧ−ＳＢＡ）、モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルα−メチルブチラート（ｍＰＥＧ−ＳＭＡ）、モノメトキシポリエチレングリコールＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ）が含まれる。
【００４４】
本発明では、ＰＥＧは、アミノ基でエンドスタチン類似体に結合され、例えば、リシン側鎖ε−アミノ基でエンドスタチン類似体に結合され、またはＮ末端α−アミノ基とリシン残基のε−アミノ基でエンドスタチン類似体に結合される。
【００４５】
本発明（例えば、実施例）に記載されているように、エンドスタチンＫ１類似体は、エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から始めて９６、１０７、１１８、および１８４番のリシン残基の、それぞれＸ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５への突然変異によって得られる配列番号２のアミノ酸配列を有するエンドスタチン類似体を指し、ここで、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４またはＸ５は、リシン以外の任意の天然アミノ酸であり、好ましくは水溶性アミノ酸であり、さらに好ましくは、荷電アミノ酸：アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸の１つであり、さらに好ましくは、正荷電アミノ酸：アルギニンおよびヒスチジンの１つであり、最も好ましくはアルギニンである。
【００４６】
本発明（例えば、実施例）に記載されているように、エンドスタチンＫ２類似体は、エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から始めて７６、１０７、１１８および１８４番のリシン残基の、それぞれＸ１、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５への突然変異によって得られる配列番号３のアミノ酸配列を有するエンドスタチン類似体を指し、ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、またはＸ５は、リシン以外の任意の天然アミノ酸であり、好ましくは水溶性アミノ酸であり、さらに好ましくは、荷電アミノ酸：アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸の１つであり、さらに好ましくは、正荷電アミノ酸：アルギニンおよびヒスチジンの１つであり、最も好ましくはアルギニンである。
【００４７】
本発明（例えば、実施例）に記載されているように、エンドスタチンＫ３類似体は、エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から始めて７６、９６、１１８および１８４番のリシン残基の、それぞれＸ１、Ｘ２、Ｘ４およびＸ５への突然変異によって得られる配列番号４のアミノ酸配列を有するエンドスタチン類似体を指し、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、またはＸ５は、リシン以外の任意の天然アミノ酸であり、好ましくは水溶性アミノ酸であり、さらに好ましくは、荷電アミノ酸：アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸の１つであり、さらに好ましくは、正荷電アミノ酸：アルギニンおよびヒスチジンの１つであり、最も好ましくはアルギニンである。
【００４８】
本発明（例えば、実施例）に記載されているように、エンドスタチンＫ４類似体は、エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から始めて７６、９６、１０７および１８４番のリシン残基の、それぞれＸ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸ５への突然変異によって得られる配列番号５のアミノ酸配列を有するエンドスタチン類似体を指し、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、またはＸ５は、リシン以外の任意の天然アミノ酸であり、好ましくは水溶性アミノ酸であり、さらに好ましくは、荷電アミノ酸：アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸の１つであり、さらに好ましくは、正荷電アミノ酸：アルギニンおよびヒスチジンの１つであり、最も好ましくはアルギニンである。
【００４９】
本発明（例えば、実施例）に記載されているように、エンドスタチンＥＳＣ類似体は、システイン残基Ｃの、エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端への連結によって得られる配列番号６のアミノ酸配列を有するエンドスタチン類似体を指す。
【００５０】
本発明（例えば、実施例）に記載されているように、エンドスタチンＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３、ＮＫ４、ＮＥＳＣ類似体は、それぞれ配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を有するエンドスタチン類似体を指す。エンドスタチンＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３、ＮＫ４、ＮＥＳＣ類似体は、それぞれ前記エンドスタチンＫ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、ＥＳＣ類似体のＮ末端のメチオニンＭとヒスチジンＨの間へのアミノ酸配列ＧＧＳＨＨＨＨＨの挿入により得られる。
【００５１】
本発明（例えば、実施例）に記載されているように、エンドスタチンＥＳＫ類似体は、エンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から始めて７６、９６、１０７、１１８および１８４番のリシン残基の、それぞれＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸ５への突然変異ならびにエンドスタチンの配列番号１のアミノ酸配列のＮ末端から始めて１２７番のアスパラギン残基のリシンへ突然変異によって得られる配列番号１２のアミノ酸配列を有するエンドスタチン類似体を指し、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４またはＸ５は、リシン以外の任意の天然アミノ酸であり、好ましくは水溶性アミノ酸であり、さらに好ましくは、荷電アミノ酸：アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸の１つであり、さらに好ましくは、正荷電アミノ酸：アルギニンおよびヒスチジンの１つであり、最も好ましくはアルギニンである。
【００５２】
本発明（例えば、実施例）に記載されているように、エンドスタチンＮＥＳＫ類似体は、前記エンドスタチンＥＳＫ類似体のＮ末端のメチオニンＭとヒスチジンＨの間へのアミノ酸配列ＧＧＳＨＨＨＨＨの挿入によって得られる配列番号１３のアミノ酸配列を有するエンドスタチン類似体を指す。
【００５３】
用語「単一修飾」は、本明細書で使用する場合、エンドスタチンまたはエンドスタチン類似体の、１つのＰＥＧ分子による修飾によって得られる生成物を指す。
【００５４】
用語「二重修飾」は、本明細書で使用する場合、エンドスタチンまたはエンドスタチン類似体の、２つのＰＥＧ分子による修飾によって得られる生成物を指す。
【００５５】
本発明はさらに、血管新生またはリンパ管新生により引き起こされる疾患を治療するための、本発明によるエンドスタチン類似体−ＰＥＧ結合複合体を含んでなる医薬組成物を提供する。いくつかの態様では、前記血管新生またはリンパ管新生により引き起こされる疾患は、限定されるものではないが、肺癌、乳癌などを含む腫瘍である。好適には、医薬組成物はさらに薬学上許容される担体を含んでなる。
【００５６】
用語「薬学上許容される担体」は、本明細書で使用する場合、安全に投与することができる、固体または液体希釈剤、増量剤、酸化防止剤、および安定剤などの物質を指す。投与経路に応じて、限定されるものではないが、糖類、デンプン、セルロースおよびそれらの誘導体、マルトース、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸バッファー、乳化剤、等張性生理食塩水、および／または発熱性物質除去水を含む、当技術分野で周知の種々の担体を投与することができる。
【００５７】
前記医薬組成物はまた、マイクロカプセル、ヒドロゲル、ミクロスフェア、微小浸透圧ポンプまたはリポソームから選択される形態の徐放性製剤であってもよい。
【００５８】
本発明はさらに、本発明によるエンドスタチン類似体−ＰＥＧ結合複合体および使用説明書を含んでなるキットを提供する。
【００５９】
本発明はさらに、対象に治療上有効な量の本発明によるエンドスタチン類似体−ＰＥＧ結合複合体を投与することを含んでなる、血管新生またはリンパ管新生により引き起こされる疾患の治療方法を提供する。いくつかの態様では、血管新生またはリンパ管新生により引き起こされる前記疾患は、限定されるものではないが、肺癌、乳癌、結腸癌を含む腫瘍である。
【００６０】
用語「治療上有効な量」は、本明細書で使用する場合、対象において臨床医によって望まれるような生物学的または医学的応答を引き起こすのに十分な有効化合物の量を指す。エンドスタチン類似体−ＰＥＧ結合複合体の「治療上有効な量」は、投与経路、対象の体重、年齢および状態などの因子に応じて当業者により決定することができる。例えば、典型的な一日用量は、体重ｋｇ当たり有効成分０．０１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲であり得る。
【００６１】
本発明により提供される医薬は、粉末または注射などの臨床上許容される投与形に調製することができる。本発明による医薬組成物は、任意の好適な経路、例えば、経口投与、静脈内注入、筋肉内注射、皮下注射、腹膜下投与、直腸投与、舌下投与、または吸入、経皮投与などの経路によって対象に投与することができる。
【００６２】
特に断りのない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者により一般に理解されている意味を持つものとする。一般に、本明細書で使用される、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学に関連する名称および技術は当技術分野で周知であり、慣用されている。
【００６３】
特に断りのない限り、本明細書で使用される方法および技術は一般に、当技術分野で周知の従来法および本明細書または本明細書に引用されている参照文献に記載されている様々な手段に従って実施される。
【００６４】
以下の例では、エンドスタチンおよびエンドスタチンＫ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、ＥＳＣ、ＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３、ＮＫ４、ＮＥＳＣ、ＥＳＫ、ＮＥＳＫ類似体の、Ｎ末端アミノ基におけるＰＥＧでの単一修飾から得られる生成物、Ｎ末端アミノ基とリシンアミノ基におけるＰＥＧでのその二重修飾から得られる生成物、リシンアミノ基におけるＰＥＧでのその単一修飾から得られる生成物、およびＣ末端チオールにおけるＰＥＧでのその単一修飾から得られる生成物をそれぞれ作製および精製し、ＨＭＥＣ遊走に関するそれらの阻害率を決定した。以下の例で使用されるエンドスタチンＫ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、ＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３、ＮＫ４、ＥＳＫ、ＮＥＳＫ類似体では、リシンの突然変異は、リシンのアルギニンへの突然変異を指す。
【実施例】
【００６５】
実施例１：２０ｋＤａのＰＥＧの、Ｎ末端アミノ基での天然ヒトエンドスタチンへの結合
天然ヒトエンドスタチンを３０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０±１．０）中で透析し、タンパク質濃度を測定し、タンパク質濃度を５〜１５ｍｇ／ｍｌに調整した。２０ｋＤａモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）の添加量を対象タンパク質とＰＥＧのモル比１：３に従って計算し、還元剤シアノ水素化ホウ素ナトリウムの量を２０ｍＭ濃度で最終溶液の容量に従って計算した。所望のモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムを秤量し、対象タンパク質に加え、均一に撹拌し、その後、室温で６〜８時間静置した。修飾結果の電気泳動図を図１に示した。電気泳動ゲルの各バンドに対して、１次元ゲル解析ソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって含量分析を行い、分子量標準と比較した。結果は、単一修飾エンドスタチン（分子量４０ｋＤａの生成物）のパーセンテージは６０％を超えていること、すなわち、エンドスタチン分子は分子量２０ｋＤａのモノメトキシＰＥＧ分子で修飾されていることを示した。
【００６６】
実施例２：２０ｋＤａのＰＥＧをＮ末端アミノ基で天然ヒトエンドスタチンに結合した生成物の精製
実施例１のモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）と天然ヒトエンドスタチンの間のカップリング反応の生成物の溶液を陽イオンクロマトグラフィーカラムによって精製した。ＳＰＦＦ媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を特に選択し、反応溶液のｐＨを５．０〜７．０に調整し、陽イオンカラムを２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨを５．０〜７．０に調整）で平衡化し、サンプルをロードした。２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０〜７．０）を用いて勾配溶出を行い、種々の画分を２８０ｎｍでの紫外線吸収に従って回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、分析結果を図１に示した。図１から分かるように、画分３はエンドスタチンの２０ｋＤａ  ＰＥＧでの単一修飾から得られた生成物（分子量４０ｋＤａ）であった。Ｎ末端アミノ基およびリシン側鎖アミノ基のｐＫａ値はそれぞれ８．０および１０．５であったので、ｐＨ５．０±１．０におけるＮ末端アミノ基の反応性はリシン側鎖アミノ基の活性の１０＾（１０．５−８．０）＝３１６倍であった。従って、この単一修飾生成物は、Ｎ末端単一修飾生成物と見なすことができた。
【００６７】
実施例３：２０ｋＤａのＰＥＧの、Ｎ末端アミノ基でのエンドスタチンＫ１類似体への結合
エンドスタチンＫ１類似体を３０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０±１．０）中で透析し、タンパク質濃度を決定し、タンパク質濃度を５〜１５ｍｇ／ｍｌに調整した。２０ｋＤａモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）の添加量を対象タンパク質とＰＥＧのモル比１：３に従って計算し、還元剤シアノ水素化ホウ素ナトリウムの量を２０ｍＭ濃度で最終溶液の容量に従って計算した。所望のモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムを秤量し、対象タンパク質に加え、均一に撹拌し、その後、室温で６〜８時間静置した。修飾結果の電気泳動図を図２に示した。電気泳動ゲルの各バンドに対して、１次元ゲル解析ソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって含量分析を行い、分子量標準と比較した。結果は、単一修飾エンドスタチンＫ１類似体のパーセンテージは６０％を超えていること、すなわち、エンドスタチンＫ１類似体は分子量２０ｋＤａのモノメトキシＰＥＧ分子で修飾されていることを示した。
【００６８】
実施例４：２０ｋＤａのＰＥＧをＮ末端アミノ基でエンドスタチンＫ１類似体に結合した生成物の精製
実施例３のモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）とエンドスタチンＫ１類似体の間のカップリング反応の生成物の溶液を陽イオンクロマトグラフィーカラムによって精製した。ＳＰＦＦ媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を選択し、反応溶液のｐＨを５．０〜７．０に調整し、陽イオンカラムを２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨを５．０〜７．０に調整）で平衡化し、サンプルをロードした。２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０〜７．０）を用いて勾配溶出を行い、種々の画分を２８０ｎｍでの紫外線吸収に従って回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、分析結果を図２に示した。図２から分かるように、画分２および３はエンドスタチンＫ１類似体の２０ｋＤａ  ＰＥＧでの単一修飾から得られた生成物であった。実施例２と同じ修飾原理分析に基づけば、単一修飾生成物は、Ｎ末端単一修飾生成物と見なすことができた。
【００６９】
実施例５：２０ｋＤａのＰＥＧの、リシン側鎖アミノ基およびＮ末端アミノ基でのエンドスタチンＫ１類似体との二重結合
エンドスタチンＫ１類似体を２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４溶液（ｐＨ８．５）中で透析し、タンパク質濃度を測定し、タンパク質濃度を５〜１５ｍｇ／ｍｌに調整した。２０ｋＤａモノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナートの添加量を対象タンパク質とＰＥＧのモル比１：１０に従って計算した。モノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナートを対象タンパク質に加え、均一に撹拌し、その後、室温で６０〜１２０分間静置した。修飾結果の電気泳動図を図３に示した。電気泳動ゲルの各バンドに対して、１次元ゲル解析ソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって含量分析を行い、分子量標準と比較した。二重修飾エンドスタチンＫ１類似体（分子量６０ｋＤａ）のパーセンテージは５０％を超え、すなわち、エンドスタチンＫ１類似体は、分子量２０ｋＤａのモノメトキシＰＥＧ分子２個で修飾されていた。
【００７０】
実施例６：２０ｋＤａのＰＥＧをリシン側鎖アミノ基およびＮ末端アミノ基でエンドスタチンＫ１類似体に二重結合した生成物の精製
実施例５のモノメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルプロピオナートとエンドスタチンＫ１類似体の間のカップリング反応の生成物の溶液を陽イオンクロマトグラフィーカラムによって精製した。ＳＰＦＦ媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を選択し、反応溶液のｐＨを５．０〜７．０に調整し、陽イオンカラムを２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨを５．０〜７．０に調整）で平衡化し、サンプルをロードした。２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０〜７．０）を用いて勾配溶出を行い、種々の画分を２８０ｎｍでの紫外線吸収に従って回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、分析結果を図３に示した。図３から分かるように、画分４はエンドスタチンＫ１類似体の２０ｋＤａポリエチレングリコールでの二重修飾から得られた生成物であった。
【００７１】
実施例７：２０ｋＤａのＰＥＧの、Ｎ末端アミノ基でのエンドスタチンＫ２類似体への結合、ならびに精製
Ｎ末端結合は、実施例３に記載されている方法によって実施し、修飾生成物を実施例４に記載されている方法によって精製し、同様の実験結果が得られた。
【００７２】
実施例８：２０ｋＤａのＰＥＧの、リシン側鎖アミノ基およびＮ末端アミノ基でのエンドスタチンＫ２類似体への結合、ならびに精製
結合は実施例５に記載されている方法によって実施し、修飾生成物を実施例６に記載されている方法によって精製し、同様の実験結果が得られた。
【００７３】
実施例９：２０ｋＤａのＰＥＧの、Ｎ末端アミノ基でのエンドスタチンＫ３類似体への結合、ならびに精製
Ｎ末端結合は、実施例３に記載されている方法によって実施し、修飾生成物を実施例４に記載されている方法によって精製し、同様の実験結果が得られた。
【００７４】
実施例１０：２０ｋＤａのＰＥＧの、リシン側鎖アミノ基およびＮ末端アミノ基でのエンドスタチンＫ３類似体への結合、ならびに精製
結合は実施例５に記載されている方法によって実施し、修飾生成物を実施例６に記載されている方法によって精製し、同様の実験結果が得られた。
【００７５】
実施例１１：２０ｋＤａのＰＥＧの、Ｎ末端アミノ基でのエンドスタチンＫ４類似体への結合、ならびに精製
Ｎ末端結合は、実施例３に記載されている方法によって実施し、修飾生成物を実施例４に記載されている方法によって精製し、同様の実験結果が得られた。
【００７６】
実施例１２：２０ｋＤａのＰＥＧの、リシン側鎖アミノ基およびＮ末端アミノ基でのエンドスタチンＫ４類似体への結合、ならびに精製
Ｎ末端結合は、実施例５に記載されている方法によって実施し、修飾生成物を実施例６に記載されている方法によって精製し、同様の実験結果が得られた。
【００７７】
実施例１３：２０ｋＤａのＰＥＧのエンドスタチンＥＳＣ類似体への結合
エンドスタチンＥＳＣ類似体を２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４溶液（ｐＨ７．５）中で透析し、タンパク質濃度を決定し、タンパク質濃度を５〜１５ｍｇ／ｍｌに調整した。２０ｋＤａモノメトキシポリエチレングリコールマレイミド（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）の添加量を対象タンパク質とＰＥＧのモル比１：５に従って計算した。ｍＰＥＧ−ＭＡＬを対象タンパク質に加え、均一に撹拌し、その後、室温で６〜８時間静置した。修飾結果の電気泳動図を図４に示した。電気泳動ゲルの各バンドに対して、１次元ゲル解析ソフトウェアＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって含量分析を行い、分子量標準と比較した。単一修飾エンドスタチンＥＳＣ類似体（分子量４０ｋＤａ）のパーセンテージは８０％を超え、すなわち、エンドスタチンＫ１類似体は、分子量２０ｋＤａのｍＰＥＧ−ＭＡＬ分子１個で修飾されていた。ｍＰＥＧ−ＭＡＬは遊離チオール基とのみ反応することができるので、この生成物のＰＥＧ修飾部位は、エンドスタチンＥＳＣ類似体の遊離チオールと見なすことができる。
【００７８】
実施例１４：２０ｋＤａのＰＥＧとエンドスタチンＥＳＣ類似体を結合した生成物の精製
実施例１３のモノメトキシポリエチレングリコールマレイミド（ｍＰＥＧ−ＭＡＬ）とエンドスタチンＫＳＣ類似体の間のカップリング反応の生成物の溶液を陽イオンクロマトグラフィーカラムによって精製した。ＳＰＦＦ媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を選択し、反応溶液のｐＨを５．０〜７．０に調整し、陽イオンカラムを２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨを５．０〜７．０に調整）で平衡化し、サンプルをロードした。２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０〜７．０）を用いて勾配溶出を行い、種々の画分を２８０ｎｍでの紫外線吸収に従って回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、分析結果を図４に示した。図４から分かるように、画分３はエンドスタチンＥＳＣ類似体の２０ｋＤａ  ＰＥＧでの単一修飾から得られた生成物であった。
【００７９】
実施例１５：２０ｋＤａのＰＥＧの、Ｎ末端アミノ基でのエンドスタチンＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３、ＮＫ４、ＥＳＫ、ＮＥＳＫ類似体への結合、ならびに精製
Ｎ末端結合は、実施例３に記載されている方法によって実施し、修飾生成物を実施例４に記載されている方法によって精製し、同様の実験結果が得られた。
【００８０】
実施例１６：２０ｋＤａのＰＥＧの、リシン側鎖アミノ基およびＮ末端アミノ基でのエンドスタチンＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３、ＮＫ４、ＥＳＫ、ＮＥＳＫ類似体への結合、ならびに精製
結合は実施例５に記載されている方法によって実施し、修飾生成物を実施例６に記載されている方法によって精製し、同様の実験結果が得られた。
【００８１】
実施例１７：２０ｋＤａのＰＥＧをリシン側鎖アミノ基でエンドスタチンＫ１類似体に結合した生成物の精製
エンドスタチンＫ１類似体を２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４溶液（ｐＨ８．５±０．５）中で透析し、タンパク質濃度を決定し、タンパク質濃度を１０〜２０ｍｇ／ｍｌに調整した。２０ｋＤａモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）の添加量を対象タンパク質とＰＥＧのモル比１：１に従って計算し、還元剤シアノ水素化ホウ素ナトリウムの量を１０ｍＭ濃度で最終溶液の容量に従って計算した。所望のモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムを秤量し、対象タンパク質に加え、均一に撹拌し、その後、室温で６〜８時間静置した。反応生成物の溶液を陽イオンクロマトグラフィーカラムによって精製した。Ｍａｃｒｏｃａｐ  ＳＰ媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を特に選択し、反応溶液のｐＨを４．５±０．５に調整した。陽イオンカラムを３０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨを４．０〜５．０に調整）で平衡化し、サンプルをロードした。３０ｍＭのＮａＡｃ、５００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ４．０〜５．０）を用いて勾配溶出を行い、種々の画分を２８０ｎｍでの紫外線吸収に従って回収した。この修飾サンプルおよび続いての精製の後に回収された画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析し、得られた分析結果を図５に示した。回収された２つの単一修飾画分、すなわち、レーン４および５のサンプルをトリプシンで消化した後、それらの修飾部位を質量分析によって分析した。レーン５のサンプル中の画分はリシン側鎖アミノ基における単一修飾生成物であることが確認された。
【００８２】
実施例１８：２０ｋＤａのＰＥＧの、リシン側鎖アミノ基でのエンドスタチンＫ２、Ｋ３、ＮＫ１、ＮＫ２、ＮＫ３類似体への結合、ならびに精製
修飾生成物の結合および精製は実施例１７に記載されている方法によって実施し、同様の実験結果が得られた。
【００８３】
実施例１９：修飾生成物の活性アッセイ
実施例１〜実施例１８で得られた総ての対象精製生成物に対して細胞生存率アッセイを行い、それらから最適修飾プロトコールを選択した。ＨＭＥＣを選択し、遊走アッセイ（Ｔｒａｎｗｅｌｌ  Ａｓｓａｙ）を使用し、タンパク質活性を表すために細胞の数を計数し（Luo yongzhang et al., Endostatin inhibits tumourlymphangiogenesis and lymphatic metastasis via cell surface nucleolin on lymphangiogenic endothelial cells, J Pathol 2010; 222: 249-260参照）、これらの修飾生成物をそれらのＨＭＥＣ遊走阻害率に関して分析し、結果を表１に示した。
【００８４】
【表１】
2019535700.tif 000002
【００８５】
上記の活性結果に示されるように、総ての類似体のＮ末端単一修飾生成物は、エンドスタチンのＮ末端単一修飾生成物よりも低いＨＭＥＣ遊走阻害率を持っており、突然変異はタンパク質活性に特定の効果を有していたことを示し、リシン側鎖アミノ基における単一修飾の結果は、２番目のリシン側鎖アミノ基における単一修飾生成物（すなわち、エンドスタチンＫ２類似体）は、エンドスタチンのＮ末端単一修飾生成物よりもはるかに高い、最高のＨＭＥＣ遊走阻害率を有していたこと、Ｎ末端アミノ基とリシン側鎖アミノ基における二重修飾生成物の中でも、２番目のリシン側鎖アミノ基とＮ末端アミノ基における二重修飾生成物（すなわち、エンドスタチンＫ２類似体）は、総ての生成物の中で最高のＨＭＥＣ遊走阻害率を有していたことを示した。
【００８６】
包括的分析のためにエンドスタチン分子の三次構造（図６）を考慮に入れた。エンドスタチン分子は、ＰＥＧによって修飾可能な６つのアミノ基を有し、すなわち、Ｎ末端アミノ基と５つのリシン側鎖アミノ基である。それらの中で、５番目のリシン残基はＮ末端に近いＣ末端に位置する。５番目のリシン側鎖アミノ基における単一修飾を達成することは立体障害のために困難である。作出の難しさは、５番目のリシンの後にシステイン残基を付加することによるチオール修飾を介して軽減することができる。修飾に関する前記の６部位の中で、２番目のリシン残基は、タンパク質のヌクレオリン結合ドメインからも最も遠く、Ｎ末端は、タンパク質のヌクレオリン結合ドメインからさらに離れている。ＰＥＧ修飾が行われる場合、エチレングリコール長鎖は結合ドメインに及ぼす影響が最小で、従って、Ｎ末端アミノ基と２番目のリシン側鎖アミノ基において単一修飾または二重修飾される場合、それらの生成物は、ＨＭＥＣ遊走阻害率という点で、他の部位における修飾プロトコールよりも優れている。これは、ヌクレオリン結合ドメインから離れた位置で修飾することが、エンドスタチンに最適な選択であったことを十分に示した。
【００８７】
結論を確認するために、エンドスタチン分子の三次構造の特徴に従って、修飾のために三次構造の表面の１２７番の位置（ヌクレオリン結合ドメインおよび２番目のリシン残基の療法から離れている）リシン残基（すなわち、エンドスタチンＥＳＫ類似体）を導入し、その結果は、その類似体の二重修飾生成物はエンドスタチンＫ２類似体よりも低いＨＭＥＣ遊走阻害率を有していたことを示し、エンドスタチンＫ２類似体の二重修飾がエンドスタチンまたはその類似体に最適な選択であったことを示す。
【００８８】
図６および図７に示されるように、ＥＳ分子の表面の異なる領域におけるＰＥＧ修飾は、タンパク質活性に異なる影響を有していた。Ｎ末端単一修飾生成物およびＫ２単一修飾生成物は、有意に増強されたＨＭＥＣ遊走阻害活性（すなわち、阻害率）を有し、これらの２つの部位における二重修飾生成物は、最も有意に増強されたＨＭＥＣ遊走阻害活性（すなわち、阻害率）を有していた。Ｋ２はヌクレオリン結合ドメインから最も遠く、単一修飾はタンパク質のＨＭＥＣ遊走阻害活性に最も大きな増強をもたらし、一方、Ｋ１、Ｋ３、Ｋ４およびＣ末端修飾生成物は、タンパク質のＨＭＥＣ遊走阻害活性がほとんど増強されていないか、または低下していた。さらに、二重修飾生成物についても同様の結果が得られ、ヌクレオリン結合ドメインから離れたＫ２が修飾の最適な選択であったことを示す。生成物の半減期をさらに延長するためには、Ｎ末端およびＫ２における二重修飾が最適な選択であった。Ｋ２領域内であってＫ３、Ｋ４領域から離れた領域にＫ２と同等の挿入可能な修飾部位が存在したかどうかを確認するために、ＥＳ天然構造のＮ１２７に新たな修飾部位を形成するための部位突然変異誘発を行い、関連の実験を行った。結果は、この領域（この領域における単一修飾生成物かこの領域とＮ末端における二重修飾生成物かに関わらず）における修飾生成物は、対応するＫ２における修飾生成物よりも低い程度に、ＨＭＥＣ遊走阻害活性を増強したことを示した。これらのことは、Ｋ２とＮ末端における二重修飾がタンパク質活性の増強および半減期の延長に最適な選択であったことを十分に示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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