(57)【要約】  本開示は、概して、クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用した、生体化合物及び他の複合化合物のためのマルチ特性モニタリングの方法に関する。質量分析法は、高分解能質量分析計を使用し得る。本方法は、生体化合物及び他の複合化合物の特性評価及びモニタリングの両方に類似の分析技術及び器具を用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体化合物のためのマルチ特性モニタリングの方法であって、
（ｉ）クロマトグラフィー光検出器−高分解能質量分析法を使用して生体化合物標準を特性評価することであって、前記特性評価は、
（ａ）前記クロマトグラフィー−光検出器及び高分解能質量分析法を使用して前記生体化合物を分離し、前記光検出器によって生成されたピーク及び前記高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化し、前記精密質量情報を精密質量標準品情報としてライブラリに記憶することと、
（ｂ）前記生体化合物標準を第１特性に関連する第１条件に曝露することであって、前記第１条件は、前記生体化合物標準に対する少なくとも１つの第１化学変化を誘導する、ことと、
（ｃ）前記クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して、前記第１条件に曝露された前記生体化合物を分離し、前記光検出器によって生成されたピーク及び前記高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化し、前記第１条件からの前記精密質量を前記精密質量標準品情報と比較して差異を識別し、前記第１特性に関連する前記第１条件からの前記精密質量情報を標的成分の第１リストとして前記ライブラリに記憶することと、を含む、ことと、
（ｉｉ）前記標的化合物の第１リストに関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定することと、
（ｉｉｉ）前記クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して生体化合物試料を試験することであって、前記試験は、
（ａ）前記クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して前記生体化合物試料を分離し、前記光検出器によって生成されたピーク及び前記高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化することと、
（ｂ）前記生体化合物試料のピーク及び精密質量情報の同一性及び量を、前記生体化合物標準及び前記標的成分の第１リストに関連するピーク及び精密質量の前記ライブラリと比較することと、
（ｃ）前記第１特性に関連する前記少なくとも１つの品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定することと、を含むことと、を含む、方法。
【請求項２】
前記生体化合物は、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、又はオリゴ糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クロマトグラフィー光検出器−高分解能質量分析方法は、液体クロマトグラフィーと、ＵＶ検出器と、データ非依存収集モードで動作する高分解能質量分析計と、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生体化合物標準は、前記クロマトグラフィー光検出器−高分解能質量分析法を使用した単一の分析で特性評価される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＵＶピークの溶出時間、質量分析クロマトグラムにおける前記成分ピークの溶出時間、又はその両方が一致するように調整される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１特性は、脱アミド化評価、異性化評価、糖化評価、高マンノース評価、メチオニン酸化評価、シグナルペプチド評価、異常グリコシル化評価、ＣＤＲトリプトファン分解評価、非コンセンサスグリコシル化評価、ｎ末端ピログルタミン酸評価、ｎ末端切断、ｃ末端リジン評価、ガラクトシル化評価、宿主細胞タンパク質評価、変異／誤取り込み評価、ヒドロキシリシン評価、チオエーテル評価、非グリコシル化重質変化評価、フコシル化評価、残留プロテインＡ評価、及び同一性評価からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記生体化合物標準及び前記生体化合物試料の調製及びデータ収集は同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標的成分の第１リストは、保持時間、中性質量、確認フラグメント、ドリフト時間、衝突断面積、又はこれらの組み合わせによって特性評価される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記生体化合物標準を第２特性に関連する第２条件に曝露することであって、前記第２条件は、前記生体化合物標準に対する少なくとも１つの第２化学変化を誘導する、ことと、
前記クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して、前記第２条件に曝露された前記生体化合物を分離し、前記光検出器によって生成されたピーク及び前記高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化し、前記第２条件からの前記精密質量を前記精密質量標準品情報と比較して差異を識別し、前記第２特性に関連する前記第２条件からの前記精密質量情報を標的成分の第２リストとして前記ライブラリに記憶することと、
前記標的成分の第２リストに関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定することと、
前記生体化合物試料のピーク及び精密質量情報の同一性及び量を、前記標的成分の第２リストに関連するピーク及び精密質量の前記ライブラリと比較することと、
前記第２特性に関連する前記少なくとも１つの品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定することと、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体化合物試料中の新成分を識別することであって、前記新成分は、前記ライブラリに記憶された標的化合物の成分ではないと判定される、ことと、
前記生体化合物標準中の前記新イオンの更なる特性評価のために、また前記ライブラリの更新のために通知を生成することと、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記新成分は、前記生体化合物試料の０．１重量％超である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
生体化合物のためのマルチ特性モニタリングの方法であって、
クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して生体化合物試料を試験することを含み、前記試験は、
（ａ）前記クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して前記生体化合物試料を分離し、前記光検出器によって生成されたピーク及び前記高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化することと、
（ｂ）前記生体化合物試料ピーク及び精密質量情報の同一性及び量を、生体化合物標準及び標的成分の１つ以上のリストに関連するピーク及び精密質量のライブラリと比較することと、
（ｃ）前記ライブラリ内の各精密質量について、前記１つ以上の特性に関連する品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定することと、
（ｄ）前記ライブラリ外の各精密質量について、前記クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法からのピーク及び精密質量情報を更に分析し、各精密質量を既存特性又は新特性に関連付け、前記既存特性又は新特性に関連する前記精密質量情報を前記既存特性又は新特性の標的成分として前記ライブラリに記憶することと、を含む、方法。
【請求項１３】
前記既存特性又は新特性に関連する前記精密質量情報に関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定することを更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
生体化合物のためのマルチ特性モニタリングの方法であって、
（ｉ）クロマトグラフィー光検出器−質量分析法を使用して生体化合物標準を特性評価することであって、前記特性評価は、
（ａ）前記クロマトグラフィー−光検出器及び質量分析法を使用して前記生体化合物を分離し、前記光検出器によって生成されたピーク及び前記質量分析によって生成された質量を識別して定量化し、前記質量情報を質量標準品情報としてライブラリに記憶することと、
（ｂ）前記生体化合物標準を第１特性に関連する第１条件に曝露することであって、前記第１条件は、前記生体化合物標準に対する少なくとも１つの第１化学変化を誘導する、ことと、
（ｃ）前記クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して、前記第１条件に曝露された前記生体化合物を分離し、前記光検出器によって生成されたピーク及び前記質量分析によって生成された質量を識別して定量化し、前記第１条件からの前記質量を前記質量標準品情報と比較して差異を識別し、前記第１特性に関連する前記第１条件からの前記質量情報を標的成分の第１リストとして前記ライブラリに記憶することと、を含むことと、
（ｉｉ）前記標的化合物の第１リストに関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定することと、
（ｉｉｉ）前記クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して生体化合物試料を試験することであって、前記試験は、
（ａ）前記クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して前記生体化合物試料を分離し、前記光検出器によって生成されたピーク及び前記質量分析によって生成された質量を識別して定量化することと、
（ｂ）前記生体化合物試料のピーク及び質量情報の同一性及び量を、前記生体化合物試料標準及び前記標的成分の第１リストに関連するピーク及び質量の前記ライブラリと比較することと、
（ｃ）前記第１特性に関連する前記少なくとも１つの品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定することと、を含むことと、を含む、方法。
【請求項１５】
前記ＵＶピークの溶出時間、前記質量分析クロマトグラムにおける前記成分ピークの溶出時間、又はその両方が一致するように調整される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体化合物標準及び前記生体化合物試料の調製及びデータ収集は同一である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記生体化合物標準を第２特性に関連する第２条件に曝露することであって、前記第２条件は、前記生体化合物標準に対する少なくとも１つの第２化学変化を誘導する、ことと、
前記クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して、前記第２条件に曝露された前記生体化合物を分離し、前記光検出器によって生成されたピーク及び前記質量分析によって生成された質量を識別して定量化し、前記第２条件からの前記質量を前記質量標準品情報と比較して差異を識別し、前記第２特性に関連する前記第２条件からの前記質量情報を標的成分の第２リストとして前記ライブラリに記憶することと、
前記標的成分の第２リストに関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定することと、
前記生体化合物試料のピーク及び質量情報の同一性及び量を、前記標的成分の第２リストに関連するピーク及び質量の前記ライブラリと比較することと、
前記第２特性に関連する前記少なくとも１つの品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定することと、を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体化合物試料中の新成分を識別することであって、前記新成分は、前記ライブラリに記憶された標的化合物の成分ではないと判定される、ことと、
前記生体化合物標準中の前記新イオンの更なる特性評価のために、また前記ライブラリの更新のために通知を生成することと、を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
生体化合物のためのマルチ特性モニタリングの方法であって、
クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して生体化合物試料を試験することを含み、前記試験は、
（ａ）前記クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して前記生体化合物試料を分離し、前記光検出器によって生成されたピーク及び前記質量分析によって生成された質量を識別して定量化すること、
（ｂ）前記生体化合物試料のピーク及び質量情報の同一性及び量を、生体化合物標準及び標的成分の１つ以上のリストに関連するピーク及び質量のライブラリと比較すること、
（ｃ）前記ライブラリ内の各質量について、前記１つ以上の特性に関連する品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定することと、
（ｄ）前記ライブラリ外の各質量について、前記クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法からのピーク及び質量情報を更に分析し、各質量を既存特性又は新特性に関連付け、前記既存特性又は新特性に関連する前記質量情報を前記既存特性又は新特性の標的成分として前記ライブラリに記憶することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１６年９月２７日出願の「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｔｔｒｉｂｕｔｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｓａｍｐｌｅｓ」と題する米国特許仮出願第６２／４００，２８３号に対する優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、概して、クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用した、生体化合物及び他の複合化合物のためのマルチ特性モニタリングの方法に関する。質量分析法は、高分解能質量分析計（ＨＲＭＳ）及び高分解能分析を使用し得る。本方法は、生体化合物及び他の複合化合物の特性評価及びモニタリングの両方に類似の分析技術及び器具を用いる。
【背景技術】
【０００３】
マルチ特性法（ＭＡＭ）とは、一連の従来の方法を使用して従来より実施される多数の製品特性を評価できる単一のアッセイ又は方法の開発を指す。例えば、ＭＡＭでは、単一の分析で多数の重要な品質特性を検出し、測定できる。ＭＡＭは、小分子の特性評価及び試験に適用されている。それにもかかわらず、ＭＡＭは、大型生体分子、バイオ医薬製品、又は他の複合試料の分析には完全に移転されていない。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、生体複合試料及び他の複合試料のマルチ特性モニタリング用の直交検波器、例えば、光検出器及び質量分析計の使用に関する。本方法は、複合分子の多数の重要な品質特性を評価し、試験することができ、規制上のモニタリング及び品質管理分析に適用可能である。特性評価及びモニタリングは、タイムアライメントされた光学データ及び質量データを使用して実施して、生体試料及び複合試料の同一性及び生成の信頼性を向上できる。特性評価及びモニタリングはまた、同一又は類似のプラットフォーム、器具、ソフトウェアなどを使用して実施できる。タイムアライメントされた光学データ、質量データ、及び共通プラットフォームにより、従来の試験工程を削減又は更には排除し、光学データ及び質量データの両方、又は光学データ自体を使用して、規制上のモニタリングのために本方法を効率的に移転できる。本方法はまた、モニタリング中に新成分を発見すると、新特性を迅速かつ容易に更新できる。同一又は類似のプラットフォームを使用することにより、データ（ＵＶ、ＭＳなど）を分析して、将来のモニタリングのために新成分を識別し、これを新特性に相関させることができる。
【０００５】
一実施形態では、本開示は、生体化合物のマルチ特性分析モニタリングの方法に関し、この方法は、（ｉ）クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法（例えば、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳ）を使用して生体化合物標準を特性評価することであって、この特性評価は、（ｉａ）クロマトグラフィー−光検出器及び高分解能質量分析法を使用して生体化合物を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化し、精密質量標準品情報としてライブラリに精密質量情報を記憶すること、（ｉｂ）生体化合物標準を第１特性に関連する第１条件に曝露することであって、第１条件は、生体化合物標準に対する少なくとも１つの第１化学変化を誘導する、こと、（ｉｃ）クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して、第１条件に曝露された生体化合物を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化し、第１条件からの精密質量を精密質量標準品情報と比較して差異を識別し、第１特性に関連する第１条件からの精密質量情報を標的成分の第１リストとしてライブラリに記憶すること、を含む、こと、（ｉｉ）標的化合物の第１リストに関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定すること、並びに、（ｉｉｉ）クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して生体化合物試料を試験することであって、この試験は、（ｉｉｉａ）クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して生体化合物試料を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化すること、（ｉｉｉｂ）生体化合物標準ピーク及び精密質量情報の同一性及び量を、生体化合物試料及び標的成分の第１リストに関連するピーク及び精密質量のライブラリと比較すること、（ｉｉｉｃ）第１特性に関連する少なくとも１つの品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定すること、を含む、ことを含む。
【０００６】
クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法は、データ依存収集モード又はデータ非依存収集モードで動作させることができる。ＵＶピークの溶出時間、質量分析クロマトグラムにおける成分ピークの溶出時間、又はその両方が一致するように調整される。標的成分の第１リストを含む標的成分は、保持時間、中性質量、確認フラグメント、ドリフト時間、衝突断面積（ＣＣＳ）、又はこれらの組み合わせによって特性評価され得る。
【０００７】
生体化合物又は生体試料は、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、又はオリゴ糖である。生体試料における修飾を刺激するために試験される条件は、脱アミド化評価、異性化評価、糖化評価、高マンノース評価、メチオニン酸化評価、シグナルペプチド評価、異常グリコシル化評価、ＣＤＲトリプトファン分解評価、非コンセンサスグリコシル化評価、ｎ末端ピログルタミン酸評価、ｎ末端切断評価、ｃ末端リジン評価、ガラクトシル化評価、宿主細胞タンパク質評価、変異／誤取り込み評価、ヒドロキシリシン評価、チオエーテル評価、非グリコシル化重質変化評価、フコシル化評価、残留プロテインＡ評価、及び同一性評価からなる群から選択される特性に関連し得る。
【０００８】
本方法は、マルチ特性を評価することを更に含み得る。本方法は、生体化合物標準を第２特性に関連する第２条件に曝露することであって、第２条件は、生体化合物標準に少なくとも１つの第２化学変化を誘導する、こと、クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して、第２条件に曝露された生体化合物を分離すること、光検出器によって生成されたピーク及び高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化すること、第２条件からの精密質量を精密質量標準品情報と比較して差異を識別し、第２特性に関連する第２条件からの精密質量情報を標的成分の第２リストとしてライブラリに記憶すること、標的成分の第２リストに関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定すること、生体化合物試料のピーク及び精密質量情報の同一性及び量を、標的成分の第２リストに関連するピーク及び精密質量のライブラリと比較すること、並びに第２特性に関連する少なくとも１つの品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定すること、を含み得る。
【０００９】
生体化合物標準は、クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を用いた単一の分析で特性評価され得る。生体化合物標準及び生体化合物試料の調製及びデータ収集は、同一であり得る。本方法は、生体化合物試料中の新成分を識別することであって、新成分は、ライブラリに記憶された標的化合物の成分ではないと判定される、こと、並びに生体化合物標準中の新成分の更なる特性評価のために、及びライブラリの更新のために通知を生成すること、を更に含み得る。新成分は、生体化合物試料の０．１重量％超であり得る。
【００１０】
別の実施形態では、本開示は、クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して生体化合物試料を試験することを含む、生体化合物のマルチ特性モニタリングの方法に関し、この試験は、（ａ）クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して、生体化合物試料を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化すること、（ｂ）生体化合物試料のピーク及び精密質量情報の同一性及び量を、生体化合物標準及び標的成分の１つ以上のリストに関連するピーク及び精密質量のライブラリと比較すること、（ｃ）ライブラリ内の各精密質量について、１つ以上の特性に関連する品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定すること、並びに（ｄ）ライブラリ外の各精密質量について、クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法からのピーク及び正確な質量情報を更に分析し、各精密質量を既存特性又は新特性に関連付け、既存特性又は新特性に関連する精密質量情報を既存特性又は新特性の標的成分としてライブラリに記憶すること、を含む。本方法は、既存特性又は新特性に関連する精密質量情報に関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定することを更に含み得る。
【００１１】
他の実施形態では、非高分解能質量分析が使用され得る。本開示は、生体化合物のマルチ特性分析モニタリングの方法に関し、この方法は、（ｉ）クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して生体化合物標準を特性評価することであって、この特性評価は、（ａ）クロマトグラフィー−光検出器及び質量分析法を使用して生体化合物を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び質量分析によって生成された質量を識別して定量化し、質量標準品情報としてライブラリに質量情報を記憶すること、（ｂ）生体化合物標準を第１特性に関連する第１条件に曝露することであって、第１条件は、生体化合物標準に対する少なくとも１つの第１化学変化を誘導する、こと、（ｃ）クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して、第１条件に曝露された生体化合物を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び質量分析によって生成された質量を識別して定量化し、第１条件からの質量を質量標準品情報と比較して差異を識別し、第１特性に関連する第１条件からの質量情報を標的成分の第１リストとしてライブラリに記憶すること、を含む、こと、（ｉｉ）標的化合物の第１リストに関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定すること、並びに、（ｉｉｉ）クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して生体化合物試料を試験することであって、この試験が、（ａ）クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して、生体化合物試料を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び質量分析によって生成された質量を識別して定量化すること、（ｂ）生体化合物試料のピーク及び質量情報の同一性及び量を、生体化合物標準及び標的成分の第１リストに関連するピーク及び質量のライブラリと比較すること、並びに（ｃ）第１特性に関連する少なくとも１つの品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定すること、を含む、ことを含む。
【００１２】
本方法は、マルチ特性を評価することを更に含み得る。本方法は、生体化合物標準を第２特性に関連する第２条件に曝露することであって、第２条件は、生体化合物標準に少なくとも１つの第２化学変化を誘導する、こと、クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して、第２条件に曝露された生体化合物を分離すること、光検出器によって生成されたピーク及び質量分析によって生成された質量を識別して定量化し、第２条件からの質量を質量標準品情報と比較して、差異を識別し、第２特性に関連する第２条件からの質量情報を標的成分の第２リストとしてライブラリに記憶すること、標的成分の第２リストに関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定すること、生体化合物試料のピーク及び質量情報の同一性及び量を、標的成分の第２リストに関連するピーク及び質量のライブラリと比較すること、並びに第２特性に関連する少なくとも１つの品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定すること、を含み得る。
【００１３】
本開示の方法は、より少ないアッセイ（例えば、単一のアッセイ）を提供して、生体試料及び複合試料の重要特性をモニタリング及び試験することを含む、先行技術に対する利点を提供する。これらの試料の複雑さにより、バッチ間、場所間、競合品間で再現することがより困難になる。分子の適切な生成を確認すること、例えば、一次配列を確認し、他の特性を識別することは重要である。従来、このような分析を完了するには、多数の従来のアッセイ及び長時間が必要とされた。本開示の方法は、アッセイ数を削減することによって生産性を向上でき、これはまた、時間と費用の節約をもたらす。試料の直接モニタリングにより、リアルタイム分析が可能になり、試料調製エラーは生じにくくなる。
【００１４】
場合によっては、高分解能質量分析法の使用により、生体及び複合分子の生成及び確認の確実性も改善する。高分解能質量分析データの生成はまた、分子／化合物の構造的特徴に関するより正確な説明を提供する。このような情報は、複合分子が作製されるバイオ製造プロセスの開発を促進し得る。これにより、生物学的製剤の有効性及び安全性にとって重要と見なされる、これらの品質特性の測定が強化され得る。
【００１５】
加えて、本方法の実施、及びそのような方法から得られた情報は、ＦＤＡによって促進されるクオリティバイデザイン（ＱｂＤ）理念の理解を支援し得る。単一アッセイからの光学データ（ＵＶ）及び質量分析データの両方の可用性は、特性モニタリングのための高度に再現可能な定量的測定を提供するアプローチ／方法を可能にし得、その一方で、明確な同一性を提供する。
【００１６】
本開示によって提供される前述の特徴及び利点、並びに他の特徴及び利点は、添付の図面と一緒に読むとき、例示的な実施形態の以下の説明からより完全に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】標準／基準バッチ及び試料の特性評価及びモニタリングの両方で共通の工程を使用するための、本開示のアプローチの例示的な概要を示す。
【図２】実施例１で検査された例示的なトラスツズマブ品質特性を示す。
【図３Ａ】例示的な、ペプチドマッピングを実施した、実施例１のトラスツズマブ試料を示す。
【図３Ｂ】例示的な、ペプチドマッピングを実施した、実施例１のトラスツズマブ試料を示す。
【図３Ｃ】例示的な、ペプチドマッピングを実施した、実施例１のトラスツズマブ試料を示す。
【図４Ａ】実施例１の、例示的な標的特性リスト生成を示す。
【図４Ｂ】実施例１の、例示的な標的特性リスト生成を示す。
【図５】実施例１のワークフローをモニタリングするための例示的なＰｅｐＭａｐ処理パラメータを示す。
【図６】実施例１の改善されたＭＳ定量化の、例示的な３Ｄピーク検出及びコンポーネント化を示す。
【図７Ａ】実施例１のグリコペプチド（ＨＣ  Ｔ２６  Ｇ１Ｆ）の例示的な標的モニタリングを示す。
【図７Ｂ】実施例１のグリコペプチド（ＨＣ  Ｔ２６  Ｇ１Ｆ）の例示的な標的モニタリングを示す。
【図７Ｃ】実施例１のグリコペプチド（ＨＣ  Ｔ２６  Ｇ１Ｆ）の例示的な標的モニタリングを示す。
【図８Ａ】実施例１の例示的なトラスツズマブＨＣグリコペプチド抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す。
【図８Ｂ】実施例１の例示的なトラスツズマブＨＣグリコペプチド抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す。
【図９】実施例１の精密質量スクリーニングワークフローによる、グリコペプチド変異の例示的なモニタリングを示す。
【図１０Ａ】実施例１のＭＳ及びＵＶ応答対酸化率（ＨＣ：Ｔ２１酸化ストレス試料）の例示的な比較を示す。
【図１０Ｂ】実施例１のＭＳ及びＵＶ応答対酸化率（ＨＣ：Ｔ２１酸化ストレス試料）の例示的な比較を示す。
【図１１Ａ】実施例１のＭＳ及びＵＶ応答対酸化率（ＨＣ：Ｔ２１酸化（ＤＴＬＭＩＳＲ））の例示的な比較を示す。
【図１１Ｂ】実施例１のＭＳ及びＵＶ応答対酸化率（ＨＣ：Ｔ２１酸化（ＤＴＬＭＩＳＲ））の例示的な比較を示す。
【図１２】実施例１の例示的な酸化率の結果（ＨＣ  Ｔ４１  Ｏｘ  ＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ）を示す。
【図１３Ａ】実施例１のＭＳ及びＵＶクロマトグラム（ＨＣ：Ｔ１０脱アミド化ＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲ（Ｎ８４Ｄ））の例示的な比較を示す。
【図１３Ｂ】実施例１のＭＳ及びＵＶクロマトグラム（ＨＣ：Ｔ１０脱アミド化ＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲ（Ｎ８４Ｄ））の例示的な比較を示す。
【図１４Ａ】実施例１のアスパラギン酸及びイソアスパラギン酸（ＨＣ：Ｔ１０脱アミド化）の脱アミド化結果の例示的な比較を示す。
【図１４Ｂ】実施例１のアスパラギン酸及びイソアスパラギン酸（ＨＣ：Ｔ１０脱アミド化）の脱アミド化結果の例示的な比較を示す。
【図１５】実施例２の限界及びシステム適合性パラメータを設定する例示的な方法を示す。
【図１６Ａ】実施例２の例示的なクロマトグラフィーシステム適合性チェックを示す。
【図１６Ｂ】実施例２の例示的なクロマトグラフィーシステム適合性チェックを示す。
【図１６Ｃ】実施例２の例示的なクロマトグラフィーシステム適合性チェックを示す。
【図１７Ａ】実施例２のＵＶ及びＭＳの両方の例示的なＨＣリジンモニタリングを示す。
【図１７Ｂ】実施例２のＵＶ及びＭＳの両方の例示的なＨＣリジンモニタリングを示す。
【図１８Ａ】２つのプロセス間の差異を示すリジン変異体の例示的な限界チェック分析を示す。
【図１８Ｂ】２つのプロセス間の差異を示すリジン変異体の例示的な限界チェック分析を示す。
【図１９Ａ】実施例２の例示的な特性中心レポートを示す。
【図１９Ｂ】実施例２の例示的な特性中心レポートを示す。
【図１９Ｃ】実施例２の例示的な特性中心レポートを示す。
【図１９Ｄ】実施例２の例示的な特性中心レポートを示す。
【図１９Ｅ】実施例２の例示的な特性中心レポートを示す。
【図２０】本方法の例示的なフロー図を示す。
【図２１】本方法の別の例示的なフロー図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、概して、クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用した、生体化合物及び他の複合化合物のためのマルチ特性モニタリングの方法に関する。
【００１９】
本方法は、製造からＱＣ／ＱＡ及び承認後までなど開発ライフサイクルを通して（though）、大型の生体及び／又は複合試料、例えば、化合物、分子の開発及び再現に関する課題のいくつかに対処する。開発の初期段階では、試料が特性評価されるために、コンプライアンス上の問題はほとんどない。モニタリング段階では、試料関するより多くの情報が知られるに従って、ＧｘＰｓが適用され得る。確実な製品生産を行うために、標的分析が開発され得る。リリース段階では、試料に関する高度な製品知識が既知であり、規制遵守が必要である。本開示の方法は、高度な製品知識を、試料の更なる特性評価に組み入れ、集中モニタリングアッセイを生成して、ユーザからの相互作用を最小限に抑えて個別結果を提供できる。
【００２０】
特性評価及びモニタリングアッセイはまた、共通収集を使用して、特性評価からモニタリングへの効率的な移行を可能にする。図１に提供されるように、本開示のアプローチは、特性評価及びモニタリングアッセイ間に共通の器具及び情報プラットフォームを含む。データの収集には、共通の試料調製及び共通の実験条件セットが使用され得る。これにより、２つの情報プロセスを一緒に使用できる。
【００２１】
一実施形態では、本開示は、生体化合物のマルチ特性分析モニタリングの方法に関し、この方法は、（ｉ）クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法（例えば、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳ）を使用して生体化合物標準を特性化することであって、この特性評価は、（ｉａ）クロマトグラフィー−光検出器及び高分解能質量分析法を使用して生体化合物を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化し、精密質量標準品情報としてライブラリに精密質量情報を記憶すること、（ｉｂ）生体化合物標準を第１特性セットに関連する第１条件に曝露することであって、第１条件は、生体化合物標準に対する少なくとも１つの第１化学変化を誘導する、こと、（ｉｃ）クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して、第１条件に曝露された生体化合物を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化し、第１条件からの精密質量を精密質量標準品情報と比較して成分及びその差異を識別し、第１特性に関連する第１の条件からの精密質量情報を標的成分の第１リストとしてライブラリに記憶すること、を含む、こと、（ｉｉ）標的化合物の第１リストに関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定すること、並びに、（ｉｉｉ）クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して生体化合物試料を試験することであって、この試験が、（ｉｉｉａ）クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して、生体化合物試料を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化すること、（ｉｉｉｂ）生体化合物試料のピーク及び精密質量情報の同一性及び量を、生体化合物試料及び標的成分の第１リストに関連するピーク及び精密質量のライブラリと比較すること、（ｉｉｉｃ）第１特性に関連する少なくとも１つの品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定すること、を含む、ことを含む。
【００２２】
本開示の方法は、任意の生体試料、分子、若しくは化合物又は複合試料、分子、若しくは化合物（本明細書では「標準」、「試料」又は「生体試料」と称されるが、他の複合分子を含む）のマルチ特性モニタリングに使用され得る。例えば、分子は、バイオ医薬薬品又はバイオシミラーであり得る。分子は単分子であり得る。いくつかの実施形態では、複合試料は、１つ以上の分子又は化合物を含有する生物学的プロダクトバイプロセスであり得る。生体試料、分子、若しくは化合物又は複合試料、分子、若しくは化合物の例としては、ペプチド（合成及び組み換え）、タンパク質及びそれらの誘導体（例えば、タンパク質複合体）、オリゴヌクレオチド及びその類似体、オリゴ糖が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な生体分子としては、トラスツズマブ及びインフリキシマブが挙げられる。
【００２３】
本方法は、標準品又は試料を特性評価して、モニタリング用に特性セットを確立する又は定義するために使用され得る。特性評価は、標準品又は試料を１つ以上の既知の条件又はストレスに曝露して化学変化を誘発することを含み得る。化学変化に関連する又はこれを示す成分は、条件又はストレスに関連する標的成分として識別され、使用され得る。特性評価は、標準又は試料の構造−機能関係を定義し、潜在的な経路を識別するのに役立ち得る。標的成分及び関連特性は、ライブラリに記憶されて、追加の標準及び試料を試験するために使用され得る。標的成分は、品質管理の尺度を提供するために適切に管理され得る。この管理、ＧｘＰ又は他の規制品質管理要件に関連し得る。本方法は、研究及び品質管理の両方の目的でリアルタイムで試料をモニタリングし、更に分析するために使用され得る。
【００２４】
生体試料、分子、若しくは化合物又は複合試料、分子、若しくは化合物の特性評価及び試験は、クロマトグラフィー光検出器−質量分析（例えば、ＨＲＭＳ）システムを使用して実施され得る。クロマトグラフィーは、品質特性を効果的にモニタリングできるように、生体試料、分子、若しくは化合物又は複合試料、分子、若しくは化合物を効率的に分離できる任意のクロマトグラフィー技術であり得る。クロマトグラフィー技術の例としては、順相クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、二酸化炭素系クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親水性相互作用液体相互作用クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。分離はまた、キャピラリー電気泳動、等速電気泳動、エレクトロクロマトグラフィーなどの他の分離ベースの技術であり得る。クロマトグラフィーシステムは、Ｗａｔｅｒｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）であり得る。
【００２５】
光検出器は、クロマトグラフィー技術及び質量分析計に合わせて動作する、又はそれと互換性のある任意の光検出器であり得る。光検出器の例としては、（反射指数）検出器、ＭＡＬＳ（多角度光散乱）検出器、ＥＬＳＤ（蒸発光散乱検出）検出器、ＦＬＲ（蛍光）検出器、ＩＲ（赤外線）検出器、ＰＤＡ検出器、及びＵＶ／ＶＩＳ検出器、並びにこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
本開示の方法は、機器の質量分解能及び範囲内の識別可能な質量を有する任意の特性など、様々な特性をモニタリングするように構成されている、任意の質量分析計と共に使用され得る。質量分析計は、高分解能質量分析計（例えば飛行時間質量分析計）又は非高分解能質量分析計（例えば四重極質量分析計）であり得る。質量分析計は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＡＣＱＵＩＴＹ  ＱＤａ（登録商標）などシングル四重極ＭＳ検出器であり得る。質量分析計は、データ依存収集モード又はデータ非依存収集モードで動作し得る。
【００２７】
質量分析計の単位質量分解能（例えば、半値全幅）は、約０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、又は約１０ダルトンであり得る。これらの値は、約０．１〜約１ダルトンなど範囲を定義するために使用され得る。質量分析計の質量範囲は、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００又は約２０００ｍ／ｚであり得る。これらの値は、約５０〜約１００ｍ／ｚ、又は約５０〜約２０００ｍ／ｚなど範囲を定義するために使用され得る。
【００２８】
Ｗａｔｅｒｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＡＣＱＵＩＴＹ  ＱＤａ（登録商標）など質量分析計を使用して、オリゴ識別及び純度用の合成オリゴヌクレオチド試料をスクリーニングでき、より高いスループット要件を有し得る。ＡＣＱＵＩＴＹ  ＱＤａ（登録商標）はまた、ＣＤＲ（相補性ドメイン領域）ペプチドのモニタリングにも有用であり得る。これらの特定のペプチドは、抗体がその特異的抗原、例えば、ＡＣＱＵＩＴＹ  ＱＤａ（登録商標）でモニタリングされ得るトラスツズマブのＣＤＲペプチドと相互作用するかどうか決定する。ペプチドマップ内のＣＤＲ含有ペプチドのそれぞれの質量を表すクロマトグラムが抽出され得る。質量精度は、約０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１ダルトン又は約１．５ダルトン以下であり得る。これらの値は、約０．１〜約１ダルトンなど範囲を定義するために使用され得る。ダイナミックレンジは、約３であってよい、又は約３桁よりも大きくてよい。
【００２９】
高分解能質量分析計は、ピーク、成分、イオン、フラグメントなどのそれぞれについて精密質量を測定するように構成されている、並びに、それぞれの構造、例えば構造解釈を測定するように構成されている、任意の高分解能質量分析計であり得る。高分解能質量分析計は、詳細なオリゴヌクレオチドの特性評価及び配列確認を提供できる。高分解能質量分析計は、質量対電荷比（平均で約２、３、４、５、６、７、８、９又は約１０ｐｐｍ未満）で測定された精密質量を生成でき、約５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１２０００ダルトン未満又は約１５０００ダルトン未満の分子量を有する化合物の分解同位体分布を生成できる。高分解能質量分光計の例としては、Ｔｏｆ、ＦＴ−ＩＣＲ（フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析）又はオービトラップが挙げられるが、これらに限定されない。高分解能質量分析計は、Ｗａｔｅｒｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＶｉｏｎ（商標）ＩＭＳ  ＱＴｏｆ質量分析計であり得る。
【００３０】
本方法はまた、光検出器によって生成されたピーク及び精密質量、並びに質量分析（例えば、ＨＲＭＳ）によって生成された他の生理学的特性に関連する情報を識別して定量化することを含む。これらのピーク及び質量の測定により、標準品化合物標準又は試料のピーク及び質量（例えば、精密質量）のベースラインを作成できる。
【００３１】
質量分析計は、親ピーク及び娘ピークの両方の精密質量測定を提供でき、データ非依存収集が可能な任意のＭＳ器具であり得る。データ非依存収集は、識別目的のフラグメンテーションの特異性を更に増加させる。本開示は、データ非依存収集を有する質量分析計を完全に説明する米国特許第６，７１７，１３０号及び同第６，５８６，７２７号を、参照により本明細書に組み込む。
【００３２】
データ非依存モードは、例えば、試料、化合物、分子、成分、イオンなどの構造解釈に使用され得る。データ非依存モードでは、質量分析計は、イオン又は成分の高エネルギーフラグメンテーション質量スペクトル及び低エネルギーフラグメンテーション質量スペクトルの両方を使用し、これにより、低エネルギーフラグメンテーション質量スペクトルのピークセットと、極めて類似する高エネルギーフラグメンテーション質量スペクトルのピークセットとの相互参照が可能になる。成分の化学構造は、相互参照された低エネルギーデータ及び高エネルギーデータから識別され得る。イオン又は成分の高エネルギーフラグメンテーション質量スペクトル及び低エネルギーフラグメンテーション質量スペクトルは、ＭＳＥ又はＨＤＭＳＥなどデータ非依存法を使用して生成され得る。
【００３３】
データ非依存収集は、ＭＳ検出前に低衝突エネルギー及び高衝突エネルギーが入れ替わる衝突セルの使用を伴う。低エネルギースペクトルは、主にフラグメント化を解消した前駆物質からのイオンを含有し得る一方で、高エネルギースペクトルは、主にフラグメント化した前駆物質からのイオンを含有し得る。交流エネルギープロトコルは、低エネルギーモード及び高エネルギーモードの２つのモードで、同一の前駆物質からスペクトルを収集できる。
【００３４】
質量分析計は、イオンの少なくとも一部がフラグメント化されて娘イオンを生成する第１モード及び実質的により少ないイオンがフラグメント化される第２モードで動作可能な衝突セルと、質量分析器と、使用中に第１モードと第２モードとの間で衝突セルを繰り返し切り替える制御システムと、を含み得る。第１モードでは、制御システムは、≧１５Ｖ、≧２０Ｖ、≧２５Ｖ、≧３０Ｖ、≧５０Ｖ、≧１００Ｖ、≧１５０Ｖ、及び≧２００Ｖからなる群から選択される電圧を衝突セルに供給するように手配できる。第２のモードでは、制御システムは、≦５Ｖ、≦４．５Ｖ、≦４Ｖ、≦３．５Ｖ、≦３Ｖ、≦２．５Ｖ、≦２Ｖ、≦１．５≦、≦１Ｖ、≦０．５Ｖ、及び実質的に０Ｖからなる群から選択される電圧を当該衝突セルに供給するように手配できる。これらの値セットまた、約２０〜３０Ｖ、又は約５〜３Ｖなど範囲を定義するために使用され得る。
【００３５】
制御システムは、２つのモードの間で衝突セルを十分に短い時間で自動的に切り替えることができて、検体、前駆物質、又はイオンのうちの少なくとも１つを各モードに曝露できる。制御システムは、約５、４、３、２．５、２、１．５、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１秒又は０．０５秒毎に、２つのモード間で衝突セルを自動的に切り替えることができる。これらの値はまた、約５〜約０．５秒などの範囲を定義するために使用され得る。
【００３６】
データ非依存収集を使用した器具の出力は、前駆物質及びフラグメントイオンの一覧表又はリストであり、各イオンは、その保持時間、ドリフト時間、単離された／選択されたｍ／ｚ、測定されたｍ／ｚ、強度など、又はこれらの組み合わせによって説明され得る。低エネルギーモードは、主にフラグメント化を解消した前駆物質イオンを含むイオンのリストを生成できる。高エネルギーモードは、主にフラグメント化前駆物質イオンを含むイオンのリストを生成できる。米国特許第６，７１７，１３０号及び同第６，５８６，７２７号に記載されるように、親娘ピークは、これらの説明、例えば、保持時間及び／又はドリフト時間に基づいて分類され得る。これらの分類は、構造解釈に役立ち得る。
【００３７】
本方法は、精密質量標準品情報としてライブラリに精密質量情報を記憶することを含む。この情報は、コンピュータ又は他の類似の電子記憶装置に電子形態で記憶又は保持され得る。精密質量情報は、親娘質量情報及び比率、保持時間、ドリフト時間、衝突断面積、単離された／選択されたｍ／ｚ、測定されたｍ／ｚ、強度などを含み得る。
【００３８】
いくつかの例では、情報の記憶は選択的であってよく、このことは、特性評価からの情報のサブセットのみが、アッセイをモニタリングするためのライブラリに「記憶」されることを意味する。特性評価工程（プロセス）からは、多数の特性に関する情報を取得できるが、モニタリングプロセス（工程）では、特性の一部（サブセット）のみがモニタリングされ得る。モニタリングされる特性の選択は、特性が化合物の特性（例えば、安全性及び有効性）にとって重要であるかどうかに依存する。これらの特性に関して事前定義された「閾値」は、ライブラリ内に記憶され得る、又は記憶されなくてよい。親イオン及びプロダクトイオンの精密質量、それらの保持時間、ドリフト時間衝突断面積などの情報は、通常、ライブラリに記憶され得る。
【００３９】
ライブラリは科学ライブラリであってよく、このことは、ライブラリが、化合物／試料の物理化学的特性に関する情報を含み得ることを意味する。また、必要に応じてアーカイブ、バックアップ、検索、並びに更新が行われ得る。ライブラリは、機器及びソフトウェアによってアクセス可能であり得る。これは、比較して成分を識別するための更なる分析で使用され得る。ライブラリはまた、更なる分析からの新情報で更新され得る。ライブラリは、分析される試料の固有ライブラリであり得る。ライブラリは、試料及びその関連特性に関連する精密質量情報などのみを含み得る。一実施形態では、ソフトウェアは、ユーザが、特定の特性を用いて、標的成分、例えば標的ペプチドを含有するカスタム科学ライブラリを作成可能にし得る。ライブラリは、これらの標的成分を検索して定量化するデータ処理の一部として使用され得る。ライブラリは、ユーザによって開発され得る、又は特定の化合物用に開発され得る。
【００４０】
本方法は、クロマトグラフィー−光検出器−質量分析システムを制御できるソフトウェアを用いることができる。ソフトウェアはまた、ＵＶピーク、イオン、質量情報、精密質量情報などの分析を含む成分の識別及び定量化を自動化できる。ソフトウェアはまた、ライブラリ及び他のリレーショナルデータベースを含む、又はそれらにアクセスできる。ソフトウェアは、試料中の１つ以上の成分の出現が１つ以上の条件又は特性に起因し得るように、条件、特性、及び成分を調整できる。ソフトウェアは、いずれもＷａｔｅｒｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＵＮＩＦＩ（登録商標）又はＥＭＰＯＷＥＲ（登録商標）であり得る。
【００４１】
ソフトウェアは、精密質量の測定、データ処理、及び報告のために包括的プラットフォームを提供できる。標準／試料の特性評価及び試験、並びに情報の収集及び処理は、同一プラットフォーム内で実施され得る。同一プラットフォームの使用により、翻訳後修飾、例えば、タンパク質のグリコシル化など修飾の正確な識別が可能になり、迅速かつ正確な分析と連動し得る。ソフトウェアは、監査証跡及び電子署名などのＧｘＰ環境でのプラットフォームの導入に必要なツールを提供できる。ソフトウェアは、分析から収集されたデータを自動的にアーカイブ（バックアップ）する能力を有し、保存データを検索する能力を提供できる。
【００４２】
これらのデータ分析ソフトウェアは、ＭＡＳＳＬＹＮＸ（商標）とインターフェースをとることができ、オリゴヌクレオチドの質量スペクトルの自動デコンボリューション及び純度分析（平均質量及び高分解能データの両方）など自動データ分析及び報告機能、並びに高スループットワークフローをサポートする能力を提供し得る。
【００４３】
本方法は、基準生体化合物と、ストレス条件、製造プロセスの変更などを受けた、これらに曝露された、これらから生成されたなどの化合物との定量的及び定性的比較を提供できる。観測される変化は、当該条件に寄与する化合物の品質特性と相関し得る。特性について生体試料化合物をモニタリングすることは、例えば治療薬剤分子など化合物の安全性又は有効性に影響を及ぼし得る。
【００４４】
生体化合物標準又は試料は、第１特性に関連する第１条件に曝露され得、第１条件は、生体化合物標準に対する少なくとも１つの第１化学変化を誘導する。例えば、第１条件など条件は、治療タンパク質又はペプチドなど生体化合物の変化又は修飾をシミュレートするために使用される実験条件であり得る。変化は、製造プロセスの変更又はシミュレーションされた製造プロセスの変更を含み得る。条件は、安定性試験のための様々な製造プロセス条件又は試料ストレス条件によって生じる生体試料（例えば、治療タンパク質）の変化を再現するように設計され得る。条件の例としては、ｐＨ、温度、製品貯蔵中の光の変更、処方の変更、細胞培養インキュベーションにおける供給材料及び細胞株の変更が挙げられ得る。
【００４５】
試料の変化又は修飾は、化学変化であり得る。変化は、官能基の付加又は損失であり得る。変化は、化合物の量又は相対量の増減であり得る。変化は、クロマトグラフィー−光検出器−質量分析計システム（例えば、ＨＲＭＳ）によって直接的又は間接的のいずれかで判定して測定され得る変化であるべきである。各条件は、少なくとも１つの変化を誘発し得る。各条件はまた、化合物における２つ以上の変化を誘発し得る。変化のうちの１つ以上は、試料の１つ以上の特性と相関し、それに関連付けられ得る。
【００４６】
一実施形態では、生体試料における修飾を刺激するために試験される条件は、脱アミド化評価、異性化評価、糖化評価、高マンノース評価、メチオニン酸化評価、シグナルペプチド評価、異常グリコシル化評価、ＣＤＲトリプトファン分解評価、非コンセンサスグリコシル化評価、ｎ末端ピログルタミン酸評価、ｎ末端切断、ｃ末端リジン評価、ガラクトシル化評価、宿主細胞タンパク質評価、変異／誤取り込み評価、ヒドロキシリシン評価、チオエーテル評価、非グリコシル化重質変化評価、フコシル化評価、残留プロテインＡ評価、及び同一性評価からなる群から選択される特性に関連し得る。
【００４７】
一実施形態では、本方法は、生体試料の重要特性の全てが識別される特性評価を重視するデータ処理工程を含み得る。これら重要特性及び関連ピーク、精密質量、イオンなどは、ライブラリに記憶され得る。本方法はまた、標的検索を実施して、特性に関連付けられたピーク、精密質量、イオン、例えばペプチドイオンを識別して定量化し得る、第２データ処理工程に関する。いくつかの例では、データ処理工程は、同一データセット上で実施され得る。
【００４８】
重要な品質特性は、薬物の安全性及び／又は有効性にとって重要な特性であり得る。典型的には、任意の分子／化合物／試料について識別され得るロット特性が存在する。これらの一部のみが、「重要」であり得る。例えば、分子について典型的に識別される多くのグリコシル化構造が存在する。グリコシル化構造の全ては、分子に関連する「特性」であるが、分子の機能又は免疫原性にとっては、いくつかのグリコシル化構造のみが重要である。他の構造は、単に分子の作製方法を理由として存在する。
【００４９】
本方法は、クロマトグラフィー光検出器−質量分析法を使用して、第１条件に曝露された生体化合物を分離することを含み得る。分離は、試料成分のうちの１つ以上のベースライン分解能を提供し得る。分離はまた、溶出期間にわたって試料を成分又はピークの群へと分解できる。本方法は、光検出器を使用して生成されたピークを識別して定量化でき、質量分析によって生成された質量を識別して定量化できる。
【００５０】
第１条件から分離され、識別され、及び／又は定量化された質量は、質量標準品情報と比較されて、２つの差異又は変化が識別され得る。差異又は変化は、化学変化、成分、イオン、イオン比の増減などであり得る。第１特性に関連する第１条件からの質量情報及び差異は、標的成分の第１リストとして記憶され得る。標的成分の第１リストなど標的成分は、保持時間、中性質量、確認フラグメント、ドリフト時間、衝突断面積、又はこれらの組み合わせによって特性評価され得る。
【００５１】
本方法は、１つ以上の標的成分、例えば、標的成分の第１リストに関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定することを含み得る。管理限界は、典型的には、特性変化が生産プロセスの自然変動に起因する程度を反映する。品質管理（ＱＣ）限界の確立は、正常（許容可能な）又は許容不可能な値が収集される、以前の実験及び試験プロセスの結果であり得る。管理限界は、仕様限界を含み得る。管理限界は、顕著な差異を示すピーク、成分、イオン、比などの変化率、出現、又は消失であり得る。例えば、酸化副生成物を経時的に形成され得る。管理限界は、酸化副生成物の量又は量の変化であり得る。管理限界の超過は、その特性に関連する潜在的問題を示す。特性の管理限界を判定することは、１つ以上の試料を試験して、特性に関連する標的化合物の本質を理解することを含み得る。
【００５２】
各特性及び対応の管理限界の標的成分を判定する特性評価は、多数の異なる特性に関連付けられた多数の異なる条件を使用して実施され得る。特性評価は、単一の分析で実施され得る、各条件に対して別々に実行され得る、又はこれらの組み合わせであり得る。
【００５３】
最初の特性評価が完了すると、生体化合物試料の試験は、同一又は類似のクロマトグラフィー−光検出器−質量分析計システムを使用して実施され得る。試験は、クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して生体化合物試料を分離すること、及び光検出器によって生成されたピーク及び質量分析（例えば、ＨＲＭＳ）によって生成された質量（例えば、精密質量）を識別して定量化することを含み得る。識別されて定量化された、生体化合物試料のピーク及び質量情報は、生体化合物標準及び標的成分の第１リストに関連するピーク及び質量のライブラリと比較され得る。この比較を使用して、第１特性に関連する限界など品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定できる。
【００５４】
システムは、ＵＶデータ及びＭＳデータの両方を収集することを含む。ＵＶデータ及びＭＳデータの両方を識別及び／又は定量化を含むことにより、分析物の追加情報をユーザに提供する。ＵＶピークの溶出時間、質量分析クロマトグラムにおける成分ピークの溶出時間、又はその両方は、一致するように調整され得る。ソフトウェアは、同一分析の２つの別個のデータチャネルからなどの光学データ及び質量分析データをタイムアライメントさせ得る。質量分析データから識別された成分はまた、光学データによって割り当てられ、定量化され得る。光学データは、１つ以上の成分の定量化に使用され得、ＭＳデータは、質量の識別に使用され得る。光検出器は、選択成分のより正確かつ／又はより精密な定量化を提供できる。光検出器の使用により、システム測定値の差異率を約５％、１０、１５、２０、２５、３０、４０又は約５０％減少させることができる。これらの値は、約１０％〜約３０％など範囲を定義するために使用され得る。光検出器の使用により、システム測定の標準偏差又は標準誤差を約５％、１０、１５、２０、２５、３０、４０又は約５０％減少させることができる。これらの値は、約５％〜約２０％など範囲を定義するために使用され得る。光検出器はまた、より良好なシステム適合性を提供し得る。例えば、光検出器、例えばＵＶでの定量化は、結果としてイオン化変動を除去でき、より再現可能な結果を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、質量分析データを使用して、ＵＶピークが２つ以上の共溶出成分を含むかどうかを判定することを更に含み得る。２つ以上の共溶出成分を有するＵＶピークの場合、これらのピークは、生体化合物試料の試験工程、例えば、比較工程から除外できる。場合によっては、本方法は、ＵＶデータのみを使用して分離されて定量化され得るピークを識別できる。そのような例では、本方法は、従来のより安価なクロマトグラフィー−光検出器機能を有するシステム又は実験室で使用できる、又はそこに移転できる。
【００５５】
本方法は、マルチ特性を評価することを更に含み得る。例えば、本方法は、生体化合物標準を第２特性に関連する第２条件に曝露することであって、第２条件は、生体化合物標準に少なくとも１つの第２化学変化を誘導する、こと、クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して、第２条件に曝露された生体化合物を分離すること、光検出器によって生成されたピーク及び高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化すること、第２条件からの精密質量を精密質量標準品情報と比較して差異を識別し、第２特性に関連する第２条件からの精密質量情報を標的成分の第２リストとしてライブラリに記憶すること、標的成分の第２リストに関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定すること、生体化合物試料のピーク及び質量情報の同一性及び量を、標的成分の第２リストに関連するピーク及び正確な質量のライブラリと比較すること、並びに第２特性に関連する少なくとも１つの品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定すること、を含み得る。
【００５６】
別の実施形態では、本方法は、生体化合物標準を第２特性に関連する第２条件に曝露することであって、第２条件は、生体化合物標準に少なくとも１つの第２化学変化を誘導する、こと、クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して、第２条件に曝露された生体化合物を分離すること、光検出器によって生成されたピーク及び質量分析によって生成された質量を識別して定量化すること、第２条件からの質量を質量標準品情報と比較して、差異を識別し、第２特性に関連する第２条件からの質量情報を標的成分の第２リストとしてライブラリに記憶すること、標的成分の第２リストに関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定すること、生体化合物試料のピーク及び質量情報の同一性及び量を、標的成分の第２リストに関連するピーク及び質量のライブラリと比較すること、並びに第２特性に関連する少なくとも１つの品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定すること、を含み得る。
【００５７】
特性の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０などであり得る。これらの値は、約１〜約２０など範囲を定義するために使用され得る。
【００５８】
１つ以上の特性に対する生体化合物標準の特性評価は、単一の分析で、又はクロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用する、特性の数よりも少ない分析で実施され得る。マルチ特性は、単一の分析で特性評価され、試験され得る。
【００５９】
生体化合物標準及び生体化合物試料の調製及びデータ収集は、同一又は実質的に同一であり得る。調製とデータ収集との類似性を維持することによって、本方法は、生体化合物試料中の新成分を識別することを更に含み得、この新成分は、ライブラリに記憶された標的化合物の成分ではないと判定される。新成分の発見により、新成分の更なる特評価のための通知が生成され得る。特性評価が実施されると、ライブラリは、適切な特性に関連付けられるために、新成分、例えば、質量情報又は精密質量情報で更新され得る。場合によっては、新成分は、０．０５重量％超、０．１、０．５、１、５、又は約１０重量％超で存在する成分である。これらの値は、約０．１〜約０．５重量％など範囲を定義するために使用され得る。
【００６０】
本方法は、生体試料又は複合試料の１つ以上の特性に関連付けられた１つ以上の標的成分を含有する既存のライブラリと共に使用され得る。本方法は、特性（単数又は複数）の試験及び／又はモニタリングに使用され得、分析又は更なる分析に基づいてライブラリに新標的成分を追加することによって、ライブラリの強化、追加、又は改良にも使用され得る。場合によっては、試料の収集は、クロマトグラフ−光検出器−質量分析計で実施され、それにより、新成分の分析は、更なる分析を実行せずに実行され得る。収集された既存のＵＶデータ及びＭＳデータは、新成分を識別し、それを新特性又は既存特性に関連付けるために再分析され得る。
【００６１】
別の実施形態では、本開示は、クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して生体化合物試料を試験することを含む、生体化合物のためのマルチ特性モニタリングの方法に関し、この試験は、（ａ）クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して生体化合物試料を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化すること、（ｂ）生体化合物試料のピーク及び精密質量情報の同一性及び量を、生体化合物標準及び標的成分の１つ以上のリストに関連するピーク及び精密質量のライブラリと比較すること、（ｃ）ライブラリ内の各精密質量について、１つ以上の特性に関連する品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定すること、並びに（ｄ）ライブラリ外の各精密質量について、クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法からのピーク及び精密質量情報を更に分析し、各精密質量を既存特性又は新特性に関連付け、既存特性又は新特性に関連する精密質量情報を既存特性又は新特性の標的成分としてライブラリに記憶すること、を含む。本方法は、既存特性又は新特性に関連する精密質量情報に関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定することを更に含み得る。
【００６２】
別の実施形態では、本開示は、クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して生体化合物試料を試験することを含む、生体化合物のためのマルチ特性モニタリングの方法に関し、この試験は、（ａ）クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して、生体化合物試料を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び質量分析によって生成された質量を識別及び定量化すること、（ｂ）生体化合物試料のピーク及び質量情報の同一性及び量を、生体化合物標準及び標的成分の１つ以上のリストに関連するピーク及び質量のライブラリと比較すること、（ｃ）ライブラリ内の各質量について、１つ以上の特性に関連する品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定すること、並びに（ｄ）ライブラリ外の各質量について、クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法からのピーク及び質量情報を更に分析し、各質量を既存特性又は新特性に関連付け、既存特性又は新特性に関連する質量情報を既存特性又は新特性の標的成分としてライブラリに記憶すること、を含む。本方法は、既存特性又は新特性に関連する質量情報に関連する少なくとも１つの品質特性管理限界を判定することを更に含み得る。
【００６３】
別の実施形態では、条件変化を模倣する陽性対照を生成するために使用され得る試料ストレスは、例えば、条件変化又は特性のうちの１つ以上が既知である場合に、省略され得る。別の実施形態では、本開示は、生体化合物のためのマルチ特性分析モニタリングの方法に関し、この方法は、（ｉ）クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法（例えば、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳ）を使用して生体化合物標準を特性評価することであって、この特性評価は、（ｉａ）クロマトグラフィー−光検出器及び高分解能質量分析法を使用して生体化合物を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化し、精密質量、保持時間、フラグメンテーションなど成分情報を精密質量標準品情報としてライブラリに記憶すること、を含む、こと、（ｉｉ）ライブラリからの１つ以上の特性リストをモニタリングワークフローにエクスポートし、モニタリングワークフロー下で少なくとも１つの品質特性を判定すること、並びに（ｉｉｉ）クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して生体化合物試料を試験することであって、この試験は、（ｉｉｉａ）クロマトグラフィー−光検出器−高分解能質量分析法を使用して生体化合物試料を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び高分解能質量分析によって生成された精密質量を識別して定量化すること、（ｉｉｉｂ）生体化合物標準ピーク及び精密質量情報の同一性及び量を、生体化合物試料及び標的成分の第１リストに関連するピーク及び精密質量のライブラリと比較すること、並びに（ｉｉｉｃ）第１特性に関連する少なくとも１つの品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定すること、を含む、ことを含む。
【００６４】
別の実施形態では、本開示は、生体化合物のためのマルチ特性分析モニタリングの方法に関し、この方法は、（ｉ）クロマトグラフィー光検出器−質量分析法（例えば、ＬＣ／ＵＶ／ＭＳ）を使用して生体化合物標準を特性評価することであって、この特性評価は、（ｉａ）クロマトグラフィー−光検出器及び質量分析法を使用して生体化合物を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び質量分析によって生成された質量を識別して定量化し、質量、保持時間、フラグメンテーションなど成分情報を質量標準品情報としてライブラリに記憶すること、を含む、こと、（ｉｉ）ライブラリからの１つ以上の特性リストをモニタリングワークフローにエクスポートし、モニタリングワークフロー下で少なくとも１つの品質特性を判定すること、並びに（ｉｉｉ）クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して生体化合物試料を試験することであって、この試験が、（ｉｉｉａ）クロマトグラフィー−光検出器−質量分析法を使用して、生体化合物試料を分離し、光検出器によって生成されたピーク及び質量分析によって生成された質量を識別して定量化すること、（ｉｉｉｂ）生体化合物標準のピーク及び質量情報の同一性及び量を、生体化合物試料及び標的成分の第１リストに関連するピーク及び質量のライブラリと比較すること、（ｉｉｉｃ）第１特性に関連する少なくとも１つの品質特性管理限界が超えられたかどうかを判定すること、を含む、こと、を含む。
【００６５】
刊行物、特許、及び特許出願を含む全ての引用文献の開示は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
【００６６】
量、濃度、又は他の値若しくはパラメータが、範囲、好ましい範囲、又はより高い好ましい値及びより低い好ましい値のリストのいずれかとして与えられる場合、範囲が個別に開示されているかどうかにかかわらず、任意の上限範囲又は好ましい値及び任意の下限範囲又は好ましい値の任意の対から形成される全ての範囲を具体的に開示するものとして理解されるべきである。数値の範囲が本明細書に記載されている場合、特に明記しない限り、その範囲は、その端点、並びに範囲内の全ての整数及び分数を含むことが意図される。本発明の範囲は、範囲を定義するときに列挙される特定の値に限定されることを意図するものではない。
【００６７】
本発明は、以下の実施例において更に定義される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、実例としてのみ与えられることを理解されたい。
【００６８】
【実施例】
【００６９】
実施例１−トラスツズマブストレス試験
【００７０】
この試験は、トラスツズマブのペプチドマッピングを使用して、本開示の特性評価及び品質管理試験を示す。トラスツズマブは、細胞ベースアッセイにおいて、ヒト上皮成長因子受容体２タンパク質（ＨＥＲ２）の細胞外ドメインに高親和性で選択的に結合する、組み換えＤＮＡ由来のヒトモノクローナル抗体である。この抗体は、ＨＥＲ２に結合するマウス抗体（４Ｄ５）の相補性決定領域を有するヒトフレームワーク領域を含むＩｇＧ１κである。トラスツズマブは、抗生ゲンタマイシンを含有する培養液中の哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ））懸濁培養によって産生され得る。
【００７１】
ＬＣ／ＵＶ／ＨＲＭＳを使用して、トラスツズマブの選択した重要特性を特性評価し、試験した。トラスツズマブは、１つには、脱アミド化を受ける部分、及びグリコシル化に対するその一般的な抵抗など、既知のトラスツズマブに関する多くの特徴により選択した（図２を参照）。６０分間のトリプシン消化の前に、トラスツズマブ試料を還元し、アルキル化した。各消化物は、ＬｅｕＥｎｋ、５μＭの内部標準を含有した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ液体クロマトグラフィーシステムには、ＣＳＨ２．１×１００ｍｍ、１．７μカラムを装備した。１０μＬの消化物の注入量を使用した。３〜３３％  ＡＣＮ（０．１％  ＦＡ）からの１２０分勾配を、０．２ｍＬ／分の流速、カラム温度６５℃で使用した。ＵＶ検出を２１５ｎｍで行った。Ｗａｔｅｒｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＶｉｏｎ（商標）ＩＭＳ  ＱＴｏｆ質量分析計を、ＬＣＭＳＥ収集モード（すなわち、データ非依存モード）で使用した。ＷＡＴＥＲＳ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＵＮＩＦＩ（登録商標）１．８（ＳＲ２）ソフトウェアを使用して、収集、処理、及び報告を制御した。
【００７２】
ストレス条件及び非ストレス条件下で、トラスツズマブ試料を試験した。２つのストレス試料はアルカリストレスを含み、試料はｐＨ９．０、３７℃で最大２、４及び７日間保持した。酸化ストレスも実施し、室温、０．００３％、０．０１％及び０．０１５％の濃度（ｖ／ｖ）で、試料をＨ２Ｏ２に２４時間曝露した。合計４つの対照試料を試験し、各ストレス条件について２つの試料を試験した。
【００７３】
質量データは、標準的な生物情報学のペプチドピーク割り当てを使用して分析した。図３Ａ〜Ｃは、トラスツズマブ試料のペプチドマッピングを示す。質量データを分析して、各修飾（複数可）、例えば脱アミド化に関連する標的成分を判定した。標的成分のリストを識別し、成分ライブラリに記憶した。各標的成分について、識別子、保持時間、中性質量、確認フラグメント、必要に応じてＵＶ信号など追加情報も記憶した。図４Ａ〜Ｂは、トラスツズマブの部分標的特性リストを示す。次いで、準標的モードで精密質量スクリーニングワークフローを使用して、質量データを処理した。各成分について、保持時間窓、成分を識別するための前駆物質質量窓、フラグメント質量窓（必要に応じて）、及び電荷担体の基準を設定した。識別した特定の電荷担体の一部を定量化に使用した。図５は、ＰｅｐＭａｐ処理ソフトウェア画面表示の一例を示す。図６は、ＭＳ定量化用の３Ｄピーク検出及びコンポーネント化を示す。
【００７４】
標的成分、例えば、グリコペプチドＨＣ：Ｔ２６  Ｇ１Ｆの標的スクリーニングを実施した。図７Ａ〜Ｃは、ＴＵＶデータ窓及びＭＳデータ窓を示す。質量データからのイオンの２つの電荷状態からのｍ／ｚ値は、ＨＣ：Ｔ２６  Ｇ１Ｆのライブラリ値と一致した。ＨＣ：Ｔ２６  Ｇ１Ｆ成分の同一性は、質量データ中のオキソニウムイオンによって更に確認した。他のグリコ変異体を同様に識別して定量化した。図８Ａ〜Ｂは、定量化目的のいくつかのトラスツズマブＨＣグリコペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す。加速試験からのデータのサマリを図９に示す。これは、精密質量スクリーニングワークフローがグリコペプチド変動のモニタリングに適用されたときの定量化結果を示す。成分は、％ＲＳＤ値が主ピークに対して２％未満であり、副ピークに対して１０％未満であるように、良好な再現性で判定された。グリコフォームは、ストレス条件、すなわち、高ｐＨ及び酸化の両方において良好な安定性を示した。図９に示すように、２つの最も豊富な成分においては、微量の系統的差のみが観測された。
【００７５】
酸化に関連する特性もまた特性評価して試験した。図１０Ａ〜Ｂは、ＨＣ：Ｔ２１に対するＭＳ応答及びＵＶ応答対酸化率の比較を示す。酸化形態は、異なるデータ形態（ＴＵＶ、ＸＩＣなど）にわたって示される。ＵＶにおいて、酸化形態は、別の未修飾ペプチドピークに融合される。結果として、ＵＶデータによるＴ２１の定量化は困難であった。しかしながら、ＸＩＣは明快であり、定量化に使用した。未修飾形態は、ＵＶスキャン及びＸＩＣスキャンの両方において分解ピークを示す。ＵＶ及びＸＩＣの両方を使用して、未修飾形態を定量化した。
【００７６】
ＵＶ及びＸＩＣからの酸化結果を、図１１Ａ〜ＢのＨＣ：Ｔ２１（ＤＴＬＭＩＳＲ）について比較した。質量データは、より感度が高く、２％レベルの酸化を検出できる。質量データはまた、過酸化ストレスに対する増加した応答に示されるように、より再現可能であった。ＵＶ検出器は、２つの融合ピークを個別に再現可能に測定できなかった。ＨＣ：Ｔ４１（ＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＨＮＨＹＴＱＫ）の酸化からの質量データを図１２に要約する。酸化したＴ４１は、わずかに内側を向いているメチオニン基を有する重鎖のｃ末端に近い。ここでも、質量データは、高ｐＨストレス試験において、Ｔ４１を良好に検出する。質量データはまた、酸化ストレス試料に対する応答の増加を示す。
【００７７】
アミド化については、複数の脱アミド化部位の結果として複数のピークをモニタリングした。図１３Ａ〜Ｂは、ＨＣ：Ｔ１０脱アミド化ＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲ（Ｎ８４Ｄ）についてのＭＳ及びＵＶクロマトグラムの比較を示す。より低い２つのＸＩＣグラフは拡大され、分解ピークを示す。アスパラギン酸形態及びイソアスパラギン酸形態の両方は、脱アミド化の生成物である。アスパラギン酸形態及びイソアスパラギン酸形態（ＨＣ：Ｔ１０脱アミド化）の定量化結果の比較を図１４Ａ〜Ｂに示す。質量データは、高ｐＨストレスに対する応答が時間依存であり、アスパラギン酸形態又はイソアスパラギン酸形態のいずれかの脱アミド化の程度も同一傾向であることを示す。２つの脱アミド化形態の傾向の一致は、低レベルの試料の変化に対するＭＳ定量化の妥当性を示す。
【００７８】
実施例２−インフリキシマブのバイオシミラー試験
【００７９】
本開示の他の特性を強調するために、バイオシミラー比較可能性試験を実施した。市販のインフリキシマブは、マウス細胞株から産生される。ＣＨＯ細胞株を使用して、インフリキシマブのバイオシミラー試料を再現した。２つの細胞株によって、本方法によって識別されて定量化され得る差異が生じることが予想される。２つの試料を、実施例１に記載した同一のＬＣ／ＵＶ／ＨＲＭＳを使用して試験した。
【００８０】
市販のインフリキシマブを特性評価し、異なる特性に関連する標的成分を識別した。図１５に示すように、特性評価に基づいて仕様を設定した。ソフトウェアはシステム適合性を評価する能力を提供して、データが高品質であり、アッセイのモニタリングに使用されるようにする。これは、測定の許容範囲を設定する。例えば、システム適合性の一部として、ペプチドのうちの１つのクロマトグラフピーク幅をモニタリングし、アッセイに対するシステム適合性を測定した。図１５は、モニタリング下の成分（例えば、Ｔ１１）について、ＵＶ応答、基準正規化（ＭＳ及びＵＶ）に対する試料の割合（％）に基づいた一部の使用及び限界の設定を示す。モニタリング特性が仕様内にあるかどうかを迅速に示すように、フラグ及び警告も設定した。ＵＶデータを収集した。このデータは、モニタリング目的で（質量信号に対して）独立して使用できる。図１６Ａ〜Ｃに示されるように、クロマトグラフピーク幅は一貫しており、適切な再現可能測定を確実に行うために十分であった。ペプチドについてのＵＶ応答が示され、適量の試料が分析され、各定量化可能な成分について良好な測定が行われ得ることを示唆する。図１６Ａ〜Ｃはまた、分析された試料にわたるＵＶ信号の変化を示し、ペプチドＴ１１の存在量の変動を示す。黄色のバーは、当該試料中のＴ１１の存在量が、試料にとって既に警告範囲内にあることを示す。
【００８１】
２つの細胞株間で異なる他の特性をモニタリングすることもできる。例えば、図１７Ａ〜Ｂに示されるように、重鎖のｃ末端ペプチド（ＨＣ：Ｔ４３及びＨＣ：Ｔ４３（−Ｋ  ｃ末端））のリジン処理をモニタリングできる。未処理リジンを有するペプチド及び処理済みリジンを有するペプチドは、ＵＶ及びＭＳの両方を使用して測定された、分解ピークを示す。図１８Ａ〜Ｂは、２つのプロセス間の差異を示すリジン変異体の限界チェック分析を示す。このデータは、単純な視覚を提供して差異を示す。再現されたインフリキシマブ（プロセス２）は、ほとんどの分子が未処理リジンを有さず、多量の処理済み生成物を有することを示す。ソフトウェアを使用して、サマリデータレポートを生成した。図１９Ａ〜Ｅは、特性中心レポートを示す。データは、特性、例えば、酸化ペプチド別に整理され、各特性は、要約され、報告され得る。
【図１】
2019535007.tif 000002
【図２】
2019535007.tif 000003
【図３Ａ】
2019535007.tif 000004
【図３Ｂ】
2019535007.tif 000005
【図３Ｃ】
2019535007.tif 000006
【図４Ａ】
2019535007.tif 000007
【図４Ｂ】
2019535007.tif 000008
【図５】
2019535007.tif 000009
【図６】
2019535007.tif 000010
【図７Ａ】
2019535007.tif 000011
【図７Ｂ】
2019535007.tif 000012
【図７Ｃ】
2019535007.tif 000013
【図８Ａ】
2019535007.tif 000014
【図８Ｂ】
2019535007.tif 000015
【図９】
2019535007.tif 000016
【図１０Ａ】
2019535007.tif 000017
【図１０Ｂ】
2019535007.tif 000018
【図１１Ａ】
2019535007.tif 000019
【図１１Ｂ】
2019535007.tif 000020
【図１２】
2019535007.tif 000021
【図１３Ａ】
2019535007.tif 000022
【図１３Ｂ】
2019535007.tif 000023
【図１４Ａ】
2019535007.tif 000024
【図１４Ｂ】
2019535007.tif 000025
【図１５】
2019535007.tif 000026
【図１６Ａ】
2019535007.tif 000027
【図１６Ｂ】
2019535007.tif 000028
【図１６Ｃ】
2019535007.tif 000029
【図１７Ａ】
2019535007.tif 000030
【図１７Ｂ】
2019535007.tif 000031
【図１８Ａ】
2019535007.tif 000032
【図１８Ｂ】
2019535007.tif 000033
【図１９Ａ】
2019535007.tif 000034
【図１９Ｂ】
2019535007.tif 000035
【図１９Ｃ】
2019535007.tif 000036
【図１９Ｄ】
2019535007.tif 000037
【図１９Ｅ】
2019535007.tif 000038
【図２０】
2019535007.tif 000039
【図２１】
2019535007.tif 000040
【配列表】
2019535007000001.app
【国際調査報告】
2019535007.tif 000041
2019535007.tif 000042