(57)【要約】  本発明はがんの予後コンパニオン後成的試験に関連する後成的染色体相互作用を判定する方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サブグループ間を区別するがんの予後コンパニオン後成的試験に関連する後成的染色体相互作用を決定する方法であって、
サブグループからの核酸の第１セットを、染色体相互作用のインデックス集団を代表する核酸の第２セットと接触させ、
そして相補配列をハイブリダイズさせることを含み、
前記核酸の第１および第２セット中の前記核酸が一緒になって後成的染色体相互作用をする染色体領域の両方からの配列を含むライゲート産物を表し、
前記核酸の第１および第２セット間のハイブリダイゼーションの前記パターンによって、どの後成的染色体相互作用が前記集団におけるサブグループに対して特異的であるかを判定することが可能になり、前記サブグループは、予後に関連する少なくとも１つの特性が異なり、
ここで：
（ｉ）前記サブグループは、チロシンキナーゼ阻害剤療法に対する応答性に関して異なる、および／または
（ｉｉ）前記がんは、キナーゼ遺伝子および／またはチロシンキナーゼ遺伝子からの異常発現に関連する、および／または
（ｉｉｉ）前記がんは、以下の遺伝子：ＦＩＰ１Ｌ１、ＰＤＧＦＲＡ、Ｆｌｔ３、ＡＢＬ１、ＦＧＦＲ１およびｃＫＩＴの１以上における遺伝子変化または後成的変化と関連する、方法。
【請求項２】
−前記サブグループが、前記ヒト集団のサブグループである、および／または
−前記核酸の第１セットが少なくとも８個体由来である；および／または
−前記核酸の第１セットが、好ましくは前記第１サブグループとオーバーラップしない第１のサブグループからの少なくとも４個体および第２サブグループからの少なくとも４個体由来である、および／または
−前記核酸の第２セットが染色体相互作用の非選択群を表す、および／または
−前記核酸の第２セットが所定の位置でアレイに結合する、および／または
−前記核酸の第２セットが少なくとも１００の異なる遺伝子または座における染色体相互作用を表す、および／または
−前記核酸の第２セットが少なくとも１０００の異なる後成的染色体相互作用を表す少なくとも１０００の異なる核酸を含む、および／または
−前記核酸の第１セットおよび前記核酸の第２セットが１０〜１００ヌクレオチド塩基の長さの核酸配列を含む、および／または
−前記核酸の第１セットが少なくとも２つのサブグループ由来であり、そのうちの１つは所定の遺伝子変化または後成的変化を有し、もう１つは前記遺伝子変化または後成的変化を有さず、前記プロセスは、どちらの染色体相互作用が前記遺伝子変化に関連するか、および／または前記遺伝子変化によって影響を受けるかを決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サブグループの２以上ががんを有するが、前記がんが：
（ｉ）キナーゼ遺伝子および／またはチロシンキナーゼレセプター遺伝子からの発現および／またはキナーゼ遺伝子および／またはチロシンキナーゼレセプター遺伝子における変異からの発現、および／または
（ｉｉ）以下の遺伝子：ＦＩＰ１Ｌ１、ＰＤＧＦＲＡ、Ｆｌｔ３、ＡＢＬ１、ＦＧＦＲ１およびｃＫＩＴの１以上と関連する少なくとも１つの後成的染色体相互作用の有無、および／または
（ｉｉｉ）特定の治療および／または予防（特に特異的薬品治療および／または予防）に対する応答
に関して異なる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記キナーゼ遺伝子が細胞質／レセプターキナーゼ遺伝子、好ましくはチロシンキナーゼ遺伝子またはセリン／トレオニンキナーゼ遺伝子である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記サブグループがチロシンキナーゼ阻害剤治療に対して応答し：
（ｉ）場合によって、前記チロシンキナーゼレセプターが成長因子レセプターＡ由来の血小板（ＰＤＧＦＲＡ）であるチロシンキナーゼレセプターの上方調節を有する、および／または
（ｉｉ）前記ライゲート産物がチロシンキナーゼレセプター由来の配列を含む第１核酸に対応する、および／または
（ｉｉｉ）前記ライゲート産物がＦＩＰ１Ｌ１およびＰＤＧＦＲＡの両方由来の配列を含む第１核酸に対応する、および／または
（ｉｖ）前記ライゲート産物が以下の遺伝子：ＦＩＰ１Ｌ１、ＰＤＧＦＲＡ、Ｆｌｔ３、ＡＢＬ１、ＦＧＦＲ１、ｃＫＩＴの１以上由来の配列を含む第１核酸に対応し、場合によって、前記配列が少なくとも１０の核酸を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）一緒になって後成的染色体相互作用をする前記染色体領域の少なくとも１つがチロシンキナーゼレセプター座位内にあり、場合によってＰＤＧＦＲＡ内にあってよい、および／または
（ｉｉ）一緒になって後成的染色体相互作用をする前記染色体領域の少なくとも１つがＦＩＰ１Ｌ１座位内にある、および／または
（ｉｉｉ）欠失ブレイクポイント変異が、一緒になって後成的染色体相互作用をする染色体領域内に存在する、
請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
がんの予後を決定する方法であって：
（ａ）請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によって特定された染色体相互作用を分類し、および／または
（ｂ）（ｉ）チロシンキナーゼ阻害剤療法に対する応答性、および／または
（ｉｉ）キナーゼ遺伝子および／またはチロシンキナーゼレセプター遺伝子からの異常発現および／または
（ｉｉｉ）１以上の以下の遺伝子：ＦＩＰ１Ｌ１、ＰＤＧＦＲＡ、Ｆｌｔ３、ＡＢＬ１、ＦＧＦＲ１、ｃＫＩＴ
に関連する少なくとも１つの後成的染色体相互作用の有無を検出することを含み、
前記後成的染色体相互作用が場合によって請求項１〜６のいずれか一項で定義されたとおりであってよい、方法。
【請求項８】
（ｉ）一緒になって染色体相互作用をして架橋核酸を形成する染色体領域のインビトロ架橋のステップと、
（ｉｉ）前記架橋酸を酵素での制限消化切断に供するステップと、
（ｉｉｉ）前記架橋切断核酸末端をライゲートして前記ライゲート産物を形成するステップと
を含む方法によって、請求項１〜６に記載の核酸の第１セットを生成する；および／または
−請求項７に記載の染色体相互作用の分類を実施する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ライゲート産物が：
−１０〜１０００ヌクレオチド塩基長、
−１０〜８００ヌクレオチド塩基長、
−１０〜５００ヌクレオチド塩基長、
−１０〜１００ヌクレオチド塩基長、
−１０〜４００ヌクレオチド塩基長、
−１０〜５００ヌクレオチド塩基長、
−２００〜６００ヌクレオチド塩基長、
−２００〜８００ヌクレオチド塩基長、または
−２００〜１０００ヌクレオチド塩基長
の核酸配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記分類または検出が、前記ライゲート産物を増幅することができるプライマーと、ＰＣＲ反応の間に前記ライゲーション部位と結合するプローブとを使用する定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）による前記ライゲート産物の特異的検出を含み、前記プローブが、一緒になって染色体相互作用をする前記染色体領域の各々からの配列に対して相補的である配列を含む、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブが：
前記ライゲート産物と特異的に結合するオリゴヌクレオチド、および／または
オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合するフルオロフォア、および／または
前記オリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合するクエンチャーを含み、
場合によって、前記フルオロフォアがＨＥＸ、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄおよびＦＡＭから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記プローブが、１０〜４０ヌクレオチド塩基長、好ましくは２０〜３０ヌクレオチド塩基長の核酸配列を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
−前記がんが以下のいずれか１つである、および／または
−前記サブグループの１以上が以下のがんのいずれかを有する、および／または
−請求項７に記載の方法を以下のがんのいずれかを有する対象に対して実施する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法：
（ａ）突発性過好酸性症候群（ｉＨＥＳ）
（ｂ）慢性および急性好酸球性白血病
（ｃ）急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）
（ｄ）ＰＤＧＦＲＡ陽性非小細胞がん。
（ｅ）多形性膠芽腫および星状細胞腫を含む神経膠芽腫
（ｆ）前立腺がん。
（ｇ）進行卵巣がん。
（ｈ）消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）。
【請求項１４】
一緒になって後成的染色体相互作用をする２つの染色体領域からの前記配列が、染色体において、少なくとも１０００塩基対離れているか、または少なくとも１０，０００塩基対離れているかまたは少なくとも１００，０００塩基対離れている、
および／または一緒になって後成的染色体相互作用をする染色体領域間に欠失ブレイクポイントがある、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記個体が請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法によって特定されている個体における状態の治療および／または予防で使用するための治療薬、場合によってチロシンキナーゼ阻害剤。
【請求項１６】
ＰＣＲ反応の間に活性化に際して検出可能であるプローブを使用して、染色体相互作用に関連するライゲートされた配列を定量的に検出するための方法であって、
前記ライゲートされた配列が、一緒になって後成的染色体相互作用をする二つの染色体領域からの配列を含み、
前記方法が、ＰＣＲ反応の間に前記ライゲートされた配列を前記プローブと接触させ、そして前記プローブの活性化の前記程度を検出することを含み、そして
前記プローブが、前記ライゲーション部位と結合し、そして
場合によって：
−前記ライゲートされた配列は、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法で定義されるかまたは請求項１〜１３のいずれかに記載の方法によって作製されるライゲート産物である、および／または
−前記プローブが請求項１０または１１で定義のとおりである、および／または
−前記ライゲートされた配列の前記長さが請求項９で定義のとおりである、および／または
−前記ライゲートされた配列が、請求項８に記載の方法によって作製され、そして前記ライゲートされた配列の前記ライゲーション部位が、前記架橋した核酸を切断するために使用した前記制限酵素の前記制限酵素認識配列を含み、好ましくは、前記制限酵素がＴａｑＩである、方法。
【請求項１７】
前記ライゲート産物または配列がヘリカルターンあたり少なくとも５°の曲率傾向ピークスコアを有する、請求項１〜１４および１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ヘリカルターンあたりの前記曲率傾向スコアが、前記ライゲーション部位の上流および／または下流の最大２０〜４００塩基について算出される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１６で定義される方法で使用するためのプライマーおよびプローブを選択する方法であって、ライゲートされた配列を結合し増幅するそれらの能力に基づいてプライマーを選択し、そしてその曲率に基づいてプローブ配列を選択し、好ましくは請求項１７または１８で定義する曲率傾向ピークスコアを選択することを含む、方法。
【請求項２０】
個体における癌を治療する方法で使用するための核酸であって、
−前記がんが、請求項１または１３で定義するとおりであり、
−前記治療がサブグループに関連する染色体相互作用を変化させることにより、前記サブグループまたは染色体相互作用が請求項１〜１４のいずれか一項で定義するとおりであり、
−好ましくは、前記核酸がＲＮＡｉ分子であり、
−場合によって、前記個体が請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法によって同定されていてもよい、核酸。
【請求項２１】
候補薬剤ががんに関連する染色体相互作用において変化を引き起こすことができるか否かを判定することを含む、がんの治療で使用するための治療薬を同定する方法であって、
−前記治療が場合によって請求項２０で定義するとおりであってよく、
−前記候補薬剤が場合によって核酸であってよく、
−前記サブグループまたは染色体相互作用が請求項１〜１４のいずれか一項で定義するとおりであり、
−場合によって、前記個体が請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法によって同定されていてもよく、そして
−場合によって、前記候補薬剤を細胞または染色体と接触させ、そして前記染色体相互作用の変化を検出することによって実施してもよい、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は染色体相互作用に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の人口は増大して、あらゆる技術面において、特に医療の分野で急速かつ効果的なサービスを期待するようになっている。個別化療法における改善は、多くの場合、タンパク質、ｍＲＮＡ、抗体およびＳＮＰマーカーなどのバイオマーカーの使用に依存する。
【発明の概要】
【０００３】
本発明者らは、がんの予後における染色体相互作用の役割を調査した。彼らの研究は、特異的染色体相互作用が、療法に対する応答性などの特定の結果と関連づけられることを示している。この研究の一部として、本発明者らは染色体相互作用を検出する過程で生じるライゲートされた核酸の検出に特に適した新しい後成的試験アッセイも開発した。
【０００４】
したがって、本発明は、サブグループを区別するがんの予後コンパニオン後成的試験に関連する後成的染色体相互作用の決定方法であって、サブグループからの核酸の第１セットを、染色体相互作用のインデックス集団を代表する核酸の第２セットと接触させ、そして相補配列をハイブリダイズさせることを含み、核酸の第１および第２セット中の核酸は、一緒になって後成的染色体相互作用する染色体領域の両方からの配列を含むライゲート産物を代表し、そして核酸の第１および第２セット間のハイブリダイゼーションのパターンによって、どの後成的染色体相互作用が集団中のサブグループに対して特異的であるかの判定が可能になり、サブグループは、予後に関連する少なくとも１つの特性が異なる。典型的には、サブグループはチロシンキナーゼ阻害剤療法の応答性に関して異なる、および／またはがんはキナーゼ遺伝子および／またはチロシンキナーゼレセプター遺伝子からの異常発現と関連付けられる、および／またはがんは、以下の遺伝子：ＦＩＰ１Ｌ１、ＰＤＧＦＲＡ、Ｆｌｔ３、ＡＢＬ１、ＦＧＦＲ１およびｃＫＩＴの１以上における遺伝子変化または後成的変化と関連づけられる。
【０００５】
本発明はまた、がんの予後を判定する方法であって：（ａ）前記方法によって特定された染色体相互作用を分類し、および／または（ｂ）（ｉ）チロシンキナーゼ阻害剤療法に対する応答性、および／または（ｉｉ）キナーゼ遺伝子および／またはチロシンキナーゼレセプター遺伝子からの異常発現、および／または（ｉｉｉ）以下の遺伝子：ＦＩＰ１Ｌ１、ＰＤＧＦＲＡ、Ｆｌｔ３、ＡＢＬ１、ＦＧＦＲ１およびｃＫＩＴの１以上に関連する少なくとも１つの後成的染色体相互作用の存在または非存在を検出することを含む方法を提供する。
【０００６】
本発明はさらに、ＰＣＲ反応の間の活性化に際して検出可能であるプローブを使用して染色体相互作用に関連するライゲートされた配列を定量的に検出するための方法を提供し、前記ライゲートされた配列は、一緒になって後成的染色体相互作用する２つの染色体領域からの配列を含み、前記方法は、ＰＣＲ反応の間にライゲートされた配列をプローブと接触させ、そしてプローブの活性化の程度を検出することを含み、前記プローブがライゲーション部位と結合する。この方法によって、二重標識蛍光加水分解プローブを使用してＭＩＱＥに準拠した方法で特定の相互作用を検出することが可能になる。
【０００７】
出願人の研究は、腫瘍学的状況における予後を決定するためのＭＩＱＥに準拠した染色体コンフォメーション（３Ｃ）アッセイを初めて産業界に提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、３Ｃプロセスの概略図である。３Ｃとは、クロマチンコンフォメーションキャプチャ、または染色体コンフォメーションキャプチャを意味する。
【図２】図２は、ライゲートされた配列１の配列位置に対する曲率および曲げ性のグラフである。１０．５ｂｐヘリカルターン当たりの度で表した予想される曲率を黒色で示し（左側のＹ軸上の０〜９の目盛り）、ａ．ｕ．で表した曲げ性を灰色で示す（右側のＹ軸上の４〜６．５の目盛り）。０〜５００の塩基対で表した配列数をＸ軸上に示す。
【図３】図３はライゲートされた配列２の配列位置に対する曲率および曲げ性のグラフである。１０．５ｂｐヘリカルターンあたりの度で表した予想される曲率を黒色で示し（左側のＹ軸上の０〜１２の目盛り）、ａ．ｕ．で表した曲げ性を灰色で示す（右側のＹ軸上の３〜６．５の目盛り）。０〜７００の塩基対で表した配列数をＸ軸に示す。
【図４】図４は、ライゲートされた配列３の配列位置に対する曲率および曲げ性のグラフである。１０．５ｂｐヘリカルターンあたりの度で表した予想される曲率を黒色で示し（左側のY軸上の０〜９の目盛り）、およびａ．ｕ．で表した曲げ性を灰色で示す（右側Ｙ軸上の４〜６の目盛り）。０〜４５０の塩基対で表した配列数をＸ軸上に示す。
【図５】図５はライゲートされた配列４の配列位置に対する曲率および曲げ性のグラフである。１０．５ｂｐヘリカルターンあたりの度で表した予想される曲率を黒色で示し（左側のＹ軸上の０〜１０の目盛り）、そしてａ．ｕ．で表した曲げ性を灰色で示す（右側のＹ軸上の３〜７の目盛り）。０〜５００の塩基対で表した配列数をＸ軸上に示す。
【図６】図６は、ライゲートされた配列５の配列位置に対する曲率および曲げ性のグラフである。１０．５ｂｐヘリカルターンあたりの度で表した予想される曲率を黒色で示し（左側のＹ軸上の０〜９の目盛り）、そしてａ．ｕ．で表した曲げ性を灰色で示す（右側のＹ軸上の３〜６．５の目盛り）。０〜７００の塩基対で表した配列数をＸ軸上に示す。
【図７】図７は、ライゲートされた配列６の配列位置に対する曲率および曲げ性のグラフである。１０．５ｂｐヘリカルターンあたりの度で表した予想される曲率を黒色で示し（左側のＹ軸上の０〜１２の目盛り）、そしてａ．ｕ．で表した曲げ性を灰色で示す（右側のＹ軸上の３〜６．５の目盛り）。０〜６００の塩基対で表した配列数をＸ軸上に示す。
【図８】図８は治療実施形態に関するデータを示す。
【図９】図９は治療実施形態に関するデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、特に着実な定量試験を用いて特定の異常なプロセスを特定することに関する。本発明は、特に以下のものを含むいくつかの異なる態様を有する：
−  異なるサブグループに関連する後成的染色体相互作用を特定するための方法
−  個体のサブグループを特定するための方法
−  染色体相互作用に関連するライゲートされた配列を定量的に検出する方法
−  ＰＣＲ反応の間の活性化に際して検出可能な加水分解プローブであって、ライゲートされた核酸のライゲーション部位と結合する加水分解プローブ
−  ＰＣＲ反応での使用のためにプライマーおよびプローブを選択する方法
−  がんを治療する方法
−  がんの治療で使用する核酸
−  治療薬を特定する方法。
【００１０】
本発明に関連するがん
本発明は、がん、例えば、酵素における変異（ＤＮＡの脱メチル反応の原因となるものを含む）などの異なる遺伝機構に起因するか、または選択的遺伝子スプライシングもしくはブレイクポイント変異に起因するがんに関連する後成的相互作用に関する。がんは、レセプターの上方調節に起因する可能性がある。がんは、キナーゼ遺伝子および／またはチロシンキナーゼレセプター遺伝子、例えば細胞質キナーゼ遺伝子および／またはセリン／トレオニンキナーゼ遺伝子からの異常発現と関連付けることができる。がんは、以下の遺伝子：ＦＩＰ１Ｌ１、ＰＤＧＦＲＡ、Ｆｌｔ３、ＡＢＬ１、ＦＧＦＲ１およびｃＫＩＴの１以上における遺伝子変化または後成的変化と関連付けることができる。がんは、ＡＴＰ模倣物、場合によってＡＢＬ１、ブルトン型チロシンキナーゼ、ｃＫＩＴ、ＦＧＦＲ１、ＰＤＧＦＲＡおよびＰＤＧＦＲＢなどのチロシンキナーゼ遺伝子に対して感受性であるタンパク質における遺伝子変化または後成的変化と関連付けることができる。チロシンキナーゼ遺伝子（ＡＢＬ１、Ｂｒｕｔｏｎｓ、ｃＫＩＴ、ＦＧＦＲ１、およびＰＤＧＦＲＡ）は、発現されると機能的にがん遺伝子と分類されることが多い。ＡＴＰ模倣物に対して感受性であるタンパク質における遺伝子変化または後成的変化は、ＡＴＰ模倣物に対して感受性であるタンパク質の上方調節を引き起こす遺伝子の発現における変化のためであり得る。例えば、ＦＩＰ１Ｌ１はＰＤＧＦＲＡ  ｍＲＮＡ発現を直接上方調節すると考えられる。
【００１１】
がんは、白血病、骨髄増殖性腫瘍、腫瘍、肺がんまたは卵巣がんであり得る。がんは、突発性過好酸性症候群（ｉＨＥＳ）、慢性および急性好酸球性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、ＰＤＧＦＲＡ陽性非小細胞がん（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽腫（多形性膠芽腫および星状細胞腫を含む）、前立腺がん、進行卵巣がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）および腎細胞がんから選択される。
【００１２】
分類された染色体相互作用
本発明は、染色体相互作用、例えばがん、および／またはチロシンキナーゼ阻害剤療法に対する応答性と関連づけられるものの分類に関する。染色体相互作用は、本明細書中で言及する疾患状態のいずれかにおいてのように、疾患の態様に影響を及ぼすかまたは関連づけられる。染色体相互作用は、疾患に対する感受性、療法に対する応答性または再発の可能性に影響を及ぼし得るかまたは関連づけられ得る。染色体相互作用は、患者および／または患者のサブグループの予後に影響を及ぼし得るかまたは関連づけられ得る。特異的染色体相互作用、遺伝子および領域を本明細書中で開示し、一実施形態では、それらの染色体相互作用、またはそれらの遺伝子および領域における染色体相互作用を分類することができる。好ましい領域は、表ｌａ中の範囲として開示されている。具体的なライゲートされた配列を本明細書中に開示する。染色体相互作用の分類は、そのようなライゲートされた配列またはそれらのホモログおよび／もしくはフラグメントの検出を必要とし得る。
【００１３】
好ましい染色体相互作用、遺伝子および領域（ゲノム位置）は、表５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３および１４を含む表中で示す。さらなる好ましい染色体相互作用は、本明細書中で言及される任意の核酸、例えばプローブまたはプライマー対を用いて規定または検出することができるものである。
【００１４】
分類される染色体相互作用は、遺伝子（コーディング配列を含む）とその調節領域、例えばプロモーターとの間に存在するものであってもよいし、そうでなくてもよい。
【００１５】
染色体相互作用は、遺伝子の調節解除、例えばエンハンサーにおける活性の変化（例えば増加または減少）と関連づけることができる。染色体相互作用は、融合ゲノム（染色体）産物（活性が変更された融合タンパク質の発現に至る可能性があるかまたは至らない可能性がある）をもたらす変異、例えばブレイクポイント変異と関連づけることができる。
【００１６】
ブレイクポイント変異は：
−本明細書中で記載する任意の変異であり得るか、または
−本明細書中で記載する任意の遺伝子の範囲内であり得るか、及び得るか、もしくは含み得るか、または
−がんと関連づけられるかもしくはがんを引き起こすブレイクポイント変異
であり得る。
【００１７】
ブレイクポイント変異は、少なくとも１，０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、５０，０００ヌクレオチド、１００，０００ヌクレオチド、５００，０００ヌクレオチド、例えば少なくとも８００，０００ヌクレオチドの長さであり得、これは、欠失したフラグメントの長さを表す。
【００１８】
予後
本明細書中で使用する場合、予後とは、１以上の転帰などの医学的状態の起こり得る過程を予測することに関する。予後の因子は、例えば治療されたまたは未治療の個体において、客観的に測定可能であり、がん疾患の起こり得る転帰に関する情報を提供する、臨床的または生物学的特性である。予測因子は、治療から受け得る恩恵に関する情報を提供することができる（例えば、腫瘍縮小または生存のいずれかの観点で）。そのような予測因子は、与えられた療法から恩恵を受ける可能性が最も高い患者の亜集団を特定するために使用できる。マーカーは、予後に関連し、また治療から恩恵を受けやすいことを予測する特性を有し得る。
【００１９】
キナーゼ
本発明は、キナーゼ遺伝子またはキナーゼレセプター遺伝子改変における変化、例えば発現における変化および／または後成的形態における変化および／または遺伝子（ゲノム配列）変化に関連する可能性があり、これは、がんに関連する、および／またはがんを引き起こす。したがって、典型的にはがんはキナーゼ遺伝子および／またはチロシンキナーゼレセプターの異常発現と関連付けることができる。一実施形態において、がんは細胞質チロシンキナーゼ（例えば、ＡＢＬ１）および／または細胞質キナーゼ（例えば、セリン／トレオニンキナーゼ）の異常発現と関連付けられる。「異常発現」という用語は、上方調節もしくは下方調節を包含し得るか、または異なるタンパク質の発現を包含し得る。
【００２０】
この文脈で、「キナーゼ」は、核、細胞質中もしくは細胞膜で、または細胞外の位置を含む任意の他の細胞の位置で、ＡＴＰから他のタンパク質へ移行する間にコンフォメーション変化を受けるとして機能的に定義することができる。関連するキナーゼファミリーの例としては、細胞表面上にあるレセプターチロシンキナーゼ（例えば、ＰＤＧＦＲＡ）、および非レセプターキナーゼ、例えば細胞質チロシンキナーゼ（例えば、ＡＢＬ１）およびセリン／トレオニンキナーゼが挙げられる。
【００２１】
後成的相互作用
本明細書中で使用する場合、「後成的」相互作用という用語は、典型的には、染色体上の遠位領域間の相互作用を指し、前記相互作用は、一実施形態では動的であり、染色体の領域の状態に応じて変更、形成、または破壊される。
【００２２】
本発明の特定の方法では、染色体相互作用は、相互作用の一部である染色体の両領域からの配列を含むライゲートされた核酸をまず生成することによって、検出される。そのような方法において、領域は任意の好適な手段によって架橋することができる。好ましい実施形態において、相互作用は、ホルムアルデヒドを用いて架橋されるが、任意のアルデヒド、またはＤ−ビオチノイル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルもしくはジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによって架橋することもできる。パラホルムアルデヒドを使用することができ、４オングストローム離れたＤＮＡ鎖を架橋することができる。
【００２３】
染色体相互作用は、例えば、生理学的状態の変化に応答して転写されているかまたは抑制されている場合、染色体の領域の状態を反映する可能性がある。本明細書中で定義するようなサブグループに対して特異的である染色体相互作用は、安定であり、したがって、２つのサブグループ間の差異を測定する信頼性のある手段を提供することが判明している。
【００２４】
加えて、特性（疾患状態など）に対して特異的な染色体相互作用は、通常、例えばヒストンタンパク質のメチル化または結合に対する変化などの他の後成的マーカーと比較して、生物学的プロセスにおいてより早期に起こる。したがって、本発明の方法は、生物学的プロセスの早期段階で検出することができる。これによって早期介入（例えば治療）が可能になり、結果としてより効果的であり得る。さらに、同じサブグループ内の個体間で関連する染色体相互作用にばらつきはほとんどない。
【００２５】
後成的相互作用の位置および原因
後成的染色体相互作用はオーバーラップするかまたは関連するかまたは記載されていない遺伝子をコードすることが示されている染色体の領域を含み得るが、等しく遺伝子間領域であり得る。本発明で検出される染色体相互作用は、環境因子、ＤＮＡメチル化、非コーディングアンチセンスＲＮＡ転写物、非変異原性発がん物質、ヒストン修飾、クロマチンリモデリングおよび特異的局所ＤＮＡ相互作用による、基礎となるＤＮＡ配列に対する変更によって引き起こされ得る。同じ染色体相互作用が、異なる対象において異なる因子によって引き起こされ得る。例えば、特定の染色体相互作用は、例えば、相互作用が観察される場所とは異なる染色体の領域におけるＩＤＨの変異に起因する、ＤＮＡメチル化における変化によって引き起こされ得る。同じ染色体相互作用が、例えば、相互作用が観察されるのと同じ染色体領域における欠失などの、基礎となる配列に対する変化によって引き起こされ得る。
【００２６】
染色体相互作用をもたらす変化は、それ自体は遺伝子産物または遺伝子発現の様式に直接影響を及ぼさない、基礎となる核酸配列に対する変化によって引き起こされ得る。そのような変化は、例えば、遺伝子の内部および／または外部のＳＮＰ、遺伝子融合および／または遺伝子間ＤＮＡの欠失、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、および非コーディングＲＮＡであり得る。例えば、ＳＮＰのほぼ２０％が非コーディング領域中にあることが知られており、したがって、記載される方法は非コーディング状況において有用である。一緒になって相互作用を形成する染色体の領域は、同じ染色体上で５ｋｂ、３ｋｂ、１ｋｂ、５００塩基対または２００塩基対未満離れている可能性がある。一緒になって相互作用を形成する染色体の領域は、同じ染色体上で５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、２００ｋｂ、５００ｋｂ、または８００ｋｂ超離れている可能性があり、例えば８００ｋｂ〜１，２００ｋｂ、例えば９００ｋｂ〜１，０００ｋｂ離れている可能性がある。本明細書中で開示する任意のそのような値および範囲は、正常な染色体（ブレイクポイント変異のない）またはブレイクポイント変異を有する染色体を指す。
【００２７】
検出される染色体相互作用は、好ましくは本明細書中で言及する遺伝子のいずれかの内部である。しかしながら、遺伝子の上流または下流、例えば遺伝子またはコーディング配列から最大５０，０００、最大３０，０００、最大２０，０００、最大１０，０００または最大５０００塩基上流または下流でもあり得る。
【００２８】
臨床状況のタイプ
本発明の目的は、集団中のサブグループを規定する特性に関連する染色体相互作用の検出を可能にすることである。例えば、このテクノロジーは、特異的表現型（例えば、医学的状態に関連する）のバイオマーカーに基づいた、すなわち、特定の染色体コンフォメーションシグネチャーおよび／またはその特定のシグネチャーにおける変化を認識することによって、階層化を可能にする。サブグループを規定する特性は、がんの予後に関連する。本発明の方法を、治療に対する応答性、最も効果的な療法／薬物の特定、疾患の過程のモニタリング、疾患に対する素因の特定、余病の存在および／または再発の可能性の特定などの疾患に関連する特異的特性の関連で使用することができる。したがって、方法を、特定の状態の存在の診断のために使用してもよいし、しなくてもよい。一実施形態において、本発明を使用して、例えば、継続的に治療に対する応答をモニタリングすることができる。本発明の方法を使用して、疾患のメカニズムが未知であるか、不明であるか、または複雑である座位を分類することができる。染色体相互作用の検出は、異なる調節レベルでの変化を追従する効率的な方法を提供し、その一部は複雑である。例えば、場合によって、約３７，０００の非コーディングＲＮＡを単一のインパルスによって活性化することができる。
【００２９】
予後に関連する特性
特性はチロシンキナーゼ阻害剤療法に対して応答性であり得る。特性は、キナーゼ遺伝子から、および／またはチロシンキナーゼ遺伝子からの異常発現であり得、例えば、特性はチロシンキナーゼ発現の上方調節であり得る。がんの予後に関連することが知られているキナーゼとしては、細胞表面上にあるレセプターチロシンキナーゼ（例えば、ＰＤＧＦＲＡ）、非レセプターキナーゼ、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、ＡＢＬ１）およびセリン／トレオニンキナーゼが挙げられる。特性は、公知の阻害剤、例えばチロシンキナーゼ阻害剤に対して応答性であるか、または応答性である遺伝子産物をコードするキナーゼ遺伝子からの異常発現であり得る。特性は、チロシンキナーゼ阻害剤に対して応答性であるか、または応答性である遺伝子産物をコードする遺伝子における遺伝子変化または後成的変化であり得る。特性は、以下の遺伝子：ＦＩＰ１Ｌ１、ＰＤＧＦＲＡ、Ｆｌｔ３、ＡＢＬ１、ＦＧＦＲ１およびｃＫＩＴの１以上における遺伝子変化または後成的変化であり得る。
【００３０】
特性は、ＡＴＰ模倣物である薬物に対する応答性であり得る。チロシンキナーゼ遺伝子（例えば、ＡＢＬ１、Ｂｒｕｔｏｎｓ、ｃＫＩＴ、ＦＧＦＲ１、ＰＤＧＦＲＡおよびＰＤＧＦＲＢ）は、ＡＴＰ模倣物に対して感受性であるタンパク質をコードする。
【００３１】
特性は、特異的治療および／または予防（特に特異的薬品治療および／または予防）、例えばチロシンキナーゼ阻害剤に対する応答であり得、場合によって薬物はレセプターチロシンキナーゼ、例えばＰＤＧＦＲＡを標的とすることが知られて、好ましくはダサチニブ、クレノラニブ、ドビチニブおよびイマチニブを含む群からの１以上である。チロシンキナーゼ阻害剤は、セジラニブ、クレノラニブ、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）；ドビチニブ、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）；ＩＭＣ−３Ｇ３（オララツマブ、ＬＹ３０１２２０７）Ｌａｒｔｒｕｖｏ（ＰＤＧＦＲＡ）；マシチニブ（ＡＢ１０１０）、ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ）；パゾパニブ；ＰＫＣ４１２（ミドスタウリン、ＣＧＰ４１２５１）；キザルチニブ；レゴラフェニブ；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）；スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）；バタラニブ；Ｓ１１６８３６であってよい。特性は、特定の状態、場合によって過好酸球増加症に対する素因であり得る。
【００３２】
サブグループおよび個別化治療
本明細書中で使用する場合、「サブグループ」は、好ましくは、集団サブグループ（集団におけるサブグループ）を指し、さらに好ましくは、特定の真核生物、または哺乳類（例えば、ヒト、非ヒト、非ヒト霊長類、または齧歯類、例えばマウスもしくはラット）などの特定の動物の集団におけるサブグループを指す。最も好ましくは、「サブグループ」は、ヒト集団におけるサブグループを指す。
【００３３】
本発明は、集団における特定のサブグループを検出することおよび治療することを含む。そのようなサブグループ内で、本明細書において考察する特性（治療に対する応答性など）が存在するかまたは存在しない。染色体に関する後成的相互作用の相違は、一般的に、ゲノムレベルで存在する構造的相違である。本発明者らは、これらが所与の集団においてサブセット（例えば、２つまたは少なくとも２つのサブセット）間で異なることを見出した。これらの相違を特定することにより、医師は方法で記載するように集団の１つのサブセットの一部として患者を分類することが可能になるであろう。したがって、本発明は医師に、後成的染色体相互作用に基づいて患者の医薬を個別化する方法を提供し、また、特に前記サブグループの一部として特定されている結果として予後が影響を受ける患者のサブグループにとって、より効果的な、代替的治療法を提供する。
【００３４】
典型的には、サブグループは集団の少なくとも１％、５％、１０％、３０％、５０％または８０％である。集団は一般的な集団であり得る。集団はがん患者群であり得、この場合、がんは場合によって以下のがんのいずれか１つであってよい：ｉＨＥＳ、慢性および急性好酸球性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、ＰＤＧＦＲＡ陽性非小細胞がん（ＮＳＣＬＣ）、多形性膠芽腫および星状細胞腫を含む神経膠芽腫、前立腺がん、進行卵巣がん、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）および腎細胞がん。さらに多くのサブグループの１つは、先に列挙したがんのいずれかであり得、がんの予後を決定する方法は、前記がんのいずれかを有する対象に関して実施することができる。
【００３５】
ライゲートされた核酸の生成
本発明のある特定の実施形態はライゲートされた核酸、特にライゲートされたＤＮＡを利用する。これらは、一緒になって染色体相互作用をする領域の両方からの配列を含み、したがって、相互作用に関する情報を提供する。本明細書中で記載するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）方法は、そのようなライゲートされた核酸の生成を使用して染色体相互作用を検出する。
【００３６】
したがって、本発明の方法は：
（ｉ）染色体座位に存在する後成的染色体相互作用のインビトロ架橋すること；
（ｉｉ）場合によって、前記染色体座位から架橋したＤＮＡを単離すること；
（ｉｉｉ）前記架橋したＤＮＡを、例えば、少なくとも１回切断する酵素（特に前記染色体座位内で少なくとも１回切断する酵素）での制限消化による切断に供すること；
（ｉｖ）前記架橋し切断したＤＮＡ末端をライゲートすること（特にＤＮＡループを形成するため）；そして
（ｖ）前記ライゲートされたＤＮＡおよび／または前記ＤＮＡループの存在を、特にＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）などの技術を使用して特定して、特異的染色体相互作用の存在を特定すること
によってライゲートされた核酸（例えば、ＤＮＡ）を生成するステップを含み得る。
【００３７】
ＰＣＲを用いて、ライゲートされた核酸を検出または特定することができ、例えば産生されたＰＣＲ産物のサイズは、存在する特異的染色体相互作用を示すものであり得、したがって、座位の状態を特定するために使用することができる。当業者は、関心対象内の染色体座位内のＤＮＡを切断するために使用できる多くの制限酵素を知っているであろう。使用する特定の酵素が、研究対象の座位およびその中に位置するＤＮＡの配列に依存することは明らかであろう。本発明で記載するようなＤＮＡを切断するために使用できる制限酵素の非限定例はＴａｑＩである。
【００３８】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）テクノロジーなどの実施形態
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）テクノロジーは、表現型に対して特異的な後成的染色体コンフォメーションシグネチャーの検出におけるマイクロアレイＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーデータの使用に関する。本明細書中で記載するような方法でライゲートされた核酸を利用するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）などの実施形態はいくつかの利点を有する。それらは低レベルの確率的ノイズを有し、例えば、本発明の核酸の第１セットからの核酸配列が、核酸の第２セットとハイブリダイズするかまたはハイブリダイズできないかのいずれかであるためである。これにより、後成的レベルで複雑なメカニズムを測定するための比較的簡単な方法を可能にする二次元的結果がもたらされる。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）テクノロジーはまた、処理時間が短く低コストである。一実施形態において、処理時間は３〜６時間である。
【００３９】
試料および試料処理
試料は個体由来のＤＮＡを含む。通常は、細胞を含む。一実施形態において、試料は低侵襲性手段によって得られ、例えば血液であってよい。ＤＮＡを抽出し、標準的制限酵素で切断することができる。これは、どの染色体コンフォメーションが保持され、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームで検出されるかをあらかじめ決定することができる。試料が患者から前もって得られた血液試料である一実施形態では、記載した方法は、手順が低侵襲性であるので有利である。水平伝播を含む組織と血液との間の染色体相互作用の同期化のために、血液試料を使用して、疾患に関連する組織などの組織における染色体相互作用を検出することができる。がんなどのある特定の状態に関して、変異に起因する遺伝子ノイズ（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｎｏｉｓｅ）は関連する組織における染色体相互作用「シグナル」に影響を及ぼす可能性があり、したがって血液を使用するのが有利である。
【００４０】
本発明に関連する核酸の特性
本発明の実施形態で作製または検出される核酸は、本明細書中で言及する第１および第２核酸と同じであり得るか、または第１および第２核酸の特性のいずれかを有し得る。本発明の核酸は、典型的には、各々、一緒になって染色体相互作用をする染色体の２つの領域の一方からの配列を含む、２つの部分を含む。典型的には、各部分は、少なくとも８、１０、１５、２０、３０または４０ヌクレオチド長、例えば１０〜４０ヌクレオチド長である。好ましい核酸は、表のいずれかで言及する遺伝子のいずれかからの配列を含む。好ましい核酸は本明細書中で言及する任意の特異的プローブまたはプライマー配列と結合する。好ましくは、核酸はＤＮＡである。特異的配列が規定される場合、本発明は特定の実施形態で必要とされるような相補配列を使用し得ると理解される。
【００４１】
核酸の第２セット−「インデックス」配列
核酸配列の第２セットは、インデックス配列のセットであるという機能を有し、本質的に、サブグループ特異的配列を特定するのに適した核酸配列のセットである。それらは、「バックグラウンド」染色体相互作用を表す場合があり、また何らかの方法で選択されるかもしくは選択されなくてもよい。それらは概して、あらゆる可能な染色体相互作用のサブセットである。
【００４２】
核酸の第２セットは任意の好適な方法によって誘導することができる。それらはコンピューター計算から誘導することができるか、またはそれらは個体における染色体相互作用に基づく可能性がある。それらは典型的には核酸の第１セットよりも大きな集団群を表す。一つの特定の実施形態において、核酸の第２セットは遺伝子の特定のセットにおけるあらゆる可能な後成的染色体相互作用を表す。別の特定の実施形態において、核酸の第２セットは、本明細書中で記載する集団中に存在するあらゆる可能な後成的染色体相互作用の大部分を示す。一つの特定の実施形態において、核酸の第２セットは、少なくとも２０、５０、１００または５００の遺伝子において、例えば２０〜１００または５０〜５００の遺伝子において、後成的染色体相互作用の少なくとも５０％または少なくとも８０％を示す。
【００４３】
核酸の第２セットは、典型的には集団における疾患状態／表現型を場合によって修飾、調節または何らかの形で媒介してもよい少なくとも１００の可能な後成的染色体相互作用を表す。核酸の第２セットは、例えば、サイトカイン、キナーゼ、または任意の疾患状態、疾患に対する素因もしくは疾患表現型と関連するレギュレーターをコードする核酸配列を含む、種における疾患状態に影響を及ぼす染色体相互作用を表し得る。核酸の第２セットは、典型的には、サブグループを定義する特性に関連する後成的相互作用および関連しない後成的相互作用を表す配列を含む。
【００４４】
特定の一実施形態において、核酸の第２セットは、集団において自然発生的な配列から少なくとも部分的に誘導され、典型的にはコンピューターによる方法によって得られる。前記核酸は、自然発生的な核酸において存在する核酸の対応する部分と比較して、単一または複数の変異をさらに含んでもよい。変異は、１以上のヌクレオチド塩基対の欠失、置換および／または付加を含む。一つの特定の実施形態において、核酸の第２セットは、自然発生的な種において存在する核酸の対応する部分に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するホモログおよび／またはオルトログを表す配列を含み得る。別の特定の実施形態において、自然発生的な種において存在する核酸の対応する部分に対して少なくとも８０％の配列同一性または少なくとも９０％の配列同一性が提供される。
【００４５】
核酸の第２セットの特性
一つの特定の実施形態において、核酸の第２セットには、少なくとも１００の異なる核酸配列、好ましくは少なくとも１０００、２０００または５０００の異なる核酸配列があり、最大１００，０００、１，０００，０００または１０，０００，０００の異なる核酸配列がある。典型的な数は１００〜１，０００，０００、例えば１，０００〜１００，０００の異なる核酸配列である。これらの全部、または少なくとも９０％もしくは少なくとも５０％は、異なる染色体相互作用に相当する。
【００４６】
一つの特定の実施形態において、核酸の第２セットは、少なくとも２０の異なる座位もしくは遺伝子、好ましくは少なくとも４０の異なる座位もしくは遺伝子、そしてさらに好ましくは少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００または少なくとも５０００の異なる座位もしくは遺伝子、例えば１００〜１０，０００の異なる座位または遺伝子における染色体相互作用を表す。核酸の第２セットの長さは、ワトソンクリック塩基対合に従って核酸の第１セットに対して特異的にハイブリダイズさせて、サブグループに対して特異的な染色体相互作用の特定を可能にするために好適である。典型的には、核酸の第２セットは、一緒になって染色体相互作用をする二つの染色体領域に配列において対応する２つの部分を含む。核酸の第２セットは、典型的には少なくとも１０、好ましくは２０、そしてさらに好ましくは３０塩基（ヌクレオチド）長の核酸配列を含む。別の実施形態において、核酸配列は、最大で５００、好ましくは最大で１００、そしてさらに好ましくは最大で５０塩基対長であり得る。好ましい実施形態において、核酸の第２セットは、１７〜２５塩基対の核酸配列を含む。一実施形態において、核酸配列の第２セットの少なくとも１００、８０％または５０％が前記のような長さを有する。好ましくは、異なる核酸は重複配列も有さず、例えば核酸の少なくとも１００％、９０％、８０％または５０％は少なくとも５つの近接ヌクレオチドにわたって同じ配列を有さない。
【００４７】
核酸の第２セットが「インデックス」として作用すると仮定すると、第２の核酸の同じセットを、異なる特性のサブグループを代表する第１核酸の異なるセットとともに使用することができる、すなわち、核酸の第２セットは、異なる特性に関連する染色体相互作用を特定するために使用できる核酸の「ユニバーサル」なコレクションを表す可能性がある。
【００４８】
核酸の第１セット
核酸の第１セットは、通常、予後コンパニオン後成的試験に関連する特性、例えば本明細書中で言及する任意のそのような特性の有無によって規定される２以上の異なるサブグループにあることが知られている個体由来である。第１核酸は特性のいずれかおよび本明細書中で言及する核酸の第２セットの特性を有し得る。核酸の第１セットは、通常、本明細書中で記載するような治療および処理、特にＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）架橋および切断ステップを受けた個体からの試料に由来する。典型的には、核酸の第１セットは、個体から採取された試料中に存在する染色体相互作用の全部または少なくとも８０％もしくは５０％である。
【００４９】
典型的には、核酸の第１セットは、核酸の第２セットによって表される染色体相互作用と比較して、核酸の第２セットによって表される座位または遺伝子にわたる染色体相互作用のより小さな集団を表す、すなわち、核酸の第２セットは座位または遺伝子の所定のセットにおける相互作用のバックグラウンドまたはインデックスセットを表す。
【００５０】
一実施形態において、核酸の第１セットは標識され、典型的には異なるサブグループからの核酸は異なる標識で標識される。これによって、検出方法においてそれらを識別することが可能になる。
【００５１】
核酸
本明細書中で記載する核酸は、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００または少なくとも１００００の異なる本発明の核酸、例えば「第２の」核酸を含む核酸のライブラリの形態であり得る。本発明は、典型的には少なくとも２００の異なる核酸を含む核酸の特定のライブラリを提供する。ライブラリは、アレイに結合した核酸の形態であり得る。
【００５２】
ハイブリダイゼーション
本発明は、核酸の第１セットおよび核酸の第２セットからの全体的または部分的に相補的な核酸配列をハイブリダイズさせる手段を必要とする。一実施形態において、核酸の第１セットのすべてを単一のアッセイにおいて、すなわち、単一のハイブリダイゼーションステップにおいて、核酸の第２セットの全部と接触させる。しかしながら、任意の好適なアッセイを使用できる。
【００５３】
標識された核酸およびハイブリダイゼーションのパターン
本明細書中で言及する核酸は、好ましくは、ハイブリダイゼーション検出の成功を支援するフルオロフォア（蛍光分子）または放射性標識などの独立した標識を使用して標識してもよい。ある特定の標識はＵＶ光下で検出できる。例えば本明細書中で記載するアレイ上のハイブリダイゼーションのパターンは、２つのサブグループ間の後成的染色体相互作用における差異を表し、したがって、後成的染色体相互作用を比較する方法と、どの後成的染色体相互作用が本発明の集団におけるサブグループに対して特異的であるかの決定とを提供する。
【００５４】
「ハイブリダイゼーションのパターン」という用語は、核酸の第１および第２セット間のハイブリダイゼーションの有無、すなわち、第１セットからのどの特定の核酸が第２セットからのどの特定の核酸とハイブリダイズするかを広範に対象とし、したがって、任意の特定のアッセイもしくは技術、または「パターン」を検出することができる表面もしくはアレイを有する必要性に限定されない。
【００５５】
サブグループの特定の状態および選択
染色体相互作用、および染色体相互作用における変化に焦点を合わせることによって、本発明者らは、通常の診断法の使用では見逃される可能性がある、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を使用する潜在的な救命的診断治療介入に応答できる患者群を特定した。
【００５６】
一実施形態において、本発明の方法は、チロシンキナーゼ阻害剤療法、例えばＡＴＰ模倣物である阻害剤に対する応答性を検出する。好ましくは、がんのチロシンキナーゼ阻害剤療法に対する応答性は、好酸球が増大した患者において検出される。好ましくは、がんは、ｉＨＥＳ，慢性および急性好酸球性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ＰＤＧＦＲＡ陽性非小細胞がん、多形性膠芽腫および星状細胞腫を含む神経膠芽腫、前立腺がん、進行卵巣がんまたは消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）である。そのような実施形態において、ＰＤＧＦＲＡおよび／またはＦＩＰ１Ｌ１における染色体相互作用、例えば本明細書中で記載する任意の特異的相互作用の検出が好ましい（例えば、特異的プライマーおよび／またはプローブへの参照による）。
【００５７】
好ましくは、本明細書中で言及する任意の関連する遺伝子内での任意の染色体相互作用の存在または非存在が、例えば少なくとも１、２、３、４、５または６の遺伝子において検出される。好ましくは、本明細書中で開示する任意の特異的プライマーおよび／またはプローブ配列によって表される染色体相互作用の有無は、当該方法で決定される。これらの数の遺伝子または染色体相互作用は、本明細書中で言及する異なる実施形態のいずれかで使用することができる。
【００５８】
本発明は、個体における特性の有無を判定するために、染色体相互作用、典型的には１〜５、または５〜２０、または５〜５００のそのような相互作用の有無を検出することを含む方法を提供する。好ましくは、染色体相互作用は本明細書中で言及する遺伝子のいずれかにおけるものである。
【００５９】
３Ｃ相互作用およびがん
本発明の異なる実施形態は、本明細書中で言及する任意のがんまたは遺伝子、例えば以下に列挙するものに関するものであってよい。
【００６０】
本発明者らは、乳がん、卵巣がん、白血病、神経膠腫、リンパ腫、およびがん腫を含むがんに関連するＡＢＬ１、ブルトン型チロシンキナーゼ、ｃＫＩＴ、ＦＧＦＲ１、ＦｌＰＬｌ、ＦＬＴ３およびＰＤＧＦＲＡにおける３Ｃ相互作用を見出した。
【００６１】
典型的には、本明細書中に記載する方法に関連するか、または本明細書中に記載する方法を使用して同定される相互作用は、以下の状態のいずれかと関連する：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ＣＭＬ−急性転化、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性障害（骨髄増殖性腫瘍、ＭＰＮ）、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂ細胞悪性腫瘍、ＮＨＬ、リンパ腫（全種類）、骨髄腫、再発性成熟Ｂ細胞腫瘍、慢性移植片対宿主病、再発性有毛細胞白血病、再発性または難治性固形腫瘍、難治性マントル細胞リンパ腫、増幅食道胃がん、慢性関節リウマチ、肥満細胞症、肥満細胞性白血病、前立腺腫瘍、進行性黒色腫、変異悪性黒色腫、二次的（２ｎｄ  Ｌｉｎｅ）、切除不能または転移性消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）悪性中皮腫、進行型、白金−難治性卵巣がん、再発性卵巣上皮癌、卵管、または原発性腹膜癌、卵巣低悪性度潜在的腫瘍、子宮乳頭漿液性がん、進行期小細胞肺がん、局所進行性鼻咽頭がん、再発性／難治性非ホジキンリンパ腫、転移性腎細胞がん、転移性膵消化管神経内分泌腫瘍、再発性卵巣明細胞癌、食道扁平上皮癌、持続性子宮がん、乳がん、甲状腺がん、口腔腺腫、急性白血病、前立腺腫瘍、転位置ＦＧＦＲ１−３、変異、または増幅された再発性頭頸部がん、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ遺伝子融合を発現する再発性悪性神経膠腫、進行非小細胞肺がん。
【００６２】
一実施形態において、本明細書中に記載する方法に関連するか、または本明細書中に記載する方法を使用して特定される相互作用は、以下の状態のいずれかと関連づけられる：ｉＨＥＳ、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、転移性黒色腫、腎細胞がん、難治性ホジキンリンパ腫、以前に治療された卵巣がん、局所進行性鼻咽頭がん、難治性慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、スミチニブ不成功（Ｓｕｍｉｔｉｎｉｂ−ｆａｉｌｅｄ）消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）。好ましい状態は、神経膠腫、急性骨髄性白血病および乳がん、ｉＨＥＳおよび慢性白血病である。
【００６３】
例えば９ｑ３４に位置する細胞質チロシンキナーゼ遺伝子であるＡＢＬ１における相互作用は、以下の疾患と関連づけられる：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、乳がん、（ＧＩＳＴ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）または骨髄増殖性障害（骨髄増殖性腫瘍、ＭＰＮ）。
【００６４】
ブルトン型チロシンキナーゼ、例えばＸｑ２２．１に位置する細胞質チロシンキナーゼ遺伝子における相互作用は以下の疾患に関連づけられる：Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂ細胞悪性腫瘍、ＮＨＬ、リンパ腫（全種類）、骨髄腫、慢性リンパ球性白血病、再発性成熟Ｂ細胞腫瘍、慢性移植片対宿主病、再発性有毛細胞白血病、再発性または難治性固形腫瘍、難治性マントル細胞リンパ腫、増幅食道胃がんおよび慢性関節リウマチ。
【００６５】
ｃＫＩＴ、例えば４ｑ１２に位置するレセプターチロシンキナーゼ遺伝子における相互作用は以下の疾患に関連づけられる：肥満細胞症および肥満細胞性白血病ならびに前立腺腫瘍、進行性黒色腫、変異悪性黒色腫、二次的切除不能または転移性消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、発現悪性中皮腫。進行型、白金−難治性卵巣がん、再発性卵巣上皮癌、卵管、または原発性腹膜癌、または卵巣低悪性度潜在的腫瘍、進行期小細胞肺がん、局所進行性鼻咽頭がん、再発性／難治性非ホジキンリンパ腫、転移性腎細胞がん、転移性膵消化管神経内分泌腫瘍、再発性卵巣明細胞癌、食道扁平上皮癌、持続性子宮がんおよび乳がん。
【００６６】
例えば８ｐｌｌに位置するレセプターチロシンキナーゼ遺伝子であるＦＧＦＲ１における相互作用は以下の疾患に関連づけられる：甲状腺がん、口腔腺腫、慢性白血病、急性白血病、前立腺腫瘍および乳がん、転位置ＦＧＦＲ１−３、変異、または増幅された再発性頭頸部がん、ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ遺伝子融合を発現する再発性悪性神経膠腫、進行非小細胞肺がん。
【００６７】
しばしばＰＤＧＦＲＡ（例えば４ｑ１２）に融合するポリアデニル化特異性因子であるＦＩＰ１Ｌ１における相互作用は以下の疾患と関連づけられる：ｉＨＥＳ、慢性白血病。
【００６８】
例えば１３ｑ１１−１２．２に位置するＦＬＴ３レセプターチロシンキナーゼ遺伝子における相互作用は以下の疾患に関連づけられる：慢性白血病、急性骨髄性白血病および乳がん、ｉＨＥＳ、慢性白血病、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、結腸直腸がん、転移性黒色腫または腎細胞がん、神経膠腫、難治性ホジキンリンパ腫、以前に治療された卵巣がん、局所進行性鼻咽頭がん、難治性慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、スミチニブ不成功消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）。
【００６９】
例えば４ｑ１２に位置するレセプターチロシンキナーゼ遺伝子であるＰＤＧＦＲＡにおける相互作用は以下の疾患に関連づけられる：神経膠腫、慢性白血病、急性骨髄性白血病、乳がん、ｉＨＥＳ。
【００７０】
試験した個体
試験される個体は本明細書中で言及される任意の疾患状態または特性のいずれかの症状を有していてもよいし、有していなくてもよい。個体は、任意のそのような状態または特性の危険にさらされ得る。個体は、当該特性のために危険にさらされ得る。個体は、当該特性のためにより悪い予後を有する可能性があり、当該特性に対して特異的な療法を必要とする可能性がある。個体は、状態または特性から回復し得るか、または回復の途上にあり得る。個体は、好ましくは哺乳類、例えば霊長類、ヒト、非ヒト哺乳類または齧歯類である。個体は、オスであっても、メスであってもよい。個体は３０歳以上であってよい。個体は２９歳以下であってよい。
【００７１】
本明細書中で検討する遺伝子、座位、領域および核酸のいずれも、本明細書中で言及される個体のタイプのいずれかを有するものであり得るか、またはそれに由来するものであり得る。
【００７２】
好ましい遺伝子領域、座位、遺伝子および染色体相互作用
本発明のすべての態様について、好ましい遺伝子領域、座位、遺伝子および染色体相互作用が本明細書中で言及されている。典型的には、本発明の方法において、染色体相互作用は、本明細書中で列挙されている少なくとも１、２、３、４、５、または６つの関連する遺伝子から検出される。好ましくは、本明細書中で言及されているプライマーおよび／またはプローブ配列によって表される、少なくとも１、２、３、４、５または６つの関連する特異的染色体相互作用の存在または非存在が検出される。
【００７３】
領域は、本明細書中で言及する遺伝子のいずれかの上流または下流であり得、例えばコーディング配列から、例えば、５０ｋｂ上流または２０ｋｂ下流であり得る。
【００７４】
一実施形態において、検出される染色体相互作用は、表中に示される位置のいずれかまたは領域のいずれかで存在する。ライゲート産物が当該方法で検出される場合は、本明細書中で開示されるプライマーまたはプローブ配列のいずれかに示される配列を検出することができる。したがって、典型的には、ライゲート産物の両領域から（すなわち、染色体相互作用の両部位から）の配列を検出することができた。好ましい実施形態では、本明細書中で開示されるプライマーおよび／またはプローブと同じかまたは相補的の配列を含むかまたはそれからなるプライマーおよび／またはプローブが当該方法で用いられる。いくつかの実施形態において、本明細書中で示されるプライマーおよび／またはプローブ配列のいずれかに対して相同性である配列を含むプライマーおよび／またはプローブを使用する。
【００７５】
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるライゲート産物の検出
一実施形態において、染色体相互作用に関連するライゲートされた配列は、例えば蛍光検出を使用して定量的に検出される。この実施形態は、本明細書中で開示されるか、または本明細書中で開示される分類／検出方法に関連する任意のライゲートされた配列に関して実施することができるが、そのような配列または方法に限定されない。したがって、ｑＰＣＲに関連する実施形態を実施して、一緒にされて任意の染色体相互作用をする染色体の領域からの配列を含む、本明細書中で言及される任意の特性を有し得る任意のライゲートされた配列を検出することができる。
【００７６】
従って、本発明は、ＰＣＲ反応の間に活性化に際して検出可能であるプローブを使用して染色体相互作用に関連するライゲートされた配列を定量的に検出するための方法であって、前記ライゲートされた配列は、一緒になって後成的染色体相互作用をする二つの染色体領域からの配列を含み、ＰＣＲ反応の間にライゲートされた配列をプローブと接触させ、そしてプローブの活性化の程度を検出することを含み、前記プローブがライゲーション部位と結合する方法を提供する。
【００７７】
プライマーおよびプローブ配列は、任意のそのような開示された特異的配列または特異的配列のホモログおよび／もしくはフラグメントであり得る。プライマー配列は、典型的には、３ＣまたはＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）法、例えば本明細書中で開示するような任意のかかる方法またはライゲート産物などの染色体相互作用を検出するプロセスで作製されるライゲート産物を増幅することができる。プライマーは、典型的には単方向性である。場合によって、プライマー配列は、問題となる３Ｃ相互作用のライゲート産物に特有であるように設計される。プローブは、典型的には、ライゲーション部位を含むライゲート産物中の配列と特異的に結合できる。プローブは、典型的には、ＰＣＲ反応の間に標識を活性化するために、これから１以上の部分を切断／放出することができる「加水分解」プローブである。
【００７８】
ライゲートされた配列は、核酸の試料を架橋し、続いて核酸をさらに小さな断片に、例えば酵素消化によって、または物理的せん断プロセスによって分解することによって調製することができる。ライゲーションステップを次に実施する。ライゲートされた配列は、典型的には、本明細書中で記載するような治療および処理、特にＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）架橋および切断ステップを受けた個体または細胞株から誘導される。ライゲートされた配列は、前記方法のいずれかで定義されるかまたは前記方法のいずれかによって作製されるライゲート産物であり得る。ライゲートされた配列のライゲーション部位は、架橋した核酸を切断するために使用した制限酵素の制限酵素認識配列を含んでいてもよい。好ましい制限酵素はＴａｑＩまたはＴａｑＩの任意の修飾形態（例えば同じ制限部位を認識するもの）である。ライゲートされたＤＮＡ分子は、１０〜１００ヌクレオチド塩基長、または１０〜４００ヌクレオチド塩基長、または１０〜５００ヌクレオチド塩基長、または２００〜６００ヌクレオチド塩基長、または２００〜８００ヌクレオチド塩基長または２００〜１０００ヌクレオチド塩基長の核酸配列を含み得る。
【００７９】
好ましくは、１セットのプライマー（すなわち、一緒に増幅できる２つのＰＣＲプライマー）だけを検出で使用し、１セットより多いプライマーを用いたネステッドＰＣＲは実施しない。好ましくは、プライマーは単方向性である。なお一層好ましくは、プライマー配列は、問題となる３Ｃ相互作用に特有であるように選択される。一実施形態において、検出方法は、増幅されていない、および／またはプローブが結合しない他の核酸（例えば他のライゲート産物）の存在下で実施される。典型的には、他の核酸（例えばライゲート産物）は、存在する核酸またはライゲート産物の少なくとも１０％、３０％または少なくとも５０％であってよい。
【００８０】
ｑＰＣＲによって検出される状況
本明細書中で記載するｑＰＣＲ法を使用して、それらが関連する任意の状況、例えば記載される任意の状況において染色体相互作用を検出することができる。それを典型的には使用して、たとえば本明細書中で定義するようなサブグループに関連する染色体相互作用を検出することができる。それを使用して、染色体相互作用における変化および／または変異に関連する染色体相互作用、遺伝子からの発現における変化もしくは遺伝子の調節解除を検出することができる。
【００８１】
本明細書中で記載するｑＰＣＲ法を使用して染色体相互作用を検出することができ、ここで、一緒になって後成的染色体相互作用をする二つの染色体領域からの配列は、染色体において少なくとも１０００塩基対離れているかまたは少なくとも１０，０００塩基対離れているかまたは少なくとも１００，０００塩基対離れている。本明細書中で記載するｑＰＣＲ法は、一緒になって後成的染色体相互作用をする二つの染色体領域からの配列が１００，０００塩基対超離れてあり、したがって相互作用は１００キロベース超、場合によって５００キロベース超、好ましくは９００キロベース超のＤＮＡループを生成する長範囲（ｌｏｎｇ  ｒａｎｇｅ）染色体相互作用を検出するために使用できる。本明細書中で記載するｑＰＣＲ法は、チロシンキナーゼ阻害剤療法に対して応答する遺伝子、例えばＰＤＧＦＲＡにおける遺伝子変化または後成的変化と関連付けられる長範囲染色体相互作用を検出するために使用することができる。
【００８２】
ｑＰＣＲプローブの設計／構造
ｑＰＣＲ反応で使用するためのプローブは、ライゲーション部位に近接したライゲートされたＤＮＡ分子と、ライゲーション部位を含み、場合によって前記染色体領域の各々からの配列に相補的な配列を有するライゲートされたＤＮＡ分子上の部位で特異的に結合させるように設計することができる。プローブは、両フラグメントの接合部に及び、例えばライゲーション部位に対して５’および３’の少なくとも５、１０または２０ヌクレオチド塩基と結合する配列を有する。プローブは、１０〜４０ヌクレオチド塩基長の核酸配列を含み得、または好ましくは１０〜３５ヌクレオチド塩基長の核酸配列を含み得、またはさらに好ましくは２０〜３０ヌクレオチド塩基長の核酸配列を含み得る。プローブは、ライゲートされたＤＮＡ分子の配列に対して少なくとも７０％の相同性／同一性または本明細書中で定義するような同一性の他のレベルを有する配列を有し得る。
【００８３】
ｑＰＣＲプローブの標識
プローブは、概して、活性化された場合にのみ検出されるように、不活性および活性状態を有する検出可能な標識で標識されている。活性化の程度は、ＰＣＲ反応において存在する鋳型（ライゲーションされた産物）の程度に関連するであろう。検出は、ＰＣＲの全部または一部の間、例えばＰＣＲのサイクルの少なくとも５０％または８０％の間に実施することができる。
【００８４】
プローブは、オリゴヌクレオチドの一端に共有結合したフルオロフォアと、ヌクレオチドの他端に結合したクエンチャーとを含み得、その結果、フルオロフォアの蛍光がクエンチャーによって消光される。一実施形態において、フルオロフォアはオリゴヌクレオチドの５’末端に結合し、クエンチャーはオリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合する。本発明の方法で使用できるフルオロフォアとしては、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ、ＨＥＸ、Ｃｙａｎｉｎｅ３、ＡＴＴＯ５５０、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙａｎｉｎｅ３．５、ＬＣ６１０、ＬＣ６４０、ＡＴＴＯ６４７Ｎ、Ｃｙａｎｉｎｅ５、Ｃｙａｎｉｎｅ５．５およびＡＴＴＯ６８０が挙げられる。適切なフルオロフォアとともに使用できるクエンチャーとしては、ＴＡＭ、ＢＨＱ１、ＤＡＢ、Ｅｃｌｉｐ、ＢＨＱ２およびＢＢＱ６５０が挙げられ、場合によって前記フルオロフォアは、ＨＥＸ、Ｔｅｘａｓ  ＲｅｄおよびＦＡＭから選択される。フルオロフォアとクエンチャーとの好ましい組み合わせとしては、ＦＡＭとＢＨＱ１およびＴｅｘａｓ  ＲｅｄとＢＨＱ２が挙げられる。他の好ましい組み合わせを表３に示す。
【００８５】
ｑＰＣＲアッセイにおけるプローブの使用
本発明の加水分解プローブは、典型的には、濃度が適合したネガティブ対照で最適化された温度勾配である。好ましくは、シングルステップＰＣＲ反応が至適である。より好ましくは、標準曲線が算出される。ライゲートされた配列の接合部にわたって結合する特異的プローブを使用する利点は、ライゲートされた配列に対する特異性が、ネステッドＰＣＲアプローチを使用することなく達成できることである。本明細書中に記載する方法によって低コピー数標的の正確かつ精密な定量化が可能になる。標的ライゲートされた配列を温度勾配最適化の前に精製することができ、例えば、ゲル精製することができる。標的ライゲートされた配列を配列決定することができる。好ましくは、ＰＣＲ反応は、約１０ｎｇ、または５〜１５ｎｇ、または１０〜２０ｎｇ、または１０〜５０ｎｇ、または１０〜２００ｎｇの鋳型ＤＮＡを使用して実施される。順および逆プライマーは、一方のプライマーがライゲートされたＤＮＡ配列で表される染色体領域のうちの１つの配列と結合し、他方のプライマーが、例えば、配列に対して相補的であることによってライゲートされたＤＮＡ配列において表される他の染色体領域と結合するように設計される。
【００８６】
ライゲートされたＤＮＡ標的の選択
本発明は、本明細書中で定義するようなＰＣＲ法で使用するためのプライマーおよびプローブを選択する方法であって、プライマーがライゲートされた配列と結合し増幅する能力に基づいてプライマーを選択し、プローブ配列が結合する標的配列の特性、特に標的配列の曲率に基づいて、プローブ配列を選択することを含む方法を提供する。
【００８７】
プローブは、典型的には、制限部位に及ぶ並置された制限フラグメントであるライゲートされた配列と結合するように設計／選択される。本発明の一実施形態において、特定の染色体相互作用に関連する可能なライゲートされた配列の予想される曲率は、例えば本明細書中で参照する特定のアルゴリズムを使用して算出される。曲率は、ヘリカルターンあたりの度として、例えばヘリカルターンあたり１０．５°として表すことができる。ライゲートされた配列は、ライゲートされた配列がヘリカルターンあたり少なくとも５°、典型的にはヘリカルターンあたり少なくとも１０°、１５°または２０°、例えばヘリカルターンあたり５°〜２０°の曲率傾向ピークスコアを有する場合を標的とする目に選択される。好ましくは、ヘリカルターンあたりの曲率スコアは、ライゲーション部位の少なくとも２０、５０、１００、２００または４００塩基、例えば２０〜４００塩基上流および／または下流について算出される。したがって、一実施形態において、ライゲート産物中の標的配列は、曲率のこれらのレベルのいずれかを有する。標的配列はまた、最低の熱力学的構造自由エネルギーに基づいて選択することができる。
【００８８】
試料調製および染色体相互作用検出のための好ましい実施形態
試料調製および染色体コンフォメーション検出の方法を本明細書中に記載する。これらの方法の最適化（従来型）バージョンを、例えばこの節で記載するようにして使用することができる。
【００８９】
典型的には、試料は少なくとも２×１０５ 細胞を含む。試料は最大で５×１０５の細胞を含み得る。一実施形態において、試料は２×１０５〜５．５×１０５細胞を含む。
染色体座位において存在する後成的染色体相互作用の架橋は本明細書中で記載されている。これは、細胞溶解が起こる前に実施することができる。細胞溶解は、３〜７分、例えば４〜６または約５分間実施することができる。いくつかの実施形態では、細胞溶解は少なくとも５分間かつ１０分未満実施される。
【００９０】
ＤＮＡを制限酵素で消化することは本明細書中で記載されている。典型的には、ＤＮＡ制限は、約５５℃〜約７０℃、例えば約６５℃で、約１０〜３０分の期間、例えば約２０分間実施される。
【００９１】
好ましくは、高頻度カッター（ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｃｕｔｔｅｒ）制限酵素が使用され、これは最大４０００塩基対の平均フラグメントサイズを有するライゲートされたＤＮＡをもたらす。場合によって、制限酵素は、約２００〜３００塩基対、例えば約２５６塩基対の平均フラグメントサイズを有するＤＮＡのフラグメントをもたらす。一実施形態では、典型的なフラグメントサイズは、２００塩基対〜４，０００塩基対、例えば４００〜２，０００または５００〜１，０００塩基対である。
【００９２】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ方法の一実施形態において、ＤＮＡ沈降ステップは、ＤＮＡ制限消化ステップとＤＮＡライゲーションステップとの間で実施されない。
【００９３】
ＤＮＡライゲーションは本明細書中で記載されている。典型的には、ＤＮＡライゲーションは、５〜３０分間、例えば約１０分間実施される。
【００９４】
試料中のタンパク質は、例えばプロテイナーゼ、場合によってプロテイナーゼＫを使用して、酵素により消化することができる。タンパク質は、約３０分〜１時間、例えば約４５分間、酵素によって消化することができる。一実施形態において、タンパク質の消化後、例えばプロテイナーゼＫ消化後、架橋逆転（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋ  ｒｅｖｅｒｓａｌ）またはフェノールＤＮＡ抽出ステップはない。
【００９５】
一実施形態において、ＰＣＲ検出は、好ましくはライゲートされた核酸の存在／非存在に関する二元的リードアウトを用いてライゲートされた核酸の単一コピーを検出することができる。
【００９６】
療法および治療薬の同定
本発明者らは、がんの治療で使用される化合物がどのようにして３Ｃ染色体コンフォメーションに対しても直接作用することができるかなど、染色体相互作用ががんの療法にどのように関連するかを見出した。例えば、活性化されたチロシンキナーゼに対して直接作用することが知られているＡＴＰ模倣イマチニブは、ｃＫＩＴなどのイマチニブ応答性遺伝子において３Ｃ染色体コンフォメーションに対して直接作用することが見いだされている。
【００９７】
したがって、公知治療薬の標的に関連する染色体コンフォメーションにおける変化の同定またはモニタリングは、コンフォメーションにおいて同じ変化をもたらし、同じ治療効果を有する化合物を同定するために使用できる。したがって、公知治療薬の標的に関連した染色体コンフォメーションにおける変化の同定またはモニタリングは、染色体コンフォメーションにおける変化も引き起こし得る治療薬または他の治療薬による治療に感受性である対象、または細胞を特定するために使用することができる。
【００９８】
さらに、本発明は、関連する染色体相互作用を、例えば本明細書中で言及するように変更することによってがんを予防または治療するために使用することができる治療用核酸を提供する。そのような核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、「干渉」によって機能し得る、ＲＮＡｉなどである。
【００９９】
ホモログおよびフラグメント
本発明は、本明細書中で開示する特定の配列を含む、本明細書中で言及する核酸のホモログおよび／またはフラグメントの使用を含む。そのようなホモログおよび／またはフラグメントは、例えば関連するライゲート産物と特異的に結合できるなど、元の核酸と同じ結合特性を有し得る。
【０１００】
ポリヌクレオチド／核酸（例えば、ＤＮＡ）のホモログは、典型的には、例えば少なくとも１０、１５、２０、３０、１００もしくはそれ以上の近接ヌクレオチドの領域にわたって、または染色体相互作用に関与する染色体の領域由来である核酸の部分にわたって、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の相同性を有する。相同性は、ヌクレオチド同一性（「ハード相同性」と称する場合もある）に基づいて算出してもよい。
【０１０１】
例えば、ＵＷＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅは、相同性および／または％配列同一性を算出するために使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えばそのデフォルト設定で使用）（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，ｐ３８７−３９５）。ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムは、相同性および／または％配列同一性および／またはラインナップ（ｌｉｎｅ  ｕｐ）配列を計算するために使用できる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０に記載されているようにするなど、同等または対応する配列の同定（典型的にはそれらのデフォルト設定に基づく）。
【０１０２】
ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、典型的には、全米バイオテクノロジー情報センターから公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させた場合、ある正の値の閾値スコアＴとマッチするかまたは満足するクエリ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって高スコアの配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは近傍ワードスコア閾値と称する（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、上記）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、各配列が沿って両方向に伸長される。各方向におけるワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアが到達した最大値から量Ｘだけ低下した場合；１以上の負のスコアリング残余アライメントの蓄積のために、累積スコアが０以下になる場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ５ＴおよびＸはアライメントの感受性および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトとして１１のワード長さ（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９を参照）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。
【０１０３】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を実施する；例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は、最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのポリヌクレオチド配列間のマッチが偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、ある配列は、第一配列を第二配列と比較した最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、さらに好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合に、別の配列に類似しているとみなされる。
【０１０４】
相同性配列は、典型的には、１、２、３、４またはそれ以上の塩基、例えば１０、１５または２０未満の塩基（ヌクレオチドの置換、欠失または挿入であり得る）で異なる。これらの変化は、相同性および／または％配列同一性の算出に関連して前述した領域のいずれかにわたって測定することができる。
【０１０５】
フラグメントは、典型的には、もとの配列の少なくとも９０％、８０％または５０％である長さを有する。それらは、５’および／または３’末端から少なくとも５、８または１０ヌクレオチドのトランケーションを有し得る。
【０１０６】
アレイ
核酸の第２セットはアレイに結合することができ、そして一実施形態において、好ましくは少なくとも３００、９００、２０００または５０００座位を表す、アレイに結合した、少なくとも１５，０００、４５，０００、１００，０００または２５０，０００の異なる第２の核酸がある。一実施形態において、第２の核酸の異なる集団の一つもしくはそれ以上、またはすべてが、アレイの一つより多くの異なる領域に結合して、事実上、アレイ上で繰り返されて、エラー検出を可能にする。アレイはＡｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  ＣＧＨマイクロアレイプラットフォームに基づくものであり得る。第１核酸のアレイへの結合の検出は、二色システムによって実施することができる。
【０１０７】
治療薬
治療薬は本明細書中で言及されている。本発明は、関連する状態の予防または治療に使用するための薬剤を提供する。これは、必要とする個体に治療上効果的な量の薬剤を投与することを含み得る。本発明の方法は、治療のために個体を選択するために使用することができる。本発明の方法、特に予後コンパニオン後成的試験を実施するための方法は、方法によって特定される個人に、次いで関連する状態を予防または治療する薬剤、例えばチロシンキナーゼ阻害剤、好ましくは、セジラニブ、クレノラニブ、ダサチニブ（Ｓｐｒｙｃｅｌ）；ドビチニブ、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ）；ＩＭＣ−３Ｇ３（オララツマブ、ＬＹ３０１２２０７）Ｌａｒｔｒｕｖｏ（ＰＤＧＦＲＡ）；マシチニブ（ＡＢ１０１０）、ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ）；パゾパニブ；ＰＫＣ４１２（ミドスタウリン、ＣＧＰ４１２５１）；キザルチニブ；レゴラフェニブ；ソラフェニブ（Ｎｅｘａｖａｒ）；スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ）；バタラニブ；Ｓ１１６８３６を含む公知チロシンキナーゼ阻害剤の群からのもの、さらに好ましくはダサチニブ、クレノラニブ、ドビチニブおよびイマチニブを含む群からの１以上を投与することができる治療ステップを含み得る。
【０１０８】
薬剤の処方は薬剤の性質に依存する。薬剤は、薬剤および医薬的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物の形態で提供される。好適な担体および希釈剤には、等張食塩水溶液、例えばリン酸塩緩衝食塩水が含まれる。典型的な経口投薬組成物としては、錠剤、カプセル、溶液および懸濁液が挙げられる。薬剤は、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮または経口投与用に処方することができる。
【０１０９】
薬剤の用量は、様々なパラメータに従って、特に使用する物質；治療する個体の年齢、体重および状態；投与経路；ならびに必要とされるレジメンに従って決定することができる。医師は、任意の特定の薬剤について必要とされる投与経路および投薬量を決定することができるであろう。しかしながら、好適な用量は、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重であり得、例えば、1日につき１〜３回摂取される。
【０１１０】
本明細書中で言及される物質の形態
本明細書中で言及される、核酸または治療薬などの任の物質は、精製または単離された形態であってよい。それは天然で見出されるものとは異なる形態であり得、例えば、それらは天然でともに存在しない他の物質との組み合わせで存在し得る。核酸（本明細書中で定義する配列の部分を含む）は、例えば相同性に関する節で記載したように配列において少なくとも１、２、３、４またはそれ以上のヌクレオチド変化を有する、天然で見出されるものと異なる配列を有し得る。核酸は５’または３’末端で異種配列を有し得る。核酸は、天然で見出されるものと化学的に異なり得、例えばそれらは何らかの方法で修飾することができるが、好ましくは依然としてワトソンクリック塩基対合が可能である。必要に応じて、核酸は二本鎖または一本鎖形態で提供される。本発明は、一本鎖または二本鎖形態で、本明細書中で言及される特定の核酸配列のすべてを提供し、したがって、開示された任意の配列に対して相補的な鎖を含む。
【０１１１】
本発明はまた、特定のサブグループと関連する染色体相互作用の検出を含む、本発明の任意のプロセスを実施するためのキットも提供する。そのようなキットは、本発明のプロセスによって生成されるライゲートされた核酸を検出することができる薬剤などの、関連する染色体相互作用を検出できる特異的結合剤を含み得る。キット中に存在する好ましい薬剤には、ライゲートされた核酸またはプライマー対とハイブリダイズすることができるプローブ、例えばＰＣＲ反応またはｑＰＣＲ反応においてライゲートされた核酸を増幅できる、本明細書中で記載するような加水分解性プローブが含まれる。
【０１１２】
本発明はまた、関連する染色体相互作用を検出できるデバイスを提供する。デバイスは、好ましくは、本明細書中で記載する任意のそのような薬剤、プローブまたはプライマー対などの、染色体相互作用を検出できる任意の特異的結合剤、プローブまたはプライマー対を含む。
【０１１３】
本明細書中で言及する核酸はＤＮＡの形態であってよい。
【０１１４】
具体的な実施形態
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームテクノロジーは、座位での正常状態と異常状態との間の調整変化の後成的調整シグネチャーを検出する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームは、染色体コンフォメーションシグネチャーとしても公知のヒト染色体の調整高次構造と関連する遺伝子調節の基本的後成的レベルを特定しモニタリングする。染色体シグネチャーは、遺伝子調節解除のカスケードにおける明確な最初のステップである。それらは、後期後成的および遺伝子発現バイオマーカー、例えばＤＮＡメチル化およびＲＮＡプロファイリングを利用するバイオマーカープラットフォームに対して独自の利点のセットを有する高次バイオマーカーである。
【０１１５】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイアッセイ
カスタムＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイスクリーニングプラットフォームは、１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋの独自の染色体コンフォメーションの４種の密度で供給され、各キメラフラグメントはアレイ上で４回繰り返され、各々６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋおよび１００００００の効果的な密度を作製する。
【０１１６】
カスタム設計のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ
１５Ｋ  ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ発見テクノロジーを用いて調べた約３００座位を含む全ゲノムをスクリーニングできる。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイをＡｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  ＣＧＨ  マイクロアレイプラットフォーム上に構築する；このテクノロジーは、６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋおよび１００００００プローブの４種の密度を提供する。アレイ当たりの密度は、各ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プローブが四連で提示され、したがって再現性の統計的評価を可能にするので、１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋおよび２５０Ｋに減少される。遺伝子座位ごとに調べた潜在的なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの平均数は５０である；したがって、調査できる座位の数は、３００、９００、２０００、および５０００である。
【０１１７】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）カスタムアレイパイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、１セットの試料を有する二色システムであり、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ライブラリ生成の後、Ｃｙ５で標識され、他方の試料（対照）は比較／分析・Ｃｙ３で標識される。Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｃａｎ  Ｓｃａｎｎｅｒを使用してアレイをスキャンし、得られた特徴を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ抽出ソフトウェアを用いて抽出する。次に、ＲにおいてＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ処理スクリプトを使用してデータを処理する。アレイを、ＲにおけるＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ：Ｌｉｍｍａ＊において標準的二色パッケージを使用して処理する。アレイの正規化は、Ｌｉｍｍａ＊における正規化アレイ内関数を使用して実施し、これは、オンチップＡｇｉｌｅｎｔポジティブ対照およびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ポジティブ対照を使用して実施する。データは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｌａｇコールに基づいてフィルタリングされ、Ａｇｉｌｅｎｔ対照プローブを除去し、技術的複製プローブを平均して、Ｌｉｍｍａ＊を用いてそれらを分析する。プローブを、比較される２つのシナリオ間のそれらの差異に基づいてモデル化し、次にＦａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅを用いて補正する。＜＝−１．１または＝＞１．１であり、ｐ＜＝０．１  ＦＤＲｐ値に合格する、変動係数（ＣＶ）＜＝３０％を有するプローブをさらなるスクリーニングのために使用する。プローブセットを減少させるために、ＲにおけるＦａｃｔｏｒＭｉｎｅＲパッケージを使用してさらなる多因子分析を実施する。
＊注：ＬＩＭＭＡはマイクロアレイ実験における差次的発現変動を評価するための線形モデルおよび経験的ベイズプロセスである。Ｌｉｍｍａは、マイクロアレイまたはＲＮＡ−Ｓｅｑから得られる遺伝子発現データの分析のためのＲパッケージである。
【０１１８】
プローブのプールをまず、最終ピッキングについて調節されたｐ値、ＦＣおよびＣＶ＜３０％（任意のカットオフポイント）パラメータに基づいて選択した。さらなる分析および最終リストは最初の２つのパラメータ（ａｄｊ．ｐ値；ＦＣ）のみに基づいて描画される。
【０１１９】
統計パイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）スクリーニングアレイを、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォーム上への翻訳用に高値のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを選択するために、ＲにおいてＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）分析パッケージを使用して処理する。
【０１２０】
ステップ１
プローブを、改変された線形回帰モデルの積である、補正されたｐ値（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒａｔｅ、ＦＤＲ）に基づいて選択する。ｐ値＜＝０．１以下のプローブを選択し、次にそれらの後成的比率（ＥＲ）によってさらに減少させ、さらなる分析のために選択するためにはプローブＥＲは＜＝−１．１または＝＞１．１でなければならない。最後のフィルターは変動係数（ＣＶ）であり、プローブは＜＝０．３以下でなければならない。
【０１２１】
ステップ２
統計的リストからの上位４０のマーカーを、ＰＣＲ翻訳のためのマーカーとしての選択のためにそれらのＥＲに基づいて選択する。最高の負のＥＲロードを有する上位２０のマーカーと最高の正のＥＲロードを有する上位２０のマーカーとでリストは構成されている。
【０１２２】
ステップ３
ステップ１から得られたマーカー、統計的に有意なプローブは、超幾何学的濃縮（ＨＥ）を使用する濃縮分析の基礎を形成する。この分析により、有意なプローブリストからのマーカーを減らすことが可能になり、ステップ２からのマーカーとともに、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームに翻訳されたプローブのリストを形成する。
【０１２３】
統計的プローブをＨＥによって処理して、どの遺伝子位置が統計的に有意なプローブの濃縮を有するかを判定して、どの遺伝子位置が後成的差異の中心であるかを示す。
【０１２４】
補正されたｐ値に基づく最も有意な濃縮座位をプローブリスト作成のために選択する。０．３または０．２のｐ値の遺伝子位置を選択する。ステップ２からのマーカーを使用したこれらの遺伝子位置に対する統計的プローブマッピングによって、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ翻訳のための高価値マーカーが形成される。
【０１２５】
アレイ設計および処理
１．遺伝子座は、ＳＩＩソフトウェア（現在ｖ３．２）を使用して処理して：
ａ．これらの特定の遺伝子座（上流に５０ｋｂおよび下流に２０ｋｂを有する遺伝子配列）でゲノムの配列を取り出す
ｂ．この領域内の配列がＣＣに含まれる確率を明示する
ｃ．特異的ＲＥを使用して配列を切断する
ｄ．どの制限フラグメントがある特定の配向において相互作用する可能性が高いかを判定する
ｅ．異なるＣＣが互いに相互作用する可能性をランク付けする。
２．アレイサイズ、そして利用可能なプローブ位置の数（ｘ）を決定する。
３．ｘ／４相互作用を抜き出す。
４．各相互作用について、パート１からの制限部位に対しては３０ｂｐの配列、パート２の制限部位については３０ｂｐの配列を規定する。これらの領域が繰り返し配列でないことを調べ、もしそうならば除外して、次の相互作用をリストに載せる。両３０ｂｐを合わせてプローブを規定する。
５．ｘ／４プローブ＋規定した対照プローブのリストを作製し、４回複製して、アレイ上に作成されるリストを作成する。
６．プローブのリストをカスタムＣＧＨアレイ用のＡｇｉｌｅｎｔ  Ｓｕｒｅデザインウェブサイトにアップロードする。
７．プローブ群を使用して、ＡｇｉｌｅｎｔカスタムＣＧＨアレイを設計する。
【０１２６】
アレイ処理
１．鋳型産生用のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＳＯＰを使用して試料を処理する。
２．アレイ処理実験室によるエタノール沈降で浄化する。
３．Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＴａｇコンプリートＤＮＡ標識キット−血液、細胞または組織のゲノムＤＮＡ分析酵素標識のためのＡｇｉｌｅｎｔオリゴヌクレオチドアレイベースのＣＧＨにしたがって試料を処理する。
４．Ａｇｉｌｅｎｔ特徴抽出ソフトウェアを使用するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｃ  Ｓｃａｎｎｅｒを用いてスキャンする。
【０１２７】
刊行物
本明細書中で言及されすべての刊行物の内容は、参照により本明細書中に組み込まれ、本発明に関連する特徴をさらに定義するために使用され得る。
【実施例】
【０１２８】
実施例１．がんにおける染色体相互作用の分析
序文
ゲノムＤＮＡに基づく現行のがん診断法は、効果であり、半定量的であり、全てのブレイクポイント変異体を捕捉することはできない。ネステッドＲＴ−ＰＣＲに基づく診断法は、生細胞を必要とし、他の方法を使用して確認しなければならず、複雑なＲＮＡ処理ステップを有する。本研究で開発された方法は、全てのブレイクポイント変異体を捕捉し、定量的であり、ＲＮＡ安定性の問題がなく、少量の試料を使用し、処理時間が速い。したがって、この方法は誤診や誤った治療を施す可能性を減らす。
【０１２９】
本研究はまた、チロシンキナーゼ阻害剤に対して治療的に応答性である３Ｃ相互作用を特定する。これは、チロシンキナーゼ阻害剤で治療可能な患者を検出するために使用できる予後検査の基礎をなす。現行の検査は、例えばブレイクポイントの変動のために正確ではないか、または感受性ではない。誤診によって、患者はチロシンキナーゼ阻害剤療法を受けないで、その代わりに無応答性であるステロイドを受けることになるであろう。例えば未治療のｉＨＥＳ患者の予後は悪い。
【０１３０】
我々はがんに関連する後成的相互作用およびチロシン−キナーゼ阻害剤での治療に関する患者の階層化におけるそれらの有用性を調査した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈＴＭとして公知の高分解能染色体−コンフォメーションキャプチャまたは３Ｃ分析プラットフォームおよび定量的ＰＣＲを使用して、我々は、ＩＤＨ変異の有無にかかわらず神経膠腫細胞株におけるＦＩＰ１Ｌ１とＰＤＧＦＲＡとの間のコンフォメーション的並置をマッピングし、評価し、定量した。４ｑ１２での中間部欠失によるＰＤＧＦＲＡの調節解除と慢性好酸球性白血病に関連するＦＩＰ１Ｌ１への融合によって、我々のグループは同じ染色体コンフォメーション相互作用がＥＯＬ−１および他の白血球細胞株で存在するか否かも調査した。
【０１３１】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈＴＭとして公知の高分解能染色体コンフォメーションキャプチャまたは３Ｃ分析プラットフォームを使用することによって、変異に関連する３Ｃ後成的−相互作用の選択を特定した。プライマーを最適化するために、我々はＱｊａｇｅｎ  ＱＩＡｇｉｌｉｔｙ  Ｈｉｇｈ−Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを使用する９６ウェルプレートアッセイで温度勾配を使用し、３６の別個の温度勾配ＰＣＲにおいて７２のプライマーを試験した。合計２０の個々のＯＢＤ予測３Ｃ相互作用をスクリーニングした。可能な場合は、予想される相互作用各々について複数のプライマーセットを使用した。我々は、２つのＡＭＬ細胞株ＥＯＬ−１およびＨＬ−６０からの１０ｎｇの標的−３Ｃ鋳型を使用してシングルステップＰＣＲを最適化した。ＳＹＢＲ検出および濃度がマッチしたネガティブ対照を使用して、（標的の）ＰＣＲ増幅を実施した。ネガティブ対照は、３Ｃ試料として処理したホルムアルデヒドを含まないＥＯＬ−１（消化およびライゲーションを伴う）、および正常なゲノムＤＮＡを含んでいた。すべてのＰＣＲ産物をＬａｂＣｈｉｐに掛けた。予想されるサイズのＰＣＲ産物を、ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して精製し、順および逆プライマー配向で配列決定した。プライマーは、１００ｂｐあたり１ｎｇ／μＬの鋳型濃度で、反応あたり３．２ｐｍｏｌ／μＬで使用した。予想される３Ｃフラグメントに対して１００％の相同性を示す産物をｑＰＣＲデザインに進めた。
【０１３２】
ＩＤＨ１  ＳＮＰ  ｒｓｌｌ５５４１３７およびＩＤＨ１  Ｒ１３２Ｈ変異についてスクリーニングするために、１０ｎｇの３Ｃ鋳型を学術出版から誘導される従来型ＩＤＨ１ゲノムプライマーとともにしようした；これらのプライマー配列は外部で設計され、本願には含まれない。
【０１３３】
濃度マッチしたネガティブ対照を用いた加水分解−プローブに基づくｑＰＣＲを使用してシングルステップｑＰＣＲを実施した。次いで、標的化３Ｃ  ＤＮＡフラグメントの接合領域に対して設計された加水分解プローブを使用してＢ７  ４６２ｂｐ相互作用の検出を最適化した。ｑＰＣＲアッセイで使用するプローブは３Ｃ  ＤＮＡフラグメントに対して特異的である。ＥＯＬ−１鋳型（１０ｎｇ）を使用して、温度勾配に基づくｑＰＣＲ（５８〜６８℃）においてプローブを最適化した。プライマーを加水分解プローブｑＰＣＲアッセイ開発のために選択した。Ｂ７産物を使用して、３Ｃ  フラグメント特異的ｑＰＣＲを設計した。５’−ＦＡＭ／ＢＨＱｌ−３’または５’Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ／ＢＨＱ２−３’で標的化した二重標識加水分解プローブを使用して、配列決定された相互作用を検出した。プローブは３Ｃフラグメントの接合領域に及ぶように設計され、それによって３Ｃ産物の検出がＦＩＰＬ１Ｌ１およびＰＤＧＦＲＡ相互作用について特異的であることを確実にした。ｑＰＣＲ標準曲線（１０６−１コピー）を配列決定された産物から産生した。
【０１３４】
二重標識５’ＦＡＭ−ＢＨＱｌ−３’標識された加水分解プローブを使用して配列決定された相互作用を検出した。すべての試料を２０ｎｇでスクリーニングし、ＭＭＰ１コピー数を記録した。配列決定されたＰＣＲ産物Ｂ７を使用して、ｑＰＣＲスクリーニングのための標準曲線を作成した。２０ｎｇの３ＣライブラリＤＮＡに対して調節したｑＰＣＲ鋳型を濃度マッチしたネガティブ対照とともに使用した。対照は、脂肪生検および正常な血液から誘導される３Ｃライブラリを含んでいた。さらなるネガティブ対照は、ホルムアルデヒド固定化をしていない細胞株材料、消化しライゲートされたライブラリ材料、および正常なゲノムＤＮＡを含んでいた。この研究は米国血液学会のガイドラインにしたがって実施した。細胞株はＡＴＣＣから提供された。倫理上の同意を得た患者材料はＴｉｓｓｕｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｏｘｆｏｒｄ  ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ  ＴＳＤ−ＯＢＤ２２７３）から提供された。
【０１３５】
同定された６つのＦＩＰ１Ｌ１−ＰＤＧＦＲＡ  ３Ｃ配列配向配列のうち、２つが再発した（表１）。具体的には、ゲノム配列標識されたＧＢＡ４６１ＧＢ＿ＧＢＡ４９６Ａ６を４回同定した。ゲノム配列ＦＨ１４７９４６＿ＦＨ１４９ＡＡ７を２回同定した。シングルステップＰＣＲを使用して、これらの６つの相互作用をＡＭＬ細胞株ＥＯＬ−１で増幅した。ＦＩＰ１Ｌ１  ＰＤＧＦＲＡ  ３Ｃ  Ｂ７相互作用はシングルステップＰＣＲを使用してＡＭＬ細胞株（急性骨髄性好酸球性白血病）ＥＯＬ−１（ｎ＝２、加水分解プローブアッセイ）において再現可能に見いだされた。ＥＯＬ−１においてＦＩＰ１Ｌ１とＰＤＧＦＲＡとの間のトポロジー遮蔽の喪失は、欠失によって部分的に媒介され得る。
【０１３６】
４６２塩基対Ｂ７相互作用を２つのイマチニブ感受性細胞株：ＧＤＭ−１（ｎ＝１）およびＨＬ−６０（ｎ＝２）において増幅した。ＦＩＰ１Ｌ１およびＰＤＧＦＲＡ遺伝子間のトポロジー遮蔽喪失のメカニズムはわかっていないが、どちらの細胞株もイマチニブに応答する。神経膠芽腫細胞株ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ（ｎ＝２  ｑＰＣＲアッセイ）およびＵ−３７３（ｎ＝１  ｑＰＣＲアッセイ）もＢ７相互作用について陽性である。ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧで見いだされる最大コピー数は２９．８９コピーであった（２０ｎｇの鋳型、表２）。ＩＤＨ１変異またはＳＮＰ  ｒｓｌｌ５５４１３７が同定されていない１つの神経膠腫試料は１．１９（２０ｎｇあたり）のＦＩＰＬ１−ＰＤＧＦＲＡ  ３Ｃフラグメントを有していた。ＩＤＨ１  Ｒ１３２Ｈ変異が同定された２つの神経膠腫試料はＦＩＰＬ１−ＰＤＧＦＲＡ  ３Ｃフラグメントについて陽性であった。
【０１３７】
ｑＰＣＲ標準曲線（１０６−１コピー）を配列決定されたＰＣＲ産物から作製した。ｑＰＣＲデータの分析はＣＦＸマネジャーソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を使用して実施した。ＭＭＰ１における安定な３Ｃ相互作用を用いて正規化を実施した。標準曲線は、シングルステップｑＰＣＲを使用したＡＭＬおよび神経膠芽腫試料におけるＢ７相互作用の選択的増幅を示した。
【０１３８】
染色体コンフォメーションを使用して、神経膠芽腫およびＡＭＬ−細胞株におけるＦＬＩＰＬ１およびＰＤＧＦＲＡ間のインシュレータ機能の喪失に関連するＤＮＡ配列の検出に成功した。ＦＩＰ１Ｌ１およびＰＤＧＦＲＡ遺伝子間の遮蔽の喪失は、ｑＰＣＲを用いてＡＭＬおよび神経膠芽腫において検出可能である３Ｃ変更に至る。これらの相互作用は従来型シーケンシング法を使用して検出できない。
【０１３９】
実施例２．定量的ＰＣＲアッセイの開発
ＭＩＱＥガイドラインで取り扱われるｑＰＣＲのデータおよび技術的要件に適合するために、我々はｑＰＣＲを用いた３Ｃの増幅および検出のための新規技術を開発した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって、標的試料において高感受性でＤＮＡコピー数の決定が可能になる。これは、染色体相互作用の検出に関連する核酸産物の分析の要求に特に適していることが判明した。
【０１４０】
ＭＩＱＥガイドラインはｑＰＣＲ実験について報告されなければならない最低限の情報についての明細を提供して、その関連性、正確性、正しい解釈、および再現性を確実にする。ＭＩＱＥ（定量的リアルタイムＰＣＲ実験の公開のための最低限の情報）は、ＤＮＡマイクロアレイ分析、プロテオミクス実験、ゲノム配列明細、ならびにＲＮＡ干渉研究およびメタボロミクスについて議論中のものについて作成された同様のガイドラインに基づいてモデル化され、これらはすべてＭＩＢＢＩの傘下で調整されたイニシアチブである（生物学的および生物医学的調査のための最低限の情報）。
【０１４１】
従来、蛍光に基づくＰＣＲアプローチが使用される場合の３Ｃ分析では、３Ｃフラグメントの複雑なＤＮＡの所定の「定常」領域において設計される。しかしながら、そのようなアプローチはｑＰＣＲのＭＩＱＥ原理に固着せず、技術的にはネステッドＰＣＲの派生物である。そのようなアプローチは、相互作用の少なくとも半分が知られていることを必要とする。
【０１４２】
従来型検出技術では、ＤＮＡポリメラーゼは既知ＤＮＡ標的とハイブリダイズするプローブのみ、そして逆ＰＣＲプライマーが同じ３Ｃライブラリフラグメントと結合する場合に切断する。蛍光の増加は、標的がプローブに対して相補的であり、ＰＣＲ中に増幅される場合にのみ起こる。これらの要件のために、非特異的増幅は検出されない。
【０１４３】
ライゲーション産物を検出するために必要なゲノムＤＮＡの量から、ある座位特異的ライゲーション事象が、１／２，０００〜１／２０，０００の哺乳類細胞においてのみ起こり得ると推定される。したがって、従来型アプローチを用いたライゲーション産物の信頼性のある定量化は、大量のＤＮＡ（すなわち、多くのゲノム等価物）が従来型技術において各ＰＣＲに添加される場合にのみ可能である。しかしながら、我々は、我々が開発した新規技術を用いたＰＣＲにつき２０〜１００ｎｇの３Ｃ鋳型（約３．２×ｌ０４〜１．６×１０５ゲノム当量）をルーチン的に使用する。我々のテクノロジーは、３Ｃ加水分解性プローブがライゲーション接合部にわたって結合することを必要とする。これもまた、マイクロアレイ分析がＰＣＲ分析と適合性であることを必要とする。
【０１４４】
なぜ既存のテクノロジーは従来の技術を用いて機能しないのであろうか？３Ｃコピー数の検出および定量化の特異性に関連する技術的問題。
従来型アプローチは２セットのプライマー、および２ラウンドのＰＣＲを必要とする。技術的には、これは蛍光に基づく検出を用いるネステッドＰＣＲの派生物である。他のアプローチはこれを模倣するが、１つのプライマーセットを用い、４５サイクルのＰＣＲの間である。試料間で差異が見られる場合があるが、アプローチは定量的とはいえず、多くの重大な技術的問題を含んでいる：
（ａ）ネステッドＰＣＲは非定量的として受け入れられ、プライマーセットとある反応においてプラトー期に到達するＰＣＲとの間の効率の差のために低コピー数の正確・精密な定量化は不可能になる。
（ｂ）非特異的産物はネステッドプライマーを用いて増幅することができる。
（ｃ）アッセイは多くの場合配列決定されない。
（ｄ）２ラウンドのＰＣＲアプローチが「真性」でないと、コピー数に関する絶対的定量化はデータから得ることができる。
（ｅ）標準曲線は作成されず（１ラウンドのＰＣＲを必要とする）、低コピー数の正確・精密な定量化は不可能になる。
（ｆ）既存のキットは安全な臨床的ｑＰＣＲアッセイのために確立されたがインドラインに適合しない。
（ｇ）ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲはしばしば複数のＰＣＲ産物を増幅し、産物の特異性に関する重大な技術的問題を引き起こす。
（ｈ）ポイント（ｇ）３Ｃの検出のための加水分解プローブの使用に関して、プローブは「定常領域」に位置する。
（ｉ）定常領域は３ＣフラグメントまたはＴａｑＩ部位の両方について配列特異的領域ではない−加水分解プローブによって検出されるＰＣＲ産物が３Ｃフラグメントであるという任意の特異性主張はしたがって疑わしい。
【０１４５】
従来型アプローチは以下の対照を使用する：
対照１．すべてのライゲーション産物を等しい量で含む対照鋳型を作製する。この鋳型を使用して、プライマー効率の差異について正規化する。
【０１４６】
対照２．ランダムな相互作用の頻度を推定するためにゲノム距離を増大させることによって分離した部位間の相互作用を決定する。良好な出発点は０〜１００ｋｂの範囲のゲノム距離によって分離された部位間の約１ダースの相互作用を試験する。
【０１４７】
対照３．２つの異なる細胞型または２つの異なる状態を比較する場合、この２つの場合で類似したコンフォメーションを有すると推定されるゲノム領域における相互作用を決定する。関心対象の領域から得られるデータが定量的に比較されるように正規化のためにこのデータセットを使用する。
【０１４８】
特異的相互作用は、プライマー効率の正規化後（対照１）、相互作用頻度における局所的ピークが観察される場合（対照２）に、検出される。関連しないゲノム領域（対照３）の分析をその後使用して、異なる細胞または細胞状態を比較して、特異的相互作用が座位の転写などの生物学的活性と相関するかどうかを確立することができる。
【０１４９】
しかしながら、我々が開発した技術はそのような対照が適所にあることを必要としない。特異的増幅および検出は、蛍光クエンチャー標識システムの使用と組み合わされた、プライマーおよびプローブの結合標的の選択のために達成される。例えば、表３はいくつかの好適な蛍光プローブおよびクエンチャーを列挙する。
【０１５０】
実施例３．標的配列の特性
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ｑＰＣＲテクノロジーは、ライゲートされた並置ＤＮＡフラグメントにおけるＴａｑＩ制限部位にわたって及ぶ標的を加水分解プローブの検出のために独自に利用する（表４）。通常、加水分解プローブを用いる検出のために選択された部位は、プローブに対するハイブリダイゼーションの効率、および二次構造の形成についてのそれらの傾向およびプローブハイブリダイゼーションプロセスを干渉し得る他の生物物理学的特性、例えばフォールディングおよび屈曲特性および最低自由エネルギーレベルについて選択される。これは、これまでのところ、３Ｃ検出の関連で加水分解プローブの任意の使用が、何故ライゲーションフラグメントの一部内のプローブを標的とし、両方とオーバーラップしなかったかの説明となる。これは、標的配列内のライゲートされたフラグメントおよびライゲートされていないフラグメントのすべてに対してライゲート産物のみの検出の特異性を強力に弱体化させる。
【０１５１】
ＴａｑＩ制限部位の周りのＣｈｅｃｋ  Ｐｏｉｎｔ  Ｃｈａｒｌｉｅ（ＣＣ）部位のライゲートされた並置でのＤＮＡの曲率および最低自由エネルギーレベルは、加水分解プローブハイブリダイゼーションのための従来型標的化配列を区別する二次構造コンフォメーションを示す。プローブは、制限部位に及ぶ並置ＴａｑＩフラグメント上に設計されている。ＤＮＡの曲率は、ＢＥＮＤアルゴリズム１により、ジヌクレオチドのジオメトリのロール角、チルト角およびツイスト角を合計することによって算出する。曲率は、ヘリカルターンあたりの度として、例えばヘリカルターンあたり１０．５°または塩基対あたり１°として表される。ＴａｑＩ制限部位での最低自由エネルギーΔＧはＺｕｋｅｒ２アルゴリズムにより最近傍エネルギーパラメータ３を使用したエネルギー最小化の推定で算出する。
【０１５２】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）テクノロジーでは、我々はＴａｑＩ部位からの上流および下流配列の最大４００塩基対をスキャンし、ＤＮＡの曲率を算出する。高二次構造の２つのＣＣをあわせてライゲートする結果として、ライゲーション部位を標的とする配列は、加水分解プローブハイブリダイゼーションのための従来型標的配列と比較しての曲率傾向における量的差異を示す。テクノロジーはヘリカルターンあたり＞５°を上回る曲率傾向ピークスコアを求める。ヘリカルターンあたり５°より低い近傍配列の谷と比較した値は、ＤＮＡが曲率したコンフォメーションと取り得ることを示し得る。
【０１５３】
また、我々は、ＴａｑＩ制限部位の配列の上流および下流配列の最大２０塩基をスキャンし、Ｚｕｋｅｒアルゴリズムで記載されるようなオリゴ補正をして０ｍＭ  Ｎａ＋および４．５ｍＭ  Ｍｇ＋＋のイオン状態において６０℃にて線状ＤＮＡの最低自由エネルギーΔＧを算出する。６０℃で自由エネルギーレベルが１．１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の熱力学的構造を有する配列をプローブデザインのために選択する。
【０１５４】
プロモーター、イントロン、ターミネータのような遺伝子の調節領域に存在するそのような配列は、曲率および自由エネルギー値を算出することによってＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームにより同定される二次構造コンフォメーションを示す。プローブは、上述の曲率傾向および最低自由エネルギーレベルで選択された配列上のＴａｑＩ制限部位に及ぶように設計した。
【０１５５】
加水分解プローブの従来型使用は、ＣＣ部位のライゲートされた接合点でそのような生物物理学的に拘束された配列を標的化ハイブリダイゼーションに対して利用しないが、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ処理および検出の関連で、我々は全てのｑＰＣＲ対照とのＴａｑＩライゲーション部位オーバーラップについて特異的に加水分解プローブを使用することができ、非特異的対照に対するコピー数によってライゲート産物の効率的かつ比例的な検出を示す。これは、予定および効果的なプローブ検出のための温度勾配試験に基づいて設計された、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈアッセイの関連で実施された、３Ｃオーバーラップを標的とする加水分解プローブの最初の実用的使用である。
【０１５６】
以下の実施例で方法論を説明する：
配列１
ＴＴＣＣＡＣＧＴＧＧＣＣＴＡＣＣＡＣＡＧＣＡＴＧＴＣＡＧＧＣＣＴＧＧＧＧＧＣＡＧＡＡＴＣＴＴＧＣＣＡＴＡＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＣＡＡＡＴＴＴＧＡＡＴＧＣＣＡＡＡＧＧＣＴＴＴＣＧＴＴＴＧＴＣＴＣＴＧＧＧＧＧＧＣＣＡＣＡＧＴＣＴＡＧＧＴＣＴＡＧＴＴＣＴＧＴＧＣＡＧＧＡＧＴＴＧＴＡＡＴＡＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＴＣＧＣＡＧＡＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＡＧＴＧＣＣＡＴＴＧＡＧＡＣＧＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＴＣＡＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＣＧＡＧＡＣＣＡＴＴＧＡＡＧＡＣＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＴＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＴＴＡＧＴＧＡＧＧＡＴＡＴＧＧＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＴＡＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＴＴＧＴＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＴＴＴＴＣＴＣＡＡＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＴＧＡＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＡＧＡＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＡＴＡＴＴＣＡＧＡＣＡＡＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＧＴＧＡＡＴＡＴＴＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＴＴＡＡＴＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＴＣＧＣＡＧＣＴＧ
【０１５７】
配列の曲率傾向プロフィールを以下にプロットする。ここで、プロフィールは５０〜１００塩基で５°を超える曲率傾向の大きさを示し、そのあとに低いスコアの谷が続く。これは、ＤＮＡの曲率コンフォメーションを示す。ＴａｑＩ領域を取り巻く配列のＤＮＡフォールディングおよび自由エネルギーの推定によって、６０℃、４．５ｍＭ  Ｍｇ＋＋イオン状態で１．１３ｋｃａｌ／ｍｏｌの最低の熱力学的構造自由エネルギーΔＧを得た。この領域はＦＩＰ１Ｌ１のイントロン領域およびＰＤＧＦＲＡ遺伝子の３’末端に相当し、高調節領域を示す。この並置ＴａｑＩフラグメントを選択し、制限部位に及ぶプローブを設計した。配列におけるＴａｑＩ制限部位を黒の背景に対して白で示す。
【０１５８】
配列２
ＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＡＧＴＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＡＧＣＣＣＴＴＴＡＴＡＴＣＣＡＧＧＣＡＧＡＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＴＣＡＧＣＣＡＧＴＣＴＴＧＣＡＧＧＧＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＣＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＧＧＣＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＣＣＡＴＧＣＡＧＴＧＴＧＴＣＣＡＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＡＡＣＧＴＣＣＴＣＣＴＧＧＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＧＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡＣＡＴＣＡＴＧＣＡＴＧＡＴＴＣＧＡＡＡＡＧＡＴＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＴＴＡＧＴＧＡＧＧＡＴＡＴＧＧＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＴＡＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＴＴＧＴＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＴＴＴＴＣＴＣＡＡＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＴＧＡＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＡＧＡＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＡＴＡＴＴＣＡＧＡＣＡＡＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＧＴＧＡＡＴＡＴＴＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＴＴＡＡＴＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＴＣＧＣＡＧＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＴＧＡＴＧＡＡＴＧＧＡＴＡＧＡＴＴＡＡＡＴＧＴＧＴＴＡＴＡＴＣＣＡＴＡＣＡＧＣＧＧＡＡＴＡＴＴＡＴＴＴＧＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＡＣＴＧＧＴＡＧＡＴＧＴＴＡＣＡＡＣＡＣＧＧＡＴＧＡＡＣＣＴＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＣＧＴ
【０１５９】
２つの並置フラグメントのＴａｑＩのまわりの６４７ｂｐの配列のスキャンは、低スコアの谷を取り巻く約２１０ｂｐの位置でヘリカルターンあたり５°を上回る曲率傾向の大きさを示す。ＴａｑＩ領域を取り巻く４４ｂｐ配列のＤＮＡフォールディングおよび自由エネルギー推定は、６０℃、４．５ｍＭ  Ｍｇ＋＋イオン状態で０．７８ｋｃａｌ／ｍｏｌの最低の熱力学的構造自由エネルギーΔＧを得た。
【０１６０】
配列３
ＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＧＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＡＣＴＴＴＣＴＡＴＴＡＡＧＡＡＴＡＡＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＡＡＴＡＴＴＣＡＣＧＴＡＣＡＡＧＴＴＴＴＴＧＴＣＴＧＡＡＴＡＴＧＴＴＴＴＣＡＴＴＣＣＴＣＴＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＴＣＡＣＡＴＧＧＴＡＡＣＴＣＣＡＴＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＴＴＧＡＧＡＡＡＡＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＴＴＴＡＣＡＡＴＣＣＣＡＣＣＡＧＡＡＧＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＣＣＡＴＡＴＣＣＴＣＡＣＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴＴＴＴＡＴＣＴＴＴＴＣＧＡＧＧＴＣＣＴＴＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＧＡＣＧＴＣＡＡＴＧＡＴＡＧＴＧＡＴＣＣＣＴＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＴＣＴＡＣＡＡＧＴＧＧＣＴＡＴＡＡＡＧＡＡＣＴＣＴＧＴＡＧＧＴＡＡＧＡＡＡＴＴＣＴＧＴＡＡＧＡＴＣＡＧＡＡＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＣＴＴＣＡＴＡＡＴＡＡＡＴＴＡＣＴＴＧＧＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＡＴＧＧＧＴＧＣＴＡＡＡＴＴＧＡＴＴＧＧＧＴＡＧＡＡＧＧＡＡＴＴＧＴＡＴＧＣＣＣＡＡＧＣＣＡＣＡＴＧＧＣ
【０１６１】
ＴａｑＩ制限部位の上流および下流に及ぶ４６２ｂｐの配列のスキャンは、約４００および４５０ｂｐ間で、ヘリカルターンあたり５°を上回る傾向度の大きさと、ヘリカルターンあたり５°未満の周囲配列の値を示した。ＴａｑＩ領域を取り巻く４４ｂｐ配列のＤＮＡフォールディングおよび自由エネルギー推定により、６０℃、４．５ｍＭ  Ｍｇ＋＋イオン状態で−０．９３ｋｃａｌ／ｍｏｌの最低熱力学的構造自由エネルギーΔＧを得た。
【０１６２】
配列４
ＡＧＴＡＣＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＣＣＣＡＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡＡＡＴＡＧＴＴＴＡＣＡＴＴＧＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＡＣＧＡＧＡＴＧＴＣＡＧＡＧＧＡＡＣＣＴＧＡＧＴＣＡＴＧＣＴＣＡＧＧＣＣＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＴＧＧＣＡＧＧＣＡＧＡＣＣＡＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣＧＴＧＡＣＴＡＴＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＧＴＧＡＡＴＧＧＣＴＡＧＡＧＣＴＡＣＴＣＴＴＣＡＣＴＴＧＣＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＧＡＧＡＡＣＴＴＣＴＧＧＡＴＴＡＡＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＧＡＡＡＡＧＡＴＡＡＡＡＣＡＧＧＴＧＴＴＡＧＴＧＡＧＧＡＴＡＴＧＧＧＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＣＣＴＣＡＴＡＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＧＧＧＡＴＴＧＴＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＣＣＡＴＴＴＴＣＴＣＡＡＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＡＴＧＧＡＧＴＴＡＣＣＡＴＧＴＧＡＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＡＧＡＧＧＡＡＴＧＡＡＡＡＣＡＴＡＴＴＣＡＧＡＣＡＡＡＡＡＣＴＴＧＴＡＣＧＴＧＡＡＴＡＴＴＣＡＴＡＧＣＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＴＴＡＡＴＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＣＣＴＣＧＣＡＧＣ
【０１６３】
ＴａｑＩ制限部位の上流および下流に及ぶ４９９ｂｐの配列のスキャンによって、約１６０および２４０ｂｐで２つの曲率傾向ピークが示された。ＴａｑＩ領域を取り巻く４４ｂｐ配列のＤＮＡフォールディングおよび自由エネルギー推定によって、６０℃、４．５ｍＭ  Ｍｇ＋＋イオン状態で１．１４ｋｃａｌ／ｍｏｌの最低熱力学的構造自由エネルギーΔＧが得られた。
【０１６４】
配列５
ＣＣＴＣＴＣＣＣＡＣＡＣＡＡＡＣＣＴＧＣＴＡＣＴＧＡＧＴＡＣＣＴＴＣＧＣＴＡＡＣＴＴＡＡＣＣＡＴＴＣＡＴＴＣＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＣＡＣＣＴＡＣＴＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＴＴＣＴＴＡＡＣＡＡＡＴＧＴＡＡＡＧＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＣＴＴＴＡＣＡＣＴＡＡＣＡＡＴＡＣＡＡＡＡＣＴＡＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＧＡＣＡＡＴＴＣＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＴＴＧＡＡＣＴＴＴＧＡＣＡＴＴＴＡＣＡＧＡＡＴＴＡＡＡＴＧＴＣＡＡＡＴＧＴＧＡＣＡＣＡＡＴＡＣＣＡＴＣＡＣＡＴＣＴＧＧＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＣＴＴＡＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＡＧＴＡＡＧＧＡＡＣＡＡＣＴＴＴＴＧＡＧＣＣＴＣＡＡＴＡＴＣＴＴＡＡＴＴＣＴＴＡＡＡＡＴＧＡＴＡＡＡＧＡＡＣＡＣＴＴＡＡＣＴＣＡＡＴＴＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＡＡＡＴＡＡＧＧＴＡＡＴＧＴＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＣＴＴＡＴＴＴＡＴＴＣＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＣＴＴＣＣＡＧＡＴＧＧＧＡＣＴＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＡＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＡＧＴＣＡＴＴＧＧＣＡＣＴＧＡＴＣＴＣＴＡＡＧＡＴＧＣＴＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＡＴＴＧＧＴＧＧＴＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＡＡＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＧＣＡＡＡＧＴＡＣＴＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴＴＴＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡＧＡＡＡＣＴＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＧＴＡＧＣＴＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＣＴＣＣＡＴＧＴ
【０１６５】
ＴａｑＩ制限部位の上流および下流に及ぶ６０９ｂｐの配列のスキャンによって、約２００および５００ｂｐで２つの曲率傾向ピークと、低スコアの谷が示された。ＴａｑＩ領域を取り巻く４４ｂｐ配列のＤＮＡフォールディングおよび自由エネルギーの推定によって、６０℃、４．５ｍＭ  Ｍｇ＋＋イオン状態で０．５１ｋｃａｌ／ｍｏｌの最低熱力学的構造自由エネルギーΔＧが得られた。
【０１６６】
配列６
ＡＡＡＴＧＡＴＧＡＧＧＣＡＣＧＧＧＴＧＡＡＴＡＡＧＡＴＡＧＴＴＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＣＡＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＴＣＣＣＴＡＡＡＧＧＴＧＴＡＴＧＧＴＴＴＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＡＣＴＴＴＣＡＧＴＴＣＴＴＴＴＧＴＡＣＡＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＴＧＧＡＡＴＴＧＣＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＡＡＴＴＣＴＡＴＴＴＴＴＡＡＣＴＴＣＴＴＧＡＴＧＧＡＣＣＴＣＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＣＡＧＡＧＧＣＴＧＣＡＡＣＡＴＴＴＴＡＴＡＴＴＣＣＴＡＣＴＡＡＴＡＡＴＧＣＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＧＡＴＴＴＣＴＣＣＡＣＡＴＣＣＴＴＧＣＣＡＡＣＡＣＴＴＧＡＴＡＴＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＴＴＴＴＧＡＴＡＡＴＧＧＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＧＣＴＴＧＴＧＧＧＡＣＡＴＣＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＧＡＣＣＣＴＴＣＣＡＧＡＴＧＧＧＡＣＴＡＡＣＴＧＧＧＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＡＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＧＡＡＡＧＴＣＡＴＴＧＧＣＡＣＴＧＡＴＣＴＣＴＡＡＧＡＴＧＣＴＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＡＴＴＧＧＴＧＧＴＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＡＡＣＡＡＡＴＴＡＴＡＡＧＣＡＡＡＧＴＡＣＴＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＣＴＴＴＡＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＴＣＡＣＡＧＡＡＡＣＴＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＧＴＡＧＣＴＴＧＴＡＴＧＴＧＴＧＣＴＣＣＡＴＧ
【０１６７】
ＴａｑＩ制限部位の上流および下流に及ぶ５８６ｂｐの配列のスキャンによって、約３００および５００ｂｐで２つの曲率傾向ピークと低スコアの谷が示された。ＴａｑＩ領域を取り巻く４４ｂｐ配列のＤＮＡフォールディングおよび自由エネルギー推定によって、６０℃、４．５ｍＭ  Ｍｇ＋＋イオン状態で０．５１ｋｃａｌ／ｍｏｌの最低の熱力学的構造自由エネルギーΔＧが得られた。
【０１６８】
参考文献：
１．Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ  Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ｅ．（１９９４）“Ｂｅｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｕｒｖａｔｕｒｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂ−ＤＮＡ”Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，５４９７−５５０３
２．Ｚｕｋｅｒ  （２００３）．  Ｍｆｏｌｄ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．  Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，３４０６−３４１５
３．ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｊｒ（１９９８）Ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ，  ｄｕｍｂｂｅｌｌ  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ＤＮＡ  ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，１４６０−１４６５
【０１６９】
2019535295.tif 000002
【０１７０】
2019535295.tif 000003
【０１７１】
2019535295.tif 000004
【０１７２】
2019535295.tif 000005
【０１７３】
2019535295.tif 000006
【０１７４】
2019535295.tif 000007
【０１７５】
実施例４  さらなる研究
異所性チロシンキナーゼ活性化の検出は、複数の適応症で従来型診断法（例えば、シーケンシング）では現在不首尾に終わっている。
チロシンキナーゼ阻害剤、例えばダサチニブ、イマチニブおよびイブルチニブ／イムブルビカ（Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ  Ｌｔｄ）が多くの悪性腫瘍（慢性）および体質性障害のために開発されている。ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）阻害剤の潜在的な非悪性症状の例には関節炎が含まれる。
【０１７６】
臨床医は、チロシンキナーゼ阻害剤の処方に先立って標的チロシンキナーゼにおける分子的損傷の証拠を要求する。チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を使用する潜在的に救命的診断治療介入は、従来型診断法の使用では不首尾に終わるであろう。
【０１７７】
薬物治療に関する本発明の態様：
（ａ）イマチニブは治療上３Ｃコンフォメーションを標的とする：
【０１７８】
我々は、直接的に活性化されたチロシンキナーゼに対して作用することが知られているＡＴＰ模倣イマチニブが、ｃＫＩＴなどのイマチニブ応答性遺伝子における３Ｃ染色体コンフォメーションに対しても直接作用することを証明する。
（ｂ）ＧＳＫは３Ｃコンフォメーションを治療上標的とする：
【０１７９】
ＩＤＨ１阻害剤ＧＳＫ８６４について、この薬物が複数の細胞株において染色体コンフォメーションを直接阻害することを示すデータを提示する。効果的な治療のためのがん患者の階層化は、チロシンキナーゼ遺伝子における活性化変異と、他の経路で獲得された変化を同定活性化することによって実施した。このようにして患者を階層化するのに役立つ診断手順は潜在的に多大な利点を有するものである。ＦＩＰ１Ｌ１およびＰＤＧＦＲＡエンハンサー領域に対するコンフォメーション変化は、ＩＤＨ１  Ｒ１３２Ｈ変異を有する神経膠腫患者におけるＰＤＧＦＲＡ発現を上方調節する。異所性ＰＤＧＦＲＡ過剰発現はイマチニブで治療可能である。
【０１８０】
以下のデータは３Ｃマーカーおよび機能的ｑＰＣＲアッセイにおけるそれらの使用に関する。ＡＢＬ１およびｃＫＩＴは、非悪性試料と細胞株との間の二元的差異を示す。
【０１８１】
ＲＣ＝逆総補体。真性逆プライマー配列はＲＣ配列に隣接する。
【０１８２】
３Ｃ相互作用が特定された遺伝子とそれらが関与する適応症：
１．ＡＢＬ１、９ｑ３４に位置する細胞質チロシンキナーゼ遺伝子：適応症：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、乳がん。慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）およびＣＭＬ−急性転化または消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）。骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）または骨髄増殖性障害（骨髄増殖性腫瘍、ＭＰＮ）。
２．ブルトン型チロシンキナーゼ、Ｘｑ２２．１に位置する細胞質チロシンキナーゼ遺伝子：適応症：
Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、Ｂ細胞悪性腫瘍。ＮＨＬ、リンパ腫（全種類）、骨髄腫。慢性リンパ球性白血病。再発性成熟Ｂ細胞腫瘍に罹っている患者。慢性移植片対宿主病。再発性有毛細胞白血病。再発性または難治性固形腫瘍。難治性マントル細胞リンパ腫。増幅食道胃がんおよび慢性関節リウマチ。
３．ｃＫＩＴ、４ｑ１２に位置するレセプターチロシンキナーゼ遺伝子  適応症：
肥満細胞症および肥満細胞性白血病および前立腺腫瘍。進行性黒色腫、変異悪性黒色腫、二次的、切除不能または転移性消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、発現悪性中皮腫。進行型、白金−難治性卵巣がん。再発性卵巣上皮癌、卵管、または原発性腹膜癌、または卵巣低悪性度潜在的腫瘍。子宮乳頭漿液性がん、進行期小細胞肺がん、局所進行性鼻咽頭がん、再発性／難治性非ホジキンリンパ腫を有する患者。転移性腎細胞がん、転移性膵消化管神経内分泌腫瘍、再発性卵巣明細胞癌、食道扁平上皮癌、持続性子宮がんおよび乳がん。
４．ＦＧＦＲ１、８ｐｌｌに位置するレセプターチロシンキナーゼ遺伝子：適応症：甲状腺がん、口腔腺腫、慢性白血病、急性白血病、前立腺腫瘍および乳がん。
転位置ＦＧＦＲ１−３、変異、または増幅された再発性頭頸部がん。ＦＧＦＲ−ＴＡＣＣ遺伝子融合を発現する再発性悪性神経膠腫。進行非小細胞肺がんの患者。
５．ＦＩＰ１Ｌ１、ＰＤＧＦＲＡにしばしば融合するポリアデニル化特異性因子（４ｑ１２）。非チロシンキナーゼ遺伝子：ｉＨＥＳ、慢性白血病。
６．１３ｑ１１−１２．２に位置するＦＬＴ３レセプターチロシンキナーゼ遺伝子：適応症：慢性白血病、急性骨髄性白血病および乳がん、ｉＨＥＳ、慢性白血病。非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）。結腸直腸がん、転移性黒色腫または腎細胞がん、神経膠腫、難治性ホジキンリンパ腫。以前に治療された卵巣がん。局所進行性鼻咽頭がん。難治性慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）。スミチニブ不成功消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）。
７．ＰＤＧＦＲＡ  ４ｑ１２に位置するレセプターチロシンキナーゼ遺伝子：適応症：神経膠腫。慢性白血病、急性骨髄性白血病および乳がん、ｉＨＥＳ、慢性白血病。
【０１８３】
2019535295.tif 000008
＞ＯＲＦ１＿９＿１３０７００６００＿１３０７０３０７１＿１３０７１９４６１＿１３０７２０８８４＿ＦＲ
ＧＣＡＡＧＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＧＧＴＴＣＡＡＧＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧＡＧＴＡＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＴＧＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣＴＣＴＧＣＴＡＡＴＴＴＡＴＣＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＧＡＧＡＴＧＧＧＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＧＴＴＧＧＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＴＧＡＡＴＴＣＣＴＧＡＣＣＴＴＧＴＧＡＴＣＣＡＣＣＣＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＧＡＣＡＣＴＧＣＡＣＣＣＴＧＣＣＣＣＡＴＴＣＣＴＴＴＴＡＡＴＣＴＣＣＣＴＴＧＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＴＴＧＧＴＴＧＡＴＴＴＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＴＧＡＴＡＣＴＧＴＣＴＧＡＧＴＣＡＴＡＡＡＴＧＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＴＴＴＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＴＣＡＣＧＴＡＴＴＴＴＧＧＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＴＡＴＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＴＴＧＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＧＡＣＧＧＡＧＴＧＡＧＡＣＴＣＣＡＴＣＴＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＧＡＴＧＡＣＡＧＣＣＣＡＡＣＣＴＧＴＣＡＣＴＴＴＴＴＴＣＡＧＡＴＣＣＣＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＣＴＴＡＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＧＡＡＧＡＣＡＡＡＣＣＡＡＴＴＴＣＴＴＴＧＧＡＣＣＣＴＧＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＡＡＧＧＧＡＡＴＡＣＣＡＴＧＴＴＡＴＴＴＴＧＴＧＴＴＡＣＡＧＡＴＴＧＴＴＴＧＣＧＡＴＣＴＴＴＣＡＴＡＧＧＣＴＧＡＴＣＴＴＴＣＴＡＧＡＧＴＴＧＧＴＴＡＡＴＡＴＣＣＡＴＧＴＡＧＧＴＴＡＧＡＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＡＴＧＴＡＣＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＣＡＧＡＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＣＣＡＡＧＡＡＴＡＧＣＧＴＴＧＧＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＴＧＧＴＧＡＡＴＣＴＧ
【０１８４】
Ｌａｂ  Ｃｈｉｐデータは、正常な物質（患者３７５）においては３Ｃ相互作用の増幅を示すが、慢性骨髄性白血病急性転化細胞株Ｋ５６２（６８℃プライマーアニーリング温度）では示さない。このパターンはまた、アニーリング温度６７．５℃および６６．４℃でも見られた。予想される産物のサイズ：５１５ｂｐ。
【０１８５】
2019535295.tif 000009
【０１８６】
＞ＯＲＦ１＿９＿１３０７００６００＿１３０７０３０７１＿１３０７１９４６１＿１３０７２０８８４＿ＲＦ
ＣＣＡＣＴＧＣＡＣＣＡＧＡＧＣＡＡＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＡＧＡＧＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＡＡＡＡＴＧＧＡＧＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＴＧＧＣＣＴＴＡＴＴＧＧＣＣＣＡＴＴＴＣＡＡＧＧＡＴＴＴＴＧＡＣＴＴＴＧＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＴＧＧＧＡＡＧＧＣＣＴＴＧＧＡＧＡＡＴＴＴＴＣＣＧＡＧＧＧＧＡＣＴＡＴＡＣＴＡＴＣＴＧＡＴＧＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＴＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡＡＴＣＴＣＴＣＴＧＧＣＴＧＣＴＡＴＧＡＴＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＧＡＴＴＣＣＡＣＧＧＧＧＧＣＡＴＴＧＡＴＴＧＣＡＣＡＧＡＧＣＣＡＧＧＴＡＡＧＡＧＴＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＧＧＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＧＡＧＧＧＴＣＡＧＡＡＣＣＧＡＣＡＡＧＡＴＴＴＧＣＴＣＴＣＧＧＡＴＴＡＧＡＴＧＴＧＧＧＡＴＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＧＡＧＡＧＧＧＧＣＣＡＡＧＴＧＴＧＡＣＴＣＴＣＡＧＧＴＴＴＴＣＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＴＧＧＧＡＴＴＡＣＡＧＧＴＧＴＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＡＣＣＴＧＧＣＣＴＴＣＴＧＴＣＴＧＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＴＡＴＴＣＡＴＧＡＣＡＡＣＣＡＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＴＡＡＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＴＧＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＣＡＡＡＧＡＴＴＧＴＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＣＣＡＴＴＧＧＡＧＡＧＧＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＴＧＧＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＧＡＣＡＧＧＡＣＡＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣＡＡＧＧＣＴＧＣＴＧＴＴＴＧＴＴＣＣＴＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＧＣＡＧＴＧＴＴＣＴＣＴＧＡＣＧＧＡＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＴＧＣＡＣＡＣＧＡＧＧＡＧＣＣＴＧＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＡＡＧＴＡＡＧＴＣＧＧＧＣＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＣＴＧＡＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＣＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＴＣＣＣＣＡＴ
【０１８７】
Ｌａｂ  Ｃｈｉｐデータは、６７．５℃にて、正常な物質（患者３７５）では３Ｃ相互作用の増幅を示すが、悪性物質では示さない（細胞株Ｋ５６２由来）では示さない。予想される産物サイズ：６７６ｂｐ。
【０１８８】
2019535295.tif 000010
【０１８９】
Ｂ細胞悪性腫瘍＝ブルトン型チロシンキナーゼを含むと考えられる悪性腫瘍
【０１９０】
＞ＯＲＦ２＿Ｘ＿１０１３５５４７０＿１０１３５７９７６＿１０１４０７１８３＿１０１４０８８４６＿ＦＲ
ＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＡＡＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＡＴＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＴＡＧＧＡＧＧＴＧＧＧＡＴＧＣＣ
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ＴＴＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＴＡＣＴＡＡＴＴＧＡＡＡＴＡＣＡＣＴＧＣＣＴＡＡＣＴＧＡＡＴＡＴＡＴＴＣＣＣ
ＡＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＴＴＡＧＣＴＣＡＣＡＴＣＣＴＡＣＣＴＴＣＴＴＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＴＴＣＣＣＣＣＡＴＡＴＣ
ＣＡＴＧＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＴＧＴＣＴＣＡＧＴＴＴＴＴＡＧＡＡＡＴＴＴＴＡＣＡＧＴＧＣＴＴＡＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＣＴＧ
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【０１９１】
Ｌａｂ  Ｃｈｉｐデータは、このアニーリング温度でのみ細胞株において３Ｃ相互作用の増幅を示す。予想される産物サイズ：１５５ｂｐ。
【０１９２】
2019535295.tif 000011
＊これらのプライマーの組み合わせは、シングルステップ産物を産生し、ネステッドＰＣＲに使用しなかったことに留意されたい。
【０１９３】
１＞ＯＲＦ３＿４＿５４７１１７１９＿５４７１５１６７＿５４７３６７４９＿５４７４０８５３＿ＦＲ
ＴＣＣＣＡＴＴＴＴＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＴＴＴＡＡＴＧＡＣＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＣＡＧＴＧＣＧＧＴＧＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴ
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ＡＡＴＣＡＧＣＣＡＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＣＡＣＣＣＡＧＡＡＴＡＡＧＧＣＴＴＣＴＣＧＡＴＴＣＴＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡＡＧＡＴ
ＧＡＴＣＡＡＧＧＡＡＧＧＣＴＴＣＣＧＧＡＴＧＣＴＣＡＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＣＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＴＧＴＡＡＧＡＧＣＣ
ＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＡＧＧＴＣＡＣＧＴＴＴＴＣＣＣＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＧＡＧＡＣＡＧＡＡＡＣＣ
ＣＡＧＡＴＧＴＴＧＡＧＧＧＴＴＴＴＣＡＴＡＡＣＡＣＡＧＴＴＴＧＡＡＡＴＧＴＣＡＣＴＴＧＧＡＴＴＣＴＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡＣ
ＴＧＧＴＣＡＡＡＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＧＴＡＧＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＡＡＴＣＴＣＴＴＧＴＣＡＣＣＡＡＡＡＡＴＡＣＡＧＡＡＡ
ＧＴＴＴＣＡＧＴＡＡＴＡＴＴＴＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＧＴＧＴＴＴＴＡＴＧＴＴＡＴＣＴＡＴＡＴＧＴＣＡＧＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣ
ＣＡＧＴＴＧＣＡＴＡＧＣＣＣＴＧＧＡＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＡＡＧＴＴＧＣＴＧＧＡＴＧＣＣＣＡＴＡＣＡＴＴＴＧＡＡＡＡＣＡＡ
ＧＣＴＧＡＧＧＧＣＡＴＴＧＡＧＧＡＧＧＧ
【０１９４】
Ｌａｂ  Ｃｈｉｐデータは、正常な物質では３Ｃ相互作用の増幅を示すが、悪性物質（細胞株ＥＯＬ１由来）では示さない。予想される産物サイズは４２９ｂｐである。
【０１９５】
2019535295.tif 000012
【０１９６】
＞ＯＲＦ４＿８＿３８４２７４９９＿３８４３０４４９＿３８４８０５４５＿３８４８６０３４＿ＦＦ（５）
ＧＡＧＣＣＧＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＣＡＣＴＴＡＣＴＧＧＡＧＧＣＴＡＣＴＧＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＧＴＧＧＧＡＡＴＴＧＧＡＧＣＡＴＧＧＧＴＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＧＡＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＣＣＣＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＧＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＧＣＡＡＡＧＴＴＡＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＴＡＧＣＡＧＣＡＴＴＡＡＧＣＧＣＡＴＴＴＣＡＴＴＴＣＣＣＣＣＡＴＣＣＴＡＡＧＧＧＧＡＡＡＧＧＴＣＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧＧＡＣＴＴＣＴＴＴＧＴＧＴＣＣＧＧＡＧＴＴＧＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧＡＴＧＣＴＣＡＧＴＴＣＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＴＴＧＣＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＡＣＡＣＣＣＣＡＴＴＴＣＣＴＴＴＧＧＧＡＴＡＧＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＣＣＣＴＴＣＣＣＴＡＧＣＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＣＡＡＡＣＣＣＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＡＡＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＣＡＡＧＴＣＧＡＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＣＣＡＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＴＣＴＧＧＧＴＣＣＡＧＣＡＧＡＣＣＴＧＧＡＧＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＡＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＧＧＡＣＴＧＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡＣＴＧＴＴＧＴＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＴＧＣＡＧＣＣＣＡＴＧＴＧＡＣＡＧＧＣＣＴＴＡＡＴＧＡＧＴＣＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡＣＡＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＧＧＣＡＣＡＧＧＣＴＣＴＣＴＧＡＡＴＡＧＧＴＴＧＣＴＧＴＴＴＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＣＡＧＧＧＧＣＴＧＴＧＴＴＧＴＧＧＣＡＡＣＣＴＣＣＴＣＴＣＴＴＡＴＴＣＡＡＣＣＴＣＣＧＧＣＡＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＡＣＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＴＡＴＣＴＡＣＴＴＴＡＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＣＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＴＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＴＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧＴ
【０１９７】
Ｌａｂ  Ｃｈｉｐデータは、６８℃で、正常な物質（患者３７５）において３Ｃ相互作用の増幅を示すが、悪性物質（細胞株ＣＣＬ３０）では示さない。予想される産物サイズ：４６０ｂｐ。
【０１９８】
2019535295.tif 000013
【０１９９】
＞ＦＩＰ１Ｌ１ＰＤＧＦＲＡ＿４＿５４２３１９３１＿５４２３６０６３＿５５１４３３５６＿５５１４５０４７＿ＦＲ
ＣＡＧＣＴＡＡＡＧＡＣＴＡＣＴＴＴＴＣＣＡＡＧＣＣＴＣＴＴＧＣＡＧＣＴＡＧＣＴＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴＧＡＴＧＡＧＧＣＡＣＧ
ＧＧＴＧＡＡＴＡＡＧＡＴＡＧＴＴＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＣＡＴＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＴＣＣＣＴＡＡＡＧＧＴＧＴＡＴ
ＧＧＴＴＴＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＡＣＴＴＴＣＡＧＴＴＣＴＴＴＴＧＴＡＣＡＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＴＧＧＡＡＴ
ＴＧＣＴＧＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＴＡＡＴＴＣＴＡＴＴＴＴＴＡＡＣＴＴＣＴＴＧＡＴＧＧＡＣＣＴＣＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴ
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ＣＧＧＧＴＣＴＴＧＧＧＧＴＣＴＧＧＡＧＣＧＴＴＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧＧＴＴＧＡＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＴＡＴＧＧＡＴＴＡＡＧＣ
ＣＧＧＴＣＣＣＡＡＣＣＴＧＴＣＡＴＧＡＡＡＧＴＴＧＣＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＣＴＡＡＡＡＣＧＴＡＡＧＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧ
ＧＧＧＡＴＴＴＴＴＴＧＡＧＣＡＣＧＧＧＧＡＴＴＴＴＴＴＧＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＴＡＴＴＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＣＴＣＡＡＡＡＴ
ＣＡＴＧＣＡＧＣＴＡＧＴＡＡＡＴＡＡＧＡ
【０２００】
2019535295.tif 000014
【０２０１】
＞ＯＲＦ５＿１３＿２８０２５２８６＿２８０２６６４４＿２８１１６７０１＿２８１１８０５４＿ＲＦ
ＴＡＡＴＴＧＣＡＴＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＧＴＧＡＧＡＡＣＴＴＧＴＣＴＴＡＡＡＧＡＡＡＣＡＡＡＧＣＡＧＧＴＴＣＴＴＴＣＣＴＣＴＣＡＧＡＡＧＣＣＣＣＴＣＴＣＴＣＴＴＡＣＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＴＣＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＡＴＴＡＡＡＣＣＴＣＣＧＣＴＣＣＴＡＡＡＡＡＣＡＣＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＣＣＴＡＡＡＡＡＡＣＴＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＴＧＧＴＡＡＡＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＴＡＣＡＡＡＡＡＡＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＣＴＡＧＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＡＴＧＴＧＣＣＴＧＴＡＧＴＣＣＣＡＡＣＴＡＴＴＣＡＧＧＧＡＡＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＧＣＴＴＧＡＧＡＣＣＧＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＣＧＡＧＡＴＧＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＡＣＴＣＴＡＧＣＣＴＣＧＧＣＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＡＣＴＣＴＧＴＣＧＡＴＣＴＣＡＴＴＣＴＴＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＡＴＡＡＴＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＣＧＡＧＡＧＴＣＣＣＧＴＡＡＧＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＡＡＧＣＴＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＣＴＧＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＣＴＧＴＡＧＧＡＡＴＴＡＴＡＡＧＴＡＧＡＴＣＡＣＧＡＴＴＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＡＴＡＴＡＣＧＡＧＴＴＴＡＡＣＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＴＣＴＴＴＡＧＧＡＡＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＡＣＡＡＡＴＡＴＴＣＣＡＡＡＡＧＧＡＡＴＡＡＴＴＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＴＡＡＴＡＴＴＣＣＡＧＴＧＡＡＣＡＧＡＡＣＧＡＡＴＣＡＡＡＧＧＧＧＣＴＡＡＧＴＡＣＴＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＣＴＧＧＴＣＡＣ
【０２０２】
Ｌａｂ  Ｃｈｉｐデータ−Ｂ列。これは、６７．５℃で、正常な物質（患者３７６）において３Ｃ相互作用の増幅を示すが、悪性物質（ＡＭＬ患者２７７由来）においては示さない。予想される産物サイズ：２２３ｂｐ。
【０２０３】
2019535295.tif 000015
【０２０４】
Ｎｏ  ３  ＞ＯＲＦ５＿１３＿２８０２５２８６＿２８０２６６４４＿２８１１６７０１＿２８１１８０５４＿ＦＦ
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＡＧＡＡＴＧＣＴＣＣＡＡＧＧＣＴＣＡＡＣＧＡＡＴＧＣＣＴＣＣＡＴＣＡＧＡＡＴＧＣＣＴＧＧＧＡＡＴＣＣＡＴＴＣＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＧＣＴＡＣＡＡＡＧＣＣＡＴＧＡＴＧＣＴＣＡＡＧＴＡＡＴＴＡＧＣＡＡＧＡＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＣＴＡＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＴＴＡＴＧＣＣＣＧＣＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＧＣＡＴＣＴＣＴＣＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＧＧＡＧＧＡＴＡＡＡＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＧＴＴＡＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＡＣＴＧＴＧＴＣＣＣＣＡＴＣＡＣＧＴＧＴＣＧＡＣＡＧＡＧＴＣＴＣＡＣＴＣＴＧＴＣＧＣＣＧＡＧＧＣＴＡＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＧＣＧＣＣＡＴＣＴＣＧＧＣＴＣＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＣＣＧＧＴＣＴＣＡＡＧＣＡＡＡＣＣＴＣＣＣＡＣＣＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＴＡＧＴＴＧＧＧＡＣＴＡＣＡＧＧＣＡＣＡＴＡＣＣＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＣＴＡＧＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＴＴＴＴＡＣＣＡＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＡＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＴＧＴＧＴＴＴＴＴＡＧＧＡＧＣＧＧＡＧＧＴＴＴＡＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＣＡＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＡＧＴＡＡＧＡＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＴＣＴＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＴＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＡＡＧＴＴＣＴＣＡＣＴＧＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＣＡＧＴＧＡＴＧＣＡＡＴＴＡ
【０２０５】
Ｌａｂ  Ｃｈｉｐデータは、６８．０℃で、正常な物質において３Ｃ相互作用の増幅を示す（患者３７６）が、悪性物質では示さない（ＡＭＬ患者２７７由来）。予想される産物サイズ：２０４ｂｐ。
【０２０６】
2019535295.tif 000016
【０２０７】
＞ＯＲＦ５＿１３＿２８０２５２８６＿２８０２６６４４＿２８１１６７０１＿２８１１８０５４＿ＲＲ
ＧＴＧＡＣＣＡＧＴＡＴＣＣＡＣＴＧＧＴＣＡＧＴＡＣＴＴＡＧＣＣＣＣＴＴＴＧＡＴＴＣＧＴＴＣＴＧＴＴＣＡＣＴＧＧＡＡＴＡＴＴＡＡＡＴＡＣＡＣＴＧＡＡＡＴＴＡＴＴＣＣＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＴＴＧＴＧＧＴＣＴＧＡＡＡＧＣＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＣＴＡＡＡＧＡＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＴＧＧＧＴＴＡＡＡＣＴＣＧＴＡＴＡＴＴＡＧＡＡＴＡＡＡＴＴＧＡＡＴＣＧＴＧＡＴＣＴＡＣＴＴＡＴＡＡＴＴＣＣＴＡＣＡＧＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡＡＡＡＧＡＧＡＴＴＴＧＴＡＴＴＡＴＴＧＣＴＡＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＴＣＡＣＡＧＴＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴＴＡＣＡＡＡＧＧＣＡＡＡＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＧＡＴＧＧＴＧＡＡＡＣＧＣＴＴＡＣＧＧＧＡＣＴＣＴＣＧＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＴＡＴＴＡＴＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＴＧＧＧＣＴＧＡＧＴＴＣＡＧＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＧＡＧＡＴＣＧＡＧＴＧＡＴＴＧＣＴＡＧＧＴＧＡＴＧＧＡＣＣＴＧＴＡＧＧＧＡＧＡＧＡＴＣＡＣＴＡＧＡＴＧＡＧＴＴＣＡＧＧＴＧＧＴＡＡＡＴＡＧＡＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＴＧＧＧＧＴＧＣＡＧＴＧＡＧＡＧＡＴＧＡＡＧＧＴＡＧＴＧＡＡＡＴＧＡＡＡＧＧＡＴＧＧＧＧＡＴＣＡＡＴＴＴＴＡＴＡＴＧＡＧＧＧＣＴＴＴＡＡＴＴＴＧＡＡＡＴＧＧＧＡＡＴＴＴＧＧＴＧＡＴＡＴＴＣＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＡＣＡＡＧＴＴＴＴＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＡＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＧＣＣＡＡＴＡＡＣＡＣＧＧＧＡＡＡＧＴＣＴＣＣＡＡＧＧＧＴＧＣＣＣＡＧＴＧＡＣＴＴＡＣＴＴＧＣＣＴＡＴＡＡＡＣＡＡＡＧＣＣＡＴＴＣＣＴＧＡＧＣＡＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＡＡＡＴＴＴＣＡＡＡＡＴＡＣＡＴＧＴＴＴＴＡＧＡＧＡＡＴＴＴＴＡＣＴＧＡＣＡＣＴＴＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＡＧＡＧＧＡＴＡＡＴＴＴＡＧＡＴＴＴＣＡＴＡＡＡＴＴＴＴＧＴＴＴＣＣＴＴＣＣＣＴＴ
【０２０８】
Ｌａｂ  Ｃｈｉｐデータは、６８．０℃で、正常な物質において３Ｃ相互作用の増幅を示す（患者３７６）が、悪性物質では示さない（ＡＭＬ患者２７７由来）。予想される産物サイズ：１７３ｂｐ。
【０２０９】
2019535295.tif 000017
【０２１０】
＞ＯＲＦ５＿１３＿２８００９０６１＿２８０１４２０４＿２８０２５２８６＿２８０２６６４４＿ＦＲ
ＣＡＣＡＣＴＣＡＴＧＣＴＴＣＡＴＡＡＧＡＡＡＧＧＧＣＴＡＧＴＧＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧＧＣＣＡＧＧＧＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＴＧＴＣＴＡＣＴＴＣＡＣＴＧＣＡＣＴＧＡＡＣＴＣＴＴＡＡＧＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＴＴＡＴＴＡＡＴＣＡＴＴＴＧＧＣＴＧＡＡＡＴＣＡＧＧＡＡＡＧＧＴＧＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＣＴＡＡＡＡＡＣＡＴＴＴＴＴＡＴＣＡＡＴＡＴＧＴＣＴＴＡＧＧＧＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＡＧＣＴＣＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＡＴＣＣＣＡＧＣＡＣＴＴＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＧＧＧＧＡＡＴＣＧＣＴＴＧＡＧＣＣＣＡＧＧＡＧＴＴＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＡＣＡＧＴＧＡＴＡＣＣＣＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＣＧＴＧＧＴＧＣＴＧＣＣＣＴＣＣＣＡＴＧＧＴＣＣＴＡＧＣＴＡＣＴＴＧＧＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＴＧＣＴＴＧＡＧＣＴＴＧＧＧＡＧＧＴＣＧＡＴＣＴＣＡＴＴＣＴＴＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＧＣＣＣＡＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＡＴＡＡＴＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＣＧＡＧＡＧＴＣＣＣＧＴＡＡＧＣＧＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＣＴＴＣＴＴＴＴＴＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＣＴＴＴＧＴＡＡＡＧＣＴＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＡＣＴＧＴＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＡＴＡＧＣＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＡＴＣＴＣＴＴＴＴＡＡＧＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＴＴＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＧＣＴＣＴＧＴＡＧＧＡＡＴＴＡＴＡＡＧＴＡＧＡＴＣＡＣＧＡＴＴＣＡＡＴＴＴＡＴＴＣＴＡＡＴＡＴＡＣＧＡＧＴＴＴＡＡＣＣＣＡＡＴＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＴＣＴＴＴＡＧＧＡＡＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＧＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＡＣＡＡＡＴＡＴＴＣＣＡＡＡＡＧＧＡＡＴＡＡＴＴＴＣＡＧＴＧＴＡＴＴＴＡＡＴＡＴＴＣＣＡＧＴＧＡＡＣＡＧＡＡＣＧＡＡＴＣＡＡＡＧＧＧＧＣＴＡＡＧＴＡＣＴＧＡＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＣＴＧＧＴＣＡＣ
【０２１１】
Ｌａｂ  Ｃｈｉｐデータは、６８℃で、正常な物質において３Ｃ相互作用の増幅を示す（患者３７６）が、悪性物質では示さない（ＡＭＬ患者２７７由来）。予想される産物サイズ：７４２ｂｐ。
【０２１２】
追加データ
温度勾配データのコンフォメーションを以下に提示する。アルファベット順に各遺伝子について選択された相互作用を以下に提示し、２０ｎｇ中の各相互作用の平均コピー（反応ごと＝９６ウェルプレートあたり１ウェル）が含まれている。
１．Ｋ５６２細胞株および正常な血液（１０ｎｇ／反応）由来の材料のＡＢＬ１  ＡＢＬ１−５１５  ＳＹＢＲに基づくｑＰＣＲアッセイ
Ｋ５６２は、正常な血液中の２０ｎｇあたりコピー３３．２４６６７、ＳＤ＋／−３５．０４１５３と比較して、２０ｎｇで減少した平均コピー数（１２．３６３３３、ＳＤ＋／−１５．６７２９４）を示す（ｐ＝０．１４３２４５Ｔ試験）。
２．ブルトン型チロシンキナーゼ
ＯＲＦ２＿Ｘ＿１０１３５５４７０＿１０１３５７９７６＿１０１４０７１８３＿１０１４０８８４６＿ＦＲ
細胞株（ＢＴ１４２、ＥＯＬ１およびＨＬ６０）は、正常な血液中、２０ｎｇあたりコピー４３．８３２７７  ＳＤ＋／−７２．８０８９２６と比較して、２０ｎｇで減少した平均コピー数（２０．９９３３８  ＳＤ＋／−４３．４１３１６６）を示す（０．４１４２６Ｔ試験）。
３．ｃＫＩＴ実験：非常に有意な差
ＯＲＦ３＿４＿５４７１１７１９＿５４７１５１６７＿５４７３６７４９＿５４７４０８５３＿ＦＲ
悪性細胞株（ＢＴ１４２、ＥＯＬ１およびＨＬ６０）は、正常な血液中、２０ｎｇあたりコピー２．６３９９３２（ＳＤ＋／−１．７４２１７５）と比較して、２０ｎｇで減少した平均コピー数（０．２０５１３５ＳＤ＋／−０．４５３５２６）を示す。（ｐ＝０．００１２９４Ｔ試験）。これは、細胞株と非悪性試料との間で非常に有意な差である。
４．ＦＧＦＲ１
ＯＲＦ４＿８＿３８４２７４９９＿３８４３０４４９＿３８４８０５４５＿３８４８６０３４＿Ｆ
悪性細胞株ＣＣＬ３０は、正常な血液中２０ｎｇあたりコピー１．２４２２２２（ＳＤ＋／−１．７１５３１９）と比較して（ｐ＝０．３１４７４３  Ｔ試験）２０ｎｇで増大した平均コピー数２．０５（ＳＤ＋／−０．８４３２６７）を示す。
５．ＦＩＰ１Ｌ１実験
ＦＩＰ１Ｌ１ＰＤＧＦＲＡ  ４  ５４２３１９３１  ５４２３６０６３  ５５１４３３５６  ５５１４５０４７  ＦＲ
悪性細胞株（ＢＴ１４２、ＥＯＬ１およびＨＬ６０）は、正常な血液における２０ｎｇについてのコピー３２．６１１１７（ＳＤ＋／−３８．５８２５２）と比較して、２０ｎｇで減少した平均コピー数１３．０７３２５（ＳＤ＋／−１９．４６０４２）を示す（ｐ＝０．１４７８９６Ｔ試験）。
６．ＦＬＴ３実験：
ＯＲＦ５＿１３＿２８００９０６１＿２８０１４２０４＿２８０２５２８６＿２８０２６６４４＿Ｆ：有意差
悪性患者物質は、コピー６．５８７７７８、正常な血液中２０ｎｇあたりＳＤ＋／−７．６７２７９４と比較して、２０ｎｇで減少した平均コピー数０．４２７６１９（ＳＤ＋／−０．６６７５９９）を示す（ｐ＝０．０４３２３８Ｔ試験）。
【０２１３】
薬物感受性およびイマチニブ
イマチニブ（Ｇｌｉｖｅｃ）は、ＡＢＬ１、ｃＫＩＴおよびＰＤＧＦＲＡを含む複数のチロシンキナーゼに対して活性を示す。慢性骨髄性白血病における臨床試験の成功は、薬理遺伝学的戦略の同定のための機動力を提供した。
以下のイマチニブ応答性の選択された遺伝子におけるイマチニブの作用に関する新規データの実施例を以下に記載する。２０ｎｇの鋳型をイマチニブで処理した試料のために各ウェルに添加した。
前記ｃＫＩＴ相互作用（ＯＲＦ３＿４＿５４７１１７１９＿５４７１５１６７＿５４７３６７４９＿５４７４０８５３＿ＦＲ）およびイマチニブ：
ｃＫＩＴおよび例示的データ。ＢＴ１４２細胞を１μｍのイマチニブで処理した。２０ｎｇの鋳型を各ウェルにロードした。ｃＫＩＴ  ３Ｃ相互作用はイマチニブで処理した細胞株では完全に存在していなかったことに留意されたい（以下を参照）。
【０２１４】
ウェルＣＩ中の産物は、先に列挙したｃＫＩＴ相互作用（ＯＲＦ３＿４＿５４７１１７１９＿５４７１５１６７＿５４７３６７４９＿５４７４０８５３＿ＦＲ）として確認されている。このデータは、ｃＫＩＴ  ３Ｃ染色体コンフォメーションに関するイマチニブの直接作用を示す。
【０２１５】
ＢＴ１４２細胞株におけるＭＭＰ１相互作用を以下に示す。これによって、試料の品質が確認される。これは加水分解プローブに基づくアッセイである。
【０２１６】
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【０２１７】
処理された細胞株に対するＧＳＫ８６４の作用
非固定化対照およびホルムアルデヒドで処理した試料を用いたＭＭＰ−１  ３Ｃ定量化。本願で使用する例示的細胞株は：
（ａ）ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ（神経膠芽腫）
（ｂ）ＨＬ−６０（急性骨髄性白血病）
である。
【０２１８】
これらの細胞株をＩＤＨ１阻害剤ＧＳＫ８６４で２４時間および４８時間にわたって処理した。二元的差異が細胞株ＤＢＴＲＧで観察され、量的差異が、ＭＭＰ１染色体コンフォメーションに対する化合物の直接作用を示すＨＬ６０で観察される（図８参照）。
【０２１９】
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【０２２０】
ＨＬ６０細胞株をＩＤＨ１阻害剤ＧＳＫ８６４で２４時間および４８時間にわたって処理した。二元的量的差異が、ＭＭＰ１染色体コンフォメーションに対する化合物の直接作用を示す細胞株ＨＬ６０中の３Ｃ  ＭＭＰ１コピー数において観察される（図９参照）。
【０２２１】
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【０２２２】
まとめ
ＳＹＢＲグリーン検出を使用するこれらのシングルステップアッセイは、正常な血液と悪性物質とを識別する（前記表で記載した細胞株を参照されたい）。ｑＰＣＲ  ３Ｃコピー数は、正常な物質（例えば、ｃＫＩＴおよびＦＬＴ３）と比較した場合に悪性細胞株において有意に減少し得るか、または例えばＣＣＬ３０  ＦＧＦＲ１細胞株は増加し得る。
【０２２３】
薬物イマチニブ（Ｇｌｉｖｅｃ：Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＰＬＣ）はＢＣＲ−ＡＢＬ  タンパク質に対して作用すると考えられている。我々は、遺伝子ｃＫＩＴにおいて特定された３Ｃコンフォメーション相互作用に対するイマチニブの新規直接的作用を示す。データは、イマチニブの３Ｃコンフォメーションに対する直接的治療効果を示す。
【０２２４】
さらに、ＧＳＫ８６４（ＩＤＨｌ変異阻害剤）は、細胞株ＤＢＴＲＧおよびＨＬ６０において１μｍで３Ｃ  ＭＭＰｌコピー数に対して直接作用を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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