(57)【要約】  本発明は、フレーバー生成に関する。特に、本発明は、プロリダーゼ酵素を用いた、熱処理された食品製品におけるフレーバー生成のための方法に関する。本発明はまた、本発明の方法により調製された、熱処理された食品製品に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ペプチド含有食用物質をプロリダーゼと接触させ、加水分解調製物を形成するステップであって、前記プロリダーゼが、配列番号１に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むステップと、
ｂ．ステップ（ａ）から得ることができる前記加水分解調製物を、少なくとも１つの還元糖を含む食品調製物に組み込むステップ、又は、
前記加水分解調製物が既に少なくとも１つの還元糖を含む場合、前記加水分解調製物が前記食品調製物であり得るステップと、
ｃ．前記食品調製物に熱処理を施し、熱処理された食品製品を得るステップと
を含む、フレーバー生成のための方法。
【請求項２】
前記プロリダーゼが、クルイベロマイセス・ラクチスから得ることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記プロリダーゼが、クルイベロマイセス・ラクチスの自己分解により得ることができる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチド含有食用物質を、プロリルエンドペプチダーゼと接触させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記還元糖がラムノースである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記加水分解調製物が、前記食品調製物の０．０１〜５重量部の量で前記食品調製物に組み込まれる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記熱処理された食品製品が、ビスケット、押出成形シリアル、ピザ、飲料粉末及びカラメルからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチド含有食用物質が、フラワー、乳、及びこれらのペプチド含有成分からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチド含有食用物質、前記プロリルエンドペプチダーゼ及び前記プロリダーゼを、水性分散液において、３０〜６０℃の温度で接触させる、請求項４〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ペプチド含有食用物質とプロリダーゼとの接触により得ることができ、前記プロリダーゼが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、加水分解調製物。
【請求項１１】
前記加水分解調製物が、前記ペプチド含有食用物質と、前記プロリダーゼに加えてプロリルエンドペプチダーゼとの接触により得ることができる、請求項１０に記載の加水分解調製物。
【請求項１２】
遊離アミノ酸としてのプロリンのモル分率は、前記ペプチド含有食用物質が完全に遊離アミノ酸に加水分解されていることを除いて同様の組成を有する加水分解調製物より、少なくとも２倍高い、請求項１１に記載の加水分解調製物。
【請求項１３】
プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼ、遊離アミノ酸としてのプロリン及び遊離アミノ酸としてのオルニチンを含み、
前記プロリダーゼが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
遊離アミノ酸としてロイシンが存在する場合、遊離アミノ酸としてのロイシンに対するプロリンのモル比は２．５より大きく、遊離アミノ酸としてのロイシンに対するオルニチンのモル比は１より大きい、食品調製物。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法により得ることができる熱処理された食品製品。
【請求項１５】
熱処理された食品製品のフレーバーを改善するための、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むプロリダーゼの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フレーバー生成に関する。特に、本発明は、プロリダーゼ酵素を用いた、熱処理された食品製品におけるフレーバー生成のための方法に関する。本発明はまた、本発明の方法により調製された、熱処理された食品製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品においては、メイラード反応により、フレーバーの生成と褐変の両方がもたらされる（Ｂａｉｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．（１９９４）Ｍａｉｌｌａｒｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅａｔ  ｆｌａｖｏｕｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐａｇｅｓ  １５３〜１７３，Ｉｎ：Ｆｌａｖｏｕｒ  ｏｆ  ｍｅａｔ  ａｎｄ  ｍｅａｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｄ．Ｆ．Ｓｈａｈｉｄｉ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｍｅｓ，Ｊ．Ｍ．（１９９２）Ｔｈｅ  Ｍａｉｌｌａｒｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ  ９９〜１４３，Ｉｎ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｅｄ．Ｂ．Ｊ．Ｆ．Ｈｕｄｓｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ａｐｐ．Ｓｃｉ．Ｌｏｎｄｏｎ参照）。
【０００３】
フレーバー生成に関して、メイラード反応を４段階に分けることができる。第１段階は、グリコシルアミンの形成に関与する。第２段階は、グリコシルアミンを再配置し、Ａｍａｄｏｒｉ転移生成物及びＨｅｙｎｓ転移生成物（文献において、それぞれ「ＡＲＰ」及び「ＨＲＰ」と略記されることが多い）を形成することに関与する。第３段階は、Ａｍａｄｏｒｉ転移生成物及びＨｅｙｎｓ転移生成物が、脱水及び又は分裂（fission）により、フラン誘導体、レダクトン及び他のカルボニル化合物（有意な官能特性を有してもよい）になることに関与する。これらの「第３段階の生成物」は、ＡＲＰ又はＨＲＰを形成せずに生産され得る。第４段階は、これらのフラン誘導体、レダクトン及び他のカルボニル化合物が、着色され、アロマ／フレーバー化合物へ変換することに関与する。これにより、メイラード反応の第３と第４の両段階に存在する生成物及び反応物は、アロマ／フレーバーに寄与する。
【０００４】
メイラード反応は食品において自然に発生するが、食料品のフレーバーやアロマを改善するためにメイラード反応生成物を用いることも知られている。
【０００５】
フレーバー前駆体としてのアミノ酸は、メイラード反応系において、還元糖と組み合わせて広範に研究されてきた。Ｈｏｄｇｅら（１９７２，Ｃｅｒｅａｌ  Ｓｃｉ  Ｔｏｄａｙ  １７：３４４０）は、プロリンをローストアロマに重要なアミノ酸前駆体として記載した。更に、Ｓｃｈｉｅｂｅｒｌｅ（１９９０，Ｚ  Ｌｅｂｅｎｓｍ  Ｕｎｔｅｒｓ  Ｆｏｒｓｃｈ  １９１：２０６〜２０９）によって、重要な影響を与える化合物である、２−アセチル−１−ピロリンは、プロリン及びオルニチンから生成されることが示された。米国特許第−Ａ−３６８７６９２号及び米国特許第−Ａ−３７８２９７３号において、プロリン系反応混合物は、環状ケトンで加熱した際、カラメル特性（caramel character）をもたらすことが報告された。米国特許第４，０２２，９２０号は、Ａｍａｄｏｒｉ転移化合物が、還流下におけるエタノール中で、プロリン及びラムノースなどの６−デオキシ−アルドヘキソースから生成され、続いて乾燥されることを開示する。この乾燥された混合物を食品マトリックスに組み込み、加熱する。プロリン及びラムノースから生成されることが知られる化合物の中には、４−ヒドロキシ−２，５−ジメチル−３（２Ｈ）−フラノン及びいくつかの２，３−ジヒドロ（ＩＨ）−ピロリジン（Ｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｈｏ  １９８９，Ｔｈｅｒｍａｌ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｏｍａｓ，ｅｄｓ．Ｐａｒｌｉａｍｅｎｔ  ＴＨ，ＭｃＧｏｒｒｉｎ  ＲＪ，Ｈｏ  Ｃ−Ｔ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．；Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，Ｐｅｒｆｕｍｅｒ  ＆  Ｆｌａｖｏｒｉｓｔ  １５：６０〜６６；Ｔｒｅｓｓｌ  ｅｔ  ａｌ．１９８５，Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ３３：９１９〜９２３  ａｎｄ  Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ３３：９２４〜９２８）がある。
【０００６】
国際公開第２００５／１１７５９５号は、プロリン特異的エンドプロテアーゼと共に、焼成された穀類製品におけるフレーバーの改良のためのエキソペプチダーゼの使用を記載する。カルボキシル末端プロリン残基を有するペプチド鎖をもたらすプロリン特異的エンドプロテアーゼ酵素に関して、国際公開第２００５／１１７５９５号は、エンドプロテアーゼとカルボキシペプチダーゼＣＰＤ−Ｙ又はキサントモナス属（Xanthomonas）若しくはエシェリキア属（Escherichia）からのプロリン特異的カルボキシペプチダーゼとを結合するステップを示す。しかし、フレーバー生成は複雑で微妙なもの（subtle）であり、最終的に得られたフレーバーにおいて、多くの場合重要な役割を果たす副反応を有する。酵素の選択は生成されたフレーバーの特性、並びに種々の食品マトリクス及び条件で、一次作用が類似する酵素との生成の効率にも影響し得る。
【０００７】
国際公開第２００８／１４８７３７号は、改良されたフレーバーを有する焼成された食料品を記載しており、それはフレーバー前駆体（アミノ酸及び還元糖）を直接原材料に添加し、次いで焼成して焼成された食料品を形成することにより得られる。このようなアプローチにより、焼成期間が短い場合であっても、アロマ分子（aroma molecules）を形成することが可能となる。
【０００８】
上記の本発明により提供される利点に関わらず、焼成された食料品におけるフレーバーを生成することは、それでもいくつかの不利益がある。
【０００９】
加熱時にアロマを生成するため、外部材料由来のフレーバー前駆体を使用することにより、消費者になじみがないか、又はその種の食品に期待されない可能性がある成分が食品に添加される。例えば、フレーバー前駆体は、消費者が彼ら自身で食品を調理する場合に使用する成分でなくてもよい。多くの消費者は、外部材料からのフレーバー前駆体を添加するよりも、食品製品中の成分として使用することができる原料から直接のフレーバーの生成を高く評価する。このような原料は、理想的に良い消費者の許容性（acceptance）があるほうがよい。
【００１０】
従って、焼成された食料品の調製のプロセス中に、レシピの成分として役立つ可能性がある原料から直接、このようなフレーバーを生成することは、好都合である。
【００１１】
フレーバー前駆体を一般的な原料の加工中に生成する場合、魅力的なロースト又は焼成されたフレーバーをもたらすフレーバー前駆体の選択的生成を増加させることが望ましく、プロリンなどの遊離アミノ酸の選択的生成を増加させることが望ましい。目的のフレーバー前駆体の効率的な生成により、より速いフレーバー生成プロセス、より強力なフレーバー生成が可能となり、非目的前駆体の生成から望ましくないフレーバーの生成を回避する。また、フレーバー前駆体を生成する既知の酵素に選択肢を提供し、種々のフレーバーノート（flavour notes）を形成し、製品（products）のための新しいフレーバープロファイルを作成することを可能にするのに有利である。このようなフレーバープロファイルは商標のついた食品製品と関連する場合、それは「シグネチャーフレーバー（signature flavour）」として時々記載される。更には、フレーバーにおける微妙な差異は、製品の出来具合に重要である可能性がある。
【００１２】
酵素を使用して、例えば食品調製プロセス中に原料の変換を行う場合、これらの酵素及びそれらが添加された形態は、良い消費者の許容性（acceptability）があるほうが望ましい。良い消費者の許容性を有する微生物に由来の酵素、例えば、食品での長い使用歴がある微生物を用いることが好ましい。多数の消費者は、それらの食品の製造に関連する遺伝子改変微生物を有することを望まないため、遺伝子改変微生物を用いることなく、フレーバー前駆体の生成を達成することは有利である。
【００１３】
本明細書における先行技術文献のいかなる参照も、かかる先行技術が周知であるか、又は当分野で共通の一般的な認識の一部を形成していると認めるものとはみなされるべきではない。本明細書中で使用される場合、「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」という語、及び同様の語は、排他的又は網羅的な意味で解釈されるべきではない。換言すれば、これらは「含むが、これらに限定されない」ことを意味することを目的としている。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の課題は、技術水準を高め、上記の不便さを少なくともある程度克服する解決策を提供すること、あるいは少なくとも有効な代替案を提供することである。本発明の目的は、独立請求項の主題によって達成される。従属請求項は、本発明の着想を更に展開するものである。
【００１５】
従って、本発明は、第１の態様において、（ａ）ペプチド含有食用物質をプロリダーゼと接触させ、加水分解調製物を形成するステップであって、プロリダーゼが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むステップと、（ｂ）ステップ（ａ）から得ることができる加水分解調製物を、少なくとも１つの還元糖を含む食品調製物に組み込むステップか、又は、加水分解調製物が既に少なくとも１つの還元糖を含む場合、加水分解調製物が食品調製物であり得るステップと、（ｃ）食品調製物に熱処理を施し、熱処理された食品製品を得るステップとを含む、フレーバー生成のための方法を提供する。
【００１６】
第２の態様においては、本発明は、ペプチド含有食用物質とプロリダーゼとの接触により得ることができ、プロリダーゼが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、加水分解調製物に関する。
【００１７】
本発明の第３の態様は、プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼ、遊離アミノ酸としてのプロリン及び遊離アミノ酸としてのオルニチンを含み、プロリダーゼが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、遊離アミノ酸としてロイシンが存在する場合、遊離アミノ酸としてのロイシンに対するプロリンのモル比は２．５より大きく、遊離アミノ酸としてのロイシンに対するオルニチンのモル比は１より大きい、食品調製物に関する。
【００１８】
更に、本発明の更なる態様は、本発明の方法により得ることができる熱処理された食品製品及び、熱処理された食品製品のフレーバーを改良するための、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むプロリダーゼの使用である。
【００１９】
驚くべきことに、本発明者らにより、特に良好に焼成されたフレーバーが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むプロリダーゼを使用し、ペプチド含有食用物質を加水分解し、次いで還元糖と組み合わせて、加熱するステップにより得ることができることが見いだされた。特に、プロリンを非常に効率的な方法で、プロリルエンドペプチダーゼを、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むプロリダーゼと組み合わせることにより、選択的に食品タンパク質及び食品ポリペプチドから遊離させることができる。還元糖を含む食品調製物において、得られた混合物が加熱により更に処理される場合、焼成された及び焼いたノートを有する魅力的なフレーバーが生成される。驚くべきことに、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むプロリダーゼの使用により、特に魅力的なフレーバープロファイルがもたらす。驚くべきことに、プロリルエンドペプチダーゼとプロリダーゼＣＰＤ−Ｙとの組み合わせと比較して、プロリン生成に対するより高い特異性が観察された。
【００２０】
本発明による方法は、熱処理された食品製品において、プロセス中にフレーバー前駆体としてアミノ酸を添加する必要がなく、フレーバーノートを加える利点を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】未反応の小麦グルテン（ブランク）、プロリルエンドペプチダーゼ及びＫ．ラクチス（K. lactis）プロリダーゼと反応した小麦グルテン（Ｂ）並びにプロリルエンドペプチダーゼ単独と反応した小麦グルテン（Ａ）における遊離アミノ酸量（μＭ）のプロットである。アミノ酸は、アラニン（ａｌａ）、アルギニン（ａｒｇ）、アスパラギン（ａｓｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ）、グルタミン（ｇｌｎ）、グルタミン酸（ｇｌｕ）、グリシン（ｇｌｙ）、ヒスチジン（ｈｉｓ）、イソロイシン（ｉｌｅ）、ロイシン（ｌｅｕ）、リジン（ｌｙｓ）、メチオニン（ｍｅｔ）、オルニチン（ｏｒｎ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ）、プロリン（ｐｒｏ）、セリン（ｓｅｒ）、スレオニン（ｔｈｒ）、トリプトファン（ｔｒｐ）、チロシン（ｔｙｒ）、バリン（ｖａｌ）である。
【図２】プロリルエンドペプチダーゼ及びＣＰＤ−Ｙプロリダーゼでインキュベートされた（Ｃ）又はプロリルエンドペプチダーゼ及びＫ．ラクチス（K. lactis）プロリダーゼでインキュベートされた（Ｄ）小麦グルテンの遊離アミノ酸モル分率のプロットである。
【図３】実施例３に記載の実験の結果としての、カゼインペプトン培養液におけるＫ．ラクチス（K. lactis）の発酵の間に経時的な（ｈ）グルコースの消費量（ｍＭ）を示す。
【図４】実施例３に記載の実験の結果としての、カゼインペプトン培養液における発酵時間（ｈ）に対する、Ｋ．ラクチス（K. lactis）細胞の生存率（ｃｆｕ／ｍＬ）を示す。
【図５】実施例３に記載の実験の結果としての、カゼインペプトン培養液におけるＫ．ラクチス（K. lactis）の発酵の間に選択された遊離アミノ酸の放出［ｍＭ濃度］を示す。
【図６】実施例３に記載の実験の結果としての、グルコースの欠乏の６日後に得られる遊離アミノ酸濃度［ｍＭ］を示すグラフであり、Ｅ（黒塗りのバー）はＫ．ラクチス（K. lactis）発酵に由来し、Ｆ（白抜きのバー）はＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）に由来する。アミノ酸は、アラニン（ａｌａ）、アルギニン（ａｒｇ）、アスパラギン（ａｓｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ）、シトルリン（ｃｉｔ）、グルタミン（ｇｌｎ）、グルタミン酸（ｇｌｕ）、グリシン（ｇｌｙ）、ヒスチジン（ｈｉｓ）、イソロイシン（ｉｌｅ）、ロイシン（ｌｅｕ）、リジン（ｌｙｓ）、メチオニン（ｍｅｔ）、オルニチン（ｏｒｎ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ）、プロリン（ｐｒｏ）、セリン（ｓｅｒ）、スレオニン（ｔｈｒ）、トリプトファン（ｔｒｐ）、チロシン（ｔｙｒ）、バリン（ｖａｌ）である。
【図７】実施例４に記載の実験の結果としての、Ｋ．ラクチス（K. lactis）（種々の菌株）及び他の酵母群種の長期培養におけるプロリンの放出を示すグラフを示す。
【図８】コーティングされた（enrobed）ウエハースの官能評価プロファイル（基準−暗灰色線；バターに発酵カゼインペプトンを組み込んで調製−黒線；バターにＰｅｐｔｏＰｒｏ組み込んだ−淡灰色線）を示す。ウエハースは実施例６に記載の実験に従い調製した。矢印は、ビスケットフレーバーの最小信用度（confidence minimum）９５％における有意差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
これにより、本発明は、ａ）ペプチド含有食用物質をプロリダーゼと接触させ、加水分解調製物を形成するステップであって、プロリダーゼが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むステップと、ｂ）ステップ（ａ）から得ることができる加水分解調製物を、少なくとも１つの還元糖を含む食品調製物に組み込むステップか、又は、加水分解調製物が既に少なくとも１つの還元糖を含む場合、加水分解調製物が食品調製物であり得るステップと、ｃ）食品調製物に熱処理を施し、熱処理された食品製品を得るステップとを含む、フレーバー生成のための方法に部分的（例えば、熱処理された食品製品において）に関する。
【００２３】
本発明で使用される用語「フレーバー」は、風味（taste）及びアロマの組み合わせを指す。風味は口内で知覚されるフレーバーの感覚を指し、アロマは鼻内での知覚を指す。化学的に、「フレーバー」は１つ以上の風味活性分子（taste active molecules）、１つ以上のアロマ分子、又はこれらの組み合わせであり得る。いくつかの風味活性分子はまた、アロマ分子である。
【００２４】
本発明の文脈において、用語「熱処理された食品製品」は、熱処理に供された食品製品を特定する。食品製品は、食品としての使用に使用又は調製されることができる物質である。熱処理技術の非限定例は、オーブン焼成（oven baking）、ローラ乾燥、押出成形、噴霧乾燥である。本発明による熱処理された食品製品の非限定例は、ビスケット、ウエハース、シリアル（朝食又は幼児）、パン、アイスクリームコーン、乳粉末、非乳飲料クリーム（non-dairy beverage creamers）、ピザ等である。
【００２５】
本発明の文脈において使用される用語「食用」は、安全に食することができる物質を意味する。本発明は任意の特定の管轄内で摂取が許可されている物質に限定されないが、食用組成物は例えば、米国食品医薬品局によってヒトの摂取が承認される材料を含んでもよい。
【００２６】
本発明によるペプチド含有物質は、ポリペプチドを含み得る。本発明によるペプチド含有物質は、プロリンを含み得る。ペプチド含有物質は、タンパク質を含み得る。タンパク質は、生物学的に機能的な方法で配置された１つ以上のポリペプチドからなる。本発明によるペプチド含有物質は、小麦フラワー又は乳などのタンパク質含有食品原材料であり得る。好ましくは、ペプチド含有物質は１０を超えるアミノ酸を有するポリペプチドを含む。ペプチド含有物質はペプトン、ポリペプチドの水溶性混合物及びタンパク質の部分的な加水分解により形成されるアミノ酸であってもよい。
【００２７】
プロリダーゼは、アミノ酸とプロリン又はヒドロキシプロリンとのペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である。本発明の文脈において、プロリダーゼはプロリンジペプチダーゼであり得るが、末端アミノ酸としてプロリンを有するトリペプチド又はテトラペプチドなどのより大きなペプチドのペプチド結合の加水分解を触媒もし得る。
【００２８】
プロリダーゼは、配列番号１と少なくとも９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。例えば、プロリダーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し得る。
【００２９】
ＭＬＡＲＶＦＰＫＲＳＳＦＡＡＮＨＴＩＫＴＴＶＴＶＫＴＲＲＳＳＲＦＹＳＫＬＳＩＤＮＮＮＬＲＫＩＫＭＳＳＳＶＡＥＫＮＦＥＳＬＦＱＫＩＤＥＬＫＰＲＦＩＥＲＬＡＫＡＩＥＩＰＡＶＳＧＤＥＴＬＲＰＱＶＩＫＫＡＨＹＬＡＧＥＬＫＫＬＧＦＳＤＩＱＭＫＥＬＧＴＱＰＰＰＶＡＤＰＮＬＱＬＰＰＶＩＬＡＲＹＧＮＤＰＤＫＫＴＶＬＶＹＧＨＹＤＶＱＰＡＳＬＥＤＧＷＮＴＤＰＦＫＬＶＶＮＥＥＫＱＩＭＹＧＲＧＶＳＤＤＳＧＰＶＫＧＷＬＮＶＶＥＡＨＲＥＬＧＬＤＬＰＶＮＬＩＴＣＬＥＧＭＥＥＳＧＳＩＧＬＤＫＬＩＡＥＥＡＥＧＹＦＲＴＶＤＴＶＣＩＳＤＮＹＷＬＧＴＱＫＰＶＬＴＹＧＬＲＧＣＮＹＹＱＩＩＩＥＧＰＧＡＤＬＨＳＧＩＦＧＧＳＩＳＥＰＭＩＤＬＶＱＶＭＳＴＬＶＤＴＫＧＮＩＬＩＤＧＩＫＥＭＶＡＰＶＬＥＴＥＤＡＬＹＤＫＩＤＹＳＶＤＥＦＮＡＡＳＧＳＫＴＡＬＹＤＮＫＫＤＩＬＭＨＲＷＲＹＰＳＬＳＩＨＧＶＥＧＡＦＨＧＳＧＡＫＴＶＩＰＳＫＶＩＧＫＦＳＩＲＴＶＰＮＩＥＳＡＫＬＤＱＦＶＩＤＨＣＮＫＡＦＡＫＬＱＳＰＮＫＦＫＡＥＬＩＨＤＧＮＹＷＶＳＤＰＦＮＡＳＦＳＡＡＡＫＡＴＫＶＶＷＧＶＥＰＤＦＴＲＥＧＧＳＩＰＩＴＬＴＦＥＱＥＬＫＳＮＶＬＬＬＰＭＧＲＧＤＤＧＡＨＳＩＮＥＫＬＤＬＳＮＹＦＧＧＭＫＴＭＡＡＹＬＨＹＹＡＡＳＥＥＫ（配列番号１）
【００３０】
本発明の文脈において、用語「加水分解調製物」は、ペプチド含有食用物質に基づく組成物を特定し、存在する酵素のペプチド含有食用物質でのタンパク質分解作用により生成される任意の物質を含む。例えば微生物の活性により、酵素がｉｎ−ｓｉｔｕで生成される場合、次いで加水分解調製物は微生物及び／又はそれらの残留物を含み得る。本発明の文脈において、用語「微生物」は、細菌、糸状菌又は酵母である単細胞生物を特定する。本発明による加水分解調製物は、遊離アミノ酸としてプロリンを含み得る。
【００３１】
本発明の文脈において、用語「食品調製物」は、熱処理に供される場合、「熱処理された食品製品」となることを意味する原材料の混合物を特定する。「食品調製物」の非限定例は、バッター、ドウ、穀類及び乳粉末を含む混合物、乳粉末及びフラワーを含む混合物である。本発明の文脈において、用語「ドウ」又は「バッター」は、種々の比率における穀物フラワー及び水に主に基づく上記の食品原材料混合物を特定する。このようなドウ又はバッターは、例えば油脂、食塩、砂糖、卵、乳などの追加の原材料も含み得る。
【００３２】
本発明の文脈において、用語「還元糖」は、アルデヒド基を有するか、又は異性化により溶液中に１つの還元糖を形成することができる任意の糖を特定し、そのようなアルデヒド基は、糖が還元剤として作用することを可能にする。本発明の還元糖は、例えば単糖〜四糖の単糖又はオリゴ糖であり得る。還元糖は、Ｃ５及びＣ６単糖類からなる群から選択され得る。還元糖は、フルクトース、グルコース、キシロース、タガトース、ラムノース、マルトース、ラクトース、フコース、アラビノース、ガラクトース及びこれらの混合物からなる群から選択され得る。還元糖は、フルクトース、グルコース又はラムノースからなる群より選択され得る。還元糖はラムノースであり得る。
【００３３】
本発明の方法によるプロリダーゼは、クルイベロマイセス・ラクチス（Klyveromyces lactis）から得ることができる（例えば、得られた）。酵母は、その使用歴が長いため、食品加工において、良い消費者の許容性がある。本発明の方法によるプロリダーゼは、例えば、クルイベロマイセス・ラクチス（Klyveromyces lactis）の溶解された細胞を含む酵母調製物である酵母調製物の範囲内に含まれ得る。本発明の方法によるプロリダーゼは、クルイベロマイセス・ラクチス（Klyveromyces lactis）ＣＢＳ  ２６２１又はＣＢＳ  １４１から得ることができる（例えば、得られた）。これらの酵母株の両方は、ＣＢＳ−ＫＮＡＷ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から公的に入手可能である。このプロリダーゼは、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｑ６ＣＹＥ６を有するクルイベロマイセス・ラクチス（Klyveromyces lactis）由来のプロリダーゼであり得る。この酵素は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。
【００３４】
本発明の方法によるプロリダーゼは、クルイベロマイセス・ラクチス（Klyveromyces lactis）の自己分解により得ることができる（例えば、得られた）。クルイベロマイセス・ラクチス（Klyveromyces lactis）細胞の自己分解は、栄養（例えば、糖）の欠乏により増殖相が終了した際に開始する。この自己分解により酵素が放出される。食品製品の場合には、純酵素よりも食品製造プロセスに酵母を導入することが有用であり得る。自己分解を受ける酵母を含むことは、加水分解調製物において、プロリダーゼが自発的に加えられ、培養液への外部介入を何も必要とせずにアミノ酸フレーバー前駆体が生成されるという操作上の利点を示す。従って、このような加水分解調製物は、その標準的な更なる加工のために、食品調製物（例えば、バッターまたはドウ）中に簡単に組み込まれることができる。更に、熱処理された食品製品の構造がフレーバー活性分子が生成されるのと同時に形成するにつれて、フレーバー活性分子は食品マトリクス内に捕捉され、所望のノートは最終的な食料品において強くなる。
【００３５】
本発明の文脈において、用語「自己分解」は、微生物細胞が破壊し、微生物の細胞内内容物が増殖培養液内に放出される自発的プロセスを特定する。
【００３６】
本発明の方法によるプロリダーゼは、好適な条件下でタンパク質含有培養液においてクルイベロマイセス・ラクチス（Klyveromyces lactis）細胞を増殖することによって得られ、培養液から栄養の欠乏によるクルイベロマイセス・ラクチス（Klyveromyces lactis）細胞の自己分解を可能とする。タンパク質含有培養液の全ての成分が食品等級である場合、培養液及び溶解されたクルイベロマイセス・ラクチス（Klyveromyces lactis）細胞は本発明の方法の加水分解調製物内に組み込まれてもよい。実際に、クルイベロマイセス・ラクチス（Klyveromyces lactis）の自己分解によるプロリダーゼの遊離は、いわゆる酵素生成の「インプロセス（in-process）」である、直接的に食品製品製造プロセスの一部であり得る。
【００３７】
本発明の文脈において、用語、微生物の増殖に「好適な条件」は、特定の微生物の増殖を可能にするのに適切である温度及び雰囲気の条件を特定する。本発明の文脈において、用語「タンパク質含有培養液」は、微量栄養素、窒素源及び炭素源を含む、微生物に対する増殖培養液を特定する。上記の窒素源が既に提供されない場合、培養液はタンパク質、ペプチド又はタンパク質加水分解物などのアミノ酸源（sources of amino acids）も組み込む。
【００３８】
フレーバー生成のための方法は、ａ）好適な条件下で、タンパク質含有培養液において、培養液から栄養の欠乏後７日以内に自己分解する微生物（例えば、クルイベロマイセス・ラクチス（Klyveromyces lactis））を増殖するステップと、ｂ）ステップａ）から得ることができる微生物含有増殖培養液を、当該好適な条件下で栄養の欠乏後最大１０日までにわたる期間を保持するステップと、ｃ）ステップｂ）から得ることができる発酵調製物を、少なくとも１つの還元糖を含む食品調製物に組み込むステップと、ｄ）食品調製物に熱処理を施し、熱処理された食品製品を得るステップとを含んでもよい。
【００３９】
本発明の方法の一実施形態において、ペプチド含有食用物質を、プロリダーゼに加えてプロリルエンドペプチダーゼに接触させる。例えば、ペプチド含有食用物質を、プロリダーゼと接触させる前、又は同時にプロリルエンドペプチダーゼに接触させてもよい。プロリルエンドペプチダーゼは、カルボキシル末端プロリン残基を有するペプチド鎖を産生するプロリン特異的エンドプロテアーゼであり得る。プロリルエンドペプチダーゼは、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼであり得て、例えば、プロリルエンドペプチダーゼは、ＤＳＮのＭａｘｉｐｒｏ  ＰＳＰ又はＭａｘｉｐｒｏ  ＸＦであり得る。
【００４０】
一実施形態において、本発明の方法は、複数の遊離アミノ酸の混合物を含む加水分解調製物を生成する。例えば、本発明により生成された複数の遊離アミノ酸の混合物は、プロリン、リジン、アラニン、グルタミン、バリン、アルギニン、フェニルアラニン及びオルニチンを含み得る。本発明による加水分解調製物中に生成された複数の遊離アミノ酸の混合物は、プロリン、リジン、グルタミン、フェニルアラニン及びオルニチンを含み得る。本発明により生成された遊離アミノ酸の混合物はプロリン、リジン、グルタミン及びフェニルアラニンを含み、プロリンはそのような混合物中の最もモル分率の高い遊離アミノ酸である。実施形態において、本発明による加水分解調製物中に生成された遊離アミノ酸の混合物に、アスパラギンが実質的に存在し得ない。一実施形態において、本発明による加水分解調製物中に生成された遊離アミノ酸の混合物は、プロリン、リジン、グルタミン及びフェニルアラニンがそれぞれ１ｍＭを超える（例えば、それぞれ２ｍＭを超える）濃度で存在する遊離アミノ酸の混合物を含み得る。本発明による加水分解調製物中に生成された遊離アミノ酸の混合物は、プロリンが５ｍＭを超える濃度で存在する遊離アミノ酸の混合物を含み得る。
【００４１】
本発明の方法による食品調製物は、フラワーを含み得る。一実施形態において、本発明の方法による食品調製物における個々の遊離アミノ酸の量は、フラワーの１００部に基づき、０．００１〜１重量部の範囲内であり得る。例えば、本発明の方法による食品調製物における遊離アミノ酸の量は、フラワーの１００部に基づき、０．００５〜０．１重量部の範囲内であり得る。本発明の方法による食品調製物における遊離アミノ酸の量は、フラワーの重量に基づき、０．０５〜０．１重量部の範囲内であり得る。
【００４２】
実施形態において、用語「熱処理された食品製品」はドウ又はバッター基準製品を特定する。当該バッター又はドウは、フラワー１００部、水５〜２００部、食塩０．１〜５部、油脂０．１〜１００部、卵０〜１００部、砂糖０〜１００部を含み得る。
【００４３】
例えば、当該バッター又はドウは、フラワー１００部、水１００〜１８０部、食塩０〜５部、油脂０．５〜２部、砂糖０〜５部を含み得る。
【００４４】
特に純酵素を使用する場合、本発明の方法による加水分解調製物は少なくとも１つの還元糖を含み得、食品調製物であり得る。例えば、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むプロリルエンドペプチダーゼ及びプロリダーゼは、上記の還元糖を含むバッター組成物に直接添加され得る。微生物からｉｎ−ｓｉｔｕで生成された酵素を使用する場合、主原料とは別に加水分解調製物を生成することが好ましい。実施形態において、本発明による加水分解調製物は、乾燥重量で、フラワー１００部に基づき、０．０５〜５部の量で食品調製物に組み込まれ得る。例えば、本発明による加水分解調製物は、乾燥重量で、フラワー１００部に基づき、０．１〜３部の量で食品調製物に組み込まれてもよい。
【００４５】
本発明の方法による加水分解調製物が、食品調製物の０．０１〜５重量部の量で食品調製物に組み込まれてもよい。このようなレベル（level）は、還元糖の存在下での良好なフレーバー生成に適切である。
【００４６】
一実施形態において、本発明の方法は、ビスケット、バター様、フルーツ様、ナッツ様、カラメル、ゴールデンシロップ、蜂蜜、焼いた、ローストされたパン様及び焼成されたフレーバー特性の少なくとも１つを含む熱処理された食品製品を提供する。例えば、本発明の方法は、ビスケットフレーバーを含む熱処理された食品製品を提供し得る。一実施形態において、本発明の方法は、穀物フラワー（例えば、小麦フラワー）を含む熱処理された食品製品を提供する。
【００４７】
本発明の方法による熱処理された食品製品が、ビスケット、押出成形シリアル（例えば、朝食シリアル）、ピザ（例えばピザベース（pizza base））、飲料粉末及びカラメルからなる群から選択され得る。
【００４８】
ビスケットは、ウエハースであってもよい。ウエハースは、ウエハースのバッターから製造され、パリパリ感、脆性（brittle）及び破砕性（fragile）が調和した焼成された製品である。ウエハースは薄型であり、全体的な厚さは通常＜１〜４ｍｍであり、典型的には製品密度は０．１〜０．３ｇ／ｃｍ３の範囲である。表面は、その間でウエハースが焼成されるプレートの表面形状に従って正確に形成される。ウエハースは、多くの場合、片面又は両面にパターンを有する。ウエハースは押出成形により生成されてもよい。基本となる２種のウエハースが、Ｋ．Ｆ．Ｔｉｅｆｅｎｂａｃｈｅｒにより、「Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｐ４１７〜４２０−Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ  Ｌｏｎｄｏｎ−１９９３」に記載されている。
【００４９】
１）無糖又は低糖のウエハース。完成したビスケットは、ゼロ〜低含有率のスクロース又は他の糖類を含む。典型的な製品は、平坦で中空のウエハースシート、成形されたコーン又は装飾形状である。
【００５０】
２）糖の多いウエハース。１０％を超えるスクロース又は他の糖類は、焼き立てのシートの可塑性の原因となる。糖の再晶出が起こる前に、それらが異なる形状に成形されうる。典型的な製品は、成形して巻いたシュガーコーン、巻いたウエハーススティック及び、深絞り形成された（deep-formed）装飾形状である。
【００５１】
飲料粉末は、熱処理された乳粉末、ココア若しくは麦芽飲料粉末又はコーヒーと共に使用するための乳製品若しくは非乳クリーマーなどの飲料クリーマーであり得る。
【００５２】
本発明の文脈において、カラメルは、種々の砂糖類を加熱する（例えば、水での砂糖シロップのように）ことにより製造される菓子製品である。脱脂粉乳又はコンデンスミルクなどの乳成分は、典型的には砂糖シロップと共に加熱される。カラメルは液体であってもよく、ある程度糖結晶化し、固体を形成してもよい。それは典型的に色は茶色であり、チョコレート菓子製品におけるフィリングとして見受けられることが多い。
【００５３】
本発明の方法によるペプチド含有食用物質は、フラワー（例えば小麦フラワー）、乳及び、これら、例えば、グルテン（小麦フラワーの成分）又はカゼイン（乳の成分）のペプチド含有組成物からなる群から選択され得る。本発明の方法によるペプチド含有食用物質は、カゼイン加水分解物などのタンパク質加水分解物であり得る。
【００５４】
本発明の方法の実施形態においては、ペプチド含有食用物質、プロリルエンドペプチダーゼ及びプロリダーゼを、水性分散液において、３０〜６０℃、例えば４５〜５５℃の温度で接触させてもよい。ペプチド含有食用物質、プロリルエンドペプチダーゼ及びプロリダーゼを、水性分散液において、ｐＨ５．０〜８．５で接触させてもよい。
【００５５】
本発明の方法の実施形態において、ペプチド含有食用物質を、プロリルエンドペプチダーゼ及びプロリダーゼに、経時的に又は同時に接触させてもよい。ペプチド含有食用物質を、プロリルエンドペプチダーゼ及びプロリダーゼに、経時的に接触させる実施形態において、次いでペプチド含有食用物質をプロリダーゼと接触させる前にプロリルエンドペプチダーゼと接触させてもよい。水性分散液中でペプチド含有食用物質をプロリルエンドペプチダーゼと接触させるのに最適な温度は、選択された正確なプロリルエンドペプチダーゼに依存するであろう。本発明の方法において、水性分散液中で４５〜５５℃の温度で、ペプチド含有食用物質をプロリダーゼと接触させてもよい。水性分散液中でｐＨ６．３〜８．２で、ペプチド含有食用物質をプロリダーゼと接触させてもよい。
【００５６】
本発明の方法による熱処理の間、食品調製物を６０〜３００℃に加熱してもよい。熱処理は、低温殺菌、滅菌、オーブン焼成、ローラ乾燥、及び押出成形からなる群から選択され得る。噴霧乾燥中に熱処理を施してもよい。
【００５７】
第２の態様においては、本発明は、ペプチド含有食用物質とプロリダーゼとの接触により得ることができ、プロリダーゼが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、加水分解調製物を提供する。加水分解調製物が、ペプチド含有食用物質とプロリルエンドペプチダーゼ及びプロリダーゼとの接触により得ることができ、プロリダーゼが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、プロリルエンドペプチダーゼを、プロリダーゼの前、又は同時にペプチド含有食用物質と接触させてもよい。遊離アミノ酸としてのプロリンのモル分率は、ペプチド含有食用物質が完全に遊離アミノ酸に加水分解されていることを除いて同様の組成を有する加水分解調製物より、少なくとも２倍高くあり得る。
【００５８】
本発明は、本発明の第２の態様による加水分解調製物を組み込んだ食品調製物を提供してもよい。更なる態様において、本発明は、プロリルエンドペプチダーゼ、プロリダーゼ、遊離アミノ酸としてのプロリン及び遊離アミノ酸としてのオルニチンを含み、プロリダーゼが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、遊離アミノ酸としてロイシンが存在する場合、遊離アミノ酸としてのロイシンに対するプロリンのモル比は２．５より大きく、遊離アミノ酸としてのロイシンに対するオルニチンのモル比は１より大きい、食品調製物を提供する。ロイシンは、菓子ウエハースなどの多くの焼成された成品に望ましくないチーズ様フレーバーの原因となる。プロリルエンドペプチダーゼは、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼであり得、例えば、プロリルエンドペプチダーゼは、ＤＳＮからのＭａｘｉｐｒｏ  ＰＳＰ又はＭａｘｉｐｒｏ  ＸＦであり得る。本発明は、このような食品調製物を加熱することにより得ることができる熱処理された食品製品を提供し得る。
【００５９】
なお更なる態様において、本発明は、
ａ）ペプチド含有食用物質をプロリダーゼと接触させ、加水分解調製物を形成するステップであって、プロリダーゼが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むステップと、ｂ）ステップ（ａ）から得ることができる加水分解調製物を、少なくとも１つの還元糖を含む食品調製物に組み込むステップか、又は、加水分解調製物が既に少なくとも１つの還元糖を含む場合、加水分解調製物が食品調製物であり得るステップと、ｃ）食品調製物に熱処理を施し、熱処理された食品製品を得るステップとを含む、方法により得られる熱処理された食品製品を提供する。熱処理された食品製品は、ａ）ペプチド含有食用物質をプロリルエンドペプチダーゼ及びプロリダーゼと接触させ、加水分解調製物を形成するステップであって、プロリダーゼが、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むステップと、ｂ）ステップ（ａ）から得ることができる加水分解調製物を、少なくとも１つの還元糖を含む食品調製物に組み込むステップか、又は、加水分解調製物が既に少なくとも１つの還元糖を含む場合、加水分解調製物が食品調製物であり得るステップと、ｃ）食品調製物に熱処理を施し、熱処理された食品製品を得るステップとを含む、方法により得られ得る。
【００６０】
なお更なる態様において、本発明は、熱処理された食品製品のフレーバーを改善するために、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むプロリダーゼの使用を提供する。プロリダーゼはプロリルエンドペプチダーゼと組み合わせて使用してもよく。例えば、プロリダーゼを、プロリルエンドペプチダーゼの後又は同時に使用してもよい。
【００６１】
当業者であれば、本明細者に開示される本発明の全ての特徴を自由に組み合わせることができることを理解するであろう。特に、本発明の方法のために記載された特徴を本発明の製品と組み合わせてよく、逆もまた同様であってよい。更に、本発明の異なる実施形態について記載された特徴を組み合わせてもよい。周知の同等物が特定の特徴について存在する場合、このような同等物は、本明細書で具体的に言及されているのと同様に組み込まれる。
【００６２】
本発明の更なる利点及び特徴は、図及び非限定例から明らかである。
【実施例】
【００６３】
実施例１：プロリルエンドペプチダーゼ及びクルイベロマイセス・ラクチス（Klyveromyces lactis）プロリダーゼを有するアミノ酸の生成。
配列番号１を有するクルイベロマイセス・ラクチス（Klyveromyces lactis）由来のプロリダーゼ酵素を発現させた（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  Ｌｔｄ．ＵＫ）。小麦グルテンの１０％  ｗ／ｖ懸濁液を、１０分間、５０℃で、ｐＨ５．５で０．４％ｖｓ  ｐｒｏｔ．のプロリルエンドペプチダーゼ（ＤＳＮのＭａｘｉｐｒｏ  ＸＦ）でインキュベートした。次いでｐＨを７．２まで上昇させ、１．０％ｐｒｏｔ．ｖｓ  ｐｒｏｔ．のＫ．ラクチス（K. lactis）由来のプロリダーゼを添加し、混合物を再度２４時間５０℃でインキュベートした。比較のため、プロリルエンドペプチダーゼを用いるだけでなく、同一のｐＨ及びインキュベーション条件下で小麦グルテンを処理した。
【００６４】
アミノ酸の決定は、Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ  １００−３  ＨＩＬＩＣカラムを用いて行った。両方とも０．５％の酢酸を含む、アセト二トリル中で水の勾配を用いてアミノ酸を溶出した。検出はトリプル四重極（ＱＱＱ）質量分析計を用いて行った。種々の希釈度の標準溶液を用いて、濃度の関数として、各アミノ酸のピーク面積と対応する重水素化アミノ酸のピーク面積との比の直線回帰を測定した。得られたアミノ酸の量は、図１中にプロットされ、未反応の小麦グルテンも示される（ブランク）。小麦グルテンとＫ．ラクチス（K. lactis）由来のプロリルエンドペプチダーゼ及びプロリダーゼとの接触（Ｂ）は、プロリルエンドペプチダーゼ単独で用いる（Ａ）よりも、大きいプロリンの収率をもたらすことが見られることもある。
【００６５】
実施例２：プロリルエンドペプチダーゼ／カルボキシペプチダーゼＣＰＤ−Ｙでの比較。
プロリルエンドペプチダーゼ／Ｋ．ラクチス（K. lactis）プロリダーゼの組み合わせを、国際公開第２００５／１１７５９５号で提案された組み合わせである、プロリルエンドペプチダーゼ／カルボキシペプチダーゼＣＰＤ−Ｙを用いて、比較した。まず、小麦フラワーの４９％  ｗ／ｖ懸濁液（小麦グルテンの１０％  ｗ／ｖ懸濁液に対応）を、２時間５０℃で、ｐＨ５．０で０．４％ｖｓ  ｐｒｏｔ．のプロリルエンドペプチダーゼ（Ｍａｘｉｐｒｏ  ＸＦ）及び０．１％ｐｒｏｔ．ｖｓ  ｐｒｏｔ．のカルボキシペプチダーゼＣＰＤ−Ｙ（Ｓｉｇｍａ）又は実施例１のようなＫ．ラクチス（K. lactis）由来のプロリダーゼのいずれかでインキュベートした。カルボキシペプチダーゼＣＰＤ−Ｙの活性は、Ｋ．ラクチス（K. lactis）由来のプロリダーゼと同様でない（カルボキシペプチダーゼＣＰＤ−Ｙは全体的に活性が高い）ことが見られ、酵素の選択性を評価するため、類似する変換率の範囲で更なる実験を行い、減少したＣＤＰ−Ｙの量をＫ．ラクチス（K. lactis）由来のプロリダーゼと比較した。
【００６６】
小麦グルテンの１０％  ｗ／ｖ懸濁液を、１．０％ｐｒｏｔ．ｖｓ  ｐｒｏｔ．のＫ．ラクチス（K. lactis）由来のプロリダーゼ又は０．１％ｐｒｏｔ．ｖｓ  ｐｒｏｔ．のＣＰＤ−Ｙのいずれかで加水分解する前に、１０分間５０℃で、ｐＨ５．５で０．４％ｖｓ  ｐｒｏｔ．のプロリン特異性エンドペプチダーゼ（Ｍａｘｉｐｒｏ  ＸＦ）でインキュベートした。ｐＨを７．２に上昇させ、混合物を約２４時間５０℃でインキュベートした。生成された遊離アミノ酸を、図２に示す。アミノ酸の量はモル分率として与えられる。モル分率は、酵素加水分解後に存在する全ての遊離アミノ酸の合計に対する１つの個々のアミノ酸の比率を示す。酵素の選択性を例示することは簡単な方法である。Ｋ．ラクチス（K. lactis）由来のプロリダーゼ（Ｄ）は、ＣＰＤ−Ｙよりもはるかに多いプロリン及びオルニチン生成への特異性を有することが見られることもある。これは、プロリン及びオルニチンの両方がメイラード反応で魅力的な焼成されたフレーバーを生成するので、有益である。加えて、Ｋ．ラクチス（K. lactis）由来のプロリダーゼは、ＣＰＤ−Ｙよりもロイシンの生成が少ない。ロイシンは、菓子ウエハースなどの多くの焼成された成品において望ましくないチーズ様フレーバーの原因となる。ロイシンに対するプロリンの割合は、ＣＤＰ−Ｙでは１．９であったが、Ｋ．ラクチス（K. lactis）プロリダーゼでは４．３であった。ロイシンに対するオルニチンの割合は、ＣＤＰ−Ｙでは０．６であったが、Ｋ．ラクチス（K. lactis）プロリダーゼでは１．７であった。
【００６７】
実施例３：クルイベロマイセス・ラクチス（Klyveromyces lactis）の自己分解。
水１リットルあたり酵母エキス１０ｇ、カゼインペプトン２０ｇ及びデキストロース２０ｇを溶解させて、カゼインペプトン（ＣＰ）培養液を調製した。溶液はｐＨ約６．５であり、０．２μｍフィルタを通して更に滅菌した。クルイベロマイセス・ラクチス（Klyveromyces lactis）酵母（菌株ＣＢＳ１４１）をＣＰ培養液で培養した。−８０℃で保管された酵母菌株のグリセロールのストックから、接種菌液を調製した。第１の培養は、２％の菌株のストックで、新鮮なＣＰ培養液１０ｍＬの接種を行った。その後、第２の培養を行い、２％の第１の培養で、新鮮なＣＰ培養液１０ｍＬを接種した。次いで、ブロス（broth）を好気条件下で、振とう機で２４時間、３０℃で、１３０ｒｐｍでインキュベートした。ＣＰ培養液を含む小さな発酵機で、以下の条件下で発酵を行った。１％  ｖ／ｖの接種菌液、温度３０℃、最低レベル３０％で溶解した酸素を制御する好気条件。
【００６８】
増殖培養液における糖類の欠乏は、増殖培養液における栄養の欠乏を示し、微生物の増殖の終了を示す。糖類は、イオン排除と分配を組み合わせたＨＰＬＣ（カラムＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ，３００×７．８ｍｍ）により測定される。糖類は、５ｍＭの硫酸で、０．６ｍＬ／分で溶出され、屈折率検出器を用いて検出される。種々の希釈度の標準溶液を使用して、濃度の関数として、ピーク面積の直線回帰を測定した。
【００６９】
最大の増殖性は、グルコースが完全に欠乏した時点で、２４時間以内に得られた（図３参照）。
【００７０】
微生物細胞の自己分解は、増殖培養液に微生物細胞の生菌の一覧に基づいて間接的に計測する。使用した方法は、発酵ブロス１ミリリットルあたりにユニットを形成するコロニー（Colony Forming Units per millilitre）（ｃｆｕ／ｍＬ）の数を数えることであった。試料の連続希釈を使用して、全ての単一の生菌数が他から単離される場合の最適な濃度を見いだした。希釈液は、水１リットルあたり１ｇのトリプトン及び８．５ｇの塩化ナトリウムからなる。次いで、種々の希釈度のアリコート（２０μＬ）を、ＹＰＤ（酵母ペプトンデキストロース）寒天プレート上に堆積させた。乾燥後、プレートを３０℃で４８時間インキュベートした。前ステップのそれぞれは無菌条件において行った。最後に、コロニーを数え、生菌数の算出を式を用いて算出した。
生菌数の算出＝Ｎ×５０×Ｄ
式中、Ｎは選択された局所のコロニーの数であり、Ｄは希釈係数である。
【００７１】
Ｋ．ラクチス（K. lactis）細胞の生存率は、長期発酵の間に下がり（図４参照）、温度及び好気生活に関して初期条件を保持した。
【００７２】
発酵培養液中に存在する遊離アミノ酸の量は、様々な時点で測定した（実施例１のような測定方法）。選択された遊離アミノ酸の結果は、図５に報告される（アスパラギン、グルタミン、リジン、オルニチン、フェニルアラニン及びプロリンの時間経過で生じる量）。放出された全てのアミノ酸に対する発酵培養液内の測定された最終的な濃度［ｍＭ］が図６−サンプルＥに報告される。
【００７３】
最初にＣＰ培養液中に存在する遊離アミノ酸は、Ｋ．ラクチス（K. lactis）の増殖中に、完全に消費された。理論に束縛されるものではないが、Ｋ．ラクチス（K. lactis）細胞が死滅すると即座に、プロテアーゼ／ペプチダーゼが、カゼインペプトン及び酵母抽出物に由来するタンパク質及びペプチドを加水分解し、再度、プロリンを主とする遊離アミノ酸を放出する（図５及び６参照）。
【００７４】
Ｋ．ラクチス（K. lactis）が自己分解をして、プロリダーゼ酵素を放出することが見られることもある。
【００７５】
比較のため、温度感受性菌株であるＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）酵母（ＣＮＣＭ  Ｉ−４００６）により生成されるアミノ酸を同定した（図６−サンプルＦ）。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccaromyces cerevisiae）ＣＮＣＭ  Ｉ−４００６を、ｔｈｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅ，ｏｎ  １２ｔｈ  Ｊｕｎｅ  ２００８で堆積させ、それに受託番号Ｉ−４００６を与えた。
【００７６】
−８０℃で保管された酵母菌株のグリセロールのストックから、接種菌液を調製した。第１の培養は、２％の菌株のストックで、新鮮なＣＰ培養液１０ｍＬの接種を行った。その後、第２の培養を行い、２％の第１の培養で、新鮮なＣＰ培養液１０ｍＬを接種した。次いで、ブロスを好気条件下で、振とう機で２４時間、２５℃で、１３０ｒｐｍでインキュベートした。ＣＰ培養液を含む小さな発酵機で、以下の条件下で発酵を行った。１％  ｖ／ｖの接種菌液、温度２５℃、最低レベル３０％で溶解した酸素を制御する好気条件。
【００７７】
最初に計測した、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）酵母（温度感受性菌株ＣＮＣＭ  Ｉ−４００６）の培養中の増殖培養液のｐＨは、約６．５であった。最大の増殖性は、グルコースが完全に欠乏した時点で、２４時間以内に得られた。２４時間で、４時間以内で３５０ｍＭの濃度までグルコースを培養液に添加した。同時に、温度を２５から３７℃まで上昇させた。
【００７８】
グルコースは、増殖相の間で完全に消費され、約２５０ｍＭの添加されたグルコースは溶解の間に消費された。
【００７９】
加熱の際にＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）が溶解して、プロリダーゼ酵素を放出することが見られることもある。この実験において、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）（Ｆ）及びＫ．ラクチス（K. lactis）（Ｅ）酵母の両方が類似した量のプロリンを生成するが、Ｋ．ラクチス（K. lactis）菌株はＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）より少ないグルタミン酸、ロイシン及びリジンを生成する。魅力的なパン−クラスト及びビスケットアロマを生成するとき、スパイシーな（savoury）ノートをもたらすグルタミン酸、並びにチーズ様ノートを生成するロイシン及びリジンも制限することが有用である。
【００８０】
実施例４：長期発酵における他の酵母種と比較して、Ｋ．ラクチス（K. lactis）で発酵カゼインペプトンに放出されたプロリンの同定。
３種類の異なるＫ．ラクチス（K. lactis）（ＣＢＳ１４１、ＣＢＳ２６２１及びＣＢＳ１０６５）の菌株並びに種々の他の酵母種（デバリオマイセス・ハンセニイ（Debaromyces hansenii）、デッケラ・ブルキセレンシス（Dekkerabruxellensis）、ピキア・サブペリキュローサ（Pichia subpelliculosa）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces Cerevisiae）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schyzosaccharomycespombe）、トルラスポラ・デルブリュッキイ（Torulaspora delbruekii））の長期培養を行い、発酵培養液中のプロリンの量を、実施例３のような同様の方法で時間をかけて測定した（図７参照）。Ｋ．ラクチス（K. lactis）で発酵させた培養液中で、任意の他の酵母種で発酵した培養液からより高いプロリンの放出が達成される。早期の固定相において非常に迅速に死滅した菌株ＣＢＳ１４１及びＣＢＳ２６２１に特に良好な結果が得られた。
【００８１】
実施例５：コーティングのない（naked）ウエハースの調整
焼成中に生成されるフレーバー及ぼす、Ｋ．ラクチス（K. lactis）で発酵されたカゼインペプトンの影響を評価するため、ウエハースの原形を調製した。３つの変形例を、それぞれ組み込んだものと比較した。
【００８２】
基準
実施例３のような、Ｋ．ラクチス（K. lactis）（ＣＢＳ１４１）で発酵され、凍結乾燥されたカゼインペプトン；
ＰｅｐｔｏＰｒｏ（プロリンが豊富な市販の乳タンパク質加水分解物、ＤＳＭ）
【００８３】
以下の配合を有するバッターを混合により調整した。
【表１】
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【００８４】
バッターを２分間、オーブン（Ｈａａｓ）で、１６０℃で加熱した２枚の金属板の間で焼成することによりウエハースを調製した。
【００８５】
ウエハースを評価するためにトレーニングされた官能パネル（１０人のパネリスト）が、ウエハースを評価した。
【００８６】
コーティングされていないウエハースは以下のように記載された。
【表２】
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【００８７】
従って、本発明の方法により生成されたフレーバーの効果は、コーティングがないため、焼成の際に発生するフレーバーの一部が保持されない、コーティングしていないウエハースであっても認識されることが結論づける。
【００８８】
実施例６：コーティングされたウエハースの調製
実施例４により調製したウエハースシートを、フィリングクリームで層にし、切り取って３層ウエハースビスケットを生成した。次いで、層にしたウエハースをチョコレートでコーティングした。全てのサンプルに同一のフィリングとチョコレートを使用した。
【００８９】
ウエハースを評価するためにトレーニングされた官能パネルが、コーティングされたウエハースを評価した。
【００９０】
官能結果を図８に示す。本発明の方法により調製したコーティングされたウエハースは、基準のウエハースと比較して、はるかに強いビスケットフレーバーを示す。それらは、ＰｅｐｔｏＰｒｏを組み込んだレシピを使用して調製したウエハースと比較するとき、より強いビスケットフレーバーも示す。プロリンが豊富である後者は、還元糖（ラムノース）の存在下で焼成する際に、にビスケットにフレーバーを加えることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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