(57)【要約】  本発明は、大腸癌を有する治療対象体の分類、予後の予測のため、及び治療法の決定を導くための客観的かつ定量的な方法における使用のための遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ、ＫＬＫ６及びＭＵＣ２を含む分子バイオマーカーの群を提供する。より具体的には、本発明は、治療対象体から得られた所属リンパ節、原発性腸腫瘍、血液又は糞便試料における遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ、ＫＬＫ６及び／又はＭＵＣ２の遺伝子発現レベルを決定することを含む、治療対象体の大腸癌の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定するための方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療対象体の大腸癌の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定する方法であって、工程：
ａ）前記治療対象体から得られた所属リンパ節試料における遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３及びＰＯＳＴＮの遺伝子発現レベルを決定すること、及び
ｂ）工程ａ）で決定された前記遺伝子発現レベルを参照罹患体集団における同じ遺伝子の参照遺伝子発現レベルと比較すること
を含み、
前記遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３及びＰＯＳＴＮの前記参照と比較して高い前記発現レベルは、増加した転移能及び／又は腫瘍の侵攻性と関連付けられる、
方法。
【請求項２】
工程：
ａ）前記治療対象体から得られた所属リンパ節試料における遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ及びＫＬＫ６の遺伝子発現レベルを決定すること、及び
ｂ）工程ａ）で決定された前記遺伝子発現レベルを参照罹患体集団における同じ遺伝子の参照遺伝子発現レベルと比較すること、
を含み、
前記遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ及びＫＬＫ６の前記参照と比較して高い前記発現レベルは、増加した転移能及び／又は腫瘍の侵攻性と関連付けられる、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程：
ａ）前記治療対象体から得られた所属リンパ節試料における遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ及びＭＵＣ２の遺伝子発現レベルを決定すること、及び
ｂ）工程ａ）で決定された前記遺伝子発現レベルを参照罹患体集団における同じ遺伝子の参照遺伝子発現レベルと比較すること、
を含み、
前記遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ及びＭＵＣ２の前記参照と比較して高い前記発現レベルは、増加した転移能及び／又は腫瘍の侵攻性と関連付けられる、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程：
ａ）前記治療対象体から得られた所属リンパ節試料における遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ、ＫＬＫ６及びＭＵＣ２の遺伝子発現レベルを決定すること、及び
ｂ）工程ａ）で決定された前記遺伝子発現レベルを参照罹患体集団における同じ遺伝子の参照遺伝子発現レベルと比較すること
を含み、
前記遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ、ＫＬＫ６及びＭＵＣ２の前記参照と比較して高い前記発現レベルは、増加した転移能及び／又は腫瘍の侵攻性と関連付けられる、
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
工程：
ｃ）前記試料における遺伝子ＣＥＡＣＡＭ５の遺伝子発現レベル及び１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルを決定すること
ｄ）工程ａ）及びｃ）で得られた結果に基づいて、ＳＬＣ３５Ｄ３／ＣＥＡＣＡＭ５、ＫＬＫ６／ＣＥＡＣＡＭ５、ＰＯＳＴＮ／１８ＳｒＲＮＡ及びＭＵＣ２／ＣＥＡＣＡＭ５の比率を計算すること、
ｅ）工程ｂ）で得られた前記比率に、当該比率が前記参照罹患体集団における同じ比率に基づくカットオフ値よりも大きいかどうかに基づいて、（＋１）又は（０）の値を与えること、ここで、カットオフ値より高い前記比率は（＋１）の値を得、カットオフ値より低い前記比率は（０）の値を得、及び
ｆ）工程ｅ）で得られた前記比率を用いて、及び式［Ａ＝ＳＬＣ３５Ｄ３／ＣＥＡＣＡＭ５＋ＫＬＫ６／ＣＥＡＣＡＭ５＋ＰＯＳＴＮ／１８ＳｒＲＮＡ−ＭＵＣ２／ＣＥＡＣＡＭ５］を用いて指標Ａを計算すること
を更に含み、
指標（＋３）は非常に高い転移能及び／又は腫瘍の侵攻性と関連付けられ、指標（＋２）及び（＋１）は高い転移能及び／又は腫瘍の侵攻性と関連付けられ、指標（０）及び（−１）は低い転移能及び／又は腫瘍の侵攻性と関連付けられる、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記カットオフ値は、前記参照罹患体集団の７番目の十分位数の比率であるか、前記参照罹患体集団の３番目の四分位数の比率であるか、又は前記参照罹患体集団の８番目の十分位数の比率である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
治療対象体の大腸癌の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定する方法であって、
ａ）治療対象体から得られた原発性腸腫瘍、血液又は糞便試料における遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＫＬＫ６、ＭＵＣ２及びＣＥＡＣＡＭ５の遺伝子発現レベルを決定すること、
ｂ）工程ａ）で得られた結果に基づきＳＬＣ３５Ｄ３／ＣＥＡＣＡＭ５、ＫＬＫ６／ＣＥＡＣＡＭ５及びＭＵＣ２／ＣＥＡＣＡＭ５の比率を計算すること、及び
ｃ）工程ａ）で決定された前記比率を参照罹患体集団における同じ遺伝子発現レベルから計算された参照比率と比較すること
を含み、
ＳＬＣ３５Ｄ３／ＣＥＡＣＡＭ５及びＫＬＫ６／ＣＥＡＣＡＭ５の前記参照と比較して高い前記比率は、増加した転移能及び／又は腫瘍の侵攻性と関連付けられ、ＭＵＣ２／ＣＥＡＣＡＭ５の前記参照と比較して高い前記比率は、減少した転移能及び／又は腫瘍の侵攻性に関連付けられる、
方法。
【請求項８】
前記遺伝子発現レベルは、前記遺伝子から発現されるｍＲＮＡの量を定量することによって決定される、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍＲＮＡの量は、ハイブリダイゼーション、配列決定又は定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｍＲＮＡの量は、マイクロアレイ及びビーズアレイ技術、トランスクリプトーム配列決定、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ、多重定量的ＲＴ−ＰＣＲから選択される方法の使用によって決定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｍＲＮＡの量は、ＲＮＡ又はＤＮＡコピー標準を使用して決定される、請求項８〜１０の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
大腸癌と診断され、腫瘍を有する治療対象体の予後を決定するための方法であって、当該方法は、工程：
ａ）請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法を用いて前記転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定すること、及び
ｂ）前記転移能及び／又は腫瘍の侵攻性が低い場合、前記治療対象体が良好な予後を有すると決定し、或いは
前記転移能及び／又は腫瘍の侵攻性が高い場合、前記治療対象体が不良な予後を有すると決定すること
を含む方法。
【請求項１３】
前記不良な予後は前記良好な予後と比較して生存の可能性が低下する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
大腸癌と診断され、腫瘍を有する治療対象体の治療法を決定する方法であって、当該方法は、工程：
ａ）請求項１〜１１の何れか１項に記載の方法を用いて前記転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定すること、及び
ｂ）工程ａ）で得られた結果に基づいて、前記治療対象体の治療法を決定することを含む方法。
【請求項１５】
前記治療法を決定することは、術後治療を行うか、又は術後治療をやめることである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療法は、高い転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を有すると決定された罹患体へ術後治療、例えば、化学療法を行うことである請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療法は、低い転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を有する罹患体への術後治療をやめることである請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
大腸癌と診断された治療対象体の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定するためのキットであって、遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３及びＰＯＳＴＮの遺伝子発現レベルを決定するための核酸プライマー及びプローブを含むキット。
【請求項１９】
遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ及びＫＬＫ６の遺伝子発現レベルを決定するための核酸プライマー及びプローブを含む請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ及びＭＵＣ２の遺伝子発現レベルを決定するための核酸プライマー及びプローブを含む請求項１７に記載のキット。
【請求項２１】
遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ、ＫＬＫ６及びＭＵＣ２の遺伝子発現レベルを決定するための核酸プライマー及びプローブを含む請求項１７に記載のキット。
【請求項２２】
遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ、ＫＬＫ６、ＭＵＣ２及びＣＥＡＣＡＭ５の遺伝子発現レベルを決定するための核酸プライマー及びプローブを含む請求項１７に記載のキット。
【請求項２３】
核酸プライマー及びプローブは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択される、請求項１７〜２１の何れか１項に記載のキット。
【請求項２４】
ｍＲＮＡ、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡコピー標準をさらに含む請求項１７〜２２の何れか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、癌、特に大腸癌の分類、予後診断及び治療の分野に関する。
【背景】
【０００２】
大腸癌（ＣＲＣ）は、世界の癌患者の死亡率の２番目に主要な原因であり、また世界で３番目に多く診断される癌である。それは、医療システムへの多大な負担を意味する。ＣＲＣの最も重要な予後特性は、リンパ節転移の有無である（Chang G. J. et al. J. Natl. Cancer Inst., vol.99, p. 433-441 (2007)；Iddings D. and Bilchik A. J. Surg. Oncol., vol. 96, p. 671-677 (2007)；Nicastri D. G. et al. J. Mol. Diagn., vol. 9, p. 563-571 (2007)）。関連するリンパ節は、罹患体が治療のために切除を受けた場合にのみ、調査用に利用可能である。そのため、切除された腫瘍標本におけるリンパ節の状態の完全な決定が重要である。現在のところ、腫瘍細胞陽性のリンパ節を有する、即ち、ステージＩＩＩＣＲＣ（ａｎｙＴＮ１−２Ｍ０）の罹患体の約５０％、及び腫瘍細胞陽性のリンパ節が検出されない、即ち、ステージＩ（Ｔ１−２Ｎ０Ｍ０）及びステージＩＩ（Ｔ３−４Ｎ０Ｍ０）の罹患体の約２５％が再発するであろう（Boeckelman C. et al. Acta Oncol., vol. 54, p. 5-16 (2015)）。これらの結果は、リンパ節内の腫瘍細胞は侵攻性が異なり得ること、また、多くの場合、現在の標準的な方法では節における腫瘍細胞の存在が見逃されることが多いことを強く示唆している。したがって、１）リンパ節内の腫瘍細胞の存在を正確に検出すること、及び２）それらの転移能、即ち、それらの侵攻性を決定することが最も重要である。リンパ節の状態の決定の改善、Ｎ−ステージ決定及び拡散する腫瘍細胞における侵攻性パラメータの導入により、改善されたステージ決定が達成されるであろうし、それによってステージＩ及びＩＩの罹患体の不十分な治療及びステージＩＩＩの罹患体の過度な治療が防止される。更に、リンパ節に腫瘍細胞を有する罹患体を再発及び癌死の危険性の違いに従ってサブグループに分類することが可能な場合、この情報は、現存の薬剤による治療だけでなく、新薬の開発、新しい治療スケジュール並びに再発の危険性に合わせた追跡治療スケジュール等にも用いられ得る。
【０００３】
臨床診療において、リンパ節転移の有無は、現在、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色された、切除された所属リンパ節の組織切片の組織病理学的検査によって決定される。現在のガイドラインでは、少なくとも１２個のリンパ節を検査するべきであることを要求している（Tsai H. L. et al. BMC Surg., vol. 16, p. 17 (2016)）。ＴＮＭ分類においては、Ｎ１は１〜３個の検査された節が腫瘍細胞の存在について陽性であったことを示し、Ｎ２は４〜６個の節が陽性であったことを意味する。Ｎ２の罹患体はＮ１の罹患体よりも不良な予後を有する。さらに、リンパ節比率、即ち検査されたリンパ節の総数に対する陽性リンパ節の数は、重要な予後因子であり、比率が高いほど予後は不良である（Parnaby C. N. et al, Br. J. Cancer, vol. 113, p. 212-219 (2015)）。腫瘍細胞が通常の方法によって見逃される主な理由は、試料サイズが小さすぎること及び感度が不適切であることの２重の要素からなる。組織切片のＨ＆Ｅ染色によって、せいぜいリンパ節の体積のほんの数％のみが検査される。別の方法は、このタイプの全ての腫瘍細胞で発現される１つ又は幾つかのバイオマーカーのｍＲＮＡレベルを決定すること、及びリンパ節全体か、又は道義上が現在の選択肢であるため、節の半分からＲＮＡを抽出することである。コピー標準を用いたリアルタイム定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析は、バイオマーカーのｍＲＮＡ分析にとって最も有用な方法であることが示されている。それは高感度、客観的、定量的であり、且つ自動化のために改変可能である。バイオマーカーである癌胎児性抗原（ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５）のｍＲＮＡ分析は、大腸に由来する腫瘍細胞の検出に非常に有用であることが見出された。このバイオマーカーは、現在の代表的な標準、即ちＨ＆Ｅ染色切片の組織病理検査によって検出されなかった、リンパ節内に腫瘍細胞を有するステージＩ及びステージＩＩ罹患体の同定を可能にした（Ohlsson L. et al. Br. J. Cancer, vol. 95, p. 218-225 (2006)；Ohlsson L. et al. Int. J. Cancer, vol. 130, p. 1833-1843 (2012)）。このような罹患体のうち幾らかは、再発疾患で死亡している（Ohlsson L. et al. Br. J. Cancer, vol. 95, p. 218-225 (2006)；Ohlsson L. et al. Int. J. Cancer, vol. 130, p. 1833-1843 (2012)）。したがって、このマーカーを使用することにより、代表的な標準のみと比較してより洗練された分類が得られた。バイオマーカーであるサイトケラチン２０（ＣＫ２０）もまた、幾分感度に劣るがこの目的において有用である（Ohlsson L. et al. Br. J. Cancer, vol. 95, p. 218-225 (2006)）。現在のところ、侵攻性マーカー、即ちカリクレイン関連ペプチダーゼ６（ＫＬＫ６）の特性を示す、公開されているＣＲＣ用のマーカーは１つだけである（Ohlsson L. et al. Br. J. Cancer, vol. 107, p. 150-157 (2012)）。これは、ＣＲＣ腫瘍細胞で異所的に発現され、増加する侵攻性を伴って増加するレベルで発現するようである。
【０００４】
一般的に受け入れられているＣＲＣにおける遠隔転移の進行の経路は、腫瘍細胞がリンパ管を介して結腸又は直腸内の原発部位を離れ、まず所属リンパ節に定着し、その後肝臓のような遠隔部位に広がることである。それは、最終的に罹患体を死亡させる遠隔転移である。この経路の証拠は、所属リンパ節内の腫瘍細胞の存否が、ＣＲＣ死又は生存についての最も優れた予後マーカーであるという事実である。
【０００５】
本発明は、１）ＣＲＣのための２つの新規の侵攻性バイオマーカーの同定に関する。１つはＣＲＣ腫瘍細胞自身において発現され、もう１つはリンパ節の微小環境における支持細胞で発現する。本発明はまた、２）リンパ節の状態を決定するための方法に関し、当該方法は、リンパ節内の腫瘍細胞の存否を正確に検出することに加え、これらの細胞の侵攻性に関する情報を提供する。提案した方法においては、２つの新しいバイオマーカー及び前述した３つのバイオマーカーの定量的ｍＲＮＡレベルが決定される。ＣＲＣリンパ節分析に用いる場合、リンパ節の関与を正確に決定し、一次治療、即ち腫瘍の外科的切除後の再発及び癌死の危険性に関する異なるリスク群にＣＲＣ罹患体を分類することを可能にするであろう。この目標は今まで達成することができていなかった。
【発明の概要】
【０００６】
発明の目的
大腸癌を有する治療対象体の分類、予後予測及び治療法の決定の方向付けにおいてに有用な分子バイオマーカーの群を提供することが、本発明の目的である。
【０００７】
治療対象体の大腸癌を分類するため、ならびに治療対象体の予後を予測するためにこの分類を使用するため及び治療対象体の治療法の決定を行うための客観的かつ定量的方法を提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【０００８】
発明の説明
本発明者らは、治療対象体の大腸癌の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定するために用いることができる分子バイオマーカーとしての遺伝子である溶質輸送体ファミリー３５メンバーＤ３（ＳＬＣ３５Ｄ３）（ジェンバンクＮＭ＿００１００８７８３）及びペリオスチン、骨芽細胞特異的因子（ＰＯＳＴＮ）（ジェンバンクＮＭ＿００６４７５）の発現レベルを同定した。
【０００９】
転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定するために、遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３及びＰＯＳＴＮの発現レベルは、好ましくは遺伝子、リクレイン関連ペプチダーゼ６（ＫＬＫ６）（ジェンバンクＮＭ＿００２７７４）の発現レベルと一緒に用いられ得、より好ましくは遺伝子ムチン２、オリゴマー粘液／ゲル形成（ＭＵＣ２）（ジェンバンクＮＭ＿００２４５７）の発現レベルとも一緒に用いられ得る。
【００１０】
本方法は、治療対象体から得られた所属リンパ節試料、又は治療対象体から得られた原発性腸腫瘍、血液、及び／又は糞便試料における遺伝子発現レベルを決定するために適用することができる。
【００１１】
これらの遺伝子発現レベルは遺伝子癌胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）（ジェンバンク ＮＭ＿００４３６３）の発現レベルに関連し得、これは知られた腫瘍マーカーであり、及び／又は１８ＳｒＲＮＡのレベルに関連する。
【００１２】
したがって、本発明の１つの様態は、次の工程を含む、治療対象体の大腸癌の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定するための方法を提供する：
ａ）治療対象体から得られた所属リンパ節試料における遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３及びＰＯＳＴＮの遺伝子発現レベルを決定すること、及び
ｂ）工程ａ）で決定された遺伝子発現レベルを参照罹患体集団における同じ遺伝子の参照遺伝子発現レベルと比較すること
ここで、遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３及びＰＯＳＴＮの参照と比較して高い発現レベルは、増加した転移能及び／又は腫瘍の侵攻性と関連付けられる。
【００１３】
好ましくは当該方法は、前記試料における遺伝子ＫＬＫ６の遺伝子発現レベルを決定することを更に含み得る。
【００１４】
したがって、１つの実施形態において、本発明の第１の様態は、次の工程を含む治療対象体の大腸癌の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定するための方法を提供する：
ａ）治療対象体から得られた所属リンパ節試料における遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ及びＫＬＫ６の遺伝子発現レベルを決定すること、及び
ｂ）工程ａ）で決定された遺伝子発現レベルを参照罹患体集団における同じ遺伝子の参照遺伝子発現レベルと比較すること
ここで、遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ及びＫＬＫ６の参照と比較して高い発現レベルは、増加した転移能及び／又は腫瘍の侵攻性と関連付けられる。
【００１５】
好ましくは当該方法は、前記試料における遺伝子ＭＵＣ２の遺伝子発現レベルを決定することを更に含み得る。
【００１６】
したがって、他の実施形態において、本発明の第１の様態は、次の工程を含む治療対象体の大腸癌の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定するための方法を提供する：
ａ）治療対象体から得られた所属リンパ節試料における遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ、ＫＬＫ６及びＭＵＣ２の遺伝子発現レベルを決定すること、及び
ｂ）工程ａ）で決定された遺伝子発現レベルを参照罹患体集団における同じ遺伝子の参照遺伝子発現レベルと比較すること、
ここで、遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ、ＫＬＫ６及びＭＵＣ２の参照と比較して高い発現レベルは増加した転移能及び／又は腫瘍の侵攻性と関連付けられる。
【００１７】
好ましくは当該方法は、次の工程を更に含み得る：
ｃ）前記試料における遺伝子ＣＥＡＣＡＭ５の遺伝子発現レベル及び１８Ｓ ｒＲＮＡのレベルを決定すること、
ｄ）工程ａ）及びｃ）で得られた結果に基づいて、ＳＬＣ３５Ｄ３／ＣＥＡＣＡＭ５、ＫＬＫ６／ＣＥＡＣＡＭ５、ＰＯＳＴＮ／１８ＳｒＲＮＡ、及びＭＵＣ２／ＣＥＡＣＡＭ５の比率を計算すること、
ｅ）工程ｂ）で得られた比率に、前記比率が前記参照罹患体集団における同じ比率に基づくカットオフ値よりも大きいかどうかに基づいて、（＋１）又は（０）の値を与えること、ここで、カットオフ値より高い比率は（＋１）の値を得、カットオフ値より低い比率は（０）の値を得、及び
ｆ）式［Ａ＝ＳＬＣ３５Ｄ３／ＣＥＡＣＡＭ５＋ＫＬＫ６／ＣＥＡＣＡＭ５＋ＰＯＳＴＮ／１８Ｓ ｒＲＮＡ−ＭＵＣ２／ＣＥＡＣＡＭ５］を用いて、工程ｅ）で得られた比率を用いて指標を計算すること、
ここで、指標（＋３）は、非常に高い転移能及び／又は腫瘍の侵攻性と関連付けられ、指標（＋２）及び（＋１）は、高い転移能及び／又は腫瘍の侵攻性と関連付けられ、指標（０）及び（−１）は、低い転移能及び／又は腫瘍の侵攻性と関連付けられる。
【００１８】
前記カットオフ値は、前記参照罹患体集団の７番目の十分位数の比率であるか、前記参照罹患体集団の３番目の四分位数の比率であるか、又は前記参照罹患体集団の８番目の十分位数の比率であり得る。
【００１９】
当該方法は、インビトロ及び／又はエクスビボで行うことができる。
【００２０】
当該方法は、治療を必要とする治療対象体の大腸癌を治療する追加の工程を更に含み得る。
【００２１】
他の様態において、本発明は、以下を含む、治療対象体の大腸癌の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定する方法を提供する；
ａ）治療対象体から得られた原発性腸腫瘍、血液又は糞便試料における遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＫＬＫ６、ＭＵＣ２及びＣＥＡＣＡＭ５の遺伝子発現レベルを決定すること、
ｂ）工程ａ）で得られた結果に基づき、比率ＳＬＣ３５Ｄ３／ＣＥＡＣＡＭ５、ＫＬＫ６／ＣＥＡＣＡＭ５及びＭＵＣ２／ＣＥＡＣＡＭ５を計算すること、及び
ｃ）工程ｂ）で決定された比率を参照罹患体集団における同じ遺伝子の発現レベルから計算された参照比率と比較すること、
ここで、ＳＬＣ３５Ｄ３／ＣＥＡＣＡＭ５及びＫＬＫ６／ＣＥＡＣＡＭ５の参照と比較して高い比率は、増加した転移能及び／又は腫瘍の侵攻性と関連付けられ、ＭＵＣ２／ＣＥＡＣＡＭ５の参照と比較して高い比率は減少した転移能及び／又は腫瘍の侵攻性に関連付けられる。
【００２２】
当該方法は、インビトロ及び／又はエクスビボで行うことができる。
【００２３】
当該方法は、治療を必要とする治療対象体の大腸癌を治療する追加の工程を更に含み得る。
【００２４】
本発明に従うと遺伝子発現レベルは前記遺伝子から発現されるｍＲＮＡの量を定量することによって決定され得る。
【００２５】
ｍＲＮＡの量は、ハイブリダイゼーション、配列決定又は定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定され得る。
【００２６】
より具体的には、ｍＲＮＡの量は、マイクロアレイ及びビーズアレイ技術、トランスクリプトーム配列決定、リアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ、多重定量的ＲＴ−ＰＣＲから選択される方法の使用によって決定され得る。
【００２７】
当該方法によれば遺伝子発現レベルはＲＮＡ又はＤＮＡコピー標準を使用して決定され得、及び／又は１８Ｓ ｒＲＮＡレベルは１８ＳｒＲＮＡ標準を使用して決定され得る。
【００２８】
本発明の他の様態は、大腸癌と診断された治療対象体の予後を決定するための方法を提供する。この方法は、本発明に従う方法を用いて治療対象体の大腸癌の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定することを含み得る。この方法は、転移能及び／又は腫瘍の侵攻性が低い場合に治療対象体が良好な予後を有すると決定し、或いは転移能及び／又は腫瘍の侵攻性が高い場合に治療対象体が不良な予後を有すると決定することを含み得る。不良な予後は良好な予後と比較して生存の可能性が低下し得る。
【００２９】
当該方法は、インビトロ及び／又はエクスビボで行うことができる。
【００３０】
当該方法は、治療を必要とする治療対象体の大腸癌を治療する追加の工程を更に含み得る。
【００３１】
本発明の他の様態は、大腸癌と診断され、腫瘍を有する治療対象体のための治療法を決定するための方法を提供する。当該方法は、本発明に従う方法を用いて治療対象体の大腸癌の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定すること、及び決定された転移能及び／又は腫瘍の侵攻性に基づいて、前記治療対象体に対する治療法を決定することを含み得る。
【００３２】
当該方法は、インビトロ及び／又はエクスビボで行うことができる。
【００３３】
当該方法は、治療を必要とする治療対象体の大腸癌を治療する追加の工程を更に含み得る。
【００３４】
当該治療法は、高い転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を有すると決定された罹患体に、術後治療、例えば、化学療法を与えることであり得る。
【００３５】
当該治療法は、低い転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を有する罹患体への術後治療をやめることであり得る。
【００３６】
本発明の他の様態は、大腸癌と診断された治療対象体の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定するためのキットを提供する。キットは、遺伝子ＣＥＡＣＡＭ５、ＫＬＫ６、ＰＯＳＴＮ、ＳＬＣ３５Ｄ３及びＭＵＣ２のうちの１つ以上の遺伝子発現レベルの決定のための核酸プライマー及びプローブ、そして任意に１８ＳｒＲＮＡのレベルを決定するための核酸プライマー及びプローブを含み得る。
【００３７】
１つの実施形態において、本発明は、遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３及びＰＯＳＴＮの遺伝子発現レベルを決定するための核酸プライマー及びプローブを含む、大腸癌と診断された治療対象体の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定するためのキットを提供する。
【００３８】
他の実施形態において、本発明は、遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ及びＫＬＫ６の遺伝子発現レベルを決定するための核酸プライマー及びプローブを含む、大腸癌と診断された治療対象体の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定するためのキットを提供する。
【００３９】
他の実施形態において、本発明は、遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ及びＭＵＣ２の遺伝子発現レベルを決定するための核酸プライマー及びプローブを含む、大腸癌と診断された治療対象体の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定するためのキットを提供する。
【００４０】
他の実施形態において、本発明は、遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ、ＫＬＫ６及びＭＵＣ２の遺伝子発現レベルを決定するための核酸プライマー及びプローブを含む、大腸癌と診断された治療対象体の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定するためのキットを提供する。
【００４１】
他の実施形態において、本発明は、遺伝子ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ、ＫＬＫ６、ＭＵＣ２及びＣＥＡＣＡＭ５の遺伝子発現レベルを決定するための核酸プライマー及びプローブを含む、大腸癌と診断された治療対象体の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定するためのキットを提供する。
【００４２】
核酸プライマー及びプローブは、表１に提供されるものから選択され得る。より具体的には、核酸プライマー及びプローブは配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から選択され得る。
【００４３】
キットは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡコピー標準を更に含み得る。
【００４４】
本発明の他の様態は、大腸癌の治療のための方法を提供する。当該方法は、本発明に従う方法を用いて治療対象体の大腸癌の転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を決定すること、及び決定された転移能及び／又は腫瘍の侵攻性に基づいて前記治療対象体を治療することを含み得る。
【００４５】
当該治療は、高い転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を有すると決定された罹患体へ術後治療、例えば、化学療法を与えることであり得る。
【００４６】
当該治療は、低い転移能及び／又は腫瘍の侵攻性を有する罹患体への術後治療をやめることであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】原発性ＣＲＣ腫瘍（●）（ｎ＝５６）及び正常結腸組織（ｎ＝５）（○）におけるＣＥＡＣＡＭ５、ＭＵＣ２、ＫＬＫ６、ＰＯＳＴＮ及びＳＬＣ３５Ｄ３のｍＲＮＡの発現レベル。
【図２】ステージＩからＩＶまでのＣＲＣの罹患体及び対照の罹患体（Ｃｔｒ）のリンパ節における（Ａ）ＳＬＣ３５Ｄ３及び（Ｂ）ＰＯＳＴＮのｍＲＮＡ発現レベル。１６６人のＣＲＣ罹患体及び２３人の対照罹患体のそれぞれを最も高いｍＲＮＡ値を有するリンパ節で表す。
【図３】ステージＩからＩＶまでのＣＲＣの罹患体からのリンパ節におけるＣＥＡＣＡＭ５のｍＲＮＡに対するバイオマーカーのｍＲＮＡの比率。１６６人の罹患体それぞれを最も高いｍＲＮＡを有するリンパ節で表し、塗りつぶした丸で示す。
【図４】ＣＲＣ罹患体（ｎ＝１６６）におけるカプラン・マイヤーに従う累積生存曲線。バイオマーカーＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ、ＫＬＫ６、ＭＵＣ２及びＣＥＡＣＡＭ５のｍＲＮＡ値に基づいて、式：（式Ａ＝ＳＬＣ３５Ｄ３／ＣＥＡＣＡＭ５＋ＫＬＫ６／ＣＥＡＣＡＭ５＋ＰＯＳＴＮ／１８ＳｒＲＮＡ−ＭＵＣ２／ＣＥＡＣＡＭ５）に従って計算し、群（−１、０、＋１、＋２及び＋３）に罹患体を分類した。各マーカーにおけるｍＲＮＡの８番目の十分位数は、マーカー値を陽性又は陰性に分類するために用いられ、前者には（１）の値、後者には（０）の値を与えた。罹患体を表すために、最も高いＣＥＡＣＡＭ５のｍＲＮＡ値を有するリンパ節を選択した。更なる詳細については、本文を参照のこと。
【図５】ＣＲＣ罹患体（ｎ＝１６６）におけるカプラン・マイヤーに従う累積生存曲線。バイオマーカーＳＬＣ３５Ｄ３、ＫＬＫ６、ＭＵＣ２及びＣＥＡＣＡＭ５のｍＲＮＡ値に基づいて、式：（式Ｅ＝ＳＬＣ３５Ｄ３／ＣＥＡＣＡＭ５＋ＫＬＫ６／ＣＥＡＣＡＭ５−ＭＵＣ２／ＣＥＡＣＡＭ５）に従って計算し、群（−１、０、＋１及び＋２）に罹患体を分類した。詳細は図４の説明文及び本文を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
例
大腸癌の治療対象体における癌死の危険性と有意に関連する遺伝子及び遺伝子特性の同定
腫瘍の進行に重要な遺伝子は、原発腫瘍組織内及び腸を排液させる所属リンパ節に存在する二次的腫瘍内の両方で発現する可能性が最も高い。侵攻性マーカーのマイクロアレイ調査は、ステージＩＩＩＣＲＣを有する４人の罹患体の４つの異なるＨ＆Ｅ陽性リンパ節（即ち、腫瘍細胞を含むリンパ節）及びこれらの罹患体のうち３人からの３つの原発腫瘍からのＲＮＡを分析することによって行った。７人の対照の罹患体（２人の潰瘍性大腸炎罹患体、１人のクローンズ病罹患体、１人の結腸脂肪腫罹患体由来のリンパ節及び３人からの正常結腸上皮細胞試料）からのＲＮＡも分析した。ＣＲＣ試料を１つの群としての対照試料の全てと個別に比較した。統計的有意性をＰ＜０．０５に、ｆｏｌｄｃｈａｎｇｅを≧５に、最小強度を１５に設定することによって、マイクロアレイデータをフィルタリングした。この方法によって、ＣＲＣ試料のほとんど（≧５／７）で発現したｆｏｌｄｃｈａｎｇｅ≧５倍の多数の遺伝子が同定された。これらの中にＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ及びＫＬＫ６があった。
【００４９】
ＰＯＳＴＮ、ＳＬＣ３５Ｄ３及びＫＬＫ６におけるマイクロアレイの結果（ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ）を評価するために、市販のリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いた。後者の場合においては、異なるスプライス形態についての３つのアッセイを行った。３つの遺伝子全てが原発性ＣＲＣ腫瘍試料（ｎ＝８）のパネルにおいて発現された一方、全てのＣＲＣ細胞株（ｎ＝５）では、ＳＬＣ３５Ｄ３及びＫＬＫ６は発現されたが、ＰＯＳＴＮは発現されなかった。
【００５０】
【表１】
2019514365.tif 000002
【００５１】
（Fahlgren A. et al. Clin. Exp. Immunol., vol. 131, p. 90-101 (2003)；Ohlsson L. Thesis, ISBN 978-91-7459-318-1 (2011)）に記載されたＴａｑｍａｎ ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲ技術を使用した、ＲＮＡコピー標準を用いたリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを構築した。ＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ、ＫＬＫ６、ＭＵＣ２及びＣＥＡのｍＲＮＡのリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲアッセイのためのプライマー及びプローブ配列を表１に示し、ＲＮＡコピー標準の構築のためのプライマーを表２に示す。これらのアッセイを用いて、原発性ＣＲＣ腫瘍、正常結腸組織及び精製結腸上皮細胞、ＣＲＣ細胞株、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、異なる免疫細胞株及び線維芽細胞株を含むＲＮＡ試料のパネルを分析した（表３）。５６個の原発性ＣＲＣ腫瘍及び５つの正常結腸試料の個々の値を図１に示す。比較のためにＣＥＡＣＡＭ５及びＭＵＣ２についての結果を含めている（Ohlsson L. Thesis, ISBN 978-91-7459-318-1 (2011)）。
【００５２】
ＣＥＡＣＡＭ５についての１６４の中央値からＳＬＣ３５Ｄ３についての０．１７までの、サンプル中の１８Ｓ ｒＲＮＡ含量に正規化された、個々のｍＲＮＡがコードしているタンパク質分子の存在量を反映して非常に異なるコピー数レベルではあるが、５つのバイオマーカーｍＲＮＡの全てが原発性ＣＲＣ腫瘍において発現することは明らかである。
【００５３】
第２に、ＣＲＣ細胞株はＰＯＳＴＮを除く全てのマーカーｍＲＮＡを発現し、ＰＯＳＴＮは代わりに線維芽細胞株において高レベルに発現する。
【００５４】
第３に、免疫細胞株において有意な程度に発現するマーカーはない。
【００５５】
第４に、ＣＥＡＣＡＭ５は、原発性ＣＲＣ腫瘍と正常結腸上皮細胞とで同レベルに発現される。この発見及び過去の知見（Ohlsson L. et al. Br. J. Cancer, vol. 95, p. 218-225 (2006)）に基づいて、ＣＥＡＣＡＭ５は大腸に由来する細胞の好適なマーカーであると考えられた。更に、その高い発現レベルは、それをリンパ節における大腸癌細胞の検出のための非常に高感度なマーカーにしている。
【００５６】
第５に、ＭＵＣ２はＣＲＣ腫瘍がどの程度粘液性であるか否かを測定するが、ＭＵＣ２は結腸及び直腸において主要なムチンである。粘液性腫瘍の罹患体は、非粘液性腫瘍の罹患体よりも良好な予後を有する（Byrd J. C. and Bresalier R. S. Cancer Metastasis Review, vol. 23, p. 77-99 (204)；Ohlsson L. et al. Int. J. Cancer, vol. 130, p. 1833-1843 (2012)）。
【００５７】
最後に、ＣＥＡＣＡＭ５及びＭＵＣ２に対して、ＫＬＫ６及びＳＬＣ３５Ｄ３の両方がＣＲＣ腫瘍及びほとんどのＣＲＣ株で発現したが、正常結腸上皮細胞では発現せず、即ち、それらはＣＲＣ腫瘍で異所的に発現する。
【００５８】
【表２】
2019514365.tif 000003
【００５９】
【表３】
2019514365.tif 000004
【００６０】
ＣＲＣ死の可能性を予測するための複合バイオマーカーｍＲＮＡ分析の適用
ＳＬＣ３５Ｄ３のｍＲＮＡ及びＰＯＳＴＮのｍＲＮＡの発現レベルについて、４つのＴＮＭステージを全て示すＣＲＣ罹患体、及び知られたＣＥＡＣＡＭ５のｍＲＮＡ、ＫＬＫ６のｍＲＮＡ、ＭＵＣ２のｍＲＮＡ、及び１８ＳｒＲＮＡの発現レベルを有する罹患体の、１６６人の外科的治療を受けた罹患体からのリンパ節の臨床材料を分析した。合計で、６００個を超えるリンパ節からｍＲＮＡを分析した。ｍＲＮＡ値は１８ＳｒＲＮＡに対して正規化し、ｍＲＮＡコピー／１８ＳｒＲＮＡユニットとして表した。我々のグループによる過去の研究は、１８ＳｒＲＮＡが正規化において非常に優れたＲＮＡ種であることを実証した（Bas A. et al, Scand. J. Immunol., vol. 59, p. 566-573 (2004)；Ohlsson L. et al. Int. J. Cancer, vol. 130, p. 1833-1843 (2012)）。最も高いｍＲＮＡ発現レベルを有する節を更なる分析において罹患体を表すために用いた。これは、Ｈ＆Ｅ陽性節は情報価値があると考えられる一方、Ｈ＆Ｅ陰性節は全ての節が陰性である場合を除いて情報価値がないと考えられる現在の臨床実務と同様である。図２は、結果を示す。図は、非ＣＲＣの対照の罹患体からのリンパ節についてのｍＲＮＡ値も示し、破線はこの対照群で最も高い値を示す。ステージＩＩＩ及びＩＶ罹患体からのリンパ節は、ステージＩ又はＩＩ罹患体からの節よりも多くの割合の節がカットオフ値を上回るｍＲＮＡ値を有することを示した［ＳＬＣ３５Ｄ３：ステージＩ＝１８％、ステージＩＩ＝９％、ステージＩＩＩ＝２５％、及びステージＩＶ＝７９％；ＰＯＳＴＮ：ステージＩ＝２５％、ステージＩＩ＝１３％、ステージＩＩＩ＝３２％、及びステージＩＶ＝６９％］。
【００６１】
ＳＬＣ３５Ｄ３及びＰＯＳＴＮのｍＲＮＡの発現レベルの分析からの結果は、ＣＲＣ罹患体の同じ節におけるＣＥＡＣＡＭ５、ＫＬＫ６及びＭＵＣ２のｍＲＮＡについての知られた発現レベルと組み合わせて用いられた（Ohlsson L. et al. Br. J. Cancer, vol. 95, p. 218-225 (2006)；Ohlsson L. Thesis, ISBN 978-91-7459-318-1 (2011)；Ohlsson L. et al. Br. J. Cancer, vol. 107, p. 150-157 (2012)）。５つのバイオマーカーについて決定されたカットオフ値は、以下のとおりである。罹患体を最も高いリンパ節におけるバイオマーカー発現レベルに従ってランク付けした後、同数の罹患体の５つの群に分けた。Ｃｏｘ回帰分析を用いて無病生存率に関して群を比較した。５つの全てのマーカーについて８番目の十分位数未満の群は無病生存率において有意に異ならなかったため、この分析から、カットオフ値を８番目の十分位数のｍＲＮＡ発現レベルとして規定した。ＣＲＣ以外の原因で死亡した罹患体は、無病として考慮した。罹患体は、２つの群、即ち、ｍＲＮＡ発現値がカットオフよりも高いか、又はｍＲＮＡ発現値がカットオフよりも低いかに分け、各群について手術後の平均生存時間の中央値をカプラン・マイヤーに従う累積生存分析によって計算し、単変量Ｃｏｘ回帰分析に従ってＣＲＣの再発リスクを推定した。５つのバイオマーカーにおける結果を表４に示す。表から分かるように、それらの全てにおけるカットオフ値より高いｍＲＮＡ値は、非常に有意なＰ値で不良な予後に関連していた。
【００６２】
【表４】
2019514365.tif 000005
【００６３】
５つ全てのバイオマーカーのレベルを決定すること及び異なる測定値を組み合わせることは、生存率に関する罹患体群の更なる区別を達成する。手術後の生存率を予想するためのバイオマーカー分析に由来する組み合わせた情報は、本発明の１つの実施形態において、次のように用いられる。各もっとも高いリンパ節について、バイオマーカーＳＬＣ３５Ｄ３、ＫＬＫ６及びＭＵＣ２についての値を、それらに対応するＣＥＡＣＡＭ５値で最初に割る。次いでＳＬＣ３５Ｄ３／ＣＥＡＣＡＭ５及びＫＬＫ６／ＣＥＡＣＡＭ５については、比率は＞０．００００１又は＜０．００００１の２つの群のうち１つを参照した（図３）。前者の群に１の値、後者に０の値を割り当てた。ＭＵＣ２／ＣＥＡＣＡＭ５については、分割は、３．０の比率で行い、３．０を上回る節に１、下回るものに０を割り当てた（図３）。ＰＯＳＴＮについては、ＰＯＳＴＮ／１８ＳｒＲＮＡ比率及び臨床的カットオフ（８．０コピー／１８ＳｒＲＮＡユニット；図２）を２つの群を得るために用い、臨床的カットオフを上回るものに１の値、下回るものに０を割り当てた。式（式Ａ：ＳＬＣ３５Ｄ３／ＣＥＡＣＡＭ５＋ＫＬＫ６／ＣＥＡＣＡＭ５＋ＰＯＳＴＮ／１８ＳｒＲＮＡ−ＭＵＣ２／ＣＥＡＣＡＭ５）を５つの群（式の結果：−１、０、＋１、＋２、＋３）の１つに各罹患体を分類するために用い、カプラン・マイヤーに従う累積生存分析をこれらの群において実施した。結果を図４に示す。５つの異なる曲線が得られた。群（−１）及び（０）は、良好な３及び５年生存率を示し、群（＋１）及び（＋２）は相対的に不良な生存率を示し、群（＋３）は非常に不良な生存率を示した（表５）。群（０）、（＋１）、（＋２）及び（＋３）の群（−１）と比較したリスク率を単変量Ｃｏｘ回帰分析に従って計算し、表６に示す。
【００６４】
本発明の他の実施形態において、バイオマーカーｍＲＮＡ測定値は、これらの式、例えば、式Ｂから式Ｅの要素の１つが体系的に除外されていることを除いて、式Ａにおけるものと同じ方法で計算した。図５は、式Ｅに従って計算されたカプラン・マイヤーに従う累積生存率を示す。表５に５つの式（式Ａから式Ｅ）によって決定されたバイオマーカーｍＲＮＡ測定における３及び５年生存率をまとめ、表６に式Ａ、Ｂ及びＣによって決定された、バイオマーカーｍＲＮＡ測定におけるハザード比をまとめる。手術後の生存率に関する有用な情報が、式Ｂから式Ｅまでに従って処理されたバイオマーカーのデータによって生成されるが、式Ａに従ってバイオマーカーｍＲＮＡのデータを処理することは最も情報価値があることは明らかであり、これらのバイオマーカーの全てが結果に寄与することを実証している。
【００６５】
【表５】
2019514365.tif 000006
【００６６】
【表６】
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【００６７】
バイオマーカーｍＲＮＡの決定のためのキット
本発明は、バイオマーカーｍＲＮＡ及び１８Ｓ ｒＲＮＡの分析、及び式Ａから式Ｅの式によって示されるような、生データの臨床的に有用な情報への変換のためのキットも含む。
【００６８】
本発明の１つの実施形態において、表１に提供される特定のフォワード及びリバースプライマー並びにプローブ配列がリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて用いられる。定量は、特定のコピー標準（ＲＮＡ）及び逆転写のための３’プライマーを用いることによって達成され、バイオマーカーのｍＲＮＡ値は、試料における１８ＳｒＲＮＡの含量及び／又はＣＥＡＣＡＭ５のｍＲＮＡの含量に対して正規化される。正規化した値は、外科的に治療されたＣＲＣ罹患体由来のリンパ節の臨床的材料の分析から決定されたカットオフ値を用いてバイオマーカーレベルにしたがって、２つの群、即ち、（１＝高い再発のリスク）及び（０＝低い再発のリスク）のどちらかのうち１つに割り当てられる。特別に設計されたアルゴリズムを用いて、各バイオマーカーにおける（１）及び（０）の値を−１、０、＋１、＋２、＋３の範囲を有する癌死の相対的リスクの推測値に変換する。ここでは、式：ＳＬＣ３５Ｄ３／ＣＥＡＣＡＭ５＋ＫＬＫ６／ＣＥＡＣＡＭ５＋ＰＯＳＴＮ／１８ＳｒＲＮＡ−ＭＵＣ２／ＣＥＡＣＡＭ５に基づいて、−１は最も低いリスクを表し、＋３は最も高いリスクを表す。
【００６９】
図４及び５並びに表５及び６に例示される本発明の実施形態において、好ましくは最も高いバイオマーカーｍＲＮＡを有するリンパ節からの情報のみが価値がある。しかしながら、多くの罹患体が腫瘍細胞を含む２つ以上のリンパ節を有する。本発明に従う方法はこの場合、即ち、予後の値を付加するＮ１及びＮ２ステージの罹患体間の差別化にも用いることができる。
【００７０】
実験方法
一般的な方法
バイオインフォマティクス分析−マイクロアレイ遺伝子発現解析からの結果を直接ハイブリダイゼーションアッセイのためにＩｌｌｕｍｉｎａＢｅａｄｓｔｕｄｉｏソフトウェア（バージョン３．３）を用いることによって分析した。強度データを減算されたバックグラウンドでＢｅａｄｓｔｕｄｉｏｓ三次スプラインアルゴリズムによって正規化した。発現における有意な差を、ＢｅｎｊａｍｉｎｉとＨｏｃｈｂｅｒｇのＦａｌｓｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙＲａｔｅ（Reiner A. et al. Bioinformatics, vol. 19, p. 368-375 (2003)）を用いた多重検定補正でＢｅａｄｓｔｕｄｉｏソフトウェアＥｒｒｏｒＭｏｄｅｌＩｌｌｕｍｉｎａＣｕｓｔｏｍを用いて計算した。遺伝子発現における差をｆｏｌｄｃｈａｎｇｅとして計算し、関心のあるＣＲＣ試料における信号を対照の平均信号で割った。
【００７１】
細胞株及び末梢血単核細胞−以下の確立されたヒト細胞株を利用した：ＬＳ１７４Ｔ、ＨＴ２９、Ｔ８４、ＨＣＴ８及びＣａＣｏ２（全ての結腸癌）、ジャーカット及びＭｏｌｔ−４（Ｔ細胞リンパ腫）、Ｂ６及びＫＲ４（ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株）、Ｕ２６６（形質細胞腫）、Ｕ９３７（単球様細胞株）、Ｋ５６２（赤芽球様細胞株）、ＨＬ６０（顆粒球細胞株）、ＦＳＵ（線維芽細胞株）。末梢血液単核球（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｉｓｏｐａｑｕｅ勾配遠心によって健康な成人の末梢血から単離した。ＰＢＭＣは、０．４％ヒト血清アルブミンを添加したＨＥＰＥＳ緩衝ＲＰＭＩ１６４０中のＯＫＴ３モノクローナル抗体（５０ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートすることによってインビトロで活性化した。７人の個体由来のＰＢＭＣを４時間、７時間、２０時間、４８時間及び７２時間の平行培養で刺激してインキュベートし、洗浄し、プールし、ＲＮＡを抽出した。
【００７２】
ＣＲＣ罹患体及び対照の臨床的特徴−１６６人の罹患体［８１人の男性、８５人の女性、年齢の中央値７２（範囲４２〜９０）歳］においてＣＲＣの治療のための手術を行った。１３人の腫瘍が直腸に位置し、１５３人が結腸に位置していた。７人の直腸癌罹患体が術前放射線療法である２５Ｇｙを受けた。全ての罹患体において、局所的な根治的腫瘍切除を行った。腫瘍の差別化のグレードは、１１個、１４５個、及び１０個の腫瘍でそれぞれ弱、中及び高であった。通常のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を２，３５１個のリンパ節で実施し、罹患体当たり中央値１３（範囲１〜５１）個の節を得た。ＴＮＭ分類に従うと、３０人の罹患体がステージＩ（Ｔ１−２Ｎ０Ｍ０）、７４人がステージＩＩ（Ｔ３−４Ｎ０Ｍ０）、４６人がステージＩＩＩ（ａｎｙＴＮ１−２Ｍ０）、１６人がステージＩＶ（ａｎｙＴａｎｙＮＭ１）にあった。３４人の罹患体（４人がステージＩＩ、１９人がステージＩＩＩ、１１人がステージＩＶにあった）が手術後、化学療法を受けた。経過観察期間の中央値は７５（範囲３３〜１４７）ヶ月であり、経過観察期間中に死亡した罹患体はいなかった。
【００７３】
対照は１８人の男性及び５人の女性［年齢の中央値２５（範囲１０〜６１）歳］を含み、潰瘍性大腸炎（ｎ＝１８）、クローン大腸炎（ｎ＝３）、直腸脱（ｎ＝１）及び結腸脂肪腫（ｎ＝１）の手術を受けている。
【００７４】
罹患体から、１つのケースでは彼の両親から、インフォームドコンセントを得た。スウェーデン、ウメオ大学の医学部研究倫理委員会が研究を承認した。
【００７５】
原発性及び遠隔ＣＲＣ腫瘍及び正常結腸組織−８５個の原発性ＣＲＣ腫瘍に由来する１１３個の試料を、バイオマーカーｍＲＮＡレベルに関して分析した（１６人のステージＩの罹患体由来の２２個の試料、３５人のステージＩＩの罹患体由来の４４個の試料、２５人のステージＩＩの罹患体由来の４１個の試料、８人のステージＩＶの罹患体由来の８個の試料）。原発性腫瘍ステージ分布（ｐＴ１〜ｐＴ４）はそれぞれ、２、１４、５５及び１３であった。差別化のグレードは、１１個の腫瘍において弱、７１個の腫瘍において中、３個の腫瘍において高であった。切除の直後に、１個から４個までの試料（約０．５×０．５×０．５ｃｍのサイズ）を原発性腫瘍標本から回収し、すぐに冷凍し、ＲＮＡ抽出まで−７０℃で保管した。近位側又は遠位側切除断端から取り出した６つの正常結腸試料及び２つの遠隔肝転移試料を回収し、原発性ＣＲＣ腫瘍と同様の方法で処理した。
【００７６】
結腸組織からの上皮細胞−（Fahlgren A. et al. Clin. Exp. Immunol., vol. 131, p. 90-101 (2003)）に記載のように結腸上皮細胞（ＥＣ）を正常結腸粘膜の切除断端から単離した。
【００７７】
リンパ節−切除された標本からリンパ節を回収し、別々の滅菌ナイフで二等分した。各リンパ節の一方の半分を通常のＨ＆Ｅ染色のために１０％の緩衝化ホルマリン中で定着させた。他方の半分をすぐに液体窒素中で冷凍し、ＲＮＡ抽出まで−７０℃で保管した。ＣＲＣ罹患体から、５０３個のリンパ節（ステージＩ〜ＩＶの罹患体からそれぞれ９１、２５３、１０７及び５２個の節）を回収した。２つのリンパ節の中央値（範囲１〜１５）を罹患体毎に得た。
【００７８】
対照の罹患体から、１０８個のリンパ節（潰瘍性大腸炎、クローン大腸炎、結腸脂肪腫及び直腸脱の罹患体からそれぞれ、８２、９、１３及び４個の節）を回収した。
【００７９】
ＲＮＡの単離−リンパ節、正常な及び腫瘍の結腸組織、結腸上皮細胞、ＰＢＭＣ及び細胞株から、酸グアニジンフェノールクロロホルム法（Chomczynski P and Sacchi N. Analyt. Biochem., vol. 162, p. 156-159 (1987)）を用いて、第１均質化工程において、２５ｍｇの組織あたりで最大２．５×１０６個の細胞について、４Ｍのグアニジニウムチオシアネート、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．５％のサルコシル及び０．１Ｍの２−メルカプトエタノールを含む０．５ｍｌの溶液を加えることにより総ＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡをＲＮＡｓｅ阻害剤であるＲＮａｓｉｎ（１Ｕ／μｌ；プロメガ、マディソン、ウィスコンシン州）を含むＲＮＡｓｅフリー水に溶解した。ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐテクノロジーズ）において測定し、ビーズマイクロアレイ分析のためにＲＮＡの全体をＲＮＡナノアッセイ（アジレント・テクノロジー）を用いて２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで分析した。
【００８０】
ＲＮＡコピー標準の調製−原発性ＣＲＣ腫瘍、ＣＲＣの２体の罹患体からの２つのリンパ節並びに結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ及びＴ８４からの総ＲＮＡをコピー標準調製のための出発原料として使用した。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーを表２に示す。ＰＣＲ産物は、定量的ＲＴ−ＰＣＲで増幅した各配列を含むが、それを複製し、配列決定し、Ｔ７ポリメラーゼ／RiboProbe In Vitro Transcription Systems（プロメガ）を用いるインビトロ転写のための鋳型として用いた。線状化ＤＮＡ、３〜７μｇ、を３７℃で２〜３時間実行した大規模合成反応に使用した。次いで反応産物を１Ｕ／μｇのＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（プロメガ）で３７℃で３０〜４０分間処理し、続いてフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）及びクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出した。２．５体積の９９．５％エタノール及び０．５体積の７．５Ｍ酢酸アンモニウムを用いて−７０℃で少なくとも１時間、ＲＮＡを沈殿させた。ＤＮａｓｅ処理を少なくとも２回繰り返した。最後に、ＤＮＡ含量を評価するためにコピー標準をＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲで確認し、それら全てで０．２％未満であることが証明された。転写物の濃度は、ＯＤ２６０値、転写物の分子量及びアボガドロ数に基づいて計算した。最終的に標準物質を１０８コピー／μｌに希釈した。
【００８１】
リアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ−タックマンＥＺ ＲＴ−ＰＣＲ技術（アプライドバイオシステムズ、フィスターシティ、カリフォルニア州）を用いて、ＲＮＡコピー標準を用いたリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲアッセイをＳＬＣ３５Ｄ３、ＰＯＳＴＮ、ＫＬＫ６、ＣＥＡＣＡＭ５及びＭＵＣ２について構築した。プライマー及びプローブの配列を表１に示す。ＲＴ−ＰＣＲプロファイルは、４９℃で２分、５９℃で３０分、９４℃で５分、その後９３℃で２０秒及び６１℃で１分を４５サイクルであった。１０３コピー／μｌから１０８コピー／μｌまでの濃度の各ＲＮＡコピー標準の一連の希釈物を各分析に用いた。全てのｑＲＴ−ＰＣＲ分析は３反復で行った。放出されたレポーター色素からの発光をABI Prism 7900 Sequence Detection System（パーキンエルマー、ウェルズリー、マサチューセッツ州）でモニタリングした。ｍＲＮＡレベルの正規化については、１８ＳｒＲＮＡの濃度を製造業者のプロトコール（アプライドバイオシステムズ）に従って、或いは表１に与えられたプライマー及びプローブ（配列番号１６〜１８）の使用によってリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって試料ごとに決定し、コピー標準は表２に与えられたプライマー（配列番号２６、１７）を用いて調製した。結果を１８ＳｒＲＮＡのユニット当たりのｍＲＮＡコピーとして、或いは１８ＳｒＲＮＡのコピーあたりのＲＮＡコピーとして表し、どちらの場合もバイオマーカーの直接同等のレベルが得られた。
【００８２】
統計分析−罹患体群間の手術後の無病生存率及び再発疾患のリスクの差を対数順位検定及び単変量Ｃｏｘ回帰分析と組み合わせたカプラン・マイヤー生存モデルに従って計算した。Ｐ値＜０．０５の生存期間及びハザード比における差は、統計的に有意であると考えられた。使用したソフトウェアは、ＳＰＳＳ（バージョン１８）であった。
【図１】
2019514365.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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