(57)【要約】【解決手段】本開示は、リガンドにコンジュゲートされている複数の量子ドットナノ粒子に、特に各ナノ粒子がエクソソーム特異的結合リガンドにコンジュゲートされている複数の量子ドットナノ粒子に関する。本開示はまた、そのような複数のコンジュゲートされた量子ドットナノ粒子を製造する方法と、このような複数のコンジュゲートされた量子ドットナノ粒子を用いたエクソソームの検出方法と、そのような複数のコンジュゲートされた量子ドットナノ粒子を用いて癌を検出する方法とに関する。【選択図】図１
2019535000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各ナノ粒子がエクソソーム特異的結合リガンドに連結している、複数の量子ドットナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２】
各量子ドットナノ粒子は、
コア半導体材料と
外層と、
を含んでおり、外層は、エクソソーム特異的結合リガンドに連結した官能化有機コーティングを含む、請求項１に記載の複数の量子ドットナノ粒子コンジュゲート。
【請求項３】
各量子ドットナノ粒子が、その量子ドットの蛍光波長に基づいて特定のエクソソーム特異的結合リガンドにコンジュゲートされている、請求項１に記載の複数の量子ドットナノ粒子コンジュゲート。
【請求項４】
エクソソーム特異的結合リガンドが、
ｉ）抗体、抗体のフラグメント、合成ペプチド、アプタマー、合成核酸、及びそれらの任意の組合せから選択される、又は、
ii）グリピカン−１、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、メソテリン、ＰＤ−Ｌ１、テロメラーゼ、及びそれらの任意の組合せに特異的である、又は、
iii）グリピカン−１抗体、グリピカン−１タグ付け分子、又はそれらの組合せ、
である、請求項１に記載の複数の量子ドットナノ粒子コンジュゲート。
【請求項５】
各量子ドットナノ粒子が、ＩＩ−ＶＩ族、ＩＩＩ−Ｖ族、又はＩ−ＩＩＩ−ＶＩ族材料、或いは、それらの任意の合金又はドープされた誘導体を含む、請求項１に記載の複数の量子ドットナノ粒子コンジュゲート。
【請求項６】
各量子ドットナノ粒子は、約３５０ｎｍ乃至約１０００ｎｍの範囲の発光スペクトルを伴っている、請求項１に記載の複数の量子ドットナノ粒子コンジュゲート。
【請求項７】
各量子ドットナノ粒子は、細胞取込促進剤、組織浸透促進剤、又はそれらの組合せを更に含む、請求項１に記載の複数の量子ドットナノ粒子コンジュゲート。
【請求項８】
エクソソームを検出する方法であって、
ｉ）請求項１に記載の複数の量子ドットナノ粒子コンジュゲートをエクソソームと接触させる工程と、
ii）複数の量子ドットナノ粒子コンジュゲートを光源で励起する工程と、
iii）複数の量子ドットナノ粒子コンジュゲートによる発光又は吸光を検出する工程と、
を含む、方法。
【請求項９】
量子ドットナノ粒子は、量子ドットの蛍光波長に基づいて特定のエクソソーム特異的結合リガンドにコンジュゲートされており、任意選択的に検出はリアルタイムで行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
特定のタイプのエクソソームに関連し得る特有の発光コード（特有のフィンガープリント）が得られる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
癌を検出する方法であって、
ｉ）請求項１に記載の複数の量子ドットナノ粒子コンジュゲートをエクソソームと接触させる工程と、
ii）複数の量子ドットナノ粒子コンジュゲートを光源で励起する工程と、
iii）複数の量子ドットナノ粒子コンジュゲートによる発光又は吸光を検出する工程と、
を含む、方法。
【請求項１２】
量子ドットナノ粒子は、量子ドットの蛍光波長に基づいて特定のエクソソーム特異的結合リガンドにコンジュゲートされており、任意選択的に検出はリアルタイムで行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
特定のタイプのエクソソームに関連し得る特有の発光コード（特有のフィンガープリント）が得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
癌は、膵臓癌、膀胱癌、肺癌、又はそれらの任意の組合せである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
検出は、
ｉ）インビボ又はインビトロで、或いは
ii）固定された組織若しくは体液の試料である、又は、細胞培養で培養された生細胞中の組織若しくは体液の試料である試料で、或いは、
iii）ラテラルフローアッセイ装置を使用して、
実行される、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に開示された実施形態は、リガンドにコンジュゲートされた複数の量子ドットナノ粒子に、特に、各ナノ粒子がエクソソーム特異的結合リガンドにコンジュゲートされた複数の量子ドットナノ粒子に関する。実施形態は、そのような複数のコンジュゲートされた量子ドットナノ粒子を作製する方法と、そのような複数のコンジュゲートされた量子ドットナノ粒子を使用してエクソソームを検出する方法と、そのような複数のコンジュゲートされた量子ドットナノ粒子を使用してエクソソームを検出する方法とを含んでいる。
【背景技術】
【０００２】
癌が非常に無秩序で且つ予測不可能な疾患であることはよく知られている。それは、成長の潜在期を過ぎると、指数関数的に成長して広がる。従って、癌、特に予後が芳しくない癌の早期診断は、生存率と寛解の主要な決定要素である。膵管腺癌は、予後が良くない腫瘍の典型的な例であって、５年の診断後において死亡率が発生率とほぼ一致する。近年、研究者達は、エクソソーム、即ち、様々な細胞型や組織から放出される１００〜２００ｎｍの小胞が、伝統的に考えられていたような単なる「細胞片（cell debris）」ではないことに気付いた。エクソソームは、細胞伝達、ホメオスタシス、及び腫瘍形成において非常に重要な役割を果たすことが分かっている。多くの研究は、炎症性組織又は腫瘍組織から放出されたエクソソームが特定のカーゴ（cargo）及び表面組成を有することを示している。疾患組織から除かれたエクソソームの検出は、汎用の診断ツールとして求められている。しかしながら、主な問題は、濃縮、単離及び検出のための簡単な方法の欠如である。
【０００３】
現在の単離方法及び検出方法は、限外濾過及び遠心分離の複数の工程に基づいている。これらの工程の次に、免疫学的検定を用いた検出が続く。更なる問題は、様々な組織由来のエクソソームの大半が重複マーカーを共有できるので、特異性の欠如と高レベルのシグナルノイズを引き起こす可能性があるという事実に関係している。これらの問題が、エクソソームに基づいた診断キットの開発及び実現を遅らせている。
【０００４】
量子ドット又はナノ結晶と大抵の場合に呼ばれる、例えば２〜５０ｎｍの範囲の大きさを有する粒子の調製及び特性決定に、かなりの関心が持たれている。量子ドット（ＱＤ）は、独特な光学特性を有する蛍光ナノ粒子であって、広範囲な励起、サイズ調整可能な発光、狭い発光帯域幅、（高い吸光係数に起因した）向上した明るさ、光安定性、多重化能力、単一励起源を用いた同時多重発光などの光学特性がある。通常の蛍光色素とは異なる、ＱＤの独特な特性により、未だになされていない診断、臨床イメージング、ターゲット薬物送達、光線力学療法のような幾つかの潜在的な医療用途が可能になる。
【０００５】
インビトロ及びインビボで（例えば、リアルタイムで）、エクソソームを検出する、そして、癌を検出するための新しい方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
開示される実施形態は、エクソソームを検出するために、そして癌（例えば、膵臓癌、肺癌、膀胱癌）を検出するために使用できる複数の量子ドットナノ粒子を含んでいる。
【０００７】
開示される実施形態は、複数の量子ドットナノ粒子を含んでおり、各ナノ粒子は、量子ドットナノ粒子の無機表面に直にある、又はナノ粒子を水溶性及び生体適合性にするために使用される有機コロナ層にある、アミド、エステル、チオエステル、又はチオール固定基によって、エクソソーム特異的結合リガンドに結合している（例えば、（イオン対形成又はファンデルワールス相互作用により）共有結合又は物理的結合している）。特定の実施形態における水溶性量子ドットナノ粒子は、幾つかの実施形態では、ある半導体材料のコアと、それと異なる半導体材料の少なくとも１つのシェルとを含んでおり、他の実施形態では、水溶性量子ドットナノ粒子は、組成傾斜合金化（compositionally graded alloying）によって外側に向かって増加するバンドギャップ値を有する合金化半導体材料を含んでいる。それらの実施形態は、インビトロ及びインビボで（例えば、リアルタイムで）エクソソームを検出するため及び癌を検出するために有用である。
【０００８】
幾つかの実施形態では、光応答性量子ドット（ＱＤ）は、リガンド相互作用剤及び表面修飾リガンドを有する水溶性ＱＤナノ粒子を含んでいる。その水溶性ＱＤナノ粒子は、ヘキサメトキシメチルメラミンを含む溶液中でリガンド相互作用剤及び表面修飾リガンドをＱＤに化学的に加えることによって形成できる。幾つかの実施形態では、リガンド相互作用剤は、Ｃ８−Ｃ２０脂肪酸、コレステロール、又はそれらのエステルであり、一方で、表面修飾リガンドは、モノメトキシポリエチレンオキシドである。
【０００９】
ある実施形態では、複数の量子ドットナノ粒子の各々は、量子ドットの蛍光波長（例えば、緑色、黄色又は赤色など）に基づいて特定のエクソソーム特異的結合リガンドにコンジュゲートされている。特定のエクソソームに結合すると、蛍光により、その種類のエクソソームと、その特定のエクソソームを放出する特定の種類の癌とに関連し得る特有の発光コード（特有の発光フィンガープリント（fingerprint））が得られる。
【００１０】
ある実施形態では、本明細書に記載されている複数の量子ドットナノ粒子の各々は、アミド結合を介してエクソソーム特異的結合リガンドに共有結合している。
【００１１】
ある実施形態では、複数の量子ドットナノ粒子の各々は、コア半導体材料と、外層とを含んでおり、外層は、粒子を水溶性及び生体適合性にするための有機コーティング（官能化有機コーティング）のコロナと、エクソソーム特異的結合リガンドとを含んでいる。ある実施形態では、各量子ドットナノ粒子は、半導体材料の複数のシェルを含んでおり、外側シェルは外層を含んでいる。外層は、粒子を水溶性及び生体適合性にするための有機コーティング（官能化有機コーティング）のコロナと、エクソソーム特異的結合リガンドとを含んでいる。
【００１２】
ある実施形態では、複数の量子ドットナノ粒子の各々は、合金化量子ドットとエクソソーム特異的結合リガンドとを含んでいる。
【００１３】
ある実施形態では、複数の量子ドットナノ粒子の各々は、ドープされた量子ドットとエクソソーム特異的結合リガンドとを含んでいる。
【００１４】
ある実施形態では、エクソソーム特異的結合リガンドは、合成又は天然のエクソソーム特異的結合剤であってよい。例えば、エクソソーム特異的結合リガンドは、抗体、抗体のフラグメント、合成ペプチド、アプタマー、合成核酸、及びそれらの任意の組合せから選択されてよい。適切なエクソソーム特異的結合リガンドとしては、グリピカン−１、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９、メソテリン、ＰＤ−Ｌ１、テロメラーゼ、及びそれらの任意の組合せに対するリガンド（例えば、それらに特異的なリガンド）が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、エクソソーム特異的結合リガンドは、グリピカン−１抗体、グリピカン−１タグ付き（tagging）分子、又はそれらの組合せである。
【００１５】
ある実施形態では、複数の量子ドットナノ粒子の各々は、量子ドットの蛍光波長（例えば、緑色、黄色又は赤色など）に基づいて特定のエクソソーム特異的結合リガンドにコンジュゲートされている。当然のことながら、複数の量子ドットナノ粒子の各々は、可視スペクトル全体にわたって、また、それを超えて、特定の波長で発光するように個々に調整されてよい。
【００１６】
本明細書に記載の複数の量子ドットナノ粒子の何れかのある実施形態では、ナノ粒子は、ＩＩ−ＶＩ族材料、ＩＩＩ−Ｖ族材料、若しくはＩ−ＩＩＩ−ＩＶ族材料、又はそれらの任意の合金若しくはドープされた誘導体を含んでいる。
【００１７】
ある実施形態では、本明細書に記載の複数の量子ドットナノ粒子の発光スペクトルは、約３５０ｎｍ乃至約１０００ｎｍの範囲である。
【００１８】
ある実施形態では、本明細書に記載の複数の量子ドットナノ粒子の発光スペクトルは、約４５０ｎｍ乃至約８００ｎｍの範囲である。
【００１９】
更なる実施形態では、本明細書に記載されている複数の量子ドットナノ粒子の何れも、細胞内取込促進剤（cellular uptake enhancer）、（細胞透過性ペプチド（ＴＡＴ、ＲＧＤ、又はポリアルギニンのようなＣＰＰ））、組織浸透促進剤（tissue penetration enhancer）（例えば、サポニン、カチオン性脂質、ストレプトリシンＯ（ＳＬＯ））、又はそれらの任意の組合せを更に含んでよい。細胞内取込促進剤の例には、例えば、トランス活性化転写活性化因子（ＴＡＴ）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）トリペプチド、又はポリアルギニンペプチドが含まれる。リガンド−ナノ粒子コンジュゲートは、細胞内取込みを促進することができる、例えばサポニン、カチオン性リポソーム、又はストレプトリシンＯなどの他の既知の薬剤を更に含んでよい。
【００２０】
別の実施形態では、インビトロ又はインビボで（例えば、リアルタイムで）エクソソームを検出する方法が提供される。ある実施形態では、この方法は、i）本明細書に記載の実施形態の何れかに従って、複数のリガンドナノ粒子コンジュゲート（例えば、一群のリガンドナノ粒子コンジュゲート）をエクソソームと接触させる工程と、ii）複数のナノ粒子コンジュゲートによる発光又は吸光を検出する工程とを含んでいる。その実施形態の更なる態様では、複数の量子ドットナノ粒子は光源で励起される（例えば蛍光）。ある実施形態では、その種類のエクソソームに関連し得る特有の発光コード（フィンガープリント）が得られる。ある実施形態では、発光コード（信号）は、例えば任意の携帯光源（例えば、携帯紫外線（ＵＶ）光源など）を使用して裸眼で読み取られる。別の実施形態では、発行コード（信号）は、デジタル画像システムによって読み取られる。
【００２１】
別の実施形態では、インビトロ又はインビボで（例えば、リアルタイムで）癌（例えば、膵臓癌、膀胱癌、肺癌など）を検出する方法が提供される。ある実施形態では、当該方法は、i）本明細書に記載の実施形態のうちの何れかによる複数のリガンドナノ粒子コンジュゲート（例えば、一群のリガンドナノ粒子コンジュゲート）をエクソソームと接触させる工程と、ii）複数のナノ粒子コンジュゲートによる発光又は吸光を検出する工程と、を含んでいる。その実施形態の追加の態様では、複数の量子ドットナノ粒子は、（例えば、蛍光を誘発するために）光源で励起される。ある実施形態では、特定のエクソソームが放出されるその癌の種類に関連し得る特有の発行コード（フィンガープリント）が得られる。ある実施形態では、発光コード（信号）は、例えば任意の携帯光源（例えば、携帯紫外線（ＵＶ）光源など）を使用して裸眼で読み取られる。別の実施形態では、発光コード（信号）は、デジタル画像システムによって読み取られる。ある実施形態では、この方法は、膵臓癌の早期検出／ステージングなどの癌の早期検出に使用される。
【００２２】
本明細書に記載の方法の何れかのある実施形態では、複数の量子ドットは多光子を用いて励起される（例えば、２光子励起）。そのような実施形態では、特定の量子ドットナノ粒子を励起するために２本以上の光ビームの結合エネルギーが使用される。
【００２３】
本明細書に記載の方法の何れかのある実施形態では、量子ドットナノ粒子に結合したエクソソームが破壊されて、エクソソームカーゴタンパク質が検出される。
【００２４】
本明細書に記載の方法の何れかのある実施形態では、複数のコンジュゲートは、単純なポイントオブケア（point-of-care）検出のために使用され得るラテラルフロー試験装置（ディップスティック型）のような診断システムにおいて、インビトロで使用される。ラテラルフロー試験は、競合アッセイ又はサンドイッチアッセイとして機能する。ある実施形態では、診断システムは、各蛍光マーカーのタイターを推定し、それによって膵臓癌などの癌の適切なステージングを可能にする。
【００２５】
ある実施形態では、本明細書に記載の方法の何れも、体液（例えば、血液、膵液、血漿、細針吸引液）及び／又は組織試料中でインビボで（例えば、リアルタイムで）行われる。ある実施形態では、本明細書に記載される方法のうちの何れかは、採取及び検査された体液及び／又は組織試料中でインビトロで行われる。
【００２６】
ある実施形態では、試料は分析前に濃縮される。例えば、試料は、ゲルろ過スピンカラムを使用して濃縮されてよく、又はラテラルフロークロマトグラフィー装置に組み込まれてよい。
【００２７】
ある実施形態では、試料は固定された組織試料である。別の実施形態では、試料は細胞培養で培養された生細胞中にある。別の実施形態では、複数のリガンド−ナノ粒子コンジュゲートが生きた組織に導入される。別の実施形態において、複数のリガンド−ナノ粒子コンジュゲートは、癌のリアルタイム検出のために哺乳動物に導入される。
【００２８】
別の態様では、本発明は、例えばインビボ及び／又はインビトロでのエクソソームの検出のための、本明細書に記載の実施形態の何れかに基づく複数のリガンド−ナノ粒子コンジュゲートの使用を提供する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、例えばインビボ及び／又はインビトロで癌を検出するための、本明細書に記載の実施形態の何れかに基づく複数のリガンド−ナノ粒子コンジュゲートの使用を提供する。
【００３０】
別の態様では、本発明は、インビボ及び／又はインビトロでエクソソームを検出するためのキット（例えば、診断キット）を提供する。キットは、本明細書に記載の実施形態の何れかに基づく複数のリガンド−ナノ粒子コンジュゲートを含んでいる。
【００３１】
別の態様では、本発明は、インビボ及び／又はインビトロで、癌（例えば、膵臓癌、膀胱癌、肺癌など）を検出するためのキット（例えば、診断キット）を提供する。そのキットは、本明細書に記載の実施形態の何れかに基づく複数のリガンド−ナノ粒子コンジュゲートを含んでいる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、赤色量子ドット−ストレプトアビジン（streptavidin）コンジュゲートが調製されて、ビオチン化ポリマー球体ターゲットの特異的標識を示すために使用される、例示的な検出の概略を示す。
【００３３】
【図２】図２は、赤色及び緑色ＱＤ−ストレプトアビジンコンジュゲートを用いたビオチン化モデルポリマー球体の着色を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
エクソソーム特異的結合リガンドとコンジュゲートされた量子ドット（ＱＤ）が本明細書に開示されており、ＱＤが光子を放出する条件下でＱＤを刺激すると検出される能力を有している。高い安全性及び生体適合性を特徴としており、エクソソーム特異的リガンドとコンジュゲートされた量子ドットナノ粒子（ＱＤ）を提供する特定の実施形態も、本明細書に開示されている。幾つかの実施形態では、ＱＤは、生体適合性の非毒性蛍光量子ドットナノ粒子（ＱＤ）のコンジュゲートとして作り出される。
【００３５】
省略形：本発明の理解を促進するために、そして、本明細書で特許請求の範囲を解釈する際の疑義の回避のために、幾つかの用語を以下で定義する。本明細書で定義される用語は、本発明に関連する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本発明の特定の実施形態を説明するのに仕様される用語は、特許請求の範囲で述べられる場合を除いて本発明を限定するものではない。
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
ＥＤＣ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＨＭＭＭ：ヘキサメトキシメチルメラミン
Ｉｎ（ＭＡ）３：ミリスチン酸インジウム
ＱＤ：量子ドット
ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのスルホ誘導体
ＳＭＣＣ：スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート
（ＴＭＳ）３Ｐ：トリス（トリメチルシリル）ホスフィン
【００３６】
「ある」、「その」などの用語は、明示的に定義されていない限り、特異的な実体を示すことを意図したものではなく、一般的な種類を含んでおり、その種類の一般的な特定の例が、説明のために使用される。 特許請求の範囲及び／又は明細書中の「含む」と共に使用される場合における用語「ある」の使用は、１つを意味することもあるが、１つ以上、少なくとも１つ、及び／又は２つ以上と矛盾しないこともある。
【００３７】
特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、相互に排他的であるとして選択肢を示すことを明示的に示されていない限り、「及び／又は」を意味するために使用される。故に、特に明記されていない限り、一群の選択肢における用語「又は」は、その群のメンバーの任意の１つ又は任意の組合せを意味する。更に、相互に排他的であるとして選択肢を指すことが明示的に示されていない限り、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」なる言い回しは、要素Ａ単独、要素Ｂ単独、要素Ｃ単独、又はＡ、Ｂ及びＣの任意の組合せをまとめて含んだ実施形態を意味する。
【００３８】
同様に、疑義を避けるために、そして、別に相互排他的に選択肢に言及することを明示的に示さない限り、項目のリストと組み合わされた「少なくとも１つ」なる言い回しは、リストからの単一の項目、又はリスト内の項目の任意の組合せを意味する。例えば、そして別に定義されない限り、「Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも１つ」なる言い回しは、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＡ、Ｂ及びＣの任意の組合せからなる群からの少なくとも１つを意味する。従って、他に定義されない限り、この言い回しは、列挙された項目のうちの１又は複数を必要としているが、必ずしも全てではない。
【００３９】
「備えている」（及びその任意の形態、例えば「備える」）、「有している」（及びその任意の形態、例えば「有する」）、「含んでいる」（及びその任意の形態、例えば「含む」）、「含有している」（及びその任意の形態、例えば「含有する」）は、包括的又はオープンエンドであって、列挙されていない更なる要素又は工程を除外しない。
【００４０】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される「有効な」という用語は、所望の、予想される、又は意図された結果をもたらす又は達成するのに適切なことを意味する。
【００４１】
「約」又は「ほぼ」なる用語は、当業者によって理解されるように「近い」と定義され、ある１つの非限定的な実施形態においては、この用語は、１０％以内、５％以内、１％以内、幾つかの態様では、０．５％以内と規定される。
【００４２】
幾つかの実施形態では、エクソソーム特異的結合リガンドは、エクソソームエピトープを認識する抗体である。本明細書で使用されるように、用語「抗体」は、無傷の免疫グロブリン分子と、その部分、フラグメント、及び誘導体とを含んでおり、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｓｃ、ＣＤＲ、又は、キメラ抗体を含む抗原又はエピトープに結合できる抗体の任意の部分が含まれ、キメラ抗体は、二重特異性であるか、又は、抗体に由来する抗原結合ドメインと、別のタイプのポリペプチドとを組み合わせる。用語「抗体」は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と、キメラ抗体と、ヒト化抗体と、公知技術によって提供されるそれらのフラグメント、部分、領域又は誘導体とを含んでおり、当該公知技術には、酵素的開裂及び組換え技術が含まれるが、これらに限定されない。本明細書では、用語「抗体」は、重鎖抗体の単一のモノマー可変抗体ドメイン（monomeric variable antibody domain）（ＶＨ）を有する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）及びそのフラグメントも含んでいる。ｓｄＡｂは、可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを欠いており、ラクダ科動物（ＶＨＨ）及び軟骨魚類（ＶＮＡＲ）に天然に見られ、ラマでｓｄＡｂに結合する特異的抗原を開発した製薬会社Ａｂｌｙｎｘによって、時にナノボディ（Nanobody）と称される。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られるものとしての抗体の特徴を示しており、特定の方法による抗体の生成を要するものと解釈されるべきではない。
【００４３】
ＱＤは、独特の光学特性を有する蛍光半導体ナノ粒子である。ＱＤは、サイズが非常に小さい特定の形態の半導体材料を意味しており、粒子のサイズ及び形状が光励起に対して量子力学的効果をもたらす。一般的に、半径が５〜６ｎｍであるような大きいＱＤは、発光色がオレンジ色又は赤色であるより長い波長を放射し、半径が２乃〜３ｎｍであるような小さいＱＤは、青色及び緑色で短い波長を放射するが、具体的な色及びサイズはＱＤの構成によって異なる。量子ドットは、従来の蛍光色素（インドシアニングリーン（ＩＣＧ）など）よりも約２０倍明るく輝き、光安定性が何倍も高い。重要なことであるが、ＱＤの滞留時間は、それらの化学的性質及びナノサイズに起因して長い。ＱＤは、遙かに強い光強度を吸収及び放出できる。幾つかの実施形態では、ＱＤは、２つ以上の結合タグを備えてよく、二重又は三重特異性ナノデバイスを形成する。ＱＤの独自の特性により、満たされていないニーズに応える幾つかの医療用途が可能になる。
【００４４】
本明細書に示される実施形態では、ＱＤは、親水性外層又はコロナを示すように機能化されており、例えば、生細胞におけるインビボ及びインビトロの用途のような水性環境でのＱＤの使用を可能にしている。このようなＱＤは、水溶性ＱＤと呼ばれる。
【００４５】
ある実施形態では、ＱＤは、コンジュゲーション可能な官能基（ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、アジド、アルキン）を表面に備えていてよい。例示的なある実施形態では、水溶性非毒性ＱＤは、カルボキシル官能化されているか又はカルボキシル官能化される。 例えば、ＣＯＯＨ−ＱＤは、水溶性１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いるカルボジイミド連結技術を用いてターゲティング抗体のアミン末端に連結することができる。カルボキシル官能化ＱＤは、ＥＤＣと混合して、活性Ｏ−アシルイソ尿素中間体を形成し、当該中間体は、その後、反応混合物中のモノクローナル抗体上の第一級アミノ基からの求核攻撃によって置換される。所望であれば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのスルホ誘導体（ｓｕｌｆｏ−ＨＳ）が、第一級アミン含有抗体との反応中に加えられる。ｓｕｌｆｏ−ＨＳの添加により、ＥＤＣは、ＮＨＳをカルボキシルに結合し、ＮＨＳエステルを形成する。当該ＮＨＳエステルは、Ｏ−アシルイソ尿素中間体よりも安定である一方で、生理学的ｐＨで第一級アミンへの効率的なコンジュゲーションを可能にする。 何れの場合でも、結果は、ＱＤと抗体との間の共有結合である。鈴木−宮浦クロスカップリング、（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）（ＳＭＣＣ）のような他の化学反応、又はアルデヒドベースの反応が代わりに使用されてよい。
【００４６】
コア及びコア−シェルナノ粒子を合成する方法は、例えば、所有者を同じくする米国特許第７，８６７，５５６号、第７，８６７，５５７号、第７，８０３，４２３号、第７，５８８，８２８号、及び第６，３７９，６３５号に開示されている。前述の特許の各々の内容は、その全体が参照により本明細書の一部となる。米国特許第９，１１５，０９７号、第８，０６２，７０３号、第７，９８５，４４６号、第７，８０３，４２３号、及び第７，５８８，８２８号、並びに米国特許公開第２０１０／０２８３００５号、第２０１４／０２６４１９６号、第２０１４／０２７７２９７号、及び第２０１４／０３７０６９０号は、それらの各々の全体が本明細書の一部となる。これら引用文献には、大量の高品質単分散量子ドットを製造する方法が記載されている。
【００４７】
ある実施形態では、コア／シェル粒子が利用され、コア／シェル粒子は、少なくとも１つの半導体組成の中心領域又はコアを有しており、コアは、半導体組成が明確に異なる１又は複数の外層又はシェル内に埋め込まれて、又は覆われている。一例として、コアは、Ｉｎ、Ｐ、Ｚｎ及びＳの合金で構成されてよく、例えば、ＺｎＳ分子クラスタ上へのインジウム系ＱＤの分子シーディングとそれに続くＺｎＳのシェルの形成とを含む実施例１の説明に基づいて形成される。
【００４８】
更に別の実施形態では、使用される水溶性ＱＤナノ粒子は、コア／シェルＱＤを作製する代わりに、合金化半導体材料を含んでおり、当該合金化半導体材料は、傾斜合金化によって外向きに増加するバンドギャップ値又はエネルギー（Ｅｇ）を有する。バンドギャップエネルギー（Ｅｇ）は、基底状態の価電子エネルギーバンドから空いている伝導エネルギーバンドに電子を励起するのに要する最小エネルギーである。
【００４９】
傾斜合金ＱＤ組成は、別個のシェル層によって覆われた別個のコアとして形成されるのではなく、粒子の中心又はその近傍からＱＤの最外面まで元素組成が「傾斜」しているものと考えられる。１つの例は、ｘ及びｙがＱＤの中心から表面に向かって０から１まで次第に増加するＩｎ１−ｘＰ１−ｙＺｎｘＳｙ傾斜合金ＱＤであろう。そのような例では、ＱＤのバンドギャップは、中心近くの純粋なＩｎＰのバンドギャップから表面における純粋なＺｎＳのより大きいバンドギャップまで次第に変化するであろう。バンドギャップは粒子サイズに依存するが、ＺｎＳのバンドギャップはＩｎＰのバンドギャップよりも広いので、傾斜合金のバンドギャップは、ＱＤの内側から表面に向かって徐々に増加する。
【００５０】
本明細書の実施例１において説明されている分子シーディング法の変形として、ワンポット合成法が使用されてよい。これは、実施例１におけるコア粒子の生成について記載するように、プロセス中に量を増加しつつ亜鉛及び硫黄前駆体を添加しながら、粒子成長を維持するために反応溶液に添加されるミリスチン酸インジウム及び（ＴＭＳ）３Ｐの量を徐々に減少させることによって達成されてよい。故に、ある例では、ジブチルエステル及び飽和脂肪酸が反応フラスコに入れられて、加熱しながら脱気される。窒素が導入されて、昇温される。 例えば、ＺｎＳ分子クラスタ［Ｅｔ３ＮＨ］４［Ｚｎ１０Ｓ４（ＳＰｈ）１６］のような分子クラスタが、撹拌しながら加えられる。濃度を徐々に減少させた第１の半導体材料と濃度を徐々に減少させた第２の半導体材料の添加を含む傾斜プロトコルに従って傾斜合金前駆体溶液が加えられるにつれて、昇温される。例えば、ランピング（ramping）プロトコルは、ジカルボン酸エステル（例えば、ジ−ｎ−ブチルセバケートエステルなど）に溶解したミリスチン酸インジウム（Ｉｎ（ＭＡ）３）及びトリメチルシリルホスフィン（ＴＭＳ）３Ｐの添加で開始でき、添加されるＩｎ（ＭＡ）３及び（ＴＭＳ）３Ｐの量は、経時的に徐々に減少して、徐々に濃度が増加する硫黄及び亜鉛化合物、例えば（ＴＭＳ）２Ｓ及び酢酸亜鉛で置き換えられる。Ｉｎ（ＭＡ）３及び（ＴＭＳ）３Ｐの添加量が減少するにつれて、酢酸亜鉛と共に加えられる飽和脂肪酸（例えば、ミリスチン酸又はオレイン酸）及びジカルボン酸エステル（例えば、ジ−ｎ−ブチルセバケートエステル）に溶解した（ＴＭＳ）２Ｓの量は徐々に増加する。次に続く反応は、ＺｎＳ化合物の生成を増加させるであろう。 添加が続くにつれて、所望のサイズのＱＤ粒子が形成され、発光極大波長は徐々に増加する。ＩｎＰ及びＺｎＳの濃度は傾斜しており、ＱＤ粒子の中心近くでＩｎＰの濃度が最も高く、ＱＤ粒子の外層で、ＺｎＳの濃度が最も高い。所望の発光極大が得られると、反応への更なる添加が停止され、得られた傾斜合金粒子をアニールした後、沈殿及び洗浄によって粒子の単離が行われる。
【００５１】
媒体に対するナノ粒子の適合性と、凝集、光酸化及び／又はクエンチングについてのナノ粒子の受け易さとは、主にナノ粒子の表面組成によって媒介される。任意のコア、コア−シェル又はコア−マルチシェルナノ粒子の最終的な無機表面原子の周りの配位は不完全なことがあり、表面に反応性が高いダングリングボンドを有し、これは粒子の凝集をもたらし得る。この問題は、本明細書でキャッピングリガンド又はキャッピング剤と呼ばれる保護有機基で、ベアな表面原子を不動態化する（キャッピングする）ことによって克服される。粒子のキャッピング又は不動態化は、粒子の凝集を防ぐだけでなく、周囲の化学的環境から粒子を保護し、コア材料の場合には、粒子に電子的安定化（不動態化）をもたらす。キャッピングリガンドは、粒子の最も外側の無機層の表面金属原子に結合したルイス塩基であってよいが、これに限定されない。キャッピングリガンドの性質は、特定の媒体に対するナノ粒子の適合性を大きく左右する。キャッピングリガンドは、所望の特性に応じて選択されてよい。使用可能なキャッピングリガンドの種類には、チオール基、カルボキシル基、アミン基、ホスフィン基、ホスフィンオキシド基、ホスホン酸基、ホスフィン酸基、イミダゾール基、ＯＨ基、チオエーテル基、及びカリックスアレーン基が挙げられる。カリックスアレーンを除いて、これらのキャッピングリガンドは全て、キャッピングリガンドのための固定中心を粒子の表面に形成できる頭部基を有する。キャッピングリガンドの本体は、直鎖であっても、環状であっても、芳香族であってよい。キャッピングリガンド自体は、大きく、小さく、オリゴマー状又は多座状であってよい。リガンドの本体の性質と、粒子に結合していない突出側部とは一緒になって、リガンドが親水性、疎水性、両親媒性、負性、陽性、又は双性イオン性であるか否かを決定する。
【００５２】
多くの量子ドット材料では、キャッピングリガンドは疎水性である（例えば、アルキルチオール、脂肪酸、アルキルホスフィンやアルキルホスフィンオキシドなど）。故に、ナノ粒子は通常、ナノ粒子の合成及び単離後に、トルエンなどの疎水性溶媒中に分散される。このようにキャッピングされたナノ粒子は通常、極性がより高い媒体には分散しない。ＱＤの表面修飾が望まれる場合に最も広く使用されている手法は、リガンド交換として知られている。親油性リガンド分子は、コア合成及び／又はシェル形成手順中にナノ粒子の表面に配位し、続いて、極性／荷電リガンド化合物と交換されてよい。別の表面修飾ストラテジーは、極性／荷電分子又はポリマー分子を、ナノ粒子の表面に既に配位しているリガンド分子とインターカレートさせることである。しかしながら、ある種のリガンド交換及びインターカレーション手法は、水性媒体に対してナノ粒子をより相溶性にする一方で、対応する未修飾ナノ粒子よりも量子収率（ＱＹ）が低い、及び／又はサイズが実質的に大きい材料をもたらすことがある。
【００５３】
インビボ及びインビトロ用途においては、必要とされない場合には、低毒性プロフィールを有するＱＤが望ましい。故に、幾つかの用途では、量子ドットナノ粒子は、カドミウム、鉛やヒ素などの有毒な重金属を実質的に含まないこと（例えば、カドミウム、鉛、ヒ素などの重金属が５重量％未満、具体的には、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、０．０１重量％未満）、或いは、カドミウム、鉛、ヒ素などの重金属を含まないことが好ましい。ある実施形態では、カドミウム、鉛、ヒ素などの重金属を含まない低毒性ＱＤがもたらされる。
【００５４】
ＱＤに特有の性質は、未だになされていない生細胞におけるインビトロ及びインビボ診断を含む幾つかの潜在的な医学的用途を可能にする。ＱＤの医療応用に関する大きな懸念の１つは、カドミウム、鉛、ヒ素などの有毒な重金属を含むＱＤに研究の大部分が集中しているということである。本明細書に記載の、生物学的に適合した重金属フリーの水溶性ＱＤは、インビトロ及びインビボの両方で医療用途に安全に使用することができる。幾つかの実施形態では、（完全ＩｇＧ２抗体の寸法サイズの範囲内である）１０〜２０ｎｍの水力学的サイズを有する、インビボ適合性でカドミウムフリーな水分散性ＱＤがもたらされる。ある実施形態では、インビボ適合性でカドミウムフリーな水分散性ＱＤは、本明細書の実施例１及び実施例２に記載の手順に従って製造される。幾つかの実施形態では、インビボ適合性でカドミウムフリーな水分散性ＱＤは、カルボキシル官能化されており、更にリガンド結合部で誘導体化されている。
【００５５】
カドミウム、鉛及びヒ素を含まないナノ粒子の例には、例えば、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＳｂ、ＡｌＰ、ＡｌＳ、ＡｌＳｂ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＡｇＩｎＳ２、ＣｕＩｎＳ２、Ｓｉ、Ｇｅなどの半導体材料、それらの合金及びドープされた誘導体を含むナノ粒子、特に、これらの材料のうちの１つのコアと、これらの材料のうちの別の材料の１又は複数のシェルとを含むナノ粒子が挙げられる。
【００５６】
幾つかの実施形態では、非毒性ＱＤナノ粒子は表面修飾されて、水溶性にされて、且つ、それらをリガンド相互作用剤に曝すことによって誘導体化する表面部分を有しており、リガンド相互作用剤とＱＤの表面との会合をもたらすことを可能にする。リガンド相互作用剤は、以下に記載するように、鎖部分と、連結／架橋剤に対して特異的な親和性又はそれとの反応性を有する官能基とを含んでよい。鎖部分は、例えば、アルカン鎖であってよい。官能基の例には、チオ基、ヒドロキシル基、カルボキサミド基、エステル基やカルボキシル基などの求核基が挙げられる。リガンド相互作用剤はまた、ＱＤの表面に対して親和性を有する部分を含んでも含まなくてもよい。そのような部分の例には、チオール、アミン、カルボキシル基やホスフィンが挙げられる。リガンド相互作用基がそのような部分を含まない場合、リガンド相互作用基は、キャッピングリガンドとインターカレートすることによってナノ粒子の表面と会合してよい。リガンド相互作用剤の例には、例えばミリスチン酸イソプロピルのようなＣ８−２０脂肪酸及びそのエステルが含まれる。
【００５７】
リガンド相互作用剤は、単にナノ粒子の合成に使用されるプロセスの結果としてＱＤナノ粒子と会合してよく、ナノ粒子を更なる量のリガンド相互作用剤に曝す必要性を無くすことに留意のこと。このような場合、更なるリガンド相互作用剤をナノ粒子と会合させる必要はないかもしれない。代替的に又は追加で、ナノ粒子が合成及び単離された後に、ＱＤナノ粒子をリガンド相互作用剤に曝してもよい。例えば、ナノ粒子は、リガンド相互作用剤を含む溶液中にて、一定期間インキュベートされてよい。そのようなインキュベーション、又はインキュベーション期間の一部は、高温であってよく、リガンド相互作用剤とナノ粒子の表面との会合が促進する。リガンド相互作用剤をナノ粒子の表面と会合させた後に、ＱＤナノ粒子は、連結／架橋剤及び表面修飾リガンドに曝される。連結／架橋剤は、リガンド相互作用剤の基に対して、また、表面修飾リガンドに対して特異的な親和性を有する官能基を含んでいる。リガンド相互作用剤−ナノ粒子会合複合体は、連結／架橋剤及び表面修飾リガンドに順次曝される。例えば、ナノ粒子は、架橋／架橋剤にある期間曝されて架橋をもたらし、その後、表面修飾リガンドに曝されて、それをナノ粒子のリガンドシェルへと組み込んでよい。或いは、ナノ粒子は、結合／架橋剤と表面修飾リガンドとの混合物に曝されてよく、よって、単一の工程で架橋されて、表面修飾リガンドが組み込まれる。
【００５８】
ある実施形態では、量子ドット前駆体は、分子クラスタ化合物の存在下で、分子クラスタの完全性が維持される条件下で与えられて、十分に分離した（well-defined）予め作製されたシード又はテンプレートとして作用し、化学前駆体と反応する核形成中心をもたらして、工業的用途に十分な規模で高品質のナノ粒子が生成される。
【００５９】
本発明において有用な量子ドットナノ粒子の適切な種類には、以下の種類を含むコア材料（それらの任意の組合せ、合金、又はドープされた誘導体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
周期律表の第２族からの第１元素と、周期律表の第１６族からの第２元素とを含んでいるＩＩＡ−ＶＩＢ（２−１６）族材料であって、三元材料、四元材料及びドープされた材料も含まれる。適切なナノ粒子材料としては、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、及びＢａＴｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
周期律表の第１２族からの第１元素と周期律表の第１５族からの第２元素とを含んでいるＩＩ−Ｖ族材料であって、三元材料、四元材料、及びドープされた材料も含まれる。適切なナノ粒子材料としては、Ｚｎ３Ｐ２、Ｚｎ３Ａｓ２、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、Ｃｄ３Ｎ２、及びＺｎ３Ｎ２が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
周期律表の第１２族からの第１元素と、周期律表の第１６族からの第２元素と含むＩＩ−ＶＩ族材料であって、三元材料、四元材料及びドープされた材料も含まれる。適切なナノ粒子材料としては、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＺｎＯ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＣｄＳｅＳ、ＣｄＳｅＴｅ、ＣｄＳＴｅ、ＺｎＳｅＳ、ＺｎＳｅＴｅ、ＺｎＳＴｅ、ＨｇＳｅＳ、ＨｇＳｅＴｅ、ＨｇＳＴｅ、ＣｄＺｎＳ、ＣｄＺｎＳｅ、ＣｄＺｎＴｅ、ＣｄＨｇＳ、ＣｄＨｇＳｅ、ＣｄＨｇＴｅ、ＨｇＺｎＳ、ＨｇＺｎＳｅ、ＨｇＺｎＴｅ、ＣｄＺｎＳｅＳ、ＣｄＺｎＳｅＴｅ、ＣｄＨｇＳｅＳ、ＣｄＨｇＳｅＴｅ、ＣｄＨｇＳＴｅ、ＨｇＺｎＳｅＳ、及びＨｇＺｎＳｅＴｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
周期律表の第１３族からの第１元素と周期律表の第１５族からの第２元素とを含んでいるＩＩＩ−Ｖ族材料であって、三元材料、四元材料及びドープされた材料も含まれる。適切なナノ粒子材料には、ＢＰ、Ａ１Ｐ、ＡｌＳｂ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＳｂ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＳｂ、ＡＩＮ、及びＢＮが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
周期律表の第１３族からの第１元素と周期律表の第１４族からの第２元素とを含んでいるＩＩＩ−Ｖ族材料であって、三元材料、四元材料及びドープされた材料も含まれる。適切なナノ粒子材料には、Ｂ４Ｃ、Ａ１４Ｃ３、Ｇａ４Ｃ、Ｓｉ、及びＳｉＣが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
周期律表の第１３族からの第１元素と周期律表の第１６族からの第２元素とを含んでいるＩＩＩ−ＶＩ族材料であって、三元材料及び四元材料も含まれる。適切なナノ粒子材料には、Ａ１２Ｓ３、Ａｌ２Ｓｅ３、Ａｌ２Ｔｅ３、Ｇａ２Ｓ３、Ｇａ２Ｓｅ３、ＧｅＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｇａ２Ｔｅ３、Ｉｎ２Ｔｅ３、及びＩｎＴｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
周期律表の第１４族からの第１元素と周期律表の第１６族からの第２元素とを含んでいるＩＶ−ＶＩ族材料であって、三元材料、四元材料及びドープされた材料も含まれる。適切なナノ粒子材料には、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＰｂＴｅ、Ｓｂ２Ｔｅ３、ＳｎＳ、ＳｎＳｅ、ＳｎＴｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
周期律表の遷移金属の任意の族からの第１元素と、周期律表の第１６族からの第２元素とを含んでいるナノ粒子材料であって、三元材料、四元材料及びドープされた材料も含まれる。適切なナノ粒子材料としては、ＮｉＳ、ＣｒＳ、ＡｇＳ、並びに、ＣｕＩｎＳｅ２、ＣｕＧａＳ２、ＣｕＧａＳ２、及びＡｇＩｎＳ２などのＩ−ＩＩＩ−ＶＩ族材料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書及び特許請求の範囲の意図するものとしては、「ドープされたナノ粒子」という用語は、上記と、大抵の場合には遷移金属又は希土類元素である１又は複数の主族元素又は希土類元素を含むドーパントとからなるナノ粒子を指しており、例えば、Ｍｎ＋でドープされたＺｎＳナノ粒子のようなマンガンを含む硫化亜鉛であるが、これに限定されない。
【００６９】
ある実施形態では、量子ドットナノ粒子は、カドミウムなどの重金属を実質的に含まない（例えば、カドミウムなどの重金属が５重量％未満、例えば、４重量％未満、３重量％未満、２重量％未満、１重量％未満、０．５重量％未満、０．１重量％未満、０．０５重量％未満、又は、０．０１重量％未満）、或いは、カドミウムなどの重金属を含んでいない。
【００７０】
インビボ用途では、重金属フリー半導体インジウム系量子ドット、例えばＩｎＰ量子ドット、その合金及びドープされた誘導体が好ましい。
【００７１】
ある実施形態において、本明細書に記載の量子ドットナノ粒子は、ナノ粒子コア上に設けられた第１の半導体材料を含む第１の層を含んでいる。第２の半導体材料を含む第２の層が、第１の層の上に設けられてよい。
【００７２】
［合成］
以下の合成工程が、コンジュゲーションに用いられてよい。リンカーが使用されて、ナノ粒子上のカルボキシル官能基とエクソソーム特異的結合リガンド上のアミン末端基との間にアミド基が形成されてよい。既知のリンカー、例えば、量子ドットナノ粒子の無機表面上に直接存在するチオール固定基などが使用できる。当業者には知られているであろう標準的なカップリング条件が用いられてよい。適切なカップリング剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などのカルボジイミドが挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、カップリング剤はＥＤＣである。
【００７３】
ある実施例では、カルボキシル末端基とエクソソーム特異的リガンドとを有する量子ドットナノ粒子が、溶媒に混合されてよい。カップリング剤、例えばＥＤＣが、混合物に加えられてよい。反応混合物は、インキュベートされてよい。未精製のエクソソーム特異的結合リガンドナノ粒子コンジュゲートは、精製及び／又は単離されてよい。
【００７４】
一般的な固相精製法が使用されてよい。過剰な未反応の修飾された特異的結合リガンド及び／又はＥＤＣを除去するために、濾過及び適切な溶媒での洗浄が、数サイクル必要とされることがある。
【００７５】
別の態様では、ある実施形態は、本明細書に記載の実施形態の何れかに基づくリガンドナノ粒子コンジュゲートの調製プロセスを提供する。ある実施形態では、当該プロセスは、ｉ）リガンド−ナノ粒子コンジュゲートを得るために、量子ドットナノ粒子をエクソソーム特異的結合リガンドとカップリングさせる工程であって、ナノ粒子はコア半導体材料及び外層を含んでおり、外層はカルボキシル基を含む、工程を含んでいる。ある実施形態では、カップリングさせる工程ｉ）は、（ａ）外層のカルボキシル基をカルボジイミドリンカーと反応させてカルボキシル基を活性化させる工程と、ｂ）活性化カルボキシル基をメチル化特異的結合リガンド（例えば、リガンド上のアミン末端）と反応させる工程と、を含んでいる。
【００７６】
更なる実施形態では、プロセスは更に、ii）リガンドナノ粒子コンジュゲートを精製する工程を含んでいる。更なる実施形態では、プロセスは更に、iii）リガンドナノ粒子コンジュゲートを単離する工程を含んでいる。ある実施形態では、プロセスは、工程ｉ）、ii）、及びiii）を含んでいる。
【００７７】
更なる実施形態では、プロセスは、ii）量子ドットナノ粒子を精製する工程を更に含んでいる。更なる実施形態では、この方法は更に、iii）特異的結合ナノ粒子コンジュゲートを単離する工程を含んでいる。ある実施形態では、プロセスは、工程ｉ）、ii）、及びiii）を含んでいる。
【００７８】
以下の実施例は、開示を完全にするため、本発明の組成物及び複合物を製造する方法を説明するため、並びに組成物の特定の特徴を示すために記載されている。これらの実施例は、本発明の範囲又は教示を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００７９】
[実施例１  無毒性量子ドットの合成]
分子シーディングプロセスを使用して、無毒性量子ドット（ＱＤ）を生成した。概要を説明すると、５００〜７００ｎｍの範囲で発光する非官能化インジウム系量子ドットの調製を以下のようにして行った。ジブチルエステル（約１００ｍｌ）及びミリスチン酸（ＭＡ）（１０．０６ｇ）を三つ口フラスコに入れて、真空下で約７０℃で１時間脱気した。この期間の後、窒素を導入し、そして温度を約９０℃に上げた。約４．７ｇのＺｎＳ分子クラスタ［Ｅｔ３ＮＨ］４［Ｚｎ１０Ｓ４（ＳＰｈ）１６］を加え、混合物を約４５分間撹拌した。次に、温度を約１００℃に上げて、続いてＩｎ（ＭＡ）３（１Ｍ、１５ｍｌ）を滴下し、続いてトリス（トリメチルシリル）ホスフィン（ＴＭＳ）３Ｐ（１Ｍ、１５ｍｌ）を滴下した。反応混合物を撹拌しながら温度を約１４０℃に上げた。１４０℃で、ジ−ｎ−ブチルセバケートエステルに溶解させたミリスチン酸インジウム（Ｉｎ（ＭＡ）３）（１Ｍ、３５ｍｌ）（５分間撹拌したままにした）と、ジ−ｎ−ブチルセバケートエステルに溶解させた（ＴＭＳ）３Ｐ（１Ｍ、３５ｍｌ）を更に滴下した。その後、温度をゆっくりと１８０℃に上げて、Ｉｎ（ＭＡ）３（１Ｍ、５５ｍｌ）、続いて（ＴＭＳ）３Ｐ（１Ｍ、４０ｍｌ）を更に滴下した。このようにして前駆体を添加することで、発光極大が５００ｎｍから７２０ｎｍまで徐々に増加するインジウム系粒子を作製した。所望の発光極大が得られた時点で反応を停止し、反応温度で半時間撹拌し続けた。この期間の後、混合物を約４日間（反応温度よりも約２０乃〜４０℃低い温度で）アニールした。この段階でＵＶランプも使用して、アニーリングを促進した。
【００８０】
カニューレ法を用いて、乾燥脱気メタノール（約２００ｍｌ）の添加により粒子を単離した。沈殿物を沈殿させ、次に、フィルタスティックを用いてカニューレを介してメタノールを除去した。乾燥脱気クロロホルム（約１０ｍｌ）を加えて固体を洗浄した。真空下で１日間固体を乾燥させた。この手法により、ＺｎＳ分子クラスタにインジウム系ナノ粒子が形成された。更なる処理において、結果として得られたインジウム系ナノ粒子の量子収率は、希フッ酸（ＨＦ）中で洗浄することによって更に増加した。インジウム系コア材料の量子収率は、約２５％〜５０％の範囲であった。この組成物は、Ｉｎ、Ｐ、Ｚｎ及びＳを含む合金構造と考えられる。
【００８１】
ＺｎＳシェルの成長：ＨＦエッチングしたインジウム系コア粒子の２０ｍｌ部を三つ口フラスコ内で乾燥させた。１．３ｇのミリスチン酸及び２０ｍｌのジ−ｎ−ブチルセバケートエステルを添えて、３０分間脱気した。溶液を２００℃に加熱して、２ｍｌの１Ｍ（ＴＭＳ）２Ｓを（７．９３ｍｌ／時の速度で）滴加した。この添加が完了した後、溶液を２分間放置し、次に１．２ｇの無水酢酸亜鉛を加えた。２００℃で１時間溶液を保持して、次に室温に冷却した。４０ｍｌの無水脱気メタノールを添加して遠心分離することで、得られた粒子を単離した。上澄み液を捨てて、残った固体に３０ｍｌの無水脱気ヘキサンを加えた。 溶液を５時間静置し、次に再度遠心分離した。上澄み液を集めて、残った固体を捨てた。最終的な非官能化インジウム系ナノ粒子材料の量子収率は、有機溶媒中で約６０％〜９０％の範囲であった。
【００８２】
［実施例２  水溶性の表面修飾ＱＤ］
メラミンヘキサメトキシメチルメラミン（ＨＭＭＭ）修飾蛍光ナノ粒子を、薬物送達ビヒクルとして生成及び使用するための方法の一実施形態が、本実施例で提供される。独特なメラミンベースのコーティングは、優れた生体適合性と、低毒性と、非常に低い非特異的結合とを示す。これらの独特の作用により、インビトロとインビボの両方で幅広い生物医学的用途が可能になる。
【００８３】
適切な水溶性ナノ粒子の調製の一例を以下に示す。実施例１に記載されており、コア材料としてインジウム及びリンを含む合金と、Ｚｎ含有シェルとを有しており、６０８ｎｍで赤色発光する２００ｍｇのカドミウムフリー量子ドットナノ粒子を、ミリスチン酸イソプロピル（１００マイクロリットル）と共にトルエン（１ｍｌ）中に分散させた。ミリスチン酸イソプロピルは、リガンド相互作用剤として含まれる。５０℃で約１〜２分間混合物を加熱し、次に室温で１５時間ゆっくりと振とうした。ヘキサメトキシメチルメラミン（ＨＭＭＭ）（ＣＹＭＥＬ  ３０３、Ｃｙｔｅｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ウェストパターソン）（４００ｍｇ）、モノメトキシポリエチレンオキシド（ＣＨ３−Ｏ−ＰＥＧ２０００−ＯＨ）（４００ｍｇ）、及びサリチル酸（５０ｍｇ）のトルエン溶液（４ｍｌ）をナノ粒子分散系に加えた。サリチル酸は、官能化反応に用いられ、触媒、架橋剤、及びＣＯＯＨの供給源として３つの役割を果たす。ＯＨ基に関するＨＭＭＭの選好性に部分的に起因して、サリチル酸によって提供される多くのＣＯＯＨ基は、架橋後もＱＤ上で利用可能なままである。
【００８４】
ＨＭＭＭは、以下の構造を有するメラミンベースの連結剤／架橋剤である。
【化１】
2019535000.tif 000003
【００８５】
ＨＭＭＭは、酸触媒反応で反応して、アミド、カルボキシル基、ヒドロキシル基、及びチオールなどの様々な官能基を架橋できる。
【００８６】
混合物を脱気し、電磁撹拌機で３００ｒｐｍで撹拌しながら、最初の１時間は１３０℃で、次に１４０℃で３時間還流した。最初の１時間の間、窒素流をフラスコに通過させて、ＨＭＭＭと求核基の反応によって発生した揮発性副生成物を確実に除去した。混合物を室温に冷却して、不活性ガス下で保存した。表面修飾ナノ粒子は、未修飾ナノ粒子と比較して、蛍光量子収率がほとんど又は全く損なわれず、発光ピーク又は半値全幅（ＦＷＨＭ）値の変化がないことを示した。表面修飾ナノ粒子のアリコートを真空下で乾燥させて、脱イオン水を残留物に添加した。表面修飾ナノ粒子は、水性媒体によく分散し、常に分散したままであった。対照的に、未修飾ナノ粒子は水性媒体中に懸濁しなかった。上記手順による表面修飾ナノ粒子の蛍光量子収率は、４０〜５０％である。典型的なバッチでは、４７％±５％の量子収率が得られる。
【００８７】
別の実施形態では、６０８ｎｍで赤色発光するカドミウムフリー量子ドットナノ粒子（２００ｍｇ）を、コレステロール（７１．５ｍｇ）と共にトルエン（１ｍｌ）に分散させた。５０℃で約１〜２分間混合物を加熱し、次に室温で１５時間ゆっくりと振とうした。ＨＭＭＭ（Ｃｙｍｅｌ ３０３）（４００ｍｇ）、モノメトキシポリエチレンオキシド（ＣＨ３Ｏ−ＰＥＧ２０００−ＯＨ）（４００ｍｇ）、グアイフェネシン（１００ｍｇ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（２ｍＬ）及びサリチル酸（５０ｍｇ）のトルエン溶液（４ｍｌ）を、ナノ粒子分散系に加えた。
【００８８】
ここで用いられる化合物グアイフェネシンは、以下の化学構造を有する。
【化２】
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【００８９】
ここで用いられる化合物サリチル酸は、以下の化学構造を有する。
【化３】
2019535000.tif 000005
【００９０】
混合物を脱気して、磁気撹拌機で３００ｒｐｍで撹拌しながら、１４０℃で４時間還流した。先の手順と同様に、最初の１時間の間に窒素流をフラスコに通過させて、ＨＭＭＭと求核基の反応によって発生した揮発性副生成物を確実に除去した。混合物を室温に冷却し、不活性ガス下で保存した。表面修飾ナノ粒子のアリコートを真空下で乾燥させ、脱イオン水を残留物に加えた。１００ｍＭのＫＯＨ溶液を用いて、溶液のｐＨを６．５に調整し、Ａｍｉｃｏｎフィルタ（３０ｋＤ）［Ｍｅｒｃｋ  ＫＧＡＡ，フランクフルト  シュトラッサー，２５０  Ｄ−６４２９３，ダルムシュタット，ドイツ］を用いた３サイクルの限外濾過により、過剰な未反応物質を除去した。使用するまで最終水溶液を冷蔵保存した。
【００９１】
水溶性を増大させるようにナノ粒子を修飾する伝統的な方法（例えば、メルカプト官能化水溶性リガンドとのリガンド交換）は、ナノ粒子を水溶性にする温和な条件下では効果がないことに注目すべきである。熱及び超音波処理などの過酷な条件下では、フラクションは水溶性になり、非常に低い量子収率（ＱＹ＜２０％）を有する。対照的に、本方法は、高い量子収率を有する水溶性ナノ粒子を提供する。本明細書で規定されるように、高い量子収率は４０％以上である。幾つかの実施形態において、４５％以上の高い量子収率が得られる。この実施例のように調製された表面修飾ナノ粒子はまた、エタノール、プロパノール、アセトン、メチルエチルケトン、ブタノール、トリプロピルメチルメタクリレート、メチルメタクリレートを含む他の極性溶媒によく分散し、常に分散したままである。
【００９２】
[実施例３  標的化リガンドを含む水溶性ＱＤ]
特定の実施形態では、水溶性ＱＤは、ＱＤに付された標的化リガンドを含むように修飾される。故に、ある実施形態では、非毒性且つ水溶性（生体適合性）であり、コンジュゲーション可能な基（ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、アジド、アルキン）を表面に備えた量子ドットナノ粒子が合成される。例えば本明細書の実施例２で与えられたＣＯＯＨ官能基のような、ＱＤに付加できる官能基を用いて、サンプル、細胞及び組織中のエクソソームを選択的に同定することを可能にする標的化リガンドを含むように、ＱＤを修飾できる。標的化リガンド修飾ＱＤは、照射されると、検出用の光を発光する。
【００９３】
例示的なある実施形態では、水溶性の非毒性ＱＤはカルボキシル官能化されているか、カルボキシル官能化される。水溶性１−エチル−３−（−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いるカルボジイミド結合法のような化学的方法を使用して、ＣＯＯＨ−ＱＤを、特異的抗体などのエクソソームの標的部のアミン末端に結合する。カルボキシル官能化ＱＤをＥＤＣと混合して、活性Ｏ−アシルイソ尿素中間体を形成し、次に、当該中間体を、反応混合物中でモノクローナル抗体の第一級アミノ基からの求核攻撃によって置換する。必要であれば、第一級アミン含有抗体（primary amine bearing antibody）との反応中に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのスルホ誘導体（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）を加える。ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳの添加により、ＥＤＣは、カルボキシルにＮＨＳを結合し、Ｏ−アシルイソ尿素中間体よりも安定なＮＨＳエステルを形成する一方で、生理学的ｐＨで第一級アミンへの効率的なコンジュゲーションを可能にする。何れの場合でも、結果は、ＱＤと抗体の間の共有結合となる。鈴木−宮浦クロスカップリング、スクシンイミジル  ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、又はアルデヒドを用いた反応のような他の化学反応が、代わりに用いられてもよい。
【００９４】
ある実施形態において、非毒性の水溶性量子ドットは、グリピカン−１、ＣＡ１９−９、メソテリン、ＰＤ−Ｌ１、テロメラーゼ、又はそれらの任意の組合せに特異的なエクソソーム特異的結合リガンドのようなエクソソーム結合部位に対する抗体に化学的に結合している。
【００９５】
エクソソーム特異的結合リガンドとのインビボ適合水分散性カドミウムフリーＱＤの共有結合コンジュゲーション：エッペンドルフ（Eppendorf）チューブにおいて、１ｍｇのカルボキシル官能化水溶性量子ドットを、１００μｌのＭＥＳ活性化緩衝液と混合する（つまり、４０ｍｇ／ｍｌストックの２５μｌを１００μｌのＭＥＳに入れる）。ＭＥＳ緩衝液は、ｐＨ４．５の脱イオン（ＤＩ）水の２５ｍＭ溶液（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸ヘミナトリウム塩（ＭＥＳ）、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）として調製される。これに、３３μｌの新しいＥＤＣ溶液（脱イオン水の３０ｍｇ／ｍｌストック、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加えて、その溶液を混合する。４μｌの新しいｓｕｌｆｏ−ＨＳ（１００ｍｇ／ｍｌストック、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＤＩ水中）を加えて、混合する。ＮａｎｏＳｅｐ  ３００Ｋフィルタ（ＰＡＬＬ  ＮａｎｏＳｅｐ  ３００Ｋ  Ｏｍｅｇａウルトラフィルタ）を、１００μｌのＭＥＳで予め湿らせる。ＭＥＳ／ＥＤＣ／Ｓｕｌｆｏ−ＨＳ／ＱＤ溶液を、ＮａｎｏＳｅｐ  ３００Ｋフィルタに添加し、十分なＭＥＳで満たす。５０００ｒｐｍ／１５分で、フィルタを遠心分離する。ドットを、５０μｌの活性化緩衝液に再度分注して、１０μｌのメチル化特異的リガンドを含んでいるエッペンドルフチューブに移す。溶液をよく混ぜて、室温で一晩（約１６乃至１８時間）インキュベートする。１６μｌの６−アミノカプロン酸（６ＡＣ）（１９．７ｍｇ／１００ｍＭ）で、溶液をクエンチする。クエンチングは、第一級アミンを有する他の化合物を用いて代替的に行えるが、６ＡＣは、ＣＯＯＨを有しており、生成物のコロイド安定性を維持することができるので、６ＡＣがこの実施態様に対して選択されていることに留意のこと。予め濡らしたＮａｎｏｓｅｐ  ３００Ｋフィルタ（１００μｌ  １×ＰＢＳ）に溶液を移し、５００μｌのラインまで１×ＰＢＳで満たした。Ｎａｎｏｓｅｐ  ３００Ｋフィルタと１×ＰＢＳ緩衝液とを用いた３サイクルの限外濾過によって、過剰なＳＡＶを除去した。遠心分離の各サイクルは、５０００ｒｐｍで２０分間行われて、各サイクル後に約４００μｌの１×ＰＢＳを用いて再分散した。１００μｌのＰＢＳ中に最終濃縮物を再分散した。
【００９６】
[実施例４］
標準的なコンジュゲーション化学反応が、コンジュゲーションに使用されてよい。ナノ粒子エクソソーム−特異的結合リガンドコンジュゲートを調製する方法は、ナノ粒子を準備するする工程と、カップリング剤を準備する工程と、例えば、グリピカン−１、ＣＡ１９−９、メソテリン、ＰＤ−Ｌ１、テロメラーゼ、又はそれらの任意の組合せに特異的なエクソソーム特異的結合リガンドを準備する工程と、エクソソーム特異的結合リガンドを提供する工程と、混合物をインキュベートして、ナノ粒子エクソソーム特異的結合リガンドコンジュゲートを形成する工程と、を含んでよい。次に、混合物を精製及び単離して、ナノ粒子エクソソーム特異的結合リガンドコンジュゲートが得られてよい。
【００９７】
インキュベーション条件は、アミド又はエステルの何れかの形成を可能にするように選択されてよい。他の結合（例えば、共有結合と非共有結合の両方）が形成されてよいことは理解されるべきである。エクソソーム特異的結合リガンドは、共有結合、物理的結合、イオン対形成、又はファンデルワールス相互作用の何れかによってナノ粒子とコンジュゲートされてよい。結合は、量子ドットナノ粒子の無機表面に直かにある、又は、ナノ粒子を水溶性及び生体適合性にするために使用される有機コロナ層にあるアミド、エステル、チオエステル、又はチオール固定基によってなされてよい。
【００９８】
カップリングのための標準的なインキュベーション条件が使用されてよい。例えば、カップリング条件は、０．５乃至４時間の溶解であってよい。カップリング条件の温度範囲は、１００℃乃至２００℃の範囲であってよい。カップリング条件は、反応中において一定であってよく、又は変化してよい。例えば、反応条件は、１時間１３０℃であってよく、その後３時間１４０℃に上げられてよい。
【００９９】
リンカーを用いて、ナノ粒子上のカルボキシル官能基と、エクソソーム特異的結合リガンド上のカルボキシル又はアミン末端基の何れかとの間に、アミド又はエステル基が形成されてよい。リンカー又はカップリング剤は、ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）とカルボジイミド、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）や１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含んでよい。ＥＤＣは、アミドカップリング剤として使用するのに好ましいカルボジイミドである。
【０１００】
ある実施例では、カルボキシル末端基とエクソソーム特異的結合リガンドを有する量子ドットナノ粒子が、溶媒中で混合されてよい。ＥＤＣなどのカップリング剤が混合物に添加されてよい。反応混合物はインキュベートされてよい。未精製のエクソソーム特異的結合リガンド−ＱＤナノ粒子コンジュゲートを精製して、コンジュゲートされたＱＤナノ粒子コンジュゲートが得られてよい。
【０１０１】
標準的な固相精製方法が使用されてよい。過剰な未反応エクソソーム特異的結合リガンド及びＥＤＣを除去するために、濾過と適切な溶媒による洗浄とが数サイクル必要なことがある。
【０１０２】
続いて、リアルタイムイメージングのために、ナノ粒子エクソソーム特異的結合リガンドコンジュゲートが哺乳動物又は組織に導入されて、特定のエクソソームが放出される特定の種類の癌が決定又は診断されてよい。例えば、複数の量子ドットナノ粒子の各々は、量子ドットの発光色（例えば、緑色、黄色又は赤色など）に基づいて特定のエクソソーム特異的結合リガンドにコンジュゲートされてよい。特定のエクソソームに結合されると、蛍光により、その種類のエクソソームと、その特定のエクソソームが放出される特定の種類の癌とに関連する可能性がある特有の発光コード（特有の発光フィンガープリント）が得られる。
【０１０３】
エクソソーム特異的結合リガンドコンジュゲートの投与は、経腸的又は非経口的であってよい。例えば、エクソソーム特異的結合リガンドコンジュゲートは、皮下に、静脈内に、筋肉内に、局所的に、経口的に投与されてよい。例としては、ボーラス注射又は静脈内注射が挙げられる。
【０１０４】
［臨床サンプルの調製及び分析］
膵臓癌の診断及びステージが確認された患者から採取された陽性体液試料を、適切な患者の同意及び許可の後に調製する。最初に、膵液、針吸引液、胆汁ブラッシング（biliary brushings）や血漿からのサンプルを未処理の体液として使用し、ＱＤコンジュゲートと混合し、ＱＤ−エクソソーム又はエクソソームタンパク質複合体を捕捉するために固定された二次抗体を有するドットブロット紙に、サンプルを塗布する。蛍光検出法（目視、顕微鏡検査又はプレートリーダ）を用いて信号を確認すると、サンプルの種類が、ラテラルフローアッセイ装置を使用する更なる分析のために得られる。観察される信号が弱い場合には、ゲル濾過スピンカラムを用いたワンステップエクソソーム濃縮ステップが使用できる。更なるマーカーが検出システムに追加されてよい。
【０１０５】
別の実施形態では、リガンド−ナノ粒子コンジュゲートは、インビボで生体に導入される。そのような生体には、原核生物、又は哺乳動物を含む真核生物が挙げられる。リガンド−ナノ粒子コンジュゲートの適切なエクソソーム結合リガンドとしては、これらに限定されないが、例えば、グリピカン−１、ＣＡ１９−９、メソテリン、ＰＤ−Ｌ１、テロメラーゼ、又はそれらの組合せに特異的なエクソソーム特異的結合リガンドが挙げられる。リガンド−ナノ粒子コンジュゲートはエクソソームと接触させられる。リガンド−ナノ粒子コンジュゲートは、インビボで、又は、検出のために組織試料が生体から除去されているとエクスビボで光源によって励起される。リガンド−ナノ粒子コンジュゲートによる発光又は吸光は、測定及び定量化される。検出は、リアルタイムで実行されてよい。
【０１０６】
本発明のこれら及びその他の利点は、本明細書から当業者には明らかであろう。例えば、当業者は、特定の種類の癌に特異的な異なる蛍光波長を放出する複数のエクソソームリガンドコンジュゲートＱＤを、哺乳動物又はその一部に導入することができることを理解するであろう。例えば、赤色を発するＱＤが膵臓癌に特異的である一方で、緑色を発するＱＤが別の種類の癌に特異的であってよい。故に、本発明の広範な発明概念から逸脱することなく、上述の実施形態に変更又は修正を加えることができることを当業者は理解のこと。本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されず、本発明の範囲及び精神の範囲内にあるすべての変更及び修正を含むことを意図していることを理解のこと。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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