(57)【要約】  本発明は、呼吸器系疾患を治療するための、グルココルチコイドとポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾インターロイキン−２を含んでなる吸入可能な医薬組成物を提供する。本発明はさらに、呼吸器系疾患の治療におけるグルココルチコイドの有効性を増強するための医薬組成物を調製するためのＰＥＧ修飾インターロイキン−２の適用を提供する。本発明はまた、呼吸器系疾患を治療するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾インターロイキン２およびグルココルチコイドを含んでなり、かつ薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含んでいてもよい、吸入可能な医薬組成物。
【請求項２】
前記グルココルチコイドが、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、ブデソニド（Ｂｕｄ）、二プロピオン酸ベクロメタゾン（ＢＤＰ）、シクレソニド、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、酪酸クロベタゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド、フロ酸モメタゾン、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、ハロメタゾン一水和物および二酢酸ジフロラゾンからなる群から選択される１種以上であり、
好ましくは、前記グルココルチコイドが、デキサメタゾン、ブデソニドおよび二プロピオン酸ベクロメタゾンからなる群から選択される１種以上であり、並びに
好ましくは、前記グルココルチコイドが、デキサメタゾン、ブデソニドおよび二プロピオン酸ベクロメタゾンを含んでなる、
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記インターロイキン２（ＩＬ−２）が、例えば配列番号１に示されるようなヒト由来ＩＬ−２である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＰＥＧ修飾が、非分岐ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧによる修飾であり、例えば、分子量２〜６０ＫＤの非分岐ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧによる修飾、好ましくは、分子量２、４、６、８、１０、２０、３０、４０、５０または６０ＫＤの非分岐ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧによる修飾、好ましくは、分子量１０もしくは２０ＫＤの非分岐ＰＥＧによる修飾または分子量２０ＫＤの分岐ＰＥＧによる修飾であり、好ましくは、前記ＰＥＧが前記ＩＬ−２のＮ末端を修飾する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
（１）１種以上の好適な希釈剤もしくは担体、例えば、ラクトース、デキストラン、マンニトールもしくはグルコース、好ましくは、α−ラクトース一水和物、を含んでいてもよいドライパウダー組成物の形態；または
（２）ＰＥＧ修飾ＩＬ−２とグルココルチコイドの両方が液体噴射剤混合物中に懸濁しているか、もしくは完全に溶解している、加圧式定量吸入の形態
で処方される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の前記グルココルチコイドに対する比が、１，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド〜１０，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドの間であり、好ましくは、３，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；４，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  グルココルチコイド；５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；または６，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量が、３，０００ＩＵ〜１００，０００ＩＵの間であり、好ましくは５，０００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
（１）前記グルココルチコイドがＤｅｘであり、好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の前記Ｄｅｘに対する比が４，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  Ｄｅｘであり、好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量が７，５００ＩＵ〜８０，０００ＩＵの間であり、より好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量が１２，５００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である；または
（２）前記グルココルチコイドがＢｕｄであり、好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２のＢｕｄに対する比が５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  Ｂｕｄであり、好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量が３，５００ＩＵ〜８０，０００ＩＵの間であり、より好ましくは前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量が５，０００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である；または
（３）前記グルココルチコイドがＢＤＰであり、好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２のＢＤＰに対する比が５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  ＢＤＰであり、好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量が３，５００ＩＵ〜８０，０００ＩＵの間であり、より好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量が５，０００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
呼吸器系疾患の治療において使用するための、好ましくは、前記呼吸器系疾患が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または喘息である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
呼吸器系疾患に対するグルココルチコイドの治療効力を増強するための医薬組成物を調製するためのポリエチレングリコール修飾インターロイキン２の使用であって、前記医薬組成物が薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含んでいてもよく、
好ましくは、前記医薬組成物が吸入可能な医薬組成物であり、
好ましくは、前記呼吸器系疾患が慢性閉塞性肺疾患または喘息であり、並びに
より好ましくは、前記医薬組成物がグルココルチコイドを含んでなる、
使用。
【請求項１１】
呼吸器系疾患を治療する方法であって、
治療上有効な量の、請求項１〜９のいずれか一項に定義されるポリエチレングリコール修飾インターロイキン２およびグルココルチコイド、例えば、請求項１〜９のいずれか一項に定義される医薬組成物、を患者の吸入によって投与することを特徴とし、
好ましくは、前記投与が経口吸入または鼻腔内吸入によるものであり、好ましくは、エアロゾルまたはスプレーの手段によるものであり、かつ、
好ましくは、前記呼吸器系疾患が慢性閉塞性肺疾患または喘息である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼吸器系疾患を治療するための医薬組成物、特に、グルココルチコイドとポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾インターロイキン２（ＩＬ−２）の吸入可能な医薬組成物に関し、本発明はまた、呼吸器系疾患に対するグルココルチコイドの治療効力を増強するための医薬組成物を調製するためのポリエチレングリコール修飾インターロイキン２の使用および呼吸器系疾患を治療するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生活環境の変化や接触可能なアレルゲンの増加に伴い、喘息をはじめとする呼吸器系アレルギー性疾患の罹患率は年々増えており、発展途上国および先進国に大きな経済的負担を生じ、喘息は全年齢および性別で危険性を有し、一定の死亡率を有し、その予防および治療を大きな懸念のある公衆衛生および臨床問題としている（参考文献１、２）。
【０００３】
喘息の病理学的プロセスでは、アレルゲンは抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってリンパ節内のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に提示され、さらにこれらのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ２型エフェクターＴ細胞への分化を誘導し、エフェクター細胞は、様々なサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３など）を分泌し、これらのサイトカインは、炎症部位への好酸球の蓄積を促進し、腺による粘液の分泌を促進し、活性化されたＢリンパ球によるＩｇＥの分泌を促進することができ、ＩｇＥは肥満細胞の表面に結合し、それらのアレルゲンが身体に再侵入した後にアレルゲンが肥満細胞の表面に結合したＩｇＥと架橋し、これが呼吸器系の過敏反応を引き起こす一連の内容物を分泌するように肥満細胞を刺激する。長期疾患集団は組織形態の変化、気道のリモデリング、および不可逆的気道狭窄の形成を受ける（参考文献３）。現在のところ、気道平滑筋を弛緩させ気管を拡張させる効果を有する薬剤がグルココルチコイドと組み合わせて喘息管理のために臨床実践で主として使用されており、これは１日に複数回、長期の投与を必要とし、明白な副作用があり、薬剤耐性を生じやすい。
【０００４】
制御性Ｔ細胞は、胸腺に由来する天然の制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）と抗原刺激のある特定の強度の下でＴｈ０から分化した誘導性制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）に分けられ、これらの制御性Ｔ細胞は免疫調節の役割を果たし、エフェクターＴ細胞との直接的接触、またはＩＬ−１０およびＴＧＦ−βなどを含む抗炎症性因子の分泌による死滅効果を介した自己免疫系による傷害から身体を保護する（参考文献３〜５）。喘息の病因において、Ｔｒｅｇは、多様な機構を介して免疫調節に重要な役割を果たす（参考文献６）。現在、身体のＴｈ２細胞とＴｒｅｇ細胞のバランスが喘息の病因につながる重要な機構であることを示す証拠があり（参考文献１）、喘息患者に対するいくつかの研究では、Ｔｈ２／Ｔｒｅｇの比が喘息の重篤度および寛解と密接に関連していることが見出されている（参考文献７，８）。
【０００５】
全体的な疾患管理および治療問題として、喘息の従来の治療方法には制限および副作用があり、喘息における慢性気道炎症の長期管理を達成する、従って、短期投与による気道リモデリングを阻害する治療方法は存在していない。最近、いくつかの研究が、１，２５−（ＯＨ）２  ＶｉｔＤ３（参考文献９）、ＩＬ−２／抗ＩＬ−２（参考文献１０）、ステロイド薬（参考文献１１）または体内のＴｒｅｇをアップレギュレートするためのＴｒｅｇの直接注入（参考文献１２）を使用することにより、喘息を管理および治療する目標に達した。従来の治療方法に比べ、Ｔｒｅｇをアップレギュレートすることにより喘息を治療するための方法は、喘息の病因から疾患を治療することであり、これは投与回数が少なく、比較的長期の治癒効果を持つが、これらの方法には喘息の誘発の予防にのみに使用可能なもの、および一般治療における実施が困難なものがあるとともに、Ｔｒｅｇに対するこれらの方法のアップレギュレーション効果はなお理想的ではなく、それらの長期使用はなお特定の副作用を有する。本発明者らの従前の研究では、グルココルチコイド（Ｄｅｘ）とインターロイキン２の組合せの腹腔内注射が長期間、身体のＴｒｅｇの比を効果的にアップレギュレートし、喘息症状を軽減することが示され、そのアップレギュレーション機構が探究された（参考文献１３）。しかしながら、このＴｒｅｇをアップレギュレートして症状を軽減する全身治療はまた、持つべきＴｈ２／Ｔｒｅｇ比を変化させ、免疫バランスを乱し、不利益を持つ可能性があり；用量は比較的大きくて、ヒトに忍容される用量を超え；このような大用量のインターロイキン２のｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、発熱、硬直、造血阻害、および重度の漏出症候群を起こす可能性があり、これは喘息患者にとっては特に忍容しがたい。
【０００６】
局所投与が効果を発揮し得るという前提条件は、高濃度薬剤が局部的に標的細胞と密接し得ることを含む。研究によれば、抗原の提示、ならびに炎症部位でのＴ細胞の濃縮および持続的活性化が総て気道において全うされることが示された（参考文献１４）。従って、霧化により気道に吸入された薬物は、気道内の免疫調節標的に結合し、それに対して働き得る。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、気道における霧化による局所投与の方法を提供し、この便利かつ非侵襲的な方法により、Ｔｒｅｇは少用量の薬剤で局所的にアップレギュレートされて長期間喘息を効果的に緩和するという目的を達成し得ることを実証する。
【０００８】
第１の態様では、本発明は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾インターロイキン２およびグルココルチコイドと場合により薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤とを含んでなる吸入可能な医薬組成物を提供する。
【０００９】
１つの実施態様では、グルココルチコイドは、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、ブデソニド（Ｂｕｄ）、二プロピオン酸ベクロメタゾン（ＢＤＰ）、シクレソニド、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレドニソン(prednison)、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、酪酸クロベタゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド、フロ酸モメタゾン、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、ハロメタゾン一水和物、および二酢酸ジフロラゾンからなる群から選択される１種以上であり、好ましくは、グルココルチコイドは、デキサメタゾン、ブデソニドおよび二プロピオン酸ベクロメタゾンからなる群から選択される１種以上であり、好ましくは、グルココルチコイドは、デキサメタゾン、ブデソニドおよび二プロピオン酸ベクロメタゾンを含んでなり、好ましくは、グルココルチコイドは、デキサメタゾン、ブデソニドおよび二プロピオン酸ベクロメタゾンの組合せである。
【００１０】
別の実施態様では、インターロイキン２（ＩＬ−２）は、例えば配列番号１に示されるようなヒト由来ＩＬ−２である。
【００１１】
別の実施態様では、ＰＥＧ修飾は、非分岐ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧでの修飾、例えば、分子量２〜６０ＫＤの非分岐ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧでの修飾、好ましくは、分子量２、４、６、８、１０、２０、３０、４０、５０または６０ＫＤの非分岐ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧでの修飾、好ましくは、分子量１０もしくは２０ＫＤの非分岐ＰＥＧでのまたは分子量２０ＫＤの分岐ＰＥＧでの修飾である。本発明によるＰＥＧ修飾は、例えば、ＩＬ−２のリシン、セリン、トレオニン残基またはＮ末端α−アミノ残基など、ＰＥＧ修飾されるに好適なＩＬ−２内のいずれの部位であってもよい。１つの実施態様では、ＰＥＧ修飾は、ＩＬ−２のＮ末端アミノ酸残基、例えば、ＩＬ−２のＮ末端リシン、セリンまたはトレオニンにおける。１つの実施態様では、ＰＥＧ修飾は、ＩＬ−２のＮ末端α−アミノにおける。ＰＥＧ修飾は、一部位修飾でも多部位修飾でもよい。
【００１２】
別の実施態様では、本発明の医薬組成物は、ドライパウダー組成物の形態で処方され、場合により、１以上の好適な希釈剤または担体、例えば、ラクトース、デキストラン、マンニトールまたはグルコース、好ましくは、α−ラクトース一水和物を含んでなる。
【００１３】
別の実施態様では、本発明の医薬組成物は、加圧式定量吸入の形態で処方され、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２（ＩＬ−２（ＰＥＧ））とグルココルチコイドの両方が液体噴射剤混合物中に懸濁されているか、または完全に溶解されている。
【００１４】
別の実施態様では、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２のグルココルチコイドに対する比は、１，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド〜１０，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドの間である。例えば、ＩＬ−２（ＰＥＧ）のグルココルチコイドに対する比は、１，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；２，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；３，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドまたは４，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；６，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；７，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；８，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；９，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドまたは１０，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドである。好ましくは、ＩＬ−２（ＰＥＧ）のグルココルチコイドに対する比は、３，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；４，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドまたは６，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドである。
【００１５】
別の実施態様では、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、３，０００ＩＵ〜１００，０００ＩＵの間、好ましくは５，０００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である。例えば、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、３，０００ＩＵ、４，０００ＩＵ、５，０００ＩＵ、６，０００ＩＵ、７，０００ＩＵ、８，０００ＩＵ、９，０００ＩＵ、１０，０００ＩＵ、１１，０００ＩＵ、１２，０００ＩＵ、１３，０００ＩＵ、１４，０００ＩＵ、１５，０００ＩＵ、１６，０００ＩＵ、１７，０００ＩＵ、１８，０００ＩＵ、１９，０００ＩＵ、２０，０００ＩＵ、２５，０００ＩＵ、３０，０００ＩＵ、３５，０００ＩＵ、４０，０００ＩＵ、４５，０００ＩＵ、５０，０００ＩＵ、６０，０００ＩＵ、７０，０００ＩＵ、８０，０００ＩＵ、９０，０００ＩＵまたは１００，０００ＩＵであり得る。
【００１６】
別の実施態様では、グルココルチコイドはＤｅｘであり、好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２のＤｅｘに対する比は、４，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  Ｄｅｘであり、好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、７，５００ＩＵ〜８０，０００ＩＵの間であり、より好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、１２，５００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である。例えば、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、７，５００ＩＵ、８，０００ＩＵ、８，５００ＩＵ、９，０００ＩＵ、９，５００ＩＵ、１０，０００ＩＵ、１０，５００ＩＵ、１１，０００ＩＵ、１１，５００ＩＵ、１２，０００ＩＵ、１２，５００ＩＵ、１３，０００ＩＵ、１３，５００ＩＵ、１４，０００ＩＵ、１４，５００ＩＵ、１５，０００ＩＵ、１６，０００ＩＵ、１７，０００ＩＵ、１８，０００ＩＵ、１９，０００ＩＵ、２０，０００ＩＵ、２５，０００ＩＵ、３０，０００ＩＵ、３５，０００ＩＵ、４０，０００ＩＵ、４５，０００ＩＵまたは５０，０００ＩＵであり得る。
【００１７】
別の実施態様では、グルココルチコイドはＢｕｄであり、好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２のＢｕｄに対する比は、５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  Ｂｕｄであり、好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、３，５００ＩＵ〜８０，０００ＩＵの間であり、より好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、５，０００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である。例えば、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、３，５００ＩＵ、４，０００ＩＵ、４，５００ＩＵ、５，０００ＩＵ、５，５００ＩＵ、６，０００ＩＵ、６，５００ＩＵ、７，０００ＩＵ、７，５００ＩＵ、８，０００ＩＵ、８，５００ＩＵ、９，０００ＩＵ、９，５００ＩＵ、１０，０００ＩＵ、１０，５００ＩＵ、１１，０００ＩＵ、１１，５００ＩＵ、１２，０００ＩＵ、１２，５００ＩＵ、１３，０００ＩＵ、１３，５００ＩＵ、１４，０００ＩＵ、１４，５００ＩＵ、１５，０００ＩＵ、１６，０００ＩＵ、１７，０００ＩＵ、１８，０００ＩＵ、１９，０００ＩＵ、２０，０００ＩＵ、２５，０００ＩＵ、３０，０００ＩＵ、３５，０００ＩＵ、４０，０００ＩＵ、４５，０００ＩＵまたは５０，０００ＩＵであり得る。
【００１８】
別の実施態様では、グルココルチコイドはＢＤＰであり、好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２のＢＤＰに対する比は５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  ＢＤＰであり、好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、３，５００ＩＵ〜８０，０００ＩＵの間であり、より好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、５，０００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である。例えば、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、３，５００ＩＵ、４，０００ＩＵ、４，５００ＩＵ、５，０００ＩＵ、５，５００ＩＵ、６，０００ＩＵ、６，５００ＩＵ、７，０００ＩＵ、７，５００ＩＵ、８，０００ＩＵ、８，５００ＩＵ、９，０００ＩＵ、９，５００ＩＵ、１０，０００ＩＵ、１０，５００ＩＵ、１１，０００ＩＵ、１１，５００ＩＵ、１２，０００ＩＵ、１２，５００ＩＵ、１３，０００ＩＵ、１３，５００ＩＵ、１４，０００ＩＵ、１４，５００ＩＵ、１５，０００ＩＵ、１６，０００ＩＵ、１７，０００ＩＵ、１８，０００ＩＵ、１９，０００ＩＵ、２０，０００ＩＵ、２５，０００ＩＵ、３０，０００ＩＵ、３５，０００ＩＵ、４０，０００ＩＵ、４５，０００ＩＵまたは５０，０００ＩＵであり得る。
【００１９】
第２の態様では、本発明は、呼吸器系疾患を治療するための上記医薬組成物を提供し、好ましくは、前記呼吸器系疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または喘息である。
【００２０】
第３の態様では、本発明は、呼吸器系疾患に対するグルココルチコイドの治療効力を増強するための医薬組成物を調製するためのポリエチレングリコール修飾インターロイキン２の使用を提供し、前記医薬組成物は場合により薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含んでなる。
【００２１】
１つの実施態様では、本発明の医薬組成物は、吸入可能な医薬組成物である。
【００２２】
別の実施態様では、本発明の呼吸器系疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または喘息である。
【００２３】
別の実施態様では、前記医薬組成物は、グルココルチコイドを含んでなる。
【００２４】
別の実施態様では、本発明のグルココルチコイドは、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、ブデソニド（Ｂｕｄ）、二プロピオン酸ベクロメタゾン（ＢＤＰ）、シクレソニド、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレドニソン(prednison)、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、酪酸クロベタゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド、フロ酸モメタゾン、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、ハロメタゾン一水和物および二酢酸ジフロラゾンからなる群から選択される１以上であり、好ましくは、グルココルチコイドは、デキサメタゾン、ブデソニドおよび二プロピオン酸ベクロメタゾンからなる群から選択される１以上であり、好ましくは、グルココルチコイドは、デキサメタゾン、ブデソニドおよび二プロピオン酸ベクロメタゾンを含んでなる。
【００２５】
別の実施態様では、インターロイキン２（ＩＬ−２）は、例えば配列番号１に示されるようなヒト由来ＩＬ−２である。
【００２６】
別の実施態様では、ＰＥＧ修飾は、非分岐ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧでの修飾、例えば、分子量２〜６０ＫＤの非分岐ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧでの修飾、好ましくは、分子量２、４、６、８、１０、２０、３０、４０、５０または６０ＫＤの非分岐ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧでの修飾、好ましくは、分子量１０もしくは２０ＫＤの非分岐ＰＥＧもしくは分子量２０ＫＤの分岐ＰＥＧでの修飾である。本発明によるＰＥＧ修飾は、例えば、ＩＬ−２のリシン、セリン、トレオニンまたはＮ末端α−アミノ残基など、ＰＥＧ修飾されるに好適なＩＬ−２内のいずれの部位であってもよい。１つの実施態様では、ＰＥＧ修飾は、ＩＬ−２のＮ末端アミノ酸残基、例えば、ＩＬ−２のＮ末端リシン、セリンまたはトレオニンにおける。１つの実施態様では、ＰＥＧ修飾は、ＩＬ−２のＮ末端α−アミノにおける。ＰＥＧ修飾は、一部位修飾でも多部位修飾でもよい。
【００２７】
別の実施態様では、本発明の医薬組成物はドライパウダー組成物の形態で処方され、場合により、１以上の好適な希釈剤または担体、例えば、ラクトース、デキストラン、マンニトールまたはグルコース、好ましくは、α−ラクトース一水和物を含んでなる。
【００２８】
別の実施態様では、本発明の組成物は加圧式定量吸入の形態であり、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２とグルココルチコイドの両方が液体噴射剤混合物に懸濁されているか、または完全に溶解されている。
【００２９】
別の実施態様では、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２のグルココルチコイドに対する比は、１，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド〜１０，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドの間である。例えば、ＩＬ−２（ＰＥＧ）のグルココルチコイドに対する比は、１，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；２，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；３，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドまたは４，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；６，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；７，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  グルココルチコイド；８，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  グルココルチコイド；９，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドまたは１０，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドである。好ましくは、ＩＬ−２（ＰＥＧ）のグルココルチコイドに対する比は、３，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；４，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドまたは６，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドである。
【００３０】
別の実施態様では、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、３，０００ＩＵ〜１００，０００ＩＵの間、好ましくは、５，０００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である。例えば、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、３，０００ＩＵ、４，０００ＩＵ、５，０００ＩＵ、６，０００ＩＵ、７，０００ＩＵ、８，０００ＩＵ、９，０００ＩＵ、１０，０００ＩＵ、１１，０００ＩＵ、１２，０００ＩＵ、１３，０００ＩＵ、１４，０００ＩＵ、１５，０００ＩＵ、１６，０００ＩＵ、１７，０００ＩＵ、１８，０００ＩＵ、１９，０００ＩＵ、２０，０００ＩＵ、２５，０００ＩＵ、３０，０００ＩＵ、３５，０００ＩＵ、４０，０００ＩＵ、４５，０００ＩＵ、５０，０００ＩＵ、６０，０００ＩＵ、７０，０００ＩＵ、８０，０００ＩＵ、９０，０００ＩＵまたは１００，０００ＩＵであり得る。
【００３１】
別の実施態様では、グルココルチコイドはＤｅｘであり、好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２のＤｅｘに対する比は、４，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  Ｄｅｘであり、好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、７，５００ＩＵ〜８０，０００ＩＵの間であり、より好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、１２，５００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である。例えば、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、７，５００ＩＵ、８，０００ＩＵ、８，５００ＩＵ、９，０００ＩＵ、９，５００ＩＵ、１０，０００ＩＵ、１０，５００ＩＵ、１１，０００ＩＵ、１１，５００ＩＵ、１２，０００ＩＵ、１２，５００ＩＵ、１３，０００ＩＵ、１３，５００ＩＵ、１４，０００ＩＵ、１４，５００ＩＵ、１５，０００ＩＵ、１６，０００ＩＵ、１７，０００ＩＵ、１８，０００ＩＵ、１９，０００ＩＵ、２０，０００ＩＵ、２５，０００ＩＵ、３０，０００ＩＵ、３５，０００ＩＵ、４０，０００ＩＵ、４５，０００ＩＵまたは５０，０００ＩＵであり得る。
【００３２】
別の実施態様では、グルココルチコイドはＢｕｄであり、好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２のＢｕｄに対する比は、５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  Ｂｕｄであり、好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、３，５００ＩＵ〜８０，０００ＩＵの間であり、より好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、５，０００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である。例えば、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、３，５００ＩＵ、４，０００ＩＵ、４，５００ＩＵ、５，０００ＩＵ、５，５００ＩＵ、６，０００ＩＵ、６，５００ＩＵ、７，０００ＩＵ、７，５００ＩＵ、８，０００ＩＵ、８，５００ＩＵ、９，０００ＩＵ、９，５００ＩＵ、１０，０００ＩＵ、１０，５００ＩＵ、１１，０００ＩＵ、１１，５００ＩＵ、１２，０００ＩＵ、１２，５００ＩＵ、１３，０００ＩＵ、１３，５００ＩＵ、１４，０００ＩＵ、１４，５００ＩＵ、１５，０００ＩＵ、１６，０００ＩＵ、１７，０００ＩＵ、１８，０００ＩＵ、１９，０００ＩＵ、２０，０００ＩＵ、２５，０００ＩＵ、３０，０００ＩＵ、３５，０００ＩＵ、４０，０００ＩＵ、４５，０００ＩＵまたは５０，０００ＩＵであり得る。
【００３３】
別の実施態様では、グルココルチコイドはＢＤＰであり、好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２のＢＤＰに対する比は５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  ＢＤＰであり、好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、３，５００ＩＵ〜８０，０００ＩＵの間であり、より好ましくは、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、５，０００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である。例えば、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量は、３，５００ＩＵ、４，０００ＩＵ、４，５００ＩＵ、５，０００ＩＵ、５，５００ＩＵ、６，０００ＩＵ、６，５００ＩＵ、７，０００ＩＵ、７，５００ＩＵ、８，０００ＩＵ、８，５００ＩＵ、９，０００ＩＵ、９，５００ＩＵ、１０，０００ＩＵ、１０，５００ＩＵ、１１，０００ＩＵ、１１，５００ＩＵ、１２，０００ＩＵ、１２，５００ＩＵ、１３，０００ＩＵ、１３，５００ＩＵ、１４，０００ＩＵ、１４，５００ＩＵ、１５，０００ＩＵ、１６，０００ＩＵ、１７，０００ＩＵ、１８，０００ＩＵ、１９，０００ＩＵ、２０，０００ＩＵ、２５，０００ＩＵ、３０，０００ＩＵ、３５，０００ＩＵ、４０，０００ＩＵ、４５，０００ＩＵまたは５０，０００ＩＵであり得る。
【００３４】
第４の態様では、本発明は、患者に治療上有効な量の本発明のポリエチレングリコール修飾インターロイキン２とグルココルチコイドを吸入により、投与すること、例えば、本発明の組成物を投与することを特徴とする、呼吸器系疾患を治療するための方法を提供する。
【００３５】
１つの実施態様では、本発明のよる投与は、経口または鼻腔吸入を開始、好ましくは、エアロゾルまたはスプレーの手段による。
【００３６】
別の実施態様では、本発明の呼吸器系疾患は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または喘息である。
【００３７】
第５の態様では、本発明は、本発明の組成物を調製するための方法を提供する。
【００３８】
本発明は、グルココルチコイド単独に比べ、Ｌ−２と組み合わせたグルココルチコイドは、効果を速くすることを実証した。全身投与に比べ、気道におけるＩＬ−２と組み合わせたグルココルチコイドの短期局所適用は、身体の他の免疫系に影響を及ぼさずに低用量でＴｒｅｇをアップレギュレートし、喘息症状を少なくとも６週間首尾良く軽減することができ、この方法の定期的使用が喘息における慢性気道炎症および気道リモデリングの問題を解決し、さらには喘息を治癒させると思われることを示す。ＩＬ−２およびＩＬ−２（ＰＥＧ）の投与形の違いのために、後者の代謝率は前者の代謝率よりも著しく低く、この薬物はより長期間、投与形が変化した後に局部的に作用することができ、アップレギュレーション効果を達成するために要される用量が著しく低減される。ＩＬ−２（ＰＥＧ）：Ｂｕｄ、ＩＬ−２（ＰＥＧ）：ＢＤＰなどの投与形の使用は、与用量をヒトに安全で好適な範囲にさらに低減することができる。この薬物の組合せによって産生されるＴｒｅｇは主として非特異的Ｔｒｅｇであり、それらは種々のアレルゲンにより引き起こされる気道過敏反応に対抗する際に身体を助けることができる。非侵襲的、便利、即効性、かつ長期持続的なこの新規な喘息治療方法は、臨床で患者に明確に多大な利益をもたらし得る。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１：局所投薬の有効性の評価。Ａ：モデル化および投薬時点。Ｂ：対照、Ｄｅｘ単独、ＩＬ−２単独および合剤投薬の気管支肺胞洗浄液におけるＴｒｅｇのフローサイトメトリー。Ｃ：肺病理切片の画像（２０倍顕微鏡）、Ｈ＆Ｅ染色。データは平均±標準偏差（ｎ＝６〜８／群）として表す。＊群、対ＮａＣｌ群、Ｐ＜０．０５。ｉ．ｐ：感作に対するＯＶＡ抗原の腹腔内注射；ｉ．ｎ：抗原刺激のためのＯＶＡ抗原の鼻腔滴下。
【図２】図２：一定比率での薬物の最適投与形の試験。Ａ：一定比率、異なる用量でのＩＬ−２：Ｄｅｘ使用後のＴｒｅｇのアップレギュレーション。Ｂ：２０ＫＤ非分岐ＰＥＧでの修飾の前後のＩＬ−２のゲル電気泳動画像。Ｃ：精製後のＩＬ−２（ＰＥＧ）保存溶液の高速液相サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰ−ＳＥＣ）検出。Ｄ：ＰＥＧ−ＩＬ−２（すなわち、ＩＬ−２（ＰＥＧ））の活性検出。Ｅ：一定比率、異なる用量でＩＬ−２（ＰＥＧ）：Ｄｅｘを用いた後のＴｒｅｇのアップレギュレーション。Ｆ：一定比率、異なる用量でＩＬ−２（ＰＥＧ）：  Ｂｕｄを用いた後のＴｒｅｇのアップレギュレーション。Ｇ：ＩＬ−２：Ｄｅｘ、ＩＬ−２（ＰＥＧ）：ＤｅｘおよびＩＬ−２（ＰＥＧ）：Ｂｕｄの３つの投与形のＴｒｅｇアップレギュレーションの比較。Ｈ：ＩＬ−２：Ｄｅｘ、ＩＬ−２（ＰＥＧ）：ＤｅｘおよびＩＬ−２（ＰＥＧ）：Ｂｕｄの３つの投与形で処置した後の肺機能測定。Ｉ：ＩＬ−２（ＰＥＧ）：ＢＤＰで処置した後の肺機能測定。データは平均±標準偏差（Ｔｒｅｇ測定：ｎ＝６〜８／群；肺機能：ｎ＝３／群）として表す。＊群、対ＮａＣｌ群  Ｐ＜０．０５。
【図３】図３：異なる投薬比のＩＬ−２（ＰＥＧ）：Ｂｕｄ投与形で処置した後のＴｒｅｇのアップレギュレーションレベル。Ｂｕｄは２μｇで固定し、異なる用量のＩＬ−２（ＰＥＧ）と組み合わせた。データは、平均±標準偏差（ｎ＝６／群）として表す。＊群、対ＮａＣｌ群  Ｐ＜０．０５。
【図４】図４：最適比、異なる用量のＩＬ−２（ＰＥＧ）：Ｂｕｄ投与形で処置した後のＴｒｅｇのアップレギュレーションレベルおよび喘息治療指標の検出。Ａ：気管支肺胞洗浄液中のＴｒｅｇのアップレギュレーションレベル。Ｂ：ＩＬ−２（ＰＥＧ）単独、Ｂｕｄ単独および異なる用量での合剤投薬による処置の後の肺機能測定。Ｃ：肺病理切片の画像（２０倍の顕微鏡下）、左：Ｈ＆Ｅ染色；右：ＰＡＳ染色。データは平均±標準偏差として表す（Ｔｒｅｇ測定：ｎ＝６／群；肺機能：ｎ＝３／群）。Ｄ：１０ＫＤ非分岐ＰＥＧ修飾ＩＬ−２または２０ＫＤ分岐ＰＥＧ修飾ＩＬ−２とＢｕｄの合剤投薬による処置の後の肺機能測定。＊群、対ＮａＣｌ群  Ｐ＜０．０５。
【図５】５：ＩＬ−２（ＰＥＧ）：Ｂｕｄの局所霧化投薬とＤｅｘの腹腔内注射の有効性の比較。Ａ：モデル化および投薬時点。Ｂ：３、５、および７日のデキサメタゾン（４０μｇ）の腹腔内注射による処置の後および３日のＩＬ−２（ＰＥＧ）：Ｂｕｄの局所投薬による処置の後の肺機能測定。Ｃ：肺病理切片の画像（２０倍の顕微鏡下）、左：Ｈ＆Ｅ染色；右：ＰＡＳ染色。データは平均±標準偏差（ｎ＝３／群）として表す。＊群、対ＮａＣｌ群  Ｐ＜０．０５。
【図６】図６：６週間のＩＬ−２（ＰＥＧ）：Ｂｕｄの局所投薬の後の治療効果の評価。Ａ：モデル化および投薬時点。Ｂ：６週間の投薬後の肺機能測定。Ｃ：肺病理切片の画像（２０倍顕微鏡下）、左：Ｈ＆Ｅ染色；右：ＰＡＳ染色。データは、平均±標準偏差（ｎ＝４／群）として表す。＊群、対ＮａＣｌ群  Ｐ＜０．０５。
【図７】図７：ＩＬ−２（ＰＥＧ）：Ｂｕｄの局部適用後の気管支肺胞洗浄液におけるＴｈ２細胞およびサイトカインの測定。Ａ：Ｔｈ２細胞のフローサイトメトリー。Ｂ：サイトカインの検出。データは、平均±標準偏差（ｎ＝６／群）として表す。＊群、対ＮａＣｌ群  Ｐ＜０．０５。
【図８】図８：薬物誘導後のフローソーティングによって得られた気管支肺胞洗浄液中のｉＴｒｅｇの特異的および非特異的阻害効果。Ａ：ＯＶＡにより刺激されたＤＯ１０．１１マウス（ＯＶＡ抗原特異的ＴＣＲトランスジェニックマウス）の脾臓リンパ球生成に対する脾臓中のｉＴｒｅｇおよびｎＴｒｅｇの阻害効果。Ｂ：ＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７マウスの脾臓リンパ球混合反応系におけるリンパ球生成に対する脾臓中のｉＴｒｅｇおよびｎＴｒｅｇの阻害効果。データは、平均±標準偏差（ｎ＝６／群）として表す。＊群、対ＮａＣｌ群  Ｐ＜０．０５。
【図９】図９：局所投薬により処置後、Ａ：脾臓細胞中のＴｈ２およびＴｒｅｇのフローサイトメトリー、およびＢ：血清中のサイトカインの測定。データは、平均±標準偏差（ｎ＝６／群）として表す。
【発明の具体的説明】
【００４０】
本発明は、本明細書に記載の特定の方法、実施態様、試薬などは可変かつ修正可能であるので、これらに限定されない。本明細書で使用される用語は、特定の実施態様を説明することを目的とし、本発明の範囲を限定するものではない。そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【００４１】
本発明の例示的実施態様を詳細に記載する前に、本発明の理解のために重要な用語について定義を示す。
【００４２】
本発明による「グルココルチコイド」は、いずれの合成または天然グルココルチコイドであってもよい。本発明で使用可能なグルココルチコイドは、例えば、呼吸器系疾患を治療するために有用なグルココルチコイドであり、例としては、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、ブデソニド（Ｂｕｄ）、二プロピオン酸ベクロメタゾン（ＢＤＰ）、シクレソニド、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレドニソン(prednison)、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、酪酸クロベタゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド、フロ酸モメタゾン、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、ハロメタゾン一水和物、二酢酸ジフロラゾン、モメタゾン、ロテプレドノール、エチプレドノール、トリアムシノロン、フルニソリド、フルモキソニド、ロフレポニド、ブチキソコルト、チプレダンなどが挙げられる。
【００４３】
本明細書に関して、「グルココルチコイド」という場合には、特に断りのない限り、グルココルチコイドから誘導され得る総ての活性な塩、溶媒和物または誘導体を含む。グルココルチコイドのあり得る塩または誘導体の例としては、ナトリウム塩、スルホ安息香酸塩、リン酸塩、イソニコチン酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、リン酸二水素塩、パルミチン酸塩、ピバル酸塩、フマル酸塩および薬学的に許容可能なエステル（例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキルエステル）が含まれる。グルココルチコイドおよびその活性な塩または誘導体はまた、それらの溶媒和物の形態、例えば水和物の形態であり得る。
【００４４】
本発明の「ＩＬ−２」は、ヒト、マウス、ラット、霊長類、およびブタなどの哺乳動物起源を含むいずれの起源のＩＬ−２も指し、天然であっても、または微生物宿主によって産生された組換えＩＬ−２ポリペプチドを含む組換えもしくは合成技術によって得られてもよい。ＩＬ−２は天然ポリペプチド配列であり得るか、もしくは含んでなり得、または天然ＩＬ−２ポリペプチドの活性な変異体であり得る。好ましくは、ＩＬ−２ポリペプチドまたは活性な変異体はヒト供給源に由来し、微生物宿主により産生された組換えヒトＩＬ−２、特に、組換えヒトＩＬ−２を含んでなる。
【００４５】
好ましい実施態様では、本発明は、ヒト由来ＩＬ−２またはその活性な変異体、より好ましくは組換え生産されたものを使用する。ヒト由来ＩＬ−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、それぞれＧｅｎｂａｎｋ  ｒｅｆ３５５８またはＰ６０５６８に開示され、例えば、本発明で使用されるヒト由来ＩＬ−２の配列は、配列番号１
【化１】
2019512506.tif 000002
で示される。そうではないことが述べられない限り、本発明で使用されるＩＬ−２はヒト由来ＩＬ−２であり、例えば、９５％以上の純度、より好ましくは９６、９７、９８または９９％の純度を有する実質的に純粋な形態である。ＩＬ−２は、単量体または多量体タンパク質の形態で使用され得る。
【００４６】
本発明の「気道」は、肺胞につながる空気の通り道であり、肺の構成要素である。本発明の「呼吸器系疾患」は、呼吸器系に関連する疾患または病態を意味する。例としては、限定されるものではないが、気道炎症、アレルギー、呼吸器系障害、嚢胞性線維症（ＣＦ）、アレルギー性鼻炎（ＡＲ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、癌、肺高血圧症、肺炎症、気管支炎、気道閉塞、気管支修復、微生物およびウイルス感染、例えば、ＳＡＲＳが挙げられる。
【００４７】
ＣＯＰＤは、気道閉塞および肺からの最大呼気流量の減少を特徴とする慢性疾患であり、息切れ（呼吸困難）および日常活動または労作を遂行する能力の制限などの持続的日常症状として発現される。加えて、疾患状態の周期的再燃が見られ、日常症状の増悪および活動の制限に至り、その悪化症状／制限の重篤度が患者の入院という結果ももたらし得る。加えて、数年にわたって肺機能の段階的な低下が（疾病進行）が見られる。
【００４８】
喘息は、咳、喘鳴音、多呼吸および／または胸部の圧迫感を含む症状を伴う、広範囲で、変動のある可逆的な気流閉塞を特徴とする慢性疾患状態である。喘息発作は、通常、気道収縮（気管支収縮）を引き起こす花粉、塵埃または他のアレルゲンなどの誘発因子に曝されることによって起こる。喘息などの疾患状態を有する人は、時折目に見える症状のない疾患状態を呈することがあり、または症状を呈するか、疾患状態の増悪もしくは悪化を受け得る周期的発作を受ける場合があることが理解されるべきである。
【００４９】
本発明による「予防」は、従前に診断された疾患または疾患に苦しむ対象が増悪を受ける前に行われ、それにより、その対象がその疾患の症状または関連する疾患を回避する、防止するまたはその見込みを引き下げることを可能とする予防的処置を意味する。対象は、進行性疾患の高いリスクまたは増悪を受けると従前に診断された疾患を有する対象であり得る。
【００５０】
本発明の「治療」、「治療上」または「治療的」とは、このような治療方法が与えられる対象が疾患の症状または他の病態のあり得る軽減を示すような方法を意味する。本明細書の文脈では、そうでないことが具体的に述べられてない限り、用語「治療」は、既存の疾患状態のこのような周期的発作または再燃を予防することを含むものとする。このような治療は、「維持治療」または「維持療法」とも呼ばれることがある。用語「治療的」および「治療上」もまた相応に解釈され得る。
【００５１】
用語「薬学的に許容可能な担体」または「賦形剤」は、任意の、あらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。このような媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。本発明で使用される有効成分、例えば、グルココルチコイドおよびポリエチレングリコール修飾インターロイキン２は、１以上の薬学的に許容可能な添加剤、希釈剤または担体と混合して使用することができる。好適な希釈剤または担体の例としては、ラクトース（例えば、一水和物）、デキストラン、マンニトールまたはグルコースが挙げられる。
【００５２】
本発明の医薬組成物は、溶液、懸濁液、エアロゾルまたはドライパウダー処方物の形態で吸入により好適に投与される（例えば、気道に局所投与される）。投与は経口または鼻腔内を介した吸入によるものであってよく、好ましくは、粉末または液体、鼻腔吸い込み可能なまたは吸入可能な粒子からなるエアロゾルまたはスプレーによる。有効成分を含有する医薬組成物は、吸い込み可能なまたは吸入可能な粒子の手段により、すなわち、気道への吸入または鼻腔投与の手段により対象によって吸入される。この処方物は吸い込み可能なまたは吸入可能な医薬組成物の液体または固体粒子を含有してよく、本発明の粒子は、吸入後に口腔および咽喉を通過し、気管支および肺胞へ入り続けるよう十分に小さい体積である吸い込み可能なまたは吸入可能な粒子を含んでなる。粒子の直径は一般に、約０．０５、０．１、０．５、１、２、４、６、８、または１０ミクロンである。特に、吸い込み可能なまたは吸入可能な粒子は、約０．５μｍ〜５μｍ未満の直径を有する。エアロゾルまたはスプレー中の吸入可能でない粒子は、咽喉内に容易に定着し、嚥下される。よって、エアロゾル中の吸い込み可能でない粒子の量は最小限でなければならない。鼻腔適用に関する限り、鼻腔中のその保持を保証するために好ましい粒径範囲は、約８、１０、２０、２５、３５、５０、１００、１５０、２５０、５００μｍ（直径）である。液体製剤は、特に新生児および乳児のために気道（鼻腔部分）にスプレーすることができる。
【００５３】
本発明の有効成分は好ましくは、ドライパウダー吸入器、定量噴霧式吸入器または噴霧器で一緒にまたは別個に投与するのに好適である。ドライパウダー吸入器、定量噴霧式吸入器および噴霧器は周知であり、様々なこのような装置が利用可能である。
【００５４】
ドライパウダー吸入器は、有効成分単独または薬学的に許容可能な担体と組み合わせて投与するために使用でき、有効成分を薬学的に許容可能な担体と組み合わせて投与する場合、微粉粉末の形態でまたは規則混合物の形態で投与される。ドライパウダー吸入器は、単回用量または多用量であってよく、ドライパウダーまた粉末を含有するカプセルであり得る。
【００５５】
定量噴霧式吸入器は、好適な噴射剤中に付加的賦形剤（例えば、エタノール）、界面活性剤、滑沢剤、抗酸化剤、または安定剤とともにまたは伴わずに分散された有効成分を投与するために使用できる。好適な噴射剤としては、炭化水素、クロロフルオロカーボンおよびヒドロフルオロカーボン（例えば、セボフルラン）噴射剤、またはこのような噴射剤のいずれの混合物も含まれる。好ましい噴射剤はＰ１３４ａおよびＰ２２７であり、これらはそれぞれ単独でまたは他の噴射剤および／または界面活性剤および／または他の賦形剤と組み合わせて使用され得る。また、単位用量もしくは多用量処方物の形態の霧化水性懸濁液、好ましくは、好適なｐＨおよび／または張力調整剤を含むもしくは含まない溶液を使用することも可能である。
【００５６】
有効成分それぞれが一緒にまたは別個に噴霧器で投与される場合、それらは単回用量または多用量装置中の、好適なｐＨおよび／または張力調整剤を含むまたは含まない霧化水性懸濁液または溶媒の形態であり得る。
【００５７】
用語「治療上有効な量」は、本発明で使用する場合、患者に送達された場合に治療効果をもたらすために、例えば、処置される特定の病態を緩和する、予防するまたは阻害するために必要とされる薬剤の量を含有する吸入処方物の量を指す。本発明で使用される有効成分の量は、そうではないことが具体的に定義されない限り単位用量を意味する。治療上有効な量は、１以上の噴出口を備えたＤＰＩ装置によって送達され得る。よって、薬物の性質ならびに処置される疾患の性質および重篤度によって、数日間、数週間、数か月間など毎日、数時間ごとに１回以上の噴出を行うことが必要である。
【００５８】
治療上有効な量は、薬物の性質、患者の病態、ならびに処置する疾患の性質および重篤度にかなりの程度まで依存する。治療上有効な量は、例えば、喘息などの局部疾患を治療する場合に有効物質が効果的に使用される１ｎｇ／ｋｇといった少量から、１０ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得、より詳しくは、２０ｎｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲である。治療用量は、ＤＰＩ装置のパッケージまたはラベルに示されるべきである。
【００５９】
よって、本発明は、本発明の処方物を含んでなるこのような定量吸入器に関する。多用量吸入器は、数十のまたはさらには数百の治療上有効な量を含有するドライパウダーリザーバーを含み得る。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、バルクおよび単位用量の形態、ならびに当技術分野で公知の開封可能なまたは貫通可能なインプラント、カプセル、ブリスターパッケージまたはカートリッジの形態で提供され得る。本発明はまた、送達デバイス、別個の容器に本発明の組成物および場合により別の好適な添加剤、例えば、別の治療化合物、賦形剤、界面活性物質（治療薬および処方物の成分として）、抗酸化剤、香味剤および着色剤、増量剤、揮発油、バッファー、分散剤、界面活性物質、抗酸化剤、香味剤、発泡剤、噴射剤、および保存剤、ならびにキットの成分の使用に関する説明書を備えたキットを提供する。
【００６１】
本発明の技術的解決策および利点を明らかにするために、以下、添付の図面を参照して本発明の実施態様をさらに詳説する。これらの実施例および図面は限定として解釈されるべきでないと理解されるべきである。当業者は、本明細書に挙げられた原理にさらなる修正を想定する。
【実施例】
【００６２】
実施例１：喘息マウスのモデル化
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入）を喘息のモデル化に使用し、１日目と８日目に１００μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）（Ｓｉｇｍａ）および２ｍｇの注射用Ａｌ（ＯＨ）３（Ｓｉｇｍａ）の腹腔内注射によって感作させ、９〜１４日目に２０μｌの２％ＯＶＡを毎日鼻腔滴下することによって抗原投与を行った（図１Ａ）。
【００６３】
実施例２：デキサメタゾンとＩＬ−２の組合せは気道においてＴｒｅｇをアップレギュレートし、呼吸器系炎症応答を軽減した
実施例１の喘息マウスモデルに、１２〜１４日目に鼻腔滴下による抗原投与とともに薬物介入を行った。特定の投与方法は、マウスを７％抱水クロラール（Ｓａｎｇｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  （Ｓｈａｎｇｈａｉ）  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で麻酔した後、霧化定量装置（ＭｉｃｒｏＳｐｒａｙｅｒ（登録商標）−モデルＩＡ−１Ｂ）を用いて肺内において霧化により定量的に投与し、投与容量は２５ｕｌ／マウスに固定し、投与用量は濃度レベルにより調整するというものであった。１５日目に、関連の指標を検出した。
【００６４】
気管支肺胞洗浄液の採取
マウスを頚椎脱臼により犠牲にした。マウスに気管の切開部を介して３００ｕｌのＰＢＳ溶液による気管支肺胞洗浄を施し、３回繰り返して約９００ｕｌの気管支肺胞洗浄液を得た。この気管支肺胞洗浄液を２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。これらの細胞をフローサイトメトリーのために回収した。上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３を、市販のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｃｏｒｐ）を使用することによって測定した。
【００６５】
フローサイトメトリー
気管支肺胞洗浄液および脾細胞から回収した細胞中のＴｒｅｇを検出するためにフローサイトメトリーを使用し、ＣＤ４をＦＩＣＴで標識し、ＦｏｘＰ３をＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｅｉｃｎｃｅ）で標識した。ＣＤ４は細胞表面マーカーであって直接標識することができ、ＦｏｘＰ３は細胞内転写因子であって、不動化のための細胞の穿孔処理後に標識される（参考文献１５）。脾臓においてＴｈ２細胞を検出する場合、Ｐｅｒ−ＣＰ標識Ｇａｔｅ３抗体（ｅＢｉｏｓｅｉｃｎｃｅ）を使用し、細胞を穿孔処理した後、標識した。結果は総て、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）によって分析した。
【００６６】
肺組織病理学
マウスの肺を１０％ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、切片とし、Ｈ＆Ｅ（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ，Ｉｎｃ）およびＰＡＳ（Ｓｉｇｍａ）それぞれで染色し、２０倍顕微鏡下で観察した。
【００６７】
従前の試験で、最適用量としての４００，０００ＩＵ  ＩＬ−２と１００μｇデキサメタゾンの組合せは体内でＴｒｅｇを効果的にアップレギュレートし、喘息マウスにおける肺組織の病理学的症状を緩和することができた（参考文献１３）。従前の研究と同じ薬物比を用い（４，０００ＩＵ  ＩＬ−２：１μｇ  Ｄｅｘ）、５０，０００ＩＵ  ＩＬ−２（Ｘｉａｍｅｎ  Ａｍｏｙｔｏｐ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）と１．２５μｇ  Ｄｅｘの組合せを、気道における霧化を介した局所投与により喘息マウスを処置するために試みた。管支肺胞洗浄液中のＴｒｅｇはアップレギュレートされたことが見て取れた（ｐ＜０．０５、図１Ｂ）。肺の病理切片は、肺炎症の病理学的症状が緩和されたことを示した。同じ用量のいずれの薬物単独を用いても同じ効果は達成できず（図１Ｂ、Ｃ）、この合剤投薬が効果的であること、およびその効果は単剤によってはもたらされなかったことを示す。
【００６８】
実施例３：合剤投薬は用量依存的であり、ＩＬ−２（ＰＥＧ）とブデソニド（Ｂｕｄ）の修正組合せは少用量で抗炎症効果を発揮した
薬物は局所適用中に肺で高濃度となること、最適用量は全身適用の最適用量とは異なること、および従前の研究はこの合剤投薬が用量依存的であることを示したこと（参考文献１３）を考慮して、局所投薬の用量依存および最適用量を試験した。モデル化は実施例１と同様に行い、投与およびＴｒｅｇ検出は実施例２と同様に行った。ある一定の範囲内で、薬物の濃度が増すほど、Ｔｒｅｇアップレギュレーションの規模は徐々に大きくなり、その後、効果が低下し始め、これは従前のｉｎ  ｖｉｖｏ試験の結果と一致している。この場合、５０，０００ＩＵ  ＩＬ−２：１２．５μｇ  Ｄｅｘおよび７５，０００ＩＵ  ＩＬ−２：１８．８μｇ  Ｄｅｘの両用量とも、気道のＴｒｅｇを効果的にアップレギュレートした（ｐ＜０．０５、図２Ａ）。
【００６９】
５０，０００ＩＵ  ＩＬ−２の用量はＴｒｅｇを効果的にアップレギュレートできるが、なお比較的大きい（６０ｋｇの成人では１５００万ＩＵのインターロイキン２が必要とされる）。実際の治療では、高用量のＩＬ−２は漏出症候群を引き起こすことがあり、それにより、肺水腫および喘息症状の再燃などのリクスが高まり、組み合わせるグルココルチコイドも比較的高用量であり、これも同様にグルココルチコイドによって引き起こされる有害反応をもたらし得る。
【００７０】
高分子薬に対するＰＥＧ修飾は、その薬物の抗原性を低減できるだけでなく、薬物の半減期を延長し、体内の薬物滞留時間を増やし、それにより、薬物の有効性を改善することができることが分かっている（参考文献１６）。これまでのところ、ＰＥＧ修飾薬の臨床適用は一般に長期有効性を達成するために使用されるが、この試験では、それは薬物の用量をヒト使用に適した用量まで減じるためであり、薬物の作用時間を延長するために使用するのではない（本試験は３日を必要とするに間だけである）。気道腔に薬物を局在させ、他の組織へのその分布を減らすためにＰＥＧ修飾方法が使用できるかどうかを確認することを目的に、ＰＥＧ保持を利用することにより短時間で気道に高い局部的濃度を達成するために、用量検討に一般的なＩＬ−２に代えて分子量２０ｋＤの非分岐ＰＥＧで修飾されたＩＬ−２を使用した。特に断りのない限り、本発明では、分子量２０ｋＤの非分岐ＰＥＧで修飾されたＩＬ−２を使用した。
【００７１】
ＩＬ−２（ＰＥＧ）の調製
バッファーを酢酸−酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４〜６）に置き換えて、ＩＬ−２（配列番号１に示されるような配列）をＭ−ＡｌＤ−２０ｋＤ（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｊｅｎｋｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）非分岐ＰＥＧと混合し（質量比：１：２〜１：６）、この混合物をシアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元し、２〜１０℃で３〜１８時間反応させて粗ＩＬ−２（ＰＥＧ）を得た。粗ＩＬ−２（ＰＥＧ）をまず、酢酸−酢酸ナトリウムバッファー系を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにより分離した。標的タンパク質のピークを収集し、逆相クロマトグラフィーを行い、アセトニトリル・トリフルオロ酢酸系で勾配溶出した。標的タンパク質ピークを収集し、酢酸−酢酸ナトリウムバッファー系を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーにより濃縮した。標的タンパク質ピークを収集し、最後に、限外濾過して酢酸−酢酸ナトリウムバッファーと交換し、ＩＬ−２（ＰＥＧ）保存溶液を得た。
【００７２】
２０ｋＤの非分岐ＰＥＧ修飾ＩＬ−２（ＰＥＧ）の調製と同じ方法で１０ｋＤの非分岐ＰＥＧ修飾ＩＬ−２および２０ｋＤの分岐ＰＥＧ修飾ＩＬ−２をさらに調製した。
【００７３】
選択されたＰＥＧ型による主要な修飾部位はペプチド鎖のＮ末端であり、２０ｋＤ非分岐ＰＥＧによる修飾の後に、ＩＬ−２は１５ｋＤ〜３５ｋＤの分子量（図２Ｂ）と高純度（図２Ｃ）を有していた。活性はＣＴＬＬ−２細胞アッセイによって調べ、ＰＥＧ修飾ＩＬ−２は、ＩＬ−２の実用標準の活性に匹敵する活性を有していたことが確認された（図２Ｄ）。
【００７４】
予期しないことに、ＩＬ−２（ＰＥＧ）に置き換えた後、この合剤投薬はより低用量のＩＬ−２活性単位（１２，５００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）＋３．１３μｇ  Ｄｅｘ）でＴｒｅｇのアップレギュレーションに役割を果たし得ることが見出された（図２Ｅ）。Ｄｅｘは喘息治療のための従来の霧化吸入ホルモンではなく、その分子粒子は、局所的に作用し、血液に容易に入るための薬剤を作製する助けとはならないことから、Ｄｅｘは、喘息の局所治療のための臨床的に一般的なグルココルチコイドであるＢｕｄに置き換えた。開始用量はさらに５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）＋１．２５μｇ  Ｂｕｄまで低減されることが認められた（図２Ｆ）。
【００７５】
３種類の異なる薬物の組合せによるＴｒｅｇアップレギュレーションの詳細な分析で、Ｔｒｅｇアップレギュレーションの規模は主としてＩＬ−２の用量に関連し、ＩＬ−２の用量が高いほどＴｒｅｇアップレギュレーションの規模も大きくなるが、気道で迅速かつ局所的に働く、修飾ＩＬ−２（ＰＥＧ）およびグルココルチコイドＢｕｄは、開始濃度の低減を助けたことが見て取れた（図２Ｇ）。アップレギュレーションの規模はＩＬ−２用量によって決定され、対応するグルココルチコイドの量は二者の比により決定される。本試験の比は従前のｉｎ  ｖｉｖｏ創薬（参考文献１３）に基づいたが、Ｔｒｅｇは、これら２つの薬物の相乗作用によってアップレギュレートされ得る。Ｔｒｅｇは免疫調節に役割を果たすので、それがアップレギュレートされる限り効果がもたらされ得る。
【００７６】
次に、３種類の投与形、５０，０００ＩＵ  ＩＬ−２＋１２．５μｇ  Ｄｅｘ、１２，５００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）＋３．１３μｇ  Ｄｅｘおよび５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）＋１．２５μｇ  Ｂｕｄの開始用量を、喘息マウスを処置するために使用し、マウスの肺機能を測定した。
【００７７】
肺機能測定
２％ペントバルビタールナトリウムで麻酔した後、マウスにそれぞれＰＢＳ中に調製した３．１２５ｍｇ／ｍｌ、６．２５ｍｇ／ｍｌ、および１２．５ｍｇ／ｍｌのメタコリン（Ｓｉｇｍａ）で呼吸器誘発試験を行った。気道抵抗曲線をプロットし、分析した（ＦｉｎｅＰｏｉｎｔ  ＮＡＭ）。アッセイをＢＵＸＣＯ  Ａｉｒｗａｙ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｌｕｎｇ  Ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＵＸＣＯ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）を用いて遂行した。
【００７８】
用量が異なり、Ｔｒｅｇアップレギュレーションの規模も異なったが、気道コンプライアンスの改善が見られ、５０，０００ＩＵ  ＩＬ−２＋１２．５μｇ  Ｄｅｘ群のマウス以外、他の組合せで有意差は見られず、ＩＬ−２（ＰＥＧ）＋Ｂｕｄ投与形は、より少用量で気道抵抗性を改善するより有意な効果を有したことが見て取れた（ｐ＜０．０５、図２Ｈ）。
【００７９】
加えて、喘息の局所治療のための別の臨床的に一般的なグルココルチコイドであるＢＤＰで置き換えた場合、５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）＋１μｇ  ＢＤＰ投与形もまた、気道抵抗性を有意に改善することができた（＊群、対ＮａＣｌ群、ｐ＜０．０５、図２Ｉ）。
【００８０】
実施例４：ＩＬ−２（ＰＥＧ）＋Ｂｕｄ合剤の新規投与形の最適比
ＩＬ−２（ＰＥＧ）＋ＢｕｄはＴｒｅｇのアップレギュレーションおよび喘息の緩和に効果的であったが、その作用範囲は狭かった（図２Ｇ）。従来のＩＬ−２と比較して、ＩＬ−２（ＰＥＧ）は低い抗原性および薬物の容易な局所保持（参考文献１６）の特徴を有し、気道におけるＤｅｘの局所投薬に比べて、Ｂｕｄは、罹患部位に迅速に到達し、即効という特徴を有する（参考文献１７）。さらに、投与様式の変更のために、薬物濃度および代謝は従前のものとは異なる。従って、全身投薬により探索された最適比を持つ従来の投与形に比べ、新規投与形の最も好適な用量比には違いがあるはずである。実施例３は、ＩＬ−２（ＰＥＧ）＋Ｂｕｄは最適効果を有したが、その効果範囲は狭いことを示し、これは不適当な比の薬物を原因とすると推論された。
【００８１】
モデル化は実施例１と同様に行い、投与およびＴｒｅｇ検出は実施例２と同様に行い、Ｂｕｄは、それぞれ２，５００、５，０００、１０，０００または２０，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）との組合せにおいて２μｇに固定した。１０，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）と２μｇ  Ｂｕｄ（５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  Ｂｕｄ）の組合せは気道においてＴｒｅｇを最大限にアップレギュレートすることができたと結論付けられ、これは最適な投与比であった（ｐ＜０．０５、図３）。
【００８２】
実施例５：最適比を有するＩＬ−２（ＰＥＧ）＋Ｂｕｄの新規投与形は、Ｔｒｅｇをアップレギュレートするための広い効果的な範囲を有し、少用量で治療効果を発揮することができた
モデル化は実施例１と同様に行い、投与、Ｔｒｅｇ検出および組織病理学的分析は実施例２と同様に行い、肺機能測定は実施例３と同様に行った。喘息モデルマウスに対する高用量（５０，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１０μｇ  Ｂｕｄ）、中用量（２５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：５μｇ  Ｂｕｄ）および低用量（５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  Ｂｕｄ）、最適用量（５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  Ｂｕｄ）の３日間の連続投与の後に、気管支肺胞洗浄液中の細胞を分析した。３種類の用量総てがＴｒｅｇのアップレギュレートに効果的であることが見て取れ（ｐ＜０．０５、図４Ａ）、用量がさらに低減された場合（２，５００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：  ０．５μｇ  Ｂｕｄ）、アップレギュレーション効果は消失した。肺機能測定および肺組織病理顕微鏡では、Ｔｒｅｇをアップレギュレートすることができる３種類の用量は総て、肺の病理学的症状ならびに気道コンプライアンスおよび気道抵抗性を改善できたことが見て取れた（ｐ＜０．０５、図４Ｂおよび４Ｃ）。２，５００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：０．５μｇ  Ｂｕｄは、Ｔｒｅｇをアップレギュレートすること、または同期的に気道抵抗性を軽減することもできず、さらに、Ｔｒｅｇアップレギュレーションは気道抵抗性を軽減する治療効果に関連していることが示された。
【００８３】
グルココルチコイドと組み合わせた場合の、異なる分子量のＰＥＧで修飾されたＩＬ−２の効果を決定するために、それぞれ実施例２に記載の通りの１０ＫＤの非分岐ＰＥＧ修飾ＩＬ−２および２０ＫＤの分岐ＰＥＧ修飾ＩＬ−２を用いて試験を行った。喘息マウスへの２０，０００ＩＵ  ＰＥＧ修飾ＩＬ−２と４μｇ  Ｂｕｄの組合せの３日間の連続投与の後に、気道抵抗性に軽減が見られ、一定の治療効果を示した（ｐ＜０．０５、図４Ｄ）。これは、１０ｋＤ、２０ｋＤの非分岐ＰＥＧ修飾ＩＬ−２および２０ｋＤの分岐ＰＥＧ修飾ＩＬ−２が喘息に対して治療効果を有していたことを示した。
【００８４】
実施例６：霧化によるＩＬ−２（ＰＥＧ）：Ｂｕｄの局所投薬は、Ｄｅｘの腹腔内注射に比べて即効および顕著な治癒効果を有していた
喘息モデルマウスのモデル化および投与
実施例１と同じマウスを喘息のモデル化に使用し、これらのマウスを、１日目および８日目に１００μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）（Ｓｉｇｍａ）および２ｍｇの注射用Ａｌ（ＯＨ）３（Ｓｉｇｍａ）の腹腔内注射によって感作させ、９〜１８日目に２０μｌの２％ＯＶＡを毎日鼻腔滴下することによって抗原投与を行った。本試験の目的に従い、それぞれ１２〜１８日目、１４〜１８日目および１６〜１８日目に、４０μｇのＤｅｘを腹膜内に注射するか、または２５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）＋５μｇ  Ｂｕｄを霧化により投与した。
【００８５】
投与および組織病理学的分析は実施例２と同様に行い、肺機能試験は実施例３と同様に行った。それはＤｅｘを注射することにより喘息を含む呼吸器系アレルギー性疾患を治療するために臨床上しばしば使用される。２回目の腹腔内注射の翌日から１０日間、マウスに連続的に抗原投与を行い、抗原投与の４、６、および８日後に投与した（図５Ａ）。喘息マウスにおいて、マウス１個体当たり４０μｇ用量のＤｅｘ（喘息を軽減するための用量である６０ｋｇの成人１人当たり１２ｍｇのＤｅｘに相当）を３日間または５日間、連続的に腹腔内注射しても気道抵抗性は緩和されず、喘息に対して治療効果を発揮するためには少なくとも連続７日の腹腔内注射が必要とされた。
【００８６】
しかしながら、少用量（２５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）＋５μｇ  Ｂｕｄ）（図５Ａと同様に投与）での気道に対する局所的霧化治療は、わずか処置３日後に同レベルの治療効果を達成することができた（図５Ｂおよび５Ｃ）。
【００８７】
実施例７：気道に対する局所用合剤投薬は少なくとも６週間治療効果を維持することができた
喘息モデルマウスのモデル化および投与
喘息のモデル化には実施例１と同じマウスを用い、これらのマウスを、１日目および８日目に１００μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）（Ｓｉｇｍａ）および２ｍｇの注射用Ａｌ（ＯＨ）３（Ｓｉｇｍａ）の腹腔内注射によって感作させ、９〜１８日目に２０μｌの２％ＯＶＡを毎日鼻腔滴下することによって抗原投与を行った。薬物介入はモデル化後１２〜１４日目および６週間後に行い、再び、連続３日間の抗原投与のために２０μｌの２％ＯＶＡを使用した。合剤処置（合剤ならびにそれらの比および用量は実施例６と同じであった）は、３日間、気道における局所的霧化投与によって行い、６週間後に、３日間さらなる抗原投与を行った（図６Ａ）。マウスの肺機能測定では、生理食塩水単独で処置したマウス（この群は不良な気道抵抗を示した）に比べ、合剤投薬群のマウスは、より低濃度の濃度のメタコリンによる抗原刺激の後の健常マウスよりも肺機能が不良であったが、これら合剤群のマウスは１２．５ｍｇ／ｍｌのメタコリンによる抗原刺激の後の健常マウスと実質的に同等の肺機能を有していたことが見て取れた。肺組織の病理学的症状はまた、薬物処置の効果が少なくとも６週間維持されたことも示した（図６Ｂおよび６Ｃ）。また、この長期効果は短期効果と同等であった。
【００８８】
実施例８：合剤投薬の作用機序はＴｈ２細胞を相対的にダウンレギュレートすることであり、アップレギュレートされたＴｒｅｇは抗免疫因子を分泌することにより免疫調節効果を発揮することができる
モデル化は実施例１と同様に行い、投与（合剤ならびにそれらの比および用量は実施例６と同じであった）、Ｔｈ２検出、およびサイトカイン検出は実施例２と同様に行った。喘息の発生を促進する重要なエフェクターＴ細胞として、合剤投薬後のマウスの気管支肺胞洗浄液の細胞中のＴｈ２細胞（ＣＤ４＋ｇａｔａ３＋）も分析した。合剤投薬後、Ｔｈ２の比は有意にダウンレギュレートされたが、Ｔｒｅｇ細胞は増加したことが見出され（図７Ａ）、合剤投薬は、喘息の発生に至る重要な因子であるＴｈ２／Ｔｒｅｇの比を調節しつつＴｒｅｇを増やし、喘息は病因から治療されたことを示す（参考文献１，７）。気管支肺胞洗浄液中のサイトカインの分析は、Ｂ細胞からのＩｇＥ抗体の分泌を誘導する病原性サイトカインＩＬ−４は合剤投薬後にダウンレギュレートされたが、免疫バランスを調節するサイトカインＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０は、投薬後に増加したことを明らかにした。加えて、粘液分泌を促進するＩＬ−１３はこれら２群間に有意差を示さず、それは合剤投薬の喘息治療の機構に重要でないことを示唆する（図７Ｂ）。
【００８９】
実施例９：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒｅｇ阻害試験は、合剤投薬により誘導されるＴｒｅｇが非特異的Ｔｒｅｇであったことを示した
脾臓リンパ球の回収
マウス脾臓組織を無菌条件下で採取し、ＰＢＳ中で摩砕した。単細胞を単一のセルストレーナー（ＢＤ）により回収し、遠心分離してＰＢＳを除去し、赤血球溶解バッファー（ＴＩＡＮＧＥＮ）を用いて赤血球溶解処理を施し、再びＰＢＳで洗浄し、１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁させて脾細胞懸濁液を得た。
【００９０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒｅｇ阻害試験
モデル化は実施例１と同様に行い、投与（合剤ならびにそれらの比および用量は実施例６と同じであった）は実施例２と同様に行った。ＤＯ１０．１１マウス（ＯＶＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックマウス）の脾臓のリンパ球を、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋フローソーティングキットを用いて単離した。投薬後の喘息マウスの気管支肺胞洗浄液を無菌的に回収した。Ｔｒｅｇは、フローソーティング法を用いて得た。マウス１個体当たり約１０５細胞が得られた。ＤＯ１０．１１マウスの単離された脾臓リンパ球の培養系にＯＶＡを加え、さらに、健常ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞および薬物処置後の喘息マウスの気管支肺胞洗浄液から選別したＴｒｅｇをそれぞれ加え、１０％血清を含有する１６４０培地で２４時間培養し、細胞増殖を測定するためにＣＦＳＥ染色を施した。
【００９１】
これらの結果は、ＤＯ１０．１１マウスの脾臓リンパ球の培養系へのＯＶＡの添加はエフェクターＴ細胞の増殖を有意に促進できたことを示した。非感作マウスの脾細胞から選別したｎＴｒｅｇの添加および合剤投薬後の喘息モデルマウスで産生されたＴｒｅｇの添加は両方とも、この特異的抗原により誘発されたＴ細胞の増殖を効果的に阻害することができた（図８Ａ）。
【００９２】
リンパ球反応系を各ウェルに約１０５の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス脾細胞を含む９６ウェルプレートに構築し、増殖を刺激するためにマイトマイシンで処理した約１０５のＣ５７ＢＬ／６マウス脾細胞を加え、混合リンパ球反応系を形成した。健常ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞および薬物処置後の喘息マウスの気管支肺胞洗浄液中で選別したＴｒｅｇをそれぞれ加え、１０％血清を含有する１６４０培地で２４時間培養し、細胞増殖を測定するためにＣＦＳＥ染色を施した。
【００９３】
これらの結果は、非感作マウスの脾細胞から選別したｎＴｒｅｇの添加、および合剤投薬後の喘息モデルマウスで産生されたＴｒｅｇの添加は両方とも、リンパ球の活性化および増殖を阻害する同等の効果を有したことを示した（図８Ｂ）。
【００９４】
実施例１０：局所投薬は全身効果を持たなかった
本発明者らのこれまでの研究では、全身投薬は脾細胞でＴｒｅｇをアップレギュレートすることができ、これは自己免疫性ホメオスタシスに効果を有する可能性がある（参考文献１３）。モデル化は実施例１と同様に行い、投与（合剤ならびにそれらの比および用量は実施例６と同じであった）は実施例２と同様に行い、脾細胞を回収した。投薬を行った、および行わなかった喘息モデルマウスの脾細胞のＴｒｅｇとＴｈ２の比を分析し、有意差は見られなかった（Ｐ＞０．０５、図９Ａ）。加えて、数種のサイトカインにも有意差は無く、これは２群のマウスの気管支肺胞洗浄液、血清では異なった（ｐ＞０．０５、図９Ｂ）。
【００９５】
参考文献
2019512506.tif 000003
2019512506.tif 000004
2019512506.tif 000005
【００９６】
【図１】
2019512506.tif 000006
【図２−１】
2019512506.tif 000007
【図２−２】
2019512506.tif 000008
【図３】
2019512506.tif 000009
【図４−１】
2019512506.tif 000010
【図４−２】
2019512506.tif 000011
【図５】
2019512506.tif 000012
【図６】
2019512506.tif 000013
【図７】
2019512506.tif 000014
【図８】
2019512506.tif 000015
【図９】
2019512506.tif 000016
【配列表】
2019512506000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年1月9日(2019.1.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
フローサイトメトリー
気管支肺胞洗浄液および脾細胞から回収した細胞中のＴｒｅｇを検出するためにフローサイトメトリーを使用し、ＣＤ４をＦＩＣＴで標識し、ＦｏｘＰ３をＡＰＣ（ｅＢｉｏｓｅｉｃｎｃｅ）で標識した。ＣＤ４は細胞表面マーカーであって直接標識することができ、ＦｏｘＰ３は細胞内転写因子であって、不動化のための細胞の穿孔処理後に標識される（参考文献１５）。脾臓においてＴｈ２細胞を検出する場合、Ｐｅｒ−ＣＰ標識Ｇａｔａ３抗体（ｅＢｉｏｓｅｉｃｎｃｅ）を使用し、細胞を穿孔処理した後、標識した。結果は総て、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）によって分析した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
実施例６：霧化によるＩＬ−２（ＰＥＧ）：Ｂｕｄの局所投薬は、Ｄｅｘの腹腔内注射に比べて即効および顕著な治癒効果を有していた
喘息モデルマウスのモデル化および投与
実施例１と同じマウスを喘息のモデル化に使用し、これらのマウスを、１日目および８日目に１００μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）（Ｓｉｇｍａ）および２ｍｇの注射用Ａｌ（ＯＨ）３（Ｓｉｇｍａ）の腹腔内注射によって感作させ、９〜１８日目に２０μｌの２％ＯＶＡを毎日鼻腔滴下することによって抗原投与を行った。本試験の目的に従い、それぞれ１２〜１８日目、１４〜１８日目および１６〜１８日目に、４０μｇのＤｅｘを腹膜内に注射するか、または１６〜１８日目に２５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）＋５μｇ  Ｂｕｄを霧化により投与した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
実施例７：気道に対する局所用合剤投薬は少なくとも６週間治療効果を維持することができた
喘息モデルマウスのモデル化および投与
喘息のモデル化には実施例１と同じマウスを用い、これらのマウスを、１日目および８日目に１００μｇのオボアルブミン（ＯＶＡ）（Ｓｉｇｍａ）および２ｍｇの注射用Ａｌ（ＯＨ）３（Ｓｉｇｍａ）の腹腔内注射によって感作させ、９〜１１日目および１２〜１４日目に２０μｌの２％ＯＶＡを毎日鼻腔滴下することによって抗原投与を行った。薬物介入はモデル化後１２〜１４日目に行い、再び、６週間後の５６〜５８日目に連続３日間の抗原投与のために２０μｌの２％ＯＶＡを使用した。合剤処置（合剤ならびにそれらの比および用量は実施例６と同じであった）は、３日間、気道における局所的霧化投与によって行った（図６Ａ）。マウスの肺機能測定では、生理食塩水単独で処置したマウス（この群は不良な気道抵抗を示した）に比べ、合剤投薬群のマウスは、より低濃度の濃度のメタコリンによる抗原刺激の後の健常マウスよりも肺機能が不良であったが、これら合剤群のマウスは１２．５ｍｇ／ｍｌのメタコリンによる抗原刺激の後の健常マウスと実質的に同等の肺機能を有していたことが見て取れた。肺組織の病理学的症状はまた、薬物処置の効果が少なくとも６週間維持されたことも示した（図６Ｂおよび６Ｃ）。また、この長期効果は短期効果と同等であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾インターロイキン２およびグルココルチコイドを含んでなり、かつ薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含んでいてもよい、吸入可能な医薬組成物。
【請求項２】
前記グルココルチコイドが、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）、ブデソニド（Ｂｕｄ）、二プロピオン酸ベクロメタゾン（ＢＤＰ）、シクレソニド、ヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、酪酸クロベタゾン、トリアムシノロンアセトニド、フルオシノロンアセトニド、フロ酸モメタゾン、ハルシノニド、プロピオン酸クロベタゾール、ハルシノニド、ハロメタゾン一水和物および二酢酸ジフロラゾンからなる群から選択される１種以上であり、
好ましくは、前記グルココルチコイドが、デキサメタゾン、ブデソニドおよび二プロピオン酸ベクロメタゾンからなる群から選択される１種以上であり、並びに
好ましくは、前記グルココルチコイドが、デキサメタゾン、ブデソニドおよび二プロピオン酸ベクロメタゾンを含んでなる、
請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記インターロイキン２（ＩＬ−２）が、例えば配列番号１に示されるようなヒト由来ＩＬ−２である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＰＥＧ修飾が、非分岐ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧによる修飾であり、例えば、分子量２〜６０ＫＤの非分岐ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧによる修飾、好ましくは、分子量２、４、６、８、１０、２０、３０、４０、５０または６０ＫＤの非分岐ＰＥＧまたは分岐ＰＥＧによる修飾、好ましくは、分子量１０もしくは２０ＫＤの非分岐ＰＥＧによる修飾または分子量２０ＫＤの分岐ＰＥＧによる修飾であり、好ましくは、前記ＰＥＧが前記ＩＬ−２のＮ末端を修飾する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
（１）１種以上の好適な希釈剤もしくは担体、例えば、ラクトース、デキストラン、マンニトールもしくはグルコース、好ましくは、α−ラクトース一水和物、を含んでいてもよいドライパウダー組成物の形態；または
（２）ＰＥＧ修飾ＩＬ−２とグルココルチコイドの両方が液体噴射剤混合物中に懸濁しているか、もしくは完全に溶解している、加圧式定量吸入の形態
で処方される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の前記グルココルチコイドに対する比が、１，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド〜１０，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドの間であり、好ましくは、３，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；４，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  グルココルチコイド；５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイド；または６，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇグルココルチコイドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量が、３，０００ＩＵ〜１００，０００ＩＵの間であり、好ましくは５，０００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
（１）前記グルココルチコイドがＤｅｘであり、好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の前記Ｄｅｘに対する比が４，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  Ｄｅｘであり、好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量が７，５００ＩＵ〜８０，０００ＩＵの間であり、より好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量が１２，５００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である；または
（２）前記グルココルチコイドがＢｕｄであり、好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２のＢｕｄに対する比が５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  Ｂｕｄであり、好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量が３，５００ＩＵ〜８０，０００ＩＵの間であり、より好ましくは前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量が５，０００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である；または
（３）前記グルココルチコイドがＢＤＰであり、好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２のＢＤＰに対する比が５，０００ＩＵ  ＩＬ−２（ＰＥＧ）：１μｇ  ＢＤＰであり、好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量が３，５００ＩＵ〜８０，０００ＩＵの間であり、より好ましくは、前記ＰＥＧ修飾ＩＬ−２の用量が５，０００ＩＵ〜５０，０００ＩＵの間である、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
呼吸器系疾患の治療において使用するための、好ましくは、前記呼吸器系疾患が慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または喘息である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
呼吸器系疾患に対するグルココルチコイドの治療効力を増強するための医薬組成物を調製するためのポリエチレングリコール修飾インターロイキン２の使用であって、前記医薬組成物が薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含んでいてもよく、
好ましくは、前記医薬組成物が吸入可能な医薬組成物であり、
好ましくは、前記呼吸器系疾患が慢性閉塞性肺疾患または喘息であり、並びに
より好ましくは、前記医薬組成物がグルココルチコイドを含んでなる、
使用。
【請求項１１】
治療上有効な量の、請求項１〜９のいずれか一項に定義されるポリエチレングリコール修飾インターロイキン２およびグルココルチコイド、例えば、請求項１〜９のいずれか一項に定義される医薬組成物、を患者の吸入によって投与することにより、呼吸器系疾患を治療するための、請求項１〜９のいずれか一項に定義される医薬組成物であって、
好ましくは、前記投与が経口吸入または鼻腔内吸入によるものであり、好ましくは、エアロゾルまたはスプレーの手段によるものであり、かつ、
好ましくは、前記呼吸器系疾患が慢性閉塞性肺疾患または喘息である、医薬組成物。
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
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【国際調査報告】
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