(57)【要約】  本発明は、新規多機能化ケイ素ナノ粒子、その調製方法、及び新規多機能化ケイ素ナノ粒子を含む組成物に関する。本発明は、電気化学発光に基づく検出方法における、及び分析物のインビトロ検出における、新規多機能化ケイ素ナノ粒子の使用にも関する。特に、本発明は、新規多機能化ケイ素ナノ粒子を使用するインビトロの方法により分析物を測定する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１ｎｍ〜１０ｎｍのサイズのケイ素コアと、
（ｂ）ケイ素コアに共有結合している、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキル基、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピル基、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピル基、又はアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチル基と、
（ｃ）好ましくはリンカーを介して、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキル基、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピル基、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピル基、又はアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチル基に共有結合している、１〜１０個の親和性結合剤と、
（ｄ）好ましくはリンカーを介して、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキル基、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピル基、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピル基、又はアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチル基に共有結合している、１〜１００個の電気化学発光化合物と
を含む、多機能化ケイ素ナノ粒子。
【請求項２】
式（Ｉ）
【化１】
2019534994.tif 000073
（式中、
ｎは３〜１８の整数であり、
ｘは１〜１０の整数であり、
ｙは少なくとも１であり、
ｚは１〜１００の整数であり、
Ｌ１はリンカーであり、
Ｌ２はリンカーであり、
ここで、Ｌ１とＬ２は同一又は異なっており、
Ｓｉは１ｎｍ〜１０ｎｍのサイズを有するケイ素コアであり、
Ｒは、Ｈ、１つの反応性基を有する−ＣＯ−Ｌ２、−ＣＯ−不活性化Ｌ２（Ｌ２は上記で定義される通りである）、又は表面修飾剤の残基であり、
Ｍは電気化学発光金属錯体、又はその塩である）
に対応する、請求項１に記載の多機能化ケイ素ナノ粒子。
【請求項３】
親和性結合剤が、分析物、タンパク質、抗体、ビオチン、ビオチン類似体、アビジン、ストレプトアビジン、糖、レクチン、酵素、ポリペプチド、核酸、核酸類似体、相補的核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、多糖、金属イオン封鎖剤、受容体アゴニスト、及び受容体アンタゴニストから成る群から選択され、
親和性結合剤が、好ましくは核酸、相補的核酸、抗原、抗体、又は分析物である、
請求項１又は２に記載の多機能化ケイ素ナノ粒子。
【請求項４】
親和性結合剤が親和性結合対のパートナー又はメンバーである、請求項１から３のいずれか一項に記載の多機能化ケイ素ナノ粒子。
【請求項５】
親和性結合剤が、核酸と相補的核酸又は抗原と抗体から選択される結合対のメンバーである、請求項１から４のいずれか一項に記載の多機能化ケイ素ナノ粒子。
【請求項６】
ｎが３、６、又は１１であり、好ましくはｎが３である、請求項２から５のいずれか一項に記載の多機能化ケイ素ナノ粒子。
【請求項７】
ｘが１〜５、１〜４、１〜３の整数、１若しくは２、又は１である、請求項２から６のいずれか一項に記載の多機能化ケイ素ナノ粒子。
【請求項８】
ｙが１〜１０００の整数であり、好ましくはｙが１〜５００の整数である、請求項２から７のいずれか一項に記載の多機能化ケイ素ナノ粒子。
【請求項９】
Ｌ１が、骨格として、直鎖又は分岐鎖の非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル鎖、Ｃ１〜Ｃ２０アルケニル鎖、又は炭素原子、置換炭素原子、及び／若しくはＯ、Ｎ及びＳから選択される１つ若しくは複数の原子から成る１〜２０個の原子の鎖、又は１つ若しくは複数の環状若しくは複素環の芳香族若しくは非芳香族環系を含有する骨格を有する前述の鎖を有する、請求項２から８のいずれか一項に記載の多機能化ケイ素ナノ粒子。
【請求項１０】
Ｌ２が、例えばスルフヒドリル基及びアミノ基へ結合するためのヘテロ二官能性である、ヘテロ二官能性架橋剤の反応により形成されるリンカーである、請求項２から９のいずれか一項に記載の多機能化ケイ素ナノ粒子。
【請求項１１】
電気化学発光に基づく検出方法における、請求項１から１０のいずれか一項に記載の多機能化ケイ素ナノ粒子の使用。
【請求項１２】
水溶液中で電気化学発光反応を行うための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の多機能化ケイ素ナノ粒子の使用。
【請求項１３】
分析物のインビトロ検出における、請求項１から１０のいずれか一項に記載の多機能化ケイ素ナノ粒子の使用。
【請求項１４】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の多機能化ケイ素ナノ粒子を含む組成物。
【請求項１５】
（ａ）分析物を含むことが疑われる又は知られている試料を提供するステップと、
（ｂ）分析物と多機能化ケイ素ナノ粒子との複合体の形成に適した条件下で、前記試料を請求項１から１０のいずれか一項に記載の多機能化ケイ素ナノ粒子と接触させて、分析物−多機能化ケイ素ナノ粒子複合体を得るステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された分析物−多機能化ケイ素ナノ粒子複合体を測定し、それにより分析物の測定値を得るステップと
を含む、インビトロの方法により分析物を測定する方法。
【請求項１６】
（ａ）分析物を含むことが疑われる又は知られている試料を提供するステップと、
（ｂ）多機能化ケイ素ナノ粒子と分析物特異的親和性結合剤との複合体の形成に適した条件下で、前記試料を、分析物特異的親和性結合剤と共に、分析物を含む請求項１から１０のいずれか一項に記載の多機能化ケイ素ナノ粒子と接触させて、分析物特異的親和性結合剤−多機能化ケイ素ナノ粒子複合体を得るステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された分析物特異的親和性結合剤−多機能化ケイ素ナノ粒子複合体を測定し、それにより分析物の測定値を得るステップと
を含む、インビトロの方法により分析物を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規多機能化ケイ素ナノ粒子、その調製方法、及び新規多機能化ケイ素ナノ粒子を含む組成物に関する。本発明は、電気化学発光に基づく検出方法における、及び分析物のインビトロ検出における、新規多機能化ケイ素ナノ粒子の使用にも関する。特に、本発明は、新規多機能化ケイ素ナノ粒子を使用するインビトロの方法により分析物を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケイ素ナノ粒子は比表面積が大きく、薬物装填の高い能力をもたらす。その高い生体適合性及びインビボでの低い毒性は、特に細胞内への薬物／化合物の送達において、ケイ素ナノ粒子を魅力的な材料とする。
【０００３】
Ｙ．−Ｒ．Ｋｉｍら（Ｙ．−Ｒ．Ｋｉｍら、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ  ２０１３年、２５（４）、１０５６〜１０６３頁）は、Ｒｕ（ｂｐｙ）３）２＋ドープシリカナノ粒子及びカリックス［４］クラウン−５自己組織化単分子膜に基づく免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の検出のための、電気発生化学発光（ＥＣＬ）系免疫センサーを記載する。
【０００４】
国際公開第２０１３／０８７７３４  Ａ２号は、治療上適切な放射性核種を含む放射性金属錯体で機能化されたケイ素ナノ粒子、及び放射性核種療法におけるそれらの使用を記載する。
【０００５】
電気発生化学発光（電気化学発光とも呼ばれＥＣＬと略される）は、電極で生成される酸化された共反応物が高エネルギー電子移動反応を経て金属錯体の励起状態を形成し、これが発光するというプロセスである。最初の詳細なＥＣＬ研究はＨｅｒｃｕｌｅｓ及びＢａｒｄらにより１９６０年代半ばに記述された。約５０年の研究の後、ＥＣＬは現在では非常に有力な分析技術となり、例えば、イムノアッセイ、食品及び水の検査、並びに生物兵器剤の検出の分野で広く使用されている。
【０００６】
実際に、大部分のＥＣＬ系イムノアッセイは、標識としての電気化学発光化合物の使用を伴う。結合反応における標識物質の存在又は標識物質の関与は、ＥＣＬ標識からの電気化学発光の検出により測定される。
【０００７】
イムノアッセイにおけるより高感度な検出方法は常に必要性が高い。これは電気化学発光に基づく検出方法についてもあてはまる。今では驚くことに、ＥＣＬ系イムノアッセイで使用するための新規多機能化ケイ素ナノ粒子を提供することが可能であること、意外にもそのような多機能化ケイ素ナノ粒子がこれらのアッセイにおいて非常に有利に使用できることが分かった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、一態様において、
（ａ）１ｎｍ〜１０ｎｍのサイズのケイ素コアと、
（ｂ）ケイ素コアに共有結合している、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキル基、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピル基、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピル基、又はアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチル基と、
（ｃ）好ましくはリンカーを介して、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキル基、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピル基、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピル基、又はアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチル基に共有結合している、１〜１０個の親和性結合剤と、
（ｄ）好ましくはリンカーを介して、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキル基、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピル基、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピル基、又はアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチル基に共有結合している、１〜１００個の電気化学発光化合物と
を含む、多機能化ケイ素ナノ粒子に関する。
【０００９】
一実施形態において、多機能化ケイ素ナノ粒子は式（Ｉ）
【００１０】
【化１】
2019534994.tif 000002
【００１１】
（式中、
ｎは３〜１８の整数であり、
ｘは１〜１０の整数であり、
ｙは少なくとも１であり、
ｚは１〜１００の整数であり、
Ｌ１はリンカーであり、
Ｌ２はリンカーであり、
ここで、Ｌ１とＬ２は同一又は異なっており、
Ｓｉは１ｎｍ〜１０ｎｍのサイズを有するケイ素コアであり、
Ｒは、Ｈ、１つの反応性基を有する−ＣＯ−Ｌ２、−ＣＯ−不活性化Ｌ２（Ｌ２は上記で定義される通りである）、又は表面修飾剤に由来する残基であり、
Ｍは電気化学発光金属錯体、又はその塩である）
に対応する。
【００１２】
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、親和性結合剤は、分析物、タンパク質、抗体、ビオチン、ビオチン類似体、アビジン、ストレプトアビジン、糖、レクチン、酵素、ポリペプチド、核酸、核酸類似体、相補的核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、多糖、金属イオン封鎖剤、受容体アゴニスト、及び受容体アンタゴニストから成る群から選択される。好ましい実施形態において、親和性結合剤は、核酸、相補的核酸、抗原若しくは抗体、又は分析物である。
【００１３】
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、親和性結合剤は、親和性結合対のパートナー又はメンバーである。
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、親和性結合剤は、核酸と相補的核酸又は抗原と抗体から選択される結合対のメンバーである。
【００１４】
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、ｎは３、６、又は１１であり、好ましくはｎは３である。
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、ｘは、１〜５、１〜４、１〜３の整数、１若しくは２、又は１である。
【００１５】
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、ｙは１〜１０００の整数であり、好ましくはｙは１〜５００の整数である。
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、ｚは、１〜９０、例えば２０〜９０、３０〜９０、４０〜９０、５０〜９０、６０〜９０、７０〜８０、１〜８０、１〜７０、１〜６０、１〜５０、又は１〜４０の整数である。好ましい実施形態において、ｚは５０〜１００の整数である。特に好ましい実施形態において、ｚは５０〜７０の整数である。
【００１６】
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、Ｌ１は、骨格として、直鎖又は分岐鎖の非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル鎖、Ｃ１〜Ｃ２０アルケニル鎖、又は炭素原子、置換炭素原子、及び／若しくはＯ、Ｎ及びＳから選択される１つ若しくは複数の原子から成る１〜２０個の原子の鎖、又は１つ若しくは複数の環状若しくは複素環の芳香族若しくは非芳香族環系を含有する骨格を有する前述の鎖を有する。
【００１７】
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、Ｌ２は、例えばスルフヒドリル基及びアミノ基へそれぞれ結合するためのヘテロ二官能性である、ヘテロ二官能性架橋剤の反応により形成されるリンカーである。
【００１８】
本明細書において定義される多機能化ケイ素ナノ粒子の任意の実施形態の任意の組み合わせは、本発明の範囲内と考えられる。
別の態様において、本発明は、電気化学発光に基づく検出方法における、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子の使用に関する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、水溶液中で電気化学発光反応を行うための、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子の使用に関する。
別の態様において、本発明は、分析物のインビトロ検出における、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子の使用に関する。
【００２０】
別の態様において、本発明は、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子を含む組成物に関する。
別の態様において、本発明は、インビトロの方法により分析物を測定する方法に関し、この方法は、
（ａ）分析物を含むことが疑われる又は知られている試料を提供するステップと、
（ｂ）分析物と多機能化ケイ素ナノ粒子との複合体の形成に適した条件下で、前記試料を上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子と接触させて、分析物−多機能化ケイ素ナノ粒子複合体を得るステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された分析物−多機能化ケイ素ナノ粒子複合体を測定し、それにより分析物の測定値を得るステップと、
を含む。
【００２１】
別の態様において、本発明は、インビトロの方法により分析物を測定する方法に関し、この方法は、
（ａ）分析物を含むことが疑われる又は知られている試料を提供するステップと、
（ｂ）多機能化ケイ素ナノ粒子と分析物特異的親和性結合剤との複合体の形成に適した条件下で、前記試料を、分析物特異的親和性結合剤と共に、分析物を含む上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子と接触させて、分析物特異的親和性結合剤−多機能化ケイ素ナノ粒子複合体を得るステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された分析物特異的親和性結合剤−多機能化ケイ素ナノ粒子複合体を測定し、それにより分析物の測定値を得るステップと
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１−１】図１は、Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子のＸＰＳスペクトルを示す。図１（ａ）は、サーベイスキャンを示す。図１（ｂ）は、Ｓｉスキャンを示す。
【図１−２】図１（ｃ）は、Ｃスキャンを示す。図１（ｄ）は、デコンボリューションと共にＮスキャンを示す。
【図２】図２は、Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子のＴＥＭ像を示す。
【図３】図３（ａ）は水溶液中のＳｉ−ＮＨ２ナノ粒子、Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子、及びＲｕｂｐｙのＵＶ−可視吸収スペクトルを示す。図３（ｂ）は水溶液中のＳｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子及びＲｕｂｐｙ−ＣＯＯＨのλｅｘ＝３７５ｎｍにおける発光スペクトルを示す。Ｒｕｂｐｙの濃度は１０−５Ｍである。
【図４】図４は、ＰｒｏＣｅｌｌ溶液中のＳｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子及びＲｕｂｐｙのＵＶ−可視吸収スペクトルを示す。Ｒｕｂｐｙの濃度は１０−５Ｍである。
【図５−１】図５（ａ）は、ＰｒｏＣｅｌｌ中の１０−５Ｍ  Ｒｕｂｐｙ（上側の線）及び１０−５Ｍ  Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子（下側の線）の、０．０５Ｖｓ−１のスキャン速度におけるサイクリックボルタンメトリーの間に記録されたＥＣＬ強度を示す。図５（ｂ）は、ＰｒｏＣｅｌｌ中の１０−５Ｍ  Ｒｕｂｐｙ（上側の線）及び１０−５Ｍ  Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子（下側の線）の、ＥＣＬ強度対時間を示す。
【図５−２】図５（ｃ）は、ＰｒｏＣｅｌｌ中の１０−５Ｍ  Ｒｕｂｐｙ（上側の線）及び１０−５Ｍ  Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子（下側の線）の、ＥＣＬスペクトルを示す。
【図６−１】図６（ａ）は、０．１Ｍ  ＴＢＡＰＦ６  ＤＭＦ  溶液中の０．１ｍＭ  Ｒｕｂｐｙの、０．０５Ｖｓ−１〜１Ｖｓ−１の範囲の様々なスキャン速度におけるサイクリックボルタンメトリーを示す。図６（ｂ）は、ＲｕｂｐｙのＩ対ｖ１／２プロットを示す。
【図６−２】図６（ｃ）は、０．１Ｍ  ＴＢＡＰＦ６  ＤＭＦ  溶液中の０．１ｍＭ  Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子の、０．０５Ｖｓ−１〜１Ｖｓ−１の範囲の様々なスキャン速度におけるサイクリックボルタンメトリーを示す。図６（ｄ）は、Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子のＩ対ｖ１／２プロットを示す。
【図７−１】図７は、Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子のＸＰＳスペクトルを示す。図７（ａ）は、サーベイスキャンを示す。図７（ｂ）は、Ｉｒスキャンを示す。
【図７−２】図７（ｃ）は、Ｓｉスキャンを示す。図７（ｄ）は、デコンボリューションと共にＮスキャンを示す。
【図８】図８は、Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子のＴＥＭ像を示す。Ｉｒ錯体の濃度は１０−５Ｍである。
【図９】図９は、ＤＭＦ溶液中のＳｉ−ＮＨ２  ＮＰｓ、Ｓｉ−［Ｉｒ］  ＮＰｓ、及びＩｒ錯体のＵＶ−可視吸収スペクトルを示す。
【図１０】図１０は、ＰｒｏＣｅｌｌ溶液中のＳｉ−［Ｉｒ］  ＮＰｓ、及びＩｒ錯体のＵＶ−可視吸収スペクトルを示す。
【図１１−１】図１１（ａ）は、ＰｒｏＣｅｌｌ中の１０−５Ｍ  Ｒｕｂｐｙ（上側の線）、１０−５Ｍ  Ｉｒ錯体（下側の線）、及び１０−５Ｍ  Ｓｉ−［Ｉｒ］  ＮＰｓ（真ん中の線）の、０．０５Ｖｓ−１のスキャン速度におけるサイクリックボルタンメトリーの間に記録されたＥＣＬ強度を示す。図１１（ｂ）は、ＰｒｏＣｅｌｌ中の１０−５Ｍ  Ｒｕｂｐｙ（上側の線）、１０−５Ｍ  Ｉｒ錯体（下側の線）、及び１０−５Ｍ  Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子（真ん中の線）の、ＥＣＬ強度対時間を示す。
【図１１−２】ＰｒｏＣｅｌｌ中の１０−５Ｍ  Ｒｕｂｐｙ（上側の線）、１０−５Ｍ  Ｉｒ錯体（下側の線）、及び１０−５Ｍ  Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子（真ん中の線）の、ＥＣＬスペクトルを示す。
【図１２】図１２（ａ）は、０．１Ｍ  ＴＢＡＰＦ６  ＤＭＦ  溶液中の０．１ｍＭ  Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子の、０．０５Ｖｓ−１〜１Ｖｓ−１の範囲の様々なスキャン速度におけるサイクリックボルタンメトリーを示す。図１２（ｂ）は、Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子のＩ対ｖ１／２プロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
新規多機能ケイ素ナノ粒子
上記のように、電気化学発光に基づく検出方法、及び分析物のインビトロ検出、特にＥＣＬ系サンドイッチイムノアッセイなどのＥＣＬ系イムノアッセイでの使用に適している多機能化ケイ素ナノ粒子が必要とされている。特に、ナノ粒子のサイズ及び表面機能化を最適化することによりケイ素ナノ粒子の物理特性及び化学特性の調整を可能にする、ＥＣＬ系イムノアッセイのためのケイ素ナノ粒子が必要とされる。
【００２４】
本発明により解決される課題はしたがって、上記の所望の特性を有する多機能化ケイ素ナノ粒子を提供することであった。
一態様において、本発明は、
（ａ）１ｎｍ〜１０ｎｍのサイズのケイ素コアと、
（ｂ）ケイ素コアに共有結合している、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキル基、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピル基、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピル基、又はアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチル基と、
（ｃ）好ましくはリンカーを介して、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキル基、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピル基、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピル基、又はアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチル基に共有結合している、１〜１０個の親和性結合剤と、
（ｄ）好ましくはリンカーを介して、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキル基、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピル基、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピル基、又は２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチル基に共有結合している、１〜１００個の電気化学発光化合物と
を含む、新規多機能化ケイ素ナノ粒子を提供する。
【００２５】
ケイ素コアは、１ｎｍ〜１０ｎｍのサイズを有し、複数のケイ素原子を含む。一実施形態において、ケイ素コアのサイズは１ｎｍ〜９ｎｍ、例えば１ｎｍ〜８ｎｍ、１．５ｎｍ〜７ｎｍ、２ｎｍ〜６ｎｍ、２ｎｍ〜５ｎｍの範囲である。
【００２６】
アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキル基、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピル基、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピル基、及びアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチル基は、Ｓｉ−Ｃ結合によってケイ素コアに共有結合している。
【００２７】
添付の特許請求の範囲を含め、本明細書で使用する、集合的に使用される用語は、以下の意味を有する。
本明細書で使用する、用語「多機能化ケイ素ナノ粒子」は、少なくとも２つの異なる種類の機能性化合物がケイ素ナノ粒子のケイ素コアの表面に結合していることを意味する。一実施形態において、機能性化合物は、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキル基、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピル基、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピル基、又はアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチル基へのリンカーを介してケイ素コアに結合している。
【００２８】
本明細書で使用する、用語「機能性化合物」は、特定の用途のため、例えば特定の種類の組織又は細胞を標的にするため、又はアッセイにおける検出を可能にするために必要である任意の化合物を意味する。例としては、限定はされないが、親和性結合剤、目的の分析物を測定するためのアッセイで使用するための電気化学発光化合物及び蛍光性化合物などの任意の標識が挙げられる。一実施形態において、多機能化ケイ素ナノ粒子に含まれる少なくとも１つの機能性化合物は親和性結合剤であり、多機能化ケイ素ナノ粒子に含まれる少なくとも１つの化合物は電気化学発光化合物である。
【００２９】
本明細書で使用する、用語「リンカー」は、当業者に知られている意味を有し、２つ以上の分子を結合させるのに使用される分子又は分子のグループに関する。リンカーは、フレキシブル又はリジッドな足場上の２つ以上の化学的に直交する官能性を有することを特徴とする。共有結合は本発明の意味においてはリンカーではない。
【００３０】
本明細書で使用する、用語「Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキル」は単独で又は組み合わせでＨ２Ｎ−Ｒ’−基を意味し、ここで、Ｒ’はＣ３〜Ｃ１８アルキルであり、３〜１８個の炭素原子を有する直鎖又は分岐アルキル基、好ましくは３、６、又は１１個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基、特に好ましくは３個の炭素原子を有する直鎖アルキル基である。直鎖Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキル基の例は、アミノプロピル、アミノブチル、アミノヘキシル、及びアミノウンデシル、好ましくはアミノプロピルである。
【００３１】
本明細書で使用する、用語「親和性結合剤」は、分子が互いに近接する安定な会合をもたらす分子間の引力相互作用に起因して、別の分子（標的分子又は標的）に分子結合することが可能である分子を意味する。分子結合の結果は、分子複合体の形成である。複合体の成分間の引力的結合は、通常は共有結合よりも弱い。本発明の場合では、結合剤は親和性結合剤であり、これは親和性結合剤とその標的との間で親和性複合体を形成することが可能であることを意味する。そのような複合体はそれぞれの条件下で、例えば 標準条件下の水性媒体中で安定である。分子結合に関与することができる分子としては、限定はされないが、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、及び小さい有機分子、例えば薬物などが挙げられる。したがって、分子結合の結果として生成する複合体の種類としては、限定はされないが、以下の親和性結合剤−標的分子複合体：タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−ホルモン、タンパク質−薬物、抗原−抗体、受容体−配位子、ビオチン−アビジン若しくはストレプトアビジン、核酸−相補的核酸、又は受容体−受容体（アンタゴニスト）アゴニストが挙げられる。
【００３２】
親和性結合剤の例としては、限定はされないが、分析物、抗原、タンパク質、抗体、ビオチン、ビオチン類似体、アビジン、ストレプトアビジン、糖、レクチン、酵素、ポリペプチド、核酸、核酸類似体、相補的核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、多糖、金属イオン封鎖剤、受容体アゴニスト、又は受容体アンタゴニストが挙げられる。例えば、親和性結合剤は、特定の結合対の一方のパートナーであってもよく、前記結合対の他方のパートナーは細胞表面若しくは細胞内構造上の標的である、又はそれと関連している。
【００３３】
親和性結合剤は、その標的に対して、例えば抗体のような特異的な結合対の一方のメンバーは、その抗原のような特異的な結合対の他方のメンバーに対して、少なくとも１０７Ｌ／ｍｏｌの親和性を有する。親和性結合剤は好ましくは、その標的に関して１０８Ｌ／ｍｏｌ、又はさらにより好ましくは１０９Ｌ／ｍｏｌの親和性を有する。
【００３４】
本明細書で使用する、用語「分析物」は、対象である任意の生体物質を含めた、任意の無機又は有機分子を意味する。本発明の意味における分析物を代表する適切な生体物質の例は、細胞、ウイルス、細胞内粒子、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、細胞代謝産物、ハプテン、ホルモン、薬理学的物質、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、及び糖である。
【００３５】
分析物は、ポリペプチド、炭水化物、及び無機又は有機薬物分子から成る群から選択されてもよい。
ポリペプチド又はタンパク質は、アミノ酸から本質的に成りペプチド結合により結合した少なくとも２つのアミノ酸を有する分子である。本明細書で開示される方法により調べようとする対象の分析物の場合、ポリペプチドは好ましくは少なくとも５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、及び３０から最大で約１０，０００個のアミノ酸から成ることになる。好ましくはポリペプチドは、５〜２，０００個、また好ましくは１０〜１，０００個のアミノ酸を含有することになる。
【００３６】
分析物が核酸である場合、これらの核酸は、好ましくは天然のＤＮＡ又はＲＮＡオリゴヌクレオチドである。
ビオチン類似体は、アミノビオチン、イミノビオチン、又は デスチオビオチンである。
【００３７】
本明細書で使用する、用語「オリゴヌクレオチド」又は「核酸」は一般に、少なくとも８個のヌクレオチド、最大で約１０００個のヌクレオチドを含む、短鎖の一般には一本鎖のポリヌクレオチドを指す。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも９、１０、１１、１２、１５、１８、２１、２４、２７、又は３０個のヌクレオチドの長さを有することになる。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドは２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、又は３０個以下のヌクレオチドの長さを有することになる。
【００３８】
オリゴヌクレオチドという用語は、広義に理解されるべきであり、ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びにそれらの類似体及び修飾物を含む。
核酸類似体は、例えば標準的な塩基であるデオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、デオキシシトシン（ｄＣ）、デオキシチミジン（ｄＴ）、デオキシウラシル（ｄＵ）において置換基を有する、置換ヌクレオチドを含んでいてもよい。そのような置換核酸塩基の例は、５−置換ピリミジン、例えば５メチルｄＣ、アミノアリルｄＵ又はｄＣ、５−（アミノエチル−３−アクリルイミド）−ｄＵ、５−プロピニル−ｄＵ又は−ｄＣ、５ハロゲン化−ｄＵ又は−ｄＣなど；Ｎ置換ピリミジン、例えばＮ４−エチル−ｄＣなど；Ｎ置換プリン、例えばＮ６−エチル−ｄＡ、Ｎ２−エチル−ｄＧなど；８置換プリン、例えば８−［６−アミノ）−ヘキサ−１−イル］−８−アミノ−ｄＧ又は−ｄＡ、８ハロゲン化ｄＡ又はｄＧ、８−アルキルｄＧ又はｄＡなど；及び２置換ｄＡ、例えば２アミノｄＡなどである。
【００３９】
核酸類似体は、ヌクレオチド又はヌクレオシド類似体を含んでいてもよい。すなわち、天然の核酸塩基は、核酸塩基類似体を使用して、例えば５−ニトロインドール−ｄ−リボシド；３−ニトロ−ピロール−ｄ−リボシド、デオキシイノシン（ｄＩ）、デオキシキサントシン（ｄＸ）；７デアザ−ｄＧ、−ｄＡ、−ｄＩ、又は−ｄＸ；７−デアザ−８−アザ−ｄＧ、−ｄＡ、−ｄＩ、又は−ｄＸ；８−アザ−ｄＡ、−ｄＧ、−ｄＩ、又は−ｄＸ；ｄ−ホルマイシン；疑似ｄＵ；疑似イソｄＣ；４チオｄＴ；６チオｄＧ；２チオｄＴ；イソｄＧ；５−メチル−イソ−ｄＣ；Ｎ８−結合８−アザ−７−デアザ−ｄＡ；５，６−ジヒドロ−５−アザ−ｄＣ；及びエテノ−ｄＡ、又はピロロ−ｄＣなどを使用して、交換することができる。当業者に明らかなように、相補鎖の核酸塩基は、二本鎖形成が特異的であるように選択されなければならない。例えば、５−メチル−イソ−ｄＣが１つの鎖（例えば（ａ））で使用される場合、イソｄＧが相補鎖（例えば（ａ’））中になければならない。
【００４０】
核酸類似体において、オリゴヌクレオチド骨格は、置換糖残基、糖類似体、ヌクレオシド間のリン酸部分の修飾物を含有するように修飾されてもよく、及び／又はＰＮＡであってもよい。
【００４１】
オリゴヌクレオチドは、例えば、置換デオキシリボース、例えば２’−メトキシ、２’−フルオロ、２’−メチルセレノ、２’−アリルオキシ、４’−メチルｄＮ（Ｎは核酸塩基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、又はＵである）などを有するヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００４２】
糖類似体は、例えばキシロース；２’，４’架橋リボース、例えば（２’−Ｏ、４’−Ｃメチレン）−（ＬＮＡとして知られるオリゴマー）又は（２’−Ｏ、４’−Ｃエチレン）−（ＥＮＡとして知られるオリゴマー）など；Ｌ−リボース、Ｌ−ｄ−リボース、ヘキシトール（ＨＮＡとして知られるオリゴマー）；シクロヘキセニル（ＣｅＮＡとして知られるオリゴマー）；アルトリトール（ＡＮＡとして知られるオリゴマー）；Ｃ３’及びＣ５’原子がシクロプロパン環に縮合したエチレン架橋により結合している三環リボース類似体（トリシクロＤＮＡとして知られるオリゴマー）；グリセリン（ＧＮＡとして知られるオリゴマー）；グルコピラノース（ホモＤＮＡとして知られるオリゴマー）；カルバリボース（テトラヒドロフランサブユニットの代わりにシクロペンタンを有する）；ヒドロキシメチル−モルホリン（モルホリノＤＮＡとして知られるオリゴマー）である。
【００４３】
ヌクレオシド間のリン酸部分の多数の修飾は、ハイブリダイゼーション特性と干渉しないことも知られており、そのような骨格の修飾は置換ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体と組み合わせることもできる。例は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、及びメチルホスホネートオリゴヌクレオチドである。
【００４４】
ＰＮＡ（リン酸及びｄ−リボースを含まない骨格を有する）は、ＤＮＡ類似体として使用することもできる。
上記の修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、並びにオリゴヌクレオチド骨格修飾物は、本発明の意味でのオリゴヌクレオチドにおいて所望の通りに組み合わせることができる。
【００４５】
一実施形態において、親和性結合剤として上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子に含まれる分析物は、低分子量分析物、すなわち分子量が２０００ダルトン以下である分析物である。そのような多機能化ケイ素ナノ粒子に含まれる好ましい分析物は、とりわけ、診断上適切なホルモン又は／及び代謝産物である。診断上適切なホルモン又は代謝産物としては、葉酸、特に血漿及び赤血球の両方に含まれるいわゆる全葉酸、ステロイド、例えばエストラジオール、エストロン、プロゲステロン、１７−ヒドロキシプロゲステロン、コルチゾール、テストステロン、アンドロステンジオン（ａｎｄｒｏｓｔｅｎｄｉｏｎｅ）など、及びホルモン、例えば２５−ヒドロキシビタミンＤ３などが挙げられる。
【００４６】
本明細書において用語「抗体」は最も広い意味で使用され、具体的にはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の生物活性を示す限りにおいて抗体断片を網羅する。
【００４７】
「単離」抗体は、同定され、その自然環境の成分から分離及び／又は回収された抗体である。その自然環境の不純物成分は、抗体の研究、診断、又は治療上の使用を妨げることになる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク性又は非タンパク性溶質を挙げることができる。いくつかの実施形態において、抗体は（１）例えばローリー法により決定される抗体の９５重量％超まで、いくつかの実施形態では９９重量％超まで；（２）例えばスピニングカップ配列決定装置を使用して少なくとも１５残基のＮ−末端の又は内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度まで、又は（３）例えばクーマシーブルー又は銀染色を使用して還元条件又は非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質になるまで、精製される。抗体の自然環境の少なくとも１つの成分は存在しないので、単離抗体は組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体を含む。通常は、しかし、単離抗体は少なくとも１つの精製ステップにより調製される。
【００４８】
「自然抗体」は、通常は、２つの同一の軽鎖（Ｌ）及び２つの同一の重鎖（Ｈ）で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有結合性ジスルフィド結合により重鎖へ結合しているが、ジスルフィド結合の数は様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖によって異なる。各重鎖及び軽鎖は規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの定常ドメインがそれに続く。各軽鎖は一方の端に可変ドメイン（ＶＬ）、他方の端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと一直線になっており、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと一直線になっている。特定のアミノ酸残基が軽鎖可変ドメインと重鎖重鎖可変ドメインの間で界面を形成すると考えられる。
【００４９】
抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と呼ばれることがある。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と呼ばれることがある。これらのドメインは一般に抗体の最も可変な部分であり、抗原結合部位を含有する。
【００５０】
用語「可変」とは、可変ドメインの特定の部分は配列が抗体によって幅広く異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性において使用されるという事実を指す。しかし、可変性は抗体の可変ドメインの全体にわたって均一に分布していない。これは、軽鎖及び重鎖可変ドメインの両方において、超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存される部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、３つのＨＶＲにより接続されたベータ−シート構造を主にとる４つのＦＲ領域を含み、これはループ接続を形成し、場合によってはベータ−シート構造の一部を形成する。各鎖のＨＶＲはＦＲ領域により互いに近接して維持され、他の鎖のＨＶＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）を参照）。定常ドメインは抗体 の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性における抗体の関与などの、様々な エフェクター機能を示す。
【００５１】
任意の脊椎動物種に由来する抗体（イムノグロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの１つに帰属させることができる。
【００５２】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（イムノグロブリン）は様々なクラスに帰属させることができる。イムノグロブリンの５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。イムノグロブリンの様々なクラスのサブユニット構造及び３次元構造は良く知られており、例えばＡｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｃｏ．（２０００）において一般的に記載されている。抗体は、抗体と１つ又は複数の他のタンパク質又はペプチドとの共有結合的又は非共有結合的な会合により形成される、より大きい融合分子の一部であってもよい。
【００５３】
用語「完全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」は、以下で定義されるような抗体断片ではなくその実質的にインタクトな形態の抗体を指すのに、本明細書において交換可能に使用される。この用語は特にＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。
【００５４】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部を含み、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００５５】
抗体のパパイン消化は、各々が単一抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、名前が容易に結晶化する能力を反映する、残りの「Ｆｃ」断片とを生成させる。ペプシン処理は２つの抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）２断片を生じ、さらに抗原を架橋させることが可能である。
【００５６】
「Ｆｖ」は完全抗原結合部位を含有する最小抗体断片である。一実施形態において、二本鎖Ｆｖ種は、しっかりとした非共有結合的な会合をしている１本の重鎖及び１本の軽鎖可変ドメインの二量体から成る。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種において、１本の重鎖及び１本の軽鎖可変ドメインはフレキシブルペプチドリンカーにより共有結合することができるので、軽鎖及び重鎖が二本鎖Ｆｖ種における構造と類似した「二量体」構造で会合することができる。各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を画定するのはこの構造においてである。全体として、６つのＨＶＲが抗原結合特異性を抗体に与える。しかし、完全な結合部位よりも親和性は低いが、１つの可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）であっても、抗原を認識し抗原に結合する能力を有する。
【００５７】
Ｆａｂ断片は重鎖及び軽鎖可変ドメインを含有し、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域に由来する１つ又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端においていくつかの残基を加えることにより、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして生成された。抗体断片の他の化学カップリングも知られている。
【００５８】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは一本のポリペプチド鎖に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨ及びＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これはｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖのレビューについては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ（ｅｄｓ．）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）２６９〜３１５頁を参照すること。
【００５９】
用語「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有する抗体断片を指し、この断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続している重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上で２つのドメインの対合を可能にするのには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合せざるを得ず、２つの抗原結合部位を作る。二重特異性抗体は二価又は二重特異性であってもよい。二重特異性抗体は、例えば欧州特許第０４０４０９７号；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ、Ｐ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９〜１３４頁；及びＨｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０（１９９３）６４４４〜６４４８頁でより十分に記載される。三重特異性抗体（Ｔｒｉａｂｏｄｙ）及び四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）もＨｕｄｓｏｎ、Ｐ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９（２００３）１２９〜１３４頁において記載される。
【００６０】
本明細書で使用する、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち集団を構成する個々の抗体は、少量で存在する場合がある、考えられる突然変異、例えば自然に発生する突然変異を除いて同一である。したがって、修飾語句の「モノクローナル」は、個々の抗体の混合物ではないものとしての抗体の性質を示す。特定の実施形態において、そのようなモノクローナル抗体は典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から１つの標的結合ポリペプチド配列を選択することを含む方法により得られた。例えば、選択の方法は、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン、又は組換え型ＤＮＡクローンのプールしたものなどから特異的なクローンを選択することであってもよい。例えば標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養におけるその生成を改善するため、インビボでのその免疫原性を低下させるため、多重特異性抗体を作るため、又はシステインのような反応性基を規定の位置に導入するなどのために、選択された標的結合配列をさらに変化させることができること、及び変化させた標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを、理解するべきである。典型的には様々な決定因子（エピトープ）に対する様々な抗体を含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は抗原上の１つの決定因子に向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他のイムノグロブリンによって汚染されていないという点で有利である。
【００６１】
本明細書で使用する、用語「電気化学発光化合物」は、適切な場合にリンカーを介して、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキル基、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピル基、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピル基、又は２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチル基に共有結合することができる、任意の電気化学発光化合物を意味する。電気化学発光（ＥＣＬ）化合物の例としては、正に帯電したＥＣＬ金属錯体、負に帯電したＥＣＬ金属錯体、及び電気的に中性のＥＣＬ金属錯体が挙げられる。
【００６２】
一実施形態において、本発明の多機能化ケイ素ナノ粒子は式（Ｉ）
【００６３】
【化２】
2019534994.tif 000003
【００６４】
（式中、
ｎは３〜１８の整数であり、
ｘは１〜１０の整数であり、
ｙは少なくとも１であり、
ｚは１〜１００の整数であり、
Ｌ１はリンカーであり、
Ｌ２はリンカーであり、
ここで、Ｌ１とＬ２は同一又は異なっており、
Ｓｉは１ｎｍ〜１０ｎｍのサイズを有するケイ素コアであり、
Ｒは、Ｈ、１つの反応性基を有する−ＣＯ−Ｌ２、−ＣＯ−不活性化Ｌ２（Ｌ２は上記で定義される通りである）、又は表面修飾剤に由来する残基であり、
Ｍは電気化学発光金属錯体、又はその塩である）
に対応する。
【００６５】
一実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、親和性結合剤は、分析物、タンパク質、抗体、ビオチン、ビオチン類似体、アビジン、ストレプトアビジン、糖、レクチン、酵素、ポリペプチド、核酸、核酸類似体、相補的核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、多糖、金属イオン封鎖剤、受容体アゴニスト、及び受容体アンタゴニストから成る群から選択される。好ましい実施形態において、親和性結合剤は、核酸、相補的核酸、抗原、抗体、又は分析物である。
【００６６】
別の実施形態において、親和性結合剤は、低分子量分析物又はその誘導体、好ましくは分子量が２０００ダルトン以下である分析物である。本発明の多機能化ケイ素ナノ粒子に含まれる好ましい分析物は、本明細書において定義される、生理学的に／診断上適切なホルモン及び代謝産物である。
【００６７】
本明細書で使用する、用語「低分子量分析物の誘導体」は、試料中の分析物の結合特性に匹敵する結合特性を有する分析物の任意の誘導体を意味する。
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、親和性結合剤は親和性結合対のパートナー又はメンバーである。
【００６８】
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、親和性結合剤は、核酸と相補的核酸、又は抗原と抗体から選択される、結合対のメンバーである。
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、ｎは３〜１７、例えば３〜１６、１〜１５、１〜１４、３〜１２、又は３〜１１の整数であり；好ましくは、ｎは３、６、又は１１である。特に好ましい実施形態において、ｎは３である。
【００６９】
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、ｘは、１〜５、例えば１〜４、１〜３の整数、１若しくは２、又は１である。特に好ましい実施形態において、ｘは１である。
【００７０】
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、ｙは、１〜１０００、例えば１〜９００、１〜８００、１〜７００、１〜６００、又は１〜５００の整数である。特に好ましい実施形態において、ｙは１〜５００の整数である。
【００７１】
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、ｚは、１〜９０、例えば２０〜９０、３０〜９０、４０〜９０、５０〜９０、６０〜９０、７０〜８０、１〜８０、１〜７０、１〜６０、１〜５０、又は１〜４０の整数である。好ましい実施形態において、ｚは５０〜１００の整数である。特に好ましい実施形態において、ｚは５０〜７０の整数である。
【００７２】
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、Ｌ１は、骨格として、直鎖又は分岐鎖の非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル鎖、Ｃ１〜Ｃ２０アルケニル鎖、又は炭素原子、置換炭素原子、及び／若しくはＯ、Ｎ及びＳから選択される１つ若しくは複数の原子から成る１〜２０個の原子の鎖、又は１つ若しくは複数の環状若しくは複素環の芳香族又は非芳香族環系を含有する骨格を有する前述の鎖を有する。
【００７３】
本明細書で使用する、単独の又は組み合わせにおける用語「アルキル」は、１〜２０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐アルキル基、好ましくは１〜１０個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基、特に好ましくは１〜６個の炭素原子を有する直鎖又は分岐鎖アルキル基；又はＯ、Ｎ、Ｐ、及びＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含む、１〜２０個の原子、好ましくは１〜１０個の原子を有するヘテロアルキル鎖を意味する。直鎖及び分岐基の例としては、限定はされないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、異性体ヘプチル、異性体オクチル、好ましくはメチル及びエチル、最も好ましくはメチルが挙げられる。
【００７４】
本明細書で使用する、単独又は組み合わせにおける用語「アルケニル」は、オレフィン結合及び２〜２０個、好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜６個の炭素原子を含む直鎖又は分岐鎖の炭化水素残基を意味する。アルケニル基の例は、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、及びイソブテニルである。好ましい例は、２−プロペニルである。
【００７５】
本明細書で使用する、用語「Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ」は基Ｒ’Ｏ−を意味し、ここで、Ｒ’はＣ１〜Ｃ１０アルキルであり、上記で定義される意味を有する。Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、及びｔｅｒｔ−ブトキシ、好ましくはメトキシ及びエトキシである。
【００７６】
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、Ｌ１は、骨格として、直鎖又は分岐鎖の非置換又は置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル鎖、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル鎖、又は炭素原子、置換炭素原子、及び／若しくはＯ、Ｎ及びＳから選択される１つ若しくは複数の原子から成る１〜１２個の原子の鎖、又は１つ若しくは複数の環状若しくは複素環の芳香族又は非芳香族環系を含有する骨格を有する前述の鎖を有する。
【００７７】
一実施形態において、Ｌ１は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル鎖又は８〜２０個の炭素原子を有するアリールアルキル（ａｒｙｌａｌｋｙ）鎖を含むリンカーである。
一実施形態において、Ｌ１は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル鎖、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル鎖、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ鎖、−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル−ＣＯＮＨ−、−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル−ＮＨＣＯ−、又は置換若しくは非置換の５員若しくは６員芳香族環を含むリンカーである。
【００７８】
特に好ましい実施形態において、Ｌ１は−ＣＨ２−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
別の実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、Ｌ２は、例えばスルフヒドリル基及びアミノ基へそれぞれ結合するためのヘテロ二官能性である、ヘテロ二官能性架橋剤の反応により形成されるリンカーである。
【００７９】
好ましくは、ヘテロ二官能性架橋剤は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びマレイミド反応性基に基づくＮＨＳ−マレイミド架橋剤；スクシンイミジル−（ＰＥＧ）ｎ  ＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミド架橋剤、ＮＨＳ−ハロアセチル架橋剤；並びにＮＨＳ−ピリジルジチオール架橋剤から成る群から選択される。特に好ましい実施形態において、ヘテロ二官能性架橋剤はスクシンイミジル−（ＰＥＧ）ｎ  ＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミド架橋剤である。
【００８０】
本明細書において定義される、用語「反応性基」は、リンカーをアミノ基へ結合させるために、アミン基と反応するのに適している任意の基、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンイミド基若しくはマレイミド基；又は例えばＳＨ−基と反応するための、第２の官能性結合に適している基、好ましくはリンカーをＳＨ−基へ結合させるためのマレイミド基を意味する。
【００８１】
特に好ましい実施形態において、Ｌ２は、
ＮＨＳ−マレイミド架橋剤、例えば
【００８２】
【化３】
2019534994.tif 000004
【００８３】
【化４】
2019534994.tif 000005
【００８４】
【化５】
2019534994.tif 000006
【００８５】
【化６】
2019534994.tif 000007
【００８６】
【化７】
2019534994.tif 000008
【００８７】
【化８】
2019534994.tif 000009
【００８８】
【化９】
2019534994.tif 000010
【００８９】
【化１０】
2019534994.tif 000011
【００９０】
【化１１】
2019534994.tif 000012
【００９１】
【化１２】
2019534994.tif 000013
【００９２】
【化１３】
2019534994.tif 000014
【００９３】
【化１４】
2019534994.tif 000015
【００９４】
【化１５】
2019534994.tif 000016
【００９５】
【化１６】
2019534994.tif 000017
【００９６】
【化１７】
2019534994.tif 000018
【００９７】
スクシンイミジル−（ＰＥＧ）ｎ−マレイミド又はＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミド架橋剤、例えば
【００９８】
【化１８】
2019534994.tif 000019
【００９９】
【化１９】
2019534994.tif 000020
【０１００】
【化２０】
2019534994.tif 000021
【０１０１】
【化２１】
2019534994.tif 000022
【０１０２】
【化２２】
2019534994.tif 000023
【０１０３】
【化２３】
2019534994.tif 000024
【０１０４】
ＮＨＳ−ハロアセチル架橋剤、例えば
【０１０５】
【化２４】
2019534994.tif 000025
【０１０６】
【化２５】
2019534994.tif 000026
【０１０７】
【化２６】
2019534994.tif 000027
【０１０８】
【化２７】
2019534994.tif 000028
【０１０９】
並びにＮＨＳ−ピリジルジチオール架橋剤、例えば
【０１１０】
【化２８】
2019534994.tif 000029
【０１１１】
【化２９】
2019534994.tif 000030
【０１１２】
【化３０】
2019534994.tif 000031
【０１１３】
【化３１】
2019534994.tif 000032
【０１１４】
【化３２】
2019534994.tif 000033
【０１１５】
【化３３】
2019534994.tif 000034
【０１１６】
及び
【０１１７】
【化３４】
2019534994.tif 000035
【０１１８】
から成る群から選択されるヘテロ二官能性 架橋剤の反応により形成される、リンカーである。
一実施形態において、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子では、Ｒは、Ｈ、１つの反応性基を有する−ＣＯ−Ｌ２、−ＣＯ−不活性化Ｌ２（Ｌ２は上記で定義される通りである）、又はＮＨＳ−ＰＥＧｎ−ＯＭｅ表面修飾剤に由来する残基である。
【０１１９】
本明細書において定義されるように、用語「１つの反応性基を有する−ＣＯ−Ｌ２」は、ヘテロ二官能性架橋剤の１つの反応性基を反応させることにより、すなわちアミド基−ＣＯ−ＮＨ−を介してＮ−ヒドロキシスクシンイミド基をアミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキル基、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピル基、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピル基、又はアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチル基と反応させることにより得られる１つの反応性基を有するリンカーを意味する。
【０１２０】
本明細書において定義されるように、用語「−ＣＯ−不活性化Ｌ２」は、リンカーの残留活性基をクエンチすることにより得られるリンカー、例えばシステインでクエンチされたマレイミドを意味する。
【０１２１】
表面修飾剤は例えば以下の試薬から選択されてもよい：
【０１２２】
【化３５】
2019534994.tif 000036
【０１２３】
及び
【０１２４】
【化３６】
2019534994.tif 000037
【０１２５】
一実施形態において、Ｍは、電気化学発光（ＥＣＬ）ルテニウム、オスミウム、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ジスプロシウム、又はイリジウム錯体である。
好ましい実施形態において、Ｍは、電気化学発光（ＥＣＬ）ルテニウム又はイリジウム錯体である。
【０１２６】
本発明に関するＥＣＬ錯体は当業者に良く知られており、正に帯電したＥＣＬ錯体、負に帯電したＥＣＬ錯体、及び電気的に中性なＥＣＬ錯体が挙げられる。
配位金属錯体における金属イオンがカチオン性であるので、標識分子の電気的中性は対イオン（複数可）により得られる。
【０１２７】
一実施形態において、Ｍは、全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２００３／００２９７４  Ａ２号、米国特許第５，２２１，６０５号及び第６，３１６，６０７号に開示されるＥＣＬ錯体から選択される、正に帯電した発光団を有するＥＣＬ錯体であり、対イオンはクロリド、ヘキサフルオロリン酸などである。
【０１２８】
一実施形態において、Ｍは、全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，８０８，９３９号に開示されるＥＣＬ錯体から選択される、負に帯電した発光団を有するＥＣＬ錯体であり、対イオンは例えばナトリウムイオン又はプロトンである。
【０１２９】
一実施形態において、Ｍは、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第２０１６／０１４６８２６Ａ１号に開示されるＥＣＬ錯体から選択される、電気的に中性のＥＣＬルテニウム錯体である。
【０１３０】
一実施形態において、Ｍは、参照により本明細書に組み込まれている、国際公開第２０１２／１０７４１９  Ａ１号、国際公開第２０１２／１０７４２０  Ａ１号、国際公開第２０１４／０１９７０７  Ａ２号、国際公開第２０１４／０１９７０８  Ａ２号、国際公開第２０１４／０１９７０９  Ａ２号、国際公開第２０１４／０１９７１０  Ａ２号、及び国際公開第２０１４／０１９７１１  Ａ２号に開示されるＥＣＬ錯体から選択される、ＥＣＬイリジウム錯体である。
【０１３１】
好ましい実施形態において、Ｍは、
【０１３２】
【化３７】
2019534994.tif 000038
【０１３３】
から選択されるコア構造を有するＥＣＬ錯体である。
特に好ましい実施形態において、Ｌ１−Ｍは、以下の金属錯体の１つから得られる：
Ｒｕ（ｂｐｙ）２−ｂｐｙＣＯ−ＯＳｕ（ＣＡＳ登録番号１３７３２３−７６−３、＝ルテニウム（２＋）、ｂｉｓ（２，２’−ビピリジン−κＮ１，κＮ１’）［１−［４−（４’−メチル［２，２’−ビピリジン］−４−イル−κＮ１，κＮ１’）−１−オキソブトキシ］−２，５−ピロリジンジオン］−、（ＯＣ−６−３３）、Ｒｕ（ｂｐｙ）２−ｂｐｙＣＯ２Ｈ（＝ＢＰＲｕ、又はＲｕ−ｂｐｙ）ＣＡＳ登録番号１１５２３９−５９−３の反応性エステル、））；又は
Ｓｕｌｆｏ−ＢＰＲｕ  ＮＨＳエステル（＝ＣＡＳ登録番号４８２６１８−４２−８、当技術分野においてルテネート（２−）、ビス［［２，２’−ビピリジン］−４，４’−ジメタンスルホナト（２−）−κＮ１，κＮ１’］［１−［４−（４’−メチル［２，２’−ビピリジン］−４−イル−κＮ１，κＮ１’）−１−オキソブトキシ］−２，５−ピロリジンジオン］−、ナトリウム（１：２）、（ＯＣ−６−３１）としても知られる；又は
Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）２−ピリジン−２−カルボン酸又はその誘導体、限定はされないが、例えばＩｒ（６−フェニルフェナントリジン）２−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸、Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）２−４−（ヒドロキシメチル）ピリジン−２−カルボン酸、Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）２−２−（カルボキシエチル−フェニル）ピリジン−２−カルボン酸、Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）２−５−（メトキシ）ピリジン−２−カルボン酸、又はＩｒ（６−フェニルフェナントリジン）２−２−（カルボキシエチル−フェニル）ピリジン−２−カルボン酸エステル、又はその誘導体、例えば１つ又は複数のスルホン酸で置換された配位子を有するイリジウム錯体など、又は例えばＣＡＳ登録番号１５５６７３０−０７−４（＝ＩＢ３／４７、当技術分野においてイリデート（３−）、［５−［４−（２−カルボキシエチル）フェニル］−２−ピリジンカルボキシラト（２−）−κＮ１，κＯ２］ビス［２−（６−フェナントリジニル−κＮ）−５−（３−スルホナトプロポキシ）フェニル−κＣ］−、セシウム水素（１：２：１）としても知られる）、又はそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、又は２つのスルホナトプロポキシ置換基、２つのスルホメチルを有する（２，９−フェナントリジンジメタンスルホン酸、６−フェニル−、ナトリウム塩（ＣＡＳ登録番号１５５４４６５−５０−７）を含む）、若しくは２つのポリエチレングリコール置換基、若しくは各々の３つを有する、２つのフェニル−フェナントリジン配位子を有するイリジウム錯体、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１３４】
一実施形態において、本発明の多機能化ケイ素ナノ粒子は式（Ｉ）
【０１３５】
【化３８】
2019534994.tif 000039
【０１３６】
（式中、
ｎは３であり、
ｘは１であり、
ｙは少なくとも１であり、
ｚは１であり、
Ｌ１は−ＣＨ２−ＣＨ２−又は−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、
Ｌ２は上記で定義されるリンカーであり、
ここで、Ｌ１とＬ２は同一又は異なっており、
Ｓｉは１ｎｍ〜１０ｎｍのサイズを有するケイ素コアであり、
Ｒは、Ｈ、１つの反応性基を有する−ＣＯ−Ｌ２、−ＣＯ−不活性化Ｌ２（Ｌ２は上記で定義される通りである）、又は上記で定義される表面修飾剤に由来する残基であり、
Ｍは、
【０１３７】
【化３９】
2019534994.tif 000040
【０１３８】
から成る群から選択されるコア構造を有する電気化学発光金属錯体、又はその塩である）
に対応する。
上記で定義される実施形態のいずれかの任意の組み合わせは、本発明の主題であると考えられる。
【０１３９】
本発明の多機能化ケイ素ナノ粒子を調製する方法
本発明の課題は、イムノアッセイにおける所望の使用に応じた多機能化ケイ素ナノ粒子の調整を可能にする、多機能化ケイ素ナノ粒子を調製する方法を提供することであった。
【０１４０】
したがって、本発明は、一態様において、多機能化ケイ素ナノ粒子を調製するための新規の方法に関する。
本発明による多機能化ケイ素ナノ粒子は、例えば以下の２つの方法によって調製できる。
【０１４１】
方法Ｉ：親和性結合剤が低分子量分析物又はその誘導体である場合、本発明の方法は少なくとも以下のステップを含む：
（ａ）適切な場合に溶媒の存在下で、及び適切な場合にカップリング試薬の存在下で、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキルケイ素ナノ粒子、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピルケイ素ナノ粒子、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピルケイ素ナノ粒子、又はアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチルケイ素ナノ粒子を、活性リンカーを含む電気化学発光化合物と反応させて、
各々の場合でリンカーを介して１〜１００個の電気化学発光化合物に共有結合している、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキルケイ素ナノ粒子、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピルケイ素ナノ粒子、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピルケイ素ナノ粒子、又はアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチルケイ素ナノ粒子を得るステップと、
（ｂ）適切な場合に溶媒の存在下で、及び適切な場合にカップリング試薬の存在下で、プロセスステップ（ａ）に従って得られる機能化ケイ素ナノ粒子を、活性リンカーに共有結合している少なくとも１つの親和性結合剤と反応させ、それにより本明細書に記載の本発明の多機能化ケイ素ナノ粒子を得るステップであって、親和性結合剤が本明細書において定義される低分子量分析物又はその誘導体である、ステップ。
【０１４２】
一実施形態において、方法Ｉでは、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子中に親和性結合剤として含まれる分析物は低分子量分析物であり、すなわち分子量が２０００ダルトン以下である。そのような多機能化ケイ素ナノ粒子に含まれる好ましい分析物は、生理学的に／診断上適切なホルモン及び代謝産物である。
【０１４３】
生理学的に／診断上適切なホルモン及び代謝産物としては、葉酸、特に血漿及び赤血球の両方に含まれるいわゆる全葉酸、ステロイド、例えばエストラジオール、エストロン、プロゲステロン、１７−ヒドロキシプロゲステロン、コルチゾール、テストステロン、アンドロステンジオン（ａｎｄｒｏｓｔｅｎｄｉｏｎｅ）など、ホルモン、例えば２５−ヒドロキシビタミンＤ３などが挙げられる。
【０１４４】
方法ＩＩ：親和性結合剤がアミノ基を含む場合、例えば親和性結合剤がタンパク質である場合、本発明の方法は少なくとも以下のステップを含む：
（ａ）適切な場合に溶媒の存在下で、及び適切な場合にカップリング試薬の存在下で、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキルケイ素ナノ粒子、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピルケイ素ナノ粒子、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピルケイ素ナノ粒子、又はアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチルケイ素ナノ粒子を、活性リンカーを含む電気化学発光化合物と反応させて、
各々の場合でリンカーを介して１〜１００個の電気化学発光化合物に共有結合しているが依然として末端アミノ基を含む、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキルケイ素ナノ粒子、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピルケイ素ナノ粒子、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピルケイ素ナノ粒子、又はアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチルケイ素ナノ粒子を得るステップと、
（ｂ）プロセスステップ（ａ）に従って得られる機能化ケイ素ナノ粒子を、アミノ基に結合するための第１の反応性基及び例えばＳＨ−基に結合するための第２の反応性基を含むヘテロ二官能性架橋剤と反応させ、それにより第１の（アミン−）反応性基を介してリンカーを末端アミノ基の１つ又は複数に結合させて、１〜１００個の電気化学発光化合物並びに１つ又は複数の活性リンカー（複数可）を含み依然として第２の反応性基（例えばＳＨ−反応性官能基）を含む機能化ケイ素ナノ粒子を得るステップと、
（ｃ）プロセスステップ（ｂ）に従って得られる機能化ケイ素ナノ粒子をタンパク質と反応させ、それにより第２の反応性基を介してタンパク質を親和性結合剤に結合させて、本明細書において定義される本発明の多機能化ケイ素ナノ粒子の一実施形態を得るステップ。
【０１４５】
方法Ｉ及びＩＩのプロセスステップ（ａ）において出発物質として使用される、アミン末端Ｃ３〜Ｃ１８アミノアルキルケイ素ナノ粒子、アミン末端３−（２−アミノ−エトキシ）−プロピルケイ素ナノ粒子、アミン末端３−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−プロピルケイ素ナノ粒子、及びアミン末端２−（４−アミノ−メチル−フェニル）−エチルケイ素ナノ粒子は、例えばＭ．Ｒｏｓｓｏ−Ｖａｓｉｃ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００９）、１９（３３）、５９２６〜５９３３頁に記載される方法によって調製されてもよい。あるいは、それらは、国際公開第２０１３／０８７７３４  Ａ２号又はＹ．Ｚｈｏｎｇ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（２０１３）、１３５、８３５０〜８３５６頁に記載のように得ることができる。
【０１４６】
アミン末端ケイ素ナノ粒子の調製に適したモノマーとしては、限定はされないが、２−プロペン−１−アミン、３−ブテン−１−アミン、４−ペンテン−１−アミン、５−ヘキセン−１−アミン、６−ヘプテン−１−アミン、７−オクテン−１−アミン、８−ノネン−１−アミン、９−デセン−１−アミン、１０−ウンデセン−１−アミン、１１−ドデセン−１−アミン、１７−オクタデセン−１−アミン、２−（２−プロペン−１−イルオキシ）−エタンアミン、２−［−（２−プロペン−１−イルオキシ）エトキシ］−エタンアミン、及び４−エテニルベンゼンメタンアミンが挙げられる。
【０１４７】
方法Ｉ及びＩＩのプロセスステップ（ａ）において出発物質として使用される、活性リンカーを含む電気化学発光化合物は、当業者に良く知られており、市販されているか、又は最新技術において記載される方法に従って調製できる。活性リンカーを含む電気化学発光化合物は、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第２０１６／０１４６８２６  Ａ１号、国際公開第２０１４／０１９７０７  Ａ２号、国際公開第２０１４／０１９７０８  Ａ２号、国際公開第２０１４／０１９７０９  Ａ２号、国際公開第２０１４／０１９７１０  Ａ２号、及び国際公開第２０１４／０１９７１１  Ａ２号において開示されている。
【０１４８】
一実施形態において、活性リンカーを含む電気化学発光化合物は、
Ｒｕ（ｂｐｙ）２−ｂｐｙＣＯ２Ｈ（＝ＢＰＲｕ、これはＣＡＳ登録番号１１５２３９−５９−３のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルであり、当技術分野においてルテニウム（１＋）、ビス（２，２’−ビピリジン−κＮ１，κＮ１’）（４’−メチル［２，２’−ビピリジン］−４−ブタノアト−κＮ１，κＮ１’）−、（ＯＣ−６−３３）−、水素ヘキサフルオロホスフェート（１−）（１：１：２）としても知られ、ルテニウム（１＋）、ビス（２，２’−ビピリジン−Ｎ，Ｎ’）（４’−メチル［２，２’−ビピリジン］−４−ブタノアト−Ｎ１，Ｎ１’）−、（ＯＣ−６−３３）−、水素ヘキサフルオロホスフェート（１−）（１：１：２）としても知られる）の反応性エステルである、Ｒｕ（ｂｐｙ）２−ｂｐｙＣＯ−ＯＳｕ；又は
Ｓｕｌｆｏ−ＢＰＲｕ  ＮＨＳエステル（＝ＣＡＳ登録番号４８２６１８−４２−８、当技術分野においてルテネート（２−）、ビス［［２，２’−ビピリジン］−４，４’−ジメタンスルホナト（２−）−κＮ１，κＮ１’］［１−［４−（４’−メチル［２，２’−ビピリジン］−４−イル−κＮ１，κＮ１’）−１−オキソブトキシ］−２，５−ピロリジンジオン］−、ナトリウム（１：２）、（ＯＣ−６−３１）としても知られ、ルテネート（２−）、ビス［［２，２’−ビピリジン］−４，４’−ジメタンスルホナト（２−）−κＮ１，κＮ１’］［１−［４−（４’−メチル［２，２’−ビピリジン］−４−イル−κＮ１，κＮ１’）−１−オキソブトキシ］−２，５−ピロリジンジオン］−、二ナトリウム、（ＯＣ−６−３１）−（９ＣＩ）としてさらに知られる）；及び
Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）２−ピリジン−２−カルボン酸又はその誘導体の反応性ＮＨＳエステル、限定はされないが、例えばＩｒ（６−フェニルフェナントリジン）２−３−ヒドロキシピリジン−２−カルボン酸、Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）２−４−（ヒドロキシメチル）ピリジン−２−カルボン酸、Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）２−２−（カルボキシエチル−フェニル）ピリジン−２−カルボン酸、Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）２−５−（メトキシ）ピリジン−２−カルボン酸、又はＩｒ（６−フェニルフェナントリジン）２−２−（カルボキシエチル−フェニル）ピリジン−２−カルボン酸エステル、又はその誘導体、例えば１つ又は複数のスルホン酸で置換された配位子を有するイリジウム錯体など、又は例えばＣＡＳ登録番号１５５６７３０−０７−４（＝ＩＢ３／４７、当技術分野においてイリデート（３−）、［５−［４−（２−カルボキシエチル）フェニル］−２−ピリジンカルボキシラト（２−）−κＮ１，κＯ２］ビス［２−（６−フェナントリジニル−κＮ）−５−（３−スルホナトプロポキシ）フェニル−κＣ］−、セシウム水素（１：２：１）としても知られる）、又はそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、又は、２つのスルホナトプロポキシ置換基、２つのスルホメチルを有する、２つのフェニル−フェナントリジン配位子を有するイリジウム錯体（２，９−フェナントリジンジメタンスルホン酸、６−フェニル−、ナトリウム塩（ＣＡＳ登録番号１５５４４６５−５０−７）を含む）、若しくは２つのポリエチレングリコール置換基、又は各々の３つを有する、２つのフェニル−フェナントリジン配位子を有するイリジウム錯体、又はそれらの組み合わせ
から成る群から選択される。
【０１４９】
方法Ｉ及びＩＩのプロセスステップ（ａ）は、標準的なカップリング条件下で行われる。適切な溶媒及び適切なカップリング試薬は当業者に良く知られている。
方法Ｉのプロセスステップ（ｂ）で出発物質として使用される、活性リンカーに共有結合している親和性結合剤は、当業者に良く知られている。あるいは、それらは、親和性結合剤を市販のヘテロ二官能性架橋剤と、例えば上記のヘテロ二官能性架橋剤のいずれかと反応させることにより調製できる。活性リンカーに共有結合している親和性結合剤の例としては、限定はされないが、以下の分析物−活性リンカーが挙げられる：
【０１５０】
【化４０】
2019534994.tif 000041
【０１５１】
テストステロン−３−カルボキシメトキシム−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
【０１５２】
【化４１】
2019534994.tif 000042
【０１５３】
テストステロン−３−ジメチル−カルボキシメトキシム−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
【０１５４】
【化４２】
2019534994.tif 000043
【０１５５】
エストラジオール−３−カルボキシメチルエステル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
【０１５６】
【化４３】
2019534994.tif 000044
【０１５７】
テストステロン−１７−ヘミスクシナト−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、及び
【０１５８】
【化４４】
2019534994.tif 000045
【０１５９】
方法Ｉ及びＩＩのプロセスステップ（ｂ）並びに方法（ｃ）のプロセスステップ（ｃ）は、標準的なカップリング条件下で行われる。適切な溶媒及び適切なカップリング試薬は当業者に良く知られている。適切な溶媒及び適切なカップリング試薬は当業者に良く知られている。
【０１６０】
実施形態において、式（Ｉ）の多機能化ケイ素ナノ粒子
【０１６１】
【化４５】
2019534994.tif 000046
【０１６２】
（式中、ｎ、ｘ、ｙ、ｚ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓｉ、Ｍ、及び親和性結合剤は上記で定義される通りであり、ＲはＨである）を調製する方法Ｉは、少なくとも以下のステップを含む：
（ａ）適切な場合に溶媒の存在下で、及び適切な場合にカップリング試薬の存在下で、式（ＩＩ）のアミン末端ケイ素ナノ粒子
【０１６３】
【化４６】
2019534994.tif 000047
【０１６４】
（式中、ｎ、ｘ、ｙ、ｚ、及びＳｉは上記のように定義される）
を、式（ＩＩＩ）のｚ活性リンカー−ＥＣＬ−金属錯体
【０１６５】
【化４７】
2019534994.tif 000048
【０１６６】
（式中、Ｌ１及びＭは上記のように定義され、ＬＧ１−ＣＯ−はアミノ基に結合するための反応性基であり、好ましくはＬＧ１−ＣＯはスクシンイミジル−Ｏ−ＣＯ基である）
と反応させて、式（ＩＶ）の機能化ケイ素ナノ粒子
【０１６７】
【化４８】
2019534994.tif 000049
【０１６８】
（式中、ｎ、ｙ、Ｓｉ、Ｌ１、及びＭは上記のように定義される）を得るステップと、
（ｂ）式（ＩＶ）の機能化ケイ素ナノ粒子を、式（Ｖ）のｘ活性リンカー−親和性結合剤
【０１６９】
【化４９】
2019534994.tif 000050
【０１７０】
（式中、Ｌ２及び親和性結合剤は上記で定義される通りであり、ＬＧ２はアミノ基に結合するための反応性基であり、好ましくはＬＧ２−ＣＯはスクシンイミジル−Ｏ−ＣＯ基である）
と反応させて、ＲがＨである上記で定義される式（Ｉ）の多機能化ケイ素ナノ粒子を得るステップ。
【０１７１】
方法Ｉにおいて、ＬＧ１とＬＧ２は同一又は異なっていてもよい。
プロセスステップ（ａ）で出発物質として使用される式（ＩＩ）のアミン末端ケイ素ナノ粒子は、例えばＭ．Ｒｏｓｓｏ−Ｖａｓｉｃ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００９）、１９（３３）、５９２６〜５９３３頁に記載の方法により調製されてもよい。あるいは、それらは国際公開第２０１３／０８７７３４  Ａ２号及びＹ．Ｚｈｏｎｇ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（２０１３）、１３５、８３５０〜８３５６頁に記載のように得ることができる。
【０１７２】
式（ＩＩ）のアミン末端ケイ素ナノ粒子の調製に適したモノマーとしては、限定はされないが、２−プロペン−１−アミン、３−ブテン−１−アミン、４−ペンテン−１−アミン、５−ヘキセン−１−アミン、６−ヘプテン−１−アミン、７−オクテン−１−アミン、８−ノネン−１−アミン、９−デセン−１−アミン、１０−ウンデセン−１−アミン、１１−ドデセン−１−アミン、１７−オクタデセン−１−アミン、２−（２−プロペン−１−イルオキシ）−エタンアミン、２−［−（２−プロペン−１−イルオキシ）エトキシ］−エタンアミン、及び４−エテニルベンゼンメタンアミンが挙げられる。
【０１７３】
プロセスステップ（ａ）で出発物質として使用される式（ＩＩＩ）の活性リンカー−ＥＣＬ−金属錯体は当業者に良く知られている。式（ＩＩＩ）の活性リンカー−ＥＣＬ−金属錯体は、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第２０１６／０１４６８２６  Ａ１号、国際公開第２０１４／０１９７０７  Ａ２号、国際公開第２０１４／０１９７０８  Ａ２号、国際公開第２０１４／０１９７０９  Ａ２号、国際公開第２０１４／０１９７１０  Ａ２号、及び国際公開第２０１４／０１９７１１  Ａ２号において開示されている。
【０１７４】
プロセスステップ（ａ）は標準的なカップリング条件下で行われる。適切な溶媒及び適切なカップリング試薬は当業者に良く知られている。好ましい実施形態において、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）が溶媒として使用される。実施例２及び３は式（ＩＶ）の機能化ケイ素ナノ粒子をプロセスステップ（ａ）によってどのように得ることができるかを示す。
【０１７５】
式（ＩＶ）の機能化ケイ素ナノ粒子は新規である。したがって、一態様において、本発明は上記で定義される式（ＩＶ）の機能化ケイ素ナノ粒子に関する。
プロセスステップ（ｂ）で出発物質として使用される式（Ｖ）の活性リンカー−親和性結合剤は当業者に良く知られている。あるいは、それらは、上記で定義される親和性結合剤を市販のヘテロ二官能性架橋剤と、例えば上記のヘテロ二官能性架橋剤のいずれかと反応させることにより調製できる。式（Ｖ）の活性リンカー−親和性結合剤の例としては、限定はされないが、上記の分析物−活性リンカーが挙げられる。
【０１７６】
プロセスステップ（ｂ）も標準的なカップリング条件下で行われる。適切な溶媒及び適切なカップリング試薬は当業者に良く知られている。
一実施形態において、方法Ｉは、
（ｃ）上記で定義される式（Ｉ）の多機能化ケイ素ナノ粒子（式中、ＲはＨである）を、式（ＶＩ）の化合物
【０１７７】
【化５０】
2019534994.tif 000051
【０１７８】
（式中、ＣＯ−ＬＧ３はアミノ基に結合するための反応性基であり、好ましくはＬＧ３−ＣＯはスクシンイミジル−Ｏ−ＣＯ基であり、
Ｒ’’−ＣＯ−は、上記で定義されるＬ２、上記で定義される不活性化Ｌ２、又は好ましくはＮＨＳ−ＰＥＧｎ−ＯＭｅ表面修飾剤との反応により生成される上記で定義される表面修飾剤である）
と反応させて、式（Ｉ）の多機能化ケイ素ナノ粒子（式中、Ｒは、上記で定義されるＬ２、上記で定義される不活性化Ｌ２、又は上記で定義される表面修飾剤の残基である）を得るステップ
をさらに含む。
【０１７９】
プロセスステップ（ｃ）の出発物質として使用される式（ＶＩ）の化合物は当業者に良く知られている。
上記に示すように、親和性結合剤がアミノ基を含む場合は、方法ＩＩに記載される方法をとらなければならない。
【０１８０】
したがって、一実施形態において、式（Ｉ）の多機能化ケイ素ナノ粒子
【０１８１】
【化５１】
2019534994.tif 000052
【０１８２】
（式中、ｎ、ｘ、ｙ、ｚ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓｉ、Ｍは上記のように定義され、親和性結合剤は上記で定義される通りでありアミノ基を含み、ＲはＨ、１つの反応性基を有する−ＣＯ−Ｌ２、−ＣＯ−不活性化Ｌ２である）
を調製するための方法ＩＩは、少なくとも以下のステップを含む：
（ａ）適切な場合に溶媒の存在下で、及び適切な場合にカップリング試薬の存在下で、式（ＩＩ）のアミン末端ケイ素ナノ粒子
【０１８３】
【化５２】
2019534994.tif 000053
【０１８４】
（式中、ｎ、ｘ、ｙ、ｚ、及びＳｉは上記のように定義される）
を、式（ＩＩＩ）のｚ活性リンカー−ＥＣＬ−金属錯体
【０１８５】
【化５３】
2019534994.tif 000054
【０１８６】
（式中、Ｌ１及びＭは上記のように定義され、ＬＧ１−ＣＯ−はアミノ基に結合するための反応性基であり、好ましくはＬＧ１−ＣＯはスクシンイミジル−Ｏ−ＣＯ基である）
と反応させて、式（ＩＶ）の機能化ケイ素ナノ粒子
【０１８７】
【化５４】
2019534994.tif 000055
【０１８８】
（式中、ｎ、ｘ、ｙ、ｚ、Ｓｉ、Ｌ１、及びＭは上記のように定義される）を得るステップと、
（ｂ）適切な場合に溶媒の存在下で、及び適切な場合にカップリング試薬の存在下で、式（ＩＶ）の機能化ケイ素ナノ粒子を、式（ＶＩＩ）のｘヘテロ二官能化架橋剤
【０１８９】
【化５５】
2019534994.tif 000056
【０１９０】
（式中、ＬＧ４はアミノ基に結合するための反応性基であり、好ましくはＬＧ４−ＣＯはスクシンイミジル−Ｏ−ＣＯ基であり、ＲＧは例えばＳＨ基への結合に適した反応性基である）
と反応させて、式（ＶＩＩＩ）の機能化ケイ素ナノ粒子
【０１９１】
【化５６】
2019534994.tif 000057
【０１９２】
（式中、ｎ、ｘ、ｙ、ｚ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓｉ、Ｍ、及びＲＧは上記で定義される通りである）
を得るステップと、
（ｃ）適切な場合に溶媒の存在下で、プロセスステップ（ｂ）に従って得られる式（ＶＩＩＩ）の機能化ケイ素ナノ粒子を、例えばチオール基を含む親和性結合剤と、例えばタンパク質と反応させて、式（Ｉ）の多機能化ケイ素ナノ粒子（式中、ｎ、ｘ、ｙ、ｚ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓｉ、及びＭは上記のように定義され、親和性結合剤は上記で定義される通りでありアミノ基を含み、Ｒは、Ｈ、１つの反応性基を有する−ＣＯ−Ｌ２、−ＣＯ−不活性化Ｌ２である）を得るステップ。
【０１９３】
プロセスステップ（ａ）で出発物質として使用される式（ＩＩ）のアミン末端ケイ素ナノ粒子は、上記の方法によって調製されてもよい。
プロセスステップ（ａ）で出発物質として使用される式（ＩＩＩ）の活性リンカー−ＥＣＬ−金属錯体は、上記で示される通りである。
【０１９４】
一実施形態において、方法ＩＩは、
（ｄ）上記で定義される式（Ｉ）の多機能化ケイ素ナノ粒子（式中、ＲはＨである）を、式（ＶＩ）の化合物
【０１９５】
【化５７】
2019534994.tif 000058
【０１９６】
（式中、ＣＯ−ＬＧ３はアミノ基に結合するための反応性基であり、好ましくはＬＧ３−ＣＯはスクシンイミジル−Ｏ−ＣＯ基であり、
Ｒ’’−ＣＯ−は、上記で定義されるＬ２、上記で定義される不活性化Ｌ２、又は好ましくはＮＨＳ−ＰＥＧｎ−ＯＭｅ表面修飾剤との反応により生成される上記で定義される表面修飾剤である）
と反応させて、式（Ｉ）の多機能化ケイ素ナノ粒子（式中、Ｒは、上記で定義されるＬ２、上記で定義される不活性化Ｌ２、又は上記で定義される表面修飾剤の残基である）を得るステップ
をさらに含む。
【０１９７】
プロセスステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、及び（ｄ）も標準的なカップリング条件下で行われる。適切な溶媒及び適切なカップリング試薬は当業者に良く知られている。
本発明の多機能化ケイ素ナノ粒子の使用
発明者らは現在、驚くことにまた予想外に、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子が非常に好ましい特性を有することを見出した。例えば、多機能化ケイ素ナノ粒子は高いＥＣＬ効率を示す。有機溶媒中で分析される場合にのみ高いＥＣＬ−効率を示す多くのＥＣＬ−標識と比較して、この高い効率は対応する測定が水性の系で行われる場合にも存在する。例えば、多くの電気化学発光分子は通常はアセトニトリル中で分析され、水溶液に不溶性であるか、又は可溶性である場合、水溶液中で効率的な電気化学発光を示さない。
【０１９８】
さらに、多機能化ケイ素ナノ粒子の物理特性及び化学特性を試験様式の要求に応じて調整できるので、多機能化ケイ素ナノ粒子を、ＥＣＬ系イムノアッセイの要求を満たすように適合させることができることが分かった。
【０１９９】
したがって、一態様において、本発明は、電気化学発光に基づく検出方法における、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子の使用に関する。
別の態様において、本発明は、水溶液中の電気化学発光反応を行うための上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子の使用に関する。
【０２００】
水溶液は少なくとも９０ｗｔ．％の水（重量／重量）を含む任意の溶液である。明らかにそのような水溶液は、例えば市販のＰｒｏＣｅｌｌ溶液におけるように、緩衝剤化合物、洗剤、及び例えば第３級アミン、例えばＥＣＬ反応における電子供与体としてのトリプロピルアミンなどのような成分をさらに含有していてもよい。
【０２０１】
別の態様において、本発明は、本明細書において定義されるような分析物のインビトロ検出における、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子の使用に関する。
別の態様において、本発明は、上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子を含む組成物に関する。組成物は、試料中に存在する対象である分析物の検出に使用されてもよい。
【０２０２】
本発明の多機能化ケイ素ナノ粒子を使用する分析物の測定方法
別の態様において、本発明は、インビトロの方法により分析物を測定する方法に関し、この方法は、
（ａ）分析物を含むことが疑われる又は知られている試料を提供するステップと、
（ｂ）分析物と多機能化ケイ素ナノ粒子との複合体の形成に適した条件下で、前記試料を上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子と接触させて、分析物−多機能化ケイ素ナノ粒子複合体を得るステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された分析物−多機能化ケイ素ナノ粒子複合体を測定し、それにより分析物の測定値を得るステップと、
を含む。
【０２０３】
別の態様において、本発明は、インビトロの方法により分析物を測定する方法に関し、この方法は、
（ａ）分析物を含むことが疑われる又は知られている試料を提供するステップと、
（ｂ）多機能化ケイ素ナノ粒子と分析物特異的親和性結合剤との複合体の形成に適した条件下で、前記試料を、分析物特異的親和性結合剤と共に、分析物を含む上記で定義される多機能化ケイ素ナノ粒子と接触させて、分析物特異的親和性結合剤−多機能化ケイ素ナノ粒子複合体を得るステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で形成された分析物特異的親和性結合剤−多機能化ケイ素ナノ粒子複合体を測定し、それにより分析物の測定値を得るステップと
を含む。
【０２０４】
一実施形態において、分析物の測定は、試料中の分析物の量を検出することを意味する。
一実施形態において、分析物の検出のための上記の方法における測定は、電気化学発光に基づく検出方法を使用して行われる。
【０２０５】
好ましい実施形態において、本発明の方法は水溶液中で実施される。
上記で定義される本発明の多機能化ナノ粒子を使用した分析物の測定方法は、最新技術の手順に従って実施できる。そのような方法は、サンドイッチアッセイ及び競合結合アッセイなどの当技術分野において知られている多様な様式において構築することができる（例えば以下の参考文献を参照のこと：Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｃ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ１９９２年；Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｗｉｌｄ，Ｄ．編、Ｓｔａｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９４年；Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ｈ．及びＭａｎａｋ，Ｍ．Ｍ．ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ、第２版、ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ．：Ｌｏｎｄｏｎ、１９９３年；Ｔｉｅｔｚ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２版、Ｂｕｒｔｉｓら編、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏ．：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９４年）。
【０２０６】
当業者が容易に認識することになるように、分析物の測定は通常は、シグナルの生成、生成されるシグナルの測定によって、及び分析物の標準曲線から分析物の濃度を計算する、すなわちそれにより分析物を測定することにより、行われる。通常の場合標識が結合されるアッセイの成分、すなわち上記で定義される多機能化ナノ粒子は、分析物特異的結合剤（サンドイッチ型アッセイ）又は分析物（競合型アッセイ）のいずれかを含む。多機能化ナノ粒子に含まれる電気化学発光標識が測定される前に、通常はそのような方法において固相に結合している上記で定義される多機能化ナノ粒子は、固相に結合していない多機能化ナノ粒子から分離される。
【０２０７】
一実施形態において、本発明の方法はサンドイッチアッセイ様式で実施される。
典型的なサンドイッチ型アッセイにおいて、結合対の第２のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、及び検出可能に標識された分析物特異的結合剤はそれぞれ、異なっており重複しないエピトープにおいて分析物に結合する。第１の分析物特異的結合剤（例えば抗体）は、固体表面に共有結合的に又は受動的に結合する。固体表面は典型的にはガラス又はポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、又はイムノアッセイを行うのに適した任意の他の表面の形態であってもよい。結合プロセスは当技術分野において良く知られており、一般に架橋性共有結合又は物理的吸着から成り、ポリマー−抗体複合体は試験試料に備えて洗浄される。次いで、試験しようとする一定分量の試料を固相複合体に加え、第１の抗体又は捕捉抗体と対応する抗原との間の結合を可能にするのに十分な一定時間で（例えば２〜４０分、又はより好都合であれば一晩）及び適切な条件下で（例えば、室温〜４０℃、例えば２５℃以上３２℃以下で）インキュベートする。インキュベーションの時間に続いて、第１の抗体又は捕捉抗体を含みそれに抗原が結合している固相を洗浄し、抗原上の別のエピトープに結合している第２の抗体又は標識抗体と共にインキュベートすることができる。第２の抗体は、第１の抗体と対象である抗原との複合体への第２の抗体の結合を示すのに使用されるレポーター分子に結合している。後者は本明細書で開示される多機能化ケイ素ナノ粒子の１つの特定の実施形態を表す。
【０２０８】
極めて多目的な別のサンドイッチアッセイの様式は、結合対の第１のパートナーで被覆された固相、例えば常磁性のストレプトアビジンで被覆された微粒子の使用を含む。そのような微粒子を、結合対の第２のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、分析物を含むことが疑われる又は分析物を含む試料と共に混合及びインキュベートし、ここで、結合対の前記第２のパートナーは、前記分析物特異的結合剤、及び検出可能に標識された第２の分析物特異的結合剤、例えば本明細書で開示される多機能化ケイ素ナノ粒子に結合している。当業者にとって明らかなように、これらの成分は、分析物、結合対の第２のパートナー（に結合した）分析物特異的結合剤、及び結合対の第１のパートナーを介して、多機能化粒子を固相微粒子に結合させるのに十分な適切な条件下及び一定時間でインキュベートされる。必要に応じてそのようなアッセイは１つ又は複数の洗浄ステップ（複数可）を含んでいてもよい。
【０２０９】
典型的なサンドイッチ型アッセイにおいて、結合対の第２のパートナーに結合した分析物特異的結合剤、及び検出可能に標識された分析物特異的結合剤はそれぞれ、異なっており重複しないエピトープにおいて分析物に結合する。
【０２１０】
一実施形態において、本発明の方法は競合的アッセイの様式で実施される。
典型的には競合的アッセイの様式は検出可能に標識された分析物を利用する。親和性結合剤として分析物を含む多機能化ケイ素ナノ粒子は、本開示による一実施形態を表す。競合的アッセイの様式において、分析使用とする試料に含まれる分析物及び検出可能に標識された分析物が、親和性結合剤への結合、例えばタンパク質、受容体、又は抗体への結合に関して競合する。当業者が認識するように、分析物自体を使用しケイ素ナノ粒子に結合させてもよいが、しかし親和性結合剤が、結合した分析物−類似体と調べようとする試料中のフリーの分析物の両方に結合する限り、そのような手順において分析物の類似体、例えば関連物質、又は分析物の断片を使用することも可能である。通常、親和性結合剤は固相に直接又は間接的に結合する。結合したものとフリーのものを分離した後、通常は結合した断片を分析し、生成されるシグナルは試料中の分析物の濃度に反比例する、すなわち試料中の分析物濃度が高いほど、測定されるシグナルは低い。
【０２１１】
以下の実施例は、本発明、添付の特許請求の範囲に示される真の範囲を理解するのを助けるために示される。本発明の精神から逸脱せずに、記載される手順において修正を行うことができることが理解される。
【０２１２】
本明細書において特定されるあらゆる特許及び発行物はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【実施例】
【０２１３】
Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、動的光散乱（法）（ＤＬＳ）、ゼータ電位測定、ＵＶ−可視吸収測定、フォトルミネセンス測定、ＥＣＬ、及びクロノアンペロメトリーの測定を標準的測定デバイスにより行った。
【０２１４】
実施例１
出発物質の合成
１．１  アミン末端ケイ素ナノ粒子の合成
Ｍ．Ｒｏｓｓｏ−Ｖａｓｉｃら、Ｓｍａｌｌ（２００８）、４（１０）、１８３５〜１８４１頁に記載されるように、アルキル機能化ケイ素ナノ粒子を調製した。Ｊ．Ｈ．Ｗａｒｎｅｒら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ（２００５）、１１７、４６２６〜４６３０頁；Ｍ．Ｒｏｓｓｏ−Ｖａｓｉｃ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００９）、１９（３３）、５９２６〜５９３３頁；及びＹ．Ｚｈｏｎｇ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（２０１３）、１３５、８３５０〜８３５６頁に記載されるように、アミン末端３−アミノプロピルケイ素ナノ粒子を調製した。
【０２１５】
実施例２
［Ｒｕ］標識ケイ素ナノ粒子の調製及び特性決定並びにそのＥＣＬ性能
２．１  ［Ｒｕ］標識ケイ素ナノ粒子の調製
【０２１６】
【化５８】
2019534994.tif 000059
【０２１７】
Ｒｕｂｐｙ−ＯＳｕ（ＣＡＳ登録番号１１５２３９−５９−３、５７．６ｍｇ、５４．５μｍｏｌ）を２５ｍｌフラスコ中で５ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解させた。アミン末端３−アミノプロピルケイ素ナノ粒子（１．８ｍＬ、Ｈ２Ｏ中、４０ｍｇ）を溶液へゆっくりと加えた。その後、反応混合物をアルゴン雰囲気下で室温にて２日間撹拌した。次いで、溶液を約２ｍｌの溶媒まで濃縮した。粗生成物を水に対して透析（ＭＷＣＯ：１０００）により６時間精製した。水を２時間ごとに交換した。その後、透析バッグに残った溶液を分液漏斗へ移し、ジクロロメタン層が無色になるまでジクロロメタンで洗浄した。最後に、水層を濃縮して１３ｍＬ（１．６８ｍｇ／ｍＬ）のＳｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子（Ｓｉ−［Ｒｕ］ＮＰ）を得た。
【０２１８】
２．２  Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子の特性決定
２．２．１  Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）
Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子をＸ線光電子分光法により特性決定した。
【０２１９】
Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子の化学組成をＸＰＳ測定により同定した。図１（ａ）に示すように、Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子は以下の元素：Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｒｕ、Ｆ、及びＳｉを含有する（表１を参照）。Ｓｉ２ｐの結合エネルギーは１０１．５３ｅＶであり、Ｓｉ−Ｃ結合に相当する。シリカ形成の痕跡は見られなかった（約１０４ｅＶ）。
【０２２０】
さらに、図１（ｄ）に示すようにＮスキャンのデコンボリューションを行い、表２にまとめた。Ｎスキャンのデコンボリューションは、Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子が異なる３種類の窒素：ルテニウムビピリジンに由来するピリジンＮ、３−アミノプロピルケイ素ナノ粒子に由来するアミンＮ、及びアミン末端３−アミノ−プロピルケイ素ナノ粒子とルテニウム錯体のカップリングに由来するアミドＮを含有することを実証し、これはルテニウム錯体が３−アミノプロピルケイ素ナノ粒子に共有結合していることを証明する。
【０２２１】
【表１】
2019534994.tif 000060
【０２２２】
【表２】
2019534994.tif 000061
【０２２３】
２．２．２  透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）撮像
図２はＳｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子のＴＥＭ像を示す。図２は、Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子が約４ｎｍのサイズ及び結晶構造を有することを実証する。
【０２２４】
２．２．３  動的光散乱（ＤＬＳ）及びゼータ電位
動的光散乱（ＤＬＳ）測定の結果は、Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子の流体力学的半径が約５１．７ｎｍでありゼータ電位が２７．０５ｍＶであることを示す。
【０２２５】
【表３】
2019534994.tif 000062
【０２２６】
２．２．４  光物理的特性
Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子を標準的なＲｕｂｐｙと比較するため、同じ吸収に到達するのに必要な吸光度をモニタリングするために、ＵＶ−可視吸収を行った。４００〜５００ｎｍの範囲におけるケイ素ナノ粒子の吸収がないので、ルテニウムビピリジンのＭＬＣＴ吸収帯は、２つの吸光度が等しい場合に、Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子における及びＲｕｂｐｙにおけるルテニウム錯体と同じ濃度を有するように、直接当てはめることができる。
【０２２７】
図３（ａ）に示すように、水溶液中の１０−５ＭにおいてＲｕｂｐｙを測定し、２４５、２５３、及び２８６ｎｍでの吸収帯は配位子ππ＊遷移に帰属され、４５６ｎｍでの吸収帯はＭＬＣＴ帯に帰属される。Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子の吸光度は４５６ｎｍ（ＭＬＣＴ帯）においてＲｕｂｐｙと等しく１０−５Ｍに到達したことが分かった。２４５、２５６、２８６、及び４５６ｎｍにおける吸収ピークはＲｕｂｐｙに帰属され、２５０ｎｍ未満の吸収強度の増加はＳｉナノ粒子の存在に起因する。
【０２２８】
発光スペクトルを水溶液中の１０−５Ｍにおいて記録し、図３（ｂ）に示す。Ｒｕｂｐｙ及びＳｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子の両方が、同じ発光プロファイル、強度、及び６３０ｎｍに中心を有するピークを示す。また、Ｒｕｂｐｙ及びＳｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子の寿命は同一であり、Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子において発光消光がないことを示す。Ｒｕｂｐｙ及びＳｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子の両方が発光量子収率３．５％を示す。
【０２２９】
さらに、ＥＣＬ効率を試験するために、図４に示すようにＰｒｏＣｅｌｌ溶液中で１０−５Ｍにおいて両方の化合物のＵＶ−可視吸収を行った。光物理的データを表４にまとめる。
【０２３０】
【表４】
2019534994.tif 000063
【０２３１】
２．３  電気化学発光（ＥＣＬ性能）
図５（ｃ）は、Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子のＥＣＬ発光がＲｕｂｐｙ標準物質と同一であるプロファイルを有するがより低い強度を有することを示す。ＥＣＬ効率はＲｕｂｐｙ（１００％）と比較して７０％である。さらに、クロノアンペロメトリー測定を行い、ＥＣＬ効率について計算した。異なる３日で、一日に３回の実験で、９回の実験を行った。誤差は１０％未満であった。クロノアンペロメトリー測定におけるＳｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子のＥＣＬ効率はＲｕｂｐｙ（１００％）と比較して６７％である。すべてのＥＣＬデータを表５にまとめる。
【０２３２】
【表５】
2019534994.tif 000064
【０２３３】
２．４  拡散係数の計算
Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子の低いＥＣＬ効率を調べるために、サイクリックボルタンメトリーにより様々なスキャン速度で拡散係数を計算した。これらのサイクリックボルタンメトリーの結果を図６（ａ）及び６（ｃ）に示す。さらに、図６（ｂ）及び６（ｄ）は、電流がスキャン速度のルートに比例することを示し、物質移動挙動が拡散律速であり、拡散係数の計算を可能にするＲａｎｄｌｅｓ−Ｓｅｖｃｉｋ方程式に従うことを示す。結果を表６にまとめる。Ｓｉ−［Ｒｕ］ナノ粒子のこの低い拡散係数がＲｕｂｐｙと比べて低いＥＣＬ効率を生じさせる。すべてのデータを表６にまとめる。
【０２３４】
【表６】
2019534994.tif 000065
【０２３５】
実施例３
［Ｉｒ］標識ケイ素ナノ粒子の調製及び特性決定並びにそのＥＣＬ性能
３．１  ［Ｉｒ］標識ケイ素ナノ粒子の調製
【０２３６】
【化５９】
2019534994.tif 000066
【０２３７】
Ｉｒ錯体（５２．９ｍｇ、５４．５μｍｏｌ）（ＣＡＳ登録番号１３９３１２８−５７−８）、ＥＤＣ（１６．９ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ）、及びＮＨＳ（１２．５ｍｇ、０．１０９ｍｍｏｌ）を２５ｍｌフラスコ中で７ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解させ、Ａｒ雰囲気下で室温にて１時間撹拌した。その後、アミン末端３−アミノプロピルケイ素ナノ粒子（１．８ｍＬ、Ｈ２Ｏ中、４０ｍｇ）及びジイソプロピルエチルアミン（１０μＬ）を溶液へゆっくり加え、反応物をアルゴン雰囲気下で室温にて２日間撹拌した。次いで、溶媒を真空下で除去した。未反応のＩｒ錯体及び未反応のアミン末端３−アミノプロピルケイ素ナノ粒子を除去するために、粗生成物を水及びジクロロメタンで洗浄した。生成物を１５ｍＬ  ＤＭＦ中に分散させて４．１２ｍｇ／ｍＬのＳｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子を得た。
【０２３８】
３．２  Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子の特性決定
３．２．１  Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）
Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子をＸ線光電子分光法により特性決定した。
【０２３９】
Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子の化学組成をＸＰＳ測定により同定した。図７（ａ）に示すように、Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子は以下の元素：Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｉｒ、及びＳｉを含有する（表７を参照）。Ｓｉ２ｐの結合エネルギーは１０２．００ｅＶであり、Ｓｉ−Ｃ結合に相当する。シリカ形成の痕跡は確認されなかった（約１０４ｅＶ）。
【０２４０】
さらに、図７（ｄ）に示し、表７にまとめたように、Ｎスキャンのデコンボリューションを実施した。Ｎスキャンのデコンボリューションは、Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子が異なる４種類の窒素：Ｒｕｂｐｙに由来するピリジン窒素、アミン末端３−アミノプロピルケイ素ナノ粒子に由来するアミンＮ及びアンモニウムＮ、アミン末端３−アミノプロピルケイ素ナノ粒子とイリジウム錯体のカップリングに由来するアミドＮを含有することを示し、これはイリジウム錯体がケイ素ナノ粒子に共有結合していることを証明する。
【０２４１】
【表７】
2019534994.tif 000067
【０２４２】
【表８】
2019534994.tif 000068
【０２４３】
３．２．２  透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）撮像
図８は、Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子のＴＥＭ像を示す。図８は、Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子が約４ｎｍのサイズ及び結晶構造を有することを実証する。
【０２４４】
３．２．３  光物理的特性
Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子をＩｒ錯体と比較するため、Ｉｒ錯体と同じ吸収に到達するのに必要な吸光度をモニタリングするために、ＵＶ−可視吸収を行った。４００〜５００ｎｍの範囲におけるＳｉナノ粒子の吸収がないので、Ｉｒ錯体のＭＬＣＴ吸収帯は、２つの吸光度が等しい場合に、Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子における及びＩｒ錯体におけるＩｒ錯体と同じ濃度を有するように、直接当てはめることができる。
【０２４５】
図９に示すように、ＤＭＦ溶液中の１０−５ＭにおいてＩｒ錯体を測定し、２８８、３５０、３５８、及び３８０ｎｍでの吸収帯は配位子ππ＊遷移に帰属され、４３０及び４６８ｎｍでの吸収帯はＭＬＣＴ帯に帰属される。Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子の吸光度はＭＬＣＴ帯においてＩｒ錯体と等しく１０−５Ｍに到達したことが分かった。２８８、３５０、３５８、４３０、及び４６８ｎｍにおける吸収ピークはＩｒ錯体に帰属される。
【０２４６】
さらにＥＣＬ効率を試験するために、図１０に示すようにＰｒｏＣｅｌｌ溶液中で１０−５Ｍにおいて両方の化合物のＵＶ−可視吸収を行った。
３．３  電気化学発光（ＥＣＬ）性能
図１１（ｃ）は、Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子のＥＣＬ発光がＩｒ錯体と同一であるプロファイルを有するがより低い強度を有することを示す。ＥＣＬ効率はＲｕｂｐｙ（１００％）と比較して２８％である。また、クロノアンペロメトリー測定を行い、ＥＣＬ効率について計算した。異なる３日で、一日に３回の実験で、９回の実験を行った。誤差は１０％未満であった。クロノアンペロメトリー測定におけるＳｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子のＥＣＬ効率はＲｕｂｐｙ（１００％）と比較して３１％である。すべてのＥＣＬデータを表９にまとめる。
【０２４７】
【表９】
2019534994.tif 000069
【０２４８】
３．４  拡散係数の計算
ＥＣＬは電極表面上のみ生じるので、分析物の電極表面への物質拡散速度が重要である。Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子の低いＥＣＬ効率を調べるために、図１２（ａ）に示すようにサイクリックボルタンメトリーにより様々なスキャン速度で拡散係数を計算した。
【０２４９】
図１２（ｂ）では、電流がスキャン速度のルートに比例し、物質移動挙動が拡散律速であり、拡散係数の計算を可能にするＲａｎｄｌｅｓ−Ｓｅｖｃｉｋ方程式に従うことを示し、表１０にまとめられる。Ｓｉ−［Ｉｒ］ナノ粒子の低いＥＣＬ効率は、均質な条件下で３．２１ｘ１０〜７−７ｃｍ２ｓ−１の低い拡散係数に起因する。すべてのデータを表１０にまとめる。
【０２５０】
【表１０】
2019534994.tif 000070
【０２５１】
実施例４
［Ｒｕ］標識ケイ素ナノ粒子の機能化
４．１  ヘテロ二官能性リンカーと［Ｒｕ］標識ケイ素ナノ粒子との反応
【０２５２】
【化６０】
2019534994.tif 000071
【０２５３】
６０個のルテニウム錯体（１．６８ｍｇ、１ｍＬ溶液中）で機能化されたＳｉナノ粒子（Ｒ１）及び３−［２−（２−｛２−［２−（２−｛２−［３−（２，５−ジオキソ−２，５−ジヒドロ−ピロール−１−イル）−プロピオニルアミノ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−エトキシ］−プロピオン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル（Ｒ２）を１０ｍＬフラスコ中で混合した。反応物を室温で一晩撹拌した。次いで、１ｋＤａ膜を使用して透析により赤色溶液を精製して過剰のＲ２を除去した。２日の透析後、赤色溶液を凍結乾燥して赤色固体を得た。赤色固体を２ｍＬの水に再懸濁させ、懸濁液をろ過して不溶性残留物を除去した。
収量：２ｍＬの最終溶液：橙色溶液
ＵＶによる溶液中のＲｕの平均濃度（λｍａｘ：４５６；ε：１４６００）：０．５２
濃度：３．５  １０−０５ＭのＲｕ錯体
４．２  ヘテロ二官能性リンカーで機能化された［Ｒｕ］標識ケイ素ナノ粒子と抗体とのコンジュゲーション
コンジュゲーションの手順は米国特許第７，５２１，５４１号に記載のように行った。ルテニウム錯体で機能化されたマレイミド機能化Ｓｉ−ナノ粒子を、改変システイン（ＴｈｉｏＭａｂ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して部位特異的コンジュゲーションによりＭＡｂ＜ＴＮ−Ｔ＞Ｃｈｉｍ−５Ｄ８−ＩｇＧに由来するＦａｂ−断片とコンジュゲートし、ゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）により精製した。
【０２５４】
４．３  修飾した分析物と［Ｒｕ］標識ケイ素ナノ粒子との反応
【０２５５】
【化６１】
2019534994.tif 000072
【０２５６】
６０個のルテニウム錯体で機能化されたＳｉ−ナノ粒子（Ｒ１）（１．６８ｍｇ、１ｍＬ溶液中）及びテストステロン−３−カルボキシメチルオキシム−ＮＨＳエステルを１０ｍＬフラスコ中で混合した。混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、１ｋＤａ膜を使用して透析により赤色溶液を精製して過剰のＲ２を除去した。２日の透析後、赤色溶液を凍結乾燥させて赤色固体を得た。赤色固体を２ｍＬの水中で再懸濁させ、懸濁液をろ過して不溶性残留物を除去した。
【図１−１】
2019534994.tif 000074
【図１−２】
2019534994.tif 000075
【図２】
2019534994.tif 000076
【図３】
2019534994.tif 000077
【図４】
2019534994.tif 000078
【図５−１】
2019534994.tif 000079
【図５−２】
2019534994.tif 000080
【図６−１】
2019534994.tif 000081
【図６−２】
2019534994.tif 000082
【図７−１】
2019534994.tif 000083
【図７−２】
2019534994.tif 000084
【図８】
2019534994.tif 000085
【図９】
2019534994.tif 000086
【図１０】
2019534994.tif 000087
【図１１−１】
2019534994.tif 000088
【図１１−２】
2019534994.tif 000089
【図１２】
2019534994.tif 000090
【国際調査報告】
2019534994.tif 000091
2019534994.tif 000092
2019534994.tif 000093
2019534994.tif 000094