(57)【要約】本発明は、標的化された遺伝子改変のための組成物および方法を対象とする。免疫細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ遺伝子改変のための方法であって、免疫細胞に、（ａ）トランスポサーゼ酵素をコードする配列を含む核酸配列またはアミノ酸配列と、（ｂ）トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列を含む組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列とを送達することを含む方法が開示される。ある特定の実施形態では、本方法は、免疫細胞を１つまたは複数のサイトカインで刺激するステップをさらに含む。
2019506177.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ遺伝子改変のための方法であって、該免疫細胞に、
（ａ）トランスポサーゼ酵素をコードする配列を含む核酸配列またはアミノ酸配列と、
（ｂ）トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列を含む組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列と
を送達するステップを含む方法。
【請求項２】
トランスポサーゼ酵素をコードする前記配列がｍＲＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トランスポサーゼ酵素をコードする前記配列がＤＮＡ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
トランスポサーゼ酵素をコードする前記配列がアミノ酸配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記送達するステップが、前記免疫細胞の電気穿孔またはヌクレオフェクションを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫細胞を１つまたは複数のサイトカインで刺激するステップをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫細胞を１つまたは複数のサイトカインで刺激する前記ステップが、前記送達するステップの後に存在する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫細胞を１つまたは複数のサイトカインで刺激する前記ステップが、前記送達するステップの前に存在する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記１つまたは複数のサイトカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−７、および／またはＩＬ−１５を含む、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫細胞が自家免疫細胞である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記免疫細胞がＴリンパ球である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫細胞がサイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫細胞がナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
トランスポサーゼ酵素をコードする前記ｍＲＮＡ配列がｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される、請求項２および５から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記トランスポサーゼ酵素がＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ｓＰＢｏ）トランスポサーゼ酵素である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素が、
MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEVSDHVSEDDVQSDTEEAFIDEVHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWSTSKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKWTNAEISLKRRESMTSATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDDLFDRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKIWDLFIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRVYIPNKPSKYGIKILMMCDSGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDNWFTSIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDGPLTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGVDTLDQMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQSRKKFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPKEVPGTSDDSTEEPVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF（配列番号１）
と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記トランスポサーゼ酵素がＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼ酵素である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼが機能亢進性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ＳＢ１００Ｘトランスポサーゼである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼ酵素が、
MGKSKEISQDLRKKIVDLHKSGSSLGAISKRLKVPRSSVQTIVRKYKHHGTTQPSYRSGRRRYLSPRDERTLVRKVQINPRTTAKDLVKMLEETGTKVSISTVKRVLYRHNLKGRSARKKPLLQNRHKKARLRFATAHGDKDRTFWRNVLWSDETKIELFGHNDHRYVWRKKGEACKPKNTIPTVKHGGGSIMLWGCFAAGGTGALHKIDGIMRKENYVDILKQHLKTSVRKLKLGRKWVFQMDNDPKHTSKVVAKWLKDNKVKVLEWPSQSPDLNPIENLWAELKKRVRARRPTNLTQLHQLCQEEWAKIHPTYCGKLVEGYPKRLTQVKQFKGNATKY（配列番号２）
と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼ酵素が、
MGKSKEISQDLRKRIVDLHKSGSSLGAISKRLAVPRSSVQTIVRKYKHHGTTQPSYRSGRRRYLSPRDERTLVRKVQINPRTTAKDLVKMLEETGTKVSISTVKRVLYRHNLKGHSARKKPLLQNRHKKARLRFATAHGDKDRTFWRNVLWSDETKIELFGHNDHRYVWRKKGEACKPKNTIPTVKHGGGSIMLWGCFAAGGTGALHKIDGIMDAVQYVDILKQHLKTSVRKLKLGRKWVFQHDNDPKHTSKVVAKWLKDNKVKVLEWPSQSPDLNPIENLWAELKKRVRARRPTNLTQLHQLCQEEWAKIHPNYCGKLVEGYPKRLTQVKQFKGNATKY（配列番号３）
と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２２】
トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列を含む前記組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列が環状である、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
トランスポゾンをコードする前記組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列がプラスミドベクター内に含有されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
トランスポゾンをコードする前記組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列がミニサークルＤＮＡベクター内に含有されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
トランスポゾンをコードする前記組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列が線状である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
トランスポゾンをコードする前記組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列がｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
トランスポゾンをコードする前記組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列が、環状ＤＮＡの制限消化の産物である、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記環状ＤＮＡが、プラスミドベクターまたはミニサークルＤＮＡベクターである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
トランスポゾンをコードする前記組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産物である、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項３０】
トランスポゾンをコードする前記組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列が、二本鎖のｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡ配列である、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡ配列が、抗原、プロモーター、ポリＡテール、およびテロメア末端を含む抗原発現カセットだけをコードする酵素プロセスにより産生される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫細胞が、ヒトから単離されるか、またはそれに由来する、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫細胞が、非ヒト哺乳動物から単離されるか、またはそれに由来する、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記非ヒト哺乳動物が、齧歯動物、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ、ラクダ、または霊長類である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
トランスポゾンをコードする前記組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列が、キメラ抗原受容体をコードする配列またはその一部分をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
キメラ抗原受容体をコードする前記配列の前記一部分が、抗原認識領域をコードする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗原認識領域が、１つまたは複数の相補性決定領域を含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗原認識領域が、抗体、抗体模倣物、タンパク質足場、またはそれらの断片を含む、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗体が、キメラ抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体がアフィニティー調整されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体が、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＶＨＨ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ）、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）分子、もしくはナノボディを含むか、またはそれからなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＶＨＨがラクダ科抗体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＶＨＨがヒト化抗体である、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体断片が、相補性決定領域、可変領域、重鎖、軽鎖、もしくはそれらの任意の組合せを含むか、またはそれからなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体模倣物が、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、もしくはモノボディを含むか、またはそれからなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記タンパク質足場が、センチリンを含むか、またはそれからなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＤＮＡ配列であり、
（ｂ）該トランスポサーゼ酵素をコードする該ＤＮＡ配列の量、および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の量が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり１０μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡ配列の前記量および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、１００μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項４８に記載の方法。
【請求項４９】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＤＮＡ配列であり、
（ｂ）該トランスポサーゼ酵素をコードする該ＤＮＡ配列の量、および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の量が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり７．５μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡ配列の前記量および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、７５μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＤＮＡ配列であり、
（ｂ）該トランスポサーゼ酵素をコードする該ＤＮＡ配列の量、および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の量が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり６．０μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡ配列の前記量および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、６０μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記トランスポサーゼがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼである、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポサーゼがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  １００Ｘ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポサーゼである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＤＮＡ配列であり、
（ｂ）該トランスポサーゼ酵素をコードする該ＤＮＡ配列の量、および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の量が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり５．０μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡ配列の前記量および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、５０μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＤＮＡ配列であり、
（ｂ）該トランスポサーゼ酵素をコードする該ＤＮＡ配列の量、および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の量が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり２．５μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡ配列の前記量および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、２５μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＤＮＡ配列であり、
（ｂ）該トランスポサーゼ酵素をコードする該ＤＮＡ配列の量、および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の量が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり１．６７μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡ配列の前記量および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、１６．７μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記トランスポサーゼがＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポサーゼである、請求項５９または６０に記載の方法。
【請求項６２】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＤＮＡ配列であり、
（ｂ）該トランスポサーゼ酵素をコードする該ＤＮＡ配列の量、および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の量が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり０．５５μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡ配列の前記量および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、５．５μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＤＮＡ配列であり、
（ｂ）該トランスポサーゼ酵素をコードする該ＤＮＡ配列の量、および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の量が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり０．１９μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡ配列の前記量および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、１．９μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＤＮＡ配列であり、
（ｂ）該トランスポサーゼ酵素をコードする該ＤＮＡ配列の量、および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の量が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり０．１μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記ＤＮＡ配列の前記量および前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、１．０μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＲＮＡ配列であり、
（ｂ）前記トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり１０μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、１００μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＲＮＡ配列であり、
（ｂ）前記トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり７．５μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、７５μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＲＮＡ配列であり、
（ｂ）前記トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり６．０μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、６０μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記トランスポサーゼがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼである、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポサーゼがＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  １００Ｘ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポサーゼである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＲＮＡ配列であり、
（ｂ）前記トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり５．０μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、５０μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＲＮＡ配列であり、
（ｂ）前記トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり２．５μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、２５μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＲＮＡ配列であり、
（ｂ）前記トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり１．６７μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、１６．７μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記トランスポサーゼがＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポサーゼである、請求項８０または８１に記載の方法。
【請求項８３】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＲＮＡ配列であり、
（ｂ）前記トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり０．５５μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、５．５μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＲＮＡ配列であり、
（ｂ）前記トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり０．１９μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、１．９μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
（ａ）前記トランスポサーゼ酵素をコードする前記核酸配列がＲＮＡ配列であり、
（ｂ）前記トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列が、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり０．１μｇと等しいかまたはそれ未満である、請求項５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、前記トランスポゾンをコードする前記ＤＮＡ配列の前記量の濃度が、１．０μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
請求項１から８８のいずれか一項に記載の方法に従って改変された免疫細胞。
【請求項９０】
Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項８９に記載の免疫細胞。
【請求項９１】
第２の遺伝子編集ツールによってさらに改変されている、請求項８９または９０に記載の免疫細胞。
【請求項９２】
前記第２の遺伝子編集ツールが、Ｃａｓ９またはＴＡＬＥ配列のいずれかに作動可能に連結したエンドヌクレアーゼを含む、請求項９１に記載の免疫細胞。
【請求項９３】
前記エンドヌクレアーゼが、共有結合で、Ｃａｓ９またはＴＡＬＥ配列のいずれかに作動可能に連結している、請求項９２に記載の免疫細胞。
【請求項９４】
前記エンドヌクレアーゼが、非共有結合で、Ｃａｓ９またはＴＡＬＥ配列のいずれかに作動可能に連結している、請求項９２に記載の免疫細胞。
【請求項９５】
前記Ｃａｓ９が不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である、請求項８９から９４のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項９６】
前記不活性化Ｃａｓ９が、触媒部位内にＤ１０ＡおよびＮ５８０Ａを含む、請求項９５に記載の免疫細胞。
【請求項９７】
前記Ｃａｓ９が小型の不活性化Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）である、請求項９５または９６に記載の免疫細胞。
【請求項９８】
前記ｄＳａＣａｓ９が、
mkrnyilglaigitsvgygiidyetrdvidagvrlfkeanvennegrrskrgarrlkrrrrhriqrvkkllfdynlltdhselsginpyearvkglsqklseeefsaallhlakrrgvhnvneveedtgnelstkeqisrnskaleekyvaelqlerlkkdgevrgsinrfktsdyvkeakqllkvqkayhqldqsfidtyidlletrrtyyegpgegspfgwkdikewyemlmghctyfpeelrsvkyaynadlynalndlnnlvitrdenekleyyekfqiienvfkqkkkptlkqiakeilvneedikgyrvtstgkpeftnlkvyhdikditarkeiienaelldqiakiltiyqssediqeeltnlnseltqeeieqisnlkgytgthnlslkainlildelwhtndnqiaifnrlklvpkkvdlsqqkeipttlvddfilspvvkrsfiqsikvinaiikkyglpndiiielareknskdaqkminemqkrnrqtnerieeiirttgkenakyliekiklhdmqegkclysleaipledllnnpfnyevdhiiprsvsfdnsfnnkvlvkqeeaskkgnrtpfqylsssdskisyetfkkhilnlakgkgrisktkkeylleerdinrfsvqkdfinrnlvdtryatrglmnllrsyfrvnnldvkvksinggftsflrrkwkfkkernkgykhhaedaliianadfifkewkkldkakkvmenqmfeekqaesmpeieteqeykeifitphqikhikdfkdykyshrvdkkpnrelindtlystrkddkgntlivnnlnglydkdndklkklinkspekllmyhhdpqtyqklklimeqygdeknplykyyeetgnyltkyskkdngpvikkikyygnklnahlditddypnsrnkvvklslkpyrfdvyldngvykfvtvknldvikkenyyevnskcyeeakklkkisnqaefiasfynndlikingelyrvigvnndllnrievnmidityreylenmndkrppriiktiasktqsikkystdilgnlyevkskkhpqiikkg（配列番号４）
のアミノ酸配列を含む、請求項９７に記載の免疫細胞。
【請求項９９】
請求項８９から９８のいずれか一項に記載の免疫細胞を含む組成物。
【請求項１００】
それを必要とする被験体における疾患または障害の処置のための、請求項９９に記載の組成物の使用。
【請求項１０１】
前記疾患または障害が、がんである、請求項１００に記載の使用。
【請求項１０２】
前記疾患または障害が、感染性疾患である、請求項１００に記載の使用。
【請求項１０３】
前記免疫細胞が自家免疫細胞である、請求項９９から１０２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０４】
前記免疫細胞が同種免疫細胞である、請求項９９から１０２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０５】
ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはそれらの任意の組合せを含む改変された免疫細胞の生存率を向上させるための培養培地。
【請求項１０６】
前記改変された免疫細胞が、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項１０５に記載の培養培地。
【請求項１０７】
前記改変された免疫細胞が、１つまたは複数の外来性ＤＮＡ配列を含有する、請求項１０５または１０６に記載の培養培地。
【請求項１０８】
前記改変された免疫細胞が、１つまたは複数の外来性ＲＮＡ配列を含有する、請求項１０５または１０６に記載の培養培地。
【請求項１０９】
前記改変された免疫細胞が、電気穿孔またはヌクレオフェクトされている、請求項１０５から１０８のいずれか一項に記載の培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年２月２６日に出願された米国特許出願大６２／３００，３８７号の優先権を請求し、その内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
２０１７年２月２４日に作成された「ＰＯＴＨ−００７００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名称のテキストファイルの内容は、２６ＫＢのサイズであり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、標的化された遺伝子改変のための組成物および方法を対象とする。
【背景技術】
【０００４】
非ウイルス性ベクターに基づく遺伝子移入送達系を使用した非形質転換初代ヒトＴリンパ球のｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子改変は、極めて困難であった。結果として、ほとんどのグループは、一般に、レンチウイルスを含むレトロウイルスなどのウイルスベクターに基づく形質導入を使用してきた。いくつかの非ウイルス性の方法が試験されており、これらは、抗体標的化リポソーム、ナノ粒子、アプタマーｓｉＲＮＡキメラ、電気穿孔、ヌクレオフェクション、リポフェクション、およびペプチド形質導入を含む。全体的に、これらのアプローチは、不十分なトランスフェクション効率、直接的な細胞毒性、または実験のスループット不足という結果に終わっている。
【０００５】
ヒトリンパ球の遺伝子改変のためのプラスミドベクターの使用は、現在利用可能なプラスミドトランスフェクション系を使用した低い効率、および多くのプラスミドトランスフェクション試薬がこれらの細胞に与える毒性により、限定されてきた。免疫細胞における非ウイルス性遺伝子改変の方法については、長年にわたり満たされていない需要が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
Ｔリンパ球などの免疫細胞のウイルス形質導入と比較すると、ｐｉｇｇｙＢａｃおよびＳｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙなどのＤＮＡトランスポゾンを介した導入遺伝子の送達は、使用しやすさ、大幅に大きな積荷を送達する能力、診療所までの速度、および生産コストという点で、著しい利点を提示する。特に、ｐｉｇｇｙＢａｃ  ＤＮＡトランスポゾンは、導入遺伝子の長期にわたる高レベルかつ安定な発現をもたらすという点で、また、レトロウイルスより変異原性が有意に低く、非発癌性であり、かつ完全に可逆的であるという点で、さらなる利点を提示する。ＤＮＡトランスポゾンを使用して導入遺伝子をＴ細胞に送達するための以前の試みは、以前の方法が非効率的であったため、商業的に実現可能な製品または製造方法を生み出すことに成功していない。例えば、導入遺伝子をＴ細胞に送達するためにＤＮＡトランスポゾンを使用する以前の方法により明示された不十分な効率は、長期のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖の必要性をもたらしている。この問題を解決しようとして失敗に終わった他者による以前の試みは全て、免疫細胞に送達されるＤＮＡトランスポゾンの量を増加させることに焦点を合わせてきたが、これは、非免疫細胞には良好に機能した方策であった。本開示は、免疫細胞においてＤＮＡトランスポゾンの量の増加は、ＤＮＡ媒介毒性を増加させることにより効率問題を悪化させることを明示する。この問題を解決するために本開示の方法は、直観に反して、免疫細胞に送達されるＤＮＡの量を減少させる。本明細書において提供されるデータは、本開示の方法を使用すると、細胞に導入されるＤＮＡトランスポゾンの量の減少が生存率を増加させたことのみならず、本方法が転位事象を保有した細胞の百分率を増加させ、実現可能な商業的プロセスおよび実現可能な商業的製品をもたらすことも明示する。このように、本開示の方法は、他者が失敗した点における成功を明示する。
【０００７】
本開示は、免疫細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ遺伝子改変のための非ウイルス性の方法であって、免疫細胞に、（ａ）トランスポサーゼ酵素をコードする配列を含む核酸配列またはアミノ酸配列と、（ｂ）トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列を含む組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列とを送達するステップを含む方法を提供する。ある特定の実施形態では、本方法は、免疫細胞を１つまたは複数のサイトカインで刺激するステップをさらに含む。
【０００８】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする配列はｍＲＮＡ配列である。トランスポサーゼ酵素をコードするｍＲＮＡ配列はｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されてもよい。
【０００９】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする配列はＤＮＡ配列である。トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列はｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されてもよい。ＤＮＡ配列はｃＤＮＡ配列であってもよい。
【００１０】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする配列はアミノ酸配列である。トランスポサーゼ酵素をコードするアミノ酸配列はｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されてもよい。タンパク質のｓＰＢｏがトランスポゾンＤＮＡとのプレインキュベーション後に送達されてもよい。
【００１１】
本開示の方法のある特定の実施形態では、送達するステップは、免疫細胞の電気穿孔またはヌクレオフェクションを含む。
【００１２】
本開示の方法のある特定の実施形態では、免疫細胞を１つまたは複数のサイトカインで刺激するステップは、送達するステップの後に存在する。代替または追加として、ある特定の実施形態では、免疫細胞を１つまたは複数のサイトカインで刺激するステップは、送達するステップの前に存在する。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−７、および／またはＩＬ−１５を含む。
【００１３】
本開示の方法のある特定の実施形態では、免疫細胞は自家免疫細胞である。免疫細胞は、ヒト免疫細胞および／または自家免疫細胞でありうる。免疫細胞は、初代細胞、培養細胞もしくは細胞株、胚性幹細胞もしくは成体幹細胞、人工多能性幹細胞、または分化転換細胞を含むがこれらに限定されない、非自家起源に由来してもよい。免疫細胞は、以前に遺伝子改変されていてもよく、または遺伝子改変された細胞もしくは細胞株に由来してもよい。免疫細胞は、１つまたは複数のアポトーシス経路を抑制するように改変されていてもよく、またはそのように改変されている細胞もしくは細胞株に由来してもよい。免疫細胞は、例えば、養子細胞移入を伴う療法の文脈において、レシピエントの過半数により「普遍的に」同種であるように改変されていてもよく、またはそのように改変されている細胞もしくは細胞株に由来してもよい。
【００１４】
本開示の方法のある特定の実施形態では、免疫細胞は活性化免疫細胞である。
【００１５】
本開示の方法のある特定の実施形態では、免疫細胞は休止免疫細胞である。
【００１６】
本開示の方法のある特定の実施形態では、免疫細胞はＴリンパ球である。ある特定の実施形態では、Ｔリンパ球は活性化Ｔリンパ球である。ある特定の実施形態では、Ｔリンパ球は休止Ｔリンパ球である。
【００１７】
本開示の方法のある特定の実施形態では、免疫細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【００１８】
本開示の方法のある特定の実施形態では、免疫細胞はサイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞である。
【００１９】
本開示の方法のある特定の実施形態では、免疫細胞はナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。
【００２０】
本開示の方法のある特定の実施形態では、免疫細胞は、ヒトから単離されるか、またはそれに由来する。
【００２１】
本開示の方法のある特定の実施形態では、免疫細胞は、非ヒト哺乳動物から単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、齧歯動物、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマ、ウシ、またはラクダである。ある特定の実施形態では、免疫細胞は、非ヒト霊長類から単離されるか、またはそれに由来する。
【００２２】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素は、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ｓＰＢｏ）トランスポサーゼ酵素である。Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポサーゼ酵素は、MGSSLDDEHILSALLQSDDELVGEDSDSEVSDHVSEDDVQSDTEEAFIDEVHEVQPTSSGSEILDEQNVIEQPGSSLASNRILTLPQRTIRGKNKHCWSTSKSTRRSRVSALNIVRSQRGPTRMCRNIYDPLLCFKLFFTDEIISEIVKWTNAEISLKRRESMTSATFRDTNEDEIYAFFGILVMTAVRKDNHMSTDDLFDRSLSMVYVSVMSRDRFDFLIRCLRMDDKSIRPTLRENDVFTPVRKIWDLFIHQCIQNYTPGAHLTIDEQLLGFRGRCPFRVYIPNKPSKYGIKILMMCDSGTKYMINGMPYLGRGTQTNGVPLGEYYVKELSKPVHGSCRNITCDNWFTSIPLAKNLLQEPYKLTIVGTVRSNKREIPEVLKNSRSRPVGTSMFCFDGPLTLVSYKPKPAKMVYLLSSCDEDASINESTGKPQMVMYYNQTKGGVDTLDQMCSVMTCSRKTNRWPMALLYGMINIACINSFIIYSHNVSSKGEKVQSRKKFMRNLYMSLTSSFMRKRLEAPTLKRYLRDNISNILPKEVPGTSDDSTEEPVMKKRTYCTYCPSKIRRKANASCKKCKKVICREHNIDMCQSCF（配列番号１）と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなっていてもよい。
【００２３】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼ酵素である（例えば、内容の全体が本明細書に援用される米国特許第９，２２８，１８０号を参照されたい）。ある特定の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼは機能亢進性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ＳＢ１００Ｘトランスポサーゼである。ある特定の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼ酵素は、MGKSKEISQDLRKKIVDLHKSGSSLGAISKRLKVPRSSVQTIVRKYKHHGTTQPSYRSGRRRYLSPRDERTLVRKVQINPRTTAKDLVKMLEETGTKVSISTVKRVLYRHNLKGRSARKKPLLQNRHKKARLRFATAHGDKDRTFWRNVLWSDETKIELFGHNDHRYVWRKKGEACKPKNTIPTVKHGGGSIMLWGCFAAGGTGALHKIDGIMRKENYVDILKQHLKTSVRKLKLGRKWVFQMDNDPKHTSKVVAKWLKDNKVKVLEWPSQSPDLNPIENLWAELKKRVRARRPTNLTQLHQLCQEEWAKIHPTYCGKLVEGYPKRLTQVKQFKGNATKY（配列番号２）と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼが機能亢進性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ＳＢ１００Ｘトランスポサーゼであるものを含め、ある特定の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼ酵素は、MGKSKEISQDLRKRIVDLHKSGSSLGAISKRLAVPRSSVQTIVRKYKHHGTTQPSYRSGRRRYLSPRDERTLVRKVQINPRTTAKDLVKMLEETGTKVSISTVKRVLYRHNLKGHSARKKPLLQNRHKKARLRFATAHGDKDRTFWRNVLWSDETKIELFGHNDHRYVWRKKGEACKPKNTIPTVKHGGGSIMLWGCFAAGGTGALHKIDGIMDAVQYVDILKQHLKTSVRKLKLGRKWVFQHDNDPKHTSKVVAKWLKDNKVKVLEWPSQSPDLNPIENLWAELKKRVRARRPTNLTQLHQLCQEEWAKIHPNYCGKLVEGYPKRLTQVKQFKGNATKY（配列番号３）と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を含む。
【００２４】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列を含む組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列は環状であってもよい。非限定的な例として、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列は、プラスミドベクターであってもよい。非限定的な例として、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列は、ミニサークルＤＮＡベクターであってもよい。
【００２５】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンをコードする組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列は線状であってもよい。トランスポゾンをコードする線状の組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生されてもよい。本開示の線状の組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列は、環状ＤＮＡの制限消化の産物であってもよい。ある特定の実施形態では、環状ＤＮＡは、プラスミドベクターまたはミニサークルＤＮＡベクターである。本開示の線状の組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の産物であってもよい。本開示の線状の組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列は、二本鎖のｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡ配列であってもよい。本開示のＤｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡ配列は、抗原、プロモーター、ポリＡテール、およびテロメア末端を含む抗原発現カセットだけをコードする酵素プロセスにより産生されてもよい。
【００２６】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンをコードする組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列は、キメラ抗原受容体をコードする配列またはその一部分をさらに含む。本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、（ａ）抗原認識領域を含むエクトドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含みうる。ある特定の実施形態では、エクトドメインは、シグナルペプチドをさらに含みうる。代替または追加として、ある特定の実施形態では、エクトドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインとの間にヒンジをさらに含んでもよい。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはＧＭ−ＣＳＦＲシグナルペプチドをコードする配列を含みうる。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８αシグナルペプチドをコードする配列を含みうる。ある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはＧＭ−ＣＳＦＲ膜貫通ドメインをコードする配列を含みうる。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインをコードする配列を含みうる。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、エンドドメインは、ヒトＣＤ３ζエンドドメインを含みうる。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ヒト４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ−４０細胞内セグメント、またはそれらの任意の組合せを含みうる。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＣＤ２８および／または４−１ＢＢ共刺激ドメインを含みうる。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、ヒンジは、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、および／またはＣＤ４配列に由来する配列を含みうる。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態では、ヒンジは、ヒトＣＤ８α配列に由来する配列を含みうる。
【００２７】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポゾンをコードする組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列は、キメラ抗原受容体をコードする配列またはその一部分をさらに含む。キメラ抗原受容体をコードする配列の一部分は、抗原認識領域をコードしてもよい。抗原認識領域は、１つまたは複数の相補性決定領域を含みうる。抗原認識領域は、抗体、抗体模倣物、タンパク質足場、またはそれらの断片を含みうる。ある特定の実施形態では、抗体は、キメラ抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。ある特定の実施形態では、抗体はアフィニティー調整されている（ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｔｕｎｅｄ）。本開示の抗体の非限定的な例としては、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ＶＨＨ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ）、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）分子、またはナノボディが挙げられる。ある特定の実施形態では、ＶＨＨはラクダ科抗体である。代替または追加として、ある特定の実施形態では、ＶＨＨはヒト化抗体である。本開示の抗体断片の非限定的な例としては、相補性決定領域、可変領域、重鎖、軽鎖、またはそれらの任意の組合せが挙げられる。本開示の抗体模倣物の非限定的な例としては、アフィボディ、アフィリン（afflilin）、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、およびアビマー、ＤＡＲＰｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、またはモノボディが挙げられる。本開示のタンパク質足場の非限定的な例としては、センチリン（Ｃｅｎｔｙｒｉｎ）が挙げられる。
【００２８】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＤＮＡ配列であり、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量、およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり１０．０μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、１００μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。
【００２９】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＤＮＡ配列であり、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量、およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり７．５μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、７５μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。
【００３０】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＤＮＡ配列であり、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量、およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり６．０μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、６０μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、トランスポサーゼはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼである。ある特定の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポサーゼはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  １００Ｘ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポサーゼである。
【００３１】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＤＮＡ配列であり、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量、およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり５．０μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、５０μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。
【００３２】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＤＮＡ配列であり、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量、およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり２．５μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、２５μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。
【００３３】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＤＮＡ配列であり、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量、およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり１．６７μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、１６．７μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、トランスポサーゼはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポサーゼである。
【００３４】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＤＮＡ配列であり、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量、およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり０．５５μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、５．５μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。
【００３５】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＤＮＡ配列であり、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量、およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり０．１９μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、１．９μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。
【００３６】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＤＮＡ配列であり、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量、およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり０．１０μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポサーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列の量およびトランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、１．０μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。
【００３７】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＲＮＡ配列であり、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり１０．０μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、１００μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。
【００３８】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＲＮＡ配列であり、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり７．５μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、７５μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。
【００３９】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＲＮＡ配列であり、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり６．０μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、６０μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、トランスポサーゼはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポサーゼである。ある特定の実施形態では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙトランスポサーゼはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  １００Ｘ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポサーゼである。
【００４０】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＲＮＡ配列であり、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり５．０μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、５０μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。
【００４１】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＲＮＡ配列であり、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり２．５μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、２５μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。
【００４２】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＲＮＡ配列であり、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり１．６７μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、１６．７μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、トランスポサーゼはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポサーゼである。
【００４３】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＲＮＡ配列であり、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり０．５５μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、５．５μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。
【００４４】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＲＮＡ配列であり、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり０．１９μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、１．９μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。
【００４５】
本開示の方法のある特定の実施形態では、トランスポサーゼ酵素をコードする核酸配列はＲＮＡ配列であり、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量は、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物１００μＬ当たり１．０μｇと等しいかまたはそれ未満である。ある特定の実施形態では、電気穿孔またはヌクレオフェクション反応物中の、トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列の量の濃度は、１．０μｇ／ｍＬと等しいかまたはそれ未満である。
【００４６】
本開示は、本開示の方法に従って改変された免疫細胞を提供する。免疫細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞でありうる。免疫細胞は、Ｃａｓ９またはＴＡＬＥ配列のいずれかに作動可能に連結したエンドヌクレアーゼを含む遺伝子編集ツールを含むがこれらに限定されない、第２の遺伝子編集ツールによってさらに改変されていてもよい。第２の遺伝子編集ツールのある特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、共有結合で、Ｃａｓ９またはＴＡＬＥ配列のいずれかに作動可能に連結している。第２の遺伝子編集ツールのある特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、非共有結合で、Ｃａｓ９またはＴＡＬＥ配列のいずれかに作動可能に連結している。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９は不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。ある特定の実施形態では、不活性化Ｃａｓ９は、触媒部位内にＤ１０ＡおよびＮ５８０Ａを含む。ある特定の実施形態では、Ｃａｓ９は小型の不活性化Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）である。ある特定の実施形態では、ｄＳａＣａｓ９は、
【化１】
2019506177.tif 000003
のアミノ酸配列を含む。
【００４７】
本開示は、本開示の方法に従って改変された免疫細胞を提供する。免疫細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞でありうる。免疫細胞は、Ｃａｓ９またはＴＡＬＥ配列のいずれかに作動可能に連結したエンドヌクレアーゼを含む遺伝子編集ツールを含むがこれらに限定されない、第２の遺伝子編集ツールによってさらに改変されていてもよい。代替または追加として、第２の遺伝子編集ツールは、挿入された配列またはその任意の一部分を再切除するための切除専用（ｅｘｃｉｓｉｏｎ−ｏｎｌｙ）ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼを含みうる。例えば、切除専用ｐｉｇｇｙＢａｃトランスポサーゼを使用して、トランスポゾンを「再切除」することができる。
【００４８】
本開示は、本開示の免疫細胞を含む組成物を提供する。
【００４９】
本開示は、それを必要とする被験体における疾患または障害の処置のための、本開示の免疫細胞を含む組成物の使用を提供する。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、がんである。ある特定の実施形態では、疾患または障害は、感染性疾患である。例えば、感染性疾患は、ウイルス、細菌、酵母、微生物、またはそれらの任意の組合せによって引き起こされうる。ある特定の実施形態では、組成物の免疫細胞は自家免疫細胞である。ある特定の実施形態では、組成物の免疫細胞は同種免疫細胞である。
【００５０】
本開示は、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはそれらの任意の組合せを含む、改変された免疫細胞の生存率を向上させるための培養培地を提供する。改変された免疫細胞は、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞でありうる。改変された免疫細胞は、１つまたは複数の外来性ＤＮＡ配列を含有しうる。改変された免疫細胞は、１つまたは複数の外来性ＲＮＡ配列を含有しうる。改変された免疫細胞は、電気穿孔またはヌクレオフェクトされていてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、初代ヒトＴリンパ球におけるプラスミドＤＮＡヌクレオフェクション後のトランスフェクション効率および細胞生存率を表す一連のグラフである。
【００５２】
【図２−１】図２は、Ｔ細胞に対するＤＮＡ細胞傷害を表す一連のグラフである。
【図２−２】図２は、Ｔ細胞に対するＤＮＡ細胞傷害を表す一連のグラフである。
【図２−３】図２は、Ｔ細胞に対するＤＮＡ細胞傷害を表す一連のグラフである。
【００５３】
【図３−１】図３は、Ｔ細胞におけるＤＮＡ媒介性細胞傷害が用量依存的であることを示す一連のグラフである。
【図３−２】図３は、Ｔ細胞におけるＤＮＡ媒介性細胞傷害が用量依存的であることを示す一連のグラフである。
【図３−３】図３は、Ｔ細胞におけるＤＮＡ媒介性細胞傷害が用量依存的であることを示す一連のグラフである。
【図３−４】図３は、Ｔ細胞におけるＤＮＡ媒介性細胞傷害が用量依存的であることを示す一連のグラフである。
【図３−５】図３は、Ｔ細胞におけるＤＮＡ媒介性細胞傷害が用量依存的であることを示す一連のグラフである。
【００５４】
【図４−１】図４は、細胞外プラスミドＤＮＡが細胞傷害性でないことを示す一連のグラフである。
【図４−２】図４は、細胞外プラスミドＤＮＡが細胞傷害性でないことを示す一連のグラフである。
【００５５】
【図５】図５は、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるｓＰＢｏ  ｍＲＮＡを使用した効率的な転位を表す一連のグラフである。
【００５６】
【図６】図６は、ｓＰＢｏ  ｍＲＮＡを使用したＴリンパ球における効率的な転位を表す一連のグラフである。
【００５７】
【図７】図７は、線状化ＤＮＡトランスポゾン産物の効率的な送達を表す一連のグラフである。
【００５８】
【図８−１】図８は、ヌクレオフェクション後のＩＬ−７およびＩＬ−１５の添加ならびにＴ細胞の即時刺激が細胞生存率を向上させることを示す一連のグラフである。
【図８−２】図８は、ヌクレオフェクション後のＩＬ−７およびＩＬ−１５の添加ならびにＴ細胞の即時刺激が細胞生存率を向上させることを示す一連のグラフである。
【図８−３】図８は、ヌクレオフェクション後のＩＬ−７およびＩＬ−１５の添加ならびにＴ細胞の即時刺激が細胞生存率を向上させることを示す一連のグラフである。
【図８−４】図８は、ヌクレオフェクション後のＩＬ−７およびＩＬ−１５の添加ならびにＴ細胞の即時刺激が細胞生存率を向上させることを示す一連のグラフである。
【図８−５】図８は、ヌクレオフェクション後のＩＬ−７およびＩＬ−１５の添加ならびにＴ細胞の即時刺激が細胞生存率を向上させることを示す一連のグラフである。
【図８−６】図８は、ヌクレオフェクション後のＩＬ−７およびＩＬ−１５の添加ならびにＴ細胞の即時刺激が細胞生存率を向上させることを示す一連のグラフである。
【図８−７】図８は、ヌクレオフェクション後のＩＬ−７およびＩＬ−１５の添加ならびにＴ細胞の即時刺激が細胞生存率を向上させることを示す一連のグラフである。
【図８−８】図８は、ヌクレオフェクション後のＩＬ−７およびＩＬ−１５の添加ならびにＴ細胞の即時刺激が細胞生存率を向上させることを示す一連のグラフである。
【図８−９】図８は、ヌクレオフェクション後のＩＬ−７およびＩＬ−１５の添加ならびにＴ細胞の即時刺激が細胞生存率を向上させることを示す一連のグラフである。
【図８−１０】図８は、ヌクレオフェクション後のＩＬ−７およびＩＬ−１５の添加ならびにＴ細胞の即時刺激が細胞生存率を向上させることを示す一連のグラフである。
【００５９】
【図９−１】図９は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５がＤＮＡ媒介毒性からＴ細胞をレスキューすることを示す一連のグラフである。
【図９−２】図９は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５がＤＮＡ媒介毒性からＴ細胞をレスキューすることを示す一連のグラフである。
【００６０】
【図１０−１】図１０は、ヌクレオフェクション後のＴ細胞の即時刺激が細胞生存率を向上させることを示す一連のグラフである。
【図１０−２】図１０は、ヌクレオフェクション後のＴ細胞の即時刺激が細胞生存率を向上させることを示す一連のグラフである。
【図１０−３】図１０は、ヌクレオフェクション後のＴ細胞の即時刺激が細胞生存率を向上させることを示す一連のグラフである。
【００６１】
【図１１−１】図１１Ａ〜Ｃは、様々な量のＤＮＡを用いたＴ細胞転位を表す一連のグラフである。ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）を使用し、初代ヒト汎Ｔ細胞に様々な量のＤＮＡをヌクレオフェクトした。Ｔ細胞には、示された量のトランスポゾンおよび５μｇのｓＰＢｏ  ｍＲＮＡをヌクレオフェクトした。次いで、ヌクレオフェクション後２日目に、細胞をＣＤ３およびＣＤ２８によって刺激した。予想通り、低いＤＮＡ用量ではエピソーム発現がほとんど観察されなかった一方で、高い量のＤＮＡをヌクレオフェクトしたＴ細胞は、ヌクレオフェクション後１日目に高いエピソーム発現を呈した。対照的に、ヌクレオフェクション後２１日目の増殖後では、導入遺伝子陽性細胞の最大の百分率は、より低いＤＮＡ量において観察され、このトランスポゾンでは１．６７μｇでピークになった。（Ａ）１日目および２１日目における導入遺伝子陽性細胞に関するフロー解析。（Ｂ）導入遺伝子陽性Ｔ細胞の百分率。（Ｃ）１日目および２１日目における生存Ｔ細胞の百分率。この図に示される全てのグラフに関し、Ｙ軸は、２０％きざみで０〜１００％の範囲であり、Ｘ軸は、１０の累乗で０〜１０５の範囲である。
【図１１−２】図１１Ａ〜Ｃは、様々な量のＤＮＡを用いたＴ細胞転位を表す一連のグラフである。ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）を使用し、初代ヒト汎Ｔ細胞に様々な量のＤＮＡをヌクレオフェクトした。Ｔ細胞には、示された量のトランスポゾンおよび５μｇのｓＰＢｏ  ｍＲＮＡをヌクレオフェクトした。次いで、ヌクレオフェクション後２日目に、細胞をＣＤ３およびＣＤ２８によって刺激した。予想通り、低いＤＮＡ用量ではエピソーム発現がほとんど観察されなかった一方で、高い量のＤＮＡをヌクレオフェクトしたＴ細胞は、ヌクレオフェクション後１日目に高いエピソーム発現を呈した。対照的に、ヌクレオフェクション後２１日目の増殖後では、導入遺伝子陽性細胞の最大の百分率は、より低いＤＮＡ量において観察され、このトランスポゾンでは１．６７μｇでピークになった。（Ａ）１日目および２１日目における導入遺伝子陽性細胞に関するフロー解析。（Ｂ）導入遺伝子陽性Ｔ細胞の百分率。（Ｃ）１日目および２１日目における生存Ｔ細胞の百分率。この図に示される全てのグラフに関し、Ｙ軸は、２０％きざみで０〜１００％の範囲であり、Ｘ軸は、１０の累乗で０〜１０５の範囲である。
【図１１−３】図１１Ａ〜Ｃは、様々な量のＤＮＡを用いたＴ細胞転位を表す一連のグラフである。ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）を使用し、初代ヒト汎Ｔ細胞に様々な量のＤＮＡをヌクレオフェクトした。Ｔ細胞には、示された量のトランスポゾンおよび５μｇのｓＰＢｏ  ｍＲＮＡをヌクレオフェクトした。次いで、ヌクレオフェクション後２日目に、細胞をＣＤ３およびＣＤ２８によって刺激した。予想通り、低いＤＮＡ用量ではエピソーム発現がほとんど観察されなかった一方で、高い量のＤＮＡをヌクレオフェクトしたＴ細胞は、ヌクレオフェクション後１日目に高いエピソーム発現を呈した。対照的に、ヌクレオフェクション後２１日目の増殖後では、導入遺伝子陽性細胞の最大の百分率は、より低いＤＮＡ量において観察され、このトランスポゾンでは１．６７μｇでピークになった。（Ａ）１日目および２１日目における導入遺伝子陽性細胞に関するフロー解析。（Ｂ）導入遺伝子陽性Ｔ細胞の百分率。（Ｃ）１日目および２１日目における生存Ｔ細胞の百分率。この図に示される全てのグラフに関し、Ｙ軸は、２０％きざみで０〜１００％の範囲であり、Ｘ軸は、１０の累乗で０〜１０５の範囲である。
【００６２】
【図１２−１】図１２Ａ〜Ｂは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（商標）１００Ｘ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポサーゼを使用した低いＤＮＡ量によるＴ細胞転位を表す一連のグラフである。初代ヒト汎Ｔ細胞に、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）またはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（商標）（ＳＢ）のいずれかのＩＴＲをコードするＧＦＰプラスミドをヌクレオフェクトした。（Ａ）細胞には、示された量のＳＢトランスポゾンおよび１μｇのＳＢトランスポサーゼｍＲＮＡをヌクレオフェクトした。（Ｂ）細胞には、示された量のＳＢトランスポサーゼおよび０．７５μｇのＳＢトランスポゾンをヌクレオフェクトした。全ての試料でヌクレオフェクション後１４日目にフロー解析を行った。この図に示される全てのグラフに関し、Ｙ軸は、５０Ｋきざみで０〜２５０Ｋの範囲であり、Ｘ軸は、１０の累乗で０〜１０５の範囲である。
【図１２−２】図１２Ａ〜Ｂは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（商標）１００Ｘ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポサーゼを使用した低いＤＮＡ量によるＴ細胞転位を表す一連のグラフである。初代ヒト汎Ｔ細胞に、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）またはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（商標）（ＳＢ）のいずれかのＩＴＲをコードするＧＦＰプラスミドをヌクレオフェクトした。（Ａ）細胞には、示された量のＳＢトランスポゾンおよび１μｇのＳＢトランスポサーゼｍＲＮＡをヌクレオフェクトした。（Ｂ）細胞には、示された量のＳＢトランスポサーゼおよび０．７５μｇのＳＢトランスポゾンをヌクレオフェクトした。全ての試料でヌクレオフェクション後１４日目にフロー解析を行った。この図に示される全てのグラフに関し、Ｙ軸は、５０Ｋきざみで０〜２５０Ｋの範囲であり、Ｘ軸は、１０の累乗で０〜１０５の範囲である。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
免疫細胞のｅｘ−ｖｉｖｏ遺伝子改変のための組成物および方法であって、免疫細胞に、（ａ）トランスポサーゼ酵素をコードする配列を含む核酸配列またはアミノ酸配列と、（ｂ）トランスポゾンをコードするＤＮＡ配列を含む組換えの天然に存在しないＤＮＡ配列とを送達するステップを含む、組成物および方法が開示される。ある特定の実施形態では、本方法は、免疫細胞を１つまたは複数のサイトカインで刺激するステップをさらに含む。
【００６４】
本開示のセンチリンは、タンパク質足場を含む場合があり、この足場には、抗原に特異的に結合する能力がある。本開示のセンチリンは、少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含むタンパク質足場を含んでもよく、この足場には、抗原に特異的に結合する能力がある。少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインは、ヒトタンパク質に由来してもよい。ヒトタンパク質は、テネイシンＣでありうる。コンセンサス配列は、LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号５）またはMLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号６）を含みうる。コンセンサス配列は、LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号５）またはMLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号６）と少なくとも７４％同一のアミノ配列（an  amino  sequence）を含みうる。コンセンサス配列は、atgctgcctgcaccaaagaacctggtggtgtctcatgtgacagaggatagtgccagactgtcatggactgctcccgacgcagccttcgatagttttatcatcgtgtaccgggagaacatcgaaaccggcgaggccattgtcctgacagtgccagggtccgaacgctcttatgacctgacagatctgaagcccggaactgagtactatgtgcagatcgccggcgtcaaaggaggcaatatcagcttccctctgtccgcaatcttcaccaca（配列番号７）を含む核酸配列によってコードされうる。コンセンサス配列は、（ａ）コンセンサス配列の１３〜１６位における、アミノ酸残基ＴＥＤＳ（配列番号８）を含むか、またはそれからなるＡ−Ｂループ；（ｂ）コンセンサス配列の２２〜２８位における、アミノ酸残基ＴＡＰＤＡＡＦ（配列番号９）を含むか、またはそれからなるＢ−Ｃループ；（ｃ）コンセンサス配列の３８〜４３位における、アミノ酸残基ＳＥＫＶＧＥ（配列番号１０）を含むか、またはそれからなるＣ−Ｄループ；（ｄ）コンセンサス配列の５１〜５４位における、アミノ酸残基ＧＳＥＲ（配列番号１１）を含むか、またはそれからなるＤ−Ｅループ；（ｅ）コンセンサス配列の６０〜６４位における、アミノ酸残基ＧＬＫＰＧ（配列番号１２）を含むか、またはそれからなるＥ−Ｆループ；（ｆ）コンセンサス配列の７５〜８１位における、アミノ酸残基ＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号１３）を含むか、またはそれからなるＦ−Ｇループ；または（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の任意の組合せ内の、１つまたは複数の位置において改変されていてもよい。本開示のセンチリンは、少なくとも５個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、少なくとも１０個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、または少なくとも１５個のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含んでもよい。足場は、１０−９Ｍ未満かまたはそれと等しいＫＤ、１０−１０Ｍ未満かまたはそれと等しいＫＤ、１０−１１Ｍ未満かまたはそれと等しいＫＤ、１０−１２Ｍ未満かまたはそれと等しいＫＤ、１０−１３Ｍ未満かまたはそれと等しいＫＤ、１０−１４Ｍ未満かまたはそれと等しいＫＤ、および１０−１５Ｍ未満かまたはそれと等しいＫＤから選択される、少なくとも１つのアフィニティーで、抗原に結合することができる。ＫＤは、表面プラズモン共鳴によって決定することができる。
【００６５】
「抗体模倣物」という用語は、標的配列に特異的に結合し、かつ天然に存在する抗体と明確に異なる構造を有する有機化合物を記述することを意図する。抗体模倣物は、タンパク質、核酸、または小分子を含みうる。本開示の抗体模倣物が特異的に結合する標的配列は、抗原でありうる。抗体模倣物は、優れた溶解性、組織透過、熱および酵素に対する安定性（例えば、酵素的分解への耐性）、ならびにより低い生産コストを含むがこれらに限定されない、抗体と比べて優れた特性を提供しうる。例示的な抗体模倣物としては、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、およびアビマー（アビディティーマルチマーとしても公知）、ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリン反復タンパク質（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ａｎｋｙｒｉｎ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ））、Ｆｙｎｏｍｅｒ、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、およびモノボディが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本開示のアフィボディ分子は、ジスルフィド架橋が全くない１つまたは複数のアルファヘリックスを含むか、またはそれからなる、タンパク質足場を含む。好ましくは、本開示のアフィボディ分子は、３つのアルファヘリックスを含むか、またはそれからなる。例えば、本開示のアフィボディ分子は、免疫グロブリン結合ドメインを含みうる。本開示のアフィボディ分子は、プロテインＡのＺドメインを含んでもよい。
【００６７】
本開示のアフィリン分子は、例えば、ガンマＢクリスタリンまたはユビキチンの、露出したアミノ酸の改変によって産生される、タンパク質足場を含む。アフィリン分子は、抗原に対する抗体のアフィニティーを機能的に模倣するが、抗体を構造的には模倣しない。アフィリンを作製するために使用される任意のタンパク質足場において、適切にフォールディングされたタンパク質分子中の、溶媒または可能性のある結合パートナーにアクセス可能であるアミノ酸は、露出したアミノ酸と考えられる。これらの露出したアミノ酸のうちのいずれか１つまたは複数が、標的配列または抗原に特異的に結合するように改変されていてよい。
【００６８】
本開示のアフィマー分子は、特異的な標的配列のための高アフィニティー結合部位をもたらすペプチドループを提示するように操作された、高度に安定なタンパク質を含むタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、シスタチンタンパク質またはその三次構造に基づくタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、逆平行ベータシートの上に位置するアルファヘリックスを含む共通の三次構造を共有しうる。
【００６９】
本開示のアフィチン分子は、人工タンパク質足場を含み、その構造は、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄ）に由来してもよい。本開示のアフィチンは、抗原の全体または一部でありうる標的配列に選択的に結合する。本開示の例示的なアフィチンは、ＤＮＡ結合タンパク質の結合表面上の１つまたは複数のアミノ酸配列をランダム化し、結果として生じたタンパク質をリボソームディスプレイおよび選択に供することによって製造される。本開示のアフィチンの標的配列は、例えば、ゲノム内、またはペプチド、タンパク質、ウイルス、もしくは細菌の表面上に見出されうる。本開示のある特定の実施形態では、アフィチン分子は、酵素の特異的阻害剤として使用されてもよい。本開示のアフィチン分子は、耐熱性タンパク質またはその誘導体を含みうる。
【００７０】
本開示のアルファボディ分子は、細胞透過性アルファボディ（ＣＰＡＢ）と称される場合もある。本開示のアルファボディ分子は、多様な標的配列（抗原を含む）に結合する小タンパク質（典型的には１０ｋＤａ未満）を含む。アルファボディ分子には、細胞内標的配列に達し、それに結合する能力がある。構造的に、本開示のアルファボディ分子は、単鎖アルファヘリックス（天然に存在するコイルドコイル構造に類似）を形成する人工配列を含む。本開示のアルファボディ分子は、標的タンパク質に特異的に結合するように改変されている１つまたは複数のアミノ酸を含むタンパク質足場を含みうる。分子の結合特異性にかかわらず、本開示のアルファボディ分子は、正しいフォールディングおよび熱安定性を維持する。
【００７１】
本開示のアンチカリン分子は、タンパク質または小分子のいずれかにおける標的配列または部位に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアンチカリン分子は、ヒトリポカリンに由来する人工タンパク質を含みうる。本開示のアンチカリン分子は、例えば、モノクローナル抗体またはその断片の代わりに使用されてもよい。アンチカリン分子は、モノクローナル抗体またはその断片よりも優れた組織透過および熱安定性を明示しうる。本開示の例示的なアンチカリン分子は、およそ２０ｋＤａの質量を有し、約１８０アミノ酸を含みうる。構造的に、本開示のアンチカリン分子は、ループが接続しアルファヘリックスが結合したペアワイズの逆平行ベータ鎖を含むバレル構造を含む。好ましい実施形態では、本開示のアンチカリン分子は、ループが接続しアルファヘリックスが結合したペアワイズの８つの逆平行ベータ鎖を含むバレル構造を含む。
【００７２】
本開示のアビマー分子は、標的配列（これは抗原でもありうる）に特異的に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアビマーは、同じ標的内または明確に異なる標的内の複数の結合部位を認識しうる。本開示のアビマーが１つより多くの標的を認識する場合、このアビマーは、二重特異性抗体の機能を模倣する。人工タンパク質アビマーは、それぞれおよそ３０〜３５アミノ酸の、２つまたはそれよりも多くのペプチド配列を含みうる。これらのペプチドは、１つまたは複数のリンカーペプチドを介して接続されていてもよい。アビマーのペプチドのうちの１つまたは複数のアミノ酸配列は、膜受容体のＡドメインに由来してもよい。アビマーは、ジスルフィド結合および／またはカルシウムを任意選択で含みうる強固な構造を有する。本開示のアビマーは、抗体と比較して高い熱安定性を明示しうる。
【００７３】
本開示のＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリン反復タンパク質）は、標的配列に対して高い特異性および高いアフィニティーを有する、遺伝子操作されたタンパク質、組換えタンパク質、またはキメラタンパク質を含む。ある特定の実施形態では、本開示のＤＡＲＰｉｎは、アンキリンタンパク質に由来し、任意選択で、アンキリンタンパク質の少なくとも３つの反復モチーフ（反復構造単位とも称される）を含む。アンキリンタンパク質は、高アフィニティーのタンパク質間相互作用を媒介する。本開示のＤＡＲＰｉｎは、大きな標的相互作用表面を含む。
【００７４】
本開示のＦｙｎｏｍｅｒは、ヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに由来し、抗体と等しいアフィニティーおよび等しい特異性で標的配列および分子に結合するように操作された、小さな結合タンパク質（約７ｋＤａ）を含む。
【００７５】
本開示のＫｕｎｉｔｚドメインペプチドは、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質足場を含む。Ｋｕｎｉｔｚドメインは、プロテアーゼ活性を阻害するための活性部位を含む。構造的に、本開示のＫｕｎｉｔｚドメインは、ジスルフィドに富むアルファ＋ベータフォールドを含む。この構造は、ウシ膵臓トリプシンインヒビターにより例示される。Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチドは、特異的なタンパク質構造を認識し、競合的プロテアーゼインヒビターとして働く。本開示のＫｕｎｉｔｚドメインは、エカランチド（ヒトリポタンパク質関連凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）由来）を含みうる。
【００７６】
本開示のモノボディは、サイズにおいて単鎖抗体と同等の小タンパク質である（約９４個のアミノ酸を含み、約１０ｋＤａの質量を有する）。これらの遺伝子操作されたタンパク質は、抗原を含む標的配列に特異的に結合する。本開示のモノボディは、１つまたは複数の明確に異なるタンパク質または標的配列を特異的に標的としうる。好ましい実施形態では、本開示のモノボディは、ヒトフィブロネクチンの構造を模倣し、より好ましくはフィブロネクチンの１０番目の細胞外ＩＩＩ型ドメインの構造を模倣する、タンパク質足場を含む。フィブロネクチンの１０番目の細胞外ＩＩＩ型ドメインおよびそのモノボディ模倣物は、抗体の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する各側面に、バレルを形成する７つのベータシートおよび３つの露出したループを含有する。抗体の可変ドメインの構造とは対照的に、モノボディは、金属イオンのための結合部位ならびに中央のジスルフィド結合を欠いている。多特異性モノボディは、ループＢＣおよびＦＧを改変することにより最適化することができる。本開示のモノボディは、アドネクチンを含んでもよい。
【００７７】
本開示全体において使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数形は、文脈による明確な別段の指示がない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「方法（ａ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、複数のかかる方法を含み、「用量（ａ  ｄｏｓｅ）」への言及は、１つまたは複数の用量および当業者に公知であるその均等物への言及を含むなどということである。
【００７８】
「約」または「およそ」という用語は、当業者により決定される特定の値に関する許容される誤差範囲内を意味し、これは、その値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定系の限界に部分的に依存する。例えば、「約」は、１またはそれよりも多い標準偏差内を意味しうる。代替として、「約」は、所与の値の２０％まで、または１０％まで、または５％まで、または１％までの範囲を意味しうる。代替として、特に生物系または生物学的プロセスに関して、この用語は、値の一桁分以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味しうる。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記述されている場合、別段明記されない限り、「約」という用語は特定の値に関する許容される誤差範囲内を意味することを前提とすべきである。
【００７９】
本開示は、単離された、または実質的に精製された、ポリヌクレオチドまたはタンパク質組成物を提供する。「単離された」もしくは「精製された」ポリヌクレオチドもしくはタンパク質、またはそれらの生物学的に活性な部分は、その天然に存在する環境において見出されるポリヌクレオチドもしくはタンパク質に通常付随するか、またはそれらと相互作用する構成要素を、実質的にまたは本質的に含まない。したがって、単離または精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え技術によって産生された場合、他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まないか、または、化学合成された場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。最適には、「単離された」ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて天然にそのポリヌクレオチドに隣接する配列（すなわち、そのポリヌクレオチドの５’および３’末端に位置する配列）（最適には、タンパク質をコードする配列）を含まない。例えば、種々の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて天然にそのポリヌクレオチドに隣接するヌクレオチド配列を、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満含有してもよい。細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満（乾燥重量基準）の混入タンパク質を有するタンパク質の調製物を含む。本発明のタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え産生される場合、培養培地は、化学的前駆体または目的のタンパク質ではない化学物質が約３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満（乾燥重量基準）に相当するのが最適である。
【００８０】
本開示は、開示されるＤＮＡ配列の断片およびバリアントならびにこれらのＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質を提供する。本開示全体において使用される場合、「断片」という用語は、ＤＮＡ配列の一部分またはアミノ酸配列の一部分、したがってそれらによってコードされるタンパク質を指す。コード配列を含むＤＮＡ配列の断片は、天然タンパク質の生物学的活性を保持するタンパク質断片をコードし、したがって本明細書に記述される標的ＤＮＡ配列へのＤＮＡ認識または結合活性をコードしうる。代替として、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なＤＮＡ配列の断片は、一般に、生物学的活性を保持するタンパク質をコードせず、またはプロモーター活性を保持しない。したがって、ＤＮＡ配列の断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから、本発明の全長ポリヌクレオチドまでの範囲でありうる。
【００８１】
本開示の核酸またはタンパク質は、後に最終目的のベクターへとアセンブルされうる標的ベクターにおいて単量体単位および／または反復単位をプリアセンブルすることを含むモジュラーアプローチによって構築することができる。本開示のポリペプチドは、本開示の反復単量体を含んでよく、後に最終目的のベクターへとアセンブルされうる標的ベクターにおいて反復単位をプリアセンブルすることによるモジュラーアプローチによって構築することができる。本開示は、本方法によって産生されたポリペプチドのほか、これらのポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本開示は、このモジュラーアプローチによって産生されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む宿主生物および細胞を提供する。
【００８２】
「抗体」という用語は、最も広い意味において使用され、単一モノクローナル抗体（アゴニスト抗体およびアンタゴニスト抗体を含む）および多エピトープ特異性を有する抗体組成物を明確に含む。また、本明細書において定義される本発明の抗体の天然または合成の類似体、変異体、バリアント、対立遺伝子、ホモログ、およびオルソログ（本明細書では集合的に「類似体」と称される）を使用することも本発明の範囲内である。したがって、本発明の一実施形態によれば、「本発明の抗体」という用語は、その最も広い意味において、そのような類似体も含む。一般に、そのような類似体では、本明細書において定義される本発明の抗体と比較して、１つまたは複数のアミノ酸残基が、置き換えられ、欠失し、かつ／または付加されていてもよい。
【００８３】
本明細書において使用される「抗体断片」およびそのあらゆる文法的な変化形は、無傷抗体の抗原結合部位または可変領域を含む無傷抗体の一部分であって、無傷抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含まない一部分と定義される。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；限定されないが、（１）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（２）軽鎖可変ドメインを１つだけ含有する単鎖ポリペプチド、または関連した重鎖部分のない軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するその断片、および（３）重鎖可変領域を１つだけ含有する単鎖ポリペプチド、または関連した軽鎖部分のない重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するその断片を含む、連続したアミノ酸残基の１つの中断されていない配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（本明細書では「単鎖抗体断片」または「単鎖ポリペプチド」と称される）；ならびに抗体断片から形成された多特異性または多価の構造が挙げられる。１つまたは複数の重鎖を含む抗体断片において、重鎖（複数可）は、無傷抗体の非Ｆｃ領域内に見出される任意の定常ドメイン配列（例えばＩｇＧアイソタイプにおけるＣＨＩ）を含有することができ、かつ／または、無傷抗体内に見出される任意のヒンジ領域配列を含有することができ、かつ／または、ヒンジ領域配列もしくは重鎖（複数可）の定常ドメイン配列に融合した、もしくはその中に位置した、ロイシンジッパー配列を含有することができる。この用語は、単一の単量体可変抗体ドメイン（例えば、ラクダ科由来）を有する抗体断片を一般に指す単一ドメイン抗体（「ｓｄＡＢ」）をさらに含む。そのような抗体断片のタイプは、当業者には容易に理解されよう。
【００８４】
「結合」とは、高分子間の（例えば、タンパク質と核酸との間の）配列特異的で非共有結合性相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合性相互作用の全ての構成要素が配列特異的である（例えば、ＤＮＡ骨格内のリン酸残基と接触する）必要はない。
【００８５】
「含む」という用語は、組成物および方法が、列挙された要素を含むが他を除外しないことを意味するよう意図される。組成物および方法を定義するために使用される場合の「から本質的になる」とは、意図される目的のために使用されるとき、組合せに対していずれかの本質的な重要性をもつ他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書において定義される要素から本質的になる組成物は、微量の混入物または不活性担体を除外しない。「からなる」とは、他の成分の微量要素より多くの要素および実質的な方法ステップより多くのステップを除外することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。
【００８６】
「エピトープ」という用語は、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、そのエピトープに特有である空間的立体構造内に３つのアミノ酸を含む場合がある。一般に、エピトープは、少なくとも４、５、６、または７個のかかるアミノ酸からなり、より一般的には、少なくとも８、９、または１０個のかかるアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的立体構造を決定する方法は当技術分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴を含む。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡが後にペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含みうる。
【００８８】
「遺伝子発現」とは、遺伝子内に含有された情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、構造ＲＮＡ、または任意の他のタイプのＲＮＡ）であってもよく、またはｍＲＮＡの翻訳により産生されたタンパク質であってもよい。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスにより改変されたＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化（myristilation）、およびグリコシル化によって改変されたタンパク質も含む。
【００８９】
遺伝子発現の「モジュレーション」または「調節」とは、遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションとしては、遺伝子の活性化および遺伝子の抑制を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００９０】
「動作可能に連結した」という用語またはその均等物（例えば、「作用的に連結している（linked  operatively）」）は、２つまたはそれよりも多くの分子が相互作用して、一方もしくは両方の分子またはそれらの組合せに起因しうる機能に影響をもたらすことができるように、それらが互いに対して位置していることを意味する。
【００９１】
非共有結合で連結した構成要素、ならびに非共有結合で連結した構成要素の作製および使用の方法が開示される。種々の構成要素は、本明細書に記述される多様な異なる形態をとることができる。例えば、非共有結合で連結した（すなわち、作用的に連結した）タンパク質を使用すると、当技術分野における１つまたは複数の問題を回避する一時的な相互作用が可能になりうる。非共有結合で連結した構成要素、例えばタンパク質の、会合および解離する能力は、かかる会合が所望の活性のために必要な状況下でのみ、または主にそのような状況下で、機能的会合を可能にする。結合は、所望の効果を可能にするのに十分な持続時間のものでありうる。
【００９２】
生物のゲノム内の特異的遺伝子座にタンパク質を方向付けるための方法が開示される。本方法は、ＤＮＡ局在化成分を用意するステップと、エフェクター分子を用意するステップとを含んでよく、このＤＮＡ局在化成分およびエフェクター分子は、非共有結合による結合によって動作可能に連結することができる。
【００９３】
「ｓｃＦｖ」という用語は、単鎖可変断片を指す。ｓｃＦｖは、リンカーペプチドで接続された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーペプチドは、約５〜４０アミノ酸、または約１０〜３０アミノ酸、または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、もしくは４０アミノ酸の長さでありうる。単鎖可変断片は、完全な抗体分子内に見出される定常Ｆｃ領域、したがって、抗体を精製するために使用される一般的な結合部位（例えば、プロテインＧ）を欠いている。この用語は、イントラボディ、すなわち細胞の細胞質内で安定であり、細胞内タンパク質に結合しうる抗体である、ｓｃＦｖをさらに含む。
【００９４】
「単一ドメイン抗体」という用語は、特異的抗原に選択的に結合することができる、単一の単量体可変抗体ドメインを有する抗体断片を意味する。単一ドメイン抗体は一般に、全抗体と同様な抗原に対するアフィニティーを有するが、より耐熱性があり、洗剤および高濃度の尿素に対して安定である、重鎖抗体の、または一般的なＩｇＧの、１つの可変ドメイン（ＶＨ）を含む、約１１０アミノ酸長のペプチド鎖である。例は、ラクダ科抗体または魚類抗体に由来するものである。代替として、単一ドメイン抗体は、４つの鎖を有する一般的なマウスまたはヒトＩｇＧから作製することができる。
【００９５】
本明細書で使用される「特異的に結合する」および「特異的結合」という用語は、抗体、抗体断片、またはナノボディが、異なる抗原の均質混合物中に存在する特定の抗原に優先的に結合する能力を指す。ある特定の実施形態では、特異的結合相互作用は、試料中の望ましい抗原と望ましくない抗原とを、一部の実施形態では約１０倍から１００倍超、またはそれよりも多く（例えば、約１０００倍または１０，０００倍超）識別する。「特異性」とは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片、例えばナノボディが、異なる抗原性標的と対比して１つの抗原性標的に優先的に結合する能力を指し、必ずしも高いアフィニティーを暗示するものではない。
【００９６】
「標的部位」または「標的配列」とは、結合のための十分な条件が存在することを条件として、結合性分子が結合する核酸の一部分を定義する核酸配列である。
【００９７】
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」という用語は、共有結合で一緒に連結した少なくとも２つのヌクレオチドを指す。一本鎖の表現は、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、表された一本鎖の相補鎖も包含しうる。本開示の核酸は、同じ構造を保持するかまたは同じタンパク質をコードする、実質的に同一な核酸およびその相補体も包含する。
【００９８】
本開示のプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズすることができる一本鎖核酸を含みうる。したがって、本開示の核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを指す場合がある。
【００９９】
本開示の核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。本開示の核酸は、分子の大部分が一本鎖である場合でさえ、二本鎖配列を含有しうる。本開示の核酸は、分子の大部分が二本鎖である場合でさえ、一本鎖配列を含有しうる。本開示の核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッドを含みうる。本開示の核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組合せを含有しうる。本開示の核酸は、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組合せを含有しうる。本開示の核酸は、非天然アミノ酸改変を含むように合成されてもよい。本開示の核酸は、化学合成法または組換え法によって得ることができる。
【０１００】
本開示の核酸は、その配列全体かまたはその任意の一部分のいずれであっても、天然に存在しないものでもよい。本開示の核酸は、核酸配列全体を天然に存在しないものにする、天然に存在しない１つまたは複数の変異、置換、欠失、または挿入を含有しうる。本開示の核酸は、核酸配列全体を天然に存在しないものにして、結果として生じるその配列が天然に存在しない、１つまたは複数の重複配列、逆位配列、または反復配列を含有してもよい。本開示の核酸は、核酸配列全体を天然に存在しないものにする、天然に存在しない改変ヌクレオチド、人工ヌクレオチド、または合成ヌクレオチドを含有してもよい。
【０１０１】
遺伝コードにおける冗長性を考慮すると、複数のヌクレオチド配列は、いずれの特定のタンパク質をコードしてもよい。そのようなヌクレオチド配列は全て、本明細書において想定される。
【０１０２】
本開示全体において使用される場合、「作動可能に連結した」という用語は、空間的に接続しているプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を指す。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置しうる。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターと、そのプロモーターが由来する遺伝子においてそれが制御する遺伝子との間の距離と、およそ同じでありうる。プロモーターと遺伝子との間の距離の変動は、プロモーター機能を損失させずに適応させることができる。
【０１０３】
本開示全体において使用される場合、「プロモーター」という用語は、細胞内の核酸の発現をもたらすか、活性化させるか、または向上させる能力がある、合成または天然由来の分子を指す。プロモーターは、発現をさらに向上させ、かつ／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を変更させる、１つまたは複数の特異的な転写調節配列を含みうる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千個ほどの塩基対分の位置にありうる遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含んでもよい。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源に由来してよい。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは臓器に関して、または発現が生じる発生段階に関して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外的刺激に応答して、構成的または差次的に、遺伝子構成要素の発現を調節することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが挙げられる。
【０１０４】
本開示全体において使用される場合、「実質的に相補的な」という用語は、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、もしくはそれよりも多くのヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％同一であること、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを指す。
【０１０５】
本開示全体において使用される場合、「実質的に同一な」という用語は、第１および第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０もしくはそれよりも多くのヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、または第１の配列が第２の配列の相補体に対して実質的に相補的である場合は核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であることを指す。
【０１０６】
本開示全体において使用される場合、核酸を記述するために使用されるときの「バリアント」という用語は、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の一部分もしくは断片、（ｉｉ）参照されるヌクレオチド配列もしくはその一部分の相補体、（ｉｉｉ）参照される核酸もしくはその相補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）参照される核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を指す。
【０１０７】
本開示全体において使用される場合、「ベクター」という用語は、複製起点を含有する核酸配列を指す。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体でありうる。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってもよい。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであってもよく、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。ベクターは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、またはＤＮＡおよびＲＮＡ配列の両方との、アミノ酸の組合せを含みうる。
【０１０８】
本開示全体において使用される場合、ペプチドまたはポリペプチドを記述するために使用されるときの「バリアント」という用語は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によりアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを指す。バリアントはまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照されるタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味しうる。
【０１０９】
アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、当技術分野において、典型的にわずかな変化を伴うものとして認識されている。これらのわずかな変化は、当技術分野において理解されているように、部分的には、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮に入れることにより同定することができる。Kyteら、J.  Mol.  Biol.、１５７巻：１０５〜１３２頁（１９８２年）。アミノ酸のヒドロパシー指数は、その疎水性および荷電の検討事項に基づく。類似のヒドロパシー指数のアミノ酸は、置換してもタンパク質機能を保持することができる。一態様では、±２のヒドロパシー指数を有するアミノ酸が置換される。生物学的機能を保持するタンパク質をもたらす置換を明らかにするためには、アミノ酸の親水性を使用することもできる。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の検討事項は、抗原性および免疫原性と深く相関すると報告されている有用な指標である、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にする。参照により本明細書に完全に援用される、米国特許第４，５５４，１０１号。
【０１１０】
類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらしうる。置換は、互いの±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて行うことができる。アミノ酸の疎水性（hyrophobicity）指数および親水性値はいずれも、そのアミノ酸の特定の側鎖に影響される。その観察と一致して、生物学的機能と適合性があるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、荷電、サイズ、および他の特性により明らかにされる、アミノ酸の相対的類似性、特にこれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「保存的」アミノ酸置換とは、以下の表Ａ、Ｂ、またはＣに記載のように定義することができる。一部の実施形態では、融合ポリペプチドおよび／またはかかる融合ポリペプチドをコードする核酸は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの改変により導入された保存的置換を含む。アミノ酸は、物理的特性、ならびに二次および三次タンパク質構造への寄与によって分類することができる。保存的置換とは、１つのアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸への置換である。例示的な保存的置換を表Ａに記載する。
【０１１２】
【表Ａ】
2019506177.tif 000004
【０１１３】
代替として、保存的アミノ酸は、Lehninger、（Biochemistry、第２版；Worth  Publishers,  Inc.  NY、N.Y.（１９７５年）、７１〜７７頁）に記述されているように、表Ｂに記載のようにグループ分けすることができる。
【０１１４】
【表Ｂ】
2019506177.tif 000005
【０１１５】
代替として、例示的な保存的置換を表Ｃに記載する。
【０１１６】
【表Ｃ】
2019506177.tif 000006
【０１１７】
本開示のポリペプチドは、アミノ酸残基の１つまたは複数の挿入、欠失、もしくは置換、またはそれらの任意の組合せ、ならびにアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の改変を保有するポリペプチドを含むよう意図されることを理解されたい。本開示のポリペプチドまたは核酸は、１つまたは複数の保存的置換を含有しうる。
【０１１８】
本開示全体において使用される場合、前述のアミノ酸置換の「１つより多く」という用語は、列挙されたアミノ酸置換の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個、またはそれよりも多くを指す。「１つより多く」という用語は、列挙されたアミノ酸置換の２、３、４、または５個を指す場合がある。
【０１１９】
本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、その配列全体にしろ、そのいずれか一部分にしろ、天然に存在しない場合がある。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸配列全体を天然に存在しないものにする、天然に存在しない１つまたは複数の変異、置換、欠失、または挿入を含有しうる。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸配列全体を天然に存在しないものにして、その結果として生じる配列が天然に存在しない、１つまたは複数の重複配列、逆位配列、または反復配列を含有してもよい。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸配列全体を天然に存在しないものにする、天然に存在しない改変アミノ酸、人工アミノ酸、または合成アミノ酸を含有してもよい。
【０１２０】
本開示全体において使用される場合、「配列同一性」は、デフォルトパラメータを使用し、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のｆｔｐサイトから検索することができる、２つの配列をブラストするためのスタンドアロンで実行可能なＢＬＡＳＴエンジンプログラム（ｂｌ２ｓｅｑ）を使用することにより、決定することができる（TatusovaおよびMadden、FEMS  Microbiol  Lett.、１９９９年、１７４巻、２４７〜２５０頁；これは、参照により本明細書にその全体が援用される）。「同一な」または「同一性」という用語は、２つまたはそれよりも多くの核酸またはポリペプチド配列の文脈において使用される場合、それぞれの配列の特定された領域にかけて同じである残基の特定の百分率（specified  percentage）を指す。この百分率は、２つの配列を最適にアラインし、特定された領域にかけて２つの配列を比較し、両配列において同一の残基が存在する位置の数を決定し、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を特定された領域内の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性の百分率を得ることによって、計算することができる。２つの配列の長さが異なるか、またはアライメントが１つもしくは複数の付着末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｎｄ）をもたらし、比較の特定された領域が単一の配列しか含まない場合、単一の配列の残基は、計算の分子ではなく分母内に含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較するとき、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は均等物と考えることができる。同一性は、手作業で行ってもよく、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ  ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することにより行ってもよい。
【０１２１】
本開示全体において使用される場合、「内在性」という用語は、核酸またはタンパク質配列であって、それが導入される標的遺伝子または宿主細胞と天然に関連するものを指す。
【０１２２】
本開示全体において使用される場合、「外来性」という用語は、核酸またはタンパク質配列であって、それが導入される標的遺伝子または宿主細胞と天然に関連しないものを指し、天然に存在する核酸、例えば、ＤＮＡ配列の、天然に存在しない複数のコピー、または天然に存在しないゲノム位置に位置する天然に存在する核酸配列を含む。
【０１２３】
本開示は、ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入する方法を提供する。「導入する」とは、ポリヌクレオチド構築物を、構築物が宿主細胞の内部にアクセスするような様式で植物に提示することを意図する。本発明の方法は、ポリヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入するための特定の方法に依存せず、ポリヌクレオチド構築物が宿主の１つの細胞の内部へのアクセスを得るというだけである。ポリヌクレオチド構築物を細菌、植物、真菌、および動物に導入するための方法は、当技術分野で公知であり、安定形質転換法、一過性形質転換法、およびウイルス媒介性の方法を含むが、これらに限定されない。
【０１２４】
「安定形質転換」とは、植物に導入されたポリヌクレオチド構築物が宿主のゲノム内に組み込まれ、その子孫に遺伝することができることを意図する。「一過性形質転換」とは、宿主に導入されたポリヌクレオチド構築物が宿主のゲノム内に組み込まれないことを意図する。
【０１２５】
本開示全体において使用される場合、「遺伝子改変された植物（またはトランスジェニック植物）」という用語は、そのゲノム内に外来性ポリヌクレオチドを含む植物を指す。一般に、また好ましくは、外来性ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが後続世代に受け継がれるように、ゲノム内に安定に組み込まれる。外来性ポリヌクレオチドは、ゲノム単独に組み込まれてもよく、または組換え発現カセットの一部として組み込まれてもよい。本明細書において「トランスジェニック」は、外来性核酸の存在によってその遺伝子型が変更されている任意の細胞、細胞株、カルス、組織、植物部分または植物を含むように使用され、これには、最初にそのように変更された導入遺伝子（trans  genies）、ならびに最初のトランスジェニックから有性交雑または無性繁殖によって作出されたものを含む。本明細書で使用される「トランスジェニック」という用語は、従来の植物育種法による、またはランダムな異種交配、非組換えウイルス感染、非組換え細菌形質転換、非組換え転位、もしくは自発的変異などの天然に存在する事象による、ゲノムの（染色体性または染色体外の）変更を包含しない。
【０１２６】
本開示全体において使用される場合、「改変する」という用語は、配列が単純にポリペプチドの結合により改変されていると考えられることを意味するよう意図される。ヌクレオチドの配列が変化することを示唆する意図はないが、ポリペプチドが目的の核酸に結合した後にそのような変化（およびその他）が確実になる場合がある。一部の実施形態では、核酸配列はＤＮＡである。目的の核酸の改変（モジュラー反復単位を含有するように改変されたポリペプチドによる目的の核酸への結合という意味で）は、いくつかの方法（例えば、ゲル移動度シフトアッセイ、標識されたポリペプチドの使用、ここで標識は、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、またはビオチン／ストレプトアビジン標識を含みうる）のうちのいずれかにおいて検出されうる。目的の核酸配列の改変（およびその検出）が、要求される全てである場合がある（例えば、疾患の診断において）。しかしながら、望ましくは、試料のさらなる処理が行われる。好都合には、ポリペプチド（およびそれに特異的に結合した核酸配列）が試料の残りから分離される。有利なことには、そのような分離を容易にするために、ポリペプチド−ＤＮＡ複合体を固相支持体に結合させる。例えば、ポリペプチドは、アクリルアミドもしくはアガロースゲルマトリックス内に存在しうるか、またはより好ましくは、膜表面上もしくはマイクロタイタープレートのウェル内に固定される。
【０１２７】
全ての百分率および比率は、別段の指示がない限り重量基準で計算されている。
【０１２８】
全ての百分率および比率は、別段の指示がない限り全組成に基づいて計算されている。
【０１２９】
本開示全体において与えられる全ての最大数値的限界は、全ての数値的下限を、かかる数値的下限が本明細書に明示的に記載されているかのように含む。本開示全体において与えられる全ての最小数値的限界は、全ての数値的上限を、かかる数値的上限が本明細書に明示的に記載されているかのように含む。本開示全体において与えられる全ての数値的範囲は、かかるより広い数値的範囲内に含まれる全てのより狭い数値的範囲を、かかるより狭い数値的範囲の全てが本明細書に明示的に記載されているかのように含む。
【０１３０】
本明細書において開示される値は、列挙された数値そのものに厳密に限定されるものと理解されてはならない。むしろ、別段の規定がない限り、かかる値はそれぞれ、列挙された値と、その値周辺の機能的に均等な範囲との両方を意味するよう意図される。例えば、「２０μｍ」として開示される値は、「約２０μｍ」を意味するよう意図される。
【０１３１】
相互参照される、または関連する、あらゆる特許もしくは出願を含め、本明細書で引用される全ての文書は、明示的に除外または他に限定される場合を除き、参照によりその全体が本明細書に援用される。いかなる文書の引用も、それが本明細書において開示または請求されるいずれかの発明に関する先行技術であるという承認でもなければ、それが単独にしろいずれかの他の参考文献（複数可）との任意の組合せにしろ、いずれかのかかる発明を教示、示唆、または開示するという承認でもない。さらに、本文書中の用語のいずれかの意味または定義が、参照により援用される文書中の同じ用語のいずれかの意味または定義と矛盾する限りにおいて、本文書中でその用語に与えられる意味または定義が優先するものとする。
【０１３２】
本開示の特定の実施形態を説明および記述してきたが、本開示の趣旨および範囲を逸脱することなく、種々の他の変更および改変を行うことができる。添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲内にある、そのような変更および改変の全てを含む。
【実施例】
【０１３３】
本明細書において開示される本発明がより効率的に理解されうるように、以下に実施例を提供する。これらの実施例は説明のみを目的とし、いかようにも本発明を限定するものと解釈されてはならないことを理解されたい。これらの実施例の全体において、分子クローニング反応および他の標準的な組換えＤＮＡ技術は、別段の注記がある場合を除き、Maniatisら、Molecular  Cloning  -  A  Laboratory  Manual、第２版、Cold  Spring  Harbor  Press（１９８９年）に記述されている方法に従い、市販の試薬を使用して行った。
（実施例１）
Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子改変
【０１３４】
自家ＣＡＲ−Ｔ免疫療法の生成および他の用途のためにヒトリンパ球を遺伝子改変するため、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＰＢ）トランスポゾン系を使用した。患者の血液またはアフェレーシス産物から精製されたＴリンパ球に、プラスミドＤＮＡトランスポゾンおよびトランスポサーゼを電気穿孔により導入した。トランスポゾン系のＴ細胞送達のためには、Ｎｅｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、ＢＴＸ  ＥＣＭ  ８３０（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）、ＭａｘＣｙｔｅ  ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ（ＭａｘＣｙｔｅ）、ならびにＡｍａｘａ  ２ＢおよびＡｍａｘａ  ４Ｄ（Ｌｏｎｚａ）を含む、いくつかの異なる電気穿孔システムが使用されている。一部は、製造元により提供または推奨された電気穿孔緩衝液のほか、いくつかのインハウスで開発した緩衝液を使用して試験した。結果は、休止Ｔリンパ球がＤＮＡトランスフェクションに対して特に不応性であり、かつ、電気穿孔されたプラスミドからのＧＦＰ発現により測定された電気穿孔効率と細胞生存率との間に逆相関があるようだという、一般的な定説と一致した。図１は、複数の電気穿孔システムおよびヌクレオフェクションプログラムを試験する実験例を示す。
【０１３５】
ヌクレオフェクション中にプラスミドＤＮＡがＴ細胞に対して毒性であるか否かをさらに試験するため、初代ヒトＴリンパ球に２つの異なるＤＮＡプラスミドを電気穿孔により導入した。第１のプラスミドは、Ｌｏｎｚａ  Ａｍａｘａヌクレオフェクションキット内に対照プラスミドとして提供されているｐｍａｘＧＦＰ（商標）プラスミドであった。これはＨＰＬＣにより高度に精製されており、検出可能なレベルの内毒素を含有しない。第２のプラスミドは、本発明者らのインハウスで産生した、ＧＦＰを駆動するヒトＥＦ１アルファプロモーターをコードするＰＢトランスポゾンであった。電気穿孔されたプラスミドからのＧＦＰ発現により測定されるトランスフェクション効率と細胞生存率とを、電気穿孔後２日目、３日目、および６日目にＦＡＣＳによって評価した。データは図２に表示されている。偽電気穿孔した細胞（プラスミドＤＮＡなし）は、電気穿孔後６日目までに比較的高いレベルの細胞生存率５４％を呈したが、いずれかのプラスミドを電気穿孔により導入したＴ細胞は１．４〜２．６％しか生存していなかった。これらのデータは、プラスミドＤＮＡがＴリンパ球に対して細胞傷害性であったことを示す。追加として、これらのデータは、ｐｍａｘＧＦＰ（商標）プラスミドにはＩＴＲ領域またはコアインスレーターなどのトランスポゾンエレメントがなく、また同じＤＮＡ濃度で細胞傷害性であったため、ＤＮＡ媒介毒性がこれらのエレメントに起因するものではなかったことを示す。両方のプラスミドがおよそ同じサイズであり、これは類似の量のＤＮＡがＴ細胞に電気穿孔により導入されたことを意味する。
【０１３６】
Ｔ細胞におけるＤＮＡ媒介毒性が用量依存的であったか否かを試験するため、本発明者らは、本発明者らのＰＢ−ＧＦＰプラスミドの力価測定を行った。図３は、ヌクレオフェクション反応物に添加されるプラスミドＤＮＡの用量が徐々に増加するにつれて（１．３、２．５、５．０、１０．０、および２０．０μｇのプラスミドＤＮＡ）、ヌクレオフェクション後１日目および５日目の両方で測定した細胞生存率が減少したことを示す。１．３μｇのプラスミドＤＮＡでさえ、４日目までのＴ細胞生存率の２．４倍の減少の一因であった。
【０１３７】
ヌクレオフェクション中にプラスミドＤＮＡがＴ細胞に対して毒性であることは明らかであったため、本発明者らは、細胞外プラスミドＤＮＡが細胞死に寄与するか否かを検討した。図４は、細胞外プラスミドＤＮＡがＴ細胞に対して細胞傷害性でなかったことを示す。この実験では、電気穿孔の４５分後に５μｇのプラスミドＤＮＡを細胞に添加したところ、１日目にも４日目にも細胞死はほとんど観察されなかった。同様に、電気穿孔の非存在下でヌクレオフェクション反応物に５μｇのプラスミドＤＮＡを添加したところ、細胞死はほとんど観察されなかった。しかしながら、電気穿孔反応の前にプラスミドＤＮＡを添加すると、細胞は、１日目には細胞生存率の２．０倍の低減、そして４日目には１３．２倍の低減を呈した。
【０１３８】
ＤＮＡ媒介毒性は用量依存的であるため、本発明者らは次に、転位に要求されるＴ細胞に送達されるＤＮＡの総量を低減する方法に注目した。これを達成する比較的簡単な１つの方法は、ＤＮＡ内でコードされる代わりにｍＲＮＡ内でコードされるものとしてトランスポサーゼを送達することであろう。初代ヒトＴ細胞へのｍＲＮＡ送達は非常に効率的であり、高いトランスフェクション効率および高い生存率をもたらす。本発明者らは、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ｓＰＢｏ）トランスポサーゼ酵素を本発明者らのインハウスｍＲＮＡ産生ベクターにサブクローニングし、高品質のｓＰＢｏ  ｍＲＮＡを産生させた。Ｊｕｒｋａｔ細胞における種々の用量のｓＰＢｏ  ｍＲＮＡ（３０、１０、３．３、３、１、０．３３μｇのｍＲＮＡ）とＰＢ−ＧＦＰトランスポゾンの共送達は、試験した全ての用量において強力な転位を明示した（図５）。これらのデータは、ｓＰＢｏトランスポサーゼが、プラスミドＤＮＡまたはｍＲＮＡのいずれとしても送達可能であり、かつ等しく有効であることを示す。追加として、ｓＰＢｏ  ｍＲＮＡの量が、ＧＦＰ＋細胞の全体的な百分率またはＧＦＰ発現のＭＦＩのいずれにおいても、Ｊｕｒｋａｔにおける全体的な転位効率の差異をほとんど生じない。これがＴリンパ球にも当てはまるかどうかを確かめるため、本発明者らは、ＰＢ−ＧＦＰを、３：１の比でｓＢＰｏプラスミドＤＮＡ、または５μｇのｓＰＢｏ  ｍＲＮＡのいずれかと共に送達した。ヌクレオフェクション反応ならびにＩＬ７およびＩＬ１５の添加の７日後、ＧＦＰ転位を評価した。図６は、ｓＰＢｏ  ｍＲＮＡがＴリンパ球へのＧＦＰトランスポゾンの転位を効率的に媒介したことを示す。重要なことに、Ｔ細胞生存率は、ｍＲＮＡとしてのｓＰＢｏを共送達したときにｐＤＮＡと対比して改善し、それぞれ３２．４％対２５．４％であった。これらのデータは、ｍＲＮＡとしてのｓＰＢｏの共送達が、Ｔ細胞に送達されるプラスミドＤＮＡの総量において用量節約性があり、したがって細胞傷害性が低いことを示唆する。
【０１３９】
現在のプラスミドトランスポゾンは、細菌におけるプラスミド増幅に要求される骨格も含有するため、この配列を除外することにより、ＤＮＡの総量を有意に低減させることが可能である。これは、ヌクレオフェクション反応前のプラスミドトランスポゾンの制限消化によって達成することができる。追加として、これは、ＰＣＲ産物として、またはプラスミドの細菌複製に要求される最初の骨格エレメントを除外する機構によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生される二重鎖ＤＮＡであるｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡとして、トランスポゾンを投与することによって達成されうる。
【０１４０】
本発明者らは、プラスミドトランスポゾンが環状である必要があるか否か、またはそれが細胞に線状様式で送達されうるかどうかを確かめるため、パイロット実験を行った。これを試験するために、トランスポゾンを制限酵素（ＡｐａＬＩ）と共に一晩インキュベートして、プラスミドを線状化した。切断されていないプラスミドまたは線状化プラスミドのいずれかを初代Ｔリンパ球に電気穿孔により導入し、２日後にＧＦＰ発現を評価した。図７は、線状化プラスミドもまた細胞核に効率的に送達されたことを示す。これらのデータは、線状トランスポゾン産物もまた、初代ヒトＴ細胞に効率的に電気穿孔により導入されうることを明示する。
【０１４１】
本発明者らは、プラスミドＤＮＡが初代Ｔリンパ球において毒性であることを上記に示すが、本発明者らは、この毒性効果が腫瘍細胞株および他の形質転換細胞においてはさほど劇的でないことを観察した。この観察に基づき、本発明者らは、初代Ｔリンパ球がＤＮＡ感知経路の増強を理由としてプラスミドＤＮＡトランスフェクションに対して不応性である可能性があり、これが免疫細胞をウイルスおよび細菌による感染から保護するであろうと仮定した。これらのデータがＤＮＡ感知機構の増強の結果であれば、ヌクレオフェクション後の反応物へのＤＮＡ感知経路阻害剤の添加により、プラスミドトランスフェクション効率および／または細胞生存率を向上させることが可能でありうる。したがって本発明者らは、ＴＬＲ−９経路、カスパーゼ経路、または細胞質内の二重鎖ＤＮＡの感知に関与するものを阻害した、いくつかの異なる試薬を試験した。これらの試薬には、エンドソーム酸性化に干渉し、ＴＬＲ９によるＮＦｋＢシグナル伝達を遮断するオートファジー阻害剤であるバフィロマイシンＡ１、ＴＬＲ９アンタゴニストであるクロロキン、ＴＬＲ９アンタゴニストおよびｃＧＡＳアンタゴニストであるキナクリン、ＡＩＭ２経路を標的とするカスパーゼ１阻害剤であるＡＣ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ、汎カスパーゼ阻害剤であるＺ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、ＴＬＲ９経路により誘発されるカスパーゼ８阻害剤であるＺ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫが含まれる。追加として、本発明者らはまた、サイトカインＩＬ７およびＩＬ１５の添加、ならびに抗ＣＤ３抗ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの添加により、電気穿孔されたＴ細胞の刺激を試験した。結果は図８に表示されている。本発明者らは、化合物またはカスパーゼ阻害剤のうち、試験した用量においてヌクレオフェクション後４日目の細胞生存率にいずれかの好影響を及ぼしたものは少なかったことを見出した。しかしながら、本発明者らは、これらの試薬をより良好に試験するためには、さらなる投薬研究が要求されうることを認める。これらの経路を遺伝学的に阻害することがより有効である可能性もある。２つのヌクレオフェクション後条件は、Ｔ細胞の生存率を向上させた。ＩＬ７およびＩＬ１５の添加は、それらが電気穿孔の１時間後に添加されたか１日後に添加されたかを問わず、さらなる処置なしのプラスミドトランスポゾン単独の導入と比較して、生存率を３倍超向上させた。さらに、アクチベーターまたはエキスパンダービーズのいずれかを使用したヌクレオフェクション後のＴ細胞の刺激もまた、Ｔ細胞生存率を劇的に向上させた。刺激は、ヌクレオフェクションの１時間後または１日後にビーズを添加した場合に、２日後にそれらを添加した場合と比較してより良好であった。最後に本発明者らは、ＭｉｌｔｅｎｙｉのＤｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｍｏｖａｌキットを使用し、ＲＯＣＫ阻害剤および培養物からの死細胞の除去も試験したが、細胞生存率の改善は見られなかった。
【０１４２】
ヌクレオフェクション後のＴ細胞の刺激が生存率を改善することを明示するこれらの所見をさらに発展させるため、本発明者らは、サイトカインＩＬ７およびＩＬ１５の添加を使用する研究を繰り返した。図９は、ヌクレオフェクション直後または最大１時間後のいずれかにおいて、これらのサイトカインをそれぞれ２０ｎｇ／ｍＬの用量で添加すると、細胞生存率が処置なしと比較して最大２．９倍向上したことを示す。ヌクレオフェクションの最大１日後にこれらのサイトカインを添加しても生存率は向上したが、それより前の時点ほど強力ではなかった。
【０１４３】
本発明者らは、ヌクレオフェクション後のＴ細胞の即時刺激が細胞生存率を増加させることができたことを見出したため、本発明者らは、ヌクレオフェクション前の細胞の刺激も生存率およびトランスフェクション効率を向上させうると仮定した。これを試験するため、本発明者らは、トランスポゾンヌクレオフェクションの２日前、３日前、または４日前のいずれかにおいて、初代Ｔリンパ球を刺激した。図１０は、ヌクレオフェクション反応前にＴ細胞を刺激した後にトランスポゾンおよびトランスポサーゼを共送達すると、あるレベルの転位が生じることを示す。予備刺激の有効性は、刺激の動態に影響される可能性があり、したがって、選択されるエキスパンダー技術の正確なタイプに依存する可能性がある。
【図１】
2019506177.tif 000007
【図２−１】
2019506177.tif 000008
【図２−２】
2019506177.tif 000009
【図２−３】
2019506177.tif 000010
【図３−１】
2019506177.tif 000011
【図３−２】
2019506177.tif 000012
【図３−３】
2019506177.tif 000013
【図３−４】
2019506177.tif 000014
【図３−５】
2019506177.tif 000015
【図４−１】
2019506177.tif 000016
【図４−２】
2019506177.tif 000017
【図５】
2019506177.tif 000018
【図６】
2019506177.tif 000019
【図７】
2019506177.tif 000020
【図８−１】
2019506177.tif 000021
【図８−２】
2019506177.tif 000022
【図８−３】
2019506177.tif 000023
【図８−４】
2019506177.tif 000024
【図８−５】
2019506177.tif 000025
【図８−６】
2019506177.tif 000026
【図８−７】
2019506177.tif 000027
【図８−８】
2019506177.tif 000028
【図８−９】
2019506177.tif 000029
【図８−１０】
2019506177.tif 000030
【図９−１】
2019506177.tif 000031
【図９−２】
2019506177.tif 000032
【図１０−１】
2019506177.tif 000033
【図１０−２】
2019506177.tif 000034
【図１０−３】
2019506177.tif 000035
【図１１−１】
2019506177.tif 000036
【図１１−２】
2019506177.tif 000037
【図１１−３】
2019506177.tif 000038
【図１２−１】
2019506177.tif 000039
【図１２−２】
2019506177.tif 000040
【配列表】
2019506177000001.app
【国際調査報告】
2019506177.tif 000041
2019506177.tif 000042
2019506177.tif 000043
2019506177.tif 000044