(57)【要約】  本出願のキメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩに結合したｖＷＦドメインのために、投与された場合に有意に延長されたインビボ半減期を有し、そのため、血友病Ａ治療薬として用いられた場合に、患者の利便性を高め、医療費を削減することができる。
2019522977.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖および重鎖を含むヒト第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）であって、その全長が完全に欠失しているかまたは部分的に欠失しているＢドメインを含むヒトＦＶＩＩＩ；および
少なくとも１つのｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインを含むキメラタンパク質であって、
軽鎖および重鎖が、１つのポリペプチドまたは２つのポリペプチドとして発現され、
軽鎖および重鎖が１つのポリペプチドとして発現される場合、キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩとｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインとをつなぎ、かつ、その間に位置する酵素切断部位を有するリンカーを含み、ここで、ＦＶＩＩＩおよびｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは、リンカーを基準にして、それぞれＮ末端方向およびＣ末端方向に位置しているか、または、それぞれＣ末端方向およびＮ末端方向に位置している；および、
軽鎖および重鎖が２つのポリペプチドとして発現される場合、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインのＮ末端が、重鎖に含有されるＢドメインのＣ末端に連結している、キメラタンパク質。
【請求項２】
部分的に欠失しているＢドメインが、配列番号１の１６４８および１６４９の残基位置に基づいて、Ｎ末端方向および／またはＣ末端方向のそれぞれに少なくとも５つのアミノ酸欠失を有し、該欠失が、１６４８および１６４９の残基を含む；または、４〜６つのグリケーション部位を含むように、Ｂドメインが部分的に欠失している、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
部分的に欠失しているＢドメインが、配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基７４１〜９０２および１６５４〜１６８９、または、アミノ酸残基７４１〜９３６の配列で表される、請求項１または２に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
２つのｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインを含み、ここで、２つのｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインが、酵素切断部位を有する、または有さないリンカーにより連結している、および／または、そこでの共有結合により二量体を形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
さらに少なくとも１つのＦｃを含み、ここで、Ｆｃが、酵素切断部位を有する、または有さないリンカーにより、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインおよび／またはＦＶＩＩＩに連結している、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
２つのＦｃを含み、ここで、２つのＦｃが、酵素切断部位を有する、または有さないリンカーにより連結している、および／または、それらの間の共有結合により二量体を形成する、請求項５に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
酵素切断部位が、トロンビン、ＦＶＩＩａ、ＦＸａ、またはＦＸＩａにより切断され得る配列である；および
酵素切断部位を有するリンカーの他の配列が、［Ｇ４Ｓ］ｎのアミノ酸配列により表され、式中、ｎは０、または１〜１００の整数である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
ｎが６、８、１０、１２、１８、２４または６０である、請求項７に記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
トロンビンにより切断され得るアミノ酸配列が、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号３６）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号３７）、またはＬＶＰＲＧＳ（配列番号３８）であり；ＦＶＩＩａにより切断され得るアミノ酸配列が、ＡＳＫＰＱＧＲＩＶＧＧ（配列番号３９）であり；ＦＸａにより切断され得るアミノ酸配列が、ＩＤＧＲ（配列番号４０）またはＩＥＧＲ（配列番号４１）であり；ＦＸＩａにより切断され得る配列が、ＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦ（配列番号４２）である、請求項７に記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
２つのポリペプチドが、第１および第２のポリペプチドであり、ここで、
第１のポリペプチドがＦＶＩＩＩの重鎖およびＢドメインの全部または一部を含み、かつ、第２のポリペプチドがＦＶＩＩＩの軽鎖またはＢドメインの一部を含み；
ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインが、第１のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端方向、または、第２のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端方向に位置し；かつ
場合により、キメラタンパク質がさらに、少なくとも１つのＦｃを含み、ＦｃがｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインおよび／または第２のポリペプチドに連結している、
請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
第１のポリペプチドが、ＦＶＩＩＩの重鎖およびＢドメインの一部を含み、Ｂドメインの一部が、配列番号１に基づくアミノ酸残基７４１〜９３６のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
２つ以上のｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインを含み、２つ以上のｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインが酵素切断部位を有する、または有さないリンカーにより連結している、および／またはｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインが該ドメイン間の共有結合により複合体を形成する、請求項１０に記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
ＦｃまたはｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインが、酵素切断部位を有する、または有さないリンカーにより連結している、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
１つのポリペプチドとして発現されるキメラタンパク質が、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、もしくは２５により表されるアミノ酸配列、または、前記アミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
２つのポリペプチドとして発現されるキメラタンパク質が、配列番号４および５（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号２３および２４（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号２６および２７（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号２８および２９（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号３０および３１（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号３２、および３３（それぞれ、重鎖および軽鎖）、もしくは配列番号３４および３５（それぞれ、重鎖および軽鎖）により表されるアミノ酸配列、または、該アミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
ＦＶＩＩＩがＡおよび／またはＢドメイン断片の１つ以上のアミノ酸残基で親水性ポリマーにコンジュゲートしており、コンジュゲート位置が、Ｂドメイン中の配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基７５４、７８１、７８２、７８８、７８９、８２５、および８９７からなる群から選択される少なくとも１つ、および／または、Ａドメイン中の配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基４９１、４９５、４９８および１８０６からなる群から選択される少なくとも１つであり、かつ、コンジュゲート位置の１つ以上の残基が親水性ポリマーとのコンジュゲートのためにシステインで置換されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１７】
親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド、デキストランであり、ＰＥＧが、コンジュゲート位置で、アクリロイル、スルホンまたはマレイミドを介して連結されている、請求項１６に記載のキメラタンパク質。
【請求項１８】
ＦＶＩＩＩが、Ｂドメイン断片の１つ以上のアミノ酸残基で、親水性ポリマーにコンジュゲートし、コンジュゲート位置がアミノ酸残基７８２である、請求項１６または１７に記載のキメラタンパク質。
【請求項１９】
ＰＥＧが平均分子量２０ｋＤａ以上を有する、請求項１７または１８に記載のキメラタンパク質。
【請求項２０】
ＰＥＧが平均分子量４０ｋＤａまたは６０ｋＤａを有する、請求項１９に記載のキメラタンパク質。
【請求項２１】
野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、少なくとも２倍延長された半減期を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項２２】
請求項１４に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２３】
請求項１５に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２４】
配列番号４８〜６４、６６、または７０で表される、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２５】
核酸分子が配列番号４６、４７、６８、６９、または７１〜８０で表される、請求項２３に記載の核酸分子。
【請求項２６】
請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２８】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２６に記載のベクター、または、請求項２７に記載の細胞、および、薬理的に許容される担体を含む、血友病Ａを治療するための医薬組成物。
【請求項２９】
１日に１回またはより間隔を空けて、好ましくは週に１回、または特に１ヶ月に１回、投与され得るような半減期を有する、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
請求項２８または２９に記載の組成物の治療的有効量を、血友病治療を必要とする対象に投与することを含む、血友病Ａを治療するための方法。
【請求項３１】
請求項２８または２９に記載の組成物の有効量を、血友病治療を必要とする対象に投与することを含む、血液凝固の方法。
【請求項３２】
血友病の治療における、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２６に記載のベクター、または、請求項２７に記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、血友病の治療において用いられる組換え型第ＶＩＩＩ因子に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
血友病は、凝固因子の欠如のために止血が達成されないがゆえに、出血が連続的に発生する疾病である。血液中の凝固因子は第Ｉ〜第ＸＩＩＩで構成され、その中で血友病に関連する因子は第ＶＩＩＩ、第ＩＸおよび第ＸＩである。血友病は、上記因子の遺伝的欠損により引き起こされる。欠損した凝固因子のタイプに応じて、血友病は、第ＶＩＩＩ因子が欠損している血友病Ａ、第ＩＸ因子が欠損している血友病Ｂ、および第ＸＩ因子が欠損している血友病Ｃに分類することができる。そして、血友病Ａは、血友病の約８０〜８５％を占める。
【０００３】
投与のための薬物は血友病のタイプによって異なり、あるタイプの血友病に対する投与量および投与方法も投与部位によって異なる。しかしながら、血友病治療の目的は止血であり、そして治療は、酵素補充療法（ＥＲＴ）を使用して、予防およびオンデマンド治療の２つの局面で行われる。現行の治療は、予防的局面に向かう傾向を示している。
【０００４】
ＥＲＴに用いられる酵素としては、全血および血漿から抽出され濃縮されたＦＶＩＩＩ（血友病Ａ）およびＦＩＸ（血友病Ｂ）が過去に用いられていた。しかしながら、血友病因子が全血および血漿から抽出される際に、エイズやＨＢＶなどのウイルスに感染した人々の血液の一部が使用され、凝固因子の抽出プロセス中にこれらのウイルスの除去が不十分であったためにウイルス感染などの有害事象および合併症が発生した。そのため、最近は、組換えＤＮＡ技術により生産された様々な因子が開発され用いられている。例えば、ＦＶＩＩＩの完全型、Ｂドメインが欠失したＦＶＩＩＩ、および特定の残基での修飾により半減期が延長されたＦＶＩＩＩなど、様々な形態のＦＶＩＩＩが開発されている。
【０００５】
ＦＶＩＩＩが予防的治療のために使用される場合、ＦＶＩＩＩの血液中の半減期は１２時間と同じくらい短く（ヒト）、ＦＶＩＩＩを２〜３日ごとに一度投与すべきであるために不便である。さらに、この投与は静脈内投与であるため、投与頻度の減少は患者の利便性の観点から重要である。それゆえに、最近、ＦＶＩＩＩの半減期を延長するために、長時間作用性ＦＶＩＩＩが開発されている。
【０００６】
その１つが、抗体のＦｃドメインがＦＶＩＩＩのＣ末端に融合した、ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ融合タンパク質（ＦＶＩＩＩ−Ｆｃ）であり、この物質は、ＦｃＲｎリサイクリングを利用してその半減期を延ばす戦略を採用している。いくつかのペグ化された（ＰＥＧｙｌａｔｅｄ）ＦＶＩＩＩが開示されており、ここでは、体内のＦＶＩＩＩのクリアランスに責任を負っていることが知られているＬＲＰ（低密度リポプロテイン受容体関連タンパク質）への結合部位周辺にＰＥＧ（ポリエチレングリコール）がコンジュゲートされている。しかしながら、これらの長時間作用性ＦＶＩＩＩの半減期の平均は１８時間であり、これは従来のＦＶＩＩＩの１２時間と比較して約１．５倍にしか延長しておらず、これは、従来のＦＶＩＩＩの場合の週３〜４回の投与頻度が週２〜３回に減少したことを意味する。ＦＶＩＩＩ−Ｆｃおよびペグ化されたＦＶＩＩＩの半減期が大きく延長されないのは、ＦＶＩＩＩが血中のｖＷＦとの強い非共有結合性相互作用の状態で血中を循環しているためである。ＦＶＩＩＩ−Ｆｃおよびペグ化されたＦＶＩＩＩもまた、血中に存在するｖＷＦと非共有結合性の相互作用を有する傾向があり、したがって、それらはｖＷＦの半減期によって影響されてｖＷＦの半減期（１２時間）に収束するという制限を有する(Tiede A. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 13 (Suppl. 1): S176-S179)。
【０００７】
これまで開発されてきた治療薬は、機能面で投与（静脈内注射）の間隔がまだ短く、十分な長さではない半減期に起因する体内での効果の喪失により出血が頻発するという問題がある。従って、投与頻度を１週間に１回以下に減らすために、３倍以上延長された半減期を有する長時間作用性ＦＶＩＩＩの開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の開示
技術的課題
本発明の目的は、体内での滞留時間を延長させることにより、週に１回以下の投与頻度で投与することができる改善されたＦＶＩＩＩを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
課題の解決
一実施形態において、軽鎖および重鎖を含むヒト第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）であって、その全長が完全に欠失しているかまたは部分的に欠失しているＢドメインを含むヒトＦＶＩＩＩと、少なくとも１つのｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインとを含む、キメラタンパク質を提供する。本発明のタンパク質は、少なくとも２倍延長された半減期を有する。
【００１０】
本発明のキメラタンパク質において、軽鎖および重鎖は、１つのポリペプチドとして、または、２つのポリペプチドとして発現され得る。
【００１１】
本発明によれば、軽鎖および重鎖が１つのポリペプチドとして発現される場合、ＦＶＩＩＩはｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインに連結し、キメラタンパク質はその間に位置する酵素切断部位を有するリンカーを含み、ここで、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインのＮ末端は、リンカーを基準にしてＮ末端方向またはＣ末端方向に位置しており、すなわち、ＦＶＩＩＩおよびｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは、リンカーを基準にして、それぞれＮ末端方向およびＣ末端方向に位置しているか、または、それぞれＣ末端方向およびＮ末端方向に位置している。一実施形態において、例えば、それらは、ＮからＣ方向に、ＦＶＩＩＩ−リンカー−Ｄ’Ｄ３、または、Ｄ’Ｄ３−リンカー−ＦＶＩＩＩの順番に配列されてよい。
【００１２】
本発明によれば、軽鎖および重鎖が２つのポリペプチドとして発現される場合、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインのＮ末端が、重鎖に含まれるＢドメインのＣ末端に連結していてよい。
【００１３】
一実施形態において、部分的に欠失しているＢドメインは、配列番号１の１６４８および１６４９の残基位置に基づいて、Ｎ末端方向および／またはＣ末端方向のそれぞれに少なくとも５つのアミノ酸欠失を有し、該欠失は、１６４８および１６４９の残基を含む；または、少なくとも４つのグリケーション部位、または４〜６つのグリケーション部位を含むように、Ｂドメインが部分的に欠失している。
【００１４】
別の実施形態において、本発明の部分的に欠失しているＢドメインに含まれ得るＢドメインは、配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基７４１〜９０２および１６５４〜１６８９、または、アミノ酸残基７４１〜９３６の配列によって表される。
【００１５】
別の実施形態において、本発明のキメラタンパク質はさらに、少なくとも１つのＦｃを含み、ここで、ＦｃはｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインおよび／またはＦＶＩＩＩに連結していてよい。
【００１６】
本発明の別の実施形態によれば、本発明のキメラタンパク質はさらに、２つ以上のｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインおよび／または２つ以上のＦｃを含んでよい。ここで、複数のｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインの間および複数のＦｃの間で、それらは酵素切断部位を有する、または有さないリンカーによって互いに連結していてもよく、および／または、互いの間の共有結合によって複合体を形成してもよく、例えば、二量体は、それらのうちの２つが含まれる場合に形成され得る。本明細書で用いられる酵素切断部位およびリンカーについては、本明細書中に記載のものを参照することができる。
【００１７】
別の実施形態において、本発明のキメラタンパク質において、酵素切断部位を含むリンカーが用いられる場合、酵素切断部位は、トロンビン、ＦＶＩＩａ、ＦＸａまたはＦＸＩａにより切断され得る配列であり、酵素切断部位を有するリンカーの他の配列は、［Ｇ４Ｓ］ｎのアミノ酸配列により表され、式中、ｎは０、または１〜１００の整数であり、特にｎは６、８、１０、１２、１８、２４または６０である。
【００１８】
別の実施形態において、本発明のキメラタンパク質において、リンカーに含まれる酵素切断部位では、トロンビンにより切断され得るアミノ酸配列は、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号３６）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号３７）、またはＬＶＰＲＧＳ（配列番号３８）であり；ＦＶＩＩａにより切断され得るアミノ酸配列は、ＡＳＫＰＱＧＲＩＶＧＧ（配列番号３９）であり；ＦＸａにより切断され得るアミノ酸配列は、ＩＤＧＲ（配列番号４０）またはＩＥＧＲ（配列番号４１）であり；ＦＸＩａにより切断され得る配列は、ＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦ（配列番号４２）により表され得る。
【００１９】
別の実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、第１および第２のポリペプチドの形態で発現され、ここで、第１のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩの重鎖およびＢドメインの全部または一部を含み、かつ、第２のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩの軽鎖またはＢドメインの一部を含み；ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは、第１のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端方向に位置し、または、第２のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端方向に位置する。ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインが、第１のポリペプチドのＮ末端または第２のポリペプチドのＣ末端と連結している場合、それは、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインが、ｓｃＦＶＩＩＩのＮ末端またはＣ末端に連結しているのと同様の構造を有し、違いは、ＦＶＩＩＩが一本鎖または二本鎖のいずれであるかである。
【００２０】
一実施形態において、第１および第２のポリペプチドの形態で発現される場合、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは、第１のポリペプチドのＣ末端方向に位置している。
【００２１】
本発明のキメラタンパク質は、１つ以上、具体的には２つのｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインを含んでよく、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインの間に複合体（二量体）を形成してよい。
【００２２】
場合により、本発明のキメラタンパク質はさらに、少なくとも１つ、具体的には２つのＦｃを含んでよく、ここで、Ｆｃは、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインおよび／または第２のポリペプチドに連結し得る。複合体（二量体）は、Ｆｃの間に形成され得る。
【００２３】
一実施形態において、本発明のキメラタンパク質において、ＦｃまたはｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは、酵素切断部位を有する、または有さないリンカーにより連結している。
【００２４】
一実施形態において、本発明のキメラタンパク質が、１つのポリペプチドとして発現される場合、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、もしくは２５により表されるアミノ酸配列、または、前記アミノ酸配列にその生物学的機能に関して同等であるか、もしくは、少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列が、本発明に含まれてよい。
【００２５】
別の実施形態において、本発明のキメラタンパク質が、２つのポリペプチドとして発現される場合、配列番号４および５（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号２３および２４（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号２６および２７（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号２８および２９（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号３０および３１（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号３２、および３３（それぞれ、重鎖および軽鎖）、もしくは配列番号３４および３５（それぞれ、重鎖および軽鎖）で表されるアミノ酸配列、または、前記アミノ酸配列にその生物学的機能に関して同等であるか、もしくは、少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列が、本発明に含まれてよい。
【００２６】
本発明のキメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩのＡおよび／またはＢドメイン断片の１つ以上のアミノ酸残基で親水性ポリマーにコンジュゲートしていてよく、コンジュゲート位置が、Ｂドメイン中の配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基７５４、７８１、７８２、７８８、７８９、８２５、および８９７からなる群から選択される少なくとも１つ、および、Ａドメイン中の配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基４９１、４９５、４９８および１８０６からなる群から選択される少なくとも１つであり、かつ、コンジュゲート位置の１つ以上の残基が親水性ポリマーとのコンジュゲートのためにシステインで置換されている。
【００２７】
一実施形態において、親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、またはデキストランである。
【００２８】
別の実施形態において、親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、使用するＰＥＧの平均分子量は２０ｋＤａ以上、具体的には４０ｋＤａまたは６０ｋＤａである。
【００２９】
一実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩのＢドメイン断片において、具体的には残基７８２で、修飾されている。
【００３０】
別の実施形態において、本発明は、上述のキメラタンパク質をコードする核酸、該核酸を含むベクター、および、該ベクターを含有する細胞を提供する。
【００３１】
さらに別の実施形態において、本発明は、キメラタンパク質、それをコードする核酸、該核酸を含むベクター、および該ベクターを含む細胞の使用を提供する。
【００３２】
本出願による本発明の使用には、血友病を治療するための組成物、血友病を治療するための方法、血液凝固組成物、血液凝固方法、または、本発明のタンパク質を生産するための方法が含まれる。
【発明の効果】
【００３３】
発明の効果
本発明による、ＦＶＩＩＩおよびｖＷＦドメインが連結しているキメラタンパク質、または、ＰＥＧによって修飾された形態のキメラタンパク質は、投与された場合に体内における大幅に延長された半減期を有し、それにより、週に２〜４回の従来の薬剤の投与頻度を、１週間に１回よりも減少させる。従って、血友病Ａの治療薬としての当該キメラタンパク質は、患者の利便性の向上と治療費の削減につながる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、本発明の半減期が延長された組換え型ＦＶＩＩＩの半減期延長のメカニズムの概略図である。第１の戦略は、体内のＦＶＩＩＩの消失に最大の効果を及ぼすことが知られているＬＲＰ結合部位を、ＰＥＧおよびｖＷＦのドメインであるＤ’Ｄ３でマスキングすることである。同時に、第２の戦略は、血中の内在性ｖＷＦが、本発明のキメラタンパク質へ結合するのを防ぐために、ｖＷＦのドメインであるＤ’Ｄ３を、本発明のキメラタンパク質へ共有結合させることである。
【００３５】
【図２】図２ａおよび図２ｂは、それぞれ、本発明の一本鎖（一本鎖ポリペプチド）および二本鎖（二本鎖ポリペプチド）として発現されたキメラタンパク質の様々な分子構造の概略図である。
【００３６】
【図３】図３は、本発明の一実施形態の一本鎖ポリペプチドとして発現されるキメラタンパク質をコードするベクターの概略図である。
【００３７】
【図４】図４は、本発明の一実施形態の様々な長さのリンカーを含むキメラタンパク質の発現および精製後の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。
【００３８】
【図５】図５は、本発明の一実施形態の様々な長さのリンカーを含むキメラタンパク質の、重鎖、軽鎖およびＤ’Ｄ３に対する抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果を示し、用いた抗体はそれぞれ、以下の通りである：重鎖：Ｇｒｅｅｎ  ｍｏｕｎｔａｉｎ、ＧＭＡ−０１２；軽鎖：Ａｂｃａｍ、４１１８８；およびＤ’Ｄ３：Ａｂｃａｍ、９６３４０。
【００３９】
【図６】図６は、本発明のある実施形態のｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−６０、−１２０および−３００のＰＥＧによる修飾により調製されたペグ化されたキメラタンパク質の精製後の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す。
【００４０】
【図７】図７は、本発明の一実施形態のキメラＦＶＩＩＩ（ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１）およびペグ化されたキメラＦＶＩＩＩ（ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１）の、ｖＷＦ結合解析の結果を示す。比較群として、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）を用いた。
【００４１】
【図８】図８は、本発明の一実施形態のキメラＦＶＩＩＩ（ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１）およびペグ化されたキメラＦＶＩＩＩ（ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１）のＬＲＰ結合解析の結果を示す。比較群として、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）を用いた。
【００４２】
【図９】図９は、本発明の一実施形態により調製したペグ化されたキメラＦＶＩＩＩ（ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０）の、ＨＡマウスにおけるＰＫ解析の結果を示す。比較群として、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）を用いた。
【００４３】
【図１０】図１０は、本発明の一実施形態により調製したペグ化されたキメラＦＶＩＩＩ（４０ｋＤａＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０、６０ｋＤａＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０）の、ＨＡマウスにおけるＰＫ解析の結果を示す。比較群として、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）を用いた。
【００４４】
【図１１】図１１は、本発明の一実施形態により調製したペグ化されたキメラＦＶＩＩＩ（ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−６０、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３／Ｆｃ−１２０，Ｆｃ）の、ＨＡマウスにおけるＰＫの結果を示す。比較群として、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）を用いた。
【００４５】
【図１２】図１２は、本発明の一実施形態により調製したペグ化されたキメラＦＶＩＩＩ（ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−３００、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３／Ｄ’Ｄ３−１２０）の、ＨＡマウスにおけるＰＫの結果を示す。比較群として、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）を用いた。
【００４６】
【図１３】図１３は、本発明の一実施形態により調製したペグ化されたキメラＦＶＩＩＩ（ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−６０、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−３００）の、ＨＡマウスにおけるＰＫの結果を示す。比較群として、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）を用いた。
【００４７】
【図１４】図１４は、本発明の一実施形態により調製したペグ化されたキメラＦＶＩＩＩ（ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ２）の、ＨＡマウスにおけるＰＫの結果を示す。比較群として、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）を用いた。
【００４８】
【図１５】図１５は、本発明の一実施形態により調製したペグ化されたキメラＦＶＩＩＩ（２０ｋＤａ直鎖型（ｌｉｎｅａｒ）ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１、２０ｋＤａ分岐鎖型（ｂｒａｎｃｈ）ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１、４０ｋＤａ分岐鎖型（ｂｒａｎｃｈ）ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１）の、ＰＫの結果を示す。比較群として、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）を用いた。
【００４９】
【図１６】図１６は、本発明の一実施形態により調製したペグ化されたキメラＦＶＩＩＩ（ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１）のトロンビン生成解析の結果を示す。
【００５０】
【図１７】図１７は、ペグ化されたキメラＦＶＩＩＩ（ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ２）についての尾切断（tail clip）モデルにおける、急性有効性研究の結果を示す。比較群として、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）を用いた。
【００５１】
【図１８】図１８は、本発明の一実施形態により調製したペグ化されたキメラＦＶＩＩＩ（ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ２）のＰＫの結果を示す。比較群として、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）を用いた。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
発明を実施するための最良の形態
本発明は、ＦＶＩＩＩが内在性ｖＷＦタンパク質と複合体を形成するのを防止または阻害し、同時にＦＶＩＩＩのＬＲＰ（低密度リポプロテイン受容体関連タンパク質）への結合を阻害してＦＶＩＩＩタンパク質の半減期を延長するための技術を提供する。これは、ＬＲＰおよびプロテアーゼ依存性ＦＶＩＩＩ消失を遅らせることと同時にｖＷＦ依存性消失の減少をもたらし、半減期の延長をもたらす。
【００５３】
従って、一実施形態において、本発明は、ヒト第ＶＩＩＩ因子（第ＶＩＩＩ因子またはＦＶＩＩＩ）および１つ以上のｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインが融合した、キメラタンパク質を提供する。
【００５４】
本発明のキメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩ（野生型では軽鎖と重鎖で構成されている）の軽鎖と重鎖が一本鎖ポリペプチドとして発現されている一本鎖（ｓｃ）の形態を有し得るか、または、ＦＶＩＩＩの軽鎖および重鎖のそれぞれが別々のポリペプチドとして発現されているｄｃ（二本鎖）の形態を有し得る。
【００５５】
一実施形態において、本発明のキメラタンパク質は、一本鎖（一本鎖ポリペプチド）として例示され、ここで、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインはＦＶＩＩＩのＮ末端またはＣ末端方向に位置し、酵素切断部位を有するアミノ酸リンカーによって連結している。
【００５６】
本発明のキメラタンパク質はまた、二本鎖（二本鎖ポリペプチド）として例示され、ここで、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは、ＦＶＩＩＩの重鎖または軽鎖の、Ｎ末端またはＣ末端方向に連結され得る。一実施形態において、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは、ＢドメインのＣ末端方向に連結され得る。
【００５７】
本発明のキメラタンパク質に含まれ得るＦＶＩＩＩタンパク質は、それがｖＷＦとの結合を通して本発明の目的を達成する限り、様々な長さまたは起源のものであってよい。
【００５８】
ＦＶＩＩＩは、Ａ１−Ａ２−Ｂ−Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ドメインから構成され、一本鎖タンパク質として肝細胞で合成される。合成後、プロセシングを経て成熟し、重鎖および軽鎖から構成される２８０ｋＤａのヘテロ二量体を形成する。ヘテロ二量体において、軽鎖は８０ｋＤａの分子量を有し、Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ドメインから構成され、また、重鎖はＡ１−Ａ２−Ｂドメインから構成され、９０〜２００ｋＤａの分子量を有し、Ｂドメインの長さに応じて大きく異なる。ヘテロ二量体は、血液中でｖＷＦと結合することにより不活性な状態で存在し、血管損傷などの刺激に曝された時に、アルギニン残基の後ろで、すなわち、配列番号１の配列に基づく３７２、７４０および１６８９残基の後ろで、トロンビンにより切断される。その結果、ｖＷＦから分かれ、活性化されて、Ａ１、Ａ２およびＡ３−Ｃ１−Ｃ２の三量体を形成する。次に三量体はＦＩＸａによるＦＸの活性化を触媒し、急速に分解される。
【００５９】
本発明のキメラタンパク質に含まれ得るＦＶＩＩＩタンパク質は、完全長のＦＶＩＩＩタンパク質、その機能的断片、バリアント、類似体またはその誘導体を含み、これらは、凝固経路において、完全長野生型ＦＶＩＩＩ因子の機能を有する。「ＦＶＩＩＩタンパク質」という用語は、「ＦＶＩＩＩポリペプチド」または「ＦＶＩＩＩ」と互換的に使用される。ＦＶＩＩＩ機能の例には、血液凝固を活性化する能力、第ＩＸ因子の補因子として作用する能力、またはＣａ２＋およびリン脂質の存在下で第ＩＸ因子とテナーゼ複合体を形成する能力（その後、第Ｘ因子は活性化型第Ｘａ因子に変換される）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
また、様々な起源のＦＶＩＩＩタンパク質、例えばヒト、ブタ科、ネコ科、ラットまたはニワトリ科のＦＶＩＩＩタンパク質が使用され得る。ＦＶＩＩＩアミノ酸および核酸配列の非限定的な例には、開示されたＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＭ＿０００１３２、ＮＰ＿０００１２３、１０１２２９６Ａ、ＡＡＡ５２４２０．１、ＣＡＡ２５６１９．１、ＡＡＡ５２４８４．１、１０１２２９８Ａ、ＥＡＷ７２６４７．１、ＥＡＷ７２６４６．１、ＸＰ＿００１４９８９５４．１、ＡＣＫ４４２９０．１、ＡＣＯ９５３５９．１、ＮＰ＿００１１３８９８０．１、ＡＢＺ１０５０３．１、ＮＰ＿０３２００３．２が含まれ得る。
【００６１】
本発明の一実施形態において、ヒトＦＶＩＩＩが用いられ、例えば、ヒトＦＶＩＩＩは、配列番号１の配列により表され得（シグナルペプチドは含まない）、また、野生型配列において、重鎖は１〜７４０残基から構成され、Ｂドメインはａ３ドメインを含む７４１〜１６８９残基から構成され、軽鎖は１６９０〜２３３２残基から構成される。
【００６２】
また、ＦＶＩＩＩのバリアント、誘導体、変異体、複合体または類似体もまた、当業界で既知であり、本発明に含まれる。例えば、米国特許第５，６６８，１０８号には、１２４１位置のアスパラギン酸がグルタミン酸で置換されており、付随する核酸変化を有するＦＶＩＩＩバリアントが開示されている；米国特許第５，１４９，６３７号には、グリコシル化または非グリコシル化Ｃ末端断片を含むＦＶＩＩＩバリアントが記載されている；および、米国特許第５，６６１，００８号には、少なくとも３つのアミノ酸残基により、アミノ酸１６４９〜２２３２に連結されたアミノ酸１〜７４０を含むＦＶＩＩＩバリアントが開示されている。
【００６３】
本発明のキメラタンパク質に含まれ得るＦＶＩＩＩは、そのＢドメインが欠失しているＦＶＩＩＩを含み、該ＦＶＩＩＩの例には、米国特許第６，３１６，２２６号、６，３４６，５１３号、７，０４１，６３５号、５，７８９，２０３号、６，０６０，４４７号、５，５９５，８８６号、６，２２８，６２０号、５，９７２，８８５号、６，０４８，７２０号、５，５４３，５０２号、５，６１０，２７８号、５，１７１，８４４号、５，１１２，９５０号、４，８６８，１１２号および６，４５８，５６３号に開示されたＦＶＩＩＩが含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明のキメラタンパク質に含まれ得るＦＶＩＩＩには、Ｂドメインが部分的に欠失しており、該ＦＶＩＩＩが重鎖および軽鎖を含むが、フューリンなどのタンパク質分解酵素の切断部位を含まないようにいくつかの残基が欠失しているＦＶＩＩＩが含まれる。
【００６５】
一実施形態において、部分的に欠失しているＢドメインには、配列番号１の１６４８および１６４９の残基位置に基づいて、Ｎ末端方向およびＣ末端方向のそれぞれに少なくとも５つのアミノ酸欠失を有し、該欠失が１６４８および１６４９残基を含むＢドメイン、および／または、４〜６つのグリケーション部位を含むように部分的に欠失しているＢドメインが含まれる。
【００６６】
一実施形態において、本発明のキメラタンパク質に含まれ得るＦＶＩＩＩは、Ｂドメイン欠失を有し、この部分的に欠失しているＢドメインには、配列番号１に基づくアミノ酸残基７４１〜９０２および１６５４〜１６８９が含まれる。
【００６７】
別の実施形態において、この部分的に欠失しているＢドメインには、配列番号１に基づくアミノ酸残基７４１〜９０２および１６５４〜１６８９のアミノ酸が含まれ、かつ、いくつかの残基、具体的には７８２位置のイソロイシン残基が、親水性ポリマーによる修飾のためにシステインで置換されているＢドメインが含まれる。
【００６８】
別の実施形態において、Ｂドメインが欠失している本発明のキメラタンパク質に含まれ得るＦＶＩＩＩは、配列番号３で表されるアミノ酸配列またはそれと９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。配列番号３のアミノ酸配列に含まれるＢドメインは、配列番号１に基づく残基７４１〜９０２を含む。
【００６９】
本発明のキメラタンパク質に含まれ得るＦＶＩＩＩは、Ａドメインおよび／またはＢドメイン断片のいくつかのアミノ酸残基で、親水性ポリマーとコンジュゲートすることにより、修飾されてよい。
【００７０】
具体的には、本発明では、修飾により本発明のキメラタンパク質のＬＲＰ結合を阻害するために、部位特異的に、および様々な位置で修飾を行うことにより上記目的を達成することができる。
【００７１】
一実施形態において、本発明のキメラタンパク質のコンジュゲート位置は、Ａドメイン中の、配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基４９１、４９５、４９８および１８０６からなる群から選択される少なくとも１つの残基、および、Ｂドメイン中の、配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基７５４、７８１、７８２、７８８、７８９、８２５および８９７からなる群から選択される少なくとも１つの残基である。
【００７２】
別の実施形態によれば、キメラタンパク質は、ペグ化されており、具体的には、Ｂドメインで、および、具体的には上述の位置で、ペグ化されている。
【００７３】
本発明の実施形態によれば、キメラタンパク質は、Ｂドメインの７８２番目のイソロイシン残基で修飾されており、具体的には、ペグ化されており、ペグ化のために、該残基がシステインで置換され得るか、または、システイン基が以下のように挿入され得る。
【００７４】
本発明のＦＶＩＩＩの修飾において用いられ得る親水性ポリマーは、該目的を達成する限り、当業界で既知の親水性ポリマーであってよく、その例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド、デキストランが含まれてよいが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明の一実施形態において、ＰＥＧが用いられ、具体的には、分子量２０ｋＤａ以上のＰＥＧが用いられる。本発明によれば、ＰＥＧはＬＲＰ結合領域の近傍に結合し、ＰＥＧ障害によりＦＶＩＩＩのＬＲＰとの結合を阻害する機能を果たす。従って、ＰＥＧの長さが短すぎると、十分な障害を提供できないため、長さが２０ｋＤａ以上であることが重要である。一実施形態において、具体的には、４０ｋＤａ、６０ｋＤａまたはそれを上回る分子量を有するＰＥＧが用いられる。
【００７６】
本発明による修飾におけるペグ化に使用されるＰＥＧは、当業界で既知の種々の官能基を使用して、対応する残基に連結させることができる。
【００７７】
本発明の一実施形態において、ＰＥＧは、システインなどの残基に存在する遊離ＳＨ基を介して部位特異的に連結され、この場合、ＰＥＧは、チオール、オルトピリジルジスルフィド、アクリロイル、スルホンまたはマレイミド基を介して連結され得るが、これらに限定されない。
【００７８】
本発明のＦＶＩＩＩにおいて、親水性ポリマーに連結される残基は、親水性ポリマーによる修飾のために置換または挿入されてよく、置換または挿入のための残基は、修飾に使用される物質に応じて変化してよく、好適な残基は、当業者によって選択され得る。
【００７９】
本発明の一実施形態において、ペグ化が修飾として用いられ、この場合、修飾のための残基がシステインで置換されてよく、または、システイン残基が好適な位置に挿入されてよい。
【００８０】
本発明の一実施形態において、Ｂドメインの７８２位置のイソロイシン残基が修飾され、具体的にはペグ化され、該残基はペグ化のためにシステイン残基で置換される。
【００８１】
ペグ化反応は、既知の方法を用いて実行することができる。例えば、遊離のシステインをマスキングするために使用されたシステインまたはグルタチオンは、ペグ化反応の前に除去され、導入されたシステインの遊離のチオールが回復される。上記のプロセスは、ＴＣＥＰ、ＤＴＴ、βメルカプトエタノール、システイン、およびグルタチオン（還元型）などの還元剤で処理するステップ、および、還元により切断されたＦＶＩＩＩ本来のジスルフィド結合を回復させる酸化ステップを含むことができる。修飾のためにシステインで置換されたタンパク質の発現は、当業界で既知の方法を用いて行うことができる。例えば、ペグ化されたタンパク質の場合、発現の間または細胞外への排出後に、導入された遊離のシステインが、チオールを含む低分子物質であるシステインまたはグルタチオンとジスルフィド結合を形成するために、遊離のシステインをマスキングして、ペグ化まで安定化させることにより、ペグ化効率を上昇させることが必要である。
【００８２】
本発明のキメラタンパク質は、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインを含む。
【００８３】
ｖＷＦ（Ｆ８ｖＷＦとしても知られる）は血液中に存在する大きな多量体糖タンパク質であり、血管内皮、バイベル・パラーデ小体、巨核球（血小板のα顆粒）、および内皮下結合組織で産生される。基本的なｖＷＦ単量体は、２８１３個のアミノ酸から構成され（シグナルペプチドを含む）、全ての単量体は、特定の機能を有する多くの特定のドメインを含有している。すなわち、Ｄ’／Ｄ３ドメイン（第ＶＩＩＩ因子に結合する）、Ａ１ドメイン（血小板糖タンパク質Ｉｂ受容体、ヘパリン、および／またはおそらくコラーゲンに結合する）、Ａ３ドメイン（コラーゲンに結合する）、Ｃ１ドメイン（活性化されると、その中のＲＧＤドメインが血小板インテグリンαＩＩβ３に結合する）、および該タンパク質のＣ末端にある「システインノット」ドメインである。システインノットはまた、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）およびβ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）において見られる。
【００８４】
ｖＷＦアミノ酸配列、およびｖＷＦまたはその一部をコードする核酸配列の非限定的な例には、開示された、ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＮＰ＿０００５４３，ＮＭ＿０００５５２、ＡＡＥ２０７２３、ＡＡＢ５９５１２、Ｐ０４２７５、ＥＡＷ８８８１５、ＡＣＰ５７０２７、ＥＡＷ８８８１６、およびＡＡＤ０４９１９；米国特許第５，２６０，２７４号； Titani et al., Biochemistry, 25: 3171-84 (1986);および Sadler et al., PNAS, 82: 6391-6398 (1985)が含まれ得る。
【００８５】
例えば、完全長のヒトｖＷＦのアミノ酸配列は、配列番号２により表される（シグナルペプチドは含まない）。配列番号２に基づき、ｖＷＦの「プロペプチド」部分（Ｄ１−Ｄ２）は、アミノ酸残基１〜Ａｒｇ７４１から構成され、「成熟」ｖＷＦタンパク質は、アミノ酸残基７４２〜２７９１から構成される。それぞれのドメインは、Ｄ’：７４２−８４２；Ｄ３：８４３−１２４８；Ａ１：１２４９−１４５７；Ａ２：１４５８−１６５０；Ａ３：１６５１−１８５０；Ｄ４：１８５１−２２３２；Ｃ１：２２３３−２３１１；Ｃ２：２３１２−２３８０；Ｃ３：２４０７−２４７４；Ｃ４：２４７５−２５５５；Ｃ５：２５５６−２６４４；Ｃ６：２６２５−２７００およびＣＫ：２７０１−２７９１として表すことができる(Lenting. P. J. BLOOD, 26 MARCH 2015. VOLUME 125, NUMBER 13)。あるいは、別のｖＷＦドメインマッピングおよび命名システムとしてのＥＸＰＡＳＹタンパク質データベース命名法（ｗｏｒｌｄｗｉｄｅｗｅｂ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｐ０４２７５）により、それぞれのドメインは、Ｄ１：１２−２１８；Ｄ２：３６５−５７６；Ｄ’：７５４−８０５；Ｄ３：８４４−１０５２；Ａ１：１２５５−１４３１；Ａ２：１４７６−１６４３；Ａ３：１６６９−１８４９；Ｄ４：１９２７−２１３１；Ｂ：２２３３−２３０６（ＥＸＰＡＳＹではＣ１と命名）；Ｃ１：２４０７−２４７３（ＥＸＰＡＳＹではＣ２と命名）；Ｃ２：２５５８−２６２３（ＥＸＰＡＳＹではＣ３と命名）；およびＣＫ：２７０１−２７９０として表すことができる。
【００８６】
本発明のキメラタンパク質に含まれるｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは、本発明の組換え型ＦＶＩＩＩが内在性ｖＷＦ（完全長ｖＷＦ）に結合するのを阻害するためにＦＶＩＩＩと融合される。
【００８７】
本発明のキメラタンパク質に含まれるｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは、その活性を保持する限り、様々な長さまたは起源のｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインであってよく、その変異体、誘導体、バリアント、複合体または類似体を含む。
【００８８】
一実施形態において、本発明のキメラタンパク質に含まれるｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは、アミノ酸７４２〜１２４８から構成されるか、または、それに少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の相同性を有し、内在性ｖＷＦが本発明の組換え型ＦＶＩＩＩに結合するのを妨げる。
【００８９】
上述のように、本発明のキメラタンパク質は、１つのポリペプチドとしてＦＶＩＩＩの軽鎖および重鎖を発現する一本鎖ポリペプチドとして、または、別々のポリペプチドとして軽鎖および重鎖のそれぞれを発現する二本鎖ポリペプチドとして、例示され得る。
【００９０】
図２Ａに関して、本発明のキメラタンパク質が一本鎖または一本鎖ポリペプチドとして例示される場合、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは、ＦＶＩＩＩのＮ末端方向またはＣ末端方向に位置してよく、および、体内でＤ’Ｄ３を分離するための酵素切断部位を含むアミノ酸リンカーによって連結されてよい。
【００９１】
一実施形態において、本発明のキメラタンパク質に含まれるＦＶＩＩＩおよびＤ’Ｄ３ドメインは、［Ｇ４Ｓ］ｎ（Ｇはグリシン、Ｓはセリン、およびｎは１〜１００の間の整数である）のアミノ酸配列により表されるリンカーによって連結されてよく、リンカーは酵素切断部位を含む。リンカーは、Ｄ’Ｄ３およびＦＶＩＩＩをつなぎ、Ｄ’Ｄ３がＦＶＩＩＩのｖＷＦ結合部位に正確に結合するための柔軟性を提供する機能を有する。具体的には、Ｄ’Ｄ３がＦＶＩＩＩに融合できる位置は、ＦＶＩＩＩ重鎖のＮ末端またはＣ末端、または、ＦＶＩＩＩ軽鎖のＮ末端またはＣ末端である。Ｄ’Ｄ３ドメインのＮ末端に対応するＤ’ドメインがＦＶＩＩＩのＡ３ドメイン部分に結合し、Ｄ３ドメインがＦＶＩＩＩのＣ２ドメイン部分に結合することを考慮すると、Ｄ’Ｄ３がＦＶＩＩＩ軽鎖のＣ末端に融合している場合に、Ｄ’ドメインとＦＶＩＩＩのＡ３ドメインとの間の距離が最大であることが決定された。従って、Ｄ’Ｄ３がＦＶＩＩＩに融合される際、Ｄ’Ｄ３がＦＶＩＩＩに適切に結合することを可能にするために柔軟性のあるリンカーを選択した。以前に報告されたＦＶＩＩＩの結晶構造に基づいて、Ｃ２ドメインのＣ末端からＡ３ドメインのＮ末端までの直線距離を測定し、その距離をアミノ酸の数に変換することによってリンカーの長さを選択した。したがって、リンカーの長さが上記の直線距離より短い場合、Ｄ’ドメインはＦＶＩＩＩのＡ３ドメインに達することができず、よって、リンカーの長さが短すぎる場合、Ｄ’Ｄ３はＦＶＩＩＩ結合部位に正確に結合することができない。ゆえに、上記条件を満たす十分な長さを有するリンカーが必要とされる。リンカーの最適な長さは、Ｄ’Ｄ３が融合している場所に応じて異なり得る。上記の機能を有する限り、様々な長さのリンカーを使用することができる。一実施形態において、ｎは少なくとも６である。別の実施形態において、式中のｎは６、８、１０、１２、１８、２４、または６０であり得る。
【００９２】
さらに、リンカーは酵素切断部位を含有するため、リンカーはまた、ＦＶＩＩＩが活性化された場合に、ｖＷＦのＤ’Ｄ３、または、ｖＷＦのＤ’Ｄ３およびリンカーを、ＦＶＩＩＩから切り離す機能も有している。
【００９３】
本発明のリンカーに含まれる酵素切断部位は、リンカーのＮ末端またはＣ末端方向に連結されてよい。
【００９４】
本発明の一実施形態において、酵素切断部位は、トロンビンにより切断できる部位であり、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号３６）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号３７）、またはＬＶＰＲＧＳ（配列番号３８）で表され得る。この場合、本発明のキメラタンパク質は、トロンビンにより体内で切断されＦＶＩＩＩａとして活性化され、活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）と共に第Ｘ因子を活性化して活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）に変換させる。
【００９５】
また、本発明のリンカーに含まれ得る酵素切断部位は、トロンビンと同様に、血液凝固カスケード中のＦＶＩＩａ、ＦＸａ、またはＦＸＩａにより切断され得る部位を含み、ＡＳＫＰＱＧＲＩＶＧＧ（配列番号３９）、ＩＤＧＲ（配列番号４０）、ＩＥＧＲ（配列番号４１）、またはＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦ（配列番号４２）によって表され得る。
【００９６】
本発明の一実施形態において、酵素切断部位は、リンカーのＮ末端方向に含まれ、該部位がトロンビンなどの酵素により切断される場合、リンカーおよびＤ’Ｄ３ドメインがＦＶＩＩＩから分離される。
【００９７】
本発明の別の実施形態によれば、酵素切断部位は、リンカーのＣ末端方向に含まれ、該部位がトロンビンにより切断される場合、リンカーおよびＤ’Ｄ３ドメインがＦＶＩＩＩから分離される。
【００９８】
図２Ｂを参照すると、上述の通り、本発明のキメラタンパク質は、重鎖および軽鎖のそれぞれが別々のポリペプチドとして発現される、すなわち、重鎖および軽鎖が第１および第２のポリペプチドの２つのポリペプチドとして発現される、二本鎖の形態で例示される。ここで、軽鎖および重鎖は、金属イオン媒介非共有結合により結合され得る。
【００９９】
本発明のキメラタンパク質が二本鎖として例示される場合、第１のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩの重鎖のＡ１、Ａ２ドメイン、およびＢドメインの全部または一部を含み、第２のポリペプチドは、ＦＶＩＩＩの軽鎖のＡ３、Ｃ１、Ｃ２ドメインおよび／またはＢドメインの一部を含む。
【０１００】
本発明のタンパク質が二本鎖として例示される場合、第１のポリペプチドに含まれるＢドメインに関する上記および下記の記載を参照することができる。
【０１０１】
本発明のタンパク質が二本鎖として例示される場合、第２のポリペプチドがＢドメインを含有していなくてよく、または、Ｂドメインの一部が用いられてもよい。後者の場合、例えば、ＢドメインのＣ末端残基からＮ末端方向に８６残基が含まれる。第２のポリペプチドによって発現されるＢドメインの一部は、細胞外に分泌される際に、切断される。
【０１０２】
本発明のキメラタンパク質が二本鎖として例示される場合、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは、第１のポリペプチドのＣ末端方向に連結している。ここで、Ｂドメインは、一種のリンカーとして作用することができる。本発明のタンパク質が二本鎖として例示される場合、タンパク質が一本鎖で発現される場合と比較して、同一の長さの、またはより長いＢドメインが用いられ得る。
【０１０３】
本発明の一実施形態において、一本鎖には、配列番号１の配列に基づく残基７４１〜９０２および１６５４〜１６８９のＢドメインが用いられ、二本鎖には、配列番号１に基づく１９６残基長の残基７４１〜９３６のＢドメインが用いられる。二本鎖の形態で発現される場合、Ｄ’ドメインは、融合するタンパク質間の構造的により自然な連結を目的として、Ｂドメインに連結され得るが、この理論に限定されるものではない。具体的には、一実施形態において、本発明に用いられる１９６残基長のＢドメインのＣ末端のアミノ酸残基配列は、−ＳＧＧＰＬＳＬＳである。Ｄ’ドメインのＮ末端のアミノ酸配列は、ＳＬＳＣＲＰＰＭＶＫＬＶＣＰＡ−で始まる。従って、１９６残基長のＢドメインは、上記に示したＳＬＳの３つのアミノ酸残基に重複するよう用いた。１９６個の残基長のＢドメインは、−ＳＧＧＰＬＳＬＳに存在するＳＧＧＰＬ残基までを含めて計算された。
【０１０４】
本発明のキメラタンパク質は、１つ以上のｖＷＦのＤ’Ｄ３を含んでよい。
【０１０５】
Ｄ’Ｄ３はｖＷＦのＮ末端に位置する２つのドメインであり、Ｄ３ドメインは実際にＤ３ドメインを介して別の分子のｖＷＦと二量体を形成する。従って、Ｄ’Ｄ３は、本発明において、単量体の形態または二量体の形態で、ＦＶＩＩＩに融合し得る。
【０１０６】
複数のｖＷＦのＤ’Ｄ３、例えば、２つのｖＷＦのＤ’Ｄ３が含まれる場合、それらは、ＦＶＩＩＩに連結された第１のＤ’Ｄ３および第１のＤ’Ｄ３に連結された第２のＤ’Ｄ３として例示され得る。
【０１０７】
複数のｖＷＦのＤ’Ｄ３が含まれる場合、第１および第２のＤ’Ｄ３は、リンカーで連結されてよく、または、第２のＤ’Ｄ３が、別で発現されて、キメラタンパク質と複合体を形成してもよい。例えば、第１および第２のＤ’Ｄ３が、ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３／Ｄ’Ｄ３−１２０キメラタンパク質のように、リンカーを用いて連結される場合、リンカーに関する前述の記述を参照することができるが、酵素切断部位は含まない。
【０１０８】
また、Ｄ’Ｄ３が二量体の形態で用いられる場合、Ｄ’Ｄ３はＤ３ドメインにおいてＳ−Ｓ結合により二量体を形成することができる。複数のＤ’Ｄ３が二本鎖のように、別々のベクターで発現される場合、例えば、ＦＶＩＩＩ−Ｄ’Ｄ３のＤＮＡとＤ’Ｄ３のＤＮＡとを１つの細胞内で同時に発現させてＤ’Ｄ３間に二量体を形成させ、細胞外に分泌されてよく、その後単離および精製後に、使用されてよい。
【０１０９】
さらに、本発明のキメラタンパク質は、１つ以上のＦｃタンパク質を含んでよい。さらにＦｃが、Ｄ’Ｄ３を有するＦＶＩＩＩと融合すると、Ｄ’Ｄ３によって血中のｖＷＦの結合を阻害する効果に加えて、ＦＶＩＩＩによるＦｃＲｎの再利用による半減期の延長の効果が期待できる。一実施形態において、具体的には、約５０ｋＤａのＦｃが融合し、Ｆｃによる立体障害が、血中のｖＷＦがＦＶＩＩＩに結合することをより困難にし得る。
【０１１０】
従って、本発明の目的を達成する限り、様々な長さまたは起源のＦｃを含むことができる。本発明の一実施形態において、配列番号２２により表されるＦｃ、またはヒトＩｇＧ由来のＦｃが用いられる。
【０１１１】
本発明のキメラタンパク質が一本鎖として例示される場合、ＦｃはｖＷＦのＤ’Ｄ３に連結され得る。ここで、それらはリンカーを用いて連結され得、また、リンカーに関する前述の記述を参照することができるが、酵素切断部位は含まない。
【０１１２】
本発明のキメラタンパク質が二本鎖として例示される場合、Ｆｃは、重鎖の一部として表されるｖＷＦのＤ’Ｄ３および／または軽鎖のＣ末端方向に連結されてよい。ここで、それらはリンカーを用いて連結され得る。リンカーに関する前述の記述を参照することができる。具体的には、軽鎖と連結される場合、酵素切断部位を含むが、Ｄ’Ｄ３と連結される場合、酵素切断部位を含まない。
【０１１３】
２つ以上のＦｃが、本発明のキメラタンパク質に含まれ得る。
【０１１４】
複数のＦｃ、例えば、２つのＦｃが含まれる場合、一実施形態において、それらは、キメラＦＶＩＩＩに連結された第１のＦｃ、および第１のＦｃに連結された第２のＦｃとして例示され得る。別の実施形態において、第１のＦｃは二本鎖として発現されたキメラＦＶＩＩＩの重鎖に連結されてよく、および、第２のＦｃは軽鎖に連結されてよく（あるいはその逆でもよく）、この場合、当該複数のＦｃの間に二量体などの複合体が形成され得る。
【０１１５】
複数のＦｃが含まれる場合、第１および第２のＦｃは、リンカーにより連結されてよく、または、第２のＦｃ領域は、１つの細胞内で別のベクターに発現させてＦｃ間に二量体を形成させてよく、その後単離および精製後に、使用されてよい。
【０１１６】
上述の通り、本発明のキメラタンパク質は、一本鎖または二本鎖として例示されてよい。
【０１１７】
一実施形態において、本発明の一本鎖中のキメラタンパク質は、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、または２５で表され得る。
【０１１８】
一実施形態において、本発明の二本鎖中のキメラタンパク質は、配列番号４および５（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号２３および２４（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号２６および２７（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号２８および２９（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号３０および３１（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号３２、および３３（それぞれ、重鎖および軽鎖）、または配列番号３４および３５（それぞれ、重鎖および軽鎖）により表すことができる。該タンパク質は、別々のＤ’Ｄ３および／またはＦｃと複合体を形成してよく、一実施形態において、配列番号２８および２９（それぞれ、重鎖および軽鎖）、または配列番号３２および３３（それぞれ、重鎖および軽鎖）のキメラタンパク質は、少なくとも１つの配列番号２２により表されるＦｃと複合体を形成してよい。
【０１１９】
上述の配列番号４〜３５により表されるアミノ酸配列にはまた、これらに対して９０％以上の相同性を有するタンパク質、または、実質的に同一の配列もまた含まれる。
【０１２０】
これらの実質的同一性または相同性は、当業界で既知の配列比較法を用いて決定することができる。本明細書に開示された配列および他の任意の配列がそれらの間の最大の一致でアラインメントされ、かつアラインメントされた配列が当業界で一般的に使用されるアルゴリズムを使用して分析される場合、実質的に同一の配列とは、好ましくは少なくとも８０％の相同性、具体的には８５％以上、より具体的には９０％以上の相同性、さらにより具体的には９５％以上の相同性を示す配列を指す。配列比較のためのアラインメント法は、当業界で周知である。例えば、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482; Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. (1970) 48:443; Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. (1988) 24: 307-31; Higgins and Sharp, Gene (1988) 73:237-44; Higgins and Sharp, CABIOS (1989) 5:151-3; Corpet et al., Nuc. Acids Res. (1988) 16:10881-90; Huang et al., Comp. Appl. BioSci. (1992) 8:155-65 および Pearson et al., Meth. Mol. Biol. (1994) 24:307-31に開示されている。NCBI Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）(Altschul et al., J. MoI. Biol. 215: 403-10(1990))は、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biological Information）（NBCI, Bethesda, Md.）などから入手可能であり、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘなどの配列分析プログラムと関連して使用される。これを用いた配列相同性比較法が、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BI-AST/blast help.htmlで利用可能である。
【０１２１】
本発明のキメラタンパク質は、野生型ＦＶＩＩＩと比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、および少なくとも３倍延長された半減期を有する。半減期を測定する方法は開示されており、当業者であれば、本発明の記載、当業界の技術、および当業界の参考文献の記載を考慮して、半減期および活性を測定するための適切な方法を選択することができるであろうし、その後、測定結果に基づき本発明の範囲に含まれるキメラタンパク質を決定することができるであろう。
【０１２２】
別の実施形態において、本発明はまた、本発明に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸分子またはポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、または該ベクターで形質転換された細胞（株）に関する。
【０１２３】
本発明の核酸分子は、本発明のキメラタンパク質が発現される細胞のタイプに対してコドン最適化されているものを含む。本発明の一実施形態において、核酸配列は、ＣＨＯのコドンに最適化され、該核酸配列は、配列番号５８、５９、６０、６２、６３、６４、６５、または６６の配列により表され得る。
【０１２４】
本発明のキメラタンパク質をコードする核酸分子はまた、上述のように、実質的に同一のＦＶＩＩＩ、および、生物学的に同等のＦＶＩＩＩをコードする核酸分子を含む。
【０１２５】
また、本発明のキメラタンパク質をコードする核酸分子は、様々な目的のために、様々な発現ベクターにクローニングすることにより、用いられてよい。発現ベクターの特定の組成物は、本発明のキメラタンパク質が発現される宿主細胞に応じて異なってよい。しかしながら、発現ベクターの特定の組成物は、本発明の核酸分子のｍＲＮＡへの発現またはｍＲＮＡのタンパク質への発現を調節する配列、例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサーなどを含む。上記目的または様々な他の目的のために用いられ得る様々なベクターおよび調節配列は、当業界で既知であり、本発明の特定の目的および効果に照らして当業者により適切に選択され得、これらのベクターおよび配列には、例えば、本発明の実施例および図面に開示されたものが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１２６】
本発明のキメラタンパク質をコードする核酸分子を含むベクターは、当業界で既知の方法により調製されてよく、例えば、本発明のキメラタンパク質をコードする核酸分子を、プロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結することにより調製されてよい。一実施形態において、本発明のキメラタンパク質をコードする核酸分子は、細胞内で外来遺伝子を発現することができる組換え発現ベクターに挿入され、これらのベクターの例には、ｐＭＳＧｎｅｏおよびｐｃＤＮＡ３．１（＋）などの一般的なタンパク質発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。ｐＭＳＧｎｅｏベクターは、核マトリックスに結合するＭＡＲ（マトリックス付着領域）エレメントを含む発現ベクターであり、ＭＡＲエレメントは、発現ベクターで使用される場合、位置非依存性発現を誘導することによって遺伝子発現を増強する役割を果たす。従って、ｐＭＳＧｎｅｏベクターが用いられる場合、安定かつ高い発現レベルを達成することができる。さらに、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターは強力なＣＭＶプロモーターを含有するため、タンパク質発現に広く用いられている。本発明の一実施形態において、図３に示したベクターが用いられる。本発明のキメラタンパク質は、上述の一本鎖ポリペプチドまたは２つのポリペプチドとして発現されることができる。
【０１２７】
さらに、本発明のキメラタンパク質をコードする核酸分子を含む組換え発現ベクターは、様々な目的のために、好適な宿主細胞にトランスフェクトされてよい。宿主細胞は、本発明のベクターを増幅することができ、および／または、該ベクターに含まれる核酸分子を発現することができる原核細胞および真核細胞の両方を含む。上記目的のために用いられ得る様々な細胞は、当業界で既知であり、当業者であれば、本発明の特定の目的および効果を考慮して、適切な細胞を選択することができるであろうし、これらの細胞は、本発明の実施例および図面に記載される細胞を含むが、これらに限定されない。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、哺乳動物細胞、酵母、植物細胞、および昆虫細胞が含まれ得る。本発明の一実施形態において、真核細胞、特に哺乳動物細胞株が、組換え型ＦＶＩＩＩの発現に用いられる。当業者であれば、本発明の組換え型ＦＶＩＩＩの特性を考慮して、これらの特性をもったタンパク質を発現できる適切な細胞株を選択できるであろうし、例えば、当業界で既知のＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ７  ＨＥＫ細胞株などがこれらの哺乳動物細胞株として用いられてよく、好ましくはＣＨＯ細胞株（具体的にはＣＨＯ−Ｓ細胞株もしくはＣＨＯ−Ｋ１細胞株もしくはＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株）またはＨＥＫ細胞株（具体的にはＨＥＫ２９３細胞株）が用いられてよいが、本発明はこれらに限定されない。
【０１２８】
本発明のベクターは、発現のために上記宿主細胞に導入される。ベクターをこれらの宿主細胞に導入する方法は当業界で既知であり、当業界で既知の方法によって実行されてよく、硫酸カルシウム沈殿、ショットガン法、リポソームを用いる方法、ナノ粒子法、またはエレクトロポレーションなどの方法などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１２９】
別の局面では、本発明はまた、上述の本発明のベクターを真核細胞にトランスフェクトすること；培養液中で該細胞を培養すること；該培養液を回収してシステイン導入キメラタンパク質を精製すること；および精製されたシステイン導入タンパク質をペグ化バッファー液で処理すること；還元プロセスを介して導入されたシステインの遊離のチオール基を回復させること；得られたものを酸化して還元プロセスで分離したキメラタンパク質のジスルフィド結合を回復させること；具体的には、還元チオール基で回復されたキメラタンパク質上のシステインをペグ化して、ペグ化されたキメラタンパク質を単離することを含む、キメラタンパク質を産生する方法に関する。
【０１３０】
本発明の方法で用いられる特定のベクター、細胞、および処理ステップに関して、本明細書の実施例に記載されるものを参照することができる。
【０１３１】
本発明のキメラタンパク質は、血液凝固を必要する疾病、血友病、具体的には血友病Ａを患う患者の血液凝固に有用であることができ、または、血友病Ａの治療に有用であることができる。
【０１３２】
別の実施形態において、本発明はまた、治療的有効量で、上述の本発明のキメラタンパク質、これをコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクター、または該核酸分子もしくはベクターを含む細胞、または、上記成分に加えて医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物を、血液凝固を必要とする疾病、すなわち血友病、具体的には血友病Ａを患う患者に投与することを含む、血友病、具体的には血友病Ａを治療するための方法、または、血液凝固のための方法を提供する。
【０１３３】
本発明のキメラタンパク質、それをコードする核酸分子、該核酸分子を含むベクターは、血友病、具体的には血友病Ａを治療するための上記成分に加えて、医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物の形態で提供され得る。
【０１３４】
さらに、本発明の医薬組成物は、単独で、または他の薬物療法と組み合わせて、および、生体応答修飾物質を使用する方法と組み合わせて、使用することができる。
【０１３５】
上述の有効成分に加えて、本発明の組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容される担体または薬理的に許容される担体をさらに含むことにより、調製されてよい。
【０１３６】
本明細書で用いられる「担体」という用語は、使用される用量および濃度でそれに曝露された細胞または哺乳動物に対して無毒である、医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤を意味することを意図している。これらの担体の例には、生理食塩水、リンゲル液、緩衝生理食塩水、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子量の（約１０アミノ酸より小さい）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸、単糖、二糖、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンなどの糖、ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール、ナトリウムなどの塩形成のための対イオン、および／またはＴｗｅｅｎ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびプルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標））などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１３７】
所望であれば、組成物はさらに、抗酸化剤、緩衝剤、抗菌剤などの当業界で既知の他の添加剤を含んでよい。本組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および滑沢剤を添加することによって、溶液、懸濁液、エマルジョンなどの注射用製剤に製剤化されてよい。さらに、組成物は、好ましくは、当業界における、またはRemington’ s Pharmaceutical Science（最新版；Mack Publishing Company, Easton PA）に開示された適切な方法を用いて、疾病または成分に応じて製剤化され得る。
【０１３８】
本発明の組成物は、好ましくは、所望の方法に従い、非経口的（例えば、静脈内、皮下、腹腔内）に投与される。投与量は、患者の病状および体重、疾病の程度、薬剤タイプ、投与経路および投与時間に応じて異なるが、当業者であれば適切に選択することができる。
【０１３９】
本発明の組成物は、治療的有効量で投与される。本発明において、「治療的有効量」とは、薬物療法に適用可能な妥当なリスク／ベネフィット比（ｂｅｎｅｆｉｔ／ｒｉｓｋ  ｒａｔｉｏ）で疾病を治療するのに十分な量を指す。有効な用量のレベルは、患者の疾病のタイプ、重症度、薬剤の活性、薬剤への感受性、投与時間，投与経路、排出率、治療期間、同時に使用される薬剤、および医薬分野で周知の他の要因に応じて決定されてよい。本発明の組成物は、単一治療薬として投与されてよく、あるいは、他の治療薬と組み合わせて投与されてよい。また、本発明の組成物は、従来の治療薬と共に、連続してまたは同時に投与されてよく、および、該組成物は、単回投与または複数回投与に用いられてよい。上述のすべての要因を考慮して、副作用なしに最大の効果をもたらすことができる最小量用量で組成物を投与することが重要であり、その用量は当業者であれば容易に決定し得る。
【０１４０】
本明細書で用いられる場合、用語「治療」は、本発明の組成物の投与によって有益な方法で疾病の症候を改善または変化させる任意の行為を指す。本発明の方法が用いられる対象は、ヒトを含む霊長類であってよいが、これらに限定されない。
【０１４１】
本発明の組換え型キメラタンパク質は、血友病を患う対象、または血液凝固を必要とする対象に、治療的有効量で、そのまま、または上述の組成物の形態で投与されてよく、および、血液凝固方法または血友病を治療するための方法の形態で提供されてよく、前述の記述を参照することができる。
【０１４２】
以下、本発明を実施例により、詳細に説明する。以下の実施例は、その範囲を限定することなく本発明をさらに例示することを意図している。
【０１４３】
本発明の形態
【実施例】
【０１４４】
実施例１．キメラＦＶＩＩＩの構築
実施例１−１．ｓｃＦＶＩＩＩ（一本鎖ＦＶＩＩＩ）の調製
一本鎖の形態で発現されるＦＶＩＩＩの構築のために、フューリン切断部位、残基１６４８（完全長ＦＶＩＩＩアミノ酸配列を表す配列番号１のアミノ酸配列に基づく）を含むＢドメインの一部が欠失したＦＶＩＩＩを構築した。構築された各ｓｃＦＶＩＩＩを、ＢドメインのＮ末端（配列番号１の７４１番目のアミノ酸残基）から数えて特定の長さのＢドメインを含み、含まれるＢドメインが、元々存在する糖鎖をそのまま含有するように構築し、該Ｂドメインに位置する７８２番目のイソロイシン残基を、部位特異的ペグ化のためにシステインで修飾した。
【０１４５】
調製方法は以下の通りである。
【０１４６】
表１に示した欠失を有するＢドメインを含む各ｓｃＦＶＩＩＩを、ヒトＦＶＩＩＩ核酸配列（ＮＭ０００１３２）に基づいて合成した。ｓｃＦＶＩＩＩ遺伝子発現ベクターを調製するために、ヒトＦＶＩＩＩ核酸配列（ＮＭ０００１３２）に基づき、５’末端にＰａｃＩ−ＸｈｏＩ酵素切断部位を、３’末端にＰａｃＩ−ＸｈｏＩ酵素切断部位を含むように、ＧｅｎｅＡｒｔにより、ＣＳＬ形態（リーダー−重鎖−Ｂドメイン（７４１−７６４、１６５３−１６８９）−軽鎖）の遺伝子全体を合成した。合成した遺伝子を、ｐｃＤＳＷベクターのＮｏｔＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより、ｐｃＤＳＷ−ＣＳＬ発現ベクターを構築した。発現ベクター構築の正確さを、ＡｓｉｓＩ／ＰａｃＩ酵素を用いて切断したバンドのサイズ比較により確認した。続いて、Ｂドメインが欠失した各ｓｃＦＶＩＩＩを、ＦＶＩＩＩ重鎖のＡ２ドメインに存在するＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）から、軽鎖の３’末端のＰａｃｌ酵素切断部位までの配列を含むように、ＧｅｎｅＡｒｔにより合成した。続いて、既存のＦＶＩＩＩの領域を、予め調製したｐｃＤＳＷ−ＣＳＬ発現ベクターから、酵素ＢａｍＨＩ／ＰａｃＩを用いて除去し、合成した遺伝子をＢａｍＨＩ／ＰａｃＩ酵素で切断して、ｐｃＤＳＷ−ＣＳＬ発現ベクターのＢａｍＨＩ／ＰａｃＩ部位にクローニングし、ｐｃＤＳＷ−ｓｃＦＶＩＩＩ発現ベクターを構築した。発現ベクター構築の正確さを、ＢａｍＨＩ／ＰａｃＩ酵素で切断後に、サイズ比較により確認した。
【表１】
2019522977.tif 000003
【０１４７】
システインが導入されたｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３、配列番号３）については、システイン置換部位およびＦＶＩＩＩ重鎖Ａ２ドメインのＢａｍＨＩ部位（ＧＧＡＴＣＣ）から、軽鎖の３’末端のＰａｃｌ酵素切断部位までの配列を含むように、ＧｅｎｅＡｒｔにより該遺伝子を合成した。続いて、既存のＦＶＩＩＩ領域を、予め調製した発現ベクターｐｃＤＳＷ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４から、酵素ＢａｍＨＩ／ＰａｃＩを用いて除去し、合成した遺伝子をＢａｍＨＩ／ＰａｃＩ部位にクローニングし、システインが置換されたｐｃＤＳＷ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）発現ベクターを構築した。発現ベクター構築の正確さは配列解析により確認した。
【０１４８】
実施例１−２．ｄｃＦＶＩＩＩ（二本鎖ＦＶＩＩＩ）の調製
Ｄ’Ｄ３を含有する二量体の形態で発現されたＦＶＩＩＩを構築するために、Ｄ’Ｄ３を含有する重鎖と、軽鎖とを、１つの細胞で、異なるベクターを用いて発現させた。Ｄ’Ｄ３を含有する重鎖は、実施例１−１で用いられるＢ３に対応するＢドメインを含有し、軽鎖は、韓国特許番号第２５１２８６号に記載の軽鎖を発現するベクターを参照して産生した。
【０１４９】
実施例１−３．キメラＦＶＩＩＩの調製
キメラＦＶＩＩＩを、実施例１−１および１−２で調製した一本鎖ＦＶＩＩＩおよび二量体ＦＶＩＩＩに基づき、１つまたは２つのＤ’Ｄ３と融合させ、リンカーを、融合したＤ’Ｄ３のＦＶＩＩＩへの有効な結合のために用いた。リンカーのために、ＦＶＩＩＩのＢドメインの一部または［Ｇ４Ｓ］ｎを用いた。また、いくつかのキメラＦＶＩＩＩは、上述の組成物に加えてＦｃを含有した（図２および図３、および表２）。
【表２−１】
2019522977.tif 000004
【表２−２】
2019522977.tif 000005
【表２−３】
2019522977.tif 000006
【０１５０】
キメラＦＶＩＩＩのクローニングを、特許実施例１−１に記載のｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）を用いて実行した。配列番号４のＦＶＩＩＩ重鎖については、ＦＶＩＩＩのＡ２ドメインに存在するＫｐｎＩ酵素切断部位から、３’末端のＰａｃＩ酵素切断部位の配列を含むように、ＧｅｎｅＡｒｔにより遺伝子を合成した。続いて、既存のＦＶＩＩＩ領域を、ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）発現ベクターｐｃＤＳＷ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）から、酵素ＫｐｎＩ／ＰａｃＩを用いて除去し、合成した遺伝子をＫｐｎＩ／ＰａｃＩ部位にクローニングし、配列番号４の重鎖に対応する発現ベクターを構築した。発現ベクター構築の正確さは酵素切断による長さ解析により確認した。配列番号５の軽鎖については、５’末端のＡｓｉｓリーダー配列から、ＦＶＩＩＩ軽鎖Ｃ１ドメインに存在するＢｓｐＥＩ酵素切断部位までの配列を含むように、ＧｅｎｅＡｒｔにより遺伝子を合成した。続いて、既存のＦＶＩＩＩ領域を、実施例１−１で調製したｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）発現ベクターｐｃＤＳＷ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）から、酵素ＡｓｉＳＩ／ＢｓｐＥＩを用いて除去し、合成した遺伝子をＡｓｉＳＩ／ＢｓｐＥＩ部位にクローニングし、配列番号５の軽鎖に対応する発現ベクターを構築した。ベクター構築の正確さは酵素切断による長さ解析により確認した。配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６の遺伝子を、ＦＶＩＩＩ軽鎖のＣ１ドメインに存在するＢｓｐＥＩ酵素部位配列から、３’末端のＰａｃＩ酵素切断部位までの配列を含むように、ＧｅｎｅＡｒｔにより合成した。続いて、既存のＦＶＩＩＩ領域を、実施例１−１で調製したｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）発現ベクターｐｃＤＳＷ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）から、酵素ＢｓｐＥＩ／ＰａｃＩを用いて除去し、合成した遺伝子をＢｓｐＥＩ／ＰａｃＩ部位にクローニングし、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５および１６に対応するキメラＦＶＩＩＩ発現ベクターを構築した。発現ベクター構築の正確さは酵素切断による長さ解析および配列解析により確認した。配列番号１４と比較して、配列番号１５で表されるペプチドは、リンカーにおけるトロンビン切断部位の位置において異なり、配列番号１６で表されるペプチドは、トロンビン切断部位の位置、およびリンカーそのものの配列において異なり、これらをＴＨ１およびＴＨ２と名付けた。
【０１５１】
配列番号１７、１８および２１については、ＦＶＩＩＩ軽鎖Ｃ１ドメインのＢｓｐＥＩ酵素部位から、３’末端のＰａｃＩ酵素切断部位までの配列を含むように、Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈにより、ＣＨＯコドン最適化および遺伝子合成を実施した。続いて、既存のＦＶＩＩＩ領域を、実施例１−１で調製したｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）発現ベクターｐｃＤＳＷ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）から、酵素ＢｓｐＥＩ／ＰａｃＩを用いて除去し、合成した遺伝子をＢｓｐＥＩ／ＰａｃＩ部位にクローニングし、配列番号１７、配列番号１８および配列番号２１に対応するキメラＦＶＩＩＩ発現ベクターを構築した。発現ベクター構築の正確さは酵素切断による長さ解析により確認した。
【０１５２】
配列番号１９については、５’末端に付加されたＮｏｔＩ−ＡｓｉＳＩ酵素切断部位から、ＦＶＩＩＩ重鎖Ａ１ドメインに存在するＡｆｌＩＩ酵素切断部位までの配列を含むように、Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈにより、ＣＨＯコドン最適化および遺伝子合成を実施した。続いて、既存のＦＶＩＩＩ領域を、実施例１−１で調製したｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）発現ベクターｐｃＤＳＷ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）から、酵素ＡｓｉＳＩ／ＡｆｌＩＩを用いて除去し、合成した遺伝子をＡｓｉＳＩ／ＡｆｌＩＩ部位にクローニングし、配列番号１９に対応するキメラＦＶＩＩＩ発現ベクターを構築した。発現ベクター構築の正確さは酵素切断による長さ解析により確認した。
【０１５３】
配列番号２０については、Ｃｏｓｍｏｇｅｎｅｔｅｃｈで合成した配列番号６４で表される遺伝子を、酵素ＭｆｅＩ／ＸｂａＩを用いて既存の領域の遺伝子から除去し、配列番号６３により表される合成遺伝子を、酵素ＭｆｅＩ／ＸｂａＩで処理してインサートを得、次いでこれをＭｆｅＩ／ＸｂａＩ部位への一次クローニングに供した。一次クローニングされた遺伝子を発現ベクターに導入するために、既存のＦＶＩＩＩ領域を、以前に調製したｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）発現ベクターｐｃＤＳＷ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）から、酵素ＮｏｔＩ／ＰａｃＩを用いて除去し、一次クローニングされた遺伝子を酵素ＮｏｔＩ／ＰａｃＩで切断してインサートを切り出し、これを該発現ベクターのＮｏｔＩ／ＰａｃＩ部位にクローニングして配列番号２０に対応する発現ベクターを構築した。発現ベクター構築の正確さは、酵素切断による長さ解析により確認した。
【０１５４】
配列番号２２については、５’末端のＡｓｉｓＩおよび３’末端のＰａｃＩ  酵素切断部位を含むように、ＧｅｎｅＡｒｔにより遺伝子を合成した。続いて、既存のＦＶＩＩＩ領域を、実施例１−１で調製したｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）発現ベクターｐｃＤＳＷ−ｓｃＦＶＩＩＩ  Ｇ４（Ｂ３）から、酵素ＡｓｉｓＩ／ＰａｃＩを用いて除去し、合成した遺伝子をＡｓｉｓＩ／ＰａｃＩ部位にクローニングし、配列番号２２に対応する発現ベクターを構築した。発現ベクター構築の正確さは、酵素切断による長さ解析により確認した。
【０１５５】
加えて、配列番号１５については、ＣＨＯ発現ベクターをさらに調製して、ＣＨＯ形質転換細胞株を調製した。Ｂｉｏｂａｓｉｃｓ  Ｃｏ．、ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｃｏ．およびＧｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏ．により、５’末端にＡａｔＩＩ−ＡｓｃＩ酵素切断部位を含み３’末端にＢｓｉＷＩ−ＰａｃＩ酵素切断部位を含むように、または、ＣＨＯ発現に最適化するように、遺伝子を合成した。合成した遺伝子を、ＣＨＯ発現ベクターｐＭＳＩＤ２のＡｓｃＩ／ＰａｃＩ部位にクローニングして、配列番号１５に対応するＣＨＯ発現ベクターを構築した。発現ベクター構築の正確さは酵素切断による長さ解析により確認した。
【０１５６】
実施例２．キメラＦＶＩＩＩの発現
実施例１で構築したキメラＦＶＩＩＩを細胞で発現し、発現を示す細胞を細胞培養培地で培養した。発現のために、実施例１で構築した発現ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｃｏ．，  Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ａ１４６３５）を用いて、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞に導入および移入した。トランスフェクション法および培養は３０ｍＬスケールで以下のように行い、実際の培養液量はタンパク質の必要量に応じて調整した。トランスフェクトの２４時間前に、Ｅｘｐｉ２９３培養培地を用いて、予想される必要量に従って、２．０×１０６細胞／ｍＬでＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞を継代培養した。トランスフェクト当日に、細胞の数および細胞生存率を測定し、細胞生存率が９５％以上の場合にトランスフェクトを実施した。Ｅｘｐｉ２９３培養培地を１２５ｍＬフラスコに加えて７．５×１０７細胞の量を得、２５．５ｍＬに調整した。実施例１で構築した発現ベクター３０μｇをＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合して、全量１．５ｍＬとした。トランスフェクション試薬８０μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合して、全量１．５ｍＬとし、室温で５分間インキュベートした。５分後に、トランスフェクション試薬を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭを、ＤＮＡ含有Ｏｐｔｉ−ＭＥＭに加えて、その後穏やかに混合した。２０分〜３０分間、反応を室温で実行した。３ｍＬのＤＮＡ：トランスフェクション試薬混合物を、予め調製した１２５ｍＬフラスコのＥｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞に滴下して（全量：２８．５ｍＬ）、５％ＣＯ２振とう培養器中、３７℃、１２５ｒｐｍでインキュベートした。１６〜２０時間後、それぞれ１５０μＬおよび１．５ｍＬの、エンハンサー１およびエンハンサー２をそこに加えて、細胞を、５％ＣＯ２振とう培養器中、３４℃、１２５ｒｐｍでインキュベートした。培養２日目に、全ての細胞を遠心分離して既存の培養培地を完全に取り除き、全ての細胞を３０ｍＬの新しい培養培地に分注して、５％ＣＯ２振とう培養器中、３４℃、１２５ｒｐｍでインキュベートした。導入３日目に、キメラＦＶＩＩＩを発現した細胞を全て遠心分離し、培養液を回収した。培地の回収後に残っている細胞を、同じ容量の新しい培養培地に分注し、３４℃で１日培養した。このプロセスを、培養５日目まで繰り返し、３日目、４日目、および５日目の培養液を回収し、システインを導入したキメラＦＶＩＩＩの活性解析と精製を行った。上記と同様の方法により、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞においてＦＶＩＩＩ発現を実施した。
【０１５７】
さらに、ＣＨＯ形質転換細胞株を調製して、キメラＦＶＩＩＩを発現させた。トランスフェクトの２４時間前に、必要量に従って、５〜６×１０５細胞／ｍＬの量でＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を、ＣＤＭ４ＣＨＯ培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ，ＳＨ３０５５７．０２）で継代培養した。トランスフェクト当日に、細胞を３ｍＬの量で、１ｘ１０７細胞／ｍＬで、ＯｐｔｉＰｒｏ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｕｍｂｅｒ  １２３０９−０１９）を用いて、１２５ｍＬフラスコに分注した。実施例１で構築したＣＨＯ発現ベクター３０μｇをＯｐｔｉＰｒｏと混合して、全量１．５ｍＬとした。得られた混合物を、９０ＬのＰＥＩ  ＭＡＸ（１μｇ／μＬ）およびＯｐｔｉＰｒｏを用いて混合して、全量１．５ｍＬとした。５分後に、ＰＥＩ  ＭＡＸを含有するＯｐｔｉＰｒｏ１．５ｍＬを、ＤＮＡを含有するＯｐｔｉＰｒｏ１．５ｍＬに加えて、その後室温で３０分間、穏やかに混合した。３ｍＬのＤＮＡ：ＰＥＩ混合物を、予め調製したＣＨＯ  ＤＧ４４細胞に滴下した。該細胞を、５％ＣＯ２振とう培養器中、３７℃、１４０ｒｐｍで４時間インキュベートした。ＣＤＭ４ＣＨＯ培地２４ｍＬをそこに加えて、細胞を１４０ｒｐｍでインキュベートし、４８時間後に細胞スクリーニングを実施した。
【０１５８】
形質転換したＣＨＯ  ＤＧ４４細胞を、２０ｎＭのＭＴＸを含有するＣＤＭ４ＣＨＯ培養培地を用いて、５ｘ１０６細胞／ｍｌでＴ−１７５フラスコに懸濁し、５０ｍｌの容量を得、これを５％ＣＯ２培養器中、３７℃で７日間、静置培養に供した。細胞数が足りない場合は、全体の容量を減らして進めた。７日間の細胞スクリーニングの後、細胞数を数え、細胞を２０ｎＭ  ＭＴＸを含有する培養培地を用いて５ｘ１０５細胞／ｍＬで、１２５ｍＬフラスコにて、５％ＣＯ２振とう培養器中、３７℃、１４０ｒｐｍで継代培養した。細胞を３〜４日の間隔で１２５ｍＬフラスコにて継代培養し、細胞濃度が１×１０ ６細胞／ｍＬ以上で生存率が９０％以上であれば、スクリーニング完了と判断した。
【０１５９】
キメラＦＶＩＩＩの発現のために、ＣＨＯ形質転換細胞株を３×１０５細胞／ｍＬで播種し、５％ＣＯ２振とう培養器中、３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。培養４日目に、全ての細胞を遠心分離して既存の培養培地を完全に取り除き、全ての細胞を同じ容量の新しい培養培地に分注して、５％ＣＯ２振とう培養器中、３１℃、１４０ｒｐｍで１日間インキュベートした。培養培地の交換および培養プロセスを培養８日目まで繰り返し、６日目、７日目および８日目の培養液を回収して、キメラＦＶＩＩＩの活性解析および精製を行った。
【０１６０】
実施例３．キメラＦＶＩＩＩ発現の確認
実施例３−１．キメラＦＶＩＩＩ発現レベルの測定
広く用いられているＦＶＩＩＩ活性の２つの測定試験法は、一段階法による凝固法（ｏｎｅ−ｓｔａｇｅ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）および発色法（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ）である。それらのうち、キメラＦＶＩＩＩ発現レベルを、発色法で測定した。発色法は、発色物質の発色の程度に基づいてＦＶＩＩＩ活性を測定する方法であり、ＦＩＸａ、ＦＸ、トロンビン、カルシウム、リン脂質およびＦＶＩＩＩサンプルを混合し、ＦＸａによる切断時に発色する発色基質を、ＦＶＩＩＩサンプルにより活性化されたＦＸａの量を測定するためにそこに添加する。
【０１６１】
発色法の実験方法については、ＣＨＲＯＭＯＧＥＮＩＸ  Ｃｏ．により発売されている発色アッセイキットをエンドポイント法として用い、製造者によって提供された試験方法を本試験に好適な方法に変更することによって試験を行った。サンプルを、１×希釈バッファーを用いて、標準範囲（０．２５−１ＩＵ／ｍＬ）になるように希釈する。１×希釈バッファーを用いて、０、０．２５、０．５、および１ＩＵ／ｍＬの濃度で、キャリブレーション用血漿を調製した。調製したサンプル、および１０μｌのキャリブレーション用血漿を、７９０μＬの１×希釈バッファーにより希釈して、希釈したサンプル５０μｌを９６ウェルプレートに分注し、３７℃で５分間静置させた。５０μｌのファクター試薬（ｆａｃｔｏｒ  ｒｅａｇｅｎｔ）を、自動分注ピペットを用いて各ウェルに分注し、その後３７℃で２分間反応させた。５０μの基質を各ウェルに分注し、その後発色のために３７℃で２分間静置させた。発色を示すサンプルに、５０μｌの２％クエン酸を添加することにより、反応を停止させた。吸光度を４０５ｎｍの波長で測定して線形検量線を描き、サンプルの吸光度を検量線に代入してサンプルの活性を測定した。
【表３】
2019522977.tif 000007
【０１６２】
Ｄ’Ｄ３と融合していないｓｃＦＶＩＩＩ−Ｂ３の測定された発現レベルは、１．６〜８．０ＩＵ／ｍＬの範囲であった。Ｄ’Ｄ３と融合したキメラＦＶＩＩＩの場合、一本鎖形態で発現された際に、その発現レベルがｓｃＦＶＩＩＩ−Ｂ３の発現レベルと類似していることがわかった。しかしながら、二量体として発現された際に、その発現レベルは０．１ＩＵ／ｍＬであり、既存のｓｃＦＶＩＩＩ−Ｂ３の１０倍以上低いことがわかった。測定結果を表３に示す。
【０１６３】
実施例３−２．発現パターン解析
本発明で構築したキメラＦＶＩＩＩを実施例４に従い精製した後、精製サンプルの発現パターンをウェスタンブロット解析により確認した。
【０１６４】
培養液とＬＤＳサンプルバッファーを３：１の比で混合し、混合サンプル３０μＬを４〜１２％ビス−トリス（ＢＴ）ゲル上にロードし、１５０ボルトで約１時間泳動した。泳動が完了したゲルをニトロセルロース（ＮＣ）メンブレンに移し、ブロッキングバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に１時間静置した。第ＶＩＩＩ因子の重鎖を認識する一次抗体（ＧＭＡ−０１２、Ｇｒｅｅｎ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、軽鎖を認識する一次抗体（ａｂ４１１８８、Ａｂｃａｍ）およびＤ’Ｄ３を認識する一次抗体（９６３４０、Ａｂｃａｍ）を、ＴＢＳＴバッファーで希釈することによって調製し、ブロッキングを完了したＮＣメンブレンと１時間反応させた。得られたＮＣメンブレンを、ＴＢＳＴバッファーを用いて５分間隔で３回洗浄した。二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート）をＴＢＳＴバッファーで希釈することによって調製し、１０分間ＮＣメンブレンと反応させた。得られたＮＣメンブレンを、ＴＢＳＴバッファーを用いて５分間隔で５回洗浄した。ＮＣメンブレンを発色させるためにＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを散布して、該メンブレンをＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に曝し、暗室中で発色させた。
【０１６５】
その結果、一本鎖で発現しているキメラＦＶＩＩＩは全て本発明の設計通りに発現しており、リンカーの長さによって発現パターンが変化していないことが確認された（図５）。
【０１６６】
実施例４．キメラＦＶＩＩＩ産生
キメラＦＶＩＩＩの産生プロセスは、大きく５つのステップから成る。実施例２の培養に用いた培養液を用いて、精製を実施した。
【０１６７】
第１のステップでは、ＧＥ社が精製用に開発したＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂を用いて、培養培地からのキメラＦＶＩＩＩの分離および精製のプロセスを実施した。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔ樹脂をカラムに充填し、カラムを２％クエン酸で洗浄した。平衡バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０２％ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．０）を流して、カラムを平衡化した。５Ｍ ＮａＣｌバッファーを最終濃度１Ｍ ＮａＣｌになるまで培養液に添加し、次いでこれをｐＨ７．０に滴定し、カラムにロードした。培養液をロードした後、ＵＶがベースラインに下がるまで平衡バッファーを流して平衡化した。キメラＦＶＩＩＩを、溶出バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．９Ｍアルギニン、４５％プロピレングリコール、０．０２％ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ６．５）を流すことにより溶出した。
【０１６８】
第２のステップでは、ＧＥ社製Ｑファーストフロー（Q fast flow）樹脂を用いて、第１のステップの溶出液中に混入しているプロピレングリコールを除去し、混入した不純物を除去するステップを実施した。Ｑファーストフロー樹脂をカラムに充填した後、洗浄バッファー（０．５Ｍ ＮａＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ）を流すことによってカラムを洗浄した。平衡バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０２％ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．０）を流して平衡化した。ＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔプロセスの溶出液を、平衡バッファーによって１０倍に希釈し、ｐＨ７．０に滴定した後、カラムにロードした。ロードした後、ＵＶがベースラインに下がるまで平衡バッファーを流して平衡化した。キメラＦＶＩＩＩを、溶出バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．０）を流すことにより溶出した。
【０１６９】
第３のステップでは、精製したキメラＦＶＩＩＩをＰＥＧとコンジュゲートさせるプロセスを実施した。ＴＣＥＰを精製したキメラＦＶＩＩＩ溶液に最終濃度０．１ｍＭになるまで添加し、４℃で１時間静置して挿入されたシステインを還元させた。ペグ化バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ ＣａＣｌ２、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（GE healthcare）を用いて残留ＴＣＥＰを除去した。４℃で２時間静置して、還元型キメラＦＶＩＩＩ自体のジスルフィド結合を酸化させた。ＰＥＧ対タンパク質の比が１：２０となるように、ＤＭＳＯに溶解したＰＥＧ溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）を添加することによってＰＥＧコンジュゲートを実施し、次いで４℃で１２〜１６時間静置した。
【０１７０】
第４のステップでは、ペグ化プロセス中に形成された不純物である、ＰＥＧを含まないキメラＦＶＩＩＩおよび２つ以上のＰＥＧを含むキメラＦＶＩＩＩを除去するプロセスを、ＧＥ社のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００樹脂を用いて実施した。予め充填されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを平衡化バッファー（２０ｍＭヒスチジン、５ｍＭ ＣａＣｌ ２、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．０）を流すことによって平衡化した。サンプルループを使用して、ペグ化プロセスサンプルをカラムにロードした。ロード後、平衡バッファーを流してピークを回収し、適切な画分をプールするためにＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析を実施した。
【０１７１】
第５のステップでは、第４のステップでプールした、ペグ化されたキメラＦＶＩＩＩを濃縮するプロセスを実施した。本プロセスでは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＡｍｉｃｏｎ  ３０ｋＤａを使用してＦＶＩＩＩを２５ＩＵ／ｍＬの濃度に濃縮した。
【０１７２】
精製およびペグ化の程度を解析するために、本プロセスの中間サンプルおよび最終サンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した（図４および図６）。ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３の場合、リンカー長が異なるサンプルの精製パターンがほぼ同様であることが確認された。第１のプロセスであるＶＩＩＩＳｅｌｅｃｔプロセスではほとんどのＨＣＰが除去され、第２のプロセスであるＱ  ＦＦプロセスでは単量体形態のｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３のみが精製されたことがわかった。その後、ペグ化プロセスを行った後、サンプルを精製し、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３のみが精製されたことを確認した。
【０１７３】
実施例５．キメラＦＶＩＩＩ物質の比活性の確認
キメラＦＶＩＩＩの比活性を確認するために、キメラＦＶＩＩＩ活性を発色法により測定し、キメラＦＶＩＩＩタンパク質の量をＢＳＡを標準物質として用いるＢＣＡ法により測定した。比活性を、活性測定の結果をタンパク質の量で割ることによって測定した。結果を表４に示す。
【表４】
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【０１７４】
ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３の場合、リンカーの長さを変えても比活性の値に有意差は見られず、本実施例で測定した比活性は他の組換え型ＦＶＩＩＩの比活性と同様であることが確認された。
【０１７５】
実施例６．キメラＦＶＩＩＩの、ＬＲＰまたはｖＷＦへの結合親和性の測定
ＬＲＰまたはｖＷＦに対するキメラＦＶＩＩＩの結合親和性を、ＥＬＩＳＡ法により測定した。ｖＷＷＦ（ＨＣＶＷＦ−０１９１、Ｈａｅｍｔｅｃｈ、２００μｇ／ｍＬ）またはＬＲＰ（＃０４−０３、Ｂｉｏｍａｃ、２６０μｇ／ｍＬ）を９６ウェルプレート上に１ウェルあたり１００μＬの量でコーティングし、室温で２時間静置させた。２時間インキュベートした後、ＰＢＳに０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を加えて作製した洗浄バッファーでウェルを洗浄した。ブロッキングは、ＰＢＳに１％ＢＳＡを加えて作製したブロッキングバッファー２００μＬを各ウェルに加えた後、室温で１時間インキュベートすることにより実施した。１時間インキュベートした後、ＰＢＳに０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を加えて作製した洗浄バッファーでウェルを洗浄した。ブロッキングバッファーを用いてＦＶＩＩＩサンプルを適切な濃度に希釈し、１ウェルあたり１００μＬの量でウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳに０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加した洗浄バッファーでウェルを洗浄した。抗第ＶＩＩＩ因子ビオチン（ＳＡＦ８Ｃ−ＡＰＢＩＯ、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、１００μｇ／ｍＬ）をブロッキングバッファーを用いて１／２０００に希釈し、１ウェルあたり１００μＬの量でウェルに添加し、室温で１時間静置した。ＰＢＳに０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加して作製した洗浄バッファーでウェルを洗浄した。
【０１７６】
ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｓ２４３８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をブロッキングバッファーを用いて１／３０００に希釈し、１ウェルあたり１００μＬの量でウェルに添加し、室温で４５分間インキュベートした。ＰＢＳに０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を添加して作製した洗浄バッファーでウェルを洗浄した。１ウェルあたり１００μＬの量のＴＭＢ基質（５２−００−０３、ＫＰＬ）でウェルを処理した後、１０分間インキュベートした。停止溶液（１Ｎ硫酸）をウェル当たり１００μＬの量でウェルに入れて反応を停止させ、４９０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１７７】
実験の結果、ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）と比較して、キメラＦＶＩＩＩのＬＲＰまたはｖＷＦへの結合が有意に低下していることが確認された。さらに、キメラＦＶＩＩＩがペグ化された場合には、ＬＲＰまたはｖＷＦへの結合がさらに低下することが確認された（図７および８）。
【０１７８】
実施例７．動物薬物動態（ＰＫ）試験：ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０
体内でのペグ化されたキメラＦＶＩＩＩの半減期を測定するために、血友病Ａマウスモデル（ＨＡマウス）を用いたＰＫ試験を行った。ＨＡマウスとして８週齢のマウス（２０±２ｇ）を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした（ｎ＝３／時点）。続いて、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）（コントロール）およびペグ化されたキメラＦＶＩＩＩ（本実施例ではＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０を使用）を１２５ＩＵ／ｋｇの用量で一回、静脈内投与した。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）投与群では、投与後０、０．０８３、２、６、９、１６、２２、および３０時間で、また、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０投与群では、投与後０、０．０８３、２、６、１６、３０、４０、４８、６４、および７２時間で、血液を２００μｌサンプリングすることにより、ＰＫ血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤（クエン酸ナトリウム３．２％バッファー）と１：９の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Ａｄｖａｔｅ（登録商標）およびＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０の力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェア（バージョン６．４）の非コンパートメント（ＮＣＡ）モデルを用いて計算した。ＰＫアッセイの結果（図９）、測定したＡｄｖａｔｅ（登録商標）の半減期は約７．８６時間であり、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０の半減期は２６．１２時間であり、これはＡｄｖａｔｅ（登録商標）の３．３倍であった。ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０の平均滞留時間（ＭＲＴ）も、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）と比較して３．６倍増加した。さらに、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０の消失率（ＣＬ）はＡｄｖａｔｅ（登録商標）と比較して約２倍減少し、曲線下面積（ＡＵＣ）は約２倍増加した。
【表５】
2019522977.tif 000009
【０１７９】
実際の予防療法では、血中のＦＶＩＩＩ濃度が１％または３％以上に保たれているため、半減期の長い持続性ＦＶＩＩＩを使用することによって血中のＦＶＩＩＩ濃度が１％または３％以下になる時点を遅らせることができ、これは投与頻度の減少に繋がる。これまでに開発された持続性ＦＶＩＩＩの場合、ＨＡマウスにおける半減期は、コントロールと比較して２倍以下で延長された。これは、上述にようにＦＶＩＩＩがｖＷＦと強力に非共有結合した状態で血中を循環するため、ＦＶＩＩＩの半減期がｖＷＦの半減期より長くならなかったことを示唆する。本発明で開発されたキメラＦＶＩＩＩは血中でのｖＷＦとの結合を阻害し、また、ＬＲＰによるキメラＦＶＩＩＩのクリアランスも防ぐため、本発明で開発されたキメラＦＶＩＩＩの半減期は比較すると２倍以上延長されたと考えられ、これは、これまでに開発された持続性ＦＶＩＩＩが達成できなかったレベルである。これは非常に意味のある結果と考えられている。
【０１８０】
実施例８．動物ＰＫ試験：様々なサイズのＰＥＧとコンジュゲートしたｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０
実施例７と同様に、血友病Ａ型マウスモデル（ＨＡマウス）を用いたＰＫ試験を実施した。ＨＡマウスとして８週齢のマウス（２０±２ｇ）を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした（ｎ＝３／時点）。続いて、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、コントロール、およびペグ化されたキメラＦＶＩＩＩを１２５ＩＵ／ｋｇの用量で一回、静脈内投与した。本実施例では、異なるサイズのＰＥＧとコンジュゲートしたｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０を用いて、ＰＫ試験を行った。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）投与群（コントロール）では、投与後０、０．０８３、２、６、９、１６、２２、および３０時間で、また、試験群では、投与後０、０．０８３、２、６、１６、３０、４０、４８、６４、７２、および９６時間で、血液を２００μｌサンプリングすることにより、ＰＫ血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤（クエン酸ナトリウム３．２％バッファー）と１：９の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Ａｄｖａｔｅ（登録商標）およびキメラＦＶＩＩＩの力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェア（バージョン６．４）の非コンパートメント（ＮＣＡ）モデルを用いて計算した。
【０１８１】
ＰＫアッセイの結果、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、４０ｋＤａ  ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０、および６０ｋＤａ  ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０の測定した半減期は、それぞれ、約７．８８時間、約２０．９３時間、および約２８．０９時間であった。薬物動態プロファイルおよび薬物動態パラメータを、図１０および表６に示す。
【表６】
2019522977.tif 000010
【０１８２】
実施例９：動物ＰＫ試験：ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−６０およびＦｃと融合したｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０へのＰＥＧのコンジュゲート
血友病Ａマウスモデル（ＨＡマウス）を用いたＰＫ試験を実施した。ＨＡマウスとして８週齢のマウス（２０±２ｇ）を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした（ｎ＝３／時点）。続いて、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、コントロール、およびペグ化されたキメラＦＶＩＩＩを１２５ＩＵ／ｋｇの用量で一回、静脈内投与した。本実施例では、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−６０およびＦｃと融合したｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０にＰＥＧをコンジュゲートさせることにより得られた物質を用いて、ＰＫ試験を行った。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）投与群（コントロール）では、投与後０、０．０８３、２、６、９、１６、２２、および３０時間で、また、試験群では、投与後０、０．０８３、２、６、１６、３０、４０、４８、６４、７２、および９６時間で、血液を２００μｌサンプリングすることにより、血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤（クエン酸ナトリウム３．２％バッファー）と１：９の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Ａｄｖａｔｅ（登録商標）およびキメラＦＶＩＩＩの力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェア（バージョン６．４）の非コンパートメント（ＮＣＡ）モデルを用いて計算した。
【０１８３】
ＰＫアッセイの結果、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−６０、およびＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３／Ｆｃ−１２０，Ｆｃの測定した半減期は、それぞれ、約７．０８時間、約１６．５３時間、および約１８．８９時間であった。薬物動態プロファイルおよび薬物動態パラメータを、図１１および表７に示す。
【表７】
2019522977.tif 000011
【０１８４】
実施例１０．動物ＰＫ試験：ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−３００およびＦＶＩＩＩが二量体形態のＤ’Ｄ３にＣ末端で融合しているｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０へのＰＥＧのコンジュゲート
血友病Ａマウスモデル（ＨＡマウス）を用いたＰＫ試験を実施した。ＨＡマウスとして８週齢のマウス（２０±２ｇ）を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした（ｎ＝３／時点）。続いて、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、コントロール、およびペグ化されたキメラＦＶＩＩＩを１２５ＩＵ／ｋｇの用量で一回、静脈内投与した。本実施例では、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−３００およびＦＶＩＩＩが二量体形態のＤ’Ｄ３にＣ末端で融合しているｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０にＰＥＧをコンジュゲートさせることにより得られた物質を用いて、ＰＫ試験を行った。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）投与群（コントロール）では、投与後０、０．０８３、２、６、９、１６、２２、および３０時間で、また、試験群では、投与後０、０．０８３、２、６、１６、３０、４０、４８、６４、７２、および９６時間で、血液を２００μｌサンプリングすることにより、ＰＫ血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤（クエン酸ナトリウム３．２％バッファー）と１：９の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Ａｄｖａｔｅ（登録商標）およびキメラＦＶＩＩＩの力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェア（バージョン６．４）の非コンパートメント（ＮＣＡ）モデルを用いて計算した。
【０１８５】
ＰＫアッセイの結果、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−３００、およびＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３／Ｄ’Ｄ３−１２０の測定した半減期は、それぞれ、約９．０２時間、約１５．７６時間、および約１８．００時間であった。薬物動態プロファイルおよび薬物動態パラメータを、図１２および表８に示す。
【表８】
2019522977.tif 000012
【０１８６】
実施例１１．動物ＰＫ試験：ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−６０、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０、およびＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−３００
血友病Ａマウスモデル（ＨＡマウス）を用いたＰＫ試験を実施した。ＨＡマウスとして８週齢のマウス（２０±２ｇ）を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした（ｎ＝３／時点）。続いて、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、コントロール、およびペグ化されたキメラＦＶＩＩＩを１２５ＩＵ／ｋｇの用量で一回、静脈内投与した。本実施例では、ＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−６０、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０およびＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−３００を用いて、ＰＫ試験を行った。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）投与群（コントロール）では、投与後０、０．０８３、２、６、９、１６、２２、および３０時間で、また、試験群では、投与後０、０．０８３、２、６、１６、３０、４０、４８、６４、７２、および９６時間で、血液を２００μｌサンプリングすることにより、血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤（クエン酸ナトリウム３．２％バッファー）と１：９の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Ａｄｖａｔｅ（登録商標）およびキメラＦＶＩＩＩの力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェア（バージョン６．４）の非コンパートメント（ＮＣＡ）モデルを用いて計算した。
【０１８７】
ＰＫアッセイの結果、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）の測定した半減期は約６．９９時間であり、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−６０、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０およびＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−３００の測定した半減期は、それぞれ、約２０．０７、２４．４８、および１７．１３時間であった。薬物動態プロファイルおよび薬物動態パラメータを、図１３および表９に示す。
【表９】
2019522977.tif 000013
【０１８８】
実施例１２．動物ＰＫ試験:ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１、およびＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ２
血友病Ａマウスモデル（ＨＡマウス）を用いたＰＫ試験を実施した。ＨＡマウスとして８週齢のマウス（２０±２ｇ）を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした（ｎ＝３／時点）。続いて、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、コントロール、およびペグ化されたキメラＦＶＩＩＩを１２５ＩＵ／ｋｇの用量で一回、静脈内投与した。本実施例では、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１、およびＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’３−１２０−ＴＨ２を用いて、ＰＫ試験を行った。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）投与群（コントロール）では、投与後０、０．０８３、２、６、９、１６、２２、および３０時間で、また、試験群では、投与後０、０．０８３、２、６、１６、３０、４０、４８、６４、７２、および９６時間で、血液を２００μｌサンプリングすることにより、血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤（クエン酸ナトリウム３．２％バッファー）と１：９の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Ａｄｖａｔｅ（登録商標）およびキメラＦＶＩＩＩの力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェア（バージョン６．４）の非コンパートメント（ＮＣＡ）モデルを用いて計算した。
【０１８９】
ＰＫアッセイの結果、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）の測定した半減期は約６．２６時間であり、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０、ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１、およびＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’３−１２０−ＴＨ２の測定した半減期は、それぞれ、約２１．２８、２４．１９、および２５．２８時間であった。薬物動態プロファイルおよび薬物動態パラメータを、図１４および表１０に示す。
【表１０】
2019522977.tif 000014
【０１９０】
実施例１３．動物ＰＫ試験：様々なサイズおよび形態のＰＥＧとコンジュゲートしたｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１
血友病Ａマウスモデル（ＨＡマウス）を用いたＰＫ試験を実施した。ＨＡマウスとして８週齢のマウス（２０±２ｇ）を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした（ｎ＝３／時点）。続いて、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、コントロール、およびペグ化されたキメラＦＶＩＩＩを１２５ＩＵ／ｋｇの用量で一回、静脈内投与した。本実施例では、様々なＰＥＧをｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１にコンジュゲートさせることにより得られた物質を用いて、ＰＫ試験を行った。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）投与群（コントロール）では、投与後０、０．０８３、２、６、９、１６、２２、および３０時間で、また、試験群では、投与後０、０．０８３、２、６、１６、３０、４０、４８、６４、７２、および９６時間で、血液を２００μｌサンプリングすることにより、血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤（クエン酸ナトリウム３．２％バッファー）と１：９の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Ａｄｖａｔｅ（登録商標）およびキメラＦＶＩＩＩの力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェア（バージョン６．４）の非コンパートメント（ＮＣＡ）モデルを用いて計算した。
【０１９１】
ＰＫアッセイの結果、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）の測定した半減期は約７．６６時間であり、２０ｋＤａ直鎖型（ｌｉｎｅａｒ）ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１、２０ｋＤａ分岐鎖型（ｂｒａｎｃｈ）ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１、４０ｋＤａ分岐鎖型（ｂｒａｎｃｈ）ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１の測定した半減期は、それぞれ、約２２．９８、１６．１０、および２７．３３時間であった。薬物動態プロファイルおよび薬物動態パラメータを、図１５および表１１に示す。
【表１１】
2019522977.tif 000015
【０１９２】
実施例１４．トロンビン生成アッセイ
ペグ化されたキメラＦＶＩＩＩのトロンビン生成プロファイルを調べるために、トロンビン生成アッセイを行った。Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ（商標）ＦＬマイクロプレート蛍光光度計およびルミノメーター（５２１０４６０、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）装置を３７℃に予熱し、機器のラインを３７℃に予熱した蒸留水（ＤＷ）で洗浄した。ＦＶＩＩＩ欠損血漿（ＯＴＸＷ１７、Ｓｉｅｍｅｎｓ）、検量用試料（ＴＳ２０．００、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）、およびＰＰＰ−ｌｏｗ−ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＳ３１．００、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）を、室温で１５分以上放置して温めた後、１ｍＬの３７℃に予熱した蒸留水（ＤＷ）で溶解した。サンプルを、予め調製したＦＶＩＩＩ血漿を用いて、適切な濃度に希釈した。ＦｌｕＣａ−Ｋｉｔ（ＴＳ５０．００、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ）中のＦｌｕｏバッファーを、３７℃に温めることによって調製した。調製した試料をそれぞれ８０μＬずつＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ装置のプレートに加え、４０μＬのＦｌｕｏ基質を、３７℃に温めたＦｌｕｏバッファーの入った１つのバイアルに入れた。調製したＦｌｕ−Ｃａを該機器に入れた後、予めプログラムしたソフトウェアを用いて１ウェルあたり２０μＬになるようにＦｌｕ−Ｃａを分注し、トロンビン生成を進めた。
【０１９３】
トロンビン生成アッセイは、トロンビン生成プロファイルがＦＶＩＩＩ欠損血漿において有意に低いが、一方でキメラＦＶＩＩＩにおけるトロンビン生成プロファイルは、濃度依存的に徐々に増加したことを示した。キメラＦＶＩＩＩ  １ＩＵ／ｍＬのトロンビン生成プロファイルは、正常な血漿のトロンビン生成プロファイルと同様であった（図１６）。
【０１９４】
実施例１５．動物急性有効性試験
キメラＦＶＩＩＩの有効性を調べるために、血友病Ａ型マウス（ＨＡマウス）の尾切断モデルを用いて急性有効性試験を行った。野生型マウス（ＷＴ）については、Ｏｒｉｅｎｔ  Ｂｉｏによって提供された体重１９〜２５ｇの雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用した。ＨＡマウスについては、Ｇｒｅｅｎ  Ｃｒｏｓｓによって提供された体重１９〜２５ｇの雄のマウスを選択して使用した。試験当日、１５ｍＬコニカルチューブ（マウス１匹あたり１つ）に生理食塩水を１４ｍＬまで充填した後、生理食塩水の温度を３７℃で維持するためにチューブを加熱したウォーターバス中で保管し、投与前のマウスの体重を測定した。ペントバルビタールナトリウムを６０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内（ＩＰ）投与して麻酔した後、０．９％の生理食塩水（ネガティブコントロール）、またはＡｄｖａｔｅ（登録商標）（ポジティブコントロール）およびペグ化されたキメラＦＶＩＩＩを、頸静脈に、一用量５ｍＬ／ｋｇの容量で、１００ＩＵ／ｋｇの用量を投与した。５分後に、ＨＡマウスの尾を尾の端から４ｍｍの位置で切断し、尾を生理食塩水バッファーに３０分間入れて採血した。３０分間採取した血液サンプルを１５００ｇで５分間遠心分離して上清を除去した後、１０ｍＬピペットを用いて三次蒸留水（ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）１０ｍＬをコニカルチューブに添加し、血液をボルテックスを用いて完全に溶血させた。失血量（blood loss）を測定するために、溶血させたサンプルをヘモグロビンアッセイキット（ＭＡＫ１１５−１ＫＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて解析した。
【０１９５】
ヘモグロビンの濃度は、野生型マウス（ＷＴ）では約１００ｎＭ、ネガティブコントロールであるＨＡマウス（ＫＯ）では約１，０００ｎＭであった。Ａｄｖａｔｅ（登録商標）およびペグ化されたキメラＦＶＩＩＩは、ネガティブコントロールより約５５％低い、約１４０〜４５０ｎＭのヘモグロビン濃度を示すことがわかった。Ａｄｖａｔｅ（登録商標）とペグ化されたキメラＦＶＩＩＩとの間には、統計的に有意な差がないことがわかった（図１７）。
【０１９６】
実施例１６．動物ＰＫ試験：ＣＨＯ細胞で発現されたｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１への様々なサイズおよび形態のＰＥＧのコンジュゲート
血友病Ａマウスモデル（ＨＡマウス）を用いたＰＫ試験を実施した。ＨＡマウスとして８週齢のマウス（２０±２ｇ）を使用し、投与前に体重測定に供して、その後グループ分けした（ｎ＝３／時点）。続いて、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）、コントロール、およびペグ化されたキメラＦＶＩＩＩを１２５ＩＵ／ｋｇの用量で一回、静脈内投与した。本実施例では、ＣＨＯ細胞で発現されたｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１に様々なＰＥＧをコンジュゲートさせることにより得られた物質を用いて、ＰＫ試験を行った。ＡＤＶＡＴＥ（登録商標）投与群（コントロール）では、投与後０、０．０８３、２、６、９、１６、２２、および３０時間で、また、試験群では、投与後０、０．０８３、２、６、１６、３０、４０、４８、６４、７２、および９６時間で、血液を２００μｌサンプリングすることにより、血液サンプルを回収した。サンプリング直後に、サンプルを抗凝固剤（クエン酸ナトリウム３．２％バッファー）と１：９の体積比で混合し、遠心分離して血漿を分離した。Ａｄｖａｔｅ（登録商標）およびキメラＦＶＩＩＩの力価を発色法を用いて測定し、薬物動態パラメータをＷｉｎＮｏｎＬｉｎソフトウェア（バージョン６．４）の非コンパートメント（ＮＣＡ）モデルを用いて計算した。
【０１９７】
ＰＫアッセイの結果、Ａｄｖａｔｅ（登録商標）の測定した半減期は約８．２２時間であり、２０ｋＤａ直鎖型（ｌｉｎｅａｒ）ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’Ｄ３−１２０−ＴＨ１および４０ｋＤａ直鎖型（ｌｉｎｅａｒ）ＰＥＧ−ｓｃＦＶＩＩＩ／Ｄ’３−１２０−ＴＨ１の測定した半減期は、それぞれ、約２５．０１および２６．８８時間であった。薬物動態プロファイルおよび薬物動態パラメータを、図１８および表１２に示す。
【表１２】
2019522977.tif 000016
【０１９８】
本発明を例示的な実施形態に関連して説明してきたが、本開示は開示された実施形態に限定されず、本発明の基本概念を使用した様々な変更および改良を網羅することを意図していることが、理解されるべきである。
【０１９９】
本発明において使用された全ての技術用語は、他に特定されない限り、当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。参考文献として本明細書に開示されている全ての刊行物の内容が、本発明に組み込まれる。
【図１】
2019522977.tif 000017
【図２ａ】
2019522977.tif 000018
【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019522977.tif 000024
【図８】
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【図９】
2019522977.tif 000026
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
2019522977000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年3月5日(2019.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖および重鎖を含むヒト第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）であって、その全長が完全に欠失しているかまたは部分的に欠失しているＢドメインを含むヒトＦＶＩＩＩ；および
少なくとも１つのｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインを含むキメラタンパク質であって、
軽鎖および重鎖が、１つのポリペプチドまたは２つのポリペプチドとして発現され、
軽鎖および重鎖が１つのポリペプチドとして発現される場合、キメラタンパク質は、ＦＶＩＩＩとｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインとをつなぎ、かつ、その間に位置する酵素切断部位を有するリンカーを含み、ここで、ＦＶＩＩＩおよびｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインは、リンカーを基準にして、それぞれＮ末端方向およびＣ末端方向に位置しているか、または、それぞれＣ末端方向およびＮ末端方向に位置している；および、
軽鎖および重鎖が２つのポリペプチドとして発現される場合、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインのＮ末端が、重鎖に含有されるＢドメインのＣ末端に連結している、キメラタンパク質。
【請求項２】
部分的に欠失しているＢドメインが、配列番号１の１６４８および１６４９の残基位置に基づいて、Ｎ末端方向および／またはＣ末端方向のそれぞれに少なくとも５つのアミノ酸欠失を有し、該欠失が、１６４８および１６４９の残基を含む；または、４〜６つのグリケーション部位を含むように、Ｂドメインが部分的に欠失している、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項３】
部分的に欠失しているＢドメインが、配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基７４１〜９０２および１６５４〜１６８９、または、アミノ酸残基７４１〜９３６の配列で表される、請求項１または２に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
２つのｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインを含み、ここで、２つのｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインが、酵素切断部位を有する、または有さないリンカーにより連結している、および／または、そこでの共有結合により二量体を形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
さらに少なくとも１つのＦｃを含み、ここで、Ｆｃが、酵素切断部位を有する、または有さないリンカーにより、ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインおよび／またはＦＶＩＩＩに連結している、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項６】
２つのＦｃを含み、ここで、２つのＦｃが、酵素切断部位を有する、または有さないリンカーにより連結している、および／または、それらの間の共有結合により二量体を形成する、請求項５に記載のキメラタンパク質。
【請求項７】
酵素切断部位が、トロンビン、ＦＶＩＩａ、ＦＸａ、またはＦＸＩａにより切断され得る配列である；および
酵素切断部位を有するリンカーの他の配列が、［Ｇ４Ｓ］ｎのアミノ酸配列により表され、式中、ｎは０、または１〜１００の整数である、
請求項１〜６のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項８】
ｎが４、６、８、１０、１６、２１、２２または５８である、請求項７に記載のキメラタンパク質。
【請求項９】
トロンビンにより切断され得るアミノ酸配列が、ＤＦＬＡＥＧＧＧＶＲ（配列番号３６）、ＴＴＫＩＫＰＲ（配列番号３７）、またはＬＶＰＲＧＳ（配列番号３８）であり；ＦＶＩＩａにより切断され得るアミノ酸配列が、ＡＳＫＰＱＧＲＩＶＧＧ（配列番号３９）であり；ＦＸａにより切断され得るアミノ酸配列が、ＩＤＧＲ（配列番号４０）またはＩＥＧＲ（配列番号４１）であり；ＦＸＩａにより切断され得る配列が、ＳＫＬＴＲＡＥＴＶＦ（配列番号４２）である、請求項７に記載のキメラタンパク質。
【請求項１０】
２つのポリペプチドが、第１および第２のポリペプチドであり、ここで、
第１のポリペプチドがＦＶＩＩＩの重鎖およびＢドメインの全部または一部を含み、かつ、第２のポリペプチドがＦＶＩＩＩの軽鎖またはＢドメインの一部を含み；
ｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインが、第１のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端方向、または、第２のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端方向に位置し；かつ
場合により、キメラタンパク質がさらに、少なくとも１つのＦｃを含み、ＦｃがｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインおよび／または第２のポリペプチドに連結している、
請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項１１】
第１のポリペプチドが、ＦＶＩＩＩの重鎖およびＢドメインの一部を含み、Ｂドメインの一部が、配列番号１に基づくアミノ酸残基７４１〜９３６のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のキメラタンパク質。
【請求項１２】
２つ以上のｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインを含み、２つ以上のｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインが酵素切断部位を有する、または有さないリンカーにより連結している、および／またはｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインが該ドメイン間の共有結合により複合体を形成する、請求項１０に記載のキメラタンパク質。
【請求項１３】
ＦｃまたはｖＷＦのＤ’Ｄ３ドメインが、酵素切断部位を有する、または有さないリンカーにより連結している、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１４】
１つのポリペプチドとして発現されるキメラタンパク質が、配列番号６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、もしくは２５により表されるアミノ酸配列、または、前記アミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のキメラタンパク質。
【請求項１５】
２つのポリペプチドとして発現されるキメラタンパク質が、配列番号４および５（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号２３および２４（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号２６および２７（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号２８および２９（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号３０および３１（それぞれ、重鎖および軽鎖）、配列番号３２、および３３（それぞれ、重鎖および軽鎖）、もしくは配列番号３４および３５（それぞれ、重鎖および軽鎖）により表されるアミノ酸配列、または、該アミノ酸配列に少なくとも９０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載のキメラタンパク質。
【請求項１６】
ＦＶＩＩＩがＡおよび／またはＢドメイン断片の１つ以上のアミノ酸残基で親水性ポリマーにコンジュゲートしており、コンジュゲート位置が、Ｂドメイン中の配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基７５４、７８１、７８２、７８８、７８９、８２５、および８９７からなる群から選択される少なくとも１つ、および／または、Ａドメイン中の配列番号１の配列に基づくアミノ酸残基４９１、４９５、４９８および１８０６からなる群から選択される少なくとも１つであり、かつ、コンジュゲート位置の１つ以上の残基が親水性ポリマーとのコンジュゲートのためにシステインで置換されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項１７】
親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド、デキストランであり、ＰＥＧが、コンジュゲート位置で、アクリロイル、スルホンまたはマレイミドを介して連結されている、請求項１６に記載のキメラタンパク質。
【請求項１８】
ＦＶＩＩＩが、Ｂドメイン断片の１つ以上のアミノ酸残基で、親水性ポリマーにコンジュゲートし、コンジュゲート位置がアミノ酸残基７８２である、請求項１６または１７に記載のキメラタンパク質。
【請求項１９】
ＰＥＧが平均分子量２０ｋＤａ以上を有する、請求項１７または１８に記載のキメラタンパク質。
【請求項２０】
ＰＥＧが平均分子量４０ｋＤａまたは６０ｋＤａを有する、請求項１９に記載のキメラタンパク質。
【請求項２１】
野生型ＦＶＩＩＩタンパク質と比較して、少なくとも２倍延長された半減期を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のキメラタンパク質。
【請求項２２】
請求項１４に記載のキメラタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２３】
請求項１５に記載のキメラタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項２４】
配列番号４８〜６４、６６、または７０で表される、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２５】
核酸分子が配列番号４６、４７、６８、６９、または７１〜８０で表される、請求項２３に記載の核酸分子。
【請求項２６】
請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２８】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２６に記載のベクター、または、請求項２７に記載の細胞を含む、血友病を治療するための医薬組成物。
【請求項２９】
血友病が血友病Aである、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載のキメラタンパク質、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項２６に記載のベクター、または、請求項２７に記載の細胞を含む、血液凝固のための医薬組成物。
【請求項３１】
薬理的に許容される担体をさらに含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
１日に１回またはより間隔を空けて、好ましくは週に１回、または特に１ヶ月に１回、投与され得るような半減期を有する、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
別の実施形態において、本発明のキメラタンパク質において、酵素切断部位を含むリンカーが用いられる場合、酵素切断部位は、トロンビン、ＦＶＩＩａ、ＦＸａまたはＦＸＩａにより切断され得る配列であり、酵素切断部位を有するリンカーの他の配列は、［Ｇ４Ｓ］ｎのアミノ酸配列により表され、式中、ｎは０、または１〜１００の整数であり、特にｎは４、６、８、１０、１６、２１、２２または５８である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
一実施形態において、本発明のキメラタンパク質に含まれるＦＶＩＩＩおよびＤ’Ｄ３ドメインは、［Ｇ４Ｓ］ｎ（Ｇはグリシン、Ｓはセリン、およびｎは１〜１００の間の整数である）のアミノ酸配列により表されるリンカーによって連結されてよく、リンカーは酵素切断部位を含む。リンカーは、Ｄ’Ｄ３およびＦＶＩＩＩをつなぎ、Ｄ’Ｄ３がＦＶＩＩＩのｖＷＦ結合部位に正確に結合するための柔軟性を提供する機能を有する。具体的には、Ｄ’Ｄ３がＦＶＩＩＩに融合できる位置は、ＦＶＩＩＩ重鎖のＮ末端またはＣ末端、または、ＦＶＩＩＩ軽鎖のＮ末端またはＣ末端である。Ｄ’Ｄ３ドメインのＮ末端に対応するＤ’ドメインがＦＶＩＩＩのＡ３ドメイン部分に結合し、Ｄ３ドメインがＦＶＩＩＩのＣ２ドメイン部分に結合することを考慮すると、Ｄ’Ｄ３がＦＶＩＩＩ軽鎖のＣ末端に融合している場合に、Ｄ’ドメインとＦＶＩＩＩのＡ３ドメインとの間の距離が最大であることが決定された。従って、Ｄ’Ｄ３がＦＶＩＩＩに融合される際、Ｄ’Ｄ３がＦＶＩＩＩに適切に結合することを可能にするために柔軟性のあるリンカーを選択した。以前に報告されたＦＶＩＩＩの結晶構造に基づいて、Ｃ２ドメインのＣ末端からＡ３ドメインのＮ末端までの直線距離を測定し、その距離をアミノ酸の数に変換することによってリンカーの長さを選択した。したがって、リンカーの長さが上記の直線距離より短い場合、Ｄ’ドメインはＦＶＩＩＩのＡ３ドメインに達することができず、よって、リンカーの長さが短すぎる場合、Ｄ’Ｄ３はＦＶＩＩＩ結合部位に正確に結合することができない。ゆえに、上記条件を満たす十分な長さを有するリンカーが必要とされる。リンカーの最適な長さは、Ｄ’Ｄ３が融合している場所に応じて異なり得る。上記の機能を有する限り、様々な長さのリンカーを使用することができる。一実施形態において、ｎは少なくとも４である。別の実施形態において、式中のｎは４、６、８、１０、１６、２１、２２または５８であり得る。
【国際調査報告】
2019522977.tif 000036
2019522977.tif 000037
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2019522977.tif 000039
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