(57)【要約】本開示は、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤として有用な化合物、その組成物、およびそれを使用する方法を提供する。本開示は、神経変性疾患もしくは障害または神経学的疾患もしくは障害を治療するために有用な化合物、その組成物、およびそれを使用する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、軸索変性または軸索障害を伴う多くの神経学的障害の治療標的としての酵素を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＭ１阻害剤を同定し、および／または特徴付けるためのアッセイを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害および／あるいは神経変性疾患もしくは障害または神経学的疾患もしくは障害の治療を必要とする患者においてＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を阻害するおよび／あるいは神経変性疾患もしくは障害または神経学的疾患もしくは障害を治療する方法であって、前記患者に、式ＩＡ：
【化５８】
2019535804.tif 000071
の組成物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含み、式中、
ＸＡは、−Ｓ−、−ＳＯ−または−ＳＯ２−であり、
Ｒ１Ａは、水素、Ｃ１〜４脂肪族、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムまたはＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４であり、
環ＡＡは、ベンゾ縮合環、ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する５〜６員の複素環式芳香族縮合環から選択され、
環ＢＡは、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環から選択され、
ＲＸＡおよびＲＹＡは、独立して、水素、１〜４個のハロゲンにより任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族、−ＯＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＡ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２ＲＡ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＡ）２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−Ｓ（Ｏ）２ＲＡ、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環であり、
各ＲＡは、独立して、水素であるか、またはＣ１〜６脂肪族、３〜８員の飽和または部分不飽和の単環式炭素環、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環から選択される任意選択で置換された基であり、
ｍＡおよびｎＡは、独立して、０、１、２、または３である、
方法。
【請求項２】
式ＩＡの化合物が、
【化５９】
2019535804.tif 000072
【化６０】
2019535804.tif 000073
【化６１】
2019535804.tif 000074
【化６２】
2019535804.tif 000075
からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＸＡが−ＳＯ−である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｎＡが０または１であり、ｍＡが２または３である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
環ＡＡがアリール縮合環であり、環ＢＡがヘテロアリール環である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
環ＡＡがベンゾ縮合環であり、環ＢＡがピリジル環である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
環ＡＡが複素環式芳香族縮合環であり、環ＢＡがヘテロアリール環である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
環ＡＡが、ピリド縮合環、ピリミジノ縮合環、ピリダジノ縮合環、ピラジノ縮合環、トリアジノ縮合環、ピロロ縮合環、チオフェノ縮合環、フラノ縮合環、チアゾロ縮合環、イソチアゾロ縮合環、イミダゾロ縮合環、ピラゾロ縮合環、オキサゾロ縮合環およびイソキサゾロ縮合環からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
環ＢＡが、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラシル、インダニル、フタルイミジル、ナフトイミジル、フェナントリジニル、テトラヒドロナフチル、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニルおよびプテリジニルからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ１Ａが、水素、Ｃ１〜４脂肪族またはアルカリ金属である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ１Ａが、水素、メチルまたはナトリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＲＹＡが、水素、１〜４個のハロゲンにより任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族または−ＯＲＡであり、ＲＡが、任意選択で置換されたＣ１〜６脂肪族である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＹＡが、水素、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＦ３または−Ｏ（ＣＨ２）３ＯＣＨ３である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＲＸＡが、水素、−ＯＲＡ、またはヘテロアリールであり、ＲＡが、任意選択で置換されたＣ１〜６脂肪族またはベンジルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＲＸＡが、水素、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨＣＦ２、ピロリルまたは−ＯＣＨ２−フェニルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
式ＩＡの化合物が、薬学的に許容される組成物の一部として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
式ＩＡの化合物が経口投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
式ＩＡの化合物が、前記患者の体重１ｋｇあたり０．０１〜１００ｍｇの範囲内で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記神経変性疾患もしくは障害または前記神経学的疾患もしくは障害が、軸索変性、軸索傷害、軸索障害、脱髄疾患、橋中央ミエリン溶解、神経損傷疾患または障害、代謝性疾患、ミトコンドリア疾患、代謝性軸索変性、白質脳症または白質ジストロフィーの結果としてもたらされる軸索傷害に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記神経変性疾患もしくは障害または前記神経学的疾患もしくは障害が、脊髄損傷、卒中、多発性硬化症、進行性多病巣性白質脳症、先天性ミエリン形成減少、脳脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎、橋中央ミエリン溶解、浸透圧性低ナトリウム血症、低酸素性脱髄、虚血性脱髄、副腎脳白質ジストロフィ、アレキサンダー病、ニーマン・ピック病、ペリツェウス・メルツバッハー病、脳室周囲白質軟化症、球様細胞白質萎縮（クラッベ病）、ワーラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリッグ病）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、テイ・サックス病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、外傷性脳損傷、照射後損傷、化学療法の神経学的合併症（化学療法誘発性ニューロパチー；ＣＩＰＮ）、ニューロパチー、急性虚血性視神経症、ビタミンＢ１２欠乏症、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、バッセン・コルンツヴァイク症候群、緑内障、レーバー遺伝性視神経萎縮（ニューロパチー）、レーバー先天性黒内障、視神経脊髄炎、異染性白質ジストロフィー、急性出血性白質脳炎、三叉神経痛、ベル麻痺、脳虚血、多系統萎縮症、外傷性緑内障、熱帯性痙性対麻痺ヒトＴリンパ球向性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）関連脊髄症、ウエストナイルウイルス脳症、ラクロスウイルス脳炎、ブニヤウイルス脳炎、小児ウイルス性脳炎、本態性振戦、シャルコー・マリー・トゥース病、運動ニューロン疾患、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチー（ＨＳＡＮ）、副腎脊髄ニューロパチー、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、フリードライヒ運動失調症、遺伝性運動失調症、騒音性難聴、先天性難聴、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、アミロイドーシス、糖尿病性ニューロパチー、ＨＩＶニューロパチー、腸神経障害および軸索障害、ギラン・バレー症候群、および重症急性運動性軸索型ニューロパチー（ＡＭＡＮ）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害および／あるいは神経変性疾患もしくは障害または神経学的疾患もしくは障害の治療を必要とする患者においてＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を阻害するおよび／あるいは神経変性疾患もしくは障害または神経学的疾患もしくは障害を治療する方法であって、前記患者に、式ＩＢ：
【化６３】
2019535804.tif 000076
の組成物またはその薬学的に許容される塩を投与することを含み、式中、
Ｘ１ＢおよびＸ２Ｂは、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＲＢ−であり、但し、Ｘ１ＢおよびＸ２Ｂの１つは−Ｏ−または−Ｓ−であり、Ｘ１ＢおよびＸ２Ｂの両方が−Ｏ−であることはなく、
ＹＢは、−Ｎ−または−ＣＨ−であり、
各Ｒ１Ｂは、独立して、水素または任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族であり、
環ＡＢは、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環から選択され、
各ＲＸＢは、独立して、水素、ハロゲンであるか、またはＣ１〜６脂肪族、３〜８員の飽和または部分不飽和の単環式炭素環、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環から選択される任意選択で置換された基であり、
各ＲＢは、独立して、水素であるか、またはＣ１〜６脂肪族、３〜８員の飽和または部分不飽和の単環式炭素環、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環から選択される任意選択で置換された基であり、
ＬＢは、共有結合、Ｃ１〜６員の直鎖もしくは分岐鎖の二価の炭化水素鎖、シクロプロピレニル、シクロブチレニル、またはオキセタニレニルであり、
ｎＢは、０、１、２、３または４である、
方法。
【請求項２２】
式ＩＢの化合物が、
【化６４】
2019535804.tif 000077
からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｘ１ＢおよびＸ２Ｂが−Ｓ−であり、ＹＢが−Ｎ−である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
環ＡＢが、アリールまたはヘテロアリールである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
環ＡＢが、フェニル、ビフェニル、ナフチルおよびアントラシルからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
環ＡＢが、インダニル、フタルイミジル、ナフトイミジル、フェナントリジニル、テトラヒドロナフチル、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニルおよびプテリジニルからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
Ｒ１Ｂが、任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
Ｒ１Ｂがメチルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
ＬＢが、共有結合または１〜６員の直鎖もしくは分岐鎖の二価の炭化水素鎖である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
ＬＢが、共有結合またはメチレン基である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
ＲＸＢが、水素、ハロゲンまたは任意選択で置換されたＣ１〜６脂肪族である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
ＲＸＢが、水素または−Ｃｌである、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
式ＩＢの化合物が、薬学的に許容される組成物の一部として投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
式ＩＢの化合物が経口投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
式ＩＢの化合物が、前記患者の体重１ｋｇあたり０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内で投与される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
前記神経変性疾患もしくは障害または前記神経学的疾患もしくは障害が、軸索変性、軸索傷害、軸索障害、脱髄疾患、橋中央ミエリン溶解、神経損傷疾患または障害、代謝性疾患、ミトコンドリア疾患、代謝性軸索変性、白質脳症または白質ジストロフィーの結果としてもたらされる軸索傷害に関連する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３７】
前記神経変性疾患もしくは障害または前記神経学的疾患もしくは障害が、脊髄損傷、卒中、多発性硬化症、進行性多病巣性白質脳症、先天性ミエリン形成減少、脳脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎、橋中央ミエリン溶解、浸透圧性低ナトリウム血症、低酸素性脱髄、虚血性脱髄、副腎脳白質ジストロフィ、アレキサンダー病、ニーマン・ピック病、ペリツェウス・メルツバッハー病、脳室周囲白質軟化症、球様細胞白質萎縮（クラッベ病）、ワーラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリッグ病）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、テイ・サックス病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、外傷性脳損傷、照射後損傷、化学療法の神経学的合併症（化学療法誘発性ニューロパチー；ＣＩＰＮ）、ニューロパチー、急性虚血性視神経症、ビタミンＢ１２欠乏症、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、バッセン・コルンツヴァイク症候群、緑内障、レーバー遺伝性視神経萎縮、レーバー先天性黒内障、視神経脊髄炎、異染性白質ジストロフィー、急性出血性白質脳炎、三叉神経痛、ベル麻痺、脳虚血、多系統萎縮症、外傷性緑内障、熱帯性痙性対麻痺ヒトＴリンパ球向性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）関連脊髄症、ウエストナイルウイルス脳症、ラクロスウイルス脳炎、ブニヤウイルス脳炎、小児ウイルス性脳炎、本態性振戦、シャルコー・マリー・トゥース病、運動ニューロン疾患、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチー（ＨＳＡＮ）、副腎脊髄ニューロパチー、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、フリードライヒ運動失調症、遺伝性運動失調症、騒音性難聴および先天性難聴からなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３８】
ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法であって、
ａ．ｉ）ＳＡＲＭ１の変異体または断片、ｉｉ）ＮＡＤ＋およびｉｉｉ）阻害剤候補を含む混合物を提供するステップであって、前記変異体または前記断片が構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する、ステップ、
ｂ．前記混合物をインキュベートするステップ、
ｃ．前記インキュベート後の前記混合物中のＮＡＤ＋およびＡＤＰＲを定量化するステップ、
ｄ．ＮＡＤ＋：ＡＤＰＲのモル比を決定するステップ、および
ｅ．前記モル比が、前記阻害剤候補を含有しない対照混合物のモル比より高い場合、前記阻害剤候補の化合物をＮＡＤアーゼ阻害剤として同定するステップ
を含む、方法。
【請求項３９】
前記混合物中のＮＡＤ＋およびＡＤＰＲを定量化するステップが、ＨＰＬＣ分析を行うことを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記混合物が、ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片を含む細胞溶解物を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
細胞溶解物が、ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片を含むＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片がＳＡＲＭ−ＴＩＲ断片である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片が、ヒトＳＡＲＭ１の残基４１０〜７２１からなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片が、ヒトＳＡＲＭ１の残基４１０〜７２１に相同的なマウスＳＡＲＭ１の残基からなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片が、Ｎ末端自己阻害ドメインを欠失したＳＡＲＭ１ポリペプチドである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記阻害剤候補の化合物が、ＮＡＤ＋：ＡＤＰＲの前記モル比が４：１より高い場合にＮＡＤアーゼ阻害剤として同定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記溶解物中のＮＡＤ＋を定量化するステップが、化学ルミネセンスアッセイを行うことを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
ＳＡＲＭ１の変異体または断片からなるポリペプチドであって、前記変異体または前記断片が構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する、ポリペプチド。
【請求項４９】
構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する、ＳＡＲＭ１の変異体または断片、および
少なくとも１つのタグ
からなるポリペプチド。
【請求項５０】
前記少なくとも１つのタグが、Ｓｔｒｅｐ  ｔａｇ、Ｈｉｓタグ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４９に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片がＳＡＲＭ１−ＴＩＲ断片である、請求項４９に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ断片、Ｈｉｓタグ、およびストレプトアビジンタグからなる、請求項４９に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
前記ストレプトアビジンタグが、タンデムなストレプトアビジンタグである、請求項５２に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
アミノ末端からカルボキシ末端への順序で、タンデムなストレプトアビジンタグ、ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ断片、およびＨｉｓタグからなる、請求項４９に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片が、Ｎ末端自己阻害ドメインを欠失したＳＡＲＭ１ポリペプチドである、請求項４９に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片が、ヒトＳＡＲＭ１の残基４１０〜７２１からなる、請求項４９に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片が、ヒトＳＡＲＭ１の残基４１０〜７２１に相同的なマウスＳＡＲＭ１の残基からなる、請求項４９に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
構成的なＮＡＤアーゼ活性を有し、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１の断片の配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチド。
【請求項５９】
構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１の断片の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項５８に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１の断片の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項５８に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１の断片の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項５８に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する、ヒトＳＡＲＭ１の断片。
【請求項６３】
請求項４８から６２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするベクター。
【請求項６４】
請求項４８から６２のいずれか一項に記載のポリペプチド、および固体支持体を含む組成物。
【請求項６５】
前記固体支持体がビーズである、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法であって、
ａ．ｉ）請求項４８から６２のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび少なくとも１つのタグ、ｉｉ）ＮＡＤ＋、ならびにｉｉｉ）阻害剤候補が結合した固体支持体を含む混合物を提供するステップと、
ｂ．前記混合物をインキュベートするステップと、
ｃ．前記インキュベート後の前記ＮＡＤ＋を定量化するステップと、
ｄ．ＮＡＤ＋の濃度が対照のＮＡＤ＋濃度より高い場合、前記阻害剤候補の化合物をＮＡＤアーゼ阻害剤として同定するステップと
を含む、方法。
【請求項６７】
前記少なくとも１つのタグがＮ末端タグである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記Ｎ末端タグがストレプトアビジンタグである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
Ｎ末端タンパク質タグが、タンデムなストレプトアビジンタグである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記少なくとも１つのタグがＣ末端タグである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７１】
前記Ｃ末端タグがＨｉｓタグである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記固体支持体がＨｉｓタグ精製ビーズである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７３】
前記少なくとも１つのタグが、少なくとも２つのタグである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７４】
前記少なくとも２つのタグが、Ｎ末端タグおよびＣ末端タグである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記Ｎ末端タグがタンデムなストレプトアビジンタグであり、前記Ｃ末端タグがＨｉｓタグである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＮＡＤ＋を定量化するステップが、ＨＰＬＣアッセイを行うことを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７７】
ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法であって、
ａ．ｉ）少なくとも１つの軸索を含む少なくとも１つの培養ニューロンおよびｉｉ）ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤候補を含む混合物を提供するステップ、
ｂ．標識されたＮＡＭを前記混合物に加えるステップ、
ｃ．前記少なくとも１つの軸索を離断するステップ、
ｄ．前記混合物中の標識されたＮＡＤ＋および未標識のＮＡＤ＋の量を定量化するステップ、ならびに
ｅ．損傷後ＮＡＤ＋消費速度が、前記阻害剤候補を含有しない対照混合物の損傷後ＮＡＤ＋消費速度と比べて減少した場合、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼの阻害剤を同定するステップ
を含む、方法。
【請求項７８】
ＮＡＤ＋消費の正味の速度を決定するステップをさらに含む、請求項７７に記載のＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法。
【請求項７９】
前記ＮＡＤ＋消費の正味の速度を決定するステップが、重いＮＡＤ＋に対する軽いＮＡＤ＋の減少の％を経時的に算出することを含む、請求項７７に記載のＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法。
【請求項８０】
前記標識されたＮＡＭが、重水素標識されたＮＡＭである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記標識されたＮＡＭがＤ４−ＮＡＭである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記標識されたＮＡＤ＋および未標識のＮＡＤ＋を定量化するステップが、ＨＰＬＣアッセイを行うことを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
前記少なくとも１つの培養ニューロンが、少なくとも１つの後根神経節の培養ニューロンである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
軸索変性の阻害剤を同定する方法であって、
ａ．ｉ）軸索を含む少なくとも１つの培養ニューロンおよびｉｉ）阻害剤候補を含む混合物を提供するステップ、
ｂ．前記ニューロンを破壊するステップ、
ｃ．少なくとも１つの顕微鏡画像を使用して変性指数を算出するステップ、ならびに
ｄ．対照の変性指数と比べて前記変性指数の統計的に有意な減少がある場合、軸索変性の阻害剤を同定するステップ
を含む、方法。
【請求項８５】
前記ニューロンを破壊するステップが、前記軸索を離断することを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ニューロンを破壊するステップが、前記混合物にビンクリスチンを加えることを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法であって、
ａ．ｉ）ＳＡＲＭ１の変異体または断片、ｉｉ）ＮＡＤ＋およびｉｉｉ）阻害剤候補を含む混合物を提供するステップであって、前記変異体または前記断片が構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する、ステップ、
ｂ．前記混合物をインキュベートするステップ、
ｃ．前記インキュベート後の前記混合物中のＮＡＤ＋を定量化するステップ、ならびに
ｄ．ＮＡＤ＋の量が前記阻害剤候補を含有しない対照混合物のＮＡＤ＋量より多い場合、前記阻害剤候補の化合物をＮＡＤアーゼ阻害剤として同定するステップ
を含む、方法。
【請求項８８】
前記混合物中のＮＡＤ＋を定量化するステップが、化学ルミネセンスアッセイを行うことを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記混合物中のＮＡＤ＋を定量化するステップが、ＨＰＬＣ分析を行うことを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
前記混合物が、ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片を含む細胞溶解物を含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
前記細胞溶解物が、ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片を含むＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片がＳＡＭ−ＴＩＲ断片である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９３】
ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片が、ヒトＳＡＲＭ１の残基４１０〜７２１からなる、請求項８７に記載の方法。
【請求項９４】
ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片が、構成的なＮＡＤアーゼ活性を呈するように改変されたマウスＳＡＲＭ１からなる、請求項８７に記載の方法。
【請求項９５】
ＳＡＲＭ１の前記変異体または前記断片が、Ｎ末端自己阻害ドメインを欠失したＳＡＲＭ１ポリペプチドである、請求項８７に記載の方法。
【請求項９６】
薬学的に有効な量のＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤を投与することを含む、軸索障害を治療する方法。
【請求項９７】
ＳＡＲＭ１をＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤と接触させることを含む、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を阻害する方法。
【請求項９８】
請求項４８から６２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞。
【請求項９９】
真核細胞である、請求項９８に記載の細胞。
【請求項１００】
哺乳動物細胞である、請求項９８に記載の細胞。
【請求項１０１】
請求項４８から６２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞。
【請求項１０２】
真核細胞である、請求項１０１に記載の細胞。
【請求項１０３】
哺乳動物細胞である、請求項１０１に記載の細胞。
【請求項１０４】
請求項４８から６２のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む原核細胞。
【請求項１０５】
Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１０４に記載の原核細胞。
【請求項１０６】
請求項４８から６２のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む原核細胞。
【請求項１０７】
Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１０６に記載の原核細胞。
【請求項１０８】
軸索障害を治療する方法であって、それを必要とする被験体に治療有効量のＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項１０９】
前記ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤がプロトンポンプ阻害剤である、請求項１０８に記載の軸索障害を治療する方法。
【請求項１１０】
前記ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤が、式ＩＣ：
【化６５】
2019535804.tif 000078
の化合物またはその薬学的に許容される塩であり、式中、
ＸＣは、ＮまたはＣであり、
Ｒ１Ｃは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ５ハロアルコキシであり、
Ｒ２Ｃは、Ｃ１〜Ｃ５アルキルまたはＣ１〜Ｃ５アルコキシであり、
Ｒ３Ｃは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０ハロアルキルまたはエーテルであり、
Ｒ４Ｃは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ５アルキルまたはＣ１〜Ｃ５アルコキシである、
請求項１０８に記載の軸索障害を治療する方法。
【請求項１１１】
前記ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤が、
【化６６】
2019535804.tif 000079
からなる群より選択される、請求項１０８に記載の軸索障害を治療する方法。
【請求項１１２】
前記ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤が、
【化６７】
2019535804.tif 000080
【化６８】
2019535804.tif 000081
からなる群より選択される、請求項１０８に記載の軸索障害を治療する方法。
【請求項１１３】
軸索障害を治療する方法であって、それを必要とする被験体に治療有効量のニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（ＮＨＤ）を投与することを含む、方法。
【請求項１１４】
ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法であって、
ａ）ｉ）構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１の断片と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチド、ｉｉ）ＮＡＤ＋およびｉｉｉ）阻害剤候補を含む混合物を提供するステップであって、前記ポリペプチドが構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する、ステップ、
ｂ）前記混合物をインキュベートするステップ、
ｃ）前記インキュベート後の前記混合物中のＮＡＤ＋および少なくとも１つのＮＡＤアーゼ切断生成物を定量化するステップ、ならびに
ｄ）前記少なくとも１つのＮＡＤアーゼ切断生成物に対するＮＡＤ＋のモル比が、前記阻害剤候補を含有しない対照混合物のモル比より高い場合、前記阻害剤候補の化合物をＮＡＤアーゼ阻害剤として同定するステップ
を含む、方法。
【請求項１１５】
ポリペプチドが、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１の断片と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
ポリペプチドが、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１の断片と少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
ポリペプチドが、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１の断片と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１８】
ポリペプチドが、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１の断片である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１９】
前記少なくとも１つのＮＡＤアーゼ切断生成物がＡＤＰＲである、請求項１１３から１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記少なくとも１つのＮＡＤアーゼ切断生成物がＮａｍである、請求項１１３から１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ＮＡＤ＋を定量化するステップが、ＨＰＬＣ分析を行うことを含む、請求項１１３から１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記少なくとも１つのＮＡＤアーゼ切断生成物を定量化するステップが、ＨＰＬＣ分析を行うことを含む、請求項１１３から１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
溶解物中のＮＡＤ＋を定量化するステップが、化学ルミネセンスアッセイを行うことを含む、請求項１１３から１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記混合物が、前記ポリペプチドを含む細胞溶解物を含む、請求項１１３から１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
細胞溶解物が、前記ポリペプチドを含むＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物である、請求項１１３から１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
ポリペプチドが、ＳＡＲＭ−ＴＩＲ断片である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２７】
ポリペプチドが、ヒトＳＡＲＭ１の残基４１０〜７２１からなる、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２８】
ポリペプチドが、ヒトＳＡＲＭ１の残基５６０〜７２４からなる、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１２９】
ポリペプチドが、Ｎ末端自己阻害ドメインを欠失したＳＡＲＭ１ポリペプチドである、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１３０】
阻害剤候補の化合物が、少なくとも１つの切断生成物に対するＮＡＤ＋のモル比が４：１より高い場合にＮＡＤアーゼ阻害剤として同定される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１３１】
ＳＡＲＭ１ポリペプチドをプロトンポンプ阻害剤と接触させることを含む、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を阻害する方法。
【請求項１３２】
ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を阻害する方法であって、ＳＡＲＭ１ポリペプチドを式ＩＣ：
【化６９】
2019535804.tif 000082
の化合物またはその薬学的に許容される塩と接触させることを含み、式中、
ＸＣは、ＮまたはＣであり、
Ｒ１Ｃは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ５ハロアルコキシであり、
Ｒ２Ｃは、Ｃ１〜Ｃ５アルキルまたはＣ１〜Ｃ５アルコキシであり、
Ｒ３Ｃは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０ハロアルキルまたはエーテルであり、
Ｒ４Ｃは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ５アルキルまたはＣ１〜Ｃ５アルコキシである、
方法。
【請求項１３３】
前記化合物またはその塩が、テナトプラゾール、パントプラゾールナトリウム、デクスランソプラゾール、エソメプラゾールマグネシウム水和物およびラベプラゾールナトリウムからなる群より選択される、請求項１０８に記載のＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を阻害する方法。
【請求項１３４】
軸索障害の治療において使用するための式ＩＣ：
【化７０】
2019535804.tif 000083
の化合物、またはその薬学的に許容される塩であって、式中、
ＸＣは、ＮまたはＣであり、
Ｒ１Ｃは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ５ハロアルコキシであり、
Ｒ２Ｃは、Ｃ１〜Ｃ５アルキルまたはＣ１〜Ｃ５アルコキシであり、
Ｒ３Ｃは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０ハロアルキルまたはエーテルであり、
Ｒ４Ｃは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ５アルキルまたはＣ１〜Ｃ５アルコキシである、
化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項１３５】
前記化合物またはその塩が、テナトプラゾール、パントプラゾールナトリウム、デクスランソプラゾール、エソメプラゾールマグネシウム水和物、ランソプラゾール、オメプラゾールまたはラベプラゾールナトリウムからなる群より選択される、請求項１１０に記載の化合物。
【請求項１３６】
ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法であって、
ａ．ｉ）全長ＳＡＲＭ１、ｉｉ）ＮＡＤ＋およびｉｉｉ）阻害剤候補を含む混合物を提供するステップであって、前記全長ＳＡＲＭ１が構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する、ステップ、
ｂ．前記混合物をインキュベートするステップ、
ｃ．前記インキュベート後の前記混合物中のＮＡＤ＋およびＡＤＰＲを定量化するステップ、
ｄ．ＮＡＤ＋：ＡＤＰＲのモル比を決定するステップ、ならびに
ｅ．前記モル比が、前記阻害剤候補を含有しない対照混合物のモル比より高い場合、前記阻害剤候補の化合物をＮＡＤアーゼ阻害剤として同定するステップ
を含む、方法。
【請求項１３７】
前記混合物中のＮＡＤ＋およびＡＤＰＲを定量化するステップが、ＨＰＬＣ分析を行うことを含む、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記混合物が、前記全長ＳＡＲＭ１を含む細胞溶解物を含む、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３９】
ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法であって、
ａ．ｉ）全長ＳＡＲＭ１および少なくとも１つのタグ、ｉｉ）ＮＡＤ＋、ならびにｉｉｉ）阻害剤候補が結合した固体支持体を含む混合物を提供するステップと、
ｂ．前記混合物をインキュベートするステップと、
ｃ．前記インキュベート後の前記ＮＡＤ＋を定量化するステップと、
ｄ．ＮＡＤ＋の濃度が対照のＮＡＤ＋濃度より高い場合、前記阻害剤候補の化合物をＮＡＤアーゼ阻害剤として同定するステップと
を含む、方法。
【請求項１４０】
ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法であって、
ａ．ｉ）全長ＳＡＲＭ１、ｉｉ）ＮＡＤ＋およびｉｉｉ）阻害剤候補を含む混合物を提供するステップであって、前記全長ＳＡＲＭ１が構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する、ステップ、
ｂ．前記混合物をインキュベートするステップ、
ｃ．前記インキュベート後の前記混合物中のＮＡＤ＋を定量化するステップ、ならびに
ｄ．ＮＡＤ＋の量が、前記阻害剤候補を含有しない対照混合物のＮＡＤ＋量より多い場合、前記阻害剤候補の化合物をＮＡＤアーゼ阻害剤として同定するステップ
を含む、方法。
【請求項１４１】
ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法であって、
ａ）ｉ）構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する全長ＳＡＲＭ１、ｉｉ）ＮＡＤ＋およびｉｉｉ）阻害剤候補を含む混合物を提供するステップであって、前記全長ＳＡＲＭ１が構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する、ステップ、
ｂ）前記混合物をインキュベートするステップ、
ｃ）前記インキュベート後の前記混合物中のＮＡＤ＋および少なくとも１つのＮＡＤアーゼ切断生成物を定量化するステップ、ならびに
ｄ）前記少なくとも１つのＮＡＤアーゼ切断生成物に対するＮＡＤ＋のモル比が、前記阻害剤候補を含有しない対照混合物のモル比より高い場合、前記阻害剤候補の化合物をＮＡＤアーゼ阻害剤として同定するステップ
を含む、方法。
【請求項１４２】
前記少なくとも１つのＮＡＤアーゼ切断生成物がＡＤＰＲである、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記少なくとも１つのＮＡＤアーゼ切断生成物がＮａｍである、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４４】
前記ＮＡＤ＋を定量化するステップが、ＨＰＬＣ分析を行うことを含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４５】
ＳＡＲＭ１  Ｎ末端自己阻害ドメインの少なくとも機能的断片、１つまたは複数のＳＡＭドメインの少なくとも機能的断片、およびＳＡＲＭ１  ＴＩＲドメインの少なくとも機能的断片を含み、ミトコンドリア標的化配列を欠いている、ＳＡＲＭ１ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年９月２４日に出願された米国仮出願第６２／３９９，３３９号、２０１７年３月２０日に出願された米国仮出願第６２／４７３，８０５号、２０１７年３月２０日に出願された米国仮出願第６２／４７３，９１６号および２０１７年３月２０日に出願された米国仮出願第６２／４７３，９２１号（これらの各々は、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本出願は、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害および／あるいは神経変性疾患もしくは障害または神経学的疾患もしくは障害の治療のために有用な様々な化合物および組成物、および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
軸索変性は、末梢性ニューロパチー、外傷性脳損傷、および神経変性疾患などのいくつもの神経学的障害の特徴である（Gerdtsら、SARM1  activation  triggers  axon  degeneration  locally  via  NAD(+)  destruction.、Science  ３４８巻、２０１６年、４５３〜４５７頁；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症において、軸索変性は初期の事象であり、症状の発症および広範なニューロン喪失に先立つ（Kurowskaら、２０１７年；Fischerら、Axonal  degeneration  in  motor  neuron  disease、Neurodegener.  Dis.  ４巻、２００７年、４３１〜４４２頁；これらの両方は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇｅｒｄｔｓら、ＳＡＲＭ１  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ａｘｏｎ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｌｏｃａｌｌｙ  ｖｉａ  ＮＡＤ（＋）  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１６年）３４８巻４５３〜４５７頁
【非特許文献２】Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ａｘｏｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ、Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ．Ｄｉｓ．（２００７年）４巻４３１〜４４２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一部の実施形態では、本開示は、軸索変性または軸索障害を伴う多くの神経学的障害の治療標的としての酵素を提供する。
【０００６】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＭ１阻害剤を同定し、および／または特徴付けるためのアッセイを提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＭ１  Ｎ末端自己阻害ドメインが欠失したＳＡＭ−ＴＩＲの他に、ＴＩＲドメインのタグ付きバージョンなどの、これらのアッセイにおいて使用するためのある特定のベクター構築物およびポリペプチドを提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤をスクリーニングするために使用されるポリペプチドおよび固体支持体を含む組成物を提供する。
【０００７】
一部の実施形態では、本開示は、軸索変性、軸索障害、ならびに軸索変性を伴う神経学的疾患および障害を治療し、予防しまたは改善するためにＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を使用する方法を提供する。一部の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼの阻害剤を提供する。一部のそのような実施形態では、そのような化合物は、ＮＡＤの低減または枯渇の結果としてもたらされる軸索変性などの軸索変性を阻害する。一部の実施形態では、本開示は、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（ＮＨＤ）がＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤として有用であるという認識を包含する。
【０００８】
一部の実施形態では、本開示は、軸索変性に関連するニューロパチーまたは軸索障害を治療する方法を提供する。一部のそのような実施形態では、軸索変性に関連するニューロパチーまたは軸索障害は、遺伝性または先天性のニューロパチーまたは軸索障害から選択される。一部の実施形態では、軸索変性に関連するニューロパチーまたは軸索障害は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ヘルペス感染症、糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、脱髄疾患、虚血または卒中、化学的損傷、熱損傷、およびＡＩＤＳから選択されるまたはそれに関連する。一部の実施形態では、軸索変性に関連するニューロパチーまたは軸索障害は、パーキンソン病または非パーキンソン病(non-Parkinson’s  disease)、およびアルツハイマー病から選択される。
【０００９】
本開示の化合物、およびその薬学的に許容される組成物は、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤として有効であることが分かった。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤は、一般式ＩＡまたは式ＩＢ：
【化１】
2019535804.tif 000002
またはその薬学的に許容される塩を有し、各変数は本明細書で定義および説明される。
【００１０】
一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤は、一般式ＩＣまたは式ＩＤ：
【化２】
2019535804.tif 000003
またはその薬学的に許容される塩を有し、各変数は本明細書で定義および説明される。
【００１１】
一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤は、
【化３】
2019535804.tif 000004
【化４】
2019535804.tif 000005
【化５】
2019535804.tif 000006
【化６】
2019535804.tif 000007
またはその薬学的に許容される塩から選択される。
【００１２】
本開示の化合物、およびその薬学的に許容される組成物は、様々な疾患、障害または状態を治療するために有用である。そのような疾患、障害、または状態としては、本明細書に記載されるものが挙げられる。
【００１３】
本開示によって提供される化合物はまた、生物学的および病的現象におけるＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の研究、脂質生成組織において生じる細胞内シグナル伝達経路の研究、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの新たなＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性阻害剤の比較評価のためにも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＳＡＲＭ１タンパク質の構造を説明する。
【００１５】
【図２−１】図２Ａ〜Ｆは、天然のＳＡＲＭ１−ＴＩＲタンパク質複合体がｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＮＡＤ＋を切断することを示す。図２Ａは、ＮＡＤ＋の合成および分解の選択された経路を示す。図２Ｂは、ＮＡＤアーゼ活性およびその阻害を検出するための手順を示す。図２Ｃは、ＳｔｒｅｐＴａｇ−ｈＳＡＲＭ１−ＴＩＲのＮＡＤアーゼ活性を示す。図２Ｄは、野生型ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ複合体がＮａＡＤを分解しないことを示す。図２Ｅは、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  ＮＡＤアーゼアッセイにおけるヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲ  Ｇ６０１Ｐ、ＴＬＲ４−ＴＩＲ、およびＭｙＤ８８−ＴＩＲ担持ビーズのＮＡＤ＋の反応の時間経過を示す（０分での対照に対して正規化）。図２Ｆは、アッセイにおいて使用されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲ  Ｇ６０１Ｐ、ＴＬＲ４−ＴＩＲ、およびＭｙＤ８８−ＴＩＲ担持ビーズの代表的なＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙゲルを示す。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【００１６】
【図３】図３は、ＮＲの添加を伴うＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ安定株がＳＡＲＭ１−ＴＩＲ発現時により高いＮＡＤ＋レベルを維持することを示す。
【００１７】
【図４−１】図４Ａ〜Ｅは、ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲを含む細胞溶解物によるＮＡＤ＋の切断を示す。図４Ａは、ＡＤＰＲ、ＮＡＭ＋およびＮＡＤ＋のレベルの経時的な変化を示すＨＰＬＣトレースを示す。図４Ｂは、ＮＡＤアーゼ活性が対照溶解物では呈されないことを示すＨＰＬＣトレースを示す。図４Ｃは、図４ＡのＨＰＬＣトレースのＮＡＤ＋およびＡＤＰＲの定量的な値を示す。図４Ｄは、ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物によるＮＡＤ＋の用量依存的な切断を示す。図４Ｅは、ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物および対照によるＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ比の定量化を示す。
【図４−２】同上。
【図４−３】同上。
【００１８】
【図５】図５Ａ〜Ｂは、ＮＣＩ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＶ化合物ライブラリーからのＳＡＭ−ＴＩＲ  ＮＡＤアーゼ阻害剤候補のスクリーニングを示す。図５Ａは、ＮＣＩ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＶ化合物ライブラリーからの１６００個全ての化合物の一次スクリーニングを示す。図５Ｂは、一次スクリーニングからの２０個のポジティブ「ヒット」の再試験を示す。
【００１９】
【図６−１】図６Ａ〜Ｃは、ＳＡＭ  ＴＩＲ  ＮＡＤアーゼ活性を抑制する１８個の化合物の構造を示す。ＮＳＣ番号を示している。
【図６−２】同上。
【００２０】
【図７−１】図７Ａ〜Ｄは、ＳＡＭ−ＴＩＲ  ＮＡＤアーゼ阻害剤の追加のスクリーニングアッセイとしてのＮＡＤ＋サイクリングアッセイを示す。図７Ａは、ＮＡＤ＋  Ｇｌｏアッセイによる決定で、ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物（ＳＴＬ）はＮＡＤ＋を減少させるが、対照（ｃｏｎ）溶解物は減少させないことを示す。図７Ｂは、アッセイの頑強性を示す。図７Ｃは、初期ＨＰＬＣアッセイにおいて同定されたほとんどのヒット（１４／１８）が、ＮＡＤ＋−ＧｌｏアッセイにおいてＳＡＭ−ＴＩＲ  ＮＡＤアーゼ活性の有意な阻害を示したことを示す。
【図７−２】同上。
【００２１】
図７Ｄは、２つの化合物のＮＡＤアーゼ阻害活性を示す。
【００２２】
【図８】図８は、細菌から発現および精製されたＳＡＲＭ１  ＴＩＲタンパク質によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＡＤ＋の切断を示す。
【００２３】
【図９】図９は、ｗｔの軸索において軸索切断後にＮＡＤ＋消費速度が増加することを示す。
【００２４】
【図１０−１】図１０Ａ〜Ｃは、軸索変性に対する阻害剤候補の効果を示す。図１０Ａは、軸索変性指数（axon  degeneration  index）に対する化合物の効果の試験を示す。図１０Ｂは、軸索変性に対する化合物ＮＳＣ６２２６０８の予防効果を示す。図１０Ｃは、化合物ＮＳＣ６２２６０８による軸索変性の用量依存的な阻害を示す。
【図１０−２】同上。
【００２５】
【図１１−１】図１１Ａ〜Ｇは、ＮＡＤ＋切断酵素活性がＳＡＲＭ１−ＴＩＲに内因性であることを示す。図１１Ａは、ヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲのＩＰＴＧ誘導後の細菌中の内因性ＮＡＤ＋レベルを示す。図１１Ｂは、細菌から発現および精製されたヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲタンパク質によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＡＤ＋切断反応を示す。図１１Ｃは、細菌により発現されたマウスおよびゼブラフィッシュＳＡＲＭ１−ＴＩＲタンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＮＡＤ＋を切断することを示す。図１１Ｄは、ＮＡＤアーゼアッセイにおいて使用された細菌から精製されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲ担持ビーズのＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙゲルを示す。図１１Ｅは、ＴＡＰにより精製され、精製中に１Ｍおよび２Ｍ  ＮａＣｌでの洗浄に供された細菌により合成されたヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲを使用するＮＡＤ＋切断反応の時間経過を示す（０分での対照に対して正規化）。図１１Ｆは、ＴＡＰにより精製され、精製中に０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００または０．５％  Ｔｗｅｅｎ−２０での洗浄に供された細菌により合成されたヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲを使用するＮＡＤ＋切断反応の時間経過を示す（０分での対照に対して正規化）。図１１Ｇは、ＮＡＤ＋および非組換えプラスミドとインキュベートした無細胞タンパク質転写／翻訳システムの精製された成分の反応時間経過を示す。
【図１１−２】同上。
【図１１−３】同上。
【００２６】
【図１２−１】図１２Ａ〜Ｍは、ＳＡＲＭ１−ＴＩＲのＮＡＤ＋切断反応の特徴付けを示す。図１２Ａ〜１２Ｅは、ヒトおよびショウジョウバエＳＡＲＭ１−ＴＩＲのＮＡＤ＋切断生成物を示すＨＰＬＣクロマトグラムを描写する。保持時間：Ｎａｍ  ｔ  約２．４０分；ｃＡＤＰＲ  ｔ  約０．８５分；ＡＤＰＲ  ｔ  約１．１０分。図１２Ｆ〜１２Ｇは、図１２Ａ〜Ｅに示される図１２Ｆではヒト、図１２ＧではショウジョウバエのＳＡＲＭ１−ＴＩＲにより生成された代謝物の定量化を示す（０分のＮＡＤ＋に対して正規化）。図１２Ｈは、マウスおよびゼブラフィッシュＳＡＲＭ１−ＴＩＲのＮＡＤ＋切断反応が主生成物としてＮａｍおよびＡＤＰＲ、微量生成物としてｃＡＤＰＲを生成することを示すＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図１２Ｉは、ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ酵素の動態アッセイが飽和動態を明らかにしたことを示す。図１２Ｊは、ＡＤＰＲがＳＡＲＭ１−ＴＩＲのＮＡＤアーゼ活性を阻害しないことを示す。図１２Ｋは、ＮａｍがＳＡＲＭ１−ＴＩＲの酵素活性を阻害することを示す。図１２Ｌは、ＳＡＲＭ１−ＴＩＲの酵素活性のＮａｍ用量応答阻害を示す。図１２Ｍは、ＳＡＲＭ１が軸索のＮＡＤアーゼであることを示す。
【図１２−２】同上。
【図１２−３】同上。
【図１２−４】同上。
【図１２−５】同上。
【図１２−６】同上。
【００２７】
【図１３】図１３は、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（ＮＨＤ）がＳＡＲＭ１  ＴＩＲによるＮＡＤ＋の切断を阻害することを示す。
【００２８】
【図１４】図１４は、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（ＮＨＤ）がＳＡＲＭ１  ＴＩＲ酵素の基質であることを示す。
【００２９】
【図１５】図１５は、表１、実施例７に表される候補アナログの化学構造を示す。
【００３０】
【図１６】図１６は、ＭｉｌＢシチジン５’一リン酸（ＣＭＰ）加水分解酵素とのＳＡＲＭ１−ＴＩＲのアミノ酸配列アラインメントを示す。ＣＭＰ触媒性グルタミン酸を赤い枠で強調し、これはＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメイン中のグルタミン酸６４２にアラインメントしている。
【００３１】
【図１７】図１７は、ＣＭＰに結合したＣＭＰ加水分解酵素の結晶構造上のＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインのモデル化を示す。Ｅ６４２は、ＣＭＰ加水分解酵素の触媒性残基とアラインメントしている。
【００３２】
【図１８】図１８は、無細胞タンパク質翻訳システムから精製されたヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲ  Ｅ６４２ＡのＮＡＤ＋の反応の時間経過を示す（０分での対照に対して正規化）。
【００３３】
【図１９】図１９は、無細胞タンパク質翻訳システムから精製されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲ  Ｅ６４２ＡのＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙゲルを示す。
【００３４】
【図２０】図２０は、ＤＲＧ軸索中の示した構築物のＶｅｎｕｓ発現を示し、各視野について全軸索区画を評価するためにＴｕｊ１について共染色している。
【００３５】
【図２１】図２１は、ＤＲＧ細胞体中の示した構築物のＶｅｎｕｓ発現を示し、各視野において全核を評価するためにヘキストで共染色している。
【００３６】
【図２２】図２２は、軸索切断後の軸索のＮＡＤ＋レベルを示す（０時間での対照に対して正規化）。ＮＣベクター、ＳＡＲＭ１  ＷＴ、およびＳＡＲＭ１  Ｅ６４２Ａ構築物をＳＡＲＭ１−／−ＤＲＧニューロン中で発現させ、軸索切断後の示した時点にＮＡＤ＋のレベルを得た。
【００３７】
【図２３】図２３は、変性指数（ＤＩ）として定量化した、軸索切断後の軸索変性の時間経過を示し、０．３５（点線により指し示す）またはそれより高いＤＩは変性した軸索を表す。
【００３８】
【図２４】図２４は、図２３に表す示した構築物を発現する軸索の明視野顕微鏡写真を示す。
【００３９】
【図２５】図２５は、ＤＩとして定量化した、ビンクリスチン処理後の軸索変性の時間経過を示す。定量化データは、少なくとも３つの独立した生物学的実験から生成した。データを平均±ＳＥＭとして表す；エラーバー：ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、
【００４０】
＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析。
【００４１】
【図２６】図２６は、図２５における選択された群に対応するビンクリスチン処理後の軸索の明視野顕微鏡写真を示す。スケールバー、５μｍ。
【００４２】
【図２７】図２７は、ＮＡＤ＋消費酵素としてＳＡＲＭ１を含むＮＡＤ＋の合成および分解の選択された経路を示す。
【００４３】
【図２８】図２８は、プロトンポンプ阻害剤ファミリーのメンバーによるＳＡＲＭ１−ＴＩＲのＮＡＤアーゼの阻害を示す。
【００４４】
【図２９】図２９は、ＳＡＲＭ１−ＴＩＲのＮＡＤアーゼ活性のラベプラゾール阻害の用量応答曲線を示す。
【００４５】
【図３０】図３０は、無細胞タンパク質発現システムの概略図を示す。
【００４６】
【図３１】図３１は、無細胞タンパク質発現システムから精製されたヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲがＮＡＤアーゼアッセイにおいてＮＡＤ＋を切断することを示す。
【００４７】
【図３２】図３２は、無細胞転写／翻訳システムから精製されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲ担持ビーズのＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙゲルを示す。
【００４８】
【図３３】図３３Ａおよび図３３Ｂは、化合物ＩＡ−２、ＩＡ−３、ＩＡ−６およびＩＡ−８によるＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性阻害の用量曲線を描写し、図３３ＡはＮＡＤ消費についての対照の％を示し、図３３ＢはＡＤＰＲ生成についての対照の％を示す。
【００４９】
【図３４】図３４は、化合物ＩＢ−１およびＩＢ−２によるＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性阻害の用量曲線を描写する。
【００５０】
【図３５】図３５は、０時間、６時間、１２時間および２４時間の間隔での化合物ＩＢ−２による軸索変性の予防を描写する。
【００５１】
【図３６】図３６Ａおよび図３６Ｂは、化合物ＩＢ−２への曝露のあり（図３６Ａ）およびなし（図３６Ｂ）の変性条件下での損傷した軸索のＳＥＭ顕微鏡写真を描写する。
【００５２】
【図３７−１】図３７Ａ〜３７Ｄは、全長ＳＡＲＭ１のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を描写する。図３７Ａは、ＳＡＲＭ１のドメインおよび損傷後のＴＩＲ１ドメインの二量体化などの変化を示す概略図である。ＡｘＤ＝軸索変性。図３７Ｂは、ＡＤＰＲ、ＮＡＭおよびＮＡＤのレベルを示すＨＰＬＣトレースを示す。図３７Ｃは、活性ＳＡＲＭ１変異体（ＳＡＭ−ＴＩＲ）のＮＡＤアーゼ活性に対する全長ＳＡＲＭ１の相対的なＮＡＤアーゼ活性を示す。図３７Ｄは、触媒として不活性な変異体（ＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１（Ｅ６４２Ａ））のＮＡＤアーゼ活性に対する全長ＳＡＲＭ１の相対的なＮＡＤアーゼ活性を示す。
【図３７−２】同上。
【図３７−３】同上。
【図３７−４】同上。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
Ｔｏｌｌ／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメインは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、およびそれらの細胞質アダプタータンパク質中に存在する進化的に保存されたタンパク質ドメインであり、スキャフォールドドメインとして、先天免疫シグナル伝達を促進して侵入病原体から宿主を保護する（O'Neill,  L.A.ら、Nat.  Rev.  Immunol.、２０１３年、１３巻、４５３〜４６０頁）。ステライルアルファおよびＴＩＲモチーフ含有１（Ｓｔｅｒｉｌｅ  Ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ＴＩＲ  ｍｏｔｉｆ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １）（ＳＡＲＭ１）は細胞質アダプタータンパク質のファミリーに属するが、進化的に最も古いアダプターであり、逆説的にＴＬＲシグナル伝達を阻害し、損傷誘導性軸索死経路の中心的実行因子として最近同定されたことから、該ファミリーのメンバーの中で独特である（O'Neill,  L.A.およびBowie,  A.G.、Nat.  Rev.  Immunol.、２００７年、７巻、３５３〜３６４頁；Osterloh,  J.M.ら、Science、２０１２年、３３７巻、４８１〜４８４頁；Gerdts,  J.ら、J.  Neurosci.  ３３巻、２０１３年、１３５６９〜１３５８０頁）。軸索損傷によるまたはＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインの強制的な二量体化によるＳＡＲＭ１の活性化は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の迅速かつ破局的な枯渇を促進し、軸索の死がその後間もなく起こる（Gerdts,  J.ら、Science、２０１５年、３４８巻、４５３〜４５７頁）。このプロセスの背景にあるＮＡＤ＋を枯渇させる酵素を同定しようとする以前の試みは不成功であった（Gerdts,  J.ら、Science、２０１５年、３４８巻、４５３〜４５７頁）。さらに、ＳＡＲＭ１および他のタンパク質からのＴＩＲドメインのいずれも公知の酵素活性を有しない。
【００５４】
アポトーシスのような伝統的な細胞死経路とは別個の内因性の自己破壊プログラムを介して、傷害を受けたまたは健常でない軸索が排除される（Gerdts,  J.ら、Neuron、２０１６年、８９巻、４４９〜４６０頁；Whitmore,  A.V.ら、Cell  Death  Differ.、２００３年、１０巻、２６０〜２６１頁）。軸索変性は、以下に限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＡＬＳ、多発性硬化症、糖尿病性末梢性ニューロパチー、化学療法誘導性末梢性ニューロパチー、遺伝性ニューロパチー、外傷性脳損傷、および緑内障などのいくつもの神経学的疾患の主な構成要素である。変性促進遺伝子の中で、ＳＡＲＭ１は変性プログラムの中心的な実行因子である。ＳＡＲＭ１の喪失は、損傷後何週にもわたって軸索変性を阻止し（Osterloh,  J.M.ら、Science、２０１２年、３３７巻、４８１〜４８４頁；Gerdts,  J.ら、J.  Neurosci.、２０１３年、３３巻、１３５６９〜１３５８０頁）、また外傷性脳損傷後のマウスにおいて機能的転帰を改善させる（Henninger,  N.ら、Brain  １３９巻、２０１６年、１０９４〜１１０５頁）。ＳＡＲＭ１はまた、化学療法誘導性末梢性ニューロパチーにおける軸索変性のためにも必要とされ、ＳＡＲＭ１の喪失は化学療法誘導性末梢性ニューロパチーの発症を阻止し、軸索変性、および化学療法剤ビンクリスチンでの治療後の疼痛感受性の高まりの発生の両方を停止させる（Geislerら、Brain、２０１６年、１３９巻、３０９２〜３１０８頁）。他方、ＳＡＲＭ１の活性化は、損傷なしで軸索変性を誘導するのに十分である（Gerdts,  J.ら、Science、２０１５年、３４８巻、４５３〜４５７頁）。ＳＡＲＭ１はまた、化学療法誘導性末梢性ニューロパチーにおける軸索変性のためにも必要とされる。
【００５５】
ＳＡＲＭ１の活性化は、ＮＡＤ＋の破局的な枯渇に至り（Gerdts,  J.ら、Science、２０１５年、３４８巻、４５３〜４５７頁）、したがって、ＮＭＮＡＴ１での研究によって最初に暗示されたように、軸索の完全性におけるＮＡＤ＋ホメオスタシスの中心的役割を強調する。
【００５６】
これらの進歩にもかかわらず、傷害を受けた軸索におけるＮＡＤ＋の破綻の背景にある酵素は依然として未知である。
【００５７】
ＳＡＲＭ１は、オリゴマー化およびタンパク質−タンパク質相互作用を媒介するＳＡＭドメイン、ＡＲＭ／ＨＥＡＴモチーフおよびＴＩＲドメイン（図１）などの複数の保存されたモチーフを含有する（O'Neill,  L.A.およびBowie,  A.G.、Nat.  Rev.  Immunol.、２００７年、７巻、３５３〜３６４頁；Tewari,  R.ら、Trends  Cell  Biol.、２０１０年、２０巻、４７０〜４８１頁；Qiao,  F.およびBowie,  J.U.、Sci.  STKE  2005、ｒｅ７、２００５年）。ＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインの二量体化は、軸索変性を誘導するため、およびＮＡＤ＋の分解を迅速に誘発するために十分であり、これは、ＮＡＤアーゼ活性は、二量体化ＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインに関連しまたはそれによって誘導されることを実証する。ＴＩＲドメインは、自然免疫経路において機能するシグナル伝達タンパク質においてよく見られ、該経路においてそれらはタンパク質複合体のための足場として働く（O'Neill,  L.A.およびBowie,  A.G.、Nat.  Rev.  Immunol.、２００７年、７巻、３５３〜３６４頁）。
【００５８】
いくつものグループが、ＮＡＤ＋およびＡＤＰリボース（ＡＤＰＲ）などの代謝物を以前に測定している（例えば、Hasan,  M.A.ら、Korean  J.  Physiol.  Pharmacol.、２０１４年、１８巻、４９７〜５０２頁；Breen,  L.T.ら、Am.  J.  Physiol.  Renal.  Physiol.、２００６年、２９０巻、Ｆ４８６〜Ｆ４９５頁；およびLi,  P.L.ら、Am.  J.  Physiol.  Heart  Circ.  Physiol.、２００２年、２８２巻、Ｈ１２２９〜Ｈ１２２３６頁）。しかしながら、これらのグループのいずれも、それをＳＡＲＭ１活性との関連で具体的に行っていない。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＤＰＲはｃＡＤＰＲ、例えばサイクリックＡＤＰＲである。
【００５９】
ＳＡＲＭ１の喪失は、損傷後何週にもわたって軸索変性を阻止し（Gerdtsら、Sarm1-mediated  axon  degeneration  requires  both  SAM  and  TIR  interactions、J.  Neurosci.  ３３巻、２０１３年、１３５６９〜１３５８０頁；Osterlohら、２０１２年；これらの両方は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）、また外傷性脳損傷後（Henningerら、２０１６年）およびビンクリスチン誘導性末梢性ニューロパチー後（Geislerら、２０１６年）の両方のマウスにおいて機能的転帰を改善させる。軸索損傷はＮＡＤ＋の喪失を誘導し（Wangら、２００５年）、ＳＡＲＭ１はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方でのこの損傷誘導性のＮＡＤ＋の枯渇のために必要とされる（Gerdtsら、SARM1  activation  triggers  axon  degeneration  locally  via  NAD(+)  destruction、Science  ３４８巻、２０１５年、４５３〜４５７頁；Sasakiら、２０１６年；これらの両方は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、そのＴＩＲドメインの強制的な二量体化を介したＳＡＲＭ１シグナル伝達の活性化は、軸索のＮＡＤ＋の破局的な枯渇による損傷なしで軸索変性を誘導するのに十分である（Gerdtsら、SARM1  activation  triggers  axon  degeneration  locally  via  NAD(+)  destruction、Science  ３４８巻、２０１５年、４５３〜４５７頁）。
【００６０】
ＮＡＤ＋は多くの酸化還元反応に必須のジヌクレオチドであるが、様々な酵素（例えば、ＰＡＲＰ、ＣＤ３８、サーチュイン）によっても消費され、結果として生じる代謝物は、カルシウム動員またはタンパク質のポリＡＤＰリボシル化（parylation）に対するそれらの効果を介してシグナル伝達経路に影響を及ぼす（Cantoら、２０１５年；Verdin、２０１５年）。損傷した軸索においてＳＡＲＭ１活性化に応答し、ＮＡＤ＋の喪失を媒介するＮＡＤアーゼ酵素の正体は未知であるが、ＰＡＲＰ１およびＣＤ３８は以前に候補としては排除された（Gerdtsら、２０１５年；Sasakiら、２００９年）。さらに、ＳＡＲＭ１は酵素活性を有することは公知でなく、いずれのタンパク質からのＴＩＲドメインも酵素活性に関連付けられていない。ＴＩＲドメインはむしろ、Ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達におけるスキャフォールド特性が公知であり、下流酵素を活性化して炎症促進性および防御遺伝子を調節する（O’Neillら、２０１３年）。
【００６１】
驚くべきことに、ＳＡＲＭ１のＴＩＲドメインがＮＡＤ＋を切断する酵素として作用すること、およびＳＡＲＭ１の酵素活性が外傷性およびビンクリスチン誘導性の両方の軸索損傷後に軸索のＮＡＤ＋の枯渇および軸索変性を促進することが分かった。本明細書で提示されるこれらの知見は、末梢性ニューロパチー、外傷性脳損傷、および神経変性疾患などの軸索変性によって特徴付けられる疾患に対する新規の治療標的としてＳＡＲＭ１の酵素活性を同定する。より広範には、本明細書で提示される知見は、ＴＩＲドメインが内因性の酵素活性を持ち得ることを示す。
【００６２】
１．本開示の化合物の概要：
ある特定の実施形態では、本開示は、式ＩＡ：
【化７】
2019535804.tif 000008
の化合物またはその薬学的に許容される塩（式中、
ＸＡは、−Ｓ−、−ＳＯ−または−ＳＯ２−であり、
Ｒ１Ａは、水素、Ｃ１〜４脂肪族、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムまたはＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４であり、
環ＡＡは、ベンゾ縮合環、ならびに窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する５〜６員の複素環式芳香族縮合環から選択され、
環ＢＡは、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環から選択され、
ＲＸＡおよびＲＹＡは、独立して、水素、１〜４個のハロゲンにより任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族、−ＯＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＡ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｓ（Ｏ）２ＲＡ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＡ）２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−Ｓ（Ｏ）２ＲＡ、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環であり、
各ＲＡは、独立して、水素であるか、またはＣ１〜６脂肪族、３〜８員の飽和または部分不飽和の単環式炭素環、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環から選択される任意選択で置換された基であり、
ｍＡおよびｎＡは、独立して、０、１、２、または３である）
を提供する。
【００６３】
ある特定の実施形態では、本開示は、式ＩＢ：
【化８】
2019535804.tif 000009
の化合物またはその薬学的に許容される塩（式中、
Ｘ１ＢおよびＸ２Ｂは、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＲＢ−であり、但し、Ｘ１ＢおよびＸ２Ｂの１つは−Ｏ−または−Ｓ−であり、Ｘ１ＢおよびＸ２Ｂの両方が−Ｏ−であることはなく、
ＹＢは−Ｎ−または−ＣＨ−であり、
各Ｒ１Ｂは、独立して、水素または任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族であり、
環ＡＢは、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環から選択され、
各ＲＸＢは、独立して、水素、ハロゲンであるか、またはＣ１〜６脂肪族、３〜８員の飽和または部分不飽和の単環式炭素環、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環から選択される任意選択で置換された基であり、
各ＲＢは、独立して、水素であるか、またはＣ１〜６脂肪族、３〜８員の飽和または部分不飽和の単環式炭素環、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環から選択される任意選択で置換された基であり、
ＬＢは、共有結合、Ｃ１〜６員の直鎖もしくは分岐鎖の二価の炭化水素鎖、シクロプロピレニル、シクロブチレニル、またはオキセタニレニルであり、
ｎＢは、０、１、２、３または４である）
を提供する。
【００６４】
２．化合物および定義：
本開示の化合物は、上記に一般的に記載される化合物を含み、さらに本明細書に開示されるクラス、サブクラス、および種によって示される。本明細書で使用される場合、特に指示がない限り以下の定義が適用される。本開示の目的のために、化学元素は、Handbook  of  Chemistry  and  Physics、第７５版中のＣＡＳ方式の元素周期表に従って特定される。さらに、有機化学の一般原則は、「Organic  Chemistry」、Thomas  Sorrell、University  Science  Books、Sausalito：１９９９年、ならびに「March's  Advanced  Organic  Chemistry」、第５版、Smith,  M.B.およびMarch,  J.編、John  Wiley  &  Sons、New  York：２００１年（これらの内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「脂肪族」または「脂肪族基」という用語は、直鎖（すなわち、非分岐）または分岐鎖の、置換または非置換の、完全飽和であるかまたは１つもしくは複数の不飽和単位を含有する炭化水素鎖であるか、または完全飽和であるかまたは１つもしくは複数の不飽和単位を含有するが、芳香族ではない単環式炭化水素または二環式炭化水素（本明細書において「炭素環」、「脂環式」、または「シクロアルキル」とも称する）であって、分子の残部への単一の結合点を有するものを意味する。別段の指定がない限り、脂肪族基は、１〜６個の脂肪族炭素原子を含有する。一部の実施形態では、脂肪族基は、１〜５個の脂肪族炭素原子を含有する。他の実施形態では、脂肪族基は、１〜４個の脂肪族炭素原子を含有する。また他の実施形態では、脂肪族基は、１〜３個の脂肪族炭素原子を含有し、さらに他の実施形態では、脂肪族基は、１〜２個の脂肪族炭素原子を含有する。一部の実施形態では、「脂環式」（または「炭素環」もしくは「シクロアルキル」）は、完全飽和であるかまたは１つもしくは複数の不飽和単位を含有するが、芳香族ではなく、分子の残部への単一の結合点を有する単環式Ｃ３〜Ｃ６炭化水素を指す。好適な脂肪族基としては、直鎖または分岐鎖の、置換または非置換の、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびこれらのハイブリッド（（シクロアルキル）アルキル、（シクロアルケニル）アルキルまたは（シクロアルキル）アルケニルなど）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、直鎖（すなわち、非分岐）または分岐鎖の、置換または非置換の、完全飽和の炭化水素鎖、または完全飽和の単環式炭化水素もしくは二環式炭化水素（本明細書において「シクロアルキル」とも称する）であって、分子の残部への単一の結合点を有するものを指す。別段の指定がない限り、アルキル基は、１〜６個の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、アルキル基は、１〜５個の炭素原子を含有する。他の実施形態では、アルキル基は、１〜４個の炭素原子を含有する。また他の実施形態では、アルキル基は、１〜３個の炭素原子を含有し、さらに他の実施形態では、アルキル基は、１〜２個の炭素原子を含有する。一部の実施形態では、「シクロアルキル」は、完全飽和の単環式Ｃ３〜Ｃ６炭化水素であって、分子の残部への単一の結合点を有するものを指す。
【００６７】
「低級アルキル」という用語は、Ｃ１〜４の直鎖または分岐鎖のアルキル基を指す。例示的な低級アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルである。
【００６８】
「低級ハロアルキル」という用語は、１つまたは複数のハロゲン原子で置換されたＣ１〜４の直鎖または分岐鎖のアルキル基を指す。
【００６９】
「ヘテロ原子」という用語は、酸素、硫黄、窒素、リン、またはケイ素（窒素、硫黄、リン、またはケイ素の任意の酸化形態、任意の塩基性窒素の四級化形態であるか、または複素環式環の置換可能な窒素、例えば、Ｎ（例えば３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリルの場合）、ＮＨ（例えばピロリジニルの場合）、またはＮＲ＋（例えばＮ置換ピロリジニルの場合）を含む）の１つまたは複数を意味する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「不飽和」という用語は、ある部分が１つまたは複数の不飽和単位を有することを意味する。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「二価のＣ１〜８（またはＣ１〜６）の飽和または不飽和の、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖」という用語は、本明細書において定義される、直鎖または分岐鎖の、二価のアルキレン鎖、アルケニレン鎖、およびアルキニレン鎖を指す。
【００７２】
「アルキレン」という用語は二価のアルキル基を指す。「アルキレン鎖」は、ポリメチレン基、すなわち−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｎは正の整数、好ましくは１〜６、１〜４、１〜３、１〜２、または２〜３である。置換アルキレン鎖は１つまたは複数のメチレン水素原子が置換基で置き換えられているポリメチレン基である。好適な置換基としては、置換脂肪族基について下記に記載するものが挙げられる。
【００７３】
「アルケニレン」という用語は二価のアルケニル基を指す。置換アルケニレン鎖は、少なくとも１つの二重結合を含有し、１つまたは複数の水素原子が置換基で置き換えられているポリメチレン基である。好適な置換基としては置換脂肪族基について下記に記載するものが挙げられる。
【００７４】
「ハロゲン」という用語は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩを意味する。
【００７５】
単独で、または「アラルキル」、「アラルコキシ」、もしくは「アリールオキシアルキル」の場合のようにより大きい部分の一部として使用される「アリール」という用語は、合計で５〜１４個の環員を有し、その系内の少なくとも１つの環が芳香族であり、その系内の各環が３〜７個の環員を含有する、単環式または二環式の環系を指す。「アリール」という用語は、「アリール環」という用語と交換可能に使用されることがある。一部の実施形態では、「アリール」という用語は、合計で５〜１０個の環員を有する単環式または二環式環系であって、系中の少なくとも１つの環が芳香族であり、系中の各環が３〜７個の環員を含有するものを指す。本開示のある特定の実施形態では、「アリール」は芳香族環系を指し、これにはフェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラシルなどが含まれるがこれらに限定されず、１つまたは複数の置換基を有していてもよい。本明細書で使用される場合、「アリール」という用語の範囲には、芳香族環が１つまたは複数の非芳香族環に縮合している基、例えば、インダニル、フタルイミジル、ナフトイミジル、フェナントリジニル、またはテトラヒドロナフチルなども含まれる。
【００７６】
単独で、またはより大きい部分、例えば、「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアラルコキシ」の一部として使用される「ヘテロアリール」および「ヘテロアラ−（ｈｅｔｅｒｏａｒ−）」という用語は、５〜１０個の環原子、好ましくは５個、６個、または９個の環原子を有し、環状配置で共有された６個、１０個、または１４個のπ電子を有し、炭素原子に加えて、窒素、酸素および硫黄から選択される１〜５個のヘテロ原子を有する基を指す。例えば、ヘテロアリールは、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環を指すことがある。ヘテロアリール基としては、以下に限定されないが、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、およびプテリジニルが挙げられる。本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」および「ヘテロアラ−」という用語はまた、複素環式芳香族環が１つまたは複数のアリール環、脂環式環、またはヘテロシクリル環に縮合しており、そのラジカルまたは結合点がその複素環式芳香族環上にある、基を含む。非限定的な例としては、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、４Ｈ−キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、およびピリド［２，３−ｂ］−１，４−オキサジン−３（４Ｈ）−オンが挙げられる。ヘテロアリール基は、単環式であってもよいし、二環式であってもよい。「ヘテロアリール」という用語は、「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」、または「ヘテロ芳香族」という用語と交換可能に使用されることがあり、これらの用語のいずれも、任意選択で置換された環を含む。「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールによって置換されたアルキル基を指し、ここでアルキル部分およびヘテロアリール部分は独立して、任意選択で置換されている。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「複素環」、「ヘテロシクリル」、「複素環式ラジカル」、および「複素環式環」という用語は交換可能に使用され、安定な５〜７員の単環式または７〜１０員の二環式の複素環式部分であって、飽和または部分不飽和のいずれかであり、炭素原子に加えて１つまたは複数の、好ましくは１〜４個の、上で定義されるヘテロ原子を有するものを指す。複素環の環原子に関して使用される場合、「窒素」という用語は置換された窒素を含む。一例としては、酸素、硫黄または窒素から選択される０〜３個のヘテロ原子を有する飽和または部分不飽和の環において、窒素は、Ｎ（例えば３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリルの場合）、ＮＨ（例えばピロリジニルの場合）、または＋ＮＲ（例えばＮ置換ピロリジニルの場合）であり得る。
【００７８】
複素環式環は、そのペンダント基に、安定な構造を結果としてもたらす任意のヘテロ原子または炭素原子において結合することができ、任意の環原子は、任意選択で置換されていてもよい。そのような飽和または部分不飽和の複素環式ラジカルの例としては、以下に限定されないが、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニルピロリジニル、ピペリジニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニル、およびキヌクリジニルが挙げられる。「複素環」、「ヘテロシクリル」、「ヘテロシクリル環」、「複素環式基」、「複素環式部分」、および「複素環式ラジカル」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、そしてまた、ヘテロシクリル環が１つまたは複数のアリール環、ヘテロアリール環、または脂環式環に縮合している基（例えば、インドリニル、３Ｈ−インドリル、クロマニル、フェナントリジニル、またはテトラヒドロキノリニルなどであり、ここでラジカルまたは結合点は、ヘテロシクリル環上にある）を含む。ヘテロシクリル基は、単環式であってもよいし、二環式であってもよい。「ヘテロシクリルアルキル」という用語は、ヘテロシクリルによって置換されたアルキル基を指し、ここでアルキル部分およびヘテロシクリル部分は独立して、任意選択で置換されている。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「測定可能に阻害する」という用語は、提供される化合物または組成物、およびＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼを含む試料と、提供される組成物または組成物なしのＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼを含む同等の試料との間のＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性における測定可能な変化を指す。一部の実施形態では、化合物または組成物は、対照と比べて少なくとも２倍、３倍、４倍、またはそれより大きくＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を「測定可能に阻害する」。一部の実施形態では、化合物または組成物は、対照と比べて少なくとも１０％、２０％、２５％、５０％、７５％またはそれより大きくＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を「測定可能に阻害する」。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「部分不飽和」という用語は、少なくとも１つの二重結合または三重結合を含む環部分を指す。「部分不飽和」という用語は、複数の不飽和部位を有する環を包含することを意図するが、本明細書で定義されるアリール部分またはヘテロアリール部分を含むことは意図しない。
【００８１】
本明細書に記載されるように、本開示の化合物は、「任意選択で置換された」部分を含み得る。一般に、「置換された」という用語は、「任意選択で」という用語が先行しても先行してなくても、指定される部分の１つまたは複数の水素が好適な置換基で置き換えられていることを意味する。特に指示がない限り、「任意選択で置換された」基は、その基の各置換可能な位置において好適な置換基を有してもよく、任意の所与の構造中の１つより多くの位置が特定の基から選択される１つより多くの置換基で置換され得る場合、その置換基はあらゆる位置で同じであってもよいし、異なっていてもよい。本開示によって想定される置換基の組み合わせは、好ましくは、安定なまたは化学的に実現可能な化合物の形成を結果としてもたらす組み合わせである。本明細書で使用される場合、「安定な」という用語は、それらの製造、検出、ある特定の実施形態では、それらの回収、精製、および本明細書に開示される１つまたは複数の目的のための使用を可能にする条件に供された時に、実質的に変化しない化合物を指す。
【００８２】
「任意選択で置換された」基の置換可能な炭素原子上の好適な一価の置換基は、独立して、ハロゲン；−（ＣＨ２）０〜４Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４ＯＲ○；−Ｏ（ＣＨ２）０〜４Ｒ○、−Ｏ−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−（ＣＨ２）０〜４ＣＨ（ＯＲ○）２；−（ＣＨ２）０〜４ＳＲ○；Ｒ○で置換されていてもよい−（ＣＨ２）０〜４Ｐｈ；Ｒ○で置換されていてもよい−（ＣＨ２）０〜４Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ；Ｒ○で置換されていてもよい−ＣＨ＝ＣＨＰｈ；Ｒ○で置換されていてもよい−（ＣＨ２）０〜４Ｏ（ＣＨ２）０〜１−ピリジル；−ＮＯ２；−ＣＮ；−Ｎ３；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒ○）２；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｓ）Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｓ）ＮＲ○２；−（ＣＨ２）０〜４Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｎ（Ｒ○）Ｎ（Ｒ○）Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｃ（Ｓ）Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＯＲ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＳＲ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＯＳｉＲ○３；−（ＣＨ２）０〜４ＯＣ（Ｏ）Ｒ○；−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）０〜４ＳＲ○−；−（ＣＨ２）０〜４ＳＣ（Ｏ）Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｃ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｃ（Ｓ）ＮＲ○２；−Ｃ（Ｓ）ＳＲ○；−ＳＣ（Ｓ）ＳＲ○、−（ＣＨ２）０〜４ＯＣ（Ｏ）ＮＲ○２；−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ○）Ｒ○；−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ○；−Ｃ（ＮＯＲ○）Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４ＳＳＲ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｓ（Ｏ）２Ｒ○；−（ＣＨ２）０〜４Ｓ（Ｏ）２ＯＲ○；−（ＣＨ２）０〜４ＯＳ（Ｏ）２Ｒ○；−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ○２；−（ＣＨ２）０〜４Ｓ（Ｏ）Ｒ○；−Ｎ（Ｒ○）Ｓ（Ｏ）２ＮＲ○２；−Ｎ（Ｒ○）Ｓ（Ｏ）２Ｒ○；−Ｎ（ＯＲ○）Ｒ○；−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ○２；−Ｐ（Ｏ）２Ｒ○；−Ｐ（Ｏ）Ｒ○２；−ＯＰ（Ｏ）Ｒ○２；−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ○）２；ＳｉＲ○３；−（Ｃ１〜４の直鎖または分岐鎖のアルキレン）Ｏ−Ｎ（Ｒ○）２；または−（Ｃ１〜４の直鎖または分岐鎖のアルキレン）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｎ（Ｒ○）２であり、各Ｒ○は、以下に定義されるように置換されていてもよく、独立して、水素、Ｃ１〜６脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、−ＣＨ２−（５〜６員のヘテロアリール環）、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環であるか、または上記定義にかかわらず、Ｒ○の２個の独立した出現は、それらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、または硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する、３〜１２員の飽和、部分不飽和、またはアリールの単環式環または二環式環を形成し、これは以下に定義されるように置換されていてもよい。
【００８３】
Ｒ○（またはＲ○の２個の独立した出現がこれらの介在原子と一緒になって形成される環）上の好適な一価の置換基は、独立して、ハロゲン、−（ＣＨ２）０〜２Ｒ●、−（ハロＲ●）、−（ＣＨ２）０〜２ＯＨ、−（ＣＨ２）０〜２ＯＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＣＨ（ＯＲ●）２、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｎ３、−（ＣＨ２）０〜２Ｃ（Ｏ）Ｒ●、−（ＣＨ２）０〜２Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−（ＣＨ２）０〜２Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＳＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＳＨ、−（ＣＨ２）０〜２ＮＨ２、−（ＣＨ２）０〜２ＮＨＲ●、−（ＣＨ２）０〜２ＮＲ●２、−ＮＯ２、−ＳｉＲ●３、−ＯＳｉＲ●３、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ●、−（Ｃ１〜４の直鎖または分岐鎖のアルキレン）Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、または−ＳＳＲ●であり、各Ｒ●は非置換であるか、または「ハロ」が先行する場合、１つまたは複数のハロゲンのみで置換されており、Ｃ１〜４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環から独立して選択される。Ｒ○の飽和炭素原子上の好適な二価置換基としては、＝Ｏおよび＝Ｓが挙げられる。
【００８４】
「任意選択で置換された」基の飽和炭素原子上の好適な二価置換基としては、以下のもの：＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮＲ＊２、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝ＮＮＨＣ（Ｏ）ＯＲ＊、＝ＮＮＨＳ（Ｏ）２Ｒ＊、＝ＮＲ＊、＝ＮＯＲ＊、−Ｏ（Ｃ（Ｒ＊２））２〜３Ｏ−、または−Ｓ（Ｃ（Ｒ＊２））２〜３Ｓ−が挙げられ、ここでＲ＊の各独立した出現は、水素、以下に定義されるように置換されていてもよいＣ１〜６脂肪族、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環から選択される。「任意選択で置換された」基のビシナルの置換可能な炭素に結合した好適な二価置換基としては−Ｏ（ＣＲ＊２）２〜３Ｏ−が挙げられ、ここでＲ＊の各独立した出現は、水素、以下に定義されるように置換されていてもよいＣ１〜６脂肪族、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環から選択される。
【００８５】
Ｒ＊の脂肪族基上の好適な置換基としては、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２、または−ＮＯ２が挙げられ、ここで各Ｒ●は非置換であるか、または「ハロ」が先行する場合、１つまたは複数のハロゲンのみで置換されており、独立して、Ｃ１〜４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環である。
【００８６】
「任意選択で置換された」基の置換可能な窒素上の好適な置換基としては、−Ｒ†、−ＮＲ†２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ†、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ†、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ†２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ†２、−Ｃ（ＮＨ）ＮＲ†２、または−Ｎ（Ｒ†）Ｓ（Ｏ）２Ｒ†が挙げられ、ここで各Ｒ†は独立して水素、以下に定義されるように置換されていてもよいＣ１〜６脂肪族、非置換の−ＯＰｈ、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環であるか、または上記定義にかかわらず、Ｒ†の２つの独立した出現は、これらの介在原子と一緒になって、窒素、酸素、または硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する非置換の３〜１２員の飽和、部分不飽和、またはアリールの単環式環または二環式環を形成する。
【００８７】
Ｒ†の脂肪族基上の好適な置換基は、独立して、ハロゲン、−Ｒ●、−（ハロＲ●）、−ＯＨ、−ＯＲ●、−Ｏ（ハロＲ●）、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ●、−ＮＨ２、−ＮＨＲ●、−ＮＲ●２、または−ＮＯ２であり、ここで各Ｒ●は非置換であるか、または「ハロ」が先行する場合、１つまたは複数のハロゲンのみで置換されており、独立して、Ｃ１〜４脂肪族、−ＣＨ２Ｐｈ、−Ｏ（ＣＨ２）０〜１Ｐｈ、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される０〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の飽和環、部分不飽和環、もしくはアリール環である。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などなしで、ヒトおよび下等動物の組織と接触させて使用するのに好適であり、合理的な利益／リスク比に見合う、塩を指す。薬学的に許容される塩は当技術分野において周知である。例えば、S.  M.  Bergeらは、J.  Pharmaceutical  Sciences、１９７７年、６６巻、１〜１９頁において薬学的に許容される塩を詳細に説明しており、これは参照により本明細書に組み込まれる。本開示の化合物の薬学的に許容される塩としては、好適な無機および有機の酸および塩基に由来する塩が挙げられる。薬学的に許容される非毒性の酸付加塩(acid  addition  salt)の例としては、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸など、または有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、またはマロン酸と形成されたアミノ基の塩であるか、またはイオン交換などの当技術分野において使用される他の方法を使用することによって形成されたアミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。
【００８９】
適切な塩基に由来する塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、およびＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４塩が挙げられる。代表的なアルカリ塩またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。さらなる薬学的に許容される塩としては、適切である場合、例えばハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸、硫酸、リン酸、硝酸、低級アルキルスルホン酸、アリールスルホン酸などの対イオンを使用して形成された、非毒性のアンモニウム、第４級アンモニウム、およびアミンカチオンが挙げられる。
【００９０】
別段の言及がない限り、本明細書に示される構造は、その構造の全ての異性体（例えば、エナンチオマーの、ジアステレオマーの、および幾何（または配座））の形態（例えば、各不斉中心についてＲ配置およびＳ配置、Ｚ体およびＥ体の二重結合異性体、ならびにＺ体およびＥ体の配座異性体）をも含むことを意味する。したがって、本化合物の単一の立体化学的異性体の他に、エナンチオマー、ジアステレオマー、および幾何（または配座）混合物は、本発明の範囲内である。別段の言及がない限り、本開示の化合物の全ての互変異性形態は本開示の範囲内である。さらに、別段の言及がない限り、本明細書に示される構造はまた、１つまたは複数の同位体が濃縮された原子の存在においてのみ異なる化合物を含むことも意味する。例えば、水素がジュウテリウムもしくはトリチウムで置き換えられたもの、または炭素が１３Ｃもしくは１４Ｃ濃縮炭素で置き換えられたものを含めて本構造を有する化合物は、本開示の範囲内である。そのような化合物は例えば、分析ツールとして、生物学的アッセイにおけるプローブとして、または本開示による治療剤として有用である。
本明細書で使用される場合、ＳＡＲＭ１に言及するために使用される場合の「全長」という用語は、少なくとも、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１ポリペプチドの、（ｉ）Ｎ末端自己阻害ドメインまたはその機能的断片、（ｉｉ）１つまたは複数のＳＡＭドメインまたはその機能的断片、および（ｉｉｉ）ＴＩＲドメインまたはその機能的断片を含むＳＡＲＭ１ポリペプチドを指す。一部の実施形態では、全長ＳＡＲＭ１は、ミトコンドリア標的化配列を欠いている。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１  Ｎ末端自己阻害ドメインの少なくとも機能的断片、１つまたは複数のＳＡＭドメインの少なくとも機能的断片、およびＳＡＲＭ１  ＴＩＲドメインの少なくとも機能的断片を含むＳＡＲＭ１ポリペプチドであって、ミトコンドリア標的化配列を欠いているＳＡＲＭ１ポリペプチドが提供される。
【００９１】
３．例示的な実施形態の説明：
ある特定の実施形態では、本開示は、式ＩＡ：
【化９】
2019535804.tif 000010
の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。一部の実施形態では、式ＩＡの化合物はＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤である。式ＩＡのある特定の化合物はプロトンポンプ阻害剤であることが理解されるものとする。
【００９２】
上記に一般的に定義される通り、ＸＡは、−Ｓ−、−ＳＯ−または−ＳＯ２−である。一部の実施形態では、ＸＡは−Ｓ−である。一部の実施形態では、ＸＡは−ＳＯ−である。一部の実施形態では、ＸＡは−ＳＯ２−である。
【００９３】
上記に一般的に定義される通り、Ｒ１Ａは、水素、Ｃ１〜４脂肪族、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムまたはＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４である。Ｒ１Ａが水素またはＣ１〜４脂肪族である場合、Ｒ１Ａは式ＩＡ中の窒素原子に共有結合していることが理解されるものとする。Ｒ１Ａがアルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム（すなわち、ＮＨ４＋）またはＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４である場合、Ｒ１Ａは式ＩＡ中の窒素原子にイオン会合していることがさらに理解されるものとする。一部の実施形態では、Ｒ１Ａは、水素またはＣ１〜４脂肪族である。一部の実施形態では、Ｒ１Ａは、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム（すなわち、ＮＨ４＋）またはＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４から選択される。一部の実施形態では、Ｒ１Ａは水素である。一部の実施形態では、Ｒ１ＡはＣ１〜４脂肪族である。一部の実施形態では、Ｒ１Ａはアルカリ金属である。一部のそのような実施形態では、Ｒ１Ａはナトリウム（Ｎａ＋）である。一部の実施形態では、Ｒ１Ａはアルカリ土類金属である。一部の実施形態では、Ｒ１Ａはアンモニウムである。一部の実施形態では、Ｒ１ＡはＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４である。
【００９４】
上記に一般的に定義される通り、式ＩＡの環ＡＡ基は、ベンゾ縮合環、または窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する５〜６員の複素環式芳香族縮合環である。一部の実施形態では、環ＡＡはベンゾ縮合環である。一部の実施形態では、環ＡＡは、窒素、酸素および硫黄から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を有する５〜６員の複素環式芳香族縮合環である。一部の実施形態では、環ＡＡは、１〜２個の窒素を有する６員の複素環式芳香族縮合環である。一部の実施形態では、環ＡＡは、ピリド縮合環、ピリミジノ縮合環、ピリダジノまたはピラジノ縮合環である。一部の実施形態では、環ＡＡはトリアジノ縮合環である。一部の実施形態では、環ＡＡは、酸素、窒素および硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を含有する５員の複素環式芳香族縮合環である。一部の実施形態では、環ＡＡは、ピロロ縮合環、チオフェノ縮合環、フラノ縮合環、チアゾロ縮合環、イソチアゾロ縮合環、イミダゾロ縮合環、ピラゾロ縮合環、オキサゾロ縮合環、またはイソキサゾロ縮合環である。
【００９５】
上記に一般的に定義される通り、式ＩＡの環ＢＡ基は、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環から選択される。一部の実施形態では、環ＢＡはアリールである。一部の実施形態では、環ＢＡは、フェニル、ビフェニル、ナフチル（napthyl）またはアントラシルである。一部の実施形態では、環ＢＡは、インダニル、フタルイミジル、ナフトイミジル、フェナントリジニル、またはテトラヒドロナフチルである。一部の実施形態では、環ＢＡはヘテロアリールである。一部の実施形態では、環ＢＡは、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニルまたはプテリジニルである。
【００９６】
上記に一般的に定義される通り、ＲＸＡおよびＲＹＡは、独立して、水素、１〜４個のハロゲンにより任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族、−ＯＲＡ、−ＳＲＡ、−Ｎ（ＲＡ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＡ）２、−Ｎ（ＲＡ）Ｓ（Ｏ）２ＲＡ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＡ）２、−Ｃ（Ｏ）ＲＡ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲＡ、−ＯＣ（Ｏ）ＲＡ、−Ｓ（Ｏ）ＲＡ、−Ｓ（Ｏ）２ＲＡ、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環である。
【００９７】
一部の実施形態では、ＲＸＡおよびＲＹＡは同一である。一部の実施形態では、ＲＸＡおよびＲＹＡの両方は水素である。一部の実施形態では、ＲＸＡおよびＲＹＡの両方は、１〜４個のハロゲンにより任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族である。一部の実施形態では、ＲＸＡおよびＲＹＡの両方は−ＯＲＡである。一部の実施形態では、ＲＸＡおよびＲＹＡの両方はアリールである。一部の実施形態では、ＲＸＡおよびＲＹＡの両方はヘテロアリールである。
【００９８】
一部の実施形態では、ＲＸＡとＲＹＡとは異なる。一部の実施形態では、ＲＸＡは水素であり、ＲＹＡは、１〜４個のハロゲンにより任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族、および／または−ＯＲＡである。一部の実施形態では、ＲＸＡは−ＯＲＡであり、ＲＹＡは、１〜４個のハロゲンにより任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族である。一部の実施形態では、ＲＸＡはアリールであり、ＲＹＡは、−ＯＲＡ、および／または１〜４個のハロゲンにより任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族である。一部の実施形態では、ＲＸＡはヘテロアリールであり、ＲＹＡは、−ＯＲＡ、および／または１〜４個のハロゲンにより任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族である。
【００９９】
上記に一般的に定義される通り、ｍＡおよびｎＡは、独立して、０、１、２、または３である。一部の実施形態では、ｍＡおよびｎＡは同一である。一部の実施形態では、ｍＡおよびｎＡは両方とも０である。一部の実施形態では、ｍＡおよびｎＡは両方とも１である。一部の実施形態では、ｍＡおよびｎＡは両方とも２である。一部の実施形態では、ｍＡおよびｎＡは両方とも３である。
【０１００】
一部の実施形態では、ｍＡとｎＡとは異なる。一部の実施形態では、ｍＡは０であり、ｎＡは、１、２または３である。一部の実施形態では、ｍＡは１であり、ｎＡは、０、２または３である。一部の実施形態では、ｍＡは２であり、ｎＡは、０、１または３である。一部の実施形態では、ｍＡは３であり、ｎＡは、０、１または２である。一部の実施形態では、ｍＡは、１、２または３であり、ｎＡは０である。一部の実施形態では、ｍＡは、０、２または３であり、ｎＡは１である。一部の実施形態では、ｍＡは、０、１または３であり、ｎＡは２である。一部の実施形態では、ｍＡは、０、１または２であり、ｎＡは３である。一部の実施形態では、ｍＡは１であり、ｎＡは、２または３である。
【０１０１】
一部の実施形態では、ｎＡは１であり、ＲＸＡは−ＯＣＨ３である。一部の実施形態では、ｎＡは１であり、ＲＸＡは−ＯＣＨＦ２である。一部の実施形態では、ｎＡは１であり、ＲＸＡは５員のヘテロアリール環である。一部のそのような実施形態では、ｎＡは１であり、ＲＸＡはピロリルである。一部の実施形態では、ｎＡは１であり、ＲＸＡは−ＯＲＡである。一部のそのような実施形態では、ＲＡは、任意選択で置換されたＣ１〜６脂肪族である。一部の実施形態では、ｎＡは１であり、ＲＸＡは−ＯＲＡであり、ＲＡは、フェニルで置換されたＣ１〜６脂肪族である。
【０１０２】
一部の実施形態では、ｍＡは２であり、各ＲＹＡは、−ＯＲＡ、および１〜４個のハロゲンにより任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族から独立して選択される。そのような実施形態では、１つのＲＹＡは−ＣＨ３であり、他のＲＹＡは−ＯＣＨ３である。一部の実施形態では、１つのＲＹＡは−ＣＨ３であり、他のＲＹＡは−ＯＣＨ２ＣＦ３である。一部の実施形態では、ｍＡは２であり、各ＲＹＡは−ＯＣＨ３である。一部の実施形態では、ｍＡは２であり、各ＲＹＡは、−ＯＲＡ、および１〜４個のハロゲンにより任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族から選択され、ＲＡは、−（ＣＨ２）０〜４ＯＲ○で置換されたＣ１〜６脂肪族である。一部のそのような実施形態では、１つのＲＹＡは−ＣＨ３であり、他のＲＹＡは−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である。
【０１０３】
一部の実施形態では、ｍＡは３であり、各ＲＹＡは、−ＯＲＡ、および１〜４個のハロゲンにより任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族から独立して選択される。一部の実施形態では、１つのＲＹＡは−ＯＣＨ３であり、２つのＲＹＡは−ＣＨ３である。一部の実施形態では、１つのＲＹＡは−ＯＣＨ２ＣＦ３であり、２つのＲＹＡは−ＣＨ３である。
【０１０４】
一部の実施形態では、環ＡＡは、下記の表１Ａに示される化合物中の環ＡＡ基から選択される。一部の実施形態では、環ＢＡは、下記の表１Ａに示される化合物中の環ＢＡ基から選択される。一部の実施形態では、ＲＸＡは、下記の表１Ａに示される化合物中のＲＸＡ基から選択される。一部の実施形態では、ＲＹＡは、下記の表１Ａに示される化合物中のＲＹＡ基から選択される。一部の実施形態では、ＸＡは、下記の表１Ａに示される化合物中のＸＡ基から選択される。一部の実施形態では、式ＩＡの化合物は、下記の表１Ａに示される化合物から選択される。一部の実施形態では、式ＩＡの化合物は、表１Ａ：
【表１−１】
2019535804.tif 000011
【表１−２】
2019535804.tif 000012
【表１−３】
2019535804.tif 000013
中の化合物から選択される。
【０１０５】
一部の実施形態では、ＸＡは−ＳＯ−である。一部の実施形態では、ｎＡは、０または１であり、ｍＡは、２または３である。一部の実施形態では、Ｒ１Ａは、水素、Ｃ１〜４脂肪族またはアルカリ金属である。一部の実施形態では、Ｒ１Ａは、水素、メチルまたはナトリウムである。一部の実施形態では、ＲＹＡは、水素、１〜４個のハロゲンにより任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族または−ＯＲＡであり、ＲＡは、任意選択で置換されたＣ１〜６脂肪族である。一部の実施形態では、ＲＹＡは、水素、−ＣＨ３、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＦ３または−Ｏ（ＣＨ２）３ＯＣＨ３である。一部の実施形態では、ＲＸＡは、水素、−ＯＲＡ、またはヘテロアリールであり、ＲＡは、任意選択で置換されたＣ１〜６脂肪族またはベンジルである。一部の実施形態では、ＲＸＡは、水素、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨＣＦ２、ピロリルまたは−ＯＣＨ２−フェニルである。
【０１０６】
一部の実施形態では、環ＡＡはアリール（arylo）縮合環であり、環ＢＡはヘテロアリール環である。一部の実施形態では、環ＡＡはベンゾ縮合環であり、環ＢＡはピリジル環である。一部の実施形態では、環ＡＡは複素環式芳香族縮合環であり、環ＢＡはヘテロアリール環である。
【０１０７】
一部の実施形態では、環ＡＡは、ピリド縮合環、ピリミジノ縮合環、ピリダジノ縮合環、ピラジノ縮合環、トリアジノ縮合環、ピロロ縮合環、チオフェノ縮合環、フラノ縮合環、チアゾロ縮合環、イソチアゾロ縮合環、イミダゾロ縮合環、ピラゾロ縮合環、オキサゾロ縮合環およびイソキサゾロ縮合環からなる群より選択される。
【０１０８】
一部の実施形態では、環ＢＡは、フェニル、ビフェニル、ナフチル、アントラシル、インダニル、フタルイミジル、ナフトイミジル、フェナントリジニル、テトラヒドロナフチル、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニルおよびプテリジニルからなる群より選択される。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、本開示は、式ＩＢ：
【化１０】
2019535804.tif 000014
の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０１１０】
上記に一般的に定義される通り、Ｘ１ＢおよびＸ２Ｂは、独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＲＢ−であり、但し、Ｘ１ＢおよびＸ２Ｂの１つは、−Ｏ−または−Ｓ−であり、Ｘ１ＢおよびＸ２Ｂの両方が−Ｏ−ではない。一部の実施形態では、Ｘ１ＢおよびＸ２Ｂは同一である。一部の実施形態では、Ｘ１ＢとＸ２Ｂとは異なる。一部の実施形態では、Ｘ１ＢおよびＸ２Ｂは−Ｓ−である。一部の実施形態では、Ｘ１Ｂは−Ｓ−であり、Ｘ２Ｂは−Ｏ−である。一部の実施形態では、Ｘ１Ｂは−Ｏ−であり、Ｘ２Ｂは−Ｓ−である。一部の実施形態では、Ｘ１ＢおよびＸ２Ｂは、下記の表１Ｂに示される化合物中のＸ１Ｂ基およびＸ２Ｂ基から選択される。
【０１１１】
上記に一般的に定義される通り、ＹＢは、−Ｎ−または−ＣＨ−である。一部の実施形態では、ＹＢは−Ｎ−である。一部の実施形態では、ＹＢは−ＣＨ−である。一部の実施形態では、ＹＢは、下記の表１Ｂに示される化合物中のＹＢ基から選択される。
【０１１２】
上記に一般的に定義される通り、Ｒ１Ｂは、水素または任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族である。一部の実施形態では、各Ｒ１Ｂは同一である。一部の実施形態では、各Ｒ１Ｂは異なる。一部の実施形態では、各Ｒ１Ｂは水素である。一部の実施形態では、各Ｒ１Ｂは、任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族である。一部の実施形態では、１つのＲ１Ｂは水素であり、他のＲ１Ｂは、任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族である。一部の実施形態では、Ｒ１Ｂは、下記の表１Ｂに示される化合物中のＲ１Ｂ基から選択される。
【０１１３】
上記に一般的に定義される通り、環ＡＢは、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環である。一部の実施形態では、環ＡＢはアリールである。一部の実施形態では、環ＡＢは、フェニル、ビフェニル、ナフチルまたはアントラシルである。一部の実施形態では、環ＡＢは、インダニル、フタルイミジル、ナフトイミジル、フェナントリジニル、またはテトラヒドロナフチルである。一部の実施形態では、環ＡＢはヘテロアリールである。一部の実施形態では、環ＡＢは、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニルまたはプテリジニルである。一部の実施形態では、環ＡＢは、下記の表１Ｂに示される化合物中の環ＡＢ基から選択される。
【０１１４】
上記に一般的に定義される通り、各ＲＸＢは、独立して、水素、ハロゲンであるか、またはＣ１〜６脂肪族、３〜８員の飽和または部分不飽和の単環式炭素環、フェニル、８〜１０員の二環式芳香族炭素環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜２個のヘテロ原子を有する４〜８員の飽和または部分不飽和の単環式複素環式環、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を有する５〜６員の単環式複素環式芳香族環、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する８〜１０員の二環式複素環式芳香族環から選択される任意選択で置換された基である。
【０１１５】
一部の実施形態では、各ＲＸＢは同一である。一部の実施形態では、各ＲＸＢは異なる。一部の実施形態では、ＲＸＢは水素である。一部の実施形態では、ＲＸＢはハロゲンである。一部の実施形態では、ＲＸＢは、任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族である。一部の実施形態では、ＲＸＢはアリールである。一部の実施形態では、ＲＸＢは、フェニル、ビフェニル、ナフチルまたはアントラシルである。一部の実施形態では、ＲＸＢは、インダニル、フタルイミジル、ナフトイミジル、フェナントリジニル、またはテトラヒドロナフチルである。一部の実施形態では、ＲＸＢはヘテロアリールである。一部の実施形態では、ＲＸＢは、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニルまたはプテリジニルである。一部の実施形態では、ＲＸＢは、下記の表１Ｂに示される化合物中のＲＸＢ基から選択される。
【０１１６】
上記に一般的に定義される通り、ＬＢは、共有結合、Ｃ１〜６員の直鎖もしくは分岐鎖の二価の炭化水素鎖、シクロプロピレニル、シクロブチレニル、またはオキセタニレニルである。一部の実施形態では、ＬＢは共有結合である。一部の実施形態では、ＬＢは、Ｃ１〜６員の直鎖もしくは分岐鎖の二価の炭化水素鎖である。一部の実施形態では、ＬＢはシクロプロピレニルである。一部の実施形態では、ＬＢはシクロブチレニルである。一部の実施形態では、ＬＢはオキセタニレニルである。一部の実施形態では、ＬＢは−Ｃ（ＣＨ３）２−である。一部の実施形態では、ＬＢは−ＣＨ２−である。一部の実施形態では、ＬＢは−ＣＨ（ＣＨ３）−である。一部の実施形態では、ＬＢは、キラル中心において（Ｓ）配置を有する−ＣＨ（ＣＨ３）−である。一部の実施形態では、ＬＢは、キラル中心において（Ｒ）配置を有する−ＣＨ（ＣＨ３）−である。一部の実施形態では、ＬＢは、下記の表１Ｂに示される化合物中のＬＢ基から選択される。
【０１１７】
上記に一般的に定義される通り、ｎＢは０〜４である。一部の実施形態では、ｎＢは０である。一部の実施形態では、ｎＢは１である。一部の実施形態では、ｎＢは２である。一部の実施形態では、ｎＢは３である。一部の実施形態では、ｎＢは４である。
【０１１８】
一部の実施形態では、式ＩＢの化合物は、表１Ｂ：
【表１−４】
2019535804.tif 000015
中の化合物から選択される。
【０１１９】
一部の実施形態では、Ｘ１ＢおよびＸ２Ｂは−Ｓ−であり、ＹＢは−Ｎ−である。一部の実施形態では、Ｒ１Ｂは、水素または任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族である。一部の実施形態では、Ｒ１Ｂは、水素またはメチルである。一部の実施形態では、ＬＢは、共有結合またはＣ１〜６員の直鎖もしくは分岐鎖の二価の炭化水素鎖である。一部の実施形態では、ＬＢは、共有結合またはメチレン基である。一部の実施形態では、ＲＸＢは、水素、ハロゲンまたは任意選択で置換されたＣ１〜４脂肪族である。一部の実施形態では、ＲＸＢは、水素または−Ｃｌである。
【０１２０】
一部の実施形態では、環ＡＢは、アリールまたはヘテロアリールである。一部の実施形態では、環ＡＢは、フェニル、ビフェニル、ナフチルおよびアントラシルからなる群より選択される。一部の実施形態では、環ＡＢは、インダニル、フタルイミジル、ナフトイミジル、フェナントリジニル、テトラヒドロナフチル、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニルおよびプテリジニルからなる群より選択される。
【０１２１】
一部の実施形態では、本開示は、式ＩＣ：
【化１１】
2019535804.tif 000016
の化合物またはその薬学的に許容される塩（式中、
ＸＣは、ＮまたはＣであり、
Ｒ１Ｃは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ５ハロアルコキシであり、
Ｒ２Ｃは、Ｃ１〜Ｃ５アルキルまたはＣ１〜Ｃ５アルコキシであり、
Ｒ３Ｃは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０ハロアルキルまたはエーテルであり、
Ｒ４Ｃは、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ５アルキルまたはＣ１〜Ｃ５アルコキシである）
を提供する。
【０１２２】
一部の実施形態では、ＸＣはＮである。一部の実施形態では、ＸＣはＣである。
【０１２３】
一部の実施形態では、Ｒ１ＣはＨである。一部の実施形態では、Ｒ１Ｃは、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、またはＣ１〜Ｃ５ハロアルコキシである。
【０１２４】
一部の実施形態では、Ｒ１ＣはＣ１〜Ｃ５アルキルである。一部のそのような実施形態では、Ｒ１Ｃは、メチル、エチル、ｎ−プロピルまたはイソプロピルである。
【０１２５】
一部の実施形態では、Ｒ１ＣはＣ１〜Ｃ５アルコキシである。一部のそのような実施形態では、Ｒ１Ｃは、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２である。
【０１２６】
一部の実施形態では、Ｒ１ＣはＣ１〜Ｃ５ハロアルコキシである。一部の実施形態では、Ｒ１ＣはＣ１〜Ｃ５フルオロアルコキシである。一部のそのような実施形態では、Ｒ１Ｃは、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、フルオロエトキシ、ジフルオロエトキシ、またはトリフルオロメトキシである。一部の実施形態では、Ｒ１Ｃは、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｆ、−ＯＣＨ２ＣＨＦ２、または−ＯＣＨ２ＣＦ３である。
【０１２７】
一部の実施形態では、Ｒ２ＣはＣ１〜Ｃ５アルキルである。一部のそのような実施形態では、Ｒ２Ｃは、メチル、エチル、ｎ−プロピルまたはイソプロピルである。
【０１２８】
一部の実施形態では、Ｒ２ＣはＣ１〜Ｃ５アルコキシである。一部のそのような実施形態では、Ｒ２Ｃは、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２である。
【０１２９】
一部の実施形態では、Ｒ３ＣはＣ１〜Ｃ１０アルキルである。一部のそのような実施形態では、Ｒ３Ｃは、メチル、エチル、ｎ−プロピルまたはイソプロピルである。
【０１３０】
一部の実施形態では、Ｒ３ＣはＣ１〜Ｃ１０ハロアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ３Ｃはフルオロアルキルである。一部のそのような実施形態では、Ｒ３Ｃは、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、フルオロエチル、ジフルオロエチル、またはトリフルオロエチルである。一部の実施形態では、Ｒ３Ｃは、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２ＣＨＦ２、または−ＣＨ２ＣＦ３である。
【０１３１】
一部の実施形態では、Ｒ３Ｃはエーテルである。一部のそのような実施形態では、Ｒ３Ｃはメトキシプロピル（すなわち、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）である。
【０１３２】
一部の実施形態では、Ｒ４ＣはＨである。一部の実施形態では、Ｒ４ＣはＣ１〜Ｃ５アルキルである。一部のそのような実施形態では、Ｒ４Ｃは、メチル、エチル、ｎ−プロピルまたはイソプロピルである。
【０１３３】
一部の実施形態では、Ｒ４ＣはＣ１〜Ｃ５アルコキシである。一部のそのような実施形態では、Ｒ４Ｃは、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２である。
【０１３４】
一部の実施形態では、式ＩＣの化合物は、表１Ｃ：
【表１−５】
2019535804.tif 000017
中の化合物から選択される。
【０１３５】
一部の実施形態では、パントプラゾールは、ナトリウム塩の形態である。
【化１２】
2019535804.tif 000018
【０１３６】
一部の実施形態では、ラベプラゾールは、ナトリウム塩の形態である。
【化１３】
2019535804.tif 000019
【０１３７】
一部の実施形態では、エソメプラゾールは、マグネシウム水和物の形態である。
【化１４】
2019535804.tif 000020
【０１３８】
一部の実施形態では、本開示は、式ＩＤ：
【化１５】
2019535804.tif 000021
の化合物またはその薬学的に許容される塩（式中、
Ｒ１ＤおよびＲ２Ｄはそれぞれ、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ５ハロアルキル、またはＣ１〜Ｃ５ハロアルコキシから独立して選択され、
ｎＤは１〜５の整数である）
を提供する。
【０１３９】
一部の実施形態では、Ｒ１ＤおよびＲ２Ｄは同一である。一部の実施形態では、Ｒ１ＤおよびＲ２Ｄのそれぞれは水素である。
【０１４０】
一部の実施形態では、Ｒ１ＤとＲ２Ｄとは異なる。一部の実施形態では、Ｒ１Ｄは水素であり、Ｒ２ＤはＣ１〜Ｃ５アルキルである。
【０１４１】
一部の実施形態では、Ｒ１Ｄは、メチル、エチル、ｎ−プロピルまたはイソプロピルから選択される。一部の実施形態では、Ｒ１Ｄは、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２から選択される。一部の実施形態では、Ｒ１Ｄは、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、フルオロエチル、ジフルオロエチル、またはトリフルオロエチルから選択される。一部のそのような実施形態では、Ｒ１Ｄは、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、−ＣＦ３、−  ＣＨ２ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２ＣＨＦ２または−ＣＨ２ＣＦ３から選択される。一部の実施形態では、Ｒ１Ｄは、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、フルオロエトキシ、ジフルオロエトキシ、またはトリフルオロエトキシから選択される。一部のそのような実施形態では、Ｒ１Ｄは、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｆ、−ＯＣＨ２ＣＨＦ２、または−ＯＣＨ２ＣＦ３から選択される。
【０１４２】
一部の実施形態では、Ｒ２Ｄは、メチル、エチル、ｎ−プロピルまたはイソプロピルから選択される。一部の実施形態では、Ｒ２Ｄは、−ＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、または−ＯＣＨ（ＣＨ３）２から選択される。一部の実施形態では、Ｒ２Ｄは、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、フルオロエチル、ジフルオロエチル、またはトリフルオロエチルから選択される。一部のそのような実施形態では、Ｒ２Ｄは、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＨＦ２、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＨ２Ｆ、−ＣＨ２ＣＨＦ２または−ＣＨ２ＣＦ３から選択される。一部の実施形態では、Ｒ２Ｄは、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、フルオロエトキシ、ジフルオロエトキシ、またはトリフルオロエトキシから選択される。一部のそのような実施形態では、Ｒ２Ｄは、−ＯＣＨ２Ｆ、−ＯＣＨＦ２、−ＯＣＦ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｆ、−ＯＣＨ２ＣＨＦ２、または−ＯＣＨ２ＣＦ３から選択される。
【０１４３】
一部の実施形態では、ｎＤは１〜２である。一部の実施形態では、ｎＤは１である。一部の実施形態では、ｎＤは２である。一部の実施形態では、ｎＤは３である。一部の実施形態では、ｎＤは４である。一部の実施形態では、ｎＤは５である。
【０１４４】
一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤は、表２：
【表２−１】
2019535804.tif 000022
【表２−２】
2019535804.tif 000023
中の化合物から選択される。
【０１４５】
一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤は、表３：
【表３−１】
2019535804.tif 000024
【表３−２】
2019535804.tif 000025
中の化合物の群より選択される。
【０１４６】
一部の実施形態では、式ＩＡ、式ＩＢ、式ＩＣおよび式ＩＤのいずれかの化合物は、薬学的に許容される組成物の一部として投与される。一部の実施形態では、式ＩＡ、式ＩＢ、式ＩＣおよび式ＩＤのいずれかの化合物は、経口投与される。一部の実施形態では、式ＩＡ、式ＩＢ、式ＩＣおよび式ＩＤのいずれかの化合物は、患者の体重１ｋｇあたり０．０１〜１００ｍｇの範囲内で投与される。
【０１４７】
一部の実施形態では、神経変性疾患もしくは障害または神経学的疾患もしくは障害は、軸索変性、軸索傷害、軸索障害、脱髄疾患、橋中央ミエリン溶解、神経損傷疾患または障害、代謝性疾患、ミトコンドリア疾患、代謝性軸索変性、白質脳症または白質ジストロフィーの結果としてもたらされる軸索傷害に関連する。一部の実施形態では、神経変性疾患もしくは障害または神経学的疾患もしくは障害は、脊髄損傷、卒中、多発性硬化症、進行性多病巣性白質脳症、先天性ミエリン形成減少、脳脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎、橋中央ミエリン溶解（central  pontine  myelolysis）、浸透圧性低ナトリウム血症（osmotic  hyponatremia）、低酸素性脱髄、虚血性脱髄、副腎脳白質ジストロフィ、アレキサンダー病、ニーマン・ピック病、ペリツェウス・メルツバッハー病、脳室周囲白質軟化症、球様細胞白質萎縮（クラッベ病）、ワーラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリッグ病）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、テイ・サックス病（Tay-Sacks  disease）、ゴーシェ病、ハーラー症候群、外傷性脳損傷、照射後損傷、化学療法の神経学的合併症（化学療法誘発性ニューロパチー；ＣＩＰＮ）、ニューロパチー、急性虚血性視神経症、ビタミンＢ１２欠乏症、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、バッセン・コルンツヴァイク症候群、緑内障、レーバー遺伝性視神経萎縮（ニューロパチー）、レーバー先天性黒内障、視神経脊髄炎、異染性白質ジストロフィー、急性出血性白質脳炎、三叉神経痛、ベル麻痺、脳虚血、多系統萎縮症、外傷性緑内障、熱帯性痙性対麻痺ヒトＴリンパ球向性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）関連脊髄症、ウエストナイルウイルス脳症、ラクロスウイルス脳炎、ブニヤウイルス脳炎、小児ウイルス性脳炎、本態性振戦、シャルコー・マリー・トゥース病、運動ニューロン疾患、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチー（ＨＳＡＮ）、副腎脊髄ニューロパチー、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、フリードライヒ運動失調症（Friedrich’s  ataxia）、遺伝性運動失調症、騒音性難聴、先天性難聴、レビー小体型認知症、前頭側頭型認知症、アミロイドーシス、糖尿病性ニューロパチー、ＨＩＶニューロパチー、腸神経障害および軸索障害、ギラン・バレー症候群、および重症急性運動性軸索型ニューロパチー（severe  acute  motor  axonal  neuropathy）（ＡＭＡＮ）からなる群より選択される。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害のための、上記の表１Ａに示される化合物から選択される任意の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。表１Ａに示される化合物は、公知のプロトンポンプ阻害剤であり、例えば、オメプラゾール（化合物ＩＡ−１）；ランソプラゾール（化合物ＩＡ−２）；デクスランソプラゾール（化合物ＩＡ−３）；エソメプラゾール（化合物ＩＡ−４）；パントプラゾール（化合物ＩＡ−５）；ラベプラゾール（化合物ＩＡ−６）；イラプラゾール（化合物ＩＡ−７）；テナトプラゾール（化合物ＩＡ−８）；ランソプラゾールスルフィド（化合物ＩＡ−９）；ランソプラゾールスルホン（化合物ＩＡ−１０）；Ｎ−メチルオメプラゾール（化合物ＩＡ−１１）；５−ベンジルオキシオメプラゾール（化合物ＩＡ−１２）およびエソメプラゾールナトリウム（化合物ＩＡ−１３）などである。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害のための、上記の表１Ｂに示される化合物から選択される任意の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害のための、上記の表１Ｃに示される化合物から選択される任意の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害のための、上記の表２に示される化合物から選択される任意の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害のための、上記の表３に示される化合物から選択される任意の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供する。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、本開示は、表１Ａ、表１Ｂ、表ＩＣ、表２、または表３のいずれかから選択される化合物、またはその薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１５４】
４．本発明の化合物を提供するための一般的方法
式ＩＡのある特定の化合物はプロトンポンプ阻害剤であり、様々な供給元から市販されていることが理解されるものとする。
【０１５５】
本明細書において式ＩＡによって表される本開示の化合物はまた、公知の手順に従って合成することもできる。例えば、１９８９年１２月２８日に出願され、１９９１年９月３日に特許が発行された米国特許第５，０４５，５５２号（「’５５２特許」；その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）には、式ＩＡの化合物およびそれらの合成が記載されている。１９８７年１１月１３日に出願され、１９８８年６月１日に公開されたＥＰ２６８９５６（「ＥＰ‘２５６」；その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）にも式ＩＡの化合物およびそれらの合成が記載されている。
【０１５６】
式ＩＡの化合物の一般的調製：
【化１６】
2019535804.tif 000026
式ＩＡの化合物は、以下ならびに’５５２特許およびＥＰ‘２５６に記載されるステップおよび中間体（例えば、スキーム１Ａ）に従って調製することができる。ある特定の実施形態では、式ＩＡの本開示の化合物は、以下に記載されるスキーム１Ａに従って一般に調製される：
【化１７】
2019535804.tif 000027
【０１５７】
本明細書において式ＩＢによって記載される化合物は、類似の化合物について当業者に公知の合成および／または半合成方法によって、ならびに本明細書中の実施例に詳細に記載される方法によって、一般に調製または単離することができる。例えば、本明細書において式ＩＢによって記載される化合物は、２００６年２月８日に出願され、２００６年８月１７日に公開されたＷＯ２００６／０８４８５４号（「ＷＯ’８５４」；その全体が、参照により本明細書に組み込まれる；式ＩＢの化合物およびそれらの合成が記載されている）に従って合成することができる。Oliverら、J.  Org.  Chem.、３９巻、１５号、１９７４年、２２２５〜２２２８頁およびPandeyaら、Pharmaceutical  Research、４巻、４号、１９８７年、３２１〜３２６頁（これらの両方の全体が、参照により本明細書に組み込まれる）にも式ＩＢの化合物の合成が記載されている。
【０１５８】
式ＩＢの化合物の一般的調製：
【化１８】
2019535804.tif 000028
式ＩＢの化合物は、以下およびＷＯ’８５４に記載されるステップおよび中間体（例えば、スキーム１Ｂ）に従って調製することができる。ある特定の実施形態では、式ＩＢの本開示の化合物は、以下に記載されるスキーム１Ｂに従って一般に調製される：
【化１９】
2019535804.tif 000029
【０１５９】
５．使用、製剤および投与ならびに薬学的に許容される組成物
別の実施形態によれば、本開示は、式ＩＡ、式ＩＢ、式ＩＣ、もしくは式ＩＤの化合物、または表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２および表３から選択される任意の化合物、またはその薬学的に許容される塩、エステル、もしくはエステルの塩、および薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本開示の組成物中の化合物の量は、生体試料または患者において、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を測定可能に阻害するためおよび／または神経変性疾患もしくは障害または神経学的疾患もしくは障害を治療するために有効であるような量である。一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、生体試料においてＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を測定可能に阻害するのに有効な量の式ＩＡ、式ＩＢ、式ＩＣ、もしくは式ＩＤの化合物、または表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２および表３から選択される任意の化合物を含有し、および／または送達する。一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、適切な投薬レジメンで患者に投与された時に患者においてＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を測定可能に阻害するためおよび／または神経変性疾患もしくは障害または神経学的疾患もしくは障害を治療するのに有効な量の式ＩＡ、式ＩＢ、式ＩＣ、もしくは式ＩＤの化合物、または表１Ａ、表１Ｂ、表１Ｃ、表２および表３から選択される任意の化合物を含有し、および／または送達する。ある特定の実施形態では、本開示の組成物は、そのような組成物を必要とする患者への投与のために製剤化される。一部の実施形態では、本開示の組成物は、患者への経口投与のために製剤化される。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。
【０１６１】
「薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクル」という用語は、一緒に製剤化された化合物の薬理活性を壊さない非毒性の担体、アジュバント、またはビヒクルを指す。本開示の組成物において使用され得る薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルとしては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンなど、緩衝物質、例えば、ホスフェートなど、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩など、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６２】
「薬学的に許容される誘導体」は、本開示の化合物の非毒性の塩、エステル、エステルの塩、または他の誘導体のいずれかであって、レシピエントに投与されると、直接的または間接的に、本開示の化合物またはその阻害活性代謝物もしくは残留物を提供できるものを意味する。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「その阻害活性代謝物または残留物」という用語は、その代謝物または残留物もまたＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤であることを意味する。
【０１６４】
一部の実施形態では、本開示の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入噴霧によって、局所的に、直腸に、経鼻的に、口腔内に、経膣的に、または埋め込み式リザーバーを介して、投与され得る。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語には、皮下の、静脈内の、筋肉内の、関節内の、滑液包内の、胸骨内の、髄腔内の、肝内の、病巣内の、および頭蓋内の注射または注入技術が含まれる。好ましくは、組成物は、経口的に、腹腔内に、または静脈内に投与される。一部の実施形態では、本開示の組成物の滅菌注射形態は、水性または油性の懸濁物であり得る。これらの懸濁物は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、当技術分野で公知の技術に従って製剤化され得る。一部の実施形態では、滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁物、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液などであり得る。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー液、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒（suspending  medium）として従来通りに用いられる。
【０１６５】
この目的のために、合成モノまたはジグリセリドなどの任意の無刺激固定油を用いることができる。例えばオレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、天然の薬学的に許容される油、例えば、オリーブ油またはヒマシ油、特にこれらのポリオキシエチル化されたバージョンなどと同様に、注射物質の調製において有用である。これらの油溶液または油懸濁物はまた、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、またはエマルションおよび懸濁剤を含む、薬学的に許容される剤形の製剤において一般に使用される類似の分散剤などを含有し得る。他の一般に使用される界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、および薬学的に許容される固体、液体、または他の剤形の製造において一般に使用される他の乳化剤またはバイオアベイラビリティ増強剤などもまた、製剤の目的のために使用され得る。
【０１６６】
一部の実施形態では、本開示の薬学的に許容される組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、または液剤が挙げられるがこれらに限定されない、任意の経口的に許容される剤形として経口投与することができる。一部の実施形態では、経口使用のための錠剤の場合、一般に使用される担体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。一部の実施形態では、例えばステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も通常加えられる。一部の実施形態では、カプセル剤形態での経口投与のために有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。一部の実施形態では、経口使用のために水性懸濁剤が必要な場合、活性成分は乳化剤および懸濁化剤と合わせられる。一部の実施形態では、ある特定の甘味剤、矯味矯臭剤、または着色剤を加えてもよい。
【０１６７】
一部の実施形態では、本開示の薬学的に許容される組成物は、直腸投与用の坐薬の形態で投与することができる。これらは、薬剤と、室温で固体であるが直腸の温度で液体であるため直腸内で溶けて薬物を放出する好適な非刺激性の賦形剤とを混合することによって調製することができる。一部の実施形態では、そのような物質としては、カカオ脂、蜜蝋、およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１６８】
一部の実施形態では、本開示の薬学的に許容される組成物はまた、特に眼、皮膚、または下部腸管の疾患など、局所適用によって容易に接近可能な領域または臓器を治療標的が含む場合、局所的に投与することができる。これらの領域または臓器のそれぞれのために好適な局所用製剤は容易に調製される。
【０１６９】
一部の実施形態では、下部腸管用の局所適用は、直腸坐薬製剤（上記を参照）または好適な浣腸製剤において行うことができる。一部の実施形態では、局所経皮パッチを使用してもよい。
【０１７０】
局所適用のために、提供される薬学的に許容される組成物は、１つまたは複数の担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する好適な軟膏剤として製剤化することができる。一部の実施形態では、本開示の化合物の局所投与用の担体としては、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋、および水が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、提供される薬学的に許容される組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体中に懸濁または溶解された活性成分を含有する好適なローション剤またはクリーム剤において製剤化することができる。好適な担体としては、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７１】
眼科用途のために、提供される薬学的に許容される組成物は、等張の、ｐＨ調整した滅菌食塩水中の微細化懸濁剤として、または好ましくは、塩化ベンジルアルコニウムなどの保存料を含むもしくは含まない等張の、ｐＨ調整した滅菌食塩水中の液剤として、製剤化することができる。あるいは、眼科用途のために、薬学的に許容される組成物は、ワセリンなどの軟膏剤中に製剤化され得る。
【０１７２】
一部の実施形態では、本開示の薬学的に許容される組成物はまた、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することができる。そのような組成物は、医薬製剤の技術分野において周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の好適な防腐剤、バイオアベイラビリティを増進するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の従来の可溶化剤または分散剤を用いて、食塩水中の液剤として調製することができる。
【０１７３】
最も好ましくは、本開示の薬学的に許容される組成物は、経口投与のために製剤化される。そのような製剤は、食品と共にまたは食品を伴わずに投与され得る。一部の実施形態では、本開示の薬学的に許容される組成物は、食品を伴わずに投与される。他の実施形態では、本開示の薬学的に許容される組成物は、食品と共に投与される。
【０１７４】
一部の実施形態では、単一剤形中の組成物を製造するために担体物質と合わせられ得る本開示の化合物の量は、治療される宿主、具体的な投与方式に応じて変化する。好ましくは、提供される組成物は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の投与量の阻害剤をこれらの組成物を与えられる患者に投与できるように製剤化されるべきである。
【０１７５】
任意の具体的な患者のための特定の投与量および治療レジメンは、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、全身の健康、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、治療医の判断、および治療される具体的な疾患の重症度などの様々な要因に依存することがあることも理解されるべきである。一部の実施形態では、組成物中の本開示の化合物の量は、組成物中の具体的な化合物にも依存する。
【０１７６】
一部の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法を提供する。そのような方法は、ａ）ｉ）ＳＡＲＭ１の変異体または断片、ｉｉ）ＮＡＤ＋、およびｉｉｉ）阻害剤候補を含む混合物を提供するステップであって、変異体または断片が構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する、ステップ、ｂ）混合物をインキュベートするステップ、およびｃ）インキュベート後の混合物中のＮＡＤ＋、ＡＤＰＲ（および／またはｃＡＤＰＲ）、ニコチンアミドまたはこれらの任意の組み合わせを定量化するステップを含む。一部の実施形態では、提供される方法は、ｄ）ＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ（および／またはＮＡＤ＋／ｃＡＤＰＲ）のモル比を決定するステップ、およびｅ）ＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ（および／またはＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ）のモル比が、阻害剤候補を含有しない対照混合物のモル比より高い場合、阻害剤候補の化合物をＮＡＤアーゼ阻害剤と同定するステップをさらに含み得る。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋、ＡＤＰＲ（および／またはｃＡＤＰＲ）、ニコチンアミドまたはこれらの任意の組み合わせの１つまたは複数が、例えば、ＨＰＬＣ分析、化学ルミネセンスアッセイ、質量分光分析、液体クロマトグラフィー−質量分光分析、またはこれらの組み合わせを行うことなどの、任意の利用可能な解析方法によって定量化される。一部の実施形態では、混合物は、ＳＡＲＭ１の変異体または断片を含む細胞溶解物を含む。一部の実施形態では、細胞溶解物は、ＮＡＤアーゼ活性を有するＳＡＲＭ１の変異体または断片を含む、それからなる、またはそれから本質的になるＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物である。一部の実施形態では、混合物は、精製されたＳＡＭ−ＴＩＲポリペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）で処理され、これは、構成的に活性なＳＡＲＭ１分子の存在下で高いＮＡＤ＋レベルを維持し、細胞生存度を増加させるために有用であり得る。一部の実施形態では、阻害剤は、ＡＤＰＲ（またはｃＡＤＰＲ）に対するＮＡＤ＋のモル比が４：１より高い場合にＮＡＤアーゼ阻害剤として同定される。一部の実施形態では、阻害剤候補の化合物は、ＡＤＰＲ（またはｃＡＤＰＲ）に対するＮＡＤ＋のモル比が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１または１０：１より高い場合にＮＡＤアーゼ阻害剤として同定される。
【０１７７】
一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するＳＡＭ−ＴＩＲ断片である。
【０１７８】
構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するＳＡＲＭ１の断片としては、例えば、以下に限定されないが、例えば、自己阻害ドメインを欠失したＳＡＲＭ１、自己阻害ドメインを不活性にするＳＡＲＭ１の少なくとも１つの点変異、ＴＩＲドメインからなるＳＡＲＭ１の断片、またはＳＡＭドメインおよびＴＩＲドメインからなるＳＡＲＭ１の断片が挙げられる。本教示のポリペプチドは、Ｈｉｓタグ、ストレプトアビジンタグ、またはこれらの組み合わせなどのタグとして作用できる１つまたは複数の追加のアミノ酸配列をさらに含み得る。ポリペプチドは、アミノ末端、カルボキシ末端、またはこれらの組み合わせにタグを含み得る。
【０１７９】
一部の実施形態では、ＳＡＭ−ＴＩＲドメインは、ヒトＳＡＭ−ＴＩＲ：
【０１８０】
【化２０】
2019535804.tif 000030
を含み得る。
【０１８１】
本教示はまた、単離されたＴＩＲドメイン構築物の使用も提供する。
【０１８２】
これらとしては、ヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメイン：
【化２１】
2019535804.tif 000031
【０１８３】
マウスＳＡＲＭ１−ＴＩＲ：
【化２２】
2019535804.tif 000032
【０１８４】
およびゼブラフィッシュＳＡＲＭ１−ＴＩＲ：
【化２３】
2019535804.tif 000033
を含む構築物が挙げられる。当業者は、ＮＡＤアーゼ活性を欠いた変異または断片を同定できるであろう。
【０１８５】
一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１タンパク質の活性変異体または断片は、ｈＳＡＲＭ１−ＴＩＲ（５６１〜７２４）、ｍＳＡＲＭ１−ＴＩＲ（５６１〜７２４）、ｚｆＳＡＲＭ１−ＴＩＲ（５５４〜７１３）、ＭｙＤ８８−ＴＩＲ（１４８〜２９６）、またはＴＬＲ４−ＴＩＲ（６７０〜８３９）である。
【０１８６】
一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１タンパク質の活性変異体または断片は、ｈＳＡＲＭ１−ＴＩＲ（５６１〜７２４）、ｍＳＡＲＭ１−ＴＩＲ（５６１〜７２４）、ｚｆＳＡＲＭ１−ＴＩＲ（５５４〜７１３）、ＭｙＤ８８−ＴＩＲ（１４８〜２９６）、またはＴＬＲ４−ＴＩＲ（６７０〜８３９）である。
【０１８７】
精製を容易にするために、ＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインは、様々なタンパク質タグを用いて操作することができる。これらのタグとしては、以下に限定されないが、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ、およびＶＥＮＵＳタグなどが挙げられる。
【０１８８】
本明細書で使用される場合、ストレプトアビジンタグは、生物工学によって作られたストレプトアビジンタンパク質に親和性を有するタンパク質ドメインである。それは、以下に限定されないが、Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（配列番号５）などの配列を有し得る。発現ベクターおよび樹脂がＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）およびＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）（ＩＢＡ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などの商標名で販売されている。
【０１８９】
本明細書で使用される場合、ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ニコチンアミドリボシドキナーゼ１（ＮＲＫ１）を発現するＨＥＫ２９３細胞株を指す。ＮＲＫ１は、配列
【化２４】
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を有する。これらの細胞は、ＮＲＫ１を用いて安定的に形質転換もしくはトランスフェクトすることができ、またはＮＲＫ１を用いて一過的に形質転換もしくはトランスフェクトすることができる。一部の構成では、ＮＲＫ１は、以下に限定されないが、ＦＣＩＶ発現ベクターなどの発現ベクターから形質転換またはトランスフェクトすることができる（Araki,  T.ら、Science  ３０５巻：１０１０〜１０１３頁、２００４年）。一部の構成では、ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ヒトニコチンアミドリボシドキナーゼ１（ＮＲＫ１）を発現するＦＣＩＶ発現ベクターで安定的にトランスフェクトされたポリクローナル細胞株を含み得る。
【０１９０】
一部の実施形態では、混合物は、精製されたＳＡＭ−ＴＩＲポリペプチドを含み得る。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、ヒトＳＡＲＭ１の残基４１０〜７２１（配列番号８）からなっていてもよいし、またはそれから本質的になっていてもよい。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、ヒトＳＡＲＭ１の残基５６０〜７２４からなっていてもよいし、またはそれから本質的になっていてもよい。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、ヒトＳＡＲＭ１の残基５６０〜７２３からなっていてもよいし、またはそれから本質的になっていてもよい。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、ヒトＳＡＲＭ１の残基５６０〜７２２からなっていてもよいし、またはそれから本質的になっていてもよい。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、ヒトＳＡＲＭ１の残基５６０〜７２１からなっていてもよいし、またはそれから本質的になっていてもよい。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、以下に限定されないが、例えば、ヒトの残基４１０〜７２１に相同的なマウスＳＡＲＭ１ポリペプチド断片などの、ヒトＳＡＲＭ１に相同的なポリペプチドを有する任意の種からのＳＡＲＭ１の変異体または断片からなっていてもよいし、またはそれから本質的になっていてもよい。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１変異体またはＳＡＲＭ１断片は、ヒトＳＡＲＭ１変異体または断片、マウスＳＡＲＭ１変異体または断片、ゼブラフィッシュＳＡＲＭ１変異体または断片、チンパンジーＳＡＲＭ１変異体または断片、アカゲザルＳＡＲＭ１変異体または断片、イヌＳＡＲＭ１変異体または断片、ラットＳＡＲＭ１変異体または断片、ニワトリＳＡＲＭ１変異体または断片、ショウジョウバエＳＡＲＭ１変異体または断片、蚊ＳＡＲＭ１変異体または断片、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ＳＡＲＭ１変異体または断片、またはカエルＳＡＲＭ１変異体または断片である。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、Ｎ末端自己阻害ドメインを欠失したＳＡＲＭ１ポリペプチドである。一部の実施形態では、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するＳＡＲＭ１ポリペプチドは、約１５０〜約３００アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するＳＡＲＭ１ポリペプチドは、約１６０〜約３１０アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するＳＡＲＭ１ポリペプチドは、約１６０〜約３２０アミノ酸残基の長さである。
【０１９１】
一部の実施形態では、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するＳＡＲＭ１ポリペプチドは、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１ポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有する配列を有する。一部の実施形態では、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するＳＡＲＭ１ポリペプチドは、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を有する。一部の実施形態では、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するＳＡＲＭ１ポリペプチドは、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する。一部の実施形態では、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するＳＡＲＭ１ポリペプチドは、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する。一部の実施形態では、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有し、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１ポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有するＳＡＲＭ１ポリペプチドは、保存的なアミノ酸置換、挿入、欠失、またはこれらの組み合わせを有する。一部の実施形態では、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有し、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性を有するＳＡＲＭ１ポリペプチドは、保存的なアミノ酸置換、挿入、欠失、またはこれらの組み合わせを有する。一部の実施形態では、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有し、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１ポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有するＳＡＲＭ１ポリペプチドは、保存的なアミノ酸置換、挿入、欠失、またはこれらの組み合わせを有する。一部の実施形態では、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有し、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１ポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有するＳＡＲＭ１ポリペプチドは、保存的なアミノ酸置換、挿入、欠失、またはこれらの組み合わせを有する。一部の実施形態では、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有し、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するヒトＳＡＲＭ１ポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有するＳＡＲＭ１ポリペプチドは、人工的な配列を有し、または非ヒト種のＳＡＲＭ１からの相同配列もしくはオルソロガスな配列と同一の配列を有する。
【０１９２】
一部の実施形態では、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するＳＡＲＭ１ポリペプチドは、全長ＳＡＲＭ１ポリペプチドである。
【０１９３】
一部の実施形態では、本教示は、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する真核生物起源のＳＡＲＭ１の変異体または断片をコードする核酸を宿す宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌を含む。一部の実施形態では、本教示は、構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する真核生物起源の変異体ＳＡＲＭ１ポリペプチドを宿すＥ．ｃｏｌｉなどの細菌を含む。
【０１９４】
一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法は、ａ）ｉ）ＳＡＲＭ１の変異体または断片、ｉｉ）ＮＡＤ＋およびｉｉｉ）阻害剤候補を含む混合物を提供するステップであって、変異体または断片が構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する、ステップ、ｂ）混合物をインキュベートするステップ、ｃ）インキュベート後の混合物中のＮＡＤ＋を定量化するステップ、およびｄ）ＮＡＤ＋の量が、阻害剤候補を含有しない対照混合物の量より多い場合、阻害剤候補の化合物をＮＡＤアーゼ阻害剤と同定するステップを含む。
【０１９５】
一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法であって、ａ）ｉ）全長ＳＡＲＭ１、ｉｉ）ＮＡＤ＋およびｉｉｉ）阻害剤候補を含む混合物を提供するステップであって、全長ＳＡＲＭ１が構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する、ステップ、ｂ）混合物をインキュベートするステップ、ｃ）インキュベート後の混合物中のＮＡＤ＋およびＡＤＰＲ（またはｃＡＤＰＲ）を定量化するステップ、ｄ）ＮＡＤ＋：ＡＤＰＲ（またはｃＡＤＰＲ）のモル比を決定するステップ、およびｅ）モル比が、阻害剤候補を含有しない対照混合物のモル比より高い場合、阻害剤候補の化合物をＮＡＤアーゼ阻害剤として同定するステップを含む、方法が提供される。
【０１９６】
一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法であって、ａ）ｉ）全長ＳＡＲＭ１および少なくとも１つのタグ、ｉｉ）ＮＡＤ＋、ならびにｉｉｉ）阻害剤候補が結合した固体支持体を含む混合物を提供するステップ、ｂ）混合物をインキュベートするステップ、ｃ）インキュベート後のＮＡＤ＋を定量化するステップ、およびｄ）ＮＡＤ＋の濃度が対照の濃度より高い場合、阻害剤候補の化合物をＮＡＤアーゼ阻害剤として同定するステップを含む、方法が提供される。
【０１９７】
一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法であって、ａ）ｉ）全長ＳＡＲＭ１、ｉｉ）ＮＡＤ＋およびｉｉｉ）阻害剤候補を含む混合物を提供するステップであって、全長ＳＡＲＭ１が構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する、ステップ、ｂ）混合物をインキュベートするステップ、ｃ）インキュベート後の混合物中のＮＡＤ＋を定量化するステップ、およびｄ）ＮＡＤ＋の量が、阻害剤候補を含有しない対照混合物の量より多い場合、阻害剤候補の化合物をＮＡＤアーゼ阻害剤として同定するステップを含む、方法が提供される。
【０１９８】
一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法であって、ａ）ｉ）構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する全長ＳＡＲＭ１、ｉｉ）ＮＡＤ＋およびｉｉｉ）阻害剤候補を含む混合物を提供するステップであって、全長ＳＡＲＭ１が構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する、ステップ、ｂ）混合物をインキュベートするステップ、ｃ）インキュベート後の混合物中のＮＡＤ＋および少なくとも１つのＮＡＤアーゼ切断生成物を定量化するステップ、およびｄ）少なくとも１つのＮＡＤアーゼ切断生成物に対するＮＡＤ＋のモル比が、阻害剤候補を含有しない対照混合物のモル比より高い場合、阻害剤候補の化合物をＮＡＤアーゼ阻害剤として同定するステップを含む、方法が提供される。
【０１９９】
一部の実施形態では、混合物中のＮＡＤ＋を定量化することは、化学ルミネセンスアッセイを行うことを含む、それからなる、またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、混合物中のＮＡＤ＋を定量化することは、ＨＰＬＣ分析を行うことを含む、それからなる、またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、混合物は、精製されたＳＡＭ−ＴＩＲ断片を含み得る。一部の実施形態では、混合物は、ＳＡＲＭ１の変異体または断片を含む細胞溶解物を含む。一部の実施形態では、細胞溶解物は、ＳＡＲＭ１の変異体または断片を含むＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の溶解物である。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片を含むＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＮＲで処理される。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、ＳＡＭ−ＴＩＲ断片である。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、ヒトＳＡＲＭ１の残基４１０〜７２１（配列番号８）を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、ヒトＳＡＲＭ１の残基に相同的なマウスＳＡＲＭ１の残基を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、Ｎ末端自己阻害ドメインが欠失したＳＡＲＭ１ポリペプチドである。
【０２００】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、ａ）構成的なＮＡＤアーゼ活性を有する、ＳＡＲＭ１の変異体または断片、およびｂ）少なくとも１つのタグを含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、少なくとも１つのタグは、ストレプトアビジンタグ、Ｈｉｓタグ、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、ＳＡＭ−ＴＩＲ断片である。一部の実施形態では、変異体または断片は、ＳＡＭ−ＴＩＲ断片、Ｈｉｓタグ、およびストレプトアビジンタグを含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、ストレプトアビジンタグは、タンデムなストレプトアビジンタグである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、アミノ末端のタンデムなストレプトアビジン、ＳＡＭ−ＴＩＲ断片、およびＣ末端のＨｉｓタグを含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、Ｎ末端自己阻害ドメインが欠失したＳＡＲＭ１ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、ヒトＳＡＲＭ１の残基４１０〜７２１（配列番号８）を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、ヒトＳＡＲＭ１の残基４１０〜７２１（配列番号８）に相同的なマウスＳＡＲＭ１の残基を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の変異体または断片は、ヒトＳＡＲＭ１の残基４１０〜７２１を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、ポリペプチドは、固体支持体に固定化されている。一部の実施形態では、固体支持体はビーズである。一部の実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする配列を含むプラスミドまたはウイルスを含む。
【０２０１】
一部の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法であって、ａ）ＮＡＤ＋、および構成的なＮＡＤアーゼ活性を有するＳＡＲＭ１の変異体または断片からなるポリペプチドが結合したビーズを含む混合物を提供するステップ、ｂ）阻害剤候補を混合物に加えるステップ、ｃ）混合物をインキュベートするステップ、ｄ）混合物中のＮＡＤ＋を定量化するステップ、およびｅ）ＮＡＤ＋の濃度が対照の濃度より高い場合、阻害剤候補の化合物をＳＡＲＭ１阻害剤として同定するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、提供される方法は、インキュベート後の混合物中のＮＡＤアーゼ活性（それがある場合）を停止させることを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、Ｎ末端タグなどの少なくとも１つのタグをさらに含む。一部の実施形態では、Ｎ末端タグはストレプトアビジンタグである。一部の実施形態では、Ｎ末端タグは、タンデムなストレプトアビジンタグである。一部の実施形態では、少なくとも１つのタグはＣ末端タグである。一部の実施形態では、Ｃ末端タグはポリヒスチジンタグである。一部の実施形態では、ビーズはヒスチジンタグ精製ビーズである。一部の実施形態では、少なくとも１つのタグは少なくとも２つのタグである。一部の実施形態では、少なくとも２つのタグは、Ｎ末端タグおよびＣ末端タグである。一部の実施形態では、Ｎ末端タグはタンデムなストレプトアビジンタグであり、Ｃ末端タグはポリヒスチジンタグである。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋を定量化することは、ＨＰＬＣベースの解析を行うことを含む。一部の実施形態では、ＮＡＤ＋およびＡＤＰＲ（またはｃＡＤＰＲ）を定量化することは、ＬＣ／ＭＳベースの解析を行うことを含む。一部の実施形態では、阻害剤候補の化合物は、ＡＤＰＲ（またはｃＡＤＰＲ）に対するＮＡＤのモル比が４：１より高い場合にＳＡＲＭ１阻害剤として同定される。一部の実施形態では、阻害剤候補の化合物は、ＡＤＰＲ（またはｃＡＤＰＲ）に対するＮＡＤのモル比が、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または１０：１より高い場合にＳＡＲＭ１阻害剤として同定される。
【０２０２】
一部の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＭ１ポリペプチドの変異体または断片を提供する。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１ポリペプチドの変異体または断片は、ビーズなどの固体支持体に結合されていてもよい。一部の実施形態では、固体支持体に結合したＳＡＲＭ１ポリペプチドの変異体または断片は、ＳＡＭ−ＴＩＲ、ＴＩＲドメイン、または自己阻害ドメインを欠失したＳＡＲＭ１ポリペプチドを含む、それからなる、またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１ポリペプチドの変異体または断片は、ヒトＳＡＲＭ１ポリペプチドの変異体または断片、マウスＳＡＲＭ１ポリペプチドの変異体または断片、およびゼブラフィッシュＳＡＲＭ１ポリペプチドの変異体または断片からなる群より選択される。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１ポリペプチドの変異体または断片は、タグをさらに含む、それからなる、またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ＮＡＤアーゼ活性を有するＳＡＲＭ１ポリペプチドの変異体または断片は、タンパク質タグを介して固体支持体に結合したＳＡＲＭ１変異体または断片を含む、それからなる、またはそれから本質的になる。
【０２０３】
一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤を同定する方法は、ａ）軸索を含む少なくとも１つの培養ニューロンを含む混合物を提供するステップ、ｂ）ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤候補を混合物に加えるステップ、ｃ）標識されたＮＡＭを混合物に加え、軸索を離断するステップ、ｄ）混合物をインキュベートするステップ、およびｅ）混合物中の標識されたＮＡＤ＋および未標識のＮＡＤ＋の量を定量化するステップを含む。一部の実施形態では、提供される方法は、ｆ）例えば、全ＮＡＤ＋に対する未標識のＮＡＤ＋（例えば、全（軽いおよび重い）ＮＡＤ＋に対する軽いＮＡＤ）の減少の％を経時的に算出することによって、ＮＡＤ＋消費の正味の速度を算出することをさらに含み得る。一部の実施形態では、算出は、例えば％／時間（ｈｒ）として表される。一部の実施形態では、ＳＡＲＭ１の阻害剤は、阻害剤候補を含有しない対照混合物の損傷後ＮＡＤ＋消費速度と比べて損傷後ＮＡＤ＋消費速度の減少がある場合に同定される。一部の実施形態では、標識されたＮＡＭは、重水素標識された（「重い」）ＮＡＭである。一部の実施形態では、標識されたＮＡＭはｄ４−ＮＡＭである。一部の実施形態では、標識されたＮＡＤ＋および未標識のＮＡＤ＋の定量化は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳなどの解析方法を使用して行われる。一部の実施形態では、少なくとも１つの培養ニューロンは、少なくとも１つの後根神経節の培養ニューロンである。
【０２０４】
一部の実施形態では、軸索変性の阻害剤を同定する方法は、ａ）軸索を含む少なくとも１つの培養ニューロンを含む混合物を提供するステップ、ｂ）阻害剤候補を混合物に加えるステップ、ｃ）ニューロンを破壊するステップ、ｄ）少なくとも１つの顕微鏡画像を使用して変性指数を算出するステップ（Sasaki,  Y.ら、Journal  of  Neuroscience  ２００９年、２９巻（１７号）：５５２５〜５５３５頁）、およびｆ）阻害剤なしの対照と比べて変性指数の有意な減少がある場合に軸索変性の阻害剤を同定するステップを含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる。一部の実施形態では、ニューロンを破壊することは、軸索を離断することを含む。一部の実施形態では、ニューロンを破壊することは、ビンクリスチンを混合物に加えることを含む。
【０２０５】
一部の実施形態では、本開示はまた、ニコチンアミドリボシドキナーゼ１（ＮＲＫ１）で形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含むＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３細胞株も提供する。一部の実施形態では、ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３細胞は、ニコチンアミドリボシドキナーゼ１（ＮＲＫ１）をコードするＤＮＡ配列を用いて形質転換またはトランスフェクトされている。一部の実施形態では、ＮＲＫ１をコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。一部の実施形態では、ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３細胞は、宿主細胞に対して外因性の供給源からのＮＲＫ１をコードするＤＮＡを用いて安定的にまたは一過的に形質転換またはトランスフェクトされている。一部の実施形態では、ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３細胞は、対照細胞と比べて上昇したレベルでＮＲＫ１を発現するように、ＮＲＫ１をコードするＤＮＡを用いて安定的にまたは一過的に形質転換またはトランスフェクトされている。一部の実施形態では、ＮＲＫ１をコードするＤＮＡは、プロモーター、エンハンサーまたはこれらの組み合わせなどの１つまたは複数の外因性の調節配列の制御下にある。一部の実施形態では、ＮＲＫ１および調節配列をコードするＤＮＡ配列の組み合わせは、天然に存在しない組み合わせである。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかである、ＮＲＫ１をコードするＤＮＡは、ＦＣＩＶ発現ベクターなどの発現ベクターを含む。一部の実施形態では、ＮＲＫ１をコードするＤＮＡは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを起源とし、以下に限定されないが、ヒト、マウス、ゼブラフィッシュまたはショウジョウバエなどの、脊椎動物または無脊椎動物の種からのものであり得る。一部の構成では、ＮＲＫ１  ＤＮＡはヒトＮＲＫ１  ＤＮＡである。
【０２０６】
医薬的使用
一部の実施形態では、本開示は、軸索変性または軸索障害を伴う神経変性疾患もしくは障害または神経学的疾患もしくは障害の治療のための、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤を提供する。本開示はまた、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤を使用して軸索変性、軸索障害、および軸索変性を伴う神経変性疾患もしくは障害または神経学的疾患もしくは障害を治療し、予防しまたは改善する方法も提供する。
【０２０７】
一部の実施形態では、本開示は、軸索変性、軸索傷害、軸索障害、脱髄疾患、橋中央ミエリン溶解、神経損傷疾患または障害、代謝性疾患、ミトコンドリア疾患、代謝性軸索変性、白質脳症または白質ジストロフィーの結果としてもたらされる軸索傷害に関する神経変性疾患もしくは障害または神経学的疾患もしくは障害を治療する方法を提供する。
【０２０８】
そのような神経変性疾患もしくは障害または神経学的疾患もしくは障害としては、脊髄損傷、卒中、多発性硬化症、進行性多病巣性白質脳症、先天性ミエリン形成減少、脳脊髄炎、急性散在性脳脊髄炎、橋中央ミエリン溶解、浸透圧性低ナトリウム血症、低酸素性脱髄、虚血性脱髄、副腎脳白質ジストロフィ、アレキサンダー病、ニーマン・ピック病、ペリツェウス・メルツバッハー病、脳室周囲白質軟化症、球様細胞白質萎縮（クラッベ病）、ワーラー変性、視神経炎、横断性脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリッグ病）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、テイ・サックス病、ゴーシェ病、ハーラー症候群、外傷性脳損傷、照射後損傷、化学療法の神経学的合併症（化学療法誘発性ニューロパチー；ＣＩＰＮ）、ニューロパチー、急性虚血性視神経症、ビタミンＢ１２欠乏症、孤立性ビタミンＥ欠乏症候群、バッセン・コルンツヴァイク症候群、緑内障、レーバー遺伝性視神経萎縮、レーバー先天性黒内障、視神経脊髄炎、異染性白質ジストロフィー、急性出血性白質脳炎、三叉神経痛、ベル麻痺、脳虚血、多系統萎縮症、外傷性緑内障、熱帯性痙性対麻痺ヒトＴリンパ球向性ウイルス１（ＨＴＬＶ−１）関連脊髄症、ウエストナイルウイルス脳症、ラクロスウイルス脳炎、ブニヤウイルス脳炎、小児ウイルス性脳炎、本態性振戦、シャルコー・マリー・トゥース病、運動ニューロン疾患、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、遺伝性感覚性自律神経性ニューロパチー（ＨＳＡＮ）、副腎脊髄ニューロパチー、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、フリードライヒ運動失調症、遺伝性運動失調症、騒音性難聴、先天性難聴を挙げることができる。
【０２０９】
一部の実施形態では、軸索変性に関連するニューロパチーまたは軸索障害は、例えば、遺伝性もしくは先天性であるか、またはパーキンソン病、アルツハイマー病、ヘルペス感染症、糖尿病、筋萎縮性側索硬化症、脱髄疾患、虚血もしくは卒中、化学的損傷、熱損傷、およびＡＩＤＳに関連するものなどの、多数のニューロパチーまたは軸索障害のいずれであってもよい。加えて、上記していない神経変性疾患の他に上記した疾患のサブセットもまた、本開示の方法で治療することができる。疾患のそのようなサブセットとしては、パーキンソン病もしくは非パーキンソン病、またはアルツハイマー病を挙げることができる。
【０２１０】
ニューロパチーおよび軸索障害としては、ニューロンおよび／または支持細胞、例えば、グリア、筋肉細胞または線維芽細胞などを伴う任意の疾患または状態、特に、軸索傷害を伴う疾患または状態を挙げることができる。軸索傷害は、外傷によって、または疾患、状態、または毒性分子もしくは薬物への曝露による非機械的損傷によって引き起こされ得る。そのような傷害の結果は、軸索の変性または機能障害および機能的なニューロンの活動の喪失であり得る。そのような軸索傷害を生じるまたはそれに関連する疾患および状態は、多数の神経障害性疾患および状態に含まれる。そのようなニューロパチーとしては、末梢性ニューロパチー、中枢性ニューロパチー、およびこれらの組み合わせを挙げることができる。さらには、末梢性の神経障害の症状発現は、主に中枢神経系を病巣とする疾患によって生じることがあり、また、中枢神経系の症状発現は、本質的に末梢性または全身性疾患によって生じることがある。
【０２１１】
末梢性ニューロパチーは、末梢神経への傷害を伴うことがあり、また、神経の疾患によって、または全身性の病気の結果として引き起こされることがある。一部のそのような疾患としては、糖尿病、尿毒症、ＡＩＤｓまたは癩病などの感染性疾患、栄養欠乏症、アテローム性動脈硬化症などの血管またはコラーゲン障害、ならびに全身性エリテマトーデス、強皮症、サルコイドーシス、関節リウマチ、および結節性多発性動脈炎などの自己免疫疾患を挙げることができる。末梢神経の変性はまた、神経への外傷性（機械的）傷害の他に神経への化学的または熱傷害の結果としてももたらされることがある。末梢神経を損傷させるそのような状態としては、緑内障、手根管症候群、直接外傷、穿通性損傷、挫傷、骨折もしくは脱臼などの圧迫または絞扼損傷；松葉づえの長期的な使用または１つの姿勢を長くとり過ぎること、または腫瘍の結果としてもたらされることがある表在神経（尺骨、橈骨、または腓骨）を伴う圧迫；神経内出血；虚血；寒冷または放射線または除草剤もしくは農薬などのある特定の医薬品もしくは毒性物質への曝露が挙げられる。特に、神経傷害は、例えば、タキソール、シスプラチン（cisplatinin）、プロテアソーム阻害剤、またはビンクリスチンなどのビンカアルカロイドなどの細胞毒性抗がん剤による化学的損傷の結果としてもたらされることがある。そのような末梢性ニューロパチーの典型的な症状としては、虚弱、痺れ、知覚異常（灼熱感、くすぐり感、刺痛（pricking）またはヒリヒリ感（tingling）などの異常な感覚）、ならびに腕、手、脚および／または足の痛みが挙げられる。ニューロパチーはまた、ミトコンドリア機能障害に関連することもある。そのようなニューロパチーは、エネルギーレベルの減少、すなわち、ＮＡＤおよびＡＴＰのレベルの減少を呈することがある。
【０２１２】
末梢性ニューロパチーはまた、代謝性および内分泌性ニューロパチーであってもよく、これには代謝起源の全身性疾患に関連する広範な末梢神経障害が含まれる。これらの疾患としては、例えば、糖尿病、低血糖症、尿毒症、甲状腺機能低下症、肝不全、赤血球増加症、アミロイドーシス、先端巨大症、ポルフィリン症、脂質／糖脂質代謝の障害、栄養／ビタミン欠乏症、およびミトコンドリア障害が特に挙げられる。これらの疾患のよくみられる特徴は、代謝経路調節異常によるミエリンおよび軸索の構造または機能の変化による末梢神経の関与である。
【０２１３】
ニューロパチーとしてはまた、緑内障などの視神経症；網膜色素変性症および外網膜のニューロパチーに関連するものなどの網膜神経節変性；多発性硬化症に関連するものなどの視神経炎および／または変性；例えば、腫瘍除去中の損傷などの視神経への外傷；ケジェール病（Ｋｊｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）およびレーバー遺伝性視神経症などの遺伝性視神経症；巨細胞性動脈炎に続発するものなどの虚血性視神経症；上記のレーバーニューロパチー、ビタミンＢ１２もしくは葉酸の欠乏症などの栄養欠乏症、およびエタンブトールもしくはシアン化物によるものなどの毒性を含めた、神経変性疾患などの代謝性視神経症；有害な薬物反応によって引き起こされるニューロパチーおよびビタミン欠乏症によって引き起こされるニューロパチーも挙げることができる。虚血性視神経症としてはまた、非動脈炎性前部虚血性視神経症も挙げられる。
【０２１４】
中枢神経系におけるニューロパチーまたは軸索障害に関連する神経変性疾患としては、様々な疾患が挙げられる。そのような疾患としては、例えば、アルツハイマー病、老年性認知症、ピック病、およびハンチントン病などの進行性認知症を伴う疾患；例えば、パーキンソン病、運動ニューロン疾患、および筋萎縮性側索硬化症などの進行性運動失調症などの筋肉機能に影響する中枢神経系疾患；例えば多発性硬化症などの脱髄疾患；例えば、エンテロウイルス、アルボウイルス、および単純ヘルペスウイルスによって引き起こされるものなどのウイルス性脳炎；およびプリオン病が挙げられる。緑内障などの機械的損傷または頭部および脊椎への外傷もまた、脳および脊髄において神経損傷および変性を引き起こすことがある。加えて、虚血および卒中の他に、栄養欠乏症および化学療法剤によるものなどの化学毒性などの状態は、中枢神経系ニューロパチーを引き起こすことがある。
【０２１５】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」、および「治療すること」という用語は、本明細書に記載されるような疾患もしくは障害またはその１つまたは複数の症状を逆転させ、軽減し、その発症を遅延させ、またはその進行を阻害することを指す。一部の実施形態では、治療は、１つまたは複数の症状が発症した後に施され得る。他の実施形態では、治療は、症状の非存在下で施され得る。例えば、治療は、（例えば、症状の履歴、および／または遺伝因子もしくは他の感受性因子を考慮して）症状の発症前に感受性個体に施され得る。治療はまた、例えば再発を予防しまたは遅延させるために、症状の消散後にも継続され得る。
【０２１６】
必要とされる正確な量は、被験体の種、年齢、および全身の状態、感染の重症度、具体的な薬剤、その投与方式などに応じて、被験体ごとに変化する。本開示の提供される化合物または組成物は、好ましくは、投与を容易にし、投薬量を均一にするために単位剤形に製剤化される。本明細書で使用される場合、「単位剤形」という表現は、治療がなされる患者に適した薬剤の物理的に別個になった単位を指す。しかしながら、本開示の提供される化合物または組成物の１日あたりの総使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるものとする。任意の具体的な患者または生物に特異的な有効用量レベルは、治療されている障害および障害の重症度；用いられる特定の化合物の活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、全身の健康、性別、および食事；用いられる特定の化合物の投与時間、投与経路、および排泄速度；治療の継続期間；用いられる特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物、および医療分野で周知の同様の要因を含めた、様々な要因に依存することになる。
【０２１７】
本開示の薬学的に許容される組成物は、治療がなされる感染症の重症度に応じて、経口的に、直腸に、静脈内に、非経口的に、槽内に、膣内に、腹腔内に、局所的に（散剤、軟膏剤、またはドロップ剤による）、口腔内に、経口または経鼻噴霧剤などとして、ヒトおよび他の動物に投与することができる。ある特定の実施形態では、本開示の提供される化合物は、所望の治療効果を得るために、１日に１回または複数回、１日あたり、被験体の体重の、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇから約２５ｍｇ／ｋｇの投与量レベルで経口的または非経口的に投与することができる。
【０２１８】
経口投与用の液体剤形としては、薬学的に許容されるエマルション剤、マイクロエマルション剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられるがこれらに限定されない。液体剤形は、活性化合物に加えて、当技術分野において一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（具体的には、綿実油、落花生油（groundnut  oil）、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物などを含有し得る。経口組成物は、不活性希釈剤の他に、アジュバント、例えば、湿潤剤、乳化剤、および懸濁化剤など、甘味剤、矯味矯臭剤、および芳香剤も含み得る。
【０２１９】
注射用調製物、例えば滅菌注射用の水性または油性の懸濁剤は、好適な分散剤または湿潤剤、および懸濁化剤を使用して公知の技術に従って製剤化され得る。滅菌注射用調製物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液、懸濁物、またはエマルション、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。用いられ得る許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒として従来通りに用いられる。この目的のために、任意の無刺激固定油（合成モノまたはジグリセリドが挙げられる）を用いることができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸が注射物質の調製において使用される。
【０２２０】
注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、または使用前に滅菌水または他の滅菌注射媒体に溶解または分散させることができる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって滅菌することができる。
【０２２１】
提供される化合物の効果を長続きさせるために、皮下または筋肉内注射からの化合物の吸収を遅くすることがしばしば望ましい。これは、水溶性に乏しい結晶質または非晶質材料の液体懸濁物を使用することによって達成され得る。化合物の吸収速度はその溶解速度に依存し、そして溶解速度は結晶サイズおよび結晶形態に依存し得る。あるいは、非経口的に投与される化合物形態の遅延吸収は、油ビヒクルへの化合物の溶解または懸濁によって達成される。注射デポ形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に化合物のマイクロカプセルマトリクスを形成することによって作られる。ポリマーに対する化合物の比および用いられる具体的なポリマーの性質に応じて、化合物の放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポ注射製剤はまた、体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルション中に化合物を捕捉することによって調製される。
【０２２２】
直腸または膣投与用の組成物は好ましくは坐薬であり、坐薬は、好適な非刺激性の賦形剤または担体、例えば、周囲温度で固体であるが体温で液体であるため、直腸または膣腔内で溶けて活性化合物を放出する、カカオ脂、ポリエチレングリコール、または坐剤ワックスなどと本開示の化合物を混合することによって調製することができる。
【０２２３】
経口投与用の固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が挙げられる。そのような固体剤形では、活性化合物は、少なくとも１つの不活性の、薬学的に許容される賦形剤または担体、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなど、および／またはａ）充填剤または増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸など、ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidinone）、スクロース、およびアカシアなど、ｃ）保湿剤、例えば、グリセロールなど、ｄ）崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケート、および炭酸ナトリウムなど、ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィンなど、ｆ）吸収促進剤、例えば、第４級アンモニウム化合物など、ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど、ｈ）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイトクレイなど、およびｉ）滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物など）と混合される。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形は緩衝剤も含み得る。
【０２２４】
同様の種類の固体組成物は、ラクトースや乳糖などの賦形剤の他に高分子量ポリエチレングリコールなどを使用した軟質および硬質充填ゼラチンカプセル内の充填剤としても用いられ得る。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶性コーティングおよび医薬製剤の技術分野で周知の他のコーティングなどの、コーティングおよびシェルを用いて調製することができる。これらは、任意選択で乳白剤を含有してもよく、また、腸管のある特定の部分のみにおいてまたは該部分において優先的に、任意選択で、遅延的様式で、活性成分を放出する組成物であり得る。使用できる埋め込み組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。同様の種類の固体組成物は、ラクトースや乳糖などの賦形剤の他に高分子量ポリエチレングリコール（polethylene  glycol）などを使用する、軟質および硬質充填ゼラチンカプセルの充填剤としても用いられ得る。
【０２２５】
提供される化合物はまた、上述の１つまたは複数の賦形剤を有するマイクロカプセル形態であり得る。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶性コーティング、放出制御コーティング、および医薬製剤の分野で周知の他のコーティングなどの、コーティングおよびシェルを用いて調製することができる。そのような固体剤形では、活性化合物は、スクロース、ラクトース、またはデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合されていてもよい。そのような剤形はまた、通常の実施と同様に、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば、錠剤化滑沢剤および他の錠剤化助剤、例えばステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースなども含み得る。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形は緩衝剤も含み得る。これらは、任意選択で乳白剤を含有してもよく、また、腸管のある特定の部分のみにおいてまたは該部分において優先的に、任意選択で、遅延的様式で、活性成分を放出する組成物であり得る。使用できる埋め込み組成物の例としては、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。
【０２２６】
本開示の化合物の局所または経皮投与用剤形としては、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、液剤、噴霧剤、吸入剤、またはパッチ剤が挙げられる。活性成分は、滅菌条件下で、薬学的に許容される担体および任意の必要とされる防腐剤または緩衝液と、必要に応じて混合される。眼科用製剤、点耳薬、および点眼薬もまた本開示の範囲内にあると企図される。さらに、本開示は、経皮パッチの使用を企図し、これは身体への化合物の制御送達を提供するという追加の利点を有する。そのような剤形は、適切な媒体中に化合物を溶解しまたは分散させることによって作ることができる。皮膚を横切る化合物のフラックスを増大させるために、吸収強化剤も使用することができる。速度は、速度制御膜を設けることによって、またはポリマーマトリクスまたはゲル中に化合物を分散させることによって、制御することができる。
【０２２７】
一実施形態によれば、本開示は、生体試料中のＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を阻害する方法であって、前記生体試料を提供される化合物、または前記化合物を含む組成物と接触させるステップを含む方法に関する。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、本開示は、生体試料中の軸索変性を治療する方法であって、前記生体試料を提供される化合物、または前記化合物を含む組成物と接触させるステップを含む方法に関する。
【０２２９】
本明細書で使用される場合、「生体試料」という用語は、以下に限定されないが、細胞培養物またはその抽出物、哺乳動物から得られた生検材料またはその抽出物、および血液、唾液、尿、糞便、精液、涙液、もしくは他の体液、またはその抽出物を含む。
【０２３０】
生体試料中の酵素の阻害は、当業者に公知の様々な目的のために有用である。そのような目的の例としては、生物学的アッセイ、遺伝子発現の研究、および生物学的標的の同定が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３１】
本開示の別の実施形態は、患者においてＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を阻害する方法であって、前記患者に提供される化合物、または前記化合物を含む組成物を投与するステップを含む方法に関する。
【０２３２】
それらの追加の薬剤は、複数の投与レジメンの一部として、提供される化合物またはその組成物とは別々に投与することができる。あるいは、それらの薬剤は、提供される化合物と共に単一の組成物中に混合された、単一剤形の一部であってもよい。複数の投与レジメンの一部として投与される場合、２つの活性剤は、同時に、逐次的に、または互いにある期間内、通常、互いに５時間以内に与えることができる。
【０２３３】
本明細書で使用される場合、「組み合わせ」、「組み合わせた」という用語、および関連する用語は、本開示による治療剤の同時のまたは逐次的な投与を指す。例えば、提供される化合物は、別の治療剤と、別々の単位剤形で、または単一単位剤形で一緒に、同時にまたは逐次的に投与することができる。したがって、本開示は、提供される化合物、追加の治療剤、および薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルを含む単一単位剤形を提供する。
【０２３４】
（上記のような追加の治療剤を含む組成物において）単一剤形を製造する担体物質と合わせることができる提供される化合物および追加の治療剤の両方の量は、治療される宿主および具体的な投与方式に応じて変化することになる。好ましくは、本開示の組成物は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の投与量の提供される化合物を投与できるように製剤化すべきである。
【０２３５】
追加の治療剤を含む組成物において、その追加の治療剤および提供される化合物は相乗的に作用し得る。したがって、そのような組成物中の追加の治療剤の量は、その治療剤のみを利用する単剤療法において必要とされる量よりも少なくなる。そのような組成物において、０．０１〜１００μｇ／ｋｇ体重／日の間の投与量の追加の治療剤を投与することができる。
【０２３６】
提供される化合物を含む組成物中に存在する追加の治療剤の量は、唯一の活性剤としてその治療剤を含む組成物中で通常投与される量と等しいかそれより少ない。好ましくは、提供される組成物中の追加の治療剤の量は、唯一の治療活性剤としてその薬剤を含む組成物中に通常存在する量の約５０％〜１００％の範囲内となる。
【実施例】
【０２３７】
本教示は、実施例に提供される説明を含み、実施例は任意の請求項の範囲を限定することを意図するものではない。具体的に過去形で表現されない限り、実施例に含めたものは実験が実際に行われたという含意を意図しない。以下の非限定的な実施例は、本教示をさらに例示するために提供される。本開示に照らして、当業者は、開示された特定の実施形態に多くの変更を行い、それでもなお、本教示の精神および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果を得ることができることを理解するであろう。
【０２３８】
実施例１〜１０の材料および方法
ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株
タンパク質発現中のＮＲの添加によって細胞のＮＡＤ＋レベルが有意に増大し、タンパク質精製のために十分な細胞生存度が維持されるように、ニコチンアミドリボシドキナーゼ１（ＮＲＫ１）を発現するクローンのＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ）を開発した（図３）。図３は、ＮＲを添加されたＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ安定株がＳＡＲＭ１−ＴＩＲ発現時により高いＮＡＤ＋レベルを維持することを示す。３つの独立したトランスフェクション実験からの３つの独立したＮＡＤ＋測定からデータを作成し、並行して行った非トランスフェクト実験からのデータに対して正規化した。データを平均±ＳＥＭとして表す；エラーバー：ＳＥＭ；＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側のスチューデントのｔ検定。
【０２３９】
方法
本明細書に記載される一部の方法および組成物は、当業者に周知の実験技術を利用し、それらは、Sambrook,  J.ら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.、２００１年；Methods  In  Molecular  Biology、Richard編、Humana  Press、NJ、１９９５年；Spector,  D.  L.ら、Cells:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.、１９９８年；およびHarlow,  E.、Using  Antibodies:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.、１９９９年などの実験マニュアルに見出すことができる。医薬品の投与方法および投与レジメンは、Remington:  the  Science  and  Practice  of  Pharmacy（Alfonso  R.  Gennaro編、第１９版、１９９５年）；Hardman,  J.G.ら、Goodman  &  Gilman’s  The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics、第９版、McGraw-Hill、１９９６年；およびRowe,  R.C.ら、Handbook  of  Pharmaceutical  Excipients、第４版、Pharmaceutical  Press、２００３年などの標準的な参照文献によって提供される方法を使用して、薬理学の標準的な原則に従って決定することができる。
【０２４０】
試薬
ＭａｇＳｔｒｅｐ（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ）  ｔｙｐｅ  ３  ＸＴビーズ（ＩＢＡ−Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、２−４０９０−００２）。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＨｉｓＴａｇ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｌｌｄｏｗｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１０１０３Ｄ）。ビオチン（Ｓｉｇｍａ、Ｂ４５０１）。β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ）、ニコチン酸アデニンジヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ）、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ  ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｓ１２０００）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９  ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）、Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ−ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）。
【０２４１】
細胞培養
ペニシリン／ストレプトマイシンおよびグルタミンを添加したＤＭＥＭ中の１０％  ＦＢＳ中でＨＥＫ２９３ＴおよびＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を維持し、０．０５％トリプシンに懸濁することによって継代した。汚染について細胞株を連続的にモニターした。マイコプラズマ汚染についてＨＥＫ２９３Ｔのバッチを試験した。ＨＥＫ２９３ＴはＡＴＣＣから得た。ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔは、ニコチンアミドリボシドキナーゼ１（ＮＲＫ１）を安定的に発現し、それにより、タンパク質発現中のＮＡＤ＋生合成前駆体であるニコチンアミドリボシド（ＮＲ）の添加によって細胞のＮＡＤ＋レベルが有意に増大し、タンパク質精製のために十分な細胞生存度が維持されるように開発された細胞株である。
【０２４２】
組換えＤＮＡ
哺乳動物発現構築物をＦＣＩＶレンチウイルスベクターにクローニングした：ＳｔｒｅｐＴａｇ−ｈＳＡＲＭ１−ＴＩＲ−Ｖｅｎｕｓ、ＳｔｒｅｐＴａｇ−ｈＳＡＲＭ１−ＴＩＲ（Ｅ５９６Ｋ）−Ｖｅｎｕｓ、ＳｔｒｅｐＴａｇ−ＧＳＴ−ＭｙＤ８８−ＴＩＲ、ＳｔｒｅｐＴａｇ−ＧＳＴ−ＴＬＲ４−ＴＩＲ、ＳｔｒｅｐＴａｇ−ｈＳＡＲＭ１−ＴＩＲ−Ｖｅｎｕｓ−ＨｉｓＴａｇ、ＳｔｒｅｐＴａｇ−ｈＳＡＲＭ１−ＴＩＲ（Ｅ５９６Ｋ）−Ｖｅｎｕｓ−ＨｉｓＴａｇ。
【０２４３】
細菌発現構築物をｐＥＴ３０ａ＋にクローニングした：ＳｔｒｅｐＴａｇ−ｈＳＡＲＭ１−ＴＩＲ−ＨｉｓＴａｇ、ＳｔｒｅｐＴａｇ−ｍＳＡＲＭ１−ＴＩＲ−ＨｉｓＴａｇ、ＳｔｒｅｐＴａｇ−ｚｆＳＡＲＭ１ＴＩＲ−ＨｉｓＴａｇ。
ＴＩＲドメイン残基：
ｈＳＡＲＭ１−ＴＩＲ（５６１〜７２４）、ｍＳＡＲＭ１−ＴＩＲ（５６１〜７２４）、ｚｆＳＡＲＭ１−ＴＩＲ（５５４〜７１３）、ＭｙＤ８８−ＴＩＲ（１４８〜２９６）、ＴＬＲ４−ＴＩＲ（６７０〜８３９）。
【０２４４】
マウス胚性後根神経節（ＤＲＧ）ニューロン培養物
以前に記載された通りにＳＡＲＭ１−／−Ｅ１３．５マウス胚からＤＲＧニューロンを単離し（Gerdtsら、２０１５年、Science  ３４８巻、４５３〜４５７頁）、ポリ−Ｄ−リシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）およびラミニン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を予めコーティングしたプレートに播種した。Ｌ−グルタミン、２％のＢ２７（Ｇｉｂｃｏ）、５０ｎｇ／ｍＬの神経成長因子（Ｅｎｖｉｇｏ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、および１μＭの５−フルオロ−２’デオキシウリジン＋１μＭのウリジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した神経基礎培地中でＤＲＧニューロンを維持した。ＤＩＶ１において、Ｖｅｎｕｓを単独で発現するか、またはＣ末端をＶｅｎｕｓに融合させた、示したＳＡＲＭ１構築物を発現する以前に記載された（Sasakiら、２００９年、J.  Neurosci.、２９巻、５５２５〜５５３５頁）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から生成されたレンチウイルス粒子をニューロンに形質導入した。示した構築物を発現するＳＡＲＭ１−／−ＤＲＧからの軸索をかみそりの刃で切り離し、またはＤＩＶ７において４０ｎＭのビンクリスチンで処理した。ＳＡＲＭ１−／−マウス（Ｃ５７／ＢＬ６）を飼育し（１２時間の明暗周期およびケージあたり５匹未満のマウス）、Ｓｔ．ＬｏｕｉｓのＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの施設内動物実験ガイドラインの指示に従って使用した。
【０２４５】
ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ安定株からのタンパク質の発現および精製
約１０００万個の細胞を平板培養し、翌日にＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ（商標）９試薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を使用して１５μｇのＳｔｒｅｐＴａｇ  ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ構築物ＤＮＡをトランスフェクトした。ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）を１ｍＭの最終濃度で加えて細胞生存度を向上させた。２日後に細胞を回収し、結合緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８、３００ｍＭの塩化ナトリウム、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０、プロテアーゼ阻害剤タブレット）中で超音波処理によって溶解した。単一ステップのアフィニティー精製のために、全細胞溶解物を２０μＬのＭａｇＳｔｒｅｐ（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ）ｔｙｐｅ  ３  ＸＴビーズ懸濁物（ＩＢＡ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）と３０分間インキュベートした。次いでビーズを結合緩衝液で３回洗浄し、酵素アッセイおよび他の下流の適用のために１００μＬの結合緩衝液に再懸濁した。
【０２４６】
ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ安定株からのタンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）
二重タグ付き（Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇおよびＨｉｓタグＳＡＲＭ１−ＴＩＲ）タンパク質を上記に記載される通りにＳｔｒｅｐ  Ｔａｇアフィニティー法によって最初に精製した。次いで、タンデムアフィニティー精製のために、２２．５ｍＭのビオチンを用いてタンパク質をＭａｇＳｔｒｅｐ  ｔｙｐｅ  ３  ＸＴビーズから２５分間溶出させた。溶出したタンパク質を含有する上清をＭａｇＳｔｒｅｐビーズから分離した後、１０μＬのＣｏ２＋  Ｄｙｎａｂｅａｄ懸濁物と３０分間インキュベートしてＨｉｓタグを介してＳＡＲＭ１−ＴＩＲタンパク質に結合させた。次いでビーズを少なくとも２回結合緩衝液で洗浄し、下流の適用のために１００μＬの結合緩衝液に再懸濁した。
【０２４７】
細菌によるタンパク質発現およびタンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）
適切な二重タグ（ＳｔｒｅｐＴａｇおよびＨｉｓＴａｇ）ＳＡＲＭ１−ＴＩＲをｐＥＴ３０ａ＋プラスミドにクローニングした。これらの構築物の他に非組換えｐＥＴ３０ａ＋でＳｈｕｆｆｌｅ  Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．−ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を形質転換した。単一コロニーを終夜成長させ、翌日に培養物をＬＢ培地で希釈し、Ａ６００＝０．４〜０．８となるまで３０℃で成長させ、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭの最終濃度）を加えた。細菌をさらに４時間成長させ、遠心分離によってペレット化し、ＰＢＳで洗浄し、−８０℃で貯蔵した。タンパク質精製のために、冷凍した細菌ペレットを氷上で解凍し、結合緩衝液（プロテアーゼ阻害剤なし）に再懸濁し、１００μｇ／ｍＬのリゾチームと１５分間氷上でインキュベートした。
【０２４８】
次いでプロテアーゼ阻害剤カクテルを加え、細胞を超音波処理によって溶解した。タンデムアフィニティー精製を上記の通りに実行した。
【０２４９】
ＬＣ−ＭＳ用のペプチドの調製
４％のＳＤＳおよびジチオトレイトール（１００ｍＭ）を含有するトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６、１００ｍＭ）（４０μＬ）中のコバルト磁気ビーズを１５分間煮沸することによって、精製されたＴＡＰ複合体を溶出させた。ビーズを１６，０００×ｇで５分間回転させ、溶出したタンパク質を８Ｍの尿素を含有する３００μＬのトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５、１００ｍＭ）と混合した。フィルター支援試料調製（ＦＡＳＰ）法（Wisniewskiら、Nat.  Methods、２００９年、６巻、３５９〜３６２頁）を使用してＳＤＳを除去した。緩衝液の交換後、１００μＬの緩衝液（重炭酸アンモニウム、ｐＨ７．８、５０ｍＭ）をピペットでＭｉｃｒｏｃｏｎ（登録商標）濾過ユニット（ＹＭ−３０）に入れ、トリプシンを加えた（１μＬ中に１μｇ）。消化物を３７℃で４時間インキュベートした後、別のアリコートのトリプシンを加えた後に湿潤チャンバー中で終夜インキュベートした。消化物を酸性化し（５μＬの純ギ酸）、遠心分離によってペプチドを下部チャンバーに回収した。以前に記載された通りに（Erdeら、J.  Proteome  Res.、２０１４年、１３巻、１８８５〜１８９５頁）、酸性化されたペプチドを酢酸エチルで処理した。Ｃ４および多孔性グラファイト炭素Ｎｕｔｉｐｓ（Ｇｌｙｇｅｎ）を用いてＢｅｃｋｍａｎ  ＢｉｏＭｅｋ  ＮｘＰロボットでの固相抽出によってペプチドを脱塩した（Chenら、Mol.  Cell.  Proteomics、２０１２年、１１巻、M111.011445）。アセトニトリル（１％ギ酸中で６０％）で溶出したペプチドを合わせ、真空遠心分離機中で乾燥させ、アセトニトリル／ギ酸（１％／０．１％）（１６μＬ）中に溶解した。蛍光アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する解析のためにアリコート（２μＬ）を取り、残りをピペットでオートサンプラーバイアル（ＳＵＮ−ＳＲｉ）に入れ、真空遠心分離によって濃縮し、ＬＣ−ＭＳ解析（下記を参照）のために水性ＴＦＡ（０．１％）（０．６／μｇ）に溶解した。
【０２５０】
ＮＡＤアーゼアッセイおよび代謝物の抽出
示した細胞溶解物とインキュベートした１０マイクロリットルのビーズを反応緩衝液（９２．４ｍＭのＮａＣｌおよび０．６４×ＰＢＳ）中で５μＭのＮＡＤ＋とインキュベートした。反応は、示した期間にわたって２５℃で実行し、１Ｍの過塩素酸（ＨＣｌＯ４）を加えてチューブを氷上に置くことによって停止させた。ＨＣｌＯ４／Ｋ２ＣＯ３法を使用してＮＡＤ＋代謝物を抽出し、ＨＰＬＣによって定量化した（代謝物測定のためのＨＰＬＣを参照）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析のために、蒸留水およびクロロホルム中の５０％メタノールを使用して抽出を行った（さらなる詳細についてはＬＣ−ＭＳ／ＭＳでの代謝物測定を参照）。
【０２５１】
ＨＰＬＣでの代謝物測定
１ＭのＨＣｌＯ４で抽出することによって代謝物を酵素反応混合物から単離し、３ＭのＫ２ＣＯ３で中和した後、遠心分離によって分離した。抽出された代謝物を含有する上清（９０μＬ）を０．５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（１０μＬ）と混合し、Ｋｉｎｅｔｅｘ（１００×３ｍｍ、２．６μｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）カラムを用いてＨＰＬＣ（Ｎｅｘｅｒａ  Ｘ２）によって代謝物を解析した。ＮＡＤ＋、ニコチンアミド（Ｎａｍ）、ニコチン酸アデニンジヌクレオチド（ＮａＡＤ）、ＡＤＰリボース（ＡＤＰＲ）またはｃＡＤＰＲの内部標準を使用して各々の化合物の定量化のための標準曲線を生成した。各実験試料中の各化合物のレベルを、並行して解析した０分時点に対して正規化した。
【０２５２】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでの代謝物測定
蒸留水中の５０％のメタノールと反応物を混合することによって試料を調製した。試料を氷上に置き、遠心分離した。
【０２５３】
上清中の可溶性代謝物をクロロホルムで抽出し、水相を凍結乾燥し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析まで−２０℃で貯蔵した。
【０２５４】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのために、５ｍＭのギ酸アンモニウムで代謝物試料を再構成し、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、清澄化された上清を代謝物の同定および定量化のためにＬＣ−ＭＳ／ＭＳに適用した。Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｆｕｓｉｏｎ−ＲＰ（４．６×１５０ｍｍ、４μｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）カラムと共にＨＰＬＣシステム（１２９０；Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して液体クロマトグラフィーを行った。移動相Ａに５ｍＭのギ酸アンモニウム、移動相Ｂに１００％のメタノールを用いて、０．５５ｍｌ／分の流量で試料（１０μｌ）を注入した。０〜７分、０〜７０％のＢ；７〜８分、７０％のＢ；９〜１２分、０％のＢの勾配で代謝物を溶出させた。ポジティブＥＳＩ多重反応モニタリング（ＭＲＭ）下でＴｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄ質量分析計（６４６０  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ；Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて代謝物を検出した。標準曲線と共にＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ定量解析ツール（Ａｇｉｌｅｎｔ）の補助により代謝物を定量化した。５ｍＭのギ酸アンモニウム中に再構成したＮＡＤ＋、ＡＤＰＲ、およびＮａｍを解析することによって各化合物の標準曲線を生成した。各実験試料中の各化合物のレベルを、並行して解析した０分時点に対して正規化した。試料の正体を実験を行う個体には分からないようにした。
【０２５５】
内因性の細菌および哺乳動物細胞のＮＡＤ＋の定量化
ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ構築物を宿すＥ．ｃｏｌｉの終夜培養物を希釈し、Ａ６００＝０．４〜０．８となるまで３０℃で成長させた。ＩＰＴＧ（０．１ｍＭの最終濃度）を加えてタンパク質発現を誘導し、６０分後に培養物を収穫した。培養物をＡ６００＝０．５±０．０５に対して正規化し、０．５ＭのＨＣｌＯ４を加えることによって５００μｌの培養懸濁物からのペレットを溶解した。ＨＣｌＯ４／Ｋ２ＣＯ３法を使用してＮＡＤ＋代謝物を抽出し、ＨＰＬＣによって測定した。ＮＲの存在下で成長させた２０万個のＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に１μｇのＳＡＲＭ１−ＴＩＲ発現構築物をトランスフェクトした。２日後、０．５ＭのＨＣｌＯ４および３ＭのＫ２ＣＯ３を用いてＮＡＤ＋代謝物を抽出し、ＨＰＬＣによって測定した。
【０２５６】
ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙゲル染色
【０２５７】
精製したビーズ−ＳＡＲＭ１−ＴＩＲタンパク質複合体をＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中で１０分間煮沸し、１０％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｐｌｕｓゲルで分離した。電気泳動後、５０％のメタノール／７％の酢酸中３０分間のゲルの固定を２回行った後、ＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇｅｌ染色剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で終夜インキュベートした。翌日、１０％のメタノール／７％の酢酸溶液でゲルを３０分間洗浄し、蒸留水中での５分間のすすぎを２回行い、染色されたタンパク質をＵＶトランスルミネーターで可視化した。
【０２５８】
酵素動態の研究
【０２５９】
基質（ＮＡＤ＋）濃度を増加させる反応の最初の６０秒におけるＮＡＤ＋消費の反応速度からＶｍａｘ、Ｋｍ、ｋｃａｔを決定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の非線形曲線フィットを使用してミカエリス・メンテン式に対してデータをフィッティングした。精製されたｈＳＡＲＭ１−ＴＩＲの二量体あたりのｋｃａｔを算出した。３つの独立した生体試料および反応測定値からの平均±ＳＥＭとしてデータを示す。精製されたタンパク質のＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙゲルに対するデンシトメトリー解析を介して酵素濃度を決定し、炭酸脱水酵素を標準として使用した。
【０２６０】
酵素阻害の研究
【０２６１】
精製された細菌ｈＳＡＲＭ１−ＴＩＲを、反応混合物中に１ｍＭのＮａｍまたは１ｍＭのＡＤＰＲを加えてＮＡＤアーゼアッセイにおいて試験した。用量応答阻害実験のために、様々な濃度のＮａｍ（１、１０、１０２、１０３、１０４μＭ）を反応混合物に加えた。５分後に反応を停止させ、過塩素酸法によってＮＡＤ＋代謝物を抽出し、上記に示した通りにＨＰＬＣによって測定した。
【０２６２】
軸索のＮＡＤ＋測定
【０２６３】
上記の通りにＳＡＲＭ１−／−ＤＲＧにレンチウイルスを形質導入した。新鮮な培地を２日毎に細胞に添加した。ＤＩＶ７に軸索をかみそりの刃で切り離した。示した時点において細胞体を除去した後、過塩素酸／炭酸ナトリウム法を使用して軸索のＮＡＤ＋を抽出し、以前に記載された通りに高速液体クロマトグラフィーで分離した（Sasakiら、J.  Neurosci.、２００９年、２９巻、５５２５〜５５３５頁）。
【０２６４】
ＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインのモデル化
【０２６５】
ＨＨｐｒｅｄ（Soeding,  J.ら、Nucleic  Acids  Res.、２００５年、３３巻、Ｗ２４４〜２４８頁）およびＰＨＹＲＥ２（Kelley,  L.A.ら、Nat.  Protoc.、２０１５年、１０巻、８４５〜８５８頁）を使用してプロテインデータバンク（ＰＤＢ）中の構造ホモログについてヒトＳＡＲＭ１  ＴＩＲドメイン（ａａ５５９〜７２４）を解析した。ＨＨｐｒｅｄによってタンパク質配列アラインメントを生成し、ＪａｌＶｉｅｗのフォーマットとした。０．１より高いＥ値および４０未満のスコアのヒットは正確な予測の確率が低いため、除外した。ＰＨＹＲＥ２およびＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ（Arnold,  K.ら、Bioinformatics、２００６年、２２巻、１９５〜２０１頁）を使用し、鋳型としてＭｉｌＢ  ＣＭＰ−グリコシダーゼ（ＰＤＢ：４ＪＥＭ）またはヌクレオシド２−デオキシリボシルトランスフェラーゼ（2-deoxyribsoyltransrferase）（ＰＤＢ：１Ｆ８Ｙ）を使用してＳＡＲＭ１  ＴＩＲドメインの３Ｄ構造モデルを生成した。これらの構造を可視化し、Ｃｈｉｍｅｒａと重ね合わせた（Pettersen,  E.F.ら、J.  Comput.  Chem.、２００４年、２５巻、（１６０５〜１２頁）。
【０２６６】
統計解析
試料サイズを予め決定するためには統計的方法を使用しなかった。ｎの数および説明は各図のレジェンドまたは適切な方法セクションにおいて示す。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）比較を複数の群に対して行い、対応のないｔ検定または対応のない両側ｔ検定を個々の比較のために使用した。データは、全ての統計試験が群間で類似の分散で行われたという仮定を満たす。全てのエラーバーはＳＥＭを表し、試料群内の変動の推定値である。最初の５、１０分の反応および動態アッセイの後に行われたＮＡＤアーゼの短い経過時間（１〜４分）実験からの試料は、細菌ペレットの貯蔵の増加または他の技術的／生物学的現象のいずれかにより酵素活性が部分的に低減しており、解析から除外した。新鮮な細菌調製物をその後に調製した。Ｖｅｎｕｓ発現の定量化のために、ＤＲＧをパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｙｈｙｄｅ）中に固定し、各実験について軸索の複数の視野からのＶｅｎｕｓ蛍光を顕微鏡法によって可視化した。
【０２６７】
ＤＲＧをベータチューブリン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄのマウス抗ベータ３チューブリン（ＴＵＪ１））について共染色して各視野について全軸索面積を評価した。軸索変性は、全軸索面積に対する断片化された軸索面積の比を測定するＩｍａｇｅＪ  ｍａｃｒｏを使用して明視野画像からの遠位軸索において定量化した（Sasaki,  Y.ら、J.  Neurosci.、２００９年、２９巻、５５２５〜５５３５頁）。個々の実験のために、条件あたり２〜３ウェルからの６個の視野を解析した。他のデータ解析は、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７、Ｉｍａｇｅ  Ｊ  ｍａｃｒｏ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ、Ａｄｏｂｅ  ＩｌｌｕｓｔｒａｔｏｒおよびＰｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて行った。
【０２６８】
データおよびソフトウェアの利用可能性
組換えＤＮＡ配列は、受託番号：ＫＹ５８４３８８〜ＫＹ５８４４０１でＢａｎｋＩｔに寄託されている。
【０２６９】
（実施例１）
本実施例は、ＮＡＤアーゼ活性についてのＳＡＭ−ＴＩＲアッセイ、および傷害を受けたまたは健常でない軸索の排除における極めて重要なステップであるＳＡＲＭ１媒介性のＮＡＤ＋の切断を阻止する化合物を同定し、および／または特徴付けるアッセイの使用を示す。このアッセイを利用して、例えば、ＴＩＲドメインに触媒されるＮＡＤ＋の切断を阻害する化合物および潜在的にＳＡＭ媒介性の多量体化を妨害する化合物を同定し、および／または特徴付けることができる。このアッセイは、ＳＡＭドメインおよびＴＩＲドメインを包含するＳＡＲＭ１分子の断片を使用する。本明細書で実証されるように、自己阻害性Ｎ末端ドメインを有しないこの断片の発現は、ＮＡＤ＋を切断する活性な酵素を生成する。
【０２７０】
ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物（ＳＴＬ）の調製
ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ヒトニコチンアミドリボシドキナーゼ１（ＮＲＫ１）を発現するＦＣＩＶ発現ベクターを安定的にトランスフェクトされた細胞株であり、ＮＲＫ１は、ＮＡＤ＋生合成前駆体ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）を、ＮＡＤ＋の中間前駆体であるＮＭＮに変換する酵素である。この発現ベクターは、ＤＮＡ配列：
【化２５】
2019535804.tif 000035
【化２６】
2019535804.tif 000036
【化２７】
2019535804.tif 000037
【化２８】
2019535804.tif 000038
【化２９】
2019535804.tif 000039
を有する。これらのＮＲＫ１発現細胞にＮＲを添加した場合、ＮＡＤ＋レベルが増大し、細胞生存度が増進されて、構成的に活性なヒトＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ（配列番号１）タンパク質断片の効率的な産生および精製が可能となる。
【０２７１】
ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲを発現するために、ＳＡＲＭ１  Ｎ末端自己阻害ドメインを欠失させ、開始Ｍｅｔのみを残した。
【０２７２】
この開始Ｍｅｔ下流の、結果として得られるタンパク質は、Ｎ末端ＳＴＲＥＰ−ＴＡＧ（登録商標）を有し、ヒトＳＡＲＭ１の残基４１０〜７２１：
【化３０】
2019535804.tif 000040
から構成される。ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲタンパク質をコードする断片を標準的な方法によってＦＣＩＶ発現構築物にクローニングしてＦＣＩＶ−ＳＳＴベクターを生成した。結果として得られるベクターは以下の配列：
【化３１】
2019535804.tif 000041
【化３２】
2019535804.tif 000042
【化３３】
2019535804.tif 000043
【化３４】
2019535804.tif 000044
を有する。
【０２７３】
ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をプレートあたり２０×１０６個の細胞で１５０ｃｍ２のプレートに播種した。翌日、Ｘ−ＴＲＥＭＥＧＥＮＥ（商標）９  ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、製品番号０６３６５７８７００１）を使用して１５μｇのＦＣＩＶ−ＳＳＴ（ＳＡＭ−ＴＩＲ発現プラスミド、配列番号９）を細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの際に培養物に１ｍＭのＮＲを添加してＳＡＭ−ＴＩＲの過剰発現からの毒性を最小化した。トランスフェクションの４８時間後に細胞を収穫し、１，０００ｒｐｍでの遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＴ  １６Ｒ遠心分離機、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）によってペレット化し、冷ＰＢＳ（０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水、ＮａＣｌ  ０．１３８Ｍ；ＫＣｌ  ０．００２７Ｍ；ｐＨ７．４）で１回洗浄した。プロテアーゼ阻害剤（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｒｏｃｈｅ、製品番号１１８７３５８０００１）と共に細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｅｒ  ４５０、出力＝３、２０回のストローク）によって細胞溶解物を調製した。溶解物を遠心分離（１２，０００×ｇ、４℃で１０分間）して細胞破片を除去し、後にｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ  ＮＡＤアーゼアッセイ（下記を参照）において使用するために上清（ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲタンパク質を含有する）を−８０℃で貯蔵した。タンパク質濃度をビシンコニン酸（ＢＣＡ）法によって決定し、溶解物濃度を正規化するために使用した。
【０２７４】
化合物ライブラリー
ＮＣＩ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＶ化合物ライブラリーおよびＰｈａｒｍａｃｏｎ  １６００化合物ライブラリーをＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ阻害剤についてスクリーニングした。各化合物のストック濃度は１０ｍＭ（ＤＭＳＯ中）である。化合物を最初に１０倍に希釈して１ｍＭのストック（ＤＭＳＯ中）を製造した。このストックをさらに２０倍に希釈して２０％のＤＭＳＯ／８０％の水とし、各化合物の５０μＭのワーキングストックを製造した。
【０２７５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ  ＮＡＤアーゼアッセイおよび阻害剤スクリーニング
ＨＰＬＣベースのアッセイ１
ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ細胞溶解物（０．１４μｇの全タンパク質）、化合物ストック（５μＭの最終濃度）、およびＰＢＳ（ｐＨ７．４）を混合して１２μｌの最終体積にすることによって氷上で反応混合物を調製した。次いでＮＡＤ＋（５μＭの最終濃度）を加えて２０μｌの最終反応体積とした。混合物を３７℃で６０分間インキュベートした後、１８０μｌの０．５５Ｍの過塩素酸（ＨＣｌＯ４）を加えることによって反応を停止させた。次いで反応物を氷上に１０分間置き、反応プレートを４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＴ  １６Ｒ遠心分離機）。上清（１２０μｌ）を新たなプレートに移し、１０μｌの３ＭのＫ２ＣＯ３を加えて溶液を中和した。沈殿した塩を４，０００ｒｐｍでの１０分の遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＴ  １６Ｒ遠心分離機）によって除去した。上清を移し、ＫＩＮＥＴＥＸ（登録商標）（１００×３ｍｍ、２．６μｍ；ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（登録商標））カラムを用いてＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｎｅｘｅｒａ  Ｘ２）によって解析し、代謝物を２５４ｎｍでの吸光度によりモニターした。
【０２７６】
結果
ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物はＮＡＤ＋を切断する
ＨＰＬＣベースのアッセイ１を使用したところ、ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物は用量および時間依存的にＮＡＤ＋を切断した一方（図４Ａ、Ｃ、Ｄ）、トランスフェクトされていないＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から調製された対照溶解物はＮＡＤ＋の切断を示さなかった（図４Ｂ）。ＮＡＤ＋の減少にはニコチンアミド（Ｎａｍ）およびＡＤＰリボース（ＡＤＰＲ）の増加が付随し、ＮＡＤ＋のニコチンアミド−リボシル結合の切断を示す（図４Ａ）。示した時間にわたってＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物をＮＡＤ＋（５μＭ）とインキュベートした。図４Ａ（ＨＰＬＣトレースの２．５２分にピーク）に示すＮＡＤ＋レベルは時間と共に減少し、ＡＤＰＲレベルは増加した（１．１５分にピーク）。トレースの色：黒−ＮＡＤ単独；緑−溶解物；青−ビーズ上、緑は溶出液中。
【０２７７】
図４Ａについて、Ｓｔｒｅｐ  Ｔａｇアフィニティー法によってＳＡＲＭ１  Ｓａｍ−ＴＩＲタンパク質を精製した。２０μＬのＭａｇＳｔｒｅｐ（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ）ｔｙｐｅ  ３  ＸＴビーズ懸濁物（ＩＢＡ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）と３０分間ＨＥＫ−ＮＲＫ１溶解物（１００ｕｌ）をインキュベートした（緩衝液Ｗ：１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１５０ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ中）。次いでビーズを緩衝液Ｗで３回洗浄し、結合したタンパク質を緩衝液Ｗ中で２５ｍＭのビオチンを用いて３０分間ＭａｇＳｔｒｅｐ  ｔｙｐｅ  ３  ＸＴビーズから溶出させた。溶出したタンパク質を含有する上清をＮＡＤアーゼ活性アッセイのために使用することができる。Ｐｉｅｒｃｅプロテアーゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号８８２６６）を全ての緩衝液中に加えた。図４Ａは、開始時の基質、ＮＡＤ、ならびに活性ＳＡＲＭ１  ＴＩＲ  ＮＡＤアーゼによって生成された切断生成物、ＡＤＰＲおよびニコチンアミド（ＮＡＭ）についてのＨＰＬＣトレースを示す。黒のトレースは、酵素を加えていないＮＡＤを示す。赤のトレースは、ＳＡＭ−ＴＩＲ含有溶解物が強力なＮＡＤアーゼ活性を有することを示す（ＮＡＤが失われ、生成物であるＡＤＰＲおよびＮＡＭが生成される）。青のトレースは、ＳＡＭ−ＴＩＲ酵素が上記のようにビーズ上で精製できること、およびこの酵素が活性であることを示す（再び、ＮＡＤの減少ならびにＡＤＰＲおよびＮＡＭの生成）。最後に、緑のトレースは、活性ＳＡＭ−ＴＩＲ酵素をビーズから溶出させることができ、この酵素は活性のままであることを示す（ＮＡＤの減少、ＡＤＰＲおよびＮＡＭの生成）。図４Ｂは、対照溶解物は同じ期間のインキュベーション後にＮＡＤ＋を消費しなかったことを示す。図４Ｃは、図４ＡにおけるＨＰＬＣトレースのＮＡＤ＋およびＡＤＰＲの定量的な値を示す。図４Ｄは、ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物によるＮＡＤ＋の切断が用量依存的であることを示す。ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物の示した量をＮＡＤ＋（５μＭ）と３７℃で６０分間インキュベートし、ＡＤＰＲへのＮＡＤ＋の変換をモニターした。図４Ｅは、対照およびＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物のいずれかの０．１４μｇのタンパク質を使用する６０分の反応後のＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ比の定量化を示す。これらの結果は、ＴＩＲアッセイ（図８を参照）を使用して観察されたＮＡＤアーゼ活性と合致する。
【０２７８】
要約すると、本実施例は、ＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインを含有する溶解物がＮＡＤアーゼ活性を含有することを実証する。
【０２７９】
ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ  ＮＡＤアーゼ阻害剤の同定および／または特徴付け
ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤を同定するために、反応物中のＮＡＤ＋および酵素切断生成物ＡＤＰＲのレベルをＨＰＬＣによって定量化した。これらの値から、各化合物についてＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ比を算出し、この比をＮＡＤ＋切断活性の指標として使用した（注記：ＨＥＫ２９３溶解物に由来する対照試料中の小さく残余の、しかし検出可能なＡＤＰＲシグナルがある）。この比を化合物阻害剤の非存在下で生成された比と比較した。ＮＡＤアーゼ活性の有意な低減（ＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ比＞４として定義される）を使用して、ＳＡＭ−ＴＩＲ触媒性のＮＡＤ＋の切断を阻害する化合物を同定した（図５Ａ〜Ｂ）。図５Ａは、ライブラリーからの１６００個全ての化合物の一次スクリーニングを示す（５μＭのＮＡＤ＋と共に５μＭの化合物）。図５Ｂでは、上パネルからの２０個のポジティブヒット（ＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ＞４を再試験した。２０個の元々の「ポジティブヒット」のうちの１８個は、二次スクリーニングにおいて阻害剤として再び同定された（対照：四角、反応時間なし；三角形：ＤＭＳＯ対照）。
【０２８０】
ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ  ＮＡＤアーゼ活性を阻害する化合物の同定および特徴付け
ＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ比を使用し、ＨＰＬＣベースのアッセイ１を使用してＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物のＮＡＤ＋切断活性を決定した。ＮＡＤ＋レベルを測定する任意の精密な定量的方法をＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の検出のために使用できることが理解されるものとする。ＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ比＝約１をベースライン対照（阻害剤なし）として確立した。アッセイはロバストであった（Ｚ’＝０．５３７、対照溶解物（ｎ＝１４）ＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ＝１９．５２±２．２５；ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物（ｎ＝１４）ＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ＝１．１８６±０．６０７（平均±ＳＤ）。対照条件において、少量のＡＤＰＲがＨＰＬＣによって検出された）（図４Ａ〜Ｂ）。実験的に生成された４：１の（ＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ）カットオフ値を使用し、ＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ＞４は、ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物のＮＡＤアーゼ活性の有意な抑制を表す。
【０２８１】
ＮＣＩ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ＩＶ化合物ライブラリーからの１６００個から２０個の化合物を一次スクリーニングにおいて阻害剤として同定した（図５Ａ）。これらのうちの１８個を二次スクリーニングにおいてポジティブ「ヒット」として同定し、これらのうちの１０個はＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ活性のロバストな阻害を示した（すなわち、ＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ＞１０（図５Ｂ；図６Ａ〜Ｃ）。
【０２８２】
次いで、初期スクリーニングで同定された阻害剤をＮＡＤ＋Ｇｌｏアッセイ（後述のセクションを参照）において試験し、該アッセイでは酵素サイクリング反応を用いてＮＡＤ＋濃度を決定した。アッセイ自体は再現性が高い（図７Ａ〜Ｂ）。図７Ａは、ＮＡＤ＋Ｇｌｏアッセイによって決定されるＮＡＤ＋をＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物（ＳＴＬ）は減少させたが対照（ｃｏｎ）溶解物は減少させなかったことを示す。高用量溶解物条件での上昇したＮＡＤ＋レベルは、ほぼ溶解物自体に由来するようである。図７Ｂは、アッセイが非常にロバストであることを示す（Ｚ’＝０．６６、対照の２時間の反応時間対ＳＡＭ−ＴＩＲの１時間の反応時間；Ｚ’＝０．７１、対照の２時間の反応時間対ＳＡＭ−ＴＩＲの２時間の反応時間）。対照の２時間のＮＡＤ＋＝１９６．２０±１５．６６ｎＭ；ＳＡＭ−ＴＩＲの１時間のＮＡＤ＋＝２２．４８±３．９８ｎＭ；ＳＡＭ−ＴＩＲの２時間のＮＡＤ＋＝８．１８±２．７９ｎＭ。初期ＨＰＬＣアッセイにおいて同定されたほとんどのヒット（１４／１８）は、ＮＡＤ＋−ＧｌｏアッセイにおけるＳＡＭ−ＴＩＲ  ＮＡＤアーゼ活性の有意な阻害を示した（図７Ｃ）。サイクリングアッセイはＨＰＬＣアッセイと高度に相関する。ＨＰＬＣからの１８個のうち１４個のヒットもＮＡＤアーゼ活性を有意に阻止した（発光強度の２倍の増加）。ＨＰＬＣアッセイ１についての相対的な比はＮＡＤ＋／ＡＤＰＲ比を表す一方、サイクリングアッセイについて、それはＩＣ５０＝約１５０ｎＭの比を表す（図７Ｄ）。２つの化合物がＮＡＤ＋Ｇｌｏアッセイにおいて最良の阻害を示した。ＮＳＣ６２２６０８のＩＣ５０＝約１５０ｎＭ。
【０２８３】
発光ベースのアッセイ。このアッセイは、ＨＰＬＣによって得られる結果を補完することができ、ＨＰＬＣ法で可能であるよりも化合物ライブラリースクリーニングのより高いスループットを可能とすることができる。このアッセイは、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ−ＧＬＯ（商標）アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ９０７１、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を適合させたものである。このアッセイにおいて、ＮＡＤ＋サイクリング酵素は、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨに変換する。ＮＡＤＨの存在下で、レダクターゼは、レダクターゼの基質であるプロルシフェリンをルシフェリンに酵素的に変換する。ルシフェリンはＵＬＴＲＡ−ＧＬＯＴＭ  ｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを使用して検出され、化学発光強度は試料中のＮＡＤ＋およびＮＡＤＨの量に比例する。本アッセイ条件下で、溶解物中に存在するＮＡＤ＋およびＮＡＤＨの量はこのアッセイで検出できず、検出される最終のＮＡＤ＋に対する任意の内因性の寄与を妨げる。アッセイを以下の通りに設定した：２μｌの阻害剤候補（最終濃度１μＭ、２％のＤＭＳＯ）、０．０７μｇの溶解物（２μｌ）、および２μｌの４００ｎＭのＮＡＤ＋。反応物を３７℃で６０分間インキュベートした後、６μｌのＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ−ＧＬＯ（商標）検出試薬を加えた。室温での３０分後、ＣＹＴＡＴＩＯＮ（商標）５イメージングリーダー（ＢＩＯＴＥＫ（登録商標））を使用して発光シグナルを定量化した。ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物はＮＡＤ＋の用量依存的な枯渇を触媒した一方、対照ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から調製された溶解物を用いて反応を行った場合にＮＡＤ＋レベルは減少しなかった（図７Ａ〜Ｄ）。
【０２８４】
（実施例２）
本実施例は、ＳＡＲＭ１  ＴＩＲベースのアッセイを記載する。このアッセイは実施例１に記載のアッセイに類似するが、ＴＩＲドメインと直接的に相互作用する化合物の同定および／または特徴付けを可能とする一方、実施例１に記載のアッセイは、ＳＡＭドメイン相互作用を妨害する化合物も同定することができる。このアッセイは、アフィニティー精製できるＳＡＲＭ１  ＴＩＲ断片のタグ付きバージョンの細菌発現を使用する。固体表面（すなわち、アフィニティービーズ）上にこの人工的なＳＡＲＭ１  ＴＩＲドメインを提示することで活性のＮＡＤ＋切断酵素が生成される。
材料および方法
タグ付きタンパク質は以下を含んでいた：ＳｔｒｅｐＴａｇ−ヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲ−６×ＨｉｓＴａｇ
【化３５】
2019535804.tif 000045
ＳｔｒｅｐＴａｇ−マウスＳＡＲＭ１−ＴＩＲ−６×ＨｉｓＴａｇ
【化３６】
2019535804.tif 000046
ＳｔｒｅｐＴａｇ−ゼブラフィッシュＳＡＲＭ１−ＴＩＲ−６×ＨｉｓＴａｇ
【化３７】
2019535804.tif 000047
【０２８５】
細菌によるタンパク質発現およびタンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）
ＳＡＲＭ１のＴＩＲドメインをＮ末端はタンデムなＳＴＲＥＰ−ＴＡＧ（登録商標）、Ｃ末端はポリヒスチジンタグでタグ付けし、ｐＥＴ３０ａ＋プラスミドにクローニングした。次いで、構築物でＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ−ｃｏｌｉ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を形質転換し、単一コロニーを終夜成長させた。翌日、培養物をＬＢ培地で希釈し、Ａ６００＝０．４〜０．８となるまで３０℃で成長させ、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭの最終濃度）を加えた。細菌をさらに４時間成長させ、遠心分離によってペレット化し、ＰＢＳで洗浄し、−８０℃で貯蔵した。タンパク質精製のために、冷凍した細菌ペレットを氷上で解凍し、結合緩衝液（プロテアーゼ阻害剤なし）に再懸濁し、１００μｇ／ｍＬのリゾチームと１５分間氷上でインキュベートした。次いでプロテアーゼ阻害剤カクテルを加え、細胞を超音波処理によって溶解した。
【０２８６】
ＳＡＲＭ１  ＴＩＲタンパク質を最初にＳｔｒｅｐ  Ｔａｇアフィニティー法によって精製し、該方法では、細菌溶解物を２０μＬのＭａｇＳｔｒｅｐ（ＳＴＲＥＰ−ＴＡＣＴＩＮ（登録商標）、ＩＢＡ  ＧｍＢＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）ｔｙｐｅ  ３  ＸＴビーズ懸濁物（ＩＢＡ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）と３０分間インキュベートした。次いで、ビーズを結合緩衝液で３回洗浄し、結合したタンパク質を２２．５ｍＭのビオチンを用いて２５分間ＭａｇＳｔｒｅｐ  ｔｙｐｅ  ３  ＸＴビーズから溶出させた。溶出したタンパク質を含有する上清をＭａｇＳｔｒｅｐビーズから分離させ、１０μＬのＣｏ２＋  ＤＹＮＡＢＥＡＤ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）懸濁物と３０分間インキュベートしてＨｉｓタグを介してＳＡＲＭ１−ＴＩＲタンパク質に結合させた。次いで、ビーズを結合緩衝液で少なくとも２回洗浄し、ＮＡＤアーゼアッセイのために１００μＬの結合緩衝液に再懸濁した。
【０２８７】
１０マイクロリットルの精製されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲ担持ビーズを反応緩衝液（９２．４ｍＭのＮａＣｌおよび０．６４×ＰＢＳ）中５μＭのＮＡＤ＋とインキュベートした。示した期間にわたって２５℃で反応を実行し、１Ｍの過塩素酸（ＨＣｌＯ４）を加え、チューブを氷上に置くことによって反応を停止させた。ＨＣｌＯ４／Ｋ２ＣＯ３法を使用してＮＡＤ＋代謝物を抽出し、ＨＰＬＣによって定量化した（下記の代謝物測定を参照）。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析のために、蒸留水およびクロロホルム中の５０％のメタノールを使用して抽出を行った（下記のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ代謝物測定を参照）。図８は、ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲアッセイにおいて阻害剤として同定された一部の化合物がｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて精製されたＳＡＲＭ１  ＴＩＲのＮＡＤアーゼ活性も阻害することを示す。ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物スクリーニングから同定された選択された強力な阻害剤（６２２６０８、６２２６８９）を５μＭで反応物に加えた。ＮＡＤは０分での対照に対して正規化した。
【０２８８】
ＨＰＬＣでの代謝物測定
１ＭのＨＣｌＯ４を用いて抽出することによって代謝物を酵素反応混合物から単離し、３ＭのＫ２ＣＯ３を用いて中和した後、遠心分離によって分離した。抽出された代謝物を含有する上清（９０μＬ）を０．５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（１０μＬ）と混合し、ＫＩＮＥＴＥＸ（登録商標）（１００×３ｍｍ、２．６μｍ；ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（登録商標））カラムを用いてＨＰＬＣ（Ｎｅｘｅｒａ  Ｘ２）によって代謝物を解析し、２５４ｎｍでの吸光度により代謝物をモニターした。ＮＡＤ＋、ニコチンアミド（Ｎａｍ）、ＡＤＰリボース（ＡＤＰＲ）の内部標準を使用して各々の化合物の定量化用の標準曲線を生成した。各実験試料中の各化合物のレベルを、並行して解析した０分時点に対して正規化した。
【０２８９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳでの代謝物測定
反応物を蒸留水中の５０％のメタノールと混合することによって試料を調製した。試料を氷上に置き、遠心分離し、上清中の可溶性代謝物をクロロホルムを用いて抽出し、水相を凍結乾燥し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析まで−２０℃で貯蔵した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのために、代謝物試料を５ｍＭのギ酸アンモニウムを用いて再構成し、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、清澄化された上清を代謝物の同定および定量化のためにＬＣ−ＭＳ／ＭＳに適用した。ＳＹＮＥＲＧＩ（商標）Ｆｕｓｉｏｎ−ＲＰ（４．６×１５０ｍｍ、４μｍ；ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（登録商標）、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｔｏｒａｎｃｅ、ＣＡ）カラムを用いてＨＰＬＣシステム（１２９０；Ａｇｉｌｅｎｔ）によって液体クロマトグラフィーを行った。移動相Ａについては５ｍＭのギ酸アンモニウム、移動相Ｂについては１００％のメタノールを用いて０．５５ｍｌ／分の流量で試料（１０μｌ）を注入し、代謝物を０〜７分、０〜７０％のＢ；７〜８分、７０％のＢ；９〜１２分、０％のＢの勾配で溶出させた。ポジティブＥＳＩ多重反応モニタリング（ＮＡＤ＋：６６４＞４２８、１６０Ｖ（フラグメンテーション）、２２Ｖ（衝突）、７Ｖ（加速後））下でＴｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄ質量分析計（６４６０  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ；ＡＧＩＬＥＮＴ（登録商標））を用いて代謝物を検出した。標準曲線を用いてＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ定量解析ツール（ＡＧＩＬＥＮＴ（登録商標））によって代謝物を定量化した。５ｍＭのギ酸アンモニウム中で再構成されたＮＡＤ＋、ＡＤＰＲ、およびＮａｍを解析することによって各化合物の標準曲線を生成した。各実験試料中の各化合物のレベルを、並行して解析した０分時点に対して正規化した。試料の正体を実験を行う個体には分からないようにした。
【０２９０】
（実施例３）
本実施例は、培養ニューロンの軸索においてＳＡＲＭ１媒介性のＮＡＤ消費を阻害する化合物の同定および／または特徴付けを可能とするＮＡＤフラックスアッセイを示す。このアッセイは、ニューロンにおけるニューロン損傷によって活性化された全長ＳＡＲＭ１タンパク質を利用する。このアッセイでは、軸索におけるＮＡＤ＋の損傷活性化ＳＡＲＭ１依存的分解を測定する。この方法は、ＮＡＤ＋合成およびＮＡＤ＋消費の独立した評価を可能とする。
【０２９１】
ＤＲＧニューロン培養物
マウス後根神経節（ＤＲＧ）を胎生（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｄａｙ）１３．５のＣＤ１マウス胚（胚あたり約５０個の神経節）から解剖し、０．０２％のＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する０．０５％のトリプシン溶液と３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、軽くピペッティングすることによって細胞懸濁物を粉砕し、ＤＲＧ成長培地（２％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｎｇ／ｍｌの２．５Ｓ  ＮＧＦ（Ｈａｒｌａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｔｓ）、１μＭのウリジン（Ｓｉｇｍａ）、１μＭの５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含有する神経基礎培地（Ｇｉｂｃｏ））で３回洗浄した。１００μｌの培地／５０個のＤＲＧの比で細胞をＤＲＧ成長培地に懸濁した。これらの懸濁物の細胞密度は約７×１０６細胞／ｍｌであった。ポリ−Ｄ−リシン（０．１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）およびラミニン（３μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングした２４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して細胞懸濁物（１０μｌ）をウェルの中心に置いた。細胞を湿潤組織培養インキュベーター（５％のＣＯ２）中で１５分間接着させた後、ＤＲＧ成長培地を穏やかに加えた（５００μｌ）。
【０２９２】
軸索代謝物の収集
ＤＩＶ６において、代謝物収集の０時間前（対照のＮＡＤ＋消費）または４時間前（切断された軸索のＮＡＤ＋消費）に顕微鏡下で顕微手術ブレードを使用してニューロン細胞体および軸索を分離した。次いで、ＤＲＧ培養物を氷上に置き、培養培地を氷冷した０．９％のＮａＣｌ溶液（０．５μｌ）と置き換え、ピペットを使用してＤＲＧ細胞体を除去した。０．９％のＮａＣｌ溶液を除去し、ＭｅＯＨおよび水の氷冷した１：１混合物（ウェルあたり１５０μｌ）と氷上で１０分間インキュベートすることによって軸索代謝物を抽出した。代謝物含有溶液を試験チューブに移し、クロロホルム（試料あたり１００μｌ）を用いて２回抽出した。水相（１２０μｌ）を凍結乾燥し、５０μｌの５ｍＭのギ酸アンモニウムを用いて再構成し、１２，０００×ｇで１０分間の遠心分離後の清澄化された上清を試料バイアルに移し、測定した。
【０２９３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用するＮＡＤ＋測定
５ｍＭのギ酸アンモニウム中のＮＡＤ＋の連続希釈物（２５μＭ〜３２０ｐＭ、Ｓｉｇｍａ）を較正のために使用した。移動相Ａには５ｍＭのギ酸アンモニウム、移動相Ｂには１００％のメタノールを用いて０．５５ｍｌ／分の流量で注入した１０μｌの各試料により液体クロマトグラフィーを行った（ＨＰＬＣ：１２９０；ＡｇｉｌｅｎｔおよびＳｙｎｅｒｇｉ  Ｆｕｓｉｏｎ−ＲＰ（４．６×１５０ｍｍ、４μｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ））。０〜７分、０〜７０％のＢ；７〜８分、７０％のＢ；９〜１２分、０％のＢの勾配で代謝物を溶出させた。ポジティブＥＳＩ多重反応モニタリング（ＭＲＭ）下でＴｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄ質量分析計（６４６０  ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ；Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて代謝物を検出した（Ｄ４−ＮＡＤ＋：６６８＞４２８、Ｄ３−ＮＡＤ＋：６６７＞４２８、ＮＡＤ＋：６６４＞４２８、１６０Ｖ（フラグメンテーション）、２２Ｖ（衝突）、７Ｖ（加速後））。標準曲線を用いてＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ定量解析ツール（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって代謝物を定量化した。
【０２９４】
ＮＡＤ＋消費の測定
ＮＡＤ＋消費の測定のために、ＤＲＧニューロンをＤ４−Ｎａｍ（３００μＭ：２，３，４，５重水素Ｎａｍ；Ｃ／Ｄ／Ｎ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｄ−３４５７）と４時間インキュベートし、軸索代謝物を上記の通りに収集した。軸索損傷後のＮＡＤ＋フラックス測定のために、Ｄ４−Ｎａｍを軸索切断と同時に加えた。標識化（重い）または非標識化（軽い）ＮＡＤ＋をＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって定量化した。重標識化ＮＡＤ＋について、Ｄ３−ＮＡＤ＋の他にＤ４−ＮＡＤ＋を観察した。これは、ＮＡＤ＋−ＮＡＤＨサイクリングの間の非標識化プロトンによるＣ４位の重水素の置き換えによる。Ｄ３−ＮＡＤ＋およびＤ４−ＮＡＤ＋の値を加え、この合わせた値を重いＮＡＤ＋の量として使用した。Ｄ４−Ｎａｍの適用の４時間後に全ＮＡＤ＋（重いＮＡＤ＋および軽いＮＡＤ＋の和）に対する軽いＮＡＤ＋の減少の％によってＮＡＤ＋消費の正味の速度を算出し、％／ｈｒとして表した。軸索のＮＡＤ＋消費は、軸索切断なしで−８．５±３．８％／ｈｒであり、切断された軸索では−２１．７±１．６％／ｈｒに増加した。ＮＡＤ＋消費のこの加速は、ＳＡＲＭ１  ＫＯ軸索において完全に阻止され（非損傷での−６．３±２．４％／ｈｒに対して軸索切断後に−７．９±３．７％／ｈｒ）、損傷後のＳＡＲＭ１活性化の読取りのために使用することができる（図９）。図９は、ＳＡＲＭ１の枯渇がＮＡＤ＋消費の増加を完全に阻止したことを示す。したがって、増加したＮＡＤ＋消費は、損傷したニューロンにおけるＳＡＲＭ１活性化の読取りとして使用することができる。一元配置分散分析Ｆ（３，３２）＝５０．６、ｐ＝３×１０〜１２。＊ｐ＜０．００５は、ホルム−ボンフェローニの多重比較による非切断の対照からの有意差を示す（ｎ＝９）。
【０２９５】
ニューロンにおけるＳＡＲＭ１阻害剤の有効性を評価するためのＮＡＤ＋消費アッセイ
選択された化合物（Ｄ４−Ｎａｍの追加の３０分前の最終濃度５μＭ）の他に３００μＭのＤ４−ＮａｍをＤＲＧ培養培地に加え、軸索を直ちに離断するか（３つのウェル）または無傷のままとした（３つのウェル）。Ｄ４−Ｎａｍの追加の４時間後に軸索代謝物を収集し、代謝物を上記の通りに解析することができる。軸索切断の前後のＮＡＤ＋消費速度を算出することができる。ＳＡＲＭ１の非存在下（ＳＡＲＭ１ノックアウト、ＫＯ）で、ＮＡＤ＋消費速度の軸索切断誘導性の増加がないという実証がここに示される（図９）。したがって、ＳＡＲＭ１活性化に対する化合物の阻害効果は、損傷後ＮＡＤ＋消費速度の減少によって評価することができる。このアッセイは、培養ニューロンの軸索におけるＳＡＲＭ１阻害剤の有効性を試験する。
【０２９６】
（実施例４）
本実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ軸索変性アッセイおよび化合物を特徴付けるためのこのアッセイの適用を示す。本実施例では、このアッセイを使用して、損傷後に軸索のＮＡＤ＋の減少が迅速に引き続いて起こる軸索変性をＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤が阻害できるかどうかを試験する。
【０２９７】
軸索切断によって、またはＤＩＶ６における９６ウェル中のＤＲＧドロップ培養物を使用するビンクリスチン（０．０４μＭ）の追加によって軸索変性を誘導した。顕微鏡下で顕微手術ブレードを使用して細胞体および軸索を分離することによって軸索切断を行った。軸索の明視野画像（ウェルあたり６視野）を２０×の対物レンズと共にｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｍａｇｅｒ（Ｏｐｅｒｅｔｔａ；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して軸索切断の０〜７２時間後に撮影した。ＩｍａｇｅＪを使用して算出された変性指数（ＤＩ）を使用して軸索変性を定量化した（NIH、Sasakiら、２００９年、J.  Neurosci.、１９巻（１７号）：５５２５〜５５３５頁）。ウェルあたり６視野からの平均ＤＩを得、各独立したウェルについて平均化した。軸索切断の前（０時間）および後（９〜７２時間）の同じ視野からの軸索画像からＤＩを算出した。実施例１〜３のアッセイからのＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の有意な阻止を伴う化合物（図１０Ａ）を、上記の通りにＤＲＧニューロンの培養物における軸索変性に対する効果について試験した。ＨＰＬＣスクリーニングからの１８個全てのポジティブヒットを軸索変性を阻害する能力について（５μＭで）試験した。軸索切断の３０分前に０．０５〜５μＭの濃度で候補化合物を培養培地に加えた。損傷前、および軸索切断後の様々な時点に軸索を画像化することによって軸索変性をモニターした。
【０２９８】
結果
図１０Ａは、損傷前および損傷（軸索切断）の２４時間後の軸索変性指数を示す。より高い変性指数は、より多くの軸索変性（すなわち、より低い阻害）を示す。図１０Ｂは、有意な保護を示す代表的な化合物を示す（ＮＳＣ６２２６０８）。軸索切断の前後の代表的な画像を示す。図１０Ｃは、化合物ＮＳＣ６２２６０８による軸索変性の用量依存的な阻害を示す。
【０２９９】
したがって、本実施例は、化合物を特徴付けるための軸索変性アッセイの開発の成功を実証する。さらに、本実施例は、ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ  ＮＡＤアーゼ活性の阻害剤として本開示において同定された化合物は用量依存的な様式で軸索変性を阻害することも実証する。
【０３００】
（実施例５）
本実施例は、哺乳動物細胞から精製されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲ複合体がＮＡＤ＋を切断することを実証する。
【０３０１】
本実施例はまた、ＮＡＤ＋枯渇アッセイの適用も示す。
【０３０２】
ヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインを、Ｎ末端はタンデムなＳｔｒｅｐＴａｇ  ＩＩで、Ｃ末端はＶｅｎｕｓ蛍光タグで操作し、ＮＲを添加したＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中でそれを一過的に発現させた。その後に、超音波処理によってネイティブ条件下で細胞を溶解することによって細胞溶解物を調製し、ＭａｇＳｔｒｅｐ（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ）磁気ビーズを使用して組換えＳＡＲＭ１−ＴＩＲタンパク質複合体をアフィニティー精製した。ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ複合体を伴うビーズを最大３０分間ＮＡＤ＋（５μＭ）とインキュベートし、代謝物を抽出した後、ＨＰＬＣを使用してＮＡＤ＋レベルを測定した（図２Ｂ）。ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ複合体を担持したビーズを試験した時、ＮＡＤ＋レベルは５分以内に急激に低下した（図２Ｃ）。対照的に、溶解物に曝露されるビーズが、トランスフェクトされていないＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＳｔｒｅｐＴａｇ  ＩＩを欠いたＳＡＲＭ１−ＴＩＲを発現するＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のいずれかから調製された場合、ＮＡＤ＋の減少は観察されなかった（図２Ｃ）。損傷誘導性の軸索のＮＡＤ＋枯渇および変性を支持できないＴＩＲドメイン変異体［ＳＡＲＭ１（Ｅ５９６Ｋ）］も試験した。このＳＡＲＭ１（Ｅ５９６Ｋ）変異体に集合した複合体を担持した磁気ビーズは、このｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＮＡＤ＋を分解しなかった（図２Ｃ）。
【０３０３】
ＳＡＲＭ１−ＴＩＲのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＡＤアーゼ反応の基質特異性を調べた。
【０３０４】
Gerdts,  J.ら（Science、２０１５年、３４８巻、４５３〜４５７頁）は以前に、ＮＡＤ＋の密接に関連するアナログであるニコチン酸アデニンジヌクレオチド（ＮａＡＤ）は、ＳＡＲＭ１活性化後に切断されないことを示した。このｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、野生型ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ複合体がＮａＡＤを分解しないことが分かった（図２Ｄ）。これらの結果は合わせて、精製されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲ複合体は、軸索変性プロセスの先行する特徴付けと合致する様式でＮＡＤ＋を能動的に分解することを示す。
【０３０５】
酵素活性がＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインに関連する複合体に独特であるかどうか、または他のタンパク質からのＴＩＲドメインもＮＡＤアーゼ活性を呈する複合体を集合させることができるかどうかを次に調査した。ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ様受容体）およびＭｙＤ８８（ＴＩＲアダプターファミリーの別のメンバー）のＴＩＲドメインをＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から発現および精製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＡＤ＋枯渇アッセイでそれらを試験した。ＴＬＲ４およびＭｙＤ８８の両方のＴＩＲ含有複合体は、ＮＡＤアーゼ活性を示さなかった（図２Ｅおよび図２Ｆ）。これらの結果は、軸索変性およびニューロンのＮＡＤ＋枯渇の促進におけるＴＩＲアダプタータンパク質の中でのＳＡＲＭ１の以前に報告された独特の役割を支持する（Gerdts,  Jら、Science、２０１５年、３４８巻、４５３〜４５７頁；O'Neill,  L.A.ら、Nat.  Rev.  Immunol.、２０１３年、１３巻、４５３〜４６０頁、Summers,  D.W.ら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA.、２０１６年、１１３巻、Ｅ６２７１〜Ｅ６２８０頁）。
【０３０６】
（実施例６）
本実施例は、本明細書に記載される他の実験において観察されたＮＡＤ＋切断活性が、ＳＡＲＭ１−ＴＩＲと共精製された他のタンパク質によるものではないこと、したがってＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインが内因性のＮＡＤ＋切断活性を持つことを実証する。さらに、本実施例は、このＮＡＤ＋切断活性の特徴付け、およびＳＡＲＭ１−ＴＩＲ酵素反応がシクラーゼ活性およびグリコヒドロラーゼ活性の両方を含むことを記載する。
【０３０７】
ＮＡＤアーゼ活性を有するタンパク質が共精製されないようにヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲをＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉ中のＳＡＲＭ１−ＴＩＲ発現は、ＩＰＴＧを加えることによって誘導し、内因性代謝物を抽出し、ＮＡＤ＋レベルをＨＰＬＣによって評価した。野生型ＳＡＲＭ１−ＴＩＲを産生する細菌は、非組換えベクターを宿す細菌と比べた時にＩＰＴＧを加えて６０分以内に際立って低い（ほぼ検出不可能な）内因性ＮＡＤ＋のレベルを有した。さらに、変異体ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ（Ｅ５９６Ｋ）を宿す細菌は、非組換えベクターを宿す細菌または野生型ＳＡＲＭ１が誘導されない細菌と同等のＮＡＤ＋レベルを有した（図１１Ａ）。図１１Ａは、ヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲのＩＰＴＧ誘導後の細菌中の内因性ＮＡＤ＋レベルを示す。細菌により発現されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲをＴＡＰを使用して精製し、ＮＡＤアーゼ活性について試験した。実施例５における哺乳動物細胞から単離されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲ複合体を使用した結果と合致して、細菌により産生されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲタンパク質によってＮＡＤ＋は迅速に消費された（図１１Ｂ）。図１１Ｂは、細菌から発現および精製されたヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲタンパク質によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＡＤ＋切断反応を示す。ヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲがＥ．ｃｏｌｉ  ＮＡＤアーゼと会合する可能性は非常に低いが、ＳＡＲＭ１  ＴＩＲ精製複合体を高濃度の塩または界面活性剤でストリンジェントに洗浄して潜在的な会合タンパク質を除去することによってＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の内因性の性質を試験した。これらの洗浄されたＳＡＲＭ１  ＴＩＲビーズを使用したところ、ＮＡＤ＋切断活性の減少は見られず、ＳＡＲＭ１自体がＮＡＤアーゼ活性を有することを示した（図１１Ｅおよび図１１Ｆ）。
【０３０８】
マウス、ゼブラフィッシュおよびショウジョウバエＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインをＥ．ｃｏｌｉで発現および精製した。次いで、精製されたタンパク質をＮＡＤ＋を切断する能力について試験した。ヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインと類似して、細菌により発現されたマウス、ゼブラフィッシュおよびショウジョウバエＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインもまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＡＤ＋を迅速に分解する（図１１Ｃ〜Ｄ）。図１１Ｃは、細菌により発現されたマウス、ゼブラフィッシュおよびショウジョウバエＳＡＲＭ１−ＴＩＲタンパク質がｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＮＡＤアーゼアッセイにおいてＮＡＤ＋を切断することを示す。図１１Ｄは、３つの独立した実験の代表的な、ＮＡＤアーゼアッセイにおいて使用された細菌から精製されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲ担持ビーズのＳＹＰＲＯ  Ｒｕｂｙゲルを示す。これらの細菌により発現されたタンパク質は、Ｖｅｎｕｓ蛍光タグを欠いており、したがってＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現されたタンパク質とは異なる大きさに移動する。少なくとも３つの独立した細菌クローンからの精製されたタンパク質を使用する少なくとも３つの独立した反応実験からデータを作成した。データを平均±ＳＥＭとして表す；エラーバー：ＳＥＭ；＊＊＊Ｐ＜０．００１、対応のない両側スチューデントのｔ検定。
【０３０９】
ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ自体が酵素活性を持つことを決定的に実証するために、転写および翻訳のために精製されたＥ．ｃｏｌｉ成分を利用する無細胞タンパク質発現システムにおいてヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲを合成した。精製されたＥ−ｃｏｌｉ転写／翻訳成分のいずれも公知のＮＡＤアーゼではなく（Shimizuら、Nat.  Biotechnol.、２００１年、１９巻、７５１〜７５５頁）、これらの実験により、これらの精製された成分はＮＡＤアーゼ活性を呈しないことが確認された（図１１Ｇ）。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳システムから精製されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲがＮＡＤ＋を切断できるかどうかを試験するために、ヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲプラスミドＤＮＡを最初に、精製された転写および翻訳試薬ならびにＲＮアーゼ阻害剤と３７℃で２．５時間インキュベートした。次に、反応から新たに合成されたタンパク質をＴＡＰによって精製し、アッセイにおいてＮＡＤアーゼ活性について試験した（図３０）。この無細胞タンパク質翻訳システムから精製されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲはＮＡＤ＋を迅速に切断し、哺乳動物細胞および細菌の両方から精製されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲでの以前の知見と合致した（図３１および図３２）。理論によって限定されるものではないが、ＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインが細菌においてＮＡＤ＋を枯渇させ、複数の種からの細菌により合成されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲがｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＡＤ＋を切断するという知見は、ＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインが内因性のＮＡＤアーゼ活性を有することを実証し、ＳＡＲＭ１自体が軸索損傷後に観察されるＮＡＤ＋の枯渇に関与することを示す。さらに、これらの知見は、タンパク質相互作用ドメインとして機能することが以前に実証されたＴＩＲドメインが酵素活性も宿すことができることを初めて明らかにする。
【０３１０】
ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ  ＮＡＤアーゼ活性をさらに特徴付けるために、この酵素反応のＮＡＤ＋切断生成物を同定し、反応パラメーターを確立した。ヒトＳＡＲＭ１−ＴＩＲによって産生された代謝物のＨＰＬＣおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析を行い、ＮａｍおよびＡＤＰリボース（ＡＤＰＲ）を主生成物として同定し、サイクリックＡＤＰＲ（ｃＡＤＰＲ）を微量生成物として同定した（図１２Ａ〜Ｇ）。マウスおよびゼブラフィッシュのオルソログはヒト酵素と類似の反応生成物の比を生成したが（図１２Ｈ）、細菌またはＮＲＫ１−２９３Ｔ細胞のいずれかから精製されたショウジョウバエＳＡＲＭ１−ＴＩＲは、ＡＤＰＲより多くのｃＡＤＰＲを生成した（図１２Ａ〜Ｇ）。この知見は、ＮＡＤアーゼのＡＤＰリボシルシクラーゼファミリーでの結果（Liuら、J.  Biol.  Chem.、２００９年、２８４巻、２７６３７〜２７６４５頁）と類似し、該結果では哺乳動物ＡＤＰリボシルシクラーゼＣＤ３８はＮＡＤ＋を切断して、微量のｃＡＤＰＲと共に主生成物としてＡＤＰＲを生成する一方、海洋軟体動物Ａｐｌｙｓｉａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａから単離されたＡＤＰリボシルシクラーゼは、ＮＡＤ＋をｃＡＤＰＲに切断する（Liuら、J.  Biol.  Chem.、２００９年、２８４巻、２７６３７〜２７６４５頁）。ショウジョウバエおよび脊椎動物のＳＡＲＭ１−ＴＩＲ  ＮＡＤアーゼの間の反応生成物のこの差異は、ＡＤＰリボシルシクラーゼファミリー酵素の多様化した酵素活性に関する洞察を提供し得る。
【０３１１】
さらには、ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ酵素の動態アッセイは飽和動態を明らかにし（図１２Ｉ）、２４μＭの推定のミカエリス定数（Ｋｍ）、３．６μＭ／分の最大速度（Ｖｍａｘ）、および１０．３分−１のターンオーバー数（ｋｃａｔ）を有して酵素触媒が際立って特徴的であった（図１２Ｉ）。ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ切断反応の動態パラメーター。Ｖｍａｘ、Ｋｍ、ｋｃａｔは、データをミカエリス・メンテン式にフィッティングすることによって決定し、３つの独立した生体試料および実験の平均±ＳＥＭとして表す。推定のｋｃａｔは他のＡＤＰリボシルシクラーゼおよびＮＡＤ＋グリコヒドロラーゼについて報告された値（Ghoshら、J.  Biol.  Chem.、２０１０年、２８５巻、５６８３〜５６９４頁）より低いが、推定のＫｍ値は類似している（Cantoら、Cell  Metab.、２０１５年、２２巻、３１〜５３頁）。
【０３１２】
反応生成物を試験して、それらがＳＡＲＭ１−ＴＩＲの酵素活性を阻害できるかどうかを決定した。ＡＤＰＲはＳＡＲＭ１−ＴＩＲ  ＮＡＤアーゼ活性を阻害しなかったが（図１２Ｊ；５分時に生成されたＮａｍに対して正規化した活性）、Ｎａｍは４３．８μＭのＩＣ５０で酵素活性を阻害することができ、これは開始時の反応ＮＡＤ＋濃度より約９倍高い（図１２Ｋ〜Ｌ）。図１２Ｋは、ＮａｍがＳＡＲＭ１−ＴＩＲ酵素活性（５分時に生成されたＡＤＰＲに対して正規化）を阻害することを示す。図１２Ｌは、ＳＡＲＭ１−ＴＩＲ酵素活性のＮａｍ用量応答阻害を示す。ニコチンアミドに倣ったＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインの阻害剤は初期の軸索変性の予防に有用であり得る（Gerdts,  Jら、Neuron、２０１６年、８９巻、４４９〜４６０頁；Fliegert,  R.ら、Biochem.  Soc.  Trans.、２００７年、３５巻、１０９〜１１４頁）。
【０３１３】
これらのデータは、ＳＡＲＭ１のＴＩＲドメインがＮＡＤ＋をＮａｍおよびＡＤＰＲに切断することを実証した。ＳＡＲＭ１−ＴＩＲはこれに関して独特であると考えられ、他の試験されたＴＩＲドメインはこの活性を有しない。ＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインの結晶構造は、ＮＡＤ＋結合ポケットの他にＮＡＤ＋の切断に関与する他の鍵となる残基の同定において重要であり得る。
【０３１４】
要約すると、これらの結果は、ＴＩＲドメインに内因性の初めての酵素活性を説明する。これらのデータは、保存された軸索死プログラムにＮＡＤアーゼ活性が不可欠であることを確立する。ＳＡＲＭ１が軸索のＮＡＤアーゼであるという発見（図１２Ｊ）はここで、神経変性疾患の治療用の新規治療剤候補としての阻害剤の設計のための同定された標的を提供する。
【０３１５】
（実施例７）
本実施例は、ＳＡＲＭ１の酵素活性の阻害剤としておよび／または切断反応の基質としての活性に関してニコチンアミド（公知のＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤）のアナログおよびＮＡＤ＋のアナログの特徴付けを記載する。実施例２に記載されるＳＡＲＭ１  ＴＩＲ断片の細菌により発現されたタグ付きバージョンを使用するアッセイを使用してこれらのアナログを試験した。固体表面（すなわち、アフィニティービーズ）上でのこの人工的なＳＡＲＭ１  ＴＩＲドメインの提示は活性のＮＡＤ＋切断酵素を生成する。
【０３１６】
【表４】
2019535804.tif 000048
【０３１７】
（実施例８）
本実施例は、グルタミン酸６４２がＳＡＲＭ１−ＴＩＲ酵素の活性部位中の触媒性残基であることを示す。
【０３１８】
ＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインの結晶構造の報告はないので、バイアスなしの鋳型ベースの予測（Soeding,  J.ら、Nucleic  Acids  Res.、２００５年、３３巻、Ｗ２４４〜２４８頁）を使用してＳＡＲＭ１−ＴＩＲのタンパク質ホモログを同定した。最近のバイオインフォマティクス研究は、一部のＴＩＲドメインがヌクレオチド／ヌクレオシドヒドロラーゼに対して強い構造的類似性を共有することを示した（Burroughs,  A.M.ら、Nucleic  Acids  Res.、２０１５年、４３巻、１０６３３〜１０６５４頁）。ＳＡＲＭ１−ＴＩＲを使用するドメイン予測解析から、期待された通りに他のＴＩＲドメインが同定された。しかしながら、これらのＴＩＲドメインに加えて、多数のヌクレオチドヒドロラーゼ／トランスフェラーゼ酵素も検出された。これらの酵素の一部について触媒活性に寄与する残基が確立されている（Sikowitz,  M.D.ら、Biochemistry、２０１３年、５２巻、４０３７〜４０４７頁；Armstrong,  S.R.ら、Structure、１９９５年、４巻、９７〜１０７頁）。構造的モデル化および配列アラインメントを使用して、酵素活性に寄与する可能性があるＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメイン中の推定上の残基を同定した（図１６および図１７）。予測から同定された２つの酵素であるＭｉｌＢシチジン５’一リン酸（ＣＭＰ）ヒドロラーゼ（ＰＤＢ：４ＪＥＭ）（図１７）およびヌクレオシド２−デオキシリボシルトランスフェラーゼ（ＰＤＢ：１Ｆ８Ｙ）の結晶構造を使用してＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメインをモデル化した。ＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメイン中のグルタミン酸Ｅ６４２は、ＣＭＰヒドロラーゼ中の鍵となる触媒性グルタミン酸残基（Sikowitz,  M.D.ら、Biochemistry、２０１３年、５２巻、４０３７〜４０４７頁）およびヌクレオシド２−デオキシリボシルトランスフェラーゼの活性部位中の提案された求核性グルタミン酸（Armstrong,  S.R.ら、Structure、１９９５年、４巻、９７〜１０７頁）の両方とアラインメントされた（図１６および図１７）。さらに、グルタミン酸残基は、他のＮＡＤアーゼにおいても公知の触媒性残基である（Ghosh,  J.ら、J.  Biol.  Chem.、２０１０年、２８５巻、５６８３〜５６９４頁）。ＳＡＲＭ１  ＴＩＲ  Ｅ６４２が類似の触媒特性を有するかどうかを試験するために、この残基をＳＡＲＭ１−ＴＩＲにおいてアラニン（Ｅ６４２Ａ）に変異させ、無細胞タンパク質翻訳システムからタンパク質を精製し、ＮＡＤ＋切断活性について試験した。精製されたＳＡＲＭ１−ＴＩＲ  Ｅ６４２ＡはＮＡＤアーゼアッセイにおいてＮＡＤ＋を切断しなかった（図１８および図１９）。ＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメイン中のＥ６４２は、ＮＡＤ＋の切断に関与する活性部位内の鍵となる触媒性残基である。
【０３１９】
（実施例９）
本実施例は、ＳＡＲＭ１の酵素活性は、軸索において機能して病的な軸索変性を促進することを示す。
【０３２０】
ＳＡＲＭ１  ＴＩＲドメインが酵素であることが実証され、その触媒性残基が同定されたので、ＳＡＲＭ１−ＴＩＲドメイン、特に同定されたグルタミン酸の酵素活性を検討して、ニューロンにおける全長ＳＡＲＭ１の変性促進機能のためにこれらが必要とされるかどうかを決定した。野生型ニューロンにおいて、軸索切断は軸索のＮＡＤ＋の迅速な枯渇および軸索変性を誘発するが、ＳＡＲＭ１欠損ニューロンでは軸索変性は阻止され、ＮＡＤ＋レベルは損傷した野生型軸索におけるよりも有意に高いままである（Gerdtsら、Science、２０１５年、３４８巻、４５３〜４５７頁）。最初に、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を試験して、そのような活性が損傷誘導性の軸索のＮＡＤ＋の枯渇およびその後の軸索変性のために必要であるかどうかを決定した。これらの実験では、野生型（酵素的に活性の）全長ＳＡＲＭ１または変異体（酵素的に不活性の）ＳＡＲＭ１（Ｅ６４２Ａ）のいずれかを培養ＳＡＲＭ１欠損ＤＲＧニューロンで発現させた。図２０および図２１は、両方が軸索においてよく発現されたことを示す。軸索切断後、軸索のＮＡＤ＋レベルおよび軸索変性を測定した。
【０３２１】
ＳＡＲＭ１欠損ＤＲＧニューロンにおける酵素的に活性の野生型ＳＡＲＭ１の発現は、軸索切断後に軸索のＮＡＤ＋の枯渇および軸索変性の両方を促進する。
【０３２２】
野生型ＳＡＲＭ１とは対照的に、酵素的に不活性のＳＡＲＭ１（Ｅ６４２Ａ）変異体をこれらのニューロンにおいて発現させた場合、軸索切断は軸索変性も迅速なＮＡＤ＋の枯渇も誘導しなかった（図２２〜２４）。
【０３２３】
別の損傷モデルであるビンクリスチン誘導性神経毒性においてＳＡＲＭ１の酵素活性のための要件も試験した。培養ＳＡＲＭ１欠損ＤＲＧ軸索は、ビンクリスチン誘導性軸索変性から保護される（Gerdts,  J.ら、J.  Neurosci.、２０１３年、３３巻、１３５６９〜１３５８０頁）。さらに、ＳＡＲＭ１は、ビンクリスチン誘導性末梢性ニューロパチーの発症のためにマウスにおいて必要とされる（Geislerら、２０１６年、Brain、１３９巻、３０９２〜３１０８頁）。軸索切断と同様に、野生型（酵素的に活性の）全長ＳＡＲＭ１または変異体（酵素的に不活性の）ＳＡＲＭ１（Ｅ６４２Ａ）のいずれかを培養ＳＡＲＭ１欠損ＤＲＧニューロンにおいて発現させた。酵素的に活性のＳＡＲＭ１は化学療法剤ビンクリスチンに応答して軸索喪失を媒介するが、酵素的に不活性のＳＡＲＭ１はビンクリスチン投与後に軸索喪失を促進しない（図２５、および図２６）。これらの知見は合わせて、ＳＡＲＭ１の内因性のＮＡＤアーゼ活性（図２７）は、外傷性および神経毒性の両方の損傷後に軸索変性を促進するために必要であることを実証し、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼの阻害剤は病的な軸索変性を阻止し得ることを示唆する。
【０３２４】
（実施例１０）
本実施例は、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を有効に阻害する小分子ファミリーの同定および特徴付けを示す。
【０３２５】
本教示の方法を使用する初期スクリーニングは、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ阻害剤としてデクスランソプラゾールおよびテナトプラゾール（tenatorprazole）を同定した。これらの分子の両方は、タンパク質ポンプ阻害剤と称される分子クラスのメンバーである。５μＭのＮＡＤを用いて、実施例１に詳述するＨＰＬＣベースのＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ  ＮＡＤアーゼアッセイを使用して薬物クラスの残りをスクリーニングした。図２８は、５μＭ（系列１）、１５μＭ（系列２）、および５０μＭ（系列３）での、オメプラゾール（１）、ランソプラゾール（２）、エソメプラゾールマグネシウム水和物（３）、パントプラゾールナトリウムセスキ水和物（４）、ラベプラゾールナトリウム（５）、デクスランソプラゾール（６）およびテナトプラゾール（７）の試験を示す。ファミリーの各メンバーは少なくとも一部の阻害活性を呈した（図２８）。これらの結果に基づいて、ラベラプラゾール（rabeprozole）の用量応答解析（図２９）を行った。この分子は、１０μＭで９５％の阻害、３０μＭで９８．８％の阻害を示した。これらの結果は、この分子ファミリーがＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を有することを示す。
【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
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【化４１】
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【化４２】
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ＭｙＤ８８−５、ＳＡＭＤ２、ＳＡＲＭ１遺伝子のＳＡＲＭホモログとしても公知
ＳＡＲＭ１遺伝子は、チンパンジー、アカゲザル、イヌ、マウス、ラット、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、蚊、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ、およびカエルで保存されている。
【０３２６】
（実施例１１〜１６）
以下の実施例に示されるように、ある特定の例示的な実施形態では、化合物は以下の一般的手順に従って調製される。一般的方法は本開示のある特定の化合物の合成を描写するが、以下の一般的方法、および当業者に公知の他の方法を本明細書に記載される全ての化合物ならびにこれらの化合物のそれぞれのサブクラスおよび種に適用できることが理解されるものとする。
【０３２７】
一般的手順
以下は、式ＩＡおよび式ＩＢの化合物のＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を決定するために使用されるアッセイの説明である。
【０３２８】
アッセイ１．ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物（ＳＴＬ）の調製
ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ヒトニコチンアミドリボシドキナーゼ１（ＮＲＫ１）を発現するＦＣＩＶ発現ベクターを安定的にトランスフェクトされたポリクローナル細胞株であり、ＮＲＫ１は、ＮＡＤ＋の生合成前駆体ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）をＮＡＤ＋の中間前駆体であるＮＭＮに変換する酵素である。この発現ベクターは、ＤＮＡ配列：
【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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【化４６】
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【化４７】
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を有する。これらのＮＲＫ１発現細胞にＮＲを添加した場合、ＮＡＤ＋レベルが増大し、細胞生存度が増進されて、構成的に活性なヒトＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲタンパク質断片の効率的な製造および精製が可能となる。ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲを発現させるために、ＳＡＲＭ１  Ｎ末端自己阻害ドメインを欠失させ、開始Ｍｅｔのみを残した。この開始Ｍｅｔ（imitator  Met）から下流の、結果として得られるタンパク質は、ヒトＳＡＲＭ１の残基４１０〜７２１：
【化４８】
2019535804.tif 000059
からなる。ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲタンパク質をコードする断片を標準的な方法によってＦＣＩＶ発現構築物にクローニングしてＦＣＩＶ−ＳＳＴベクターを生成した。結果として得られたベクターは以下の配列を有していた：
【化４９】
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【化５０】
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【化５１】
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【化５２】
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【化５３】
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【０３２９】
９０％のＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  １１９６５−０８４）および１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｆ０９２６）からなる２５ｍＬの増殖培地中に、プレートあたり２０×１０６個の細胞で１５０ｃｍ２のプレートにＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。翌日、最初に１５ｕｇのＦＣＩＶ−ＳＳＴ  ＳＳＴ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙからのＳＡＭ−ＴＩＲ発現プラスミド）を４５ｕｌのＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ、製品番号０６３６５７８７００１）および７５０ｕｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ３１９８５０６２）と予め混合した後、この混合物を細胞に直接的に加えることによって細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの際に培養物に１ｍＭのニコチンアミドリボシド（Ｔｈｏｒｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＴＨＲ−００４６７）を添加してＳＡＭ−ＴＩＲの過剰発現からの毒性を最小化した。トランスフェクションの４８時間後に細胞を収穫し、１，０００ｒｐｍでの遠心分離によってペレット化し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５８０４Ｒ、１５  Ａｍｐ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）、冷ＰＢＳ（０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水  ＮａＣｌ  ０．１３８Ｍ；ＫＣｌ  ０．００２７Ｍ；ｐＨ７．４）で１回洗浄した。細胞をプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｒｏｃｈｅ、製品番号１１８７３５８０００１）と共に０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。超音波処理（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｍｉｃｒｏｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ、出力＝３、２０回のストローク）によって細胞溶解物を調製した。溶解物を１２，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４１５Ｃ）して細胞破片を除去し、後で使用するために上清（ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲタンパク質を含有する）のアリコートを−８０℃で貯蔵した。タンパク質濃度をビシンコニン酸（ＢＣＡ）法によって決定し、溶解物濃度を正規化するために使用した。
【０３３０】
アッセイ２、発光ベースのアッセイ（ＮＡＤ  ＧＬｏ）
このアッセイは、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ９０７１）を適合させたものである。このアッセイにおいて、ＮＡＤ＋サイクリング酵素はＮＡＤ＋をＮＡＤＨに変換する。ＮＡＤＨの存在下で、レダクターゼは、レダクターゼの基質であるプロルシフェリンをルシフェリンに酵素的に変換する。ルシフェリンはＵｌｔｒａ−ＧｌｏＴＭ  ｒＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを使用して検出され、化学発光強度は試料中のＮＡＤ＋およびＮＡＤＨの量に比例する。本発明者らのアッセイ条件下で、溶解物中に存在するＮＡＤ＋およびＮＡＤＨの量はこのアッセイで検出できず、検出される最終のＮＡＤ＋に対する任意の内因性の寄与を妨げる。アッセイを以下の通りに設定した：２μｌの阻害剤（最終濃度１μＭ、２％のＤＭＳＯ）、０．０７μｇの溶解物（２μｌ）、および２μｌの４００ｎＭのＮＡＤ＋。反応物を３７℃で６０分間インキュベートした後、６μｌのＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ  Ｇｌｏ検出試薬を加えた。室温での３０分後、Ａｎａｌｙｓｔ  ＨＴリーダー（ＬＪＬ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して発光シグナルを定量化した。ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ溶解物はＮＡＤ＋の用量依存的な枯渇を触媒した一方、対照ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から調製された溶解物を用いて反応を行った場合にＮＡＤ＋レベルは減少しなかった。
【０３３１】
アッセイ３．ＨＰＬＣベースのアッセイ２
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の１０ｕｌのＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ細胞溶解物（溶解物１１−３−２０１６の３２０倍希釈、または時間依存性の評価のための８０倍の溶解物希釈）を５ｕｌの化合物ストックと混合することによって反応混合物を氷上で調製した。化合物を最初に１０ｍＭ（最終のストック濃度）でＤＭＳＯに溶解した。１０ポイントの化合物希釈曲線を最初にＤＭＳＯ中の２０ｕｌ〜４０ｕｌの段階希釈、続いてＰＢＳ中の１０倍希釈（１２ｕｌ＋１０８ｕｌ）で調製した。アッセイ中の化合物の最高濃度は２５０ｕＭである。次いで、化合物および溶解物を様々な時間量（時間依存性の解析のために０分または１２０分）にわたって二連でプレインキュベートした。次いで、５ｕｌの２０ｕＭのＮＡＤ＋（５μＭの最終濃度）を２０μｌの最終反応体積となるように加えた。反応物を３７℃で６０（または時間依存性の評価のために室温で１０分間）の間インキュベートした後、１８０μｌの０．５５Ｍ過塩素酸（ＨＣｌＯ４）を加えることによって反応を停止させた。次いで、反応物を１０分間置いておき、１６．６μｌの３ＭのＫ２ＣＯ３を加えて溶液を中和した。沈殿した塩を４，０００ｒｐｍでの１０分の遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＴ  １６Ｒ遠心分離機）によって除去した。Ｋｉｎｅｔｅｘ（５０×４．６ｍｍ、５μｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いてＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５）によって８０ｕｌの上清を分析した。１００％のＡ：ＫＰＯ４（１ＬのＨ２Ｏ中、５．０２６ｇのＫ２ＨＰＯ４および２．８７６のＫＨ２ＰＯ４）から１分で３％のメタノールへの１ｍｌ／分の勾配、続いて１．５分で１５％のメタノールへの線形勾配、１分間の保持の後、再平衡化のため２．５分間０％のメタノールに戻すことで、ＮＡＤおよび代謝物を溶出させた。ＮＡＤ（３分）およびＡＤＰＲ（１．５分）を２６０ｎｍでの吸光度によってモニターした。対照の変換のパーセントを各化合物濃度について確立した。ＡＤＰＲについてブランク（溶解物なし、ＮＡＤのみ）の値を試料および対照（溶解物＋ＮＡＤ）から引き、ＮＡＤ枯渇からの対照の値を試料およびブランクから引いて最大のＡＤＰＲ変換またはＮＡＤ枯渇を決定した（使用した溶解物の希釈は、典型的に約５０％の変換を生じた）。ブランクおよび対照を三連（またはそれより多く）で行い、次いで平均化した。１０ポイントの用量曲線からの二連のデータポイントを、Ｇｒａｆｉｔを使用してプロットし、４パラメーターログフィットを使用してＩＣ５０を算出した。
【０３３２】
（実施例１１）
化合物ＩＡ−６の合成
【０３３３】
化合物ＩＡ−６を上掲のスキーム１Ａに従って調製した。下記のスキーム２Ａに従って側鎖を調製した。
【化５４】
2019535804.tif 000065
【０３３４】
次いで、この分子を使用して上掲のスキーム１Ａに従って化合物ＩＡ−６を調製した。合成経路を以下に示す。
【化５５】
2019535804.tif 000066
【０３３５】
（実施例１２）
化合物ＩＡ−２、ＩＡ−３、ＩＡ−６およびＩＡ−８でのＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性阻害の１０ポイントの用量曲線
【０３３６】
化合物ＩＡ−２、ＩＡ−３、ＩＡ−６およびＩＡ−８は、図３３に示すように、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害を実証する。上記のアッセイ３（ＨＰＬＣベースのアッセイ２）を使用して、０．０１〜２５０ｕＭに及ぶ化合物ＩＡ−２、ＩＡ−３、ＩＡ−６およびＩＡ−８の１０ポイントの化合物曲線（ｎ＝２の平均）の二連の試料からＮＡＤ消費およびＡＤＰＲ生成を評価した。結果を図３３に示し、図３３Ａは、化合物ＩＡ−２、ＩＡ−３、ＩＡ−６およびＩＡ−８の濃度の関数としてＮＡＤ消費を示し、図３３Ｂは、化合物ＩＡ−２、ＩＡ−３、ＩＡ−６およびＩＡ−８の濃度の関数としてＡＤＰＲ生成を示す。見ることができるように、０．０１〜２５０ｕＭでのこれらの化合物ＩＡ−６の濃度の増加は、より高いＮＡＤ消費およびより低いＡＤＰＲ生成に繋がる。アッセイ３におけるこれらの化合物のＩＣ５０を下記の表５Ａに提供する。
【０３３７】
【表５】
2019535804.tif 000067
【０３３８】
（実施例１３）
化合物ＩＡ−３、ＩＡ−８、ＩＡ−９、ＩＡ−１０、ＩＡ−１１およびＩＡ−１３でのＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性阻害のスクリーニング
【０３３９】
化合物ＩＡ−３、ＩＡ−８、ＩＡ−９、ＩＡ−１０、ＩＡ−１１およびＩＡ−１３は、下記の表６Ａに示すように、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害を実証する。上記のアッセイ３（ＨＰＬＣベースのアッセイ）を使用して、それぞれ１５０μＭの化合物ＩＡ−３、ＩＡ−８、ＩＡ−９、ＩＡ−１０、ＩＡ−１１およびＩＡ−１３で単一ポイントスクリーニング（ｎ＝２の平均）の二連の試料からのＮＡＤ消費およびＡＤＰＲ生成を評価した。表６Ａにおいて、化合物ＩＡ−３、ＩＡ−８、ＩＡ−９、ＩＡ−１０、ＩＡ−１１およびＩＡ−１３を、ＮＡＤ消費を制御する能力によって分類し、「Ａ」は＞７５％を示し、「Ｂ」は５０％〜７５％の間を示し、「Ｃ」は＜５０％を示す。化合物ＩＡ−３、ＩＡ−８、ＩＡ−９、ＩＡ−１０、ＩＡ−１１およびＩＡ−１３を、ＡＤＰＲ生成を制御する能力によっても分類し、「Ａ」は＞７５％を示し、「Ｂ」は５０％〜７５％の間を示し、「Ｃ」は＜５０％を示す。
【表６】
2019535804.tif 000068
【０３４０】
いずれの特定の理論にも縛られることを望まないが、本明細書に記載される式ＩＡの化合物は、（約１のｐＨを有する壁細胞における）二重のプロトン化、それに続いて、Ｈ＋−Ｋ＋  ＡＴＰアーゼを迅速に不活性化する活性化された四環系中間体への再構成を必要とする独特の機序によって作用し得ると考えられる。これは、式ＩＡの化合物のスルホキシド基の、式ＩＡの化合物の２つの活性化された環への精密な配置から生じると考えられる。本明細書に提示するデータは、式ＩＡの化合物のベンズイミダゾール−ピリジン−スルホキシドスキャフォールドとの微細なＳＡＲ／区別およびＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害を示すものである。
【０３４１】
（実施例１４）
化合物ＩＢ−１の合成
【０３４２】
上掲のスキーム１Ｂに従って化合物ＩＢ−１を調製した。合成経路を以下に示す。
【化５６】
2019535804.tif 000069
【０３４３】
（実施例１５）
化合物ＩＢ−２の合成
【０３４４】
上掲のスキーム１Ｂに従って化合物ＩＢ−２を調製した。合成経路を以下に示す。
【化５７】
2019535804.tif 000070
【０３４５】
（実施例１６）
化合物ＩＢ−１およびＩＢ−２によるＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性阻害の用量曲線
【０３４６】
化合物ＩＢ−１およびＩＢ−２は、図３４に示すように、ＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性の阻害を実証する。上記のアッセイ３（ＨＰＬＣベースのアッセイ）を使用して、０〜約６ｕＭに及ぶ化合物ＩＢ−１およびＩＢ−２の７ポイントの化合物曲線（ｎ＝２の平均）の二連の試料からＮＡＤ消費を評価した。結果を図３４に示し、この図により、ＮＡＤアーゼ活性が化合物ＩＢ−１およびＩＢ−２の濃度の増加と共に減少することが示される。上の曲線は化合物ＩＢ−１を表し、下の曲線はＩＢ−２を表す。アッセイ３における化合物ＩＢ−２のＩＣ５０は約１５０ｎＭと決定され、アッセイ３における化合物ＩＢ−１のＩＣ５０は約０．７μＭと決定された。
【０３４７】
（実施例１７）
化合物ＩＢ−２による軸索変性の予防
【０３４８】
マウスＤＲＧのドロップ培養：マウス後根神経節（ＤＲＧ）を胎生１３．５のＣＤ１マウス胚（胚あたり５０個の神経節）から解剖し、０．０２％のＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を含有する０．０５％のトリプシン溶液と３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、軽くピペッティングすることによって細胞懸濁物を粉砕し、ＤＲＧ成長培地（２％のＢ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００ｎｇ／ｍｌの２．５Ｓ  ＮＧＦ（Ｈａｒｌａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｔｓ）、１ｍＭのウリジン（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭの５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含有する神経基礎培地（Ｇｉｂｃｏ））で３回洗浄した。１００ｍｌの培地／５０個のＤＲＧの比で細胞をＤＲＧ成長培地に懸濁した。これらの懸濁物の細胞密度は約７×１０６細胞／ｍｌであった。ポリ−Ｄ−リシン（０．１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）およびラミニン（３μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングした９６または２４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のいずれかを使用して細胞懸濁物（１．５ｍｌ／９６ウェル、１０ｍｌ／２４ウェル）をウェルの中心に置いた。細胞を湿潤組織培養インキュベーター（５％のＣＯ２）中で１５分間接着させた後、ＤＲＧ成長培地を穏やかに加えた（１００ｍｌ／９６ウェル、５００ｍｌ／２４ウェル）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ日数（ＤＩＶ）１〜２にレンチウイルスを加え（１〜１０×１０３ｐｆｕ）、６〜７ＤＩＶに代謝物を抽出したか、または軸索変性アッセイを行った。２４ウェルのＤＲＧ培養物を使用した場合、ＤＩＶ４に５０％の培地を新鮮な培地と交換した。軸索切断または代謝物収集の２４時間前にＮＲ（１００ｍＭ）を加えた。
【０３４９】
軸索変性アッセイ：ＤＩＶ６に９６ウェル中のＤＲＧドロップ培養物からの軸索を顕微鏡下で顕微手術ブレードを使用して離断した。遠位軸索の明視野画像（ウェルあたり６視野）を２０×の対物レンズと共にｈｉｇｈ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｉｍａｇｅｒ（Ｏｐｅｒｅｔｔａ；Ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）を使用して軸索切断の０〜７２時間後に撮影した。ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して算出された変性指数（ＤＩ）を使用して軸索変性を定量化した。ウェルあたり６視野からの平均ＤＩを得、各独立したウェルについて平均化した。軸索切断の前（０時間）および後（９〜７２時間）の同じ視野からの軸索画像からＤＩを算出した。３つの独立したウェルを用いて実験を３回繰り返した（ｎ＝９）。統計解析のために、Ｒ（ＲＲＩＤ：ＳＣＲ  ００２３９４）を使用する一元配置分散分析およびホルム−ボンフェローニの多重比較を使用してＤＩを比較した。この実験からのデータを図３５において棒グラフとして以下に表し、画像を図３６に示す。
【０３５０】
化合物ＩＢ−２は、上記の通り、マウス後根神経節（ＤＲＧ）ドロップ培養アッセイにおいて軸索変性の予防を実証する。図３５は、対照試料（図３５の左側にグループ化）および化合物ＩＢ−２を含む試料（図３５の右側にグループ化）、ならびに０時間、６時間、１２時間および２４時間の間隔での両方の試料への曝露後の軸索変性のレベルを示す。見ることができるように、化合物ＩＢ−２に曝露された軸索は、６時間、１２時間および２４時間の間隔後に対照試料と比べて軸索変性の大きな減少を示した。
【０３５１】
図３６は、化合物ＩＢ−２への曝露あり（図３６Ａ）およびなし（図３６Ｂ）での変性条件下の損傷した軸索のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。見ることができるように、化合物ＩＢ−２に曝露された軸索は変性条件下で無傷であった一方、化合物ＩＢ−２に曝露されなかった軸索は変性した。
【０３５２】
（実施例１８）
本実施例は、全長ＳＡＲＭ１を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの開発の成功を実証する。本実施例に記載されるアッセイを使用して、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで全長ＳＡＲＭ１を阻害する化合物を同定するおよび／または特徴付けることができる。
【０３５３】
ＳＡＲＭ１を発現する細胞は、長期の成長後に発現の減少を示す。ＮＡＤ＋レベルはＳＡＲＭ１発現細胞においてより低いが、これらの細胞は死なない。さらに、Ｃ末端のＧＦＰタグはＳＡＲＭ１  ＮＡＤアーゼ活性を減少させた。本明細書に記載のアッセイはこれらの課題を克服した。
【０３５４】
以下に記載するように、ミトコンドリア標的化配列（ＭＴＳ）を欠いた全長ＳＡＲＭ１（ＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１）を製造し、試験した。
【０３５５】
アフィニティータグ付きＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１の製造
ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ヒトニコチンアミドリボシドキナーゼ１（ＮＲＫ１）を発現するＦＣＩＶ発現ベクターを安定的にトランスフェクトされたポリクローナル細胞株であり、ＮＲＫ１は、ＮＡＤ＋生合成前駆体ニコチンアミドリボシド（ＮＲ）をＮＡＤ＋の中間前駆体であるＮＭＮに変換する酵素である。これらのＮＲＫ１発現細胞にＮＲを添加した場合、ＮＡＤ＋レベルが増大し、細胞生存度が増進されてＳＡＲＭ１の効率的な製造および精製が可能となる。
【０３５６】
これらの実験のために、ＳＡＲＭ１のミトコンドリア標的化配列に対応する最初の２６残基を欠いたヒトＳＡＲＭ１を、Ｎ末端にＳｔｒｅｐＴａｇアフィニティータグを有するように操作した（ＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１と称する；図３７Ａを参照）。この改変されたＳＡＲＭ１タンパク質をレンチウイルスベクターＦＣＩＶにクローニングしてＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１哺乳動物発現ベクターを生成した。ＳＡＲＭ１の６４２位の触媒性Ｇｌｕ残基がＡｌａに変更された類似の構築物を生成した。本実施例に記載するアッセイにおいて、この不活性な変異体ＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１（Ｅ６４２Ａ）を陰性対照として使用した。最後に、Ｎ末端のＳｔｒｅｐＴａｇがＳＡＲＭ１の残基４０９〜７２４に融合した活性ＳＡＲＭ１変異体（ＳＡＭ−ＴＩＲ）を同様に構築し、これらのアッセイにおいて陽性対照として使用した。
【０３５７】
ＳｔｒｅｐＴａｇ−ＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１およびＳｔｒｅｐＴａｇ−ＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１（Ｅ６４２Ａ）または活性ＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲタンパク質を製造するために、ＮＲＫ１−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をプレートあたり２０×１０６個の細胞で１５０ｃｍ２のプレートに播種した。翌日、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ９  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ、製品番号０６３６５７８７００１）を使用して１５μｇのＦＣＩＶ−ＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１またはＦＣＩＶ  ＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１（Ｅ６４２Ａ）またはＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲ発現ベクターを細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの際に培養物に１ｍＭのＮＲを添加してＳＡＲＭ１タンパク質発現からの毒性を最小化した。トランスフェクションの４８時間後に細胞を収穫し、１，０００ｒｐｍでの遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＴ  １６Ｒ遠心分離機、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）によってペレット化し、冷ＰＢＳ（０．０１Ｍのリン酸緩衝生理食塩水、ＮａＣｌ  ０．１３８Ｍ；ＫＣｌ  ０．００２７Ｍ；ｐＨ７．４）で１回洗浄した。プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル、Ｒｏｃｈｅ、製品番号１１８７３５８０００１）と共に細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｅｒ  ４５０、出力＝３、２０回のストローク）によって細胞溶解物を調製した。溶解物を遠心分離（１２，０００×ｇ、４℃で１０分間）して細胞破片を除去し、後で使用するために、アフィニティータグ付きＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１またはＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１（Ｅ６４２Ａ）またはＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲタンパク質を含有する上清を−８０℃で貯蔵した。アフィニティー精製のために、上清を１００μＬのＭａｇＳｔｒｅｐ（Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ）ｔｙｐｅ  ３  ＸＴビーズ懸濁物（ＩＢＡ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）と３０分間インキュベートした。次いで、ＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１またはＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１（Ｅ６４２Ａ）またはＳＡＲＭ１  ＳＡＭ−ＴＩＲタンパク質と結合したビーズを結合緩衝液で３回洗浄し、酵素アッセイのために１００μＬの結合緩衝液に再懸濁した。
【０３５８】
ＮＡＤ切断活性のアッセイ
アフィニティータグ付きＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１またはＦＬ−ＭＴＳ  ＳＡＲＭ１（Ｅ６４２Ａ）タンパク質（１〜４ｕｌのビーズ上に１〜３０ｎｇまたは活性のＳＡＭ−ＴＩＲタンパク質（０．２５ｎｇ）およびＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１２μｌの最終体積）を担持したＭａｇＳｔｒｅｐビーズを使用して反応混合物を調製した。次いでＮＡＤ（５μＭの最終濃度）を加えて２０μｌの最終反応体積とした。反応物を３７℃で６０分間インキュベートした後、１８０μｌの０．５５Ｍの過塩素酸（ＨＣｌＯ４）を加えることによって反応を停止させ、氷上に置いた。氷上での１０分の後、反応プレートを４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＴ  １６Ｒ遠心分離機）。上清（１２０μｌ）を新たなプレートに移し、１０μｌの３ＭのＫ２ＣＯ３を加えて溶液を中和した。沈殿した塩を４，０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離（Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＴ  １６Ｒ遠心分離機）によって除去した。抽出された代謝物を含有する上清（９０μｌ）を０．５Ｍのリン酸カリウム緩衝液（１０μＬ）と混合し、Ｃ１８逆相カラム（Ｋｉｎｅｔｅｘ  １００×３ｍｍ、２．６μｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いてＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｎｅｘｅｒａ  Ｘ２）によって代謝物を解析して、ＮＡＤおよびＡＤＰＲ（ＮＡＤ切断反応の生成物である）の量を定量化した。ＮＡＤおよびＡＤＰＲの内部標準を使用して各々の化合物の定量化のための標準曲線を生成した。各実験試料中の各化合物のレベルを、並行して解析した０分時点に対して正規化した。これらの値から、ＮＡＤ／ＡＤＰＲ比をＮＡＤ切断活性の尺度として算出した。
【０３５９】
図３７Ｂは、アッセイからのＨＰＬＣトレースを示し、ＮＡＤ、ＮＡＭ、およびＡＤＰＲに対応するピークに矢印を付している。図３７Ｃおよび図３７Ｄに示すように、全長ＳＡＲＭ１はＳＡＭ−ＴＩＲより有意に低いＮＡＤアーゼ活性を示したが、ＦＬ  ＳＡＲＭ１  Ｅ６４２Ａ変異体は全長ＳＡＲＭ１より有意に低いＮＡＤアーゼ活性を有した。
【０３６０】
したがって、本明細書に記載のアッセイにより、全長ＳＡＲＭ１を使用するＮＡＤアーゼ活性の測定に成功する。
【０３６１】
本開示の多くの実施形態を記載したが、本発明者らの基本的な実施例を変更して、本開示の化合物および方法を利用する他の実施形態を提供できることが明らかである。したがって、本開示の範囲は、例として示した特定の実施形態ではなく、添付の特許請求の範囲によって定義されることが理解されるものとする。
【図１】
2019535804.tif 000084
【図２−１】
2019535804.tif 000085
【図２−２】
2019535804.tif 000086
【図２−３】
2019535804.tif 000087
【図３】
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【図４−１】
2019535804.tif 000089
【図４−２】
2019535804.tif 000090
【図４−３】
2019535804.tif 000091
【図５】
2019535804.tif 000092
【図６Ａ】
2019535804.tif 000093
【図６Ｂ】
2019535804.tif 000094
【図６Ｃ】
2019535804.tif 000095
【図７−１】
2019535804.tif 000096
【図７−２】
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【図８】
2019535804.tif 000098
【図９】
2019535804.tif 000099
【図１０−１】
2019535804.tif 000100
【図１０−２】
2019535804.tif 000101
【図１１−１】
2019535804.tif 000102
【図１１−２】
2019535804.tif 000103
【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１３】
2019535804.tif 000111
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
2019535804.tif 000129
【図３２】
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【図３３】
2019535804.tif 000131
【図３４】
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【図３５】
2019535804.tif 000133
【図３６】
2019535804.tif 000134
【図３７−１】
2019535804.tif 000135
【図３７−２】
2019535804.tif 000136
【図３７−３】
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【図３７−４】
2019535804.tif 000138
【配列表】
2019535804000001.app
【国際調査報告】
2019535804.tif 000139
2019535804.tif 000140
2019535804.tif 000141
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