(57)【要約】  本開示は、全血試料の定量分析を実施する方法、デバイス、及びキットを提供する。開示された方法、デバイス、及びキットに対する様々な変更が説明される。
2019516377.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス量又は腫瘍量について全血試料の定量分析を実施する方法であって、前記全血試料がウイルス又は腫瘍についての細胞表面マーカーを含有する複数の細胞を含み、ここで前記方法が、
ａ）固定された抗細胞表面マーカー抗体を含有する表面を含む流体流路を規定する管を含むデバイスに前記全血試料を加えること、
ｂ）前記表面と前記試料を前記デバイス内で混合して枯渇試料を生成し、ここで前記枯渇試料が、前記細胞表面マーカーを含有する５％未満の細胞を含み、そして混合工程が、前記流路中にフィルターを伴わず、かつ前記試料中の細胞を溶解させない条件で行われ、及び
ｃ）前記枯渇試料中のウイルス量又は腫瘍量を前記デバイス内で測定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記デバイスは、その内部に配置された試料前処理室を含み、
前記試料前処理室は、近位端から遠位端にわたって第１の隣接区画、内部区画、及び第２の隣接区画を含み、
前記混合工程は、前記試料前処理室の１つ以上の区画を選択的に圧縮して、前記内部区画の流路の直径が前記第１及び第２の隣接区画の流路の直径よりも小さくなるように前記試料前処理室内に流路を形成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記内部区画の流路の直径は、前記第１及び第２の隣接区画の流路の直径の２５〜５０％である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記内部区画の流路の直径は、前記第１及び第２の隣接区画の流路の直径の約３３％である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記デバイスは試料前処理室を含み、前記表面は前記前処理室の内壁である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記枯渇試料は、前記細胞表面マーカーを含有する２．５％未満の細胞を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記枯渇試料は、前記細胞表面マーカーを含有する１％未満の細胞を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ）に続いて、細胞表面マーカー細胞が固定された表面から前記枯渇試料を前記デバイス内で分離することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞表面マーカーは、ＣＤ４、ＣＤ４５、βミクログロブリン、又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルス量又は腫瘍量の測定値は、前記全血試料を提供する患者から採取した血漿試料中のウイルス量又は腫瘍量の測定値に対しそれぞれ直線関係にある、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ウイルス又は腫瘍についての細胞表面マーカーを含有する複数の細胞を含む全血試料中の１つ以上のウイルス又は腫瘍の標的オリゴヌクレオチド配列のＰＣＲ定量分析を実施するように構成されたデバイスであって、当該デバイスが、流体流路及びその内部に配置された複数の区画を規定する管を含み、当該デバイスが、
ａ）近位端から遠位端にわたって第１の隣接区画、内部区画、及び第２の隣接区画を含み、１つ以上の前記区画内に固定された抗細胞表面マーカー抗体を含み、かつフィルターを含まない試料前処理室を規定する前記流体流路内の第１の組の区画、
ｂ）前記試料前処理室に隣接し、かつ各々が試薬調製、標的濃縮、阻害剤除去、核酸抽出、増幅及び即時検出を含む前記ＰＣＲ定量分析のうちの１つ以上の工程を実施する１つ以上の追加の区画を含むＰＣＲ分析領域を規定する前記流体流路内の第２の組の区画、及び
ｃ）前記複数の区画に動作可能に接続され、かつ前記試料前処理室の１つ以上の区画を選択的に圧縮して、前記内部区画の流路の直径が前記第１及び第２の隣接区画の流路の直径よりも小さくなるように前記試料前処理室内に流路を形成する複数の圧縮部材を含み、
前記細胞表面マーカーを含有する５％未満の細胞を含む前記試料前処理室内で枯渇試料を生成するようになっている、前記デバイス。
【請求項１２】
前記内部区画の流路の直径は、前記第１及び第２の隣接区画の流路の直径の２５〜５０％である、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
前記内部区画の流路の直径は、前記第１及び第２の隣接区画の流路の直径の約３３％である、請求項１１又は１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
ウイルス又は腫瘍の１００コピー／ｍＬ未満の検出限界を有する、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記細胞表面マーカーは、ＣＤ４、ＣＤ４５、βミクログロブリン、又はそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、複数の区画を含む試料処理デバイスに関し、少なくとも１つの区画は、全血試料の細胞表面マーカーの枯渇工程を実施するようになっている。
【背景技術】
【０００２】
現在、供給源が限られる環境でのウイルス負荷試験によるＨＩＶ−１の定量は、血漿試料を使用し、ＰＣＲに基づく方法によって集中試験室で実施されている。乾燥した血液滴が代替の試料種として使用されているが、その代替試料は様々な理由で有益である場合があるものの、ウイルス負荷試験への乾燥血液試料の適合性には疑問があり、使用される試験法に依っては、乾燥した血液滴内に存在するプロウイルスＤＮＡ及び細胞内ウイルスＲＮＡがＲＮＡの定量を妨害する。
【０００３】
静脈切開術やラボ機器に頼れない、又はそれらを実施できない供給源が限られる環境やその他の現場ベースの試験においては、血漿の収集やその処理は困難でありまた不可能である。臨床現場即時検査試験は、多数の患者のケアを容易にする能力がある代替物であり、臨床現場即時検査装置を使用して、指や踵への刺し傷を利用して容易に採取され、追加の機器を使用することなく処理する全血試料を分析することができる。しかし、ＲＴ−ＰＣＲによって測定されるＨＩＶウイルス量には、全血試料と血漿との間に乏しい相関性しかない。全血中の白血球細胞のＴ細胞亜集団は、ＨＩＶプロウイルスＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及び細胞関連のウイルス粒子を有する。したがって、全血による定量は、特に低力価で、血漿による定量よりも高くなることが多い。これは、別の方法での１０００コピー／ｍＬの臨床閾値未満を１０００コピー／ｍＬを超えるウィルス量としてしまう可能性がある。これらの結果は、新鮮な凍結した全血で、ならびに乾燥した血液滴でも観察されている。
【０００４】
供給源の限られる環境では血漿試料を採取することが困難であるために、血漿に匹敵する定量結果を得る臨床現場即時検査の分子状ウイルス負荷試験のための解決策を見出すことが望まれる。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書に記載の方法は、ウイルス量又は腫瘍量に関して全血試料の定量分析を実施するために使用される。この方法で使用される全血試料は、ウイルス細胞又は腫瘍細胞の表面マーカーを含有する複数の細胞を含み、この方法は、（ａ）フィルターを含まず、かつ固定された抗ウイルス細胞又は抗腫瘍細胞の表面マーカー抗体を含有する表面を含むデバイス又はその構成要素に全血試料を加えること、（ｂ）デバイス内で表面と試料とを試料中の細胞を溶解させない条件下で混合して、細胞の表面マーカーを含有する５％未満の細胞を含む枯渇試料を生成すること、及び（ｃ）枯渇試料中のウイルス量又は腫瘍量をデバイス内で測定することを含む。
【０００６】
一態様において、標的核酸に対して全血試料の定量分析を実施する方法が提供され、前記全血試料は、標的核酸に関連する細胞表面マーカーを含有する複数の細胞を含み、前記方法は、ａ）流体流路を規定しかつ固定された抗細胞表面マーカー抗体を含有する表面を含む管を備えるデバイスに前記全血試料を加えること、（ｂ）流路内にフィルターは含まずかつ前記試料中の細胞を溶解させない条件で、前記表面と試料を前記デバイス内で混合して、前記細胞表面マーカーを含有する５％未満の細胞を含む枯渇試料を生成すること、及び（ｃ）前記枯渇試料中の標的核酸を前記デバイス内で測定することを含む。
【０００７】
別の態様において、腫瘍量に対して全血試料の定量分析を実施する方法が提供され、前記全血試料は、腫瘍細胞表面マーカーを含有する複数の細胞を含み、この方法は、（ａ）フィルターを含まず、かつ固定された抗腫瘍細胞表面マーカー抗体を含有する表面を含むデバイス又はその構成要素に全血試料を加えること、ｂ）試料中の細胞を溶解させない条件で、表面と試料をデバイス内で混合して、細胞表面マーカーを含有する５％未満の細胞を含む枯渇試料を生成すること、及び（ｃ）枯渇試料中の腫瘍量をデバイス内で測定することを含む。
【０００８】
さらに別の態様において、ウイルス量に対して全血試料の定量分析を実施する方法が提供され、前記全血試料は、ウイルス細胞表面マーカーを含有する複数の細胞を含み、この方法は、（ａ）フィルターを含まず、かつ固定された抗ウイルス細胞表面マーカー抗体を含有する表面を含むデバイス又はその構成要素に全血試料を加えること、ｂ）試料中の細胞を溶解させない条件下で、表面と試料をデバイス内で混合して、細胞表面マーカーを含有する５％未満の細胞を含む枯渇試料を生成すること、及び（ｃ）枯渇試料中のウイルス量をデバイス内で測定することを含む。
【０００９】
さらなる態様において、ウイルス量又は腫瘍量に対して全血試料の定量分析を実施する方法が提供され、前記全血試料は、ウイルス又は腫瘍の細胞表面マーカーを含有する複数の細胞を含み、前記方法は、ａ）固定された抗細胞表面マーカー抗体を含有する表面を含む流体流路を規定する管を含むデバイスに前記全血試料を加えること、（ｂ）流体流路中にフィルターは含まず、かつ前記試料中の細胞を溶解させない条件で前記表面と試料を前記デバイス内で混合して、前記細胞表面マーカーを含有する５％未満の細胞を含む枯渇試料を生成すること、及び（ｃ）前記枯渇試料中のウイルス量又は腫瘍量を前記デバイス内で測定することを含む。
【００１０】
一態様において、前記デバイスは、その内部に配置された試料前処理室を含み、前記試料前処理室は、近位端から遠位端にわたって第１の隣接区画、内部区画、及び第２の隣接区画を含み、前記混合工程は、前記試料前処理室の１つ以上の区画を選択的に圧縮して、内部区画の流路の直径が第１の隣接区画及び第２の隣接区画の流路の直径よりも小さくなるように、試料前処理室内の流路を形成することを含む。一態様において、前記内部区画の流路の直径は、第１隣接区画及び第２の隣接区画の流路の直径の２５〜５０％である。一態様において、前記内部区画の流路の直径は、第１隣接区画及び第２の隣接区画の流路の直径の約３３％である。一態様において、前記デバイスは試料前処理室を備え、前記表面は前記前処理室の内壁である。一態様において、前記枯渇試料は、前記細胞表面マーカーを含有する２．５％未満の細胞を含む。別の態様において、前記枯渇試料は、前記細胞表面マーカーを含有する１％未満の細胞を含む。一態様において、この方法は、工程（ｂ）に続いて細胞表面マーカー細胞が固定された表面から前記枯渇試料を前記デバイス内で分離することをさらに含む。一態様において、前記方法は、ウイルス又は腫瘍の１００コピー／ｍＬ未満の検出限界を達成する。一態様において、前記細胞表面マーカーは、ＣＤ４、ＣＤ４５、βミクログロブリン、又はそれらの混合物からなる群から選択される。特定の態様において、前記細胞表面マーカーはＣＤ４である。一態様において、前記ウイルス量又は腫瘍量の測定値は、前記全血試料を提供する患者から採取した血漿試料中のウイルス量又は腫瘍量の測定値のそれぞれに対し直線関係にある。
【００１１】
特定の態様において、この方法は、１つ以上のウイルス又は腫瘍関連標的オリゴヌクレオチド配列の核酸分析を実施するデバイス内で実行され、このデバイスは、フィルターを含まず、かつ固定された抗ウイルス又は抗腫瘍細胞表面マーカー抗体を含有する表面を含む試料前処理室を備え、この方法は、
ａ）全血試料を試料前処理室に加えること、
ｂ）試料中の細胞を溶解させない条件下で表面及び試料を混合するのに十分な条件で試料前処理室を処理して、ウイルス又は腫瘍細胞表面マーカーを含有する５％未満の細胞を含む枯渇試料、及び細胞表面マーカーの細胞結合表面を生成すること、
ｃ）枯渇試料を表面から分離すること、
ｄ）枯渇試料をデバイス内の試料前処理室から核酸分析領域に移すこと、
ｅ）デバイス内で枯渇試料の核酸分析を実施すること、及び
ｆ）枯渇試料中の１つ以上の標的オリゴヌクレオチドをデバイス内で検出すること、かつ
ｇ）検出工程ｆ）に基づいてウイルス量又は腫瘍量を計算することを含む。
【００１２】
一態様において、１つ以上のウイルス標的オリゴヌクレオチド配列の核酸分析を実施するデバイスで実行される方法が提供され、このデバイスは、フィルターを含まず、かつ固定された抗ウイルス細胞表面マーカー抗体を含有する表面を含む試料前処理室を備え、この方法は、
ａ）全血試料を試料前処理室に加えること、
ｂ）試料中の細胞を溶解させない条件下で表面及び試料を混合するのに十分な条件で試料前処理室を処理して、ウイルス細胞表面マーカーを含有する５％未満の細胞を含む枯渇試料及び細胞表面マーカーの細胞結合表面を生成すること、
ｃ）枯渇試料を表面から分離すること、
ｄ）枯渇試料をデバイス内の試料前処理室から核酸分析領域に移すこと、
ｅ）前記デバイス内で枯渇試料の核酸分析を実施すること、及び
ｆ）枯渇試料中の１つ以上のウイルス標的オリゴヌクレオチドをデバイス内で検出すること、かつ
ｇ）検出工程ｆ）に基づいてウイルス量を計算することを含む。
【００１３】
一態様において、１つ以上の腫瘍標的オリゴヌクレオチド配列の核酸分析を実施するデバイスで実行される方法が提供され、このデバイスは、フィルターを含まず、かつ固定された抗腫瘍細胞表面マーカー抗体を含有する表面を含む試料前処理室を備え、この方法は、
ａ）全血試料を試料前処理室に加えること、
ｂ）試料中の細胞を溶解させない条件下で表面及び試料を混合するのに十分な条件で試料前処理室を処理して、ウイルス細胞表面マーカーを含有する５％未満の細胞を含む枯渇試料及び細胞表面マーカーの細胞結合表面を生成すること、
ｃ）枯渇試料を表面から分離すること、
ｄ）枯渇試料をデバイス内の試料前処理室から核酸分析領域に移すこと、
ｅ）デバイス内で枯渇試料の核酸分析を実施すること、及び
ｆ）枯渇試料中の１つ以上の腫瘍標的オリゴヌクレオチドをデバイス内で検出すること、かつ
ｇ）検出工程ｆ）に基づいてウイルス量を計算することを含む。
【００１４】
別の態様において、細胞表面マーカーを含有する複数の細胞を含む全血試料中の１つ以上の標的オリゴヌクレオチド配列の核酸定量分析を実施するデバイスが提供され、このデバイスは、（ａ）フィルターを含まず、かつ固定された細胞表面マーカー抗体を含有する磁性粒子を含む試料前処理室、及び（ｂ）試薬調製、標的濃縮、阻害剤除去、核酸抽出、増幅及び即時検出を含む前記核酸分析のうちの１つ以上の工程をそれぞれ実施する１つ以上の追加区画を備える核酸分析領域を含み、この試料前処理室は、細胞表面マーカーを含有する５％未満の細胞を含む枯渇試料を生成するようになっている。
【００１５】
一態様において、細胞表面マーカーを含有する複数の細胞を含む全血試料中の１つ以上の標的オリゴヌクレオチド配列のＰＣＲ定量分析を実施するデバイスが提供され、前記デバイスは流体流路を規定する管及びその内部に配置した複数の区画を含み、前記デバイスは、（ａ）近位端から遠位端にわたって第１の隣接区画、内部区画、及び第２の隣接区画、及び前記区画の１つ以上に固定された抗細胞表面マーカー抗体を含み、かつフィルターを含まない試料前処理室を規定する前記流体流路内の第１組の区画、（ｂ）前記試料前処理室に隣接し、かつ試薬調製、標的濃縮、阻害剤除去、核酸抽出、増幅及び即時検出を含む前記ＰＣＲ分析のうちの１つ以上の工程をそれぞれ実施する１つ以上の追加区画を含むＰＣＲ分析領域を規定する前記流体流路内の第２組の区画、及び（ｃ）前記複数の区画に動作可能に接続され、かつ前記試料前処理室の１つ以上の区画を選択的に圧縮して、内部区画の流路の直径が第１隣接区画及び第２の隣接区画内の流路の直径よりも小さくなるように、試料前処理室内に流路を形成する複数の圧縮部材を含み、前記デバイスは、前記細胞表面マーカーを含有する５％未満の細胞を含む枯渇試料を試料前処理室内に生成するようになっている。特定の態様において、このデバイスは、その内部に配置された試料前処理室を含み、前記試料前処理室は、近位端から遠位端にわたって第１の隣接区画、内部区画、及び第２の隣接区画を含み、前記混合工程は、前記試料前処理室の１つ以上の区画を選択的に圧縮して、内部区画の流路の直径が第１の隣接区画及び第２の隣接区画の流路の直径より小さくなるように、前記試料前処理室内に流路を形成することを含む。特定の態様において、内部区画の流路の直径は、第１の隣接区画及び第２の隣接区画の流路の直径の２５〜５０％であり、特に内部区画の流路の直径は、第１隣接区画及び第２の隣接区画内の流路の直径の約３３％である。
【００１６】
一態様において、ウイルス又は腫瘍の細胞表面マーカーを含有する複数の細胞を含む全血試料中の１つ以上のウイルス又は腫瘍標的オリゴヌクレオチド配列のＰＣＲ定量分析を実施するデバイスが提供され、前記デバイスは、流体流路を規定する管及びその内部に配置した複数の区画を含み、前記デバイスは、（ａ）近位端から遠位端にわたって第１の隣接区画、内部区画、及び第２の隣接区画、及び前記区画のうちの１つ以上に固定された抗細胞表面マーカー抗体を含み、かつフィルターを含まない試料前処理室を規定する前記流体流路内の第１組の区画、（ｂ）前記試料前処理室に隣接し、かつ試薬調製、標的濃縮、阻害剤除去、核酸抽出、増幅及び即時検出を含む前記ＰＣＲ分析のうちの１つ以上の工程をそれぞれ実施する１つ以上の追加区画を含むＰＣＲ分析領域を規定する前記流体流路内の第２組の区画、及び（ｃ）前記複数の区画に動作可能に接続され、かつ前記試料前処理室の１つ以上の区画を選択的に圧縮して、内部区画の流路の直径が第１隣接区画及び第２の隣接区画の流路の直径よりも小さくなるように、前記試料前処理室内に流路を形成する複数の圧縮部材を含み、前記デバイスは、前記細胞表面マーカーを含有する５％未満の細胞を含む枯渇試料を試料前処理室内に生成するようになっている。このデバイスの一態様において、前記内部区画の流路の直径は、第１の隣接区画及び第２の隣接区画の流路の直径の２５〜５０％である。一態様において、前記内部区画の流路の直径は、第１隣接区画及び第２の隣接区画内の流路の直径の約３３％である。一態様において、前記デバイスは、ウイルス又は腫瘍の１００コピー／ｍＬ未満の検出限界を有する。一態様において、前記細胞表面マーカーは、ＣＤ４、ＣＤ４５、βミクログロブリン、又はそれらの混合物からなる群から選択される。特定の態様において、前記細胞表面マーカーはＣＤ４である。
【００１７】
本明細書中に開示される方法及びデバイスの特定の態様において、複数の細胞は、単核細胞及びＴ細胞を含み、前記表面は、前記単核細胞及びＴ細胞の細胞表面マーカーに結合する。枯渇試料は、細胞表面マーカーを含有する２．５％未満の細胞、特に１％未満の細胞を含むことができる。この方法は、２００コピー／ｍＬ未満の、特に１００コピー／ｍＬ未満の標的の検出限界を達成できる。細胞表面マーカーは、ＣＤ４、ＣＤ４５、βミクログロブリン、又はそれらの混合物からなる群から選択されてもよく、この表面は、例えば磁性粒子などの粒子、又はデバイスの前処理区画の内壁であってもよい。このデバイス及び方法は、限定はされないが試料中のＨＩＶのウイルス量を含む標的核酸の量を評価するために、ならびに限定はされないが、肝炎（例えば、Ａ型肝炎（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）及びＥ型肝炎（ＨＥＶ）、特にＢ型肝炎及びＣ型肝炎）、エスプタインバー（ＥＢＶ）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、日本脳炎（ＪＮＶ）、チクングニア（ＣＨＩＫ）、デング熱、ＢＫウイルス、ジーカ、バベシア及びそれらの組み合わせを含む標的核酸の量を評価するために使用されてもよい。特定の態様において、このデバイス及び方法は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、又はＨＣＶのウイルス量を評価するために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、典型的な試料処理デバイスを示す。
【００１９】
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、血漿中のコバスＬｉａｔ（登録商標）によるＨＩＶ定量分析のダイナミックレンジを示す。
【００２０】
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、全血中のコバスＬｉａｔ（登録商標）によるＨＩＶ定量分析のダイナミックレンジを示す。
【００２１】
【図４】図４は、血漿及び全血中のコバスＬｉａｔ（登録商標）によるＨＩＶ定量分析の検出限界（ＬＯＤ）を示す。
【００２２】
【図５】図５は、血漿、全血（ＷＢ）、及びＣＤ４抗体粒子（ＷＢ／粒子）で処理した全血を含む５つの患者試料のＨＩＶウイルス量の測定値を示す。ＣＤ４抗体粒子での処理は、２つの試料（番号３及び５）でウイルス量の相関性を改善した。
【００２３】
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、どの程度ＣＤ４抗体粒子での前処理が全血及び血漿のウイルス量の相関性を改善するかを示す。図６Ａには、ＣＤ４抗体粒子の処理前のウイルス量の相関性が示され、図６Ｂには、ＣＤ４抗体の前処理後のウイルス量の相関性が示されている。
【００２４】
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、通常の溶解（図７Ｂ）、激しい溶解（図７Ｃ）、及び細胞の枯渇（図７Ｄ）を実施する試料処理デバイス（図７Ａ）の試料前処理室の構成を示す。
【００２５】
【図８】図８Ａ〜８Ｂは、通常の溶解及び激しい溶解（図８Ａ）、及び細胞の枯渇（図８Ｂ）に使用される圧縮部材のモータ速度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
本明細書において他に定義のない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を持つものとする。さらに、文脈によって特に要求のない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数も含むものとする。「a」及び「an」の冠詞は、本明細書では、その冠詞の文法的な対象である１つ又は１つより多い（すなわち、少なくとも１つ）ことを指すように使用される。例として、「要素（an element）」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
【００２７】
「検出する（detect）」、「検出すること（detecting）」、「検出（detection）」及びその類似の用語は、本出願では、工程、あるいは何らかの有無、ならびに程度、量、水準、又は発生確率を知見又は判定することを広範囲に指すように使用される。例えば、標的核酸配列に関して使用される際の「検出すること」という用語は、その配列の有無、水準又は量、ならびに配列の有無の確率又は尤度の知見又は判定を示すことができる。「有無を検出すること」、「有無の検出」及びそれに関連する表現は、定性検出かつ定量検出を含むと理解すべきである。例えば、定量検出には、試料中のＨＩＶ関連核酸配列の水準、分量又は含量の判定が含まれる。
【００２８】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」の用語は、ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド）のポリマーを指し、天然に存在する核酸（アデノシン、グアニジン、シトシン、ウラシル及びチミジン）、天然に存在しない核酸、及び修飾された核酸を含む。この用語は、ポリマーの長さ（例えばモノマーの数）によっては限定されない。核酸は一本鎖又は二本鎖であってもよく、かつ一般に５’−３’ホスホジエステル結合を含むが、場合によっては、ヌクレオチド類似体は他の結合を有していてもよい。モノマーは、典型的にはヌクレオチドを指す。「非天然ヌクレオチド」又は「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾された窒素性塩基、糖又はリン酸基を含有するか、又はその構造中に非天然部分を組み込んでいるヌクレオチドを指す。非天然ヌクレオチドの例として、ジデオキシヌクレオチド、及びビオチン化した、アミノ化した、脱アミノ化した、アルキル化した、ベンジル化した、かつ蛍光体で標識化した各ヌクレオチドが挙げられる。
【００２９】
「プライマー」という用語は、適切な条件下で核酸ポリメラーゼによるポリヌクレオチド鎖合成の開始点として作用する短い核酸（オリゴヌクレオチド）を指す。ポリヌクレオチド合成反応及び増幅反応は、典型的には、適切な緩衝液、ｄＮＴＰ及び／又はｒＮＴＰ、及び１つ以上の任意の補因子を含み、かつ適切な温度で実施される。プライマーは、典型的には、標的配列に少なくとも実質的に相補的である少なくとも１つの標的ハイブリダイズ領域を含む。この領域は、典型的には約１５〜約４０ヌクレオチドの長さである。「プライマー対」は、標的配列の対向鎖に相補的であり、かつ標的配列を増幅するように設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマー（５’プライマー及び３’プライマーとも呼ばれる）を指す。フォワードプライマー及びリバースプライマーは、標的配列に互いに、例えば約１０〜５０００ヌクレオチド、又は約２５〜５００ヌクレオチドの増幅可能な距離以内に配置される。
【００３０】
本明細書中で使用される「プローブ」は、特異的に意図された標的生体分子、例えばプローブにより結合、捕捉又はハイブリダイズされる目的の核酸配列に、選択的に結合可能な任意の分子を意味する。
【００３１】
「相補的」又は「相補性」という用語は、ポリヌクレオチド中の核酸が別のポリヌクレオチド中の別の核酸と塩基対を形成する能力を意味する。例えば、５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’の配列（ＲＮＡでは、５’−Ａ−Ｇ−Ｕ−３’）は、３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’（ＲＮＡでは、３’−Ｕ−Ｃ−Ａ−５’）の配列に相補的である。相補性は、核酸の一部分のみが塩基対形成に沿って一致するような部分的なものであってもよく、又はすべての核酸が塩基対形成に沿って一致するような完全なものであってもよい。プローブ又はプライマーは、それが標的配列に対し少なくとも部分的に相補的である場合に、標的配列に対し「特異的」であると考えられる。条件にも依るが、標的配列に対する相補性の程度は、典型的には、より長い配列に対するよりも、プライマーのようなより短い核酸（例えば、８０％を超え、９０％、９５％、又はそれ以上）に対する方が高い。
【００３２】
「増幅条件」又はその類似の表現である用語は、プライマーのハイブリダイズ化及び鋳型依存性伸長を可能にする核酸増幅反応（例えばＰＣＲ増幅）での条件を指す。「アンプリコン」という用語は、標的核酸配列の全部分又は一部分を含み、かつ任意の適切な増幅方法による生体外での増幅産物として生成される核酸分子を指す。種々のＰＣＲ条件は、PCR Protocolsの第１４章にあるPCR Strategies（Innis et al., 1995, Academic Press, San Diego, CA）、及びA Guide to Methods and Applications（Innis et al., Academic Press, NY, 1990）に記載されている。
【００３３】
「熱安定性核酸ポリメラーゼ」又は「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、例えば大腸菌由来のポリメラーゼと比較した場合に、高温で相対的に安定であるポリメラーゼ酵素を指す。熱安定性ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）に典型的な温度サイクル条件下での使用に適している。典型的な熱安定性ポリメラーゼには、サーマス・サーモフィラスThermus thermophilus、サーマス・カルドフィラス（Thermus caldophilus）、サーマス種Ｚ０５（Thermus sp. Z05）例えば、米国特許第５，６７４，７３８号を参照）、ならびにサーマス種Ｚ０５ポリメラーゼ（Thermus sp. Z05 polymerase）、サーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）、サーマス・フラバス（Thermus flavus）、サーマス・フィリホルミス（Thermus filiformis）、サーマス種ｓｐｓ１７（Thermus sp. sps17）、ディノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）、ホットスプリングファミリーＢ／コロン７（Hot Spring family B/clone 7）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・カルドテナス（Bacillus caldotenax）、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga neapolitana）、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）及びサーモシホ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）の各変異体、ならびにその修飾版が挙げられる。
【００３４】
「試料」又は「生体試料」という用語は、個体由来の核酸を含むか、又は含むと推定される任意の組成物を指す。この用語は、細胞、組織又は血液の精製成分又は分離成分、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、無細胞部分、又は細胞溶解物を含む。特定の態様において、分析は全血試料に対し実施される。本明細書で使用される「全血試料」は、身体から採取され、かつ血漿や血小板のような構成成分が除去されていない血液を含む。一般に、この試料は、抗凝血剤の添加以外は修飾されていない。この試料はまた、他の種類の生体試料、例えば、血漿、血清、血液成分（白血球膜）、及び乾燥血液滴を指すこともできる。この試料はまた、細胞株を含む個体から得られた細胞の生体外での培養物の組成分及び成分を含んでもよい。
【００３５】
「キット」という用語は、本明細書に記載の標的核酸配列を特異的に増幅、捕捉、タグ付け／変換又は検出するために、本明細書に記載する固相担体を含有する少なくとも１つのデバイスを含む任意の製造物（例えば、パッケージ又は容器）を指す。このキットは、本明細書に記載の方法又はその工程で使用する使用説明書、補充試薬及び／又は構成要素又はモジュールをさらに含むことができる。
方法
【００３６】
本開示は、細胞表面マーカーを含有する複数の細胞を含む全血試料に、標的核酸配列の定量分析を実施する方法を提供する。特定の態様において、標的核酸配列はウイルスの配列であり、細胞表面マーカーはウイルス細胞表面マーカーである。この方法は、
ａ）固定された抗細胞表面マーカー抗体を含有する表面を含むデバイスに全血試料を加える工程、
ｂ）試料中の細胞を溶解させない条件で表面及び試料をデバイス内で混合して、細胞表面マーカーを含有する５％未満の細胞を含む枯渇試料を生成する工程、及び
ｃ）枯渇試料中の標的核酸配列の量をデバイス内で測定する工程
を含む。
【００３７】
標的核酸配列がウイルスの配列である場合に、枯渇試料中の標的核酸配列の量は、試料中のウイルス量と相関する。あるいは、標的核酸配列が腫瘍に関連する場合には、工程ａ）で抗腫瘍細胞表面マーカー抗体を表面に使用し、枯渇試料中の標的核酸配列の量は、試料中の腫瘍量と相関する。
【００３８】
特定の態様において、混合工程は、試料から細胞表面マーカーを濾過することなく実施される。
【００３９】
本明細書に記載の方法で試験される全血試料は、限定はされないが、単核細胞及びＴ細胞、ならびにマクロファージ及び樹状細胞を含む細胞表面マーカーを含有する複数の細胞型を含む。特定の態様において、複数の細胞は、単核細胞及びＴ細胞を含む。
【００４０】
特定の態様において、本明細書に記載の方法及びデバイスは、ＨＩＶウイルス量を分析するために使用され、本明細書に記載の方法で使用されるＨＩＶ感染細胞マーカーは、ＣＤ４、ＣＤ４５、βミクログロブリン、又はそれらの組み合わせであってもよい。特定の態様において、ＨＩＶ感染細胞マーカーはＣＤ４である。さらなるＨＩＶ感染マーカーには、限定はされないが、ＣＤ２７、ＴＮＦＲ−ＩＩ、ＩＬ−１２、及び／又はＣＤ３８を含んでもよい。このデバイス及び方法は、ＨＩＶのウイルス量を評価するために、ならびに限定はされないが、肝炎（例えば、Ａ型肝炎（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）及びＥ型肝炎（ＨＥＶ）、特にＢ型肝炎及びＣ型肝炎）、エスプタインバー（ＥＢＶ）、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、日本脳炎（ＪＮＶ）、チクングニア（ＣＨＩＫ）、デング熱、ＢＫウイルス、ジーカ、バベシア及びそれらの組み合わせを含む他のウイルス量を評価するために使用されてもよい。特定の態様において、このデバイス及び方法は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、又はＨＣＶのウイルス量を評価するために使用される。
【００４１】
さらに、本明細書に記載のデバイス及び方法はまた、その存在が所定の細胞表面マーカーと関連する任意の標的核酸配列の量を評価するために使用することができる。細胞表面マーカーは、患者の特定の疾患状態又は症状に特徴的な特定の細胞型のマーカーとして作用する、細胞の表面に発現されるタンパク質である。例えば、ウイルス細胞表面マーカーは、ウイルス感染のマーカーであり、同様に、腫瘍細胞マーカーは、様々な形態の癌のマーカーである。ウイルス細胞マーカーを評価する際に、試料中のウイルス量が算定され、腫瘍細胞マーカーを評価する際には、試料中の腫瘍量が算定される。通常の腫瘍マーカーとしては、限定はされないが、ＡＬＫ、ＡＦＰ、Ｂ２Ｍ、βｈＣＧ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＢＲＡＦＶ６００変異体、Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７、ＣＡ１５−３／ＣＡ２７．２９、ＣＡ１９−９、ＣＡ−１２５、カルシトニン、ＣＥＡ、ＣＤ２０、ＣｇＡ、上皮由来循環性腫瘍細胞、サイトケラチン断片２１−１、ＥＧＦＲ、ＥＲ、ＰＲ、フィブリン、フィブリノゲン、ＨＥ４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＩｇＧ、ＫＲＡＳ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ＮＳＥ、核基質スタンパク質２２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＳＡ、サイログロブリン、ｕＰＡ、及びそれらの組み合わせが挙げられる。さらに、所定の疾患又は症状の他の細胞マーカー特性もまた、本明細書に記載の方法を用いて分析することができる。例えば、胎児の遺伝マーカーは、本明細書に記載の方法及びデバイスを使用して母体血漿中で検出することができる。
【００４２】
本明細書に記載の方法及びデバイスは、ウイルスの細胞表面受容体に特異な抗体又は他の結合試薬を使用してもよい。「抗体」という用語は、（抗体サブユニットの体外での再会合によって集合したハイブリッド抗体を含む）生来の抗体分子、（例えば、Porter, R. R. and Weir, R. C. J. Cell Physiol., 67 (Suppl); 51-64 (1966)及びHochman, l. Inbar, D. and Givol, D. Biochemistry 12: 1130 (1973)に記載されるような）抗体断片及び抗体の抗原結合領域を含む組換えタンパク質構築物、ならびに化学的に修飾された抗体構築物を含む。本明細書で使用される抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであってもよい。特定の態様において、抗体はモノクローナルである。さらに又はあるいは、本方法及びデバイスは、ウイルス細胞表面受容体に結合特異性を持つ他の結合試薬を使用することができる。この結合試薬は、天然由来であってもよく、又は完全な又は部分的な合成物であってもよく、限定はされないが、配位子、酵素、オリゴヌクレオチド、又はアプタマーが挙げられる。
【００４３】
従って、本明細書に記載の表面は、細胞表面マーカーのための複数の結合試薬を含む。一態様において、この細胞表面マーカーは、限定はされないが、抗ＣＤ４、抗ＣＤ４５、抗βミクログロブリン、抗ＣＤ２７、抗ＴＮＦＲ−ＩＩ、抗ＩＬ−１２、及び／又は抗ＣＤ３８を含むＨＩＶ感染細胞マーカーである。別の典型的な態様において、細胞表面マーカーは、限定はされないが、抗ＡＬＫ、抗ＡＦＰ、抗Ｂ２Ｍ、抗βｈＣＧ、抗ＢＲＣＡ１、抗ＢＲＣＡ２、抗ＢＣＲ−ＡＢＬ、抗ＢＲＡＦＶ６００変異体、抗Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７、抗ＣＡ１５−３／ＣＡ２７．２９、抗ＣＡ１９−９、抗ＣＡ−１２５、抗カルシトニン、抗ＣＥＡ、抗ＣＤ２０、抗ＣｇＡ、抗上皮由来循環性腫瘍細胞、抗サイトケラチン断片２１−１、抗ＥＧＦＲ、抗ＥＲ、抗ＰＲ、抗フィブリン、抗フィブリノゲン、抗ＨＥ４、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗ＩｇＧ、抗ＫＲＡＳ、抗乳酸デヒドロゲナーゼ、抗ＮＳＥ、抗核基質タンパク質２２、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＳＡ、抗サイログロブリン、又は抗ｕＰＡを含む腫瘍マーカーである。特定の態様において、粒子は、例えば２つ以上の異なる細胞マーカーである複数のマーカーを含み、例えば２つ以上のマーカーとして、抗ＣＤ４、抗ＣＤ４５、抗βミクログロブリン、抗ＣＤ２７、抗ＴＮＦＲ−ＩＩ、抗ＩＬ−１２、及び／又は抗ＣＤ３８が挙げられ、または２つ以上のマーカーとして、抗ＡＬＫ、抗ＡＦＰ、抗Ｂ２Ｍ、抗βｈＣＧ、抗ＢＲＣＡ１、抗ＢＲＣＡ２、抗ＢＣＲ−ＡＢＬ、抗ＢＲＡＦＶ６００変異体、抗Ｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７、抗ＣＡ１５−３／ＣＡ２７．２９、抗ＣＡ１９−９、抗ＣＡ−１２５、抗カルシトニン、抗ＣＥＡ、抗ＣＤ２０、抗ＣｇＡ、抗上皮由来循環性腫瘍細胞、抗サイトケラチン断片２１−１、抗ＥＧＦＲ、抗ＥＲ、抗ＰＲ、抗フィブリン、抗フィブリノゲン、抗ＨＥ４、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、抗ＩｇＧ、抗ＫＲＡＳ、抗乳酸デヒドロゲナーゼ、抗ＮＳＥ、抗核基質タンパク質２２、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＰＳＡ、抗サイログロブリン、又は抗ｕＰＡが挙げられる。
【００４４】
特に、この表面は、抗ＣＤ４、抗ＣＤ４５、及び／又は抗βミクログロブリンのうちの２つ以上の複数を含む。あるいは、表面は、抗ＨＩＶ感染細胞マーカーの均一な集団を含む。特定の態様において、表面は複数の抗ＣＤ４抗体を含み、又は複数の抗ＣＤ４５抗体、又は複数の抗βマイクログロブリン抗体を含む。
【００４５】
適切な表面には、ビーズ又は粒子、ならびにこの方法が実施されるデバイスの区画、例えば前処理室の内側の溶液対向壁に配置される結合表面が含まれる。一態様において、表面は、ビーズ、又は磁性粒子、ポリプロピレン粒子、及びラテックス粒子などの他の種類の粒子に基づく分析で一般に使用される（限定はされないが、コロイド又はビーズを含む）粒子などの粒子、及びポリスチレン粒子及びポリアクリルアミド粒子などの固相合成に典型的に使用される材料、ならびにシリカ、アルミナ、ポリアクリルアミド、ポリスチレンなどのクロマトグラフィー用途に典型的に使用される材料を含む。この材料はまた、炭素原線維のような繊維であってもよい。この粒子は、無生物であってもよく、あるいは、細胞、ウイルス、細菌などの生物を含んでもよい。
【００４６】
本方法で使用される粒子は、１つ以上の結合試薬への付着に適し、かつ例えば遠心分離、重力、濾過又は磁気での収集により採取される任意の材料を含んでいてもよい。結合試薬に付着できる多種多様な種類の粒子は、結合分析に使用するように市販されている。これら粒子には、非磁性粒子、ならびに磁場で粒子を採取できる磁化可能材料を含有する粒子が含まれる。一態様において、粒子は、コロイド状金粒子などの導電性材料及び／又は半導電性材料を含む。
【００４７】
粒子は、様々な大きさ及び形状であってもよい。限定はしないが例として、粒子は５ｎｍ〜１００μｍであってもよい。例えば、粒子は２０ｎｍ〜１０μｍの大きさである。特定の態様において、粒子は０．１μｍ〜１０μｍであり、特に５μｍ以下である。例えば、粒子は１〜５μｍである。粒子は、球形、長方形、棒状などであってもよく、あるいは形状は不規則であってもよい。
【００４８】
別の態様において、本明細書に記載の方法を実施するために使用するデバイスは、ウイルス表面マーカーに対する固定された複数の結合試薬を含むように修飾された表面を含む。この態様において、この方法は、ウイルス感染細胞表面マーカーがその上に固定された複数の結合試薬を持つ内部試料対向壁を含む試料前処理室に全血試料を加えることを含む。次いで前処理室は、枯渇試料がウイルス細胞表面マーカーを含有する５％未満の細胞を含むように、枯渇試料及び固定されたウイルス表面マーカー細胞を含有する表面を形成するのに十分な条件で処理される。特定の態様において、試料中の細胞を溶解させない条件で、この処理工程を実施する。次に、より詳細に以下に記載するように、枯渇試料を前処理室から分離し、核酸分析領域に移す。
【００４９】
本明細書に記載の方法を使用して、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２、ならびにその任意の群又は亜型を含むＨＩＶの任意の病原性株を分析できる。例えば、この方法を使用して、ＨＩＶ−１群のＭ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、及びそれらの組み合わせを分析できる。特定の例において、この方法を使用して、ＨＩＶ−１群のＭ及び／又はＯ、場合によって１つ以上のさらなるＨＩＶ−１群を分析する。この方法をさらに使用して、限定はされないが、亜型であるＡ、Ａ１、Ａ２、ＣＲＦ１９、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、ＣＲＦ０２＿ＡＧ、Ｈ、ＣＲＦ０４＿ｃｐｘ、Ｊ、Ｋ、及びそれらの組み合わせを含む１つ以上のＨＩＶ−１の亜型を分析できる。さらにこの方法を使用して、ＨＩＶ−２のＡ〜Ｈ群、特にＨＩＶ−２のＡ群及びＢ群を検出できる。さらにこの方法を使用して、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、又はＣＭＶを検出できる。
【００５０】
特定の態様において、本明細書に記載の方法は、細胞表面マーカーを持つ１０％未満の細胞を含む枯渇試料を生成するように設計される。特に枯渇試料は、細胞表面マーカーを持つ５％未満の細胞、特に細胞表面マーカーを持つ３％未満の細胞、さらに特に１％未満の細胞を含む。さらなる特定の態様において、本明細書に記載の方法は、１０００コピー／ｍＬ未満の全血ウイルス量及び／又は腫瘍量を達成できる。
【００５１】
試料処理デバイス
本明細書に記載の方法は、核酸増幅技術を実施する試料処理デバイス内で実行される。生体試料から抽出された核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び鎖置換増幅反応（ＳＤＡＲ）の典型的な手法のうちの少なくとも一つを使用する核酸の増幅によって、さらに処理されてもよい。いくつかの態様において、生物から抽出された核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）であり、それらの処理は、ＴｔｈポリメラーゼとＴａｑポリメラーゼ又は逆転写酵素とＴａｑポリメラーゼなどの酵素の組合せを用いる結合型逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含んでもよい。いくつかの態様において、刻み目付き環状核酸プローブは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ又はAmpligaseTMを用いて環状化でき、ＤＮＡ標的やＲＮＡ標的のような核酸を誘導でき、続いて体外での選択工程後に閉環状プローブの生成を検出する。この検出は、当業者に周知の酵素を用いてＰＣＲ、ＴＭＡ、ＲＣＡ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ又はＳＤＡＲを介して実施できる。典型的な態様において、核酸の増幅は、核酸増幅中の蛍光の増大を検出する蛍光標識核酸プローブ又はＤＮＡ挿入色素、ならびに分子分析器内の光度計又は電荷結合デバイスを使用して即時に検出することができる。これらの蛍光標識されたプローブは、当業者に周知の検出方式（すなわち、TaqManTM、molecular beaconsTM、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）プローブ、scorpionTMプローブ）を使用し、蛍光の消光ならびに消光時の放出、又は一方のレポーターから他方のレポーターへの蛍光エネルギー移動を通常は使用して、特定の核酸の合成又は存在を検出する。
【００５２】
一態様において、本明細書で開示される方法は、ミクロ寸法からマクロ寸法の内蔵型経路、室、貯蔵部、検出領域及び処理領域を含むデバイスで実行される。このデバイスは、例えば、米国特許第６，４４０，７２５号、６，７８３，９３４号、６，８１８，１８５号、６，９７９，４２４号、８，５８０，５５９号、及び８，９４０，５２６号に記載されるカートリッジ、デバイス、容器、又はパウチであってもよく、ならびにCepheid Corp.、Idaho Technology, Inc.、及び／又はBiofire Diagnostics, Incから入手できるようなデバイスであってもよい。
【００５３】
例えば、本明細書中に記載される方法は、米国公開特許第２０１０００５６３８３号の図１に示されるように、細胞溶解領域、核酸調製領域、第１段階増幅領域、第２段階増幅領域を含む内蔵型核酸分析パウチ内で実行できる。このパウチは、様々なサイズの種々の経路及び膨らみ部を含み、かつ試料がシステム及び種々の領域を通って流れ、それに応じて処理されるようには配置されている。試料処理は、パウチ内に配置された種々の膨らみ部で行われる。処理領域内及び処理領域間で試料を移動させるように多数の経路が設けられ、流体及び試薬を試料に送達し、あるいは試料からその流体及び試薬を除去するようにその他の経路が設けられる。パウチ内の液体は、圧力、例えば空気圧によって膨らみ部間を移動する。特定の態様において、本明細書に記載の細胞枯渇工程は、細胞溶解領域に先行する領域で実施される。
【００５４】
別の例において、本明細書に記載された方法は、米国特許第９，３２２，０５２号の図３〜５及び図９に示されるような内蔵型核酸分析カートリッジで実行できる。このカートリッジは、特に、入口ポートを通して導入された流体試料を保持する試料室、洗浄液を保持する洗浄室、溶解試薬を保持する試薬室、溶解室、使用済みの試料と洗浄液を受け入れる廃物室、中和剤を保持する中和剤室、及び主要混合物（例えば、増幅試薬及び蛍光プローブ）を保持し、その試薬とプローブを液体試料から分離された検体と混合する主要混合物室、反応容器、及び検出室を含む。この特定の態様において、本明細書に記載の細胞枯渇工程は、溶解室に先行する室内で行われる。
【００５５】
特定の態様において、本明細書に記載の方法は、米国特許第７，７１８，４２１号に記載されるような試料処理デバイスで実施される。米国特許第７，７１８，４２１号に記載されるような区画化デバイスは、生体試料を受取り、保存し、処理し、及び／又は分析するのに好都合な容器を提供する。特定の態様において、区画化措置は、複数の処理工程を含む試料処理手順を容易にする。特定の態様において、試料デバイス内に試料を収集し、次いでそのデバイスをデバイス及びその内容物を操作する分析器内に配置して試料を処理する。
【００５６】
特定の態様は、破断可能なシールによって区画に分割された可撓性デバイスを含む。個々の区画は、試料を処理する様々な試薬及び緩衝剤を含んでもよい。締め具及びアクチュエータは、様々な組み合わせで、かつ様々なタイミングで適用されて、流体の移動を導き破断可能なシールを破裂させることができる。この破断可能なシールの破裂では、流体流れに対する障害物を実質的に含まない内部デバイス表面を残していてもよい。一態様において、生体試料の流れは、処理が進行するにつれてデバイスの遠位端に向かって導かれ、一方で廃物の流れは、試料が最初に注入されたデバイスの開口部に向かって反対方向に移動することができる。この試料注入口は、係止機構を備えたキャップによって、場合によっては恒久的に密封されてもよく、廃物室はキャップ内に配置されて、保管するように廃物を受け入れてもよい。この手段の顕著な利点は、処理試料が未処理試料に接した表面と接触しないことにある。その結果、未処理試料中にあり、かつデバイスの壁を覆う可能性がある微量の反応阻害物質が、処理試料を汚染しにくいことになる。
【００５７】
試料処理デバイスは、図１に示され、１６、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０及び／又は１９０などの複数の区画を形成でき、圧縮によって実質的に平坦にできる透明な可撓性デバイス１０を含んでもよい。一態様において、デバイスには少なくとも２つの区画があってもよい。一態様において、デバイスには少なくとも３つの区画があってもよい。この可撓性デバイスは、約２〜１０５℃での動作機能性、試料、標的及び試薬との適合性、低いガス透過性、最小限の蛍光特性、及び／又は反復の圧縮及び屈曲サイクル中の弾力性を提供できる。このデバイスは、様々な材料で作製でき、その材料の例として、限定はされないが、ポリプロピレン又はポリエチレンなどのポリオレフィン、ポリウレタン、ポリオレフィンコポリマー及び／又は適切な特性を提供する他の材料が挙げられる。
【００５８】
さらなる態様において、フィルターをデバイス区画内に埋め込むことができる。一態様において、複数層の可撓性フィルター材料を積み重ねてフィルターを形成することができる。試料と直接接触するフィルターの最上層は、濾過用に選択された孔径を備えてもよく、フィルターの底部層は、はるかに大きな孔径を備える材料を含んで、濾過中に圧力が加えられた際に最上層のための支持構造を提供してもよい。この好ましい態様において、フィルターを折り畳んで袋を形成してもよく、その開放端の端部はデバイスの壁に強固に取り付けられている。フィルター袋を備える区画は、デバイスの外部を圧縮して実質的に平坦にできる場合がある。
【００５９】
さらに、デバイスの試料注入口は、ウイルス感染細胞マーカーの固定化基質又は試料中のウイルス細胞マーカーに結合する培地を含む細胞枯渇モジュールを受け入れ、枯渇試料をその基質又は培地を通して流し、デバイスの試料入口内に流すことができる。このモジュールを使用して、培地／試料の手動混合による細胞枯渇方法を実施することができる。
【００６０】
典型的な態様において、１つ以上の試薬は、デバイス区画内で、乾燥物質として及び／又は溶液として保存することができる。試薬が乾燥形状で保存される場合の態様において、溶液を隣接する区画に保存して、試薬溶液の再構成を容易に行える。典型的な試薬の例として、溶解試薬、溶出緩衝液、洗浄緩衝液、ＤＮＡ分解酵素阻害剤、ＲＮＡ分解酵素阻害剤、タンパク質分解酵素阻害剤、キレート剤、中和試薬、カオトロピック塩溶液、洗浄剤、界面活性剤、抗凝固剤、発芽溶液、イソプロパノール、エタノール溶液、抗体、核酸プローブ、ペプチド核酸プローブ、及びホスホロチオ酸核酸プローブが挙げられる。試薬のうちの１つがカオトロピック塩溶液である態様において、好ましい成分は、イソシアン酸グアニジニウム又は塩酸グアニジニウム又はそれらの組み合わせである。いくつかの態様において、試料が注入される開口部に関連して試薬をデバイス内に保存する順序は、管を活用する方法において試薬の使用可能な順序に反映される。好ましい態様において、試薬は、試料中の所定の成分に特異的に結合可能な物質を含む。例えば、その物質は核酸に特異的に結合してもよく、又は核酸プローブは特定の塩基配列を備える核酸に特異的に結合してもよい。
【００６１】
特定の態様において、上記に説明した枯渇表面に加えて、デバイスは、さらに1つ以上の粒子などの基質を含んで、核酸の選択的吸着を促進できる。この粒子は、例えば、シリカ粒子、磁性粒子、シリカ磁性粒子、ガラス粒子、ニトロセルロースコロイド粒子、及び磁化ニトロセルロースコロイド粒子である。この粒子を常磁性にできるくつかの態様において、粒子は磁場によって捕捉できる。官能基で被覆された表面への核酸分子の選択的吸着を可能にし得る試薬の例は、例えば、米国特許第５，７０５，６２８号、５，８９８，０７１、及び６，５３４，２６２号に記載されている。分離は、溶液のイオン強度及びポリアルキレングリコール濃度を操作して、核酸を固相表面に選択的に沈殿させ、かつ可逆的に吸着させることで達成できる。これらの固相表面が常磁性微粒子である場合に、標的核酸分子が吸着された磁性粒子は、核酸は保持するが他の分子は保持しない条件下で洗浄できる。この工程により単離された核酸分子は、哺乳類細胞のキャピラリー電気泳動、ヌクレオチド配列決定、逆転写、クローニング、形質移入、形質導入、微量注入に適し、遺伝子治療手順、ＲＮＡプローブの生体外合成、ｃＤＮＡのライブラリー構築、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に適している。いくつかの企業が、例えばQIAGENのMagAttractTM, Cortex BiochemのMagaZorbTM、及びRoche Life ScienceのMagNA Pure LCTMなどの磁気に基づく精製システムを提供している。これらの製品は、負に帯電した粒子を使用し、かつ種々の核酸を粒子に選択的に結合させ、粒子を洗浄し、水性緩衝液中で粒子を溶出するように緩衝液条件を操作する。これらの企業によって使用される製品の多くは、核酸の磁性粒子への沈殿を支援するようにカオトロピック塩を活用している。それらの例は、米国特許第４，４２７，５８０号、４，４８３，９２０号、及び５，２３４，８０９号に記載されている。
【００６２】
好ましい典型的な態様は、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０及び／又は１９０（図１）のうちの２つ以上のデバイス区画の直線配列を含んでもよい。この直線配列は、試料及び結果としての廃物及び目的物を管を通して制御された方法で移動させることを容易にする。試料、例えば全血試料は、デバイスの第１の区画１１０内の第１の開口部１２を通して注入できる。その後に、処理された試料からの廃物は、目的物が対向端部に向かって押し出される間に第１の開口部に向かって戻され、それにより、デバイス壁に取り付けられた反応阻害剤による目的物の汚染が最小限に抑えられ、目的物の更なる操作に適切な試薬を収容可能な清浄なデバイス区画に目的物を封入できる。いくつかの態様では、各々が少なくとも１つの試薬を含有する複数の区画を使用する場合がある。いくつかの態様において、これらの区画は、次の通りに試薬を含んでもよい。第２の区画は、枯渇粒子及び／又は固定化結合試薬及び希釈緩衝液を備える表面を含むことができる。第３の区画は、２つの副区画に分割することができ、このうち第１の副区画はタンパク質分解酵素Ｋを含み、第２の副区画はシリカ磁気ビーズ又は他の適切な粒子を含む。第４の区画中の試薬は、溶解試薬であってもよく、第５の区画中の試薬は、いずれかの洗浄緩衝液であってもよく、第６〜第８の区画の試薬は、洗浄緩衝液、中和試薬、懸濁緩衝液、溶出試薬、又は核酸増幅試薬及び核酸検出試薬であってもよい。いくつかの態様において、これらの区画は連続的に配置されてもよく、他の態様においては、これらの区画は、別の区画又は間に入れた区画によって分離されてもよい。
【００６３】
いくつかの態様において、前の段落で説明したデバイスを用いて生体試料から核酸を抽出する方法が検討される。特定の態様において、このような試験での経緯は、１）採取器具で採集された生体試料、２）試験中に必要となる試薬を含有する複数の区画を含み、かつ採取された試料がデバイス中で第1開口部を用いて配置されることができる可撓性デバイス、３）制御された温度及び／又は他の条件に設定され、所定の培養期間中に標的有機物又は核酸を捕捉し得る少なくとも１つの基質、４）基質に結合せず、それにより液体を廃物貯蔵部に移して除去できる未処理の試料中の有機物又は分子、５）デバイスに対して圧縮した締め具及び／又はアクチュエータによって目的物から分離され得る廃物貯蔵部に保管されている廃物、６）デバイスの別の区画から放出され、反応阻害剤を除去できる洗浄緩衝液、７）制御された温度での培養後に基質に結合した目的物を脱離できる別の区画からの溶出試薬、及び８）当業者に周知の技術によって検出され、あるいはデバイス内の第２開口部を通して採取され得る核酸を含む。典型的な態様において、試験が進行するにつれて試料の流れは、デバイスの第１の開口部から遠位端部に向かってもよく、廃物の流れは、デバイスの閉じられた試料注入口に向かってもよく、ここでデバイスのキャップにある廃物室は保管のために廃物を受け取る。その結果、処理された試料と未処理の試料が接触した反応容器の表面との間の望まない接触は回避され、それにより未処理試料中にあり、かつ反応容器壁を覆う可能性のある微量の反応阻害剤による反応阻害を防止する。
【００６４】
いくつかの態様は、区画１６、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０及び／又は１９０などの複数の区画に分割された可撓性デバイス１０を備える試験管１の使用を組み込んでもよく、複数の区画は、デバイスの長手方向軸にわたって配置してもよく、２１０、２２１、２２２、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０及び／又は２９０などの試薬を含んでもよく、ならびにアクチュエータ３１２、３２２、３３２、３４２、３５２、３６２、３７２、３８２、及び／又は３９２などの複数の圧縮部材、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、及び／又は３９０などの締め具、及び３１４、３４４、及び／又は３９４（簡略化のため他は番号なし）などのアクチュエータ及び締め具に対向するブロックを備える分析器を含んで、試料を処理できる。これらのアクチュエータ、締め具及び／又はブロックの様々な組み合わせを使用して、デバイスを閉鎖してそれにより流体を分離できるように効果的に締めることができる。典型的な態様において、アクチュエータ又はブロックのうちの少なくとも１つは、試料処理のためのデバイス区画の温度を制御する熱制御要素を備えてもよい。試料処理デバイスは、区画に磁場をかけることが可能な少なくとも１つの磁場源４３０をさらに備えることができる。試料処理デバイスは、光度計又はＣＣＤのような検出デバイス４９２をさらに備えて、デバイス内で起こる反応又は完了した反応を監視できる。
【００６５】
中央に配置されたアクチュエータと、もし配置したならその側面締め具とを用いてデバイスを圧縮して、流路を介して流体を駆動して、各区画を貫通する約１〜約５００μｍ、好ましくは約５〜約５００μｍの間隙を持つ流路を形成できる。隣接するアクチュエータは、流路に流体連通する隣接区画を穏やかに圧縮して、内圧の片寄りを生成し流路に実質的に均一な間隙を確保する。次いで、２つの隣接するアクチュエータは、デバイスのそれぞれの区画に交互に圧縮し圧力を解放して、制御した流量の流れを発生させることができる。任意の流れ、圧力、及び／又は力センサを組み込んで、流れ挙動の閉ループ制御を可能にしてもよい。流路工程は、洗浄、基質結合効率の向上、及び検出に使用することができる。
【００６６】
粒子固定化及び再懸濁工程を用いて、粒子を試料液体から分離することができる。磁気源４３０（図１）によって生成された磁場は、磁性粒子懸濁液を含有する区画にかけられて、粒子を管壁に捕捉し固定化できる。捕捉固定中に撹拌工程を使用することができる。別の態様において、磁場をかけた区画に流路を形成することができ、磁性粒子を流れ中で捕捉して捕捉効率を高めることができる。固定化された粒子を再懸濁させるために、磁場を切るか又は除去してもよく、撹拌工程又は流路工程を用いて再懸濁することができる。
【００６７】
ある特定の態様において、生体試料から抽出された核酸は、さらにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）転写増幅法（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び鎖置換増幅反応（ＳＤＡＲ）の群からの1つ以上の方法を用いて、核酸の増幅処理を実施されてもよい。いくつかの態様において、生物から抽出された核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）であってもよく、それらの処理は、ＴｔｈポリメラーゼとＴａｑポリメラーゼ、又は逆転写酵素とＴａｑポリメラーゼなどの酵素の組合せを用いる結合した逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を含んでもよい。いくつかの態様において、刻み目付き環状核酸プローブは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ又はAmpligaseTMを用いて環状化され、ＤＮＡ標的又はＲＮＡ標的のような核酸を誘導でき、続いて生体外の選択工程後に閉環状プローブの生成を検出することができる。この検出は、当業者に周知の酵素を用いて、ＰＣＲ、ＴＭＡ、ＲＣＡ、ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡ又はＳＤＡＲを経て行うことができる。典型的な態様において、核酸の増幅は、核酸増幅中に蛍光の増大を検出する分子分析器で、蛍光標識核酸プローブ又はＤＮＡ挿入色素、ならびに光度計又は電荷結合デバイスを使用して即時に検出できる。これらの蛍光標識されたプローブは、当業者に周知の検出方式（すなわち、TaqManTM、molecular beaconsTM、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）プローブ、scorpionTMプローブ）を使用し、蛍光の消光ならびに消光時の放出、又は一方のレポーターから他方のレポーターへの蛍光エネルギー移動を通常は使用して、特定の核酸の合成又は存在を検出する。
【００６８】
デバイス区画からの信号の即時検出は、ブロック４９０などのブロックに接続された光度計、分光計、ＣＣＤなどのセンサ４９２（図１）を使用して達成できる。典型的な態様において、デバイス区画１９０のアクチュエータ３９２によって圧力を加えて、デバイス区画の形状を適切に規定することができる。信号の方式は、蛍光、スペクトルのような特定の波長の光の強度、及び／又は細胞の画像などの画像、又は量子ドットのような人工要素であってもよい。蛍光の検出のために、光学システムからの光の励起を用いて反応系を照射することができ、その発光は光度計によって検出することができる。特定の波長を持つ複数の信号を検出するように、専用の検出チャネル又は分光器によって異なる波長信号を直列又は並列で検出できる。
【００６９】
キット
いくつかの態様において、本開示の方法を実施する試薬、材料、及びデバイスが、キット内に含まれる。いくつかの態様において、このキットは、試料を入手し、保存し、及び／又は調製する構成要素を含む。この構成要素には、例えば、無菌針及びシリンジ、枯渇モジュール、ＥＤＴＡ被覆チューブ、（例えば、核酸を基質に結合させ、基質から溶出する）緩衝液、ＲＮＡ分解酵素阻害剤、及び／又はＤＮＡ分解酵素などが含まれる。
【００７０】
さらに、このキットは、上述のような分析処理デバイスを含み、及び試料を入手し、保存し、及び／又は調製し、かつ限定はされないが上述のような枯渇モジュールを備える１つ以上の構成要素を任意に含む。特定の態様において、分析処理デバイスは、本明細書に開示された方法を実施するのに必要な様々な試薬を含み、その試薬はデバイスの１つ以上の区画内に保存される。
【００７１】
このキットは、例えば、検出される配列が野生型であるポリヌクレオチド、又は検出される配列を含むポリヌクレオチドなどの対照をさらに含むことができる。
【００７２】
このキットはまた、試料管又はバイアルのような追加のデバイス、反応容器（例えば、管、複数のウェル板、マイクロ流体チップ又はマイクロ流体室など）、ならびに使用又はウェブサイトへの照合のための指示書を含む。
【実施例】
【００７３】
実施例１：ウイルスＲＮＡの単離及び全血からの検出
ＲＮＡ単離及びＲＮＡ配列検出は、管１（図１）内で実施でき、この管は、剥離可能なシールによって分離され、予め充填された試薬を含む９つの区画を備える可撓性デバイス、及びその内部に収容された廃物貯蔵部を備えるキャップを含む。デバイスの１つの区画又は副区画から他の区画又は副区画への流体の流れは、デバイスの１つ以上の区画又は副区画内に動作可能に接続された１つ以上のアクチュエータ及び締め具の選択的な係合によって本明細書に記載されるように制御される。このデバイスの第１の区画は、全血試料を受入れることができる。第２の区画は、１００μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、４．３ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、１．４ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．３）を含む希釈緩衝液中に懸濁した抗ＣＤ４抗体に結合した５６０μｇのDynal ParticlesTM（Dynal Biotech）を含有する。第３の区画は、定量標準を含有する。第４の区画は、２つの副区画に分割され、第１の副区画は２００μｇのタンパク質分解酵素Ｋを含み、第２の副区画は２５０μｇのシリカ磁性粒子を含み、これら副区画は剥離可能なシールによって分離されている。第５の区画は、４．７Ｍの塩酸グアニジニウムを含有するカオトロピック塩、１０ｍＭの尿素、１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ５．７、及び２％のトリトンＸ−１００を含む２００μＬの溶解緩衝液を含有する。第６の区画は、（例えば、５０％エタノール、２０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５を含む）８０μＬの洗浄緩衝液を含有する。第７の区画は、８０μＬの２０ｍＭの２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液をｐＨ５．３で含有する。ＭＥＳ緩衝液は、粒子からのＤＮＡ溶出を回避するのに十分な低いｐＨに調整される。第８の区画は、４０μＬの溶出緩衝液（例えば、１０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．５、又はＰＣＲに適した任意の緩衝液）を含有する。溶出緩衝液は、粒子の表面から緩衝液中にＤＮＡを溶出させるのに十分な高いｐＨに調整される。第９の区画は、ＰＣＲ試薬を含有する（その試薬は、それぞれ１０ｎｍｏｌのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、２０ｎｍｏｌのｄＵＴＰ、２．５ｍｍｏｌのＫＣｌ、２００ｎｍｏｌのＭｇＣｌ2、１〜５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、１〜５単位のＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、それぞれ２０〜１００ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチドプライマー、及び６〜２５ｐｍｏｌのＴａｑＭａｎプローブ）。第１０の区画は、ＭｇＣｌ2などの二価の金属補因子を含んでもよい。第９（又は第１０）の区画の端部は、増幅反応の生成物を回収するために恒久的に密封され、又は圧力ゲートを備えて、ＤＮＡ配列決定又は当業者に周知のいくつかの他の試験による遺伝子型判定試験の結果を確認する。
【００７４】
ウイルスＲＮＡの単離及び検出のために、１００μＬの全血を第１の区画に負荷する。次にデバイスはキャップで閉じ分析器内に挿入できる。試料処理は、以下の手順を含むことができる。
（ａ）細胞の枯渇及び試料の溶解：  第１の締め具を除くすべての締め具を、デバイスの上から閉じる。第１の区画に作動可能に接続されたアクチュエータを、血液量を調節するように使用し、区画内に約１００μＬを保持し、次いで第１の区画を対応する区画締め具を用いて閉じる。第２の区画に動作可能に接続されたアクチュエータは、全体的に又は部分的に、第２の区画の第１の副区画を圧縮して第１、第２及び第３の区画間の剥離可能なシールを破壊し、抗ＣＤ４粒子を試料及び定量標準と混合する。第１の副区画に動作可能に接続されたアクチュエータを、この副区画を交互に圧縮して、粒子を試料と混合できる。次に第３の区画の近傍の磁気源によって磁場を発生させて粒子を捕捉できる。その区画／副区画内の対応するアクチュエータ及び締め具を係合させて、細胞枯渇試料を第４の区画に移動させ、第４の区画上の締め具を閉じて、枯渇細胞が下流の枯渇試料と混合しないようにし、次に第５の区画に移動させて溶解緩衝液と細胞枯渇試料とを混合する。第４及び第５の区画内の混合物を５０℃で２分間培養する。
（ｂ）核酸捕捉：  溶解液の培養後に、アクチュエータは、それらの各区画を交互に圧縮し、混合物を攪拌しかつ室温で２分間培養して粒子へのＤＮＡ結合を促進する。次いで、磁場が区画の近傍の磁気源によって形成され、懸濁液中の粒子を捕捉する。アクチュエータは、それらの区画を交互に圧縮して粒子を捕捉できる。アクチュエータ及び締め具は、未結合試料及び廃物を廃物貯蔵部に移動するように順次開閉される。
（ｃ）洗浄；  捕捉行程に続いて、洗浄工程が、さらなる試料処理に使用される粒子及び区画から、残留かす及び反応阻害剤を除去するために実施される。希釈に基づく洗浄はエタノール洗浄緩衝剤と共に使用され、流動に基づく洗浄はＭＥＳ洗浄緩衝液と共に使用される。締め具とアクチュエータがまず開いて、次にアクチュエータが閉じてエタノール緩衝液を第６の区画に移動させ、続いて締め具が閉じる。アクチュエータ及び少なくとも１つの隣接するアクチュエータを、磁場はかけずにそれらの各区画に対して交互に圧縮して、粒子を再懸濁する流れを生成する。その後、磁場をかけて実質的に全ての粒子を捕捉し、液体を廃物貯蔵部に移動させる。最初の洗浄が完了した後に、ＭＥＳ洗浄緩衝液をある区画から別の区画に移動させ、対応するアクチュエーター及び締め具を順次適用及び解放しその緩衝液を操作して、流路を通る洗浄緩衝液を本質的に層流とすることを確実にする。洗浄が完了すると、アクチュエータ及び締め具を閉じ、実質的にすべての廃物を廃物貯蔵部に移動させる。
（ｄ）核酸溶出：  前述と類似の工程を用いて、溶出緩衝液を第の８区画から移動させる。磁場をかけずに、粒子を第４及び第５の区画間の流動下で溶出緩衝液中に再懸濁する。粒子懸濁液を、定常流又は攪拌条件で９５℃で２分間培養する。磁場をかけて、実質的に全ての粒子を固定化し、アクチュエータ及び締め具を順次開閉して、溶出した核酸溶液を第８の区画に移動する。アクチュエータは、第８の区画を圧縮して、溶出された核酸溶液の容量を４０μＬに調整し、次に締め具をデバイスに対し閉じてＤＮＡ抽出工程を完了する。
（ｅ）核酸増幅及び検出：  次に核酸溶液を第９の区画に移し、混合し、ＵＮＧ２８０と共に３７℃で１分間培養して、生体試料中に存在していた可能性がある任意の汚染ＰＣＲ産物を分解できる。培養後に、温度を９５℃に上げて、核酸及びＵＮＧを２分間で変性させてもよい。その後、核酸溶液を第１０の区画に移し、６５℃で１０分間ＲＴ−ＰＣＲ試薬と混合し、続いて６０℃で培養してホットスタートＰＣＲを開始することができる。９５℃で２秒間及び６０℃で１５秒間の５０サイクルによる典型的な二温度増幅分析は、第８の区画を９５℃に第９の区画を６０℃に設定し、かつ関連のアクチュエータを開閉して区画間で反応混合物を交互に移動させることにより実施される。９５℃で２秒間、６０℃で１０秒間、７２℃で１０秒間の５０サイクルによる典型的な三温度増幅分析は、第８の区画を９５℃に、第９の区画を７２℃に、第１０の区画を６０℃に設定し、かつ関連のアクチュエータを開閉して区画間で反応混合物を交互に移動させることにより実施される。第９の区画に光学的に接続された光度計のような検出センサは、デバイス壁の一部を通してレポーター色素からの即時蛍光発光を監視することができる。分析の完了後に、試験結果が報告される。
【００７５】
実施例２：オフラインのＣＤ４枯渇及び分析
ロッシュのコバスＬｉａｔ（登録商標）６８００／８８００ＨＩＶ定量較正パネルを用いて、血漿のダイナミックレンジを決定した。パネル成分は、以下の表１に提供される。
【表１】
2019516377.tif 000003
【００７６】
各ロッシュパネル部材に対して、３つの複製物をコバスＬｉａｔ（登録商標）分析器で試験した。コバスＬｉａｔ（登録商標）分析器で試験を行うために、１００μＬの各パネル部材材料を１００μＬの希釈緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．１％アジ化ナトリウム）と混合し、次いでこの希釈した材料を下記の分析試薬を予め詰めたコバスＬｉａｔ（登録商標）デバイスに加えた。このデバイスをコバスＬｉａｔ（登録商標）分析器内で分析し、分析の完了時に、Ｃｔ（サイクル閾値）と標的注入量水準をダイナミックレンジの回帰分析に使用した。その結果は、図２Ａ〜２Ｂのように、血漿中では６点に対し対数直線性を示し、かつその分析の定量基準性能に対するＨＩＶの阻害は見られない。
【００７７】
全血のダイナミックレンジについて、ロッシュＨＩＶ−１定量較正パネル部材（表２参照）に、貯蔵した正常ヒトＥＤＴＡ全血を１：２０の比で添加した。例えば、ＨＩＶ−１を添加した１ｍＬの全血試料を作製するために、５０μＬのパネル部材を９５０μＬの正常ヒト全血（Bioreclamation IVT、カタログ番号：HMWBEDTA2）と組み合わせて、ピペット操作により混合した。以下の表２に示すように、全血のダイナミックレンジに対して４つの試験試料を調製した。
【表２】
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【００７８】
各試料に対して、３つの複製物をコバスＬｉａｔ（登録商標）分析器で試験した。コバスＬｉａｔ（登録商標）分析器で試験を行うために、１００μＬの全血試料を１００μＬの希釈緩衝液と混合し、次に充填した他の分析試薬を予め詰めたコバスＬｉａｔ（登録商標）デバイスに加えた。このデバイスをコバスＬｉａｔ（登録商標）分析器内で分析し、分析の完了時に、Ｃｔ及び標的注入量の水準をダイナミックレンジの回帰分析に使用した。その結果は、図３Ａ〜３Ｂのように、全血中で少なくとも４点に対し対数直線性を示し、分析の定量基準性能に対するＨＩＶの阻害は見られない。さらに、血漿と全血に対する分析の検出限界（ＬＯＤ）を図４に示す。
【００７９】
各患者の血液試料について、血漿及び全血中のウイルス量を評価し、ならびにＣＤ４抗体の細胞枯渇後の全血中のウイルス量を測定した。
【００８０】
Vacutainer Lavender採血管中の１０ｍＬの全血から血漿を分離するために、室温のSorvall遠心分離機により１２００ｇで１０分間遠心分離を実施した。上清（血漿）を標識化した５０ｍＬの遠心分離管に移した。Eppendorf管に８０μＬの希釈緩衝液を添加し、続いて１００μＬの全血試料を添加した。Eppendorf管に血液試料を加える前に、血液が均一になるまで試料管を逆にして全血試料を混合し、続いてピペット操作を３〜５回実施した。血液及び希釈緩衝液をピペット操作で６回混合した。
【００８１】
ＣＤ４抗体粒子を１５秒間渦巻き混合して粒子を再懸濁させ、次いで２０μＬのＣＤ４抗体を備えるDynabeadsをEppendorf管に添加した（ＣＤ４抗体粒子の種類に依るが、１００〜５００μｇ）。この混合物を２回渦巻き混合して（１回当たり１秒）、試料を粒子と混合した。その管を回転機に載せ、室温で１０分間回転しながら培養した（回転機は６０°の傾斜角と１０ｒｐｍに設定した）。この管を磁気棚に１分間配置し、その後にすべての液体（〜２００μＬ）をコバスＬｉａｔ（登録商標）デバイスに移した。管が第２の区画内に粒子を含まないこと以外は、実施例１に記載の管内で、枯渇試料中のＲＮＡ単離及び配列検出を完了した。第２の区画は、代わりに定量標準を含んだ。
【００８２】
各患者試料に対して、１００μＬの希釈緩衝液と混合した１００μＬの血漿、１００μＬの希釈緩衝液と混合した１００μＬのＥＤＴＡ全血、及びＣＤ４抗体細胞枯渇を含む１００μＬのＥＤＴＡ全血を、コバスＬｉａｔ（登録商標）デバイスに負荷して、コバスＬｉａｔ（登録商標）分析器で試験した。試験の終了後にデータを収集した。血漿又は全血でのダイナミックレンジの回帰において生成された関係式を使用して、各試料種のウイルス量を計算した。血漿と全血の間のウイルス量の相関性、又は血漿とＣＤ４細胞枯渇を含む全血の間のウイルス量の相関性を評価した。
【００８３】
上記の方式に従って、ＣＤ４磁性粒子との１回の結合により、未凍結全血試料から９６％のＣＤ４陽性細胞を削除できた。結果を表３及び図５、及び図６Ａ〜図６Ｂに示す。図５では、ＣＤ４の枯渇処理が、試料３及び５においてウイルス量の相関性を改善したことを示す。図６Ａでは、ＣＤ４の枯渇前のウイルス量の相関性を示し、図６Ｂは、枯渇処理後のウイルス量の相関性を示す。
【表３】
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【００８４】
試験した５つの患者試料のうち、２つの試料の血漿中ウイルス量の測定値は、１０００コピー／ｍL未満であり、２つの患者試料の直接的全血中ウイルス量の測定値は、１０００コピー／ｍLより高かった。２つの患者全血試料をＣＤ４抗体粒子で前処理することにより、全血及び血漿のウイルス量の相関性が改善された。抗ＣＤ４粒子による前処理の後には、その前に検討した同一の２つの試料の全血のウイルス量は、１０００コピー／ｍL未満となった。
【００８５】
実施例３：コバスＬｉａｔ（登録商標）デバイスでのＣＤ４枯渇の最適化条件
所望の細胞溶解度に基づいて、管内での種々の流体の流動駆動機構を評価した。上述のように、通常は図１に示すデバイスでは、流体の流動は、中央に配置されたアクチュエータ及びそれに隣接する締め具を用いて管の所定の区画を圧縮して制御されて、約１〜約５００μｍ（０．００１〜０．５ｍｍ）、例えば約５〜５００μｍ（０．００５〜０．５ｍｍ）の間隙（すなわち流路の直径）を持つ流路をデバイス内に形成する。隣接するアクチュエータは、流路と液体連通する隣接区画を穏やかに圧縮し、ずれた内圧を生成流路に形成して、実質的に均一な流路の間隙を確保する。細胞溶解の程度は、完全な細胞溶解を達成するのに使用された範囲に対して、前処理区画のより短い範囲にわたって間隙を変化させて変更できることが見出された。したがって、この方法を使用して、細胞前処理区画に配置されるフィルターを使用せずとも、細胞溶解の無い細胞枯渇を達成することができた。
【００８６】
試料前処理区画（すなわち、試料導入ポートと核酸捕捉に使用する区画との間に配置されたデバイス部分）で使用するように、３種の異なる流体流動機構を設計した。
ａ）通常の溶解の流体流動（細胞溶解を伴う低剪断の混合）、
ｂ）激しい溶解の流体流動（細胞溶解を伴う高剪断の混合）、及び
ｃ）細胞枯渇の流体流動（細胞溶解を伴わない低剪断の混合）
【００８７】
試料前処理室は、複数の区画、例えば５つ以下の区画を含み、通常の溶解及び激しい溶解では、その室の区画の各々を、流体混合が室の流体流路の全長にわたって実施されるように使用した。対照的に、細胞枯渇及びその後の細胞枯渇した試料の核酸抽出を達成するためには、室内の区画の部分集合を使用し、例えば５区画のうちの少なくとも３区画から室内の全区画までを使用することができる。流体流動機構は、より少ない区画内で実施し、混合／溶解工程中の区画内及び区画間の流路の直径は、通常の溶解及び激しい溶解と比較して変更できることを見出した。従来の溶解、激しい溶解、及び細胞枯渇での最適化条件を以下に示す。
【表４】
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【００８８】
通常の溶解（表の第２列に示す）を達成するためには、アクチュエータ及び締め具を選択的に係合／解放して、前処理室全体にわたって流路内に液体を移動させた。激しい溶解を達成するためには、流路（Ｐ２）の最内側の区画を内部区画に隣接する間隙に比較してより狭い固定間隙に保持し、それにより、比較的激しい溶解条件を生じる剪断力で処理流路の内部区画中の流体を処理した。最内側の区画の間隙は、隣接する区画での間隙に比較して実質的に縮小され、かつ固定され、すなわちＰ０〜Ｐ１及びＰ３〜Ｐ４での最大３ｍｍに対してＰ２では０．１５ｍｍであった。対照的に、細胞溶解を伴わない細胞枯渇を達成するためには、より少数のデバイス区画（例えばＰ０〜Ｐ２）を含むより短い流体流路にわたって混合の全工程を実施することができ、かつ隣接する区画での間隙の約３分の１である最大１．１ｍｍの間隙に最内側の区画を圧縮して、それによって細胞溶解をもたらさない穏やかな混合を達成できる。一態様において、間隙は、隣接する区画での流路の直径の２５〜５０％、例えば直径の３３％まで縮小することができる。
【００８９】
この工程を図７Ａ〜図７Ｄに説明する。試料処理デバイス部分が図７Ａに示されており、管７０１は、試料処理デバイス７０８内の残りの区画と流体連通する複数の区画７０３〜７０７を含む試料前処理室７０２を備える。流体流路７０９は、試料処理デバイスの残りの区画内まで前処理室に広がっている。前処理室と連通しているアクチュエータ（Ｐ０〜Ｐ４）と締め具（Ｃ０〜Ｃ５）が管に係合していない場合は、流体流路は約５ｍｍの直径であるが、管がデバイス内に配置される場合は、アクチュエータと締め具の位置を制御するモータ（図示せず）は、アクチュエータ及び締め具を管の外壁に対し押し付け、流体流路が約３ｍｍの直径であるように管を僅かに圧縮し、この状態を処理室の全開位置とする。図７Ｂは、通常の溶解中の流体流路の相対寸法を示し、流体流路はＰ０〜Ｐ５に亘り、流路の直径は最大３ｍｍである。図７Ｃは、激しい溶解中の流体流路の相対的な寸法を示し、流体流路はＰ０〜Ｐ５に亘り、最内側の区画Ｐ２は最大０．１５ｍｍの直径まで縮小されている。したがって、激しい溶解中の流体流動は、隣接する区画に比較してＰ２に高圧をかけられ、激しい細胞溶解をもたらす高い剪断力を導入する。対照的に、図７Ｄは、細胞枯渇中の流体流路の相対的な寸法を示し、流体流路はＰ０〜Ｐ２にわたり、最内側の区画Ｐ１の流路の直径は（Ｐ０及びＰ２での）最大３ｍｍから最大１．１ｍｍまで縮小されている。最内側の流路は、激しい溶解中と同じ程度には圧縮されず、流体中の細胞を溶解させないより穏やかな混合サイクルとなる。
【００９０】
変更された流体流動機構に加えて、アクチュエータ及び締め具の各々に作動可能に接続されたモータの速度は、細胞枯渇中の細胞溶解を回避するように調節された。通常の溶解及び激しい溶解中に、アクチュエータ及び締め具と係合している各モータは、アクチュエータ及び締め具を等速度で迅速に係合かつ解放する。しかし、細胞溶解を伴わない細胞枯渇を達成するためには、解放中のモータ速度は、モータが加速度に対して対数的に減速するように調節された。これは図８Ａ及び図８Ｂに示され、図８Ａは通常の溶解及び激しい溶解中のモータの動きを示し、図８Ｂは、細胞枯渇中のモータの動きを示す。
【００９１】
本明細書及び実施例１に記載の方法を用いて、試料処理デバイス中の患者試料のウイルス量を測定した。その結果を以下に示す。
【表５】
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【００９２】
表５に示す結果は、実施例２で説明したオフライン処理を用いて得られた結果と同様である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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