(57)【要約】  本発明はピラノース環の４位及び５位に二重結合を含む新規な多糖誘導体の調製に関する。該調整法は，６位のＯＨ基のアルデヒドへの酸化と，それに続く４位及び５位の二重結合−Ｃ＝Ｃ−を生じる脱離，そして最後の６位のアルデヒド基の元のアルコールへの還元からなる。本発明により調製される多糖の誘導体は，増強された抗酸化活性を示し，それらのいくつかはがん細胞の生存率に対して選択的な悪影響をも示す。2019522705.tif 000016（式中，Ｒは−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ３又は−ＯＨを表す）
2019522705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式Ｘ：
2019522705.tif 000014
（式中，Ｒは−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ３又は−ＯＨを表す）
による，その構造内の４位と５位に二重結合を有する複素環を少なくとも一つ含む多糖の不飽和誘導体。
【請求項２】
それらの分子量が５×１０３〜５×１０５の範囲にあり，前記多糖が，コンドロイチン硫酸，カラギーナン，デルマタン硫酸，ヒアルロン酸又はケラタン硫酸を含む群から選択されることを特徴とする請求項１記載の多糖の誘導体。
【請求項３】
請求項１又は２記載の多糖の誘導体の調製法であって，第１工程において断片Ｙ：
2019522705.tif 000015
（式中，Ｒは−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ３又は−ＯＨを表し，Ｒ１は−ＳＯ２−ＯＮａ，−ＳＯ２−ＯＨ又は−Ｈを表す）を含む出発多糖を６位でアルデヒドに酸化し，第２工程においてその環の４位及び５位で脱離して二重結合を形成し，そして第３工程において該アルデヒド基を選択的に還元することを特徴とする方法。
【請求項４】
前記出発多糖がコンドロイチン硫酸，カラギーナン，デルマタン硫酸，ヒアルロン酸又はケラタン硫酸であることを特徴とする請求項３記載の調製法。
【請求項５】
前記第１工程において，Ｃ−６位の前記酸化が，０〜１０℃の温度で水中におけるＲ３−ＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯ（Ｒ３は水素又はＮ−アセチル基である）システム（多糖の繰り返し単位につきＮａＣｌＯのモル量が０．３〜０．８当量の範囲内にあり，Ｒ３−ＴＥＭＰＯのモル量が０．００５〜０．２当量の範囲内にある）により，又は１０〜５０℃の温度におけるＤＭＳＯ中の1,1,1-トリアセトキシ−1,1−ジヒドロ−1,2−ベンズヨードキソール-3(1H)-オン（ＤＭＰ）（ここでＤＭＰの量は多糖の繰り返し単位につき０．０５〜２当量の範囲内である）により行われることを特徴とする請求項３又は４記載の調製法。
【請求項６】
前記出発多糖がヒアルロン酸又はケラタン硫酸であること，及び前記第２工程において，前記酸化された多糖が３０〜８０℃，好ましくは５０〜６０℃の温度で，塩基の存在下で，水／極性非プロトン性溶媒の混合物中で脱離反応を受けることを特徴とする請求項３〜５いずれか１項記載の調製法。
【請求項７】
前記塩基の量が前記繰り返し多糖単位につき０．０１〜２０当量，好ましくは５〜１０当量であり，該塩基が有機塩基，例えばピリジン，トリエチルアミン若しくはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン，又は無機塩基，例えばＣａ（ＯＨ）２を含む群から選択されることを特徴とする請求項６記載の調製法。
【請求項８】
前記非プロトン性溶媒が水混和性であり，例えばＤＭＳＯ又はスルホランを含み，溶媒／水の体積比が３／１〜１／２の範囲にあることを特徴とする請求項６又は７記載の調製法。
【請求項９】
前記第２反応工程が１２〜１５０時間続けられることを特徴とする請求項６〜８いずれか１項記載の調製法。
【請求項１０】
前記出発多糖がコンドロイチン硫酸，カラギーナン又はデルマタン硫酸であり，前記酸化された多糖が，第２工程において直接前記反応混合物中で自発的に脱離されてα，β−不飽和アルデヒドを形成し，その自発的な脱離がいかなる塩基，有機溶媒も加える必要なしに，また反応温度を上げることなしに進むことを特徴とする請求項３〜５いずれか１項記載の調製法。
【請求項１１】
前記出発多糖の分子量が５×１０３〜５×１０５の範囲にあることを特徴とする請求項３〜１０いずれか１項記載の調製法。
【請求項１２】
前記第３工程において，水素化ホウ素ナトリウムを，水中で，繰り返し多糖単位について計算して０．１〜１０当量，好ましくは０．３〜２当量の量で，５〜４０℃，好ましくは１５〜２５℃の温度で，５〜１０，好ましくは６〜８の範囲のｐＨで添加することを特徴とする請求項３〜１１いずれか１項記載の調製法
【請求項１３】
増強された抗酸化効果を有する材料の調製のための請求項１又は２記載の誘導体の使用。
【請求項１４】
前記多糖がヒアルロン酸である，抗がん作用を有する材料の調製のための請求項２記載の誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は，構造式Ｘ：
2019522705.tif 000003
（式中，Ｒは−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ３又は−ＯＨを表す）
による，その構造内に４位及び５位の二重結合を有する複素環を含む多糖誘導体に関する。
【０００２】
さらに，本発明は，構造断片Ｙを含む出発多糖からの前記式Ｘの誘導体の調製であって，その修飾が下記式に要約され得るものに関する。
2019522705.tif 000004
（式中，Ｒは−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ３又は−ＯＨを表し，Ｒ１は−ＳＯ２−ＯＮａ，−ＳＯ２−ＯＨ又は−Ｈを表し，炭素４の絶対配置がＲ又はＳであり得る）。
【０００３】
さらに，本発明は，天然の多糖類とは異なり増強された抗酸化性を示し，そしてそのいくつかはがん細胞の増殖を選択的に抑制する，これらの不飽和誘導体の使用に関する。
【０００４】
発明の背景
一般式Ｙの多糖
多糖類は生物における広範囲にわたる機能，例えば構築, 貯蔵又は調節機能を有する。一般式Ｙの多糖も生物に天然に生じる高分子化合物に属する。
2019522705.tif 000005
（式中，ＲはＣＨ３−ＣＯ−ＮＨ−又は−ＯＨを表し，Ｒ１は−ＳＯ２−ＯＮａ，−ＳＯ２−ＯＨ又は−Ｈを表す）。これは例えばコンドロイチン硫酸，デルマタン硫酸，カラギーナン，ケラタン硫酸又はヒアルロン酸を含む。
【０００５】
コンドロイチン硫酸は，β（１→３）及びβ（１→４）Ｏ−グリコシド結合で互いに結合された繰り返しモノマー単位Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン及びＤ−グルクロン酸からなる線状の，硫酸化された，負に帯電したグリコサミノグリカンである（コンドロイチン硫酸の構造式を下記に示す）。
2019522705.tif 000006
（式中，Ｒ１は−Ｈ又は−Ｎａであり，
Ｒ２は−Ｈ，−ＳＯ２−ＯＮａ又は−ＳＯ２−ＯＨである）。
【０００６】
コンドロイチン硫酸は，動物の結合組織由来であり，タンパク質に結合され，従ってプロテオグリカンの一部を形成する。コンドロイチンの硫酸化は，様々な位置における様々なタイプによるスルホトランスフェラーゼにより実現される。ポリマー鎖における特定の位置における硫酸化の独特のパターンは，コンドロイチン硫酸の特定の生物学的活性をコード（encode）する。コンドロイチン硫酸は関節における軟骨の重要な構造ブロック(block)であり，それに対して圧縮強度を与え，関節滑液組成のバランスを回復させる(Baeurle S. A. a kol.  Polymer 50, 1805, 2009)。
【０００７】
デルマタン硫酸は，β（１→３）及びβ（１→４）Ｏ−グリコシド結合で互いに結合された繰り返しモノマー単位Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン及びＬ−イズロン酸からなる線状の，硫酸化され，かつ，負に帯電したグリコサミノグリカンである（デルマタン硫酸の構造式を下記に示す）。
2019522705.tif 000007
（式中，
Ｒ１は−Ｈ又は−Ｎａであり，
Ｒ２は−Ｈ，−ＳＯ２−ＯＨ又は−ＳＯ２−ＯＮａである）。
【０００８】
デルマタン硫酸はＤ−グルクロン酸のＣ５エピマーであるＬ−イズロン酸の存在によりコンドロイチン硫酸とは異なる。イズロン酸における逆の配置はより良好な柔軟性をデルマタン硫酸鎖に付与し，その周辺領域におけるそれらの特有のグリコサミノグリカン−タンパク質相互作用を確保する。これらの相互作用は，いくつかの細胞プロセス，例えば移動，増殖，分化又は血管形成の調節に寄与する。コンドロイチン硫酸のデルマタン硫酸への転化は，３つの酵素(すなわちデルマタン硫酸エピメラーゼ1(DS-epi1)，デルマタン硫酸エピメラーゼ2(DS-epi2)，及びデルマタン4-Ｏ-スルホトランスフェラーゼ(D4ST1))によって確保される(Thelin M., et al. FEBS Journal 280, 2431, 2013)。
【０００９】
ケラタン硫酸は，β（１→３）及びβ（１→４）結合で結合されたＤ−ガラクトース，Ｎ−アセチルグルコサミン及びガラクトース−６−硫酸を含み、コンドロイチン硫酸に似た構造及び結合を有する線状の硫酸化された多糖類に属する。それは角膜，軟骨，硬骨及び結合組織に見出され得る(ケラタン硫酸の構造式は下記を参照)。
2019522705.tif 000008
（式中，Ｒ２は−Ｈ，−ＳＯ２−ＯＨ又は−ＳＯ２−ＯＮａである）
【００１０】
カラギーナンは，海産の紅藻（red sea algae）の抽出によって得られる線状の，硫酸化された多糖類群に属する。β（１→３）及びβ（１→４）Ｏ−グリコシド結合で互いに結合されたガラクトース及びその3，6-アンヒドロ誘導体がそれらの基本的な構造単位である。硫酸化度及び水溶性が異なるカラギーナンの３つの主要な群が存在する。κ‐カラギーナンは二量体中に１個の硫酸エステル基を有しており，水性環境で硬いゲルを形成する。ι−カラギーナンは２個の硫酸エステルを含んでおり軟かいゲルを形成し，一方，λ−カラギーナンは３個の硫酸エステルを有しており，ゲル化性を示さない。
【００１１】
ヒアルロン酸は，Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの二つの繰り返し単位からなる，硫酸化されていないグリコサミノグリカンである。
2019522705.tif 000009
（式中，Ｒ１はＨ又はＮａである）。
【００１２】
天然のヒアルロン酸の分子量は５×１０４〜５×１０６の範囲にある。この非常に親水性の高い多糖は結合組織，皮膚，関節滑液の一部であり，プロテオグリカンの構成，細胞水和及び分化のような多くの生物学的プロセスに重要な役割を果たす。このポリマーは体内に自然に生じるので，生物分解性であり，組織工学の分野における基材として，又は生物活性物質のキャリヤーとして有用である。
【００１３】
多重結合を含む多糖類
糖環（saccharide cycle)の一部を形成し，鎖の端に位置していない−Ｃ＝Ｃ−多重結合を有する多糖類は非常にまれである。一般的な多糖類の例として，セルロセン（cellulosenes）として知られているセルロースの5,6-不飽和誘導体 (Vigo T. L. et al. Polymers for Advanced Technologies, 10, 6, 311-320, 1999)又はそれらの2,3-不飽和類似体が記載されている。5,6-不飽和誘導体の調製方法は，エノールエーテルを生ずる，塩基性条件下における６位の脱離基と５位の水素原子との脱離反応に基づく (−Ｃ＝Ｃ−多重結合はヘテロ環の酸素と結合している)。セルロース，アミロース又はキシランの2,3-不飽和誘導体の調製  (D. Horton et al. Carbohydrate Research, 40, 2, 345-352, 1975)は，普通のアルケン(多重結合と酸素の共役のない)を生産するために，脱離基の存在に加えて，還元剤，通常は亜鉛を必要とする。
【００１４】
多重結合を含む多糖類の利用
その利用はほとんど糖環の直接の部分ではない−Ｃ＝Ｃ−多重結合の修飾を目的とする。これらの方法はポリマー骨格への新しい物質の結合に基づき，そこではその構造が重大な方法で変化させられ，つまり，多糖の本来の性質が失われている。そのような場合，多重結合は，通常は重合(Bellini D. WO96/37519)，付加(Khetan S. et al. Soft Matter, 5, 1601-1606, 2009)又は付加環化反応(Nimmo Ch. M. et al. Biomacromolecules, 12, 824-830, 2011; Bobula, T. et al. Carbohydrate. Polymers, 125, 153-160, 2015)に使用される。これらの方法は，多糖の有効な架橋(Collins M. N. et al. Carbohydrate Polymers, 92, 1262-1279, 2013; Hacker M. C. et al., Inter. J. of Mol. Sc., 16, 27677-706, 2015)と，該ポリマーへの活性物質の選択的結合(Mero A. et al. Polymers, 6, 346-369, 2014) の両方を導き得る。メタクリレート基の多重結合も，重合反応を行なうために非常によく使用される(Granstrom M. a kol. EP2899214)。
【００１５】
−Ｃ＝Ｃ−多重結合をポリマー鎖中の糖環に直接導入する方法は僅かしかない。それらのうちの一つは，リアーゼによるポリマーの酵素開裂であり，これは二重結合がポリマー，この場合にはヒアルロン酸の非還元末端に生じるものである(Kelly S. J. a kol. Glycobiology, 11, 4, 294-304, 2001) (下記式を参照)。
2019522705.tif 000010
【００１６】
これはこの修飾の発生が分子量に強く依存すること;例えば，４×１０４ の分子量については，１００の二糖類のうちの１つだけが修飾され，分子量が４×１０５である場合，１０００の二糖類のうちの１つが修飾されることを意味する。従って，多糖オリゴマーを除いて，このタイプの修飾はわずかであり，また，出発の及び結果として生じた高分子のポリマーの間の差は実質的にないことが明白である。
【００１７】
第二の方法は，全鎖長に沿って多糖構造の４位及び５位に二重結合を組み込むことを可能にする。従って，より高い分子量を有するポリマーを効率的に修飾できる(Buffa R. et al. WO2014/023272, Bobula T. et al. Carbohydrate Polymers, 136, 1002-1009, 2016)。しかしながら，この方法では多重−Ｃ＝Ｃ−結合が形成され，この結合は強い電子受容体であるアルデヒド基に直接結合する。この修飾は広い範囲の求核分子，通常はアミンの共有結合の形成を可能にするので，多糖類の化学的性質を著しく変更する。上記の事実はさらに，このように修飾されたポリマーが著しく高い求電子特性を有しており，従って天然のポリマーとは化学的に異なることを示唆する。さらに，それは非修飾ポリマーに比べて活性がより低い酸化防止剤と考えることもできる。
【００１８】
本発明に記載した解決法はこれらの欠点をなくすことができる。即ち，非修飾ポリマーと比較して，修飾されたポリマーに反応性求電子基はない。逆に，ヘテロ環の酸素と結合した二重結合は，求核の(酸化防止剤の)性質を有する基と見なすことができる。
【００１９】
発明の要約
本発明は，構造式Ｘ：
2019522705.tif 000011
（式中，Ｒは−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ３又は−ＯＨを表す）
による，その構造内の４位と５位に二重結合を有する複素環を含む多糖の不飽和誘導体に関する。
【００２０】
前記誘導体の分子量は５×１０３〜５×１０５の範囲にあり，出発多糖が，コンドロイチン硫酸，カラギーナン，デルマタン硫酸，ヒアルロン酸又はケラタン硫酸を含む群から選択されることが好ましい。
【００２１】
さらに，本発明は，３つの工程に基づく調製法である（以下のスキームを参照のこと）
2019522705.tif 000012
（式中，Ｒは−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ３又は−ＯＨを表し，Ｒ１は−ＳＯ２−ＯＮａ，−ＳＯ２−ＯＨ又は−Ｈを表す）。
【００２２】
１．酸化−糖環の６位にアルデヒド基を導入する
６位の第一級水酸基のアルデヒド基への酸化
この反応は，例えば水中における2,2,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシルラジカルＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯ酸化システムによって行なうことができる。この工程は，好ましくは多糖の繰り返し単位につき０．０３〜０．８当量のモル量のＮａＣｌＯ及び０．００５〜０．２当量の範囲のモル量のＴＥＭＰＯを用いて，水中で０〜１０℃の温度で行なわれる。出発多糖は，５×１０３〜５×１０５の範囲の分子量を有することができ，好ましくは０．１〜８重量％の多糖水溶液が使用される。最後に，エタノール，チオ硫酸ナトリウム等をこの反応混合物に添加して反応を終了させ，そして未反応の試薬(次亜塩素酸塩)の残滓を除去し得る。さもなければ，この酸化はＤＭＳＯ中，１０℃〜５０℃の温度で，1,1,1-トリアセトキシ-1,1-ジヒドロ-1,2-ベンズヨードキソール-3(1H)-オン（ＤＭＰ）システムにより行なうことができ，ここでＤＭＰの量は多糖の繰り返し単位につき０．０５〜２当量の範囲である。
【００２３】
２．脱離
２ａ． Ｒ１＝−Ｈの場合，水の脱離が行なわれる(脱水)
これは好ましくは水−有機媒体中で行うことができ，該有機溶媒は水混和性で，溶媒/水の体積比が３／１〜１／２の範囲にあるものである。好ましくは，ピリジン，トリエチルアミン又はN,N-ジイソプロピルエチルアミンのような塩基，又は無機塩基，例えばＣａ（ＯＨ）２をこの工程で使用し得る。該反応における塩基の量は多糖の繰り返し単位に基づき０．０１〜２０当量，好ましくは５〜１０当量である。有機溶媒として，水混和性の非プロトン性極性溶媒，好ましくはＤＭＳＯ又はスルホランを使用し得る。酸化は，０．１〜１２時間，好ましくは１〜４時間行なわれ；反応の第２工程は３０〜８０℃，好ましくは５０〜６０℃の温度で，１２〜１５０時間，好ましくは２０〜４０時間行われる。
２ｂ．Ｒ１＝−ＳＯ２ＯＮａ又はＳＯ２−ＯＨの場合には，各々ＮａＯ−ＳＯ２−ＯＮａ又はＨＯ−ＳＯ２−ＯＮａの脱離が行なわれる。環の４位の−ＯＲ１基が５位の水素に関してアンチペリプラナー位置にある場合，脱離は，塩基の追加の必要なしに，及び反応温度を増加させる必要なしに自発的に進行する。工程１＋２ｂの反応時間は，０．１〜１２時間，好ましくは１〜４時間である。糖環の４位の−ＯＲ１基が５位の水素に関してアンチペリプラナー位置にない場合，パート２ａに記載した方法も有効な脱離に使用し得る。
【００２４】
３．還元−糖環の４位及び５位の多重結合を維持しつつ，アルデヒド基をホウ化水素，好ましくはＮａＢＨ４を用いて選択的に還元して第一級アルコール−ＣＨ２ＯＨを形成する。当業者は−ＣＨＯアルデヒド基（又はジェミナルジオール−ＣＨ（ＯＨ）２）の還元に加えて−Ｃ＝Ｃ−結合の還元を予測するであろうが，驚くべきことに，本発明による方法では−Ｃ＝Ｃ−二重結合の還元は生じない。還元剤の量は，多糖の繰り返し単位につき０．１〜１０当量，好ましくは０．３〜２当量の範囲であり得る。この反応は，５〜４０℃の温度かつｐＨ５〜１０，好ましくは１５〜２５℃の温度かつｐＨ６〜８の水中で１〜２４時間行ない得る。出発アルデヒド溶液の濃度は好ましくは０．１〜８重量％である。
【００２５】
上記の事実は，本発明による多糖誘導体の調製法は，出発多糖が（１→３）結合した糖環，６位の第一級−ＣＨ２ＯＨ基及び４位の−ＯＨ，−ＳＯ２−ＯＨ又は−ＳＯ２ＯＮａ基を含む構造Ｙ：
2019522705.tif 000013
を含むことを要することを示唆している。２位の基は所定の修飾の成果の成功に重要ではなく；ほとんどの多糖についてＲは−ＯＨ又は−ＮＨＣＯ−ＣＨ３である。
【００２６】
さらに，本発明は，一般式Ｘの多糖誘導体の使用に関する。上記のように，本発明に記載された解決法は，増強された求核性（抗酸化性）を有し，同時に５位から水素を脱離し４位から−ＯＨ，−Ｏ−ＳＯ２−ＯＨ又は−Ｏ−ＳＯ２−ＯＮａ基を脱離することにより引き起こされる多糖の一次構造の変化がほんの僅かである新しいタイプの多糖誘導体を提供する。これらの新規な誘導体の抗酸化性が，2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジルラジカルを用いる標準測定によって証明され，そこで本発明により調製された多糖不飽和誘導体と飽和（非修飾）類似化合物との間の顕著な違いが観察された。これが，本発明による誘導体が，例えば抗酸化効果を有する材料の調製に使用され得る理由である。
【００２７】
さらに，ヒアルロン酸がその多糖である場合，その不飽和誘導体を抗がん作用を有する材料の調製に使用し得ることがわかった。調製された誘導体の生物学的特性をいくつかのがん細胞株について試験し，すべての場合に低下した生存率が観察され，一方，標準線維芽細胞の増殖は試験濃度の全範囲内において抑制されなかった。
【００２８】
用語「多糖」は，構造単位Ｙを含む多糖，例えばヒアルロン酸，カラギーナン，デルマタン硫酸，ケラタン硫酸もしくはコンドロイチン硫酸，又はその薬学的に許容され得る塩を表す。
【００２９】
用語「薬学的に許容され得る塩」は，生体内の使用にとって安全かつ有効であり，かつ所望の生物活性を有する塩を表す。薬学的に許容され得る塩は，好ましくはアルカリ金属イオン又はアルカリ土類金属イオン，より好ましくは，Ｎａ＋，Ｋ＋，Ｍｇ＋又はＬｉ＋を含む。
【００３０】
この発明に記載した解決法の実現は技術的に複雑ではなく，高価な化学薬品，溶剤又は単離処理の使用を必要としない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
無し
【００３２】
図面の詳細な説明
図１−実施例２５により調製されたΔＨＡの細胞の生存率に対する効果
この図は，NHDF-初代ヒト皮膚線維芽細胞の抑制と比較した，MDA-MB-231−乳腺がん，A-549−肺腺がん，HEP-G2−肝細胞がんのがん細胞の増殖抑制の変化を示す。その方法は実施例２７に述べられている。
図２−非修飾多糖ＨＡ，ＣＳ及び標準の−トロロックス−6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボキシル酸と比較したΔＨＡ及びΔＣＳ材料の抗酸化性
ＨＡ−ヒアルロン酸
ΔＨＡ−４位及び５位が脱水されたヒアルロン酸（実施例２２）
ＣＳ−コンドロイチン硫酸
ΔＣＳ−４位及び５位が脱水されたコンドロイチン硫酸（実施例２）
2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル(DTTH)を用いて実施例２３に記載された方法により試験された。
統計的有意差t検定  −＊p<0.05；** p<0.01;*** p<0.001
【００３３】
本発明の好ましい実施態様
DS =置換度= 100% *(修飾された糖単位のモル量)/(多糖の繰り返し単位のモル量)
ここに使用される当量(eq.)の用語は，特記しない限り特定の多糖類の繰り返し単位に関するものである。パーセンテージは特記しない限り重量パーセントとして記載している。
出発多糖の分子量は，SECMALLS方法によって決定した重量平均分子量である。
【００３４】
実施例１
コンドロイチン硫酸（ＣＳ）の酸化及び脱離＝α，β-不飽和CSアルデヒドの調製
５℃に冷却された，リン酸水素二ナトリウム・十二水和物(２．２当量），臭化ナトリウム（０．８当量)及び4-AcNH-TEMPO(０．０１当量)を含むＣＳ（２００mg，Ｍｗ＝４×１０４)の２％水溶液に，次亜塩素酸ナトリウム溶液(０．８当量，活性塩素１１％)を徐々に添加した。その混合物を５℃の温度で２時間撹拌した。その後，エタノール（１０当量)を該反応(the reaction)に添加し，該反応を室温でさらに１時間撹拌した。その生成物をＩＰＡを用いた沈殿により単離し，ＮＭＲによって分析した。
Ｄ＝２３％(ＮＭＲにより決定した)
【００３５】
実施例２  
α,β-不飽和ＣＳアルデヒドの還元＝ΔＣＳの調製
蒸留水中のα，β−不飽和ＣＳアルデヒド（２００mg，０．５mmol) の２w/v％溶液を調製し，その溶液を５℃に冷却し，その後水素化ホウ素ナトリウム２当量を添加した。その反応混合物を５℃で４時間撹拌した。その生成物をイソプロパノールを用いた沈殿によって単離し，ＮＭＲによって分析した。
ＤＳ＝２５％（ＮＭＲにより決定した)
ΔＣＳのスペクトル分析: NMR 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 2.02 及び2.04 (3H; Ac-NH-; bs); 4.03 (2H; H6; bs); 4.22 (1H; H2; bs); 4.26 (1H; H3; bs); 5.06 (1H; H1; bs); 5.18 (1H; H4; bs); NMR 1H-1H COSY (D2O);クロスピーク; δ ppm: 4.22-5.06; 4.26-5.18; NMR 1H-13C HSQC (D2O); クロスピーク; δ ppm: 4.03-61.0; 4.22-50.5; 4.26-73.4; 5.06-98.3; 5.18-98.9; NMR DOSY (D2O); log D ((2.02 及び2.04; Ac-NH-); (4.03; H6); (4.22; H2); (4.26; H3); (5.06; H4); (5.18; H1)) 〜 -10.4 m2s-1; log D (4.72; H2O) 〜 -8;6 m2s-1; IR (KBr; cm-1): 1660 (ν-C=C- st); 
【００３６】
実施例３
デルマタン硫酸（ＤｅＳ）の酸化及び脱離＝α，β−不飽和ＤｅＳアルデヒドの調製
５℃に冷却された，リン酸水素二ナトリウム・十二水和物（２．２当量)，臭化ナトリウム（０．８当量)及び4-AcNH-TEMPO(０．０１当量)を含むＤｅＳ（２００mg，０．４２mmol）の２％水溶液に，次亜塩素酸ナトリウム（０．８当量，活性塩素１１％）の水溶液を徐々に添加し，その混合物を５℃で２時間撹拌した。その後，エタノール（１０当量)を該反応に添加し，該反応を室温でさらに一時間撹拌した。その生成物をＩＰＡを用いた沈殿によって単離し，ＮＭＲによって分析した。
ＤＳ＝２０％(ＮＭＲにより決定した)
【００３７】
実施例４
α,β−不飽和デルマタン硫酸アルデヒドの還元＝ΔＤｅＳの調製
蒸留水中のα，β−不飽和ＤｅＳアルデヒド（２００mg，０．５mmol)の２w/v%溶液を調製した。該溶液を５℃に冷却し，その後，水素化ホウ素ナトリウム(ＤｅＳ二糖につき２当量)を添加した。その反応混合物を５℃で４時間撹拌した。その生成物をイソプロパノールを用いた沈殿によって単離し，ＮＭＲによって分析した。
ＤＳ＝２３％（ＮＭＲにより決定した）
ΔＤｅＳのスペクトル分析：NMR 1H (500 MHz, D2O, δ ppm)：2.01 (3H, Ac-NH-, bs), 5.05 (1H, H1, bs), 5.17 (1H, H1, bs)
【００３８】
実施例５
カラギーナン(ＫＡ)の酸化及び脱離＝α,β- 不飽和ＫＡアルデヒドの調製
１０℃に冷却された，リン酸水素二ナトリウム・十二水和物(２．２当量)，臭化ナトリウム(０．８当量)及び4-AcNH-TEMPO(０．０１当量)を含むＫＡ（２００mg，０．３１mmol）の１％水溶液に，次亜塩素酸ナトリウム（０．８当量，活性塩素１１％）の水溶液を徐々に添加した。その混合物を１０℃で２時間撹拌した。その後，エタノール（１０当量）を該反応に添加し，該反応を室温でさらに１時間撹拌した。その生成物をＩＰＡを用いた沈殿によって単離し，ＮＭＲによって分析した。
ＤＳ＝１０％（ＮＭＲにより決定した）
【００３９】
実施例６
α,β−不飽和のカラギーナンアルデヒドの還元＝ΔＫＡの調製
蒸留水中のα，β -不飽和のＫＡアルデヒド（２００mg，０．５mmol）の２w/v％の溶液を調製した。該溶液を５℃に冷却し，その後，水素化ホウ素ナトリウム（ＫＡ二糖につき２当量）を添加した。この反応混合物を５℃で４時間撹拌した。その生成物をイソプロパノールを用いた沈殿によって単離し，ＮＭＲによって分析した。
ＤＳ＝１３％（ＮＭＲにより決定した）
NMR 1H (500 MHz, D2O, δ ppm): 5.07 (1H, H1, bs), 5.18 (1H, H1, bs)
【００４０】
実施例７
ケラタン硫酸（ＫＳ）の酸化＝ＫＳアルデヒドの調製
ＮａＣｌＯ（０．３当量）の水溶液を，ＮａＣｌ１％，ＫＢｒ１％，ＴＥＭＰＯ（０．０１当量）及びＮａＨＣＯ３（２０当量）を含むＫＳ（１ｇ，Ｍｗ＝２×１０４）の１％水溶液に窒素下で徐々に添加した。その混合物を０℃で２４時間撹拌し，その後，０．１ｇのチオ硫酸ナトリウムを添加し，その混合物をさらに１０分間撹拌した。結果として生じた溶液を蒸留水で０．２％まで希釈し，５リットル（０．１％のＮａＣｌ，０．１％のＮａＨＣＯ３）の混合物に対して３回（１日１回），及び５リットルの蒸留水に対して７回（１日２回）透析した。その後，結果として生じた溶液を蒸発させ分析した。
ＤＳ＝３％（ＮＭＲにより決定した）
【００４１】
実施例８
ＫＳアルデヒドの脱離＝α，β−不飽和ＫＳアルデヒド＝調製
６．７mlのＤＭＳＯ及びＤＩＰＥＡ塩基（５当量）を，水中の３％ＫＳアルデヒド溶液（０．１g，ＤＳの酸化度（oxidation degree of DS）＝３％，実施例７）に添加した。その混合物を６０℃の温度で７２時間撹拌した。その後，結果として生じた溶液をイソプロパノール／ヘキサン混合物によって沈殿させ，固体部分を真空乾燥した。
ＤＳ＝２％（ＮＭＲにより決定した）
1H NMR (D2O) δ 9.22 (s, 1H, -CH=O),  6.32 (m, 1H, -CH=C-CH=O)
【００４２】
実施例９
α，β−不飽和ＫＳアルデヒドの還元＝ΔＫＳの調製
水素化ホウ素ナトリウム（２当量）を蒸留水中のα，β−不飽和ＫＳアルデヒド（２００mg，実施例８）の２％溶液に添加した。その反応混合物を５℃で３時間撹拌し，その後，イソプロパノールで沈殿させ，ＮＭＲによって分析した。
ＤＳ＝２％（ＮＭＲにより決定した）
1H NMR (D2O)   5.05 (1H, H1, bs), 5.17 (1H, H4, bs)
【００４３】
実施例１０
ヒアルロン酸（ＨＡ）の酸化＝ＨＡ−アルデヒドの調製
ＮａＣｌＯ（０．５当量）の水溶液を，ＮａＣｌ１％，ＫＢｒ１％，ＴＥＭＰＯ（０．０１当量）及びＮａＨＣＯ３（２０当量）を含むＨＡ（１ｇ，Ｍｗ＝２×１０５）の１％水溶液に窒素下で徐々に添加した。その混合物を０℃で１２時間撹拌し，その後，０．５ｍｌのエタノールを添加し，その混合物をさらに１時間撹拌した。結果として生じた溶液を蒸留水で０．２％まで希釈し，５リットル（０．１％のＮａＣｌ，０．１％のＮａＨＣＯ３）の混合物に対して３回（１日１回），及び５リットルの蒸留水に対して７回（１日２回）透析した。その後，結果として生じた溶液を蒸発させ分析した。
ＤＳ＝１０％（ＮＭＲにより決定した）
【００４４】
実施例１１
ＨＡの酸化＝ＨＡ−アルデヒドの調製
ＮａＣｌＯ（０．５当量）の水溶液を，ＮａＣｌ１％，ＫＢｒ１％，Ｎ−アセチルアミノ−ＴＥＭＰＯ（０．０１当量）及びＮａＨＣＯ３（２０当量）を含むＨＡ（１g，Ｍｗ＝２×１０５）の１％水溶液に窒素下で徐々に添加した。その混合物を１０℃で１２時間撹拌し，その後，０．１ｍｌのエタノールを添加し，その混合物をさらに１時間撹拌した。結果として生じた溶液を蒸留水で０．２％まで希釈し，５リットル（０．１％のＮａＣｌ，０．１％のＮａＨＣＯ３）の混合物に対して３回（１日１回），及び５リットルの蒸留水に対して７回（１日２回）透析した。その後，結果として生じた溶液を蒸発させ分析した。
ＤＳ＝９％（ＮＭＲにより決定した）
【００４５】
実施例１２
ＨＡの酸化＝ＨＡ−アルデヒドの調製
ＮａＣｌＯ（０．３当量）の水溶液を，ＮａＣｌ１％，ＫＢｒ１％，ＴＥＭＰＯ（０．２当量）及びＮａＨＣＯ３（２０当量）を含むＨＡ（１ｇ，Ｍｗ＝２×１０５）の１％水溶液に窒素下で徐々に添加した。その混合物を５℃で４８時間撹拌し，その後，０．１ｍｌのエタノールを添加し，その混合物をさらに１時間撹拌した。結果として生じた溶液を蒸留水で０．２％まで希釈し，５リットル（０．１％のＮａＣｌ，０．１％のＮａＨＣＯ３）の混合物に対して３回（１日１回），及び５リットルの蒸留水に対して７回（１日２回）透析した。その後，結果として生じた溶液を蒸発させ分析した。
ＤＳ＝５％（ＮＭＲにより決定した）
【００４６】
実施例１３
ヒアルロン酸（ＨＡ）の酸化＝ＨＡ−アルデヒドの調製
ＮａＣｌＯ（０．７当量）の水溶液を，ＮａＣｌ１％，ＫＢｒ１％，ＴＥＭＰＯ（０．０１当量）及びＮａＨＣＯ３（２０当量）を含むＨＡ（１g，Ｍｗ＝２×１０５）の１％水溶液に窒素下で徐々に添加した。その混合物を０℃で０．５時間撹拌し，その後，０．１mlのエタノールを添加し，その混合物をさらに１時間撹拌した。結果として生じた溶液を蒸留水で０．２％まで希釈し，５リットル（０．１％のＮａＣｌ，０．１％のＮａＨＣＯ３）の混合物に対して３回（１日１回），及び５リットルの蒸留水に対して７回（１日２回）透析した。その後，結果として生じた溶液を蒸発させ分析した。
ＤＳ＝９％（ＮＭＲにより決定した）
【００４７】
実施例１４
ヒアルロン酸（ＨＡ）の酸化＝ＨＡ−アルデヒドの調製
ＮａＣｌＯ（０．５当量）の水溶液を，ＮａＣｌ１％，ＫＢｒ１％，ＴＥＭＰＯ（０．０１当量）及びＮａＨＣＯ３（２０当量）を含むＨＡ（１g，Ｍｗ＝２×１０５）の１％水溶液に窒素下で徐々に添加した。その混合物を０℃で１２時間撹拌し，その後，０．１mlのエタノールを添加し，その混合物をさらに１時間撹拌した。結果として生じた溶液を蒸留水で０．２％まで希釈し，５リットル（０．１％のＮａＣｌ，０．１％のＮａＨＣＯ３）の混合物に対して３回（１日１回），及び５リットルの蒸留水に対して７回（１日２回）透析した。その後，結果として生じた溶液を蒸発させ分析した。
ＤＳ＝１０％（ＮＭＲにより決定した）
【００４８】
実施例１５
ヒアルロン酸（ＨＡ）の酸化＝ＨＡアルデヒドの調製
1,1,1-トリアセトキシ−1,1−ジヒドロ−1,2−ベンズヨードキソール-3(1H)-オン（デス・マーチンペルヨージナン）１．２当量を１％の酸型ヒアルロナン（１g，Ｍｗ＝１×１０５）の無水（non-aqueous)ＤＭＳＯ溶液に添加し，この混合物を２０℃で５時間撹拌した。その後，結果として生じた溶液を蒸留水で０．２％まで希釈し，５リットルの（０．１％のＮａＣｌ，０．１％のＮａＨＣＯ３）の混合物に対して３回（１日１回），及び５リットルの蒸留水に対して７回（１日２回）透析した。その後，結果として生じた溶液を蒸発させ分析した。
ＤＳ＝４０％（ＮＭＲにより決定した）
【００４９】
実施例１６
ＨＡ−アルデヒドの脱離＝α，β−不飽和ＨＡアルデヒドの調製
６．７mlのＤＭＳＯ及びＤＩＰＥＡ塩基（５当量）を，３％のＨＡ−アルデヒド（０．１ｇ，酸化度ＤＳ（oxidation degree DS）＝４０％，実施例１５）の水溶液に添加した。その混合物を６０℃で７２時間撹拌した。その後，結果として生じた溶液をイソプロパノール／ヘキサン混合物によって沈殿させ，固体部分を真空乾燥した。
ＤＳ＝２０％（ＮＭＲにより決定した）
1H NMR (D2O)   δ 9.24 (s, 1H, -CH=O),  6.32 (m, 1H, -CH=C-CH=O)
UV-Vis (D2O)  252 nm, π-π* 遷移 α,β-不飽和アルデヒド
【００５０】
実施例１７
ＨＡ−アルデヒドの脱離＝α，β−不飽和ＨＡアルデヒドの調製
６．７ｍｌのＤＭＳＯ及びトリエチルアミン塩基（２０当量）を，３％のＨＡ−アルデヒド（０．１ｇ，酸化度ＤＳ＝１０％，実施例１０）の水溶液に添加した。その混合物を３０℃で１５０時間撹拌した。その後，結果として生じた溶液をイソプロパノール／ヘキサン混合物によって沈殿させ，固体部分を真空乾燥した。
ＤＳ＝５％（ＮＭＲにより決定した）
【００５１】
実施例１８
ＨＡ−アルデヒドの脱離＝α，β−不飽和ＨＡアルデヒドの調製
６．７mlのＤＭＳＯ及びピリジン塩基（０．０１当量）を，３％のＨＡ−アルデヒド（０．１ｇ，酸化度ＤＳ＝１０％，実施例１０）の水溶液に添加した。その混合物を８０℃で１２時間撹拌した。その後，結果として生じた溶液をイソプロパノール／ヘキサン混合物によって沈殿させ，固体部分を真空乾燥した。
ＤＳ＝３％（ＮＭＲにより決定した）
【００５２】
実施例１９
ＨＡ−アルデヒドの脱離＝α，β−不飽和ＨＡアルデヒドの調製
１．７mlのＤＭＳＯ及びピリジン塩基（１０当量）を，３％のＨＡ−アルデヒド（０．１ｇ，酸化度ＤＳ＝１０％，実施例１０）の水溶液に添加した。その混合物を６０℃で４８時間撹拌した。その後，結果として生じた溶液をイソプロパノール／ヘキサン混合物によって沈殿させ，固体部分を真空乾燥した。
ＤＳ＝４％（ＮＭＲにより決定した）
【００５３】
実施例２０
ＨＡ−アルデヒドの脱離＝α，β−不飽和ＨＡアルデヒドの調製
１０mlのＤＭＳＯ及びＤＩＰＥＡ塩基（５当量）を，３％のＨＡ−アルデヒド（０．１g，酸化度ＤＳ＝１０％，実施例１０）の水溶液に添加した。その混合物を６０℃で４８時間撹拌した。その後，結果として生じた溶液をイソプロパノール／ヘキサン混合物によって沈殿させ，固体部分を真空乾燥した。
ＤＳ＝５％（ＮＭＲにより決定した）
【００５４】
実施例２１
ＨＡ−アルデヒドの脱離＝α，β−不飽和ＨＡアルデヒドの調製
６．７mlのスルホラン及びＤＩＰＥＡ塩基（５当量）を，３％のＨＡ−アルデヒド（０．１ｇ，酸化度ＤＳ＝１０％，実施例１０）の水溶液に添加した。その混合物を５０℃で７２時間撹拌した。その後，結果として生じた溶液をイソプロパノール／ヘキサン混合物によって沈殿させ，固体部分を真空乾燥した。
ＤＳ＝５％（ＮＭＲにより決定した）
【００５５】
実施例２２
α，β−不飽和ＨＡアルデヒドの還元＝ΔＨＡの調製
水素化ホウ素ナトリウム（１０ 当量）を，５℃の，２％のα，β−不飽和ＨＡアルデヒド（２００mg，実施例１６）の蒸留水溶液に添加した。この反応混合物を５℃で１時間撹拌し，その後，イソプロパノールで沈殿させ，ＮＭＲによって分析した。
ＤＳ＝２０％（ＮＭＲにより決定した）
1H NMR (D2O)   5.06 (1H, H1, bs), 5.17 (1H, H1, bs)
【００５６】
実施例２３
α，β−不飽和ＨＡアルデヒドの還元＝ΔＨＡの調製
水素化ホウ素ナトリウム（０．１ 当量）を，５℃の，２％のα，β−不飽和ＨＡアルデヒド（２００mg，実施例１７）の蒸留水溶液に添加した。この反応混合物を５℃で２０時間撹拌し，その後，イソプロパノールで沈殿させ，ＮＭＲによって分析した。
ＤＳ＝４％（ＮＭＲにより決定した）
【００５７】
実施例２４
α，β−不飽和ＨＡアルデヒドの還元＝ΔＨＡの調製
水素化ホウ素ナトリウム（１当量）を，４０℃の，２％のα，β−不飽和ＨＡアルデヒド（２００mg，実施例１７）の蒸留水溶液に添加した。この反応混合物を４０℃で１時間撹拌し，その後，イソプロパノールで沈殿させ，ＮＭＲによって分析した。
ＤＳ＝５％（ＮＭＲにより決定した）。
【００５８】
実施例２５
α，β−不飽和ＨＡアルデヒドの還元＝ΔＨＡの調製
水素化ホウ素ナトリウム（２当量）を，２０℃の，２％のα，β−不飽和ＨＡアルデヒド（２００mg，実施例１７）の蒸留水溶液に添加した。この反応混合物を２０℃で４時間撹拌し，その後，イソプロパノールで沈殿させ，ＮＭＲによって分析した。
ＤＳ＝５％（ＮＭＲにより決定した）。
【００５９】
実施例２６
酸化活性の測定（図２）
実施例２２によって調製したΔＨＡ多糖類と実施例２によって調製したΔＣＳの抗酸化力を安定なフリーラジカルである2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）によって測定した。この測定は, Brand-Williams W. et al.の「LWT- Food Science and Technology」（28, 1, 25-30, 1995）の記載に基づき，マイナーな修正を加えて行った。簡潔に述べると，０．０１％のＤＰＰＨメタノール溶液１００μLを，５０mMのTris（pH7.1）に溶解した試験物質１００μLに添加した。１５分後に吸光度の減少を５１５nmで測定した。トロロックス(6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボキシル酸）をポジティブコントロールとして使用した。データは３つの独立した実験で測定した。ｔ検定を統計的有意差の評価に使用した*p<0.05,** p<0.01,*** p<0.001（図２）。
【００６０】
実施例２７
実施例２５によって調製した誘導体の細胞毒性の試験（図１）
該ＨＡ誘導体の細胞毒性効果を，非がん細胞−初代ヒト皮膚繊維芽細胞について，そして乳がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１），肺がん細胞株（Ａ−５４９）及び肝細胞がん細胞株（ＨＥＰ−Ｇ２）について比較した。実験の目的で，細胞を適切な培地（１０％ＦＢＳ−ウシ胎児血清）中で標準条件（３７℃，５％ＣＯ２）下で培養した。８０％コンフルエントに達した後に，細胞を継代し，自動カウンターＣＡＳＹ  ＴＴ，Ｒｏｃｈｅにより測定し，培地２００μl中９６ウェルパネルに各ウェル細胞５０００個の密度で入れた。２４時間後，培地を濃度１，０００；５００；１００；及び１０μg/mLの試験物質の１０％培地溶液に替えた。細胞の生存率を処理後２４，４８及び７２時間後にＭＴＴ試験により測定した−２０μLのＭＴＴ溶液（５mg／ｍＬ）を各ウェルに添加し，続いて２．５時間のインキュベーション及び３０分間の可溶化溶液（ＩＰＡ：ＤＭＳＯ  １：１  ｓ１０％のTriton X-100及び９．９％ ３７％ＨＣｌ）による細胞溶解を行った。その後，吸光度を５７０nm及び６９０nm（バックグラウンド補正）でマイクロプレートリーダＶＥＲＳＡｍａｘによって測定した。処理された細胞の生存率を図１中の０に相当する未処理のコントロールとの相関によって評価した。０より高い値は，細胞活性化（誘導体の細胞毒性がないこと）を表し，０より低い値は，細胞の生存率が減少していること（即ち誘導体の細胞毒性効果）を示す。ＮＨＤＦの場合に，試験誘導体に細胞毒性がなかったことが図１において明らかである。がん細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，Ａ−５４９，ＨＥＰ−Ｇ２）の場合に，誘導体の細胞毒性が観察された。示された試験の結果に基づいて，誘導体の潜在的ながん治療効果を推定できる（図１）。
【図１】
2019522705.tif 000017
【図２】
2019522705.tif 000018
【国際調査報告】
2019522705.tif 000019
2019522705.tif 000020