(57)【要約】  本発明は、異常ヘモグロビン症の治療のためのゲノム編集システム、試薬および方法に関する。
2019500043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子であって、前記ｃｒＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子（例えば、ヒトＢＣＬ１１ａ遺伝子）、ＢＣＬ１１ａエンハンサー（例えば、ヒトＢＣＬ１１ａエンハンサー）、またはＨＦＰＨ領域（例えば、ヒトＨＰＦＨ領域）の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子。
【請求項２】
前記標的配列は、前記ＢＣＬ１１Ａ遺伝子のものであり、かつ前記標的化ドメインは、配列番号１〜配列番号８５または配列番号４００〜配列番号１２３１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記標的配列は、ＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、かつ前記標的化ドメインは、配列番号１２３２〜配列番号１４９９のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記標的配列は、ＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、かつ前記標的化ドメインは、配列番号１８２〜配列番号２７７または配列番号３３４〜配列番号３４１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記標的化ドメインは、配列番号３４１、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２４７、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２４４、配列番号１９９、配列番号２５１、配列番号２５０、配列番号３３４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号３３６、または配列番号３３７のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項４に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記標的化ドメインは、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、または配列番号３３８のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項４に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７】
前記標的化ドメインは、配列番号２４８または配列番号３３８のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項４に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項８】
前記標的化ドメインは、配列番号２４８を含む、例えばそれからなる、請求項４に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項９】
前記標的化ドメインは、配列番号３３８を含む、例えばそれからなる、請求項４に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記標的配列は、ＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、かつ標的化ドメインは、配列番号２７８〜配列番号３３３のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１１】
前記標的化ドメインは、配列番号３１８、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号２９４、配列番号３１０、配列番号３１９、配列番号２９８、配列番号３２２、配列番号３１１、配列番号３１５、配列番号２９０、配列番号３１７、配列番号３０９、配列番号２８９、または配列番号２８１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項１０に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１２】
前記標的化ドメインは、配列番号３１８を含む、例えばそれからなる、請求項１０に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１３】
前記標的配列は、ＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、かつ前記標的化ドメインは、配列番号１５９６〜配列番号１６９１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１４】
前記標的化ドメインは、配列番号１６８３、配列番号１６３８、配列番号１６４７、配列番号１６０９、配列番号１６２１、配列番号１６１７、配列番号１６５４、配列番号１６３１、配列番号１６２０、配列番号１６３７、配列番号１６１２、配列番号１６５６、配列番号１６１９、配列番号１６７５、配列番号１６４５、配列番号１５９８、配列番号１５９９、配列番号１６６３、配列番号１６７７、または配列番号１６２６のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項１３に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１５】
前記標的配列は、ＨＦＰＨ領域（例えば、フランス型ＨＰＦＨ領域）のものであり、かつ前記標的化ドメインは、配列番号８６〜配列番号１８１、配列番号１５００〜配列番号１５９５、または配列番号１６９２〜配列番号１７６１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１６】
前記標的化ドメインは、配列番号１００、配列番号１６５、配列番号１１３、配列番号９９、配列番号１１２、配列番号９８、配列番号１５８０、配列番号１０６、配列番号１５０３、配列番号１５８９、配列番号１６０、配列番号１５３７、配列番号１５９、配列番号１０１、配列番号１６２、配列番号１０４、配列番号１３８、配列番号１５３６、配列番号１５３９、配列番号１５８５のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項１５に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１７】
前記標的化ドメインは、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１５０５、配列番号１５８９、配列番号１７００、または配列番号１７５０のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項１５に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１８】
前記標的化ドメインは、配列番号１００、配列番号１６５、または配列番号１１３のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、請求項１５に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１９】
前記標的化ドメインは、前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸を含む、例えばそれからなる、請求項２〜１８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２０】
前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸は、前記記載される標的化ドメイン配列の３’末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸である、請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２１】
前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸は、前記記載される標的化ドメイン配列の５’末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸である、請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２２】
前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸は、前記記載される標的化ドメイン配列の５’核酸または３’核酸のいずれも含まない、請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２３】
前記標的化ドメインは、前記記載される標的化ドメイン配列からなる、請求項２〜２２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２４】
前記ｃｒＲＮＡの一部分と前記ｔｒａｃｒの一部分とは、ハイブリダイズして、配列番号６５８４または６５８５を含むフラッグポールを形成する、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２５】
前記フラッグポールは、前記フラッグポールの前記ｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第１のフラッグポール伸長部は、配列番号６５８６を含む、請求項２４に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２６】
前記フラッグポールは、前記フラッグポールの前記ｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する第２のフラッグポール伸長部および存在する場合には前記第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第２のフラッグポール伸長部は、配列番号６５８７を含む、請求項２４または２５に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２７】
前記ｔｒａｃｒは、配列番号６６６０または配列番号６６６１を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２８】
前記ｔｒａｃｒは、配列番号７８１２を含み、任意選択で３’末端に追加の１、２、３、４、５、６、または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項２９】
前記ｃｒＲＮＡは、５’から３’に、［標的化ドメイン］−：
ａ）配列番号６５８４；
ｂ）配列番号６５８５；
ｃ）配列番号６６０５；
ｄ）配列番号６６０６；
ｅ）配列番号６６０７；
ｆ）配列番号６６０８；または
ｇ）配列番号７８０６
を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３０】
前記ｔｒａｃｒは、５’から３’に、
ａ）配列番号６５８９；
ｂ）配列番号６５９０；
ｃ）配列番号６６０９；
ｄ）配列番号６６１０；
ｅ）配列番号６６６０；
ｆ）配列番号６６６１；
ｇ）配列番号７８１２；
ｈ）配列番号７８０７；
ｉ）（配列番号７８０８；
ｊ）配列番号７８０９；
ｋ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６、または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む前記ａ）〜ｊ）のいずれか；
ｌ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６、または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む前記ａ）〜ｋ）のいずれか；または
ｍ）５’末端に（例えば、５’側端に）少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば１、２、３、４、５、６、または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む前記ａ）〜ｌ）のいずれか
を含む、請求項１〜２３または２９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３１】
前記標的化ドメインと前記ｔｒａｃｒとは、別個の核酸分子に配置され、前記標的化ドメインを含む前記核酸分子は配列番号６６０７を含み、配列番号６６０７は任意選択で前記標的化ドメインのすぐ３’側に配置され、および前記ｔｒａｃｒを含む前記核酸分子は、配列番号６６６０を含む、例えばそれからなる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３２】
前記フラッグポールの前記ｃｒＲＮＡ部分は、配列番号６６０７または配列番号６６０８を含む、請求項２７または２８に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３３】
前記ｔｒａｃｒは、配列番号６５８９または６５９０と、任意選択で、第１のフラッグポール伸長部が存在する場合、配列番号６５８９または６５９０の５’側に配置された第１のｔｒａｃｒ伸長部とを含み、前記第１のｔｒａｃｒ伸長部は、配列番号６５９１を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３４】
前記標的化ドメインと前記ｔｒａｃｒとは、別個の核酸分子に配置される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３５】
前記標的化ドメインと前記ｔｒａｃｒとは、単一の核酸分子に配置され、前記ｔｒａｃｒは、前記標的化ドメインの３’側に配置される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３６】
前記標的化ドメインの３’側かつ前記ｔｒａｃｒの５’側に配置されたループをさらに含む、請求項３５に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３７】
前記ループは、配列番号６５８８を含む、請求項３６に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３８】
５’から３’に、［標的化ドメイン］−：
（ａ）配列番号６６０１；
（ｂ）配列番号６６０２；
（ｃ）配列番号６６０３；
（ｄ）配列番号６６０４；
（ｅ）配列番号７８１１；または
（ｆ）３’末端に１、２、３、４、５、６または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む前記（ａ）〜（ｅ）のいずれか
を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３９】
前記標的化ドメインと前記ｔｒａｃｒとは、単一の核酸分子に配置され、前記核酸分子は、前記標的化ドメインと配列番号７８１１とを含み、例えばそれからなり、配列番号７８１１は任意選択で前記標的化ドメインのすぐ３’側に配置される、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４０】
前記ｇＲＮＡ分子を含む前記核酸分子の１つまたは任意選択で２つ以上は、
ａ）前記１つまたは複数の核酸分子の３’末端における１つ以上、例えば３つのホスホロチオエート修飾；
ｂ）前記１つまたは複数の核酸分子の５’末端における１つ以上、例えば３つのホスホロチオエート修飾；
ｃ）前記１つまたは複数の核酸分子の前記３’末端における１つ以上、例えば３つの２’−Ｏ−メチル修飾；
ｄ）前記１つまたは複数の核酸分子の前記５’末端における１つ以上、例えば３つの２’−Ｏ−メチル修飾；
ｅ）前記１つまたは複数の核酸分子の末端から４番目、末端から３番目、および末端から２番目の３’残基の各々における２’Ｏ−メチル修飾；
ｆ）前記１つまたは複数の核酸分子の末端から４番目、末端から３番目、および末端から２番目の５’残基の各々における２’Ｏ−メチル修飾；または
ｆ）これらの任意の組み合わせ
を含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４１】
配列：
（ａ）配列番号３４２；
（ｂ）配列番号３４３；または
（ｃ）配列番号１７６２
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４２】
（ａ）配列番号３４４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３４４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号３４５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３４５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４３】
配列：
（ａ）配列番号３４７；
（ｂ）配列番号３４８；または
（ｃ）配列番号１７６３
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４４】
（ａ）配列番号３４９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３４９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号３５０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３５０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４５】
配列：
（ａ）配列番号３５１；
（ｂ）配列番号３５２；または
（ｃ）配列番号１７６４
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４６】
（ａ）配列番号３５３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３５３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号３５４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３５４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４７】
配列：
（ａ）配列番号３５５；
（ｂ）配列番号３５６；または
（ｃ）配列番号１７６５
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４８】
（ａ）配列番号３５７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３５７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号３５８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３５８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４９】
配列：
（ａ）配列番号３５９；
（ｂ）配列番号３６０；または
（ｃ）配列番号１７６６
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５０】
（ａ）配列番号３６１を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３６１を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号３６２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３６２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５１】
配列：
（ａ）配列番号３６３；
（ｂ）配列番号３６４；または
（ｃ）配列番号１７６７
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５２】
（ａ）配列番号３６５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３６５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号３６６を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３６６を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５３】
配列：
（ａ）配列番号３６７；
（ｂ）配列番号３６８；または
（ｃ）配列番号１７６８
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５４】
（ａ）配列番号３６９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３６９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号３７０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３７０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５５】
配列：
（ａ）配列番号３７１；
（ｂ）配列番号３７２；または
（ｃ）配列番号１７６９
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５６】
（ａ）配列番号３７３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３７３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号３７４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３７４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５７】
配列：
（ａ）配列番号３７５；
（ｂ）配列番号３７６；または
（ｃ）配列番号１７７０
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５８】
（ａ）配列番号３７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号３７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５９】
配列：
（ａ）配列番号３７９；
（ｂ）配列番号３８０；または
（ｃ）配列番号１７７１
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６０】
（ａ）配列番号３８１を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３８１を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号３８２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３８２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６１】
配列：
（ａ）配列番号３８３；
（ｂ）配列番号３８４；または
（ｃ）配列番号１７７２
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６２】
（ａ）配列番号３８５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３８５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号３８６を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３８６を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６３】
配列：
（ａ）配列番号３８７；
（ｂ）配列番号３８８；または
（ｃ）配列番号１７７３
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６４】
（ａ）配列番号３８９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３８９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号３９０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３９０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６５】
配列：
（ａ）配列番号３９１；
（ｂ）配列番号３９２；または
（ｃ）配列番号１７７４
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６６】
（ａ）配列番号３９３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３９３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号３９４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３９４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６７】
配列：
（ａ）配列番号３９５；
（ｂ）配列番号３９６；または
（ｃ）配列番号１７７５
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６８】
（ａ）配列番号３９７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号３９７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号３９８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または
（ｄ）配列番号３９８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６９】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、インデルは、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインと相補的な前記標的配列にまたはその近傍に形成される、請求項１〜６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７０】
前記インデルは、ＧＡＴＡ−１またはＴＡＬ−１結合部位のヌクレオチドを含まない、請求項６９に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７１】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、インデルは、前記集団の細胞の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９６％、例えば少なくとも約９７％、例えば少なくとも約９８％、例えば少なくとも約９９％において、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインと相補的な前記標的配列にまたはその近傍に形成される、請求項１〜７０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７２】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、ＧＡＴＡ−１またはＴＡＬ−１結合部位のヌクレオチドを含まないインデルは、前記集団の細胞の少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約３５％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約４５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約６５％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９９％において、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインと相補的な前記標的配列にまたはその近傍に形成される、請求項１〜６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７３】
前記インデルは、前記集団の細胞の少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９６％、例えば少なくとも約９７％、例えば少なくとも約９８％、例えば少なくとも約９９％において、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７のいずれかに挙げられるインデルである、請求項７１または７２に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７４】
前記細胞の集団中において最も高頻度で検出される３つのインデルは、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７のいずれかに挙げられる任意のｇＲＮＡ分子に関連するインデルを含む、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７５】
前記インデルは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって計測されるとおりである、請求項６９〜７４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７６】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、胎児ヘモグロビンの発現は、前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において増加する、請求項１〜７５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７７】
胎児ヘモグロビンの発現は、前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９６％、例えば少なくとも約９７％、例えば少なくとも約９８％、例えば少なくとも約９９％増加する、請求項７６に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７８】
前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、または約８〜約９ピコグラム、または約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、請求項７６または７７に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７９】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、オフターゲットインデル、例えば次世代シーケンシングおよび／またはヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、前記細胞において形成されない、請求項１〜７８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項８０】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、オフターゲットインデル、例えば次世代シーケンシングおよび／またはヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、前記細胞の集団の細胞の約５％超、例えば約１％超、例えば約０．１％超、例えば約０．０１％超において検出されない、請求項１〜７８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項８１】
前記細胞は、哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞であり、例えばヒト細胞である（または細胞の集団はそれを含む）、請求項６９〜８０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項８２】
前記細胞は、ＨＳＰＣである（または細胞の集団はそれを含む）、請求項８１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項８３】
前記ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋である、請求項８２に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項８４】
前記ＨＳＰＣは、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋である、請求項８３に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項８５】
前記細胞は、前記細胞が投与される患者にとって自己由来である、請求項６９〜８４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項８６】
前記細胞は、前記細胞が投与される患者にとって同種異系由来である、請求項６９〜８４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項８７】
１）請求項１〜８６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）、およびＣａｓ９分子；
２）請求項１〜８６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）、およびＣａｓ９分子をコードする核酸；
３）請求項１〜８６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）をコードする核酸、およびＣａｓ９分子；
４）請求項１〜８６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）をコードする核酸、およびＣａｓ９分子をコードする核酸；または
５）前記１）〜４）のいずれか、および鋳型核酸；または
６）前記１）〜４）のいずれか、および鋳型核酸をコードする配列を含む核酸
を含む組成物。
【請求項８８】
Ｃａｓ９分子をさらに含む、請求項１〜８６のいずれか一項に記載の第１のｇＲＮＡ分子を含む組成物。
【請求項８９】
前記Ｃａｓ９分子は、活性または不活性化膿レンサ球菌（ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である、請求項８７または８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１を含む、請求項８７〜８９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９１】
前記Ｃａｓ９分子は、
（ａ）配列番号７８２１；
（ｂ）配列番号７８２２；
（ｃ）配列番号７８２３；
（ｄ）配列番号７８２４；
（ｅ）配列番号７８２５；
（ｆ）配列番号７８２６；
（ｇ）配列番号７８２７；
（ｈ）配列番号７８２８；
（ｉ）配列番号７８２９；
（ｊ）配列番号７８３０；または
（ｋ）配列番号７８３１
を含む、例えばそれからなる、請求項８７〜８９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９２】
前記第１のｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子は、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）に存在する、請求項８８〜９１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９３】
第２のｇＲＮＡ分子；第２のｇＲＮＡ分子および第３のｇＲＮＡ分子；または第２のｇＲＮＡ分子、任意選択で第３のｇＲＮＡ分子、および任意選択で第４のｇＲＮＡ分子をさらに含み、前記第２のｇＲＮＡ分子、前記任意選択の第３のｇＲＮＡ分子、および前記任意選択の第４のｇＲＮＡ分子は、請求項１〜６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子であり、前記組成物の各ｇＲＮＡ分子は、異なる標的配列と相補的である、請求項８７〜９２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９４】
前記第１のｇＲＮＡ分子、前記第２のｇＲＮＡ分子、前記任意選択の第３のｇＲＮＡ分子、および前記任意選択の第４のｇＲＮＡ分子の２つ以上は、同じ遺伝子または領域内の標的配列と相補的である、請求項９３に記載の組成物。
【請求項９５】
前記第１のｇＲＮＡ分子、前記第２のｇＲＮＡ分子、前記任意選択の第３のｇＲＮＡ分子、および前記任意選択の第４のｇＲＮＡ分子は、２００００ヌクレオチド以下、１００００ヌクレオチド以下、６０００以下、５０００ヌクレオチド以下、４０００以下、１０００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以下、８０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下または１０ヌクレオチド以下離れた標的配列と相補的である、請求項９３または９４に記載の組成物。
【請求項９６】
前記第１のｇＲＮＡ分子、前記第２のｇＲＮＡ分子、前記任意選択の第３のｇＲＮＡ分子、および前記任意選択の第４のｇＲＮＡ分子の２つ以上は、異なる遺伝子または領域内の標的配列と相補的である、請求項９３に記載の組成物。
【請求項９７】
第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
（ａ）請求項４に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；
（ｂ）請求項５に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；
ｃ）請求項６に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；または
（ｄ）請求項７に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；または
（ｅ）請求項４１〜５６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である、請求項９４または９５に記載の組成物。
【請求項９８】
第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
（ａ）請求項１０に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；または
（ｂ）請求項１１に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である、請求項９４または９５に記載の組成物。
【請求項９９】
第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
（ａ）請求項１３に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；または
（ｂ）請求項１４に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である、請求項９４または９５に記載の組成物。
【請求項１００】
第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、前記第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
（ａ）請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；
（ｂ）請求項１７に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；
（ｃ）請求項１８に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；または
（ｄ）請求項５７〜６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である、請求項９４〜９６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０１】
第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、
（１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項４に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）請求項５に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項６に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）請求項７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｅ）請求項４１〜５６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１０に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｂ）請求項１１に記載のｇＲＮＡ分子から選択される、請求項９４〜９６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０２】
第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、
（１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項４に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）請求項５に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項６に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）請求項７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｅ）請求項４１〜５６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１３に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、（ｂ）請求項１４に記載のｇＲＮＡ分子から選択される、請求項９４〜９６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０３】
第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、
（１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項４に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）請求項５に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項６に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）請求項７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｅ）請求項４１〜５６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）請求項１７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項１８に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）請求項５７〜６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から選択される、請求項９４〜９６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０４】
第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、
（１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１０に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｂ）請求項１１に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１３に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、（ｂ）請求項１４に記載のｇＲＮＡ分子から選択される、請求項９４〜９６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０５】
第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、
（１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１０に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｂ）請求項１１に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）請求項１７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項１８に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）請求項５７〜６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から選択される、請求項９４〜９６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０６】
第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、
（１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１３に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、（ｂ）請求項１４に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）前記第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）請求項１７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項１８に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）請求項５７〜６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から選択される、請求項９４〜９６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０７】
第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、
（１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項１６に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）請求項１７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項１８に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）請求項５７〜６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；および（２）前記第２のｇＲＮＡ分子は、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むか、または
（１）前記第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）請求項４に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）請求項５に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）請求項６に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）請求項７に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｅ）請求項４１〜５６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｆ）請求項１０に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｇ）請求項１１に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｈ）請求項１３に記載のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｉ）請求項１４に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；および（２）前記第２のｇＲＮＡ分子は、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む、請求項９６に記載の組成物。
【請求項１０８】
前記第１のｇＲＮＡ分子および前記第２のｇＲＮＡ分子は、請求項４１〜６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択される、請求項９４〜９６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０９】
前記組成物の前記ｇＲＮＡ分子成分に関して、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とからなる、請求項８７〜１０８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１０】
前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子、例えば請求項９０または９１に記載のＣａｓ９分子と共にリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中にある、請求項８７〜１０９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１１】
鋳型核酸を含み、前記鋳型核酸は、前記第１のｇＲＮＡ分子の前記標的配列にまたはその近傍にあるヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む、請求項８７〜１１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記鋳型核酸は、
（ａ）ヒトβグロビン、例えば突然変異Ｇ１６Ｄ、Ｅ２２ＡおよびＴ８７Ｑの１つ以上を含むヒトβグロビン、もしくはその断片；または
（ｂ）ヒトγグロビン、もしくはその断片
をコードする核酸を含む、請求項１１１に記載の組成物。
【請求項１１３】
エレクトロポレーションに好適な媒体中に製剤化される、請求項８７〜１１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１４】
前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子と共にＲＮＰ中にあり、前記ＲＮＰの各々は、約１０μＭ未満、例えば約３μＭ未満、例えば約１μＭ未満、例えば約０．５μＭ未満、例えば約０．３μＭ未満、例えば約０．１μＭ未満の濃度である、請求項８７〜１１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１５】
請求項１〜６８のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列。
【請求項１１６】
前記核酸は、前記１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする前記配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１１５に記載の核酸配列。
【請求項１１７】
前記プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターである、請求項１１６に記載の核酸配列。
【請求項１１８】
前記プロモーターは、Ｕ６プロモーターまたはＨＩプロモーターである、請求項１１７に記載の核酸配列。
【請求項１１９】
前記核酸は、Ｃａｓ９分子をさらにコードする、請求項１１５〜１１８のいずれか一項に記載の核酸配列。
【請求項１２０】
前記Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１、配列番号７８２１、配列番号７８２２、配列番号７８２３、配列番号７８２４、配列番号７８２５、配列番号７８２６、配列番号７８２７、配列番号７８２８、配列番号７８２９、配列番号７８３０、または配列番号７８３１のいずれかを含む、請求項１１９に記載の核酸配列。
【請求項１２１】
前記核酸は、Ｃａｓ９分子をコードする前記配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１１９または１２０に記載の核酸配列。
【請求項１２２】
前記プロモーターは、ＥＦ−１プロモーター、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである、請求項１２１に記載の核酸配列。
【請求項１２３】
請求項１１５〜１２２のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２４】
前記ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、およびＲＮＡベクターからなる群から選択される、請求項１２３に記載のベクター。
【請求項１２５】
細胞（例えば、細胞の集団）を前記細胞内の標的配列でまたはその近傍で改変する（例えば、核酸の構造（例えば、配列）を改変する）方法であって、前記細胞（例えば、細胞の集団）を、
１）請求項１〜６８のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子；
２）請求項１〜６８のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子をコードする核酸；
３）請求項１〜６８のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびＣａｓ９分子；
４）請求項１〜６８のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびＣａｓ９分子をコードする核酸；
５）前記１）〜４）のいずれか、および鋳型核酸；
６）前記１）〜４）のいずれか、および鋳型核酸をコードする配列を含む核酸；
７）請求項８７〜１１４のいずれか一項に記載の組成物；または
８）請求項１２３または１２４に記載のベクター
と接触させる（例えば、それに導入する）ステップを含む方法。
【請求項１２６】
前記ｇＲＮＡ分子または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、前記Ｃａｓ９分子または前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸とは、単一の組成物に製剤化される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記ｇＲＮＡ分子または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、前記Ｃａｓ９分子または前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸とは、２つ以上の組成物に製剤化される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
前記２つ以上の組成物は、同時にまたは逐次的に送達される、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記細胞は、動物細胞である、請求項１２５〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記細胞は、哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞である、請求項１２５〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記細胞は、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記細胞は、ＣＤ３４＋細胞である、請求項１２５〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
前記細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である、請求項１２５〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記細胞は、ＣＤ３４＋細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物中に配置される、請求項１２５〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、動員末梢血または臍帯血から単離されている、請求項１２５〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記細胞は、前記細胞が投与される患者にとって自己由来または同種異系由来である、請求項１２５〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記改変は、前記１つ以上のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインと相補的なゲノムＤＮＡ配列にまたはその近傍にインデルをもたらす、請求項１２５〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記インデルは、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデルである、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記インデルは、約４０ヌクレオチド未満、例えば３０ヌクレオチド未満、例えば２０ヌクレオチド未満、例えば１０ヌクレオチド未満の挿入または欠失である、請求項１３７または１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記インデルは、単一のヌクレオチド欠失である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
細胞の集団をもたらし、前記集団の細胞の少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）は、改変されている、例えばインデルを含む、請求項１３７〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記改変は、赤血球系統の分化細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有する細胞（例えば、細胞の集団）をもたらし、前記分化細胞は、胎児ヘモグロビンの増加したレベル、例えば非改変細胞（例えば、細胞の集団）と比べて胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈する、請求項１２５〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記改変は、分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有する細胞の集団をもたらし、前記分化細胞の集団は、Ｆ細胞の増加した割合、例えば非改変細胞の集団と比べてＦ細胞の増加した割合（例えば、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％高い）を有する、請求項１２５〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記改変は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有する細胞をもたらし、前記分化細胞は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、または約８〜約９ピコグラム、または約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、請求項１２５〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
請求項１２５〜１４４のいずれか一項に記載の方法によって改変された細胞。
【請求項１４６】
請求項１２５〜１４４のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能な細胞。
【請求項１４７】
請求項１〜６８のいずれか一項に記載の第１のｇＲＮＡ分子、または請求項８７〜１１４のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１５〜１２２のいずれか一項に記載の核酸、または請求項１２３もしくは１２４に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１４８】
Ｃａｓ９分子を含む、請求項１４７に記載の細胞。
【請求項１４９】
前記Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１、配列番号７８２１、配列番号７８２２、配列番号７８２３、配列番号７８２４、配列番号７８２５、配列番号７８２６、配列番号７８２７、配列番号７８２８、配列番号７８２９、配列番号７８３０、または配列番号７８３１のいずれかを含む、請求項１４８に記載の細胞。
【請求項１５０】
請求項１〜６８のいずれか一項に記載の第２のｇＲＮＡ分子、または請求項１〜６８のいずれか一項に記載の第２のｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含むか、それを含んでいたか、またはそれを含むことになり、前記第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、同一でない標的化ドメインを含む、請求項１４５〜１４９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５１】
胎児ヘモグロビンの発現は、ｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じ細胞型の細胞またはその子孫と比べて前記細胞またはその子孫（例えば、その赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫）において増加する、請求項１４５〜１５０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５２】
分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分化細胞は、胎児ヘモグロの増加したレベル、例えばｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じタイプの細胞と比べて胎児ヘモグロの増加したレベルを呈する、請求項１４５〜１５０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５３】
前記分化細胞（例えば、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞）は、少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、または約８〜約９ピコグラム、または約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを、例えばｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じタイプの細胞と比べて、産生する、請求項１５２に記載の細胞。
【請求項１５４】
幹細胞増殖剤と接触されていた、請求項１４５〜１５３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５５】
前記幹細胞増殖剤は、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１および化合物４）である、請求項１５４に記載の細胞。
【請求項１５６】
前記幹細胞増殖剤は、化合物４である、請求項１５５に記載の細胞。
【請求項１５７】
請求項１〜６８のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインと相補的なゲノムＤＮＡ配列にまたはその近傍にインデルを含む細胞、例えば請求項１４５〜１５６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５８】
前記インデルは、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデルである、請求項１５７に記載の細胞。
【請求項１５９】
前記インデルは、約４０ヌクレオチド未満、例えば３０ヌクレオチド未満、例えば２０ヌクレオチド未満、例えば１０ヌクレオチド未満の挿入または欠失である、請求項１５７または１５８に記載の細胞。
【請求項１６０】
前記インデルは、単一のヌクレオチド欠失である、請求項１５７〜１５９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６１】
動物細胞である、請求項１４５〜１６０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６２】
哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞である、請求項１６１に記載の細胞。
【請求項１６３】
造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）である、請求項１４５〜１６２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６４】
ＣＤ３４＋細胞である、請求項１４５〜１６３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６５】
ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である、請求項１６４に記載の細胞。
【請求項１６６】
前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、動員末梢血または臍帯血から単離されている、請求項１４５〜１６５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６７】
前記細胞が投与される患者にとって自己由来である、請求項１４５〜１６６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６８】
前記細胞が投与される患者にとって同種異系由来である、請求項１４５〜１６６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６９】
請求項１４５〜１６８のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞の集団。
【請求項１７０】
前記集団の細胞の少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）は、請求項１４５〜１６８のいずれか一項に記載の細胞である、請求項１６９に記載の細胞の集団。
【請求項１７１】
分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、Ｆ細胞の増加した割合、例えば同じタイプの修飾されていない細胞の集団と比べてＦ細胞の増加した割合（例えば、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％高い）を有する、請求項１６９または１７０に記載の細胞の集団。
【請求項１７２】
前記分化細胞の集団のＦ細胞は、１細胞当たり平均で少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、または約８〜約９ピコグラム、または約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、請求項１７１に記載の細胞の集団。
【請求項１７３】
１）少なくとも１ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ、
２）少なくとも２ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ、
３）少なくとも３ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ、
４）少なくとも４ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ、または
５）２ｅ６〜１０ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ
を含む、請求項１６９〜１７２のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１７４】
前記集団の細胞の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％）は、ＣＤ３４＋細胞である、請求項１６９〜１７３のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１７５】
前記集団の細胞の少なくとも約１０％、例えば少なくとも約１５％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である、請求項１７４に記載の細胞の集団。
【請求項１７６】
骨髄に由来する、請求項１６９〜１７５のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１７７】
哺乳動物細胞、例えばヒト細胞を含む、例えばそれからなる、請求項１６９〜１７６のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１７８】
前記細胞の集団が投与される患者に対して自己由来である、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１７９】
前記細胞の集団が投与される患者に対して同種異系由来である、請求項１６９〜１７７のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項１８０】
請求項１４５〜１６８のいずれか一項に記載の細胞または請求項１６９〜１７９のいずれか一項に記載の細胞の集団を含む組成物。
【請求項１８１】
薬学的に許容可能な媒体、例えば凍結保存に好適である薬学的に許容可能な媒体を含む、請求項１８０に記載の組成物。
【請求項１８２】
異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、請求項１４５〜１６８のいずれか一項に記載の細胞、請求項１６９〜１７９のいずれか一項に記載の細胞の集団、または請求項１８０もしくは１８１に記載の組成物を患者に投与するステップを含む方法。
【請求項１８３】
哺乳動物における胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法であって、請求項１４５〜１６８のいずれか一項に記載の細胞、請求項１６９〜１７９のいずれか一項に記載の細胞の集団、または請求項１８０もしくは１８１に記載の組成物を患者に投与するステップを含む方法。
【請求項１８４】
前記異常ヘモグロビン症は、β−サラセミアまたは鎌状赤血球症である、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８５】
細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法であって、
（ａ）細胞（例えば、細胞の集団）（例えば、ＨＳＰＣ（例えば、ＨＳＰＣの集団））を提供するステップ；
（ｂ）幹細胞増殖剤を含む細胞培養培地中で前記細胞（例えば、前記細胞の集団）をエキソビボで培養するステップ；および
（ｃ）請求項１〜６８のいずれか一項に記載の第１のｇＲＮＡ分子、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の第１のｇＲＮＡ分子をコードする核酸分子、請求項８７〜１１４のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１５〜１２２のいずれか一項に記載の核酸、または請求項１２３もしくは１２４に記載のベクターを前記細胞に導入するステップ
を含む方法。
【請求項１８６】
前記ステップ（ｃ）の導入の後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、分化細胞（例えば、分化細胞の集団）、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球系統の細胞の集団）、例えば赤血球細胞（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞（例えば、分化細胞の集団）は、増加した胎児ヘモグロビン、例えばステップ（ｃ）に供されていない同じ細胞と比べて増加した胎児ヘモグロビンを産生する、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
前記幹細胞増殖剤は、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１および化合物４）である、請求項１８５または１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
前記幹細胞増殖剤は、化合物４である、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、およびヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む、請求項１８５〜１８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
前記細胞培養培地は、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）をさらに含む、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
前記細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、およびヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をそれぞれ約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で含む、請求項１８９または１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
前記細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、およびヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をそれぞれ約５０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
前記細胞培養培地は、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）を約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度で含む、請求項１９０〜１９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９４】
前記細胞培養培地は、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）を約５０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約１ｎＭ〜約１ｍＭの範囲の濃度で含む、請求項１８５〜１９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９６】
前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約１μＭ〜約１００μＭの範囲の濃度で含む、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約５０μＭ〜約７５μＭの範囲の濃度で含む、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約５０μＭの濃度、例えば５０μＭの濃度で含む、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約７５μＭの濃度、例えば７５μＭの濃度で含む、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２００】
前記ステップ（ｂ）の培養は、前記ステップ（ｃ）の導入の前の培養期間を含む、請求項１８５〜１９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０１】
前記ステップ（ｃ）の導入の前の前記培養期間は、少なくとも１２時間、例えば約１日〜約３日の期間であり、例えば約１日〜約２日の期間であり、例えば約２日の期間である、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
前記ステップ（ｂ）の培養は、前記ステップ（ｃ）の導入の後の培養期間を含む、請求項１８５〜２０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０３】
前記ステップ（ｃ）の導入の後の前記培養期間は、少なくとも１２時間、例えば約１日〜約１０日の期間であり、例えば約１日〜約５日の期間であり、例えば約２日〜約４日の期間であり、例えば約２日の期間であり、または約３日の期間であり、または約４日の期間である、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
前記細胞の集団は、少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、例えばステップ（ｂ）によって培養されていない細胞と比べて、増殖する、請求項１８５〜２０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０５】
前記ステップ（ｃ）の導入は、エレクトロポレーションを含む、請求項１８５〜２０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０６】
前記エレクトロポレーションは、１〜５パルス、例えば１パルスを含み、各パルスは、７００ボルト〜２０００ボルトの範囲のパルス電圧であり、かつ１０ｍｓ〜１００ｍｓの範囲のパルス持続時間を有する、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０７】
前記エレクトロポレーションは、１パルスを含む、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２０８】
前記パルス電圧は、１５００〜１９００ボルトの範囲、例えば１７００ボルトである、請求項２０６または２０７に記載の方法。
【請求項２０９】
前記パルス持続時間は、１０ｍｓ〜４０ｍｓの範囲、例えば２０ｍｓである、請求項２０６〜２０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１０】
ステップ（ａ）で提供される前記細胞（例えば、細胞の集団）は、ヒト細胞（例えば、ヒト細胞の集団）である、請求項１８５〜２０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１１】
ステップ（ａ）で提供される前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）または臍帯血から単離されたものである、請求項２１０に記載の方法。
【請求項２１２】
ステップ（ａ）で提供される前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄から単離されたものである、例えば異常ヘモグロビン症に罹患している患者の骨髄から単離されたものである、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１３】
ステップ（ａ）で提供される前記細胞の集団は、ＣＤ３４＋細胞に関して富化されたものである、請求項１８５〜２１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１４】
前記ステップ（ｃ）の導入の後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、凍結保存される、請求項１８５〜２１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１５】
前記ステップ（ｃ）の導入の後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、前記第１のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインと相補的なゲノムＤＮＡ配列にまたはその近傍にインデルを含む、請求項１８５〜２１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１６】
前記インデルは、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデルである、請求項１３２に記載の方法。
【請求項２１７】
前記ステップ（ｃ）の導入の後、前記細胞の集団の細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％は、前記第１のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインと相補的なゲノムＤＮＡ配列にまたはその近傍にインデルを含む、請求項１８５〜２１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１８】
前記細胞の集団の細胞の各々における前記インデルは、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデルである、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２１９】
請求項１８５〜２１８のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能な細胞（例えば、細胞の集団）。
【請求項２２０】
異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、請求項２１９に記載の細胞（例えば、細胞の集団）を含む組成物をヒト患者に投与するステップを含む方法。
【請求項２２１】
ヒト患者における胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法であって、請求項２１９に記載の細胞（例えば、細胞の集団）を含む組成物を前記ヒト患者に投与するステップを含む方法。
【請求項２２２】
前記異常ヘモグロビン症は、β−サラセミアまたは鎌状赤血球症である、請求項２２０に記載の方法。
【請求項２２３】
前記ヒト患者は、前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約１ｅ６個の請求項２１９に記載の細胞、例えば前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約１ｅ６個の請求項２１９に記載のＣＤ３４＋細胞を含む組成物を投与される、請求項２２０〜２２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２４】
前記ヒト患者は、前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個の請求項２１９に記載の細胞、例えば前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個の請求項２１９に記載のＣＤ３４＋細胞を含む組成物を投与される、請求項２２３に記載の方法。
【請求項２２５】
前記ヒト患者は、前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり約２ｅ６〜約１０ｅ６個の請求項２１９に記載の細胞、例えば前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６〜約１０ｅ６個の請求項２１９に記載のＣＤ３４＋細胞を含む組成物を投与される、請求項２２３に記載の方法。
【請求項２２６】
薬剤として用いられる、請求項１〜８６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項８７〜１１４または１８０もしくは１８１のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１５〜１２２のいずれか一項に記載の核酸、請求項１２３または１２４に記載のベクター、請求項１４５〜１６８または２１９のいずれか一項に記載の細胞、あるいは請求項１６９〜１７９のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項２２７】
薬剤の製造に用いられる、請求項１〜８６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項８７〜１１４または１８０もしくは１８１のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１５〜１２２のいずれか一項に記載の核酸、請求項１２３または１２４に記載のベクター、請求項１４５〜１６８または２１９のいずれか一項に記載の細胞、あるいは請求項１６９〜１７９のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項２２８】
疾患の治療に用いられる、請求項１〜８６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項８７〜１１４または１８０もしくは１８１のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１５〜１２２のいずれか一項に記載の核酸、請求項１２３または１２４に記載のベクター、請求項１４５〜１６８または２１９のいずれか一項に記載の細胞、あるいは請求項１６９〜１７９のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項２２９】
疾患の治療に用いられ、前記疾患は、異常ヘモグロビン症である、請求項１〜８６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項８７〜１１４または１８０もしくは１８１のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１５〜１２２のいずれか一項に記載の核酸、請求項１２３または１２４に記載のベクター、請求項１４５〜１６８または２１９のいずれか一項に記載の細胞、あるいは請求項１６９〜１７９のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【請求項２３０】
疾患の治療に用いられ、前記異常ヘモグロビン症は、β−サラセミアまたは鎌状赤血球症である、請求項１〜８６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項８７〜１１４または１８０もしくは１８１のいずれか一項に記載の組成物、請求項１１５〜１２２のいずれか一項に記載の核酸、請求項１２３または１２４に記載のベクター、請求項１４５〜１６８または２１９のいずれか一項に記載の細胞、または請求項１６９〜１７９のいずれか一項に記載の細胞の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１５年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／２７１，９６８号明細書、および２０１６年６月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３４７，４８４号明細書に対する優先権を主張する。これらの出願の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム型リピート））は、細菌においてウイルスの攻撃を防御するための適応免疫システムとして進化した。ウイルスへの曝露時、ウイルスＤＮＡの短いセグメントが細菌ゲノムのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。ウイルス配列を含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一部からＲＮＡが転写される。ウイルスゲノムに相補的な配列を含むこのＲＮＡがウイルスゲノム中の配列へのＣａｓ９タンパク質のターゲティングを媒介する。Ｃａｓ９タンパク質がウイルス標的を切断し、それによってサイレンシングする。
【０００３】
近年、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが真核細胞のゲノム編集に応用されるようになっている。部位特異的一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入により、例えば非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）を用いて標的配列を改変することが可能になる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
理論によって拘束されるものではないが、本発明は、一部には、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲシステムを用いることにより、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）発現が増加し、および／またはβグロビン（例えば、疾患原因突然変異を有するβグロビン遺伝子）の発現が低下するように細胞（例えば、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ））を修飾することができ、およびかかる細胞を用いることにより、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球症およびβサラセミアを治療し得るという発見に基づく。
【０００５】
したがって、ある態様において、本発明は、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子を１つ以上、例えば１つ含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃａｓ  ＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲシステム）を提供する。かかるシステム、ならびに本明細書に記載される方法および細胞では、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子のいずれも使用し得る。
【０００６】
ある態様において、本発明は、ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｃｒＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子、ＢＣＬ１１ａエンハンサー、またはＨＦＰＨ領域の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。
【０００７】
別の態様において、本発明は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的配列に相補的、例えば、ＢＣＬ１１ａコード領域内（例えば、ＢＣＬ１１ａエクソン内、例えばＢＣＬ１１ａエクソン２内）の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を提供する。実施形態において、本ｇＲＮＡは、配列番号１〜配列番号８５または配列番号４００〜配列番号１２３１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
【０００８】
別の態様において、本発明は、ＢＣＬ１１Ａエンハンサーの標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を提供する。
【０００９】
実施形態において、本ｇＲＮＡは、配列番号１２３２〜配列番号１４９９のいずれか１つを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
【００１０】
実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの標的配列に対するｇＲＮＡは、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの＋５８領域内の標的配列に対するｇＲＮＡであり、標的化ドメインは、配列番号１８２〜配列番号２７７または配列番号３３４〜配列番号３４１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３４１、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２４７、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２４４、配列番号１９９、配列番号２５１、配列番号２５０、配列番号３３４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号３３６、または配列番号３３７のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２４８を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２４７を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２４５を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３３６を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３３７を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３３８を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３３５を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２５２を含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡは、例えば５’から３’に、配列番号２４８−配列番号６６０７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、例えば５’から３’に、配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むｄｇＲＮＡである。ある実施形態において、ｇＲＮＡは、例えば５’から３’に、配列番号２４７−配列番号６６０７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、例えば５’から３’に、配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むｄｇＲＮＡである。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番号３３８−配列番号６６０４−ＵＵＵＵを含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番号３３５−配列番号６６０４−ＵＵＵＵを含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番号３３６−配列番号６６０４−ＵＵＵＵを含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番号２４５−配列番号６６０４−ＵＵＵＵを含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番号３３７−配列番号６６０４−ＵＵＵＵを含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番号２５２−配列番号６６０４−ＵＵＵＵを含む、例えばそれからなる。
【００１１】
実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの標的配列に対するｇＲＮＡは、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの＋６２領域内の標的配列に対するｇＲＮＡであり、標的化ドメインは、配列番号２７８〜配列番号３３３のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３１８、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号２９４、配列番号３１０、配列番号３１９、配列番号２９８、配列番号３２２、配列番号３１１、配列番号３１５、配列番号２９０、配列番号３１７、配列番号３０９、配列番号２８９、または配列番号２８１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３１８を含む、例えばそれからなる。
【００１２】
実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの標的配列に対するｇＲＮＡは、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの＋５５領域内の標的配列に対するｇＲＮＡであり、標的化ドメインは、配列番号１５９６〜配列番号１６９１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１６８３、配列番号１６３８、配列番号１６４７、配列番号１６０９、配列番号１６２１、配列番号１６１７、配列番号１６５４、配列番号１６３１、配列番号１６２０、配列番号１６３７、配列番号１６１２、配列番号１６５６、配列番号１６１９、配列番号１６７５、配列番号１６４５、配列番号１５９８、配列番号１５９９、配列番号１６６３、配列番号１６７７、または配列番号１６２６のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。
【００１３】
別の態様において、本発明は、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症（ＨＰＦＨ）領域の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を提供する。ある実施形態において、ＨＰＦＨ領域はフランス型ＨＰＦＨ領域である。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号８６〜配列番号１８１または配列番号１５００〜配列番号１５９５のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１００、配列番号１６５、配列番号１１３、配列番号９９、配列番号１１２、配列番号９８、配列番号１５８０、配列番号１０６、配列番号１５０３、配列番号１５８９、配列番号１６０、配列番号１５３７、配列番号１５９、配列番号１０１、配列番号１６２、配列番号１０４、配列番号１３８、配列番号１５３６、配列番号１５３９、配列番号１５８５のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１００を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１６５を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１１３を含む、例えばそれからなる。
【００１４】
前述の実施形態のいずれにおいても、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載される領域および／または特性をさらに有し得る。ある態様において、ｇＲＮＡ分子（例えば、前述の態様または実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子）は、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の３’末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸である。実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸である。実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’核酸または３’核酸のいずれも含まない。前述の態様または実施形態のいずれにおいても、標的化ドメインは、記載される標的化ドメイン配列からなり得る。
【００１５】
前述の態様および実施形態のいずれかにあるものを含め、ｇＲＮＡ分子の実施形態において、標的化ドメインは、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸を含む。前述の態様および実施形態のいずれかにあるものを含め、ｇＲＮＡ分子の他の実施形態において、標的化ドメインは、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸からなる。前述の態様および実施形態のいずれかにあるものを含め、ｇＲＮＡ分子の実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の３’末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸である。前述の態様および実施形態のいずれかにあるものを含め、ｇＲＮＡ分子の他の実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸である。前述の態様および実施形態のいずれかにあるものを含め、ｇＲＮＡ分子の他の実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’核酸または３’核酸のいずれも含まない。
【００１６】
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、ハイブリダイズして配列番号６５８４または６５８５を含むフラッグポールを形成するｃｒＲＮＡの一部分とｔｒａｃｒの一部分とを含む。実施形態において、フラッグポールは、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第１のフラッグポール伸長部は配列番号６５８６を含む。実施形態において、フラッグポールは、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する第２のフラッグポール伸長部、および存在する場合には第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第２のフラッグポール伸長部は配列番号６５８７を含む。
【００１７】
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、配列番号６６６０または配列番号６６６１を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含むｇＲＮＡ分子を提供する。実施形態において、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分は配列番号６６０７または配列番号６６０８を含む。
【００１８】
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、配列番号６５８９または６５９０を含むｔｒａｃｒと、任意選択で、第１のフラッグポール伸長部が存在する場合、配列番号６５８９または６５９０の５’側に配置された第１のｔｒａｃｒ伸長部であって、配列番号６５９１を含む第１のｔｒａｃｒ伸長部とを含むｇＲＮＡ分子を提供する。
【００１９】
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、標的化ドメインとｔｒａｃｒとが別個の核酸分子に配置されるｇＲＮＡ分子（例えば、ｄｇＲＮＡ分子）を提供する。
【００２０】
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、標的化ドメインとｔｒａｃｒとが単一の核酸分子に配置され、ここで、ｔｒａｃｒが標的化ドメインの３’側に配置されたｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子）を提供する。実施形態において、ｓｇＲＮＡ分子は、標的化ドメインの３’側かつｔｒａｃｒの５’側に配置されたループ、例えば、配列番号６５８８を含む、例えばそれからなるループを含む。
【００２１】
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、５’から３’に、［標的化ドメイン］−：
（ａ）配列番号６６０１；
（ｂ）配列番号６６０２；
（ｃ）配列番号６６０３；
（ｄ）配列番号６６０４；または
（ｅ）１、２、３、４、５、６または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば４個のウラシルヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかを含むｇＲＮＡ分子を提供する。実施形態において、標的化ドメインと（ａ）〜（ｅ）のいずれかの配列との間に介在ヌクレオチドはない。
【００２２】
別の態様において、本発明は、前述の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子を１つ以上、例えば１つ含むＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣａｓ  ＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲシステムを提供する。ある態様において、本発明は、前述の態様および実施形態のいずれかの第１のｇＲＮＡ分子を含み、Ｃａｓ９分子をさらに含む組成物を提供する。実施形態において、Ｃａｓ９分子は活性または不活性化膿レンサ球菌（ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である。実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子はリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中に存在する。
【００２３】
別の態様において、本発明は、ｇＲＮＡを２つ以上含む、例えば、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子を２つ以上含む、例えば、前述のｇＲＮＡ分子の態様または実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子を２つ以上含む組成物を提供する。したがって、さらなる態様において、本発明は、第２のｇＲＮＡ分子；第２のｇＲＮＡ分子および第３のｇＲＮＡ分子；または第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子、および第４のｇＲＮＡ分子をさらに含む、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物を提供し、ここで、第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子（存在する場合）、および第４のｇＲＮＡ分子（存在する場合）は、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子、例えば、前述のｇＲＮＡ分子の態様または実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子である。ある実施形態において、本組成物の各ｇＲＮＡ分子は異なる標的配列に相補的である。ある実施形態において、各ｇＲＮＡ分子は同じ遺伝子内または領域内の標的配列と相補的である。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子（存在する場合）、および第４のｇＲＮＡ分子（存在する場合）は、２００００ヌクレオチド以下、１００００ヌクレオチド以下、６０００以下、５０００ヌクレオチド以下、４０００以下、１０００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以下、８０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下または１０ヌクレオチド以下離れた標的配列と相補的である。別の態様において、本組成物の各ｇＲＮＡ分子は異なる遺伝子内または領域内の標的配列と相補的である。
【００２４】
本発明の２つ以上のｇＲＮＡ分子の具体的かつ好ましい組み合わせが本明細書に記載される。ある態様において、本組成物は第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、ここで、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とは異なる標的配列に相補的であり、および：
（ａ）ＢＣＬ１１ａ遺伝子に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択されるか；
（ｂ）＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択されるか；
（ｃ）＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択されるか；
（ｄ）＋５５  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択されるか；または
（ｅ）ＨＰＦＨ領域に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択される。
【００２５】
ある態様において、本組成物は第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、ここで、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とは異なる標的配列に相補的であり、および：
（ａ）第１のｇＲＮＡ分子はＢＣＬ１１ａ遺伝子に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｂ）第１のｇＲＮＡ分子はＢＣＬ１１ａ遺伝子に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｃ）第１のｇＲＮＡ分子はＢＣＬ１１ａ遺伝子に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋５５  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｄ）第１のｇＲＮＡ分子はＢＣＬ１１ａ遺伝子に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子はＨＰＦＨ領域に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｅ）第１のｇＲＮＡ分子は＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｆ）第１のｇＲＮＡ分子は＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋５５  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｇ）第１のｇＲＮＡ分子は＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子はＨＰＦＨ領域に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｈ）第１のｇＲＮＡ分子は＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋５５  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｉ）第１のｇＲＮＡ分子は＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子はＨＰＦＨ領域に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｊ）第１のｇＲＮＡ分子は＋５５  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子はＨＰＦＨ領域に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択される。
【００２６】
別の態様において、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む本組成物は、以下を含む：
（ａ）ＨＰＦＨ領域に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択される第１のｇＲＮＡ分子を含み、かつ第２のｇＲＮＡ分子が、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むか；または
（ｂ）ＢＣＬ１１ａエンハンサー、例えば、＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサー、＋５５  ＢＣＬ１１ａエンハンサーまたは＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択される第１のｇＲＮＡ分子を含み、かつ第２のｇＲＮＡ分子が、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。
【００２７】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれにおいても、本組成物は、組成物のｇＲＮＡ成分に関して、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とからなり得る。
【００２８】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれにおいても、本組成物は、エレクトロポレーションに好適な媒体中に製剤化し得る。
【００２９】
別の態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲシステムのｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ分子をコードする核酸を提供する。理論によって拘束されるものではないが、かかる核酸を細胞に送達すると、細胞内でＣＲＩＳＰＲシステムの発現が起こるであろうと考えられる。ある態様において、本発明は、前出のｇＲＮＡの態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列を提供する。実施形態において、核酸は、１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。実施形態において、このプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターである。実施形態において、このプロモーターはＵ６プロモーターまたはＨＩプロモーターである。
【００３０】
さらなる態様において、核酸は、Ｃａｓ９分子をコードする配列をさらに含む。実施形態において、核酸は、Ｃａｓ９分子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。実施形態において、このプロモーターは、ＥＦ−１プロモーター、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである。
【００３１】
ある態様において、本発明は、前出の核酸の態様および実施形態のいずれかの核酸を含むベクターを提供する。実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、およびＲＮＡベクターからなる群から選択される。
【００３２】
別の態様において、本発明は、１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子、例えば前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかにおけるｇＲＮＡ分子と、Ｃａｓ９分子をコードする核酸とを含む組成物を提供する。
【００３３】
別の態様において、本発明は、１つ以上のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子、例えば前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子）をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子とを含む組成物を提供する。
【００３４】
別の態様において、本発明は、鋳型核酸をさらに含む組成物、例えば、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物を提供する。別の態様において、本発明は、鋳型核酸をコードする核酸配列をさらに含む組成物、例えば、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物を提供する。実施形態において、鋳型核酸は、ｇＲＮＡ分子の標的配列のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。実施形態において、鋳型核酸は、ヒトβグロビン、例えば、突然変異Ｇ１６Ｄ、Ｅ２２ＡおよびＴ８７Ｑの１つ以上を含むヒトβグロビンをコードする核酸を含む。実施形態において、鋳型核酸は、ヒトγグロビンをコードする核酸を含む。
【００３５】
別の態様において、本発明は、ｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲシステム、組成物または核酸（例えば、本明細書に記載されるとおりのもの、例えば、前述の態様および実施形態のいずれかにあるとおりのもの）を含む（または任意の時点で含んでいた）細胞を提供する。かかる態様において、本発明は、このように含むことによって修飾されている細胞を提供する。
【００３６】
したがって、ある態様において、本発明は、細胞の核酸内にある標的配列を改変する方法、例えば、その構造、例えば配列を改変する方法であって、前記細胞を、
１）前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）；
２）前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）をコードする核酸；
３）前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）；
４）前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）をコードする核酸；または
５）上記１）〜４）のいずれか、および鋳型核酸（例えば、本明細書に記載されるとおりの）；
６）上記１）〜４）のいずれか、および鋳型核酸（例えば、本明細書に記載されるとおりの）をコードする配列を含む核酸；
７）本明細書に記載されるとおりの（例えば、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの）組成物；または
８）前述のベクターの態様および実施形態のいずれかのベクター
と接触させることを含む方法を提供する。
【００３７】
実施形態において、ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９分子をコードする核酸とは、単一の組成物に製剤化される。他の実施形態において、ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９分子をコードする核酸とは、２つ以上の組成物に製剤化される。実施形態において、２つ以上の組成物は同時にまたは逐次的に送達される。
【００３８】
実施形態において、細胞は動物細胞である。実施形態において、細胞は哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞である。実施形態において、細胞は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋細胞である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−細胞である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋細胞である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ４９ｆ＋細胞である。実施形態において、本方法は、ＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を富化した細胞の集団を含む。
【００３９】
実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は骨髄から単離されている。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は動員末梢血から単離されている。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は臍帯血から単離されている。
【００４０】
実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は、前記細胞（例えば、細胞の集団）が投与される患者にとって自己由来である。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は、前記細胞（例えば、細胞の集団）が投与される患者にとって同種異系由来である。
【００４１】
本明細書に記載される方法の実施形態では、改変する結果として細胞の胎児ヘモグロビン発現が増加する。本明細書に記載される方法の実施形態では、改変する結果として細胞の胎児ヘモグロビン発現が減少する。
【００４２】
別の態様において、本発明は、前述の方法の態様および実施形態のいずれかの方法によって改変された細胞を提供する。別の態様において、本発明は、前出の態様および実施形態のいずれかの第１のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）、または組成物（例えば、本明細書に記載されるとおりの）、または第１のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）をコードする核酸を含む細胞を提供する。実施形態において、細胞は動物細胞である。実施形態において、細胞は哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞である。実施形態において、細胞は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋細胞である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−細胞である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋細胞である。実施形態において、本方法は、ＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を富化した細胞の集団を含む。
【００４３】
実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は骨髄から単離されている。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は動員末梢血から単離されている。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は臍帯血から単離されている。
【００４４】
実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は、前記細胞（例えば、細胞の集団）が投与される患者にとって自己由来である。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は、前記細胞（例えば、細胞の集団）が投与される患者にとって同種異系由来である。
【００４５】
実施形態において、細胞は、第２のｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載されるとおりの第２のｇＲＮＡ分子、例えば前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの第２のｇＲＮＡ分子、または第２のｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含むか、それを含んでいたか、またはそれを含むことになり、ここで、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とは同一でない標的化ドメインを含む。
【００４６】
実施形態において、細胞における胎児ヘモグロビンの発現が、例えばｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）を含むように修飾されていない同じ細胞型の細胞と比べて増加する。実施形態において、細胞におけるβグロビンの発現が、例えばｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）を含むように修飾されていない同じ細胞型の細胞と比べて低下する。実施形態において、例えばｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）を含むように修飾されていない同じ細胞型の細胞と比べて細胞における胎児ヘモグロビンの発現が増加し、かつβグロビンの発現が低下する。
【００４７】
ある態様において、本発明の細胞（または細胞を含む方法）は、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるとおりの幹細胞増殖剤、例えば、化合物１、化合物２、化合物３または化合物４と接触させたものである。ある態様において、本発明の細胞（または細胞を含む方法）は、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるとおりの幹細胞増殖剤、例えば、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１および化合物４）と接触させたものである。ある実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物４である。ある実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物１と化合物４との組み合わせである。実施形態において、接触はエキソビボである。
【００４８】
別の態様において、本発明は、治療方法、例えば異常ヘモグロビン症の治療方法を提供する。ある態様において、本発明は、前出の細胞または方法の態様および実施形態のいずれかの細胞（例えば、細胞の集団）を患者に投与することを含む、異常ヘモグロビン症を治療する方法を提供する。
【００４９】
別の態様において、本発明は、前出の細胞または方法の態様および実施形態のいずれかの細胞を患者に投与することを含む、哺乳動物における胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法を提供する。ある実施形態において、異常ヘモグロビン症はβ−サラセミアまたは鎌状赤血球症である。
【００５０】
別の態様において、本発明は、薬剤として用いられる、例えば疾患の治療に用いられるガイドＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載されるとおりのガイドＲＮＡ分子を提供する。実施形態において、疾患は異常ヘモグロビン症、例えばβ−サラセミアまたは鎌状赤血球症である。
【００５１】
別の態様において、本発明は、ｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子、例えば、前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかに記載されるとおりのｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、例えばＨＳＣ）に導入されると、ＮＧＳによって計測したとき、生じるインデルの少なくとも約１５％が、非修飾標的ＤＮＡと比べて（ａ）フレームシフト突然変異；または（ｂ）大規模欠失を含む。実施形態において、ＮＧＳによって計測したとき、生じるインデルの少なくとも約２５％が、非修飾標的ＤＮＡと比べて（ａ）フレームシフト突然変異；または（ｂ）大規模欠失を含む。実施形態において、ＮＧＳによって計測したとき、生じるインデルの少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％  少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、非修飾標的ＤＮＡと比べて（ａ）フレームシフト突然変異；または（ｂ）大規模欠失を含む。
【００５２】
別の態様において、本発明は、ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）のエキソビボ増殖および修飾方法を提供する。ある態様において、本発明は、細胞（例えば、細胞の集団）を修飾する方法であって、
（ａ）細胞の集団を提供するステップと；
（ｂ）エキソビボで幹細胞増殖剤の存在下で前記細胞を増殖させるステップと；
（ｃ）第１のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの第１のｇＲＮＡ分子、例えば、前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの第１のｇＲＮＡ分子）、第１のｇＲＮＡ分子をコードする核酸分子、または組成物（例えば、本明細書に記載されるとおりの組成物、例えば、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物）を前記細胞に導入するステップと
を含み、これによりステップ（ｃ）に供されていない同じ細胞型と比べて前記細胞におけるヘモグロビン、例えば胎児ヘモグロビンの発現が増加する方法を提供する。
【００５３】
実施形態において、細胞は、それを必要としている対象、例えば、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球症またはβサラセミアを有する対象に導入される。
【００５４】
実施形態において、細胞はＣＤ３４＋細胞であるか、またはそれを含む。実施形態において、細胞はＨＳＰＣであるか、またはそれを含む。実施形態において、細胞は骨髄、動員末梢血または臍帯血から単離されたものである。好ましい実施形態において、細胞は骨髄から単離されたものである。他の実施形態において、細胞は動員末梢血から単離されたものである。態様において、動員末梢血は、Ｇ−ＣＳＦが投与された対象から単離されたものである。態様において、動員末梢血は、Ｇ−ＣＳＦ以外の動員剤、例えばＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）が投与された対象から単離されたものである。実施形態において、細胞は、富化された細胞の集団である。
【００５５】
実施形態において、幹細胞増殖剤は、化合物１、化合物２、化合物３、または化合物４、例えば化合物４である。実施形態において、幹細胞増殖剤は、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１と化合物４との組み合わせ）である。実施形態において、細胞は、約１〜約２００マイクロモル（μＭ）の濃度の化合物４に接触させる。ある実施形態において、化合物４の濃度は約７５マイクロモル（μＭ）である。実施形態において、エキソビボで幹細胞増殖剤の存在下で前記細胞を増殖させるステップは、約１〜１０日、例えば約１〜５日、例えば約２〜５日、例えば約４日の期間にわたって行われる。
【００５６】
実施形態において、細胞は、前記細胞の投与が意図される患者にとって自己由来である。実施形態において、細胞は、前記細胞の投与が意図される患者にとって同種異系由来である。
【００５７】
実施形態において、ステップ（ｂ）の増殖は、さらに、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）およびヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）の存在下である。実施形態において、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）およびヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）は、それぞれ約５０ｎｇ／ｍＬの濃度である。実施形態において、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）およびヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）は、それぞれ５０ｎｇ／ｍＬの濃度である。
【００５８】
さらなる態様および実施形態を以下に記載する。
【００５９】
ある態様において、本発明は、ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｃｒＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子（例えば、ヒトＢＣＬ１１ａ遺伝子）、ＢＣＬ１１ａエンハンサー（例えば、ヒトＢＣＬ１１ａエンハンサー）、またはＨＦＰＨ領域（例えば、ヒトＨＰＦＨ領域）の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。
【００６０】
実施形態において、標的配列はＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的配列であり、標的化ドメインは、配列番号１〜配列番号８５または配列番号４００〜配列番号１２３１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。これらの実施形態は、本明細書ではｇＲＮＡ分子の実施形態２と称される。
【００６１】
他の実施形態において、標的配列はＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、標的化ドメインは、配列番号１２３２〜配列番号１４９９のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。これらの実施形態は、本明細書ではｇＲＮＡ分子の実施形態３と称される。好ましい実施形態において、標的配列はＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、標的化ドメインは、配列番号１８２〜配列番号２７７または配列番号３３４〜配列番号３４１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。これらの実施形態は、本明細書ではｇＲＮＡ分子の実施形態４と称される。より好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３４１、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２４７、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２４４、配列番号１９９、配列番号２５１、配列番号２５０、配列番号３３４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号３３６、または配列番号３３７のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。これらの実施形態は、本明細書ではｇＲＮＡ分子の実施形態５と称される。さらにより好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、または配列番号３３８のいずれか１つを含み、例えばそれからなり（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態６と称される）、例えば、配列番号２４８または配列番号３３８のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態７と称される）。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２４８を含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態８と称される）。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３３８を含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態９と称される）。
【００６２】
他の実施形態において、標的配列はＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、標的化ドメインは、配列番号２７８〜配列番号３３３のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１０と称される）。好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３１８、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号２９４、配列番号３１０、配列番号３１９、配列番号２９８、配列番号３２２、配列番号３１１、配列番号３１５、配列番号２９０、配列番号３１７、配列番号３０９、配列番号２８９、または配列番号２８１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１１と称される）。好ましい一実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３１８を含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１２と称される）。
【００６３】
他の実施形態において、標的配列はＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、標的化ドメインは、配列番号１５９６〜配列番号１６９１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１３と称される）。好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１６８３、配列番号１６３８、配列番号１６４７、配列番号１６０９、配列番号１６２１、配列番号１６１７、配列番号１６５４、配列番号１６３１、配列番号１６２０、配列番号１６３７、配列番号１６１２、配列番号１６５６、配列番号１６１９、配列番号１６７５、配列番号１６４５、配列番号１５９８、配列番号１５９９、配列番号１６６３、配列番号１６７７、または配列番号１６２６のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１４と称される）。
【００６４】
他の実施形態において、標的配列はＨＦＰＨ領域（例えば、フランス型ＨＰＦＨ領域）のものであり、標的化ドメインは、配列番号８６〜配列番号１８１、配列番号１５００〜配列番号１５９５、または配列番号１６９２〜配列番号１７６１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１５と称される）。好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１００、配列番号１６５、配列番号１１３、配列番号９９、配列番号１１２、配列番号９８、配列番号１５８０、配列番号１０６、配列番号１５０３、配列番号１５８９、配列番号１６０、配列番号１５３７、配列番号１５９、配列番号１０１、配列番号１６２、配列番号１０４、配列番号１３８、配列番号１５３６、配列番号１５３９、配列番号１５８５のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１６と称される）。さらにより好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１５０５、配列番号１５８９、配列番号１７００、または配列番号１７５０のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１７と称される）。他の好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１００、配列番号１６５、または配列番号１１３のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１８と称される）。
【００６５】
実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載される任意の標的化ドメイン配列、例えば表１または表２の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個、好ましくは２０個の連続する核酸を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。実施形態において、本明細書に記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つ、例えば表１または表２の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個、好ましくは２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の３’末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個、好ましくは２０個の連続する核酸である。他の実施形態において、本明細書に記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つ、例えば表１または表２の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個、好ましくは２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個、好ましくは２０個の連続する核酸である。他の実施形態において、本明細書に記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つ、例えば表１または表２の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個、好ましくは２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’核酸または３’核酸のいずれも含まない。
【００６６】
実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載される任意の標的化ドメイン配列、例えば表５、表６、表７、表８または表９の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、または２０個、好ましくは２０個の連続する核酸を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。実施形態において、本明細書に記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つ、例えば表５、表６、表７、表８または表９の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、または２０個、好ましくは２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の３’末端に配置された１７、１８、１９、または２０個、好ましくは２０個の連続する核酸である。他の実施形態において、本明細書に記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つ、例えば表５、表６、表７、表８または表９の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、または２０個、好ましくは２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’末端に配置された１７、１８、１９、または２０個、好ましくは２０個の連続する核酸である。他の実施形態において、本明細書に記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つ、例えば表５、表６、表７、表８または表９の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、または２０個、好ましくは２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’核酸または３’核酸のいずれも含まない。
【００６７】
以下の態様は、前述の態様および実施形態のいずれかと組み合わせ得るｇＲＮＡ分子の特徴について記載する。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、前述の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子を含め、ハイブリダイズして配列番号６５８４または６５８５を含むフラッグポールを形成するｃｒＲＮＡの一部分とｔｒａｃｒの一部分とを含む。実施形態において、フラッグポールは、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第１のフラッグポール伸長部は配列番号６５８６を含む。実施形態において、フラッグポールは（第１のフラッグポール伸長部に加えてまたはそれに代えて）フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する第２のフラッグポール伸長部、および存在する場合には第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、ここで、前記第２のフラッグポール伸長部は配列番号６５８７を含む。
【００６８】
前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ｔｒａｃｒは配列番号６６６０または配列番号６６６１を含む。実施形態において、ｔｒａｃｒは配列番号７８１２を含み、任意選択で３’末端に追加的な１、２、３、４、５、６、または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む。実施形態において、ｃｒＲＮＡは、５’から３’に、［標的化ドメイン］−：ａ）配列番号６５８４；ｂ）配列番号６５８５；ｃ）配列番号６６０５；ｄ）配列番号６６０６；ｅ）配列番号６６０７；ｆ）配列番号６６０８；またはｇ）配列番号７８０６を含む。
【００６９】
前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ｔｒａｃｒは、５’から３’に、ａ）配列番号６５８９；ｂ）配列番号６５９０；ｃ）配列番号６６０９；ｄ）配列番号６６１０；ｅ）配列番号６６６０；ｆ）配列番号６６６１；ｇ）配列番号７８１２；ｈ）配列番号７８０７；ｉ）配列番号７８０８；ｊ）配列番号７８０９；ｋ）少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記ａ）〜ｊ）のいずれか；ｌ）少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記ａ）〜ｋ）のいずれか；またはｍ）少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドを５’末端に（例えば、５’側端に）さらに含む上記ａ）〜ｌ）のいずれかを含む。
【００７０】
実施形態において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとは別個の核酸分子上に配置される。かかるｇＲＮＡ分子の実施形態において、標的化ドメインを含む核酸分子は、任意選択で標的化ドメインのすぐ３’側に配置された配列番号６６０７を含み、およびｔｒａｃｒを含む核酸分子は配列番号６６６０を含む、例えばそれからなる。
【００７１】
実施形態において、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分は配列番号６６０７または配列番号６６０８を含む。
【００７２】
実施形態において、ｔｒａｃｒは、配列番号６５８９または６５９０と、任意選択で、第１のフラッグポール伸長部が存在する場合、配列番号６５８９または６５９０の５’側に配置された第１のｔｒａｃｒ伸長部とを含み、前記第１のｔｒａｃｒ伸長部は配列番号６５９１を含む。
【００７３】
前述の態様および実施形態のいずれかの実施形態におけるものを含め、実施形態において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとは別個の核酸分子に配置される。前述の態様および実施形態のいずれかの実施形態におけるものを含め、他の実施形態において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとは単一の核酸分子に配置され、例えば、ｔｒａｃｒは標的化ドメインの３’側に配置される。
【００７４】
実施形態において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとが単一の核酸分子に配置されるとき、ｇＲＮＡ分子は、標的化ドメインの３’側かつｔｒａｃｒの５’側に配置されたループをさらに含む。実施形態において、ループは配列番号６５８８を含む、例えばそれからなる。
【００７５】
実施形態において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとが単一の核酸分子に配置されるとき、ｇＲＮＡ分子は、５’から３’に、［標的化ドメイン］−：（ａ）配列番号６６０１；（ｂ）配列番号６６０２；（ｃ）配列番号６６０３；（ｄ）配列番号６６０４；（ｅ）配列番号７８１１；または（ｆ）１、２、３、４、５、６または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかを含む。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、前記標的化ドメインと配列番号７８１１とを含み、例えばそれからなり、配列番号７８１１は任意選択で前記標的化ドメインのすぐ３’側に配置される。
【００７６】
前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ｇＲＮＡ分子の核酸残基の各々は、核酸分子の各残基間にある非修飾Ａ、Ｕ、ＧまたはＣ核酸残基および非修飾リン酸結合である。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、他の実施形態において、ｇＲＮＡ分子を構成する核酸分子の１つ、または任意選択で２つ以上が、ａ）前記１つまたは複数の核酸分子の３’末端における１つ以上、例えば３つのホスホロチオエート修飾；ｂ）前記１つまたは複数の核酸分子の５’末端における１つ以上、例えば３つのホスホロチオエート修飾；ｃ）前記１つまたは複数の核酸分子の３’末端における１つ以上、例えば３つの２’−Ｏ−メチル修飾；ｄ）前記１つまたは複数の核酸分子の５’末端における１つ以上、例えば３つの２’−Ｏ−メチル修飾；ｅ）前記１つまたは複数の核酸分子の末端から４番目、末端から３番目、および末端から２番目の３’残基の各々における２’Ｏ−メチル修飾；ｆ）前記１つまたは複数の核酸分子の末端から４番目、末端から３番目、および末端から２番目の５’残基の各々における２’Ｏ−メチル修飾；またはｆ）これらの任意の組み合わせを含む。
【００７７】
好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３４２；（ｂ）配列番号３４３；または（ｃ）配列番号１７６２を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態４１と称される）。
【００７８】
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３４４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｂ）配列番号３４４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３４５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または（ｄ）配列番号３４５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態４２と称される）。
【００７９】
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３４７；（ｂ）配列番号３４８；または（ｃ）配列番号１７６３を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態４３と称される）。
【００８０】
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３４９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｂ）配列番号３４９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３５０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または（ｄ）配列番号３５０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態４４と称される）。
【００８１】
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３５１；（ｂ）配列番号３５２；または（ｃ）配列番号１７６４を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態４５と称される）。
【００８２】
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３５３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｂ）配列番号３５３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３５４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または（ｄ）配列番号３５４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態４６と称される）。
【００８３】
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３５５；（ｂ）配列番号３５６；または（ｃ）配列番号１７６５を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態４７と称される）。
【００８４】
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３５７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｂ）配列番号３５７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３５８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または（ｄ）配列番号３５８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態４８と称される）。
【００８５】
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３５９；（ｂ）配列番号３６０；または（ｃ）配列番号１７６６を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態４９と称される）。
【００８６】
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３６１を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｂ）配列番号３６１を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３６２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または（ｄ）配列番号３６２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態５０と称される）。
【００８７】
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３６３；（ｂ）配列番号３６４；または（ｃ）配列番号１７６７を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態５１と称される）。
【００８８】
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３６５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｂ）配列番号３６５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３６６を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または（ｄ）配列番号３６６を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態５２と称される）。
【００８９】
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３６７；（ｂ）配列番号３６８；または（ｃ）配列番号１７６８を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態５３と称される）。
【００９０】
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３６９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｂ）配列番号３６９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３７０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または（ｄ）配列番号３７０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態５４と称される）。
【００９１】
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３７１；（ｂ）配列番号３７２；または（ｃ）配列番号１７６９を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態５５と称される）。
【００９２】
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３７３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｂ）配列番号３７３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３７４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または（ｄ）配列番号３７４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態５６と称される）。
【００９３】
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３７５；（ｂ）配列番号３７６；または（ｃ）配列番号１７７０を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態５７と称される）。
【００９４】
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｂ）配列番号３７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または（ｄ）配列番号３７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態５８と称される）。
【００９５】
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３７９；（ｂ）配列番号３８０；または（ｃ）配列番号１７７１を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態５９と称される）。
【００９６】
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３８１を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｂ）配列番号３８１を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３８２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または（ｄ）配列番号３８２を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態６０と称される）。
【００９７】
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３８３；（ｂ）配列番号３８４；または（ｃ）配列番号１７７２を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態６１と称される）。
【００９８】
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３８５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｂ）配列番号３８５を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３８６を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または（ｄ）配列番号３８６を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態６２と称される）。
【００９９】
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３８７；（ｂ）配列番号３８８；または（ｃ）配列番号１７７３を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態６３と称される）。
【０１００】
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３８９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｂ）配列番号３８９を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３９０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または（ｄ）配列番号３９０を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態６４と称される）。
【０１０１】
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３９１；（ｂ）配列番号３９２；または（ｃ）配列番号１７７４を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態６５と称される）。
【０１０２】
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３９３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｂ）配列番号３９３を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３９４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または（ｄ）配列番号３９４を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態６６と称される）。
【０１０３】
他の好ましい実施形態において、本発明は、配列：（ａ）配列番号３９５；（ｂ）配列番号３９６；または（ｃ）配列番号１７７５を含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態６７と称される）。
【０１０４】
他の好ましい実施形態において、本発明は、（ａ）配列番号３９７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｂ）配列番号３９７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；（ｃ）配列番号３９８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；または（ｄ）配列番号３９８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ、および配列番号３４６を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含む、例えばそれからなるｇＲＮＡ分子（例えば、デュアルｇＲＮＡ分子である）を提供する（本発明のこの概要ではｇＲＮＡ分子の実施形態６８と称される）。
【０１０５】
前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、インデルは、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと相補的な標的配列にまたはその近傍に形成される。＋５８エンハンサー領域の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む実施形態におけるものを含め、実施形態において、インデルはＧＡＴＡ−１および／またはＴＡＬ−１結合部位のヌクレオチドを含まない。実施形態において、インデルはＧＡＴＡ−１および／またはＴＡＬ−１のその結合部位への結合を妨げない。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、インデルは、集団の細胞の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９６％、例えば少なくとも約９７％、例えば少なくとも約９８％、例えば少なくとも約９９％において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと相補的な標的配列にまたはその近傍に形成される。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、ＧＡＴＡ−１および／またはＴＡＬ−１結合部位のヌクレオチドを含まないインデルは、集団の細胞の少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約３５％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約４５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約６５％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約８５％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９９％において、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと相補的な標的配列にまたはその近傍に形成される。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、インデルは、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７のいずれかに挙げられるインデルである。実施形態において、集団の細胞の少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９６％、例えば少なくとも約９７％、例えば少なくとも約９８％、例えば少なくとも約９９％において、インデルは、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７のいずれかに挙げられるインデルである。実施形態において、前記細胞の集団中において最も高頻度で検出される３つのインデルには、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７のいずれかに挙げられる任意のｇＲＮＡ分子に関連するインデルが含まれる。実施形態において、インデル（または上位インデルのパターン）は、例えば当該技術分野で記載されるとおりの次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって計測されるとおりである。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、例えば、ＨＰＣＳ細胞、例えばＣＤ３４＋細胞でアッセイされる、例えば次世代シーケンシングおよび／またはヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、前記細胞において形成されない。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、例えば、ＨＰＳＣ細胞の集団、例えばＣＤ３４＋細胞の集団でアッセイされる、例えば次世代シーケンシングおよび／またはヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、細胞の集団の約５％超、例えば約１％超、例えば約０．１％超、例えば約０．０１％超の細胞において検出されない。
【０１０６】
前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、胎児ヘモグロビンの発現は、前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において増加する。実施形態において、前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において胎児ヘモグロビンの発現は、少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％、例えば少なくとも約９６％、例えば少なくとも約９７％、例えば少なくとも約９８％、例えば少なくとも約９９％増加する。実施形態において、前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫は１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、または約８〜約９ピコグラム、または約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、胎児ヘモグロビン（例えば、γグロビン）ｍＲＮＡのレベルは、前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において増加する。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、ＢＣＬ１１ａ  ｍＲＮＡの発現は、前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において増加する。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明はｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、ＢＣＬ１１ａ  ｍＲＮＡのレベルは、前記細胞またはその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において低下する。
【０１０７】
細胞に言及する前述の態様および実施形態のいずれにおいても、細胞は哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞であり（または細胞の集団はそれを含み）、例えばヒト細胞またはヒト細胞の集団である。実施形態において、細胞はＨＳＰＣであり（または細胞の集団はそれを含み）、例えばＣＤ３４＋であり、例えばＣＤ３４＋ＣＤ９０＋である。実施形態において、細胞（または細胞の集団）は、前記細胞の投与を受ける患者にとって自己由来である。他の実施形態において、細胞（または細胞の集団）は、前記細胞の投与を受ける患者にとって同種異系由来である。
【０１０８】
別の態様において、本発明は、１）本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）、例えば前出の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子、例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子；２）本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）、例えば前出の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子（本明細書に記載される）をコードする核酸；３）本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）、例えば前出の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびＣａｓ９分子（本明細書に記載される）；４）本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）、例えば前出の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびＣａｓ９分子（本明細書に記載される）をコードする核酸；または５）上記１）〜４）のいずれか、および鋳型核酸；または６）上記１）〜４）のいずれか、および鋳型核酸をコードする配列を含む核酸を含む組成物を提供する。
【０１０９】
好ましい実施形態において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるもの、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの第１のｇＲＮＡ分子）を含み、さらにＣａｓ９分子（本明細書に記載される）を含む組成物を提供する。
【０１１０】
実施形態において、Ｃａｓ９分子は活性または不活性化膿レンサ球菌（ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は配列番号６６１１を含む。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、（ａ）配列番号７８２１；（ｂ）配列番号７８２２；（ｃ）配列番号７８２３；（ｄ）配列番号７８２４；（ｅ）配列番号７８２５；（ｆ）配列番号７８２６；（ｇ）配列番号７８２７；（ｈ）配列番号７８２８；（ｉ）配列番号７８２９；（ｊ）配列番号７８３０；または（ｋ）配列番号７８３１を含む、例えばそれからなる。
【０１１１】
好ましい実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子はリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）に存在する。
【０１１２】
実施形態において、本発明は、第２のｇＲＮＡ分子；第２のｇＲＮＡ分子および第３のｇＲＮＡ分子；または第２のｇＲＮＡ分子、任意選択で第３のｇＲＮＡ分子、および任意選択で第４のｇＲＮＡ分子をさらに含む組成物、例えば前出の態様および実施形態のいずれかの組成物を提供し、ここで、第２のｇＲＮＡ分子、任意選択の第３のｇＲＮＡ分子、および任意選択の第４のｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子のｇＲＮＡ分子であり、ここで、組成物の各ｇＲＮＡ分子は異なる標的配列に相補的である。
【０１１３】
実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、任意選択の第３のｇＲＮＡ分子、および任意選択の第４のｇＲＮＡ分子の２つ以上は、同じ遺伝子内または領域内の標的配列に相補的である。実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、任意選択の第３のｇＲＮＡ分子、および任意選択の第４のｇＲＮＡ分子は、２００００ヌクレオチド以下、１００００ヌクレオチド以下、６０００以下、５０００ヌクレオチド以下、４０００以下、１０００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以下、８０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下または１０ヌクレオチド以下離れた標的配列に相補的である。
【０１１４】
他の実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、任意選択の第３のｇＲＮＡ分子、および任意選択の第４のｇＲＮＡ分子の２つ以上は、異なる遺伝子内または領域内の標的配列に相補的である。
【０１１５】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；
（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；
ｃ）ｇＲＮＡ分子の実施形態６のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；または
（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形態７のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；または
（ｅ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４１〜５６のいずれかのｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である。
【０１１６】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１０のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；または
（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１１のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である。
【０１１７】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１３のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；または
（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１４のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である。
【０１１８】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、
（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１６のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；
（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１７のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；
（ｃ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１８のｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的であるか；または
（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５７〜６８のいずれかのｇＲＮＡ分子から独立して選択され、かつ異なる標的配列に相補的である。
【０１１９】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）ｇＲＮＡ分子の実施形態６のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形態７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｅ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４１〜５６のいずれかのｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１０のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１１のｇＲＮＡ分子から選択される。
【０１２０】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）ｇＲＮＡ分子の実施形態６のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形態７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｅ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４１〜５６のいずれかのｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１３のｇＲＮＡ分子から選択され、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１４のｇＲＮＡ分子から選択される。
【０１２１】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）ｇＲＮＡ分子の実施形態６のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形態７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｅ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４１〜５６のいずれかのｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１６のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１８のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５７〜６８のいずれかのｇＲＮＡ分子から選択される。
【０１２２】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１０のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１１のｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１３のｇＲＮＡ分子から選択され、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１４のｇＲＮＡ分子から選択される。
【０１２３】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１０のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１１のｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１６のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１８のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５７〜６８のいずれかのｇＲＮＡ分子から選択される。
【０１２４】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１３のｇＲＮＡ分子から選択され、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１４のｇＲＮＡ分子から選択され；および
（２）第２のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１６のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１８のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５７〜６８のいずれかのｇＲＮＡ分子から選択される。
【０１２５】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む組成物を提供し、
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１６のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１８のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５７〜６８のいずれかのｇＲＮＡ分子から選択され；および（２）第２のｇＲＮＡ分子は、βグロビン遺伝子の標的配列と相補的な標的化ドメインを含むか；または
（１）第１のｇＲＮＡ分子は、（ａ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｂ）ｇＲＮＡ分子の実施形態５のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｃ）ｇＲＮＡ分子の実施形態６のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｄ）ｇＲＮＡ分子の実施形態７のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｅ）ｇＲＮＡ分子の実施形態４１〜５６のいずれかのｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｆ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１０のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｇ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１１のｇＲＮＡ分子から選択されるか、（ｈ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１３のｇＲＮＡ分子から選択されるか、または（ｉ）ｇＲＮＡ分子の実施形態１４のｇＲＮＡ分子から選択され；および（２）第２のｇＲＮＡ分子は、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。
【０１２６】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子がｇＲＮＡ分子の実施形態４１〜６８のいずれかのｇＲＮＡ分子から独立して選択される組成物を提供する。
【０１２７】
本組成物の実施形態において、組成物のｇＲＮＡ分子成分に関して、本組成物は第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とからなる。
【０１２８】
本組成物の実施形態において、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子と共にリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中にある。
【０１２９】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明は、鋳型核酸をさらに含む組成物を提供し、鋳型核酸は、第１のｇＲＮＡ分子の標的配列にまたはその近傍にあるヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。実施形態において、鋳型核酸は、（ａ）ヒトβグロビン、例えば突然変異Ｇ１６Ｄ、Ｅ２２ＡおよびＴ８７Ｑの１つ以上を含むヒトβグロビン、もしくはその断片；または（ｂ）ヒトγグロビン、もしくはその断片をコードする核酸を含む。
【０１３０】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本組成物は、エレクトロポレーションに好適、例えばＨＳＰＣ細胞へのエレクトロポレーションに好適な媒体中に製剤化される。１つ以上のｇＲＮＡ分子を含む本組成物の実施形態において、前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子と共にＲＮＰ中にあり、および前記ＲＮＰの各々は、約１０μＭ未満、例えば約３μＭ未満、例えば約１μＭ未満、例えば約０．５μＭ未満、例えば約０．３μＭ未満、例えば約０．１μＭ未満の濃度である。
【０１３１】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば、前出の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列を提供する。実施形態において、本核酸は、１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーター、例えば、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーター、例えばＵ６プロモーターまたはＨＩプロモーターを含む。実施形態において、本核酸は、Ｃａｓ９分子、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子、例えば、配列番号６６１１、配列番号７８２１、配列番号７８２２、配列番号７８２３、配列番号７８２４、配列番号７８２５、配列番号７８２６、配列番号７８２７、配列番号７８２８、配列番号７８２９、配列番号７８３０、または配列番号７８３１のいずれかを含む（例えば、それからなる）Ｃａｓ９分子をさらにコードする。実施形態において、本核酸は、Ｃａｓ９分子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーター、例えば、ＥＦ−１プロモーター、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターを含む。
【０１３２】
別の態様において、本発明は、前出の核酸の態様および実施形態のいずれかの核酸を含むベクターを提供する。実施形態において、本ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、およびＲＮＡベクターからなる群から選択される。
【０１３３】
別の態様において、本発明は、細胞（例えば、細胞の集団）を前記細胞内の標的配列でまたはその近傍で改変する（例えば、核酸の構造（例えば、配列）を改変する）方法であって、前記細胞（例えば、細胞の集団）を、１）前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載される）；２）前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載される）をコードする核酸；３）前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載される）；４）前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載される）をコードする核酸；５）上記１）〜４）のいずれか、および鋳型核酸；６）上記１）〜４）のいずれか、および鋳型核酸をコードする配列を含む核酸；７）前出の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物；または８）前出のベクターの態様および実施形態のいずれかのベクターと接触させる（例えば、それに導入する）ステップを含む方法を提供する。実施形態において、ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９分子をコードする核酸とは、単一の組成物に製剤化される。他の実施形態において、ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９分子をコードする核酸とは、２つ以上の組成物に製剤化される。２つ以上の組成物を含む実施形態において、２つ以上の組成物は同時にまたは逐次的に送達される。実施形態において、細胞は動物細胞、例えば、哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞である。実施形態において、細胞は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）であり、例えば細胞はＣＤ３４＋細胞であり、例えば細胞はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である。実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物中に配置される。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は骨髄、動員末梢血または臍帯血から単離されている。実施形態において、細胞は、前記細胞の投与を受ける患者にとって自己由来である。他の実施形態において、細胞は、前記細胞の投与を受ける患者にとって同種異系由来である。実施形態において、本方法は、１つ以上のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと相補的なゲノムＤＮＡ配列にまたはその近傍にインデル、例えば、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデル、例えば、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるとおりのｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに関連するインデルをもたらす。実施形態において、インデルは、約４０ヌクレオチド未満、例えば３０ヌクレオチド未満、例えば２０ヌクレオチド未満、例えば１０ヌクレオチド未満の挿入または欠失であり、例えば、単一のヌクレオチド欠失である。実施形態において、本方法は、集団の少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の細胞が改変されている、例えばインデルを含む細胞の集団をもたらす。実施形態において、本方法（例えば、細胞の集団、例えば本明細書に記載される細胞の集団に対して実施される方法）は、赤血球系統の分化細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有する細胞（例えば、細胞の集団）をもたらし、ここで、前記分化細胞は、例えば非改変細胞（例えば、細胞の集団）と比べて胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈する。実施形態において、本方法は、分化細胞の集団、例えば、赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有する細胞の集団をもたらし、ここで、前記分化細胞の集団は、例えば非改変細胞の集団と比べてＦ細胞の増加した（例えば、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％高い）割合を有する。実施形態において、本方法は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有する細胞をもたらし、ここで、前記分化細胞は１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、または約８〜約９ピコグラム、または約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、本方法はエキソビボで実施される。他の実施形態において、本方法はインビボで実施される。
【０１３４】
別の態様において、本発明は、前出の方法の態様および実施形態のいずれかの細胞を改変する方法によって改変された細胞を提供する。
【０１３５】
別の態様において、本発明は、前出の方法の態様および実施形態のいずれかの細胞を改変する方法によって得ることが可能な細胞を提供する。
【０１３６】
別の態様において、本発明は、第１のｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載される第１のｇＲＮＡ分子、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの第１のｇＲＮＡ分子、または組成物、例えば、本明細書に記載される組成物、例えば、前出の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物、核酸、例えば、本明細書に記載される核酸、例えば、前出の核酸の態様および実施形態のいずれかの核酸、またはベクター、例えば、本明細書に記載されるベクター、例えば、前出のベクターの態様および実施形態のいずれかのベクターを含む細胞を提供する。実施形態において、本細胞は、Ｃａｓ９分子、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子、例えば、配列番号６６１１、配列番号７８２１、配列番号７８２２、配列番号７８２３、配列番号７８２４、配列番号７８２５、配列番号７８２６、配列番号７８２７、配列番号７８２８、配列番号７８２９、配列番号７８３０、または配列番号７８３１のいずれかを含む、例えばそれからなるＣａｓ９分子をさらに含む。実施形態において、細胞は、第２のｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載される第２のｇＲＮＡ分子、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの第２のｇＲＮＡ分子、または第２のｇＲＮＡ分子をコードする、例えば、本明細書に記載される第２のｇＲＮＡ分子をコードする、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの第２のｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含むか、それを含んでいたか、またはそれを含むことになり、ここで、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とは同一でない標的化ドメインを含む。実施形態において、胎児ヘモグロビンの発現は、ｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じ細胞型の細胞またはその子孫と比べて前記細胞またはその子孫（例えば、その赤血球系子孫、例えば、その赤血球細胞子孫）において増加する。実施形態において、本細胞は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、ここで、前記分化細胞は、例えばｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じ型の細胞と比べて胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈する。実施形態において、分化細胞（例えば、赤血球系統の細胞、例えば、赤血球細胞）は、例えばｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じ型の細胞と比べて少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、または約８〜約９ピコグラム、または約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、本細胞は、幹細胞増殖剤、例えば、本明細書に記載されるもの、例えば、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１および化合物４）である幹細胞増殖剤、例えば、化合物４である幹細胞増殖剤と接触させたもの、例えばエキソビボで接触させたものである。前述の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本細胞は、そこに導入されたｇＲＮＡ分子（本明細書に記載されるとおりのもの、例えば、前述の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子）の標的化ドメインと相補的なゲノムＤＮＡ配列にまたはその近傍にインデル、例えば、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデル、例えば、そこに導入されたｇＲＮＡ分子（本明細書に記載されるとおりのもの、例えば、前述の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子）に関連する図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデルを含む。実施形態において、インデルは、約４０ヌクレオチド未満、例えば３０ヌクレオチド未満、例えば２０ヌクレオチド未満、例えば１０ヌクレオチド未満の挿入または欠失であり、例えば、インデルは単一のヌクレオチド欠失である。前述の細胞の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本細胞は動物細胞であり、例えば、本細胞は哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞である。前述の細胞の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本細胞は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）であり、例えば、本細胞はＣＤ３４＋細胞であり、例えば、本細胞はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である。前述の細胞の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本細胞（例えば、細胞の集団）は骨髄、動員末梢血または臍帯血から単離されている。前述の細胞の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本細胞は、前記細胞の投与を受ける患者にとって自己由来である。実施形態において、本細胞は、前記細胞の投与を受ける患者にとって同種異系由来である。
【０１３７】
別の態様において、本発明は、前出の細胞の態様および実施形態のいずれかの細胞を含む細胞の集団を提供する。実施形態において、本集団の少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の細胞が前出の細胞の態様および実施形態のいずれかに係る細胞である。実施形態において、本細胞の集団は、分化細胞の集団、例えば、赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、ここで、前記分化細胞の集団は、例えば同じ型の非修飾細胞の集団と比べてＦ細胞の増加した（例えば、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％高い）割合を有する。実施形態において、分化細胞の集団のＦ細胞は１細胞当たり平均で少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、または約８〜約９ピコグラム、または約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、本集団は、１）少なくとも１ｅ６  ＣＤ３４＋細胞／細胞を投与する患者の体重ｋｇ；２）少なくとも２ｅ６  ＣＤ３４＋細胞／細胞を投与する患者の体重ｋｇ；３）少なくとも３ｅ６  ＣＤ３４＋細胞／細胞を投与する患者の体重ｋｇ；４）少なくとも４ｅ６  ＣＤ３４＋細胞／細胞を投与する患者の体重ｋｇ；または５）２ｅ６〜１０ｅ６  ＣＤ３４＋細胞／細胞を投与する患者の体重ｋｇを含む。実施形態において、本集団の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％）の細胞がＣＤ３４＋細胞である。実施形態において、本集団の細胞の少なくとも約１０％、例えば少なくとも約１５％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である。実施形態において、本細胞の集団は、骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）、臍帯血、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する。好ましい実施形態において、本細胞の集団は骨髄に由来する。実施形態において、本細胞の集団は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞を含む、例えばそれからなる。実施形態において、本細胞の集団は、それが投与される患者にとって自己由来である。他の実施形態において、細胞の集団は、それが投与される患者にとって同種異系由来である。
【０１３８】
別の態様において、本発明は、前出の細胞の態様および実施形態のいずれかの細胞、または前出の細胞の集団の態様および実施形態のいずれかの細胞の集団を含む組成物を提供する。実施形態において、本組成物は、薬学的に許容可能な媒体、例えば、凍結保存に好適な薬学的に許容可能な媒体を含む。
【０１３９】
別の態様において、本発明は、前出の細胞の態様および実施形態のいずれかの細胞、前出の細胞の集団の態様および実施形態のいずれかの細胞の集団、または前出の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物を患者に投与するステップを含む、異常ヘモグロビン症を治療する方法を提供する。実施形態において、異常ヘモグロビン症はサラセミア、例えば、β−サラセミア、または鎌状赤血球症である。
【０１４０】
別の態様において、本発明は、前出の細胞の態様および実施形態のいずれかの細胞、前出の細胞の集団の態様および実施形態のいずれかの細胞の集団、または前出の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物を患者に投与するステップを含む、哺乳動物における胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法を提供する。
【０１４１】
別の態様において、本発明は、（ａ）細胞（例えば、細胞の集団）（例えば、ＨＳＰＣ（例えば、ＨＳＰＣの集団））を提供するステップ；（ｂ）幹細胞増殖剤を含む細胞培養培地中で前記細胞（例えば、前記細胞の集団）をエキソビボで培養するステップ；および（ｃ）第１のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるもの、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子）、第１のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるもの、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子）をコードする核酸分子、組成物（例えば、本明細書に記載されるもの、例えば、前出の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物）、核酸（例えば、本明細書に記載されるもの、例えば、前出の核酸の態様および実施形態のいずれかの核酸）、またはベクター（例えば、本明細書に記載されるもの、例えば、前出のベクターの態様および実施形態のいずれかのベクター）を前記細胞に導入するステップを含む、細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法を提供する。前記方法の実施形態において、前記ステップ（ｃ）の導入の後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、分化細胞（例えば、分化細胞の集団）、例えば、赤血球系統の細胞（例えば、赤血球系統の細胞の集団）、例えば、赤血球細胞（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、ここで、前記分化細胞（例えば、分化細胞の集団）は、例えばステップ（ｃ）に供されていない同じ細胞と比べて増加した胎児ヘモグロビンを産生する。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、幹細胞増殖剤は、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１および化合物４）であり、例えば化合物４である。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、およびヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、細胞培養培地はヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）をさらに含む。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、およびヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）をそれぞれ約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えばそれぞれ約５０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、細胞培養培地はヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）を約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えば約５０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、細胞培養培地は幹細胞増殖剤を約１ｎＭ〜約１ｍＭの範囲の濃度、例えば約１μＭ〜約１００μＭの範囲の濃度、例えば約５０μＭ〜約７５μＭの範囲の濃度、例えば約５０μＭの濃度、例えば５０μＭの濃度、または約７５μＭの濃度、例えば７５μＭの濃度で含む。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ｂ）の培養はステップ（ｃ）の導入の前の培養期間を含み、例えば、ステップ（ｃ）の導入の前の培養期間は少なくとも１２時間であり、例えば約１日〜約３日の期間であり、例えば約１日〜約２日の期間であり、例えば約２日の期間である。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ｂ）の培養はステップ（ｃ）の導入の後の培養期間を含み、例えば、ステップ（ｃ）の導入の後の培養期間は少なくとも１２時間であり、例えば約１日〜約１０日の期間であり、例えば約１日〜約５日の期間であり、例えば約２日〜約４日の期間であり、例えば約２日の期間であり、または約３日の期間であり、または約４日の期間である。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、細胞の集団は、例えばステップ（ｂ）により培養されていない細胞と比べて少なくとも４倍、例えば、少なくとも５倍、例えば、少なくとも１０倍増殖する。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ｃ）の導入は、エレクトロポレーション、例えば、１〜５パルス、例えば１パルスを含むエレクトロポレーションを含み、ここで、各パルスは７００ボルト〜２０００ボルトの範囲のパルス電圧であり、かつ１０ｍｓ〜１００ｍｓの範囲のパルス持続時間を有する。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、エレクトロポレーションは１パルスを含む、例えばそれからなる。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、パルス電圧は１５００〜１９００ボルトの範囲であり、例えば１７００ボルトである。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、パルス持続時間は１０ｍｓ〜４０ｍｓの範囲であり、例えば２０ｍｓである。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ａ）で提供される細胞（例えば、細胞の集団）はヒト細胞（例えば、ヒト細胞の集団）である。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ａ）で提供される細胞（例えば、細胞の集団）は骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）、臍帯血、または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、好ましくは骨髄から単離されたものである。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ａ）で提供される細胞（例えば、細胞の集団）は骨髄から単離されたもの、例えば、異常ヘモグロビン症に罹患している患者の骨髄から単離されたものである。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ａ）で提供される細胞の集団は、ＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞に関して富化されている。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ｃ）の導入の後、細胞（例えば、��胞の集団）は凍結保存される。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ｃ）の導入の後、細胞（例えば、細胞の集団）は、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと相補的なゲノムＤＮＡ配列にまたはその近傍にインデル、例えば、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデル、例えば第１のｇＲＮＡ分子に関連するとおりの図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデルを含む。前述の方法の態様および実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、ステップ（ｃ）の導入の後、細胞の集団の細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％は、第１のｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと相補的なゲノムＤＮＡ配列にまたはその近傍にインデル、例えば、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデル、例えば第１のｇＲＮＡ分子に関連するとおりの図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に示されるインデルを含む。
【０１４２】
別の態様において、本発明は、前出の態様および実施形態のいずれかの細胞調製方法によって得ることが可能な細胞（例えば、細胞の集団）を提供する。別の態様において、本発明は、異常ヘモグロビン症（例えば、サラセミア（例えば、β−サラセミア）または鎌状赤血球症）を治療する方法であって、前記細胞（例えば、細胞の集団）を含む組成物をヒト患者に投与するステップを含む方法を提供する。別の態様において、本発明は、ヒト患者の胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法であって、前記細胞（例えば、細胞の集団）を含む組成物を前記ヒト患者に投与するステップを含む方法を提供する。実施形態において、ヒト患者には、細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、例えば、前出の態様および実施形態のいずれかの細胞調製方法によって得ることが可能な細胞）をヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約１ｅ６個含む、例えば、前出の態様および実施形態のいずれかの細胞調製方法によって得ることが可能なＣＤ３４＋細胞をヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約１ｅ６個含む組成物が投与される。実施形態において、ヒト患者には、細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、例えば、前出の態様および実施形態のいずれかの細胞調製方法によって得ることが可能な細胞）をヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個含む、例えば、前出の態様および実施形態のいずれかの細胞調製方法によって得ることが可能なＣＤ３４＋細胞をヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個含む組成物が投与される。実施形態において、ヒト患者には、細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、例えば、前出の態様および実施形態のいずれかの細胞調製方法によって得ることが可能な細胞）をヒト患者の体重１ｋｇ当たり約２ｅ６〜約１０ｅ６個含む、例えば、前出の態様および実施形態のいずれかの細胞調製方法によって得ることが可能なＣＤ３４＋細胞をヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６〜約１０ｅ６個含む組成物が投与される。
【０１４３】
別の態様において、本発明は、薬剤として用いられる、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子、本明細書に記載される組成物、例えば、前出の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物、本明細書に記載される核酸、例えば、前出の核酸の態様および実施形態のいずれかの核酸、本明細書に記載されるベクター、例えば、前出のベクターの態様および実施形態のいずれかのベクター、本明細書に記載される細胞、例えば、前出の細胞の態様および実施形態のいずれかの細胞、または本明細書に記載される細胞の集団、例えば、前出の細胞の集団の態様および実施形態のいずれかの細胞の集団を提供する。
【０１４４】
別の態様において、本発明は、薬剤の製造に用いられる、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子、本明細書に記載される組成物、例えば、前出の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物、本明細書に記載される核酸、例えば、前出の核酸の態様および実施形態のいずれかの核酸、本明細書に記載されるベクター、例えば、前出のベクターの態様および実施形態のいずれかのベクター、本明細書に記載される細胞、例えば、前出の細胞の態様および実施形態のいずれかの細胞、または本明細書に記載される細胞の集団、例えば、前出の細胞の集団の態様および実施形態のいずれかの細胞の集団を提供する。
【０１４５】
別の態様において、本発明は、疾患の治療に用いられる、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子、本明細書に記載される組成物、例えば、前出の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物、本明細書に記載される核酸、例えば、前出の核酸の態様および実施形態のいずれかの核酸、本明細書に記載されるベクター、例えば、前出のベクターの態様および実施形態のいずれかのベクター、本明細書に記載される細胞、例えば、前出の細胞の態様および実施形態のいずれかの細胞、または本明細書に記載される細胞の集団、例えば、前出の細胞の集団の態様および実施形態のいずれかの細胞の集団を提供する。
【０１４６】
別の態様において、本発明は、疾患の治療に用いられる、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば、前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子、本明細書に記載される組成物、例えば、前出の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物、本明細書に記載される核酸、例えば、前出の核酸の態様および実施形態のいずれかの核酸、本明細書に記載されるベクター、例えば、前出のベクターの態様および実施形態のいずれかのベクター、本明細書に記載される細胞、例えば、前出の細胞の態様および実施形態のいずれかの細胞、または本明細書に記載される細胞の集団、例えば、前出の細胞の集団の態様および実施形態のいずれかの細胞の集団を提供し、ここで、疾患は異常ヘモグロビン症、例えばサラセミア（例えば、β−サラセミア）または鎌状赤血球症である。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】Ｂｃｌ１１ａ  ＋５８赤血球系エンハンサー領域のＣａｓ９編集。＋５８エンハンサー領域を標的とするｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡをリポフェクションによって送達した２４時間後にＨＥＫ−２９３  Ｃａｓ９ＧＦＰにおいてＮＧＳにより検出された編集の割合。各ドットが異なるｃｒＲＮＡを示し、ｔｒＲＮＡは一定とした。ゲノム座標は、例えばｈｇ３８をリファレンスとした２番染色体上の位置を示す。（ｎ＝１）
【図２】Ｂｃｌ１１ａ  ＋６２赤血球系エンハンサー領域のＣａｓ９編集。＋６２エンハンサー領域を標的とするｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡをリポフェクションによって送達した２４時間後にＨＥＫ−２９３  Ｃａｓ９ＧＦＰにおいてＮＧＳにより検出された編集の割合。各ドットが異なるｃｒＲＮＡを示し、ｔｒＲＮＡは一定とした。ゲノム座標は、例えばｈｇ３８をリファレンスとした２番染色体上の位置を示す。（ｎ＝１）
【図３】Ｃａｓ９編集システム導入後の細胞の選択に関するゲーティング戦略。
【図４】Ｃａｓ９編集システムで処理したＣＤ３４＋細胞の遺伝子断片のアガロースゲル電気泳動（ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋およびＣＤ３４＋ＣＤ９０−細胞集団の両方を、ソートしていない参照細胞と共に示す）。上側のバンドは切断されていないホモ二重鎖ＤＮＡを表し、下側のバンドはヘテロ二重鎖ＤＮＡから生じた切断産物を示す。一番左寄りのレーンはＤＮＡラダーである。バンド強度はＩｍａｇｅＪソフトウェアによる未処理画像のピーク積分によって計算した。％遺伝子修飾（インデル）は以下のとおり計算したもの：％遺伝子修飾＝１００×（１−（１−切断割合）１／２）であり、ゲルの対応する各レーンの下に示す。
【図５】下線のヌクレオチドと相補的な標的化ドメインを含むｓｇＲＮＡ分子によって標的化されるゲノムＤＮＡの部位を示す赤血球系エンハンサー領域。
【図６Ａ】ＣＤ３４＋  ＨＳＣ細胞におけるｓｇＥＨ１（ＣＲ００２７６）（Ａ）によるインデル形成のＮＧＳ結果。挿入は大文字である。欠失は破線によって示す。切断部位近傍のマイクロホモロジー領域は太字下線で強調表示する。
【図６Ｂ】ＣＤ３４＋  ＨＳＣ細胞におけるｓｇＥＨ２（ＣＲ００２７５）（Ｂ）によるインデル形成のＮＧＳ結果。挿入は大文字である。欠失は破線によって示す。切断部位近傍のマイクロホモロジー領域は太字下線で強調表示する。
【図６Ｃ】ＣＤ３４＋  ＨＳＣ細胞におけるｓｇＥＨ８（ＣＲ００２７３）（Ｃ）によるインデル形成のＮＧＳ結果。挿入は大文字である。欠失は破線によって示す。切断部位近傍のマイクロホモロジー領域は太字下線で強調表示する。
【図６Ｄ】ＣＤ３４＋  ＨＳＣ細胞におけるｓｇＥＨ９（ＣＲ００２７７）（Ｄ）によるインデル形成のＮＧＳ結果。挿入は大文字である。欠失は破線によって示す。切断部位近傍のマイクロホモロジー領域は太字下線で強調表示する。
【図７】ｇ７、ｇ８およびｇ２に関するＮＧＳ結果および複数のドナーにわたるインデルパターン形成。ｇ７およびｇ８を用いた２つのバイオロジカルレプリケート実験からの上位３つのインデルの配列は同一であり、ｇ２を用いた上位３つのインデルの配列は前の実験と同一であった。
【図８】修飾ｇＲＮＡ足場（ＢＣ）を用いたＮＧＳ結果およびインデルパターン形成。これらの実験からの上位３つのインデルの配列は標準ｇＲＮＡ足場の使用時に形成されるものと同一である。
【図９】異なる送達方法間におけるインデルパターンの比較。平均％は、指示されるインデルを呈するＮＧＳリードの％（２つの実験の平均）を指す。
【図１０】非伸長フラッグポール領域（「ｒｅｇ」）または第１のフラッグポール伸長部および第１のｔｒａｃｒ伸長部有り（「ＢＣ」）のいずれかを有するｇ７  ｇＲＮＡとｇ８  ｇＲＮＡとの共導入によるインデル形成。これらの２つのｇＲＮＡのＰＡＭ配列は囲み線で囲む。
【図１１】ＮＧＳによって計測したときの（ｎ＝３）、ＣＤ３４＋細胞におけるＢＣＬ１１ａ遺伝子の＋５８エンハンサー領域を指向する上位ｇＲＮＡ配列。
【図１２】ＮＧＳによって計測したときの（ｎ＝３）、ＣＤ３４＋細胞におけるＢＣＬ１１ａ遺伝子の＋６２エンハンサー領域を指向する上位ｇＲＮＡ配列。
【図１３】ＣＲ００１８７（薄い灰色のバー）またはＣＲ００２０２（濃い灰色のバー）のいずれかを一定として、指示されるｇＲＮＡの標的化ドメインを含む第２のｇＲＮＡ分子と共に細胞に共挿入したときの、ＢＣＬ１１  ＋６２エンハンサー遺伝子座を標的とする２つのｇＲＮＡ分子をＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９細胞に導入したときの予想切り出しサイズ。
【図１４】ＣＲ００１８７の標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子およびグラフに指示する第２のｇＲＮＡ分子を加えることによるＢＣＬ１１ａの＋６２エンハンサー内のゲノムＤＮＡの切り出し。星印（＊）は、３０％より高い頻度で観察された切り出しを示し、キャレット（＾）は、それより低い頻度（＜３０％）で観察された切り出しを示す。５０ｎｔ未満の断片をもたらす予想切り出し産物は区別することができなかった。
【図１５】ＣＲ００２０２の標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子およびグラフに指示する第２のｇＲＮＡ分子を加えることによるＢＣＬ１１ａの＋６２エンハンサー内のゲノムＤＮＡの切り出し。星印（＊）は、３０％より高い頻度で観察された切り出しを示し、キャレット（＾）は、それより低い頻度（＜３０％）で観察された切り出しを示す。
【図１６】フランス型ＨＰＦＨ領域に標的化された１９２個のｇＲＮＡ分子による％インデル形成（Ｓａｎｋａｒａｎ  ＶＧ  ｅｔ  ａｌ．「胎児ヘモグロビンサイレンシングに必要な機能エレメント（Ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｆｅｔａｌ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）」．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４）。
【図１７】ゲノム編集と続く遺伝子および表現型の特徴付けのための初代ヒトＣＤ３４＋  ＨＳＰＣへのＣａｓ９：ｇＲＮＡリボ核タンパク質（Ｃａｓ９−ＲＮＰ）送達の実験スキーム。
【図１８】ＣＤ３４＋  ＨＳＰＣへのモックエレクトロポレーションまたはＣａｓ９−ＲＮＰ複合体のエレクトロポレーション後の細胞生存率。ＲＮＰ複合体のエレクトロポレーション後４８時間にわたってＨＳＰＣをインビトロで増殖させて、細胞生存率をモニタし、およびパーセント生存率を決定した。ＲＮＰ複合体の作製に使用したｇＲＮＡの名称をｘ軸に示し、対応する細胞生存率をｙ軸に示す。ＣＲｘｘｘｘ識別名はｇＲＮＡ分子の標的化ドメインを示す。
【図１９】Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイを用いたミスマッチ検出。ヒトＨＳＣをエレクトロポレートしてＲＮＰ複合体を送達することにより、ＮＨＥＪによってＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーの＋５８  ＤＨＳ領域にインデルを導入した。標的領域にわたるＰＣＲアンプリコンをＴ７Ｅ１アッセイに供し、得られた断片を２％アガロースゲル電気泳動によって分析した。＋５８赤血球系エンハンサーＢＣＬ１１Ａの領域を両方のガイドＲＮＡフォーマットによって破壊した（デュアルガイドＲＮＡ−黒色；シングルガイドＲＮＡ−灰色（下のグラフ、および上のグラフのｇ７ＢＣＬ１１ａ−ＢＣ（１）およびｇ７ＢＣＬ１１Ａ−ＢＣ（２）））。ＤＮＡバンド強度をＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）によって推定することにより、編集されたアレルのパーセントを求めた。使用したｇＲＮＡの名称およびミスマッチ検出アッセイから求めた対応する遺伝子編集効率もゲル画像の下の表に示す。
【図２０】次世代シーケンシングによるパーセントアレル編集。ラベルは図１８および図１９について記載されるとおりである。
【図２１】５つの選択のｇＲＮＡに関して観察されたコロニー数およびコロニーのタイプを示すコロニー形成細胞（ＣＦＣ）単位アッセイ。＋５８赤血球系エンハンサーで編集されたＨＳＰＣゲノムをメチルセルロースにプレーティングし、ＳＴＥＭｖｉｓｉｏｎを使用して形態学上および表現型上の基準を用いた成熟細胞の数およびタイプに基づきクローナルコロニーを分類およびカウントした。コロニーは、赤芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｅ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球／マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）および顆粒球／赤血球／マクロファージ／巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）に分類された。
【図２２】赤血球系分化中の細胞分裂の動態。赤血球系分化中、０、７、１４および２１日目に細胞の総数を決定し、細胞増殖倍数を計算した。
【図２３】ゲノム編集および赤血球系分化後のＨＳＣにおけるＢＣＬ１１Ａ、γおよびβ−グロビンｍＲＮＡレベル。単系統赤血球系培養物におけるＢＣＬ１１Ａ、γおよびβ−グロビン鎖の相対ｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲによって定量化した。転写物レベルはヒトＧＡＰＤＨ転写物レベルに対して正規化した。
【図２４Ａ】ＢＣＬ１１ａエンハンサー（＋５８）を破壊するためのデュアルｇＲＮＡ／ｃａｓ９システムで達成されたＨＳＣの効率的編集により、高レベルのＨｂＦが誘導された。エレクトロポレーション後４８時間のＨＳＣをインビトロ赤血球系分化に供し、ＨｂＦ発現を計測した。７、１４および２１日目にＦＡＣＳ分析によってＨｂＦ陽性細胞（Ｆ−細胞）パーセントをモニタした。この図に示すデータは、ｄｇＲＮＡが指示される標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡシステムで作成した。
【図２４Ｂ】ＢＣＬ１１ａエンハンサー（＋５８）を破壊するためのｓｇＲＮＡ／ｃａｓ９システムで達成されたＨＳＣの効率的編集により、高レベルのＨｂＦが誘導された。エレクトロポレーション後４８時間のＨＳＣをインビトロ赤血球系分化に供し、ＨｂＦ発現を計測した。７、１４および２１日目にＦＡＣＳ分析によってＨｂＦ陽性細胞（Ｆ−細胞）パーセントをモニタした。この図に示すデータは、ｓｇＲＮＡが指示される標的化ドメインを含むｓｇＲＮＡシステムで作成した。
【図２５】指示される標的化ドメインを含むｇＲＮＡによってＨＳＰＣに生じるインデルパターン。
【図２６Ａ】細胞表面マーカー染色によるＣＤ３４＋細胞増殖培地中の編集済みおよび未編集培養物のフェノタイピング。ｇＲＮＡ分子は全てｄｇＲＮＡフォーマットで試験した。使用したＴｒａｃｒは配列番号７８０８であり、ｃｒＲＮＡは以下のフォーマットおよび配列を有した（２’Ｏ−メチル（ｍ）修飾およびホスホロチオエート結合（＊）修飾を示す）：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（式中、Ｎは、指示される標的化ドメインの残基である）。「材料および方法」に記載するとおり各抗体パネルまたは対応するアイソタイプ対照で染色した細胞の蛍光を示す代表的なドットプロットを示す。示される細胞は、生存細胞集団に関して前方・側方散乱特性およびＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）判別によって予めゲーティングした。プロットの上に名称を指示した各細胞集団のパーセンテージは、太線で囲んで示したゲートによって決定した。
【図２６Ｂ】細胞表面マーカー染色によるＣＤ３４＋細胞増殖培地中の編集済みおよび未編集培養物のフェノタイピング。ｇＲＮＡ分子は全てｄｇＲＮＡフォーマットで試験した。使用したＴｒａｃｒは配列番号７８０８であり、ｃｒＲＮＡは以下のフォーマットおよび配列を有した（２’Ｏ−メチル（ｍ）修飾およびホスホロチオエート結合（＊）修飾を示す）：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（式中、Ｎは、指示される標的化ドメインの残基である）。編集済みおよび未編集培養物中にある名称を指示した各細胞集団のパーセンテージを示す。編集済み培養物の標的化ドメインは指示されるとおりである。
【図２７】ＨＰＦＨ領域内の２つの部位を標的とするｄｇＲＮＡを含むＲＮＰで編集したＣＤ３４＋細胞の集団から分化した赤血球における％Ｆ細胞。「ｇ２」は陽性対照であり（ＢＣＬ１１ａ遺伝子のコード領域に対する標的化ドメイン）、「ｃｎｔｒｌ」は陰性対照である（Ｃａｓ９のみの導入）。
【図２８Ａ】指示されるｄｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）を含むＲＮＰのエレクトロポレーション後２日目のＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにおけるＮＧＳによって決定したときの％編集率。対照は、非修飾ＣＲ００３１７の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡ（ＣＲ００３１７−ｍ）、または緩衝液のみでのエレクトロポレーション（Ｃａｓ９またはｇＲＮＡなし；「モック」）を含む。
【図２８Ｂ】指示されるｄｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）を含むＲＮＰのエレクトロポレーション後２日目のＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにおけるＮＧＳによって決定したときの％編集率。対照は、緩衝液のみでのエレクトロポレーション（Ｃａｓ９またはｇＲＮＡなし；「モック」）を含む。
【図２９】指示されるｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり。いずれの場合にも数字は標的化ドメインのＣＲｘｘｘｘｘｘ識別名に対応し、例えば、Ｕｎｍｏｄ  ｓｇ３１２は、ＣＲ００３１２の標的化ドメインを含む非修飾ｓｇＲＮＡを指す）を含むＲＮＰのエレクトロポレーション後２日目のＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにおけるＮＧＳによって決定したときの％編集率。対照は、Ｃａｓ９タンパク質のみのエレクトロポレーション（「Ｃａｓ９」）、緩衝液のみによるエレクトロポレーション（「モック」）、またはエレクトロポレーションなし（「ＷＴ」）を含む。
【図３０Ａ】指示されるｄｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）を含むＲＮＰでＣＤ３４＋  ＨＳＰＣをエレクトロポレートし、次に赤血球系分化培地中で培養することにより分化を誘導した後のＨｂＦ＋である正規化％赤血球（「モック」の％Ｆ細胞を減じた）。対照は、緩衝液のみのエレクトロポレーション（「モック」）を含む。
【図３０Ｂ】指示されるｄｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）を含むＲＮＰでＣＤ３４＋  ＨＳＰＣをエレクトロポレートし、次に赤血球系分化培地中で培養することにより分化を誘導した後のＨｂＦ＋である正規化％赤血球（「モック」の％Ｆ細胞を減じた）。対照は、緩衝液のみのエレクトロポレーション（「モック」）を含む。
【図３１】指示されるｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり。いずれの場合にも数字は標的化ドメインのＣＲｘｘｘｘｘｘ識別名に対応し、例えば、Ｕｎｍｏｄ  ｓｇ３１２は、ＣＲ００３１２の標的化ドメインを含む非修飾ｓｇＲＮＡを指す）を含むＲＮＰでＣＤ３４＋  ＨＳＰＣをエレクトロポレートし、次に赤血球系分化培地中で培養することにより分化を誘導した後のＨｂＦ＋である正規化％赤血球（「モック」の％Ｆ細胞を減じた）。対照は、Ｃａｓ９タンパク質およびｔｒａｃｒのみのエレクトロポレーション（「Ｃａｓ９＋ＴｒａｃＲＮＡのみ」）、緩衝液のみでのエレクトロポレーション（「細胞のみ＋パルス」）、またはエレクトロポレーションなし（「細胞のみ、パルスなし」）を含む。
【図３２】指示されるｓｇＲＮＡ（いずれの場合でも、数字は標的化ドメインのＣＲｘｘｘｘｘｘ識別名に対応し、例えば、Ｕｎｍｏｄ  ｓｇ３１２は、ＣＲ００３１２の標的化ドメインを含む非修飾ｓｇＲＮＡを指す）を含むＲＮＰをＣＤ３４＋細胞にエレクトロポレートした後の赤血球系分化後１４日目の培養物における総細胞増殖倍数。対照は、Ｃａｓ９タンパク質およびｔｒａｃｒのみのエレクトロポレーション（「Ｃａｓ９＋ＴｒａｃＲＮＡのみ」）、緩衝液のみでのエレクトロポレーション（「細胞のみ＋パルス」）、またはエレクトロポレーションなし（「細胞のみ、パルスなし」）を含む。
【図３３】ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域を標的とするｄｇＲＮＡ分子によって導かれるＣａｓ９により切断された潜在的オフターゲット部位の評価。試験した各ガイドＲＮＡについて、三角はオンターゲット部位を表し、一方、白抜きの丸は潜在的オフターゲット部位を表す。
【図３４】ＮＧＳおよびフローサイトメトリーによって判定したときの、種々のＣａｓ９変異体によるＣＤ３４＋造血幹細胞の標的Ｂ２Ｍ遺伝子座における編集効率。ＮＬＳ＝ＳＶ４０  ＮＬＳ、Ｈｉｓ６またはＨｉｓ８は、それぞれ６個または８個のヒスチジン残基を指し、ＴＥＶ＝タバコエッチウイルス切断部位、Ｃａｓ９＝野生型化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９−突然変異体または変異体は指示されるとおりである）。
【図３５】データは、増殖培地で合計１０日間培養（エレクトロポレーション前に３日間培養、およびエレクトロポレーション後に７日間培養）した後の細胞数の増加倍数を示す。シングルおよびデュアルガイドＲＮＡフォーマットの両方を含め、試験した全てのガイドＲＮＡで細胞増殖は２〜７倍の範囲であった。矢印で示すＣＲ００３１２およびＣＲ００１１２８は、１０日間の細胞増殖後に３〜６倍の増加を実証した。ラベル「Ｃｒｘｘｘｘ」は、指示される標的化ドメインを有するｄｇＲＮＡを指し、「ｓｇｘｘｘｘ」は、同じ数字のＣＲｘｘｘｘｘ識別名の標的化ドメインを有するｓｇＲＮＡを指し（例えば、ｓｇ３１２はＣＲ００３１２の標的化ドメインを有する）、「Ｕｎｍｏｄ」は、そのＲＮＡに修飾がないことを示し、「Ｏ’ＭｅＰＳ」は、ｄｇＲＮＡに関して用いられるとき、非修飾ｔｒａｃｒとの組み合わせで、３つの３’および３つの５’  ２’−ＯＭｅ修飾およびホスホロチオエート結合を有するｃｒＲＮＡを指し、「Ｏ’ＭｅＰＳ」は、ｓｇＲＮＡに関して用いられるとき、３つの５’側端２’−ＯＭｅ修飾およびホスホロチオエート結合、３つの３’側端ホスホロチオエート結合、ならびに最後から４番目、最後から３番目および最後から２番目の３’ヌクレオチドの３つの２’ＯＭｅ修飾を有するｇＲＮＡを指す。
【図３６】異なるＨＳＰＣサブ集団を区別するためのゲーティング戦略。
【図３７】指示される培地（ＩＬ６、化合物４、またはＩＬ６と化合物４との両方を含む変法ＳＴＦ）中における４８時間のエキソビボ培養後、但しＣＲＩＳＰＲシステムのエレクトロポレーション前の各造血サブセットの頻度。ＳＴＦ＝ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ。
【図３８】指示される培地（ＩＬ６、化合物４、またはＩＬ６と化合物４との両方を含む変法ＳＴＦ）で培養した、ＢＣＬ１１ａの＋５８エンハンサーを標的とするＣＲＩＳＰＲシステムを導入するエレクトロポレーション後７日の各造血サブセットの頻度。ＳＴＦ＝ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ。
【図３９Ａ】種々のＲＮＰ濃度を用いて遺伝子編集したときの細胞生存率であり、ここで、ＲＮＰは、＋５８領域を標的とするｄｇＲＮＡを含有する。
【図３９Ｂ】種々のＲＮＰ濃度を用いて遺伝子編集したときの細胞生存率であり、ここで、ＲＮＰは、＋５８領域を標的とするｓｇＲＮＡを含有する。
【図４０Ａ】種々のＲＮＰ濃度を用いて遺伝子編集したときのＮＧＳによって計測した遺伝子編集効率であり、ここで、ＲＮＰは、＋５８領域を標的とするｄｇＲＮＡを含有する。
【図４０Ｂ】種々のＲＮＰ濃度を用いて遺伝子編集したときのＮＧＳによって計測した遺伝子編集効率であり、ここで、ＲＮＰは、＋５８領域を標的とするｓｇＲＮＡを含有する。
【図４１Ａ】種々のＲＮＰ濃度を用いて遺伝子編集したときのフローサイトメトリーによって計測したＨｂＦ誘導のパーセンテージであり、ここで、ＲＮＰは、＋５８領域を標的とするｄｇＲＮＡを含有する。
【図４１Ｂ】種々のＲＮＰ濃度を用いて遺伝子編集したときのフローサイトメトリーによって計測したＨｂＦ誘導のパーセンテージであり、ここで、ＲＮＰは、＋５８領域を標的とするｓｇＲＮＡを含有する。
【図４２Ａ】種々のＣａｓ９タンパク質を含むＲＮＰの遺伝子編集効率。遺伝子編集は、種々のＣａｓ９変異体（Ｘ軸に挙げる）を非修飾バージョンのｓｇＲＮＡ  ＣＲ００３１２およびｓｇＲＮＡ  ＣＲ００１１２８、または修飾バージョンのｓｇＲＮＡ  ＣＲ００３１２およびｓｇＲＮＡ  ＣＲ００１１２８のいずれかと組み合わせて用いて実施した。編集した細胞はＮＧＳに供して％編集率（Ｙ軸）を決定した。
【図４２Ｂ】種々のＣａｓ９タンパク質を用いて遺伝子編集したときのＨｂＦ＋細胞の誘導。遺伝子編集は、種々のＣａｓ９変異体（Ｘ軸に挙げる）を非修飾バージョンのｓｇＲＮＡ  ＣＲ００３１２およびｓｇＲＮＡ  ＣＲ００１１２８、または修飾バージョンのｓｇＲＮＡ  ＣＲ００３１２およびｓｇＲＮＡ  ＣＲ００１１２８のいずれかと組み合わせて用いて実施した。編集した細胞は赤血球系統に分化させ、フルオロフォアをコンジュゲートした抗ＨｂＦ抗体を用いたフローサイトメトリーによってＨｂＦ産生を評価した。
【図４３】指示されるｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）（ラベルは、表３６に指示するとおりのｇＲＮＡ配列を指す）を含むＲＮＰのエレクトロポレーションによるＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにおけるＮＧＳによって決定したときの％編集率。編集はエレクトロポレーションの２日後（黒色のバー）または６日後（灰色のバー）に決定した。Ｃａｓ９タンパク質およびＴｒａｃｒのみ（「なし」、データは示さず）の対照エレクトロポレーション後は各部位で１．５％未満の編集率が検出された。２つのエレクトロポレーションレプリケートの平均値＋標準偏差を示す。
【図４４】指示されるｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）（ラベルは、表３６に指示するとおりのｇＲＮＡ配列を指す）を含むＲＮＰをＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにエレクトロポレートし、赤血球系分化条件で７日間培養した後のＣＤ７１＋である生存細胞のパーセント。エレクトロポレーション後、細胞は、実施例４．７に記載されるとおりのプロトコル１（黒色のバー）またはプロトコル２（灰色のバー）によって維持した。対照は、Ｃａｓ９タンパク質およびＴｒａｃｒのみのエレクトロポレーション（「なし」）を含む。２つのエレクトロポレーションレプリケートの平均値＋標準偏差を示す。
【図４５】指示されるｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）（ラベルは、表３６に指示するとおりのｇＲＮＡ配列を指す）を含むＲＮＰをＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにエレクトロポレートし、赤血球系分化条件で７日間培養した後のＨｂＦ＋である赤血球系細胞のパーセント。エレクトロポレーション後、細胞は、実施例４．７に記載されるとおりのプロトコル１（黒色のバー）またはプロトコル２（灰色のバー）によって維持した。対照は、Ｃａｓ９タンパク質およびＴｒａｃｒのみのエレクトロポレーション（「なし」）を含む。２つのエレクトロポレーションレプリケートの平均値＋標準偏差を示す。
【図４６】指示されるｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）（ラベルは、表３６に指示するとおりのｇＲＮＡ配列を指す）を含むＲＮＰをＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにエレクトロポレートし、赤血球系分化条件で１４日間培養した後のＨｂＦ＋である細胞のパーセント。エレクトロポレーション後、細胞は、実施例４．７に記載されるとおりのプロトコル１（黒色のバー）またはプロトコル２（灰色のバー）によって維持した。対照は、Ｃａｓ９タンパク質およびＴｒａｃｒのみのエレクトロポレーション（「なし」）を含む。２つのエレクトロポレーションレプリケートの平均値＋標準偏差を示す。
【図４７】指示されるｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）（ラベルは、表３６に指示するとおりのｇＲＮＡ配列を指す）を含むＲＮＰをＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにエレクトロポレートし、赤血球系分化条件で２１日間培養した後のＨｂＦ＋である細胞のパーセント。エレクトロポレーション後、細胞は、実施例４．７に記載されるとおりのプロトコル１（黒色のバー）またはプロトコル２（灰色のバー）によって維持した。対照は、Ｃａｓ９タンパク質およびＴｒａｃｒのみのエレクトロポレーション（「なし」）を含む。２つのエレクトロポレーションレプリケートの平均値＋標準偏差を示す。
【図４８】指示されるｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ（非修飾（ｕｎｍｏｄ）または修飾は指示するとおり）（ラベルは、表３６に指示するとおりのｇＲＮＡ配列を指す）を含むＲＮＰをＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにエレクトロポレートした後の７日間（黒色のバー）または２１日間（黒色のバー）にわたる赤血球系分化培養での総細胞増殖倍数。エレクトロポレーション後、細胞は、実施例４．７に記載されるとおりのプロトコル２によって維持した。対照は、Ｃａｓ９タンパク質およびＴｒａｃｒのみのエレクトロポレーション（「なし」）を含む。２つのエレクトロポレーションレプリケートの平均値＋標準偏差を示す。
【図４９】ＨＰＦＨ領域を標的とするｄｇＲＮＡ分子によって導かれるＣａｓ９により切断された潜在的オフターゲット部位の評価。試験した各ガイドＲＮＡについて、三角はオンターゲット部位を表し、一方、白抜きの丸は潜在的オフターゲット部位を表す。
【発明を実施するための形態】
【０１４８】
定義
用語「ＣＲＩＳＰＲシステム」、「Ｃａｓシステム」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム」は、一緒になって標的配列でＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子による核酸の修飾を誘導し達成するのに必要かつ十分なＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子とｇＲＮＡ分子とを含む分子の組を指す。一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｇＲＮＡとＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質とを含む。Ｃａｓ９または修飾Ｃａｓ９分子を含むかかるシステムは、本明細書では「Ｃａｓ９システム」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム」と称される。一例において、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ分子とは複合体化してリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成し得る。
【０１４９】
用語「ガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ分子」、「ｇＲＮＡ分子」または「ｇＲＮＡ」は同義的に使用され、ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子（典型的にはｇＲＮＡ分子と複合体化している）が標的配列へ特異的に誘導されるよう促進する核酸分子の組を指す。一部の実施形態において、前記誘導は、ｇＲＮＡの一部分がＤＮＡに（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインを介して）ハイブリダイズすることを通じて、およびｇＲＮＡ分子の一部分がＲＮＡガイド型ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子に（例えば、少なくともｇＲＮＡ  ｔｒａｃｒを介して）結合することにより達成される。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は単一の連続するポリヌクレオチド分子からなり、本明細書において「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」などと称される。他の実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、それ自体が通常ハイブリダイゼーションを通じて会合する能力を有する複数の、通常２つのポリヌクレオチド分子からなり、本明細書において「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」などと称される。ｇＲＮＡ分子について以下にさらに詳細に記載するが、概して標的化ドメインとｔｒａｃｒとを含むものである。実施形態において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとは単一のポリヌクレオチドに配置される。他の実施形態において、標的化ドメインとｔｒａｃｒとは別個のポリヌクレオチドに配置される。
【０１５０】
用語「標的化ドメイン」とは、この用語がｇＲＮＡに関連して使用されるとき、標的配列、例えば、細胞の核酸内、例えば遺伝子内の標的配列を認識する、例えばそれと相補的であるｇＲＮＡ分子の一部分である。
【０１５１】
用語「ｃｒＲＮＡ」は、この用語がｇＲＮＡ分子に関連して使用されるとき、標的化ドメインと、ｔｒａｃｒと相互作用してフラッグポール領域を形成する領域とを含むｇＲＮＡ分子の一部分である。
【０１５２】
用語「標的配列」は、ｇＲＮＡ標的化ドメインと相補的、例えば完全に相補的な核酸の配列を指す。実施形態において、標的配列はゲノムＤＮＡ上に配置されている。ある実施形態において、標的配列は、ヌクレアーゼ活性または他のエフェクター活性を有するタンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列、例えばＣａｓ９によって認識されるＰＡＭ配列に（ＤＮＡの同じ鎖上または相補鎖上のいずれかで）隣接している。実施形態において、標的配列は、グロビン遺伝子の発現に影響を及ぼす遺伝子内または遺伝子座内、例えばβグロビンまたは胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の発現に影響を及ぼす遺伝子内または遺伝子座内にある標的配列である。実施形態において、標的配列は、グロビン遺伝子座内にある標的配列である。実施形態において、標的配列は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子内にある標的配列である。実施形態において、標的配列は、ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域内にある標的配列である。実施形態において、標的配列は、ＨＰＦＨ領域内にある標的配列である。
【０１５３】
用語「フラッグポール」は、本明細書でｇＲＮＡ分子に関連して使用されるとき、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒとが互いに結合するかまたはハイブリダイズするｇＲＮＡの一部分を指す。
【０１５４】
用語「ｔｒａｃｒ」は、本明細書でｇＲＮＡ分子に関連して使用されるとき、ヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子に結合するｇＲＮＡの一部分を指す。実施形態において、ｔｒａｃｒは、Ｃａｓ９に特異的に結合する核酸配列を含む。実施形態において、ｔｒａｃｒは、フラッグポールの一部を形成する核酸配列を含む。
【０１５５】
用語「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９分子」は、ＤＮＡ切断に関与する細菌ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの酵素を指す。Ｃａｓ９には、野生型タンパク質ならびにその機能性および非機能性突然変異体も含まれる。実施形態において、Ｃａｓ９は化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９である。
【０１５６】
用語「相補的」は、核酸に関連して使用されるとき、ＡとＴまたはＵ、およびＧとＣの塩基の対合を指す。相補的という用語は、完全に相補的である、すなわち参照配列全体にわたってＡがＴまたはＵと対を形成し、およびＧがＣと対を形成する核酸分子、ならびに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％相補的な分子を指す。
【０１５７】
「鋳型核酸」は、相同組換え修復または相同的組換えに関連して使用されるとき、切断部位における遺伝子修復（挿入）のためＣＲＩＳＰＲシステムドナー配列によって修飾部位に挿入される核酸を指す。
【０１５８】
「インデル」は、本明細書においてこの用語が使用されるとき、ｇＲＮＡ分子を含む組成物、例えばＣＲＩＳＰＲシステムへの曝露後に生じる、参照核酸と比べた１つ以上のヌクレオチド挿入、１つ以上のヌクレオチド欠失、またはヌクレオチド挿入および欠失の組み合わせを含む核酸を指す。インデルは、ｇＲＮＡ分子を含む組成物に曝露した後の核酸を例えばＮＧＳによってシーケンシングすることにより決定し得る。インデルの部位に関して、インデルは、それが参照部位から約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチドの範囲内に少なくとも１つの挿入または欠失を含むか、または前記参照部位の一部または全てとオーバーラップしている（例えば、ｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的化ドメインに相補的な部位とオーバーラップしているか、またはそれから１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチドの範囲内にある少なくとも１つの挿入または欠失を含む）場合、参照部位（例えば、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと相補的な部位）「にあるかまたはその近傍にある」と言われる。
【０１５９】
「インデルパターン」は、本明細書においてこの用語が使用されるとき、ｇＲＮＡ分子を含む組成物への曝露後に生じるインデルの組を指す。ある実施形態において、インデルパターンは、出現頻度を基準として上位３つのインデルからなる。ある実施形態において、インデルパターンは、出現頻度を基準として上位５つのインデルからなる。ある実施形態において、インデルパターンは、全シーケンシングリードに対して約５％より高い頻度で存在するインデルからなる。ある実施形態において、インデルパターンは、インデルシーケンシングリードの総数（すなわち、非修飾参照核酸配列からなるのでないリード）に対して約１０％より高い頻度で存在するインデルからなる。ある実施形態において、インデルパターンは、上位５つの最も高頻度に観察されるインデルの任意の３つを含む。インデルパターンは、例えばｇＲＮＡ分子に曝露した細胞の集団の細胞をシーケンシングすることにより決定し得る。
【０１６０】
「オフターゲットインデル」は、本明細書においてこの用語が使用されるとき、ｇＲＮＡ分子の標的化ドメインの標的配列以外の部位にまたはその近傍にあるインデルを指す。かかる部位は、ｇＲＮＡの標的化ドメインの配列と比べて例えば１、２、３、４、５個またはそれを超えるミスマッチヌクレオチドを含み得る。例示的実施形態において、かかる部位は、インシリコで予想されるオフターゲット部位の標的シーケンシングを用いるか、または当該技術分野において公知の挿入法によって検出される。
【０１６１】
用語「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、その冠詞の文法上の指示対象の１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）を指す。例として、「要素」は１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【０１６２】
量、時間的持続などの計測可能な値に言及するときの用語「約」は、指定される値から±２０％または一部の例では±１０％、または一部の例では±５％、または一部の例では±１％、または一部の例では±０．１％の変動を（かかる変動が本開示の方法の実施に適切であるものとして）包含することが意図される。
【０１６３】
用語「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答を引き起こす分子を指す。この免疫応答には、抗体産生、または特異的免疫適格細胞の活性化のいずれか、または両方が含まれ得る。当業者は、任意の巨大分子が、事実上あらゆるタンパク質またはペプチドを含めて、抗原となり得ることを理解するであろう。さらに、抗原は組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。当業者は、したがって免疫応答を生じさせるタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、その用語が本明細書において使用されるとおりの「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が、ある遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はないことを理解するであろう。本発明には、限定はされないが、２つ以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用が含まれること、およびこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を生じさせるポリペプチドをコードするように様々な組み合わせで配列されることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原は合成してもよく、もしくは生体試料から得てもよく、またはポリペプチド以外の巨大分子である可能性もあることは容易に明らかである。かかる生体試料には、限定はされないが、組織試料、細胞または他の生物学的成分を含む体液が含まれ得る。
【０１６４】
用語「自己由来」は、後にそれが再び導入されることになる同じ個体に由来する任意の材料を指す。
【０１６５】
用語「同種異系由来」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる動物に由来する任意の材料を指す。２つ以上の個体は、１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でないとき、互いに同種異系由来であると言われる。一部の態様において、同じ種の個体からの同種異系由来材料は、抗原として相互作用するのに遺伝的に十分に異なるものであり得る。
【０１６６】
用語「異種」は、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
【０１６７】
「〜に由来する」は、その用語が本明細書において使用されるとき、第１の分子と第２の分子との間の関係を示す。これは、概して、第１の分子と第２の分子との間の構造的類似性を指し、第２の分子に由来する第１の分子に対するプロセスまたは供給源の限定は含意または包含しない。
【０１６８】
用語「コードする」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなど、ポリヌクレオチド中の特異的ヌクレオチド配列が、定義付けられたヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）または定義付けられたアミノ酸配列のいずれかおよびそれから生じる生物学的特性を有する生物学的過程における他のポリマーおよび巨大分子の合成用鋳型としての役割を果たす固有の特性を指す。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳によって細胞または他の生物学的システムでタンパク質が産生される場合、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一で、通常配列表に提供されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写用鋳型として用いられる非コード鎖との両方が、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると称され得る。
【０１６９】
特記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を全て含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句には、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列が何らかのバージョンで１つまたは複数のイントロンを含み得る限りにおいて、イントロンも含まれ得る。
【０１７０】
用語「有効量」または「治療有効量」は、本明細書では同義的に使用され、本明細書に記載されるとおりの化合物、製剤、材料、または組成物が特定の生物学的結果を達成するのに有効な量を指す。
【０１７１】
用語「内因性」は、生物、細胞、組織または系由来のまたはその内部で産生される任意の材料を指す。
【０１７２】
用語「外因性」は、生物、細胞、組織または系の外側から導入されるかまたはその外側で産生される任意の材料を指す。
【０１７３】
用語「発現」は、プロモーターによってドライブされる特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。
【０１７４】
用語「トランスファーベクター」は、単離核酸を含む組成物であって、細胞の内部への単離核酸の送達に使用し得る組成物を指す。限定はされないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含め、多くのベクターが当該技術分野において公知である。したがって、用語「トランスファーベクター」には自己複製プラスミドまたはウイルスが含まれる。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなど、細胞への核酸のトランスファーを促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物をさらに含むものと解釈されなければならない。ウイルストランスファーベクターの例としては、限定はされないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられる。
【０１７５】
用語「発現ベクター」は、発現させるヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用エレメントを含む。他の発現用エレメントは宿主細胞によって供給するか、またはインビトロ発現系に供給することができる。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込むコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドまたはリポソームに含まれるもの）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含め、当該技術分野において公知のもの全てが含まれる。
【０１７６】
用語「相同」または「同一性」は、２つのポリマー分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子または２つのＲＮＡ分子など、２つの核酸分子間、または２つのポリペプチド分子間におけるサブユニットの配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットによって占有されるとき、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンによって占有される場合、それらはその位置で相同または同一である。２つの配列間の相同性は、一致する位置または相同な位置の数の直接の関数である。例えば、２つの配列における位置の半分（例えば、１０サブユニット長のポリマーにおける５個の位置）が相同である場合、それらの２つの配列は５０％相同である。位置の９０％（例えば、１０個中９個）が一致するかまたは相同である場合、それらの２つの配列は９０％相同である。
【０１７７】
用語「単離されている」は、自然状態から改変されているかまたは取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離されている」のではないが、その自然状態の共存する材料から部分的または完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離されている」。単離核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または例えば宿主細胞など、非天然環境中に存在することができる。
【０１７８】
用語「作動可能に連結された」または「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列との間における後者の発現をもたらす機能的な連結を指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的に関係した状態に置かれているとき、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されるＤＮＡ配列は互いに隣接していてもよく、例えば２つのタンパク質コード領域をつなぎ合わせる必要がある場合、同じリーディングフレーム内にある。
【０１７９】
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または胸骨内注射、腫瘍内、または注入技法を含む。
【０１８０】
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）およびそのポリマーを指す。具体的に限定しない限り、この用語には、参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと同じように代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸が包含される。特に指示されない限り、ある詳細な核酸配列がまた、黙示的に、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、および相補配列ならびに明示的に指示される配列も包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択の（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作成することによって達成し得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【０１８１】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は同義的に使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結したアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列またはペプチドの配列を含むことのできるアミノ酸の最大数に制限は課されない。ポリペプチドは、互いにペプチド結合によってつなぎ合わされた２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用されるとき、この用語は、当該技術分野では、一般に例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される短鎖と、当該技術分野では概してタンパク質と称される、多数の種類があるより長い鎖との両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が特に含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、またはこれらの組み合わせが含まれる。
【０１８２】
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始させるのに必要である、細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。
【０１８３】
用語「プロモーター／調節配列」は、そのプロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を指す。一部の例では、この配列はコアプロモーター配列であってもよく、他の場合、この配列は、エンハンサー配列および遺伝子産物の発現に必要な他の調節エレメントも含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、遺伝子産物を組織特異的に発現するものであり得る。
【０１８４】
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたはそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、細胞のほとんどまたは全ての生理条件下で細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
【０１８５】
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードするかまたはそれを指定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的にプロモーターに対応する誘発物質が細胞に存在する場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
【０１８６】
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子をコードするかまたはそれによって指定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結されているとき、実質的に細胞がプロモーターに対応する組織型の細胞である場合に限り細胞において遺伝子産物の産生を生じさせるヌクレオチド配列を指す。
【０１８７】
本明細書でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に関連して使用されるとき、５’キャップ（ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７−メチルグアノシンキャップまたはＲＮＡ  ｍ７Ｇキャップとも称される）は、転写開始直後に真核生物メッセンジャーＲＮＡの「前」または５’末端に付加された修飾グアニンヌクレオチドである。５’キャップは、１番目の転写ヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識およびＲＮアーゼからの保護に重要である。キャップ付加は転写と結び付いており、それぞれが他方に影響を与えるようにして同時転写的に起こる。転写開始直後、合成されるｍＲＮＡの５’末端に、ＲＮＡポリメラーゼに関連するキャップ合成複合体が結合する。この酵素複合体が、ｍＲＮＡキャッピングに必要な化学反応を触媒する。合成は多段階生化学反応として進行する。キャッピング部分は、ｍＲＮＡのその安定性または翻訳効率などの機能を調整するため修飾することができる。
【０１８８】
本明細書で使用されるとき、「インビトロ転写ＲＮＡ」は、インビトロ合成されたＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡを指す。概して、インビトロ転写ＲＮＡはインビトロ転写ベクターから作成される。インビトロ転写ベクターは、インビトロ転写ＲＮＡの作成に使用される鋳型を含む。
【０１８９】
本明細書で使用されるとき、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに付加される一連のアデノシンである。一過性発現用のコンストラクトの好ましい実施形態において、ポリＡは５０〜５０００（配列番号６５９６）、好ましくは６４より多く、より好ましくは１００より多く、最も好ましくは３００または４００より多い。ポリ（Ａ）配列は、局在性、安定性または翻訳効率などのｍＲＮＡ機能を調整するために化学的または酵素的に修飾することができる。
【０１９０】
本明細書で使用されるとき、「ポリアデニル化」は、メッセンジャーＲＮＡ分子へのポリアデニリル部分またはその修飾変異体の共有結合を指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子が３’末端でポリアデニル化される。３’ポリ（Ａ）テールは、酵素、ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用によってｍＲＮＡ前駆体に付加されるアデニンヌクレオチドの長い配列（多くの場合に数百個）である。高等真核生物では、ポリ（Ａ）テールは、特異的配列、ポリアデニル化シグナルを含有する転写物に付加される。ポリ（Ａ）テールおよびそれに結合したタンパク質は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼによる分解から保護するのに役立つ。ポリアデニル化は、転写終結、核からのｍＲＮＡの搬出、および翻訳にも重要である。ポリアデニル化はＤＮＡからＲＮＡへの転写直後に核内で起こるが、さらに後に細胞質でも起こり得る。転写が終了した後、ＲＮＡポリメラーゼに関連するエンドヌクレアーゼ複合体の作用によってｍＲＮＡ鎖が切断される。切断部位は、通常、切断部位近傍の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在によって特徴付けられる。ｍＲＮＡが切断された後、切断部位の遊離３’末端にアデノシン残基が付加される。
【０１９１】
本明細書で使用されるとき、「一過性」は、数時間、数日間または数週間の期間にわたる組み込まれないトランス遺伝子の発現を指し、この発現期間は、宿主細胞のゲノムに組み込まれた場合または安定プラスミドレプリコンの中に含まれている場合の遺伝子の発現期間よりも短い。
【０１９２】
本明細書で使用されるとき、用語「治療する」、「治療」および「治療している」は、１つ以上の療法（例えば、本発明のｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲシステム、または修飾細胞など、１つ以上の療法剤）の投与によってもたらされる障害、例えば異常ヘモグロビン症の進行、重症度および／または持続期間の低減または改善、または障害、例えば異常ヘモグロビン症の１つ以上の症状（好ましくは、１つ以上の認識し得る症状）の改善を指す。具体的な実施形態において、用語「治療する」、「治療」および「治療している」は、患者には認識できない、異常ヘモグロビン症障害の少なくとも１つの計測可能な理学的パラメータの改善を指す。他の実施形態において、用語「治療する」、「治療」および「治療している」は、障害の進行の物理的な、例えば認識し得る症状の安定化による阻害、生理学的な、例えば理学的パラメータの安定化による阻害のいずれか、または両方を指す。他の実施形態において、用語「治療する」、「治療」および「治療している」は、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球症またはβ−サラセミアの症状の低減または安定化を指す。
【０１９３】
用語「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達において役割を果たす種々のシグナル伝達分子間の生化学的関係を指す。語句「細胞表面受容体」は、シグナルを受け取り、細胞の膜を越えてシグナルを伝える分子および分子複合体を含む。
【０１９４】
用語「対象」は、免疫応答を生じさせることのできる生きている生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を含むことが意図される。
【０１９５】
用語の「実質的に精製された」細胞は、他の細胞型を本質的に含まない細胞を指す。実質的に精製された細胞とは、その天然に存在する状態でそれが通常結び付いている他の細胞型と分離されている細胞も指す。一部の例では、実質的に精製された細胞の集団とは、均質な細胞の集団を指す。他の例では、この用語は単に、その自然状態でそれが天然に結び付いている細胞から分離されている細胞を指す。一部の態様において、これらの細胞はインビトロで培養される。他の態様において、これら細胞はインビトロで培養されない。
【０１９６】
用語「療法的」とは、本明細書で使用されるとき、治療を意味する。療法的効果は疾患状態の低減、抑制、寛解、または根絶によって達成される。
【０１９７】
用語「予防」とは、本明細書で使用されるときに疾患または疾患状態の予防または防御的治療を意味する。
【０１９８】
用語「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」は、外因性核酸および／またはタンパク質を宿主細胞に移入させるかまたは導入するプロセスを指す。「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸および／またはタンパク質をトランスフェクトされた、形質転換された、または形質導入されたものである。細胞には初代対象細胞およびその子孫が含まれる。
【０１９９】
用語「特異的に結合する」は、試料中に存在する結合パートナー（例えば、タンパク質または核酸）を認識してそれと結合する分子であって、しかし試料中の他の分子を実質的に認識または結合しない分子を指す。
【０２００】
用語「生物学的に均等」は、参照用量または参照量の参照化合物によって生じる効果と均等な効果を生じさせるのに必要な量の参照化合物以外の薬剤を指す。
【０２０１】
「不応性」は、本明細書で使用されるとき、治療に応答しない疾患、例えば異常ヘモグロビン症を指す。実施形態において、不応性異常ヘモグロビン症は治療の開始前または開始時点で治療に抵抗性であり得る。他の実施形態において、不応性異常ヘモグロビン症は治療中に抵抗性になり得る。不応性異常ヘモグロビン症は抵抗性異常ヘモグロビン症とも称される。
【０２０２】
「再発性」は、本明細書で使用されるとき、改善期間後、例えば、ある療法、例えば異常ヘモグロビン症療法の先行治療後に異常ヘモグロビン症などの疾患（例えば、異常ヘモグロビン症）または疾患の徴候および症状が再来することを指す。
【０２０３】
範囲：本開示全体を通じて、本発明の様々な態様が範囲の形式で提示され得る。範囲の形式による記載は単に便宜上のものであり、簡潔にするために過ぎないことが理解されなければならず、本発明の範囲を柔軟性なく限定するものと解釈されてはならない。したがって、範囲の記載は、あらゆる可能な部分的範囲ならびにその範囲内にある個々の数値を具体的に開示したものと見なされなければならない。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分的範囲、ならびにその範囲内にある個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、および６を具体的に開示したものと見なされなければならない。別の例として、９５〜９９％の同一性のような範囲には、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するあるものが含まれ、および９６〜９９％、９６〜９８％、９６〜９７％、９７〜９９％、９７〜９８％および９８〜９９％の同一性などの部分的範囲が含まれる。これは範囲の広さとは無関係に適用される。
【０２０４】
用語「ＢＣＬ１１ａ」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩコアプロモーター近接領域配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質であるＢ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ、および前記タンパク質をコードする遺伝子を、全てのイントロンおよびエクソンと共に指す。この遺伝子はＣ２Ｈ２型ジンクフィンガータンパク質をコードする。ＢＣＬ１１Ａは、胎児ヘモグロビン産生の抑制において役割を果たすことが分かっている。ＢＣＬ１１ａは、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａ（ジンクフィンガータンパク質）、ＣＴＩＰ１、ＥＶＩ９、エコトロピックウイルス組込み部位９タンパク質ホモログ、ＣＯＵＰ−ＴＦ相互作用タンパク質１、ジンクフィンガータンパク質８５６、ＫＩＡＡ１８０９、ＢＣＬ−１１Ａ、ＺＮＦ８５６、ＥＶＩ−９、およびＢ細胞ＣＬＬ／リンパ腫１１Ａとしても知られる。この用語にはＢＣＬ１１ａのあらゆるアイソフォームおよびスプライス変異体が包含される。ＢＣＬ１１ａをコードするヒト遺伝子は染色体位置２ｐ１６．１にマッピングされる（Ｅｎｓｅｍｂｌによる）。ヒトおよびマウスアミノ酸および核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔおよびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔなどの公開データベースを参照することができ、およびヒトＢＣＬ１１ａのゲノム配列はＧｅｎＢａｎｋにおいてＮＣ＿０００００２．１２を参照することができる。ＢＣＬ１１ａ遺伝子は、全てのイントロンおよびエクソンを含め、このゲノム位置を指す。ＢＣＬ１１ａには複数の既知のアイソタイプがある。
【０２０５】
ヒトＢＣＬ１１ａのアイソフォーム１をコードするｍＲＮＡの配列はＮＭ＿０２２８９３を参照することができる。
【０２０６】
ヒトＢＣＬ１１ａのアイソフォーム１のペプチド配列は以下である。
【化１】
2019500043.tif 000003
【０２０７】
他のＢＣＬ１１ａタンパク質アイソフォームの配列は以下に提供される。
アイソフォーム２：Ｑ９Ｈ１６５−２
アイソフォーム３：Ｑ９Ｈ１６５−３
アイソフォーム４：Ｑ９Ｈ１６５−４
アイソフォーム５：Ｑ９Ｈ１６５−５
アイソフォーム６：Ｑ９Ｈ１６５−６
【０２０８】
本明細書で使用されるとき、ヒトＢＣＬ１１ａタンパク質には、その完全長にわたってＢＣＬ１１ａアイソフォーム１〜６と少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するタンパク質も包含され、ここで、かかるタンパク質はなおもＢＣＬ１１ａの機能の少なくとも１つを有する。
【０２０９】
用語「グロビン遺伝子座」は、本明細書で使用されるとき、胚（ε）、胎児（Ｇ（γ）およびＡ（γ））、成人グロビン遺伝子（γおよびβ）、遺伝子座制御領域およびＤＮアーゼＩ高感受性部位の遺伝子を含むヒト１１番染色体の領域を指す。
【０２１０】
用語「相補的」は、核酸に関連して使用されるとき、ＡとＴまたはＵ、およびＧとＣの塩基の対合を指す。相補的という用語は、完全に相補的である、すなわち参照配列全体にわたってＡがＴまたはＵと対を形成し、およびＧがＣと対を形成する核酸分子、ならびに少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％相補的な分子を指す。
【０２１１】
用語「ＨＰＦＨ」は遺伝性高胎児ヘモグロビン血症を指し、成人赤血球細胞における胎児ヘモグロビンの増加を特徴とする。用語「ＨＰＦＨ領域」は、修飾されると（例えば、突然変異または欠失すると）成人赤血球細胞におけるＨｂＦ産生の増加を引き起こすゲノム部位を指し、文献に同定されているＨＰＦＨ部位が含まれる（例えば、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／１４１７４９を参照されたい）。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、１１番染色体ｐ１５上のβグロビン遺伝子クラスター内にあるかまたはそれを包含する領域である。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、δグロビン遺伝子の少なくとも一部の範囲内にあるかまたはそれを包含する。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、ＨＢＧ１のプロモーターの領域である。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、ＨＢＧ１のプロモーターの領域である。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ  ＶＧ  ｅｔ  ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載される領域である。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ  ＶＧ  ｅｔ  ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載されるとおりのフランス型ブレイクポイント欠失ＨＰＦＨである。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ  ＶＧ  ｅｔ  ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載されるとおりのアルジェリア型ＨＰＦＨである。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ  ＶＧ  ｅｔ  ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載されるとおりのスリランカ型ＨＰＦＨである。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ  ＶＧ  ｅｔ  ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載されるとおりのＨＰＦＨ−３である。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ  ＶＧ  ｅｔ  ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載されるとおりのＨＰＦＨ−２である。ある実施形態において、ＨＰＦＨ−１領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ  ＶＧ  ｅｔ  ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載されるとおりのＨＰＦＨ−３である。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ  ＶＧ  ｅｔ  ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載されるとおりのスリランカ型（δβ）０−サラセミアＨＰＦＨである。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ  ＶＧ  ｅｔ  ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載されるとおりのシチリア型（δβ）０−サラセミアＨＰＦＨである。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ  ＶＧ  ｅｔ  ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載されるとおりのマケドニア型（δβ）０−サラセミアＨＰＦＨである。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ  ＶＧ  ｅｔ  ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載されるとおりのクルド型β０−サラセミアＨＰＦＨである。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領���は、Ｃｈｒ１１：５２１３８７４〜５２１４４００（ｈｇ１８）に位置する領域である。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｃｈｒ１１：５２１５９４３〜５２１５０４６（ｈｇ１８）に位置する領域である。例示的実施形態において、ＨＰＦＨ領域は、Ｃｈｒ１１：５２３４３９０〜５２３８４８６（ｈｇ３８）に位置する領域である。
【０２１２】
「ＢＣＬ１１ａエンハンサー」は、本明細書においてこの用語が使用されるとき、ＢＣＬ１１ａの発現または機能に影響を及ぼす、例えばそれを増進させる核酸配列を指す。例えば、Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．３４２，２０１３，ｐｐ．２５３−２５７を参照されたい。ＢＣＬ１１ａエンハンサーは、例えば、ある種の細胞型、例えば赤血球系統の細胞においてのみ作用することが可能であり得る。ＢＣＬ１１ａエンハンサーの一例は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間の核酸配列（例えば、ｈｇ３８に記録されているとおりの位置＋５５：Ｃｈｒ２：６０４９７６７６〜６０４９８９４１；＋５８：Ｃｈｒ２：６０４９４２５１〜６０４９５５４６；＋６２：Ｃｈｒ２：６０４９０４０９〜６０４９１７３４にあるかまたはそれに対応する核酸）である。ある実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間にある核酸配列の＋６２領域である。ある実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間にある核酸配列の＋５８領域である。ある実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーは、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のエクソン２とエクソン３との間にある核酸配列の＋５５領域である。
【０２１３】
用語「造血幹細胞・前駆細胞」または「ＨＳＰＣ」は同義的に使用され、造血幹細胞（「ＨＳＣ」）および造血前駆細胞（「ＨＰＣ」）の両方を含む細胞の集団を指す。かかる細胞は、例えばＣＤ３４＋として特徴付けられる。例示的実施形態において、ＨＳＰＣは骨髄から単離されたものである。他の例示的実施形態において、ＨＳＰＣは末梢血から単離されたものである。他の例示的実施形態において、ＨＳＰＣは臍帯血から単離されたものである。
【０２１４】
「幹細胞増殖剤」は、本明細書で使用されるとき、細胞、例えば、ＨＳＰＣ、ＨＳＣおよび／またはＨＰＣを、前記薬剤がない同じ細胞型と比べて速い速度で増殖させる、例えば数を増加させる化合物を指す。例示的な一態様において、幹細胞増殖剤はアリール炭化水素受容体経路の阻害剤である。幹細胞増殖剤のさらなる例は以下に提供する。実施形態において、増殖、例えば数の増加はエキソビボで達成される。
【０２１５】
「生着」または「生着する」は、レシピエント、例えば哺乳動物またはヒト対象の体内への細胞または組織、例えばＨＳＰＣの集団の取込みを指す。一例において、生着は、レシピエントにおける生着細胞の成長、増殖および／または分化を含む。一例では、ＨＳＰＣの生着は、レシピエントの体内における前記ＨＳＰＣの赤血球系細胞への分化および成長を含む。
【０２１６】
用語「造血前駆細胞」（ＨＰＣ）は、本明細書で使用されるとき、自己複製能が限られた、かつ造血ヒエラルキー内における位置に応じて多系統分化（例えば、骨髄、リンパ）、単系統分化（例えば、骨髄またはリンパ）または細胞型限定的分化（例えば、赤血球系前駆細胞）の潜在的能力を有する原始的な造血細胞を指す（Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２０１２）。
【０２１７】
「造血幹細胞」（ＨＳＣ）は、本明細書で使用されるとき、自己複製して、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網赤血球、赤血球）、栓球（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、および単球（例えば、単球、マクロファージ）を含むより成熟した血球細胞に分化する能力を有する未熟血球細胞を指す。本明細書全体を通じてＨＳＣは幹細胞と同義的に記載される。当該技術分野において、かかる細胞はＣＤ３４＋細胞を含むこともまたは含まないこともあることは公知である。ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４細胞表面マーカーを発現する未熟細胞である。ＣＤ３４＋細胞は、上記に定義した幹細胞特性を有する細胞のサブ集団を占めると考えられる。ＨＳＣが、原始的前駆細胞（例えば、多能性前駆細胞）および／または特異的造血系統（例えば、リンパ球前駆細胞）にコミットした前駆細胞を生じさせることができる多能性細胞であることは当該技術分野において周知である。特異的造血系統にコミットした幹細胞は、Ｔ細胞系統、Ｂ細胞系統、樹状細胞系統、ランゲルハンス細胞系統および／またはリンパ系組織特異的マクロファージ細胞系統のものであり得る。加えて、ＨＳＣはまた、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）および短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）も指す。ＳＴ−ＨＳＣはＬＴ−ＨＳＣよりも高活性かつ高増殖性である。しかしながら、ＬＴ−ＨＳＣは無制限の自己複製を有し（すなわち、これは成人期を通して生存する）、一方、ＳＴ−ＨＳＣは自己複製が限られている（すなわち、これは限られた期間のみ生存する）。本明細書に記載される方法のいずれにおいても、これらのＨＳＣのいずれを使用することもできる。ＳＴ−ＨＳＣは高増殖性で、したがってＨＳＣおよびその子孫の数が急速に増加するため、任意選択でＳＴ−ＨＳＣが有用である。造血幹細胞は、任意選択で血液製剤から入手される。血液製剤には、造血起源の細胞を含む身体または身体の臓器から得られた製剤が含まれる。かかる供給源には、未分画骨髄、臍帯、末梢血（例えば、動員末梢血、例えば、Ｇ−ＣＳＦまたはＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）などの動員剤で動員したもの）、肝臓、胸腺、リンパおよび脾臓が含まれる。前述の粗製または未分画血液製剤は全て、造血幹細胞特徴を有する細胞を当業者に公知の方法で富化することができる。ある実施形態において、ＨＳＣはＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−として特徴付けられる。実施形態において、ＨＳＣはＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋細胞として特徴付けられる。
【０２１８】
細胞との関連において「増殖」または「増殖する」は、同じであってもまたは同じでなくてもよい細胞の初期細胞集団からの１つまたは複数の特徴的細胞型の数の増加を指す。増殖に使用される初期細胞は、増殖によって生じる細胞と同じでなくてもよい。
【０２１９】
「細胞集団」は、生物学的供給源、例えば血液製剤または組織から単離された、かつ２つ以上の細胞に由来する真核生物哺乳動物、好ましくはヒトの細胞を指す。
【０２２０】
「富化された」は、細胞集団との関連で使用されるとき、１つ以上のマーカー、例えばＣＤ３４＋の存在に基づき選択された細胞集団を指す。
【０２２１】
用語「ＣＤ３４＋細胞」は、その表面にＣＤ３４マーカーを発現する細胞を指す。ＣＤ３４＋細胞は、例えばフローサイトメトリーおよび蛍光標識抗ＣＤ３４抗体を用いて検出およびカウントすることができる。
【０２２２】
「ＣＤ３４＋細胞が富化された」は、細胞集団がＣＤ３４マーカーの存在に基づき選択されていることを意味する。したがって、選択方法後の細胞集団中のＣＤ３４＋細胞のパーセンテージは、ＣＤ３４マーカーに基づく選択ステップ前の初期細胞集団中のＣＤ３４＋細胞のパーセンテージよりも高い。例えば、ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４＋細胞を富化した細胞集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または少なくとも９０％を占め得る。
【０２２３】
用語「Ｆ細胞」および「Ｆ−細胞」は、胎児ヘモグロビンを含有および／または産生する（例えば、発現する）細胞、通常、赤血球（例えば、赤血球細胞）を指す。例えば、Ｆ−細胞は、検出可能なレベルの胎児ヘモグロビンを含有または産生する細胞である。例えば、Ｆ−細胞は、少なくとも５ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含有または産生する細胞である。別の例において、Ｆ−細胞は、少なくとも６ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含有または産生する細胞である。別の例において、Ｆ−細胞は、少なくとも７ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含有または産生する細胞である。別の例において、Ｆ−細胞は、少なくとも８ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含有または産生する細胞である。別の例において、Ｆ−細胞は、少なくとも９ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含有または産生する細胞である。別の例において、Ｆ−細胞は、少なくとも１０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを含有または産生する細胞である。胎児ヘモグロビンのレベルは、本明細書に記載されるアッセイを用いるか、または当該技術分野において公知の他の方法、例えば抗胎児ヘモグロビン検出試薬を用いたフローサイトメトリー、高速液体クロマトグラフィー、質量分析法、または酵素結合免疫吸着アッセイにより計測し得る。
【０２２４】
特に指定されない限り、全てのゲノムまたは染色体座標はｈｇ３８に基づく。
【０２２５】
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、組成物および方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いた真核細胞におけるゲノム編集に関する。詳細には、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、組成物および方法は、グロビンレベルの調節に関し、例えば、グロビン遺伝子およびタンパク質の発現および産生の調節において有用である。本ｇＲＮＡ分子、組成物および方法は、異常ヘモグロビン症の治療において有用であり得る。
【０２２６】
Ｉ．ｇＲＮＡ分子
ｇＲＮＡ分子は、以下にさらに詳しく記載するとおり幾つものドメインを有し得るが、しかしながら、ｇＲＮＡ分子は、典型的には、少なくともｃｒＲＮＡドメイン（標的化ドメインを含む）とｔｒａｃｒとを含む。ＣＲＩＳＰＲシステムの一成分として使用される本発明のｇＲＮＡ分子は、標的部位にまたはその近傍にあるＤＮＡの修飾（例えば、配列の修飾）に有用である。かかる修飾には、例えば標的部位を含む遺伝子の機能性産物の発現の低下または消失をもたらす欠失および／または挿入が含まれる。これらの使用およびさらなる使用について、以下にさらに詳しく説明する。
【０２２７】
ある実施形態では、単分子の、すなわちｓｇＲＮＡが、好ましくは５’から３’に、ｃｒＲＮＡ（標的配列と相補的な標的化ドメインおよびフラッグポールの一部を形成する領域（すなわち、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域）を含有する）；ループ；およびｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡフラッグポール領域と相補的なドメイン、およびヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子、例えばＣａｓ分子、例えばＣａｓ９分子をさらに結合するドメインを含有する）を含み、以下のフォーマットをとり得る（５’から３’に）：
［標的化ドメイン］−［ｃｒＲＮＡフラッグポール領域］−［任意選択の第１のフラッグポール伸長部］−［ループ］−［任意選択の第１のｔｒａｃｒ伸長部］−［ｔｒａｃｒフラッグポール領域］−［ｔｒａｃｒヌクレアーゼ結合ドメイン］。
【０２２８】
実施形態において、ｔｒａｃｒヌクレアーゼ結合ドメインはＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質に結合する。
【０２２９】
ある実施形態では、二分子の、すなわちｄｇＲＮＡが、２つのポリヌクレオチド；第１のポリヌクレオチド、好ましくは５’から３’に、ｃｒＲＮＡ（標的配列と相補的な標的化ドメインおよびフラッグポールの一部を形成する領域を含有し；および第２のポリヌクレオチド、好ましくは５’から３’に、ｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡフラッグポール領域と相補的なドメイン、およびヌクレアーゼまたは他のエフェクター分子、例えばＣａｓ分子、例えばＣａｓ９分子をさらに結合するドメインを含有する）を含み、以下のフォーマットをとり得る（５’から３’に）：
ポリヌクレオチド１（ｃｒＲＮＡ）：［標的化ドメイン］−［ｃｒＲＮＡフラッグポール領域］−［任意選択の第１のフラッグポール伸長部］−［任意選択の第２のフラッグポール伸長部］
ポリヌクレオチド２（ｔｒａｃｒ）：［任意選択の第１のｔｒａｃｒ伸長部］−［ｔｒａｃｒフラッグポール領域］−［ｔｒａｃｒヌクレアーゼ結合ドメイン］。
【０２３０】
実施形態において、ｔｒａｃｒヌクレアーゼ結合ドメインはＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質に結合する。
【０２３１】
一部の態様において、標的化ドメインは、本明細書に記載される標的化ドメイン配列、例えば、表１、表２、表３、表４、表５、または表６に記載される標的化ドメイン、または表１、表２、表３、表４、表５、または表６に記載される標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個（好ましくは２０個）の連続するヌクレオチドを含むかまたはそれからなる標的化ドメインを含むかまたはそれからなる。
【０２３２】
一部の態様において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、５’から３’に、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号６５８４）を含む。
【０２３３】
一部の態様において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、５’から３’に、ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号６５８５）を含む。
【０２３４】
一部の態様においてループは、５’から３’に、ＧＡＡＡ（配列番号６５８８）を含む。
【０２３５】
一部の態様においてｔｒａｃｒは、５’から３’に、
【化２】
2019500043.tif 000004
を含み、好ましくは配列番号６５８４を含むｇＲＮＡ分子に使用される。
【０２３６】
一部の態様においてｔｒａｃｒは、５’から３’に、
【化３】
2019500043.tif 000005
を含み、好ましくは配列番号６５８５を含むｇＲＮＡ分子に使用される。
【０２３７】
一部の態様において、ｇＲＮＡは、３’末端に追加的なＵ核酸も含み得る。例えば、ｇＲＮＡは、３’末端に追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＵ核酸を含み得る。ある実施形態において、ｇＲＮＡは３’末端に追加的な４個のＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に追加的なＵ核酸を含み得る。例えば、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＵ核酸を含み得る。ある実施形態において、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に追加的な４個のＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、ｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドのみが追加的なＵ核酸、例えば４個のＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドのみが追加的なＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドの両方が追加的なＵ核酸、例えば４個のＵ核酸を含む。
【０２３８】
一部の態様において、ｇＲＮＡは、３’末端に追加的なＡ核酸も含み得る。例えば、ｇＲＮＡは、３’末端に追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＡ核酸を含み得る。ある実施形態において、ｇＲＮＡは３’末端に追加的な４個のＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に追加的なＡ核酸を含み得る。例えば、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＡ核酸を含み得る。ある実施形態において、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチド（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の１つ以上が３’末端に追加的な４個のＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、ｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドのみが追加的なＡ核酸、例えば４個のＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドのみが追加的なＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの実施形態において、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドおよびｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドの両方が追加的なＵ核酸、例えば４個のＡ核酸を含む。
【０２３９】
実施形態において、ｇＲＮＡ分子のポリヌクレオチドの１つ以上が５’末端にキャップを含み得る。
【０２４０】
ある実施形態において、単分子の、すなわちｓｇＲＮＡが、好ましくは５’から３’に、ｃｒＲＮＡ（標的配列と相補的な標的化ドメインを含有する；ｃｒＲＮＡフラッグポール領域；第１のフラッグポール伸長部；ループ；第１のｔｒａｃｒ伸長部（第１のフラッグポール伸長部の少なくとも一部分と相補的なドメインを含有する）；およびｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡフラッグポール領域と相補的なドメイン、およびＣａｓ９分子をさらに結合するドメインを含有する）を含む。一部の態様において、標的化ドメインは、本明細書に記載される標的化ドメイン配列、例えば、表１、表２、表３、表４、表５、または表６に記載される標的化ドメイン、または表１、表２、表３、表４、表５、または表６に記載される標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個（好ましくは２０個）の連続するヌクレオチド、例えば、表１、表２、表３、表４、表５、または表６に記載される標的化ドメイン配列の３’側の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個（好ましくは２０個）の連続するヌクレオチドを含むかまたはそれからなる標的化ドメインを含む。
【０２４１】
第１のフラッグポール伸長部および／または第１のｔｒａｃｒ伸長部を含む態様において、フラッグポール、ループおよびｔｒａｃｒ配列は上記に記載したとおりであり得る。一般に任意の第１のフラッグポール伸長部および第１のｔｒａｃｒ伸長部を用いることができ、但しそれらは相補的であるものとする。実施形態において、第１のフラッグポール伸長部および第１のｔｒａｃｒ伸長部は、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超える相補ヌクレオチドからなる。
【０２４２】
一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部は、５’から３’に、ＵＧＣＵＧ（配列番号６５８６）を含む。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部は配列番号６５８６からなる。
【０２４３】
一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、５’から３’に、ＣＡＧＣＡ（配列番号６５９１）を含む。一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部は配列番号６５９１からなる。
【０２４４】
ある実施形態において、ｄｇＲＮＡは２つの核酸分子を含む。一部の態様において、ｄｇＲＮＡは、好ましくは５’から３’に、標的配列と相補的な標的化ドメイン；ｃｒＲＮＡフラッグポール領域；任意選択で第１のフラッグポール伸長部；および任意選択で第２のフラッグポール伸長部を含有する第１の核酸と；好ましくは５’から３’に、任意選択で第１のｔｒａｃｒ伸長部；およびｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡフラッグポール領域と相補的なドメイン、およびＣａｓ、例えばＣａｓ９分子をさらに結合するドメインを含有する）を含む第２の核酸（本明細書ではｔｒａｃｒと称され得る）、および少なくとも、Ｃａｓ分子、例えばＣａｓ９分子を結合するドメインを含む）とを含む。第２の核酸は、加えて、３’末端に（例えば、ｔｒａｃｒの３’側に）追加的なＵ核酸を含み得る。例えば、ｔｒａｃｒは、３’末端に（例えば、ｔｒａｃｒの３’側に）追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＵ核酸を含み得る。第２の核酸は、加えてまたは代わりに、３’末端に（例えば、ｔｒａｃｒの３’側に）追加的なＡ核酸を含み得る。例えば、ｔｒａｃｒは、３’末端に（例えば、ｔｒａｃｒの３’側に）追加的な１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のＡ核酸を含み得る。一部の態様において、標的化ドメインは、本明細書に記載される標的化ドメイン配列、例えば、表１、表２、表３、表４、表５、または表６に記載される標的化ドメイン、または表１、表２、表３、表４、表５、または表６に記載される標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個（好ましくは２０個）の連続するヌクレオチドを含むかまたはそれからなる標的化ドメインを含む。
【０２４５】
ｄｇＲＮＡが関わる態様において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域、任意選択の第１のフラッグポール伸長部、任意選択の第１のｔｒａｃｒ伸長部およびｔｒａｃｒ配列は上記に記載したとおりであり得る。
【０２４６】
一部の態様において、任意選択の第２のフラッグポール伸長部は、５’から３’に、ＵＵＵＵＧ（配列番号６５８７）を含む。
【０２４７】
実施形態において、ｇＲＮＡ分子（およびｄｇＲＮＡ分子の場合、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドおよび／またはｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）の３’側の１、２、３、４、または５ヌクレオチド、５’側の１、２、３、４、または５ヌクレオチド、または３’側および５’側の両方の１、２、３、４、または５ヌクレオチドは、以下の第ＸＩＩＩ節にさらに詳しく説明するとおり、修飾核酸である。
【０２４８】
これらのドメインについて以下に手短に考察する：
１）標的化ドメイン：
標的化ドメインの選択に関する指針については、例えば、Ｆｕ  Ｙ  ｅｌ  ａｌ．ＮＡＴ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ  ２０１４（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８）およびＳｔｅｒｎｂｅｒｇ  ＳＨ  ｅｌ  ａｌ．ＮＡＴＵＲＥ  ２０１４（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅｌ３０１１）を参照することができる。
【０２４９】
標的化ドメインは、標的核酸上の標的配列と相補的、例えば、少なくとも８０、８５、９０、９５、または９９％相補的、例えば完全に相補的なヌクレオチド配列を含む。標的化ドメインはＲＮＡ分子の一部であり、したがって塩基ウラシル（Ｕ）を含むことになり、一方、ｇＲＮＡ分子をコードする任意のＤＮＡは塩基チミン（Ｔ）を含むことになる。理論によって拘束されることを望むものではないが、標的配列との標的化ドメインの相補性は、標的核酸とのｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の相互作用の特異性に寄与すると考えられる。標的化ドメインと標的配列との対において、標的化ドメイン中のウラシル塩基は標的配列中のアデニン塩基と対合し得ることが理解される。
【０２５０】
ある実施形態において、標的化ドメインは、５〜５０、例えば１０〜４０、例えば１０〜３０、例えば１５〜３０、例えば１５〜２５ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは１６ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは１７ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは１８ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは１９ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは２０ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは２１ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは２２ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは２３ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは２４ヌクレオチド長である。ある実施形態において、標的化ドメインは２５ヌクレオチド長である。実施形態において、前述の１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドは、表１、表２、表３、表４、表５、または表６に記載される標的化ドメインからの５’−１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドを含む。実施形態において、前述の１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドは、表１、表２、表３、表４、表５、または表６に記載される標的化ドメインからの３’−１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドを含む。
【０２５１】
理論によって拘束されるものではないが、標的化ドメインの３’末端に配置された標的化ドメインの８、９、１０、１１または１２個の核酸が標的配列のターゲティングに重要であると考えられ、したがって標的化ドメインの「コア」領域と称され得る。ある実施形態において、コアドメインは標的配列に完全に相補的である。
【０２５２】
標的化ドメインが相補的である標的核酸の鎖が、本明細書では標的配列と称される。一部の態様において、標的配列は染色体上に配置され、例えば遺伝子内の標的である。一部の態様において標的配列は遺伝子のエクソン内に配置される。一部の態様において標的配列は遺伝子のイントロン内に配置される。一部の態様において、標的配列は、目的の遺伝子の調節エレメントの結合部位、例えばプロモーターまたは転写因子結合部位を含むかまたはそれに近接している（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、または１０００核酸以内にある）。ドメインのヌクレオチドの一部または全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節に掲載される修飾を有し得る。
【０２５３】
２）ｃｒＲＮＡフラッグポール領域：
フラッグポールは、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒの両方からの一部分を含む。ｃｒＲＮＡフラッグポール領域はｔｒａｃｒの一部分に相補的であり、ある実施形態では、少なくとも一部の生理条件下、例えば通常の生理条件下で二重鎖化した領域を形成するのに十分なｔｒａｃｒの一部分との相補性を有する。ある実施形態において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域は５〜３０ヌクレオチド長である。ある実施形態において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域は５〜２５ヌクレオチド長である。ｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、細菌ＣＲＩＳＰＲアレイからのリピート配列の天然に存在する一部分と相同性を共有するかまたはそれに由来し得る。ある実施形態において、これは本明細書に開示されるｃｒＲＮＡフラッグポール領域、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ｃｒＲＮＡフラッグポール領域と少なくとも５０％の相同性を有する。
【０２５４】
ある実施形態において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号６５８４を含む。ある実施形態において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号６５８４と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の相同性を有する配列を含む。ある実施形態において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号６５８４の少なくとも５、６、７、８、９、１０、または１１ヌクレオチドを含む。ある実施形態において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号６５８５を含む。ある実施形態において、フラッグポールは、配列番号６５８５と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の相同性を有する配列を含む。ある実施形態において、フラッグポール、例えばｃｒＲＮＡフラッグポール領域は、配列番号６５８５の少なくとも５、６、７、８、９、１０、または１１ヌクレオチドを含む。
【０２５５】
ドメインのヌクレオチドの一部または全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節に記載される修飾を有し得る。
【０２５６】
３）第１のフラッグポール伸長部
第１のｔｒａｃｒ伸長部を含むｔｒａｃｒが使用されるとき、ｃｒＲＮＡは第１のフラッグポール伸長部を含み得る。一般に任意の第１のフラッグポール伸長部および第１のｔｒａｃｒ伸長部を用いることができ、但しそれらは相補的であるものとする。実施形態において、第１のフラッグポール伸長部および第１のｔｒａｃｒ伸長部は、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超える相補ヌクレオチドからなる。
【０２５７】
第１のフラッグポール伸長部は、第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドと相補的、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％、例えば完全に相補的なヌクレオチドを含み得る。一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドは連続している。一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドは不連続であり、例えば、第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドによって分離された２つ以上のハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれを超えるヌクレオチドを含む。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部は、５’から３’に、ＵＧＣＵＧ（配列番号６５８６）を含む。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部は配列番号６５８６からなる。一部の態様において第１のフラッグポール伸長部は、配列番号６５８６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の相同性である核酸を含む。
【０２５８】
第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドの一部または全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節に掲載される修飾を有し得る。
【０２５９】
３）ループ
ループは、ｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡフラッグポール領域（または存在する場合には任意選択で第１のフラッグポール伸長部）をｔｒａｃｒ（または存在する場合には任意選択で第１のｔｒａｃｒ伸長部）と連結する役割を果たす。ループはｃｒＲＮＡフラッグポール領域とｔｒａｃｒとを共有結合的または非共有結合的に連結し得る。ある実施形態において、この連結は共有結合性である。ある実施形態において、ループはｃｒＲＮＡフラッグポール領域とｔｒａｃｒとを共有結合的にカップリングする。ある実施形態において、ループは第１のフラッグポール伸長部と第１のｔｒａｃｒ伸長部とを共有結合的にカップリングする。ある実施形態において、ループは、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域と、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域にハイブリダイズするｔｒａｃｒのドメインとの間に介在する共有結合であるか、またはそれを含む。典型的には、ループは１ヌクレオチド以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを含む。
【０２６０】
ｄｇＲＮＡ分子では、２つの分子は、ｃｒＲＮＡの少なくとも一部分（例えば、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域）とｔｒａｃｒの少なくとも一部分（例えば、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域と相補的なｔｒａｃｒのドメイン）との間のハイブリダイゼーションによって会合することができる。
【０２６１】
多様なループがｓｇＲＮＡにおける使用に好適である。ループは共有結合からなってもよく、または１または数ヌクレオチドほどの短さ、例えば、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長であってもよい。ある実施形態において、ループは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５ヌクレオチド長であるかまたはそれを超える。ある実施形態において、ループは、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１０、または２〜５ヌクレオチド長である。ある実施形態において、ループは天然に存在する配列と相同性を共有するかまたはそれに由来する。ある実施形態において、ループは、本明細書に開示されるループと少なくとも５０％の相同性を有する。ある実施形態において、ループは配列番号６５８８を含む。
【０２６２】
ドメインのヌクレオチドの一部または全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節に記載される修飾を有し得る。
【０２６３】
４）第２のフラッグポール伸長部
ある実施形態において、ｄｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域、または存在する場合には第１のフラッグポール伸長部の３’側に、本明細書において第２のフラッグポール伸長部と称される追加的な配列を含み得る。ある実施形態において、第２のフラッグポール伸長部は、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、または２〜４ヌクレオチド長である。ある実施形態において、第２のフラッグポール伸長部は、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長であるかまたはそれを超える。ある実施形態において、第２のフラッグポール伸長部は配列番号６５８７を含む。
【０２６４】
５）Ｔｒａｃｒ：
ｔｒａｃｒは、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９の結合に必要な核酸配列である。理論によって拘束されるものではないが、各Ｃａｓ９種が特定のｔｒａｃｒ配列に関連付けられると考えられる。ｔｒａｃｒ配列はｓｇＲＮＡおよびｄｇＲＮＡの両方のシステムで利用される。ある実施形態において、ｔｒａｃｒは、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ｔｒａｃｒからの配列を含むかまたはそれに由来する。一部の態様において、ｔｒａｃｒは、ｃｒＲＮＡのフラッグポール部分にハイブリダイズする一部分、例えば、少なくともある生理条件下で二重鎖化した領域を形成するのに十分なｃｒＲＮＡフラッグポール領域との相補性を有する一部分（ときに本明細書においてｔｒａｃｒフラッグポール領域またはｃｒＲＮＡフラッグポール領域と相補的なｔｒａｃｒドメインと称されることもある）を有する。実施形態において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域とハイブリダイズするｔｒａｃｒのドメインは、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドを含む。一部の態様において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域の相補ヌクレオチドとハイブリダイズするｔｒａｃｒヌクレオチドは連続している。一部の態様において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域の相補ヌクレオチドとハイブリダイズするｔｒａｃｒヌクレオチドは不連続であり、例えば、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドによって分離された２つ以上のハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域にハイブリダイズするｔｒａｃｒの一部分は、５’から３’に、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡ（配列番号６５９７）を含む。一部の態様において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域にハイブリダイズするｔｒａｃｒの一部分は、５’から３’に、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡ（配列番号６５９８）を含む。実施形態において、ｃｒＲＮＡフラッグポール領域とハイブリダイズする配列は、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ分子、例えばＣａｓ９分子をさらに結合するｔｒａｃｒの配列の５’側のｔｒａｃｒ上に配置される。
【０２６５】
ｔｒａｃｒは、ヌクレアーゼ、例えばＣａｓ分子、例えばＣａｓ９分子にさらに結合するドメインをさらに含む。理論によって拘束されるものではないが、異なる種のＣａｓ９は異なるｔｒａｃｒ配列に結合すると考えられる。一部の態様において、ｔｒａｃｒは、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子に結合する配列を含む。一部の態様において、ｔｒａｃｒは、本明細書に開示されるＣａｓ９分子に結合する配列を含む。一部の態様において、Ｃａｓ９分子をさらに結合するドメインは、５’から３’に、
ＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号６５９９）
を含む。一部の態様において、Ｃａｓ９分子をさらに結合するドメインは、５’から３’に、
ＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号６６００）
を含む。
【０２６６】
一部の実施形態において、ｔｒａｃｒは配列番号６５８９を含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒは配列番号６５９０を含む。
【０２６７】
ｔｒａｃｒのヌクレオチドの一部または全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節に掲載される修飾を有し得る。実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／またはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ成分のいずれかは、ｇＲＮＡの５’末端、３’末端または５’末端と３’末端との両方に逆位脱塩基残基を含む。実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／またはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ成分のいずれかは、ポリヌクレオチドの５’末端の残基間に１つ以上のホスホロチオエート結合を含み、例えば、最初の２つの５’残基間、最初の３つの５’残基の各々の間、最初の４つの５’残基の各々の間、または最初の５つの５’残基の各々の間にホスホロチオエート結合を含む。実施形態において、ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ成分は、それに代えてまたは加えて、ポリヌクレオチドの３’末端の残基間に１つ以上のホスホロチオエート結合を含み、例えば、最初の２つの３’残基間、最初の３つの３’残基の各々の間、最初の４つの３’残基の各々の間、または最初の５つの３’残基の各々の間にホスホロチオエート結合を含み得る。ある実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／またはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ成分のいずれかは、最初の４つの５’残基の各々の間にホスホロチオエート結合を含み（例えば、５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含み、例えばそれからなり）、かつ最初の４つの３’残基の各々の間にホスホロチオエート結合を含む（例えば、３’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）。ある実施形態において、上記に記載されるホスホロチオエート修飾のいずれかが、ポリヌクレオチドの５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端との両方における逆位脱塩基残基と組み合わされる。かかる実施形態において、逆位脱塩基ヌクレオチドはリン酸結合またはホスホロチオエート結合によって５’および／または３’ヌクレオチドに連結され得る。実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／またはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ成分のいずれかは、２’Ｏ−メチル修飾を含むヌクレオチドを１つ以上含む。実施形態において、５’残基の最初の１、２、３つ、またはまたはそれを超えるものの各々が２’Ｏ−メチル修飾を含む。実施形態において、３’残基の最初の１、２、３つ、またはまたはそれを超えるものの各々が２’Ｏ−メチル修飾を含む。実施形態において、末端から４番目、末端から３番目、および末端から２番目の３’残基が２’Ｏ−メチル修飾を含む。実施形態において、５’残基の最初の１、２、３つまたはまたはそれを超えるものの各々が２’Ｏ−メチル修飾を含み、かつ３’残基の最初の１、２、３つまたはまたはそれを超えるものの各々が２’Ｏ−メチル修飾を含む。ある実施形態において、５’残基の最初の３つの各々が２’Ｏ−メチル修飾を含み、かつ３’残基の最初の３つの各々が２’Ｏ−メチル修飾を含む。実施形態において、５’残基の最初の３つの各々が２’Ｏ−メチル修飾を含み、かつ末端から４番目、末端から３番目、および末端から２番目の３’残基が２’Ｏ−メチル修飾を含む。実施形態において、２’Ｏ−メチル修飾のいずれか、例えば上記に記載したとおりのものが、１つ以上のホスホロチオエート修飾、例えば上記に記載したとおりのもの、および／または１つ以上の逆位脱塩基修飾、例えば上記に記載したとおりのものと組み合わされてもよい。ある実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／またはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ成分のいずれかは、最初の４つの５’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の４つの３’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の３つの５’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾、かつ最初の３つの３’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾を含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／またはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ成分のいずれかは、最初の４つの５’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の４つの３’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の３つの５’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾、かつ末端から４番目、末端から３番目、および末端から２番目の３’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾を含む、例えばそれからなる。
【０２６８】
ある実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／またはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ成分のいずれかは、最初の４つの５’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の４つの３’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の３つの５’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾、最初の３つの３’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾、および５’末端および３’末端の各々に追加的な逆位脱塩基残基を含む、例えばそれからなる。
【０２６９】
ある実施形態において、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡのｔｒａｃｒおよび／またはｃｒＲＮＡ）、例えば、上記に記載されるｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ成分のいずれかは、最初の４つの５’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の４つの３’残基の各々の間にホスホロチオエート結合（例えば、ポリヌクレオチドの５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む、例えばそれからなる）、最初の３つの５’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾、および末端から４番目、末端から３番目、および末端から２番目の３’残基の各々に２’Ｏ−メチル修飾、および５’末端および３’末端の各々に追加的な逆位脱塩基残基を含む、例えばそれからなる。
【０２７０】
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）；および
ｔｒａｃｒ：
【化４】
2019500043.tif 000006
（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
【０２７１】
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）；および
ｔｒａｃｒ：
【化５】
2019500043.tif 000007
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
【０２７２】
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＧ
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）；および
ｔｒａｃｒ：
【化６】
2019500043.tif 000008
（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
【０２７３】
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
ｃｒＲＮＡ：
ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＧ
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）；および
ｔｒａｃｒ：
【化７】
2019500043.tif 000009
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、および＊はホスホロチオエート結合を示す）（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
【０２７４】
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
ｃｒＲＮＡ：
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ
（式中、Ｎは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）；および
ｔｒａｃｒ：
【化８】
2019500043.tif 000010
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、および＊はホスホロチオエート結合を示す）（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
【０２７５】
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
【化９】
2019500043.tif 000011
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
【０２７６】
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
【化１０】
2019500043.tif 000012
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
【０２７７】
ある実施形態において、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡであり、以下を含む、例えばそれからなる：
【化１１】
2019500043.tif 000013
（式中、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、＊はホスホロチオエート結合を示し、およびＮは、例えば本明細書に記載されるとおりの標的化ドメインの残基を示す）（任意選択で５’末端および／または３’末端に逆位脱塩基残基を有する）。
【０２７８】
６）第１のＴｒａｃｒ伸長部
ｇＲＮＡが第１のフラッグポール伸長部を含む場合、ｔｒａｃｒは第１のｔｒａｃｒ伸長部を含み得る。第１のｔｒａｃｒ伸長部は、第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドと相補的、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％、例えば完全に相補的なヌクレオチドを含み得る。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする第１のｔｒａｃｒ伸長部ヌクレオチドは連続している。一部の態様において、第１のフラッグポール伸長部の相補ヌクレオチドとハイブリダイズする第１のｔｒａｃｒ伸長部ヌクレオチドは不連続であり、例えば、第１のフラッグポール伸長部のヌクレオチドと塩基対合しないヌクレオチドによって分離された２つ以上のハイブリダイゼーション領域を含む。一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれを超えるヌクレオチドを含む。一部の態様において、第１のｔｒａｃｒ伸長部は配列番号６５９１を含む。一部の態様において第１のｔｒａｃｒ伸長部は、配列番号６５９１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の相同性である核酸を含む。
【０２７９】
第１のｔｒａｃｒ伸長部のヌクレオチドの一部または全てが、修飾、例えば本明細書の第ＸＩＩＩ節に掲載される修飾を有し得る。
【０２８０】
一部の実施形態において、ｓｇＲＮＡは、５’から３’に、標的化ドメインの３’側に配置された以下を含み得る：
【化１２】
2019500043.tif 000014
ｅ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む上記ａ）〜ｄ）のいずれか；
ｆ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む上記ａ）〜ｄ）のいずれか；または
ｇ）５’末端（例えば、５’側端、例えば、標的化ドメインの５’側）に、少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む上記ａ）〜ｆ）のいずれか。実施形態において、上記ａ）〜ｇ）のいずれかは、標的化ドメインのすぐ３’側に配置される。
【０２８１】
ある実施形態において、本発明のｓｇＲＮＡは、５’から３’に、［標的化ドメイン］−
【化１３】
2019500043.tif 000015
を含む、例えばそれからなる。
【０２８２】
ある実施形態において、本発明のｓｇＲＮＡは、５’から３’に、
［標的化ドメイン］−
【化１４】
2019500043.tif 000016
を含む、例えばそれからなる。
【０２８３】
一部の実施形態において、ｄｇＲＮＡは以下を含み得る：
５’から３’に、好ましくは標的化ドメインのすぐ３’側に配置された以下を含むｃｒＲＮＡ：
ａ）  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号６５８４）；
ｂ）  ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号６５８５）；
ｃ）  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧ（配列番号６６０５）；
ｄ）  ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧ（配列番号６６０６）；
ｅ）  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号６６０７）；
ｆ）  ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号６６０８）；または
ｇ）  ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ  （配列番号７８０６）：
および５’から３’に以下を含むｔｒａｃｒ：
【化１５】
2019500043.tif 000017
ｋ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドをさらに含む上記ａ）〜ｊ）のいずれか；
ｌ）３’末端に少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む上記ａ）〜ｊ）のいずれか；または
ｍ）５’末端に（例えば、５’側端に）少なくとも１、２、３、４、５、６または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチド、例えば、１、２、３、４、５、６、または７個のアデニン（Ａ）ヌクレオチドをさらに含む上記ａ）〜ｌ）のいずれか。
【０２８４】
ある実施形態において、上記ｋ）の配列は、例えば転写にＵ６プロモーターが使用される場合、３’配列ＵＵＵＵＵＵを含む。ある実施形態において、上記ｋ）の配列は、例えば転写にＨＩプロモーターが使用される場合、３’配列ＵＵＵＵを含む。ある実施形態において、上記ｋ）の配列は、例えば使用されるｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターの終結シグナルに応じて変わり得る数の３’Ｕを含む。ある実施形態において、上記ｋ）の配列は、Ｔ７プロモーターが使用される場合、ＤＮＡ鋳型に由来する可変的な３’配列を含む。ある実施形態において、上記ｋ）の配列は、例えばインビトロ転写を用いてＲＮＡ分子が作成される場合、ＤＮＡ鋳型に由来する可変的な３’配列を含む。ある実施形態において、上記ｋ）の配列は、例えばｐｏｌ−ＩＩプロモーターを用いて転写がドライブされる場合、ＤＮＡ鋳型に由来する可変的な３’配列を含む。
【０２８５】
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的化ドメインと、標的化ドメインの３’側に配置される（例えば、標的化ドメインのすぐ３’側に配置される）、配列番号６６０７を含む、例えばそれからなる配列と、
【化１６】
2019500043.tif 000018
を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含む、例えばそれからなる。
【０２８６】
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的化ドメインと、標的化ドメインの３’側に配置される（例えば、標的化ドメインのすぐ３’側に配置される）、配列番号６６０８を含む、例えばそれからなる配列と、
【化１７】
2019500043.tif 000019
を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含む、例えばそれからなる。
【０２８７】
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的化ドメインと、標的化ドメインの３’側に配置される（例えば、標的化ドメインのすぐ３’側に配置される）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号７８０６）を含む、例えばそれからなる配列と、
【化１８】
2019500043.tif 000020
を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含む、例えばそれからなる。
【０２８８】
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的化ドメインと、標的化ドメインの３’側に配置される（例えば、標的化ドメインのすぐ３’側に配置される）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号７８０６）を含む、例えばそれからなる配列と、
【化１９】
2019500043.tif 000021
を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含む、例えばそれからなる。
【０２８９】
ある実施形態において、ｃｒＲＮＡは、標的化ドメインと、標的化ドメインの３’側に配置される（例えば、標的化ドメインのすぐ３’側に配置される）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号６６０７）を含む、例えばそれからなる配列と、
【化２０】
2019500043.tif 000022
を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含む、例えばそれからなる。
【０２９０】
ＩＩ．グロビン遺伝子の発現を改変するのに有用な標的化ドメイン
以下の表に、本発明の様々な態様、例えば、グロビン遺伝子、例えば胎児ヘモグロビン遺伝子またはヘモグロビンβ遺伝子の発現の改変に用いられるｇＲＮＡ分子の標的化ドメインを提供する。
【０２９１】
【表１】
2019500043.tif 000023
【０２９２】
【表２】
2019500043.tif 000024
【０２９３】
【表３】
2019500043.tif 000025
【０２９４】
【表４】
2019500043.tif 000026
【０２９５】
【表５】
2019500043.tif 000027
【０２９６】
【表６】
2019500043.tif 000028
【０２９７】
【表７】
2019500043.tif 000029
【０２９８】
【表８】
2019500043.tif 000030
【０２９９】
【表９】
2019500043.tif 000031
【０３００】
【表１０】
2019500043.tif 000032
【０３０１】
【表１１】
2019500043.tif 000033
【０３０２】
【表１２】
2019500043.tif 000034
【０３０３】
【表１３】
2019500043.tif 000035
【０３０４】
【表１４】
2019500043.tif 000036
【０３０５】
【表１５】
2019500043.tif 000037
【０３０６】
【表１６】
2019500043.tif 000038
【０３０７】
【表１７】
2019500043.tif 000039
【０３０８】
【表１８】
2019500043.tif 000040
【０３０９】
【表１９】
2019500043.tif 000041
【０３１０】
【表２０】
2019500043.tif 000042
【０３１１】
【表２１】
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【０３１２】
【表２２】
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【０３１３】
【表２３】
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【０３１４】
【表２４】
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【０３１５】
【表２５】
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【０３１６】
【表２６】
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【０３１７】
【表２７】
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【０３１８】
【表２８】
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【０３１９】
【表２９】
2019500043.tif 000051
【０３２０】
【表３０】
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【０３２１】
【表３１】
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【０３２２】
【表３２】
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【０３２３】
【表３３】
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【０３２４】
【表３４】
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【０３２５】
【表３５】
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【０３２６】
【表３６】
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【０３２７】
【表３７】
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【０３２８】
【表３８】
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【０３２９】
【表３９】
2019500043.tif 000061
【０３３０】
【表４０】
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【０３３１】
【表４１】
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【０３３２】
【表４２】
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【０３３３】
【表４３】
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【０３３４】
【表４４】
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【０３３５】
【表４５】
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【０３３６】
【表４６】
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【０３３７】
【表４７】
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【０３３８】
【表４８】
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【０３３９】
【表４９】
2019500043.tif 000071
【０３４０】
【表５０】
2019500043.tif 000072
【０３４１】
【表５１】
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【０３４２】
【表５２】
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【０３４３】
【表５３】
2019500043.tif 000075
【０３４４】
【表５４】
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【０３４５】
【表５５】
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【０３４６】
【表５６】
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【０３４７】
【表５７】
2019500043.tif 000079
【０３４８】
【表５８】
2019500043.tif 000080
【０３４９】
【表５９】
2019500043.tif 000081
【０３５０】
【表６０】
2019500043.tif 000082
【０３５１】
【表６１】
2019500043.tif 000083
【０３５２】
【表６２】
2019500043.tif 000084
【０３５３】
【表６３】
2019500043.tif 000085
【０３５４】
【表６４】
2019500043.tif 000086
【０３５５】
実施形態において、ｇＲＮＡ標的化ドメインは、上記の表中にある配列のいずれか１つの２０個の３’ｎｔからなる。
【０３５６】
本発明の組成物および方法において有用な例示的な好ましいｇＲＮＡ標的化ドメインを以下の表に記載する。
【０３５７】
【表６５】
2019500043.tif 000087
【０３５８】
【表６６】
2019500043.tif 000088
【０３５９】
【表６７】
2019500043.tif 000089
【０３６０】
【表６８】
2019500043.tif 000090
【０３６１】
【表６９】
2019500043.tif 000091
【０３６２】
【表７０】
2019500043.tif 000092
【０３６３】
【表７１】
2019500043.tif 000093
【０３６４】
【表７２】
2019500043.tif 000094
【０３６５】
【表７３】
2019500043.tif 000095
【０３６６】
【表７４】
2019500043.tif 000096
【０３６７】
【表７５】
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【０３６８】
【表７６】
2019500043.tif 000098
【０３６９】
本発明の一部の態様において、ＨＰＦＨ領域に対するｇＲＮＡ分子は、例えば実施例４に記載されるアッセイにおいて、対照と比べて少なくとも約２０％のＦ細胞の増加を生じさせる能力を有するｇＲＮＡの標的化ドメインを含む、例えばそれからなることが好ましい。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
【０３７０】
本発明の一部の態様において、例えば、本明細書において指摘するとおり、２つ以上の、例えば２つの標的部位を標的とするｇＲＮＡ分子（例えば、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子）を含むことが有益であり得る。一部の実施形態において、２つの標的部位は両方ともにＨＰＦＨ領域に位置する。かかる態様において、表６に挙げる標的化ドメインを含む２つ以上の、例えば２つのｇＲＮＡ分子（例えば、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子）の任意の組み合わせを用いることができる。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１００および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１３および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分
子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９９および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１１２および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号９８および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８０および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号９９を含む、例えば
それからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０６および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５０３および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８９および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配
列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３７および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０１および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１
５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１０４および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１３８および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３６および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番
号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５３９および配列番号１５８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１６５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１５８０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１０６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１５０３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１５８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１６０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１５３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１５９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１０１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１６２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１０４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１５３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５８５および配列番号１５３９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
【０３７１】
【表７７】
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【０３７２】
【表７８】
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【０３７３】
【表７９】
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【０３７４】
【表８０】
2019500043.tif 000102
【０３７５】
本発明の一部の態様において、ＢＣＬ１１ａの＋５８エンハンサー領域に対するｇＲＮＡ分子は、図１１に挙げるｇＲＮＡの標的化ドメインを含むことが好ましい。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３４１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
【０３７６】
本発明の一部の態様において、例えば、本明細書において指摘するとおり、２つ以上の、例えば２つの標的部位を標的とするｇＲＮＡ分子（例えば、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子）を含むことが有益であり得る。一部の実施形態において、２つの標的部位は両方ともに＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域に位置する。かかる態様において、表７に挙げる標的化ドメインを含む２つ以上の、例えば２つのｇＲＮＡ分子（例えば、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子）の任意の組み合わせを用いることができる。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１お���び配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３４１および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２���ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４６および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある���様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４８および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４７および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４５および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号１８５を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４９および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２４４および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１９９および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５１および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮ
Ａ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２５０および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３４および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８５および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる
標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１８６および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３６および配列番号３３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２４６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２４８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２４９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２４４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号１９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２５１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号２５０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号３３４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号１８５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号１８６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３３７および配列番号３３６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
【０３７７】
実施形態において、本発明の態様は、ＧＡＴＡ−１結合部位の３’側、例えばＧＡＴＡ１結合部位およびＴＡＬ−１結合部位の３’側に配置されたＢＣＬ１１ａ遺伝子の＋５８エンハンサー領域内にある標的配列と相補的なｇＲＮＡ分子に関するかまたはそれを包含する。実施形態において、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位にまたはその近傍に１つ以上のインデルを含む。実施形態において、インデルはＧＡＴＡ−１結合部位のヌクレオチドを含まず、および／またはＴＡＬ−１結合部位のヌクレオチドを含まない。実施形態において、本ＣＲＩＳＰＲシステムは、例えばＮＧＳによって計測したとき、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％の総フレームシフトインデル率で、標的部位にまたはその近傍に１つ以上のフレームシフトインデルを誘導する。実施形態において、総インデル率は、例えばＮＧＳによって計測したとき、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％である。
【０３７８】
【表８１】
2019500043.tif 000103
【０３７９】
【表８２】
2019500043.tif 000104
【０３８０】
本発明の一部の態様において、ＢＣＬ１１ａの＋６２エンハンサー領域に対するｇＲＮＡ分子は、図１２に挙げるｇＲＮＡの標的化ドメインを含むことが好ましい。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３１８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
【０３８１】
本発明の一部の態様において、例えば、本明細書において指摘するとおり、２つ以上の、例えば２つの標的部位を標的とするｇＲＮＡ分子（例えば、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子）を含むことが有益であり得る。一部の実施形態において、２つの標的部位は両方ともに＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域に位置する。かかる態様において、表８に挙げる標的化ドメインを含む２つ以上の、例えば２つのｇＲＮＡ分子（例えば、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子）の任意の組み合わせを用いることができる。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号３１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１８および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２お���び配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号３１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１２および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２���ｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号３１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１３および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号３１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある���様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９４および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号３１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲ
ＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１０および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号３１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１９および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号３１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９８および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号３１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３２２および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号３１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１１および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号３１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号２８９を含む、例えばそれからな
る標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１５および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号３１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２９０および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３１７および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号３１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号３０９および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号３１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８９および配列番号２８１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号３１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号３１３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号２９４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号３１０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号３１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号２９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号３２２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号３１１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号３１５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号２９０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号３１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号３０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号２８１および配列番号２８９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
【０３８２】
【表８３】
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【０３８３】
【表８４】
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【０３８４】
【表８５】
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【０３８５】
【表８６】
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【０３８６】
本発明の一部の態様において、ＢＣＬ１１ａの＋５５エンハンサー領域に対するｇＲＮＡ分子は、配列番号１６８３、配列番号１６３８、配列番号１６４７、配列番号１６０９、配列番号１６２１、配列番号１６１７、配列番号１６５４、配列番号１６３１、配列番号１６２０、配列番号１６３７、配列番号１６１２、配列番号１６５６、配列番号１６１９、配列番号１６７５、配列番号１６４５、配列番号１５９８、配列番号１５９９、配列番号１６６３、配列番号１６７７、および配列番号１６２６から選択される標的化ドメイン配列を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含むことが好ましい。
【０３８７】
本発明の一部の態様において、例えば、本明細書において指摘するとおり、２つ以上の、例えば２つの標的部位を標的とするｇＲＮＡ分子（例えば、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子）を含むことが有益であり得る。一部の実施形態において、２つの標的部位は両方ともに＋５５  ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域に位置する。かかる態様において、＋５５  ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域の異なる標的部位を標的とする、表９に挙げる標的化ドメインを含む、例えばそれからなる２つ以上の、例えば２つのｇＲＮＡ分子（例えば、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子）の任意の組み合わせを用いることができる。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１��４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６８３および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメイ��を含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３８および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分��および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４７および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮ
Ａ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６０９および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２１および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１７および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。あ
る態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５４および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３１および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２０および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６３７および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６５６を含む、例えばそれから
なる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１２および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６５６および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６１９および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７５および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１
６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６４５および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９８および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１５９９および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６６３および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列
番号１６７７および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６７７および配列番号１６２６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６３８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６４７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６０９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６２１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６１７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６５４を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６３１を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６２０を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６３７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６１２を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６５６を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６１９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６７５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６４５を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１５９８を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１５９９を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６６３を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子および第２のｇＲＮＡ分子は、それぞれ配列番号１６２６および配列番号１６７７を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
【０３８８】
ＩＩＩ．ｇＲＮＡの設計方法
ｇＲＮＡの設計方法が、標的配列の選択、設計および検証方法を含め、本明細書に記載される。例示的標的化ドメインも本明細書に提供される。本明細書で考察される標的化ドメインは、本明細書に記載されるｇＲＮＡに組み込むことができる。
【０３８９】
標的配列の選択および検証方法ならびにオフターゲット分析については、例えば、Ｍａｌｉ  ｅｌ  ａｌ．，２０１３  ＳＣＩＥＮＣＥ  ３３９（６１２１）：８２３−８２６；Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１３  ＮＡＴ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ，３１（９）：８２７−３２；Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１４  ＮＡＴ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭ  ＩＤ：２４４６３５７４；Ｈｅｉｇｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１４  ＮＡＴ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ｌｌ（２）：１２２−３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２８１２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４８１２１６；Ｂａｅ  ｅｌ  ａｌ，２０１４  ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４４６３１８１；Ｘｉａｏ  Ａ  ｅｌ  ａｌ，２０１４  ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４３８９６６２に記載される。
【０３９０】
例えば、ソフトウェアツールを使用してユーザーの標的配列の範囲内でｇＲＮＡの選択を最適化する、例えば、ゲノムにわたる全オフターゲット活性を最小限に抑えることができる。オフターゲット活性は切断以外であり得る。ツールは、可能なｇＲＮＡの選択毎に、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を用いて、特定の数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）に至るまでのミスマッチ塩基対を含有するゲノムにわたる全てのオフターゲット配列（例えば、ＮＡＧ  ＰＡＭまたはＮＧＧ  ＰＡＭのいずれかの前にあるもの）を同定し得る。各オフターゲット配列における切断効率は、例えば、実験的に導き出された重み付けスキームを用いて予想し得る。次に、可能な各ｇＲＮＡが、その総合的な予想オフターゲット切断に従い順位付けされる。上位順位のｇＲＮＡが、オンターゲット切断が最大でオフターゲット切断が最小である可能性が高いものに相当する。他の機能、例えば、ＣＲＩＳＰＲ構築のための自動試薬設計、オンターゲットＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイ用のプライマー設計、および次世代シーケンシングによるオフターゲット切断のハイスループット検出および定量化用のプライマー設計もツールに含まれ得る。候補ｇＲＮＡ分子は、当該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり判定することができる。
【０３９１】
ソフトウェアアルゴリズムを用いて潜在的ｇＲＮＡ分子の初期リストを作成し得るが、切断効率および特異性は必ずしも予測値を反映しているとは限らず、ｇＲＮＡ分子は、典型的には、特定の細胞株、例えば初代ヒト細胞株、例えばヒトＨＳＰＣ、例えばヒトＣＤ３４＋細胞でスクリーニングして、例えば、切断効率、インデル形成、切断特異性および所望の表現型の変化を決定する必要がある。これらの特性は本明細書に記載される方法によってアッセイし得る。
【０３９２】
本発明の態様において、ＣＲ００３１２の標的化ドメイン（配列番号２４８、以下に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
【化２１】
2019500043.tif 000109
【０３９３】
本発明の態様において、ＣＲ００１１２８の標的化ドメイン（配列番号３３８、以下に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
【化２２】
2019500043.tif 000110
【０３９４】
本発明の態様において、ＣＲ００１１２６の標的化ドメイン（配列番号３３６、以下に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
【化２３】
2019500043.tif 000111
【０３９５】
本発明の態様において、ＣＲ００３１１の標的化ドメイン（配列番号２４７、以下に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
【化２４】
2019500043.tif 000112
【０３９６】
本発明の態様において、ＣＲ００３０９の標的化ドメイン（配列番号２４５、以下に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
【化２５】
2019500043.tif 000113
【０３９７】
本発明の態様において、ＣＲ００１１２７の標的化ドメイン（配列番号３３７、以下に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
【化２６】
2019500043.tif 000114
【０３９８】
本発明の態様において、ＣＲ００３１６の標的化ドメイン（配列番号２５２、以下に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
【化２７】
2019500043.tif 000115
【０３９９】
本発明の態様において、ＣＲ００１１２５の標的化ドメイン（配列番号３３５、以下に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
【化２８】
2019500043.tif 000116
【０４００】
本発明の態様において、ＣＲ００１０３０の標的化ドメイン（配列番号１００、以下に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
【化２９】
2019500043.tif 000117
【０４０１】
本発明の態様において、ＣＲ００１０２８の標的化ドメイン（配列番号９８、以下に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
【化３０】
2019500043.tif 000118
【０４０２】
本発明の態様において、ＣＲ００１２２１の標的化ドメイン（配列番号１５８９、以下に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
【化３１】
2019500043.tif 000119
【０４０３】
本発明の態様において、ＣＲ００１１３７の標的化ドメイン（配列番号１５０５、以下に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
【化３２】
2019500043.tif 000120
【０４０４】
本発明の態様において、ＣＲ００３０３５の標的化ドメイン（配列番号１５０５、以下に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
【化３３】
2019500043.tif 000121
【０４０５】
本発明の態様において、ＣＲ００３０８５の標的化ドメイン（配列番号１７５０、以下に下線を引く）を含むｇＲＮＡ、例えば、以下に記載するｇＲＮＡ分子の１つは、例えば本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子が２つ以上関わる態様を含め、本発明のＣＲＩＳＰＲシステム、方法、細胞および他の態様および実施形態において有用である。
【化３４】
2019500043.tif 000122
【０４０６】
上記に記載されるｇＲＮＡ分子の各々において、「＊」は隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を意味し、および「ｍＮ」（式中、Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＣまたはＵ）は２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを意味する。実施形態において、本明細書に記載される任意のｇＲＮＡ分子、例えば上記に記載されるｇＲＮＡ分子は、例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と複合体化してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する。かかるＲＮＰは、例えば本明細書に記載される本発明の方法、細胞、および他の態様および実施形態において特に有用である。
【０４０７】
ＩＶ．Ｃａｓ分子
Ｃａｓ９分子
好ましい実施形態において、Ｃａｓ分子はＣａｓ９分子である。本明細書に記載される方法および組成物では、様々な種のＣａｓ９分子を使用することができる。化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子が本明細書における開示の多くの主題であるが、本明細書に挙げる他の種のＣａｓ９タンパク質のＣａｓ９分子、それに由来するＣａｓ９分子、またはそれをベースとするＣａｓ９分子も同様に使用することができる。換言すれば、他のＣａｓ９分子、例えば、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）および／または髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子が、本明細書に記載されるシステム、方法および組成物で用いられ得る。さらなるＣａｓ９種としては、アシドボラクス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ）、アクチノミセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、アリサイクリフィルス・デニトリフィカンス（Ａｌｉｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．）、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ  ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム属種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラド（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｄ）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マツルショッティイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｈｉｂａｅ）、ユーバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｄ��ａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、パラインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シネディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌、メチロシスティス属種（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、メチロサイナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ  ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ）、黄色球菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア属種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ．）、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属種（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、パルビバクラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ  ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラルクトバクテリウム・スクシナツテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム属種（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ  ｓｐ．）、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス属種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、スポロラクトバチルス・ビネエ（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、サブドリグラヌルム属種（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ  ｓｐ．）、ティストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ  ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ属種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐ．）、またはベルミネフォロバクター・エイセニエ（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｅｉｓｅｎｉａｅ）が挙げられる。
【０４０８】
Ｃａｓ９分子は、その用語が本明細書において使用されるとき、ｇＲＮＡ分子（例えば、ｔｒａｃｒのドメインの配列）と相互作用し、かつｇＲＮＡ分子と協力して標的配列およびＰＡＭ配列を含む部位に局在化する（例えば、それを標的化するかまたはそこにホーミングする）ことのできる分子を指す。
【０４０９】
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は標的核酸分子の切断能を有し、これは本明細書では活性Ｃａｓ９分子と称され得る。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は以下の活性の１つ以上を含む：ニッカーゼ活性、すなわち、核酸分子の一本鎖、例えば非相補鎖または相補鎖を切断する能力；二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両方の鎖を切断して二本鎖切断を作り出す能力、これはある実施形態では２つのニッカーゼ活性の存在である；エンドヌクレアーゼ活性；エキソヌクレアーゼ活性；およびヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力。
【０４１０】
ある実施形態において、酵素的に活性なＣａｓ９分子は両方のＤＮＡ鎖を切断して二本鎖切断を生じさせる。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は一方の鎖のみ、例えば、ｇＲＮＡがハイブリダイズする方の鎖、またはｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖を切断する。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性を含む。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性を含む。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性とＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性とを含む。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、活性なまたは切断コンピテントなＨＮＨ様ドメインと、不活性なまたは切断インコンピテントなＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む。ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、不活性なまたは切断インコンピテントなＨＮＨ様ドメインと、活性なまたは切断コンピテントなＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインとを含む。
【０４１１】
ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子が標的核酸と相互作用してそれを切断する能力は、ＰＡＭ配列依存的である。ＰＡＭ配列は標的核酸中の配列である。ある実施形態において、標的核酸の切断はＰＡＭ配列から上流で起こる。異なる細菌種の活性Ｃａｓ９分子は異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識することができる。ある実施形態において、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の活性Ｃａｓ９分子は配列モチーフＮＧＧを認識し、その配列から１〜１０、例えば３〜５塩基対上流の標的核酸配列の切断を導く。例えば、Ｍａｌｉ  ｅｌ  ａｉ，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１３；３３９（６１２１）：８２３−８２６を参照されたい。ある実施形態において、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の活性Ｃａｓ９分子は配列モチーフＮＧＧＮＧおよびＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）を認識し、これらの配列から１〜１０、例えば３〜５塩基対上流のコア標的核酸配列の切断を導く。例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１０；３２７（５９６２）：１６７−１７０、およびＤｅｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ  ２００８；１９０（４）：１３９０−１４００を参照されたい。ある実施形態において、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）の活性Ｃａｓ９分子は配列モチーフＮＧＧまたはＮＡＡＲ（Ｒ−ＡまたはＧ）を認識し、この配列から１〜１０、例えば３〜５塩基対上流のコア標的核酸配列の切断を導く。例えば、Ｄｅｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ  ２００８；１９０（４）：１  ３９０−１４００を参照されたい。
【０４１２】
ある実施形態において、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の活性Ｃａｓ９分子は配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識し、その配列から１〜１０、例えば３〜５塩基対上流の標的核酸配列の切断を導く。例えば、Ｒａｎ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ，ｖｏｌ．５２０，２０１５，ｐｐ．１８６−１９１を参照されたい。ある実施形態において、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の活性Ｃａｓ９分子は配列モチーフＮＮＮＮＧＡＴＴを認識し、その配列から１〜１０、例えば３〜５塩基対上流の標的核酸配列の切断を導く。例えば、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＥＡＲＬＹ  ＥＤＩＴＩＯＮ  ２０１３，１−６を参照されたい。Ｃａｓ９分子がＰＡＭ配列を認識する能力は、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１２，３３７：８１６に記載される形質転換アッセイを用いて決定することができる。
【０４１３】
幾つかのＣａｓ９分子はｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と併せてコア標的ドメインにホーミングする（例えば、標的化または局在化される）能力を有するが、標的核酸を切断する能力は有しない、または効率的な比率で切断する能力は有しない。切断活性を全く有しない、または実質的に有しないＣａｓ９分子は、本明細書では、不活性Ｃａｓ９（酵素的に不活性なＣａｓ９）、デッドＣａｓ９、またはｄＣａｓ９分子と称され得る。例えば、不活性Ｃａｓ９分子は切断活性を欠き、または実質的に低い、例えば本明細書に記載されるアッセイによって計測したときに参照Ｃａｓ９分子の２０、１０、５、１または０．１％未満の切断活性を有し得る。
【０４１４】
例示的な天然に存在するＣａｓ９分子については、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３；１０：５，７２７−７３７に記載される。かかるＣａｓ９分子には、クラスター１細菌ファミリー、クラスター２細菌ファミリー、クラスター３細菌ファミリー、クラスター４細菌ファミリー、クラスター５細菌ファミリー、クラスター６細菌ファミリー、クラスター７細菌ファミリー、クラスター８細菌ファミリー、クラスター９細菌ファミリー、クラスター１０細菌ファミリー、クラスター１１細菌ファミリー、クラスター１２細菌ファミリー、クラスター１３細菌ファミリー、クラスター１４細菌ファミリー、クラスター１細菌ファミリー、クラスター１６細菌ファミリー、クラスター１７細菌ファミリー、クラスター１８細菌ファミリー、クラスター１９細菌ファミリー、クラスター２０細菌ファミリー、クラスター２１細菌ファミリー、クラスター２２細菌ファミリー、クラスター２３細菌ファミリー、クラスター２４細菌ファミリー、クラスター２５細菌ファミリー、クラスター２６細菌ファミリー、クラスター２７細菌ファミリー、クラスター２８細菌ファミリー、クラスター２９細菌ファミリー、クラスター３０細菌ファミリー、クラスター３１細菌ファミリー、クラスター３２細菌ファミリー、クラスター３３細菌ファミリー、クラスター３４細菌ファミリー、クラスター３５細菌ファミリー、クラスター３６細菌ファミリー、クラスター３７細菌ファミリー、クラスター３８細菌ファミリー、クラスター３９細菌ファミリー、クラスター４０細菌ファミリー、クラスター４１細菌ファミリー、クラスター４２細菌ファミリー、クラスター４３細菌ファミリー、クラスター４４細菌ファミリー、クラスター４５細菌ファミリー、クラスター４６細菌ファミリー、クラスター４７細菌ファミリー、クラスター４８細菌ファミリー、クラスター４９細菌ファミリー、クラスター５０細菌ファミリー、クラスター５１細菌ファミリー、クラスター５２細菌ファミリー、クラスター５３細菌ファミリー、クラスター５４細菌ファミリー、クラスター５５細菌ファミリー、クラスター５６細菌ファミリー、クラスター５７細菌ファミリー、クラスター５８細菌ファミリー、クラスター５９細菌ファミリー、クラスター６０細菌ファミリー、クラスター６１細菌ファミリー、クラスター６２細菌ファミリー、クラスター６３細菌ファミリー、クラスター６４細菌ファミリー、クラスター６５細菌ファミリー、クラスター６６細菌ファミリー、クラスター６７細菌ファミリー、クラスター６８細菌ファミリー、クラスター６９細菌ファミリー、クラスター７０細菌ファミリー、クラスター７１細菌ファミリー、クラスター７２細菌ファミリー、クラスター７３細菌ファミリー、クラスター７４細菌ファミリー、クラスター７５細菌ファミリー、クラスター７６細菌ファミリー、クラスター７７細菌ファミリー、またはクラスター７８細菌ファミリーのＣａｓ９分子が含まれる。
【０４１５】
例示的な天然に存在するＣａｓ９分子には、クラスター１細菌ファミリーのＣａｓ９分子が含まれる。例としては、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（例えば、株ＳＦ３７０、ＭＧＡＳ  １０２７０、ＭＧＡＳ  １０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１およびＳＳＩ−１）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、株ＬＭＤ−９）、Ｓ．シュードポルシヌス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）（例えば、株ＳＰＩＮ  ２００２６）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）（例えば、株ＵＡ  １５９、ＮＮ２０２５）、Ｓ．マカカエ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）（例えば、株ＮＣＴＣ１  １５５８）、Ｓ．ガロリティカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）（例えば、株ＵＣＮ３４、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−２０６９）、Ｓ．エクイナス（Ｓ．ｅｑｕｉｎｕｓ）（例えば、株ＡＴＣＣ  ９８１２、ＭＧＣＳ  １２４）、Ｓ．ディスガラクティアエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、株ＧＧＳ  １２４）、Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）（例えば、株ＡＴＣＣ  ７００３３８）、Ｓ．アンギノサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（例えば、株Ｆ０２１１）、Ｓ．アガラクティアエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、株ＮＥＭ３１６、Ａ９０９）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（例えば、株Ｆ６８５４）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）（Ｌ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）、例えば、株Ｃｌｉｐ  ｌ  ２６２）、エンテロコッカス・イタリクス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｔａｌｉｃｕｓ）（例えば、株ＤＳＭ  １５９５２）、またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）（例えば、株１，２３１，４０８）のＣａｓ９分子が挙げられる。さらなる例示的Ｃａｓ９分子は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子（Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３，１−６）および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である。
【０４１６】
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子、例えば活性Ｃａｓ９分子または不活性Ｃａｓ９分子は、本明細書に記載される任意のＣａｓ９分子配列または天然に存在するＣａｓ９分子配列、例えば、本明細書に挙げられるかまたはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１３，１０：５，’Ｉ２’Ｉ−Τ，１，Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  Ｅａｒｌｙ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２０１３，１−６に記載される種のＣａｓ９分子と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、それと比較したときに１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、または４０％以下のアミノ酸残基が異なるか、それと１、２、５、１０または２０アミノ酸以上１００、８０、７０、６０、５０、４０または３０アミノ酸以下異なるか、またはそれと同一である。
【０４１７】
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９：
【化３５】
2019500043.tif 000123
【化３６】
2019500043.tif 000124
【化３７】
2019500043.tif 000125
【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
2019500043.tif 000128
と６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、それと比較したときに１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、または４０％以下のアミノ酸残基が異なるか、それと１、２、５、１０または２０アミノ酸以上１００、８０、７０、６０、５０、４０または３０アミノ酸以下異なるか、またはそれと同一である。
【０４１８】
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、正電荷アミノ酸（例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジン）に対して非荷電または非極性アミノ酸、例えばアラニンを前記位置に導入する１つ以上の突然変異を含む配列番号６６１１の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、突然変異は、Ｃａｓ９のｎｔ溝にある１つ以上の正電荷アミノ酸に対する突然変異である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１の８５５位における突然変異、例えば、配列番号６６１１の８５５位における非荷電アミノ酸、例えばアラニンへの突然変異を含む配列番号６６１１の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１と比べて配列番号６６１１の８５５位にのみ、例えば、非荷電アミノ酸、例えばアラニンへの突然変異を有する。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１の８１０位における突然変異、１００３位における突然変異、および／または１０６０位における突然変異、例えば配列番号６６１１の８１０位、１００３位、および／または１０６０位におけるアラニンへの突然変異を含む配列番号６６１１の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１と比べて配列番号６６１１の８１０位、１００３位、および１０６０位にのみ突然変異を有し、例えば、ここで、各突然変異は、非荷電アミノ酸、例えばアラニンへの突然変異である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１の８４８位における突然変異、１００３位における突然変異、および／または１０６０位における突然変異、例えば配列番号６６１１の８４８位、１００３位、および／または１０６０位におけるアラニンへの突然変異を含む配列番号６６１１の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１と比べて配列番号６６１１の８４８位、１００３位、および１０６０位にのみ突然変異を有し、例えば、ここで、各突然変異は、非荷電アミノ酸、例えばアラニンへの突然変異である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（２０１５年１２月１日、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｄ５２２７においてオンラインで利用可能）に記載されるとおりのＣａｓ９分子である。
【０４１９】
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、１つ以上の突然変異を含む配列番号６６１１の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は配列番号６６１１の８０位に突然変異を含み、例えば、配列番号６６１１の８０位にロイシンを含む（すなわち、Ｃ８０Ｌ突然変異を有する配列番号６６１１を含む、例えばそれからなる）。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は配列番号６６１１の５７４位に突然変異を含み、例えば、配列番号６６１１の５７４位にグルタミン酸を含む（すなわち、Ｃ５７４Ｅ突然変異を有する配列番号６６１１を含む、例えばそれからなる）。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は、配列番号６６１１の８０位における突然変異および５７４位における突然変異を含み、例えば、配列番号６６１１の８０位にロイシン、および配列番号６６１１の５７４位にグルタミン酸を含む（すなわち、Ｃ８０Ｌ突然変異およびＣ５７４Ｅ突然変異を有する配列番号６６１１を含む、例えばそれからなる）。理論によって拘束されるものではないが、かかる突然変異はＣａｓ９分子の溶解特性を改善すると考えられる。
【０４２０】
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、１つ以上の突然変異を含む配列番号６６１１の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は配列番号６６１１の１４７位に突然変異を含み、例えば、配列番号６６１１の１４７位にチロシンを含む（すなわち、Ｄ１４７Ｙ突然変異を有する配列番号６６１１を含む、例えばそれからなる）。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は配列番号６６１１の４１１位に突然変異を含み、例えば、配列番号６６１１の４１１位にスレオニンを含む（すなわち、Ｐ４１１Ｔ突然変異を有する配列番号６６１１を含む、例えばそれからなる）。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は、配列番号６６１１の１４７位における突然変異および４１１位における突然変異を含み、例えば、配列番号６６１１の１４７位にチロシン、および配列番号６６１１の４１１位にスレオニンを含む（すなわち、Ｄ１４７Ｙ突然変異およびＰ４１１Ｔ突然変異を有する配列番号６６１１を含む、例えばそれからなる）。理論によって拘束されるものではないが、かかる突然変異はＣａｓ９分子の例えば酵母におけるターゲティング効率を改善すると考えられる。
【０４２１】
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、１つ以上の突然変異を含む配列番号６６１１の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９変異体は配列番号６６１１の１１３５位に突然変異を含み、例えば、配列番号６６１１の１１３５位にグルタミン酸を含む（すなわち、Ｄ１１３５Ｅ突然変異を有する配列番号６６１１を含む、例えばそれからなる）。理論によって拘束されるものではないが、かかる突然変異はＣａｓ９分子のＮＡＧ  ＰＡＭ配列と比べたＮＧＧ  ＰＡＭ配列に対する選択性を改善すると考えられる。
【０４２２】
実施形態において、Ｃａｓ９分子は、特定の位置に非荷電または非極性アミノ酸、例えばアラニンを導入する１つ以上の突然変異を含む配列番号６６１１の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１の４９７位における突然変異、６６１位における突然変異、６９５位における突然変異および／または９２６位における突然変異、例えば配列番号６６１１の４９７位、６６１位、６９５位および／または９２６位におけるアラニンへの突然変異を含む配列番号６６１１の化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９変異体である。実施形態において、Ｃａｓ９分子は、配列番号６６１１と比べて配列番号６６１１の４９７位、６６１位、６９５位、および９２６位にのみ突然変異を有し、例えば、ここで、各突然変異は、非荷電アミノ酸、例えばアラニンへの突然変異である。理論によって拘束されるものではないが、かかる突然変異はＣａｓ９分子によるオフターゲット部位の切断を低減すると考えられる。
【０４２３】
Ｃａｓ９分子に対する本明細書に記載される突然変異は組み合わせてもよく、本明細書に記載される融合または他の修飾のいずれかと組み合わせて、そのＣａｓ９分子を本明細書に記載されるアッセイで試験してもよいことが理解されるであろう。
【０４２４】
本明細書に開示される本発明の実施には、様々なタイプのＣａｓ分子を使用することができる。一部の実施形態において、ＩＩ型ＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。他の実施形態において、他のＣａｓシステムのＣａｓ分子が使用される。例えば、Ｉ型またはＩＩＩ型Ｃａｓ分子が使用されてもよい。例示的Ｃａｓ分子（およびＣａｓシステム）については、Ｈａｆｔ  ｅｔ  ａｉ，ＰＬｏＳ  ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ２００５，１（６）：ｅ６０およびＭａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ，ＮＡＴＵＲＥ  ＲＥＶＩＥＷ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ２０１  １，９：４６７−４７７（両方の参考文献の内容が全体として参照により本明細書に援用される）に記載される。
【０４２５】
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は、以下の活性の１つ以上を含む：ニッカーゼ活性；二本鎖切断活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；またはｇＲＮＡ分子と一緒になって標的核酸に局在化する能力。
【０４２６】
改変Ｃａｓ９分子
天然に存在するＣａｓ９分子は、ニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；ｇＲＮＡ分子と機能的に関連する能力；および核酸上の部位を標的化する（またはそこに局在化する）能力（例えば、ＰＡＭ認識および特異性）を含め、幾つもの特性を有する。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子はこれらの特性の全てまたは一部を含み得る。典型的な実施形態において、Ｃａｓ９分子はｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協力して核酸の部位に局在化する能力を有する。他の活性、例えば、ＰＡＭ特異性、切断活性、またはヘリカーゼ活性はＣａｓ９分子でより広く異なり得る。
【０４２７】
所望の特性を有するＣａｓ９分子は、幾つもの方法で、例えば、親の、例えば天然に存在するＣａｓ９分子の改変によって所望の特性を有する改変Ｃａｓ９分子を提供することにより作製し得る。例えば、親Ｃａｓ９分子と比べた１つ以上の突然変異または違いを導入することができる。かかる突然変異および違いには、置換（例えば、保存的置換または非必須アミノ酸の置換）；挿入；または欠失が含まれる。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は、参照Ｃａｓ９分子と比べて１つ以上の突然変異または違い、例えば１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０個以上の突然変異、２００、１００、または８０個未満の突然変異を含み得る。
【０４２８】
ある実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、Ｃａｓ９活性、例えば本明細書に記載されるＣａｓ９活性に実質的な効果を及ぼさない。ある実施形態において、１つまたは複数の突然変異は、Ｃａｓ９活性、例えば本明細書に記載されるＣａｓ９活性に対して実質的な効果を及ぼす。ある実施形態において、例示的活性には、ＰＡＭ特異性、切断活性、およびヘリカーゼ活性の１つ以上が含まれる。１つまたは複数の突然変異は、例えば、１つ以上のＲｕｖＣ様ドメイン、例えばＮ末端ＲｕｖＣ様ドメイン；ＨＮＨ様ドメイン；ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインの外側の領域に存在し得る。一部の実施形態において、１つまたは複数の突然変異はＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに存在する。一部の実施形態において、１つまたは複数の突然変異はＨＮＨ様ドメインに存在する。一部の実施形態において、突然変異はＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインおよびＨＮＨ様ドメインの両方に存在する。
【０４２９】
詳細な配列、例えば置換が、ターゲティング活性、切断活性などの１つ以上の活性に影響を及ぼし得るか否かは、例えば、その突然変異が保存されたものかどうかを判定することにより、または第ＩＩＩ節に記載される方法により、判定または予想することができる。ある実施形態において、「非必須」アミノ酸残基とは、Ｃａｓ９分子との関連において使用されるとき、Ｃａｓ９活性（例えば、切断活性）を無効にすることなく、またはより好ましくはそれを実質的に改変することなくＣａｓ９分子、例えば天然に存在するＣａｓ９分子、例えば活性Ｃａｓ９分子の野生型配列から改変することのできる残基であり、一方、「必須」アミノ酸残基の変化は実質的な活性（例えば、切断活性）の喪失をもたらす。
【０４３０】
改変されたＰＡＭ認識を有するかまたはＰＡＭ認識のないＣａｓ９分子
天然に存在するＣａｓ９分子は、特異的ＰＡＭ配列、例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）について上記に記載したＰＡＭ認識配列を認識することができる。
【０４３１】
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は天然に存在するＣａｓ９分子と同じＰＡＭ特異性を有する。他の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、天然に存在するＣａｓ９分子との関連性がないＰＡＭ特異性、またはそれが最も近い配列相同性を有する天然に存在するＣａｓ９分子との関連性がないＰＡＭ特異性を有する。例えば、天然に存在するＣａｓ９分子を改変することにより、例えばＰＡＭ認識を改変する、例えばＣａｓ９分子が認識するＰＡＭ配列を改変してオフターゲット部位を減少させる、および／または特異性を向上させるか、またはＰＡＭ認識要件をなくすことができる。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子を改変することにより、例えばＰＡＭ認識配列の長さを増加させ、および／またはＣａｓ９特異性を高い同一性レベルとなるよう向上させて、オフターゲット部位を減少させ、かつ特異性を高めることができる。ある実施形態において、ＰＡＭ認識配列の長さは少なくとも４、５、６、７、８、９、１０または１５アミノ酸長である。異なるＰＡＭ配列を認識する、および／またはオフターゲット活性が低下したＣａｓ９分子は、定方向進化を用いて作成することができる。Ｃａｓ９分子の定方向進化に用いることのできる例示的方法およびシステムについては、例えば、Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｌ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１１，４７２（７３４４）：４９９−５０３に記載されている。候補Ｃａｓ９分子は、例えば本明細書に記載される方法によって評価することができる。
【０４３２】
非切断型および修飾切断型Ｃａｓ９分子
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子は、天然に存在するＣａｓ９分子と異なる、例えば、最も近い相同性を有する天然に存在するＣａｓ９分子と異なる切断特性を含む。例えば、Ｃａｓ９分子は、天然に存在するＣａｓ９分子、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子と以下のとおり異なり得る：例えば天然に存在するＣａｓ９分子（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較したときに二本鎖切断の切断（エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）を調整する、例えば低下または増加させるその能力；例えば天然に存在するＣａｓ９分子（例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子）と比較したときに核酸の一本鎖、例えば核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖の切断（ニッカーゼ活性）を調整する、例えば低下または増加させるその能力；または核酸分子、例えば二本鎖または一本鎖核酸分子を切断する能力を除去し得る。
【０４３３】
修飾切断型活性Ｃａｓ９分子
ある実施形態において、活性Ｃａｓ９分子は、以下の活性の１つ以上を含む：Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性；ＨＮＨドメインに関連する切断活性およびＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性。
【０４３４】
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子はＣａｓ９ニッカーゼであり、例えばＤＮＡの一本鎖のみを切断する。ある実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは配列番号６６１１の１０位における突然変異および／または８４０位における突然変異を含み、例えば、配列番号６６１１に対するＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ突然変異を含む。
【０４３５】
非切断型不活性Ｃａｓ９分子
ある実施形態において、改変Ｃａｓ９分子は、核酸分子を（二本鎖核酸分子または一本鎖核酸分子のいずれも）切断しない、または核酸分子を著しく低い効率で、例えば、本明細書に記載されるアッセイによって例えば計測したときに参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１または０．１％未満の効率で切断する不活性Ｃａｓ９分子である。参照Ｃａｓ９分子は、天然に存在する非修飾Ｃａｓ９分子、例えば、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）または髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子など、天然に存在するＣａｓ９分子であり得る。ある実施形態において、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然に存在するＣａｓ９分子である。ある実施形態において、不活性Ｃａｓ９分子は、実質的なＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性およびＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性を欠いている。
【０４３６】
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子はｄＣａｓ９である。Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：５６９−５７７。
【０４３７】
触媒的に不活性なＣａｓ９分子が転写リプレッサーと融合してもよい。不活性Ｃａｓ９融合タンパク質はｇＲＮＡと複合体化し、ｇＲＮＡの標的化ドメインによって指定されるＤＮＡ配列に局在化するが、活性Ｃａｓ９と異なり、それが標的ＤＮＡを切断することはない。転写抑制ドメインなどのエフェクタードメインを不活性Ｃａｓ９に融合すると、ｇＲＮＡによって指定される任意のＤＮＡ部位にそのエフェクターを動員することが可能になる。Ｃａｓ９融合タンパク質を遺伝子のプロモーター領域に部位特異的に標的化すると、そのプロモーター領域へのポリメラーゼの結合、例えば転写因子（例えば、転写活性化因子）とのＣａｓ９融合および／または核酸への転写エンハンサーの結合を遮断し、またはそれに影響を及ぼして、転写活性化を増加させるかまたは阻害することができる。あるいは、転写リプレッサーとのＣａｓ９融合物を遺伝子のプロモーター領域に部位特異的に標的化することを用いて、転写活性化を低下させることができる。
【０４３８】
不活性Ｃａｓ９分子と融合させ得る転写リプレッサーまたは転写リプレッサードメインには、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）、Ｍａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）またはＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）が含まれ得る。
【０４３９】
別の実施形態において、不活性Ｃａｓ９分子が、クロマチンを修飾するタンパク質と融合してもよい。例えば、不活性Ｃａｓ９分子が、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＳＵＶ３９Ｈ１、ＳＵＶ３９Ｈ２、Ｇ９Ａ、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ  ｌ、Ｐｒ−ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４−２０Ｈ１，ＲＩＺ１）、ヒストンリジンデメチラーゼ（例えば、ＬＳＤ１／ＢＨＣ１１０、ＳｐＬｓｄｌ／Ｓｗ，ｌ／Ｓａｆｌ  １０、Ｓｕ（ｖａｒ）３−３、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、Ｒｐｈｌ、ＪＡＲＩＤ  １Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤＩＢ／ＰＬＵ−Ｉ、ＪＡＲ１Ｄ  １Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、Ｌｉｄ、Ｊｈｎ２、Ｊｍｊ２）、ヒストンリジンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、Ｒｐｄ３、Ｈｏｓｌ、Ｃｉｒ６、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、Ｈｄａｌ、Ｃｉｒ３、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、Ｓｉｒ２、Ｈｓｔｌ、Ｈｓｔ２、Ｈｓｔ３、Ｈｓｔ４、ＨＤＡＣ１１）およびＤＮＡメチラーゼ（ＤＮＭＴ１，ＤＮＭＴ２ａ／ＤＭＮＴ３ｂ、ＭＥＴ１）と融合してもよい。不活性Ｃａｓ９−クロマチン修飾分子融合タンパク質を使用してクロマチン状態を改変し、標的遺伝子の発現を低下させることができる。
【０４４０】
異種配列（例えば、転写リプレッサードメイン）は不活性Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合し得る。代替的実施形態において、異種配列（例えば、転写リプレッサードメイン）は不活性Ｃａｓ９タンパク質の内側部分（すなわち、Ｎ末端またはＣ末端以外の部分）に融合し得る。
【０４４１】
Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が標的核酸に結合してそれを切断する能力は、例えば、本明細書の第ＩＩＩ節に記載される方法によって判定することができる。Ｃａｓ９分子、例えば活性Ｃａｓ９または不活性Ｃａｓ９のいずれかの、単独での、またはｇＲＮＡ分子との複合体での活性も、遺伝子発現アッセイおよびクロマチンに基づくアッセイ、例えばクロマチン免疫沈降（ＣｈｉＰ）およびクロマチンインビボアッセイ（ＣｉＡ）を含め、当該技術分野において周知の方法によって判定し得る。
【０４４２】
他のＣａｓ９分子融合物
実施形態において、Ｃａｓ９分子、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９は、さらなる活性を付与する１つ以上のアミノ酸配列をさらに含み得る。
【０４４３】
一部の態様において、Ｃａｓ９分子は１つ以上の核移行配列（ＮＬＳ）、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるＮＬＳを含み得る。一部の実施形態において、Ｃａｓ９分子は、アミノ末端にまたはその近傍に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれを超えるＮＬＳを含むか、カルボキシ末端にまたはその近傍に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれを超えるＮＬＳを含むか、またはこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端に１つ以上のＮＬＳおよびカルボキシ末端に１つ以上のＮＬＳ）である。２つ以上のＮＬＳが存在するとき、各々は他と独立して選択されてもよく、したがって２つ以上のコピーに単一のＮＬＳが存在することも、および／または１つ以上のコピーに存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組み合わせで存在することもある。一部の実施形態において、ＮＬＳは、ＮＬＳの最も近いアミノ酸がポリペプチド鎖に沿ってＮ末端またはＣ末端から約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０アミノ酸、またはそれを超える範囲内にあるとき、Ｎ末端またはＣ末端の近傍にあると見なされる。典型的には、ＮＬＳは、タンパク質表面に露出した正電荷リジンまたはアルギニンの１つ以上の短い配列からなるが、他のタイプのＮＬＳが公知である。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６６１２）を有する、ＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６６１３）を有するヌクレオプラスミンバイパータイトＮＬＳ；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号６６１４）またはＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰ（配列番号６６１５）を有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹ（配列番号６６１６）を有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ；インポーチン−αのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ（配列番号６６１７）；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（配列番号６６１８）およびＰＰＫＫＡＲＥＤ（配列番号６６１９）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（配列番号６６２０）；マウスｃ−ａｂ１  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（配列番号６６２１）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（配列番号６６２２）およびＰＫＱＫＫＲＫ（配列番号６６２３）；肝炎ウイルスδ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（配列番号６６２４）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（配列番号６６２５）；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ（配列番号６６２６）；およびステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫ（配列番号６６２７）を含むかまたはそれに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。他の好適なＮＬＳ配列は当該技術分野において公知である（例えば、Ｓｏｒｏｋｉｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｍｏｓｃｏｗ）（２００７）７２：１３，１４３９−１４５７；Ｌａｎｇｅ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（２００７）２８２：８，５１０１−５）。
【０４４４】
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子は、例えばＣａｓ９分子のＮ端側に配置された、ＳＶ４０のＮＬＳ配列を含む。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子のＮ端側に配置されたＳＶ４０のＮＬＳ配列およびＣａｓ９分子のＣ端側に配置されたＳＶ４０のＮＬＳ配列を含む。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子のＮ端側に配置されたＳＶ４０のＮＬＳ配列およびＣａｓ９分子のＣ端側に配置されたヌクレオプラスミンのＮＬＳ配列を含む。前述の実施形態のいずれにおいても、この分子は、例えばＮ末端またはＣ末端に、タグ、例えばＨｉｓタグ、例えばＨｉｓ（６）タグまたはＨｉｓ（８）タグをさらに含み得る。
【０４４５】
一部の態様において、Ｃａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子が特異的に認識されることを可能にする１つ以上のアミノ酸配列、例えばタグを含み得る。一実施形態において、タグは、ヒスチジンタグ、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれを超えるヒスチジンアミノ酸を含むヒスチジンタグである。実施形態において、ヒスチジンタグはＨｉｓ６タグ（６個のヒスチジン）である。他の実施形態において、ヒスチジンタグはＨｉｓ８タグ（８個のヒスチジン）である。実施形態において、ヒスチジンタグは、リンカーによってＣａｓ９分子の１つ以上の他の部分と分離されていてもよい。実施形態において、リンカーはＧＧＳである。かかる融合物の例は、Ｃａｓ９分子ｉＰｒｏｔ１０６５２０である。
【０４４６】
一部の態様において、Ｃａｓ９分子は、プロテアーゼによって認識される１つ以上のアミノ酸配列を含み得る（例えば、プロテアーゼ切断部位を含む）。実施形態において、切断部位はタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり、例えば、配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号７８１０）を含む。一部の態様においてプロテアーゼ切断部位、例えばＴＥＶ切断部位は、タグ、例えばＨｉｓタグ、例えばＨｉｓ６またはＨｉｓ８タグとＣａｓ９分子の残りの部分との間に配置される。理論によって拘束されるものではないが、かかる導入により、タグを例えばＣａｓ９分子の精製に使用し、次に続いて切断して、タグがＣａｓ９分子の機能を妨げないようにすることが可能になると考えられる。
【０４４７】
実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子）はＮ末端ＮＬＳおよびＣ末端ＮＬＳを含み（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳを含み）、例えば、ここで、各ＮＬＳはＳＶ４０  ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６６１２））である。実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子）はＮ末端ＮＬＳ、Ｃ末端ＮＬＳ、およびＣ末端Ｈｉｓ６タグを含み（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ−Ｈｉｓタグを含み）、例えば、ここで、各ＮＬＳはＳＶ４０  ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６６１２））である。実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子）はＮ末端Ｈｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ）、Ｎ末端ＮＬＳ、およびＣ末端ＮＬＳを含み（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、Ｈｉｓタグ−ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳを含み）、例えば、ここで、各ＮＬＳはＳＶ４０  ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６６１２））である。実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子）はＮ末端ＮＬＳおよびＣ末端Ｈｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ）を含み（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、Ｈｉｓタグ−Ｃａｓ９−ＮＬＳを含み）、例えば、ここで、ＮＬＳはＳＶ４０  ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６６１２））である。実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子）はＮ末端ＮＬＳおよびＣ末端Ｈｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ）を含み（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、ＮＬＳ−Ｃａｓ９−Ｈｉｓタグを含み）、例えば、ここで、ＮＬＳはＳＶ４０  ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６６１２））である。実施形態において、Ｃａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子）はＮ末端Ｈｉｓタグ（例えば、Ｈｉｓ８タグ）、Ｎ末端切断ドメイン（例えば、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断ドメイン（例えば、配列ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号７８１０）を含む））、Ｎ末端ＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳ；配列番号６６１２）、およびＣ末端ＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳ；配列番号６６１２）を含む（例えば、Ｎ末端からＣ末端に、Ｈｉｓタグ−ＴＥＶ−ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＮＬＳを含む）。前述の実施形態のいずれにおいてもＣａｓ９は配列番号６６１１の配列を有する。あるいは、前述の実施形態のいずれにおいても、Ｃａｓ９は、例えば本明細書に記載されるとおりの、配列番号６６１１のＣａｓ９変異体の配列を有する。前述の実施形態のいずれにおいても、Ｃａｓ９分子は、Ｈｉｓタグと分子の別の部分との間にリンカー、例えばＧＧＳリンカーを含む。上記に記載される例示的Ｃａｓ９分子のアミノ酸配列を以下に提供する。「ｉＰｒｏｔ」識別名は図６０のものと一致する。
【化４１】
2019500043.tif 000129
【化４２】
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【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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【化４６】
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【化４７】
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【化４８】
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【化４９】
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【化５０】
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【化５１】
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【０４４８】
Ｃａｓ９分子をコードする核酸
Ｃａｓ９分子、例えば活性Ｃａｓ９分子または不活性Ｃａｓ９分子をコードする核酸が本明細書に提供される。
【０４４９】
Ｃａｓ９分子をコードする例示的核酸は、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１３，３９９（６１２１）：８１９−８２３；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＣＥＬＬ  ２０１３，１５３（４）：９１０−９１８；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１３，３９９（６１２１）：８２３−８２６；Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１２，３３７（６０９６）：８１６−８２１に記載されている。
【０４５０】
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子をコードする核酸は合成核酸配列であってもよい。例えば、合成核酸分子は、例えば第ＸＩＩＩ節に記載するとおり、化学的に修飾することができる。ある実施形態において、Ｃａｓ９  ｍＲＮＡは以下の特性の１つ以上、例えば全てを有する：これはキャッピングされている、ポリアデニル化されている、５−メチルシチジンおよび／またはプソイドウリジンで置換されている。
【０４５１】
加えてまたは代わりに、合成核酸配列はコドン最適化されてもよく、例えば、少なくとも１つのまれな頻度のコドンまたは低頻度のコドンが高頻度のコドンに置き換えられている。例えば、合成核酸は、例えば本明細書に記載される哺乳動物発現系における発現に例えば最適化された、最適化メッセンジャーｍＲＮＡの合成を導くことができる。
【０４５２】
以下に、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９分子をコードする例示的コドン最適化核酸配列を提供する。
【化５２】
2019500043.tif 000140
【化５３】
2019500043.tif 000141
【化５４】
2019500043.tif 000142
【化５５】
2019500043.tif 000143
【０４５３】
上記のＣａｓ９配列をＣ末端でペプチドまたはポリペプチドと融合させる場合（例えば、Ｃ末端で転写リプレッサーと融合した不活性Ｃａｓ９）、終止コドンは取り除かれるであろうことが理解される。
【０４５４】
ＶＩ．候補分子の機能分析
候補Ｃａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、候補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体は、当該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり評価することができる。例えば、Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価する例示的方法が、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｌ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１２；３３７（６０９６）：８１６−８２１に記載されている。
【０４５５】
ＶＩＩ．鋳型核酸（核酸導入用）
用語「鋳型核酸」または「ドナー鋳型」は、本明細書で使用されるとき、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムによって修飾、例えば切断された標的配列にまたはその近傍に挿入される核酸を指す。ある実施形態において、標的配列のまたはその近傍の核酸配列が、典型的には１つまたは複数の切断部位にまたはその近傍に鋳型核酸の配列の一部または全てを有するように修飾される。ある実施形態において、鋳型核酸は一本鎖である。代替的実施形態において、鋳型核酸は二本鎖である。ある実施形態において、鋳型核酸はＤＮＡ、例えば二本鎖ＤＮＡである。代替的実施形態において、鋳型核酸は一本鎖ＤＮＡである。
【０４５６】
実施形態において、鋳型核酸は、グロビンタンパク質、例えばβグロビンをコードする配列を含み、例えばβグロビン遺伝子を含む。ある実施形態において、核酸によってコードされるβグロビンは１つ以上の突然変異、例えば抗鎌状化突然変異を含む。ある実施形態において、核酸によってコードされるβグロビンは突然変異Ｔ８７Ｑを含む。ある実施形態において、核酸によってコードされるβグロビンは突然変異Ｇ１６Ｄを含む。ある実施形態において、核酸によってコードされるβグロビンは突然変異Ｅ２２Ａを含む。ある実施形態において、βグロビン遺伝子は、突然変異Ｇ１６Ｄ、Ｅ２２ＡおよびＴ８７Ｑを含む。実施形態において、鋳型核酸は、１つ以上の調節エレメント、例えば、プロモーター（例えば、ヒトβグロビンプロモーター）、３’エンハンサー、および／またはグロビン遺伝子座制御領域の少なくとも一部分（例えば、１つ以上のＤＮアーゼＩ高感受性部位（例えば、ヒトグロビン遺伝子座のＨＳ２、ＨＳ３および／またはＨＳ４））をさらに含む。
【０４５７】
他の実施形態において、鋳型核酸は、γグロビンをコードする配列を含み、例えばγグロビン遺伝子を含む。実施形態において、鋳型核酸は、γグロビンタンパク質の２つ以上のコピーをコードする配列を含み、例えば、２つ以上、例えば２つのγグロビン遺伝子配列を含む。実施形態において、鋳型核酸は１つ以上の調節エレメント、例えばプロモーターおよび／またはエンハンサーをさらに含む。
【０４５８】
ある実施形態において、鋳型核酸は、相同組換え修復イベントに関与することによって標的位置の構造を改変する。ある実施形態において、鋳型核酸は標的位置の配列を改変する。ある実施形態において、鋳型核酸は標的核酸への修飾された、または天然に存在しない塩基の取込みをもたらす。
【０４５９】
本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変異は、本明細書で考察する手法の１つを用いて修正し得る。ある実施形態において、本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変異は、鋳型核酸を用いた相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修正される。ある実施形態において、本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変異は、鋳型核酸を用いた相同的組換え（ＨＲ）によって修正される。ある実施形態において、本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変異は、鋳型核酸を用いた非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復によって修正される。他の実施形態において、目的の分子をコードする核酸が、本発明のＣＲＩＳＰＲシステムによって修飾された部位にまたはその近傍に挿入され得る。実施形態において、鋳型核酸は、例えば本明細書に記載されるとおりの、目的の分子をコードする核酸配列に作動可能に連結された調節エレメント、例えば１つ以上のプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。
【０４６０】
ＨＤＲまたはＨＲ修復および鋳型核酸
本明細書に記載されるとおり、ヌクレアーゼ誘導相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同的組換え（ＨＲ）を用いて標的配列を改変し、およびゲノムの突然変異を修正（例えば、修復または編集）することができる。理論によって拘束されることを望むものではないが、標的配列の改変は、ドナー鋳型または鋳型核酸に基づく修復によって起こると考えられる。例えば、ドナー鋳型または鋳型核酸が標的配列の改変をもたらす。プラスミドドナーまたは線状二本鎖鋳型を相同的組換えの鋳型として使用し得ることが企図される。さらに、一本鎖ドナー鋳型を標的配列とドナー鋳型との間の代替的相同組換え修復方法（例えば、一本鎖アニーリング）による標的配列の改変の鋳型として使用し得ることが企図される。ドナー鋳型によって達成される標的配列の改変は、Ｃａｓ９分子による切断に依存し得る。Ｃａｓ９による切断には、二本鎖切断、１つの一本鎖切断、または２つの一本鎖切断が含まれ得る。
【０４６１】
ある実施形態において、突然変異は単一の二本鎖切断または２つの一本鎖切断のいずれによっても修正することができる。ある実施形態において、突然変異は、（１）１つの二本鎖切断、（２）２つの一本鎖切断、（３）標的配列の各側に切断が生じる２つの二本鎖切断、（４）標的配列の各側に二本鎖切断および２つの一本鎖切断が生じる１つの二本鎖切断および２つの一本鎖切断、（５）標的配列の各側に一対の一本鎖切断が生じる４つの一本鎖切断、または（６）１つの一本鎖切断を作り出すＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムおよび鋳型を提供することにより修正し得る。
【０４６２】
二本鎖切断の媒介による修正
ある実施形態において、ＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性とＲｕｖＣ様ドメイン、例えばＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性とを有するＣａｓ９分子、例えば野生型Ｃａｓ９によって二本鎖切断が達成される。かかる実施形態には単一のｇＲＮＡのみが必要である。
【０４６３】
一本鎖切断の媒介による修正
他の実施形態において、ニッカーゼ活性、例えばＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性またはＮ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する切断活性を有するＣａｓ９分子によって２つの一本鎖切断、すなわちニックが達成される。かかる実施形態には、各一本鎖切断の配置につき１つずつ、２つのｇＲＮＡが必要である。ある実施形態において、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断し、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖は切断しない。ある実施形態において、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖を切断せず、むしろｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖を切断する。
【０４６４】
ある実施形態において、ニッカーゼはＨＮＨ活性を有し、例えば、ＲｕｖＣ活性が不活性化されているＣａｓ９分子、例えば、Ｄ１０における突然変異、例えばＤ１０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子である。Ｄ１０ＡはＲｕｖＣを不活性化する。したがって、Ｃａｓ９ニッカーゼはＨＮＨ活性（のみ）を有し、ｇＲＮＡがハイブリダイズする鎖（例えば、そこにＮＧＧ  ＰＡＭを有しない相補鎖）を切断することになる。他の実施形態において、Ｈ８４０、例えばＨ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９分子をニッカーゼとして使用することができる。Ｈ８４０ＡはＨＮＨを不活性化する。したがって、Ｃａｓ９ニッカーゼはＲｕｖＣ活性（のみ）を有し、非相補鎖（例えば、ＮＧＧ  ＰＡＭを有し、かつその配列がｇＲＮＡと同一である鎖）を切断する。
【０４６５】
ニッカーゼおよび２つのｇＲＮＡを使用して２つの一本鎖ニックを配置する実施形態において、１つのニックは標的核酸の＋鎖上にあり、１つのニックは−鎖上にある。ＰＡＭは外側に面している。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡが約０〜５０、０〜１００、または０〜２００ヌクレオチド分離されるように選択することができる。ある実施形態において、２つのｇＲＮＡの標的化ドメインと相補的な標的配列間にオーバーラップはない。ある実施形態において、ｇＲＮＡはオーバーラップせず、５０、１００、または２００ヌクレオチドほども分離されている。ある実施形態において、２つのｇＲＮＡを使用すると、例えばオフターゲット結合が減少することにより特異性が増加し得る（Ｒａｎ  ｅｌ  ｃｉｌ．，ＣＥＬＬ  ２０１３）。
【０４６６】
ある実施形態では、単一のニックを使用してＨＤＲが誘導され得る。本明細書では、単一のニックを使用して所与の切断部位におけるＨＤＲ、ＨＲまたはＮＨＥＪ率を増加させ得ることが企図される。
【０４６７】
標的位置に対する二本鎖切断または一本鎖切断の配置
鎖の一方における二本鎖切断点または一本鎖切断点は、修正が起こるように標的位置に十分に近くなければならない。ある実施形態において、距離は５０、１００、２００、３００、３５０または４００ヌクレオチド以下である。理論によって拘束されることを望むものではないが、切断点は、末端リセクション間に切断点がエキソヌクレアーゼ媒介性の除去を受ける領域内にあるように、標的位置に十分に近くなければならないと考えられる。ドナー配列は末端リセクション領域内の配列の修正にのみ用いられ得ることに伴い、標的位置と切断点との間の距離が離れ過ぎている場合、末端リセクションに突然変異が含まれないこともあり、したがって修正されないこともある。
【０４６８】
ｇＲＮＡ（単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ）およびＣａｓ９ヌクレアーゼがＨＤＲ媒介性またはＨＲ媒介性の修正を誘導する目的で二本鎖切断を誘導する実施形態において、切断部位は標的位置から０〜２００ｂｐ（例えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜２００、２５〜１７５、２５〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、７５〜１００ｂｐ）離れている。ある実施形態において、切断部位は標的位置から０〜１００ｂｐ（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜１００、５０〜７５または７５〜１００ｂｐ）離れている。
【０４６９】
Ｃａｓ９ニッカーゼと複合体化した２つのｇＲＮＡ（独立に、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ）がＨＤＲ媒介性の修正を誘導する目的で２つの一本鎖切断を誘導する実施形態において、近い方のニックは標的位置から０〜２００ｂｐ（例えば、０〜１７５、０〜１５０、０〜１２５、０〜１００、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜２００、２５〜１７５、２５〜１５０、２５〜１２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜２００、５０〜１７５、５０〜１５０、５０〜１２５、５０〜１００、５０〜７５、７５〜２００、７５〜１７５、７５〜１５０、７５〜１２５、７５〜１００ｂｐ）離れており、および２つのニックは、理想的には互いから２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、３０〜５５、３０〜５０、３０〜４５、３０〜４０、３０〜３５、３５〜５５、３５〜５０、３５〜４５、３５〜４０、４０〜５５、４０〜５０、４０〜４５ｂｐ）にあり、互いに１００ｂｐ以下離れている（例えば、互いに９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０または５ｂｐ以下離れている）。ある実施形態において、切断部位は標的位置から０〜１００ｂｐ（例えば、０〜７５、０〜５０、０〜２５、２５〜１００、２５〜７５、２５〜５０、５０〜１００、５０〜７５または７５〜１００ｂｐ）離れている。
【０４７０】
一実施形態において、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡが、標的位置の両側に二本鎖切断を置くように構成される。代替的実施形態において、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡが、標的位置のいずれかの側に二本鎖切断（すなわち、１つのｇＲＮＡがＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体化する）、および２つの一本鎖切断または対をなす一本鎖切断（すなわち、２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）を置くように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて標的位置の上流（すなわち５’側）を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて標的位置の下流（すなわち３’側）を標的化する）。別の実施形態において、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡが、標的位置のいずれかの側に２対の一本鎖切断を生じさせる（すなわち、２対の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）ように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて標的位置の上流（すなわち５’側）を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて標的位置の下流（すなわち３’側）を標的化する）。二本鎖切断または対における２つの一本鎖ニックのうちのより近い方は、理想的には標的位置から０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０または２５ｂｐ以下）にあり得る。ニッカーゼが用いられる場合、対における２つのニックは互いから２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐ）にあり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。
【０４７１】
一実施形態において、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡが、標的位置の両側に二本鎖切断を置くように構成される。代替的実施形態において、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡが、２つの標的配列に二本鎖切断（すなわち、１つのｇＲＮＡがＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体化する）および２つの一本鎖切断または対をなす一本鎖切断（すなわち、２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）を置くように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて挿入部位の上流（すなわち５’側）の標的配列を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて下流（すなわち３’側）の標的配列を標的化する）。別の実施形態において、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡが、挿入部位のいずれかの側に２対の一本鎖切断を生じさせる（すなわち、２対の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）ように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される上流（すなわち５’側）の標的配列を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される下流（すなわち３’側）の標的配列を標的化する）。二本鎖切断または対における２つの一本鎖ニックのうちのより近い方は、理想的には標的位置から０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０または２５ｂｐ以下）である。ニッカーゼが用いられる場合、対における２つのニックは互いから２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐ）にあり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。
【０４７２】
相同性アームの長さ
相同性アームは、例えばリセクションされた一本鎖オーバーハングがドナー鋳型内の相補領域を見付けることを可能にするため、少なくとも末端リセクションが起こり得る領域のところまで延在しなければならない。全長は、プラスミドサイズまたはウイルスパッケージング限界などのパラメータによって制限され得る。ある実施形態において、相同性アームは反復エレメント、例えばＡＬＵリピート、ＬＩＮＥリピートまでは延在しない。鋳型は同じまたは異なる長さの２つの相同性アームを有し得る。
【０４７３】
例示的相同性アーム長さは、少なくとも２５、５０、１００、２５０、５００、７５０または１０００ヌクレオチドを含む。
【０４７４】
標的位置とは、本明細書で使用されるとき、Ｃａｓ９分子依存的過程によって修飾される標的核酸（例えば、染色体）上の部位を指す。例えば、標的位置は、修飾Ｃａｓ９分子による標的核酸の切断および鋳型核酸によって導かれる標的位置の修飾、例えば修正であってもよい。ある実施形態において、標的位置は、１つ以上のヌクレオチドが付加される標的核酸上の２つのヌクレオチド間、例えば隣接ヌクレオチド間の部位であり得る。標的位置は、鋳型核酸によって改変、例えば修正される１つ以上のヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、標的位置は標的配列（例えば、ｇＲＮＡが結合する配列）の範囲内にある。ある実施形態において、標的位置は標的配列（例えば、ｇＲＮＡが結合する配列）の上流または下流にある。
【０４７５】
典型的には、鋳型配列は標的配列との切断媒介性または触媒性の組換えを起こす。ある実施形態において、鋳型核酸は、Ｃａｓ９媒介性の切断イベントによって切断される標的配列上の部位に対応する配列を含む。ある実施形態において、鋳型核酸は、第１のＣａｓ９媒介性イベントで切断される標的配列上の第１の部位と、第２のＣａｓ９媒介性イベントで切断される標的配列上の第２の部位との両方に対応する配列を含む。
【０４７６】
ある実施形態において、鋳型核酸は、翻訳配列のコード配列の改変を生じさせる配列、例えばタンパク質産物における１つのアミノ酸の別のアミノ酸との、例えば突然変異アレルを野生型アレルに転換する、野生型アレルを突然変異アレルに転換する、および／または終止コドンを導入する置換、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、またはナンセンス突然変異を生じさせる配列を含み得る。
【０４７７】
他の実施形態において、鋳型核酸は、非コード配列の改変、例えば、エクソンまたは５’もしくは３’非翻訳または非転写領域の改変を生じさせる配列を含み得る。かかる改変には、制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサーの改変、およびシス作用またはトランス作用制御エレメントの改変が含まれる。
【０４７８】
鋳型核酸は、組み込まれたときに以下を生じさせる配列を含み得る：
ポジティブ制御エレメントの活性の低下；
ポジティブ制御エレメントの活性の増加；
ネガティブ制御エレメントの活性の低下；
ネガティブ制御エレメントの活性の増加；
遺伝子の発現の低下；
遺伝子の発現の増加；
障害または疾患に対する抵抗性の増加；
ウイルス侵入に対する抵抗性の増加；
突然変異の修正または望ましくないアミノ酸残基の改変；
遺伝子産物の生物学的特性の付与、増加、消失または低下、例えば、酵素の酵素活性の増加、または遺伝子産物が別の分子と相互作用する能力の増加。
【０４７９】
鋳型核酸は、以下を生じさせる配列を含み得る：
標的配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヌクレオチドまたはそれを超える配列の変化。
【０４８０】
ある実施形態において、鋳型核酸は、２０±１０、３０±１０、４０±１０、５０±１０、６０±１０、７０±１０、８０±１０、９０±１０、１００±１０、１１０±１０、１２０±１０、１３０±１０、１４０±１０、１５０±１０、１６０±１０、１７０±１０、１８０±１０、１９０±１０、２００±１０、２１０±１０、２２０±１０、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、９００〜１０００、１０００〜２０００、２０００〜３０００または３０００超のヌクレオチド長である。
【０４８１】
鋳型核酸は、以下の成分を含む：
［５’相同性アーム］−［挿入配列］−［３’相同性アーム］。
【０４８２】
相同性アームは染色体への組換えをもたらし、これにより、望ましくないエレメント、例えば突然変異またはシグネチャを置換配列に置き換えることができる。ある実施形態において、相同性アームは最も遠位の切断部位に隣接する。
【０４８３】
ある実施形態において、５’相同性アームの３’末端は置換配列の５’末端の隣の位置である。ある実施形態において、５’相同性アームは、置換配列の５’末端から５’側に少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチド延在し得る。
【０４８４】
ある実施形態において、３’相同性アームの５’末端は置換配列の３’末端の隣の位置である。ある実施形態において、３’相同性アームは、置換配列の３’末端から３’側に少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１５０、１８０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、または２０００ヌクレオチド延在し得る。
【０４８５】
本明細書では、一方または両方の相同性アームを短縮することにより特定の配列リピートエレメント、例えば、Ａｌｕリピート、ＬＩＮＥエレメントが含まれることを回避し得ることが企図される。例えば、５’相同性アームを短縮して配列リピートエレメントを回避し得る。他の実施形態では、３’相同性アームを短縮して配列リピートエレメントを回避し得る。一部の実施形態では、５’および３’相同性アームの両方を短縮して特定の配列リピートエレメントが含まれることを回避し得る。
【０４８６】
本明細書では、突然変異の修正用の鋳型核酸を一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）として用いられるように設計し得ることが企図される。ｓｓＯＤＮを使用するとき、５’および３’相同性アームは最大約２００塩基対（ｂｐ）長、例えば、少なくとも２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ｂｐ長までの範囲となり得る。ｓｓＯＤＮについては、オリゴヌクレオチド合成が改善され続けるように、より長い相同性アームも企図される。
【０４８７】
遺伝子ターゲティングのためのＮＨＥＪ手法
本明細書に記載されるとおり、ヌクレアーゼ誘導性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を用いて遺伝子特異的ノックアウトを標的化することができる。ヌクレアーゼ誘導性ＮＨＥＪを用いてまた、目的の遺伝子の配列を除去する（例えば、欠失させる）こともできる。
【０４８８】
理論によって拘束されることを望むものではないが、ある実施形態において、本明細書に記載される方法に関連するゲノム改変は、ヌクレアーゼ誘導性ＮＨＥＪおよびＮＨＥＪ修復経路のエラープローン的性質に頼るものであると考えられる。ＮＨＥＪはＤＮＡの二本鎖切断を、その両端を共につなぎ合わせることによって修復する。しかしながら、概して、２つの適合性のある末端が二本鎖切断による形成時そのままに完全にライゲートされる場合に限り、元の配列が復元される。二本鎖切断のＤＮＡ末端は高頻度で酵素的処理の対象となるため、それらの末端が再びつなぎ合わされる前に一方または両方の鎖にヌクレオチドの付加または除去が生じる。この結果、ＮＨＥＪ修復部位のＤＮＡ配列に挿入および／または欠失（インデル）突然変異が存在することになる。これらの突然変異の３分の２はリーディングフレームを改変し、したがって非機能性タンパク質を生じ得る。加えて、リーディングフレームを維持するが、多量の配列を挿入し、または欠失させる突然変異が、タンパク質の機能を破壊し得る。重要な機能ドメインにおける突然変異はタンパク質の重要でない領域における突然変異と比べて許容されない可能性が高いため、これは遺伝子座依存的である。
【０４８９】
ＮＨＥＪによって作成されるインデル突然変異は本質的に予測不可能である。しかしながら、所与の切断部位で特定のインデル配列が優先され、集団中に多く出現する。欠失の長さは幅広く異なり得、最も一般的には１〜５０ｂｐの範囲であるが、１００〜２００ｂｐ超にも容易に達し得る。挿入はそれより短い傾向があり、切断部位を直接取り囲む配列の短い重複を含むことが多い。しかしながら、大きい挿入を達成することが可能であり、その場合、挿入された配列は、ゲノムの他の領域までまたは細胞中に存在するプラスミドＤＮＡまで至ることが多い。
【０４９０】
ＮＨＥＪは変異原性過程であるため、特定の最終配列の作成が不要である限り、ＮＨＥＪを用いて小さい配列モチーフを欠失させることができる。二本鎖切断が短い標的配列の近傍に標的化される場合、ＮＨＥＪ修復によって引き起こされる欠失突然変異は多くの場合に望ましくないヌクレオチドに及び、したがってそれを除去する。より大きいＤＮＡセグメントの欠失については、その配列の各側に１つずつ、２つの二本鎖切断を導入すると、末端間でＮＨＥＪが生じ、介在配列全体が除去され得る。これらの手法は両方とも、特異的ＤＮＡ配列の欠失に用いることができる。しかしながら、ＮＨＥＪのエラープローンの性質は、なおも修復部位にインデル突然変異を生じさせ得る。
【０４９１】
本明細書に記載される方法および組成物では、ＮＨＥＪ媒介性インデルの作成に、二本鎖切断Ｃａｓ９分子および一本鎖、またはニッカーゼＣａｓ９分子の両方を使用することができる。遺伝子、例えば目的の遺伝子のコード領域、例えば初期コード領域を標的とするＮＨＥＪ媒介性インデルを用いて目的の遺伝子をノックアウトする（すなわち、その発現を消失させる）ことができる。例えば、目的の遺伝子の初期コード領域は、転写開始部位の直後、コード配列の最初のエクソンの範囲内、または転写開始部位から５００ｂｐ（例えば、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００または５０ｂｐ未満）の範囲内の配列を含む。
【０４９２】
標的位置に対する二本鎖または一本鎖切断の配置
ＮＨＥＪ媒介性インデルを誘導する目的でｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼが二本鎖切断を作成する実施形態において、ｇＲＮＡ、例えば単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡ分子は、標的位置のヌクレオチドにごく接近して１つの二本鎖切断を置くように構成される。ある実施形態において、切断部位は標的位置から０〜５００ｂｐ（例えば、標的位置から５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｂｐ未満）離れている。
【０４９３】
ＮＨＥＪ媒介性インデルを誘導する目的で２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化して２つの一本鎖切断を誘導する実施形態において、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡは、標的位置のヌクレオチドのＮＨＥＪ修復をもたらすため２つの一本鎖切断を置くように構成される。ある実施形態において、ｇＲＮＡは、本質的に二本鎖切断を模倣して、異なる鎖上の同じ位置に、または互いから数ヌクレオチド以内に切断を置くように構成される。ある実施形態において、近い方のニックは標的位置から０〜３０ｂｐ（例えば、標的位置から３０、２５、２０、１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ｂｐ未満）離れており、および２つのニックは互いから２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐ）にあり、互いから１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。ある実施形態において、ｇＲＮＡは標的位置のヌクレオチドのいずれかの側に一本鎖切断を配置するように構成される。
【０４９４】
本明細書に記載される方法および組成物では、標的位置の両側への切断の作成に、二本鎖切断Ｃａｓ９分子および一本鎖、またはニッカーゼＣａｓ９分子の両方を使用することができる。標的位置の両側に二本鎖または対をなす一本鎖切断を作成して、２つのカット間にある核酸配列を除去し得る（例えば、２つの切断間にある領域が欠失する）。一実施形態において、２つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡが、標的位置の両側に二本鎖切断を置くように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変異の上流（すなわち５’側）を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変異の下流（すなわち３’側）を標的化する）。代替的実施形態において、３つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡが、標的位置のいずれかの側に二本鎖切断を置き（すなわち、１つのｇＲＮＡがＣａｓ９ヌクレアーゼと複合体化する）および２つの一本鎖切断または対をなす一本鎖切断を置く（すなわち、２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）ように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変異の上流（すなわち５’側）を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変異の下流（すなわち３’側）を標的化する）。別の実施形態において、４つのｇＲＮＡ、例えば、独立に、単分子（またはキメラ）またはモジュラーｇＲＮＡが、標的位置のいずれかの側に２対の一本鎖切断を生じさせる（すなわち、２対の２つのｇＲＮＡがＣａｓ９ニッカーゼと複合体化する）ように構成される（例えば、第１のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変異の上流（すなわち５’側）を標的化し、第２のｇＲＮＡを用いて本明細書に記載される遺伝子または経路における突然変異の下流（すなわち３’側）を標的化する）。１つまたは複数の二本鎖切断または対における２つの一本鎖ニックのうちのより近い方は、理想的には、標的位置から０〜５００ｂｐ以内（例えば、標的位置から４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０または２５ｂｐ以下）にあり得る。ニッカーゼが用いられる場合、対における２つのニックは互いから２５〜５５ｂｐ以内（例えば、２５〜５０、２５〜４５、２５〜４０、２５〜３５、２５〜３０、５０〜５５、４５〜５５、４０〜５５、３５〜５５、３０〜５５、３０〜５０、３５〜５０、４０〜５０、４５〜５０、３５〜４５、または４０〜４５ｂｐ）にあり、互いに１００ｂｐ以下（例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｂｐ以下）離れている。
【０４９５】
他の実施形態において、鋳型核酸の挿入はマイクロホモロジー末端結合（ＭＭＥＪ）によって媒介され得る。例えば、Ｓａｋｓｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，「ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９をＰＩＴＣｈシステムと共に用いたＭＭＥＪに基づく遺伝子ノックイン（ＭＭＥＪ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ＴＡＬＥＮｓ  ａｎｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＰＩＴＣｈ  ｓｙｓｔｅｍｓ）」Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １１，１１８−１３３（２０１６）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１５．１４０、２０１５年１２月１７日オンライン発表（この内容は全体として参照により援用される）を参照されたい。
【０４９６】
ＶＩＩＩ．２つ以上のｇＲＮＡ分子を含むシステム
理論によって拘束されることを意図するものではないが、意外にも、本明細書では、連続核酸上でごく近接して位置する２つの標的配列を（例えば、各々がそのそれぞれの標的配列にまたはその近傍に一本鎖または二本鎖切断を誘導する２つのｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体によって）標的化すると、２つの標的配列間に位置する核酸配列（または核酸配列の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の切り出し（例えば、欠失）が誘導されることが示されている。一部の態様において、本開示は、連続核酸、例えば染色体、例えばそのイントロン、エクソンおよび調節エレメントを含めた遺伝子または遺伝子座上でごく近接した標的配列を標的化する標的化ドメインを含む２つ以上のｇＲＮＡ分子の使用を提供する。この使用は、例えば、２つ以上のｇＲＮＡ分子を１つ以上のＣａｓ９分子と共に（または２つ以上のｇＲＮＡ分子および／または１つ以上のＣａｓ９分子をコードする核酸を）細胞に導入することにより得る。
【０４９７】
一部の態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子の標的配列は連続核酸上で５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、または１５，０００ヌクレオチド以上離れ、連続核酸上で２５，０００ヌクレオチド以下離れて位置する。ある実施形態において、これらの標的配列は約４０００ヌクレオチド離れて位置する。ある実施形態において、これらの標的配列は約６０００ヌクレオチド離れて位置する。
【０４９８】
一部の態様において、複数のｇＲＮＡ分子は、それぞれ同じ遺伝子内または遺伝子座内の配列を標的とする。別の態様において、複数のｇＲＮＡ分子は、それぞれ２つ以上の異なる遺伝子内の配列を標的とする。
【０４９９】
一部の態様において、本発明は、本発明のｇＲＮＡ分子を複数、例えば、２つ以上、例えば２つ含む組成物および細胞を提供し、ここで、複数のｇＲＮＡ分子は、１５，０００未満、１４，０００未満、１３，０００未満、１２，０００未満、１１，０００未満、１０，０００未満、９，０００未満、８，０００未満、７，０００未満、６，０００未満、５，０００未満、４，０００未満、３，０００未満、２，０００未満、１，０００未満、９００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満、３００未満、２００未満、１００未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、または３０未満のヌクレオチド離れた配列を標的とする。ある実施形態において、これらの標的配列は二重鎖核酸の同じ鎖上にある。ある実施形態において、これらの標的配列は二重鎖核酸の異なる鎖上にある。
【０５００】
一実施形態において、本発明は、二重鎖核酸の同じまたは異なる鎖上で２５，０００未満、２０，０００未満、１５，０００未満、１４，０００未満、１３，０００未満、１２，０００未満、１１，０００未満、１０，０００未満、９，０００未満、８，０００未満、７，０００未満、６，０００未満、５，０００未満、４，０００未満、３，０００未満、２，０００未満、１，０００未満、９００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満、３００未満、２００未満、１００未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、または３０未満のヌクレオチド離れて配置された２つのｇＲＮＡ結合部位間に配置された核酸を切り出す（例えば、欠失させる）方法を提供する。ある実施形態において、この方法は、各ｇＲＮＡ結合部位に関連するＰＡＭ部位間に配置されたヌクレオチドの５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、または１００％の欠失をもたらす。実施形態において、この欠失は、各ｇＲＮＡ結合部位に関連するＰＡＭ部位の１つ以上の範囲内にある１つ以上のヌクレオチドをさらに含む。実施形態において、この欠失は、各ｇＲＮＡ結合部位に関連するＰＡＭ部位間の領域外にある１つ以上のヌクレオチドも含む。
【０５０１】
一態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、遺伝子調節エレメント、例えば、プロモーター結合部位、エンハンサー領域、またはリプレッサー領域に隣接する標的配列を標的化する標的化ドメインを含み、介在配列（または介在配列の一部分）の切り出しにより目的の遺伝子の上方制御または下方制御を生じさせる。
【０５０２】
ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表１または表５の標的化ドメイン配列を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、同じ遺伝子内の配列に相補的な標的化ドメインを含む。態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、異なる遺伝子の配列に相補的な標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表６の標的化ドメイン配列を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表２、表７、表８および／または表９の標的化ドメイン配列を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、同じ遺伝子内の配列に相補的な標的化ドメインを含む。態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、異なる遺伝子の配列に相補的な標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表７、表８および／または表９のｇＲＮＡ分子から選択される。ある実施形態において、第１および第２のｇＲＮＡ分子は、表１〜表９から選択される標的化ドメイン配列を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含み、かつ異なる表から選択され、例えば、かつ異なる遺伝子の配列に相補的な標的化ドメインを含む。
【０５０３】
一態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、遺伝子調節エレメント、例えば、プロモーター結合部位、エンハンサー領域、またはリプレッサー領域に隣接する標的配列を標的化する標的化ドメインを含み、介在配列（または介在配列の一部分）の切り出しにより目的の遺伝子の上方制御または下方制御を生じさせる。例として、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、ＢＣＬ１１ａ遺伝子の赤血球系エンハンサー領域の（例えば、＋５５、＋５８または＋６２領域内の）ＧＡＴＡ１結合部位（またはその一部分）またはＴＡＬ１結合部位（またはその一部分）に隣接する標的配列を標的化する標的化ドメインを含む。他の実施形態において、１つまたは複数のｇＲＮＡ分子は、ＢＣＬ１１ａエンハンサー内のＧＡＴＡ１結合部位またはＴＡＬ１結合部位の破壊をもたらさない。
【０５０４】
ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表１から選択される標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表２から選択される標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表３から選択される標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表４から選択される標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表５から選択される標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表６から選択される標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表７から選択される標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表８から選択される標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。ある実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、表９から選択される標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
【０５０５】
態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、上記の第ＩＩ節に挙げられる標的化ドメイン配列対を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
【０５０６】
理論によって拘束されるものではないが、胎児ヘモグロビン（例えば、γグロビン）の発現が増加すると同時にβグロビン（例えば、鎌状赤血球化突然変異を含むβグロビン）の発現が減少または消失することにより、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球症の治療における有効性の増加がもたらされるであろうことが考えられる。したがって、一態様において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、γグロビン発現の増加を生じさせる第１のｇＲＮＡ分子と、βグロビン、例えば鎌状赤血球突然変異を有するβグロビンの発現を減少または消失させる第２のｇＲＮＡ分子とを含む。実施形態において、２つ以上のｇＲＮＡ分子は、例えば本明細書に記載されるとおりの、ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域内にある配列を標的とする第１のｇＲＮＡ分子、例えば、表７、表８または表９の標的化ドメインを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子と、鎌状グロビン遺伝子（例えば、鎌状赤血球化突然変異を含むβグロビン遺伝子）の配列を標的とする第２のｇＲＮＡ分子とを含む。
【０５０７】
ＩＸ．ｇＲＮＡの特性
さらに、意外にも、本明細書では、ｇＲＮＡ分子および前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムが、同じ細胞型、送達方法およびｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒ成分を使用すると複数の実験にわたって同様または同一のインデルパターンを生じることが示されている。理論によって拘束されるものではないが、ある種のインデルパターンが他よりも有利であり得ると考えられる。例えば、「フレームシフト突然変異」（例えば、１塩基対または２塩基対の挿入または欠失、またはｎ／３（式中、ｎ＝挿入または欠失におけるヌクレオチドの数）が整数でない場合の任意の挿入または欠失）をもたらす挿入および／または欠失を主に含むインデルが、機能タンパク質の発現を低下または消失させるのに有益であり得る。同様に、「大規模欠失」（１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、または３０ヌクレオチドより多い欠失）を主に含むインデルも、例えば、同様に機能タンパク質の発現に向上した効果を及ぼし得るプロモーター結合部位などの重要な調節配列の除去に有益であり得る。所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムによって誘導されるインデルパターンは、意外にも、本明細書に記載されるとおり、細胞型にわたって一貫して再現されることが分かっているが、所与の細胞においてｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムの導入時にいずれかの単一のインデル構造が必ず生じるわけではない。
【０５０８】
したがって本発明は、例えばフレームシフト突然変異および／または大規模欠失で主に構成されるインデルパターンまたは構造を有する有益なインデルパターンまたは構造を作り出すｇＲＮＡ分子を提供する。かかるｇＲＮＡ分子は、試験細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）または目的の細胞、例えばＨＳＰＣ細胞で候補ｇＲＮＡ分子によって作り出されたインデルパターンまたは構造を本明細書に記載されるとおりＮＧＳによって評価することにより選択し得る。実施例に示すとおり、所望の細胞集団に導入されると、標的遺伝子にフレームシフト突然変異を有する細胞が大きな割合を占める細胞の集団をもたらすｇＲＮＡ分子が発見されている。ある場合には、フレームシフト突然変異の比率は、７５％、８０％、８５％、９０％またはそれを超える高さである。したがって本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位にまたはその近傍に、例えば本明細書に記載されるとおりのフレームシフト突然変異を有する細胞が少なくとも約４０％（例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）を占める細胞の集団を提供する。本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位にまたはその近傍に、例えば本明細書に記載されるとおりのフレームシフト突然変異を有する細胞が少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）を占める細胞の集団も提供する。
【０５０９】
したがって本発明は、本発明の治療方法に用いられるｇＲＮＡ分子を選択する方法であって、１）目的の標的に対する複数のｇＲＮＡ分子を提供することと、２）前記ｇＲＮＡ分子の使用によって作り出されるインデルパターンまたは構造を評価することと、３）フレームシフト突然変異、大規模欠失またはこれらの組み合わせで主に構成されるインデルパターンまたは構造を形成するｇＲＮＡ分子を選択することと、４）前記選択されたｇＲＮＡを本発明の方法において使用することとを含む方法を提供する。
【０５１０】
本発明はさらに、細胞を改変する方法、および改変された細胞を提供し、ここで、その細胞型では所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムで一貫して特定のインデルパターンが作製される。本明細書に記載されるｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムで観察される最も出現頻度が高い上位５つのインデルを含め、インデルパターンが、例えば実施例に開示される。実施例に示すとおり、細胞の集団が作成され、ここで、細胞の大きい割合が上位５つのインデルの１つを含む（例えば、集団の細胞の３０％超、４０％超、５０％超、６０％超またはそれを超えて上位５つのインデルの１つが存在する細胞の集団。したがって、本発明は、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムで観察される上位５つのインデルのいずれか１つのインデルを含む細胞、例えばＨＳＰＣ（本明細書に記載されるとおりの）を提供する。さらに、本発明は、例えばＮＧＳによって評価したとき、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムについて本明細書に記載される上位５つのインデルの１つを含む細胞が高いパーセンテージを占める細胞の集団、例えばＨＳＰＣの集団（本明細書に記載されるとおりの）を提供する。インデルパターン分析との関連において使用するとき、「高いパーセンテージ」は、集団の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）の細胞が所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムについて本明細書に記載される上位５つのインデルの１つを含むことを指す。他の実施形態において、細胞の集団は、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムについて本明細書に記載される上位５つのインデルの１つを有する細胞が少なくとも約２５％（例えば、約２５％〜約６０％、例えば約２５％〜約５０％、例えば約２５％〜約４０％、例えば約２５％〜約３５％）を占める。実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの＋５８領域を標的とする所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムについて、上位のインデル、例えば上位５つのインデルは、表１５、図２５、および表３７に提供される。実施形態において、ＨＰＦＨ領域を標的とする所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムについて、上位のインデル、例えば上位５つのインデルは、表２６、表２７および表３７に提供される。
【０５１１】
また、特定のｇＲＮＡ分子が、標的細胞型のゲノム内にあるオフターゲット配列にインデルを生成しない、またはオフターゲット部位では標的部位におけるインデル生成頻度と比べて極めて低い頻度（例えば、集団中の細胞の＜５％）でインデルを生じることも発見されている。したがって、本発明は、標的細胞型においてオフターゲットインデル形成を呈しない、または＜５％の頻度のオフターゲットインデル形成を生じるｇＲＮＡ分子およびＣＲＩＳＰＲシステムを提供する。実施形態において、本発明は、標的細胞型においていかなるオフターゲットインデル形成も呈しないｇＲＮＡ分子およびＣＲＩＳＰＲシステムを提供する。したがって、本発明はさらに、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位にまたはその近傍にインデル（例えば、フレームシフトインデル、または例えば本明細書に記載されるとおりの、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムによって生じる上位５つのインデルのいずれか１つ）を含むが、ｇＲＮＡ分子のいかなるオフターゲット部位にもインデルを含まない、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞、例えば細胞の集団、例えばＨＳＰＣの集団を提供する。他の実施形態において、本発明はさらに、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的部位にまたはその近傍にインデル（例えば、フレームシフトインデル、または例えば本明細書に記載されるとおりの、所与のｇＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲシステムによって生じる上位５つのインデルのいずれか１つ）を有する細胞が＞５０％を占めるが、ｇＲＮＡ分子の任意のオフターゲット部位にインデルを含む細胞は５％未満、例えば、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満を占める、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団、例えばＨＳＰＣの集団を提供する。
【０５１２】
実施形態において、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム）によって生じるインデルは、ＧＡＴＡ−１結合部位のヌクレオチドを含まず、および／またはＴＡＬ−１結合部位のヌクレオチドを含まない（例えば、図２５に記載されるＧＡＴＡ−１結合部位および／またはＴＡＬ−１結合部位のヌクレオチドを含まない）。
【０５１３】
Ｘ．送達／コンストラクト
成分、例えばＣａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子、または両方は、種々の形態で送達、製剤化、または投与することができる。非限定的な例として、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子は、（１つ以上の組成物に）製剤化し、ゲノム編集イベントが所望される細胞に直接送達または投与することができる。あるいは、１つ以上の成分、例えばＣａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子、または両方をコードする核酸を（１つ以上の組成物に）製剤化して送達または投与することもできる。一態様において、ｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡとして提供され、およびＣａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子をコードするＤＮＡとして提供される。一実施形態において、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子とは別個の核酸分子上にコードされる。一実施形態において、ｇＲＮＡ分子とＣａｓ９分子とは同じ核酸分子上にコードされる。一態様において、ｇＲＮＡ分子はＲＮＡとして提供され、およびＣａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子をコードするＤＮＡとして提供される。一実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、例えば本明細書に記載されるとおりの、１つ以上の修飾を伴い提供される。一態様において、ｇＲＮＡ分子はＲＮＡとして提供され、およびＣａｓ９分子は、Ｃａｓ９分子をコードするｍＲＮＡとして提供される。一態様において、ｇＲＮＡ分子はＲＮＡとして提供され、およびＣａｓ９分子はタンパク質として提供される。一実施形態において、ｇＲＮＡおよびＣａｓ９分子はリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）として提供される。一態様において、ｇＲＮＡ分子は、ｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡとして提供され、およびＣａｓ９分子はタンパク質として提供される。
【０５１４】
送達、例えばＲＮＰの（例えば、本明細書に記載されるとおりのＨＳＰＣ細胞への）送達は、例えば、エレクトロポレーション（例えば、当該技術分野において公知のとおりの）または細胞膜を核酸および／またはポリペプチド分子に対して透過性にする他の方法により達成し得る。実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば本明細書に記載されるとおりのＲＮＰは、エレクトロポレーションにより、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いて、例えば、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）のプログラムＣＭ−１３７を用いて送達される。実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば本明細書に記載されるとおりのＲＮＰは、エレクトロポレーションにより、約８００ボルト〜約２０００ボルト、例えば約１０００ボルト〜約１８００ボルト、例えば約１２００ボルト〜約１８００ボルト、例えば約１４００ボルト〜約１８００ボルト、例えば約１６００ボルト〜約１８００ボルト、例えば約１７００ボルトの電圧を用いて、例えば１７００ボルトの電圧で送達される。実施形態において、パルス幅／パルス長は約１０ｍｓ〜約５０ｍｓ、例えば約１０ｍｓ〜約４０ｍｓ、例えば約１０ｍｓ〜約３０ｍｓ、例えば約１５ｍｓ〜約２５ｍｓ、例えば約２０ｍｓ、例えば２０ｍｓである。実施形態において、１、２、３、４、５つ、またはそれを超える、例えば２つ、例えば１つのパルスが用いられる。ある実施形態において、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば本明細書に記載されるとおりのＲＮＰは、エレクトロポレーションにより、約１７００ボルト（例えば、１７００ボルト）の電圧、約２０ｍｓ（例えば、２０ｍｓ）のパルス幅を用いて、単一（１つ）のパルスを用いて送達される。実施形態において、エレクトロポレーションはＮｅｏｎエレクトロポレーターを使用して達成される。膜透過性にするためのさらなる技法は当該技術分野において公知であり、例えば、セルスクイージング（ｃｅｌｌ  ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）（例えば、国際公開第２０１５／０２３９８２号パンフレットおよび国際公開第２０１３／０５９３４３号パンフレット（これらの内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に記載されるとおり）、ナノニードル（例えば、Ｃｈｉａｐｐｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍａｔ．，１４；５３２−３９、または米国特許出願公開第２０１４／０２９５５５８号明細書（これらの内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に記載されるとおり）およびナノストロー（例えば、Ｘｉｅ，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ，７（５）；４３５１−５８（この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に記載されるとおり）が挙げられる。
【０５１５】
成分がＤＮＡにコードされて送達される場合、ＤＮＡは、典型的には、発現を生じさせるため、例えばプロモーターを含む制御領域を含むことになる。Ｃａｓ９分子配列に有用なプロモーターとしては、ＣＭＶ、ＥＦ−１α、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、ＣＡＧ制御プロモーターが挙げられる。ｇＲＮＡに有用なプロモーターとしては、Ｈ１、ＥＦ−１ａおよびＵ６プロモーターが挙げられる。同様の、または異なる強度のプロモーターを選択して、成分の発現を調整することができる。Ｃａｓ９分子をコードする配列は、核移行シグナル（ＮＬＳ）、例えばＳＶ４０  ＮＬＳを含み得る。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子またはｇＲＮＡ分子用のプロモーターは、独立に、誘導性、組織特異的、または細胞特異的であり得る。
【０５１６】
Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子のＤＮＡベースの送達
Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＤＮＡは、当該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり対象に投与し、または細胞に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９コードＤＮＡおよび／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは、例えば、ベクター（例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター）、非ベクターベースの方法（例えば、ネイキッドＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を使用して）、またはこれらの組み合わせによって送達することができる。
【０５１７】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは、ベクター（例えば、ウイルスベクター／ウイルス、プラスミド、ミニサークルまたはナノプラスミド）によって送達される。
【０５１８】
ベクターは、Ｃａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子をコードする配列を含み得る。ベクターは、例えばＣａｓ９分子配列に融合した、シグナルペプチド（例えば、核移行、核小体移行、ミトコンドリア移行のための）をコードする配列も含み得る。例えば、ベクターは、Ｃａｓ９分子をコードする配列に融合した１つ以上の核移行配列（例えば、ＳＶ４０由来）を含み得る。
【０５１９】
ベクターには、１つ以上の調節／制御エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、２Ａ配列、およびスプライスアクセプターまたはドナーが含まれ得る。一部の実施形態において、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識される（例えば、ＣＭＶプロモーター）。他の実施形態において、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識される（例えば、Ｕ６プロモーター）。一部の実施形態において、プロモーターは調節型プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。他の実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは組織特異的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターはウイルスプロモーターである。他の実施形態において、プロモーターは非ウイルスプロモーターである。
【０５２０】
一部の実施形態において、ベクターまたは送達媒体はミニサークルである。一部の実施形態において、ベクターまたは送達媒体はナノプラスミドである。
【０５２１】
一部の実施形態において、ベクターまたは送達媒体はウイルスベクター（例えば、組換えウイルスの作成用）である。一部の実施形態において、ウイルスはＤＮＡウイルス（例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルス）である。他の実施形態において、ウイルスはＲＮＡウイルス（例えば、ｓｓＲＮＡウイルス）である。
【０５２２】
例示的ウイルスベクター／ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。ウイルスベクター技術は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）、ならびに他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載されている。
【０５２３】
一部の実施形態において、ウイルスは分裂細胞を感染させる。他の実施形態において、ウイルスは非分裂細胞を感染させる。一部の実施形態において、ウイルスは分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させる。一部の実施形態において、ウイルスは宿主ゲノムに組み込まれることができる。一部の実施形態において、ウイルスは例えばヒトにおける免疫が低下するように操作される。一部の実施形態において、ウイルスは複製コンピテントである。他の実施形態において、ウイルスは複製欠損であり、例えば、さらなるビリオン複製および／またはパッケージングラウンドに必要な遺伝子の１つ以上のコード領域が他の遺伝子に置き換えられているか、または欠失している。一部の実施形態において、ウイルスはＣａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の一過性発現を生じさせる。他の実施形態において、ウイルスはＣａｓ９分子および／またはｇＲＮＡ分子の持続的な、例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、６ヵ月、９ヵ月、１年、２年、または永久的な発現を生じさせる。ウイルスのパッケージング能力は、例えば、少なくとも約４ｋｂ〜少なくとも約３０ｋｂまで様々で、例えば、少なくとも約５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、２５ｋｂ、３０ｋｂ、３５ｋｂ、４０ｋｂ、４５ｋｂ、または５０ｋｂであり得る。
【０５２４】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは組換えレトロウイルスによって送達される。一部の実施形態において、レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）は、例えば、宿主ゲノムへの組込みを可能にする逆転写酵素を含む。一部の実施形態において、レトロウイルスは複製コンピテントである。他の実施形態において、レトロウイルスは複製欠損であり、例えば、さらなるビリオン複製およびパッケージングラウンドに必要な遺伝子の１つ以上のコード領域が他の遺伝子に置き換えられているか、または欠失している。
【０５２５】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは複製欠損であり、例えば、ウイルス複製に必要な１つ以上の遺伝子を含まない。
【０５２６】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは組換えアデノウイルスによって送達される。一部の実施形態において、アデノウイルスは、ヒトにおける免疫が低下するように操作される。
【０５２７】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは組換えＡＡＶによって送達される。一部の実施形態において、ＡＡＶはそのゲノムを宿主細胞、例えば本明細書に記載されるとおりの標的細胞のゲノムに組み込むことができる。一部の実施形態において、ＡＡＶは自己相補性アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）、例えば、一体にアニールして二本鎖ＤＮＡを形成する両方の鎖をパッケージングするｓｃＡＡＶである。本開示の方法において使用し得るＡＡＶ血清型には、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、修飾ＡＡＶ２（例えば、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆおよび／またはＳ６６２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ３、修飾ＡＡＶ３（例えば、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆおよび／またはＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、修飾ＡＡＶ６（例えば、Ｓ６６３Ｖおよび／またはＴ４９２Ｖにおける修飾）、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ  ｒｈ  １０が含まれ、またＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６などのシュードタイプＡＡＶも本開示の方法において使用することができる。
【０５２８】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは、ハイブリッドウイルス、例えば、本明細書に記載されるウイルスの１つ以上のハイブリッドによって送達される。
【０５２９】
パッケージング細胞を使用して、宿主または標的細胞を感染させる能力を有するウイルス粒子が形成される。かかる細胞としては、アデノウイルスをパッケージングすることのできる２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングすることのできるψ２細胞またはＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングするプロデューサー細胞株によって作成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよび続く宿主または標的細胞への組込み（該当する場合）に必要な最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現させるタンパク質をコードする発現カセットに置き換えられている。例えば、遺伝子療法に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主または標的細胞における遺伝子発現に必要なＡＡＶゲノム由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列のみを有する。欠損したウイルス機能はパッケージング細胞株によってトランスで付与される。これ以降、ウイルスＤＮＡは細胞株にパッケージングされ、細胞株は、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠いているヘルパープラスミドを含有する。細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ヘルパープラスミドからのＡＡＶベクターの複製およびＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドはＩＴＲ配列を欠いているため多量にはパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えばＡＡＶよりもアデノウイルスの方が感受性が高い熱処理によって低減することができる。
【０５３０】
ある実施形態において、ウイルスベクターは細胞型および／または組織型認識能力を有する。例えば、ウイルスベクターは、異なる／代替的なウイルスエンベロープ糖タンパク質を有し、細胞型特異的受容体で操作されており（例えば、ペプチドリガンド、単鎖抗体、成長因子などの標的リガンドを取り込むようなウイルスエンベロープ糖タンパク質の遺伝子修飾）、および／またはウイルス糖タンパク質を認識する一端と、標的細胞表面の部分を認識する他端とを含む二重特異性を有する分子架橋を有するように操作されている（例えば、リガンド−受容体、モノクローナル抗体、アビジン−ビオチンおよび化学的コンジュゲーション）シュードタイプであり得る。
【０５３１】
ある実施形態において、ウイルスベクターは細胞型特異的発現を実現する。例えば、組織特異的プロモーターを構築して、標的細胞においてのみトランス遺伝子（Ｃａｓ９およびｇＲＮＡ）が発現するように制限することができる。ベクターの特異性は、トランス遺伝子発現のマイクロＲＮＡ依存的制御によっても媒介され得る。ある実施形態において、ウイルスベクターは、ウイルスベクターと標的細胞膜との高い融合効率を有する。例えば、融合コンピテントな赤血球凝集素（ＨＡ）などの融合タンパク質を組み込んで細胞へのウイルスの取込みを増加させることができる。ある実施形態において、ウイルスベクターは核移行能力を有する。例えば、細胞壁の破壊が（細胞分裂中に）必要である、したがって非分裂細胞に感染しないウイルスを改変してウイルスのマトリックスタンパク質に核移行ペプチドを組み込み、それにより非増殖細胞の形質導入を可能にすることができる。
【０５３２】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは、非ベクターベースの方法により（例えば、ネイキッドＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を用いて）送達される。例えば、ＤＮＡは、例えば、有機修飾シリカまたはケイ酸塩（オルモシル（Ｏｒｍｏｓｉｌ））、エレクトロポレーション、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、脂質媒介性トランスフェクション、デンドリマー、無機ナノ粒子、リン酸カルシウム、またはこれらの組み合わせにより送達することができる。
【０５３３】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９および／またはｇＲＮＡコードＤＮＡは、ベクターおよび非ベクターベースの方法の組み合わせにより送達される。例えば、ビロソームは、不活化ウイルス（例えば、ＨＩＶまたはインフルエンザウイルス）と組み合わせたリポソームを含み、これにより、ウイルス方法またはリポソーム方法のいずれか単独と比べて、例えば呼吸上皮細胞においてより効率的な遺伝子トランスファーがもたらされ得る。
【０５３４】
ある実施形態において、送達媒体は非ウイルスベクターである。ある実施形態において、非ウイルスベクターは無機ナノ粒子（例えば、ナノ粒子の表面に対するペイロードに付加される）である。例示的無機ナノ粒子としては、例えば、磁気ナノ粒子（例えば、Ｆｅ  ｌｖｌｎ０２）、またはシリカが挙げられる。ナノ粒子の外表面は正電荷ポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン）とコンジュゲートすることができ、それによりペイロードの付加（例えば、コンジュゲーションまたは捕捉）が可能となる。ある実施形態において、非ウイルスベクターは有機ナノ粒子である（例えば、ナノ粒子内部へのペイロードの捕捉）。例示的有機ナノ粒子としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびプロタミンで被覆されている中性ヘルパー脂質および脂質コーティングで被覆された核酸複合体と共にカチオン性脂質を含有するＳＮＡＬＰリポソームが挙げられる。
【０５３５】
ＣＲＩＳＰＲシステムまたはＣＲＩＳＰＲシステムもしくはその成分をコードする核酸、例えばベクターのトランスファー用の例示的脂質および／またはポリマーとしては、例えば、国際公開第２０１１／０７６８０７号パンフレット、国際公開第２０１４／１３６０８６号パンフレット、国際公開第２００５／０６０６９７号パンフレット、国際公開第２０１４／１４０２１１号パンフレット、国際公開第２０１２／０３１０４６号パンフレット、国際公開第２０１３／１０３４６７号パンフレット、国際公開第２０１３／００６８２５号パンフレット、国際公開第２０１２／００６３７８号パンフレット、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット、および国際公開第２０１５／０９５３４６号パンフレット（前述の各々の内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に記載されるものが挙げられる。ある実施形態において、媒体は、標的細胞によるナノ粒子およびリポソームの取込みを増加させるためのターゲティング修飾、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、一本鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖類、および細胞透過性ペプチドを有する。ある実施形態において、媒体は融合性およびエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを使用する。ある実施形態において、媒体は、酸によって惹起されるコンホメーション変化を受ける（例えば、それによりカーゴのエンドソームエスケープが加速する）。ある実施形態において、刺激によって切断可能なポリマーが、例えば細胞内コンパートメントにおける放出のため使用される。例えば、還元細胞環境で切断されるジスルフィドベースのカチオン性ポリマーを使用することができる。
【０５３６】
ある実施形態において、送達媒体は生物学的非ウイルス送達媒体である。ある実施形態において、媒体は、弱毒化細菌（例えば、侵入性だが弱毒化されていて発病およびトランス遺伝子の発現を防ぐように天然に、または人工的に操作されたもの（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ある種のサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、および修飾大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））、栄養向性および組織特異的向性を有して特異的組織を標的とする細菌、修飾表面タンパク質を有して標的組織特異性を改変する細菌）である。ある実施形態において、媒体は、遺伝子修飾されたバクテリオファージ（例えば、大きいパッケージング能力、低い免疫原性を有し、哺乳動物プラスミド維持配列を含み、かつ組み込まれた標的リガンドを有する操作されたファージ）である。ある実施形態において、媒体は哺乳動物ウイルス様粒子である。例えば、修飾ウイルス粒子を作成（例えば、「空の」粒子を精製し、続いてエキソビボでウイルスを所望のカーゴとアセンブルすることにより）することができる。媒体は、標的リガンドを組み込んで標的組織特異性を改変させるように操作することもできる。ある実施形態において、媒体は生物学的リポソームである。例えば、生物学的リポソームは、ヒト細胞に由来するリン脂質ベースの粒子（例えば、対象に由来する球構造体に分解される赤血球細胞である赤血球ゴースト（例えば、組織ターゲティングは、様々な組織または細胞特異的リガンドの付加によって実現することができる）、または分泌エキソソーム−エンドサイトーシス起源の対象（すなわち患者）由来膜結合型ナノ小胞（３０〜１００ｎｍ）（例えば、様々な細胞型から作製することができ、したがって標的リガンドの必要性なしに細胞によって取り込まれ得る）である。
【０５３７】
ある実施形態において、Ｃａｓシステムの成分、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子成分および／またはｇＲＮＡ分子成分以外の１つ以上の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）が送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Ｃａｓシステムの成分の１つ以上が送達されるのと同じ時点で送達される。ある実施形態において、核酸分子はＣａｓ９システムの成分の１つ以上の送達の（例えば、約３０分、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日、３日、１週、２週間、または４週間未満）前または後に送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Ｃａｓ９システムの成分の１つ以上、例えば、Ｃａｓ９分子成分および／またはｇＲＮＡ分子成分が送達されるのと異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれによっても送達することができる。例えば、核酸分子はウイルスベクター、例えば組込み欠損レンチウイルスによって送達することができ、かつＣａｓ９分子成分および／またはｇＲＮＡ分子成分はエレクトロポレーションによって送達することができ、これにより例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）によって引き起こされる毒性を低減することができる。ある実施形態において、核酸分子は治療用タンパク質、例えば本明細書に記載されるタンパク質をコードする。ある実施形態において、核酸分子はＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載されるＲＮＡ分子をコードする。
【０５３８】
Ｃａｓ９分子をコードするＲＮＡの送達
Ｃａｓ９分子（例えば、活性Ｃａｓ９分子、不活性Ｃａｓ９分子または不活性Ｃａｓ９融合タンパク質）および／またはｇＲＮＡ分子をコードするＲＮＡは、当該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり、細胞、例えば本明細書に記載される標的細胞に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９コードＲＮＡおよび／またはｇＲＮＡコードＲＮＡは、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、またはこれらの組み合わせによって送達することができる。
【０５３９】
タンパク質としてのＣａｓ９分子の送達
Ｃａｓ９分子（例えば、活性Ｃａｓ９分子、不活性Ｃａｓ９分子または不活性Ｃａｓ９融合タンパク質）は、当該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり細胞に送達することができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質分子は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、脂質媒介トランスフェクション、ペプチド媒介送達、セルスクイージングまたはアブレーション（例えば、ナノニードルによる）またはこれらの組み合わせによって送達することができる。送達は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡによるか、またはｇＲＮＡにより、例えばｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質とをリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）に予め複合体化することによって達成し得る。
【０５４０】
ある態様において、例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子はタンパク質として送達され、かつｇＲＮＡ分子は１つ以上のＲＮＡとして（例えば、本明細書に記載されるとおりのｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡとして）送達される。実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞への送達前に、リボ核タンパク質複合体（「ＲＮＰ」）としてｇＲＮＡ分子と複合体化される。実施形態において、ＲＮＰは、例えば本明細書に記載される細胞に、当該技術分野において公知の任意の方法、例えばエレクトロポレーションによって送達することができる。本明細書に記載されるとおり、および理論によって拘束されるものではないが、細胞に送達されるＲＮＰの濃度が低下する場合でも、例えば本明細書に記載される標的細胞において標的配列に高い％編集率（例えば、＞８５％、＞９０％、＞９５％、＞９８％、または＞９９％）をもたらすｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を使用することが好ましい。この場合にも、理論によって拘束されるものではないが、標的細胞において（低いＲＮＰ濃度の場合を含め）標的配列の高い％編集率を生じるｇＲＮＡ分子を含むＲＮＰを低下したまたは低い濃度で送達することは、オフターゲット編集イベントの頻度および数を低減し得るため有益であり得る。一態様において、低いまたは低下した濃度のＲＮＰを使用する場合、以下の例示的手順を用いてｄｇＲＮＡ分子を含むＲＮＰを作成することができる：
１．Ｃａｓ９分子およびｔｒａｃｒを溶液中に高濃度（例えば、細胞に送達される最終ＲＮＰ濃度よりも高い濃度）で提供し、これらの２つの成分を平衡化させる；
２．ｃｒＲＮＡ分子を提供し、成分を平衡化させる（それによりＲＮＰの高濃度溶液を形成する）；
３．ＲＮＰ溶液を所望の濃度に希釈する；
４．前記所望の濃度の前記ＲＮＰを標的細胞に例えばエレクトロポレーションによって送達する。
【０５４１】
上記の手順は、上記のステップ２を省略し、かつステップ１において、溶液中に高濃度のＣａｓ９分子およびｓｇＲＮＡ分子を提供して成分を平衡化させることにより、ｓｇＲＮＡ分子で用いるように改良し得る。実施形態において、Ｃａｓ９分子および各ｇＲＮＡ成分は溶液中に１：２比（Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ）、例えば１：２モル比のＣａｓ９：ｇＲＮＡ分子で提供される。ｄｇＲＮＡ分子が使用される場合、比、例えばモル比は１：２：２（Ｃａｓ９：ｔｒａｃｒ：ｃｒＲＮＡ）である。実施形態において、ＲＮＰは２０μＭ以上の濃度、例えば約２０μＭ〜約５０μＭの濃度で形成される。実施形態において、ＲＮＰは１０μＭ以上の濃度、例えば約１０μＭ〜約３０μＭの濃度で形成される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に１０μＭ以下の最終濃度（例えば、約０．０１μＭ〜約１０μＭの濃度）に希釈される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に３μＭ以下の最終濃度（例えば、約０．０１μＭ〜約３μＭの濃度）に希釈される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に１μＭ以下の最終濃度（例えば、約０．０１μＭ〜約１μＭの濃度）に希釈される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に０．３μＭ以下の最終濃度（例えば、約０．０１μＭ〜約０．３μＭの濃度）に希釈される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約３μＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約１μＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約０．３μＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約０．１μＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約０．０５μＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約０．０３μＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、標的細胞（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む前記標的細胞への送達用溶液中に約０．０１μＭの最終濃度で提供される。実施形態において、ＲＮＰは、エレクトロポレーションに好適な媒体中に製剤化される。実施形態において、ＲＮＰは、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞、例えばＨＳＰＣ細胞にエレクトロポレーションにより、例えば本明細書に記載されるエレクトロポレーション条件を用いて送達される。
【０５４２】
成分のバイモーダル送達または差次的送達
Ｃａｓシステムの成分、例えばＣａｓ９分子成分およびｇＲＮＡ分子成分を別々に送達する、より詳細には成分を異なる様式で送達すると、例えば組織特異性および安全性が改善されるため、パフォーマンスを増進させることができる。
【０５４３】
ある実施形態において、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子は、異なる様式により、または本明細書においてときに差次的様式と称されるとおり送達される。異なる様式または差次的様式とは、本明細書で使用されるとき、対象成分分子、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、または鋳型核酸に異なる薬力学的または薬物動態学的特性を付与する送達様式を指す。例えば、送達様式は、例えば、選択されたコンパートメント、組織、または臓器に異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間分布をもたらし得る。
【０５４４】
幾つかの送達様式、例えば、細胞、または細胞の子孫において例えば自己複製または細胞核酸への挿入によって持続する核酸ベクターによる送達は、成分のより持続的な発現および存在をもたらす。
【０５４５】
ＸＩ．治療方法
本明細書に記載されるＣａｓ９システム、例えば、１つ以上のｇＲＮＡ分子および１つ以上のＣａｓ９分子は、哺乳動物、例えばヒトにおける疾患の治療に有用である。用語「〜を治療する」、「治療された」、「治療している」、および「治療」には、ｃａｓ９システム、例えば１つ以上のｇＲＮＡ分子および１つ以上のｃａｓ９分子を細胞に投与することにより、疾患の症状、合併症、または生化学的徴候を予防し、またはその発生を遅延させること、疾患、病態、または障害の症状を軽減し、またはそのさらなる発症を阻止または阻害することが含まれる。治療には、本発明のｇＲＮＡ分子（または２つ以上のｇＲＮＡ分子）の導入により、または本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムの導入により、または本明細書に記載される前記細胞の調製方法のいずれかによって修飾された１つ以上の細胞、例えばＨＳＰＣ（例えば、その集団）の投与により、疾患の症状、合併症、または生化学的徴候を予防し、またはその発生を遅延させること、疾患、病態、または障害の症状を軽減し、またはそのさらなる発症を阻止または阻害することも含まれ得る。治療は予防的であってもよく（それにより疾患を予防し、またはその発生を遅延させるか、またはその臨床的もしくは準臨床的症状の発現を予防する）、または疾患発現後の症状の療法的抑制または軽減であってもよい。治療は、本明細書に記載される療法的手段によって計測することができる。したがって、本発明の「治療」方法には、細胞へのｃａｓ９システム（例えば、１つ以上のｇＲＮＡ分子および１つ以上のＣａｓ９分子）の導入によって改変された細胞を対象に投与することにより、疾患または病態の１つ以上の症状を治癒し、その重症度を低減し、またはそれを改善すること、かかる治療がない場合の予想を超えて対象の健康または生存を延ばすことも含まれる。例えば、「治療」には、対象の疾患症状の少なくとも５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える軽減が含まれる。
【０５４６】
本明細書、例えば、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、および／または表９に記載される標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を含むＣａｓ９システムは、異常ヘモグロビン症の治療に有用である。
【０５４７】
異常ヘモグロビン症
異常ヘモグロビン症には、赤血球細胞（ＲＢＣ）の産生低下および／または破壊増加（溶血）がある遺伝的原因の幾つもの貧血症が含まれる。それらには、酸素濃度を維持する能力の低下が付随する異常ヘモグロビンの産生をもたらす遺伝的欠陥も含まれる。かかる障害の中には、正常なβ−グロビンを十分な量で産生できないことが関係するものもあれば、正常なβ−グロビンを全く産生できないことが関係するものもある。β−グロビンタンパク質に関連するこれらの障害は、一般にβヘモグロビン異常症と称される。例えば、β−サラセミアは、β−グロビン遺伝子の発現の部分的または完全な欠損がＨｂＡ欠損または欠如につながることによって起こる。鎌状赤血球貧血は、β−グロビン構造遺伝子の点突然変異が異常な（鎌状の）ヘモグロビン（ＨｂＳ）の産生につながることによって起こる。ＨｂＳは、特に脱酸素化条件下で重合し易い。ＨｂＳ  ＲＢＣは正常ＲＢＣと比べて脆弱で溶血を起こし易く、最終的に貧血につながる。
【０５４８】
ある実施形態において、αグロビンまたはβグロビンの遺伝的欠陥が、例えば、本明細書に記載されるＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子、例えばＣＲＩＳＰＲシステムを用いた相同組換えによって修正される。
【０５４９】
ある実施形態において、αグロビンまたはβグロビンの野生型（例えば、非突然変異型）コピーをコードする遺伝子が、例えば、セーフハーバー部位、例えばＡＡＶＳ１セーフハーバー部位に、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムおよび方法を用いた相同組換えによって細胞のゲノムに挿入される。
【０５５０】
ある実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子を用いて異常ヘモグロビン症関連遺伝子が標的化される。例示的標的としては、例えば、γ−グロビン遺伝子の制御に関連する遺伝子が挙げられる。ある実施形態において、標的はＢＣＬ１１Ａである。ある実施形態において、標的はＢＣＬ１１ａエンハンサーである。ある実施形態において、標的はＨＰＦＨ領域である。
【０５５１】
胎児ヘモグロビンは（またヘモグロビンＦまたはＨｂＦまたはα２γ２も）、２つの成人α−グロビンポリペプチドおよび２つの胎児β様γ−グロビンポリペプチドの四量体である。ＨｂＦは、ヒト胎児における子宮内発育期の最後の７ヵ月間および新生児における生後約６ヵ月までの間の主要な酸素輸送タンパク質である。機能上、胎児ヘモグロビンは、発育中の胎児に母体の血流から酸素がより良好に届くように、酸素を成人型よりも高い親和性で結合可能である点が、成人ヘモグロビンと最も異なる。
【０５５２】
新生児では、胎児ヘモグロビンは生後約６ヵ月までにほぼ完全に成人ヘモグロビンに置き換わる。成人では、胎児ヘモグロビンの産生を薬理学的に再活性化することができ、これは異常ヘモグロビン症などの疾患の治療に有用である。例えば、特定の異常ヘモグロビン症患者では、高レベルのγ−グロビン発現がβ−グロビン遺伝子産生の欠損または障害を部分的に代償することができ、これらの疾患における臨床的重症度を改善し得る。ＨｂＦレベルまたはＦ−細胞（ＨｂＦを含有する赤血球）数の増加は、異常ヘモグロビン症、例えば重症型β−サラセミアおよび鎌状赤血球貧血の疾患重症度を改善することができる。
【０５５３】
ＨｂＦレベルまたはＦ−細胞の増加は、細胞におけるＢＣＬ１１Ａ発現の低下に関連し得る。ＢＣＬ１１Ａ遺伝子はマルチジンクフィンガー転写因子をコードする。ある実施形態において、ＢＣＬ１１Ａの発現が調整、例えば下方制御される。ある実施形態において、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子が編集される。ある実施形態において、例えば赤血球系統細胞におけるＢＣＬ１１ａの機能が障害され、または下方制御される。ある実施形態において、細胞は造血幹細胞または前駆細胞である。
【０５５４】
鎌状赤血球症
鎌状赤血球症は、ヘモグロビンに影響を及ぼす一群の障害である。この障害を持つ人は異型ヘモグロビン分子（ヘモグロビンＳ）を有し、これによって赤血球細胞が歪んで鎌状、または三日月形の形状になり得る。この障害に特有の特徴としては、低赤血球細胞数（貧血症）、反復感染、および周期性疼痛発作が挙げられる。
【０５５５】
ＨＢＢ遺伝子の突然変異が鎌状赤血球症を引き起こす。ＨＢＢ遺伝子はβ−グロビン作製の指令を与える。ＨＢＢ遺伝子の異なる突然変異によって様々なバージョンのβ−グロビンが生じる。１つの特定のＨＢＢ遺伝子突然変異は、ヘモグロビンＳ（ＨｂＳ）として知られる異常なバージョンのβ−グロビンを作り出す。ＨＢＢ遺伝子の他の突然変異は、ヘモグロビンＣ（ＨｂＣ）およびヘモグロビンＥ（ＨｂＥ）など、さらなる異常なバージョンのβ−グロビンにつながる。ＨＢＢ遺伝子突然変異は、異常に低いレベルのβ−グロビン、すなわちβサラセミアも生じさせ得る。
【０５５６】
鎌状赤血球症の人では、ヘモグロビン中のβ−グロビンサブユニットの少なくとも１つがヘモグロビンＳに置き換わっている。鎌状赤血球症の一般的な型である鎌状赤血球貧血では、ヘモグロビン中の両方のβ−グロビンサブユニットがヘモグロビンＳに置き換わる。他のタイプの鎌状赤血球症では、ヘモグロビン中の一方のβ−グロビンサブユニットのみがヘモグロビンＳに置き換わる。他方のβ−グロビンサブユニットは、ヘモグロビンＣなど、別の異常変異体に置き換わる。例えば、鎌状ヘモグロビンＣ（ＨｂＳＣ）症の人は、β−グロビンの代わりにヘモグロビンＳおよびヘモグロビンＣを含むヘモグロビン分子を有する。ヘモグロビンＳを産生する突然変異とβサラセミアとが一緒に起こる場合、個体はヘモグロビンＳ−βサラセミア（ＨｂＳβＴｈａｌ）症を有する。
【０５５７】
βサラセミア
βサラセミアは、ヘモグロビンの産生が低下する血液障害である。βサラセミアの人では、低レベルのヘモグロビンが体の多くの箇所の酸素欠乏につながる。罹患者はまた、赤血球細胞の不足も有し（貧血）、そのため青白い皮膚、脱力感、疲労、およびより重篤な合併症を生じ得る。βサラセミアの人は血液凝固異常を発症するリスクが高い。
【０５５８】
βサラセミアは症状の重症度に応じて２つのタイプ：重症型サラセミア（クーリー貧血としても知られる）および中間型サラセミアに分けられる。これらの２つのタイプのなかでは、重症型サラセミアがより重篤である。
【０５５９】
ＨＢＢ遺伝子の突然変異がβサラセミアを引き起こす。ＨＢＢ遺伝子はβ−グロビン作製の指令を与える。ＨＢＢ遺伝子の幾つかの突然変異が任意のβ−グロビンの産生を妨げる。β−グロビンが存在しない場合、β−ゼロ（Ｂ０）サラセミアと称される。他のＨＢＢ遺伝子突然変異は何らかのβ−グロビンの産生が可能であるものの量が低下し、すなわち、β−プラス（Ｂ＋）サラセミアである。両方のタイプをもつ人が、重症型サラセミアおよび中間型サラセミアと診断されている。
【０５６０】
ある実施形態において、第１の遺伝子を標的とするＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体を使用して、第２の遺伝子、例えば第２の遺伝子の突然変異によって特徴付けられる障害が治療される。例として、第１の遺伝子を例えば編集またはペイロード送達によって標的化することにより、第２の遺伝子、例えば突然変異体の第２の遺伝子の影響を代償するか、またはそれからのさらなる損傷を抑えることができる。ある実施形態において、対象が保因する第１の遺伝子の１つまたは複数のアレルは、障害の原因ではない。
【０５６１】
一態様において、本発明は、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）の増加を必要としている哺乳動物、例えばヒトの治療に関する。
【０５６２】
一態様において、本発明は、異常ヘモグロビン症と診断された、またはその発症リスクがある哺乳動物、例えばヒトの治療に関する。
【０５６３】
一態様において、異常ヘモグロビン症はβヘモグロビン異常症である。一態様において、異常ヘモグロビン症は鎌状赤血球症である。一態様において、異常ヘモグロビン症はβサラセミアである。
【０５６４】
異常ヘモグロビン症の治療方法
別の態様において、本発明は治療方法を提供する。態様において、本発明のｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲシステムおよび／または細胞を使用して、それを必要としている患者が治療される。態様において、患者は哺乳動物、例えばヒトである。態様において、患者は異常ヘモグロビン症を有する。実施形態において、患者は鎌状赤血球症を有する。実施形態において、患者はβサラセミアを有する。
【０５６５】
一態様において、本治療方法は、１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、または表９に記載される標的化ドメインを含む１つ以上のｇＲＮＡ分子、および本明細書に記載される１つ以上のｃａｓ９分子を哺乳動物、例えばヒトに投与することを含む。
【０５６６】
一態様において、本治療方法は哺乳動物に細胞集団を投与することを含み、ここで、細胞集団は、１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、または表９に記載される標的化ドメインを含む１つ以上のｇＲＮＡ分子、および本明細書に記載される１つ以上のｃａｓ９分子、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムを投与された哺乳動物、例えばヒト由来の細胞集団である。一実施形態において、細胞への１つ以上のｇＲＮＡ分子またはＣＲＩＳＰＲシステムの投与はインビボで達成される。一実施形態において、細胞への１つ以上のｇＲＮＡ分子またはＣＲＩＳＰＲシステムの投与はエキソビボで達成される。
【０５６７】
一態様において、本治療方法は、１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、または表９に記載される標的化ドメインを含む１つ以上のｇＲＮＡ分子、および本明細書に記載される１つ以上のｃａｓ９分子を含む、または一時的にそれらを含んでいた細胞、または前記細胞の子孫を含む細胞集団の有効量を哺乳動物、例えばヒトに投与することを含む。一実施形態において、細胞は哺乳動物にとって同種異系由来である。一実施形態において、細胞は哺乳動物にとって自己由来である。一実施形態において、細胞は哺乳動物から採取され、エキソビボで操作されて、哺乳動物に戻される。
【０５６８】
態様において、１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、または表９に記載される標的化ドメインを含む１つ以上のｇＲＮＡ分子、および本明細書に記載される１つ以上のｃａｓ９分子を含む、または一時的にそれらを含んでいた細胞、または前記細胞の子孫は、幹細胞または前駆細胞を含む。一態様において、幹細胞は造血幹細胞である。一態様において、前駆細胞は造血前駆細胞である。一態様において、細胞は造血幹細胞および造血前駆細胞の両方を含み、例えばＨＳＰＣである。一態様において、細胞はＣＤ３４＋細胞を含む、例えばそれからなる。一態様において、細胞はＣＤ３４−細胞を実質的に含まない。一態様において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋幹細胞を含む、例えばそれからなる。一態様において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ９０−細胞を含む、例えばそれからなる。ある態様において、細胞は、上記に記載されるまたは本明細書に記載される細胞型の１つ以上を含む集団である。
【０５６９】
一実施形態において、本開示は、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球症またはβ−サラセミアを治療する方法、またはそれを必要としている哺乳動物、例えばヒトの胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法を提供し、この方法は、
ａ）哺乳動物からＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を提供する、例えば採取または単離するステップ；
ｂ）前記細胞をエキソビボで、例えば細胞培養培地中に、任意選択で少なくとも１つの幹細胞増殖剤を含む組成物の有効量の存在下で提供するステップであって、それにより前記ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を未処理の集団よりも高い程度に増殖させるステップ；
ｃ）ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を、有効量の、本明細書に記載される標的化ドメイン、例えば、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表８、または表９に記載される標的化ドメインを含む少なくとも１つのｇＲＮＡ分子、または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、例えば本明細書に記載される少なくとも１つのｃａｓ９分子、または前記ｃａｓ９分子をコードする核酸とを含む組成物、例えば本明細書に記載されるとおりの１つ以上のＲＮＰに、例えば、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムに接触させるステップ；
ｄ）集団の細胞の少なくとも一部（例えば、集団のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞の少なくとも一部）に少なくとも１つの修飾を生じさせるステップであって、それにより、例えば、前記ＨＳＰＣが赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化したとき、例えばステップｃ）により接触させていない細胞と比べて胎児ヘモグロビン発現が増加するステップ；および
ｆ）前記修飾ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を含む細胞の集団を哺乳動物に戻すステップ
を含む。
【０５７０】
ある態様において、ＨＳＰＣは、それが戻される哺乳動物にとって同種異系由来である。ある態様において、ＨＳＰＣは、それが戻される哺乳動物にとって自己由来である。態様において、ＨＳＰＣは骨髄から単離されたものである。態様において、ＨＳＰＣは末梢血、例えば動員末梢血から単離されたものである。態様において、動員末梢血は、Ｇ−ＣＳＦが投与された対象から単離されたものである。態様において、動員末梢血は、Ｇ−ＣＳＦ以外の動員剤、例えばＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）が投与された対象から単離されたものである。態様において、ＨＳＰＣは臍帯血から単離されたものである。
【０５７１】
本方法のさらなる実施形態において、本方法は、ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を例えば上記に記載される供給源から提供した後、細胞の集団をＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）について富化するステップをさらに含む。本方法の実施形態において、前記富化後、細胞、例えばＨＳＰＣの集団は、ＣＤ３４−細胞を実質的に含まない。
【０５７２】
実施形態において、哺乳動物に戻される細胞の集団は、少なくとも７０％の生存細胞を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される細胞の集団は、少なくとも７５％の生存細胞を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される細胞の集団は、少なくとも８０％の生存細胞を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される細胞の集団は、少なくとも８５％の生存細胞を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される細胞の集団は、少なくとも９０％の生存細胞を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される細胞の集団は、少なくとも９５％の生存細胞を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される細胞の集団は、少なくとも９９％の生存細胞を含む。生存率は、代表的な一部の細胞の集団を例えば当該技術分野において公知のとおりの細胞生死判別マーカーに関して染色することにより決定し得る。
【０５７３】
別の実施形態において、本開示は、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球症またはβ−サラセミアを治療する方法、またはそれを必要としている哺乳動物、例えばヒトの胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法を提供し、この方法は、
ａ）例えば哺乳動物の骨髄から、哺乳動物のＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を提供する、例えば採取または単離するステップ；
ｂ）ステップａ）の細胞の集団からＣＤ３４＋細胞を単離するステップ；
ｃ）前記ＣＤ３４＋細胞をエキソビボで提供し、および前記細胞を例えば細胞培養培地中、少なくとも１つの幹細胞増殖剤、例えば化合物４、例えば約０．５〜約０．７５マイクロモル濃度の化合物４を含む組成物の有効量の存在下で培養するステップであって、それにより前記ＣＤ３４＋細胞の集団を未処理の集団よりも高い程度に増殖させるステップ；
ｄ）ＣＤ３４＋細胞の集団の細胞に、有効量の、例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子と、例えば本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子とを含む組成物を導入するステップであって、例えば、任意選択でＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子は、例えば本明細書に記載されるとおりのＲＮＰの形態であり、および任意選択で前記導入は、前記細胞への前記ＲＮＰの、例えば本明細書に記載されるとおりのエレクトロポレーションによる導入である、ステップ；
ｅ）集団の細胞の少なくとも一部（例えば、集団のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞の少なくとも一部）に少なくとも１つの遺伝子修飾を生じさせるステップであって、それにより、ステップｄ）で導入されたｇＲＮＡの標的化ドメインと相補的なゲノム部位にまたはその近傍に、例えば本明細書に記載されるとおりのインデルを作り出すステップ；
ｆ）任意選択で、加えて、前記導入後に、例えば細胞培養培地中、少なくとも１つの幹細胞増殖剤、例えば化合物４、例えば約０．５〜約０．７５マイクロモル濃度の化合物４を含む組成物の有効量の存在下で前記細胞を培養するステップであって、それにより細胞が少なくとも２倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍に増殖するステップ；
ｇ）前記細胞を凍結保存するステップ；および
ｈ）細胞を哺乳動物に戻すステップであって、哺乳動物に戻される細胞が、１）赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力を維持しており、２）赤血球細胞に分化したとき、例えばステップｅ）のｇＲＮＡによって修飾されていない細胞と比べて高いレベルの胎児ヘモグロビンを産生する、例えば、１細胞当たり少なくとも６ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する細胞を含む、ステップ
を含む。
【０５７４】
ある態様において、ＨＳＰＣは、それが戻される哺乳動物にとって同種異系由来である。ある態様において、ＨＳＰＣは、それが戻される哺乳動物にとって自己由来である。態様において、ＨＳＰＣは骨髄から単離されたものである。態様において、ＨＳＰＣは末梢血、例えば動員末梢血から単離されたものである。態様において、動員末梢血は、Ｇ−ＣＳＦが投与された対象から単離されたものである。態様において、動員末梢血は、Ｇ−ＣＳＦ以外の動員剤、例えばＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）が投与された対象から単離されたものである。態様において、ＨＳＰＣは臍帯血から単離されたものである。
【０５７５】
上記の方法の実施形態において、記載されるステップｂ）は、ＣＤ３４−細胞を実質的に含まない細胞の集団をもたらす。
【０５７６】
本方法のさらなる実施形態において、本方法は、ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を例えば上記に記載される供給源から提供した後、細胞の集団がＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）に関して富化されることをさらに含む。
【０５７７】
これらの方法のさらなる実施形態において、増加した胎児ヘモグロビン発現を分化する能力を有する修飾ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋幹細胞）の集団が凍結保存され、哺乳動物への再導入まで貯蔵される。実施形態において、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力、および／または赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化したときに高いレベルの胎児ヘモグロビンを産生する能力を有するＨＳＰＣの凍結保存された集団が解凍され、次に哺乳動物に再導入される。これらの方法のさらなる実施形態において、本方法は、哺乳動物の内因性造血前駆細胞または幹細胞を除去または低減するため化学療法および／または放射線療法を含む。これらの方法のさらなる実施形態において、本方法は、哺乳動物の内因性造血前駆細胞または幹細胞を除去または低減するため化学療法および／または放射線療法ステップを含まない。これらの方法のさらなる実施形態において、本方法は、哺乳動物の内因性造血前駆細胞または幹細胞を部分的に低減する（例えば、部分的リンパ球枯渇）ため化学療法および／または放射線療法を含む。実施形態において、患者が完全リンパ球枯渇用量のブスルファンで治療された後、修飾ＨＳＰＣが哺乳動物に再導入される。実施形態において、患者が部分的リンパ球枯渇用量のブスルファンで治療された後、修飾ＨＳＰＣが哺乳動物に再導入される。
【０５７８】
実施形態において、細胞は、＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域に対するｇＲＮＡと複合体化したＣａｓ９分子、例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子を含むＲＮＰと接触させる。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ０００３１２の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ０００３１１の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００１１２８の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００１１２５の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００１１２６の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００１１２７の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号２４８］−［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、［配列番号７８１２］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号２４８］−［配列番号６６０１を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号２４８］−［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号２４７］−［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号２４７］−［配列番号６６０１を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号２４７］−［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号３３８］−［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号３３８］−［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号３３８］−［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号３３５］−［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイド���ＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号３３５］−［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号３３５］−［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号３３６］−［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号３３６］−［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号３３６］−［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号３３７］−［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号３３７］−［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号３３７］−［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。前述の実施形態のいずれにおいても、ｇＲＮＡのＲＮＡ成分の一部または全てが、例えば本明細書に記載されるとおりの１つ以上のヌクレオチドで修飾されていてもよい。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３４２である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３４３である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６２である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３４４および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３４４および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３４５および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３４５および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３４７である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３４８である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６３である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３４９および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３４９および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５０および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５０お���び配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３５１である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３５２である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６４である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５３および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５３および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５４および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５４および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３５５である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３５６である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６５である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５７および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５７および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５８および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３５８および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３５９である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３６０である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６６である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６１および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６１および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６２および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６２および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３６３である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３６４である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６７である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６５および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６５および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６６および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６６および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３６７である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３６８である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６８である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６９および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３６９および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７０および配列番号６６６０からなるｄ���ＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７０および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３７１である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３７２である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７６９である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７３および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７３および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７４および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７４および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。
【０５７９】
実施形態において、細胞は、ＨＰＦＨ領域に対するｇＲＮＡと複合体化したＣａｓ９分子、例えば本明細書に記載されるとおりのＣａｓ９分子を含むＲＮＰと接触させる。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００１０３０の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００１０２８の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００１２２１の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００１１３７の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００３０３５の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡはＣＲ００３０８５の標的化ドメインを含む。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号９８］−［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号９８］−［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号９８］−［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号１００］−［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号１００］−［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号１００］−［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号１５８９］−［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号１５８９］−［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号１５８９］−［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号１５０５］−［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号１５０５］−［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号１５０５］−［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号１７００］−［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号１７００］−［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号１７００］−［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号１７５０］−［配列番号６６０７］を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、配列番号７８１２を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むデュアルガイドＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡは、［配列番号１７５０］−［配列番号６６０１］を含む、例えばそれからなる、任意選択で１、２、３、４、５、６、または７個の追加的な３’ウラシルヌクレオチドを伴う、例えば［配列番号１７５０］−［配列番号７８１１］を含む、例えばそれからなるｓｇＲＮＡである。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３７５である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３７６である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７７０である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７７および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７７および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７８および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３７８および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３７９である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３８０である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７７１である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８１および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８１および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８２および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８２および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３８３である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３８４である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７７２である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８５および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８５および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８６および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８６および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３８７である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３８８である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７７３である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８９および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３８９および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９０および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９０および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３９１である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３９２である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７７４である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９３および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９４および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９４および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３９５である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号３９６である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は配列番号１７７５である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９７および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９７および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９８および配列番号６６６０からなるｄｇＲＮＡ分子である。実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、配列番号３９８および配列番号３４６からなるｄｇＲＮＡ分子である。
【０５８０】
実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物１である。実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物２である。実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物３である。実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物４である。実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物４であり、２〜０．１マイクロモル濃度、例えば１〜０．２５マイクロモル濃度、例えば０．７５〜０．５マイクロモル濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は、国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレットに記載される分子（例えば、国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレットの実施例１に記載される分子）である。
【０５８１】
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞、例えばＨＳＰＣは、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させるステップの前に、約１時間〜約１５日の期間、例えば約１２時間〜約１２日の期間、例えば約１２時間〜４日の期間、例えば約１日〜約４日の期間、例えば約１日〜約２日の期間、例えば約１日の期間または約２日の期間にわたってエキソビボで培養される。実施形態において、前記接触させるステップの前の前記培養は、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるもの、例えば化合物４、例えば約０．２５μＭ〜約１μＭの濃度の化合物４、例えば約０．７５〜０．５マイクロモル濃度の化合物４を含む組成物（例えば、細胞培養培地）中における培養である。実施形態において、細胞は、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させるステップの後、例えば、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるもの、例えば化合物４、例えば約０．２５μＭ〜約１μＭの濃度の化合物４、例えば約０．７５〜０．５マイクロモル濃度の化合物４を含む細胞培養培地中で約１日以下、例えば、約１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１時間以下の期間にわたってエキソビボで培養される。他の実施形態において、細胞は、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させるステップの後、細胞培養培地中、例えば、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるもの、例えば化合物４、例えば約０．２５μＭ〜約１μＭの濃度の化合物４、例えば約０．７５〜０．５マイクロモル濃度の化合物４を含む細胞培養培地中で約１時間〜約１５日の期間、例えば約１２時間〜約１０日の期間、例えば約１日〜約１０日の期間、例えば約１日〜約５日の期間、例えば約１日〜約４日の期間、例えば約２日〜約４日の期間、例えば約２日、約３日または約４日の期間にわたってエキソビボで培養される。実施形態において、細胞は、約１時間〜約２０日の期間、例えば約６〜１２日の期間、例えば約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、または約１２日の期間にわたってエキソビボで培養される（例えば、前記接触させるステップの前に培養される、および／または前記接触させるステップの後に培養される）。
【０５８２】
実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも約１００万個の細胞（例えば、少なくとも約１００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも約２００万個の細胞（例えば、少なくとも約２００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも約３００万個の細胞（例えば、少なくとも約３００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも約４００万個の細胞（例えば、少なくとも約４００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも約５００万個の細胞（例えば、少なくとも約５００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも約６００万個の細胞（例えば、少なくとも約６００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも１００万個の細胞（例えば、少なくとも１００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも２００万個の細胞（例えば、少なくとも２００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも３００万個の細胞（例えば、少なくとも３００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも４００万個の細胞（例えば、少なくとも４００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも５００万個の細胞（例えば、少なくとも５００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり少なくとも６００万個の細胞（例えば、少なくとも６００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約１００万個の細胞（例えば、約１００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約２００万個の細胞（例えば、約２００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約３００万個の細胞（例えば、約３００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約４００万個の細胞（例えば、約４００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約５００万個の細胞（例えば、約５００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、１ｋｇ当たり約６００万個の細胞（例えば、約６００万個のＣＤ３４＋細胞）を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、患者の体重１ｋｇ当たり約２×１０６個の細胞を含む。実施形態において、哺乳動物に戻される修飾ＨＳＰＣを含む細胞の集団は、患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも２×１０６個の細胞を含む。
【０５８３】
実施形態において、上記に記載される方法のいずれによっても、例えば、哺乳動物への細胞の再導入から少なくとも１５日後、例えば、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０または少なくとも６０日後に計測したとき、患者が有するその循環ＣＤ３４＋細胞の少なくとも８０％が、本方法で使用されるｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと相補的なゲノム部位にまたはその近傍にインデルを含むことになる。
【０５８４】
実施形態において、上記に記載される方法のいずれによっても、例えば、哺乳動物への細胞の再導入から少なくとも１５日後、例えば、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０または少なくとも６０日後に計測したとき、患者が有するその骨髄ＣＤ３４＋細胞の少なくとも２０％が、本方法で使用されるｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと相補的なゲノム部位にまたはその近傍にインデルを含むことになる。
【０５８５】
実施形態において、哺乳動物に再導入されるＨＳＰＣは、インビボで赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化可能であり、および前記分化細胞は、胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈し、例えば、１細胞当たり少なくとも６ピコグラムの胎児ヘモグロビン、例えば、１細胞当たり少なくとも７ピコグラムの胎児ヘモグロビン、１細胞当たり少なくとも８ピコグラムの胎児ヘモグロビン、１細胞当たり少なくとも９ピコグラムの胎児ヘモグロビン、１細胞当たり少なくとも１０ピコグラムの胎児ヘモグロビン、例えば１細胞当たり約９〜約１０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生して、例えばそれにより哺乳動物の異常ヘモグロビン症が治療される。
【０５８６】
細胞が増加した胎児ヘモグロビンを有すると特徴付けられるとき、それには、その細胞の子孫、例えば分化した子孫が増加した胎児ヘモグロビンを呈する実施形態が含まれることは理解されるであろう。例えば、本明細書に記載される方法において、改変または修飾ＣＤ３４＋細胞（または細胞集団）は増加した胎児ヘモグロビンを発現しないこともあるが、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化すると、細胞は増加した胎児ヘモグロビン、例えば同様の条件下にある非修飾または非改変細胞と比べて増加した胎児ヘモグロビンを発現する。
【０５８７】
ＸＩＩ．培養方法および細胞の製造方法
本開示は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子で修飾された、または修飾されることになる細胞、例えばＨＳＰＣ、例えば造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞の培養方法を提供する。
【０５８８】
ＤＮＡ修復経路阻害剤
理論によって拘束されるものではないが、特定の標的配列において所与のｇＲＮＡ分子によって作り出されるインデルのパターンは、細胞内の活性ＤＮＡ修復機構（例えば、非相同末端結合、マイクロホモロジー媒介末端結合等）の各々の産物であると考えられる。理論によって拘束されるものではないが、編集しようとする細胞を、所望のインデルを生じないＤＮＡ修復経路の阻害剤と接触させることにより、特に有利なインデルを選択または富化し得ると考えられる。したがって、本発明のｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲシステム、方法および他の態様は、かかる阻害剤と組み合わせて実施し得る。かかる阻害剤の例としては、例えば、国際公開第２０１４／１３０９５５号パンフレット（この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に記載されるものが挙げられる。実施形態において、阻害剤はＤＮＡＰＫｃ阻害剤、例えばＮＵ７４４１である。
【０５８９】
幹細胞増殖剤
一態様において本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子で修飾された、または修飾されることになる細胞、例えばＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を、薬剤で処理されていない細胞と比べて増殖速度の増加、増殖レベルの増加、または生着の増加をもたらす１つ以上の薬剤と共に培養することに関する。かかる薬剤は、本明細書では幹細胞増殖剤と称される。
【０５９０】
ある態様において、薬剤で処理されていない細胞と比べて増殖速度の増加または増殖レベルの増加をもたらす１つ以上の薬剤、例えば幹細胞増殖剤には、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）経路の阻害剤である薬剤が含まれる。態様において、幹細胞増殖剤は、国際公開第２０１３／１１０１９８号パンフレットに開示される化合物または国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレットに開示される化合物である（これらの明細書の内容は全体として参照により援用される）。
【０５９１】
一態様において、薬剤で処理されていない細胞と比べて増殖速度の増加または増殖レベルの増加をもたらす１つ以上の薬剤は、例えば国際公開第２０１３／１１０１９８号パンフレット（この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に開示されるとおりの、ピリミド［４，５−ｂ］インドール誘導体である。一実施形態において薬剤は化合物１（（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン）：
化合物１：
【化５６】
2019500043.tif 000144
である。
【０５９２】
別の態様において、薬剤は化合物２（メチル４−（３−ピペリジン−１−イルプロピルアミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート）：
化合物２：
【化５７】
2019500043.tif 000145
である。
【０５９３】
別の態様において、薬剤で処理されていない細胞と比べて増殖速度の増加または増殖レベルの増加をもたらす１つ以上の薬剤は、国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に開示される薬剤である。
【０５９４】
一実施形態において、幹細胞増殖剤は４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノールであり、すなわち、以下の構造を有する国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレットの実施例１の化合物：
化合物３：
【化５８】
2019500043.tif 000146
である。
【０５９５】
別の態様において、幹細胞増殖剤は化合物４（（Ｓ）−２−（６−（２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−１−オールであり、すなわち、以下の構造を有する国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット）に係る化合物１５７Ｓ：
化合物４：
【化５９】
2019500043.tif 000147
である。
【０５９６】
実施形態においてＨＳＰＣの集団は、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本発明のｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子）を前記ＨＳＰＣに導入する前に、幹細胞増殖剤、例えば、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１と化合物４との組み合わせ）に接触させる。実施形態において、ＨＳＰＣの集団は、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本発明のｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子）を前記ＨＳＰＣに導入した後、幹細胞増殖剤、例えば、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１と化合物４との組み合わせ）に接触させる。実施形態において、ＨＳＰＣの集団は、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本発明のｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ９分子）を前記ＨＳＰＣに導入する前および導入した後の両方に、幹細胞増殖剤、例えば、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１と化合物４との組み合わせ）に接触させる。
【０５９７】
実施形態において、幹細胞増殖剤は、同じ培地中にあるが幹細胞増殖剤の非存在下であるＨＳＰＣと比べてＨＳＰＣの増殖レベルを増加させるのに有効な量で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は約０．０１〜約１０μＭ、例えば約０．１μＭ〜約１μＭの濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は細胞培養培地中に約１μＭ、約９５０ｎＭ、約９００ｎＭ、約８５０ｎＭ、約８００ｎＭ、約７５０ｎＭ、約７００ｎＭ、約６５０ｎＭ、約６００ｎＭ、約５５０ｎＭ、約５００ｎＭ、約４５０ｎＭ、約４００ｎＭ、約３５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、または約１０ｎＭの濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は約５００ｎＭ〜約７５０ｎＭの範囲の濃度で存在する。
【０５９８】
実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物４であり、これは細胞培養培地中に約０．０１〜約１０マイクロモル（μＭ）の範囲の濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物４であり、これは細胞培養培地中に約０．１〜約１マイクロモル（μＭ）の範囲の濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物４であり、これは細胞培養培地中に約０．７５マイクロモル（μＭ）の濃度で存在する。実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物４であり、これは細胞培養培地中に約０．５マイクロモル（μＭ）の濃度で存在する。前述のいずれの実施形態においても、細胞培養培地は化合物１をさらに含む。
【０５９９】
実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物１と化合物４との混合物である。
【０６００】
実施形態において、本発明の細胞は、ＣＤ３４＋細胞の２〜１０，０００倍の増殖、例えばＣＤ３４＋細胞の２〜１０００倍の増殖、例えばＣＤ３４＋細胞の２〜１００倍の増殖、例えばＣＤ３４＋細胞の２０〜２００倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子と接触させる。本明細書に記載されるとおり、１つ以上の幹細胞増殖剤との接触は、細胞を例えば本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムに接触させる前、細胞を例えば本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムに接触させた後、またはこれらの組み合わせであり得る。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞、例えば、前記細胞に導入されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｇＲＮＡの標的化ドメインと相補性を有する標的部位にまたはその近傍にインデルを含むＣＤ３４＋細胞の少なくとも２倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子、例えば化合物４に接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞、例えば、前記細胞に導入されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｇＲＮＡの標的化ドメインと相補性を有する標的部位にまたはその近傍にインデルを含むＣＤ３４＋細胞の少なくとも４倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子、例えば化合物４に接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞、例えば、前記細胞に導入されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムのｇＲＮＡの標的化ドメインと相補性を有する標的部位にまたはその近傍にインデルを含むＣＤ３４＋細胞の少なくとも５倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子、例えば化合物４に接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも１０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子に接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも２０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子に接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも３０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子に接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも４０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子に接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも５０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子に接触させる。ある実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも６０倍の増殖を生じさせるのに十分な時間にわたって、それに十分な量の１つ以上の幹細胞増殖剤分子に接触させる。実施形態において、細胞は、約１〜６０日、例えば約１〜５０日、例えば約１〜４０日、例えば約１〜３０日、例えば１〜２０日、例えば約１〜１０日、例えば約７日、例えば約１〜５日、例えば約２〜５日、例えば約２〜４日、例えば約２日、または例えば約４日の期間にわたって１つ以上の幹細胞増殖剤に接触させる。
【０６０１】
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞、例えばＨＳＰＣは、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させるステップの前に、約１時間〜約１０日の期間、例えば約１２時間〜約５日の期間、例えば約１２時間〜４日の期間、例えば約１日〜約４日の期間、例えば約１日〜約２日の期間、例えば約１日の期間または約２日の期間にわたってエキソビボで培養される。実施形態において、前記接触させるステップの前の前記培養は、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるもの、例えば化合物４、例えば約０．２５μＭ〜約１μＭの濃度の化合物４、例えば約０．７５〜０．５マイクロモル濃度の化合物４を含む組成物（例えば、細胞培養培地）中における培養である。実施形態において、細胞は、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させるステップの後、例えば、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるもの、例えば化合物４、例えば約０．２５μＭ〜約１μＭの濃度の化合物４、例えば約０．７５〜０．５マイクロモル濃度の化合物４を含む細胞培養培地中で約１日以下、例えば、約１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１時間以下の期間にわたってエキソビボで培養される。他の実施形態において、細胞は、例えば本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムと細胞を接触させるステップの後、細胞培養培地中、例えば、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるもの、例えば化合物４、例えば約０．２５μＭ〜約１μＭの濃度の化合物４、例えば約０．７５〜０．５マイクロモル濃度の化合物４を含む細胞培養培地中で約１時間〜約１４日の期間、例えば約１２時間〜約１０日の期間、例えば約１日〜約１０日の期間、例えば約１日〜約５日の期間、例えば約１日〜約４日の期間、例えば約２日〜約４日の期間、例えば約２日、約３日または約４日の期間にわたってエキソビボで培養される。
【０６０２】
実施形態において、細胞培養培地は化学限定培地である。実施形態において、細胞培養培地は、例えばＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０９６５０）をさらに含有し得る。実施形態において、細胞培養培地は、それに代えてまたは加えて、例えば、ＨＳＣ  Ｂｒｅｗ、ＧＭＰ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含有し得る。実施形態において、培地には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、ヒトインターロイキン−６、Ｌ−グルタミン、および／またはペニシリン／ストレプトマイシンが補足され得る。実施形態において、培地には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、ヒトインターロイキン−６、およびＬ−グルタミンが補足される。他の実施形態において、培地には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、およびヒトインターロイキン−６が補足される。他の実施形態において、培地には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、およびヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）が補足されるが、ヒトインターロイキン−６は補足されない。培地中に存在するとき、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、ヒトインターロイキン−６、および／またはＬ−グルタミンは、それぞれ約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えば約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えば約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えば約２５ｎｇ／ｍＬ〜約７５ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、例えば約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で存在する。実施形態において、補足される成分の各々は同じ濃度である。他の実施形態において、補足される成分の各々は異なる濃度である。ある実施形態において、培地は、ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０９６５０）、５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（Ｔｐｏ）、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、５０ｎｇ／ｍＬのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）、および５０ｎｇ／ｍＬのヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）を含む。ある実施形態において、培地は、ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０９６５０）、５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（Ｔｐｏ）、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、および５０ｎｇ／ｍＬのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）を含み、かつＩＬ−６を含まない。実施形態において、培地は、幹細胞増殖剤、例えば化合物４、例えば０．７５μＭの濃度の化合物４をさらに含む。実施形態において、培地は、幹細胞増殖剤、例えば化合物４、例えば０．５μＭの濃度の化合物４をさらに含む。実施形態において、培地は、１％Ｌ−グルタミンおよび２％ペニシリン／ストレプトマイシンをさらに含む。実施形態において、細胞培養培地は無血清である。
【０６０３】
ＸＩＩ．併用療法
本開示は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、または本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子で修飾された細胞（例えば、造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞）を１つ以上の他の治療モダリティおよび／または薬剤と併用した使用を企図する。したがって、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子で修飾された細胞の使用に加えて、異常ヘモグロビン症を治療するための１つ以上の「標準」療法も対象に投与し得る。
【０６０４】
異常ヘモグロビン症を治療するための１つ以上の追加的な療法には、例えば、追加的な幹細胞移植、例えば造血幹細胞移植が含まれ得る。幹細胞移植は同種異系由来または自己由来であり得る。
【０６０５】
異常ヘモグロビン症を治療するための１つ以上の追加的な療法には、例えば、輸血および／または鉄キレート化（例えば、除去）療法が含まれ得る。公知の鉄キレート化剤としては、例えば、デフェロキサミンおよびデフェラシロクスが挙げられる。
【０６０６】
異常ヘモグロビン症を治療するための１つ以上の追加的な療法としては、例えば、葉酸補充、またはヒドロキシウレア（例えば、５−ヒドロキシウレア）を挙げることができる。異常ヘモグロビン症を治療するための１つ以上の追加的な療法はヒドロキシウレアであり得る。実施形態において、ヒドロキシウレアは、例えば１日１０〜３５ｍｇ／ｋｇ、例えば１日１０〜２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され得る。実施形態において、ヒドロキシウレアは１日１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。実施形態において、ヒドロキシウレアは１日１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。実施形態において、ヒドロキシウレアは１日２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。実施形態において、ヒドロキシウレアは、例えば本明細書に記載されるとおりの、本発明の細胞（または細胞の集団）、例えばＣＤ３４＋細胞（または細胞の集団）の前および／または後に投与される。
【０６０７】
１つ以上の追加的な療法剤としては、例えば、抗ｐ−セレクチン抗体、例えばＳｅｌＧ１（Ｓｅｌｅｘｙｓ）を挙げることができる。Ｐ−セレクチン抗体については、例えば、国際公開第１９９３／０２１９５６号パンフレット、国際公開第１９９５／０３４３２４号パンフレット、国際公開第２００５／１００４０２号パンフレット、国際公開第２００８／０６９９９９号パンフレット、米国特許出願公開第２０１１／０２９３６１７号明細書、米国特許第５８００８１５号明細書、米国特許第６６６７０３６号明細書、米国特許第８９４５５６５号明細書、米国特許第８３７７４４０号明細書および米国特許第９０６８００１号明細書（これらの各々の内容は全体として本明細書に援用される）に記載されている。
【０６０８】
１つ以上の追加的な薬剤としては、例えば、胎児ヘモグロビンを上方制御する小分子を挙げることができる。かかる分子の例としては、ＴＮ１（例えば、Ｎａｍ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ  ２０１１，６，７７７−７８０，ＤＯＩ：１０．１００２／ｃｍｄｃ．２０１０００５０５（本明細書において参照により援用される）に記載されるとおり）が挙げられる。
【０６０９】
１つ以上の追加的な療法としては、照射または当該技術分野において公知の他の骨髄アブレーション療法も挙げることができる。かかる療法の例はブスルファンである。かかる追加的な療法は、本発明の細胞を対象に導入する前に実施され得る。ある実施形態において、本明細書に記載される治療方法（例えば、本明細書に記載される方法によって修飾された（例えば、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムで例えばＨｂＦ産生が増加するように修飾された）細胞（例えば、ＨＳＰＣ）の投与を含む治療方法）であり、本方法は、骨髄アブレーションステップを含まない。実施形態において、本方法は部分的骨髄アブレーションステップを含む。
【０６１０】
本明細書に記載される療法（例えば、ＨＳＰＣ、例えば、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲシステムを用いて修飾されたＨＳＰＣの集団を投与することを含む）は、追加的な療法剤と併用することもできる。ある実施形態において、追加的な療法剤はＨＤＡＣ阻害薬、例えばパノビノスタットである。ある実施形態において、追加的な療法薬は、国際公開第２０１４／１５０２５６号パンフレットに記載される化合物、例えば、国際公開第２０１４／１５０２５６号パンフレットの表１に記載される化合物、例えばＧＢＴ４４０である。ＨＤＡＣ阻害薬の他の例としては、例えばスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）が挙げられる。１つ以上の追加的な薬剤としては、例えばＤＮＡメチル化阻害薬を挙げることができる。かかる薬剤は、ＢＣＬ１１ａ活性が低下した細胞におけるＨｂＦ誘導を増加させることが示されている（例えば、Ｊｉａｎ  Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３４，９９３（２０１１）；ＤＯＩ：０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２１１０５３（本明細書において参照により援用される））。他のＨＤＡＣ阻害薬としては、当該技術分野において公知の任意のＨＤＡＣ阻害薬、例えば、トリコスタチンＡ、ＨＣ毒素、ＤＡＣＩ−２、ＦＫ２２８、ＤＡＣＩ−１４、デピュディシン（ｄｅｐｕｄｉｃｉｎ）、ＤＡＣＩ−１６、チュバシン（ｔｕｂａｃｉｎ）、ＮＫ５７、ＭＡＺ１５３６、ＮＫ１２５、スクリプタイド、ピロキサミド、ＭＳ−２７５、ＩＴＦ−２３５７、ＭＣＧ−Ｄ０１０３、ＣＲＡ−０２４７８１、ＣＩ−９９４、およびＬＢＨ５８９が挙げられる（例えば、Ｂｒａｄｎｅｒ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１０（ｖｏｌ．１０７：２８），１２６１７−１２６２２（本明細書において全体として参照により援用される）を参照されたい）。
【０６１１】
本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、または本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子で修飾された細胞（例えば、造血幹細胞、例えばＣＤ３４＋細胞）と、共療法剤または共療法とは、同じ製剤でまたは別個に投与することができる。別個に投与する場合、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、または本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子で修飾された細胞は、共療法薬または共療法の前、その後、またはそれと同時に投与することができる。一方の薬剤が他方の薬剤の投与に数分間〜数週間の範囲にわたる間隔で先行または後続してもよい。２つ以上の異なる種類の療法剤が別個に対象に適用される実施形態では、概して各送達時点間に著しく長い期間が経過しないことが確実にされ、したがってこれらの異なる種類の薬剤はなおも有利には標的組織または細胞に併用効果を発揮し得る。
【０６１２】
ＸＩＩＩ．修飾ヌクレオシド、ヌクレオチド、および核酸
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは核酸、例えば、特にｇＲＮＡに存在し、しかし他の形態のＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはｓｉＲＮＡにも存在し得る。本明細書に記載されるとおり「ヌクレオシド」は、五炭糖分子（ペントースまたはリボース）またはその誘導体、および有機塩基、プリンまたはピリミジンまたはその誘導体を含有する化合物として定義される。本明細書に記載されるとおり、「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含むヌクレオシドとして定義される。
【０６１３】
修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の１つ以上を含み得る：
（ｉ）非連結リン酸酸素の一方または両方、および／またはリン酸ジエステル骨格連結における連結リン酸酸素の１つ以上の改変、例えば置換；
（ｉｉ）リボース糖の構成要素、例えばリボース糖上の２’ヒドロキシルの改変、例えば置換；
（ｉｉｉ）「デホスホ」リンカーによるリン酸部分のホールセール置換；
（ｉｖ）非カノニカル核酸塩基によるものを含めた、天然に存在する核酸塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボース−リン酸骨格の置換または修飾；
（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置換、または部分、キャップもしくはリンカーのコンジュゲーション；および
（ｖｉｉ）糖の修飾または置換。
【０６１４】
上記に列挙する修飾を組み合わせて、２、３、４個、またはそれを超える修飾を有し得る修飾ヌクレオシドおよびヌクレオチドを提供することができる。例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは修飾糖および修飾核酸塩基を有し得る。ある実施形態において、ｇＲＮＡのあらゆる塩基が修飾され、例えば、全ての塩基が修飾リン酸基を有し、例えば、全てがホスホロチオエート基である。ある実施形態において、単分子またはモジュラーｇＲＮＡ分子のリン酸基の全て、または実質的に全てがホスホロチオエート基に置換されている。実施形態において、ｇＲＮＡの５つの３’末端塩基の１つ以上および／または５つの５’末端塩基の１つ以上がホスホロチオエート基で修飾されている。
【０６１５】
ある実施形態において、修飾ヌクレオチド、例えば本明細書に記載されるとおりの修飾を有するヌクレオチドは、核酸、例えば「修飾核酸」に取り込まれ得る。一部の実施形態において、修飾核酸は、１、２、３個またはそれを超える修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、修飾核酸中の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％）が修飾ヌクレオチドである。
【０６１６】
非修飾核酸は、例えば細胞ヌクレアーゼによる分解を受け易いものであり得る。例えば、ヌクレアーゼは核酸リン酸ジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様において、本明細書に記載される修飾核酸は１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有し、それにより例えばヌクレアーゼに対する安定性を導入し得る。
【０６１７】
一部の実施形態において、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、インビボおよびエキソビボの両方で、細胞の集団に導入されたときに自然免疫応答の低下を呈し得る。用語「自然免疫応答」には、サイトカインの発現および放出、特にインターフェロンの誘導、および細胞死に関わる、概してウイルスまたは細菌起源の、一本鎖核酸を含めた外因性核酸に対する細胞応答が含まれる。一部の実施形態において、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、核酸との主溝相互作用パートナーの結合を破壊し得る。一部の実施形態において、本明細書に記載される修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および修飾核酸は、インビボおよびエキソビボの両方で、細胞の集団に導入されたときに自然免疫応答の低下を呈し、また核酸との主溝相互作用パートナーの結合も破壊し得る。
【０６１８】
化学基の定義
本明細書で使用されるとき、「アルキル」とは、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素基を指すことが意図される。例示的なアルキル基としては、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（例えば、ｎ−プロピルおよびイソプロピル）、ブチル（例えば、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル）、ペンチル（例えば、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル）などが挙げられる。アルキル基は、１〜約２０、２〜約２０、１〜約１２、１〜約８、１〜約６、１〜約４、または１〜約３個の炭素原子を含有し得る。
【０６１９】
本明細書で使用されるとき、「アリール」は、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、フェナントレニル、インダニル、インデニルなど、単環式または多環式（例えば、２、３または４個の縮合環を有する）芳香族炭化水素を指す。一部の実施形態において、アリール基は６〜約２０個の炭素原子を有する。
【０６２０】
本明細書で使用されるとき、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する脂肪族基を指す。本明細書で使用されるとき、「アルキニル」は、２〜１２個の炭素原子を含有し、かつ１つ以上の三重結合を有することを特徴とする直鎖状または分枝状炭化水素鎖を指す。例示的なアルキニル基としては、限定はされないが、エチニル、プロパルギル、および３−ヘキシニルが挙げられる。
【０６２１】
本明細書で使用されるとき、「アリールアルキル」または「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基に置換されているアルキル部分を指す。アラルキルは、２つ以上の水素原子がアリール基に置換されている基を含む。「アリールアルキル」または「アラルキル」の例としては、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、９−フルオレニル、ベンズヒドリル、およびトリチル基が挙げられる。
【０６２２】
本明細書で使用されるとき、「シクロアルキル」は、３〜１２個の炭素を有する環式、二環式、三環式、または多環式非芳香族炭化水素基を指す。シクロアルキル部分の例としては、限定はされないが、シクロプロピル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられる。
【０６２３】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロシクリル」は、複素環系の一価ラジカルを指す。代表的なヘテロシクリルとしては、限定なしに、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピペリジニル、ピロリニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、およびモルホリニルが挙げられる。
【０６２４】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロアリール」は、ヘテロ芳香環系の一価ラジカルを指す。ヘテロアリール部分の例としては、限定はされないが、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピロリル、フラニル、インドリル、チオフェニル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、キノリル、およびプテリジニルが挙げられる。
【０６２５】
リン酸骨格修飾
リン酸基
一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドのリン酸基が、酸素の１つ以上を異なる置換基に置換することによって修飾されてもよい。さらに、修飾ヌクレオチド、例えば修飾核酸に存在する修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるとおりの修飾リン酸による非修飾リン酸部分のホールセール置換を含み得る。一部の実施形態において、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカーまたは非対称電荷分布の荷電リンカーのいずれかをもたらす改変を含み得る。
【０６２６】
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート類、ボラノホスフェート類、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート類、ホスホロアミデート類、アルキルまたはアリールホスホネート類およびリン酸トリエステル類が挙げられる。一部の実施形態において、リン酸骨格部分における非架橋リン酸酸素原子の１つが以下の基：硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、ＢＲ３（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、Ｃ（例えば、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（式中、Ｒは、例えば、水素、アルキル、またはアリールであり得る）、またはＯＲ（式中、Ｒは、例えばアルキルまたはアリールであり得る）のいずれかに置換されてもよい。非修飾リン酸基のリン原子はアキラルである。しかしながら、非架橋酸素の１つを上記の原子または原子団の１つに置換すると、リン原子をキラルにすることができる。すなわち、このように修飾されたリン酸基のリン原子はステレオジェン中心である。ステレオジェニックなリン原子は「Ｒ」配置（本明細書ではＲｐ）または「Ｓ」配置（本明細書ではＳｐ）のいずれかを有し得る。
【０６２７】
ホスホロジチオエート類では両方の非架橋酸素が硫黄によって置換される。ホスホロジチオエート類のリン中心はアキラルであり、これがオリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を妨げる。一部の実施形態において、一方または両方の非架橋酸素に対する修飾は、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、およびＯＲ（Ｒは、例えばアルキルまたはアリールであり得る）から独立して選択される基による非架橋酸素の置換も含み得る。
【０６２８】
リン酸リンカーは、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）を窒素（架橋ホスホロアミデート類）、硫黄（架橋ホスホロチオエート類）および炭素（架橋メチレンホスホネート類）で置換することによっても修飾し得る。この置換は、連結酸素のいずれか、または連結酸素の両方に行うことができる。
【０６２９】
リン酸基の置換
リン酸基は非リン含有連結基によって置換することができる。一部の実施形態において、荷電リン酸基が中性部分によって置換されてもよい。
【０６３０】
リン酸基を置換することのできる部分の例としては、限定なしに、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノを挙げることができる。
【０６３１】
リボリン酸骨格の置換
核酸を模倣することのできる足場も構築することができ、ここで、リン酸リンカーおよびリボース糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートに置換される。一部の実施形態において、核酸塩基はサロゲート骨格によってテザー係留することができる。例としては、限定なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジンおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシドサロゲートを挙げることができる。
【０６３２】
糖修飾
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖基に１つ以上の修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）が幾つもの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基によって修飾または置換されてもよい。一部の実施形態において、２’ヒドロキシル基に対する修飾は、ヒドロキシルが脱プロトン化して２’−アルコキシドイオンを形成することがもはやできないため、核酸の安定性を増進し得る。２’−アルコキシドは、リンカーリン原子に対する分子内求核攻撃による分解を触媒し得る。
【０６３３】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であってよい）；ポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ（式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意選択で置換されていてもよいアルキルであってよく、およびｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、および４〜２０）の整数であってよい）を挙げることができる。一部の実施形態において、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾としては、２’ヒドロキシルが例えばＣ１〜６アルキレンまたはＣ１〜６ヘテロアルキレン架橋によって同じリボース糖の４’炭素に結合されていてもよい「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を挙げることができ、ここで、例示的架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋；Ｏ−アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであってよい）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎ−アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであってよい）を挙げることができる。一部の実施形態において、「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾としては、メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、例えばＰＥＧ誘導体）を挙げることができる。
【０６３４】
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわちデオキシリボース糖、例えば部分的ｄｓＲＮＡのオーバーハング部分におけるもの）；ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）；アミノ（ここで、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であってよい）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミノ（ここで、アミノは、例えば本明細書に記載されるとおりであってよい）、−ＮＨＣ（０）Ｒ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であってよい）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；およびアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニル（これらは任意選択で、例えば本明細書に記載されるとおりのアミノによって置換されていてもよい）を挙げることができる。
【０６３５】
糖基は、リボースの対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素も含有し得る。したがって、修飾核酸は、例えばアラビノースを糖として含有するヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド「単量体」は、糖上のγ位にα結合、例えばα−ヌクレオシドを有し得る。修飾核酸は、Ｃ−に核酸塩基を欠く「脱塩基」糖も含み得る。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子の１つ以上でさらに修飾されてもよい。修飾核酸は、Ｌ型の１つ以上の糖、例えばＬ−ヌクレオシドも含み得る。
【０６３６】
概して、ＲＮＡは、酸素を有する５員環である糖基リボースを含む。例示的修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、限定なしに、リボースの酸素の（例えば、硫黄（Ｓ）、セレン（Ｓｅ）、または例えばメチレンもしくはエチレンなどのアルキレンによる）置換；二重結合の付加（例えば、リボースをシクロペンテニルまたはシクロヘキセニルで置換する）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボースの環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、およびホスホルアミデート骨格も有するモルホリノなど、追加の炭素またはヘテロ原子を有する６員または７員環を例えば形成する）を含み得る。一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドは、多環型（例えば、トリシクロ；および「アンロックド」型、例えば、グリコール核酸（ＧＮＡ）（例えば、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ（リン酸ジエステル結合に付加されたグリコール単位によってリボースが置換されている）、トレオース核酸（ＴＮＡ、ａ−Ｌ−トレオフラノシル−（３’−→２’）によってリボースが置換されている））を含み得る。
【０６３７】
核酸塩基に対する修飾
修飾核酸に組み込むことのできる本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、限定はされないが、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。これらの核酸塩基を修飾し、または完全に置換して、修飾核酸に組み込むことのできる修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供することができる。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジン類似体から独立して選択することができる。一部の実施形態において、核酸塩基は、例えば、塩基の天然に存在するおよび合成の誘導体を含み得る。
【０６３８】
ウラシル
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、プソイドウリジン（ψ）、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば、５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（ｔｃｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（ｔｒｎ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ、すなわち、核酸塩基デオキシチミンを有する）、１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１ψ）、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピルプソイドウリジン、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル］））−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、ａ−チオ−ウ���ジン、２’−０−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２’−０−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２’−０−メチル−プソイドウリジン（ψｍ）、２−チオ−２’−０−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２’−０−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２’−０−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−０−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２’−０−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２’−０−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２’−Ｆ−ａｒａ−ウリジン、２’−Ｆ−ウリジン、２’−ＯＨ−ａｒａ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン類、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
【０６３９】
シトシン
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、５−アザ−シチジン、６−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン（ｍ３Ｃ）、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃｔ）、５−ホルミル−シチジン（ｆ５Ｃ）、Ｎ４−メチル−シチジン（ｍ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン（ｋ２Ｃ）、ａ−チオ−シチジン、２’−０−メチル−シチジン（Ｃｍ）、５，２’−０−ジメチル−シチジン（ｍ５Ｃｍ）、Ｎ４−アセチル−２’−０−メチル−シチジン（ａｃ４Ｃｍ）、Ｎ４，２’−０−ジメチル−シチジン（ｍ４Ｃｍ）、５−ホルミル−２’−０−メチル−シチジン（ｆ５Ｃｍ）、Ｎ４，Ｎ４，２’−０−トリメチル−シチジン（ｍ４２Ｃｍ）、１−チオ−シチジン、２’−Ｆ−ａｒａ−シチジン、２’−Ｆ−シチジン、および２’−ＯＨ−ａｒａ−シチジンが挙げられる。
【０６４０】
アデニン
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノ−６−ハロ−プリン（例えば、２−アミノ−６−クロロ−プリン）、６−ハロ−プリン（例えば、６−クロロ−プリン）、２−アミノ−６−メチル−プリン、８−アジド−アデノシン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノ−プリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍｓ２ｍ６Ａ）、Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｉ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニル−アデノシン（ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｉｏ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（ｍｓ２ｉｏ６Ａ）、Ｎ６−グリシニルカルバモイル−アデノシン（ｇ６Ａ）、Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｔ６Ａ）、Ｎ６−メチル−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍ６ｔ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｇ６Ａ）、Ｎ６，Ｎ６−ジメチル−アデノシン（ｍ６２Ａ）、Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｈｎ６Ａ）、２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン（ｍｓ２ｈｎ６Ａ）、Ｎ６−アセチル−アデノシン（ａｃ６Ａ）、７−メチル−アデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、ａ−チオ−アデノシン、２’−０−メチル−アデノシン（Ａｍ）、Ｎ６，２’−０−ジメチル−アデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン、Ｎ６，Ｎ６，２’−０−トリメチル−アデノシン（ｍ６２Ａｍ）、ｌ，２’−０−ジメチル−アデノシン（ｍ’Ａｍ）、２’−０−リボシルアデノシン（リン酸）（Ａｒ（ｐ））、２−アミノ−Ｎ６−メチル−プリン、１−チオ−アデノシン、８−アジド−アデノシン、２’−Ｆ−ａｒａ−アデノシン、２’−Ｆ−アデノシン、２’−ＯＨ−ａｒａ−アデノシン、およびＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）−アデノシンが挙げられる。
【０６４１】
グアニン
一部の実施形態において、修飾核酸塩基は修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的核酸塩基およびヌクレオシドとしては、限定なしに、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ’ｌ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、４−デメチル−ワイオシン（ｉｍＧ−１４）、イソワイオシン（ｉｍＧ２）、ワイブトシン（ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｏ２ｙＷ）、ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ）、不完全修飾型ヒドロキシワイブトシン（ＯＨｙＷ＊）、７−デアザ−グアノシン、キューオシン（Ｑ）、エポキシキューオシン（ｏＱ）、ガラクトシル−キューオシン（ｇａｌＱ）、マンノシル−キューオシン（ｍａｎＱ）、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱｉ）、アーケオシン（Ｇ＋）、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチル−イノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−グアノシン（ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７−ジメチル−グアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メト  チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン、ａ−チオ−グアノシン、２’−０−メチル−グアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２−メチル−２’−０−メチル−グアノシン（ｍ２Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−２’−０−メチル−グアノシン（ｍ２２Ｇｍ）、１−メチル−２’−０−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇｍ）、Ｎ２，７−ジメチル−２’−０−メチル−グアノシン（ｍ２，７Ｇｍ）、２’−０−メチル−イノシン（Ｉｍ）、ｌ，２’−０−ジメチル−イノシン（ｍ１Ｉｍ）、０６−フェニル−２’−デオキシイノシン、２’−０−リボシルグアノシン（ホスフェート）（Ｇｒ（ｐ））、１−チオ−グアノシン、０６−メチル］）−グアノシン、０６−メチル−２’−デオキシグアノシン、２’−Ｆ−ａｒａ−グアノシン、および２’−Ｆ−グアノシンが挙げられる。
【０６４２】
修飾ｇＲＮＡ
一部の実施形態において、修飾核酸は修飾ｇＲＮＡであり得る。一部の実施形態において、ｇＲＮＡは３’末端で修飾されてもよい。この実施形態において、ｇＲＮＡは３’末端Ｕリボースで修飾されてもよい。例えば、Ｕリボースの２つの末端ヒドロキシル基をアルデヒド基に酸化し、同時にリボース環を開環すると、修飾ヌクレオシド（Ｕは非修飾または修飾ウリジンであってよい）を得ることができる。
【０６４３】
別の実施形態において、３’末端Ｕは２’３’環状リン酸で修飾されてもよい（Ｕは非修飾または修飾ウリジンであってよい）。一部の実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、例えば本明細書に記載される修飾ヌクレオチドの１つ以上を取り入れることにより、分解に対して安定化させ得る３’ヌクレオチドを含有し得る。この実施形態において、例えばウリジンは、修飾ウリジン、例えば、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、および５−ブロモウリジンに置換するか、または本明細書に記載される修飾ウリジンのいずれかに置換することができ、アデノシンおよびグアノシンは、修飾アデノシンおよびグアノシン、例えば８位の修飾、例えば８−ブロモグアノシンに置換するか、または本明細書に記載される修飾アデノシンまたはグアノシンのいずれかに置換することができる。一部の実施形態において、デアザヌクレオチド、例えば７−デアザ−アデノシンをｇＲＮＡに取り入れることができる。一部の実施形態において、Ｏ−およびＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンをｇＲＮＡに取り入れることができる。一部の実施形態において、糖修飾リボヌクレオチドを取り入れることができ、例えば、ここで、２’ＯＨ基が、Ｈ、−ＯＲ、−Ｒ（式中、Ｒは、例えば、メチル、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であってよい）、ハロ、−ＳＨ、−ＳＲ（式中、Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖であってよい）、アミノ（式中、アミノは、例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であってよい）；またはシアノ（−ＣＮ）から選択される基に置換される。一部の実施形態において、リン酸骨格が本明細書に記載されるとおり、例えばホスホチオエート基で修飾されてもよい。一部の実施形態において、ｇＲＮＡのオーバーハング領域のヌクレオチドが、各々独立して、２−Ｆ  ２’−０−メチル，チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組み合わせなど、限定はされないが２’−糖修飾型を含め、修飾型または非修飾型ヌクレオチドであってよい。
【０６４４】
ある実施形態において、ＲＮＡ分子、例えばｇＲＮＡ分子の一本鎖オーバーハングにおけるヌクレオチドの１つ以上または全てがデオキシヌクレオチドである。
【０６４５】
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載されるとおりの複数のｇＲＮＡ分子、または本明細書に記載される１つ以上のｇＲＮＡ分子で修飾された１つ以上の細胞を含む細胞（例えば、細胞の集団、例えば、造血幹細胞の、例えばＣＤ３４＋細胞の集団）を、１つ以上の薬学的または生理学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。かかる組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン類、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。本発明の組成物は、一態様では、静脈内投与用に製剤化される。
【０６４６】
本発明の医薬組成物は、治療（または予防）しようとする疾患に適切な方法で投与し得る。投与の分量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患のタイプおよび重症度などの要因によって決まることになるが、適切な投薬量は臨床試験によって決定されてもよい。
【０６４７】
一実施形態において、本医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、マウス抗体、ヒトプール血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地成分、望ましくないＣＲＩＳＰＲシステム成分、細菌および真菌からなる群から選択される夾雑物を実質的に含まず、例えば、検出可能なレベルの夾雑物は存在しない。一実施形態において、細菌は、アルガリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｏｍｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、およびＡ群化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からなる群から選択される少なくとも１つである。
【０６４８】
主題組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸液、植込みまたは移植によることを含め、任意の好都合な方法で行われてもよい。本明細書に記載される組成物は、患者に対し、経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射により、または腹腔内に投与され得る。一態様において、本発明の組成物は患者に対して皮内または皮下注射によって投与される。一態様において、本発明の細胞組成物はｉ．ｖ．注射によって投与される。
【０６４９】
患者に投与する上記の治療の投薬量は、治療下の病態および治療の被投与者の詳細な性質によって異なり得る。ヒト投与についての投薬量のスケーリングは、当該技術分野で認められている手法に従い実施することができる。
【０６５０】
細胞
本発明は、本発明のｇＲＮＡ分子、または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含む細胞にも関する。
【０６５１】
ある態様において本細胞は、本明細書に記載される方法によって作製される細胞である。
【０６５２】
実施形態において、細胞は造血幹細胞（例えば、造血幹細胞・前駆細胞；ＨＳＰＣ）、例えばＣＤ３４＋幹細胞である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋幹細胞である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ９０−幹細胞である。実施形態において、細胞はヒト造血幹細胞である。実施形態において、細胞は自己由来である。実施形態において、細胞は同種異系由来である。
【０６５３】
実施形態において、細胞は骨髄、例えば自己由来の骨髄に由来する。実施形態において、細胞は末梢血、例えば動員末梢血、例えば自己由来の動員末梢血に由来する。動員末梢血を用いる実施形態において、細胞は、動員剤を投与された患者から単離されたものである。実施形態において、動員剤はＧ−ＣＳＦである。実施形態において、動員剤はＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）である。実施形態において、細胞は臍帯血、例えば同種異系由来の臍帯血に由来する。
【０６５４】
実施形態において、細胞は哺乳動物細胞である。実施形態において、細胞はヒト細胞である。
【０６５５】
ある態様において、本発明は、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムの一部として前記細胞に導入される例えば本明細書に記載されるとおりの１つまたは複数のｇＲＮＡ分子と相補性を有する核酸配列にまたはその近傍に（例えば、それから２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ヌクレオチド以内に）修飾または改変、例えばインデルを含む細胞を提供する。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋細胞である。実施形態において、改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、多系統の細胞に分化する能力を維持しており、例えば、赤血球系統の細胞に分化する能力を維持している。実施形態において、改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、培養液中、例えば、幹細胞増殖剤、例えば化合物４を含む培養液中で少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０回またはそれを超える倍加を起こしているか、またはそれを起こす能力がある。実施形態において、改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、培養液中、例えば、幹細胞増殖剤分子、例えば本明細書に記載されるとおりのもの、例えば化合物４を含む培養液中で少なくとも５回、例えば約５回の倍加を起こしているか、またはそれを起こす能力がある。実施形態において、改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、同様の非修飾または非改変細胞と比べて胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発現レベルおよび／またはタンパク質レベル）の増加、例えば胎児ヘモグロビンタンパク質レベルの少なくとも２０％の増加を呈する、および／またはそれを呈する細胞、例えば赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力がある。実施形態において、改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、同様の非修飾または非改変細胞と比べて胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発現レベルおよび／またはタンパク質レベル）の増加を呈し、および／またはそれを呈する細胞、例えば赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力があり、例えば、少なくとも６ピコグラム、例えば、少なくとも７ピコグラム、少なくとも８ピコグラム、少なくとも９ピコグラム、または少なくとも１０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞は、同様の非修飾または非改変細胞と比べて胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発現レベルおよび／またはタンパク質レベル）の増加を呈し、および／またはそれを呈する細胞、例えば赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力があり、例えば、約６〜約１２、約６〜約７、約７〜約８、約８〜約９、約９〜約１０、約１０〜約１１または約１１〜約１２ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。
【０６５６】
ある態様において、本発明は、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステムの一部として前記細胞に導入される例えば本明細書に記載されるとおりの１つまたは複数のｇＲＮＡ分子と相補性を有する核酸配列にまたはその近傍に（例えば、それから２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ヌクレオチド以内に）修飾または改変、例えばインデルを有する細胞を含む細胞の集団を提供する。実施形態において、例えば本発明のｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲシステムの導入後２日目に、例えば本明細書に記載されるとおり例えばＮＧＳによって計測したとき、集団の細胞の少なくとも５０％、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％は、修飾または改変を有する（例えば、少なくとも１つの修飾または改変を有する）。実施形態において、例えば本発明のｇＲＮＡおよび／またはＣＲＩＳＰＲシステムの導入後２日目に、例えば本明細書に記載されるとおり例えばＮＧＳによって計測したとき、集団の細胞の少なくとも９０％、例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％は、修飾または改変を有する（例えば、少なくとも１つの修飾または改変を有する）。実施形態において、細胞の集団はＣＤ３４＋細胞を含み、例えば少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９８％のＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、細胞の集団は改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞を含み、例えば、多系統の細胞を産生する能力、例えばそれに分化する能力を維持しており、例えば、赤血球系統の細胞を産生する能力、例えばそれに分化する能力を維持している。実施形態において、細胞の集団、例えばＣＤ３４＋細胞の集団は、培養液中、例えば、幹細胞増殖剤、例えば化合物４を含む培養液中で少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０回またはそれを超える集団倍加を起こしているか、またはそれを起こす能力がある。実施形態において、改変または修飾された細胞の集団、例えばＣＤ３４＋細胞の集団は、培養液中、例えば、幹細胞増殖剤分子、例えば本明細書に記載されるとおりのもの、例えば化合物４を含む培養液中で少なくとも５回、例えば約５回の集団倍加を起こしているか、またはそれを起こす能力がある。実施形態において、改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞を含む細胞の集団は、同様の非修飾または非改変細胞と比べて胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発現レベルおよび／またはタンパク質レベル）の増加、例えば胎児ヘモグロビンタンパク質レベルの少なくとも２０％の増加を呈する、および／またはそれを呈する細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団、例えば赤血球細胞の集団に分化する能力がある。実施形態において、改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞を含む細胞の集団は、同様の非修飾または非改変細胞と比べて胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発現レベルおよび／またはタンパク質レベル）の増加を呈し、および／またはそれを呈する細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団、例えば赤血球細胞の集団に分化する能力があり、例えば、１細胞当たり少なくとも６ピコグラム、例えば、少なくとも７ピコグラム、少なくとも８ピコグラム、少なくとも９ピコグラム、または少なくとも１０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する細胞を含む。実施形態において、改変または修飾された細胞、例えばＣＤ３４＋細胞の集団は、同様の非修飾または非改変細胞と比べて胎児ヘモグロビンレベル（例えば、発現レベルおよび／またはタンパク質レベル）の増加を呈し、および／またはそれを呈する細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団、例えば赤血球細胞の集団に分化する能力があり、例えば、１細胞当たり約６〜約１２、約６〜約７、約７〜約８、約８〜約９、約９〜約１０、約１０〜約１１または約１１〜約１２ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する細胞を含む。
【０６５７】
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ３個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ４個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ５個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ８個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ９個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ１０個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ１１個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、少なくとも約１ｅ１２個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ１３個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約２ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約３ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約４ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約５ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約６ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約７ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約８ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約９ｅ６個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約２ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約３ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約４ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約５ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約６ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約７ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約８ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約９ｅ７個の細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ８個の細胞を含む。前述の実施形態のいずれにおいても、細胞の集団は、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％）のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含み得る。前述の実施形態のいずれにおいても、細胞の集団は、約６０％のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含み得る。ある実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、約３ｅ７個の細胞を含み、および約２ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。
【０６５８】
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１．５ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約２ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約３ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約４ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約５ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約６ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約７ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約８ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約９ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約２ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約３ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約４ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約５ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約６ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約７ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約８ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約９ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約２ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約３ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約４ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり少なくとも約５ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。
【０６５９】
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約１ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約１．５ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約２ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約３ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約４ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約５ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約６ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約７ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約８ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約９ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約１ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約２ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約３ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約４ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約５ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約６ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約７ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約８ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約９ｅ７個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約１ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約２ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約３ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約４ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約５ｅ８個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。
【０６６０】
実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり約２ｅ６〜約１０ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。実施形態において、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団は、それを投与する患者の体重１キログラム当たり２ｅ６〜１０ｅ６個のＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を含む。
【０６６１】
本発明の細胞は、本発明のｇＲＮＡ分子、または前記ｇＲＮＡ分子をコードする核酸、および本発明のＣａｓ９分子、または前記Ｃａｓ９分子をコードする核酸を含み得る。ある実施形態において、本発明の細胞は、本発明のｇＲＮＡ分子と本発明のＣａｓ９分子とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含み得る。
【０６６２】
本発明の細胞は、好ましくは、本発明のｇＲＮＡ分子を含むように、例えば本明細書に記載される方法、例えばエレクトロポレーションによってエキソビボで修飾される。
【０６６３】
本発明の細胞には、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムの導入によって１つ以上の遺伝子の発現が改変されている、例えば低下または阻害されている細胞が含まれる。例えば、本発明の細胞は、非修飾細胞と比べて低下したＢＣＬ１１ａ発現レベルを有し得る。別の例として、本発明の細胞は、非修飾細胞と比べて増加した胎児ヘモグロビン発現レベルを有し得る。別の例として、本発明の細胞は、非修飾細胞と比べて低下したβグロビン発現レベルを有し得る。それに代えて、または加えて、本発明の細胞は、非修飾細胞から分化した細胞と比べて低下したＢＣＬ１１ａ発現レベルを有する別のタイプの細胞、例えば赤血球を生じ得る、例えばそれに分化し得る。それに代えて、または加えて、本発明の細胞は、非修飾細胞から分化した細胞と比べて増加した胎児ヘモグロビン発現レベルを有する別のタイプの細胞、例えば赤血球を生じ得る、例えばそれに分化し得る。それに代えて、または加えて、本発明の細胞は、非修飾細胞から分化した細胞と比べて低下したβグロビン発現レベルを有する別のタイプの細胞、例えば赤血球を生じ得る、例えばそれに分化し得る。
【０６６４】
本発明の細胞には、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムの導入によって１つ以上の遺伝子の発現が改変されている、例えば低下または阻害されている細胞が含まれる。例えば、本発明の細胞は、非修飾細胞と比べて低下したヘモグロビンβ、例えば突然変異型または野生型ヘモグロビンβの発現レベルを有し得る。別の態様において、本発明は、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞から誘導された、例えばそれから分化した細胞を提供する。かかる態様において、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞は、ヘモグロビンβ、例えば突然変異型または野生型ヘモグロビンβのレベルの低下を呈しないものであり得るが、前記細胞から誘導された、例えばそれから分化した細胞は、ヘモグロビンβ、例えば突然変異型または野生型ヘモグロビンβのレベルの低下を呈し得る。実施形態において、誘導、例えば分化は、インビボで（例えば、患者の体内で）達成される。実施形態において、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞はＣＤ３４＋細胞であり、それから誘導された、例えば分化した細胞は赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞である。
【０６６５】
本発明の細胞には、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムの導入によって１つ以上の遺伝子の発現が改変されている、例えば増加しているか、または促進されている細胞が含まれる。例えば、本発明の細胞は、非修飾細胞と比べて増加した胎児ヘモグロビン発現レベルを有し得る。別の態様において、本発明は、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞から誘導された、例えばそれから分化した細胞を提供する。かかる態様において、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞は、胎児ヘモグロビンレベルの増加を呈しないものであり得るが、前記細胞から誘導された、例えばそれから分化した細胞は、胎児ヘモグロビンレベルの増加を呈し得る。実施形態において、誘導、例えば分化は、インビボで（例えば、患者の体内で）達成される。実施形態において、本発明のｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが導入された細胞はＣＤ３４＋細胞であり、それから誘導された、例えば分化した細胞は赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞である。
【０６６６】
別の態様において、本発明は、細胞に導入される１つまたは複数のｇＲＮＡ分子と相補性を有する核酸配列に（例えば、その範囲内に）またはその近傍に（例えば、それから２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ヌクレオチド以内に）インデルを含む細胞に関する。実施形態において、インデルはフレームシフトインデルである。実施形態において、インデルは、表１５に挙げられるインデルである。実施形態において、インデルは、表２６、表２７または表３７に挙げられるインデルである。実施形態において本発明は、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団に関し、ここで、細胞の集団は、表１５に挙げられるインデルを有する細胞を含む。実施形態において本発明は、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞の集団に関し、ここで、細胞の集団は、表２６、表２７または表３７に挙げられるインデルを有する細胞を含む。
【０６６７】
ある態様において、本発明は、例えば本明細書に記載されるとおりの細胞に導入される例えば本明細書に記載されるとおりの１つまたは複数のｇＲＮＡ分子と相補性を有する核酸配列にまたはその近傍に（例えば、それから２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１ヌクレオチド以内に）、例えば本明細書に記載されるとおりのインデル、例えば、図２５、表１５、表２６、表２７または表３７に記載されるインデルまたはインデルパターンを含む細胞を含む細胞の集団、例えばＨＳＰＣの集団に関する。実施形態において、インデルはフレームシフトインデルである。実施形態において、集団の細胞の２０％〜１００％が前記１つまたは複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の３０％〜１００％が前記１つまたは複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の４０％〜１００％が前記１つまたは複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の５０％〜１００％が前記１つまたは複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の６０％〜１００％が前記１つまたは複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の７０％〜１００％が前記１つまたは複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の８０％〜１００％が前記１つまたは複数のインデルを含む。実施形態において、集団の細胞の９０％〜１００％が前記１つまたは複数のインデルを含む。実施形態において、細胞の集団は複数の細胞型に分化する能力を保持しており、例えば、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力を維持している。実施形態において、編集され、かつ分化した細胞（例えば、赤血球細胞）は、増殖する能力、例えば、例えば実施例に記載されるとおりの赤血球系分化培地（ＥＤＭ）中で７日後に少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍またはそれを超えて増殖する能力、および／または例えば実施例に記載されるとおりの赤血球系分化培地（ＥＤＭ）中で２１日後に少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも５５倍、少なくとも６０倍、少なくとも６５倍、少なくとも７０倍、少なくとも７５倍、少なくとも８０倍、少なくとも８５倍、少なくとも９０倍、少なくとも９５倍、少なくとも１００倍、少なくとも１１０倍、少なくとも１２０倍、少なくとも１３０倍、少なくとも１４０倍、少なくとも１５０倍、少なくとも２００倍、少なくとも３００倍、少なくとも４００倍、少なくとも５００倍、少なくとも６００倍、少なくとも７００倍、少なくとも８００倍、少なくとも９００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１１００倍、少なくとも１２００倍、少なくとも１３００倍、少なくとも１４００倍、少なくとも１５００倍またはそれを超えて増殖する能力を維持している。
【０６６８】
ある実施形態において、本発明は、集団の細胞の少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子の標的化ドメインと相補的な部位にまたはその近傍に、例えば本明細書に記載されるとおりのインデルを含む細胞、例えばＣＤ３４＋細胞の集団を提供し（理論によって拘束されるものではないが、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子またはＣＲＩＳＰＲシステムを細胞の集団に導入すると、前記集団にインデルパターンが生じ、したがってインデルを含む集団の各細胞が同じインデルを呈しないこともあると考えられる）、ここで、前記細胞は、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞に分化する能力を維持している、および／または同様の非修飾細胞の集団から分化した細胞と比べて、細胞の集団から分化した前記細胞は増加した胎児ヘモグロビンレベルを有する（例えば、集団はより高い％Ｆ細胞を有する）。実施形態において、細胞の集団はエキソビボで、例えば化合物４を含む培養液中で少なくとも５倍の増殖を起こしている。
【０６６９】
実施形態において、インデルは、約５０ヌクレオチド未満、例えば、約４５未満、約４０未満、約３５未満、約３０未満または約２５未満のヌクレオチドである。実施形態において、インデルは約２５ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約２０ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約１５ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約１０ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約９ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約９ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約７ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約６ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約５ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約４ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約３ヌクレオチド未満である。実施形態において、インデルは約２ヌクレオチド未満である。前述の実施形態のいずれにおいても、インデルは少なくとも１ヌクレオチドである。実施形態において、インデルは１ヌクレオチドである。
【０６７０】
ある態様において、本発明は、例えば本明細書に記載されるとおりの、修飾ＨＳＰＣまたは前記ＨＳＰＣから分化した（例えば、エキソビボでまたは患者の体内で分化した）赤血球系細胞の集団を提供し、ここで、細胞の少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％がＦ細胞である。実施形態において、細胞の集団は、例えば本明細書に記載されるとおりの１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が細胞に導入されていない同様の細胞の集団と比べてより高い割合のＦ細胞を含有する（またはそれを含有する赤血球系の集団への例えばインビボでの分化能を有する）。実施形態において、細胞の集団は、例えば本明細書に記載されるとおりの１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が細胞に導入されていない同様の細胞の集団と比べてＦ細胞の少なくとも２０％の増加、例えば、少なくとも２１％の増加、少なくとも２２％の増加、少なくとも２３％の増加、少なくとも２４％の増加、少なくとも２５％の増加、少なくとも２６％の増加、少なくとも２７％の増加、少なくとも２８％の増加、または少なくとも２９％の増加を有する（またはそれを有する赤血球系の集団への例えばインビボでの分化能を有する）。実施形態において、細胞の集団は、例えば本明細書に記載されるとおりの１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が細胞に導入されていない同様の細胞の集団と比べてＦ細胞の少なくとも３０％の増加、例えば、少なくとも３５％の増加、少なくとも４０％の増加、少なくとも４５％の増加、少なくとも５０％の増加、少なくとも５５％の増加、少なくとも６０％の増加、少なくとも６５％の増加、少なくとも７０％の増加、少なくとも７５％の増加、少なくとも８０％の増加、少なくとも８５％の増加、少なくとも９０％の増加または少なくとも９５％の増加を有する（またはそれを有する赤血球系の集団への例えばインビボでの分化能を有する）。実施形態において、細胞の集団は、例えば本明細書に記載されるとおりの１つまたは複数のｇＲＮＡ分子が細胞に導入されていない同様の細胞の集団と比べてＦ細胞の１０〜９０％、２０％〜８０％、２０％〜７０％、２０％〜６０％、２０％〜５０％、２０％〜４０％、２０％〜３０％、２５％〜８０％、２５％〜７０％、２５％〜６０％、２５％〜５０％、２５％〜４０％、２５％〜３５％、２５％〜３０％、３０％〜８０％、３０％〜７０％、３０％〜６０％、３０％〜５０％、３０％〜４０％、または３０％〜３５％の増加を有する（またはそれを有する赤血球系の集団への例えばインビボでの分化能を有する）。実施形態において、細胞の集団、例えば本明細書に記載される方法によって作製されるとおりの細胞の集団は、それを必要としている患者に例えば治療有効量で導入したとき、前記患者の異常ヘモグロビン症、例えば本明細書に記載されるとおりのもの、例えば鎌状赤血球症および／またはβサラセミアを治療するのに十分な数の細胞および／または十分な％Ｆ細胞の増加を���む。実施形態において、Ｆ細胞の増加は、例えば本明細書に記載されるとおりの赤血球系分化アッセイで計測されるとおりである。
【０６７１】
本明細書に記載される実施形態および態様のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明は、例えば、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、方法および／またはＣＲＩＳＰＲシステムのいずれかによって修飾されるとおりの、１細胞当たり少なくとも６ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生するＦ細胞を含む細胞、例えば細胞の集団に関する。実施形態において、Ｆ細胞は１細胞当たり少なくとも７ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、Ｆ細胞は１細胞当たり少なくとも８ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、Ｆ細胞は１細胞当たり少なくとも９ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、Ｆ細胞は１細胞当たり少なくとも１０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。実施形態において、Ｆ細胞は１細胞当たり平均６．０〜７．０ピコグラム、７．０〜８．０、８．０〜９．０、９．０〜１０．０、１０．０〜１１．０、または１１．０〜１２．０ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する。
【０６７２】
前述の実施形態のいずれかにおける実施形態を含め、実施形態において、本発明の細胞および／または細胞の集団は、Ｃａｓ９分子をコードする核酸を含まない細胞を含む、例えばそれからなる。
【０６７３】
治療方法
送達タイミング
ある実施形態において、本明細書に記載されるＣａｓシステムの成分、例えばＣａｓ９分子成分および／またはｇＲＮＡ分子成分以外の１つ以上の核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）が送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Ｃａｓシステムの成分の１つ以上が送達されるのと同時に送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Ｃａｓシステムの成分の１つ以上が送達される前またはその後（例えば、約３０分、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、１日、２日、３日、１週、２週間、または４週間未満）に送達される。ある実施形態において、核酸分子は、Ｃａｓシステムの成分の１つ以上、例えば、Ｃａｓ９分子成分および／またはｇＲＮＡ分子成分が送達されるのと異なる手段によって送達される。核酸分子は、本明細書に記載される送達方法のいずれかによって送達することができる。例えば、核酸分子はウイルスベクター、例えば組込み欠損レンチウイルスによって送達することができ、かつＣａｓ９分子成分および／またはｇＲＮＡ分子成分はエレクトロポレーションによって送達することができ、これにより例えば、核酸（例えば、ＤＮＡ）によって引き起こされる毒性を低減することができる。ある実施形態において、核酸分子は治療用タンパク質、例えば、本明細書に記載されるタンパク質をコードする。ある実施形態において、核酸分子はＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載されるＲＮＡ分子をコードする。
【０６７４】
成分のバイモーダル送達または差次的送達
Ｃａｓシステムの成分、例えばＣａｓ９分子成分およびｇＲＮＡ分子成分を別々に送達する、より詳細には成分を異なる様式で送達すると、例えば組織特異性および安全性が改善されるため、パフォーマンスを増進させることができる。ある実施形態において、Ｃａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子は、異なる様式により、または本明細書においてときに差次的様式と称されるとおり送達される。異なる様式または差次的様式とは、本明細書で使用されるとき、対象成分分子、例えば、Ｃａｓ９分子、ｇＲＮＡ分子、鋳型核酸、またはペイロードに異なる薬力学的または薬物動態学的特性を付与する送達様式を指す。例えば、送達様式は、例えば、選択されたコンパートメント、組織、または臓器に異なる組織分布、異なる半減期、または異なる時間分布をもたらし得る。
【０６７５】
幾つかの送達様式、例えば、細胞、または細胞の子孫において例えば自己複製または細胞核酸への挿入によって持続する核酸ベクターによる送達は、成分のより持続的な発現および存在をもたらす。例としては、ウイルス送達、例えばアデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルス送達が挙げられる。
【０６７６】
例として、成分、例えばＣａｓ９分子およびｇＲＮＡ分子は、身体、または特定のコンパートメント、組織もしくは臓器における送達された成分がもたらす半減期または持続性の点で異なる様式によって送達することができる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、かかる様式によって送達することができる。Ｃａｓ９分子成分は、持続性がより低い、または身体または特定のコンパートメントもしくは組織もしくは臓器へのその曝露量がより低い様式によって送達することができる。
【０６７７】
より一般的には、ある実施形態において、第１の送達様式を用いて第１の成分が送達され、および第２の送達様式を用いて第２の成分が送達される。第１の送達様式は第１の薬力学的または薬物動態学的特性を付与する。第１の薬力学的特性は、例えば、身体、コンパートメント、組織または臓器における成分または成分をコードする核酸の分布、持続性、または曝露量であり得る。第２の送達様式は第２の薬力学的または薬物動態学的特性を付与する。第２の薬力学的特性は、例えば、身体、コンパートメント、組織または臓器における成分または成分をコードする核酸の分布、持続性、または曝露量であり得る。
【０６７８】
ある実施形態において、第１の薬力学的または薬物動態学的特性、例えば、分布、持続性または曝露量は、第２の薬力学的または薬物動態学的特性よりも限定的である。
【０６７９】
ある実施形態において、第１の送達様式は、薬力学的または薬物動態学的特性、例えば、分布、持続性または曝露量を最適化する、例えば最小限に抑えるように選択される。
【０６８０】
ある実施形態において、第２の送達様式は、薬力学的または薬物動態学的特性、例えば、分布、持続性または曝露量を最適化する、例えば最大化するように選択される。
【０６８１】
ある実施形態において、第１の送達様式は、比較的持続性の高いエレメント、例えば核酸、例えばプラスミドまたはウイルスベクター、例えばＡＡＶまたはレンチウイルスの使用を含む。かかるベクターは比較的持続性が高いため、それから転写された産物は比較的持続性が高いものとなり得る。
【０６８２】
ある実施形態において、第２の送達様式は、比較的一過性のエレメント、例えばＲＮＡまたはタンパク質を含む。
【０６８３】
ある実施形態において、第１の成分はｇＲＮＡを含み、および送達様式は比較的持続性が高く、例えばｇＲＮＡはプラスミドまたはウイルスベクター、例えばＡＡＶまたはレンチウイルスから転写される。これらの遺伝子の転写は、遺伝子がタンパク質産物をコードせず、かつｇＲＮＡは単独では作用できないため、生理学的影響がほとんどないものであり得る。第２の成分、Ｃａｓ９分子は一過性方式で、例えばｍＲＮＡとして、またはタンパク質として送達され、完全なＣａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体が短期間のみ存在して活性であることが確実にされる。
【０６８４】
さらに、成分を異なる分子型でまたは互いに相補的な異なる送達ベクターによって送達することにより、安全性および組織特異性を増進させることができる。
【０６８５】
差次的送達様式を用いると、パフォーマンス、安全性および有効性を増進させることができる。例えば、最終的なオフターゲット修飾の可能性を低下させることができる。免疫原性成分、例えばＣａｓ９分子を持続性の低い様式で送達すると、細菌由来のＣａｓ酵素からのペプチドはＭＨＣ分子によって細胞の表面上に提示されるため、免疫原性が低下し得る。２パート送達システムはこのような欠点を緩和することができる。
【０６８６】
差次的送達様式を用いて、異なる、しかしオーバーラップする標的領域に成分を送達することができる。標的領域のオーバーラップ外での活性複合体の形成は最小限に抑えられる。したがって、ある実施形態において、第１の成分、例えばｇＲＮＡ分子が、第１の空間分布、例えば組織分布をもたらす第１の送達様式によって送達される。第２の成分、例えばＣａｓ９分子が、第２の空間分布、例えば組織分布をもたらす第２の送達様式によって送達される。ある実施形態において、第１の様式は、リポソーム、ナノ粒子、例えばポリマーナノ粒子、および核酸、例えばウイルスベクターから選択される第１のエレメントを含む。第２の様式は、この群から選択される第２のエレメントを含む。ある実施形態において、第１の送達様式は第１の標的化エレメント、例えば細胞特異的受容体または抗体を含み、第２の送達様式はそのエレメントを含まない。ある実施形態において、第２の送達様式は第２の標的化エレメント、例えば第２の細胞特異的受容体または二次抗体を含む。
【０６８７】
Ｃａｓ９分子がウイルス送達ベクター、リポソーム、またはポリマーナノ粒子で送達されるとき、単一組織のみの標的化が所望され得る場合に複数の組織に送達されて治療活性が生じる可能性がある。２パート送達系はこの難題を解消し、組織特異性を増進させることができる。ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子が、異なるが重複もある組織向性を有する別々の送達媒体にパッケージングされる場合、完全に機能性の複合体は、両方のベクターによって標的化される組織においてのみ形成される。
【０６８８】
候補Ｃａｓ分子、例えばＣａｓ９分子、候補ｇＲＮＡ分子、候補Ｃａｓ９分子／ｇＲＮＡ分子複合体、および候補ＣＲＩＳＰＲシステムは、当該技術分野において公知の方法により、または本明細書に記載されるとおり評価することができる。例えば、Ｃａｓ９分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価する例示的方法が、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｌ  ａｌ．，ＳＣＩＥＮＣＥ  ２０１２；３３７（６０９６）：８  １６−８２１に記載されている。
【実施例】
【０６８９】
実施例１
ガイド選択および設計
目的の領域内にあるＰＡＭを同定するため、インシリコでヒト参照ゲノムおよびユーザー定義による目的のゲノム領域（例えば、遺伝子、遺伝子のエクソン、非コード調節領域等）を使用して初期ガイド選択を実施した。同定されたＰＡＭの各々について分析を実施し、統計が報告された。例えば、本明細書に記載されるとおり、効率および有効性を決定するための幾つもの方法に基づきｇＲＮＡ分子をさらに選択し、順位付けした。
【０６９０】
本実施例全体を通じて、以下の実験では、ｓｇＲＮＡ分子またはｄｇＲＮＡ分子のいずれかを使用した。特に指示がない限り、ｄｇＲＮＡ分子を使用した場合、ｇＲＮＡは以下を含む。
ｃｒＲＮＡ：［標的化ドメイン］−［配列番号６６０７］
ｔｒａｃｒ（ｔｒＲＮＡ）：配列番号６６６０
【０６９１】
特に指示がない限り、ｓｇＲＮＡ分子を用いる実験では、以下の配列を使用した。
［標的化ドメイン］−［配列番号６６０１］−ＵＵＵＵ
【０６９２】
特に指示がない限り、「ＢＣ」と表示されるｓｇＲＮＡ分子を用いる実験では、以下の配列を使用した。
［標的化ドメイン］−［配列番号６６０４］−ＵＵＵＵ
【０６９３】
一次ガイドスクリーニングのためのＨＥＫ−２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ細胞のトランスフェクション
標的特異的ｃｒＲＮＡの一次スクリーニングには、Ｃａｓ９ＧＦＰを発現するＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ−２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ）のトランスフェクションを用いた。この例では、例えば本明細書に記載されるとおりのインシリコオフターゲット検出を含む定義された基準を用いて一次スクリーニング用に標的特異的ｃｒＲＮＡを設計し、選択した。選択されたｃｒＲＮＡを化学的に合成し、９６ウェルフォーマットで送達した。ＨＥＫ−２９３−Ｃａｓ９ＧＦＰ細胞に標的ｃｒＲＮＡをストックｔｒＲＮＡと１：１比でトランスフェクトした。トランスフェクションは、製造者のプロトコル（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従いリポフェクション技術を用いて媒介した。リポフェクション後２４時間でトランスフェクト細胞を溶解させて、ライセート中でＴ７Ｅ１アッセイおよび／または次世代シーケンシング（ＮＧＳ；以下）によって編集（例えば、切断）を検出した。
【０６９４】
Ｔ７Ｅ１アッセイ
Ｔ７Ｅ１アッセイを用いて、Ｃａｓ９によるＤＮＡ切断後の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって作り出された挿入、欠失および置換などのゲノムＤＮＡの突然変異イベントを検出した（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃａｓ９  ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼによるヒト細胞の標的ゲノムエンジニアリング（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｃａｓ９  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）」．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１３；３１，２３０−２３２を参照されたい）。
【０６９５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって切断の標的となったゲノムＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅し、９５℃で１０分間変性させて、次に９５℃から２５℃まで０．５℃／秒で降下させることによりリアニールした。増幅領域内に突然変異が存在した場合、そのＤＮＡを組み合わせてヘテロ二重鎖を形成した。次にリアニールしたヘテロ二重鎖をＴ７Ｅ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって３７℃で２５分間またはそれを超えて消化した。Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼはＤＮＡミスマッチ、ヘテロ二重鎖およびニック入りの二本鎖ＤＮＡを認識して、それらの部位に二本鎖切断を作成する。得られたＤＮＡ断片を、フラグメントアナライザーを用いて分析し、定量化して切断効率を決定した。
【０６９６】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ならびにオンターゲット切断効率およびインデル形成に関する分析
ゲノムにおける標的位置の編集（例えば、切断）効率を決定するため、ディープシーケンシングを利用して、非相同末端結合によって導入された挿入および欠失の存在を同定した。
【０６９７】
初めに標的部位に関するＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム範囲をＰＣＲ増幅した。製造者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従いさらなるＰＣＲを実施して、シーケンシングに必要な化学基を加えた。次にＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ機器でアンプリコンをシーケンシングした。次に、低品質スコアを有するものを除去した後、リードをヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）とアラインメントした。参照ゲノムにマッピングしたリードを含む得られたファイル（ＢＡＭファイル）から、目的の標的領域とオーバーラップするリードを選択し、野生型リードの数に対する挿入または欠失を含むリードの数を計算した。次に編集率パーセンテージを、野生型を含めたリードの総数に対する、挿入または欠失を有するリードの総数として定義した。編集によって生じた挿入および／または欠失パターンを決定するため、インデルを含むアラインメントされたリードを選択し、所与のインデルを含むリードの数を合計した。次にこの情報をリストとして表示すると共に、各インデルの頻度を表すヒストグラムの形式で視覚化した。
【０６９８】
ＲＮＰ作成
Ｃａｓ９タンパク質にｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを加えると活性Ｃａｓ９  リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）が形成され、これはｃｒＲＮＡによって指定される標的領域への結合および標的ゲノムＤＮＡの特異的切断を媒介する。ｔｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡをＣａｓ９に負荷することによってこの複合体を形成した。これはＣａｓ９にコンホメーション変化を引き起こし、Ｃａｓ９によるｄｓＤＮＡへの結合および切断が可能になるものと考えられる。
【０６９９】
ｃｒＲＮＡおよびｔｒＲＮＡを別々に９５℃で２分間変性させ、室温に戻した。Ｃａｓ９タンパク質（１０ｍｇ／ｍｌ）を５×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、５％グリセロール）に加え、次にそこにｔｒＲＮＡおよび様々なｃｒＲＮＡを（別個の反応で）加え、３７℃で１０分間インキュベートすると、それにより活性ＲＮＰ複合体が形成された。この複合体をエレクトロポレーションおよび他の方法によってＨＥＫ−２９３およびＣＤ３４＋造血細胞を含めた多様な細胞に送達した。
【０７００】
ＣＤ３４＋  ＨＳＣへのＲＮＰの送達
ＣＤ３４＋  ＨＳＣにＣａｓ９  ＲＮＰを送達した。
【０７０１】
ＣＤ３４＋  ＨＳＣを解凍し、ＩＬ１２、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌおよびペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地で一晩培養した（約５００，０００細胞／ｍｌ）。約９０，０００細胞をアリコートに分け、それぞれのＲＮＰ送達反応毎にペレット化した。次に細胞を６０μｌ  Ｐ３ヌクレオフェクション緩衝液（Ｌｏｎｚａ）に再懸濁し、続いてそこに活性ＲＮＰを加えた。次にトリプリケート（２０μＬ／エレクトロポレーション）でＨＳＣをエレクトロポレートした（例えば、Ｌｏｎｚａ  ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒのプログラムＣＡ−１３７を使用してヌクレオフェクションした）。エレクトロポレーション後直ちにＨＳＣにＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ培地（ＩＬ１２、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌおよびペニシリン／ストレプトマイシン含有）を加え、これを少なくとも２４時間培養した。次にＨＳＣを回収し、Ｔ７Ｅ１、ＮＧＳ、および／または表面マーカー発現分析に供した。
【０７０２】
ＨＳＣ機能アッセイ
ＣＤ３４＋  ＨＳＣは、フローサイトメトリーまたはインビトロコロニー形成アッセイなど、既知の技法を用いて幹細胞表現型に関してアッセイし得る。例として、製造者のプロトコルを用いたＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  Ｈ４０３４  Ｏｐｔｉｍｕｍキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用するインビトロコロニー形成アッセイ（ＣＦＣ）により、細胞をアッセイした。簡潔に言えば、１〜１．２５ｍｌ  ｍｅｔｈｏｃｕｌｔに≦１００μｌ容積中の５００〜２０００個のＣＤ３４＋細胞を加える。この混合物を４〜５秒間激しくボルテックスして完全に混合し、次に室温に少なくとも５分間放置した。シリンジを使用して１〜１．２５ｍｌのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ＋細胞を３５ｍｍディッシュまたは６ウェルプレートのウェルに移した。１２〜１４日後に製造者のプロトコルに従いコロニーの数および形態を評価した。
【０７０３】
インビボ異種移植
ＨＳＣは、機能的には、その自己複製能力により、および多系統分化について定義される。この機能性はインビボでのみ評価することができる。ヒトＨＳＣ機能を決定する際のゴールドスタンダードは、一連の突然変異によって重度免疫不全となり、したがってヒト細胞のレシピエントとしての役割を果たすことができるＮＯＤ−ＳＣＩＤγマウス（ＮＳＧ）への異種移植によるものである。編集後のＨＳＣがＮＳＧマウスに移植され、誘導された編集がＨＳＣ機能に影響しないことを検証し得る。毎月の末梢血分析を用いてヒトキメラ状態および系統発達を評価し、２０週後の二次移植を用いて機能性ＨＳＣの存在を確立し得る。
【０７０４】
結果
Ｔ７Ｅ１（「Ｔ７」）および／またはＮＧＳによってアッセイしたときの、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子（例えば、上記に記載されるとおりのｄｇＲＮＡ分子）を用いたＨＥＫ２９３＿Ｃａｓ９ＧＦＰ細胞における編集の結果は、図１（＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域に対するｇＲＮＡ分子）および図２（＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域に対するｇＲＮＡ分子）、ならびに以下の表に指示されるとおり要約される。ＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにおける平均編集率は、例えば、以下の表１０（＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域に対するｇＲＮＡ分子）、表１１（＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域に対するｇＲＮＡ分子）、表１２Ｂ（＋５５  ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域に対するｇＲＮＡ分子）、および表１３（フランス型ＨＰＦＨ領域に対するｇＲＮＡ分子）に報告される。Ｔ７Ｅ１アッセイ結果を報告する場合、「２」は高効率切断を示し、「１」は低効率切断を示し、および「０」は切断がないことを示す。一般に、Ｔ７Ｅ１結果は、ＮＧＳによってアッセイされる定量的切断と相関する。上位１５個のｇＲＮＡ（ＣＤ３４＋細胞における最も高い％編集率によって順位付けしたとき）を図１１（＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域）および図１２（＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域）に示す。
【０７０５】
【表８７】
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【０７０６】
【表８８】
2019500043.tif 000149
【０７０７】
【表８９】
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【０７０８】
【表９０】
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【０７０９】
【表９１】
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【０７１０】
【表９２】
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【０７１１】
【表９３】
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【０７１２】
【表９４】
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【０７１３】
上記の実験後、同じガイドＲＮＡ分子をＨＥＫ−２９３−Ｃａｓ９細胞およびＣＤ３４＋細胞の両方において、新規に設計したＮＧＳ分析用プライマーの組を用いてトリプリケートで再び試験した。結果は以下の表１２Ｂに報告する。
【０７１４】
【表９５】
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【０７１５】
【表９６】
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【０７１６】
【表９７】
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【０７１７】
【表９８】
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【０７１８】
【表９９】
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【０７１９】
【表１００】
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【０７２０】
【表１０１】
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【０７２１】
【表１０２】
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【０７２２】
【表１０３】
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【０７２３】
【表１０４】
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【０７２４】
【表１０５】
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【０７２５】
ＢＣＬ１１ａエンハンサー部位におけるゲノム編集
ＢＣＬ１１ａの＋５８または＋６２赤血球系エンハンサー領域内のゲノムＤＮＡに特異的な標的化ドメインを含有する合成ｓｇＲＮＡ分子を注文した。図５は、ｓｇＥＨ１〜ｓｇＥＨ９と命名した、ｓｇＲＮＡによって標的化されるゲノムＤＮＡを示す。
ｓｇＥＨ１標的化ドメイン（ＣＲ００２７６）：ＡＵＣＡＣＡＵＡＵＡＧＧＣＡＣＣＵＡＵＣ（配列番号２１２）
ｓｇＥＨ２標的化ドメイン（ＣＲ００２７５）：ＣＡＣＡＧＵＡＧＣＵＧＧＵＡＣＣＵＧＡＵ（配列番号２１１）
ｓｇＥＨ８標的化ドメイン（ＣＲ００２７３）：ＣＡＧＧＵＡＣＣＡＧＣＵＡＣＵＧＵＧＵＵ（配列番号２０９）
ｓｇＥＨ９（ＣＲ００２７７）標的化ドメイン：ＵＧＡＵＡＧＧＵＧＣＣＵＡＵＡＵＧＵＧＡ（配列番号２１３）
【０７２６】
Ｃａｓ９と予め複合体化したｓｇＥＨ［Ｘ］を含有するＲＮＰをＣＤ３４＋骨髄細胞（Ｌｏｎｚａに注文した骨髄ＣＤ３４＋細胞、カタログ番号２Ｍ−１０１Ｃ、ロット番号４６６９７７、３０ｙ、Ｆ、Ｂ（９６．８％））にエレクトロポレーション（ＮＥＯＮエレクトロポレーター）を用いて導入した。Ｔ７Ｅ１およびＮＧＳを用いてＣＤ３４＋幹細胞で切断を決定した。結果は図６Ａ〜図６Ｄに要約し、これらの図は、４つの実験（２人の異なるドナーから２つの実験）にわたる総合的なインデル形成、ならびに上位のインデルパターンを示す。ｓｇＥＨ１、２および９は、切断を高効率で導く能力があった。
【０７２７】
意外にも、異なるドナー由来の細胞を用いる実験を含め、複数の実験にわたってインデルパターンが一定のままであったことが分かった（図６Ａ〜図６Ｄを参照されたい）。すなわち、各ｇＲＮＡが一定のインデル形成パターンをもたらした。同様に欠失も、切断部位近傍のマイクロホモロジー領域と関係があるように見えた。
【０７２８】
この現象をさらに調べるため、ＢＣＬ１１ａ遺伝子座に対するｇＲＮＡを設計し、異なる生体試料ならびに異なる送達方法、およびｇＲＮＡ足場を用いて試験した。この実験には、以下の標的化ドメインを含むｇＲＮＡを使用した。
Ｇ７（ｇ７とも称される）標的化ドメイン：ＧＵＧＣＣＡＧＡＵＧＡＡＣＵＵＣＣＣＡＵ（例えば、配列番号１１９１の３’２０ｎｔ）
Ｇ８（ｇ８とも称される）標的化ドメイン：ＣＡＣＡＡＡＣＧＧＡＡＡＣＡＡＵＧＣＡＡ（例えば、配列番号１１８６の３’２０ｎｔ）
【０７２９】
最初の実験では、２つの異なる生体試料にわたってｇ７およびｇ８を試験した。図７に示すとおり、各ｇＲＮＡについて上位３つの最も高頻度に見られるインデルのパターンは同一であった。次に、Ｇ７およびＧ８標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を異なるｔｒａｃｒＲＮＡ成分で試験した。前の実験では、配列番号６６０１と、続く−ＵＵＵＵをｇＲＮＡ標的化ドメインに直接付加してｓｇＲＮＡを形成した。次の実験セットでは、配列番号６６０４と、続く−ＵＵＵＵをｇ７およびｇ８のｇＲＮＡ標的化ドメインに直接付加して、異なる足場を有するｓｇＲＮＡ分子（ｇ７ＢＣまたはｇ８ＢＣと呼ばれるｇＲＮＡ）を作った。図８に示すとおり、異なるｓｇＲＮＡ足場を使用した場合でもインデルパターンは一定のままであった。最後に、異なる送達方法を用いてインデルパターンを比較した。ＲＮＰエレクトロポレーションを用いるか、またはｇ７をコードするプラスミドのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いた送達によるかのいずれかの２９３細胞へのｇ７の送達を調べ、結果を図９に報告した。示されるとおり、インデルパターンは同じままであった。総合すると、これらの結果は、インデルパターン形成が配列依存的であることを強く示唆している。切断が大規模欠失および／またはフレームシフト欠失をもたらす場合の配列を標的とするｇＲＮＡ分子は、機能喪失に有益であり得る。
【０７３０】
複数のガイドによる切り出し
上記のＧ７およびｇ８は、近接部位のゲノムＤＮＡを標的とする（ＰＡＭ配列はＢＣＬ１１ａ遺伝子内で互いから５０ヌクレオチド以内にある）。２つの近接部位を同時に標的化する効果を調べるため、Ｇ７の標的化ドメインを有するｇＲＮＡを含むＲＮＰならびにＧ８の標的化ドメインを有するｇＲＮＡを含むＲＮＰでＣＤ３４＋細胞をトランスフェクトした。切断効率およびインデルパターンをＮＧＳによって評価した。図１０に示すとおり、主要なインデルは、２つのｇＲＮＡ結合部位間のヌクレオチドの欠失である。これらの結果は、近接して結合する複数の、例えば２つのガイドを使用して、それらの２つの結合部位間にあるＤＮＡの切り出しを達成し得ることを実証している。
【０７３１】
ＣＤ３４＋幹細胞におけるゲノム編集
ＣＤ３４＋初代造血幹細胞でＢＣＬ１１ａ遺伝子座におけるゲノム編集を実証した。簡潔に言えば、製造者の指示に従い免疫選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて成人ドナー由来のＧ−ＣＳＦ動員末梢血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）からＣＤ３４＋細胞を単離した。細胞ゲーティングは図３に示す。細胞をアリコートに分けて凍結保存した。解凍した細胞を２×１０５／ｍｌでＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋１×抗生物質／抗真菌薬＋各５０ｎｇ／ｍｌのサイトカイン（ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ６およびＳＣＦ）＋５００ｎＭ化合物４に播種し、加湿インキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２で５日間培養した。５日後の細胞濃度は１×１０６／ｍｌであった。
【０７３２】
各１５０ｎｇのＣａｓ９（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  ＃２６５４２５−７）およびｓｇＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ、ｓｇＢＣＬ１１Ａ＿７標的化ドメイン（すなわちｇ７の標的化ドメイン）：
【化６０】
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を含む）からなるプレインキュベートしたＲＮＰ複合体を２×１０５細胞に加え、製造者のプロトコルに従いＮｅｏｎシステム（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でパルスパラメータ：１６００Ｖ、２０ｍｓ、１パルスを用いてエレクトロポレートした。デュプリケートのエレクトロポレーションを実施した。ＲＮＰ複合体の非存在下でモックエレクトロポレーションも実施した。エレクトロポレーション後、細胞を１ｍｌ培地に播種して一晩回復させた。
【０７３３】
エレクトロポレーションの翌日、未選別の培養物の１／２０をＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋１×抗生物質／抗真菌薬＋各５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＩＬ３およびＧＣＳＦに６日間播種した。残りの細胞はヒトＣＤ３４およびヒトＣＤ９０に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによってＣＤ３４＋ＣＤ９０＋およびＣＤ３４＋ＣＤ９０−集団を選別した。ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞は、免疫不全マウスにおける長期多系統生着によって定義付けられるとおり、造血幹細胞を含有することが知られている（Ｍａｊｅｔｉ  ｅｔ  ａｌ．２００７  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １，６３５−６４５を参照されたい）。選別用に選択した細胞集団は、図３の代表的なドットプロットにゲートによって指示する。選別した細胞をＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）＋１×抗生物質／抗真菌薬＋各５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＩＬ３およびＧＣＳＦで６日間培養し、６日経った時点でゲノム編集分析のため全ての培養物を回収した。
【０７３４】
回収した細胞からゲノムＤＮＡを精製し、以下のプライマー：ＢＣＬ１１Ａ−７  Ｆ、ｇｃｔｔｇｇｃｔａｃａｇｃａｃｃｔｃｔｇａ；ＢＣＬ１１Ａ−７  Ｒ、ｇｇｃａｔｇｇｇｇｔｔｇａｇａｔｇｔｇｃｔで標的領域を増幅した。ＰＣＲ産物を変性させてリアニーリングし、続いて製造者の推奨に従いＴ７Ｅ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と共にインキュベートした。次にこの反応物をアガロースゲル電気泳動によって分析した（図４）。上側のバンドは切断されていないホモ二重鎖ＤＮＡを表し、下側のバンドはヘテロ二重鎖ＤＮＡから生じた切断産物を示す。一番左寄りのレーンはＤＮＡラダーである。バンド強度はＩｍａｇｅＪソフトウェアによる未処理画像のピーク積分によって計算した。％遺伝子修飾（インデル）は以下のとおり計算した：％遺伝子修飾＝１００×（１−（１−切断割合）１／２）、ゲルの対応する各レーンの下に示す。
【０７３５】
結果は図４に示す。造血幹細胞を含有するＣＤ３４＋ＣＤ９０＋集団の遺伝子編集効率はＣＤ３４＋ＣＤ９０−細胞または未選別と均等であった。これらの実験は、ＨＳＣがさらに富化されているＣＤ３４＋  ＨＳＰＣおよびＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞で遺伝子編集を達成し得ることを実証している。
【０７３６】
実施例３．成人赤血球系細胞における胎児グロビン発現の抑制を解除するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いた造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）におけるＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサー編集
方法：
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞をＡｌｌＣｅｌｌｓ（カタログ番号：ＡＢＭ０１７Ｆ）またはＬｏｎｚａ（カタログ番号：２Ｍ−１０１Ｃ）のいずれかから購入し、５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（Ｔｐｏ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号３００−１８）、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号３００−１９）、５０ｎｇ／ｍＬのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号３００−０７）、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号２００−０６）、１％Ｌ−グルタミン；２％ペニシリン／ストレプトマイシン、および化合物４（０．７５μＭ）を補足したＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０９６５０）を用いて２〜３日間増殖させた。２〜３日間増殖させた後、培養物をＡｌｌＣｅｌｌｓから購入した出発細胞数と比べて２倍〜３倍およびＬｏｎｚａからのと比べて１倍〜１．５倍に増殖させた。本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの導入前および導入後の両方を含め、全てのＣＤ３４＋増殖ステップについてこれらの培養条件を用いた。
【０７３７】
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＣの調製、およびＨＳＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）はエレクトロポレーションの直前に調製した。デュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）を用いるＲＮＰの形成については、初めに各３μｇのｃｒＲＮＡ（２．２４μＬ中）およびｔｒａｃｒ（１．２５μＬ中）を別個のチューブにおいて９５℃で２分間変性させて、次に室温に冷却した。Ｃａｓ９タンパク質の調製のため、７．３μｇのＣＡＳ９タンパク質（１．２１μＬ中）を０．５２μＬの５×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣＬ、５ｍＭ  ＭｇＣＬ２、５％グリセロールおよび新たに添加した１ｍＭ  ＤＴＴ）と混合した。初めにＴｒａｃｒをＣａｓ９調製物と混合し、３７℃で５分間インキュベートした。次にｃｒＲＮＡをＴｒａｃｒ／ＣＡＳ９複合体に加え、３７℃で５分間インキュベートした。２００×ｇで１５分間遠心することによりＨＳＣを回収し、Ｎｅｏｎエレクトロポレーションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号：ＭＰＫ１０９６）に付属するＴ緩衝液中に２×１０７／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを１２μＬの細胞と上下に３回穏やかにピペッティングすることによって混合した。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびＣａｓ９複合体の調製には、２．２５μｇ  ｓｇＲＮＡ（１．５μＬ中）を２．２５μｇ  Ｃａｓ９タンパク質（３μＬ中）と混合し、室温で５分間インキュベートした。次にｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を１０．５μＬの２×１０７／ｍＬ細胞と上下に数回穏やかにピペッティングすることによって混合し、室温で２分間インキュベートした。ＲＮＰ／細胞混合物（１０μＬ）をＮｅｏｎエレクトロポレーションプローブに移した。Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＭＰＫ５０００Ｓ）で１７００ボルト／２０ミリ秒および１パルスを用いてエレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーション後、上記に記載したとおりの成長因子およびサイトカインを補足した０．５ｍＬの予め温めたＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ培地に細胞を移し、３７℃で２日間培養した。
【０７３８】
ゲノムＤＮＡ調製。エレクトロポレーションの４８時間後、編集済みおよび未編集ＨＳＣからゲノムＤＮＡを調製した。１０ｍＭトリス−ＨＣＬ、ｐＨ８．０；０．０５％ＳＤＳおよび２５μｇ／ｍＬの新たに添加したプロテアーゼＫ中に細胞を溶解させ、３７℃で１時間インキュベートした後、８５℃で１５分間さらにインキュベートしてプロテアーゼＫを不活性化した。
【０７３９】
Ｔ７Ｅ１アッセイ。ＨＳＣの編集効率を決定するため、Ｔ７Ｅ１およびアッセイを実施した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号：Ｆ−５４９Ｌ）を以下のサイクル条件で用いてＰＣＲを実施した：９８℃で３０秒；９８℃で５秒、６８℃で２０分、７２℃で３０秒を３５サイクル；７２℃で５分。以下のプライマーを使用した：フォワードプライマー：５’−ＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＡＣＣＡＣＡＧＧＧ−３’（配列番号２００１）およびリバースプライマー：５’−ＴＡＣＡＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＣＡＣＧＧＣＡ−３’（配列番号２００２）。以下の条件を用いてＰＣＲ産物を変性させてリアニーリングした：９５℃で５分、−２℃／ｓで９５〜８５℃、−０．１℃／ｓで８５〜２５℃、４℃で保持。アニーリング後、１０μＬの上記のＰＣＲ産物に１μＬのミスマッチ高感受性Ｔ７  Ｅ１ヌクレアーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０３０２Ｌ）を加え、３７℃で１５分間さらにインキュベートしてヘテロ二重鎖を消化し、得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル（２％）電気泳動によって分析した。編集効率はＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて定量化した。
【０７４０】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。編集効率ならびに挿入および欠失（インデル）のパターンをより正確に決定するため、ＰＣＲ産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供した。Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カタログ番号：６３９２１０）を以下のサイクル条件で使用してＰＣＲをデュプリケートで実施した：９８℃で５分；９５℃で１５秒、６８℃で１５秒、７２℃で１分を３０サイクル；７２℃で７分。以下のプライマーを使用した：フォワードプライマー：５’−ＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＡＣＣＡＣＡＧＧＧ−３’（配列番号２００１）およびリバースプライマー：５’−ＴＡＣＡＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＣＡＣＧＧＣＡ−３’（配列番号２００２）。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動によって分析し、ディープシーケンシングにかけた。
【０７４１】
ＨＳＰＣ培養物のフローサイトメトリー分析。ＨＳＰＣをフローサイトメトリーに供して幹細胞および前駆細胞集団を特徴付けた。細胞培養物のアリコートでゲノム編集前および編集後のＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞サブセットのパーセンテージを決定した。０．５％ＢＳＡを補足したＰＢＳを含有する染色緩衝液中、抗ＣＤ３４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５８２４）、抗ＣＤ９０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２８１０９）と共に細胞を暗所下４℃で３０分間インキュベートした。細胞生存率は７ＡＡＤによって決定する。細胞を染色緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で多色ＦＡＣＳ分析を実施した。Ｆｌｏｗｊｏを用いてフローサイトメトリー結果を分析し、データは全細胞集団に対するパーセントＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋として提示した。培養物中の各細胞型集団の絶対数は、細胞の総数に各集団のパーセンテージを乗じることにより計算した。
【０７４２】
インビトロ赤血球新生およびＨｂＦ含有赤血球系細胞に関するＦＡＣＳ分析。エレクトロポレーションの４８時間後、ゲノム編集したＨＳＣをインビトロ赤血球系分化に供した。簡潔に言えば、３３０μｇ／ｍＬヒトホロトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ０６６５）、１０μｇ／ｍＬ組換えヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ３５３６）、２ＩＵ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ３１４９）、５％ヒト血漿（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ９５２３）、３ＩＵ／ｍＬヒトエリスロポエチン（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号２８７−ＴＣ）、１％Ｌ−グルタミン、および２％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３１９８０−０９７）からなる赤血球系分化培地（ＥＤＭ）中において編集済みＨＳＣを培養した。培養０〜７日目の間、ＥＤＭには、１０−６Ｍヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ０８８８）、１００ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号３００−０７）、および５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００−０３）を７日間にわたってさらに補足した。培養７〜１１日目の間、ＥＤＭには１００ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦのみを補足した。培養１１〜２１日目の間、ＥＤＭに追加の補足はしない。培養７、１４および２１日目、細胞（２〜１０×１０５）をＨｂＦ発現に関して細胞内染色によって分析した。簡潔に言えば、３５０×ｇで５分間遠心することによって細胞を回収し、染色緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０２０１）で１回洗浄した。細胞を０．５ｍＬの固定化緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０８０１）で固定化し、３５０×ｇで５分間遠心することによって２ｍＬの１×細胞内染色・透過処理・洗浄緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２１００２）で３回洗浄した。次に、１００μＬの１×細胞内染色・透過処理・洗浄緩衝液中、細胞を５μＬの抗ＨｂＦ抗体（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＭＨＦＨ０１）と共に室温で２０分間インキュベートした。細胞を２ｍＬの１×細胞内染色・透過処理・洗浄緩衝液で２回洗浄し、２００μＬ染色緩衝液中に再懸濁して、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でＨｂＦ発現に関して分析した。Ｆｌｏｗｊｏを用いて結果を分析し、データは全細胞集団中のＨｂＦ陽性細胞（Ｆ−細胞）の％として提示した。
【０７４３】
遺伝子発現アッセイ。ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０４）を使用したＲＮＡの精製に、約１×１０６細胞を使用した。ｑＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａ、カタログ番号９５０４７−５００）を使用した第１鎖合成に、２００〜４００ｎｇのＲＮＡを使用した。供給者のプロトコルに従いＴａｑ−Ｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅ  ＰＲ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４４４４９６３）およびＧＡＰＤＨ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤ番号Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１）、ＨｂＢ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤ番号：Ｈｓ００７４７２２３＿ｇ１）、ＨｂＧ２／ＨｂＧ１（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤ番号Ｈｓ００３６１１３１＿ｇ１）およびＢＣＬ１１Ａ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤ番号：Ｈｓ０１０９３１９７＿ｍ１）を使用してＴａｑ−ｍａｎ  ＰＣＲを実施した。各遺伝子の相対発現はＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。
【０７４４】
コロニー形成単位細胞アッセイ。コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイのため、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、およびエリスロポエチンを含有するＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  Ｈ４４３４メチルセルロース培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にデュプリケートで１．１ｍＬ  Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ／３５ｍｍディッシュ当たり３００細胞をプレーティングした。Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔにペニシリン／ストレプトマイシンを添加した。培養ディッシュを加湿インキュベーターにおいて３７℃でインキュベートした。プレーティング後１４日目に、ＳｔｅｍＶｉｓｉｏｎ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してプレート全体の画像を撮ることにより、少なくとも３０細胞を含有するコロニーをカウントした。次に、コロニーの総数、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ（顆粒球、赤血球、マクロファージ、巨核球）、ＣＦＵ−ＧＭ（顆粒球、マクロファージ）、ＣＦＵ−Ｍ（マクロファージ）、ＣＦＵ−Ｅ（赤血球）およびＢＦＵ−Ｅ（赤芽球バースト形成細胞）の数をＳｔｅｍＶｉｓｉｏｎ画像分析ソフトウェアでカウントし、ＳｔｅｍＶｉｓｉｏｎコロニーマーカーソフトウェアを使用して手動で確認した。
【０７４５】
インビボ生着試験。インビボ生着試験はＩＡＣＵＣの承認を得たプロトコル下で行われる。３０，０００出発細胞と均等なゲノム編集済みＨＳＣの最終培養物の一部を亜致死的に照射された（２００ｃＧＹ）６〜８週齢ＮＳＧマウスに尾静脈から静脈内注射する。生着は照射後２４時間以内に実施する。生着は、抗ヒトＣＤ４５および抗マウスＣＤ４５抗体を使用した、注射後４、８、および１２週間で採取した血液のフローサイトメトリー分析によってモニタする。移植後１３週間でマウスを犠牲にし、フローサイトメトリーおよびコロニー形成細胞単位アッセイによる分析のため、骨髄、脾臓および胸腺を採取する。二次生着については、各レシピエントマウスの骨髄の５０％を１匹の亜致死的に照射された二次ＮＳＧマウスに移植する。生着は、抗ヒトＣＤ４５および抗マウスＣＤ４５抗体を用いた汎白血球マーカーＣＤ４５を使用した、注射後４、８、および１２週間で採取した血液のフローサイトメトリー分析によってモニタする。移植１５週間後、二次マウスから骨髄および脾臓を摘出し、フローサイトメトリーおよびコロニー形成細胞単位アッセイによって分析した。
【０７４６】
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＳＣのＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーを標的化して遺伝子破壊すると、赤血球系細胞系統におけるＢＣＬ１１Ａの発現が選択的に下方制御され、γ−グロビン発現の抑制が解除されて、ＨｂＦタンパク質の含有量が高い赤血球細胞であるＦ−細胞の産生が可能になると考えられる。高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびＳＣＤの両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤、例えば国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は全体として参照により援用される）に記載されるとおりのもの、例えば化合物４と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの送達用量が増加した。
【０７４７】
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞および組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９−ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化する。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験概要は図１７に示す。
【０７４８】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）または完全長シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と複合体化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡのリストおよび配列は、表１４に示す。「材料および方法」に記載されるとおりエレクトロポレーションによってＲＮＰ複合体を健常またはＳＣＤ患者由来の骨髄ＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の送達前に、化合物４を含有するＨＳＣ増殖培地で細胞を２日間にわたって増殖させた。活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーションによって送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。トランスフェクション過程からの回復を促進するため、化合物４を含有する変法増殖培地で細胞をさらに２日間培養した。エレクトロポレーション後４８時間の細胞の生存率を、７ＡＡＤを用いたフローサイトメトリーにより決定した。生存率は比較的高く、＞８０％の細胞が生存していた（図１８）ことから、文献に報告されるＣａｓ９およびｇＲＮＡ送達システムの他の方法と比べてＨＳＰＣがＲＮＰ複合体のエレクトロポレーションに比較的よく耐えたことが示唆される。
【０７４９】
【表１０６】
2019500043.tif 000168
【０７５０】
Ｔ７Ｅ１アッセイは、ゲノム中の特定の部位における編集を評価する簡便な方法である。エレクトロポレーションの２日後にＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを抽出した。標的ＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサー領域をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＰＣＲ産物をＴ７Ｅ１アッセイに供した。Ｔ７Ｅ１アッセイの最終産物を２％アガロースゲル電気泳動に供し、編集されたアレルのパーセントをｉｍａｇｅＪ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）によって定量化した。予想ＰＣＲ産物サイズおよびＴ７Ｅ１消化断片の近似的予想サイズを図１９に示す。総編集頻度はアガロースゲル画像の下に全編集に対するパーセンテージとして示す。ＢＣＬ１１Ａ  Ｃａｓ９  ＲＮＰで処理した細胞ではＢＣＬ１１Ａ遺伝子座におけるゲノム編集が観察されたが、モックエレクトロポレーション対照細胞では観察されなかった（図１９）。
【０７５１】
ＢＣＬ１１Ａの＋５８赤血球系エンハンサー領域のゲノムＰＣＲ産物は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）にも供した。ＮＧＳは多数の試料の同時モニタリングを促進し、アレルの全体像をもたらす。さらに、ＮＧＳは、挿入および欠失（インデル）の不均一性に関する情報を提供する。配列を対照（モック）処理細胞の配列と比較した。配列解析の結果から、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によって誘導された二本鎖切断がＮＨＥＪによって修復され、＋５８  ＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサー領域に位置するＣａｓ９切断部位の近傍に様々な頻度の小さい欠失および挿入（インデル）が生じたことが示された（図２０および表１５）。全体的に見て、観察された編集効率は、同じ配列を標的とするｄｇＲＮＡと比較してｓｇＲＮＡでより高く、１４個中１２個のｓｇＲＮＡが５０％超のアレルに編集を生じたが（図２０および表１５）、しかしながら（理論によって拘束されるものではないが）ｓｇＲＮＡとｄｇＲＮＡとの間の効率の差は、材料の供給源の影響を受けたものであり得る。
【０７５２】
【表１０７】
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【０７５３】
【表１０８】
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【０７５４】
【表１０９】
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【０７５５】
【表１１０】
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【０７５６】
【表１１１】
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【０７５７】
【表１１２】
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【０７５８】
【表１１３】
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【０７５９】
【表１１４】
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【０７６０】
ＣＤ３４＋  ＨＳＰＣがゲノム編集を含めたエキソビボ操作後にもエフェクター細胞に分化するその多系統分化能を保持しているかどうかを決定するため、選択のｇＲＮＡについてインビトロコロニー形成細胞（ＣＦＣ）単位アッセイを実施した。ゲノム編集済み細胞をサイトカイン添加メチルセルロース中に懸濁し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で１４日間維持した。個別のコロニーが発達し、それらに含まれる成熟細胞の数およびタイプに基づき形態学上および表現型上の基準を用いて（ＳＴＥＭｖｉｓｉｏｎ）それらを分類してカウントし、赤芽球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｅ）、赤芽球バースト形成細胞（ＢＦＵ−Ｅ）、顆粒球／マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）および顆粒球／赤血球／マクロファージ／巨核球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ；図２１）への寄与に関してスコア化した。モックトランスフェクト細胞のコロニー形成能が最も高く、それにＢＣＬ１１Ａの＋５８赤血球系エンハンサーを標的とするｇＲＮＡが続いた。ＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーを標的とするｇＲＮＡについて同様の数およびタイプのコロニーが観察された。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするガイドＲＮＡで得られたコロニーが最小数であった（図２２）。
【０７６１】
単系統赤血球系培養物におけるＢＣＬ１１Ａ、γ−およびβ−グロビン鎖の相対ｍＲＮＡ発現レベルをリアルタイムＰＣＲによって定量化した。転写物レベルはヒトＧＡＰＤＨ転写物レベルに対して正規化した。ゲノム編集済みＨＳＰＣではＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡレベルが低下した。対照的に、赤血球系分化の７日目および１４日目におけるＢＣＬ１１Ａのエクソン２のＢＣＬ１１Ａ  ｍＲＮＡレベルは未編集または編集済みＨＳＰＣで同じままであった（図２３）。赤血球系分化中、編集済みＨＳＰＣではγグロビンｍＲＮＡレベルが増加し、対応してβ−グロビン  ｍＲＮＡが徐々に減少した（図２３）。ゲノム編集済み細胞に由来する赤血球におけるＨｂＦレベルの増加およびβ−グロビン（鎌状化グロビン）レベルの減少は、鎌状化の低下による治療的意味を有するものと思われる。
【０７６２】
赤血球系分化の様々な段階（７、１４および２１日目）にあるゲノム編集済みおよび未編集のＨＳＰＣについて、蛍光色素にコンジュゲートした抗体を使用して胎児グロビンならびに２つの赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）およびグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現レベルをフローサイトメトリーによって分析した。７ＡＡＤの除外によって生存細胞を同定し、ゲーティングした。培養細胞が後期赤芽球に一致する同様のＣＤ７１およびＣＤ２３５Ａ陽性レベルを示したとおり、ゲノム編集は赤血球系分化に悪影響を及ぼさなかった。＋５８赤血球系エンハンサー領域のゲノム編集により、他のｇＲＮＡおよびモックエレクトロポレート細胞と比べてＨｂＦ含有細胞の増加（最大６７％）が大きくなった（図２４）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ７  ｇＲＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の極めて高い誘導が観察された。しかしながら、エクソン２標的化細胞の細胞増殖およびコロニー形成能は劇的に低下した（図２１および図２２）。
【０７６３】
本発明者らは、標的領域のディープシーケンシングに基づき、ゲノム編集した標的領域においてＧＡＴＡ１およびＴＡＬ１結合モチーフがインタクトであったことを認めた（図２５）。最近の文献において、ＢＣＬ１１Ａ発現の調節および胎児グロビンの抑制解除におけるＧＡＴＡ１結合部位の重要性が実証された。Ｖｉｅｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５，１２：９２７。成人赤血球系細胞におけるＢＣＬ１１Ａレベルの維持にこれらの２つのモチーフが重要であることを示した文献報告と対照的に、本発明者らの知見は、これらの２つの転写因子結合部位の上流の配列もＢＣＬ１１ａ遺伝子発現の調節において重要であり、およびこれらの上流部位のみをゲノム編集することにより、ＧＡＴＡ１およびＴＡＬ１結合部位がインタクトなままであっても、ＨｂＦの上方制御がもたらされることを実証している。
【０７６４】
実施例３．１
方法：
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。製造業者の説明書に従って免疫選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて成人ドナーのＧ−ＣＳＦ動員末梢血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）からヒトＣＤ３４＋細胞を単離し、各５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポイエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ９４１３）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１１３）、およびヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ００６３）、さらには１×抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８−０１６）および５００ｎＭの化合物４が追加されたＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０９６５０）を用いて３日間増殖させた。
【０７６５】
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰＣの調製、ならびにＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）は、エレクトロポレーションの直前に調製した。デュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）を用いてＲＮＰを形成するために、最初に、各３μｇのｃｒＲＮＡ（２．２４μＬ中）およびｔｒａｃｒ（１．２５μＬ中）を個別のチューブにおいて９５℃で２分間変性し、次いで室温に冷却した。Ｃａｓ９タンパク質の調製物を得るために、６μｇのＣＡＳ９タンパク質（１μＬ中）を０．５μＬの５×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣＬ、５ｍＭ  ＭｇＣＬ２、５％グリセロール、および新たに添加した１ｍＭ  ＤＴＴ）と混合した。最初に、ＴｒａｃｒをＣａｓ９調製物と混合し、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、ｃｒＲＮＡをＴｒａｃｒ／ＣＡＳ９複合体に添加し、３７℃で５分間インキュベートした。無／対照条件では、ｃｒＲＮＡではなく媒体をＴｒａｃｒ／ＣＡＳ９複合体に添加した。ＨＳＰＣを遠心分離により捕集し、２．５×１０６／ｍＬの細胞密度でＰ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＰＢＰ３−００６７５）に再懸濁した。上下にピペッティングすることによってＲＮＰを２０μＬの細胞と混合し、室温で２分間インキュベートした。４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣＭ−１３７を用いてＲＮＰ／細胞混合物（２０μＬ）をエレクトロポレートした。デュプリケートで２０μＬのエレクトロポレーションを行った。この実施例３．１の実験では、使用したｔｒａｃｒは、配列番号７８０８であり、ｃｒＲＮＡは、指定された２’Ｏ−メチル（ｍ）修飾およびホスホロチオエート結合（＊）修飾を伴って以下の形式および配列：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（式中、Ｎは、指定された（例えば、ＣＲｘｘｘｘｘ識別子によって指定された）標的化ドメインのヌクレオチドである）を有していた。
【０７６６】
インビトロ赤血球新生およびＨｂＦ含有赤血球系細胞のＦＡＣＳ分析。エレクトロポレーション後、ＩＭＤＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２２８．０１）、３３０μｇ／ｍＬヒトホロトランスフェリン（Ｉｎｖｉｔｒｉａ、カタログ番号７７７ＴＲＦ０２９）、１０μｇ／ｍＬ組換えヒトインスリン（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ１１３８２１１）、２ＩＵ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ、品番Ｈ３３９３）、５％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ４５２２）、１２５ｎｇ／ｍＬヒトエリトロポイエチン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ番号１０７７９−０５８）、および１×抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８−０１６）からなる２５０μＬの予備加温した赤血球系分化培地（ＥＤＭ）に細胞を直ちに移した。１μＭヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ  Ｈ８６７２）、１００ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＦ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１１３）、および５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ番号１０７７９−５９８）をＥＤＭにさらに追加した。２日後、細胞培養物を新鮮培地で希釈した。培養物を合計７日間にわたり維持し、その時点でＨｂＦ発現に関して細胞内染色により細胞を分析した。簡潔に述べると、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）固定可能菫色死細胞染色液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｌ３４９６３、ＰＢＳ中１：１０００）に再懸濁し、３０分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、抗ＣＤ７１−ＢＶ７１１抗体（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｌｃ．ＢＤＢ５６３７６７）および抗ＣＤ２３５ａ−ＡＰＣ抗体（ＢＤ５５１３３６）で３０分間染色した。次いで、細胞を洗浄し、続いて固定緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０８０１）で固定し、かつ製造業者の説明書に従って１×細胞内染色透過化洗浄緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２１００２）で透過化した。次いで、５０μＬの１×細胞内染色透過化洗浄緩衝液中で０．５μＬの抗ＨｂＦ−ＰＥ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、品番ＭＨＦＨ０４）と共に細胞を室温で２０分間インキュベートした。２ｍＬの１×細胞内染色透過化洗浄緩衝液で細胞を２回洗浄し、染色緩衝液に再懸濁し、ＨｂＦ発現に関してＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。Ｆｌｏｗｊｏを用いて結果を分析し、生存可能ＣＤ７１陽性赤血球系細胞集団中のＨｂＦ陽性細胞（Ｆ細胞）の％としてデータを提示した。
【０７６７】
ゲノムＤＮＡの調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。Ｑｕｉｃｋ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）を用いて、エレクトロポレーションの４８時間後に編集および未編集のＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを調製した。挿入および欠失（インデル）の編集効率およびパターンを決定するために、標的部位にフランキングするプライマーを用いてＰＣＲ産物を生成し、次いでそれを次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供した。未編集サンプル中の対応する配列のパーセント編集は、典型的には１％未満であり、決して３％を超えなかった。
【０７６８】
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサー領域の標的遺伝子破壊は、γ−グロビン発現の抑制を解除することにより、上昇したＨｂＦタンパク質を含有する赤血球の産生を可能にするであろうと考えられる（胎児ヘモグロビンを発現する細胞、例えば、上昇したレベルの胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、本明細書では「Ｆ細胞」ということがある。実施形態では、１細胞当たり少なくとも６ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する場合、細胞はＦ細胞と見なされる）。上昇したＨｂＦは、脱酸素条件下で赤血球の鎌状化を予防するため、βサラセミア患者およびＳＣＤ患者の両方に治療効果／治癒効果があるであろう。また、エキソビボ増殖を向上させて、送達される遺伝子改変ＨＳＣの用量を増加させるために、ＳＣＤ患者のエキソビボゲノム編集ＨＳＣを用いた自己造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）と、幹細胞増殖促進技術、例えば、アリール炭化水素レセプター（ＡＨＲ）阻害剤、例えば、国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（その内容は、その全体が参照により組み込まれる）に記載のもの、例えば化合物４とが組み合わされた。
【０７６９】
プログラマブルヌクレアーゼＣａｓ９を介して効率的ゲノム編集を行うには、標的細胞内および標的組織内へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達に成功することが不可欠である。Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、エレクトロポレーションによって標的細胞内に送達した場合、幾つかの異なる細胞型で効率的かつ特異的なゲノム編集を達成可能であることが最近の報告で実証された。Ｃａｓ９−ＲＮＰ複合体は、ほぼ送達直後に染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で迅速に分解されるため、オフターゲット効果を低減する。これとは対照的に、Ｃａｓ９送達に用いられるプラスミドベクター系およびウイルスベクター系の使用は、酵素の長期発現をもたらすため、系に関連するオフターゲット効果を悪化させる。加えて、標的細胞内へのＲＮＰの送達は、追加のツールを必要としないため、ゲノム編集を治療目的の診療に移すことがかなり容易になるであろう。精製した組換えＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡの複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣ内に送達した。また、使用した実験の概要を図１７に示す。
【０７７０】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し、かつｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化することにより、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を生成した。研究に使用したｇＲＮＡのリストを表１７に示す（例えば、指定されたＣＲｘｘｘｘｘｘ識別子の標的化ドメインを含むｇＲＮＡ）。材料および方法に記載したように、エレクトロポレーションを介してＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の送達前に細胞を増殖させた。活発に分裂する細胞は、エレクトロポレーションによって送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
【０７７１】
【表１１５】
2019500043.tif 000177
【０７７２】
蛍光色素にコンジュゲートされた抗体を用いて、胎児グロビンならびに２種の赤血球系細胞表面マーカー、すなわちトランスフェリンレセプター（ＣＤ７１）およびグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現レベルに関して、ゲノム編集およびゲノム未編集のＨＳＰＣをフローサイトメトリーによって分析した。生細胞を同定し、Ｌｉｖｅ  Ｄｅａｄ  Ｖｉｏｌｅｔの排除によってゲートした。ＢＣＬ１１Ａ赤血球特異的エンハンサー領域標的化は、モックエレクトロポレート細胞（２２．４％）と比較して、ＨｂＦを含有する赤血球系細胞のパーセントの増加（５０．７％まで）をもたらした（表１７）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の誘導も並行して観測された。また、ＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサー領域のゲノムＰＣＲ産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供して、細胞集団中の編集対立遺伝子のパーセントを決定した。４０％超のＨｂＦ＋細胞を生じたｄｇＲＮＡ処理は、７４．８％〜９４．０％の範囲内の編集を有していた（表１７）。同じ標的化ドメインに対して、この実施例のｄｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒおよびｃｒＲＮＡの配列が実施例３のものと異なっていたが、編集およびＨｂＦ誘導は、ｄｇＲＮＡ形式全体にわたりほとんどの標的化ドメインで類似していた。注目すべきことに、本研究のｄｇＲＮＡ形式のＣＲ０００３１７＿ＥＨ４は、５０．７％のＨｂＦ＋細胞までの高いＨｂＦ誘導をもたらした。ゲノム編集細胞に由来するＨｂＦ含有赤血球の増加は、鎌状化が低減されることから、確かな治療的意義を有する可能性がある。
【０７７３】
実施例３．２．ＨＳＰＣにおけるＢＣＬ１１ａエンハンサーの＋５８領域を標的とするｇＲＮＡを使用したｇＲＮＡ編集および胎児ヘモグロビン上方制御の最適化
ＢＣＬ１１ａエンハンサーの＋５８領域を標的とするｇＲＮＡの包括的スクリーニングによる％編集率の結果に基づき、さらなる研究および最適化に８つのｇＲＮＡ標的化ドメインを選択した。ｇＲＮＡ分子に対する修飾が％編集率、赤血球系分化、および胎児ヘモグロビン発現に及ぼす効果を試験するため、ＢＣＬ１１ａエンハンサー領域の＋５８領域内にある部位を標的とする種々のバージョンの８つのｇＲＮＡ分子を設計した。ＣＲ００３０９、ＣＲ００３１１、ＣＲ００３１２、ＣＲ００３１６、ＣＲ０１１２５、ＣＲ０１１２６、ＣＲ０１１２７、およびＣＲ０１１２８の標的化ドメインを含む以下のバージョンのｇＲＮＡを作製した。
ｄｇＲＮＡ（標的化ドメインの配列以外の全配列は実施例１に記載されるとおり）：
１．非修飾ｃｒＲＮＡおよび非修飾ｔｒａｃｒ（「非修飾」または「Ｕｎｍｏｄ」）
２．非修飾ｃｒＲＮＡおよび非修飾ｔｒａｃｒ、但し、指示される標的化ドメインの５’−１８ｎｔのみを含む（完全な２０ｎｔでない）（「１８ｎｔ」）
３．ホスホロチオエート結合で修飾されたｃｒＲＮＡの３個の３’ｎｔおよび３個の５’ｎｔ、および非修飾ｔｒａｃｒ（「ＰＳ」）
４．ｃｒＲＮＡの５’末端および３’末端の両方に追加的な逆位脱塩基残基、および非修飾ｔｒａｃｒ（「Ｉｎｖｄ」）
５．ホスホロチオエート結合および２’−Ｏメチル基で修飾されたｃｒＲＮＡの３個の３’ｎｔおよび３個の５’ｎｔ、および非修飾ｔｒａｃｒ（「ＯＭｅＰＳ」）
６．２’−フルオロ基で修飾されたｃｒＲＮＡの３個の３’ｎｔおよび３個の５’ｎｔ、および非修飾ｔｒａｃｒ（「Ｆ」）
７．ホスホロチオエート結合および２’−フルオロ基で修飾されたｃｒＲＮＡの３個の３’ｎｔおよび３個の５’ｎｔ、および非修飾ｔｒａｃｒ（「Ｆ−ＰＳ」）
【０７７４】
ｓｇＲＮＡ（標的化ドメイン以外の全配列は実施例１に記載されるとおりである）：
１．非修飾ｓｇＲＮＡ（「非修飾」または「Ｕｎｍｏｄ」）
２．指示される標的化ドメインの５’−１８ｎｔのみからなる標的化ドメイン（完全な２０ｎｔでない）（「１８ｎｔ」）
３．ホスホロチオエート結合で修飾されたｓｇＲＮＡの３個の３’ｎｔおよび３個の５’ｎｔ（「ＰＳ」）
４．ｓｇＲＮＡの５’末端および３’末端の両方に追加的な逆位脱塩基残基（「Ｉｎｖｄ」）
５．ホスホロチオエート結合および２’−Ｏメチル基で修飾されたｓｇＲＮＡの３個の３’ｎｔおよび３個の５’ｎｔ（「ＯＭｅＰＳ」）
６．２’−フルオロ基で修飾されたｓｇＲＮＡの３個の３’ｎｔおよび３個の５’ｎｔ（「Ｆ」）
７．ホスホロチオエート結合および２’−フルオロ基で修飾されたｓｇＲＮＡの３個の３’ｎｔおよび３個の５’ｎｔ（「Ｆ−ＰＳ」）
【０７７５】
他の全ての試薬および方法は実施例３に記載されるとおりであった。結果は全てデュプリケートで実行したものであり、結果は図２８〜図３２に報告する。図２８Ａおよび図２８Ｂは、指示されるデュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）を含むＲＮＰのエレクトロポレーション後２日のＣＤ３４＋細胞におけるＮＧＳによって計測したときの％編集率を示す。図２９は、指示されるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むＲＮＰのエレクトロポレーション後２日のＣＤ３４＋細胞におけるＮＧＳによって計測したときの％編集率を示す。図３０は、指示されるデュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）を含むＲＮＰのエレクトロポレーション後、編集したＣＤ３４＋細胞を赤血球系分化培地に移してから１４日目にフローサイトメトリーによって計測したときの％ＨｂＦ陽性細胞を示す。図３１は、指示されるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含むＲＮＰのエレクトロポレーション後、編集したＣＤ３４＋細胞を赤血球系分化培地に移してから１４日目にフローサイトメトリーによって計測したときの％ＨｂＦ陽性細胞を示す。図３２は、赤血球系分化培地中で１４日後の編集済み細胞の増殖倍数を示す。これらの結果は、選択されたｇＲＮＡ分子の多くが、ｄｇＲＮＡおよびｓｇＲＮＡの両方のフォーマットとも、ＲＮＰとしてエレクトロポレーションによってＣＤ３４＋細胞に送達したとき、標的部位におけるゲノム編集を９０％より高い効率、ある場合には９８％より高い効率で実現する能力を有することを示している。同様に、選択されたｇＲＮＡの多くが、非修飾細胞（「モック」）と比べて２０％より高い％Ｆ細胞の増加を実現することが可能であった。最後に、ＨＳＰＣにおけるＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーのゲノム編集によって赤血球系細胞の増殖能が低下し、一部のｇＲＮＡ（例えば、ＣＲ００３０９）は他のｇＲＮＡ（例えば、ＣＲ００３１２）よりもその効果が一層顕著であったが、赤血球に分化した編集済み細胞集団のほとんどは、それでもなおエキソビボで赤血球系分化培地中において１４日間で５００〜１５００倍の集団倍加を実現する能力を有したことから、編集済み細胞は患者の鎌状赤血球症またはβサラセミアなどの異常ヘモグロビン症の治療において療法として有用であり得ることが示される。
【０７７６】
実施例４．成人赤血球系細胞における胎児グロビン発現の抑制を解除するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いた造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）におけるＨＰＦＨ領域編集
方法：
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。製造者の指示に従い免疫選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて成人ドナー由来のＧ−ＣＳＦ動員末梢血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）からヒトＣＤ３４＋細胞を単離し、各５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ９４１３）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１１３）およびヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ００６３）、ならびに１×抗生物質／抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８−０１６）および５００ｎＭ化合物４を補足したＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０９６５０）を用いて４〜６日間増殖させた。この実施例全体を通じて（そのサブ実施例を含め）、プロトコルがその細胞を「増殖させた」と指示する場合、この培地を使用した。この培地は本実施例では（そのサブ実施例を含め）「幹細胞増殖培地」、または「増殖培地」とも称される。
【０７７７】
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰＣの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）はエレクトロポレーションの直前に調製した。デュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）を用いるＲＮＰの形成については、初めに各３μｇのｃｒＲＮＡ（２．２４μＬ中）およびｔｒａｃｒ（１．２５μＬ中）を別個のチューブにおいて９５℃で２分間変性させて、次に室温に冷却した。Ｃａｓ９タンパク質の調製のため、６μｇのＣＡＳ９タンパク質（０．８〜１μＬ中）を０．５μＬの５×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣＬ、５ｍＭ  ＭｇＣＬ２、５％グリセロールおよび新たに添加した１ｍＭ  ＤＴＴ）と混合した。初めにＴｒａｃｒをＣａｓ９調製物と混合し、３７℃で５分間インキュベートした。次にｃｒＲＮＡをＴｒａｃｒ／ＣＡＳ９複合体に加え、３７℃で５分間インキュベートした。無し／対照条件については、Ｔｒａｃｒ／ＣＡＳ９複合体にｃｒＲＮＡではなく媒体を加えた。遠心によってＨＳＰＣを回収し、Ｎｅｏｎエレクトロポレーションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号：ＭＰＫ１０９６）に付属するＴ緩衝液中に５×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを２０μＬの細胞と上下にピペッティングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。ＲＮＰ／細胞混合物（１０μＬ）をＮｅｏｎエレクトロポレーションプローブに移した。Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＭＰＫ５０００Ｓ）で１７００ボルト／２０ミリ秒および１パルスを用いてエレクトロポレーションを実施した。デュプリケートの１０μＬエレクトロポレーションを実施した。
【０７７８】
インビトロ赤血球新生およびＨｂＦを含有する赤血球系細胞に関するＦＡＣＳ分析。エレクトロポレーション後、直ちに、ＩＭＤＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２２８．０１）、３３０μｇ／ｍＬヒトホロトランスフェリン（Ｉｎｖｉｔｒｉａ  カタログ番号７７７ＴＲＦ０２９）、１０μｇ／ｍＬ組換えヒトインスリン（Ｇｉｂｃｏ  カタログ番号Ａ１１３８２１１）、２ＩＵ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ、品番Ｈ３３９３）、５％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｈ４５２２）、１２５ｎｇ／ｍＬヒトエリスロポエチン（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＃１０７７９−０５８）、および１×抗生物質／抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８−０１６）からなる２５０μＬの予め温めた赤血球系分化培地（ＥＤＭ）に細胞を移した。ＥＤＭには、１μＭヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ  Ｈ８６７２）、１００ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＦ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１１３）、および５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＃１０７７９−５９８）をさらに補足した。２日後、細胞培養物を新鮮培地に希釈した。培養物は合計７日間維持し、７日経った時点で細胞をＨｂＦ発現に関して細胞内染色によって分析した。簡潔に言えば、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉｏｌｅｔ死細胞染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｌ３４９６３；ＰＢＳ中１：１０００）に再懸濁して、３０分間インキュベートした。次に細胞を洗浄し、抗ＣＤ７１−ＢＶ７１１（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｌｌｃ．ＢＤＢ５６３７６７）および抗ＣＤ２３５ａ−ＡＰＣ（ＢＤ  ５５１３３６）抗体で３０分間染色した。次に細胞を洗浄し、続いて製造者の指示に従い固定化緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０８０１）で固定化し、および１×細胞内染色・透過処理・洗浄緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２１００２）で透過処理した。次に細胞を５０μＬの１×細胞内染色・透過処理・洗浄緩衝液中０．５μＬの抗ＨｂＦ−ＰＥ抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、品番ＭＨＦＨ０４）と共に室温で２０分間インキュベートした。細胞を２ｍＬの１×細胞内染色・透過処理・洗浄緩衝液で２回洗浄し、染色緩衝液中に再懸濁し、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＨｂＦ発現に関して分析した。結果はＦｌｏｗｊｏを使用して分析し、およびデータは、生存ＣＤ７１陽性赤血球系細胞集団中のＨｂＦ陽性細胞（Ｆ−細胞）の％として提示した。
【０７７９】
遺伝子発現解析。記載されるとおりのインビトロ赤血球新生の７日後、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＺＲ−９６  ｑｕｉｃｋ  ＲＮＡキット（Ｚｙｍｏ  カタログ番号Ｒ１０５３）を使用したＲＮＡの精製に、約１×１０５細胞を使用した。Ｑｕａｎｔｉｓｃｒｉｐｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２０５３１３）を使用した第１鎖合成に、最大１μｇのＲＮＡを使用した。供給業者のプロトコルに従い２×Ｔａｑ−Ｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅ  ＰＲ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４４４４９６３）を使用してＴａｑ−ｍａｎ定量的リアルタイムＰＣＲを実施し、およびＧＡＰＤＨ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤ番号Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１、ＶＩＣ）、ＨＢＢ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤ番号Ｈｓ００７４７２２３＿ｇ１、ＶＩＣ）およびＨＢＧ２／ＨＢＧ１（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤ番号Ｈｓ００３６１１３１＿ｇ１、ＦＡＭ）に関してＴａｑ−Ｍａｎ遺伝子発現アッセイを実施した。各遺伝子の相対発現はＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ΔΔＣｔ法による無し／対照ＲＮＰを送達した試料の倍数として報告した。あるいは、転写物をＧＡＰＤＨ正規化相対量に変換した後（２＾−ΔＣｔ）、ＨＢＢおよびＨＢＧ２／ＨＢＧ１発現の合計に対するパーセンテージとしてＨＢＧ２／ＨＢＧ１発現レベルを計算した。
【０７８０】
ゲノムＤＮＡ調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。エレクトロポレーションの４８時間後に、Ｑｕｉｃｋ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  カタログ番号ＱＥ０９０５０）を使用して編集済みおよび未編集ＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを調製した。編集効率ならびに挿入および欠失（インデル）のパターンを決定するため、文献に記載されるとおり標的部位に隣接するプライマーを用いてＰＣＲ産物を作成し、次にこれを次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供した。未編集試料（Ｃａｓ９およびＴｒａｃｒのみからなるＲＮＰをエレクトロポレートした）における対応する配列のパーセント編集率は、典型的には１％未満であり、３％を超えることはなかった。
【０７８１】
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＰＦＨ領域を標的化して遺伝子破壊するとγ−グロビン発現の抑制が解除され、高いＨｂＦタンパク質を含有する赤血球細胞（胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「Ｆ−細胞」と称されることもある）の産生が可能になると考えられる。高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびＳＣＤの両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤、例えば国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は全体として参照により援用される）に記載されるとおりのもの、例えば化合物４と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの送達用量が増加した。
【０７８２】
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞および組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９−ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化する。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験概要は図１７に示す。
【０７８３】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡのリストおよび配列は、表１６に示す。「材料および方法」に記載されるとおりエレクトロポレーションによってＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の送達前に細胞は増殖させた。活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーションによって送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
【０７８４】
【表１１６】
2019500043.tif 000178
【０７８５】
【表１１７】
2019500043.tif 000179
【０７８６】
【表１１８】
2019500043.tif 000180
【０７８７】
【表１１９】
2019500043.tif 000181
【０７８８】
【表１２０】
2019500043.tif 000182
【０７８９】
ゲノム編集済みおよび未編集のＨＳＰＣについて、蛍光色素にコンジュゲートした抗体を使用して胎児グロビンならびに２つの赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）およびグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現レベルをフローサイトメトリーによって分析した。Ｌｉｖｅ  Ｄｅａｄ  Ｖｉｏｌｅｔの除外によって生存細胞を同定し、ゲーティングした。培養細胞が未編集細胞と同様の赤芽球と一致するＣＤ７１＋細胞のパーセンテージを示したとおり、ゲノム編集は赤血球系分化に悪影響を及ぼさなかった。ＨＰＦＨ領域を標的化すると、モックエレクトロポレート細胞（２１．０％）と比較して、ＨｂＦを含有する赤血球系細胞のパーセンテージが（５１．４％まで）増加した（表１６）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の誘導も並行して観察された。またＨＰＦＨ領域のゲノムＰＣＲ産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供し、細胞集団中の編集されたアレルのパーセンテージを決定した。Ｃａｓ９、所与の標的化ドメインのｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｒを含むＲＮＰをエレクトロポレートした細胞培養物の多くでは、ＨＦＰＨ遺伝子座における高いゲノム編集パーセンテージが観察されたが（表１６）、標的化ドメインを送達しない対照細胞（Ｃａｓ９およびＴｒａｃｒのみを含むＲＮＰ）では観察されなかった。詳細には、４０％より高いＨｂＦ＋細胞をもたらしたｄｇＲＮＡ処理では、編集されたアレルは４３．０％〜９１．７％の範囲であった（表１６）。
【０７９０】
【表１２１】
2019500043.tif 000183
【０７９１】
本研究における一部の培養物をヘモグロビン遺伝子発現に関して分析した。これらの標的化ドメインのうち、胎児γ−グロビン遺伝子発現が無し／対照と比べて１．６〜３．８倍誘導され、これは成人β−グロビン発現の中程度の低下を伴った（無し／対照の０．５８〜０．９１倍）（表１８）。これらの効果が一緒になって、細胞集団における全β型グロビンの１３．８％〜２６．６％の範囲のγ−グロビン発現レベル（γ／［γ＋β］）をもたらし（表１７）、標的化ドメインにわたる相対的胎児グロビン誘導は、ＨｂＦタンパク質誘導について観察されるものと同様であった（表１６）。ゲノム編集済み細胞に由来する赤血球におけるＨｂＦ／γ−グロビンの増加またはβ−グロビン（鎌状化したグロビン）レベルの低下と併せたＨｂＦ／γ−グロビンの増加のいずれも、鎌状化の低下による治療的意味を有するものと思われる。
【０７９２】
実施例４．２
方法：方法は、以下の点を除いて実施例４にあるとおりである。
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰＣの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。遠心によって収集したＨＳＰＣをＰ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ  カタログ番号ＰＢＰ３−００６７５）に２．５×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを２０μＬの細胞と上下にピペッティングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣＭ−１３７を用いてＲＮＰ／細胞混合物（２０μＬ）をエレクトロポレートした。
【０７９３】
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＰＦＨ領域を標的化して遺伝子破壊するとγ−グロビン発現の抑制が解除され、高いＨｂＦタンパク質を含有する赤血球細胞（胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「Ｆ−細胞」と称されることもある）の産生が可能になると考えられる。高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびＳＣＤの両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤、例えば国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は全体として参照により援用される）に記載されるとおりのもの、例えば化合物４と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの送達用量が増加した。
【０７９４】
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞および組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９−ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化する。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験概要は図１７に示す。
【０７９５】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡのリストは、表１９に示す。「材料および方法」に記載されるとおりエレクトロポレーションによってＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の送達前に細胞は増殖させた。活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーションによって送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
【０７９６】
【表１２２】
2019500043.tif 000184
【０７９７】
【表１２３】
2019500043.tif 000185
【０７９８】
【表１２４】
2019500043.tif 000186
【０７９９】
ゲノム編集済みおよび未編集のＨＳＰＣについて、蛍光色素にコンジュゲートした抗体を使用して胎児グロビンならびに２つの赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）およびグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現レベルをフローサイトメトリーによって分析した。Ｌｉｖｅ  Ｄｅａｄ  Ｖｉｏｌｅｔの除外によって生存細胞を同定し、ゲーティングした。培養細胞が未編集細胞と同様の赤芽球と一致するＣＤ７１＋細胞のパーセンテージを示したとおり、ゲノム編集は赤血球系分化に悪影響を及ぼさなかった。ＨＰＦＨ領域を標的化すると、モックエレクトロポレート細胞（１８．９および２１．１％）と比較して、ＨｂＦを含有する赤血球系細胞のパーセンテージが（４６．６％まで）増加した（表１９）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の誘導も並行して観察された。
【０８００】
最後に、ＣＲ００３０３１、ＣＲ００３０３３、ＣＲ００３０３５、ＣＲ００３０３７、ＣＲ００３０３８、ＣＲ００３０５２、ＣＲ００３０８５の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡについて標的部位にまたはその近傍に作り出されたインデルパターンをＮＧＳによって評価した。各位置における上位５つの最も高頻度のインデルを表２７に示す。
【０８０１】
【表１２５】
2019500043.tif 000187
【０８０２】
【表１２６】
2019500043.tif 000188
【０８０３】
【表１２７】
2019500043.tif 000189
【０８０４】
これらの結果は、指示されるｇＲＮＡ分子によって標的とされるＨＰＦＨ領域の小さいインデル（例えば、この場合、１〜２０ヌクレオチドのインデル）が、ＨｂＦの発現および産生に大きい影響を有し得るという本明細書に記載される前出の実験の結論を裏付けている。ゲノム編集済み細胞に由来するＨｂＦ含有赤血球の増加は、鎌状化の低下による治療的意味を有するものと思われる。
【０８０５】
実施例４．３
方法：方法は、以下の点を除いて実施例４にあるとおりである。
【０８０６】
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。ヒトＣＤ３４＋細胞を増殖培地でＲＮＰ送達前に３日間増殖させた。
【０８０７】
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰＣの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。遠心によって収集したＨＳＰＣをＰ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ  カタログ番号ＰＢＰ３−００６７５）に６．４×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを２０μＬの細胞と上下にピペッティングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣＭ−１３７を用いてＲＮＰ／細胞混合物（２０μＬ）をエレクトロポレートした。エレクトロポレーションはデュプリケートで実施した。Ｔｒａｃｒは配列番号７８０８であり、およびｃｒＲＮＡは、以下のフォーマット（２’Ｏ−メチル（ｍ）およびホスホロチオエート結合（＊）修飾が指示される）：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（式中、Ｎは標的化ドメインのヌクレオチドである）を有した。
【０８０８】
インビトロ赤血球新生およびＨｂＦを含有する赤血球系細胞に関するＦＡＣＳ分析。エレクトロポレーション後、直ちに、ＥＤＭおよび補足物からなる予め温めた培地に細胞を移した。培養０〜７日目の間、ＥＤＭには、１μＭヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ  Ｈ８６７２）、１００ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＦ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１１３）、および５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＃１０７７９−５９８）をさらに補足した。培養７〜１１日目の間、ＥＤＭには１００ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦのみを補足した。培養１１〜２１日目の間、ＥＤＭに追加の補足はしなかった。細胞培養物０日目に２．６×１０４細胞／ｍｌで開始し、７日目に４．０×１０４細胞／ｍｌに調整し、および１１日目に１．０×１０６細胞／ｍｌに調整した。１４日目および１９日目に培地を補充した。ＲＮＰ送達後１、４、７、１１、１４および２１日に生存細胞をカウントした。生存細胞数は全て、ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  カタログ番号ＰＣＢ１００）を用いたフローサイトメトリーにより、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色によって生存不能細胞を判別して決定した。培養７、１６および２１日目、細胞（１×１０５）をＨｂＦ発現に関して細胞内染色によって分析した。１６日目および２１日目、ＨｂＦ発現に関する細胞内染色に抗ＣＤ７１および抗ＣＤ２３５ａ抗体は含まず、生存細胞集団全体におけるＨｂＦ陽性細胞（Ｆ−細胞）の％を報告した。２１日目、生死判別色素としてＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｌ３４９７５）を使用した。
【０８０９】
ゲノムＤＮＡ調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。エレクトロポレーションの７日後に、Ｑｕｉｃｋ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  カタログ番号ＱＥ０９０５０）を使用して編集済みおよび未編集ＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを調製した。
【０８１０】
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＰＦＨ領域を標的化して遺伝子破壊するとγ−グロビン発現の抑制が解除され、高いＨｂＦタンパク質を含有する赤血球細胞（胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「Ｆ−細胞」と称されることもある）の産生が可能になると考えられる。高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびＳＣＤの両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤、例えば国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は全体として参照により援用される）に記載されるとおりのもの、例えば化合物４と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの送達用量が増加した。
【０８１１】
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞および組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９−ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化する。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験概要は図１７に示す。
【０８１２】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡのリストは、表２０に示す。「材料および方法」に記載されるとおりエレクトロポレーションによってＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の送達前に細胞は増殖させた。活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーションによって送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
【０８１３】
【表１２８】
2019500043.tif 000190
【０８１４】
ゲノム編集済みおよび未編集のＨＳＰＣについて、三段階赤血球系分化細胞培養プロトコルで増殖に関して分析した。エレクトロポレーション後１日のパーセント細胞回収率は５８％〜９６％の範囲であり、未編集であるがエレクトロポレートした対照を含め、条件間で同様であった（表２０）。増殖は、ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡによって編集した細胞では抑制されたが（２１日目に未編集対照の１０〜１２％、表２０）、含まれたＨＰＦＨ領域を標的とするｄｇＲＮＡによって編集した細胞の増殖は対照と同様であった（２１日目に未編集対照の４７〜９９％、表２０）。
【０８１５】
【表１２９】
2019500043.tif 000191
【０８１６】
ゲノム編集済みおよび未編集のＨＳＰＣについて、蛍光色素にコンジュゲートした抗体を使用して胎児グロビンならびに２つの赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）およびグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現レベルをフローサイトメトリーによって分析した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｆｉｘａｂｌｅ死細胞染色の除外によって生存細胞を同定し、ゲーティングした。分化７日目に培養細胞が未編集細胞と同様の赤芽球と一致するＣＤ７１＋細胞のパーセンテージを示したとおり、ゲノム編集は赤血球系分化に悪影響を及ぼさなかった。含まれたＨＰＦＨ領域標的化ｄｇＲＮＡで培養物を処理すると、モックエレクトロポレート細胞と比較して、２１日間の培養期間全体を通じてＨｂＦを含有する赤血球系細胞のパーセンテージが増加した（表２１）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の誘導も並行して観察された。またＨＰＦＨ領域のゲノムＰＣＲ産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供し、細胞集団中の編集されたアレルのパーセンテージを決定した。Ｃａｓ９、所与の標的化ドメインのｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｒを含有するＲＮＰをエレクトロポレートした細胞培養物ではＨＦＰＨ遺伝子座におけるゲノム編集が観察されたが（表２１）、標的化ドメインを送達しない対照細胞（Ｃａｓ９およびＴｒａｃｒのみを含むＲＮＰ）では観察されなかった。ゲノム編集済み細胞に由来するＨｂＦ含有赤血球の増加は、鎌状化の低下による治療的意味を有するものと思われる。
【０８１７】
実施例４．４
方法：方法は、以下の点を除いて実施例４にあるとおりである。
【０８１８】
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。研究に応じて、ＲＮＰ送達前の３〜６日間にわたって増殖培地でヒトＣＤ３４＋細胞を増殖させた。
【０８１９】
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰＣの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。一部の研究については、ＲＮＰ複合体は４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を使用して送達した。そのような研究では、遠心によって収集したＨＳＰＣをＰ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ  カタログ番号ＰＢＰ３−００６７５）に、研究に応じて２．２×１０６／ｍＬ〜６．４×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを２０μＬの細胞と上下にピペッティングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣＭ−１３７を用いてＲＮＰ／細胞混合物（２０μＬ）をエレクトロポレートした。エレクトロポレーションはデュプリケートで実施した。ｄｇＲＮＡフォーマットは、研究間で異なり、以下の表記法によって表２２に示す。フォームＡは、上記の実施例１に記載したｄｇＲＮＡフォーマットであり、指示される標的化ドメイン配列を含む。フォームＢは、ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵｒＧｒＣｒＵ（式中、ｒはＲＮＡ塩基を示し、およびＮは、指示される標的化ドメイン配列に対応する）のｃｒＲＮＡ、および配列番号７８０８からなるｔｒａｃｒを用いるｄｇＲＮＡフォーマットである。フォームＣは、配列ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（式中、ｒはＲＮＡ塩基を示し、Ｎは、指示される標的化ドメイン配列に対応し、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、および＊はホスホロチオエート結合を示す）のｃｒＲＮＡ、および配列番号７８０８からなるｔｒａｃｒを用いるｄｇＲＮＡフォーマットである。
【０８２０】
インビトロ赤血球新生およびＨｂＦを含有する赤血球系細胞に関するＦＡＣＳ分析。一研究では、細胞培養は０日目に２．６×１０４細胞／ｍｌで開始した。２５０μｌに直接播種することにより開始したものについては（実施例４に記載されるとおり）、研究に応じて１〜３日後に細胞培養物を新鮮培地に希釈した。
【０８２１】
ゲノムＤＮＡ調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。研究に応じてエレクトロポレーションの２４時間〜７日後に、Ｑｕｉｃｋ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  カタログ番号ＱＥ０９０５０）を使用して編集済みおよび未編集ＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを調製した。
【０８２２】
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＰＦＨ領域を標的化して遺伝子破壊するとγ−グロビン発現の抑制が解除され、高いＨｂＦタンパク質を含有する赤血球細胞（胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「Ｆ−細胞」と称されることもある）の産生が可能になると考えられる。高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびＳＣＤの両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤、例えば国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は全体として参照により援用される）に記載されるとおりのもの、例えば化合物４と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの送達用量が増加した。
【０８２３】
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞および組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９−ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化する。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験概要は図１７に示す。
【０８２４】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡのリストは、表２２に示す。「材料および方法」に記載されるとおりエレクトロポレーションによってＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の送達前に細胞は増殖させた。活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーションによって送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
【０８２５】
【表１３０】
2019500043.tif 000192
【０８２６】
【表１３１】
2019500043.tif 000193
【０８２７】
【表１３２】
2019500043.tif 000194
【０８２８】
ゲノム編集済みおよび未編集のＨＳＰＣについて、蛍光色素にコンジュゲートした抗体を使用して胎児グロビンならびに２つの赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）およびグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現レベルをフローサイトメトリーによって分析した。Ｌｉｖｅ  Ｄｅａｄ  Ｖｉｏｌｅｔの除外によって生存細胞を同定し、ゲーティングした。ＨＰＦＨ領域を標的化すると、モックエレクトロポレート細胞と比較して、ＨｂＦを含有する赤血球系細胞のパーセンテージが増加し、これは複数の評価およびｄｇＲＮＡフォーマット間で一貫した結果であった（表２２）。一部の例では、％ＨｂＦ＋細胞の増加は特定のｄｇＲＮＡフォーム、例えばＣＲ００１０２８についてのフォームＣと関連付けられた（表２２）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の誘導も並行して観察された。またＨＰＦＨ領域のゲノムＰＣＲ産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供し、細胞集団中の編集されたアレルのパーセンテージを決定した。Ｃａｓ９、所与の標的化ドメインのｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｒを含有するＲＮＰをエレクトロポレートした細胞培養物ではＨＦＰＨ遺伝子座におけるゲノム編集が観察されたが（表２２）、標的化ドメインを送達しない対照細胞（Ｃａｓ９およびＴｒａｃｒのみを含むＲＮＰ）では観察されなかった。
【０８２９】
最後に、各ｇＲＮＡについてインデルパターンならびに各インデルの頻度をＮＧＳによって評価した。各標的部位に最も高頻度に出現するインデルを表２６に示す。
【０８３０】
【表１３３】
2019500043.tif 000195
【０８３１】
【表１３４】
2019500043.tif 000196
【０８３２】
【表１３５】
2019500043.tif 000197
【０８３３】
【表１３６】
2019500043.tif 000198
【０８３４】
【表１３７】
2019500043.tif 000199
【０８３５】
ある場合には、最も高頻度のインデルの相対的存在量は実験毎に異なったが、上位のインデルは、いずれの所与のｇＲＮＡについても両方の実験で概して同じであった。これは、これらのｄｇＲＮＡについて、ＨＳＣ細胞に作り出されたインデルパターンが一貫していたことを示している。同様に、これらの結果は、これらのｇＲＮＡによって標的化されるＨＰＦＨ領域における小さいインデル（例えば、この場合、１〜２０ヌクレオチドのインデル）が胎児ヘモグロビンの大幅な上方制御をもたらし得るという前出の実験からの意外な知見を裏付けている。ゲノム編集済み細胞に由来するＨｂＦ含有赤血球の増加は、鎌状化の低下による治療的意味を有するものと思われる。
【０８３６】
実施例４．５
方法：方法は、以下の点を除いてサブ実施例４．１にあるとおりである。
【０８３７】
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。ヒトＣＤ３４＋細胞は骨髄に由来した（Ｈｅｍａｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号ＢＭ３４Ｃ−３）。ＣＤ３４＋細胞を解凍し、ＲＮＰ送達前に増殖培地で１日増殖させた。ＲＮＰ送達後、細胞を直ちに２００μｌ増殖培地に戻し、一晩回復させた。翌日、培養物をカウントし、２．０×１０５生存細胞／ｍｌに調整した。パーセント回収率は、エレクトロポレートした生存細胞のパーセンテージとしてＲＮＰ送達後１日の生存細胞数として計算した。増殖培地中でさらに７日後（ＲＮＰ送達後８日）、生存細胞数を再び決定した。増殖倍数は、増殖培地中で７日後の生存細胞数を２．０×１０５細胞／ｍｌで除したものとして計算した。生存細胞数は全て、ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  カタログ番号ＰＣＢ１００）を用いたフローサイトメトリーにより、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色によって生存不能細胞を判別して計測した。増殖培地中でさらに１日後（ＲＮＰ送達後９日）、細胞培養物の表現型を「細胞フェノタイピング」に記載するとおりフローサイトメトリーによって決定した。
【０８３８】
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰＣの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。遠心によって収集したＨＳＰＣをＰ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ  カタログ番号ＰＢＰ３−００６７５）に５．４×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを２０μＬの細胞と上下にピペッティングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣＭ−１３７を用いてＲＮＰ／細胞混合物（２０μＬ）をエレクトロポレートした。エレクトロポレーションはデュプリケートで実施した。使用したｃｒＲＮＡは配列ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（式中、ｒはＲＮＡ塩基を示し、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、および＊はホスホロチオエート結合を示す）のものであった。Ｎは、指示される標的化ドメインの残基を示す。使用したｔｒａｃｒ配列は配列番号７８０８であった。
【０８３９】
コロニー形成単位細胞アッセイ。ＲＮＰ送達の翌日、「ヒトＣＤ３４＋細胞培養」に記載されるとおり生存細胞をカウントした。顆粒球／マクロファージ前駆細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイについて、１ｍＬのＭｅｔｈｏｃｕｌｔ  Ｈ４０３５メチルセルロース培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）当たり２２７細胞をデュプリケートでプレーティングした。Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔに１×抗生物質／抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１０３７８−０１６）を添加した。培養ディッシュを加湿インキュベーターにおいて３７℃でインキュベートした。プレーティング後１５日目に、少なくとも５０細胞を含むコロニーをカウントした。Ｍｅｔｈｏｃｕｌｔ  １ｍｌ当たりのコロニー数を２２７で除して１０００を乗じることにより、１０００細胞当たりのＣＦＵ頻度を求めた。
【０８４０】
細胞フェノタイピング。以下の抗体パネルで染色した後、表面マーカー発現に関して細胞を分析した。パネル１：ＣＤ３８（ＦＩＴＣコンジュゲート、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃３４０９２６、クローンＨＢ７）、ＣＤ１３３エピトープ１（ＰＥコンジュゲート、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＃１３０−０８０−８０１、クローンＡＣ１３３）、ＣＤ３４（ＰｅｒＣＰコンジュゲート、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃３４０６６６、クローン８Ｇ１２）、ＣＤ９０（ＡＰＣコンジュゲート、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃５９８６９５、クローンＥ１０）、ＣＤ４５ＲＡ（Ｐｅ−Ｃｙ７コンジュゲート、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＃２５−０４５８−４２、クローンＨＩ１００）。パネル２：ＣＤ３４（ＰｅｒＣＰコンジュゲート、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃３４０６６６、クローン８Ｇ１２）、ＣＤ３３（ＰＥ−Ｃｙ７コンジュゲート、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃３３３９４６、クローンＰ６７．６）、ＣＤ１４（ＡＰＣ−Ｈ７コンジュゲート、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃５６０２７０、クローンＭφＰ９）、ＣＤ１５（ＰＥコンジュゲート、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３０１９０５、クローンＨＩ９８）。パネル３：ＣＤ３４（ＰｅｒＣＰコンジュゲート、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃３４０６６６、クローン８Ｇ１２）、ＣＤ４１ａ（ＡＰＣ−Ｈ７コンジュゲート、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃５６１４２２、クローンＨＩＰ８）、ＣＤ７１（ＦＩＴＣコンジュゲート、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃５５５５３６、クローンＭ−Ａ７１２）、ＣＤ１９（ＰＥコンジュゲート、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃３４０７２０、クローンＳＪ２５Ｃ１）、ＣＤ５６（ＡＰＣコンジュゲート、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３１８３１０、クローンＨＣＤ５６）に特異的な抗体。並行して、対応するアイソタイプ対照抗体パネルを使用して培養物を染色し、但し、そのアイソタイプ対照の代わりに抗ＣＤ４５ＲＡを含めた。生存不能細胞はＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色によって判別した。染色した試料をＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で細胞表面タンパク質発現に関して分析した。結果はＦｌｏｗｊｏを使用して分析し、データはＤＡＰＩ陰性生存細胞集団の％として提示した。
【０８４１】
ゲノムＤＮＡ調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。エレクトロポレーションの１日および８日後に、Ｑｕｉｃｋ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  カタログ番号ＱＥ０９０５０）を使用して編集済みおよび未編集ＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを調製した。
【０８４２】
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＰＦＨまたはＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサー領域を標的化して遺伝子破壊すると、γ−グロビン発現の抑制が解除されて、高いＨｂＦタンパク質を含有する赤血球細胞（胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「Ｆ−細胞」と称されることもある）の産生が可能になると考えられる。高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびＳＣＤの両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤、例えば国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は全体として参照により援用される）に記載されるとおりのもの、例えば化合物４と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの送達用量が増加した。
【０８４３】
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞および組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９−ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化する。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験概要は図１７に示す。
【０８４４】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡのリストは、表２３に示す。「材料および方法」に記載されるとおりエレクトロポレーションによってＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の送達前に細胞は増殖させた。活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーションによって送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
【０８４５】
【表１３８】
2019500043.tif 000200
【０８４６】
エレクトロポレーション１日後のパーセント細胞回収率は７２．５％〜８９．８％の範囲であり、未編集であるがエレクトロポレートした対照を含め、条件間で同様であった（表２３）。ゲノム編集済みおよび未編集ＨＳＰＣをＣＤ３４＋細胞増殖培地での増殖に関して分析した。増殖は７日間で編集済み細胞培養物について４．８倍〜１７．３倍の範囲であり、未編集の細胞について１９．３〜２０．５倍の範囲であった（表２２）。表面マーカー発現によって決定するとき、未編集対照と比較して培養物における細胞型の組成が、ＨＰＦＨまたはＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサー領域を標的とする本研究におけるｄｇＲＮＡによる編集によって変化することはなく、これらの条件下でこれらの部位のターゲティングによってはＨＳＰＣ運命が変化しないことが示された（図２６Ａ〜図２６Ｂ）。対照的に、ＢＣＬ１１Ａエクソンのｇ８を標的とするｄｇＲＮＡで編集すると、増殖は中程度の低下となったが、細胞組成の顕著なシフトが起こり、特に全ＣＤ３４＋  ＨＳＰＣサブタイプならびにＣＤ７１＋赤血球系集団のパーセンテージが減少し、およびＣＤ１４＋単球およびＣＤ１５＋顆粒球集団のパーセンテージが増加した（表２３および図２６Ａ〜図２６Ｂ）。顆粒球／マクロファージ前駆細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ）の頻度は編集済み培養物間で同様で、未編集の培養物（１０００細胞当たり１５４〜１８５ＣＦＵ）と比較して編集済み培養物ではＣＦＵの低下は僅かであった（１０００細胞当たり９５〜１４５ＣＦＵの範囲）ことから、これらの部位を標的化することにより顆粒球／マクロファージ前駆細胞機能が著しく変化することはないことが示唆される（表２３）。
【０８４７】
実施例４．６
方法：方法は、以下の点を除いて実施例４にあるとおりである。
【０８４８】
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰＣの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。一部の例では、２つの異なる標的化ドメインを含むｃｒＲＮＡを同じ細胞培養物に送達した。このような場合、細胞に送達される全ＲＮＰは、サブ実施例４．１にあるとおり、６μｇのＣａｓ９、３μｇのｃｒＲＮＡおよび３μｇのＴｒａｃｒを含んだ。しかしながら、各１．５μｇを含む２つのｃｒＲＮＡは、１．５μｇ  Ｔｒａｃｒおよび３μｇ  Ｃａｓ９を含むＴｒａｃｒ／ＣＡＳ９混合物と独立に複合体化し、細胞に加えるときにのみ組み合わせた。遠心によって収集したＨＳＰＣをＰ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ  カタログ番号ＰＢＰ３−００６７５）に２．５×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを２０μＬの細胞と上下にピペッティングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣＭ−１３７を用いてＲＮＰ／細胞混合物（２０μＬ）をエレクトロポレートした。エレクトロポレーションはデュプリケートで実施した。ｄｇＲＮＡフォーマットは、配列番号７８０８を有するｔｒａｃｒ、および配列ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＮｒＧｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＧｒＣｒＵｒＡｒＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵ（式中、ｒはＲＮＡ塩基を示し、ｍは２’Ｏ−メチル修飾を有する塩基を示し、および＊はホスホロチオエート結合を示し、およびＮは、指示される標的化ドメインの残基を示す）のｃｒＲＮＡを使用した。
【０８４９】
インビトロ赤血球新生およびＨｂＦを含有する赤血球系細胞に関するＦＡＣＳ分析。３日後に細胞培養物を新鮮培地に希釈した。
【０８５０】
ゲノムＤＮＡ調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。エレクトロポレーションの３日後に、Ｑｕｉｃｋ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  カタログ番号ＱＥ０９０５０）を使用して編集済みおよび未編集ＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを調製した。
【０８５１】
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＰＦＨまたはＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサー領域を標的化して遺伝子破壊すると、γ−グロビン発現の抑制が解除されて、高いＨｂＦタンパク質を含有する赤血球細胞（胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「Ｆ−細胞」と称されることもある）の産生が可能になると考えられる。高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびＳＣＤの両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤、例えば国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は全体として参照により援用される）に記載されるとおりのもの、例えば化合物４と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの送達用量が増加した。
【０８５２】
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞および組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９−ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化する。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験概要は図１７に示す。
【０８５３】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなる合成デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡのリストは、表２４に示す。「材料および方法」に記載されるとおりエレクトロポレーションによってＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の送達前に細胞は増殖させた。活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーションによって送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
【０８５４】
【表１３９】
2019500043.tif 000201
【０８５５】
ゲノム編集済みおよび未編集のＨＳＰＣについて、蛍光色素にコンジュゲートした抗体を使用して胎児グロビンならびに２つの赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）およびグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現レベルをフローサイトメトリーによって分析した。Ｌｉｖｅ  Ｄｅａｄ  Ｖｉｏｌｅｔの除外によって生存細胞を同定し、ゲーティングした。ＨＰＦＨ領域またはＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーを標的化すると、モックエレクトロポレート細胞と比較して、ＨｂＦを含有する赤血球系細胞のパーセンテージが増加した（表２４）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の誘導も並行して観察された。ＨＰＦＨ領域およびＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーを同じ細胞集団中で同時に標的化したとき、ＨｂＦ含有細胞のパーセンテージは、いずれか一方の領域を独立に標的化した場合を上回って増加した（表２４）。したがって、編集済み細胞に由来するＨｂＦ含有赤血球の増加は、ＨＰＦＨ領域またはＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサーのいずれかを標的化することによって実現できると共に、両方の領域を同時に標的化することによっても一層高い程度で実現できる。
【０８５６】
両方の領域のゲノムＰＣＲ産物を独立に次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供して、細胞集団中における編集されたアレルのパーセンテージを決定した。Ｃａｓ９、所与の標的化ドメインのｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｒを含有するＲＮＰをエレクトロポレートした細胞培養物ではゲノム編集が観察されたが（表２４）、標的化ドメインを送達しない対照細胞（Ｃａｓ９およびＴｒａｃｒのみを含むＲＮＰ）では観察されなかった。２つの部位を標的とするＲＮＰを同じ細胞集団に送達したとき、両方の部位における編集が観察された（表２４）。一部の例では、２つのＲＮＰを送達したとき、１つのみのＲＮＰを送達したときと比較して、所与の部位におけるパーセント編集済み細胞がやや低下し（表２４）、これは恐らく、所与の部位を標的化するＲＮＰ濃度が前者の例では低かったことに起因した。２つのＲＮＰを同時に送達する場合、各個別のＲＮＰ濃度を増加させることにより、より高い編集率パーセンテージおよび潜在的にはより高いＨｂＦ含有細胞パーセンテージを実現し得る。ゲノム編集済み細胞に由来するＨｂＦ含有赤血球の増加は、鎌状化の低下による治療的意味を有するものと思われる。
【０８５７】
実施例４．７
方法：方法は、以下の点を除いて実施例４にあるとおりである。
【０８５８】
ヒトＣＤ３４＋細胞培養。ヒトＣＤ３４＋細胞は骨髄に由来した（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号２Ｍ−１０１Ｄ）。ＣＤ３４＋細胞を解凍し、ＲＮＰ送達前に増殖培地で２日間増殖させた。
【０８５９】
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰＣの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を用いるＲＮＰの形成については、５μＬの総容積中の６μｇのＣａｓ９タンパク質（０．８〜１μＬ中）および０．５μＬの５×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣＬ、５ｍＭ  ＭｇＣＬ２、５％グリセロールおよび新たに添加した１ｍＭ  ＤＴＴ）に６μｇのｓｇＲＮＡを加え、３７℃で５分間インキュベートした。ＨＳＰＣを遠心によって収集し、Ｐ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ  カタログ番号ＰＢＰ３−００６７５）に６．４×１０６／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを２０μＬの細胞と上下にピペッティングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣＭ−１３７を用いてＲＮＰ／細胞混合物（２０μＬ）をエレクトロポレートした。エレクトロポレーションはデュプリケートで実施した。ｄｇＲＮＡについては、ｄｇＲＮＡ−ＰＳおよびｄｇＲＮＡ−ＯＭｅＰＳ  Ｔｒａｃｒは配列番号６６６０であり、但しｇ８は除き、これはｔｒａｃｒ配列番号７８０８と使用した。この実験で使用した全てのｇＲＮＡのフォーマットを表３６に示し、但しｄｇＲＮＡ  ｇ８  ＯＭｅＰＳは除き、これは配列ｍＣ＊ｍＡ＊ｍＣ＊ＡＡＡＣＧＧＡＡＡＣＡＡＵＧＣＡＡＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ｍＵを有するｃｒＲＮＡおよび配列番号７８０８の配列を有するｔｒａｃｒを含んだ。
【０８６０】
インビトロ赤血球新生およびＨｂＦを含有する赤血球系細胞に関するＦＡＣＳ分析。ＲＮＰ送達後、細胞をプロトコル１またはプロトコル２に従い維持した。プロトコル１については、細胞は直ちに、ＥＤＭおよび補足物からなる予め温めた培地に移した。培養０〜７日目の間、ＥＤＭには、１μＭヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ  Ｈ８６７２）、１００ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＦ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１１３）、および５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＃１０７７９−５９８）をさらに補足した。培養７〜１１日目の間、ＥＤＭには１００ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦのみを補足した。培養１１〜２１日目の間、ＥＤＭに追加の補足はしなかった。７日目に細胞培養物を４．０×１０４細胞／ｍｌに調整した。１１、１４および１９日目に培地を補充した。プロトコル２については、細胞を直ちに２００μｌ増殖培地に戻し、さらに２日間増殖させた。ＲＮＰ送達２日後に培養物をカウントした。次に細胞をペレット化し、ＥＤＭおよび補足物からなる予め温めた培地に再懸濁した。ＥＤＭ培養０〜７日目の間、ＥＤＭには、１μＭヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ  Ｈ８６７２）、１００ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＦ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１１３）、および５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＃１０７７９−５９８）をさらに補足した。培養７〜１１日目の間、ＥＤＭには１００ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦのみを補足した。培養１１〜２１日目の間、ＥＤＭに追加の補足はしなかった。細胞培養は０日目に４．０×１０４細胞／ｍｌで開始し、４日目に新鮮培地で４倍希釈し、および７日目に２．０×１０５細胞／ｍｌに調整した。１１、１４および１９日目に培地を補充した。７、１８および２１日にＥＤＭ培養物中の生存細胞をカウントした。生存細胞数は全て、ＡｃｃｕＣｈｅｃｋ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  カタログ番号ＰＣＢ１００）を用いたフローサイトメトリーにより、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色によって生存不能細胞を判別して決定した。両方のプロトコルとも、赤血球系分化培養７、１４および２１日目に、細胞をＨｂＦ発現に関して細胞内染色によって分析した。１４日目および２１日目に、ＨｂＦ発現に関する細胞内染色に抗ＣＤ７１および抗ＣＤ２３５ａ抗体は含まず、生存細胞集団全体におけるＨｂＦ陽性細胞（Ｆ−細胞）の％を報告した。生死判別色素としてＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｌ３４９７５）を使用した。
【０８６１】
ゲノムＤＮＡ調製および次世代シーケンシング（ＮＧＳ）。プロトコル２によって培養した編集済みおよび未編集のＨＳＰＣから、エレクトロポレーションの２日および６日後にＱｕｉｃｋ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  カタログ番号ＱＥ０９０５０）を使用してゲノムＤＮＡを調製した。
【０８６２】
結果：
理論によって拘束されるものではないが、ＨＰＦＨ領域を標的化して遺伝子破壊するとγ−グロビン発現の抑制が解除され、高いＨｂＦタンパク質を含有する赤血球細胞（胎児ヘモグロビンを発現する細胞は、ときに本明細書において「Ｆ−細胞」と称されることもある）の産生が可能になると考えられる。高いＨｂＦは脱酸素化条件下で赤血球細胞の鎌状化を防ぎ、β−サラセミアおよびＳＣＤの両方の患者に治療効果／治癒効果があり得る。エキソビボでゲノム編集したＳＣＤ患者由来のＨＳＣによる自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）はまた、幹細胞増殖の増進技術、例えばアリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）阻害剤、例えば国際公開第２０１０／０５９４０１号パンフレット（この内容は全体として参照により援用される）に記載されるとおりのもの、例えば化合物４と併用すると、エキソビボ増殖が改善し、かつ遺伝子修飾ＨＳＣの送達用量が増加した。
【０８６３】
プログラム可能なヌクレアーゼ、Ｃａｓ９による効率的なゲノム編集には、標的細胞および組織へのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）およびＣａｓ９タンパク質の送達の成功が不可欠である。最近の報告では、幾つかの異なる細胞型で、Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体がエレクトロポレーションによって標的細胞に送達された場合に効率的かつ特異的ゲノム編集を達成し得ることが実証された。Ｃａｓ９−ＲＮＰ複合体はほぼ送達直後に染色体ＤＮＡを切断し、細胞内で急速に分解されるため、オフターゲット効果が低下する。対照的に、Ｃａｓ９の送達に用いられるプラスミドおよびウイルスベクターシステムを使用すると、酵素の発現が長引き、このシステムに付随するオフターゲット効果が悪化する。加えて、ＲＮＰを標的細胞に送達するのに追加的なツールは不要であり、これにより臨床における治療を目的としたゲノム編集の適用が大幅に促進され得る。精製組換えＣａｓ９タンパク質およびｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ）を培養ＨＳＰＣに送達した。用いた実験概要は図１７に示す。
【０８６４】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から組換えＣａｓ９タンパク質を精製し、合成シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒからなるデュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）と複合体化して、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作成した。本研究に使用したｇＲＮＡのフォーマットは、表３６に示す。「材料および方法」に記載されるとおりエレクトロポレーションによってＲＮＰ複合体をＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにエレクトロポレートした。ＲＮＰ複合体の送達前に、ある場合には（プロトコル２）エレクトロポレーション後にも細胞を増殖させた。活発に分裂している細胞は、エレクトロポレーションによって送達されたＲＮＰ複合体の取込みを促進し得る。
【０８６５】
ＨＰＦＨ領域のゲノムＰＣＲ産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供し、細胞集団中の編集されたアレルのパーセンテージを決定した。Ｃａｓ９、所与の標的化ドメインのｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｒを含有するＲＮＰをエレクトロポレートした細胞培養物ではＨＦＰＨ遺伝子座におけるゲノム編集が観察されたが（図４３）、標的化ドメインを送達しない対照細胞（Ｃａｓ９およびＴｒａｃｒのみを含むＲＮＰ）では観察されなかった。一部の例では、修飾ｓｇＲＮＡを使用した所与の標的部位における編集率が、他のｇＲＮＡフォーマットと比べて高かった（図４３）。最後に、各ｇＲＮＡについてインデルパターンならびに各インデルの頻度をＮＧＳによって評価した。同じｇＲＮＡ／Ｃａｓ９を使用した複数のレプリケート間でインデルパターンは同様であった。各標的部位に最も高頻度に出現する代表的なインデルを表３７に示す。
【０８６６】
【表１４０】
2019500043.tif 000202
【０８６７】
【表１４１】
2019500043.tif 000203
【０８６８】
【表１４２】
2019500043.tif 000204
【０８６９】
【表１４３】
2019500043.tif 000205
【０８７０】
【表１４４】
2019500043.tif 000206
【０８７１】
【表１４５】
2019500043.tif 000207
【０８７２】
【表１４６】
2019500043.tif 000208
【０８７３】
【表１４７】
2019500043.tif 000209
【０８７４】
【表１４８】
2019500043.tif 000210
【０８７５】
【表１４９】
2019500043.tif 000211
【０８７６】
【表１５０】
2019500043.tif 000212
【０８７７】
【表１５１】
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【０８７８】
【表１５２】
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【０８７９】
【表１５３】
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【０８８０】
【表１５４】
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【０８８１】
【表１５５】
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【０８８２】
【表１５６】
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【０８８３】
【表１５７】
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【０８８４】
ゲノム編集済みおよび未編集ＨＳＰＣについて、三段階赤血球系分化細胞培養プロトコルで増殖およびＨｂＦ上方制御に関して分析した。ゲノム編集済みおよび未編集ＨＳＰＣについて、胎児グロビンの発現レベルをフローサイトメトリーによって分析し、７日目に、２つの赤血球系細胞表面マーカー、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）およびグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）について、蛍光色素にコンジュゲートした抗体を使用して分析した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｆｉｘａｂｌｅ死細胞染色の除外によって生存細胞を同定し、ゲーティングした。含まれたＨＰＦＨ領域標的化およびＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサー標的化ｇＲＮＡによるゲノム編集は、培養細胞が分化７日目に未編集の細胞と同様の赤芽球と一致するＣＤ７１＋細胞のパーセンテージを示したとおり、赤血球系分化に悪影響を及ぼさなかったが、プロトコル１およびプロトコル２は条件間でＣＤ７１＋のパーセンテージに違いがあった（図４４）。含まれたＨＰＦＨ領域標的化およびＢＣＬ１１Ａ赤血球系エンハンサー標的化ｇＲＮＡで培養物を処理すると、２１日間の培養期間全体を通じてモックエレクトロポレート細胞と比較して、およびこれらの２つのプロトコル間で、ＨｂＦを含有する赤血球系細胞のパーセンテージの相対的変化は同様のパターンになった（図４５、図４６および図４７）。ＲＮＰに曝露し、かつプロトコル１またはプロトコル２のいずれかで維持した細胞ではＨｂＦが誘導されたが、しかしながら、ＨｂＦ陽性の細胞のパーセンテージはプロトコル２を用いた条件および時点で低くなる傾向があった（図４５、図４６および図４７）。ＨｂＦの誘導は、標的ドメインＣＲ００１０３０、ＣＲ００３１２およびＣＲ００１１２８からなるｇＲＮＡで、特に遅い時点において最も顕著であった（図４５、図４６および図４７）。標的化ドメイン間では、ｓｇＲＮＡ、特にＯＭｅＰＳ修飾ｓｇＲＮＡが、ｄｇＲＮＡよりも高いＨｂＦを誘導する傾向があった（図４５、図４６および図４７）。標的化ドメインＣＲ００１１３７による比較的低いＨｂＦの誘導は、この標的部位における低い編集レベルによって説明し得る（図４３、図４５〜図４７）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡによるＨｂＦ陽性細胞の誘導も並行して観察された（図４５〜図４７）。ゲノム編集済み細胞に由来するＨｂＦ含有赤血球の増加は、鎌状化の低下による治療的意味を有するものと思われる。編集済み細胞は、赤血球系分化条件下で増殖能を有したが（７日目に９〜５３倍および２１日目に３６〜１４３倍、図４８）、しかしながら、ある場合には、未編集対照細胞と比べて増殖は抑制された（７日目に未編集対照の１４〜８３％および２１日目に未編集対照の１８〜９５％）（図４８）。ＢＣＬ１１Ａのエクソン２を標的とするｇ８の標的化ドメインを含むｄｇＲＮＡ（７日目に未編集対照の３０％および２１日目に未編集対照の１８％）およびＯＭｅＰＳ修飾ｓｇＲＮＡの多くによって編集した細胞で最も低い増殖が観察された（図４８）。
【０８８５】
実施例５  ＨＰＦＨ領域に対する２つのｇＲＮＡを使用した切り出し
初代ヒトＣＤ３４＋  ＨＳＰＣに、ＨＰＦＨ領域内の異なる部位に対する２つの異なるｇＲＮＡ分子を含有するＲＮＰをエレクトロポレートした。各ＲＮＰに、上記に記載したとおりのｄｇＲＮＡ分子を使用した。簡潔に言えば、フランス型ＨＰＦＨ領域内の第１の部位を標的とするｄｇＲＮＡを含むＲＮＰと、フランス型ＨＰＦＨ領域内の第２の部位を標的とするｄｇＲＮＡを含むＲＮＰとを以下の比で組み合わせて、ＣＤ３４＋  ＨＳＰＣにエレクトロポレートした：０．５×第１のｄｇＲＮＡ  ＲＮＰ＋０．５×第２のｄｇＲＮＡ  ＲＮＰ；１．０×ｇ２  ｄｇＲＮＡ（「ｇ２」＝ＢＣＬ１１ａ遺伝子のコード配列を標的とする、ＣＲ００００８８の標的化ドメインを含む陽性対照）；ＲＮＰなし（「対照」）。上記に記載されるプロトコルを用いて細胞を上記に記載したとおり培養し、赤血球に分化させた（図１７を参照されたい）。胎児ヘモグロビン発現を評価した。結果は図２７および表２５に示す。理論によって拘束されるものではないが、２つの標的配列に対するｇＲＮＡ分子を含むＲＮＰを同時に導入すると、その領域内に含まれる任意の調節配列またはコード配列を含め、２つの切断部位間のＤＮＡ（例えば、２つの切断部位間にある全てまたはほとんどのＤＮＡ）の欠失（すなわち、切り出し）が起こることになると考えられる。これらの結果は、ＨＰＦＨ領域内の２つの別個の領域を標的とするＲＮＰをエレクトロポレーションによってＣＤ３４＋  ＨＳＰＣに同時に送達して、赤血球に分化した編集済み細胞に胎児ヘモグロビン発現を誘導できたことを示している。
【０８８６】
【表１５８】
2019500043.tif 000220
【０８８７】
実施例６．ＢＣＬ１１ａエンハンサーを標的とするｇＲＮＡの潜在的オフターゲット編集の評価
オリゴ挿入に基づくアッセイ（例えば、Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．３３，１８７−１９７；２０１５を参照されたい）を用いて、ＢＣＬ１１ａエンハンサーを標的とするＣａｓ９によって切断される潜在的オフターゲットゲノム部位を決定した。ＢＣＬ１１ａエンハンサーを標的とする合計２８個のガイド（指示される標的化ドメインを含むデュアルガイドＲＮＡ）およびＨＰＦＨ領域を標的とする１０個のｇＲＮＡを上記に記載されるＣａｓ９発現ＨＥＫ２９３細胞でスクリーニングした。結果は図３３（ＢＣＬ１１ａエンハンサー）および図４９（ＨＰＦＨ）にプロットする。ＢＣＬ１１ａエンハンサーを標的とするｇＲＮＡに関して、このアッセイで一部のガイドの潜在的オフターゲット部位が同定されたが、しかしながら標的ディープシーケンシングを用いて、それらの潜在的な部位が本当にＣａｓ９によって切断されるオフターゲット部位かどうかを決定した。潜在的オフターゲット部位に隣接するプライマーを用いて単離ゲノムＤＮＡを増幅し、アンプリコンをシーケンシングした。潜在的オフターゲット部位がＣａｓ９によって切断された場合、その部位にインデルが検出されるはずである。ガイドＲＮＡの少なくとも３つ：ＣＲ０００３１１、ＣＲ０００３１２、ＣＲ００１１２８について、これらの潜在的オフターゲット部位に関する後続研究からは、潜在的オフターゲット部位にインデルは検出されなかった。ＢＣＬ１１ａエンハンサーを標的とするｇＲＮＡに関しては、少なくともｇＲＮＡ、ＣＲ００１１３７、ＣＲ００１２１２、およびＣＲ００１２２１について、このアッセイでいかなる潜在的オフターゲット部位も同定されなかった。標的ディープシーケンシングを実施して、他のｇＲＮＡ分子について同定された潜在的オフターゲット部位が本当にＣａｓ９によって切断されるオフターゲット部位かどうかを決定することになる。
【０８８８】
実施例７：Ｃａｓ９変異体の評価
ＣＤ３４＋造血幹細胞における評価
本発明者らは、初代ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）におけるβ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子のノックアウト効率を計測することにより、１４個の精製化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳＰｙＣａｓ９）タンパク質を評価した。これらのタンパク質は３群に分けた：第１群は、選択性が向上したＳＰｙＣａｓ９変異体からなった（Ｓｌａｙｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５１：８４（ｅ１．０、ｅ１．１およびＫ８５５Ａ）；Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１６，Ｎａｔｕｒｅ  ５２９：４９０（ＨＦ））。第２群は、数および／または位置が異なるＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）および切断可能なＴＥＶ部位を伴うまたは伴わない６×ヒスチジン（Ｈｉｓ６）または８×ヒスチジン（Ｈｉｓ８）タグを含む野生型ＳＰｙＣａｓ９、および２つのシステイン置換（Ｃ８０Ｌ、Ｃ５７４Ｅ）（構造研究用にＣａｓ９を安定化させることが報告されている（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１４，Ｃｅｌｌ  １５６：９３５））を有するＳＰｙＣａｓ９タンパク質からなった。第３群は、異なるプロセスによって作製した同じ組換えＳＰｙＣａｓ９からなった（図６０）。Ｂ２ＭノックアウトはＦＡＣＳおよび次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって決定した。
【０８８９】
方法
材料
１．Ｎｅｏｎエレクトロポレーション機器（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＰＫ５０００）
２．Ｎｅｏｎエレクトロポレーションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＰＫ１０２５）
３．ｃｒＲＮＡ（ＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＵＣＵの標的化ドメイン配列、Ｂ２Ｍ遺伝子中の配列と相補的、配列番号６６０７と融合）
４．ｔｒａｃｒＲＮＡ（配列番号６６６０）
５．Ｃａｓ９保存緩衝液：２０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、２００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
６．骨髄由来ＣＤ３４＋  ＨＳＣ（Ｌｏｎｚａ、２Ｍ−１０１Ｃ）
７．細胞培養培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳｔｅｍＳｐａｍ  ＳＦＥＭ  ＩＩ、ＳｔｅｍＳｐａｍ  ＣＣ−１００含有）
８．ＦＡＣＳ洗浄緩衝液：ＰＢＳ中２％ＦＣＳ
９．ＦＡＣＳブロック緩衝液：ＰＢＳ１ｍＬ当たり、０．５ｕｇマウスＩｇＧ、１５０ｕｇ  Ｆｃブロック、２０μＬ  ＦＣＳを添加
１０．Ｃｈｅｌｅｘ懸濁液：Ｈ２Ｏ中１０％Ｃｈｅｌｅｘ  １００（ｂｉｏＲａｄ、カタログ番号１４２−１２５３）
１１．抗Ｂ２Ｍ抗体：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１６３０４
【０８９０】
プロセス
Ｌｏｎｚａの推奨に従い細胞を解凍して成長させ、２〜３日おきに培地を加える。５日目、細胞を２００×ｇで１５分間ペレット化し、ＰＢＳで１回洗浄し、細胞をＮＥＯＮキットのＴ−緩衝液に２×１０４／μＬで再懸濁し、氷上に置く。Ｃａｓ９タンパク質をＣａｓ９保存緩衝液で５ｍｇ／ｍｌに希釈する。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡをＨ２Ｏで１００μＭに再構成する。各０．８μＬのＣＡＳ９タンパク質、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを０．６μＬのＣａｓ９保存緩衝液と混合することによりリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を作製し、室温で１０分間インキュベートする。７μＬのＨＳＣをＲＮＰ複合体と２分間混合し、１０μＬ全てをＮｅｏｎピペットティップに移し、１７００ｖ、２０ｍｓおよび１パルスでエレクトロポレートする。エレクトロポレーション後直ちに、３７℃、５％ＣＯ２で予めキャリブレーションした１ｍｌ培地が入った２４ウェルプレートのウェルに細胞を移す。エレクトロポレーション後７２時間でＦＡＣＳおよびＮＧＳ分析のため細胞を回収する。
【０８９１】
ＦＡＣＳ：２４ウェルプレートの各ウェルから２５０μＬの細胞を９６ウェルＵ底プレートのウェルに取り、細胞をペレット化する。２％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）−ＰＢＳで１回洗浄する。細胞に５０μＬ  ＦＡＣＳブロック緩衝液を加え、氷上で１０分間インキュベートし、１μＬ  ＦＩＴＣ標識Ｂ２Ｍ抗体を加え、３０分間インキュベートする。１５０μＬ  ＦＡＣＳ洗浄緩衝液で１回洗浄し、続いてもう１回２００μＬ  ＦＡＣＳ洗浄緩衝液で１回洗浄する。細胞を２００μＬ  ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁してＦＡＣＳ分析を行った。
【０８９２】
ＮＧＳ試料調製：２４ウェルプレートの各ウェルから２５０μＬの細胞懸濁液を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、１ｍＬ  ＰＢＳを加え、細胞をペレット化する。１００μＬのＣｈｅｌｅｘ懸濁液を加え、９９℃で８分間インキュベートして１０秒間ボルテックスし、続いて９９℃で８分間インキュベートし、１０秒間ボルテックスする。１０，０００×ｇで３分間遠心することにより樹脂をペレットダウンさせて、上清ライセートをＰＣＲに使用する。４μＬライセートを取り、Ｔｉｔａｎｉｕｍキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ、カタログ番号６３９２０８）を使用して、かつ製造者の指示に従い、ｂ２ｍプライマー（ｂ２ｍｇ６７Ｆ：ＣＡＧＡＣＡＧＣＡＡＡＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴ、ｂ２ｍｇ６７Ｒ：ＣＴＧＡＣＧＣＴＴＡＴＣＧＡＣＧＣＣＣＴ）でＰＣＲ反応を行う。以下のＰＣＲ条件を用いる：９８℃で５分を１サイクル；９５℃で１５秒、６２℃で１５秒、および７２℃で１分を３０サイクル；および最後に７２℃で３分を１サイクル。このＰＣＲ産物をＮＧＳに使用した。
【０８９３】
統計：ＦＡＣＳによるＢ２Ｍ  ＫＯ細胞のパーセンテージおよびＮＧＳによるインデルのパーセンテージを用いてＣＡＳ９切断効率を評価する。この実験はＣａｓ９を固定効果として設計した。各実験は、入れ子型変量効果として、ドナー内に入れ子になっている。したがって、ＦＡＣＳおよびＮＧＳデータの分析には混合線形モデルを適用した。
【０８９４】
結果
実験およびドナーのばらつきを正規化するため、本発明者らは、２つのＳＶ４０  ＮＬＳが野生型ＳＰｙＣａｓ９に隣接し、かつタンパク質のＣ末端のＨｉｓ６タグを含む元の設計であるｉＰｒｏｔ１０５０２６に対する各タンパク質の相対活性をグラフ化した（図３４）。統計的分析は、参照Ｃａｓ９タンパク質ｉＰｒｏｔ１０５０２６と比較して、ｉＰｒｏｔ１０６３３１、ｉＰｒｏｔ１０６５１８、ｉＰｒｏｔ１０６５２０およびｉＰｒｏｔ１０６５２１のＨＳＣにおけるＢ２Ｍのノックアウトに有意な差はないが、試験した他の変異体（ＰＩＤ４２６３０３、ｉＰｒｏｔ１０６５１９、ｉＰｒｏｔ１０６５２２、ｉＰｒｏｔ１０６５４５、ｉＰｒｏｔ１０６６５８、ｉＰｒｏｔ１０６７４５、ｉＰｒｏｔ１０６７４６、ｉＰｒｏｔ１０６７４７、ｉＰｒｏｔ１０６８８４）はＨＳＣにおけるＢ２Ｍのノックアウトに参照ｉＰｒｏｔ１０５０２６と比べて大きい有意差があることを示している。本発明者らは、Ｈｉｓ６タグをＣ末端からＮ末端に動かしても（ｉＰｒｏｔ１０６５２０）、タンパク質の活性に影響が及ばないことを見出した（図３４）。ＮＬＳがタンパク質のＣ末端に配置された場合に限り、活性を維持するのに１つのＮＬＳで十分であった（ｉＰｒｏｔ１０６５２１対ｉＰｒｏｔ１０６５２２、図３４）。プロセス１から精製したタンパク質は、一貫してプロセス２および３よりも高いノックアウト効率を有した（ｉＰｒｏｔ１０６３３１対ｉＰｒｏｔ１０６５４５およびＰＩＤ４２６３０３、図３４）。一般に、既報告の向上した選択性を有するＳＰｙＣａｓ９変異体は、野生型ＳＰｙＣａｓ９ほど活性でなかった（ｉＰｒｏｔ１０６７４５、ｉＰｒｏｔ１０６７４６およびｉＰｒｏｔ１０６７４７、図３４）。興味深いことに、ｉＰｒｏｔ１０６８８４は標的化部位を切断しなかった。これは、この変異体が哺乳動物細胞における論理的な標的化部位の最大２０％を切断できなかったというＫｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌによる報告と一致する（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１６，Ｎａｔｕｒｅ  ５２９：４９０）。最後に、２つのシステイン置換を含むＣａｓ９変異体（ｉＰｒｏｔ１０６５１８）は高レベルの酵素活性を維持した（図３４）。
【０８９５】
次に、＋５８エンハンサー領域を標的とする修飾ｇＲＮＡまたは非修飾ｇＲＮＡのいずれかと共に、異なるＣａｓ９変異体を含むＲＮＰの編集効率を試験した。非修飾（ＣＲ００３１２＝配列番号３４２；ＣＲ００１１２８＝配列番号３４７）または修飾（ＯＭｅＰＳ  ＣＲ００３１２＝配列番号１７６２；ＯＭｅＰＳ  ＣＲ００１１２８＝配列番号１７６３）のいずれかでｃｒ００３１２およびｃｒ１１２８の標的化ドメインを含むｓｇＲＮＡ分子を試験し、表３５に示すＣａｓ９変異体と予め複合体化した。
【０８９６】
【表１５９】
2019500043.tif 000221
【０８９７】
これらの実施例に記載されるとおり、上記に記載したとおり形成したＲＮＰを上記に記載したとおりＨＳＰＣ細胞に送達し、％編集率（ＮＧＳによる）および赤血球系分化時の％ＨｂＦ誘導に関して細胞を評価した。結果は図４２Ａ（％編集率）および図４２Ｂ（ＨｂＦ誘導）に示す。これらの結果は、試験した変異体間でＣａｓ９成分が異なっても非修飾および修飾の両方のバージョンのｓｇＲＮＡ  ＣＲ００３１２およびＣＲ００１１２８の遺伝子編集効率は変わらず、Ｃａｓ９変異体が赤血球分化した遺伝子編集済み細胞のＨｂＦ産生能力にも影響を与えなかったことを示している。
【０８９８】
実施例８：遺伝子編集済みＨＳＰＣのエキソビボ増殖、およびＨＳＰＣサブセットにおける編集分析
遺伝子編集前の細胞の増殖
ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞をＡｌｌＣｅｌｌｓ（カタログ番号：ＡＢＭ０１７Ｆ）またはＬｏｎｚａ（カタログ番号：２Ｍ−１０１Ｃ）のいずれかから購入し、５０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（Ｔｐｏ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号３００−１８）、５０ｎｇ／ｍＬのヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号３００−１９）、５０ｎｇ／ｍＬのヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号３００−０７）、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号２００−０６）、１％Ｌ−グルタミン；２％ペニシリン／ストレプトマイシン、および化合物４（０．７５μＭ）を補足したＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０９６５０）を使用して２〜３日間増殖させた。
【０８９９】
細胞へのＣａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のエレクトロポレーション
Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）はエレクトロポレーションの直前に調製した。デュアルガイドＲＮＡを用いるＲＮＰの形成については、初めに各３μｇのｃｒＲＮＡ（２．２４μＬ中）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（１．２５μＬ中）を別個のチューブにおいて９５℃で２分間変性させて、次に室温に冷却した。Ｃａｓ９タンパク質の調製のため、７．３μｇのＣａｓ９タンパク質（１．２１μＬ中）を０．５２μＬの５×ＣＣＥ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣＬ、５ｍＭ  ＭｇＣＬ２、５％グリセロールおよび新たに添加した１ｍＭ  ＤＴＴ）と混合した。初めにＴｒａｃｒＲＮＡをＣａｓ９調製物と混合し、３７℃で５分間インキュベートした。次にＣｒＲＮＡをＴｒａｃｒＲＮＡ／ＣＡＳ９複合体に加え、３７℃で５分間インキュベートした。２００×ｇで１５分間遠心することによりＨＳＰＣを収集し、Ｎｅｏｎエレクトロポレーションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ番号：ＭＰＫ１０９６）に付属するＴ緩衝液に２×１０７／ｍＬの細胞密度で再懸濁した。ＲＮＰを１２μＬの細胞と上下に３回穏やかにピペッティングすることによって混合した。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）およびＣａｓ９複合体の調製には、２．２５μｇ  ｓｇＲＮＡ（１．５μＬ中）を２．２５μｇ  Ｃａｓ９タンパク質（３μＬ中）と混合し、室温で５分間インキュベートした。次にｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体を１０．５μＬの２×１０７／ｍＬ細胞と上下に数回穏やかにピペッティングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。ＲＮＰ／細胞混合物（１０μＬ）をＮｅｏｎエレクトロポレーションプローブに移した。Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＭＰＫ５０００Ｓ）で１７００ボルト／２０ミリ秒および１パルスを用いてエレクトロポレーションを実施した。
【０９００】
遺伝子編集後の細胞の増殖
エレクトロポレーション後、上記に記載したとおりの成長因子、サイトカインおよび化合物４を補足した０．５ｍＬの予め温めたＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ培地に細胞を移し、３７℃で３日間培養した。エレクトロポレーション前３日間およびエレクトロポレーション後７日間の合計１０日間の細胞増殖の後、総細胞数は出発細胞数と比べて２〜７倍増加した（図３５）。
【０９０１】
ゲノムＤＮＡ調製
エレクトロポレーションの４８時間後、編集済みおよび未編集ＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを調製した。１０ｍＭトリス−ＨＣＬ、ｐＨ８．０；０．０５％ＳＤＳおよび２５μｇ／ｍＬの新たに添加したプロテアーゼＫ中に細胞を溶解させ、３７℃で１時間インキュベートした後、８５℃で１５分間さらにインキュベートしてプロテアーゼＫを不活性化した。
【０９０２】
Ｔ７Ｅ１アッセイ
ＨＳＰＣの編集効率を決定するため、Ｔ７Ｅ１アッセイを実施した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＩＩ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カタログ番号：Ｆ−５４９Ｌ）を以下のサイクル条件で用いてＰＣＲを実施した：９８℃で３０秒；９８℃で５秒、６８℃で２０分、７２℃で３０秒を３５サイクル；７２℃で５分。以下のプライマーを使用した：フォワードプライマー：５’−ＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＡＣＣＡＣＡＧＧＧ−３’およびリバースプライマー：５’−ＴＡＣＡＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＣＡＣＧＧＣＡ−３’。以下の条件を用いてＰＣＲ産物を変性させてリアニーリングした：９５℃で５分、−２℃／ｓで９５〜８５℃、−０．１℃／ｓで８５〜２５℃、４℃で保持。アニーリング後、１０μＬの上記のＰＣＲ産物に１μＬのミスマッチ高感受性Ｔ７  Ｅ１ヌクレアーゼ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０３０２Ｌ）を加え、３７℃で１５分間さらにインキュベートしてヘテロ二重鎖を消化し、得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル（２％）電気泳動によって分析した。編集効率はＩｍａｇｅＪソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を用いて定量化した。
【０９０３】
次世代シーケンシング（ＮＧＳ）用のＰＣＲ調製
編集効率ならびに挿入および欠失（インデル）のパターンをより正確に決定するため、ＰＣＲ産物を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供した。Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カタログ番号：６３９２１０）を以下のサイクル条件で使用してＰＣＲをデュプリケートで実施した：９８℃で５分；９５℃で１５秒、６８℃で１５秒、７２℃で１分を３０サイクル；７２℃で７分。以下のプライマーを使用した：フォワードプライマー：５’−ＡＧＣＴＣＣＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＡＣＣＡＣＡＧＧＧ−３’およびリバースプライマー：５’−ＴＡＣＡＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡＣＡＣＧＧＣＡ−３’。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動によって分析し、ディープシーケンシングにかけた。
【０９０４】
造血幹細胞・前駆細胞サブ集団における編集効率のフローサイトメトリー分析
細胞をフローサイトメトリーに供して幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）サブ集団における編集効率を特徴付けた。ゲノム編集前（培養下４８時間）およびゲノム編集後（培養下１０日；ゲノム編集後３日）における、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞、およびＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４９ｆ＋細胞を含むＨＳＰＣサブセットの頻度を細胞培養物のサンプリングアリコートから決定した（図３６、図３７、図３８）。細胞を抗ＣＤ３４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５８２４）、抗ＣＤ３８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６０６７７）、抗ＣＤ９０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５５９６）、抗ＣＤ４５ＲＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６３９６３）、抗ＣＤ４９ｆ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５６２５８２）と共に、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．４を補足したＰＢＳを含有する改良ＦＡＣＳ緩衝液中、暗所下４℃で３０分間インキュベートした。細胞生存率は７ＡＡＤによって決定した。細胞を改良ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で多色ＦＡＣＳ分析を実施した。フローサイトメトリー結果はＦｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して分析した。化合物４（単独）の存在下で成長させたゲノム編集済み細胞は、ＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−、およびＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４９ｆ＋サブセットを含め、評価した全てのＨＳＰＣサブセットについて検出可能なレベルを呈したことから、ゲノム編集後に化合物４（単独）の存在下で細胞培養物中に長期ＨＳＣ集団が存在し続けることが示される（図３８）。
【０９０５】
遺伝子編集の４時間後、細胞培養物のアリコートをサンプリングし、細胞をＨＳＰＣサブセット（ＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ９０＋ＣＤ４９ｆ−、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ９０−ＣＤ４９ｆ−、およびＣＤ３４＋ＣＤ３８−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ９０−ＣＤ４９ｆ＋細胞）に選別し、ＮＧＳに供して編集効率を計測した（表２８）。長期ＨＳＣが富化されたサブセットを含め、全ての造血サブセットが、同様に高い遺伝子編集効率（＞９５％）を示した点に留意することが重要である。これらの細胞は長期にわたる患者への生着能を有し、かつ生涯の造血多系統再生を維持するため、長期ＨＳＣにおけるこの高い遺伝子編集効率は大きい治療的影響を有する。
【０９０６】
【表１６０】
2019500043.tif 000222
【０９０７】
実施例９  潜在的オフターゲット編集の評価
ＨＳＰＣ培養およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集
ＲＮＰ作成および細胞操作方法は、以下を除いて実施例４にあるとおりである。ヒトＣＤ３４＋細胞培養。ヒトＣＤ３４＋細胞は、成人ドナー由来のＧ−ＣＳＦ動員末梢血（ＡｌｌＣｅｌｌｓ、カタログ番号ｍＰＢ０２５−Ｒｅｇ．Ｅ）から製造者の指示に従い免疫選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて単離するか、または骨髄（Ｈｅｍａｃａｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号ＢＭ３４Ｃ−３）から誘導するかのいずれかであった。ＣＤ３４＋細胞を解凍し、ＲＮＰ送達前に２日間または５日間増殖させた。ＲＮＰ送達後、以下のとおり、細胞を増殖培地でさらに１３日間培養するか、または赤血球系分化培地で７日または１１日間培養した。培養０〜７日目の間、ＥＤＭには、１μＭヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ  Ｈ８６７２）、１００ｎｇ／ｍＬヒトＳＣＦ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＰＨＣ２１１３）、および５ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＃１０７７９−５９８）をさらに補足した。培養７〜１１日目の間、ＥＤＭには１００ｎｇ／ｍＬのヒトＳＣＦのみを補足した。培養期間の終わりに、ゲノムＤＮＡ調製および分析用に細胞を回収した。
【０９０８】
Ｃａｓ９およびガイドＲＮＡリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体のアセンブリ、ＨＳＰＣの調製、およびＨＳＰＣへのＲＮＰのエレクトロポレーション。遠心によって収集したＨＳＰＣをＰ３初代細胞溶液（Ｌｏｎｚａ  カタログ番号ＰＢＰ３−００６７５）に再懸濁した。ＲＮＰを２０μＬの細胞と上下にピペッティングすることにより混合し、室温で２分間インキュベートした。４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）でコードＣＭ−１３７を用いてＲＮＰ／細胞混合物（２０μＬ）をエレクトロポレートした。配列ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（式中、Ｎは、指示される標的化ドメインの残基を示す）を有するｃｒＲＮＡと、配列番号６６６０の配列を有するｔｒａｃｒとを含むｄｇＲＮＡを使用した。
【０９０９】
ゲノムＤＮＡ抽出
製造者の推奨に従いＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号６９５０６）を使用してＲＮＰ処理済みおよび未処理ＨＳＰＣからゲノムＤＮＡを単離した。
【０９１０】
潜在的ｇＲＮＡオフターゲット遺伝子座のインシリコ同定
ＢＣＬ１１＋５８領域ｇＲＮＡ、ＣＲ００３０９、ＣＲ００３１１、ＣＲ００３１２、ＣＲ００３１６、ＣＲ００１１２５、ＣＲ００１１２６、ＣＲ００１１２７、およびＣＲ００１１２８、およびＨＰＦＨ領域ｇＲＮＡ、ＣＲ００１０２８、ＣＲ００１０３０、ＣＲ００１１３７、ＣＲ００１２２１、ＣＲ００３０３５、およびＣＲ００３０８５の潜在的オフターゲット遺伝子座を以下のとおり同定した。各ｇＲＮＡについて、ＢＦＡＳＴシーケンスアライナー（バージョン０．６．４ｆ、Ｈｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，４（１１），ｅ７７６７，ＰＭＩＤ：１９９０７６４２）を使用して、最大５ヌクレオチドまでのミスマッチを許容する標準パラメータを用いて、２０ヌクレオチドｇＲＮＡプロトスペーサー配列をヒトゲノム参照配列（ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｈ３８）とアラインメントした。Ｃａｓ９カノニカル５’−ＮＧＧ−３’ＰＡＭ配列に隣接して５’側にある部位のみを含むように同定された遺伝子座をフィルタリングした（すなわち５’−オフターゲット遺伝子座−ＰＡＭ−３’）。ＢＥＤＴｏｏｌｓスクリプト（バージョン２．１１．２、Ｑｕｉｎｌａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１０  ２６（６）：８４１−２，ＰＭＩＤ：２０１１０２７８）を用いて、５ヌクレオチドミスマッチを有する部位をＲｅｆＳｅｑ遺伝子アノテーションに対して、エクソンとしてアノテートされた遺伝子座のみを含むようにさらにフィルタリングした（Ｐｒｕｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１４  ４２（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ７５６−６３，ＰＭＩＤ：２４２５９４３２）。ＢＣＬ１１＋５８領域およびＨＰＦＨ領域ｇＲＮＡについて同定された潜在的オフターゲット遺伝子座のカウントを、それぞれ表１および表２に示す。
【０９１１】
【表１６１】
2019500043.tif 000223
【０９１２】
【表１６２】
2019500043.tif 000224
【０９１３】
潜在的オフターゲット部位の標的増幅用ＰＣＲプライマー設計
Ｐｒｉｍｅｒ３（バージョン２．３．６、Ｕｎｔｅｒｇａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１２  ４０（１５）：ｅ１１５，ＰＭＩＤ：２２７３０２９３）を使用して、アンプリコンの中心にｇＲＮＡプロトスペーサー配列が位置する約１６０〜３００塩基対長のアンプリコンサイズ範囲を目標とするデフォルトパラメータを用いて、ＢＣＬ１１＋５８領域ｇＲＮＡ（ＣＲ００３０９、ＣＲ００３１１、ＣＲ００３１２、ＣＲ００３１６、ＣＲ００１１２５、ＣＲ００１１２６、ＣＲ００１１２７、およびＣＲ００１１２８）およびＨＰＦＨ領域ｇＲＮＡ（ＣＲ００１０２８、ＣＲ００１０３０、ＣＲ００１１３７、ＣＲ００１２２１、ＣＲ００３０３５、およびＣＲ００３０８５）について同定された潜在的オフターゲット遺伝子座（およびオンターゲット遺伝子座）を標的とするＰＣＲアンプリコンを設計した。ｇＲＮＡ  ＣＲ００１１２７については、ＰＣＲプライマーは０〜４ヌクレオチドミスマッチを含む部位のみを設計し、ＲｅｆＳｅｑエクソン内に５ヌクレオチドミスマッチを含む部位のプライマーは設計しなかった。得られたＰＣＲプライマー対およびアンプリコン配列は、ヒトゲノム参照配列（ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｈ３８）に対して配列をＢＬＡＳＴ検索（バージョン２．２．１９、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５（３）：４０３−１０，ＰＭＩＤ：２２３１７１２）することによりユニークさを調べた。２つ以上のアンプリコン配列をもたらすプライマー対は破棄し、設計し直した。表３および表５は、それぞれＢＣＬ１１＋５８領域およびＨＰＦＨ領域ｇＲＮＡについて設計した成功するＰＣＲプライマー対のカウントを示す。
【０９１４】
Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリ調製、定量化およびシーケンシング
製造者の推奨を用いてＱｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｐ７５８１）を使用して、ＲＮＰ処理済み（ｇＲＮＡ当たり２レプリケート）、および未処理（ｇＲＮＡ当たり１レプリケート）のＨＳＰＣ試料からのゲノムＤＮＡを定量化した。各試料について、二連続ＰＣＲ反応を用いて、個々のオフターゲット遺伝子座（およびオンターゲット遺伝子座）を標的とするＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリを作成した。最初のＰＣＲでは、ユニバーサルなＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシング適合配列をテール付加した標的特異的ＰＣＲプライマー（上記で設計した）を使用して標的遺伝子座を増幅した。２回目のＰＣＲでは、シーケンシング時の多重化を可能にするサンプルバーコードを含め、追加的なＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシング適合配列を最初のＰＣＲアンプリコンに加えた。ＰＣＲ１は１０μＬの最終容積で実施し、各反応には、３〜６ｎｇのｇＤＮＡ（約５００〜１０００細胞相当）、０．２５μＭの最終濃度のＰＣＲ１プライマー対（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１×最終濃度のＱ５  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号１０２５００−１４０）が含まれた。ＰＣＲ１左プライマーは、配列５’−ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３’で５’テールが付加され（すなわち５’−テール−標的特異的左プライマー−３’）、および右プライマーは、配列５’−ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３’で５’テールが付加された（すなわち５’−テール−標的特異的右プライマー−３’）。ＰＣＲ１は、サーモサイクラーで以下のサイクル条件を用いて実施した：９８℃で１分を１サイクル；９８℃で１０秒、６３℃で２０秒、および７２℃で３０秒を２５サイクル；７２℃で２分を１サイクル。次にヌクレアーゼフリー水（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ９９３２）を使用してＰＣＲ１を１００に対して１で希釈し、ＰＣＲ２への入力として使用した。ＰＣＲ２は１０μＬの最終容積で実施し、各反応には、２μＬの希釈したＰＣＲ１産物、０．５μＭの最終濃度のＰＣＲ２プライマー対（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１×最終濃度のＱ５  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号１０２５００−１４０）が含まれた。使用したＰＣＲ２左プライマー配列は５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＮＮＮＮＮＮＮＮＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ−３’であり、使用したＰＣＲ２右プライマー配列は５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ−３’であった（式中、ＮＮＮＮＮＮＮＮは、標準Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプロセスの一部としてサンプル多重化に使用した８ヌクレオチドバーコード配列を意味する）。ＰＣＲ２は、サーモサイクラーで以下のサイクル条件を用いて実施した：７２℃で３分を１サイクル；９８℃で２分を１サイクル；９８℃で１０��、６３℃で３０秒、および７２℃で２分を１５サイクル。ここで、実行可能となったＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリであるＰＣＲ２アンプリコンを、製造者の推奨に従いＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号Ａ６３８８２）を使用してクリーンアップした。次に、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４３６７６６０）およびＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリ末端に特異的なプライマー（フォワードプライマー配列５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ−３’およびリバースプライマー配列５’−ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡ−３’）を使用した標準的なｑＰＣＲ定量化方法を用いて、クリーンなＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリを定量化した。次にＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリを等モルでプールし、製造者の推奨に従いＭｉＳｅｑ試薬キットｖ３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＭＳ−１０２−３００３）を使用してＭｉＳｅｑ機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＳＹ−４１０−１００３）で３００塩基ペアエンドリードによってＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングに供した。少なくとも１つの処理済みレプリケートについて各遺伝子座につき最低１０００倍の配列カバレッジが生成された。処理済みおよび未処理の試料のＰＣＲ、クリーンアップ、プールおよびシーケンシングは別個に実施して、処理済み試料と未処理試料との間のクロスコンタミネーションまたはそれから生成されるＰＣＲアンプリコンのいかなる可能性も回避した。
【０９１５】
ＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングデータＱＣおよび変異体分析
デフォルトパラメータを用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ分析ソフトウェア（ＭｉＳｅｑレポーター、バージョン２．６．２、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してアンプリコン特異的ＦＡＳＴＱシーケンシングデータファイルを作成した（Ｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１０，３８（６）：１７６７−７１，ＰＭＩＤ：２００１５９７０）。次に、標準Ｐｅｒｌスクリプトラッパーを用いて一体に結合した一連のパブリックドメインソフトウェアパッケージからなる内部開発の変異体分析パイプラインでＦＡＳＴＱファイルを処理した。使用したワークフローは５段階に分けられた。
【０９１６】
ステージ１、ＰＣＲプライマーならびにオンターゲットおよびオフターゲット配列ＱＣ：オンターゲット部位およびオフターゲット部位の両方について、２０ヌクレオチドｇＲＮＡプロトスペーサー配列＋ＰＡＭ配列および標的特異的ＰＣＲプライマー配列（左および右、追加的なＩｌｌｕｍｉｎａ配列はなし）をＢＬＡＳＴ検索（バージョン２．２．２９＋、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５（３）：４０３−１０，ＰＭＩＤ：２２３１７１２）を用いてヒトゲノム参照配列（ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｈ３８）とアラインメントした。複数のゲノム位置を含むオンターゲット部位およびオフターゲット部位にフラグを立てた。
【０９１７】
ステージ２、シーケンサーファイル解凍：ｇｚｉｐスクリプト（バージョン１．３．１２）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａシーケンサーにより作成されたＦＡＳＴＱ．ＧＺファイルを解凍してＦＡＳＴＱファイルにし、ファイル当たりのリード数を計算した。リードのないファイルは以降の分析から除外した。
【０９１８】
ステージ３、配列リードアラインメントおよびクオリティトリミング：ＢＷＡ−ＭＥＭアライナー（バージョン０．７．４−ｒ３８５、Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄｕｒｂｉｎ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９，２５（１４）：１７５４−６０，ＰＭＩＤ：１９４５１１６８）を使用して、「ハードクリッピング」を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ配列のリードの３’末端および低品質塩基をトリミングして、ＦＡＳＴＱファイルのシーケンシングリードをヒトゲノム参照配列（ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｈ３８）とアラインメントした。ＢＡＭファイル形式（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９  ２５（１６）：２０７８−９，ＰＭＩＤ：１９５０５９４３）の得られたアラインメント後のリードをＳＡＭｔｏｏｌｓスクリプト（バージョン０．１．１９−４４４２８ｃｄ、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９  ２５（１６）：２０７８−９，ＰＭＩＤ：１９５０５９４３）を使用してＦＡＳＴＱファイルに変換した。次にＢＷＡ−ＭＥＭアライナーを今回は「ハードクリッピング」なしで使用して、ＦＡＳＴＱファイルを再びヒトゲノム参照配列（ｂｕｉｌｄ  ＧＲＣｈ３８）とアラインメントした。
【０９１９】
ステージ４、変異体（ＳＮＰおよびインデル）分析：アレル頻度検出限界を＞＝０．０００１に設定したＶａｒＤｉｃｔバリアントコーラー（開発者ＺｈａｎｇＷｕ  Ｌｉａによって改良されたバージョン１．０「Ｃａｓ９アウェア（Ｃａｓ９  ａｗａｒｅ）」、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１６，４４（１１）：ｅ１０８，ＰＭＩＤ：２７０６０１４９）を使用して、アラインメントされたリードのＢＡＭファイルを処理し、変異体（ＳＮＰおよびインデル）を同定した。Ｃａｓ９アウェアＶａｒＤｉｃｔコーラーはパブリックドメインパッケージに基づくが、変異イベントのアラインメント領域における反復配列に起因して生成された曖昧な変異体コールを、ＰＡＭ配列の５’側の３塩基に位置するｇＲＮＡプロトスペーサー配列の潜在的Ｃａｓ９ヌクレアーゼ切断部位の方へ動かすことができる。ＳＡＭｔｏｏｌｓスクリプトを使用してサンプルアンプリコン当たりのリードカバレッジを計算し、オンターゲット部位およびオフターゲット部位が＞１０００倍配列カバレッジでカバーされたかどうかを決定した。＜１０００倍配列カバレッジの部位にフラグを立てた。
【０９２０】
ステージ５、ｄｂＳＮＰフィルタリングおよび処理済み／未処理判別分析：同定された変異体は、ｄｂＳＮＰに見られる公知の変異体（ＳＮＰおよびインデル）に関してフィルタリングした（ｂｕｉｌｄ  １４２、Ｓｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１，２９（１）：３０８−１１，ＰＭＩＤ：１１１２５１２２）。処理済みサンプルの変異体をさらにフィルタリングして、以下を除外した：１）未処理対照サンプルに同定される変異体；２）ＶａｒＤｉｃｔ鎖バイアスが２：１の変異体（ここでは参照配列を支持するフォワードおよびリバースリードカウントがバランスしているが、非参照変異体コールについてはアンバランスである）；３）潜在的Ｃａｓ９切断部位の周囲１００ｂｐウィンドウ外に位置する変異体；４）潜在的Ｃａｓ９切断部位の周囲１００ｂｐウィンドウ内にあるシングルヌクレオチド変異体。最後に、潜在的Ｃａｓ９切断部位の１００ｂｐウィンドウにおける合計インデル頻度が＞２％（約１０〜２０細胞超における編集）の部位のみが考慮された。ゲノム参照配列とのリードアラインメントの目視検査を可能にするＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶバージョン２．３、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１，９（１）：２４−６，ＰＭＩＤ：２１２２１０９５）を使用して、潜在的な活性編集部位をリードアラインメントレベルでさらに調べた。
【０９２１】
オンターゲットおよびオフターゲット分析結果
ＢＣＬ１１＋５８領域およびＨＰＦＨ領域ｇＲＮＡのオンターゲット部位は、処理済みサンプルにおいて意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、インデル頻度は全てのｇＲＮＡについて８８％より高かった。表３および表５は、少なくとも１つのバイオロジカルレプリケートで特徴付けられたオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。
【０９２２】
ＢＣＬ１１＋５８領域インシリコ標的分析結果
ｇＲＮＡ  ＣＲ００３０９：ｇＲＮＡ  ＣＲ００３０９のオンターゲット部位は意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９２％であった。表３１は、特徴付けられたオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。潜在的オフターゲット部位の特徴付けにより、両方の処理済みレプリケートにおいて、提案されるＣａｓ９切断部位の周囲１００ｂｐウィンドウに４つのオフターゲット部位が同定された。部位１は約１８％の平均インデル頻度を有し、オンターゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて
【化６１】
2019500043.tif 000225
を有し、およびエクソン１から約２．３ｋｂ離れた、１１番染色体上の塩基対位置２２，１９５，８００〜２２，１９５，８１９におけるアノクタミン５遺伝子（ＡＮＯ５）のイントロン１に位置する。部位２は約１８％の平均インデル頻度を有し、オンターゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて
【化６２】
2019500043.tif 000226
を有し、および１２番染色体上の塩基対位置３，３１１，９０１〜３，３１１，９２６における遺伝子間領域に位置する。部位３は約８０％の平均インデル頻度を有し、オンターゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて
【化６３】
2019500043.tif 000227
を有し、および１番染色体上の塩基対位置２３６，０６５，４１５〜２３６，０６５，４３４におけるＧｅｎＢａｎｋ（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１６  Ｊａｎ  ４；４４（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ６７−Ｄ７２，ＰＭＩＤ：２６５９０４０７）転写物（ＢＣ０１２５０１  ＲｅｆＳｅｑでアノテーションなし）に位置する。部位４は約２％の平均インデル頻度を有し、オンターゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて
【化６４】
2019500043.tif 000228
を有し、および１番染色体上の塩基対位置３３，４１２，６５９〜３３，４１２，６７８におけるポリホメオティック２タンパク質（ＲｅｆＳｅｑでアノテーションなし）と呼ばれるＧｅｎＢａｎｋアノテーション付き転写物のイントロン１に位置する。
【０９２３】
ｇＲＮＡ  ＣＲ００３１１：ｇＲＮＡ  ＣＲ００３１１のオンターゲット部位は意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９５％であった。表３１は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。これまでのところ、調べた部位に有意なオフターゲット活性は観察されなかった。
【０９２４】
ｇＲＮＡ  ＣＲ０００３１２：ｇＲＮＡ  ＣＲ０００３１２のオンターゲット部位は意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９８％であった。表３１は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。これまでのところ、調べた部位に有意なオフターゲット活性は観察されなかった。
【０９２５】
ｇＲＮＡ  ＣＲ０００３１６：ｇＲＮＡ  ＣＲ０００３１６のオンターゲット部位は意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９１％であったが、しかしながらオフターゲット部位の大多数は依然として特徴付けられていない。
【０９２６】
ｇＲＮＡ  ＣＲ００１１２５：ｇＲＮＡ  ＣＲ０００１１２５のオンターゲット部位は意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９１％であった。表３１は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。これまでのところ、調べた部位に有意なオフターゲット活性は観察されなかった。
【０９２７】
ｇＲＮＡ  ＣＲ００１１２６：ｇＲＮＡ  ＣＲ０００１１２６のオンターゲット部位は意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９２％であった。表３１は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。潜在的オフターゲット部位の特徴付けにより、これまでに、両方の処理済みレプリケートにおいて、提案されるＣａｓ９切断部位の周囲１００ｂｐウィンドウに２つのオフターゲット部位が同定された。第１の部位は約２％の平均インデル頻度を有し、オンターゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて３つのミスマッチ
【化６５】
2019500043.tif 000229
を有し、および最も近いＧｅｎＢａｎｋ転写物（ＲｅｆＳｅｑでアノテーションなし）から約９．５ｋｂ離れた、４番染色体上の塩基対位置３５，８８１，８１５〜３５，８８１，８３４における遺伝子間領域に位置する。第２の部位は約１．７％の平均インデル頻度を有し、オンターゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて４つのミスマッチ
【化６６】
2019500043.tif 000230
を有し、およびエクソン６から約２．７ｋｂ離れた、６番染色体上の塩基対位置１６，５１９，９０７〜１６，５１９，９２６におけるアタキシン１遺伝子（ＡＴＸＮ１）のイントロン６に位置する。
【０９２８】
ｇＲＮＡ  ＣＲ００１１２７：ｇＲＮＡ  ＣＲ０００１１２７のオンターゲット部位は意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９７％であった。表３１は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。これまでのところ、調べた部位に有意なオフターゲット活性は観察されなかった。
【０９２９】
ｇＲＮＡ  ＣＲ００１１２８：ｇＲＮＡ  ＣＲ０００１１２８のオンターゲット部位は意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９４％であった。表３１は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。これまでのところ、調べた部位に有意なオフターゲット活性は観察されなかった。
【０９３０】
同定された全ての活性に編集されたＢＣＬ１１  ＋５８領域オフターゲット部位を手動で調べると、Ｃａｓ９媒介性二本鎖切断の非相同末端結合ＤＮＡ修復に典型的である、提案されるＣａｓ９切断部位を取り囲む典型的なインデルパターンが示された。同定された部位における編集が遺伝子発現または細胞生存率に有害な影響を及ぼすかどうかは不明であり、さらなる分析が必要である。
【０９３１】
【表１６３】
2019500043.tif 000231
【０９３２】
ＢＣＬ１１＋５８領域ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑヒットバリデーション結果
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５，３３（２）：１８７−９７，ＰＭＩＤ：２５５１３７８２）によって同定された潜在的オフターゲットヒットをＲＮＰ処理済みおよび未処理ＨＳＰＣにおいて上記にインシリコで定義された部位に関して記載した標的シーケンシング方法を用いて特徴付けた。ｇＲＮＡ  ＣＲ００３１２、ＣＲ００３１６、ＣＲ００１１２５、ＣＲ００１１２６、ＣＲ００１１２７およびＣＲ００１１２８について、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ潜在的ヒットが同定された。ｇＲＮＡ  ＣＲ００３１１およびＣＲ００１１２８について、潜在的ヒットは同定されなかった。標的シーケンシングを用いて潜在的ヒットをＨＳＰＣで調べたとき、ｇＲＮＡ  ＣＲ００３１２、ＣＲ００１１２５およびＣＲ００１１２７について処理済みＨＳＰＣでは潜在的ヒットのいずれもバリデートされなかった。ｇＲＮＡ  ＣＲ００１１２６について１つの潜在的ヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ）によってＡＴＸＮ１のイントロン６に同定されたのと同じ部位（６番染色体：１６，５１９，９０７〜１６，５１９，９２６塩基対）であった。ｇＲＮＡ  ＣＲ００３０９およびＣＲ００３１６の潜在的ヒットのバリデーションはなおも進行中である。
【０９３３】
ＨＰＦＨ領域インシリコ標的分析結果
ｇＲＮＡ  ＣＲ００１０２８：ｇＲＮＡ  ＣＲ０００１０２８のオンターゲット部位は意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９１％であった。表３２は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。潜在的オフターゲット部位の特徴付けにより、これまでに、両方の処理済みレプリケートにおいて、提案されるＣａｓ９切断部位の周囲１００ｂｐウィンドウに２つのオフターゲット部位が同定された。部位１は約２．８％の平均インデル頻度を有し、オンターゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて２つのミスマッチ
【化６７】
2019500043.tif 000232
を有し、および４番染色体上の塩基対位置５８，１６９，３０８〜５８，１６９，３２７に位置する非コードＲＮＡ（ＬＦ３３０４１０、ＲｅｆＳｅｑでアノテーションなし）のイントロン２に位置する。部位２は約３．５％の平均インデル頻度を有し、オンターゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて３つのミスマッチ
【化６８】
2019500043.tif 000233
を有し、およびエクソン２から約１．３ｋｂの、６番染色体上の塩基対位置２６，３６６，７３３〜２６，３６６，７５２に位置するブチロフィリンサブファミリー３メンバーＡ２遺伝子（ＢＴＮ３Ａ２）のイントロン１に位置する。
【０９３４】
ｇＲＮＡ  ＣＲ００１０３０：ｇＲＮＡ  ＣＲ０００１０３０のオンターゲット部位は意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約８９％であった。表３２は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。潜在的オフターゲット部位の特徴付けにより、これまでに、両方の処理済みレプリケートにおいて、提案されるＣａｓ９切断部位の周囲１００ｂｐウィンドウに５７％の平均インデル頻度で１つのオフターゲット部位が同定された。この部位はオンターゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて３つのミスマッチ
【化６９】
2019500043.tif 000234
を有し、およびＸ染色体上の塩基対位置２４，５０３，４７６〜２４，５０３，４９５に位置するピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ３遺伝子（ＰＤＫ３）のエクソン４に位置する。
【０９３５】
ｇＲＮＡ  ＣＲ００１１３７：ｇＲＮＡ  ＣＲ０００１０３７のオンターゲット部位は意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約８４％であった。表３２は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。これまでのところ、調べた部位に有意なオフターゲット活性は観察されなかった。
【０９３６】
ｇＲＮＡ  ＣＲ００１２２１：ｇＲＮＡ  ＣＲ０００１２２１のオンターゲット部位は意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９５％であった。表３２は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。これまでのところ、調べた部位に有意なオフターゲット活性は観察されなかった。
【０９３７】
ｇＲＮＡ  ＣＲ００３０３５：ｇＲＮＡ  ＣＲ０００３０３５のオンターゲット部位は意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約８９％であった。表３２は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。潜在的オフターゲット部位の特徴付けにより、これまでに、両方の処理済みレプリケートにおいて、提案されるＣａｓ９切断部位の周囲１００ｂｐウィンドウに２つのオフターゲット部位が同定された。部位１は約２０％の平均インデル頻度を有し、オンターゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて２つのミスマッチ
【化７０】
2019500043.tif 000235
を有し、および２番染色体上の塩基対位置６６，２８１，７８１〜６６，２８１，８００における遺伝子間領域に位置し、最も近い転写物（ＪＤ４３２５６４、ＲｅｆＳｅｑでアノテーションなし）から約７．１ｋｂである。部位２は約２．５％の平均インデル頻度を有し、オンターゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて３つのミスマッチ
【化７１】
2019500043.tif 000236
を有し、および１０番染色体上の塩基対位置４２，９９７，２８９〜４２，９９７，３０８における遺伝子間領域に位置し、マイクロＲＮＡ５１００（ＭＩＲ５１００）から約０．３ｋｂである。
【０９３８】
ｇＲＮＡ  ＣＲ００３０８５：ｇＲＮＡ  ＣＲ０００３０３８のオンターゲット部位は意図したＣａｓ９切断部位でロバストな編集を示し、平均インデル頻度は約９４％であった。表３２は、特徴付けに成功したオフターゲット部位の数を示す。特徴付けられていない部位はＰＣＲプライマー設計またはＰＣＲ増幅に失敗したものであり、引き続き調査中である。潜在的オフターゲット部位の特徴付けにより、これまでに、両方の処理済みレプリケートにおいて、提案されるＣａｓ９切断部位の周囲１００ｂｐウィンドウに約２％の平均インデル頻度で１つのオフターゲット部位が同定された。この部位はオンターゲットｇＲＮＡプロトスペーサー配列と比べて３つのミスマッチ
【化７２】
2019500043.tif 000237
を有し、および２番染色体上の塩基対位置１７１，８７２，６３０〜１７１，８７２，６４９に位置する溶質輸送体ファミリー２５メンバー１２遺伝子（ＳＬＣ２５Ａ１２）のイントロン２に位置し、エクソン３から約３．８ｋｂである。
【０９３９】
同定された全ての活性に編集されたＨＰＦＨ領域オフターゲット部位を手動で調べると、Ｃａｓ９媒介性二本鎖切断の非相同末端結合ＤＮＡ修復に典型的である、提案されるＣａｓ９切断部位を取り囲む典型的なインデルパターンが示された。同定された部位における編集が遺伝子発現または細胞生存率に有害な影響を及ぼすかどうかは不明であり、さらなる分析が必要である。
【０９４０】
【表１６４】
2019500043.tif 000238
【０９４１】
ＨＰＦＨ領域ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑヒットバリデーション結果
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５，３３（２）：１８７−９７，ＰＭＩＤ：２５５１３７８２）を用いて同定された潜在的オフターゲットヒットをＲＮＰ処理済みおよび未処理のＨＳＰＣにおいてインシリコ部位に関して記載したのと同じ方法を用いて調べた。ｇＲＮＡ  ＣＲ００１０２８、ＣＲ００１０３０、ＣＲ００３０３５およびＣＲ００３０８５についてＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ潜在的オフターゲットヒットが（現在までのところ）同定された。ｇＲＮＡ  ＣＲ００１１３７およびＣＲ００１２２１については現在までにヒットは同定されていない。ＨＳＰＣにおいてｇＲＮＡ  ＣＲ００１０２８について１つのヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法によって４番染色体上の塩基対位置５８，１６９，３０８〜５８，１６９，３２７に同定されたのと同じ部位であった。ＨＳＰＣにおいてｇＲＮＡ  ＣＲ００１０３０について１つのヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法によってＰＤＫ３遺伝子のエクソン４に同定されたのと同じ部位であった。ＨＳＰＣにおいてｇＲＮＡ  ＣＲ００３０３５について１つのヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法によって２番染色体上の塩基対位置６６，２８１，７８１〜６６，２８１，８００における遺伝子間領域に同定されたのと同じ部位であった。ＨＳＰＣにおいてｇＲＮＡ  ＣＲ００３０８５について１つのヒットがバリデートされ、インシリコ主導の方法によって２番染色体上の塩基対位置１７１，８７２，６３０〜１７１，８７２，６４９に同定されたのと同じ部位であった。
【０９４２】
ｇＲＮＡ編集効率スクリーニングのオンターゲット分析
ｇＲＮＡオンターゲット部位を標的とするＰＣＲアンプリコンを製造者の推奨に従いＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号Ａ６３８８２）を使用してクリーンアップした。製造者の推奨を用いてＱｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｐ７５８１）を使用して試料を定量化した。製造者の推奨に従いＮｅｘｔｅｒａ  ＤＮＡライブラリ調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号  ＦＣ−１２１−１０３１）を使用してアンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングライブラリに転換した。得られたシーケンシングライブラリをＡＭＰｕｒｅビーズでクリーンアップし、ｑＰＣＲで定量化し、プールし、およびオフターゲット分析の節に記載されるとおり、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ機器で１５０塩基（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＭＳ−１０２−２００２）または２５０塩基（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カタログ番号ＭＳ−１０２−２００３）のペアエンドリードを用いてシーケンシングした。各ライブラリにつき最低１０００倍のシーケンシングカバレッジが生じ、一連のインハウススクリプトを用いて変異体をコールした。簡単に言えば、ストリングベースの配列検索を用いてｇＲＮＡ配列の中央にある８０〜１００塩基対ウィンドウにわたるシーケンシングリードを同定し、アンプリコン配列と比較し、配列の違いでビニングして、変異体頻度を計算した。加えて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑレポーターソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａバージョン２．６．１）を使用してシーケンシングリードをアンプリコン配列とアラインメントし、得られたリードアラインメントをＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶバージョン２．３、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１，９（１）：２４−６，ＰＭＩＤ：２１２２１０９５）を用いて調べた。
【０９４３】
実施例１０：遺伝子編集およびＨｂＦ誘導に対するＲＮＰ濃度の評価
ＲＮＰ希釈アッセイによる遺伝子編集に最適なＲＮＰ濃度の決定
Ｃａｓ９（ｉＰｒｏｔ：１０６３３１）およびガイドリボヌクレオチド複合体（ＲＮＰ）濃縮物の段階希釈液を用いて遺伝子編集を実施した（表３３）。使用した様々なｇＲＮＡ、そのフォーマット、およびこのアッセイで適用した修飾を表３４に挙げる。
【０９４４】
【表１６５】
2019500043.tif 000239
【０９４５】
【表１６６】
2019500043.tif 000240
【０９４６】
ＣＤ３４＋細胞を先述のとおりエレクトロポレートし、細胞生存率、遺伝子編集効率、およびＨｂＦ産生能力の測定に供した。細胞生存率を評価したとき、結果は、シングルまたはデュアルのいずれのガイドフォーマットを使用したときも、ＲＮＰ濃度の違いはエレクトロポレーション時の細胞生存率に影響を与えなかったことを示した（図３９Ａおよび図３９Ｂ）。ＣＤ３４＋細胞の遺伝子編集では、ＮＧＳデータは、１．４７μＭに至るまでの低いＲＮＰ濃度が非修飾ＣＲ００３１２およびＣＲ００１１２８、および修飾ＣＲ００３１２について最大％遺伝子編集効率を達成した一方、修飾ＣＲ００１２２８について最大％遺伝子編集効率は２．９４μＭもの低いＲＮＰ濃度で達成されたことを示した（図４０Ａ）。ｓｇＲＮＡフォーマットについては、試験した全てのｇＲＮＡが、０．４８μＭに至るまでの低いＲＮＰ濃度で最大％編集率を達成した（図４０Ｂ）。遺伝子編集済み細胞が赤血球系統に分化してＨｂＦを産生する能力の測定では、本発明者らのデータは、ｄｇＲＮＡ含有ＲＮＰについて２．９４μＭに至るまでの低いＲＮＰ濃度（図４１Ａ）およびｓｇＲＮＡ含有ＲＮＰについて０．９７μＭに至るまでの低いＲＮＰ濃度（図４１Ｂ）が最高レベルのＨｂＦ誘導をもたらしたことを示した。
【０９４７】
本願は配列表と共に出願されるものである。配列表と本明細書に記載される任意の配列との間に相違がある範囲において、本明細書に記載される配列が正しい配列であると見なされるべきである。特に指示されない限り、全てのゲノム位置はｈｇ３８に基づく。
【０９４８】
参照による援用
本明細書で言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が参照によって援用されることが具体的かつ個別的に指示されたものとして参照により全体として本明細書に援用される。矛盾が生じる場合、本明細書における任意の定義を含め、本願が優先する。
【０９４９】
均等物
当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、またはルーチンに過ぎない実験を用いて確認することができるであろう。本発明は具体的な態様を参照して開示されているが、本発明の他の態様および変形形態が当業者によって本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、かかる態様および均等な変形形態の全てを含むものと解釈されることが意図される。
【図１】
2019500043.tif 000241
【図２】
2019500043.tif 000242
【図３】
2019500043.tif 000243
【図４】
2019500043.tif 000244
【図５】
2019500043.tif 000245
【図６Ａ】
2019500043.tif 000246
【図６Ｂ】
2019500043.tif 000247
【図６Ｃ】
2019500043.tif 000248
【図６Ｄ】
2019500043.tif 000249
【図７】
2019500043.tif 000250
【図８】
2019500043.tif 000251
【図９】
2019500043.tif 000252
【図１０】
2019500043.tif 000253
【図１１】
2019500043.tif 000254
【図１２】
2019500043.tif 000255
【図１３】
2019500043.tif 000256
【図１４】
2019500043.tif 000257
【図１５】
2019500043.tif 000258
【図１６】
2019500043.tif 000259
【図１７】
2019500043.tif 000260
【図１８】
2019500043.tif 000261
【図１９】
2019500043.tif 000262
【図２０】
2019500043.tif 000263
【図２１】
2019500043.tif 000264
【図２２】
2019500043.tif 000265
【図２３】
2019500043.tif 000266
【図２４Ａ】
2019500043.tif 000267
【図２４Ｂ】
2019500043.tif 000268
【図２５】
2019500043.tif 000269
【図２６Ａ】
2019500043.tif 000270
【図２６Ｂ】
2019500043.tif 000271
【図２７】
2019500043.tif 000272
【図２８Ａ】
2019500043.tif 000273
【図２８Ｂ】
2019500043.tif 000274
【図２９】
2019500043.tif 000275
【図３０Ａ】
2019500043.tif 000276
【図３０Ｂ】
2019500043.tif 000277
【図３１】
2019500043.tif 000278
【図３２】
2019500043.tif 000279
【図３３】
2019500043.tif 000280
【図３４】
2019500043.tif 000281
【図３５】
2019500043.tif 000282
【図３６】
2019500043.tif 000283
【図３７】
2019500043.tif 000284
【図３８】
2019500043.tif 000285
【図３９Ａ】
2019500043.tif 000286
【図３９Ｂ】
2019500043.tif 000287
【図４０Ａ】
2019500043.tif 000288
【図４０Ｂ】
2019500043.tif 000289
【図４１Ａ】
2019500043.tif 000290
【図４１Ｂ】
2019500043.tif 000291
【図４２Ａ】
2019500043.tif 000292
【図４２Ｂ】
2019500043.tif 000293
【図４３】
2019500043.tif 000294
【図４４】
2019500043.tif 000295
【図４５】
2019500043.tif 000296
【図４６】
2019500043.tif 000297
【図４７】
2019500043.tif 000298
【図４８】
2019500043.tif 000299
【図４９】
2019500043.tif 000300
【手続補正書】
【提出日】平成29年7月28日(2017.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１５年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／２７１，９６８号明細書、および２０１６年６月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３４７，４８４号明細書に対する優先権を主張する。これらの出願の内容全体は、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された、参照により全体として本明細書に援用される配列表を含む。２０１７年１月２６日に作成された前記ＡＳＣＩＩ複製物は、名称がＰＡＴ０５７１７９−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズが１，１１５，２１７バイトである。
【背景技術】
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム型リピート））は、細菌においてウイルスの攻撃を防御するための適応免疫システムとして進化した。ウイルスへの曝露時、ウイルスＤＮＡの短いセグメントが細菌ゲノムのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。ウイルス配列を含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一部からＲＮＡが転写される。ウイルスゲノムに相補的な配列を含むこのＲＮＡがウイルスゲノム中の配列へのＣａｓ９タンパク質のターゲティングを媒介する。Ｃａｓ９タンパク質がウイルス標的を切断し、それによってサイレンシングする。
【０００４】
近年、このＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが真核細胞のゲノム編集に応用されるようになっている。部位特異的一本鎖切断（ＳＳＢ）または二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入により、例えば非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）を用いて標的配列を改変することが可能になる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
理論によって拘束されるものではないが、本発明は、一部には、例えば本明細書に記載されるとおりのＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲシステムを用いることにより、胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）発現が増加し、および／またはβグロビン（例えば、疾患原因突然変異を有するβグロビン遺伝子）の発現が低下するように細胞（例えば、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ））を修飾することができ、およびかかる細胞を用いることにより、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球症およびβサラセミアを治療し得るという発見に基づく。
【０００６】
したがって、ある態様において、本発明は、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子を１つ以上、例えば１つ含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、Ｃａｓ  ＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲシステム）を提供する。かかるシステム、ならびに本明細書に記載される方法および細胞では、本明細書に記載されるｇＲＮＡ分子のいずれも使用し得る。
【０００７】
ある態様において、本発明は、ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｃｒＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子、ＢＣＬ１１ａエンハンサー、またはＨＦＰＨ領域の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。
【０００８】
別の態様において、本発明は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的配列に相補的、例えば、ＢＣＬ１１ａコード領域内（例えば、ＢＣＬ１１ａエクソン内、例えばＢＣＬ１１ａエクソン２内）の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を提供する。実施形態において、本ｇＲＮＡは、配列番号１〜配列番号８５または配列番号４００〜配列番号１２３１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
【０００９】
別の態様において、本発明は、ＢＣＬ１１Ａエンハンサーの標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を提供する。
【００１０】
実施形態において、本ｇＲＮＡは、配列番号１２３２〜配列番号１４９９のいずれか１つを含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。
【００１１】
実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの標的配列に対するｇＲＮＡは、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの＋５８領域内の標的配列に対するｇＲＮＡであり、標的化ドメインは、配列番号１８２〜配列番号２７７または配列番号３３４〜配列番号３４１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３４１、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２４７、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２４４、配列番号１９９、配列番号２５１、配列番号２５０、配列番号３３４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号３３６、または配列番号３３７のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２４８を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２４７を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２４５を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３３６を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３３７を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３３８を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３３５を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２５２を含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡは、例えば５’から３’に、配列番号２４８−配列番号６６０７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、例えば５’から３’に、配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むｄｇＲＮＡである。ある実施形態において、ｇＲＮＡは、例えば５’から３’に、配列番号２４７−配列番号６６０７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡと、例えば５’から３’に、配列番号６６６０を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒとを含むｄｇＲＮＡである。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番号３３８−配列番号６６０４−ＵＵＵＵを含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番号３３５−配列番号６６０４−ＵＵＵＵを含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番号３３６−配列番号６６０４−ＵＵＵＵを含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番号２４５−配列番号６６０４−ＵＵＵＵを含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番号３３７−配列番号６６０４−ＵＵＵＵを含む、例えばそれからなる。ある実施形態において、ｇＲＮＡ分子はｓｇＲＮＡ分子であり、例えば５’から３’に、配列番号２５２−配列番号６６０４−ＵＵＵＵを含む、例えばそれからなる。
【００１２】
実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの標的配列に対するｇＲＮＡは、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの＋６２領域内の標的配列に対するｇＲＮＡであり、標的化ドメインは、配列番号２７８〜配列番号３３３のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３１８、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号２９４、配列番号３１０、配列番号３１９、配列番号２９８、配列番号３２２、配列番号３１１、配列番号３１５、配列番号２９０、配列番号３１７、配列番号３０９、配列番号２８９、または配列番号２８１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３１８を含む、例えばそれからなる。
【００１３】
実施形態において、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの標的配列に対するｇＲＮＡは、ＢＣＬ１１ａエンハンサーの＋５５領域内の標的配列に対するｇＲＮＡであり、標的化ドメインは、配列番号１５９６〜配列番号１６９１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１６８３、配列番号１６３８、配列番号１６４７、配列番号１６０９、配列番号１６２１、配列番号１６１７、配列番号１６５４、配列番号１６３１、配列番号１６２０、配列番号１６３７、配列番号１６１２、配列番号１６５６、配列番号１６１９、配列番号１６７５、配列番号１６４５、配列番号１５９８、配列番号１５９９、配列番号１６６３、配列番号１６７７、または配列番号１６２６のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。
【００１４】
別の態様において、本発明は、遺伝性高胎児ヘモグロビン血症（ＨＰＦＨ）領域の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡ分子を提供する。ある実施形態において、ＨＰＦＨ領域はフランス型ＨＰＦＨ領域である。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号８６〜配列番号１８１または配列番号１５００〜配列番号１５９５のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１００、配列番号１６５、配列番号１１３、配列番号９９、配列番号１１２、配列番号９８、配列番号１５８０、配列番号１０６、配列番号１５０３、配列番号１５８９、配列番号１６０、配列番号１５３７、配列番号１５９、配列番号１０１、配列番号１６２、配列番号１０４、配列番号１３８、配列番号１５３６、配列番号１５３９、配列番号１５８５のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１００を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１６５を含む、例えばそれからなる。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１１３を含む、例えばそれからなる。
【００１５】
前述の実施形態のいずれにおいても、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載される領域および／または特性をさらに有し得る。ある態様において、ｇＲＮＡ分子（例えば、前述の態様または実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子）は、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の３’末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸である。実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸である。実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’核酸または３’核酸のいずれも含まない。前述の態様または実施形態のいずれにおいても、標的化ドメインは、記載される標的化ドメイン配列からなり得る。
【００１６】
前述の態様および実施形態のいずれかにあるものを含め、ｇＲＮＡ分子の実施形態において、標的化ドメインは、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸を含む。前述の態様および実施形態のいずれかにあるものを含め、ｇＲＮＡ分子の他の実施形態において、標的化ドメインは、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸からなる。前述の態様および実施形態のいずれかにあるものを含め、ｇＲＮＡ分子の実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の３’末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸である。前述の態様および実施形態のいずれかにあるものを含め、ｇＲＮＡ分子の他の実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸である。前述の態様および実施形態のいずれかにあるものを含め、ｇＲＮＡ分子の他の実施形態において、記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９、２０、２１（参照配列に存在する場合）、２２（参照配列に存在する場合）、２３（参照配列に存在する場合）、または２４（参照配列に存在する場合）、または２５（参照配列に存在する場合）個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’核酸または３’核酸のいずれも含まない。
【００１７】
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、ｇＲＮＡ分子は、ハイブリダイズして配列番号６５８４または６５８５を含むフラッグポールを形成するｃｒＲＮＡの一部分とｔｒａｃｒの一部分とを含む。実施形態において、フラッグポールは、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第１のフラッグポール伸長部は配列番号６５８６を含む。実施形態において、フラッグポールは、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分の３’側に位置する第２のフラッグポール伸長部、および存在する場合には第１のフラッグポール伸長部をさらに含み、前記第２のフラッグポール伸長部は配列番号６５８７を含む。
【００１８】
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、配列番号６６６０または配列番号６６６１を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒを含むｇＲＮＡ分子を提供する。実施形態において、フラッグポールのｃｒＲＮＡ部分は配列番号６６０７または配列番号６６０８を含む。
【００１９】
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、配列番号６５８９または６５９０を含むｔｒａｃｒと、任意選択で、第１のフラッグポール伸長部が存在する場合、配列番号６５８９または６５９０の５’側に配置された第１のｔｒａｃｒ伸長部であって、配列番号６５９１を含む第１のｔｒａｃｒ伸長部とを含むｇＲＮＡ分子を提供する。
【００２０】
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、標的化ドメインとｔｒａｃｒとが別個の核酸分子に配置されるｇＲＮＡ分子（例えば、ｄｇＲＮＡ分子）を提供する。
【００２１】
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、標的化ドメインとｔｒａｃｒとが単一の核酸分子に配置され、ここで、ｔｒａｃｒが標的化ドメインの３’側に配置されたｇＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ分子）を提供する。実施形態において、ｓｇＲＮＡ分子は、標的化ドメインの３’側かつｔｒａｃｒの５’側に配置されたループ、例えば、配列番号６５８８を含む、例えばそれからなるループを含む。
【００２２】
前述の態様または実施形態のいずれかにあるものを含め、ある態様において、本発明は、５’から３’に、［標的化ドメイン］−：
（ａ）配列番号６６０１；
（ｂ）配列番号６６０２；
（ｃ）配列番号６６０３；
（ｄ）配列番号６６０４；または
（ｅ）１、２、３、４、５、６または７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチド、例えば４個のウラシルヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記（ａ）〜（ｄ）のいずれかを含むｇＲＮＡ分子を提供する。実施形態において、標的化ドメインと（ａ）〜（ｅ）のいずれかの配列との間に介在ヌクレオチドはない。
【００２３】
別の態様において、本発明は、前述の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子を１つ以上、例えば１つ含むＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣａｓ  ＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲシステムを提供する。ある態様において、本発明は、前述の態様および実施形態のいずれかの第１のｇＲＮＡ分子を含み、Ｃａｓ９分子をさらに含む組成物を提供する。実施形態において、Ｃａｓ９分子は活性または不活性化膿レンサ球菌（ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９である。実施形態において、第１のｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子はリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中に存在する。
【００２４】
別の態様において、本発明は、ｇＲＮＡを２つ以上含む、例えば、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子を２つ以上含む、例えば、前述のｇＲＮＡ分子の態様または実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子を２つ以上含む組成物を提供する。したがって、さらなる態様において、本発明は、第２のｇＲＮＡ分子；第２のｇＲＮＡ分子および第３のｇＲＮＡ分子；または第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子、および第４のｇＲＮＡ分子をさらに含む、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物を提供し、ここで、第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子（存在する場合）、および第４のｇＲＮＡ分子（存在する場合）は、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子、例えば、前述のｇＲＮＡ分子の態様または実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子である。ある実施形態において、本組成物の各ｇＲＮＡ分子は異なる標的配列に相補的である。ある実施形態において、各ｇＲＮＡ分子は同じ遺伝子内または領域内の標的配列と相補的である。ある態様において、第１のｇＲＮＡ分子、第２のｇＲＮＡ分子、第３のｇＲＮＡ分子（存在する場合）、および第４のｇＲＮＡ分子（存在する場合）は、２００００ヌクレオチド以下、１００００ヌクレオチド以下、６０００以下、５０００ヌクレオチド以下、４０００以下、１０００ヌクレオチド以下、５００ヌクレオチド以下、４００ヌクレオチド以下、３００ヌクレオチド以下、２００ヌクレオチド以下、１００ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以下、８０ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、２０ヌクレオチド以下または１０ヌクレオチド以下離れた標的配列と相補的である。別の態様において、本組成物の各ｇＲＮＡ分子は異なる遺伝子内または領域内の標的配列と相補的である。
【００２５】
本発明の２つ以上のｇＲＮＡ分子の具体的かつ好ましい組み合わせが本明細書に記載される。ある態様において、本組成物は第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、ここで、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とは異なる標的配列に相補的であり、および：
（ａ）ＢＣＬ１１ａ遺伝子に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択されるか；
（ｂ）＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択されるか；
（ｃ）＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択されるか；
（ｄ）＋５５  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択されるか；または
（ｅ）ＨＰＦＨ領域に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から独立して選択される。
【００２６】
ある態様において、本組成物は第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含み、ここで、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とは異なる標的配列に相補的であり、および：
（ａ）第１のｇＲＮＡ分子はＢＣＬ１１ａ遺伝子に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｂ）第１のｇＲＮＡ分子はＢＣＬ１１ａ遺伝子に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｃ）第１のｇＲＮＡ分子はＢＣＬ１１ａ遺伝子に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋５５  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｄ）第１のｇＲＮＡ分子はＢＣＬ１１ａ遺伝子に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子はＨＰＦＨ領域に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｅ）第１のｇＲＮＡ分子は＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｆ）第１のｇＲＮＡ分子は＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋５５  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｇ）第１のｇＲＮＡ分子は＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子はＨＰＦＨ領域に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｈ）第１のｇＲＮＡ分子は＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子は＋５５  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｉ）第１のｇＲＮＡ分子は＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子はＨＰＦＨ領域に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され；
（ｊ）第１のｇＲＮＡ分子は＋５５  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択され、かつ第２のｇＲＮＡ分子はＨＰＦＨ領域に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択される。
【００２７】
別の態様において、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とを含む本組成物は、以下を含む：
（ａ）ＨＰＦＨ領域に対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択される第１のｇＲＮＡ分子を含み、かつ第２のｇＲＮＡ分子が、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含むか；または
（ｂ）ＢＣＬ１１ａエンハンサー、例えば、＋５８  ＢＣＬ１１ａエンハンサー、＋５５  ＢＣＬ１１ａエンハンサーまたは＋６２  ＢＣＬ１１ａエンハンサーに対する本明細書（例えば、上記）に記載のｇＲＮＡ分子から選択される第１のｇＲＮＡ分子を含み、かつ第２のｇＲＮＡ分子が、βグロビン遺伝子の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。
【００２８】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれにおいても、本組成物は、組成物のｇＲＮＡ成分に関して、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とからなり得る。
【００２９】
前述の組成物の態様および実施形態のいずれにおいても、本組成物は、エレクトロポレーションに好適な媒体中に製剤化し得る。
【００３０】
別の態様において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲシステムのｇＲＮＡ分子および／またはＣａｓ分子をコードする核酸を提供する。理論によって拘束されるものではないが、かかる核酸を細胞に送達すると、細胞内でＣＲＩＳＰＲシステムの発現が起こるであろうと考えられる。ある態様において、本発明は、前出のｇＲＮＡの態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列を提供する。実施形態において、核酸は、１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。実施形態において、このプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーターである。実施形態において、このプロモーターはＵ６プロモーターまたはＨＩプロモーターである。
【００３１】
さらなる態様において、核酸は、Ｃａｓ９分子をコードする配列をさらに含む。実施形態において、核酸は、Ｃａｓ９分子をコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。実施形態において、このプロモーターは、ＥＦ−１プロモーター、ＣＭＶ  ＩＥ遺伝子プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ユビキチンＣプロモーター、またはホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターである。
【００３２】
ある態様において、本発明は、前出の核酸の態様および実施形態のいずれかの核酸を含むベクターを提供する。実施形態において、ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド、およびＲＮＡベクターからなる群から選択される。
【００３３】
別の態様において、本発明は、１つ以上のｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子、例えば前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかにおけるｇＲＮＡ分子と、Ｃａｓ９分子をコードする核酸とを含む組成物を提供する。
【００３４】
別の態様において、本発明は、１つ以上のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子、例えば前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかのｇＲＮＡ分子）をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子とを含む組成物を提供する。
【００３５】
別の態様において、本発明は、鋳型核酸をさらに含む組成物、例えば、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物を提供する。別の態様において、本発明は、鋳型核酸をコードする核酸配列をさらに含む組成物、例えば、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物を提供する。実施形態において、鋳型核酸は、ｇＲＮＡ分子の標的配列のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。実施形態において、鋳型核酸は、ヒトβグロビン、例えば、突然変異Ｇ１６Ｄ、Ｅ２２ＡおよびＴ８７Ｑの１つ以上を含むヒトβグロビンをコードする核酸を含む。実施形態において、鋳型核酸は、ヒトγグロビンをコードする核酸を含む。
【００３６】
別の態様において、本発明は、ｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲシステム、組成物または核酸（例えば、本明細書に記載されるとおりのもの、例えば、前述の態様および実施形態のいずれかにあるとおりのもの）を含む（または任意の時点で含んでいた）細胞を提供する。かかる態様において、本発明は、このように含むことによって修飾されている細胞を提供する。
【００３７】
したがって、ある態様において、本発明は、細胞の核酸内にある標的配列を改変する方法、例えば、その構造、例えば配列を改変する方法であって、前記細胞を、
１）前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）；
２）前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）をコードする核酸；
３）前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）；
４）前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸、およびＣａｓ９分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）をコードする核酸；または
５）上記１）〜４）のいずれか、および鋳型核酸（例えば、本明細書に記載されるとおりの）；
６）上記１）〜４）のいずれか、および鋳型核酸（例えば、本明細書に記載されるとおりの）をコードする配列を含む核酸；
７）本明細書に記載されるとおりの（例えば、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの）組成物；または
８）前述のベクターの態様および実施形態のいずれかのベクター
と接触させることを含む方法を提供する。
【００３８】
実施形態において、ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９分子をコードする核酸とは、単一の組成物に製剤化される。他の実施形態において、ｇＲＮＡ分子またはｇＲＮＡ分子をコードする核酸と、Ｃａｓ９分子またはＣａｓ９分子をコードする核酸とは、２つ以上の組成物に製剤化される。実施形態において、２つ以上の組成物は同時にまたは逐次的に送達される。
【００３９】
実施形態において、細胞は動物細胞である。実施形態において、細胞は哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞である。実施形態において、細胞は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋細胞である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−細胞である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋細胞である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ４９ｆ＋細胞である。実施形態において、本方法は、ＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を富化した細胞の集団を含む。
【００４０】
実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は骨髄から単離されている。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は動員末梢血から単離されている。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は臍帯血から単離されている。
【００４１】
実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は、前記細胞（例えば、細胞の集団）が投与される患者にとって自己由来である。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は、前記細胞（例えば、細胞の集団）が投与される患者にとって同種異系由来である。
【００４２】
本明細書に記載される方法の実施形態では、改変する結果として細胞の胎児ヘモグロビン発現が増加する。本明細書に記載される方法の実施形態では、改変する結果として細胞の胎児ヘモグロビン発現が減少する。
【００４３】
別の態様において、本発明は、前述の方法の態様および実施形態のいずれかの方法によって改変された細胞を提供する。別の態様において、本発明は、前出の態様および実施形態のいずれかの第１のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）、または組成物（例えば、本明細書に記載されるとおりの）、または第１のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）をコードする核酸を含む細胞を提供する。実施形態において、細胞は動物細胞である。実施形態において、細胞は哺乳動物細胞、霊長類細胞またはヒト細胞である。実施形態において、細胞は造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋細胞である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−細胞である。実施形態において、細胞はＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋細胞である。実施形態において、本方法は、ＨＳＰＣ、例えばＣＤ３４＋細胞を富化した細胞の集団を含む。
【００４４】
実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は骨髄から単離されている。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は動員末梢血から単離されている。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は臍帯血から単離されている。
【００４５】
実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は、前記細胞（例えば、細胞の集団）が投与される患者にとって自己由来である。実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は、前記細胞（例えば、細胞の集団）が投与される患者にとって同種異系由来である。
【００４６】
実施形態において、細胞は、第２のｇＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載されるとおりの第２のｇＲＮＡ分子、例えば前出のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの第２のｇＲＮＡ分子、または第２のｇＲＮＡ分子をコードする核酸を含むか、それを含んでいたか、またはそれを含むことになり、ここで、第１のｇＲＮＡ分子と第２のｇＲＮＡ分子とは同一でない標的化ドメインを含む。
【００４７】
実施形態において、細胞における胎児ヘモグロビンの発現が、例えばｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）を含むように修飾されていない同じ細胞型の細胞と比べて増加する。実施形態において、細胞におけるβグロビンの発現が、例えばｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）を含むように修飾されていない同じ細胞型の細胞と比べて低下する。実施形態において、例えばｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの）を含むように修飾されていない同じ細胞型の細胞と比べて細胞における胎児ヘモグロビンの発現が増加し、かつβグロビンの発現が低下する。
【００４８】
ある態様において、本発明の細胞（または細胞を含む方法）は、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるとおりの幹細胞増殖剤、例えば、化合物１、化合物２、化合物３または化合物４と接触させたものである。ある態様において、本発明の細胞（または細胞を含む方法）は、幹細胞増殖剤、例えば本明細書に記載されるとおりの幹細胞増殖剤、例えば、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１および化合物４）と接触させたものである。ある実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物４である。ある実施形態において、幹細胞増殖剤は化合物１と化合物４との組み合わせである。実施形態において、接触はエキソビボである。
【００４９】
別の態様において、本発明は、治療方法、例えば異常ヘモグロビン症の治療方法を提供する。ある態様において、本発明は、前出の細胞または方法の態様および実施形態のいずれかの細胞（例えば、細胞の集団）を患者に投与することを含む、異常ヘモグロビン症を治療する方法を提供する。
【００５０】
別の態様において、本発明は、前出の細胞または方法の態様および実施形態のいずれかの細胞を患者に投与することを含む、哺乳動物における胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法を提供する。ある実施形態において、異常ヘモグロビン症はβ−サラセミアまたは鎌状赤血球症である。
【００５１】
別の態様において、本発明は、薬剤として用いられる、例えば疾患の治療に用いられるガイドＲＮＡ分子、例えば本明細書に記載されるとおりのガイドＲＮＡ分子を提供する。実施形態において、疾患は異常ヘモグロビン症、例えばβ−サラセミアまたは鎌状赤血球症である。
【００５２】
別の態様において、本発明は、ｇＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載されるとおりのｇＲＮＡ分子、例えば、前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかに記載されるとおりのｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲシステムが細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、例えばＨＳＣ）に導入されると、ＮＧＳによって計測したとき、生じるインデルの少なくとも約１５％が、非修飾標的ＤＮＡと比べて（ａ）フレームシフト突然変異；または（ｂ）大規模欠失を含む。実施形態において、ＮＧＳによって計測したとき、生じるインデルの少なくとも約２５％が、非修飾標的ＤＮＡと比べて（ａ）フレームシフト突然変異；または（ｂ）大規模欠失を含む。実施形態において、ＮＧＳによって計測したとき、生じるインデルの少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％  少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、非修飾標的ＤＮＡと比べて（ａ）フレームシフト突然変異；または（ｂ）大規模欠失を含む。
【００５３】
別の態様において、本発明は、ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）のエキソビボ増殖および修飾方法を提供する。ある態様において、本発明は、細胞（例えば、細胞の集団）を修飾する方法であって、
（ａ）細胞の集団を提供するステップと；
（ｂ）エキソビボで幹細胞増殖剤の存在下で前記細胞を増殖させるステップと；
（ｃ）第１のｇＲＮＡ分子（例えば、本明細書に記載されるとおりの第１のｇＲＮＡ分子、例えば、前述のｇＲＮＡ分子の態様および実施形態のいずれかの第１のｇＲＮＡ分子）、第１のｇＲＮＡ分子をコードする核酸分子、または組成物（例えば、本明細書に記載されるとおりの組成物、例えば、前述の組成物の態様および実施形態のいずれかの組成物）を前記細胞に導入するステップと
を含み、これによりステップ（ｃ）に供されていない同じ細胞型と比べて前記細胞におけるヘモグロビン、例えば胎児ヘモグロビンの発現が増加する方法を提供する。
【００５４】
実施形態において、細胞は、それを必要としている対象、例えば、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球症またはβサラセミアを有する対象に導入される。
【００５５】
実施形態において、細胞はＣＤ３４＋細胞であるか、またはそれを含む。実施形態において、細胞はＨＳＰＣであるか、またはそれを含む。実施形態において、細胞は骨髄、動員末梢血または臍帯血から単離されたものである。好ましい実施形態において、細胞は骨髄から単離されたものである。他の実施形態において、細胞は動員末梢血から単離されたものである。態様において、動員末梢血は、Ｇ−ＣＳＦが投与された対象から単離されたものである。態様において、動員末梢血は、Ｇ−ＣＳＦ以外の動員剤、例えばＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）が投与された対象から単離されたものである。実施形態において、細胞は、富化された細胞の集団である。
【００５６】
実施形態において、幹細胞増殖剤は、化合物１、化合物２、化合物３、または化合物４、例えば化合物４である。実施形態において、幹細胞増殖剤は、化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、またはこれらの組み合わせ（例えば、化合物１と化合物４との組み合わせ）である。実施形態において、細胞は、約１〜約２００マイクロモル（μＭ）の濃度の化合物４に接触させる。ある実施形態において、化合物４の濃度は約７５マイクロモル（μＭ）である。実施形態において、エキソビボで幹細胞増殖剤の存在下で前記細胞を増殖させるステップは、約１〜１０日、例えば約１〜５日、例えば約２〜５日、例えば約４日の期間にわたって行われる。
【００５７】
実施形態において、細胞は、前記細胞の投与が意図される患者にとって自己由来である。実施形態において、細胞は、前記細胞の投与が意図される患者にとって同種異系由来である。
【００５８】
実施形態において、ステップ（ｂ）の増殖は、さらに、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）およびヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）の存在下である。実施形態において、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）およびヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）は、それぞれ約５０ｎｇ／ｍＬの濃度である。実施形態において、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）およびヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）は、それぞれ５０ｎｇ／ｍＬの濃度である。
【００５９】
さらなる態様および実施形態を以下に記載する。
【００６０】
ある態様において、本発明は、ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子を提供し、ここで、ｃｒＲＮＡは、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子（例えば、ヒトＢＣＬ１１ａ遺伝子）、ＢＣＬ１１ａエンハンサー（例えば、ヒトＢＣＬ１１ａエンハンサー）、またはＨＦＰＨ領域（例えば、ヒトＨＰＦＨ領域）の標的配列に相補的な標的化ドメインを含む。
【００６１】
実施形態において、標的配列はＢＣＬ１１Ａ遺伝子の標的配列であり、標的化ドメインは、配列番号１〜配列番号８５または配列番号４００〜配列番号１２３１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。これらの実施形態は、本明細書ではｇＲＮＡ分子の実施形態２と称される。
【００６２】
他の実施形態において、標的配列はＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、標的化ドメインは、配列番号１２３２〜配列番号１４９９のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。これらの実施形態は、本明細書ではｇＲＮＡ分子の実施形態３と称される。好ましい実施形態において、標的配列はＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、標的化ドメインは、配列番号１８２〜配列番号２７７または配列番号３３４〜配列番号３４１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。これらの実施形態は、本明細書ではｇＲＮＡ分子の実施形態４と称される。より好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３４１、配列番号２４６、配列番号２４８、配列番号２４７、配列番号２４５、配列番号２４９、配列番号２４４、配列番号１９９、配列番号２５１、配列番号２５０、配列番号３３４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号３３６、または配列番号３３７のいずれか１つを含む、例えばそれからなる。これらの実施形態は、本明細書ではｇＲＮＡ分子の実施形態５と称される。さらにより好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号３３５、配列番号３３６、配列番号３３７、または配列番号３３８のいずれか１つを含み、例えばそれからなり（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態６と称される）、例えば、配列番号２４８または配列番号３３８のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態７と称される）。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号２４８を含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態８と称される）。実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３３８を含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態９と称される）。
【００６３】
他の実施形態において、標的配列はＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、標的化ドメインは、配列番号２７８〜配列番号３３３のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１０と称される）。好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３１８、配列番号３１２、配列番号３１３、配列番号２９４、配列番号３１０、配列番号３１９、配列番号２９８、配列番号３２２、配列番号３１１、配列番号３１５、配列番号２９０、配列番号３１７、配列番号３０９、配列番号２８９、または配列番号２８１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１１と称される）。好ましい一実施形態において、標的化ドメインは、配列番号３１８を含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１２と称される）。
【００６４】
他の実施形態において、標的配列はＢＣＬ１１ａエンハンサーのものであり、標的化ドメインは、配列番号１５９６〜配列番号１６９１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１３と称される）。好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１６８３、配列番号１６３８、配列番号１６４７、配列番号１６０９、配列番号１６２１、配列番号１６１７、配列番号１６５４、配列番号１６３１、配列番号１６２０、配列番号１６３７、配列番号１６１２、配列番号１６５６、配列番号１６１９、配列番号１６７５、配列番号１６４５、配列番号１５９８、配列番号１５９９、配列番号１６６３、配列番号１６７７、または配列番号１６２６のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１４と称される）。
【００６５】
他の実施形態において、標的配列はＨＦＰＨ領域（例えば、フランス型ＨＰＦＨ領域）のものであり、標的化ドメインは、配列番号８６〜配列番号１８１、配列番号１５００〜配列番号１５９５、または配列番号１６９２〜配列番号１７６１のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１５と称される）。好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１００、配列番号１６５、配列番号１１３、配列番号９９、配列番号１１２、配列番号９８、配列番号１５８０、配列番号１０６、配列番号１５０３、配列番号１５８９、配列番号１６０、配列番号１５３７、配列番号１５９、配列番号１０１、配列番号１６２、配列番号１０４、配列番号１３８、配列番号１５３６、配列番号１５３９、配列番号１５８５のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１６と称される）。さらにより好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１５０５、配列番号１５８９、配列番号１７００、または配列番号１７５０のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１７と称される）。他の好ましい実施形態において、標的化ドメインは、配列番号１００、配列番号１６５、または配列番号１１３のいずれか１つを含む、例えばそれからなる（本明細書においてｇＲＮＡ分子の実施形態１８と称される）。
【００６６】
実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載される任意の標的化ドメイン配列、例えば表１または表２の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個、好ましくは２０個の連続する核酸を含む、例えばそれからなる標的化ドメインを含む。実施形態において、本明細書に記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つ、例えば表１または表２の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個、好ましくは２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の３’末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個、好ましくは２０個の連続する核酸である。他の実施形態において、本明細書に記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つ、例えば表１または表２の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個、好ましくは２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’末端に配置された１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個、好ましくは２０個の連続する核酸である。他の実施形態において、本明細書に記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つ、例えば表１または表２の標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個、好ましくは２０個の連続する核酸は、記載される標的化ドメイン配列の５’核酸または３’核酸のいずれも含まない。
【００６７】
実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載される任意の標的化ドメイン配列、例えば表５、表６、表７、表８または表９の標的化ドメイン配列の１７、볯颼胣醼볯膀臣龁臣銼볯讀胣붥臣鞁臣꾁볯邼胥꺁胩骶臣讂ꃦ뢅苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃藩鞈臣蒁臣貂臣醼臣膀뻤袁臣ꢡ볯膀ꇨ隼胣ꢡ볯膀ꇨ颼臣龁臣ꢡ볯꺁꣦蒚賥覃菣ꒂ菣超裥꺁볯鞼胣醼볯膀볯馼胣뺁臣꾁볯邼胥膀ꗥ뺁臣辁臣銼볯讀臣ꎀ뛧馁苣뢠藩꾁胣風볨閁苣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣超裥꺁볯馀鳦꾫臣超뷧閁苣龁볯鞼胣醼볯膀볯馼胣뺁臣꾁볯邼胥膀ꗥ뺁臣辁臣銼볯讀臣ꎀ뛧馁苣뢠藩ꞁ臣讂胣隻臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀鳦躘듧뢛臣風볨閁苣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣超裥꺁臣骁苣讁볯ꒁ胣设臣낁ꇨ閼胣ꢡ볯膀ꇨ鞼胣ꢡ볯뺁臣꾁ꇨ馼臣馨髧隌菣ꆃ苣뎃藩鞈臣醼볯膀볯颼胣醼볯膀臣龁臣銼볯讀胣붥臣鞁臣꾁볯邼胥꺁胩骶臣讂ꃦ뢅臣膀꣨覼臣貂苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃藩鞈臣閼胢ꮜꯧꮁ藩꺽臣貂臣醼볯膀볯颼胣醼볯膀臣龁臣銼볯讀胣붥臣鞁臣꾁볯邼胥꺁胩骶臣讂ꃦ뢅臣芁苣芀믤꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣貂苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃藩鞈臣蒁臣貂臣醼臣膀뻤袁臣ꢡ볯膀ꇨ隼胣ꢡ볯膀ꇨ颼臣龁臣ꢡ볯꺁꣦蒚賥覃菣ꒂ菣超裥꺁볯鞼胣醼볯膀볯馼胣뺁臣꾁볯邼胥膀ꗥ뺁臣辁臣銼볯讀臣ꎀ뛧馁苣뢠藩꾁胣風볨閁苣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣超裥꺁볯馀ꃦ뢅臣龁臣鎼胢뢠藩꺁臣骁苣节郥뺁臣蒁胣ં䐼噉邀볯邼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†믤许臣讅꟦꾁胣趉뿨꺁藦颧臣袂臣龮雦ꊽ藦꺁臣骁苣讁臣蒵臣袐苣鮁뻥讂뷯늼볯ꆼ裥邭臣릉뻥ꮁ臣蒁臣風볨馁苣芀껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣趉뿨꺁藦颧臣袂臣龮雦ꊽ藦꺁臣骁苣讁臣螽볯꺼볯蚈귥銂郥膂胣较苣隃菣肃苣몂臣ꚁ藩鞈闧랏볯閼볯钼臣龁臣隼볯颼볯銂郥肂菣ꦃ菣낂菣벃菣銂뷥邈臣讂뷯銽볯꺼볯꺁룤ꢃ裥ꢁ뷯銽뷯莽뷯꺁룤ꢃ裥ꢁ苣ꮐ苣芀껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣閃菣莃苣鶃菣ꮃ臣膀菣ꦃ菣낂菣벃菣꺁뷯銽볯꺼볯ꢃ裥꺁볯馀臥ꮁ뷤꺽臣讂곧醼臣閃菣莃苣鶃菣ꮃ볤랕菩銂臣覂臣ꮐ臣膀觥風곧醼臣閃菣莃苣鶃菣ꮃ볤랕菩꾁藩鞈闧랏볯閼볯隼苣ꮐ苣芀껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣閃菣莃苣鶃菣ꮃ臣袼곧醼臣閃菣莃苣鶃菣ꮃ볤랕菩ꮁ諥袁臣뺁臣꾁臣貂臣ꎻ臣ꚁ볯閃菣莃苣鶃菣ꮃ臣莽뷯늼볯ꆼ菩蚈臣鎼胢뒁臣趽뷧馁苣견볯꺁菣ꦃ菣낂菣벃菣뢼闩ꢃ胣誁苣뎁귥ꢜ臣讂ꃥ袐臣꾁곧醼臣閃菣莃苣鶃菣ꮃ볤랕菩銂臣覂臣ꮐ臣膀臣鎁臣膀觥風곧銼臣閃菣莃苣鶃菣ꮃ볤랕菩꾁藩鞈闧랏볯閼볯鞼苣ꮐ苣芀㰊䥄㹖胣邼볯隼볯醀⼼䥄㹖 趉뿨꺁藦颧臣袂臣龮雦ꊽ藦꺁臣骁苣讁臣誁臣讂껥붖뷥讅苣ꮐ苣膀껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣钽뷯膽뷯銽臣超裥ꪕ迥隼볯隼볯뺁臣꾁藩鞈闧랏볯隼볯醼苣ꮐ苣芀껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣钽뷯膽뷯銽臣超裥ꪕ迥鞼볯醼볯銂郥뾁胣뮻蓦뢁諦ꞁ볯馀鳦꾫臣붿諥蒚臣醼胣銼胣鎼胣钼胣閼胣隼胣뺁臣꾁볯讀臣Ꚃ菣랂菣袼볯覼菣꾂菣ꪂ菣覃苣閁苣ꮁ郥肂胣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀뷯銽볯꺼볯꾁胣閼胢讁苣鎼胢ꮁ胣뮼꣦蒚賥覃菣ꒂ菣붼裢骼뷯覼藩鞈闧랏볯閼볯钼볯芽볯超裥ꪕ迥隼볯颼볯鮼뷯覼藩鞈闧랏볯隼볯閼볯蒽볯超裥ꪕ迥隼볯邼볯鮼뷯覼藩鞈闧랏볯隼볯鞼볯蚽볯超裥ꪕ迥隼볯邼볯鮼臣龁臣螽볯超裥ꪕ迥鞼볯邼볯銂郥肂胣ં䐼噉邀볯邼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†觥낿臣讅꟦誁苣뎁껥붖뷥讅臣蒁臣貂臣ꮁ臣醁苣龮雦ꊽ藦銂郥膂胣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀뷯銽뷯莽뷯꾁胣閼胢讁苣鎼胢ꮁ胣膽볯超裥ꪕ迥隼볯颼볯鮼뷯覼藩鞈闧랏볯閼볯邼볯莽볯超裥ꪕ迥隼볯邼볯鮼뷯覼藩鞈闧랏볯隼볯邼볯薽볯超裥ꪕ迥隼볯隼볯鮼뷯覼藩鞈闧랏볯隼볯醼볯螽볯超裥ꪕ迥鞼볯醼볯鮼뷯覼藩鞈闧랏볯颼볯鞼볯覽볯超裥ꪕ迥鞼볯邼볯鮼뷯覼藩鞈闧랏볯颼볯馼볯讽볯醰臣辁臣节볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯讀臣Ꚃ菣랂菣袼볯覼菣꾂菣ꪂ菣覃胣设臣낁胣醼胣銼胣鎼胣钼胣閼胣隼胣뺁臣꾁볯讀臣Ꚃ菣랂菣袼볯覼菣꾂菣ꪂ菣覃苣鎼胢ꮜꯧꮁ臣覂臣ꮐ苣誸꣨膽볯鲀뷯覼臣蒁臣貂臣鮼뷯覼냥ꪁ臣ꢁ苣醼胣銼胣鎼胣钼胣閼胣隼臣龁臣鞼胥꺁苣螃菣뎃볯ꆼ볯貃苣것苣膃菣膀뻤袁臣膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀臣龁臣鞼胥꺁苣螃菣뎃볯ꆼ볯貃苣것苣膃菣銂볯馀鳦꾫臣閁苣ꮁ郥肂룤風뷯覼胣讽볯꺁臣骁苣讁볯뺁臣꾁뷯覼냥ꪁ臣ꢁ苣醼胣銼胣鎼胣钼胣閼胣隼臣龁臣鞼胥꺁苣螃菣뎃볯ꆼ볯貃苣것苣膃菣膀뻤袁臣膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀볯膀臣龁臣鞼胥꺁苣螃菣뎃볯ꆼ볯貃苣것苣膃菣銂볯馀鳦꾫臣袼뻤袁臣膀볯馀臥꾫臣覼臣覂臣ꮐ苣誸꣨膽볯鲀뷯覼臣蒁臣貂臣銂郥肂胣ં䐼噉邀볯邼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣馨髧隌菣ꆃ苣뎃臣钽뷯膽뷯銽臣꾁裥讀臣뢠藩蚈귥誸臣超뷧閁苣讂胣讁臣讂뷯늼볯ꆼ裥邭臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂ꃦ뢅裥邭臣膀믤辄臩麊臣馨髧隌菣ꆃ苣뎃臣馁臣鎼胢뒁臣超뷧閁苣龁藩鞈闧랏볯隼볯鞼苣ꮐ臣膀臣袂臣钽뷯膽뷯銽苣ꮐ苣뢠藩蚈귥꾁藩鞈闧랏볯隼볯邼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣芀㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀菣ꦃ菣낂菣벃菣꺁뷯銽볯꺼볯ꢃ裥꾁藩鞈闧랏볯隼볯鞼臣龁臣超裥ꪕ迥隼볯邼볯銂郥肂胣ં䐼噉邀볯邼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣钽뷯膽뷯銽臣膀藩鞈闧랏볯閼볯馼臣龁臣隼볯馼볯ꢁ胣뮻蓦뢁諦ꞁ胣견볯꺁菣ꦃ菣낂菣벃菣뢼闩ꢃ臣颭鳥馁苣뒠郥膀藩鞈闧랏볯閼볯馼臣龁臣隼볯馼볯꺁볯馀臥ꮁ藩꺽臣貂臣견볯꺁뷯銽뷯莽뷯뢼闩ꢃ臣銂郥뾁胣趉꣨견볯꺁뷯銽뷯莽뷯뢼闩ꢃ臣超裥ꪕ迥隼볯馼볯銂郥肂胣ં䐼噉邀볯邼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†觥낿臣讅꟦誁苣뎁껥붖뷥讅臣蒁臣貂臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣讂苣꺁苣ꮐ苣膀껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣馨髧隌菣ꆃ苣뎃臣钽뷯膽뷯銽臣꾁裥讀臣뢠藩蚈귥ꮁ藩꺽臣貂苣芀觥낿臣讅꟦誁苣뎁껥붖뷥讅臣蒁臣貂臣꺁껥붖뷥讅臣誁臣讂苣꺁苣ꮐ苣膀믤꺁껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣馨髧隌菣ꆃ苣뎃臣钽뷯膽뷯銽臣꾁跥肸臣뢠藩蚈귥ꮁ藩꺽臣貂胣设臣낁胣钽뷯膽뷯銽臣馨髧隌菣ꆃ苣뎃臣鎼胢뒁臣超뷧閁苣讂胣ં䐼噉邀볯邼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣馨髧隌菣ꆃ苣뎃臣钽뷯膽뷯銽臣貁跥肸臣뢠藩蚈귥ꮁ藩꺽臣貂苣ꢁ臣膀뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀꣦蒚賥覃菣ꒂ菣꺁볯馀臥讁臣钽뷯膽뷯銽臣閼胢뒁臣超뷧閁苣龁菣벃菣銂臣覂臣ꮐ苣芀껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣ꮃ菣鞃臣超裥ꪕ迥隼볯颼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂胣ં䐼噉邀볯邼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣馨髧隌菣ꆃ苣뎃臣钽뷯膽뷯銽臣貁跥肸臣뢠藩蚈귥ꮁ藩꺽臣貂苣ꢁ臣膀뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀볯馀臣覂볯馀臣膀볯馨髧隌菣ꆃ苣뎃볯銈볯袼뷯覼藩鞈闧랏볯隼볯醼볯袼뷯覼藩鞈闧랏볯隼볯銼볯袼뷯覼藩鞈闧랏볯隼볯鎼볯袼뷯覼藩鞈闧랏볯隼볯钼볯袼뷯覼藩鞈闧랏볯颼볯醼볯뺁臣꾁볯蚽볯醼胣銼胣鎼胣钼胣閼胣隼臣龁臣鞼胥꺁苣ꦃ苣ꮃ볯떼볯貃苣것苣膃菣銂볯馀鳦꾫臣閁苣ꮁ郥肂룤風볯膽볯鲀볯薽볯꺁臣骁苣讁苣ꮐ苣芀껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣趉꣨馨髧隌菣ꆃ苣뎃臣超裥ꪕ迥鞼볯醼볯ꢁ苣ꮐ臣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣膀藩鞈闧랏볯颼볯醼臣뮻蓦뢁諦ꞁ觥風꣦蒚賥覃菣ꒂ菣꺁臣邁볯馀臥ꮁ藩꺽臣貂苣芀㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 趉뿨꺁藦颧臣袂臣龮雦ꊽ藦꺁臣骁苣讁臣誁臣讂껥붖뷥讅苣ꮐ苣膀껥붖뷥讅臣誁臣ꚁ胣螽볯꺼볯蚈귥꺁ꃦ뢅껦몟臣蒐胣꾁胣뢠藩蚈귥꺁郥议鿥鎖臣芁苣麝뿤뺣볯膀볯膀볯뺁臣꾁볯뢠藩议鿥誁苣뎁鷩꺿ꏩꪃ菣뢅뗧袐臣芁苣芀觥낿臣讅꟦誁苣뎁껥붖뷥讅臣蒁臣貂臣ꮁ臣醁苣龮雦ꊽ藦銂郥膂胣隻臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀뷯늼볯ꆼ裥邭苣讧裦馁苣뢠藩蚈귥꺁볯ꒁ胣뺁臣꾁믤辄臩麊臣銼臣ꖻ룤貁胣膽볯趉꣨醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣뢠藩蚈귥꺁볯馀鳦꾫臣誁臣讂볯ꒁ믤誸胣设臣낁볯ꒁ臣鮃苣鮃菣膃苣ꢂ菣袃뿤뺣볯芽볯趉꣨醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣뢠藩蚈귥꺁볯馀鳦꾫臣誁臣讂볯ꒁ믤誸胣设臣낁볯ꒁ臣鮃苣鮃菣膃苣ꢂ菣袃뿤뺣볯莽볯趉꣨醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣뢠藩蚈귥꺁볯馀鳦꾫臣誁臣讂볯ꒁ믤誸胣设臣낁볯ꒁ臣銼胢銈볯銈菣膃菣꺿ꏩ鮼뷯覼觥風볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁ꃦ뢅裥邭臣閼胢ꮜꯧꮁ臣醁苣醼臣ꖻ룤膀뻤袁臣鎼臣꺁볯馀裢꾼裢ꆃ菣ꮃ뿤뺣볯薽볯趉꣨醼臣뺁臣꾁ꓨ낕臣뢠藩蚈귥꺁鳦꾫臣覂볯ꪕ鯧膀鳦꾫臣覂볯ꪕ鯧膀臣袂臣ꮜꯧ讁苣銼闧꺛臣鎼胢议鿥꺁郥薀臣誁臣讂볯馀볯銈菣膃菣꺿ꏩ鮼뷯覼觥風볯ꒁ臣龁臣螤闦꺁ꃦ뢅裥邭臣ꮜꯧ讁苣钼闧꺛胣ꮜꯧ讁苣鎼闧꺛胣誁苣뎁鳦꾫臣覂볯ꪕ鯧꺁볯馀껦몟臣蒐胣ꮁ臣醁苣銼胢꾼裢ꆃ菣ꮃ뿤뺣볯뺁臣꾁뷯覼臣貂苣꺁믤辄臣蒵臣袐苣鮁苣ꮐ苣芀㰊䥄㹖胣邼볯鞼볯醀⼼䥄㹖 붥臣鞁臣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣膀鳦몙飦꾁胣超裥骼볯膽볯超裥ꪕ迥鎼볯銼볯袼뷯覼藩鞈闧랏볯钼볯鮼臣龁臣袼뷯覼藩鞈闧랏볯鞼볯銼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣螽볯꺼볯蚈귥袼뻤袁臣膀뷯螽볯꺼볯蚈귥ꞁ臣讂볯銂迦鮾臣讂볯겜駧躘臣鎁臣芦ꛨꞁ臣螽볯꺼볯蚈귥꺁껥붖뷥讅볯醼臣낧臣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貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥銼볯颼臣袂臣超裥ꪕ迥鎼볯馼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯馼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯銼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥銼볯颼臣袂臣超裥ꪕ迥鎼볯醼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯馼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯醼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥銼볯颼臣袂臣超裥ꪕ迥銼볯邼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯馼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯醼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥銼볯颼臣袂臣超裥ꪕ迥鎼볯馼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯馼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯颼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥銼볯颼臣袂臣超裥ꪕ迥銼볯醼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯銼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯醼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯銼臣袂臣超裥ꪕ迥鎼볯鎼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯銼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯馼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯銼臣袂臣超裥ꪕ迥鎼볯邼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯銼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯醼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯銼臣袂臣超裥ꪕ迥銼볯颼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯銼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯醼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯銼臣袂臣超裥ꪕ迥鎼볯閼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯銼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯馼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯銼臣袂臣超裥ꪕ迥鎼볯鞼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯銼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯邼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯銼臣袂臣超裥ꪕ迥銼볯馼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯銼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯颼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯醼臣袂臣超裥ꪕ迥鎼볯銼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯醼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯醼臣袂臣超裥ꪕ迥銼볯钼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯醼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯醼臣袂臣超裥ꪕ迥鎼볯馼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯馼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯醼臣袂臣超裥ꪕ迥鎼볯銼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯醼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯醼臣袂臣超裥ꪕ迥銼볯邼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯醼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯醼臣袂臣超裥ꪕ迥鎼볯馼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯颼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯醼臣袂臣超裥ꪕ迥銼볯醼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯醼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥鎼볯鎼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯馼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥鎼볯邼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯醼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥銼볯颼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯銼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥鎼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥鎼볯醼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣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貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯馼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯鎼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯鞼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯馼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯邼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯醼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯馼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯醼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯钼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯馼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯鎼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯邼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯馼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯鎼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯銼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯馼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯閼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯閼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯馼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯钼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯閼볯颼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯馼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯馼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯鎼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯馼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯鞼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯醼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯隼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯鎼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯鞼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯鞼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯邼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯鞼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯醼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯醼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯鞼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯钼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯鎼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯鞼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯邼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯鎼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯鞼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯銼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯閼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯鞼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯馼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯钼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯鞼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯閼볯颼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯馼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯鞼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯鎼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯鞼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯鞼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯隼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯鎼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯钼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯鞼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥醼戼㹲隼볯馼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯銼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯钼볯誁苣뎁藩鞈闧랏볯隼볯鞼苣ꮐ苣膀뻤袁臣鶁苣讁苣ꪁ苣馨髧隌菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀臣讂藦颧臣誁臣ꚁ胣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣袂臣견볯꺁뷯늼볯ꆼ裥邭臣膀臣貂臣貂藩鞈闧랏볯隼볯閼臣袂臣超裥ꪕ迥醼볯閼볯銂郥肂胣设臣낁臣貂臣覂臣讂꣦蒚賥覃菣ꒂ菣銂郥肂胣芁苣讅꟦ꮁ臣蒁臣膀곧醼臣螽볯꺼볯蚈귥誁苣뎁곧銼臣螽볯꺼볯蚈귥꾁胣鶁苣麁苣超裥ꪕ迥醼볯钼볯誁苣뎁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