(57)【要約】  本発明は、等温核酸増幅のためのレポーター染料、クエンチャーが含まれる等温ベースの二重機能性オリゴヌクレオチド及びそれを用いた核酸増幅並びに測定方法に関する。本発明は、ＬＡＭＰの核酸増幅反応のために、４〜６種のオリゴヌクレオチド以外に追加的に設計されるオリゴヌクレオチドが不要であり、ＤＮＡとＲＮＡに対するターゲット（ｔａｒｇｅｔ）遺伝子特異的配列の核酸増幅による蛍光量を検出し、反応終了後に検出も可能であり、リアルタイムでも蛍光量を検出することができる方法であって、ターゲット遺伝子に応じてレポーター染料を異ならせて一つのチューブで反応終了後又はリアルタイムで蛍光量を測定することによって、同時多重検査が可能であるという効果がある。
2019522959.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット遺伝子の特定の配列に対するループ媒介等温核酸増幅反応（ＬＡＭＰ）用プライマーのうち、フォワードインナープライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｉｎｎｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ）又はリバースインナープライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｉｎｎｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ）を対象として、３’末端を除いた配列のうち一部の配列をインターナル（ｉｎｔｅｒｎａｌ）ｄＴ、インターナル（ｉｎｔｅｒｎａｌ）ｄＧ、インターナル（ｉｎｔｅｒｎａｌ）ｄＣ、インターナル（ｉｎｔｅｒｎａｌ）ｄＡ、インターナル（ｉｎｔｅｒｎａｌ）ｄＵ、またはインターナル（ｉｎｔｅｒｎａｌ）ｄＲに配列を変形させ、この部位にレポーター染料又はクエンチャーを位置させ、一定温度以下で全体又は一部の配列が二本鎖を形成し、バブル構造が１個以上である、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドは、レポーター染料とクエンチャーとの間隔が２１〜３３ｍｅｒ以内に位置する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドは、フォワードインターナルプローブとリバースインターナルプローブを個別又は共に使用することを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドのレポーター染料は、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ、ＣＹ３、及びＣＹ５のうちの１つであるか、または４５０〜６８５ｎｍの発光波長帯の染料であることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドのクエンチャーは、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １もしくは２であるか、または５００〜７０５ｎｍの吸光波長帯のクエンチャーであることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドは１〜４個のバブル構造を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドは、二本鎖から一本鎖に解離する融解温度が３０〜７０℃であることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドは、配列番号５〜８、及び配列番号１５〜１６に記載されたオリゴヌクレオチドのうちの１つであることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを使用して等温でリアルタイム核酸増幅蛍光検出のためのループ媒介等温核酸増幅反応（ＬＡＭＰ）又は逆転写（ＲＴ）−ＬＡＭＰ反応を行う方法。
【請求項１０】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを使用して等温又は２つ以上の温度条件で終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）核酸増幅蛍光検出のためのループ媒介等温核酸増幅反応（ＬＡＭＰ）又は逆転写（ＲＴ）−ＬＡＭＰ反応を行う方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドは、フォワードインターナルプローブとリバースインターナルプローブを個別又は共に使用することを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法の等温温度条件は５０〜７５℃の範囲であることを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法は、ＤＮＡ及びｃＤＮＡ核酸を対象として行うことを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法は、ＲＮＡ核酸を対象として逆転写反応後に特定の遺伝子をワンステップ反応で行うことを特徴とする、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを含む感染性疾患、遺伝性疾患、薬剤耐性、薬物抵抗性または感受性検体に対する特定の遺伝子を個別又は同時多重的に増幅するキット。
【請求項１６】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含む等温核酸増幅反応用組成物。
【請求項１７】
前記等温核酸増幅反応用組成物は、配列番号１〜１８のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１６に記載の等温核酸増幅反応用組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドを有効成分として含むエボラウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）核酸増幅用組成物。
【請求項１９】
前記核酸増幅用組成物は、配列番号１〜１８のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１８に記載のエボラウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）核酸増幅用組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドとアンチセンスプローブを共に使用して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡに対する等温核酸増幅反応を行う方法。
【請求項２１】
前記アンチセンスプローブは、５５〜６５℃以内で設計及び使用することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドとアンチセンスプローブは、フォワードとリバースの位置で個別又は共に使用することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記アンチセンスプローブは、配列番号１９〜２３に記載された配列のうちの１つを有することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、等温核酸増幅のためのレポーター染料、クエンチャーが含まれる等温ベースの二重機能性オリゴヌクレオチド及びそれを用いた核酸増幅並びに測定方法に関し、より詳細には、等温核酸増幅反応時にリアルタイム蛍光モニタリングを通じて反応時間毎に核酸増幅の有無の測定、及び終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）段階で蛍光量の測定を通じて反応産物の核酸増幅反応の有無を検出する等温ベースの二重機能性オリゴヌクレオチドの用途及びそれを用いた核酸増幅方法並びに測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅技術は、分子生物学及び生命工学の分野で主に用いられる技術であって、少量の核酸を検出し、分析することができる方法である。核酸増幅のために耐熱性酵素（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｅｎｚｙｍｅ）を使用してＤＮＡ／ＲＮＡを分析するＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）技術が最も広く用いられる方法で、高い温度条件で二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性させた後、温度を下げて一本鎖にプライマー（始発体）が結合し、Ｔａｑポリメラーゼ（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｅｎｚｙｍｅ）が二本鎖ＤＮＡに伸長させる過程が繰り返される方法である。
【０００３】
蛍光物質を用いたリアルタイムＰＣＲ方法は、ＰＣＲ過程中に蛍光の発光強度によって核酸を検出する方法であって、ＰＣＲ反応物の中間位置に該当する相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドに５‘末端にレポーター染料を付着させ、３’末端にクエンチャーが付着された一本鎖のプローブ（ｐｒｏｂｅ）を追加して、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）の５‘→３’エキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性によって、ＰＣＲ反応時に一本鎖のプローブが相補的な配列に結合し、Ｔａｑポリメラーゼの伸長反応によって、プローブが５‘末端から加水分解されてレポーター染料がクエンチャーから離れることによって蛍光を発し、リアルタイムＰＣＲ装備の蛍光探知器によって蛍光量を表示する。リアルタイムＰＣＲ装備の蛍光探知器によって蛍光波長を異ならせて２つ以上のターゲット（ｔａｒｇｅｔ）を検出する同時多重検出が可能であるため、病原体の検出及び突然変異の検出などの診断分野で多く使用される技術であって、高価のリアルタイムＰＣＲ装備及び熟練した技術者（ｔｅｃｈｎｉｃｉａｎ）が必要であるという欠点を有している。
【０００４】
高価のリアルタイムＰＣＲ装備なしに等温条件でＤＮＡ／ＲＮＡを検出し、ＰＣＲ方法よりもさらに短時間内に核酸を検出する等温増幅法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）が開発されている。ＲＮＡ増幅のために、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、Ｒｎａｓｅ  Ｈのような酵素（ｅｎｚｙｍｅ）を使用するＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法があり、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、ｅｘｏｎｕｃｌａｓｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅが二本鎖の核酸を合成するために既存の鎖一つを置換（ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）させ、制限酵素（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ）でニック（ｎｉｃｋ）を形成させて、この過程が繰り返されながら核酸が増幅される方法であり、これと類似のＮＥＡＲ（Ｎｉｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、制限酵素の代わりにニッキング酵素（ｎｉｃｋｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）を使用する方法である。ＨＤＡ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、５‘末端と３’末端から二本鎖をほどくヘリカーゼ（Ｈｅｌｉｃａｓｅ）の機能を用いたものであり、これと類似のＲＰＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、二本鎖をほどくリコンビナーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）を用いた方法である。
【０００５】
ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）は、４〜６個の特異的プライマ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ）と鎖置換活性（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有するＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いる核酸増幅技術（Ｐａｔｅｎｔ．Ｎｏ．ＰＣＴ／ＪＰ２０００／００１９１９）である。
【０００６】
ＬＡＭＰの測定方法では、アガロースゲル電気泳動分析を通じて、ｓｍｅａｒｅｄ  ｐａｔｔｅｒｎのｂａｎｄを確認して特定の遺伝子の核酸増幅反応の有無を分析することができるが、アガロースゲル電気泳動分析時に、反応チューブを開封して核酸汚染の根源となり得る。
【０００７】
したがって、核酸汚染源の遮断のために、反応チューブを開封せずに測定できる技術が開発されており、一般的にＬＡＭＰで使用されている濁度測定法（Ｍｏｒｉ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２００１，２８９：１５０−１５４）は、等温核酸増幅反応物の増加に伴ってピロリン酸マグネシウム（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、Ｍｇ２Ｐ２Ｏ７）による白色沈殿物が蓄積されて４００ｎＭの波長の濁度を測定してリアルタイム検出及び終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）検出が可能であるので、反応チューブの開封なしに核酸増幅の有無を確認することができる。しかし、２つ以上のターゲット（ｔａｒｇｅｔ）区別のような同時多重検出は不可能であり、測定しようとするピロリン酸マグネシウムの沈殿により、測定法に対する正確度が低いという欠点がある。
【０００８】
ＬＡＭＰで核酸増幅の有無をリアルタイムで測定するための蛍光検出法は、反応チューブの開封なしに蛍光物質のみを測定することで、汚染の発生を除去し、沈殿物の発生による正確度減少の問題もなくし得るという利点を有している。
【０００９】
ＬＡＭＰでＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉのような二本鎖特異インターカレーター（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｒ）を反応液に添加して、核酸増幅反応物の増加に伴って蛍光強度が増大してリアルタイム測定が可能である。リアルタイムＰＣＲ増幅反応においても使用されるＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉは、核酸増幅産物の配列特異的に確認されないため、プライマーダイマー（ｐｒｉｍｅｒ  ｄｉｍｅｒ）の発生にも蛍光度が測定されてしまい、非特異反応の区別のためには、リアルタイム測定以降に温度を９５℃まで徐々に高めて核酸増幅反応物の融解温度を測定して非特異反応の有無を判断しなければ、検出の有無を確認することができず、２つ以上のターゲット（ｔａｒｇｅｔ）区別のような同時多重検出は不可能である。
【００１０】
ＬＡＭＰによる核酸増幅配列特異的に蛍光を検出するための技術が開発された。同化プローブ（Ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏｂｅ）は、核酸増幅配列特異的に設計された二本のプローブであって、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ）原理を用いてリアルタイムで測定する方法（Ｐａｔｅｎｔ．Ｎｏ．ＰＣＲ／ＵＳ１１／４１５４０）である。二本のプローブのうち、一方はレポーター染料が５‘末端に付着され、他方は３’末端にクエンチャーが位置する。ＬＡＭＰ核酸増幅に使用されるオリゴヌクレオチドの数は６種で、多数のプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）が含まれ、同化プローブは、これらのうちループプライマー（ｌｏｏｐ  ｐｒｉｍｅｒ）の一つを対象として、５‘末端にレポーター染料を付着させた一方のプローブを設計し、これに相補的な配列を一部を設計して、３’末端にクエンチャーを付着させた他方のプローブを設計して７種のオリゴヌクレオチドを合成しなければならず、同化プローブは、ＬＡＭＰ反応の前に２つのプローブを高温から低温に徐々に温度を減少させて一対のプローブに合成して核酸増幅に使用される。ＬＡＭＰにおいて遺伝子配列特異的なリアルタイム検出のために同化プローブを使用することで、核酸増幅反応時にＬＡＭＰ反応の抑制効果が示され、検出時間とリアルタイム測定時間が長くなる。
【００１１】
同化プローブと類似のプローブを使用する蛍光検出法として、蛍光プローブ（ｆｌｕｏｒｅｐｈｏｒｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ／ｐｒｏｂｅ）とクエンチャープローブ（ｑｕｅｎｃｈｅｒ−ｌａｂｅｌｅｄ  ｐｒｏｂｅ）を相補的な配列を有するように設計して一対のプローブを使用する方法（Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．ＰＣＴ／ＪＰ２０１２／０７７５９６）がある。蛍光プローブとクエンチャープローブの融解温度を異ならせて設計して、ＬＡＭＰ核酸増幅反応中には蛍光プローブのみがターゲット遺伝子特異配列にアニーリングして反応し、ＬＡＭＰ核酸増幅反応の終了後に温度を下げて、残存している蛍光プローブがクエンチャープローブと結合した後、蛍光量を検出する方法である。この一対のプローブはリアルタイム検出を確認することができず、同化プローブと同様に、一つのオリゴヌクレオチドが追加されて設計されなければならない。
【００１２】
ＬＡＭＰ核酸増幅反応においてリアルタイム検出及び蛍光量の測定を通じて、反応チューブの開封なしに核酸増幅の有無を確認することで、汚染による偽陽性反応を解決し、低濃度で存在するターゲット（ｔａｒｇｅｔ）核酸の増幅の有無を敏感に測定するための技術が開発されたが、濁度の測定及びインターカレーター蛍光測定のようなターゲット核酸配列に特異的ではない方法は、非特異増幅の有無を確認することができず、同時多重核酸検出が不可能であるという制限点があり、プローブを使用する方法は、ターゲット遺伝子配列特異的に設計が可能であり、様々なレポーター染料とクエンチャーを使用するので、同時多重核酸検出の実行が可能である。しかし、ＬＡＭＰに使用される６種のオリゴヌクレオチド以外に、一対のプローブを形成させるためのクエンチャープローブというオリゴヌクレオチドの設計が必要であり、一対のプローブを反応物の調製の前に合成させて反応物に添加させなければならない過程が追加される。また、一対のプローブの設計位置は、ループプライマーを代替して蛍光プローブとして設計しなければならない。ループプライマーは、ＬＡＭＰ反応時に、ダンベル構造のループ（ｌｏｏｐ）が形成された後にアニーリングして、次の過程が進行するため、蛍光が測定される時点は、実際に核酸が増幅される時点よりも蛍光検出時間が遅延して測定される。同化プローブはＬＡＭＰの反応性に抑制効果を与え、蛍光プローブとクエンチャープローブを使用する方法の場合は、リアルタイム検出を行うことができず、反応終了後に温度が低くならなければ検出できないという制限点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記問題点を解決し、上記の必要性によって案出されたもので、本発明の目的は、ＬＡＭＰの核酸増幅反応のために４〜６種のオリゴヌクレオチド以外に追加的に設計されるオリゴヌクレオチドがなく、ターゲット（ｔａｒｇｅｔ）遺伝子配列特異的に検出が可能であり、反応終了後の検出ではなく、リアルタイムで検出できる技術の開発、及びＬＡＭＰ等温増幅過程中に現れる増幅産物をリアルタイムで測定し、同時多重検査が可能な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成するために、本発明は、ターゲット遺伝子の特定の配列に対するループ媒介等温核酸増幅反応（ＬＡＭＰ）用プライマーのうち、フォワードインナープライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｉｎｎｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ）又はリバースインナープライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｉｎｎｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ）を対象として、３’末端を除いた配列のうち一部の配列をインターナル（ｉｎｔｅｒｎａｌ）ｄＴ、インターナル（ｉｎｔｅｒｎａｌ）ｄＧ、インターナル（ｉｎｔｅｒｎａｌ）ｄＣ、インターナル（ｉｎｔｅｒｎａｌ）ｄＡ、インターナル（ｉｎｔｅｒｎａｌ）ｄＵ、またはインターナル（ｉｎｔｅｒｎａｌ）ｄＲに配列を変形させ、この部位にレポーター染料又はクエンチャーを位置させ、一定温度以下で全体又は一部の配列が二本鎖を形成し、バブル構造が１個以上であるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１５】
本発明の一具現例において、前記オリゴヌクレオチドは、レポーター染料とクエンチャーとの間隔が２１〜３３ｍｅｒ以内に位置することが好ましいが、これに限定されない。
【００１６】
本発明の他の具現例において、前記オリゴヌクレオチドは、フォワードインターナルプローブとリバースインターナルプローブを個別又は共に使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００１７】
本発明の一実施例において、前記オリゴヌクレオチドのレポーター染料は、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ、ＣＹ３、及びＣＹ５のうちの１つであるか、または４５０〜６８５ｎｍの発光波長帯であるものが好ましく、
前記オリゴヌクレオチドのクエンチャーは、ＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １もしくは２であるか、または５００〜７０５ｎｍの吸光波長帯であるものが好ましいが、これに限定されない。
【００１８】
本発明の一具現例において、前記オリゴヌクレオチドは１〜４個のバブル構造を有することが好ましく、
前記オリゴヌクレオチドは、二本鎖から一本鎖に解離する融解温度が３０〜７０℃であることが好ましいが、これに限定されない。
【００１９】
本発明の一実施例において、前記オリゴヌクレオチドは、配列番号５〜８、及び配列番号１５〜１６に記載されたオリゴヌクレオチドのうちの１つであることが好ましいが、これに限定されない。
【００２０】
また、本発明は、本発明の前記オリゴヌクレオチドを使用して等温でリアルタイム核酸増幅蛍光検出のためのループ媒介等温核酸増幅反応（ＬＡＭＰ）又は逆転写（ＲＴ）−ＬＡＭＰ反応を行う方法を提供する。
【００２１】
また、本発明は、前記本発明のオリゴヌクレオチドを使用して等温又は２つ以上の温度条件で終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）核酸増幅蛍光検出のためのループ媒介等温核酸増幅反応（ＬＡＭＰ）又は逆転写（ＲＴ）−ＬＡＭＰ反応を行う方法を提供する。
【００２２】
本発明の方法において、前記オリゴヌクレオチドは、フォワードインターナルプローブとリバースインターナルプローブを個別又は共に使用することが好ましく、
前記方法の等温温度条件は５０〜７５℃の範囲であることが好ましいが、これに限定されない。
【００２３】
本発明の方法において、前記方法は、ＤＮＡ及びｃＤＮＡ核酸を対象として行うことが好ましく、前記方法は、ＲＮＡ核酸を対象として逆転写反応後に特定の遺伝子をワンステップ反応で行うことが好ましいが、これに限定されない。
【００２４】
また、本発明は、前記本発明のオリゴヌクレオチドを含む感染性疾患、遺伝性疾患、薬剤耐性、薬物抵抗性または感受性検体に対する特定の遺伝子を個別又は同時多重的に増幅するキットを提供する。
【００２５】
また、本発明は、前記本発明のオリゴヌクレオチドを有効成分として含むエボラウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）核酸増幅用組成物を提供する。
【００２６】
また、本発明は、前記本発明のオリゴヌクレオチドを有効成分として含む等温核酸増幅反応用組成物を提供する。
【００２７】
本発明の一具現例において、前記組成物は配列番号１〜１８のオリゴヌクレオチドを含むことが好ましいが、これに限定されない。
【００２８】
また、本発明は、前記本発明のオリゴヌクレオチドとアンチセンスプローブを共に使用して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡに対する等温核酸増幅反応を行う方法を提供する。
【００２９】
本発明の一具現例において、前記アンチセンスプローブは、５５〜６５℃以内で設計及び使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００３０】
本発明の他の具現例において、前記オリゴヌクレオチドとアンチセンスプローブは、フォワードとリバースの位置で個別又は共に使用することが好ましいが、これに限定されない。
【００３１】
本発明の更に他の具現例において、前記アンチセンスプローブは、配列番号１９〜２３に記載された配列のうちの１つを有することが好ましいが、これに限定されない。
【００３２】
以下、本発明を説明する。
【００３３】
本発明で使用された略語は、次の通りである：
【００３４】
Internal dT : Internal Amino-C6(or C2)- deoxythymine
【００３５】
Internal dA : Internal Amino-C6- deoxyadenocine
【００３６】
Internal dC : Internal Amino-C6- deoxycytidine
【００３７】
Internal dG : Internal Amino-C6- deoxyguanosine
【００３８】
Internal dU : Internal Amino-C6- deoxyuridine
【００３９】
Internal dR : Internal Amino-C6- deoxyribose
【００４０】
本発明は、Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）方法のＦＩＰ（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｉｎｎｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ）とＲＩＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｉｎｎｅｒ  Ｐｒｉｍｅｒ）は、それぞれ２つのターゲット（ｔａｒｇｅｔ）遺伝子部位に対するプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）が一つのオリゴヌクレオチドとして設計されており、この２つのターゲット遺伝子部位の間に１つ以上のバブル構造を形成させ、３‘末端を除いて５’末端又はチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）部位をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに変形させ、レポーター染料又はクエンチャーを付着させる構造で、一つのＩＢ−ＤＦＯには一つのレポーター染料と一つのクエンチャーが位置してプライマー及びプローブの２つの機能を行い、等温核酸増幅反応時にリアルタイム蛍光モニタリングを通じて反応時間毎に核酸増幅の有無の測定、及び終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）段階で蛍光モニタリングを通じて反応産物の蛍光測定により等温核酸増幅反応の有無を検出する等温ベースの二重機能性オリゴヌクレオチドの用途及びそれを用いた核酸増幅方法並びに測定方法を提供する。
【００４１】
本発明は、ターゲット遺伝子の特定の配列に対するＬＡＭＰ等温核酸増幅反応用プライマーのうち、ＦＩＰ又はＲＩＰを対象として、３’末端を除いた配列にチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）塩基をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに、またはアデニン（Ａｄｅｎｉｎｅ）、チミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）、グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）、シトシン（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ）、ウリジン（Ｕｒｉｄｉｎｅ）塩基をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＲに変形させ、この部位にレポーター染料又はクエンチャーを位置させ、一定温度以下で全体又は一部の配列が二本鎖を形成し、バブル構造が１個以上であるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００４２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ターゲットＤＮＡ及びｃＤＮＡ、ＲＮＡの特定の遺伝子配列の等温核酸増幅のために、等温ベースの二重機能性オリゴヌクレオチドを１つ以上含む等温核酸増幅反応混合物を提供する。
【００４３】
本発明は、前記反応混合物の組成をＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ベタイン（Ｂｅｔａｉｎｅ）、ＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、ｄＮＴＰｓ、ウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、ホルムアミド（Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）、一本鎖結合タンパク質（Ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ピロホスフェート（Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ピロホスファターゼ（Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）などを含み、５‘→３’エキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）（−）、３’→５’エキソヌクレアーゼ（−）、鎖置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有しているＤＮＡポリメラーゼと共にＩＢ−ＤＦＯを含むＬＡＭＰ核酸増幅反応用混合物である。そして、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとＡｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ（ＡＭＶ）  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｍｏｌｏｎｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅなどの逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）と熱安定性逆転写酵素（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）、逆転写酵素の機能を有しているＤＮＡポリメラーゼと共にＩＢ−ＤＦＯを含むＲＴ−ＬＡＭＰ核酸増幅反応用混合物を使用するものである。
【００４４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、レポーター染料とクエンチャーとの間隔が２１〜３３ｍｅｒ以内に位置するオリゴヌクレオチドを提供し、これに限定するものではない。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドのフォワードプローブ（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｏｂｅ）であるＦＩＰ−ＩＢ−ＤＦＯとリバースプローブ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｏｂｅ）であるＲＩＰ−ＩＢ−ＤＦＯを個別又は共に使用することを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供する。
【００４６】
本発明のオリゴヌクレオチドのレポーター染料はＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ、ＣＹ３、及びＣＹ５のうちの１つを含み、４５０〜６８５ｎｍの発光波長帯を含むオリゴヌクレオチドを提供し、これに限定するものではない。
【００４７】
本発明のオリゴヌクレオチドのクエンチャーをＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １，２を含み、５００〜７０５ｎｍの吸光波長帯を含むオリゴヌクレオチドを提供し、これに限定するものではない。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドを使用して等温でリアルタイム核酸増幅蛍光検出のためのＬＡＭＰ及びＲＴ−ＬＡＭＰ反応方法を提供する。
【００４９】
本発明のオリゴヌクレオチドを使用して等温又は２つ以上の温度で終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）核酸増幅蛍光検出のためのＬＡＭＰ及びＲＴ−ＬＡＭＰ反応方法を提供する。
【００５０】
前記方法は、オリゴヌクレオチドＩＢ−ＤＦＯとして０．２〜１．６ｕＭの濃度のＦＩＰ又はＲＩＰ、あるいはＦＩＰ及びＲＩＰを含む混合物を提供し、これに限定するものではない。
【００５１】
本発明のオリゴヌクレオチドを使用したＬＡＭＰ反応方法の等温温度条件が５０〜７５℃の範囲を有する方法を提供し、これに限定するものではない。
【００５２】
本発明のオリゴヌクレオチドを使用してＤＮＡ及びｃＤＮＡ核酸を対象として行う方法を提供する。
【００５３】
本発明のオリゴヌクレオチドを使用してＲＮＡ核酸を対象として逆転写反応後に特定の遺伝子をワンステップ反応で行う方法を提供する。
【００５４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、１〜４個のバブル構造を有するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００５５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、二本鎖から一本鎖に解離する融解温度が３０〜７０℃であることを特徴とするオリゴヌクレオチドを提供し、これに限定するものではない。
【００５６】
本発明のオリゴヌクレオチドを含む感染性疾患、遺伝性疾患、薬剤耐性、薬物抵抗性または感受性検体のＤＮＡ及びｃＤＮＡ、ＲＮＡに対する特定の遺伝子を個別又は同時多重に増幅するキットを提供する。
【００５７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、エボラウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）のサブタイプ（ｓｕｂｔｙｐｅ）であるＢｕｎｄｉｂｕｇｙｏとＲｅｓｔｏｎに対する配列番号１〜１８までオリゴヌクレオチド配列とＬＡＭＰ及びＲＴ−ＬＡＭＰ  ｐｒｉｍｅｒ配列を提供する。
【発明の効果】
【００５８】
本発明から分かるように、本発明は、ＬＡＭＰの核酸増幅反応のために、４〜６種のオリゴヌクレオチド以外に追加的に設計されるオリゴヌクレオチドが不要であり、ＤＮＡとＲＮＡに対するターゲット（ｔａｒｇｅｔ）遺伝子特異的配列の核酸増幅による蛍光量を検出し、反応終了後に検出も可能であり、リアルタイムでも蛍光量を検出することができる方法であって、ターゲット遺伝子に応じてレポーター染料を異ならせて一つのチューブで反応終了後又はリアルタイムで蛍光量を測定することによって、同時多重検査が可能であるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）のレポーター染料とクエンチャーとの間のｍｅｒ数（距離）の３３ｍｅｒ、２５ｍｅｒ、２１ｍｅｒによるＬＡＭＰ核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定の結果である。
【図２】本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）のフォワードインナープライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｉｎｎｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ；ＦＩＰ）とリバースインナープライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｉｎｎｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ；ＲＩＰ）として設計されたＩＢ−ＤＦＯを個別的に使用してＬＡＭＰ核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定を行った結果である。
【図３】本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）のフォワードインナープライマー（ＦＩＰ）とリバースインナープライマー（ＲＩＰ）として設計されたＩＢ−ＤＦＯを個別又は共に適用してＬＡＭＰ核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定を行った結果である。
【図４】本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）をＦＩＰとＦＩＰの配列で設計されたＩＢ−ＤＦＯでＦＩＰ：ＦＩＰ−ＩＢ−ＤＦＯの比率を０：１．６ｕＭ／０．４：１．２ｕＭ／０．８：０．８ｕＭ／１．２：０．４ｕＭ／１．４：０．２ｕＭ／１．６：０ｕＭにしてＬＡＭＰ核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定を行った結果である。
【図５】本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）をＦＩＰとＦＩＰの配列で設計されたＩＢ−ＤＦＯでＦＩＰ：ＦＩＰ−ＩＢ−ＤＦＯの比率を０：１．６ｕＭ／０．４：１．２ｕＭ／０．８：０．８ｕＭ／１．２：０．４ｕＭ／１．４：０．２ｕＭ／１．６：０ｕＭにしてＬＡＭＰ核酸増幅反応に対する終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）蛍光測定を行った結果である。
【図６】本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）を使用してプラスミドＤＮＡ（ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ）を鋳型としてＬＡＭＰ核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定を行った結果である。
【図７】本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）を使用してプラスミドＤＮＡを鋳型としてＬＡＭＰ核酸増幅反応に対する終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）蛍光測定を行った結果である。
【図８】本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）を使用してＲＮＡ転写物（ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を鋳型としてワンステップＲＴ−ＬＡＭＰ核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定を行った結果である。
【図９】本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）を使用してＲＮＡ転写物を鋳型としてワンステップＲＴ−ＬＡＭＰ核酸増幅反応に対する終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）蛍光測定を行った結果である。
【図１０−１３】本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）及び温度別（５５℃、６０℃、６５℃、７０℃）に設計されたクエンチャーが含まれたアンチセンスプローブ（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ｐｒｏｂｅ）を使用してプラスミドＤＮＡを鋳型としてＬＡＭＰ核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定を行った結果である。
【図１４】本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）及び温度別（５５℃、６０℃、６５℃、７０℃）に設計されたクエンチャーが含まれたアンチセンスプローブ（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ｐｒｏｂｅ）を使用してプラスミドＤＮＡを鋳型としてＬＡＭＰ核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定の結果のＲｎ  ｖｓ  ｍｉｎ（ｎｏｎ−ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）ｔｙｐｅの結果である。
【図１５−１７】本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）をフォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）、またはリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）、またはフォワード（Ｆ）及びリバース（Ｒ）を使用し、これに相補的な配列を６０℃に設計したクエンチャーが含まれたアンチセンスプローブ（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ｐｒｏｂｅ）を共にプラスミドＤＮＡを鋳型としてＬＡＭＰ核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光測定を行った結果である。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
以下、実施例を通じて本発明を詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の内容が下記の実施例によって限定されるものではない。
【００６１】
実施例１：本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）のレポーター染料とクエンチャーとの距離（ｍｅｒ数）による蛍光検出効果の分析
【００６２】
本発明のＩＢ−ＤＦＯのレポーター染料とクエンチャーとの距離（ｍｅｒ数）によるＬＡＭＰ等温核酸増幅反応による蛍光検出効果を観察するために、エボラウイルスのサブタイプのうちの１つであるＢｕｎｄｉｂｕｇｙｏのＬ  ｓｅｇｍｅｎｔ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）部位の配列に対してＬＡＭＰ等温核酸増幅用の４種のプライマーをＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ  Ｖ４  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ／ｅｌａｍｐ４．０．０／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）で設計した。
【００６３】
設計されたプライマーは、ＥＢ＿Ｂ＿Ｆ３（配列番号１）、ＥＢ＿Ｂ＿Ｒ３（配列番号２）、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ（配列番号３）、ＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ（配列番号４）であり、ＩＢ−ＤＦＯは、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ  ｐｒｉｍｅｒ配列にチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに変形し、この部位をＦＡＭレポーター染料に変形させ、３３ｍｅｒ（ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２、配列番号５）、２５ｍｅｒ（ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２．５、配列番号６）、２１ｍｅｒ（ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ３、配列番号７）間隔の位置のチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに変形し、この部位にＢＨＱ１クエンチャーを付着した。３つのＩＢ−ＤＦＯが二本鎖から一本鎖に解離する温度（Ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）は５４℃と示された。
【００６４】
前記ＩＢ−ＤＦＯオリゴヌクレオチドに対する等温核酸増幅反応は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｅａｃｈ、０．５Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ、８Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＭＣＬＡＢ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＥＢ＿Ｂ＿Ｆ３とＥＢ＿Ｂ＿Ｒ３を０．２ｕＭ使用し、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰは１．２ｕＭ、ＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰは１．６ｕＭを混合物に添加し、ＩＢ−ＤＦＯは０．４ｕＭを追加した。エボラウイルスのＢｕｎｄｉｂｕｇｙｏ  Ｌ  ｓｅｇｍｅｎｔ（ｇｂ：ＦＪ２１７１６１、５２１ｂｐ）を遺伝子合成を通じて作製して、１×１０＾７、１×１０＾５、１×１０＾３、０  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎ濃度で使用した。等温核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光検出のために、６５℃で６０分間行い、１分単位でＣＦＸ−９６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）リアルタイム蛍光測定装備を使用して蛍光量を測定した。
【００６５】
図１は、ＩＢ−ＤＦＯのレポーター染料とクエンチャーとの間隔に対するＬＡＭＰ等温核酸増幅反応の結果であり、３３ｍｅｒ、２５ｍｅｒ、２１ｍｅｒの間隔で設計されたＩＢ−ＤＦＯを使用して、１×１０＾７  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎでそれぞれ１１．９８分、１２．０３分、１２．１６分と示され、１×１０＾５  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎは、それぞれ１５．３分、１５．２８分、１５．７３分、１×１０＾３  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎは、それぞれ２０．４２分、２０．０９分、２２．２９分として類似蛍光検出時間が観察され、０  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎでＤ．Ｗ．のみを添加した反応では蛍光シグナルが検出されなかった。したがって、ＩＢ−ＤＦＯのレポーター染料とクエンチャーは、２１〜３３ｍｅｒ以内で蛍光量が測定された。この中で２５ｍｅｒ  ＩＢ−ＤＦＯで最も高いＲＦＵ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔ）が確認された。
【００６６】
実施例２：本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）のフォワード、リバース位置での使用効果の分析
【００６７】
本発明のＩＢ−ＤＦＯをフォワード又はリバース位置で使用時に、ＬＡＭＰ等温核酸増幅反応による蛍光検出の効果を観察するために、エボラウイルスのサブタイプのうちの１つであるＢｕｎｄｉｂｕｇｙｏのＬ  ｓｅｇｍｅｎｔ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）部位の配列に対してＬＡＭＰ等温核酸増幅用の４種のプライマーをＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ  Ｖ４  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ／ｅｌａｍｐ４．０．０／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）で設計した。設計されたプライマーは、ＥＢ＿Ｂ＿Ｆ３（配列番号１）、ＥＢ＿Ｂ＿Ｒ３（配列番号２）、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ（配列番号３）、ＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ（配列番号４）であり、ＩＢ−ＤＦＯとしては、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ  ｐｒｉｍｅｒ配列にチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに変形し、この部位をＦＡＭレポーター染料に変形させ、３３ｍｅｒ間隔の位置のチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに変形し、この部位にＢＨＱ１クエンチャーを付着したＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２（配列番号５）、及びＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ  ｐｒｉｍｅｒ配列にＦＡＭレポーター染料とＢＨＱ１クエンチャーを３０ｍｅｒの間隔で設計したＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ＿Ｐ２（配列番号８）を使用した。
【００６８】
前記ＩＢ−ＤＦＯオリゴヌクレオチドに対する等温核酸増幅反応は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｅａｃｈ、０．５Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ、８Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＭＣＬＡＢ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＥＢ＿Ｂ＿Ｆ３とＥＢ＿Ｂ＿Ｒ３を０．２ｕＭ使用し、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰは１．２又は１．６ｕＭ、ＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰは１．２又は１．６ｕＭを混合物に添加し、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２及びＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ＿Ｐ２は個別に０．４ｕＭずつ追加した。エボラウイルスのＢｕｎｄｉｂｕｇｙｏ  Ｌ  ｓｅｇｍｅｎｔ（ｇｂ：ＦＪ２１７１６１，５２１ｂｐ）を遺伝子合成を通じて作製して、１×１０＾７、１×１０＾５、１×１０＾３、０  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎ濃度で使用した。等温核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光検出のために、６５℃で６０分間行い、１分単位でＣＦＸ−９６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）リアルタイム蛍光測定装備を使用して蛍光量を測定した。
【００６９】
図２は、ＦＩＰ及びＲＩＰとして設計されたＩＢ−ＤＦＯを個別に使用してＬＡＭＰ等温核酸増幅反応を行った結果であって、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２を含むか、またはＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ＿Ｐ２を含む反応において１×１０＾７  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎでそれぞれ１２．３分、１３．０２分と示され、１×１０＾５  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎは、それぞれ１５．９２分、１６．１３分、１×１０＾３  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎは、それぞれ１８．９４分、１８．５９分として類似蛍光検出時間が観察され、０  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎでＤ．Ｗ．のみを添加した反応では蛍光シグナルが検出されなかった。したがって、ＩＢ−ＤＦＯの設計時にＦＩＰ及びＲＩＰの位置と関係なく、類似のＬＡＭＰ等温核酸増幅に対するリアルタイム蛍光検出を確認した。
【００７０】
実施例３：本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）をフォワード、リバース位置で個別又は共に使用時に蛍光検出効果の分析
【００７１】
本発明のＩＢ−ＤＦＯをフォワード又はリバース位置で共に使用時にＬＡＭＰ等温核酸増幅反応による蛍光検出効果を観察するために、エボラウイルスのサブタイプのうちの１つであるＲｅｓｔｏｎのＬ  ｓｅｇｍｅｎｔ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）部位の配列に対してＬＡＭＰ等温核酸増幅用の６種のプライマーをＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ  Ｖ４  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ／ｅｌａｍｐ４．０．０／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）で設計した。設計されたプライマーは、ＥＢ＿Ｒ＿Ｆ３（配列番号９）、ＥＢ＿Ｒ＿Ｒ３（配列番号１０）、ＥＢ＿Ｒ＿ＦＩＰ（配列番号１１）、ＥＢ＿Ｒ＿ＲＩＰ（配列番号１２）、Ｒｅｓ＿ＬＰ（配列番号１３）、Ｒｅｓ＿ＲＬＰ（配列番号１４）であり、ＩＢ−ＤＦＯとしては、ＥＢ＿Ｒ＿ＦＩＰ  ｐｒｉｍｅｒ配列にチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに変形し、この部位をＦＡＭレポーター染料に変形させ、３１ｍｅｒ間隔の位置のチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに変形し、この部位にＢＨＱ１クエンチャーを付着したＥＢ＿Ｒ＿ＦＩＰ＿Ｐ２（配列番号１５）、及びＥＢ＿Ｒ＿ＲＩＰ  ｐｒｉｍｅｒの配列にＦＡＭレポーター染料とクエンチャーを３３ｍｅｒの間隔で設計したＥＢ＿Ｒ＿ＲＩＰ＿Ｐ２（配列番号１６）を使用した。
【００７２】
前記ＩＢ−ＤＦＯオリゴヌクレオチドに対する等温核酸増幅反応は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｅａｃｈ、０．５Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ、８Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＭＣＬＡＢ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＥＢ＿Ｒ＿Ｆ３とＥＢ＿Ｒ＿Ｒ３を０．２ｕＭ、Ｒｅｓ＿ＬＰとＲｅｓ＿ＲＬＰは０．８ｕＭを使用し、ＥＢ＿Ｒ＿ＦＩＰは１．２又は１．６ｕＭ、ＥＢ＿Ｒ＿ＲＩＰは１．２又は１．６ｕＭを混合物に添加し、ＥＢ＿Ｒ＿ＦＩＰ＿Ｐ２とＥＢ＿Ｒ＿ＲＩＰ＿Ｐ２は、個別に０．４ｕＭずつ追加した。ＥＢ＿Ｒ＿ＦＩＰ＿Ｐ２とＥＢ＿Ｒ＿ＲＩＰ＿Ｐ２を共に使用する条件では、それぞれ０．２ｕＭを添加し、ＥＢ＿Ｒ＿ＦＩＰとＥＢ＿Ｒ＿ＲＩＰ  ｐｒｉｍｅｒはそれぞれ１．４ｕＭを使用した。エボラウイルスのＲｅｓｔｏｎ  Ｌ  ｓｅｇｍｅｎｔ（ｇｂ：ＪＸ４７７１６６、４１０ｂｐ）を遺伝子合成を通じて作製して、１×１０＾４、１×１０＾３、０  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎ濃度で使用した。等温核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光検出のために、６５℃で３０分間行い、１分単位でＣＦＸ−９６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）リアルタイム蛍光測定装備を使用して蛍光量を測定した。
【００７３】
図３は、ＦＩＰ及びＲＩＰとして設計されたＩＢ−ＤＦＯを個別又は共に使用してＬＡＭＰ等温核酸増幅反応を行った結果であって、ＥＢ＿Ｒ＿ＦＩＰ＿Ｐ２を含む反応、ＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ＿Ｐ２を含む反応、及びＥＢ＿Ｒ＿ＦＩＰ＿Ｐ２とＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ＿Ｐ２を共に使用する反応において１×１０＾４  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎでそれぞれ１６．０２分、１６．９５分、１６．４０分と示され、１×１０＾３  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎは、それぞれ１８．４１分、１８．６５分、２０．６４分として類似蛍光検出時間が観察され、０  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎでＤ．Ｗ．のみを添加した反応では蛍光シグナルが検出されなかった。したがって、ＦＩＰとＲＩＰに対するＩＢ−ＤＦＯは個別又は共に使用しても、類似のＬＡＭＰ等温核酸増幅に対するリアルタイム蛍光検出を確認した。
【００７４】
実施例４：本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）と同一の配列で設計されたインナープライマー（ｉｎｎｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）の比率による蛍光検出効果の分析
【００７５】
本発明のＩＢ−ＤＦＯとインナープライマーは同一の配列で設計されており、これら２つの比率による、ＬＡＭＰ等温核酸増幅反応による蛍光検出効果を観察するために、エボラウイルスのサブタイプのうちの１つであるＢｕｎｄｉｂｕｇｙｏのＬ  ｓｅｇｍｅｎｔ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）部位の配列に対してＬＡＭＰ等温核酸増幅用の４種のプライマーをＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ  Ｖ４  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ／ｅｌａｍｐ４．０．０／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）で設計した。設計されたプライマーは、ＥＢ＿Ｂ＿Ｆ３（配列番号１）、ＥＢ＿Ｂ＿Ｒ３（配列番号２）、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ（配列番号３）、ＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ（配列番号４）であり、ＩＢ−ＤＦＯとしては、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ  ｐｒｉｍｅｒ配列にチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに変形し、この部位をＦＡＭレポーター染料に変形させ、３３ｍｅｒ間隔の位置のチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに変形し、この部位にＢＨＱ１クエンチャーを付着したＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２（配列番号５）を使用した。
【００７６】
前記ＩＢ−ＤＦＯオリゴヌクレオチドに対する等温核酸増幅反応は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｅａｃｈ、８Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＭＣＬＡＢ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＥＢ＿Ｂ＿Ｆ３とＥＢ＿Ｂ＿Ｒ３を０．２ｕＭ使用し、ＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰは１．６ｕＭを使用し、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ：ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２は、０：１．６ｕＭ、０．４：１．２ｕＭ、０．８：０．８ｕＭ、１．２：０．４ｕＭ、１．６：０ｕＭの比率でそれぞれ混合物に添加した。エボラウイルスのＢｕｎｄｉｂｕｇｙｏ  Ｌ  ｓｅｇｍｅｎｔ（ｇｂ：ＦＪ２１７１６１、５２１ｂｐ）を遺伝子合成を通じて作製して、１×１０＾７  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎ濃度で使用した。等温核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光検出のために、６５℃で６０分間行い、１分単位でＣＦＸ−９６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）リアルタイム蛍光測定装備を使用して蛍光量を測定した。そして、終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）蛍光検出のために、６５℃で６０分間行った後、３０℃で１分ずつ１０ｃｙｃｌｅｓ反応して蛍光量を測定した。
【００７７】
図４及び図５の結果から、ｉｎｎｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ：ＩＢ−ＤＦＯの比率が０：１．６ｕＭで、ｉｎｎｅｒ  ｐｒｉｍｅｒを使用しなくても、ｉｎｎｅｒ  ｐｒｉｍｅｒが添加された条件と類似の蛍光検出時間を確認し、ＩＢ−ＤＦＯの濃度が減少するにつれてＲＦＵが減少する結果が観察された。
【００７８】
図４は、リアルタイム蛍光検出の結果であり、図５は、終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）蛍光検出の結果であって、ＩＢ−ＤＦＯの濃度が減少するにつれてＲＦＵが減少するという同一の様相を確認した。したがって、ＩＢ−ＤＦＯは、プライマー及びプローブの２つの機能を共に行うものと確認され、リアルタイム蛍光検出及び終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）蛍光検出を行うことができるという利点を有している。
【００７９】
実施例５：本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）を適用してプラスミドＤＮＡ（ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ）を鋳型としたＬＡＭＰ等温核酸増幅蛍光検出効果の分析
【００８０】
本発明のＩＢ−ＤＦＯをＦＩＰの位置に添加使用してプラスミドＤＮＡを鋳型としてＬＡＭＰ等温核酸増幅反応による蛍光検出効果を観察するために、エボラウイルスのサブタイプのうちの１つであるＢｕｎｄｉｂｕｇｙｏのＬ  ｓｅｇｍｅｎｔ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）部位の配列に対してＬＡＭＰ等温核酸増幅用の６種のプライマーをＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ  Ｖ４  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ／ｅｌａｍｐ４．０．０／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）で設計した。設計されたプライマーは、ＥＢ＿Ｂ＿Ｆ３（配列番号１）、ＥＢ＿Ｂ＿Ｒ３（配列番号２）、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ（配列番号３）、ＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ（配列番号４）、ＥＢ＿ＢＬＰ＿Ｆ（配列番号１７）、ＥＢ＿Ｂ＿ＬＰ＿Ｒ（配列番号１８）であり、ＩＢ−ＤＦＯとしては、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ  ｐｒｉｍｅｒ配列にチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに変形し、この部位をＦＡＭレポーター染料に変形させ、３３ｍｅｒ間隔の位置のチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに変形し、この部位にＢＨＱ１クエンチャーを付着したＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２（配列番号５）を使用した。
【００８１】
前記ＩＢ−ＤＦＯオリゴヌクレオチドに対する等温核酸増幅反応は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｅａｃｈ、８Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＭＣＬＡＢ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＥＢ＿Ｂ＿Ｆ３とＥＢ＿Ｂ＿Ｒ３を０．２ｕＭ、ＥＢ＿Ｂ＿ＬＰ＿ＦとＥＢ＿Ｂ＿ＬＰ＿Ｒは０．８ｕＭを使用し、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰは１．２ｕＭ、ＥＢ＿Ｒ＿ＲＩＰは１．６ｕＭを混合物に添加し、本発明のＩＢ−ＤＦＯであるＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２は０．４ｕＭを混合物に追加した。エボラウイルスのＢｕｎｄｉｂｕｇｙｏ  Ｌ  ｓｅｇｍｅｎｔ（ｇｂ：ＦＪ２１７１６１、５２１ｂｐ）を遺伝子合成を通じて作製して、１×１０＾７、１×１０＾６、１×１０＾５、１×１０＾４、１×１０＾３、１×１０＾２、１×１０＾１、０  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎ濃度で使用した。等温核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光検出のために、６５℃で６０分間行い、１分単位でＣＦＸ−９６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）リアルタイム蛍光測定装備を使用して蛍光量を測定した。そして、終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）蛍光検出のために、６５℃で６０分間行った後、３０℃で１分ずつ１０ｃｙｃｌｅｓ反応して蛍光量を測定した。
【００８２】
図６は、ＩＢ−ＤＦＯを使用してプラスミドＤＮＡに対する低濃度区間の敏感度をリアルタイム蛍光測定を行った結果であって、１×１０＾７〜１×１０＾２  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎまで陽性検出を確認し、１×１０＾１及び０  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎは陰性検出と確認された。検出時間は、高濃度からそれぞれ６．２９分、８．０１分、９．１２分、１０．１２分、１１．７３分、１３．１７分として蛍光検出時間が観察された。
【００８３】
図７は、終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）蛍光検出の測定結果であって、リアルタイム蛍光測定の結果と同一に、１×１０＾７〜１×１０＾２  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎまで陽性検出を確認し、１×１０＾１及び０  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎは陰性検出と確認された。
【００８４】
図６及び図７の結果から、本発明のＩＢ−ＤＦＯを使用時に、リアルタイム及び終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）蛍光検出が鋳型の濃度によって同一に検出の有無を確認することができ、リアルタイム蛍光検出方法を使用する場合、ＬＡＭＰ核酸増幅反応時間を短縮させることができる。
【００８５】
実施例６：本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）を適用してＲＮＡ転写物（ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を鋳型としたＲＴ−ＬＡＭＰ等温核酸増幅蛍光検出効果の分析
【００８６】
本発明のＩＢ−ＤＦＯをＦＩＰの位置に添加使用してＲＮＡ転写物を鋳型としてＲＴ−ＬＡＭＰ等温核酸増幅反応による蛍光検出効果を観察するために、エボラウイルスのサブタイプのうちの１つであるＢｕｎｄｉｂｕｇｙｏのＬ  ｓｅｇｍｅｎｔ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）部位の配列に対してＲＴ−ＬＡＭＰ等温核酸増幅用の６種のプライマーをＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ  Ｖ４  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ／ｅｌａｍｐ４．０．０／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）で設計した。設計されたプライマーは、ＥＢ＿Ｂ＿Ｆ３（配列番号１）、ＥＢ＿Ｂ＿Ｒ３（配列番号２）、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ（配列番号３）、ＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ（配列番号４）、ＥＢ＿ＢＬＰ＿Ｆ（配列番号１７）、ＥＢ＿Ｂ＿ＬＰ＿Ｒ（配列番号１８）であり、ＩＢ−ＤＦＯとしては、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ  ｐｒｉｍｅｒ配列にチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに変形し、この部位をＦＡＭレポーター染料に変形させ、２５ｍｅｒ間隔の位置のチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに変形し、この部位にＢＨＱ１クエンチャーを付着したＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２．５（配列番号６）を使用した。
【００８７】
前記ＩＢ−ＤＦＯオリゴヌクレオチドに対する等温核酸増幅反応は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、５ｍＭ  ＤＴＴ、５Ｕ  ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）、１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｅａｃｈ、８Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＭＣＬＡＢ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＥＢ＿Ｂ＿Ｆ３とＥＢ＿Ｂ＿Ｒ３を０．２ｕＭ、ＥＢ＿Ｂ＿ＬＰ＿ＦとＥＢ＿Ｂ＿ＬＰ＿Ｒは０．８ｕＭを使用し、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰは１．４ｕＭ、ＥＢ＿Ｒ＿ＲＩＰは１．６ｕＭを混合物に添加し、本発明のＩＢ−ＤＦＯであるＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２．５は０．２ｕＭを混合物に追加した。エボラウイルスのＢｕｎｄｉｂｕｇｙｏ  Ｌ  ｓｅｇｍｅｎｔ（ｇｂ：ＦＪ２１７１６１，５２１ｂｐ）を遺伝子合成を通じてプラスミドＤＮＡ（ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ）を作製し、本プラスミドＤＮＡをＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎを通じてＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔを合成した。Ｂｕｎｄｉｂｕｇｙｏ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔを１×１０＾５、１×１０＾４、１×１０＾３、０  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎ濃度で使用した。等温核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光検出のために、６５℃で３０分間行い、１分単位でＣＦＸ−９６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）リアルタイム蛍光測定装備を使用して蛍光量を測定した。そして、終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）蛍光検出のために、６５℃で６０分間行った後、３０℃で１分ずつ１０ｃｙｃｌｅｓ反応して蛍光量を測定した。
【００８８】
図８は、ＩＢ−ＤＦＯを使用してＲＮＡ転写物（ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）に対するＲＴ−ＬＡＭＰ等温核酸増幅リアルタイム蛍光測定を行った結果であって、１×１０＾５〜１×１０＾３  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎまで陽性検出を確認し、Ｄ．Ｗを使用した０  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎは陰性検出と確認された。検出時間は、高濃度からそれぞれ８．７２分、１０．０３分、１０．９８分として蛍光検出時間が観察された。
【００８９】
図９は、終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）蛍光検出の測定結果であって、リアルタイム蛍光測定の結果と同一に１×１０＾５〜１×１０＾３  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎまで陽性検出を確認し、Ｄ．Ｗを使用した０  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎは陰性検出と確認された。
【００９０】
図８及び図９の結果から、本発明のＩＢ−ＤＦＯを使用してワンステップＲＴ−ＬＡＭＰ反応時に、リアルタイム及び終点（ｅｎｄ−ｐｏｉｎｔ）蛍光検出が鋳型の濃度によって同一に検出の有無を確認することができ、リアルタイム蛍光検出方法を使用する場合、ワンステップＲＴ−ＬＡＭＰ核酸増幅反応においても、ＤＮＡを使用するＬＡＭＰと同様に反応時間を短縮することができる。
【００９１】
実施例７：本発明のオリゴヌクレオチド（ＩＢ−ＤＦＯ）及び温度別（５５℃、６０℃、６５℃、７０℃）に設計されたクエンチャーを含むアンチセンスプローブ（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ｐｒｏｂｅ）を適用してプラスミドＤＮＡ（ｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ）を鋳型としたＬＡＭＰ等温核酸増幅蛍光検出効果の分析
【００９２】
本発明のＩＢ−ＤＦＯをＦＩＰの位置に添加し、ＩＢ−ＤＦＯのレポーター染料の配列から３‘末端まで相補的なアンチセンス（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ）配列を温度別（５５℃、６０℃、６５℃、７０℃）に設計して、アンチセンス配列の３’末端にクエンチャーを位置させてアンチセンスプローブを設計した。そして、ＩＢ−ＤＦＯをＲＩＰの位置に添加し、アンチセンスプローブを６０℃に設計した。これを使用して、プラスミドＤＮＡを鋳型としてＬＡＭＰ等温核酸増幅反応においてアンチセンスプローブの温度別の設計によるリアルタイム蛍光検出の効果を観察するために、エボラウイルスのサブタイプのうちの１つであるＢｕｎｄｉｂｕｇｙｏのＬ  ｓｅｇｍｅｎｔ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）部位の配列に対してＬＡＭＰ等温核酸増幅用の６種のプライマーをＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ  Ｖ４  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ．ｊｐ／ｅｌａｍｐ４．０．０／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）で設計した。設計されたプライマーは、ＥＢ＿Ｂ＿Ｆ３（配列番号１）、ＥＢ＿Ｂ＿Ｒ３（配列番号２）、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ（配列番号３）、ＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ（配列番号４）、ＥＢ＿ＢＬＰ＿Ｆ（配列番号１７）、ＥＢ＿Ｂ＿ＬＰ＿Ｒ（配列番号１８）であり、ＩＢ−ＤＦＯとしては、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ  ｐｒｉｍｅｒ配列にチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに変形し、この部位をＦＡＭレポーター染料に変形させ、２５ｍｅｒ間隔の位置のチミン（Ｔｈｙｍｉｎｅ）をｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴに変形し、この部位にＢＨＱ１クエンチャーを付着したＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２（配列番号５）を使用した。アンチセンスプローブは、５５℃に設計されたＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２＿Ｑ２＿５５（配列番号１９）、６０℃に設計されたＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２＿Ｑ２＿６０（配列番号２０）、６５℃に設計されたＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２＿Ｑ２＿６５（配列番号２１）、７０℃に設計されたＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２＿Ｑ２＿７０（配列番号２２）を使用した。そして、ＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ＿Ｐ２（配列番号８）のＩＢ−ＤＦＯに相補的なアンチセンスプローブを６０℃に設計したＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ＿Ｐ２＿Ｑ６０（配列番号２３）を使用した。
【００９３】
前記ＩＢ−ＤＦＯオリゴヌクレオチドに対する等温核酸増幅反応は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１．４ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｅａｃｈ、８Ｕ  Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＭＣＬＡＢ、ＣＡ、ＵＳＡ）、ＥＢ＿Ｂ＿Ｆ３とＥＢ＿Ｂ＿Ｒ３を０．２ｕＭ、ＥＢ＿Ｂ＿ＬＰ＿ＦとＥＢ＿Ｂ＿ＬＰ＿Ｒは０．４ｕＭを使用し、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰは１．２ｕＭ、ＥＢ＿Ｒ＿ＲＩＰは１．６ｕＭを混合物に添加し、本発明のＩＢ−ＤＦＯであるＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２  ０．４ｕＭとアンチセンスプローブ１．６ｕＭをＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２＿Ｑ２＿５５、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２＿Ｑ２＿６０、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２＿Ｑ２＿６５、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２＿Ｑ２＿７０をそれぞれ使用して混合物を製造した。そして、ＩＢ−ＤＦＯをＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ＿Ｐ２で０．４ｕＭ代替し、これに対するアンチセンスプローブであるＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ＿Ｐ２＿Ｑ＿６０を１．６ｕＭ混合し、ＩＢ−ＤＦＯであるＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２とＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ＿Ｐ２を０．４ｕＭずつ、ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２＿Ｑ２＿６０とＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ＿Ｐ２＿Ｑ＿６０を１．６ｕＭ混合した。エボラウイルスのＢｕｎｄｉｂｕｇｙｏ  Ｌ  ｓｅｇｍｅｎｔ（ｇｂ：ＦＪ２１７１６１、５２１ｂｐ）を遺伝子合成を通じて作製して、１×１０＾５、１×１０＾４、１×１０＾３  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎ濃度のプラスミドＤＮＡを使用した。等温核酸増幅反応に対するリアルタイム蛍光検出のために、６５℃で６０分間行い、１分単位でＡＢ７５００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）リアルタイム蛍光測定装備を使用して蛍光量を測定した。
【００９４】
図１０乃至図１３は、アンチセンスプローブ（Ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ｐｒｏｂｅ）を温度別に設計し、ＩＢ−ＤＦＯと共に使用して、ＬＡＭＰ等温核酸増幅リアルタイム蛍光測定を行った結果であって、５５℃で１×１０＾５〜１×１０＾３  ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎまでの検出時間は、高濃度からそれぞれ１３．４分、１５．３分、１８．４分として蛍光検出時間が観察された。６０℃は、それぞれ２０．３分、２２．７分、２４．６分に蛍光検出され、６５℃は、それぞれ４７．７分、４９．７分に検出され、１×１０＾３は検出されなかった。７０℃は、いずれも蛍光検出されなかった。蛍光量は、６０℃アンチセンスプローブに比べて、５５℃で約５０％程度であったが、検出時間は約６〜７分早く示された。
【００９５】
図１４に示されたように、Ｒｎ  ｖｓ  Ｍｉｎ（ｎｏｎ−ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）タイプの結果、５５℃アンチセンスプローブのｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｒｎが、６０℃アンチセンスプローブに比べて２倍高く示された。このように、アンチセンスプローブの設計温度に応じてｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｒｎ及びｄｅｌｔａ  Ｒｎを調節することができる。
【００９６】
図１５乃至図１７は、ＩＢ−ＤＦＯをＦＩＰ、またはＲＩＰ、またはＦＩＰ及びＲＩＰをそれぞれ使用し、これに対する６０℃アンチセンスプローブを含んで反応させた場合であり、ＦＩＰとＲＩＰをそれぞれ代替した場合、蛍光量は類似に示されたが、ＲＩＰのＩＢ−ＤＦＯがＦＩＰのＩＢ−ＤＦＯに比べて約１０分早く示された。
【００９７】
［配列リスト］
配列番号１：ＥＢ＿Ｂ＿Ｆ３
５’−ＧＴＧＴＧＴＴＣＡＡＧＴＡＣＡＧＣＡＴＴ−３’
配列番号２：ＥＢ＿Ｂ＿Ｒ３
５’−ＡＴＡＡＧＧＧＡＧＧＡＴＧＡＴＣＡＡＧＧ−３’
配列番号３：ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ
５’−ＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＡＧＡＴＧＴＴＴＡＴＣＴＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＡＴＴＡＴＴＴＴＧＡＴＡＧＣＣ−３’
配列番号４：ＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ
５’−ＴＡＣＡＴＴＡＡＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＴＴＴＣＣＧＣＴＧＡＴＡＧＡＡＴＴＣＣＣＡＣＡＡＴＡＡＧＴＣＴＴ−３’
配列番号５：ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２
５’−ＡＣＣＴＧＧ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＴＴＡＧＡＴＧＴＴＴＡＴＣＴＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＡＴＴＡＴＴＴ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴ−ＢＨＱ１）ＧＡＴＡＧＣＣ−３’
配列番号６：ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２．５
５’−ＡＣＣＴＧＧＴＧＴ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴ−ＦＡＭ）ＡＧＡＴＧＴＴＴＡＴＣＴＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＡＴ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴ−ＢＨＱ１）ＡＴＴＴＴＧＡＴＡＧＣＣ−３’
配列番号７：ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ３
５’−ＡＣＣＴＧＧＴＧＴＴＡＧＡ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴ−ＦＡＭ）ＧＴＴＴＡＴＣＴＧＡＧＧＣＣＡＡＡＣＡＴ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴ−ＢＨＱ１）ＡＴＴＴＴＧＡＴＡＧＣＣ−３’
配列番号８：ＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ＿Ｐ２
５’−ＴＡＣＡ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴ−ＦＡＭ）ＴＡＡＧＡＧＧＡＡＣＣＡＡＴＴＴＣＣＧＣＴＧＡＴＡＧＡＡＴ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴ−ＢＨＱ１）ＣＣＣＡＣＡＡＴＡＡＧＴＣＴＴ−３’
配列番号９：ＥＢ＿Ｒ＿Ｆ３
５’−ＧＣＣＴＣＡＣＡＡＴＧＴＴＡＡＴＣＴＴＡＧＣ−３’
配列番号１０：ＥＢ＿Ｒ＿Ｒ３
５’−ＧＡＴＴＧＴＣＴＣＣＣＡＴＧＡＣＣＧ−３’
配列番号１１：ＥＢ＿Ｒ＿ＦＩＰ
５’−ＣＣＴＣＴＡＴＧＣＣＴＣＣＴＡＡＧＴＧＣＣＡＡＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＧＡＡ−３’
配列番号１２：ＥＢ＿Ｒ＿ＲＩＰ
５’−ＧＡＴＴＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＡＣＴＴＡＡＡＡＣＣＡＧＴ−３’
配列番号１３：Ｒｅｓ＿ＬＰ
５’−ＧＧＴＡＣＧＡＡＣＴＣＧＧＧＣ−３’
配列番号１４：Ｒｅｓ＿ＲＬＰ
５’−ＴＧＴＧＣＡＣＡＡＡＴＣＴＣＣＴＴＡＧＴ−３’
配列番号１５：ＥＢ＿Ｒ＿ＦＩＰ＿Ｐ２
５’−ＣＣＴＣ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴ−ＦＡＭ）ＡＴＧＣＣＴＣＣＴＡＡＧＴＧＣＣＡＡＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＣＣ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴ−ＢＨＱ１）ＣＣＴＧＡＡ−３’
配列番号１６：ＥＢ＿Ｒ＿ＲＩＰ＿Ｐ２
５’−ＧＡＴ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴ−ＦＡＭ）ＡＣＡＡＣＡＡＡＡＡＣＴＧＴＧＧＡＣＧＡＧＣＴＧＡＴＣＧＴＡＡＣ（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄＴ−ＢＨＱ１）ＴＡＡＡＡＣＣＡＧＴ−３’
配列番号１７：ＥＢ＿Ｂ＿ＬＰ＿Ｆ
５’−ＡＴＴＡＣＡＣＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＴＴ−３’
配列番号１８：ＥＢ＿Ｂ＿ＬＰ＿Ｒ
５’−ＣＡＣＴＧＣＣＴＡＴＧＡＴＴＡＡＡＧＡＣＴ−３’
配列番号１９：ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２−Ｑ２＿５５
５’−ＣＣＴＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＴＣＴＡＡＣ−ＢＨＱ１−３’
配列番号２０：ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２−Ｑ２＿６０
５’−ＧＧＣＣＴＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＴＣＴＡＡＣ−ＢＨＱ１−３’
配列番号２１：ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２−Ｑ２＿６５
５’−ＴＧＴＴＴＧＧＣＣＴＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＴＣＴＡＡＣ−ＢＨＱ１−３’
配列番号２２：ＥＢ＿Ｂ＿ＦＩＰ＿Ｐ２−Ｑ２＿７０
５’−ＧＧＣＴＡＴＣＡＡＡＡＴＡＡＴＧＴＴＴＧＧＣＣＴＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＴＣＴＡＡＣ−ＢＨＱ１−３’
配列番号２３：ＥＢ＿Ｂ＿ＲＩＰ＿Ｐ２−Ｑ＿６０
５’−ＣＧＧＡＡＡＴＴＧＧＴＴＣＣＴＣＴＴＡ−ＢＨＱ１−３’
【図１】
2019522959.tif 000003
【図２】
2019522959.tif 000004
【図３】
2019522959.tif 000005
【図４】
2019522959.tif 000006
【図５】
2019522959.tif 000007
【図６】
2019522959.tif 000008
【図７】
2019522959.tif 000009
【図８】
2019522959.tif 000010
【図９】
2019522959.tif 000011
【図１０】
2019522959.tif 000012
【図１１】
2019522959.tif 000013
【図１２】
2019522959.tif 000014
【図１３】
2019522959.tif 000015
【図１４】
2019522959.tif 000016
【図１５】
2019522959.tif 000017
【図１６】
2019522959.tif 000018
【図１７】
2019522959.tif 000019
【国際調査報告】
2019522959.tif 000020
2019522959.tif 000021
2019522959.tif 000022
2019522959.tif 000023