(57)【要約】本明細書では、試料の精製または増幅を必要としない、試料から標的ＤＮＡ配列を検出するための方法及び組成物が開示される。本方法は、断片化、プローブの配列特異的結合または連結、及びナノ細孔センサーを使用した標的配列の選択的検出のためのペイロード分子を使用する。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内に存在すると予想される標的ポリヌクレオチド配列の有無を検出する方法であって、
（ａ）標的配列を含む標的ポリヌクレオチドを含むと予想される試料においてポリヌクレオチドを断片化する工程、
（ｂ）前記試料を、前記標的配列に特異的に結合するよう適合されたプローブに、前記プローブが前記標的配列に結合するのを促進する条件の下で接触させて、ポリヌクレオチド−プローブ複合体を形成する工程、
（ｃ）前記試料を、ナノ細孔、第１チャンバ、及び第２チャンバを含むナノ細孔デバイスにロードする工程であって、前記第１及び第２チャンバは前記ナノ細孔を通して導電性流体を介し電気的且つ流体的に連通しており、前記ナノ細孔デバイスは、前記ナノ細孔を通過する物体を同定するように構成されたセンサーをさらに含む、前記ロードする工程、
（ｄ）前記ナノ細孔全体にわたって電位を印加して、前記ナノ細孔を通る前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の移動を引き起こす工程、及び
（ｅ）前記ナノ細孔を通る前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の前記移動に付随する電気シグナルを検出する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記電気シグナルを分析して、前記試料内の前記標的ポリヌクレオチドの有無を判定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電気シグナルを基準シグナルと比較して、前記試料内の前記標的ポリヌクレオチドの量を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブが、ペイロード分子に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブが、ペイロード結合部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ペイロード結合部分が、化学基、反応基、小分子、またはペプチドを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記小分子が、ビオチンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記反応基が、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）またはアジドを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記反応基が、反応性マレイミド、遊離チオール（チオレート）、または硫黄原子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記電位を印加する前に、ペイロード分子が前記ペイロード結合部分に結合する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料を前記プローブに接触させた後に、前記ペイロード分子が前記ペイロード結合部分に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料を前記プローブに接触させる前に、前記ペイロード分子が前記ペイロード結合部分に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペイロード分子が、デンドリマー、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡアプタマー、フルオロフォア、タンパク質、抗体、ポリペプチド、ナノビーズ、ナノロッド、ナノチューブ、ナノ粒子、フラーレン、ＰＥＧ分子、リポソーム、またはコレステロール−ＤＮＡハイブリッドからなる群から選択される、請求項４または１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペイロード分子が、荷電されている、請求項４または１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記荷電ペイロード分子が、ペプチド、アミノ酸、荷電ナノ粒子、合成分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、金属、及びイオンからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ナノ細孔デバイスによる前記標的ポリヌクレオチドの有無の検出に対する感度または特異度が、前記標的ポリヌクレオチドが前記荷電ペイロード分子と結合した場合、未結合標的ポリヌクレオチドと比較して増加する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペイロード結合部分及び前記ペイロード分子が、共有結合を介して結合される、請求項４または１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記共有結合が、クリックケミストリーによって形成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記クリックケミストリーが、銅触媒である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記クリックケミストリーが、銅フリーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記共有結合が、チオ−エーテル結合を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記チオ−エーテル結合が、マレイミド−チオレート化学反応によって形成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペイロード結合部分と前記ペイロード分子が、非共有結合を介して結合される、請求項４または１０に記載の方法。
【請求項２４】
前記非共有結合が、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、極性結合、カチオン−π相互作用、平面スタッキング相互作用、及び金属結合からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的ポリヌクレオチドの有無の検出に対する感度または特異度が、前記標的ポリヌクレオチドが前記ペイロード分子と結合した場合、未結合標的ポリヌクレオチドと比較して増加する、請求項４または１０に記載の方法。
【請求項２６】
２つ以上のペイロード分子が、前記標的ポリヌクレオチドに結合される、請求項４または１０に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドの前記標的配列への前記プローブの前記特異的結合が、配列特異的連結を介して起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドの断片化が、前記試料を断片化条件に曝すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記断片化条件が、化学的剪断、熱及び２価金属陽イオン、音響剪断、超音波処理、水力学的剪断、噴霧、ニードル剪断、及びフレンチプレスからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチドの断片化が、前記試料を断片化試薬と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記断片化試薬が、制限酵素、部位特異的ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、非特異的ヌクレアーゼ、トランスポサーゼ、及び触媒活性ＤＮＡまたはＲＮＡからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料が、複数の標的ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記プローブを提供することが、
前記複数の標的ポリヌクレオチド−プローブ複合体のそれぞれが前記ナノ細孔を通る移動を受けて固有で検出可能なシグナルを生成するように、標的配列に特異的に結合するよう適合された複数の独自のプローブを提供すること
を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料を前記プローブに接触させることが、前記試料を前記複数の独自のプローブに接触させることを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記電気シグナルを検出することが、前記複数の標的ポリヌクレオチド−プローブ複合体の少なくとも１つの前記移動に付随する電気シグナルを検出することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ナノ細孔デバイスが、少なくとも２つのナノ細孔を含み、前記ナノ細孔デバイスは、独立して制御される電圧を前記少なくとも２つのナノ細孔のそれぞれの全体にわたって印加するように構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも２つのナノ細孔が、直列している、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体を前記デバイス内の少なくとも２つのナノ細孔において同時に捕捉する工程をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記試料が、前記ポリヌクレオチドの前記断片化の前に前記デバイスにロードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料が、前記ポリヌクレオチドの前記断片化の後に前記デバイスにロードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記試料が、前記試料と前記プローブの前記接触の前に前記デバイスにロードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記試料が、前記試料と前記プローブの前記接触の後に前記デバイスにロードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記試料が、精製されない、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記試料が、前記断片化の前、前記試料と前記プローブの接触の前、および前記ナノ細孔における前記検出の前に精製されない、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料が、少なくとも１：２００００、１：１００００、１：５０００、１：２０００、１：１０００、１：５００、１：２００、１：１００、１：５０、１：２０、１：１０、１：５、１：２、１：１．５、１：１．２、１：１．１または１：１．０５の希釈度で前記ナノ細孔デバイスにロードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料が、前記ナノ細孔デバイスに希釈なしにロードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料が、前記ナノ細孔デバイス内で非標的ポリヌクレオチド、断片化反応試薬、及び連結反応試薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記ナノ細孔が、少なくとも直径５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、２０ｎｍ、４０ｎｍ、または５０ｎｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記ナノ細孔が、直径２００ｎｍ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリヌクレオチドの断片化が、配列特異的断片化反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記配列特異的断片化反応が、部位特異的制限酵素またはＣＲＩＳＰＲベースの切断を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリヌクレオチドの断片化が、非配列特異的断片化反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
前記非配列特異的断片化反応が、剪断によって達成される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記プローブを、前記ナノ細孔デバイスの内部空間で前記試料と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的ポリヌクレオチドが、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、または二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的ポリヌクレオチドが、天然に存在するポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
前記標的ポリヌクレオチドが、人工的に合成されたポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
前記標的ポリヌクレオチドが、組換えポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５９】
前記センサーが、
前記ナノ細孔全体にわたって前記電位を生成するようにおよび前記電気シグナルを検出するように構成された、電極対
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６０】
前記ペイロード結合標的ポリヌクレオチドが前記ナノ細孔を通過するときに生成される前記電気シグナルが、バックグラウンド分子の電気シグナルから識別可能である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記電気シグナルが、経時的な電流の測定基準であり、
前記電気シグナルが、その深さの平均値、深さ最大値、持続時間、深さレベルの数、深さと持続時間のエリア、またはノイズレベルで識別可能である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
試料内に存在する標的ポリヌクレオチド配列を定量する方法であって、
（ａ）標的配列を含む標的ポリヌクレオチドを含むと予想される試料においてポリヌクレオチドを断片化する工程、
（ｂ）前記試料を、前記標的配列に特異的に結合するよう適合されたプローブに、前記プローブが前記標的配列に結合するのを促進する条件の下で接触させて、ポリヌクレオチド−プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記試料を、ナノ細孔、第１チャンバ、及び第２チャンバを含むナノ細孔デバイスにロードする工程であって、前記第１及び第２チャンバは前記ナノ細孔を通して導電性流体を介し電気的且つ流体的に連通しており、前記ナノ細孔デバイスは、前記ナノ細孔を通過する物体を同定するように構成されたセンサーをさらに含む、前記ロードする工程、
（ｄ）前記ナノ細孔全体にわたって電位を印加して、前記ナノ細孔を通る前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の移動を引き起こす工程、
（ｅ）前記ナノ細孔を通る前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の前記移動に付随する電気シグナルを検出する工程、及び
（ｆ）前記電気シグナルを分析して、前記試料中の前記標的ポリヌクレオチド配列を定量する工程
を含む、前記方法。
【請求項６３】
前記プローブが、ペイロード分子に結合する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記プローブが、ペイロード結合部分を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記ペイロード分子が、前記試料を前記プローブに接触させた後に前記ペイロード結合部分に結合する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記標的ポリヌクレオチドの前記定量化が、標的イベントと対照イベントの比率を決定することを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記試料が、既知の濃度の標的ポリヌクレオチドを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
既知の濃度の対照ポリヌクレオチドを含む別の試料について前記方法を実行する工程をさらに含み、
前記対照ポリヌクレオチド−プローブ複合体の前記移動に付随する前記電気シグナルは、前記標的ポリヌクレオチドプローブ複合体の前記移動に付随する前記電気シグナルと異なる平均的特徴を有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
前記標的ポリヌクレオチドに特異的に結合するように適合された前記プローブと、前記対照ポリヌクレオチドに特異的に結合するように適合されたプローブとが異なる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
ナノ細孔を含むデバイスであって、前記ナノ細孔は前記デバイスの内部空間を２つの容積に分け、前記デバイスは前記ナノ細孔を通過する物体を同定するように適合された前記ナノ細孔のためのセンサーを含む、前記デバイス、
ポリヌクレオチドの標的配列に特異的に結合するように適合されたプローブ、及び
試料内の前記標的配列の有無を検出するための使用についての説明
を含む、キット。
【請求項７１】
前記プローブが、ペイロード分子に結合する、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
前記プローブが、ペイロード結合部分を含む、請求項７０に記載のキット。
【請求項７３】
前記ペイロード結合部分に結合するよう適合されたペイロード分子をさらに含む、請求項７２に記載のキット。
【請求項７４】
前記ポリヌクレオチドの断片化のための試薬をさらに含む、請求項７０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法１１９（ｅ）に基づき、２０１６年３月３１日に出願された米国仮出願第６２／３１６，４５２号、２０１６年６月２３日出願にされた米国仮出願第６２／３５４，０６８号、及び２０１６年１０月２４日に出願された米国仮出願第６２／４１２，２２１号の利益を主張し、その各内容の全体が参照により援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ナノ細孔デバイスを用いた標的配列検出のための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ある生物に特異的な核酸の検出は、微生物、ウイルス、及び他の感染病原体を同定するのに正確で効果的な方法である。加えて、特異的核酸配列の検出、または特異的配列を含むＤＮＡセグメントの有無の検出は、病因性突然変異を同定することができる。これを達成することが可能であることは、生物医学と技術、医学、農学及び法医学、ならびに他の分野への適用性を有する。
【０００４】
遺伝子及びそれらの改変、配列、位置、または数の検出は、医学における分子診断学の進歩に重要である。ＤＮＡマイクロアレイ、ＰＣＲ、サザンブロット法、及びＦＩＳＨ（蛍光インサイツハイブリダイゼーション法）は、全て核酸検出を実行または補助するのに使用できる方法である。これらの方法は、緩徐で労働集約的であり得、且つ正確性と解決に制限があり得る。リアルタイムＰＣＲ及び次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術等の、より近年の方法は、改善された処理量と正確性を有するが、定量化を実行するのに複雑で予算のかかるデバイス基盤を必要とし、典型的には、感知のための何らかの光学的方法を組み込んでいる。
【０００５】
比較して、固体ナノ細孔は、電気的な核酸センサーを光学の必要なしに提供することができる。さらに固体ナノ細孔デバイスは、拡張性のある製作技術を非常に低価格で使用して作成することが可能で、また、携帯使用のためにスモールフォームファクタへ組み込むことができる。
【０００６】
固体ナノ細孔は細孔全体にわたって電圧を加えて分子を検出し、分子がナノ細孔を通過するときの電流インピーダンスの変化（「イベント」）を測定することによって、分子を検出することができる。任意の所与のナノ細孔デバイスの全体的な有効性は、ノイズを超えるインピーダンスイベントを正確且つ確実に測定する能力と、対象分子により生ずるイベントをいずれのバックグラウンド分子（存在する場合）から生じるイベントとも識別する能力に依存する。
【０００７】
文献で公開されている実験は、細孔を通過する精製されたＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖両方の検出を行っている。特異的配列に結合した合成分子を持つＤＮＡは、標的配列の検出を可能にすることが示されているが、これは、既定のポリヌクレオチド長を有する精製ＤＮＡ試料の関連でのみである。試料からのＤＮＡ検出の実際の適用では、ポリヌクレオチドが長さ１Ｍｂｐを超えることがあり、ナノ細孔での検出をブロックまたは妨げることがある。
【０００８】
したがって、バックグラウンド分子に耐性があり非常に長いＤＮＡ分子を持つ試料を扱うことのできるナノ細孔内での標的配列の検出を促進する方法が必要とされる。
【発明の概要】
【０００９】
概要
いくつかの実施形態において、試料中に存在すると予想される標的ポリヌクレオチド配列の有無を検出するための方法であって、標的配列を含むポリヌクレオチドを含有すると予想される試料を提供することと、該ポリヌクレオチドを断片化することと、該ポリヌクレオチドの該標的配列へ特異的に結合するように適合されたプローブを提供することと、該プローブが該標的配列に結合して、ポリヌクレオチド−プローブ複合体を形成するのを促進する条件の下で該試料を該プローブに接触させることと、該試料をナノ細孔、第１チャンバ、及び第２チャンバを備えるナノ細孔デバイスにロードすること（ここで、該第１及び第２チャンバは導電性流体を介して電気的且つ流体的に該ナノ細孔を通して連通しており、さらに該ナノ細孔デバイスはナノ細孔を通過する物体を同定するように構成されたセンサーを含む）と、該ナノ細孔全体にわたって電位を印加して、該ナノ細孔を通る該ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の移動を引き起こすことと、該ナノ細孔を通る該ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の移動に付随する電気シグナルを検出することと、を含む方法をここに提供する。いくつかの実施形態において、この方法は、該試料中の該標的ポリヌクレオチド配列の有無を決定するために、該電気シグナルを分析することをさらに含む。いくつかの実施形態において、プローブは、ペイロード分子に結合する。
【００１０】
いくつかの実施形態において、プローブはペイロード結合部分を含む。いくつかの実施形態において、ペイロード結合部分は、化学基、反応基、小分子、またはペプチドを含む。いくつかの実施形態において、小分子は、ビオチンを含む。いくつかの実施形態において、反応基は、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）またはアジドを含む。いくつかの実施形態において、反応基は、反応性マレイミド、遊離チオール（チオレート）、または硫黄原子を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、方法はさらに、該電位を加える前に、ペイロード分子を該ペイロード結合部分に結合することを含む。いくつかの実施形態において、ペイロード分子は、該試料と該プローブが接触した後に該ペイロード結合部分に結合する。いくつかの実施形態において、ペイロード分子は、該試料と該プローブが接触する前に該ペイロード結合部分に結合する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ペイロード分子は、デンドリマー、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡアプタマー、フルオロフォア、タンパク質、抗体、ポリペプチド、ナノビーズ、ナノロッド、ナノチューブ、ナノ粒子、フラーレン、ＰＥＧ分子、リポソーム、またはコレステロール−ＤＮＡハイブリッドからなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ペイロード分子は電荷を含む。いくつかの実施形態において、荷電ペイロード分子は、ペプチド、アミノ酸、荷電ナノ粒子、合成分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、金属及びイオンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドの有無の検出に対する感度または特異度は、該標的ポリヌクレオチドが該荷電ペイロード分子と結合した場合、未結合標的ポリヌクレオチドと比較して増加する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ペイロード結合部分及びペイロード分子は、共有結合を介して結合される。いくつかの実施形態において、共有結合は、クリックケミストリーによって形成される。いくつかの実施形態において、クリックケミストリーは、銅触媒される。いくつかの実施形態において、クリックケミストリーは、銅フリーである。いくつかの実施形態において、共有結合は、チオ−エーテル結合を含む。いくつかの実施形態において、チオ−エーテル結合は、マレイミド−チオレート化学によって形成される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ペイロード結合部分及びペイロード分子は、非共有結合を介して結合される。いくつかの実施形態において、非共有結合は、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、極性結合、カチオン−π相互作用、平面スタッキング相互作用、及び金属結合からなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドの有無の検出に対する感度または特異度は、該標的ポリヌクレオチドが該ペイロード分子と結合した場合、未結合標的ポリヌクレオチドと比較して増加する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、２つ以上のペイロード分子が、標的ポリヌクレオチドに結合する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、該プローブの該ポリヌクレオチドの該標的配列への特異的結合は、配列特異的連結を介して起こる。
【００１９】
いくつかの実施形態において、該ポリヌクレオチドを断片化することは、該試料を断片化条件に曝すことを含む。いくつかの実施形態において、断片化条件は、化学的剪断、熱及び２価金属陽イオン、音響剪断、超音波処理、水力学的剪断、噴霧、ニードル剪断、ならびにフレンチプレスからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、該ポリヌクレオチドを断片化することは、該試料と断片化試薬を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、断片化試薬は、制限酵素、部位特異的ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、非特異的ヌクレアーゼ、トランスポサーゼ、及び触媒活性ＤＮＡまたはＲＮＡからなる群から選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、試料は、複数の標的ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、該プローブを提供することは、標的配列へ特異的に結合するように適合された複数の独自のプローブを提供し、そうすることで該複数の標的ポリヌクレオチド−プローブ複合体のそれぞれが、ナノ細孔を通る移動を受けて固有で検出可能なシグナルを生成することを含む。いくつかの実施形態において、該試料を該プローブに接触させることは、該試料を該複数の独自のプローブに接触させることを含む。いくつかの実施形態において、方法は、該複数の標的ポリヌクレオチド−プローブ複合体の少なくとも１つの移動に付随する電気シグナルを検出することを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ナノ細孔デバイスは、少なくとも２つのナノ細孔を含み、該ナノ細孔デバイスは、独立して制御された電圧を該少なくとも２つのナノ細孔のそれぞれの全体にわたって印加するように構成されている。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのナノ細孔は、直列する。いくつかの実施形態において、方法は、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体を該デバイス内の少なくとも２つのナノ細孔において同時に捕捉することをさらに含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、試料は、該ポリヌクレオチドの該断片化の前に該デバイスにロードされる。いくつかの実施形態において、試料は、該ポリヌクレオチドの該断片化の後に該デバイスにロードされる。いくつかの実施形態において、試料は、該試料と該プローブの該接触の前に該デバイスにロードされる。いくつかの実施形態において、試料は、該試料と該プローブの該接触の後に該デバイスにロードされる。
【００２３】
いくつかの実施形態において、試料は、精製されない。いくつかの実施形態において、試料は、該断片化の前、該試料と該プローブの接触の前、および該ナノ細孔における該検出の前に精製されない。いくつかの実施形態において、試料は、少なくとも１：２００００、１：１００００、１：５０００、１：２０００、１：１０００、１：５００、１：２００、１：１００、１：５０、１：２０、１：１０、１：５、１：２、１：１．５、１：１．２、１：１．１または１：１．０５の希釈度で該ナノ細孔デバイスにロードされる。いくつかの実施形態において、試料は、該ナノ細孔デバイスに希釈なしにロードされる。いくつかの実施形態において、試料は、該ナノ細孔デバイス内で非標的ポリヌクレオチド、断片化反応試薬、及び連結反応試薬を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ナノ細孔は、少なくとも直径５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、２０ｎｍ、４０ｎｍ、または５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ナノ細孔は、直径２００ｎｍ未満である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、該ポリヌクレオチドの断片化は、配列特異的断片化反応を含む。いくつかの実施形態において、配列特異的断片化反応は、部位特異的制限酵素またはＣＲＩＳＰＲベースの切断を含む。いくつかの実施形態において、該ポリヌクレオチドの断片化は、非配列特異的断片化反応を含む。いくつかの実施形態において、非配列特異的断片化反応は、剪断によって達成される。
【００２６】
いくつかの実施形態において、プローブを、ナノ細孔デバイスの内部空間で該試料と接触させる。
【００２７】
いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、または二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、人工的に合成されたポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、組換えポリヌクレオチドである。
【００２８】
いくつかの実施形態において、センサーは、該ナノ細孔全体にわたって該電位を生成し、該電気シグナルを検出するように設計された電極対を含む。いくつかの実施形態において、ペイロード結合標的ポリヌクレオチドがナノ細孔を通過するときに生成される電気シグナルは、バックグラウンド分子の電気シグナルから識別可能である。いくつかの実施形態において、電気シグナルは、経時的な電流の測定基準であり、その深さの平均値、深さ最大値、持続時間、深さレベルの数、深さ及び持続時間のエリア、またはノイズレベルで識別可能である。
【００２９】
試料中の標的ポリヌクレオチド配列を定量する方法であって、標的配列を含むポリヌクレオチドを含有すると予想される試料を提供することと、該ポリヌクレオチドを断片化することと、該ポリヌクレオチドの該標的配列へ特異的に結合するよう適合されたプローブを提供することと、該プローブが該標的配列に結合して、ポリヌクレオチド−プローブ複合体を形成するのを促進する条件の下で該試料を該プローブに接触させることと、該試料をナノ細孔、第１チャンバ、及び第２チャンバを備えるナノ細孔デバイスにロードすること（ここで、該第１及び第２チャンバは導電性流体を介して電気的且つ流体的に該ナノ細孔を通して連通しており、さらに該ナノ細孔デバイスはナノ細孔を通過する物体を同定するように構成されたセンサーを含む）と、該ナノ細孔全体にわたって電位を印加して該ナノ細孔を通る該ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の移動を引き起こすことと、該ナノ細孔を通る該ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の移動に付随する電気シグナルを検出することと、該電気シグナルを分析して、該試料中の該標的ポリヌクレオチド配列の定量測定値を決定することとを含む方法もここに提供する。
【００３０】
いくつかの実施形態において、プローブは、ペイロード分子に結合している。いくつかの実施形態において、プローブは、ペイロード結合部分を含む。いくつかの実施形態において、ペイロード分子は、該試料と該プローブが接触した後に該ペイロード結合部分に結合する。
【００３１】
ナノ細孔を含むデバイスであって、該ナノ細孔はデバイスの内部空間を２つの容積に分け、デバイスはナノ細孔を通過する物体を同定するように適合された該ナノ細孔のためのセンサー、ポリヌクレオチドの標的配列に特異的に結合するように適合されたプローブ、及び試料内の該標的配列の有無を検出するための使用についての説明を含む、デバイスを含むキットもここに提供される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、プローブは、ペイロード分子に結合している。いくつかの実施形態において、プローブは、ペイロード結合部分を含む。いくつかの実施形態において、キットは、該ペイロード結合部分に結合するように適合されたペイロード分子を含む。いくつかの実施形態において、キットは、該ポリヌクレオチドを断片化するための試薬を含む。
【００３３】
試料内の標的配列を含むポリヌクレオチドを検出する方法であって、該プローブが該標的配列に結合して、ポリヌクレオチド−プローブ複合体を形成するのを促進する条件の下で、該標的配列を含む該ポリヌクレオチドに特異的に結合するプローブに該試料を接触させることと、ナノ細孔デバイスの第１チャンバに該試料をロードすること（ここで該ナノ細孔デバイスは、少なくとも１つのナノ細孔と、該少なくとも１つのナノ細孔を介して電気的且つ流体的に連通している少なくとも該第１チャンバ及び第２チャンバと、さらに該少なくとも１つのナノ細孔それぞれの全体にわたる独立して制御される電圧と、該少なくとも１つのナノ細孔のそれぞれに付随したセンサーとを含み、該センサーは、少なくとも１つのナノ細孔を通過する物体を同定するように構成されており、該少なくとも１つのナノ細孔を通って移動する該ポリヌクレオチド−プローブ複合体は、該ポリヌクレオチド−プローブ複合体に付随する検出可能なシグナルをもたらす）と、該検出可能なシグナルを観察することによって、該試料における該ポリヌクレオチド−プローブ複合体の有無を決定し、それによって該標的配列を含む該ポリヌクレオチドを検出することとを含む方法がここに提供される。一実施形態において、方法はさらに該少なくとも１つのナノ細孔を介して電圧電位を生成することを含み、該電圧電位は該ポリヌクレオチド−プローブ複合体への力を生成して、該少なくとも１つのナノ細孔を介して該ポリヌクレオチド−プローブ複合体を引っ張り、該少なくとも１つのナノ細孔を介した該ポリヌクレオチド−プローブ複合体の移動を生じさせて該検出可能なシグナルを生成する。
【００３４】
いくつかの実施形態において、該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。一実施形態において、該検出可能なシグナルは、電気シグナルである。一実施形態において、該検出可能なシグナルは、光学的シグナルである。一実施形態において、該プローブは、タンパク質、ペプチド、核酸、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、ペプチド核酸、または化合物からなる群から選択される分子を含む。一実施形態において、該プローブは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ポリペプチド、または化学的に誘導されたポリマーのからなる群から選択される分子を含む。
【００３５】
一実施形態において、該プローブは、少なくとも１つの該ナノ細孔を通って移動する間に該ポリヌクレオチドに結合したプローブの検出を容易にするように構成された２次分子に結合されたＰＮＡ分子を含む。さらなる実施形態において、該２次分子は、ＰＥＧである。さらなる実施形態において、該ＰＥＧは、少なくとも１ｋＤａ、２ｋＤａ、３ｋＤａ、４ｋＤａ、５ｋＤａ、６ｋＤａ、７ｋＤａ、８ｋＤａ、９ｋＤａ、または１０ｋＤａの分子量を有する。
【００３６】
一実施形態において、試料内の標的配列を含むポリヌクレオチドを検出する該方法は、プローブと標的配列間の結合相互作用を変更すると予想される該試料へ条件を適用することをさらに含む。さらなる実施形態において、条件は、試料からプローブを除去すること、標的配列との結合についてプローブと競合する薬剤を添加すること、及び初期ｐＨ、塩、または温度条件を変えることからなる群から選択される。
【００３７】
一実施形態において、該ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドとプローブの結合を改変するように構成された化学修飾を含む。さらなる実施形態において、化学修飾は、ビオチン化、アセチル化、メチル化、ＳＵＭＯ化、グリコシル化、リン酸化及び酸化からなる群から選択される。
【００３８】
一実施形態において、該プローブは、切断可能な結合を通してプローブと結合された化学修飾を含む。一実施形態において、該プローブは、共有結合、水素結合、イオン結合、金属結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、または平面スタッキング相互作用を介してポリヌクレオチドの標的配列と相互作用する。一実施形態において、試料内の標的配列を含むポリヌクレオチドを検出する該方法は、試料をプローブまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体と結合することのできる１つまたは複数の検出可能な標識と接触させることをさらに含む。一実施形態において、該ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの標的配列を含む。
【００３９】
一実施形態において、該ナノ細孔は、直径が約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、長さが１ｎｍ〜約１００ｎｍであり、チャンバのそれぞれは電極を含む。一実施形態において、該ナノ細孔デバイスは、両ナノ細孔において該ポリヌクレオチドの動きを同時に制御するように構成されている少なくとも２つのナノ細孔を含む。一実施形態において、試料内の標的配列を含むポリヌクレオチドを検出する該方法は、ナノ細孔を通じた該ポリヌクレオチドの動きをプローブ結合部分がナノ細孔を通過した後に逆転するように該検出可能なシグナルによるポリヌクレオチド−プローブ複合体の初期検出後に該独立して制御された電圧を逆転し、それによってポリヌクレオチド−プローブ複合体の有無を再度同定することをさらに含む。
【００４０】
一実施形態において、該ナノ細孔デバイスは２つのナノ細孔を含み、該ポリヌクレオチドは両該２つのナノ細孔内に同時に位置づけられる。さらなる実施形態において、試料内の標的配列を含むポリヌクレオチドを検出する該方法は、反対の力がナノ細孔によって生成されて、ナノ細孔を通るポリヌクレオチドの移動速度を制御するように該２つのナノ細孔のそれぞれにおいて電圧の大きさ及び／または方向を調整することを含むことを含む。
【００４１】
試料内でポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を検出する方法であって、該試料と第１プローブ及び第２プローブを接触させること（ここで該第１プローブは該第１プローブが該第１標的配列へ結合するのを促進する条件の下で該ポリヌクレオチドの第１標的配列に特異的に結合し、該第２プローブは該第２プローブが該第２標的配列へ結合するのを促進する条件の下で該ポリヌクレオチドの第２標的配列に特異的に結合する）と、該試料と、該第１及び第２のプローブが互いに十分に近接している場合には該第１及び第２のプローブに同時に結合するように構成された第３の分子とを、該第３の分子の該第１のプローブ及び第２のプローブへの結合を促進する条件下で接触させ、それによって、該ポリヌクレオチド、該第１のプローブ、該第２のプローブ、及び該第３の分子を含む融合複合体を形成することと、該試料をナノ細孔デバイスの第１チャンバへロードすること（該ナノ細孔デバイスは少なくとも１つのナノ細孔及び少なくとも該第１チャンバと第２チャンバを含み、該第１及び第２チャンバは該少なくとも１つのナノ細孔を介して電気的且つ流体的に連通し、ナノ細孔デバイスは該少なくとも１つのナノ細孔のそれぞれの全体にわたる制御された電圧電位と、該少なくとも１つのナノ細孔のそれぞれに付随したセンサーをさらに含み、該センサーは少なくとも１つのナノ細孔を通過する物体を同定するように構成されており、該少なくとも１つのナノ細孔を通って移動する該融合複合体は該融合複合体に関連する検出可能なシグナルを提供する）と、及び該試料における該融合複合体の有無を該検出可能なシグナルを観察することによって判断することとを含む方法もここに提供する。
【００４２】
一実施形態において、該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。一実施形態において、該検出可能なシグナルは、電気シグナルである。一実施形態において、該検出可能なシグナルは、光学的シグナルである。一実施形態において、該十分な近接は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチド未満である。一実施形態において、該第３分子は、ＰＥＧまたは抗体を含む。
【００４３】
一実施形態において、該第３分子及び該第１及び第２プローブはｓｓＤＮＡに結合し、ここで該第３分子に連結された該ｓｓＤＮＡは、該第１プローブに連結されたｓｓＤＮＡの領域と相補的な領域を含み、且つ該第２プローブに連結したｓｓＤＮＡの領域と相補的である。一実施形態において、試料内でポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を検出する方法は、試料を第３分子または融合複合体と結合することができる１つまたは複数の検出可能な標識と接触させることをさらに含む。
【００４４】
第１プローブ、第２プローブ、及び第３分子を含むキットも本明細書で提供され、ここで第１プローブは標的ポリヌクレオチド上の第１標的配列に結合するように構成され、第２プローブは該標的ポリヌクレオチド上の第２標的配列に結合するように構成され、該第３分子は、該第１及び第２プローブが該第１及び第２標的配列で該ポリヌクレオチドと結合する場合、第１プローブと第２プローブに結合するように構成され、それによって該第３分子の該第１及び第２プローブへの同時結合を可能にするように第１及び第２プローブが十分に近接して位置する。
【００４５】
一実施形態において、該第１プローブ及び該第２プローブは、タンパク質、ペプチド、核酸、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、ペプチド核酸、または化合物からなる群から選択される。一実施形態において、該第３分子は、ＰＥＧまたは抗体を含む。一実施形態において、該第３分子は、該プローブに対する結合親和性を変化させるための修飾を含む。
【００４６】
ナノ細孔デバイスであって、少なくとも２つのチャンバ及びナノ細孔を含み、ここで該デバイスは該ナノ細孔内でポリヌクレオチドと結合する修飾ＰＮＡプローブを含むナノ細孔デバイスもここに提供する。
【００４７】
２つの細孔を通る荷電ポリマーを検出するためのデュアル細孔でデュアルアンプのデバイスであって、デバイスは上部チャンバ、中間チャンバ及び下部チャンバ、上部チャンバと中間チャンバを結合している第１細孔、及び中間チャンバと下部チャンバを結合している第２細孔を含み、ここで該デバイスは該第１または第２細孔内でポリヌクレオチドと結合する修飾ＰＮＡプローブを含む、２つの細孔を通る荷電ポリマーを検出するためのデュアル細孔でデュアルアンプのデバイスもここに提供する。
【００４８】
一実施形態において、デバイスは、両該第１細孔及び該第２細孔を通じる該荷電ポリマーの動きを同時に制御するように構成される。一実施形態において、修飾ＰＮＡプローブは、少なくとも１つのＰＥＧ分子と結合する。一実施形態において、デバイスは上部チャンバと中間チャンバの間に第１電圧を、及び中間チャンバと下部チャンバの間に第２電圧を提供するように構成された電源をさらに含み、各電圧は個別に調製可能であり、ここで中間チャンバは２つの電圧に対して共通の接地に接続され、ここでデバイスは各細孔での個別の電圧制御及び電流測定のために構成されたデュアルアンプ電子装置を備え、ここで２つの電圧の大きさは異なっていてよく、ここで第１及び第２細孔は、荷電ポリマーが両細孔を通過してどちらの方向へも制御された様式で同時に移動することができるように構成される。
【００４９】
本開示の実施形態として提供される図面は、単に例示するためのものであって、限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】プローブを通してペイロード分子に結合する標的ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、及びナノ細孔を通過する複合体を図示する。
【図２】ペイロード結合標的ポリヌクレオチドが細孔を通過するときの電流シグネチャの違いを、非標的バックグラウンドポリヌクレオチド及び一般非ポリヌクレオチドバックグラウンド分子と比較して図示する。
【図３】試料から標的配列を増幅なしに検出する方法を図示する。特に図３は、標的配列の部位特異的切断の使用と、ナノ細孔の検出を容易にするペイロード分子への接続に適したプローブの連結を伴う、標的配列の検出方法を示す。
【図４】それぞれが標的保有分子で独自の標的配列へ結合するナノ細孔の移動を受けて独自のシグネチャを生成する、異なるサイズまたは電荷または他の構成のプローブを例示する。
【図５Ａ】リガンド電荷が増加するように修飾されており、それによってナノ細孔による検出を容易にするＰＮＡリガンドを示す。
【図５Ｂ】二本鎖ＤＮＡが、標的保有ポリマーとして使用される例、及び検出されることが所望される標的配列に結合する複数の異なるＤＮＡ結合プローブを示す。
【図６Ａ】ｄｓＤＮＡ分子上でその標的配列と結合するＰＮＡ−ＰＥＧプローブを示す。
【図６Ｂ】以下の試料：ＤＮＡのみ（レーン１）、ＤＮＡ／ＰＮＡ（レーン２）、ＤＮＡ／ＰＮＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）（レーン３）、及びＤＮＡ／ＰＮＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）（レーン４）を用いたゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図６Ｃ】以下の試料：ＤＮＡマーカー（レーン１）、ＰＮＡプローブと共にインキュベートされたランダムＤＮＡ配列（レーン２）、対応するＰＮＡプローブとインキュベートされた標的配列でシングルミスマッチを有するＤＮＡ（レーン３）、及び標的配列に特異的な対応するＰＮＡプローブと混合された標的配列を有するＤＮＡ（レーン４）を用いたゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、代表的な電流シグネチャイベントを分子として、印加された電圧下でナノ細孔を通過する各電流シグネチャの下に図示する。
【図７Ｂ】図７Ｂは、３つの集団：ＤＮＡ／ｂｉｓＰＮＡ（正方形）、ＤＮＡ／ｂｉｓＰＮＡ−ＰＥＧ  ５ｋＤａ（円）、及びＤＮＡ／ｂｉｓＰＮＡ−ＰＥＧ  １０ｋＤａ（菱形）におけるイベントの継続期間及びナノ細孔を通した移動から生じる平均コンダクタンスシフトを特徴とするイベントの散布図を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、上に記載される３つの集団のそれぞれに関した平均コンダクタンスシフトの確率をヒストグラムで示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、上に記載される３つの集団のそれぞれに関連したイベント持続期間の確率をヒストグラムで示す。
【図８Ａ】図８Ａは、ＤＮＡ分子に結合するＰＮＡ−ＰＥＧプローブの移動に付随した代表的なイベントシグネチャを示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ナノ細孔における、バクテリアＤＮＡ及びＰＮＡ−ＰＥＧプローブを含む試料からの各イベント記録に対する平均コンダクタンスシフト対継続期間のプロットを示す。
【図８Ｃ】図８Ｃ及び図８Ｄは、平均コンダクタンスシフト及び継続期間によって検出されたこれらのイベントを特徴づけたそれぞれに対応するヒストグラムを示す。
【図８Ｄ】図８Ｃ及び図８Ｄは、平均コンダクタンスシフト及び継続期間によって検出されたこれらのイベントを特徴づけたそれぞれに対応するヒストグラムを示す。
【図８Ｅ】図８Ｅは、１００ｂｐラダー（レーン１）、ＰＮＡ−ＰＥＧプローブとインキュベートされた野生型ｃｆｔｒ配列を持つＤＮＡ３００ｂｐ（レーン２）、及びＰＮＡ−ＰＥＧプローブとインキュベートされたｃｆｔｒΔＦ５０８配列を持つＤＮＡ３００ｂｐ（レーン３）を示しているゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図９Ａ】ｂｉｓＰＮＡ−ＰＥＧが結合していないＳ．ミティスバクテリアＤＮＡを含むレーン１、及び部位特異的ｂｉｓＰＮＡ−ＰＥＧが結合しているＳ．ミティスＤＮＡを含むレーン２を用いた、ゲルシフトアッセイの結果を示す。
【図９Ｂ】２回の連続する実験の全ての記録イベントにおける、垂直軸上の平均コンダクタンスシフト（ｄＧ）対水平軸上の持続時間の散布図を示す。第１の試料にはＰＥＧ修飾ＰＮＡプローブを持つバクテリアＤＮＡ（ＤＮＡ／ｂｉｓＰＮＡ−ＰＥＧ）が含まれる。第２の試料にはバクテリアＤＮＡのみが含まれる。
【図１０】断片化及びペイロードを含む配列特異的プローブの標的配列への結合の工程を、本発明の一実施形態にしたがって例示する。
【図１１】アガロースゲルバクテリアのプラスミド分画を示すアガロースゲルである。
【図１２】特異的１２−ｍｅｒ標的オリゴヌクレオチド配列、及び４０ｋＤａの３アームマレイミドＰＥＧペイロードと共有結合を形成することができるシステインリンカーと結合する領域を含む代表的なｂｉｓＰＮＡプローブを例示する。図１２は、３アームマレイミドＰＥＧペイロードと共有結合し、且つその標的ＤＮＡ配列と結合しているｂｉｓＰＮＡプローブの実施形態も例示する。
【図１３】ｂｉｓＰＮＡ−ＰＥＧコンジュゲーション反応のＨＰＬＣ精製の結果を示す。
【図１４】以下の試料、ｉ）断片化されたＤＮＡのみ、ｉｉ）ＰＮＡ−ＰＥＧプローブのみ、ｉｉｉ）ＰＮＡプローブと混合されたＤＮＡ、及びｉｖ）ペイロード（４アームＰＥＧ）に結合するＤＮＡプローブと混合されたＤＮＡ、のナノ細孔内での検出結果を示す。パネルａ）は各イベントに対するイベント継続期間及び最大δＧのプロットで各集団の分離を示す。パネルｂ）及びｃ）は、ナノ細孔内で検出された各集団の最大δＧの値（パネルｂ））と、イベント継続期間（パネルｃ））に対する確率ヒストグラムを示す。
【図１５】同じ細孔上で順次に行われた、２つの分子型（９６ｂｐＤＮＡ／プローブ−ペイロード複合体及び２次分子）に対するイベント継続期間対最大δＧのイベントプロットを示す。
【図１６Ａ】標的ＤＮＡ／プローブ−ペイロード複合体と２次分子の識別及び既知量の２次分子に対する標的の相対的な存在比を定量する方法を例示する。
【図１６Ｂ】標的ＤＮＡ／プローブ−ペイロード複合体と２次分子の識別及び既知量の２次分子に対する標的の相対的な存在比を定量する方法を例示する。
【図１６Ｃ】標的ＤＮＡ／プローブ−ペイロード複合体と２次分子の識別及び既知量の２次分子に対する標的の相対的な存在比を定量する方法を例示する。
【００５１】
図の一部または全部は、例示のための概略図である。それゆえ、それらは示された要素の実際の相対的なサイズまたは位置を必ずしも図示していない。図は、それらが下記のクレームの範囲または意味を限定しないという明確な理解を持って、１つまたは複数の実施形態を説明する目的で提示される。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
詳細な説明
本出願を通じて、本文は、本栄養素、組成物及び方法のさまざまな実施形態に言及する。記載されたさまざまな実施形態は、種々の例示的実施例を提供するものであり、代替種の記載として解釈されるべきではない。むしろ、本明細書に提供されたさまざまな実施形態の説明は、重複した範囲であってもよいことに留意すべきである。本明細書で述べられる実施形態は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００５３】
また、本開示を通じて、さまざまな刊行物、特許及び公開特許明細書は、識別のための引用によって参照される。これらの刊行物、特許及び公開特許明細書の開示は、本発明が関係する技術水準をより完全に説明するために、参照により本開示に組み入れられる。
【００５４】
本明細書及び特許請求の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数形の言及を含む。例えば、用語「電極」（ａｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）は、組み合わせたものを含めて、複数の電極を含む。
【００５５】
本明細書で使用する用語「含む」は、デバイス及び方法が列挙された構成要素またはステップを含むが、他の構成要素またはステップを排除しないことを意味することが意図される。デバイス及び方法を定義するために使用する場合の「から本質的になる」とは、その組み合わせに対して本質的に重要な他の構成要素またはステップを排除することを意味するものとする。「からなる」とは、他の構成要素またはステップを排除することを意味するものとする。これらの接続語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００５６】
全ての数字表示、例えば距離、サイズ、温度、時間、電圧及び濃度（範囲を含む）は、これらのパラメーターの測定における通常の実験的変動を包含することを意図した近似値であり、その変動は記載された実施形態の範囲内にあることが意図される。必ずしも明記されるわけではないが、全ての数字表示は、用語「約」が前につくと理解されるべきである。また、必ずしも明記されるわけではないが、本明細書に記載された構成要素は単に例示的なものであり、その同等物は当該技術分野で既知のものであることも理解されるべきである。
【００５７】
本明細書で使用される用語「標的配列」は、対象の核酸の配列を有するポリヌクレオチドの部分を指す。標的配列は、ポリヌクレオチドを複数の断片化されたセグメントへ分離（すなわち、断片化）する試薬によって特異的に標的化されてよい。標的配列は、本明細書で記載されるように、プローブによって結合のために特異的に標的化されて、ナノ細孔センサー内で標的配列の検出を容易にすることもできる。
【００５８】
本明細書で使用される用語「断片化」は、ポリヌクレオチドの少なくとも２つのポリヌクレオチド断片への物理的な分離を指す。これは、ポリヌクレオチドの分離を容易にする条件へポリヌクレオチドを曝すことによって達成できる。これはまた、ポリヌクレオチドを酵素またはポリヌクレオチドの２つ以上の断片への分離を容易にする他の試薬に曝すことによっても達成できる。この断片化は、ポリヌクレオチド上の特異的標的配列で起こるようにデザインすることができる。
【００５９】
本明細書で使用される用語「連結」は、プローブが標的配列を含むポリヌクレオチドに結合することを指す。いくつかの実施形態において、標的配列を含むポリヌクレオチドは断片化されている。例として、ポリヌクレオチドに対するプローブの連結は、相補性のある配列を介した結合を通して起きることができ、または連結酵素によって容易することができる。
【００６０】
本明細書で使用される用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、プローブが標的配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片に標的結合することを指す。
【００６１】
本明細書で使用される用語「プローブ」は、標的配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片に特異的に結合する分子を指す。いくつかの実施形態において、プローブはペイロード分子を含む。いくつかの実施形態において、プローブは、ペイロード分子に結合するように適合されたペイロード分子結合部位を含む。
【００６２】
本明細書で使用される用語「ペイロード分子」は、相関した範囲の寸法内でナノ細孔において捕捉された場合、独自の電気シグナルの生成を容易にする物理的寸法を持つ分子を指す。ペイロード分子は、ナノ細孔デバイスにおける標的分子の検出を容易にするのに標的分子に結合し得る。いくつかの実施形態において、ペイロード分子はまた、ドライバー分子として作用するのに荷電され得る。いくつかの実施形態において、ペイロード分子は、プローブ分子に特異的に結合することができるプローブ結合部位を含む。
【００６３】
用語「ナノ細孔」（または、単に「細孔」）は本明細書で使用される場合、２つの容積を分離する膜内の単一のナノスケールの開口部を指す。細孔は、例えば、脂質二重層膜に挿入されたタンパク質チャネルであり得るか、あるいはドリリングもしくはエッチングによって、または窒化ケイ素、二酸化ケイ素、グラフェン、もしくはこれらの材料や他の材料の組み合わせ層などの、薄い固体基板を介した電圧パルス法を用いることによって作成され得る。幾何学的には、細孔は、直径が０．１ｎｍ以上で１ミクロン以下の寸法を有し、細孔の長さは膜の厚さによって決まり、その膜はサブナノメートルの厚さ、または最大１ミクロンもしくはそれ以上の厚さであってよい。数百ナノメートルよりも厚い膜の場合、ナノ細孔は「ナノチャネル」と呼ばれ得る。
【００６４】
本明細書で使用する用語「ナノ細孔機器」または「ナノ細孔デバイス」は、１つ以上のナノ細孔（並行または直列で）を、単一分子イベントを検知する回路と組み合わせたデバイスを指す。具体的には、ナノ細孔機器は、細孔（複数可）を通じるイオン電流を測定する間、細孔（複数可）全体にわたって特定の電圧を印加するために高感度の電圧クランプアンプを使用する。二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のような単一荷電分子が捕電気泳動によって細孔を通して捕捉され駆動される場合、ナノ細孔内に捕捉された分子を特徴づけるために、捕捉イベント（すなわち、ナノ細孔を通る分子の移動、またはナノ細孔内の分子の捕捉）を示す測定された電流シフト及びシフト量（電流振幅における）とイベントの持続時間を使用する。実験中に多くのイベントを記録した後、イベントの分布を分析し、そのシフト量（すなわち、その電流シグネチャ）にしたがって対応する分子を特徴づける。このようにして、ナノ細孔は、生体分子検知のための簡便で、標識なしで、純粋に電気的な単一分子法を提供する。
【００６５】
本明細書で使用される用語「電気シグナル」は、電気回路の配置に応じて、経時的に収集された電流、インピーダンス／抵抗、または電圧の一連のデータを含有する。従来的に、電流は「電圧クランプ」配置で測定され、電圧は「電流クランプ」配置で測定され、そして抵抗測定値はオームの法則Ｖ＝ＩＲを用いてどちらかの配列から導き出すことができる。インピーダンスもまた、ナノ細孔デバイスから収集された電流または電圧データからの測定によっても生成することができる。本明細書で参照される電気シグナルのタイプは、電流シグネチャ及び電流インピーダンスシグネチャを含むが、粒子をナノ細孔内で検出するために他のさまざまな電気シグナルも使用し得る。
【００６６】
本明細書で使用する用語「イベント」は、ナノ細孔を通して検出可能な分子または分子複合体の移動及びそれに関連する、電気シグナル、例えば、経時的なナノ細孔を通る電流の変化を介した測定値を指す。イベントは、その電流、持続時間、及び／またはナノ細孔内の分子の検出の他の特徴によって定義され得る。同様の特徴を有する複数のイベントは、同一であるかまたは類似の特性（例えば、バルク、電荷）を有する分子または複合体の集団を指示している。
【００６７】
本明細書で使用される用語「切断可能なリンカー」または「不安定なリンカー」は、標的分子または条件による酵素的、光分解的、または化学的切断に感度の高い基質リンカーを指す。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ポリペプチド、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、炭素−窒素結合、または炭素−炭素結合であることができる。いくつかの実施形態において、光分解的切断に高感度な切断可能なリンカーは、オルソ−ニトロベンジル誘導体またはフェナシルエステル誘導体であり得る。いくつかの実施形態において、化学的切断に高感度な切断可能なリンカーは、アゾ化合物、ジスルフィド架橋、スルホン、ジコハク酸エチレングリコリル、ヒドラゾン、アセタール、イミン、ビニルエーテル、隣接ジオール、またはピコリン酸エステルであることができる。
【００６８】
分子検出
本開示は、分子の検出及び定量のための方法及びシステムを提供する。加えて、方法及びシステムは、標的分子に結合するプローブの親和性を測定するように構成することもできる。さらに、そのような検出、定量及び測定を、多重化された方法で実施して、その効率を大幅に増加させることもできる。
【００６９】
したがって、検出されるまたは定量されることが望まれる標的配列を含有するポリヌクレオチド検出するまたは定量するための組成物及び方法が本明細書で提供される。
【００７０】
標的配列の検出法が適用される核酸及びポリペプチドに関して、標的配列はプローブ分子によって認識可能なヌクレオチド配列であることができる。標的配列は、化学的に修飾（例えば、メチル化）されていてもよく、または他の分子（例えば、アクチベーターまたはリプレッサー）によって占有されていてもよく、プローブの性質に応じて、標的配列の結合状態を解明することができる。いくつかの態様において、標的配列は、プローブがポリヌクレオチドに結合するための化学的修飾を含む。いくつかの態様において、化学修飾は、アセチル化、メチル化、ＳＵＭＯ化、グリコシル化、リン酸化、ビオチン化、及び酸化からなる群から選択される。
【００７１】
ナノ細孔デバイスを使用した標的配列の検出を容易にするために、標的ＤＮＡは断片化されてよい。いくつかの実施形態において、断片化は、標的ＤＮＡ上の配列特異的位置で起こる。いくつかの実施形態において、断片化は、そのＤＮＡの少なくとも一部を含む、一組の同一長さの配列を生成する。いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡは対象の標的配列で断片化される。断片化は、ナノ細孔を通した移動を受けてより一貫した及び／またはより識別可能な電流シグネチャを生成することによって正確な標的ＤＮＡの検出を容易にするために均一な長さを有する標的ＤＮＡを提供することができる。この断片化は、ナノ細孔での検出を強化するため、標的配列の少なくとも一部分を含むＤＮＡに特異的なプローブの結合または連結と組み合わせることもできる。
【００７２】
したがって、ポリヌクレオチド上で特定の標的配列に結合することができるプローブもまた本明細書で提供される。これらのプローブは断片化ＤＮＡの末端に連結される、または断片化ＤＮＡ上の標的配列に結合することができる。プローブはまた、滞留時間または電流を変えることによってナノ細孔内のポリヌクレオチド−プローブ複合体の検出を助けるために、ペイロード分子を含む、あるいはペイロード分子に結合することもできる。
【００７３】
一実施形態において、もし全てが溶液中に存在する場合、プローブは、標的配列に対するプローブの特異的認識を通して標的配列に結合する。そのような結合は、プローブ及び標的配列を含む複合体の形成を引き起こす。
【００７４】
形成されたポリヌクレオチド−プローブ複合体は、ナノ細孔デバイスによって検出されることができる。ナノ細孔デバイスは、ナノ細孔全体にわたる電流の流れを測定する回路に加えて、１つまたは複数のナノ細孔全体にわたって制御された電圧を送達する（ここで電圧は、いくつかの実施形態において、独立して、制御及びクランプされることができる）電気的構成要素を含む。各ナノ細孔全体にわたり印加される電位、（例えば、電圧差動）は電圧場に曝された荷電ポリヌクレオチドへの静電力適用を通して、荷電ポリヌクレオチドの捕捉及び移行を容易にする。以下に特定されない限り、細孔またはナノ細孔またはナノ細孔デバイスは、シングル、デュアルまたはマルチ細孔デバイスを本発明の精神の範囲内に包含することが意図される。
【００７５】
ポリヌクレオチド標的配列を含む試料がナノ細孔デバイスに存在する場合、ナノ細孔はポリヌクレオチド標的配列を捕捉し、ナノ細孔に通すように構成されることができる。例えば、図１に示すように、標的配列を含むポリヌクレオチドは、ペイロード分子を含むプローブによって特異的に結合される。図１に示すように、プローブはアダプターを通してペイロード分子に結合されることができる。いくつかの実施形態において、ペイロードは、例えば、酵素的検出後に連結を通して標的配列に結合され得る。標的配列が細孔内にある（図１に示すように）または細孔に近接してある場合、標的配列の結合状態は、例えば、複合体の細孔を通る電流上への測定された作用によって生成された独自の電気的シグネチャに起因して、センサーによって検出することができる。
【００７６】
標的配列の「結合状態」は、本明細書で使用される場合、標的配列がプローブと結合しているか否かを指す。本質的に、結合状態は、結合か未結合のどちらかである。（ｉ）標的配列がフリーでプローブと結合していないか、（ｉｉ）標的配列はプローブと結合している、のどちらかである。図２は、ペイロード、未結合バックグラウンド非標的ＤＮＡ、ならびにナノ細孔内に捕捉され、ナノ細孔を通って移動している他のバックグラウンド分子に結合する標的配列の存在に起因する、ナノ細孔を通る電流の代表的変化を示す。異なるサイズまたは異なるプローブ結合部位を有するプローブを使用して、１つを超える標的配列が、同じポリヌクレオチド上または異なるポリヌクレオチド上のどちらかで、試料内に検出されるのを可能にするためにさらなる電流プロファイルをもたらすことができる。
【００７７】
標的配列の結合状態の検出は、さまざまな方法によって実施することができる。１つの態様において、標的配列のサイズが各状態（すなわち、占有または非占有）で異なるために、標的モチーフが細孔を通過するとき、その異なるサイズは細孔全体にわたって異なる電流をもたらす。この点において、電源に接続されて電流を検出できる電極がセンシング機能を果たし得ることから、検出のために別個のセンサーを必要としない。したがって、２つの電極は「センサー」として機能し得る。
【００７８】
いくつかの態様では、検出を容易にするために、ペイロード分子がプローブに添加されることができる。このペイロード分子は、すでにプローブに結合されているか、プローブまたはポリヌクレオチド／プローブ複合体に結合することができてよい。１つの態様において、ペイロード分子は、電気シグナルを介したナノ細孔内での検出を容易にするために、負または正のいずれかの電荷を含む。別の態様において、ペイロード分子は、電気シグナルを介した検出を容易にするために、サイズを足す。別の態様において、ペイロード分子は、フルオロフォアなどの検出可能な標識を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態において、プローブは、該ペイロード分子に結合するように適合されたペイロード結合部分を含む。ペイロード結合部分とペイロード分子の間の結合相互作用は、共有結合または非共有結合であることができる。いくつかの実施形態において、非共有結合相互作用は、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、カチオン−π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合として特徴づけられる。
【００８０】
このコンテキストにおいて、結合状態（ｉｉ）の識別は、標的がプローブと結合していることを示す。換言すると、標的配列が検出されたことを示す。
【００８１】
いくつかの実施形態において、標的配列特異的検出及び／またはナノ細孔での定量化は、以下（図１にも図示される）の方法を用いて実行されることができる。
【００８２】
標的ポリヌクレオチドを含有していると予想される試料が得られる。試料は、その試料内でポリヌクレオチドを断片化するように処理される。この処理は、剪断状態への暴露、または制限酵素等の酵素的切断への暴露であってよい。切断は、標的配列の検出を容易にするために、部位特異的であってよい。断片化後、試料を、断片化されたポリヌクレオチド上で特異的標的配列に結合できるＰＮＡプローブ（または他の適したプローブ）と接触させる。ＰＮＡプローブは、ペイロード結合部分に結合するか、ナノ細孔デバイスでの検出の前にペイロード結合部分に結合されるペイロード分子結合部位を含む。その後、試料は、ナノ細孔デバイスに配置されてナノ細孔を通したポリヌクレオチドの移動を誘発するために電圧が印加される。
【００８３】
ナノ細孔を通る電流の経時的な流れは、ナノ細孔デバイスのセンサーを使用して収集される。このデータは、その後プローブ−ペイロード複合体、すなわち、ポリヌクレオチド−プローブ複合体に結合するポリヌクレオチド標的配列に関連した電流シグネチャの有無を判断するために分析される。試料における標的配列量の定量化は、ナノ細孔内でのポリヌクレオチド−プローブ複合体の捕捉率（または他のイベント定量化法）と、捕捉率を既定条件下における濃度に結びつける基準値とを比較することによっても実行可能である。
【００８４】
断片化
ある生物または環境から得られた試料における標的配列検出の実際の適用では、試料は１００万を超える長さの塩基対のＤＮＡを含有することがあり、また莫大な数のバックグラウンド分子を含有することもある。このタイプの試料から標的配列を検出することは、重大な挑戦を提示する。実行可能で簡便であるべき商業用ナノ細孔技術において、標的配列の検出用途のための方法は、さまざまな形態でバックグラウンド分子に耐性がなくてはならない。これは、ナノ細孔検知の直前または最中に、試料の断片化、及び任意の配列特異的標識化が、ナノ細孔に隣接するチャンバで直接起こった場合、特に当てはまる。
【００８５】
本明細書でいくつかの実施形態において、本発明者らは、ナノ細孔測定の前にいずれのバックグラウンド分子を除去する精製ステップを必要とすることなく、断片化されたＤＮＡ分子の総集団内から任意の標的ポリヌクレオチド配列を検出及び／または定量することを可能にする方法を記載する。バックグラウンド分子は、断片化からの非標的ＤＮＡ、及びペイロード分子を標的配列含有ＤＮＡ断片に加えるのに化学的手法で利用された任意の試薬または分子を含むことができ、ここでペイロード分子はナノ細孔のセンサーを使用して標的配列含有ＤＮＡ断片の選択的検出を可能にする。
【００８６】
いくつかの実施形態において、バックグラウンド分子、すなわち、標的核酸でない全ての分子、を識別するのを可能にするために、プローブ及び／またはペイロード分子の結合による、ナノ細孔を用いた標的ポリヌクレオチド配列を検出する方法が本明細書で記載される。方法は、いずれのステップにおいても核酸の精製を必要とせず、それは本方法を実現するのに必要とされるデバイスの基盤を簡便化する。本明細書で記載の方法は、さまざまなナノ細孔のサイズ及び幾可学的形状と互換性があり、低予算及び携帯フォームファクタで実現可能である。方法は、ナノ細孔センサーに隣接するチャンバにおける標的配列を含む核酸の定量化（すなわち、濃度の推定）もまた可能にする。
【００８７】
いくつかの実施形態において、標的配列を含むポリヌクレオチドは、特異的（例えば、制限酵素を介して）あるいは非特異的（例えば、剪断を介して）に断片化される。これに続いて、プローブを標的配列を含む断片に結合する。これは、例えば、プローブを断片化された配列の末端へ連結することによって、またはポリヌクレオチドの標的配列への配列特異的結合を通して行うことができる。いくつかの実施形態において、プローブは、ペイロード分子を含む。いくつかの実施形態において、プローブは、ペイロード分子がプローブに結合するためのペイロード結合部位を含み、それによってペイロード分子を標的配列とコンジュゲートする。いくつかの実施形態において、配列特異的剪断は、制限酵素、ＣＲＩＳＰＲ技術、または他の当該技術分野で既知の剪断方法の使用を通して達成される。
【００８８】
いくつかの実施形態において、標的配列を含むポリヌクレオチド断片は、連結反応を介してプローブに結合する。いくつかの実施形態において、連結反応は、ポリヌクレオチド断片の末端側をプローブへ結合させる。いくつかの実施形態において、連結反応はプローブを断片に結合され、ここでプローブはペイロード分子結合部位を介してペイロード分子に特異的に結合するように適合される。いくつかの実施形態において、プローブは、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、ＰＮＡ、またはＬＮＡであってよい。いくつかの実施形態において、プローブとペイロード分子は、共有結合、または非共有結合、例えば水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、カチオン−π相互作用、平面スタッキング相互作用、または金属結合を介して接続される。
【００８９】
特定の実施形態において、断片化及び／または標的配列を含むポリヌクレオチドのプローブへの結合は、該デバイス内の１つまたは複数の容積内で実行される。いくつかの実施形態において、断片化及び／または結合ステップにより生じるバックグラウンド分子は、ナノ細孔デバイスを使用した標的配列の検出の間、容積内に存在する。
【００９０】
本発明者らの断片化及びプローブ結合アプローチの利点は、ナノ細孔内の標的配列によって生成されたシグネチャの特異性であり、これは大集団のバックグラウンド分子の間からでも識別を可能にする。したがって、いくつかの実施形態において、標的配列を含むポリヌクレオチドは、その起源（例えば、起源となる生物体または環境）から試料を取得した後、精製していない粗試料から検出される。
【００９１】
いくつかの実施形態において、２つ以上のペイロード分子は、標的配列を含む各核酸分子に結合する。いくつかの実施形態において、それぞれ異なるペイロード分子へ結合している複数の独自の標的プローブ複合体は、ナノ細孔センサーで検出することができ、異なるペイロード分子は多重化のためにナノ細孔における標的配列間の識別を可能にするよう適合される。
【００９２】
特定の好ましい実施形態において、標的配列を含むポリヌクレオチドの濃度の推定値は、集約された一組のセンサー測定値から決定することができる。いくつかの実施形態において、測定値は、標的配列を含むポリヌクレオチドの濃度または分画存在比を測定するために、基準と比較される。
【００９３】
プローブの特異性
いくつかの態様において、方法は十分に長い標的配列に特異的に結合するプローブの使用をさらに含み、そうすることで、標的集団中で唯一の独自の配列と結合することができるだけでなく、もし単一塩基対ミスマッチのみが存在する場合、標的部位に結合しない能力も有する。この識別は、例えば、ＰＮＡを含むプローブを使用した場合可能である。２０ｂｐのγ−ＰＮＡプローブは、完全にマッチした標的配列に効率的に結合することが可能だが、標的配列とプローブ配列でたった一つの塩基が異なる場合、結合は抑制される（Ｓｔｒａｎｄ−Ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ，  Ｍｉｘｅｄ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂ−ＤＮＡ  ｂｙ  γＰＮＡｓ，Ｇ．Ｈｅ，Ｄ．Ｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００９  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２；１３１（３４）：１２０８８−１２０９０．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａ９００２２８ｊ）。ヒトゲノムが３１億の塩基を含むと考えた場合、２０塩基対配列はおおよそ０．００３の倍率で生じる。したがって、研究対象の特異的配列に結合するようデザインされた２０塩基対プローブは、希望しない位置に結合したり、偽陽性をもたらしたりするとは考えにくい。それゆえ、いくつかの実施形態において、標的配列は、長さを少なくとも２０塩基対とする。
【００９４】
切断可能なペイロード分子
いくつかの態様において、プローブはセンサーによる検出を可能にするペイロード分子を含むが、それらは切断可能なリンカーを使用してプローブへ結合される。こうしてナノ細孔内で互いに識別が可能な一組のプローブは、標的保有ポリヌクレオチドに結合する。一度一組のプローブがナノ細孔で検出されると、特徴は切り離され、切断可能な検出特徴も有する新たなプローブ一組が加えられる。この追加／切断／洗浄サイクルは、捕捉された標的分子から全ての配列情報が抽出されるまで続けられる。プローブの検出を助ける分子の例は、前に考察された通りである。切断可能なリンカーの例は、還元剤切断型リンカー（ＴＣＥＰによって切断されたジスルフィドリンカー）、酸切断型リンカー（ヒドラゾン／ヒドラジド結合）、タンパク質分解酵素によって切断されたアミノ酸配列、エンドヌクレアーゼによって切断された核酸リンカー（部位特異的制限酵素）、塩基切断型リンカー、または光切断型リンカー［Ｌｅｒｉｃｈｅ，Ｇｅｏｆｆｒａｙ，Ｌｏｕｉｓｅ  Ｃｈｉｓｈｏｌｍ，ａｎｄ  Ａｌａｉｎ  Ｗａｇｎｅｒ．“Ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｌｉｎｋｅｒｓ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．”Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０，ｎｏ．２（２０１２）：５７１−５８２．］
【００９５】
プローブ分子
本方法で使用されるプローブは、ポリヌクレオチド上の部位に特異的に結合できると理解され、部位は配列または構造により特徴づけられる。プローブ分子は、その標的配列保有ポリヌクレオチドへの結合、ならびに複合体の捕捉及びナノ細孔を通した移動によって検出または定量化されることができる。プローブ分子の例には、ＰＮＡ（タンパク質核酸）、ｂｉｓ−ＰＮＡ、γ−ＰＮＡ、ＰＮＡのサイズまたは電荷を増加させるＰＮＡコンジュゲートが含まれる。他のプローブ分子の例は、天然または組換えタンパク質、タンパク質融合物、タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ、ＰＮＡ（タンパク質核酸）、ｂｉｓ−ＰＮＡ、γ−ＰＮＡ、サイズ、電荷、蛍光、または官能性を増加させるＰＮＡコンジュゲート（例えばオリゴ標識）、または任意の他のＰＮＡ誘導体化ポリマー、及び化合物からのものである。
【００９６】
いくつかの態様において、プローブは、γ−ＰＮＡを含む。γ−ＰＮＡは、特にＮ−（２−アミノエチル）グリシン主鎖のγ位置でペプチド様主鎖に簡単な修飾を有し、これによってキラル中心を生成する。（Ｒａｐｉｒｅｄｄｙ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２９：１５５９６−６００、Ｈｅ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３１：１２０８８−９０、Ｃｈｅｍａ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  ９：２３８８−９１、Ｄｒａｇｕｌｅｓｃｕ−Ａｎｄｒａｓｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２８：１０２５８−１０２６７）。ｂｉｓ−ＰＮＡとは異なり、γ−ＰＮＡは、配列の制限なしにｄｓＤＮＡに結合することが可能であり、さらなるハイブリダイゼーションのために２つのＤＮＡ鎖の一つを利用可能にする。
【００９７】
いくつかの態様において、プローブの機能は、安定した複合体を形成するために相補的な塩基対を生成することによって、標的配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズすることである。ＰＮＡ分子は、さらに追加の分子に結合して、複合体を形成し、バックグラウンドのシグナル振幅（これは、非プローブ結合ポリヌクレオチドの断面に対応する平均シグナル振幅である）を超えるシグナル振幅の検出可能な変化またはコントラストを生じるのに十分な広さの断面面積を有し得る。
【００９８】
ポリヌクレオチド標的配列のＰＮＡ分子への結合の安定性は、ナノ細孔デバイスによって検出されるのに重要である。結合の安定性は、標的保有ポリヌクレオチドがナノ細孔を通って移動している期間を通じて維持されなければならない。もし安定性が弱いまたは不安定であると、プローブは標的ポリヌクレオチドから分離することがあり、標的保有ポリヌクレオチド配列がナノ細孔を通り抜けるときに検出がされないことがある。
【００９９】
特定の実施形態において、プローブの例は、ペイロード分子に結合するＰＮＡまたはＰＮＡが中でヌクレオチド配列を特異的に認識するペイロード分子に結合するよう適合された結合部分を含む分子に結合するＰＮＡであり、ペイロード分子は、ナノ細孔デバイスにおける検出の感度を増加させる。サイズ／形状／電荷に違いを持つ異なるペイロード分子は、ナノ細孔内で各自の標的配列に結合した異なるＰＮＡ−ペイロード複合体間を識別するのに使用され得る。
【０１００】
図４に例示するように、プローブＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、それぞれＤＮＡ分子上の部位に特異的に結合し、これらのプローブは結合したペイロード分子の幅、長さ、サイズ及び／または電荷によって互いが同定及び識別されることが可能である。対応する部位がそれぞれＡ、Ｂ、Ｃ及びＤと示される場合、リガンドの同定は、これらのＤＮＡ配列Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄの特定をもたらす。ここで、プローブは、独自のポリヌクレオチドに結合可能であり、その可能性は断片化されたポリヌクレオチドでより高いことに留意されたい。
【０１０１】
異なる反応性ペイロード結合部分は、ペイロード分子が結合し得る化学的ハンドルを提供するためにプローブに組み込まれ得る。反応性ペイロード結合部分の例には、限定するものではないが、一級アミン、カルボン酸、ケトン、アミド、アルデヒド、ボロン酸、ヒドラゾン、チオール、マレイミド、アルコール及びヒドロキシル基、及びビオチンが含まれる。
【０１０２】
図５Ａは、ＰＮＡプローブであって、その電荷を増加させるように修飾されており、そうすることでナノ細孔による検出を容易にするＰＮＡプローブを示す。具体的には、このプローブは、ＰＮＡ分子上の塩基と標的ＤＮＡ配列（すなわち、標的配列）中の塩基間の相補的塩基対形成及びフーグスティーン塩基対形成により標的ＤＮＡ配列に結合するが、主鎖にはシステイン残基が組み込まれており、このシステイン残基が遊離チオールペイロード結合部分を提供し、１つまたは複数のペイロード分子に結合する。ここで、システインはマレイミドリンカーを介してペプチド２−アミノエチルメタンチオスルホネート（ＭＴＳＥＡ）に結合しており、それが、プローブがその標的配列に結合しているかどうかの、ナノ細孔デバイスにおける検出を強化する手段を提供する。これは、ペイロード分子がプローブの電荷を増加させるためである。このより大きな電荷は、ペイロード分子結合のないＰＮＡプローブと比較して、移動中、細孔を通る電流の流れにより大きな変化をもたらす。
【０１０３】
いくつかの態様において、試料に存在するポリヌクレオチド−プローブ複合体と他のバックグラウンド分子との間での識別の特異性及び感度を向上させるために、シュードペプチド主鎖に修正を施してＰＮＡプローブのサイズ全体を変えることができる。例えば、図５Ｂを参照。図５Ｂは、ペプチドのＮ末端アミンを通して、ペプチド（３０３）にコンジュゲーションするのを可能にするサクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカー（３０２）で修飾されたシステイン残基（３０１）が組み込まれているＰＮＡを示す。電荷をプローブへ直接加えること（例えば、図５Ａのように）に加えて、非極性アミノ酸ではなくより荷電されたアミノ酸を選択することは、ＰＮＡの電荷を増加させるのに役立つことがある。小粒子、分子、タンパク質、ペプチドまたはポリマー（例えばＰＥＧ）などのペイロード分子は、シュードペプチド主鎖に結合してポリヌクレオチド−プローブ複合体のバルクまたは断面表面積を増大させることができる。増大したバルクは、例えば、非精製試料のように、非常に多量のバックグラウンド分子がある中でさえも、バルクの増加から生じるいかなる差動シグナルも容易に検出できるように、シグナル振幅のコントラストを向上させるのに役立つ。シュードペプチド主鎖に結合するペイロード分子として作用する小粒子、分子、タンパク質、またはペプチドの例には、限定するものではないが、αヘリックス形成ペプチド、ナノメートルサイズの金粒子またはロッド（例えば、３ｎｍ）、量子ドット、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。分子のコンジュゲーション（すなわち、結合）の方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，１８０，８１６号、第６，４２３，６８５号、第６，７０６，２５２号、第６，８８４，７８０号、及び第７，０２２，６７３号に記載されており、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０４】
上記の実施形態は、システイン残基を通したペイロード分子のＰＥＧプローブへの結合を記載しているが、他の残基を使用することもできる。例えば、リシン残基は、システイン残基と容易に入れ替えられ、ＮＨＳエステル及び遊離アミンを使用して結合化学を可能にする。また、ＰＥＧは、デンドロン、ビーズもしくはロッド等の、他のバルク追加成分と容易に入れ替えられることもできる。二官能性リンカーとＰＮＡとの間で、またはデンドロンに直接カップリングする。当業者は、アミノ酸を変更することができ、その特定のアミノ酸（例えば、セリン反応性イソシアネート）に対して結合化学反応が改変されるという、このシステムの柔軟性を認識するであろう。この反応に使用できる結合化学反応のいくつかの例を以下の表に挙げる。
【０１０５】
（表１）結合化学反応
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【０１０６】
図１、２、５Ａ、５Ｂ及び６Ａは、プローブのサイズを増加させるため修飾されている、またはペイロード分子、ｓｓＤＮＡオリゴマー、フルオロフォア、または電荷に結合するＰＮＡプローブを示す。いくつかの実施形態において、ペイロード分子は、多重化された標的配列検出の間、検出を促進するためまたは他のプローブから識別するためサイズを増加する。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、結合部位は、プローブをペイロード分子に結合させる化学的ハンドルを含む。化学的ハンドルを組み込む一般的な方法は、特定のアミノ酸をプローブの主鎖の中へ含めることである。例には、限定するものではないが、システイン類（チオレートを提供）、リシン類（遊離アミンを提供）、トレオニン（ヒドロキシルを提供）、グルタミン酸及びアスパラギン酸（カルボン酸を提供）が含まれる。
【０１０８】
異なるタイプのペイロード分子を、結合部分を使用して加えることができる。これらは下記のペイロード分子を含む：
１．プローブのサイズを増加するペイロード分子、例えばビオチン／ストレプトアビジン、ペプチド、核酸、
２．プローブの電荷を変えるペイロード分子、例えば荷電ペプチド（６×ＨＩＳ）、またはタンパク質（例えば、カリブドトキシン）、または小分子またはペプチド（例えばＭＴＳＥＴ）、
３．蛍光を変化させるまたはプローブへ蛍光を加えるペイロード分子、例えば一般的なフルオロフォア、ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、もしくは
４．第３の分子と結合するためのエピトープまたは相互作用部位を提供するペイロード分子、例えば、抗体結合用のペプチド。
【０１０９】
定量化
全ての他の検出されたイベントから標的含有断片のイベントシグネチャを識別できるようにするペイロードプローブの検出機序を介した標的断片の向上された検出は、標的の相対的な存在比の値を提供するが、これはナノ細孔における全ての分子の捕捉及び検出率だけによって反映はされない。したがって、一般に、検出されたペイロード結合標的対非標的のイベント比率から正確な標的：非標的の比率を同定することは、検出されるイベントのタイプの比率が分子チャンバ内の分子タイプの比率とは非常に異なるため、不可能である恐れがある。
【０１１０】
したがって、ＤＮＡ／ＰＮＡ−ペイロード集団の濃度、そしてさらに標的含有断片を特定するために、本明細書では、標的分子の強化された検出を補償する方法を提供する。一実施形態において、標的分子−ペイロード複合体及び非標的断片から、独自のイベントシグネチャ（単独またはプローブ／プローブ−ペイロード複合体への結合体のどちらか）を伴うナノ細孔内で検出可能な２次分子タイプを使用して試料で標的分子を定量する方法を提供する。
【０１１１】
本発明者らは、これまで２次分子と比較して標的分子（例えば、ペイロード結合標的断片）の分画量を定量する方法を導き出してきた。（２０１６年１０月２４日に出願された、米国仮出願第６２／４１２，２２１号であり、その全体を参照により援用する。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、非標的断片及びペイロード結合標的から識別される独自のイベントプロファイルを有する２次分子のタイプは、既知の濃度で導入される。既知の濃度の２次分子は、調製された試料（非標的断片及びペイロード結合標的断片を含む）と混合することができる。混合物はその後、ナノ細孔上で測定される。ナノ細孔上で混合物を測定する前または後に、ペイロード結合標的分子の既知の濃度と２次分子の既知の濃度を含む対照混合物もまたナノ細孔上で測定されてよい。対照混合物は、ペイロード結合標的断片と２次分子の等しい濃度（すなわち、比率１：１）または任意他の比率を使用することができる。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、対照濃度における２次分子と標的分子の比率は、未知試料における２次分子と標的分子の予測される比率に近かいが、これは前もってわからない可能性がある。未知試料についての可能性の高い範囲が特定されれば、対照または２次分子の濃度は、予想範囲内から選択することができる。対照混合物とは別に、２次分子単独と標的ペイロード分子単独を含む単離された対照をとることができる。そのような単離された対照は、対照混合物に代わって使用することも、対照混合物に添加して使用することもでき、併せて対照（単離された対照及び対照混合物）は、試料における分画存在比または標的濃度の測定を改善することができる。
【０１１４】
多重化
いくつかの実施形態において、同じ種類のプローブを含めるのではなく、それぞれが独自の標的配列に結合する異なるプローブの収集物が加えられる。
【０１１５】
そのような設定では、同じまたは異なる標的保有ポリヌクレオチド中の複数の異なる標的配列を検出するのに使用することができる。それぞれが独自の電流プロファイル（例えば、サイズが異なる）を提供するプローブを使用することによって、本技術は、同じ分子中で異なる標的配列を検出することができ、標的配列検出の多重化のための手段を提供する。さらに、各独自のプローブのいくつが結合したか数え上げることにより、各標的（またはコピー数）の数を特定することができる。結合に影響をもたらす条件を調整することによって、システムはより詳細な結合動態情報を得ることができる。
【０１１６】
同様に、多重化は、異なる配列に結合するプローブは互いに識別可能であるという要件のみを満たせば、性質が異なるプローブの収集物を任意の数の組み合せで有して達成することができる。
【０１１７】
ナノ細孔デバイス
ここで提供されるようにナノ細孔デバイスは、デバイスの内部空間を２つの容積に分ける構造で開口部を形成する細孔を含み、例えば、センサーを用いて細孔を通過する物体を同定するように（例えば、物体を示すパラメーターの変化を検出することによって）構成される。本明細書で記載の方法に使用されるナノ細孔デバイスは、ＰＣＴ出願公開ＷＯ／２０１３／０１２８８１にも開示され、全体が参照により援用される。
【０１１８】
ナノ細孔デバイスにおける細孔（複数可）はナノスケールまたはミクロスケールである。１つの態様において、各細孔は、小さいまたは大きい分子あるいは微生物の通過を可能にするサイズを有する。１つの態様において、各細孔は、少なくとも直径約１ｎｍである。代替的に、各細孔は、少なくとも約２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１３ｎｍ、１４ｎｍ、１５ｎｍ、１６ｎｍ、１７ｎｍ、１８ｎｍ、１９ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、または１００ｎｍの直径である。
【０１１９】
１つの態様において、細孔は、直径約１００ｎｍ以下である。代替的に、細孔は、約９５ｎｍ、９０ｎｍ、８５ｎｍ、８０ｎｍ、７５ｎｍ、７０ｎｍ、６５ｎｍ、６０ｎｍ、５５ｎｍ、５０ｎｍ、４５ｎｍ、４０ｎｍ、３５ｎｍ、３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、または１０ｎｍ以下の直径である。
【０１２０】
いくつかの態様において、各細孔は、少なくとも約１００ｎｍ、２００ｎｍ、５００ｎｍ、１０００ｎｍ、２０００ｎｍ、３０００ｎｍ、５０００ｎｍ、１００００ｎｍ、２００００ｎｍ、または３００００ｎｍの直径である。１つの態様において、細孔は、直径約１０００００ｎｍ以下である。代替的に、細孔は、約５００００ｎｍ、４００００ｎｍ、３００００ｎｍ、２００００ｎｍ、１００００ｎｍ、９０００ｎｍ、８０００ｎｍ、７０００ｎｍ、６０００ｎｍ、５０００ｎｍ、４０００ｎｍ、３０００ｎｍ、２０００ｎｍ、または１０００ｎｍ以下の直径である。
【０１２１】
１つの態様において、細孔は、約１ｎｍ及び約１００ｎｍの間、あるいは代替的に、約２ｎｍ及び約８０ｎｍの間、または約３ｎｍ及び約７０ｎｍの間、または約４ｎｍ及び約６０ｎｍの間、または約５ｎｍ及び約５０ｎｍの間、または約１０ｎｍ及び約４０ｎｍの間、または約１５ｎｍ及び約３０ｎｍの間の直径を有する。
【０１２２】
いくつかの態様において、ナノ細孔デバイスにおける細孔（複数可）は大きい微生物または細胞を検出するための、より大きいスケールの細孔である。１つの態様において、各細孔は、大きい細胞または微生物の通過を可能にするサイズを有する。１つの態様において、各細孔は、少なくとも直径約１００ｎｍである。代替的に、各細孔は、少なくとも約２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍ、１１００ｎｍ、１２００ｎｍ、１３００ｎｍ、１４００ｎｍ、１５００ｎｍ、１６００ｎｍ、１７００ｎｍ、１８００ｎｍ、１９００ｎｍ、２０００ｎｍ、２５００ｎｍ、３０００ｎｍ、３５００ｎｍ、４０００ｎｍ、４５００ｎｍ、または５０００ｎｍの直径である。
【０１２３】
１つの態様において、細孔は、直径約１００，０００ｎｍ以下である。代替的に、細孔は、約９０，０００ｎｍ、８０，０００ｎｍ、７０，０００ｎｍ、６０，０００ｎｍ、５０，０００ｎｍ、４０，０００ｎｍ、３０，０００ｎｍ、２０，０００ｎｍ、１０，０００ｎｍ、９０００ｎｍ、８０００ｎｍ、７０００ｎｍ、６０００ｎｍ、５０００ｎｍ、４０００ｎｍ、３０００ｎｍ、２０００ｎｍ、または１０００ｎｍ以下の直径である。
【０１２４】
１つの態様において、細孔は、約１００ｎｍ及び約１００００ｎｍの間、あるいは代替的に約２００ｎｍ及び約９０００ｎｍの間、または約３００ｎｍ及び約８０００ｎｍの間、または約４００ｎｍ及び約７０００ｎｍの間、または約５００ｎｍ及び約６０００ｎｍの間、または約１０００ｎｍ及び約５０００ｎｍの間、または約１５００ｎｍ及び約３０００ｎｍの間の直径を有する。
【０１２５】
いくつかの態様において、ナノ細孔デバイスは、細孔を通過してポリヌクレオチドを移動させる手段及び／または細孔を通過する物体を同定する手段をさらに含む。さらなる詳細は下記に提供され、２細孔デバイスのコンテキストにおいて記載される。
【０１２６】
単一細孔ナノ細孔デバイスと比較して、２細孔デバイスは、細孔を通過するポリヌクレオチドの移動の速度及び方向の良好な制御を提供するように構成することがより容易であり得る。
【０１２７】
特定の実施形態において、ナノ細孔デバイスは、各チャンバが少なくとも１つの細孔を通して、近接するチャンバと連通している複数のチャンバを含む。これらの細孔のうち、２つの細孔、すなわち第１細孔及び第２細孔は、少なくともポリヌクレオチドの一部が第１細孔から第２細孔へ移動するのを可能にするように配置される。さらに、デバイスは、移動中にポリヌクレオチドを同定することが可能なセンサーを備える。１つの態様において、同定はポリヌクレオチドの個々の構成要素を同定することを伴う。他の態様において、同定は、ポリヌクレオチドに結合する融合分子及び／または標的分析物を同定することを伴う。単一センサーが使用される場合、単一センサーは、細孔全体にわたるイオン電流を測定するために、細孔の両端に配置された２つの電極を含み得る。もう一つの実施形態において、単一センサーは、電極以外に構成要素を含む。
【０１２８】
１つの態様において、デバイスは、２つの細孔を通して接続される３つのチャンバを含む。３つ以上のデバイスを備えるチャンバは、３チャンバデバイスのいずれの側面上に、または３つのチャンバの任意の２つの間に、１つまたは複数の追加チャンバを含むよう容易にデザインされることができる。同様に、２つを超える細孔はチャンバに接触するようにデバイス内に含まれることができる。
【０１２９】
１つの態様において、２つの近接するチャンバ間に２つ以上の細孔があってよく、複数のポリヌクレオチドが１つのチャンバから次へ同時に移動するのを可能にする。そのようなマルチ細孔デザインは、デバイスにおけるポリヌクレオチド分析の処理量を向上させることができる。
【０１３０】
いくつかの態様において、デバイスは、ポリヌクレオチドを１つのチャンバから他へ移動する手段をさらに含む。１つの態様において、移動は、ポリヌクレオチドを同時に第１細孔と第２細孔の両方に通過させてロードするようにさせる。もう一つの態様において、手段は、両細孔を通したポリヌクレオチドの同じ方向への移動をさらに可能にする。
【０１３１】
例えば、３チャンバ２細孔デバイス（「２細孔」デバイス）では、チャンバのそれぞれが電源と接続するための電極を含有し、別々の電圧がチャンバ間の細孔のそれぞれの全体にわたって印加されるのを可能にする。
【０１３２】
本開示の実施形態にしたがって、上部チャンバ、中間チャンバ及び下部チャンバを含むデバイスが提供され、ここで上部チャンバは第１細孔を通して中間チャンバと連通しており、中間チャンバは第２細孔を通して下部チャンバと連通している。そのようなデバイスは、デュアル細孔デバイス（Ｄｕａｌ−Ｐｏｒｅ  Ｄｅｖｉｃｅ）と題する米国特許出願公開第２０１３−０２３３７０９号に以前に開示された寸法または他の特徴のいずれかを有し得、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、デバイスは、上部チャンバ、中間チャンバ、及び下部チャンバを含む。チャンバは、それぞれが個別の細孔を有する２つの分離した層または膜に分けられる。さらに、各チャンバは、電源に接続するための電極を備える。上部、中間及び下部チャンバという注記は、相対的な表現であり、例えば、上部チャンバが地面に対して中間または下部チャンバの上に配置されること、またはその逆であることを示さない。
【０１３４】
２つの細孔は、チャンバ間の流体連通を可能にし、それらの間に既定のサイズと距離を有する限り、任意の位置に配置することができる。１つの態様において、細孔は互いの間に直接の妨害物がないように配置される。
【０１３５】
１つの態様において、デバイスは、１つまたは複数の電源に接続される。いくつかの態様において、電源は、各細孔の全体にわたって電圧を印加し且つ各細孔を通る電流を独立して測定することができる、電圧クランプまたはパッチクランプを含む。この点において、電源及び電極の配置は、両電源に対して共通の接地に中間チャンバを設定することができる。１つの態様において、電源（複数可）は、上部チャンバと中間チャンバの間に第１の電圧Ｖ１を、及び中間チャンバと下部チャンバの間に第２の電圧Ｖ２を印加するように構成される。
【０１３６】
いくつかの態様において、第１の電圧Ｖ１及び第２の電圧Ｖ２は、独立して調整可能である。１つの態様において、中間チャンバは、２つの電圧に対して接地となるように調整される。１つの態様において、中間チャンバは、中間チャンバ内の細孔と電極の各々の間に伝導性を提供するための媒体を含む。１つの態様において、中間チャンバは、中間チャンバ内の細孔と電極の各々の間に抵抗を提供するための媒体を含む。このような抵抗をナノ細孔抵抗と比べて十分に小さく保つことは、細孔全体にわたって２つの電圧と電流を切り離すのに有用であり、電圧の独立した調整に役立つ。
【０１３７】
電圧の調整は、チャンバ内で荷電粒子の移動を制御するために使用することができる。例えば、両方の電圧が同じ極性に設定された場合、適切に荷電された粒子を、上部チャンバから中間チャンバ、そして下部チャンバへ、またはその逆の方向へ、順に移動させることができる。いくつかの態様において、２つの電圧が反対の極性に設定された場合、荷電粒子を上部または下部チャンバから中間チャンバに移動させて、そこに保持することができる。
【０１３８】
デバイスにおける電圧の調整は、両細孔を同時に横切るのに十分な長さの、荷電ポリヌクレオチドのような、大きな分子の移動を制御するのに特に有用であり得る。このような態様において、分子の移動の方向及び速度は、以下に記載されるように電圧の相対的な大きさ及び極性によって制御することができる。
【０１３９】
デバイスは、液体試料、特に生物学的試料、及び／またはナノ加工に適する材料を保持するのに適した材料を含むことができる。１つの態様において、このような材料は、限定するものではないが、シリコン、窒化ケイ素、二酸化ケイ素、グラフェン、カーボンナノチューブ、ＴｉＯ２、ＨｆＯ２、Ａｌ２Ｏ３、または他の金属層、あるいはこれらの材料の任意の組み合わせなどの、誘電材料が含まれる。いくつかの態様において、例えば、約０．３ｎｍの厚さのグラフェン膜の単一シートを、細孔保持膜として使用することができる。
【０１４０】
マイクロ流体デバイスであり、且つ２細孔のマイクロ流体チップの実装を行うデバイスは、さまざまな手法及び方法によって作成することができる。２つの平行な膜を含むマイクロ流体チップの場合、両方の膜を単一のビームで同時に穿孔して２つの同心の細孔を形成することができるが、膜の各側に異なるビームを使用することもまた、任意の適切なアラインメント技術と併せて可能である。
【０１４１】
１つの態様において、前記デバイスは、スペーサによって接続された２つの平行な膜から構成されたマイクロ流体チップ（「デュアルコアチップ」と表示）を含む。各膜は、膜の中心を貫く単一ビームによって開けられた細孔を含む。さらに、デバイスは、好ましくはチップ用のＴｅｆｌｏｎ（登録商標）ハウジングを有する。ハウジングは、チャンバＡ〜Ｃの密封された分離を確実にし、電極に最小のアクセス抵抗を提供して、各電圧が主に各細孔の全体にわたって印加されることを確実にする。
【０１４２】
デバイスの細孔に電圧が存在するために、荷電された分子はチャンバ間の細孔を通って移動することができる。移動の速度及び方向は大きさ及び電圧の極性によって制御することができる。さらに、２つの電圧のそれぞれが独自に制御することができることにより、荷電された分子の移動の方向及び速度は各チャンバ内で精密に制御が可能である。
【０１４３】
ＤＮＡのような荷電ポリヌクレオチドに関連する１例は、両細孔の深さと２細孔間の距離を合わせた距離よりも長い鎖長を有する。例えば、１０００ｂｐのｄｓＤＮＡは、長さが約３４０ｎｍであり、２０ｎｍ離れた深さ１０ｎｍの２つの細孔を合わせた長さ４０ｎｍよりもかなり長くなる。第１のステップにおいて、ポリヌクレオチドは、上部または下部チャンバのどちらかにロードされる。約ｐＨ７．４の生理学的条件下でのその負電荷のために、ポリヌクレオチドは、電圧が印加された細孔を通過して移動することができる。そのため、第２のステップでは、ポリヌクレオチドが連続して両方の細孔を通過して移動するように、２つの電圧が、同じ極性で且つ同じまたは類似の大きさで、細孔に印加される。
【０１４４】
ポリヌクレオチドが第２細孔に達するころ、１つまたは両方の電圧が変化可能である。２つの細孔間の距離はポリヌクレオチドの長さより短く選択されるため、ポリヌクレオチドが第２細孔に達する時点で、第１細孔にもある。したがって、第１細孔での電圧の極性の迅速な変化は、第２細孔からポリヌクレオチドを引き離す力を生成するであろう。
【０１４５】
２つの細孔が同一の電圧−力の影響を有し、｜Ｖ１｜＝｜Ｖ２｜＋δＶだと仮定すると、値δＶ＞０（または＜０）はＶ１｜（またはＶ２）方向で調節可能な動きに対して調節することができる。実際には、各細孔での電圧誘発力は、Ｖ１＝Ｖ２と一致しないが、較正実験は、所与の２細孔チップに対するのと同等の引っ張り力をもたらす適切なバイアス電圧を同定することができ、その後、そのバイアス電圧の変動を方向の制御のために使用することができる。
【０１４６】
この時点で、第１細孔での電圧誘発力の大きさが第２細孔での電圧誘発力より小さい場合、ポリヌクレオチドは、より遅い速度ではあるが、第２細孔に向かって両細孔を横断し続けるであろう。これに関して、ポリヌクレオチドの移動の速度及び方向が、両電圧の極性及び大きさによって制御されることができることは、容易に理解されるであろう。下記にさらに記載するように、そのような移動の精密な制御は広い用途を有する。
【０１４７】
センサー
特定の実施形態において、本発明のナノ細孔デバイスは、本明細書に記載の方法を使用して、ナノ細孔内の標的配列同定を実行する、１つまたは複数のセンサーを含む。
【０１４８】
デバイスに使用されるセンサーは、ナノ細孔を通るポリヌクレオチド−プローブ複合体の移動を介してポリヌクレオチドの標的配列を同定するのに適した任意のセンサーであってよい。例えば、センサーは、電流、電圧、ｐＨ、光学的特徴またはポリヌクレオチド−プローブ複合体または荷電されたポリマーの１つ以上の個別要素に関する滞留時間を測定することによってポリヌクレオチド−プローブ複合体を同定するように構成することができる。いくつかの実施形態において、センサーは、分子または粒子、特にポリヌクレオチド−プローブ複合体、がナノ細孔を通るとき、細孔を通じるイオン電流を測定するために細孔の側面と対面する側に配置された一対の電極を含む。
【０１４９】
特定の実施形態において、センサーはポリヌクレオチド−プローブ複合体またはポリマーの構成要素（または単位）の光学的特徴を測定する。そのような測定の１例には、特定の単位固有の吸収帯を赤外（または紫外）分光法で同定することが含まれる。
【０１５０】
滞留時間の測定値が使用される場合、測定値は、検出デバイスを通過するのにかかる時間の長さに基づいて、具体的な単位に単位のサイズを相関させる。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、センサーは、プローブのそれぞれに別個の非共有結合を形成する試薬で官能化される。これに関して、ギャップはより大きくても、有効な測定が可能である。例えば、５ｎｍのギャップが、おおよそ５ｎｍであるプローブ／標的複合体を検出するのに使用することができる。官能化されたセンサーを用いたトンネル検出は、「認識トンネリング」と呼ばれる。認識トンネリングと共に走査型トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）を使用すると、標的配列に結合したプローブが容易に同定される。
【０１５２】
したがって、本技術の方法は、ナノ細孔チャネルの１つまたは両方または細孔間にそれぞれ位置する、１つまたは複数の認識トンネリング部位に対して、ポリヌクレオチド−プローブ複合体送達の速度を制御することを提供することができ、電圧制御は、各プローブ／標的複合体がロバストな同定に十分な期間、各部位に存在するのを確実にすることができる。
【０１５３】
本開示のデバイス及び方法におけるセンサーは、金、白金、グラフェン、または炭素、または他の適切な材料を含むことができる。特定の態様において、センサーはグラフェン製の部品を含む。グラフェンは、導電体及び絶縁体として作用することができ、そうすることでグラフェンを通りナノ細孔を通過するトンネル電流は、ポリヌクレオチド−プローブ複合体の同定を正確に検出することができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、トンネルギャップは、約１ｎｍから約２０ｎｍの幅を有する。１つの態様において、ギャップの幅は、少なくとも約１ｎｍ、あるいは代替的に少なくとも約１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１２または１５ｎｍである。もう一つの態様において、ギャップの幅は、約２０ｎｍ以下、あるいは代替的に約１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２ｎｍ以下である。いくつかの態様において、幅は、約１ｎｍ及び約１５ｎｍの間、約１ｎｍ及び約１０ｎｍの間、約２ｎｍ及び約１０ｎｍの間、約２．５ｎｍ及び約１０ｎｍの間、または約２．５ｎｍ及び約５ｎｍの間である。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、センサーは、電気シグナルを検出する。いくつかの実施形態において、センサーは、該プローブ及び／またはペイロード分子から発光される蛍光シグナルを検出する。出口における放射線源は、ポリヌクレオチド−プローブ複合体特異的シグナルを検出するのに使用することができる。
【０１５６】
本発明を上記の実施形態を併せて記載してきたが、前述の記載及び以下の実施例は例示を意図したものであり、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の他の態様、利点及び変更は、本発明が属する技術分野の当業者には明らかであろう。
【実施例】
【０１５７】
実施例１−配列特異的プローブの合成及び標的配列の結合
この実施例では、ナノ細孔における検出感度の増大を可能にする特徴が加えられている、対象の標的配列に結合するためのＰＮＡプローブの生成を示す。
【０１５８】
３つのシステイン残基を含有するｂｉｓＰＮＡプローブを生成した。ｂｉｓＰＮＡプローブは、ＣＴＴＴＣＣＣの標的配列を含むＤＮＡ配列に、標的ＤＮＡ分子上のこの標的配列の位置で結合することができるＰＮＡの配列を含む。ｂｉｓＰＮＡプローブはまた、ｂｉｓＰＮＡプローブ上の３つのシステイン残基で、ナノ細孔内で標的ＤＮＡ分子に結合しているプローブの検出を向上させるためのマレイミド−ＰＥＧ−Ｍｅにより標識された。ＰＮＡ−ＰＥＧプローブは、１００倍超過量のリンカー（メチル−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）−マレイミド）を還元条件の下、ｂｉｓＰＮＡ（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ３−ＪＴＴＴＪＪＪ−ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＰＥＧ−ＣＣＣＴＴＴＣ−ＰＥＧ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）と共にインキュベートすることによって生成した。リンカーのマレイミド部分はＰＮＡ中ｐＨ７．４で遊離チオールと反応し、これによってＰＥＧ化ＰＮＡが生成された。リシンの添加は、その特定の同族ＤＮＡ配列に対する試薬の親和性を増大させて、高塩濃度条件（１Ｍ  ＬｉＣｌ）下でも結合を可能なままにする。結果として得たｄｓＤＮＡ分子上でのＰＮＡ−ＰＥＧプローブのその標的配列への結合は図６Ａに示される。
【０１５９】
ＤＮＡ分子上のその標的配列へのＤＮＡ−ＰＥＧプローブの結合を確認するため、ＰＥＧプローブの異なるバージョンをＤＮＡと共にインキュベートし、結果として得た溶液を使用してゲルシフトアッセイを実施した。このアッセイでは図６Ｂに示すように４つの試料で実験を行った。レーン１はＤＮＡのみ、レーン２はＤＮＡ＋ＰＮＡ、レーン３はＤＮＡ＋ＰＮＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）、そしてレーン４はＤＮＡ＋ＰＮＡ−ＰＥＧ（２０ｋＤａ）である。レーン２〜４における上方シフトは、ＤＮＡに結合したｂｉｓＰＮＡ種と一致する。丸で囲まれた種はＤＮＡ／ＰＮＡ−ＰＥＧであり、四角で囲まれた種は、標識実験において残存ＰＮＡ（ＰＥＧなし）として存在するレーン３及び４のＤＮＡ／ＰＮＡである。ゲルシフトアッセイの結果は、ＰＮＡへのＰＥＧの結合に関わらず、標的配列を含むＤＮＡと、標的配列に相補的な同族ＤＮＡ配列を持つＰＮＡプローブとの複合体形成を示す。このように、ナノ細孔において検出できる配列特異的プローブの複合体形成の成功が示された。
【０１６０】
次いで、ＰＮＡプローブのその標的ＤＮＡ配列に対する特異性を示すアッセイを実施した。ここでＰＮＡプローブ（ＰＥＧなし）を、標的配列を持たないＤＮＡを含む試料（レーン２）、ＰＮＡプローブとの一塩基ミスマッチを含む標的配列を含むＤＮＡを含む試料（レーン３）、及び完全な標的配列を持つＤＮＡを含む試料（レーン４）と共にインキュベートし、各試料をゲルシフトアッセイを使用して分析して、その結果を図６に示す。レーン１はＤＮＡマーカーである。結果が示すように、完全標的配列マッチを持つＤＮＡ（レーン４）はＰＮＡと結合したが、一塩基ミスマッチを含む標的配列を持つＤＮＡ（レーン３）、及び標的配列を持たないＤＮＡ（標的配列の代わりにランダム配列）（レーン２）はＰＮＡとの結合を示さなかった。したがって、ゲルシフトアッセイはＰＮＡが、標的配列内にミスマッチを一つでも有するＤＮＡとは結合することなく、その標的配列を含むＤＮＡに特異的に結合することを示した。
【０１６１】
実施例２−修飾配列特異的プローブを使用したナノ細孔における標的配列検出
この実施例では、標的配列を含むＤＮＡ分子と本発明者らのＰＥＧ修飾配列特異的ＰＮＡプローブの結合の検出を示す。
【０１６２】
ＰＥＧ結合とＰＥＧの長さをベースにして異なる体積を有するように３つの異なるＰＮＡプローブを用意した。使用した３種のプローブは：１）ＰＥＧを持たないＰＮＡ、２）５ｋＤａのＰＥＧと結合しているＰＮＡ、及び３）１０ｋＤａのＰＥＧと結合しているＰＮＡであった。各プローブを標的配列を含むＤＮＡと混合し、ＤＮＡのＰＮＡプローブへの結合の検出を観察するため、ナノ細孔内を泳動させた。試料における各複合体の濃度は、１Ｍ  ＬｉＣｌバッファ中で２ｎＭであった。試料は１００ｍＶの電圧を印加した状況下でナノ細孔デバイス内を泳動させた。結果を図７Ａ〜７Ｄに示す。
【０１６３】
ＤＮＡの各種プローブへの結合に関する観察された代表的な個別のイベントを図７Ａに示す。ＤＮＡ／ｂｉｓＰＮＡイベントからのイベントシグネチャを左側に示す。最大３つのＰＥＧが各ＰＮＡに結合したＤＮＡ／ｂｉｓＰＮＡ−ＰＥＧ複合体、及びサイズ５ｋＤａのＰＥＧからのイベントシグネチャを中央に示す。最大３つのＰＥＧが各ＰＮＡに結合したＤＮＡ／ｂｉｓＰＮＡ−ＰＥＧ複合体及びサイズ１０ｋＤａのＰＥＧからのイベントシグネチャを右側に示す。それぞれのイベントシグネチャは、同定された複合体の移動の間、ナノ細孔を通る電流の封鎖により測定した。図７Ａにおける分子描写は、平面ＰＥＧ及び視覚的比較の調整のためサイズ分類されたＤＮＡを示す。プローブサイズ（体積）が増大するにしたがってイベントシグネチャは変化を示す。
【０１６４】
イベントの集団を分析し、各データセットにおける全てのイベントに対して平均コンダクタンスシフト（ｄＧ）対継続期間の分散プロットを作成した。図７Ｂに示す実験から、イベント平均コンダクタンス（電圧で割った平均電流シフト）対イベント継続期間（幅）の分散プロットを作成した。プロットは、イベント継続期間及び平均コンダクタンスに基づいて、ＤＮＡ／ＰＮＡ、ＤＮＡ／ＰＮＡ−ＰＥＧ（５ｋＤａ）、及びＤＮＡ／ＰＮＡ−ＰＥＧ（１０ｋＤａ）が別個の重なり合う集団を生じさせることを示した。異なる複合体間の各イベント（ｄＧ）に関して観察された平均コンダクタンスシフトの違いを示すヒストグラムを作成した（図７Ｃ）。また、異なる複合体間で観察されたイベント継続期間の違いを示すためにもヒストグラムを作成した（図７Ｄ）。
【０１６５】
実施例３−ヒト嚢胞性線維症検出のためのナノ細孔における変異ｃｆｔｒ遺伝子標的配列の検出
本発明者らの修飾ＰＮＡプローブが標的配列に結合する特異性、及びナノ細孔デバイス内でプローブを使用して標的配列を検出する能力を示した。これより、患者からの試料において疾患を引き起こす突然変異、特に嚢胞性線維症を検出するためナノ細孔デバイスでの修飾ＰＮＡプローブの使用を見ていく。
【０１６６】
本発明者らは（実施例４に記載の方法にしたがって）嚢胞性線維症を引き起こす突然変異（ΔＦ５０８）を有するｃｆｔｒ遺伝子を含む標的ＤＮＡ配列に特異的に結合するＰＮＡ分子を含む修飾ＰＮＡプローブ（ＰＮＡ−ＰＥＧプローブ）を生成した。ＰＮＡプローブへの結合したＰＥＧは５ｋＤａであった。嚢胞性線維症突然変異を含むＤＮＡは、その突然変異に特異的なＰＥＧ化ＰＮＡと共にインキュベートした。その後、試料は、２６ｎｍの細孔を有するナノ細孔デバイスに配置され、ナノ細孔を通る移動イベントは記録し、分析を行った。
【０１６７】
ＤＮＡ分子に結合しているＰＮＡ−ＰＥＧプローブの移動と相関する移動イベントシグネチャを、嚢胞性線維症を引き起こす変異（ΔＦ５０８）を含むＤＮＡを持つ試料において観察した。代表的なイベントシグネチャを図８Ａに示す。ＤＮＡのみ、またはＤＮＡ／ＰＮＡのみを持つ（すなわち、ＰＥＧ−ＰＮＡなし）試料を使用した実験からは、バックグラウンドを上回る決定的な移動イベントはみられず、ＤＮＡに結合しているＰＮＡ−ＰＥＧプローブを正確に同定する細孔の能力、及びここに提供する修飾プローブが提供する検出の向上を示した。標的変異遺伝子を有する試料及びＰＮＡ−ＰＥＧプローブから記録した一連のイベントに関して、イベントを平均コンダクタンスシフト及び継続期間で特徴づけし、分析を行った。図８Ｂは、各記録イベントに関する平均コンダクタンスシフト対継続期間のプロットを示す。図８Ｃ及び図８Ｄは、各イベントの平均コンダクタンスシフト及び継続期間によって検出されたイベントを特徴づけるために対応するヒストグラムをそれぞれに示す。分析されたデータはナノ細孔を通したＤＮＡ／ＰＮＡ−ＰＥＧ（５ｋＤａ）複合体移動に関する予想データと一致し、ナノ細孔デバイスにおけるｃｆｔｒ変異標的配列の結合及び同定の成功が示された。
【０１６８】
本発明者らのΔＦ５０８ｃｆｔｒ遺伝子変異に特異的なＰＮＡ−ＰＥＧ（５ｋＤａ）プローブを含む試料について、野生型ｃｆｔｒ配列を持つ３００ｂｐのＤＮＡを含む試料（レーン２）及びΔＦ５０８ｃｆｔｒ遺伝子変異を持つ３００ｂｐのＤＮＡを持つ試料（レーン３）を用いてゲルシフトアッセイを行った（図８Ｅ）。このデータは、ＰＮＡ−ＰＥＧプローブは、ΔＦ５０８標的配列だけに特異的に結合し、野生型配列には結合しないことを示した。
【０１６９】
したがって、一塩基ｃｆｔｒ遺伝子突然変異（ΔＦ５０８）を含むＤＮＡを成功裏に検出し、また、ヒト患者における診断または処置指標を含めた、試料におけるポリ核酸の特異的配列を検出する、本発明者らのシステムの使用をここに実証した。
【０１７０】
実施例４−ナノ細孔におけるＰＮＡ−ＰＥＧプローブを用いた感染性微生物の検出
この実施例では、ナノ細孔デバイスを使用した試料において、バクテリアＤＮＡの存在を検出するための、本発明者らの修飾プローブの使用に着目する。
【０１７１】
プローブをスタフィロコッカス  ミティス（Ｓ．ミティス）バクテリアＤＮＡに特異的に結合できるＰＮＡ分子と合成した。ｂｉｓＰＮＡは、Ｓ．ミティス微生物種に特異的な配列に相補的な配列を含有する。
【０１７２】
このアッセイでは、バクテリアＤＮＡに結合した場合におけるナノ細孔内での検出を可能にするため、ＰＮＡプローブを１０ｋＤａのＰＥＧに結合させる。ＰＮＡプローブをバクテリアＤＮＡと混合し、結合を観察するため試料上でゲルシフトアッセイを実施した。図９Ａは、ＰＮＡプローブを持たないバクテリアＤＮＡを含むレーン１、及びＰＮＡプローブを持つバクテリアＤＮＡを含むレーン２を用いたゲルシフトアッセイの結果を示す。観察結果は、本発明者らのＰＮＡ／ＰＥＧ（１０ｋＤａ）プローブはＳ．ミティスバクテリアＤＮＡに結合したことを示した。
【０１７３】
次に、ナノ細孔内での検出のため、２つの試料を調製した。第１の試料は、ＰＥＧ修飾ＰＮＡプローブを持つバクテリアＤＮＡ（ＤＮＡ／ｂｉｓＰＮＡ−ＰＥＧ）を含んでいた。第２の試料は単独のバクテリアＤＮＡを含んでいた。２回の連続する実験で、ナノ細孔デバイスにこれらの試料を通過させ、結果として生じるイベントを分析した。図９Ｂは２回の連続する実験における全ての記録イベントにおける、垂直軸上の平均コンダクタンスシフト（ｄＧ）対水平軸上の持続時間の散布図を示す。タグをつけられた試料１（正方形）及びタグをつけられていない試料２（円）からのイベントが示される。
【０１７４】
タグをつけられた分子は一貫してバックグラウンドの閾値（破線）を上回ったが、一方、タグをつけていない分子はラインを下回りバックグラウンド集団との一致を示した。タグイベントを示すための閾値（ライン）を確立するのに、さまざまなバックグラウンド実験（ＰＥＧを持たないＤＮＡ／ＰＮＡ、濾過された血清、等）実験からの分子集団を使用した。バックグラウンドイベントは本明細書では示していない。試料におけるバクテリアＤＮＡの正確な検出のために、ＤＮＡは高度に部位特異的なプローブを使用してタグをつけるべきである。
【０１７５】
結果は、ＤＮＡのみ及びＤＮＡ／ＰＮＡのみは不可能なのに対してＳ．ミティスバクテリアＤＮＡのＰＮＡ／ＰＥＧ結合集団はバックグラウンドイベントから識別可能であることを示した。したがって、修飾ＰＮＡ−ＰＥＧ配列特異的プローブは、試料におけるＳ．ミティスＤＮＡの有無の確信の持てる検出を可能にする。
【０１７６】
実施例５−ナノ細孔デバイス内での標的配列検出のための断片化及び連結
大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）のプラスミドゲノムにおける標的配列５′−ＴＣＣＣＣＴＣＣＴＴＴＴ−３′（配列番号１）の検出の成功を示すが、検出は以下にしたがって行った、大腸菌からのプラスミドＤＮＡを単離し、断片化した。断片化されたＤＮＡを、標的配列に特異的に結合する部位特異的なプローブに暴露した。プローブは検出を容易にするためにペイロード分子に結合させた。プローブ−ペイロードが結合したポリヌクレオチド断片は、ナノ細孔デバイス内で成功裏に検出された（図１０）。
【０１７７】
大腸菌からプラスミドＤＮＡを単離するため、採取された大腸菌を溶解し、標準シリカカラムを使用して５．６ｋｂｐプラスミドＤＮＡを単離して、水に溶出させた。その後ＤＮＡを、超音波処理を使用して約３００ｂｐに分画し、続いて完全一致の同族配列を含有する分画ＤＮＡ分子と結合する配列特異的（ＴＣＣＣＣＴＣＣＴＴＴＴ−配列番号１）ｂｉｓＰＮＡプローブ−ペイロードと共に１時間の間、６５°Ｃでインキュベートした。アガロース電気泳動ゲルシフトアッセイを実施したところ、標的ＤＮＡ部位を含有する一部（１１％）の分画ＤＮＡにプローブ−ペイロードが結合することを示した（図１１）。
【０１７８】
ｂｉｓＰＮＡプローブは、ＤＮＡ配列５′−ＡＡＡＡＧＧＡＧＧＧＧＡ−３′（配列番号２）と完全に一致するヌクレオチド塩基、Ｎ及びＣ末端リシン（ＤＮＡ結合を助ける）、及び４０ｋＤａの３アーム  マレイミド−ＰＥＧペイロードへの共有結合的なコンジュゲーションを可能にするＣ末端システインを含有する（図１２）。コンジュゲーション後、ｂｉｓＰＮＡ−ＰＥＧは、ＨＰＬＣ精製を使用して副生物及び未反応出発物質から単離した（図１３）。
【０１７９】
断片化されたＤＮＡ（プローブ−ペイロード結合断片及び未結合断片）の収集物は、記録バッファ（１．５Ｍ  ＬｉＣｌ、１０ｍＭ  リン酸Ｎａ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．８の最終バッファ組成）と混合し、細孔の上のチャンバに導入し、−１５０ｍＶの電圧を使用して約３５ナノメートルのナノ細孔を通過させた。
【０１８０】
結果として得たプローブ−ペイロードへ暴露させたＤＮＡの集団とプローブを持たないＤＮＡ断片及びプローブのみを持つＤＮＡ断片（ペイロードは持たない）の対照試料の比較は、新たな集団が生じたことを示した。図１４、パネルａ）は、時間（イベント継続期間、ミリ秒）をＸ軸に、電流遮断（最大δＧ、ナノシーメンス）をＹ軸にして、４つの試料に対する２−Ｄプロットを示す。細孔を通過する各ＤＮＡ分子は、細孔を横切るのにかかった時間及び細孔を閉鎖している間に遮断されている電流の量の２つの基準に基づいてプロットした。赤色の集団はＤＮＡ断片のみを示し、黒色の集団はＤＮＡ−プローブを示し、青色の集団はプローブ−ペイロードに曝されたＤＮＡ断片を示し、緑色はプローブ−ペイロードのみ（ＤＮＡなし）を示す。青色の集団は、プローブ−ペイロードがついた短いＤＮＡ断片が、プローブのないＤＮＡ断片及びペイロードのないＤＮＡ断片（ただしプローブを有する）から容易に識別できることを明瞭に示し、これは、対象の標的配列を含有するＤＮＡ断片の検出に対するプローブ−ペイロードのコンビネーションの重要性を示している。
【０１８１】
４つの異なる試料における違いは、各試料に対するヒストグラムを参照することによっても理解される。図１４の、パネルｂ）及びｃ）は、任意の１イベントが、特定の深さ（ｄＧ）または継続期間（秒）のイベントとなる確率をそれぞれ示す。ＤＮＡ及びＤＮＡ／プローブは細孔を通過するとき、非常に似たイベントシグネチャをもたらすが、ＤＮＡ／ＰＮＡ−ペイロードは明確に違うイベントシグネチャであることが見て取れる。予想のように、青色の試料（ＰＮＡ−ペイロードに曝された断片化ＤＮＡ）は２つの主な集団を有する。一方は、ＰＮＡ−ペイロードを持たないＤＮＡ断片（集団の８９％）を表す赤色の試料と重複する集団であり、もう一方は、ＤＮＡ／ＰＮＡ−ペイロード集団を表す異なる集団である。後者は、総ＤＮＡ断片集団の約１１％を占める。
【０１８２】
この方法での標的配列の同定は、例えば、微生物の種間または微生物とウイルス間の水平遺伝子導入の監視等の他の用途に加えて、抗生物質耐性変異または遺伝子カセットのような病原性を同定するために使用され得る。
【０１８３】
実施例６−ナノ細孔内の標的配列の定量化
実施例５からのＤＮＡ／ＰＮＡ−ペイロード集団は、総ＤＮＡ断片集団数の１１％であるが、イベントプロットはＤＮＡ／ＰＮＡ−ペイロードイベントが検出された総イベント集団の１１％よりも著しく多いことを示している。実施例において、図１４のパネルｃ）継続期間ヒストグラムから、ペイロード結合断片は総イベント集団の約７０％である。この標的断片の向上された検出は、ペイロードプローブ検出機序を介する設計、すなわち、標的含有断片のイベントシグネチャを全ての他の検出されたイベントから識別する設計によるものである。ＤＮＡ／ＰＮＡ−ペイロード集団の濃度を計測し、それにより標的含有断片を計測するために、標的分子の向上された検出に補正する方法を必要とする。一般に、図１４に示すように、検出されたイベントタイプの比率は分子のチャンバ内の分子タイプの比率と著しく異なるため、ペイロードが結合した標的と非標的の検出イベントの比率から１１：８９の標的：非標的比率を同定することは不可能である。したがって、標的分子−ペイロード複合体及び非標的断片から、独自のイベントシグネチャ（単独またはプローブ／プローブ−ペイロード複合体への結合のどちらか）を伴うナノ細孔で検出可能な２次分子タイプを使用して、試料内の標的分子を定量する方法を本明細書に提供する。
【０１８４】
分画存在比の計算方法代表的な例として、図１５は同じ細孔上を連続して泳動させた２つの分子タイプに関するイベントプロットを示す。まず始めに、９６ｂｐのＤＮＡ／プローブ−ペイロード複合体を含有する試料を調製しナノ細孔デバイス内で測定した。複合体は図１４に示すプローブ−ペイロードと結合した標的３００ｂｐ断片に対するモデルである。プローブ−ペイロードは４−アームＰＥＧ構造を持つＰＮＡ−ＰＥＧであった。次に、２次分子を含有する試料をナノ細孔デバイスに配置し測定した。２次分子は、ナノ細孔を通る移動を受けて独自のイベントシグネチャを生成するようにデザインされて、それにより分画存在比計算が達成可能となった。２次分子はＰＮＡ−ＰＥＧ結合を有する７４ｂｐのＤＮＡであり、ここでＰＥＧは８アーム構造を有する。２次分子はむしろｄｓＤＮＡであることもでき、例えば、５ｋｂまたはそれ以上の長さでもよい。代替的に、この実施例でのように、２次分子はプローブ−ペイロード結合を有する任意の既知の長さのＤＮＡであってよい。重要な点は、２次分子が、標的／プローブ−ペイロード分子または他の大多数のバックグラウンドイベントとは異なる固有のイベントのサブ集団を生成することである。
【０１８５】
標的ＤＮＡ／プローブ−ペイロード及び２次分子に関して独自のイベントシグネチャ分布を生成した後（図１５）、その分布を本発明者らの方法にしたがって分画存在比を測定するために分析した。
【０１８６】
図１６Ａ〜Ｃは、図１５に示す分子の分画存在比（ＦＡ）をどのように計測できるかという実施例を提示する。具体的には、個別の対照として別々に実験した、標的−ペイロード（または短い表現で「標的」）及び２次分子に関するイベント集団は、ヒストグラムモードができる限り別個になるように１つまたは複数のイベントシグネチャを使用してヒストグラムに区間分けした。この例において、イベントｌｏｇ１０面積（ここで面積はイベントシグネチャの継続期間（ｍｓｅｃ）によって乗算されたイベントシグネチャの平均電流深さ（ｎＡ）として定義）を使用した（図１６Ａ）。この測定は、リニアスケール上での２次分子と標的−ペイロード複合体を識別し、さらなる分析のための集団ヒストグラムを作成することを可能にした。ここで、２次分子は標的−ペイロード分子より小さい面積を有するが、これは２次分子に関するイベントシグネチャの平均継続期間がより速いことに大いに起因する（図１５）。そして本発明者らは、Ｑ（ｑ）＝閾値ｑを超える面積を持つイベントの分画と確定した。これは図１６Ｂに標的及び２次分子に対してプロットされている。２つの分子タイプの混合もナノ細孔デバイスに加え、ナノ細孔からイベントシグネチャを検出した。集めたデータから、混合モードヒストグラム（図１６Ａ）及び対応するＱ（ｑ）曲線（図１６Ｂ）を生成した。この例において、使用された既知の混合比率は標的：２次分子が３：１０であり、標的分子の３０％の分画量に対応する。ここで分画量は、２次分子に対する標的の濃度の分画として定義され、総量に対する標的の比率ではないことに留意されたい。図１６Ｃは、どのように図１６Ｂで提供される情報が、混合物における標的の推定分画量として定義されるＰＦＡ（ｑ）値を計算するために使用されたか例示する。ＰＦＡ（ｑ）値を２次分子の２５％五分位値から標的分子の７５％五分位値までのｑ範囲にわたって計算し、平均化した。この例において、平均ＰＦＡ（ｑ）値は０．３２２であると決定され、これは０．３０の真のＦＡ値によく一致していた。
【０１８７】
この出願のコンテキストにおいてパフォーマンスを改善する枠組みに関する他のデザイン要素が存在する。例えば、個別の対照を未知の混合物の前と後に泳動し、Ｑ（ｑ）値を平均化して、いくつかのケースにおける実証を改善することができる。
【０１８８】
捕捉速度定数（例えば、ここでの２種に対しては１００〜２００（分×ｎＭ）−１）及び所望される確信を得るための１００〜２００のイベントの必要性は、総ナノ細孔検知時間（対照、混合物）が数分以内にｎＭ濃度で行われ得ることを示唆している。また、捕捉確率／２つの分子タイプ（標的及び二次分子）の割合が十分に異なる場合、推定におけるバイアスが導入され得る。これは、対照実験時に確立される２つの分子タイプに対する異なる捕捉速度定数の情報を使用することによって補償することができる。対照混合（例えば、５０：５０）を行うことによって、存在するバイアスの量を同定することもでき、バイアスを取り消す（削減／反転）のにそれを使用することもできる。この補償はＰＦＡ（ｑ）方程式でＱｍｉｘ（ｑ）項を乗ずるパラメーターの形態をとることができる。
【０１８９】
記載した枠組みを使用して、図１５及び１６Ａ〜Ｃからの分画量（２次分子濃度に対する標的／ペイロード分子濃度の比率として定義）を推測した。表２に結果を示す。表の各行は、１つまたは複数の混合物が未知として処理され、且つこの枠組みが適用された、独立したナノ細孔実験である。それぞれ、推測エラーは１０％もしくはそれより低かった。一つ以上のナノ細孔から情報を収集することによって、推測エラーはさらに減少することができる（本例では６％またはより低いエラー割合）。
【０１９０】
（表２）分画存在比測定の結果
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【０１９１】
この例で実証された、集団における標的配列の存在比を定量するためのワークフローは、いかなる増幅、精製、濃度またはバッファ交換のステップも必要としなかった。結果は、単にＰＮＡ−プローブ−ペイロード及び塩などの試薬の連続する添加によって得られる。このワークフローは、低予算で、使い捨て試料用カートリッジに対応することができ、小型化された（手持ちまたはデスクトップ）ユニットで試料を投入して結果が得られる形のワークフローを可能にする。
【０１９２】
他の実施形態
使用された単語は限定ではなく説明のための単語であり、本発明の真の範囲及び精神から逸脱することなく、そのより広い態様において、添付の特許請求の範囲内で変更が可能であることを理解すべきである。
【０１９３】
本発明は、いくつかの記載された実施形態に関してかなり長く且つ相当詳しく説明されているが、本発明はそのような詳細事項または実施形態または任意の特定の実施形態に限定されるべきであることを意図せず、本発明は、先行技術を考慮して特許請求の範囲の最も広い可能な解釈を提供するように、したがって、本発明の意図された範囲を効果的に包含するように、添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。
【０１９４】
本明細書で言及された全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合は、定義を含めて、本明細書が優先するものとする。さらに、セクションの見出し、材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、限定することを意図したものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
2019516087.tif 000011
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年11月30日(2018.11.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内に存在すると予想される標的ポリヌクレオチド配列の有無を検出する方法であって、
（ａ）標的配列を含む標的ポリヌクレオチドを含むと予想される試料においてポリヌクレオチドを断片化する工程、
（ｂ）前記試料を、前記標的配列を含む断片化標的ポリヌクレオチドに特異的に結合するよう適合されたプローブに、前記プローブが前記断片化ポリヌクレオチドに結合するのを促進する条件の下で接触させて、ポリヌクレオチド−プローブ複合体を形成する工程、
（ｃ）前記試料を、ナノ細孔、第１チャンバ、及び第２チャンバを含むナノ細孔デバイスにロードする工程であって、前記第１及び第２チャンバは前記ナノ細孔を通して導電性流体を介し電気的且つ流体的に連通しており、前記ナノ細孔デバイスは、前記ナノ細孔を通過する物体を同定するように構成されたセンサーをさらに含む、前記ロードする工程、
（ｄ）前記ナノ細孔全体にわたって電位を印加して、前記ナノ細孔を通る前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の移動を引き起こす工程、及び
（ｅ）前記ナノ細孔を通る前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の前記移動に付随する電気シグナルを検出する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記電気シグナルを分析して、前記試料内の前記標的ポリヌクレオチドの有無を判定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電気シグナルを基準シグナルと比較して、前記試料内の前記標的ポリヌクレオチドの量を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブが、ペイロード分子に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記プローブが、ペイロード結合部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ペイロード結合部分が、化学基、反応基、小分子、またはペプチドを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記小分子が、ビオチンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記反応基が、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）またはアジドを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記反応基が、反応性マレイミド、遊離チオール（チオレート）、または硫黄原子を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記電位を印加する前に、ペイロード分子が前記ペイロード結合部分に結合する工程をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料を前記プローブに接触させた後に、前記ペイロード分子が前記ペイロード結合部分に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料を前記プローブに接触させる前に、前記ペイロード分子が前記ペイロード結合部分に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ペイロード分子が、デンドリマー、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡアプタマー、フルオロフォア、タンパク質、抗体、ポリペプチド、ナノビーズ、ナノロッド、ナノチューブ、ナノ粒子、フラーレン、ＰＥＧ分子、リポソーム、またはコレステロール−ＤＮＡハイブリッドからなる群から選択される、請求項４または１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペイロード分子が、荷電されている、請求項４または１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記荷電ペイロード分子が、ペプチド、アミノ酸、荷電ナノ粒子、合成分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、金属、及びイオンからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ナノ細孔デバイスによる前記標的ポリヌクレオチドの有無の検出に対する感度または特異度が、前記標的ポリヌクレオチドが前記荷電ペイロード分子と結合した場合、未結合標的ポリヌクレオチドと比較して増加する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ペイロード結合部分及び前記ペイロード分子が、共有結合を介して結合される、請求項４または１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記共有結合が、クリックケミストリーによって形成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記クリックケミストリーが、銅触媒である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記クリックケミストリーが、銅フリーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記共有結合が、チオ−エーテル結合を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記チオ−エーテル結合が、マレイミド−チオレート化学反応によって形成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ペイロード結合部分と前記ペイロード分子が、非共有結合を介して結合される、請求項４または１０に記載の方法。
【請求項２４】
前記非共有結合が、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、極性結合、カチオン−π相互作用、平面スタッキング相互作用、及び金属結合からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的ポリヌクレオチドの有無の検出に対する感度または特異度が、前記標的ポリヌクレオチドが前記ペイロード分子と結合した場合、未結合標的ポリヌクレオチドと比較して増加する、請求項４または１０に記載の方法。
【請求項２６】
２つ以上のペイロード分子が、前記断片化標的ポリヌクレオチドに結合される、請求項４または１０に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的配列を含む前記断片化標的ポリヌクレオチドへの前記プローブの前記特異的結合が、配列特異的連結を介して起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリヌクレオチドの断片化が、前記試料を断片化条件に曝すことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記断片化条件が、化学的剪断、熱及び２価金属陽イオン、音響剪断、超音波処理、水力学的剪断、噴霧、ニードル剪断、及びフレンチプレスからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチドの断片化が、前記試料を断片化試薬と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記断片化試薬が、制限酵素、部位特異的ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、非特異的ヌクレアーゼ、トランスポサーゼ、及び触媒活性ＤＮＡまたはＲＮＡからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料が、別個の標的配列を含む複数の標的ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料を前記プローブに接触させることが、
前記複数の別個の標的ポリヌクレオチド−プローブ複合体のそれぞれが前記ナノ細孔を通る移動を受けて固有で検出可能なシグナルを生成するように、別個の標的配列を含む複数の断片化標的ポリヌクレオチドに特異的に結合するよう適合された複数の独自のプローブを提供すること
を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記電気シグナルを検出することが、前記複数の別個の標的ポリヌクレオチド−プローブ複合体の少なくとも１つの前記移動に付随する電気シグナルを検出することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ナノ細孔デバイスが、少なくとも２つのナノ細孔を含み、前記ナノ細孔デバイスは、独立して制御される電圧を前記少なくとも２つのナノ細孔のそれぞれの全体にわたって印加するように構成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも２つのナノ細孔が、直列している、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体を前記デバイス内の少なくとも２つのナノ細孔において同時に捕捉する工程をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記試料が、前記ポリヌクレオチドの前記断片化の前に前記デバイスにロードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記試料が、前記ポリヌクレオチドの前記断片化の後に前記デバイスにロードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料が、前記試料と前記プローブの前記接触の前に前記デバイスにロードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記試料が、前記試料と前記プローブの前記接触の後に前記デバイスにロードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記試料が、精製されない、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記試料が、前記断片化の前、前記試料と前記プローブの接触の前、および前記ナノ細孔における前記検出の前に精製されない、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記試料が、少なくとも１：２００００、１：１００００、１：５０００、１：２０００、１：１０００、１：５００、１：２００、１：１００、１：５０、１：２０、１：１０、１：５、１：２、１：１．５、１：１．２、１：１．１または１：１．０５の希釈度で前記ナノ細孔デバイスにロードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料が、前記ナノ細孔デバイスに希釈なしにロードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記試料が、前記ナノ細孔デバイス内で非標的ポリヌクレオチド、断片化反応試薬、及び連結反応試薬を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記ナノ細孔が、少なくとも直径５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、２０ｎｍ、４０ｎｍ、または５０ｎｍである、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記ナノ細孔が、直径２００ｎｍ未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記ポリヌクレオチドの断片化が、配列特異的断片化反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記配列特異的断片化反応が、部位特異的制限酵素またはＣＲＩＳＰＲベースの切断を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポリヌクレオチドの断片化が、非配列特異的断片化反応を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
前記非配列特異的断片化反応が、剪断によって達成される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記プローブを、前記ナノ細孔デバイスの内部空間で前記試料と接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的ポリヌクレオチドが、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、または二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的ポリヌクレオチドが、天然に存在するポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的ポリヌクレオチドが、人工的に合成されたポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
前記標的ポリヌクレオチドが、組換えポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
前記センサーが、
前記ナノ細孔全体にわたって前記電位を生成するようにおよび前記電気シグナルを検出するように構成された、電極対
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５９】
前記ペイロード結合標的ポリヌクレオチドが前記ナノ細孔を通過するときに生成される前記電気シグナルが、バックグラウンド分子の電気シグナルから識別可能である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記電気シグナルが、経時的な電流の測定基準であり、
前記電気シグナルが、その深さの平均値、深さ最大値、持続時間、深さレベルの数、深さと持続時間のエリア、またはノイズレベルで識別可能である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
試料内に存在する標的ポリヌクレオチド配列を定量する方法であって、
（ａ）標的配列を含む標的ポリヌクレオチドを含むと予想される試料においてポリヌクレオチドを断片化する工程、
（ｂ）前記試料を、前記標的配列を含む断片化標的ポリヌクレオチドに特異的に結合するよう適合されたプローブに、前記プローブが前記断片化ポリヌクレオチドに結合するのを促進する条件の下で接触させて、ポリヌクレオチド−プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記試料を、ナノ細孔、第１チャンバ、及び第２チャンバを含むナノ細孔デバイスにロードする工程であって、前記第１及び第２チャンバは前記ナノ細孔を通して導電性流体を介し電気的且つ流体的に連通しており、前記ナノ細孔デバイスは、前記ナノ細孔を通過する物体を同定するように構成されたセンサーをさらに含む、前記ロードする工程、
（ｄ）前記ナノ細孔全体にわたって電位を印加して、前記ナノ細孔を通る前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の移動を引き起こす工程、
（ｅ）前記ナノ細孔を通る前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の前記移動に付随する電気シグナルを検出する工程、及び
（ｆ）前記電気シグナルを分析して、前記試料中の前記標的ポリヌクレオチド配列を定量する工程
を含む、前記方法。
【請求項６２】
前記プローブが、ペイロード分子に結合する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記プローブが、ペイロード結合部分を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記ペイロード分子が、前記試料を前記プローブに接触させた後に前記ペイロード結合部分に結合する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記標的ポリヌクレオチドの前記定量化が、標的イベントと対照イベントの比率を決定することを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記試料が、既知の濃度の標的ポリヌクレオチドを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６７】
既知の濃度の対照ポリヌクレオチドを含む別の試料について前記方法を実行する工程をさらに含み、
前記対照ポリヌクレオチド−プローブ複合体の前記移動に付随する前記電気シグナルは、前記標的ポリヌクレオチドプローブ複合体の前記移動に付随する前記電気シグナルと異なる平均的特徴を有する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６８】
前記標的ポリヌクレオチドに特異的に結合するように適合された前記プローブと、前記対照ポリヌクレオチドに特異的に結合するように適合されたプローブとが異なる、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
ナノ細孔を含むデバイスであって、前記ナノ細孔は前記デバイスの内部空間を２つの容積に分け、前記デバイスは前記ナノ細孔を通過する物体を同定するように適合された前記ナノ細孔のためのセンサーを含む、前記デバイス、
標的配列を含む断片化標的ポリヌクレオチドに特異的に結合するように適合されたプローブ、及び
試料内の前記標的配列の有無を検出するための使用についての説明
を含む、キット。
【請求項７０】
前記プローブが、ペイロード分子に結合する、請求項６９に記載のキット。
【請求項７１】
前記プローブが、ペイロード結合部分を含む、請求項６９に記載のキット。
【請求項７２】
前記ペイロード結合部分に結合するよう適合されたペイロード分子をさらに含む、請求項７１に記載のキット。
【請求項７３】
前記ポリヌクレオチドの断片化のための試薬をさらに含む、請求項６９に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
一実施形態において、デバイスは、両該第１細孔及び該第２細孔を通じる該荷電ポリマーの動きを同時に制御するように構成される。一実施形態において、修飾ＰＮＡプローブは、少なくとも１つのＰＥＧ分子と結合する。一実施形態において、デバイスは上部チャンバと中間チャンバの間に第１電圧を、及び中間チャンバと下部チャンバの間に第２電圧を提供するように構成された電源をさらに含み、各電圧は個別に調製可能であり、ここで中間チャンバは２つの電圧に対して共通の接地に接続され、ここでデバイスは各細孔での個別の電圧制御及び電流測定のために構成されたデュアルアンプ電子装置を備え、ここで２つの電圧の大きさは異なっていてよく、ここで第１及び第２細孔は、荷電ポリマーが両細孔を通過してどちらの方向へも制御された様式で同時に移動することができるように構成される。
[本発明1001]
試料内に存在すると予想される標的ポリヌクレオチド配列の有無を検出する方法であって、
（ａ）標的配列を含む標的ポリヌクレオチドを含むと予想される試料においてポリヌクレオチドを断片化する工程、
（ｂ）前記試料を、前記標的配列に特異的に結合するよう適合されたプローブに、前記プローブが前記標的配列に結合するのを促進する条件の下で接触させて、ポリヌクレオチド−プローブ複合体を形成する工程、
（ｃ）前記試料を、ナノ細孔、第1チャンバ、及び第2チャンバを含むナノ細孔デバイスにロードする工程であって、前記第1及び第2チャンバは前記ナノ細孔を通して導電性流体を介し電気的且つ流体的に連通しており、前記ナノ細孔デバイスは、前記ナノ細孔を通過する物体を同定するように構成されたセンサーをさらに含む、前記ロードする工程、
（ｄ）前記ナノ細孔全体にわたって電位を印加して、前記ナノ細孔を通る前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の移動を引き起こす工程、及び
（ｅ）前記ナノ細孔を通る前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の前記移動に付随する電気シグナルを検出する工程
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記電気シグナルを分析して、前記試料内の前記標的ポリヌクレオチドの有無を判定する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記電気シグナルを基準シグナルと比較して、前記試料内の前記標的ポリヌクレオチドの量を決定する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記プローブが、ペイロード分子に結合する、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記プローブが、ペイロード結合部分を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記ペイロード結合部分が、化学基、反応基、小分子、またはペプチドを含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記小分子が、ビオチンを含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記反応基が、ジベンゾシクロオクチル（ＤＢＣＯ）またはアジドを含む、本発明1006の方法。
[本発明1009]
前記反応基が、反応性マレイミド、遊離チオール（チオレート）、または硫黄原子を含む、本発明1006の方法。
[本発明1010]
前記電位を印加する前に、ペイロード分子が前記ペイロード結合部分に結合する工程をさらに含む、本発明1005の方法。
[本発明1011]
前記試料を前記プローブに接触させた後に、前記ペイロード分子が前記ペイロード結合部分に結合する、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記試料を前記プローブに接触させる前に、前記ペイロード分子が前記ペイロード結合部分に結合する、本発明1010の方法。
[本発明1013]
前記ペイロード分子が、デンドリマー、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡアプタマー、フルオロフォア、タンパク質、抗体、ポリペプチド、ナノビーズ、ナノロッド、ナノチューブ、ナノ粒子、フラーレン、ＰＥＧ分子、リポソーム、またはコレステロール−ＤＮＡハイブリッドからなる群から選択される、本発明1004または1010の方法。
[本発明1014]
前記ペイロード分子が、荷電されている、本発明1004または1010の方法。
[本発明1015]
前記荷電ペイロード分子が、ペプチド、アミノ酸、荷電ナノ粒子、合成分子、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、金属、及びイオンからなる群から選択される、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記ナノ細孔デバイスによる前記標的ポリヌクレオチドの有無の検出に対する感度または特異度が、前記標的ポリヌクレオチドが前記荷電ペイロード分子と結合した場合、未結合標的ポリヌクレオチドと比較して増加する、本発明1014の方法。
[本発明1017]
前記ペイロード結合部分及び前記ペイロード分子が、共有結合を介して結合される、本発明1004または1010の方法。
[本発明1018]
前記共有結合が、クリックケミストリーによって形成される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記クリックケミストリーが、銅触媒である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記クリックケミストリーが、銅フリーである、本発明1018の方法。
[本発明1021]
前記共有結合が、チオ−エーテル結合を含む、本発明1017の方法。
[本発明1022]
前記チオ−エーテル結合が、マレイミド−チオレート化学反応によって形成される、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記ペイロード結合部分と前記ペイロード分子が、非共有結合を介して結合される、本発明1004または1010の方法。
[本発明1024]
前記非共有結合が、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、極性結合、カチオン−π相互作用、平面スタッキング相互作用、及び金属結合からなる群から選択される、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記標的ポリヌクレオチドの有無の検出に対する感度または特異度が、前記標的ポリヌクレオチドが前記ペイロード分子と結合した場合、未結合標的ポリヌクレオチドと比較して増加する、本発明1004または1010の方法。
[本発明1026]
2つ以上のペイロード分子が、前記標的ポリヌクレオチドに結合される、本発明1004または1010の方法。
[本発明1027]
前記ポリヌクレオチドの前記標的配列への前記プローブの前記特異的結合が、配列特異的連結を介して起こる、本発明1001の方法。
[本発明1028]
前記ポリヌクレオチドの断片化が、前記試料を断片化条件に曝すことを含む、本発明1001の方法。
[本発明1029]
前記断片化条件が、化学的剪断、熱及び2価金属陽イオン、音響剪断、超音波処理、水力学的剪断、噴霧、ニードル剪断、及びフレンチプレスからなる群から選択される、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記ポリヌクレオチドの断片化が、前記試料を断片化試薬と接触させることを含む、本発明1001の方法。
[本発明1031]
前記断片化試薬が、制限酵素、部位特異的ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、非特異的ヌクレアーゼ、トランスポサーゼ、及び触媒活性ＤＮＡまたはＲＮＡからなる群から選択される、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記試料が、複数の標的ポリヌクレオチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1033]
前記プローブを提供することが、
前記複数の標的ポリヌクレオチド−プローブ複合体のそれぞれが前記ナノ細孔を通る移動を受けて固有で検出可能なシグナルを生成するように、標的配列に特異的に結合するよう適合された複数の独自のプローブを提供すること
を含む、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記試料を前記プローブに接触させることが、前記試料を前記複数の独自のプローブに接触させることを含む、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記電気シグナルを検出することが、前記複数の標的ポリヌクレオチド−プローブ複合体の少なくとも1つの前記移動に付随する電気シグナルを検出することを含む、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記ナノ細孔デバイスが、少なくとも2つのナノ細孔を含み、前記ナノ細孔デバイスは、独立して制御される電圧を前記少なくとも2つのナノ細孔のそれぞれの全体にわたって印加するように構成されている、本発明1001の方法。
[本発明1037]
前記少なくとも2つのナノ細孔が、直列している、本発明1036の方法。
[本発明1038]
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体を前記デバイス内の少なくとも2つのナノ細孔において同時に捕捉する工程をさらに含む、本発明1036の方法。
[本発明1039]
前記試料が、前記ポリヌクレオチドの前記断片化の前に前記デバイスにロードされる、本発明1001の方法。
[本発明1040]
前記試料が、前記ポリヌクレオチドの前記断片化の後に前記デバイスにロードされる、本発明1001の方法。
[本発明1041]
前記試料が、前記試料と前記プローブの前記接触の前に前記デバイスにロードされる、本発明1001の方法。
[本発明1042]
前記試料が、前記試料と前記プローブの前記接触の後に前記デバイスにロードされる、本発明1001の方法。
[本発明1043]
前記試料が、精製されない、本発明1001の方法。
[本発明1044]
前記試料が、前記断片化の前、前記試料と前記プローブの接触の前、および前記ナノ細孔における前記検出の前に精製されない、本発明1001の方法。
[本発明1045]
前記試料が、少なくとも1：20000、1：10000、1：5000、1：2000、1：1000、1：500、1：200、1：100、1：50、1：20、1：10、1：5、1：2、1：1．5、1：1．2、1：1．1または1：1．05の希釈度で前記ナノ細孔デバイスにロードされる、本発明1001の方法。
[本発明1046]
前記試料が、前記ナノ細孔デバイスに希釈なしにロードされる、本発明1001の方法。
[本発明1047]
前記試料が、前記ナノ細孔デバイス内で非標的ポリヌクレオチド、断片化反応試薬、及び連結反応試薬を含む、本発明1001の方法。
[本発明1048]
前記ナノ細孔が、少なくとも直径5ｎｍ、10ｎｍ、20ｎｍ、20ｎｍ、40ｎｍ、または50ｎｍである、本発明1001の方法。
[本発明1049]
前記ナノ細孔が、直径200ｎｍ未満である、本発明1001の方法。
[本発明1050]
前記ポリヌクレオチドの断片化が、配列特異的断片化反応を含む、本発明1001の方法。
[本発明1051]
前記配列特異的断片化反応が、部位特異的制限酵素またはＣＲＩＳＰＲベースの切断を含む、本発明1050の方法。
[本発明1052]
前記ポリヌクレオチドの断片化が、非配列特異的断片化反応を含む、本発明1001の方法。
[本発明1053]
前記非配列特異的断片化反応が、剪断によって達成される、本発明1052の方法。
[本発明1054]
前記プローブを、前記ナノ細孔デバイスの内部空間で前記試料と接触させる、本発明1001の方法。
[本発明1055]
前記標的ポリヌクレオチドが、二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、一本鎖リボ核酸（ｓｓＲＮＡ）、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、または二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）を含む、本発明1001の方法。
[本発明1056]
前記標的ポリヌクレオチドが、天然に存在するポリヌクレオチドである、本発明1001の方法。
[本発明1057]
前記標的ポリヌクレオチドが、人工的に合成されたポリヌクレオチドである、本発明1001の方法。
[本発明1058]
前記標的ポリヌクレオチドが、組換えポリヌクレオチドである、本発明1001の方法。
[本発明1059]
前記センサーが、
前記ナノ細孔全体にわたって前記電位を生成するようにおよび前記電気シグナルを検出するように構成された、電極対
を含む、本発明1001の方法。
[本発明1060]
前記ペイロード結合標的ポリヌクレオチドが前記ナノ細孔を通過するときに生成される前記電気シグナルが、バックグラウンド分子の電気シグナルから識別可能である、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記電気シグナルが、経時的な電流の測定基準であり、
前記電気シグナルが、その深さの平均値、深さ最大値、持続時間、深さレベルの数、深さと持続時間のエリア、またはノイズレベルで識別可能である、本発明1060の方法。
[本発明1062]
試料内に存在する標的ポリヌクレオチド配列を定量する方法であって、
（ａ）標的配列を含む標的ポリヌクレオチドを含むと予想される試料においてポリヌクレオチドを断片化する工程、
（ｂ）前記試料を、前記標的配列に特異的に結合するよう適合されたプローブに、前記プローブが前記標的配列に結合するのを促進する条件の下で接触させて、ポリヌクレオチド−プローブ複合体を形成させる工程、
（ｃ）前記試料を、ナノ細孔、第1チャンバ、及び第2チャンバを含むナノ細孔デバイスにロードする工程であって、前記第1及び第2チャンバは前記ナノ細孔を通して導電性流体を介し電気的且つ流体的に連通しており、前記ナノ細孔デバイスは、前記ナノ細孔を通過する物体を同定するように構成されたセンサーをさらに含む、前記ロードする工程、
（ｄ）前記ナノ細孔全体にわたって電位を印加して、前記ナノ細孔を通る前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の移動を引き起こす工程、
（ｅ）前記ナノ細孔を通る前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド−プローブ複合体の前記移動に付随する電気シグナルを検出する工程、及び
（ｆ）前記電気シグナルを分析して、前記試料中の前記標的ポリヌクレオチド配列を定量する工程
を含む、前記方法。
[本発明1063]
前記プローブが、ペイロード分子に結合する、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記プローブが、ペイロード結合部分を含む、本発明1062の方法。
[本発明1065]
前記ペイロード分子が、前記試料を前記プローブに接触させた後に前記ペイロード結合部分に結合する、本発明1064の方法。
[本発明1066]
前記標的ポリヌクレオチドの前記定量化が、標的イベントと対照イベントの比率を決定することを含む、本発明1062の方法。
[本発明1067]
前記試料が、既知の濃度の標的ポリヌクレオチドを含む、本発明1062の方法。
[本発明1068]
既知の濃度の対照ポリヌクレオチドを含む別の試料について前記方法を実行する工程をさらに含み、
前記対照ポリヌクレオチド−プローブ複合体の前記移動に付随する前記電気シグナルは、前記標的ポリヌクレオチドプローブ複合体の前記移動に付随する前記電気シグナルと異なる平均的特徴を有する、本発明1062の方法。
[本発明1069]
前記標的ポリヌクレオチドに特異的に結合するように適合された前記プローブと、前記対照ポリヌクレオチドに特異的に結合するように適合されたプローブとが異なる、本発明1068の方法。
[本発明1070]
ナノ細孔を含むデバイスであって、前記ナノ細孔は前記デバイスの内部空間を2つの容積に分け、前記デバイスは前記ナノ細孔を通過する物体を同定するように適合された前記ナノ細孔のためのセンサーを含む、前記デバイス、
ポリヌクレオチドの標的配列に特異的に結合するように適合されたプローブ、及び
試料内の前記標的配列の有無を検出するための使用についての説明
を含む、キット。
[本発明1071]
前記プローブが、ペイロード分子に結合する、本発明1070のキット。
[本発明1072]
前記プローブが、ペイロード結合部分を含む、本発明1070のキット。
[本発明1073]
前記ペイロード結合部分に結合するよう適合されたペイロード分子をさらに含む、本発明1072のキット。
[本発明1074]
前記ポリヌクレオチドの断片化のための試薬をさらに含む、本発明1070のキット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019516087000001.app
【国際調査報告】
2019516087.tif 000034
2019516087.tif 000035