(57)【要約】  本発明は、腫瘍を治療するための新たな大腸菌ＩＩ型アスパラギナーゼを開示する。
2019535308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６に相当する配列を有する単離ペプチド。
【請求項２】
配列がＮ末端にｈｉｓタグをさらに含む、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項３】
配列番号５のヌクレオチド配列によってコードされる請求項１記載の単離ペプチド。
【請求項４】
配列番号５に相当する配列を有する単離ヌクレオチド配列。
【請求項５】
請求項４に記載の単離ヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターでクローニングされた宿主細胞。
【請求項７】
細菌、酵母又は哺乳動物細胞を含む群から選択される、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
大腸菌の細胞である、請求項６又は７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項３に記載のベクターでクローニングされた大腸菌細胞を適切な培地中で培養し、引き続いて抽出物を回収し、タンパク質を精製するステップを含む、請求項１に記載の単離ペプチドを調製する方法。
【請求項１０】
ＰＥＧ化によって化学的に修飾されている、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項１１】
赤血球内に封入されている、請求項１に記載の単離ペプチド。
【請求項１２】
医薬品として使用するための、請求項１又は１０又は１１に記載の単離ペプチド。
【請求項１３】
原発性と続発性の両方の固形腫瘍の治療に医薬品として使用するための請求項１２に記載の単離ペプチド。
【請求項１４】
胃腸、肺、乳房、前立腺、卵巣、肝臓、腎臓、甲状腺、鼻咽頭の腫瘍、肉腫、リンパ腫及び多発性骨髄腫を含む群から選択される新生物の治療に使用するための請求項１２又は１３に記載の単離ペプチド。
【請求項１５】
急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療に医薬品としての使用するための請求項１２に記載の単離ペプチド。
【請求項１６】
ヒト又は動物用の医薬品として使用するための、請求項１２に記載の単離ペプチド。
【請求項１７】
適量の請求項１又は１０又は１１に記載のペプチドを、それを必要とする患者に投与するステップを含む、腫瘍を治療する方法。
【請求項１８】
腫瘍が胃腸、肺、乳房、前立腺、卵巣、肝臓、腎臓、甲状腺、鼻咽頭の腫瘍、肉腫、リンパ腫及び多発性骨髄腫を含む群から選択される、請求項１７に記載の腫瘍を治療する方法。
【請求項１９】
腫瘍が急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である、請求項１７に記載の腫瘍を治療する方法。
【請求項２０】
患者が１８歳未満の年齢の小児である、請求項１７又は１８又は１９に記載の腫瘍を治療する方法。
【請求項２１】
患者がヒト又は動物である、請求項１７又は１８又は１９に記載の腫瘍を治療する方法。
【請求項２２】
請求項１又は１０又は１１に記載のペプチドを化学療法薬と組み合わせて投与する、請求項１８に記載の腫瘍を治療する方法。
【請求項２３】
化学療法薬がアミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カーフィルゾミブ、カルムスチン、クロラムブシル、クロロキン、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デメトキシビリジン、ジクロロアセテート、ジエンエストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、ロニダミン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトホルミン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペントスタチン、ペリホシン、プリカマイシン、ポマリドミド、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、二塩化チタノセン、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン又はビノレルビンを含む群から選択される、請求項２２に記載の腫瘍を治療する方法。
【請求項２４】
請求項１又は１０又は１１に記載の単離ペプチドと、複数の薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤及び／又は保存剤の１つとを含む医薬製剤。
【請求項２５】
化学療法薬をさらに含む、請求項２４に記載の医薬製剤。
【請求項２６】
化学療法薬がアミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カーフィルゾミブ、カルムスチン、クロラムブシル、クロロキン、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デメトキシビリジン、ジクロロアセテート、ジエンエストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、ロニダミン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトホルミン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペントスタチン、ペリホシン、プリカマイシン、ポマリドミド、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、二塩化チタノセン、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン又はビノレルビンを含む群から選択される、請求項２５に記載の医薬製剤。
【請求項２７】
静脈内又は筋肉内投与用の請求項２４又は２５又は２６に記載の医薬製剤。
【請求項２８】
食品の加工中のアクリルアミドの生成を減少させる方法であって、食品を加工する前に請求項１に記載のペプチドを食品に適用するステップを含む上記方法。
【請求項２９】
食品が、ポテトチップス、フライドポテト、ポテトクリスプ又はコロッケ、穀類含有製品（穀類はライ麦、コーン、トウモロコシ、オオムギ、イネ及びエンバクを含む群から選択される）；コムギ系製品を含む群から選択されるデンプン系食品；コーヒー、ココア、ナッツ、野菜及び果物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
食品加工が、焼成、フライ、煮込及び焙煎を含む、請求項２８又は２９に記載の方法。
【請求項３１】
食品添加物としての請求項１に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野において、特に腫瘍の治療、より具体的には急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療に用途を見出す。
【背景技術】
【０００２】
細菌ＩＩ型Ｌ−アスパラギナーゼ（ＡＳＮａｓｅ）は、Ｌ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）からＬ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）及びアンモニアへの加水分解を触媒するアミドヒドロラーゼ（ＥＣ  ３．５．１．１）である。
【０００３】
効率は低いが、ＡＳＮａｓｅはＬ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）を脱アミノ化して、Ｌ−グルタミン酸（Ｌ−Ｇｌｕ）及びアンモニアを放出することもできる。
【０００４】
構造的には、ＡＳＮａｓｅはおよそ１３０〜１４０ｋＤａのホモ四量体である。
【０００５】
ＡＳＮａｓｅ単量体は、規則正しいループによって接続された２つの明確に異なるドメイン、Ｎドメイン（およそ２３０残基）及びＣドメイン（およそ１１０残基）を有する。
【０００６】
四量体の折り畳みでは、各単量体が、１つは遠位の二量体を表し、あまり広がっていない接触、もう１つは密接な二量体を表し、より広がっている接触の２セットの接触を獲得する。
【０００７】
後者の二量体はＡＳＮａｓｅの機能単位であり、２つの密接な二量体の各々がサブユニット界面に２つの活性部位を有する。各活性部位は、主に各単量体Ｎ−ドメインに、より低い程度では第２の同族単量体のＣ−ドメインに属する残基から構成される。
【０００８】
Ｎ−ドメインは、２つの必須触媒残基（Ｔｈｒ及びＴｙｒ）を伴う、基質結合時に活性部位上で閉じる蓋として作用する特有の構造要素である活性部位フレキシブルループ（残基３〜２７）を含む。
【０００９】
ＡＳＮａｓｅ触媒残基は、スレオニンが主な役割を果たす２つの高度に保存されたトライアド（Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ及びＴｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ）によって記載されている［１］。
【００１０】
Ｌ−アスパラギナーゼは１９５０年代初頭に抗増殖剤として単離及び記載され［２］、それ以来、細菌が酵素薬の主な供給源として使用されてきた。ＡＳＮａｓｅｓ抗増殖機構は、血液からのＬ−アスパラギンの迅速な除去に依存しており、Ｌ−Ａｓｎデノボ生合成経路においてしばしば損なわれている腫瘍細胞に主に影響を及ぼす。
【００１１】
Ｌ−Ａｓｎ飢餓の結果として、またデノボ産生の非存在下で、腫瘍細胞はアポトーシス促進性経路及びオートファジー経路を活性化する［３］。
【００１２】
数年前までは、Ｌ−Ｇｌｎ除去が健康な組織に対するＡＳＮａｓｅ毒性の主な原因と考えられていたため、ＡＳＮａｓｅの二次Ｌ−グルタミナーゼ活性は薬物毒性との関連性が低く、有害でさえあると考えられてきた。今日では、ＡＳＮａｓｅ抗腫瘍活性におけるＬ−Ｇｌｎ除去の役割が再評価されており、酵素二重活性の必要性を支持する証拠が文献でますます多く報告されている［４〜６］。
【００１３】
Ｌ−アスパラギナーゼは、小児急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）治療の第一選択薬として現在４０年以上にわたって使用されている。
【００１４】
その高い有効性及び独特の飢餓活性は、それらをＡＬＬ療法の改善だけでなく、他の腫瘍の新規でより有効な治療の確立にとっても非常に興味深いものにしている。残念なことに、ＡＳＮａｓｅベースの療法は、主にそれに関連するいくつかの制限を有する：（ｉ）代謝副作用、（ｉｉ）高い免疫原性、（ｉｉｉ）成人患者における低い有効性、及び（ｉｖ）インビボでの高い不安定性。
【００１５】
小児患者では、抗ＡＳＮａｓｅ抗体の早期開発は治療の失敗の高い可能性につながり、ひいては患者にとって悪い結果につながる。
【００１６】
さらに、成人の免疫系は小児のものよりも外因性分子に対してより反応性であるので、ＡＳＮａｓｅ免疫原性が成人患者における使用にとっての主な制限である。
【００１７】
抗ＡＳＮａｓｅ抗体を生成するアプローチは、より頻繁には重度より軽度のアレルギー反応、又は薬物のサイレント不活性化を引き起こす可能性があるので、完全には成功していない。
【００１８】
後者の現象は、薬理学的有効性の欠如を示し得る症状又は明白な徴候なしに薬物の早期不活性化を引き起こすので非常に危険である。
【００１９】
現在、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＥｃＡＩＩ）及び黒脚病菌（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）（ＥｒＡＩＩ）ＩＩ型ＡＳＮａｓｅが臨床用途に利用可能である。
【００２０】
ＥｃＡＩＩは、天然型とＰＥＧ化型の両方で、第一選択薬として使用され、代わりに、ＥｒＡＩＩは大腸菌由来ＡＳＮａｓｅに対する免疫反応の場合にのみ使用される。
【００２１】
残念なことに、両タンパク質は、高いインビボ不安定性、短い半減期、及び薬理学的活性濃度を得るための数回の投与の必要性を特徴とする。さらに、タンパク質の不安定性は、抗体産生の可能性の増加、ひいては免疫反応に関連している。
【００２２】
ＡＳＮａｓｅ臨床用途について考慮されるべき別の態様は、プロテアーゼ媒介分解に対する分子の感受性である。
【００２３】
２００９年に、Ｐａｔｅｌら［７］は加水分解によりＥｃＡＩＩを不活性化することができる２つのリソソームプロテアーゼを記載した。
【００２４】
２つのプロテアーゼはカテプシンＢ（ＣＴＳＢ）及びアスパラギンエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）であり、薬物活性及び薬物動態を損なう白血病リンパ芽球によって過剰発現され得る。さらに、ＥｒＡＩＩもＣＴＳＢタンパク質分解に感受性となることをもたらした。
【００２５】
ＡＥＰ及びＣＴＳＢの高発現が、例えばフィラデルフィア陽性（Ｐｈ＋）及びｉＡＭＰ２１白血病に罹患している患者において報告されており、これらは非常に侵襲性で反応性の悪い白血病の形態である。
【００２６】
ＡＳＮａｓｅ免疫原性を防止すると同時に分子安定性を改善する試みにおいて、天然ＥｃＡＩＩ及びＥｒＡＩＩタンパク質がＰＥＧ化によって化学的に修飾されてきた。
【００２７】
ＰＥＧ化ＥｃＡＩＩ（ＰＥＧＡＳＰＡＳＥ）及び、ごく最近になってＰＥＧ化ＥｒＡＩＩ（すなわち、ＰＥＧＣＲＩＳＡＮＴＡＳＰＡＳＥ）が、診療所で日常的に使用されている。
【００２８】
それにもかかわらず、ＰＥＧＡＳＰＡＳＥは、天然ＥｃＡＩＩと比較して頻度が低いにもかかわらず、アレルギー反応を引き起こす可能性があり、さらに、それは重度の膵炎及び代謝機能不全をもたらし得る高トリグリセリド血症を引き起こす可能性がある。
【００２９】
さらに、ＰＥＧＡＳＰＡＳＥは、天然酵素のＣＴＳＢ加水分解に対して同じ感受性を有し、ＡＳＮａｓｅ不活性化腫瘍の治療のためのその使用を妨げる。
【００３０】
ＰＥＧ化アスパラギナーゼの代替として、患者由来の赤血球（ＧＲＡＳＰＡ）に搭載された天然型ＥｃＡＩＩが近年診療所に導入されている（第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床試験）。この新しい薬物送達システムは、ＡＳＮａｓｅ免疫原性の低減とその半減期の改善において非常に成功しているように思われ、小児患者だけでなく成人患者においてもより安全なＡＳＮａｓｅ送達のための有効な新しいプラットフォームとなり得る。
【００３１】
上記を考慮して、改善された耐熱性及びタンパク質分解耐性を特徴とするさらなるアスパラギナーゼの必要性が感じられる。
【発明の概要】
【００３２】
本発明は、大腸菌ＩＩ型Ｌ−アスパラギナーゼの変異体が、腫瘍のための改善されたＡＳＮａｓｅベース療法に適するようにする特に望ましい特性を示すという発見に基づいている。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】タンパク質安定性についての試験の結果を示す図である。
【図２】熱シフトアッセイの結果を示す図である。
【図３】ＳＤ１（グラフＡ）及びＲＥＨ細胞（グラフＢ）に対する野生型及びＮ２４Ｓ  ＡＳＮａｓｅの効果の結果を報告する図である。
【図４】ＳＤ１細胞溶解物によるＥｃＡＩＩ野生型、Ｎ２４Ｓ及びＥｌｓｐａｒの分解を示す（ポンソーレッド染色）図である。
【図５】野生型及びＮ２４Ｓ突然変異体の４週間での分解パターンを報告する図である。
【図６】それぞれ野生型タンパク質及び突然変異型タンパク質中にＮ２４残基及びＳ２４残基を含むループの構造を示す図である。
【００３４】
発明の目的
第１の目的によると、本発明は、配列番号６に相当する配列を有することを特徴とする、大腸菌ＩＩ型アスパラギナーゼの変異体を開示する。
【００３５】
さらなる目的において、本発明のタンパク質を調製する方法が開示される。
【００３６】
第２の目的によると、本発明のアスパラギナーゼ酵素は、医薬品として、特に腫瘍を治療するための医薬品として開示される。
【００３７】
医薬品としての使用は、ヒト及び動物を意図している。
【００３８】
本発明のさらなる目的は、適切な量の開示される大腸菌ＩＩ型アスパラギナーゼを、それを必要とする患者に投与するステップを含む、腫瘍を治療する方法によって表される。
【００３９】
治療方法はヒト及び動物を意図している。
【００４０】
本発明のタンパク質を含む医薬製剤は本発明のさらなる目的を表す。
【００４１】
さらなる目的において、本発明は、食品、特に揚げ物中のアクリルアミドの含量を減少させる方法を開示する。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
第１の目的によると、配列番号６のアミノ酸配列を有することを特徴とする、大腸菌ＩＩ型アスパラギナーゼの変異体（Ｎ２４Ｓ突然変異体）が開示される：
【表１】
2019535308.tif 000003
【００４３】
特に、このタンパク質は、配列番号５に相当する核酸配列によってコードされる：
【表２】
2019535308.tif 000004
【００４４】
本発明の特定の実施形態によると、開示されるタンパク質が適切なポリマーで化学的に修飾されていてもよい。
【００４５】
好ましくは、前記ポリマーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によって表される。
【００４６】
本発明の目的のために、アスパラギナーゼＰＥＧ化は、モノメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ、５０００Ｄａ以下の分子量）の天然タンパク質への共有結合によって得られる［８］。バイオコンジュゲーション（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、天然タンパク質と、タンパク質表面上の特定の残基に結合する化学的に活性化されたＰＥＧを混合することによって得られる。
【００４７】
代替実施形態では、本発明のＮ２４Ｓタンパク質が赤血球内に封入され得る。
【００４８】
特に、周知のＧＲＡＳＰＡ技術が参照される。
【００４９】
赤血球（ＲＢＣ）への封入は、循環薬をより安全に投与するための周知の方法である［９］。ＲＢＣに封入された市販型のＬ−アスパラギナーゼが近年診療所で利用可能になった（ＥｒｉｔｅｃｈによるＧＲＡＳＰＡ）。封入の技術は、患者の血液に由来するＲＢＣの一過的浸透圧ショックからなる。ＲＢＣの浸透性透過は、緩やかな透析によって行われ、膨張及び孔の開口のために細胞膜の一過的透過性を引き起こす。膨張したＲＢＣはＬ−アスパラギナーゼに対して透過性であり、これが開いた孔を使用して細胞に入る。その後、細胞は等張性に戻り、Ｌ−アスパラギナーゼは活性分子として細胞内に残存する［１０］。封入されたＲＢＣが患者に輸血され、溶血すると、Ｌ−アスパラギナーゼが患者の血清中に放出される。Ｌ−アスパラギナーゼ送達用のバイオリアクターとして使用されるＲＢＣは、患者の循環系における遊離薬物の短期間の永続性のために薬物の安定性の改善ならびに免疫原性の減少を可能にする。
【００５０】
さらなる目的において、本発明のタンパク質を調製する方法が開示される。
【００５１】
特に、本発明のタンパク質の調製は、配列番号５に対応するコード配列を含むベクターで形質転換された適切な宿主細胞を適切な培地中で培養し、引き続いて抽出物を回収し、タンパク質を精製するステップを含む。
【００５２】
本発明によると、適切な宿主は、細菌、酵母又は哺乳動物細胞を含む群から選択され得る。
【００５３】
好ましい実施形態では、宿主が大腸菌により表される。
【００５４】
より好ましい実施形態では、大腸菌細胞が菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）の細胞である。
【００５５】
特に、タンパク質の調製は、以下の配列を有することを特徴とするセンスプライマー及びアンチセンスプライマーの使用を含む：
【表３】
2019535308.tif 000005
【００５６】
第２の目的によると、本発明のアスパラギナーゼは医薬品として開示される。
【００５７】
より具体的には、以下において、本発明のアスパラギナーゼは、以下の形態のいずれか１つであることが意図されている：
上に開示される
−Ｎ２４Ｓタンパク質、
−ＰＥＧ化Ｎ２４Ｓタンパク質、
−赤血球内に封入されたＮ２４Ｓタンパク質。
【００５８】
特に、アスパラギナーゼは、原発性と続発性の両方の固形腫瘍を治療するための医薬品としての用途を見出す。
【００５９】
特定の態様によると、固形腫瘍は、胃腸、肺、乳房、前立腺、卵巣、肝臓、腎臓、甲状腺、鼻咽頭の腫瘍、肉腫、リンパ腫及び多発性骨髄腫を含む群から選択される新生物を指すために使用される。
【００６０】
患者は成人又は小児によって表され得る。
【００６１】
好ましい実施形態では、タンパク質が急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療への用途を見出す。
【００６２】
より好ましい実施形態として、急性リンパ芽球性白血病は、フィラデルフィア陽性（Ｐｈ＋）又はｉＡＭＰ２１白血病であり得る。
【００６３】
特定の実施形態では、急性リンパ芽球性白血病の治療が、典型的には１８歳未満の年齢の小児に行われる。
【００６４】
本発明の目的のために、本発明のタンパク質の医薬品としての使用は、ヒトだけでなく動物にも意図されている。
【００６５】
本発明のさらなる目的は、適切な量の上に開示される大腸菌ＩＩ型アスパラギナーゼを、それを必要とする患者に投与するステップを含む、腫瘍を治療する方法によって表される。
【００６６】
より具体的には、本方法は、上に開示される本発明のアスパラギナーゼタンパク質：
−Ｎ２４Ｓタンパク質、
−ＰＥＧ化Ｎ２４Ｓタンパク質、
−赤血球内に封入されたＮ２４Ｓタンパク質
のいずれか１つの投与を含み得る。
【００６７】
特に、前記腫瘍は原発性と続発性の両方の固形腫瘍を含み、成人と小児の両方に罹患し得る。
【００６８】
別の特定の実施形態によると、固形腫瘍は、胃腸、肺、乳房、前立腺、卵巣、肝臓、腎臓、甲状腺、鼻咽頭の腫瘍、肉腫、リンパ腫及び多発性骨髄腫を含む群から選択される新生物を指すために使用される。
【００６９】
本発明の目的のために、腫瘍を治療する方法は、ヒトだけでなく動物にも意図されている。
【００７０】
本発明の好ましい態様は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を治療する方法によって表される。
【００７１】
代替として、白血病はフィラデルフィア陽性（Ｐｈ＋）又はｉＡＭＰ２１白血病であり得る。
【００７２】
特定の実施形態では、患者が典型的には１８歳未満の年齢の小児によって表される。
【００７３】
別の実施形態によると、本発明のアスパラギナーゼは、他の医学的治療と組み合わせて、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を含む腫瘍の治療に使用され得る、又は既に行われた治療もしくは伝統的な治療の後でもしくはその代替として行われ得る。
【００７４】
本発明のタンパク質を含む医薬製剤は本発明のさらなる目的を表す。
【００７５】
特に、本発明のタンパク質を含む製剤は静脈内又は筋肉内投与される。
【００７６】
したがって、本発明の目的の範囲内の適切な医薬製剤は、有効量の本発明のタンパク質（Ｎ２４Ｓ）と、医薬品の観点から許容される複数の担体及び／又は賦形剤及び／又は保存剤の１つとを含む。
【００７７】
医薬製剤は、異なる薬量学スキームに従って投与され得る。
【００７８】
本発明の目的のために、医薬製剤は、
−本発明のＮ２４Ｓタンパク質；
−ＰＥＧ化によって修飾された本発明のＮ２４Ｓタンパク質；
−赤血球内に封入された本発明のＮ２４Ｓタンパク質
を含み得る。
【００７９】
特に、ＰＥＧ化によって場合により化学的に修飾された本発明のＮ２４Ｓタンパク質は、上に開示されるタンパク質である。
【００８０】
封入カプセルについては、周知のＧＲＡＳＰＡ技術が参照される。
【００８１】
その中に本発明の封入Ｎ２４Ｓタンパク質を含む赤血球の医薬製剤は、本発明のさらなる目的を表す。
【００８２】
本発明の目的のために、医薬製剤は、上記の形態の本発明のタンパク質に加えて、１種又は複数の化学療法薬を含み得る。
【００８３】
具体的には、前記薬物は、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、ＢＣＧ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カーフィルゾミブ、カルムスチン、クロラムブシル、クロロキン、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デメトキシビリジン、ジクロロアセテート、ジエンエストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン（ｉｒｏｎｏｔｅｃａｎ）、レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、ロニダミン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトホルミン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペメトレキセド、ペントスタチン、ペリホシン、プリカマイシン、ポマリドミド、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、二塩化チタノセン、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン又はビノレルビンを含む群から選択され得る。
【００８４】
本発明のさらなる目的として、食品中のアクリルアミドの含量を減少させる方法が開示される。
【００８５】
好ましい実施形態では、前記食品がデンプン系食品によって表される。
【００８６】
特に、デンプン系食品には、例えば、ポテトチップス、フライドポテト、ポテトクリスプもしくはコロッケ、穀類、例えばライ麦、コーン、トウモロコシ、オオムギ、イネもしくはエンバク含有製品、又はコムギ系製品が含まれる。
【００８７】
他の食品は、コーヒー、ココア、ナッツ、野菜、例えばアスパラガス又は果実、例えばバナナによって表され得る。
【００８８】
したがって、食品加工、特にデンプン系食品の加工中のアクリルアミドの生成を減少させる方法は、加工前に本発明の酵素を食品に適用するステップを含む。
【００８９】
特に、食品は前に列挙したものであり得るが、加工は、例えば、焼成、フライ、煮込もしくは焙煎、又は１２０℃以上でさえ行われる他の任意の加工を含む。
【００９０】
より詳細には、本発明の酵素が作用し、食品中のアスパラギンの量を減少させるのを可能にするために、酵素を食品と接触させることによって、又は食品を、加工前の適切な時間、酵素を含む溶液に浸漬することによって、酵素を食品に適用することが好ましい。
【００９１】
したがって、本発明のタンパク質を食品添加物として使用することができる。
【００９２】
以下の実験節では、本発明のタンパク質をＮ２４Ｓ突然変異体と呼ぶ。
【００９３】
また、１単位のＬ−アスパラギナーゼを、記載される条件下で１マイクロモルの基質を生成物に変換するのに必要な酵素の量として定義する。
【００９４】
材料及び方法
１．突然変異原理
改善されたタンパク質を得るためにＮ２４Ｓ突然変異体を設計した。
【００９５】
２．クローニング
大腸菌株Ｋ−１２亜種ＭＧ１６５５由来のａｎｓＢ遺伝子のヌクレオチド配列を、ＮＣＢＩヌクレオチドデータベース（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００９１３．２）から得た。菌株は、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ及びＢｅａｃｈａｍ［１１］に従って選択した。この配列は、クローン化インサートに含まれていなかった分泌シグナル伝達のための６３ヌクレオチド長のリーダー配列（リーダー配列、ＬＳ）を含む。その５’に６ｘＨｉｓをコードする１８コドンを含むａｎｓＢ構築物を、鋳型として全長遺伝子の合成型（ｐＭＡ  ＥｃＡｎｓＢ、ＧｅｎｅＡｒｔ）を用いてＰＣＲによって得た。反応混合物は、１×反応緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、３００μＭのｄＮＴＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｎｇの鋳型（ｐＭＡ  ＥｃＡｎｓＢ）、３００ｎＭのプライマー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、表１、下線を付した文字は元の配列中に存在しない余剰ヌクレオチドを示す）、２．５Ｕの白金Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含んでいた。反応容量は５０μｌであった。得られた増幅産物を発現ベクターへのａｎｓＢ遺伝子のクローニングに使用した。
【００９６】
ＬＳを含まず、かつＮ末端６×Ｈｉｓタグを有するａｎｓＢ遺伝子を含むベクターを、部位特異的突然変異誘発のための鋳型として使用した。Ｎ２４Ｓ突然変異体を製造するために使用されたプライマーを表２に報告し、ここで太字は突然変異コドンを示す。下線を付した文字は置換ヌクレオチドを示す。ＰＣＲ反応混合物は、１×反応緩衝液（Ａｇｉｌｅｎｔ）、３００μＭのｄＮＴＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００ｎｇの鋳型、３００ｎＭのプライマー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２．５ＵのＰｆｕ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を含んでいた。反応容量は５０μｌであった。
【表４】
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【表５】
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【００９７】
３．タンパク質過剰発現及び精製
組換えタンパク質の過剰発現を得るために、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｎｓＡ／ａｎｓＢ株を使用した。この菌株は、それぞれ大腸菌内因性Ｉ型及びＩＩ型Ｌ−アスパラギナーゼをコードするａｎｓＡ及びａｎｓＢ遺伝子を欠くように、Ｄｒ．Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｓｃｏｔｔ  Ｍｅｒｒｅｌｌ（米国メリーランド州ベセスダの軍人保健科学大学）によりカスタム設計された。タンパク質の過剰発現は、Ｓｔｕｄｉｅｒ［１２］に従って自己誘導によって得た。細胞抽出物を、２．０ｍｌ／分でＮＡ緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＩｍＯＨ  ｐＨ８．０）中で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ  ５ｍｌカラムに適用した。タンパク質を段階勾配（２５、５０、１００、２５０、５００ｍＭのＩｍＯＨ）を用いて溶出し、５ｍｌの画分を集めた。
【００９８】
画分をＬ−アスパラギナーゼ活性についてチェックし、１２％アクリルアミド／ビス−アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。活性について陽性の画分をプールし、同じ緩衝液中で平衡化した５０ｍｌの脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４に対して透析した。溶出したタンパク質試料を、ＱＡ緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４）中で平衡化した１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＸＬカラムに適用した。フロースルー画分を集め、高塩濃度の溶出緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１ＭのＮａＣｌ  ｐＨ７．４）を用いて結合タンパク質を溶出し、１０ｍｌ画分を集めた。フロースルー画分及び結合画分を、Ｌ−アスパラギナーゼ活性について調べた。アリコートを、１２％アクリルアミド／ビス−アクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。以下の実験には、酵素活性に対して陽性であり、均一性に純粋な画分を使用した。細胞傷害性アッセイに使用されるタンパク質を、５０ｍｌの脱塩カラムを使用してリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、０．０１ＭのＮａ／Ｋ−リン酸緩衝液、０．００２７ＭのＫＣｌ及び０．１３７ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に対して透析した。結晶化に使用されるタンパク質を、同じカラムを使用して０．０３ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して透析した。試料を、５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ中で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＨＲ  １０／３００カラム（ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ）上のＳＥＣによっても分析した。ＳＥＣの前に、適切なカットオフを有する遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して試料を濃縮した。
【００９９】
４．Ｌ−アスパラギナーゼ及びＬ−グルタミナーゼ活性アッセイ
Ｌ−アスパラギナーゼ及びＬ−グルタミナーゼ活性を測定するために、２つの方法を使用した：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＨ）により触媒される共役反応を用いる分光光度法及びネスラー試薬を用いる比色法。
【０１００】
ＧＤＨ共役反応によるアンモニア放出を測定するために使用された標準反応混合物は、０．５ｍｌの最終容量中５０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液ｐＨ７．５、１ｍＭのα−ケトグルタル酸（α−ＫＧ）、０．２４ｍＭのＮＡＤＨ、２０Ｕのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ及び１０ｍＭのＬ  −  Ａｓｎ又は１０ｍＭのＬ−Ｇｌｎを含んでいた。酵素溶液（５〜３００μｇ）を添加することによって反応を開始させ、ＮＡＤＨ消費を、単線分光光度計を用いて３４０ｎｍで監視した。ネスラー試薬を用いたアンモニア測定のための標準プロトコルを、９６ウェルプレート中での分析用に調整した。手短に言えば、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５、０〜１０ｍＭのＬ−Ａｓｎ又は０〜１０ｍＭのＬ−Ｇｌｎ及び５〜３０μｇの酵素溶液を含む溶液を、Ｌ−アスパラギナーゼ活性測定については１５分間又はＬ−グルタミナーゼ活性については３０分間、３７℃でインキュベートした。次いで、氷上で１５分間０．０７５Ｍトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を添加して反応を停止させた。遠心分離（１４０００×ｇ、１５分）後、１０μｌの反応液をネスラー試薬による分析に使用した。製造業者の説明書に従って、ネスラー試薬を１０倍希釈し、９０μｌの作業溶液を１０μｌの反応液に添加し、最終容量を１００μｌとした。全ての場合において、基質からのアンモニアの自然放出によるバックグラウンドノイズを決定するために、酵素を含まない陰性対照を設定した。
【０１０１】
アンモニアの量を決定するために、アンモニア源として硫酸アンモニウム（１０〜０．００５ｍＭ）を使用して標準曲線を設定した。硫酸アンモニウムの各分子は２分子のアンモニアを放出する。
【０１０２】
Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．）用の酵素キネティックモジュール１．１を用いて、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットによって動態パラメータＫｍを決定した。
【０１０３】
ｋｃａｔ又は代謝回転数は、１秒当たりの触媒イベントの数である。Ｋｍは反応速度が最大半分になる基質濃度である。ｋｃａｔ／Ｋｍは、亜飽和（ｓｕｂ−ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ）基質濃度における触媒効率の指標である。
【０１０４】
５．細胞株
実験に使用したヒト急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞を表３に入れる。ＭＯＬＴ−４、ＲＳ４；１１、ＳＤ１及びＲＥＨ細胞に対する実験を、米国カリフォルニア州ロサンゼルス小児病院、サバン研究所の内分泌学及び肥満研究所で行った。
【０１０５】
ヒト急性リンパ芽球性白血病細胞（ＭＯＬＴ−４、ＳＤ１、ＲＥＨ、ＲＳ４；１１）をＲＰＭＩ  １６４０完全培地（１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン）中で増殖させた。細胞を、５％ＣＯ２の存在下、３７℃の加湿インキュベーター中で培養した。
【表６】
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【０１０６】
６．細胞傷害性評価
組換え野生型及びＮ２４Ｓ  ＥｃＡＩＩタンパク質の細胞傷害性を市販のＥｌｓｐａｒ酵素（Ｍｅｄａｃ）の細胞傷害性と比較するために、１×１０５個細胞（すなわち、ＭＯＬＴ４、ＲＳ４；１１、ＲＥＨ、ＳＤ１）を、２００μｌの完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン）に蒔いた。凍結乾燥したＡＳＮａｓｅタンパク質を完全培地に再懸濁し、Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒら［５］に従って各細胞株についてＩＣ５０値に近い最終濃度でウェルに添加した。各実験を３連で行い、異なる日に少なくとも３回繰り返した。
【０１０７】
ウェル内の細胞を粉砕し、チューブ内の１０μｌの細胞試料に２×トリパンブルー溶液を添加することによって、盲検観察者によって７２時間の時点でトリパンブルー排除色素カウントを行った。生細胞のみをカウントした。
【０１０８】
主要プロテアーゼ認識部位を欠くＮ２４Ｓ突然変異体の安定性の改善を評価するために、その長期の細胞傷害効果を評価した。ＳＤ１細胞はＡＳＮａｓｅ不活性化に関与するプロテアーゼを過剰発現するが、ＲＥＨ細胞はしないので、ＳＤ１及びＲＥＨ細胞株を試験のモデル系として選択した。
【０１０９】
１×１０５個細胞を、２４ウェルプレート中の１．５ｍｌの完全培地に蒔いた。細胞を、各細胞株についてＩＣ５０値未満の濃度のＥｃＡＩＩ野生型及びＮ２４Ｓで処理した。特に、０．５Ｕ／ｍｌ及び１Ｕ／ｍｌをそれぞれＳＤ１及びＲＥＨに使用した。細胞生存率をトリパンブルー生細胞排除色素によって７２時間及び１４４時間に測定した。データを、初期プレーティング（ＩＰ）に対する生細胞の百分率として表した。
【０１１０】
データを一元配置分散分析及びテューキー検定によって比較した。０．０５以下のｐ値を有意と見なした。
【０１１１】
７．タンパク質安定性アッセイ
タンパク質安定性をＴ５０値としてアッセイした。各タンパク質のＴ５０を決定するために、リン酸ナトリウム５０ｍＭ  ｐＨ７．４の中の酵素を、サーマルサイクラーを用いて１０分間、様々な温度（３７、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、７０℃）でインキュベートした。インキュベーション後、酵素溶液を氷上で冷却し、酵素活性を前記のようにネスラー法によって測定した。反応混合物は１０ｍＭのＬ−Ａｓｎを含んでいた。Ｔ５０値を、Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔのための温度溶融プロット（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．）を用いて決定する。処理酵素の残存活性を、未処理の試料に対する熱処理試料の百分率として表す。得られたＴ５０値は、タンパク質安定性の良好な指標である：Ｔ５０値が高いほど、タンパク質安定性が高い。
【０１１２】
８．プロテアーゼ感受性試験
コンフルエントなＳＤ１細胞を遠心分離（３５００ｒｐｍ、５分、４℃）によって集め、ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄した細胞ペレットを、１×１０６個細胞：０．１ｍｌ緩衝液比を用いて溶解緩衝液（５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５、５ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁した。細胞を−８０℃で４サイクルの凍結−解凍によって溶解した。細胞溶解物を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分、４℃）によって清澄化し、全タンパク質抽出物をビシンコニン酸アッセイ（ＢＣＡ、Ｐｉｅｒｃｅ）によって定量した。反応混合物最終容量は５０μｌであり、５０ｍＭ酢酸三ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５、５ｍＭ  ＤＴＴ中に１００μｇの細胞溶解物及び４μｇのＡＳＮａｓｅ（すなわち、組換えＥｃＡＩＩ野生型及びＮ２４Ｓ、ならびにＥｌｓｐａｒ）を含んでいた。３７℃で２４時間インキュベートした後、試料にＢｏｌｔ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液（４Ｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＢｏｌｔ（登録商標）試料還元剤（１０Ｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加し、９９℃で５分間煮沸した。プレキャスト勾配４〜１２％ポリアクリルアミドゲル（Ｂｏｌｔ（登録商標）ゲル、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた電気泳動によってタンパク質分離を行った。ｉＢｏｌｔ（登録商標）２装置（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。膜をポンソーレッド染料を用いて染色した。
【０１１３】
９．サーマルシフト
ＭｉｎｉＯｐｔｉｃｏｎリアルタイムシステム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いてサーマルシフトアッセイを行った。ＰＢＳ緩衝液中の試料（０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＣＲチューブ中５０μｌの最終容量で２０×ＳＹＰＲＯオレンジ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した。試料を遠心分離し、２５℃から９５℃まで、１℃又は０．５℃／分で加熱した。蛍光を５１７ｎｍで監視した。生データを、以下の式に従って正規化した：ｆｕ（Ｔ）＝ｆ（Ｔ）−ｆｎ／ｆｄ−ｆｎ［１４］（式中、ｆｕ＝所与の温度（Ｔ）での正規化蛍光、ｆ＝所与の温度（Ｔ）での蛍光、ｆｎ＝蛍光の最小値、ｆｄ：蛍光の最大値）。したがって、値１は完全に折り畳まれていないタンパク質に相当する。得られた曲線から、各タンパク質についてのＴ０．５を外挿した。
【０１１４】
１０．ウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析のために、タンパク質をゲル内からＰＶＤＦ０．２２μｍ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。ブロックした膜を、１：７０００に希釈したＨＲＰ結合抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。
【０１１５】
１１．結晶化
大腸菌ＩＩ型Ｌ−アスパラギナーゼＮ２４Ｓ突然変異体を上記のように精製した。純粋なタンパク質画分を３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して透析し、結晶化に使用した。結晶化の試みは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ（ＭＤ１−０３）の疎行列スクリーニングを使用して行った。シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて、及び等容量の母液と４ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を２μｌの滴で混合することによって、結晶を２１℃で成長させた。元の結晶化条件は、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１０％ｗ／ｖのＰＥＧ８０００、８％ｖ／ｖのエチレングリコールを含んでいた。結晶品質を改善するために、緩衝液ｐＨ及び沈殿剤濃度を変えて条件を最適化した。ナイロンループ上に低温設置し、Ｘ線によって分析される結晶を、母液に溶解した１００μＭのＬ−アスパラギン酸（Ｌ−Ａｓｐ）に１０分間浸漬した。
【０１１６】
１２．構造解明
Ｘ線データをフランスのグルノーブルの欧州シンクトロン研究施設（ＥＳＲＦ）のビームラインＩＤ−２９で収集した［１５］。
【０１１７】
データをＭｏｓｆｌｍ［１６］で積分し、ＳＣＡＬＡ［１７］と融合した。空間群をＰＯＩＮＴＬＥＳＳ［１７］で決定した。構造を、ＰＨＥＮＩＸ−ＭＲによる分子置換［１８］及び大腸菌野生型アスパラギナーゼの構造からのＬ−アスパラギナーゼの密接な二量体（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＥＣＡ）［１９］を検索モデルとして使用することによって解析した。構造の精密化を、ＰＨＥＮＩＸ−ＲＥＦＩＮＥ［１８］を用いて、リガンド及び活性部位フレキシブルループに属する残基（残基８〜３５）を含まない初期モデルから出発して行った。各精密化実験において、明確な電子密度が存在する場所に手動で残渣を添加した。配位子を、ＰＨＥＮＩＸ−ＬＩＧＡＮＤ  ＦＩＴを用いて、また検索モデルとしてＬ−アスパラギン酸を用いて添加した［２０］。
【０１１８】
結果
１．部位特異的突然変異誘発
突然変異Ｎ末端６×Ｈｉｓタグ付き大腸菌ａｎｓＢ遺伝子（すなわち、Ｎ  −  ａｎｓＢ＿Ｎ２４Ｓ）を含むベクターを、標準Ｔ７プライマーを用いてインサート（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）について配列決定した。配列決定後、設計された突然変異を有し、他のいかなるランダム突然変異も有さない構築物を、タンパク質過剰発現のために大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ΔａｎｓＡ／ａｎｓＢ化学的コンピテント細胞に形質転換した。
【０１１９】
２．ＥｃＡＩＩ精製
ＩＭＡＣの後、Ｎタグ付きＥｃＡＩＩ野生型及びＮ２４Ｓタンパク質は、いくつかの汚染物質と共に２５０ｍＭ  ＩｍＯＨに対応する画分に溶出した。プールし、透析した画分（５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４）を１ｍｌのＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＸＬカラムに充填した。タンパク質はフロースルー画分中に溶出したが、他の全ての汚染物質は結合画分内に溶出した。
【０１２０】
均質まで純粋な野生型及びＮ２４Ｓ突然変異体は、それぞれＬ−アスパラギン（Ｌ−Ａｓｎ）に対して１０５±８．１４及び１０３．５±１０．２３Ｕ／ｍｇならびにそれぞれＬ−グルタミン（Ｌ−Ｇｌｎ）に対して０．８９±０．２２及び０．９３±０．２０Ｕ／ｍｇの比活性を有していた。比活性を、ＧＡＤＨ結合法を用いて、基質として１０ｍＭのＬ−Ａｓｎ又はＬ−Ｇｌｎを用いて測定した。
【０１２１】
タンパク質の適切な四量体折り畳みを、５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４中で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＨＲ  １０／３００カラムを使用する分析的ゲル濾過によって評価した。タンパク質は、およそ１３６ｋＤａに相当する１３．４１ｍｌの容量で単一のよく形づくられたピークとして溶出した（データは示さず）。
【０１２２】
３．ＥｃＡＩＩ野生型及びＮ２４Ｓ：動態特性評価
ＥｃＡＩＩ野生型及びＮ２４Ｓ変異体を、Ｌ−Ａｓｎ及びＬ−Ｇｌｎに対するそれらの動態特性について特徴付けた。ネスラー法を使用して酵素ミカエリス定数（Ｋｍ）を決定した。動態パラメータを表４に報告する。ＥｃＡＩＩ動態を決定するために使用されたネスラー法はＶｍａｘ外挿に対して信頼性がないので、各基質に対する酵素の比活性を用いてｋｃａｔ値を計算した。
【０１２３】
野生型酵素及びＮ２４Ｓ突然変異体は、Ｌ−ＡｓｎとＬ−Ｇｌｎの両方に対して双曲線応答を示した。野生型タンパク質について得られた見かけの動態パラメータは、文献に公開されているものと類似している。これらの酵素は、基質としてＬ−ＧｌｎよりもＬ−Ａｓｎに対する強い選択を有し（Ｎ２４Ｓについては×１１１、野生型タンパク質については×１１７）、同様の動的パラメータを有していた。
【表７】
2019535308.tif 000009
【０１２４】
４．ＥｃＡＩＩ野生型及びＮ２４Ｓ突然変異体のタンパク質安定性
ＥｃＡＩＩ野生型の熱安定性を評価するために、均質まで純粋なタンパク質を、５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４中で１０種の様々な温度（範囲、４０〜７０℃）で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、タンパク質を氷上で冷却し、１０ｍＭのＡＳＮの存在下でネスラー法を用いて残存活性を測定した。残存活性を、熱処理した試料対未処理タンパク質の活性の百分率として計算した。１０分のインキュベーション後に活性が未処理試料の半分になる温度として定義される融解温度をＴ５０と決定した。ＥｃＡＩＩは４９±１．３℃に等しいＴ５０値を有し、Ｎ２４Ｓ突然変異体は５９±２．２℃に等しいＴ５０を有していた（図１）。
【０１２５】
＋４℃でのＥｃＡＩＩ野生型安定性は１〜１．５週間であり、Ｎ２４Ｓ突然変異体安定性を９週間及び１年で試験したが、ＳＤＳゲル上で分解は見られなかった。タンパク質の時間依存性分解は酵素活性の喪失をもたらした。
【０１２６】
野生型ＥｃＡＩＩタンパク質及びＮ２４Ｓタンパク質の熱誘導アンフォールディングを、タンパク質の半分が折り畳まれていない状態にある温度（Ｔ０．５）を基準パラメータとして使用する熱シフト分析によって評価した。Ｎ２４Ｓ突然変異体は、野生型タンパク質に関して２．４１℃高いＴ０．５値を有していた（それぞれＴ０．５  ６２．０４±０．１０℃対５９．６３±０．６２℃、図２）。さらに、野生型タンパク質は、折り畳まれていない画分が１２℃で１０％から１００％（７．５％／℃に相当）に増加するにつれて、より速いアンフォールディング動態を有したが、Ｎ２４Ｓ突然変異体は５．３％／℃のアンフォールディング速度というより遅いアンフォールディング速度を有した。野生型の初期アンフォールディング（すなわち５％の折り畳まれていない画分）は５１℃で始まり、Ｎ２４Ｓ突然変異体（５７℃）よりも６℃低い値であった。
【０１２７】
酵素安定性を様々な方法によって評価することができる。ここで本発明者らは、生物学的活性保持（Ｔ５０又は残存活性）の関数として、及びアンフォールディング速度（Ｔ０．５又は熱シフト）として、ＥｃＡＩＩ野生型及びＮ２４Ｓ安定性を分析した。前者の方法は、所与の時間（すなわち、１０分間）様々な温度で酵素を熱処理し、引き続いて氷上で直ちに冷却し、最後に酵素活性を評価することからなる。これは、温度の上昇にさらされたときに酵素がその機能的折り畳みを維持する能力を評価するための良好なパラメータであり、結果として、より高いＴ５０値は酵素機能安定性の良好な指標である。これに関して、ＥｃＡＩＩ  Ｎ２４Ｓは野生型よりも１０℃高いＴ５０値をそれぞれもたらし（それぞれ５９℃対４９℃）、変異体が野生型酵素よりも極端な条件でその機能的折り畳みを維持することができることを示している。Ｎ２４Ｓ変異体のこのような特徴は、患者に薬物として投与した場合に活性が保持される能力の非常に有望な指標である。さらに、酵素残存活性を＋４℃で保存した際に評価した。Ｎ２４Ｓ変異体は野生型タンパク質よりも８倍長い安定性を示し、変異体が生物学的安定性を改善することを確認した。
【０１２８】
野生型及びＮ２４Ｓタンパク質のアンフォールディング速度もサーマルシフトによって評価した。  Ｔ０．５Δ値は、残存活性評価から得られたものよりも低く（Δ、２．４１℃対１０℃）、Ｎ２４Ｓの改善安定性が四量体の安定化よりも活性部位安定化に主に関連することを示している。アスパラギナーゼ活性部位は、特に触媒作用のための必須残基を含む可動構造要素である活性部位のフレキシブルループ（残基３〜２７）の存在のために、タンパク質安定化において本質的な役割を果たす。タンパク質の活性喪失が、単量体分子量よりおよそ３ｋＤａ低い位置にある分解バンドのＳＤＳ  ＰＡＧＥにおける存在に比例するという観察により、この仮説が確認される。さらに、低いバンドはウエスタンブロットにおいて抗Ｈｉｓタグ抗体に対して非反応性となり、６×Ｈｉｓタグと活性部位ループの両方を含むタンパク質Ｎ末端の喪失を示した。
【０１２９】
さらなる確認は構造研究から得られる。Ｘ線分析によって得られた突然変異体Ｎ２４Ｓ構造は、全体的折り畳み（ＲＭＳ  ０．２３２Å、標準ｐｙｍｏｌアラインメントを用いて計算）ならびに界面溶媒和エネルギー（野生型−２９１．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｎ２４Ｓ  −２９０．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）及び溶媒露出面積（野生型１４３６６．０Å、Ｎ２４Ｓ  １４１４８．９Å）に関して野生型と極めて類似となった。野生型と突然変異体四量体アセンブリとの間の有意差が、結合（ΔＧｉｎｔ）及び解離（ΔＧｄｉｓｓ）エネルギーに見られた。特に、Ｎ２４Ｓ  ΔＧｉｎｔは、野生型よりも１０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ低い（すなわち、それぞれ−５０．８対−４０．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）と計算され、ΔＧｄｉｓｓ変動は４．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ（野生型２１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ、Ｎ２４Ｓ  ２６．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であった。全ての計算は、Ｅｍｂｌ−ＥｂｉオープンアクセスソフトウェアＰＩＳＡを使用して行った。
【０１３０】
５．ＥｃＡＩＩ野生型及びＮ２４Ｓ突然変異体細胞傷害性
ＥｃＡＩＩ野生型及びＮ２４Ｓタンパク質のインビトロ抗増殖効果を市販の酵素Ｅｌｓｐａｒ（Ｍｅｄａｃ）と比較するために、４つのＡＬＬモデル細胞株（すなわちＭＯＬＴ−４、ＲＥＨ、ＲＳ４；１１及びＳＤ１）を用いて材料及び方法の節に記載されるように行った。細胞生存率を、未処理試料に対する生存細胞の百分率として表し、Ｐａｒｍｅｎｔｉｅｒら［５］によって記載されるＩＣ５０値に近いＥｃＡＩＩ野生型及びＮ２４Ｓ及びＥｌｓｐａｒ濃度（Ｕ／ｍｌ）を用いて評価した。各細胞株についてのタンパク質濃度及び７２時間での生存細胞の百分率を表５に報告する。
【０１３１】
組換え野生型及びＮ２４Ｓ  ＥｃＡＩＩタンパク質は、ＳＤ１を除く全ての細胞株において市販のＥｌｓｐａｒタンパク質に匹敵する細胞傷害性効果を示した。実際、ＥｃＡＩＩタンパク質は、市販の酵素Ｅｌｓｐａｒと比較して、３．０Ｕ／ｍｌでＳＤ１細胞に対してほぼ４．３０倍高い細胞傷害性効果を有していた。
【０１３２】
長期細胞傷害性も、ＳＤ１及びＲＥＨ細胞株において７２及び１４４時間で評価した。野生型及びＮ２４Ｓ突然変異体は、７２時間でＳＤ１細胞とＲＥＨ細胞の両方に対して同じ細胞傷害性効果を有していた。１４４時間で、ＥｃＡＩＩ変異体Ｎ２４Ｓは、野生型よりもＳＤ１細胞に対して４７．５％高い細胞傷害性を有し、代わりに、野生型と突然変異体の両方がＲＥＨ細胞に対して同じ細胞傷害性を有した（図２Ａ及び図２Ｂ）。
【表８】
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【０１３３】
６．プロテアーゼ感受性試験
野生型及びＮ２４Ｓ  ＥｃＡＩＩ及びＥｌｓｐａｒを、腫瘍放出プロテアーゼに対する感受性を決定するために、ＳＤ１細胞溶解物の存在下３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、試料中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜にブロットした。ポンソーレッド染色後、はっきりした分解バンドが野生型及びＥｌｓｐａｒ試料において明らかであり、これはＮ２４Ｓ試料においては存在しなかった（図４）。実験を４回繰り返し、常に同じ結果が得られた。
【０１３４】
７．貯蔵時の安定性
ＥｃＡＩＩ野生型及びＮ２４Ｓタンパク質の時間依存的分解を電気泳動分離及びウエスタンブロットによって評価した。分解すると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約３０ｋＤａのはっきりした分解バンドを観察することができた（図５Ａ）。四量体の折り畳みが分解時に維持されるかどうかを決定するために、十分に分解されたＥｃＡＩＩのアリコートを未変性ＰＡＧＥによっても分析した。図５Ｂに示されるように、完全に分解されたタンパク質（２レーン）は単一の種として天然条件下で泳動し、新たに精製されたタンパク質（３レーン）に対して減少した分子量を有した。ウエスタンブロット分析（図５Ｃ）は、完全に分解されたタンパク質（２レーン）が、タンパク質Ｎ末端６×Ｈｉｓタグに対する抗Ｈｉｓタグ抗体に反応性でないことを示した。プロテアーゼが存在しないことは、基質としてカゼインを使用し、比色指示薬としてＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ試薬を使用する定性試験によって確認された（データは示さず）。
【０１３５】
８．Ｘ線構造決定
Ｎ２４Ｓ突然変異体の単角柱結晶を１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５％ｗ／ｖのＰＥＧ８０００、４％ｖ／ｖのエチレングリコール中、２１℃で４日後に得た。条件は、良好な寸法で十分に回折する結晶を生成することにおいて再現性が高く、効率的であることとなった。本文に記載される結晶は１．５１Åの分解能で回折した。結晶非対称単位（ＡＳＵ）は、２つの異なる密接な二量体（すなわち、Ａ１／Ｃ１及びＡ２／Ｃ２）を含んでいた；Ｌ−Ａｓｐ産物に対応するはっきりした電子密度がＡＳＵの４つの活性部位全てに存在していた。４つのモノマーのうちの２つ（すなわち、Ａ１及びＣ２）は、活性部位フレキシブルループに属する残基（残基３〜２７）についてはっきりした電子密度を示した一方、残基１５〜２６は、モノマーＡ２及びＣ１において欠けていた。
【０１３６】
２４位のアスパラギンをセリンで置換すると、局所的なＨ結合の再配列が引き起こされる。特に、突然変異型タンパク質では、Ｔｙｒ２５ＮとＳｅｒ２４Ｏγとの間の新たなＨ結合のために、残基Ｔｙｒ２５と近くのモノマーのＡｌａ２８２を結合するＨ結合が失われている（図６）。
【０１３７】
アスパラギン２４をセリンで置換するとプロテアーゼ活性が妨げられ、同じ位置の他の突然変異体について記載されるのと同様の結果が得られる。さらに、アスパラギン側鎖の除去は、水の存在下でアスパラギンに隣接するペプチド結合の自発的な開裂を妨げる可能性があり、これは［２１］に記載されるように貯蔵タンパク質において一般的な望ましくない反応である。
【０１３８】
上記の説明から、本発明によって提供される利点は当業者には直ちに自明であろう。
【０１３９】
特に、開示されるアスパラギナーゼは、既に知られている野生型タンパク質と比較して機能的パラメータを保存することを示した。
【０１４０】
したがって、タンパク質の保存された触媒的及び抗増殖的特性は、長期の細胞傷害性の改善を説明するものであり、そのインビボ有効性に対する確固たる基礎となる。
【０１４１】
しかしながら、同時に、本発明のタンパク質は、培養中及び貯蔵時のはるかに改善された長期安定性を有し、これは療法における薬物の開発及び導入のための有望な特徴となる。
【０１４２】
収集したデータを考慮すると、このタンパク質は、野生型と少なくとも同等又はそれより優れたＩＣ５０値を有すると結論付けることができる。
【０１４３】
上記に加えて、開示されるタンパク質はインビトロデータによるとより少ない腫瘍抵抗性を生じると予想される。
【０１４４】
腫瘍関連プロテアーゼはそれを分解することによって、及び新たな免疫原性エピトープを隠すことによってＡＳＮａｓｅの有効性を大幅に損ない、よって抗体産生及び再発のリスクを高める可能性があるという事実に鑑みて、プロテアーゼ耐性は薬物特性の大きな改善となるので、後者の特徴は極めて重要である。
【０１４５】
研究により、タンパク質分解活性の増大は、腫瘍塊だけでなく腫瘍周囲の細胞にも起因し得ることが明らかにされた。
【０１４６】
癌発生及び腫瘍転移に大きく寄与するタンパク質分解活性の増加が固形腫瘍で観察されている。
【０１４７】
本発明はまた、タンパク質をＰＥＧ化で修飾する可能性も包含する。
【０１４８】
前記化学修飾は、特に熱安定性を含む安定性、及び免疫原性の低下などの、Ｎ２４Ｓ突然変異体の特徴をさらに改善することを可能にし、それが薬物の安全性及び有効性の増強につながる。
【０１４９】
代替アプローチとして、本発明はまた、赤血球への封入によって本発明のタンパク質を搭載するためにＧＲＡＳＰＡ技術を使用する可能性を包含する。
【０１５０】
アスパラギンは、フライの焼成又は１２０℃を超える加熱などの加工中にデンプン系食品に含まれる還元糖と反応し、したがってメイラード反応の生成物としてのアクリルアミドの生成を担うことが知られている（例えば、［２２、２３］参照）。
【０１５１】
種々の食品のフライや焼成の間に高レベルのアクリルアミドが形成されることを示した２００２年にスウェーデンで行われた研究の結果として、アクリルアミドへの食物性曝露に関する懸念が生じた。ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品添加物専門家会議（ＪＥＣＦＡ）は、２００５年にアクリルアミドの安全性を検討し、世界中で行われている進行中の発癌性及び長期神経毒性試験の結果が入手可能になったら、アクリルアミドを再評価すべきこと、及び食品中のアクリルアミド濃度を減少させるための適切な努力を継続すべきであることを勧告した。
【０１５２】
したがって、本発明は食品業界においてもさらなる有用な用途を見出す。
【０１５３】
特に、本発明の酵素は、他の公知の酵素と比較してアクリルアミドを不活性化するのに必要な時間を有利に短縮する。
参考文献：
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配列表：
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【配列表フリーテキスト】
【０１５４】
配列表１  ＜２２３＞プライマー
配列表２  ＜２２３＞アンチセンスプライマー
配列表３  ＜２２３＞センスプライマー構築物Ｎ２４Ｓ
配列表４  ＜２２３＞アンチセンスプライマー構築物Ｎ２４Ｓ
配列表５  ＜２２３＞Ｎ２４Ｓをコードする配列
配列表６  ＜２２３＞配列Ｎ２４Ｓ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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