(57)【要約】本発明は、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドの組成物及び方法に関し、ここでＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、ＧＤＮＦ改変体に直接又はリンカーを解して結合したＦｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、又はヒト血清アルブミンを含む。ＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、肥満ならびに１型及び２型糖尿病などの代謝性疾患、ならびに筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及びパーキンソン病などの神経性疾患を治療するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ−Ｌ−Ｂを有するグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）融合ポリペプチドであって、式中、
ＡはＦｃドメインを含み、
Ｌはリンカーであり、かつ
Ｂは、配列番号１のアミノ酸１１８〜２１１を含む参照ＧＤＮＦ配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＧＤＮＦ改変体を含む、
ＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＦｃドメインのＮ末端に結合したアルブミン結合ペプチドをさらに含む、請求項１に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記ＦｃドメインのＮ末端に結合したフィブロネクチンドメインをさらに含む、請求項１に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記ＦｃドメインのＮ末端に結合したヒト血清アルブミンをさらに含む、請求項１に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項５】
式Ａ−Ｌ−Ｂを有するＧＤＮＦ融合ポリペプチドであって、式中、
Ａはアルブミン結合ペプチドを含み、
Ｌはリンカーであり、かつ
Ｂは、配列番号１のアミノ酸１１８〜２１１を含む参照ＧＤＮＦ配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＧＤＮＦ改変体を含む、
ＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項６】
式Ａ−Ｌ−Ｂを有するＧＤＮＦ融合ポリペプチドであって、式中、
Ａはフィブロネクチンドメインを含み、
Ｌはリンカーであり、かつ
Ｂは、配列番号１のアミノ酸１１８〜２１１を含む参照ＧＤＮＦ配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＧＤＮＦ改変体を含む、
ＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項７】
式Ａ−Ｌ−Ｂを有するＧＤＮＦ融合ポリペプチドであって、式中、
Ａはヒト血清アルブミンを含み、
Ｌはリンカーであり、かつ
Ｂは、配列番号１のアミノ酸１１８〜２１１を含む参照ＧＤＮＦ配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するＧＤＮＦ改変体を含む、
ＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項８】
ＧＤＮＦ改変体は、配列番号１のアミノ酸９２〜２１１又はその断片からなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記参照ＧＤＮＦ配列は、配列番号１のアミノ酸１１７〜２１１を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記参照ＧＤＮＦ配列は、配列番号１のアミノ酸１１０〜２１１を含む、請求項９に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記参照ＧＤＮＦ配列は、配列番号１のアミノ酸９２〜２１１を含む、請求項１０に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記参照ＧＤＮＦ配列は、配列番号１のアミノ酸７８〜２１１を含む、請求項１１に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項１３】
ＧＤＮＦ改変体は、野生型ヒトＧＤＮＦに対し、配列番号１のアミノ酸残基８５と１２０との間のタンパク質分解を減少させるアミノ酸置換を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項１４】
ＧＤＮＦ改変体は、野生型ヒトＧＤＮＦに対する以下の残基：非塩基性アミノ酸については、配列番号１の配列に対し、Ｒ８８、Ｒ８９、Ｒ９１、Ｒ９３、Ｒ１０４、Ｋ１０６、Ｒ１０８、Ｒ１０９、Ｒ１１２、Ｋ１１４、及びＲ１１６のうちの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１３に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項１５】
アルブミン結合ペプチドは配列番号２の配列を含む、請求項２又は５に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項１６】
前記Ｆｃドメインは二量体を形成しない、請求項１〜３及び９〜１５のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項１７】
前記Ｆｃドメインはヒンジドメインを含まない、請求項１〜３及び９〜１５のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項１８】
前記Ｆｃドメインは、以下のアミノ酸置換：ヒトＩｇＧ１の配列に対して、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｖ、Ｌ３５１Ｔ、Ｌ３５１Ｈ、Ｌ３５１Ｎ、Ｌ３５２Ｋ、Ｐ３５３Ｓ、Ｓ３５４Ｄ、Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｄ３５６Ｓ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ａ、Ｔ３６６Ｅ、Ｌ３６８Ｔ、Ｌ３６８Ｙ、Ｌ３６８Ｅ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｑ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｔ３９４Ｎ、Ｐ３９５Ｎ、Ｐ３９６Ｔ、Ｖ３９７Ｔ、Ｖ３９７Ｑ、Ｌ３９８Ｔ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｎ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｈ、Ｆ４０５Ｒ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ｈ、Ｙ４０７Ｉ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｔ、及びＫ４０９Ｉのうちの１つ以上を含む、請求項１６に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項１９】
ＧＤＮＦ融合ポリペプチド中のリンカーは結合である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項２０】
ＧＤＮＦ融合ポリペプチド中のリンカーはスペーサーである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項２１】
スペーサーは配列番号４〜２９のいずれか１つの配列を含む、請求項２０に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項２２】
前記配列は配列番号４又は２９からなる、請求項２１に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項２３】
ＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、３〜６０日の血清半減期を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項２４】
２０〜２０，０００ｐＭのＫＤでヒトＧＤＮＦファミリー受容体アルファ−１（ＧＦＲα１）に結合する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項２５】
単一のオープンリーディングフレームによってコードされている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項２６】
前記ＧＤＮＦ改変体は参照ＧＤＮＦ配列に対して８５％の配列同一性を有する、請求項１〜７及び９〜１２のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項２７】
前記ＧＤＮＦ改変体は参照ＧＤＮＦ配列に対して９０％の配列同一性を有する、請求項２６に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項２８】
前記ＧＤＮＦ改変体は参照ＧＤＮＦ配列に対して９５％の配列同一性を有する、請求項２７に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項２９】
前記ＧＤＮＦ改変体は参照ＧＤＮＦ配列に対して９７％の配列同一性を有する、請求項２８に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項３０】
ＧＤＮＦ改変体は、配列番号１のアミノ酸１１８〜２１１、１１７〜２１１、１１０〜２１１、９２〜２１１、又は７８〜２１１からなる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項３２】
請求項３１に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３３】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド、請求項３１に記載の核酸分子、又は請求項３２に記載のベクターを発現する宿主細胞。
【請求項３４】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３３に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチドを調製する方法であって、
ａ）請求項３１に記載の核酸分子又は請求項３２に記載のベクターを含む宿主細胞を提供する工程、及び
ｂ）ＧＤＮＦ融合ポリペプチドの産生を可能にする条件下で、宿主細胞において核酸分子又はベクターを発現させる工程
を含む方法。
【請求項３６】
前記宿主細胞はＣＨＯ細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド、請求項３１に記載の核酸分子、又は請求項３２に記載のベクターと、１つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項３８】
ＧＤＮＦ融合ポリペプチドが治療上有効な量である、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
対象における代謝性疾患を治療及び／又は予防する方法であって、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド、請求項３１に記載の核酸分子、請求項３２に記載のベクター、又は請求項３７又は３８に記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法。
【請求項４０】
代謝性疾患は、肥満、１型糖尿病、及び２型糖尿病からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
代謝性疾患は肥満である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
代謝性疾患は１型糖尿病である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
代謝性疾患は２型糖尿病である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
対象の体重及び／又は体重増加の割合を減少させる、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
対象の食物摂取に対する食欲に影響を及ぼさない、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
対象の脂肪症を軽減する、請求項３９〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
対象の精巣上体及び腎周囲の脂肪体の重量を減少させる、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
対象の空腹時のインスリンレベルを低下させる、請求項３９〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
対象のグルコースクリアランス速度を増加させる、請求項３９〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
対象の血清脂質プロファイルを改善する、請求項３９〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
対象における神経学的疾患を治療及び／又は予防する方法であって、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド、請求項３１に記載の核酸分子、請求項３２に記載のベクター、又は請求項３７又は３８に記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含む方法。
【請求項５２】
神経学的疾患は、統合失調症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、不安、卒中、脳腫瘍、及び脳転移からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＧＤＮＦ融合ポリペプチド及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は米国で増加している問題であり、人口の約２５％の有病率である。内臓脂肪や皮下脂肪の増加は様々な臓器の機能不全を引き起こす。過剰体重は、肥満、糖尿病（例えば、１型及び２型糖尿病）、心血管疾患、及びいくつかの形態の癌を含む、あらゆる一連の合併症の危険因子である。
【０００３】
インスリン抵抗性は、末梢組織が高量のインスリンを必要とし、かつ肥満と関連している場合に生じる。膵臓β細胞がその要求を満たすのに十分なインスリンを産生できなくなると、高血糖が起こり、２型糖尿病を発症する。肥満で増加する脂肪細胞は、この過程に関与すると考えられている。代謝性疾患（特に１型及び２型糖尿病）及びインスリン抵抗性を含む肥満ならびにそれに関連する疾患及び状態を治療するための努力は、外科手術から医薬品に至るまで様々なアプローチを取ってきた。
【０００４】
肥満及び糖尿病（例えば、１型及び２型糖尿病）などの代謝性疾患の有病率にもかかわらず、利用可能な治療選択肢はほとんどない。これらの代謝性疾患に対する新規な治療法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）改変体のＮ末端に直接又はリンカーを介して結合されたＦｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、又はヒト血清アルブミンを含むＧＤＮＦ融合ポリペプチドを特徴とする。本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、ヒトＧＤＮＦファミリー受容体アルファ−１（ＧＦＲα１）に結合し、望ましくは長い血清半減期を有する。本発明はまた、肥満ならびに１型及び２型糖尿病などの代謝疾患、ならびに統合失調症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、不安、脳卒中、脳腫瘍、脳転移などの神経疾患を治療及び／又は予防するためのこれらのＧＤＮＦ融合ポリペプチドの医薬組成物及び使用方法を特徴とする。
【０００６】
一態様では、本発明は、式Ａ−Ｌ−Ｂを有するＧＤＮＦ融合ポリペプチドを特徴とし、式中、ＡはＦｃドメインを含み、Ｌはリンカーであり、Ｂは、配列番号１のアミノ酸１１８〜２１１を含む参照ＧＤＮＦ配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性）を有するＧＤＮＦ改変体を含む。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、ＦｃドメインのＮ末端に結合したアルブミン結合ペプチドをさらに含む。
他の実施形態では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、ＦｃドメインのＮ末端に結合したフィブロネクチンドメインをさらに含む。
【０００８】
さらに他の実施形態では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドはさらに、ＦｃドメインのＮ末端に結合したヒト血清アルブミンを含む。
別の態様では、本発明は、式Ａ−Ｌ−Ｂを有するＧＤＮＦ融合ポリペプチドを特徴とし、式中、Ａはアルブミン結合ペプチドを含み、Ｌはリンカーであり、Ｂは、配列番号１のアミノ酸１１８〜２１１を含む参照ＧＤＮＦ配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性）を有するＧＤＮＦ改変体を含む。
【０００９】
別の態様では、本発明は、式Ａ−Ｌ−Ｂを有するＧＤＮＦ融合ポリペプチドを特徴とし、式中、Ａはフィブロネクチンドメインを含み、Ｌはリンカーであり、Ｂは、配列番号１のアミノ酸１１８〜２１１を含む参照ＧＤＮＦ配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性）を有するＧＤＮＦ改変体を含む。
【００１０】
さらに別の態様では、本発明は、式Ａ−Ｌ−Ｂを有するＧＤＮＦ融合ポリペプチドを特徴とし、式中、Ａはヒト血清アルブミンを含み、Ｌはリンカーであり、Ｂは、配列番号１のアミノ酸１１８〜２１１を含む参照ＧＤＮＦ配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性）を有するＧＤＮＦ改変体を含む。
【００１１】
上記の態様のいずれかの特定の実施形態では、ＧＤＮＦ改変体は、配列番号１のアミノ酸９２〜２１１又はその断片からなる。
上記の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、参照ＧＤＮＦ配列は、配列番号１のアミノ酸１１７〜２１１、アミノ酸１１０〜２１１、アミノ酸９２〜２１１、又はアミノ酸７８〜２１１を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦ改変体は、野生型ヒトＧＤＮＦに対し、配列番号１のアミノ酸残基８５と１２０との間のタンパク質分解を減少させるアミノ酸置換を含む。特定の実施形態では、ＧＤＮＦ改変体は、野生型ヒトＧＤＮＦに対する以下の残基のうちの１つ以上のアミノ酸置換を含む：非塩基性アミノ酸については、配列番号１の配列に対し、Ｒ８８、Ｒ８９、Ｒ９１、Ｒ９３、Ｒ１０４、Ｋ１０６、Ｒ１０８、Ｒ１０９、Ｒ１１２、Ｋ１１４、及びＲ１１６。
【００１３】
いくつかの実施形態では、アルブミン結合ペプチドは配列番号２の配列を含む。
他の実施形態では、Ｆｃドメインは二量体を形成しない。さらに他の実施形態では、Ｆｃドメインはヒンジドメインを含まない。
【００１４】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む：ヒトＩｇＧ１の配列に対して、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｖ、Ｌ３５１Ｔ、Ｌ３５１Ｈ、Ｌ３５１Ｎ、Ｌ３５２Ｋ、Ｐ３５３Ｓ、Ｓ３５４Ｄ、Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｄ３５６Ｓ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ａ、Ｔ３６６Ｅ、Ｌ３６８Ｔ、Ｌ３６８Ｙ、Ｌ３６８Ｅ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｑ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｔ３９４Ｎ、Ｐ３９５Ｎ、Ｐ３９６Ｔ、Ｖ３９７Ｔ、Ｖ３９７Ｑ、Ｌ３９８Ｔ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｎ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｈ、Ｆ４０５Ｒ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ｈ、Ｙ４０７Ｉ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｔ、及びＫ４０９Ｉ。野生型Ｆｃドメインの配列は、配列番号３に示されている。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチド中のリンカーは結合である。他の実施形態では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチド中のリンカーはスペーサーである。特定の実施形態では、スペーサーは配列番号４〜２９のいずれか１つの配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチド中のフィブロネクチンドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  ＮＯ：Ｐ０２７５１の配列のアミノ酸６１０〜７０２を有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（配列番号３０）である。他の実施形態では、フィブロネクチンドメインはアドネクチンタンパク質である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチド中のヒト血清アルブミンは、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  ＮＯ：Ｐ０２７６８（配列番号３１）の配列を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、３〜６０日の血清半減期を有する。
【００１８】
他の実施形態では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、２０〜２０，０００ｐＭのＫＤでヒトＧＤＮＦファミリー受容体アルファ−１（ＧＦＲα１）に結合する。
いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドは単一のオープンリーディングフレームによってコードされている。
【００１９】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子を特徴とする。
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを特徴とする。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド、本明細書に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、又はそのような核酸分子を含むベクターを発現する宿主細胞を特徴とする。
【００２１】
特定の実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）である。他の実施形態では、宿主細胞はヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｆ）、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＰＣ３、Ｖｅｒｏ、ＭＣ３Ｔ３、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、Ｔ４７Ｄ、ＮＳ０（内因的に免疫グロブリン鎖を産生しないネズミ骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、又はＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞である。
【００２２】
さらに他の実施形態では、宿主細胞は細菌細胞（例えば大腸菌細胞）である。大腸菌株の例としては、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，４４６）、大腸菌λ１７７６（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，５３７、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ−１０２５）、及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，６０８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
別の態様では、本発明は、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドを調製する方法を特徴とする。この方法は、ａ）本明細書に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子又はそのような核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を提供する工程、及びｂ）ＧＤＮＦ融合ポリペプチドの産生を可能にする条件下で、宿主細胞において核酸分子又はベクターを発現させる工程を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本発明の任意のＧＤＮＦ融合ポリペプチドを調製する方法において使用される宿主細胞はＣＨＯ細胞である。他の実施形態では、この方法で使用される宿主細胞は、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｆ）、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＰＣ３、Ｖｅｒｏ、ＭＣ３Ｔ３、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、Ｔ４７Ｄ、ＮＳ０（内因的に免疫グロブリン鎖を産生しないネズミ骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、又はＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞である。
【００２５】
さらに他の実施形態では、この方法で使用される宿主細胞は細菌細胞（例えば大腸菌細胞）である。大腸菌株の例としては、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，４４６）、大腸菌λ１７７６（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，５３７、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ−１０２５）、及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，６０８）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
別の態様では、本発明は、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチド、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、又は本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターと、１つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物であって、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドが治療上有効な量である医薬組成物を特徴とする。
【００２７】
さらに別の態様では、本発明は、対象における代謝性疾患を治療及び／又は予防する方法を特徴とする。この方法は、本明細書に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、又は医薬組成物を対象に投与する工程を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、代謝性疾患は、肥満、１型糖尿病、及び２型糖尿病からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、代謝性疾患は肥満である。他の実施形態では、代謝性疾患は１型糖尿病である。さらに他の実施形態では、代謝性疾患は２型糖尿病である。
【００２９】
他の実施形態において、対象における代謝性疾患を治療及び／又は予防する方法は、対象の体重及び／又は体重増加の割合を減少させる。
いくつかの実施形態では、この方法は対象の食物摂取に対する食欲に影響を及ぼさない。他の実施形態では、この方法は対象の脂肪症を軽減する。他の実施形態では、この方法は、除脂肪量に影響を与えることなく対象の脂肪症を軽減する。さらに他の実施形態では、この方法は対象の精巣上体及び腎周囲の脂肪体の重量を減少させる。さらに他の実施形態では、この方法は、対象の空腹時のインスリンレベルを低下させ、対象のグルコースクリアランス速度を増加させ、かつ／又は対象の血清脂質プロファイルを改善する。
【００３０】
なお別の態様では、本発明は、対象における神経学的疾患を治療及び／又は予防する方法を特徴とする。この方法は、本明細書に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、又は医薬組成物を対象に投与する工程を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、神経学的疾患は、統合失調症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、不安、卒中、脳腫瘍、及び脳転移からなる群から選択される。
【００３２】
定義
本明細書で使用されるとき、用語「ＧＤＮＦ改変体」は、野生型ヒトＧＤＮＦよりも長い血清半減期を有する野生型ヒトＧＤＮＦ（本明細書でさらに定義される）の改変体又は断片を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦ改変体は、配列番号１のアミノ酸１１８〜２１１、１１７〜２１１、１１０〜２１１、９２〜２１１、又は７８〜２１１を有する参照ＧＤＮＦ配列（本明細書でさらに定義される）に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性）を有する。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦ改変体は、野生型ヒトＧＤＮＦに対し、配列番号１のアミノ酸残基８５と１２０との間のタンパク質分解を減少させるアミノ酸置換を含む。そのようなアミノ酸置換は、本明細書においてさらに詳細に記載される。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、用語「野生型ヒトＧＤＮＦ」とは、配列番号１の配列を有する天然型のヒトグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）をいう。
本明細書で使用されるとき、用語「Ｆｃドメイン」とは、少なくともＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むヒトＦｃドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性）を有するタンパク質をいう。任意選択で、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメイン二量体化を低下させ又は阻害する１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。任意選択で、Ｆｃドメインはヒンジドメインを含む。Ｆｃドメインは、免疫グロブリン抗体アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＤのものであり得る。さらに、Ｆｃドメインは、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）であり得る。Ｆｃドメインはまた、天然に存在しないＦｃドメイン、例えば組換えＦｃドメインであり得る。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、用語「アルブミン結合ペプチド」とは、血清アルブミンに対して親和性を有し、それに結合するように機能する、１２〜１６アミノ酸のアミノ酸配列をいう。アルブミン結合ペプチドは、異なる起源、例えば、ヒト、マウス、又はラットのものであり得る。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ペプチドは配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号２）を有する。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、用語「フィブロネクチンドメイン」とは、例えばインテグリンなどの膜貫通受容体タンパク質ならびにコラーゲンやフィブリンなどの細胞外マトリックス成分に結合する、細胞外マトリックスの高分子量糖タンパク質又はその断片をいう。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  ＮＯ：Ｐ０２７５１の配列のアミノ酸６１０〜７０２を有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（配列番号３０）である。他の実施形態では、フィブロネクチンドメインはアドネクチンタンパク質である。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、用語「ヒト血清アルブミン」は、ヒト血漿中に存在するアルブミンタンパク質をいう。ヒト血清アルブミンは、血中で最も豊富なタンパク質である。これは血清タンパク質の約半分を構成する。いくつかの実施形態では、ヒト血清アルブミンは、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  ＮＯ：Ｐ０２７６８（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）の配列を有する。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、用語「リンカー」とは、２つの要素間、例えばタンパク質ドメイン間の結合をいう。リンカーは、共有結合又はスペーサーであり得る。「結合」という用語は、化学結合、例えばアミド結合又はジスルフィド結合、もしくは化学反応、例えば化学的共役から生じる任意の種類の結合を指す。用語「スペーサー」は、２つのポリペプチド又はポリペプチドドメインの間に存在してその２つのポリペプチド又はポリペプチドドメインの間に空間及び／又は柔軟性を提供する部分（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー）又はアミノ酸配列（例えば、３〜２００アミノ酸配列）を指す。アミノ酸スペーサーは、ポリペプチドの一次配列の一部であり得る（例えば、間隔のあいたポリペプチド又はポリペプチドドメインに、ポリペプチド主鎖を介して連結される）。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、用語「結合された」は、化学的共役、組換え手段、及び化学結合、例えばジスルフィド結合及びアミド結合を含む手段による、２つ以上の要素、成分、又はタンパク質ドメイン、例えばポリペプチドの組み合わせ又は付着を記載するために使用される。例えば、化学的共役、化学結合、ペプチドリンカー、又は任意の他の共有結合手段を介して、２つの単一ポリペプチドを結合して１つの一繋がりのタンパク質構造を形成することができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ペプチドリンカーによってＧＤＮＦ改変体に結合され、ここで、ペプチドリンカーのＮ末端は、化学結合、例えばペプチド結合を介してＦｃドメインのＣ末端に結合され、ペプチドリンカーのＣ末端は化学結合、例えばペプチド結合を介してＧＤＮＦ改変体のＮ末端に結合している。他の実施形態では、アルブミン結合ペプチドのＣ末端は、上記と同じ様式でリンカーを介してＧＤＮＦ改変体のＮ末端に連結されている。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、用語「ヒトＧＤＮＦファミリー受容体α−１（ＧＦＲα１）」とは、少なくとも４つのメンバー：ＧＦＲα１、ＧＦＲα２、ＧＦＲα３、及びＧＦＲα４からなるＧＤＮＦファミリー受容体αサブタイプに属する細胞表面タンパク質に連結されたグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）を指す。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、用語「結合親和性」とは、２つの分子間の結合相互作用の強度を指す。一般に、結合親和性とは、分子とその結合パートナー、例えば本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドとその標的受容体（例えば、ヒトＧＤＮＦファミリー受容体α−１（ＧＦＲα１））との間の非共有相互作用の合計の強度を指す。特に明記しない限り、結合親和性は、結合対のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。２つの分子間の結合親和性は一般的に解離定数（ＫＤ）又は親和定数（ＫＡ）によって表される。互いに低い結合親和性を有する２つの分子は、一般的にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があり、大きいＫＤを示す。互いに高い親和性を有する２つの分子は、一般的に容易に結合し、より長く結合したままである傾向があり、小さいＫＤを示す。２つの相互作用分子のＫＤは、当技術分野において周知の方法及び技術、例えば表面プラズモン共鳴を使用して決定することができる。ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算される。具体的な例示的実施形態が本明細書にさらに記載されている（例えば実施例２参照）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、例えば２０〜２０，０００ｐＭのＫＤでヒトＧＤＮＦファミリー受容体アルファ−１（ＧＦＲα１）に結合する。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、用語「血清半減期」は、対象への治療用タンパク質の投与に関して、そのタンパク質の対象における血漿濃度が半減するのに必要とされる時間を指す。タンパク質は血流から再分配されるか、除去されるか、又は分解、すなわちタンパク質分解され得る。例えば、ＧＤＮＦ改変体を含む本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、タンパク質分解性切断部位（すなわち、配列番号１のアミノ酸８５〜１２０）を除去されているか、又はタンパク質分解性切断部位内にアミノ酸置換を含み、野生型ヒトＧＤＮＦよりも長い血清半減期を有する。タンパク質の血清半減期は、当技術分野において周知の技術、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）（例えば、実施例４及び図２参照）、ウエスタンブロット、顕微鏡観察、及び質量分析法を用いて測定することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、例えば３〜６０日の血清半減期を有する。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、用語「タンパク質分解」とは、ペプチド骨格の加水分解によるタンパク質のより小さなポリペプチド又はアミノ酸への分解のプロセスをいう。野生型ヒトＧＤＮＦは、配列番号１のアミノ酸残基８５と１２０との間に潜在的なタンパク質分解性切断部位を含み、したがって短い血清半減期を有する。本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドが野生型ヒトＧＤＮＦと比較して減少したタンパク質分解及び増加した血清半減期を有するように、タンパク質分解性切断部位を欠失させるか又はタンパク質分解性切断部位内のアミノ酸置換を有するＧＤＮＦ改変体を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチド中のＧＤＮＦ改変体は、タンパク質分解性切断部位内でタンパク質分解性切断部位（すなわち、配列番号１のアミノ酸残基８５及び１２０）が欠失又は改変されている。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、用語「非塩基性アミノ酸」とは、その側鎖が、例えば生理学的ｐＨ、例えばｐＨ７．４において正電荷を有しないアミノ酸を指す。非塩基性アミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、プロリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸である。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、用語「単一のオープンリーディングフレーム」とは、宿主細胞の分子機構によって翻訳され単一のポリペプチドに発現され得る単一鎖中の核酸（すなわちＤＮＡ）残基の配置を指す。単一のオープンリーディングフレーム内の核酸残基は、連続して直列に配置されている１つ又は複数の遺伝子をコードすることができる。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、用語「核酸分子」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらのアナログであるか、もしくはＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼによって、あるいは合成反応によってポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。核酸分子は、メチル化ヌクレオチド及びそれらのアナログなどの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーアセンブリの完成前又は完成後に付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。核酸分子は、標識との結合などによって合成後にさらに修飾されてもよい。他の種類の修飾としては、例えば、天然に存在するヌクレオチドの１つ以上をアナログで置換すること、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）及び荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）でのヌクレオチド間修飾、ペンダント部分を含むもの、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジンなど）、インターカレーターを含むもの（例えばアクリジン、ソラレンなど）、キレート剤を含むもの（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属など）、アルキル化剤を含むもの、結合が修飾されたもの（例、アルファアノマー核酸など）、ならびに未修飾核酸分子の形態が挙げられる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基により置換されるか、標準的な保護基により保護されるか、又はさらなるヌクレオチドへのさらなる結合を調製するために活性化されるか、固体支持体又は半固体支持体に結合され得る。５’及び３’末端ＯＨはリン酸化されてもよく、又はアミンもしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換されていてもよい。他のヒドロキシルも標準的な保護基に誘導体化することができる。核酸分子はまた、当技術分野において一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖のアナログ形態、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル−、２’−フルオロ−、又は２’−アジド−リボース、炭素環式糖アナログ、α−アノマー糖、アラビノース、キシロース又はリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式アナログ及びメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシドアナログを含み得る。１つ以上のホスホジエステル結合は、代替の結合基によって置き換えられてもよい。これらの代替の連結基は、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、又はＣＨ２（「ホルムアセタール」）で置換されており、ここで、各Ｒ又はＲ’は独立してＨもしくは任意選択でエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、又はアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を含む置換又は非置換のアルキル（１〜２０Ｃ）である実施形態を含むが、こ���らに限定されない。核酸分子中の全ての結合が同一である必要はない。上記の説明は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む、本明細書で言及される全ての核酸分子に適用される。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」とは、モノマーがアミド結合を介して互いに結合しているアミノ酸残基である単一のポリマーを指す。ポリペプチドは、天然のもの、組換えのもの、及び合成的に製造されたもののいずれのアミノ酸配列も包含することを意図している。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、用語「治療及び／又は予防」は、本発明の方法及び組成物を使用した、疾患、例えば代謝性疾患（例えば肥満、１型及び２型糖尿病）又は神経疾患（例えばＡＬＳ及びパーキンソン病）の治療及び／又は予防を指す。一般に、代謝性疾患又は神経性疾患の治療は、対象が代謝性疾患又は神経性疾患を発症した後、及び／又は代謝性疾患又は神経性疾患と既に診断された後に行われる。代謝性疾患又は神経性疾患を予防することは、対象が代謝性疾患又は神経性疾患を発症する危険性があるときにとられるステップ又は手順を指す。対象は、代謝性疾患又は神経学的疾患を発症する徴候又は危険因子であることが医師によって判断される兆候又は軽度の症状を示し得るが、まだ疾患を発症していない。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、用語「代謝性疾患」は、食物中の炭水化物、タンパク質、及び脂肪を分解してエネルギーを放出し、化学物質を他の物質に変換し、エネルギー利用及び／又は貯蔵のために細胞内にそれらを輸送するといった対象の代謝に関連する疾患、障害、又は症候群を指す。代謝性疾患のいくつかの症状には、高い血清トリグリセリド、高い低密度コレステロール（ＬＤＬ）、低い高密度コレステロール（ＨＤＬ）、及び／又は空腹時インスリン値の上昇、空腹時血漿グルコースの上昇、腹部（中部）肥満、ならびに血圧の上昇が挙げられる。代謝性疾患は、心血管疾患などの他の疾患を発症するリスクを高める。本発明において、代謝性疾患としては、肥満、１型糖尿病、及び２型糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、用語「体重増加率」は、以前の時点における対象の以前の体重と比較した、増加した体重の割合を指す。体重増加率は次のように計算できる。
１００×［（後の時点の体重−前の時点の体重）／（前の時点の体重）］
本発明において、ＧＤＮＦ融合ポリペプチド、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、又はそのような核酸分子を含むベクターの対象への投与は、対象の体重増加率を減少させる（例えば、実施例５及び図３を参照のこと）。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、用語「食物摂取に対する食欲」は、対象の食物に対する自然な欲求又は必要性を指す。対象の食物摂取に対する食欲は、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドが投与された後に消費される食物の量を測定することによってモニタリングされ得る（例えば、実施例６及び図４を参照のこと）。本発明において、ＧＤＮＦ融合ポリペプチド、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、又はそのような核酸分子を含むベクターの対象への投与は、対象の食物摂取に対する食欲に影響を及ぼさない。
【００５１】
本明細書で使用されるとき、用語「脂肪症」は、対象の脂肪組織に貯蔵されている脂肪を指す。本発明において、ＧＤＮＦ融合ポリペプチド、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、又はそのような核酸分子を含むベクターを対象に投与することは、除脂肪量に影響を及ぼすことなく対象の脂肪症を軽減する。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、用語「除脂肪量」は、例えば除脂肪分、体脂肪、及び体液を含む体組成のうちの成分を指す。通常、除脂肪量は、総体重から体脂肪及び体液の重量を引くことによって計算される（例えば、実施例７及び図５参照）。典型的には、対象の除脂肪量は全体重の６０％〜９０％である。本発明では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチド、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、又はそのような核酸分子を含むベクターを対象に投与することで、除脂肪量に影響を与えることなく対象の脂肪症（すなわち脂肪）が減少する。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、用語「精巣上体及び腎周囲の脂肪体」とは、精巣上体及び腎臓周辺の密集した脂肪細胞を指す。本発明では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチド、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、又はそのような核酸分子を含むベクターを対象に投与することで、対象の精巣上体及び腎周囲の脂肪体の重量が減少する。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、用語「空腹時インスリン」とは、対象がある期間（すなわち、１２〜２４時間）にわたって食物摂取を全くしていない間の対象のインスリンレベルをいう。空腹時インスリン値は代謝性疾患の診断に使用される。空腹時インスリンレベルは、対象が代謝性疾患を発症する危険性があるかどうかの指標としても使用される。通常、１型糖尿病に罹患している対象において、対象の空腹時インスリンレベルは健康な対象のそれと比較して低い。インスリン抵抗性（すなわち、２型糖尿病）に罹患している対象において、対象の空腹時インスリンレベルは健康な対象のそれと比較して高い。本発明において、ＧＤＮＦ融合ポリペプチド、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、又はそのような核酸分子を含むベクターを対象に投与することで、対象の空腹時インスリンレベルが低下する。
【００５５】
本明細書で使用されるとき、用語「グルコースクリアランス速度」は、グルコースが血液から除去される速度を指す。グルコースクリアランス速度は、グルコース負荷試験（ＧＴＴ）で測定することができる（例えば、実施例８及び図６を参照のこと）。ＧＴＴでは、対象に一定量のグルコースを投与し、その後血液試料を採取して、それが血液からどれだけ早く除去されるかを決定する。グルコースクリアランス速度は、肥満、糖尿病、及びインスリン抵抗性などの代謝性疾患を発症するリスクを診断及び／又は決定する際のパラメータとして使用することができる。
【００５６】
本明細書で使用されるとき、用語「血清脂質プロファイル」とは、対象の血清中の様々な種類の脂質及びリポタンパク質の分布の測定をいう。そのような測定は、一揃いの血液検査によって達成され得る。対象の血清中の脂質及びリポタンパク質の種類としては、コレステロール（例えば、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ））、トリグリセリド、及び遊離脂肪酸（ＦＦＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。様々な種類の脂質及びリポタンパク質の分布は、肥満、糖尿病、及びインスリン抵抗性などの代謝性疾患を発症する危険性を診断及び／又は決定する際のパラメータとして使用することができる。高レベルのコレステロール、特に低密度リポタンパク質は、一般的に特定の代謝性疾患を、又はいくつかの重度の医学的症例では心血管疾患を発症する兆候又は危険因子と見なされている。本発明では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチド、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、又はそのような核酸分子を含むベクターを対象に投与することで、コレステロールレベル（特に低密度リポタンパク質）及びトリグリセリドが低下するように対象の血清脂質プロファイルが改善される。
【００５７】
本明細書で使用されるとき、用語「流体力学的注入」とは、目的のタンパク質（例えば、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチド）をコードする核酸分子を含有する操作プラスミド（例えば、ウイルスプラスミド）を大量の液体によって迅速に対象に静脈内注射するインビボ遺伝子送達方法を指す。流体力学的注入は、静脈内の制御された流体力学的圧力を使用して細胞透過性を高め、その結果、大量の流体を迅速に注入することに由来する高圧が、静脈からの流体及びプラスミドの血管外遊出をもたらす。一般に、核酸分子は、操作されたプラスミド中の強力なプロモーターの制御下に置かれる。核酸分子の発現は主に肝臓によって促進される。マウスでは、流体力学的注入はしばしば尾静脈へのプラスミドの注射によって行われる。
【００５８】
本明細書で使用されるとき、用語「配列同一性パーセント（％）」とは、最大の配列同一性パーセントを達成するように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の（すなわち、ギャップは最適なアラインメントのために候補配列及び参照配列の一方又は両方に導入することができ、非相同配列は、比較目的のために無視することができる）、参照配列（例えば野生型ヒトＧＤＮＦ）のアミノ酸（又は核酸）と同一である候補配列（例えばＧＤＮＦ改変体の配列）のアミノ酸（又は核酸）残基の百分率を指す。同一性パーセントを決定する目的のための整列は、例えばＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。いくつかの実施形態では、所与の参照配列に対する所与の候補配列（あるいは、所与の参照配列に対し、あるアミノ酸（又は核酸）同一性パーセントを有する又は含む所与の候補配列と言い換えることができる）のアミノ酸（又は核酸）配列同一性パーセントは、以下のように計算される。
【００５９】
１００×（分数Ａ／Ｂ）
ここで、Ａは候補配列と参照配列とのアラインメントにおいて同一と評価されたアミノ酸（又は核酸）残基の数であり、Ｂは参照配列のアミノ酸（又は核酸）残基の総数である。候補配列の長さが参照配列の長さと等しくないいくつかの実施形態では、参照配列に対する候補配列のアミノ酸（又は核酸）配列同一性パーセントは、候補配列に対する参照配列のアミノ酸（又は核酸）配列同一性パーセントと等しくないであろう。
【００６０】
特定の実施形態では、候補配列との比較のために整列された参照配列は、候補配列の全長又は連続するアミノ酸（又は核酸）残基の選択された部分にわたって候補配列が５０％〜１００％の同一性を示すことを示し得る。比較目的のために整列される候補配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％である。候補配列中の位置が参照配列中の対応する位置と同じアミノ酸（又は核酸）残基によって占められている場合、それらの分子はその位置では同一である。
【００６１】
本明細書で使用されるとき、用語「参照ＧＤＮＦ配列」とは、他の配列、すなわちＧＤＮＦ改変体の配列と比較して、例えばＧＤＮＦ改変体の配列の参照ＧＤＮＦ配列に対する配列同一性パーセントを計算することができる塩基配列を指す。参照ＧＤＮＦ配列のアミノ酸（又は核酸）残基の総数は、典型的にはそのような比較において使用される。上記の式において、１００×（分数Ａ／Ｂ）は、参照配列、例えば参照ＧＤＮＦ配列に対する候補配列、例えばＧＤＮＦ改変体の配列の配列同一性パーセントを算出し、ＡはＧＤＮＦ改変体の配列中の、参照ＧＤＮＦ配列中の対応する位置にある残基と同一のアミノ酸（又は核酸）残基の数であり、Ｂは参照ＧＤＮＦ配列のアミノ酸（又は核酸）残基の総数である。
【００６２】
本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」とは、タンパク質をそれらの対応する核酸から発現するのに必要とされる必須の細胞成分、例えば、細胞小器官を含む媒体を指す。核酸は、典型的には、当該分野で公知の従来技術（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなど）によって宿主細胞に導入することが可能な核酸ベクターに含まれる。宿主細胞は原核細胞、例えば細菌細胞、又は真核細胞、例えば哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）であり得る。本明細書に記載されるように、宿主細胞は、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子を発現するために使用される。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」とは、それに結合している別の核酸分子を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１種は「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントを連結することができる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはファージベクターである。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。ある種のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌性ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（又は単に「組換えベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。いくつかの実施形態において、ベクターは、複数のＧＤＮＦ融合ポリペプチドの発現を可能にする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。本発明のいくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子のｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子送達及び発現に使用される。遺伝子送達のためのウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）などのワクシニアウイルスベクター）、アデノ随伴ウイルスベクター、及びアルファウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語「対象」は哺乳動物、例えば好ましくはヒトを指す。哺乳動物には、ヒト、ならびにサル（例えば、カニクイザル）、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシなどの家庭動物及び家畜などが含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書で使用されるとき、用語「医薬組成物」は、活性成分ならびにその活性成分を投与方法に適したものにするための賦形剤及び希釈剤を含有する医薬又は医薬製剤を指す。本発明の医薬組成物は、ＧＤＮＦ融合ポリペプチド、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、又はそのような核酸分子を含むベクターと適合性のある薬学的に許容される成分を含む。医薬組成物は、静脈内又は皮下投与用には水性の形態であり得、経口投与用には錠剤又はカプセルの形態であり得る。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、用語「薬学的に許容される担体」とは、医薬組成物中の賦形剤又は希釈剤を指す。薬学的に許容される担体は、製剤の他の成分と親和性でなければならず、レシピエントに有害であってはならない。本発明において、薬学的に許容される担体は、ＧＤＮＦ融合ポリペプチド、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子、又はそのような核酸分子を含むベクターに適切な薬学的安定性を提供しなければならない。担体の性質は投与方法によって異なる。例えば、静脈内投与のためには、水溶液担体が一般的に使用される。経口投与のためには、固体担体が好まれる。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、用語「治療有効量」とは、対象又は患者において所望の生物学的効果を誘導するのに、又は患者が本明細書に記載の症状又は疾患を有するのを治療及び／又は予防するのに有効な量、例えば医薬用量を指す。また、本明細書において、「治療有効量」は、単独で又は他の治療薬と組み合わせて摂取され、１用量もしくは任意の用量又は経路で摂取されて、所望の治療効果を与える量として解釈され得ることもまた理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ】本発明の様々なＧＤＮＦ融合ポリペプチド（融合ポリペプチド１〜５、実施例１参照）の発現を示すウエスタンブロットである。
【図１Ｂ】３つのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルの説明図であり、それぞれ融合ポリペプチド２、３、及び４の還元条件下又は非還元条件下における発現を示す。
【図２】マウスにおけるＧＤＮＦ融合ポリペプチドの血清濃度を示す４つのグラフを示す図である。
【図３】ＧＤＮＦ融合ポリペプチド６の体重に対する効果を示す２つのグラフを示す図である。
【図４】ＧＤＮＦ融合ポリペプチド６の食物摂取に対する効果を示す棒グラフである。
【図５】ＧＤＮＦ融合ポリペプチド６の体組成に対する効果を示す２つのグラフを含む。
【図６】ＧＤＮＦ融合ポリペプチド６のグルコースクリアランス速度に対する効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本発明は、治療用タンパク質としてグリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）融合ポリペプチドを調製する組成物及び方法を特徴とする。本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、ヒトＧＤＮＦファミリー受容体アルファ−１（ＧＦＲα１）に結合し、長い血清半減期を有する。本発明はまた、肥満ならびに１型及び２型糖尿病などの代謝疾患、ならびに統合失調症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、不安、脳卒中、脳腫瘍、脳転移などの神経疾患を治療及び／又は予防するためのこれらのＧＤＮＦ融合ポリペプチドの医薬組成物及び使用方法を特徴とする。
【００７０】
Ｉ．ＧＤＮＦ融合ポリペプチド
一般に、本発明は式Ａ−Ｌ−Ｂを有するＧＤＮＦ融合ポリペプチドを特徴とし、ここで、Ａは、ＧＤＮＦ改変体のＮ末端に直接又はリンカーによって結合されたＦｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、又はヒト血清アルブミンを含む。好ましい実施形態では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドは単一のオープンリーディングフレームによってコードされる。いくつかの実施形態では、ＡがＦｃドメインを含む場合、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、ＦｃドメインのＮ末端に直接又はリンカーによって結合されたアルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、又はヒト血清アルブミンをさらに含む。
【００７１】
特定の実施形態では、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、３〜６０日の血清半減期を有する。他の実施形態では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、２０〜２０，０００ｐＭのＫＤでヒトＧＤＮＦファミリー受容体アルファ−１（ＧＦＲα１）に結合する。
【００７２】
ＩＩ．ＧＤＮＦ改変体
ＧＤＮＦ改変体は、野生型ヒトＧＤＮＦ（配列番号１）の改変体又は断片を含有するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦ改変体は、配列番号１のアミノ酸１１８〜２１１、１１７〜２１１、１１０〜２１１、９２〜２１１、又は７８〜２１１を含む参照ＧＤＮＦ配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性）を有する。野生型ヒトＧＤＮＦのアミノ酸配列を以下に示す。
【００７３】
【化１】
2019535267.tif 000002
【００７４】
ヒトＧＤＮＦのアミノ酸７８〜２１１は、ＧＤＮＦ機能ドメインを形成する。特定の実施形態では、ＧＤＮＦ改変体は、配列番号１のアミノ酸９２〜２１１又はその断片からなる。いくつかの実施形態では、ＧＤＮＦ改変体は、配列番号１のアミノ酸１１８〜２１１、アミノ酸１１７〜２１１、アミノ酸１１０〜２１１、アミノ酸９２〜２１１、又はアミノ酸７８〜２１１からなる。
【００７５】
野生型ヒトＧＤＮＦは、配列番号１のアミノ酸８５と１２０の間の辺りにある潜在的なタンパク質分解性切断部位を含む。ＧＤＮＦのこの部位は、タンパク質分解及びさらなる分解をしやすくする。したがって、野生型ヒトＧＤＮＦは、例えば１０分未満の短い血清半減期を示すことが多い（例えば、Ｂｏａｄｏら、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ．３７：２２９９−３０４，２００９のＦｉｇ．４を参照）。
【００７６】
タンパク質の血清半減期を改善するために、ＧＤＮＦ改変体のタンパク質分解性切断部位を欠失させることができる。他の実施形態では、ＧＤＮＦ改変体は、野生型ヒトＧＤＮＦに対して、潜在的なタンパク質分解部位内（すなわち、配列番号１のアミノ酸残基８５と１２０の間）でのタンパク質分解を減少させるアミノ酸置換を含む。そのようなアミノ酸置換は、タンパク質分解性切断部位における荷電アミノ酸、例えばアルギニン及びリジンを非塩基性アミノ酸に置換することを含む。非塩基性アミノ酸に置換することができるアミノ酸８５と１２０の間の荷電アミノ酸、例えばアルギニン及びリジンは、Ｒ８８、Ｒ８９、Ｒ９１、Ｒ９３、Ｒ１０４、Ｋ１０６、Ｒ１０８、Ｒ１０９、Ｒ１１２、Ｋ１１４、及びＲ１１６を含む。これらのアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、プロリン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸などの非塩基性アミノ酸に置換することができる。
【００７７】
上記のＧＤＮＦ改変体を含むＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、例えば３〜６０日という長い血清半減期を示し、ＧＦＲα１に対する所望の結合親和性、例えば２０〜２０，０００ｐＭのＫＤを維持する。
【００７８】
ＩＩＩ．Ｆｃドメイン
本発明において、「Ｆｃドメイン」は、少なくともＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むヒトＦｃドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、又は１００％の配列同一性）を有するタンパク質を指す。任意選択で、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメイン二量体化を低減又は阻害する１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。任意選択で、Ｆｃドメインはヒンジドメインを含む。Ｆｃドメインは、免疫グロブリン抗体アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、又はＩｇＤのものであり得る。さらに、Ｆｃドメインは、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）であり得る。Ｆｃドメインはまた、天然に存在しないＦｃドメイン、例えば組換えＦｃドメインであり得る。
【００７９】
二量体化が減少したＦｃドメインを操作する方法は当技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、大きい側鎖を有する１つ以上のアミノ酸（例えば、チロシン又はトリプトファン）をＣＨ３−ＣＨ３二量体界面に導入して、立体的衝突による二量体形成を妨げることができる。他の実施形態では、小さい側鎖を有する１つ以上のアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、又はスレオニン）をＣＨ３−ＣＨ３二量体界面に導入して、好ましい相互作用を除去することができる。大きい側鎖又は小さい側鎖を有するアミノ酸をＣＨ３ドメインに導入する方法は、例えば、Ｙｉｎｇら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８７：１９３９９−１９４０８，２０１２）、米国特許公開第２００６／００７４２２５号、米国特許第８，２１６，８０５号及び第５，７３１，１６８号、Ｒｉｄｇｗａｙら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：６１７−６１２，１９９６）、Ａｔｗｅｌｌら（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２７０：２６−３５，１９９７）、及びＭｅｒｃｈａｎｔら（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：６７７−６８１，１９９８）に記載されており、これらは全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８０】
さらに他の実施形態では、２つのＦｃドメイン間のＣＨ３−ＣＨ３界面を構成するＣＨ３ドメイン中の１つ以上のアミノ酸残基が、正に荷電したアミノ酸残基（例えば、リジン、アルギニン、又はヒスチジン）又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）で置換され、導入された特定の荷電アミノ酸に応じて、相互作用が静電的に不都合になる。二量体形成を不利にするか又は防止するためにＣＨ３ドメインに荷電アミノ酸を導入する方法は、例えば、Ｙｉｎｇら（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８７：１９３９９−１９４０８，２０１２）、米国特許出願公開第２００６／００７４２２５号、同第２０１２／０２４４５７８号、及び同第２０１４／００２４１１１号に記載されており、これらは全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００８１】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、以下のアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む：ヒトＩｇＧ１の配列に対して、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｖ、Ｌ３５１Ｔ、Ｌ３５１Ｈ、Ｌ３５１Ｎ、Ｌ３５２Ｋ、Ｐ３５３Ｓ、Ｓ３５４Ｄ、Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｄ３５６Ｓ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｅ３５７Ｑ、Ｓ３６４Ａ、Ｔ３６６Ｅ、Ｌ３６８Ｔ、Ｌ３６８Ｙ、Ｌ３６８Ｅ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｑ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｔ３９４Ｎ、Ｐ３９５Ｎ、Ｐ３９６Ｔ、Ｖ３９７Ｔ、Ｖ３９７Ｑ、Ｌ３９８Ｔ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｎ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｈ、Ｆ４０５Ｒ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ｈ、Ｙ４０７Ｉ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｔ、及びＫ４０９Ｉ。特定の一実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１の配列に対して、アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含む。野生型Ｆｃドメインの配列は、配列番号３に示されている。
【００８２】
ＩＶ．アルブミン結合ペプチド
血清タンパク質ペプチドへの結合は、タンパク質医薬品の薬物動態を改善することができ、特に本明細書に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、血清タンパク質結合ペプチドと結合され得る。
【００８３】
一例として、本明細書に記載の方法及び組成物に使用することができるアルブミン結合ペプチドは、当技術分野において一般的に知られている。一実施形態では、アルブミン結合ペプチドは配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号２）を含む。
【００８４】
本発明において、アルブミン結合ペプチドは、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチド中のＦｃドメインのＮ末端に連結されて、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドの血清半減期を延長し得る。アルブミン結合ペプチドは、直接又はリンカーを介して、ＦｃドメインのＮ末端に結合させることができる。他の実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、直接又はリンカーを介して、ＧＤＮＦ改変体のＮ末端に結合される。
【００８５】
アルブミン結合ペプチドは、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドに遺伝的に融合させることができるか、又は化学的手段により、例えば化学的共役によりＧＤＮＦ融合ポリペプチドに結合させることができる。必要に応じて、スペーサーをＧＤＮＦ融合ポリペプチドとアルブミン結合ペプチドとの間に挿入することができる。理論に縛られるものではないが、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドにアルブミン結合ペプチドを含めることで、治療用タンパク質の血清アルブミンへの結合を介して治療用タンパク質の長期保持をもたらし得ることが予想される。
【００８６】
Ｖ．フィブロネクチンドメイン
フィブロネクチンドメインへの結合は、タンパク質医薬品の薬物動態を改善することができ、特に本明細書に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、フィブロネクチンドメインと結合され得る。
【００８７】
フィブロネクチンドメインは、細胞外マトリックスの高分子量糖タンパク質、又はその断片であり、例えば、インテグリンなどの膜貫通型受容体タンパク質、ならびにコラーゲン及びフィブリンなどの細胞外マトリックス成分に結合する。本発明のいくつかの実施形態において、フィブロネクチンドメインは、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチド中のＦｃドメインのＮ末端に連結されて、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドの血清半減期を延長させる。フィブロネクチンドメインは、直接又はリンカーを介して、ＦｃドメインのＮ末端に結合させることができる。他の実施形態では、フィブロネクチンドメインは、直接又はリンカーを介して、ＧＤＮＦ改変体のＮ末端に結合される。
【００８８】
一例として、本明細書に記載の方法及び組成物に使用することができるフィブロネクチンドメインは、当技術分野において一般的に知られている。一実施形態では、フィブロネクチンドメインは、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  ＮＯ：Ｐ０２７５１の配列のアミノ酸６１０〜７０２を有するフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（配列番号３０）である。別の実施形態では、フィブロネクチンドメインはアドネクチンタンパク質である。
【００８９】
フィブロネクチンドメインは、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドに遺伝的に融合させることができるか、又は化学的手段により、例えば化学的共役によりＧＤＮＦ融合ポリペプチドに結合させることができる。必要に応じて、スペーサーをＧＤＮＦ融合ポリペプチドとフィブロネクチンドメインとの間に挿入することができる。理論に縛られるものではないが、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドにフィブロネクチンドメインを含めることで、インテグリンならびに細胞外マトリックス成分、例えばコラーゲン及びフィブリンへの治療用タンパク質の結合を介して治療用タンパク質の長期保持をもたらし得ることが予想される。
【００９０】
ＶＩ．血清アルブミン
血清アルブミンへの結合は、タンパク質医薬品の薬物動態を改善することができ、特に本明細書に記載のＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、血清アルブミンと結合され得る。
【００９１】
血清アルブミンは、哺乳動物において最も豊富な血液タンパク質である球状タンパク質である。血清アルブミンは肝臓で生成され、血清タンパク質の約半分を占める。それは単量体であり、血液に対し溶解性である。血清アルブミンの最も重要な機能のいくつかとして、体内でホルモン、脂肪酸、及び他のタンパク質を輸送すること、ｐＨを緩衝すること、及び血管と体組織との間に体液を適切に分配するのに必要な浸透圧を維持することが挙げられる。好ましい態様において、血清アルブミンはヒト血清アルブミンである。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト血清アルブミンは、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチド中のＦｃドメインのＮ末端に結合して、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドの血清半減期を延長する。ヒト血清アルブミンは、直接又はリンカーを介して、ＦｃドメインのＮ末端に結合させることができる。他の実施形態では、ヒト血清アルブミンは、直接又はリンカーを介して、ＧＤＮＦ改変体のＮ末端に結合される。
【００９２】
一例として、本明細書に記載の方法及び組成物に使用することができる血清アルブミンは、当技術分野において一般的に知られている。一実施形態では、血清アルブミンは、ＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤ  ＮＯ：Ｐ０２７６８（配列番号：３１）の配列を含む。
【００９３】
血清アルブミンは、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドに遺伝的に融合させることができ、又は化学的手段、例えば化学的共役によりＧＤＮＦ融合ポリペプチドに結合させることができる。必要に応じて、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドとヒト血清アルブミンとの間にスペーサーを挿入することができる。理論に縛られるものではないが、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドにヒト血清アルブミンを含めることで、治療用タンパク質の長期保持をもたらし得ることが予想される。
【００９４】
ＶＩＩ．リンカー
本発明において、リンカーは、ポリペプチド又はタンパク質ドメイン及び／又は関連する非タンパク質部分の間の連結又は結合を記載するために使用される。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｆｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、又はヒト血清アルブミンとＧＤＮＦ改変体との間の連結又は結合であり、そのためにリンカーはＦｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、又はヒト血清アルブミンのＣ末端をＧＤＮＦ改変体のＮ末端に繋いで、２つのポリペプチドを互いに直列に連結する。
【００９５】
リンカーは、単純な共有結合、例えばペプチド結合、合成ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー、又は化学反応、例えば化学的共役から生成される任意の種類の結合であり得る。リンカーがペプチド結合である場合、１つのタンパク質ドメインのＣ末端のカルボン酸基は、縮合反応において別のタンパク質ドメインのＮ末端のアミノ基と反応してペプチド結合を形成することができる。具体的には、ペプチド結合は、当技術分野で周知の従来の有機化学反応による合成手段から、又は宿主細胞から自然に産生させることによって形成することができ、ここで、核酸分子は両方のタンパク質、例えばＦｃドメイン及びＧＤＮＦ改変体が直列に並んだＤＮＡ配列をコードしたものであり、宿主細胞内で必要な分子機構、例えばＤＮＡポリメラーゼ及びリボソームによって直接転写され、両タンパク質をコードする一繋がりのポリペプチドに翻訳されることができる。
【００９６】
リンカーが合成ポリマー、例えばＰＥＧポリマーである場合、ポリマーは各末端で反応性化学官能基により官能化され、２つのタンパク質の結合端部の末端アミノ酸と反応することができる。
【００９７】
リンカー（上記のペプチド結合を除く）が化学反応から作製される場合、化学官能基、例えばアミン、カルボン酸、エステル、アジド、又は当技術分野で一般的に使用される他の官能基を一方のタンパク質のＣ末端及び他方のタンパク質のＮ末端にそれぞれ合成的に結合させることができる。次いで、２つの官能基を合成化学手段を介して反応させて化学結合を形成することにより、２つのタンパク質を互いに結合させることができる。そのような化学的共役操作は当業者にとって日常的である。
【００９８】
スペーサー
本発明において、Ｆｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、又はヒト血清アルブミンとＧＤＮＦ改変体との間のリンカーは、３〜２００個のアミノ酸を含むアミノ酸スペーサーであり得る。適切なペプチドスペーサーは当該分野で公知であり、例えば、グリシン及びセリンなどの柔軟なアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーが挙げられる。特定の実施形態では、スペーサーは、例えばＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧ（配列番号４）、ＧＧＧＧＳ（配列番号６）、ＧＧＳＧ（配列番号５）、ＧＧＳＧ（配列番号６）、又はＳＧＧＧ（配列番号７）といった複数又は反復モチーフなどのモチーフを含み得る。特定の実施形態では、スペーサーは、ＧＳのモチーフを含む２〜１２個のアミノ酸、例えばＧＳ、ＧＳＧＳ（配列番号８）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号９）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１０）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１１）、又はＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号１２）を含み得る。他の特定の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＳのモチーフを含む３〜１２個のアミノ酸、例えばＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１３）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１４）、及びＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１５）を含み得る。さらに他の実施形態では、スペーサーは、ＧＧＳＧ（配列番号１６）のモチーフを含む４〜１２個のアミノ酸、例えばＧＧＳＧ（配列番号１７）、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１８）、又はＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１９）を含み得る。他の実施形態では、スペーサーはＧＧＧＧＳ（配列番号２０）のモチーフ、例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２１）を含むことができる。他の実施形態では、スペーサーは、グリシン及びセリン以外のアミノ酸、例えばＧＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号２２）、ＧＥＮＬＹＦＱＳＧＧ（配列番号２３）、ＳＡＣＹＣＥＬＳ（配列番号２４）、ＲＳＩＡＴ（配列番号２５）、ＲＰＡＣＫＩＰＮＤＬＫＱＫＶＭＮＨ（配列番号２６）、ＧＧＳＡＧＧＳＧＳＧＳＳＧＧＳＳＧＡＳＧＴＧＴＡＧＧＴＧＳＧＳＧＴＧＳＧ（配列番号２７）、ＡＡＡＮＳＳＩＤＬＩＳＶＰＶＤＳＲ（配列番号２８）、又はＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号２９）も含み得る。本発明の特定の実施形態では、３又は９アミノ酸ペプチドスペーサーを用いて、Ｆｃドメイン、アルブミン結合ペプチド、フィブロネクチンドメイン、又はヒト血清アルブミン、及びＧＤＮＦ改変体を直列に結合する。それぞれ配列ＧＧＧ（配列番号４）及びＧＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号２２）からなる３及び９アミノ酸ペプチドスペーサー。ペプチドスペーサーの長さ及び使用されるアミノ酸は、関与する２つのタンパク質ドメイン及び最終的なタンパク質融合ポリペプチドに望まれる柔軟性の程度に応じて調整することができる。スペーサーの長さは、適切なタンパク質フォールディングを確実にし、凝集体形成を回避するように調節することができる。例えば、小さいＧＤＮＦ改変体（例えば、配列番号１のアミノ酸１１７〜２１１又は１１８〜２１１を有するＧＤＮＦ改変体）を、短いスペーサー（例えば、ＧＧＧ（配列番号４））ではなく、より長いスペーサー（例えば、配列ＧＧＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号２２）のスペーサー）に結合させてもよい。
【００９９】
ＶＩＩＩ．ベクター、宿主細胞、及びタンパク質生産
本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、宿主細胞から産生され得る。宿主細胞とは、本明細書に記載のポリペプチド及び融合ポリペプチドをそれらの対応する核酸から発現させるのに必要な必須の細胞成分、例えばオルガネラを含む媒体を指す。核酸は、宿主細胞に導入することができる核酸ベクターに、当技術分野において公知の従来技術（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、感染など）によって含ませてもよい。核酸ベクターの選択は部分的には使用される宿主細胞に依存する。一般に、好ましい宿主細胞は原核生物（例えば細菌）又は真核生物（例えば哺乳動物）起源のものである。
【０１００】
核酸ベクターの構築及び宿主細胞
本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列は、当該分野において公知の種々の方法によって調製され得る。これらの方法としては、オリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発及びＰＣＲ突然変異誘発が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子は、標準的な技術、例えば遺伝子合成を使用して得ることができる。あるいは、野生型ヒトＧＤＮＦをコードする核酸分子を、当技術分野における標準的な技術、例えばＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（商標）突然変異誘発を用いて、切断し及び／又は突然変異させて特定のアミノ酸置換を含むようにすることができる。核酸分子は、ヌクレオチド合成機又はＰＣＲ技術を用いて合成することができる。
【０１０１】
本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸配列は、原核生物又は真核生物宿主細胞において核酸分子を複製及び発現することができるベクターに挿入することができる。多くのベクターが当該分野で利用可能であり、本発明の目的のために使用され得る。各ベクターは、特定の宿主細胞との適合性について調整及び最適化され得る様々な構成要素を含み得る。例えば、ベクター成分は、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位、シグナル配列、目的のタンパク質をコードする核酸配列、及び転写終結配列を含み得るが、これらに限定されない。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞が本発明のための宿主細胞として使用される。哺乳動物細胞種の例としては、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｆ）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＰＣ３、Ｖｅｒｏ、ＭＣ３Ｔ３、ＮＳ０、Ｓｐ２／０、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、Ｔ４７Ｄ、ＮＳ０（内因的に免疫グロブリン鎖を産生しないネズミ骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ、及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態では、大腸菌細胞が本発明の宿主細胞として使用される。大腸菌株の例としては、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，４４６）、大腸菌λ１７７６（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，５３７、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ−１０２５）、及び大腸菌ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ（登録商標）３１，６０８）が挙げられるが、これらに限定されない。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセシング及びタンパク質産物の修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。発現されたＧＤＮＦ融合ポリペプチドの正しい修飾及びプロセシングを確実にするために適切な細胞株又は宿主系を選択することができる。上記の発現ベクターは、当技術分野における従来技術、例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、及び直接マイクロインジェクションを用いて適切な宿主細胞に導入することができる。ベクターをタンパク質産生のための宿主細胞に導入したら、宿主細胞を、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変された従来の栄養培地中で培養する。治療用タンパク質の発現方法は当技術分野において公知である。例えば、Ｐａｕｌｉｎａ  Ｂａｌｂａｓ、Ａｒｇｅｌｉａ  Ｌｏｒｅｎｃｅ（編））Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；第２版、２００４及びＶｌａｄｉｍｉｒ  ＶｏｙｎｏｖとＪｕｓｔｉｎ  Ａ．Ｃａｒａｖｅｌｌａ（編）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；第２版、２０１２を参照。
【０１０３】
タンパク質の産生、回収、及び精製
本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドを産生するために使用される宿主細胞は、当該分野で公知の、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖され得る。哺乳動物宿主細胞に適した培地の例には、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ、及びＲＰＭＩ−１６４０が挙げられる。細菌宿主細胞に適した培地の例には、ルリアブロス（ＬＢ）＋必要な補助剤、例えば選択剤、例えばアンピシリンが含まれる。宿主細胞は、約２０℃〜約３９℃、例えば２５℃〜約３７℃、好ましくは３７℃などの適切な温度、及び５〜１０％（好ましくは８％）などのＣＯ２レベルで培養される。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、通常約６．８〜７．４、例えば７．０である。誘導性プロモーターが本発明の発現ベクターにおいて使用される場合、タンパク質発現はプロモーターの活性化に適した条件下で誘導される。
【０１０４】
タンパク質回収は、典型的には、浸透圧ショック、超音波処理、又は溶解などの手段によって、宿主細胞を破壊することを含む。細胞が破壊されたら、細胞片を遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質はさらに精製され得る。ＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、タンパク質精製の分野で公知の任意の方法によって、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、及びサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度によって、又はタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって精製され得る。例えば、プロテインＡカラム（例えば、ＰＯＲＯＳプロテインＡクロマトグラフィー）及びクロマトグラフィーカラム（例えば、ＰＯＲＯＳ  ＨＳ−５０陽イオン交換クロマトグラフィー）などのアフィニティーカラム、濾過、限外濾過、塩析及び透析手順を適切に選択し、組み合わせることによって、タンパク質を単離及び精製することができる。いくつかの例において、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、精製を容易にするためにペプチドなどのマーカー配列に結合させることができる。マーカーアミノ酸配列の例は、ヘキサヒスチジンペプチド（Ｈｉｓタグ）であり、これは、マイクロモル濃度の親和性でニッケル官能化アガロースアフィニティーカラムに結合する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグが挙げられるが、これらに限定されない（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７、１９８４）。
【０１０５】
あるいは、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、例えば、遺伝子治療の状況において、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含有するベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）などのワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びアルファウイルスベクター）））を投与することによって、対象（例えば、ヒト）の細胞によって産生され得る。ベクターは、（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、感染などによって）対象の細胞内に入ると、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドの発現を促進し、それはその後細胞から分泌される。疾患又は障害の治療が望ましい結果である場合、それ以上の処置は必要ないかもしれない。タンパク質の回収が所望される場合、対象から血液が採取されてもよく、タンパク質が当該分野で公知の方法によってその血液から精製され得る。
【０１０６】
ＩＸ．医薬組成物及び製剤
本発明は、本明細書に記載の１つ以上のＧＤＮＦ融合ポリペプチドを含む医薬組成物を特徴とする。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、治療用タンパク質として本発明の１つ以上のＧＤＮＦ融合ポリペプチドを含む。他の実施形態では、１つ以上のＧＤＮＦ融合ポリペプチドを含有する本発明の医薬組成物は、治療において他の薬剤（例えば、治療用生物製剤及び／又は小分子）又は組成物と組み合わせて使用され得る。ＧＤＮＦ融合ポリペプチドの治療有効量に加えて、医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を含有してもよく、それらは当業者に公知の方法によって製剤化することができる。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の１つ以上のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子（ＤＮＡ又はＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）、又はそのような核酸分子を含むベクターを含む。
【０１０７】
医薬組成物において許容される担体及び賦形剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒性である。許容される担体及び賦形剤には、リン酸塩、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、及びＴＡＥなどの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンなどの抗酸化剤、塩化ヘキサメトニウム、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、レゾルシノール、及び塩化ベンザルコニウムなどの保存剤、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、デキストラン、及び免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、ヒスチジン、及びリジンなどのアミノ酸、ならびにグルコース、マンノース、スクロース、及びソルビトールなどの炭水化物が含まれる。本発明の医薬組成物は注射用製剤の形態で非経口的に投与することができる。注射用医薬組成物は、無菌溶液又は任意の薬学的に許容される液体を媒体として用いて製剤化することができる。薬学的に許容される媒体としては、滅菌水、生理食塩水、及び細胞培養培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、α−改変イーグル培地（α−ＭＥＭ）、Ｆ−１２培地）が挙げられるが、これらに限定されない。製剤方法は当技術分野において公知であり、例えばＢａｎｇａ（編）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（第２版）Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００６）を参照のこと。
【０１０８】
本発明の医薬組成物は、ヒドロキシルメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルなどのマイクロカプセル中に調製することができる。本発明の医薬組成物はまた、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセルなどの他の薬物送達システム中に調製することもできる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ第２２版（２０１２）に記載されている。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される医薬組成物は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０１０９】
本発明の医薬組成物は徐放性製剤として調製することもできる。徐放性製剤の適切な例には、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ（商標）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。いくつかの徐放性製剤は、数ヶ月、例えば１〜６ヶ月にわたる分子の放出を可能にし、一方、他の製剤は、より短い期間、例えば、数日から数週間、本発明の医薬組成物を放出する。
【０１１０】
医薬組成物は、必要に応じて単位用量の剤形に形成することができる。医薬製剤中に含まれる活性成分、例えば本発明の１つ以上のＧＤＮＦ融合ポリペプチドの量は、指定された範囲内の適切な用量が提供されるようなものである（例えば、０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内の用量）。
【０１１１】
遺伝子治療のための医薬組成物は、許容される希釈剤中にあり得るか、又は遺伝子送達用媒体が埋め込まれている徐放性マトリックスを含み得る。流体力学的注入が送達方法として使用される場合、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子又はその核酸分子を含むベクター（例えば、ウイルスベクター）を含む医薬組成物は、大量の流体容量で静脈内に迅速に送達される。ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子送達用媒体として使用され得るベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、修飾ワクシニアアンカラなどのワクシニアウイルスベクター）、アデノ随伴ウイルスベクター、及びアルファウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１２】
Ｘ．経路、用量、及び投与
治療用タンパク質として本発明の１つ以上のＧＤＮＦ融合ポリペプチドを含む医薬組成物は、静脈内投与、非経口投与、皮下投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄腔内投与、又は腹腔内投与用に製剤化することができる。医薬組成物はまた、経口投与、経鼻投与、スプレー投与、エアロゾル投与、直腸投与、もしくは膣投与用に製剤化され得るか、又はそれらを介して投与され得る。注射用製剤について、様々な有効な医薬担体が当分野において知られている。例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州フィラデルフィア、Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｒｍｅｒｓ編、２３８〜２５０頁（１９８２年）、及びＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ、Ｔｏｉｓｓｅｌ、第４版、６２２〜６３０頁（１９８６）を参照のこと。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本発明の１つ以上のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子又はそのような核酸分子を含むベクターを含む医薬組成物は、遺伝子送達によって投与され得る。遺伝子送達の方法は当業者に周知である。ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子送達及び発現のために使用され得るベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター（例えば、修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）などのワクシニアウイルスベクター）、アデノ随伴ウイルスベクター、及びアルファウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ベクターは、複数のＧＤＮＦ融合ポリペプチドの発現を可能にする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。特定の実施形態において、１つ以上のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子は、対象に直接投与され得る。
【０１１４】
本発明のいくつかの実施形態において、１つ以上のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子又はそのような核酸分子を含むベクターは、流体力学的注入プラットフォームを用いて投与され得る。流体力学的注入法では、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子は、遺伝子操作されたプラスミド（例えば、ウイルスプラスミド）中の強力なプロモーターの制御下に置かれる。プラスミドは静脈内に大量の液量で迅速に送達されることが多い。流体力学的注入は、静脈内の制御された流体力学的圧力を用いて細胞透過性を高め、その結果、大量の流体を急速に注入することによる高圧が、静脈からの流体及びプラスミドの血管外遊出をもたらす。核酸分子の発現は主に肝臓によって促進される。マウスでは、流体力学的注射はしばしば尾静脈へのプラスミドの注射によって行われる。特定の実施形態において、１つ以上のＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子は、流体力学的注入を用いて投与され得る。
【０１１５】
本発明の医薬組成物の用量は、投与経路、治療される疾患、及び対象の身体的特徴、例えば年齢、体重、全身の健康状態などの要因に依存する。典型的には、単回用量に含まれる本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドの量は、有意な毒性を誘発することなく疾患を効果的に予防、遅延、又は治療する量であり得る。本発明の医薬組成物は、０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５，１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００ｍｇ／ｋｇ）、より具体的な実施形態では約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇであり、より具体的な実施形態では、約１〜約３０ｍｇ／ｋｇである範囲の用量の本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドを含み得る。用量は、疾患の程度および対象の様々なパラメータなどの従来の要因に従って医師により適合され得る。
【０１１６】
医薬組成物は、剤形に適合する方法で、そして症状の向上又は改善をもたらすのに治療上有効であるような量で投与される。医薬組成物は、様々な剤形、例えば静脈内剤形、皮下剤形、及び経口剤形（例えば、摂取可能な溶液、薬物放出カプセル）で投与される。一般に、治療用タンパク質は０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば１〜５０ｍｇ／ｋｇで投与される。本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物は、それを必要とする対象に、例えば、毎日、毎週、毎月、隔年、毎年、又は医学的な必要に応じて１回以上（例えば１〜１０回又はそれ以上）投与され得る。用量は、単回投与計画又は複数回投与計画のいずれかで提供され得る。投与間隔は、病状が改善するにつれて減少し、又は患者の健康が低下するにつれて増加する。
【０１１７】
ＸＩ．兆候
本発明の医薬組成物及び方法は、代謝性疾患、例えば肥満及び糖尿病（１型及び２型糖尿病）、ならびに神経疾患などの病状を治療及び／又は予防するのに有用である。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物は、肥満の発症を予防するために、及び／又は既に肥満と診断された患者を治療するために使用され得る。例えば、対象への本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドの投与は、除脂肪量を維持しながら脂肪の量を減少させることにより対象の体重を減少させるのに役立ち得る（例えば、実施例５及び７参照）。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物は、糖尿病（例えば、１型及び２型糖尿病）の発症を予防するために及び／又は既に糖尿病と診断された患者を治療するために使用され得る。糖尿病を発症する可能性がある患者、例えば遺伝的素因、糖尿病の家族歴、他の自己免疫疾患との関連、又は他の代謝性疾患を有する個体には、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドによってβ細胞の正常な機能と健康を維持し、β細胞に対する自己免疫性炎症性損傷を予防又は遅延させるために、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドを予防的に投与してもよい。他の実施形態では、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドを含有する医薬組成物は、糖尿病（例えば、１型及び２型糖尿病）と診断される前又は糖尿病の臨床症状、例えば高血糖レベル、高空腹時インスリンレベル、インスリン抵抗性、多尿症、多飲、及び多食症を発症する前に個体に投与され得る。いくつかの実施形態において、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、患者がインスリンを必要とする前に患者に投与され得る。さらに他の実施形態において、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドの投与は、糖尿病患者におけるインスリン治療の必要性を遅らせるか又は延期することができる。例えば、対象への本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドの投与は、血液からのグルコースクリアランス速度を上げるのを助け得る（例えば、実施例８参照）。
【０１２０】
本発明の医薬組成物及び方法はまた、精神分裂病、てんかん、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、不安、卒中、脳腫瘍、及び脳転移を含むがこれらに限定されない神経疾患を治療するのに有用である。
【０１２１】
実施例
実施例１−ＧＤＮＦ融合ポリペプチドの発現
ＧＤＮＦ融合ポリペプチドの発現のために、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターを、エレクトロポレーションによってチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションした。タンパク質発現後、発現された融合ポリペプチドを、プロテインＡベースのアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。精製ＧＤＮＦ融合ポリペプチドを、抗ＧＤＮＦ抗体を用いてウエスタンブロットにより分析した。図１Ａは、５つのＧＤＮＦ融合ポリペプチドの発現を示す。
【０１２２】
融合ポリペプチド１：Ｆｃ−ｈＧＤＮＦ７８−２１１（配列番号３２）
融合ポリペプチド２：Ｆｃ−ＧＧＧ−ｈＧＤＮＦ９２−２１１（配列番号３３）
融合ポリペプチド３：Ｆｃ−ＧＧＧ−ｈＧＤＮＦ１１０−２１１（配列番号３４）
融合ポリペプチド４：Ｆｃ−ＧＧＧ−ｈＧＤＮＦ１１７−２１１（配列番号３５）
融合ポリペプチド５：Ｆｃ−ＧＧＧＧＡＧＧＧＧ−ｈＧＤＮＦ１１７−２１１（配列番号３６）
上記の各融合ポリペプチドは、単一のオープンリーディングフレームによってコードされている。５つの融合ポリペプチドのそれぞれを２日目及び６日目に分析した。図１Ａに示すように、潜在的なタンパク質分解性切断部位（すなわち、配列番号１のアミノ酸８５〜１２０）を含む融合ポリペプチド１は、６日目までに分解産物を生成するように見えた。
【０１２３】
融合ポリペプチド２、３及び４のそれぞれもまた、還元条件下又は非還元条件下のいずれかで分析した（図１Ｂ）。
実施例２−結合親和性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドのＧＦＲα１に対する結合親和性を決定した。この例におけるＧＤＮＦ融合ポリペプチドは、実施例１に記載の融合ポリペプチド２〜４、ならびに、配列番号１のアミノ酸１１７〜２１１を有するＧＤＮＦ改変体のＮ末端にＧＧＧリンカーを介して結合した（ヒトＩｇＧ１の配列に対して）アミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを有するＦｃドメインを有するＦｃ（Ｔ３６６Ｗ）−ＧＧＧ−ｈＧＤＮＦ１１７−２１１（配列番号３７）（融合ポリペプチド６）を含む。ＳＰＲアッセイは、Ｈｉｓタグ捕捉キット（ＧＥ）を用いてＣＭ５チップ表面上にヒトＧＦＲα１、ＧＦＲα２、及びＧＦＲα３Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を動態学的分析のための適切なレベルまで捕捉するように構成された。ＧＤＮＦ融合ポリペプチドを固定化ＧＦＲ上に流して、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドのカイネティクスならびにＧＦＲ会合及び解離を測定した。様々な濃度のＧＤＮＦ融合ポリペプチドの結合をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中で３０μＬ／分の流速で測定した。見かけの結合親和性及び速度定数を得るために、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２ソフトウェアを用いて結合曲線をフィッティングした。
【０１２４】
表１は、Ｃ末端がＦｃドメインに結合したヒトＧＤＮＦファミリー受容体アルファ−１（ＧＦＲα１）への結合について、本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチドの平衡解離定数ＫＤが８７０ｐＭ（融合ポリペプチド２）〜３．８ｎＭ（融合ポリペプチド４）の範囲であることを示す。
【０１２５】
【表１】
2019535267.tif 000003
【０１２６】
実施例３−ＧＦＲαｌレポーターアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ及び抗生物質を含有するＤＭＥＭ中、２０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルコラーゲンコートプレートに播種した。６時間後、製造者の指示に従ってＦｕｇｅｎｅ６を用いてｐＦＲ−Ｌｕｃ（６２．５ｎｇ）、ｐＦＡ−ＥＬＫ１（７．５ｎｇ）、ｈＲｅｔ（１０．５ｎｇ）及びＧＦＲαｌ（４．５ｎｇ）プラスミドを細胞にトランスフェクションした。翌日、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１％ＦＢＳを含有する新鮮なＤＭＥＭ中に６〜８時間置いた。次いで、細胞を表示濃度のＧＤＮＦ融合ポリペプチドで１６時間処理した。基質としてルシフェリン（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１２７】
実施例４−ｉｎ  ｖｉｖｏ血清濃度
本発明のＧＤＮＦ融合ポリペプチド２〜４（実施例１に記載）及び６（実施例２に記載）のｉｎ  ｖｉｖｏ血清濃度を測定するために、トランスジェニックマウス系統Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａのマウスに、ＧＤＮＦ融合ポリペプチドをコードする１０μｇの核酸分子を流体力学的注入により注入した。ＧＤＮＦ融合ポリペプチドの血清濃度は、注入後の異なる時点で、マウスから採取した血液試料を用いて、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。図２に示す結果は、半減期がマウスにおいて４８時間を超えることを示す。
【０１２８】
実施例５−体重に対する融合ポリペプチド６の効果
体重に対する融合ポリペプチド６（実施例２に記載）の効果を測定するために、トランスジェニックマウス系統Ｃ５７ＢＬ／６ＮＴａの３匹のマウスに、０．３、３．０又は１０．０ｍｇ／ｋｇの融合ポリペプチド６又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を０日目に腹腔内注射した。２〜３日ごとに３匹のマウスの平均体重を記録した。体重変化率も計算して記録した。図３は、融合ポリペプチド６による処理が用量依存的に体重を減少させたことを示す。
【０１２９】
実施例６−食物摂取に対する融合ポリペプチド６の効果
実施例５に記載したのと同じプロトコルを用いて、異なる投与量の融合ポリペプチド６又はＰＢＳを注入したマウスを食物摂取量（すなわち高脂肪食（ＨＦＤ））についてモニタリングした。１日の平均摂食量を０日目から２〜３日ごとに測定し記録した。図４は、融合ポリペプチド６による処理が食物摂取に対するマウスの食欲に有意な影響を及ぼさなかったことを示す。
【０１３０】
実施例７−体組成に対する融合ポリペプチド６の効果
実施例５に記載したものと同じプロトコルを用いて、異なる投与量の融合ポリペプチド６又はＰＢＳを注入したマウスの脂肪、除脂肪分、及び体液量の変化を注入後１８日目に測定した。
【０１３１】
ベースラインからの変化＝（脂肪、除脂肪分、又は体液の最終重量）−（脂肪、除脂肪分、又は体液の初期重量）
ベースラインからの変化率＝１００×［（最終重量−初期重量）／（初期重量）］
図５に示すように、融合ポリペプチド６による処理は、体内の除脂肪量に影響を与えることなく脂肪の量を有意に減少させ、これはマウスの体重減少が脂肪症の軽減に完全に起因することを示している。
【０１３２】
実施例８−グルコースクリアランス速度に対する融合ポリペプチド６の効果
実施例５に記載したものと同じプロトコルを用いて、異なる投与量の融合ポリペプチド６又はＰＢＳを注入したマウスをグルコース負荷試験（ＧＴＴ）に供した。５時間絶食後、マウスの空腹時血糖値を測定し記録した。マウスにＤ−グルコースを２ｇ／ｋｇ体重の用量で腹腔内注射した。血糖測定は、グルコース注射の１５、３０、６０、９０及び１２０分後に行った。全てのサンプルは尾静脈からの採血で採取し、グルコメーターで測定した。
【０１３３】
図６に示すように、融合ポリペプチド６による処理はグルコースクリアランス速度を有意に改善した。１０ｍｇ／ｋｇの融合ポリペプチド６を注射したマウスにおける血清グルコースのレベルは、２時間後にＧＴＴ前の血清グルコースの初期レベルに戻った。
【０１３４】
他の実施形態
本発明をその特定の実施形態に関連して説明してきたが、それはさらなる変更が可能であること、また、本出願は以下の本発明の、概して発明の原理の任意の変形、使用又は適応を包含することを意図するものであることが理解されよう。本発明及び本開示からのそのような逸脱を含む本発明は、本発明が属する技術分野内の既知の又は慣習的な慣例の範囲内であり、上記の本質的な特徴に適用することができる。
【０１３５】
全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それら個々の刊行物、特許又は特許出願が全体として参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
他の実施形態は添付の特許請求の範囲内にある。
【図１Ａ】
2019535267.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2019535267.tif 000010
【配列表】
2019535267000001.app
【国際調査報告】
2019535267.tif 000011
2019535267.tif 000012
2019535267.tif 000013