(57)【要約】  体液の試料中の標的分析物の濃度を決定するための方法および装置が開示されている。該方法は、標的分析物を含めた体液の試料を提供するステップ、標的分析物の複数の同位体を含む構成成分の混合物を含めた内部標準溶液を提供するステップであって、各同位体の濃度が不明であるステップ、内部標準溶液を試料に添加するステップ、質量分析計の手段によって、内部標準溶液を含めた試料を分析するステップ、シグナル強度に基づく試料関数曲線を作成するステップであって、シグナル強度が自由裁量による単位を定義するステップ、試料関数曲線の手段によって、分析物シグナルを対応する自由裁量による分析物単位に変換するステップ、および自由裁量による単位に依存して濃度の曲線を表す標準化関数の手段によって、自由裁量による分析物単位を標的分析物の濃度に変換するステップを含む。【選択図】図１
2019516098.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液の試料中の標的分析物の濃度を決定するための方法であって：
−  標的分析物を含めた体液の試料を提供するステップと、
−  標的分析物の複数の同位体を含む構成成分の混合物を含めた内部標準溶液を提供するステップであって、各同位体の濃度が不明であるステップと、
−  内部標準溶液を試料に添加するステップと、
−  質量分析計の手段によって、内部標準溶液を含めた試料を分析するステップと、
−  シグナル強度に基づく試料関数曲線を作成するステップであって、シグナル強度が自由裁量による単位を定義するステップと、
−  試料関数曲線の手段によって、分析物シグナルを対応する自由裁量による分析物単位に変換するステップと、
−  自由裁量による単位に依存して濃度の曲線を表す標準化関数の手段によって、自由裁量による分析物単位を標的分析物の濃度に変換するステップと
を含む方法。
【請求項２】
標準化関数が、患者試料を分析する手段によって作成され、ここで、患者試料の各々は標的分析物の既知濃度を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者試料が内部標準溶液と混合される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
体液の試料が所定の体積で提供され、ここで、内部標準溶液は、体液の試料に所定の体積で添加される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
構成成分がシグナル強度に従ってランク付けされる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
構成成分が高い強度から低い強度へランク付けされる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
試料関数曲線が、自由裁量による単位に依存してシグナル強度をプロットすることに基づいて作成される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
試料関数曲線が、プロットされたシグナル強度からの算出の手段によって作成される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
標準化関数が多項式関数、指数関数または部分線形関数である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
患者試料が参照方法に従って測定される、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
標準化関数が標的分析物の型に依存する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
同位体が安定同位体である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
体液の試料および添加された内部標準溶液が、質量分析計の手段によって単一測定で分析される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
質量分析計および請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法を実施するように構成された制御ユニットを含む、体液の試料中の標的分析物の濃度を決定するための装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示方法は、体液の試料中の標的分析物の濃度を決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの生体医学およびヘルスケア用途において、血液、血漿、血清、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、または組織抽出物などの体液中の分析物の濃度の速やかな決定は、極めて重要である。伝統的に、こうした測定は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのイムノアッセイベースの技法を介して行われる。こうした技法は、試料内の標的分析物への抗体の選択的結合に依拠する。大部分のアッセイにおいて、比色の、蛍光定量的な、または放射活性ベースの検出システムに連結されている第２の抗体が使用されて、分析物−抗体複合体を検出する。
【０００３】
体液にイムノアッセイを実行できる多くの完全自動化装置が開発されており、病院および研究の場において共通して使用されている。これらのシステムは自動化および能力の利点を有する一方で、それらは著しい欠点も有する。例えば、各アッセイの特異性および選択性は、使用されている抗体と同様である。
【０００４】
より近年には、免疫吸着アッセイによって伝統的に分析される臨床および研究の場における定量的アッセイの多くは、質量分光分析ベースの技法によって分析されている。
質量分光分析に連結された液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳまたはＧＣ−ＭＳ）ベースの方法は、しばしば、本質的な特異性、非常に良好な精度および高い感受性により、絶対的な分析物定量化測定のためのゴールドスタンダードと考えられる。しかしながら、絶対的な定量化の品質は、測定されたシグナルを分析物濃度に変換するために使用される較正プロセスの品質に大きく依拠する。ＬＣ−ＭＳ定量化についての最先端の方法論は、安定同位体希釈の概念および参照標準から生成される外部較正線に依拠する。
【０００５】
安定同位体希釈は、同位体標識化分析物構造（ほとんど排他的に、重水素化されている、１３Ｃ標識化されている、１５Ｎ標識化されている）が試料調製プロセスにおいて可能な限りすぐに試料に添加されるプロセスである。それゆえに、試料は同位体標識で希釈される。同位体標識は、試料調製中および測定プロセス中に、試料中の標的分析物と同一の特性を有することが想定または検証される。そのため、該プロセスにおける任意のランダム誤差または系統誤差が、標的分析物および同位体標識化分析物に対して同等に影響することで、それらの濃度比は依然として同じである。同位体標識化分析物の追加の特色は、それが、標的分析物から別々に検出されるのを可能にする異なる質量（またはより正確には質量対電荷比）を有することである。そのため、該プロセスは、標的分析物（ＳＡ）から１つおよび同位体標識化分析物（Ｓｉｓｔｄ）から１つの、２つの非依存性シグナルをもたらす。分析物シグナルは、次いで、典型的にピーク面積比であるシグナル比を生成するために、プロセスを妨げていた可能性がある任意の系統誤差またはランダム誤差を調整するために、同位体標識化シグナルによって正規化される。この正規化プロセスは、全体精度を改善する。
【０００６】
外部較正プロセスは、既知濃度の標的分析物を含有する外部キャリブレーターに依拠し、これは、質量分光分析検出器応答が較正曲線の形態で記載されるのを可能にする。試験されるべき全ての試料と同様に、キャリブレーターも同じ量の同位体標識化分析物でスパイクされる。これは、シグナル比応答対分析物濃度が較正曲線上にプロットされるのを可能にする。
【０００７】
同位体標識化分析物でスパイクされた不明な試料は、シグナル比（シグナル分析物／シグナル同位体標識化分析物）を決定するために測定される。この正規化シグナル応答は、次いで、外部で生成された較正曲線を使用して濃度に変換される。
【０００８】
同位体希釈の原理に依拠する外部較正曲線は、１）同位体標識化分析物の量が、キャリブレーターおよび定量化されるべき不明な試料の全てにおいて同じく正確である場合、２）キャリブレーターのマトリックスと測定されるべき不明な試料のマトリックスとの間の機器応答に差異がない場合、ならびに３）外部較正の時点でのＭＳ応答が、該時点でのＭＳ応答と同じである場合にのみ妥当である。そのため、外部較正曲線が、不明な試料を定量化することが適当である定義寿命を有することは明らかである。この寿命は、上記の３つの態様がどのくらい良く制御されるかに依存する。該リスクは、多くの実験室開発のＬＣ−ＭＳ試験において新たな較正曲線が１日数回生成されるように較正頻度を増加させることによって、現在では最小化されている。一部の方法には、外部較正曲線が定量化に適当であることを確実にするために、あらゆる２０個の不明な試料と同じほどの新たな全７点外部較正が要求される。
【０００９】
較正頻度を増加させるという戦略は、測定時間を犠牲にしながらデータの品質および信頼を改善する。このモデルは、バッチ式アッセイのための臨床的環境において広く適応される一方で、ランダムアクセスにおいて多くの異なるアッセイを実行できる動的な多重システムを取り扱うことは、あまり適当でない。この場合における較正需要は、この種類の日常頻度で定期的再較正を可能にするには高すぎる。
【００１０】
較正頻度を低減するための１つの手法は、機器応答が各々およびあらゆる試料内に記載される内部較正の概念にシフトすることである。これは、外部キャリブレーターおよびコストがかかる外部較正時間の必要を完全に軽減する潜在性を有する。この場合において、安定同位体希釈手順は、同位体標識化分析物がキャリブレーターであるという追加の役割を割り当てられることを除いて同じである。これは、分析物シグナルを分析物比に変換するために濃度値を同位体標識化分析物に割り当てることに依拠する。分析物と同位体標識化分析物との間の機器応答における差異が、しばしば含まれる。
【００１１】
この場合において著しく異なるのは、機器応答が代用分析物（同位体標識化分析物）によって定義されることであり、このプロセスの妥当性には、分析物と同位体標識化分析物との間の相対的な機器応答が時間の経過により同じであることが要求される。同位体標識化分析物のＭＳ応答が、分析物のシグナル応答のそれに相対して変化するならば、内部較正応答は、もはや妥当でない。そのため、同位体標識化分析物応答を変化させることについてモニタリングおよび補正するための戦略も記載されており、これは、応答因子を組み込むことに依拠する。
【００１２】
ＷＯ２０１５／１０６１６９Ａ１は、単一の内部キャリブレーター点として単一の同位体標識化分析物を使用する内部較正方法を記載している。
内部較正方法によって提供される利点にもかかわらず、単一点内部較正の概念は、以下の欠点を有する：１）不明な試料における正確性は、単一の較正測定の信頼性に依存する、２）機器応答は、全測定範囲において常に正しく記載されるわけではない可能性がある、３）適切なｙ切片（ブランク値）をどのように定義するかの問題が取り組まれていない、４）内部キャリブレーターシグナルが決定され得ないならば、またはそれが外れ値であるならば、定量化は可能でない、ならびに５）精度は、分析物および単一の同位体標識化分析物が、全プロセスを介して互いにどれほど密接に追跡されるかに依存する。
【発明の概要】
【００１３】
これらの限界の全ては、内部較正を構築する際に、より多くの同位体標識化分析物を使用することによって解決することができる。現実には、この解決法は、異なる同位体標識化分析物の利用可能性の限界により、それの実際的な限界を有する。しかしながら、少なくとも１つの例において、２つの非依存性同位体標識化分析物の使用が内部較正について記載されている。これを超えて、異なる同位体標識化分析物に基づく多点内部較正のさらなる公共の記載は、我々の知る限りない。いくつかの異なって同位体標識化された分析物、例えば２Ｈ６および１３Ｃ３標識化分析物の合成は、極めてコストおよび時間がかかる。
【００１４】
「較正」という用語は、本明細書で使用される場合、試料の妥当な定量化を確実にするために機器応答と分析物濃度との間の関係を決定するプロセスを指す。
本明細書に開示されているのは、体液の試料中の標的分析物の濃度を決定するための方法である。体液の試料中の標的分析物の濃度を決定するための本開示方法の実施形態は、独立請求項の特色を有する。別々のやり方でまたは任意の自由裁量による組合せで実現することができる特別な実施形態は、従属請求項に開示されている。
【００１５】
以下において使用されている通り、「有する」、「含む」もしくは「含まれる」という用語、またはそれらの任意の自由裁量による文法的変化は、非排他的なやり方で使用される。したがって、これらの用語は両方とも、これらの用語によって導入される特色の他に、さらなる特色が、この文脈に記載されている実体に存在しない状況および１つまたは複数のさらなる特色が存在する状況を指すことができる。例として、「ＡはＢを有する」、「ＡはＢを含む」および「ＡにはＢが含まれる」の表現は両方とも、Ｂの他に、他の要素がＡに存在しない状況（即ち、Ａが唯一におよび排他的にＢからなる状況）、ならびにＢの他に、要素Ｃ、要素ＣおよびＤ、またはなおさらなる要素など、１つまたは複数のさらなる要素が実体Ａに存在する状況を指すことがある。
【００１６】
さらに、「少なくとも１つ」、「１つまたは複数」という用語、または特色もしくは要素が１回もしくは１回より多く存在し得ることを示す同様の表現は、典型的に、それぞれの特色または要素を導入する場合に１回だけ使用されることが留意されるべきである。以下において、大抵の場合、それぞれの特色または要素を指す場合、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」という表現は、それぞれの特色または要素が１回または１回より多く存在し得るという事実にもかかわらず反復されない。
【００１７】
さらに、以下において使用されている通り、「特に」、「さらに特に」、「具体的に」、「より具体的に」という用語または同様の用語は、代替の可能性を制限することなく、特別または代替実施形態（単数または複数）の特色と併せて使用される。本開示方法／システムは、当技術者が認識する通り、代替の特色を使用することによって行うことができる。同様に、「本開示方法／システムのある実施形態において」または同様の表現によって導入される特色は、代替実施形態に関していかなる制限もなく、本開示方法／システムの範疇に関していかなる制限もなく、および本開示方法／システムの他の任意選択または非任意選択の特色を有するこうしたやり方において導入される特色を組み合わせるという可能性に関していかなる制限もなく、追加および／または代替の特色であると意図される。
【００１８】
本開示方法によると、体液の試料中の標的分析物の濃度を決定するための方法が開示されている。該方法は、以下のステップを含む：
−  標的分析物を含めた体液の試料を提供するステップ、
−  標的分析物の複数の同位体を含む構成成分の混合物を含めた内部標準溶液を提供するステップであって、各同位体の濃度が不明であるステップ、
−  内部標準溶液を試料に添加するステップ、
−  質量分析計の手段によって、内部標準溶液を含めた試料を分析するステップ、
−  シグナル強度に基づく試料関数曲線を作成するステップであって、シグナル強度が任意の単位を定義するステップ、
−  試料関数曲線の手段によって、分析物シグナルを対応する自由裁量による分析物単位に変換するステップ、および
−  任意の単位に依存して濃度の曲線を表す標準化関数の手段によって、自由裁量による分析物単位を標的分析物の濃度に変換するステップ。
【００１９】
「標的分析物」という用語は、本明細書で使用される場合、濃度が決定されるべき目的の任意の分析物を指す。
「内部標準溶液」という用語は、本明細書で使用される場合、標的分析物と異なる分子量を有する構成成分の混合物を指す。内部標準溶液の同位体の濃度は不明であるが、最小シグナルと最大シグナルとの間の構成成分のシグナル強度を与えるように調整される。内部標準溶液は、体液などの複合体マトリクスにおける妥当なＬＣ−ＭＳ定量化に必須である。これは、標的分析物と理想的には同一の物質であり、分子質量においてのみ異なる。従来の質量分光分析を用いると、内部標準は、典型的に、分析物シグナル対内部標準シグナルの比、即ち、いわゆるピーク面積比に基づく正規化機器応答を生成するために使用される。本開示方法を用いると、内部標準溶液は、各々の試料における内部較正を可能にするための内部キャリブレーターとして使用される。これは、相対的応答因子が一定であることまたは相対的応答因子が外部標準を参照することによって補正されるという想定を必要とする。
【００２０】
「較正」という用語は、本明細書で使用される場合、試料の妥当な定量化を確実にするために機器応答と分析物濃度との間の関係を決定するプロセスを指す。
「構成成分」という用語は、本明細書で使用される場合、元素が、１種の化学物質由来の天然同位体分布の混合物および／または個々の同位体分布を有する２種以上の化学物質の混合物であり得る元素の混合物を指す。
【００２１】
「自由裁量による単位」という用語は、本明細書で使用される場合、互いに対する測定シグナル強度の関連を表現するのに適当な任意の単位を指す。
「標準化関数」という用語は、本明細書で使用される場合、内部標準溶液の各ロットについてかなり特定の関数を生成させるとともに自由裁量による単位に対する濃度の依存を記載する関数を指す。濃度は、ｍｍｏｌ／ｌまたはｍｇ／ｌなどのＳＩ単位における試料中の分析物濃度である。
【００２２】
本開示方法を用いると、内部標準溶液の構成成分の正確な濃度を調製する必要が回避され、これがコストおよび時間を節約する。むしろ、シグナル強度に起因する自由裁量による単位を標的分析物の濃度に変換するための鍵は、あらかじめ外部で提供されるとともに標的分析物の各型に対して特異的である標準化関数によって提供される。
【００２３】
標準化関数は、患者試料を分析する手段によって作成することができ、ここで、患者試料の各々は、既知濃度の標的分析物を含む。したがって、標準化関数が標的試料と同じ生物学的マトリックスから作成されることが確実にされる。そのため、標準化関数の作成のための標的試料および試料基盤内における同位体分布のいかなる変動も防止される。
【００２４】
患者試料は、内部標準溶液と混合することができる。したがって、患者試料は、標的試料と同じ同位体分布を含む。
体液の試料は、所定の体積で提供され得る。内部標準溶液は、体液の試料に所定の体積で添加することができる。したがって、同位体の濃度が不明であっても、内部標準溶液および試料の正確な比が提供される。それによって、自由裁量による単位から標的分析物のそれぞれの濃度への正確な算出は容易である。
【００２５】
構成成分は、シグナル強度に従ってランク付けすることができる。したがって、それぞれの構成成分の濃度が不明であっても、これらは、互いに相対的なそれらの定量に従って分類される。
【００２６】
例えば、構成成分は、高い強度から低い強度へランク付けされる。言うまでもなく、構成成分は、代替として、低い強度から高い強度へランク付けすることができる。
試料関数曲線は、自由裁量による単位に依存してシグナル強度をプロットすることに基づいて作成することができる。したがって、自由裁量による単位によって表現される自由裁量による濃度を表すさらなる値を試料関数曲線から引き出すことを可能にする、シグナル強度と自由裁量による単位との間の相関関係が提供される。
【００２７】
例えば、試料関数曲線は、プロットされたシグナル強度からの算出の手段によって作成される。
標準化関数は、多項式関数、指数関数または部分線形関数、例えば区分的線形関数であってよい。これらの関数は周知されており、したがって、本開示方法に簡便に統合することができる。
【００２８】
患者試料は、参照方法に従って測定することができる。したがって、標準化関数が再現性を増加させる標準化方法に基づくことが確実にされる。
標準化関数は、標的分析物の型に依存し得る。したがって、標準化関数は、それぞれの標的分析物に依存して信頼できる内部較正を確実にするそれぞれの標的分析物に適応される。
【００２９】
同位体は安定同位体であり得る。したがって、安定な測定結果が提供される。
体液の試料および添加された内部標準溶液は、質量分析計の手段によって単一測定で分析することができる。したがって、内部較正プロセスは、いかなる分析も遅延させないが分析と同時に実施される。
【００３０】
さらに、体液の試料中の標的分析物の濃度を決定するための装置が開示されている。該装置は、質量分析計、および本開示方法を実施するように構成された制御ユニットを含む。
【００３１】
本開示方法は、プログラムがコンピューターまたはコンピューターネットワーク上で実行される場合、本明細書に包含されている実施形態の１つまたは複数において本開示方法による方法を行うためのコンピューター実行可能指示を含めたコンピュータープログラムをさらに開示および提案する。具体的には、該コンピュータープログラムは、コンピューター可読データキャリアに格納することができる。したがって、具体的には、上記に示されている通りの方法ステップの１つ、１つより多く、または全てさえも、コンピューターまたはコンピューターネットワークを使用することによって、好ましくはコンピュータープログラムを使用することによって行うことができる。
【００３２】
本開示方法は、プログラムがコンピューターまたはコンピューターネットワーク上で実行される場合、本明細書に包含される実施形態の１つまたは複数において本開示方法／システムに従った方法を行うためにプログラムコード手段を有するコンピュータープログラム製品をさらに開示および提案する。具体的には、該プログラムコード手段は、コンピューター可読データキャリアに格納することができる。
【００３３】
さらに、本発明は、そこに格納されたデータ構造を有するデータキャリアを開示および提案し、これは、コンピューターまたはコンピューターネットワークに、例えばコンピューターまたはコンピューターネットワークのワーキングメモリまたはメインメモリにロードした後、本明細書に開示されている実施形態の１つまたは複数に従った方法を実行することができる。
【００３４】
本発明は、プログラムがコンピューターまたはコンピューターネットワーク上で実行される場合、本明細書に開示されている実施形態の１つまたは複数に従った方法を行うために機械可読キャリアに格納されたプログラムコード手段を有するコンピュータープログラム製品をさらに提案および開示する。本明細書で使用される場合、コンピュータープログラム製品は、取引可能な製品としてのプログラムを指す。該製品は、一般に、紙フォーマット中またはコンピューター可読データキャリア上などの自由裁量によるフォーマットに存在することができる。具体的には、該コンピュータープログラム製品は、データネットワーク上で頒布される。
【００３５】
最終的に、本発明は、本明細書に開示されている実施形態の１つまたは複数に従った方法を行うための、コンピューターシステムまたはコンピューターネットワークによって可読の指示を含有する変調データシグナルを提案および開示する。
【００３６】
好ましくは、本発明のコンピューター実装態様を参照して、本明細書に開示されている実施形態の１つまたは複数に従った方法の方法ステップの１つもしくは複数または方法ステップの全てさえも、コンピューターまたはコンピューターネットワークを使用することによって行うことができる。したがって、一般に、データの提供および／または操作を含めて、方法ステップのいずれも、コンピューターまたはコンピューターネットワークを使用することによって行うことができる。一般に、これらの方法ステップには、試料を提供することおよび／または実際の測定を行うためのある特定の態様など、典型的には手作業を必要とする方法ステップを除いて、方法ステップのいずれもが含まれ得る。
【００３７】
具体的には、本開示方法は、以下をさらに開示する：
−  少なくとも１つのプロセッサーを含むコンピューターまたはコンピューターネットワーク、ここでプロセッサーは、この明細書に記載されている実施形態の１つに従った方法を実行するように適応される、
−  データ構造がコンピューター上で実行されている間、この明細書に記載されている実施形態の１つに従った方法を行うように適応される、コンピューターロード可能なデータ構造、
−  コンピュータープログラム、ここでコンピュータープログラムは、プログラムがコンピューター上で実行されている間、この明細書に記載されている実施形態の１つに従った方法を行うように適応される、
−  コンピュータープログラムがコンピューターまたはコンピューターネットワーク上で実行されている間、この明細書に記載されている実施形態の１つに従った方法を行うためのプログラム手段を含むコンピュータープログラム、
−  先行する実施形態に従ったプログラム手段を含むコンピュータープログラム、ここでプログラム手段は、コンピューターに可読の記憶媒体に格納される、
−  記憶媒体、ここでデータ構造は、記憶媒体に格納され、ならびにここでデータ構造は、コンピューターまたはコンピューターネットワークの主記憶および／または作業用記憶にロードされた後、この明細書に記載されている実施形態の１つに従った方法を行うように適応される、ならびに
−  プログラムコード手段を有するコンピュータープログラム製品、ここでプログラムコード手段は、プログラムコード手段がコンピューターまたはコンピューターネットワーク上で実行されるならば、この明細書に記載されている実施形態の１つに従った方法を行うため、記憶媒体に格納することができるまたは格納される。
【００３８】
本開示方法および装置の所見を要約すると、以下の実施形態が開示される：
実施形態１：以下を含む体液の試料中の標的分析物の濃度を決定するための方法：
−  標的分析物を含めた体液の試料を提供するステップ、
−  標的分析物の複数の同位体を含む構成成分の混合物を含めた内部標準溶液を提供するステップであって、各同位体の濃度が不明であるステップ、
−  内部標準溶液を試料に添加するステップ、
−  質量分析計の手段によって、内部標準溶液を含めた試料を分析するステップ、
−  シグナル強度に基づく試料関数曲線を作成するステップであって、シグナル強度が自由裁量による単位を定義するステップ、
−  試料関数曲線の手段によって、分析物シグナルを対応する自由裁量による分析物単位に変換するステップ、および
−  自由裁量による単位に依存して濃度の曲線を表す標準化関数の手段によって、自由裁量による分析物単位を標的分析物の濃度に変換するステップ。
実施形態２：標準化関数が患者試料を分析する手段によって作成され、ここで、患者試料の各々は既知濃度の標的分析物を含む、実施形態１に従った方法。
実施形態３：患者試料が内部標準溶液と混合される、実施形態２に従った方法。
実施形態４：体液の試料が所定の体積で提供され、ここで内部標準溶液は、体液の試料に所定の体積で添加される、実施形態１から３のいずれか１つに従った方法。
実施形態５：構成成分がシグナル強度に従ってランク付けされる、実施形態１から４のいずれか１つに従った方法。
実施形態６：構成成分が高い強度から低い強度へランク付けされる、実施形態５に従った方法。
実施形態７：試料関数曲線が、自由裁量による単位に依存してシグナル強度をプロットすることに基づいて作成される、実施形態１から６のいずれか１つに従った方法。
実施形態８：試料関数曲線が、プロットされたシグナル強度からの算出の手段によって作成される、実施形態７に従った方法。
実施形態９：標準化関数が多項式関数、指数関数または部分線形関数である、実施形態１から８のいずれか１つに従った方法。
実施形態１０：患者試料が参照方法に従って測定される、実施形態１から９のいずれか１つに従った方法。
実施形態１１：標準化関数が標的分析物の型に依存する、実施形態１から１０のいずれか１つに従った方法。
実施形態１２：同位体が安定同位体である、実施形態１から１１のいずれか１つに従った方法。
実施形態１３：体液の試料および添加された内部標準溶液が、質量分析計の手段によって単一測定で分析される、実施形態１から１２のいずれか１つに従った方法。
実施形態１４：質量分析計、および実施形態１から１３のいずれか１つに従った方法を実施するように構成された制御ユニットを含む、体液の試料中の標的分析物の濃度を決定するための装置。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
本発明のさらなる特色および実施形態は、実施形態の後続の記載において、好ましくは従属請求項と併せて、より具体的に開示される。そこにおいて、それぞれの特色は、別々の様式で、ならびに任意の自由裁量による実行可能な組合せで、技術者が実現する通りに、実現することができる。実施形態は、図において模式的に図示されている。そこにおいて、これらの図における同一の参照数字は、同一の要素または機能的に同一の要素を指す。
【００４０】
図において：
【図１】体液の試料中の標的分析物の濃度を決定するための装置を示す図である；
【図２】分子量に依存したシグナル強度のグラフを示す図である；
【図３】自由裁量による単位に依存したシグナル強度のグラフを示す図である；
【図４】自由裁量による単位に依存した濃度のグラフを示す図である；
【図５】濃度に依存したシグナル強度のグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
図１は、体液の試料１０２中の標的分析物Ａの濃度Ｃａを決定するための装置１００を模式的に示す。標的分析物Ａはテストステロンであってよい。体液は血液であってよい。装置１００は、質量分析計１０４および制御ユニット１０６を含む。制御ユニット１０６は、体液の試料１０２中の標的分析物Ａの濃度Ｃａを決定するための方法を実施するように構成されている。この目的のため、制御ユニット１０４は質量分析計１０２と連動する。該方法は、下記でさらに詳細に説明される通りに実施される。
【００４２】
基本的に、体液の試料１０２が提供される。例えば、患者からの血液が提供される。さらに、内部標準溶液１０８が提供される。内部標準溶液１０８としては、標的分析物の複数の同位体を含む構成成分Ｎ１からＮｎの混合物が挙げられる。同位体は、それらの分子量が異なる。特に、同位体は安定同位体である。各同位体の濃度は不明である。内部標準溶液１０８は、試料１０２に添加される。体液の試料１０２は、２５ｍｌなどの所定の体積で提供され、内部標準溶液１０８は、５ｍｌなどの所定の体積で体液の試料１０２に添加される。引き続いて、内部標準溶液１０８を含めた試料１０２は、質量分析計１０４の手段によって分析される。特に、体液の試料１０２および添加された内部標準溶液１０８は、質量分析計１０４の手段によって単一測定で分析される。次いで、シグナル強度に基づく試料関数曲線１１０は、後文でさらに詳細に説明される通りに作成される。
【００４３】
図２は、分子量に依存するシグナル強度のグラフを示す。構成成分は、シグナル強度に従ってランク付けされる。構成成分は、高い強度から低い強度へランク付けされる。例えば、内部標準溶液１０８は、図２において４種の構成成分Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４を含む。構成成分Ｎ１は分子量ＭＷ１を含み、構成成分Ｎ２は分子量ＭＷ２を含み、構成成分Ｎ３は分子量ＭＷ３を含み、および構成成分Ｎ４は分子量ＭＷ４を含む。分析された構成成分Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４は、シグナル強度Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４をもたらす。
【００４４】
図３は、自由裁量による単位に依存するシグナル強度のグラフを示す。シグナル強度Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４は、自由裁量による単位Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４を定義する。試料関数曲線１１０は、自由裁量による単位Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４に依存してシグナル強度Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４をプロットすることに基づいて作成される。特に、試料関数曲線１１０は、プロットされたシグナル強度Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４からの算出の手段によって作成される。例えば、試料関数曲線１１０は、自由裁量による単位Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４の補間の手段によって作成される。標的分析物ＡもシグナルＳＡをもたらす。分析物シグナルＳＡは、試料関数曲線１１０の手段によって対応する自由裁量による分析物単位ＵＡに変換される。言い換えると、シグナルＳＡはｙ軸上にプロットされる。この出発点から、ｘ軸に平行な想像線が引かれ、試料関数曲線１１０との迎合点をもたらす。この迎合点から、ｙ軸に平行な想像線が引かれ、ｘ軸上の結び付けられた値は、自由裁量による分析物単位ＵＡをもたらす。図３に示されている例において、自由裁量による分析物単位ＵＡは、１．６の自由裁量による単位Ｕ、即ち１．６Ｕに対応する。
【００４５】
図４は、自由裁量による単位に依存する濃度のグラフを示す。このグラフは、自由裁量による単位Ｕに依存して濃度ＣＡ１からＣＡｎの曲線を表す標準化関数１１２である。標準化関数１１２は、患者試料を分析する手段によって作成され、ここで、患者試料の各々は、既知濃度ＣＡ１からＣＡｎの標的分析物Ａを含む。患者試料は内部標準溶液１０８と混合されていることが留意されるべきである。標準化関数１１２は、標的分析物Ａの型に依存する。そのため、標準化関数１１２は、多項式関数、指数関数または部分線形関数である。標準化関数１１２を生成させるために、患者試料は参照方法に従って測定される。図４に示されている例において、患者試料は、４つの既知濃度ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、ＣＡ４の標的分析物Ａを含み、ここで、各濃度ＣＡ１、ＣＡ２、ＣＡ３、ＣＡ４は、自由裁量による単位Ｕ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４の対応する量と結び付けられる。
【００４６】
図５は、濃度に依存するシグナル強度のグラフを示す。標準化関数１１２の手段によって、標準溶液１０８を含めた分析試料１０２のシグナル強度Ｓは、濃度Ｃ１からＣｎに変換することができ、グラフ１１４をもたらす。次いで、自由裁量による分析物単位ＵＡは、標準化関数１１２の手段によって標的分析物Ａの濃度ＣＡに変換される。言い換えると、シグナルＳＡはｙ軸上にプロットされる。この出発点から、ｘ軸に平行な想像線が引かれ、グラフ１１４との迎合点をもたらす。この迎合点から、ｙ軸に平行な想像線が引かれ、ｘ軸上の結び付けられた値は、標的分析物Ａの濃度ＣＡをもたらす。
【００４７】
本発明の方法は、以下の実施例に基づいてさらに詳細に記載される。実施例は、質量分光分析に連結された液体クロマトグラフィーの手段によって調製した。
液体クロマトグラフィーのための装置として、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（高速液体クロマトグラフィー−ＨＰＬＣ）システムを利用することで、質量分光分析の手段による検出の前に、分析物を血清構成成分から分離した。移動相Ａは、水中０．１％のギ酸との２ｍＭの酢酸アンモニウムであり、移動相Ｂは、９５％アセトニトリルおよび５％水中０．１％のギ酸との２ｍＭの酢酸アンモニウムであった。該カラムには、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｋｉｎｅｔｅｘ  ２．６ｕ  Ｆ５  １００Ａ、１５０×２．１ｍｍ（００Ｆ−４７２３−ＡＮ）を使用した。以下の線形の段階的勾配プログラムを適用した：１．５分で９７％Ａ／３％Ｂから９５％Ａ／５％Ｂへ、０．３分で５０％Ａ／５０％Ｂへ、３．０分で０％Ａ／１００％Ｂへ、１．５分間均一濃度、０．１分で９７％Ａ／３％Ｂへの戻り、および１．１分間平衡化。合計実行時間は７．４分であった。カラムオーブンを４０℃で調節し、試料を８℃でオートサンプラー内にて冷却した。注入体積は５μｌであり、針を８０％メタノールおよび２０％水で５秒間フラッシュポート内にて洗浄した。
【００４８】
質量分析計は、Ｓｅｌｅｘｉｏｎ  ＦＡＩＭＳモジュールを有するＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＱＴｒａｐ  ６５００  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＬ２７４２１４０９）であった。イオン源は、正および負の極性について以下の等しいソースパラメータを有するターボスプレーＥＳＩ（ＥＳＩ−エレクトロスプレーイオン化法）であった：温度３００℃、カーテンガス３０ｐｓｉ、イオンスプレー電位±４３００Ｖ、イオン源ガス１６０ｐｓｉ、イオン源ガス２３０ｐｓｉおよび衝突ガス媒体。Ｓｅｌｅｘｉｏｎを以下の条件下で操作した：温度低い、モディファイヤーなし、分離電圧３５００Ｖ、および解像度増強オープン（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｐｅｎ）。
【００４９】
実施例の分析物を表１に示す。各分析物を、最適な質量分光分析電圧設定、即ちクラスター分離電位、衝突エネルギー、入口電位、出口セル電位および補償電圧について調整した。以下の多重反応モニタリング推移を獲得し、異なる内部標準関数に割り当てた。同位体、または内部標準（ＩＳ）に対応する多重反応モニタリング推移は、外部較正手法のための内部標準として使用される。該内部較正手法のために、内部標準の全ての他の同位体を含めた。
【００５０】
【表１】
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【００５１】
ストック分析物溶液を、メタノール、イソプロパノールまたは水のいずれかの適当な溶媒中で、より高い濃度にて調製した。スパイク試料を次いで、ストック溶液をビタミンＤ除去ヒト血清中に希釈することによって調製することで、１００％と定義されている最も高い濃縮試料を獲得した。この希釈標準溶液から、表２に示されている通り希釈液としてビタミンＤ除去ヒト血清を使用して希釈標準溶液２％〜１００％を範囲として、７つの較正標準（Ｃａｌ１からＣａｌ７）および２０品質管理試料（Ｍ０１からＭ２０）を調製した。ここにおいて、希釈標準溶液は％で示されており、試料濃度はｎｇ／ｍｌで示されている。
【００５２】
【表２】
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【００５３】
内部標準混合物は、表２に示されている１００％試料Ｃａｌ７よりも１０倍高い濃度で調製される。各試料１００μｌを１．５ｍｌのエッペンドルフカップ中に、続いて、同位体標識化内部標準１０μｌを添加することによって、試料を処理した。試料を１０分間３７℃で混合した。次いで、アセトニトリル１５０μｌを添加することで、血清タンパク質を沈殿させた。試料を次いで１０分間２５℃でボルテックスし、続いて、４℃〜８℃で１時間インキュベーションした。上澄みおよそ１５０μｌを単離し、試料を３０分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離した後にＨＰＬＣバイアルに移した。１５０μｌの水を添加することによって、試料をさらに希釈した。次いで、試料５μｌをＬＣ−ＭＳ分析のために注入した。各試料を４回分析することで、中間精度を決定した。
【００５４】
品質対照試料Ｍ０１からＭ２０を、外部較正の原理に従って定量化した。全７点較正を構築し、１／ｘ重み付けを使用して線形曲線とフィットさせた。このデータ評価は、本開示による内部多点較正が比較されるべき最先端技術手法と考えられる。
【００５５】
品質対照試料Ｍ０１からＭ２０を、上に記載されている通りの内部標準の同位体クラスターに基づく内部較正の原理に従って定量化した。内部較正点の数は、分析物に基づく３から５の間で変動した。単一の分析物較正標準を使用して、同位体の濃度を最初に標準化した。これについて、較正標準Ｃａｌ５を選択したが、それが標的測定範囲の真ん中を表すからである。線形の１／ｘ重み付け関数を使用して、個々の同位体のシグナル強度を、それらの濃度に対してフィットさせた。上記分析物のこのように調製された内部標準の結果として得られた同位体分布を表３から１０に示す。
【００５６】
【表３】
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【００５７】
【表４】
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【００５８】
【表５】
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【００５９】
【表６】
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【００６０】
【表７】
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【００６１】
【表８】
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【００６２】
【表９】
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【００６３】
【表１０】
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【００６４】
表３から１０において、左から第１の欄は、イオンとして表示されるそれぞれの同位体を示す。左から第２の欄は、同位体の分子量を示す。左から第３の欄は、参照物質存在率として表示されている参照物質の同位体の相対的含有量を示す。左から第４の欄は、上に記載されているおよび標識化物質存在率として表示されている通りに調製された標識化物質の同位体の相対的含有量を示す。
【００６５】
それぞれ表３から１０に表示されている通りの参照物質および内部標準、それらの商標、およびそれぞれの供給源を表１１に示す。
【００６６】
【表１１】
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【００６７】
表３から１０からわかる通り、一連の同位体標識化分析物がうまく実現および利用されることで、ＬＣ−ＭＳ分析に基づく内部較正を行うことができる。同位体標識化内部標準は、実際に、天然同位体分布によりまたは合成変更によってのいずれかで、それぞれ、多くの異なる同位体構造および同位体クラスターの分布であることは明らかである。表３から１０に示されている通りのこの分布は、あらゆる単一小分子において明らかであり、小分子を合成的に標識化する場合にも依然として存在する。個々の同位体は全て、独特の存在率または濃度を有することも明らかである。
【００６８】
外部較正に基づくとともに内部多点較正を含めた本開示方法に基づく分析物の試料Ｍ０１からＭ２０の測定結果を、表１２から２０に示す。
【００６９】
【表１２】
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【００７０】
【表１３】
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【００７１】
【表１４】
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【００７２】
【表１５】
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【００７３】
【表１６】
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【００７４】
【表１７】
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【００７５】
【表１８】
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【００７６】
【表１９】
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【００７７】
【表２０】
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【００７８】
表１２から２０において、左から第１の欄は分析物を示す。左から第２の欄は試料を示す。左から第３の欄は、外部較正に従ってｎｇ／ｍｌで測定濃度を示す。左から第４の欄は、外部較正に従って変動のパーセント係数で精度を示す。第５の欄は、内部多点較正を含めた本開示方法に従ってｎｇ／ｍｌで測定濃度を示す。左から第６の欄は、内部多点較正を含めた本開示方法に従って変動のパーセント係数で精度を示す。左から第７の欄は、外部較正に対する、内部多点較正を含めた本開示方法に従った正確性を示す。
【００７９】
表１２から２０からわかる通り、分析物の同位体は、本開示方法に組み込まれる多点内部較正を行うための内部キャリブレーターとして使用することができる。データは、内部較正が、最先端技術の７点外部較正と同等の精度および正確性を有する結果を生成することを示す。示された９つの異なる分析物の実施例は、外部較正および本開示方法に従った分析性能が同等であることを明らかにする。本開示方法に含まれる内部較正は、充分な標準化に単一較正標準だけしか必要ないので、較正標準およびそれらの測定の必要を低減する。
【００８０】
同位体濃度および存在率は、それぞれ、２つの異なる合成内部標準を混合することによって調整することができることが留意されるべきである。例えば、一方が重水素化されるとともに他方が１３Ｃである２つの異なる内部標準標識は、異なる組成物中で一緒に混合されることで、個々の同位体の分布をカスタマイズすることができる。したがって、同位体分布は、異なる組成物中で一緒に２つの異なる標識化物質を混合することによってテーラーメイドすることができる。そのため、内部較正の較正点から所望の濃度にカスタマイズすることが可能である。
【符号の説明】
【００８１】
参照数字のリスト
１００  装置
１０２  試料
１０４  質量分析計
１０６  制御ユニット
１０８  標準溶液
１１０  試料関数曲線
１１２  標準化関数
１１４  グラフ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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