(57)【要約】本発明は、全身性疾患、好ましくは敗血症に関連するかまたは敗血症によって引き起こされる全身性疾患の処置において使用するための、微小断片化脂肪または微小断片化脂肪を含む組成物に関する。さらに、微小断片化脂肪または微小断片化脂肪を含む組成物は、全身性疾患、炎症性疾患、免疫疾患、または慢性疾患を処置するために使用され、前記疾患は、敗血症疾患の結果であることが意図される。好ましくは、微小断片化脂肪は、敗血症の急性期（初期）および後期の両方を処置するために有用である。【選択図】図４
2019514997.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全身性疾患／状態の処置において使用するため、または全身性疾患／状態に関連する健康への有害な影響を改善するための、微小断片化脂肪または微小断片化脂肪を含む組成物であって、前記全身性疾患／状態が、好ましくは、敗血症に関連するかあるいは敗血症によって引き起こされる、微小断片化脂肪または微小断片化脂肪を含む組成物。
【請求項２】
前記疾患／状態が全身性疾患／状態、炎症性疾患／状態、免疫疾患／状態、または慢性疾患／状態であり、前記疾患／状態が敗血症疾患／状態によって引き起こされることが意図される、請求項１に記載の使用のための微小断片化脂肪または微小断片化脂肪を含む組成物。
【請求項３】
前記疾患／状態がプロスタグランジン合成および／または非ＣＯＸ標的に関係している、請求項１または２に記載の使用のための微小断片化脂肪または微小断片化脂肪を含む組成物。
【請求項４】
敗血症が急性期または後期であり、前記急性期の健康への有害な影響が体温の変化、サイトカインストームおよびプロカルシトニン上昇から選択され、前記後期の有害な影響が、急性肺損傷、ショック、腎不全、筋力低下、認知機能障害、好ましくは、不眠症、悪夢、鮮明な幻覚およびパニック発作、極度の疲労、集中力低下、精神機能の低下、自尊心および自信の喪失、ならびに多臓器不全症候群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための微小断片化脂肪または微小断片化脂肪を含む組成物。
【請求項５】
前記微小断片化脂肪が非酵素的な微小断片化脂肪であり、好ましくは、軽度の機械力を用いて、かつ溶液、好ましくは生理食塩水の存在下で、脂肪組織サンプルを小さいクラスタに漸進的に縮小することによって得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための微小断片化脂肪または微小断片化脂肪を含む組成物。
【請求項６】
前記微小断片化脂肪が、５０〜５０００μｍ、好ましくは１００〜３０００μｍ、より好ましくは２００〜２５００μｍ、より好ましくは３００〜１５００μｍ、より好ましくは４００〜９００μｍの範囲のサイズを有する脂肪クラスタを含有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための微小断片化脂肪または微小断片化脂肪を含む組成物。
【請求項７】
前記微小断片化脂肪が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および／または周皮細胞および／または脂肪幹細胞を含む脂肪クラスタを含有し、前記細胞が、好ましくは、その天然／無傷の間質血管ニッチを維持する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための微小断片化脂肪または微小断片化脂肪を含む組成物。
【請求項８】
前記微小断片化脂肪が、ヒト脂肪組織、より好ましくは、個体の下腹部および／または側腹部領域からのヒト脂肪組織、より好ましくは単離／吸引脂肪組織に由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための微小断片化脂肪または微小断片化脂肪を含む組成物。
【請求項９】
前記敗血症状態／疾患が炎症促進性分子の誤制御を伴い、前記分子が、好ましくは、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ｇ、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、プロカルシトニン分子およびクレアチンキナーゼおよびＴＮＦ−ａから選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための微小断片化脂肪または微小断片化脂肪を含む組成物。
【請求項１０】
前記微小断片化脂肪が、腹腔内、筋肉内、肺胞性、経鼻、肺内、くも膜下腔内、篩板（篩骨篩板）経由（好ましくは、鼻腔経路を用いる）、またはリンパ投与のためのものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための微小断片化脂肪または微小断片化脂肪を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全身性疾患、好ましくは敗血症に関連するかあるいは敗血症によって引き起こされる全身性疾患の処置において使用するための、微小断片化（ｍｉｃｒｏ−ｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ）脂肪組織または微小断片化脂肪組織を含む組成物に関する。
さらに、微小断片化脂肪組織または微小断片化脂肪組織を含む組成物は、全身性疾患、炎症性疾患、免疫疾患、または慢性疾患を処置するために使用され、前記疾患は、敗血症疾患の結果であることが意図される。
好ましくは、微小断片化脂肪組織は、敗血症の急性期（初期）および後期の両方を処置するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
敗血症、または全身性炎症反応症候群は、感染によって誘発される生理学的、病理学的、および生化学的な異常の症候群であると定義され、血管漏出、組織損傷、多臓器障害につながる全身性の制御されない炎症反応をもたらす。さらに現在、利用可能な処置があまり有効ではないため、敗血症は症例の３０％〜４０％において死に至る。
米国では、敗血症は年間２００，０００人を超える人々の死亡原因であることが報告されている。
従って、敗血症は医療の全体的なコストを著しく増大させる。
最近では、敗血症患者の管理は良くなってきているが、敗血症関連の罹患率は上昇している。例えば、半数の症例において、生存患者の状態は後天性ニューロミオパチーにより複雑化され、患者は、筋力低下および筋肉消耗、エネルギー障害、ならびにタンパク質分解のために、長期間にわたる身体障害に直面することがある。
敗血症に関連する有害な影響は、部分的に、組織および臓器に損傷を与える制御されないサイトカインストームに起因する。さらに、炎症経路の広範な活性化は、多臓器不全、循環系の崩壊に進行し、かつ最終的には死に至る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記で報告された事項を全て考慮して、特に敗血症に関するこれらの種類の全身性疾患を処置するための新規／代替の治療法を開発する必要性が依然として強く感じられている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、好ましくは腹腔内経路で、微小断片化脂肪組織を使用／投与することにより、上記で報告された必要性を解決する。
実際に、本出願人は、驚くことに、例えば、微小断片化脂肪組織により処置された敗血症患者が、敗血症に関連するかあるいは敗血症によって引き起こされる有害な影響の大部分の低減を示すことを見出した。より興味深いことに、微小断片化脂肪組織の使用／投与は、敗血症の急性期および後期の両方に特有の機能障害を回復させた。
微小断片化脂肪組織の使用／投与は、特に、臓器不全および／または傷害、筋力低下または認知機能障害などの敗血症に関連する長期にわたる影響の救済において有効である。
【０００５】
実際に、本出願人は、微小断片化脂肪組織で処置したマウスにおいて、生存率の改善および敗血症スコアの持続的な低下を観察した。さらに、処置マウスは、体温および生物学的パラメータの正常化、炎症促進性サイトカインレベルの低下、ならびに抗炎症性サイトカインレベルの上昇を示した。さらに、処置マウスは、肝臓および肺における免疫細胞の浸潤の低下も示した。最後に、微小断片化脂肪組織の投与は、敗血症の後期に関連するニューロミオパチーおよび筋力低下／筋肉消耗の回復を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（微小断片化脂肪組織）または生理食塩水を注射したＣＬＰマウスにおける敗血症スコア（Ａ〜Ｂ）、ならびにＬｉｐｏｇｅｍｓ（微小断片化脂肪組織）を注射したまたは注射しないＬＰＳ処置マウスにおける敗血症スコアおよび生存率（Ｃ〜Ｄ）を示す。
【図２】生理食塩水またはＬｉｐｏｇｅｍｓ（微小断片化脂肪組織）を注射したＣＬＰマウスの生存率（Ａ）および体温（Ｂ）を示す。
【図３】生理食塩水またはＬｉｐｏｇｅｍｓ（微小断片化脂肪組織）を注射したＣＬＰマウスにおけるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の血漿レベル（Ａ）；白血球数（Ｂ〜Ｃ）を示す。
【図４】Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（微小断片化脂肪組織）を注射したまたは注射しないＣＬＰマウスにおける炎症促進性サイトカインレベルを示す。
【図５】Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（微小断片化脂肪組織）を注射したまたは注射しないＣＬＰマウスの肝臓および腎臓中のＦ４／８０＋、Ｂ２２０＋およびＣＤ３＋細胞の数を示す。
【図６】Ｌｉｐｏｇｅｍｓ、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ＋インドメタシン、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ＋ＳＣ−５６０およびＬｉｐｏｇｅｍｓ＋ＬＳ−３９８（Ｌｉｐｏｇｅｍｓ＝微小断片化脂肪組織）を注射したＣＬＰマウスの炎症性スコア（Ａ）、生存率（Ｂ）、白血球数（Ｃ）、および炎症促進性サイトカインレベル（Ｄ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の第１の態様は、全身性疾患または全身性状態、好ましくは敗血症に関連するかあるいは敗血症によって引き起こされる全身性疾患または全身性状態の処置において使用するための微小断片化脂肪組織または微小断片化脂肪組織を含む組成物に関する。
言い換えれば、本発明によると、微小断片化脂肪組織は、全身性疾患または全身性状態、好ましくは敗血症に関連するかあるいは敗血症によって引き起こされる全身性疾患または全身性状態に関連する健康への有害な影響、好ましくは敗血症に関連するかあるいは敗血症によって引き起こされる長期にわたる影響を改善する（回復させるおよび／または救済する）ために有用である。
従って、本発明の第１の態様は、全身性状態または全身性疾患、好ましくは、敗血症に関連するかあるいは敗血症によって引き起こされる疾患／状態を処置するための方法に関し、前記方法は、それを必要としている個体に、有効量の微小断片化脂肪組織または微小断片化脂肪組織を含む組成物を投与する少なくとも１つのステップを含む。
疾患または状態は、好ましくは、全身性疾患／状態、炎症性疾患／状態、免疫疾患／状態、または慢性疾患／状態であり、前記疾患／状態は、敗血症疾患／状態によって引き起こされることが意図される。
【０００８】
好ましい実施形態によると、疾患または状態は、プロスタグランジン合成および／または非ＣＯＸ標的に関係している。従って、状態または疾患は、非ＣＯＸ標的に媒介される。
言い換えれば、疾患または状態は、ＣＯＸ、好ましくはＣＯＸ−２経路に関与しない。実際、これらの酵素の阻害薬は、本発明の治療効果を損なわない。
【０００９】
これに関連して、全身性状態または全身性疾患は、いくつかの臓器および組織、あるいは身体全体にも影響を与える状態または疾患であると定義される。
これに関連して、敗血症は全身性炎症反応症候群も意味する。
これに関連して、敗血症または全身性炎症反応症候群は、血管漏出、組織損傷および／または多臓器障害につながる全身性の制御されない炎症反応をもたらす感染を意味する。特に、敗血症の後期には、これらの影響は、敗血症患者のニューロミオパチー、筋力低下、エネルギー障害、タンパク質分解、筋肉消耗、かつ最後には死さえも引き起こし得る。
これに関連して、敗血症に関係する健康への有害な影響は、好ましくは、ニューロミオパチー、エネルギー障害、タンパク質分解、筋肉消耗、急性の腎臓および肝臓傷害、多臓器不全、ならびに恐らく死から選択される。
【００１０】
好ましくは、急性期の損傷効果は、体温の変化、サイトカインストーム（大幅で急速な増大）およびＰＣＴ（プロカルシトニン）の上昇から選択される。
後期の有害な影響（または長期にわたる敗血症の影響）は、好ましくは、臓器不全および／または傷害、急性肺損傷、ショック、腎不全、筋力損失および／または低下、認知機能障害（不眠症、悪夢、鮮明な幻覚およびパニック発作、極度の疲労、集中力低下、精神機能の低下、自尊心および自信の喪失）、ならびに多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）から選択される。
好ましくは、微小断片化脂肪組織は、非酵素的な微小断片化脂肪組織である。言い換えれば、本発明において使用／投与される脂肪は、どんな酵素処理も用いずに微小断片化されている。
【００１１】
本発明のさらに好ましい実施形態によると、微小断片化脂肪組織、好ましくは、吸引脂肪組織は、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）デバイスを用いることにより、より好ましくは特許出願の国際公開第２０１１／１４５０７５号パンフレットに完全に開示されているプロセスに従って得られる。
好ましくは、単離された脂肪はＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）デバイスに導入され、軽度の機械力を用いて、かつ溶液、好ましくは生理食塩水の存在下で、小さい組織クラスタに漸進的に縮小（断片化）される。
好ましくは、微小断片化脂肪は、５０〜５０００μｍ、好ましくは１００〜３０００μｍ、より好ましくは２００〜２５００μｍ、より好ましくは３００〜１５００μｍ、より好ましくは４００〜９００μｍの範囲のサイズを有する脂肪クラスタを含有する。
より好ましくは、これらの脂肪クラスタは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および／または周皮細胞、好ましくは、周皮細胞関連ＭＳＣおよび／または脂肪幹細胞および／または内皮細胞および／または線維芽細胞および／または脂肪細胞を含む。脂肪クラスタ内へのこれらの細胞はそのニッチを維持し、これは、細胞がその天然／無傷の間質血管ニッチを維持することを意味する。従って、有利に、これらの細胞は、間質によって、栄養および／またはシグナル伝達に関して支持される。さらに、これらは、移植の間に侵襲性環境から、かつ任意の物理的および化学的な外部侵襲（例えば、機械的、酸素など）から保護される。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態によると、非微小断片化組織、すなわち本出願および特許出願の国際公開第２０１１／１４５０７５号パンフレットに開示される微小断片化プロセスを受けなかった脂肪組織、好ましくは吸引脂肪組織と比べて、微小断片化脂肪組織、好ましくは微小断片化吸引脂肪組織は、微小血管の含量がより高く、好ましくは、ＣＤ３１＋細胞の含量がより高く、より好ましくは、ＣＤ３１＋細胞の含量が５〜１０倍高い。
【００１３】
本発明のさらに好ましい実施形態によると、非微小断片化組織、すなわち本出願および特許出願の国際公開第２０１１／１４５０７５号パンフレットに開示される微小断片化プロセスを受けなかった脂肪組織、好ましくは吸引脂肪組織と比べて、微小断片化脂肪組織、好ましくは微小断片化吸引脂肪組織は、より大きい血管の含量および／または周皮細胞、すなわちＮＧ２陽性細胞の数がより多い。
【００１４】
従って、本発明の微小断片化脂肪組織、好ましくは微小断片化吸引脂肪組織は、好ましくは、
−  ５０〜５０００μｍの範囲のサイズを有する組織のクラスタ；ならびに／または
−  間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および／もしくは周皮細胞、好ましくは周皮細胞関連ＭＳＣおよび／もしくは脂肪幹細胞および／もしくは内皮細胞および／もしくは線維芽細胞および／もしくは脂肪細胞；ならびに／または
−  好ましくは、血液残渣および炎症促進性の油性物質が存在しないこと
を含む。
【００１５】
これらの細胞、好ましくは脂肪間葉系幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６およびＣＤ１６６から選択される少なくとも１つ、好ましくは全てのマーカーを発現し、好ましくは、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｂ−チューブリンＩＩＩ  ＮＥＳＴＩＮ、ＮＥＵＲＯＤ１、ＭＵＳＡＳＨＩ１、ＰＡＸ６、およびＳＯＸ３から選択される少なくとも１つのマーカー、より好ましくは全てのマーカーも発現する。より好ましくは、これらの細胞は、ネスチン、ｂ−チューブリンＩＩＩ、ＧＦＡＰ、およびＯ４を同時発現する。
制御された脂肪断片化は、デバイス内に含有される１つまたは複数の断片化／脱凝集（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）手段の使用によって可能にされる。
好ましくは、この手段は金属手段、より好ましくは金属ビーズであり、前記ビーズは、好ましくは、０，１〜３０ミリメートル、好ましくは１〜２０ｍｍ、より好ましくは５〜１０ｍｍ、より好ましくは７，５〜８，５ｍｍの範囲のサイズを有する。
デバイスの制御された振とうにより、脂肪組織全体を通る断片化／分離（ｄｉｓｇｒｅｇａｔｉｏｎ）手段の緩やかな移動が可能になり、従って、穏やかな脂肪の断片化／分離が可能になる。
好ましくは、断片化／分離は、流動する生理食塩水緩衝液中、より好ましくは、油および血液残渣の除去を可能にする生理食塩水緩衝液の連続的な流れの中で実施される。
【００１６】
脂肪の断片化／分離ステップは、好ましくは、１５〜２０分を要する。従って、本発明の微小断片化脂肪組織は、穏やかで無酵素、無菌の手術中の迅速な操作を用いることにより得られる。
本発明の脂肪組織は、好ましくは、ヒトに由来する。
好ましい実施形態によると、脂肪組織はヒト脂肪組織であり、より好ましくは、個体の下腹部および／または側腹部領域からのヒト脂肪組織、より好ましくは単離／吸引脂肪組織である。
しかしながら、前記脂肪組織は、任意の有用な身体領域から単離することもできる。
好ましくは、脂肪組織、好ましくは微小断片化脂肪組織は、自家性または異種性である。
本発明の好ましい実施形態によると、敗血症を患っている個体は人間である。
本発明のさらに好ましい実施形態によると、敗血症は院内感染であるか、あるいは敗血症は細菌、真菌またはウイルス感染に関連する。
【００１７】
好ましくは、本発明に従う敗血症状態／疾患は炎症促進性分子の誤制御を伴い、前記分子は、好ましくは、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ｇ、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、プロカルシトニン（ＰＣＴ）分子およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ）およびＴＮＦ−ａから選択されるが、これらに限定されない。
好ましくは、本発明に従う敗血症状態／疾患は抗炎症性分子の誤制御を伴い、前記分子は、好ましくは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＧ−ＣＳＦから選択されるが、これらに限定されない。
実際に、敗血症患者における微小断片化脂肪投与の後、抗炎症性分子は上方制御され、炎症促進性分子は下方制御される。
従って、微小断片化脂肪は、好ましくはＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ｇ、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＲＡＮＴＥＳから選択されるがこれらに限定されない炎症促進性分子を減少させるため、かつ／あるいは好ましくはＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＧ−ＣＳＦから選択される抗炎症性分子を増加させるために使用／投与することができる。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態によると、全身性疾患または状態、好ましくは、敗血症または敗血症に関連する（によって引き起こされる）状態の処置において使用するための微小断片化脂肪は、腹腔内、筋肉内、肺胞性、経鼻、肺内、くも膜下腔内、篩板（篩骨篩板（ｌａｍｉｎａ  ｃｒｉｂｒａ））経由（好ましくは、鼻腔経路を用いる）、またはリンパ投与のためのものである。最も好ましい投与経路は腹腔内経路である。好ましくは、微小断片化脂肪組織または微小断片化脂肪組織を含む組成物はそれ自体で投与されるか、あるいはさらなる分子、好ましくは抗炎症薬および／または抗菌薬と組み合わせて投与される。
【００１９】
好ましい実施形態によると、投与は、さらなる処置：
−  感染部位における手術；および／または
−  好ましくは電解質の注射による、血行動態の再平衡化；および／または
−  心臓作用性（Ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｅｓ）および／または血管作用性（ｖａｓｏａｃｔｉｖｅｓ）（例えば、カテコールアミンなど）分子の投与、および／または
−  好ましくは低用量のコルチコ療法（ｃｏｒｔｉｃｏｔｈｅｒａｐｙ）；および／または
−  好ましくは換気により援助される、呼吸、；および／または
−  血液透析および／またはインスリン療法、および／または
−  輸血
に関連するか、あるいはこれらに従う。
好ましくは、使用／投与は、現在の臨床業務の投薬に従って敗血症症状が現れてから最初の６時間（医学界ではゴールデンアワーと呼ばれる）以内に行われる。あるいは、使用／投与は、敗血症症状が現れてから数日および／または数週間後に行われる。
【実施例】
【００２０】
マウスおよび収容条件
全てのプロトコルは、動物愛護に関するフランスおよびヨーロッパの法令、ならびに公衆衛生サービスの推奨を順守するために監督当局のパスツール研究所により審査された。
使用したマウスは、６〜１０週齢のオスＣ５７Ｂｌ／６ＲＪＲＪであった。いずれかの所与の時点の炎症性スコアが２１よりも高ければ、あるいは呼吸数または品質に起因するポイントが３２２を超えて増大したら、マウスを安楽死させた。特定されない限り、実験ごとに使用した動物の総数は、非ＣＬＰ対照については５匹、実験点ＣＬＰについては７匹、およびＣＬＰ＋Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）群については７匹であった。実験は常に、独立して２回繰り返した。ＬＰＳ負荷については、対照としてｎ＝４の動物、ＬＰＳとしてｎ＝８の動物、およびＬＰＳ＋Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）群としてｎ＝８の動物を使用した。１２：１２の明／暗サイクルにおいて、温度および湿度が制御された病原体を含まない施設内にマウスを収容した。食物および飲料を自由に与えた。全体を通して、良好な実践実験研究のためのＡＲＲＩＶＥガイドラインに従った。
【００２１】
盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）注射
本研究において２つの敗血症マウスモデルを使用した：
１．盲腸結紮穿刺２０（ＣＬＰ）モデル
これは、６〜１０週齢のオスＣ５７Ｂｌ／６ＲＪＲＪにおける炎症のモデルとしてＣＬＰにより誘発される腹膜炎で構成された。ＣＬＰモデルは盲腸の穿孔からなり、糞便物質が腹膜腔へ放出されるようになり、複数細菌感染により誘発される免疫応答の増悪が生じる。輸液蘇生と共にＣＬＰを受けるマウスは、第１の（早期）高心拍出量段階を示し、やがて第２の（後期）低心拍出量段階に進行する。手術の前に、ケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ１０００  １００ｍｇ／Ｋｇ  Ｍｅｒｉａｌ）およびキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ  ２％  ２０ｍｇ／Ｋｇ  Ｂａｙｅｒ）により動物を腹腔内で麻酔した。開腹手術の後、４．０縫合糸により盲腸を第３遠位において（ａｔ  ｔｈｅ  ｄｉｓｔａｌ  ｔｈｉｒｄ）結紮し、遠位部分を２１ゲージ針で２回穿孔した。全てのマウス群に水分を補給し、手術後４日間、鎮痛薬（ブプレノルフィン（Ｂｕｐｒｅｎｏｒｐｈｉｎ）Ａｘｉｅｎｃｅ  ０．３ｍｇ／ｋｇ）で１日２回処置した。
２．ＬＰＳ投与
マウスの体重に応じて補正される０．９％ＮａＣｌ中に保存された１０ｍｇ／ｍｌの源液から１０ｍｇ／Ｋｇに達するようにＬＰＳを腹腔内に投与した。この群は、主目的（炎症性スコアおよび生存率）に対するＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）の効果のみを確認するために実施した。
【００２２】
両方のモデルにおいて、対照動物は、同じ用量のケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ１０００  １００ｍｇ／Ｋｇ  Ｍｅｒｉａｌ）およびキシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ２％  ２０ｍｇ／Ｋｇ  Ｂａｙｅｒ）により腹腔内で麻酔しただけであった。全ての外科的処置は、午前中に無菌フード下で実行した。
【００２３】
Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）の収集
各患者は、手術組織の調査のための使用に対する異議なしのインフォームドコンセントに署名した（そうでない場合は、破壊することになる）。個人データ保護承認のためのフランス国家当局（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｄａｔａ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｐｐｒｏｖａｌ）の後に設定された、将来を見越して保持されるデータベース上に患者のデータを集めた（Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｑｕｅ  ｅｔ  ｌｉｂｅｒｔｅ：ＣＮＩＬ．ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｎｉｌ．ｆｒ．Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  １９２２０８１−０２．０２．２０１６）。
【００２４】
−ヒト脂肪組織の収集
伝統的な外科的脂肪吸引から得られる技術を用いる脂肪組織収集のためのドナー部位として下腹部または側腹部領域を選択した。１×２ｍｍの複数の楕円孔がそれに沿って配置された鈍い１３Ｇカニューレを、脂肪組織収集のために使用した。１０ｃｃのシリンジと接続したこの使い捨てカニューレにより、数回のカニューレストロークで高速かつ非侵襲的な脂肪組織の収集が可能になる。選択領域から生理食塩水および１：１０００エピネフリンによるチューメセント（ｔｕｍｅｓｃｅｎｔ）浸潤の１０分後に脂肪組織を収集した。
【００２５】
−Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）デバイスによる脂肪組織の処理
収集した脂肪組織をＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）閉鎖系において直ちに処理した。微小断片化、洗浄、およびろ過の機械的プロセスは生理溶液中に完全に浸漬された系で行われ、体積の減少を可能にすると共に細胞生成物に対する任意の外傷性作用を最小限にするために空気の存在が回避される。得られた生成物は、無傷の間質血管ニッチ内に保持された周皮細胞／ＭＳＣを含有し、移植後にレシピエント組織とすぐに相互作用することができる。精製Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）脂肪組織を６０ｃｃのシリンジ内に採取し、過剰の生理食塩水を除去するために、重力により穏やかにデカントするように配置した。次に、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）生成物をいくつかの１ｃｃシリンジに移し、レシピエントマウスの腹腔内に再注入した。
【００２６】
シクロオキシゲナーゼ阻害薬
マウスにシクロオキシゲナーゼ阻害薬の注射を受けさせた（Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を送達するときに腹腔内に注射した）。インドメタシン（１０ｍｇ／ｋｇで使用されるＣＯＸ酵素の非選択的阻害薬；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉ７３７８，ＵＳＡ）、またはＳＣ−５６０（６ｍｇ／ｋｇで使用されるＣＯＸ１の選択的阻害薬；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓ２０６４，ＵＳＡ）、またはＮＳ−３９８（６ｍｇ／Ｋｇで使用されるＣＯＸ２の選択的阻害薬；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｎ１９４、ＵＳＡ）のいずれかにより注射を実施した。注射は８時間ごとに２４時間実施した。全ての注射は体重補正され、０．９％ＮａＣｌ中で注射前に新たに調製された１０ｍｇ／ｍｌ溶液から開始された。対照群には同体積の０．９％ＮａＣｌを注射した。この実験セットのために、ｎ＝８の敗血症ＣＬＰマウス、ｎ＝８の敗血症ＣＬＰ＋Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）マウス、およびｎ＝５の対照（非敗血症の注射なしマウス）を使用した。独立した実験を２回繰り返した。
【００２７】
Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）（マルチプレックスイムノアッセイ）
ヘパリンコートしたＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブおよびシリンジ内に心臓内穿刺から血液を採取した。血液を４℃で１０分間、１５００ｒｐｍで回転させ、上澄み（血漿）を採取して凍結した。凍結血漿を解凍し、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）複合サイトカインおよびケモカイン分析（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ（登録商標）ＰｒｏＴＭ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ２３−Ｐｌｅｘ，Ｇｒｏｕｐ  ＩおよびＳｔａｎｄａｒｄ  ９−Ｐｌｅｘ，Ｇｒｏｕｐ  ＩＩ）のために処理した。炎症性サイトカインの研究は、対照マウス、敗血症（ＣＬＰ）マウス、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を注射した敗血症マウスにおいて行った。この実験セットのために、ｎ＝７の敗血症ＣＬＰマウス、ｎ＝７の敗血症ＣＬＰ＋Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）マウスおよびｎ＝５の対照（非敗血症の注射なしマウス）を使用した。
【００２８】
ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色および免疫組織化学的検査
Ｈ＆Ｅ分析のために、臓器を４％ホルムアルデヒド中で２日間固定し、６０℃でパラフィン中に包埋した。次に組織を５０μｍの切片にし、一晩乾燥させた。切片をヘマトキシリン中に３０秒間浸漬させた。アルコール酸およびアンモニア水で洗浄した後、エオシン中に１５秒間浸漬させた。各ステップの後、蒸留水で切片をすすいだ。次に、増大する濃度（７０％、８０％、９５％、および１００％）のアルコールによる処理で、切片を脱水した。最後に、切片をキシレンで処理し、ガラススリップで被覆した。
免疫染色のために、標準技術を使用して、凍結した連続の１０μｍ切片を調製した。全ての組織をパラホルムアルデヒド４％で１５分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。次に組織をＰＢＳ中で０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００および３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）と共に３０分間インキュベートした。徹底的に洗浄した後、一次抗体を３７℃のＰＢＳ中で１時間インキュベートした。次に切片をＰＢＳで洗浄し、室温で５０分間、二次抗体に曝露した（Ｈｉｓｔｏｆｉｎｅ、正しい宿主に向けられたシンプルステインＭａｘ  ＰＯペルオキシダーゼポリマー）。全ての免疫組織化学染色と同時に負の対照（一次抗体なしの染色）を実施した。組織学カウントのために、ｎ＝４の対照、ｎ＝５の敗血症マウス（ＣＬＰ）、またはｎ＝５の敗血症（ＣＬＰ）＋Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）注射を使用した。カウントは二重盲検で手作業により行った。使用した抗体リストは、次の：抗ＣＤ３、Ｄａｋｏ＃Ａ０４５２；抗ＣＤ４  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ＃５５０２８０；抗Ｆ４／８０  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ♯ＲＭ２６００；抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ａ１４７４８；抗ビオチン化  Ｊａｃｋｓｏｎ＃７１２０６５１５０であった。
【００２９】
測定
主要エンドポイント
主要エンドポイントは、ＣＬＰの２４時間後の炎症性スコアの評価であった（表１）。比較および確認の目的で、このスコアは、１０ｍｇ／ｋｇの腹腔内ＬＰＳ注射マウスにおいても２４時間後に計算した。
【００３０】
二次エンドポイント
測定した二次エンドポイントには、炎症後２１日目までの生存および体温、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の血漿レベル、白血球数、ならびにＣＬＰ後２４時間および２１日目までの炎症促進性および抗炎症性サイトカインの血漿レベル、ＣＬＰの６時間後の肝臓および腎臓中のＦ４／８０＋、Ｂ２２０＋およびＣＤ３＋細胞の数が含まれた。
【００３１】
データ分析
サンプルサイズは、有意な結果を得るために、これまでの実験および最小ｎ値を基準とした。骨髄間葉系幹細胞の注射後に動物の死において変動性の低い重要な違いが以前に観察された。高グレードＣＬＰの誘発後に６５％の死が生じ、骨髄間葉系幹細胞の注射後に５％に降下した。α＝５％および９０％の検出力で、ｎ値＝７になった。脂肪由来の間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞よりも効率的であり得る証拠（研究室および文献に基づいて、骨髄由来間葉系幹細胞に対して脂肪間葉系幹細胞で観察された、より高いサイトカインの降下のように実験的な証拠）が得られている。従って、ｎ＝８で十分なはずある。体温、サイトカイン量および白血球数（平均±ＳＤで表される）を除いて、各条件についてデータは中央値［ＩＱＲ］で表される。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ｎｓ、各対照と比べて統計的に非有意。
【００３２】
一重盲検（敗血症スコア、体温、Ｌｕｍｉｎｅｘ）または二重盲検（臨床生物学、組織学的検査）のいずれかでデータ分析を実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し、適切な試験（指定されない限り、ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）および有意性のための最低９５％の信頼区間を用いて統計分析を実施した；図面に表示されるＰ値は＜０．０５（＊）、＜０．０１（＊＊）、および＜０．００１（＊＊＊）である。図面は、試験した全ての動物の中央値±信頼区間を示すか、あるいは他の実験について表示される通りである。全ての動物を分析に含めた。
【００３３】
敗血症マウスにおける炎症反応に対するＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）の効果
主要エンドポイント
第１に、ＣＬＰまたはＬＰＳの腹腔内注射のいずれかの２４時間後の炎症性スコアを調べた。
Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を注射したＣＬＰマウスの敗血症スコア（９［８−１２］；ｐ＝０．００６）は、生理食塩水を注射したＣＬＰマウス（１７［１４−２０］  図１Ａ）と比べて、有意に低下することが観察された。生理食塩水を注射したＣＬＰマウスでは、炎症性スコアは５日間高いままであり（約１６）、敗血症の誘発後７日目と９日目との間に急激に低下した。生理食塩水を注射した敗血症マウス群では、敗血症の誘発後２１日目にスコアは７［５−９］に達した（図１Ｂ）。敗血症の誘発の２１日後に、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を注射した敗血症群の炎症性スコアは３［２−５］であり、敗血症未処置対照群または生理食塩水を注射した敗血症群の５［３−６］よりも低かった（ｐ＝０．０３；図１Ｂ）。
【００３４】
第２に、ＬＰＳ処置マウスにおける炎症の２４時間後の炎症性スコアを調べた。ＬＰＳ注射の２４時間後に、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を注射した炎症性マウスの１０［９−１１］に対して、炎症性マウス（ＬＰＳのみを注射）の炎症性スコアは１６［１５−２０］に達した（ｐ＝０．０００６、図１Ｃ）。ＬＰＳ負荷されたマウスは２日以内に限界（２１の炎症性スコアを有すると定義される）に達した（生存期間中央値）（図１Ｃ，Ｄ）。
【００３５】
二次エンドポイント
Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を腹腔内注射したマウスの生存率は、生理食塩水を注射した敗血症マウスと比べて統計的に有意に改善された（６５％対２５％の生存マウス、炎症の誘発の６０日後  ｐ＝０．０３；図２Ａ）。Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を注射したＣＬＰマウスは、生理食塩水を注射した敗血症マウスと比べて、より高い体温およびその体温のより小さい降下を有した（それぞれ、３６．３±０．６℃対３４．９±０．９８℃）炎症の誘発の２４時間後、Ｐ＝０．００４、図２Ｂ）。体温の差は、炎症後１４日目まで保持された。炎症後１９日目に、両方の群の体温は正常値に戻った（ＣＬＰおよびＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を注射したＣＬＰでは３６．９±０．３８℃であるのに対し、対照では３７．２±０．３℃、ｐ＝０．３４、図２Ｂ）。
炎症の４８時間後のＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を注射したマウスの生存率は、生理食塩水を注射したＬＰＳマウスでは生存期間中央値がわずか２［１−３］日であるのに対して、７１％であった（７匹の動物のうち５匹、その生存期間中央値は５［３−６］日（生存期間中央値）、図１Ｄ）（ｐ＝０．００９；図１Ｄ）。
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の血漿レベルは、非炎症性対照群と比較して、ＣＬＰマウスにおいて炎症の２４時間後に統計的に高かった（図３Ａ）。Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を注射した場合、ＣＬＰマウスは、対照に近い生物学的パラメータを示した（図３Ａ）。ＣＬＰの２４時間後に、白血球数の初期降下が観察された。これは、ＣＬＰマウスにＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を注射したときには観察されなかった（図３Ｂ、ｐ＝０．０７２２）。ＣＬＰの誘発後の後期の時点では任意の試験条件の群の間で、白血球数の違いは検出されなかった（図３Ｃ、ｐ＞０．０５）。
【００３６】
サイトカインストームおよび臓器免疫浸潤に対するＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）の効果
敗血症ＣＬＰマウスの血漿中、全てのサイトカインレベルは穿刺の２４時間後に上昇した（図３、表Ｉ）。以下の炎症促進性サイトカインレベルは、未処置のＣＬＰマウスと比べて、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を注射したＣＬＰマウスにおいて有意に低下した：ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ｇ、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−ａ（図４、表Ｉ）。炎症促進性ＩＬ−６に注目すると、未処置のＣＬＰ敗血症マウスと比較して、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を注射した敗血症マウスにおけるそのレベルの低下が観察された（２９６２８ｐｇ／μｌ±６１６６に対して、９１３９ｐｇ／μｌ±４３０７、ｐ＝０．００７９、図４、表Ｉ）。反対に、以下の抗炎症性サイトカインは増大することが分かった：ＩＬ−４、ＩＬ−１０、Ｇ−ＣＳＦ（図４、表Ｉ）。抗炎症性ＩＬ−４に注目すると、未処置のＣＬＰマウスと比べて、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を注射したＣＬＰマウスの血漿レベルの有意な増大が観察された（１６．９１ｐｇ／μｌ±１．６に対して、２３．９６ｐｇ／μｌ±３．６、ｐ＝０．００８、図４、表Ｉ）。敗血症の誘発の２１日後に、未処置の敗血症マウスと、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を注射した敗血症マウスとの間に差は見出されなかった。
【００３７】
【表１】
2019514997.tif 000003
【００３８】
敗血症の誘発の６日後に、対照マウスと比べて、炎症性ＣＬＰマウスの肝臓におけるＦ４／８０＋、Ｂ２２０＋およびＣＤ３＋細胞数の増大も観察された。Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）の注射の後、未処置のＣＬＰマウスと比較して、Ｆ４／８０（図５Ａ、ｐ＝０．０３３）；Ｂ２２０（図５Ｂ、ｐ＝０．０２４）；ＣＤ３（図５Ｃ；ｐ＝０．０３５）の数の有意な減少が観察された。また腎臓も、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）注射の後、試験した全ての免疫細胞型の全体的な減少を示した：Ｆ４／８０（図５Ｄ、ｐ＝０．００１４）；Ｂ２２０（図５Ｅ  ｐ＝０．０５）；ＣＤ３（図５Ｆ、ｐ＝０．０３）。対照と炎症性動物とを比較すると、炎症後に検出可能なＧｒ１陽性細胞は見出されず、従って、これらのマーカーは我々の分析に含まれないことが決定された。
【００３９】
ＣＬＰの２４時間後のＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）効果に対するシクロオキシゲナーゼ阻害薬の効果
Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）効果がＣＯＸ経路により媒介されるかどうかを理解するために、選択されたＣＯＸ阻害薬を同時投与してこれまでのプロトコルを繰り返した。詳細には、ＣＬＰにより炎症を誘発し、敗血症の誘発の２時間後にＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を注射し、ＣＬＰの２４時間後にマウスを屠殺した。Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）＋インドメタシンの注射またはＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）＋ＮＳ−３９８の注射の２４時間後（それぞれ、炎症性スコア＝１６．５０［１５−１８］；ｐ＝０．００１および１６．００［１２−１９］  ｐ＝０．００１）に、炎症性スコアは未処置の敗血症マウスと比較して変化しないことが見出された（図６Ａ）。しかしながら、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）の効果は、ＳＣ−５６０との同時注射の後に影響を受けなかった（炎症性スコア：９［８−１２］Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）単独に対して、１０［８−１５］Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）＋ＳＣ−５６０；ｐ＝０．６５  図６Ａ）。Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を、インドメタシン（生存率中央値２６［２２−２９］日；ｐ＝０．１２）またはＮＳ−３９８（生存率中央値２１［１８−２４］日；ｐ＝０．０９）のいずれかと同時注射すると、より低い生存率が観察された。Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）単独、またはＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）＋ＳＣ−５６０を動物に注射したときに、統計的差異は検出されなかった（生存率中央値６０［５５−６７］日；ｐ＝０．０４、図６Ｂ）。Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）＋インドメタシン（３９８６±１１７２の白血球／ｍｌ；ｐ＝０．０２）またはＮＳ−３９８（４０６８±５５１の白血球／ｍｌ、ｐ＝０．０１）のいずれかを同時注射すると、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）注射単独の場合（６３０７±５１６の白血球／ｍｌ、図６Ｃ）と比較して白血球数はＣＬＰの３日後に降下した。Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）とＳＣ−５６０（６０２５±５９７の白血球／ｍｌ、ｐ＝０．０９５  図６Ｃ）を同時注射したとき、白血球数の差は観察されなかった。Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）単独の場合と比べて、敗血症（ＣＬＰ）マウスにＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）＋インドメタシンを注射すると炎症促進性サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＦＮ−ｇ、ＭＩＰ−１、ＴＮＦ−ａの血漿レベルが増強された（図６Ｄ、表ＩＩ）。例えば、ＩＬ−６レベルは、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）＋インドメタシンを注射した炎症性マウスでは１４２２５ｐｇ／μｌ±１０７８であったのに対して、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）を注射した炎症性マウスの血漿中では９１５１ｐｇ／μｌ±８９７であった（ｐ＝０．０２８、図６Ｄ、表ＩＩ）。特定のシクロオキシゲナーゼ−１阻害薬ＳＣ−５６０を用いると、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）のみを注射したＣＬＰマウスと比べて、ＩＬ−１７の血漿レベルだけが増大したが、他の炎症促進性サイトカインは全て変化しなかった（表ＩＩ）。例えば、ＩＬ−６は８５４８ｐｇ／μｌ±９７１の濃度を有し、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）注射された炎症性マウスの９１５１ｐｇ／μｌ±８９７と差はなかった（ｐ＝０．４８、表ＩＩ）。
【００４０】
Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）＋ＮＳ−３９８選択的シクロオキシゲナーゼ−２阻害薬を同時注射すると類似の結果が得られ、ＣＬＰ後およびＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）のみを注射した群と比べて、ＣＬＰの２４時間後にＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−ａの血漿レベルが増大した（図６Ｄ、表ＩＩ）。ＩＬ−６に注目すると、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）およびＮＳ−３９８をマウスに同時注射したとき、ＣＬＰの２４時間後に１２４６４ｐｇ／μｌ±２３４６の血漿濃度が観察された。これは、ＣＬＰおよびＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）単独注射マウスよりも高かった（９１５１ｐｇ／μｌ±８９７；ｐ＝０．０２８、図６Ｆ）。Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）およびインドメタシンを炎症性マウスに注射すると、ＣＬＰの２４時間後にＩＬ−４およびＩＬ−１０およびＩＬ−１３の血漿レベルの低下が検出された（図６Ｄ、表ＩＩ）。同様に、ＣＬＰおよびＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）注射マウスにインドメタシンを同時注射すると、ＩＬ−１０の血漿濃度は２３６４ｐｇ／μｌ±２１００であった。これは、ＣＬＰおよびＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）のみで観察された濃度（８８３９ｐｇ／μｌ±１４４２；ｐ＝０．０２８、図６Ｄ、表ＩＩ）よりも低かった。ＳＣ−５６０の注射は抗炎症性サイトカインのレベルを変化させなかった（ＩＬ−１０の場合、８１２０ｐｇ／μｌ±９５２．２、ｐ＝０．４８、図６Ｄ、表ＩＩ）が、ＮＳ−３９８の注射は、抗炎症性サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３の血漿レベルを低下させた（ＩＬ−１０の場合、２０５２ｐｇ／μｌ±１１５８、ｐ＝０．０３、図６Ｄ、表ＩＩ）。
【００４１】
【表２】
2019514997.tif 000004
【００４２】
結論
上記に例示されたデータは、微小断片化脂肪（Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標））の腹腔内投与が、敗血症、特に急性期の敗血症の有害な影響を効率的に低減することを示す。
実際、データは、微小断片化脂肪で処置した敗血症マウスの生存率の改善および敗血症スコアの持続的な低下を実証する。加えて、マウスの体温は３７℃に近く、炎症促進性サイトカインのレベルは低下するが、抗炎症性サイトカインのレベルは上昇する。吸引脂肪組織の腹腔内投与などの敗血症マウスのさらなる処置は同じ結果を示さなかった。
さらに、上記に報告されたデータは、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）微小断片化脂肪がプロスタグランジン経路により作用することを実証する。特に、ＣＯＸ−２の酵素活性はその抗炎症性効果に不可欠である。実際、インドメタシン（強力なプロスタグランジン合成の抑制因子）の投与は、敗血症マウスにおけるＬｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）微小断片化脂肪の投与の効果を遮断する。従って、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ（登録商標）微小断片化脂肪は、プロスタグランジン合成および非ＣＯＸ標的に影響を与える。
【００４３】
敗血症マウスへの微小断片化脂肪組織の注射の長期にわたる効果
Ｌｉｐｏｇｅｍｓ抽出による微小断片化脂肪は、敗血症の急性期の炎症を減少させることが示された。敗血症の長期にわたる影響の１つは、１）５年間持続し得る筋力低下、および２）認知機能障害であり得る。敗血症の誘発の数日後にＬｉｐｏｇｅｍｓ（微小断片化脂肪組織）がマウスに注射されると、ミクログリア細胞（脳の免疫細胞）はあまり損なわれないことが実験的に実証された。特に、Ｌｉｐｏｇｅｍｓ注射は、敗血症マウスの前頭皮質および海馬におけるミクログリア細胞の脱分岐（ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を低減し、従って、敗血症の慢性期におけるＬｉｐｏｇｅｍｓ注射はミクログリア細胞の挙動を改善する。
結論として、微小断片化脂肪の注射は、敗血症に関連する／敗血症によって引き起こされる認知機能障害を防止または改善／低減することが示された。
さらに、Ｐａｘ７＋細胞の数を測定し、Ｌｉｐｏｇｅｍｓの後期投与の後に敗血症マウスにおけるサテライト細胞の低減を見出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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