(57)【要約】  本発明は、中咽頭腔、泌尿器官、消化／排泄器官、皮膚疾患および細菌感染症の治療に使用のための、ポプラの芽の抽出物を含む組成物に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
中咽頭腔、泌尿器官、消化／排泄器官、皮膚疾患、および細菌感染症の治療に使用のための組成物であって、０．１〜７０重量％までのポプラの芽の抽出物と、薬学的に許容される担体、賦形剤、香料、防腐剤のうちの１つまたはそれ以上と、を含む組成物。
【請求項２】
前記ポプラの芽の抽出物が、０．３〜４５重量％で存在する、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
０．１〜７０重量％のポプラの芽の抽出物と、
１〜８０重量％の賦形剤と、
０〜８０重量％の溶媒と、
０〜５０重量％の天然または凍結乾燥果汁と、
０．０５〜２重量％の天然または人工香料と、
０．０１〜１重量％の精油と、を含む、請求項１または２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
０．５〜１０重量％の乾燥したポプラの芽の抽出物と、
１０〜９７重量％の賦形剤と、
０．５％〜３重量％の天然または人工香料と、
０．０５〜１重量％の精油と、
０．５〜１５重量％の粉末または凍結乾燥果汁および／または天然抽出物と、
１〜１０重量％の甘味料と、を含む、請求項１または２に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
請求項１、２、または３のいずれか一項に記載の使用のための組成物であって、
【表１】
2019516740.tif 000040
または
【表２】
2019516740.tif 000041
または
【表３】
2019516740.tif 000042
または
【表４】
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からなり、前記組成物は流体形態である、組成物。
【請求項６】
請求項１、２または４のいずれか一項に記載の使用のための組成物であって、
【表５】
2019516740.tif 000044
または
【表６】
2019516740.tif 000045
または
【表７】
2019516740.tif 000046
または
【表８】
2019516740.tif 000047
からなり、前記組成物は固体形態である、組成物。
【請求項７】
前記中咽頭腔の疾患が、咽頭痛、咽頭炎、アフタ、口腔炎症または感染症から選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
前記消化／排泄器官の疾患が、胃炎、逆流、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、痔核、感染症から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記細菌感染症が、化膿性連鎖球菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌のうちの１つまたはそれ以上によって生じる感染症である、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
化膿性連鎖球菌からの前記感染症が、咽頭炎、猩紅熱、膿皮症または膿痂疹、丹毒、蜂巣炎、壊死性筋膜炎、連鎖球菌毒素ショック症候群、菌血症、急性リウマチ熱、急性糸球体腎炎、結節性紅斑、Ｐ．Ａ．Ｎ．Ｄ．Ａ．Ｓ（連鎖球菌感染症に関連する小児自己免疫性神経精神障害）、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）、線維筋痛症、良性線維束性収縮症候群（ＢＦＳ）から選択される、請求項９に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
前記ポプラの芽の抽出物は、
ａ．８５°エタノールでの抽出によりポプラの芽の水−アルコール抽出物を調製する工程と、
ｂ．１３°エタノールでの抽出によりポプラの芽の水−アルコール抽出物を調製する工程と、
ｃ．ａ．およびｂ．で調製された抽出物を混合することによって、多分画アルコール抽出物を得る工程と、
ｄ．前記アルコール抽出物（ｃ．）をデカントおよび／または遠心分離し、濾過して、上清を収集する工程と、
ｅ．ｄ．で得られた濾過した前記上清を、濃縮および凍結乾燥に供する工程と、随意に、
ｆ．ｄ．で得られた前記濾過した上清にアラビアガムを添加し、その後、それを濃縮および凍結乾燥に供する工程と、
含む方法によって得ることができる抽出物である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
粉末、錠剤、カプセル、硬質または軟質ゼラチン、シロップ、スプレー、懸濁液の形態である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中咽頭腔、泌尿器官、消化／排泄器官、皮膚疾患および細菌感染症の治療に使用のための、ポプラの芽の抽出物を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
文献では、黒ポプラ（セイヨウハコヤナギ）の樹脂性滲出物が、ヨーロッパプロポリス、一般的には温帯におけるミツバチが産生するプロポリスの基本成分を構成することが知られている。
【０００３】
多くの薬理学的活性で知られているプロポリスは、（主に黒ポプラの）樹脂性滲出液をミツバチが収集した後でミツバチによって産生される物質である。概して、プロポリスは、２５〜３５％のミツロウ、５％の花粉、５％の、ミツバチの足に存在する様々な物質、および約５０％の植物樹脂で構成される。
【０００４】
ポプラの芽に基づく薬物の様々な使用もまた文献で知られている。
【０００５】
数多くの疾患の治療のための天然起源の物質の使用に対する関心が絶え間なく高まっていることを考えると、また、ミツバチがさらされている現在の劇的な絶滅危機を考えると、同等またはより効果的な方法で、ミツバチが産生する物質に同等に取って代わることのできる天然起源の生成物を発見することが重要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の立案者らは、ポプラの芽の抽出物を分析して、プロポリスに対する植物起源の完全な代替物としての治療目的でのその可能な使用を確認した。
【０００７】
ポプラの芽の抽出物は、プロポリスとは異なり、動物由来の物質および花粉などのアレルギー物質を含まないという利点も伴う。
【０００８】
本発明の立案者らは、驚くべきことに、ヨーロッパプロポリスに対して、ポプラの芽の抽出物が同等またはさらに高い粘膜付着特性を示すことを確認した。
【０００９】
本発明の立案者らはまた、随意に凍結乾燥され、随意に天然ガムと共凍結乾燥された（ガムで担持された）、ポプラの芽の抽出物の、特に化膿性連鎖球菌、緑膿菌および黄色ブドウ球菌に対する有効な抗菌活性を初めて明らかにした。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、
中咽頭腔、泌尿器官、消化／排泄器官、皮膚疾患、および細菌感染症の治療に使用のための組成物であって、０．１〜７０重量％までのポプラの芽の抽出物と、薬学的に許容される担体、賦形剤、香料、防腐剤のうちの１つまたはそれ以上と、を含む組成物である。
【００１１】
さらに、本発明の目的は、中咽頭腔、泌尿器官、消化／排泄器官、皮膚疾患および細菌感染症を、本発明の混合物または組成物を前記障害の影響を受けた対象に投与することにより治療することである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１に記載したように実施した様々な製剤の粘膜付着アッセイである。
【図１Ａ】組成物−希釈（１：２．５および１：５）実施例固体組成物４の、ヒト口腔細胞に対する粘膜付着率（％）を示す。
【図１Ｂ】組成物−希釈（１：２．５および１：５）実施例固体組成物３の、ヒト口腔細胞に対する粘膜付着率（％）を示す。
【図１Ｃ】組成物−非希釈または希釈（１：２および１：５）実施例流体組成物４の、ヒト口腔細胞に対する粘膜付着率（％）を示す。
【図１Ｄ】組成物−非希釈または希釈（１：２および１：５）実施例流体組成物３の、ヒト口腔細胞に対する粘膜付着率（％）を示す。
【図２】模擬唾液溶液（０．９％ＮａＣｌ生理溶液）に対する異なる時間における（様々な希釈度で、異なる時間に本発明の異なる製剤で得られた）粘膜付着層の抵抗を示す。
【図２Ａ】模擬唾液溶液（０．９％ＮａＣｌ生理溶液）に対する異なる時間（０時間、０．５時間、１時間および２時間）における組成物−（１：２．５希釈）実施例固体組成物４を示す。
【図２Ｂ】模擬唾液溶液（０．９％ＮａＣｌ生理溶液）に対する異なる時間（時間：０時間、０．５時間、１時間および２時間）における組成物−（１：２．５希釈）実施例固体組成物３を示す。
【図２Ｃ】人工唾液溶液に対する異なる時間（時間：０時間、０．５時間、１時間および２時間）における組成物−（１：２希釈）実施例流体組成物４を示す。
【図３】バリアアッセイにおけるＩＬ６産生を示す。グラフは、細胞に対して本発明の組成物によって及ぼされる保護を示し、データは対照Ｃ−と比較したフォールドオーバー（Ｆ．Ｏ．）の点で表される。フォールドオーバーＣ−＝［測定されたＩＬ−６］／［Ｃ−  ＩＬ−６］
【図３Ａ】組成物−実施例固体組成物４を示す。
【図３Ｂ】組成物−実施例固体組成物３を示す。
【図３Ｃ】組成物―実施例流体組成物４を示す。
【図３Ｄ】組成物−実施例流体組成物３を示す。
【図４】記載された本発明の様々な実施形態について計算されたバリア効果を、ＩＬ６放出阻害率（％）の観点からグラフで描く。
【図４Ａ】組成物−実施例固体組成物４を示す。
【図４Ｂ】組成物−実施例固体組成物３を示す。
【図４Ｃ】組成物−実施例流体組成物４を示す。
【図４Ｄ】組成物−実施例流体組成物３を示す。
【図５】内部対照におけるフォールドオーバーＣ−の観点から細胞産生ＩＬ−６値をグラフで描く。
【図５Ａ】組成物−実施例固体組成物４を示す。
【図５Ｂ】組成物−実施例固体組成物３を示す。
【図５Ｃ】組成物−実施例流体組成物４を示す。
【図５Ｄ】組成物−実施例流体組成物３を示す。
【図６】アスコルビン酸と比較した、本発明によるポプラの芽の抽出物の抗酸化活性を示す。
【図７】本発明によるポプラの芽の抽出物の細菌性バイオフィルムからの阻害活性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、
中咽頭腔、泌尿器官、消化／排泄器官、皮膚疾患、および細菌感染症の治療に使用のための組成物であって、０．１〜７０重量％までのポプラの芽の抽出物と、薬学的に許容される担体、賦形剤、香料、防腐剤のうちの１つまたはそれ以上と、を含む組成物である。
【００１４】
一実施形態によれば、組成物は、
０．１〜７０重量％までのポプラの芽の抽出物と、
１〜８０重量％の賦形剤と、
０〜８０重量％の溶媒と、
０〜５０重量％の天然または凍結乾燥果汁と、
０．０５〜２重量％の天然または人工香料と、
０．０１〜１重量％の精油と、を含むか、またはこれらからなることができる。
【００１５】
さらなる実施形態によれば、本発明の組成物は、
０．５〜１０重量％の凍結乾燥された乾燥ポプラ芽抽出物と、
１０〜９７重量％の賦形剤と、
０．５％〜３重量％の天然または人工香料と、
０．０５〜１重量％の精油と、
０．５〜１５重量％の粉末または凍結乾燥果汁および／もしくは天然抽出物と、
１〜１０重量％の甘味料と、を含むか、またはこれらからなることができる。
【００１６】
「ポプラの芽の抽出物」とは、本発明の目的上、黒ポプラ（セイヨウハコヤナギ）の葉芽から、または主として葉芽から調製された抽出物を意味する。
【００１７】
特に、本発明による抽出物は、開いていない葉芽の抽出物である。芽は、ヨーロッパでは通常３月から５月までである、春期には主に開いていないと認められる。
【００１８】
本発明の一実施形態によれば、組成物の唯一の有効成分は、ポプラの芽の抽出物によって表される。
【００１９】
上記で報告された実施形態のいずれか１つによる組成物において、ポプラの芽の抽出物は、１：２〜１：２０の範囲で構成される抽出物：ガム比率で天然ガムと関連付けられ得る。
【００２０】
上記で定義され、以下の実施例でさらに例示されるような組成物を、中咽頭腔疾患の治療のために、以下に述べるように使用することができる。そのような疾患は、例えば、咽頭痛、咽頭炎、アフタ、口腔炎症または感染症から選択することができる。
【００２１】
前記組成物が消化／排泄器官疾患の治療に使用される実施形態において、これらは胃炎、逆流、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、痔核、感染症から選択され得る。
【００２２】
さらに、本発明の組成物は、例えば膀胱炎のような尿路の疾患の治療に使用することができる。
【００２３】
好ましい一実施形態では、本発明の組成物は、細菌感染症の治療のために使用することができ、これらのうち、化膿性連鎖球菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌のうちの少なくとも１つの感染症が特に好適である。
【００２４】
化膿性連鎖球菌感染症の治療において、本発明による組成物は、例えば、咽頭炎、猩紅熱、膿皮症または膿痂疹、丹毒、蜂巣炎、壊死性筋膜炎、連鎖球菌毒素ショック症候群、菌血症、急性リウマチ熱、急性糸球体腎炎、結節性紅斑、Ｐ．Ａ．Ｎ．Ｄ．Ａ．Ｓ（連鎖球菌感染症に関連する小児自己免疫性神経精神障害）、慢性疲労症候群（ＣＦＳ）および線維筋痛症、良性線維束性収縮症候群（ＢＦＳ）の治療に使用され得る。
【００２５】
本発明の組成物を実施するためには、ポプラの芽の水―アルコール抽出物を好ましくは３５〜７０のアルコール度数の等級で使用することができる。特に好ましい実施形態では、抽出物を凍結乾燥することができる。随意に、抽出物は、水中での抽出物溶解度を増加させ、乾燥抽出物をより容易に加工可能にするために、天然ガムと共凍結乾燥され得る。
【００２６】
しかしながら、得られたデータは、実験の項で見ることができるが、天然ガムとの共凍結乾燥（担持）が抽出物の粘膜付着および保護特性を増加させ、ガムで担持された抽出物を含む本発明の組成物を特に有効にすることを示している。
【００２７】
特に、ポプラの芽の抽出物は、
ａ．８５°エタノールでの抽出によりポプラの芽の水−アルコール抽出物を調製する工程と、
ｂ．１３°エタノールでの抽出によりポプラの芽の水−アルコール抽出物を調製する工程と、
ｃ．ａ．およびｂ．で調製された抽出物を混合することによって、多分画アルコール抽出物を得る工程と、
ｄ．前記アルコール抽出物（ｃ．）をデカントおよび／または遠心分離し、濾過して、上清を収集する工程と、
ｅ．ｄ．で得られた濾過した上清を、濃縮および凍結乾燥に供する工程と、随意に、
ｆ．ｄ．で得られた濾過した上清に、天然ガムを添加し（以下の説明に記載のガムまたはそれらの組み合わせから選択されたもの、特にアラビアガムを添加し）、したがって濃縮および凍結乾燥に供する工程と、を含む方法によって得ることができる抽出物であり得る。
【００２８】
特に、ａ．およびｂ．の抽出物は、唯一の抽出溶媒の動きによる浸出物消化（ｐｅｒｃｏｌａｔｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）による抽出、およびブレードスターラーを備えた抽出器による抽出の両方、ならびに溶媒および芽の両方の移動によって調製することができる。抽出は、３５〜５５℃で構成される温度、例えば４０℃〜５０℃（両端を含む）の範囲で構成される温度、特に約４０℃または５０℃の温度で実施することができる。
【００２９】
抽出は、４〜１２時間の時間の長さで、例えば約８時間、実施することができる。
【００３０】
ａ．およびｂ．で調製した抽出物は、ｃ．の時点で、好ましくは５０：５０の比率で混合されるが、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５５：４５、６０：４０、６５：３５の比率で混合してもよい。混合は、８５°アルコール抽出物中で１３°アルコール抽出物を徐々に添加する（添加速度：１５〜２０Ｌ／分）ことによって実施されるが、逆の添加も可能である。混合は２０℃±５℃の温度で実施する。
【００３１】
ｃ．の時点で調製した多分画抽出物は、最低７２時間、円錐形の底部を備えた容器でデカントすることによる清澄化に供する。前記時間が経過すると、抽出物をこぼし、セルロースフィルターで濾過する。このような濾過は、例えば、０．５μｍ、１５μｍのカットオフ、または３０μｍもしくはさらに高いカットオフなど、単一ステップまたは複数の連続ステップで例えば０．５〜５０μｍ（両端を含む）のカットオフを有するパネルフィルター上で、実施することができる。
【００３２】
濾過の終了時に、アルコールの等級を制御し、アルコール度５０°±１５°に調整する。
【００３３】
デカントの代わりに、５〜２０Ｌ／分の流速で供給される垂直遠心分離機での遠心分離によって抽出物を分離することができる。
【００３４】
ｄ．のように清澄化した抽出物を、多分画アルコール抽出物としてそのまま（ｔｅｌ  ｑｕｅｌ）使用することができる。
【００３５】
ｄ．のように清澄化した抽出物を、ｅ．のように濃縮および凍結乾燥プロセスに供して、固形製剤に使用できる凍結乾燥抽出物を提供する。
【００３６】
ｄ．のように清澄化された抽出物に、アラビアガムまたは天然ガムが添加されたものを、ｆ．のように濃縮および凍結乾燥にかけて、固形製剤に使用することができるアラビアガムに担持された凍結乾燥抽出物を提供する。アラビアガム、または１つまたはそれ以上の天然ガムは、固体に対して１０〜２０％のパーセンテージを生じるような量で使用される。
【００３７】
ダイアグラム１：ポプラの芽のアルコール多分画抽出物のブロックダイアグラム
【化１】
2019516740.tif 000003
【００３８】
ダイアグラム２：ポプラの芽の凍結乾燥多分画抽出物のブロックダイアグラム
【化２】
2019516740.tif 000004
【００３９】
ダイアグラム３：ポプラの芽のアラビアガム（または以下に示すような１つもしくはそれ以上の天然ガム）に担持された凍結乾燥多分画抽出物のブロックダイアグラム
【化３】
2019516740.tif 000005
【００４０】
上記の方法に従って得られた抽出物は、以下の組成を特徴とする。
【表Ａ−１】
2019516740.tif 000006
【００４１】
値は、上記で報告された方法論に従って異なる抽出物の分析の平均によって与えられる。
【００４２】
一実施形態によれば、上記で定義した任意の形態のポプラの芽の抽出物は、０．３〜４５重量％であり得る。
【００４３】
例えば、流体形態の組成物は、以下の実施例に従うことができる。
【表Ａ−２】
2019516740.tif 000007
【表Ａ−３】
2019516740.tif 000008
【表Ａ−４】
2019516740.tif 000009
【表Ａ−５】
2019516740.tif 000010
【表Ａ−６】
2019516740.tif 000011
【表Ａ−７】
2019516740.tif 000012
【表Ａ−８】
2019516740.tif 000013
【表Ａ−９】
2019516740.tif 000014
【００４４】
本発明の組成物は、例えば、粉末、錠剤、カプセル、硬質または軟質ゼラチン、シロップ、スプレー、懸濁液の形態であり得る。
【００４５】
したがって、当業者に既知の薬学的に許容される担体、賦形剤、香料、防腐剤のうちの１つまたはそれ以上を使用することができる。
【００４６】
広義には、流体形態で製造される場合、組成物は、有効成分として、本明細書に記載の任意の実施形態におけるポプラの芽の抽出物と、当業者に既知の賦形剤、溶媒、香料、防腐剤などのうちの１つまたはそれ以上と、を含む。非限定的な例として、賦形剤としては、例えばアラビアガム、キサンタンガム、グアーガム、タラガムまたはそれらの混合物などの天然ガム；例えばスクロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはそれらの混合物などの天然および合成ポリアルコール；例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはそれらの混合物などのセルロースおよびセルロース誘導体；例えばポリビニルピロリドン、ポリメタクリレートまたはそれらの混合物などの合成ポリマー；マルトデキストリン、イヌリンおよび／またはシクロデキストリン、のうちの１つまたはそれ以上を使用することができる。
【００４７】
溶媒としては、常に非限定的な例として、エタノール、イソプロパノール、グリセリン、プロピレングリコールまたはそれらの混合物を使用することができる。
【００４８】
例えばリンゴ、ナシ、オレンジ、レモン、ラズベリー、ブルーベリー果汁またはそれらの混合物などの天然または凍結乾燥果汁；例えばイチゴ、レモン、オレンジ、ラズベリー、モモ、サクランボ、ミックスベリー、マンダリンオレンジ香料またはそれらの混合物などの天然または人工香料；例えばレモン、オレンジ、ミント、ユーカリ精油またはそれらの混合物などの精油（Ｅ．Ｏ．）も使用することができる。
【００４９】
概して、固体形態で製造される場合、組成物は、本明細書に記載の任意の実施形態におけるポプラの芽の抽出物と、当業者に既知の賦形剤、溶媒、香料、防腐剤などのうちの１つまたはそれ以上と、を有効成分として含む。非限定的な例として、例えばスクロース、マンニトール、ソルビトール、キシリトールまたはそれらの混合物などの糖；例えば、微結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、またはそれらの混合物などのセルロースおよびセルロース誘導体；マルトデキストリン、シクロデキストリンおよび／またはイヌリン、のうちの１つまたはそれ以上を賦形剤として使用することができる。
【００５０】
例えば米デンプン、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、アルファ化デンプンまたはそれらの混合物などのデンプンおよびデンプン誘導体；例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ベヘン酸グリセリルまたはそれらの混合物などの潤滑剤；例えば、イチゴ、レモン、オレンジ、ラズベリー、モモ、サクランボ、ミックスベリー香料またはそれらの混合物などの天然および合成香料；例えばレモン、オレンジ、ミント、ユーカリ精油またはそれらの混合物などの精油；例えばリンゴ、ナシ、オレンジ、レモン、ラズベリー、ブルーベリー、イチゴ、ニワトコ果汁またはそれらの混合物などの凍結乾燥果汁；ライム（シナノキ）、ゼニアオイ、アロエ、アルテアまたはそれらの混合物などの粉末または凍結乾燥天然抽出物；例えばはちみつ、糖類、アスパルテーム、シクラマート、アセスルファムＫ、ステビア抽出物、スクラロースまたはそれらの混合物などの甘味剤、のうちの１つまたはそれ以上を使用することができる。
【００５１】
明細書および特許請求の範囲のいずれの箇所においても、「含む」という用語は、「からなる」または「で作られている」という用語で置き換えることができる。
【００５２】
以下の実施例は、本発明をさらに明確にするために提供され、限定目的ではない。
【実施例】
【００５３】
１．粘膜付着アッセイ
良好な粘膜付着効果は、生成物が意図された作用部位（咽頭粘膜）に留まり、既に説明したようにそこでその保護的および治癒的作用を機械的に実行するために最も重要な要件である。このアッセイの主な目的は、口腔細胞の使用を想定した適切な細胞モデルにおける異なる製剤中の本発明の組成物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ付着を評価することである。このアッセイの第２の目的は、人工唾液溶液の流れに対する経時的な生体付着抵抗を決定することである。異なる製剤における本発明の組成物の粘膜付着は、膜糖タンパク質と結合するレクチン（グルコシドおよびマンノシド残基に対する高い親和性を有するタンパク質）を阻害することにより細胞に付着する生成物の能力の評価によって決定された。粘膜付着の程度は、粘膜付着生成物が関与する、レクチンが関与していない糖タンパク質上の部位を定量することを可能にする比色反応によって測定される。以下のダイアグラムに示す、特有のレクチン標識システムにより、比色反応が可能である。
【化４】
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【００５４】
吸光値の減少は、生成物が細胞に付着する（「粘膜付着する」）能力に比例する。粘膜付着能力は、糖タンパク質／レクチン結合の阻害率として表され、以下の式によって、生成物によって占有される粘膜部位の割合を表す：
生成物の粘膜付着率＝（１−ａｂｓサンプル／ａｂｓ対照）×１００
【００５５】
この生成物は、実際の使用において、送達直後に、中咽頭腔に存在する唾液との混合が生じるという事実を考慮に入れて、希釈後に適用される。以下のグラフは、異なる製剤中において本発明による組成物の異なるサンプルで得た結果を示す。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
2019516740.tif 000019
【００５６】
実験の第２段階では、経時的に粘膜に付着したままである組成物の能力を、ｐＨ７のリン酸緩衝液および０．５％のムチンを含む等張性水溶液で作られた人工唾液の２ｍＬ／分の流れにシステムを供することによって評価した。得られた結果は、適用の最初の１時間の間に粘膜に生物付着したままである興味深い生成物の能力を強調した。
【００５７】
模擬唾液溶液（０．９％ＮａＣｌ生理溶液）に対する０．５時間、１時間および２時間の異なる時間における１：２．５に希釈した組成物の、実施例固体組成物３で得られた粘膜付着層の抵抗を以下の表５に報告する。
【表５】
2019516740.tif 000020
【表６】
2019516740.tif 000021
【表７】
2019516740.tif 000022
【表８】
2019516740.tif 000023
【００５８】
この実験で得られた結果は、本発明の組成物の異なる製剤が口腔細胞に対する高い粘膜付着能力を有することを実証する。さらに、人工唾液溶液での流れに対する粘膜付着保護層の抵抗の評価は、適用の最初の１時間の間、良好な粘膜付着保持能力を強調することを可能にした。
【００５９】
得られた結果に照らして、良好な抵抗性の粘膜付着性を有することが実証された本発明の組成物は、中咽頭粘膜に対して実際の保護的役割を果たすことができると述べることができる。
【００６０】
２．バリアアッセイ
アッセイの目的は、既知の刺激剤と比較して、その膜形成および保護能力をアッセイすることによって、本発明の組成物の作用機序を実証することである。使用される刺激剤は、炎症誘導の古典的モデルであるリポ多糖（ＬＰＳ）膜である。前記アッセイは、粘膜と外部刺激剤との間の接触を制限する生成物の有効な能力を強調することを目的とする。
【００６１】
選択された刺激剤は、大腸菌細胞膜から単離された。ＬＰＳの寸法は、刺激に、したがってこの特定の繊細な環境に負担をかける異なる病状の発症に結び付く、ほこり、スモッグ、花粉および他の物質から粘膜を保護する上で有効なバリアを考慮できるようなものである。
【００６２】
実験プロトコルをより詳細に分析して、ＩＬ６産生を測定し、細胞層（線維芽細胞）とＬＰＳとの接触の結果として、バリアとして作用するサンプルの能力を評価する。この実験システムは、特別なトランスウェルのウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ｗｅｌｌ）を使用し、このウェルは、コラーゲンでコーティングされた半透膜を備え、この半透膜は、ウェルの２部分間の唯一の連絡ルートを表す、底部に沈着した細胞とオーバーハングする半透膜上に層化されたサンプルとの間の直接接触を防止する。ＬＰＳはサンプル上の空間に接種されるため、サンプル自体によって発揮されるバリア効果が大きいほど、膜通過がより困難になる。したがって、ＬＰＳ添加から＋２４時間で産生されるインターロイキンの定量化は、アッセイされたサンプルによって発揮されるバリア効果の直接的な証拠をもたらす。ＩＬ６阻害は、バリア効果の直接測定である。
【００６３】
バリア効果（ＢＥ）は、ＩＬ−６の放出の減少率として表され、陽性対照（Ｃ＋）から得られた値、すなわちサンプルの非存在下でＬＰＳのみで処理した細胞から得られた値、との比較を通じて得る。
ＢＥ率（％）＝産生されたＩＬ−６（ｐｇ／ｍＬ）の阻害率（％）
【００６４】
本発明の組成物の異なる実施形態で３回実施した実験で得られた結果を以下の表に報告する。高濃度の樹脂の存在のために、バリアアッセイを１：２．５希釈生成物および１：５希釈生成物の両方で行った。まず、ＬＰＳ損傷後の細胞分泌ＩＬ６のピコグラムを、そして次の表では、陽性対照と比較した阻害率（％）を報告する。
【表９】
2019516740.tif 000024
【００６５】
この結果から、アッセイされた生成物が存在する実験において産生されたＩＬ−６の濃度の顕著な低下が、両方の希釈において明らかであり、時間が長期化するバリアを示し、これは、錠剤を口でゆっくりと溶解することができないことによる生成物の部分損失の場合にも有効である。
【００６６】
陰性対照について検出された６４．６ｐｇ／μＬに等しいＩＬ−６値は、正常な基底値、すなわち非炎症状態に同化可能である。図２Ａのグラフは、生成物が細胞に及ぼす保護を明確に示している。データは対照Ｃ−と比較したフォールドオーバー（Ｆ．Ｏ．）の点で表される。
【００６７】
バリアアッセイおよび陽性対照において測定された平均ＩＬ−６値から、ＩＬ−６放出減少率が計算される。
１００−［（ＩＬ−６サンプル）／ＩＬ−６Ｃ＋）×１００］
【００６８】
したがって、この式を適用することにより、アッセイされたサンプルの存在下で、上記の詳細な部分に記載した成人用錠剤（実施例固体組成物３）の形態で製造された本発明の組成物について表１０に報告されている陽性対照と比較して、１：５希釈で５４％および１：２．５希釈で４８％のＩＬ−６産生の減少の値が得られる。
【表１０】
2019516740.tif 000025
【表１１】
2019516740.tif 000026
【００６９】
バリアアッセイおよび陽性対照において測定された平均ＩＬ−６値から、ＩＬ−６放出減少率が計算される。１００−［（ＩＬ−サンプル）／ＩＬ−６Ｃ＋）×１００］
【００７０】
したがって、この式を適用することにより、アッセイされたサンプルの存在下で、上記の詳細な部分に記載した小児用錠剤（実施例固体組成物４）の形態で製造された本発明の組成物について表１２に報告されている陽性対照と比較して、１：５希釈で４９％および１：２．５希釈で５１％のＩＬ−６産生の減少の値が得られる。
【表１２】
2019516740.tif 000027
値は小数第４位で四捨五入したもの
【表１３】
2019516740.tif 000028
【００７１】
バリアアッセイおよび陽性対照において測定された平均ＩＬ−６値から、ＩＬ−６放出減少率が計算される。１００−［（ＩＬ−サンプル）／ＩＬ−６Ｃ＋）×１００］
【００７２】
したがって、式を適用することによって、アッセイされたサンプルの存在下で、上記の詳細な部分に記載されているような強力なスプレー（実施例流体組成物３）の形態で製造された本発明の組成物について表１４に報告された陽性対照と比較して３９％であるＩＬ−６産生の減少の値が得られる。
【表１４】
2019516740.tif 000029
【００７３】
以下の表１５は、本発明の詳細な部分で報告された実施例による、アルコールなしのスプレー（実施例流体組成物４）における本発明の組成物の製剤でのバリアアッセイにおけるＩＬ６産生を示す。
【表１５】
2019516740.tif 000030
【００７４】
バリアアッセイおよび陽性対照において測定された平均ＩＬ−６値から、ＩＬ−６放出減少率が計算される。
１００−［（ＩＬ−６サンプル）／ＩＬ−６Ｃ＋）×１００］
【００７５】
したがって、式を適用することによって、アッセイされたサンプルの存在下で、上記の詳細な部分に記載されているようなアルコールなしのスプレー（実施例流体組成物４）の形態で製造された本発明の組成物について表１６に報告された陽性対照と比較して５６％であるＩＬ−６産生の減少の値が得られる。
【表１６】
2019516740.tif 000031
【００７６】
使用した方法を検証し、その結果がアッセイされたサンプルの唯一のバリア効果に依存し、あらゆる薬理学的、免疫学的または代謝的効果（例えば、サイトカイン合成調節）を排除することを検証するために、バリアアッセイは、各サンプルに対して付随して行った内部対照（ＩＣ）により補助された。
【００７７】
ＩＣアッセイでは、最初に細胞をＬＰＳで刺激するが、サンプルはトランスウェルにその後に添加される。この場合、０％のＩＬ６阻害は、アッセイされた組成物の存在が機械的保護を与え、決して細胞性サイトカイン合成を妨害しないことを明確に示す。
【００７８】
成人用錠剤の形態の組成物（実施例固体組成物３）による前記処置がＬＰＳ損傷の後に行われる、内部対照実験で測定したＩＬ−６濃度値を以下の表１７に報告する。
【表１７】
2019516740.tif 000032
値は小数第４位で四捨五入したもの
【００７９】
小児用錠剤の形態の組成物（実施例固体組成物４）による前記処置がＬＰＳ損傷の後に行われる、内部対照実験で測定したＩＬ−６濃度値を以下の表１８に報告する。
【表１８】
2019516740.tif 000033
値は小数第４位で四捨五入したもの
【００８０】
強力なスプレーの形態の組成物（実施例固体組成物３）による前記処置がＬＰＳ損傷の後に行われる、内部対照実験で測定したＩＬ−６濃度値を以下の表１９に報告する。
【表１９】
2019516740.tif 000034
【００８１】
アルコールなしのスプレーの形態の組成物（実施例流体組成物４）による前記処置がＬＰＳ損傷の後に行われる、内部対照実験で測定したＩＬ−６濃度値を以下の表２０に報告する。
【表２０】
2019516740.tif 000035
【００８２】
これらの実験で得られた値は、バリアアッセイの陽性対照（サンプル不在）の値と均質であることが判明し、どのようにしてＬＰＳ損傷後に適用されたサンプルが、炎症メディエーターの産生に影響を及ぼさず、したがって直接的な抗炎症効果を有しないのかを確認する。これは、フォールドオーバーＣの点で細胞産生ＩＬ−６の値を表す、図５に報告されたグラフでよりよく表されている。
【００８３】
３．ラジカルスカベンジャー活性のためのＤＰＰＨアッセイ
ＤＰＰＨ（２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル）アッセイにより、本明細書の説明に従ったポプラの芽の抽出物（上記の方法で得られ、上記の特徴を有する）によって誘導されたスカベンジャー抗酸化活性を評価した。ＤＰＰＨは有色の安定したラジカルであり、抗酸化化合物と化学的に反応すると色が変わり、分光光度法で検出することができる。したがって、このアッセイの目的は、分析されたサンプルが、生物学的基質に適用された場合に薬理学的、免疫学的または代謝的メカニズムを伴わずに純粋に化学的な方法（フリーラジカルへの水素転移）で行われる良好な抗酸化活性を有することを実証することである。分析されたサンプルは、１０００、１００および１０μｇ／ｍＬの濃度の、本明細書の説明に従ったポプラの芽の抽出物である。この活性を、陽性対照として用いたビタミンＣの活性と比較した。
【００８４】
図６から分かるように、本発明によるポプラの芽の抽出物は、１０００および１００μｇ／ｍＬのより高い濃度で優れた抗酸化活性を示し、１０μｇ／ｍＬのより低い濃度で良好な活性を示す。
【００８５】
４．バイオフィルム形成阻害アッセイ
このアッセイで使用される方法論は、微生物がポリスチレンプレートウェル上で付着してバイオフィルムを形成する能力を利用する。バイオフィルムの質量は、クリスタルバイオレット染色によって決定される。このアッセイで使用される細菌は、咽頭粘膜の感染を最も頻繁に含む細菌、すなわち、化膿性連鎖球菌である。分析されたサンプルは、本明細書の説明に従ったポプラの芽の抽出物（上記の方法で得ることができ、上記の特徴を有する）である。アッセイの第１段階は、最小阻止濃度（ＭＩＣ）、すなわち微生物増殖を阻害する最低サンプル濃度の評価にある。抗生物質のゲンタマイシンを陽性対照として選択した。第２段階では、バイオフィルム形成を阻害する能力が測定される。アッセイされたサンプルをＭＩＣ以下の濃度で培地に添加して、抗バイオフィルム活性が微生物増殖阻害に起因するものであることを除外する。適切なインキュベーション期間後、形成されたバイオフィルムをクリスタルバイオレットで染色した。染色後、過剰の色素を水で除去し、バイオフィルムに付着したものをエタノールに溶解した。得られた溶液を分光光度計で５７０ｎｍで分析した。この分析からの吸光度の強度は、形成されたバイオフィルムの質量が大きいほど大きくなる。したがって、抗バイオフィルム活性および記録された吸光度は、互いに反比例する。各サンプルについて、使用される濃度は、１×ＭＩＣ、０．５×ＭＩＣおよび０．１ＭＩＣであった。報告されたデータは、３回実施された９個の測定値の平均値である。統計学的有意性は、ｔ検定で計算し、＊ｐ＜０．０１および＊＊ｐ＜０．００１（処理細菌対未処理細菌）であった。このアッセイは、本発明の抽出物が、標準的な５０％水−アルコール抽出物と比較してどれだけ有効であるかを示す。
【００８６】
５．異なる実施形態における本発明による組成物と、プロポリススプレーとの間の粘膜付着および洗浄に対する抵抗の比較アッセイ
プロポリススプレー
脱イオン水ｉｎ  ３３％
プロポリスｄ．ｅ．  多分画  ４１．６％
植物グリセリンａ  ５５％
レモン遊離精油  ０．１％
アルコールなしのプロポリススプレー
脱イオン水ｉｎ  ５７．２％
プロポリス、凍結乾燥抽出物ｅ  ４％
サクランボ香料  天然  ｐ  ０．８％
イチゴ天然香料  １．２％
透明なレモン果汁  １．８％
植物グリセリンａ  ３５％
【００８７】
アッセイは、本発明の組成物および異なる希釈度のプロポリススプレーをアッセイして、実施例１について上述したように行った。
【００８８】
表中に報告されたデータは、とりわけ、より高い希釈度で、どのようにして本発明の組成物がプロポリスと比較してより大きな粘膜付着効果を有するかを示す。
【表２１】
2019516740.tif 000036
【表２２】
2019516740.tif 000037
【表２３】
2019516740.tif 000038
【表２４】
2019516740.tif 000039
【００８９】
上記で報告されたアッセイから明らかなように、アッセイされた組成物は、アッセイされたあらゆる実施形態（固体、アルコールを含むスプレー、アルコールなしのスプレー）において、どのようにしてポプラの芽の抽出物がプロポリスの粘膜付着能力よりも大きい粘膜付着能力を有するかを示し、これは、特に１：５の希釈度で得られたデータから明らかなように、アッセイされた生成物のより高い希釈率で明らかである。
【００９０】
６．水−アルコール多分画抽出物の調製
黒ポプラ（セイヨウハコヤナギ）の芽を断片化し、メカニカルスターラーを備えた抽出器により、濃度を減少させたエタノール中で、２つの抽出工程に供し、第一段階を８５％エタノールで、第二段階を１３％エタノールで行った。使用されるＤ／Ｓ比は１：６に等しい。抽出温度は４０℃に等しい。８５°エタノールでの抽出長さは８時間に等しく、１３°エタノールでの抽出長さは８時間に等しい。
【００９１】
上記のように得られたアルコール抽出物を５０：５０の比率で再結合させた。混合は、１３°アルコール抽出物を８５°アルコール抽出物に添加することを想定した（添加速度は１６Ｌ／分に等しい）。混合は２０℃±５℃で行った。添加の終わりに、混合物を２０℃±５℃で７２時間デカンテーションし、次いで上清を回収し、さらに３０μｍのカットオフを有するセルロースフィルターを備えたパネルフィルターで濾過した。濾過の終了時に、アルコールの等級をチェックし、アルコール度数６２°±１°に調整する。
【００９２】
７．凍結乾燥多分画抽出物の調製
実施例１に記載したようにして得られた清澄化アルコール抽出物は、アルコール等級を補正することなく、エタノール蒸発によって、標準的なプロトコルに従って薄膜蒸留システムを用いて、約５００Ｌ／時の流速で濃縮されるように抽出物の供給を想定して濃縮される。この作業は、残留真空度を６０〜８０ｋＰａ（０．６〜０．８ｂａｒ）に設定して実行し、蒸発壁を加熱する流体を１４０℃に設定することにより、エタノール除去後に濃縮水性抽出液を得る。このようにして得られた水性抽出物を凍結乾燥に付した。
【００９３】
８．アラビアガムに担持された凍結乾燥多分画抽出物の調製
実施例１に記載したように得られた清澄化アルコール抽出物をアラビアガムと混合し、実施例２に記載のように濃縮および凍結乾燥に供した。
【図１Ａ】
2019516740.tif 000048
【図１Ｂ】
2019516740.tif 000049
【図１Ｃ】
2019516740.tif 000050
【図１Ｄ】
2019516740.tif 000051
【図２Ａ】
2019516740.tif 000052
【図２Ｂ】
2019516740.tif 000053
【図２Ｃ】
2019516740.tif 000054
【図３Ａ】
2019516740.tif 000055
【図３Ｂ】
2019516740.tif 000056
【図３Ｃ】
2019516740.tif 000057
【図３Ｄ】
2019516740.tif 000058
【図４Ａ】
2019516740.tif 000059
【図４Ｂ】
2019516740.tif 000060
【図４Ｃ】
2019516740.tif 000061
【図４Ｄ】
2019516740.tif 000062
【図５Ａ】
2019516740.tif 000063
【図５Ｂ】
2019516740.tif 000064
【図５Ｃ】
2019516740.tif 000065
【図５Ｄ】
2019516740.tif 000066
【図６】
2019516740.tif 000067
【図７】
2019516740.tif 000068
【国際調査報告】
2019516740.tif 000069
2019516740.tif 000070
2019516740.tif 000071
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