(57)【要約】  本発明は、癌、特に癌幹細胞を含む癌を治療するための医薬品を製造するためのルテニウム（ＩＩ）錯体の使用に関する。このルテニウム錯体は、グアニン四重鎖を選択的に金属化することが可能であり、それによって、ｃ−ＭＹＣ癌遺伝子の発現を増加させる。ｃ−ＭＹＣの割合のこの増加は、癌幹細胞の分化を促進し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌が癌幹細胞を含む癌である場合の、癌を治療するための医薬品を製造するための、式（Ｉ）：
【化１】
2019535699.tif 000022
［式中、
Ｎ１−Ｎ１−Ｎ１は、Ｎ，Ｎ，Ｎ−三座アザ芳香族配位子を表し；
Ｎ２−Ｎ２は、Ｎ，Ｎ−二座アザ芳香族配位子を表し；
Ｘは、ＯＨ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、およびＳＲ１Ｒ２から選択され；
Ｒ１およびＲ２は、独立に、置換されていてよいＣ１−Ｃ１２アルキルから選択され；
Ｙ−は、一価のアニオンであり；かつ
ｎは、１または２である］
のルテニウム錯体の使用。
【請求項２】
Ｎ１−Ｎ１−Ｎ１が、以下：
【化２】
2019535699.tif 000023
［式中、各基Ｒ’は、独立に、水素、置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキル、置換されていてよいＣ６−Ｃ１４アリール、置換されていてよい５員〜１０員のヘテロアリール、およびハロゲンから選択される］
からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｎ１−Ｎ１−Ｎ１が、以下：
【化３】
2019535699.tif 000024
からなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
Ｎ２−Ｎ２が、以下：
【化４】
2019535699.tif 000025
［式中、各基Ｒ’は、独立に、水素、置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキル、置換されていてよいＣ６−Ｃ１４アリール、置換されていてよい５員〜１０員のヘテロアリール、およびハロゲンから選択される］
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
Ｎ２−Ｎ２が、以下：
【化５】
2019535699.tif 000026
からなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
Ｎ１−Ｎ１−Ｎ１が
【化６】
2019535699.tif 000027
を表し、かつＮ２−Ｎ２が
【化７】
2019535699.tif 000028
を表し、式中、各基Ｒ’は、独立に、水素、置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキル、置換されていてよいＣ６−Ｃ１４アリール、置換されていてよい５員〜１０員のヘテロアリール、およびハロゲンから選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記ルテニウム錯体が、下式：
【化８】
2019535699.tif 000029
［式中、
Ｘは、ＯＨ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、およびＳＲ１Ｒ２から選択され；
Ｒ１およびＲ２は、独立に、置換されていてよいＣ１−Ｃ１２アルキルから選択され；
Ｙ−は、一価のアニオンであり；かつ
ｎは、１または２である］
を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
ＸがＯＨ２を表し、かつｎが２である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
ＸがＳＲ１Ｒ２を表し、ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立に、ハロゲン、ＯＲ’’、Ｎ（Ｒ’’）２、Ｎ（Ｒ’’）ＣＯＲ’’、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＯＲ’’、ＣＯ２Ｒ’’、ＯＣＯＲ’’、ＯＣＯ２Ｒ’’、ＯＣＯＮＨＲ’’、ＯＣＯＮ（Ｒ’’）２、ＣＯＮＨＲ’’、ＣＯＮ（Ｒ’’）２、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、および３員〜１０員のヘテロシクリルから選択される１個以上の基で置換されていてよいＣ１−Ｃ１２アルキルから選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記ルテニウム錯体が、以下：
【化９】
2019535699.tif 000030
（式中、Ｙ−は、一価のアニオンである）
からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
Ｙ−が、ＰＦ６−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＢＦ４−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＣＨ３ＳＯ３−、およびＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＳＯ３−からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸癌、および腎臓癌から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
前記癌が、膵臓癌、好ましくは膵腺癌である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
以下：
・請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）のルテニウム錯体、および
・ＡＢＣＧ２基体
を含んでなるコンジュゲート。
【請求項１５】
前記ＡＢＣＧ２基体が、イマチニブ、ゲフィチニブ、フラボピロドール、トポテカン、イリノテカン、ＳＮ−３８、ミトキサントロン、シメチジン、プラゾシン、スタチン類、ジドブジン、エストロン、１７β−エストラジオール、プロトポルフィリンＩＸ、２−アミノ−１−メチル−６−フェニルイミダゾ［４,５−ｂ］ピリジン、アムサクリン、アスパラギナーゼ、アザチオプリン、ビサントレン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フラボピリドール、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ヒドロキシ尿素、ロイコボリン、リポソームダウノルビシン、リポソームドキソルビシン、ロムスチン、クロルメチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、サトラプラチン、ストレプトゾトシン、テガフール・ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、トレオスルファン、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ＳＮ−３８、ビノレルビン、リボフラビン、Ｄ−ルシフェリン、ローダミン１２３、フェオホルビドａ、ＢＯＤＩＰＹ−プラゾシン、およびヘキスト３３３４２から選択される、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
前記ＡＢＣＧ２基体がリボフラビンである、請求項１４または１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
以下：
・請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）のルテニウム錯体、および
・抗腫瘍薬
を含んでなる、コンジュゲート。
【請求項１８】
前記ルテニウム錯体が式（Ｉ’）：
【化１０】
2019535699.tif 000031
［式中、Ｘ、ｎ、およびＹは、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のとおりである］
の錯体である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
式（Ｉ）のルテニウム錯体中のＸがＳＲ１Ｒ２を表し、ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立に、置換されていてよいＣ１−Ｃ１２アルキルから選択される、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
Ｘが、メチオニンまたはメチオニン誘導体から選択される、請求項１８または１９に記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
Ｘが式：
【化１１】
2019535699.tif 000032
［式中、
Ｒａは、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ６  Ｏ−アルキル、ＯＡｃ、ＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６  ＮＨ−アルキル、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）２、およびＮＨＡｃから選択され；かつ
各Ｒｂは、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、およびＡｃから選択される］
の化合物である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
前記ルテニウム錯体と、前記ＡＢＣＧ２基体または前記抗腫瘍薬とに共有結合しているリンカーを含んでなる、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
前記リンカーが１〜２０個の原子長の炭化水素鎖であり、ここで、該鎖の炭素原子の１個以上は、ＮＲ’、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子で置き換えられていてもよく、ここで、Ｒ’は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、およびアセチルから選択され；かつ前記鎖の炭素原子の１個以上は、＝Ｏ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＨ３、およびＰｈから選択される置換基で置換されていてもよい、請求項２２に記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
前記リンカーが、アミノ酸またはペプチド結合を介して結合している複数のアミノ酸の配列から選択される、請求項２２または２３に記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
以下：
・請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）のルテニウム錯体（式中、Ｘはメチオニンである）、
・リボフラビン、および
・任意で、前記ルテニウム錯体の前記メチオニンと、リボフラビンとに共有結合しているリンカー
を含んでなる、請求項１４〜１６および１８〜２４のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
下記の構造：
【化１２】
2019535699.tif 000033
（式中、Ｙ−は、一価のアニオンである）
を有する、請求項２５に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
医療において使用するための、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
癌幹細胞を含む癌の治療において使用するための、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸癌、および腎臓癌から選択される、請求項２８に記載の使用のためのコンジュゲート。
【請求項３０】
前記癌が、膵臓癌、好ましくは膵腺癌である、請求項２８または２９に記載の使用のためのコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌幹細胞を含む癌を治療するための、ルテニウム錯体またはそれを含有する医薬組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
白金を含有する金属性化合物は抗腫瘍活性を示すことが知られている。これらの金属性化合物の中で最もよく知られているものはシスプラチンであり、これは今日様々な癌の臨床治療に使用されている。
【０００３】
それにもかかわらず、この種の化合物に基づく抗腫瘍治療はしばしば重篤な副作用を引き起こす。従って、シスプラチンよりも選択的で毒性が低い抗腫瘍活性を有する金属性化合物を開発することに大きな関心が寄せられている。この意味で、ルテニウム錯体は、それらの動力学的安定性ならびにそれらの酸化還元特性および光化学的特性により有望な代替物である。非共有結合により二本鎖ＤＮＡを認識し、また、ＤＮＡと共有結合性付加体も形成するルテニウム錯体が記載されている。これらの錯体の大部分はＤＮＡの二本鎖と結合する。しかしながら、グアニン四重鎖（ＧＱ）の機能的関連性のために、これらの構造との結合によって作用することが可能な錯体を開発することは非常に興味深いであろう。この意味で、Wu et al., Inorg. Chem. 2013, 2, 11332は、ＧＱ構造を共有結合的に金属化することが可能なルテニウム錯体を記載しているが、この反応はどちらかといえば非選択的である。
【０００４】
腫瘍の発生および転移の開始に関連して、異なる細胞種に分化し自己複製することが可能な「癌幹細胞」と呼ばれる細胞集団が最近同定されたため、これらの細胞は、抗腫瘍治療後の再発プロセスおよび転移の開始に関連している可能性が高いと考えられる。従って、この細胞種に作用することが可能な新しい抗腫瘍療法を提供することは非常に興味深い。
【０００５】
癌の治療における別の課題は、活性化合物を作用部位に選択的に送達することを可能にし、それによって、必要な用量を減らし、かつ癌細胞に特異的に作用することを可能にし、正常細胞の損傷を防ぐ標的療法を達成することからなる。
【０００６】
従って、最先端にある技術の欠陥を解決することを可能にする、癌を治療するための代替方法を提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、本明細書において定義されるルテニウム（ＩＩ）錯体が、平行したグアニン四重鎖（ＧＱ）中に存在する不対グアニンを選択的に金属化することが可能であることを見出した。観察されたように、この選択的金属化は、多くの細胞プロセスに関与しているｃ−ＭＹＣ癌遺伝子の発現の増加を引き起こす。加えて、本発明者らは、ｃ−ＭＹＣの割合のこの増加は癌幹細胞の分化を促進する可能性があり、このことからこれらのルテニウム錯体は生物学および医学における重要なツールとなることを見出した。さらに、光を照射すると、金属化反応は錯体の種類に応じて多かれ少なかれ増加することが観察されている。
【０００８】
これを考慮して、第１の側面において、本発明は、癌幹細胞を含む癌を治療するための医薬品を製造するための、式（Ｉ）：
【化１】
2019535699.tif 000002
［式中、
Ｎ１−Ｎ１−Ｎ１は、Ｎ，Ｎ，Ｎ−三座アザ芳香族配位子を表し；
Ｎ２−Ｎ２は、Ｎ，Ｎ−二座アザ芳香族配位子を表し；
Ｘは、ＯＨ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、およびＳＲ１Ｒ２から選択され；
Ｒ１およびＲ２は、独立に、置換されていてよいＣ１−Ｃ１２アルキルから選択され；
Ｙ−は、一価のアニオンであり；かつ
ｎは、１または２である］
のルテニウム錯体に関する。
【０００９】
第２の側面では、本発明は、癌幹細胞を含む癌の治療において使用するための、本明細書において定義される式（Ｉ）のルテニウム錯体を含んでなる医薬組成物または医薬品に関する。
【００１０】
第３の側面では、本発明は、癌幹細胞を含む癌を治療するための方法に関し、この方法は、治療上有効な量の、本明細書において定義される式（Ｉ）のルテニウム錯体を投与することおよび光を照射することを含んでなる。
【００１１】
別の側面では、本発明は、以下を含んでなるコンジュゲートに関する：
・式（Ｉ）のルテニウム錯体、および
・ＡＢＣＧ２基体。
【００１２】
別の側面では、本発明は、以下を含んでなるコンジュゲートに関する：
・式（Ｉ）のルテニウム錯体、および
・抗腫瘍薬。
【００１３】
本発明の他の側面は、医療において使用するための、および癌幹細胞を含む癌の治療において使用するための、本発明のコンジュゲートに関する。最後に、本発明の別の側面は、癌幹細胞を含む癌を治療するための方法に関し、この方法は、治療上有効な量の、本明細書において定義されるコンジュゲートを投与することおよび光を照射することを含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（上）錯体１でのＧＭＰの金属化反応およびアコ２誘導体の形成。（左下）１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中での錯体１（２５０μＭ）とＧＭＰ（７５０μＭ）との反応のＨＰＬＣ：（ａ）ｔ＝０時点で暗所内；（ｂ）暗所で３０分後；（ｃ）４５５ｎｍで３０分照射した後の初期混合物；（ｄ）暗所で２時間後の初期混合物。（右下）モノ付加体３の質量スペクトル。
【図２】１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中での錯体１（２５０μＭ）と、ＧＭＰ（３当量、７５０μＭ）、ＡＭＰ（３当量、７５０μＭ）、ＴＭＰ（３当量、７５０μＭ）、およびＣＭＰ（３当量、７５０μＭ）との反応についてのＨＰＬＣクロマトグラム：（ａ）錯体１；（ｂ）４５５ｎｍで３０分照射した後の混合物。溶出剤：ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配１、０．１％ＴＦＡ。λｏｂｓ＝２２２。
【図３】ａ）１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（３当量、７５０μＭ）の存在下での錯体１（２５０μＭ）とＧＭＰ（３当量、７５０μＭ）との反応についてのＨＰＬＣクロマトグラム：４５５ｎｍで３０分照射した後の錯体１、ＧＭＰ、およびＨ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ。溶出剤：ＴＦＡの存在下でＡＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配１。λｏｂｓ＝２２２。ＧＭＰは、異性体２’−モノホスフェートおよび３’−モノホスフェートの混合物であるため、２つのピークとして現れる。ｂ）１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中、Ａｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ（３当量、７５０μＭ）の存在下での錯体１（２５０μＭ）とＧＭＰ（３当量、７５０μＭ）との反応についてのＨＰＬＣクロマトグラム：４５５ｎｍで３０分照射した後の錯体１、ＧＭＰ、およびＡｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ。溶出剤：ＴＦＡの存在下でＡＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配１。λｏｂｓ＝２２２。
【図４】（左）１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＫＣｌ中、室温でのｃ−ＭＹＣ（１０μＭ）と錯体１（５当量）との混合物のＨＰＬＣ：（ａ）ｔ＝０時点で暗所内；（ｂ）暗所で３０分後；（ｃ）４５５ｎｍで３０分照射した後の初期混合物、溶出剤：ＴＥＡＡの存在下でＡＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配３。λｏｂｓ＝２６０ｎｍ。（右）金属化生成物（ＭＹＣ−［Ｒｕ］）の質量スペクトルは錯体（ｍ／ｚ＝８０８９）および脱金属化フラグメント（ｍ／ｚ＝７６００）に対応するピークを示している。
【図５】１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中での錯体４（２５０μＭ）とＧＭＰ（７５０μＭ）との反応についてのＨＰＬＣクロマトグラム：（ａ）錯体４；（ｂ）暗所で３０分後；（ｃ）４５５ｎｍで３０分照射した後の同じ混合物。溶出剤：ＴＦＡの存在下でＡＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配１。λｏｂｓ＝２２２ｎｍ。
【図６】１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＫＣｌ中、室温でのｃ−ＭＹＣ（１０μＭ）と錯体４（５当量）との混合物のＨＰＬＣ：（ａ）錯体４；（ｂ）暗所で３０分後；（ｃ）４５５ｎｍで３０分照射した後の同じ混合物。溶出剤：ＴＥＡＡの存在下でＡＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配３。λｏｂｓ＝２６０ｎｍ。
【図７】１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中での錯体５（２５０μＭ）とＧＭＰ（７５０μＭ）との反応についてのＨＰＬＣクロマトグラム：（ａ）錯体５；（ｂ）暗所で３０分後；（ｃ）４５５ｎｍで３０分照射した後の同じ混合物。溶出剤：ＴＦＡの存在下でＡＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配１。λｏｂｓ＝２６０ｎｍ。
【図８】１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＫＣｌ中、室温でのｃ−ＭＹＣ（１０μＭ）と錯体５（５当量）との混合物のＨＰＬＣ：（ａ）錯体５；（ｂ）暗所で３０分後；（ｃ）４５５ｎｍで３０分照射した後の同じ混合物。溶出剤：ＴＥＡＡの存在下でＡＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配３。λｏｂｓ＝２６０ｎｍ。
【図９】１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中、室温での錯体１（２５０μＭ）についてのＨＰＬＣクロマトグラム：（ａ）ｔ＝０時点で暗所内；（ｂ）暗所で３０分後；（ｃ）４５５ｎｍで３０分照射した後の同じ混合物。溶出剤：ＴＥＡＡの存在下でＡＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配２。λｏｂｓ＝２２２ｎｍ。
【図１０】１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中、室温での錯体２（２５０μＭ）とＧＭＰ（７５０μＭ）との反応についてのＨＰＬＣクロマトグラム：（ａ）ｔ＝０時点で暗所内；（ｂ）暗所で３０分後；（ｃ）４５５ｎｍで３０分照射した後の初期混合物。溶出剤：ＴＥＡＡの存在下でＡＣＮ／Ｈ２Ｏ勾配２。λｏｂｓ＝２２２ｎｍ。
【図１１】（左）ｑＲＴ−ＰＣＲによるｃ−ＭＹＣ（薄色のバー）およびＡＬＡＳ1（濃色のバー）の発現レベルの解析。ＨｅＬａ細胞を、１００μＭの錯体１（ＲｕＣｌ）、ＴＭＰｙＰ４、または５０μＭの５−ＦＵともに１６時間または４８時間インキュベートした。発現レベルは、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現レベルと比較して表される。値は３回の実験の平均であり、エラーバーは標準誤差を示す。（右）ウエスタンブロットによるｃ−ＭＹＣの発現の解析。ＨｅＬａ細胞を、１００μＭの錯体１（ＲｕＣｌ）とともに１６時間インキュベートした後溶解し、ｃ−ＭＹＣを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて、抗ＭＹＣ抗体を用いるウエスタンブロットによって検出した（右、上のパネル）。２つの独立した実験におけるタンパク質の相対量を、デンシトメトリーによって定量した（右、下のパネル）。データは、未処理の対照に対する変化率として表される。エラーバーは、未処理の対照に対する変化率の標準偏差を示す。
【図１２】ｑＲＴ−ＰＣＲによるｃ−ＭＹＣの発現レベルの解析。Ｖｅｒｏ細胞を、１００μＭの錯体２（アコ）とともに１６時間インキュベートした。相対レベルは、ＧＡＰＤＨの発現レベルと比較して表される。結果は３回の実験の平均値に相当し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図１３】錯体１（ＲｕＣｌ）で処理した異なる細胞株の生存率アッセイ。不死化Ｖｅｒｏ細胞株（白色バー）、Ａ５４９細胞株（薄灰色バー）、およびＨｅＬａ細胞株（濃灰色バー）を、１００μＭのＲｕＣｌまたはＴＭＰｙＰ４、または５０μＭの５−ＦＵとともに３日間インキュベートした。細胞生存率は、標準的なＭＴＴアッセイを用いることによって解析した。値は、未処理の細胞（黒色バー）に対する変化率を表し、３つの異なる実験の平均結果であり、それらの各々は三連で実施された。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１４】（左）暗所（黒色バー）または照射後（６０分、白色バー）のｑＲＴ−ＰＣＲによって決定されたｃ−ＭＹＣの転写レベル。ＨｅＬａ細胞を、１００μＭの錯体５（ＲｕＭｅｔ）または錯体２（アコ）とともに１６時間インキュベートした。発現値は、ＧＡＰＤＨ遺伝子の発現と比較している。（右）錯体５の存在または不在下でのウエスタンブロットによって決定されたｃ−ＭＹＣタンパク質の発現レベル。β−アクチンの発現レベルに対するタンパク質の相対量を、デンシトメトリーによって定量した（下のパネル）。実験方法は、図１１に記載したものと同様であった。
【図１５】錯体５（ＲｕＭｅｔ）、錯体１（ＲｕＣｌ）、または錯体２（アコ）の存在または不在下でのウエスタンブロットによって決定されたｃ−ＭＹＣタンパク質の発現レベル。薄色のバーは、照射条件下でのｃ−ＭＹＣの発現レベルに対応し、一方、濃色のバーは、暗条件に対応する。ｃ−ＭＹＣの発現は、未処理のサンプルにおける発現に対する変化率として表される。β−アクチンの発現レベルに対するタンパク質の相対レベルを、デンシトメトリーによって定量した。
【図１６】錯体５（ＲｕＭｅｔ）で処理した異なる細胞株の生存率アッセイ。Ｖｅｒｏ細胞株およびＨｅＬａ細胞株を、１００μＭの錯体５とともに３日間インキュベートした。細胞生存率は、標準的なＭＴＴアッセイを用いることによって解析した。薄灰色バーは、照射条件下での実験値を示し、黒色バーは、暗所で決定された値を示す。値は、暗所での未処理の細胞（対照）に対する変化率を表し、３つの異なる実験の平均であり、各々は三連で実施された。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１７】膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞に対する錯体２（ＲｕＨ２Ｏ）の効果。（Ａ）異なる濃度の錯体２で処理したＰＤＡＣにおいて、異なる時間にわたって、ウエスタンブロットによって決定されたように、錯体２（ＲｕＨ２Ｏ）は、ＰＤＡＣ細胞におけるｃ−ＭＹＣの発現を増加させる。（Ｂ）錯体２（ＲｕＨ２Ｏ）は、ＰＤＡＣ癌幹細胞の自己複製能を低下させる。上のパネルは、実験計画を示している。下のパネルは、各処理群の播種後７日目に決定されるスフェア数／ｍＬの定量を示している。
【図１８】ｃ−ＭＹＣの発現と、パス数の少ない患者由来の異種移植片に基づいて確立された接着性ＰＤＡＣ培養物における細胞増殖に対するＲｕＨ２Ｏ（２５０μＭ）の効果。ＲｕＨ２Ｏでの処理の２４時間後および４８時間後の培養物におけるｃ−ＭＹＣの発現のウエスタンブロット解析。
【図１９】パス数の少ない患者由来の異種移植片に基づいて確立された接着性ＰＤＡＣ培養物における遺伝子発現に対するＲｕＨ２Ｏの効果。Ｐａｎｃ１８５細胞およびＰａｎｃＡ６Ｌ細胞のＲＮＡを、１００μＭのＲｕＨ２Ｏでの処理の２４時間後に抽出した。処理したサンプルから生成されたｃＤＮＡにおいてＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、およびＰＧＣ１αのｑＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。データは、ＨＰＲＴ  ｍＲＮＡの発現レベルに対して正規化されている。Ｐａｎｃ１８５細胞はまた、本明細書において１８５および１８５  ｓｃｄと互換的に呼ばれ、Ｐａｃｎ６ＡＬ細胞はまた、本明細書においてＡ６Ｌと互換的に呼ばれる。
【図２０】ＰＤＡＣ培養物に対するＲｕＨ２Ｏの細胞毒性効果。指示された用量のＲｕＨ２Ｏでの処理の２４時間後、４８時間後、および７２時間後に、Ｐａｎｃ１８５（Ａ）および ＰａｎｃＡ６Ｌ（Ｂ）の接着性培養物（ＣＳＣが少ない）およびスフェア（ＣＳＣ豊富）において相対的な細胞死を決定した。
【図２１】ＰＤＡＣスフェア培養物に対するＲｕＨ２Ｏの細胞毒性効果。１００μＭのＲｕＨ２Ｏで７２時間処理した後のＰａｎｃ１８５細胞およびＰａｎｃＡ６Ｌ細胞の光学顕微鏡写真およびアネキシンＶ染色。
【図２２】ＰＤＡＣスフェア形成に対するＲｕＨ２Ｏの効果。（Ａ）ＰＤＡＣ  ＣＳＣにおけるＲｕＨ２Ｏの効果を評価するための実験の作業順序（Ｂ）２５０μＭのＲｕＨ２Ｏで１０日間処理した後のＰａｎｃ１８５細胞およびＰａｎｃＡ６Ｌ細胞から誘導されたスフェアの光学顕微鏡写真
【図２３】ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＤＡＣ造腫瘍性に対するＲｕＨ２Ｏの効果。ＮＯＤ−ＳＣＩＤ（非肥満性糖尿病、重症複合免疫不全）マウスへの皮下注射の前にＰａｎｃ１８５細胞をＲｕＨ２Ｏで前処理した。注射の１２週間後に腫瘍を摘出し、解析した。（Ａ）１０４または１０３個のＰａｎｃ１８５細胞を注射し、対照（ＣＴＬ）または２５０μＭのＲｕＨ２Ｏで前処理した１２週間後にＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスから摘出された腫瘍の写真。（Ｂ）１０４または１０３個のＰａｎｃ１８５細胞の各注射で検出された、対照（ＣＴＬ）または２５０μＭのＲｕＨ２Ｏで前処理した腫瘍の数の概略。（Ｃ）１０４または１０３個のＰａｎｃ１８５細胞を注射し、対照（ＣＴＬ）または２５０μＭのＲｕＨ２Ｏで前処理した１２週間後にＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスから摘出した腫瘍の重量。
【図２４】ＰＤＡＣ細胞におけるアポトーシスの誘導。１００μＭまたは２５０μＭのＲｕＨ２Ｏで４８時間処理したＰＤＡＣ細胞のアネキシンＶ染色。
【図２５】ＲｕＨ２Ｏ処理後のＰＤＡＣ細胞のクローン産生性。（上）培養１０日後に形成されたＰａｎｃ１８５コロニーおよびＰａｎｃＡ６Ｌコロニーの光学顕微鏡写真。コロニーをクリスタルバイオレット染色で可視化した。（下）コロニー効率の定量。コロニーをＰＢＳ−１％トリトン−Ｘで溶解し、色強度をプレートリーダーで測定した。
【図２６】ＲｕＨ２Ｏ処理後のＰＤＡＣ細胞のスフェア形成能。
【図２７】ＲｕＨ２Ｏ処理後のＰＤＡＣ細胞の造腫瘍性。ＰＤＡＣ細胞を指示された濃度のＲｕＨ２Ｏで４８時間処理した後、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。注射の７週間または１１週間後に腫瘍を摘出した。
【図２８】ＰＤＡＣ  ＣＳＣにおけるＲｕ−リボフラビンコンジュゲートの効果を評価するための実験の作業順序。
【図２９】遺伝子発現に対するＲｕ−リボフラビンコンジュゲート（ＲｕＲｂｆ）（２５０μＭ）の効果およびＰＤＡＣ  ＣＳＣの自家蛍光。（Ａ）対照（Ｃｔｒ）、２５０μＭのＲｕ−Ｒｂｆ、または２５０μＭのＲｕ−Ｒｂｆ＋ＦＴＣでの処理の２４時間後にＰａｎｃ１８５細胞のＲＮＡを抽出した。処理したサンプルから生成されたｃＤＮＡにおいてＣ−ＭＹＣ、Ｋｌｆ４、およびＯＣＴ３／４のｑＲＴ−ＰＣＲ解析を実施した。データは、ＨＰＲＴ  ｍＲＮＡの発現レベルに対して正規化されている。（Ｂ）フローサイトメトリーによる自家蛍光測定。
【図３０】ＰＤＡＣ  ＣＳＣの腫瘍形成に対するＲｕ−リボフラビンコンジュゲート（２５０μＭ）の効果。
【発明の具体的説明】
【００１５】
研究者らは、ＸがＣｌである式（Ｉ）ルテニウム錯体は、活性なアコ錯体（Ｘ＝Ｈ２Ｏ）への事前変換によって、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）を選択的に金属化することが可能であることを見出した。この反応は光照射によって加速され得る。
【００１６】
また、これらの錯体がｃ−ＭＹＣ癌遺伝子の発現レベルの増加を引き起こし、それ故転写活性化因子として作用することも観察されている。ＸがＳＲ１Ｒ２から選択されるルテニウム錯体の場合、これらの錯体は暗所で安定しているが、チオエーテル配位子は光照射によって容易に相互変換することができ、活性なアコ錯体を生じる。その場合、ＸがＳＲ１Ｒ２から選択されるルテニウム錯体は、光の不在下では完全に不活性であるが、光照射後にｃ−ＭＹＣレベルの増加を引き起こすことが確認された。さらに、ＸがＨ２Ｏである本発明のルテニウム錯体（アコ錯体）の場合、暗所でも光照射によってもｃ−ＭＹＣ癌遺伝子レベルを増加させることが可能であることが確認された。
【００１７】
第１の側面において、本発明は、癌幹細胞を含む癌を治療するための医薬品を製造するための、式（Ｉ）：
【化２】
2019535699.tif 000003
［式中、
Ｎ１−Ｎ１−Ｎ１は、Ｎ，Ｎ，Ｎ−三座アザ芳香族配位子を表し；
Ｎ２−Ｎ２は、Ｎ，Ｎ−二座アザ芳香族配位子を表し；
Ｘは、ＯＨ２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、およびＳＲ１Ｒ２から選択され；
Ｒ１およびＲ２は、独立に、置換されていてよいＣ１−Ｃ１２アルキルから選択され；
Ｙ−は、一価のアニオンであり；かつ
ｎは、１または２である］
のＲｕ（ＩＩ）錯体に関する。
【００１８】
ルテニウム錯体
用語「アルキル」とは、１〜１２個（「Ｃ１−Ｃ１２アルキル」）、好ましくは１〜６個（「Ｃ１−Ｃ６アルキル」）、より好ましくは１〜３個（「Ｃ１−Ｃ３アルキル」）の炭素原子を含有し、一重結合を通じて分子の残りの部分と結合している直鎖状または分岐状アルカン誘導体を指す。例えば、アルキル基としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルが挙げられる。
【００１９】
用語「アルケニル」とは、２〜６個（「Ｃ２−Ｃ６アルケニル」）、より好ましくは２〜３個（「Ｃ２−Ｃ３アルケニル」）の炭素原子を含有し、少なくとも１つの二重結合を含み、一重結合によって分子の残りの部分と結合している直鎖状または分岐状炭化水素鎖基を指す。例えば、エテニル、プロペニル、アリル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イルなどが挙げられる。
【００２０】
用語「アルキニル」とは、２〜６個（「Ｃ２−Ｃ６アルキニル」）、より好ましくは２〜３個（「Ｃ２−Ｃ３」アルキニル）の炭素原子を含有し、少なくとも１つの三重結合を含み、一重結合によって分子の残りの部分と結合している直鎖状または分岐状炭化水素鎖基を指す。例えば、エチニル、プロピニル、ブチニルなどが挙げられる。
【００２１】
用語「アリール」とは、相互に縮合した１または２個の芳香核を含んでなる、６〜１４個、好ましくは６〜１０個の炭素原子を有する芳香族基を指す。例えば、アリール基としては、フェニル、ナフチル、インデニル、フェナントリルなどが挙げられる。
【００２２】
用語「ヘテロシクリル」とは、独立に、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される１個以上、具体的には、１個、２個、３個、または４個の環ヘテロ原子を含む、３〜１０個、好ましくは５〜１０個、より好ましくは５〜７個の環原子を含有し、残りの環原子が炭素である、完全にもしくは部分的に飽和していてよくまたは芳香族（「ヘテロアリール」）であり得る単環系または二環系を指す。
【００２３】
用語「ハロゲン」とは、臭素、塩素、ヨウ素、またはフッ素を指す。
【００２４】
用語Ｎ，Ｎ−二座またはＮ，Ｎ，Ｎ−三座アザ芳香族配位子とは、窒素原子単独を通じた配位によってＲｕ（ＩＩ）金属中心の２つ（二座）または３つ（三座）の配位部位を占めることができる芳香族分子を指す。好ましくは、この芳香族分子は、炭素原子と、２個（二座）または３個（三座）から６個まで、好ましくは、２個、３個、４個、または５個、の窒素原子とによって形成される、１０〜３２員、好ましくは１２〜２８員、より好ましくは１２〜２０員を有する（二座）かまたは１５〜３２員、好ましくは１８〜３０員、より好ましくは１８〜２６員を有する（三座）、安定なヘテロアリールである。本明細書において使用される場合、表現「１０〜３２員を有するかまたは１５〜３２員を有するヘテロアリール」とは、１０〜３２個の原子または１５〜３２個の原子の主鎖を有するヘテロアリール基を意味する。本発明の目的のために、複素環は、縮合(fused or condensed)環系を含み得る多環系であり得る。Ｎ，Ｎ−二座および Ｎ，Ｎ，Ｎ−三座アザ芳香族配位子の例としては、限定されるものではないが、２，２’−ビピリジン、２，２’−ビピラジン、２，２’−ビピリミジン、１，１０−フェナントロリン、バソフェナントロリン、２，２’−ビスキノリン、１，１’−ビスイソキノリン、２−ピリジニル−２−キノリン、３−ピリジニル−２−キノリン、１−ピリジニル−２−イソキノリン、２−ピリジニル−２−［１，８］−ナフチリジン、２，２’：６’，２’’−テルピリジン、２，６−ビス（２’−ベンズイミダゾリ）ピリジン、２，６−ビス（８’−キノリニル）ピリジン、２，６−ビス（２’−［１，８］−ナフチリジニル）ピリジン、２−ピリジニル−２−［１，１０］−フェナントロリン、２−キノリニル−８−［１，１０］−フェナントロリンなどが挙げられる。これらのアザ芳香族配位子は、置換されていてよい。
【００２５】
前述の基は、１つ以上の利用可能な位置で、ＯＲ、ＳＲ、ＳＯＲ、ＳＯ２Ｒ、ＯＳＯ２Ｒ、ＳＯ３Ｒ、ＳＯ３−Ｚ＋、ＮＯ２、Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）ＣＯＲ、Ｎ（Ｒ）ＳＯ２Ｒ、ＣＮ、ハロゲン、ＣＯＲ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯ２−Ｚ＋、ＯＣＯＲ、ＯＣＯ２Ｒ、ＯＣＯＮＨＲ、ＯＣＯＮ（Ｒ）２、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮ（Ｒ）２、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、および３員〜１０員のヘテロシクリルなどの１個以上の好適な基で置換されていてよく、ここで、基Ｒの各々は、独立に、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、および３員〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択され、かつ、Ｚは、好ましくは、例えば、ナトリウムまたはカリウムのカチオンなどの無機一価カチオンである。特定の実施態様では、式（Ｉ）の化合物中の１〜５個、好ましくは２個または３個、のアザ芳香族配位子は、パラ位でスルホネート（ＳＯ３−Ｚ＋）またはカルボキシレート（ＣＯ２−Ｚ＋）基で置換されている。
【００２６】
本明細書において、「一価のアニオン」とは、Ｒｕ（ＩＩ）錯体のカチオンとイオン結合を形成することができる、単一の負電荷を有する無機または有機のアニオンを指す。好ましくは、一価のアニオンは無機である。一価のアニオンの例としては、ＰＦ６−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、Ｆ−、ＢＦ４−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＳＯ３ＮＯ３−、ＮＯ２−、ＳＣＮ−、ＢｒＯ３−、ＩＯ３−、ＨＣＯ３−、ＨＣＯＯ−、ＣＨ３ＣＯＯ−、ＣＦ３ＣＯ２−、ＨＳＯ４−、ＨＳＯ３−、およびＨ２ＰＯ３−が挙げられる。
【００２７】
特定の実施態様では、Ｎ１−Ｎ１−Ｎ１は、置換されていてよい２，２’：６’，２’’−テルピリジン、２，６−ビス（２’−ベンズイミダゾリ）ピリジン、２，６−ビス（８’−キノリニル）ピリジン、２，６−ビス（２’−［１，８］−ナフチリジニル）ピリジン、２−ピリジニル−２−［１，１０］−フェナントロリン、および２−キノリニル−８−［１，１０］−フェナントロリンからなる群から選択されるＮ，Ｎ，Ｎ−三座アザ芳香族配位子である。
【００２８】
一つの実施態様では、Ｎ１−Ｎ１−Ｎ１は、以下：
【化３】
2019535699.tif 000004
からなる群から選択され、式中、各基Ｒ’は、独立に、水素、置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキル、置換されていてよいＣ６−Ｃ１４アリール、置換されていてよい５員〜１０員のヘテロアリール、およびハロゲンから選択される］。好ましくは、各基Ｒ’は、独立に、水素、ハロゲン、スルホネート、カルボキシレート、非置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、非置換Ｃ６−Ｃ１４アリール、および非置換５員〜１０員ヘテロアリールから選択される。より好ましくは、各基Ｒ’は、独立に、水素、Ｃｌ、Ｂｒ、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、およびｔ−ブチルから選択される。特定の実施態様では、各基Ｒ’は水素である。
【００２９】
特定の実施態様によれば、Ｎ１−Ｎ１−Ｎ１は、以下からなる群から選択される。
【化４】
2019535699.tif 000005
【００３０】
別の実施態様では、Ｎ１−Ｎ１−Ｎ１は、置換されていてよい２，２’：６’，２’’−テルピリジンを表す。好ましくは、Ｎ１−Ｎ１−Ｎ１は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、５員〜１０員のヘテロアリール、スルホネート、カルボキシレート、またはハロゲンで置換されていてよい２，２’：６’，２’’−テルピリジン；より好ましくは、Ｃｌ、Ｂｒ、スルホネート、カルボキシレート、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、およびｔ−ブチルで置換されていてよい２，２’：６’，２’’−テルピリジンから選択される。特定の実施態様では、Ｎ１−Ｎ１−Ｎ１は、２，２’：６’，２’’−テルピリジンを表す。
【００３１】
本発明の特定の実施態様によれば、Ｎ２−Ｎ２は、置換されていてよい２，２’−ビピリジン、２，２’−ビピラジン、２，２’−ビピリミジン、１，１０−フェナントロリン、バソフェナントロリン、２，２’−ビスキノリン、１，１’−ビスイソキノリン、２−ピリジニル−２−キノリン、３−ピリジニル−２−キノリン、１−ピリジニル−２−イソキノリン、および２−ピリジニル−２−［１，８］−ナフチリジンからなる群から選択されるＮ，Ｎ−二座アザ芳香族配位子である。
【００３２】
一つの実施態様では、Ｎ２−Ｎ２は、以下：
【化５】
2019535699.tif 000006
からなる群から選択され、式中、各基Ｒ’は、独立に、水素、スルホネート、カルボキシレート、置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキル、置換されていてよいＣ６−Ｃ１４アリール、置換されていてよい５員〜１０員のヘテロアリール、およびハロゲンから選択される］。好ましくは、各基Ｒ’は、独立に、水素、ハロゲン、非置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、非置換Ｃ６−Ｃ１４アリール、および非置換５員〜１０員ヘテロアリールから選択される。より好ましくは、各基Ｒ’は、独立に、水素、Ｃｌ、Ｂｒ、スルホネート、カルボキシレート、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、およびｔ−ブチルから選択される。特定の実施態様では、各基Ｒ’は水素である。
【００３３】
特定の実施態様によれば、Ｎ２−Ｎ２は、以下からなる群から選択される。
【化６】
2019535699.tif 000007
【００３４】
別の実施態様では、Ｎ２−Ｎ２は、置換されていてよい２，２’−ビピリジンを表す。好ましくは、Ｎ２−Ｎ２は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、５員〜１０員のヘテロアリール、スルホネート、カルボキシレート、またはハロゲンで置換されていてよい２，２’−ビピリジン；より好ましくは、Ｃｌ、Ｂｒ、スルホネート、カルボキシレート、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、およびｔ−ブチルで置換されていてよい２，２’−ビピリジンから選択される。特定の実施態様では、Ｎ２−Ｎ２は、２，２’−ビピリジンを表す。
【００３５】
本発明の一つの実施態様によれば、Ｎ１−Ｎ１−Ｎ１は
【化７】
2019535699.tif 000008
を表し、かつＮ２―Ｎ２は
【化８】
2019535699.tif 000009
を表し、ここで、各基Ｒ’は、独立に、水素、スルホネート、カルボキシレート、置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキル、置換されていてよいＣ６−Ｃ１４アリール、置換されていてよい５員〜１０員のヘテロアリール、およびハロゲンから選択される。
【００３６】
特定の実施態様では、前記Ｒｕ（ＩＩ）錯体は、下式：
【化９】
2019535699.tif 000010
［式中、Ｘ、Ｙ−、およびｎは、本明細書において定義される通りである］
を有する。
【００３７】
ｎの値は、選択された配位子の化学構造および電荷、ならびに中心のＲｕ（ＩＩ）原子の２＋電荷によって決定される。従って、ＸがＯＨ２またはＳＲ１Ｒ２を表す場合、ｎは２である。ＸがＣｌ、Ｂｒ、またはＩを表す場合、ｎの値は１である。式（Ｉ）の錯体は中性であり、すなわち、全体の電荷がゼロである。
【００３８】
特定の実施態様では、ＸはＯＨ２を表す。好ましくは、Ｎ１−Ｎ１−Ｎ１は、上記で定義された置換されていてよい２，２’：６’，２’’−テルピリジンを表し、Ｎ２−Ｎ２は、上記で定義された置換されていてよい２，２’−ビピリジンを表し、かつＸはＯＨ２を表す。
【００３９】
別の特定の実施態様では、ＸはＣｌ、Ｂｒ、またはＩ、好ましくは、Ｃｌを表す。特定の実施態様では、Ｎ１−Ｎ１−Ｎ１は、上記で定義された置換されていてよい２，２’：６’，２’’−テルピリジンを表し、Ｎ２−Ｎ２は、上記で定義された置換されていてよい２，２’−ビピリジンを表し、かつＸは、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩ、好ましくは、Ｃｌを表す。
【００４０】
一つの実施態様では、Ｘは、ＳＲ１Ｒ２を表し、ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立に、置換されていてよいＣ１−Ｃ１２アルキルから選択される。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、好ましくは、ハロゲン、ＯＲ’’、Ｎ（Ｒ’’）２、Ｎ（Ｒ’’）ＣＯＲ’’、ＣＮ、ＮＯ２、ＣＯＲ’’、ＣＯ２Ｒ’’、ＯＣＯＲ’’、ＯＣＯ２Ｒ’’、ＯＣＯＮＨＲ’’、ＯＣＯＮ（Ｒ’’）２、ＣＯＮＨＲ’’、ＣＯＮ（Ｒ’’）２、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、および３員〜１０員のヘテロシクリルから選択される１個以上の基で置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキルから選択され、ここで、各基Ｒ’’は、独立に、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、および３員〜１０員のヘテロシクリルからなる群から選択される。より好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、独立に、ＯＲ’’、Ｎ（Ｒ’’）ＣＯＲ’’、およびＣＯ２Ｒ’’から選択される１個以上の基で置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキルから選択され、ここで、各基Ｒ’’は、独立に、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６アルケニル、Ｃ２−Ｃ６アルキニル、Ｃ６−Ｃ１４アリール、および３員〜１０員のヘテロシクリルから選択される。より好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、独立に、ＯＨ、Ｎ（Ｈ）ＣＯＣＨ３、およびＣＯ２Ｈから選択される１個以上の基で置換されていてよいＣ１−Ｃ６アルキルから選択される。一つの実施態様では、Ｒ１およびＲ２は、独立に、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、およびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＯＯＨ）Ｎ（Ｈ）ＣＯＣＨ３から選択される。
【００４１】
本発明の一つの実施態様では、前記ルテニウム錯体は、以下：
【化１０】
2019535699.tif 000011
からなる群から選択され、式中、Ｙ−は、本明細書において定義される通りである。
【００４２】
特定の実施態様では、Ｙ−は、ＰＦ６−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、Ｆ−、ＢＦ４−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＣＨ３ＳＯ３−、ＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＳＯ３ＮＯ３−、ＮＯ２−、ＳＣＮ−、ＢｒＯ３−、ＩＯ３−、ＨＣＯ３−、ＨＣＯＯ−、ＣＨ３ＣＯＯ−、ＨＳＯ４−、ＨＳＯ３−、およびＨ２ＰＯ３−からなる群から選択される。好ましくは、Ｙ−は、ＰＦ６−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＢＦ４−、ＣＦ３ＳＯ３−、ＣＨ３ＳＯ３−、およびＣＨ３Ｃ６Ｈ４ＳＯ３−からなる群から選択される。一つの実施態様では、Ｙ−は、Ｃｌ−またはＰＦ６−、好ましくは、ＰＦ６−である。
【００４３】
本発明のルテニウム錯体は、当業者に公知の方法によって、例えば、本明細書の実施例に記載の方法または当業者に公知のその変形によって得ることができる。
【００４４】
Ｒｕ錯体とＡＢＣＧ２基体とからなるコンジュゲート
本発明者らは、リボフラビンなどのＡＢＣＧ２基体へのルテニウム錯体の結合が、例えば、ルテニウム錯体を癌幹細胞に向けることを可能にすることを観察した。
【００４５】
従って、別の側面では、本発明は、以下を含んでなるコンジュゲートに関する：
・式（Ｉ）のルテニウム錯体、および
・ＡＢＣＧ２基体。
【００４６】
本明細書において使用される場合、「ＡＢＣＧ２」とは、癌化学療法における多剤耐性（ＭＤＲ）の一因となることが知られているＡＴＰ輸送体のスーパーファミリーのメンバーを指す。ヒトのＡＢＣＧ２遺伝子によってコードされるタンパク質配列は、２０１６年１１月５日の日付のＵｎｉｐｒｏｔデータベースの受託番号Ｑ９ＵＮＱ０を有する配列と一致する。
【００４７】
本明細書において使用される場合、「ＡＢＣＧ２基体」とは、ＡＢＣＧ２輸送体によって輸送され得る化合物、特に親水性共役アニオン、さらに特に硫酸化アニオンまたは疎水性分子を指す。当業者は、例えば、Ｓｆ９膜を使用するＡＴＰアーゼアッセイを使用することによってまたはGlavinas H. et al., Drug Metab Dispos. 2007 Sep;35(9):1533-42に開示されているアッセイ(essay)において、化合物がＡＢＣＧ２基体であるかどうかを同定することができるであろう。
【００４８】
特定の実施態様では、前記ＡＢＣＧ２基体は、イマチニブおよびゲフィチニブなどのチロシンキナーゼ阻害薬、フラボピリドールならびにカンプトセシン類であるトポテカン、イリノテカン、およびその活性代謝物ＳＮ−３８である[７-エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトセシン]、またはミトキサントロンである。他の基体としては、シメチジン、プラゾシン、スタチン類、およびジドブジンなどの薬物が挙げられる。加えて、他のＡＢＣＧ２基体は、エストロン、１７βエストラジオール、ヘムなどのポルフィリン類、プロトポルフィリンＩＸ、および２−アミノ−１−メチル−６−フェニルイミダゾ［４,５−ｂ］ピリジンである。別の実施態様では、前記ＡＢＣＧ２基体は、アムサクリン、アスパラギナーゼ、アザチオプリン、ビサントレン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フラボピリドール、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ヒドロキシ尿素、ロイコボリン、リポソームダウノルビシン、リポソームドキソルビシン、ロムスチン、クロルメチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、サトラプラチン、ストレプトゾトシン、テガフール・ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、トレオスルファン、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ＳＮ−３８、およびビノレルビンなどの化学療法薬である。
【００４９】
特定の実施態様では、前記ＡＢＣＧ２基体は蛍光化合物である。限定されるものではないが、例えば、前記蛍光化合物は、リボフラビン、Ｄ−ルシフェリン、ローダミン１２３、フェオホルビドａ、ＢＯＤＩＰＹ−プラゾシン、ヘキスト３３３４２であり得る。さらに好ましい実施態様では、前記蛍光ＡＢＣＧ２基体はリボフラビンである。本明細書において使用される場合、「リボフラビン」とは、ＣＡＳ番号８３−８８−５を有するビタミンＢ２を指す。
【００５０】
好ましくは、前記ルテニウム錯体と前記ＡＢＣＧ２基体は、共有結合により相互に結合する。前記ルテニウム錯体と前記ＡＢＣＧ２基体は、相互に直接結合することができるし、あるいはリンカーまたはスペーサーを介して結合することもできる。従って、特定の実施態様では、前記コンジュゲートは、式（Ｉ）のルテニウム錯体と、ＡＢＣＧ２基体と、リンカーとを含んでなる。
【００５１】
本明細書において使用される場合、用語「リンカー」とは、「スペーサー」とも呼ばれ、前記ルテニウム錯体およびＡＢＣＧ２基体と共有結合により結合する化学基または部分を指す。リンカーには、アルキレン、アリーレン、またはヘテロアリーレンなどの、二価基を含んでなるかまたはそれから誘導される化合物が含まれる。
【００５２】
特定の実施態様では、前記ルテニウム錯体と前記ＡＢＣＧ２基体は、リンカーを介して結合される。特定の実施態様では、前記リンカーは、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜６個の原子長の炭化水素鎖であり、ここで、前記鎖の炭素原子の１個以上は、ＮＲ’、Ｏ、およびＳから選択されるヘテロ原子で置き換えられ得、ここで、Ｒ’は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、およびアセチルから選択され；かつ前記鎖の炭素原子の１個以上は、＝Ｏ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＨ３、およびＰｈから選択される置換基で置換され得る。
【００５３】
特定の実施態様では、前記リンカーは、アミノ酸またはペプチド結合を介して結合している複数のアミノ酸、好ましくは、１〜５個のアミノ酸の配列である。用語「アミノ酸」とは、１個のアミノ基と１個のカルボン酸基を有する化合物を指し、天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両方を含む。アミノ酸の立体配置はＬ、Ｄ、またはラセミ混合物であり得る。
【００５４】
当業者は、使用されるルテニウム錯体およびＡＢＣＧ２基体に応じて、前記リンカー中に存在する官能基と、リンカーをルテニウム錯体およびＡＢＣＧ２基体と結合する方法とを決定することができる。好ましくは、前記リンカーは、前記ルテニウム錯体および前記ＡＢＣＧ２基体と、アミド型、アミン型、エーテル型、またはエステル型の結合を介して結合される。
【００５５】
好ましくは、前記コンジュゲート中のルテニウム錯体は、式（Ｉ）（式中、ＸはＳＲ１Ｒ２であり、ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義された通りである）の錯体である。前記コンジュゲートが作用部位に存在するかまたはそこに近づくと、本明細書において記載されるように光照射によって活性アコ錯体（Ｘ＝ＯＨ２）が放出され得る。それによって、容易に取り扱うことができ、かつ、所望の作動時間および場所で制御された方法により活性化することができる不活性誘導体を提供することができる。特定の実施態様では、ＳＲ１Ｒ２はメチオニンまたはその誘導体である。
【００５６】
用語「メチオニン誘導体」とは、基本的に、メチオニンのアミノ基および／またはカルボン酸基において好ましくは置換されている誘導体を指す。メチオニン誘導体としては、メチオニンのＣ１−Ｃ６アルキルエステル、アセテート、アミド、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミン、およびＣ１−Ｃ６ジアルキルアミンが挙げられる。
【００５７】
好ましい実施態様では、前記メチオニン誘導体は、式：
【化１１】
2019535699.tif 000012
［式中、
Ｒａは、ＯＨ、Ｃ１−Ｃ６  Ｏ−アルキル、ＯＡｃ、ＮＨ２、ＮＨ−Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｎ（Ｃ１−Ｃ６アルキル）２、およびＮＨＡｃから選択され；かつ
各Ｒｂは、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、およびＡｃから選択される］
の化合物である。
【００５８】
一つの実施態様では、前記ルテニウム錯体は、式（Ｉ’）
【化１２】
2019535699.tif 000013
（式中、Ｘは、上記で定義されたＳＲ１Ｒ２であり、好ましくは、Ｘは、メチオニンまたはその誘導体である）の錯体である。
【００５９】
特定の実施態様では、前記ルテニウム錯体は、ＳＲ１Ｒ２がメチオニンまたはその誘導体、好ましくはメチオニンである式（Ｉ’）の錯体であり、好ましくは、アミノ基またはカルボン酸基を介して前記ＡＢＣＧ２基体と直接結合される。
【００６０】
別の実施態様では、前記ルテニウム錯体は、ＳＲ１Ｒ２がメチオニンまたはその誘導体、好ましくはメチオニンである式（Ｉ’）の錯体であり、リンカーによって、好ましくは、アミノ基またはカルボン酸基を介して前記ＡＢＣＧ２基体と結合される。
【００６１】
特定の実施態様では、前記コンジュゲートは、以下を含んでなる：
・式（Ｉ）のルテニウム錯体（式中、Ｘは、メチオニンである）、
・リボフラビン、および
・場合により、前記ルテニウム錯体の前記メチオニンと、リボフラビンとに共有結合しているリンカー。
【００６２】
一つの実施態様では、前記コンジュゲートは、以下：
【化１３】
2019535699.tif 000014
であり、式中、Ｙは、上記で定義された通りであり、好ましくは、ＹはＣＦ３ＣＯ２−である。
【００６３】
本発明のコンジュゲートは様々な利点を有する。このコンジュゲートは、作用部位への活性錯体の正確な輸送を可能にして必要な用量を減らし、癌細胞に対して選択的に作用することを可能にして正常細胞への攻撃を防ぐ。
【００６４】
これらのコンジュゲートは、当業者に公知の従来の技術によって得ることができる。前記ルテニウム錯体と前記ＡＢＣＧ２基体とが、相互に化学的に結合するのに好適な官能基を含まない場合、それらは、所望の結合を達成するために誘導体化することができる。あるいは、前記ルテニウム錯体と前記ＡＢＣＧ２基体とは、当業者に公知の反応によって二官能性リンカーを介して（直接または誘導体化後に）相互に結合することができる。
【００６５】
医薬組成物
本発明のＲｕ錯体およびコンジュゲートは、癌幹細胞を含む癌を治療するための医薬組成物を調製するために使用することができる。従って、本発明の別の側面は、癌幹細胞を含む癌の治療において使用するための、本明細書において定義される式（Ｉ）のルテニウム錯体またはコンジュゲートを含んでなる医薬組成物である。
【００６６】
本明細書において使用される場合、表現「医薬組成物」とは、１種以上の有用な治療薬の所定の用量を細胞、細胞群、器官、組織、または生物に投与するのに適した処方物を指す。
【００６７】
前記ルテニウム錯体または前記コンジュゲートは、治療上有効な量で投与される。「治療上有効な量」とは、治療効果を提供することができ、かつ一般的に用いられる手段を用いて当業者が決定することができる量であると理解される。この有効な量は、医療従事者の知識および経験の範囲内で、処置する特定の障害、処置を受ける対象の年齢および身体状態、その障害の急性度、治療期間、（もしあれば）同時または併用療法の性質、特定の投与経路、ならびに同様の因子によって変動する。一般的には、最大用量、すなわち、妥当な医学的判断による最大安全用量が、好ましくは用いられる。例えば、対象が腫瘍を有する場合、その有効な量は（例えば、腫瘍の画像を取得することによって決定されるように）腫瘍量または体積を減少させる量であり得る。その有効な量はまた、血液または別の体液もしくは組織中の癌細胞の存在および／または頻度（例えば、生検）によっても評価することができる。腫瘍が通常の組織または器官の働きに影響を及ぼす場合、その有効な量は、その通常の組織または器官の働きを測定することよって評価することができる。当業者ならば、Goodman and GilmanのThe Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th edition (1996), Annex II, pages 1707-1711およびGoodman and GilmanのThe Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th edition (2001), Annex II, pages 475-493に見られるガイドラインを用いて投与量を決定することができることが分かるであろう。
【００６８】
本発明の医薬組成物は、少なくとも１種の薬学上許容されるビヒクルを含み得る。本明細書において使用される場合、用語「薬学上許容されるビヒクル」とは、固体、半固体、または液体の処方物用の増量剤、希釈液、カプセル化材料、または補助剤、すなわち、薬理学的／毒物学的観点から患者に許容され、かつ組成、処方物、安定性、患者の受容、およびバイオアベイラビリティに関する物理的／化学的観点から製薬化学者に許容される任意の不活性非毒性型のものを意味する。Gennaro（Mack Publishing、ペンシルバニア州イーストン、１９９５年）により編集された「Remington’s Pharmaceutical Sciences」には、医薬組成物の処方に使用される様々なビヒクルおよびそれを調製するための既知技術が記載されている。薬学上許容されるビヒクルとして使用することができる材料のいくつかの例としては、限定されるものではないが、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖類；コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン類；セルロース、ならびにナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐剤用ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油などの油類；プロピレングリコールなどのグリコール類；オレイン酸エチルおよび ラウリン酸エチルなどのエステル類；寒天；ツイン（商標）８０などの洗剤；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張生理食塩液；リンゲル液；エチルアルコール；およびリン酸緩衝液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの適合性のある他の非毒性滑沢剤が挙げられ；さらに、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および香料、防腐剤、および酸化防止剤もまた、処方調製者の基準に従って、組成物中に存在することができる。濾過または他の最終滅菌方法が実行可能ではない場合、無菌条件下で処方物を製造することができる。
【００６９】
本発明の医薬組成物は、任意の固体組成物（錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒など）、半固体組成物（クリーム、軟膏など）、または液体組成物（溶液、懸濁液、またはエマルション）を含む。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、経口および非経口経路を含む、当技術分野で公知の手段を用いることによって患者に投与することができる。そのような実施態様によれば、本発明の組成物は、注射（例えば、静脈内、皮下または筋肉内、腹膜内の注射）によって投与することができる。特定の実施態様では、本発明のルテニウム錯体またはコンジュゲートは、例えば静脈内注入または注射によって、全身投与される。注射用調製物、例えば、水性または油性の滅菌注射用懸濁液は、好適な懸濁化剤および分散剤または湿潤剤を用いる既知の技術に従って処方することができる。滅菌注射用調製物はまた、非経口経路によって許容される、非毒性希釈液または溶媒中の、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としての、滅菌注射用溶液、懸濁液、またはエマルションでもあり得る。使用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒としては、とりわけ、水、リンゲル液、米国薬局方、および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。さらに、滅菌固定油は、溶媒または懸濁媒体として従来から使用されている。合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の軽質固定油をこの目的に使用することができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射用製品の調製に使用されている。注射用処方物は、例えば、細菌保持フィルターで濾過することによって、または使用前に滅菌水もしくは別の滅菌注射用媒体中に溶解するかもしくは分散させることができる滅菌固体組成物の形態で殺菌薬を組み込むことによって、滅菌処理することができる。
【００７１】
前記組成物は、前記ルテニウム錯体または前記コンジュゲートを単剤としてまたは抗腫瘍薬などの別の治療薬と組み合わせて含んでなり得る。一つの実施態様では、本発明の医薬組成物または医薬品は、式（Ｉ）のルテニウム錯体またはコンジュゲートと、同時投与、個別投与、または逐次投与用に処方された抗腫瘍薬との組合せを含んでなる。これは、２種の化合物の組合せを、
・前記２種の化合物を同時に投与する、同じ医薬調製物または医薬品の一部である組合せとして；または
・同時投与、逐次投与、または個別投与の可能性を生じさせる、各々が一方の物質を含有する２種の投与形の組合せとして
投与することができるということを意味する。
【００７２】
特定の実施態様では、式（Ｉ）のルテニウム錯体またはコンジュゲートおよび前記抗腫瘍薬は、独立して（すなわち、２種の投与形で）投与されるが同時に投与される。別の特定の実施態様では、式（Ｉ）のルテニウム錯体またはコンジュゲートが最初に投与され、次いで、もう一方の抗腫瘍薬が個別にまたは逐次に投与される。さらなる特定の実施態様では、もう一方の抗腫瘍薬が最初に投与され、次いで、式（Ｉ）の化合物またはコンジュゲートが、定義されたように、個別にまたは逐次に投与される。
【００７３】
本明細書において使用される場合、用語「抗癌薬」または「抗腫瘍薬」とは、「抗癌剤」、「抗腫瘍剤」、または「抗悪性腫瘍剤」とも呼ばれ、癌の治療において有用な薬剤を指す。本発明による抗腫瘍剤としては、限定されるものではないが、アルキル化剤、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害薬、およびアントラサイクリンが挙げられる。
【００７４】
本明細書において使用される場合、用語「アルキル化剤」とは、「抗悪性腫瘍アルキル化剤」とも呼ばれ、分子からＤＮＡへのアルキル基の転移を媒介する薬剤を指す。アルキル基は、アルキルカルボカチオン、フリーラジカル、カルボアニオン、またはカルベン（またはそれらの等価物）として転移させることができる。アルキル化剤は、癌細胞のＤＮＡに損傷を与えるために化学療法において用いられる。アルキル化剤は、一般的に、６種類に分類される：
・ナイトロジェンマスタード、例えば、クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロランブシルなど；
・アルトレタミン、チオテパなどを含む、エチレンアミンおよびメチレンアミン誘導体；
・スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファンなど；
・ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、ロムスチンなど；
・トリアゼン、例えば、ダカルバジン、プロカルバジン、テモゾロミドなど；ならびに
・白金を含有する抗悪性腫瘍剤、例えば、アルキル化剤として一般的に分類されるが、ＤＮＡをアルキル化するのではなく、異なる方法によってＤＮＡとともに共有結合性金属性付加体を形成することになる、シスプラチン、カルボプラチン、およびオキサリプラチンなど。
【００７５】
本明細書において使用される場合、用語「代謝拮抗薬」とは、代謝産物の使用を阻害する化学物質を指し、これは正常な代謝の一部である別の化学物質である。そのような物質は、葉酸の使用を妨げる葉酸代謝拮抗薬など、それらが妨害する代謝産物の構造と類似の構造を有する場合が多い。代謝拮抗薬の存在は、細胞増殖および細胞分裂の停止などの細胞に対する毒性作用を有する可能性があるため、これらの化合物は癌化学療法に使用される。代謝拮抗薬は、プリンまたはピリミジンのふりをし、（細胞周期の）Ｓ期の間のそれらのＤＮＡへの取り込みを妨げ、ＤＮＡ、正常な発生および分裂を停止させる。また、代謝拮抗薬はＲＮＡ合成にも影響を及ぼす。しかしながら、チミジンがＤＮＡに使用されるがＲＮＡ（代わりにウラシルが使用される）には使用されないことを考えると、チミジル酸シンターゼによるチミジン合成の阻害は、ＲＮＡ合成に対してＤＮＡ合成を選択的に阻害する。代謝拮抗薬は、以下から選択することができる：
・プリン類似体、例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチン、クラドリビンなど；
・ピリミジン類似体、例えば、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、フロクスウリジン（ＦＵＤＲ）、シトシンアラビノシド（シタラビン）、６−アザウラシル（６−ＡＵ）など；または
・葉酸代謝拮抗薬、例えば、メトトレキサート、ペメトレキセド、プログアニル、ピリメタミン、トリメトプリムなど。
【００７６】
本明細書において使用される場合、用語「トポイソメラーゼ阻害薬」とは、トポイソメラーゼ酵素（トポイソメラーゼＩおよびＩＩ）の作用を妨害するために設計された薬剤を指す。トポイソメラーゼ阻害薬は、細胞周期のライゲーション工程を遮断し、ゲノムの完全性を損なう一本鎖および二本鎖の切断を生じさせると考えられている。これらの切断の導入に続いて、アポトーシスおよび細胞死がもたらされる。限定されるものではないが、例えば、トポイソメラーゼ阻害薬としては、エトポシド、テニポシド、トポテカン、イリノテカン、ジフロモテカン、またはエロモテカン(elomotecan)が挙げられる。
【００７７】
本明細書において使用される場合、用語「アントラサイクリン」とは、ストレプトマイセス属(Streptomyces)細菌株由来の、癌化学療法において使用される（ＣＣＮＳまたは細胞周期非特異的）薬物の種類を指す。限定されるものではないが、例えば、アントラサイクリンとしては、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン、ミトキサントロンなどが挙げられる。
【００７８】
本発明による他の抗癌剤または抗腫瘍剤としては、限定されるものではないが、以下の薬剤が挙げられる：
・血管新生阻害薬、例えば、アンギオスタチン、エンドスタチン、フマギリン、ゲニステイン、ミノサイクリン、およびスタウロスポリン；
・ＤＮＡ合成阻害薬、例えば、アミノプテリン、ガンシクロビル、およびヒドロキシ尿素；
・酵素阻害薬、例えば、Ｓ（＋）−カンプトセシン、クルクミン、２−イミノ−１−イミダゾリジン酢酸（シクロクレアチン）、ヒスピジン、ホルメスタン、およびメビノリン；
・微小管阻害薬、例えば、コルヒチンおよびドラスタチン１５；ならびに
・他の抗腫瘍剤、例えば、１７−（アリルアミノ）−１７−デメトキシゲルダナマイシン、アピゲニン、シメチジン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、およびピフィスリンα。
【００７９】
あるいは、前記ルテニウム錯体および前記抗腫瘍薬は、相互に結合してコンジュゲートを形成することができる。従って、別の側面では、本発明は、以下を含んでなるコンジュゲートに関する：
・式（Ｉ）のルテニウム錯体、および
・抗腫瘍薬。
【００８０】
好ましくは、前記ルテニウム錯体と前記抗腫瘍薬は、相互に直接共有結合しているかまたはリンカーまたはスペーサーを介して共有結合している。従って、特定の実施態様では、前記コンジュゲートは、式（Ｉ）のルテニウム錯体、抗腫瘍薬、およびリンカーを含んでなる。
【００８１】
リンカー、ルテニウム錯体、および結合方法についての特定の好ましい実施態様は、ルテニウム錯体−ＡＢＣＧ２基体コンジュゲートに関して上記で定義される。
【００８２】
使用
本発明の一側面は、癌幹細胞を含む癌を治療するための医薬品を製造するための、本明細書において定義される、ルテニウム錯体またはコンジュゲートの使用である。
【００８３】
本発明の別の側面は、癌幹細胞を含む癌の治療において使用するための、本明細書において定義されるルテニウム錯体またはコンジュゲートに関する。
【００８４】
本発明の別の側面は、癌幹細胞を含む癌を治療するための方法に関し、この方法は、前記治療を必要とする患者に治療上有効な量の、本明細書において定義されるルテニウム錯体またはコンジュゲートを投与することを含んでなる。
【００８５】
本明細書において使用される場合、用語「治療(treat, treating, and treatment)」とは、一般的に、発症後の癌の根絶、排除、復帰、救済、緩和、または管理を含む。
【００８６】
本明細書において使用される場合、用語「癌」は、「癌腫」とも呼ばれ、隣接する組織に侵入し、遠隔臓器に広がることが可能な異常な細胞の制御されない増殖を特徴とする疾患を指す。本発明の文脈内で、この用語は、任意の種類の癌または腫瘍を含む。限定されるものではないが、例えば、前記癌または腫瘍としては、血液癌（例えば、白血病またはリンパ腫）、神経学的腫瘍（例えば、星状細胞腫または膠芽腫）、黒色腫、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃腸腫瘍（例えば、胃癌、膵臓癌、または結腸直腸癌（ＣＲＣ））、肝臓癌（例えば、肝細胞癌）、腎細胞癌、泌尿生殖器腫瘍（例えば、卵巣癌、膣癌、子宮頸癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌）、骨腫瘍、血管腫瘍などが挙げられる。
【００８７】
本明細書において使用される場合、用語「癌幹細胞」とは、「ＣＳＣ」としても知られ、自己複製能および分化能を保存し、さらに、腫瘍を引き起こすことが可能である幹細胞の種類を指す。癌幹細胞は、腫瘍形成性が高く、化学的抵抗性を有する。これらの細胞は、化学療法後の腫瘍再発プロセスおよび／または転移に関連している可能性があると考えられている。この種の細胞の存在は、限定されるものではないが、血液系新生物(Lapidot T et al. 1994 Nature 367(6464): 645-648)、乳癌(Al-Hajj M et al. 2003 Proc Natl Acad Sci USA 100(7): 3983-3988)、肺癌(Kim CF et al. 2005 Cell 121(6): 823-835)、結腸癌(O’Brien CA et al. 2007 Nature 445(7123): 106-110)、前立腺癌(Collins AT et al. 2005 Cancer Res 65(23): 10946-10951)、卵巣癌(Szotec PP et al. 2006 Proc Natl Acad Sci USA 103(30): 11154-11159)、および膵臓癌(Li C et al. 2007 Cancer Res 67(3): 1030-1037)を含む様々な種類の腫瘍において記載されている。
【００８８】
特定の実施態様では、癌幹細胞を含んでなる前記癌は、血液系新生物、乳癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、子宮頸癌、および腎臓癌から選択される。さらに特定の実施態様では、前記癌は、膵臓癌、好ましくは膵腺癌である。
【００８９】
本明細書において使用される場合、用語「血液系新生物」とは、血液、骨髄、およびリンパ節に影響を及ぼしている癌の不均質群を指す。この用語には、白血病（骨髄に影響を及ぼし、末梢血に広がる）およびリンパ腫（異なるリンパ組織に由来する：リンパ節、脾臓、および粘膜関連リンパ組織）が含まれる。血液系新生物は、その起源に応じて骨髄性またはリンパ系新生物であり得る。
【００９０】
骨髄性血液系新生物には、以下が含まれる：
・慢性骨髄増殖性腫瘍（ＭＰＮ）：慢性骨髄性白血病ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性、慢性好中球性白血病、真性赤血球増加症、原発性骨髄線維症、本態性血小板減少症、慢性好酸球性白血病、全身性肥満細胞症、および分類不能の骨髄増殖性腫瘍を含む。
・好酸球増加症およびＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、またはＦＧＦＲ１異常を伴う骨髄性およびリンパ系新生物。
・骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）：単系統異形成を伴う不応性血球減少症、鉄芽球性不応性貧血、多系統異形成を伴う不応性血球減少症、芽球増加を伴う不応性貧血、単独ｄｅｌ（５ｑ）染色体異常を伴う骨髄異形成症候群(myelodysplastic syndrome with isolated del(5q))、分類不能の骨髄異形成症候群、および小児骨髄異形成症候群を含む。
・骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍（ＭＤＳ／ＭＰＮ）：慢性骨髄単球性白血病、非定型慢性骨髄性白血病ＢＣＲ−ＡＢＬ陰性、若年性骨髄単球性白血病、および分類不能の 骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍を含む。
・急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）：反復する遺伝子異常を伴うＡＭＬ、ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）ＲＵＮＸ１を伴うＡＭＬ、骨髄異形成に関連した変化を伴うＡＭＬ、治療関連ＡＭＬ、前述のカテゴリーに典型的な特徴をもたないＡＭＬ、骨髄様肉腫、ダウン症候群関連骨髄増殖、および芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍を含む。
・系統不明な急性白血病。
【００９１】
リンパ性血液系新生物は以下を含む：
・前駆細胞のリンパ系新生物：Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫／白血病およびＴ細胞リンパ芽球性リンパ腫／白血病を含む。
・成熟Ｂ細胞新生物。
・成熟Ｔ細胞およびＮＪ細胞新生物。
・ホジキンリンパ腫。
【００９２】
本明細書において使用される場合、用語「乳癌」とは、「悪性乳房新生物」または「乳房腫瘍」としても知られ、乳房組織、通常は乳管の内壁または乳管に乳汁を供給する小葉で生じる癌を指す。免疫組織化学によって検出される受容体状況、特にエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）の存在または不在、およびＨＥＲ２／ｎｅｕの発現レベル（過剰発現に対して正常発現／過少発現）に応じて、乳癌は、ＥＲ陽性（ＥＲ＋）乳癌、ＥＲ陰性（ＥＲ−）乳癌、ＰＲ陽性（ＰＲ＋）乳癌、ＰＲ陰性（ＰＲ−）乳癌、ＨＥＲ２陽性（ＨＥＲ２＋）乳癌（ＨＥＲ２を過剰発現する癌）、ＨＥＲ２陰性（ＨＥＲ２−）乳癌（正常レベルのＨＥＲ２を発現するか、またはＨＥＲ２を過少発現するか、または検出可能なレベルのＨＥＲ２を発現しない癌）、ホルモン受容体陰性乳癌、すなわち、エストロゲンまたはプロゲステロンの受容体が認められない乳癌（ＥＲ−／ＰＲ−乳癌と略される）；およびトリプルネガティブ乳癌、すなわち、エストロゲンまたはプロゲステロンの受容体は認められないが、ＨＥＲ２の正常発現／過少発現が認められる（または検出可能な発現レベルに満たない）乳癌（ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２−乳癌と略される）に分類することができる。
【００９３】
本明細書において使用される場合、用語「肺癌」は、「肺にできる癌」または「肺にできる腫瘍」とも呼ばれ、肺組織における任意の制御されない細胞増殖を指し、限定されるものではないが、小球性肺癌、複合型小球性癌腫、非小球性肺癌、肉腫様癌、唾液腺腫瘍、カルチノイド腫瘍、腺扁平上皮癌、胸膜肺芽腫、およびカルチノイド腫瘍が含まれる。
【００９４】
本明細書において使用される場合、用語「前立腺癌」とは、前立腺から生じる細胞の制御されない（悪性）増殖を指す。
【００９５】
本明細書において使用される場合、用語「卵巣癌」は、「卵巣腫瘍」とも呼ばれ、卵巣で生じる腫瘍群を指し、限定されるものではないが、漿液性卵巣癌、非浸潤性卵巣癌、混合表現型卵巣癌、粘液性卵巣癌、類内膜性卵巣癌、卵巣明細胞癌、卵巣漿液性乳頭癌、卵巣ブレンネル腫瘍、および未分化腺癌を含む。
【００９６】
本明細書において使用される場合、用語「膵臓癌」は、「膵臓腫瘍」とも呼ばれ、膵臓細胞由来の癌を指し、限定されるものではないが、腺癌、腺扁平上皮癌、印環 細胞癌、肝様癌、膠様癌、未分化癌腫、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌腫、および膵島細胞癌が含まれる。
【００９７】
本明細書において使用される場合、用語「子宮頸癌」は、「子宮頸部の癌腫」とも呼ばれ、膣内に突出する子宮の下部線維筋性部分で発生した悪性腫瘍を指す。
【００９８】
本明細書において使用される場合、用語「腎臓癌」は、「腎癌」、「腎腺癌」、または「腎細胞癌」とも呼ばれ、腎臓細胞の任意の悪性増殖性障害、特に、腎臓の尿細管の悪性細胞によって形成された癌を指す。
【００９９】
特定の実施態様では、癌幹細胞は、低ｃ−ＭＹＣ発現レベルを有する。
【０１００】
本明細書において使用される場合、用語「ｃ−ＭＹＣ」とは、細胞周期進行、アポトーシス、および細胞形質転換に関与する多機能核リンタンパク質をコードする遺伝子を指す。ヒトのｃ−ＭＹＣタンパク質は、２０１６年１１月２日の日付のＵｎｉｐｒｏｔデータベースの受託番号Ｐ０１１０６で示された配列を有する。
【０１０１】
本明細書において使用される場合、遺伝子の「発現レベル」という用語は、細胞で測定することができる遺伝子産物の量を指し、その遺伝子産物は転写産物または翻訳産物であり得る。従って、発現レベルは、ｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡなどの遺伝子の核酸産物または遺伝子のポリペプチド産物に相当し得る。
【０１０２】
当業者に理解されるように、ｃ−ＭＹＣ遺伝子の発現レベルは、前記遺伝子、すなわち、ｃ−ＭＹＣによってコードされるタンパク質の発現レベルを定量することによって、または前記タンパク質の活性を決定することによって定量することができる。ｃ−ＭＹＣの活性は、当業者に公知の様々なアッセイを用いて、限定されるものではないが、例えば、転写活性を決定することによって決定することができる。
【０１０３】
タンパク質の発現レベルは、細胞中の前記タンパク質の検出および定量を可能にする任意の従来の方法、例えば、ウエスタンブロット(Western blot Western)、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、競合ＥＩＡ（競合酵素イムノアッセイ）、ＤＡＳ−ＥＬＩＳＡ（二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ）、免疫細胞化学的および免疫組織化学的技術、特異的抗体を含むタンパク質マイクロアレイまたはバイオチップの使用に基づく技術またはディップスティックなどの形式でのコロイド沈殿に基づくアッセイによって定量することができる。
【０１０４】
さらに、遺伝子の発現レベルの定量は、その遺伝子の転写（メッセンジャーＲＮＡまたはｍＲＮＡ）から得られるＲＮＡのレベルを測定することによって、あるいは、その遺伝子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から決定することができる。ｍＲＮＡまたはその対応するｃＤＮＡのレベルを検出および定量するために、事実上、任意の従来の方法を本発明の観点から使用することができる。限定されるものではないが、例えば、その遺伝子によってコードされるｍＲＮＡレベルは、従来の方法、例えば、ｍＲＮＡを増幅し、そのｍＲＮＡの増幅産物を定量することを含んでなる方法、例えば、電気泳動および染色を用いることによって、あるいは、サザンブロットおよび好適なプローブの使用、ノーザンブロットおよび目的の遺伝子のｍＲＮＡまたはその対応するｃＤＮＡに特異的なプローブの使用、ヌクレアーゼＳ１マッピング、ＲＴ−ＬＣＲ、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲなどによって定量することができる。
【０１０５】
本明細書において使用される場合、「低発現レベル」とは、基準値より低い遺伝子の発現レベルを指す。具体的には、細胞は、細胞内発現レベルが、基準値に対して、少なくとも１．１分の１、１．５分の１、５分の１、１０分の１、２０分の１、３０分の１、４０分の１、５０分の１、６０分の１、７０分の１、８０分の１、９０分の１、または１００分の１であるか、あるいはより低い場合に、低ｃ−ＭＹＣ発現レベルを有すると考えることができる。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、「基準値」とは、実験室で得られた、ｃ−ＭＹＣの発現値についての参照として使用される値を指す。基準値または基準レベルは、絶対値、相対値、上限および／または下限を有する値、値の範囲、平均値、中央値、中間値、または特定の対照もしくは基準値と比較した値であり得る。基準値は、例えば、対象の癌幹細胞サンプルから得られた値などの個々のサンプル値に基づくことができる。基準値は、対象の集団の癌幹細胞サンプルにおけるｃ−ＭＹＣの発現値などの多数のサンプルに基づくことができる。特定の実施態様では、基準値は、癌幹細胞を有さない癌における発現レベルに相当する。
【０１０７】
本発明者らは、金属化反応は光を照射すると増加することを観察した。従って、好ましい実施態様では、本発明のルテニウム錯体またはコンジュゲートは、癌の治療において光照射の存在下で使用される。一つの実施態様では、前記照射は、紫外線（ＵＶ）、可視光線、または近赤外線（ＩＲ）を用いて実施される。特定の実施態様では、照射は、２００〜１０００ｎｍの間、好ましくは３００〜８００ｎｍの間、より好ましくは４００〜６００ｎｍの間の波長を有する光を用いて実施される。好ましくは、照射は、４００〜５００ｎｍの間の波長を有する光を用いて実施される。
【０１０８】
従って、一つの実施態様では、本発明は、光照射、好ましくは２００〜１０００ｎｍの間、より好ましくは３００〜８００ｎｍの間、より好ましくは４００〜６００ｎｍの間の波長を有する光による照射を用いて、癌幹細胞を含む癌の治療において使用するための、本明細書において定義されるルテニウム錯体またはコンジュゲートに関する。特定の実施態様では、照射は、４００〜５００ｎｍの間の波長を有する光を用いて実施される。
【０１０９】
本発明の別の態様は、癌幹細胞を含む癌を治療するための方法に関し、この方法は、前記治療を必要とする患者に治療上有効な量の、本明細書において定義されるルテニウム錯体またはコンジュゲートを投与することを含んでなり、かつ、この方法は、前記ルテニウム錯体またはコンジュゲートに光を、好ましくは２００〜１０００ｎｍの間、より好ましくは３００〜８００ｎｍの間、より好ましくは４００〜６００ｎｍの間の波長を有する光を照射することを含んでなる。特定の実施態様では、照射は、４００〜５００ｎｍの間の波長を有する光を用いて実施される。
【０１１０】
所望の波長での照射を実施するのに好適な方法は当業者に公知である。
【０１１１】
加えて、ＸがＳＲ１Ｒ２から選択される式（Ｉ）のルテニウム錯体および対応するコンジュゲートは、運動学的に安定しているが、光照射を用いてのみｃ−ＭＹＣと反応することが観察されている。従って、これらの場合において、容易に取り扱うことができ、かつ、光照射によって所望の作動時間および場所で制御された方法により活性化することができる不活性誘導体を提供することが可能である。これは、癌治療における重要な利点を表す。従って、本発明の好ましい実施態様は、ＸがＳＲ１Ｒ２から選択される、本明細書において定義されるルテニウム錯体に関する。
【０１１２】
以下の限定されない例は、本発明を説明しようとするものであるが、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１１３】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００液体クロマトグラフィー−質量分析装置を用いて行った。分析ＨＰＬＣは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ−Ｃ１８逆相分析カラム（１０×２５０ｍｍ、５μｍ）、１ｍＬ／分を用いて、異なる勾配で行った（下記参照）。付加体は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｌｕｎａ−Ｃ１８ 逆相分析カラム（２５０×１０ｍｍ）で精製した。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ／ＭＳ）は、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＬＣ／ＭＳＤ  ＶＬ  Ｇ１９５６Ａモデルを用いて陽極性モードで実施した。
【０１１４】
移動相：
ａ）Ａ：０．１％ＴＦＡを含有するＨ２Ｏ、Ｂ：０．１％ＴＦＡを含有するＡＣＮ。
勾配１：４０分間でＢ  ０％→５０％。
ｂ）Ａ：１００ｍＭ  ＴＥＡＡを含有する９５：５  Ｈ２Ｏ：ＡＣＮ、Ｂ：１００ｍＭ  ＴＥＡＡを含有する７０：３０  ＡＣＮ：Ｈ２Ｏ。
勾配２：Ｂ  ０％で５分間、続いて、５５分間でＢ  ０％→１００％。
勾配３：４０分間でＢ  １０％→５０％。
【０１１５】
実施例１．ルテニウム（ＩＩ）錯体の合成
実施例１Ａ．錯体１の合成
【化１４】
2019535699.tif 000015
【０１１６】
ルテニウム錯体１を、Kaveevivitchai et al., Inorg. Chem. 2012, 51, 2930に記載の方法に従って調製した。ＲｕＣｌ３・３Ｈ２Ｏ（５００ｍｇ、２ｍｍｏｌ）および２，２’：６’，２’’テルピリジン（４６０ｍｇ、１当量）を脱酸素化Ｈ２Ｏ：ＥｔＯＨ  １：１混合物（２０ｍＬ）に溶かし、暗所で４時間加熱還流した。得られた沈殿物をＥｔＯＨ（×３）およびＥｔ２Ｏで洗浄し、脱酸素化Ｈ２Ｏ：ＥｔＯＨ  １：１混合物（２０ｍＬ）中の２，２’−ビピリジン（３１２ｍｇ、１当量）での処理を含む第２の工程で直接使用し、一晩加熱還流した。過剰のＫＰＦ６で沈殿させると、褐色の粉末として塩［Ｒｕ（ｔｅｒｐｙ）（ｂｐｙ）Ｃｌ］ＰＦ６  １が生じ、全収率は６０％（８００ｍｇ）であった。ＥＭ−ＥＳＩ＋（ｍ／ｚ）：Ｃ２５Ｈ１９ＣｌＮ５Ｒｕについての計算値：５２５．０。測定値：５２６．０［Ｍ＋１Ｈ］＋。
【０１１７】
実施例１Ｂ．錯体２の合成
【化１５】
2019535699.tif 000016
【０１１８】
ルテニウム錯体２を、文献（Takeuchi et al., Inorg. Chem. 1984, 23, 1845）の改良方法に従って調製した。錯体１（１５０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を脱酸素化Ｈ２Ｏ：ＥｔＯＨ  １：１混合物（２０ｍＬ）に溶かし、１時間加熱還流した。粗生成物を濃縮し、この生成物を逆相ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−ＦＲ）、４ｍＬ／分、３５分間でＢ  ５〜９５％の勾配（Ａ：０．１％ＴＦＡを含有するＨ２Ｏ、Ｂ：０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ）によって精製し、質量分析によって目的生成物として同定した（収率７８％）。ＥＭ−ＥＳＩ＋（ｍ／ｚ）：Ｃ２５Ｈ２１Ｎ５ＯＲｕについての計算値：５０９．１。測定値：５０８．０［Ｍ−１Ｈ］＋。
【０１１９】
実施例１Ｃ．錯体４の合成
【化１６】
2019535699.tif 000017
【０１２０】
ルテニウム錯体４を、文献（Bahreman et al., Eur. J. 2012, 18, 10271）の改良方法に従って調製した。錯体１（５０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）をチオジエタノール（１０μＬ、１．３当量）に溶かし、暗所で一晩加熱還流した。この生成物を、３５分間でＢ  ５〜９５％の勾配（Ａ：０．１％ＴＦＡを含有するＨ２Ｏ、Ｂ：０．１％ＴＦＡを含有するＡＣＮ）で４ｍＬ／分でのＨＰＬＣ−ＦＲによって精製し、質量分析およびＮＭＲによって目的生成物として同定した（３３ｍｇ、収率６５％）。1H NMR (500 MHz, D2O) δ 9.70 (m, 1H), 8.55 (m, 3H), 8.38 (m, 2H), 8.31 (m, 1H), 8.23 (m, 2H), 7.90 (m, 3H), 7.72 (m, 3H), 7.24 (ddd, J = 7.6, 5.6, 1.3 Hz, 2H), 7.13 (dt, J = 4.1, 2.0 Hz, 1H), 6.98 (ddd, J = 7.2, 4.8, 1.3 Hz, 1H), 3.20 (t, J = 5.9 Hz, 4H), 1.87 (m, 4H). 13C NMR (500 MHz, D2O) δ 157.68 (C), 157.15 (C), 156.62 (C), 152.96 (CH), 151.72 (CH), 149.42 (CH), 138.62 (CH), 138.02 (C), 137.56 (CH), 136.56 (CH), 128.01 (CH), 127.29 (CH), 126.52 (CH), 124.63 (C), 124.25 (CH), 123.77 (CH), 123.37 (CH), 57.57 (CH2), 35.01 (CH2)。ＥＭ−ＥＳＩ＋（ｍ／ｚ）：Ｃ２９Ｈ２９Ｎ５Ｏ２ＲｕＳについての計算値：６１３．１。測定値：６１２．０［Ｍ−１Ｈ］＋。
【０１２１】
実施例１Ｄ．錯体５の合成
【化１７】
2019535699.tif 000018
【０１２２】
ルテニウム錯体５を、文献（Goldbach et al., Chem. Eur. J. 2011, 17, 9924）の改良方法に従って調製した。錯体１（５０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）およびＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン（１９ｍｇ、５当量）を脱酸素化Ｈ２Ｏ：ＥｔＯＨ  １：１混合物（２ｍＬ）に溶かし、暗所で一晩加熱還流した。この生成物を、３５分間でＢ  ５〜９５％の勾配（Ａ：０．１％ＴＦＡを含有するＨ２Ｏ、Ｂ：０．１％ＴＦＡを含有するＡＣＮ）で４ｍＬ／分でのＨＰＬＣ−ＦＲによって精製し、質量分析によって目的生成物として同定した（２４ｍｇ、収率４５％）。ＥＭ−ＥＳＩ＋（ｍ／ｚ）：Ｃ３２Ｈ３２Ｎ６Ｏ３ＲｕＳについての計算値：６８２．１。測定値：６８１．０［Ｍ−１Ｈ］＋。
【０１２３】
実施例１Ｅ．ルテニウム錯体−リボフラビン１０コンジュゲートの合成
この合成では、暗所で８０℃の水中でアコ錯体２と１のチオエーテル配位子の等量を混合する必要がある。反応の経過は、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いてモニタリングすることができる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製後、褐色の粉末として化合物[１０]・ＴＦＡ２を得た。
【０１２４】
【化１８】
2019535699.tif 000019
【０１２５】
化合物７．室温の１２ｍＬの乾燥ＤＭＦ中、リボフラビン６（２ｇ、５．３ｍｍｏｌ、１．０当量）、炭酸カリウム（１．５当量、８ｍｍｏｌ、１．１ｇ）の懸濁液を不活性雰囲気下で４５分間撹拌した。次いで、４ｍＬの乾燥ＤＭＦ中ブロモ酢酸エチル溶液（２当量、１０．６ｍｍｏｌ、１．１ｍＬ）を滴下し、反応（２４時間）が完了するまで撹拌を続けた。溶媒を蒸発させ、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製し、黄色の固体として７を得た（１．２ｇ、５０％）。1H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 8.08 (s, 1H), 8.00 (s, 1H), 4.82 (s, 2H), 4.47 (m, 1H), 4.26 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 3.85 (m, 4H), 3.69 (dd, J = 11.4, 6.0 Hz, 2H), 2.60 (s, 3H), 2.49 (s, 3H), 1.31 (t, J = 6.8 Hz, 3H)。ＥＭＡＲ（ＥＳＩ）：Ｃ２１Ｈ２６Ｎ４Ｏ８についての計算値：４６２．１８。測定値：４６３．２［Ｍ＋１Ｈ］＋。
【０１２６】
化合物８．化合物７（４００ｍｇ、０．８６ｍｍｏｌ）を６Ｍ  ＨＣｌ（１５ｍＬ）中に懸濁し、１時間加熱還流した。反応物を約ｐＨ７になるまでＮａＯＨで中和し、水で希釈し、分取ＲＰ−Ｂueｃｈｉ  Ｓｅｐａｃｏｒｅ（勾配：Ｂ  ５％、５分；Ｂ  １５％→９５％、４０分）によって精製した。溶媒を減圧下で除去すると、黄色の固体が生じた（２６０ｍｇ、６９％）。1H NMR (500 MHz, D2O) δ 7.71 (s, 1H), 7.64 (s, 1H), 4.87 (m, 1H), 4.59 (s, 2H), 4.23 (m, 1H), 3.78 (m, 4H), 3.60 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.28 (s, 3H)。ＥＭＡＲ（ＥＳＩ）： Ｃ１９Ｈ２２Ｎ４Ｏ８についての計算値：４３４．１４。測定値：４３５．２［Ｍ＋１Ｈ］＋、４５７．１［Ｍ＋１Ｎａ］＋。
【０１２７】
化合物９．Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ（３７１ｍｇ、１ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（６９５μＬ、４ｍｍｏｌ、４当量）の混合物を、２．５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中２−クロロトリチル樹脂（０．２５ｍｍｏｌ）の懸濁液に加え、この混合物を５０分間撹拌した。樹脂をＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ／ＤＩＥＡ（１７：２：１）（３×５ｍＬ、２分）、ＣＨ２Ｃｌ２（３×５ｍＬ、２分）で洗浄し、ＤＭＦ（１×５ｍＬ、１０分）中２０％ピペリジンで処理した。
【０１２８】
化合物８（１７０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ／ＤＭＦ  ０．２Ｍ（８．２ｍＬ、１．６ｍｍｏｌ、４当量）、およびＨＡＴＵ（１５２ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ、１当量）の溶液を前述の樹脂（０．４ｍｍｏｌ）に加え、この懸濁液を５０分間撹拌した。この樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ、２分）およびＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍＬ、２分）で洗浄し、次いで、脱保護カクテル（ＴＦＡ  ９００μＬ、ＣＨ２Ｃｌ２  ５０μＬ、Ｈ２Ｏ  ２５μＬおよびＴＩＳ  ２５μＬ；１ｍＬのカクテル／樹脂４０ｍｇ）で１．５〜２時間処理した。濾過後、粗生成物を減圧下で濃縮した。
【０１２９】
濃縮後に得られた残渣を分取ＲＰ−Ｂueｃｈｉ  Ｓｅｐａｃｏｒｅ、勾配：Ｂ  ５％、５分；Ｂ  １５％→９５％、４０分（Ａ：０．１％ＴＦＡを含有するＨ２Ｏ、Ｂ：０．１％ＴＦＡを含有するＭｅＯＨ）によって精製した。好適な画分を収集し、濃縮し、凍結乾燥し、淡黄色の粉末として目的生成物９を得た（５０ｍｇ、２３％）。1H NMR (500 MHz, D2O) δ 8.00 (s, 1H), 7.97 (s, 1H), 5.13 (m, 1H), 4.97 (d, J =  14.0 Hz, 1H), 4.86 (m, 2H), 4.46 (m, 1H), 3.97 (m, 2H), 3.89 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.01 (m, 2H), 2.76 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 2.61 (s, 3H), 2.50 (s, 3H), 2.26 (m, 2H), 2.09 (s, 3H)。ＥＭＡＲ（ＥＳＩ）：Ｃ２４Ｈ３１Ｎ５Ｏ９Ｓについての計算値：５６５．１８。測定値：５６６．１９。
【０１３０】
化合物１０．錯体２（３５ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）および化合物９（４０ｍｇ、１当量）を脱酸素化Ｈ２Ｏ：ＥｔＯＨ  １：１（２ｍＬ）に溶かし、暗所で一晩加熱還流した。この生成物を、３５分間でＢ  ５〜９５％の勾配（Ａ：０．１％ＴＦＡを含有するＨ２Ｏ、Ｂ：０．１％ＴＦＡを含有するＡＣＮ）で４ｍＬ／分でのＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。好適な画分を収集し、濃縮し、凍結乾燥し、褐色の粉末として目的生成物１０を得た（１０ｍｇ、１３％）。1H NMR (500 MHz, D2O) δ 8.64 (dd, J = 19.0, 8.2 Hz, 2H), 8.48 (dd, J = 24.0, 8.1 Hz, 2H), 8.32 (m, 2H), 8.09 (m, 3H), 7.98 (m, 2H), 7.81 (m, 3H), 7.62 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 7.54 (m, 3H), 7.26 (m, 2H), 7.09 (t, J = 6 Hz, 1H), 5.15 (m, 1H), 4.91 (m, 2H), 4.60 (m, 1H), 4.50 (m, 2H), 3.97 (m, 2H), 3.86 (m, 1H), 3.73 (dd, J = 11.8, 5.8 Hz, 1H), 2.60 (s, 3H), 2.36 (s, 3H), 1.92 (m, 1H), 1.79 (m, 2H), 1.69 (m, 1H), 1.24 (s, 3H)。ＥＭＡＲ(ＥＳＩ)：Ｃ４９Ｈ５０Ｎ１０Ｏ９ＲｕＳについての計算値：１０５６．２５。測定値：１０５５．２５［Ｍ−１Ｈ］＋。
【０１３１】
実施例２．ＧＭＰおよびｃ−ＭＹＣの結合アッセイ
照射を用いてＤＮＡを金属化するためのアッセイの一般的方法
オリゴヌクレオチド（１０μＭ）を、１００ｍＭ  ＫＣｌを含む１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ＝７．５）中で室温で３０分間ルテニウム錯体で処理した。この溶液を暗所でインキュベートするかまたは高出力ＬＥＤで照射した。照射のために、サンプルをサンプル支持体内の標準的な１０ｍｍキュベットに入れ、高出力ＬＥＤユニットを用いて９００ｍＷで４５５ｎｍで３０分間照射した（Ｔｈｏｒｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．、カタログ番号：Ｍ４５５Ｌ３）。ＬＥＤの光は、照射パワーを最大にする目的で短い焦点距離を有する平凸レンズによって視準する。
【０１３２】
実施例２Ａ．錯体１−ＧＭＰの結合アッセイ
最初に、錯体１のグアノシン一リン酸（ＧＭＰ）金属化能力を研究した。その目的で、錯体１（２５０μＭ）を、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中で３当量のＧＭＰ（７５０μＭ）と混合した。室温で３０分後に、アコ［Ｒｕ（ｔｅｒｐｙ）（ｂｐｙ）Ｈ２Ｏ］２＋錯体（２）の部分的形成（５０％を超える）が観察されたが、一方、ＧＭＰは本質的に未反応のままであった（図１、線ｂ）。その後の２時間のサンプルインキュベーションによって、金属化生成物３およびアコ錯体２が生じ、開始時の塩素錯体は完全に消費された（図１、線ｄ）。サンプルへの３０分間の照射（λ＝４５５ｎｍ）によって、モノ付加体３の排他的形成が起こった（ＧＭＰの消失に基づいて約８０％の転化率、図１、線ｃ）。
【０１３３】
ＧＭＰ金属化が完全に直交していることを確認するために、他の３種のヌクレオチド（ＡＭＰ、ＣＭＰ、およびＴＭＰ）を用いて競合的実験を行った。具体的には、錯体１（２５０μＭ）を、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中で、ＧＭＰ（３当量、７５０μＭ）、ＡＭＰ（３当量、７５０μＭ）、ＴＭＰ（３当量、７５０μＭ）、およびＣＭＰ（３当量、７５０μＭ）と混合した。４５５ｎｍで３０分間照射した後、アコ［Ｒｕ（ｔｅｒｐｙ）（ｂｐｙ）Ｈ２Ｏ］２＋錯体（２）の形成と、ＧＭＰの排他的修飾が観察され、モノ付加体３が生じた（図２）。
【０１３４】
リシンおよびシステインの誘導体の存在下でのＧＭＰ金属化の選択性もまた確認した。その目的で、錯体１（２５０μＭ）を、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中、Ｈ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（３当量、７５０μＭ）またはＡｃ−Ｃｙｓ−ＯＨ（３当量、７５０μＭ）の存在下でＧＭＰ（３当量、７５０μＭ）と混合した。４５５ｎｍで３０分間照射した後、ＧＭＰの排他的修飾が観察され、モノ付加体３が生じた（図３）。
【０１３５】
実施例２Ｂ．錯体１−ｃ−ＭＹＣの結合アッセイ
平行ｃ−ＭＹＣ四重鎖ｄ［ＴＴＧＡＧ３ＴＧ３ＴＡＧ３ＴＧ３ＴＡ３］（配列番号１）の１０μＭ溶液を、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＫＣｌ中で５当量のルテニウム錯体１で処理し、この混合物に室温で３０分間照射した（λ＝４５５ｎｍ）。８１％の転化率での、モノ付加誘導体ＭＹＣ−［Ｒｕ］に相当する質量を有する生成物の形成が観察された（図４、線ｃ）。光不在下での反応もまた、室温で３０分後に約４１％の転化率で観察された（図４、線ｂ）。
【０１３６】
実施例２Ｃ．錯体４−ＧＭの結合アッセイ
錯体４（２５０μＭ）を、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中で３当量のＧＭＰ（７５０μＭ）と混合した。暗所、室温で３０分後に、新たな生成物の形成は観察されなかった（図５、線ｂ）。しかしながら、最初のサンプルに３０分間照射すると（λ＝４５５ｎｍ）、モノ付加体３の排他的形成が観察された（図５、線ｃ）。
【０１３７】
実施例２Ｄ．錯体４−ｃ−ＭＹＣの結合アッセイ
四重鎖ｃ−ＭＹＣの１０μＭ溶液を、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＫＣｌ中で５当量のルテニウム錯体４で処理した。この混合物への室温で３０分間の照射（λ＝４５５ｎｍ）によって、生成物ＭＹＣ−［Ｒｕ］の形成が起こった（図６、線ｃ）。この反応を暗所で行った場合には、３０分後に金属化生成物の形成は観察されなかった（図６、線ｂ）。
【０１３８】
実施例２Ｅ．錯体５−ＧＭＰの結合アッセイ
錯体５（２５０μＭ）を、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中で３当量のＧＭＰ（７５０μＭ）と混合した。暗所、室温で３０分後に、新たな生成物の形成は観察されなかった（図７、線ｂ）。しかしながら、最初のサンプルに３０分間照射すると（λ＝４５５ｎｍ）、モノ付加体３の排他的形成が観察された（図７、線ｃ）。
【０１３９】
実施例２Ｆ．錯体５−ｃ−ＭＹＣの結合アッセイ
四重鎖ｃ−ＭＹＣの１０μＭ溶液を、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＫＣｌ中で５当量のルテニウム錯体５で処理した。この混合物への室温で３０分間の照射（λ＝４５５ｎｍ）によって、生成物ＭＹＣ−［Ｒｕ］の形成が起こった（図８、線ｃ）。この反応を暗所で行った場合には、３０分後に金属化生成物の形成は観察されなかった（図８、線ｂ）。
【０１４０】
実施例３．［Ｒｕ］−Ｃｌ錯体（１）の［Ｒｕ］−Ｈ２Ｏ（２）への加水分解
１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中の錯体１（２５０μＭ）は暗所でゆっくりとアコ２誘導体に変化することが観察された。３０分後に完全な転化が観察されたことを考え合わせると、この加水分解は、照射（λ＝４５５ｎｍ）によって著しく促進される（図９、線ｃ）。暗所での、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ＝７．５）および１００ｍＭ  ＮａＣｌ中でのアコ２誘導体（２５０μＭ）と３当量のＧＭＰ（７５０μＭ）との反応によって、３０分後に６３％の転化が起こった（図１０、線ｂ）。光照射（λ＝４５５ｎｍ）によってプロセスが加速され、３０分後に完全な転化が起こった（図１０、線ｃ）。
【０１４１】
実施例４．ｃ−ＭＹＣ発現レベルの決定
材料と方法
細胞培養物
細胞株は、１０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳ（ウシ胎仔血清、Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ中で培養した。細胞培養物は、５％ＣＯ２中、湿度を保ち、３７℃で維持した。
【０１４２】
リアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
１ウェルあたり３×１０５個のＨｅＬａ細胞（子宮頸癌細胞株）またはＶｅｒｏ細胞（腎上皮細胞株）を６ウェルプレートに播種した。１日後、アッセイする化合物を細胞培養培地に添加し、細胞を１６時間または４８時間インキュベートした。市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）を用いて製造業者の推奨に従って全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００で定量した。同量のＲＮＡを、ＣＦＸ９６リアルタイムシステム装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でのｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇｏｔａｑ  １−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ｑＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ）に使用した。使用したプライマーは以下の通りであった：ｃ−ＭＹＣ：センス：５’−ＣＴＧ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＡＡＣ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＡＧ−３ '（配列番号２）、アンチセンス：５’−ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＧＡ  ＧＧＴ  ＴＴＧ  ＣＴＧ  ＴＧ−３’（配列番号３）；ＡＬＡＳ：センス：５’−ＧＴＴ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＡＡＴ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＣＧ−３'（配列番号４）、アンチセンス：５’−ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＡＡＣ  ＡＡＣ  ＡＧ−３’（配列番号５）；ＧＡＰＤＨ：センス：５’−ＧＧＴ  ＧＴＧ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＴＡＴ  ＧＡ-３'（配列番号６）、アンチセンス：５’−ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＧＡＴ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＡＡＡ  Ｇ−３'（配列番号７）。
【０１４３】
ウエスタンブロット
指示された濃度のアッセイする物質の存在下で、５０％のコンフルエンスになるまでＨｅＬａ細胞を１６時間インキュベートした。細胞をＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｌａｅｍｍｌｉ法用バッファー中に溶解し、標準的な方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットに供した。ｃ−ＭＹＣタンパク質は、抗ＭＹＣ抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって検出した。免疫反応性タンパク質のシグナルを検出するために、化学発光法に従った（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０１４４】
ＩＣＰ−ＭＳ（誘導結合プラズマ質量分析）
ＨｅＬａ細胞を、１ウェルあたり３×１０５個の細胞の密度で６ウェルプレートに播種した。翌日、錯体１を１００μＭの濃度で細胞培養培地に添加し、細胞を１６時間インキュベートした。細胞を新鮮培地で２回洗浄し、７０％ＨＮＯ３／Ｈ２Ｏ中に溶解した。サンプルを全容量３ｍＬの水に希釈し、ＩＣＰ−ＭＳ（７，７００×  Ａｇｉｌｅｎｔ）によって分析した。
【０１４５】
細胞毒性（ＭＴＴ）アッセイ
１ウェルあたり４０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間インキュベートした。異なる濃度のアッセイする物質を培養培地に添加し、さらに７２時間、細胞をインキュベーター内に残した。次いで、ＭＴＴを終濃度０．５ｍｇ／ｍｌで添加し、４時間インキュベートした。細胞を溶解し、水中０．１Ｍ  ＨＣｌおよび１０％ＳＤＳを含有する可溶化溶液をある容量添加することによってホルマザン沈殿物を可溶化した。吸光度は、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｏ  Ｆ２００  Ｐｒｏプレートリーダーにより５７０ｎｍで決定した。
【０１４６】
細胞分画
ＨｅＬａ細胞を、１ウェルあたり３×１０５個の細胞の密度で６ウェルプレートに播種した。翌日、錯体１を１００μＭの濃度で細胞培養培地に添加し、細胞を１６時間インキュベートした。核の単離については以下のプロトコールに従った：細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離によって沈降させた。次いで、それらを細胞溶解バッファー［ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ；ｐＨ＝７．５、ＫＣｌ  １０ｍＭ、ＥＤＴＡ  ０．１ｍＭ、ジチオトレイトール  １ｍＭ（ＤＴＴ）、および０．５％ノニデット−４０］中に再懸濁し、間欠的に混合しながら氷上で１５〜２０分間放置した。チューブを激しく撹拌して細胞膜を破壊し、次に、４℃で１０分間１２，０００ｇで遠心分離した。堆積した核の完全性は、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴｉＥ装置の位相差顕微鏡によって確認した。細胞質を含有する上清画分および核を含有する沈降物を７０％ＨＮＯ３／Ｈ２Ｏ中でホモジナイズし、上記のように、ＩＣＰ−ＭＳによって分析した。クロマチン抽出のために、市販のキットを使用した（Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ａｂｃａｍ）。単離したクロマチンを７０％ＨＮＯ３／Ｈ２Ｏ中に再懸濁し、ＩＣＰ−ＭＳによって分析した．
【０１４７】
結果
本発明者らは、ｃ−ＭＹＣ癌遺伝子の発現レベルに対する本発明の錯体の効果を、メッセンジャー発現レベルおよびタンパク質発現レベルの両方において分析した。
【０１４８】
図１１および図１２は、それぞれ、ＨｅＬａ細胞およびＶｅｒｏ細胞におけるメッセンジャーＲＮＡ発現のデータを示している。グアニン四重鎖と結合し、ｃ−ＭＹＣ発現を阻害する化合物であるポルフィリンＴＭＰｙＰ４を対照として使用した。
【０１４９】
図１１で示されるように、ＤＭＥＭ中錯体１（１００μＭ）で処理したＨｅＬａ細胞は、未処理の細胞と比較して、ｃ−ＭＹＣ転写において中程度であるが有意な増加を示した（１６時間時点で８０％および４８時間時点で２００％）。予想されるように、ＴＭＰｙＰ４での代替処理は４８時間後に細胞のｃ−ＭＹＣ  ｍＲＮＡレベルの６０％の減少をもたらした。
【０１５０】
図１１はｃ−ＭＹＣタンパク質発現のデータを示している。メッセンジャーレベルと比較して観察されるように、１００μＭの濃度の錯体１での細胞の処理によって、ｃ−ＭＹＣのレベルの著しい増加が起こった（図１１、平均４０％の増加）。
【０１５１】
このデータによって、大部分の四重鎖標的化薬剤とは異なり、錯体１は遺伝子発現レベルの減少ではなく増加を促進し、それによって、転写活性化因子として作用することが確認される。
【０１５２】
下記表１および表２で分かるように、錯体１での処理後に得られた単離核およびクロマチンのＩＣＰ−ＭＳ分析によって、錯体の効率的な細胞取り込みおよび核輸送に従って、比較的多量のルテニウムの存在が確認された。
【０１５３】
【表１】
2019535699.tif 000020
【０１５４】
【表２】
2019535699.tif 000021
【０１５５】
さらに、細胞生存率アッセイによって、錯体１は本質的に非細胞毒性であることが確認された（図１３）。
【０１５６】
光活性化錯体（錯体５）に関して、ｃ−ＭＹＣ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡの発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって、錯体２（アコ）で観察されたものと同様に、照射後にＲＮＡレベルが増加することが示された。ウエスタンブロットタンパク質発現分析によって、ｃ−ＭＹＣタンパク質発現の増加は光の存在下で起こること、そして暗所ではタンパク質レベルは変化しないことが確認された（図１４および図１５）。さらに、錯体２は暗所でも照射下でも活性である。追加の実験によって、放射線による細胞生存率への影響がないことが確認された（図１６）。
【０１５７】
実施例５．膵臓の癌幹細胞におけるアッセイ
膵腺癌は、癌幹細胞（ＣＳＣ）の亜集団を含む不均一な腫瘍細胞集団を含む膵臓癌である。
【０１５８】
本発明者らは、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別”）によって６つの患者由来原発腫瘍からＣＳＣおよび 非ＣＳＣを単離した。ハイスループットＲＮＡ配列決定（ＲＮＡｓｅｑ）を行った。対応する非ＣＳＣ集団と比較したＣＳＣ集団のＲＮＡｓｅｑ分析により、共通の要素およびそれらの差次的発現に基づいて標的遺伝子のリストを作成した。負に調節された遺伝子の中で、ｃ−ＭＹＣは、６つの腫瘍の部分ＣＳＣ集団においてかなり下方調節されていると確認された。ｃ−ＭＹＣの下方調節は、様々な腫瘍におけるｃ−ＭＹＣについて一般的に特徴付けられているものとは相反することを強調しなければならない。しかしながら、本発明者らは、ｃ−ＭＹＣの発現は、そのより分化した同等物と比較して、ＣＳＣにおいて差次的に調節されることを発見した。
【０１５９】
一方で、本発明者らは、錯体２が膵臓ＣＳＣにおけるｃ−ＭＹＣ発現を増加させ得るかどうか、他方で、ｃ−ＭＹＣ発現の増加がＣＳＣ表現型、例えば、ＣＳＣ自己複製能に悪影響を与えるかどうかを分析した。この目的のために、パス数の少ない患者由来異種移植片から確立された膵管腺癌（ＰＤＡＣ）細胞を培養し、１００μＭおよび２５０μＭの濃度のルテニウム錯体２（ＲｕＨ２Ｏ）で６時間、１２時間、または２４時間処理し、ｃ−ＭＹＣタンパク質発現をウエスタンブロットによって評価した。図１７（Ａ）は、ｃ−ＭＹＣの発現が処理後に増加し、効果は処理の２４時間後に最も顕著であったことを示している。ｃ−ＭＹＣ発現の実質的な増加を達成した後に、ＣＳＣ自己複製能が影響を受けるかどうかを分析した。要するに、その目的で、ＰＤＡＣ細胞を、１００μＭおよび２５０μＭの濃度の錯体２（ＲｕＨ２Ｏ）で２回前処理した後、Cioffi M(Cioffi M et al. 2015 Gut 12: 1936-1948)に記載されている超接着性プレートでスフェア培養物を確立した。スフェア形成後４日目にスフェアを再び処理した。図１７（Ｂ）で示されるように、錯体２（ＲｕＨ２Ｏ）で処理したＰＤＡＣ細胞のスフェア形成能の有意な用量依存的低下が対照培養物と比較して観察された。このデータは、ｃ−ＭＹＣ発現の増加が、自己複製などのＰＤＡＣ癌幹細胞の機能特性に悪影響を及ぼす細胞内状態を作り出すという本発明者らの仮説を裏付けるものである。
【０１６０】
本発明の錯体を使用して、ＨｅＬａ細胞においてなされた観察を確認するために、ＲｕＨ２Ｏ錯体２が、パス数の少ない患者由来異種移植片に基づいて確立されたＰＤＡＣ接着性培養物においてｃ−ＭＹＣ発現を増加させるかどうかを試験した。前の観察と一致して、１００μＭのＲｕＨ２ＯでのＰａｎｃ１８５細胞およびＰａｎｃＡ６Ｌ細胞の処理によって処理の２４時間後にｃ−ＭＹＣタンパク質発現が増加した（図１８）。処理の４８時間後にｃ−ＭＹＣタンパク質レベルの有意な低下が観察されたため、その効果は一過性であった。
【０１６１】
さらに、１００μＭのＲｕＨ２Ｏで２４時間処理した後、既知のｃ−ＭＹＣ標的であるＰＧＣ１α発現の減少、および多能性関連遺伝子Ｏｃｔ３／４およびＳｏｘ２の減少が観察された（図１９）。
【０１６２】
次に、観察されたｃ−ＭＹＣ発現の増加および表現型および転写の変化が細胞傷害性であるかどうかを調べた。この分析には、損傷細胞から放出されたアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）酵素を測定するために設計された生物発光非破壊細胞溶解アッセイキットであるＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（商標）ＢｉｏＡｓｓａｙキットを使用した（図２０）。接着性培養物（ＣＳＣが少ない）および培養スフェア（ＣＳＣ豊富）を漸増用量のＲｕＨ２Ｏで処理し、細胞毒性を処理の２４時間後、４８時間後、および７２時間後に測定した。接着性培養物およびアッセイした両方の細胞株では、細胞を２５０μＭのＲｕＨ２Ｏで処理した場合、毒性は７２時間時点でのみ観察された（死細胞の３倍増加）。これに対して、１００μＭの濃度では、ＲｕＨ２Ｏは球状培養物で細胞死を誘導し、これは、Ｐａｎｃ１８５細胞およびＰａｎｃＡ６Ｌ細胞中のＣＳＣ集団の選択的選抜を示す。
【０１６３】
ＣＳＣを多く含む培養物に対する１００μＭのＲｕＨ２Ｏの効果は、顕微鏡レベルでもアネキシンＶ染色を測定することによっても確認された。図２１で示されるように、１００μＭのＲｕＨ２Ｏで７２時間処理したスフェアは視覚的に小さく、アポトーシス性であった。ＤＡＰＩ陰性細胞の割合によって決定される細胞生存率は５０％低下した。
【０１６４】
次いで、ルテニウム錯体２が自己複製および造腫瘍性などのＣＳＣ表現型に悪影響を及ぼす可能性があるかどうかを評価した。その目的で、パス数の少ない患者由来異種移植片に基づいて確立されたＰＤＡＣ接着性培養物を２５０μＭのルテニウム錯体２（ＲｕＨ２Ｏ）で２４時間処理した。処理済みおよび未処理の細胞をトリプシン処理し、標準的なプロトコール(Cioffi M et al. 2015 Gut 12: 1936-1948)に従ってスフェア培養物を確立した。細胞を、Ｂ２７を添加した無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２で７日間、超低接着性プレート中で培養した。これらの７日間、スフェア開始後１日目、３日目、および５日目にサンプルを２５０μＭのＲｕＨ２Ｏで再び処理した。図２２Ａは前述の実験の作業順序を示している。図２２Ｂで示されるように、対照で処理した培養物と比較して、ＲｕＨ２Ｏで処理したＰＤＡＣ細胞のスフェア形成能の有意な低下が観察された。ＣＳＣスフェアはＲｕＨ２Ｏ群においてより小さく、あまり豊富ではなかった。
【０１６５】
次に、スフェアを分離し、同数の対照処理細胞およびＲｕＨ２Ｏ処理細胞を免疫不全のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに皮下注射して、その造腫瘍性を評価した。注射の１２週間後、腫瘍を摘出し、重量を測定した。図２３Ａは、摘出した腫瘍を示している。ＲｕＨ２Ｏでの処理によってスフェア豊富なＣＳＣ(sphere-rich CSCs)の腫瘍形成能が有意に低下した。１０，０００個の対照処理細胞の４回の注射のうち４回、１，０００個の対照処理細胞の６回の注射のうち５回は腫瘍をもたらしたが、１０，０００個のＲｕＨ２Ｏ処理細胞の全６回の注射のうち１回だけが腫瘍をもたらした。１０分の１のＲｕＨ２Ｏ処理細胞を注射した場合には腫瘍は形成されなかった（図２３Ｂ）。さらに、１０，０００個のＲｕＨ２Ｏ処理細胞を注射したマウスで発生した唯一の腫瘍の重量は、対照処理マウスで形成された腫瘍の５３分の１であった（０．３１１８ｇに対して０．００５８ｇ）。
【０１６６】
上述の効果が非特異的細胞毒性効果の結果として生じる可能性を排除するために、接着性培養物（ＣＳＣが少ない）を、単回用量のＲｕＨ２Ｏ（１００μＭまたは２５０μＭ）で４８時間処理し、それらのその後のクローン産生性、自己複製、および造腫瘍性を確かめた。これらの実験条件下では、このＴｏｘｉＬｉｇｈｔアッセイを用いて毒性は観察されなかった（図２０）。パス数の少ない患者由来異種移植片に基づいて確立されたＰＤＡＣ接着性培養物を、１００μＭまたは２５０μＭのＲｕＨ２Ｏで４８時間処理した。次いで、処理済みおよび未処理の細胞をトリプシン処理し、アポトーシス細胞の割合を分析した。細胞毒性アッセイと一致して、１００μＭまたは２５０μＭのＲｕＨ２Ｏでの処理後にアポトーシス細胞の割合の増加は観察されなかった（図２４）。
【０１６７】
次いで、トリプシン処理した細胞を以下の通りにした：１）それらのクローン産生性を評価するために、低コンフルエントな状態でプレートに入れ（図２５）；２）複数世代にわたるスフェア形成能を評価するために、Ｂ２７を添加した無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２で超低接着性プレート中、７日間隔で繰り返し培養し（図２６）； ３）上記のように、それらの造腫瘍性を確かめるために、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに皮下注射した（図２７）。この総てのデータは、ＲｕＨ２Ｏでの処理がＰＤＡＣ細胞のクローン産生性、自己再生、および造腫瘍性を妨げることを明確に示している。
【０１６８】
最後に、ＣＳＣを特異的に標的とする本発明の錯体の能力を調査するために、ＲｕＨ２Ｏをメチオニンの硫黄を介してリボフラビンと結合させ（コンジュゲート１０）、詳細に記載のとおり、この修飾化合物で細胞を処理した。この場合も、パス数の少ない患者由来異種移植片に基づいて確立されたＰＤＡＣ接着性培養物を、２５０μＭのＲｕ−リボフラビンで処理した。ルテニウム錯体を活性化するために、細胞を可視光で処理して、ＲｕＨ２Ｏを放出させ活性化した。処理の２４時間後に、処理済みおよび未処理の細胞をトリプシン処理し、標準的なプロトコール(Cioffi M et al. 2015 Gut 12: 1936-1948)に従ってスフェア培養物を確立した。細胞を、Ｂ２７を添加した無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２で７日間、超低接着性プレート中で培養した。スフェア開始後３日目に、細胞を２５０μＭのＲｕ−リボフラビンで再び処理した。図２８はこの実験の作業順序を示している。
【０１６９】
さらに、細胞を、特異的ＡＢＣＧ２阻害薬であるフミトレモルギンＣ（ＦＴＣ）でも処理した。Ｒｕ−リボフラビンでの最初の処理および活性化の後、ｃＭＹＣ  ｍＲＮＡレベル、ならびに多能性関連遺伝子Ｋｌｆ４およびＯｃｔ３／４などの既知ＣＳＣ関連遺伝子の発現を評価するために、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。ＦＴＣの存在下または不在下でＲｕ−リボフラビンで処理した細胞は、ｃＭＹＣ  ＲＮＡレベルの増加と、Ｋｌｆ４およびＯｃｔ３／４  ＣＳＣ関連転写物の減少を示した（図２９Ａ）。Ｒｕ−リボフラビンがＣＳＣ中に蓄積可能であることを確認するために、Ｒｕ−リボフラビンで２４時間処理した細胞においてフローサイトメトリーによって自家蛍光を測定した。自家蛍光ＣＳＣ集団の増加が観察され、これはＦＴＣで元に戻すことができた（図２９Ｂ）。
【０１７０】
最後に、スフェア豊富なＣＳＣ (sphere-rich CSCs)の造腫瘍性を、上記のように調べた。摘出した腫瘍の分析によって、対照で処理した細胞およびＲｕ−リボフラビン／ＦＴＣで処理した細胞と比較して、Ｒｕ−リボフラビンで処理した細胞の腫瘍減少および増殖の傾向が示された（図３０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2019535699.tif 000064
2019535699.tif 000065
2019535699.tif 000066
2019535699.tif 000067