(57)【要約】自己発光部材を送達可能なマイコバクテリウムファージ及びその使用を提供する。該ファージに宿主菌を自己発光させるために必要な遺伝子LuxCDABEを含み、該自己発光部材は、トランスポゾンに存在するため、転移部材に伴って宿主菌のゲノムにランダムに挿入されることができる。該ファージは、サンプルにおける生きている宿主菌の迅速診断及び宿主菌の薬剤感受性の迅速検出に適用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細菌を自己発光させることができるファージミドであって、
前記ファージミドに宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列を含み、前記塩基配列に発光に必要な遺伝子LuxCDABEを含むことを特徴とするファージミド。
【請求項２】
前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列に、トランスポゾンシステム、耐性遺伝子及び/又はプロモーターをさらに含むことを特徴とする請求項1に記載のファージミド。
【請求項３】
前記トランスポゾンシステムは、宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列を宿主ゲノムに転移することを特徴とする請求項2に記載のファージミド。
【請求項４】
前記トランスポゾンシステムは、Himar1 mariner、TnAファミリーから選択される1種であることを特徴とする請求項2又は3に記載のファージミド。
【請求項５】
前記耐性遺伝子は、ハイグロマイシン耐性遺伝子Hyg、カナマイシン耐性遺伝子Kan、チオスポリン耐性遺伝子Tsr、アプラマイシン耐性遺伝子Aprから選択される少なくとも1種であることを特徴とする請求項2に記載のファージミド。
【請求項６】
前記プロモーターは、宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列が宿主ゲノムのあるサイトに転移したときに、該サイトの前後の遺伝子の正常発現を保証するためのものであることを特徴とする請求項2に記載のファージミド。
【請求項７】
前記プロモーターは、プロモーターMop、G13、Hsp60、A37から選択される少なくとも1種であることを特徴とする請求項2又は6に記載のファージミド。
【請求項８】
前記トランスポゾンシステムは、トランスポザーゼ遺伝子及び逆方向反復配列を含み、
前記耐性遺伝子は遺伝子LuxCDABEと結合し、LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子断片の両端にプロモーター-LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子-プロモーターと記するプロモーターが結合され、プロモーターは、トランスポゾンが宿主ゲノムのあるサイトに転移したときに、該サイトの前後の遺伝子の正常発現を保証するためのものであり、
前記プロモーター-LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子-プロモーター断片の両端に、それぞれトランスポゾンシステムにおける2つの逆方向反復配列が結合されることにより、トランスポザーゼの作用でプロモーター-LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子-プロモーター断片を宿主ゲノムに転移することを実現することを特徴とする請求項2、3、5又は6に記載のファージミド。
【請求項９】
前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列に、大腸菌内で複製可能な複製開始点をさらに含むことにより、前記塩基配列は、プラスミド又はファージミド内で大量に複製することができることを特徴とする請求項1、2、3、5又は6に記載のファージミド。
【請求項１０】
前記複製開始点はoriEであることを特徴とする請求項9に記載のファージミド。
【請求項１１】
前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列に、CosAサイトをさらに含むことを特徴とする請求項1、2、3、5、6又は10に記載のファージミド。
【請求項１２】
前記宿主細菌を自己発光させることができる目的塩基配列に、ファージミド骨格と相同組換えすることができる組換えサイトをさらに含むことにより、前記塩基配列をファージミド骨格内に結合することができることを特徴とする請求項1、2、3、5、6又は10に記載のファージミド。
【請求項１３】
前記ファージミド骨格は、ファージミドphAE159に由来することを特徴とする請求項12に記載のファージミド。
【請求項１４】
前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列は、SEQ ID NO:1に示されることを特徴とする請求項12に記載のファージミド。
【請求項１５】
前記ファージミドに、phAE159骨格をさらに含み、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列は、phAE159骨格の2つの組換えサイトの間に位置することを特徴とする請求項1、2、3、5、6、10、13又は14に記載のファージミド。
【請求項１６】
遺伝子LuxCDABEを含む目的断片と組換えできるようにファージミド骨格を線状配列に酵素消化し、酵素消化されたファージミド骨格と遺伝子LuxCDABEを含む目的断片とを混合して共に大腸菌コンピテントセルに導入し、大腸菌内で組換え、増幅を行い、陽性組換え大腸菌のプラスミドを抽出することにより、ファージミドを得ることを特徴とする請求項1〜15の何れか1項に記載のファージミドの製造方法。
【請求項１７】
制限酵素PacIでファージミド骨格phAE159を消化し、酵素消化された大断片生成物を回収し、回収された生成物とSEQ ID NO:1に示される塩基断片とを混合して共に大腸菌コンピテントセルに導入し、陽性組換え大腸菌のプラスミドを抽出することにより、ファージミドを得ることを特徴とする請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
SEQ ID NO:1に示される塩基断片の製造方法は、以下のステップ（1）〜（8）を含み、
ステップ（1):pUCF2プラスミドの構築
SEQ ID NO:2に示されるF0断片を人工合成し、F0断片をpUC19担体に結合することでpUCF0プラスミドを得、制限酵素XbaIでpUCF0プラスミドを消化し、約2.8kbの断片を回収し、XbaIで消化されたハイグロマイシン耐性遺伝子Hygを含む断片と回収された約2.8kbの断片とを結合することにより、約3.9kbのプラスミドpUCF2を得、
ステップ（2):pUCF3プラスミドの構築
SEQ ID NO:3に示されるF1断片を人工合成し、F1断片をpUC19担体に結合することでpUCF1プラスミドを得、制限酵素KpnI及びEcoRIでpUCF1プラスミドを消化し、約2.7kbの断片を回収し、制限酵素KpnI及びEcoRIでpUCF2を消化し、約1.3kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4kbのプラスミドpUCF3を得、
ステップ（3):pUCRLlux2Pプラスミドの構築
制限酵素KpnI及びXhoIでプラスミドpUCF3を消化し、約3.9kbの断片を回収し、制限酵素KpnI及びXhoIでプラスミドpluxOKを消化し、約6.3kbの断片を回収し、前記2つの機能断片を結合することにより、約10.2kbのプラスミドpUCRLlux2Pを得、
ステップ（4):プラスミドpYUBTの構築
ファージMycoMarT7からトランスポザーゼのトランス遺伝子配列を増幅し、トランス遺伝子の5’端にNcoI酵素消化サイトを増加し、3’端にSpeI酵素消化サイトを増加し、増幅された生成物をNcoI及びSpeIで消化した後、約1kbの断片を回収し、プラスミドpYUB854を制限酵素NcoI及びSpeIで消化した後、約3.8kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4.8kbのプラスミドpYUBTを得、
ステップ（5):プラスミドpYUOKの構築
プラスミドpUCRLlux2Pを制限酵素NcoI及びSpeIで消化し、約7.6kbの断片を回収し、制限酵素NcoI及びXbaIでプラスミドpYUBTを消化し、約2.9kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約10.5kbのプラスミドpYUOKを得、
ステップ（6):プラスミドp159LARTの構築
SEQ ID NO:4に示される塩基断片を合成し、担体pUC19に結合することでプラスミドp159LRを得、プラスミドp159LRをNheIで消化して回収し、増幅して両端にNheI酵素消化サイトを有するApr遺伝子断片を得、該断片を制限酵素NheIで消化して回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4.8kbのプラスミドp159LARTを得、
ステップ（7):プラスミドpYUOKLARTの構築
制限酵素PacIでプラスミドpYUOKを消化し、約10.5kbの断片を回収し、制限酵素PacIでプラスミドp159LARTを消化し、約2kb断片を回収し、前記2つの機能断片を結合することにより、約12.5kbのプラスミドpYUOKLARTを得、
ステップ（8):SEQ ID NO:1に示される塩基断片の取得
制限酵素SmaIでプラスミドpYUOKLARTを回収し、酵素消化された大断片生成物を回収することにより、SEQ ID NO:1に示される塩基断片を得ることを特徴とする請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
請求項1〜15の何れか1項に記載のファージミドを含むことを特徴とする自己発光部材を送達可能なファージ。
【請求項２０】
請求項1〜15の何れか1項に記載のファージミドの、宿主細菌検出及び/又は薬剤感受性検出における使用。
【請求項２１】
前記細菌は、マイコバクテリウムであることを特徴とする請求項20に記載の使用。
【請求項２２】
前記マイコバクテリウムは、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・マリヌム及びカルメット-ゲラン桿菌を含むことを特徴とする請求項21に記載の使用。
【請求項２３】
請求項19に記載のファージの、宿主細菌検出及び/又は薬剤感受性検出における使用。
【請求項２４】
ファージを含む液体を検出されるサンプルに加えるステップ（1)と、
36.5〜42℃で35min以上培養し、蛍光照度計により発光を検出するステップ（2)と、
陰性対照群と比較した結果、顕著な蛍光を発した場合に、サンプルに大量の生きているマイコバクテリウムを含むことを示す一方、発した蛍光の強度がファージを加えていない陰性対照群の蛍光強度の120％よりも低い場合に、ファージを死滅させる試薬SKを加えることにより、ゲノムにおける、マイコバクテリウムに入っていない前記ファージを死滅させるステップ（3)であって、前記試薬SKは、過硫酸アンモニウム、硫酸第一鉄、硫酸アンモニア、硫酸第一鉄アンモニウムから選択される少なくとも1種であるステップ（3)と、
中和剤SNを加えて過剰な試薬SKを中和し、指示菌を加え、20〜32℃で12h以上培養するステップ（4)であって、前記中和剤SNは、MgSO4、重クロム酸カリウム、CaCl2、MnCl2から選択される少なくとも1種であるステップ（4)と、
蛍光照度計により指示菌を加えた後のサンプルの発光を検出した結果、サンプルが発光した場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していたことを示す一方、サンプルが発光しなかった場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していなかったことを示すステップ（5)と、
を含むことを特徴とする請求項19に記載のファージによる宿主細菌の検出方法。
【請求項２５】
前記指示菌は、請求項19に記載のファージの宿主であり、前記ファージは該宿主内で増幅し続け、細胞を溶解することができることを特徴とする請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
ファージと宿主細菌とを混合すると同時に、一定濃度の検出される薬物を添加するステップ（1)と、
36.5〜42℃で少なくとも2h培養した後、蛍光照度計により発光を検出するステップ（2)と、
検出されたサンプルの発光値と薬物を添加していないサンプルの発光値との間に顕著な差異がある場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して敏感であることを示す一方、顕著な差異がない場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して薬剤耐性を有することを示すステップ（3)と、
を含むことを特徴とする請求項19に記載のファージによる、宿主細菌の薬剤感受性の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己発光部材を送達可能なマイコバクテリウムファージ及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリウム属(Mycobacterium)は、長細くてやや曲がった微生物であり、分岐又は糸状体を有する場合もある。現在、分類学上でマイコバクテリウム属が放線菌に分類されている。ヒトに対して病原性を有する放線菌は、ミコール酸を含有するものと含有しないものの2類に分けられる。マイコバクテリウムは、ミコール酸を含有するものに属し、鞭毛、芽胞がなく、一般的に内毒素又は外毒素を発生せず、その病原性は細菌の組成に繋がっている。マイコバクテリウムによって引き起こされる疾患は、全て肉芽腫を伴う慢性疾患である。マイコバクテリウムは、種類が多いが、主にマイコバクテリウム・ツベルクローシス複合群、非結核性マイコバクテリア、及びマイコバクテリウム・レプレの3類に分けられる。コロニー色素及び増殖速度に応じて、非結核性マイコバクテリアを4群に分け得る。群ＩＶは、迅速増殖菌であり、25〜45℃で増殖が速く、5〜7日培養すればコロニーが見られ、コロニーが粗く、発色できるものもある。マイコバクテリウム・スメグマチス(M.smegmatis)は、そのうちの1種であるが、発色することができない。
【０００３】
多くのマイコバクテリウムは疾患を引き起こせる。そのうちのマイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)（略称:結核菌(Mtb))は、結核(tuberculosis)を引き起こす病原菌である。Mtbは、人体の多くの器官、特に肺に侵入することができる。結核は、今まで単一の病原菌に起因する死亡者数が最も多い重要な伝染病である。世界には、毎年の新規結核患者数は〜900万(2014年:960万)であり、死亡人数は約150万である。近年、薬剤耐性結核の出現により、結核の治療がより困難になっている。Mtbは、増殖が極めて遅く、一般に3-5週培養してようやく、平板上で見られるコロニーが出てくる。したがって、Mtb生菌を培養することにより結核の診断を行うのに概ね4〜8週間も必要で非常に遅い。また、Mtbの薬剤感受性検出試験にも長い時間がかかり、コロニーに増殖してから薬剤感受性の検出結果が出るまでさらに4〜8週間が必要である。近年、臨床や試験室で最もよく使われているのは、BD社のMGIT 960システムである。このシステムは、診断及び薬剤感受性検出にかかる時間をそれぞれ8-12日に短縮させることができるが、速度がまだ遅く、機器及び検出に使用されるパイプのサイズが大きいことで、占めるスペースが大きいだけではなく、高価であることから、ハイスループットの研究に適用できない。したがって、より迅速、簡単、低価額で生きているMtbの存在を検出することができ、多種の薬物に対する薬剤感受性検出を行うことができ、また、検出結果の特異性及び正確性を向上させることができると、結核の治療に役に立つと考えられている。
【０００４】
本出願人は、自己発光部材であるluxCDABE遺伝子をマイコバクテリウム複合型担体に置き、次にそれをMtb、BCG又はマイコバクテリウム・スメグマチスのゲノムに挿入することにより、耐性遺伝子が漏らした耐性スクリーニングマーカーがない新規な自己発光マイコバクテリウムがスクリーニングされることができることを研究開発により知得した（特許番号:ZL 201210183007.2)。これに関する文章は発表されている[1]。出願人の前の研究では、自己発光システムは、死菌と生菌をよく区別することができ、菌の発光強度が菌の数に緊密に関連することを示している。構築された自己発光菌は、インビトロでの薬物スクリーニングに適用でき、さらに、マウス生体に便利に用いられて薬物又はワクチンの作用効果を検出することもでき、その効果が非常に高かった[2]。しかし、このような自己発光菌は、発光部材の送達効率が低いため、特殊な電気転換装置及び大量のコンピテント状態にあるMtbを必要とする。転換が成功したとしても、得られた発光菌が次の操作、例えば、薬剤感受性の検出等に使用できるまで約4週間が必要である。したがって、自己発光部材を迅速、簡単及びタイムリーにMtb等のマイコバクテリウムに送達できれば、サンプルにおける生きているマイコバクテリウムを迅速に検出することができ、野生のMtb(実験室株及び臨床的に得られた菌株を含む)の薬剤感受性を迅速に検出することができると考えられている。そのため、ファージ(phage)を介して報告部材をMtb等のマイコバクテリウムに導入することを希望している。
【０００５】
ファージは、ウイルスの1種であり、細菌を宿主とし、他のウイルスと同様にタンパク質の殻で覆われている遺伝物質であり、ほとんどのファージには遺伝物質を宿主内に注入するための「尾」がある。マイコバクテリウムファージは、マイコバクテリウムを宿主とするファージであり、マイコバクテリウムを特異的に識別することができる。ファージミド(phagemid)は、プラスミド担体及びファージ担体から構成されるものであり、プラスミドの複製開始点及びファージの複製開始点の両方を有するため、大腸菌細胞内で正常な二本鎖プラスミド分子として複製して二本鎖DNAを生成することができる。ファージミドがファージの宿主菌(例えば、マイコバクテリウム)に入ったら、宿主菌内で子孫ファージのDNA及びカプシドタンパク質を合成することができる。一定の条件下で、幾つかのファージは、ファージ粒子にパッケージングされた後、宿主細胞を溶解することで解放される。例えば、本発明の自己発光部材である温度感受性ファージ（ARP;autoluminescent reporter phage)は、30℃のときにファージ粒子にパッケージングされた後、宿主細胞を溶解することで解放されるが、37℃のときにファージ粒子が解放されない。ARPは、宿主に入った後、宿主に発光反応に必要な酵素及び基質を生成させることにより発光することができる。
【０００６】
また、基礎研究では、Mtbに遺伝的操作を行うことが困難である。効率的なトランスポゾンを担ったファージは、既にMtb遺伝子を効率的に破壊し、遺伝子破壊変異株を得る強力なツールとなっている[3]。本発明者は、該システムを用いて既存の耐性マーカーがない自己発光株を破壊してみたところ、ほとんどのトランスポゾンが自己発光菌の自己発光部材を送達する担体に挿入し、発光菌における遺伝子を真に破壊しないことを発見した。これは自己発光Mtbトランスポゾン変異株の構築に大きな困難をもたらした。そこで、自己発光部材をトランスポゾンに置き、トランスポゾンとともに野生型Mtbのゲノムに挿入することにより得られた転移挿入変異株が自己発光することができるため、挿入サイトは、必ず細菌のゲノムにあると考えている。
【０００７】
Mtbの遺伝的特性により決定される増殖サイクルが長いことにより、通常の細菌学検査方法には感度が低く、操作が複雑で、長い時間がかかり、影響要因が多く、標準化されにくい等の問題があり、それによって細菌学診断の発展が遅く、臨床診断の需要を十分に満足できない。サンプルにおけるマイコバクテリウム/Mtbを診断する従来方法及びその利点/欠点を表1に示し、臨床でマイコバクテリウム/Mtbの薬剤感受性を検出できる従来方法及びその利点/欠点を表2に示す。
【０００８】
表1:喀痰サンプルにおけるマイコバクテリウム/Mtbを診断する従来方法及びその利点/欠点
2019512227.tif 000002
2019512227.tif 000003
【０００９】
表2:臨床でマイコバクテリウム/Mtbの薬剤感受性を検出できる従来方法及びその利点/欠点
2019512227.tif 000004
【００１０】
マイコバクテリウムファージは、そのマイコバクテリウムに対する宿主特異性により、Mtb等の宿主の迅速診断及び薬剤感受性の検出に適用できる。ARPを診断及び薬剤感受性検出に適用することについては、本発明に比較的関連(類似)する従来のファージによる検出方法、製品を表1、表2に示す。
【００１１】
主要なファージによる検出方法には、ファージ生物的増幅法(PhaB法)[15]、ルシフェラーゼレポーターファージ検出法(LRP法)[16]、GFP発現ファージ検出法(EGFP-phage法)[17,18]がある。PhaB法は、野生型のD29ファージを使用し、その原理は図1に示される。該方法では、生きているマイコバクテリウムをマイコバクテリウムファージD29に感染させ、ファージ死滅試薬でMtb内のファージを死滅させずにMtb外のファージを死滅させ、その後、急速に増殖している感受性細胞(例えば、マイコバクテリウム・スメグマチスM.smegmatis)を加え、〜18時間培養することでファージ増幅を行う。D29が感染菌体内で大量に増幅することで細菌が溶解されて溶菌斑が形成されることを招き、溶菌斑の数を測定することにより初期のMtb量を推計することができる。従来のスミア抗酸染色法に比べて、ファージ感染では、Mtb有無の鑑定に少なくとも18-24時間が必要であるが、理想的状態での最低検出感度が100菌/反応であり、PCR法と近い。臨床的には、譚耀駒らは、3168個の喀痰サンプルを比較分析した結果、PhaB検出方法により喀痰サンプルにおけるMtbを検出することができ、その陽性率とスミア法及びLJ培養法の陽性率との一致率が高くないことを発見した[19]。この方法は迅速の薬剤感受性検出(24-72時間)にも適用でき、従来の平板方法との一致率が93％と高い報告もある[20]。しかし、該方法は、操作が複雑で、仮陽性が発生しやすく、汚染を引き起こしやすく、感度が十分ではない。臨床的検証や発表がよくあるが、主流製品ではなく、臨床上、実際にあまり応用されていない。
【００１２】
LRP法及びEGFP-phage法は、共に構築された組換え?告ファージにより生ファージの存在及び生菌の薬剤に対する感受性を検出するのもで、両者の構築方法が同じである(図2を参照)。LRP法は、1993年に発表され、1997年に発表されたPhaB法よりも早いが、反応のために高価のフルオレセイン基質を添加する必要があり、該基質がマイコバクテリウム細胞壁を通過する能力が弱く、発光値と生菌の数との関係が不明?であり、その検出精度も不明?であり、製品にならず、国内外において臨床応用に関する報道が多くない。2009年にEGFP-phageの構築及びその迅速診断及び薬剤感受性の検出における使用が初めて報告された。検出手段は、主に蛍光顕微鏡又はフローサイトメーターによりEGFP-phageが生菌を感染して生成したEGFPタンパク質を検出することであり、検出方法の制限により、検出の感度が低い。この方法は、操作が複雑でMtbが暴露されやすいため、環境がMtbに汚染されやすい。しかし、ホルマリンでMtbを固定し死滅させることで、蛍光を検出でき、Mtbによる環境汚染を回避できる。実験室条件下で、検出到サンプルにMtbを含むことを検出できるまで早くとも4hが必要である。薬剤感受性の検出には、リファンピン、ストレプトマイシンの場合、早くとも16hが必要である。イソニアジドの場合、MtbのINHに対する感受性を判断するために、事前にMtb細菌を24h培養し、さらに16h培養することで処理する必要がある。フローサイトメーターを使用する場合に、コストが高いが、結果が上記方法と同じである。さらに、Mtbそれ自体は一定の背景蛍光を有することから、実験結果に影響を与える場合がある。
【００１３】
上記のように、生Mtbの診断及び臨床菌株の薬剤感受性の検出のための主な方法には、検出菌増殖によるBD MGIT960システム及び上記ファージ方法が含まれる。
【００１４】
BD MGIT960システムは、現在臨床で主として使用されている方法であり、その欠点は以下の通りである。1)速度が遅く、診断に9-12日、感受性検出に9-12日が必要である。2)高価であり、培養、検出設備のコストが高いだけでなく、特殊な培地が必要であり、一薬物の一濃度の検出だけには、70元/本のチューブが必要である。3)操作が複雑で、時間がかかる。4)体積が大きく、占めるスペースが大きい。
【００１５】
PhaB法の欠点は以下の通りである。1)操作が複雑で、把握されにくく、感染時間を正確に把握しないと、侵入が十分ではないか、又は侵入した後に生細胞を溶解することで、感受性が低下し、平板を反転する等面倒な操作が必要する。2) 体積が大きく、占めるスペースが大きい。3) 診断、薬剤感受性検出のコストは本発明よりも高い。
【００１６】
LRP法は、その特許権の存続期間が経過しても、製品となっていない。反応のために高価のフルオレセイン基質を添加する必要があり、該基質がマイコバクテリウムの細胞壁を通過する能力が弱く、発光値と生菌の数との関係が不明?であり、その検出精度も不明?であるためであると考えられている。
【００１７】
EGFP-phage法の欠点は以下の通りである。1)設備が高価である。フローサイトメーターの購入及び使用はコストが高く、蛍光顕微鏡の価格も高い。緑色蛍光タンパク質発光の検出は、激発光の輔助下で行う必要があり、また、死細胞の状態でも蛍光が観察され得るので、実験結果に影響を与えることがある。Mtbそれ自体は一定の背景蛍光を有する。2)検出方法、ツールの制限により、検出の感度が低下する。3)本発明に比べて、操作が複雑で、把握されにくい。4)検出効率も低い。
【００１８】
上記の組換えファージの構築方法(図2)には、重大な欠陥が存在する。λファージによりインビトロパッケージングを行う際に、そのパッケージング範囲に制限があるため、大断片DNAを組換えファージに構築することが困難である。例えば、Fluc及びegfp遺伝子が約1kbであるが、自己発光部材が〜6kbであるため、λファージによりインビトロパッケージングを行うことができない(本発明者は試してみた結果、この方法が適用できないことを実証した)。
【００１９】
従来の組換えマイコバクテリウムファージは、レポーター遺伝子(例えば、上記のFluc,egfp等の小レポーター遺伝子) を組換えたもの又は効率的なトランスポゾンのファージ(MycoMarT7等[3,21])を組換えたものしかなく、レポーター遺伝子を効率的なトランスポゾンに導入してマイコバクテリウムファージに組換えることができることはいまだ報告されていない。
【００２０】
上記診断技術に加えて、上記のように、Mtbの応用基礎研究において、遺伝子破壊を必要とする場合が多い。例えば、研究遺伝子の機能研究では、毒性に関連する遺伝子をノックアウト、破壊する必要がある。また、変異株を自己発光させることができることにより、研究開発の効率を大幅に向上できるが、このようなツールが未だに存在しない。
【００２１】
かかる参考文献は以下の通りである。
1.Yang F,Njire M,Liu J,Wu T,Wang B,Liu T,Cao Y,Liu Z,Wan J,Tu Z,Tan Y,Tan S,Zhang T*.Engineering more stable,selectable marker-free autoluminescent mycobacteria by one step.PLoS One.2015.10:e0119341。
2.Zhang T,Li SY,Nuermberger EL*.Autoluminescent Mycobacterium tuberculosis for rapid,real-time,non-invasive assessment of drug and vaccine efficacy.PLoS One.2012.7:e29774.
3.Lamichhane G,Zignol M,Blades NJ,Geiman DE,Dougherty A,Grosset J,Broman KW,Bishai WR.A postgenomic method for predicting essential genes at subsaturation levels of mutagenesis:Application to Mycobacterium tuberculosis.Proc Natl Acad Sci USA.2003;100(12):7213-7218.
4.World Health Organisation:Geneva S.Laboratory services in tuberculosis control.World Health Organization.1998.WHO/TB/98.258http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/65942/10661/WHO_TB_10698.10258_％10628part10661％10629.pdf.
5.Robledo JA,Mejia GI,Morcillo N,Chacon L,Camacho M,Luna J,Zurita J,Bodon A,Velasco M,Palomino JC,Martin A,Portaels F.Evaluation of a rapid culture method for tuberculosis diagnosis:a Latin American multi-center study.Int J Tuberc Lung Dis.2006.10(6):613-619.
6.Heifets L,Linder T,Sanchez T,Spencer D,Brennan J.Two liquid medium systems,Mycobacteria Growth Indicator Tube and MB Redox tube,for Mycobacterium tuberculosis isolation from sputum specimens.J Clin Microbiol.2000.38(3):1227-1230.
7.Chang SC,Rihana A,Bahrman S,Gruden CL,Khijniak AI,Skerlos SJ,Adriaens P.Flow cytometric detection and quantification of mycobacteria in metalworking fluids.Int Biodeterior Biodegradation.2004.54(2-3):105-112.
8.McCann JR,McDonough JA,Pavelka MS,Braunstein M.Beta-lactamase can function as a reporter of bacterial protein export during Mycobacterium tuberculosis infection of host cells.Microbiol SGM.2007.153:3350-3359.
9.Hatta M,Sultan AR,Tandirogang N,Masjudi,Yadi.Detection and identification of mycobacteria in sputum from suspected tuberculosis patients.BMC Res Notes.2010.3:72-72.
10.Helb D,Jones M,Story E,Boehme C,Wallace E,Ho K,Kop J,Owens MR,Rodgers R,Banada P,Safi H,Blakemore R,Lan NTN,Jones-Lopez EC,Levi M,Burday M,Ayakaka I,Mugerwa RD,McMillan B,Winn-Deen E,Christel L,Dailey P,Perkins MD,Persing DH,Alland D.Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampin resistance by use of on-demand,near-patient technology.J Clin Microbiol.2010.48(1):229-237.
11.Therese KL,Gayathri R,Dhanurekha L,Sridhar R,Meenakshi N,Madhavan HN,Manoj SE,Vinayagam AK.Detection of Mycobacterium tuberculosis directly from sputum specimens&phenotypic drug resistance pattern of M.tuberculosis isolates from suspected tuberculosis patients in Chennai.Indian J Med Sci.2012.135(5):778-782.
12.Garg SK,Tiwari RP,Tiwari D,Singh R,Malhotra D,Ramnani VK,Prasad G,Chandra R,Fraziano M,Colizzi V,Bisen PS.Diagnosis of tuberculosis:available technologies,limitations,and possibilities.J Clin Lab Anal.2003.17(5):155-163.
13.Hsieh SC,Chang CC,Lu CC,Wei CF,Lin CS,Lai HC,Lin CW.Rapid identification of Mycobacterium tuberculosis infection by a new array format-based surface plasmon resonance method.Nanoscale Res Lett.2012.7(1):180.
14.于霞,梁倩,馬異峰,付育紅,黄海栄. リング媒介等温増幅技術による喀痰サンプルにおけるマイコバクテリウム・ツベルクローシスの迅速検出に対する予備評価.中国実験診断学.2013.17(5):846-849.
15.Wilson SM,AlSuwaidi Z,McNerney R,Porter J,Drobniewski F.Evaluation of a new rapid bacteriophage-based method for the drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis.Nat Med.1997.3(4):465-468.
16.Jacobs WR,Barletta RG,Udani R,Chan J,Kalkut G,Sosne G,Kieser T,Sarkis GJ,Hatfull GF,Bloom BR.Rapid assessment of drug susceptibilities of Mycobacterium-tuberculosis by means of luciferase reporter phages.Science.1993.260(5109):819-822.
17.Piuri,M.,,W.R.J.J.,and,G.F.H.Fluoromycobacteriophages for Rapid,Specific,and Sensitive Antibiotic Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis.PLoS One.2009,4,e4870.
18.Rondon L,Piuri M,Jacobs WR Jr.,de Waard J,Hatfull GF,Takiff HE.Evaluation of fluoromycobacteriophages for detecting drug resistance in Mycobacterium tuberculosis.J Clin Microbiol.2011.49(5):1838-1842.
19.譚耀駒,蔡杏珊,呉幸怡,?少佳,譚守勇*.ファージ生物増幅法による痰液マイコバクテリウム・ツベルクローシスの検出の臨床応用.中華検験医学雑誌.2011.34(5):448-450.
20.de la Iglesia AI,Stella EJ,Morbidoni HR.Comparison of the performances of two in-house rapid methods for antitubercular drug susceptibility testing.Antimicrob Agents Chemother.2009.53(2):808-810.
21.Forti F,Mauri V,Deho G,Ghisotti D.Isolation of conditional expression mutants in Mycobacterium tuberculosis by transposon mutagenesis.Tuberculosis.2011;91(6):569-578。
【発明の概要】
【００２２】
上記問題を解決するために、出願人は絶え間ない努力と多くの実験的研究を行った結果、自己発光部材を送達可能なファージミド及びファージの構築を達成した。構築されたファージミドは、以下の特徴を有する。担った自己発光部材は、効率的なトランスポゾンに存在するため、転移部材に伴って効率的に宿主のゲノムにランダムに挿入されることができる。それによって、宿主の遺伝子を破壊できる一方、遺伝子を破壊された宿主菌は自己発光することができ、自己発光という特徴を利用して破壊された宿主遺伝子の機能を効率的に研究することができる。
【００２３】
本発明は、宿主細菌を自己発光させることができるファージミドを提供することを目的とする。ARPにより自己発光の宿主菌(例えば、結核菌等)を製造することができるため、自己発光の宿主菌を便利に得ることができ、薬物のスクリーニング、評価及びワクチンのスクリーニング等が容易となり、小動物に感染しても、発光値を検出することにより生体研究を便利に行うことができる。
【００２４】
本発明の別の目的は、自己発光部材を送達可能なファージを提供することである。
本発明の別の目的は、上記ファージミドの細菌検出及び/又はその薬剤感受性の検出における使用を提供することである。
【００２５】
本発明の技術手段は以下の通りである。
宿主細菌を自己発光させることができるファージミドであって、
前記ファージミドに宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列を含み、前記塩基配列に発光に必要な遺伝子LuxCDABEを含むファージミド。
さらに、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列に、トランスポゾンシステム、耐性遺伝子及び/又はプロモーターをさらに含む。
さらに、前記トランスポゾンシステムは、宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列を宿主ゲノムに転移する。
さらに、前記トランスポゾンシステムは、Himar1 mariner、TnAファミリーから選択される1種である。
さらに、前記耐性遺伝子は、ハイグロマイシン耐性遺伝子Hyg、カナマイシン耐性遺伝子Kan、チオスポリン耐性遺伝子Tsr、アプラマイシン耐性遺伝子Aprから選択される少なくとも1種である。
さらに、前記プロモーターは、宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列が宿主ゲノムのあるサイトに転移したときに、該サイトの前後の遺伝子の正常発現を保証するためのものである。
さらに、前記プロモーターは、プロモーターMop、G13、Hsp60、A37から選択される少なくとも1種である。
さらに、前記トランスポゾンシステムは、トランスポザーゼ遺伝子及び逆方向反復配列を含み、
前記耐性遺伝子は遺伝子LuxCDABEと結合し、LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子断片の両端にプロモーター-LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子-プロモーターと記するプロモーターが結合され、プロモーターは、トランスポゾンが宿主ゲノムのあるサイトに転移したときに、該サイトの前後の遺伝子の正常発現を保証するためのものであり、
前記プロモーター-LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子-プロモーター断片の両端に、それぞれトランスポゾンシステムにおける2つの逆方向反復配列が結合されることにより、トランスポザーゼの作用でプロモーター-LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子-プロモーター断片を宿主ゲノムに転移することを実現する。
さらに、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列に、大腸菌内で複製可能な複製開始点をさらに含むことにより、前記塩基配列は、プラスミド又はファージミド内で大量に複製することができる。
さらに、上記複製開始点はoriEである。
さらに、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列に、CosAサイトをさらに含む。
さらに、前記宿主細菌を自己発光させることができる目的塩基配列に、ファージミド骨格と相同組換えすることができる組換えサイトをさらに含むことにより、前記塩基配列をファージミド骨格内に結合することができる。
さらに、前記ファージミド骨格は、ファージミドphAE159に由来する。
さらに、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列は、SEQ ID NO:1に示される。
さらに、前記ファージミドに、phAE159骨格をさらに含み、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列は、phAE159骨格の2つの組換えサイトの間に位置する。
上記ファージミドの製造方法では、遺伝子LuxCDABEを含む目的断片と組換えできるようにファージミド骨格を線状配列に酵素消化し、酵素消化されたファージミド骨格と遺伝子LuxCDABEを含む目的断片とを混合して共に大腸菌コンピテントセルに導入し、大腸菌内で組換え、増幅を行い、陽性組換え大腸菌のプラスミドを抽出することにより、ファージミドを得る。
さらに、上記ファージミドの製造方法において、制限酵素PacIでファージミド骨格phAE159を消化し、酵素消化された大断片生成物を回収し、回収された生成物とSEQ ID NO:1に示される塩基断片とを混合して共に大腸菌コンピテントセルに導入し、陽性組換え大腸菌のプラスミドを抽出することにより、ファージミドを得る。
さらに、SEQ ID NO:1に示される塩基断片の製造方法は、以下のステップ（1）〜（8）を含む。
ステップ（1):pUCF2プラスミドの構築
SEQ ID NO:2に示されるF0断片を人工合成し、F0断片をpUC19担体に結合することでpUCF0プラスミドを得、制限酵素XbaIでpUCF0プラスミドを消化し、約2.8kbの断片を回収し、XbaIで消化されたハイグロマイシン耐性遺伝子Hygを含む断片と回収された約2.8kbの断片とを結合することにより、約3.9kbのプラスミドpUCF2を得る。
ステップ（2):pUCF3プラスミドの構築
SEQ ID NO:3に示されるF1断片を人工合成し、F1断片をpUC19担体に結合することでpUCF1プラスミドを得、制限酵素KpnI及びEcoRIでpUCF1プラスミドを消化し、約2.7kbの断片を回収し、制限酵素KpnI及びEcoRIでpUCF2を消化し、約1.3kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4kbのプラスミドpUCF3を得る。
ステップ（3):pUCRLlux2Pプラスミドの構築
制限酵素KpnI及びXhoIでプラスミドpUCF3を消化し、約3.9kbの断片を回収し、制限酵素KpnI及びXhoIでプラスミドpluxOKを消化し、約6.3kbの断片を回収し、前記2つの機能断片を結合することにより、約10.2kbのプラスミドpUCRLlux2Pを得る。
ステップ（4):プラスミドpYUBTの構築
ファージMycoMarT7からトランスポザーゼのトランス遺伝子配列を増幅し、トランス遺伝子の5’端にNcoI酵素消化サイトを増加し、3’端にSpeI酵素消化サイトを増加し、増幅された生成物をNcoI及びSpeIで消化した後、約1kbの断片を回収し、プラスミドpYUB854を制限酵素NcoI及びSpeIで消化した後、約3.8kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4.8kbのプラスミドpYUBTを得る。
ステップ（5):プラスミドpYUOKの構築
プラスミドpUCRLlux2Pを制限酵素NcoI及びSpeIで消化し、約7.6kbの断片を回収し、制限酵素NcoI及びXbaIでプラスミドpYUBTを消化し、約2.9kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約10.5kbのプラスミドpYUOKを得る。
ステップ（6):プラスミドp159LARTの構築
SEQ ID NO:4に示される塩基断片を合成し、担体pUC19に結合することでプラスミドp159LRを得、プラスミドp159LRをNheIで消化して回収し、増幅して両端にNheI酵素消化サイトを有するApr遺伝子断片を得、該断片を制限酵素NheIで消化して回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4.8kbのプラスミドp159LARTを得る。
ステップ（7):プラスミドpYUOKLARTの構築
制限酵素PacIでプラスミドpYUOKを消化し、約10.5kbの断片を回収し、制限酵素PacIでプラスミドp159LARTを消化し、約2kb断片を回収し、前記2つの機能断片を結合することにより、約12.5kbのプラスミドpYUOKLARTを得る。
ステップ（8):SEQ ID NO:1に示される塩基断片の取得
制限酵素SmaIでプラスミドpYUOKLARTを回収し、酵素消化された大断片生成物を回収することにより、SEQ ID NO:1に示される塩基断片を得る。
上記の何れかのファージミドを含む自己発光部材を送達可能なファージ。
上記の何れかファージミドの、宿主細菌検出及び/又は薬剤感受性検出における使用。
さらに、上記細菌はマイコバクテリウムである。
さらに、前記マイコバクテリウムは、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・マリヌム及びカルメット-ゲラン桿菌を含む。
上記ファージの、宿主細菌検出及び/又は薬剤感受性検出における使用。
上記ファージによる宿主細菌の検出方法は、
ファージを含む液体を検出されるサンプルに加えるステップ（1)と、
36.5〜42℃で35min以上培養し、蛍光照度計により発光を検出するステップ（2)と、
陰性対照群と比較した結果、顕著な蛍光を発した場合に、サンプルに大量の生きているマイコバクテリウムを含むことを示す一方、発した蛍光の強度がファージを加えていない陰性対照群の蛍光強度の120％よりも低い場合に、ファージを死滅させる試薬SKを加えることにより、ゲノムにおける、マイコバクテリウムに入っていない前記ファージを死滅させるステップ（3)であって、前記試薬SKは、過硫酸アンモニウム、硫酸第一鉄、硫酸アンモニア、硫酸第一鉄アンモニウムから選択される少なくとも1種であるステップ（3)と、
中和剤SNを加えて過剰な試薬SKを中和し、指示菌を加え、20〜32℃で12h以上培養するステップ（4)であって、前記中和剤SNは、MgSO4、重クロム酸カリウム、CaCl2、MnCl2から選択される少なくとも1種であるステップ（4)と、
蛍光照度計により指示菌を加えた後のサンプルの発光を検出した結果、サンプルが発光した場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していたことを示す一方、サンプルが発光しなかった場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していなかったことを示すステップ（5)と、
を含む。
さらに、前記指示菌は、上記ファージの宿主であり、前記ファージは該宿主内で増幅し続け、細胞を溶解することができる。
上記ファージによる、宿主細菌の薬剤感受性の検出方法は、
ファージと宿主細菌とを混合すると同時に、一定濃度の検出される薬物を添加するステップ（1)と、
36.5〜42℃で少なくとも2h培養した後、蛍光照度計により発光を検出するステップ（2)と、
検出されたサンプルの発光値と薬物を添加していないサンプルの発光値との間に顕著な差異がある場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して敏感であることを示す一方、顕著な差異がない場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して薬剤耐性を有することを示すステップ（3)と、
を含む。
【００２６】
本発明は、以下の有益な効果を有する。
1)本発明は、合成生物学を利用し、DNAの人工合成、遺伝子工学及び分子生物学等の手段により、新規な人工マイコバクテリウムファージ(ARP)を成功に構築した。ARPは、温度感受性ファージであり、30℃以下の場合に宿主を溶解できるが、37〜42℃の場合に宿主を溶解しない。ARPは、自己発光遺伝子部材を送達することにより、その宿主となるマイコバクテリウムに対応するタンパク質(酵素)を発現させる。これらの酵素は、生きている宿主菌の代謝生成物により発光反応に必要な基質及び反応に必要な酵素を循環に産生する。したがって、いずれの基質を添加しなくても、生きている宿主菌は発光することができる。本発明のARPの担った自己発光部材は、効率的なトランスポゾンに存在するため、転移部材に伴って効率的に宿主のゲノムにランダムに挿入されることができる。それによって、宿主の遺伝子を破壊できる一方、遺伝子を破壊された宿主菌は自己発光することができ、自己発光という特徴を利用して破壊された宿主遺伝子の機能を効率的に研究することができる。重要なのは、本発明のARPは、サンプルにおける生きている宿主菌を迅速に検出でき、宿主菌の薬物に対する感受性を迅速することができることである。このような診断及び検出は、市販されているBD MGIT 960システムよりも約8日速いとともに、簡単で操作しやすく、直感的に分かりやすく、且つコストが低い。本発明のARPの宿主範囲について、マイコバクテリウムの中に特定の好みがあり、最も重要な宿主菌の1つはマイコバクテリウム・ツベルクローシスである。
【００２７】
2)本発明の構築されたファージは、マイコバクテリウムを形質転換することができ、形質転換されたマイコバクテリウムを特定温度下で培養することでそれを自己発光させることができる。前記マイコバクテリウムは、マイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium.smegmatis)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium.tubercμlosis)、カルメット-ゲラン桿菌(BCG)を含むが、これらのマイコバクテリウムに限られない。
【００２８】
3)本発明の方法では、宿主細菌の特性に応じて宿主細菌に特異性を有する自己発光部材を送達可能なファージを製造することができる。本発明のマイコバクテリウムを形質転換するファージがマイコバクテリウムを形質転換した後、自己発光のマイコバクテリウムを得る。マイコバクテリウムファージが宿主特異性(マイコバクテリウムのみに特異性)を有するため、該ファージは、マイコバクテリウムの迅速検出に適用できる。
【００２９】
4)本発明は、自己発光マイコバクテリウムを構築するためのファージミドp159OKを提供する。該ファージミドは、phAE159ファージ骨格、マイコバクテリウムの強力なプロモーター(Hsp60)、発光に必要な酵素遺伝子(LuxCDABE)、ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hyg)、トランスポザーゼ遺伝子(Trans)、逆方向反復配列IR-L及びIR-R、プロモーターMop及びG13を含む。該ファージミド又はそれによるファージが宿主を形質転換して得られた発光マイコバクテリウムは、自己発光マイコバクテリウムであり、検出が便利で、正確性が高く、マイコバクテリウムの検出及び薬剤感受性実験に適用できる。
【００３０】
5)本発明では、λファージパッケージング過程を省略する。本発明者は、初期研究にはλファージパッケージング過程を採用して大量の実験を行った結果、ファージミドp159OKを成功に得ることができなかった一方、本発明ではλファージパッケージング過程を省略することで、λファージパッケージングのサイズに制限されなくなるため、良好な実験結果を得、ファージミドp159OKを成功に構築した。構築されたファージミドp159OKは、サイズが57kb以上であるのに対し、従来のλファージパッケージングにより得られる担体は、大きくとも52kb以下である。
【００３１】
6)本発明において、自己発光部材をゲノムに導入することによっても、宿主菌を発光させることができる。本発明で得られたARPは、担った自己発光部材をMtbに導入し、生きているMtbを発光させる(死菌が発光しない)ことができることにより、サンプルにおける生きている宿主菌を迅速に診断し、宿主菌の薬剤感受性を迅速検出することができる。ここで、診断の感度を向上させるために、ファージ殺滅剤(中和剤)及び指示菌(マイコバクテリウム・スメグマチス，Mycobacterium.smegmatis MC?2155,略称:Msm)を使用する。指示菌を用いて信号を迅速に拡大することで、反応が同一の低価の小チューブ内で完成し、発光信号が強く、長期間にわたっても検出され得る。
【００３２】
8)本発明が提供する人工ファージは以下の効果を奏する。I.自己発光マイコバクテリウムトランスポゾンの変異株を効率的に製造することができ、遺伝子機能の研究が便利である。II.サンプルにおける生きているMtbを簡単、低価、迅速に診断することができ、ファージの特異性により菌種の同定を行うことができる。III.薬剤感受性試験(drug susceptibility testing,DST)を簡単、低価、迅速に行うことができる。
【００３３】
9)本発明のファージを形質転換して得られた自己発光ファージは、発光の有無によって細菌の生死を判断することができ、様々な実験検出に適用できる。
【００３４】
10)本発明のファージを形質転換して製造された自己発光マイコバクテリウムは、インビトロでの薬物活性の検出に適用でき、基質を必要とせず、同一サンプルを連続的に検出することができ、感度が高く、反復性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図1は、現在臨床で使用されている英国BIOTEC公司のファージ生物増幅法(PhaB法)による検出の原理図である。感染時間を正確に把握する必要があり、そうしないと、侵入が十分ではないか、又は侵入した後に生細胞を溶解することで、感受性が低下し、少なくとも18-24時間が必要である。
【図２】図2は、従来の組換えレポーターファージを構築する原理図である。同図には、EGFP-phageの構築を例とし、使用されるレポーター遺伝子は、強化された緑色蛍光タンパク質遺伝子(egfp)?[17,18]であり、LRP法の組換えレポーターファージが使用するレポーター遺伝子は、ホタルルシフェラーゼ遺伝子(Fluc)であり、この2つの方法の異なるところは、レポーター遺伝子の違いにある。
【図３】図3は、プラスミドpUCRLlux2Pの構築フローチャートである。
【図４】図4は、プラスミドpYUOKの構築フローチャートである。
【図５】図5は、プラスミドpYUOKLARTの構築フローチャートである。
【図６】図6は、ファージミドp159OKの構築フローチャートである。
【図７】図7は、ファージARPによるサンプルにおける宿主マイコバクテリウムの迅速検出の原理及びフローチャートである。
【図８】図8は、異なる培養時刻での、本発明のARPにより検出された実験室Mtb菌株の蛍光強度である。
【図９】図9は、本発明のARPによる臨床サンプルの検出結果である。横線は、陰性サンプルと陽性サンプルを区分する臨界値(RLU=80，即ち、蛍光強度が陰性対照の120％である)を示す。Conは対照で、喀痰スミア陰性である。P1-P9は喀痰スミア陽性である。
【図１０】図10は、本発明のARPで異なる力価のMtbを含むサンプルを検出した?果である。Conは陰性対照を示し、Mtbを含まない。Undilutedは未希釈のサンプルを示す。10?-nは、10のn倍希釈することをいい、10-8に希釈したときに、各サンプルにおけるMtbは10個のMtb未満である。横線は、陰性サンプルと陽性サンプルを区分する臨界値(即ち、蛍光強度が陰性対照の120％である)を示す。同図には、19h、24hは共に指示菌を加えてから30℃で培養した時間である。
【図１１】図11は、本発明のファージARPによる宿主マイコバクテリウムの薬剤感受性の迅速検出の原理図である。
【図１２】図12は、本発明のファージARPによるMtbの薬剤感受性の検出である。同図には、Conは、薬物を添加していないDMSO対照群であり;リファンピン(RIF，2μg/ml)、イソニアジド(INH，1μg/ml)、エタンブトール(EMB，5μg/ml)、リネゾリド(LZD，1μg/ml)、オキサゾリジノン類(PNU，0.5μg/ml);n.s.は、エタンブトールを対照群と比較した結果、有意差(p>0.05)が認められないことを示し;符号「*」は、各薬物をそれぞれ対照群と比較した結果、有意差(p<0.05)が存在することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
宿主細菌を自己発光させることができるファージミドであって、
前記ファージミドに宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列を含み、前記塩基配列に発光に必要な遺伝子LuxCDABEを含むファージミド。
【００３７】
好ましくは、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列に、トランスポゾンシステム、耐性遺伝子及び/又はプロモーターをさらに含む。
【００３８】
好ましくは、前記トランスポゾンシステムは、宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列を宿主ゲノムに転移する。
【００３９】
好ましくは、前記トランスポゾンシステムは、Himar1 mariner、TnAファミリーから選択される1種である。
【００４０】
好ましくは、前記耐性遺伝子は、ハイグロマイシン耐性遺伝子Hyg、カナマイシン耐性遺伝子Kan、チオスポリン耐性遺伝子Tsr、アプラマイシン耐性遺伝子Aprから選択される少なくとも1種である。
【００４１】
好ましくは、前記プロモーターは、宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列が宿主ゲノムのあるサイトに転移したときに、該サイトの前後の遺伝子の正常発現を保証するためのものである。
【００４２】
好ましくは、前記プロモーターは、プロモーターMop、G13、Hsp60、A37から選択される少なくとも1種である。
【００４３】
前記トランスポゾンシステムは、トランスポザーゼ遺伝子及び逆方向反復配列を含み、
前記耐性遺伝子は遺伝子LuxCDABEと結合し、LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子断片の両端にプロモーター-LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子-プロモーターと記するプロモーターが結合され、プロモーターは、トランスポゾンが宿主ゲノムのあるサイトに転移したときに、該サイトの前後の遺伝子の正常発現を保証するためのものであり、
前記プロモーター-LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子-プロモーター断片の両端に、それぞれトランスポゾンシステムにおける2つの逆方向反復配列が結合されることにより、トランスポザーゼの作用でプロモーター-LuxCDABE遺伝子-耐性遺伝子-プロモーター断片を宿主ゲノムに転移することを実現する。
【００４４】
好ましくは、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列に、大腸菌内で複製可能な複製開始点をさらに含むことにより、前記塩基配列は、プラスミド又はファージミド内で大量に複製することができる。
【００４５】
好ましくは、上記複製開始点はoriEである。
【００４６】
好ましくは、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列に、CosAサイトをさらに含む。
【００４７】
好ましくは、前記宿主細菌を自己発光させることができる目的塩基配列に、ファージミド骨格と相同組換えすることができる組換えサイトをさらに含むことにより、前記塩基配列をファージミド骨格内に結合することができる。
【００４８】
好ましくは、前記ファージミド骨格は、ファージミドphAE159に由来する。
【００４９】
好ましくは、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列は、SEQ ID NO:1に示される。
【００５０】
好ましくは、前記ファージミドに、phAE159骨格をさらに含み、前記宿主細菌を自己発光させることができる塩基配列は、phAE159骨格の2つの組換えサイトの間に位置する。
【００５１】
上記ファージミドの製造方法では、遺伝子LuxCDABEを含む目的断片と組換えできるようにファージミド骨格を線状配列に酵素消化し、酵素消化されたファージミド骨格と遺伝子LuxCDABEを含む目的断片とを混合して共に大腸菌コンピテントセルに導入し、大腸菌内で組換え、増幅を行い、陽性組換え大腸菌のプラスミドを抽出することにより、ファージミドを得る。
【００５２】
好ましくは、上記ファージミドの製造方法において、制限酵素PacIでファージミド骨格phAE159を消化し、酵素消化された大断片生成物を回収し、回収された生成物とSEQ ID NO:1に示される塩基断片とを混合して共に大腸菌コンピテントセルに導入し、陽性組換え大腸菌のプラスミドを抽出することにより、ファージミドを得る。
【００５３】
好ましくは、上記SEQ ID NO:1に示される塩基断片の製造方法は、以下のステップ（1）〜（8）を含む。
ステップ（1):pUCF2プラスミドの構築
SEQ ID NO:2に示されるF0断片を人工合成し、F0断片をpUC19担体に結合することでpUCF0プラスミドを得、制限酵素XbaIでpUCF0プラスミドを消化し、約2.8kbの断片を回収し、XbaIで消化されたハイグロマイシン耐性遺伝子Hygを含む断片と回収された約2.8kbの断片とを結合することにより、約3.9kbのプラスミドpUCF2を得る。
ステップ（2):pUCF3プラスミドの構築
SEQ ID NO:3に示されるF1断片を人工合成し、F1断片をpUC19担体に結合することでpUCF1プラスミドを得、制限酵素KpnI及びEcoRIでpUCF1プラスミドを消化し、約2.7kbの断片を回収し、制限酵素KpnI及びEcoRIでpUCF2を消化し、約1.3kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4kbのプラスミドpUCF3を得る。
ステップ（3):pUCRLlux2Pプラスミドの構築
制限酵素KpnI及びXhoIでプラスミドpUCF3を消化し、約3.9kbの断片を回収し、制限酵素KpnI及びXhoIでプラスミドpluxOKを消化し、約6.3kbの断片を回収し、前記2つの機能断片を結合することにより、約10.2kbのプラスミドpUCRLlux2Pを得る。
ステップ（4):プラスミドpYUBTの構築
ファージMycoMarT7からトランスポザーゼのトランス遺伝子配列を増幅し、トランス遺伝子の5’端にNcoI酵素消化サイトを増加し、3’端にSpeI酵素消化サイトを増加し、増幅された生成物をNcoI及びSpeIで消化した後、約1kbの断片を回収し、プラスミドpYUB854を制限酵素NcoI及びSpeIで消化した後、約3.8kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4.8kbのプラスミドpYUBTを得る。
ステップ（5):プラスミドpYUOKの構築
プラスミドpUCRLlux2Pを制限酵素NcoI及びSpeIで消化し、約7.6kbの断片を回収し、制限酵素NcoI及びXbaIでプラスミドpYUBTを消化し、約2.9kbの断片を回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約10.5kbのプラスミドpYUOKを得る。
ステップ（6):プラスミドp159LARTの構築
SEQ ID NO:4に示される塩基断片を合成し、担体pUC19に結合することでプラスミドp159LRを得、プラスミドp159LRをNheIで消化して回収し、増幅して両端にNheI酵素消化サイトを有するApr遺伝子断片を得、該断片を制限酵素NheIで消化して回収し、回収された前記2つの断片を結合することにより、約4.8kbのプラスミドp159LARTを得る。
ステップ（7):プラスミドpYUOKLARTの構築
制限酵素PacIでプラスミドpYUOKを消化し、約10.5kbの断片を回収し、制限酵素PacIでプラスミドp159LARTを消化し、約2kb断片を回収し、前記2つの機能断片を結合することにより、約12.5kbのプラスミドpYUOKLARTを得る。
ステップ（8):SEQ ID NO:1に示される塩基断片の取得
制限酵素SmaIでプラスミドpYUOKLARTを回収し、酵素消化された大断片生成物を回収することにより、SEQ ID NO:1に示される塩基断片を得る。
【００５４】
上記の何れかのファージミドを含む自己発光部材を送達可能なファージ。
【００５５】
上記の何れかファージミドの、宿主細菌検出及び/又は薬剤感受性検出における使用。
【００５６】
好ましくは、上記細菌はマイコバクテリウムである。
【００５７】
好ましくは、上記マイコバクテリウムは、マイコバクテリウム・スメグマチス、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・マリヌム及びカルメット-ゲラン桿菌を含む。
【００５８】
上記ファージの、宿主細菌検出及び/又は薬剤感受性検出における使用。
【００５９】
上記ファージによる宿主細菌の検出方法は、
ファージを含む液体を検出されるサンプルに加えるステップ（1)と、
36.5〜42℃で35min以上培養し、蛍光照度計により発光を検出するステップ（2)と、
陰性対照群と比較した結果、顕著な蛍光を発した場合に、サンプルに大量の生きているマイコバクテリウムを含むことを示す一方、発した蛍光の強度がファージを加えていない陰性対照群の蛍光強度の120％よりも低い場合に、ファージを死滅させる試薬SKを加えることにより、ゲノムにおける、マイコバクテリウムに入っていない前記ファージを死滅させるステップ（3)であって、前記試薬SKは、過硫酸アンモニウム、硫酸第一鉄、硫酸アンモニア、硫酸第一鉄アンモニウムから選択される少なくとも1種であるステップ（3)と、
中和剤SNを加えて過剰な試薬SKを中和し、指示菌を加え、20〜32℃で12h以上培養するステップ（4)であって、前記中和剤SNは、MgSO4、重クロム酸カリウム、CaCl2、MnCl2から選択される少なくとも1種であるステップ（4)と、
蛍光照度計により指示菌を加えた後のサンプルの発光を検出した結果、サンプルが発光した場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していたことを示す一方、サンプルが発光しなかった場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していなかったことを示すステップ（5)と、
を含む。
【００６０】
好ましくは、指示菌は、上記ファージの宿主であり、前記ファージは該宿主内で増幅し続け、細胞を溶解することができる。
好ましくは、上記ステップ（2)において、培養温度は36.5〜37.5℃である。
好ましくは、上記ステップ（4) において、培養温度は29〜31℃である。
【００６１】
上記ファージによる、宿主細菌の薬剤感受性の検出方法は、
ファージと宿主細菌とを混合すると同時に、一定濃度の検出される薬物を添加するステップ（1)と、
36.5〜42℃で少なくとも2h培養した後、蛍光照度計により発光を検出するステップ（2)と、
検出されたサンプルの発光値と薬物を添加していないサンプルの発光値との間に顕著な差異がある場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して敏感であることを示す一方、顕著な差異がない場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して薬剤耐性を有することを示すステップ（3)と、
を含む。
【００６２】
以下、具体的な実施例により本発明をさらに説明する。なお、本発明は、これらの実施例に制限されない。
【００６３】
以下の実施例に使用される分子生物学実験技術は、PCR増幅、プラスミド抽出、プラスミド転換、DNA断片結合、酵素消化、ゲル電気泳動等を含む。具体的には、《分子クローン実験指南》(第三版)(Sambrook J,Russell DW，Janssen K,Argentine J.黄培堂ら訳，2002，北京:科学出版社)を参照することができる。
以下の実施例において、PCR反応に使用されるDNAポリメラーゼ、dNTP及び関連する試薬は、全て北京全式金生物有限公司から購入されるものである。大腸菌コンピテントセルDH5αは、広州東盛生物科技有限公司から購入されるもの（型番:C1042）である、DNA結合反応は、Takara宝生物公司のT4DNA結合キット（型番:D6020A）を採用する。プラスミド小型キット(P1001)、大型プラスミド抽出キット(P1151-02)、ゲルDNA回収キット(D2111)、PCR生成物回収キット(D2120/D2121)は、広州美基生物公司から購入される。本発明に係る制限酵素は、全てTakara宝生物公司から購入される。アンピシリン及びアプラマイシン抗生物質は、広州威佳生物科技有限公司から購入される。係るハイグロマイシンは、LJ公司から購入される。
【００６４】
実施例1:ファージミドp159OKの構築
ファージミドp159OKの構築フローチャートを図3〜6に示す。ファージミドp159OKには、phAE159ファージ骨格、マイコバクテリウムの強力なプロモーター(Hsp60)、発光に必要な酵素遺伝子(LuxCDABE)、ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hyg)、トランスポザーゼ遺伝子(Trans)、逆方向反復配列IR-L及びIR-R、プロモーターMop及びG13。が含まれる。各部材の機能は以下の通りである。
Hsp60:マイコバクテリウムの強力なプロモーターであり、後続の遺伝子の強発現を起動することができる。
LuxCDABE:発光に必要な酵素遺伝子であり、該遺伝子の発現により宿主菌が自己発光できるようになる(Hakkila K,Maksimow M,Karp M,Virta M(2002)Reporter genes lucFF,luxCDABE,gfp,and dsred have different characteristics in whole-cell bacterial sensors.Analytical biochemistry 301:235-242)。
ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hyg):Hygは、選択的標識であり、スクリーニングにより目的菌株を得るために用いられる。ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hyg)は、マイコバクテリウム及び大腸菌で発現した後、宿主をハイグロマイシンに対する耐性を獲得させることができ、つまり、ハイグロマイシン抗生物質を含む培地で増殖することができる。ハイグロマイシン(hygromycin，略称:Hyg)は、よく使われる耐性スクリーニング薬物であり、マイコバクテリウムに使用されるHygの濃度が50μg/mLであり、大腸菌に使用されるHygの濃度が200μg/mLである。
トランスポザーゼ遺伝子(Trans):転移機能を実行する酵素の遺伝子である。
逆方向反復配列(IR-L及びIR-R):トランスポゾンの両端に位置し、トランスポゾンの構成成分である。
プロモーター(Mop及びG13):トランスポゾンがゲノムあるサイトに転移したときに、該位点の前後の遺伝子の正常発現を保証できる。
【００６５】
具体的な構築方法は、以下のステップを含む。
1.プラスミドpUCF2の構築
出発プラスミドpUCF0は、上海捷瑞公司で合成したF0断片(例えば、SEQ ID NO:2に示される)と担体pUC19とを結合したプラスミドであり (図3;F0断片にプロモーターG13、逆方向反復配列IR-R等を含む)、それを制限酵素XbaIで消化し、ゲルDNA回収キットにより約2.8kbの断片を回収し、pTYdHmプラスミドは、本実験で構築したものであり (図3;具体的な構築方法は、文献Piuri,M.,,W.R.J.J.,and,G.F.H.Fluoromycobacteriophages for Rapid,Specific,and Sensitive Antibiotic Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis.PLoS One.2009,4,e487を参照)、それを制限酵素XbaIで消化し、約1kbのハイグロマイシン耐性遺伝子Hygを含む断片を回収し、上記2つの断片を結合することで、約3.9kbのプラスミドpUCF2を得、大腸菌コンピテントセルDH5αを転換し、ハイグロマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、モノクローンを取りLB液体培地で培養した後、プラスミドを抽出し、制限酵素Sall及びPstIで酵素消化を行い、Hygの挿入方向を確認した。正確なプラスミドpUCF2は、800bpと3kbの2つのバンドを切り出せる。
【００６６】
2.pUCF3プラスミドの構築
出発プラスミドpUCF1は、是由上海捷瑞公司で合成したF1断片(SEQ ID NO:3に示される) と担体pUC19とを結合したプラスミドであり(図3;F1断片にプロモーターMop、逆方向反復配列IR-L等を含む)、KpnI及びEcoRIでプラスミドpUCF1を消化し、ゲルDNA回収キットにより約2.7kbの断片を回収した。構築された上記プラスミドpUCF2を制限酵素KpnI及びEcoRIで消化し、ゲルDNA回収キットにより1.3kbの断片を回収した。上記2つの機能断片を結合して約4kbのプラスミドpUCF3を得、大腸菌コンピテントセルDH5αを転換し、ハイグロマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、モノクローンを取りLB液体培地で培養した後、プラスミドを抽出して酵素消化を行い鑑定した。正確なプラスミドpUCF3を実験の次のステップに用いる。
【００６７】
3.pUCRLlux2Pプラスミドの構築
図3に示すように、構築された上記プラスミドpUCF3を制限酵素KpnI及びXhoIで消化し、約3.9kbの断片を回収し、制限酵素KpnI及びXhoIでプラスミドpluxOK(Eric Nuermberger教授（Johns Hopkins University）からの贈り物;具体的な構築方法は、Forti F,Mauri V,Deho G,Ghisotti D.Isolation of conditional expression mutants in Mycobacterium tuberculosis by transposon mutagenesis.Tuberculosis.2011;91(6):569-578.を参照) を消化し、約6.3kbの機能断片KpnI-Hsp60-luxCDABE-XhoIを回収した。上記2つの断片を結合することで約10.2kbのプラスミドpUCRLlux2Pを得、大腸菌コンピテントセルDH5αを転換し、ハイグロマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、モノクローンを取りLB液体培地で培養した後、プラスミドを抽出して酵素消化を行い鑑定した。正確なプラスミドを実験の次のステップに用いる。
【００６８】
4.pYUBTプラスミドの構築
1)プライマーZZf(SEQ ID NO:5に示される)及びZZr(SEQ ID NO:6に示される)によりファージMycoMarT7からトランスポザーゼトランス遺伝子配列(SEQ ID NO:9に示される) を増幅し、増幅際に、トランス遺伝子の5’端にNcoI酵素消化サイト、3’端にSpeI酵素消化サイトを増加し、増幅した生成物をNcoI及びSpeI一晩消化して回収した。
2)制限酵素NcoI及びSpeIでプラスミドpUCF2を消化し、2.7kbの断片を回収し、上記回収された2つの断片を結合して3.7kbのプラスミドpUCF4(図4)を得、シーケンシングに供した。
3)トランス遺伝子シーケンシングが正確なプラスミドpUCF4をNcoI及びSpeIで消化し、約1kbの断片(図4)を回収した。
4)プラスミドpYUB854を制限酵素NcoI及びSpeIで消化し、約3.8kbの断片(図4)を回収した。
5)ステップ3)及びステップ4)における2つの断片を結合して約4.8kbのプラスミドpYUBT(図4)を得、大腸菌コンピテントセルDH5αを転換し、ハイグロマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、モノクローンを取り、LB液体培地で培養した後、プラスミドを抽出して酵素消化を行い鑑定した。正確なプラスミドは実験の次のステップに使用され得る。
【００６９】
5.プラスミドpYUOKの構築
プラスミドpUCRLlux2Pを制限酵素NcoI及びSpeIで消化し、約7.6kbの断片を回収し、制限酵素NcoI及びXbaIでプラスミドpYUBTを消化し、約2.9kbの断片を回収した。XbaI及びSpeIはアイソカウドマー（Isocaudomer）である。上記2つの断片を結合して約10.5kbのプラスミドpYUOKを得、大腸菌コンピテントセルDH5αを転換し、ハイグロマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、モノクローンを取り、LB液体培地で培養した後、プラスミドを抽出して酵素消化を行い鑑定した。正確なプラスミドは実験の次のステップに使用され得る。
【００７０】
6.プラスミドp159LARTの構築
担体pUC19にプラスミドphAE159の2つの同じ組換え断片159L、159Rを含む塩基断片(例えば、SEQ ID NO:4に示される)を合成してプラスミドp159LR(図5)を得た。プラスミドp159LRを制限酵素NheIで消化した後回収し、プライマーAprF(SEQ ID NO:7)及びAprR(SEQ ID NO:8)によりプラスミドpMH94A(本実験室)から増幅してApr遺伝子断片を得た。増幅際に、Apr遺伝子にNheIの酵素消化サイトを増加した。PCR生成物を回収した後、制限酵素NheIで一晩消化し、そのままPCR回収キットにより回収した。上記2つの断片を結合して約4.8kbのプラスミドp159LART(図5)を得、大腸菌コンピテントセルDH5αを転換し、アプラマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、モノクローンを取り、LB液体培地で培養した後、プラスミドを抽出して酵素消化を行い鑑定した。正確なプラスミドは実験の次のステップに使用され得る。
【００７１】
7.プラスミドpYUOKLARTの構築
図5に示すように、制限酵素PacIでプラスミドpYUOKを消化し、約10.5kbの断片を回収し、制限酵素PacIでプラスミドp159LARTを消化し、約2kbの断片を回収し、上記2つの機能断片を結合して約12.6kbのプラスミドpYUOKLARTを得、大腸菌コンピテントセルDH5αを転換し、アプラマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、モノクローンを取り、LB液体培地で培養した後、プラスミドを抽出して酵素消化を行い鑑定した。正確なプラスミドは実験の次のステップに使用され得る。
【００７２】
8.ファージミドp159OKの構築
図6に示すように、制限酵素PacIでファージミドphAE159(Howard Hughes Medical Instituteからの贈り物)を消化し、エタノール沈殿法により酵素消化の生成物を回収し、制限酵素SmaIでプラスミドpYUOKLARTを消化し、エタノール沈殿法により酵素消化の生成物を回収し、この2つの生成物を混合して大腸菌BJ5183コンピテントセルに導入することで、57kbのファージミドp159OKを得た。ハイグロマイシン耐性を有するLB固体平板により陽性クローンをスクリーニングし、発光を検出した後、モノクローンを取り、LB液体培地で培養した後、発光を検出し、発光菌液からプラスミドを抽出し、制限酵素PacIで鑑定した。正確なファージミドp159OKは、10.5kb及び2.1kbのバンドを切り出せる。
【００７３】
実施例2:自己発光部材を送達可能なファージの製造方法
本実施例で使用される7H9培地、ツイーン80は、広州華奇盛生物公司から購入され、寒天粉末は、広州康龍生物公司から購入され、Biorad電気変換器(Biorad GenePμLser Xcell)及び電気変換カップは、Biorad公司から購入される。
【００７４】
材料
1)マイコバクテリウム・スメグマチス(Mycobacterium.smegmatis MC?2155，Msm);从中国普通微生物菌種寄託管理中心から入手;寄託番号:1.2621
2) 上層寒天:0.6％の寒天
3)MP緩衝液:50mL 1M Tris-HCL(pH 7.5)、8.766g NaCl(最終濃度150mM)、2.46g硫酸マグネシウム七水和物(最終濃度10mM)、0.222g無水塩化カルシウム(最終濃度2mM)を蒸留水に加え、1Lまで蒸留水を添加し、ろ過滅菌した。
【００７５】
具体的な操作方法は以下の通りである。
電気変換によるファージの製造方法
1)標識された0.2cmの電気変換カップにそれぞれ10μLの濃縮されたプラスミドP159OK及び200μLのMsmコンピテントセルを加えた。柔らかく吹吸することにより十分に混合した後、氷で10分間放置し、電気変換カップ上の水分を拭き除いてから電気変換器に入れた。
2)電気変換器を用いて、電圧2.5KV、電気抵抗1000Ω、静電容量25μFの条件下でパルス波により電気変換を行った。プラスミドを添加していない細菌陰性対照のパルス時間は19〜21秒であり、該時間範囲は、変換される細菌が良好な状態にあることを示す。コンピテントセルが十分に洗浄されないか、又はプラスミドに多くの塩が含まれると、爆発する恐れがある。
3)電気変換液に2mLの7H9(ツイーン80を含まない)培地を加え、50mL遠心管に移転し、37℃のインキュベータで3時間インキュベートした。
4)遠心分離により上澄みを除去し、150μLの7H9(ツイーン80を含まない)培地で再懸濁した後、10μL又は100μLの菌液を取って3.5mLの42℃に冷却した上層寒天に加え、LB固体培地平板に敷き、30℃のインキュベータでインキュベートした。48時間後に溶菌斑が認められ、大きな溶菌斑が48時間以内に認められる。
5)各平板に2mLのMP緩衝液を加え、4℃で数時間振盪した後、MP緩衝液で溶出された液体を取り、0.4umフィルターによりろ過した後、4℃で保存し、ファージを得た。
【００７６】
実施例3:ファージによるマイコバクテリウムの転移方法
1)マイコバクテリウムを50mLの7H9(含0.1％tween 80)を含む液体培地を入れた三角フラスコに加え、37℃でODが0.8-1.0に達するまで揺動培養した。
2)45mLの培養菌液を取り、同体積のMP緩衝液で洗浄し、6000rpmで5分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
3)5mLのMP緩衝液で再懸濁し、200μLを対照として取った。
4)約1011個の上記製造されたファージを(又はMP緩衝液を対照として)加え、37℃で4-12時間インキュベートした。なお、ファージの体積が2mL未満であることが好ましい。
5)ハイグロマイシン耐性を有する7H11固体培地の表面に敷き、37℃で3日前後(低速マイコバクテリウムの場合、3-4周) インキュベートして、コロニーが認められ、発光のコロニーを得た。トランスポゾンが挿入突然変異した自己発光可能なマイコバクテリウムコロニーを得た。
【００７７】
実施例4本発明のファージのMtb菌検出における使用
方法:サンプルにおける生きているマイコバクテリウム(例えばMtb)の検出方法;検出原理を図7に示す。
1)ファージ(以下、ARP)を含む液体を検出されるサンプルに加えた。
2)37℃で35min以上培養し、蛍光照度計により発光を検出した。該ステップにおいて、培養温度は36.5〜42℃であり得る。
3) 顕著な蛍光を発した場合に、サンプルに大量の生きているマイコバクテリウムを含むことを示す一方、発した蛍光の強度がファージを加えていない陰性対照群の蛍光強度の120％よりも低い場合に、ファージを死滅させる試薬SKを加えることにより、ゲノムにおける、マイコバクテリウムに入っていないARPを死滅させた。前記試薬SKは、過硫酸アンモニウム、硫酸第一鉄、硫酸アンモニア、硫酸第一鉄アンモニウムから選択される少なくとも1種であり、Sigma公司から購入される。
4)次に、中和剤SNを加えて過剰なSKを中和し、指示菌(Msm)を加え、30℃(該培養温度は20〜32℃であり得る)で12h以上培養した。この間に、サンプルのマイコバクテリウム内部に侵入したファージは宿主を溶解して解放された後、指示菌を大量に感染し、侵入、宿主溶解の過程を繰り返して発生することができる。十分に多くのARPが十分に多くの指示菌に侵入した後、サンプルが発光することにより、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在することを推測できる。
前記中和剤SNは、MgSO4、重クロム酸カリウム、CaCl2、MnCl2から選択される少なくとも1種であり、Sigma公司から購入される。
5) 蛍光照度計により指示菌を加えた後のサンプルの発光を検出した結果、サンプルが発光した場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していたことを示す一方、サンプルが発光しなかった場合に、前のサンプルに生きているマイコバクテリウムが存在していなかったことを示す。
【００７８】
一、上記の方法では、本発明のファージARPにより108個以上のMtbを含むサンプルを検出し、ファージARPを含む液体を検出されるサンプルに加え、37℃で35min培養した後、対照群と比較することだけで、蛍光照度計により顕著な発光強度を検出することができる。よって、本検出方法は、速度が速く、操作が簡単で、培養時間の延長につれて蛍光強度が強くなる（図8）。
【００７９】
二、上記の方法では、本発明のファージARPにより9つの(P1〜P9)陽性臨床喀痰サンプルを検出し、検出結果を図9に示す。図9からわかるように、ファージARPを含む液体を検出されるサンプルに加え、37℃で2時間培養した後、9つのサンプルにおけるP1，P4，P5及びP8が陽性を示し、4時間後、P2も陽性を示した。他の陽性喀痰サンプルにおけるMtbの含有量が少ないため、短時間内(4h内)で効果的に検出されなかった。
【００８０】
三、上記検出方法の感度をさらに研究するために、以下、希釈倍数が異なるMtbサンプルを検出する。10-8に希釈したときに、各サンプルにおけるMtbが10個以下である。具体的な操作方法は、実施例4に記載の方法である。ファージを加え、37℃で4時間培養する。検出結果を図10に示す。指示菌を加えて約24時間培養した後、サンプルにおけるマイコバクテリウムが10個未満であることを検出することができる。
【００８１】
以上のことより分かるように、サンプルに多くのMtbが存在する場合に、4時間以内に迅速に検出され得る一方、サンプルにおけるMtbが少ない場合に、約28h後にサンプルにおけるマイコバクテリウムが10個未満であることが検出され得る。
【００８２】
実施例5:本発明のファージの、宿主菌株の薬剤感受性検出における使用
方法:宿主菌株(例えば、Mtb)の薬剤感受性の検出方法;検出原理を図11に示す。
1)本発明で製造されたファージARPと1.5mL透明小管(又は96ウェルプレート)に含まれる目的生菌(例えば、Mtb)とを混合し、一定濃度の検出される薬物を添加する。
2)37℃で少なくとも2h培養した後(培養温度:36.5〜42℃)、蛍光照度計により発光を検出する。
3) 検出されたサンプルの発光値と薬物を添加していないサンプルの発光値との間に顕著な差異がある場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して敏感であることを示す一方、顕著な差異がない場合に、該標的細菌が該濃度の薬物に対して薬剤耐性を有することを示す。
【００８３】
上記検出方法により、リファンピン(RIF，2μg/ml)、イソニアジド(INH，1μg/ml)、エタンブトール(EMB，5μg/ml)、リネゾリド(LZD，1μg/ml)、オキサゾリジノン類(PNU，0.5μg/ml)に対するMtbの感受性を検出し、検出結果を図12に示す。この結果より分かるように、37℃で少なくとも4h培養した後、対照群と比較して、リファンピン(RIF，2μg/ml)、イソニアジド(INH，1μg/ml)、リネゾリド(LZD，1μg/ml)、オキサゾリジノン類(PNU，0.5μg/ml)の処理群については、全て顕著な蛍光減少が認められ、これはMtbがリファンピン(RIF，2μg/ml)、イソニアジド(INH，1μg/ml)、リネゾリド(LZD，1μg/ml)、オキサゾリジノン類(PNU，0.5μg/ml)に対して薬剤感受性を有することを示している。8h培養した後、エタンブトール(EMB，5μg/ml)処理群についても、顕著な蛍光減少が認められ、これはMtbがエタンブトール(EMB，5μg/ml)に対して高感受性を有することを示している。
【００８４】
以上のことから、本発明の検出方法によれば、4-8時間内に宿主細菌(例えば、Mtb)の複数種の薬物に対する感受性を迅速に検出することができる。
【００８５】
上記実施例は、本発明の好ましい実施形態であるが、本発明の実施形態は上記実施例に制限されず、本発明の趣旨及び原理を逸脱しない範囲内で行なった変化、修飾、置換、組合せ、簡単化などは、すべて本発明の保護範囲に含まれるべきである。
【図１】
2019512227.tif 000005
【図２】
2019512227.tif 000006
【図３】
2019512227.tif 000007
【図４】
2019512227.tif 000008
【図５】
2019512227.tif 000009
【図６】
2019512227.tif 000010
【図７】
2019512227.tif 000011
【図８】
2019512227.tif 000012
【図９】
2019512227.tif 000013
【図１０】
2019512227.tif 000014
【図１１】
2019512227.tif 000015
【図１２】
2019512227.tif 000016
【配列表】
2019512227000001.app
【国際調査報告】
2019512227.tif 000017
2019512227.tif 000018
2019512227.tif 000019
2019512227.tif 000020
2019512227.tif 000021
2019512227.tif 000022