(57)【要約】  いくつかの治療用抗体の活性は、部分的に、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって媒介される。ＮＦＡＴ応答性レポーター遺伝子の活性化によって標的細胞で発現した特異的抗原に結合した抗体のＦｃ部分のライゲーションに応答する、親和性の低いＦｃ受容体、ＦｃｙＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）を発現する操作されたエフェクター細胞系が記載されている。この細胞系では、操作された標的細胞と一緒にＡＤＣＣアッセイで使用する場合に、ＮＦＡＴにより調節されたレポーター遺伝子を発現する操作されたエフェクター細胞系に対して、改良された感度、改良されたダイナミックレンジ、改良されたヒト血清トレランス及び低減されたインキュベーション時間を付与するＮＦ−ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、及びＳＴＡＴ５に対する結合部位を含有する新規合成キメラプロモーターによって、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）レポーター遺伝子が調節される。標的細胞は、操作されており、治療用抗体によって認識される特異的抗原を一定の高レベルで過剰発現し、特異的薬物標的をコードする遺伝子がゲノム編集によって無効化されている相同な対照細胞が生じた。ＣＤ２０をコードする遺伝子が無効化されており、相同な対照細胞系と一緒に一定レベルのＣＤ２０を過剰発現するように操作されている標的細胞を使用して、高い精度で且つヒト血清からの妨害を最小限として、ＲｉｔｕｘａｎのＡＤＣＣ活性を定量した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下流プロモーターに作動可能に連結したシス作用調節配列を含むポリヌクレオチドであって、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５のうちの１つ又は複数が、前記シス作用調節配列に結合することができる上記ポリヌクレオチド。
【請求項２】
ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、及びＳＴＡＴ５がすべて、前記シス作用調節配列に結合することができることを特徴とする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
プロモーターが、第１のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレーム配列に作動可能に連結している、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
レポーターが、例えば、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質などの酵素である、請求項１から３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１と少なくとも約７０％の配列同一性、例えば、少なくとも約７５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約８０％の配列同一性など、例えば、少なくとも約８５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９０％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９８％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９９％の配列同一性などを有するヌクレオチド配列又は配列番号１と同一のＤＮＡ配列を含む、請求項１から４までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター構築物。
【請求項７】
プラスミド又はウイルスベクターである、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のベクターを含む細胞。
【請求項９】
前記ベクターが、エピソーム性であるか又は前記細胞のゲノムに組み込まれている、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
第１のレポータータンパク質と異なる第２のレポータータンパク質をさらに発現する、請求項８又は９に記載の細胞。
【請求項１１】
ｉ）抗体のＦｃ領域に結合することができる、請求項８から１０までのいずれか一項に記載のエフェクター細胞（Ｅ）；
ｉｉ）標的／抗原が細胞によって発現されないように、前記抗体が特異的である内因性標的／抗原が無効化された（突然変異した）細胞（Ｔ−）；及び
ｉｉｉ）前記抗体が特異的である標的の発現が増強されたか又は過剰発現された標的細胞（Ｔ＋）
を含むキット。
【請求項１２】
ｉｉ）の細胞及び細胞ｉｉｉ）は、ｉｉ）の細胞が、アッセイされる抗体又は薬物によって認識される特異的抗原を発現しないことを除いてすべての点において同一の全く同じ細胞である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
標的／抗原が、ＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲのうちの１つ又は複数である、請求項１１又は１２に記載のキット。
【請求項１４】
２つのバイアルを含み、ｉ）及びｉｉｉ）の細胞が、最適なＥ：Ｔ比で、１つの同じバイアルに存在する、請求項１１から１３までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
ｉ）のエフェクター細胞とｉｉｉ）の標的細胞との間の比（Ｅ：Ｔ比）が、約２４：１から約２：１、又は約６：１、又は約３：１、又は約１．５：１の範囲内である、請求項１１から１４までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６】
治療用抗体で処置した患者由来の臨床試料のｅｘ  ｖｉｖｏでの抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を定量するための方法であって、
ａ）抗体の投与を含む処置を受けている患者から得た試料を、請求項１１  ｉｉｉ）に記載の標的細胞ｉｉｉ）と接触させるステップ、
ｂ）薬物標的が無効化されている、請求項１１  ｉｉ）に記載の細胞ｉｉ）の存在下で得たシグナルを、請求項８から１０までのいずれか一項に記載のエフェクター細胞ｉ）及び請求項１１  ｉｉｉ）に記載の標的細胞ｉｉｉ）の存在下で得たシグナルから減算するステップ、及び
ｃ）ａ）及びｂ）で測定したシグナルの関係に基づいて、ＡＤＣＣ活性を決定するステップであり、式［（Ｅ＋Ｔ＋＋薬物＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋、又は［（Ｅ＋Ｔ＋＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋［式中、（Ｅ）は請求項８から１０までのいずれか一項に記載のエフェクター細胞であり、（Ｔ＋）細胞は請求項１１  ｉｉｉ）に記載の細胞であり、（Ｔ−）は請求項１１  ｉｉ）に記載の細胞であり、ＮＨＳ＝正常なヒト血清試料である］を使用して、血清試料に対する陽性の結果（すなわち、検出可能なＡＤＣＣ活性）は、エフェクター細胞ｉ）及び標的＋＋細胞ｉｉｉ）／エフェクター細胞ｉ）及び標的−／−細胞ｉｉ）に対するシグナルの関係が≧１である場合に存在し、血清試料に対する陰性の結果（すなわち、検出不可能なＡＤＣＣ活性）は、エフェクター細胞ｉ）及び標的＋＋細胞ｉｉｉ）に関する値／エフェクター細胞ｉ）及び標的−／−細胞ｉｉ）に関する値が≦１である場合に存在するステップ
を含む上記方法。
【請求項１７】
ヒト血清の存在下でレポーター遺伝子シグナルの非特異的増加を補うための方法であって、式［（Ｅ＋Ｔ＋＋薬物＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋、又は［（Ｅ＋Ｔ＋＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋［式中、（Ｅ）は請求項８から１０までのいずれか一項に記載のエフェクター細胞であり、（Ｔ＋）細胞は請求項１１  ｉｉｉ）に記載の細胞であり、（Ｔ−）は請求項１１  ｉｉ）に記載の細胞であり、ＮＨＳ＝正常なヒト血清試料である］を使用して、細胞ｉ）、すなわち、請求項８から１０までのいずれか一項に記載の細胞の存在下で得たシグナルを、請求項１６に記載のエフェクター細胞ｉ）及び薬物標的を発現する標的細胞ｉｉｉ）、又はエフェクター細胞ｉ）及び標的陰性細胞ｉｉ）が＞１である場合に、調査下の抗体に特異的なＡＤＣＣ活性に関連しない活性を示す血清試料の存在下で得たシグナルから減算するステップを含む上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）を決定するための方法における新規細胞及びそれらの使用に関する。本発明による細胞は、診断状況で使用することのできるキット又はキットオブパーツにおいて使用することができる。重要なことには、本発明による細胞を使用して、例えば、抗体をベースとする処置の有効性を決定することができる。
【背景技術】
【０００２】
いくつかのモノクローナル抗体の活性が、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によって部分的に媒介されることが周知である。抗体は、腫瘍細胞又は炎症の原因となるリンパ球などの標的細胞の特異的抗原を対象とする。標的細胞に結合すると、エフェクター細胞のＦｃ受容体部分がモノクローナル抗体のＦｃ部分に結合し、それにより、エフェクター細胞によって標的細胞が死滅する。
【０００３】
このようなＡＤＣＣプロセスにおいて抗体の有効性を定量するために、抗体の有効性を決定するためにエフェクター細胞、標的細胞、及び対照標的細胞を使用することが必要である。先行技術では、ヒト対象から内因性エフェクター細胞であるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及び標的細胞を回収し、このような試験においてそれらを使用する。古典的アッセイでは、標的細胞にクロムを負荷することにより、クロムの放出によって細胞の死滅を決定することができる。この方法には多くの不利点があり、例えば、使用される標的細胞をヒト対象から回収しなければならず、したがって、定量に使用される細胞に大きなばらつきが存在する。さらに、この方式では、細胞を得ることが困難であり且つ費用がかかる。例えば、ドナー間にかなりの変動が存在する。さらに、この古典的アッセイにおける陰性対照として、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）に対するＣＤ２０及びトラスツズマブに対するｅｒｂＢ２などの標的受容体を発現しない細胞系が使用されることになる。したがって、例えば、ＣＤ２０を発現しないＴ細胞系が使用されることになる。このような陰性対照標的細胞を使用する不利点は、当然のことながら、細胞が、標的細胞と全く類似しておらず、優れた対照とならないことである。
【０００４】
別の不利点は、これらが長期の長引くアッセイであり、終夜インキュベートしなければならないことが多いことである。ダイナミックレンジは制限されており、感度が良くない。ダイナミックレンジは、最大濃度の薬物と対照及びゼロ（薬物試料なし）での達成可能な最大シグナル間の差である。感度は、少量の抗体によって生じる活性であり、すなわち、検出可能な活性を生じるのに必要な抗体の量が少ないほど、アッセイの感度は高い。別の不利点は、アッセイが不正確である場合が多く、モノクローナル抗体の異なるバリアント間の僅かな差の検出が困難となることである。別の不利点は、アッセイが、血清、特に、成人でおよそ７０ｍｇ／ｍｌのＩｇＧを含有するヒト血清の存在に対して低いトレランスを示すことである。実際に、先行技術のアッセイに関する明細書では、通常、ウシＩｇＧがヒトＦｃγＩＩＩａ受容体に最小限にしか結合しないとしても、ＡＤＣＣアッセイは、ＩｇＧを枯渇させたウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の存在下で実施されることが推奨される（１）。
【０００５】
この標準的定量アッセイに関する１つの改良について、Ｐａｒｅｋｈら（２）に記載されており、修正されて市販されてきた（３）。このアッセイでは、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）レポーター遺伝子の活性化及びルミノメーターにおいて定量することができる発光によって、免疫グロブリンのＦｃ部分のＦｃγＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６）への結合に対して応答するＮＦＡＴ応答性レポーター遺伝子構築物を含有する組換えエフェクター細胞系が生じる。これらのエフェクター細胞は、凍結、解凍及び使用形式で販売される（３）。これが、標準的な溶解アッセイに対して改良されているのは、エフェクター細胞を回収する必要がないが、凍結及び解凍細胞を使用するような、はるかに便利な形式で、いくぶん大きなダイナミックレンジを有するはるかに感度の高い方式で定量することができるＡＤＣＣ機序のサロゲートマーカーを使用するためである。
【０００６】
それにもかかわらず、定量的ＡＤＣＣアッセイをさらに改良するという要望は常に存在する。ヒト血清の存在下でのＡＤＣＣ活性の定量を可能とする、より改良されたダイナミックレンジ、改良された感度、改良された血清トレランス、及び改良された使用し易さを有するアッセイを有することが望ましいであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ＦＬレポーター遺伝子の発現を調節するために使用される合成キメラプロモーター配列を示す図である。
【図２】ＡＤＣＣ遺伝子レポーターアッセイ：ＣＤ１６調節配列を示す図である。
【図３】組換えＡＤＣＣエフェクター細胞系を確立するために使用される分子構築物を示す図である。
【図４】ＣＤ２０ガイドＲＮＡ配列を示す図である。
【図５Ａ】野生型Ｒａｊｉ細胞、Ｒａｊｉ−／−及びＲａｊｉ＋＋／＋＋細胞の細胞表面のＣＤ２０の発現を示す図であり、ＣＤ２０の細胞表面での発現は、倒立蛍光顕微鏡（Ｅｖｏｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）及びＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ＦＡＢ４２２５Ｆ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して可視化した。
【図５Ｂ】フローサイトメトリーを使用して野生型Ｒａｊｉ及びＣＤ２０＋＋Ｒａｊｉ細胞におけるＣＤ２０発現の定量を示す図であり、ＣＤ２０の細胞表面での発現は、フローサイトメトリー及びＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ＦＡＢ４２２５Ｆ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量した。
【図５Ｃ】ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及び野生型（ＷＴ）、ＣＤ２０＋＋又はＣＤ２０−／−標的細胞を使用して決定したリツキシマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。
【図５Ｄ】ｉＬｉｔｅ（登録商標）ＣＤ１６Ｖ又はＦバリアントエフェクター細胞及びＣＤ２０＋＋標的細胞を使用して決定したリツキシマブのＡＤＣＣ活性の比較を示す図である。
【図６Ａ】ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター及びＣＤ２０＋＋標的細胞を使用するリツキシマブのＡＤＣＣ活性の定量：最適なＥ：Ｔ比（ＲＬＵ値）の決定を示す図である。
【図６Ｂ】ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター及びＣＤ２０＋＋標的細胞を使用するリツキシマブのＡＤＣＣ活性の定量：最適なＥ：Ｔ比（誘導倍率）の決定を示す図である。
【図７Ａ】リツキシマブのＡＤＣＣ活性の定量：凍結した使用準備済みの細胞の最適なＥ：Ｔ比（ＲＬＵ値、４時間）の決定を示す図である。
【図７Ｂ】リツキシマブのＡＤＣＣ活性の定量：凍結した使用準備済みの細胞の最適なＥ：Ｔ比（誘導倍率、４時間）の決定を示す図である。
【図８】リツキシマブのＡＤＣＣ活性の定量：凍結した使用準備済みの細胞の最適なＥ：Ｔ比（ウミシイタケ属（Ｒｅｎｉｌｌａ）の発現、４時間）の決定を示す図である。
【図９】異なるバイアルの凍結した使用準備済みの細胞を使用するリツキシマブのＡＤＣＣ活性の定量（誘導倍率、４時間）を示す図である。
【図１０】正常なヒト血清の存在下又は非存在下で、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター及びＣＤ２０＋＋標的細胞：対ＮＦＡＴエフェクター細胞及び野生型Ｒａｊｉ細胞を使用するリツキシマブのＡＤＣＣ活性の定量を示す図である。
【図１１Ａ】正常なヒト血清の存在下又は非存在下で、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞並びにＣＤ２０＋＋及びＣＤ２０−／−標的細胞を使用するリツキシマブのＡＤＣＣ活性の定量を示す図である。
【図１１Ｂ】式：［（Ｅ＋Ｔ＋＋薬物＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋又は［（Ｅ＋Ｔ＋＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋［式中、（Ｅ）＝エフェクター細胞、（Ｔ＋）＝抗原陽性標的細胞、（Ｔ−）＝抗原陰性標的細胞、ＮＨＳ＝正常なヒト血清試料］によって算出した、正常なヒト血清の存在下での、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞並びにＣＤ２０＋＋及びＣＤ２０−／−標的細胞を使用するリツキシマブの正規化したＡＤＣＣ活性を示す図である。正規化したＡＤＣＣ活性を算出する際に使用した測定値は、上記式において、各実体に対して測定したＲＬＵ（相対ルシフェラーゼ単位）である。
【図１２】ｅｒｂＢ２ガイドＲＮＡ配列を示す図である。
【図１３】ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｅｒｂＢ２＋＋ＨＥＫ２９３標的細胞：対ＮＦＡＴエフェクター細胞及びｅｒｂＢ２＋＋ＨＥＫ２９３標的細胞を使用するハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）のＡＤＣＣ活性の定量を示す図である。
【図１４】ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｅｒｂＢ２＋＋ＨＥＫ２９３細胞又はＳＫＢＲ３標的細胞：対ＮＦＡＴエフェクター細胞及びｅｒｂＢ２＋＋ＨＥＫ２９３標的細胞又はＳＫＢＲ３標的細胞を使用するハーセプチンのＡＤＣＣ活性の定量を示す図である。
【図１５Ａ】ハーセプチンのＡＤＣＣ活性の定量：凍結した使用準備済みのｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｅｒｂＢ２＋＋ＨＥＫ２９３標的細胞（ＲＬＵ値、６時間）に対する最適なＥ：Ｔ比の決定を示す図である。
【図１５Ｂ】ハーセプチンのＡＤＣＣ活性の定量：凍結した使用準備済みのｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｅｒｂＢ２＋＋ＨＥＫ２９３標的細胞（誘導倍率、６時間）に対する最適なＥ：Ｔ比の決定を示す図である。
【図１５Ｃ】ハーセプチンのＡＤＣＣ活性の定量：凍結した使用準備済みのｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｅｒｂＢ２  ＨＥＫ２９３標的細胞に対する最適なＥ：Ｔ比（ウミシイタケルシフェラーゼの発現、６時間）の決定を示す図である。
【図１６Ａ】ハーセプチンのＡＤＣＣ活性の定量：凍結した使用準備済みのｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｅｒｂＢ２＋＋ＳＫＢＲ３標的細胞に対する最適なＥ：Ｔ比（ＲＬＵ値、６時間）の決定を示す図である。
【図１６Ｂ】ハーセプチンのＡＤＣＣ活性の定量：凍結した使用準備済みのｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｅｒｂＢ２  ＳＫＢＲ３標的細胞に対する最適なＥ：Ｔ比（誘導倍率、６時間）の決定を示す図である。
【図１７】ヒトＴＮＦαのプロテアーゼ切断部位の部位特異的突然変異誘発を示す図である。
【図１８】ヌクレアーゼベクターＧｅｎｅＡｒｔ  ＣＲＩＳＰＲにクローニングされたガイドＲＮＡ配列を示す図である。
【図１９】ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｍＴＮＦα＋＋標的細胞を使用するレミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）のＡＤＣＣ活性の定量を示す図である。
【図２０Ａ】凍結した使用準備済みのｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｍＴＮＦα＋＋標的細胞を使用するレミケードのＡＤＣＣ活性の定量を示す図である。
【図２０Ｂ】凍結した使用準備済みのｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｍＴＮＦα＋＋標的細胞を使用するレミケードのＡＤＣＣ活性の定量を示す図である。
【図２１】ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びＥＧＦＲ＋＋標的細胞：対ＮＦＡＴエフェクター細胞及びＥＧＦＲ＋＋標的細胞を使用するセツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）のＡＤＣＣ活性の定量を示す図である。
【図２２Ａ】セツキシマブのＡＤＣＣ活性の定量：凍結した使用準備済みのｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びＥＧＦＲ標的細胞に対する最適なＥ：Ｔ比（ＲＬＵ値、６時間）の決定を示す図である。
【図２２Ｂ】セツキシマブのＡＤＣＣ活性の定量：凍結した使用準備済みのｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びＥＧＦＲ標的細胞に対する最適なＥ：Ｔ比（誘導倍率、６時間）の決定を示す図である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、上述の課題を解決し、すなわち、改良された感度、改良されたダイナミックレンジ、ヒト血清の存在に対する改良されたトレランス、及び低減されたインキュベーション時間をもたらすために、先行技術のアッセイのエフェクター細胞の凍結、解凍及び使用の実質的な改良をもたらす。改良された感度は、実質的に改良されたＥＣ５０及びＬＬＯＱ（定量下限）において示される。詳細には、本発明は、感度（ＥＣ５０として測定）又はＬＬＯＱの増加が当技術分野で公知の技術と比較して少なくとも約１０倍である、細胞系及び最終的にはキットにおけるその使用を提供する。結果的に、感度又はＬＬＯＱは、当技術分野で公知の技術と比較して少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍又は少なくとも約１００倍増加する。同様に、本発明は、ダイナミックレンジの増加が当技術分野で公知の技術と比較して少なくとも約１０倍である、細胞系及び最終的にはキットにおけるその使用を提供する。結果的に、ダイナミックレンジは、当技術分野で公知の技術と比較して少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍又は少なくとも約１００倍である。
【０００９】
結果的に、本発明は、下流プロモーターに作動可能に連結したシス作用調節配列を含むポリヌクレオチドであって、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５のうちの１つ又は複数が、前記シス作用調節配列に結合することができる上記ポリヌクレオチドに関する。本発明は、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５のすべてが、前記シス作用調節配列に結合することができる、前記ポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００１０】
プロモーターは、酵素であり得る第１のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレーム配列に作動可能に連結していてもよい。本発明の目的として、例えば、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質などの任意のレポータータンパク質を使用してもよい。
【００１１】
本発明は、ベクター、例えば、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクター構築物にも関する。ベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスベクターなど、当技術分野で公知の任意のタイプのベクターであってもよい。
【００１２】
本発明は、細胞にも関する。特に、本発明は、本発明によるベクターを含む細胞に関する。ベクターは、エピソーム性であっても、又は前記細胞のゲノムに組み込まれていてもよい。細胞は、任意の起源のもの、特に、哺乳動物細胞であってもよい。重要なことには、細胞は、第１のレポータータンパク質と異なる第２のレポータータンパク質をさらに発現してもよい。本発明による細胞は、当技術分野で公知の任意の細胞系のもの、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳＫＢＲ３、又はＨＥＫ２９３細胞のものであってもよい。
【００１３】
本発明は、キット又はキットオブパーツにも関する。キットは、
ｉ）本発明による細胞と；
ｉｉ）抗体が特異的である内因性標的が無効化された（突然変異した）細胞標的細胞と；
ｉｉｉ）抗体が特異的である標的の発現が増強された標的細胞と
を含んでもよい。
【００１４】
本発明による細胞は、ＡＤＣＣ機序においてエフェクター細胞として作用し得る。
【００１５】
一態様では、本発明は、
ｉ）抗体のＦｃ領域に結合することができる、本発明によるエフェクター細胞（Ｅ）と；
ｉｉ）標的／抗原が細胞によって発現されないように、前記抗体が特異的である内因性標的／抗原が無効化され（突然変異し）た細胞（Ｔ−）と；
ｉｉｉ）前記抗体が特異的である標的の発現が増強されたか又は過剰発現された標的細胞（Ｔ＋）と
を含むキットに関する。
【００１６】
本発明のさらなる態様では、ｉｉ）の細胞及び細胞ｉｉｉ）は、ｉｉ）の細胞が、アッセイされる抗体又は薬物によって認識される特異的抗原を発現しないことを除いてすべての点において同一である、全く同じ細胞である。
【００１７】
標的細胞は、任意のタイプの細胞であってもよい。標的細胞は、組換えのものであってもよい。したがって、キットは、抗体が特異的である内因性標的が無効化された（突然変異した）、すなわち、標的／受容体が欠失しているか若しくはそうでなければ非機能的であるか又は問題の抗体に結合する能力を何らかの手段で喪失した、標的細胞を含む。
【００１８】
キットは、同一の標的が増強される標的細胞も含み、すなわち、その結果、標的は過剰発現される。
【００１９】
標的は、原則として、関連する抗体が結合することができる任意の標的であってもよい。一態様では、標的は、ＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲのうちの１つ又は複数であってもよい。
【００２０】
キットは、１つ又は複数のバイアル、例えば、２つ又はそれより多いバイアルなどを含んでもよい。一態様では、キットは、細胞ｉ）の混合物を細胞ｉｉｉ）の混合物と共に含む１つのバイアルを含んでもよい。このような例では、キットは、２つのバイアルを含み、第２のバイアルは、上述のｉｉ）の細胞を含む。したがって、１つの例では、キットは、２つのバイアルを含み、１つのバイアルは、エフェクター細胞ｉ）と、問題の抗体が特異的に増強／過剰発現された標的を有する標的細胞ｉｉ）とを含む。第２のバイアルは、結果的に、標的細胞ｉｉ）を含み、標的は、無効化されたか或いは標的／受容体が欠失されたか若しくはそうでなければ非機能性であってもよく又は問題の抗体に結合する能力を何らかの手段で喪失している。
【００２１】
本発明の一態様では、キットの１つのバイアルは、細胞ｉ）の混合物を細胞ｉｉｉ）の混合物と共に、Ｅ：Ｔ比として本明細書で言及される最適の比で含み、ここで、Ｅは、上記段落の細胞ｉ）（エフェクター細胞）を示す。Ｔは、上記ｉｉｉ）の細胞（標的細胞）を示す。最適なＥ：Ｔ比については、本明細書及び実験部分でさらに記載されている。
【００２２】
本発明によるキット及び方法では、エフェクター細胞ｉ）と標的細胞ｉｉｉ）の間の関係について見出されたのと同じＥ：Ｔ比が、エフェクター細胞ｉ）と標的細胞ｉｉ）に使用される。
【００２３】
本発明は、治療用抗体で処置した患者由来の臨床試料のｅｘ  ｖｉｖｏでのＡＤＣＣ活性を定量するための方法にも関する。
【００２４】
方法は、
ａ）抗体の投与を含む処置を受けている患者から得た試料を、キット及び本発明による標的細胞ｉｉ）と接触させるステップと、
ｂ）細胞ｉ）の存在下で得たシグナルを、細胞ｉ）及び標的細胞ｉｉｉ）の存在下で得たシグナルから減算するステップと、
ｃ）ａ）及びｂ）で測定したシグナルの関係に基づいて、ＡＤＣＣ活性を決定するステップと
を含むことができる。
【００２５】
上述の方法では、血清試料に対する陽性の結果（すなわち、検出可能なＡＤＣＣ活性）は、エフェクター細胞ｉ）及び標的＋＋細胞ｉｉｉ）／エフェクター細胞ｉ）及び標的−／−細胞ｉｉ）に対するシグナルの関係が≧１である場合に存在する。
【００２６】
血清試料に対する陰性の結果（すなわち、検出不可能なＡＤＣＣ活性）は、エフェクター細胞ｉ）及び標的＋＋細胞ｉｉｉ）に関する値／エフェクター細胞ｉ）及び標的−／−細胞ｉｉ）に関する値が≦１である場合に存在する。
【００２７】
一態様では、本発明は、治療用抗体で処置した患者由来の臨床試料のｅｘ  ｖｉｖｏでの抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を定量するための方法であって、
ａ）抗体の投与を含む処置を受けている患者から得た試料を、本発明による標的細胞ｉｉｉ）と接触させるステップと、
ｂ）薬物標的が無効化されている本発明による細胞ｉｉ）の存在下で得たシグナルを、本発明によるエフェクター細胞ｉ）及び本発明による標的細胞ｉｉｉ）の存在下で得たシグナルから減算するステップと、
ｃ）ａ）及びｂ）で測定したシグナルの関係に基づいて、ＡＤＣＣ活性を決定するステップであり、式［（Ｅ＋Ｔ＋＋薬物＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋、又は［（Ｅ＋Ｔ＋＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋［式中、（Ｅ）は本発明によるエフェクター細胞であり、（Ｔ＋）細胞は本発明による細胞であり、（Ｔ−）は本発明による細胞であり、ＮＨＳ＝正常なヒト血清試料である］を使用して、血清試料に対する陽性の結果（すなわち、検出可能なＡＤＣＣ活性）は、エフェクター細胞ｉ）及び標的＋＋細胞ｉｉｉ）／エフェクター細胞ｉ）及び標的−／−細胞ｉｉ）に対するシグナルの関係が≧１である場合に存在し、血清試料に対する陰性の結果（すなわち、検出不可能なＡＤＣＣ活性）は、エフェクター細胞ｉ）及び標的＋＋細胞ｉｉｉ）に関する値／エフェクター細胞ｉ）及び標的−／−細胞ｉｉ）に関する値が≦１である場合に存在するステップと
を含む上記方法に関する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、ヒト血清の存在下でレポーター遺伝子シグナルの非特異的増加を補うための方法であって、式［（Ｅ＋Ｔ＋＋薬物＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋、又は［（Ｅ＋Ｔ＋＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋［式中、（Ｅ）は本発明によるエフェクター細胞であり、（Ｔ＋）細胞は本発明による細胞であり、（Ｔ−）は本発明による細胞であり、ＮＨＳ＝正常なヒト血清試料である］を使用して、細胞ｉ）、すなわち、本発明によるエフェクター細胞の存在下で得たシグナルを、本発明によるエフェクター細胞ｉ）及び薬物標的を発現する標的細胞ｉｉｉ）、又はエフェクター細胞ｉ）及び標的陰性細胞ｉｉが＞１である場合に、調査下の抗体に特異的なＡＤＣＣ活性に関連しない活性を示す血清試料の存在下で得たシグナルから減算するステップを含む上記方法に関する。
【００２９】
前述のシグナルは、任意の適切なリードアウトであってもよく、ルシフェラーゼの場合には、シグナルは、相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として表現されてもよく、結果的に、血清試料に対する陽性の結果（すなわち、検出可能なＡＤＣＣ活性）は、エフェクター細胞ｉ）及び標的＋＋細胞ｉｉｉ）に関するＲＬＵ値／エフェクター細胞ｉ）及び標的−／−細胞ｉｉ）に関するＲＬＵ値が≧１である場合に存在する。血清試料に対する陰性の結果（すなわち、検出不可能なＡＤＣＣ活性）は、エフェクター細胞ｉ）及び標的＋＋細胞ｉｉｉ）に関するＲＬＵ値／エフェクター細胞ｉ）及び標的−／−細胞ｉｉ）に関するＲＬＵ値が≦１である場合に存在する。
【００３０】
したがって、上記方法は、エフェクター細胞ｉ）及び標的陰性細胞ｉｉ）が＞１である場合に、調査下の抗体に特異的なＡＤＣＣ活性に関連しない活性を示す血清試料を排除するための方法も可能とする。
【００３１】
上記値を算出するために使用される式は、
［（Ｅ＋Ｔ＋＋薬物＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋      （Ｉ）
又は
［（Ｅ＋Ｔ＋＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋      （ＩＩ）
である
［式中、（Ｅ）＝エフェクター細胞、（Ｔ＋）＝抗原陽性標的細胞、（Ｔ−）＝抗原陰性標的細胞、及び「ＮＨＳ」＝正常なヒト血清試料］。「薬物」は、薬物と標的細胞の存在下で必要とされるＮＨＳの存在下でのＡＤＣＣ活性の測定値を示す。計算を実施する際に使用される測定値は、上記式の各実体に対して測定されたＲＬＵ（相対ルシフェラーゼ単位又はより一般的には使用した酵素に応じた相対発光単位）である。第１の方程式／式（Ｉ）は、例えば、ヒト血清の試料中の中和抗体の定量に関するものであり、第２の方程式／式（ＩＩ）は、ヒト血清における薬物の効能（活性）の定量に関するものである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
これらの特徴は、組換えエフェクター細胞に、ＮＦ−ＡＴだけではなく、例えば、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、及びＳＴＡＴ５などの他の転写因子（３〜５）にも応答するレポーター遺伝子構築物がトランスフェクトされる、本発明によって得られる。組換えエフェクター細胞を、ＮＦＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、及びＳＴＡＴ５を認識するレポーター遺伝子構築物と共に使用することによって、上述の利点が得られる。
【００３３】
好ましい実施形態では、アッセイの正規化をもたらすために、組換えエフェクター細胞は、レポーター遺伝子構築物において使用されるものと異なる、ルシフェラーゼの構成的生成に関する構築物をさらに有する。例えば、レポーター遺伝子構築物がホタルルシフェラーゼを生成する場合、構成的生成は、例えば、ウミシイタケルシフェラーゼなど、第２のルシフェラーゼのものであってもよい。第２のルシフェラーゼの活性に対して正規化した第１のルシフェラーゼの活性は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０１８９６５８号に記載されている。アッセイを行う場合、レポーター遺伝子のルシフェラーゼが測定された後、次いで、試薬を添加して、その特定のルシフェラーゼをクエンチし、その結果、任意の以下の読み出しは、構成的構築物由来のルシフェラーゼをまさに読み出すこととなり、次いで、実施例でより詳細に説明されるように、正規化のために使用されてもよい。
【００３４】
任意のルシフェラーゼの構成的発現を使用する利点は、結果が、エフェクター細胞の損失によって若しくはエフェクター細胞の標的細胞による死滅によって影響を受けず、又は血清マトリックスの作用によって影響を受けた結果でもないことである。これらのすべては、他の（第２の）ルシフェラーゼの構成的発現の測定値の使用によって得られる正規化によって補うことができる。これらの利点はいずれも、このような正規化を使用しない先行技術のアッセイの手順では得ることができない。
【００３５】
先行技術のアッセイに対する本発明のさらなる改良は、対照実験において使用するための組換え標的細胞の使用である。先行技術のアッセイには、野生型の標的細胞のみが使用され、陽性対照としての組換え、及び陰性対照としての、抗体が特異的である抗原を構成的に発現しない天然の細胞は使用されない。例えば、ＣＤ２０アッセイでは、陰性対照として、ＣＤ２０を構成的に発現しないＴ細胞が使用される。陽性対照では、野生型Ｂ細胞が、標的として使用される。本発明の好ましい実施形態では、標的細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで測定されるのと同じタイプであるが、一方で、無効化された、抗体が特異的である抗原（陰性対照）又は他方で、その発現が増強された抗原（陽性対照）を有する標的細胞から生成される。
【００３６】
抗体が特異的である抗原が無効化されている組換え標的細胞を使用することによって、Ｔ細胞が天然の標的細胞と非常に異なるため、非常に改良された陰性対照を有し、これらの差は、結果に何らかの影響を及ぼす。例えば、標的細胞の数が増加すると、異種のエフェクター細胞（Ｅ）と標的細胞（Ｔ）の比（Ｅ：Ｔ比）が変化するため、Ｅ：Ｔ比曲線が完全にゼロとなることを妨げることができる。この問題は、モノクローナル抗体によって認識される特異的抗原をコードする遺伝子が無効化されている組換え標的細胞を使用することによって解決される。
【００３７】
本発明のさらに好ましい実施形態では、抗体が特異的である抗原の発現が増強された組換え標的細胞も提供される。標的抗原の非常に強い発現を有する陽性対照を有することによって、対照アッセイにおいて非常に大きなダイナミックレンジを得ることができる。さらに、特異的抗原は、一定の高レベルで発現され、細胞が増殖するにしたがって、又は野生型細胞の場合のように、培養条件の関数として変化せず、したがって、アッセイ精度の改良をもたらす。このことにより、決定される候補抗体のＡＤＣＣ活性の微妙な差の検出が可能となる。組換え標的細胞の別の利点は、それらを、ヒト対象由来の標的細胞の回収若しくは培養又は実験室での標的細胞系の培養のいずれかよりも非常に使用が容易な凍結、解凍及び使用形式で提供することができることである。このような野生型細胞は、成熟段階、細胞周期の相又は培養条件に応じて目的の抗原の可変性発現を有することになるため、このような組換え細胞を使用することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した正常な個体又は細胞から得た標的細胞に本来存在するであろう変異性が回避される。組換え陽性対照の使用により、この変異性が排除される。
【００３８】
特異的薬物標的を過剰発現する標的細胞、及び薬物標的がゲノム編集を使用して特異的に無効化されている相同な対照細胞のアベイラビリティによって、ＡＤＣＣアッセイがヒト血清の存在下で行われる際に観察されるＦＬ（ホタルルシフェラーゼ）シグナルの非特異的増加を補うための手段が提供される。したがって、所与の薬物濃度においてエフェクター細胞及び陰性−／−標的細胞の存在下で得たシグナルは、例２のＣＤ２０＋＋及びＣＤ２０−／−標的細胞並びにリツキシマブ、さらには例４のインフリキシマブ、アダリムマブ、並びにエタネルセプトに関して示されるのと同じ薬物濃度においてエフェクター細胞及び陽性＋＋標的細胞の存在下で実測されるシグナルから減算することができる。
【００３９】
本発明のさらに好ましい特徴は、顧客がしなければならないことのすべてが、所望の濃度の薬物を添加し、インキュベートし、読み出しを行うことであるように、リツキシマブなどの特定のモノクローナル抗体に対して最適なＥ：Ｔ比で、エフェクター細胞と標的細胞の両方を含有する単一の凍結バイアルを含む、解凍及び使用形式である。特定のモノクローナル抗体に対して最適なＥ：Ｔ比で、エフェクター細胞と陰性対照標的細胞の両方を含有す単一の凍結バイアルも供給される。結果的に、本発明によれば、Ｅ：Ｔ比は、約２４：１から約１：１の範囲内である。好ましくは、比は、例えば、約２４：１から約２：１、又は約６：１、又は約３：１、又は約１．５：１、又は約１：１である。このような形式により、最適なＥ：Ｔ比及び特定のモノクローナル抗体に対する他のアッセイパラメータを決定するためのユーザー又はキット若しくは方法に対する必要性を取り除く。
【００４０】
本発明のさらに好ましい特徴は、インフリキシマブ又は任意の他の抗ＴＮＦアルファ抗体若しくはＦｃ融合タンパク質、例えば、ＥｎｂｒｅｌなどのＡＤＣＣ活性の評価のためのアッセイに特異的である。
【００４１】
ＴＮＦαアンタゴニストのＡＤＣＣ活性の定量には、膜結合型ＴＮＦαを発現する標的細胞を必要とする。ＴＮＦαは、最初に膜結合するが、次に、ＡＤＡＭ１７（ＴＡＣＥ）プロテアーゼによって切断される。したがって、膜結合型の、非切断性ＴＮＦαを発現する細胞系を確立するために、部位特異的突然変異誘発を使用して、プロテアーゼ切断部位を突然変異させた。しかし、細胞表面に発現した非切断性ＴＮＦαは、隣接細胞の表面に存在するＴＮＦαＲＩＩ受容体に結合し、細胞死をもたらし、永続的な細胞系の確立を困難にすることになる。したがって、又はこのような困難を取り除くために、ＴＮＦαＲＩＩ受容体を、ゲノム編集を使用して無効化した。
【００４２】
陰性対照では、相同な標的細胞におけるＴＮＦα発現が、ＴＮＦαＲＩＩ受容体を除いて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を使用して無効化された。
【００４３】
ＨＥＲ２受容体を対象とする抗体では、陽性対照が、標的細胞にＥＲＢＢ２を発現する構築物をトランスフェクトすることによって作成される。
【００４４】
本発明の別の特徴は、ホタルのレポーター遺伝子の発現を調節するキメラプロモーターにおいて使用される調節配列である。この目的のために、特異性の喪失を導く関連のない転写因子に対する結合部位を含有する可能性のあるネイティブプロモーターを使用せず、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、及びＳＴＡＴ５に対する結合部位を保有する調節配列を設計することが好ましく、その結果、関連のない転写因子に対する結合部位をリンカー配列に作成することなく、これらの転写因子がレポーター遺伝子構築物に結合し、レポーター遺伝子構築物を活性化することになる。
【００４５】
これらの特異的転写因子がプロモーターを活性化するのを可能とする配列は、重要である。したがって、本発明において使用する配列は、本発明の新規実施形態である。結果的に、本発明は、配列番号１：
ＧＧＡＡＧＣＧＡＡＡ  ＡＴＧＡＡＡＴＴＧＡ  ＣＴＧＧＧＡＣＴＴＴ  ＣＣＧＧＡＧＧＡＡＡ  ＡＡＣＴＧＴＴＴＣＡ  ＴＡＣＡＧＡＡＧＧＣ  ＧＴＧＧＡＴＧＴＣＣ  ＡＴＡＴＴＡＧＧＡＴ  ＧＡＧＴＣＡＧＴＧＡ  ＣＧＴＣＡＧＡＧＣＣ  ＴＧＡＴＴＴＣＣＣＣ  ＧＡＡＡＴＧＡＴＧＡ  ＧＣＴＡＧ
と少なくとも約７０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列に関する。
【００４６】
さらに、本発明は、配列番号１と少なくとも約７５％の配列同一性、例えば、８０％の配列同一性など、例えば、約８５％など、例えば、約９０％など、例えば、約９５％など、例えば、約９８％など、例えば、約９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列又は配列番号１と同一のＤＮＡ配列に関する。
【００４７】
定義
本明細書で互換的に使用される用語「無効化された」又は「突然変異した」は、特定の遺伝子をノックアウトして、最終的に、細胞の表現型を変化させることを意味する。事実上、この用語は、遺伝子を非機能性にすることを包含することを意味する。例は、表面細胞受容体の発現を除去するある特定の遺伝子の無効化であり得る。
【００４８】
「＋＋細胞」に関する用語「＋＋」は、抗原／受容体が過剰発現している標的細胞を意味することを意図する。この用語は、本明細書において、「Ｔ＋」と互換的に使用される。さらに、この表現が、受容体又は抗原と一緒に使用される場合、例えば、ＣＤ２０＋＋などは、ＣＤ２０が、問題の細胞で過剰発現していることを意味することを意図する。本発明の範囲を制限することを意図しない例として、ＣＤ２０の場合には、発現レベルが、野生型ＣＤ２０＋Ｒａｊｉ細胞に対して、ＣＤ２０＋＋標的細胞で１６倍程増加する。
【００４９】
「−／−細胞」に関する用語「−／−」は、抗原／受容体が発現していない、すなわち、関連する遺伝子がノックアウトされ（無効化され）ており、問題の抗原／受容体の発現を弱める標的細胞を意味することを意図する。この用語は、本明細書において、「Ｔ−」と互換的に使用される。結果的に、特異的抗原をコードする遺伝子が非機能性となっているため、細胞は、抗体によって認識される、検出可能なレベルの特異的抗原をもはや発現しない。本発明と関連して、これは、対照標的細胞と考えられる場合もある。
【００５０】
用語「Ｅ」は、「エフェクター細胞」、特に、本発明による「エフェクター細胞」を意味することを意図する。用語「エフェクター細胞」は、刺激に対して能動的に応答し、いくらかの変化に作用する（いくらかの変化をもたらす）任意のタイプの任意の細胞を意味することを意図する。このような例の１つは、サイトカイン誘導キラー細胞、腫瘍細胞を溶解することが可能な増殖性の強い細胞傷害性エフェクター細胞である。さらなる例では及び本発明と関連して、エフェクター細胞は、抗体のＦｃ領域に結合する前記細胞の表面に、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ又はＦＣＧＲ）を有する任意の細胞であって、抗体自体が標的細胞に特異的に結合することが可能な細胞を意味することを意図する。
【００５１】
用語「Ｔ」は、「標的細胞」、すなわち、特異的ホルモン、抗原、抗体、抗生物質、感作Ｔ細胞、又は他の物質と反応する特異的受容体／抗原を有する任意の細胞を意味することを意図する。これと関連して、用語「（Ｔ＋）」は、抗原陽性標的細胞、及び結果的に、その表面に抗原を発現し、抗体の結合を可能とする細胞を意味することを意図する。対照的に、用語「（Ｔ−）」は、抗原陰性標的細胞（対照標的細胞）、及び結果的に、その表面に抗原を発現せず、したがって、抗体と反応することができない細胞を意味することを意図する。言い換えるなら、抗原−／−細胞（又はＴ−細胞）は、特定の抗原をコードする遺伝子が非機能性となっているため、ＡＤＣＣ活性について試験される、抗体によって認識される検出可能なレベルの特異的抗原を発現しない。具体的には、本発明により使用される標的細胞は、通常、Ｔ＋細胞として１つの細胞型を用い、Ｔ−細胞として別の細胞型を用いる公知の方法と対照的である、同じタイプの細胞である。言い換えれば、アッセイされる抗体によって認識される特異的抗原を発現しないことを除いて、抗原陽性標的（Ｔ＋）細胞とすべての点で同一な、まさに同じ細胞である相同な対照標的細胞である。上述のように、これは、例えば、ＣＤ２０発現Ｂ細胞標的細胞を使用する、リツキシマブ活性の定量のための対照標的細胞として使用されることが多い、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）の使用と対照的である。
【００５２】
用語「ＮＨＳ」は、例えば、生体試料における正常なヒト血清を意味することを意図する。
【実施例】
【００５３】
（例１）
操作されたエフェクター細胞系の確立
ＦｃγＲＩＩＩａ受容体（ＣＤ１６）のライゲーションに対して最適に応答するレポーター−遺伝子構築物を確立するために、異なるスペーシング配列と共に、ＮＦＡＴ、ＮＦｋＢ、ＡＰ１、ＣＲＥＢ、及びＳＴＡＴ認識配列（４〜６）のバリアントからなる一連の構築物をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで開発した。これらの構築物に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、ヒトＴ細胞系Ｊｕｒｋａｔを使用して、インターフェロンアルファ及びガンマ（１００ＩＵ／ｍｌ）、ＴＮＦα（１００ｎｇ／ｍｌ）、ジブチリルｃＡＭＰ（１００μＭ）、ロノマイシン（５００ｍＭ）、及びＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）の単独又は組合せによる誘導の後、最小ＳＶ４０プロモーターからホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）レポーター遺伝子の転写を駆動するそれらの能力について、一過性トランスフェクション実験において試験した。次いで、これらの機能的レポーター遺伝子構築物を、１：１の比のＪｕｒｋａｔ及びＲａｊｉ細胞並びにリツキシマブ（５００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＡＤＣＣ反応において試験した。これらの実験の結果を使用して、ＦＬレポーター遺伝子構築物（図２）の発現を調節するために使用される合成キメラプロモーター配列（図１）を設計した。次いで、薬物に誘導されるＦＬ活性がＲＬの構成的発現に関して正規化されるのを可能とする構成的プロモーターの制御下で、ＦＬレポーター遺伝子構築物、ＦｃＲγＩＩＩａ（ｖバリアント）に対する発現ベクター、及びウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）レポーター遺伝子を、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞に順次トランスフェクトした（図３）。安定なクローンを単離し、所与の治療用抗体及び適当な標的細胞の存在下で、ＡＤＣＣ活性について特徴付けた。適切なクローンを単離し、特徴付け、次いで、サブクローニングし、特徴付け、増殖させて、クローンのｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞系をもたらした。
【００５４】
（例２．１）
細胞表面で高い一定レベルのＣＤ２０を発現する操作された標的細胞系の確立
ＣＤ２０をコードする遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集（７）を使用して、Ｂ細胞系Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−８６）において無効化した。簡潔には、ガイドＲＮＡ配列（図４）を設計し、合成し、Ｃａｓ９二重鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼをＣＤ２０遺伝子のエクソン１内の特異的部位にガイドして、ＣＤ２０−／−Ｒａｊｉ細胞を単離するために、ヌクレアーゼベクターＧｅｎｅＡｒｔ  ＣＲＩＳＰＲ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カタログ番号：Ａ２１１７４）にクローニングした（図５）。
【００５５】
次いで、ＣＤ２０−／−Ｒａｊｉ細胞に、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、ＣＤ２０発現ベクター（ｐＵＮＯ１−ＣＤ２０）をトランスフェクトした。蛍光活性化細胞選別及びＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ＦＡＢ４２２５Ｆ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して陽性クローンを濃縮した。安定なクローンを単離し、エフェクター細胞及びリツキシマブの存在下でＡＤＣＣ活性について特徴付け、次いで、サブクローニングした。適切なサブクローンを単離し、特徴付け、増殖させて、ＣＤ２０＋＋標的細胞系をもたらした（図５）。
【００５６】
（例２．２）
最適なＥ：Ｔ比の確立
様々な濃度のｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞（Ｅ）を、様々な濃度のＣＤ２０＋＋標的細胞（Ｔ）とインキュベートして、リツキシマブのＡＤＣＣ活性の定量のために最適なエフェクター標的細胞比（Ｅ：Ｔ）を決定した（図６Ａ及び６Ｂ）。培養物中のエフェクター細胞及びＲＡＶ２．１Ｓ８標的細胞に対する最適なＥ：Ｔ比は、容易に測定可能なレベルのＦＬ活性を与える（図６Ａ）一方、同時に、濃度の増加するリツキシマブの存在下で、エフェクター細胞及び標的細胞の４時間のインキュベーション後に、最適なダイナミックレンジをもたらす（図６Ｂ）、３：１であることが判明した。
【００５７】
ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞のバイアルとＣＤ２０＋＋標的細胞のバイアルを、標準的技法を使用して別々に凍結させた。解凍する際に、エフェクター細胞と標的細胞を、２４：１から２：１の範囲のＥ：Ｔ比で混合し、ＲＰＭＩ  １６４０培養培地及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で、濃度の増加するリツキシマブの存在下で、９６ウェルの白色面を有するマイクロタイタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ６００５１８１）中で４時間インキュベートした。次いで、ＦＬ活性を、Ｄｕａｌ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ２２９２０）というデュアルルシフェラーゼ基質を使用して決定し、発光をルミノメーター（ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ）で定量し、相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として表現した。結果を、図６及び７に示すように、４つのパラメトリックロジスティック（４ＰＬ）プロットの形態で表す。図６及び７に関連付けた表は、異なるＥ：Ｔ比のｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びＣＤ２０＋＋標的細胞に対する主要な４ＰＬパラメータを概説する（図６及び７）。Ｅ：Ｔ比３：１が、エフェクター及び標的細胞の４時間のインキュベーション後に最適であることが判明した（図６及び７）。発現レベルは、Ｅ：Ｔ比の関数として増加しなかったため（図８）、正規化遺伝子として使用することができる。さらに、治療用抗体のＡＤＣＣ活性を定量する便利で費用効果的な手段を提供することに対して、凍結した使用準備済みのエフェクター及び標的細胞はまた、４ＰＬプロットの主要なパラメータを示す図９及び関連付けた表で例証するように、バイアル間及びロット間での変動度合いが低い、精度が高く、再現性の高いアッセイの確立の基礎を提供する。
【００５８】
（例２．３）
ヒト血清の存在下でのリツキシマブのＡＤＣＣ活性の定量
ＡＤＣＣアッセイにおいてヒト血清が存在することは、ヒト血清中に存在するＩｇＧの標的細胞表面への非特異的結合による、治療用抗体の非存在下でのエフェクター細胞のレポーター遺伝子活性の濃度依存的増加をもたらす。特異的薬物標的がゲノム編集によって無効化されている相同な標的細胞のアベイラビリティによって、同じ濃度のヒト血清の存在下で特異的薬物標的を発現する相同な細胞に関して実測したものから減算することができる、標的陰性細胞及び所与の濃度のヒト血清の存在下での非特異的活性のレベルを推定する手段が提供される。ヒト血清の標的細胞との非特異的相互作用は、治療用抗体と特異的標的細胞との相互作用に関して観測した４ＰＬ曲線の傾きを有意に変化させない低い親和性のものである（図１０及び関連付けた表）。
【００５９】
ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞のバイアルとＣＤ２０＋＋標的細胞のバイアルを解凍し、エフェクター細胞と標的細胞をＥ：Ｔ比３：１で混合し、正常なヒト血清（ＮＨＳ）のプールの最終的に１／２０の希釈の有無のいずれかで、ＲＰＭＩ  １６４０培養培地及び１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で、濃度の増加するリツキシマブの存在下で、９６ウェルの白色面を有するマイクロタイタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ６００５１８１）中で４時間インキュベートした。次いで、ＦＬ活性を、Ｄｕａｌ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ２２９２０）というデュアルルシフェラーゼ基質を使用して決定し、発光をルミノメーター（ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ）で定量し、相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として表現した。結果を、図１０に示すように、４つのパラメトリックロジスティック（４ＰＬ）プロットの形態で表す。図１０に関連付けた表は、正常なヒト血清の存在下及び非存在下で、ｉＬｉｔｅ（登録商標）／ＣＤ２０＋＋及びＮＦＡＴ／ＷＴ  Ｒａｊｉアッセイの両方に対する主要な４ＰＬパラメータを概説する。エフェクター細胞及びＣＤ２０＋＋標的細胞の応答（リツキシマブを含まない対照試料に対する誘導倍率として表される）は、図１０に示すように、ＮＦＡＴエフェクター細胞と野生型ＣＤ２０＋Ｒａｊｉ細胞のものより有意に大きいことが判明した。したがって、ヒト血清の非存在下で、ＮＦＡＴエフェクター細胞及びＷＴ  Ｒａｊｉ細胞に関するおよそ１０倍に対して、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びＣＤ２０＋＋標的細胞に関しておよそ１５０倍のダイナミックレンジが得られた。アッセイのＥＣ５０は、ヒト血清の非存在下で、ＮＦＡＴ／ＷＴ  Ｒａｊｉ細胞アッセイに対する１．２μｇ／ｍｌと比較して、およそ２．０ｎｇ／ｍｌであった。ｉＬｉｔｅ（登録商標）／ＣＤ２０＋＋アッセイの応答はまた、ＮＦＡＴ／ＷＴ  Ｒａｊｉアッセイと比較して、ヒト血清の存在によって著しく及ぼされる影響が少なかった（図１０）。濃度の増加するリツキシマブの存在に対して、Ｅ：Ｔ比３：１におけるｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞とＲａｊｉ−／−標的細胞の応答は、図１０に示すように、リツキシマブを含まない対照試料の応答と有意に異ならなかった。
【００６０】
所与の濃度のヒト血清の存在下でレポーター遺伝子の非特異的活性を補うために、式［（Ｅ＋Ｔ＋＋薬物＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋、又は［（Ｅ＋Ｔ＋＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋［式中、（Ｅ）＝エフェクター細胞、（Ｔ＋）＝抗原陽性標的細胞、（Ｔ−）＝抗原陰性標的細胞、ＮＨＳ＝正常なヒト血清試料］に従って、所与のリツキシマブ濃度においてＣＤ２０−／−陰性標的細胞の存在下で実測したエフェクター細胞シグナルを、同じリツキシマブ濃度においてエフェクター細胞及びＣＤ２０＋＋標的細胞の存在下で実測したシグナルから減算して、リツキシマブのＡＤＣＣ活性に対する正規化した薬物応答曲線を得た（図１１Ａ及び１１Ｂ）。
【００６１】
別々に凍結したエフェクター及び標的細胞と同じ条件下で、解凍及びリツキシマブと共にインキュベートした場合、最適なＥ：Ｔ比が３：１の単一のバイアル中で、一緒に凍結したエフェクター細胞及び標的細胞は、別々に凍結した細胞に関して得られたものと同様の結果を与え、したがって、かなりの時間の節約を付与するより便利な形式を提供する。
【００６２】
（例３）
細胞表面で高い一定レベルのｅｒｂＢ２を発現する操作された標的細胞系の確立
ｅｒｂＢ２をコードする遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集（７）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３）及びＳＫＢＲ３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−３０）中で無効化した。簡潔には、ガイドＲＮＡ配列（図１２）を設計し、合成し、Ｃａｓ９二重鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼをＥＲＢＢ２遺伝子のエクソン６内の特異的部位にガイドして、ｅｒｂＢ２−／−ＨＥＫ２９３細胞及びｅｒｂＢ２−／−ＳＫＢＲ３細胞を単離するために、ヌクレアーゼベクターＧｅｎｅＡｒｔ  ＣＲＩＳＰＲ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、：Ａ２１１７４）にクローニングした。
【００６３】
次いで、ＨＥＫ２９３−／−細胞及びＳＫＢＲ３−／−細胞に、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、ＥＲＢＢ２発現ベクター（ｐＵＮＯ１−ＥＲＢＢ２）をトランスフェクトした。陽性のクローンを、蛍光活性化細胞選別及びＦＩＴＣ標識抗ｅｒｂＢ２モノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ３１８９１）を使用して濃縮した。安定なクローンを単離し、
ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びハーセプチンの存在下でＡＤＣＣ活性について特徴付け、次いで、サブクローニングした。適切なサブクローンを単離し、特徴付け、増殖させて、ｅｒｂＢ２＋＋ＫＥＫ２９３及びｅｒｂＢ２＋＋ＳＫＢＲ３標的細胞系をもたらした。
【００６４】
ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｅｒｂＢ２＋＋ＨＥＫ２９３標的細胞の応答（ハーセプチンを含まない対照試料に対する誘導倍率として表される）は、ＮＦＡＴエフェクター細胞及び野生型ＳＫＢＲ３標的細胞のものより有意に大きいことが判明した（図１３）。ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及び野生型ＳＫＢＲ３標的細胞の応答は、ｅｒｂＢ２  ＨＥＫ２９３＋＋標的細胞に関して実測したものよりも少ないが、それにもかかわらず、ＮＦＡＴエフェクター細胞と野生型ＳＫＢＲ３標的細胞に関して実測したものよりは有意に大きかった（図１４）。ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｅｒｂＢ２−／−標的細胞の応答は、ｅｒｂＢ２＋＋標的細胞に対して使用したものと同じＥ：Ｔ比で、濃度の増加するハーセプチンの存在に対して、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎを含まない対照試料の応答と有意に異ならなかった。
【００６５】
ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞のバイアル並びにｅｒｂＢ２＋＋ＨＥＫ２９３及びｅｒｂＢ２＋＋ＳＫＢＲ３標的細胞のバイアルを、標準的技法を使用して別々に凍結させた。解凍する際に、エフェクター細胞及び標的細胞を、２４：１から２：１の範囲のＥ：Ｔ比で混合し、ＲＰＭＩ  １６４０培養培地及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で、濃度の増加するハーセプチンの存在下で、９６ウェルの白色面を有するマイクロタイタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ６００５１８１）中で６時間インキュベートした。次いで、ＦＬ活性を、デュアルルシフェラーゼ基質を使用して決定し、発光をルミノメーター（ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ）で定量し、相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として表現した。結果を、図１５Ａ及び１５Ｂに示すように、４つのパラメトリックロジスティック（４ＰＬ）プロットの形態で表す。図１５Ａに関連付けた表は、異なるＥ：Ｔ比のｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｅｒｂＢ２＋＋ＨＥＫ２９３標的細胞に対する主要な４ＰＬパラメータを概説し、図１６Ａ及び１６Ｂ並びに関連付けた表は、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｅｒｂＢ２＋＋ＳＫＢＲ３標的細胞に関して実測したデータを示す。Ｅ：Ｔ比１．５：１が、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター並びにＨＥＫ２９３  ｅｒｂＢ２＋＋標的細胞（図１５Ａ及び１５Ｂ）及びＳＫＢＲ３  ｅｒｂＢ２＋＋標的細胞（図１６Ａ及び１６Ｂ）の両方の６時間のインキュベーション後に最適であることが判明した。ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞におけるウミシイタケルシフェラーゼの発現レベルは、ｅｒｂＢ２＋＋ＨＥＫ２９３標的細胞（図１５Ｃ）又はｅｒｂＢ２ＳＫＢＲ３標的細胞のいずれかを使用するＥ：Ｔ比の関数として増加しなかったため、正規化遺伝子として使用することができる。
【００６６】
（例４）
細胞表面で高い一定レベルのｍＴＮＦαを発現する操作された標的細胞系の確立
ＴＮＦαアンタゴニストのＡＤＣＣ活性の定量には、膜結合型ＴＮＦαを発現する標的細胞を必要とする。ＴＮＦαは、最初に膜結合するが、次に、ＡＤＡＭ１７（ＴＡＣＥ）プロテアーゼによって切断される。したがって、膜結合型の、非切断性ＴＮＦαを発現する細胞系を確立するために、部位特異的突然変異誘発を使用して、プロテアーゼ切断部位を突然変異させ、ヒトＴＮＦαをコードする遺伝子の７６〜７７位におけるアミノ酸ＡＶをＬＬに変化させた（図１７）。
【００６７】
しかし、細胞表面に発現した非切断性ＴＮＦαは、隣接細胞の表面に存在するＴＮＦαＲＩＩ受容体に結合し、細胞死をもたらし、永続的な細胞系の確立を困難にすることになる。したがって、又はこのような困難を取り除くために、ＴＮＦαＲＩＩ受容体を、ゲノム編集を使用して無効化した。
【００６８】
ＴＮＦαＲＩＩ受容体をコードする遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集（７）を使用して、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３）において無効化した。簡潔には、２つのガイドＲＮＡ配列（図１８）を設計し、合成し、Ｃａｓ９二重鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼを、第１２染色体上に位置するＴＮＦαＲＩＩ遺伝子のエクソン２及び第１染色体上に位置するＴＮＦαＲＩＩ遺伝子のエクソン２内の特異的部位にガイドして、ＴＮＦαＲＩＩ−／−ＨＥＫ２９３細胞を単離するために、ヌクレアーゼベクターＧｅｎｅＡｒｔ  ＣＲＩＳＰＲ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、：Ａ２１１７４）にクローニングした。
【００６９】
安定なクローンを単離し、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びレミケード（インフリキシマブ）の存在下で、ＡＤＣＣ活性について特徴付け、次いで、サブクローニングした。適切なサブクローンを単離し、特徴付け、増殖させて、ｍＴＮＦα標的細胞系ｍＴＮＦ６．１０をもたらした（図１９）。次いで、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｍＴＮＦ＋＋標的細胞を使用し、図１９の培養物中の細胞について示すように、レミケード（インフリキシマブ）のＡＤＣＣ活性を定量した。ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｍＴＮＦ−／−標的細胞は、６時間のインキュベーション後に、１．０μｇ／ｍｌまでのインフリキシマブの濃度で、検出可能なＡＤＣＣ活性を示さなかった（図１９）。
【００７０】
ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞のバイアルとｍＴＮＦ＋＋標的細胞のバイアルを、標準的技法を使用して別々に凍結させた。解凍する際に、エフェクター細胞と標的細胞を、２４：１から２：１の範囲のＥ：Ｔ比で混合し、ＲＰＭＩ  １６４０培養培地及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で、濃度の増加するレミケードの存在下で、９６ウェルの白色面を有するマイクロタイタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ６００５１８１）中で６時間インキュベートした。次いで、ＦＬ活性を、デュアルルシフェラーゼ基質を使用して決定し、発光をルミノメーター（ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ）で定量し、相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として表現した。結果を、図２０Ａ及び２０Ｂに示すように、４つのパラメトリックロジスティック（４ＰＬ）プロットの形態で表す。図２０Ａ及び２０Ｂに関連付けた表は、異なるＥ：Ｔ比のｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びｍＴＮＦ＋＋標的細胞に対する主要な４ＰＬパラメータを概説する（図２０Ａ及び２０Ｂ）。Ｅ：Ｔ比３：１が、エフェクター及び標的細胞の６時間のインキュベーション後に最適であることが判明した（図２０Ａ及び２０Ｂ）。ＲＬ発現レベルは、Ｅ：Ｔ比の関数として増加しなかったため（図２１）、正規化遺伝子として使用することができる。
【００７１】
治療用抗体で処置した患者は、治療に対して異なる方式で応答することが多く、一部の患者では、治療に応答するその能力に負の影響を及ぼし得る抗薬物抗体（ＡＤＡ）も生じる。したがって、治療用抗体の循環レベルと抗薬物抗体の両方について、経時的に、個々の患者を監視する必要がある。さらに、いくつかの治療用抗体の活性は、部分的に、抗体依存性細胞傷害によって媒介されるため、治療用抗体のＡＤＣＣ活性について、患者を監視する必要がある。しかし、得られる結果を混乱させ得るエフェクター細胞の活性の非特異的増加をもたらす標的細胞の表面に結合することができるヒト血清中に存在するＩｇＧの濃度が高いことにより、これは困難となる。
【００７２】
特異的薬物標的がゲノム編集によって無効化されている、相同な標的陰性細胞の使用によって、以下の式：［（Ｅ＋Ｔ＋＋薬物＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋、又は［（Ｅ＋Ｔ＋＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋［式中、（Ｅ）＝エフェクター細胞、（Ｔ＋）＝抗原陽性標的細胞、（Ｔ−）＝抗原陰性標的細胞、ＮＨＳ＝正常なヒト血清試料］を使用して、同じ濃度のヒト血清の存在下で、特異的薬物標的を発現する相同な細胞に関して実測したものから減算することができる、標的陰性細胞及び所与の濃度のヒト血清の存在下での非特異的活性のレベルを推定する手段が提供される。この技術は、クローン病を有する患者由来の血清試料におけるＴＮＦαアンタゴニストであるインフリキシマブのＡＤＣＣ活性を定量するために使用されている（表１）。５．０以上の標的＋＋／標的−／−細胞に対する読み出しは、正常なヒト血清の１／２０の最終希釈の有り及び無しにおいて、対照試料から得た結果から陽性であると考えられた（表１）。したがって、試料１、３、及び９は、この技法を使用してＡＤＣＣ活性を示すことが判明した（表１）。試料１、３、及び９は、ＥＬＩＳＡ（Ｍａｔｒｉｋｓ  Ｂｉｏｔｅｃｋ、ＴＲ−ＱＳ−ＩＮＦ）又は以前に記載したバイオアッセイ（８）のいずれかを使用して、検出可能なレベルのインフリキシマブを含有することも判明した（表１）。
【表１】
2019534713.tif 000002
【００７３】
市販のＥＬＩＳＡ（Ｍａｔｒｉｋｓ  Ｂｉｏｔｅｃｋ  参照ＴＲ−ＡＴＩｖ４）を使用して決定した抗インフリキシマブ抗体を含有することが判明した試料７、８、１４及び２０では、ＡＤＣＣ活性は検出されなかった。さらに、ＥＬＩＳＡによって検出された抗インフリキシマブ抗体は、バイオアッセイ（８）を使用して中和していることが示された。
【００７４】
アダリムマブ及びエタネルセプトのＡＤＣＣ活性も、関節リウマチを有する患者由来の血清試料において定量した（表２）。したがって、エタネルセプトで処置した患者由来の試料７から１１及び試料１７は、容易に検出可能なＡＤＣＣ活性を含有することが判明した（表２）。同様に、アダリムマブで処置した患者由来の試料４、５、８、１２、１３、１４、１７、及び１９は、容易に検出可能なＡＤＣＣ活性を含有することが判明した（表２）。
【表２】
2019534713.tif 000003
【００７５】
（例５）
細胞表面で高い一定レベルのＥＧＦＲを発現する操作された標的細胞系の確立
ＥＧＦＲ陰性ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１５７３）の細胞に、ＦｕＧＥＮＥ  ＨＤトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  カタログ番号Ｅ２３１１）を使用して、ヒトＥＧＦＲａ発現ベクター（ｐＵＮＯ１−ｈｅｆｇｒ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をトランスフェクトした。陽性のクローンを、蛍光活性化細胞選別及びＦＩＴＣ標識抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＡＢ１０９５１Ｐ）を使用して濃縮した。安定なクローンを単離し、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びセツキシマブを使用して、ＡＤＣＣ活性について特徴付け、次いで、サブクローニングした。適切なサブクローンを単離し、特徴付け、増殖させて、ＥＧＦＲ＋＋標的細胞系をもたらした（図２１）。
【００７６】
ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びＥＧＦＲ＋＋ＨＥＫ２９３標的細胞の応答（セツキシマブを含まない対照試料に対する誘導倍率として表される）は、図２１に示すように、セツキシマブの存在下での６時間のインキュベーション後に決定したＮＦＡＴエフェクター細胞とＥＧＦＲ＋＋ＨＥＫ２９３標的細胞のものより有意に大きいことが判明した。したがって、ＮＦＡＴエフェクター細胞及びＥＧＦＲ＋＋ＨＥＫ２９３標的細胞に関するおよそ２倍に対して、ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びＥＧＦＲ＋＋ＨＥＫ２９３標的細胞に関しておよそ６０倍のダイナミックレンジが得られた（図２１及び関連付けた表）。
【００７７】
ｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞のバイアルとＥＧＦＲ＋＋標的細胞のバイアルを、標準的技法を使用して別々に凍結させた。解凍する際に、エフェクター細胞と標的細胞を、２４：１から２：１の範囲のＥ：Ｔ比で混合し、ＲＰＭＩ  １６４０培養培地及び１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で、濃度の増加するレミケードの存在下で、９６ウェルの白色面を有するマイクロタイタープレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ６００５１８１）中で６時間インキュベートした。次いで、ＦＬ活性を、デュアルルシフェラーゼ基質を使用して決定し、発光をルミノメーター（ＧｌｏＭａｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ）で定量し、相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として表現した。結果を、図２２Ａ及び２２Ｂに示すように、４つのパラメトリックロジスティック（４ＰＬ）プロットの形態で表す。図２２Ａ及び２２Ｂに関連付けた表は、異なるＥ：Ｔ比のｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞及びＥＧＦＲ＋＋標的細胞に対する主要な４ＰＬパラメータを概説する（図２２Ａ及び２２Ｂ）。Ｅ：Ｔ比６：１が、エフェクター及び標的細胞の６時間のインキュベーション後に最適であることが判明した（図２２Ａ及び２２Ｂ）。ＲＬ発現レベルは、Ｅ：Ｔ比の関数として増加しなかったため、正規化遺伝子として使用することができる。
【００７８】
特定の実施形態では、本発明は、以下の項目にも関する：
項目：
１．ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、及びＳＴＡＴ５によって活性化される組換えレポーター遺伝子又は構築物を有するエフェクター細胞。
２．抗体が特異的である内因性標的が無効化された組換え標的細胞。
３．抗体が特異的である標的の発現が増強された組換え標的細胞。
４．配列番号１のヌクレオチド配列を含む、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、及びＳＴＡＴ５に結合する調節配列。
５．
ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、ＣＲＥＢ、及びＳＴＡＴ５によって活性化される組換えレポーター遺伝子アッセイ又は構築物を有するエフェクター細胞と；
抗体が特異的である内因性標的が無効化された組換え標的細胞（従属請求項、ＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２（ＳＫＢＲ３及びＨＥＫ２９３）、ＥＧＦＲ）と；
抗体が特異的である標的の発現が増強された組換え標的細胞と
を含むキット。（従属請求項、ＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２（ＳＫＢＲ３及びＨＥＫ２９３）、ＥＧＦＲ）
６．エフェクター細胞及び薬物標的が無効化されている標的細胞の存在下で得たシグナルを、エフェクター細胞及び薬物標的を発現する標的細胞の存在下で得たシグナルから減算することによって、ヒト血清の存在下でレポーター遺伝子シグナルの非特異的増加を補うための方法。
７．治療用抗体で処置した患者由来の臨床試料のｅｘ  ｖｉｖｏでのＡＤＣＣ活性を定量するための方法。
【００７９】
さらに、さらに具体的な実施形態では、本発明は、以下の項にも関する：
１．下流プロモーターに作動可能に連結したシス作用調節配列を含むポリヌクレオチドであって、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５のうちの１つ又は複数が、前記シス作用調節配列に結合することができる上記ポリヌクレオチド。
２．ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、及びＳＴＡＴ５がすべて、前記シス作用調節配列に結合することができることを特徴とする、項１に記載のポリヌクレオチド。
３．プロモーターが、第１のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレーム配列に作動可能に連結している、項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
４．レポーターが酵素である、項１から３までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
５．酵素が、例えば、ルシフェラーゼである、項１から４までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
６．酵素が、蛍光タンパク質である、項１から５までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
７．配列番号１と少なくとも約７０％の配列同一性、例えば、少なくとも約７５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約８０％の配列同一性など、例えば、少なくとも約８５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９０％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９５％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９８％の配列同一性など、例えば、少なくとも約９９％の配列同一性などを有するヌクレオチド配列又は配列番号１と同一のＤＮＡ配列を含む、項１から６までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
８．項１から７までのいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター構築物。
９．前記ベクターが、プラスミド又はウイルスベクターである、項８に記載のベクター。
１０．項８又は９に記載のベクターを含む細胞。
１１．哺乳動物細胞である、項１０に記載の細胞。
１２．前記ベクターが、エピソーム性であるか又は前記細胞のゲノムに組み込まれている、項１０又は１１に記載の細胞。
１３．細胞が、第１のレポータータンパク質と異なる第２のレポータータンパク質をさらに発現する、項１０から１２までのいずれか一項に記載の細胞。
１４．細胞が、Ｊｕｒｋａｔ、ＳＫＢＲ３、又はＨＥＫ２９３細胞である、項１０から１３までのいずれか一項に記載の細胞。
１５．
ｉ）請求項１０から１４までのいずれか一項に記載の細胞と；
ｉｉ）抗体が特異的である内因性標的が無効化された（突然変異した）細胞と；
ｉｉｉ）抗体が特異的である標的の発現が増強された細胞と
を含むキット。
１６．ｉｉ）で標的細胞において無効化された標的が、ＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲのうちの１つ又は複数を含む、項１５に記載のキット。
１７．ｉｉｉ）で標的細胞において増強された標的が、ＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲのうちの１つ又は複数を含む、項１５に記載のキット。
１８．２つのバイアルを含む、項１５から１７までのいずれか一項に記載のキット。
１９．ｉ）及びｉｉｉ）の細胞が、最適なＥ：Ｔ比で、１つの同じバイアルに存在する、項１５から１８までのいずれか一項に記載のキット。
２０．ｉ）の細胞とｉｉｉ）の標的細胞との間の比が、約２４：１から約２：１、又は例えば約６：１、又は例えば約３：１、又は例えば約１．５：１の範囲内である、項１５から１９までのいずれか一項に記載のキット。
２１．治療用抗体で処置した患者由来の臨床試料のｅｘ  ｖｉｖｏでのＡＤＣＣ活性を定量するための方法であって、
ａ）抗体の投与を含む処置を受けている患者から得た試料を、項１５の標的細胞ｉｉ）と接触させるステップと、
ｂ）薬物標的が無効化されている細胞ｉ）の存在下で得たシグナルを、エフェクター細胞ｉ）及び標的細胞ｉｉｉ）の存在下で得たシグナルから減算するステップと、
ｃ）ａ）及びｂ）で測定したシグナルの関係に基づいて、ＡＤＣＣ活性を決定するステップと
を含む上記方法。
２２．血清試料に対する陽性の結果（すなわち、検出可能なＡＤＣＣ活性）は、エフェクター細胞ｉ）及び標的＋＋細胞ｉｉｉ）／エフェクター細胞ｉ）及び標的−／−細胞ｉｉ）に対するシグナルの関係が≧１である場合に存在し、血清試料に対する陰性の結果（すなわち、検出不可能なＡＤＣＣ活性）は、エフェクター細胞ｉ）及び標的＋＋細胞ｉｉｉ）に関する値／エフェクター細胞ｉ）及び標的−／−細胞ｉｉ）に関する値が≦１である場合に存在する、項２１に記載の方法。
２３．ヒト血清の存在下で、レポーター遺伝子シグナルの非特異的増加を補うための方法であって、細胞ｉ）の存在下で得たシグナルを、項１５のエフェクター細胞ｉ）及び薬物標的を発現する標的細胞ｉｉｉ）の存在下で得たシグナルから減算するステップを含む上記方法。
２４．エフェクター細胞及び標的陰性細胞が＞１である場合に、調査下の抗体に特異的なＡＤＣＣ活性に関連しない活性を示す血清試料を排除するための、項２３に記載の方法。
【００８０】
（参考文献）
2019534713.tif 000004
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号１〜１１：＜２２３＞人工
【図１】
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【図２】
2019534713.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
2019534713.tif 000011
【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2019534713.tif 000032
【図２０Ａ】
2019534713.tif 000033
【図２０Ｂ】
2019534713.tif 000034
【図２１】
2019534713.tif 000035
【図２２Ａ】
2019534713.tif 000036
【図２２Ｂ】
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【配列表】
2019534713000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月27日(2018.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下流プロモーターに作動可能に連結したシス作用調節配列を含むポリヌクレオチドであって、ＮＦ−ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５の全てが、前記シス作用調節配列に結合することができ、該ポリヌクレオチドが配列番号１に記載のＤＮＡ配列を含む、上記ポリヌクレオチド。
【請求項２】
プロモーターが、第１のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレーム配列に作動可能に連結している、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
レポーターが、例えば、ルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質などの酵素である、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター構築物。
【請求項５】
プラスミド又はウイルスベクターである、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のベクターを含む細胞。
【請求項７】
前記ベクターが、エピソーム性であるか又は前記細胞のゲノムに組み込まれている、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
第１のレポータータンパク質と異なる第２のレポータータンパク質をさらに発現する、請求項６又は７に記載の細胞。
【請求項９】
ｉ）エフェクター細胞上に発現するＦｃガンマ受容体によって抗体のＦｃ領域に結合することができる、請求項６から８までのいずれか一項に記載の細胞であるエフェクター細胞（Ｅ）；
ｉｉ）標的／抗原が細胞によって発現されないように、前記抗体が特異的である内因性標的／抗原が無効化された（突然変異した）細胞（Ｔ−）；及び
ｉｉｉ）前記抗体が特異的である標的の発現が増強されたか又は過剰発現された標的細胞（Ｔ＋）
を含むキット。
【請求項１０】
ｉｉ）の細胞及び細胞ｉｉｉ）は、ｉｉ）の細胞が、アッセイされる抗体又は薬物によって認識される特異的抗原を発現しないことを除いてすべての点において同一の全く同じ細胞である、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
標的／抗原が、ＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲのうちの１つ又は複数である、請求項９又は１０に記載のキット。
【請求項１２】
２つのバイアルを含み、ｉ）及びｉｉｉ）の細胞が、最適なＥ：Ｔ比で、１つの同じバイアルに存在する、請求項９から１１までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
ｉ）のエフェクター細胞とｉｉｉ）の標的細胞との間の比（Ｅ：Ｔ比）が、約２４：１から約２：１、又は約６：１、又は約３：１、又は約１．５：１の範囲内である、請求項９から１２までのいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
治療用抗体で処置した患者由来の臨床試料のｅｘ  ｖｉｖｏでの抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を定量するための方法であって、
ａ）抗体の投与を含む処置を受けている患者から得た試料を、請求項９  ｉｉｉ）に記載の標的細胞ｉｉｉ）と接触させるステップ、
ｂ）薬物標的が無効化されている、請求項９  ｉｉ）に記載の細胞ｉｉ）の存在下で得たシグナルを、請求項６から８までのいずれか一項に記載のエフェクター細胞ｉ）及び請求項９  ｉｉｉ）に記載の標的細胞ｉｉｉ）の存在下で得たシグナルから減算するステップ、及び
ｃ）ａ）及びｂ）で測定したシグナルの関係に基づいて、ＡＤＣＣ活性を決定するステップであり、式［（Ｅ＋Ｔ＋＋薬物＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋、又は［（Ｅ＋Ｔ＋＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋［式中、（Ｅ）は請求項６から８までのいずれか一項に記載のエフェクター細胞であり、（Ｔ＋）細胞は請求項９  ｉｉｉ）に記載の細胞であり、（Ｔ−）は請求項９  ｉｉ）に記載の細胞であり、ＮＨＳ＝正常なヒト血清試料である］を使用して、血清試料に対する陽性の結果（すなわち、検出可能なＡＤＣＣ活性）は、エフェクター細胞ｉ）及び標的＋＋細胞ｉｉｉ）／エフェクター細胞ｉ）及び標的−／−細胞ｉｉ）に対するシグナルの関係が≧１である場合に存在し、血清試料に対する陰性の結果（すなわち、検出不可能なＡＤＣＣ活性）は、エフェクター細胞ｉ）及び標的＋＋細胞ｉｉｉ）に関する値／エフェクター細胞ｉ）及び標的−／−細胞ｉｉ）に関する値が≦１である場合に存在するステップ
を含む上記方法。
【請求項１５】
ヒト血清の存在下でレポーター遺伝子シグナルの非特異的増加を補うための方法であって、式［（Ｅ＋Ｔ＋＋薬物＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋、又は［（Ｅ＋Ｔ＋＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋［式中、（Ｅ）は請求項６から８までのいずれか一項に記載のエフェクター細胞であり、（Ｔ＋）細胞は請求項９  ｉｉｉ）に記載の細胞であり、（Ｔ−）は請求項９  ｉｉ）に記載の細胞であり、ＮＨＳ＝正常なヒト血清試料である］を使用して、細胞ｉ）、すなわち、請求項６から８までのいずれか一項に記載の細胞の存在下で得たシグナルを、請求項１４に記載のエフェクター細胞ｉ）及び薬物標的を発現する標的細胞ｉｉｉ）、又はエフェクター細胞ｉ）及び標的陰性細胞ｉｉ）が＞１である場合に、調査下の抗体に特異的なＡＤＣＣ活性に関連しない活性を示す血清試料の存在下で得たシグナルから減算するステップを含む上記方法。
【国際調査報告】
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