(57)【要約】  Ｔｈ１細胞誘導能を有する単離されたＤＥＰＤＣ１由来のエピトープペプチドが本明細書において開示される。そのようなペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識され、Ｔｈ１細胞を誘導することができる。好ましい態様では、本発明のそのようなペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子にプロミスキャスに結合することができ、Ｔｈ１細胞に加えてＤＥＰＤＣ１特異的ＣＴＬを誘導することができる。そのようなペプチドは、したがって、対象において免疫応答を増強するのに使用することに適しており、したがってがん免疫療法において、特にがんワクチンとして使用することができる。前記ペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド、そのようなペプチドによって誘導されるＡＰＣおよびＴｈ１細胞ならびにそれに関連する誘導の方法も本明細書で開示される。前記成分のいずれかを有効成分として含有する医薬組成物は、例えば膀胱がんおよび乳がんを含むがんまたは腫瘍の治療および／または予防において使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０〜３０アミノ酸長を有し、配列番号：８または１０のアミノ酸配列の一部を含む単離されたペプチドであって、
（ａ）配列番号：１、２、３または４のアミノ酸配列から選択される９アミノ酸を超える長さを有する連続するアミノ酸配列；ならびに
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞を誘導する能力を有する、ペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドまたはその断片が少なくとも２種類のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する、請求項１に記載の単離されたペプチド。
【請求項３】
前記ＭＨＣクラスＩＩ分子が、ＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５からなる群より選択される、請求項２に記載の単離されたペプチド。
【請求項４】
ＤＥＰＤＣ１特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離されたペプチド。
【請求項５】
（ａ）配列番号：１から４からなる群より選択されるアミノ酸配列；ならびに
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の単離されたペプチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
（ｉ）Ｔｈ１細胞、
（ｉｉ）ＣＴＬ、
（ｉｉｉ）Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有する抗原提示細胞（ＡＰＣ）、および
（ｉｖ）ＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣ
からなる群より選択される細胞の少なくとも１つを誘導するための組成物であって、請求項１から５のいずれか一項に記載の１つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項８】
（ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）請求項６に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有し、かつ
（ｉ）がんの治療、
（ｉｉ）がんの予防、
（ｉｉｉ）がんにおける術後再発の予防、および
（ｉｖ）上記（ｉ）から（ｉｉｉ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
からなる群より選択される目的のために製剤化されている、医薬組成物。
【請求項９】
ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５からなる群より選択される少なくとも１つを有する対象への投与用に製剤化されている、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ＣＴＬ誘導能を有する１つまたは複数のペプチドをさらに含有する、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答を増強するための組成物であって、
（ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）請求項６に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有する、組成物。
【請求項１２】
Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有するＡＰＣを誘導するための方法であって、ＡＰＣを請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階を含む、方法。
【請求項１３】
ＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣを誘導するための方法であって、
（ａ）ＡＰＣを請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階
からなる群より選択される段階を含む、方法。
【請求項１４】
Ｔｈ１細胞を誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ分子と請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示するＡＰＣと共培養する段階；および
（ｂ）両方のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットをコードするポリヌクレオチド、またはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入する段階であって、ここでＴＣＲが、細胞表面に提示されるＭＨＣクラスＩＩ分子と請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片との複合体に結合することができる、段階
からなる群より選択される段階を含む、方法。
【請求項１５】
ＣＴＬを誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の両方を、請求項４または５に記載のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階；ならびに
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、請求項４または５に記載のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階
からなる群より選択される段階を含む、方法。
【請求項１６】
ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答を増強するための方法であって、
（ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）請求項６に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分を対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項１７】
ＭＨＣクラスＩＩ分子と請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示する、単離されたＡＰＣ。
【請求項１８】
請求項１２または１３に記載の方法によって誘導されるＡＰＣ。
【請求項１９】
ＡＰＣの表面に提示された請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を認識する、単離されたＴｈ１細胞。
【請求項２０】
請求項１４に記載の方法によって誘導されるＴｈ１細胞。
【請求項２１】
前記ＴＣＲのαサブユニットおよびβサブユニットが、それぞれ配列番号：１１および２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む、請求項２０に記載のＴｈ１細胞。
【請求項２２】
がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、
（ａ）請求項１から５のいずれか一項に記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）請求項６に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有する組成物を前記対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項２３】
請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドに対する抗体またはその免疫学的に活性な断片。
【請求項２４】
請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２３に記載の抗体を含む、診断キット。
【請求項２７】
対象における、配列番号：１、２、３または４のアミノ酸配列を含むペプチドに特異的なＴｈ１応答を評価および／またはモニタリングするための方法であって、
（ａ）該ペプチドを投与された対象から得られた試料を提供する段階であって、該試料がＴ細胞を含む、段階；
（ｂ）該試料における、ＭＨＣクラスＩＩ分子と該ペプチドまたはその断片との複合体に結合するＴＣＲを発現するＴ細胞の存在を検出する段階；および
（ｃ）該Ｔ細胞の存在が（ｂ）において検出される場合に、該ペプチドに特異的なＴｈ１応答の誘導が示される段階
を含む、方法。
【請求項２８】
前記ＴＣＲが、それぞれ配列番号：１１および２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を各々含むαサブユニットおよびβサブユニットの特定のペアを含む、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物科学の分野、より詳細にはがん療法の分野に関する。特に、本発明は、がんワクチンとして極めて有効な新規ペプチド、ならびに腫瘍の治療および予防のいずれかまたは両方のための薬剤に関する。
優先権
本出願は、２０１６年１１月１８日出願の日本特許出願第２０１６−２２４６２４号の恩典を主張し、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子上で見いだされる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に由来するエピトープペプチドを認識し、その後腫瘍細胞を死滅させることが示されている。ＴＡＡの最初の例として黒色腫抗原（ＭＡＧＥ）ファミリーが発見されて以来、多くの他のＴＡＡが、主として免疫学的アプローチを通して、発見されてきた（非特許文献１、２）。これらのＴＡＡのいくつかは、現在、免疫療法の標的として臨床開発が進められている。
【０００３】
がん細胞の増殖および生存に不可欠なＴＡＡは、免疫療法のための標的として有用である。なぜなら、そのようなＴＡＡの使用は、治療的に行われる免疫選択の結果としてのＴＡＡの欠失、突然変異または下方制御に起因するがん細胞の免疫回避の広く記述されている危険性を最小限に抑え得るからである。したがって、強力で特異的な抗腫瘍免疫応答を誘導することができる新規ＴＡＡの同定はさらなる発展を保証する。そこで、様々なタイプのがんに対するペプチドワクチン戦略の臨床適用が進行中である（非特許文献３〜１０）。現在までに、これらのＴＡＡ由来ペプチドを使用した臨床試験のいくつかの報告がある。残念ながら、これまでのところ、これらのがんワクチンの治験は、今までにこれらのがんワクチン治験で認められてきた低い客観的奏効率しかもたらしていない（非特許文献１１〜１３）。したがって、免疫療法標的としての使用に適する新規ＴＡＡが当分野において依然として必要である。
【０００４】
近年、本発明者らは、ゲノムワイドｃＤＮＡマイクロアレイ解析を用いて、膀胱がん、乳がん、およびいくつかの他の悪性腫瘍において高頻度で過剰発現しているがん−精巣抗原、ＤＥＰドメイン含有１（ＤＥＰＤＣ１）を同定した（非特許文献１４〜１７）。膀胱がん細胞の増殖は、低分子干渉ＲＮＡを用いたＤＥＰＤＣ１発現のノックダウンによって有意に阻害される；したがって、ＤＥＰＤＣ１は、腫瘍の増殖および生存に必須であり、このことは、抗原特異的ながん免疫療法のための標的としてのこれらの抗原の臨床的有意性を示す。本発明者らはまた、膀胱がん患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からＨＬＡ−Ａ２４（Ａ＊２４：０２）拘束性ＣＴＬを誘導することができる、高い免疫原性を示すＤＥＰＤＣ１由来短鎖ペプチド（ＳＰ）を同定した（特許文献１、非特許文献１７）。膀胱内ＢＣＧ接種とＤＥＰＤＣ１由来ＳＰとの併用免疫療法の第Ｉ／ＩＩ相臨床試験において、ワクチンは、非筋肉浸潤性膀胱がんの再発予防に対する有望な臨床効果、ならびに、安全性およびＣＴＬを誘導する良好な免疫原性を実証した（非特許文献１７）。それゆえ、ＤＥＰＤＣ１は、がん免疫療法のための魅力的な標的分子である。
【０００５】
腫瘍特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞、特にＴヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞は、ＣＴＬ媒介性抗腫瘍免疫の効果的な誘導に重要な役割を果たす（非特許文献１８）。Ｔｈ１細胞によって主として産生されるインターフェロン（ＩＦＮ）−γおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αは、長く持続するＣＴＬ応答の誘導と維持のために必須であり、免疫記憶の維持において重要な多数の相互作用を通して支援を提供する（非特許文献１９、２０、２１）。Ｔｈ１細胞によって分泌されるＩＦＮ−γは、直接の抗腫瘍作用または抗血管新生作用も媒介する（非特許文献２２）。さらに、Ｔｈ細胞は、腫瘍部位におけるＣＴＬの侵入のための道筋をつけているであろうことが示されている（非特許文献２３）。Ｍｅｌｉｅｆらは、近年、ヒトパピローマウイルス由来の合成ＬＰが、外陰がんおよび子宮頸がんの治療のための魅力的なワクチン化合物としてのＣＴＬエピトープを天然に含むことを報告した（非特許文献２４）。ＬＰの注射後に、患者のＤＣは、ＬＰを取り込み、それらをプロセシングし、患者のＨＬＡクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子と関連する可能なＣＴＬエピトープおよびＴｈ細胞エピトープをそれぞれ提示する（非特許文献２７）。加えて、ＧＶ１００１と呼ばれるプロミスキャスな（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）テロメラーゼ由来ヘルパーエピトープワクチンを用いた近年の臨床研究は、放射線療法および化学療法と組み合わせた場合にがん患者の生存を増加させた（非特許文献２５、２６）。それゆえ、特異的Ｔｈ１細胞を活性化することができるＴＡＡ由来Ｔｈ細胞エピトープの同定は、腫瘍担持宿主における有効な腫瘍免疫の誘導のために重要である；理想的には、有効なワクチンの設計は、ＣＴＬとＴｈ１細胞の両方を刺激する複数のエピトープを含むべきである（非特許文献２４）。しかしながら、ＤＥＰＤＣ１に由来するそのようなエピトープは未だ同定されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2008/047473
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Boon T. Int J Cancer 1993;54(2): 177-80
【非特許文献２】Boon T and van der Bruggen P. J Exp Med 1996;183(3): 725-9
【非特許文献３】Harris CC. J Natl Cancer Inst 1996;88(20): 1442-55
【非特許文献４】Butterfield LH, et al., Cancer Res 1999;59(13): 3134-42
【非特許文献５】Vissers JL, et al., Cancer Res 1999;59(21): 5554-9
【非特許文献６】van der Burg SH, et al., J Immunol 1996;156(9): 3308-14
【非特許文献７】Tanaka F, et al., Cancer Res 1997;57(20): 4465-8
【非特許文献８】Fujie T et al., Int J Cancer 1999;80(2): 169-72
【非特許文献９】Kikuchi M, et al., Int J Cancer 1999;81(3): 459-66
【非特許文献１０】Oiso M, et al., Int J Cancer 1999;81(3):387-94
【非特許文献１１】Belli F, et al., J Clin Oncol 2002;20(20): 4169-80
【非特許文献１２】Coulie PG, et al., Immunol Rev 2002;188: 33-42
【非特許文献１３】Rosenberg SA, et al., Nat Med 2004;10(9): 909-15
【非特許文献１４】Kanehira M, et al., Oncogene 2007;26: 6448-55
【非特許文献１５】Harada Y, et al., Cancer Res 2010;70: 5829-39.
【非特許文献１６】Kretschmer C, et al., Mol Cancer 2011;10:15
【非特許文献１７】Obara W, et al., Clin Oncol 2012;42: 591-600.
【非特許文献１８】Chamoto K, et al., Cancer Res 2004;64: 386-90
【非特許文献１９】Bevan MJ. Nat Rev Immunol 2004;4: 595-602
【非特許文献２０】Shedlock DJ and Shen H. Science 2003;300: 337-9
【非特許文献２１】Anders K, et al., Cancer Cell 2011; 20: 755-67
【非特許文献２２】Street SE, et al., Blood 2001;97: 192-7
【非特許文献２３】Bos R, and Sherman LA. Cancer Res 2010; 70: 8368-77
【非特許文献２４】Melief CJ, et al., Nat Rev Cancer 2008;8: 351-60
【非特許文献２５】Brunsvig PF, et al., Clin Cancer Res 2011;17:6847-57
【非特許文献２６】Kyte JA, et al., Clin Cancer Res 2011;17:4568-80
【非特許文献２７】Kenter GG, et al., N Engl J Med 2009;361:1838-47
【発明の概要】
【０００８】
膀胱がんは、泌尿生殖器系に関わる最も一般的な悪性腫瘍である。白金ベースの化学療法が、依然として、進行性／転移性尿路上皮がん（ＵＣ）の第一選択治療についての標準療法である（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍａａｓｅ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９６；１５６（９）：３３０８−１４；  Ｇｕｐｔａ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒｓ  ２０１７；９（２）：ｐｉｉ：Ｅ１５）。白金ベースの化学療法での標準治療を受ける人において、転移性膀胱がんは推定全生存期間が９〜１５か月であり；ステージＩＶ膀胱がんの５年相対生存率は約１５％である（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍａａｓｅ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．、上記；  Ｄｅ  Ｓａｎｉｓ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１２；３０（２）：１９１−９）。最近まで、化学療法に不応性の患者または重篤な有害反応のために化学療法に耐えられない患者のための治療選択肢はほとんどなく、全体的な転帰は依然として非常に不良であった（Ｇｕｐｔａ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．、上記）。現在、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）特異的モノクローナル抗体およびＰＤ−１リガンド（ＰＤ−Ｌ１）特異的モノクローナル抗体（すなわち、それぞれニボルマブ／ペンブロリズマブおよびアテゾリズマブ）を用いる全身免疫療法が、尿路上皮膀胱がんの治療のために承認されており、奏効率の有意な改善を達成している（Ｇｕｐｔａ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．、上記；  Ｚｉｃｈｉ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ  ２０１７；２０１７（５６１８７４．  Ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１７／５６１８１７４））。別の近年の臨床試験により、進行性ＵＣを有する患者に投与されたＤＥＰＤＣ１由来ＳＰワクチンは、安全であり、かつ耐容性が良好であり、かつ効果的にＣＴＬを活性化したことが示された（Ｏｂａｒａ  Ｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１７；２８（４）：７９８−８０３）。
【０００９】
本発明に関連して、本発明者らは、がん免疫療法のための理想的なペプチドワクチンは、両者が互いに天然で近位である、ＣＴＬとＴｈ１細胞の両方のエピトープを含む単一ポリペプチドを含むものであると考えた。
【００１０】
そのために、本発明者らは、プロミスキャスな（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ＨＬＡクラスＩＩ分子との関連で認識され、ＣＴＬエピトープを含む、新規ＤＥＰＤＣ１由来Ｔｈ１細胞エピトープを同定する戦略を設計し、そのようにして特徴づけられたエピトープがより効果的にＴ細胞媒介性腫瘍免疫を誘導するという仮定の下で研究を進めた。ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを予測するコンピュータアルゴリズムおよびＨＬＡ−Ａ２４（Ａ＊２４：０２）またはＨＬＡ−Ａ２（Ａ＊０２：０１）拘束性ＣＴＬによって認識される公知のＣＴＬエピトープ配列を使用して、候補となる、ＣＴＬエピトープを含有するプロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ拘束性Ｔｈ１細胞エピトープを選択した。
【００１１】
本発明は、少なくとも部分的には、Ｔｈ１細胞応答を誘導するための免疫療法の標的として役立つ適切なエピトープペプチドの発見に基づく。ＤＥＰＤＣ１遺伝子は、膀胱がんおよび乳がんを含む多くのがん型で上方制御されることが認められているので、本発明は、ＤＥＰＤＣ１遺伝子の遺伝子産物、より詳細にはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１１４１２０．２（配列番号：７）またはアクセッション番号ＮＭ＿０１７７７９．５（配列番号：９）の遺伝子によってコードされる配列番号：８または１０に例示的に示すポリペプチドをさらなる解析のための標的とする。対応する分子に特異的なＴｈ１細胞を誘発するエピトープペプチドを含むＤＥＰＤＣ１遺伝子産物をさらなる試験のために特に選択した。例えば、健常ドナーから得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヒトＤＥＰＤＣ１に由来するプロミスキャスなＨＬＡ−ＤＲおよび／またはＤＰ結合ペプチドを用いて刺激した。それぞれの候補ペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲまたはＤＰ陽性標的細胞を認識するＴｈ１細胞を樹立し、ＤＥＰＤＣ１に対する強力で特異的な免疫応答を誘導することができるＨＬＡ−ＤＲおよび／またはＤＰ拘束性エピトープペプチドを同定した。これらの結果は、ＤＥＰＤＣ１が強力な免疫原性をもち、そのエピトープはＴｈ１細胞応答を通して媒介される腫瘍免疫療法のために有効であることを明らかにする。付加的な試験は、少なくとも１つのＣＴＬエピトープを含むプロミスキャスなＨＬＡ−ＤＲおよび／またはＤＰ結合ペプチドが、同じドナーにおいてＤＥＰＤＣ１特異的にＣＴＬ応答を刺激できることも明らかにした。これらの結果は、ＤＥＰＤＣ１が強い免疫原性を示すこと、ならびにＴｈ１細胞エピトープおよびＣＴＬエピトープの両方を含むそのＤＥＰＤＣ１由来ペプチドが、Ｔｈ１細胞応答およびＣＴＬ応答の両方を通して媒介される腫瘍免疫療法のために有効であることを裏付ける。
【００１２】
それゆえ、Ｔｈ１細胞誘導能ならびに配列番号：１から４の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供することが本発明の１つの目的である。本発明は、改変されたペプチド、すなわち最大３０アミノ酸までの長さであり、配列番号：８または１０（ＤＥＰＤＣ１）のアミノ酸配列から選択される連続するアミノ酸配列を有する、Ｔｈ１細胞誘導能を備えたペプチド、ならびにその機能的等価物を企図する。あるいは、本発明はまた、Ｔｈ１細胞誘導能およびＣＴＬ誘導能の両方を有するペプチドも提供する。いくつかの態様において、本発明のペプチドは、配列番号：１から４のアミノ酸配列または、Ｔｈ１細胞を誘導する能力を維持しつつ、１、２もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは付加されている、その改変型に対応する。
【００１３】
対象に投与された場合、本発明のペプチドは、好ましくは１つまたは複数の抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示され、次にこれがＴｈ１細胞を誘導する。本発明のペプチドが少なくとも１つのＣＴＬエピトープをさらに含む場合、そのようなＡＰＣはまた、本発明のペプチドから生成されるＣＴＬエピトープを提示し、したがってそれぞれのペプチドを標的とするＣＴＬを誘導するようにペプチドをプロセシングする。それゆえ、本発明のペプチドのいずれかまたはその断片を提示するＡＰＣ、ならびにＡＰＣを誘導するための方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００１４】
本発明の１つもしくは複数のペプチドまたはそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはそのようなペプチドまたはその断片を提示するＡＰＣの投与は、強力な抗腫瘍免疫応答の誘導をもたらす。したがって、以下の１つまたは複数を有効成分として含有する薬剤または医薬組成物を提供することが本発明のさらにもう１つの目的である：
（ａ）本発明の１つまたは複数のペプチド、
（ｂ）そのようなペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド、および
（ｃ）本発明の１つまたは複数のＡＰＣ。
そのような本発明の薬剤または医薬組成物は、ワクチンとして特に有用である。
【００１５】
がん（すなわち腫瘍）の治療および／もしくは予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）（すなわち予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ））、ならびに／またはその術後再発の予防のための方法を提供することが本発明のなおさらなる目的である。本発明の１つもしくは複数のペプチド、ポリヌクレオチド、ＡＰＣまたは薬剤もしくは医薬組成物を投与する段階を含む、Ｔｈ１細胞を誘導するまたは抗腫瘍免疫を誘導するための方法もまた企図される。さらに、本発明のＴｈ１細胞はがんに対するワクチンとしても使用され、がんの例には、膀胱がんおよび乳がんが含まれるが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明の特に企図される目的の例には以下が含まれる：
［１］１０〜３０アミノ酸長を有し、配列番号：８または１０のアミノ酸配列の一部を含む単離されたペプチドであって、
（ａ）配列番号：１、２、３または４のアミノ酸配列から選択される９アミノ酸を超える長さを有する連続するアミノ酸配列；ならびに
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有する、ペプチド。
［２］前記ペプチドまたはその断片が少なくとも２種類のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する、［１］に記載の単離されたペプチド。
［３］前記ＭＨＣクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５からなる群より選択される、［２］に記載の単離されたペプチド。
［４］ＤＥＰＤＣ１特異的ＣＴＬ誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む、［１］から［３］のいずれか１つに記載の単離されたペプチド。
［５］
（ａ）配列番号：１から４からなる群より選択されるアミノ酸配列；ならびに
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されているアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、［４］に記載の単離されたペプチド。
［６］［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
［７］
（ｉ）Ｔｈ１細胞、
（ｉｉ）ＣＴＬ、
（ｉｉｉ）Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有するＡＰＣ、および
（ｉｖ）ＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣ
からなる群より選択される細胞の少なくとも１つを誘導するための組成物であって、［１］から［５］のいずれか１つに記載の１つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物、または
（ｉ）Ｔｈ１細胞、
（ｉｉ）ＣＴＬ、
（ｉｉｉ）Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有するＡＰＣ、および
（ｉｖ）ＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣ
からなる群より選択される少なくとも１種類の細胞を誘導するための組成物であって、［１］から［５］のいずれか１つに記載の１つもしくは複数のペプチド、またはそれらをコードする１つもしくは複数のポリヌクレオチドを含む、組成物。
［８］
（ａ）［１］から［５］のいずれか１つに記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）［６］に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有し、かつ
（ｉ）がんの治療、
（ｉｉ）がんの予防、
（ｉｉｉ）がんにおける術後再発の予防、および
（ｉｖ）上記（ｉ）から（ｉｉｉ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
からなる群より選択される目的のために製剤化されている、医薬組成物。
［９］ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５からなる群より選択される少なくとも１つを有する対象への投与のために製剤化されている［８］に記載の医薬組成物、またはＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５からなる群より選択される少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ分子を有する対象への投与用に製剤化されている［８］に記載の医薬組成物。
［１０］ＣＴＬ誘導能を有する１つまたは複数のペプチドをさらに含有する、［８］または［９］に記載の医薬組成物。
［１１］ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答を増強するための組成物であって、
（ａ）［１］から［５］のいずれか１つに記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）［６］に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有する、組成物。
［１２］Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有するＡＰＣを誘導するための方法であって、ＡＰＣを［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階を含む、方法。
［１３］ＣＴＬを誘導する能力を有するＡＰＣを誘導するための方法であって、
（ａ）ＡＰＣを［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階
からなる群より選択される段階を含む、方法。
［１４］Ｔｈ１細胞を誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ分子と［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示するＡＰＣと共培養する段階；および
（ｂ）両方のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）サブユニットをコードするポリヌクレオチド、またはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入する段階であって、ここでＴＣＲが、細胞表面に提示されるＭＨＣクラスＩＩ分子と［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片との複合体に結合することができる、段階
からなる群より選択される段階を含む、方法、または、Ｔｈ１細胞を誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ分子と［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示するＡＰＣと共培養する段階；および
（ｂ）両方のＴＣＲサブユニットをコードする単一ポリヌクレオチド、または各々が別々のＴＣＲサブユニットをコードする複数のポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入する段階であって、ここでＴＣＲが、ＡＰＣの細胞表面に提示されるＭＨＣクラスＩＩ分子と［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片との複合体に結合することができる、段階
からなる群より選択される段階を含む、方法。
［１５］ＣＴＬを誘導するための方法であって、
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の両方を、［４］または［５］に記載のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階；ならびに
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、［４］または［５］に記載のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階
からなる群より選択される段階を含む、方法。
［１６］ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答を増強するための方法であって、
（ａ）［１］から［５］のいずれか１つに記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）［６］に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）
の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分を対象に投与する段階を含む、方法。
［１７］ＭＨＣクラスＩＩ分子と［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示する、単離されたＡＰＣ。
［１８］［１２］または［１３］に記載の方法によって誘導されるＡＰＣ。
［１９］ＡＰＣの表面に提示された［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を認識する、単離されたＴｈ１細胞。
［２０］［１４］に記載の方法によって誘導されるＴｈ１細胞。
［２１］前記ＴＣＲのαサブユニットおよびβサブユニットが、それぞれ配列番号：１１および２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を含む、［２０］に記載のＴｈ１細胞。
［２２］がんに対する免疫応答を、それを必要とする対象において誘導する方法であって、
（ａ）［１］から［５］のいずれか１つに記載の１つまたは複数のペプチド；
（ｂ）［６］に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド；
（ｃ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示する１つまたは複数のＡＰＣ；
（ｄ）［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣを認識する１つまたは複数のＴｈ１細胞；および
（ｅ）上記（ａ）から（ｄ）の任意の２つまたはそれ以上の組合せ
からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有する組成物を前記対象に投与する段階を含む、方法。
［２３］［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドに対する抗体またはその免疫学的に活性な断片。
［２４］［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
［２５］［２４］に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
［２６］［１］から［５］のいずれか１つに記載のペプチド、［６］に記載のポリヌクレオチドまたは［２３］に記載の抗体を含む、診断キット。
［２７］対象における、配列番号：１、２、３または４のアミノ酸配列を含むペプチドに特異的なＴｈ１応答を評価および／またはモニタリングするための方法であって、
（ａ）該ペプチドを投与された対象から得られた試料を提供する段階であって、該試料がＴ細胞を含む、段階；
（ｂ）該試料における、ＭＨＣクラスＩＩ分子と該ペプチドまたはその断片との複合体に結合するＴＣＲを発現するＴ細胞の存在を検出する段階；および
（ｃ）該Ｔ細胞の存在が（ｂ）において検出される場合に、該ペプチドに特異的なＴｈ１応答の誘導が示される段階
を含む、方法。
［２８］前記ＴＣＲが、それぞれ配列番号：１１および２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を各々含むαサブユニットおよびβサブユニットの特定のペアを含む、［２７］に記載の方法。
【００１７】
上記に加えて、本発明の他の目的および特徴は、以下の詳細な説明を付属の図面および実施例と併せて読めばより十分に明らかになる。しかしながら、本発明の前記概要および以下の詳細な説明はどちらも例示的な態様であり、本発明または本発明のその他の代替的な態様を限定するものではないことが理解されるべきである。特に、ここでいくつかの特定の態様を参照して本発明を説明するが、説明は本発明を例証するものであり、本発明の限定とは解釈されないことが認識される。様々な変更および適用が、付属の特許請求の範囲に記載されている本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者に想起され得る。同様に、本発明の他の目的、特徴、利益および利点は、本概要および以下に記載する特定の態様から明らかであり、また当業者には容易に明白である。そのような目的、特徴、利益および利点は、単独でまたは本明細書に組み込まれる参考文献を考慮して、付属の実施例、データ、図面およびそれらから引き出されるすべての妥当な推論と併せて上記から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本発明の様々な局面および適用は、以下の図面の簡単な説明および本発明の詳細な説明とその好ましい態様を考慮した上で当業者に明らかになるであろう。
【００１９】
【図１−１】図１は、近年開発されたコンピュータアルゴリズムによって予測された、ＣＴＬエピトープを含むＤＥＰＤＣ１由来のプロミスキャスなＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを示す。（Ａ）ヒトＤＥＰＤＣ１タンパク質のアミノ酸配列を、アルゴリズムを用いて解析した。横軸上の数字は、ＤＥＰＤＣ１由来の１５−ｍｅｒペプチドのＮ末端のアミノ酸位置を示す。より低いコンセンサスパーセンタイル順位が、ＨＬＡクラスＩＩ分子へのより強い結合親和性を示す。黒色のバーは、図１Ｂに記載されているＬＰの位置を示す。（Ｂ）複数のＨＬＡクラスＩＩアリル（ＤＲＢ１＊０９：０１、ＤＲＢ１＊０４：０５、およびＤＲＢ１＊１５：０２）産物についてより低いコンセンサスパーセンタイル順位を有する２２〜２９ｍｅｒのＬＰであるＤＥＰＤＣ１１９１−２１３−ＬＰ（ＬＰ−１）、ＤＥＰＤＣ１２９２−３１３−ＬＰ（ＬＰ−２）、ＤＥＰＤＣ１３０１−３２９−ＬＰ（ＬＰ−３）、およびＤＥＰＤＣ１６１３−６３４−ＬＰ（ＬＰ−４）、ならびに、それぞれＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬまたはＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬによって認識される９−ｍｅｒペプチドであるＤＥＰＤＣ１−Ａ２４２９４−３０２およびＤＥＰＤＣ１−Ａ２３０２−３１１を合成した。
【図１−２】（Ｃ）ヒトＤＥＰＤＣ１タンパク質のアミノ酸配列を、アルゴリズムを用いて解析した。横軸上の数字は、ＤＥＰＤＣ１由来の１５−ｍｅｒペプチドのＮ末端のアミノ酸位置を示す。より低いコンセンサスパーセンタイル順位が、ＨＬＡクラスＩＩ分子へのより強い結合親和性を示す。黒色のバーは、図１Ｂに記載されているＬＰの位置を示す。
【００２０】
【図２Ａ】図２は、健常ドナーからのＤＥＰＤＣ１特異的Ｔｈ細胞の誘導を示す。（Ａ）ＤＥＰＤＣ１特異的Ｔｈ細胞を、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１で刺激することによってＤＲ５３＋健常ドナー（ＨＤ１）から生成した。生成されたＴｈ細胞を、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１でパルスした自己ＰＢＭＣまたはＬ細胞で再刺激した。ＩＦＮ−γ産生Ｔｈ細胞の数を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって解析した。ＨＤ１から得られた、同様の結果を示した少なくとも３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。ドナーＨＤ１のＨＬＡクラスＩＩ遺伝子型をパネル上部に示す。下線が引かれたＨＬＡ−クラスＩＩアリルは、ペプチドをＴｈ細胞に提示するＨＬＡ−クラスＩＩ分子をコードする。
【図２Ｂ】（Ｂ）ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１特異的かつＨＬＡ−ＤＲ４拘束性のＴｈ細胞を、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１で刺激することによって健常ドナー（ＨＤ４）から生成した。
【図２Ｃ】（Ｃ）ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２特異的かつＨＬＡ−ＤＲ４拘束性のＴｈ細胞を、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２で刺激することによって健常ドナー（ＨＤ１）から生成した。
【図２Ｄ】（Ｄ）ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３特異的かつＨＬＡ−ＤＰ５拘束性のＴｈ細胞を、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３で刺激することによって健常ドナー（ＨＤ３）から生成した。
【図２Ｅ】（Ｅ）ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３特異的かつＨＬＡ−ＤＲ４拘束性のＴｈ細胞を、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３で刺激することによって健常ドナー（ＨＤ４）から生成した。
【図２Ｆ】（Ｆ）ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４特異的かつＨＬＡ−ＤＰ５拘束性のＴｈ細胞を、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４で刺激することによって健常ドナー（ＨＤ１）から生成した。
【図２Ｇ】（Ｇ）ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４特異的かつＨＬＡ−ＤＲ１５拘束性のＴｈ細胞を、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４で刺激することによって健常ドナー（ＨＤ５）から生成した。
【図２Ｈ】（Ｈ）ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４特異的かつＨＬＡ−ＤＰ５拘束性のＴｈ細胞を、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４で刺激することによって健常ドナー（ＨＤ７）から生成した。
【００２１】
【図３−１】図３は、ＤＣによるＤＥＰＤＣ１−ＬＰの天然プロセシングおよび提示を示す。（Ａ）ドナーＨＤ１から樹立したＨＬＡ−ＤＲ４拘束性かつＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２特異的なＴｈ細胞は、組換えＤＥＰＤＣ１タンパク質をロードした自己ＤＣを認識した。同様の結果を示した２つの独立した実験からの代表的なデータを示す。（Ｂ）ドナーＨＤ４から樹立したＨＬＡ−ＤＲ４拘束性かつＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３特異的なＴｈ細胞は、組換えＤＥＰＤＣ１タンパク質をロードした自己ＤＣを認識した。
【図３−２】（Ｃ）同様に、ＨＤ７に由来するＨＬＡ−ＤＰ５拘束性かつＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４特異的なＴｈ細胞クローンは、組換えヒトＤＥＰＤＣ１タンパク質をロードした自己ＤＣ、およびＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４をパルスしたものを認識したが、対照タンパク質をロードしたものを認識しなかった。Ｔｈ細胞応答は、抗ＨＬＡ−ＤＰ  ｍＡｂの存在下で実質的に低下したが、抗ＨＬＡ−クラスＩブロッキングＡｂの存在下では低下しなかった。
【００２２】
【図４】図４は、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２が、インビボでＣＴＬの効果的なクロスプライミングを誘導することを示す。ＨＬＡ−Ａ２  ＴｇｍまたはＨＬＡ−Ａ２４  Ｔｇｍを、ＩＦＡ中に乳化したＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２を用いて免疫した。ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２での２回目のワクチン接種後に、鼠径リンパ節中のマウスＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＤＥＰＤＣ１−Ａ２３０２−３１１ＳＰまたはＨＩＶ−Ａ２  ＳＰ（図４Ａ）およびＤＥＰＤＣ１−Ａ２４２９４−３０２ＳＰまたはＨＩＶ−Ａ２４  ＳＰ（図４Ｂ）でパルスしたＢＭ−ＤＣで刺激した。ＩＦＮ−γ産生マウスＣＤ８＋Ｔ細胞の数を、エクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって解析した。同様の結果を示した少なくとも３つの独立した実験からの代表的なデータを示す。
【００２３】
【図５−１】図５は、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的Ｔｈクローンにおける様々なＴｈ１型サイトカイン産生を示す。（Ａ〜Ｄ）ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的なバルクＴｈ細胞またはＴｈクローンを、コグネイトペプチドでまたはコグネイトペプチドなしでパルスした自己ＰＢＭＣで刺激した。表示されているサイトカインの培養上清における濃度を、「材料および方法」の項に記載されている通りに測定した。データは、３連のアッセイの平均±ＳＤとして示している。（Ａ）ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１特異的バルクＴｈ細胞を、コグネイトペプチドでまたはコグネイトペプチドなしでパルスした自己ＰＢＭＣで刺激した。（Ｂ）ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２特異的Ｔｈクローンを、コグネイトペプチドでまたはコグネイトペプチドなしでパルスした自己ＰＢＭＣで刺激した。
【図５−２】（Ｃ）ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３特異的バルクＴｈ細胞を、コグネイトペプチドでまたはコグネイトペプチドなしでパルスした自己ＰＢＭＣで刺激した。（Ｄ）ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３特異的バルクＴｈ細胞を、コグネイトペプチドでまたはコグネイトペプチドなしでパルスした自己ＰＢＭＣで刺激した。
【００２４】
【図６−１】図６は、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２特異的Ｔｈ細胞のＴＣＲ遺伝子解析の結果を示す。（Ａ〜Ｂ）ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２特異的Ｔ細胞レパートリーを、次世代シーケンサーを用いたＴＣＲ−α遺伝子およびＴＣＲ−β遺伝子のディープｃＤＮＡシーケンシングによって解析した。ＴＣＲ−αを上のパネルに示し、ＴＣＲ−βを下のパネルに示している。Ｙ軸は、コグネイトペプチドでパルスしたＤＣでのＴｈ細胞刺激の回数を示す。ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２特異的バルクＴｈ細胞のクローニングを、コグネイトペプチドでパルスした放射線照射ＰＢＭＣでバルクＴｈ細胞を５回刺激した後に行った。総刺激頻度は９回であった。Ｘ軸は、頻度が上位１０位までのＶ−Ｊ−ＣＤＲ３配列（詳細は右の四角に示す）を示し、Ｚ軸は、個々のＶ−Ｊ−ＣＤＲ３配列の頻度を示す。
【図６−２】（Ｃ）ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２特異的Ｔ細胞クローンから単離された完全長ＴＣＲ−α遺伝子およびＴＣＲ−β遺伝子を発現するＴＣＲ陰性マウスＴ細胞株ＴＧ４０は、ＣＤ６９およびＣＤ１３７の細胞表面発現によって明らかにされているように、コグネイトペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＲ発現Ｌ細胞に特異的に応答した。
【００２５】
【図７】図７は、患者のＰＢＭＣにおけるＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞の存在を示す。尿路上皮がん（ＵＣ）患者から単離されたＰＢＭＣを、インビトロでＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１、−２、−３、−４の混合物、ならびにＩＬ−２およびＩＬ−７で刺激し、個々のＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的Ｔ細胞の頻度を、ＥＬＩＳＰＯＴを用いて評価した。ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４に特異的なＴｈ細胞応答が、２人のＵＣ患者において観察された（Ａ、Ｂ）。ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞のＨＬＡクラスＩＩ拘束を、ＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＰに特異的なモノクローナル抗体を用いたブロッキングアッセイによって決定した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
態様の説明
本発明の態様を実施または試験するにあたって、本明細書に記載の方法および材料と類似または等価の任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法、装置および材料をここに記述する。しかしながら、本発明の材料および方法について記載する前に、本発明が本明細書で述べる特定の大きさ、形状、寸法、材料、方法論、プロトコル等は慣例的な実験法および最適化に応じて変更可能であるため、本発明がこれらに限定されないことが理解されるべきである。また、本記載で用いる用語は、特定のバージョンまたは態様を説明することだけを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図されず、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。
【００２７】
本明細書で言及する各々の公報、特許または特許出願の開示は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。しかしながら、本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明によるそのような開示に先行する権利がないことの承認と解釈されるべきではない。
【００２８】
Ｉ．定義
特に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。しかしながら、矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。
【００２９】
本明細書で使用する「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という語は、特に明確に示されない限り「少なくとも１つの」を意味する。
【００３０】
ある物質（例えばペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に関して使用する「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、さもなければ天然源中に含まれ得る少なくとも１つの物質を実質的に含まないことを指示する。したがって、単離されたまたは精製されたペプチドは、そのペプチドが由来する細胞もしくは組織源からの糖質、脂質もしくは他の混入タンパク質などの細胞材料を実質的に含まない、または化学合成される場合は化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないペプチドを指す。
【００３１】
「細胞物質を実質的に含まない」という用語は、ペプチドが、そのペプチドが単離されたまたは組換え生産された細胞の細胞成分から切り離されている、ペプチドの調製物を包含する。したがって、細胞物質を実質的に含まないペプチドは、約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量）未満の異種タンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも称する）を有するポリペプチドの調製物を包含する。ペプチドが組換え生産される場合は、ペプチドは、好ましくは培地も実質的に含まず、ペプチド調製物の容積の約２０％、１０％または５％未満の培地を含むペプチドの調製物を包含する。ペプチドが化学合成によって生産される場合は、ペプチドは、好ましくは化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まず、そのペプチドの合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質をペプチド調製物の容積の約３０％、２０％、１０％または５％（乾燥重量）未満含むペプチドの調製物を包含する。特定のペプチド調製物が単離または精製されたペプチドを含むことは、例えばタンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の単一バンドの出現およびゲルのクマシーブリリアントブルー染色等によって示され得る。好ましい態様では、本発明のペプチドおよびポリヌクレオチドは単離または精製されている。
【００３２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書ではアミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。本用語は、天然のアミノ酸ポリマーに加えて、１つもしくは複数のアミノ酸残基が改変された残基であるアミノ酸ポリマー、または対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的模倣体などの非天然残基にも適用される。
【００３３】
本明細書で使用する「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに細胞内で翻訳後に修飾されたもの（例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸およびＯ−ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（水素、カルボキシ基、アミノ基およびＲ基に結合したα炭素）を有するが、修飾されたＲ基または修飾された骨格（例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチルメチオニンスルホニウム）を有する化合物を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、一般的なアミノ酸とは異なる構造を有するが、同様に機能する化合物を指す。
【００３４】
アミノ酸は、本明細書ではＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される、一般に公知の３文字表記、または１文字表記によって言及され得る。
【００３５】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書では互換的に使用され、特に明確に示されない限り、一般に受け入れられている１文字コードによって言及される。
「剤」および「組成物」という用語は、本明細書では、特定量の特定成分を含む生成物、ならびに特定量の特定成分の組合せから直接または間接的に生じる任意の生成物を指すために互換的に使用される。医薬組成物に関するそのような用語は、有効成分、および担体を構成する不活性成分を含む生成物、ならびに成分の任意の２つもしくはそれ以上の組合せ、錯体形成もしくは凝集から、または成分の１つもしくは複数の解離から、または成分の１つもしくは複数の他の種類の反応もしくは相互作用から直接または間接的に生じる任意の生成物を包含することが意図されている。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の化合物と医薬的または生理学的に許容される担体とを混合することによって作製される任意の組成物を包含する。
【００３６】
「有効成分」という用語は、本明細書では生物学的または生理学的に活性な組成物中の物質を指す。特に、医薬組成物に関連して、「有効成分」という用語は、目的の薬理学効果を示す成分物質を指す。例えば、がんの治療または予防における使用のための医薬組成物の場合、組成物中の有効成分は、直接または間接的にがん細胞および／または組織に対する少なくとも１つの生物学的または生理学的作用をもたらし得る。好ましくは、そのような作用は、がん細胞増殖を低減するまたは阻害すること、がん細胞および／または組織を損傷するまたは死滅させること等を含み得る。典型的には、有効成分の間接的な作用は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答の誘導である。製剤化される前は、「有効成分」は「バルク」、「原薬」または「原体」とも称され得る。本明細書で使用する「医薬的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という語句は、液体もしくは固体増量剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料を含むがこれらに限定されない、医薬的または生理学的に許容される材料、組成物、物質またはビヒクルを意味する。
【００３７】
特に定義されない限り、「がん」という用語は、例えば膀胱がんおよび乳がんを含む、ＤＥＰＤＣ１遺伝子を発現するがんを指す。ＤＥＰＤＣ１遺伝子を発現するがんはまた、ＤＥＰＤＣ１を発現するがんまたは、ＤＥＰＤＣ１をコードする遺伝子を発現するがんとも称される。
【００３８】
特に定義されない限り、「Ｔリンパ球」および「Ｔ細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００３９】
特に定義されない限り、「細胞傷害性Ｔリンパ球」、「細胞傷害性Ｔ細胞」および「ＣＴＬ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、特に明確に指示されない限り、非自己細胞（例えば腫瘍細胞、ウイルス感染細胞）を認識し、そのような細胞の死滅を誘導することができるＴリンパ球のサブグループを指す。ＣＴＬは、ＣＤ８＋Ｔリンパ球と区別され、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるペプチドを認識することができる。
【００４０】
特に定義されない限り、「ＨＬＡ−Ａ２４」という用語は、サブタイプを含むＨＬＡ−Ａ２４型を指し、その例には、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０３、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０４、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０７、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０８、ＨＬＡ−Ａ＊２４：２０、ＨＬＡ−Ａ＊２４：２５およびＨＬＡ−Ａ＊２４：８８が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
特に定義されない限り、本明細書で使用する「ＨＬＡ−Ａ２」という用語は、典型的にはサブタイプを指し、その例には、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０３、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０４、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０５、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０７、ＨＬＡ−Ａ＊０２：１０、ＨＬＡ−Ａ＊０２：１１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：１３、ＨＬＡ−Ａ＊０２：１６、ＨＬＡ−Ａ＊０２：１８、ＨＬＡ−Ａ＊０２：１９、ＨＬＡ−Ａ＊０２：２８およびＨＬＡ−Ａ＊０２：５０が含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
特に定義されない限り、「Ｔヘルパー１型細胞」および「Ｔｈ１細胞」という用語は、本明細書では互換的に使用され、特に明確に示されない限り、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるペプチドを認識することができ、細胞性免疫に関連するＣＤ４＋Ｔリンパ球のサブグループを指す。特に定義されない限り、「Ｔｈ細胞」、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」および「ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞」という用語も本明細書では互換的に使用される。Ｔｈ１細胞は、細胞性免疫に関する他の免疫細胞（例えばＣＴＬ、マクロファージ）の活性化および／または刺激を助けるために様々なサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α等）を分泌する。
【００４３】
特に定義されない限り、「ＨＬＡ−ＤＲ５３」という用語はサブタイプを指し、その例には、ＨＬＡ−ＤＲＢ４＊０１：０１、ＤＲＢ４＊０１：０２、ＤＲＢ４＊０１：０３、ＤＲＢ４＊０１：０４、ＤＲＢ４＊０１：０５、ＤＲＢ４＊０１：０６およびＤＲＢ４＊０１：０７が含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
特に定義されない限り、「ＨＬＡ−ＤＲ４」という用語はサブタイプを指し、その例には、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０８、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０９、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：１０およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：１１が含まれるが、これらに限定されない。
【００４５】
特に定義されない限り、「ＨＬＡ−ＤＲ１５」という用語はサブタイプを指し、その例には、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０８、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０９、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：１０およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：１１が含まれるが、これらに限定されない。
【００４６】
特に定義されない限り、「ＨＬＡ−ＤＰ５」という用語はサブタイプを指し、その例には、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１が含まれるが、これに限定されない。
【００４７】
特に定義されない限り、「ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答」という語句は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるペプチドの提示によって誘導される免疫応答を指す。本明細書では、「ＭＨＣクラスＩＩ抗原によって媒介される免疫応答」は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、特にＴｈ１細胞によって誘導される免疫応答を含む。そのような免疫応答の例には、サイトカイン（例えばＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α等）の産生ならびに他の免疫細胞（例えばＣＴＬ、マクロファージ等）の活性化および／または刺激が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
特に定義されない限り、「ＤＥＰＤＣ１に特異的なＴｈ１細胞」という語句は、ＤＥＰＤＣ１に由来するペプチドを提示するＡＰＣによって特異的に活性化されるが、他のＡＰＣでは活性化されないＴｈ１細胞を指す。
【００４９】
特に定義されない限り、「ＤＥＰＤＣ１特異的ＣＴＬ」という語句は、ＤＥＰＤＣ１を発現する標的細胞に対して特異的に細胞傷害性を示すＣＴＬを指す。
特に定義されない限り、ペプチドに関連して使用される場合、「ＣＴＬ誘導能」という語句は、ＡＰＣ上に提示された場合にＣＴＬを誘導するペプチドの能力を指す。
特に定義されない限り、本明細書で使用する「キット」という用語は、試薬と他の材料の組合せに関して用いられる。キットは、マイクロアレイ、チップ、マーカー等を含み得ることが本明細書で企図される。「キット」という用語は、試薬および／または材料の特定の組合せに限定されることを意図しない。
【００５０】
本発明に関連して、「抗体」という用語は、指定されるタンパク質またはそのペプチドに特異的に反応性のある免疫グロブリンおよびその断片を指す。抗体は、ヒト抗体、霊長類化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヒト化抗体、他のタンパク質または放射性標識に融合した抗体、および抗体断片を含み得る。さらに、本明細書における抗体はその最も広い意味で使用され、特にインタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片を包含する。「抗体」は、すべてのクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）を指す。
【００５１】
特に定義されない限り、本明細書で使用するすべての技術および学術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００５２】
ＩＩ．ペプチド
以下で詳細に説明する本発明のペプチドは、「ＤＥＰＤＣ１ペプチド」または「ＤＥＰＤＣ１ポリペプチド」と称され得る。
ＤＥＰＤＣ１に由来するペプチドがＴｈ１細胞によって認識される抗原として機能することを明らかにするため、ＤＥＰＤＣ１（配列番号：８または１０）に由来するペプチドを、これらがＭＨＣクラスＩＩ分子によってプロミスキャスに拘束される抗原エピトープであるかどうかを判定するために分析した。ＤＥＰＤＣ１に由来するプロミスキャスなＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの候補を、ＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５への結合親和性に基づいて同定した。これらのペプチドをロードした樹状細胞（ＤＣ）によるＣＤ４＋Ｔ細胞のインビトロ刺激後、以下のペプチドの各々を用いてＴｈ１細胞を成功裏に樹立した：
ＤＥＰＤＣ１１９１−２１３／ＲＹＶＩＬＩＹＬＱＴＩＬＧＶＰＳＬＥＥＶＩＮＰ（配列番号１）、
ＤＥＰＤＣ１２９２−３１３／ＴＦＥＹＹＥＬＦＶＮＩＬＶＶＣＧＹＩＴＶＳＤ（配列番号２）、
ＤＥＰＤＣ１３０１−３２９／ＮＩＬＶＶＣＧＹＩＴＶＳＤＲＳＳＧＩＨＫＩＱＤＤＰＱＳＳＫ（配列番号３）、および
ＤＥＰＤＣ１６１３−６３４／ＮＲＲＫＬＱＬＬＭＲＭＩＳＲＭＳＱＮＶＤＭＰ（配列番号４）。
【００５３】
上述したこれらの樹立されたＴｈ１細胞は、それぞれのペプチドでパルスしたＡＰＣの刺激に応答して強力な特異的Ｔｈ１細胞活性を示した。さらに、前記ペプチドは、日本人において高頻度に認められるいくつかのＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＰ分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５）によって拘束されるＴｈ１細胞を刺激することができた。本明細書におけるこれらの結果は、ＤＥＰＤＣ１がＴｈ１細胞によって認識される抗原であること、およびペプチドが、いくつかのＨＬＡクラスＩＩ分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５）によってプロミスキャスに拘束されるＤＥＰＤＣ１のエピトープペプチドであることを明らかにする。
【００５４】
上記で同定したペプチドのいくつかは、ＤＥＰＤＣ１に特異的なＣＴＬを誘導する能力を有するＣＴＬエピトープのアミノ酸配列を付加的に含み、本明細書で明らかにするように、そのようなペプチドは、Ｔｈ１細胞に加えてＤＥＰＤＣ１に特異的なＣＴＬも誘導することができる。したがって、これらのペプチドは、ＤＥＰＤＣ１を発現するがんに対する免疫応答の誘導のための適切なペプチドであり得る。ＤＥＰＤＣ１遺伝子は、例えば膀胱がんおよび乳がんを含む大部分のがん組織で過剰発現されるので、免疫療法のための良好な標的である。
【００５５】
したがって、本発明は、ＤＥＰＤＣ１に特異的なＴｈ１細胞を誘導する能力を有するペプチドを提供する。本発明のペプチドは、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができ、ＡＰＣ上に提示され得る。あるいは、本発明のペプチドの断片は、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができ、ＡＰＣ上に提示され得る。ペプチドのこれらの断片は、ＡＰＣ内でのプロセシングによって生成され得る。好ましい態様では、本発明のペプチドまたはその断片は、２またはそれ以上の種類のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５）に結合する能力を有する。言い換えると、本発明のペプチドは、２またはそれ以上の種類のＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束されるＴｈ１細胞を誘導する能力を有し得る。別の態様では、本発明のペプチドは、ＤＥＰＤＣ１特異的ＣＴＬ誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む。ＤＥＰＤＣ１特異的ＣＴＬ誘導能を有するそのようなペプチドの典型的な例には、配列番号：５または６のアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。
【００５６】
ＭＨＣクラスＩＩ分子における結合溝は両端で開いているので、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドはその長さに柔軟性を有し得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子についてのコア結合モチーフは９個のアミノ酸残基から成り、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは一般に、コア結合モチーフと隣接する他のアミノ酸残基を有する。隣接アミノ酸残基の数は限定されない。したがって、配列番号：１、２、３または４のすべてのアミノ酸残基がＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するために必ずしも必要ではない。したがって、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有するペプチドであり得、そのようなペプチドは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：
（ａ）配列番号：１、２、３または４のアミノ酸配列からの９個より多い連続するアミノ酸を有するアミノ酸配列；および
（ｂ）１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されている（ａ）のアミノ酸配列。
ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの長さは一般に１０〜３０アミノ酸である。配列番号：１から４のアミノ酸配列はＤＥＰＤＣ１のアミノ酸配列（配列番号：８または１０）の一部からなるので、本発明のペプチドは以下の［１］〜［５］に記載のペプチドであり得る：
［１］１０〜３０アミノ酸長を有し、配列番号：８または１０のアミノ酸配列の一部を含む単離されたペプチドであって、
（ａ）配列番号：１、２、３または４のアミノ酸配列から選択される９アミノ酸を超える長さを有する連続するアミノ酸配列；および
（ｂ）１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されている（ａ）のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有するペプチド；
［２］前記ペプチドまたはその断片が少なくとも２種類のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を有する、［１］に記載の単離されたペプチド；
［３］前記ＭＨＣクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５からなる群より選択される、［２］に記載の単離されたペプチド；
［４］前記ペプチドが、ＤＥＰＤＣ１特異的ＣＴＬ誘導能を有するペプチドのアミノ酸配列を含む、［１］から［３］のいずれか１つに記載の単離されたペプチド；ならびに
［５］
（ａ）配列番号：１から４からなる群より選択されるアミノ酸配列；ならびに
（ｂ）１、２または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されている（ａ）のアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、［４］に記載の単離されたペプチド。
【００５７】
本発明のペプチドによって誘導されるＴｈ１細胞はＤＥＰＤＣ１に特異的である。
それゆえ、いくつかの態様において、本発明は、配列番号：８または１０のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなる３０アミノ酸残基未満のペプチドであって、配列番号：１、２、３または４のアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。
【００５８】
一般に、インターネット上で現在利用可能なソフトウェアプログラム、例えばＷａｎｇ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．４（４）：ｅ１００００４８．１１：５６８；およびＷａｎｇ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．に記載されているソフトウェアプログラムを使用して、様々なペプチドとＨＬＡ抗原との間の結合親和性をインシリコで算出することができる。ＨＬＡ抗原との結合親和性は、例えばＮｉｅｌｓｅｎ  Ｍ  ａｎｄ  Ｌｕｎｄ  Ｏ．２００９．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１０：２９６；Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．８：２３８；Ｂｕｉ  ＨＨ，ｅｔ  ａｌ．，２００５．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．５７：３０４−３１４；Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（６）：５５５−５６１およびＮｉｅｌｓｅｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００８．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．４（７）ｅ１０００１０７に記載されているように測定することができる。したがって、本発明は、そのような公知のプログラムを用いて同定されたＨＬＡ抗原と結合すると決定されたＤＥＰＤＣ１のペプチドを包含する。
【００５９】
上述したように、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドはその長さに柔軟性があるので、配列番号：１、２、３または４のアミノ酸配列は、生じるペプチドが必要なＴｈ１細胞誘導能を保持する限り、場合により付加的なアミノ酸残基と隣接していてもよい。Ｔｈ１細胞誘導能を有するそのようなペプチドは、典型的には約３０アミノ酸未満、しばしば約２９アミノ酸未満、通常は約２８または２７アミノ酸未満である。配列番号：１から４の中より選択されるアミノ酸配列に隣接する特定のアミノ酸配列は、そのような隣接アミノ酸配列がもとのペプチドのＴｈ１細胞誘導能を損なわない限り、限定されず、任意の種類のアミノ酸で構成され得る。典型的な態様では、そのような隣接アミノ酸配列は、配列番号：１、２、３または４のアミノ酸配列に隣接する配列番号：８または１０のアミノ酸配列の中から選択され得る；しかし、本発明はそれに限定されない。そこで、本発明はまた、Ｔｈ１細胞誘導能ならびに配列番号：１から４の中より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。
【００６０】
他方で、ＭＨＣクラスＩＩ分子についてのコア結合モチーフは９個のアミノ酸残基からなるので、配列番号：１、２、３または４のアミノ酸配列の必ずしも全長が、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するためおよびＴｈ１細胞の誘導のために必要であるというわけではない。したがって、本発明のペプチドは、必要なＴｈ１細胞誘導能を保持することを条件として、配列番号：１、２、３または４のアミノ酸配列から９個より多い連続するアミノ酸を有するペプチドの形態をとることができる。Ｔｈ１細胞誘導能を有するペプチドは、典型的には約１０より多いアミノ酸、しばしば１１または１２より多いアミノ酸、通常は１３または１４より多いアミノ酸である。したがって、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞誘導能を有し、かつ配列番号：１、２、３または４のアミノ酸配列からの９、１０、１１、１２、１３または１４個より多い連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する、ペプチドであり得る。
【００６１】
タンパク質中の１、２またはそれ以上のアミノ酸の改変はタンパク質の機能に影響を及ぼさず、一部の場合にはもとのタンパク質の所望の機能を増強することさえあることは一般に公知である。実際に、改変されたペプチド（すなわちもとの参照配列と比較して１、２または数個のアミノ酸残基が改変されている（すなわち置換、付加、欠失または挿入されている）アミノ酸配列からなるペプチド）が、もとのペプチドの生物学的活性を保持することは知られている（Ｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８４，８１：５６６２−６；Ｚｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９８２，１０：６４８７−５００；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８２，７９：６４０９−１３）。したがって、１つの態様では、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞誘導能ならびに配列番号：１から４の中から選択されるアミノ酸配列の両方を有し得、この配列において、１、２またはさらにそれ以上のアミノ酸が付加、挿入、欠失および／または置換されている。あるいは、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞誘導能ならびに配列番号：１、２、３または４のアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が付加、挿入、欠失および／または置換されているアミノ酸配列の両方を有し得る。すなわち、いくつかの態様において、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞誘導能ならびに配列番号：１、２、３または４のアミノ酸配列に対して、付加、挿入、欠失および置換からなる群より選択される１、２または数個の改変が行われたアミノ酸配列を有し得る。
【００６２】
当業者は、単一アミノ酸または小さな割合のアミノ酸を改変するアミノ酸配列への個々の付加または置換は、もとのアミノ酸側鎖の特性の保存をもたらす傾向があることを認識する。そこで、それらはしばしば「保存的置換」または「保存的改変」と称され、タンパク質の改変は、もとのタンパク質と類似の機能を有する改変されたタンパク質を生じさせる。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は当技術分野において周知である。アミノ酸側鎖の特性の例は、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、および以下の共通する官能基または特徴を有する側鎖：脂肪族側鎖（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）；ヒドロキシル基含有側鎖（Ｓ、Ｔ、Ｙ）；硫黄原子含有側鎖（Ｃ、Ｍ）；カルボン酸およびアミド含有側鎖（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）；塩基含有側鎖（Ｒ、Ｋ、Ｈ）；ならびに芳香族含有側鎖（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）である。加えて、以下の８群は各々相互に保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９８４参照）。
【００６３】
そのような保存的に改変されたペプチドも本発明のペプチドとみなされる。しかし、本発明のペプチドはそれらに限定されず、改変されたペプチドがもとのペプチドのＴｈ１細胞誘導能を保持する限り、非保存的改変も含み得る。さらに、改変されたペプチドは、ＤＥＰＤＣ１の多型変異体、種間相同体およびアリルのＴｈ１細胞誘導性ペプチドを除外すべきではない。
【００６４】
必要なＴｈ１細胞誘導能を保持するために、少数の（例えば１、２もしくは数個）または低い割合のアミノ酸を改変する（挿入、付加、欠失および／または置換する）ことができる。本明細書では、「数個」という用語は、５またはそれ以下のアミノ酸、例えば４または３またはそれ以下のアミノ酸を意味する。改変するアミノ酸の割合は、好ましくは２０％もしくはそれ以下、より好ましくは１５％もしくはそれ以下、さらに一層好ましくは１０％もしくは８％もしくはそれ以下、または１〜５％である。
【００６５】
本発明の好ましいペプチド、すなわち配列番号：１から４（ＤＥＰＤＣ１１９１−２１３−ＬＰ、ＤＥＰＤＣ１２９２−３１３−ＬＰ、ＤＥＰＤＣ１３０１−３２９−ＬＰおよびＤＥＰＤＣ１６１３−６３４−ＬＰ）のホモロジー解析は、これらのペプチドが他の公知のヒト遺伝子産物に由来するペプチドと有意の相同性を有さないことを確認する。したがって、免疫療法に使用した場合、これらのペプチドが未知のまたは望ましくない免疫応答を生じる可能性は有意に低い。したがって、これらのペプチドは、がん患者においてＤＥＰＤＣ１に対する免疫を誘発するために極めて有用であると期待される。
【００６６】
免疫療法に関連して使用する場合、本発明のペプチドまたはその断片は、ＡＰＣの表面に、好ましくはＨＬＡクラスＩＩ抗原との複合体として、提示されなければならない。それゆえ、Ｔｈ１細胞を誘導するだけでなく、ＨＬＡクラスＩＩ抗原に高い結合親和性も有するペプチドを選択することが好ましい。そのために、ペプチドをアミノ酸残基の置換、挿入、欠失および／または付加によって改変し、改善された結合親和性を有する改変されたペプチドを生成することができる。
【００６７】
本発明はまた、上述したペプチドのＮ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方への１〜２個のアミノ酸の付加を企図する。高いＨＬＡ抗原結合親和性を有し、Ｔｈ１細胞誘導能を保持するそのような改変ペプチドも本発明に含まれる。
【００６８】
例えば、本発明は、ＨＬＡクラスＩＩ抗原に結合し、Ｔｈ１細胞誘導能を有し、配列番号：１から４からなる群より選択されるアミノ酸配列において１、２または数個のアミノ酸が改変されているアミノ酸配列を含む、３１、３０、２９、２８、２７または２６未満のアミノ酸長の単離されたペプチドを提供する。
【００６９】
これらのペプチドはまた、ＡＰＣと接触するかまたはＡＰＣに導入された場合、ＡＰＣ中でプロセシングされて、プロセシングされた断片をその上に提示し得る。例えば、本発明のペプチドは、ＡＰＣの表面に提示される通常１１〜２６（典型的には１５〜２５）アミノ酸残基からなる断片にプロセシングされ得る。
【００７０】
しかしながら、ペプチド配列が、異なる機能を有する内因性または外因性タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一である場合、自己免疫疾患および／または特定の物質に対するアレルギー症状などの負の副作用を誘導し得る。それゆえ、ペプチドの配列が別のタンパク質のアミノ酸配列とマッチする状況を回避するために、利用可能なデータベースを用いて最初にホモロジー検索を実施することが望ましいと考えられる。目的のペプチドと比較して同一のペプチドまたは１もしくは２個のアミノ酸相違を有するペプチドが自然界に存在しないことがホモロジー検索から明らかになった場合は、そのような副作用の危険性を伴わずにＨＬＡ抗原とのその結合親和性を高めるためならびに／またはそのＴｈ１細胞誘導能および／もしくはＣＴＬ誘導能を高めるために目的のペプチドを改変することができる。
【００７１】
上述したＨＬＡクラスＩＩ抗原に高い結合親和性を有するペプチドは極めて有効であると期待されるが、指標として高い結合親和性の存在に従って選択した候補ペプチドを、Ｔｈ１細胞誘導能の存在に関してさらに検討する。本明細書では、「Ｔｈ１細胞誘導能」という語句は、ＡＰＣと接触した場合、Ｔｈ１細胞を誘導する能力をＡＰＣに付与するペプチドの能力を示す。さらに、「Ｔｈ１細胞誘導能」は、Ｔｈ１細胞の活性化および／またはＴｈ１細胞の増殖を誘導する、ＩＦＮ−γ産生を含むＴｈ１細胞媒介性サイトカイン産生を促進して他の細胞（例えばＣＴＬ、マクロファージ）を助けるおよび／または刺激する、ペプチドの能力を含む。
【００７２】
Ｔｈ１細胞誘導能の確認は、ヒトＭＨＣ抗原を担持するＡＰＣ（例えばＢリンパ球、マクロファージおよび樹状細胞（ＤＣ））、好ましくはヒト末梢血単核白血球由来のＤＣを誘導し、ペプチドで刺激した後、ＣＤ４陽性Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）と混合して、次にＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生され、放出されたＩＦＮ−γを測定することによって達成できる。あるいは、ペプチドのＴｈ１細胞誘導能は、Ｔｈ１細胞によるＣＴＬ活性化に基づいて評価することができる。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞を試験ペプチドで刺激したＤＣと共培養し、次にＣＴＬおよびＣＴＬの標的細胞と混合する。標的細胞は、５１Ｃｒなどで放射性標識することができ、Ｔｈ１細胞から分泌されるサイトカインによって活性化されたＣＴＬの細胞傷害活性を、標的細胞から放出された放射能から算出することができる。あるいは、Ｔｈ１細胞誘導能は、試験ペプチドで刺激したＡＰＣの存在下でＴｈ１細胞によって産生され、放出されたＩＦＮ−γを測定し、抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体を用いて培地上の阻止帯を可視化することによって評価できる。
【００７３】
上述した改変に加えて、本発明のペプチドはまた、生じる結合ペプチドがもとのペプチドのＴｈ１細胞誘導能を保持する限り、他の物質に結合することもできる。適切な物質の例には、例えばペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成ポリマー等が含まれる。本発明のペプチドは、修飾がもとのペプチドの生物学的活性を損なわない限り、グリコシル化、側鎖酸化またはリン酸化等のような修飾を含み得る。これらの種類の修飾は、付加的な機能（例えば標的化機能および送達機能）を付与する、またはペプチドを安定化するために実施できる。
【００７４】
例えば、ペプチドのインビボでの安定性を高めるために、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸模倣体または非天然アミノ酸を導入することは当技術分野において公知である；この概念は本発明のペプチドにも適合させ得る。ペプチドの安定性は多くの方法で評価することができる。例えば、ペプチダーゼならびにヒト血漿および血清などの様々な生物学的媒体を用いて安定性を試験することができる（例えばＶｅｒｈｏｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ  １９８６，１１：２９１−３０２参照）。
【００７５】
本発明のペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ抗原と組み合わせた複合体としてＡＰＣの表面に提示され、その後Ｔｈ１細胞を誘導し得る。それゆえ、ＡＰＣの表面でＨＬＡクラスＩＩ抗原と複合体を形成するペプチドも本発明に含まれる。本発明のペプチドを提示するＡＰＣをワクチンとして接種することができる。
【００７６】
上記複合体に含まれるＨＬＡ抗原の型は、治療および／または予防を必要とする対象の型とマッチしなければならない。例えば、日本人においては、ＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５が一般的であり、それゆえ日本人患者の治療に適する。典型的には、臨床において、治療を必要とする患者のＨＬＡ抗原の型を前もって検査し、これにより特定のＨＬＡクラスＩＩ抗原への結合能力を有するペプチドの適切な選択が可能になる。好ましい態様では、本発明のペプチドはＴｈ１細胞をプロミスキャスに誘導することができる。本明細書では、ペプチドが少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子によって拘束されるＴｈ１細胞を誘導することができる場合、このペプチドのＴｈ１細胞誘導能は「プロミスキャス」である。言い換えると、ペプチドが少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識される場合、そのような抗原認識は「プロミスキャス」とみなされる。ペプチドに関連して使用する場合、「少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子によって認識される」という語句は、ペプチドまたはその断片が少なくとも２つの異なる種類のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できることを示す。例えば、ＤＥＰＤＣ１１９１−２１３−ＬＰ（配列番号：１）は、ＨＬＡ−ＤＲ５３およびＨＬＡ−ＤＲ４によって認識され、ＤＥＰＤＣ１２９２−３１３−ＬＰ（配列番号：２）は、ＨＬＡ−ＤＲ４によって認識され、ＤＥＰＤＣ１３０１−３２９−ＬＰ（配列番号：３）は、ＨＬＡ−ＤＰ５およびＨＬＡ−ＤＲ４によって認識され、ならびにＤＥＰＤＣ１６１３−６３４−ＬＰ（配列番号：４）は、ＨＬＡ−ＤＰ５およびＨＬＡ−ＤＲ１５によって認識される。それゆえ、これらのペプチドは「プロミスキャス」なエピトープの典型的な例である。
【００７７】
ＨＬＡ−ＤＲ５３またはＨＬＡ−ＤＲ４陽性ＡＰＣを使用する場合は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドが好ましくは使用される。ＨＬＡ−ＤＲ４陽性ＡＰＣを使用する場合は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドが好ましくは使用される。ＨＬＡ−ＤＰ５またはＤＲ４陽性ＡＰＣを使用する場合は、配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドが好ましくは使用される。ＨＬＡ−ＤＰ５またはＤＲ１５陽性ＡＰＣを使用する場合は、配列番号：４のアミノ酸配列を有するペプチドが好ましくは使用される。
【００７８】
したがって、好ましい態様では、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にＨＬＡ−ＤＲ５３またはＨＬＡ−ＤＲ４を有すると同定された対象において、Ｔｈ１細胞の誘導のために使用し得る。同様に、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にＨＬＡ−ＤＲ４を有すると同定された対象において、Ｔｈ１細胞の誘導のために使用し得る。同様に、配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にＨＬＡ−ＤＰ５またはＤＲ４を有すると同定された対象において、Ｔｈ１細胞の誘導のために使用し得る。同様に、配列番号：４のアミノ酸配列を有するペプチドを、誘導の前にＨＬＡ−ＤＰ５またはＤＲ１５を有すると同定された対象において、Ｔｈ１細胞の誘導のために使用し得る。
【００７９】
ＩＩＩ．ＤＥＰＤＣ１ペプチドの調製
本発明のペプチドは周知の技術を用いて調製することができる。例えば、本発明のペプチドは、組換えＤＮＡ技術または化学合成を用いて、合成によって調製することができる。本発明のペプチドは、個別にまたは２もしくはそれ以上のペプチドからなるより長いポリペプチドとして合成することができる。本発明のペプチドを、次に、他の天然の宿主細胞タンパク質およびその断片、または他の何らかの化学物質を実質的に含まないようにするために、単離する、すなわち精製することができる。
【００８０】
本発明のペプチドは、修飾がもとの参照ペプチドの生物学的活性を損なわない限り、グリコシル化、側鎖酸化またはリン酸化などの修飾を含み得る。他の例示的な修飾には、Ｄ−アミノ酸または他のアミノ酸模倣体の取り込みが含まれる。これらの修飾は、例えばペプチドの血清半減期を延長させるために使用できる
【００８１】
本発明のペプチドは、選択したアミノ酸配列に基づく化学合成を通して得ることができる。この合成に適合させ得る従来のペプチド合成法の例には以下が含まれる：
（ｉ）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６６；
（ｉｉ）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６；
（ｉｉｉ）「ペプチド合成」（日本語）、丸善、１９７５；
（ｉｖ）「ペプチド合成の基礎と実験」（日本語）、丸善、１９８５；
（ｖ）「医薬品の開発」（日本語）、続第１４巻（ペプチド合成）、広川書店、；
（ｖｉ）国際公開第９９／６７２８８号；および
（ｖｉｉ）Ｂａｒａｎｙ  Ｇ．＆  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｒ．Ｂ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｖｏｌ．２，「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０，１００−１１８。
【００８２】
あるいは、本発明のペプチドは、ペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子工学的方法を適合させて得ることができる（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ  Ｊ，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １９７７，１３２：３４９−５１；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＆  Ｃｕｒｔｉｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ）１９８３，１０１：３４７−６２）。例えば、最初に、発現可能な形態で（例えばプロモーター配列に対応する調節配列の下流に）目的のペプチドをコードするポリヌクレオチドを保有する適切なベクターを調製し、適切な宿主細胞に形質転換する。次に宿主細胞を培養して関心対象のペプチドを生産させる。本発明のペプチドはまた、インビトロ翻訳系を採用してインビトロで作製することもできる。
【００８３】
ＩＶ．ポリヌクレオチド
本発明はまた、本発明の前記ペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。これらには、天然のＤＥＰＤＣ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１１４１２０（配列番号：７）またはＮＭ＿０１７７７９（配列番号：９））に由来するポリヌクレオチド、ならびにその保存的に改変されたヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドが含まれる。本明細書では、「保存的に改変されたヌクレオチド配列」という語句は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする配列を指す。遺伝暗号の縮重に起因して、数多くの機能的に同一の核酸が所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって特定されるあらゆる位置で、コドンを、コードされるポリペプチドを変化させることなく前述した対応するコドンのいずれかに変化させることができる。そのような核酸変異は、保存的に改変された変異の一種である、「サイレント変異」である。ペプチドをコードする本明細書のあらゆる核酸配列は、核酸のあらゆる可能なサイレント変異も表す。当業者は、核酸中の各々のコドン（通常メチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を、機能的に同一の分子を生じるように改変できることを認識する。したがって、ペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、各々の開示される配列において暗黙のうちに表現される。
【００８４】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの誘導体で構成され得る。当技術分野において周知のように、ＤＮＡはＡ、Ｔ、ＣおよびＧなどの塩基で適切に構成され、Ｔは、ＲＮＡではＵに置き換えられる。当業者は、非天然の塩基もポリヌクレオチドに含まれ得ることを認識する。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチドは、介在するアミノ酸配列を伴って、または伴わずに、本発明の複数のペプチドをコードし得る。例えば、介在アミノ酸配列は、ポリヌクレオチドまたは翻訳されたペプチドの切断部位（例えば酵素認識配列）を提供することができる。さらに、ポリヌクレオチドは、本発明のペプチドをコードするコード配列に加えて任意の付加的な配列を含み得る。例えば、ポリヌクレオチドは、ペプチドの発現に必要な調節配列を含む組換えポリヌクレオチドであり得るか、またはマーカー遺伝子などを含む発現ベクター（プラスミド）であり得る。一般に、そのような組換えポリヌクレオチドは、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用する従来の組換え技術を通したポリヌクレオチドの操作によって調製することができる。
【００８６】
組換えおよび化学合成の両方の技術が、本発明のポリヌクレオチドを作製するために使用できる。例えば、ポリヌクレオチドは適切なベクターへの挿入によって作製でき、これをコンピテント細胞にトランスフェクトした場合に発現させ得る。あるいは、ＰＣＲ技術または適切な宿主における発現を用いてポリヌクレオチドを増幅することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９参照）。あるいは、ポリヌクレオチドは、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＳＬ  ＆  Ｉｙｅｒ  ＲＰ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９２，４８：２２２３−３１１；Ｍａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １９８４，３：８０１−５に記載されているように、固相技術を用いて合成することができる。
【００８７】
Ｖ．抗原提示細胞（ＡＰＣ）
本発明はまた、ＨＬＡクラスＩＩ抗原と本発明のペプチドまたはその断片との間で形成される複合体を自らの表面に提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）も提供する。本発明のペプチドと接触させることによって得られるＡＰＣは、治療および／または予防の対象である患者に由来することができ、それだけでまたは本発明のペプチド、Ｔｈ１細胞またはＣＴＬを含む他の薬剤と組み合わせてワクチンとして投与することができる。
【００８８】
ＡＰＣは特定の種類の細胞に限定されず、リンパ球によって認識されるためにタンパク質性抗原をその細胞表面に提示することが知られている、樹状細胞（ＤＣ）、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞を含む。ＤＣはＡＰＣの中で最も強力なＴｈ１細胞誘導活性を有する代表的なＡＰＣであるので、ＤＣは本発明のＡＰＣとして有用である。
【００８９】
さらに、好ましい態様では、本発明のペプチドはまた、ＭＨＣクラスＩＩ抗原によって媒介されるＴｈ１細胞応答と同様に、ＭＨＣクラスＩ抗原によって媒介されるＣＴＬ応答を誘導することもできる。一般に、ＭＨＣクラスＩ抗原によって認識されるエピトープの長さは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原のもの（１５またはそれ以上のアミノ酸残基）より短い（例えば８〜１０アミノ酸残基）ことが周知である。それゆえ、本発明のペプチドのプロセシングされた産物はＣＴＬの誘導をもたらすであろう。実際に、ＤＥＰＤＣ１２９２−３１３−ＬＰ（配列番号：２）は断片（ＥＹＹＥＬＦＶＮＩ：配列番号：５）を認識するＣＴＬを誘導し、ＤＥＰＤＣ１２９２−３１３−ＬＰ（配列番号：２）またはＤＥＰＤＣ１３０１−３２９−ＬＰ（配列番号：３）は断片（ＩＬＶＶＣＧＹＩＴＶ：配列番号：６）を認識するＣＴＬを誘導する。したがって、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞を誘導するだけでなく、ＡＰＣ内でのプロセシング後にＣＴＬも誘導することができる。言い換えると、本発明の上記ペプチドと接触したＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩＩ抗原と共にそのようなペプチドを提示し、同時にＭＨＣクラスＩ抗原と共にそれらの断片を提示する。その結果として、Ｔｈ１細胞とＣＴＬの両方が、本発明の上記のペプチドを使用することによって誘導され得る。
【００９０】
例えば、ＡＰＣは、末梢血単核細胞からＤＣを誘導し、次にそれらをインビトロ、エクスビボまたはインビボで本発明のペプチドと接触させる（刺激する）ことによって得られる。本発明のペプチドを対象に投与した場合、本発明のペプチドまたはその断片を提示するＡＰＣが対象の体内で誘導される。本明細書では、「ＡＰＣを誘導する」という語句は、ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させて（で刺激して）、ＨＬＡクラスＩＩ抗原と本発明のペプチドまたはその断片との間で形成される複合体をＡＰＣの表面に提示させることを含む。あるいは、本発明のペプチドをＡＰＣに導入して、本発明のペプチドまたはその断片をＡＰＣに提示させた後、ＡＰＣをワクチンとして対象に投与することができる。例えば、エクスビボ投与は：
（ａ）第１の対象からＡＰＣを回収する段階、
（ｂ）段階（ａ）のＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階、および
（ｃ）ペプチドをロードした段階（ｂ）のＡＰＣを第２の対象に投与する段階
を含みうる。
【００９１】
第１の対象と第２の対象は同じ個体であってもよく、または異なる個体でもよい。あるいは、本発明によれば、ＡＰＣを誘導する医薬組成物を製造するための本発明のペプチドの使用が提供される。加えて、本発明は、ＡＰＣを誘導する医薬組成物を製造するための方法または工程を提供し、前記方法は、本発明のペプチドを医薬的に許容される担体と混合するまたは製剤化するための段階を含む。さらに、本発明はまた、ＡＰＣを誘導するための本発明のペプチドも提供する。段階（ｂ）によって得たＡＰＣをワクチンとして対象に投与することができる。
【００９２】
本発明の１つの側面として、本発明のＡＰＣは高レベルのＴｈ１細胞誘導能を有する。本明細書では、「高レベルのＴｈ１細胞誘導能」という語句において、高レベルとは、ペプチドと接触していないＡＰＣ、またはＴｈ１細胞を誘導することができないペプチドと接触したＡＰＣによるＴｈ１細胞誘導能のレベルと比較したものである。本明細書では、ＡＰＣに関連して使用する場合、「Ｔｈ１細胞誘導能」という語句は、ＣＤ４＋Ｔ細胞と接触した場合にＴｈ１細胞を誘導するＡＰＣの能力を示す。高レベルのＴｈ１細胞誘導能を有するそのようなＡＰＣは、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをインビトロでＡＰＣに移入する段階を含む方法によって調製することができる。導入する遺伝子はＤＮＡまたはＲＮＡの形態であり得る。導入のための方法の例には、特に限定されることなく、この分野で従来実施されている様々な方法が含まれ、例えばリポフェクション、エレクトロポレーションおよびリン酸カルシウム法などが使用できる。より詳細には、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９６，５６：５６７２−７；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８，１６１：５６０７−１３；Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９６，１８４：４６５−７２；公表特許公報第２０００−５０９２８１号に記載されているように実施することができる。遺伝子をＡＰＣに移入することにより、遺伝子は細胞内で転写、翻訳などを受け、その後得られたタンパク質はＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩによってプロセシングされて、提示経路を通してペプチドの提示へと進む。あるいは、本発明のＡＰＣは、ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階を誘導する方法によって調製することができる。
【００９３】
好ましい態様では、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−ＤＲ５３およびＨＬＡ−ＤＲ４から選択されるＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチド（配列番号：１のアミノ酸配列を含む）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。別の態様において、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−ＤＲ４の中から選択されるＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチド（配列番号：２のアミノ酸配列を含む）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。別の態様において、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−ＤＰ５およびＤＲ４のＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチド（配列番号：３のアミノ酸配列を含む）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。別の態様において、本発明のＡＰＣは、ＨＬＡ−ＤＰ５およびＤＲ１５のＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチド（配列番号：４のアミノ酸配列を含む）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。好ましくは、ＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５は、それぞれＨＬＡ−ＤＲＢ４＊０１：０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４：０５、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５：０２およびＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５：０１であり得る。
【００９４】
ＶＩ．Ｔヘルパー１型細胞（Ｔｈ１細胞）
本発明のペプチドのいずれかに対して誘導されるＴｈ１細胞は、インビボでがん細胞を標的とするＣＴＬを含むエフェクター細胞のいずれかの免疫応答を強化し、したがってペプチド自体と同様の方法で、ワクチンとして役立つ。そこで、本発明はまた、本発明のペプチドのいずれかによって特異的に誘導されるまたは活性化される単離されたＴｈ１細胞も提供する。
【００９５】
そのようなＴｈ１細胞は、（１）１つまたは複数の本発明のペプチドを対象に投与し、対象からＴｈ１細胞を回収すること、（２）ＡＰＣおよびＣＤ４＋Ｔ細胞もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させ（で刺激し）、その後Ｔｈ１細胞を単離すること、（３）ＣＤ４＋Ｔ細胞もしくは末梢血単核白血球をインビトロで本発明のＡＰＣと接触させること、または（４）両方のＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドもしくはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４＋Ｔ細胞に導入すること（ＴＣＲはＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチドの複合体に結合することができる）、によって得ることができる。（３）の方法のためのそのようなＡＰＣは上述した方法によって調製することができる。（４）の方法の詳細は、以下の「ＶＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章で述べる。
【００９６】
本発明のＡＰＣで刺激することによって誘導されたＴｈ１細胞は、治療および／または予防の対象である患者に由来してもよく、作用を調節するために単独でまたは本発明のペプチドを含む他の薬剤と組み合わせて投与することができる。得られたＴｈ１細胞は、細胞性免疫に関与する免疫細胞（例えばＣＴＬ、マクロファージ）を活性化するおよび／または刺激することができる。本発明のＴｈ１細胞によって活性化され得るそのような免疫細胞には、がん細胞などの標的細胞に対して細胞傷害性を示すＣＴＬが含まれる。例えば、そのようなＣＴＬの標的細胞は、内因性にＤＥＰＤＣ１を発現する細胞（例えばがん細胞）、またはＤＥＰＤＣ１遺伝子をトランスフェクトされた細胞であり得る。好ましい態様では、本発明のペプチドは、ＣＴＬエピトープペプチドの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むことができ、Ｔｈ１細胞に加えて、がん細胞などのＤＥＰＤＣ１発現細胞に対するＣＴＬも誘導することができる。この場合、本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞およびＣＴＬをインビボで同時にまたは連続的に誘導することができ、誘導されたＴｈ１細胞は、誘導されたＣＴＬを有効に活性化することができる。したがって、ＣＴＬエピトープペプチドの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むそのようなペプチドは、がん免疫療法のための適切なペプチドである。
【００９７】
さらに、本発明のＴｈ１細胞は、他の標的細胞に対するいずれのＣＴＬも抗原非依存的に活性化するおよび／または刺激する様々なサイトカイン（例えばＩＦＮ−γ）を分泌する。したがって、本発明のＴｈ１細胞は、ＤＥＰＤＣ１以外のＴＡＡを発現する細胞を標的とするＣＴＬ活性を増強することにも寄与し得る。したがって、本発明のＴｈ１細胞は、本発明のペプチドおよびＡＰＣと同様に、ＤＥＰＤＣ１を発現する腫瘍だけでなく、他のＴＡＡを発現する腫瘍のための免疫療法にも有用である。
【００９８】
いくつかの態様において、本発明のＴｈ１細胞は、ＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＰ抗原と本発明のペプチドの複合体を提示する細胞を認識するＴｈ１細胞である。Ｔｈ１細胞に関連して、「細胞を認識する」という語句は、そのＴＣＲを介して細胞表面のＭＨＣクラスＩＩ分子と本発明のペプチドの複合体の結合し、抗原特異的に活性化されることを指す。本明細書では、「抗原特異的に活性化される」という語句は、特定のＭＨＣクラスＩＩ分子とペプチドに応答して活性化されることを指し、活性化されたＴｈ１細胞からのサイトカイン産生が誘導される。好ましい態様では、ＨＬＡ−ＤＲおよびＨＬＡ−ＤＰは、ＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５からなる群より選択され得る。
【００９９】
ＶＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明はまた、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のサブユニットを形成することができる１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含有する組成物、およびこれを使用する方法を提供する。そのようなＴＣＲサブユニットは、ＤＥＰＤＣ１ペプチドを提示するＡＰＣに対するＣＤ４＋Ｔ細胞にＤＥＰＤＣ１に対する特異性を付与するＴＣＲを形成する能力を有する。当技術分野において公知の方法を用いることにより、本発明のペプチドによって誘導されるＴｈ１細胞のＴＣＲサブユニットとしてα鎖およびβ鎖の核酸を同定することができる（国際公開第２００７／０３２２５５号およびＭｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７１，３２８８（２００３））。誘導体ＴＣＲは、ＤＥＰＤＣ１ペプチドを提示するＡＰＣに高い結合力で結合することができ、場合により効果的にサイトカインを媒介することができる。
【０１００】
ＴＣＲサブユニットをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド（すなわち両方のＴＣＲサブユニットをコードする単一ポリヌクレオチドまたは各々が別々のＴＣＲサブユニットをコードする複数のポリヌクレオチド）を適切なベクター、例えばレトロウイルスベクターに組み込むことができる。これらのベクターは当技術分野において周知である。ポリヌクレオチドまたはそれらを含むベクターは、ＣＤ４＋Ｔ細胞、例えば患者由来のＣＤ４＋Ｔ細胞に有用に移入することができる。好都合には、本発明は、患者自身のＴ細胞（または別の対象のＴ細胞）の速やかな改変を可能にし、優れたがん細胞殺傷特性を有する改変されたＴ細胞を迅速かつ容易に生産する、すぐに入手可能な組成物を提供する。
【０１０１】
例えば、それぞれ配列番号：１１および２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を各々が有するＴＣＲ−αサブユニットおよびＴＣＲ−βサブユニットが、ＨＬＡ−ＤＲ４拘束様式で、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２（ＤＥＰＤＣ１２９２−３１３−ＬＰ）によって刺激されたＴｈ細胞において増加した（図６）。それゆえ、それらをコードするポリヌクレオチドは、本発明のＴｈ１細胞誘導に好ましい可能性がある。同様に、それぞれ配列番号：１１および２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を各々が有するαサブユニットとβサブユニットとの間で形成されるＴＣＲを発現するＴｈ１細胞もまた、本発明の好ましい態様である。一般に、ＴＣＲの抗原特異性は、主にそれらのＣＤＲ３に依存している。したがって、αサブユニットおよびβサブユニットのＣＤＲ３をそれぞれ配列番号：１１および２１で置き換えることによって、公知のＴＣＲからＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２特異的ＴＣＲを再構築することもできる。別のサブユニットから移植されたＣＤＲ３を有するそのようなＴＣＲは、キメラＴＣＲと称され得る。特異的なＣＤＲを移植するための方法は、当技術分野において周知である。
【０１０２】
本発明はさらに、両方のＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドでの形質導入によって調製されるＴｈ１細胞を提供し、ここで、ＴＣＲサブユニットはＤＥＰＤＣ１ペプチド（例えばＨＬＡ−ＤＲ５３もしくはＨＬＡ−ＤＲ４に関しては配列番号：１、ＨＬＡ−ＤＲ４に関しては配列番号：２、ＨＬＡ−ＤＰ５またはＤＲ４に関しては配列番号：３、ＨＬＡ−ＤＰ５またはＤＲ１５に関しては配列番号：４）に結合することができる。形質導入されたＴｈ１細胞は、インビボでがん細胞にホーミングすることができ、インビトロで周知の培養方法によって増殖させることができる（例えばＫａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，３４５２−３４６１（１９８９））。上述したように調製したＴｈ１細胞は、治療または予防を必要とする患者においてがんを治療するまたは予防する上で有用な免疫原性組成物を形成するために使用できる。
【０１０３】
ＶＩＩＩ．薬剤または医薬組成物
本発明の方法および組成物ががんの「治療」に関連して有用性を有する限り、治療が臨床上の利益、例えばＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現の低下、または対象におけるがんの大きさ、広がりあるいは転移能の低減を導く場合、治療は「有効」とみなされる。治療が予防的に適用される場合、「有効」は、がんの形成を遅延させるもしくは予防するまたはがんの臨床症状を予防するもしくは軽減することを意味する。有効性は、特定の腫瘍型を診断するまたは治療するための任意の公知の方法に関連して決定される。
本発明の方法および組成物ががんの「予防」（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）に関連して有用性を有する限り、そのような用語は、本明細書では、疾患による死亡率または罹患率の負荷を低減させる任意の行為を指すために互換的に使用される。予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、「一次、二次および三次予防レベルで」行われ得る。一次予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は疾患の発生を回避し、一方二次および三次レベルの予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、疾患の進行および症状の出現の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）、ならびに機能を回復させ、疾患に関連する合併症を減少させることによって既存の疾患の負の影響を低減することを目指す活動を包含する。あるいは、予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎおよびｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）は、特定の障害の重症度を軽減すること、例えば腫瘍の増殖および転移を低減すること、血管新生を減少させることを目指す広範囲の予防的治療を含む。
【０１０４】
本発明に関連して、がんの治療および／もしくは予防、ならびに／またはその術後再発の防止は、以下の段階、例えばがん細胞の外科的除去、がん性細胞の増殖の阻害、腫瘍の退縮または後退、寛解の誘導およびがんの発生の抑制、腫瘍退行、ならびに転移の低減または阻害などの段階のいずれかを含む。がんの有効な治療および／または予防は、がんを有する個体の死亡率を低下させ、予後を改善し、血中の腫瘍マーカーのレベルを低下させ、がんに伴う検出可能な症状を軽減する。例えば、有効な治療および／または予防を構成する症状の低減または改善は、１０％、２０％、３０％もしくはそれ以上の低減または安定な疾患を含む。
【０１０５】
上述したように、本発明のペプチドによって誘導されるＴｈ１細胞は、細胞性免疫に関与する免疫細胞を助けることができる。Ｔｈ１細胞によって分泌されるサイトカインは抗原非依存的にＣＴＬに影響を及ぼし得るので、そのような免疫細胞には、ＤＥＰＤＣ１を発現するがん細胞に対するＣＴＬだけでなく、他のＴＡＡを発現するがん細胞に対するＣＴＬも含まれる。したがって、本発明は、少なくとも１つの本発明のペプチドを含有する薬剤または医薬組成物を提供する。薬剤または医薬組成物において、そのようなペプチドは治療的または医薬的に有効な量で存在する。
【０１０６】
本発明の薬剤または組成物によって誘導されるＴｈ１細胞は、細胞性免疫に関与する任意の免疫細胞に影響を及ぼすサイトカインを分泌することができるので、本発明の薬剤または医薬組成物は、細胞性免疫に関与する任意の免疫細胞（例えばＣＴＬ、マクロファージ）を助ける、刺激するおよび／または増強するために有用である。それゆえ、本発明の薬剤または組成物は、ＣＴＬを含むそのような免疫細胞によって媒介される免疫応答を増強するまたは促進するあらゆる目的に有用である。例えば、本発明の薬剤または組成物は、そのような免疫細胞によって媒介されるがんまたは腫瘍に対する免疫応答を増強するまたは促進することができるので、本発明は、がんの治療および／または予防における使用のための、本発明のペプチドの少なくとも１つを含有する薬剤または組成物を提供する。そのような薬剤または組成物中のペプチドの量は、ＤＥＰＤＣ１を発現するがんを担持する対象において免疫応答を有意に増強するまたは刺激するのに有効な量であり得る。
【０１０７】
本発明はまた、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４などのＭＨＣクラスＩ抗原によって媒介される免疫応答を増強するまたは刺激するための薬剤または組成物も提供する。別の態様では、本発明はさらに、ＭＨＣクラスＩ抗原によって媒介される免疫応答を増強するまたは刺激するための薬剤または組成物を製造するための本発明のペプチドの使用を提供する。
【０１０８】
好ましい態様において、本発明の過程で同定されたＤＥＰＤＣ１由来ペプチドは、Ｔｈ１細胞ならびにＤＥＰＤＣ１発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる。したがって、本発明はまた、ＤＥＰＤＣ１を発現するがんまたは腫瘍に対するＣＴＬの誘導における使用のための、本発明のペプチドの少なくとも１つを含有する薬剤または組成物も提供する。
【０１０９】
さらに、本発明のペプチドの少なくとも１つを含有する薬剤または組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答を増強するまたは促進するのに使用することができる。
【０１１０】
ＤＥＰＤＣ１の発現は、正常組織と比較して、膀胱がん、乳がんおよびいくつかの他の悪性腫瘍を含むいくつかのがん型において特異的に上昇するので（国際公開第２００６／０８５６８４号、国際公開第２００７／０１３６６５号、Ｋａｎｅｈｉｒａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００７；  ２６：  ６４４８−５５および本発明者らのマイクロアレイデータ（データは示さず））、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、がんもしくは腫瘍の治療および／もしくは予防のため、ならびに／またはその術後再発の防止のために使用することができる。したがって、本発明は、本発明のペプチドまたは本発明のポリヌクレオチドの１つまたは複数を有効成分として含有する、がんもしくは腫瘍の治療および／もしくは予防のため、ならびに／またはその術後再発の防止のための薬剤または医薬組成物を提供する。あるいは、本発明のペプチドを、薬剤または医薬組成物としての使用のために、ＡＰＣなどの前記細胞のいずれかの表面で発現させることができる。加えて、前記Ｔｈ１細胞も、本発明の薬剤または医薬組成物の有効成分として使用することができる。
【０１１１】
別の態様では、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療するための医薬組成物または薬剤の製造における：
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣ、および
（ｄ）本発明のＴｈ１細胞
の中から選択される有効成分の使用を提供する。
【０１１２】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療するのに使用するための、
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣ、および
（ｄ）本発明のＴｈ１細胞
の中から選択される有効成分を提供する。
【０１１３】
あるいは、本発明はさらに、がんまたは腫瘍を治療するための医薬組成物または薬剤を製造するための方法または工程であって、有効成分として、
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣ、および
（ｄ）本発明のＴｈ１細胞
の中から選択される有効成分と医薬的または生理学的に許容される担体を製剤化する段階を含む方法または工程を提供する。
【０１１４】
別の態様において、本発明はまた、がんまたは腫瘍を治療するための医薬組成物または薬剤を製造するための方法または工程であって、
（ａ）本発明のペプチド、
（ｂ）本明細書で開示するようなペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）本発明のペプチドまたはその断片を自らの表面に提示するＡＰＣ、および
（ｄ）本発明のＴｈ１細胞
の中から選択される有効成分を医薬的または生理学的に許容される担体と混合する段階を含む方法または工程も提供する。
【０１１５】
あるいは、本発明の医薬組成物または薬剤は、がんまたは腫瘍の予防およびその術後再発の防止のいずれかまたは両方のために使用し得る。
【０１１６】
本発明の薬剤または医薬組成物はワクチンとして使用される。本発明に関連して、「ワクチン」（免疫原性組成物とも称される）という語句は、動物に接種した場合抗腫瘍免疫を誘導する機能を有する組成物を指す。
【０１１７】
本発明の薬剤または医薬組成物は、対象または患者においてがんもしくは腫瘍を治療するおよび／もしくは予防する、ならびに／またはその術後再発もしくは転移性再発を防止するために使用できる。そのような対象の例には、ヒトならびに、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、サル、ヒヒおよびチンパンジー、特に商業的に重要な動物または家畜を含むがこれらに限定されない他の哺乳動物が含まれる。
【０１１８】
本発明の過程で、配列番号：１から４の中から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドは、いくつかのＨＬＡ−ＤＲおよび／またはＨＬＡ−ＤＰ分子（例えばＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５）によって拘束されるプロミスキャスなＴｈ１細胞エピトープであることが見出され、これらは、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答に起因する、がんに対する強力で特異的な免疫応答を誘導することができる候補であり得る。それゆえ、配列番号：１から４のアミノ酸配列を有するこれらのペプチドのいずれかを含む本発明の薬剤または医薬組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５の中から選択される少なくとも１つを有する対象への投与に特に適する。同じことが、これらのペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む薬剤または医薬組成物にも当てはまる。
【０１１９】
あるいは、好ましい態様では、本発明の過程で同定されたペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２またはＨＬＡ−Ａ２４を有する対象に適用された場合、ＤＥＰＤＣ１に特異的なＣＴＬを誘導することもできる。したがって、本発明のペプチドの投与を通して、Ｔｈ１細胞の誘導に加えてＤＥＰＤＣ１を発現するがんに対するＣＴＬ応答が誘導され得ることがさらに期待される。さらに、本発明のペプチドは、ＤＥＰＤＣ１発現細胞に対するＣＴＬ応答を、そのプロセシングを介して誘導することができるだけでなく、それによって媒介されるＴｈ１細胞誘導により、ＣＴＬ応答を増強することもできる。したがって、同じ対象においてＴｈ１細胞およびＤＥＰＤＣ１特異的ＣＴＬの両方の誘導を達成するために、例えば、治療される対象は、配列番号：２または３のアミノ酸配列を有するペプチドを投与する場合は、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ４またはＨＬＡ−ＤＰ５を有し、およびＭＨＣクラスＩ分子としてＨＬＡ−Ａ２を有する。したがって、同じ対象においてＴｈ１細胞およびＤＥＰＤＣ１特異的ＣＴＬの両方の誘導を達成するために、例えば、治療される対象は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドを投与する場合は、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ４を有し、およびＭＨＣクラスＩ分子としてＨＬＡ−Ａ２４を有する。
【０１２０】
本発明において、本発明のペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩ抗原によって媒介される免疫応答を促進すること、具体的には、以下に示すような組み合わせにおけるＨＬＡ型拘束様式で促進することが確認された：
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１：ＨＬＡ−ＤＲ５３およびＨＬＡ−ＤＲ４
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２：ＨＬＡ−ＤＲ４
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３：ＨＬＡ−ＤＰ５およびＨＬＡ−ＤＲ４
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４：ＨＬＡ−ＤＰ５およびＨＬＡ−ＤＲ１５
【０１２１】
したがって、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１、−ＬＰ２、−ＬＰ３および−ＬＰ４ならびに配列番号１から４のアミノ酸配列のいずれか１つを含むペプチドは、上記組み合わせに示される、それらに一致するＨＬＡサブタイプから選択される、少なくとも１つのＨＬＡアリルを有する患者において、ＤＥＰＤＣ１を発現するがんの治療に有用である。あるいは、本発明は、患者においてＤＥＰＤＣ１を発現するがんの治療のための医薬組成物を提供し、その組成物は本発明のペプチドからなる群から選択されるペプチドのいずれか１つを含み、患者は、上記組み合わせで示される、当該ペプチドに対応するＨＬＡサブタイプから選択される少なくとも１つのＨＬＡアリルを有する。
【０１２２】
さらに、本発明はまた、上記の組み合わせに示される、ペプチドに対応するＨＬＡサブタイプから選択される少なくとも１つのＨＬＡアリルを有する患者においてＤＥＰＤＣ１を発現するがんの治療用組成物の製造のための、本発明のペプチドからなる群より選択されるペプチドの使用を提供する。さらに、いくつかの態様において、本発明は、上記の組み合わせに示される、ペプチドに対応するＨＬＡサブタイプから選択される少なくとも１つのＨＬＡアリルを有する患者においてＤＥＰＤＣ１を発現するがんの治療において使用するために、本発明のペプチドからなる群より選択されるペプチドを提供する。さらなる態様において、本発明は、患者においてＤＥＰＤＣ１を発現するがんを治療するための方法を提供し、その方法は、本発明のペプチドからなる群より選択されるペプチドを、上記の組み合わせにある、当該ペプチドのＨＬＡサブタイプから選択される少なくとも１つのＨＬＡアリルを有する患者に投与する段階を含む。
【０１２３】
加えて、いくつかの態様において、本発明は、患者においてＤＥＰＤＣ１を発現するがんを治療するための医薬組成物の製造または製剤化のための方法を提供し、その組成物は本発明のペプチドからなる群より選択されるペプチドのいずれか１つを含み、患者は、上記の組み合わせで示される、当該ペプチドに対応するＨＬＡサブタイプから選択される少なくとも１つのＨＬＡアリルを有する。本発明の方法は、例えば、本発明のペプチドからなる群より選択されるペプチドのいずれか１つおよび医薬的に許容される担体を混合するまたは製剤化するための段階を含み得る。
【０１２４】
前述の通り、Ｔｈ１細胞は、腫瘍を有する宿主における有効な腫瘍免疫の誘導のために重要であることは周知である。本発明のペプチドは、ＨＬＡ拘束性様式でＴｈ１細胞誘導能を有しており、本発明のそれぞれのペプチドの特異的ＨＬＡ拘束パターンは上記に示している。したがって、本発明は、患者においてＤＥＰＤＣ１を発現するがんに対するＴｈ１細胞応答を促進するまたは増強する組成物を提供し、その組成物は、本発明のペプチドからなる群から選択されるペプチドのいずれか１つを含み、患者は、上記に示される、当該ペプチドに対応するＨＬＡサブタイプから選択される少なくとも１つのＨＬＡアリルを有する。
【０１２５】
さらに、本発明はまた、患者においてＤＥＰＤＣ１を発現するがんに対するＴｈ１細胞応答を促進するまたは増強するための組成物を製造するための、本発明のペプチドからなる群より選択されるペプチドの使用を提供し、その患者は、上記組み合わせに示される、当該ペプチドに対応するＨＬＡサブタイプから選択される少なくとも1つのＨＬＡアリルを有する。さらに、いくつかの態様において、本発明は、患者においてＤＥＰＤＣ１を発現するがんに対するＴｈ１細胞応答を促進するまたは増強することにおける使用のための、本発明のペプチドからなる群より選択されたペプチドを提供し、その患者は、上記組み合わせに示される、当該ペプチドに対応するＨＬＡサブタイプから選択された少なくとも１つのＨＬＡアリルを有する。さらなる態様において、本発明は、患者においてＤＥＰＤＣ１を発現するがんに対するＴｈ１細胞応答を促進するまたは増強するための方法を提供し、その方法は、本発明のペプチドからなる群より選択されるペプチドを、上記の組み合わせにある、当該ペプチドのＨＬＡサブタイプから選択される少なくとも１つのＨＬＡアリルを有する患者に投与する段階を含む。
【０１２６】
加えて、いくつかの態様において、本発明は、患者においてＤＥＰＤＣ１を発現するがんに対するＴｈ１細胞応答を促進するまたは増強するための医薬組成物を製造するまたは製剤化するための方法を提供し、その組成物は、本発明のペプチドからなる群より選択されるペプチドのいずれか１つを含み、患者は、上記組み合わせに示される、当該ペプチドに対応するＨＬＡサブタイプから選択される少なくとも１つのＨＬＡアリルを有する。本発明の方法は、例えば、本発明のペプチドからなる群より選択されるペプチドのいずれか１つおよび医薬的に許容される担体を混合するまたは製剤化するための段階を含みうる。
【０１２７】
別の態様では、本発明は、Ｔｈ１細胞誘導に依存するがん免疫療法を提供する。本発明によって提供される治療戦略は、Ｔｈ１細胞から分泌されるサイトカインによって活性化される免疫細胞が目的のがん細胞を標的とする限り、ＤＥＰＤＣ１発現とは無関係に任意のがんに適用でき、有効である。
【０１２８】
本発明の薬剤または医薬組成物によって治療されるべきがんまたは腫瘍には、例えば膀胱がん、乳がんが含まれるがこれらに限定されないＤＥＰＤＣ１を発現する任意の種類のがんまたは腫瘍が含まれる。
【０１２９】
本発明の薬剤または医薬組成物は、前記有効成分に加えて、Ｔｈ１細胞またはＣＴＬを誘導する能力を有する他のペプチド、前記他のペプチドをコードする他のポリヌクレオチド、前記他のペプチドまたはその断片を提示する他の細胞等を含有し得る。Ｔｈ１細胞またはＣＴＬを誘導する能力を有するそのような「他の」ペプチドの例には、がん特異抗原（例えば同定されたＴＡＡ）に由来するペプチドが含まれるが、これに限定されない。
【０１３０】
必要に応じて、本発明の薬剤または医薬組成物は、有効成分、例えば本発明のペプチドのいずれかの抗腫瘍作用を他の治療物質が阻害しない限り、場合により他の治療物質を付加的な有効成分として含んでもよい。例えば、製剤は、抗炎症薬、鎮痛剤、化学療法剤等を含み得る。医薬自体に他の治療物質を含めることに加えて、本発明の医薬を１つまたは複数の他の薬理的剤と連続的にまたは同時に投与することもできる。医薬および薬理的剤の量は、例えば、使用される薬理的剤の種類、治療される疾患、および投与のスケジュールおよび投与経路に依存する。
【０１３１】
当業者は、本明細書で特に言及する成分に加えて、本発明の薬剤または医薬組成物が、対象となる製剤の種類を考慮して当技術分野において慣例的な他の剤（例えば増量剤、結合剤、希釈剤、賦形剤等）も含み得ることを認識する。
【０１３２】
本発明の１つの態様では、本発明の薬剤または医薬組成物を、治療する疾患、例えばがんの病的状態を治療するために有用な材料を含む製品およびキットに含めることができる。前記製品は、ラベルを付した本発明の薬剤または医薬組成物のいずれかの容器を含み得る。適切な容器には、ボトル、バイアルおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器上のラベルは、剤が疾患の１つまたは複数の状態の治療または予防に使用されることが示されるべきである。ラベルはまた、投与等に関する指示も示し得る。
【０１３３】
上述した容器に加えて、本発明の薬剤または医薬組成物を含むキットは、場合により医薬的に許容される希釈剤を収容する第二の容器をさらに含んでもよい。第二の容器は、使用のための指示書と共に、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジおよび添付文書を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【０１３４】
薬剤または医薬組成物は、所望する場合は、有効成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置中に包装することができる。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含み得る。パックまたはディスペンサー装置には、投与のための指示書が添付され得る。
【０１３５】
（１）ペプチドを有効成分として含有する薬剤または医薬組成物：
本発明のペプチドは、薬剤もしくは医薬組成物として直接投与することができるか、または必要な場合は、従来の製剤方法によって製剤化される。後者の場合、本発明のペプチドに加えて、薬剤に通常使用される担体、賦形剤などが、特に制限されることなく適宜含まれ得る。そのような担体の例には、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝液、培養液などが含まれるが、これらに限定されない。さらに、薬剤または医薬組成物は、必要に応じて、安定剤、懸濁液、防腐剤、界面活性剤などを含有し得る。本発明の薬剤または医薬組成物は抗がん目的に用いることができる。
【０１３６】
本発明のペプチドは、インビボでＴｈ１細胞を誘導する本発明のペプチドの２つまたはそれ以上で構成される、組合せとして調製することができる。ペプチドの組合せはカクテルの形態をとってもよく、または標準的な技術を用いて互いに複合化し得る。例えば、ペプチドを化学的に連結するかまたは単一融合ポリペプチド配列として発現させることができる。組合せ中のペプチドは、同じであってもよくまたは異なっていてもよい。
【０１３７】
本発明のペプチドを投与することにより、ペプチドまたはその断片がＡＰＣ上のＨＬＡクラスＩＩ抗原によって高密度で提示され、次に提示されたペプチドとＨＬＡクラスＩＩ抗原との間で形成された複合体に対して特異的に反応するＴｈ１細胞が誘導される。あるいは、対象からＡＰＣ（例えばＤＣ）を取り出し、次に本発明のペプチドによって刺激して、本発明のペプチドまたはその断片のいずれかを自らの表面に提示するＡＰＣを得る。これらのＡＰＣを対象に再投与して、対象においてＴｈ１細胞を誘導することができ、結果として、腫瘍関連内皮に対する攻撃性を増大させることができる。
【０１３８】
本発明のペプチドを有効成分として含む、がんまたは腫瘍の治療および／または予防のための薬剤または医薬組成物は、細胞性免疫を有効に樹立することが公知のアジュバントも含み得る。あるいは、薬剤または医薬組成物は、他の有効成分と共に投与することができ、または顆粒に製剤化することによって投与できる。アジュバントとは、免疫学的活性を有するタンパク質と共に（または連続的に）投与した場合、タンパク質に対する免疫応答を増強する化合物を指す。本明細書で企図されるアジュバントには、文献（Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  １９９４，７：２７７−８９）に記載されているものが含まれる。適切なアジュバントの例には、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、コレラ毒素、サルモネラ毒素、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、ＩＳＣＯＭａｔｒｉｘ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ、水中油型エマルション等が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３９】
さらに、リポソーム製剤、ペプチドが直径数マイクロメートルのビーズに結合している顆粒製剤、および脂質がペプチドに結合している製剤を好都合に使用し得る。
【０１４０】
本発明の別の態様では、本発明のペプチドはまた、医薬的に許容される塩の形態で投与し得る。好ましい塩の例には、アルカリ金属との塩、金属との塩、有機塩基との塩、有機酸（例えば酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸等）との塩、および無機酸（例えば塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸等）との塩が含まれる。本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される塩」という語句は、化合物の生物学的有効性および特性を保持し、無機酸または無機塩基、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等との反応によって得られる塩を指す。
【０１４１】
いくつかの態様において、本発明の薬剤または医薬組成物は、Ｔｈ１細胞および場合によりＣＴＬをプライミングする成分をさらに含み得る。脂質は、ウイルス抗原に対してインビボでＴｈ１細胞および場合によりＣＴＬをプライミングすることができる剤として同定されている。例えば、パルミチン酸残基をリシン残基のε−アミノ基およびα−アミノ基に結合し、次に本発明のペプチドに連結することができる。その後、脂質付加したペプチドを、ミセルもしくは粒子中で直接投与する、リポソーム中に組み込む、またはアジュバント中に乳化することができる。Ｔｈ１細胞および場合によりＣＴＬ応答の脂質プライミングの別の例として、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リポタンパク質が、適切なペプチドに共有結合した場合、Ｔｈ１細胞および場合によりＣＴＬをプライミングするために使用できる（例えばＤｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８９，３４２：５６１−４参照）。
【０１４２】
適切な投与方法の例には、経口、皮内、皮下、筋肉内、骨内、腹腔内および静脈内注射など、ならびに全身投与または標的部位の近傍への局所投与（すなわち直接注入）が含まれるが、これらに限定されない。投与は、単回投与によって実施でき、または反復投与によって強化することもできる。医薬的または治療的に有効な量のペプチドを、ＤＥＰＤＣ１を発現するがんの治療を必要とする対象に投与することができる。あるいは、Ｔｈ１細胞によって媒介される免疫応答を増強もしくは刺激する、および／またはＤＥＰＤＣ１を発現するがんもしくは腫瘍に対するＣＴＬを誘導するのに十分な量の本発明のペプチドを、ＤＥＰＤＣ１を発現するがんを担持する対象に投与することができる。本発明のペプチドの用量は、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法などに従って適切に調整することができ、通常は０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、例えば０．５ｍｇ〜５ｍｇであり、数日から数ヶ月に１回投与することができる。当業者は、適切で最適な用量を容易に決定することができる。
【０１４３】
（２）ポリヌクレオチドを有効成分として含有する薬剤または医薬組成物：
本発明の薬剤または医薬組成物はまた、本明細書で開示するペプチドを発現可能な形態でコードするポリヌクレオチドを含有し得る。本明細書では、「発現可能な形態で」という語句は、ポリヌクレオチドが、細胞内に導入された場合、抗腫瘍免疫を誘導するポリペプチドとしてインビボで発現されることを意味する。例示的な態様では、関心対象のポリヌクレオチドの核酸配列は、ポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントを含む。ポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノムへの安定な組み込みを達成するのに必要なものを備え得る（相同組換えカセットベクターの説明に関しては、例えばＴｈｏｍａｓ  ＫＲ  ＆  Ｃａｐｅｃｃｈｉ  ＭＲ，Ｃｅｌｌ  １９８７，５１：５０３−１２参照）。例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０，２４７：１４６５−８；米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，８０４，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４号；同第５，６７９，６４７号；および国際公開第９８／０４７２０号参照。ＤＮＡに基づく送達技術の例には、「裸のＤＮＡ」、促進（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド媒介性）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介性（「遺伝子銃」）または圧力媒介性送達が含まれる（例えば米国特許第５，９２２，６８７号参照）。
【０１４４】
本発明のペプチドは、ウイルスベクターまたは細菌ベクターによっても発現され得る。発現ベクターの例には、ワクシニアウイルスまたは鶏痘ウイルスなどの弱毒化ウイルス宿主が含まれる。このアプローチは、例えば本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしての、ワクシニアウイルスの使用を含む。宿主への導入後、組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって免疫応答を惹起する。免疫プロトコルに有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。別のベクターはＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９１，３５１：４５６−６０に記載されている。治療的投与または免疫のために有用である多種多様な他のベクター、例えばアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）ベクター、無毒化炭疽毒素ベクター等が明らかである。例えばＳｈａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ  ２０００，６：６６−７１；Ｓｈｅｄｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ２０００，６８：７９３−８０６；Ｈｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ２０００，１４：５７１−８５参照。
【０１４５】
対象へのポリヌクレオチドの送達は、直接的であってもよく、この場合対象はポリヌクレオチドを担持するベクターに直接暴露され、または間接的であってもよく、この場合は最初にインビトロで細胞を関心対象のポリヌクレオチドで形質転換し、次に細胞を対象に移植する。これら２つのアプローチは、それぞれインビボおよびエクスビボ遺伝子治療として公知である。
【０１４６】
遺伝子治療の方法の一般的な総説に関しては、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １９９３，１２：４８８−５０５；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  １９９１，３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １９９３，３３：５７３−９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３，２６０：９２６−３２；Ｍｏｒｇａｎ  ＆  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９３，６２：１９１−２１７；Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９３，１１（５）：１５５−２１５参照）。本発明にも使用できる、組換えＤＮＡ技術の分野で一般に公知の方法は、ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９３；およびＫｒｉｅｇｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９０に記載されている。
【０１４７】
ペプチドの投与と同様に、ポリヌクレオチドの投与は、経口、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、骨内および／または腹腔内注射などによって実施してよく、全身投与もしくは標的部位の近傍への局所投与も使用される。投与は、単回投与によって実施でき、または複数回投与によって強化することもできる。医薬的または治療的に有効な量の本発明のポリヌクレオチドを、ＤＥＰＤＣ１を発現するがんの治療を必要とする対象に投与することができる。あるいは、Ｔｈ１細胞によって媒介される免疫応答を増強もしくは刺激する、および／またはＤＥＰＤＣ１を発現するがんもしくは腫瘍に対するＣＴＬを誘導するのに十分な量の本発明のポリヌクレオチドを、ＤＥＰＤＣ１を発現するがんを担持する対象に投与することができる。適切な担体または本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された細胞中のポリヌクレオチドの用量は、治療する疾患、患者の年齢、体重、投与方法などに従って適切に調整することができ、通常は０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、例えば０．５ｍｇ〜５ｍｇであり、数日ごとに１回から数ヶ月ごとに１回投与することができる。当業者は、適切で最適な投与量を容易に決定することができる。
【０１４８】
ＩＸ．ペプチド、ＡＰＣまたはＴｈ１細胞を使用する方法
本発明のペプチドおよびそのようなペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本発明のＡＰＣおよびＴｈ１細胞を誘導するために使用できる。本発明のＡＰＣはまた、本発明のＴｈ１細胞を誘導するためにも使用できる。ペプチド、ポリヌクレオチドおよびＡＰＣは、任意の他の化合物がこれらのＴｈ１細胞誘導能を阻害しない限り、任意の他の化合物と組み合わせて使用することができる。したがって、本発明の前記薬剤または医薬組成物のいずれかを、Ｔｈ１細胞を誘導するために使用でき、それに加えて、ペプチドおよびポリヌクレオチドを含むものも、以下で論じるようにＡＰＣを誘導するために使用できる。
【０１４９】
（１）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘導する方法：
本発明は、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用してＡＰＣを誘導する方法を提供する。ＡＰＣの誘導は、「Ｖ．抗原提示細胞」の章で上述したように実施することができる。本発明はまた、Ｔｈ１細胞誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法も提供し、前記ＡＰＣの誘導は、「Ｖ．抗原提示細胞」、前出の項目でも言及されている。
【０１５０】
あるいは、本発明は、Ｔｈ１細胞を誘導する能力を有するＡＰＣを調製するための方法であって、以下の段階：
（ａ）ＡＰＣを本発明のペプチドとインビトロ、エクスビボまたはインビボで接触させる段階；および
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階
の１つを含み得る方法を提供する。
あるいは、本発明は、Ｔｈ１細胞誘導能を有するＡＰＣを誘導するための方法であって、
（ａ）ＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階；および
（ｂ）本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをＡＰＣに導入する段階
からなる群より選択される段階を含む方法を提供する。
【０１５１】
本発明の方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施することができる。好ましくは、本発明の方法はインビトロまたはエクスビボで実施できる。好ましい態様では、Ｔｈ１細胞誘導能を有するＡＰＣの誘導のために使用するＡＰＣは、好ましくはＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５の中から選択される少なくとも１つを発現するＡＰＣであり得る。そのようなＡＰＣは、ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５の中から選択される少なくとも１つを有する対象から得た末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から、当技術分野において周知の方法によって調製することができる。本発明の方法によって誘導されるＡＰＣは、本発明のペプチドまたはその断片とＨＬＡクラスＩＩ抗原（例えばＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５）の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣであり得る。対象においてがんに対する免疫応答を誘導するために、本発明の方法によって誘導されたＡＰＣを対象に投与する場合、対象は、好ましくはＡＰＣが由来するのと同じ対象である。しかし、対象がＡＰＣドナーと同じＨＬＡ型を有する限り、対象はＡＰＣドナーとは異なる対象であってもよい。
【０１５２】
別の態様では、本発明は、Ｔｈ１細胞誘導能を有するＡＰＣを誘導するのに使用するための剤または組成物を提供し、そのような剤または組成物は、本発明の１つまたは複数のペプチドまたはポリヌクレオチドを含む。
【０１５３】
別の態様では、本発明は、ＡＰＣを誘導するために製剤化される剤または組成物の製造における、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【０１５４】
あるいは、本発明はさらに、Ｔｈ１細胞誘導能を有するＡＰＣを誘導するのに使用するための本発明のペプチドまたは本発明のペプチドをコードするポリペプチドを提供する。
【０１５５】
好ましい態様では、本発明のペプチドは、Ｔｈ１応答を誘導するだけでなく、ＡＰＣにおいてプロセシングされた後にＣＴＬ応答も誘導する。したがって、好ましい態様では、本発明の方法によって調製されるＡＰＣは、がん細胞を含む、ＤＥＰＤＣ１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するためにも有用であり得る。例えば、配列番号：５のアミノ酸配列を含むペプチドによって誘導する場合は、ＨＬＡ−Ａ２を発現するＡＰＣがＤＥＰＤＣ１特異的ＣＴＬを誘導するのに適する。あるいは、配列番号：６のアミノ酸配列を含むペプチドによって誘導する場合は、ＨＬＡ−Ａ２４を発現するＡＰＣがＤＥＰＤＣ１特異的ＣＴＬを誘導するのに適する。
【０１５６】
（２）Ｔｈ１細胞を誘導する方法：
さらに、本発明は、本発明のペプチド、本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは本発明のペプチドもしくはその断片を提示するＡＰＣを用いてＴｈ１細胞を誘導するための方法を提供する。本発明はまた、本発明のペプチドとＨＬＡクラスＩＩ抗原の複合体を認識するＴＣＲサブユニットを形成することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用してＴｈ１細胞を誘導するための方法も提供する。好ましくは、Ｔｈ１細胞を誘導するための方法は：
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＨＬＡクラスＩＩ抗原と本発明のペプチドまたはその断片との複合体を自らの表面に提示するＡＰＣと接触させる段階、および
（ｂ）ＴＣＲが本発明のペプチドまたはその断片とＨＬＡクラスＩＩ抗原の複合体を認識するまたは複合体に結合することができる、両方のＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入する段階
からなる群より選択される少なくとも１つの段階を含む。
【０１５７】
本発明のペプチドを対象に投与した場合、対象の体内でＴｈ１細胞が誘導され、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答（例えばがん細胞を標的とする免疫応答）が増強される。あるいは、本発明のペプチドおよび本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをエクスビボ治療法に使用することができ、この治療法では、対象由来のＡＰＣおよびＣＤ４陽性細胞、または末梢血単核白血球をインビトロで本発明のペプチドと接触させ（本発明のペプチドで刺激し）、Ｔｈ１細胞を誘導した後、活性化したＴｈ１細胞を対象に戻す。例えば、前記方法は：
（ａ）対象からＡＰＣを回収する段階；
（ｂ）段階（ａ）のＡＰＣを本発明のペプチドと接触させる段階；
（ｃ）段階（ｂ）のＡＰＣをＣＤ４＋Ｔ細胞と混合し、Ｔｈ１細胞を誘導するために共培養する段階；および
（ｄ）段階（ｃ）の共培養物からＣＤ４＋Ｔ細胞を回収する段階。
を含み得る。
さらに、Ｔｈ１細胞は、ＴＣＲが本発明のペプチドまたはその断片とＨＬＡクラスＩＩ抗原の複合体に結合することができる、両方のＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドまたはＴＣＲサブユニットの各々をコードするポリヌクレオチドをＣＤ４陽性Ｔ細胞に導入することによって誘導できる。そのような形質導入は、「ＶＩＩ．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」の章で上述したように実施することができる。
【０１５８】
本発明の方法は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで実施することができる。好ましくは、本発明の方法はインビトロまたはエクスビボで実施できる。Ｔｈ１細胞の誘導のために使用するＣＤ４陽性Ｔ細胞は、対象から得たＰＢＭＣから当技術分野において周知の方法によって調製することができる。好ましい態様では、ＣＤ４陽性Ｔ細胞のドナーは、ＭＨＣクラスＩＩ分子としてＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５の中から選択される少なくとも１つを有する対象であり得る。本発明の方法によって誘導されるＴｈ１細胞は、本発明のペプチドまたはその断片とＨＬＡクラスＩＩ抗原の複合体を自らの表面に提示するＡＰＣを認識することができるＴｈ１細胞であり得る。対象においてがんに対する免疫応答（またはＭＨＣクラスＩ分子によって媒介される免疫応答）を誘導するために、本発明の方法によって誘導されたＴｈ１細胞を対象に投与する場合、対象は、好ましくはＣＤ４陽性Ｔ細胞が由来するのと同じ対象である。しかし、対象がＣＤ４陽性Ｔ細胞ドナーと同じＨＬＡ型を有する限り、対象はＣＤ４陽性Ｔ細胞ドナーとは異なる対象であってもよい。
【０１５９】
好ましい態様では、本発明のペプチドは、ＤＥＰＤＣ１発現細胞に対するＣＴＬならびにＴｈ１細胞を誘導することができる。それゆえ、本発明はさらに、ＣＴＬを誘導するための方法であって：
（ａ）ＣＤ４陽性Ｔ細胞およびＣＤ８陽性Ｔ細胞の両方を、本発明のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階；ならびに
（ｂ）ＣＤ８陽性Ｔ細胞を本発明のペプチドと接触させたＡＰＣと共培養する段階。
からなる群より選択される少なくとも１つの段階を含む方法を提供する。
【０１６０】
ＣＴＬを誘導するそのような方法では、本発明のペプチドはＡＰＣ内でプロセシングされてＣＴＬエピトープペプチドを生成し、生成されたＣＴＬエピトープペプチドはＡＰＣの表面に提示される。
【０１６１】
あるいは、本発明によれば、Ｔｈ１細胞を誘導する薬剤または医薬組成物を製造するための本発明のペプチドの使用が提供される。加えて、本発明は、Ｔｈ１細胞を誘導する薬剤または医薬組成物を製造するための方法または工程を提供し、方法は、本発明のペプチドを医薬的に許容される担体と混合するまたは製剤化するための段階を含む。さらに、本発明はまた、Ｔｈ１細胞を誘導するための本発明のペプチドも提供する。
【０１６２】
本発明の方法によって誘導されるＣＤ４＋Ｔ細胞は、ワクチンとして対象に投与することができる。
【０１６３】
本発明に関連して、ＤＥＰＤＣ１を過剰発現するがんをこれらの有効成分で治療することができる。そのようながんの例には、膀胱がんおよび乳がんが含まれるが、これらに限定されない。したがって、有効成分を含有するワクチンまたは医薬組成物の投与の前に、治療されるがん細胞または組織におけるＤＥＰＤＣ１の発現レベルが同じ器官の正常細胞と比較して増大しているかどうかを確認することが好ましい。したがって、１つの態様では、本発明は、ＤＥＰＤＣ１を（過剰）発現するがんを治療するための方法であって：
（ｉ）治療されるべきがんを有する対象から得たがん細胞または組織におけるＤＥＰＤＣ１の発現レベルを測定する段階；
（ｉｉ）ＤＥＰＤＣ１の発現レベルを正常対照と比較する段階；および
（ｉｉｉ）上記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を、正常対照と比較してＤＥＰＤＣ１を過剰発現するがんを有する対象に投与する段階。
を含み得る方法を提供する。
【０１６４】
あるいは、本発明は、ＤＥＰＤＣ１を過剰発現するがんを有する対象に投与するのに使用するための、上記（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つの成分を含有するワクチンまたは医薬組成物を提供し得る。言い換えると、本発明はさらに、本発明のＤＥＰＤＣ１ポリペプチドで治療されるべき対象を同定するための方法であって、対象由来のがん細胞または組織におけるＤＥＰＤＣ１の発現レベルを測定する段階を含み、遺伝子の正常対照レベルと比較したレベル上昇が、対象が本発明のＤＥＰＤＣ１ポリペプチドで治療し得るがんを有することを示す方法を提供する。本発明のがんを治療する方法を以下でより詳細に説明する。
【０１６５】
さらに、好ましい態様では、本発明のペプチドを投与する前に対象のＨＬＡ型を同定し得る。例えば、配列番号：１のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくはＨＬＡ−ＤＲ５３またはＨＬＡ−ＤＲ４を有すると同定された対象に投与する。あるいは、配列番号：２のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくはＨＬＡ−ＤＲ４を有すると同定された対象に投与する。あるいは、配列番号：３のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくはＨＬＡ−ＤＰ５またはＤＲ４を有すると同定された対象に投与する。あるいは、配列番号：４のアミノ酸配列を有するペプチドは、好ましくはＨＬＡ−ＤＰ５またはＤＲ１５を有すると同定された対象に投与する。
【０１６６】
目的のＤＥＰＤＣ１の転写または翻訳産物を含む限り、任意の対象由来の細胞または組織をＤＥＰＤＣ１発現の測定に使用することができる。適切な試料の例には、血液、唾液および尿などの体組織および体液が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、対象由来の細胞または組織試料は、上皮細胞、より好ましくはがん性上皮細胞またはがん性であることが疑われる組織由来の上皮細胞を含む細胞集団を含有する。さらに、必要な場合は、得られた体組織および体液から細胞を精製し、その後対象由来試料として使用してもよい。
【０１６７】
本発明の方法によって治療される対象は、好ましくは哺乳動物である。例示的な哺乳動物には、例えばヒト、非ヒト霊長動物、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマおよびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６８】
本発明によれば、対象から得たがん細胞または組織におけるＤＥＰＤＣ１の発現レベルを測定する。発現レベルは、当技術分野において公知の方法を用いて、転写（核酸）産物レベルで測定することができる。例えば、ＤＥＰＤＣ１のｍＲＮＡは、ハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション）によりプローブを用いて定量化し得る。検出はチップまたはアレイ上で実施し得る。ＤＥＰＤＣ１の発現レベルを検出するにはアレイの使用が好ましい。当業者は、ＤＥＰＤＣ１の配列情報を利用してそのようなプローブを調製することができる。例えば、ＤＥＰＤＣ１のｃＤＮＡをプローブとして使用し得る。必要な場合は、プローブを色素、蛍光物質および同位体などの適切な標識で標識化してもよく、遺伝子の発現レベルをハイブリダイズした標識の強度として検出し得る。
【０１６９】
さらに、ＤＥＰＤＣ１の転写産物（例えば配列番号：７または９）は、増幅に基づく検出方法（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によってプライマーを使用して定量化し得る。そのようなプライマーは、利用可能な遺伝子の配列情報に基づいて調製し得る。
【０１７０】
詳細には、本発明の方法に使用するプローブまたはプライマーは、ストリンジェントな条件下、中等度にストリンジェントな条件下または低ストリンジェントな条件下でＤＥＰＤＣ１のｍＲＮＡにハイブリダイズする。本明細書で使用する場合、「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、プローブまたはプライマーがその標的配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる状況下では異なる。より長い配列の特異的ハイブリダイゼーションは、短い配列よりも高温で認められる。一般に、ストリンジェントな条件の温度は、規定のイオン強度およびｐＨで特定の配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍとは、（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度下で）標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。標的配列は一般に過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有される。典型的には、ストリンジェントな条件とは、塩濃度がｐＨ７．０〜８．３で約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的には約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、および温度が、短いプローブまたはプライマー（例えば１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃であり、より長いプローブまたはプライマーの場合は少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によっても達成し得る。
【０１７１】
あるいは、本発明の診断のために翻訳産物を検出してもよい。例えば、ＤＥＰＤＣ１タンパク質（配列番号：９または１１）の量を測定し得る。翻訳産物としてのタンパク質の量を測定するための方法には、タンパク質を特異的に認識する抗体を使用する免疫測定法が含まれる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。さらに、抗体の断片または改変抗体がＤＥＰＤＣ１タンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変型（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を検出に使用し得る。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は当技術分野において周知であり、本発明ではそのような抗体およびその等価物を調製するために任意の方法を使用し得る。
【０１７２】
翻訳産物に基づきＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現レベルを検出する別の方法として、ＤＥＰＤＣ１タンパク質に対する抗体を用いた免疫組織化学分析を介して染色の強度を測定し得る。すなわち、この測定では、強い染色は、タンパク質の存在／レベルの増大、および同時に、ＤＥＰＤＣ１遺伝子の高い発現レベルを指す。
【０１７３】
がん細胞における標的遺伝子、例えばＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現レベルは、標的遺伝子の対照レベル（例えば正常細胞におけるレベル）から、例えば１０％、２５％もしくは５０％増大している場合、または１．１倍超、１．５倍超、２．０倍超、５．０倍超、１０．０倍超もしくはそれ以上に増大している場合、増大していると決定され得る。
【０１７４】
対照レベルは、疾患状態（がん性または非がん性）が既知である対象から以前に採取され、保存されていた試料を使用することによって、がん細胞と同時に測定し得る。加えて、治療されるべきがんを有する器官の非がん性領域から得た正常細胞を正常対照として使用してもよい。あるいは、疾患状態が既知である対象由来の試料において以前に測定されたＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現レベルを分析することによって得られた結果に基づき、統計学的方法によって対照レベルを決定してもよい。さらに、対照レベルは、以前に試験した細胞からの発現パターンのデータベースから導き出すことができる。さらに、本発明の１つの態様によれば、生物学的試料におけるＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現レベルを、複数の参照試料から決定した複数の対照レベルと比較し得る。対象由来の生物学的試料のものと類似の組織型に由来する参照試料から決定した対照レベルを使用することが好ましい。さらに、疾患状態が既知である集団におけるＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現レベルの標準値を使用することが好ましい。標準値は当技術分野において公知の任意の方法によって入手し得る。例えば、平均±２Ｓ．Ｄ．または平均±３Ｓ．Ｄ．の範囲を標準値として使用し得る。
【０１７５】
本発明に関連して、非がん性であることが既知の生物学的試料から決定した対照レベルを「正常対照レベル」と称する。他方で、対照レベルをがん性生物学的試料から決定した場合は、それを「がん性対照レベル」と称する。試料の発現レベルと対照レベルの差は、発現レベルが細胞のがん性または非がん性状態に依存して異ならないことが公知の対照核酸、例えばハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して基準化することができる。例示的な対照遺伝子には、β−アクチン、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼおよびリボソームタンパク質Ｐ１が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
ＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現レベルが正常対照レベルと比べて増大しているか、またはがん性対照レベルと類似／同等である場合、対象は、治療されるべきがんを有すると診断され得る。
【０１７７】
より詳細には、本発明は、（ｉ）対象が治療されるべきがんを有するか否かを診断する、および／または（ｉｉ）がん治療のための対象を選択する方法であって：
（ａ）治療されるべきがんを有することが疑われる対象から得たがん細胞または組織におけるＤＥＰＤＣ１の発現レベルを測定する段階；
（ｂ）ＤＥＰＤＣ１の発現レベルを正常対照レベルと比較する段階；
（ｃ）ＤＥＰＤＣ１の発現レベルが正常対照レベルと比較して増大している場合、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階；および
（ｄ）段階（ｃ）において、対象が治療されるべきがんを有すると診断された場合、その対象をがん治療のために選択する段階。
を含む方法を提供する。
【０１７８】
あるいは、そのような方法は：
（ａ）治療されるべきがんを有することが疑われる対象から得たがん細胞または組織におけるＤＥＰＤＣ１の発現レベルを測定する段階；
（ｂ）ＤＥＰＤＣ１の発現レベルをがん性対照レベルと比較する段階；
（ｃ）ＤＥＰＤＣ１の発現レベルががん性対照レベルと類似または同等である場合、対象を、治療されるべきがんを有すると診断する段階；および
（ｄ）段階（ｃ）において、対象が治療されるべきがんを有すると診断された場合、その対象をがん治療のために選択する段階。
を含む。
【０１７９】
いくつかの態様において、そのような方法は、上記で定義した段階（ａ）〜（ｄ）の後または前に、ＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５からなる群より選択されるＨＬＡを有する対象を同定する段階をさらに含み得る。本発明によるがん療法は、ＤＥＰＤＣ１を過剰発現するがんに罹患しており、ならびにＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ１５およびＨＬＡ−ＤＰ５のいずれか１つを有する対象にとって好ましい。ＨＬＡタイピングの方法は当技術分野において周知である。例えば、ＨＬＡアリルをタイピングするためのＰＣＲに基づく方法は周知である。各々のＨＬＡ分子に特異的な抗体も、対象のＨＬＡ型を同定するための適切なツールである。
【０１８０】
本発明はまた、本発明のＤＥＰＤＣ１ポリペプチドで治療することができるがんに罹患している対象を決定するためのキットも提供し、そのようなキットは、特定のがん療法、より詳細には、がん免疫療法の効果を評価するおよび／またはモニタリングするのにも有用であり得る。適切ながんの説明例には、膀胱がんおよび乳がんが含まれるが、これらに限定されない。より詳細には、キットは、好ましくは対象由来のがん細胞におけるＤＥＰＤＣ１遺伝子の発現を検出するための少なくとも１つの試薬を含み、そのような試薬は、
（ａ）ＤＥＰＤＣ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するための試薬；
（ｂ）ＤＥＰＤＣ１タンパク質を検出するための試薬；および
（ｃ）ＤＥＰＤＣ１タンパク質の生物学的活性を検出するための試薬、からなる群から選択される。
【０１８１】
ＤＥＰＤＣ１遺伝子のｍＲＮＡを検出するのに適した試薬の例には、ＤＥＰＤＣ１  ｍＲＮＡに特異的に結合するまたはＤＥＰＤＣ１  ｍＲＮＡを同定する核酸、例えばＤＥＰＤＣ１  ｍＲＮＡの一部に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、ＤＥＰＤＣ１  ｍＲＮＡに特異的なプライマーおよびプローブによって例示される。これらの種類のオリゴヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法に基づいて調製し得る。必要な場合は、ＤＥＰＤＣ１  ｍＲＮＡを検出するための試薬を固体マトリックス上に固定化し得る。さらに、ＤＥＰＤＣ１  ｍＲＮＡを検出するための複数の試薬をキットに含めてもよい。
【０１８２】
他方で、ＤＥＰＤＣ１タンパク質を検出するのに適した試薬の例には、ＤＥＰＤＣ１タンパク質に対する抗体が含まれる。抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであり得る。さらに、抗体の断片または改変された抗体がＤＥＰＤＣ１タンパク質への結合能を保持する限り、抗体の任意の断片または改変型（例えばキメラ抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ等）を試薬として使用し得る。タンパク質の検出のためのこれらの種類の抗体を調製する方法は当技術分野において周知であり、本発明ではそのような抗体およびその等価物を調製するために任意の方法を使用し得る。さらに、直接結合または間接標識技術により、抗体をシグナル生成分子で標識してもよい。標識、ならびに抗体を標識し、その標的への抗体の結合を検出するための方法は当分野において周知であり、任意の標識および方法を本発明のために利用し得る。さらに、ＤＥＰＤＣ１タンパク質を検出するための複数の試薬をキットに含めてもよい。
【０１８３】
キットは、前記試薬の複数を含んでもよい。例えば、がんを有さないまたはがんに罹患している対象から得た組織試料は、有用な対照試薬として役立ち得る。本発明のキットは、使用のための指示書と共に、緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、シリンジおよび添付文書（例えば書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。これらの試薬などは、ラベルを付した容器中に保持され得る。適切な容器には、ボトル、バイアルおよび試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。
【０１８４】
本発明の１つの態様として、試薬がＤＥＰＤＣ１  ｍＲＮＡに対するプローブである場合、少なくとも１つの検出部位を形成するために試薬を多孔性ストリップなどの固体マトリックス上に固定化し得る。多孔性ストリップの測定領域または検出領域は、各々が核酸（プローブ）を含む複数の部位を含み得る。試験ストリップはまた、陰性対照および／または陽性対照のための部位を含んでもよい。あるいは、対照部位は、試験ストリップから隔てられたストリップ上に配置し得る。場合により、異なる検出部位は異なる量の固定化核酸を含んでもよく、すなわち、第一検出部位ではより高い量を含み、それに続く部位ではより少ない量を含んでもよい。試験試料の添加後、検出可能なシグナルを提示する部位の数により、試料中に存在するＤＥＰＤＣ１  ｍＲＮＡの量の定量的指標が提供される。検出部位は、任意の適切な検出可能形状に構成することができ、典型的には、試験ストリップの幅全体にわたるバーまたはドットの形状である。
【０１８５】
本発明のキットは、陽性対照試料またはＤＥＰＤＣ１標準試料をさらに含み得る。本発明の陽性対照試料は、ＤＥＰＤＣ１陽性試料を採取し、次にそのＤＥＰＤＣ１レベルを検定することによって調製し得る。あるいは、精製されたＤＥＰＤＣ１タンパク質またはポリヌクレオチドを、ＤＥＰＤＣ１を発現しない細胞に添加して、陽性試料またはＤＥＰＤＣ１標準試料を形成してもよい。本発明では、精製ＤＥＰＤＣ１は組換えタンパク質であり得る。陽性対照試料のＤＥＰＤＣ１レベルは、例えばカットオフ値を上回る。
【０１８６】
Ｘ．抗体：
本発明はさらに、本発明のペプチドに結合する抗体を提供する。好ましい抗体は、本発明のペプチドに特異的に結合し、他のペプチドには結合しない（または弱く結合する）。あるいは、抗体は、本発明のペプチドならびにそのホモログに結合する。本発明のペプチドに対する抗体は、がんの診断アッセイおよび予後判定アッセイならびに画像化法において使用され得る。同様に、そのような抗体は、ＤＥＰＤＣ１ががん患者において発現されるまたは過剰発現される限り、他のがんの治療、診断および／または予後判定において使用され得る。さらに、細胞内で発現される抗体（例えば一本鎖抗体）は、ＤＥＰＤＣ１の発現が関与するがんを処置する際に治療的に使用され得、その例には、膀胱がんおよび乳がんが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８７】
本発明はまた、配列番号：１から４の中から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むＤＥＰＤＣ１タンパク質（配列番号：８または１０）またはその断片の検出および／または定量化のための様々な免疫学的アッセイも提供する。そのようなアッセイは、適宜に、ＤＥＰＤＣ１タンパク質またはその断片を認識し、結合することができる１つまたは複数の抗ＤＥＰＤＣ１抗体を含み得る。本発明において、ＤＥＰＤＣ１ポリペプチドに結合する抗ＤＥＰＤＣ１抗体は、好ましくは他のペプチドを排除して、好ましくは配列番号：１から４の中から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを認識する。抗体の結合特異性は阻害試験で確認することができる。すなわち、分析する抗体と全長ＤＥＰＤＣ１ポリペプチドの間の結合が配列番号：１から４の中から選択されるアミノ酸配列を有する任意の断片ポリペプチドの存在下で阻害される場合、抗体は断片に「特異的に結合する」とみなされる。本発明に関連して、そのような免疫学的アッセイは、様々なタイプの放射免疫測定法、免疫クロマトグラフィ技術、酵素結合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光検定法（ＥＬＩＦＡ）等を含むがこれらに限定されない、当技術分野において周知の様々な免疫学的アッセイ形式内で実施される。
【０１８８】
本発明の関連する免疫学的であるが抗体を使用しないアッセイには、Ｔ細胞免疫原性アッセイ（阻害性または刺激性）ならびにＭＨＣ結合アッセイも含まれ得る。加えて、本発明の標識抗体を用いたラジオシンチグラフィ画像化法を含むがこれに限定されない、ＤＥＰＤＣ１を発現するがんを検出することができる免疫学的画像化法も本発明によって提供される。そのようなアッセイは、ＤＥＰＤＣ１を発現するがんの検出、モニタリングおよび予後判定において臨床的に使用することができ、そのようながんの例には、膀胱がんおよび乳がんが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８９】
本発明はまた、本発明のペプチドに結合する抗体も提供する。本発明の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体などの任意の形態で使用することができ、ウサギなどの動物を本発明のペプチドで免疫することによって得られる抗血清、すべてのクラスのポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ヒト抗体ならびに遺伝的組換えによって作製されるヒト化抗体を包含する。
【０１９０】
抗体を得るための抗原として使用する本発明のペプチドは、任意の動物種に由来し得るが、好ましくはヒト、マウスまたはラットなどの哺乳動物、より好ましくはヒトに由来する。ヒト由来のペプチドは、本明細書で開示するヌクレオチドまたはアミノ酸配列から入手し得る。
本発明によれば、本発明のポリペプチドの完全なペプチドおよび部分ペプチドは免疫化抗原として役立ち得る。適切な部分ペプチドの例には、例えば本発明のペプチドのアミノ（Ｎ）末端断片またはカルボキシ（Ｃ）末端断片が含まれる。
【０１９１】
本明細書では、抗体は、全長ＤＥＰＤＣ１ペプチドまたはＤＥＰＤＣ１ペプチドの断片のいずれかと反応するタンパク質と定義される。好ましい態様では、本発明の抗体は、配列番号：１から４の中から選択されるアミノ酸配列を有するＤＥＰＤＣ１の断片ペプチドを認識することができる。オリゴペプチドを合成する方法は当技術分野において周知である。合成後、ペプチドを、場合により免疫原として使用する前に精製してもよい。本発明では、オリゴペプチド（例えば２４ｍｅｒまたは２６ｍｅｒ）を、免疫原性を増強するために担体と複合化または連結してもよい。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は担体として周知である。ＫＬＨとペプチドを複合化する方法も当技術分野において周知である。
【０１９２】
あるいは、本発明のペプチドまたはその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクターに挿入してもよく、次にそれを使用して本明細書で述べるような宿主細胞を形質転換する。所望のペプチドまたはその断片を任意の標準的な方法によって宿主細胞の外部または内部から回収することができ、その後抗原として使用し得る。あるいは、ペプチドを発現する細胞全体またはその溶解物または化学合成したペプチドを抗原として使用してもよい。
【０１９３】
任意の哺乳動物を抗原で免疫し得るが、好ましくは細胞融合のために使用する親細胞との適合性を考慮に入れる。一般に、げっ歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）、ウサギ目（Ｌａｇｏｍｏｒｐｈａ）または霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅ）科の動物を使用し得る。げっ歯目科の動物には、例えばマウス、ラットおよびハムスターが含まれる。ウサギ目科の動物には、例えばウサギが含まれる。霊長目科の動物には、例えばカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）、アカゲザル、マントヒヒおよびチンパンジーなどの狭鼻下目（Ｃａｔａｒｒｈｉｎｉ）のサル（旧世界ザル）が含まれる。
【０１９４】
抗原で動物を免疫する方法は当技術分野において公知である。抗原の腹腔内注射または皮下注射が哺乳動物の免疫のための標準的な方法である。より詳細には、抗原を適切な量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水等に希釈し、懸濁し得る。所望する場合は、抗原懸濁液を適切な量の標準的なアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化して、その後哺乳動物に投与してもよい。好ましくは、それに続いて、適切な量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を４〜２１日ごとに数回投与する。適切な担体も免疫のために使用し得る。上記のように免疫した後、血清を、所望抗体の量の増加に関して標準的な方法によって検査し得る。
【０１９５】
本発明のペプチドに対するポリクローナル抗体は、血清中の所望抗体の増加に関して検査した免疫哺乳動物から血液を採取し、任意の従来の方法で血液から血清を分離することによって調製し得る。ポリクローナル抗体には、ポリクローナル抗体を含有する血清、ならびに血清から単離し得るポリクローナル抗体を含有する画分が含まれる。免疫グロブリンＧまたはＭは、例えば本発明のペプチドと結合したアフィニティカラムを用いて本発明のペプチドだけを認識する画分から調製することができ、プロテインＡまたはプロテインＧカラムを用いてこの画分をさらに精製し得る。
【０１９６】
本発明に関する使用のためのモノクローナル抗体を調製するには、抗原で免疫した哺乳動物から免疫細胞を採取し、上述したように血清中の所望抗体のレベル上昇を検査して、細胞融合に供する。細胞融合に使用する免疫細胞は、好ましくは脾臓から得られる。上記免疫細胞と融合させる他の好ましい親細胞には、例えば哺乳動物の骨髄腫細胞、より好ましくは薬剤による融合細胞の選択のための獲得特性を有する骨髄腫細胞が含まれる。
上記免疫細胞と骨髄腫細胞を公知の方法に従って、例えばＭｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．の方法（Ｇａｌｆｒｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ７３：３−４６（１９８１））に従って融合させることができる。
【０１９７】
生じる細胞融合によって得られたハイブリドーマは、それらを標準的な選択培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン含有培地）で培養することによって選択し得る。細胞培養を、典型的には数日間から数週間、すなわち所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（非融合細胞）を死滅させるのに十分な時間、ＨＡＴ培地中で継続する。その後、標準的な限界希釈を実施して、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、クローン化し得る。
【０１９８】
ハイブリドーマを調製するために非ヒト動物を抗原で免疫する上記方法に加えて、ヒトリンパ球、例えばＥＢウイルスに感染したものをインビトロでペプチド、ペプチド発現細胞またはそれらの溶解物で免疫し得る。次に、免疫したリンパ球を、Ｕ２６６などの無限に分裂することができるヒト由来骨髄腫細胞と融合させて、ペプチドに結合することができる所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを生成し得る（特開昭６３−１７６８８号）。
【０１９９】
得られたハイブリドーマを、その後マウスの腹腔に移植し、腹水を抽出し得る。得られたモノクローナル抗体を、例えば硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィまたは本発明のペプチドを結合させたアフィニティカラムによって精製することができる。本発明の抗体は、本発明のペプチドの精製および検出に使用できるだけでなく、本発明のペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストの候補としても用いることができる。
あるいは、抗体を産生する、免疫リンパ球などの免疫細胞をがん遺伝子によって不死化し、モノクローナル抗体を調製するために使用してもよい。
【０２００】
このようにして得られるモノクローナル抗体は、遺伝子工学技術を用いて組換えによって調製することもできる（例えばＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ａｎｄ  Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  ｂｙ  ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  ＬＴＤ（１９９０）参照）。例えば、抗体をコードするＤＮＡを免疫細胞、例えば抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫リンパ球などからクローン化し、適切なベクターに挿入して、宿主細胞に導入し、組換え抗体を調製し得る。本発明はまた、上述したように調製される組換え抗体も提供する。
【０２０１】
本発明の抗体は、抗体の断片または改変された抗体が本発明のペプチドの１つまたは複数に結合する限り、抗体の断片または改変された抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、またはＨ鎖とＬ鎖からのＦｖ断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であり得る（Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−８３（１９８８））。より詳細には、抗体断片は、抗体をパパインまたはペプシンなどの酵素で処理することによって生成し得る。あるいは、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入して、適切な宿主細胞において発現させてもよい（例えばＣｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：２９６８−７６（１９９４）；Ｂｅｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １７８：４７６−９６（１９８９）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １７８：４９７−５１５（１９８９）；Ｌａｍｏｙｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １２１：６５２−６３（１９８６）；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １２１：６６３−９（１９８６）；Ｂｉｒｄ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９：１３２−７（１９９１）参照）。
【０２０２】
抗体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの様々な分子との結合によって修飾し得る。本発明はそのような修飾された抗体を提供する。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することによって得られ得る。これらの修飾方法は当技術分野において慣例的である。
【０２０３】
あるいは、本発明の抗体は、非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域との間のキメラ抗体として、または非ヒト抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（ＦＲ）および定常領域を含むヒト化抗体として入手し得る。そのような抗体は公知の技術に従って調製することができる。ヒト化は、げっ歯動物のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する配列を置き換えることによって実施できる（例えばＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））。したがって、そのようなヒト化抗体は、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が非ヒト種からの対応する配列によって置換されているキメラ抗体である。
【０２０４】
ヒトフレームワーク領域および定常領域に加えてヒト可変領域を含む完全ヒト抗体も使用できる。そのような抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を用いて作製することができる。例えば、インビトロ法は、バクテリオファージ上に提示されるヒト抗体断片の組換えライブラリの使用を含む（例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）参照）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されているマウスに導入することによって作製できる。このアプローチは、例えば米国特許第６，１５０，５８４号；同第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号に記載されている。
【０２０５】
上述したようにして得られた抗体を均一に精製し得る。例えば、抗体の分離および精製は、一般的なタンパク質に用いられる分離および精製方法に従って実施できる。例えば、抗体を、アフィニティクロマトグラフィ、フィルター、限外ろ過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および等電点電気泳動などの、しかしこれらに限定されないカラムクロマトグラフィの適切に選択し、組み合わせた使用によって分離および単離し得る（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））。プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムをアフィニティカラムとして使用することができる。使用される例示的なプロテインＡカラムには、例えばＨｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳおよびＳｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。
【０２０６】
適切なクロマトグラフィ技術の例には、アフィニティクロマトグラフィを除いて、例えばイオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィ、ゲルろ過、逆相クロマトグラフィ、吸着クロマトグラフィ等が含まれる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６））。クロマトグラフィ手順は、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィによって実施することができる。
【０２０７】
例えば、吸光度の測定、ＥＬＩＳＡ、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）および／または免疫蛍光法（ＩＦ）を用いて本発明の抗体の抗原結合活性を測定し得る。ＥＬＩＳＡでは、本発明の抗体をプレートに固定化し、本発明のペプチドをプレートに塗布して、次に所望の抗体を含有する試料、例えば抗体産生細胞の培養上清または精製抗体を適用する。その後、一次抗体を認識する、アルカリホスファターゼなどの酵素で標識した二次抗体を適用し、プレートをインキュベートする。次に、洗浄した後、ｐ−ニトロフェニルリン酸などの酵素基質をプレートに添加し、吸光度を測定して、試料の抗原結合活性を評価する。Ｃ末端またはＮ末端断片などのペプチドの断片を、抗体の結合活性を評価するための抗原として使用し得る。ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、本発明による抗体の活性を評価するために使用してもよい。
【０２０８】
上記方法は、本発明の抗体を、本発明のペプチドを含むと推測される試料に曝露し、抗体とペプチドによって形成される免疫複合体を検出または測定することにより、本発明のペプチドの検出または測定を可能にする。
本発明によるペプチドの検出または測定の方法は、ペプチドを特異的に検出または測定することができるため、この方法はペプチドを用いる様々な実験で使用することができる。例えば、患者から得られたがん細胞または組織において、本発明のペプチドが検出される場合、それらに対するＴｈ１細胞（またはＣＴＬ細胞）が、がん免疫療法において効果的なツールであることが期待される。
【０２０９】
ＸＩ．ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドを導入するベクターおよび宿主細胞も提供する。本発明のベクターは、本発明のペプチドを発現するためまたは遺伝子治療のために本発明のヌクレオチドを投与するための、宿主細胞における本発明のヌクレオチド、特にＤＮＡの担体として有用である。
【０２１０】
大腸菌を宿主細胞として選択し、ベクターを大腸菌（例えばＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１またはＸＬ１Ｂｌｕｅ）において大量に増幅し、生産する場合、ベクターは、大腸菌における増幅に適した「複製起点（ｏｒｉ）」および形質転換した大腸菌を選択するのに適したマーカー遺伝子（例えばアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等のような薬剤によって選択される薬剤耐性遺伝子）を有するべきである。例えば、Ｍ１３シリーズのベクター、ｐＵＣシリーズのベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ等が使用できる。加えて、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴおよびｐＴ７も、上述したベクターと同様に、ｃＤＮＡをサブクローニングし、抽出するために使用できる。本発明のタンパク質を生産するためにベクターを使用する場合は、発現ベクターが使用できる。例えば、大腸菌で発現される発現ベクターは、大腸菌において増幅される上記特徴を有するべきである。ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１またはＸＬ１  Ｂｌｕｅなどの大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ベクターは、大腸菌において所望の遺伝子を効果的に発現することができるプロモーター、例えばｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−６（１９８９）；ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ６：２４２２−７（１９９２））、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−３（１９８８））、Ｔ７プロモーター等を有するべきである。その点に関して、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＥＧＦＰおよびｐＥＴ（この場合、宿主は、好ましくはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１である）が、例えば、上記ベクターの代わりに使用できる。加えて、ベクターはまた、ペプチド分泌のためのシグナル配列も含み得る。ペプチドが大腸菌のペリプラズムに分泌されるように指令する例示的なシグナル配列は、ｐｅｌＢシグナル配列である（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １６９：４３７９（１９８７））。ベクターを標的宿主細胞に導入するための手段には、例えば塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
【０２１１】
大腸菌に加えて、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えばｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８（１７）：５３２２（１９９０））、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣバキュロウイルス発現系」（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えばｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えばｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）ならびに枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の発現ベクター（例えばｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が、本発明のポリペプチドを産生するために使用できる。
【０２１２】
ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞においてベクターを発現するために、ベクターは、そのような細胞における発現に必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：１０８（１９７９））、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：５３２２（１９９０））、ＣＭＶプロモーター等、および好ましくは形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬剤（例えばネオマイシン、Ｇ４１８）によって選択される薬剤耐性遺伝子）を担持すべきである。これらの特徴を有する公知のベクターの例には、例えばｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶおよびｐＯＰ１３が含まれる。
【０２１３】
ＸＩＩ．ペプチドによって媒介されるＴｈ１応答のモニタリング
ＴＣＲ−α遺伝子およびＴＣＲ−β遺伝子のディープｃＤＮＡ配列解析を通して、当該遺伝子の特定のペアの頻度が、本発明のペプチドによって刺激されたＴｈ細胞において増加したことが明らかになった。それゆえ、そのような遺伝子のペアが本発明のペプチドのワクチン接種後に対象において検出される場合、それは、対象におけるペプチド特異的Ｔｈ１応答が誘導されたことを意味する。したがって、本発明のペプチドによって刺激されたＴｈ細胞における遺伝子の特定のペアの増加は、刺激後の対象におけるＴｈ１応答をモニタリングまたは検出するための代用マーカーとして有用であり得る。本発明に関連して、「ペプチド特異的Ｔｈ１応答」とは、αサブユニットおよびβサブユニットのペアの間に形成されるＴＣＲが、本発明のペプチドとＨＬＡ分子との間に形成される複合体を特異的に認識することを意味するように理解される。上記で論じたように、本発明の特異的配列で定義されるペプチドのＴｈ１細胞誘導能は、アミノ酸改変後でさえも維持され得る。それゆえ、特異的ペプチドによる刺激に加えて、Ｔｈ１細胞が変異ペプチドから誘導される場合でさえも、そのＴＣＲがもとのペプチドによって形成されるそのような複合体を特異的に認識する限り、その抗原特異性は「ペプチド特異的」とみなされる。
【０２１４】
例えば、それぞれ配列番号：１１および２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３を各々が有するＴＣＲ−αサブユニットおよびＴＣＲ−βサブユニットが、ＨＬＡ−ＤＲ４拘束様式で、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２（ＤＥＰＤＣ１２９２−３１３−ＬＰ）によって刺激されたＴｈ細胞において増加した（図６）。それゆえ、対象のＴｈ細胞集団におけるそれらの蓄積は、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２によって媒介されるＴｈ１応答が、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２をワクチン接種した対象において成功裡に誘導されたことを意味する。配列番号：１１および２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３の存在は、抗体に基づく解析によって検出することができる。本出願の代替的な態様において、ＴＣＲ−αサブユニットおよびＴＣＲ−βサブユニットの特定のペアはまた、それらをコードするポリヌクレオチドを検出することによっても評価することができる。例えば、配列番号：１１および２１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３の各々をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号：３１および３２のヌクレオチド配列によって代表される。したがって、ＤＥＰＤＣ１特異的ＴＣＲのαサブユニットおよびβサブユニットをコードするｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡの各々は、それぞれ配列番号：３１および３２のヌクレオチド配列を含み得る。そのようなポリヌクレオチドは、ＰＣＲに基づく解析によって検出することができる。
【０２１５】
好ましい態様において、本発明は、ペプチドで免疫された対象におけるペプチド特異的Ｔｈ１応答をモニタリングする、評価する、または評定するための方法であって、
（ａ）該ペプチドを投与された対象から得られた試料を提供する段階であって、該試料がＴ細胞を含む、段階；
（ｂ）該試料における、ＭＨＣクラスＩＩ分子と該ペプチドまたはその断片との複合体に結合するＴＣＲを発現するＴ細胞の存在を検出する段階；および
（ｃ）該Ｔ細胞の存在が（ｂ）において検出される場合に、該ペプチドに特異的なＴｈ１応答の誘導が示される段階
を含む方法を提供する。例えば、配列番号：１１および２１のアミノ酸配列からなるαサブユニットおよびβサブユニットを検出することによって、ＨＬＡ−ＤＲ４拘束様式でのＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２（ＤＥＰＤＣ１２９２−３１３−ＬＰ）に特異的なＴ細胞の誘導を検出することができる。
【０２１６】
本発明において、対象から得られる任意の生物学的試料を、その試料にＴｈ１細胞が含まれる限り、Ｔｈ１応答をモニタリングするために使用することができる。例えば、本発明のために、血液または血液由来試料を、生物学的試料として使用することができる。本発明において、血液由来試料は、Ｔ細胞を含む細胞集団を含む。Ｔ細胞を含む細胞集団を得るための方法は、当業者に周知である。あるいは、いくつかの態様において、Ｔ細胞が浸潤した組織またはリンパ節もまた、生物学的試料として有用である。
【０２１７】
本発明のいくつかの態様において、ＴＣＲサブユニットの評定における抗体に基づく解析のために、Ｔ細胞を含む細胞集団を固定することができる。抗体は、固定された細胞と接触した後、固定された細胞のαサブユニットおよびβサブユニットのＣＤＲ３を認識し、抗体が単一細胞上のＴＣＲの両サブユニットに結合する場合、特定のサブユニットペアと共に形成されるＴＣＲ−抗体複合体を検出することができる。あるいは、ヌクレオチド配列に基づく解析において、単一細胞におけるＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドから合成されたアンプリコンの蓄積は、サブユニットの特定のペアが存在していることを意味する。あるいは、ワクチン接種されるペプチドの各々についてのＴＣＲサブユニットをコードするポリヌクレオチドの特定のペアを、Ｆａｎｇ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３：  ｅ９６８４６７，  ２０１５に示されているようなディープｃＤＮＡ配列解析によってモニタリングすることができる。
【０２１８】
本局面において、Ｔｈ１細胞上のＴＣＲの構造多様性は、主にそれらのＣＤＲ３に依存していることが周知である。その結果、それによる抗原特異性もまた、ＣＤＲ３に依存している。それゆえ、単一細胞上のαサブユニットおよびβサブユニットの特定のペアの存在を、ＣＤＲ３の検出を通してモニタリングすることができる。
本発明のいくつかの態様において、Ｔｈ１応答をモニタリングするかまたは評定するために、ＴＣＲ−αサブユニットおよびＴＣＲ−βサブユニットの特定のペアを、ワクチン接種後に少なくとも１回または複数回、検出することができる。ペアがモニタリングを通して時間依存的に増加する場合、それは、対象におけるペプチド媒介性Ｔｈ１応答が十分に誘導されていることを意味する。あるいは、特定のペアが少なくとも１回検出される場合、それは、対象におけるＴｈ１応答が生じたことを示す。
【０２１９】
以下では、特定の実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。しかし、以下の実験材料、方法および実施例は、当業者が本発明の特定の態様を作製し、使用することを助けるのに役立ち得るが、本発明の態様を例示することだけを意図し、したがっていかなる意味でも本発明の範囲を限定するものではない。当業者は容易に認識するように、本明細書で述べるものと類似または等価の方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができる。
【実施例】
【０２２０】
材料および方法
細胞株
健常ドナー（ＨＤ）およびがんを有する患者からＰＢＭＣを採取し、使用するための研究プロトコルは、熊本大学の治験審査委員会によって承認された。書面によるインフォームドコンセントを得た後に、ＨＤおよびがんを有する患者から、ＰＢＭＣを得た。ヒト単球由来ＤＣおよびマウスＢＭ由来ＤＣを、以前に報告されているように生成した（Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．  ２０１１；１０２（１）：７１−７８；  Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１３；１９（１６）：４５０８−４５２０；  Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１４；１３４（２）：３５２−３６６；  Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１４；３：ｅ２８１００；  Ｓａｙｅｍ  ＭＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１６；５（１）：ｅ１０６２２０９；  Ｈｉｒａｙａｍａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１６；５（６）：ｅ１１２３３６８）。
ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４：０５）、Ｌ−ＤＲ４；ＤＲ８（ＤＲＢ１＊０８：０３）、Ｌ−ＤＲ８；ＤＲ９（ＤＲＢ１＊０９：０１）、Ｌ−ＤＲ９；ＤＲ１５（ＤＲＢ１＊１５：０２）、Ｌ−ＤＲ１５；ＤＲ５３（ＤＲＢ４＊０１：０３）、Ｌ−ＤＲ５３；ＤＰ２（ＤＰＡ１＊０１：０３／ＤＲＢ１＊０２：０１）、Ｌ−ＤＰ２；ＤＰ４（ＤＰＡ１＊０１：０３／ＤＰＢ１＊０４：０１）、ＲＭ３−ＤＰ４；ＤＰ５（ＤＰＡ１＊０２：０２／ＤＰＢ１＊０５：０１）、Ｌ−ＤＰ５；およびＤＰ９（ＤＰＢ１＊０９：０１）、Ｌ−ＤＰ９を発現するように遺伝的に操作されたマウス線維芽細胞株（Ｌ細胞）を、Ａｌｅｓｓａｎｄｒｏ  Ｓｅｔｔｅ博士（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）より提供していただき、ＡＰＣとして使用した。
【０２２１】
ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの予測
潜在的なプロミスキャスＨＬＡクラスＩＩ結合ヒトＤＥＰＤＣ１由来ペプチドを予測するために、近年開発されたコンピュータアルゴリズム（ＩＥＤＢ解析リソース、コンセンサス法、ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ａｎａｌｙｚｅ／ｈｔｍｌ／ｍｈｃ＿ＩＩ＿ｂｉｎｄｉｎｇ．ｈｔｍｌ）（Ｗａｎｇ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０１０；１１：５６８．Ｗａｎｇ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ２００８；４：ｅ１００００４８）によってヒトＤＥＰＤＣ１タンパク質のアミノ酸配列を解析した。プログラムは、ＤＥＰＤＣ１タンパク質全体を包含する１５アミノ酸長配列のオフセットを解析した。ＤＰＢ１＊０４：０５、ＤＲＢ１＊０９：０１、ＤＲＢ１＊１５：０２、ＤＲＢ４＊０１：０３、およびＤＰＢ１＊０５：０１アリルによってコードされる複数のＨＬＡクラスＩＩ分子について相対的により低いコンセンサスパーセンタイル順位を有する２２〜２９アミノ酸長のペプチドである、ＤＥＰＤＣ１１９１−２１３ＬＰ（ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１；ＲＹＶＩＬＩＹＬＱＴＩＬＧＶＰＳＬＥＥＶＩＮＰ（配列番号：１））、ＤＥＰＤＣ１２９２−３１３−ＬＰ（ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２；ＴＦＥＹＹＥＬＦＶＮＩＬＶＶＣＧＹＩＴＶＳＤ（配列番号：２））、ＤＥＰＤＣ１３０１−３２９−ＬＰ（ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３；ＮＩＬＶＶＣＧＹＩＴＶＳＤＲＳＳＧＩＨＫＩＱＤＤＰＱＳＳＫ（配列番号：３））、およびＤＥＰＤＣ１６１３−６３４−ＬＰ（ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４；ＮＲＲＫＬＱＬＬＭＲＭＩＳＲＭＳＱＮＶＤＭＰ（配列番号：４））（それらのうちの２つは、ＤＥＰＤＣ１由来の９−ｍｅｒまたは１０−ｍｅｒのＣＴＬエピトープ（ＤＥＰＤＣ１−Ａ２３０２−３１１および／またはＤＥＰＤＣ１−Ａ２４２９４−３０２）を含む）を選択して合成した（図１および表１）。
【０２２２】
【表１−１】
2019535270.tif 000002
各々１５−ｍｅｒのＤＥＰＤＣ１由来のオーバーラップするペプチドについて、表示されているＨＬＡクラスＩＩ分子に対するペプチド結合アルゴリズムスコアを示す。
【０２２３】
【表１−２】
2019535270.tif 000003
各々１５−ｍｅｒのＤＥＰＤＣ１由来のオーバーラップするペプチドについて、表示されているＨＬＡクラスＩＩ分子に対するペプチド結合アルゴリズムスコアを示す。
【０２２４】
合成ペプチドおよび組換えタンパク質
ＨＬＡ−Ａ２によって（ＤＥＰＤＣ１−Ａ２３０２−３１１）（Ｋａｎｅｈｉｒａ  Ｍ  ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００７；  ２６：  ６４４８−５５）またはＨＬＡ−Ａ２４によって（ＤＥＰＤＣ１−Ａ２４２９４−３０２）（Ｈａｒａｄａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１０；７０：５８２９−３９）提示される２種のヒトＤＥＰＤＣ１由来ＳＰ、および４種のＬＰ（ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１〜４）を合成した（ＭＢＬ、名古屋、日本；純度＞９５％；図１Ｂ）。ＨＬＡ−Ａ２に結合するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−ＳＰ（ＨＩＶ−Ａ２）またはＨＬＡ−Ａ２４に結合するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−ＳＰ（ＨＩＶ−Ａ２４）（Ｋａｎｅｈｉｒａ  Ｍ  ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００７；  ２６：  ６４４８−５５；  Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２０１１；１０２：６９７−７０５）を、陰性対照ＳＰとして使用した。ペプチドを、１０ｍｇ／ｍＬでジメチルスルホキシドに溶解し、−８０℃で保管した。組換えヒト全長ＤＥＰＤＣ１タンパク質およびＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質を、ＤＥＰＤＣ１およびＭＰＨＯＳＰＨ１をコードするｐＥＴ２８ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，６９８６４−３）で形質転換した大腸菌ＢＬ２１において、製造業者の使用説明書に従って生成した。ＤＥＰＤＣ１タンパク質およびＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質の両方を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価し、ＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，  ＵＫ）によって精製した。ＭＰＨＯＳＰＨ１タンパク質を、陰性対照として使用した。
【０２２５】
健常ドナーからの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の生成
健常ドナーからＰＢＭＣを採取し、使用するための研究プロトコルは、熊本大学の治験審査委員会によって承認された。本発明者らは、書面によるインフォームドコンセントで、７人の健常ドナーからＰＢＭＣを得た。ＨＬＡ−Ａ、ＤＲＢ１、およびＤＰＢ１アリルの遺伝子型判定は、ＨＬＡ研究所（京都、日本）で行った（表２）。抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の誘導を、いくつか変更を加えて、以前に記載されているように行った（Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１３；  １９：４５０８−２０；  Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１４；  １３４：３５２−６６；  Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１４；  ３：ｅ２８１００；  Ｓａｙｅｍ  ＭＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１６；  ５：ｅ１０６２２０９；  Ｈｉｒａｙａｍａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１６；  ５：６，  ｅ１１２３３６８；  Ｉｎｏｕｅ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１０；１２７：１３９３−４０３；  Ｈａｒａｏ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；１２３：２６１６−２５）。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）での陽性選択によってＰＢＭＣから精製した（Ｉｎｏｕｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１０；１２７：１３９３−４０３）。単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を、以前に記載されているように（Ｈａｒａｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；１２３：２６１６−２５）、インビトロ培養によってＣＤ１４＋細胞から生成し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用して、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導した。ＤＣ（１×１０４個／ウェル）を、１０μｇ／ｍＬ  ＬＰで３時間パルスして放射線照射（４５Ｇｙ）し、次に、９６ウェル平底培養プレートの各ウェルにおいて、５％ヒト補体除去血漿を添加した２００μＬ  ＡＩＭ−Ｖ中でＣＤ４＋Ｔ細胞（３×１０４個／ウェル）と混合した。７日後、培地の半分を各培養物から除去し、ペプチド（１０μｇ／ｍＬ）でパルスした放射線照射（５０Ｇｙ）自己ＰＢＭＣ（１×１０５個）および５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトインターロイキンン７（ｒｈＩＬ−７）を含有する新鮮培地（１００μＬ／ウェル）を添加した。ペプチドでの２回目の刺激の２日後に、ｒｈＩＬ−２を各ウェルに添加した（１０ＩＵ／ｍＬ）。１週間後、各ウェル中の刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにて特異性について解析した。コグネイトペプチドに対して特異的応答を示したＴ細胞を２４ウェルプレートに移し、ｒｈＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍＬ）およびｒｈＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）を加えた培地において、ペプチドでパルスした放射線照射自己ＰＢＭＣ（１×１０６個／ウェル）で、週１回の間隔で再刺激した。場合によっては、Ｔ細胞を、さらなる研究のために、以前に記載されているように（Ｔａｂａｔａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；５９：５４９−６０）、限界希釈によってクローン化した。
【０２２６】
【表２】
2019535270.tif 000004
ａＤＥＰＤＣ１−ＬＰに特異的なＴｈ細胞は、健常ドナー（ＨＤ１〜ＨＤ７）のＰＢＭＣに由来した。
【０２２７】
ペプチドおよびタンパク質に対するＴ細胞応答の評価
ペプチドでパルスした放射線照射ＡＰＣに対するＴｈ細胞の免疫応答を、以前に記載されているように（Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ,  ｅｔ  ａｌ．,  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ  ２０１１；１０２：６９７−７０５）、ＩＦＮ−γ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって評価した。簡単に述べると、ペプチドでパルスした放射線照射ＰＢＭＣ（３×１０４個）での刺激時の３×１０４個のバルクＣＤ４＋Ｔ細胞、またはペプチドでパルスしたＨＬＡ−ＤＰもしくはＨＬＡ−ＤＲを発現するＬ細胞（５×１０４個／ウェル）での刺激時の１×１０４個のバルクＣＤ４＋Ｔ細胞当たりの、ＩＦＮ−γを産生するペプチド特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を解析した。抗原提示に関与するＨＬＡ分子による拘束を決定するために、抗ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｌ２４３，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＨＬＡ−ＤＰ  ｍＡｂ（Ｂ７／２１，Ａｂｃａｍ）、抗ヒトＨＬＡ−ＤＱ  ｍＡｂ（ＳＰＶ−Ｌ３，Ａｂｃａｍ）、または抗ＨＬＡクラスＩ  ｍＡｂ（Ｗ６／３２，Ａｂｃａｍ）を添加することによって、抗原により誘導されるＩＦＮ−γ産生のブロッキングを調べた。すべてのｍＡｂを、最終濃度５μｇ／ｍＬで使用した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイのすべての評価は、３連または２連で行い、結果を平均±ＳＤとして示す。
【０２２８】
ＵＣ患者におけるＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の評価
５人の尿路上皮がん（ＵＣ）患者から得られたＰＢＭＣを、５％ヒト補体除去血漿を添加した最終体積２ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ（２０μｇ／ｍＬ）の混合物の存在下にて３７℃で培養した（２×１０６個／ウェル、２４ウェルプレート）。ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）を、０日目および２日目に加えた。７日間の細胞培養の後、細胞を回収し、洗浄して、個々のＤＥＰＤＣ１−ＬＰまたは対照ＬＰを有するＥＬＩＳＰＯＴプレートに移して１８時間置いた（５〜１０×１０４個／ウェル）。ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を、上述したように計数した。
【０２２９】
インビボクロスプライミングアッセイ
ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４（ＨＨＤ）トランスジェニックマウス（Ｔｇｍ）は、Ｆ．Ａ．Ｌｅｍｏｎｎｉｅｒ博士のご厚意により提供された（Ｆｉｒａｔ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；２９：３１１２−２１；  Ｊｕｎｇ  ＫＯ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１２；８６：７６１６−２４）。マウスに、７日に１回の間隔で、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）中に乳化したＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２溶液（１００μｇ／マウス）を尾基底部へ皮内注射した。ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２での２回目のワクチン接種の７日後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）での陽性選択によって鼠径リンパ節から単離した。ＤＥＰＤＣ１−Ａ２３０２−３１１ＳＰまたはＤＥＰＤＣ１−Ａ２４２９４−３０２ＳＰでパルスした骨髄由来ＤＣ（ＢＭ−ＤＣ、２×１０４個／ウェル）での刺激時のＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の数（１×１０５個／ウェル）を、エクスビボＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって計数した（Ｈａｒａｏ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；１２３：２６１６−２５；  Ｉｎｏｕｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ２００９；１２６：６７−７２）。
【０２３０】
サイトカイン解析
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的バルクＴｈ細胞またはＴｈクローン（１×１０４個／ウェル）を、９６ウェルプレートにおいて、コグネイトペプチドでパルスした自己ＰＢＭＣ（３×１０４個／ウェル）と共に培養した。Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、２４時間後の培養上清中のサイトカインレベルを、以前に報告されているように製造業者の使用説明書に従って測定した。
【０２３１】
ＴＣＲシーケンシング
ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２特異的Ｔ細胞から全ＲＮＡを単離した。ＴＲＡＶおよびＴＲＢＶのシーケンシングライブラリーを、いくつか変更を加えて、以前に記載されたプロトコル（Ｆａｎｇ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１４；  ３（１２）：  ｅ９６８４６７；  Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  ＮＪ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｕｒｏｌｏｇｙ  ｆｏｃｕｓ．  ２０１６；  ２（４）：  ４４５−５２）を用いて調製し、６００サイクルＭｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  Ｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いたＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑプラットフォーム上でのシーケンシングに供した。次に、配列リードを、以前に記載されたアルゴリズム（Ｆａｎｇ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１４；  ３（１２）：  ｅ９６８４６７）で解析した。個々のＴＲＡＶおよびＴＲＢＶのシーケンシングリードにおいてＶ−（Ｄ）−Ｊセグメントを同定するために、ＦＡＳＴＱファイル中の配列リードの各々を、Ｂｏｗｔｉｅ２  ａｌｉｇｎｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１．０）（Ｌａｎｇｍｅａｄ  Ｂ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１２；  ９（４）：  ３５７−９；  Ｌｅｆｒａｎｃ  ＭＰ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２００５；  ３３（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：  Ｄ５９３−７）を用いて、ＩＭＧＴ／ＧＥＮＥ−ＤＢ  （Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  Ｖ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２００５；  ３３（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：  Ｄ２５６−６１）に由来する参照配列にマッピングした。ＴＲＡＶおよびＴＲＢＶ中の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を定義するために、ＣＤＲ３の境界を形成する、Ｖセグメントの３’部分にコードされる保存されたシステインおよびＪセグメントの５’部分にコードされる保存されたフェニルアラニンを同定した（Ｆａｎｇ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１４；  ３（１２）：  ｅ９６８４６７）。両方とも保存されたシステインと保存されたフェニルアラニンとの間のヌクレオチド配列を抽出して、ＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を決定した。
【０２３２】
ＴＣＲのクローニングおよびＴＧ４０における発現
以前に記載されているように（Ｈａｍａｎａ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ．  ２０１６；  ４７４（４）：  ７０９−１４）、ワンステップマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲを用いて、Ｔ細胞株からＴＣＲ  ｃＤＮＡを増幅した。増幅されたＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を、ダイレクトシーケンシングによって決定した。得られたＴＣＲ  ｃＤＮＡの抗原特異性を解析するために、ＴＣＲ用の発現ベクターを構築し、次にＰｌａｔ−Ｅ細胞（東京大学の北村俊雄教授のご厚意により提供された）に移入して、以前に記載されているように（Ｍｏｕ  Ｚ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２０１５；  ７（３１０）：  ３１０ｒａ１６７；  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２０１３；  １９（１１）：  １５４２−６）、組換えレトロウイルスを作製した。生じたＴＣＲを、以前に記載されているように（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２０１３；  １９（１１）：  １５４２−６）、ＴＧ４０細胞（Ｏｈｎｏ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍｄ  ：  １９５０）．  １９９１；  １４６（１１）：  ３７４２−６）に移入した。１×１０５個のＴＣＲ移入ＴＧ４０細胞を、１０μｇ／ｍＬの抗原ペプチドの存在下で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気において一晩、１×１０５個の拘束性ＨＬＡ−ＤＲ発現Ｌ細胞と共培養し、細胞表面上のＣＤ６９およびＣＤ１３７の発現をフローサイトメーターで解析した。
【０２３３】
統計解析
本発明者らは、データを、両側スチューデントｔ検定によって（棒グラフ）、またはノンパラメトリックなマン・ホイットニーＵ検定によって（散布図）比較した。すべての検定について、Ｐ値＜０．０５の差を統計的に有意とみなした。
【０２３４】
結果
ＣＴＬエピトープを含有する潜在的なプロミスキャスＨＬＡクラスＩＩ結合ＤＥＰＤＣ１長鎖ペプチドの予測および選択
ＤＥＰＤＣ１の潜在的なプロミスキャスＨＬＡクラスＩＩ結合Ｔｈ細胞エピトープを同定するために、ＤＥＰＤＣ１のアミノ酸配列を、近年開発されたコンピュータアルゴリズム（Ｗａｎｇ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２０１０；１１：５６８；  Ｗａｎｇ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．,  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ２００８；４：ｅ１００００４８）を用いて最初に調べた（図１Ａ、Ｃ、および表１）。２つの領域であるＤＥＰＤＣ１１９１−２１３−ＬＰ（ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１）およびＤＥＰＤＣ１６１３−６３４−ＬＰ（ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４）は、公知のＣＴＬエピトープ配列を含まない。他の２つのペプチドであるＤＥＰＤＣ１２９２−３１３−ＬＰ（ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２）およびＤＥＰＤＣ１３０１−３２９−ＬＰ（ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３）は、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬまたはＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬによって認識されるＣＴＬエピトープに近位であった（図１Ｂ）。それゆえ、本発明者らは、日本人集団における高頻度ＨＬＡクラスＩＩ分子（ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５、ＨＬＡ−ＤＰ２、およびＨＬＡ−ＤＰ５）に強い結合親和性を有すると予測された４つの候補ＬＰであり、そのうちの２つはＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬまたはＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬによって認識される９−ｍｅｒまたは１０−ｍｅｒのペプチドを含むＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１〜４を、その後の解析のために合成した。
【０２３５】
プロミスキャスなＤＥＰＤＣ１由来Ｔｈ細胞エピトープの同定
健常ドナーのＰＢＭＣから単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１でパルスした自己ＤＣおよび放射線照射ＰＢＭＣで、週１回の間隔で刺激した。少なくとも３回の刺激後、培養ＣＤ４＋Ｔ細胞のＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１特異的応答を、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって調べた。
ＨＬＡ−ＤＲ５３（ＤＲＢ４＊０１：０３）陽性健常ドナー（ＨＤ１）において、生成されたＴｈ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ依存的に、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１でパルスしたＰＢＭＣに応答して有意な量のＩＦＮ−γを産生した。バルクＴｈ細胞は、ＨＬＡ−ＤＲ依存的に、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１でパルスしたＬ−ＤＲ５３細胞を特異的に認識したが、パルスしていないＬ−ＤＲ５３細胞、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１でパルスしたＬ−ＤＲ４細胞およびＬ−ＤＲ９細胞を認識しなかった（図２Ａ）。これらの結果は、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１がＨＬＡ−ＤＲ５３によって提示されたことを示している。ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１が、他のＨＬＡクラスＩＩ分子によって拘束されるＴｈ細胞において応答を誘導するかどうかを調べるために、他の健常ドナー（ＨＤ４）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を試験した。本発明者らは、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１が、ＨＬＡ−ＤＲ４（ＤＲＢ１＊０４：０５／−）拘束性Ｔｈ細胞を生成することを確認した（図２Ｂ）。したがって、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１は、ＨＬＡ−ＤＲ５３およびＨＬＡ−ＤＲ４に結合し、このことは、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１が、日本人集団における高頻度ＨＬＡクラスＩＩ（Ｓａｉｔｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ２０００；５６：５２２−９；  Ｍａｃｋ  ＳＪ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ２０００；５５：３８３−４００）によって提示されるプロミスキャスなＴｈ細胞エピトープであることを示唆している。
【０２３６】
公知のＣＴＬエピトープを担持するＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２は、Ｔｈ細胞を生成することができる。
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２により誘導されたＴｈ細胞は、ＨＤ１に由来した。健常ドナーＨＤ１（ＤＲＢ１＊０４：０５／０９：０１）由来のＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２特異的Ｔｈ細胞は、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２でパルスしたＬ−ＤＲ４細胞を特異的に認識した（図２Ｃ）が、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２でパルスしたＬ−ＤＲ９およびＬ−ＤＲ５３を認識しなかった。次に、本発明者らは、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２が、このドナーにおいてＨＬＡ−ＤＲ４拘束性バルクＴｈ細胞を生成できたことを確認した。
【０２３７】
同様に公知のＣＴＬエピトープを担持するＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３は、Ｔｈ細胞を生成することができる。
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３により誘導されたＴｈ細胞は、ＨＤ３およびＨＤ４に由来した。ＨＬＡ−ＤＰ２およびＤＰ５陽性健常ドナー（ＨＤ３）において、生成されたＴｈ細胞は、ＨＬＡ−ＤＰ依存的に、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３でパルスしたＰＢＭＣに応答して有意な量のＩＦＮ−γを産生した。次に、本発明者らは、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３が、このドナーにおいてＨＬＡ−ＤＰ５拘束性バルクＴｈ細胞を生成できたことを確認した（図２Ｄ）。ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３が、他のＨＬＡクラスＩＩ分子によって拘束されるＴｈ細胞において応答を誘導できるかどうかを調べるために、他の健常ドナー（ＨＤ４）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を試験した。本発明者らは、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３が、このドナーにおいてＨＬＡ−ＤＲ４拘束性バルクＴｈ細胞を生成できたことを確認した（図２Ｅ）。
【０２３８】
同様の実験を行うことによって、本発明者らは、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４特異的なＩＦＮ−γ産生細胞を生成することもできる。ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４により誘導されたＴｈ細胞は、ＨＤ１、ＨＤ５、およびＨＤ７に由来した。ＤＰ５陽性健常ドナー（ＨＤ１）において、生成されたＴｈ細胞は、ＨＬＡ−ＤＰ依存的に、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４でパルスしたＰＢＭＣに応答して有意な量のＩＦＮ−γを産生した。次に、本発明者らは、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４が、このドナーにおいてＨＬＡ−ＤＰ５拘束性バルクＴｈ細胞を生成できたことを確認した（図２Ｆ）。本発明者らはまた、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４が、他の健常ドナー（ＨＤ７）においてＨＬＡ−ＤＰ５拘束性バルクＴｈ細胞を生成できたことも確認した（図２Ｈ）。ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４が、他のＨＬＡクラスＩＩ分子によって拘束されるＴｈ細胞において応答を誘導できるかどうかを調べるために、他の健常ドナー（ＨＤ５）由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を試験した。本発明者らは、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４が、このドナーにおいてＨＬＡ−ＤＲ１５拘束性バルクＴｈ細胞を生成できたことを確認した（図２Ｇ）。これらの結果は、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４が、少なくともＨＬＡ−ＤＰ５およびＨＬＡ−ＤＲ１５によって提示されたことを示している。これらの結果は、表３に要約されるように、これらの４つのＤＥＰＤＣ１−ＬＰがプロミスキャスなＴｈ細胞エピトープであることを実証している。これらのＬＰは、日本人集団において高頻度に観察されるＨＬＡクラスＩＩによって提示されるプロミスキャスＴｈ細胞エピトープであったため（表４）（Ｚａｒｏｕｒ  ＨＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２００２；  ６２（１）：  ２１３−８；  Ｇｒａｂｏｗｓｋａ  ＡＫ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．  ２０１５；  １３６（１）：  ２１２−２４）、これらのペプチドの組合せは、多くの日本人ドナーのＰＢＭＣにおいてＤＥＰＤＣ１特異的Ｔｈ細胞応答を誘導すると考えられる。
【０２３９】
【表３】
2019535270.tif 000005
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰおよび５人のＨＤにおけるＤＥＰＤＣ１−ＬＰに反応するＴｈ細胞の免疫応答の概要
ａ下線が引かれたＨＬＡクラスＩＩアリルは、ＨＤにおいてＤＥＰＤＣ１−ＬＰをＴｈ細胞に提示するＨＬＡクラスＩＩ分子をコードする；ドナーのＨＬＡアリルの詳細は、表２に示されている。
ｂ下線が引かれた斜体太字の配列は、ＣＴＬエピトープである；ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１およびＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４の配列は、アルゴリズムによって予測されたＨＬＡクラスＩＩ分子への高親和性結合に基づいて選択された；
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２およびＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３は、ＨＬＡクラスＩＩ結合の予測および公知のＣＴＬエピトープに近接していることの両方に基づいて選択された。ａ．ａ．：アミノ酸、陰性：陽性データを得られず、それ以上進めなかった、ＬＰ：長鎖ペプチド、ＨＤ：健常ドナー。
【０２４０】
【表４】
2019535270.tif 000006
日本人集団における各ＨＬＡアリルの抗原頻度は、以前の報告を参照した（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎ  ｒｅｓ  ２００１；６１（１２）：４７７３−８）。
【０２４１】
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３、およびＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４は、ＤＣによって天然にプロセシングされて提示される
ＤＣが、ＤＥＰＤＣ１タンパク質を取り込み、プロセシングして、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的Ｔｈクローンを刺激するかどうかを評価した。組換えＤＥＰＤＣ１タンパク質をロードしたＤＣを調製し、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるＡＰＣとして使用した（Ｋａｎｅｈｉｒａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２００７；２６：６４４８−５５；  Ｈａｒａｏ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００８；  １２３：２６１６−２５）。ＨＬＡ−ＤＲ４拘束性ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２反応性Ｔｈクローンは、ＤＥＰＤＣ１タンパク質をロードしたＤＣを効果的に認識したが、対照タンパク質をロードしたＤＣを認識せず、このことは、このエピトープが、ＤＥＰＤＣ１タンパク質から天然にプロセシングされ、ＨＬＡ−ＤＲ４分子によって提示されたことを示している（図３Ａ）。ＨＬＡ−ＤＲ４拘束性ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３反応性Ｔｈクローンは、ＨＬＡ−ＤＲ依存的に、ＤＥＰＤＣ１タンパク質をロードしたＤＣを効果的に認識したが、対照タンパク質をロードしたＤＣを認識せず、このことは、このエピトープもまた、ＤＥＰＤＣ１タンパク質から天然にプロセシングされ、ＨＬＡ−ＤＲ４分子によって提示されたことを示している（図３Ｂ）。同様に、ＨＬＡ−ＤＰ５拘束性ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４反応性Ｔｈクローンは、ＨＬＡ−ＤＰ依存的に、ＤＥＰＤＣ１タンパク質をロードしたＤＣを効果的に認識したが、対照タンパク質をロードしたＤＣを認識せず、このことは、このエピトープもまた、ＤＥＰＤＣ１タンパク質から天然にプロセシングされ、ＨＬＡ−ＤＰ５分子によって提示されたことを示している（図３Ｃ）。これらの結果は、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３、およびＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４が、ＤＣによってＤＥＰＤＣ１タンパク質から天然にプロセシングされて提示されることを示唆している。
【０２４２】
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰにより誘導されたＴｈ細胞はＴｈ１サイトカインを産生した
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞の特徴を調べるために、本発明者らは、それぞれのコグネイトペプチドでパルスした自己ＰＢＭＣでの刺激に応答してＴｈ細胞によって分泌された様々なサイトカインを測定した。相対的に大量のＴｈ１サイトカイン、例えばＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、およびＧＭ−ＣＳＦが、コグネイトペプチドでの再刺激後にＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞によって産生されたが、ＩＬ−４またはＩＬ−１７は産生されず（図５）、このことは、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰがＴｈ１に分極したＴｈ細胞を誘導する能力を有することを示唆している。それゆえ、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰによるＴｈ細胞の誘導は、抗腫瘍療法のために有用であり得る。
【０２４３】
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２特異的バルクＴｈ細胞は、収束されたＴＣＲ−α遺伝子およびＴＣＲ−β遺伝子を発現した
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２特異的Ｔ細胞のレパートリーを、次世代シーケンサーを用いたＴＣＲ−α遺伝子およびＴＣＲ−β遺伝子のディープｃＤＮＡシーケンシングによって解析した。バルクＴｈ細胞の数回の刺激後に、ＴＣＲ−α遺伝子およびＴＣＲ−β遺伝子の特定のペアの頻度が、両方のバルクＴｈ細胞において増加していた。ペプチドで４回または５回刺激された、親バルクＴ細胞株から樹立された２つのＬＰ特異的Ｔ細胞クローンが、バルクＴｈ細胞と同じペアのＴＣＲ−α遺伝子およびＴＣＲ−β遺伝子を発現していた（図６Ａおよび６Ｂ）。それぞれ、両方のＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２特異的Ｔ細胞クローンから単離されたＴＣＲ−α遺伝子およびＴＣＲ−β遺伝子のペアの、マウスＴＣＲ陰性Ｔ細胞株ＴＧ４０への導入は、フローサイトメトリー解析により検出されたＣＤ６９およびＣＤ１３７の上方制御によって明らかになったように、親Ｔｈ細胞のもとの抗原ペプチド特異性およびＨＬＡ拘束を成功裡に獲得していた（図６Ｃ）。これらの観察によって、樹立されたＴ細胞のクローン性、ならびにＴＣＲ−α鎖およびＴＣＲ−β鎖のこれらのペアの特異性が確認された。
【０２４４】
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰの交差提示は、インビボでＤＥＰＤＣ１−ＳＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を効果的にプライミングする
ＤＥＰＤＣ１−Ａ２３０２−３１１特異的ＣＴＬおよびＤＥＰＤＣ１−Ａ２４２９４−３０２特異的ＣＴＬをプライミングするＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２の能力を、エクスビボＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって調べた。ＨＬＡ−Ａ２  ＴｇｍおよびＨＬＡ−Ａ２４  Ｔｇｍを、ＩＦＡ中に乳化したＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２で２回免疫した。ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２でワクチン接種したＨＬＡ−Ａ２  ＴｇｍまたはＨＬＡ−Ａ２４  Ｔｇｍから単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＤＥＰＤＣ１−Ａ２３０２−３１１  ＳＰまたはＤＥＰＤＣ１−Ａ２４２９４−３０２  ＳＰでパルスしたＢＭ−ＤＣでの刺激に応答して特異的にＩＦＮ−γを産生した（図４Ａおよび４Ｂ）。これらの結果は、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２の取込み後に、ＡＰＣが、ＨＬＡ−Ａ２  ＴｇｍおよびＨＬＡ−Ａ２４  Ｔｇｍにおいてインビボで、ＤＥＰＤＣ１−Ａ２３０２−３１１  ＳＰ特異的ＣＴＬおよびＤＥＰＤＣ１−Ａ２４２９４−３０２特異的ＣＴＬをクロスプライミングすることができることを示唆している。
【０２４５】
ＵＣ患者から単離されたＰＢＭＣは、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰのうちのいくつかを認識した
ＵＣ患者におけるＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞応答の誘導を調べるために、本発明者らは、進行期ＵＣ患者から単離されたＰＢＭＣをインビトロでＬＰで刺激した。患者の特徴を表５に示した。刺激後に、個々のＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的Ｔ細胞の頻度を測定した。ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４は、２人の患者からペプチド特異的Ｔ細胞を誘導した。Ｔ細胞によるペプチド特異的ＩＦＮ−γの産生は、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂによって有意に阻害されたが、抗ＨＬＡ−ＤＰ  ｍＡｂや抗ＨＬＡクラスＩ  ｍＡｂによっては阻害されなかった（図７）。これらの結果は、ＩＦＮ−γが、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的かつＨＬＡ−ＤＲ拘束性のＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生されたことを実証し、このことは、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４が、ＨＤからだけではなくＵＣを有する患者からも抗原特異的Ｔｈ細胞を誘導したことを示唆している。
【０２４６】
【表５】
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ａＵＣを有する２人の患者に由来するＰＢＭＣのＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的免疫応答の概要。ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞の応答を、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）を用いて測定した。
簡単に述べると、患者由来のＰＢＭＣを、表示されているＤＥＰＤＣ１−ＬＰで刺激した。ＩＦＮ−γスポットの平均数が、２５を超え、かつバックグラウンドシグナルの２倍よりも大きかった場合に、応答を陽性として記録した。
【０２４７】
考察
第Ｉ／ＩＩ相臨床試験において、膀胱内ＢＣＧ接種とＤＥＰＤＣ１由来ＳＰワクチンとの併用免疫療法は、非筋肉浸潤性膀胱がんの再発予防に対する有望な臨床効果、ならびに、安全性およびＣＴＬを誘導する良好な免疫原性を実証した（Ｏｂａｒａ  Ｗ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１２；４２：  ５９１−６００）。それゆえ、本発明者らは、より良好なペプチドワクチン免疫療法をさらに開発するために、抗原特異的なＴｈ１細胞およびＣＴＬの両方を誘導するＬＰを同定することを試みた。
【０２４８】
本発明者らは、表３に要約されているように、４つのプロミスキャスなＤＥＰＤＣ１由来Ｔｈ細胞エピトープペプチドを同定した。それらのうちの２つは、ＨＬＡ−Ａ２および／またはＨＬＡ−Ａ２４拘束性のＣＴＬエピトープを含む。本発明者らは、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ３、およびＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４が、ＤＥＰＤＣ１タンパク質から天然にプロセシングされ、ＨＬＡクラスＩＩ分子との関連でＤＣの細胞表面上に提示されたことを確認した（図３）。このことは、これらのＤＥＰＤＣ１−ＬＰによって誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞が、がん免疫療法にとって有利な特徴を有することを示唆している。
【０２４９】
ＭＨＣクラスＩＩ分子は高度に多型性であるため、ＨＬＡクラスＩＩ拘束性Ｔｈ細胞を活性化するＬＰを臨床的にがんワクチン療法に応用するためには、当該ペプチドが、複数のＨＬＡクラスＩＩ分子に結合することができ、かつより広い適合範囲を有することが考慮されるべきである（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２００１；  ６１（１２）：  ４７７３−８；  Ｚａｒｏｕｒ  ＨＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２００２；  ６２（１）：  ２１３−８；  Ｇｒａｂｏｗｓｋａ  ＡＫ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．  ２０１５；  １３６（１）：  ２１２−２４）。本発明者らは、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰが、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ９、ＨＬＡ−ＤＲ１５（図１−１）、ＨＬＡ−ＤＲ５３、ＨＬＡ−ＤＰ２、およびＨＬＡ−ＤＰ５（図１−２）によって提示されたことを本明細書において実証し、このことは、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰの組合せのワクチン接種が、日本人集団の大多数をカバーできるであろうことを示唆している（表４）。実際に、本発明者らは、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰが患者の多くにおいて広く有用であり得ることを示唆する、２人のＵＣ患者におけるＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞の存在を観察しており、様々なＨＬＡクラスＩＩ型を有する、より多数のがん患者を用いたさらなる研究が行われるべきである。
【０２５０】
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰは、ＨＬＡ−ＤＰ５、ＤＲ４、ＤＲ５３、およびＤＲ１５拘束性Ｔｈ細胞を誘導した（図２および表３）。ＨＬＡ−ＤＰ５、ＤＲ４、ＤＲ５３、およびＤＲ１５アリルは、日本人および太平洋／アジアの集団において非常に高頻度のＨＬＡクラスＩＩアリルであり、ＨＬＡ−Ａ２およびＡ２４アリルもまた、それらの集団において高頻度で観察される（表４）。加えて、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２は、ＨＬＡ−Ａ２またはＡ２４  Ｔｇｍにおいてインビボで、ＤＥＰＤＣ１−Ａ２３０２−３１１特異的ＣＴＬおよびＤＥＰＤＣ１−Ａ２４２９４−３０２特異的ＣＴＬのプライミングおよび増殖を誘導し（図４）、このことは、ＤＥＰＤＣ１−ＳＰエピトープを担持するＤＥＰＤＣ１−ＬＰが、ＤＥＰＤＣ１特異的Ｔｈ細胞およびＣＴＬの両方を誘導できることを示唆している。それゆえ、本発明者らは、これらの免疫原性ＤＥＰＤＣ１−ＬＰが、より強力な抗腫瘍応答を誘導する可能性を有し得ることを示唆している。
【０２５１】
ＬＰの近年の研究は、天然のＣＴＬエピトープを含有するワクチンが、ＬＰの長く続く交差提示のために、抗腫瘍ＣＴＬ免疫を誘導する上で最小のＣＴＬエピトープから構成されるワクチンよりも優れていることを示している（Ｂｒｕｎｓｖｉｇ  ＰＦ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１１；１７：６８４７−５７；  Ｂｉｊｋｅｒ  ＭＳ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００８；３８：１０３３−４２；  Ｃｈａｕｖｉｎ  ＪＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１２；１８８：２１０２−１０）。公知のＣＴＬエピトープを包含するＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２は、ＨＬＡ−Ａ２  ＴｇｍまたはＡ２４  Ｔｇｍにおいてインビボで、交差提示経路を介してＣＴＬエピトープ特異的ＣＴＬを誘導した（図４）。それゆえ、ペプチドのワクチン接種は、がん患者においてＤＥＰＤＣ１−ＬＰ２特異的なＴｈ細胞およびＣＴＬの両方を同時に誘導し得る。
【０２５２】
ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１およびＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４は、それらのＬＰ特異的Ｔｈ細胞応答を効果的に誘導した（図２Ａ〜ＢおよびＦ〜Ｈ）が、それらは、公知のＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＴＬエピトープを含有しない（図１Ｂ）。近年、エピトープ拡大と呼ばれる現象が、効果的な抗腫瘍免疫応答の誘導において重要であることが報告されている（Ｉｎｄｅｒｂｅｒｇ−Ｓｕｓｏ  ＥＭ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  ２０１２；  １（５）：  ６７０−８６；  Ｃｏｒｂｉｅｒｅ  Ｖ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２０１１；  ７１（４）：  １２５３−６２）。実際に、治療用がんワクチン（最小ＣＴＬエピトープペプチドワクチン）を受けた患者は、臨床応答および長期の生存を明白に示した。それらの患者において、同じタンパク質の他のエピトープ、またはワクチンに含まれないいくつかの無関連抗原に対するＴｈ細胞応答およびＣＴＬ応答の両方が観察された。これは、ワクチン接種が、標的抗原に特異的なＣＴＬを誘導し、腫瘍細胞に損傷を与えた結果として、他のＴＡＡが放出され、ＡＰＣによって取り込まれ、提示されて、他のＴＡＡ特異的Ｔ細胞応答が誘導されたためである。この場合、ＣＴＬエピトープを含まないＤＥＰＤＣ１−ＬＰ１、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ４のワクチン接種は、他の抗腫瘍Ｔｈ１応答およびＣＴＬ応答と共にＬＰ特異的Ｔｈ１応答を誘導すると考えられる。さらに、エピトープが、がん細胞において生成された体細胞ミスセンス変異遺伝子によってコードされるタンパク質に由来する異常ペプチドである新生抗原を含むように拡大する場合は、それらの新生抗原が非自己であるため、抗腫瘍Ｔ細胞応答はより効果的であると考えられる。実際に、近年の研究は、新生抗原に特異的な多くのＴ細胞があることを示しており、このことは、抗原をコードする遺伝子が変異を有し、拡大したエピトープが新生抗原も含み得ることを示唆している。新生抗原を用いたがん抗原ワクチン療法は、多くの注目を集めている（Ｋｒｅｉｔｅｒ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１５；  ５２０（７５４９）：  ６９２−６；  Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２０１５；  ２１（１）：  ８１−５）。エピトープ拡大の誘導の他にも、がんワクチン療法の成功の鍵である、可能な限り多くのＴＡＡ特異的Ｔ細胞を誘導および活性化するために、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰおよびＳＰのワクチン製剤は、調べられるべき有望なものである可能性がある。
【０２５３】
本発明者らが、がん免疫療法のためにＴｈ細胞エピトープを有するＬＰを使用しようとする場合には、患者の体内で抗腫瘍Ｔｈ１細胞が誘導され得るかどうかが、１つの主要な懸念である。Ｔｈ細胞の表現型は、分化段階での周囲のサイトカイン環境だけではなく、ＴＣＲおよびＭＨＣ−ペプチド複合体の親和性／結合力によっても影響を受けることが報告されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  １９９５；  １８２（５）：  １５９１−６；  Ｙａｍａｎｅ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ２００５；  ２０２（６）：  ７９３−８０４；  ｖａｎ  Ｐａｎｈｕｙｓ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  ２０１４；  ４１（１）：  ６３−７４；  Ｈｏｓｋｅｎ  ＮＡ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  １９９５；  １８２（５）：  １５７９−８４）。換言すると、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、強いＴＣＲ媒介性シグナルを誘導する高密度のペプチド−ＨＬＡクラスＩＩ複合体を認識するとＴｈ１細胞に分化する傾向があり、その反対の場合には、Ｔｈ細胞はＴｈ２細胞に分化する傾向がある。本研究において健常ドナーから誘導されたＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞は、すべてＴｈ１型細胞であり、主にＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−２を産生した（図５）。それゆえ、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰは、恐らく、より高い親和性でＨＬＡクラスＩＩ分子に結合し、それによって高密度のＬＰ−ＨＬＡクラスＩＩ複合体を産生して、耐久性があるかつ潜在的に強いＴＣＲ媒介性活性化シグナルを刺激することができるために、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰはＴｈ１型Ｔｈ細胞分化を優先的に引き起こし得る。
【０２５４】
ワクチン接種によって様々なＴＡＡ特異的なＴｈ細胞およびＣＴＬを誘導することとは反対に、ＴＡＡに特異的な遺伝子操作されたＴ細胞をがん患者に直接導入することは、別の有効な抗腫瘍療法であるように見える。臨床試験において、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇらは、ＮＹ−ＥＳＯ−１反応性ＣＴＬのＴＣＲ遺伝子をレトロウイルスで形質導入した自己Ｔ細胞を、転移性の滑膜細胞肉腫およびメラノーマを有する患者に導入し、客観的な臨床応答を実証した（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ＰＦ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２０１５；  ２１（５）：  １０１９−２７）。本研究において、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞のＴＣＲ使用は、反復刺激後にそれぞれ、ＴＣＲＡ遺伝子およびＴＣＲＢ遺伝子の１つの組合せに極めて収束した（図６Ａ〜Ｂ）。ＴＣＲ遺伝子の各ペアのマウスＴＣＲ陰性Ｔ細胞株ＴＧ４０への導入は、それらのコグネイトリガンドに対するもとのＴ細胞特異性を示し（図６Ｃ）、このことは、それらのＴＣＲ遺伝子を発現する患者の自己Ｔ細胞の移入が有効な治療法であり得ることを示唆している。ＤＥＰＤＣ１−ＬＰ特異的Ｔｈ細胞のＴＣＲレパートリーの、特定のＣＤＲ配列を有するものへの収束は、抗原特異的ＴＣＲは、特定の抗原ペプチドへの結合について選択されていないランダムなＴＣＲレパートリーと比較して、ＣＤＲ中の特異的に濃縮された短い配列モチーフを共有しているというＤａｓｈらおよびＧｌａｎｖｉｌｌｅらによる最近の観察結果（Ｄａｓｈ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１７；  ５４７（７６６１）：  ８９−９３；  Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１７；  ５４７（７６６１）：  ９４−８）に類似しているように見える。
【０２５５】
結論として、本発明者らは、Ｔｈ細胞を誘導することができる４つの免疫原性ＤＥＰＤＣ１−ＬＰを同定した。それらのうちの２つは、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬエピトープおよびＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬエピトープを包含する。本発明者らの結果は、ＤＥＰＤＣ１−ＬＰが、ＤＥＰＤＣ１特異的なＴｈ１細胞およびＣＴＬの両方の増殖のための有用なツールを提供することを示唆している。これらの知見は、膀胱がんなどのいくつかのタイプのがんについて、ＤＥＰＤＣ１ペプチドに基づく免疫療法の可能性のある臨床試験を支持する。加えて、ＬＰ特異的Ｔｈ細胞上に発現した収束されたＴＣＲは、インビトロ、およびおそらくインビボでの、ＬＰ特異的Ｔｈ細胞のモニタリングのために有用であり得る。
【産業上の利用可能性】
【０２５６】
本発明は、強力な抗腫瘍免疫応答を誘導することができ、したがって多種多様ながん型に適用可能性を有する、ＤＥＰＤＣ１由来のＴｈ１細胞エピトープペプチドを記述する。そのようなペプチドは、がん、特にＤＥＰＤＣ１を発現するがんに対するペプチドワクチンとしてのさらなる開発に値する。本発明のペプチドは、Ｔｈ１細胞応答を誘導することができ、したがって、Ｔｈ１細胞によって分泌されるサイトカインが、抗原非依存的に細胞性免疫に関与する任意の免疫細胞を助けるかまたは活性化することができる。それゆえ、本発明によって提供される免疫治療戦略は、疾患がＭＨＣクラスＩＩ分子によって媒介される免疫応答によって改善され得る限り、がんを含む任意の疾患に適用することができる。特に、本発明のＴｈ１細胞は、ＣＴＬによって惹起される免疫応答を改善することができる。それゆえ、本発明のペプチドは、対象においてがんを含む疾患に対するＣＴＬ応答を増強するのに有益である。
【０２５７】
さらに、好ましい態様では、本発明のペプチドはまた、Ｔｈ１細胞だけでなく、ＤＥＰＤＣ１発現細胞に対するＣＴＬも誘導することができる。本発明のそのようなペプチドは、ＤＥＰＤＣ１に関連する疾患、例えばＤＥＰＤＣ１を発現するがん、より詳細には膀胱がんおよび乳がんの治療のためにも有用であり得る。
【０２５８】
本発明を、詳細におよびその特定の態様を参照して本明細書で説明したが、前記説明は本質的に例示的および説明的であり、本発明とその好ましい態様を例証することを意図する。日常的な実験を通して、当業者は、その境域および境界が添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正がなされ得ることを容易に認識するであろう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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