(57)【要約】  本開示は新規ＣＤ１３３結合剤を対象とする。本開示はまた、ＣＤ１３３発現細胞を検出し、かつ／または細胞のＣＤ１３３発現レベルを定量化するための、ＣＤ１３３発現細胞をターゲッティングするための、ＣＤ１３３発現細胞中のＣＤ１３３レベルを低下させるための、および癌を治療または予防するための、新規ＣＤ１３３結合剤の使用を対象とする。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖、および配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体によって結合されるＣＤ１３３エピトープ、ならびに／または（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖、および配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体によって結合されるＣＤ１３３エピトープ、に特異的に結合する、ＣＤ１３３結合剤。
【請求項２】
細胞表面発現型ＣＤ１３３に特異的に結合し、かつ変性ＣＤ１３３に特異的に結合するＣＤ１３３結合剤。
【請求項３】
ヒトＣＤ１３３に特異的に結合する抗原結合部位を形成する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインを含む、請求項１または２に記載のＣＤ１３３結合剤。
【請求項４】
（ａ）（ｉ）前記抗体軽鎖可変ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み、ならびに（ｉｉ）前記抗体重鎖可変ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、３９位のＭｅｔ残基、５５位のＳｅｒ残基、および６６位のＴｙｒ残基、を含むか、または
（ｂ）（ｉ）軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１を含む前記抗体軽鎖可変ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み、ならびに（ｉｉ）前記抗体重鎖可変ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、３９位のＩｌｅ残基、５５位のＴｙｒ残基、および６６位のＴｙｒ残基、を含む、
請求項３に記載のＣＤ１３３結合剤。
【請求項５】
前記軽鎖が、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列、もしくは配列番号２のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列、もしくは配列番号４のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３または４に記載のＣＤ１３３結合剤。
【請求項６】
前記重鎖が、（ａ）配列番号３のアミノ酸配列、もしくは配列番号３のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または（ｂ）配列番号５のアミノ酸配列、もしくは配列番号５のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３または４に記載のＣＤ１３３結合剤。
【請求項７】
（ａ）前記軽鎖は配列番号２のアミノ酸配列、もしくは配列番号２のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および前記重鎖は配列番号３のアミノ酸配列、もしくは配列番号３のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、または（ｂ）前記軽鎖は配列番号４のアミノ酸配列、もしくは配列番号４のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および前記重鎖は配列番号５のアミノ酸配列、もしくは配列番号５のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のＣＤ１３３結合剤。
【請求項８】
前記結合剤が、抗体、抗体断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、ファージＦａｂ、およびファージｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＣＤ１３３結合剤。
【請求項９】
前記結合剤が断片抗原結合性（Ｆａｂ）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＤ１３３結合剤。
【請求項１０】
前記結合剤が、（ａ）ＣＤ１３３結合性単鎖Ｆａｂおよび非ＣＤ１３３結合性ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体、（ｂ）ＣＤ１３３結合性Ｆａｂおよび非ＣＤ１３３結合性ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体、または（ｃ）ＣＤ１３３結合性およびＣＤ３結合性の二重特異性抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＤ１３３結合剤。
【請求項１１】
前記結合剤が、（ａ）ＣＤ１３３結合性単鎖ＦａｂおよびＣＤ３結合性ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体、または（ｂ）ＣＤ１３３結合性ＦａｂおよびＣＤ３結合性ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体である、請求項１〜８および１０のいずれか１項に記載のＣＤ１３３結合剤。
【請求項１２】
前記結合剤が、（ｉ）ＣＤ１３３結合性抗体可変領域および（ｉｉ）１以上の免疫細胞受容体シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲシグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＣＤ１３３結合剤。
【請求項１３】
前記ＣＤ１３３結合剤がヒト抗体定常領域を含む、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のＣＤ１３３結合剤。
【請求項１４】
前記ＣＤ１３３結合剤がＩｇＧ分子である、請求項１〜８のいずれか１項記載のＣＤ１３３結合剤。
【請求項１５】
前記結合剤が検出剤で標識されている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＣＤ１３３結合剤。
【請求項１６】
（１）請求項１〜１４のいずれか１項に記載の結合剤と、これに結合した（２）エフェクター剤とを含む、免疫複合体。
【請求項１７】
前記エフェクター剤が抗新生物剤である、請求項１６に記載の免疫複合体。
【請求項１８】
前記エフェクター剤が毒素である、請求項１６に記載の免疫複合体。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか１項のＣＤ１３３結合剤または請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の免疫複合体、および担体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
ＣＤ１３３発現細胞をターゲッティングするための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＣＤ１３３結合剤、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の免疫複合体、または請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２１】
ＣＤ１３３発現細胞を結合するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＣＤ１３３結合剤、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の免疫複合体、または請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ＣＤ１３３発現細胞を検出し、かつ／または細胞性ＣＤ１３３発現のレベルを定量化するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＣＤ１３３結合剤、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の免疫複合体、または請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２３】
ＣＤ１３３発現細胞におけるＣＤ１３３タンパク質のレベルを低下させるための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＣＤ１３３結合剤または請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２４】
前記ＣＤ１３３発現細胞は癌細胞である、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
癌を治療または予防するための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＣＤ１３３結合剤、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の免疫複合体、または請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２６】
前記癌が転移性黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌または結腸癌である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記脳腫瘍が神経膠芽腫である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記神経膠芽腫がＣＤ１３３を検出可能に発現する神経膠芽腫である、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
神経膠芽腫、任意選択でＣＤ１３３を検出可能に発現する神経膠芽腫を治療するための、請求項１０または１１に記載のＣＤ１３３結合剤の使用。
【請求項３０】
前記脳腫瘍が髄芽腫である、請求項２６に記載の使用。
【請求項３１】
前記髄芽腫が検出可能にＣＤ１３３を発現する髄芽腫である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
髄芽腫、任意選択でＣＤ１３３を検出可能に発現する髄芽腫を治療するための、請求項１０または１１に記載のＣＤ１３３結合剤の使用。
【請求項３３】
前記二重特異性抗体が、
（ａ）配列番号２２および配列番号２３、
（ｂ）配列番号２４および配列番号２５、
（ｃ）配列番号２６、
（ｄ）配列番号２７、
を含むアミノ酸配列、またはそれらの機能的変異体を含む、請求項２９または３２に記載の使用。
【請求項３４】
神経膠芽腫、任意選択でＣＤ１３３を検出可能に発現する神経膠芽腫を治療するための、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の使用。
【請求項３５】
髄芽腫、任意選択でＣＤ１３３を検出可能に発現する髄芽腫を治療するための、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞
本出願は、２０１６年１０月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／４１０，１６２号および２０１７年３月１６日に出願された米国仮出願第６２／４７２，２０９号の優先権の利益を主張するものであり、それら両方の内容を全体として本明細書の一部として援用する。
【０００２】
本開示は、一般にＣＤ１３３結合剤、ならびに該結合剤の方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ１３３は、黒色腫、脳腫瘍ならびに乳癌、結腸癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、肺癌および頭頸部扁平上皮癌を含む種々の癌腫におけるマーカーとして同定されている（Ｂｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｆｅｒｒａｎｄｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＣＤ１３３の発現は、しばしば生存率の低下、薬剤耐性、転移と関連している。ＣＤ１３３の過剰発現、病理組織学的因子および患者の予後不良の間の相関関係が、肝細胞癌で報告されている（Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＣＤ１３３は膜結合型ペンタスパン糖タンパク質であり、その正確な生理学的役割は不明のままである。それは、原始細胞分化および表皮間葉相互作用に関与し（Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｕｌａｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｅｖａｎｇｅｌｉｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、ＷＮＴシグナル伝達経路および関連の細胞増殖と関連していると考えられている（Ｒａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ａ、Ｔａｋｅｎｏｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。転移性黒色腫細胞株におけるＣＤ１３３のダウンレギュレーションは、異種移植片の転移能低下をもたらすことが示されている（Ｒａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０００４】
神経膠芽腫（ＧＢＭ）は、一様に致命的な原発性脳腫瘍であり、多様な細胞表現型および遺伝的異質性を特徴とする。外科的切除、放射線療法および化学療法を含む積極的な細胞マルチモーダル治療の使用にもかかわらず、ＧＢＭ患者の予後は有意に改善し得ていない。多数の研究が、ＧＢＭにおける化学耐性および放射線耐性の推進因子として、ＣＤ３３＋脳腫瘍始原細胞（ＢＴＩＣ）を示唆している。また最近では、ＣＤ１３３による遺伝子シグネチャが全生存率の低さを予測し（Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、またＣＤ１３３＋治療抵抗性細胞をターゲッティングすることが、ＧＢＭ再発を阻止するための有効な戦略となり得ることも示されている。ＣＤ１３３＋である髄芽腫細胞もまた、多分化能の増加および脳腫瘍幹細胞の活性増強と関連している（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【０００５】
抗ＣＤ１３３抗体に基づく薬物が、癌の治療のために提案されている（Ｓｃｈｍｏｈｌ  ａｎｄ  Ｖａｌｌｅｒａ，２０１６に概説されている）。ヒト患者では、抗ＩＬ−１３αキメラ抗原受容体Ｔ細胞療法後の再発性神経膠芽腫において、有意ではあるが一時的な後退が報告されている（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。高い親和性および特異性でＣＤ１３３に結合する新規な薬剤が、いまだ必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、細胞表面発現型ＣＤ１３３および変性ヒトＣＤ１３３の両方に特異的に結合できる新規な抗体可変領域ＲＷ０１およびＲＷ０３を記載しており、またこれらＣＤ１３３結合性可変領域を含む結合剤（例えば抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂベースの二重特異性抗体／二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）および／またはｓｃＦａｂベースの二重特異性抗体／（ＢｉＴＥ））による特異的ＣＤ１３３結合を実証した。本開示の可変領域を有する抗体は、ナノモル以下／ナノモルの範囲の解離定数（ＫＤ）で、細胞表面発現型／天然ヒトＣＤ１３３に特異的に結合することが示された。そのようなＣＤ１３３結合性抗体を使用して、癌細胞（例えば、膵臓癌細胞、結腸直腸癌細胞）などの細胞の表面上に発現されるＣＤ１３３を特異的に検出し、例えば細胞溶解物中の変性ＣＤ１３３に特異的に結合して検出し、免疫蛍光分析により、細胞ＣＤ１３３を特異的に結合し、検出し、細胞内の位置を特定することができ、またＣＤ１３３陽性（ＣＤ１３３＋）癌細胞中のＣＤ１３３タンパク質レベルを有意に減少できることが示された。さらに、抗体可変領域ＲＷ０１を含むＦａｂおよび抗体可変領域ＲＷ０３を含むＦａｂは、ＣＤ１３３への結合について、それぞれＩｇＧ  ＲＷ０３およびＩｇＧ  ＲＷ０１と競合しないことが示された。
【０００７】
本発明者らはまた、ＣＤ１３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が、インビボにおいてＣＤ１３３陽性神経膠芽腫（ＧＢＭ）の細胞死を特異的に誘導し、またＧＢＭ腫瘍の退縮を誘導することを示した。本発明者らはまた、ＣＤ１３３特異的ＢｉＴＥが、Ｔ細胞をＣＤ１３３＋ヒトＧＢＭ細胞に動員して細胞死を引き起こすことを示した。さらに、ＣＤ１３３特異的ＢｉＴＥで頭蓋内治療されたマウスの脳内に形成された腫瘍は、それほど高悪性でも侵襲的でもなかった。
【０００８】
従って、本開示は、細胞表面発現型／天然ＣＤ１３３に特異的に結合し、また変性ＣＤ１３３に特異的に結合する、ＣＤ１３３結合剤を提供する。
【０００９】
一実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、（ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖、および配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖、ならびに／または（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体により結合されるＣＤ１３３エピトープに特異的に結合する。
【００１０】
別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号３の重鎖を含む抗体、ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体によって結合される、細胞表面発現型ＣＤ１３３のＣＤ１３３エピトープに特異的に結合する。
【００１１】
さらなる実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、ならびに／または配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体によって結合される、変性ＣＤ１３３のＣＤ１３３エピトープに特異的に結合する。
【００１２】
一実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、ヒトＣＤ１３３に特異的に結合する抗原結合部位を形成する抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインを含む。
【００１３】
別の実施形態において、抗体軽鎖可変ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み、ならびに抗体重鎖可変ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、およびアミノ酸配列１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインは、ヒトＣＤ１３３に結合する抗原結合部位を形成する。任意選択で、重鎖可変ドメインはさらに、３９位にＭｅｔ残基、５５位にＳｅｒ残基、および６６位にＴｙｒ残基を含む。
【００１４】
さらなる実施形態において、抗体軽鎖可変ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号７のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含み、ならびに抗体重鎖可変ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインはヒトＣＤ１３３に結合する抗原結合部位を形成する。任意選択で、重鎖可変ドメインはさらに、３９位にＭｅｔ残基、５５位にＳｅｒ残基、および６６位にＴｙｒ残基を含む。
【００１５】
別の実施形態において、抗体軽鎖は、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１６】
別の実施形態において、抗体軽鎖は配列番号２のアミノ酸配列からなる。
【００１７】
別の実施形態において、重鎖は、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１８】
別の実施形態において、抗体重鎖は配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【００１９】
別の実施形態において、軽鎖は、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列または配列番号２のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、また（ｉｉ）重鎖は、配列番号３のアミノ酸配列または配列番号３のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２０】
別の実施形態において、軽鎖は配列番号２のアミノ酸配列からなり、重鎖は配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【００２１】
別の実施形態において、抗体軽鎖可変ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、ならびに抗体重鎖可変ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインはヒトＣＤ１３３に結合する抗原結合部位を形成する。任意選択で、重鎖可変ドメインはさらに、３９位にＩｌｅ残基、５５位にＴｙｒ残基、および６６位にＴｙｒ残基を含む。
【００２２】
一実施形態において、抗体軽鎖可変ドメインは、配列番号１２のアミノ酸配列からなる軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、配列番号１３のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含み、ならびに抗体重鎖可変ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、および配列番号１７のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインはヒトＣＤ１３３に結合する抗原結合部位を形成する。任意選択で、重鎖可変ドメインはさらに、３９位にＩｌｅ残基、５５位にＴｙｒ残基、および６６位にＴｙｒ残基を含む。
【００２３】
別の実施形態において、抗体軽鎖は配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２４】
別の実施形態において、抗体軽鎖は配列番号４のアミノ酸配列からなる。
【００２５】
別の実施形態において、抗体重鎖は配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２６】
別の実施形態において、抗体重鎖は配列番号５のアミノ酸配列からなる。
【００２７】
別の実施形態において、軽鎖は配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖は配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００２８】
別の実施形態において、軽鎖は配列番号４のアミノ酸配列からなり、重鎖は配列番号５のアミノ酸配列からなる。
【００２９】
別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、抗体、抗体断片、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体、ファージＦａｂ（ここでのＦａｂはＣＤ１３３に結合する）、およびファージ−ｓｃＦｖ（ここでのｓｃＦｖはＣＤ１３３に結合する）からなる群から選択される。
【００３０】
別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、ヒトＣＤ１３３に結合する抗体を含む。
【００３１】
別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、ヒトＣＤ１３３に結合する抗体断片を含む。
【００３２】
別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、ヒトＣＤ１３３に結合する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む。
【００３３】
別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、ヒトＣＤ１３３に結合する二重特異性抗体を含む。
【００３４】
別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤はファージＦａｂを含み、ＦａｂはヒトＣＤ１３３に結合する。
【００３５】
別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、ヒトＣＤ１３３と結合するファージｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖはヒトＣＤ１３３に結合する。
【００３６】
さらに別の実施形態において、抗体断片は断片抗原結合性（Ｆａｂ）である。
【００３７】
別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、（ａ）ＣＤ１３３結合性単鎖Ｆａｂおよび非ＣＤ１３３結合性ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体、（ｂ）ＣＤ１３３結合性Ｆａｂおよび非ＣＤ１３３結合性ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体、または（ｃ）ＣＤ１３３結合性およびＣＤ３結合性二重特異性抗体である。
【００３８】
さらに別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、（ａ）ＣＤ１３３結合性単鎖ＦａｂおよびＣＤ３結合性ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体、または（ｂ）ＣＤ１３３結合性ＦａｂおよびＣＤ３結合ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体である。
【００３９】
別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、（ｉ）ＣＤ１３３結合性抗体可変領域および（ｉｉ）１以上の免疫細胞受容体シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲシグナル伝達ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【００４０】
一実施形態において、ＣＤ１３３結合剤はヒト抗体定常領域を含む。
【００４１】
他の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤はＩｇＧ分子である。
【００４２】
さらなる実施形態において、ＩｇＧ分子はＩｇＧ１分子である。
【００４３】
別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は検出剤で標識される。
【００４４】
本開示はまた、（２）エフェクター剤に結合した（１）上記の結合剤を含む免疫複合体を提供する。任意選択で、エフェクター剤は抗新生物剤または毒素である。
【００４５】
本開示はまた、上記で述べたＣＤ１３３結合剤または免疫複合体と、担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００４６】
本開示はまた、ＣＤ１３３発現細胞をターゲッティングするための、上記で述べたＣＤ１３３結合剤、免疫複合体または医薬組成物の使用を提供する。
【００４７】
本開示はまた、ＣＤ１３３発現細胞に結合するための、上記で述べたＣＤ１３３結合剤、免疫複合体または医薬組成物の使用を提供する。
【００４８】
本開示はさらに、ＣＤ１３３発現細胞を検出し、かつ／または細胞のＣＤ１３３発現レベルを定量化するための、上記で述べたＣＤ１３３結合剤、免疫複合体または医薬組成物の使用を提供する。
【００４９】
本開示はさらに、ＣＤ１３３発現細胞におけるＣＤ１３３タンパク質のレベルを低下させるための、本明細書に記載のＣＤ１３３結合剤または医薬組成物の使用を提供する。
【００５０】
一実施形態において、ＣＤ１３３結合剤の使用は、細胞内において、細胞表面発現型ＣＤ１３３のレベルを検出および／または定量化するためのものである。別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤の使用は、細胞内において、ＣＤ１３３の総レベルを検出および／または定量するためのものである。
【００５１】
任意選択で、ＣＤ１３３発現細胞の検出および／または細胞性ＣＤ１３３発現レベルの定量は、ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光法、免疫組織化学またはフローサイトメトリーによって行われる。
【００５２】
別の実施形態において、細胞は癌細胞、任意選択で、ＣＤ１３３発現癌細胞またはＣＤ１３３を検出可能に発現する癌細胞である。
【００５３】
さらに別の実施形態において、癌細胞は黒色腫癌細胞、膵臓癌細胞、脳腫瘍細胞または結腸直腸癌細胞である。別の実施形態において、癌細胞は神経膠芽腫細胞である。別の実施形態において、癌細胞は髄芽腫細胞である。
【００５４】
本開示はさらに、癌を治療または予防するための、本明細書に記載のＣＤ１３３結合剤、免疫複合体または医薬組成物の使用を提供する。
【００５５】
一実施形態において、癌はＣＤ１３３発現癌、またはＣＤ１３３を検出可能に発現する癌である。他の実施形態において、癌は転移性黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌または結腸癌である。
【００５６】
別の実施形態において、脳腫瘍は神経膠芽腫、場合によりＣＤ１３３発現神経膠芽腫または検出可能にＣＤ１３３を発現する神経膠芽腫である。 別の実施形態において、脳腫瘍は、髄芽腫、場合によりＣＤ１３３発現髄芽腫または検出可能な程度にＣＤ１３３を発現する髄芽腫である。
【００５７】
本開示はまた、神経膠芽腫、任意選択でＣＤ１３３発現神経膠芽腫またはＣＤ１３３を検出可能に発現する神経膠芽腫を治療するための、（ａ）ＣＤ１３３結合性単鎖Ｆａｂおよび非ＣＤ１３３結合性ｓｃＦｖ、（ｂ）ＣＤ１３３結合Ｆａｂおよび非ＣＤ１３３結合ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体、または（ｃ）ＣＤ１３３結合性およびＣＤ３結合性二重特異性抗体を含むＣＤ１３３結合剤の使用を提供する。
【００５８】
本開示はまた、神経膠芽腫、任意選択でＣＤ１３３発現神経膠芽腫またはＣＤ１３３を検出可能に発現する神経膠芽腫を治療するための、（ａ）ＣＤ１３３結合性単鎖ＦａｂおよびＣＤ３結合性ｓｃＦｖ、または（ｂ）ＣＤ１３３結合性ＦａｂおよびＣＤ３結合性ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体を含むＣＤ１３３結合剤の使用を提供する。
【００５９】
本開示はまた、髄芽腫、任意選択でＣＤ１３３発現髄芽腫またはＣＤ１３３を検出可能に発現する髄芽腫を治療するための、（ａ）ＣＤ１３３結合性単鎖Ｆａｂおよび非ＣＤ１３３結合性ｓｃＦｖ、（ｂ）ＣＤ１３３結合性Ｆａｂおよび非ＣＤ１３３結合性ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体、または（ｃ）ＣＤ１３３結合性およびＣＤ３結合性二重特異性抗体を含むＣＤ１３３結合剤の使用を提供する。
【００６０】
本開示はまた、髄芽腫、任意選択でＣＤ１３３発現髄芽腫またはＣＤ１３３を検出可能に発現する髄芽腫を治療するための、（ａ）ＣＤ１３３結合性単鎖ＦａｂおよびＣＤ３結合性ｓｃＦｖ、または（ｂ）ＣＤ１３３結合性ＦａｂおよびＣＤ３結合性ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体を含むＣＤ１３３結合剤の使用を提供する。
【００６１】
一実施形態において、二重特異性抗体は、
（ａ）配列番号２２および配列番号２３、
（ｂ）配列番号２４および配列番号２５、
（ｃ）配列番号２６、
（ｄ）配列番号２７、またはそれらの機能的変異体、
を含むアミノ酸配列を含む。
【００６２】
本開示はまた、神経膠芽腫、任意選択でＣＤ１３３発現神経膠芽腫またはＣＤ１３３を検出可能に発現する神経膠芽腫を治療するための、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の使用を提供する。
【００６３】
本開示はさらに、髄芽腫、任意選択でＣＤ１３３発現髄芽腫またはＣＤ１３３を検出可能に発現する髄芽腫を治療するための、本明細書に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の使用を提供する。
【００６４】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、当業者には、本開示の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が明らかであろうから、詳細な説明および特定の例は本開示の実施形態を示すものではあるが、例示としてのみ与えられることを理解されたい。
【００６５】
以下、図面に関連して実施形態を説明する
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ】細胞表面ＣＤ１３３への結合について、ライブラリーＦまたはライブラリーＧからそれぞれ選択されたファージＦａｂクローンおよびファージｓｃＦｖクローンの、Ｃｅｌｌｅｃｔｓｅｑ法を用いたＣＤ１３３結合についての細胞ベースでのＥＬＩＳＡの結果を示す表である。細胞を選択した後、各ライブラリーについてラウンド４のアウトプットファージを単一コロニーにプレーティングした。これらのコロニーを一晩の培養で増殖させ、細胞ベースのＥＬＩＳＡにより、細胞への結合について試験した。プレートを読み取り、ＯＤ４５０ｎｍを検出して記録した。このアッセイにより、ＣＤ１３３過剰発現ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞（「ＣＤ１３３」欄見出しの下）ｖｓ．親ＨＥＫ２９３細胞（「ＨＥＫ２９３」欄見出しの下）に対するクローンの結合が測定された。
【図１Ｂ】Ｃｅｌｌｅｃｔｓｅｑ法を用いた細胞表面ＣＤ１３３への結合に関して、ライブラリーＦから選択され、かつＤＮＡ配列決定後にＨＥＫ２９３-ＣＤ１３３細胞に対して少なくとも１．５倍優先的に結合することが見出された７７クローンに存在する、３つのユニークな抗体可変領域に対応することが見出された３つのクローン（ファージＦａｂＲＷ０３、ファージＦａｂＣ１２およびファージＦａｂＦ５）の、ＣＤ１３３結合に関する細胞ベースでのＥＬＩＳＡを示すヒストグラムである。
【図２】ファージＦａｂクローンＲＷ０３がＣＤ１３３過剰発現細胞に特異的に結合することを示す一連の蛍光顕微鏡写真である。ライブラリーＦの細胞ベースのＥＬＩＳＡから得られた固有の配列を有する３つのクローンを、免疫蛍光アッセイにおけるプローブとして使用した。ファージＦａｂクローンＣ１２およびＦ５がＨＥＫ２９３細胞に非特異的に結合するのに対して、ＲＷ０３クローンはＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞に特異的に結合し、ＨＥＫ２９３細胞へのバックグラウンド結合はほとんどない。
【図３Ａ−３Ｂ】それぞれ、精製Ｆａｂ  ＲＷ０３が、ＨＥＫ２９３細胞とは対照的に、ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３に対して特異的に結合することを示すヒストグラムおよび一組の蛍光顕微鏡写真である。発現および精製されたＦａｂＲＷ０３が、細胞ベースのＥＬＩＳＡ（図３Ａ）および免疫蛍光（ＩＦ）アッセイ（図３Ｂ）によって結合について試験された。
【図４Ａ−４Ｂ】結合親和性（ＥＣ５０）を推定するための、ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞に対するＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３それぞれの結合についての結合曲線を示す折れ線グラフである。細胞をＩｇＧ  ＲＷ０１またはＩｇＧ  ＲＷ０３のいずれかの段階希釈と共にインキュベートして、抗体に対する半最大結合曲線を決定した。ＳｉｇｍａＰｌｏｔグラフ作成ソフトウェアを使用して、ＩｇＧ  ＲＷ０１のＥＣ５０は２．５ｎＭと計算され（図４Ａ）、ＩｇＧ  ＲＷ０３のＥＣ５０は０．５ｎＭと計算された（図４Ｂ）。
【図５】フローサイトメトリー分析に示されるのと同様に、ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３を用いて、膵臓癌細胞および結腸直腸癌細胞における細胞表面ＣＤ１３３を特異的に結合および検出できることを示す一組の蛍光ヒストグラムである。
【図６】免疫蛍光分析によって示されるのと同様に、ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３を用いて細胞ＣＤ１３３を特異的に結合し、検出し、細胞内の位置を特定ができることを示す一組の蛍光顕微鏡写真である。ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３およびＨＥＫ２９３細胞への結合について、抗体類を試験した。
【図７】ウエスタンブロット分析によって示されるように、ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３を用いて、結腸直腸癌細胞中の変性ＣＤ１３３／細胞性ＣＤ１３３を検出できることを示す一組のウエスタンブロット分析の写真である。ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３およびＣａｃｏ−２細胞の全細胞溶解物を、ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３でプローブし、抗ヒトＨＲＰ結合二次抗体を用いて結合を検出した。ローディング対照としてβアクチンを使用した。
【図８】抗体可変領域ＲＷ０１を含むＦａｂおよび抗体可変領域ＲＷ０３を含むＦａｂが、ＣＤ１３３への結合について、それぞれＩｇＧ  ＲＷ０３およびＩｇＧ  ＲＷ０１と競合しないことを示す。競合フローサイトメトリー実験において、ＲＷ０１およびＲＷ０３を、ＣＤ１３３への結合について試験した。（ａ）では、ＦａｂＲＷ０３（四角）の存在下に、ＩｇＧ  ＲＷ０１（丸）またはＩｇＧ  ＲＷ０１の段階希釈物と共に、細胞をインキュベートした。同様に、（ｂ）では、Ｆａｂ  ＲＷ０１（四角）の存在下に、ＩｇＧ  ＲＷ０３（丸）またはＩｇＧ  ＲＷ０３の段階的希釈液と共に、細胞をインキュベートした。
【図９】ＩｇＧ  ＲＷ０１またはＩｇＧ  ＲＷ０３による処理が、Ｃａｃｏ−２結腸直腸癌細胞におけるＣＤ１３３タンパク質の全細胞レベルを有意に低下させることを示す、一組のウエスタンブロット分析の写真である。Ｃａｃｏ−２細胞を指示された抗体と共に３７℃で２４時間インキュベーションし、全細胞溶解物を調製し、ＡＣ１３３抗ＣＤ１３３抗体でプロービングした。抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を陰性抗体対照として使用し、またＧＡＰＤＨをローディング対照として使用した。
【図１０Ａ】ＢｉＴＥ＃１、ＢｉＴＥ＃２、ＢｉＴＥ＃３およびＢｉＴＥ＃４の配置を示す一組の概略図である。
【図１０Ｂ】ＢｉＴＥ＃１、ＢｉＴＥ＃２、ＢｉＴＥ＃３およびＢｉＴＥ＃４が、それぞれ、一過性トランスフェクションプロトコルによりＨＥＫ２９３細胞から発現および精製され得ることを示すウエスタンブロット分析の写真である。
【図１１Ａ−１１Ｂ】ＢｉＴＥ＃１（図１０Ａ）、ＢｉＴＥ＃２（図１０Ａ）、ＢｉＴＥ＃３（図１０Ｂ）およびＢｉＴＥ＃４（図１０Ｂ）の各々が、フローサイトメトリーで測定したときに、０．０７３〜０．１１マイクログラム／ｍＬという低い濃度でさえも、親ＨＥＫ２９３細胞よりも有意に多くＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞に結合することを示す一組の蛍光ヒストグラムである。用いたＢｉＴＥ濃度を、各ヒストグラムに示す。各ヒストグラムにおいて、最も右側のピークはＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞への結合を表し、最も左側のピークは親のＨＥＫ２９３細胞への結合を表す。
【図１２】ＢｉＴＥ＃１、ＢｉＴＥ＃２、ＢｉＴＥ＃３およびＢｉＴＥ＃４の各々が、ＣＤ３イプシロン／ガンマおよびＣＤ３イプシロン／デルタの形態でＣＤ３に結合することを示すＥＬＩＳＡの結果のヒストグラムである。抗ＣＤ３抗体のＵＣＨＴ１およびＯＫＴ３を陽性抗体対照として使用し、ＢＳＡを抗体なしの対照として使用した。
【図１３】ＣＤ１３３特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生成させるための構築物を示す。
【図１４】ＣＡＲ−Ｔ細胞の特徴付けを示す。
【図１５】ＣＤ１３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の検証を示す。
【図１６】ＣＤ１３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＣＤ１３３＋ヒトＧＢＭ細胞の存在下で活性化されることを示す。
【図１７Ａ−１７Ｂ】活性化されたＣＤ１３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が増殖能力を増強して、ＣＤ１３３陽性のＧＢＭ細胞死およびＣＤ１３３陽性の髄芽腫細胞死を特異的に誘導することを示す。ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＣＤ１３３ｈｉｇｈおよびＣＤ１３３ｌｏｗＧＢＭ細胞、ならびにＣＤ１３３ｈｉｇｈ髄芽腫細胞と共培養した。フローサイトメトリーは、ＩＲ染料を用いた生死染色に基づいていた。
【図１８Ａ−１８Ｃ】ＣＤ１３３特異的Ｔ細胞が、インビボにおいてＧＢＭ腫瘍の退縮を誘導することを示す。治療は、１００万細胞×２の用量（２週間）で頭蓋内に送達された。
【図１９Ａ−１９Ｂ】ＣＤ１３３×ＣＤ３  ＢｉＴＥの発生を示す。
【図２０Ａ−２０Ｂ】ＣＤ１３３×ＣＤ３  ＢｉＴＥが、ＣＤ１３３＋ＧＢＭ腫瘍細胞およびＣＤ３＋Ｔリンパ球に結合することを示す。
【図２１】ＣＤ１３３特異的ＢｉＴＥがＴ細胞を活性化することを示す。
【図２２Ａ−２２Ｃ】ＣＤ１３３特異的ＢｉＴＥが、Ｔ細胞をＣＤ１３３＋ヒトＧＢＭ細胞に動員して細胞死を引き起こすことを示す。
【図２３Ａ−２３Ｄ】ＣＤ１３３×ＣＤ３  ＢｉＴＥに媒介された抗腫瘍性応答を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
他に定義しない限り、本開示に関して使用される科学的および技術的用語は、当業者が一般的に理解する意味を有するものとする。さらに、文脈によって別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。例えば、「細胞」という用語は、単一の細胞ならびに複数の、または集団の細胞を含む。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、タンパク質、およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの化学的性質、ならびにハイブリダイゼーションと関連して利用される命名法およびそれらの技術は、当技術分野において周知かつ一般的に使用されているものである（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２を参照されたい）。
【００６８】
本明細書で使用される「約」、「実質的に」、および「およそ」等の程度を表す用語は、最終結果が有意に変化しないような修飾用語の妥当な量の偏差を意味する。これらの程度に関する用語は、修飾された単語の意味を否定しない限り、修飾された用語の少なくとも±５％の偏差を含むと解釈されるべきである。
【００６９】
＜問題の組成物＞
本発明者らは、表面発現型の／天然ヒトＣＤ１３３および変性ヒトＣＤ１３３に特異的に結合することができ、かつナノモル以下／ナノモルの範囲の解離定数（ＫＤ）でヒトＣＤ１３３に特異的に結合する新規な合成抗体可変領域を提供した（以下の実施例３および６参照）。
【００７０】
本発明者らは、特に、ｓｃＦｖがＣＤ１３３結合性抗体可変領域ＲＷ０１を含むＣＤ１３３結合性ファージｓｃＦｖクローンＲＷ０１、およびＦａｂがＣＤ１３３結合性抗体可変領域ＲＷ０３を含むＣＤ１３３結合性ファージＦａｂクローンＲＷ０３を提供した。最初に酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ、下記の実施例１および２参照）により確認されたように、これらのクローンは、ＣＤ１３３発現細胞に特異的に結合するそれらの能力について、ファージディスプレイライブラリーから選択された。本発明者らはさらに、ＣＤ１３３結合性抗体可変領域ＲＷ０１が、配列番号２のＡｓｐ１〜Ｌｙｓ１０６セグメントに対応する抗体軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６、配列番号７、および配列番号８に対応する（以下の実施例２参照）ことを特に提供した。本発明者らはさらに、抗体可変領域ＲＷ０１が配列番号３のＧｌｕ１〜Ｔｈｒ１２０セグメントに対応する抗体重鎖可変ドメインを含み、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１に対応し、また３９位、５５位および６６位の（フレームワーク領域）残基はＭｅｔ、ＳｅｒおよびＴｙｒ残基である（以下の実施例２参照）ことを提供した。
【００７１】
本発明者らはさらに、ＣＤ１３３結合性抗体可変領域ＲＷ０３が、配列番号４のＡｓｐ１〜Ｌｙｓ１０９セグメントに対応する抗体軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１２、配列番号１３、および配列番号１４に対応する（以下の実施例２参照）ことを提供した。本発明者らはさらに、抗体可変領域ＲＷ０３が配列番号５のＧｌｕ１〜Ｓｅｒ１１８セグメントに対応する抗体重鎖可変ドメインを含み、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７に対応し、また３９位、５５位および６６位の（フレームワーク領域）残基はそれぞれＩｌｅ、ＴｙｒおよびＴｙｒ残基である（下記の実施例２参照）ことを提供した。
【００７２】
本発明者らはさらに、ＣＤ１３３結合性抗体可変領域ＲＷ０１およびＣＤ１３３結合抗体可変領域ＲＷ０３を含むＩｇＧ１抗体「ＩｇＧ  ＲＷ０１」および「ＩｇＧ  ＲＷ０３」をそれぞれ使用して、（ｉ）フローサイトメトリー分析によって示されるように、膵臓癌細胞株および結腸直腸癌細胞株において細胞表面ＣＤ１３３を特異的に結合および検出することができ（下記の実施例４参照）、（ｉｉ）免疫蛍光分析によって示されるように、ＣＤ１３３発現細胞中の細胞性ＣＤ１３３を特異的に結合し、検出し、細胞内の位置を特定することができ（下記実施例５参照）、（ｉｉｉ）ウエスタンブロット分析によって示されるように、結腸直腸癌細胞の全細胞溶解物中の変性ＣＤ１３３を検出することができ（下記の実施例６参照）、ならびに（ｉｖ）結腸直腸癌細胞株中の全細胞ＣＤ１３３タンパク質レベルを有意に減少させることが（下記の実施例８を参照）できることを提供した。本発明者らは、抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１が、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖を含み、また抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３が、配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖（実施例２）を含むことを開示する。本発明者らはさらに、抗体可変領域ＲＷ０１を含むＦａｂおよび抗体可変領域ＲＷ０３を含むＦａｂが、ＣＤ１３３への結合について、それぞれＩｇＧ  ＲＷ０３およびＩｇＧ  ＲＷ０１と競合しないことを開示した（以下の実施例７）。
【００７３】
本発明者らはまた、ＣＤ１３３＋ＧＢＭ細胞を特異的にターゲッティングするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞に基づく戦略も記載する。ＣＤ１３３特異的ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、ＣＤ１３３ｈｉｇｈＧＢＭ細胞の存在下で活性化され、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の表面発現の増加を示した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＤ１３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は両方とも、活性化マーカーの表面発現レベルのアップレギュレーションを示した。本発明者らはさらに、治療抵抗性で回避性のＣＤ１３３＋ＧＢＭ  ＢＴＩＣに対するＣＡＲ−Ｔ細胞に誘導された細胞傷害性を実証した（下記の実施例１０）。
【００７４】
本発明者らはさらに、Ｔ細胞共受容体ＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含み、さらにＣＤ１３３結合性抗体可変領域ＲＷ０３を組み込んだＦａｂまたは単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）を含む二重特異性抗体／二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）の多重配置が、ＣＤ１３３陽性細胞およびＣＤ３の両方に特異的に結合できることを特に開示した（下記の実施例９参照）。本発明者らはまた、組換えＣＤ１３３×ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）が、ヒトポリクローナルＴ細胞をＣＤ１３３＋ＧＢＭ細胞へとリダイレクトし、強力な抗腫瘍応答を誘導することを示した（下記の実施例１１参照）。
【００７５】
ＣＤ１３３分子は、細胞外Ｎ末端領域、交互に短い細胞内ドメインおよび長い細胞外ドメインを有する５つの膜貫通ドメイン、ならびに細胞内Ｃ末端領域を有する膜貫通タンパク質である。本明細書中で使用するとき、ＣＤ１３３は任意の種または供給源に由来し、またそのようなＣＤ１３３タンパク質のアイソフォーム、類似体、変異体または機能的誘導体を含むことができる。一実施形態において、ＣＤ１３３はヒトＣＤ１３３である。ヒトＣＤ１３３遺伝子またはタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的供給源から入手できるＣＤ１３３についての公表された既知の配列のいずれかを有することができる。そのようなタンパク質配列の例には、配列番号１として示される配列が含まれるが、それには限定されない。ヒトＣＤ１３３は、当技術分野では代替的にプロミニン−１とも呼ばれる。
【００７６】
＜ＣＤ−１３３結合性抗原＞
したがって、本開示は、細胞表面発現型／天然ＣＤ１３３に特異的に結合し、かつ変性ＣＤ１３３に特異的に結合するＣＤ１３３結合剤を提供する。
【００７７】
本明細書で使用するとき、「細胞表面発現型／天然ＣＤ１３３に特異的に結合する」ＣＤ１３３結合剤は、ＣＤ１３３発現細胞に結合する物質である。ＣＤ１３３を発現する細胞は、例えば実施例４に記載したように、フローサイトメトリー分析によって、それ自体として同定することができる。あるいは、「細胞表面発現型／天然ＣＤ１３３に特異的に結合する」ＣＤ１３３結合剤は、ＣＤ１３３を発現するＣＤ１３３発現細胞を、検出不能なレベルで、例えばフローサイトメトリー分析のようなアッセイの検出限界未満のレベルで結合する物質である。本明細書中で使用するとき、「変性ＣＤ１３３に特異的に結合する」ＣＤ１３３結合剤は、（例えば実施例６に記載したウエスタンブロット分析を介して測定されるように）サンプル中の他のポリペプチドとは対照的に、ＣＤ１３３発現細胞の変性全細胞タンパク質のサンプル中のＣＤ１３３に対して結合する物質である。「ＣＤ１３３と免疫反応する」、または「ＣＤ１３３に対して向けられる」、または「抗ＣＤ１３３」として特徴付けられるという用語もまた、同じ目的のために本明細書で使用される。
【００７８】
一実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、配列番号２のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体（すなわち、抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１）により結合されるＣＤ１３３エピトープに特異的に結合し、かつ／または配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体（すなわち抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３）により結合されるＣＤ１３３エピトープに特異的に結合する。一実施形態において、ＣＤ１３３エピトープはヒトＣＤ１３３エピトープである。
【００７９】
本明細書で使用するとき、「エピトープ」の用語は、抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１および／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３により結合される抗原上の特定の部位、または部位／アミノ酸の特定の組み合わせを指し、例えば、ヒトＣＤ１３３の未修飾もしくは修飾された（例えば、翻訳後修飾、例えばグリコシル化）アミノ酸残基、これらアミノ酸残基を包含するヒトＣＤ１３３の最小ポリペプチドセグメント、またはこれらアミノ酸残基を包含するヒトＣＤ１３３のポリペプチドセグメントの任意の組み合わせを指す。エピトープ決定基は、通常は、アミノ酸または糖側鎖などの分子からなり、また通常は、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。
【００８０】
本明細書で使用するとき、他に特定しない限り、単数形で「ａ」特異的軽鎖または「ａ」特異的重鎖を含むと称する抗体または２価抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２）は、両方の軽鎖または両方の重鎖がそれぞれ同一である抗体または２価抗体断片を指す。
【００８１】
ＣＤ１３３結合剤の実施形態には、制限なしに、任意のタイプのＣＤ１３３結合性の分子、マクロ分子、物質、化合物、材料、組成物、または複合体が含まれる。
【００８２】
一実施形態において、ＣＤ１３３結合剤はポリペプチドである。他の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、ＣＤ１３３結合性核酸またはＣＤ１３３結合性有機化合物などの非ポリペプチド物質である。ＣＤ１３３結合剤は単量体または多量体であり得る。ＣＤ１３３結合剤はポリマー性または非ポリマー性であり得る。あるいは、ＣＤ１３３結合剤は、操作されたポリペプチド（例えば、修飾アミノ酸配列を有するように操作された天然ポリペプチド、または２以上の天然アミノ酸配列を含むように操作されたキメラポリペプチド、またはランダム化されたアミノ酸配列を有する操作されたポリペプチドのライブラリーから選択される操作されたポリペプチド）、または化学的に修飾されたポリペプチドであり得る。
【００８３】
一実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、ＣＤ１３３結合性抗体可変領域を含む。
【００８４】
本明細書中で使用するとき、ＣＤ１３３結合性抗体可変領域は、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインの組み合わせであり、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインが、ＣＤ１３３と特異的に結合する結合部位を形成する。
【００８５】
ＣＤ１３３結合剤は、任意選択で、抗体、抗体の抗原結合断片、またはＣＤ１３３結合性抗体可変領域を含む物質である。
【００８６】
本明細書で使用するときは、他に特定しない限り、「抗体」の用語は免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を指す。基本的な抗体構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖対で構成されており、各対は１本の軽（「Ｌ」）鎖（約２５ｋＤａ）および１本の重（「Ｈ」）鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担い、かつ以下でより詳細に記載する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能を担う定常領域を規定する。用語「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関与する結合性タンパク質の部分を指す。抗体において、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる、重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの非常に多様なストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られるより保存された隣接するストレッチの間に挿入される。したがって、「ＦＲ」の用語は、免疫グロブリンの超可変領域の間にかつ隣接して、天然に存在するアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間において互いに対して配置されて、抗原結合性表面を形成する。この抗原結合性表面は、結合した抗原の三次元表面に対して相補的であり、重鎖および軽鎖の各３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。本明細書に開示される全てのＣＤＲおよびフレームワーク領域（ＦＲ）、本明細書に開示されるＣＤＲおよびＦＲのアミノ酸配列、ならびに本明細書に開示されるＣＤＲをコードしまたはＦＲをコードする核酸配列は、ＩＭＧＴナンバリングに従って定義されることが意図されている（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，２００３）。そのような定義のために当技術分野で代替的に使用されている別のシステムは、Ｋａｂａｔナンバリングである（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。
【００８７】
ＣＤ１３３結合剤は、操作された可変領域を含む（例えば操作された抗体可変領域を呈示するファージディスプレイライブラリー、例えばファージＦａｂライブラリーまたは例えば実施例１に記載のようなファージｓｃＦｖライブラリーから選択される可変領域を含む）ヒト抗体、またはヒト定常領域および非ヒト哺乳動物の抗体可変領域を含むキメラ抗体のような抗体であり得る。ＣＤ１３３結合剤は、ヒト化抗体、例えばヒト定常領域、ヒト可変領域フレームワーク領域、および非ヒト哺乳動物において生成されたＣＤ１３３結合性ＣＤＲを含む抗体であり得る。非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、モルモットまたはハムスターなどのげっ歯類であり得る。あるいは、非ヒト哺乳動物は、ラクダ科動物またはウシ科などの有蹄動物であり得る。ＣＤ１３３結合剤は、任意の種類のクラスまたはサブクラスに属する重鎖定常領域を含む抗体であり得る。 ＣＤ１３３結合剤は、任意の種類の軽鎖を含み得る。
【００８８】
一実施形態において、ＣＤ１３３結合剤はＩｇＧ１抗体などのヒト抗体であり、重鎖定常領域はガンマ１重鎖定常領域である。他の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体などのヒト抗体であり、重鎖定常領域はそれぞれアルファ１、アルファ２、デルタ、ガンマ２、ガンマ３、ガンマ４、イプシロンまたはミュー重鎖定常領域である。
【００８９】
なおさらなる実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、軽鎖がヒトカッパ軽鎖定常ドメインを含むか、または軽鎖がヒトカッパ軽鎖である抗体である。あるいは、ＣＤ１３３結合剤は、軽鎖がヒトラムダ軽鎖定常ドメインを含むか、または軽鎖がヒトラムダ軽鎖である抗体である。
【００９０】
なおさらなる実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、ヒトガンマ１重鎖定常領域およびヒトカッパ軽鎖を含む抗体である。
【００９１】
本開示のＣＤ１３３結合剤の実施形態は、抗原結合性断片（Ｆａｂ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、Ｆａｂ’、Ｆｖ、化学連結されたＦ（ａｂ’）２、ｄｓＦｖ、ｄｓＦｖ’、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓ−ｓｃＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖベースのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＦａｂベースのＣＡＲ、ｓｃＦａｂベースのＣＡＲ、単鎖免疫グロブリン（例、ｓｃＩｇＧ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ミニボディ（ｓｃＦｖ−ＣＨ３）、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、多量体抗体（例、ｓｃＦｖダイマー、２価ダイアボディ）、多重特異性抗体（例、二重特異性抗体、三重特異性抗体、ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｔｒｉ−ｓｃＦｖ、二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ２、三重特異性トリアボディ、三重特異性Ｆａｂ３）、多量体／多重特異性抗体（例、ｓｃＦｖダイマー、二重特異性ダイアボディ、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’）重鎖抗体、Ｆａｂ３、２価ＶＨＨ、５価ＶＨＨ（ペンタボディ）、（ｓｃＦｖ−ＳＡ）４、および［ｓｃ（Ｆｖ）２］２をさらに含むが、これらに限定されない。
【００９２】
別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、ファージＦａｂまたはファージｓｃＦｖのような、ＣＤ１３３結合性抗体可変領域を含むポリペプチドを提示するファージである（以下の実施例１および２を参照のこと）。
【００９３】
本開示のＣＤ１３３結合剤の実施形態はさらに、ＣＤ１３３結合性核酸アプタマー（例えば、ＲＮＡアプタマーまたはＤＮＡアプタマー；例えば、Ｌｉｐｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６参照）、ペプチドアプタマー（例えば、Ｐａｒａｓｈａｒ，２０１６参照）、および化学的に合成された薬剤（例えば、合成抗体模倣物；例えば、ＭｃＥｎａｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４参照）を含む。
【００９４】
別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤はペプチド類似体である。ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの性質に類似した性質を有する非ペプチド薬として、製薬業界で一般的に使用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物」または「ペプチド模倣薬」と呼ばれる（例えば、Ｆａｕｃｈｅｒｅ，１９８６、Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５、およびＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７参照）。そのような化合物は、しばしばコンピュータ化された分子モデリングを用いて開発される。生物学的に有用なペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣物を使用して、同等の生物学的効果を生じ得る。一般に、ペプチドミ模倣薬は、ヒト抗体のようなパラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的性質または薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似しているが、当該術分野で周知の方法により、−ＣＨ２ＮＨ−，−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される結合によって任意選択的に置き換えられた１以上のペプチド結合を有している。同一タイプのＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）によるコンセンサス配列の１以上のアミノ酸の系統的な置換を使用して、より安定なペプチドを生成し得る。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む束縛性ペプチドは、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成できる内部システイン残基を付加することによって、当技術分野において公知の方法（例えば、Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ，１９９２参照）で生成され得る。
【００９５】
一実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は抗体可変領域ＲＷ０１を含み、これは（ａ）配列番号２のＡｓｐ１〜Ｌｙｓ１０６セグメントに対応する抗体軽鎖可変ドメイン（配列番号２８）であって、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤ３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号６、配列番号７および配列番号８に対応する抗体軽鎖可変ドメイン（下記の実施例２を参照）と、（ｂ）配列番号３のＧｌｕ１〜Ｔｈｒ１２０セグメントに対応する抗体重鎖可変ドメイン（配列番号２９）であって、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１に対応し、また３９位、５５位および６６位の（フレームワーク領域）残基がＭｅｔ、Ｓｅｒ、およびＴｙｒ残基である抗体重鎖可変ドメイン（下記の実施例２を参照）と、を含む。
【００９６】
一実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は抗体可変領域ＲＷ０３を含み、これは（ａ）配列番号４のＡｓｐ１〜Ｌｙｓ１０９セグメントに対応する抗体軽鎖可変ドメイン（配列番号３０）であって、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤ３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４に対応する抗体軽鎖可変ドメイン（下記の実施例２を参照）と、（ｂ）配列番号５のＧｌｕ１〜Ｓｅｒ１１８セグメントに対応する抗体重鎖可変ドメイン（配列番号３１）であって、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７に対応し、また３９位、５５位および６６位の（フレームワーク領域）残基がＩｌｅ、Ｔｙｒ、およびＴｙｒ残基である抗体重鎖可変ドメイン（下記の実施例２を参照）と、を含む。
【００９７】
また、本明細書に特に開示されるのは、配列番号２に示される軽鎖アミノ酸配列および配列番号３に示される重鎖アミノ酸配列を含む、ＣＤ１３３結合剤ＩｇＧ  ＲＷ０１である（以下の実施例２を参照のこと）。
【００９８】
なおさらに本明細書で特に開示されるのは、配列番号４に示される軽鎖アミノ酸配列および配列番号５に示される重鎖アミノ酸配列を含む、ＣＤ１３３結合剤ＩｇＧ  ＲＷ０３である（以下の実施例２参照）。
【００９９】
したがって、本開示はまた、ＣＤ１３３結合剤であって、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および／もしくは配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン、ならびに／または
（ｉｉ）３９位にＭｅｔ残基および配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、５５位のＳｅｒ残基、６６位のＴｙｒ残基および配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む抗体重鎖可変ドメインを含み、抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインが、ヒトＣＤ１３３に結合する抗原結合部位を形成する、ＣＤ１３３結合剤を提供する。
【０１００】
一実施形態において、抗体軽鎖可変ドメインは、それぞれ配列番号６、配列番号７および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含み、ならびに抗体重鎖可変ドメインは、それぞれ配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変ドメインは、それぞれ３９位、５５位および６６位にＭｅｔ残基、Ｓｅｒ残基およびＴｙｒ残基を含む。
【０１０１】
別の実施形態において、抗体軽鎖可変ドメインは、それぞれ配列番号６、配列番号７および配列番号８のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含み、ならびに抗体重鎖可変ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１および３９位において重鎖ＣＤＲ１に隣接するＭｅｔ残基で構成されるアミノ酸配列（配列番号３２）、配列番号１０のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、５５位において重鎖ＣＤＲ２に隣接するＳｅｒ残基、および６６位において重鎖ＣＤＲ２に隣接するＴｙｒ残基、ならびに配列番号１１のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３で構成されるアミノ酸配列（配列番号３３）を含む。
【０１０２】
さらなる実施形態において、軽鎖は、配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号２のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または重鎖は、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
なおさらなる実施形態において、軽鎖は配列番号２のアミノ酸配列からなり、および／または重鎖は配列番号３のアミノ酸配列からなる。
【０１０４】
したがって、本開示はまた、ＣＤ１３３結合剤であって、
（ｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および／もしくは配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む抗体軽鎖可変ドメイン、ならびに／または
（ｉｉ）３９位にＭｅｔ残基および配列番号１５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、５５位と６６位のＴｙｒ残基および配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および／もしくは配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、を含む抗体重鎖可変ドメインを含み、抗体軽鎖可変ドメインおよび抗体重鎖可変ドメインは、ヒトＣＤ１３３に結合する抗原結合部位を形成する、ＣＤ１３３結合剤を提供する。
【０１０５】
一実施形態において、抗体軽鎖可変ドメインは、それぞれ配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含み、ならびに抗体重鎖可変ドメインは、それぞれ配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２、および重鎖ＣＤＲ３を含み、抗体重鎖可変ドメインは、それぞれ３９位、５５位および６６位にＩｌｅ残基、Ｔｙｒ残基およびＴｙｒ残基を含む。
【０１０６】
別の実施形態において、抗体軽鎖可変ドメインは、それぞれ配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４のアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２、および軽鎖ＣＤＲ３を含み、ならびに抗体重鎖可変ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１および３９位において重鎖ＣＤＲ１に隣接するＭｅｔ残基で構成されるアミノ酸配列（配列番号３４）、配列番号１６のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、５５位において重鎖ＣＤＲ２に隣接するＴｙｒ残基、および６６位において重鎖ＣＤＲ２に隣接するＴｙｒ残基で構成されるアミノ酸配列（配列番号３５）、ならびに配列番号１７のアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３、を含む。
【０１０７】
さらなる実施形態において、抗体軽鎖は、配列番号４のアミノ酸配列、または配列番号４のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／または抗体重鎖は、配列番号５のアミノ酸配列、または配列番号５のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０８】
なおさらなる実施形態において、軽鎖は配列番号４のアミノ酸配列からなり、重鎖は配列番号５のアミノ酸配列からなる。
【０１０９】
本開示の任意のＣＤ１３３結合剤は、周知の技術を使用して入手でき、また使用のために適切に調製され得る。
【０１１０】
本開示のポリペプチドＣＤ１３３結合剤は、当技術分野において周知であり、日常的に実施される組換え技術によって合成することができる。本開示のポリペプチドＣＤ１３３結合剤は、組換え細胞株またはトランスジェニック動物などの組換え供給源において産生され得る。技術は、ＣＤ１３３に対して特異的なｓｃＦｖのような単鎖抗体の産生のために適合させることができる（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号参照）。
【０１１１】
あるいは、本開示のＣＤ１３３結合抗体のような本開示のポリペプチドＣＤ１３３結合剤は、動物の血清中において抗体を発生させるように、動物をＣＤ１３３で、または適切なＣＤ１３３エピトープを含むポリペプチドで免疫感作することによって得ることができる。
【０１１２】
本開示のＣＤ１３３結合性ＩｇＧ抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーなどの技術によって、血清のような生物学的サンプルから精製することができる（例えば、Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，２０００を参照されたい）。追加的または代替的に、ＣＤ１３３またはＣＤ１３３結合剤により特異的に結合されるそのエピトープを含むポリペプチドをカラムに固定化して、免疫親和性クロマトグラフィーにより、サンプルからＣＤ１３３結合剤を精製することができる。
【０１１３】
本開示のＣＤ１３３結合抗体断片は、従来の技術を用いて抗体から得ることができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体をペプシンで処理することにより生成させることができる。得られたＦ（ａｂ’）２断片は、Ｆａｂ’断片を生成させるために、ジスルフィド架橋を還元するように処理することができる。
【０１１４】
本開示のポリペプチドＣＤ１３３結合剤を製造する方法を、以下にさらに詳細に記載する。
【０１１５】
上記で述べたように、一実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は二重特異性抗体であり得る。
【０１１６】
本明細書で使用するとき、二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原または同じ抗原の２つの異なるエピトープに対する結合特異性を付与する、２つの異なる抗体可変領域を含む結合剤である。
【０１１７】
本開示の二重特異性抗体は、ＣＤ１３３および他の抗原に特異的に結合するか、またはＣＤ１３３の異なるエピトープに特異的に結合する。任意選択で、二重特異性抗体は、ＣＤ１３３および細胞表面タンパク質、受容体または受容体サブユニットに結合する。
【０１１８】
一実施形態において、二重特異性抗体は、ＣＤ１３３結合性単鎖Ｆａｂおよび非ＣＤ１３３結合性ｓｃＦｖを含む。あるいは、二重特異性抗体は、ＣＤ１３３結合性Ｆａｂおよび非ＣＤ１３３結合性ｓｃＦｖを含む。
【０１１９】
別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、Ｔ細胞、マクロファージまたはＮＫ細胞などの免疫細胞をターゲッティングし、それに結合および／または係合する二重特異性抗体である。この実施形態によれば、ＣＤ１３３結合剤は、一方の結合特異性がＣＤ１３３に対するものであり、他方の結合特異性がＴ細胞、マクロファージまたはＮＫ細胞の表面に発現された抗原に対するものである二重特異性抗体である。例えば、二重特異性抗体は、ＣＤ１３３およびＴ細胞の受容体のような免疫細胞受容体に結合することができ、結合したときには免疫細胞の活性を活性化または阻害する。
【０１２０】
組換え細胞培養体から直接に、二重特異性抗体を作製および単離するための様々な技術が記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパー（例えばＫｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２参照）を用いて、「ダイアボディ」技術（例えばＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３参照）を用いて、および単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４参照）を用いて製造されている。
【０１２１】
Ｔ細胞と係合する二重特異性抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）と呼ばれることがある。本開示の一実施形態では、二重特異性抗体／ＢｉＴＥは、ＣＤ１３３とＴ細胞共受容体ＣＤ３の両方に特異的に結合する（本明細書ではＣＤ１３３結合性／ＣＤ３結合性二重特異性抗体とも呼ばれる）。したがって、本開示のＣＤ１３３結合性抗体可変領域およびＣＤ３結合性抗体可変領域を含む二重特異性抗体／ＢｉＴＥを本明細書で提供するそのような二重特異性抗体／ＢｉＴＥは、癌細胞のような細胞へのＴ細胞のターゲッティングを可能にし、表面ＣＤ１３３を発現する。二重特異性抗体／ＢｉＴＥの様々な配置が本明細書において想定される。例えば、一実施形態において、二重特異性抗体／ＢｉＴＥは、抗ＣＤ１３３  Ｆａｂおよび抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを含む。任意選択で、抗ＣＤ１３３Ｆａｂの軽鎖または重鎖のいずれかが、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖの重鎖に結合している。別の実施形態において、二重特異性抗体／ＢｉＴＥは、抗ＣＤ１３３単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）および抗ＣＤ３  ＳｃＦｖを含む。任意選択で、抗ＣＤ１３３  Ｆａｂまたは抗ＣＤ１３３  ｓｃＦａｂの軽鎖または重鎖のいずれかが、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖの重鎖に結合する。一実施形態において、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、ＣＤ３イプシロン／ガンマに結合する。一実施形態において、ＢｉＴＥ／二重特異性抗体は、ＣＤ３イプシロン／デルタに結合する。例えば、図１０Ａを参照されたい。ＢｉＴＥの様々な実施形態の配置およびアミノ酸配列の例が表６に提供されている。したがって、本開示はまた、（ａ）配列番号２２および配列番号２３、（ｂ）配列番号２４および２５、（ｃ）配列番号２６、および（ｄ）配列番号２７から選択される１以上のアミノ酸配列、またはそれらの機能的変異体を含むＢｉＴＥを提供する。一実施形態において、ＢｉＴＥは、配列番号２２〜２７のいずれか１つに対して、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
さらなる実施形態において、二重特異性抗体はＣＤ１３３およびＮＫ細胞表面受容体ＣＤ１６に結合する。
【０１２３】
本開示の別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、抗体可変領域ＲＷ０１および抗体可変領域ＲＷ０３を含む二重特異性抗体である。
【０１２４】
上記のように、ＣＤ１３３結合剤は、任意の価数および／または特異性を有し得る。例えば、三重特異性および／または３価のＣＤ１３３結合剤を調製することができる（例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１参照）。
【０１２５】
さらに上述したように、ＣＤ１３３結合剤の実施形態はまた、ＣＤ１３３結合性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をも含む。
【０１２６】
したがって、本明細書では、（ｉ）本開示のＣＤ１３３結合剤、および（ｉｉ）１以上の免疫細胞受容体シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲシグナル伝達ドメイン、を含むキメラ抗原受容体が提供される。キメラ抗原受容体は、本開示のＣＤ１３３結合性可変領域を含むポリペプチド、例えばＣＤ１３３結合性ｓｃＦｖが、例えばヒンジドメインおよび膜貫通ドメインを介して、１以上の免疫細胞受容体の１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲシグナル伝達ドメインに融合されている。ＣＡＲは、単量体ポリペプチド（例えば抗ＣＤ１３３  ｓｃＦｖベースの）または多量体ポリペプチド（例えば抗ＣＤ１３３  Ｆａｂベースの）であり得る。免疫エフェクター細胞におけるそのようなＣＡＲの発現は、表面ＣＤ１３３を発現する細胞への免疫細胞のターゲッティングを可能にし、細胞表面に発言されたＣＤ１３３へのＣＡＲの結合が、免疫エフェクター細胞のエフェクター機能を活性化する。
【０１２７】
一実施形態において、ＣＡＲシグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞共受容体ＣＤ３のシグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ゼータまたはＣＤ３ガンマ）を含む。別の実施形態において、ＣＡＲは、１以上のＴ細胞共刺激分子（例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳおよび／またはＣＤ２７）のシグナル伝達ドメインに融合したＴ細胞共受容体ＣＤ３のシグナル伝達ドメインを含む。さらに別の実施形態において、ＣＡＲシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ、ならびにＣＤ８およびＣＤ２８の一部を含む。別の実施形態において、ＣＡＲシグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ８リーダー配列およびＣＤ８ａ膜貫通ドメインを含む。一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインおよび末端ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。さらなる実施形態において、ＣＡＲシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン、４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２８シグナル伝達ドメインを含む。ＶＬ−リンカー−ＶＨおよびＶＨ−リンカー−ＶＬを含めて、ＣＡＲに含まれるｓｃＦｖの異なる配置が想定される。抗原発現細胞をターゲッティングするための適切なＣＡＲの構築およびそれらの使用は、当該技術分野は一般に「ＣＡＲ  Ｔ細胞療法」と称されるものであり、当技術分野において周知である（例えば、Ｍａｕｓ  ａｎｄ  Ｊｕｎｅ，２０１６、Ａｂａｔｅ−Ｄａｇａ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｌａ，２０１６、Ｒｅｓｅｔｃａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、およびＷａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｉｖｉｅｒｅ，２０１６参照）。
【０１２８】
さらなる実施形態において、ＣＤ１３３結合剤はファージＦａｂまたはファージｓｃＦｖであり、ここでのＦａｂまたはｓｃＦｖはＣＤ１３３に特異的に結合する。本開示はまた、本明細書に記載のようにＣＡＲを発現するＴ細胞を提供する。
【０１２９】
ＣＤ１３３発現細胞への結合／ターゲッティングにおけるその効果を高めるために、および／またはＣＤ１３３発現細胞中のＣＤ１３３レベルを低減することにおけるその有効性を高めるために、エフェクター機能に関して、本明細書に開示される結合剤を修飾することが望ましい場合があり得る。例えば、結合剤が抗体のような抗体Ｆｃ領域を含む場合、システイン残基をＦｃ領域のＣＯＯＨ末端に導入することができ、それによってこの領域において抗体モノマー間の鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にする。このようにして生成されたホモ二量体抗体は、改善された内在化能力および／または増加した補体媒介性細胞殺傷および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有することができる（例えば、Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２、およびＳｈｏｐｅｓ，１９９２参照）。あるいは、抗体は二重のＦｃ領域を有するよう操作され、それによって補体溶解およびＡＤＣＣ能力の増強を有することができる（例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９参照）。本開示には、本明細書に記載のＣＤ１３３結合剤の機能的変異体も含まれる。本明細書で使用される「機能的変異体」の用語には、本明細書で開示されるアミノ酸および核酸配列の修飾または化学的等価物であって、本明細書に開示されたポリペプチドまたは核酸分子と実質的に同じ方法で、実質的に同じ機能を果たすものが含まれる。例えば、本明細書に開示されるポリペプチドの機能的変異体には、制限なしに、保存的アミノ酸置換が含まれる。
【０１３０】
本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基が別のアミノ酸残基で置換されることが、アミノ酸を類似の生化学的特性（例えば電荷、疎水性およびサイズ）を有する異なるアミノ酸に変える置換である。ポリペプチドの変異体には、本明細書に開示されるポリペプチド配列に対する付加および欠失も含まれる。加えて、変異体ヌクレオチド配列には、その類似体および誘導体が含まれる。本明細書に開示される結合剤の変異体には、結合剤と同じ抗原またはエピトープに結合する物質が含まれる。
【０１３１】
一実施形態において、本開示には、本明細書に開示されるアミノ酸配列に対する機能的変異体が含まれる。特に、本開示は、ＩｇＧ  ＲＷ０１の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２および配列番号３）の機能的変異体、抗体可変領域ＲＷ０１のＣＤＲのアミノ酸配列（配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１）の機能的変異体、ならびに抗体可変領域ＲＷ０１の重鎖の配列番号３２および配列番号３３に対応するアミノ酸配列の機能的変異体を提供する。本開示はさらに、特にＩｇＧ  ＲＷ０３の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列（それぞれ、配列番号４および配列番号５）の機能的変異体、抗体可変領域ＲＷ０３のＣＤＲのアミノ酸配列（配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７）の機能的変異体、ならびに抗体可変領域ＲＷ０３の重鎖の配列番号３４および配列番号３５に対応するアミノ酸配列の機能的変異体を提供する。
【０１３２】
別の実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列に対する機能的変異体を含むものである。ＩｇＧ  ＲＷ０１の軽鎖および重鎖をコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号１８および配列番号１９）の機能的変異体、抗体可変領域ＲＷ０１の軽鎖および重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列（それぞれ、配列番号５２および配列番号５３）の機能的変異体、抗体可変領域ＲＷ０１のＣＤＲのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０および配列番号４１）の機能的変異体、ならびに抗体可変領域ＲＷ０１の重鎖の配列番号３２および配列番号３３に対応するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（それぞれ、配列番号４２および配列番号４３）の機能的変異体を特に提供する。
【０１３３】
本開示はさらに、特に、ＩｇＧ  ＲＷ０３の軽鎖および重鎖をコードするヌクレオチド配列（それぞれ、配列番号２０および配列番号２１）の機能的変異体、抗体可変領域ＲＷ０３の軽鎖および重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列（それぞれ、配列番号５４および配列番号５５）の機能的変異体、抗体可変領域ＲＷ０３のＣＤＲのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８および配列番号４９）の機能的変異体、ならびに抗体可変領域ＲＷ０３の重鎖の配列番号３４および配列番号３５に対応するアミノ酸配列コードするヌクレオチド配列（それぞれ、配列番号５０および配列番号５１）の機能的変異体を提供する。
【０１３４】
加えて、機能的変異体には、少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、本開示のアミノ酸配列をコードする核酸またはその相補体とハイブリダイズするヌクレオチド配列が含まれる。そのような機能的変異体には、少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４または配列番号５５、またはその相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列が含まれる。
【０１３５】
「少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、溶液中の２つの相補的核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件が選択されることを意味する。ハイブリダイゼーションは、核酸配列分子の全部または一部に対して起こり得る。ハイブリダイズ部分は、典型的には少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０または５０）ヌクレオチド長である。当業者は、核酸二本鎖またはハイブリッドの安定性が、ナトリウム含有緩衝液中ではナトリウムイオン濃度および温度の関数であるＴｍ（Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｌ）、または同様の式）によって決定されることを認識するであろう。したがって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件におけるパラメータは、ナトリウムイオン濃度および温度である。既知の核酸分子と類似するが同一ではない分子を同定するために、１％のミスマッチがＴｍの約１℃の減少をもたらすこと、例えば９５％の同一性を有する核酸配列が探索されるならば、最終洗浄温度は約５℃低下するであろうことを仮定することができる。これらの考察に基づいて、当業者は適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することができるであろう。いくつかの実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択される。例として、以下の条件を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成することができる。すなわち、上記の式に基づいて、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳ（Ｔｍ−５℃）でのハイブリダイゼーションに続いて、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳの６０℃での洗浄である。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、４２℃において３×ＳＳＣ中での洗浄工程が含まれる。しかしながら、代替の緩衝液、塩および温度を用いて同等のストリンジェンシーが達成され得ることが理解される。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなるガイダンスは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，２００２、およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１の中に見出すことができる。
【０１３６】
一実施形態において、本明細書に開示のアミノ酸配列の変異体アミノ酸配列には、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４または配列番号３５に対して、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列が含まれる。
【０１３７】
別の実施形態において、本明細書に開示されるアミノ酸配列の変異体アミノ酸配列は、配列番号２、３、４または５のフレームワーク領域に対して、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含んでいる。別の実施形態において、本明細書に開示のアミノ酸配列をコードする変異体ヌクレオチド配列には、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４または配列番号５５に対して、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列が含まれる。
【０１３８】
別の実施形態において、本明細書に開示される重鎖および軽鎖可変ドメインを含むアミノ酸配列をコードする変異体ヌクレオチド配列には、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４および配列番号５５を含むそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列が含まれる。
【０１３９】
本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の間の配列同一性のパーセンテージを指す。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、当該配列は、最適な比較のために整列される（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適な整列のために、第１のアミノ酸配列または核酸配列にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その分子はその位置において同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、それら配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の重複位置の数／位置の総数×１００％）。一実施形態において、２つの配列は同一の長さである。２つの配列間の同一性パーセントの決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な一例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０のアルゴリズムを、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３に修正したものである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本開示の核酸分子に対して相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータセット（例えばスコア＝１００、ワード長＝１２に対して）を用いて、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施することができる。本発明のタンパク質分子に対して相同なアミノ酸配列を得るためには、ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメーターセット（例えばスコア＝５０、ワード長＝３に対して）を用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施することができる。比較目的のためのギャップ付きアライメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７に記載されているように、ギャップ付きＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して、分子間の離れた関係を検出する反復検索を行うことができる。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ｌａｓｔプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる（例えば、ＮＣＢＩウェブサイト参照）。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの他の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ．，１９８８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用することができる。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを許容してまたは許容せずに、上記と同様の技術を用いて決定することができる。同一性パーセントの計算では、通常は完��一致のみがカウントされる。
【０１４０】
＜核酸およびベクター＞
本明細書に記載の抗体可変領域をコードする核酸、およびこれらの抗体可変領域を含むポリペプチドをコードする核酸もまた提供される。本明細書で使用するとき、「核酸」の用語は単離された核酸を含む。
【０１４１】
特に、本開示は、配列番号３６〜４１に記載の、抗体可変領域ＲＷ０１のＣＤＲ領域をコードする核酸、およびそれらの機能的変異体、ならびに配列番号４２および４３に記載のＲＷ０１の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸、およびそれらの機能的変異体を提供する。また、配列番号４４〜４９に記載のＲＷ０３のＣＤＲ領域をコードする核酸、およびそれらの機能的変異体、ならびに配列番号５０および５１に記載のＲＷ０３の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列をコードする核酸、ならびにそれらの機能的変異体も提供される。
【０１４２】
抗体可変領域ＲＷ０１の軽鎖可変ドメインをコードする核酸（配列番号５２）、およびその機能的変異体がさらに提供される。一実施形態において、核酸は、（ａ）配列番号２８のアミノ酸配列、または（ｂ）配列番号２８のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。ＩｇＧ  ＲＷ０１の重鎖をコードする核酸（配列番号５３）もまた提供される。一実施形態において、核酸は、（ａ）配列番号２９のアミノ酸配列、または（ｂ）配列番号２９のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
【０１４３】
抗体可変領域ＲＷ０３の軽鎖可変ドメインをコードする核酸（配列番号５４）、およびその機能的変異体をさらに提供する。一実施形態において、核酸は、（ａ）配列番号３０のアミノ酸配列、または配列番号３０のフレームワーク領域に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。抗体可変領域ＲＷ０３の重鎖可変ドメインをコードする核酸（配列番号５５）もまた提供される。一実施形態において、核酸は、（ａ）配列番号３１のアミノ酸配列、または配列番号３１のフレームワーク領域と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
【０１４４】
本開示はまた、配列番号１８、１９、２０および２１に記載のＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３の軽鎖および重鎖をコードする核酸、ならびにそれらの機能的変異体も提供する。
【０１４５】
本開示はまた、配列番号５２、５３、５４および５５に記載の抗体可変領域ＲＷ０１および抗体可変領域ＲＷ０３の軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードする核酸、ならびにそれらの機能的変異体をも提供する。
【０１４６】
本明細書中で開示されるポリペプチド結合剤は、当該分野において周知でかつ日常的に実施される方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターによって発現され得る。したがって、本開示はまた、本明細書に記載の核酸のいずれかを発現するベクターをも提供する。
【０１４７】
ポリペプチド結合剤は、ポリペプチド結合剤をコードする核酸を構築し、当該構築物を発現ベクターに挿入し、次いでそれを適切な宿主細胞中で発現させることによって調製することができる。本明細書に開示されるポリペプチド結合剤を発現させるために有用なベクターは、当技術分野において周知である。一実施形態において、ベクターは、機能的プロモーターによる動作可能な読み取り段階にある適切な翻訳開始および終結シグナルを含み、また、ベクターの維持を確実にし、望ましい場合には増幅をもたらす１以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含み得る。ベクターに加えて、本開示の核酸は、当技術分野で公知の他の任意の方法（リポソーム、裸のＤＮＡ、アジュバント補助ＤＮＡ、遺伝子銃、カテーテルなどを含むがこれらに限定されない）を介して、細胞または被験体に送達することができる。
【０１４８】
＜モノクローナルポリペプチド／モノクローナル抗体＞
上記のように、ＣＤ１３３結合剤は、ＣＤ１３３結合性抗体可変領域を含むポリペプチド、例えば抗体可変領域ＲＷ０１または抗体可変領域ＲＷ０３を特異的に含む抗体であり得る。したがって、本開示はさらに、本開示のモノクローナルＣＤ１３３結合性抗体のような本開示のモノクローナルポリペプチドＣＤ１３３結合剤を提供する。
【０１４９】
本明細書で使用するとき、本開示の「モノクローナル」ポリペプチドＣＤ１３３結合剤とは、同一のポリペプチドＣＤ１３３結合剤分子の集団を指す。例えば、本開示のモノクローナルＣＤ１３３結合性抗体のような、ＣＤ１３３結合性抗体可変領域を含む本開示のモノクローナルポリペプチドＣＤ１３３結合剤の場合、ＣＤＲは当該集団の全ての分子において同一である。本開示のモノクローナル抗体のようなモノクローナルポリペプチドの産生のために、当該分野で既知の種々の手順が使用され得る（例えば、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，２０１３参照）。モノクローナル抗体は、一般に、「ｍＡｂ」または「ＭＡｂ」の略語を用いて指称される。
【０１５０】
モノクローナル抗体は、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組換えＤＮＡ法によって作製することができる。モノクローナル抗体およびその抗原結合性断片をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）容易に単離し、配列決定することができる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されたら、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、次いでこれを、免疫グロブリンタンパク質を産生しないサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他の方法ではミエローマ細胞のような宿主細胞にトランスフェクトして、組み換え宿主細胞中においてモノクローナル抗体の合成を得ることができる。
【０１５１】
モノクローナル抗体もまた、動物をＣＤ１３３、例えばマウス、ラットもしくはヒトのＣＤ１３３またはその免疫原性断片、誘導体もしくは変異体などで免疫感作することにより生成させることができる。あるいは、発現されて、トランスフェクトされた細胞表面に結合するＣＤ１３３をコードしている核酸分子を含有するベクターでトランスフェクトされた細胞を用いて、動物を免疫感作する。あるいは、抗体は、抗体または抗原結合性ドメイン配列を含むライブラリーを、ＣＤ１３３への結合についてスクリーニングすることにより得られる。このライブラリーは、例えば、構築したファージ粒子の表面に発現されるバクテリオファージコートタンパク質とのタンパク質またはペプチドの融合体、およびファージ粒子内に含まれるコーディングＤＮＡ配列（すなわち、「「ファージディスプレイライブラリー」」として、バクテリオファージで調製される。次いで、ミエローマ／Ｂ細胞融合から生じるハイブリドーマを、ＣＤ１３３に対する反応性についてスクリーニングする。
【０１５２】
モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマ法を用いて調製することができる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５参照）。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を免疫剤で免疫感作して、免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生できるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫感作することができる。
【０１５３】
＜親和性＞
免疫グロブリン分子と、免疫グロブリンが特異的である抗原との間に非共有相互作用が生じる。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（ＫＤ）に関して表すことができ、ここでより小さいＫＤはより高い親和性を表す。特定のポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野で周知の方法を用いて定量化できる。そのような方法の１つは、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度を測定することを含み、それらの速度は複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を及ぼす幾何学的パラメータに依存する。したがって、「オン速度定数」（Ｋｏｎ）および「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度ならびに会合および解離の実際の速度の計算によって決定され得る（例えば、Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ，１９９３参照）。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関連しない全てのパラメータの相殺を可能にし、そして解離定数ＫＤに等しい（例えば、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０参照）。
【０１５４】
本明細書に開示される２価ＣＤ１３３結合剤、例えば２つのＣＤ１３３結合性抗体可変領域（例えば、抗体またはＦ（ａｂ’）２）を含むＣＤ１３３結合剤は、結合の解離定数（ＫＤ）が≦１マイクロモルであるときに、ＣＤ１３３に特異的に結合すると考えられる。本明細書に開示される１価ＣＤ１３３結合剤（すなわち、単一のＣＤ１３３結合性抗体可変領域、例えばｓｃＦｖまたはＦａｂのような、単一のＣＤ１３３結合部位を有するもの）は、２価形態のＣＤ１３３結合剤の結合の解離定数（ＫＤ）が≦１マイクロモル以下の場合に、ＣＤ１３３に特異的に結合すると言われる。本開示の１価結合剤を連結して、その適切な２価形態を生成するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、１価物質が単一の抗体可変領域を含む場合、２コピーの抗体可変領域を含む２価抗体／Ｆ（ａｂ’）２の製造、または例えばポリペプチドリンカー、核酸リンカーまたは化学合成リンカーなどの適切なリンカーを使用することを含む）。
【０１５５】
様々な実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、≦１マイクロモル、≦９００ｎＭ、≦８００ｎＭ、≦７００ｎＭ、≦６００ｎＭ、≦５００ｎＭ、≦４００ｎＭ、≦３００ｎＭ、≦２００ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦９０ｎＭ、≦８０ｎＭ、≦７０ｎＭ、≦６０ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦４０ｎＭ、≦３０ｎＭ、≦２０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦９ｎＭ、≦８ｎＭ、≦７ｎＭ、≦６ｎＭ、≦５ｎＭ、≦４ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．９ｎＭ、≦０．８ｎＭ、≦０．７ｎＭ、≦０．６ｎＭ、≦０．５ｎＭ、≦０．４ｎＭ〜０．３ｎＭ、≦０．２ｎＭ、または≦１００ｐＭ〜約１ｐＭの解離定数（ＫＤ）でＣＤ１３３に結合する。
【０１５６】
さらなる様々な実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、≦１マイクロモル〜１００ｎＭ、≦１００ｎＭ〜１０ｎＭ、≦１０ｎＭ〜１ｎＭ、≦１ｎＭ〜０．１ｎＭ、または≦０．１ｎＭ〜１０ｐＭの解離定数（ＫＤ）でＣＤ１３３に結合する。
【０１５７】
さらなる様々な実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、≦３ｎＭ〜２ｎＭ、≦２．６ｎＭ〜２．４ｎＭ、≦２．５ｎＭ、約２．５ｎＭ、≦２ｎＭ〜１ｎＭ、≦０．６ｎＭ〜０．４ｎＭ、≦０．５ｎＭ、または約０．５ｎＭの解離定数（ＫＤ）でＣＤ１３３に結合する。
【０１５８】
本明細書に開示されているように、２価ＣＤ１３３結合剤、例えば本開示のＣＤ１３３結合抗体または２価形態の１価ＣＤ１３３結合剤の結合についての解離定数ＫＤは、フローサイトメトリーで測定したとき、ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞のようなＣＤ１３３過剰発現細胞の集団への結合を飽和させるのに必要なＣＤ１３３結合剤の最大半量の濃度（「ＥＣ５０」）に対応すると考えられる（下記の実施例３参照）。この方法は、ＣＤ１３３のような膜貫通タンパク質の場合にしばしばそうであるように、適切に精製できない細胞表面分子に対する結合剤の親和性を決定するために有用である。ＣＤ１３３結合剤の細胞表面発現ＣＤ１３３への結合についての解離定数（ＫＤ）を決定する別の方法には、放射性リガンド結合アッセイ、および当業者に知られた同様のアッセイが含まれる。あるいは、本開示のＣＤ１３３結合剤に結合されたＣＤ１３３またはその一部が精製形態で利用可能である場合、解離定数（ＫＤ）は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Ｂｉａｃｏｒｅ）アッセイおよび他の適切なアッセイのような、当該分野で既知のアッセイによって測定され得る。
【０１５９】
上記のように、本開示は、抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１により結合されたＣＤ１３３エピトープおよび／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３により結合されたＣＤ１３３エピトープに特異的に結合するＣＤ１３３結合剤を提供する。
【０１６０】
当技術分野において既知の様々な方法のうちのいずれか1つを用いて、抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１により結合されたＣＤ１３３エピトープおよび／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３により結合されたＣＤ１３３エピトープに特異的に結合するＣＤ１３３結合剤を同定することができる。当業者であれば、この目的のために、競合的結合アッセイのような結合アッセイを使用できることを理解するであろう。当業者は、結合剤が、抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１により結合されるＣＤ１３３エピトープおよび／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３により結合されるＣＤ１３３エピトープを特異的に結合するかどうかを、結合剤が、抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１および／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３のヒトＣＤ１３３への結合を阻害するかどうかを確かめることによって決定できる。抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１および／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３によるヒトＣＤ１３３への結合の減少によって示されるように、試験される結合剤が抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１および／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３と競合する場合、当該結合剤は抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１および／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３と同じエピトープに結合する。結合剤の特異性を試験するための方法としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）および当該分野で既知の他の免疫学的に媒介される技術が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
一実施形態において、抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１に結合されたＣＤ１３３エピトープおよび／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３に結合されたＣＤ１３３エピトープに特異的に結合するＣＤ１３３結合剤は、ＣＤ１３３発現細胞の表面への結合について、抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１および／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３と競合するＣＤ１３３結合剤である。一実施形態において、ＣＤ１３３エピトープはヒトＣＤ１３３エピトープである。例えば、抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１に結合されるＣＤ１３３エピトープおよび／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３に結合されるＣＤ１３３エピトープに特異的に結合するＣＤ１３３結合剤は、実施例７に開示された実験と類似したフローサイトメトリーにより決定されるように、そのような結合剤の飽和濃度でプレインキュベートされたＣＤ１３３発現細胞への、抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１および／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３の結合を部分的または完全に阻害する。あるいは、膜がそのような結合剤の飽和濃度でプレインキュベートされている場合、抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１に結合されたＣＤ１３３エピトープおよび／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３に結合されたＣＤ１３３エピトープに特異的に結合するＣＤ１３３結合剤は、変性ＣＤ１３３、例えば、全細胞溶解物の変性タンパク質の還元条件下での電気泳動分離（実施例６参照）の後に、膜（例えばニトロセルロースまたはＰＶＤＦ）上にエレクトロブロットされた変性ＣＤ１３３への、抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１および／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３の結合を部分的または完全に阻害するであろう。
【０１６２】
別の実施形態において、抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１に結合されるＣＤ１３３エピトープおよび／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３に結合されるＣＤ１３３エピトープに特異的に結合するＣＤ１３３結合剤は、ＣＤ１３３発現細胞の表面への結合について抗体可変領域ＲＷ０１を含むＦａｂおよび／または抗体可変領域ＲＷ０３を含むＦａｂと競合する、１価のＣＤ１３３結合剤（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）である。一実施形態において、ＣＤ１３３エピトープはヒトＣＤ１３３エピトープである。例えば、抗体ＩｇＧ  ＲＷ０１に結合されるＣＤ１３３エピトープおよび／または抗体ＩｇＧ  ＲＷ０３に結合されるＣＤ１３３エピトープに特異的に結合する１価ＣＤ１３３結合剤は、実施例７に開示された実験に類似したフローサイトメトリーによって決定されるように、そのような結合剤の飽和濃度でプレインキュベートされたＣＤ１３３発現細胞への、抗体可変領域ＲＷ０１を含むＦａｂおよび／または抗体可変領域ＲＷ０３を含むＦａｂの結合を部分的または完全に阻害するであろう。あるいは、膜がそのような結合剤の飽和濃度でプレインキュベートされている場合、１価物質は、抗体可変領域ＲＷ０１を含むＦａｂおよび／または抗体可変領域ＲＷ０３を含むＦａｂの変性ＣＤ１３３への結合、例えば、全細胞溶解物を変性タンパク質の還元条件下で電気泳動分離（例えば実施例６参照）した後に、膜（例えばニトロセルロースまたはＰＶＤＦ）上にエレクトロブロットされた変性ＣＤ１３３への結合を、部分的または完全に阻害するであろう。一実施形態において、ＣＤ１３３はヒトＣＤ１３３である。
【０１６３】
＜検出抗原＞
本明細書に記載される結合剤は、任意に検出剤で標識される。本明細書で使用するとき、「検出剤」の用語は、結合剤の存在を検出および／または定量化することを可能にする任意の物質を指す。検出剤の例としては、ペプチドタグ、酵素（例えば、ＨＲＰまたはアルカリホスファターゼ）、タンパク質（例えば、フィコエリトリンまたはビオチン／ストレプトアビジン）、磁性粒子、発色団、蛍光分子、化学発光分子、放射性標識および染料が挙げられるが、これらに限定されない。結合剤は、検出剤で直接または間接に標識されてよい。
【０１６４】
＜ヒト化抗体＞
本明細書に開示する非ヒト、例えばマウスのＣＤ１３３結合剤をコードするヌクレオチド配列は、相同性の非ヒト、例えばマウス配列の代わりに、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインをコード配列に置換することによって（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９９４参照）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部または一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本明細書に開示される抗体の定常ドメインを置換し、または本明細書に開示される抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインを置換して、キメラ２価抗体を作製することができる。
【０１６５】
Ｆｃ領域を含む非ヒト結合剤、例えば本明細書に記載の非ヒト抗体は、それらをヒトにおける使用に対してより寛容にするためにヒト化することができる。例えば、フレームワーク領域中のアミノ酸残基は、その置換で結合剤のＣＤ１３３への結合能が損なわれない限り、それらをアミノ酸残基およびヒトフレームワーク領域で置換することによってヒト化されてよい（例えばＶｉｎｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ，２００８参照）。
【０１６６】
マウス抗体または他の種由来の抗体は、当該分野で周知の技術を使用して、ヒト化または霊長類化され得ることが理解されるであろう（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，１９９３、およびＷｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２参照）。抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列で置換するために、組換えＤＮＡ技術によって操作することができる（例えば、ＷＯ９２１０２１９０、ならびに米国特許第５，５３０，１０１号、５，５８５，０８９号、第５，５６９，７６１号、第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６２号、第５，７１４，３５０、および第５，７７７，０８５号参照）。また、キメラ免疫グロブリン遺伝子の構築のためのＩｇ  ｃＤＮＡの使用が、当技術分野において知られている（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７ａ、およびＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７ｂ参照）。ｍＲＮＡは、ハイブリドーマまたは抗体を産生する他の細胞から単離されて、ｃＤＮＡを産生するために使用される。目的のｃＤＮＡは、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって増幅することができる（米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号）。あるいは、目的の配列を単離するために、ライブラリーが作製されてスクリーニングされる。次に、抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を、ヒト定常領域配列に融合する。ヒトＣ領域遺伝子は既知のクローンから容易に入手可能である。アイソタイプの選択は、補体固定化などの所望のエフェクター機能、または抗体依存性細胞傷害性における活性によって導かれるであろう。ヒト軽鎖定常領域、カッパまたはラムダのいずれを使用してもよい。次いで、キメラヒト化抗体を従来の方法で発現させることができる。
【０１６７】
上記のように、ＣＤ１３３結合剤はヒト抗体であり得る。完全ヒト抗体は、ＣＤＲを含む軽鎖および重鎖の両方の全配列がヒト遺伝子から生じる抗体分子である。そのような抗体は、本明細書において「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体はトリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３参照）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５参照）を用いて調製することができる。ヒトモノクローナル抗体は、ヒトハイブリドーマを使用することにより（例えば、Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３参照）、またはヒトＢ細胞をインビトロにおいてエプスタインバー（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ）ウイルスで形質転換することによって（例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５参照）利用および製造され得る。
【０１６８】
ＣＤ１３３結合性ｓｃＦｖまたはＣＤ１３３結合性ＦａｂのようなＣＤ１３３結合性抗体可変領域を含むＣＤ１３３結合性ポリペプチドは、例えば、ヒト配列のみを含有する抗体を使用するファージディスプレイ法を使用して開発することができる。そのようなアプローチは当技術分野において周知である（例えば、本明細書の一部として援用するＷＯ９２／０１０４７および米国特許第６，５２１，４０４号参照）。このアプローチでは、軽鎖および重鎖のランダムな対を担持するファージのコンビナトリアルライブラリーが、天然または組換えのＣＤ１３３またはその断片の供給源を用いてスクリーニングされる。別のアプローチにおいて、抗体または断片は、プロセスの少なくとも１つの工程がトランスジェニック非ヒト動物をＣＤ１３３タンパク質で免疫感作することを含むプロセスによって産生され得る。このアプローチでは、この異種／非ヒト動物の内因性重鎖および／またはカッパ軽鎖遺伝子座のいくつかは無能化されており、抗原に応答して免疫グロブリンをコードする遺伝子を生成するために必要な再配列ができない。さらに、少なくとも１つのヒト重鎖遺伝子座および少なくとも１つのヒト軽鎖遺伝子座が、動物に安定にトランスフェクトされる。したがって、ヒト遺伝子座は、投与された抗原に応答して、抗原に対して免疫特異的なヒト可変領域をコードする遺伝子を提供するように再編成される。したがって、免疫感作されると、動物は完全なヒト免疫グロブリンを分泌するＢ細胞を産生する。
【０１６９】
異種／非ヒト動物を産生するための様々な技術が当該分野で周知である（例えば、本明細書の一部として援用する米国特許第６，０７５，１８１号および第６，１５０，５８４号、その全体を本明細書の一部として援用するＧｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、米国特許第６，１６２，９６３号、第６，１５０，５８４号、第６，１１４，５９８号、第６，０７５，１８１号、および第５，９３９，５９８号、日本国特許第３，０６８，１８０Ｂ２号、第３，０６８，５０６Ｂ２号および第３，０６８，５０７Ｂ２号、欧州特許第ＥＰ０４６３１５１Ｂ１号、国際特許出願番号ＷＯ９４／０２６０２、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９８／２４８９３、およびＷＯ００／７６３１０参照）。
【０１７０】
あるいは、「ミニフォーカス」アプローチが使用されてよく、ここでは外因性Ｉｇ遺伝子座が、Ｉｇ遺伝子座からの断片（個々の遺伝子）を含めることによって模倣される（例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５４５，８０７号、第５，５９１，６６９号、第５，６１２，２０５号、第５，６２５，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，６４３，７６３号、第５，６６１，０１６号、第５，７２１，３６７号、第５，７７０，４２９号、第５，７８９，２１５号、第５，７８９，６５０号、第５，８１４，３１８号、第５，８７７，３９７号、第５，８７４，２９９号、第６，０２３，０１０号、および第６，２５５，４５８号、欧州特許第０５４６０７３Ｂ１号、および国際特許出願番号ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９２／２２６４５、ＷＯ９２／２２６４７、ＷＯ９２／２２６７０、ＷＯ９３／１２２２７、ＷＯ９４／００５６９、ＷＯ９４／２５５８５、ＷＯ９６／１４４３６、ＷＯ９７／１３８５２、およびＷＯ９８／２４８８４参照）。したがって、１以上のＶＨ遺伝子、１以上のＤＨ遺伝子、１以上のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域、および第２の定常領域（好ましくはガンマ定常領域）が、動物に挿入するための構築物の中に形成される。
【０１７１】
ミクロ細胞融合、大きな染色体片、または全染色体を介して導入されているマウス由来のヒト抗体の生成もまた証明されている（例えば、欧州特許出願第７７３２８８号および第８４３９６１号参照）。
【０１７２】
＜免疫複合体＞
本開示には、（２）エフェクター剤に結合されている（１）ＣＤ１３３結合剤、任意選択で抗体または抗体の抗原結合性断片を含む、免疫複合体もまた含まれる。本明細書で使用するとき、「免疫複合体」の用語は、抗体可変領域を含まない本開示のＣＤ１３３結合剤を包含し、さらに抗体可変領域を含む本明細書で開示されるＣＤ１３３結合剤を包含する。
【０１７３】
一実施形態において、エフェクター物質は標識であり、これは直接的または間接的に検出可能なシグナルを生成することができる。標識の例には、放射性同位元素が含まれる（すなわち放射性複合体）。
【０１７４】
別の実施形態において、エフェクター物質は治療剤である。治療剤には、癌治療薬／抗新生物薬が含まれるが、これらに限定されない。さらに別の実施形態では、治療剤は毒素である。
【０１７５】
本明細書では、「癌治療薬」または「抗新生物薬」の用語は、膵臓癌細胞、結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、前立腺癌細胞、肝臓癌細胞、肺癌細胞、黒色腫細胞、脳腫瘍細胞（場合により神経膠芽腫または髄芽腫細胞）および頭頸部扁平上皮癌細胞のような癌細胞におけるＣＤ１３３のレベルを減少させる機能的性質を有する薬剤を指称するために使用される。
【０１７６】
毒素は、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片であり得る。使用できる毒素およびその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアシンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、シャボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセンが含まれる。
【０１７７】
本開示の抗体のような本開示の放射性複合体ＣＤ１３３結合剤を使用して、例えば細胞を可視化するために、または細胞の細胞傷害性治療として、放射性核種をＣＤ１３３発現細胞に結合させることができる。放射性複合体抗体の製造には、様々な放射性核種が利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、および１８６Ｒｅが挙げられる。
【０１７８】
当業者は、多種多様な可能性のある部分を、抗体可変領域を含むもの（例えば、ＣＤ１３３結合性抗体可変領域を含む抗体または抗体断片）など、本開示のポリペプチドＣＤ１３３結合剤に結合できることを認識するであろう（例えば、その全体の内容を本明細書の一部として援用するＣｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ，１９８９参照）。カップリングは、それらがその意図した用途のためのそれぞれの活性／特徴を保持する限り、本開示の部分およびＣＤ１３３結合剤を結合する任意の化学反応によって達成され得る。この連結には多くの化学的メカニズム、例えば、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合および複合体形成が含まれ得る。
【０１７９】
例えば、抗体のような本開示のポリペプチドＣＤ１３３結合剤とエフェクター物質との複合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（アジプイミド酸ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジサクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）のような、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８、１０９８（１９８７）に記載されているようにして調製することができる。
【０１８０】
炭素１４で標識された１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射性ヌクレオチドを抱合させるための例示的キレート剤である（例えば、Ｗ０９４／１１０２６参照）。
【０１８１】
＜医薬組成物＞
本開示はまた、有効成分としての本明細書に記載のＣＤ１３３結合剤または免疫複合体または放射性複合体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【０１８２】
本明細書で使用するとき、「薬学的に許容される担体」の用語は、薬学的投与に適合する任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤などを含むことを意図している。適切な担体は、その分野の標準的な参考書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されており、これを本明細書の一部として援用する。そのような担体または希釈剤の任意の例としては、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように処方される。投与経路の例には、非経口（例えば静脈内、皮内、皮下）、経口（例えば吸入）、経皮（すなわち局所）、経粘膜および直腸投与が含まれる。
【０１８４】
一実施形態において、活性成分は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む持続放出／制御放出製剤のように、それらを身体からの急速な排泄から保護する担体と共に調製される。エチレン−酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸のような、生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法は当業者に明らかであろう。
【０１８５】
一実施形態において、経口または非経口の組成物は、投与の容易さおよび投与量の均一さのために、投与単位形態で製剤化される。本明細書で使用される投与単位形態は、治療される被検体のための単位投与量として適した、物理的に別々の単位を指す。各単位は、必要な薬学的担体と共に、所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性成分を含有する。投与単位形態の詳細は、活性成分の独特の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに個体の治療のために係る活性成分を調製する技術に固有の制限によって規定され、それに直接依存する。
【０１８６】
製剤はまた、治療すべき特定の適応症に必要な２以上の活性成分、場合によっては互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含むことができる。代替的に、またはそれに加えて、医薬組成物はその機能を増強する薬剤、例えば細胞傷害剤、サイトカイン、化学療法剤、または成長阻害剤を含むことができる。そのような分子は、意図する目的に有効な量での組み合わせにおいて適切に存在する。
【０１８７】
＜方法および使用＞
本開示はまた、本明細書に記載のＣＤ１３３結合剤に関する使用および方法を提供する。
【０１８８】
＜ＣＤ１３３発現細胞を検出する＞
本開示のＣＤ１３３結合剤、免疫複合体および医薬組成物は、ＣＤ１３３を発現する細胞を検出するために有用である。したがって、本開示は、ＣＤ１３３発現細胞をターゲッティングし、結合し、かつ／または検出するための、本明細書に記載のＣＤ１３３結合剤の使用を提供する。任意選択で、細胞は癌細胞であり、膵臓癌細胞、結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、前立腺癌細胞、肝臓癌細胞、肺癌細胞、黒色腫細胞、脳腫瘍細胞および頭頸部扁平上皮癌細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８９】
一実施形態において、本明細書に記載のＣＤ１３３結合剤、免疫複合体、および医薬組成物は、ＣＤ１３３発現細胞の細胞表面発現をターゲッティングし、結合し、かつ／または検出するために有用である。
【０１９０】
別の実施形態において、本明細書に記載のＣＤ１３３結合剤、免疫複合体および医薬組成物は、細胞内ＣＤ１３３をターゲッティングし、結合し、検出し、かつ／または位置特定するために有用である。
【０１９１】
別の実施形態において、本明細書に記載のＣＤ１３３結合剤、免疫複合体および医薬組成物は、細胞溶解物中のＣＤ１３３をターゲッティングし、結合しおよび／または検出するために有用である。
【０１９２】
さらに別の実施形態において、本明細書に記載のＣＤ１３３結合剤、免疫複合体および医薬組成物は、サンプル中、場合によってはＣＤ１３３発現細胞中のＣＤ１３３の発現レベルを検出および／または定量するために有用である。一実施形態において、ＣＤ１３３結合剤、免疫複合体および医薬組成物は、細胞のＣＤ１３３レベルを検出および／または定量するために使用される。別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤、免疫複合体および医薬組成物は、細胞表面のＣＤ１３３レベルを検出および／または定量するために有用である。
【０１９３】
本開示のＣＤ１３３結合剤は、天然／細胞表面発現型ＣＤ１３３、および変性ＣＤ１３３の両方を検出／定量するために使用され得る。ＣＤ１３３の過剰発現は、しばしば癌性表現型と相関する。細胞の総ＣＤ１３３タンパク質レベルの減少は細胞の転移能の低下と相関することが示されているので（例えば、Ｒａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８参照）、例えば、本開示のＣＤ１３３結合剤を用いた、変性全細胞溶解物中におけるＣＤ１３３タンパク質レベルのウエスタンブロッティング検出は、ＣＤ１３３発現癌細胞の転移能を低下させる治療能力を特徴付け／確認するために使用できる。
【０１９４】
一般に、細胞内ＣＤ１３３、全細胞ＣＤ１３３または表面発現型ＣＤ１３３タンパク質のような分析物を検出するための結合剤の使用は当技術分野において周知であり、多くのアプローチの適用を通して達成され得る。これらの方法は一般に、放射性、蛍光性、生物学的および酵素的なタグのような標識またはマーカーの検出に基づいている。方法の例としては、ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光法、免疫組織化学およびフローサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９５】
本開示のＣＤ１３３結合剤、免疫複合体および医薬組成物はまた、細胞におけるＣＤ１３３タンパク質のレベルまたは量を低減および／または排除するためにも有用である。任意選択で、細胞はＣＤ１３３陽性癌細胞であり、膵臓癌細胞、結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、前立腺癌細胞、肝臓癌細胞、膵臓癌細胞、肺癌細胞、黒色腫細胞、脳腫瘍細胞（場合により神経膠芽腫または髄芽腫細胞）および頭頸部扁平上皮癌細胞が含まれるが、これらに限定されない。癌細胞中の全細胞ＣＤ１３３タンパク質レベルの低下は、その転移能を低下させるために使用され得る（例えば、Ｒａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８参照）。そのレベルが低減されるＣＤ１３３タンパク質は、任意選択で、細胞表面発現型および／または細胞内のＣＤ１３３である。ＣＤ１３３発現細胞におけるＣＤ１３３タンパク質は、任意選択で、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８もしくは９９％、または１００％低減される。
【０１９６】
＜免疫細胞に対するＣＤ１３３発現細胞のターゲティング＞
さらに、本開示のＣＤ１３３結合剤、免疫複合体および医薬組成物は、免疫系の細胞を捕捉、ターゲッティングおよび／または結合するために有用である。
【０１９７】
例えば、上記の一実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は二重特異性抗体であり、その一方の結合特異性はＣＤ１３３に対するものであり、他方の結合特異性はＴ細胞、マクロファージまたはＮＫ細胞などの免疫細胞上に発現される抗原に対するものである。上記で述べたように、Ｔ細胞を標的とする二重特異性抗体の一例は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。
【０１９８】
上記の他の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤はＣＤ１３３結合性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、これはその抗原結合性／ターゲッティングドメインとして、ＣＤ１３３結合性ｓｃＦｖのような本開示のＣＤ１３３結合剤を含む。
【０１９９】
適切なＣＡＲの構築および抗原発現細胞をターゲッティングするためのそれらの使用は、当技術分野において一般に「ＣＡＲ  Ｔ細胞療法」と呼ばれており、当技術分野において周知である（例えば、Ｍａｕｓ  ａｎｄ  Ｊｕｎｅ．，２０１６、Ａｂａｔｅ−Ｄａｇａ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｌａ、２０１６、  Ｒｅｓｅｔｃａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、およびＷａｎｇ  Ｒｉｖｉｅｒｅ．，２０１６参照）。したがって、本明細書に記載の二重特異性抗体およびキメラ抗原受容体は、免疫エフェクター細胞を、ＣＤ１３３発現細胞（ＣＤ１３３＋細胞）にターゲッティングするために有用である。
【０２００】
また、ＣＤ１３３＋細胞をターゲッティングする方法であって、ＣＤ１３３＋細胞を、本開示のＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞、または本開示の二重特異性抗体と該二重特異性抗体に特異的に結合される免疫エフェクター細胞との組み合わせに曝露することを含む方法も提供される。
【０２０１】
これらの方法により免疫エフェクター細胞をＣＤ１３３＋細胞にターゲティングすることは、ＣＤ１３３＋癌細胞の表現型を、癌性表現型から低癌性または非癌性表現型へとシフトさせるために有用であり得る。さらに、免疫エフェクター細胞をＣＤ１３３＋細胞にターゲッティングすることは、ＣＤ１３３が発現されるかまたは癌のように過剰発現される疾患を治療するために有用であり得る。
【０２０２】
＜診断方法＞
本明細書に開示されるＣＤ１３３結合剤は、患者サンプル中または健常人の対照サンプル中におけるＣＤ１３３の検出／定量に有用であり、したがって有用な診断薬となり得る。例えば、本開示の結合剤を使用して、、ＣＤ１３３の全細胞発現および／または細胞表面発現型ＣＤ１３３を検出／定量することができる。本明細書で使用するとき、「診断法」の用語は、スクリーニング、層別化、モニタリングなどを包含する。
【０２０３】
一実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、ＣＤ１３３発現細胞、任意選択で膵臓癌細胞、結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、胃癌細胞、前立腺癌細胞、肝臓癌細胞、肺癌細胞、黒色腫細胞、脳腫瘍細胞および頭頸部扁平上皮癌細胞などの癌細胞を検出するために使用される。
【０２０４】
別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、ＣＤ１３３の細胞表面発現を検出／定量するために使用される。別の実施形態において、ＣＤ１３３結合剤は、ＣＤ１３３の細胞内発現を検出／定量化するために使用される。別の実施形態において、本明細書に記載のＣＤ１３３結合剤を使用して、サンプル中のＣＤ１３３の発現を検出／定量することができる。
【０２０５】
例えば、本開示のＣＤ１３３結合剤、例えば本開示の抗体および抗体断片は、サンプル中のＣＤ１３３レベルを検出／定量するための様々なアッセイ、例えば、免疫蛍光法、フローサイトメトリーまたはＥＬＩＳＡのうちの任意の１つを実施するために使用され得る。
【０２０６】
一実施形態において、サンプル患者サンプ、例えば癌患者由来の癌サンプルである。あるいは、サンプルは健康な個体由来の対照サンプルであり得る。サンプルの例としては、培養細胞、培養細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、体液または生体組織のサンプルが挙げられるが、これらに限定されない。他の実施形態において、サンプルは癌から得られる。特定の実施形態において、サンプルは生検サンプルである。
【０２０７】
＜癌の治療＞
ＣＤ１３３は、様々な癌において重要な役割を果たすことが示されている。例えば、ＣＤ１３３は脳腫瘍における癌幹細胞（ＣＳＣ）のマーカーとして同定されており（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、脳腫瘍画分由来のＣＤ１３３＋の１００個の細胞は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍を発生させるのに十分であることが実証されている（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。さらに、ＣＤ１３３＋神経膠腫細胞は、ＣＤ１３３陰性（ＣＤ１３３−）細胞と比較して、ＤＮＡチェックポイント依存的に放射線耐性が高いことが示されている（Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。膵臓ＣＳＣが抗ＣＤ１３３抗体を用いて単離されており、この細胞は腫瘍原性であり、また標準的な化学療法に対して非常に耐性であることが実証されている（Ｈｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。同様に、膵臓癌細胞におけるＣＤ１３３発現の増加は、遊走および浸潤の増加、ならびに腫瘍の悪性度の増大を含むより攻撃的な性質と相関することも示されている（Ｍｏｒｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。前立腺癌組織由来の幹様細胞が同定されており（Ｃｏｌｌｉｎｓ，２００５）、また前立腺癌組織から、および不死化前立腺癌細胞株において単離されたＣＤ１３３＋細胞が幹細胞の特徴を示すことが実証されているが（Ｍｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７； Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、しかしながら、他の研究ではこれを確認できておらず（Ｍｉｓｓｏｌ−Ｋｏｌｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、また他の研究者がＤＵ１４５株のような膵臓癌株に帰属させる幹細胞特性は報告されていない（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ＆Ｓｃｈａｌｋｅｎ，２０１０）。ＣＤ１３３がＣＳＣマーカーとして使用される別の種類の癌は、結腸直腸癌腫である。別のグループが、結腸癌におけるＣＳＣのマーカーとしてＣＤ１３３を同定した（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｒｉｃｃｉ−Ｖｉｔｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＣＤ１３３＋細胞がＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍を容易に再現すること、および未分画腫瘍細胞と比較して、結腸癌始原細胞に精製されたＣＤ１３３＋細胞の濃縮が存在することが実証されている（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６及びＲｉｃｃｉ−Ｖｉｔｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。結腸転移由来のＣＤ１３３＋およびＣＤ１３３−陰性細胞の両方が結腸球を形成し、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍を再現できることが証明されている（Ｓｈｍｅｌｋｏｖ，２００４）。さらに、いくつかのグループが、ＣＤ１３３はより悪い臨床的予後、疾患の進行および転移と関連しており、ＣＤ１３３タンパク質は結腸直腸癌患者のための独立した予後マーカーとして使用できると結論づけている（Ｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。しかしながら、他のグループは、ＣＤ１３３と結腸癌患者における疾患の進行または生存との間の関係を見出すことには失敗したが、その代わりに，当該タンパク質の発現と腫瘍病期との間の関係を見いだした（Ｌｕｇｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０２０８】
転移性黒色腫細胞株ＦＥＭＸ−ＩにおけるＣＤ１３３のダウンレギュレーションは、より遅い細胞増殖、細胞運動性の低下、幹細胞増殖条件において球を形成する能力の低下、および腫瘍異種移植片の転移能の低下をもたらすことが実証されている（Ｒａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。モノメチルオーリスタチンＦ（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ  ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  Ｆ）にコンジュゲートされた抗ＣＤ１３３抗体ＡＣ１３３は、インビトロにおいて肝細胞癌細胞および胃癌細胞の増殖を阻害することが示されており（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、さらに、ＡＣ１３３の存在下でサポリンにコンジュゲートされた二次抗体ＡＣ１３３はＦＥＭＸ−Ｉ細胞に対して毒性であるが、ヒト線維芽細胞を抑制しないことが示された（Ｒａｐｐａら、２００８年）。さらに、サポリンに直接コンジュゲートされたＡＣ１３３は、ＣＤ１３３発現がノックダウンされているＦＥＭＸ−Ｉ細胞よりも、ＦＥＭＸ−Ｉ細胞に対してさらに効果的であることが示されている（Ｒａｐｐａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＣＤ１３３がノックダウンされている細胞では、上方制御されるに至った遺伝子がｗｎｔ阻害剤をコードすることが観察された（Ｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２ｂ）。
【０２０９】
.
さらに、多数の研究が、ＣＤ１３３＋脳腫瘍開始細胞（ＢＴＩＣ）を、神経膠芽腫（ＧＢＭ）における化学的耐性および放射線耐性の推進因子として示唆している。また、最近では、ＣＤ１３３による遺伝子シグネチャが全生存率の低さを予測し（Ｖｅｎｕｇｏｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、またＣＤ１３３＋治療抵抗性細胞をターゲッティングすることがＧＢＭ再発を阻止するための有効な戦略となりうることも示された。
【０２１０】
したがって、これらの結果は、有効な治療戦略および有効な診断戦略としての、ＣＤ１３３のターゲッティングに対するサポートを提供する。さらに、本発明者らは、ＣＤ１３３＋ＧＢＭ細胞が特異的にターゲッティングされかつ殺傷される、ＣＡＲ  Ｔ細胞に基づく戦略を記載した。本発明者らはまた、ヒトポリクローナルＴ細胞をＣＤ１３３＋ＧＢＭ細胞へとリダイレクトするＢｉＴＥ抗体が、強力な抗腫瘍応答を誘導することを示した。
【０２１１】
したがって、本開示のＣＤ１３３結合剤および医薬組成物は、癌、例えば転移性黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌、および／または結腸／結腸直腸癌を治療または予防するために有用である。一実施形態において、癌は神経膠芽腫である。他の実施形態において、癌は髄芽腫である。
【０２１２】
他の実施形態において、癌はＣＤ１３３陽性癌（ＣＤ１３３発現癌とも呼ばれる）である。一実施形態において、ＣＤ１３３陽性癌は、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を超えるＣＤ１３３陽性細胞（すなわち、ＣＤ１３３発現細胞）を有する癌として定義される。ＣＤ１３３を発現する細胞の割合は、例えば腫瘍細胞培養物中で決定され得る。したがって、特定の実施形態において、癌はＣＤ１３３陽性神経膠芽腫またはＣＤ１３３陽性髄芽腫である。別の実施形態において、癌は、ＣＤ１３３を検出可能に発現する神経膠芽腫またはＣＤ１３３を検出可能に発現する髄芽腫である。
【０２１３】
一実施形態において、本明細書に記載のＣＤ１３３結合剤および医薬組成物は、癌を治療または予防する方法において使用され、当該方法は、有効量の本明細書に開示されるＣＤ１３３結合剤または医薬組成物を、それを必要とする動物または細胞に投与することを含み、任意選択で、癌は転移性黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌および／または結腸癌である。一実施形態において、癌は神経膠芽腫または髄芽腫である。
【０２１４】
別の実施形態において、本明細書に開示される有効量のＣＤ１３３結合剤または医薬組成物は、癌を治療または予防するために使用され、任意選択で、癌は転移性黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌および／または結腸癌である。別の実施形態において、本明細書に開示されるＣＤ１３３結合剤または医薬組成物は、癌を治療または予防するための医薬の調製に使用され、任意選択で、癌は転移性黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌および／または結腸癌である。一実施形態において、癌は神経膠芽腫または髄芽腫である。
【０２１５】
さらに別の実施形態において、本明細書に開示される有効量のＣＤ１３３結合剤または医薬組成物は、癌の治療または予防に用いられ、任意選択で、癌は転移性黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌および／または結腸癌である。一実施形態において、癌は神経膠芽腫または髄芽腫である。
【０２１６】
上記のように、本開示は、（１）ＣＤ１３３結合剤および（２）エフェクター剤を含む免疫複合体を提供し、エフェクター剤は、任意選択で、毒素または抗新生物剤である。
【０２１７】
したがって、本開示は、癌を治療または予防するための、本明細書に開示の免疫複合体の使用方法を提供し、その方法は有効量の本明細書に開示の免疫複合体を、それを必要とする動物または細胞に投与することを含み、任意選択で、癌は転移性黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌および／または結腸癌である。一実施形態において、癌は神経膠芽腫または髄芽腫である。
【０２１８】
一実施形態において、有効量の本明細書に開示の免疫複合体は、癌を治療または予防するために使用され、任意選択で、癌は転移性黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌および／または結腸癌である。別の実施形態において、本明細書に開示の免疫複合体は、癌を治療または予防するための医薬の調製に使用され、任意選択で、癌は転移性黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌および／または結腸癌である。一実施形態において、癌は神経膠芽腫または髄芽腫である。
【０２１９】
本開示はまた、ＣＤ１３３発現細胞をターゲッティングするＣＡＲ、およびＣＡＲを発現するＴ細胞を提供する。したがって、別の実施形態において、本開示は、癌を治療または予防するための、本明細書に開示のＣＡＲを発現するＴ細胞の使用方法を提供し、該方法は、本明細書に開示のＣＡＲを発現する有効量のＴ細胞を動物または細胞に投与することを含み、任意選択で、癌は転移性黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌および／または結腸癌である。一実施形態において、癌は神経膠芽腫または髄芽腫である。
【０２２０】
一実施形態において、本明細書に開示されるＣＡＲを発現する有効量のＴ細胞は、癌の治療または予防に使用され、任意選択で、癌は転移性黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌および／または結腸癌である。別の実施形態において、本明細書に開示されるＣＡＲを発現するＴ細胞は、癌を治療または予防するための医薬の調製において使用され、任意選択で、癌は転移性黒色腫、脳腫瘍、前立腺癌、膵臓癌および／または結腸癌である。一実施形態において、癌は神経膠芽腫または髄芽腫である。
【０２２１】
本明細書で使用するとき、「被験体」および「動物」の用語は、動物界の全てのメンバーを含み、一実施形態において、被験体は哺乳動物である。さらなる実施形態において、被験体はヒトである。一実施形態において、被験体は、癌のようなＣＤ１３３発現細胞に関連する疾患を有する患者である。
【０２２２】
「細胞」の用語は、単一の細胞ならびに複数の細胞または細胞集団を含む。
【０２２３】
本開示のＣＤ１３３結合剤、免疫複合体または医薬組成物の有効量は、一般に、治療目的を達成するために必要とされる量に関する。上記のように、これはＣＤ１３３結合剤とＣＤ１３３との間の結合相互作用であり得、場合によっては、これはＣＤ１３３の機能を妨害する。
【０２２４】
投与を必要とされる量はさらに、ＣＤ１３３に対するＣＤ１３３結合剤の結合親和性に依存し、また投与されたＣＤ１３３結合剤が、それが投与される被験体の自由体積から枯渇する速度にも依存するであろう。本開示のＣＤ１３３結合剤、免疫複合体または医薬組成物の治療的に有効な投与量の一般的な範囲は、非限定的な例として、約０．１ｍｇ ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。一般的な投与頻度は、例えば１日２回から週１回の範囲であり得る。
【０２２５】
治療の有効性は、特定の癌を診断または治療するための任意の既知の方法と関連して決定される。癌の１以上の症状を軽減することは、抗体が臨床的利益を与えることを示している。
【０２２６】
本明細書で使用するとき、「癌を治療すること」とは、癌の進行または癌に関連する症状もしくは病態を反転、軽減するもしくは阻害することを含むが、これらに限定されない。「癌の予防」は、癌の発症または再発を予防することを含む。「癌を治療すること」はまた、被験体における生存期間を延ばすことを含む。生存期間は、本明細書に記載したＣＤ１３３結合剤、免疫複合体または医薬組成物での治療なしで予想される生存期間よりも、場合によっては少なくても１、２、３、６もしくは１２ヶ月、または少なくとは２、３、４、５もしくは１０年間延長される。「癌を治療すること」はまた、腫瘍量および／または腫瘍負荷（例えば、脳腫瘍量および／または脳腫瘍負荷）を減少させることを含む。場合により、本明細書に記載のＣＤ１３３結合剤、免疫複合体または医薬組成物での治療後には、腫瘍量および／または腫瘍負荷が少なくとも５、１０、２５、５０、７５または１００％減少する。他の実施形態において、「癌を治療する」とは、腫瘍の攻撃性、悪性度および／または侵襲性を低下させることを含む。場合により、腫瘍は新たに形成された腫瘍または治療時に既に存在している腫瘍である。
【０２２７】
一実施形態において、活性成分は、少なくとも１つの追加の治療薬と組み合わせて使用されてよい。したがって、本出願は、本明細書に記載のＣＤ１３３結合剤、免疫複合体または医薬組成物を、少なくとも１つの追加の治療薬と組み合わせて使用して癌を予防または治療する方法を提供する。追加の治療薬は、活性成分の投与の前に、それと同時に、および／またはその後に投与することができる。同時に投与する場合、ＣＤ１３３結合剤、免疫複合体または医薬組成物および追加の治療薬は、単一製剤または別々の製剤で投与することができ、別々に投与する場合は、任意選択で異なる投与様式で投与することができる。１以上のＣＤ１３３結合剤、免疫複合体または医薬組成物と１以上の他の治療薬との組み合わせは、癌と闘うために相乗的に作用し得る。
【０２２８】
追加の治療薬の実施形態としては、追加のＣＤ１３３結合剤、追加のＣＤ１３３結合性免疫複合体、追加のＣＤ１３３結合性医薬組成物、サイトカイン、成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤、抗炎症剤、抗新生物剤、細胞傷害剤および／または細胞増殖抑制剤が挙げられる。そのような併用療法は、投与された活性成分のより低い投与量を有利に利用でき、したがって、単剤療法に関連して起こり得る毒性または合併症を回避することができる。
【０２２９】
＜スクリーニングアッセイ＞
本開示はまた、本明細書に開示のタンパク質のＣＤ１３３との結合を調節、あるいはそれを妨害する調節因子、すなわち試験薬（例えば、ペプチド、ペプチド模倣薬、小分子または他の薬物）を同定するための方法（本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼ぶ）を提供する。
【０２３０】
試験薬は、当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて得ることができ、これは空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー法、デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法（例えばＬａｍ，１９９７参照）が含まれる。
【０２３１】
上記の開示は、本出願を一般的に説明するものである。より完全な理解は、以下の具体的な実施例を参照することによって得ることができる。それらの実施例は単なる例示目的のために記載されるものであり、本開示の範囲を限定することを意図しない。状況が好都合であるか、または好都合であることが示唆され得るときは、形態の変更および均等物での置換が想定される。本明細書では特定の用語が使用されているが、そのような用語は説明的な意味を意図したものであり、限定の目的を意図するものではない。
【０２３２】
以下の非限定的な実施例は本開示を例示するものである。
【０２３３】
＜実施例＞
実施例１：細胞選択および配列決定
ＣＤ１３３に特異的に結合できる新規抗体の発見を試みるために、２つのファージディスプレイライブラリー、すなわち、ライブラリーＦおよびライブラリーＧを、「Ｃｅｌｌｅｃｔｅｑ」法を用いて、細胞表面ＣＤ１３３結合剤についてスクリーニングした。（Ｃｅｌｌｅｃｔｓｅｑ法、ライブラリーＦおよびライブラリーＧは、例えば米国特許出願第１３／６２９，５２０号に以前に記載されている）。簡単に説明すると、ライブラリーＦは、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）３および３つ全ての重鎖ＣＤＲに多様性を有するＦａｂライブラリーであり、またライブラリーＧは、６つの全てのＣＤＲに多様性を有するｓｃＦｖライブラリーである。選択に使用された細胞は、陽性選択についてはＣＤ１３３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｏ４３４９０）を過剰発現するように操作されたＨＥＫ２９３細胞であり、また陰性選択については親ＨＥＫ２９３細胞が使用された。４ラウンドの陽性選択および陰性選択の後、各ライブラリーについて、ラウンド４のアウトプットファージ（１０Ｅ−１〜１０Ｅ−３）の連続希釈物を作製し、これを使用してＸＬ１−ｂｌｕｅ細胞を感染させた。ＣＤ１３３特異的結合剤を単離するためのクローン細胞ベースのＥＬＩＳＡで使用される単一コロニーを単離するために、感染細胞をプレーティングした。ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞に結合し、かつＨＥＫ２９３細胞へのバックグラウンド結合より少なくとも１．５倍高いＥＬＩＳＡシグナルを生成したクローンを、ＣＤ１３３特異的結合剤として分類した。クローンＤＮＡ由来の抗体可変（ＶＬおよびＶＨ）ドメインを、Ｍ１３でタグ付けした配列決定用プライマーを用いて増幅し、この増幅された配列をイルミナ配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により配列決定を行った。ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞において発現された、ヒトＣＤ１３３の全長アミノ酸配列を表１に示す。ＣＤ１３３の３つの細胞外ドメインにおけるアミノ酸配列座標は以下の通り、すなわち、Ｇｌｙ２０−Ｇｌｙ１０８、Ａｌａ１７９−Ｔｙｒ４３３、およびＧｌｙ５０８−Ａｓｎ７９２である。３つの細胞外ドメインの全てに亘るセグメントのアミノ酸配列座標は、Ｇｌｙ２０−Ａｓｎ７９２である。全長配列のＭｅｔ１〜Ｓｅｒ１９に対応するシグナル配列は、細胞表面発現型成熟ＣＤ１３３タンパク質には存在しない。
【表１】
2019535670.tif 000003
2019535670.tif 000004
【０２３４】
実施例２：ヒトＣＤ１３３に特異的に結合できる新規抗体可変領域ＲＷ０１およびＲＷ０３の発見および特徴付け
細胞選択および配列決定データ：
実施例１に記載のＣｅｌｌｅｃｔｅｑ法を用いて、ＣＤ１３３結合性ファージＦａｂまたはファージｓｃＦｖの細胞に基づく選択を行った。ライブラリーＦのアウトプットから選択され、かつＣＤ１３３結合特異性を決定するためにＥＬＩＳＡにかけられた９４個のファージＦａｂクローンのうち、７７クローンは、対照ＨＥＫ２９３細胞より少なくとも１．５倍高いレベルでＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞に結合することが分かった（図１Ａ）。対照的に、ライブラリーＧのアウトプットから選択されたクローンは、いずれもこのＣＤ１３３結合特異性を示さなかった。ライブラリーＦから選択された９４個のクローンを、Ｍ１３でタグ付けした配列決定用プライマーを用いて、Ｆａｂ可変領域（ＶＬおよびＶＨ領域）をコードするＤＮＡを増幅することにより配列決定した。陽性選択アウトプットプールで濃縮された結合剤を同定するために、イルミナ配列決定を介して、ライブラリーＦおよびライブラリーＧにおけるラウンド３および４の陽性および陰性のアウトプットを配列決定した。配列決定の結果、９４個のクローンのうち９１個が、クローン「ファージＦａｂ  ＲＷ０３」、「ファージＦａｂ  Ｃ１２」および「ファージＦａｂ  Ｆ５」で表されるように、それぞれ３つの固有の抗体可変領域を有するクローンで構成されていた。具体的には、９４個のクローンのうち、８９個のクローンが同じ可変領域配列を共有し、２個のクローンが固有の可変領域配列を有し、３個のクローンについては配列が得られなかった。
【０２３５】
図１Ｂは、「抗体可変領域ＲＷ０３」、ファージＦａｂ  Ｃ１２およびファージＦａｂ  Ｆ５を含むファージＦａｂ  ＲＷ０３による、ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３およびＨＥＫ２９３細胞への結合についての代表的な細胞ベースのＥＬＩＳＡ結果を示す。ファージＦａｂ  ＲＷ０３のみが、ＨＥＫ２９３細胞よりもＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞に対して、少なくとも１．５倍の優先的結合を示した。ファージＦａｂ  ＲＷ０３、ファージＦａｂ  Ｃ１２およびファージＦａｂ  Ｆ５のＦａｂをコードするＤＮＡ配列を、それぞれタンパク質発現のためのＩＰＴＧ誘導性ベクターの中にクローン化し、発現されたＦａｂ（「Ｆａｂ  ＲＷ０３」、「Ｆａｂ  Ｃ１２」および「Ｆａｂ  Ｆ５」）を、免疫蛍光（ＩＦ）アッセイによる試験のために精製した。その結果を図２に示す。ＩＦアッセイは、Ｆａｂ  ＲＷ０３がＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞に対して非常に特異的な結合を示し、ＨＥＫ２９３細胞に対するバックグラウンド結合はほとんどないのに対して、Ｆａｂ  Ｃ１２およびＦａｂ  Ｆ５は、ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞およびＨＥＫ２９３細胞の両方に非特異的に結合することを示した。ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞へのＦａｂ  ＲＷ０３の特異的結合もまた、細胞ベースのＥＬＩＳＡによって確認された（図３Ａ）。さらに、Ｆａｂ  ＲＷ０３は、ＣＤ１３３を発現することが知られている結腸直腸癌細胞株のＣａｃｏ−２細胞に結合することも見出された（図３Ｂ）。これらの結果は、ファージＦａｂクローンＣ１２およびファージＦａｂクローンＦ５の可変領域ＤＮＡ配列が、陽性および陰性選択アウトプットプールの両方に出現したのに対して、ファージＦａｂ  ＲＷ０３の可変領域ＤＮＡ配列は陽性選択プールのみに出現したというイルミナ配列決定の結果と一致した（データは示さず）。加えて、ファージＦａｂ  ＲＷ０３  ＤＮＡ配列は、ラウンド３および４の両方のアウトプットプールにおいて最も豊富な配列であり、これは、ファージＦａｂの結合剤の９４％のＤＮＡ配列が、ファージＦａｂ  ＲＷ０３のものであった細胞ベースのＥＬＩＳＡの結果とも一致する。
【０２３６】
ライブラリーＦ由来のＣＤ１３３結合ファージＦａｂをコードするＤＮＡ配列を決定することに加えて、ライブラリーＧ選択アウトプットプールからのイルミナ配列決定データもまた分析して、濃縮された結合剤を同定した（データは示さず）。１２個の選択されたファージ−ｓｃＦｖクローンの可変領域をコードするＤＮＡを、ＰＣＲ増幅によって救出し、１２個の選択されたファージ−ｓｃＦｖクローンのものに対応する可変領域を有する１２個のＩｇＧ発現のための発現ベクターを生成させるために使用した。これら１２個のＩｇＧのうち、ファージ−ｓｃＦｖクローンＲＷ０１に由来の「抗体可変領域ＲＷ０１」を含む「ＩｇＧ  ＲＷ０１」が、ＣＤ１３３＋細胞への特異的結合について、フローサイトメトリー分析により検証された。同様に、Ｆａｂ  ＲＷ０３に対応した「抗体可変領域ＲＷ０３」を有する「ＩｇＧ  ＲＷ０３」を作製し、ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３を並列してさらに試験した。
【０２３７】
ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３の軽鎖（ｈＫ）および重鎖のアミノ酸配列、ならびに抗体可変領域ＲＷ０１およびＲＷ０３の重鎖および軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列を表２に示し、ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列およびＩｇＧ  ＲＷ０１に含まれる抗体可変領域ＲＷ０１のおよびＩｇＧ  ＲＷ０３に含まれる抗体可変領域ＲＷ０３の、３９位、５５位および６６位の重鎖可変ドメイン残基を表３に示す。ＣＤＲならびにＩｇＧ  ＲＷ０１に含まれる抗体可変領域ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３に含まれる抗体可変領域ＲＷ０３の３９位、５５位および６６位の重鎖可変ドメイン残基をコードするヌクレオチド配列を表４に示す。ＩｇＧ  ＲＷ０１の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号２のＡｓｐ１〜Ｌｙｓ１０６セグメントのアミノ酸配列に対応し、ＩｇＧ  ＲＷ０１の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号３のＧｌｕ１〜Ｔｈｒ１２０セグメントのアミノ酸配列に対応し、ＩｇＧ  ＲＷ０３の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４のＡｓｐ１〜Ｌｙｓ１０９セグメントのアミノ酸配列に対応し、ＩｇＧ  ＲＷ０３の重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、配列番号５のＧｌｕ１〜Ｓｅｒ１１８セグメントのアミノ酸配列に対応する。
【表２】
2019535670.tif 000005
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【表３】
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2019535670.tif 000009
【表４】
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2019535670.tif 000012
【０２３８】
ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３の軽鎖（ｈＫ）および重鎖、ならびに抗体可変領域ＲＷ０１およびＲＷ０３の重鎖および軽鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列を表５に示す。
【表５】
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2019535670.tif 000016
【０２３９】
実施例３：ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３は、それぞれ約１桁のナノモルおよびナノモル以下の親和性で、細胞表面に発現したＣＤ１３３に結合する。
ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３抗体を、ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞に結合するそれらの能力についてフローサイトメトリーにより試験し、その後、細胞に対する各抗体の最大半量の結合濃度を推定した。具体的には、ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞を各抗体の段階希釈液と共にインキュベートし、結合を抗ヒトＦａｂ’２二次抗体で検出し、そのデータを、ＳｉｇｍａＰｌｏｔグラフ作成プログラムを使用して最も適合する線に合わせた。図４は、２．５ｎＭの計算されたＥＣ５０を有するＩｇＧ  ＲＷ０１のＥＣ５０曲線、および０．５ｎＭの計算されたＥＣ５０を有するＩｇＧ  ＲＷ０３の曲線を示す。
【０２４０】
実施例４：ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３は、フローサイトメトリー分析により示されるように、膵臓癌細胞および結腸直腸癌細胞における細胞表面ＣＤ１３３に特異的に結合し、検出するために使用できる。
ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３抗体を、フローサイトメトリーによって、以下の癌細胞株、すなわち、Ｃａｃｏ−２、ＣＤ１３３を発現することが知られている結腸癌細胞株、膵臓癌細胞株ＨＰＡＣ、ＰＬ４５、ＲＷＰ−１およびＳＵ８６８６、ならびに卵巣癌細胞株Ｏｖｃａｒ−８への結合について評価した。ＨＥＫ２９３細胞およびＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞を、それぞれ陰性対照および陽性対照として使用した。図５に示すように、５μｇ／ｍＬの両抗体は、ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３対照細胞の表面、Ｃａｃｏ−２結腸直腸癌細胞の表面、ならびにＨＰＡＣ、ＰＬ４５およびＲＷＰ−１膵臓癌細胞の表面でＣＤ１３３に結合する。ＨＰＡＣ細胞およびＰＬ４５細胞において二峰性染色ピークが観察され、操作された細胞株ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３について観察されるようなより広いピークは、より均一に発現する集団を示すＲＷＰ−１細胞で観察される狭いピークとは対照的に、不均一に発現する細胞集団の結果である可能性が最も高い。
【０２４１】
実施例５：免疫蛍光分析により示されるように、ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３は、細胞ＣＤ１３３に特異的に結合し、検出し、細胞内の位置を特定するために使用することができる。
ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３抗体を、細胞発現したＣＤ１３３への結合について免疫蛍光アッセイで試験した（図６）。このアッセイは、ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３がＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞（ＣＤ１３３の細胞内局在を示す）には結合するが、ＨＥＫ２９３細胞には結合しないことを示している。
【０２４２】
実施例６：ウエスタンブロット分析に示されるように、ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３をそれぞれ使用して、結腸直腸癌細胞の全細胞溶解物中における変性ＣＤ１３３を検出することができる。
Ｃａｃｏ−２結腸直腸癌細胞の全細胞溶解物を調製し、溶解物中の変性ＣＤ１３３を検出するＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３の能力を、ウエスタンブロッティングアッセイによって分析した。ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞およびＨＥＫ２９３細胞を、それぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。図７は、ＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３のそれぞれが、両方ともＣＤ１３３陽性であるＣａｃｏ−２細胞およびＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞の溶解物中において変性ＣＤ１３３を検出するが、ＨＥＫ２９３細胞中では検出しないことを示している。
【０２４３】
実施例７：エピトープ−Ｆａｂ  ＲＷ０１およびＦａｂ  ＲＷ０３は、ＣＤ１３３への結合について、それぞれＩｇＧ  ＲＷ０３およびＩｇＧ  ＲＷ０１と競合しない。
抗体可変領域ＲＷ０１および抗体可変領域ＲＷ０３が、細胞で発現したＣＤ１３３への結合について相互に競合するかどうかを決定するための実験を行った。細胞を最初に２５ｎＭ濃度のＦａｂ  ＲＷ０１またはＦａｂ  ＲＷ０３のいずれかと共にインキュベートし、それぞれＩｇＧ  ＲＷ０３またはＩｇＧ  ＲＷ０１の段階希釈物を添加し、ＩｇＧ結合をヒトＦｃに対する二次抗体を使用して検出した。各抗体についての結果は図８（ａ）および（ｂ）に見ることができ、ＩｇＧ  ＲＷ０１は飽和ＲＷ０３Ｆａｂの存在下で細胞に結合し得、またＩｇＧ  ＲＷ０３はＲＷ０１Ｆａｂの存在下で結合し得ることを示している。
【０２４４】
実施例８：ＩｇＧ  ＲＷ０１またはＩｇＧ  ＲＷ０３を用いた治療は、Ｃａｃｏ−２結腸直腸癌細胞における全細胞ＣＤ１３３タンパク質レベルを有意に低下させるために使用することができる
癌細胞におけるＣＤ１３３タンパク質レベルに対するＩｇＧ  ＲＷ０１およびＩｇＧ  ＲＷ０３の効果を調べるために、Ｃａｃｏ−２結腸直腸癌細胞をＩｇＧ／ＲＷ０１またはＩｇＧ  ＲＷ０３のいずれかと共に３７℃で２４時間インキュベートし、全細胞溶解物を、プローブとしてＡＣ１３３抗ＣＤ１３３抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用い、陰性抗体対照として抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いたウエスタンブロットにより分析した。図９に示すように、未処理群および抗ヒトＩｇＧ対照処理群と比較して、ＲＷ０１  ＩｇＧまたはＲＷ０３  ＩｇＧによる処理はＣＤ１３３タンパク質レベルを有意に減少させた。ＣＤ１３３タンパク質レベルの観察された減少による細胞内のＷｎｔシグナル伝達に対する影響を評価するために、β−カテニンレベルも分析したが、対照抗体で処理したサンプルと、ＩｇＧ  ＲＷ０１−またはＩｇＧ  ＲＷ０３で処理したサンプルとの間で、β−カテニンタンパク質の安定性に対する差異は観察されなかった。
【０２４５】
実施例９：単鎖Ｆａｂ  ＲＷ０３は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）をＣＤ１３３陽性細胞にターゲッティングするために使用できる
４つの新規な抗ＣＤ１３３×抗ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ；図１０Ａ）の発現のために、ベクターを構築した。４つのＢｉＴＥはそれぞれ、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを組み込んでおり、さらに抗ＣＤ１３３  Ｆａｂ  ＲＷ０３（ＦａｂベースのＢｉＴＥ）またはＦａｂ  ＲＷ０３（「ｓｃＦａｂ  ＲＷ０３」；ＦａｂベースのＢｉＴＥ）の可変領域を組み込んだ抗ＣＤ１３３単鎖Ｆａｂ（「ｓｃＦａｂ」、ｓｃＦａｂベースのＢｉＴＥ）のいずれかを組み込んでいる。４つのＢｉＴＥのそれぞれにおいて、ＦａｂまたはｓｃＦａｂはｓｃＦｖのＶＨドメインに結合している。この４つのＢｉＴＥは、ｓｃＦｖがＦａｂの軽鎖由来部分（「ＢｉＴＥ＃１」）または重鎖由来部分（「ＢｉＴＥ＃２」）のいずれかに結合している２つのＦａｂベースの変異体を含む。他の２つのＢｉＴＥはｓｃＦａｂベースの変異体であり、ここでのｓｃＦｖは同様に、ｓｃＦａｂの重鎖由来セグメント（「ＢｉＴＥ＃３」）または軽鎖由来セグメント（「ＢｉＴＥ＃４」）のいずれかに同様に連結されている。
【０２４６】
ＢｉＴＥ＃１、ＢｉＴＥ＃２、ＢｉＴＥ＃３およびＢｉＴＥ＃４のアミノ酸配列を、表６に示す。
【表６】
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【０２４７】
ＢｉＴＥ発現ベクターで一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は、トランスフェクタントの還元型および非還元型の全細胞溶解物ウエスタンブロット分析（図１０Ｂ）に示されるように、発現および精製された形態のＢｉＴＥ＃１、ＢｉＴＥ＃２、ＢｉＴＥ＃３、およびＢｉＴＥ＃４を容易に発現できた。
【０２４８】
ＢｉＴＥ＃１、ＢｉＴＥ＃２、ＢｉＴＥ＃３およびＢｉＴＥ＃４は、細胞表面ＣＤ１３３およびＣＤ３に結合する能力を有する。
精製ＢｉＴＥが細胞表面ＣＤ１３３に特異的に結合する能力が、ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞ｖｓ．ＨＥＫ２９３細胞のＢｉＴＥによる染色のフローサイトメトリー分析を用いて決定された。図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるように、ＢｉＴＥ＃１、ＢｉＴＥ＃２、ＢｉＴＥ＃３およびＢｉＴＥ＃４はそれぞれ、０．０７３〜０．１１マイクログラム／ｍＬという低い濃度でも、ＨＥＫ２９３細胞よりも有意に多く、ＨＥＫ２９３−ＣＤ１３３細胞に結合する。精製されたＢｉＴＥをＥＬＩＳＡでさらに試験して、ＣＤ３イプシロン／ガンマおよびＣＤ３イプシロン／デルタの形態のＣＤ３に結合するそれらの能力を決定した。図１２に示されるように、精製されたＢｉＴＥは、陽性対照抗体（ＵＣＨＴ１、ＯＫＴ３）と同様にＣＤ３にも結合する。これらのＢｉＴＥは、ＣＤ１３３およびＣＤ３の両方に結合することができる。
【０２４９】
実施例１０：ヒトＣＤ１３３特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾Ｔ細胞は、患者由来の神経膠芽腫脳腫瘍をターゲッティングする。
単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をＲＷ０３（上記のもの）から誘導し、第二世代のＣＡＲを生成した。ｍｙｃタグを備えた抗ＣＤ１３３  ｓｃＦｖを、ヒトＣＤ８リーダー配列、ＣＤ８ａ膜貫通ドメイン、ＣＤ２８、およびｈＣＤ３ζ（ヒトＣＤ３ゼータ）シグナル伝達テールと共に、２つの異なる方向、すなわち、軽鎖−リンカー−重鎖（ＣＤ１３３  ＣＡＲ−ＬＨ）および重鎖−リンカー−軽鎖（ＣＤ１３３  ＣＡＲ−ＨＬ）で、レンチウイルス構築物ｐＣＣＬ−ΔＮＧＦＲベクター中にインフレームでクローン化した。
【０２５０】
レンチウイルスを調製した後、ＰＢＭＣから単離したＴ細胞に、ＣＤ１３３  ＣＡＲ−ＬＨおよびＣＤ１３３  ＣＡＲ−ＶＨ構築物を形質導入した。Ｔ細胞操作が成功した後、フローサイトメトリーを用いてΔＮＧＦＲおよびｍｙｃタグの発現を分析し、それぞれ抗ＣＤ１３３の形質導入および表面発現の効率を確認した。ΔＮＧＦＲの発現は全てのＣＡＲ  Ｔ細胞（対照を含む）において観察されたが、ＣＡＲの両方のバリエーション、すなわち、ＣＤ１３３ＣＡＲ−ＨＬおよびＣＤ１３３ＣＡＲ−ＬＨにおいて、ｃ−ｍｙｃタグの発現が見られた。さらに、プレストブルーに基づく殺傷アッセイを使用して、ＣＤ１３３  ＣＡＲが、ＣＤ１３３＋ＧＢＭ脳腫瘍開始細胞株（ＢＴＩＣ）に選択的に結合して殺傷する能力を試験した。ＣＤ１３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１３３＋ＧＢＭに対して細胞傷害性であった。ＣＤ１３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞をＧＢＭと共培養すると、Ｔ細胞活性化および増殖が引き起こされ、この養子Ｔ細胞治療戦略が実証された。
【０２５１】
ＣＤ１３３特異的ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞を、抗体可変領域ＲＷ０３（上記に開示）の重鎖および軽鎖可変ドメイン、ｃ−ｍｙｃの短マーカーエピトープ、マウスＣＤ８由来のヒンジ領域、ならびにマウスＣＤ２８およびＣＤ３ζの膜貫通部分および細胞質部分を含むｓｃＦｖをクローニングすることによって操作した（図１３）。ヒトＣＤ１３３−ＣＡＲをレンチウイルストランスファーベクターｐＣＣＬ−ΔＮＧＦＲにクローニングし、レンチウイルスとしてパッケージングした。細胞外ドメイン中のｃ−ｍｙｃタグを用いてＣＡＲ発現を検証した。ΔＮＧＦＲを、形質導入細胞の追跡および選別のための細胞表面マーカーとして使用した。
【０２５２】
形質導入されたＴ細胞は、ＣＤ４陽性細胞およびＣＤ８陽性細胞からなり、両方のサブセットがＣＤ１３３特異的ＣＡＲを発現していた（図１４）。形質導入が成功した後、ΔＮＧＦＲ（ＣＤ２７１）の発現は全てのＣＡＲ  Ｔ細胞（対照を含む）において観察されたが、ｃ−ｍｙｃタグの発現増加はＣＤ１３３  ＣＡＲ−ＨＬおよびＣＤ１３３  ＣＡＲ−ＬＨ細胞においてのみ見られた（図１５）。
【０２５３】
ＣＤ１３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞をＧＢＭ  ＢＴ４５９と共にインキュベートし、染色し、１８時間後にＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の表面発現について分析した（図１６）。ＣＤ４＋（Ｔヘルパー）細胞およびＣＤ８＋（Ｔ細胞傷害性）細胞の両方が、活性化マーカーの表面発現レベルのアップレギュレーションを示した。上昇した発現は、ＣＤ１３３特異的ＣＡＲの存在下でのみ検出され、ＣＡＲ−Ｔ対照では検出されなかった。
【０２５４】
ＣＤ１３３特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１３３ｈｉｇｈＧＢＭ細胞と共培養した後に増殖能力の増強を示した（図１７Ａ）。ＣＤ１３３特異的ＣＡＲＴ細胞は、ＣＤ１３３ｌｏｗＧＢＭ細胞には影響を及ぼさずに、ＣＤ１３３ｈｉｇｈＧＢＭおよび髄芽腫において腫瘍細胞を特異的に認識し、これを殺傷した（図１７Ｂ）。ＣＤ１３３ｈｉｇｈおよびＣＤ１３３ｌｏｗＧＢＭは、腫瘍細胞培養物中に存在するＣＤ１３３陽性細胞の割合に基づいて定義された。９０％を超えるＣＤ１３３＋細胞を含むＧＢＭ培養物をＣＤ１３３ｈｉｇｈＧＢＭと定義し、５％未満のＣＤ１３３＋細胞を含む培養物をＣＤ１３３ｌｏｗＧＢＭと定義した。
【０２５５】
腫瘍移植マウスに、ＣＡＲ−ＣＯＮ（対照）Ｔ細胞（図１８Ａ）およびＣＡＲ−ＣＤ１３３Ｔ細胞を、エフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）＝２：１で注射した（図１８Ｂ）。ＣＡＲ−ＣＤ１３３Ｔ細胞で頭蓋内処理したマウスの脳内に形成された腫瘍は、対照と比較して、悪性度および侵襲性が有意に低かった（ヒト細胞についてのＣＯＸ  ＩＶ染色で評価したとき）（ｎ＝４）。ＣＡＲ−ＣＤ１３３Ｔ細胞処理後に生成されたマウス異種移植片は、有意に少ない腫瘍量を有していた（図１８Ｃ）。
【０２５６】
ＧＢＭ腫瘍担持マウスをＣＤ１３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置すると、マウスにおいて生存期間が延長され、脳腫瘍負荷が有意に減少した。
【０２５７】
実施例１１．患者由来の神経膠芽腫細胞をターゲッティンするための新規ＣＤ１３３／ＣＤ３二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）抗体の前臨床検証
ＢｉＴＥフォーマットは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＣＥＡ、ＣＤ１３３、ＥｐｈＡ２およびＨＥＲ２／ｎｅｕを含む様々な腫瘍関連抗原に対して評価されてきた（Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９年に概説されている）。 ＢｉＴＥを調査する臨床試験には、白血病患者のためのブリナツモマブ（ＮＣＴ００２７４７４２）、肺癌／結腸直腸癌／乳癌／卵巣癌患者（ＮＣＴ００６３５５９６）のためのＡＭＧ１１０／ＭＴ１１０、胃腸腺癌患者のためのＡＭＧ２１１／ＭＥＤＩ５６５（ＮＣＴ０１２８４２３１）および前立腺癌患者のためのＡＭＧ２１２／ＢＡＹ２０１０１１２（ＮＣＴ０１７３４７５）が含まれる。２つのＧＢＭ腫瘍細胞表面抗原ＣＤ１３３（Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）およびＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に対して特異性を示すＢｉＴＥもまた、異種移植腫瘍モデルにおいて抗腫瘍形成活性を誘導することが示されている。重要なことに、静脈内に送達されたＥＧＦＲｖＩＩＩ特異的ＢｉＴＥの前臨床評価は、よく確立されたＥＧＦＲｖＩＩＩ発現ＧＢＭを有するマウスにおいて、腫瘍の縮小／縮小を示し、生存を延長した。
【０２５８】
実施例９に記載されているように、２つのアーム（一方のアームは腫瘍抗原（ＣＤ１３３）を認識し、もう一方のアームはＣＤ３抗原に特異的である）からなるＣＤ１３３特異的ＢｉＴＥまたはＲＷ０３×ＣＤ３を構築した。このＢｉＴＥは４つの異なるコンホメーションで構築され、二重結合特異性はフローサイトメトリーを用いて確認された。ＣＤ１３３ｈｉｇｈおよびＣＤ１３３ｌｏｗの一次ＧＢＭ株を用いて、ＣＤ１３３＋細胞へのＢｉＴＥの結合を検証した。さらなる分析により、ＢｉＴＥは、健常ドナー末梢血単核細胞の集団内でＣＤ３を発現することが知られているヒトＴ細胞に結合することが示された。ＧＢＭを殺傷するようにＴ細胞をリダイレクトさせるＢｉＴＥの観察では、ＣＤ１３３ｈｉｇｈＧＢＭにおいてより高い効率が観察され、ＢｉＴＥ標的特異性が確認された。
【０２５９】
具体的には、ファージディスプレイ合成抗体ライブラリーの使用およびハイスループットＤＮＡ配列決定技術を組み合わせた新規な方法論であるＣｅｌｌｅｃｔＳｅｑを使用して、ＣＤ１３３特異的モノクローナル抗体「ＲＷ０３」を開発した（図１９Ａ）。ＣＤ１３３  ＲＷ０３抗体の検証後、２つのアームを有するＣＤ１３３特異的ＢｉＴＥまたはＲＷ０３×ＣＤ３を構築した（一方のアームは腫瘍抗原（ＣＤ１３３）を認識するのに対して、第二のアームはＣＤ３抗原に特異的である）。このＢｉＴＥは４つの異なるコンホメーションで構築された（図１９Ｂ）。
【０２６０】
フローサイトメトリーを用いて、適切な抗原を発現している細胞に対するＣＤ１３３×ＣＤ３  ＢｉＴＥの二重特異性を確認した。ＣＤ１３３×ＣＤ３  ＢｉＴＥは、市販のＣＤ１３３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）モノクローナル抗体への結合と比較した場合、同様のキャパシティーで、ＣＤ１３３を発現するＧＢＭ腫瘍に結合する（図２０Ａ）。分析は、健常ドナー末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団内でＣＤ３を発現することが知られているヒトＴ細胞への、ＣＤ１３３×ＣＤ３  ＢｉＴＥの結合を明らかにした（図２０Ｂ）。
【０２６１】
ＢｉＴＥおよびＣＤ１３３ｈｉｇｈＧＢＭ  ＢＴ４５９と共にインキュベートしたＴ細胞を染色し、活性化マーカーＣＤ６９およびＣＤ２５の表面発現について分析した（図２１）。ＣＤ４＋（Ｔヘルパー）細胞とＣＤ８＋（Ｔ細胞傷害性）細胞の両方が、活性化マーカーの表面発現レベルのアップレギュレーションを示した。この上昇した発現は、共培養におけるＣＤ１３３  ＢｉＴＥの存在下でのみ検出された。
【０２６２】
ＧＢＭ細胞は、単独で播種した場合（図２２Ａ（ａ））またはＴ細胞と共に播種した場合（図２２Ａ（ｂ））に単層を形成する；しかしながら、ＢｉＴＥの添加（図２２Ａ、ｃおよびｄ）はＧＢＭ細胞へのＴ細胞の動員をもたらし、球状クラスターを形成する。Ｔ細胞と共培養したＧＢＭ細胞へのＢｉＴＥの添加は、アラマーブルー細胞傷害性アッセイ（図２２Ｂ）、フローサイトメトリーに基づくＬｉｖｅ−Ｄｅａｄ染色（ＩＲ色素を用いる）による腫瘍細胞溶解の定量化（図２２Ｃ）を介して決定されるように、ＧＢＭ細胞の有意な細胞死を導く。２４時間後、ＣＤ１３３  ＢｉＴＥの存在下および非存在下での腫瘍細胞（ＣＦＳＥ標識）およびＴ細胞（Ｅ：Ｔ比、１：２）は、ＢｉＴＥ媒介性のＧＢＭ細胞死を示す。
【０２６３】
ＮＳＧ（ＮＯＤｓｃｉｄガンマ）マウスに、ＣＤ１３３ｈｉｇｈＧＢＭ細胞をｉ．ｃ．で移植し、生着に成功したときに、ＢｉＴＥを用いてまたは用いないで、未刺激のＰＢＭＣで治療した（２週間にわたって合計４用量）（図２３）。ＣＤ１３３  ＢｉＴＥで頭蓋内治療したマウスの脳内に形成された腫瘍は、対照と比較して、悪性度および侵襲性が有意に低かった（ヒト細胞のＣＯＸＩＶ染色により評価して）（ｎ＝４）（図２３、ＡおよびＢ）。ＢｉＴＥ処置後に生成されたマウス異種移植片は、腫瘍負荷がより少なく（図２３Ｃ）、また対照マウスに対して有意な生存上の優位性を維持した（ｎ＝７）（図２３Ｄ）。
【０２６４】
＜実施例１０および１１のための方法＞
フローサイトメトリーによる特徴付け：患者由来のＧＢＭ株を解離させ、単一細胞をＰＢＳ＋２ｍＭのＥＤＴＡ中に再懸濁させた。細胞懸濁液を、抗ＣＤ１３３、抗ＣＤ６９、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４または対応するアイソタイプ対照（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ／ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。サンプルをＭｏＦｌｏ  ＸＤＰ細胞ソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）にかけた。生存色素７ＡＡＤ（１：１０；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて死細胞を排除した。マウスＩｇＧ  ＣｏｍｐＢｅａｄｓ（ＢＤ）を用いて補正を行った。表面マーカー発現は、アイソタイプ対照を用いて確立された分析領域に基づいて、陽性または陰性として定義された。
【０２６５】
細胞増殖アッセイ：９６ウェルプレートに、単一種の細胞を１，０００細胞／２００μＬ／ウェルの密度で、４連で蒔き、４日間インキュベートした。読み出し時点の約２時間前に、２０μＬのプレストブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を各ウェルに添加した。ＦＬＵＯｓｔａｒオメガ蛍光５５６マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ）を使用して、それぞれ５３５ｎｍおよび６００ｎｍの励起波長および発光波長で蛍光を測定した。読取り値を、オメガ分析ソフトウェアを用いて分析した。
【０２６６】
定量的細胞傷害性アッセイ：異なるエフェクター／標的比（Ｅ：Ｔ）を用いたプレストブルー殺傷およびＬＤＨ細胞傷害性アッセイを実施して、ＣＤ１３３を発現しているＧＢＭ  ＢＴＩＣを殺傷するためにＴ細胞をリダイレクトさせるＢｉＴＥの効率を決定した。
【０２６７】
異種移植片腫瘍のインビボでのＧＢＭ頭蓋内注射およびＨ＆Ｅ染色：動物を含む全ての実験手順は、マクマスター大学動物研究倫理委員会（ＡＲＥＢ）によって検討および承認された。全ての実験において、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスを使用した。マウスはガス麻酔（イソフルラン：５％の誘導、２．５％の維持）を用いて麻酔され、低侵襲手術後の耳の刻み目を用いて同定され、回復が監視された。頭蓋内注射は、以前に記載されたようにして実施した（１）。手短に言えば、１０μＬの細胞懸濁液を８〜１０週齢のマウスの右前頭葉に注射した。疾患の徴候についてマウスを毎週モニターし、終点に達したら、脳および肺（ＩＴおよびＩＣａ注射用）を採取し、切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）についてパラフィン包埋した。画像をアペリオスライドスキャナ（Ａｐｅｒｉｏ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ）を用いてスキャンし、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ  ｖ１１．１．２．７６０ソフトウェア（Ａｐｅｒｉｏ）によって分析した。
【０２６８】
本出願は実施例を参照して記載されているが、特許請求の範囲はこれら実施例に記載された実施形態によって限定されるべきではなく、全体として、明細書と一致する最も広い解釈を与えられるべきことが理解されるべきである。
【０２６９】
全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願の各々において、その全体を本明細書の一部として援用する旨が具体的かつ個別に示されているのと同じ範囲で、それらの全体を本明細書に援用する。
【０２７０】
＜参照文献＞
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【図１Ａ】
2019535670.tif 000021
【図１Ｂ】
2019535670.tif 000022
【図２】
2019535670.tif 000023
【図３Ａ】
2019535670.tif 000024
【図３Ｂ】
2019535670.tif 000025
【図４Ａ】
2019535670.tif 000026
【図４Ｂ】
2019535670.tif 000027
【図５】
2019535670.tif 000028
【図６】
2019535670.tif 000029
【図７】
2019535670.tif 000030
【図８】
2019535670.tif 000031
【図９】
2019535670.tif 000032
【図１０Ａ】
2019535670.tif 000033
【図１０Ｂ】
2019535670.tif 000034
【図１１Ａ】
2019535670.tif 000035
【図１１Ａ１】
2019535670.tif 000036
2019535670.tif 000037
【図１１Ａ２】
2019535670.tif 000038
【図１１Ｂ】
2019535670.tif 000039
【図１１Ｂ１】
2019535670.tif 000040
【図１１Ｂ２】
2019535670.tif 000041
【図１２】
2019535670.tif 000042
【図１３】
2019535670.tif 000043
【図１４】
2019535670.tif 000044
【図１５】
2019535670.tif 000045
【図１６】
2019535670.tif 000046
【図１７Ａ】
2019535670.tif 000047
【図１７Ｂ】
2019535670.tif 000048
【図１８】
2019535670.tif 000049
【図１９】
2019535670.tif 000050
【図２０】
2019535670.tif 000051
【図２１】
2019535670.tif 000052
【図２２】
2019535670.tif 000053
【図２３】
2019535670.tif 000054
【手続補正書】
【提出日】令和1年6月20日(2019.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019535670000001.app
【国際調査報告】
2019535670.tif 000055
2019535670.tif 000056
2019535670.tif 000057
2019535670.tif 000058