(57)【要約】  本発明は、試験薬剤の皮膚感作効力を同定するための方法、およびそのような方法で使用するためのアレイおよび分析キットに関する。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤の皮膚感作効力を決定するための方法であって、
（ａ）樹状細胞の集合または樹状様細胞の集合を提供する工程と；
（ｂ）工程（ａ）で提供された細胞を試験薬剤にさらす工程と；
（ｃ）工程（ｂ）の細胞において、表Ａに定義される群から選択される２つ以上のバイオマーカーの発現を測定する工程と
を含むか、またはこれらの工程からなり、
工程（ｃ）で測定された２つ以上のバイオマーカーの発現が、工程（ｂ）の試験薬剤の皮膚感作効力を示す、方法。
【請求項２】
工程（ｃ）で測定されたバイオマーカーのうち１つ以上が、表Ａ（ｉ）および／または表Ａ（ｉｉ）に定義される群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）が、表Ａ（ｉ）に列挙された１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉ）に列挙されたバイオマーカーのうち２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の発現を測定することを含むか、またはこのことからなる、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
工程（ｃ）が、表Ａ（ｉ）に列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含むか、またはこのことからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｃ）が、表Ａ（ｉｉ）に列挙された１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｉ）に列挙されたバイオマーカーのうち２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個の発現を測定することを含むか、またはこのことからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｃ）が、表Ａ（ｉｉ）に列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含むか、またはこのことからなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）が、表Ａ（ｉｉｉ）に列挙された１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｉｉ）に列挙されたバイオマーカーのうち１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個の発現を測定することを含むか、またはこのことからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）が、表Ａ（ｉｉｉ）に列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含むか、またはこのことからなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）が、表Ａに列挙されたバイオマーカーのうち３個以上、例えば、表Ａに列挙されたバイオマーカーのうち４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個または５２個の発現を測定することを含むか、またはこのことからなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｃ）が、表Ａに列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含むか、またはこのことからなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｃ）が、表Ｂに列挙されたバイオマーカーのうち１つ以上の発現を測定することを含むか、またはこのことからなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試験薬剤が、皮膚の感作を誘発することができることが既に知られているか、またはその可能性がある、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法によって決定された前記皮膚感作効力が、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ（ＣＬＰ）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎに従って、すなわち、カテゴリー１Ａ（強）、カテゴリー１Ｂ（弱）、またはカテゴリーなし（感作剤なし）に分類される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法によって決定された前記皮膚感作効力が、Ｂａｓｋｅｔｔｅｒら、２０１４、「Ｃａｔｅｇｏｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ」、Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ、２５（１）：１１−２１に記載されるシステムに従って、すなわち、カテゴリー１（最も強い感作剤）、２、３、４、５または６（真の非感作剤）に分類される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
皮膚感作が過敏反応である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
過敏反応が、細胞媒介性過敏反応である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
過敏反応が、ＩＶ型過敏反応である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
過敏反応が、アレルギー性接触皮膚炎（ＡＣＤ）である、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｃ）が、バイオマーカーのうち１つ以上の核酸分子の発現を測定することを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記核酸分子が、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸分子が、ｍＲＮＡ分子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸分子が、ｃＤＮＡ分子である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｃ）においてバイオマーカーのうち１個以上の発現を測定することが、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィーおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法を用いて行われる、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）においてバイオマーカーのうち１個以上の発現を測定することが、ＤＮＡマイクロアレイを用いて行われる、請求項１９〜２4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｃ）においてバイオマーカーのうち１個以上の発現を測定することが、１つ以上の結合部分を用いて行われ、それぞれが表Ａに特定されるバイオマーカーの１つをコードする核酸分子に選択的に結合することができる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記１つ以上の結合部分がそれぞれ、核酸分子を含むか、または核酸分子からなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つ以上の結合部分がそれぞれ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡまたはＰＭＯを含むか、またはそれからなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記１つ以上の結合部分がそれぞれ、ＤＮＡを含むか、またはＤＮＡからなる、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記１つ以上の結合部分が、５〜１００ヌクレオチド長である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つ以上の結合部分が、１５〜３５ヌクレオチド長である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記結合部分が、検出可能な部分を含む、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出可能な部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分；放射性部分（例えば、放射性原子）；または酵素部分からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記検出可能な部分が、放射性原子を含むか、または放射性原子からなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記放射性原子が、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、リン−３２、硫黄−３５、重水素、トリチウム、レニウム−１８６、レニウム−１８８およびイットリウム−９０からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
結合部分の検出可能な部分が、蛍光部分である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ｂ）が、工程（ｃ）で定義されるバイオマーカーのうち１つ以上のタンパク質の発現を測定することを含むか、またはこのことからなる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ｃ）においてバイオマーカーのうち１個以上の発現を測定することが、表Ａに特定されるバイオマーカーの１つにそれぞれ選択的に結合することができる１つ以上の結合部分を用いて行われる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つ以上の結合部分が、抗体またはその抗原結合フラグメントを含むか、またはそれからなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体またはそのフラグメントが、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、インタクトな抗体、、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合したＦｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、単一可変ドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬドメイン）およびドメイン抗体（ｄＡｂ、単一フォーマットおよび二重フォーマット［すなわち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂを含む）から選択される、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記１つ以上の結合部分が、抗体様結合剤、例えばアフィボディーまたはアプタマーを含むか、またはそれからなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記１つ以上の結合部分が、検出可能な部分を含む、請求項３７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記検出可能な部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分および酵素部分からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
工程（ｃ）がアレイを使用して行われる、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記アレイが、ビーズ系アレイである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記アレイが、表面系アレイである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記アレイが、マクロアレイ、マイクロアレイ、ナノアレイからなる群から選択される、請求項４６〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法が、インビトロ、インビボ、エクスビボまたはインシリコで行われる、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記方法がインビトロで行われる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
２個以上のバイオマーカーの発現が、試験薬剤にさらす前および後に、工程（ａ）で提供される細胞において測定され、試験薬剤にさらす前および後の２つ以上のバイオマーカーの発現の差が、工程（ｂ）の試験薬剤の皮膚感作効力の指標である、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法であって、さらに、
（ｄ）さらなる樹状細胞の集合または樹状様細胞の集合を提供する工程と；
（ｅ）工程（ｄ）で提供された細胞を、
ｉ．ヒト皮膚を感作しない１つ以上のネガティブコントロール剤；および／または
ｉｉ．ヒト皮膚を感作する１以上のポジティブコントロール剤；および／または
ｉｉｉ．１つ以上のビヒクルコントロールにさらす工程と；
（ｆ）１つ以上のコントロール薬剤にさらす以外は、工程（ａ）で提供される細胞と同じ条件で、同じ時間インキュベートする工程と；
（ｇ）工程（ｅ）の細胞において、工程（ｃ）で測定された２つ以上のバイオマーカーの発現を測定する工程と
を含み、
工程（ｃ）で測定された２つ以上のバイオマーカーと工程（ｇ）で測定された２つ以上のバイオマーカーとの発現の差が、試験薬剤の皮膚感作効力の指標である、方法。
【請求項５３】
請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法であって、さらに、
（ｈ）さらなる樹状細胞の集合または樹状様細胞の集合を提供する工程と；
（ｉ）工程（ｈ）で提供された細胞を、所定の効力を有する皮膚感作剤にさらす工程と；
（ｊ）工程（ｈ）の細胞において、工程（ｃ）で測定された２つ以上のバイオマーカーの発現を測定する工程と
を含み、
工程（ｃ）で測定された２つ以上のバイオマーカーと工程（ｊ）で測定された２つ以上のバイオマーカーとの発現における相似が、試験薬剤の皮膚感作効力の指標である、方法。
【請求項５４】
請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法であって、さらに、
（ｋ）試験薬剤の皮膚感作効力を同定する工程を含む、方法。
【請求項５５】
樹状細胞の集団または樹状様細胞の集団が、樹状様細胞の集団である、請求項１〜５４いずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
樹状様細胞が、ＫＧ−１、ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、ＨＬ−６０、Ｍｏｎｏｍａｃ−６、ＡＭＬ−１９３およびＭＵＴＺ−３からなる群から選択されるような骨髄性白血病由来細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記方法の予測精度は、ＲＯＣ  ＡＵＣ値によって決定される場合、少なくとも０．５０、例えば、少なくとも０．５５、少なくとも０．６０、少なくとも０．６５、少なくとも０．７０、少なくとも０．７５、少なくとも０．８０、少なくとも０．８５、少なくとも０．９０、少なくとも０．９５、少なくとも０．９６、少なくとも０．９７、少なくとも０．９８または少なくとも０．９９である、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記方法の予測精度は、ＲＯＣ  ＡＵＣ値によって決定される場合、少なくとも０．８０、好ましくは少なくとも０．８５である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
請求項２５〜３５および３７〜４８のいずれか一項に記載の１つ以上の結合部分を含む、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法で使用するためのアレイ。
【請求項６０】
前記アレイが、請求項１〜５９のいずれか一項に記載のそれぞれのバイオマーカーのための１つ以上の結合部分を含む、請求項５９に記載のアレイ。
【請求項６１】
薬剤の皮膚感作効力を決定するための表Ａに定義される群から選択されるバイオマーカーの使用であって、好ましくは、バイオマーカーは、表Ａ（ｉ）または表Ａ（ｉｉ）に定義される群から選択される、使用。
【請求項６２】
薬剤の皮膚感作効力を決定するための表Ａに定義される群から選択されるバイオマーカーに対する特異性を有する結合部分の使用であって、好ましくは、結合部分は、表Ａ（ｉ）または表Ａ（ｉｉ）に定義される群から選択されるバイオマーカーに対する特異性を有する、使用。
【請求項６３】
請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法で使用するための解析キットであって、
（ａ）請求項５９〜６０のいずれか一項に記載のアレイと；
（ｂ）（場合により）１種以上のコントロール薬剤と、
（ｃ）（場合により）請求項１〜５８のいずれか一項に記載の方法を行うための指示書と
を含む、解析キット。
【請求項６４】
実質的に本明細書に記載の方法、使用、アレイまたはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試験薬剤の皮膚感作効力を同定するための方法、およびそのような方法で使用するためのアレイおよび分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性接触皮膚炎（ＡＣＤ）は、人口のかなりの割合が罹患する炎症性皮膚疾患である。アレルギー性接触皮膚炎は、一般的に、社会にとってかなりの経済的負担につながるハプテンという化学物質に対する免疫反応によって生じる。化学物質に対する現在の感作試験は、動物実験に依存している。例えば医薬品産業および化粧品産業における化学物質の登録および使用に関する法律があるため、感作予測のための代替のヒト細胞系アッセイを開発するための重要な研究努力が刺激された。その目的は、動物実験を、より高い予測力を示すインビトロ試験と置き換えることである。
【０００３】
ＡＣＤは、湿疹と、周期的に起こるかゆみ現象によって特徴付けられる［Ａｋｈａｖａｎ，Ａ．およびＳ．Ｒ．Ｃｏｈｅｎ，Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．Ｃｌｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，２００３．２１（２）：ｐ．１５８−６２］。この疾患は、人口のかなりの割合が罹患しており、ヨーロッパでは７．２％〜１８．６％の有病率を有し［Ｍｏｒｔｚ，Ｃ．Ｇ．ら、Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ａｓｔｈｍａ，ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ，ａｎｄ  ｈａｎｄ  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｉｎ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ．Ｔｈｅ  Ｏｄｅｎｓｅ  Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｈｏｒｔ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  Ａｔｏｐｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，２００１．１４４（３）：ｐ．５２３−３２；およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｎ．Ｈ．ら、Ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ａｄｕｌｔ  Ｄａｎｉｓｈ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｔＷＯｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ  ｓｕｒｖｅｙｓ  ｅｉｇｈｔ  ｙｅａｒｓ  ａｐａｒｔ（ｔｈｅ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｓｔｕｄｙ）．Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ，２００１．８１（１）：ｐ．３１−４］、感作性化学物質に繰り返しさらされることによって、発症率が増加する。ＡＣＤは、以前にさらされ、免疫学的に感作された個人において、小さな化学物質であるハプテンとの接触部位でＣＤ８＋Ｔ細胞を産生する主に反応性Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）およびインターフェロン（ＩＦＮ）によって引き起こされるＩＶ型の遅延型の過敏反応である。γ［Ｆｏｎａｃｉｅｒ，Ｌ．Ｓ．，Ｓ．Ｃ．ＤｒｅｓｋｉｎおよびＤ．Ｙ．Ｌｅｕｎｇ，Ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｓｋｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５（２  Ｓｕｐｐｌ  ２）：ｐ．Ｓ１３８−４９］。表皮中の樹状細胞（ＤＣ）は、自己分子に結合したハプテンに応答し、Ｔ細胞媒介性免疫を活性化することによって免疫反応を開始する。
【０００４】
ＲＥＡＣＨ（Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ａｕｔｈｏｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）規制は、有害な影響について、約３００００種類の化学物質を含む欧州連合内の全ての新しい化学物質および既存の化学物質を試験する必要がある［Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＥＣ）Ｎｏ  １９０７／２００６において、ＥＣ  １９０７／２００６］。潜在的な感作剤の同定には、現在、動物試験が必要であるため、ＲＥＡＣＨ法は、試験に必要な動物の数に莫大な影響を与える。さらに、７ｔｈ  Ａｍｅｎｄｍｅｎｔ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  （７６／７６８／ＥＥＣ）は、２０１３年にヒトへの使用のための化粧品成分の大半について、動物試験の禁止を提起した。したがって、化学物質の感作能力の評価のための実験動物に代わる信頼性の高いインビトロでの代替法の開発が急務である。
【０００５】
本願発明者らは、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｌｌｅｒｇｅｎ  Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＧＡＲＤ）と呼ばれる、感作性化学物質の予測のためのヒト細胞系アッセイを開発した（図８）。詳細な記載については、国際公開第２０１２／０５６２３６号およびＪｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈら、Ｔｈｅ  ＧＡＲＤ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ２０１３を参照のこと（これらは参考として本明細書に組み込まれる）。樹状様細胞（例えば、ＭＵＴＺ−３細胞株）のトランスクリプトームを解析することによって、強力な識別能力を有するゲノムバイオマーカーシグネチャを特定した［Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈら、Ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｃａｎ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｓｔｓ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１１；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈら、Ｔｈｅ  ＧＡＲＤ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ２０１３；およびＪｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈら、ＧＡＲＤ  ｉｎ−ｈｏｕｓｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ−Ａ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０１４］。さらに、シグナル伝達経路が、異なる化学反応性グループによって関与される様式は、感作効力と関係があるようである［Ａｌｂｒｅｋｔら、Ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ＭＵＴＺ−３  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐｏｔｅｎｃｙ．ＢＭＣ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２０１４］。
【０００６】
しかし、今日まで、皮膚感作性の化学物質の効力を特定するための動物ではない代替法が必要とされているが、好ましいアッセイは、マウスＬｏｃａｌ  Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅ  Ａｓｓａｙ（ＬＬＮＡ）である［Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ，Ｄ．Ａ．ら，Ｌｏｃａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ａｓｓａｙ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，ｃｏｎｄｕｃｔ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，２００２．４０（５）：ｐ．５９３−８］、その後に、モルモット最大化試験（ＧＰＭＴ）である［Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｂ．およびＡ．Ｍ．Ｋｌｉｇｍａｎ，Ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｃｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ｂｙ  ａｎｉｍａｌ  ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９６９．５２（３）：ｐ．２６８−７６］。
【０００７】
これらの動物モデルに対するインビトロ代替法は、好ましくは、改善された信頼性、効力予測の精度、また、重要なことだが、ヒトの反応性との相関関係を示すだろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０５６２３６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ａｋｈａｖａｎ，Ａ．およびＳ．Ｒ．Ｃｏｈｅｎ，Ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．Ｃｌｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，２００３．２１（２）：ｐ．１５８−６２
【非特許文献２】［Ｍｏｒｔｚ，Ｃ．Ｇ．ら、Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，ａｓｔｈｍａ，ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｒｈｉｎｉｔｉｓ，ａｎｄ  ｈａｎｄ  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｉｎ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｓ．Ｔｈｅ  Ｏｄｅｎｓｅ  Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｈｏｒｔ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  Ａｔｏｐｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，２００１．１４４（３）：ｐ．５２３−３２；およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｎ．Ｈ．ら、Ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎ  ａｄｕｌｔ  Ｄａｎｉｓｈ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：ｔＷＯｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ  ｓｕｒｖｅｙｓ  ｅｉｇｈｔ  ｙｅａｒｓ  ａｐａｒｔ（ｔｈｅ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｓｔｕｄｙ）．Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ，２００１．８１（１）：ｐ．３１−４
【非特許文献３】Ｆｏｎａｃｉｅｒ，Ｌ．Ｓ．，Ｓ．Ｃ．ＤｒｅｓｋｉｎおよびＤ．Ｙ．Ｌｅｕｎｇ，Ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｓｋｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５（２  Ｓｕｐｐｌ  ２）：ｐ．Ｓ１３８−４９
【非特許文献４】Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＥＣ）Ｎｏ  １９０７／２００６において、ＥＣ  １９０７／２００６
【非特許文献５】Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈら、Ｔｈｅ  ＧＡＲＤ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ２０１３
【非特許文献６】Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈら、Ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｃａｎ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｓｔｓ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１１
【非特許文献７】Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈら、Ｔｈｅ  ＧＡＲＤ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ２０１３；およびＪｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈら、ＧＡＲＤ  ｉｎ−ｈｏｕｓｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ−Ａ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０１４
【非特許文献８】Ａｌｂｒｅｋｔら、Ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ＭＵＴＺ−３  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐｏｔｅｎｃｙ．ＢＭＣ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２０１４
【非特許文献９】Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ，Ｄ．Ａ．ら，Ｌｏｃａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ａｓｓａｙ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，ｃｏｎｄｕｃｔ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，２００２．４０（５）：ｐ．５９３−８
【非特許文献１０】Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｂ．およびＡ．Ｍ．Ｋｌｉｇｍａｎ，Ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｃｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ｂｙ  ａｎｉｍａｌ  ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９６９．５２（３）：ｐ．２６８−７６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以前の研究に基づいて、ＧＡＲＤアッセイは、皮膚感作剤の同定に役立つことが証明されている。多変量モデルを用いたヒトトランスクリプトームのより広範な評価は、驚くべきことに、改善されたインビトロ効力モデルも可能であることを明らかにした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明の第１の態様は、薬剤の皮膚感作効力を決定するための方法であって、
（ａ）樹状細胞の集合または樹状様細胞の集合を提供する工程と；
（ｂ）工程（ａ）で提供された細胞を試験薬剤にさらす工程と；
（ｃ）工程（ｂ）の細胞において、表Ａに定義される群から選択される２つ以上のバイオマーカーの発現を測定する工程とを含むか、またはこれらの工程からなり、
工程（ｃ）で測定された２つ以上のバイオマーカーの発現が、工程（ｂ）の試験薬剤の皮膚感作効力を示す、方法を提供する。
【００１２】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）で測定されたバイオマーカーのうち１つ以上が、表Ａ（ｉ）および／または表Ａ（ｉｉ）に定義される群から選択される。
【００１３】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）が、表Ａ（ｉ）に列挙された１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉ）に列挙されたバイオマーカーのうち２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の発現を測定することを含むか、またはこのことからなる。例えば、工程（ｃ）は、表Ａ（ｉ）に列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含んでいてもよく、またはこのことからなっていてもよい。
【００１４】
当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＭの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｂの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｄの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＰＡＩＣＳの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｄの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＬ／／／ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＰＬＫ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＰＨＧＤＨの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＭＣＭ２の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＭＣＭ７の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＣＤ５３の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＫＩＦＣ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＷＥＥ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＴＭＰＯの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＭＣＭ４の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＰＳＲＣ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＲＮＦ１４９の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＭＣＭ６の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＭＣＭ５の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＦＡＮＣＡの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。
【００１５】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）が、表Ａ（ｉｉ）に列挙された１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｉ）に列挙されたバイオマーカーのうち２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個の発現を測定することを含むか、またはこのことからなる。例えば、工程（ｃ）は、表Ａ（ｉｉ）に列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含んでいてもよく、またはこのことからなっていてもよい。
【００１６】
当該方法は、ＣＡＤの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＭＲＴＯ４の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＴＯＥ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＣＤＣ２０の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＰＭ２０Ｄ２の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＬＯＣ３４４８８７の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＵＮＧの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＣＤＫＮ１Ａの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＦの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｂの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、転写物ＩＤ７８９６６９７の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＪＡＤＥ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＫＩＡＡ０１２５の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＣＨＲＮＡ５の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＣＨＡＦ１Ｂ／／／ＭＯＲＣ３の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＳＥＬ１Ｌ３の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＳＳＲＰ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＦＯＸＭ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＬＭＮＢ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＫの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＣＥＮＰＡの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＮＣＡＰＨの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＢの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＴＲＡＰ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。
【００１７】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）は、表Ａ（ｉｉｉ）に列挙された１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｉｉ）に列挙されたバイオマーカーのうち１個、２個、３個、４個、５個、６個または７個の発現を測定することを含んでいてもよく、またはこのことからなっていてもよい。例えば、工程（ｃ）は、表Ａ（ｉｉｉ）に列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含んでいてもよく、またはこのことからなっていてもよい。
【００１８】
当該方法は、ＰＦＡＳの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＴＭＥＭ９７の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＤＨＣＲ２４の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＦＴＨ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＥの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＮＱＯ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＣＤ４４の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。
【００１９】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）が、表Ａに列挙された３つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａに列挙されたバイオマーカーのうち４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、または５２個の発現を測定することを含むか、またはこのことからなる。例えば、工程（ｃ）は、表Ａに列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含んでいてもよく、またはこのことからなっていてもよい。
【００２０】
当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＭの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｂの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｄの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＰＡＩＣＳの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｄの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＬ／／／ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＮの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＰＬＫ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＰＨＧＤＨの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＭＣＭ２の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＭＣＭ７の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＣＤ５３の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＫＩＦＣ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＷＥＥ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＴＭＰＯの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＭＣＭ４の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＰＳＲＣ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＲＮＦ１４９の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＭＣＭ６の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＭＣＭ５の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＦＡＮＣＡの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。
【００２１】
当該方法は、ＣＡＤの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＭＲＴＯ４の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＴＯＥ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＣＤＣ２０の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＰＭ２０Ｄ２の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＬＯＣ３４４８８７の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＵＮＧの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＣＤＫＮ１Ａの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＦの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ１Ｂの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、転写物ＩＤ７８９６６９７の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＪＡＤＥ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＫＩＡＡ０１２５の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＣＨＲＮＡ５の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＣＨＡＦ１Ｂ／／／ＭＯＲＣ３の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＳＥＬ１Ｌ３の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＳＳＲＰ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＦＯＸＭ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＬＭＮＢ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＫの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＣＥＮＰＡの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＮＣＡＰＨの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＢの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＴＲＡＰ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。
【００２２】
当該方法は、ＰＦＡＳの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＴＭＥＭ９７の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＤＨＣＲ２４の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＦＴＨ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＥの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＮＱＯ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＣＤ４４の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。
【００２３】
当該方法は、ＭＣＭ７、ＰＦＡＳ、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＥのうち１つ以上の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。
【００２４】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）は、表Ｂに列挙された１つ以上のバイオマーカーの発現を測定することを含んでいてもよく、またはこのことからなっていてもよい。例えば、工程（ｃ）は、表Ｂに列挙されたバイオマーカーのうち２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個の発現を測定することを含んでいてもよく、またはこのことからなっていてもよい。例えば、工程（ｃ）は、表Ｂに列挙されたバイオマーカーの全ての発現を測定することを含んでいてもよく、またはこのことからなっていてもよい。
【００２５】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）は、表Ｂに列挙されたバイオマーカーのうち少なくとも２個、例えば、表Ｂに列挙されたバイオマーカーのうち３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上または１８個以上の発現を測定することを含むか、またはこのことからなる。
【００２６】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）は、表Ｂ（ｉ）に列挙された１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ｂ（ｉ）に列挙されたバイオマーカーのうち２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、または１６個以上の発現を測定することを含むか、またはこのことからなる。
【００２７】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）は、表Ｂ（ｉｉ）に列挙された１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ｂ（ｉｉ）に列挙されたバイオマーカーのうち２個の発現を測定することを含むか、またはこのことからなる。
【００２８】
当該方法は、ＣＣＮＡ２の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、転写物ＩＤ８１５１２５２の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＰＩＧＷの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＳＮＲＰＤ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＡＲＨＧＡＰ１９／／／ＡＲＨＧＡＰ１９−ＳＬＩＴ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＬＲＣＨ２の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＰＫＰ４／／／ＰＫＰ４の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＲＡＶＥＲ２／／／ＲＡＶＥＲ２の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＤＵＴ／／／ＤＵＴの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＡＵＲＫＡの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、転写物ＩＤ８０５５３０９の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＮＤＣ１の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＫＩＦ２２／／／ＫＩＦ２２の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＯＫ／ＳＷ−ＣＬ．５８の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、転写物ＩＤ７９９４３４３の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢ／／／ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＥの発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。当該方法は、ＨＭＧＢ３の発現を測定することを含んでいてもよく、または除外していてもよい。
【００２９】
「発現」とは、バイオマーカーの存在、レベルおよび／または量を意味する。
【００３０】
「バイオマーカー」とは、その測定によって、感作効力を決定するのに有用な情報を与えることができる生体分子、またはその構成要素またはフラグメントを含む。したがって、表Ａの内容において、バイオマーカーは、核酸分子、例えば、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。または、バイオマーカーは、核酸分子または炭水化物部分によってコードされるタンパク質、またはその抗原成分またはフラグメントであってもよい。
【００３１】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、試験薬剤は、皮膚の感作を誘発することができることが既に知られているか、またはその可能性がある。
【００３２】
例えば、試験薬剤は、当該技術分野で既に知られている方法、例えば、国際公開第２０１２／０５６２３６号および／またはＪｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈら、Ｔｈｅ  ＧＡＲＤ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ２０１３（これらは参考として本明細書に組み込まれる）に記載される方法によって、皮膚の感作を誘発することができることが既に知られていてもよい。
【００３３】
代替の実施形態またはさらなる実施形態において、当該方法は、試験薬剤の皮膚感作効力および皮膚感作剤／非感作剤の状態を特定するためのものである（すなわち、試験物質が感作剤であるか否かを特定し、皮膚感作剤としてのその効力を特定する）。代替の実施形態または追加の実施形態において、当該方法は、国際公開第２０１２／０５６２３６号および／またはＪｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈらに記載の方法を用いて試験薬剤が感作剤であるかどうかを同定することを含む。
【００３４】
「皮膚感作効力」とは、薬剤の皮膚感作効力の強さを含み、または意味する。例えば、薬剤の感作能力の相対的な効力または強さから、最も効力が高いものから最も効力の低いものまでの試験薬剤群、またはその逆の試験薬剤群の順序を導き、および／または１つ以上の既知の規制またはシステムに従った分類を導く。
【００３５】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法によって決定された皮膚感作効力は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ（ＣＬＰ）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（ＥＣ）１２７２／２００８（ｈｔｔｐ：／／ｅｃｈａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｃｌｐ−２０１５）に従って分類される。このシステムは、国連のＧｌｏｂａｌｌｙ  Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＨＳ）に基づいており、これは、２０１５年の６月から、物質および混合物の分類およびラベリングに適用する唯一の規制である。これらを市場に出す前に、製品を適切に分類し、ラベリングし、包装する企業が必要である。１Ａ（強）、１Ｂ（弱）、またはカテゴリーなし（非感作剤）のカテゴリーを与える。
【００３６】
例えば、この方法は、
（ｉ）効力カテゴリー１Ａの１つ以上の薬剤；
（ｉｉ）効力カテゴリー１Ｂの１つ以上の薬剤；および／または
（ｉｉｉ）効力カテゴリーのカテゴリーがない１つ以上の薬剤を提供してもよい。
【００３７】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、前記方法によって決定された皮膚感作効力は、Ｂａｓｋｅｔｔｅｒら、２０１４、「Ｃａｔｅｇｏｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ」、Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ、２５（１）：１１−２１に記載されるシステムに従って、すなわち、カテゴリー１（最も強い感作剤）、２、３、４、５または６（真の非感作剤）に分類される（例えば、表４、図４）。
【００３８】
例えば、この方法は、
（ｉ）効力カテゴリー１の１つ以上の薬剤；
（ｉｉ）効力カテゴリー２の１つ以上の薬剤；
（ｉｉｉ）効力カテゴリー３の１つ以上の薬剤；
（ｉｖ）効力カテゴリー４の１つ以上の薬剤；
（ｖ）効力カテゴリー５の１つ以上の薬剤；および／または
（ｖｉ）効力カテゴリー６の１つ以上の薬剤を提供してもよい（例えば、本明細書の表８および／またはＢａｓｋｅｔｔｅｒら、２０１４（前出）を参照）。
【００３９】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、皮膚感作効力は、局所リンパ節アッセイ（ＬＬＮＡ）分類、モルモット最大化試験（ＧＰＭＴ）または無有害作用量（ＮＯＥＬ）に従って分類される。
【００４０】
ＬＬＮＡの詳細な説明は、本明細書に参考として組み込まれるＢａｓｋｅｔｔｅｒ，Ｄ．Ａ．ら、Ｌｏｃａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ａｓｓａｙ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，ｃｏｎｄｕｃｔ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，２００２．４０（５）：ｐ．５９３−８を参照。モルモット最大化試験の詳細な記載については、本明細書に参考として組み込まれるＭａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｂ．およびＡ．Ｍ．Ｋｌｉｇｍａｎ，Ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｃｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ｂｙ  ａｎｉｍａｌ  ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９６９．５２（３）：ｐ．２６８−７６を参照のこと。皮膚感作効力に関連する無有害作用量（ＮＯＥＬ）試験の詳細な記載については、本明細書に参考として組み込まれるＢａｓｋｅｔｔｅｒら、２００５，‘Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｉｓｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ」Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，５２（１）：３９−４３；およびＧｒｉｅｍ，Ｐ．ら、２００３，「Ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  ａ  ｒｉｓｋ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｄａｔａ．」Ｒｅｇｕｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３８：２６９−２９０を参照のこと。ＮＯＥＬと効力レベルとの相関関係については、本明細書に参考として組み込まれるＷＨＯ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃａｔａｌｏｇｕｉｎｇ−ｉｎ−Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａ．Ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｉｓｋ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．（ＩＰＣＳ  ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｊｅｃｔ  ｄｏｃｕｍｅｎｔ：ｎｏ．５），ＩＳＢＮ  ９７８  ９２  ４  １５６３６０  ４（特に、２６−２８ページの表１）も参照のこと。ＣＬＰの詳細な記載については本明細書に参考として組み込まれる（ｈｔｔｐ：／／ｅｃｈａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｃｌｐ−２０１５）を参照のこと。
【００４１】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現は、所定の効力を有する皮膚感作剤にさらす前および後に、工程（ａ）で提供される細胞において測定され、試験薬剤にさらす前とさらした後の１つ以上のバイオマーカーの発現の差が、工程（ｂ）の皮膚感作剤の効力の指標である。
【００４２】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーの発現は、所定の効力を有する皮膚感作剤にさらす前および後に、工程（ａ）で提供される細胞において測定され、工程（ｃ）の前と後の１つ以上のバイオマーカーの発現の差が、工程（ｂ）の皮膚感作剤の効力の指標である。
【００４３】
「発現の差」は、第１のサンプル（例えば、試験薬剤サンプル）における存在および／または量が、第２のサンプル（例えば、コントロール薬剤サンプル）の存在および／または量と異なることを含む。好ましくは、存在および／または量は、比較サンプルの４０％以下、例えば、３９％以下、３８％以下、３７％以下、３６％以下、３５％以下、３４％以下、３３％以下、３２％以下、３１％以下、３０％以下、２９％以下、２８％以下、２７％以下、２６％以下、２５％以下、２４％以下、２３％以下、２２％以下、２１％以下、２０％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下または０％である。
【００４４】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、１つ以上のバイオマーカーは、試験薬剤にさらさられる前と後に工程（ａ）で提供される細胞において測定され、試験薬剤にさらさられる前と後の１つ以上のバイオマーカーの発現の差は、工程（ｂ）の試験薬剤の皮膚感作効力の指標である。したがって、工程（ａ）において提供される細胞は、ネガティブコントロールおよび試験結果の両方を提供し得る。
【００４５】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、１つ以上のバイオマーカーは、試験薬剤にさらさられる前と後に工程（ａ）で提供される細胞において測定され、工程（ｃ）の前と後の１つ以上のバイオマーカーの発現の差は、工程（ｂ）の試験薬剤の皮膚感作効力の指標である。したがって、工程（ａ）において提供される細胞は、ネガティブコントロールおよび試験結果の両方を提供し得る。
【００４６】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法は、さらに、
（ｄ）さらなる樹状細胞の集合または樹状様細胞の集合を提供する工程と；
（ｅ）工程（ｄ）で提供された細胞を、
ｉ．ヒト皮膚を感作しない１つ以上のネガティブコントロール剤；および／または
ｉｉ．ヒト皮膚を感作する１以上のポジティブコントロール剤；および／または
ｉｉｉ．１つ以上のビヒクルコントロールにさらす工程と；
（ｆ）１つ以上のコントロール薬剤にさらす以外は、工程（ａ）で提供される細胞と同じ条件で、同じ時間インキュベートする工程と；
（ｇ）工程（ｅ）の細胞において、工程（ｃ）で測定された２つ以上のバイオマーカーの発現を測定する工程と
を含み、
工程（ｃ）で測定された２つ以上のバイオマーカーと工程（ｅ）で測定された２つ以上のバイオマーカーとの発現の差が、試験薬剤の皮膚感作効力の指標である。
【００４７】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法は、さらに、
（ｄ）さらなる樹状細胞の集合または樹状様細胞の集合を提供する工程と；
（ｅ）工程（ｄ）で提供された細胞を、
ｉ．ヒト皮膚を感作しないネガティブコントロール薬剤；
ｉｉ．ビヒクルコントロール；または
ｉｉｉ．所定の皮膚感作効力を有する薬剤にさらす以外は、工程（ａ）で提供される細胞と同じ条件で、同じ時間でのインキュベートにさらす工程と；
（ｆ）工程（ｅ）の細胞において、工程（ｃ）で測定された２つ以上のバイオマーカーの発現を測定する工程と
を含み、
工程（ｃ）で測定された２つ以上のバイオマーカーと工程（ｅ）で測定された２つ以上のバイオマーカーとの発現の差が、試験薬剤の皮膚感作効力の指標である。
【００４８】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、ビヒクルコントロールは、ＤＭＳＯを含む。
【００４９】
「発現の差」は、第１のサンプル（例えば、試験薬剤サンプル）における存在および／または量が、第２のサンプル（例えば、コントロール薬剤サンプル）の存在および／または量と異なることを含む。好ましくは、存在および／または量は、比較サンプルの４０％以下、例えば、３９％以下、３８％以下、３７％以下、３６％以下、３５％以下、３４％以下、３３％以下、３２％以下、３１％以下、３０％以下、２９％以下、２８％以下、２７％以下、２６％以下、２５％以下、２４％以下、２３％以下、２２％以下、２１％以下、２０％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下または０％である。
【００５０】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法は、さらに、
（ｈ）さらなる樹状細胞の集合または樹状様細胞の集合を提供する工程と；
（ｉ）工程（ｈ）で提供された細胞を、所定の効力を有する皮膚感作剤にさらす工程と；
（ｊ）工程（ｉ）の細胞において、工程（ｃ）で測定された２つ以上のバイオマーカーの発現を測定する工程とを含み、
工程（ｃ）で測定された２つ以上のバイオマーカーと工程（ｊ）で測定された２つ以上のバイオマーカーとの発現における相似が、試験薬剤の皮膚感作効力の指標である。
【００５１】
「発現における相似」とは、第１のサンプル（例えば、試験薬剤サンプル）における存在および／または量が、第２のサンプル（例えばコントロールサンプル）における存在および／または量と類似しているか、または同一であることを含む。好ましくは、存在および／または量は、コントロールサンプルの少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％である。
【００５２】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法は、さらに、
（ｋ）試験薬剤の皮膚感作効力を同定する工程を含む。
【００５３】
同定は、当該技術分野で公知の任意の適切な統計学的方法または機械学習アルゴリズム、例えば、ランダムフォレスト（ＲＦ）、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、主成分分析（ＰＣＡ）、通常最小二乗法（ＯＬＳ）、部分的最小二乗回帰（ＰＬＳ）、直交部分的最小二乗回帰（Ｏ−ＰＬＳ）および他の多変量統計解析（例えば、後方段階的ロジスティック回帰モデル）を用いて行われてもよい。多変量統計解析の総説については、例えば、本明細書に参考として組み込まれるＳｃｈｅｒｖｉｓｈ，Ｍａｒｋ  Ｊ．（１９８７年１１月）「Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２  （４）：３９６−４１３を参照のこと。好ましくは、Ｒａｎｄｏｍ  Ｆｏｒｅｓｔモデルが使用される（実施例Ａに詳細に記載されるように）。
【００５４】
本発明の方法のさらなる実施形態または代替の実施形態において、ＲＯＣ  ＡＵＣが少なくとも０．４５、例えば、ＲＯＣ  ＡＵＣが少なくとも０．５０、少なくとも０．５５、少なくとも０．６０、少なくとも０．６５、少なくとも０．７０、少なくとも０．７５、少なくとも０．８０、少なくとも０．８５、少なくとも０．８６、少なくとも０．８７、少なくとも０．８８、少なくとも０．８９、少なくとも０．９０、少なくとも０．９１、少なくとも０．９２、少なくとも０．９３、少なくとも０．９４、少なくとも０．９５、少なくとも０．９６、少なくとも０．９７、少なくとも０．９８、少なくとも０．９９、またはＲＯＣ  ＡＵＣが１．００である感作効力が決定される。好ましくは、ＲＯＣ  ＡＵＣが少なくとも０．８０、より好ましくは、少なくとも０．８５、さらにより好ましくは少なくとも０．８８の皮膚感作効力が決定される。
【００５５】
好ましくは、本発明の方法は、精度が、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％である。
【００５６】
好ましくは、本発明の方法は、感度が、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％である。
【００５７】
好ましくは、本発明の方法は、特異性が、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも１００％である。
【００５８】
「精度」とは、ある方法の正しい結果の割合を意味し、「感度」とは、全ての陽性化学物質のうち、陽性と正しく分類される化学物質の割合を意味し、「特異性」とは、全ての陰性の化学物質のうち、陰性と正しく分類される化学物質の割合を意味する。
【００５９】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、この方法は、さらに、
（ｌ）工程（ｈ）〜（ｊ）（存在する場合には、工程（ｋ））の１回以上の繰り返し工程を含む。
【００６０】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ａ）〜（ｃ）（および存在する場合、工程（ｄ）〜（ｆ／ｇ））のそれぞれの繰り返しは、同時に（すなわち、元の工程（ａ）〜（ｃ）（および存在する場合、工程（ｄ）〜（ｆ／ｇ）と共に）行われる。さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ａ）〜（ｃ）（および存在する場合、工程（ｄ）〜（ｆ／ｇ））のそれぞれの繰り返しは、連続して行われる。
【００６１】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｊ）は、以下の１つ以上の繰り返しを含むか、または以下の１つ以上の繰り返しからなる。
（Ｉ）１つ以上の他の繰り返しについて、工程（ｉ）で提供される所定の皮膚感作効力を有する同じ薬剤；または
（ＩＩ）１つ以上の他の繰り返しについて、工程（ｉ）で提供される所定の皮膚感作効力を有する異なる薬剤。
【００６２】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｉ）で提供される所定の皮膚感作効力を有する異なる薬剤は、以下からなる群から選択される。
（Ｉ）工程（ｉ）で提供される所定の皮膚感作効力を有する異なる薬剤と同じ感作効力を有する薬剤；または
（ＩＩ）工程（ｉ）で提供される所定の皮膚感作効力を有する異なる薬剤とは異なる感作効力を有する薬剤。
【００６３】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ａ）〜（ｃ）（および存在する場合、工程（ｆ／ｇ））は、少なくとも１回、例えば、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、７回以上、８回以上、９回以上、１０回以上、１１回以上、１２回以上、１３回以上、１４回以上、１５回以上、１６回以上、１７回以上、１８回以上、１９回以上、２０回以上、２１回以上、２２回以上、２３回以上、２４回以上、２５回以上、２６回以上、２７回以上、２８回以上、２９回以上、３０回以上、４０回以上、５０回以上、６０回以上、７０回以上、８０回以上、９０回以上、１００回以上、１５０回以上、２００回以上、２５０回以上、３００回以上、３５０回以上、４００回以上、４５０回以上、５００回以上、６００回以上、７００回以上、８００回以上、９００回以上または１０００回以上繰り返される。
【００６４】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、各工程または工程の繰り返しは、実験誤差を制御するために、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回繰り返されてもよい。
【００６５】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、測定された２つ以上のバイオマーカーの発現は、皮膚感作効力の全範囲にわたり、所定の皮膚感作効力を有する薬剤について測定される。
【００６６】
「皮膚感作効力の全範囲」には、使用される分類システムにおける最も高い皮膚感作カテゴリーの感作剤および最も低い皮膚感作カテゴリーの感作剤を評価することを含む。好ましくは、感作剤は、使用される分類システムにおける各感作剤カテゴリーで評価される。
【００６７】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、所定の効力を有する皮膚感作剤は、表２に定義される群からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含むか、またはそれからなる。例えば、当該方法は、表２に定義された薬剤のうち２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、または１１個以上を測定することを含んでいてもよい。
【００６８】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、所定の効力を有する皮膚感作剤は、表８、表９および／または表８、例えば、表８のみ、表９のみ、表１０のみ、表８と９、表８と１０、表９と１０、または表８、９および１０に定義される群からなる群から選択される薬剤を含むか、またはそれらからなる。例えば、当該方法は、表８、９および１０に定義されるコントロール剤のうち２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、２４個以上、２５個以上、２６個以上、２７個以上、２８個以上、２９個以上、３０個以上、３１個以上、３２個以上、３３個以上、３４個以上、３５個以上、３６個以上、３７個以上、３８個以上、３９個以上、４０個以上、４１個以上、４２個以上、４３個以上、４４個以上、４５個以上、４６個以上、４７個以上、４８個以上、４９個以上、５０個以上、５１個以上、５２個以上、５３個以上、５４個以上、５５個以上、５６個以上、５７個以上、５８個以上、５９個以上、６０個以上、６１個以上、６２個以上、６３個以上、６４個以上、６５個以上、６６個以上、６７個以上、６８個以上、６９個以上、７０個以上、７１個以上、７２個以上、７３個以上、７４個以上、７５個以上、７６個以上、７７個以上、７８個以上、７９個以上、８０個以上、８１個以上、８２個以上、８３個以上、８４個以上、８５個以上、８６個以上、８７個以上、８８個以上、８９個以上、９０個以上、９１個以上、９２個以上、９３個以上、９４個以上、９５個以上、９６個以上、９７個以上、９８個以上、９９個以上、１００個以上、１０１個以上、１０２個以上、１０３個以上、１０４個以上、１０５個以上、１０６個以上、１０７個以上、１０８個以上、１０９個以上、１１０個以上、１１１個以上、１１２個以上、１１３個以上、１１４個以上、１１５個以上、１１６個以上、１１７個以上、１１８個以上、１１９個以上、１２０個以上、１２１個以上または１２２個以上を測定することを含んでいてもよい。
【００６９】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、所定の効力を有する皮膚感作剤は、１−ブタノール、４−アミノ安息香酸、ベンズアルデヒド、クロロベンゼン、フタル酸ジエチル、ジメチルホルムアミド、エチルバニリン、グリセロール、イソプロパノール、乳酸、サリチル酸メチル、オクタン酸、プロピレングリコール、フェノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、過マンガン酸カリウム、サリチル酸、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ  ８０、硫酸亜鉛、２，４−ジニトロクロロベンゼン、オキサゾロン、二クロム酸カリウム、Ｋａｔｈｏｎ  ＣＧ（ＭＣ／ＭＣＩ）、ホルムアルデヒド、２−アミノフェノール、２−ニトロ−１，４−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、ヘキシルシンナムアルデヒド、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−メルカプトベンゾチアゾール、グリオキサール、シンナムアルデヒド、イソオイゲノール、エチレンジアミン、レゾルシノール、シンナミルアルコール、オイゲノール、ペニシリンＧ、ゲラニオールおよびＤＭＳＯからなる群から選択される薬剤を含むか、これらの薬剤からなる。
【００７０】
好ましい実施形態において、工程（ｃ）は、バイオマーカーのうち１つ以上の核酸分子の発現を測定することを含むか、またはこのことからなる。核酸分子は、ｃＤＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子であってもよい。好ましくは、核酸分子は、ｍＲＮＡ分子である。しかし、核酸分子は、ｃＤＮＡ分子であってもよい。
【００７１】
一実施形態において、工程（ｃ）においてバイオマーカーのうち１個以上の発現を測定することは、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィーおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法を用いて行われる。好ましくは、１つ以上のバイオマーカーの発現は、ＤＮＡマイクロアレイを用いて測定される。
【００７２】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーは、アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ）を用いて測定される。さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）で測定された１つ以上のバイオマーカーは、全ゲノムアレイを用いて測定される（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴアレイまたはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  ２．０  ＳＴアレイ）。さらなる実施形態または代替の実施形態において、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒシステムが使用される（例えば、全ゲノムアレイからの選択に基づくカスタムＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒコードセット（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴアレイまたはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  ２．０  ＳＴアレイ）。
【００７３】
当該方法は、それぞれが表Ａで特定されるバイオマーカーのうち１つをコードする核酸分子に選択的に結合することができる１つ以上の結合部分を用い、工程（ｃ）において１つ以上のバイオマーカーの発現を測定することを含んでいてもよい。
【００７４】
一実施形態において、１つ以上の結合部分はそれぞれ、核酸分子を含むか、または核酸分子からなる。さらなる実施形態において、１つ以上の結合部分はそれぞれ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡまたはＰＭＯを含むか、またはそれからなる。好ましくは、１つ以上の結合部分はそれぞれ、ＤＮＡを含むか、またはＤＮＡからなる。一実施形態において、１つ以上の結合部分は、５〜１００ヌクレオチド長である。しかし、代替の実施形態において、１つ以上の結合部分は、１５〜３５ヌクレオチド長である。
【００７５】
１つ以上の結合部分は、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）由来の１つ以上のプローブを含んでいてもよく、またはそれからなっていてもよい。プローブ識別番号は、本明細書の表Ａに示されており、ここではそれらを「転写物クラスターＩＤ」と呼ばれる。
【００７６】
適切な結合剤（結合分子または結合部分とも呼ばれる）は、後述するように、所与の核酸、タンパク質またはアミノ酸モチーフに結合する能力に基づいて、ライブラリーから選択されてもよく、またはスクリーニングされてもよい。
【００７７】
好ましい実施形態において、結合部分は、検出可能な部分を含む。
【００７８】
「検出可能な部分」とは、その存在および／または相対的な量および／または位置（例えば、アレイ上の位置）を直接的または間接的に決定することが可能な部分を含む。
【００７９】
適切な検出可能な部分は、当技術分野において周知である。
【００８０】
例えば、検出可能な部分は、特定の条件にさらされたときに検出され得る蛍光部分および／または発光部分および／または化学発光部分であってもよい。このような蛍光部分は、蛍光部分の励起を引き起こすために特定の波長および強度で放射線（すなわち、光）にさらされる必要があり、それによって、検出可能な特定の波長で検出可能な蛍光を発することができるだろう。
【００８１】
または、検出可能な部分は、基質（好ましくは検出不可能なもの）を、可視化および／または検出することができる検出可能な生成物に変換することができる酵素であってもよい。適切な酵素の例は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに関連して以下により詳細に議論される。
【００８２】
したがって、検出可能な部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分；放射性部分（例えば、放射性原子）；または酵素部分からなる群から選択されてもよい。好ましくは、検出可能な部分は、放射性原子を含むか、または放射性原子からなる。放射性原子は、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、リン−３２、硫黄−３５、重水素、トリチウム、レニウム−１８６、レニウム−１８８およびイットリウム−９０からなる群から選択されてもよい。
【００８３】
明らかに、検出される薬剤（例えば、本明細書に記載の試験サンプル中および／またはコントロールサンプル中の１つ以上のバイオマーカー、および／または選択されたタンパク質を検出する際に使用するための抗体分子）は、検出可能な部分を容易に検出可能にするために、十分な適切な同位体原子を含んでいなければならない。
【００８４】
代替の好ましい実施形態において、結合部分の検出可能な部分は、蛍光部分である。
【００８５】
放射性標識または他の標識は、本発明の方法のサンプルおよび／または本発明の結合部分に既知の方法で存在するバイオマーカーに組み込まれてもよい。例えば、結合剤がポリペプチドである場合、結合剤は、生合成されてもよく、または、例えば水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を用いた化学的なアミノ酸合成によって合成されてもよい。９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈおよび１１１Ｉｎなどの標識は、例えば、結合部分のシステイン残基を介して結合させることができる。イットリウム−９０は、リジン残基を介して結合することができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．８０，４９−５７）を使用して１２３Ｉを組み込むことができる。参考文献（「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」，Ｊ−Ｆ  Ｃｈａｔａｌ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）は、他の方法を詳細に記載している。他の検出可能な部分（例えば、酵素、蛍光、発光、化学発光または放射性部分）をタンパク質に接合させる方法は、当技術分野で周知である。
【００８６】
試験されるサンプル中のバイオマーカーは、上述のタンパク質の存在、量および／または位置の決定を間接的に補助する部分で標識されてもよいことは、当業者には理解されるであろう。したがって、この部分は、多成分検出可能な部分の１つの成分を構成していてもよい。例えば、試験されるサンプル中のバイオマーカーは、ビオチンで標識されていてもよく、これにより、検出可能な標識に融合または他の方法で結合されたストレプトアビジンを用いたその後の検出を可能にする。
【００８７】
本発明の第１の態様で提供される方法は、工程（ｃ）において、表Ａに定義される１つ以上のバイオマーカーのタンパク質の発現を決定することを含んでいてもよく、またはこのことからなっていてもよい。当該方法は、それぞれが表Ａで特定されるバイオマーカーのうち１つに選択的に結合することができる１つ以上の結合部分を用い、工程（ｃ）において１つ以上のバイオマーカーの発現を測定することを含んでいてもよい。１つ以上の結合部分は、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、モノクローナル抗体またはそのフラグメント）を含んでいてもよく、またはそれらからなっていてもよい。
【００８８】
「抗体」との用語は、任意の合成抗体、組換え抗体または抗体ハイブリッドを含み、例えば、限定されないが、免疫グロブリン軽鎖および／または重鎖の可変領域および／または定常領域のファージディスプレイによって作られる単鎖抗体分子、または当業者に公知のイムノアッセイ形式で抗原に結合することができる他の免疫相互作用分子を含む。
【００８９】
アフィボディーやアプタマーなどの抗体様結合剤の使用も含まれる。
【００９０】
その特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関与する技術の一般的な総説は、Ｗｉｎｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２９３−２９９中に見出される。
【００９１】
これに加えて、またはこれに代えて、第１の結合分子のうち１つ以上がアプタマーであってもよい（Ｃｏｌｌｅｔｔら、２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３７：４−１５を参照のこと）。
【００９２】
分子ライブラリー、例えば、抗体ライブラリー（（Ｃｌａｃｋｓｏｎら，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，６２４−６２８；Ｍａｒｋｓら，１９９１，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２（３）：５８１−９７）、ペプチドライブラリー（Ｓｍｉｔｈ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８（４７０５）：１３１５−７）、発現ｃＤＮＡライブラリー（Ｓａｎｔｉら（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６（２）：４９７−５０８）、抗体レームワーク以外（例えば、アフィボディ）に関するライブラリー（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎら，１９９９，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６５（９）：４１３４−４０）、またはアプタマーに基づくライブラリー（Ｋｅｎａｎら，１９９９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１８，２１７−３１）を、本発明の方法に使用するために選択される所与のモチーフに特異的な結合分子の供給源として使用してもよい。
【００９３】
分子ライブラリーは、原核細胞においてインビボで発現させてもよい（Ｃｌａｃｋｓｏｎら，１９９１，前掲；Ｍａｒｋｓら，１９９１，前掲）または真核細胞においてインビボで発現させてもよく（Ｋｉｅｋｅら，１９９９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９６（１０）：５６５１−６）、または、細胞の関与なしにインビトロで発現させてもよい（Ｈａｎｅｓ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４（１０）：４９３７−４２；Ｈｅ ＆ Ｔａｕｓｓｉｇ，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５（２４）：５１３２−４；Ｎｅｍｏｔｏら，１９９７，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４１４（２）：４０５−８）。
【００９４】
タンパク質に基づくライブラリーが使用される場合には、潜在的な結合分子のライブラリーをコードする遺伝子は、ウイルス中に封入されることが多く、潜在的な結合分子は、ウイルス表面に提示される（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、前出；Ｍａｒｋｓら，１９９１、前出；Ｓｍｉｔｈ，１９８５，前出）。
【００９５】
おそらく、最も一般的に使用されるディスプレイ系は、その表面に抗体フラグメントをディスプレイする繊維状バクテリオファージであり、抗体フラグメントは、バクテリオファージのマイナーコートタンパク質との融合体として発現される（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１、前出；Ｍａｒｋｓら，１９９１，前出）。しかし、ディスプレイのための他の適切な系としては、他のウイルスを用いるもの（ＥＰ３９５７８）、細菌を用いるもの（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎら，１９９９前出；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１（９）：８２５−３２；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら，１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １２（７）：６１３−２１）および酵母を用いるもの（Ｓｈｕｓｔａら，１９９９，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９２（５）：９４９−５６）が挙げられる。
【００９６】
また、ディスプレイ系は、いわゆるリボソームディスプレイ系において、ポリペプチド産物がそのコードするｍＲＮＡに接続するのを利用したものが開発されており（Ｈａｎｅｓ ＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７，前出；Ｈｅ ＆ Ｔａｕｓｓｉｇ，１９９７，前出；Ｎｅｍｏｔｏら，１９９７，前出）、またはその代替として、ポリペプチド産物が、そのコードするＤＮＡに接続するのを利用したものが開発されている（米国特許第５，８５６，０９０号および国際公開第９８／３７１８６号を参照のこと）。
【００９７】
抗体の可変重鎖（ＶＨ）ドメインおよび可変軽鎖（ＶＬ）ドメインは、抗原認識に関与しており、この事実は、早期プロテアーゼ消化実験によって最初に認識されたものである。げっ歯類抗体の「ヒト化」により、さらなる確認が行われた。げっ歯類由来の可変ドメインは、得られた抗体がげっ歯類親抗体の抗原特異性を保持するように、ヒト由来の定常ドメインに融合することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１，６８５１−６８５５）。
【００９８】
その抗原特異性は、可変ドメインによって与えられ、定常ドメインとは無関係であることが、全てが１つ以上の可変ドメインを含む抗体フラグメントの細菌発現を含む実験から知られている。これらの分子は、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，１０４１）；Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，１０３８）；ＶＨおよびＶＬパートナードメインが可撓性オリゴペプチドを介して連結する単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２，４２３；Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，５８７９）および単離されたＶドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４）を含む。その特異的結合部位を保持する抗体フラグメントの合成に関与する技術の一般的な総説は、Ｗｉｎｔｅｒ ＆ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９，２９３−２９９中に見出される。
【００９９】
抗体または抗原フラグメントは、インタクトな抗体、Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖおよびジスルフィド結合したＦｖ）、Ｆａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント，Ｆａｂ’フラグメントおよびＦ（ａｂ）２フラグメント）、単一可変ドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬドメイン）およびドメイン抗体（ｄＡｂ、単一フォーマットおよび二重フォーマット［すなわち、ｄＡｂ−リンカー−ｄＡｂを含む）からなる群から選択されてもよい。好ましくは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。
【０１００】
１つ以上の結合部分は、抗体様結合剤、例えばアフィボディーまたはアプタマーを含んでいてもよく、またはそれらからなっていてもよい。
【０１０１】
「ｓｃＦｖ分子」とは、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが、可撓性オリゴペプチドを介して連結されている分子を意味する。
【０１０２】
全抗体ではなく、抗体フラグメントを使用する利点は、数倍にも及ぶ。フラグメントのサイズが小さいほど、改善された薬理学的特性（例えば、固形組織へのより良好な浸透）がもたらされるだろう。補体結合のような全抗体のエフェクター機能が除去される。Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂ抗体フラグメントは、全てＥ．Ｃｏｌｉで発現され、Ｅ．Ｃｏｌｉから分泌されるため、上述のフラグメントの大量生産が容易になる。
【０１０３】
全抗体およびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、「二価」である。「二価」とは、前記抗体およびＦ（ａｂ’）２フラグメントが２つの抗原結合部位を有することを意味する。これとは対照的に、Ｆａｂ、Ｆｖ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂフラグメントは一価であり、１つの抗原結合部位のみを有する。
【０１０４】
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってもよい。適切なモノクローナル抗体は、既知の技術、例えば、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｈ  Ｚｏｌａ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｊ  Ｇ  Ｒ  Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２）に開示される技術（両方とも本明細書に参考として組み込まれる）によって調製されてもよい。
【０１０５】
潜在的な結合分子がライブラリーから選択される場合、規定のモチーフを有する１つ以上のセレクターペプチドが通常用いられる。結合分子との相互作用を可能にするペプチドまたは帯電した極性または疎水性の側鎖における柔軟性を下げる構造を与えるアミノ酸残基を、セレクターペプチドのモチーフの設計に使用してもよい。例えば、
（ｉ）プロリンは、その側鎖が、アルファ炭素と窒素の両方に結合しているため、ペプチド構造を安定化し得る。
（ｉｉ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンは、芳香族側鎖を有し、きわめて疎水性であり、一方、ロイシンおよびイソロイシンは、脂肪族側鎖を有し、これも疎水性である。
（ｉｉｉ）リジン、アルギニンおよびヒスチジンは、塩基性側鎖を有し、中性ｐＨで正に帯電し、一方、アスパラギン酸およびグルタミン酸は、酸性側鎖を有し、中性ｐＨで負に帯電する。
（ｉｖ）アスパラギンおよびグルタミンは、中性ｐＨで中性であるが、水素結合に関与し得るアミド基を含む。
（ｖ）セリン、トレオニンおよびチロシン側鎖は、ヒドロキシル基を含み、このヒドロキシル基は、水素結合に関与し得る。
【０１０６】
典型的には、結合分子の選択は、結合分子の種類に対応するスポットへの結合を解析するためのアレイ技術およびシステムの使用を含んでいてもよい。
【０１０７】
１つ以上のタンパク質結合部分は、検出可能な部分を含んでいてもよい。検出可能な部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分および酵素部分からなる群から選択されてもよい。
【０１０８】
本発明の方法のさらなる実施形態において、工程（ｃ）は、１つ以上のタンパク質に結合することができる第２の結合剤を含むアッセイを用いて行われてもよく、第２の結合剤も、検出可能な部分を含んでいる。好適な第２の結合剤は、第１の結合剤に関連して上に詳細に記載されている。
【０１０９】
したがって、試験されるサンプル中の目的のタンパク質は、まず、第１の結合剤を用いて単離および／または固定化された後、第２の結合剤を用い、バイオマーカーの存在および／または相対量を決定することができる。
【０１１０】
一実施形態において、第２の結合剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントであり、典型的には、組換え抗体またはそのフラグメントである。簡便には、抗体またはそのフラグメントは、ｓｃＦｖ；Ｆａｂ；免疫グロブリン分子の結合ドメインからなる群から選択される。  適切な抗体およびフラグメント、およびこれらを製造するための方法は、上に詳細に記載されている。
【０１１１】
または、第２の結合剤は、抗体様結合剤（例えば、アフィボディーまたはアプタマー）であってもよい。
【０１１２】
または、試験されるサンプル中のタンパク質上の検出可能な部分が、特定の結合対（例えば、ビオチン）のメンバーを含むか、またはこのメンバーからなる場合、第２の結合剤は、特定の結合対の相補体（例えば、ストレプトアビジン）を含んでいてもよく、またはこの相補体からなっていてもよい。
【０１１３】
検出アッセイが使用される場合、検出可能な部分は、蛍光部分；発光部分；化学発光部分；放射性部分；酵素部分からなる群から選択される。本発明の方法における使用に適切な検出可能な部分の例は、上に記載されている。
【０１１４】
血清または血漿タンパク質を検出するための好ましいアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫ラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）（モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチアッセイを含む）が挙げられる。  例示的なサンドイッチアッセイは、Ｄａｖｉｄらによって、米国特許第４，３７６，１１０号および第４，４８６，５３０号に記載されており、本明細書に参考として組み込まれる。  スライド上での細胞の抗体染色は、当業者によく知られているように、細胞研究室の診断試験で周知の方法で使用することができる。
【０１１５】
したがって、一実施形態において、アッセイは、典型的には、通常は固相アッセイにおいて有色反応生成物を与える酵素の使用を含むＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）である。西洋ワサビペルオキシダーゼおよびホスファターゼなどの酵素が広く使用されている。ホスファターゼ反応を増幅する方法は、ＮＡＤＰを基質として使用し、第２の酵素系の補酵素として作用するＮＡＤを生成することである。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のピロフォスファターゼは、この酵素が組織内に存在せず、安定であり、良好な反応色を与えるため、良好なコンジュゲートを与える。ルシフェラーゼなどの酵素に基づく化学発光システムも使用することができる。
【０１１６】
ビタミンであるビオチンとのコンジュゲート化は、酵素によって結合したアビジンまたはストレプトアビジンとの反応によって容易に検出することができ、大きな特異性およびアフィニティで結合するので、頻繁に使用される。
【０１１７】
別の実施形態において、タンパク質検出に使用されるアッセイは、簡便には、蛍光定量アッセイである。したがって、第２の結合剤の検出可能な部分は、Ａｌｅｘａフルオロフォア（例えば、Ａｌｅｘａ−６４７）などの蛍光部分であってもよい。
【０１１８】
好ましくは、第１の態様に記載される方法の工程（ｃ）、（ｇ）、（ｆ）および／または（ｊ）は、アレイを用いて行われる。アレイは、ビーズ系アレイまたは表面系アレイであってもよい。アレイが、マクロアレイ、マイクロアレイ、ナノアレイからなる群から選択されてもよい。
【０１１９】
アレイ自体は、当該技術分野において周知である。典型的には、アレイは、空間があけられた（すなわち、離間した）領域（「スポット」）を有し、それぞれが有限な領域を有し、固体支持体表面に作られる線形または二次元構造で作られる。アレイは、ビーズ構造であってもよく、各ビーズは、分子コードまたはカラーコードによって特定され得るか、または連続フローで特定され得る。解析は、サンプルが溶液からその分子群を吸着する一連のスポットの上を通過する場合に、順次実行することもできる。固体支持体は、典型的にはガラスまたはポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、ディスク、シリコンチップ、マイクロプレート、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、他の多孔質膜、非多孔質膜（例えば、プラスチック、ポリマー、パースペックス、シリコン）、複数のポリマーピン、または複数のマイクロタイターウェル、またはタンパク質、ポリヌクレオチドおよび他の適切な分子を固定化し、および／またはイムノアッセイを実施するのに適した他の任意の表面の形態であってもよい。結合プロセスは当該技術分野において周知であり、一般にタンパク質分子、ポリヌクレオチドなどを固体支持体に共有結合または物理吸着によって架橋することからなる。または、アフィニティタグまたは類似の構築物を介したプローブのアフィニティカップリングを使用してもよい。接触印刷または非接触印刷、マスキングまたはフォトリソグラフィのような周知の技術を使用することによって、各スポットの位置を定義することができる。総説については、Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．Ｒ．（２００１，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２，１３−２９）およびＬａｌら（２００２，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １５；７（１８  Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１４３−９）を参照のこと。
【０１２０】
典型的には、アレイは、マイクロアレイである。「マイクロアレイ」とは、少なくとも約１００／ｃｍ２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２の離間した領域の密度を有する領域のアレイの意味を含む。マイクロアレイ内の領域は、約μ１０〜２５０μｍの範囲の典型的な寸法（例えば直径）を有し、アレイ内の他の領域からほぼ同じ距離だけ離れている。または、アレイは、マクロアレイまたはナノアレイであってもよい。
【０１２１】
適切な結合分子（上述）が同定され、単離されると、当業者は、分子生物学の分野で周知の方法を用いてアレイを製造することができる。
【０１２２】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）で測定される１つ以上のバイオマーカーは、ヒト細胞によって発現される１つ以上の相同遺伝子産物を含むか、またはヒト細胞によって発現される１つ以上の相同遺伝子産物からなる。さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）で測定される１つ以上のバイオマーカーは、タンパク質またはポリペプチドである。さらなる実施形態または代替の実施形態において、工程（ｃ）で測定される１つ以上のバイオマーカーは、核酸（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡなど）である。
【０１２３】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、当該方法は、インビトロ、インビボ、エクスビボまたはインシリコで行われる。例えば、当該方法は、特に、インビトロで行われてもよい。
【０１２４】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、皮膚感作は、過敏反応（例えば、細胞媒介性過敏反応）である。さらなる実施形態または代替の実施形態において、過敏反応は、ＩＶ型過敏反応である。さらなる実施形態または代替の実施形態において、過敏反応は、アレルギー性接触皮膚炎（ＡＣＤ）である。
【０１２５】
「試験薬剤」には、感作効力および／または感作状態が決定される任意の化学物質（または化学物質の混合物）が含まれる。
【０１２６】
「感作状態」とは、化学物質（または化学物質の混合物）が感作剤（例えば、皮膚感作剤および／または呼吸器感作剤）であるか否かを含むか、または意味する。
【０１２７】
「皮膚感作剤」とは、哺乳動物においてＩＶ型の遅延型過敏反応を誘発し、引き起こす能力を有する任意の薬剤を意味する。好ましくは、ＩＶ型の遅延型過敏反応は、ＤＣ媒介性である。
【０１２８】
一実施形態において、１つ以上の「皮膚感作剤」は、哺乳動物における表皮接触部位でＩＶ型の遅延型過敏反応を誘発し、引き起こす能力を有する薬剤である。
【０１２９】
哺乳動物は、家畜または農場動物であってもよい。好ましくは、哺乳動物は、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウマまたは霊長類である。最も好ましくは、哺乳動物はヒトである。上述のように、感作を決定するインビボ法は、当技術分野で公知である。好ましい方法は、局所リンパ節アッセイである（詳細については、Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ，Ｄ．Ａ．ら、Ｌｏｃａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ａｓｓａｙ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，ｃｏｎｄｕｃｔ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，２００２．４０（５）：ｐ．５９３−８を参照のこと）。さらに好適な、しかしあまり好ましくはない方法は、モルモット最大化試験である（詳細については、Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ，Ｂ．およびＡ．Ｍ．Ｋｌｉｇｍａｎ，Ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｔａｃｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ  ｂｙ  ａｎｉｍａｌ  ａｓｓａｙ．Ｔｈｅ  ｇｕｉｎｅａ  ｐｉｇ  ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１９６９．５２（３）：ｐ．２６８−７６を参照のこと）。
【０１３０】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、樹状細胞の集団または樹状様細胞の集団は、樹状様細胞の集団である。さらなる実施形態または代替の実施形態において、樹状様細胞は、骨髄樹状様細胞である。さらなる実施形態または代替の実施形態において、骨髄樹状様細胞は、骨髄樹状細胞に由来する。さらなる実施形態または代替の実施形態において、骨髄樹状細胞に由来する細胞は、骨髄性白血病由来細胞である。さらなる実施形態または代替の実施形態において、骨髄性白血病由来細胞は、ＫＧ−１、ＴＨＰ−１、Ｕ−９３７、ＨＬ−６０、Ｍｏｎｏｍａｃ−６、ＡＭＬ−１９３およびＭＵＴＺ−３からなる群より選択される。さらなる実施形態または代替の実施形態において、樹状様細胞は、ＭＵＴＺ−３細胞である。ＭＵＴＺ−３細胞は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆuｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）（ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から入手可能なヒト急性骨髄単球性白血病細胞である（ｗｗｗ．ｄｓｍｚ．ｄｅ；ＤＭＳＺ  Ｎｏ．ＡＣＣ  ２９５）。
【０１３１】
「樹状様細胞」とは、樹状細胞に特徴的な機能特性および表現型特性（例えば、形態学的特性）、共刺激分子およびＭＨＣクラスＩＩ分子の発現、マクロファージを貪食する能力および休止Ｔ細胞を活性化する能力を示す非樹状細胞を意味する。
【０１３２】
一実施形態において、樹状様細胞は、サイトカインでの刺激後、ＣＤ１ｄ、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩを介して抗原を提示し、および／または特異的Ｔ細胞増殖を誘発する。
【０１３３】
一実施形態において、樹状様細胞は、ＣＤ３４＋樹状細胞前駆細胞である。場合により、ＣＤ３４＋樹状細胞前駆体は、サイトカイン刺激の際に、ＣＤ１ｄ、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩを介して抗原を提示する表現型を獲得し、特異的Ｔ細胞増殖を誘発し、および／または炎症性メディエーターで刺激されたときに成熟した転写および表現型プロフィール（すなわち、未成熟樹状細胞またはランゲルハンス様樹状細胞と同様の表現型）を示す。
【０１３４】
一実施形態において、樹状細胞の集団または樹状様細胞の集団は、樹状細胞の集団である。好ましくは、樹状細胞は、原発性樹状細胞である。好ましくは、樹状細胞は、骨髄樹状細胞である。
【０１３５】
樹状細胞は、機能、表現型によって、および／または遺伝子発現パターンによって、特に細胞表面表現型によって認識され得る。これらの細胞は、その特徴的な形態、高レベルの表面ＭＨＣクラスＩＩ発現およびＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞、特にナイーブＴ細胞に抗原を提示する能力によって特徴付けられる（Ｓｔｅｉｎｍａｎら（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１）。
【０１３６】
樹状細胞の細胞表面は特有のベール様突起を伴った珍しい形状であり、細胞表面マーカーＣＤ１１ｃおよびＭＨＣクラスＩＩの発現を特徴とする。ほとんどのＤＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球／マクロファージおよび顆粒球を含む他の白血球系列のマーカーに対して陰性である。樹状細胞の亜集団は、３３Ｄ１、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＤ１ａ−ｄ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８ａｌｐｈａ、ＣＤ９、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２４、ＣＤ４０、ＣＤ４８、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９１、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３（ＩＬ３Ｒａ）、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＣＤ１５３、ＣＤ１６２、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＤＣＩＲ、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＤＥＣ２０５、Ｅ−カドへリン、ランゲリン、マンノースレセプター、ＭＡＲＣＯ、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ９および数種類のレクチンを含め、さらなるマーカーも発現する場合がある。
【０１３７】
これらの細胞表面マーカーの発現パターンは、樹状細胞の成熟度、それらの由来組織および／またはそれらの由来種とともに変化し得る。未成熟樹状細胞は、低レベルのＭＨＣクラスＩＩを発現するが、抗原タンパク質を細胞内に取り込み、ＭＨＣクラスＩＩ分子との複合体の状態で提示するために処理することができる。活性化樹状細胞は、高レベルのＭＨＣクラスＩＩ、ＩＣＡＭ−１およびＣＤ８６を発現し、例えば、混合白血球反応（ＭＬＲ）において、同種異系ナイーブＴ細胞の増殖を刺激することができる。
【０１３８】
機能的には、樹状細胞または樹状様細胞は、抗原提示の決定のための任意の簡便なアッセイによって同定されてもよい。そのようなアッセイは、試験抗原の提示、その後のＴ細胞増殖の決定、ＩＬ−２の放出などによって、抗原感作および／またはナイーブＴ細胞を刺激する能力を試験することを含んでいてもよい。
【０１３９】
タンパク質および／または核酸の濃度を検出および／または測定する方法は、当業者に周知である（例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【０１４０】
タンパク質の検出および／または測定のための好ましい方法としては、ウエスタンブロット、ノースウェスタンブロット、免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、抗体マイクロアレイ、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）、免疫沈降、インサイチュハイブリダイゼーションおよび他の免疫組織化学技術、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、イムノラジオメトリックアッセイ（ＩＲＭＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）（モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチアッセイを含む）が挙げられる。  例示的なサンドイッチアッセイは、Ｄａｖｉｄらによって、米国特許第４，３７６，１１０号および第４，４８６，５３０号に記載されており、本明細書に参考として組み込まれる。  スライド上での細胞の抗体染色は、当業者によく知られているように、細胞研究室の診断試験で周知の方法で使用することができる。
【０１４１】
典型的には、ＥＬＩＳＡは、通常は固相アッセイにおいて有色反応生成物を与える酵素の使用を含む。西洋ワサビペルオキシダーゼおよびホスファターゼなどの酵素が広く使用されている。ホスファターゼ反応を増幅する方法は、ＮＡＤＰを基質として使用し、第２の酵素系の補酵素として作用するＮＡＤを生成することである。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のピロフォスファターゼは、この酵素が組織内に存在せず、安定であり、良好な反応色を与えるため、良好なコンジュゲートを与える。ルシフェラーゼなどの酵素に基づく化学発光システムも使用することができる。
【０１４２】
ビタミンであるビオチンとのコンジュゲート化は、酵素によって結合したアビジンまたはストレプトアビジンとの反応によって容易に検出することができ、大きな特異性およびアフィニティで結合するので、頻繁に使用される。
【０１４３】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に係る方法で使用するためのアレイであって、本発明の第１の態様で定義された１つ以上の結合部分を含むアレイを提供する。
【０１４４】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、アレイは、本発明の第１の態様で定義されるようなそれぞれのバイオマーカーのための１つ以上の結合部分を含む。
【０１４５】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、１つ以上の結合部分は、固定化される。
【０１４６】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、アレイは、ビーズ系アレイである。さらなる実施形態または代替の実施形態において、アレイは、表面系アレイである。
【０１４７】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、アレイは、マクロアレイ、マイクロアレイ、ナノアレイからなる群から選択される。
【０１４８】
本発明の第２の態様のアレイは、それぞれ第１の態様で定義したバイオマーカーに選択的に結合することができる１つ以上、好ましくは２つ以上の結合部分を含んでいてもよい。したがって、アレイは、第１の態様で定義されるバイオマーカーの任意の特定の選択と相関関係がある、バイオマーカーに特異的な結合部分の特定の選択を含んでいてもよく、またはその特定の選択からなっていてもよい。
【０１４９】
本発明の第３の態様は、薬剤の皮膚感作能を決定するための、本発明の第１の態様で定義される２つ以上のバイオマーカーの使用を提供する。
【０１５０】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、薬剤の皮膚感作効力を決定するための表Ａに定義される群から選択されるバイオマーカーの使用であって、好ましくは、バイオマーカーは、表Ａ（ｉ）および／または表Ａ（ｉｉ）に定義される群から選択される、使用が提供される。
【０１５１】
さらなる実施形態または代替の実施形態において、薬剤の皮膚感作効力を決定するための表Ａに定義される群から選択されるバイオマーカーに対する特異性を有する結合部分の使用であって、好ましくは、結合部分は、表Ａ（ｉ）および／または表Ａ（ｉｉ）に定義される群から選択されるバイオマーカーに対する特異性を有する、使用が提供される。
【０１５２】
本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様に係る方法で使用するための解析キットであって、
（ａ）本発明の第２の態様に係るアレイと；
（ｂ）本発明の第１の態様で定義した方法を行うための指示書（任意）とを含む解析キットを提供する。
さらなる実施形態または代替の実施形態において、解析キットは、本発明の第１の態様において定義される１つ以上のコントロール薬剤をさらに含む。
【０１５３】
本発明の第５の態様は、患者のＩ型過敏反応（ＡＣＤなど）を治療または予防する方法であって、
（ａ）患者がさらされるか、または既にさらされた１つ以上の試験薬剤を提供する工程と；
（ｂ）工程（ａ）で提供された１つ以上の試験薬剤が、皮膚感作剤であるか、および／または本発明の方法を用いて感作剤としての効力があるかどうかを決定する工程とを含み、
（ｃ）１つ以上の試験薬剤が、皮膚感作剤であるか、および／または特定の効力を有する皮膚感作剤であると同定された場合、その１つ以上の試験薬剤に患者がさらされるのを減らすか、または予防し、および／または感作の症状の適切な治療を行う方法を提供する。
【０１５４】
好ましくは、患者がさらされるか、または既にさらされた１つ以上の試験薬剤は、患者が、現在、少なくとも１ヶ月に１回、例えば２週間に少なくとも１回、毎週少なくとも１回、または毎日少なくとも１回、さらされる薬剤である。
【０１５５】
感作の症状の治療には、例えば、局所ステロイドが挙げられる。
【０１５６】
好ましくは、治療方法は、本発明の第１の態様に記載された方法、およびそこに記載された１つ以上の実施形態と一致する。
【０１５７】
本発明の第６の態様は、本発明の方法を操作するための、例えば、工程（ｃ）（およびその後の発現測定工程）の発現データを解釈し、それによって、１つ以上の試験薬剤が呼吸感作剤であるかどうか、および／または１つ以上の試験薬剤の感作効力を決定するためのコンピュータプログラムを提供する。コンピュータプログラムは、プログラム化されたＳＶＭであってもよい。コンピュータプログラムは、当業者に公知の適切なコンピュータ可読媒体に記録されてもよい。適切なコンピュータ可読媒体は、コンパクトディスク（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ブルーレイなどを含む）、フロッピーディスク、フラッシュメモリドライブ、ＲＯＭまたはハードディスクドライブを含んでいてもよい。コンピュータプログラムは、コンピュータプログラムを実行するのに適したコンピュータにインストールされていてもよい。
【０１５８】
当業者であれば、矛盾しない全ての実施形態を組み合わせて使用することができることを理解するであろう。したがって、本発明の１つの態様の実施形態は、本発明の第２の態様にも等しく適用され得る。
【０１５９】
本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的な実施例を、以下の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】ＧＡＲＤアッセイを用いたバイナリ予測。（Ａ）ベンチマーク化学物質（実線）と、３７の新しい化学物質（点線）のバイナリ予測のためのＲＯＣ評価。（Ｂ）ＧＡＲＤ  ＳＶＭ決定値（ＤＶ）は、ＣＬＰ効力（３７化学物質、１１の１Ａ、１９の１Ｂ、７のカテゴリーなし）と相関関係にある。効力の増加は、ＤＶの増加と関係がある。
【図２】５２変数を使用した、ランダムフォレストモデルを開発するために使用されたトレーニングデータセットの可視化。（Ａ）化学物質のＣＬＰ分類に従って着色された別個の生物学的複製物を含むトレーニングセットのＰＣＡプロット。（Ｂ）階層的にクラスタリングされたサンプルの複製物を含むトレーニングセットのヒートマップ。ここで、グレースケールは、相対的な遺伝子発現強度を表す。
【図３】５２変数を使用したテストデータセットの可視化。（Ａ）ＣＬＰ分類に従って着色された別個の生物学的複製物を含む試験セットのＰＣＡプロット。トレーニングセットに対してＰＣＡが構築され、試験セットは、ＰＣＡに影響を与えることなくプロットされた。（Ｂ）階層的にクラスタリングされたサンプルを含む試験セットのヒートマップ。ここで、グレースケールは、相対的な遺伝子発現強度を表す。
【図４】ＣＬＰ効力モデルは、ヒト効力に関する情報を含む。（Ａ）ヒト効力に応じて着色された利用可能なヒト効力分類を有する複写物のトレーニングセットおよび試験セットサンプルのＰＣＡプロット。ＰＣＡは、入力として５２のランダムフォレスト変数に基づいており、トレーニングセットに対してＰＣＡが構築された。（Ｂ）試験セットのみを可視化するＰＣＡプロット。
【図５】３つのＣＬＰ分類の多群比較からの８８３の最も重要な遺伝子の投入に基づく経路分析。
【図６】経路分析によって同定された場合の、各タンパク質反応性群に固有の経路。
【図７】Ｖｅｎｎ３つの異なるタンパク質反応性分類の共通遺伝子（Ａ）および生物学的経路（Ｂ）のＶｅｎｎダイアグラム［８２］。ＭＡ＝マイケル受容体；ＳＢ＝シッフ塩基生成；ＳＮ＝二分子求核置換／求核芳香族置換。
【図８】ゲノムアレルゲン迅速検出（ＧＡＲＤ）−ワークフロー。ＳＶＭモデルは、ＧＡＲＤ予測シグネチャを表す２００遺伝子の遺伝子発現データに基づいて、化学的に処理された細胞に由来する各ＲＮＡサンプルの決定値を計算する。決定値は、化学物質のバイナリ分類に使用される［３］。
【図９】ＧＡＲＤ決定値と人間効力分類との関係。化学物質は、人間の効力分類に従ってソートされており、三つ組から導かれたそれぞれの平均ＳＶＭ決定値はＹ軸上に見出すことができる。Ｘ軸上の数字は、表８の化学物質の数を示す。
【図１０】１９７サンプルに基づくＯ−ＰＬＳモデル（Ｙ＝ヒト効力および感作剤／非感作剤）の散布図。ヒト効力分類は、Ｂａｓｋｅｔｔｅｒら（２０１４）に記載されており、分類１は、最高効力を表し、６は、非感作剤を表す。
【図１１】Ｏ−ＰＬＳモデルの順列プロットＹ−観測の順序がランダムに並べ替えられたいくつかのモデルとの、元のモデルのフィッティングおよび予測の良さの比較。プロットは、モデルが偶然によって得られていないことを強く示している。
【図１２】Ｙ予測値に対してプロットされたＹ観測値。ＲＭＳＥＥ（推定の二乗平均平方根誤差）は、モデルに対する観測値の適合誤差を示す。ＲＭＳＥｃｖも同様の測定値であるが、相互検証を使用して推定される。
【図１３】ＰＣＡプロットとヒートマップランダムフォレストモデルによって同定された１８の変数の入力に基づいて、トレーニングセット（Ａ）、トレーニングおよび試験セット（Ｂ）および試験セットのみ（Ｃ）のＰＣＡ。それぞれの円は、ＣＬＰ分類（黄色＝１Ａ、ピンク色＝１Ｂ、青色＝カテゴリーなし）に従って着色された化学物質を表す。（Ｄ）トレーニングセットのヒートマップ、（Ｅ）１８の同定されたバイオマーカーの発現に基づく試験セットのヒートマップ。
【発明を実施するための形態】
【０１６１】
実施例Ａ
序論
皮膚感作と、関連する疾患（例えば、接触性アレルギー）は、一般的な集団のかなりの部分が罹患しており、先進国では、推定有病割合は１５〜２０％である［１］。ＩＶ型過敏反応であるアレルギー性接触皮膚炎（ＡＣＤ）は、定期的に化学物質にさらされるか、または水仕事に関わる特定の職業集団で一般的である［２］。しかし、化粧品や家庭用製品にも、多くの皮膚感作性の化学物質が含まれている可能性がある。異なる法的枠組みを通じて、欧州連合は、化粧品とその成分に関する動物試験を禁止しており［３］、ＲＥＡＣＨの観点では、６０，０００を超える化学物質に試験のための必要条件を課している［４］。分類と副分類の規制要件を満たすために、化学物質の皮膚感作能と効力に関する情報を提供しなければならない。これらの要求を満たす、動物を用いない代替アッセイが緊急に必要とされている。
皮膚感作、その結果、ＡＣＤを引き起こす分子事象は、ある化学物質によって引き起こされる多数の連続的な事象（ＫＥ）によって特徴付けることができ、ＯＥＣＤによって記載されているように、有害性発現経路（ＡＯＰ）としてまとめられてきた［５］。開始事象（ＫＥ１）は、より深い皮膚層に入り込んだ後の皮膚感作性化学物質による共有結合性のタンパク質修飾であると定義される。その後のＫＥ２は、ケラチノサイト活性化時の炎症反応を表す。ＫＥ３は、樹状細胞の活性化に対応しており、次に、Ｔ細胞の活性化および増殖が起こる（ＫＥ４）。感作剤に再びさらされると、ＡＣＤの発生が引き起こされる場合があり、ＡＣＤは、特定のＴｈ１およびＣＤ８＋Ｔ細胞によって誘発される皮膚病変によって特徴付けられる有害な結果である。ＡＯＰのＫＥは十分に記述されているが、個々の重要な事象の基礎となる生物学の詳細な機構的理解はまだない［５］。
【０１６２】
マウス局所リンパ節アッセイ（ＬＬＮＡ）［６］は、皮膚感作効力情報を含むハザード同定と特性評価のためのデータを提供することができるため、長年、皮膚感作試験の好ましい代替手段であった。しかし、このアッセイは、ビヒクルの影響に対する感受性や、偽陽性結果に関する問題などの特定の制限を特徴とする［７］。最近まとめられているように、ハザード同定のための異なるテストプラットフォームからのデータを統合するための計算手法を含む化学試験に使用される動物実験を減らすために、いくつかの非動物予測方法が開発された［８］。ＯＥＣＤでは、ＡＲＥ−ＮＲＦ２ルシフェラーゼ法（ＫｅｒａｔｉｎｏＳｅｎｓ（商標））アッセイ［９、１０］、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（ＤＰＲＡ）［１１］およびヒト細胞系活性化試験（ｈ−ＣｌＡＴ）［１２］といった皮膚感作のための３つの試験方法が試験ガイドラインとして許容されている。ハザード同定に加えて、定量的なリスクアセスメントと曝露限界の定義を可能にするためには、皮膚感作剤の効力に関する情報が不可欠である。皮膚感作剤効力の予測に関するいくつかの手法が発表されており、例えば、ＫＥ２を標的とするアッセイ（表皮等価感作剤効力アッセイ［１３］、ＳＥＮＳ−ＩＳ［１４］）およびＵ−ＳＥＮＳアッセイモデリングＫＥ３［１５］など、近年、［８］にまとめられている。さらに、多くはいくつかのインビトロ法からの情報と組み合わせたインシリコモデルが記載されている。例えば、ＱＳＡＲ［１６］、人工ニューラルネットワーク［１７］、ベイズモデルを含む確率論的モデルと統合テスト戦略（ＩＴＳ）アプローチ［１８−２１］。
【０１６３】
化学物質の皮膚感作能力の評価のための代替アッセイであるゲノムアレルゲン迅速検出（ＧＡＲＤ）は、非感作性のコントロールと比較して、化学物質を感作することによって誘発されるヒト骨髄細胞株の差次的発現の全体的な転写分析に基づく。得られたバイオマーカーシグネチャであるＧＡＲＤ予測シグネチャ（ＧＰＳ）は、２００の転写物からなり、リファレンス化学物質のセットでトレーニングされたサポートベクトルマシン（ＳＶＭ）モデルへの入力として使用される［２２］。転写の変化は、感作中の樹状細胞（ＫＥ３）の成熟および活性化に関連し得る。２６の盲検化された化学物質に基づく社内試験では、アッセイの精度は８９％と推定された［２３］。以前の観察結果は、ＧＡＲＤアッセイが効力評価にも関連する情報を提供できることを示した。第１に、シグナル伝達経路は、化学反応性基のサブセットの効力に応じて、異なる様式で制御された［２４］。第２に、より強力な感作剤は、一般的に、弱い感作剤と比較してより高いＧＡＲＤ  ＳＶＭ決定値が割り当てられ、このことは、効力情報（未発表の観察結果）に寄与するシグネチャ内に遺伝子が存在することを示している。しかし、ＧＡＲＤ予測シグネチャの情報は、Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ（ＣＬＰ）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎに記載されるような十分に定義された効力グループに完全に階層化するには十分なものではなかった［２５］。
【０１６４】
ＣＬＰ規制は、Ｇｌｏｂａｌｌｙ  Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍに基づいており［２５］、化学物質分類のために、非感作剤にはカテゴリーなし（ｎｏ  ｃａｔ）、弱い感作剤にはカテゴリー１Ｂ、強い感作剤にはカテゴリー１Ａの３つの分類を使用する。上に記載した観察結果に照らして、ＧＡＲＤを、ＣＬＰカテゴリーを対象とした化学的皮膚感作剤の効力予測のためのツールにさらに発展させることができるという仮説が立てられた。確立されたＧＡＲＤ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｃｈｉｎｅモデルは、複数分類の問題に適用することができないため、ランダムフォレストモデリング［２６］に基づく別の手法を使用した。ランダムフォレストは、決定木に基づく方法であり、マイクロアレイデータに十分に適している［２７］。ランダムサブサンプリング（ブートストラッピング）により、データセットを内部的に繰り返しトレーニングセットと試験セットに分割する。試験セット中のサンプル（アウト・オブ・バッグ・サンプルと呼ばれる）は、データセット全体の約３分の１を含み、アウト・オブ・バッグ（ＯＯＰ）エラー（すなわち、分類エラー）を推定するために使用される。
【０１６５】
ここでは、ランダムフォレストモデルを用いた監視付き機械学習に基づき、ＣＬＰカテゴリーに従って皮膚感作効力を予測する新しい手法を提示する。第１に、６８の固有の化学物質と２のビヒクルコントロールサンプルを含むトレーニングセットからの全体的な遺伝子発現データを、ランダムフォレストモデルの入力として使用した。続いて、ランダムフォレストモデルを後方変数除去のためのアルゴリズムと組み合わせた。アルゴリズムは、最初に、マイクロアレイからの各遺伝子の変数重要度をランク付けし、次いで、前の繰り返しから最も重要度が低い変数を除去しつつ、次のランダムフォレストに繰り返し適合させた。この戦略を使用し、トレーニングセットからアウト・オブ・バッグサンプルを予測すると、最小のＯＯＢエラー率で５２遺伝子のセットを同定することができた。５２遺伝子の予測性能は、以前はモデルには見られなかった１８の化学物質を含む独立した試験セットを用いて挑戦された。この試験セット中の化学物質は、全体的な精度７８％で予測することができた。この予測モデルに加え、細胞レベルでの皮膚感作効力の機構的理解をさらに改善するために経路分析を行うことにより、細胞の全トランスクリプトーム解析の多様性も実証し、このことは、異なる化学反応性分類が、別個のシグナル伝達経路を誘発するという仮説を裏付けるものである。
【０１６６】
材料および方法
細胞およびフローサイトメトリー
この試験で使用した骨髄細胞株は、ＭＵＴＺ−３（ＤＳＭＺ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）に由来し、［２２、２８］に記載されているように維持された。各実験の前の細胞の表現型制御分析を、細胞の未熟状態を確認するためにフローサイトメトリーによって実施した。モノクローナル抗体は、以下のものを使用した：ＣＤ１ａ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、グロストルプ、デンマーク）、ＣＤ３４、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、サンノゼ、米国）、全てＦＩＴＣコンジュゲート化されている；ＣＤ１４（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）、ＣＤ５４、ＣＤ８０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、全てＰＥコンジュゲート化されている。ＦＩＴＣおよびＰＥコンジュゲート化マウスＩｇＧ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、アイソタイプコントロールとして用いられ、ヨウ化プロピジウムは、非生存細胞のマーカーとして用いられた（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。３バッチの細胞を独立した実験で２４時間さらし、生存率およびＣＤ８６の発現をフローサイトメトリーによって評価した。全てのＦＡＣＳサンプルを、データ収集のためにＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを用いてＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ機器で分析した。１０，０００事象を取得し、さらなる解析をＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖ４（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ロサンゼルス、ＣＡ）で行った。ＲＮＡ抽出のための細胞をＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、米国）に溶解し、さらに使用するまで−２０℃で保存した。
【０１６７】
化学物質と刺激
全ての化学物質は、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（米国セントルイス）から高純度で購入されたか、またはＣｏｓｍｅｔｉｃｓ  Ｅｕｒｏｐｅから提供されたものであった。全ての化学物質は、供給業者の推奨に従って保存された。細胞の化学的刺激は、先に記載したように行われた［２８］。簡単に言えば、ＧＡＲＤ投入濃度は、化学物質の溶解度および細胞毒性特性によって規定された。細胞毒性がなく、可溶性の化学物質では、最終濃度５００μＭが目標となり、溶解度が制限されている（媒体中、５００μＭ未満）化学物質では、可能な最も高い濃度が目標となった。細胞毒性のある化学物質は、細胞の相対生存率９０％を目標とした濃度で使用した。大部分の化学物質は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはオートクレーブ処理されたＭｉｌｌｉＱ水で１０００倍に予備希釈してから使用された。ビヒクルとしてのＤＭＳＯ濃度は、決して０．１％を超えなかった。この試験では、ＤＭＳＯサンプルおよびＭｉｌｌｉＱサンプルがビヒクルコントロールとして含まれ、したがって、これらは、非感作剤サンプルのグループに属する。
【０１６８】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡおよびアレイハイブリダイゼーション
ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）に溶解した細胞からのＲＮＡ単離を、製造者の指示に従って行った。標識されたセンスＤＮＡは、推奨されるキットとコントロールを用い、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、クリーブランド、米国）のプロトコルに従って合成した。ｃＤＮＡをＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にハイブリダイズし、さらに処理し、供給業者の推奨に従ってスキャンした。
【０１６９】
バイナリ分類
学習アルゴリズム［２２］への変数入力としてＧＰＳからのＳＣＡＮ標準化された［２９、３０］発現データを用い、ＳＶＭに基づく既に確立されたモデルを用い、表１にまとめた３７の化学物質を感作剤または非感作剤に分類するバイナリ分類を行った。モデル構築の前に、トレーニングセットと試験化学物質との間の潜在的なバッチ効果は、トレーニングセットに対する試験化学物質のアレイ発現値をスケーリングすることによって除外された。トレーニングセットのＤＭＳＯビヒクルコントロールサンプル中の各遺伝子に関する平均発現値と、試験化学物質の由来となるバッチ中のＤＭＳＯサンプル中の同じ遺伝子に関する平均発現値の比率を計算することによって、スケーリングファクターを作成した。次いで、各遺伝子に関するスケーリングファクターに、試験化学物質中の対応する遺伝子に関する遺伝子発現値を掛け算した。ＳＶＭ予測は、既に記載されているように行った［２２、３１］。簡単に言うと、線形カーネルに基づくＳＶＭモデルは、ＧＰＳの同定中に使用された元のトレーニングセットからの参照化学物質についてトレーニングされた［２２］。トレーニングされたモデルは、その後、各試験化学物質にＳＶＭ決定値（ＳＶＭ  ＤＶ）を割り当てるために適用された。全ての試験化学物質について得られたＳＶＭ  ＤＶを用い、受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を作成し、得られた曲線下面積（ＡＵＣ）を分類尺度として使用した［３２］。追加のパッケージｅ１０７１［３３］およびＲＯＣＲ［３４］を使用し、Ｒ統計的環境でＳＶＭモデリングおよびＲＯＣ曲線の可視化を行った。モデルの最終的な予測性能を評価する前に、［３１］に記載されているように、表２のベンチマークサンプルの分類中に得られた最大予測性能のために、試験化学物質の個々の複製物ごとのＳＶＭ  ＤＶをカットオフに対して較正した。続いて較正されたＳＶＭ  ＤＶを最終的な分類に使用し、複製物の出力値の中央値が０より大きければ、その試験化学物質を感作物質として分類した。精度、感度および特異性は、Ｃｏｏｐｅｒ統計を用いて推定された［３５］。ノンパラメトリックＴＷＯＳａｍｐｌｅ  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定は、ＣＬＰカテゴリー１Ａ、１ＢとカテゴリーなしのＳＶＭ  ＤＶ分布が有意に異なるかどうかを決定するために実施された。
【０１７０】
データ処理と統計解析
ランダムフォレストモデルを構築するために、６８の化学物質と２のビヒクルコントロールサンプルをトレーニングセットと定義し、１８の化学物質（各ＣＬＰカテゴリーから６）が独立した試験セットに含まれていた。試験セット中の化学物質は、モデルの構築には含まれなかった。目標は、３種類全てのＣＬＰカテゴリー（表３）および異なる化学反応性グループ（表４）を表すバランスのとれたトレーニングセットを得ることであった。試験セット中の化学物質の大部分（１８のうち１４）は、以前にＧＡＲＤアッセイを用いて調査されなかった３７の化学物質を含む、最新の実験キャンペーン（表１）に由来していた。トレーニングセットでは、この最新のデータセットからサンプルの約３分の１（６８のうち２３）を得た。ビヒクルサンプルは、全てのプロジェクトの一部であったため、より高い複製数で表される。
【０１７１】
新しいマイクロアレイデータを従来のデータ［２２、２３］と併合し、品質管理を行った。品質が悪いため、４つのアレイが除外された。しかし、生物学的複製より少ない化学物質は存在しなかった。アレイデータをＲ統計環境にインポートし、ＳＣＡＮｆａｓｔアルゴリズム［２９、３０］を用いて正規化した。いくつかの実験的キャンペーンを組み合わせる必要があったため、サンプル間のバッチ効果を除去するために、このデータセットをＣｏｍＢａｔメソッド［３６、３７］を使用して正規化した。この時点で、トレーニングセット中のサンプルは、試験セット中のサンプルから分離された。過剰適合を避けるために、予測バイオマーカーシグネチャの特定中に、分類子へのパラメータ適合のために、指定されたトレーニングセットのサンプルのみが使用され、試験セット中のサンプルは、特定されたシグネチャおよび特定の分類子の性能を検証するために別にされた。予測バイオマーカーシグネチャは、トレーニングセット中の個々のサンプルから、正規化され、バッチ補正された転写物強度を、ランダムフォレストモデルに供給し［２６］、これをＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒバージョン３．１．２のｖａｒＳｅｌＲＦパッケージ［３８］中の後方除外手順と組み合わせることによって特定された。変数重要度のランク付けに使用された最初のフォレストは、２０００個のツリーに成長し、他の全てのパラメータは、デフォルト設定に維持された。このパッケージは、最小の重要な変数の２０％を繰り返し落としつつ、フィッティングを繰り返し、ランダムフォレストモデルを評価する。変数の最良の実施セットは、最小誤差解からの１つの標準誤差（すなわち、１．ｓｅルール）内の遺伝子の最小数として、全てのフィッティングしたランダムフォレストからのＯＯＢエラー率に基づいて選択された。変数選択手順は、１００ブートストラップサンプルを用い、ｖａｒＳｅｌＲＦパッケージの．６３２＋ブートストラップ法による予測エラー率を推定することによって検証され、バイオマーカーシグネチャ中の個々の転写物の重要性は、ブートストラップサンプルの出現頻度ＶＣＦ（Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  Ｃａｌｌ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ（ＶＣＦ）と呼ばれる）によって検証された。同定されたバイオマーカーシグネチャの予測性能は、トレーニングセット中のサンプルと、変数入力としてバイオマーカーシグネチャ中の選択された転写物だけを用い、以前のパラメータに基づいてランダムフォレストパッケージに新しいフォレストを構築することによって検証された［３９］。このモデルを適用し、試験セット中の個々の複製サンプルをＣＬＰカテゴリーに割り当て、各化学物質の生物学的複製刺激についての多数決を予測カテゴリーとして受け入れた。ヒートマップおよび主成分分析（ＰＣＡ）プロットをＱｌｕｃｏｒｅ  Ｏｍｉｃｓ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｑｌｕｃｏｒｅ  ＡＢ、ルンド、スウェーデン）で構築した。
【０１７２】
経路解析
経路解析は、例えば遺伝子発現データなどを調べるための経路解析ワークフローを提供する、Ｋｅｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｄｖｉｓｏｒ（ＫＰＡ）ツール［４０］バージョン１６．６を用いて実施された。これは、生物学的解釈を可能にするために、差次的に発現される遺伝子を、上流プロセスおよび下流プロセスの両方に関連付ける。観察したデータセットは、試験セットとトレーニングセットのＳＣＡＮｆａｓｔおよびＣｏｍＢａｔの正規化された発現値からなり、全３０８サンプル中、約３分の１が残るまで、一貫して低い分散を有する変数を除去するために、最初に分散フィルタリングした（１０００９変数、σ／σｍａｘ＝０．１４７８）。次いで、差次的に制御された転写物を同定するために、ＣＬＰのカテゴリーなし、１Ｂおよび１Ａに属するサンプルを比較するマルチグループ比較（ＡＮＯＶＡ）を適用した。最も重要な８８３遺伝子（誤発見率ＦＤＲ＝１０−９；ｐ＝８．５３×１０−１１）をＫＰＡへの入力として使用した（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｏｎ  ＩＤおよびそれぞれのｐ値、過剰連結性分析）。タンパク質反応性に関連する経路を同定するために、同じ分散フィルタリングしたデータセットを、２群比較に基づいてフィルタリングした（ｔ−検定、Ｔｏｘｔｒｅｅ結合分類の「結合なし」の非感作剤（８１サンプル）対「マイケル受容体」の感作剤（ＭＡ、６３サンプル）、「結合なし」対「シッフ塩基生成」（ＳＢ、２９サンプル）、「結合なし」対「二分子求核置換／求核芳香族置換の組み合わせ」（ＳＮ、２５サンプル）。各比較からの５００個の最も著しく調節された変数を有するリストを、ｐ値および倍数変化（因果推論分析）とともに、各タンパク質反応性群についてＫＰＡツールに入力した。最小ｐ値は、ＭＡサンプルを「結合なし」と比較したときに達し（ＦＤＲ＝３．６５ｘ１０−７）、その次は、ＳＢ（ＦＤＲ＝２．３ｘ１０−５）および（ＦＤＲ＝２．４４ｘ１０−５）であった。
【０１７３】
スクリプト
以下は、正規化と効力予測に使用されるスクリプトである。
スクリプト１：モデル構築前にさまざまなプロジェクト間でバッチ効果に対処するために使用される。
【０１７４】
【表１−１】
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【０１７５】
【表１−２】
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【０１７６】
スクリプト２  ：初期効力モデルの構築に使用される
【０１７７】
【表２−１】
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【０１７８】
【表２−２】
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【０１７９】
【表２−３】
2019516950.tif 000006
【０１８０】
【表２−４】
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【０１８１】
【表２−５】
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【０１８２】
【表２−６】
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【０１８３】
結果
３７の化学物質のバイナリ分類
５１の化学物質の過去のＧＡＲＤデータを補完し、化学反応性の分類および消費者製品における使用という観点でバランスをとりつつ、関連する化学物質の選択を表すために、３７の十分に特徴付けられた化学物質を含む新規なデータセット（表１）を選択した。この新規な化学物質は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ＣＬＰデータベースおよび文献［１５、４１］に基づき、２７の化学物質を提供して下さったＳｋｉｎ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  （ＣＥ）と協力して選択された。この３７の新規化学物質は、ＧＰＳと、ＳＶＭ分類に基づく既に確立されたプロトコルを用いて感作剤または非感作剤であると予測された。ＳＶＭモデルを適用し、個々の複製物サンプルにＳＶＭ  ＤＶを割り当てた。最終的な分類の前に、３７のサンプルからのＳＶＭ  ＤＶを、まず、試験化学物質と同じサンプルバッチに含まれる１１のベンチマークサンプル（表２）に対して較正した。バイナリ予測を評価する目的で、利用可能な場合には、ＣＬＰ分類の代わりに、ヒトのデータ［４１］を優先することを決定した。この場合、１から４の分類は、感作剤に対応しており、５と６は非感作剤に対応している。３７の化学物質を予測するモデルの性能は、ＡＵＣ  ＲＯＣ  ０．８８によってまとめられており、図１Ａに示されるように（ベンチマーク化学物質−実線；３７の化学物質−点線）、良好な識別能力を示している。Ｃｏｏｐｅｒ統計に基づく感度、特異性および精度は、それぞれ７３％、８０％および７６％と推定された。既に発表されているデータ［２３］と組み合わせて、皮膚感作物質のバイナリ分類に対するＧＡＲＤの更新された予測精度は、合計７４の化学物質を含むデータセットに基づき、８４％と推定される。表１の化学物質をＣＬＰ分類に従ってグループ化し、３７の化学物質の分類中に得られたそれぞれのＳＶＭ  ＤＶ値を図１Ｂに示すようにボックスプロットにまとめると、カテゴリー１Ｂの弱い感作剤と、カテゴリーなしの非感作剤と比較して、強い感作剤には大きなＳＶＭ  ＤＶが割り当てられたため、効力の勾配が生じた。ＳＶＭ  ＤＶサンプル分布を比較するノンパラメトリックＴＷＯＳａｍｐｌｅ  Ｗｉｌｃｏｘｏｎ試験によれば、これらのグループは有意に異なっていた（カテゴリーなし対１Ｂ：ｐ＝２．８−５；１Ｂ対１Ａ  ｐ＝２．８−６、カテゴリーなし対１Ａ  ｐ＝３．５−１２）。グループ間の差は有意であったが、個々の化学物質間にいくつか重なりが存在し、このことは、この情報が、サンプルを十分に規定された効力グループに完全に層別化するのに十分ではなかったことを示している。
【０１８４】
ＣＬＰカテゴリーの予測のためのランダムフォレストモデル
ＣＬＰカテゴリーの予測のためのバイオマーカーシグネチャを確立するために、３７の新規化学物質を含むデータセットを、５１の化学物質を含む過去のデータセットと併合した。合計で、データセットは、ＣＬＰ（表３）に記載されているように、カテゴリー１Ａおよび１Ｂおよび非感作剤（カテゴリーなし）に関してバランスのとれた、８６の固有の化学物質（表４）および２のビヒクルコントロールからなっていた。４つの化学物質について、ＣＬＰ分類１Ｂは、３つの理由のうち１つのために、表４に示されるソースに従ってカテゴリーなし／非感作剤に変更された。（ｉ）以前のＧＡＲＤプロジェクトとの一貫性を保持するため（ベンズアルデヒド、キシレン）、（ｉｉ）非感作性の濃度でビヒクルとして使用されるため（ＤＭＳＯ）、ＬＬＮＡ中で十分に記載された擬陽性であるため（ドデシル硫酸ナトリウム）。
【０１８５】
３つのＣＬＰカテゴリーの予測のためのランダムフォレストモデルは、２つのビヒクルコントロールを含む７０の固有のサンプルからなるトレーニングセットに基づいて開発された。ＣＬＰ分類には、５２の予測変数（表５）が最適であると特定された。ブートストラッピングから導き出されたモデルの予測誤差率は０．２２５と推定され、これがモデル性能の指標を与える。モデルを開発するために使用されたデータセットを可視化するために、主成分分析（ＰＣＡ）を行った。全ゲノムアレイ解析に基づくランダムフォレストによって同定された５２の変数を入力として使用し、ＰＣＡをトレーニングセット上に構築した（図２Ａ）。図２Ａは、ＣＬＰカテゴリーに従って着色された生物学的複製物を有する化学物質に基づいており、第１主成分に沿って、カテゴリーなしから強い感作剤（１Ａ）までの明確な勾配を観察することができる。図２Ｂの変数の階層的クラスタリングを伴うトレーニングセットのヒートマップは、それぞれの化学およびＣＬＰカテゴリーに関連する遺伝子の調節を例示する。
【０１８６】
独立した試験セットの予測
モデルの性能は、以前はモデルには見られなかった１８の化学物質を含む独立した試験セットのＣＬＰカテゴリーを予測することによってさらに評価された。ＣＬＰカテゴリーに従って着色した試験セットを、５２の同定された変数に基づき、ＰＣＡ成分に影響を与えずに、ＰＣＡプロットで可視化した（図３Ａ）。図３Ｂは、ヒートマップの形態で、正規化された試験セットにおける５２個の遺伝子の制御を可視化する。複製物を別個に予測し、多数の投票を使用してそれぞれの化学物質を分類すると、１８の化学物質のうち１４が正しいＣＬＰカテゴリーに割り当てられ（表６、表１）、結果全体の精度は７８％となった（表７）。４つの誤って分類された化学物質は、マレイン酸ジエチル、ブチルグリシジルエーテル、リラールおよび塩化シアヌルであった。唯一の偽陰性の予測は、塩化シアヌルであり、ＣＬＰでは１Ａに分類され、本願発明者らのモデルではカテゴリーなしと分類され、一方、残りの３つの化学物質は、ＣＬＰで１Ｂと分類されたが、１Ａと予測された。トレーニングセットと試験セットの選択は偏っておらず、予測モデルがトレーニングセットの構成に完全には依存していないことを確認する次の工程では、１８の代替となるランダムフォレストモデルを構築し、ここでは、トレーニングセットと試験セットの中の化学物質の組成をランダムにシャッフルした。それぞれの新しいモデルについて、上述の変数選択の完全なプロセスを繰り返した。各化学刺激に対し利用可能な複製物サンプルの数に依存して、トレーニングセットおよび試験セットそれぞれのサンプルの合計数が変動したが、各セットの中の化学物質の数と、ＣＬＰ分布は一定に保った。この代替モデルは全て有意であり、ブートストラッピング手順から得られた平均予測エラー率は０．２２で初期モデルと同一であり、このことは、トレーニングセットと試験セットの偏った選択に起因して、提示されたモデルが得られたのではなかったことを裏付けている。
【０１８７】
ＣＬＰ効力モデルは、ヒト効力予測に関連する情報を含む
次に、ヒト効力カテゴリーに関連する情報［４１］を用いて５２の変数（表５）がどのように機能するかを調べるために、ＰＣＡを利用した。ヒト効力（クラス１〜６、６＝真の非感作剤、１＝最も強い感作剤）に従って、７０のトレーニングセットと１８の試験セットサンプルを着色し、ヒト効能カテゴリーが利用できなかったサンプルを除去した（表４を参照）。このモデルは、ＣＬＰ効力カテゴリーを予測するために開発されているが、図４Ａ、Ｂに示すように、ヒト効力に関する情報も含む。
【０１８８】
ランダムフォレストモデル変数の属性
ランダムフォレストによって特定された５２の変数（表５）は、異なる細胞区画および異なる機能的役割に属する転写物を表す。これらのうち５つは、ＧＡＲＤ予測シグネチャと重なっている。ブートストラッピングプロセスで最も頻繁に選択され、最も高い検証呼び出し頻度（表５）を有する上位１０個のマーカーのうちの５つは、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＡＢ［４２］などのヒストンクラスター１メンバーである。ヒストンは高度に保存されており、クロマチン構造を維持するだけでなく、遺伝子制御にも重要な役割を果たす［４３］。ＰＦＡＳおよびＰＡＩＣＳはプリン生合成に関与しており［４４、４５］、ＴＭＥＭ９７はコレステロールレベルの調節因子であり［４６］、これは、ＲＮＡ干渉実験による神経膠腫細胞モデルにおける細胞周期調節、細胞移動および浸潤に関与することがさらに記載されている［４７］。ＤＨＣＲ２４は、小胞体（ＥＲ）に局在化する多機能酵素であり、コレステロール合成の最終段階を触媒する［４８］が、例えば、ＥＲストレス下での神経細胞で示されるような抗アポトーシス活性も有する［４９］。キナーゼであるＰＬＫ１は、ＴＬＲ活性化に応答してリン酸化されることが示されており、ＲＮＡ干渉の結果は、ＰＬＫ１シグナル伝達がＴＬＲ誘発性の炎症応答に関与していることを示唆していた［５０］。ＰＬＫ１は、ＴＮＦ誘発性のサイクリンＤ１発現を阻害することによって細胞周期制御に関与することがさらに報告されており、ＴＮＦ誘導ＮＦ−κＢ活性化を低下させる可能性があった［５１］。残りの転写産物の多くは核タンパク質であり、従って複製、転写、スプライシングおよび細胞周期制御などのＤＮＡ依存性のプロセスに関与している可能性が高い。シグネチャには、免疫応答および／または感作に関与することが知られているタンパク質（ＮＱＯ１など）をコードするいくつかの転写産物がさらにあり、皮膚感作剤に対する細胞応答の役割について十分に説明されている［５２］。ＣＤ５３は、テトラスパニンファミリーに属し、例えば、細胞接着、遊走およびシグナル伝達において複数の機能を有する膜貫通タンパク質であり、それぞれ健康なコントロールと比較して、アトピー性湿疹患者の末梢血由来の単球［５４］と同様に、アトピー性皮膚炎患者個体からのＦｃεＲＩ陽性皮膚ＤＣについて上昇することが示されている［５３］。ＣＤ４４は、細胞表面の糖タンパク質であり、接着やヒアルロナン受容体［５５］は、多くの細胞種によって発現し、例えば、炎症組織への白血球移動を媒介することによって炎症応答に関与し［５６］、このことは、アレルギー性皮膚炎のマウスモデルで示されている［５７］。
【０１８９】
共通で独特の制御された経路は、タンパク質反応性が異なる感作剤によって誘発される  ３３の主要経路を、ＫＰＡ分析（図５）におけるＣＬＰカテゴリー間のマルチグループ比較（ＦＤＲ＝１０−９）後に、８８３の最も重要な調節遺伝子の入力によって同定し、５２の変数の機能グループのいくつかのミラーを遺伝子制御、細胞周期制御および代謝などのランダムフォレストによって定義した。「細胞増殖、生存、分化および代謝のＩＬ−４誘発性制御因子」および「ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ｐ３８、ＪＮＫおよびＮＦ−κＢを介した免疫応答＿ＩＬ−３シグナル伝達」などの免疫応答関連経路は、５０％の最も大幅に制御されたものであった。
【０１９０】
次に説明する解析は、求核置換（ＳＮ）、マイケル付加（ＭＡ）およびシッフ塩基（ＳＢ）生成を含む、本データセットの３つの最大の化学反応性グループに焦点を当てたものである。含まれている化学物質の中で、「カテゴリーなし」と表示された化学物質の大部分は、タンパク質結合特性を有していなかった。しかし、少数のＳＢ生成およびＳＮ化学物質が存在した。カテゴリー１Ｂでは、ほぼ全ての種類のタンパク質反応性が示されたが、一方、カテゴリー１Ａでは、ＭＡ化学物質が明らかに優勢であった。
【０１９１】
それぞれの関連するタンパク質反応性について、図６に示すように、それぞれのタンパク質反応性グループに属する感作性化学物質について固有の経路を同定することができた。これらの結果は、入力データからの差次的に制御された遺伝子を、いわゆるキーハブ（入力遺伝子の発現レベルを制御することができる分子）と組み合わせる。その制御は、活性変化（例えばキナーゼの場合）などの他の生物学的レベルで見ることができるか、または変化が非常に短期間であるか、大きさが小さい場合があるため、これらを遺伝子発現実験によって必ずしも同定することができるわけではない。合計で、１７３遺伝子は、全ての３つの反応性グループについて共通しており（図７Ａ）、全ての３つの反応性グループには６の経路が存在した（図７Ｂ）。「細胞周期：細胞周期制御におけるＡＰＣの役割」、「細胞周期：細胞周期制御におけるＳＣＦ複合体の役割」、「発生：顆粒球発生の転写調節」、「細胞周期：細胞周期（ジェネリックスキーマ）」、「ＤＮＡ損傷：Ｇ１／ＳチェックポイントのＡＴＭ／ＡＴＲ調節」および「乳癌におけるエストラジオール／  ＥＳＲ１（核）の分裂促進作用」。ここでも、細胞周期経路は非常によく表された。酸化ストレス応答は、ＭＡおよびＳＢ化学物質についてのみ、主要な経路の結果の一部として特定された（図６）。ＭＡ感作剤化学群では、ＫＥＡＰ１とＮＲＦ２が標的遺伝子ＮＱＯ１とＨＭＯＸ１［５２、５８］およびＡＨＲ［５９、６０］と同様にキーハブとして発見された。ＭＡ化学物質では、標的遺伝子ＮＱＯ１、ＨＭＯＸ１およびＣＥＳ１［６１］も入力遺伝子レベルでさえ存在していた。入力レベルでは、ＳＮ化学物質についてもＣＥＳ１が存在したが、ＮＱＯ１、ＮＲＦ２およびＡＨＲのみがキーハブとして識別された。ＫＥＡＰ１は、ＳＢおよびＳＮ  ＫＰＡ分析においてキーハブとして見出されず、ＡＨＲは、３つのタンパク質反応性グループの全てで同定された唯一のキーハブであった。ＮＦ−κＢサブユニット（ＲｅｌＢまたはｐ５２）は、ＭＡ化学物質を除く全ての反応性グループにおいて予測されたキーハブであった。
【０１９２】
まとめると、細胞周期やＤＮＡ損傷に関連する化学物質曝露そのものには共通する機構的な反応があるようであるが、本願発明者らによって以前に観察されたように［２４］、また他の実験系において［１４、２１、６２、６３］、経路解析結果も、異なる化学反応性分類が、以前に観察されたような異なるシグナル伝達経路を誘発するという仮説を裏付けている。いくつかの経路は、皮膚感作に関連することが知られているプロセスに関連している。
【０１９３】
議論
感作を誘発する、さらされた皮膚領域あたりの化学物質の量は、著しく変化する［４１］。したがって、正確なリスク評価のためには、皮膚感作剤の効力情報が不可欠である。代替試験法の開発者は、ヒトの感作性の高い予測性を達成するためにヒトの臨床データに依存しているが、この種のデータはむしろ不十分であり、最も有用なデータはＬＬＮＡから得られる［６４］。動物モデルは皮膚感作などの全身性疾患の複雑さを反映しているという事実にもかかわらず、インビトロデータは、今までに、動物モデルよりも十分に相関関係があり、特にＩＴＳと組み合わせた場合には良好である［６５］。さらに、代替の試験システムは、全動物を用いた試験が提供できないという機械的な洞察を提供する可能性がある［６６］。
【０１９４】
ここでは、樹状細胞（ＤＣ）モデルおよび転写プロファイリングに基づくＣＬＰシステムを用いて、皮膚感作剤の効力を予測する手法を提示する。ＣＬＰカテゴリーは、経験的に決定され、任意に定義されたカテゴリーであり、異なる化学物質の多様性、その分子特徴、感作特性があること、またはないことに関与する機構を表していない。しかし、ＣＬＰカテゴリーは、化学物質を分類し、標識するために、現在は規制が必要である。したがって、これらの新しいデータと過去のデータセットを組み合わせるために、以前に標準ＧＡＲＤアッセイで試験されていなかった３７の追加の化学物質を調べた。確立されたＧＡＲＤモデルによるこれらの新しい化学物質のバイナリ分類では、誤って分類された４つの感作性化学物質（すなわち、アニリン、ベンゾカイン、リモネンおよびブチルグリシジルエーテル）は、ベンチマークサンプルによって定義されるカットオフに近かった。このうち３つは、ヒト効力分類４に属しており、効力と十分に相関することが多いＳＶＭ値を正確な分類に変換するために、モデルのカットオフが重要であることを示している。過去の予測と合わせて、ＧＡＲＤは、バイナリ分類の全体として８４％と高い精度を示す。
【０１９５】
次に、各ＣＬＰカテゴリーについてのランダムフォレストモデルを開発するために、新しいデータと従来のデータの両方を使用し、カテゴリーなしについて９６％、カテゴリー１Ａについて７９％、カテゴリー１Ｂについて７５％のバランスのとれた精度を示す（複製物を基準とする性能について、多数決に基づく。表７を参照。）［６７］。ブチルグリシジルエーテル、マレイン酸ジエチル、塩化シアヌルおよびリラールは誤って分類された。唯一の偽陰性予測は、塩化シアヌルについて、１Ａではなく、カテゴリーなしであった。しかし、塩化シアヌルは水と発熱反応して塩化水素を形成し、おそらく他の反応生成物を生成する。ＤＭＳＯ（水を含む）中におそらく既に起こっているこの加水分解反応のために、このアッセイに存在する塩化シアヌルおよび反応生成物の量は不明である。この化学物質は、ＧＡＲＤプラットフォーム系のアッセイの適用可能ドメイン外にある可能性がある。しかし、品質管理やその他の事前モデリング解析では、これらのサンプルの除去が動機付けられていなかった。マレイン酸ジエチルおよびリラールは、ＣＬＰによれば１Ｂと分類されるが、本願発明者らのモデルでは１Ａと分類され、ここでも、Ｂａｓｋｅｔｔｅｒらによって記載されるように［４１］、これらのヒト効力カテゴリーであるカテゴリー２により良く適合しているようである。誤って分類された第４の化学物質であるブチルグリシジルエーテルは、ヒト効力カテゴリー３である。明らかに１Ｂの予測、すなわち弱い感作剤の予測が最も困難な部分であるように思われた。ＬＬＮＡにおいても、弱い感作剤の効力予測は強い感作剤の効力予測よりも大きく変動する［８、６８、６９］。さらに、１Ｂは、カテゴリー１Ｂにまとめられた化学物質に関連するＬＬＮＡ  ＥＣ３濃度およびヒト効力カテゴリーの範囲を考慮して、非常に異種混合したグループである。
【０１９６】
Ｕ−ＳＥＮＳ（商標）アッセイ（以前のＭＵＳＳＴ）は、感作剤と非感作剤を区別するために、別の骨髄細胞株、Ｕ９３７、およびＣＤ８６の測定値を使用する。著者らがＣＬＰカテゴリーを予測するために、ＣＤ８６を、細胞毒性データおよび特定のカットオフレベルと組み合わせたときに、カテゴリー１Ａで８２％（４１／５０）、カテゴリー１Ｂ／カテゴリーなしで７３％（８５／１１６）の正しい予測が報告された［１５］。しかし、カテゴリーなしとカテゴリー１Ｂの間のさらに挑戦的な識別がどのようになるかは依然として不明である。Ｃｏｔｔｒｅｚら［７０］は、近年、ある試験を公表し、ここでは、代替的なアッセイであるＳＥＮＳ−ＩＳ（３Ｄ再構成表皮モデル）が、皮膚感作剤効力の予想に非常によく機能することを報告しているが、ＣＬＰカテゴリーは対象としていない。ＣＬＰカテゴリーを予想するために規定された５２の変数入力に純粋に基づいて図４から判断すると、本願発明者らのモデルも、ヒト効力分類に関連する情報を含むように思われる。もっと多くの化学物質がヒト効力分類を得たら、ＧＡＲＤプラットフォームに基づいてヒト効力モデルを円滑に開発することが可能になるはずである。
【０１９７】
ＫＰＡ経路分析は、制御されたいくつかの経路が、皮膚感作において既知の役割を有するため（例えば、サイトカインシグナル伝達および酸化ストレス応答）、提示されたデータセットにおける生物学的に関連する事象を同定した（図５〜６）。ＤＣは、インビボでのタンパク質修飾の主要な標的ではないが、本願発明者らは、異なるタンパク質反応性分類がＤＣトランスクリプトームに差次的に影響を及ぼすと仮定した。タンパク質の反応性は、化学物質の最も重要な特徴の１つであり、皮膚感作能力と効力を特定の限界で定義している［６３］。反応性グループＭＡ、ＳＢ、およびＳＮによって誘発された最も有意に調節された遺伝子の比較によって明らかにされるように、タンパク質反応性に特異的なパターンが検出可能であった。興味深いことに、ＮＦ−κＢサブユニットは、ＭＡ化学物質を除いて全ての反応性グループのキーハブであると予測されたが、このことは、この種の化学物質のＮＦ−κＢシグナル伝達に対する上述の阻害効果を反映している可能性がある［７１］。いくつかの経路は、「乳癌におけるエストラジオール／ＥＳＲ１（核）の有糸分裂作用」などの文脈に適合していないように見えるが、調節された分子を詳しく見ると、他の経路についても確かに関連していることがわかる。この場合、例えばｐ２１、ｃ−ｍｙｃ、Ｅ２Ｆ１、ＳＧＯＬ２（シュゴシン２）およびＣＡＤ（カルバモイルホスフェートシンセターゼ）が関与しており、この中で、最初のｐ２１は、既知の細胞周期調節因子／転写因子であり［７２］、染色体分離（ＳＧＯＬ２）において役割を果たす［７３］。一方、酵素ＣＡＤは、ピリミジンヌクレオチドの生合成において律速であるが、最近、細胞シグナル伝達経路とも協働して関与しており［７４］、ヒト腸上皮細胞における細菌センサーＮＯＤ２（ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン２）抗菌作用を阻害するようである［７５］。これらの例は、本願発明者らのトランスクロプトームデータが、さらなる関心を寄せ、さらに詳細な解析をする価値があることを示しているだろう。この種の解析は、異なるバイオインフォマティクスのツールおよび最終的には機能解析を使用して、生物学的プロセスと疾患の根本である機構を解明するのに役立つだろう。
【０１９８】
既に上述したように、効力が弱いか、または中程度の化学物質に正確な効力分類を割り当てることは、より一般的な課題のようである。Ｂｅｎｉｇｎｉら［７６］は、実験的なインビボシステムでさえ、一般にヒトのデータとよく相関するが、中程度の効力を有する感作剤についてはあまりうまく機能しないことを示すデータを提示した。彼らは、さらに、タンパク質修飾工程が全感作過程の律速段階であり、他のＡＯＰ事象を標的とするインビトロ試験では、多くの情報をつけ加えないと主張している。一方、モデルペプチドによる動態プロファイリングによって決定されるＭＡ感作剤の速度定数とＬＬＮＡにおけるそれらの効力との間には、弱い関係しか存在しない［７１］。このことは、反応性とともに増加するＮＦ−κＢシグナル伝達を阻害することによって、ＭＡ化学物質の抗炎症効果に関連すると記載されている。しかし、皮膚感作ＡＯＰの重要な事象を考慮すると、感作過程自体は連続するものとして理解することができ、従って隔離された事象によって特徴付けられるだけではない。もちろん、実際には、このプロセスは、皮膚に浸透する化学物質から始める必要がある。この文脈において、化学物質が角質層に効率的に浸透する能力は、その皮膚感作能力にとって重要であるという概念があることに留意すべきであり、効力は近年誤って証明されている［７７］。さらに、下層皮膚層へのアクセスは、実際には、水仕事および小さな創傷に起因して、皮膚障壁機能の障害によって、大幅に促進される場合がある。興味深いことに、多くの強力な感作剤は、細胞毒性と相関する刺激特性を有しており、細胞毒性は、感作剤の効力に寄与しているようである［１８］。これも本願発明者らのデータセットに反映されている（データは示さず）。細胞毒性は、化学物質のタンパク質反応性にも関連している。すなわち、強いシステイン反応性を有する化学物質は、一般的に細胞毒性があるため、重要な酵素機能を妨害する可能性がある［１８、７８］。同時に、刺激作用は、細胞外ＡＴＰまたはヒアルロン酸分解産物などの危険な信号を生成する場合があり［７９、８０］、これはＤＣを活性化し、その結果、ナイーブＴ細胞をプライミングする役割を果たす可能性がある。さらに、既存の炎症や他の物質への同時曝露（アレルギー感作において確かに役割を果たす）などの他の要因は、いずれの試験システムにおいても実施するのが困難であろう。インビトロでのアッセイは費用効果が高く、実行が容易であるという要求にさらに対応しなければならないため、インビトロで達成できることは明らかな制限があるが、これまでの試験のパフォーマンスは非常に有望である［７６］。タンパク質の反応性は非常に重要であるかもしれないが、細胞系システムは、ペプチドの反応性に加えて、特定のさらなる事象を繰り返すことができなければならない。代替アッセイの性能は、皮膚感作のより詳細な機構が明らかになり、適用領域と隠れた危険性の両方をより容易に特定できるようになるので、さらに改善される可能性が最も高い。
【０１９９】
結論として、本願発明者らは、現在の規制で要求されるように、皮膚感作性化合物をＣＬＰ群に分類するための５２の転写物を含む予測バイオマーカーシグネチャを同定した。１８の独立した試験化合物で試験した場合、このアッセイは効力予測の７８％について正確な結果を与えた。さらに、１２のうち１１の感作剤が正しく同定された場合、このことは、保存的であることを示し、すなわち、偽陰性の予測を回避することを示す。提示されたバイオマーカーシグネチャは、バイナリハザード分類だけでなく、効力予測について最適化されるため、［１８］で提案されているのと同様に、正確な効力予測についてのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ内での本願発明者らのモデルの適用可能性を示唆している。さらに、この結果は、ＧＡＲＤセットアップの柔軟性と汎用性を効果的に示す。細胞の完全なトランスクリプトームの測定は、感作の経路を同定するための行動様式に基づく試験を行う機会を与えるだけでなく、バイナリ皮膚感作予測や呼吸器感作のために以前に示してきた予測バイオマーカーシグネチャを同定する機会を提供する。したがって、ここでは、ＣＬＰ群を対象とする効力モデルの概念の最初の証拠を提示するが、これは、より多くのサンプルが分析され、より正確なヒト参照データが出現するにつれて、改変し、改善することができる。
【０２００】
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５５．Ｌｅｅ−Ｓａｙｅｒ，Ｓ．Ｓ．ら、Ｔｈｅ  ｗｈｅｒｅ，ｗｈｅｎ，ｈｏｗ，ａｎｄ  ｗｈｙ  ｏｆ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１５．６：ｐ．１５０．
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５７．Ｇｏｎｄａ，Ａ．ら、ＣＤ４４，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ，ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，２００５．１４（９）：ｐ．７００−８．
５８．Ｎａｔｓｃｈ，Ａ．，Ｔｈｅ  Ｎｒｆ２−Ｋｅａｐ１−ＡＲＥ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｓ  ａ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ−−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ａｎｄ  ａ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  ｉｎｎａｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ，２０１０．１１３（２）：ｐ．２８４−９２．
５９．Ｓｃｈｕｌｚ，Ｖ．Ｊ．ら、Ａｒｙｌ  ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３．２１８（８）：ｐ．１０５５−６２．
６０．Ｋｏｈｌｅ，Ｃ．およびＫ．Ｗ．Ｂｏｃｋ，Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ  ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ａｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  Ｎｒｆ２．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００７．７３（１２）：ｐ．１８５３−６２．
６１．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｗ．，Ａ．Ｏ．ＡｐｔｕｌａおよびＧ．Ｐａｔｌｅｗｉｃｚ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ．Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｄａｔａｓｅｔ  ｏｆ  １０６  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｔｅｓｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｌｏｃａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ａｓｓａｙ．Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，２００７．２０（１）：ｐ．４４−６０．
６２．Ｍｉｇｄａｌ，Ｃ．ら、Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｔｏｗａｒｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏ  ｐｌａｙｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｒｆ２−ＡＲＥ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ＴＨＰ−１  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｓｃｉ，２０１３．１３３（２）：ｐ．２５９−７４．
６３．Ｃｈｉｐｉｎｄａ，Ｉ．，Ｊ．Ｍ．ＨｅｔｔｉｃｋおよびＰ．Ｄ．Ｓｉｅｇｅｌ，Ｈａｐｔｅｎａｔｉｏｎ：ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ（Ｃａｉｒｏ），２０１１．２０１１：ｐ．８３９６８２．
６４．Ｂａｓｋｅｔｔｅｒ，Ｄ．Ａ．ら、Ｎｏｔｈｉｎｇ  ｉｓ  ｐｅｒｆｅｃｔ，ｎｏｔ  ｅｖｅｎ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ  ａｓｓａｙ：ａ  ｃｏｍｍｅｎｔａｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＲＥＡＣＨ．Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，２００９．６０（２）：ｐ．６５−９．
６５．Ｕｒｂｉｓｃｈ，Ｄ．ら、Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｈａｚａｒｄ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｍｅｎ  ｕｓｉｎｇ  ｎｏｎ−ａｎｉｍａｌ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｒｅｇｕｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１５．７１（２）：ｐ．３３７−５１．
６６．Ｎａｔｓｃｈ，Ａ．ら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒｅｍｅ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  （Ｅ）−４−（ｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｎｅ）−２−ｐｈｅｎｙｌｏｘａｚｏｌ−５（４Ｈ）−ｏｎｅ．Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，２０１０．２３（１２）：ｐ．１９１３−２０．
６７．Ｂｒｏｄｅｒｓｅｎ，Ｋ．Ｈ．ら、Ｔｈｅ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２０１０  ２０ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．２０１０，ＩＥＥＥ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．ｐ．３１２１−３１２４．
６８．Ｄｕｍｏｎｔ，Ｃ．ら、Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅ  Ａｓｓａｙ（ＬＬＮＡ）ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｓａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎ−ａｎｉｍａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，２０１６．３４：ｐ．２２０−８．
６９．Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｓ．，ＬＬＮＡ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ：Ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｎ−ａｎｉｍａｌ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．ＡＬＴＥＸ，２０１５．３２（４）：ｐ．３７９−８３．
７０．Ｃｏｔｔｒｅｚ，Ｆ．ら、ＳＥＮＳ−ＩＳ，ａ  ３Ｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  ｂａｓｅｄ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｃｙ：Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｉｎｔｅｒ−ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｔｕｄｙ．Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，２０１６．３２：ｐ．２４８−６０．
７１．Ｎａｔｓｃｈ，Ａ．，Ｔ．ＨａｕｐｔおよびＨ．Ｌａｕｅ，Ｒｅｌａｔｉｎｇ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｔｏ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ：ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｍｉｃｈａｅｌ  ａｃｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｌｅｓｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｔｈａｎ  Ｓ（Ｎ）Ａｒ−  ａｎｄ  Ｓ（Ｎ）２−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ．Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，２０１１．２４（１１）：ｐ．２０１８−２７．
７２．Ｂｕｃｈｍａｎｎ，Ａ．Ｍ．，Ｓ．ＳｗａｍｉｎａｔｈａｎおよびＢ．Ｔｈｉｍｍａｐａｙａ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ａ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，１９９８．１８（８）：ｐ．４５６５−７６．
７３．Ｘｕ，Ｚ．ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＰ２Ａ−ｓｈｕｇｏｓｈｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，２００９．３５（４）：ｐ．４２６−４１．
７４．Ｈｕａｎｇ，Ｍ．およびＬ．Ｍ．Ｇｒａｖｅｓ，Ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ；ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ，２００３．６０（２）：ｐ．３２１−３６．
７５．Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ａ．Ｌ．ら、Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｅｎｚｙｍｅ  ＣＡＤ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＮＯＤ２  ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０１２．１４２（７）：ｐ．１４８３−９２  ｅ６．
７６．Ｂｅｎｉｇｎｉ，Ｒ．，Ｃ．ＢｏｓｓａおよびＯ．Ｔｃｈｅｒｅｍｅｎｓｋａｉａ，Ａ  ｄａｔａ−ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｆｏｒ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｔｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｒｅｇｕｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２０１６．７８：ｐ．４５−５２．
７７．Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ，Ｊ．Ｍ．，Ｄ．Ｗ．ＲｏｂｅｒｔｓおよびＧ．Ｐａｔｌｅｗｉｃｚ，Ｗｈａｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｃｙ：Ｍｙｔｈｓ，ｍａｙｂｅｓ  ａｎｄ  ｒｅａｌｉｔｉｅｓ．Ｔｈｅ  ５００  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ：Ａｎ  ｕｐｄａｔｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，２０１６．
７８．Ｂｏｈｍｅ，Ａ．ら、Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｃｈｅｍｏａｓｓａｙ  ｔｏ  ｑｕａｎｔｉｆｙ  ｔｈｉｏｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅｓ−−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａｌｐｈａ，ｂｅｔａ−ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｋｅｔｏｎｅｓ，ａｃｒｙｌａｔｅｓ，ａｎｄ  ｐｒｏｐｉｏｌａｔｅｓ．Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ，２００９．２２（４）：ｐ．７４２−５０．
７９．Ｅｓｓｅｒ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｃｏｎｔａｃｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｋｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ＲＯＳ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１２．７（７）：ｐ．ｅ４１３４０．
８０．Ｍａｒｔｉｎ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ．Ａｌｌｅｒｇｙ，２０１１．６６（９）：ｐ．１１５２−６３．
８１．Ｒｏｇｇｅｎ，Ｅ．Ｌ．およびＢ．Ｊ．Ｂｌａａｕｂｏｅｒ，Ｓｅｎｓ−ｉｔ−ｉｖ：Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｎｉｏｎ  ｐｒｏｊｅｃｔ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｎｏｖｅｌ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，２０１３．２７（３）：ｐ．１１２１．
８２．Ｈｅｂｅｒｌｅ，Ｈ．ら、ＩｎｔｅｒａｃｔｉＶｅｎｎ：ａ  ｗｅｂ−ｂａｓｅｄ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｔｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｖｅｎｎ  ｄｉａｇｒａｍｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１５．１６：ｐ．１６９．
【０２０１】
実施例１
序論
以前の試験に基づき、本願発明者らは、ＧＡＲＤアッセイによって皮膚感作物質の効力を予測することができると仮定した。効力予測モデルを開発するために、２つの手法を並行して行った。バイナリ分類を提供するためにトレーニングされた、本願発明者らの確立されたサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を利用する［１−３］。他の手法は、潜在構造に対する直交部分最小二乗投影法（Ｏ−ＰＬＳ）の線形回帰モデル（Ｓｉｍｃａ、Ｕｍｅｔｒｉｃｓ、スウェーデン）に基づいている。Ｏ−ＰＬＳ［５］は、主成分分析に関連した投影法であり、したがって、全ゲノムＲＮＡマイクロアレイデータ（２９，０００を超える転写物）の場合のように、観測値（またはサンプル）よりも多くの変数を有する行列に十分に適している。Ｏ−ＰＬＳは、マトリックスＸの構造化された変動性を予測（Ｙと相関する）および直交情報（Ｙと相関しない）に分け、残留変動を加えるように設計された、ＰＬＳ法（Ｗｏｌｄ、１９７５）の変法である。これにより、潜在変数（元の変数の線形結合）の解釈可能性が向上し得る。
【０２０２】
結果
３４の化学物質のセットとコントロールのＧＡＲＤ  ＳＶＭ決定値とヒト効力分類との関係を図９に示す。ＳＶＭモデルは、バイナリ分類（感作剤対非感作剤）のために開発された。
【０２０３】
Ｓｉｍｃａソフトウェアを使用して、多変量解析手法で複数のモデルを調べた。ヒト効力［６］は、部分的に化学的に非常に異なる物質を１つの効力カテゴリーに組み合わせる利用可能なヒトデータに基づく化学物質の分類であり、クラス１は最も高い効力を表し、クラス６は真の非感作剤を表す。
【０２０４】
ここでは、２つのＹ、すなわちヒト効力および感作剤／非感作剤を予測するように設計されたＯ−ＰＬＳモデルを提示する。図１０の散布図は、感作剤と非感作剤の分離と、第２の軸に沿って、感作剤を高効力クラスターと低効力クラスターにグループ分けしたものを示す。
【０２０５】
クロスバリデーション（Ｑ２ｃｕｍ）後にこのモデルによって説明することができる全変動の割合は０．４７８であり、これは許容可能／良好とみなされる値である。並べ替えられたＹ観察値を用いたいくつかのモデルのフィッティングに対して、それぞれの元のモデルのフィッティングおよび予測の良さを比較すると（図１１）、元のモデルが有効であることが強く示される。Ｙ観察値対Ｙ予測値を図１２にプロットしている。
【０２０６】
議論
本願発明者らの分析では、本願発明者らのマイクロアレイデータとヒト効力との間に明確な関係があることがわかる。さらなるモデル開発が進行中であり、試験された化学物質の数と種類によって性能が向上することが期待される。また、多変量解析法を機能選択ツールとして検討し、最終的に感作剤の効力に関連する機構についての新たな洞察を導き、精度の高い化学物質のヒト効力の予測を改善する手段を提供する。
【０２０７】
実施例１の参考文献
１．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈら、Ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｃａｎ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｓｔｓ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１１．
２．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈら、Ｔｈｅ  ＧＡＲＤ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ２０１３．
３．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈら、ＧＡＲＤ  ｉｎ−ｈｏｕｓｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  -  Ａ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０１４．
４．Ａｌｂｒｅｋｔら、Ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ＭＵＴＺ−３  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐｏｔｅｎｃｙ．ＢＭＣ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ２０１４．
５．ＴｒｙｇｇおよびＷｏｌｄ．Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｌａｔｅｎｔ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ（Ｏ−ＰＬＳ）．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ  ２００２．
６．Ｂａｓｋｅｔｔｅｒら、Ｃａｔｅｇｏｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ．Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ２０１４．
【０２０８】
実施例２
序論
以前の試験に基づき、本願発明者らは、ＧＡＲＤアッセイによって皮膚感作物質の効力を予測することができると仮定した。効力予測モデルを開発するために、２つの手法を並行して行った。バイナリ分類を提供するためにトレーニングされた、本願発明者らの確立されたサポートベクターマシン（ＳＶＭ）を利用し［１−３］、図９に示すように、３４の化学物質のセットとコントロールのＧＡＲＤ  ＳＶＭ決定値とヒト効力分類［４］との相関関係を示す。ＳＶＭモデルは、バイナリ分類（感作剤対非感作剤）のために開発された。
【０２０９】
他の手法は、観測値よりも変数の多いデータセットに適した決定木に基づく方法であるランダムフォレスト（ＲＦ）モデリングに基づく。変数がノイズの多い場合であっても良好な予測性能が得られ（事前選択が必要ではない）、変数重要度を返す［５］。
【０２１０】
結果
化学物質の感作効力に関し、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｇｅｎｃｙ（ＥＣＨＡ）は、１Ａ（強い感作剤）、１Ｂ（弱い感作剤）およびカテゴリーなし（非感作剤）からなる、化学物質および混合物の分類、標識および包装に関する規制（ＥＣ）Ｎｏ  １２７２／２００８に従うカテゴリー化（ＣＬＰ）を提案しており、［７］。ここでは、供給された．６３２＋ブートストラップ方法によって推定されたエラー率を有するＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒバージョン３．１．２のランダムフォレストｖａｒＳｅｌＲＦパッケージ［６］を使用し、トレーニングデータ中の複製物からの転写強度の算術平均に基づいて作成されたＲＦモデルを提示する。複製物の転写強度から直接構築することもできる。このモデルを表９に記載したトレーニングセット（７０物質）を用いてトレーニングし、次いで、表１０に示す試験（１８物質）で試験した。モデル性能のまとめを表１１に示す。図１３は、記述されたランダムフォレストモデルの主成分分析およびヒートマップ結果を含む。同定された効力バイオマーカーのリストを表１２に示す。
【０２１１】
議論
本願発明者らの分析では、本願発明者らのマイクロアレイデータと効力情報（ヒト効力とＣＬＰを両方とも含む）との間に明確な関係があることがわかる。多変量解析法を特徴選択ツールとして使用し、感作剤の効力に関連する機構に対する新たな洞察が得られる。さらに、化学物質の感作剤の効力を高精度に予測することができる。
【０２１２】
実施例２の参考文献
７．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈら、Ａ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｃａｎ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｏ  ａｎｉｍａｌ  ｔｅｓｔｓ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１１．
８．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈら、Ｔｈｅ  ＧＡＲＤ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ２０１３．
９．Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｈら、ＧＡＲＤ  ｉｎ−ｈｏｕｓｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  -  Ａ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｃｏｎｃｅｐｔ．Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０１４．
１０．Ｂａｓｋｅｔｔｅｒら、Ｃａｔｅｇｏｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ．Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ２０１４
１１．Ｄiａｚ−Ｕｒｉａｒｔｅ  Ｒ，Ａｌｖａｒｅｚ  ｄｅ  Ａｎｄｒeｓ  Ｓ．Ｇｅｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄａｔａ  ｕｓｉｎｇ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｏｒｅｓｔ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００６．
１２．Ｄiａｚ−Ｕｒｉａｒｔｅ  Ｒ．ＧｅｎｅＳｒＦ  ａｎｄ  ｖａｒＳｅｌＲＦ：ａ  ｗｅｂ−ｂａｓｅｄ  ｔｏｏｌ  ａｎｄ  Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｏｒｅｓｔ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００７
１３．ｈｔｔｐｓ：／／ｅｃｈａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／１０１６２／１３５６２／ｃｌｐ＿ｅｎ．ｐｄｆ．
【０２１３】
表
【０２１４】
【表３−１】
2019516950.tif 000010
【０２１５】
【表３−２】
2019516950.tif 000011
【０２１６】
【表４−１】
2019516950.tif 000012
【０２１７】
【表４−２】
2019516950.tif 000013
【０２１８】
【表５−１】
2019516950.tif 000014
【０２１９】
【表５−２】
2019516950.tif 000015
【０２２０】
【表６】
2019516950.tif 000016
【０２２１】
【表７−１】
2019516950.tif 000017
【０２２２】
【表７−２】
2019516950.tif 000018
【０２２３】
【表７−３】
2019516950.tif 000019
【０２２４】
【表７−４】
2019516950.tif 000020
【０２２５】
【表８−１】
2019516950.tif 000021
【０２２６】
【表８−２】
2019516950.tif 000022
【０２２７】
【表９】
2019516950.tif 000023
【０２２８】
【表１０−１】
2019516950.tif 000024
【０２２９】
【表１０−２】
2019516950.tif 000025
【０２３０】
【表１１−１】
2019516950.tif 000026
【０２３１】
【表１１−２】
2019516950.tif 000027
【０２３２】
【表１２】
2019516950.tif 000028
【０２３３】
【表１３−１】
2019516950.tif 000029
【０２３４】
【表１３−２】
2019516950.tif 000030
【０２３５】
【表１４−１】
2019516950.tif 000031
【０２３６】
【表１４−２】
2019516950.tif 000032
【０２３７】
【表１４−３】
2019516950.tif 000033
【０２３８】
【表１５】
2019516950.tif 000034
【０２３９】
【表１６】
2019516950.tif 000035
【０２４０】
【表１７】
2019516950.tif 000036
【０２４１】
【表１８】
2019516950.tif 000037
【図１Ａ】
2019516950.tif 000038
【図１Ｂ】
2019516950.tif 000039
【図２Ａ】
2019516950.tif 000040
【図２Ｂ】
2019516950.tif 000041
【図３Ａ】
2019516950.tif 000042
【図３Ｂ】
2019516950.tif 000043
【図４Ａ】
2019516950.tif 000044
【図４Ｂ】
2019516950.tif 000045
【図５】
2019516950.tif 000046
【図６】
2019516950.tif 000047
【図７Ａ】
2019516950.tif 000048
【図７Ｂ】
2019516950.tif 000049
【図８】
2019516950.tif 000050
【図９】
2019516950.tif 000051
【図１０】
2019516950.tif 000052
【図１１】
2019516950.tif 000053
【図１２】
2019516950.tif 000054
【図１３Ａ】
2019516950.tif 000055
【図１３Ｂ】
2019516950.tif 000056
【図１３Ｃ】
2019516950.tif 000057
【図１３Ｄ−１】
2019516950.tif 000058
【図１３Ｄ−２】
2019516950.tif 000059
【図１３Ｄ−３】
2019516950.tif 000060
【図１３Ｅ】
2019516950.tif 000061
【国際調査報告】
2019516950.tif 000062
2019516950.tif 000063
2019516950.tif 000064
2019516950.tif 000065
2019516950.tif 000066
2019516950.tif 000067
2019516950.tif 000068