(57)【要約】本開示は、ナノ粒子送達ビヒクルに基づいて標的ヌクレオチド配列を編集または変更するための組成物および方法に関する。当該組成物および方法は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡにコードされる標的遺伝子産物の機能的な発現に影響するために適用され得る。いくつかの実施形態では、変更された遺伝子配列は、標的細胞の機能を正常化および調整するために有用である。本開示は、ヌクレオチド配列を変える、ならびに／あるいはＤＮＡおよび／またはＲＮＡにコードされる標的遺伝子産物の発現を変える機能化ナノ粒子を生成するための方法、および組成物に関する。変化された遺伝子配列は、標的細胞の機能を正常化し、そして調整するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列に特異的なガイド核酸、
該ガイド核酸の該標的核酸配列への結合により、該標的核酸配列を改変および／または切断するヌクレアーゼ、
ナノ粒子、および必要に応じて、
該標的核酸配列の切断部位への挿入のための核酸配列を含むドナー核酸分子
を含む組成物であって、
少なくとも１つの該ガイド核酸および該ヌクレアーゼが、少なくとも１つの該ナノ粒子にコンジュゲートしている組成物。
【請求項２】
複数のナノ粒子を含み、前記ガイド核酸、前記ヌクレアーゼ、および前記ドナー核酸分子が同一のナノ粒子または異なるナノ粒子へと任意の組み合わせでコンジュゲートしている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ガイド核酸および前記ヌクレアーゼが、前記同一のナノ粒子にコンジュゲートしている、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ガイド核酸および前記ドナー核酸分子が、前記同一のナノ粒子にコンジュゲートしている、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ヌクレアーゼおよび前記ドナー核酸分子が、前記同一のナノ粒子にコンジュゲートしている、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記ガイド核酸、前記ヌクレアーゼ、および前記ドナー核酸分子が、前記同一のナノ粒子にコンジュゲートしている、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
前記ガイド核酸、前記ヌクレアーゼ、および前記ドナー核酸分子がそれぞれ、異なるナノ粒子にコンジュゲートしている、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
前記ナノ粒子が、該ナノ粒子にコンジュゲートしている少なくとも１つの細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つのＣＰＰが、５から９の塩基性アミノ酸を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのＣＰＰが、５から９の連続する塩基性アミノ酸を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＣＰＰが、５から９の連続する塩基性アミノ酸を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ナノ粒子が、直径１ｎｍから５０ｎｍの範囲のサイズである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が、超常磁性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ナノ粒子の中心が、鉄を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が、高分子コートを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ナノ粒子が、固体コアを有さない、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ナノ粒子が、リポソーム、ミセルなどの高分子性である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ナノ粒子が、ＰＬＡおよび／またはＰＬＧＡなどの、１以上の型の生物分解性モノマーをベースとする高分子性である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ガイド核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ガイド核酸が、目的の前記標的遺伝子配列に対して相補的／相同な配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ガイド核酸が、合わせて融合されるｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ガイド核酸がｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、前記ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは別個のナノ粒子にコンジュゲートして会合できる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記標的核酸配列が、細胞のゲノムＤＮＡ内にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記標的核酸配列が、ＤＮＡ配列である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記標的核酸配列が、細胞のゲノムＤＮＡ内にある、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記標的核酸配列が、ＲＮＡ配列である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ヌクレアーゼが、前記ガイド核酸と結合する第１のドメインおよび前記標的核酸配列を切断する第２のドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記標的核酸が二本鎖であり、そして前記第２のドメインが該標的核酸を切除して、二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ＳＳＢ）を生産する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ヌクレアーゼが融合タンパク質であり、そして前記第１および第２のドメインが、別個のタンパク質供給源に由来する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、ニッカーゼ、Ａｇｏ、Ｃｐｆ１、またはこれらの相同体の機能的ドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、ニッカーゼ、Ａｇｏ、Ｃｐｆ１、これらの相同体、または前記ヌクレアーゼのいずれか１つの１以上のドメインの融合体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
取り付けられたタンパク質が、ヒストン脱アセチル化酵素、メチレース、あるいは１以上の酵素活性を有する他のタンパク質、またはこれらの相同体もしくはこれらのタンパク質の１以上のドメインの融合体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記組成物が、前記切断部位で相同組み換えし得るドナー核酸分子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ドナー核酸分子が、前記改変および／または切断部位に隣接する前記標的配列へとハイブリダイズし得る配列を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３５】
第２の標的核酸配列に特異的な第２のガイド核酸をさらに含み、該第２の標的核酸配列が同じ核酸分子内の前記標的核酸配列の１０塩基、１００塩基、５００塩基、７５０塩基、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、もしくはそれ以上、またはこれらの中の任意の数もしくは範囲以内である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３６】
請求項１から３５のいずれか１項に記載の組成物を含む細胞。
【請求項３７】
細胞のゲノムを変える方法であって、該細胞と請求項１から３５のいずれか１項に記載の前記組成物とを接触させることを含む方法。
【請求項３８】
前記ナノ粒子が磁気を帯び、そして前記方法がさらに前記細胞に磁場を印加することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
細胞のゲノムまたは転写産物を変える方法であって、
該ゲノムまたは該転写産物内の標的核酸配列に特異的なガイド核酸、
該ガイド核酸が該標的核酸配列に結合することにより該標的核酸配列を改変し得るタンパク質、および必要に応じて
該標的核酸配列の切断部位への挿入のための核酸配列を含むドナー核酸分子
にコンジュゲートする１つ以上の機能化されたナノ粒子と、該細胞とを接触させることを含む方法。
【請求項４０】
前記タンパク質が、前記標的核酸配列をメチル化する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記タンパク質が、前記ガイド核酸が前記標的核酸配列に結合することにより、該標的核酸配列を切断するヌクレアーゼである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ナノ粒子が磁気を帯び、そして前記方法がさらに前記細胞に磁場を印加することを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記１以上のナノ粒子が、該ナノ粒子にコンジュゲートしている少なくとも１つの細胞膜貫通ペプチド（ＣＰＰ）を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記ガイド核酸、前記ヌクレアーゼ、および前記ドナー核酸分子が、同一のナノ粒子または異なるナノ粒子に、任意の組み合わせでコンジュゲートしている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで接触される、請求項３７または３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月１１日に出願された米国仮出願６２／４０６５４２号の利益を主張し、その開示全体が本明細書に参考として明示的に援用される。
【０００２】
発明の分野
本開示は、ヌクレオチド配列を変える、ならびに／あるいはＤＮＡおよび／またはＲＮＡにコードされる標的遺伝子産物の発現を変える機能化ナノ粒子を生成するための方法、および組成物に関する。変化された遺伝子配列は、標的細胞の機能を正常化し、そして調整するために有用である。
【０００３】
政府ライセンス権の陳述
本発明は、国立科学財団により授与された小企業革新研究（ＳＢＩＲ）フェーズＩ  ＩＩＰ−１２１４９４３のもと、政府援助によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
背景
ヒトの疾患の多くは、細胞ゲノムの遺伝性または後天性の変異によるものである。かかる変異は、アミノ酸の置換もしくは遺伝子発現の未成熟な終結を起こす１ヌクレオチド置換、または、例えば、２以上のクレオチドからなるより大きなセグメントの挿入もしくは欠失などの、より大きな変異をわずかに含み得る。影響される範囲は、遺伝子をコードする配列のみならず、そのコードする範囲の前もしくは後ろに位置する調整配列をも含み得る。ＴＡＬＥＮ系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の発達といった最近の技術進歩は、遺伝子編集および変異の修正を可能にしている。
【０００５】
異常な遺伝子配列を有する細胞の、正常に増殖し、遊走し、そして様々な細胞の型に分化する能力は、様々な病理状態の中で変化するが、その能力は、遺伝子編集ツールを用いた変異の修正により正常化され得る。例えば、骨髄幹／前駆細胞の障害された生存、および／または好中球への障害された分化などの異常な細胞機能は、周期的な、または重度の先天性好中球減少症を有する患者であって、変異型好中球エラスターゼ遺伝子を有し得、重度な生命を脅かす感染に罹患し、そして急性の骨髄性白血病または他の悪性腫瘍を発達し、発展し得る患者において観察される（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ、１０３、３３５５（２００４）；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、９１、５８９（２００６））。他の例として、Ｂａｒｔｈ症候群が挙げられ、その患者は造血細胞の生存異常、および心筋症と呼ばれる障害された心機能を有し得る。（Ｍａｋａｒｙａｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、８８、１９５（２０１２）；ＡｐｒｉｋｙａｎおよびＫｈｕｃｈｕａ、Ｂｒ．Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．、１６１、３３０（２０１３））。Ｂａｒｔｈ症候群などの遺伝性の他の疾患として、おそらくミトコンドリアのＴＡＺ遺伝子内の機能喪失型変異によって誘導される多系統幹細胞障害は、繰り返し発生する重度な、および時として生命を脅かす致死的な感染、ならびに／あるいは心臓移植によって解決され得る心不全を導き得る心筋症を引き起こし得る好中球減少症（血液の好中球レベルの減少）と関連し得る。かかる患者の臨床上の異常は、異なる遺伝子での特定の変異であって、遺伝子機能の変化、および続いて異所性の細胞内の異常という結果をもたらし、細胞死または細胞の機能不全を導く変異によって誘発される。
【０００６】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を用いた好中球減少症患者の処置は、細胞表面に位置するＧ−ＣＳＦ受容体分子内の構造変化を誘導し、続けて一連の細胞内イベントを誘発し、やがて好中球の生産を正常なレベル近くまで回復して、そして患者の生活の質を改善する（ＷｅｌｔｅおよびＤａｌｅ、Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７２、１５８（１９９６））。にもかかわらず、Ｇ−ＣＳＦで処置された患者は、白血病を発達し、発展し得（Ａｐｒｉｋｙａｎら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３１、３７２（２００３）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１４０、２１０（２００８）；Ｎｅｗｂｕｒｇｅｒら、Ｇｅｎｅｓ、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ、５５、３１４（２０１０））、これが、例えば、好中球減少症の処置のために骨髄もしくは造血幹細胞を移植すること、または心不全と戦い、そして心筋の機能を回復もしくは改善するために、ヒト人工多能性幹細胞の分化によって心臓細胞をｅｘ  ｖｉｖｏに生成した後に、患者の心臓内に新たに生成された心臓細胞を移植することなどの、代替の細胞治療アプローチが探索されている理由である（Ｍａｋａｒｙａｎら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．、１０２、１１４３（２０１７））。
【０００７】
代替の分子治療アプローチは、例えば、ＴＡＬＥＮ、ならびにクラスＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系およびクラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系に代表されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系などの遺伝子編集ツールを含む（Ｇａｊら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３１、３９７（２０１３）；Ｄｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、５３２、５２２（２０１７））。これらの技術は、例えば、Ｃａｓ９、ニッカーゼ、Ｃｐｆ１、または他のヌクレアーゼなどの好ましい遺伝子切断酵素を、目的の特定の配列へとガイドするＲＮＡまたはＤＮＡ分子の使用に基づく。かかる標的化は、細胞内で修復され得る一本鎖または二本鎖ヌクレオチド配列の切断を作り出し、そして、もしドナーヌクレオチド配列が標的を囲む範囲との相同性を有しているならば、その時には、修正されたヌクレオチドを含むドナー配列の挿入を伴う相同組み換えが起こり、したがって、遺伝子編集、ならびに正常な遺伝子および細胞機能の回復という結果をもたらす。
【０００８】
一般に、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮＳ、およびＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１方法論に基づく遺伝子編集技術は、低い編集効率、細胞ゲノムの完全性の乱れという結果をもたらし、そして様々な有害な結果を導き得るオフターゲット部位切断、および遺伝子編集ツールの標的細胞内への効率の悪い送達によって特徴づけられる。本開示は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓアプローチと幾分か類似するが、しかしながら異なる遺伝子編集技術であって、他の方法より優れ、そして前記の問題点を解決する単純かつ信頼性の高い遺伝子編集技術の開発について記載する。本開示では、高効率で細胞膜を貫通し、核に到達し、目的の標的遺伝子に高い特異性で結合し、そして遺伝子編集改変を誘導する生理活性のある分子と共有結合された１つの装置として、細胞を透過する多機能化ナノ粒子が用いられる。このナノ粒子が媒介する遺伝子編集は、哺乳動物細胞内への遺伝子編集ツールの速く、そして頑強な導入を提供し、標的細胞ゲノムに組み入り得、そしてゲノムの完全性を乱し得る外因性ＤＮＡの使用を最小化し、そして最高の遺伝子標的化の特異性を保証する故に、代替の方法と比較して最も効率の良い遺伝子編集のためのドライバーである。
【０００９】
現在、多要素遺伝子編集ツールは、ＲＮＡまたはＤＮＡに代表され得るガイド分子、ならびに別個に用いられるか、またはガイドＲＮＡ／ＤＮＡおよびＤＮＡ切断酵素を発現するためのプラスミドもしくはレンチウイルスベクターと共に用いられるＤＮＡ切断酵素（ヌクレアーゼ、ニッカーゼ）を利用している。かかるウイルスまたはプラスミドによる異なる遺伝子編集要素の送達は、細胞ゲノムへのＤＮＡ分子のランダムな組み入れであって、様々な変異を誘導し、宿主細胞での正常な遺伝子発現パターンを変え、そして発がん遺伝子の発現を誘発し、それによってがんまたは他の有害な結果を導くことが知られている組み入れに関連する故に、かかるＤＮＡを豊富に含む系の使用は、大きな問題を表す。さらに、ウイルスおよびプラスミドコンストラクト由来のヌクレオチド配列は、オフターゲット配列と結合し得、そしてしたがって、正常な細胞ゲノム内で、新たな追加の異常なオフサイト変化を作り出す。したがって、ウイルスまたはプラスミドに基づく遺伝子編集は、ヌクレオチド配列の操作、およびその後のヒトでの使用のための最善のアプローチではない。
【００１０】
さらに、かかるガイド分子およびヌクレアーゼをコードする配列の細胞内への導入は、エレクトロポレーションまたはリポソームに基づく融合の使用に基づき、そしてその後の細胞内でのこれらの分子の送達を伴う。これらのアプローチの両方は、様々な型のヒトの細胞において、細胞死の増加、および／または低いトランスフェクション／送達の効率に関連する問題を有する。
【００１１】
本開示は、前記の懸念に取り組み、ヌクレオチド配列の操作のための新しい代替を提供する。かかる遺伝子編集ツールは、明確に非組み入れ機能化ナノ粒子を用いて遺伝子編集エレメントのカクテルを細胞内へと送達することにより、より安全であり得、そしてより効率的に修正し得、そして正常な遺伝子機能を調整する。細胞膜は、外因性の刺激に影響されないように細胞内イベントのカスケードを保護する活動的なバリアーとしての役割を果たすが、この生理活性のある機能化ナノ粒子は、遺伝子編集エレメントを送達するために細胞膜を貫通し得、目的の様々な遺伝子の発現を正常化するか、オンにするか、またはオフし、ならびに／あるいは細胞機能を制御し、必要のある時に不要な細胞を除去し、および／または目的の他の細胞の型へとヒト体細胞を直接的にリプログラムする。
【００１２】
本分野の進歩にも関わらず、生物学的に活性のある分子を細胞内に送達し、効率的に細胞の遺伝子編集を誘導する一方で、染色体構造の完全性に対するダメージを避けるための、さらに効率的なアプローチが、依然として必要とされている。本開示は、非組み入れ遺伝子編集ツール、オフサイト標的の最小化／除去、および無傷なヒト細胞ゲノムの保護のための必要を満たし、そして標的遺伝子配列の制御された編集、および／またはその発現に関するさらなる進歩を達成する、新規手法を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｌｏｏｄ、１０３、３３５５（２００４）
【非特許文献２】Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、９１、５８９（２００６）
【非特許文献３】Ｍａｋａｒｙａｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、８８、１９５（２０１２）
【非特許文献４】ＡｐｒｉｋｙａｎおよびＫｈｕｃｈｕａ、Ｂｒ．Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．、１６１、３３０（２０１３）
【非特許文献５】ＷｅｌｔｅおよびＤａｌｅ、Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７２、１５８（１９９６）
【非特許文献６】Ａｐｒｉｋｙａｎら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３１、３７２（２００３）
【非特許文献７】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１４０、２１０（２００８）
【非特許文献８】Ｎｅｗｂｕｒｇｅｒら、Ｇｅｎｅｓ、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ、５５、３１４（２０１０）
【非特許文献９】Ｍａｋａｒｙａｎら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．、１０２、１１４３（２０１７）
【非特許文献１０】Ｇａｊら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、３１、３９７（２０１３）
【非特許文献１１】Ｄｏｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、５３２、５２２（２０１７）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
要約
本開示はいくつかの実施形態において、遺伝子修正および細胞機能の調整のために、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および／または他の小分子を生体適合するナノ粒子に連結する機能化の方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、機能化された生体適合ナノ粒子それ自体に関する。
【００１５】
ある側面では、本開示は、標的核酸配列に特異的なガイド核酸、標的核酸配列へのガイド核酸の結合によって標的核酸配列を改変および／または切断するヌクレアーゼ、ならびにナノ粒子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、この組成物はさらに、標的核酸配列の切断部位への挿入のための核酸配列を含むドナー核酸分子を含む。少なくとも１つのナノ粒子には、少なくとも１つのガイド核酸およびヌクレアーゼがコンジュゲートされる。
【００１６】
他の側面では、本開示は、本開示に記載されるナノ粒子に基づく組成物を含む細胞を提供する。
【００１７】
他の側面では、本開示は、細胞のゲノムを変える方法を提供する。この方法は、本開示に記載されるように、組成物での細胞への接触を含む。
【００１８】
他の側面では、本開示は、細胞のゲノムまたは転写産物を変える方法を提供する。この方法は、細胞を１以上の機能化ナノ粒子と接触させることを含む。１以上の機能化ナノ粒子は、
ゲノムまたは転写産物内の標的核酸配列に特異的なガイド核酸、および
標的核酸配列へのガイド核酸の結合により、標的核酸配列を改変し得るタンパク質
にコンジュゲートされる。
【００１９】
いくつかの実施形態では、１以上のナノ粒子は、標的核酸配列の切断部位への挿入のための核酸配列を含むドナー核酸分子にコンジュゲートされる。
【００２０】
下記の詳細な説明と添付される図面とを併せて参照すれば、本開示の、これらの、および他の側面は、本分野の当業者に対して、よりただちに明白になる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
詳細な説明
生物学的に活性のある分子を細胞内に送達するために、本開示は、共有結合された生物学的に活性のある分子を有する、細胞膜を貫通するナノ粒子を含む組成物に基づく普遍的なプラットフォームを提供する。この目的のために、本開示で提供されるものは、ナノ粒子へのタンパク質、ペプチド、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子の共有結合を保証する機能化の方法である。本開示の細胞透過可能な改変ナノ粒子は、細胞機能全般を調整および／または正常化するための、ならびにヌクレオチド配列を編集して、遺伝子の発現および機能を修正または向上させるための、生物学的に活性のある分子を細胞内に送達する普遍的な機構を提供し、この機構は続けて、ヒトの細胞機能を向上させる研究および開発、薬剤のスクリーニング、ならびに治療への適用に用いられ得る。
【００２２】
ここで開示される方法は、（これらに限られないが）例えば、科学的な文献（例えば、Ｌｅｗｉｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８、４１０−４１４（２０００）；Ｓｈｅｎら、Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．２９、５９９−６０４（１９９３）；Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｏｅｎｔｇｅｎｅｏｌ．、１５２、１６７−１７３（１９８９）；Ｋｒｕｅｔｅｒら、ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００２１９８；各参考文献全体が、本開示に参考として援用される）にすでに記載された方法からさらに改変された、でなければ類似した、超常磁性の酸化鉄もしくは金ナノ粒子、または高分子ナノ粒子を含む生体適合可能なナノ粒子を利用する。かかるナノ粒子は、例えば、骨髄細胞、リンパ節、脾臓および肝臓の磁気共鳴画像法のための臨床上のセッティングにおいて用いられ得る（例えば、Ｓｈｅｎら、Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｍｅｄ．２９、５９９（１９９３）；Ｈａｒｉｓｉｎｇｈａｎｉら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ．１７２、１３４７（１９９９）を参照のこと；各参考文献全体が、本開示に参考として援用される）。例えば５０ｎｍより小さなサイズであり、そしてＴＡＴに由来する細胞膜透過可能な架橋されたペプチドを含む磁性酸化鉄ナノ粒子は、細胞当たり最大で３０ｐｇの超常磁性鉄ナノ粒子の量で、造血および神経前駆細胞に効率的に取り入れられる（Ｌｅｗｉｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，４１０（２０００））。さらに、この組み込まれたナノ粒子は、骨髄由来ＣＤ３４＋未分化前駆細胞の増殖および分化の特徴または生存能力に影響しない（Ｌｅｗｉｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，４１０（２０００））。したがって、本開示のナノ粒子は、標識された細胞のｉｎ  ｖｉｖｏな追跡に用いられ得るのみならず、ｉｎ  ｖｉｖｏでの遺伝子編集に用いられる際にも非常に有用であり得る。標識された細胞は、分化能力を維持し、そして磁気共鳴画像法を用いて組織試料内で検出され得る。ここで開示されるものは、様々なセットのＲＮＡおよび／またはＤＮＡ、タンパク質、ペプチドならびに他の小分子を有するように機能化される新規なナノ粒子に基づく組成物であって、目的の特定のヌクレオチド配列を標的とし、目的のヌクレオチド配列の変化を導入し、そしてそれによって、細胞機能および特性を調整する、生物学的に活性のある分子を細胞内へと送達するための優れたビヒクルとして役立ち得る組成物である。
【００２３】
ナノ粒子−ペプチド／タンパク質／マイクロＲＮＡコンジュゲートの全般的な記載
ナノ粒子は、例えば酸化鉄または金を含むコアベースであり得る。または、いくつかの実施形態においてナノ粒子は、Ｘ／Ｙ官能基を有する例えば高分子性、つまり生体適合可能な高分子（デキストランポリサッカロイドなど）のコートを有する物質を含み、このＸ／Ｙ官能基に種々の長さのリンカーが共有結合により取り付けられ、そして順にリンカーは、このＸ／Ｙ官能基を介して、タンパク質、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、および/またはペプチド（もしくは他の小分子）に取り付けられる。リンカーの構造は周知であり、そして開示された機能化ナノ粒子の設計に日常的に適用され得る。リンカーは、例えば、タンパク質またはポリヌクレオチドなどの取り付けられた生物活性化合物に構造的な柔軟性を提供し、その結果取り付けられた化合物は適切な三次元構造を維持し得、そして細胞内外のパートナーとより効率的に相互作用および結合するために回転する。
【００２４】
例示的な、架橋に用いられ得る官能基の非限定的な例として、
−ＮＨ２（例えば、リシン、ａ−ＮＨ２）；
−ＳＨ；
−ＣＯＯＨ；
−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）（ＮＨ２）；
−炭水化物；
−ヒドロキシル（ＯＨ）；および
リンカー上のアジド基の光化学を介した取り付け、が挙げられる。
【００２５】
例示的な、架橋試薬の非制限的な例として、
アミノ基およびチオール基を架橋するためのスルホスクシンイミジル誘導体であるスルホ−ＳＭＣＣを含む、ＳＭＣＣ［スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート］；
スルホ−ＬＣ−ＳＭＣＣを含むＬＣ−ＳＭＣＣ（長鎖ＳＭＣＣ）；
アミンと反応し、そしてチオール基を提供するスルホ−ＳＰＤＰを含む、ＳＰＤＰ［Ｎ−スクシンイミジル−３−（ピリジルジチオ（ｐｙｐｒｉｄｙｌｄｉｔｉｏ））−プロピオナート］；
スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰを含む、ＬＣ−ＳＰＤＰ（長鎖ＳＰＤＰ）；
−ＣＯＯＨ基と−ＮＨ２基を連結するために用いられる試薬である、ＥＤＣ［１−エチルハイドロクロライド（ｈｙｄｒｏｃｈｏｌｒｉｄｅ）−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド］；
スルホ−ＳＭ（ＰＥＧ）ｎ誘導体を含むＳＭ（ＰＥＧ）ｎであって、ｎ＝１、２、３、４．．．２４グリコール単位のもの；
スルホ−ＳＰＤＰ（ＰＥＧ）ｎ誘導体を含むＳＰＤＰ（ＰＥＧ）ｎであって、ｎ＝１、２、３、４．．．１２グリコール単位のもの；
カルボキシル基およびアミノ基の両方を含むＰＥＧ分子；および
カルボキシル基およびスルフヒドリル基の両方を含むＰＥＧ分子、が挙げられる。
【００２６】
例示的な、キャッピングおよびブロッキング試薬の非制限的な例として、
ＮＨに特異的なシトラコン酸無水物；
ＳＨに特異的なエチルマレイミド；および
マレイミドに特異的なメルカプトエタノール、が挙げられる。
【００２７】
かかる目的に有用なナノ粒子は、例えば、酸化鉄もしくは金などの金属コアを含み得るか、または金属コアを有さない高分子ナノ粒子であり得るが、封入もしくは連結された生物活性分子であって、経時的に放出され得、交互および／または持続的な効果を導く生物活性分子を含む。
【００２８】
前記の観点から本発明者らは、開示全体が本明細書に参考として援用される２０１４年１１月２０日に発行された米国付与前公報番号２０１４／０３４２００４、および２０１７年６月３日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３５８２３に記載されるように、表面に官能性アミンを有し、タンパク質、核酸および短いペプチドと化学的に結合する生体適合可能なナノ粒子を処置した。手短に説明すると、超常磁性または代替のナノ粒子は、５０ｎｍ未満またはより大きなサイズであり得、そしてナノ粒子当たり１０以上のアミン（または他の）官能基を有し得る。
【００２９】
ＳＭＣＣ（例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒから）は、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、例えばＡＣＲＯＳ（密封バイアルおよび無水物）から得られるジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解される。試料はほぼ即座に密封され、そして使用される。
【００３０】
１０マイクロリットルの前記溶液は、体積２００マイクロリットルのナノ粒子に添加される。これにより、存在する利用可能なアミノ基に対して大過剰なＳＭＣＣが提供され、そして反応を１〜２時間に渡って進行させる。過剰なＳＭおよびＤＭＦは、３０００ダルトンのカットオフの遠心式フィルターカラム（例えばＡｍｉｃｏｎ（登録商標）から）を用いて取り除かれ得る。適切な緩衝液交換を保証するためには、一般に５回の容量交換が必要である。この段階で、過剰なＳＭＣＣが取り除かれることが重要である。
【００３１】
例えば、商業的に利用可能な緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）もしくは精製された組み換えＧＦＰ、または他の任意の目的のタンパク質などの、任意のＲＮＡ、ＤＮＡ、またはペプチドベースの分子は、活性化されたナノ粒子に添加される。生物活性分子−ナノ粒子溶液は反応し、そして未反応な分子は、適切なＭＷカットオフ（ＧＦＰの例では、少なくとも５００００ダルトンのカットオフ）を有する遠心式フィルターユニットによって取り除かれる。試料は、−８０℃冷凍庫または４℃で保存される。Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）の遠心式フィルターカラムを用いる代わりに、例えばＢｉｏ  Ｒａｄ  Ｐサイズ除外カラムなどの、固体のサイズでろ過を行う構成要素を含む小さなスピンカラムも用いられ得る。ＳＭＣＣがスルホ誘導体（スルホ−ＳＭＣＣ）としても購入され得、スルホ−ＳＭＣＣはより水溶性になることにも着目されるべきである。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）も標識試薬の溶媒担体として、ＤＭＦの代わりに用いられ得る；やはり、無水物でなければならない。
【００３２】
他のすべての架橋試薬は、類似した様式で適用され得る。ＳＰＤＰも、ＳＭＣＣと同様の様式で、適切なタンパク質／ペプチドに適用される。ＳＰＤＰはＤＭＦに直ちに溶解する。このジチオールは、１時間以上に渡るＤＴＴによる反応によって切断される。副産物および未反応な物質の除去の後に、それは少なくとも３０００ダルトンＭＷのカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ（登録商標）遠心式フィルターカラムを用いて精製される。
【００３３】
ナノ粒子をペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質で標識する他の手段は、開示全体が参考として本明細書に援用される米国付与前公報番号２０１４／０３４２００４に本発明者らが記載したように、異なる二官能性カップリング試薬を用いることである。
【００３４】
ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質の、ナノ粒子への取り付け
【００３５】
ある実施形態では、様々な比率のＳＭＣＣ標識タンパク質およびペプチドがビーズに添加され、反応し得る。タンパク質およびペプチドの例は、以下でさらに詳細に記載される。
【００３６】
他の側面では本開示は、ヌクレオチド配列の標的化された編集を行って遺伝子配列を正常化／改変すること、目的の遺伝子の発現を制御すること、そして／または細胞における発現のために新しい遺伝子を導入することを介した細胞内活動の調整のために、機能化ナノ粒子に取り付けられた生物活性分子を送達する方法にも関する。例えば、商業的に利用可能であるか、または標準的もしくは改変された実験手順を用いて獲得されるような、動物またはヒトの幹細胞または他の型の細胞は、まず、滅菌状態で、細胞が必要に応じて接着し得る基質（フィーダー細胞、ゼラチン、ｍａｒｔｉｇｅｌ、フィブロネクチンなど）を有する、または有しない固体面上に蒔かれる。蒔かれた細胞は、細胞の分裂／増殖、または許容可能な細胞生存および濃度の維持を可能にする特定の因子の組み合わせと共に、しばらく培養される。例として、細胞の型に適切な血清および／または種々の成長因子があり、これらは後に取り除かれるか、またはリフレッシュされ、そして培養が続けられる。蒔かれた細胞は、標的ヌクレオチド配列結合因子および改変因子（ペプチド、ＤＮＡ、またはＲＮＡベースのガイド分子、ガイド分子との結合能およびヌクレアーゼ活性を有する二機能性または多機能性の酵素、ならびに任意で遺伝子修正に必要なドナーヌクレオチド配列を含むが、これらに限られない）であって、本開示または他で（例えば、開示全体が本明細書に参考として明示的に援用され米国付与前公報番号２０１４／０３４２００４を参照のこと）手短に説明される様々な方法により取り付けられる因子と共有結合された、機能化された生体適合可能な細胞透過ナノ粒子の存在下で、磁場の存在下または非存在下で培養される。生体適合可能な超常磁性ナノ粒子の場合の磁石の使用は、細胞とナノ粒子の間の接触表面積の重要な増加を提供し、そしてそれによって、機能化ナノ粒子のさらに改良された細胞膜の貫通を補強する。さらに、細胞内の目的の遺伝子をコードするヌクレオチド配列を編集した後に磁場を印加することは、処置された細胞からの機能化ナノ粒子の除去を援助し得、さらにかかる遺伝子編集のオフターゲット効果を最小化し、したがって、処置された細胞のゲノム完全性を保存する。
【００３７】
細胞は、培地中で接着したかまたは浮遊した状態で維持され、そして非組み込みナノ粒子は遠心分離または細胞分離によって取り除かれ、クラスターとして存在する細胞を残す。その後、細胞は再び懸濁され、そして適切な期間に渡り新鮮な培地で再培養される。後のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の使用に先立ち、遺伝子編集が確認されるまで、細胞は複数回の、分離、再懸濁、そして再培養というサイクルを受け得る。本開示は、目的の遺伝子または任意の遺伝子調節配列内での、１つまたは複数のヌクレオチド置換、ニック（二本鎖ＤＮＡの内の一本鎖の切断）、欠失、挿入の導入だけでなく、目的の遺伝子のヘテロ接合性またはホモ接合性ノックアウトという結果をもたらす未成熟な切断の導入にも適用可能である。例えば、ヒトの線維芽細胞、血液細胞、上皮細胞、間葉細胞などの、幅広い型の細胞が用いられ得る。
【００３８】
遺伝子編集は、様々なポリペプチド、ＲＮＡ、およびＤＮＡ分子を含み得る生物活性分子を用いた、様々な細胞型または組織の処置に基づく。かかる生物活性分子は、それだけでは細胞膜を効率的に貫通できず、接着細胞または浮遊細胞を標的とするｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの特別な送達ビヒクルがなければ、細胞核に到達し得ない。さらに、これらの生物活性分子は、半減期が短くそして細胞核までの経路において様々なプロテアーゼおよびヌクレアーゼに晒されることで分解され得、まとめると全体として低い遺伝子編集効率という結果をもたらす。これらの不利益は、生物活性分子の効率の減少という結果をもたらし、したがって、目立った遺伝子編集効果を達成するためにさらに高用量での処置を要し、そしてオフターゲット活性の望まぬ増加を導く。したがって本開示では、前記の不利益を克服するために機能化ナノ粒子が用いられる。より具体的には、これらの生物活性分子はナノ粒子と連結され、そしてオリジナルの「裸」の状態と比較されたとき、細胞貫通能力および細胞質、核膜、またはミトコンドリア標的能力、大きなサイズ、変更された全体の三次元構造、ならびに目的の標的遺伝子のヌクレオチド配列および／または発現を編集する獲得された能力を与えるような、新しい物理的、化学的、生物学的な機能特性を獲得する。クラス１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系が、そして後にクラス２ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１が、哺乳動物細胞での遺伝子編集に適するという実証が２０１３年に初めて報告されて以来、かかる編集系の機構および適応可能性を特徴づけるために、多くの研究が行われている。例えば、Ｃｏｎｇら、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９：８１９（２０１３）；Ｍａｌｉら、Ｃａｓ  ９  ａｓ  ａ  Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  Ｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０、９５７（２０１３）を参照のこと。遺伝子編集効果を示す、多くガイド分子およびヌクレアーゼ活性を有する遺伝子産物が、次々と報告されており、そしてこの一覧は増え続けている（Ｈｓｕら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃｅｌｌ  １５７、１２６２（２０１４）；Ｊｉａｎｇら、Ｍｕｌｔｉｇｅｎｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．８１、２５０６（２０１５）；Ｄｏｅｎｃｈら、Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  ｓｇＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２、１２６２（２０１４）；Ｔｓａｉら、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ  Ｅｎａｂｌｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｏｆｆ−Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３、１８７（２０１５）；Ｆｕ．��ら、Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  ＣｅｌｌｓＵ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  Ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．５４６、２１（２０１４）；Ｗｙｖｅｋｅｎｓら、Ｄｉｍｅｒｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  ＦｏｋＩ−ｄＣａｓ９  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｂｙ  Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｇＲＮＡｓ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２６、４２５（２０１５）；Ｋｉｍら、Ｈｉｇｈｌｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｃａｓ９  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２４、１０１２（２０１４）；Ｄｏｎｇら、Ｔｈｅ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｐｆ１  ｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ、Ｎａｔｕｒｅ  ５３２，５２２（２０１６））。
【００３９】
例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼとの親和性および目的の標的ヌクレオチド配列と相同な異なる部分を有するＲＮＡベースのガイド分子、および核局在ドメインを有するＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするｃＤＮＡが、ドナー配列のテンプレートを同伴してエレクトロポレーション法またはリポフェクション法を用いて細胞に導入された。細胞ＤＮＡの標的配列と結合するガイド分子およびＣａｓ９ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡの配列によって定められる特定の場所に、ＤＮＡ中の二本鎖切断（「ＤＳＢ」）を作り出す（Ｃｈｏｕｌｉｋａら、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ｂｙ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉ−ＳｃｅＩ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５、１９６８（１９９５））。２つのかかるＤＳＢは、目的の領域の欠失を生成して非相同末端結合（ＮＨＥＪ）という内因性の機構によって結合され得、それによって目的のヌクレオチド配列を除去する（Ｂｉｂｉｋｏｖａら、Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｕｓｉｎｇ  Ｚｉｎｃ−Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６１、１１６９（２００２））。あるいは正しいヌクレオチド配列と、これに隣接する目的の領域の遺伝子と相同なヌクレオチド配列を含む外因性ドナーＤＮＡテンプレートの存在下では、相同組み換えが起こり、結果として新たに作られた欠失の場所における正しいヌクレオチド配列の挿入をもたらす。これは、「相同性由来組み換え」（「ＨＤＲ」）と呼ばれる（Ｃｈｕら、Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｒｅｐａｉｒ  ｆｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５、３３、５４３（２０１５））。
【００４０】
この遺伝子編集アプローチのさらなるバリエーションとしてニッカーゼの使用が挙げられ、ニッカーゼは遺伝子の標的調整配列へ結合し、そして遺伝子の発現を活性化もしくは阻害することで、標的遺伝子の発現を変え得る不活化ヌクレアーゼ（単独もしくは融合、または他の生物活性分子との組み合わせ）であるか、またはＣａｓ９がＤＳＢを作り出すことと対照的に一本鎖切断（「ＳＳＢ」）を作り出す活性化ヌクレアーゼである。このニッカーゼが、標的となる２つの近接したヌクレオチド配列に対してペアで、そしてドナー配列が存在する下で用いられるとき、ＳＳＢはＨＤＲによって修復され得、（もしあるならば）より低い非特異的オフターゲット活性を示す。このニッカーゼは、改変Ｃａｓ９などの任意の酵素、または以前に記載されたように、ある遺伝子（例えばＣａｓ９）のガイド分子結合ドメインとニッカーゼ（例えばＦｏｋ１ヌクレアーゼ）のヌクレアーゼドメインとを融合することで生成される、任意の融合ニッカーゼ酵素によって代表され得る。Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒら、Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  Ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓ９  ｔｏ  ＦｏｋＩ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２、５７７−５８２（２０１４）。
【００４１】
ヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）のオフターゲット部位への結合は濃度依存的であるため、組み換え酵素とガイドＲＮＡのリボ核タンパク質粒子（「ＲＮＰ」）複合体が遺伝子編集のために生成されており、そしてエレクトロポレーション法またはリポフェクション法によって細胞内に導入され得る。結果としてＲＮＰはＤＮＡを切断し得、そしてその後、細胞内で分解され、おそらくより低いオフターゲット活性という結果をもたらし得る。例えば、Ａｌｔ−Ｒ（登録商標）  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系およびＡｌｔ−Ｒ（登録商標）  Ｓ．ｐ．  ＨｉＦｉ  Ｃａｓ９ヌクレアーゼ  ３ＮＬＳ酵素（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、コーラルビル、ＩＡ）を参照のこと。しかし、このアプローチにおいては細胞内にＲＮＰが存在し続けるため、オフターゲット部位と同様に造血細胞における細胞死の増加および低いトランスフェクション効率が、依然として問題である。本開示における、活性のある酵素を有する非組み入れ機能化ナノ粒子を効率的に除去するための磁場の使用は、この酵素を細胞から急速に取り除くための独特の方法を提供する。
【００４２】
この遺伝子編集アプローチの代替的なバリエーションとして、遺伝子改変活性を有する生物活性分子の使用が挙げられる。例えば、ヒストンタンパク質のＮ末端のリシン残基のアセチル化は正電荷を取り除き、それによってヒストンとＤＮＡとの間の親和性を減らす。これにより、ＲＮＡポリメレースおよび転写因子が、プロモーター領域により容易に接近するようになる。したがって多くの場合、ヒストンのアセチル化は転写を促進するのに対し、ヒストンの脱アセチル化は転写を抑制する。かかるヒストンのアセチル化はヒストンアセチル基転移酵素（ＨＡＴ）によって触媒され、そしてヒストンの脱アセチル化は、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）に触媒される。ＤＮＡのメチル化は、遺伝子の転写に影響するメチル基転移酵素によるＤＮＡのシトシン塩基へのメチル基（ＣＨ３）の付加である。メチル化のパターンは細胞分裂後も遺伝され、故にＤＮＡのメチル化は発達過程での細胞運命の制御において重要な役割を果たす。
【００４３】
現在の遺伝子編集アプローチにおいて起こり得る問題として、標的部位と結合し得るが、酵素が細胞内でタンパク質分解されるためにＤＮＡを切断せず、そしてヌクレアーゼ活性を失うような、早すぎるＲＮＰの分解が挙げられる。かかる問題は、本開示によって取り組まれ、そして数ある利点の中でも本開示は、非組み入れペプチド、タンパク質およびＲＮＡ分子によってＤＮＡの非存在下で機能化され、それによって細胞のゲノムを無傷で保存するようなナノ粒子、あるいはＰＥＧまたは他の化合物もしくは分子などの追加の分解保護化合物の使用を提供する。
【００４４】
さらに前記のように、ガイド分子およびヌクレアーゼを細胞内に送達するためのレンチウイルスベクターの確立された使用は、ヒト細胞ゲノムへのウイルスＤＮＡのランダムな組み入れという結果をもたらすということが知られており、そして、例えばがんなどの有害な結果を導き得る。本開示は細胞ゲノムを無傷で保存する非組み入れ複合体として、上記および／または他の遺伝子編集分子を用いて機能化されたナノ粒子を生成し、そして使用することにより、この問題を克服する。
【００４５】
代替戦略として、現在の遺伝子編集ツールは非ウイルス性プラスミドＤＮＡを用いて細胞に送達された遺伝子産物の発現にも基づき得る。やはり、ＤＮＡのいかなる使用も、宿主細胞のゲノムＤＮＡへの、ヌクレオチドの予期せぬランダムな挿入を誘発しやすく、それによって有害な結果または表現型のゆがみを導き得る。本開示は、遺伝子編集に必要な構成要素を高い効率で送達する細胞貫通機能を有する非組み入れ多機能ナノ粒子に基づく、革新的なアプローチを提供することで、この問題に取り組む。
【００４６】
本開示は、細胞膜を貫通する機能化および非組み入れナノ粒子を使用することにより、挿入突然変異の生成および遺伝子型／表現型のゆがみという問題を克服する。このナノ粒子は、上記または他の生物活性分子であって、その分子への暴露が遺伝子編集、すなわち目的の遺伝子のヌクレオチド配列内の標的化された変化という結果をもたらし得る生物活性分子のいずれかによって機能化される、メタルコア（例えば、超常磁性鉄ベースであるか（電磁場を用いたヌクレアーゼの急速な除去が必要な場合）、もしくは金ベースのナノ粒子などの）であるか、または非コア（例えば、ＰＬＡ／ＰＬＧＡ、リポソーム、またはミセルなどをベースとする高分子性ナノ粒子）であり得る。列挙される細胞型、因子、および／または因子の組み合わせは限定を意図せず、そして追加の因子および／または組み合わせが新たに発見され、そしてこれらの組み合わせは本出願内での記載と同様の方法で作用し得る。
【００４７】
ガイド核酸分子、改変因子（例えば、ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、これらの相同体もしくは機能的な誘導体、または様々な活性を有する他のタンパク質などのヌクレアーゼ）、および／またはドナー核酸分子は、すべて同じナノ粒子にコンジュゲートされ得るか、または代替として前記の構成要素の１つ以上が、任意の組み合わせで異なるナノ粒子にコンジュゲートされ得る。例えば、改変因子（例えば、ヌクレアーゼまたはニッカーゼ）とガイド核酸分子とは同じナノ粒子にコンジュゲートされ得、あるいはドナー核酸分子は、もし用いられるならば異なるナノ粒子にコンジュゲートされ得る。あるいは、ガイド核酸分子およびドナー核酸分子は同じナノ粒子にコンジュゲートされ得、一方で改変因子（例えばヌクレアーゼ）は異なるナノ粒子にコンジュゲートされ得る。あるいは、改変因子（例えばヌクレアーゼ）およびドナー核酸分子は同じナノ粒子にコンジュゲートされ得、一方でガイド核酸分子は異なるナノ粒子にコンジュゲートされ得る。さらに他の代替として、３つの構成要素のそれぞれが、別個の個々のナノ粒子にコンジュゲートされ得る。前記の実施形態のいずれかにおいて複数のナノ粒子は、上でさらに詳細に記載されたナノ粒子の型であって、すべて同じまたは異なるナノ粒子の型であり得る。さらに、個々の機能化ＮＰは合わせて大きな構築物／複合体に凝集しないが、しかし代わり、細胞膜を貫通し別個の個々の機能的な構築物である積み荷を細胞内に送達し得る。
【００４８】
必要があればドナーヌクレオチド配列は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への挿入（または、挿入されるその一部分を有する）を意図されたＤＮＡまたはＲＮＡの配列であり得る。前記のように、これは例えば、細胞ゲノム内の有害な配列を修正するといった様々な適用に有用である。例えばかかる有害な配列は、ネガティブな表現型をもたらす変異であるか、または病原体からの外因性の配列であり得る。あるいは、ドナーヌクレオチド配列は、標的ゲノム内の遺伝子の発現レベルに影響する改変配列を含み得る。例えばこれは、その遺伝子の発現を増強または減少させるが一方で遺伝子自体の実際のコード配列を改変しないような、異なるまたは改変されたプロモーター配列を提供するものであり得る。さらに他の例として、ドナーヌクレオチド配列は、異種のコード配列を（プロモーター配列を伴って、または伴わずに）導入し得、その異種の遺伝子を発現し、そして究極的に、新しいタンパク質を生産する能力を細胞に提供する。
【００４９】
本開示の他の適用は、調整された遺伝子編集およびその発現のための生物活性分子（１つまたは複数の化合物）のスクリーニング／試験である。これは、本明細書で開示された方法を用いてナノ粒子に接着された化合物と、目的の細胞集団（線維芽細胞、血液細胞、間葉細胞などのいずれか）とを結びつけること、適切な期間に渡って培養すること、そして次に、化合物に起因する任意の調整効果を決定することを含む。これは、任意の目的の遺伝子産物を実質的にノックアウトすること、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入、切断、または欠失であるかを問わない、１つ以上の変異を有する遺伝子のヌクレオチド配列であって、さらに、細胞のダイレクトリプログラミング、および／または、例えば、心筋細胞、肝細胞（肝臓細胞）、または神経細胞などの目的の特定の機能的な細胞型の生成に用いられる遺伝子のヌクレオチド配列を変化させること、毒性、代謝変化、または収縮活動への影響について細胞を試験すること、ならびに／あるいは他の機能を含む。
【００５０】
記載された組成物の他の使用は、ヒトまたは動物の体の処置を意図する医薬品として、または送達装置としての特殊化した細胞の製剤である。これにより臨床医は、血管系からまたは直接的に筋肉もしくは器官壁内へと、前記の遺伝子編集分子または他のタンパク質もしくはＲＮＡベースの分子によって機能化された非組み込みナノ粒子を目的の組織（例えば、心臓、骨髄、脳、または肝臓ｅｔｃ．）の内部または周囲に投与し得、それによって特殊化した細胞は生着し、損傷を制限し、そして／または、組織の下部構造の再生成／再成長および特定の機能の回復に参加し得る。あるいは、編集されたゲノムを有する細胞は、記載された機能化ナノ粒子を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで生産され得、必要があれば、標的化リプログラミングによって目的の特定の細胞型へ改変され、そしてその後、被験体の疾患または障害のある臓器の周りの範囲へと投与される。
【００５１】
本開示で特別に定義されない限り、本開示で用いられるすべての用語は、本開示の分野の当業者にとってのものと同じ意味を有する。実施者は特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ら、（ｅｄｓ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら、（ｅｄｓ．）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０１０）へと指向される。
【００５２】
本開示は二者択一のみ、および「および／または」を指す定義を支持するが、本特許請求の範囲での用語「または」の使用は、二者択一のみであるか、または二者択一が相互背反であることを指すと明示的に示されない限り、「および／または」を意味するものとして使用される。用語「遺伝子」および「遺伝子産物」は、互換的に用いられる。
【００５３】
長年の特許法に従い、用語「ａ」および「ａｎ」は、本特許請求の範囲または明細書において用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併せて用いられる場合、特別な記載のない限り、１以上を意味する。
【００５４】
文脈が明白にそうではないことを要しない限り本記述および本特許請求の範囲に渡って、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、排他的または網羅的な語義ではなく包括的な語義；つまり、「含んでいるが、これに限定されない」という語義で解釈される。単数または複数を用いる用語も、それぞれ複数および単数を含む。さらに、用語「本明細書において」、「前記」または「後記」、および類似の趣旨の用語は、本出願で用いられる場合、本出願の全体を指し得、そして本出願のいかなる特定の部分をも指し得ない。
【００５５】
本開示の方法および組成物のために用いられ得るか、これらと併せて用いられ得るか、これらの調製のために用いられ得るか、またはこれらの産物である材料、組成物、および構成要素が開示される。これらの材料の組み合わせ、部分集合、相互作用、集団などが開示される場合、これらの組成物の各１つの組み合わせおよび順列への参照が明示的に開示され得ないが、様々な個々および集団の組み合わせの各々は、特に補完されるものと理解される。この概念は、記載された方法の段階を含むがこれに限らない、本開示のすべての側面に適用される。したがって、任意の前記の実施形態の特定のエレメントは、他の実施形態のエレメントと結び付けられ得るか、または置換され得る。例えば、もし変異を修正するか、または標的遺伝子にヌクレオチド配列の変更を導入することによる、目的の遺伝子の編集のために行われ得る様々な追加の段階がある場合、これらの追加の段階の各々は、任意の特定の方法の段階または開示された方法の、方法の段階の組み合わせと共に行われ得、そして、かかる組み合わせまたは組み合わせの部分集合の各々は、特に補完され、そして開示されたとみなされ得ると理解される。さらに、本開示で記載した実施形態は例えば、本開示のどこかで記載される、または本分野で周知な任意の適した物質を用いて実施され得ると理解される。
【００５６】
本開示で引用される刊行物および引用される主題は、その全体において具体的に参考として本開示に援用される。
【００５７】
さらなる例示および非限定の方法として、後記の実施例は本開示の他の側面を開示する。
【実施例】
【００５８】
実施例１
非組み入れ機能化ナノ粒子によるＰＤ１遺伝子のノックアウト
プログラム細胞死タンパク質１はＰＤ−１およびＣＤ２７９（分化抗原群２７９）としても知られ、ヒトにおいてはＰＤＣＤ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｔ、Ｔａｎｉｗａｋｉ  Ｍ、Ｉｓｈｉｄａ  Ｙ、Ｋａｗａｉｃｈｉ  Ｍ、Ｈｏｎｊｏ  Ｔ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  ＰＤ−１  ｇｅｎｅ（ＰＤＣＤ１）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９４；２３：７０４−６；および、ｔｈｅ  ＮＣＢＩ  ｆｕｌｌ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ＰＤＣＤ１、”Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  １  ［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  （ｈｕｍａｎ）］；Ｇｅｎｅ  ＩＤ：５１３３、２０１７年１０月８日更新、を参照のこと。ＰＤ−１は細胞表面受容体であり少なくとも２つのリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に結合することが知られ、そして免疫チェックポイントとして機能する。ＰＤ−１は、Ｔ細胞の活性化を防ぎ、次いで自己免疫を減らし、そして自己免疫寛容を促進することで、免疫系の下方調整において重要な役割を果たす。ＰＤ−１の阻害効果は、リンパ節内の抗原特異的Ｔ細胞におけるアポトーシス（プログラムされた細胞死）の促進と、同時に制御性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞）におけるアポトーシスの減少という２つの機構を経て成し遂げられる。Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＬＭ、Ｓａｇｅ  ＰＴ、Ｓｈａｒｐｅ  ＡＨ（２０１０年７月）、Ｔｈｅ  ＰＤ−１  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．２０１０；２３６：２１９−４２；および、Ｆｉｆｅ  ＢＴ、Ｐａｕｋｅｎ  ＫＥ、Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＤ−１  Ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１２１７：４５、２０１１、を参照のこと。したがって、ＰＤ−１を遮断する新しいクラスの薬物、ＰＤ−１阻害剤は、腫瘍を攻撃する免疫系を活性化し、そしてそれによって様々な成功の程度でいくつかの型のがんを処置するために用いられる。Ｓｃｈｕｍａｎｎ  Ｋ、Ｌｉｎ  Ｓ、Ｂｏｙｅｒ  Ｅ、Ｓｉｍｅｏｎｏｖ  ＤＲ、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ  Ｍら、Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｎｏｃｋ−Ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｓ９  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＰＮＡＳ、１１２：１０４３７−４２、２０１５を参照のこと。前記の非組み入れ機能化ナノ粒子は、ＰＤ−１阻害剤の魅力的で強力な代替品として標的細胞内でのＰＤ−１遺伝子の発現を止める（例えばノックアウト）ために用いられ得る。
【００５９】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびガイド核酸分子の取り付けのために、様々な道筋の機能化が、後記のかかる道筋の１つと共に用いられ得る。ヌクレアーゼＣａｓ９は、架橋鎖（ＬＣ１、ナノ粒子のアミノ基に取り付けられる）であって、その後にＣａｓ９のスルフヒドリル基に直接的にカップルされるＬＣ−ＳＭＣＣを用いて、ナノ粒子（超常磁性、金、または高分子構成のナノ粒子）に連結される。ＬＣ−ＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒから）は、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、ＡＣＲＯＳ（密封バイアルおよび無水物）から得られるジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解される。試料はほぼ即座に密封され、そして使用される。
【００６０】
１から１０マイクロリットルの前記溶液は、体積２００マイクロリットルのナノ粒子に添加され、これは存在する利用可能なアミノ基に対して様々な比率で過剰なＳＭＣＣを提供し、そして１時間に渡って反応を進行させる。過剰なＳＭＣＣおよびＤＭＦは、３０００ダルトンのカットオフを有するＡｍｉｃｏｎ（登録商標）スピンフィルターを用いて取り除かれ得る。適切な緩衝液交換を保証するためには、少なくとも５回の容量交換が必要である。この段階で、過剰なＬＣ１（ＳＭＣＣ）が取り除かれることが重要である。その後、末端にシステイン残基を有する細胞膜貫通ペプチド（国際公開ＷＯ／２０１３／０５９８３１に記載、参考としてその全体が本明細書に援用される）を、ナノ粒子上のＳＭＣＣと素早く反応させ、そして非結合ペプチドは前記のＡｍｉｃｏｎ（登録商標）スピンフィルターを用いた少なくとも５回の洗浄により除去される。この段階では、ナノ粒子上のアミノ基のいくつかが無傷のまま残り、それによってＳＭＣＣについて前記されたものと同じ手順を用いて取り付けられる、第二の異なる長さのリンカー鎖（ＬＣ２）が共有結合するためのドッキング部位を提供する。やはりこの段階で、過剰なＬＣ２が取り除かれることが重要である。
【００６１】
独立したシステインを有するＣａｓ９またはＣｐｆ１ヌクレアーゼ（または他のヌクレアーゼ／ニッカーゼ）は、記載（Ｓｃｈｕｍａｎｎ  Ｋ．ら、２０１５）のように、ＰＤ−１特異的なガイドＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）と共に３７℃で１０分間プレインキュベートされるか、または１：１の比率でＰＤ−１の標的配列と相同なｇＲＮＡを伴って、ナノ粒子に添加され、そしてこの反応を４℃で２時間に渡って進行させる。例えばＭｙｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈなどの、異なる供給元からの利用可能な適切なサイズのカラムまたは磁石を用いて機能化超常磁性ナノ粒子を通すことで、過剰な薬剤が取り除かれ、そして結果として生じる生成物は、遺伝子編集のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで用いられる。
【００６２】
記載（Ｓｃｈｕｍａｎｎ  Ｋ．ら、２０１５）の新鮮な全血またはバフィーコートのどちらかから単離されたヒトの主要なＴ細胞は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよび標的特異的ｇＲＮＡによって機能化された非組み入れ細胞貫通性ナノ粒子を用いて処置される。手短に説明すると、５％ＣＯ２および環境のＯ２を有する加湿インキュベーター内の固体表面上で、滅菌状態で培養された１００，０００個の細胞が、生物活性分子を有する細胞貫通性機能化ナノ粒子を含む懸濁液を用いて磁場の存在下または非存在下で処置される。機能化ナノ粒子は、接着細胞と同様に浮遊細胞内へのその積み荷の細胞内での送達に有効であり、そしてリポフェクション法またはエレクトロポレーション法を必要としない。
【００６３】
超常磁性ナノ粒子の場合での磁場の使用は細胞とナノ粒子の間の接触表面積の重要な増加を提供し、そしてそれによって機能化ナノ粒子の改良された細胞膜の貫通を保証する。重要なことには、ＰＥＧを取り付けられた、タンパク質ベースのいくつかの薬物のポリ（エチレングリコール）ＰＥＧ媒介保護（ＰＥＧ−ＧＣＳＦ、Ａｍｇｅｎ、ＣＡ；ＰＥＧ−Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ／Ｍｅｒｃｋ、ＮＪ）と類似して、カップルされたペプチドと併せて用いられるナノ粒子は、ポリペプチドの大きさを増やし、そしてタンパク質の表面を覆い、それによってタンパク質分解酵素によるタンパク質の分解を減らし、そして結果としてより高い遺伝子編集効率をもたらす。
【００６４】
細胞は培地中で懸濁され、そして非組み込みナノ粒子はおよそ１２００ｘｇで１０分間の遠心分離によって取り除かれ得、ペレット中にクラスターとして存在する細胞を残す。その後クラスター化された細胞は、再び懸濁され、類似の手順を用いて再び洗浄され、そして適切な期間に渡り、新鮮な培地で再培養される。細胞内に送達された特定の生物活性分子に誘発される、結果として生ずる生物学的な効果が観察されるまで、この細胞は複数回の、細胞クローニングまたは段階希釈による分離、再懸濁、そして培地内での再培養というサイクルを受け得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、その標的部位においてＤＳＢを作り出し、そしてＰＤ−１遺伝子内で２つの異なる標的部位を使用することは、その後の非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復によりＰＤ−１遺伝子のコード配列が欠失することを保証し、ＰＤ−１遺伝子のノックアウトという結果をもたらすということに、ここで着目されなければならない。
【００６５】
ＰＤ−１遺伝子の欠失を確認するために、結果として生じるクローンが拡張され、そしてその細胞由来のゲノムＤＮＡおよび標的領域を渡るＰＤ−１特異的プライマーを用いてＰＣＲが行われ、アガロースゲル上での電気泳動による評価、および／または標的化配列を渡ってシークエンシングを行う。適切な断片サイズの欠如はＰＤ−１遺伝子のノックアウトが成功したことを示す。新たに生成されたＰＤ−１遺伝子を欠き、後天性の向上された免疫反応性を有するヒトＴ細胞は、さらに拡張され得、そして様々な目的に用いられる。
【００６６】
実施例２
非組み入れ機能化ナノ粒子による、挿入突然変異の生成を用いたＰＤ−１遺伝子の不活化
ＰＤ−１遺伝子は、そのリガンドであるＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２との相互作用により機能する。故に、ＰＤ−１のエクソン１内に未成熟終止コドンを導入することは、標的Ｔ細胞におけるＰＤ−１の機能損失、およびＰＤ−１リガンドに対する後天的な不応答性による有意に向上した免疫反応という結果をもたらす。未成熟終止コドンをノックインするために、Ｃａｓ９（ＤＳＢを作り出す）の代わりにＳＳＢを生成するニッカーゼが、ＰＤ−１遺伝子のエクソン１内の標的配列と相同なｇＲＮＡと共に用いられることを除いて実施例１に前記のように、機能化ナノ粒子（それぞれ、ニッカーゼおよび異なる標的特異的ｇＲＮＡを有する対になるナノ粒子）が調製される。これらの、ニッカーゼを有する各非組み入れ機能化ナノ粒子は、エクソン１内の２つの近接した部位でＳＳＢを生成し、間のＤＮＡ断片の切除という結果をもたらす。
【００６７】
切れ目部位の５’および３’隣接領域と相同なドナーテンプレート配列の存在下では相同組み換えが起こり、正常なＰＤ−１コード配列のフレームで終止コドンを有するドナー配列の挿入という結果をもたらす。そのために、実施例１で前記された特定の手順を用いて改変ドナーＤＮＡをナノ粒子のＬＣ２部位に共有結合させることで、第２の型の細胞貫通性ナノ粒子が生成される。
【００６８】
ナノ粒子がＬＣ２に連結するようにＤＮＡを改変するためにドナーＤＮＡ断片は、５’末端をＡＴＰガンマ−Ｓ（市販されているＤＮＡ末端標識キットを用いた、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、バーリンゲーム、ＣＡから）によって標識される。結果として生じる改変ドナーＤＮＡは、実施例１においてＬＣ２段階について記載されるように行われるナノ粒子上のＬＣ２リンカーのマレイミド基とのその後の共有結合に適している。ドナーＤＮＡ配列を有するＩＩ型ナノ粒子は、ニッカーゼおよびｇＲＮＡによって機能化されたＩ型ナノ粒子を伴って細胞の培地中に直接添加され、そして実施例１の記載のように細胞が培養され、そしてクローンが拡張される。エクソン１内に未成熟終止コドンを含むＰＤ−１遺伝子を有する細胞のクローンは、ＰＤ−１に特異的なプライマーを用いたＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動によって、および／または目的の領域を渡るシークエンシングによって評価される。
【００６９】
前記の方法論は、ヌクレアーゼおよびニッカーゼを伴うと同様に、標的化遺伝子編集のための、および標的遺伝子の発現を調整するための多数のＤＮＡ／ＲＮＡ改変酵素を伴って用いられ得る。
【００７０】
本開示の好ましい実施形態が例示され記載されているが、一方で、本開示の精神および範囲から離れることなしに様々な変化がなされ得ることが理解される。最後に、細胞膜を透過する非組み入れの機能化生体適合ナノ粒子を使用する前記の遺伝子編集の方法論は、実質上、任意の目的の遺伝子の編集に適用可能である、ということも着目されなければならない。
排他的な財産または権利が主張される本発明の実施形態は、以下のように定められる。
【国際調査報告】
2019534890.tif 000002
2019534890.tif 000003