(57)【要約】  本発明は、持続型ヒト成長ホルモン結合体の液状製剤及びその製造方法に関する。
2019500390.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ヒト成長ホルモン（Human Growth Hormone、hGH）と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体、及び（ｉｉ）緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤、及び保存剤を含有し、等張化剤を含有しないことを特徴とするアルブミン−非含有安定化剤を含む、持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項２】
前記持続型ヒト成長ホルモン結合体は、ヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体を通じて連結されるか、組換え技術を利用してヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が連結される、融合タンパク質の形態である、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項３】
前記非ペプチド性重合体がポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸、polylactic acid）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸、polylactic-glycolic acid）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項４】
前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコールである、請求項２に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項５】
前記緩衝溶液は、クエン酸緩衝溶液または酢酸緩衝溶液である、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項６】
前記緩衝溶液のｐＨの範囲が４．０〜７．０である、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項７】
前記糖アルコールがマンニトール、スクロース、及びソルビトールからなる群から選択された一つ以上である、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項８】
前記糖アルコールの濃度が液状製剤の総体積に対して１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）である、請求項１又は請求項７に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項９】
前記非イオン性界面活性剤がポリソルベートまたはポロキサマーである、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項１０】
前記非イオン性界面活性剤の濃度が液状製剤の総体積に対して０．００１％（ｗ／ｖ）〜０．１％（ｗ／ｖ）である、請求項１又は９に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項１１】
前記保存剤がｍ−クレゾール、フェノール、及びベンジルアルコールからなる群から選択される１つ以上である、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項１２】
前記保存剤の濃度が液状製剤の総体積に対して０．０１％〜１．０％（ｗ／ｖ）である、請求項１又は１１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項１３】
前記液状製剤は、多回投与用である、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項１４】
前記液状製剤において持続型ｈＧＨ結合体の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項１５】
前記安定化剤が糖類、多価アルコール及びアミノ酸で構成された群から選択された一つまたはそれ以上の成分をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項１６】
前記ｈＧＨは、天然型ｈＧＨと同一なアミノ酸を有するｈＧＨ、天然型ｈＧＨのアミノ酸が変異されたｈＧＨまたは天然型ｈＧＨと類似した活性を示すペプチド類似体である、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項１７】
前記持続型ｈＧＨ結合体液状製剤は、（ｉ）ヒト成長ホルモン（Human Growth Hormone、hGH）と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体、及び（ｉｉ）緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤、及び保存剤からなるアルブミン−非含有安定化剤を含む、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項１８】
前記緩衝溶液はクエン酸緩衝溶液であり、糖アルコールはマンニトールであり、界面活性剤はポリソルベート８０であり、保存剤はｍ−クレゾール、フェノール及びベンジルアルコールからなる群から選択された、請求項１又は１７に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項１９】
前記免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭに由来した、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項２０】
前記免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項２１】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、同一な起源のドメインからなる短鎖免疫グロブリンで構成された二量体または多量体である、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項２２】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項２３】
下垂体性小人症、成長ホルモン欠乏症、プラダー・ウィリー症候群または特発性低身長の治療のためのものである、請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤。
【請求項２４】
請求項１に記載の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤の製造方法であって、ヒト成長ホルモン（Human Growth Hormone、 hGH）と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体を緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤、及び保存剤と混合する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、持続型ヒト成長ホルモン結合体の液状製剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト成長ホルモン（Human Growth Hormone、hGH、以下「ｈＧＨ」として引用される）は、ヒトの下垂体から生成される１９１個のアミノ酸で構成された分子量約２２，０００のポリペプチドホルモンであり、主に小児における下垂体性小人症の治療に使用されている。従来は、ヒトの下垂体から抽出したｈＧＨが使用されたが、その量が制限され、治療を受けることができる人が極めて制限された。また、下垂体から抽出したｈＧＨを使用した患者の一部で致命的神経疾患であるクロイツフェルト・ヤコブ（Creutzfeldt-Jacob）病が発生した例が報告され、このような下垂体から抽出したｈＧＨの使用は中止された。最近では、遺伝子工学技術が発展するにつれて大腸菌、酵母などからｈＧＨの生産に成功し、このような遺伝子工学の方法で生産された組換えｈＧＨ製剤は、毒性及び臨床試験を経て１９８５年以降に諸国で許可を得て市販されている。
【０００３】
ｈＧＨのようなポリペプチドは、一般に安定性が低いため、容易に変性され、血液中のタンパク質加水分解酵素により分解され、腎臓や肝臓を通じて容易に除去されるので、薬理成分としてポリペプチドを含むタンパク質医薬品の血中濃度及び力価を維持するためには、タンパク質の薬物を患者に頻繁に投与する必要がある。しかし、大部分注射剤の形で患者に投与されるタンパク質医薬品の場合、活性ポリペプチドの血中濃度を維持するために頻繁に注射を打つことは、患者に苦痛を引き起こすようになる。このような問題を解決するために、タンパク質薬物の血中安定性を増加させ、血中薬物濃度を長時間高く持続させて薬効を極大化しようとする努力が続けられてきた。このようなタンパク質薬物の持続性製剤は、タンパク質薬物の安定性を高めると同時に、薬物自体の力価が十分に高く維持されなければならず、患者に免疫反応を誘発しないことが望ましい。
【０００４】
一方、活性減少の最小化と安定性の増加を同時に実現する持続性タンパク質薬物製剤として、免疫グロブリンＦｃ領域、非ペプチド性重合体及び生理活性ポリペプチドを結合させて製造した結合体が大韓民国登録特許第１０−０５６７９０２号（特許文献１）及び大韓民国登録特許第１０−０７２５３１５号（特許文献２）など、本出願人によって開示されている。
【０００５】
前記方法で生理活性ポリペプチドとしてｈＧＨを適用させて持続型ｈＧＨ結合体を製造することができるが、持続型ｈＧＨ結合体が含まれた薬物を製品として供給するためには、貯蔵、輸送の過程で光、熱、または添加剤内の不純物により誘導された劣化による変性、凝集、吸着、または加水分解などの物理化学的な変化を抑制しつつ生体内の効力を維持させることが必須である。持続型ｈＧＨ結合体は、ポリペプチド上のｈＧＨに比べて体積が大きくなり、分子量が増加し、ポリペプチド上のｈＧＨに比べ製剤として安定化するのに非常に困難である。
【０００６】
製薬産業において、液状でのタンパク質の安定性が問題となり、タンパク質を凍結乾燥する方法によりこのような安定性の問題を解決しようとする試みがあった。しかし、凍結乾燥されたタンパク質製剤は長期間安定性を維持するという利点を有するが、注射時に溶解補助剤で再構成しなければならないという不便が伴い、溶解補助剤で再構成するとき、若しくは凍結乾燥過程中に重合体などの生成により多少活性が消失し、凍結乾燥過程にコスト及び時間がかかるという問題がある。
【０００７】
安定した液状ｈＧＨ製剤を開発するためには、脱アミド化、重合体の形成及び酸化過程による分解産物の生成速度調節など、ｈＧＨの分解様相を調節することが重要である。
【０００８】
液剤の温度、ｐＨ、添加剤などが分解産物の生成速度に影響を及ぼすが、現在までの全てのタンパク質を安定化させて臨床に適用できるようにする組成は現在まで知られておらず、特定のタンパク質で安定化効果を示す液状組成は、他のタンパク質の安定化には適用できないことが多い。この目的のためのタンパク質、具体的にｈＧＨタンパク質の液状での安定性を向上させるために、タンパク質の特異分解産物の生成速度を最小限に抑えることのできる因子及び添加剤の選定、並びにそれらの組み合わせが広範囲に先行される必要があることが当業界で知られている。
【０００９】
また、異なるタンパク質は、それらの化学的差異により、貯蔵中に異なる比率及び異なる条件下で徐々に不活性化することがある。すなわち、安定化のために用いられる物質による貯蔵期間延長効果は他のタンパク質に対して同等でなく、これにより、  貯蔵安定性を付与するために用いられる安定化剤は、標的タンパク質の物理化学的特性に応じて好適な比率、濃度及び種類が様々である。安定化剤を併用すると、互いの競争作用及び副作用により、目的と異なる逆効果をもたらすことがある。また、貯蔵中に貯蔵タンパク質の性質や濃度が変化するので、異なる効果を示すことがある。よって、溶液中のタンパク質を安定化するためには、多くの努力と注意を要する。
【００１０】
特に、生体内持続性及び安定性を向上させた持続型ｈＧＨ結合体の場合、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された形態であるので、分子量及び体積が一般的なヒト成長ホルモンと明確に異なるため、タンパク質を安定化するための特別な組成が求められる。また、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域はそれぞれ物理化学的特性が異なるので、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域を同時に安定化しなければならない。しかし、前述したように、異なるペプチド又はタンパク質は、それらの物理化学的性質の違いにより、貯蔵中に異なる比率及び異なる条件下で徐々に不活性化することがある。また、それぞれのペプチド又はタンパク質に好適な安定化剤を併用すると、互いの競争作用及び副作用により、目的と異なる逆効果をもたらすことがある。また、貯蔵中に貯蔵タンパク質の性質や濃度が変化するので、異なる効果を示すことがある。よって、持続型ｈＧＨ結合体の場合、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域を同時に安定化できる安定化剤の組成の探索に多くの困難が伴う。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】大韓民国登録特許第１０−０５６７９０２号公報
【特許文献２】大韓民国登録特許第１０−０７２５３１５号公報
【特許文献３】国際特許公開ＷＯ９７／３４６３１号公報
【特許文献４】国際特許公開ＷＯ９６／３２４７８号公報
【特許文献５】大韓民国登録特許第１０−０７２５３１５号公報
【特許文献６】米国特許公開第２０１３−０２８８３３３号公報
【特許文献７】大韓民国公開特許第１０−２０１０−００６７７９６号公報
【特許文献８】大韓民国公開特許第１０−２０１５−００３５６８１号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】H.Neurath、RLHill、The Proteins、Academic Press、New York、1979
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、持続型ｈＧＨ結合体をウイルス汚染の恐れなく長期間保管できるように、安定性を向上させてタンパク質沈殿を減少させる組成の探索に鋭意努力した結果、等張化剤を含まずに、緩衝溶液、糖アルコール、及び非イオン性界面活性剤を含む安定化剤を用いることにより、新規な持続型ｈＧＨ結合体の安定性を増大させ、経済的で安定的な液状製剤を製造することができることを確認し、また、前記液状製剤は、追加の保存剤を含む場合でも、持続型ｈＧＨ結合体の高い安定性を維持することができる多回の使用が可能な液状製剤を提供できることを確認し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一つの目的は、持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体、及び緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤、及び保存剤を含有するアルブミン−非含有安定化剤を含む、持続型ｈＧＨ結合体液状製剤を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、前記持続型ｈＧＨ結合体液状製剤の製造方法を提供することにある。
【００１６】
本発明のもう一つの目的は、前記持続型ｈＧＨ結合体液状製剤の下垂体性小人症、成長ホルモン欠乏症、プラダー・ウィリー症候群または特発性低身長の治療用途を提供することにある。
【００１７】
本発明のもう一つの目的は、前記持続型ｈＧＨ結合体液状製剤を投与する段階を含む、下垂体性小人症、成長ホルモン欠乏症、プラダー・ウィリー症候群または特発性低身長の治療方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１８】
本発明に係る持続型ｈＧＨ結合体の製剤は、ヒト血清アルブミン及び人体に潜在的に有害な因子を含まないため、ウイルス感染の恐れがなく、ｈＧＨと免疫グロブリンＦｃ領域の結合で構成され、天然型に比べて分子量が大きく、生理活性期間が増大した持続型ｈＧＨ結合体に対して優れた保存安定性を提供する。また、保存剤を含み多回の使用が可能な安定的な液状製剤を提供することができる。このような本発明の液状製剤は、単純な剤形で、優れた保存安定性を示し、他の安定化剤や凍結乾燥製剤に比べて経済的な提供が可能な製剤である。また、通常のｈＧＨ製剤に比べて人体内でのタンパク質活性を長期間維持することができ、効率的な薬物製剤として用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１ａ−１ｂ】本発明に係る多回の投与のための保存剤を含む液状製剤が低濃度持続型ｈＧＨ結合体の安定性に及ぼす影響を実験した結果である。図１ａ及び１ｂは、それぞれ４℃及び２５℃で保管した後、ＩＥ−ＨＰＬＣを通じて分析したグラフであり、ＩＥ−ＨＰＬＣ（％）は（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ  Ａｒｅａ％）であり、初期の結果値に比べた低濃度持続型ｈＧＨ結合体の残存率を示す。その結果、保存剤としてｍ−クレゾール、フェノール、またはベンジルアルコールが含まれるとき、そうでない場合と比較して有意な安定性の差がないことが分かった。
【図２ａ−２ｂ】それぞれ、前記図１の液状製剤に基づいて多回の投与のために追加される保存剤が高濃度持続型ｈＧＨ結合体の安定性に及ぼす影響を実験した結果である。４℃及び２５℃で保管した後、ＩＥ−ＨＰＬＣを通じて分析したグラフであり、ＩＥ−ＨＰＬＣ（％）は（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ  Ａｒｅａ％）であり、初期の結果値に比べた高濃度持続型ｈＧＨ結合体の残存率を示す。図１ａ及びｂの結果と同様に保存剤が含まれるとき、そうでない場合と比較して有意な安定性の差がないことが分かった。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明を具現するための一つの態様は、（ｉ）持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体、及び（ｉｉ）緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤、及び保存剤を含有するアルブミン−非含有安定化剤を含む、持続型ｈＧＨ結合体液状製剤である。
【００２１】
一つの具体例として、前記アルブミン−非含有安定剤は、等張化剤、例えば塩化ナトリウムを含まないことを特徴とする。
【００２２】
他の具体例として、前記持続型ヒト成長ホルモン結合体は、ヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン結合体であることを特徴とする。
【００２３】
他の具体例として、前記持続型ヒト成長ホルモン結合体は、ヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体を通じて連結されたり、組換え技術を利用して、ヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が連結された融合タンパク質の形態であることを特徴とする。
【００２４】
他の具体例として、前記非ペプチド性重合体がポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸、polylactic acid）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸、polylactic-glycolic acid）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、及びこれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする。
【００２５】
他の具体例として、前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコールであることを特徴とする。
【００２６】
他の具体例として、前記緩衝溶液は、クエン酸緩衝溶液または酢酸緩衝溶液であることを特徴とする。
【００２７】
他の具体例として、前記緩衝溶液のｐＨの範囲が４．０〜７．０であることを特徴とする。
【００２８】
他の具体例として、前記糖アルコールがマンニトール、スクロース、及びソルビトールからなる群から選択された一つ以上であることを特徴とする。
【００２９】
他の具体例として、前記糖アルコールの濃度が液状製剤の総体積に対して１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする。
【００３０】
他の具体例として、前記非イオン性界面活性剤がポリソルベートまたはポロキサマーであることを特徴とする。
【００３１】
他の具体例として、前記非イオン性界面活性剤の濃度が液状製剤の総体積に対して０．００１％（ｗ／ｖ）〜０．１％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする。
【００３２】
他の具体例として、前記保存剤がｍ−クレゾール、フェノール、及びベンジルアルコールからなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする。
【００３３】
他の具体例として、前記保存剤の濃度が液状製剤総体積に対して０．０１％〜１．０％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする。
【００３４】
他の具体例として、前記液状製剤は、多回投与用であることを特徴とする。
【００３５】
他の具体例として、前記液状製剤で持続型ｈＧＨ結合体の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする。
【００３６】
他の具体例として、前記安定化剤が糖類、多価アルコール及びアミノ酸で構成された群から選択された一つまたはそれ以上の成分をさらに含むことを特徴とする。
【００３７】
他の具体例として、前記ｈＧＨは、天然型ｈＧＨと同一なアミノ酸を有するｈＧＨ、天然型ｈＧＨのアミノ酸が変異されたｈＧＨまたは天然型ｈＧＨと類似した活性を示すペプチド類似体であることを特徴とする。
【００３８】
他の具体例として、前記持続型ｈＧＨ結合体液状製剤は、（ｉ）ヒト成長ホルモン（Human Growth Hormone、hGH）と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体、及び（ｉｉ）緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤、及び保存剤からなるアルブミン−非含有安定化剤を含むことを特徴とする。
【００３９】
他の具体例として、前記緩衝溶液はクエン酸緩衝溶液であり、糖アルコールはマンニトールであり、界面活性剤はポリソルベート８０であり、保存剤はｍ−クレゾール、フェノール及びベンジルアルコールからなる群から選択されたことを特徴とする。
【００４０】
他の具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域がＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭに由来したことを特徴とする。
【００４１】
他の具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインがＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、及びＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドであることを特徴とする。
【００４２】
他の具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、同一な起源のドメインからなる短鎖免疫グロブリンで構成された二量体または多量体であることを特徴とする。
【００４３】
他の具体例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト非グリコシル化ＩｇＧ４  Ｆｃ領域であることを特徴とする。
【００４４】
他の具体例として、前記製剤は、下垂体性小人症、成長ホルモン欠乏症、プラダー・ウィリー症候群または特発性低身長の治療のためのものであることを特徴とする。
【００４５】
本発明を具現するための他の態様は、ヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン結合体を緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤、及び保存剤と混合する段階を含む、前記持続型ｈＧＨ結合体液状製剤の製造方法である。
【００４６】
本発明を具現するための他の態様は、前記持続型ｈＧＨ結合体液状製剤の下垂体性小人症、成長ホルモン欠乏症、プラダー・ウィリー症候群または特発性低身長の治療用途である。
【００４７】
本発明を具現するための他の態様は、前記持続型ｈＧＨ結合体液状製剤を投与する段階を含む、下垂体性小人症、成長ホルモン欠乏症、プラダー・ウィリー症候群または特発性低身長の治療方法である。
【００４８】
本発明を具現するための一つの態様は、（ｉ）ヒト成長ホルモン（Human Growth Hormone、hGH）と免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体、及び（ｉｉ）緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤、及び保存剤を含有するアルブミン−非含有安定化剤を含む、持続型ｈＧＨ結合体液状製剤を提供する。
【００４９】
まず、液状製剤に含まれる持続型ｈＧＨ結合体及びその構成成分について下記に詳しく説明する。一方、本願で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本願で開示された多様な要素のすべての組み合わせが本発明の範囲に属する。
【００５０】
本発明において、用語、「持続型ヒト成長ホルモン結合体」とは、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）とキャリアが連結された形態のタンパク質であり、天然型ヒト成長ホルモンに比べて生理活性持続期間が増加された特徴を有する結合体を言う。具体的には、生理活性ペプチドであるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に免疫グロブリンＦｃ領域が連結された形態のタンパク質であってもよい。
【００５１】
ここで、前記キャリアは、免疫グロブリンＦｃ領域、アルブミン、トランスフェリン、及びＰＥＧで構成された群から選択されてもよく、具体的には、免疫グロブリンＦｃ領域であるが、これに制限されるものではない。
【００５２】
本発明において、用語「持続型」とは、生理活性持続期間が天然型に比べて増大されたことを意味するものであり、「結合体」とは、ｈＧＨとキャリアが結合された形態をいう。
【００５３】
具体的には、前記持続型ヒト成長ホルモン結合体は、ヒト成長ホルモンとキャリア、具体的には、免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体を通じて連結されたり、組換え技術を利用してヒト成長ホルモンとタンパク質の形態のキャリア、具体的には、免疫グロブリンＦｃ領域が連結された融合タンパク質の形態であってもよいが、これに制限されない。前記融合タンパク質の形態である場合には、ペプチドリンカーを通じてヒト成長ホルモンとタンパク質の形態のキャリア、具体的には免疫グロブリンＦｃ領域が連結された形態も本発明の範囲に含まれる。
【００５４】
本発明では、前記ｈＧＨは、天然型ｈＧＨと同一なアミノ酸を有するｈＧＨ、天然型ｈＧＨのアミノ酸が変異されたｈＧＨまたは天然型ｈＧＨと類似した活性を示すペプチド類似体をすべて含む概念である。前記変異の例としてはｈＧＨを構成するアミノ酸の置換、除去、または挿入などが挙げられるが、これらに限定されず、前記の変化はｈＧＨの生物学的活性に大きく影響を及ぼさない範囲内で行うことができる。
【００５５】
また、前記ｈＧＨは、天然または組換え起源のいずれも可能であるが、具体的には、微生物を宿主細胞として利用して生産された組換えｈＧＨであってもよいが、これに制限されない。前記微生物の例として大腸菌が挙げられるが、これに制限されない。
【００５６】
前記ｈＧＨの配列はＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなど公知となったデータベースから取得することができ、ｈＧＨの活性を示す限り、天然型と７０％、具体的には８０％、より具体的には９０％、さらにより具体的には９５％、最も具体的には９８％以上の相同性を有することができる。
【００５７】
本発明において、用語、「非ペプチド性重合体」とは、繰り返し単位が一つ以上結合された生体適合性重合体を意味する。前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく、任意の共有結合を介して相互に連結される。本発明では、前記非ペプチド性重合体は、非ペプチド性リンカーと混用して使用することができる。
【００５８】
前記非ペプチド性重合体は、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸、polylactic acid）とＰＬＧＡ（ポリ乳酸−グリコール酸、polylactic-glycolic acid）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、及びそれらの組み合わせで構成された群から選択することができ、具体的には、ポリエチレングリコールであるが、これに制限されない。また、前記非ペプチド性重合体は、当該分野において既に公知となったこれらの誘導体及び当該分野の技術水準で容易に製造することができる誘導体も本発明の範疇に含まれる。
【００５９】
既存のインフレーム・フュージョン（inframe fusion）法で製造された融合タンパク質で使用されたペプチド性リンカーの欠点は、生体内でタンパク質分解酵素によって容易に切断され、キャリアによる活性薬物の血中半減期の増加効果を期待するほど得ることができないということである。しかし、タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体を使用する場合、キャリアと類似した水準のペプチドの血中半減期を維持することができる。したがって、非ペプチド性重合体は、前記のような役割、すなわち、生体内タンパク質分解酵素に抵抗性のある重合体であれば制限なく使用することができる。非ペプチド性重合体の分子量は、１〜１００ｋＤａの範囲、具体的に１〜２０ｋＤａの範囲であってもよいが、これらに限定されるものではない。また、前記免疫グロブリンＦｃ領域と結合される本発明の非ペプチド性重合体は、一種類の重合体だけでなく、異なる種類の重合体の組み合わせが使用されてもよい。
【００６０】
本発明において、「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）と軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）と重鎖不変領域３（ＣＨ３）部分を意味し、重鎖不変領域にヒンジ（hinge）部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等か改善された効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域のみを除き、一部または全体の重鎖不変領域１（ＣＨ１）及び／または軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。また、ＣＨ２及び／またはＣＨ３に該当する非常に長い、いくつかのアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメイン、５）１つまたは２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。
【００６１】
これらの免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリン全体分子に比べて相対的に分子量が少ないため、結合体の製造、精製、及び収率の面で有利であるのみならず、アミノ酸配列が抗体ごとに異なり、高い非均質性を示すＦａｂ部分が除去されるため、物質の同質性が大幅に増加して血液中の抗原性の誘発可能性も低くなる効果が期待できる。
【００６２】
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体（mutant）を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはそれらの組み合わせにより異なる配列を有することを意味する。例えば、ＩｇＧ  Ｆｃの場合、結合に重要であると知られた２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番のアミノ酸残基を変形のために適当な部位として利用することができる。
【００６３】
また、ジスルフィド結合を形成することができる部位が除去されるか、または天然型ＦｃからＮ末端の一部のアミノ酸が除去されるか、または天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されるなど、多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能（effector function）をなくすために、補体結合部位、例えば、Ｃ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（antibody dependent cell mediated cytotoxicity）部位が除去されてもよい。そのような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、国際特許公開ＷＯ９７／３４６３１（特許文献３）、国際特許公開ＷＯ９６／３２４７８（特許文献４）などに開示されている。
【００６４】
分子の活性を全体的に変更させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野において公知となっている（H.Neurath、RLHill、The Proteins、Academic Press、New York、1979（非特許文献１））。最も一般的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、糖化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファルネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）及びアミル化（amidation）などで修飾（modification）することもできる。
【００６５】
前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同一な生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどの構造的安定性を増大させた誘導体である。
【００６６】
また、そのようなＦｃ領域は、ヒト、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、またはモルモットピックなどの動物の生体内から分離した天然型から得ることもでき、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組換えまたはその誘導体であってもよい。ここで、天然型から獲得する方法は、全体の免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して獲得する方法であってもよい。パパインを処理する場合には、ＦａｂとＦｃに切断され、ペプシンを処理する場合には、ｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）2に切断される。これをサイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いてＦｃまたはｐＦ’ｃを分離することができる。具体的には、ヒト由来のＦｃ領域を微生物から収得した組換え免疫グロブリンＦｃ領域であるが、これに制限されない。
【００６７】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖または糖鎖が除去された形態であってもよい。そのような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法及び微生物を利用した遺伝子工学的方法のような通常の方法を用いることができる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）との結合力が著しく低下し、抗体−依存性細胞毒性または補体−依存性細胞毒性が減少または除去されるため、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点で、薬物のキャリアとしての本来の目的により合致する形態は、糖鎖が除去されたり非グリコシル化された免疫グロブリンＦｃ領域であると言える。
【００６８】
本発明において、「糖鎖の除去（Deglycosylation)」とは、酵素で糖を除去したＦｃ領域を意味し、非グリコシル化（Aglycosylation）とは、原核動物、好ましくは大腸菌で生産されてグリコシル化されていないＦｃ領域を意味する。
【００６９】
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト起源、又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、具体的には、ヒト起源であるが、これに限定されない。
【００７０】
また、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭに由来またはそれらの組み合わせ（combination）またはそれらのハイブリッド（hybrid）によるＦｃ領域であってもよい。具体的には、ヒト血液中の最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭに由来であり、より具体的には、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることと公知となったＩｇＧ由来である。
【００７１】
一方、本発明において「組み合わせ（combination）」とは、二量体または多量体を形成する際に、同一起源の短鎖免疫グロブリンＦｃ領域を暗号化するポリペプチドが異なる起源の短鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。即ち、ＩｇＧ  Ｆｃ、ＩｇＡ  Ｆｃ、ＩｇＭ  Ｆｃ、ＩｇＤ  Ｆｃ及びＩｇＥのＦｃ断片からなるグループから選択された２つ以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
【００７２】
本発明において、「ハイブリッド（hybrid）」とは、短鎖の免疫グロブリンＦｃ領域内に２つ以上の異なる起源の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、様々な形態のハイブリッドが可能である。即ち、ＩｇＧ  Ｆｃ、ＩｇＭ  Ｆｃ、ＩｇＡ  Ｆｃ、ＩｇＥ  Ｆｃ及びＩｇＤ  ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４からなるグループから１つ〜４つのドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジを含むことができる。
【００７３】
一方、ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のサブクラスに分けることができ、本発明では、そのような組み合わせ、またはそのような混成化も可能である。具体的には、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであり、最も具体的には補体依存毒性（CDC、Complement dependent cytotoxicity）などのエフェクター機能（effector function）がほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域である。
【００７４】
より具体的な本発明の薬物のキャリア用免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域である。ヒト由来のＦｃ領域は、ヒト生体で抗原として作用し、これに対する新たな抗体を生成するなどの望ましくない免疫反応を引き起こす可能性がある非ヒト由来のＦｃ領域に比べて好ましい。
【００７５】
本発明で使用される持続型ｈＧＨ結合体は、天然または組換え起源の任意の方法で製造されたｈＧＨと、天然ＩｇＧを、特定のタンパク質分解酵素で処理したり、組換え技術を用い、形質転換細胞から製造した免疫グロブリンＦｃ領域を互いに結合させることにより製造してもよい。この時に使用される結合方法として、ｈＧＨと免疫グロブリンＦｃ領域を非ペプチド性重合体を用いて架橋結合させたり、組換え技術を用いてｈＧＨと免疫グロブリンＦｃ領域が連結された形態の融合タンパク質として製造してもよい。
【００７６】
本発明で使用される持続型ｈＧＨ結合体の製造のために大韓民国登録特許第１０−０７２５３１５号（特許文献５、免疫グロブリン断片を利用したタンパク質の結合体及びその製造方法）または米国特許公開第２０１３−０２８８３３３号（特許文献６）などの明細書の全文が本明細書の参考文献として含まれる。
【００７７】
以下では、前記持続型ｈＧＨ結合体の液状製剤の組成について具体的に述べる。前述したように、本願で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本願で開示された多様な要素のすべての組み合わせが本発明の範囲に属する。
【００７８】
本発明において、用語、「持続型ｈＧＨ結合体液状製剤」とは、持続型ｈＧＨ結合体を含む液状製剤を意味する。前記液状製剤は、液状の内用製剤及び外用製剤の両方を含む概念である。本発明において、前記持続型ｈＧＨ結合体液状製剤は、治療学的有効量の持続型ｈＧＨ結合体を含むことができ、一般に、ｈＧＨの治療学的有効量は、１回用バイアル（single-use vial）内に約１〜３ｍｇ程度が含有された量であるが、これに制限されない。
【００７９】
本発明の液状製剤に含まれる持続型ｈＧＨ結合体の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬ、具体的には、１ｍｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬ、より具体的には１０〜５８．５ｍｇ／ｍＬであってもよいが、これに限定されない。本発明の前記持続型ｈＧＨ結合体液状製剤は、持続型ｈＧＨ結合体が低濃度で存在する場合だけでなく、高濃度で存在する場合でも、結合体を沈殿させずに安定的に保存することができ、安定的に生体内に高濃度のｈＧＨを供給することができる。
【００８０】
本発明の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤は、薬理学的有効量の持続型ｈＧＨ結合体、及びアルブミン−非含有安定化剤を含む。
【００８１】
本発明において、用語、「安定化剤」とは、持続型ｈＧＨ結合体が安定して貯蔵できるようにする成分を含む物質（agent）を意味する。持続型ｈＧＨ結合体のようなタンパク質において、保存安定性は、正確な投与量を確保するためだけでなく、持続型ｈＧＨ結合体の凝集体のような抗原性物質の潜在的な生成を抑制するために重要である。
【００８２】
前記安定化剤は、緩衝溶液、糖アルコール、及び非イオン性界面活性剤を含有することが好ましく、さらに保存剤を含むことができる。より具体的には、前記安定化剤は、緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤、及び保存剤として必須で構成されたものであってもよいが、これに限定されない。また、前記安定化剤は、塩化ナトリウムのような等張化剤を含まないものであってもよいが、これに限定されない。
【００８３】
緩衝溶液は、持続型ｈＧＨ結合体が安定するように溶液製剤のｐＨが急激に変化しないように溶液のｐＨを維持させる役割をする。
【００８４】
前記緩衝溶液は、アルカリ塩（ナトリウムまたはカリウムリン酸塩またはこれらの水素または二水素塩）、ナトリウムシトレート／クエン酸（クエン酸ナトリウム／クエン酸）、酢酸ナトリウム／酢酸をはじめとして当業界に公知となった任意の他の製薬上許容可能なｐＨ緩衝剤を含むことができ、それら緩衝剤の混合物も使用することができる。
【００８５】
本発明の目的のために、より好ましい前記緩衝溶液は、酢酸またはクエン酸緩衝溶液（例えば、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム）であり、より好ましくはクエン酸緩衝溶液である。
【００８６】
酢酸またはクエン酸緩衝溶液を構成する酢酸塩及びクエン酸塩の濃度は、具体的には、１ｍＭ〜１００ｍＭであり、より具体的には、３ｍＭ〜１００ｍＭであるが、これに制限されない。
【００８７】
緩衝溶液のｐＨは、具体的には４．０〜８．０、更に具体的には４．０〜７．０であるが、これに制限されない。
【００８８】
糖アルコールは、持続型ｈＧＨ結合体の安定性を増大させる役割を行うことができる。
【００８９】
本発明に使用される糖アルコールの濃度は、具体的には、全体の液状製剤に比べ１％〜２０％（ｗ／ｖ）、より具体的には１％〜１０％（ｗ／ｖ）であるが、これに制限されるものではない。
【００９０】
前記糖アルコールは、特にこれに限定されないが、マンニトール、スクロース、及びソルビトールからなる群から選択された一つ以上を用いることができ、具体的にはマンニトールまたはソルビトール、より具体的にはマンニトールを用いることができる。
【００９１】
非イオン性界面活性剤は、タンパク質溶液の表面張力を下げて疎水性表面にタンパク質が吸着されたり凝集することを防止する。
【００９２】
本発明に用いられる非イオン性界面活性剤の具体的な例としては、ポリソルベート系非イオン性界面活性剤及びポロキサマー系非イオン性界面活性剤などが挙げられ、これらを一つ以上の組み合わせの形で用いてもよく、その中でもポリソルベート系非イオン性界面活性剤がより好ましいが、これに限定されない。
【００９３】
ポリソルベート系非イオン性界面活性剤の例としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、及びポリソルベート８０などがあり、その中でもとりわけポリソルベート８０が好ましいが、これらに限定されるものではではない。
【００９４】
本発明の溶液剤形には、前記非イオン性界面活性剤が、具体的には０．１％（ｗ／ｖ）以下の低濃度、更に具体的には０．００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）であるが、これに制限されるものではない。
【００９５】
本発明の前記安定化剤は、アルブミンを含有しないことが好ましい。タンパク質の安定化剤として用いられるヒト血清アルブミンは、人体の血液から製造されるので、ヒト由来の病原性ウイルスによる汚染の可能性が存在し、ゼラチンやウシ血清アルブミンは、疾患を引き起こしたり、一部の患者にアレルギー反応を引き起こす可能性がある。本発明のアルブミン非含有安定化剤は、ヒト又は動物由来の血清アルブミンや精製されたゼラチンなどの異種タンパク質を含有しないので、ウイルス感染の恐れがない。
【００９６】
また、本発明の前記安定化剤は、糖類、多価アルコール又は中性アミノ酸をさらに含むことができる。
【００９７】
持続型ｈＧＨ結合体の保存安定性を向上させるためにさらに含まれる糖類及び多価アルコールのうち、糖類の具体的な例としては、マンノース、グルコース、フルクトース及びキシロースなどの単糖類と、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース及びデキストランなどの多糖類などが挙げられ、多価アルコールの具体的な例としては、プロピレングリコール、低分子量のポリエチレングリコール、グリセロール、低分子量のポリプロピレングリコールなどが挙げられ、これらを単独で用いてもよく、２つ以上組み合わせて用いてもよい。
【００９８】
一方、本発明の持続型ｈＧＨ結合体液状製剤は、前記説明した結合体、緩衝溶液、糖アルコール、及び非イオン性界面活性剤以外に、多回投与用製剤の微生物汚染の防止を目的として保存剤をさらに含むことができる。
【００９９】
本発明の用語「保存剤」とは、抗菌剤として作用するために、製薬製剤に添加される化合物を意味し、このような保存剤としては、ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ−クレゾール、ρ−クレゾール、クロロクレゾール、塩化ベンザルコニウム、フェニル水銀酸硝酸塩、チメロサール、安息香酸などを使用することができるが、これに制限されるものではない。
【０１００】
これらの保存剤は、１種単独で使用したり、２種以上を任意に組み合わせて使用することができる。具体的には、本発明の液状製剤は、保存剤としてｍ−クレゾール、フェノール、及びベンジルアルコールのうち１種以上を含むことができる。本発明の液状製剤において、保存剤は０．０１％〜３％（ｗ／ｖ）の量で含まれてもよく、より具体的には０．１％〜１．０％（ｗ／ｖ）の量で含まれてもよいが、これに限定されない。
【０１０１】
本発明の具体的な一実施例では、本発明の液状製剤に保存剤としてフェノール、ｍ−クレゾール、及びベンジルアルコールを０．１％〜１．０％（ｗ／ｖ）含み、各保存剤が持続型ｈＧＨ結合体の安定性に及ぼす影響を評価した結果、持続型ｈＧＨ結合体の沈殿が起こらず結合体の安定性が維持されることを確認できた。
【０１０２】
したがって、前記した安定化剤に加えて保存剤をさらに含む、本発明の新規な持続型ｈＧＨ結合体の液状製剤は、多回の投与のために使用することができる。
【０１０３】
本発明の液状製剤には、前記説明した緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤、及び保存剤に加えて、本発明の効果を損なわない範囲内で当業界において公知となったその他の成分ないし物質を選択的にさらに含むこともできる。
【０１０４】
前記液状製剤は、より具体的に、（ｉ）ｈＧＨと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ｈＧＨ結合体、及び（ｉｉ）緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤、及び保存剤からなるアルブミン−非含有安定化剤を含むものであってもよいが、これに制限されない。
【０１０５】
ここで、前記緩衝溶液はクエン酸緩衝溶液であり、糖アルコールはマンニトールであり、界面活性剤はポリソルベート８０であり、保存剤はｍ−クレゾール、フェノール及びベンジルアルコールからなる群から選択されたものであってもよい。
【０１０６】
また、前記液状製剤は、より具体的には、持続型ｈＧＨ結合体の濃度が１０．０ｍｇ／ｍＬの〜５８．５ｍｇ／ｍＬである場合、ｐＨ５．２である２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、４％のマンニトール、０．００５％のポリソルベート８０、及び保存剤としてｍ−クレゾール、フェノール、またはベンジルを含むものであってもよい。
【０１０７】
また、前記製剤は、下垂体性小人症、成長ホルモン欠乏症、プラダー・ウィリー症候群または特発性低身長の治療のためのものであってもよい。即ち、薬学的組成物に該当することができる。
【０１０８】
もう一つの様態として、本発明は、前記液状製剤の製造方法を提供する。
【０１０９】
前記液状製剤と、これを構成する成分については、先に記述した通りである。
【０１１０】
前記製造方法は、ヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ヒト成長ホルモン結合体を緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤、及び保存剤と混合する段階を含むことができる。
【０１１１】
より具体的には、前記製造方法は、持続型ｈＧＨ結合体を製造する段階、及び前記段階で製造された持続型ｈＧＨ結合体を緩衝溶液、糖アルコール、及び非イオン性界面活性剤を含む安定化剤と混合する段階を含むことができる。また、前記安定化剤に加えて保存剤をさらに混合することにより多回の使用のための安定持続型ｈＧＨ結合体液状製剤を製造することができる。
【０１１２】
本発明の実施例によれば、緩衝溶液として、クエン酸ナトリウム、糖アルコールとしてマンニトール、界面活性剤としてポリソルベート８０、及び保存剤としてｍ−クレゾール、フェノール、またはベンジルアルコールを含む安定化剤は、低濃度及び高濃度持続型ｈＧＨ結合体で沈殿を誘発せずに安定性を提供する安定化剤であることを示した。即ち、１０〜５８．５ｍｇ／ｍＬの持続型ｈＧＨ結合体において沈殿なしに安定した液状製剤を作ることができることを確認した。
【０１１３】
もう一つの様態として、本発明は、（ｉ）ｈＧＨと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ｈＧＨ結合体、及び（ｉｉ）緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤、及び保存剤を含むアルブミン−非含有安定化剤を含む、前記持続型ｈＧＨ結合体液状製剤の下垂体性小人症、成長ホルモン欠乏症、プラダー・ウィリー症候群または特発性低身長の治療用途を提供する。
【０１１４】
前記液状製剤と、これを構成する成分については、先に記述した通りである。
【０１１５】
ｈＧＨを含む前記持続型ｈＧＨ結合体液状製剤は、前記下垂体性小人症、成長ホルモン欠乏症、プラダー・ウィリー症候群または特発性低身長症の症状が改善、予防または治療効果を有することができる。
【０１１６】
もう一つの様態として、本発明は、（ｉ）ｈＧＨと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された持続型ｈＧＨ結合体、及び（ｉｉ）緩衝溶液、糖アルコール、非イオン性界面活性剤、及び保存剤を含むアルブミン−非含有安定化剤を含む、前記持続型ｈＧＨ結合体液状製剤を投与する段階を含む、下垂体性小人症、成長ホルモン欠乏症、プラダー・ウィリー症候群または特発性低身長の治療方法を提供する。
【０１１７】
前記液状製剤と、これを構成する成分については、先に記述した通りである。
【０１１８】
以下、本発明を下記の実施例により、より詳しく説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらに限定されるものではない。
【０１１９】
製造例：持続型ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）結合体の製造
両末端にアルデヒド基を有する分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコールであるＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤをヒト成長ホルモン（ｈＧＨ，分子量２２ｋＤａ）と結合させ、これをヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域（約５０ｋＤａ）のＮ末端に結合させ、本発明の代表的な持続型ヒト成長ホルモン結合体であるｈＧＨ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（以下、「持続型ｈＧＨ結合体」と命名）を製造及び精製した。
【０１２０】
実施例１：保存剤による低濃度持続型ｈＧＨ結合体液状製剤の安定性評価
本発明者らは、生理活性ペプチドであるｈＧＨと免疫グロブリンＦｃ領域が結合された薬理学的有効量の持続型ｈＧＨ結合体、緩衝溶液、糖アルコール、界面活性剤、及び等張化剤を含有する持続型ｈＧＨ結合体液状製剤（大韓民国公開特許第１０−２０１０−００６７７９６号（特許文献７））と薬理学的有効量の持続型ｈＧＨ結合体、緩衝溶液、糖アルコール、界面活性剤を含有する低濃度及び高濃度持続型ｈＧＨ結合体の液状製剤（大韓民国公開特許第１０−２０１５−００３５６８１号（特許文献８））を開発した。
【０１２１】
しかし、保存剤をさらに含む持続型ｈＧＨ結合体液状製剤の製造が依然として要求され、下記のように保存剤を含む最適化された持続型ｈＧＨ結合体液状製剤を開発しようとした。具体的には、下記のように多回の投与のために追加される保存剤が低濃度持続型ｈＧＨ結合体の安定性に及ぼす影響を評価した。
【０１２２】
下記表１のような組成をそれぞれ持続型ｈＧＨ結合体の液状製剤として使用して４℃及び２５℃で０〜３ヶ月間保管した後、イオン交換クロマトグラフィー法（Ion exchange chromatography、IE-HPLC）とサイズ排除クロマトグラフィー法（size-exclusion chromatography）を用いて分析した。表２及び３においてＩＥ−ＨＰＬＣ（％）とＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ  Ａｒｅａ％）であり、初期の結果値に比べた持続型ｈＧＨ結合体の残存率を示す。表２は４℃で保管した後、低濃度持続型ｈＧＨ結合体のＩＥ−ＨＰＬＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣ残存率を、表３は２５℃で保管した後、低濃度持続型ｈＧＨ結合体のＩＥ−ＨＰＬＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣ残存率を示す。
【０１２３】
【表１】
2019500390.tif 000003
【０１２４】
【表２】
2019500390.tif 000004
【０１２５】
【表３】
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【０１２６】
前記結果から分かるように、４℃で保管した後、ＩＥ−ＨＰＬＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣの結果、持続型ｈＧＨ結合体の濃度が１０．０ｍｇ／ｍＬである場合、保存剤としてｍ−クレゾール、フェノール、またはベンジルアルコールが含まれるとき（表２の＃２、＃３、＃４）、そうでない場合（表２の＃１）と比較して有意な安定性の差はなかった。
【０１２７】
また、２５℃で保管した後、ＩＥ−ＨＰＬＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣの結果、持続型ｈＧＨ結合体の濃度が１０．０ｍｇ／ｍＬである場合、保存剤が含まれるとき（表３の＃２、＃３、＃４）、そうでない場合（表３の＃１）と比較して安定性がわずかに低下したが、有意な差はなかった。
【０１２８】
この時、４℃及び２５℃で保管すると、保存剤の種類による低濃度持続型ｈＧＨ結合体の安定性は類似した。
【０１２９】
実施例２：保存剤による高濃度持続型ｈＧＨ結合体液状製剤の安定性評価
前記実施例１で確認した液状製剤に基づいて多回の投与のために追加される保存剤が高濃度持続型ｈＧＨ結合体の安定性に及ぼす影響を実験した。
【０１３０】
下記表４のような組成をそれぞれ持続型ｈＧＨ結合体の液状製剤として使用して４℃及び２５℃で０〜３ヶ月間保管した後、イオン交換クロマトグラフィー法とサイズ排除クロマトグラフィー法を用いて分析した。表５及び６においてＩＥ−ＨＰＬＣ（％）とＳＥ−ＨＰＬＣ（％）は（Ａｒｅａ％／Ｓｔａｒｔ  Ａｒｅａ％）であり、初期の結果値に比べた持続型ｈＧＨ結合体の残存率を示す。表５は４℃で保管した後、高濃度持続型ｈＧＨ結合体のＩＥ−ＨＰＬＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣ残存率を、表６は２５℃で保管した後、高濃度持続型ｈＧＨ結合体のＩＥ−ＨＰＬＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣ残存率を示す。
【０１３１】
【表４】
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【０１３２】
【表５】
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【０１３３】
【表６】
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【０１３４】
前記結果から分かるように、４℃で保管した後、ＩＥ−ＨＰＬＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣの結果、持続型ｈＧＨ結合体の濃度が５８．５ｍｇ／ｍＬである場合、保存剤としてｍ−クレゾール、フェノール、またはベンジルアルコールが含まれるとき（表５の＃２、＃３、＃４）、そうでない場合（表５の＃１）と比較して有意な安定性の差はなかった。
【０１３５】
また、２５℃で保管した後、ＩＥ−ＨＰＬＣ及びＳＥ−ＨＰＬＣの結果、持続型ｈＧＨ結合体の濃度が５８．５ｍｇ／ｍＬである場合、保存剤が含まれるとき（表６の＃２、＃３、＃４）、そうでない場合（表６の＃１）と比較して安定性がわずかに低下したが、有意な差はなかった。
【０１３６】
この時、４℃及び２５℃で保管するとき、保存剤の種類による高濃度持続型ｈＧＨ結合体の安定性は類似した。
【０１３７】
特に、実施例１及び実施例２の結果から分かるように、持続型ｈＧＨ結合体の濃度が１０．０ｍｇ／ｍＬ〜５８．５ｍｇ／ｍＬである場合、ｐＨ５．２である２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、４％のマンニトール、０．００５％のポリソルベート８０の条件であるとき、保存剤としてｍ−クレゾール、フェノール、またはベンジルアルコールが含まれても安定性に優れた結果を示した。
【０１３８】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【国際調査報告】
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