(57)【要約】  本発明は、ヒト血漿またはその分画中間体から出発する、ヒトプラスミノーゲンの製造方法を提供する。  この方法の主な段階は、  ・ヒト血漿を、溶媒／界面活性剤の混合物と接触させる、ウイルス不活化工程、  ・単一アフィニティークロマトグラフィー工程、および、  ・ウイルス除去ナノ濾過工程である。  この方法は、工業的レベルまで拡張可能であり、そしていかなるプロテアーゼインヒビターも添加することなく、遺伝的プラスミノーゲン欠乏のためのヒト疾患の処置のために投与するのに適した機能的かつ無傷の最終製品を提供する。
2019534039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血漿またはその分画中間体から出発する、プラスミノーゲンの精製プロセスであって、前記プロセスは、以下を含み：
ｉｉ）ヒト血漿を、溶媒／界面活性剤の混合物と接触させる、ウイルス不活化工程；
ｖ）Ｌ-リジン固定化架橋アガロース樹脂上の単一アフィニティークロマトグラフィー工程；そして
ｉｘ）ウイルス除去ナノ濾過工程；
前記ウイルス不活性化（ｉｉ）は、アフィニティークロマトグラフィーの上流で行われ、そして、前記ナノ濾過（ｉｘ）はアフィニティークロマトグラフィーの下流で行われる、プロセス。
【請求項２】
ウイルス不活性化工程（ｉｉ）の後、かつ、アフィニティークロマトグラフィー工程（ｖ）の前に行われる、ヒマシ油添加工程（ｉｉｉ）をさらに含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
前記アフィニティークロマトグラフィー（ｖ）の下流、および、前記ナノ濾過（ｉｘ）の上流で行われる、限外濾過工程（ｖｉｉ）をさらに含む、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
工程（ｉｉ）で使用される溶媒／界面活性剤の混合物が、以下の組成を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロセス。
１％ｗ／ｗのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ-１００および１％ｗ／ｗのトリ−（ｎ-ブチル）−ホスフェート（ＴｎＢＰ）。
【請求項５】
前記アフィニティークロマトグラフィー樹脂が、ＥＣＨ-リジンセファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項６】
ＥＣＨ−リジンセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂上でのアフィニティークロマトグラフィーのために使用される緩衝液が以下のものである、請求項５に記載のプロセス：
樹脂平衡化のための、リン酸ナトリウム０．０５Ｍ、塩化ナトリウム０．１Ｍ、ｐＨ７．４；
樹脂洗浄用の、リン酸ナトリウム０．０５Ｍ、塩化ナトリウム０．１Ｍ、ｐＨ７．４；
プラスミノーゲン溶出のために、リン酸ナトリウム０．０５Ｍ、ε−アミノカプロン酸０．０５Ｍ、塩化ナトリウム０．１Ｍ、ｐＨ７．４。
【請求項７】
前記ナノ濾過工程（ｉｘ）が、２０ナノメートルのウイルスグレードのフィルターを通して行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項８】
プロテアーゼ阻害剤を使用しない、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、血液製剤の分野、特に、ヒトプラスミノーゲンの精製および製造に関する。
【０００２】
技術水準
プラスミノーゲン（Ｐｇ）は、血漿チモーゲン（ｐｌａｓｍａ  ｚｙｍｏｇｅｎ）として合成され、そして、生理学的活性化剤ウロキナーゼ（ｕＰＡ）または組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）によってセリンプロテアーゼ  プラスミン（Ｐｍ）に変換され、線溶系（ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ）の活性化を引き起こす。
【０００３】
実際、Ｐｍの主なインビボ機能は、フィブリン含有血栓（ｔｈｒｏｍｂｉ）を分解することによって、血管効力（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｏｔｅｎｃｙ）を調節することである。
プラスミノーゲンを合成する主な組織は肝臓であるが、他の起源も確認されている。それらには、副腎（ａｄｒｅｎａｌ  ｇｌａｎｄｓ）、腎臓、脳、精巣、心臓、肺、子宮、脾臓、胸腺、および腸が含まれる。
プラスミノーゲンは、８１０アミノ酸ポリペプチドとして合成される。その天然型は、ＮＨ２−末端グルタミン酸を有し、そして、それは、Ｇｌｕ−Ｐｇと呼ばれる。
成熟型のプラスミノーゲン（７９１アミノ酸）は、分泌中の１９アミノ酸リーダーペプチドの開裂によるものである。
ヒトプラスミノーゲンのプラスミンへの変換は、Ａｒｇ５６１−Ｖａｌ５６２結合の開裂を含み、５６１個のアミノ酸のＮ末端重鎖および２３０個のアミノ酸のジスルフィド架橋されたカルボキシ末端軽鎖を含む、Ｇｌｕ−Ｐｍの生成をもたらす。
【０００４】
プラスミンは、７７位のＮ末端Ｇｌｕ１-Ｐｇの加水分解を触媒し、Ｇｌｕ１-ＰｇをＬｙｓ７８-Ｐｇと呼ばれる別のプラスミノーゲン型に変換する。
この変換は、細胞表面上のＧｌｕ−Ｐｇ活性化における最大の増強にとって重要である。
【０００５】
最初に報告された異常なヒトプラスミノーゲンは、２５年以上前に、血栓症（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｅｖｅｎｔｓ）の既往歴を有するプラスミノーゲン欠乏のヘテロ接合性（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）である患者において報告された。
プラスミノーゲン遺伝子におけるホモ接合型または複合ヘテロ接合型変異（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）は、木質結膜炎（ｌｉｇｎｅｏｕｓ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｉｔｉｓ）または偽膜性疾患（ｐｓｅｕｄｏｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）と呼ばれる角膜（ｃｏｒｎｅａ）、および場合によっては閉塞性水頭症（ｏｃｃｌｕｓｉｖｅ  ｈｙｄｒｏｃｅｐｈａｌｕｓ）に影響を及ぼすと、視覚機能を脅かす重度の炎症を引き起こす。
【０００６】
プラスミノーゲン精製に関するいくつかの方法が、以前に記載されている。
Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｄ．Ｇ．およびＭｅｒｔｚ  Ｅ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９７０、１７０、１０９５−１０９６）は、リジン−セファロース４Ｂ樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーに基づく、ヒト血漿からのプラスミノーゲンの精製方法を記載している。
容量３４０ミリリットルの血漿（水で６４０ミリリットルに希釈）を、１５０ミリリットルの樹脂に通過させ、０．３Ｍリン酸緩衝液および３ｍＭ  ＥＤＴＡで洗浄し、そして、プラスミノーゲンの溶出を、０．２Ｍのε-アミノカプロン酸で行い、そして、ε-アミノカプロン酸は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いて、冷却下に取り除いた。
【０００７】
Ｇｒａｎｔ  Ａ．Ｊ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．１９９０，２０（３）、５１９-５２７）は、ＤｅｕｔｓｃｈおよびＭｅｒｔｚと同様の条件で、二重親和性クロマトグラフィーに基づく方法を記載している。そのプロセスは、血漿中に存在する活性化剤による、プラスミノーゲンのプラスミンへの自発的活性化を防止するために、各精製工程においてプロテアーゼ阻害剤を添加することによって、４℃で実施された。
米国特許第３９４３２４５号明細書は、イオン交換クロマトグラフィーにおけるように、高イオン強度の緩衝液を用いた、セファロース−Ｌ−リジンを使用する改良アフィニティークロマトグラフィーによる、ヒトおよび非ヒト哺乳動物血漿またはコーン画分（Ｃｏｈｎ’ｓ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）ＩＩＩからのプラスミノーゲンの精製を記載している。
【０００８】
ＥＰ０６３８３１４は、０．９％塩化ナトリウムを含有する０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）および、１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）５００ミリリットルで洗浄した、リジン−セファロースカラム上でのアフィニティークロマトグラフィー工程の前に、コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩを、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）ウイルス不活性化工程に付し、コーン画分ＩＩ＋ＩＩＩから出発するプラスミノーゲンの精製、および、吸着されたプラスミノーゲンの溶出を、０．２５Ｍリジンを含有する０．９％グリシン溶液（ｐＨ７．２）を用いて行ったことを記載する。
したがって、凍結乾燥したプラスミノーゲン生成物を、６０℃〜８０℃で、７２時間以上、乾熱処理して、ウイルスを除去または不活化したＬｙｓ型プラスミノーゲン含有組成物を製造した。
【０００９】
本発明の目的は、治療目的でヒトに投与するのに適した、精製され、かつ、ウイルスに対して安全なプラスミノーゲンを得るための、工業的レベルに拡張可能な方法を提供することである。
【００１０】
発明の要約
本発明の主題は、ヒト血漿またはその分画中間体から出発する、プラスミノーゲンの精製方法である。
前記プロセスは、
ｉｉ）ヒト血漿を、溶媒／界面活性剤混合物と接触させるウイルス不活化工程：
ｖ）Ｌ-リジン固定化架橋アガロース樹脂上の単一アフィニティークロマトグラフィー工程：そして、
ｉｘ）ウイルス除去ナノ濾過工程：を含む。
上記ウイルス不活性化（ｉｉ）は、アフィニティークロマトグラフィーの上流で行われ、そして、前記ナノ濾過（ｉｘ）はアフィニティークロマトグラフィーの下流で行われる。
溶媒／界面活性剤処理（ｉｉ）に加えて、エンベロープウイルスから、製品の安全を確実にする、ヒトにおける、治療に適した最終製品を確実にするために、本発明は、また、調製物を、たとえば、ＨＡＶのような小さなエンベロープおよび非エンベロープのウイルスから保護する、ナノ濾過工程（ｉｘ）も含む。
【００１１】
本発明の方法は、プロテアーゼインヒビターのいかなる添加をも必要としない。
以前に報告されたように、プラスミノーゲンの精製のための伝統的な方法は、血漿中にある活性化剤による、プラスミノーゲンのプラスミンへの自発的活性化を防ぐために、プロテアーゼインヒビター（例えばアプロチニン、ＰＭＳＦおよびダイズトリプシンインヒビター）の使用を示唆する。
それに対して、本発明の方法では、防腐剤は添加されず、そして完全に機能的なプラスミノーゲンは、いかなるプロテアーゼインヒビターも全く存在せずに得られる。
本発明によれば、ウイルス不活化され、および高純度のプラスミノーゲン調製物が、ヒト血漿からまたはその分画中間体から出発して得られる。
本明細書に記載の精製方法は、保存剤として、プロテアーゼ阻害剤を添加することなく、機能的で、無傷のＧｌｕ-プラスミノーゲンを製造することを可能にする、効率的で、再現性があり、かつ、工業レベルまで拡張可能である。
樹脂と標的タンパク質との間の特異的相互作用のおかげで、本発明は、高度に純粋なプラスミノーゲン調製物を得るのに十分な、単一のクロマトグラフィーに基づく方法を提供する。
高レベルの純度は、そのようなプラスミノーゲン組成物を、遺伝的プラスミノーゲン欠乏のためのヒト疾患の治療における使用に適したものにする。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明の方法のブロック図は、図１に詳細に記載されている。
本発明によれば、出発物質は、ヒト血漿またはその分画中間体であり得、ここで、分画中間体は、寒冷沈降物（ＣＲＹＯＰＲＥＣＩＰＩＴＡＴＥ）、コーン画分（ＣＯＨＮ  ＦＲＡＣＴＩＯＮ）ＩＩＩまたはコーン画分（ＣＯＨＮ  ＦＲＡＣＴＩＯＮ）ＩＩ＋ＩＩＩを意味する。
一つの特定の、そして好ましい局面によれば、プラスミノーゲン精製のための出発物質は凍結血漿供給源である。
好ましくは、製造の初期段階において、ヒト凍結血漿は、２０±１℃の温度に到達し、そして、加圧ＣＯ２またはＮ２で、ｐＨが７．０〜８．０に調整されるまで、連続撹拌下で解凍される。
【００１３】
本発明によれば、解凍した血漿は、好ましくは１μｍフィルター上の濾過工程（ｉ）により清澄化され、続いて、それは、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）の混合物と接触させるウイルス不活化工程（ｉｉ）に供される。
このステップ（ｉｉ）は、最終製品をエンベロープウイルスから安全に保護することを想定している（ｅｎｖｉｓａｇｅｓ）。
好ましい一態様では、Ｓ／Ｄ混合物は次の組成を有する：
１％ｗ／ｗのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ-１００および１％ｗ／ｗのトリ−（ｎ-ブチル）−ホスフェート（ＴｎＢＰ）。
好ましくは、混合物を３０℃±１℃で血漿に添加し、そして３０分間撹拌する。Ｓ／Ｄ処理は、２８℃±１℃で少なくとも６時間行われる。治療中、ｐＨをモニターし、最終的に７．０〜８．０に調整する。
【００１４】
血漿からのＳ／Ｄ混合物の分離を容易にするために、ウイルス不活性化工程（ｉｉ）の終わりに、好ましくは、ヒマシ油添加工程（ｉｉｉ）が含まれる。
好ましい実施形態では、ヒマシ油濃度は、Ｓ／Ｄ血漿の３〜５％である。
それを、２０℃±１℃で添加し、そして、６０分間撹拌し、次いで、溶液を、プラズマ相からＳ／Ｄ相を分離する目的で、少なくとも１時間静置した。
ヒマシ油を添加すると、血漿濾過性が改善され、その後のクロマトグラフィーの間に、Ｓ／Ｄがカラムに負荷される危険性が減少し、したがって樹脂の完全性が維持される。
【００１５】
前述の工程（ｉｉｉ）の終わりに、血漿は、好ましくは、濾過工程（ｉｖ）にかけられ、そして、従って、３．００〜０．５μｍの深さのフィルターを通して濾過される。
次のアフィニティークロマトグラフィー工程（ｖ）は、高度に架橋された４％アガロースに基づいており、そして、大量のサンプル量の迅速な処理を可能にする、アフィニティー樹脂ＥＣＨ-リジンセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ上で実施されるのが好ましい。
【００１６】
これまで使用されていた、プラスミノーゲンの工業生産には適していない、リジンセファロース４Ｂとは異なり、ＥＣＨ−リジンセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂は、多くの一般的な薬剤を使用して数回の洗浄サイクルに付することができる。したがって、工業レベルでも、樹脂自体の完全性および機能性に影響を与えることなく、完成品の安全性を保証する。
【００１７】
ＥＣＨ-リジンセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを使用する利点は、前記樹脂が、高度に架橋された４％アガロースをベースとしており、従って、工業生産に適した大量のサンプル量の迅速処理を可能にすることである。
Ｌ−リジンを、セファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗに結合された長い親水性スペーサーアーム（スキーム１参照）に共有結合させる、安定なエーテル結合もまた、その完全性および機能性を失うことなく樹脂を数回の洗浄サイクルにかけることを可能にする。
【００１８】
2019534039.tif 000003
【００１９】
プラスミノーゲンがヒトに投与されるように設計されているので、各製造後の樹脂の洗浄は最終製品の安全性にとって不可欠であり、それは交差汚染を回避する。
これに関して、本発明に記載のアフィニティークロマトグラフィーは、洗浄剤に対する不安定性が実証されており、当該樹脂がプラスミノーゲンの工業的製造には適さなくした、以前に使用されたリジンセファロース４Ｂ樹脂の改良を表す。
長期安定性試験により、ＥＣＨ−リジンセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗは、リガンド濃度やプラスミノーゲン結合能のいずれにおいても大きな変化なしに、多くの一般的に使用されている洗浄剤で処理できることが示された。例外は、強塩基条件下での長時間の暴露である。
【００２０】
この方法の工業的スケーラビリティ（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）のためには、最終製品の収率を最大にするために、樹脂の高い結合容量が重要である。
実験の部に示すように、最大３８カラム容量（ＣＶ）の不活性化血漿を、ＥＣＨ−リジンセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂に負荷できる。
したがって、好ましい実施形態では、樹脂の飽和を回避しながら、高いプラスミノーゲン収率を得るために、３０〜３５ＣＶが最適負荷量を表す。
特定の一態様によれば、出発材料は、≦０．１ＭＰａの圧力値で、１５０〜２５０ｃｍ／時間の線形流速比でカラムに負荷される。
より低い流速値は、長い負荷時間を必要とし、確かにこの方法の工業的規模拡大には適さない。
好ましい実施形態では、ＥＣＨ-リジンセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂での、アフィニティークロマトグラフィーに使用される緩衝液は以下の通りである：
・樹脂平衡化のために、リン酸ナトリウム０．０５Ｍ、塩化ナトリウム０．１Ｍ、ｐＨ７．４；
・樹脂洗浄用の、リン酸ナトリウム０．０５Ｍ、塩化ナトリウム０．１Ｍ、ｐＨ７．４：
・プラスミノーゲン溶出のために、リン酸ナトリウム０．０５Ｍ、ε−アミノカプロン酸０．０５Ｍ、塩化ナトリウム０．１Ｍ  ｐＨ７．４。
【００２１】
実験の部に示されるように、アフィニティークロマトグラフィー工程（ｖ）において使用される上記緩衝液（すなわち緩衝液組成物Ｂ）は、他の試験された緩衝液（すなわち緩衝液組成物Ａ）と比較して、より高いプラスミノーゲン収率を得ることを可能にする。
微粒子（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｓ）を除去するために、工程（ｖ）のクロマトグラフィー生成物は、好ましくは、０．２２μｍフィルターを通して、濾過工程（ｖｉ）に付され、次いで、プラスミノーゲン精製は、好ましくは、限外濾過工程（ｖｉｉ）を用いて実行され、眼投与に適した、濃縮透析済みタンパク質溶液（ａ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ  ａｎｄ  ｄｉａｌｙｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を得ることを可能にする。
【００２２】
特に、限外濾過（ｖｉｉ）は、２０〜２５容量の生理食塩水（０．１Ｍ塩化ナトリウム）を用いて、３０，０００ダルトンの透析カセットを用いて、ε-アミノカプロン酸を除去することによって行われる。次に、系を、０．１Ｍの塩化ナトリウムで洗浄して、０．７〜１．３ミリグラム／ミリリットルのタンパク質濃度にする。
ｐＨを、７．１±０．７に調整した後、プラスミノーゲン溶液は、好ましくは、０．１μｍフィルターを通して濾過工程（ｖｉｉｉ）に付し、続いて、ウイルス除去工程（ｉｘ）、すなわちナノ濾過に付す。
好ましい一態様では、ナノ濾過（ｉｘ）は、２０ナノメートルのウイルスグレードのフィルターを通す濾過を含む。
次いで、調製物は、好ましくは、０．２２μｍフィルター（ｘ）を通して、滅菌濾過し、こうして得られたプラスミノーゲンバルクを、≦−２０℃の温度で保存する。
エンベロープウイルスから、製品の安全を保証する、溶媒／界面活性剤処理（ｉｉ）の他に、ナノ濾過工程（ｉｘ）は、例えばＨＡＶのような小さなエンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスから保護する。
このウイルス除去手順は、確かにこれまでに文献に記載されているものと比較して、プラスミノーゲン精製プロセスの改善を可能にする。
【００２３】
Ｇｒａｎｔにより報告されているように、伝統的な精製方法は、最終製品におけるプラスミノーゲンの完全性を確実にし、そして、その活性化を防ぐために、プロテアーゼインヒビター（例えばアプロチニン、ＰＭＳＦおよびダイズトリプシンインヒビター）の使用を示唆する。
それとは反対に、本発明の方法は、保存剤を添加することなく、完全に機能的なプラスミノーゲンを得ることを可能にし、したがって、その悪影響を回避する。
プラスミノーゲンは、完全に、その完全性を保持し、そして実験の部に示されるように、アプロチニンの有無にかかわらず得られたプラスミノーゲン間の同等性（ｃｏｍｐａｒａｂｉｌｉｔｙ）試験は、プラスミノーゲン抗原にも、その活性および収率にも差がないことを示す。
【００２４】
別の好ましい態様では、本明細書に記載のプラスミノーゲン調製物は、主にＧｌｕ−Ｐｇの形態であり、これは血漿中のプラスミノーゲンの優勢な形態を表す。
Ｇｌｕ−Ｐｇの循環半減期は、Ｌｙｓ−Ｐｇよりも非常に高いので、本発明は、ヒトにおける治療に適したプラスミノーゲン調製物を得るための方法を提供する。
さらなる詳細は、以下の実施例に提供される。
当該実施例は、方法を明確にするのに有用であり、そして、それを、いかようにも限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、原料から、プラスミノーゲン最終製品を得るまでの、本発明の方法の好ましい一実施形態の概略ブロック図を示す。
【図２】図２は、ＥＣＨ−リジンセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂の最大結合容量を、カラム容量（ＣＶ）で示したものである。プラスミノーゲン活性は、プール血漿（ｐｏｏｌ  ｐｌａｓｍａ）中に見いだされる元の活性の少なくとも１０％に達するまで、通過画分（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）で評価した。
【図３】図３は、表２に報告されているように、緩衝液組成物Ａ対緩衝液組成物Ｂによって行われた、クロマトグラフィー工程の代表的なＳＤＳ-ＰＡＧＥを示す。
【図４】図４は、クロマトグラフィー緩衝液組成物Ａ対緩衝液組成物Ｂによって、アプロチニンの存在下または非存在下で得られたプラスミノーゲンの代表的なウエスタンブロットを示す。
【００２６】
実験の部
実施例１
カラム容量（ＣＶ）による樹脂の結合能
工業レベルまで拡張可能なクロマトグラフィーの最も重要な側面の一つは、生成物の機能性を変えることなく、収率を最大にすることを目的とした高い結合能である。
ＥＣＨ-リジンセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（直径１６ｍｍ×高さ１５±１ｃｍ、１ＣＶは３０ミリリットルのカラムに充填）の最大結合能を同定するために、１．３キログラムのＳ／Ｄ血漿にヒマシ油を添加し、次いで３．００〜０．５μｍの深さのフィルターを通して濾過し、５０ｃｍ／ｈでそのような樹脂上に負荷した。
通過画分（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）（ＦＴ）で、プラスミノーゲン活性を、それがプール血漿中に見出される元の活性の少なくとも１０％に達するまで分析した。
図２に示すように、３８ＣＶまでは通過画分（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）（ＦＴ）において、プラスミノーゲン活性は観察されなかったが、３９ＣＶから開始して記録された。
１０または３２ＣＶを負荷して実施された実験は、プラスミノーゲン抗原に関しても、溶出画分、すなわちＰＬＧ１における活性に関しても、何も有意差が見出されなかったことを示した（表１）。
それ故、ＥＣＨ-リジンセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗの結合能は、３８ＣＶであると確立されたが、高いプラスミノーゲン収率を保証し、そして、樹脂飽和を回避する負荷容量は、３０〜３５ＣＶの間に設定された。
この実験によって、３〜３．５ミリグラムプラスミノーゲン／ミリリットル排出樹脂の間の結合能となった。
【００２７】
実施例２
負荷と溶出条件の最適化
クロマトグラフィーに試料を負荷する工程は、最初に、５０ｃｍ／ｈで行われた。高負荷容量（３０〜３５ＣＶ）の場合、このような流速は、クロマトグラフィーの持続時間が長くなり、工業的方法には適さない。
これに関しては、低い背圧（ｌｏｗ  ｂａｃｋ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）を維持しながら、負荷流量を２００ｃｍ／ｈまで増加させ、それにより、工程時間を、７時間から２時間未満に減少させた。この条件では、プラスミノーゲン収率の８０．３５％から７０％への減少が観察され（表１）、したがって、緩衝液の組成に関するさらなる最適化を調査する必要があった。
【００２８】
最初に使用した緩衝液の組成物、すなわち組成物Ａを、組成物Ｂで置き換えたが、これは主に、ＥＤＴＡの不存在の点で異なっており（表２）、負荷量および流速は変化しなかった。
表１に示すように、緩衝液組成物Ｂを使用すると、洗浄画分中のプラスミノーゲンの損失が減少し、そして、同時に、溶出画分中のプラスミノーゲン収率が、９０．４０％まで著しく改善された。
この結果は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）分析によって確認された（図３）。
緩衝液組成物Ａを用いて行われた洗浄工程は、プラスミノーゲンの分子量に対応するバンドを示し、この工程中のプラスミノーゲンの損失を実証した。そのようなバンドは、緩衝液組成物Ｂを用いて行われた洗浄工程の場合には見えなかった。
さらに、緩衝液組成物Ｂは、洗浄工程における主たる汚染物アルブミンの除去を有意に増加させ、したがって、溶出画分中のその含有量を減少させた（表１）。
【００２９】
最適化されたクロマトグラフィー条件は以下の通りであった。
・３０〜３５ＣＶの負荷量；
・２００ｃｍ／ｈの流速；
・緩衝液組成物Ｂ
【００３０】
【表１】
2019534039.tif 000004
2019534039.tif 000005
【００３１】
【表２】
2019534039.tif 000006
【００３２】
実施例３-プロテアーゼ阻害剤の有無
その方法が、プロテアーゼ阻害剤のような、任意の保存剤の不在下で、完全に機能的なプラスミノーゲンを得ることを可能にするかどうかを確かめるために、１μｍの清澄濾過（ｃｌａｒｉｆｙｉｎｇ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行う前に、解凍した血漿に、ウシアプロチニン（２０ＫＩＵ／ミリリットル）を添加しておよび添加せずに、両方にて精製を行った。
表１に示すように、アプロチニンの非存在は、プラスミノーゲン抗原、活性および収率を変化させなかった。さらに、溶出画分中のアルブミン含有量の増加が観察されたが、それは有意ではなかった。
図４は、アプロチニンの存在下または非存在下で、緩衝液組成物Ａ対緩衝液組成物Ｂを用いて行った、クロマトグラフィーと比較した、ウエスタンブロット分析から得られた結果を示す。
分析された試料のいずれも、プラスミンに対応する活性化バンドを示さず、アプロチニンの不存在下でさえ、プラスミノーゲンは完全にその完全性を保存したことを実証した。
【００３３】
実施例４
Ｇｌｕ-Ｐｇに対するＥＬＩＳＡ
血漿中を循環するＧｌｕ−Ｐｇの半減期が、Ｌｙｓ−Ｐｇと呼ばれる他のプラスミノーゲン型よりもはるかに高いことはよく知られている。
本発明で得られたプラスミノーゲンの形態を調べるために、Ｇｌｕ−Ｐｇ形態のみを認識することができる特異的抗体を用いて、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を、完成品に対して行った。
表３に示すように、このような実験は、アプロチニンの存在下および非存在下の両方で、緩衝液組成物Ｂを用いて行われたクロマトグラフィー精製が、９８％以上のプラスミノーゲンがＧｌｕ-Ｐｇの形態である最終生成物を提供することを示した。
【００３４】
【表３】
2019534039.tif 000007
【００３５】
実施例５
プロセスの最良の実施形態
ヒト凍結血漿（１．８８キログラム）を、温度が２０℃に達するまで連続的に攪拌しながら解凍した。ＣＯ２で、ｐＨを７．５に調整し、そして、１μｍフィルターで濾過した後、１．７４キログラムの解凍血漿をウイルス不活性化工程に付した。
１％ｗ／ｗのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ-１００（１７．４４ｇ）および１％ｗ／ｗのＴｎＢＰ（１７．４４ｇ）を含む、Ｓ／Ｄ混合物を、３０℃で添加し、そして、３０分間撹拌した。
Ｓ／Ｄ処理を、２８℃で、６時間実施し、そしてこの時間の終わりに、６５．８ｇのヒマシ油（３．７％のＳ／Ｄ血漿）を、２０℃にて、撹拌条件下で、６０分間で添加した。
次いで、Ｓ／Ｄ相を、血漿相から分離するために、溶液を、１時間静置した。
３．００〜０．５μｍの深さのフィルターを通して濾過した後、１．０キログラムのＳ／Ｄプラズマを、アフィニティー樹脂ＥＣＨ-リジンセファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（直径１６ｍｍ×高さ１５ｃｍのカラムに充填された）に負荷した。負荷された血漿量は、３３ＣＶに相当した。
線形流速は、２００ｃｍ／ｈであり、そして、使用した緩衝液は表２に記載したのと同じであった（緩衝液組成物Ｂ）。
クロマトグラフィー生成物（０．０３５キログラム）を、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、そして、ε-アミノカプロン酸を除去するために、３０，０００ダルトン透析カセットを使用することにより、２０〜２５容量の食塩水（０．１Ｍ塩化ナトリウム）で限外濾過を行った。
その後、その系を、タンパク質濃度を１．２ミリグラム／ミリリットルに調整した、０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄し、そして、こうして得られたプラスミノーゲン溶液（０．０７キログラム）を、０．１μｍフィルターを用いて濾過した。
続いて、ウイルス除去工程を、２０ナノメートルのウイルスグレードのナノフィルターＰｌａｎｏｖａ  ２０Ｎに溶液を通過させることによって実施し、そして最後の滅菌濾過の後、プラスミノーゲンバルク調製物（０．０７キログラム）を、-２０℃の温度で保存した。
得られたプラスミノーゲンの９８％超がＧｌｕ-Ｐｇであった。
【図１】
2019534039.tif 000008
【図２】
2019534039.tif 000009
【図３】
2019534039.tif 000010
【図４】
2019534039.tif 000011
【国際調査報告】
2019534039.tif 000012
2019534039.tif 000013