(57)【要約】本発明は、ファブリー病の治療のためのｍＲＮＡ療法に関する。本発明で使用するためのｍＲＮＡは、インビボで投与されたとき、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、そのアイソフォーム、その機能的断片、及びＧＬＡを含む融合タンパク質をコードする。本発明のｍＲＮＡは、好ましくは、対象に投与されるときに対象における細胞及び／または組織への効率的な送達を達成するために、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にカプセル封入される。本発明のｍＲＮＡ療法は、対象におけるＧＬＡ発現及び／または活性の欠乏レベルを増加させる及び／または回復させる。本発明のｍＲＮＡ療法はさらに、対象における欠乏ＧＬＡ活性に関連する毒性代謝産物、つまりＧｂ３及びリゾ−Ｇｂ３のレベルを減少させる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬組成物であって、
（ａ）（ｉ）α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む、ＯＲＦ、及び（ｉｉ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位を含む非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、ｍＲＮＡと、
（ｂ）送達剤と、を含み、
ファブリー病の治療を必要とするヒト対象への投与に好適である、前記医薬組成物。
【請求項２】
ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物であって、前記組成物は、必要のあるヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、（ｉ）投与後少なくとも２４時間にわたって血漿中ＧＬＡ活性レベルを参照の生理的レベル以上に増加させる、及び／または（ｉｉ）投与後少なくとも２４時間にわたって血漿中ＧＬＡ活性レベルを参照の血漿中ＧＬＡ活性レベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、もしくはそれよりも高く維持するのに十分である、前記医薬組成物。
【請求項３】
前記組成物は、ファブリー病を患うヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、投与後７２時間、参照の血漿中ＧＬＡ活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％を維持するのに十分である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、脂質ナノ粒子にカプセル封入されたｍＲＮＡを含む、医薬組成物であって、前記組成物は、必要のあるヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、（ｉ）投与後少なくとも２４時間にわたって肝臓、心臓及び／または腎臓ＧＬＡ活性レベルを参照の生理的レベル以上に増加させる、及び／または（ｉｉ）投与後少なくとも２４時間にわたって血漿中ＧＬＡ活性レベルを参照の血漿中ＧＬＡ活性レベルの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、もしくはそれよりも高く維持するのに十分である、前記医薬組成物。
【請求項５】
前記組成物は、それを必要とする前記ヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、投与後７２時間、参照の肝臓及び／または心臓ＧＬＡ活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％を維持するのに十分である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記組成物は、それを必要とする前記ヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、（ｉ）投与後少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、もしくは少なくとも６週間にわたって、リゾ−Ｇｂ３血漿中レベルを少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％、及び／または（ｉｉ）投与後少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、もしくは少なくとも６週間にわたって、Ｇｂ３血漿中レベルを少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％低減するのに十分である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物であって、前記組成物は、必要のある対象に単回静脈内投与として投与されるとき、
（ｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、Ｇｂ３の血漿中レベルを治療前のＧｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％低減する、及び／または
（ｉｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、リゾ−Ｇｂ３の血漿中レベルを治療前のリゾ−Ｇｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％低減するのに十分である、前記医薬組成物。
【請求項８】
ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物であって、前記組成物は、必要のある対象に単回静脈内投与として投与されるとき、
（ｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、心臓、腎臓、肝臓、または脾臓組織中のＧｂ３の組織中レベルをその組織中の治療前のＧｂ３レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％低減する、及び／または
（ｉｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、心臓、腎臓、肝臓、または脾臓組織中のリゾ−Ｇｂ３の組織中レベルをその組織中の治療前のリゾ−Ｇｂ３レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％低減するのに十分である、前記医薬組成物。
【請求項９】
ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物であって、前記組成物は、必要のある対象に単回静脈内投与として投与されるとき、
（ｉ）投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、もしくは少なくとも１６８時間にわたって、血漿中ＧＬＡ活性レベルを増加させる、
（ｉｉ）投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、もしくは少なくとも１６８時間にわたって、心臓組織中ＧＬＡ活性レベルを増加させる、
（ｉｉｉ）投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、もしくは少なくとも１６８時間にわたって、肝臓組織中ＧＬＡ活性レベルを増加させる、
（ｉｖ）投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、もしくは少なくとも１６８時間にわたって、腎臓組織中ＧＬＡ活性レベルを増加させる、及び／または
（ｖ）投与後少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間、もしくは少なくとも１６８時間にわたって、脾臓組織中ＧＬＡ活性レベルを増加させるのに十分である、及び／または
前記増加されたＧＬＡ活性レベルは、対応する参照のＧＬＡ活性レベルの少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％超である、前記医薬組成物。
【請求項１０】
送達剤をさらに含む、請求項２〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドであって、前記ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最小ウラシルまたはチミン含量と比べた前記ＯＲＦのウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）が約１００％〜約１５０％である、前記ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記％ＵＴＭまたは％ＴＴＭは、約１１０％〜約１５０％、約１１５％〜約１５０％、約１２０％〜約１５０％、約１１０％〜約１４５％、約１１５％〜約１４５％、約１２０％〜約１４５％、約１１０％〜約１４０％、約１１５％〜約１４０％、または約１２０％〜約１４０％である、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記対応する野生型ＯＲＦの前記ウラシルまたはチミン含量と比べた前記ＯＲＦの前記ウラシルまたはチミン含量（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）は、１００％未満である、請求項１１または１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、８０％未満、７５％未満、７４％未満、７３％未満、７２％未満、７１％未満、または７０％未満である、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ＯＲＦ中の総ヌクレオチド含量と比べた前記ＯＲＦ中の前記ウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、または約２０％未満である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、約２０％未満である、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最大グアニン含量に対する前記ＯＲＦの前記グアニン含量（％ＧＴＭＸ）は、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記％ＧＴＭＸは、約６４％〜約８５％、約６５％〜約８５％、または約６５％〜約８０％である、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最大シトシン含量と比べた前記ＯＲＦの前記シトシン含量（％ＣＴＭＸ）は、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記％ＣＴＭＸは、約６０％〜約９５％、約６５％〜約９５％、約７０％〜約９５％、または約７５％〜約９０％である、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における理論上最大グアニン及びシトシン（Ｇ／Ｃ）含量と比べた前記ＯＲＦの前記Ｇ／Ｃ含量（％Ｇ／ＣＴＭＸ）は、少なくとも約７３％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である、請求項１１〜２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記％Ｇ／ＣＴＭＸは、約８０％〜約１００％、約８５％〜約９９％、約９０％〜約９９％、または約９５％〜約９９％である、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記対応する野生型ＯＲＦにおける前記Ｇ／Ｃ含量と比べた前記ＯＲＦにおける前記Ｇ／Ｃ含量（％Ｇ／ＣＷＴ）は、少なくとも１０２％、少なくとも１０３％、少なくとも１０４％、少なくとも１０５％、少なくとも１０６％、少なくとも１０７％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、または少なくとも約１２５％である、請求項１１〜２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記ＯＲＦは、配列番号３〜２７、７９、８０、及び１４１〜１５９からなる群から選択される核酸配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１１〜２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
前記ＯＲＦは、配列番号７９または８０の前記核酸配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１１〜２４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記ＯＲＦは、配列番号７９または８０の前記核酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する、請求項１１〜２５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
前記ＯＲＦは、配列番号７９または８０の前記核酸配列を含む、請求項１１〜２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２８】
ｍＲＮＡである、請求項１１〜２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
請求項２８に記載のｍＲＮＡと送達剤とを含む、医薬組成物。
【請求項３０】
前記送達剤は、脂質様物質、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、ポリマー化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、またはコンジュゲートを含む、請求項１、６、１０、及び２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、（１３Ｚ，１６５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニドコサ−１３−１６−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）、２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）、（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される脂質を含む、請求項１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記脂質ナノ粒子は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡを含む、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物
【化１２０】
2019516719.tif 000241
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるが、
但し、Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４もしくは５である場合の−Ｎ（Ｒ）２ではないか、あるいは（ｉｉ）Ｑは、ｎが１または２である場合の５、６、または７員ヘテロシクロアルキルではないことを条件とする、請求項１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、前記化合物が式（ＩＡ）、
【化１２１】
2019516719.tif 000242
またはその塩もしくは立体異性体のものであることを含み、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
ｍは、５、７、または９である、請求項３３〜３４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記化合物は、式（ＩＩ）
【化１２２】
2019516719.tif 000243
またはその塩もしくは立体異性体のものであり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
Ｍ１は、Ｍ’である、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−である、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
ｌは、１、３、または５である、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記化合物は、化合物１〜化合物２３２、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項３３に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記化合物は、化合物１〜化合物１４７、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記化合物は、化合物１８、それらの塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項４１に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、式（ＩＩＩ）を有する化合物
【化１２３】
2019516719.tif 000244
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
環Ａは、
【化１２４】
2019516719.tif 000245
であり、
ｔは、１または２であり、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−  −ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は独立して、結合、−ＣＨ２−、−ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から選択され、
Ａが
【化１２５】
2019516719.tif 000246
であるとき、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、−ＣＨ２−ではないか、及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’である、請求項１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記化合物は、下記式を有する、請求項４３に記載の医薬組成物
【化１２６】
2019516719.tif 000247
【請求項４５】
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、式（ＩＶ）を有する化合物
【化１２７】
2019516719.tif 000248
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ６−２０アルキル及びＣ６−２０アルケニルからなる群から選択され、
Ａが
【化１２８】
2019516719.tif 000249
であるとき、
ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は同じであり、ここでＲ１は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、またはＣ１８アルケニルではない、
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６−２０アルケニルから選択される、
ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも別の１つとは異なる数の炭素原子を有する、
ｉｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルキルから選択される、あるいは
ｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルケニルから選択される、請求項１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記化合物は、式（ＩＶａ）のものである、請求項４５に記載の医薬組成物。
【化１２９】
2019516719.tif 000250
【請求項４７】
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、式（Ｖ）を有する化合物
【化１３０】
2019516719.tif 000251
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ３は、ＣＨまたはＮであり、
Ａ４は、ＣＨ２またはＮＨであり、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも１つは、ＮまたはＮＨであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｘ１及びＸ２は独立して、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から選択される、請求項１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記化合物は、式（Ｖａ）のものである、請求項４７に記載の医薬組成物。
【化１３１】
2019516719.tif 000252
【請求項４９】
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、式（ＶＩ）を有する化合物、
【化１３２】
2019516719.tif 000253
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ６及びＡ７は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ６及びＡ７のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｘ４及びＸ５は独立して、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から選択される、請求項１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、化合物２３３〜化合物３４２、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される化合物を含む、請求項１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記化合物は、化合物２３６、それらの塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡと、式（Ｉ）を有する化合物
【化１３３】
2019516719.tif 000254
またはその塩もしくは立体異性体を含む送達剤とを含む、医薬組成物であって、式中、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるが、
但し、Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４もしくは５である場合の−Ｎ（Ｒ）２ではないか、あるいは（ｉｉ）Ｑは、ｎが１または２である場合の５、６、または７員ヘテロシクロアルキルではないことを条件とする、前記医薬組成物。
【請求項５３】
前記送達剤は、前記化合物は、式（ＩＡ）のもの、
【化１３４】
2019516719.tif 000255
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
ｍは、５、７、または９である、請求項５２〜５３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記化合物は、式（ＩＩ）
【化１３５】
2019516719.tif 000256
またはその塩もしくは立体異性体のものであり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリールまたはヘテロシクロアルキルであり、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される、請求項５２〜５４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
Ｍ１は、Ｍ’である、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−である、請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
ｌは、１、３、または５である、請求項５３〜５７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
前記化合物は、化合物１〜化合物２３２、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
前記化合物は、化合物１〜化合物１４７、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５９に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
前記化合物は、化合物１８、それらの塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡと、送達剤とを含む、医薬組成物であって、前記送達剤は、式（ＩＩＩ）を有する化合物
【化１３６】
2019516719.tif 000257
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
環Ａは、
【化１３７】
2019516719.tif 000258
であり、
ｔは、１または２であり、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は独立して、結合、−ＣＨ２−、−ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から選択され、
Ａが
【化１３８】
2019516719.tif 000259
であるとき、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、−ＣＨ２−ではないか、及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’である、前記医薬組成物。
【請求項６３】
前記化合物は、下記式を有する、請求項６２に記載の医薬組成物。
【化１３９】
2019516719.tif 000260
【化１４０】
2019516719.tif 000261
【請求項６４】
α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡと、送達剤とを含む、医薬組成物であって、前記送達剤は、式（ＩＶ）を有する化合物
【化１４１】
2019516719.tif 000262
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ６−２０アルキル及びＣ６−２０アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
【化１４２】
2019516719.tif 000263
であるとき、
ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は同じであり、ここでＲ１は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、またはＣ１８アルケニルではない、
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６−２０アルケニルから選択される、
ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも別の１つとは異なる数の炭素原子を有する、
ｉｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルキルから選択される、あるいは
ｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルケニルから選択される、前記医薬組成物。
【請求項６５】
前記化合物は、式（ＩＶａ）のものである、請求項６４に記載の医薬組成物。
【化１４３】
2019516719.tif 000264
【請求項６６】
α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡと、送達剤とを含む、医薬組成物であって、前記送達剤は、式（Ｖ）を有する化合物
【化１４４】
2019516719.tif 000265
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ３は、ＣＨまたはＮであり、
Ａ４は、ＣＨ２またはＮＨであり、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも１つは、ＮまたはＮＨであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｘ１及びＸ２は独立して、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から選択される、前記医薬組成物。
【請求項６７】
前記化合物は、式（Ｖａ）のものである、請求項６６に記載の医薬組成物。
【化１４５】
2019516719.tif 000266
【請求項６８】
α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡと、送達剤とを含む、医薬組成物であって、前記送達剤は、式（ＶＩ）を有する化合物
【化１４６】
2019516719.tif 000267
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ６及びＡ７は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ６及びＡ７のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｘ４及びＸ５は独立して、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から選択される、前記医薬組成物。
【請求項６９】
α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡと、送達剤とを含む、医薬組成物であって、前記送達剤は、化合物２３３〜化合物３４２、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される化合物を含む、前記医薬組成物。
【請求項７０】
前記化合物は、化合物２３６、それらの塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項６９に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、ＰＥＧ脂質をさらに含む、請求項２９〜７０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７２】
前記ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩ）、
【化１４７】
2019516719.tif 000268
またはその塩を有し、式中、
Ｒ３は、−ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択で置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
ｒは、１〜１００（端点を含む）の整数であり、
Ｌ１は、任意選択で置換されるＣ１−１０アルキレンであり、前記任意選択で置換されるＣ１−１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンは独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、または−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−で置き換えられ、
Ｄは、クリックケミストリーによって得られた部分または生理的条件下で切断可能な部分であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、
【化１４８】
2019516719.tif 000269
のものであり、
Ｌ２の各出現例は独立して、結合または任意選択で置換されるＣ１−６アルキレンであり、前記任意選択で置換されるＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位は任意選択で、−Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、または−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−で置き換えられ、
Ｒ２の各出現例は独立して、任意選択で置換されるＣ１−３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１−３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１−３０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−で置き換えられ、
ＲＮの各出現例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり、
ｐは、１または２である、請求項７１に記載の医薬組成物。
【請求項７３】
前記ＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩＩ）、
【化１４９】
2019516719.tif 000270
またはその塩を有し、式中、
Ｒ３は、−ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択で置換されるアルキルまたは酸素保護基であり、
ｒは、１〜１００（端点を含む）の整数であり、
Ｒ５は、任意選択で置換されるＣ１０−４０アルキル、任意選択で置換されるＣ１０−４０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１０−４０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ５１つ以上のメチレン基は、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−で置き換えられ、
ＲＮの各出現例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基である、請求項７１に記載の医薬組成物。
【請求項７４】
前記ＰＥＧ脂質は、下記式、
【化１５０】
2019516719.tif 000271
を有し、式中、ｒは、１〜１００の整数である、請求項７３に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
前記ＰＥＧ脂質は、化合物４２８である、請求項７４に記載の医薬組成物。
【請求項７６】
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、リン脂質をさらに含む、請求項２９〜７５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７７】
前記リン脂質は、式（ＩＸ）、
【化１５１】
2019516719.tif 000272
またはその塩を有し、式中、
各Ｒ１は独立して、任意選択で置換されるアルキルであるか、あるいは任意選択で、２つのＲ１が、介在する原子と一緒に連結して、任意選択で置換される単環式カルボシクリルまたは任意選択で置換される単環式ヘテロシクリルを形成するか、あるいは任意選択で、３つのＲ１  が、介在する原子と一緒に連結して、任意選択で置換される二環式カルボシクリルまたは任意選択で置換二環式ヘテロシクリルを形成し、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、
【化１５２】
2019516719.tif 000273
のものであり、
Ｌ２の各出現例は独立して、結合または任意選択で置換されるＣ１−６アルキレンであり、前記任意選択で置換されるＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位は任意選択で、−Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、または−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−で置き換えられ、
Ｒ２の各出現例は独立して、任意選択で置換されるＣ１−３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１−３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１−３０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−で置き換えられ、
ＲＮの各出現例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり、
ｐは、１または２であるが、
但し、前記化合物は、下記式、
【化１５３】
2019516719.tif 000274
のものではないことを条件とし、Ｒ２の各出現例は独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである、請求項７６に記載の医薬組成物。
【請求項７８】
前記リン脂質は、下記式、
【化１５４】
2019516719.tif 000275
またはその塩を有し、式中、
各ｔは独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｕは独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｖは独立して、１、２、または３である、請求項７７に記載の医薬組成物。
【請求項７９】
前記脂質ナノ粒子または前記送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む、請求項１、６、１０、２９、及び３０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８０】
前記ｍＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む、請求項１〜１０及び２９〜７９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８１】
前記ｍＲＮＡは、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含み、前記マイクロＲＮＡは、造血系の免疫細胞、またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する細胞において発現され、前記ｍＲＮＡは、１つ以上の修飾されたヌクレオ塩基を含む、請求項８０に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項８２】
前記ｍＲＮＡは、造血系の免疫細胞において豊富なマイクロＲＮＡの少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位を含み、少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位は、内皮細胞において豊富なマイクロＲＮＡのものである、請求項８１に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項８３】
前記ｍＲＮＡは、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーと、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の少なくとも１つのコピーとを含む、請求項８０〜８２のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項８４】
前記ｍＲＮＡは、同じマイクロＲＮＡの第１及び第２のマイクロＲＮＡ結合部位を含む、請求項８０〜８３のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項８５】
前記マイクロＲＮＡ結合部位は、前記同じマイクロＲＮＡの３ｐ及び５ｐアームのものである、請求項８４に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項８６】
前記マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−２６ａ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものである、請求項８０〜８５のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項８７】
前記マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものである、請求項８６に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項８８】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６結合部位である、請求項８０に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項８９】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２結合部位である、請求項８０に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項９０】
１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６結合部位であり、第２のマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６−３ｐ、ｍｉＲ−１４６−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４及びｍｉＲ−２７からなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものである、請求項８０に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項９１】
少なくとも１つのｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位とを含む、請求項８０に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項９２】
少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と、少なくとも１つの１４２−５ｐ結合部位とを含む、請求項８０に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項９３】
前記マイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの両方に位置する、請求項８０〜９２のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項９４】
前記マイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する、請求項９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項９５】
前記マイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに位置する、請求項９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項９６】
前記マイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの両方に位置する、請求項９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項９７】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡのコード領域の停止コドンに直接隣接する３’ＵＴＲに位置する、請求項９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項９８】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡのコード領域の停止コドンから７０〜８０塩基下流にある３’ＵＴＲに位置する、請求項９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項９９】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡのコード領域の開始コドンの直前の５’ＵＴＲに位置する、請求項９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１００】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡのコード領域の開始コドンより１５〜２０ヌクレオチド前の５’ＵＴＲに位置する、請求項９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、前記ｍＲＮＡのコード領域の開始コドンより７０〜８０ヌクレオチド前の５’ＵＴＲに位置する、請求項９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１０２】
前記ｍＲＮＡは、互いに直接隣接して、または５、５〜１０、１０〜１５、もしくは１５〜２０ヌクレオチド未満のスペーサーを置いて位置付けられた、同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含む、請求項９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１０３】
前記ｍＲＮＡは、前記３’ＵＴＲに位置する同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含み、前記第１のマイクロＲＮＡ結合部位は、停止コドンに直接隣接して位置付けられ、前記第２及び第３のマイクロＲＮＡ結合部位は、前記第１のマイクロＲＮＡ結合部位の最も３’側の残基から３０〜４０塩基下流に位置付けられている、請求項９３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１０４】
前記ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１２６、またはそれらの組み合わせから選択されるマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲを含む、請求項１〜１０及び２９〜１０３のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２８及び８０〜１０３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０５】
前記ｍＲＮＡは、配列番号５１〜７５、８１〜８２、８８、１０３、１０６〜１１３、１１８、及び１６１〜１７０、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される３’ＵＴＲ配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む、請求項１〜１０及び２９〜１０４のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２８及び８０〜１０４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０６】
前記３’ＵＴＲは、配列番号５１〜７５、８１〜８２、８８、１０３、１０６〜１１３、１１８、及び１６１〜１７０、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１０５に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１０７】
前記ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲを含む、請求項１〜１０及び２９〜１０６のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２８及び８０〜１０６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０８】
前記５’ＵＴＲは、配列番号３３〜５０、７７、及び１１５〜１１７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される５’ＵＴＲ配列と少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む、請求項１０７に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１０９】
前記５’ＵＴＲが、配列番号３３〜５０、７７、及び１１５〜１１７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列を含む、請求項１０８に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１１０】
前記ｍＲＮＡは、５’末端キャップをさらに含む、請求項１〜１０及び２９〜１０９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２８及び８０〜１０９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１１】
前記５’末端キャップは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体を含む、請求項１１０に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１１２】
前記５’末端キャップは、Ｃａｐ１を含む、請求項１１１に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１１３】
前記ｍＲＮＡは、ポリＡ領域をさらに含む、請求項１〜１０及び２９〜１１２のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２８及び８０〜１１２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１４】
前記ポリＡ領域は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、または少なくとも約９０ヌクレオチド長である、請求項１１３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１１５】
前記ポリＡ領域は、約１０〜約２００、約２０〜約１８０、約５０〜約１６０、約７０〜約１４０、または約８０〜約１２０ヌクレオチド長を有する、請求項１１４に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１１６】
前記ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜１０及び２９〜１１５のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２８及び８０〜１１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１７】
前記少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基は、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）、１−エチルシュードウラシル、２−チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’−チオウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１１６に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１１８】
前記ウラシルまたはチミンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が化学修飾されている、請求項１１６または１１７に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１１９】
前記グアニンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が化学修飾されている、請求項１１６〜１１８のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１２０】
前記シトシンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が化学修飾されている、請求項１１６〜１１９のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１２１】
前記アデニンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が化学修飾されている、請求項１１６〜１２０のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１２２】
前記ｍＲＮＡは、精製されている、請求項１〜１０及び２９〜１２１のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項２８及び８０〜１２１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２３】
前記ＧＬＡポリペプチドは、ＧＬＡ活性を有する野生型、バリアント、または変異体である、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
前記ＧＬＡポリペプチドは、配列番号１からなる野生型ポリペプチド配列を含む、請求項１２３に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１２５】
前記ＧＬＡポリペプチドは、ＧＬＡ融合タンパク質である、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１２６】
前記ＧＬＡ融合タンパク質は、異種タンパク質部分を含む、請求項１２５に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１２７】
ｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドであって、
（ｉ）５’ＵＴＲと、
（ｉｉ）ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３〜２７、７９〜８０、及び１４１〜１５９からなる群から選択される核酸配列を含む、ＯＲＦと、
（ｉｉｉ）ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１２６、またはそれらの組み合わせから選択されるマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲと、を含み、
前記ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項１２８】
ｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドであって、
（ｉ）５’−末端キャップと、
（ｉｉ）配列番号３３〜５０、７７、及び１１５〜１１７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列を含む５’ＵＴＲと、
（ｉｉｉ）ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３〜２７、７９〜８０、及び１４１〜１５９からなる群から選択される配列を含む、ＯＲＦと、
（ｉｖ）配列番号５１〜７５、８１〜８２、８８、１０３、１０６〜１１３、１１８、及び１６１〜１７０、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む３’ＵＴＲと、
（ｖ）ポリＡ領域と、を含み、
前記ｍＲＮＡは、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）、１−エチルシュードウラシル、２−チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’−チオウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項１２９】
配列番号１１９〜１２０、１２２〜１４０、及び１６０からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１２７または１２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３０】
請求項１２７〜１２９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、送達剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１３１】
前記送達剤は、化合物１〜３４２もしくは化合物４１９〜４２８のうちのいずれか一方からなる群から選択される化合物、その塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせを含む脂質ナノ粒子である、請求項１３０に記載の医薬組成物。
【請求項１３２】
前記送達剤は、化合物１８もしくは化合物２３６、化合物４２８、それらの塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせを含む脂質ナノ粒子である、請求項１３０に記載の医薬組成物。
【請求項１３３】
前記送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む、請求項１３０に記載の医薬組成物。
【請求項１３４】
前記対象は、ファブリー病に対する治療または予防を必要とするヒト対象である、請求項１〜１０、２９〜１２６、及び１３０〜１３３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３５】
前記対象に投与されると、前記ｍＲＮＡは、配列番号２の前記核酸配列を有する及び／またはネイキッドｍＲＮＡとして投与される対応するｍＲＮＡと比べて、
（ｉ）より長い血漿中半減期、
（ｉｉ）前記ＯＲＦによってコードされるＧＬＡポリペプチドの増加した発現、
（ｉｉｉ）より高い構造安定性、または
（ｉｖ）それらの任意の組み合わせ、
を有する、請求項１〜１０、２９〜１２６、及び１３０〜１３４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３６】
１つの単回単位用量または複数の単回単位用量としての投与に好適である、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１３７】
前記対象においてファブリー病の１つ以上のバイオマーカーのレベルを低減するのに好適である、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１３８】
前記対象においてファブリー病の徴候または症状の発症を治療、予防または遅延させるのに使用するための、先行請求項のいずれか１項に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１３９】
前記徴候または症状には、疼痛、胃腸障害、被角血管腫等の皮膚病変、腎機能障害、心筋症、卒中、またはそれらの組み合わせが含まれる、請求項１３８に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド。
【請求項１４０】
必要のあるヒト対象におけるα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドの発現方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１〜１０、２９〜１２６、及び１３０〜１３９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項１１〜２８、８０〜１３０、及び１３６〜１３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与することを含み、前記医薬組成物またはポリヌクレオチドは、１つの単回用量としてまたは複数の単回単位用量として前記対象に投与するのに好適である、前記方法。
【請求項１４１】
必要のあるヒト対象におけるファブリー病の徴候または症状の治療、予防、または、その発症の遅延方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１〜１０、２９〜１２６、及び１３０〜１３９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項１１〜２８、８０〜１３０、及び１３６〜１３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与することを含み、前記投与は、前記対象におけるファブリー病の前記徴候または症状のうちの１つ以上を、治療するか、予防するか、その前記発症を遅延させる、前記方法。
【請求項１４２】
前記投与は、前記対象の血漿または組織中のＧｂ３またはリゾ−Ｇｂ３の進行的蓄積を減速する、停止する、または逆行させる、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
ファブリー病の治療方法であって、ファブリー病を患うヒト対象に、請求項１〜１０、２９〜１２６、及び１３０〜１３９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項１１〜２８、８０〜１３０、及び１３６〜１３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの単回静脈内投与を投与することを含む、前記方法。
【請求項１４４】
ヒト対象におけるＧｂ３血漿中レベル及び／またはリゾ−Ｇｂ３血漿中レベルの低減方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１〜１０、２９〜１２６、及び１３０〜１３９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項１１〜２８、８０〜１３０、及び１３６〜１３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与することを含み、前記投与は、前記対象における前記Ｇｂ３血漿中レベルまたはリゾ−Ｇｂ３血漿中レベルを低減する、前記方法。
【請求項１４５】
（ｉ）前記Ｇｂ３血漿中レベルは、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、治療前のＧｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも５０％低減される、及び／または
（ｉｉ）前記リゾ−Ｇｂ３血漿中レベルは、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、治療前のリゾ−Ｇｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも５０％低減される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記Ｇｂ３血漿中レベルは、前記対象において１０ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、９ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、８ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、７ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、６ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、５ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、４ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、３ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、または２ｎｍｏｌ／ｍＬ未満に低減される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４７】
ヒト対象におけるＧｂ３組織中レベル及び／またはリゾ−Ｇｂ３組織中レベルの低減方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１〜１０、２９〜１２６、及び１３０〜１３９のいずれか１項に記載の医薬組成物、または請求項１１〜２８、８０〜１３０、及び１３６〜１３９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを投与することを含み、前記投与は、前記対象における前記Ｇｂ３組織中レベル及び／またはリゾ−Ｇｂ３組織中レベルを低減する、前記方法。
【請求項１４８】
前記組織は、心臓、腎臓、肝臓、または脾臓組織である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
（ｉ）前記Ｇｂ３組織中レベルは、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、その組織中の治療前のＧｂ３レベルと比較して少なくとも５０％低減される、及び／または
（ｉｉ）前記リゾ−Ｇｂ３組織中レベルは、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、その組織中の治療前のリゾ−Ｇｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも５０％低減される、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１５０】
前記医薬組成物またはポリヌクレオチドが前記対象に投与されてから２４時間、前記対象における前記ＧＬＡ活性は、参照個体における前記ＧＬＡ活性の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％に増加する、請求項１４０〜１４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５１】
前記ＧＬＡ活性は、前記対象の前記心臓、腎臓、肝臓、または脾臓において増加する、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記増加したＧＬＡ活性は、２４、３６、４８、６０、７２、９６、１２０、１４４、または１６８時間を超えて持続する、請求項１５０または１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記医薬組成物またはポリヌクレオチドが前記対象に投与されてから２４時間、前記対象における前記Ｇｂ３のレベルは、前記対象のベースラインＧｂ３レベルと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％低減される、請求項１４０〜１５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記Ｇｂ３のレベルは、前記対象の前記血漿、心臓、腎臓、肝臓、及び／または脾臓のうちの１つ以上において低減される、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記対象への投与後、前記対象における前記Ｇｂ３のレベルは、前記対象における前記ベースラインレベルと比較して少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、または少なくとも６週間低減される、請求項１５３または１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記医薬組成物またはポリヌクレオチドが前記対象に投与されてから２４時間、前記対象における前記リゾ−Ｇｂ３のレベルは、前記対象のベースラインリゾ−Ｇｂ３レベルと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％低減される請求項１４０〜１５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５７】
前記リゾ−Ｇｂ３のレベルは、前記対象の前記血漿、心臓、腎臓、肝臓、及び／または脾臓のうちの１つ以上において低減される、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
前記対象への投与後、前記対象における前記リゾ−Ｇｂ３のレベルは、前記対象における前記ベースラインレベルと比較して少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、または少なくとも６週間低減される、請求項１５６または１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記医薬組成物またはポリヌクレオチドは、１．５ｍｇ／ｋｇ未満、１．２５ｍｇ／ｋｇ未満、１ｍｇ／ｋｇ未満、０．７５ｍｇ／ｋｇ未満、または０．５ｍｇ／ｋｇ未満の単回用量として投与される、請求項１４０〜１５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６０】
前記対象への前記投与は、約週１回、約２週間に１回、または約１カ月に１回である、請求項１４０〜１５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６１】
前記医薬組成物またはポリヌクレオチドは、静脈内投与される、請求項１４０〜１６０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年５月１８日に出願された米国仮出願第６２／３３８，３５４号の優先権の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＥＦＳ−ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表への参照
この電子的に提出された配列表の内容（名前：３５２９．１０７ＰＣ０２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：１７７，５２６バイト、作成日：２０１７年５月１７日）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ファブリー病は、細胞のリソソーム区画内での脂肪の再利用に関与する酵素をコードするα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）遺伝子の変異によって引き起こされる、Ｘ染色体連鎖遺伝性障害である。ファブリー病は、α−ガラクトシダーゼＡ欠乏症、アンダーソン・ファブリー病、広汎性体部被角血管腫、広汎性角化血管腫、セラミドトリヘキソシダーゼ欠乏症、ファブリー病、ＧＬＡ欠乏症、及び遺伝性異所リピドーシス（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｄｙｓｔｏｐｉｃ  ｌｉｐｉｄｏｓｉｓ）とも称される。その発生率は男性４０，０００〜４００，０００人に一人と推定される。Ｄｅｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｊ  “Ｍｅｄ．”Ｇｅｎｅｔ．４３（４）：３４７−３５２。
【０００４】
ＧＬＡ（ＧＡＬＡとも称される）は、糖脂質及び糖タンパク質からの末端α−ガラクトシル部分を加水分解するホモ二量体糖タンパク質である。例えば、ＧＬＡ  ｍＲＮＡ配列についてはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００１６９、ＧＬＡアミノ酸配列についてはＮＰ＿０００１６０を参照されたい。ＧＬＡ前駆体タンパク質は、４２９アミノ酸長であり、タンパク質プロセシング中に切断される３１アミノ酸のシグナルペプチドを含有する。ＧＬＡの変異は、血管樹の内皮を含むいくつかの組織のリソソームにおけるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）、グロボトリアオシルスフィンゴシン（リゾ−Ｇｂ３）、ガラビオシルセラミド（Ｇａ２）、及び中性スフィンゴ糖脂質の蓄積をもたらす。Ｇｅｒｖａｓ−Ａｒｒｕｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５  ＢＭＣ  Ｇｅｎｅｔ  １６：１０９。正常な個体は非常に低いＧｂ３レベルを有するが、ファブリー病の患者では、血漿及び様々な組織の両方でＧｂ３が進行的に蓄積する。
【０００５】
ファブリー病の古典的な形態は、通常、小児期または青年期に顕在化し、四肢の激痛（先端触覚異常）、血管皮膚病変の出現（角化血管腫）、発汗異常（無汗症、乏汗症、及びまれには多汗症）、特徴的な角膜及び水晶体混濁、ならびにタンパク尿症という周期的危機を伴う。通常、２０代から４０代で末期腎疾患が生じ、腎疾患の治療が奏功した個体であっても、通常は心疾患または心血管疾患を患う。Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ：Ｆａｂｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ（２０１３）。
現在、ファブリー病に対する治療は、典型的には、疼痛を低減するためのジフェニルヒダントイン、カルバマゼピン、またはガバペンチン、タンパク尿症を低減するためのＡＣＥ阻害剤またはアンギオテンシン受容体遮断剤、ならびに腎疾患を治療するための慢性血液透析及び／または腎移植からなる。酵素補充療法もまた推奨されることが多いが、その有効性は証明されていない。Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ：Ｆａｂｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ（２０１３）。故に、ファブリー病を治療するための改善された治療薬及び療法が必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄｅｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６  Ｊ  “Ｍｅｄ．”Ｇｅｎｅｔ．４３（４）：３４７−３５２
【非特許文献２】Ｇｅｒｖａｓ−Ａｒｒｕｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５  ＢＭＣ  Ｇｅｎｅｔ  １６：１０９
【非特許文献３】Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ：Ｆａｂｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ（２０１３）
【非特許文献４】Ｍｅｈｔａ  ｅｔ  ａｌ．ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ：Ｆａｂｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ（２０１３）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ファブリー病の治療のためのｍＲＮＡ治療薬を提供する。本発明のｍＲＮＡ治療薬は、この技術がＧＬＡをコードするｍＲＮＡの細胞内送達、続いて標的細胞内での機能的ＧＬＡタンパク質のデノボ合成を可能にするため、ファブリー病の治療に特によく適している。本発明は、（１）不要な免疫活性化（例えば、外来性核酸のインビボ導入に関連する自然免疫応答）を最小化する、及び（２）ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳効率を最適化するための、治療的ｍＲＮＡ内での修飾されたヌクレオチドの組み込みを特徴とする。本発明の例となる態様は、タンパク質発現を増大させるための、特にＧＬＡをコードする治療的ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内での、自然免疫応答を低減する及び配列最適化のためのヌクレオチド修飾の組み合わせを特徴とする。
【０００８】
さらなる実施形態では、本発明のｍＲＮＡ治療技術はまた、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡの、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系を介した送達も特徴とする。本発明は、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡと組み合わされ、インビボで投与されたときに、例えば、細胞取り込み、細胞内輸送及び／またはエンドソーム放出もしくはエンドソーム脱出等の改善された特性を有する、新規のイオン性脂質系ＬＮＰを特徴とする。本発明のＬＮＰ製剤はまた、ＬＮＰのインビボ投与に関連する免疫原性の低減を示す。
【０００９】
ある特定の態様では、本発明は、α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）をコードするポリヌクレオチド、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物及び送達製剤、ならびにこれらを投与することによる、ファブリー病の治療を必要とする対象におけるファブリー病の治療方法に関する。
【００１０】
本開示は、α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、脂質ナノ粒子にカプセル封入されたｍＲＮＡを含む、医薬組成物を提供し、この組成物は、ファブリー病の治療を必要とするヒト対象への投与に好適である。
【００１１】
本開示はさらに、（ａ）（ｉ）α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む、ＯＲＦ、（ｉｉ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位を含む非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、ｍＲＮＡと、（ｂ）送達剤とを含む、医薬組成物を提供し、この医薬組成物は、ファブリー病の治療を必要とするヒト対象への投与に好適である。
【００１２】
本開示はさらに、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物を提供し、この組成物は、ファブリー病を患うヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、もしくは少なくとも７２時間にわたって、血漿中ＧＬＡ活性レベルを参照の生理的レベル以上に増加させるのに十分である。いくつかの実施形態では、本医薬組成物は、ファブリー病を患うヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、投与後２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、または１６８時間、参照の血漿中ＧＬＡ活性の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％超を維持するのに十分である。いくつかの実施形態では、本医薬組成物、ファブリー病を患うヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、投与後少なくとも２４時間にわたって、少なくとも４８時間にわたって、少なくとも７２時間にわたって、少なくとも９６時間にわたって、少なくとも１２０時間にわたって、少なくとも１４４時間にわたって、または少なくとも１６８時間にわたって血漿中ＧＬＡ活性を増加させるのに十分であり、増加した血漿中ＧＬＡ活性レベルは、対象のベースラインＧＬＡ活性レベルまたは参照ＧＬＡ活性レベルと比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％超である。
【００１３】
本開示はさらに、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物を提供し、この組成物は、ファブリー病を患うヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、もしくは少なくとも７２時間にわたって、血漿、肝臓、心臓、腎臓、または脾臓のうちの１つ以上のＧＬＡ活性レベルを１つ以上の対応する参照レベル以上に増加させるのに十分である。いくつかの実施形態では、本医薬組成物、ファブリー病を患うヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、投与後２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間、１４４時間、または１６８時間にわたって、対象の血漿、肝臓、心臓、腎臓、または脾臓のうちの１つ以上における少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％超のＧＬＡ活性を維持するのに十分である。いくつかの実施形態では、本医薬組成物は、ファブリー病を患うヒト対象に単回静脈内投与として投与されるとき、投与後少なくとも２４時間にわたって、少なくとも４８時間にわたって、少なくとも７２時間にわたって、少なくとも９６時間にわたって、少なくとも１２０時間にわたって、少なくとも１４４時間にわたって、または少なくとも１６８時間にわたって、血漿、肝臓、心臓、腎臓、または脾臓のうちの１つ以上のＧＬＡ活性を増加させるのに十分であり、増加した１つ以上の血漿、肝臓、心臓、腎臓、または脾臓ＧＬＡ活性レベルは、対象の対応するベースラインＧＬＡ活性レベルまたは対応する参照のＧＬＡ活性レベルと比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％超である。
【００１４】
本開示はさらに、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物を提供し、この組成物は、必要のある対象に単回静脈内投与として投与されるとき、（ｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、または少なくとも４２日間にわたって、Ｇｂ３の血漿中レベルを、対象のベースラインＧｂ３血漿レベルまたは参照のＧｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍低減する、及び／または（ｉｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、リゾ−Ｇｂ３の血漿中レベルを、対象のベースラインＧｂ３血漿中レベルまたは参照のリゾ−Ｇｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍低減するのに十分である。いくつかの実施形態では、投与は、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、または少なくとも４２日間にわたって、血漿中Ｇｂ３レベルまたは血漿中リゾ−Ｇｂ３を、対象のベースラインＧｂ３血漿中レベルまたは参照のリゾ−Ｇｂ３血漿中レベルと比較して４０％〜１００％、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、または９０％〜１００％低減する。
【００１５】
本開示はさらに、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む、医薬組成物を提供し、この組成物は、必要のある対象に単回静脈内投与として投与されるとき、（ｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、または少なくとも４２日間にわたって、心臓、腎臓、肝臓、または脾臓組織のうちの１つ以上におけるＧｂ３のレベルを、これらの組織のうちの１つ以上における対象のベースラインレベルまたはこれらの組織のうちの１つ以上における参照Ｇｂ３レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍低減する、及び／または（ｉｉ）投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、心臓、腎臓、肝臓、または脾臓組織のうちの１つ以上におけるリゾ−Ｇｂ３のレベルを、これらの組織のうちの１つ以上における対象のベースラインレベルまたはこれらの組織のうちの１つ以上における参照リゾ−Ｇｂ３レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、もしくは少なくとも５０倍低減するのに十分である。いくつかの実施形態では、投与は、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、または少なくとも４２日間にわたって、心臓、腎臓、肝臓、または脾臓組織のうちの１つ以上におけるＧｂ３のレベルまたはリゾ−Ｇｂ３のレベルを、その組織における対象のベースラインレベルまたは参照レベルと比較して４０％〜１００％、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、または９０％〜１００％低減する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、送達剤をさらに含む。
【００１７】
ある特定の態様では、本発明は、α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドに関し、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最小ウラシルまたはチミン含量と比べたＯＲＦのウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）は、約１００％〜約１５０％である。
【００１８】
ある特定の実施形態では、％ＵＴＭまたは％ＴＴＭは、約１１０％〜約１５０％、約１１５％〜約１５０％、約１２０％〜約１５０％、約１１０％〜約１４５％、約１１５％〜約１４５％、約１２０％〜約１４５％、約１１０％〜約１４０％、約１１５％〜約１４０％、または約１２０％〜約１４０％である。ある特定の実施形態では、％ＵＴＭまたは％ＴＴＭは、（ｉ）１１５％、１１６％、１１７％、１１８％、１１９％、１２０％、１２１％、１２２％、または１２３％〜（ｉｉ）１３８％、１３９％、１４０％、１４１％、１４２％、１４３％、１４４％、または１４５％である。ある特定の実施形態では、対応する野生型ＯＲＦのウラシルまたはチミン含量と比べたＯＲＦのウラシルまたはチミン含量（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）は、１００％未満である。ある特定の実施形態では、％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、８０％未満、７５％未満、７４％未満、７３％未満、７２％未満、７１％未満、または７０％未満である。ある特定の実施形態では、％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、６２％〜７０％である。
【００１９】
ある特定の実施形態では、ＯＲＦにおける総ヌクレオチド含量と比べたＯＲＦにおけるウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、または約２０％未満である。ある特定の実施形態では、％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、約２０％である。ある特定の実施形態では、％ＵＴＬまたは％ＴＴＬは、約１６％〜約１８％である。
【００２０】
ある特定の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最大グアニン含量に対するＯＲＦのグアニン含量（％ＧＴＭＸ）は、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。ある特定の実施形態では、％ＧＴＭＸは、約７０％〜約８５％、約７０％〜約８０％、約７１％〜約８０％、または約７２％〜約８０％である。
【００２１】
ある特定の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最大シトシン含量に対するＯＲＦのシトシン含量（％ＣＴＭＸ）は、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。ある特定の実施形態では、％ＣＴＭＸは、約６０％〜約８０％、約６５％〜約８０％、約７０％〜約８０％、または約７０％〜約７６％である。
【００２２】
ある特定の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における理論上最大グアニン及びシトシン（Ｇ／Ｃ）含量に対するＯＲＦのＧ／Ｃ含量（Ｇ／Ｃ）（％Ｇ／ＣＴＭＸ）は、少なくとも約７３％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。ある特定の実施形態では、％Ｇ／ＣＴＭＸは、約８０％〜約１００％、約８５％〜約９９％、約９０％〜約９７％、または約９１％〜約９５％である。ある特定の実施形態では、対応する野生型ＯＲＦにおけるＧ／Ｃ含量と比べたＯＲＦにおけるＧ／Ｃ含量（％Ｇ／ＣＷＴ）は、少なくとも１０２％、少なくとも１０３％、少なくとも１０４％、少なくとも１０５％、少なくとも１０６％、少なくとも１０７％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１１５％、少なくとも約１２０％、または少なくとも約１２５％である。ある特定の実施形態では、ＯＲＦの３番目のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含量は、対応する野生型ＯＲＦの３番目のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含量よりも、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、または少なくとも４０％高い。
【００２３】
ある特定の実施形態では、ＯＲＦは、少なくとも１つの低頻度コドンをさらに含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、配列番号３〜２７、７９〜８０、及び１４１〜１５９からなる群から選択される配列との少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、配列番号３〜２７、７９〜８０、及び１４１〜１５９からなる群から選択される核酸配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、配列番号７９または８０の核酸配列との少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、配列番号７９または８０の核酸配列との少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、配列番号７９または８０の核酸配列を含む。
【００２５】
ある特定の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドは、野生型ＧＬＡのポリペプチド配列（配列番号１）と少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、ＧＬＡポリペプチドは、α−ガラクトシダーゼ活性を有する。
【００２６】
ある特定の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドは、α−ガラクトシダーゼ活性を有するバリアント、誘導体、または変異体である。
【００２７】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列輸送ペプチドをコードするヌクレオチドをさらに含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１本鎖である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２本鎖である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基は、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）、２−チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’−チオウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基は、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）、１−エチルシュードウラシル、２−チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’−チオウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基は、５−メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、ウラシルの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、５−メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、ウラシルまたはチミンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、化学修飾されている。いくつかの実施形態では、グアニンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、化学修飾されている。いくつかの実施形態では、シトシンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、化学修飾されている。いくつかの実施形態では、アデニンの少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、化学修飾されている。
【００３０】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ結合部位をさらに含む。
【００３１】
ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、表３または表４から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）結合部位を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡは、造血系の免疫細胞、またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する細胞において発現され、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）は、１つ以上の修飾されたヌクレオ塩基を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、造血系の免疫細胞において豊富なマイクロＲＮＡの少なくとも１つの第１のマイクロＲＮＡ結合部位を含み、少なくとも１つの第２のマイクロＲＮＡ結合部位は、内皮細胞において豊富なマイクロＲＮＡのものである。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーと、第２のマイクロＲＮＡ結合部位の少なくとも１つのコピーとを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、同じマイクロＲＮＡの第１及び第２のマイクロＲＮＡ結合部位を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、同じマイクロＲＮＡの３ｐ及び５ｐアームのものである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、ｍｉＲ−２６ａ、またはそれらの任意の組み合わせに結合する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、またはそれらの任意の組み合わせに結合する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６結合部位である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２結合部位である。いくつかの実施形態では、１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６結合部位であり、第２のマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４６−３ｐ、ｍｉＲ−１４６−５ｐ、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４及びｍｉＲ−２７からなる群から選択されるマイクロＲＮＡに対するものである。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位と、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位とを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位と、少なくとも１つの１４２−５ｐ結合部位とを含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの両方に位置する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの両方に位置する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡのコード領域の停止コドンに直接隣接する３’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡのコード領域の停止コドンから７０〜８０塩基下流にある３’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ  結合部位は、ｍＲＮＡのコード領域の開始コドンの直前の５’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡのコード領域の開始コドンより１５〜２０ヌクレオチド前の５’ＵＴＲに位置する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡのコード領域の開始コドンより７０〜８０ヌクレオチド前の５’ＵＴＲに位置する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、互いに直接隣接して、または５、５〜１０、１０〜１５、もしくは１５〜２０ヌクレオチド未満のスペーサーを置いて位置付けられた、同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ＵＴＲに位置する同じマイクロＲＮＡ結合部位の複数のコピーを含み、第１のマイクロＲＮＡ結合部位は、停止コドンに直接隣接して位置付けられ、第２及び第３のマイクロＲＮＡ結合部位は、第１のマイクロＲＮＡ結合部位の最も３’側の残基から３０〜４０塩基下流に位置付けられている。
【００４５】
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号３０及び配列番号３２から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２に結合する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｍｉＲ−１４２−５ｐに結合する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−１４２は、配列番号２８を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号８５及び配列番号８７から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６に結合する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐに結合する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２６は、配列番号８３を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１２６、またはそれらの組み合わせに結合するマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲを含む。
【００４８】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号５１〜７５、８１〜８２、８８、１０３、１０６〜１１３、１１８、及び１６１〜１７０、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される３’ＵＴＲ配列と少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％同一である核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号５１〜７５、８１〜８２、８８、１０３、１０６〜１１３、１１８、及び１６１〜１７０、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む。
【００４９】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲをさらに含む。ある特定の実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号３３〜５０、７７、及び１１５〜１１７、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される５’ＵＴＲ配列と少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一である核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、配列番号３３〜５０、７７、及び１１５〜１１７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号３３の核酸配列を含む５’ＵＴＲを含む。
【００５０】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、５’末端キャップをさらに含む。ある特定の実施形態では、５’末端キャップは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジドグアノシン、Ｃａｐ２、Ｃａｐ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体を含む。いくつかの実施形態では、５’末端キャップは、Ｃａｐ１を含む。
【００５１】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、ポリＡ領域をさらに含む。ある特定の実施形態では、ポリＡ領域は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、または少なくとも約９０ヌクレオチド長である。ある特定の実施形態では、ポリＡ領域は、約１０〜約２００、約２０〜約１８０、約５０〜約１６０、約７０〜約１４０、または約８０〜約１２０ヌクレオチド長を有する。
【００５２】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、１つ以上の異種ポリペプチドに融合されたＧＬＡポリペプチドをコードする。ある特定の実施形態では、１つ以上の異種ポリペプチドは、ＧＬＡポリペプチドの薬物動態特性を増加させる。ある特定の実施形態では、対象に投与されると、ポリヌクレオチドは、配列番号２を含む対応するポリヌクレオチドと比べて、（ｉ）より長い血漿中半減期、（ｉｉ）ＯＲＦによってコードされるＧＬＡポリペプチドの増加した発現、（ｉｉｉ）より高い構造安定性、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせを有する。
【００５３】
ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、（ｉ）５’−末端キャップ、（ｉｉ）５’−ＵＴＲ、（ｉｉｉ）ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦ、（ｉｖ）３’−ＵＴＲ、及び（ｖ）ポリＡ領域を含む。ある特定の実施形態では、３’−ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１１９〜１２０、１２２〜１４０、及び１６０からなる群から選択される、例えば、配列番号１１９または１２０の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’−末端キャップ（例えば、Ｃａｐ１）及びポリＡ尾部領域（例えば、約１００ヌクレオチド長）をさらに含む。
【００５４】
ある特定の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡの生産方法に関し、本方法は、少なくとも１つのウラシルヌクレオ塩基をアデニン、グアニン、もしくはシトシンヌクレオ塩基で置換することによって、または少なくとも１つのアデニン、グアニン、もしくはシトシンヌクレオ塩基をウラシルヌクレオ塩基で置換することによって、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦを修飾することを含み、これらの置換全ては、同義置換である。ある特定の実施形態では、方法は、ウラシルの少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または約１００％を５−メトキシウラシルと置き換えることをさらに含む。
【００５５】
ある特定の態様では、本発明は、（ａ）本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡと、（ｂ）送達剤とを含む組成物に関する。ある特定の実施形態では、送達剤は、脂質様物質（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、ポリマー化合物、ペプチド、タンパク質、細胞、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、またはコンジュゲートを含む。ある特定の実施形態では、送達剤は、脂質ナノ粒子を含む。ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、（１３Ｚ，１６５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニドコサ−１３−１６−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）、２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）、（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される脂質を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡを含む。
【００５６】
ある特定の実施形態では、送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物
【化１】
2019516719.tif 000002
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、
−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるが、
但し、Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４もしくは５である場合の−Ｎ（Ｒ）２ではないか、あるいは（ｉｉ）Ｑは、ｎが１または２である場合の５、６、または７員ヘテロシクロアルキルではないことを条件とする。
【００５７】
ある特定の態様では、本発明は、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、送達剤とを含む組成物に関し、この送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物
【化２】
2019516719.tif 000003
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、
−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及び
Ｃ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及び
Ｃ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるが、但し、Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４もしくは５である場合の−Ｎ（Ｒ）２ではないか、あるいは（ｉｉ）Ｑは、ｎが１または２である場合の５、６、または７員ヘテロシクロアルキルではないことを条件とする。
【００５８】
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（Ｉ）を有する化合物、またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ｒ１は、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、あるいはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、
−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、
−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及び
Ｃ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及び
Ｃ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択されるが、但し、Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４もしくは５である場合の−Ｎ（Ｒ）２ではないか、あるいは（ｉｉ）Ｑは、ｎが１または２である場合の５、６、または７員ヘテロシクロアルキルではないことを条件とする。
【００５９】
ある特定の実施形態では、化合物は、式（ＩＡ）のもの、
【化３】
2019516719.tif 000004
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、１、２、３、４、または５であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、
−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される。
【００６０】
ある特定の実施形態では、ｍは、５、７、または９である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＡ）のもの、またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、１、２、３、４、または５であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、
−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ｍは、５、７、または９である。
【００６３】
ある特定の実施形態では、化合物は、式（ＩＩ）のもの、
【化４】
2019516719.tif 000005
またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＩ）のもの、またはその塩もしくは立体異性体であり、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、
−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される。
【００６５】
いくつかの実施形態では、Ｍ１は、Ｍ’である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ｌは、１、３、または５である。
【００６８】
いくつかの実施形態では、化合物は、化合物１〜化合物２３２、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、化合物は、化合物１〜化合物１４７、それらの塩及び立体異性体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【００７０】
ある特定の実施形態では、化合物は、式（ＩＩａ）のもの、
【化５】
2019516719.tif 000006
またはその塩もしくは立体異性体である。
【００７１】
ある特定の実施形態では、化合物は、式（ＩＩｂ）のもの、
【化６】
2019516719.tif 000007
またはその塩もしくは立体異性体である。
【００７２】
ある特定の実施形態では、化合物は、式（ＩＩｃ）または（ＩＩｅ）のもの、
【化７】
2019516719.tif 000008
またはその塩もしくは立体異性体である。
【００７３】
ある特定の実施形態では、Ｒ４は、本明細書に記載される通りである。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱ及び−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。
【００７４】
ある特定の実施形態では、化合物は、式（ＩＩｄ）のもの、
【化８】
2019516719.tif 000009
またはその塩もしくは立体異性体であり、
式中、ｎは、２、３、及び４から選択され、ｍ、Ｒ’、Ｒ”、及びＲ２〜Ｒ６は、本明細書に記載される通りである。例えば、Ｒ２及びＲ３の各々は独立して、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群から選択され得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＩｄ）のもの、またはその塩もしくは立体異性体であり、
式中、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、及び４から選択され、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ５、Ｒ６及びｍは、本明細書で定義される通りである。
【００７６】
いくつかの実施形態では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。
【００７７】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、Ｃ８アルキル、またはＣ９アルキルである。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ｍは、５、７、または９である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、各Ｒ５は、Ｈである。
【００８０】
いくつかの実施形態では、各Ｒ６は、Ｈである。いくつかの実施形態では、送達剤は、式（ＩＩＩ）を有する化合物
【化９】
2019516719.tif 000010
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
環Ａは、
【化１０】
2019516719.tif 000011
であり、
ｔは、１または２であり、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、
−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は独立して、結合、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
【化１１】
2019516719.tif 000012
であるとき、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、−ＣＨ２−ではないか、及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＩＩａ１）〜（ＩＩＩａ６）のうちのいずれかのものである。
【化１２−１】
2019516719.tif 000013
【化１２−２】
2019516719.tif 000014
【００８２】
式（ＩＩＩ）、または（ＩＩＩａ１）〜（ＩＩＩａ６）のうちのいずれかの化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化１３】
2019516719.tif 000015
である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化１４】
2019516719.tif 000016
または
【化１５】
2019516719.tif 000017
である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化１６】
2019516719.tif 000018
である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化１７】
2019516719.tif 000019
である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化１８】
2019516719.tif 000020
である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化１９】
2019516719.tif 000021
であり、この環は、Ｎ原子がＸ２と接続されている。
【００８９】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、Ｚは、不在である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも一方は、Ｎである。
【００９２】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、Ｎである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、ＣＨである。
【００９４】
いくつかの実施形態では、Ａ１は、Ｎであり、Ａ２は、ＣＨである。
【００９５】
いくつかの実施形態では、Ａ１は、ＣＨであり、Ａ２は、Ｎである。
【００９６】
いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、−ＣＨ２−ではない。例えば、ある特定の実施形態では、Ｘ１は、−ＣＨ２−ではない。いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、−Ｃ（Ｏ）−である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、Ｘ２は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、Ｘ３は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−である。他の実施形態では、Ｘ３は、−ＣＨ２−である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、Ｘ３は、結合または−（ＣＨ２）２−である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じである。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの多くても１つが、−Ｒ”ＭＲ’である。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの少なくとも１つが、−Ｒ”ＭＲ’であり得、及び／またはＲ４及びＲ５のうちの少なくとも１つが、−Ｒ”ＭＲ’であり得る。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＭは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、各Ｍは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭは、−ＯＣ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、各Ｍは、−ＯＣ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭは、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、各Ｍは、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ３アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ５アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ５アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ７アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ７アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ５アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ１アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ１アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ２アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ２アルキルである。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ１２アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の各々は、Ｃ１２アルキルである。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（ＩＶ）を有する化合物
【化２０】
2019516719.tif 000022
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ６−２０アルキル及びＣ６−２０アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
【化２１】
2019516719.tif 000023
であるとき、
ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は同じであり、ここでＲ１は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、またはＣ１８アルケニルではない、
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６−２０アルケニルから選択される、
ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも別の１つとは異なる数の炭素原子を有する、
ｉｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルキルから選択される、あるいは
ｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルケニルから選択される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＶａ）のものである。
【化２２】
2019516719.tif 000024
【０１０５】
式（ＩＶ）または（ＩＶａ）の化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、Ｚは、不在である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも一方は、Ｎである。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、Ｎである。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、ＣＨである。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、Ａ１は、Ｎであり、Ａ２は、ＣＨである。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、Ａ１は、ＣＨであり、Ａ２は、Ｎである。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じであり、かつＣ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、またはＣ１８アルケニルではない。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じであり、かつＣ９アルキルまたはＣ１４アルキルである。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６−２０アルケニルから選択される。ある特定のかかる実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じ数の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ５−２０アルケニルから選択される。例えば、Ｒ４は、Ｃ１２アルケニルまたはＣ１８アルケニルであり得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも別の１つとは異なる数の炭素原子を有する。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルキルから選択される。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じ数の炭素原子を有し、及び／またはＲ４及びＲ５は、同じ数の炭素原子を有する。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２、１４、または１８個の炭素原子を有し得る。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、Ｃ１８アルケニル（例えば、リノレイル）である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２、または１４個の炭素原子を含むアルキル基である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。他の実施形態では、Ｒ３は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。さらなる実施形態では、Ｒ４は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。
【０１１８】
他の実施形態では、送達剤は、を含む。式（Ｖ）を有する化合物
【化２３】
2019516719.tif 000025
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ３は、ＣＨまたはＮであり、
Ａ４は、ＣＨ２またはＮＨであり、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも１つは、ＮまたはＮＨであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｘ１及びＸ２は独立して、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から選択される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（Ｖａ）のものである。
【化２４】
2019516719.tif 000026
【０１２０】
式（Ｖ）または（Ｖａ）の化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、Ｚは、不在である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも一方は、ＮまたはＮＨである。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、Ａ３は、Ｎであり、Ａ４は、ＮＨである。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、Ａ３は、Ｎであり、Ａ４は、ＣＨ２である。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、Ａ３は、ＣＨであり、Ａ４は、ＮＨである。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも一方は、−ＣＨ２−ではない。例えば、ある特定の実施形態では、Ｘ１は、−ＣＨ２−ではない。いくつかの実施形態では、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも一方は、−Ｃ（Ｏ）−である。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、Ｘ２は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、Ｃ５−２０アルキル及びＣ５−２０アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、またはＣ１４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ１８アルケニルである。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、リノレイルであり得る。
【０１３０】
他の実施形態では、送達剤は、式（ＶＩ）を有する化合物、
【化２５】
2019516719.tif 000027
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ６及びＡ７は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ６及びＡ７のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｘ４及びＸ５は独立して、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から選択される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、独立して、Ｃ６−２０アルキル及びＣ６−２０アルケニルからなる群から選択される。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じである。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ９−１２アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の各々は独立して、Ｃ９、Ｃ１２またはＣ１４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の各々は、Ｃ９アルキルである。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、Ａ６は、Ｎであり、Ａ７は、Ｎである。いくつかの実施形態では、Ａ６は、ＣＨであり、Ａ７は、Ｎである。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、Ｘ４は、−ＣＨ２−であり、Ｘ５は、−Ｃ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、Ｘ４及びＸ５は、−Ｃ（Ｏ）−である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、Ａ６がＮであり、かつＡ７がＮであるとき、Ｘ４及びＸ５のうちの少なくとも一方は、−ＣＨ２−ではなく、例えば、Ｘ４及びＸ５のうちの少なくとも一方は、−Ｃ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、Ａ６がＮであり、かつＡ７がＮであるとき、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’ではない。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、組成物は、ナノ粒子組成物である。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、送達剤は、リン脂質をさらに含む。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、リン脂質は、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１８：０ジエーテルＰＣ）、１−オレオイル−２−コレステリルヘミスクシノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６リゾＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＭＥ  １６：０  ＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）、スフィンゴミエリン、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、送達剤は、構造脂質をさらに含む。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、ウルソール酸、アルファ−トコフェロール、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、送達剤は、ＰＥＧ脂質をさらに含む。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの任意の混合物からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、下記式、
【化２６】
2019516719.tif 000028
を有し、式中、ｒは、１〜１００の整数である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、化合物４２８である。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、送達剤は、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）、及び（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる群から選択されるイオン性脂質をさらに含む。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、送達剤は、リン脂質、構造脂質、ＰＥＧ脂質、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を、例えば約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
【０１４７】
ある特定の実施形態では、組成物は、インビボ送達用に製剤化される。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、組成物は、筋肉内、皮下、または皮内送達用に製剤化される。
【０１４９】
本開示はさらに、（ｉ）５’ＵＴＲと、（ｉｉ）ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３〜２７、７９〜８０、及び１４１〜１５９からなる群から選択される核酸配列を含む、ＯＲＦと、（ｉｉｉ）ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１２６、またはそれらの組み合わせから選択されるマイクロＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲとを含むｍＲＮＡを含む、ポリヌクレオチドを提供し、このｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基を含む。
【０１５０】
本開示はさらに、（ｉ）５’−末端キャップと、（ｉｉ）配列番号３３〜５０、７７、及び１１５〜１１７、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列を含む５’ＵＴＲと、（ｉｉｉ）ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であって、配列番号３〜２７、７９〜８０、及び１４１〜１５９からなる群から選択される配列を含み、ｍＲＮＡが、シュードウラシル（ψ）、Ｎ１−メチルシュードウラシル（ｍ１ψ）、１−エチルシュードウラシル、２−チオウラシル（ｓ２Ｕ）、４’−チオウラシル、５−メチルシトシン、５−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、及びそれらの任意の組み合わせ少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基を含む、ＯＲＦと、（ｉｖ）配列番号５１〜７５、８１〜８２、８８、１０３、１０６〜１１３、１１８、及び１６１〜１７０、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む３’ＵＴＲと、（ｖ）ポリＡ領域とを含むｍＲＮＡを含む、ポリヌクレオチドを提供する。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１１９〜１２０、１２２〜１４０、及び１６０からなる群から選択される、例えば、配列番号１１９または１２０の核酸配列を含む。
【０１５２】
本開示はさらに、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡと、送達剤とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、化合物２３６、その塩もしくは立体異性体、またはそれらの任意の組み合わせを含む脂質ナノ粒子である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜２３２のうちのいずれか、例えば、化合物１８、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３〜３４２のうちのいずれか、例えば、化合物２３６、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９〜４２８のうちのいずれか、例えば、化合物４２８、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を、例えば約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
【０１５３】
本明細書に開示される実施形態の一態様では、対象は、ファブリー病に対する治療または予防を必要とするヒト対象である。
【０１５４】
本明細書に開示される実施形態の一態様では、対象に投与されると、ｍＲＮＡは、配列番号２の核酸配列を有する及び／またはネイキッドｍＲＮＡとして投与される対応するｍＲＮＡと比べて、（ｉ）より長い血漿中半減期、（ｉｉ）ＯＲＦによってコードされるＧＬＡポリペプチドの増加した発現、（ｉｉｉ）発現断片をもたらす停止した翻訳のより低い頻度、（ｉｖ）より高い構造安定性、または（ｖ）それらの任意の組み合わせを有する。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、１つの単回単位用量または複数の単回単位用量としての投与に好適である。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、対象においてファブリー病の１つ以上のバイオマーカーのレベルを低減するのに好適である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、対象においてファブリー病の徴候または症状を治療するか、予防するか、その発症を遅延させるのに使用するためのものである。いくつかの実施形態では、徴候または症状には、疼痛、胃腸障害、被角血管腫等の皮膚病変、腎機能障害、心筋症、卒中、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【０１５８】
ある特定の態様では、本発明は、該ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを含む宿主細胞に関する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。ある特定の態様では、本発明は、該ポリヌクレオチドを含むベクターに関する。ある特定の態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを酵素的にまたは化学的に合成することを含む、ポリヌクレオチドの作製方法に関する。ある特定の態様では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、または開示されるポリヌクレオチドの作製方法によって生産されるポリヌクレオチドに関する。ある特定の態様では、本発明は、対象に有効量のポリヌクレオチド、組成物、宿主細胞、またはベクターを投与することを含む、必要のある対象における活性ＧＬＡポリペプチドのインビボでの発現方法に関する。ある特定の態様では、本発明は、対象に治療上有効量のポリヌクレオチド、組成物、宿主細胞、またはベクターを投与することを含む、必要のある対象におけるファブリー病の治療方法またはファブリー病の徴候及び／または症状の予防方法に関し、この投与は、対象においてファブリー病の徴候または症状を緩和する。
【０１５９】
ある特定の態様では、本発明は、ファブリー病の徴候または症状が顕在化する前に対象に予防上有効量のポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）、組成物、宿主細胞、またはベクターを投与することを含む、必要のある対象におけるファブリー病の徴候または症状の発症の予防または遅延方法に関し、この投与は、対象においてファブリー病の徴候または症状を予防するかまたは遅延させる。ある特定の態様では、本発明は、ファブリー病の徴候または症状が顕在化する前に対象に治療上有効量のポリヌクレオチド、組成物、宿主細胞、またはベクターを投与することを含む、必要のある対象におけるファブリー病の徴候または症状の寛解方法に関し、この投与は、対象においてファブリー病の徴候または症状を寛解させる。
【０１６０】
本開示はさらに、対象に有効量の本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを投与することを含む、必要のあるヒト対象におけるα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）ポリペプチドの発現方法を提供し、この医薬組成物またはポリヌクレオチドは、１つの単回用量としてまたは複数の単回単位用量として対象に投与するのに好適である。
【０１６１】
本開示はさらに、対象に有効量の本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを投与することを含む、必要のあるヒト対象におけるファブリー病の徴候または症状の治療、予防、または、その発症の遅延方法を提供し、この投与は、対象におけるファブリー病の徴候または症状のうちの１つ以上を治療するか、予防するか、またはその発症を遅延させる。いくつかの実施形態では、投与は、対象の血漿または組織中のＧｂ３またはリゾ−Ｇｂ３の進行的蓄積を減速する、停止する、または逆行させる。
【０１６２】
本開示はさらに、ファブリー病を患うヒト対象に、本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡの単回静脈内投与を投与することを含む、ファブリー病の治療のための方法を提供する。
【０１６３】
本開示はさらに、対象に有効量の本明細書に記載の医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡを投与することを含む、ヒト対象におけるＧｂ３血漿中レベルまたはリゾ−Ｇｂ３血漿中レベルの低減方法を提供し、この投与は、対象においてＧｂ３またはリゾ−Ｇｂ３レベルを低減する。いくつかの実施形態では、（ｉ）Ｇｂ３血漿中レベルは、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、対象のベースラインＧｂ３血漿中レベルもしくは参照のＧｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、もしくは少なくとも２０倍低減され、及び／または（ｉｉ）リゾ−Ｇｂ３血漿中レベルは、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、もしくは少なくとも４２日間にわたって、対象のベースラインリゾ−Ｇｂ３血漿中レベルもしくは参照のリゾ−Ｇｂ３血漿中レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、もしくは少なくとも２０倍低減される。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、Ｇｂ３血漿中レベルは、対象において１０ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、９ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、８ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、７ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、６ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、５ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、４ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、３ｎｍｏｌ／ｍＬ未満、または２ｎｍｏｌ／ｍＬ未満に低減される。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡが対象に投与されてから２４時間、対象における前記ＧＬＡ活性は、対象のベースラインＧＬＡ活性または参照のＧＬＡ活性レベルと比較して少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、または少なくとも６００％増加する。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡ活性は、対象の心臓、腎臓、肝臓、または脾臓において増加する。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、増加したＧＬＡ活性は、２４、３６、４８、６０、７２、９６、１２０、１４４、または１６８時間を超えて持続する。いくつかの実施形態では、増加したＧＬＡ活性は、１週間を超えて、２週間を超えて、３週間を超えて、４週間を超えて、５週間を超えて、または６週間を超えて持続する。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡが対象に投与され、対象におけるＧｂ３のレベルは、対象のベースラインＧｂ３レベルまたは参照のＧｂ３レベルと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％低減される。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、Ｇｂ３のレベルは、対象の血漿、心臓、腎臓、肝臓、及び／または脾臓のうちの１つ以上において低減される。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、投与は、投与後少なくとも７日間、少なくとも１４日間、少なくとも２１日間、少なくとも２８日間、少なくとも３５日間、または少なくとも４２日間にわたって、血漿、心臓、腎臓、肝臓、または脾臓組織のうちの１つ以上におけるＧｂ３のレベルまたはリゾ−Ｇｂ３のレベルを、その組織における対象のベースラインレベルまたは参照レベルと比較して４０％〜１００％、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、または９０％〜１００％に低減する。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、対象への投与後、対象におけるＧｂ３のレベルは、対象のベースラインＧｂ３レベルまたは参照のＧｂ３レベルと比較して少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、または少なくとも６週間低減される。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡが対象に投与されてから２４時間、対象におけるリゾ−Ｇｂ３のレベルは、対象のベースラインリゾ−Ｇｂ３レベルまたは参照のリゾ−Ｇｂ３レベルと比較して少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％低減される。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、リゾ−Ｇｂ３のレベルは、対象の血漿、心臓、腎臓、肝臓、及び／または脾臓のうちの１つ以上において低減される。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、対象への投与後、対象におけるリゾ−Ｇｂ３のレベルは、対象のベースラインリゾ−Ｇｂ３レベルまたは参照のリゾ−Ｇｂ３レベルと比較して少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、または少なくとも６週間低減される。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、１．５ｍｇ／ｋｇ未満、１．２５ｍｇ／ｋｇ未満、１ｍｇ／ｋｇ未満、０．７５ｍｇ／ｋｇ未満、または０．５ｍｇ／ｋｇ未満の単回用量として投与される。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、対象への投与は、約週１回、約２週間に１回、または約１カ月に１回である。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物またはポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、静脈内投与される。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】野生型ＧＬＡのタンパク質配列（パネルＡ）、ドメイン特徴を有する表（パネルＢ）、及びドメイン構造の図式表示（パネルＣ）を示す。
【図２】野生型ＧＬＡの核酸配列を示す。
【図３】野生型ＧＬＡ及び２５個の配列最適化ＧＬＡポリヌクレオチドに対応するウラシル（Ｕ）評価基準を示す。「Ｕ含量（％）」と標示された欄は、％ＵＴＬパラメータに対応する。「Ｕ含量ｖ．ＷＴ（％）」と標示された欄は、％ＵＷＴに対応する。「Ｕ含量  ｖ．理論上最小（％）」と標示された欄は、％ＵＴＭに対応する。「ＵＵ対ｖ．ＷＴ（％）」と標示された欄は、％ＵＵＷＴに対応する。
【図４】野生型ＧＬＡ及び２５個の配列最適化ＧＬＡポリヌクレオチドに対応するグアニン（Ｇ）評価基準を示す。「Ｇ含量（％）」と標示された欄は、％ＧＴＬに対応する。「Ｇ含量ｖ．ＷＴ（％）」と標示された欄は、％ＧＷＴに対応する。「Ｇ含量ｖ．理論上最大（％）」と標示された欄は、％ＧＴＭＸに対応する。
【図５】野生型ＧＬＡ及び２５個の配列最適化ＧＬＡポリヌクレオチドに対応するシトシン（Ｃ）評価基準を示す。「Ｃ含量（％）」と標示された欄は、％ＣＴＬに対応する。「Ｃ含量ｖ．ＷＴ（％）」と標示された欄は、％ＣＷＴに対応する。「Ｃ含量ｖ．理論上最大（％）」と標示された欄は、％ＣＴＭＸに対応する。
【図６】野生型ＧＬＡ及び２５個の配列最適化ＧＬＡポリヌクレオチドに対応するグアニン＋シトシン（Ｇ／Ｃ）評価基準を示す。「Ｇ／Ｃ含量（％）」と標示された欄は、％Ｇ／ＣＴＬに対応する。「Ｇ／Ｃ含量ｖ．ＷＴ（％）」と標示された欄は、％Ｇ／ＣＷＴに対応する。「Ｇ／Ｃ含量ｖ．理論上最大（％）」と標示された欄は、％Ｇ／ＣＴＭＸに対応する。
【図７】野生型ＧＬＡ及び２５個の配列最適化ＧＬＡポリヌクレオチドに対応するコドン位置１、２、３のＧ／Ｃ組成バイアスの間の比較を示す。
【図８】ヘマトキシリンで対比染色された、ＧＦＰをコードするｍＲＮＡで処置された野生型ＣＤ１マウスの肝臓の抗ＧＬＡ免疫組織化学染色を示す。マウスは、ｍＲＮＡの注射の４８時間後に屠殺された。図８は、これらの肝臓切片におけるほんの低い抗ＧＬＡ染色レベルを示す。
【図９】ヘマトキシリンで対比染色された、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡで処置された野生型ＣＤ１マウスの肝臓の抗ＧＬＡ免疫組織化学染色を示す。マウスは、ｍＲＮＡの注射の４８時間後に屠殺された。図９は、ＧＬＡ  ｍＲＮＡ処置された動物の肝臓の肝細胞及び洞様血管の両方における、高い抗ＧＬＡ染色レベルを示す。
【図１０ＡＢ】図１０〜１０Ｇは、制御ＧＦＰ  ｍＲＮＡ及びＧＬＡ  ｍＲＮＡ注射された野生型ＣＤ１マウスの血漿、肝臓、脾臓、腎臓、及び心臓におけるＧＬＡタンパク質レベルを示す。ベースラインとして、図１０Ａは、制御ＧＦＰ  ｍＲＮＡを投与された野生型マウスの脾臓、肝臓、心臓、腎臓、及び血漿における経時的なＧＬＡ活性レベルを示す。図１０Ｂは、ＧＬＡ  ｍＲＮＡで処置された野生型マウスの脾臓、肝臓、心臓、腎臓、及び血漿における増加されたＧＬＡ活性レベルを示す。図１０Ｃ、１０Ｄ、１０Ｅ、１０Ｆ、及び１０Ｇは、それぞれ、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、及び血漿における、ＧＬＡ  ｍＲＮＡと比較してＧＦＰ  ｍＲＮＡを投与された野生型マウスのＧＬＡ活性を示す。心臓（図１０Ｃ）、肝臓（図１０Ｄ）、及び腎臓（図１０Ｅ）のおおよその外因性マウスのＧＬＡ活性は、参照のために各図内で点線として示される。ＧＬＡ  ｍＲＮＡでの処置後、ＧＬＡ活性レベルの増加が、試験された全ての組織において処置後の２４時間観察された。
【図１０ＣＤ】同上
【図１０ＥＦ】同上
【図１０Ｇ】同上
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）によって分析された場合の静脈内投与後７２時間での、ＧＬＡノックアウトマウスの肝臓におけるＧＬＡタンパク質レベルを示す。図１１Ａは、投与されたＧＬＡ  ｍＲＮＡの各濃度で観察されたＧＦＰ制御に対する著しいＧＬＡ発現を伴う、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡの投与後７２時間の肝臓におけるＧＬＡ発現の投与反応を示す。７２時間でのタンパク質発現の定量化は、図１１Ｂに図示される。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｄは、ＧＬＡまたはＧＦＰをコードするｍＲＮＡでの処置後の血漿中のＧＬＡ活性の投与反応分析を示す。図１２Ａは、制御ＧＦＰ  ｍＲＮＡを投与されたマウスの血漿中のＧＬＡ活性と比較した、ＧＬＡ  ｍＲＮＡの各投与の経時的なＧＬＡノックアウトマウスの血漿中のＧＬＡ活性の対数グラフを示す。図１２Ｂ、１２Ｃ、及び１２Ｄは、それぞれ、処置後６時間、２４時間、及び７２時間での各投与の血漿中のＧＬＡ活性を示す。ＧＬＡをコードするｍＲＮＡで処置されたマウスは、各時点で用量依存的様式で増加されたＧＬＡ活性を示した。
【図１２ＢＣ】図１２Ａ〜１２Ｄは、ＧＬＡまたはＧＦＰをコードするｍＲＮＡでの処置後の血漿中のＧＬＡ活性の投与反応分析を示す。図１２Ａは、制御ＧＦＰ  ｍＲＮＡを投与されたマウスの血漿中のＧＬＡ活性と比較した、ＧＬＡ  ｍＲＮＡの各投与の経時的なＧＬＡノックアウトマウスの血漿中のＧＬＡ活性の対数グラフを示す。図１２Ｂ、１２Ｃ、及び１２Ｄは、それぞれ、処置後６時間、２４時間、及び７２時間での各投与の血漿中のＧＬＡ活性を示す。ＧＬＡをコードするｍＲＮＡで処置されたマウスは、各時点で用量依存的様式で増加されたＧＬＡ活性を示した。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｄは、ＧＬＡまたはＧＦＰをコードするｍＲＮＡでの処置後の血漿中のＧＬＡ活性の投与反応分析を示す。図１２Ａは、制御ＧＦＰ  ｍＲＮＡを投与されたマウスの血漿中のＧＬＡ活性と比較した、ＧＬＡ  ｍＲＮＡの各投与の経時的なＧＬＡノックアウトマウスの血漿中のＧＬＡ活性の対数グラフを示す。図１２Ｂ、１２Ｃ、及び１２Ｄは、それぞれ、処置後６時間、２４時間、及び７２時間での各投与の血漿中のＧＬＡ活性を示す。ＧＬＡをコードするｍＲＮＡで処置されたマウスは、各時点で用量依存的様式で増加されたＧＬＡ活性を示した。
【図１３】ＧＬＡまたはＧＦＰをコードするｍＲＮＡを投与した後６時間の、血漿中のＧＬＡ発現を定量化するために行われたＥＬＩＳＡアッセイを示す。ＧＬＡ  タンパク質が制御ＧＦＰマウスの血漿中で検出されなかった一方で、著しいレベルのＧＬＡタンパク質が、０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ  ｍＲＮＡを投与されたマウスの血漿中で検出された。
【図１４ＡＢ】図１４Ａ〜１４Ｄは、ＧＬＡ  ｍＲＮＡの投与後７２時間のＧＬＡノックアウトマウスから採取された、それぞれ、心臓、腎臓、肝臓、及び脾臓組織におけるＧＬＡ活性を示す。各組織において、ＧＬＡ活性は、用量依存的様式でＧＬＡ  ｍＲＮＡ処置されたマウスについて高められた。
【図１４ＣＤ】図１４Ａ〜１４Ｄは、ＧＬＡ  ｍＲＮＡの投与後７２時間のＧＬＡノックアウトマウスから採取された、それぞれ、心臓、腎臓、肝臓、及び脾臓組織におけるＧＬＡ活性を示す。各組織において、ＧＬＡ活性は、用量依存的様式でＧＬＡ  ｍＲＮＡ処置されたマウスについて高められた。
【図１５ＡＢ】図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃは、ＧＬＡ  ｍＲＮＡの投与後７２時間のＧＬＡノックアウトマウスから採取された、それぞれ、心臓、腎臓、肝臓、及び脾臓組織におけるＧＬＡ活性を示す。図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃは、０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ  ｍＲＮＡ  投与での肝臓、血漿、及び心臓における超生理的（＞１００％）ＧＬＡ活性、及び０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ  ｍＲＮＡ  投与での腎臓におけるＧＬＡ活性の少なくとも５０％回復を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃは、ＧＬＡ  ｍＲＮＡの投与後７２時間のＧＬＡノックアウトマウスから採取された、それぞれ、心臓、腎臓、肝臓、及び脾臓組織におけるＧＬＡ活性を示す。図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃは、０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ  ｍＲＮＡ  投与での肝臓、血漿、及び心臓における超生理的（＞１００％）ＧＬＡ活性、及び０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ  ｍＲＮＡ  投与での腎臓におけるＧＬＡ活性の少なくとも５０％回復を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｅは、ＧＬＡ  ｍＲＮＡまたは制御ＧＦＰ  ｍＲＮＡを投与されたＧＬＡノックアウトマウスの血漿中及び組織試料におけるリゾ−Ｇｂ３のレベルを示す。図１６Ａ、１６Ｂ、及び１６Ｃは、０．５ｍｇ／ｋｇの制御ＧＦＰ  ｍＲＮＡ、０．５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ  ｍＲＮＡ、０．１ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ  ｍＲＮＡ、または０．０５ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ  ｍＲＮＡの投与後７２時間の、それぞれ、血漿、腎臓、及び心臓におけるリゾ−Ｇｂ３レベルを示す。これらのデータは、ＧＬＡ  ｍＲＮＡの単回用量の投与後７２時間の、血漿中のリゾ−Ｇｂ３レベルの用量依存的減少を示す。図１６Ｄ及び１６Ｅは、未処置のノックアウトマウスの血漿、心臓、及び腎臓におけるリゾ−Ｇｂ３レベル対するパーセントとしての、リゾ−Ｇｂ３レベルの用量依存的低減を示す。
【図１６ＢＣ】同上
【図１６ＤＥ】同上
【図１６ＦＧＨ】図１６Ｆ、１６Ｇ、及び１６Ｈは、ＧＬＡ機能に関する他の読出しに対する測定されたＧＬＡ活性の図を示す。図１６Ｆ及び１６Ｇは、それぞれ、血漿及び肝臓におけるＧＬＡ発現レベルの測定値に対するＧＬＡ活性の図を示す。両方の場合において、高い程度の相関関係がある（決定係数＞０．９）。これらの結果は、増加されたＧＬＡ発現が、ＧＬＡノックアウトマウスの血液及び組織の両方における増加されたＧＬＡ活性と相関することを示す。図１６Ｈは、ＧＬＡノックアウトマウスにおけるリゾ−Ｇｂ３のレベルに対するＧＬＡ活性の図を示す。この図は、ＧＬＡ  ｍＲＮＡの単回用量を投与されたＧＬＡノックアウトマウスにおける、増加されたＧＬＡ活性が、インビボでのファブリー病のバイオマーカーの減少されたレベルと相関することを示す。
【図１７ＡＢ】図１７Ａ、１７Ｂ、及び１７Ｃは、単回用量のＧＬＡ  ｍＲＮＡで処置されたＧＬＡ  −／−ノックアウトマウスにおけるＧＬＡのバイオマーカーのレベルを示す。図１７Ａは、ＧＬＡ−ｍＲＮＡ  ＃１で処置されたマウスにおけるパーセント低減リゾ−Ｇｂ３を示すが、図１７Ｂは、ＧＬＡ−ｍＲＮＡ  ＃２３で処置されたマウスにおけるパーセント低減リゾ−Ｇｂ３を示す。両方の場合において、リゾ−Ｇｂ３は、処置後３日間までに血漿中で８０〜９０％低減された。リゾ−Ｇｂ３レベルは、ＧＬＡ−ｍＲＮＡ  ＃１については、４週間の時間経過全体で初期測定値未満の７０％のレベル（図１７Ａを参照されたい）、及びＧＬＡ−ｍＲＮＡ  ＃２３については、６週間の時間経過全体の初期測定値未満の７０％レベル（図１７Ｂを参照されたい）を維持した。図１７Ｃは、ｍＲＮＡの投与の効果を酵素補充療法（ＥＲＴ）の投与と比較する並列試験の結果を示す。ＥＲＴ及びｍＲＮＡ療法の両方は、おおよそ２０％のベースラインレベルにＧｂ３レベルを低減した。図１７Ｃは、ＧＬＡ−ｍＲＮＡ  ＃２３で処置されたマウスにおけるＧｂ３血漿レベルが、処置後少なくとも６週間おおよそ２０％のベースラインを維持したと同時に、処置後２〜３週間のＥＲＴ−処置マウスにおける血漿Ｇｂ３のレベルの回復を示す。
【図１７Ｃ】同上
【図１８】図１８Ａ及び１８Ｂは、それぞれ、投与後４週間及び６週間の、ＧＬＡ  ｍＲＮＡを投与されたＧＬＡノックアウトマウスの心臓、腎臓、肝臓、及び脾臓試料におけるリゾ−Ｇｂ３のレベルを示す。図１８Ａは、処置後４週間の、処置されたマウスの心臓及び腎臓が、未処置のノックアウトマウスにおいて観察されたリゾ−Ｇｂ３の３０〜４０％のみを有したこと、ならびに処置されたマウスの肝臓及び脾臓が、未処置のノックアウトマウスにおいて観察されたリゾ−Ｇｂ３の１０〜２０％のみを有したことを示す。図１８Ｂは、処置後６週間の、処置されたマウスの心臓及び腎臓が、未処置のノックアウトマウスにおいて観察されたリゾ−Ｇｂ３の４０〜４５％のみを有したこと、ならびに処置されたマウスの肝臓及び脾臓が、未処置のノックアウトマウスにおいて観察されたリゾ−Ｇｂ３のおおよそ２０％を有したことを示す。
【図１９】未処置のサルに対して、ＧＬＡ−ｍＲＮＡで処置されたサルの血漿中のＧＬＡ活性レベルの時間経過を示す。ＧＬＡ活性は、ＧＬＡ−ｍＲＮＡでの処置の後約６〜１２時間でピークに達した。
【図２０】複数回投与後、インビボでＧＬＡ活性を促進する、配列最適化、化学修飾されたＧＬＡ−コードｍＲＮＡの能力を示す。ＧＬＡ活性は、ＧＬＡ−ｍＲＮＡでの各処置の後約６〜１２時間でピークに達した。さらに、図２０は、ＧＬＡ活性レベルが、ＧＬＡ−ｍＲＮＡでの第２の処置の後で各時点でＧＬＡ−ｍＲＮＡでの第１の処置の後の同等の時点に対してより高かったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１７９】
本発明は、ファブリー病の治療のためのｍＲＮＡ治療薬を提供する。ファブリー病は、複数の細胞型のリソソーム内でのグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）及び関連するスフィンゴ糖脂質の進行的蓄積をもたらす、スフィンゴ糖脂質異化作用の遺伝性代謝障害である。ファブリー病は、酵素α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）をコードするＧＬＡ遺伝子の変異によって引き起こされる。ｍＲＮＡ治療薬は、この技術がＧＬＡをコードするｍＲＮＡの細胞内送達、続いて標的細胞内での機能的ＧＬＡタンパク質のデノボ合成を可能にするため、ファブリー病の治療に特によく適している。ｍＲＮＡの標的細胞への送達後、所望のＧＬＡタンパク質が細胞自体の翻訳機構によって発現され、よって、完全に機能的なＧＬＡタンパク質が、欠陥のあるまたは欠損したタンパク質を置き換える。さらに、ｍＲＮＡベースのファブリー病の療法は、ある割合の合成されたＧＬＡが細胞から分泌され、マンノース−６−リン酸受容体を通して受容体介在性エンドサイトーシスによって取り込まれるため、ｍＲＮＡが送達される細胞を超えて広がり得る。
【０１８０】
核酸ベースの治療薬（例えば、ｍＲＮＡ治療薬）をインビボで送達することに関連する１つの課題は、身体の免疫系が外来性核酸に遭遇するときに生じ得る自然免疫応答に起因する。外来性ｍＲＮＡは、１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）によって活性化される、トール様受容体（ＴＬＲ）、特にＴＬＲ７／８を通した認識を介して免疫系を活性化し得る。非免疫細胞においては、外来性ｍＲＮＡの認識は、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）により生じ得る。外来性ｍＲＮＡの免疫認識は、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）産生、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）分布及び強力なＩ型インターフェロン（Ｉ型ＩＦＮ）応答を含む、不要なサイトカイン作用をもたらし得る。本発明は、免疫活性化を最小限に抑え、ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳効率を最適化するための、治療的ｍＲＮＡ内での異なる修飾されたヌクレオチドの組み込みを特徴とする。本発明の特定の態様は、タンパク質発現を増大させるための、特にＧＬＡをコードする治療的ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内での、自然免疫応答を低減する及び配列最適化のためのヌクレオチド修飾の組み合わせを特徴とする。
【０１８１】
本発明のｍＲＮＡ治療技術のある特定の実施形態はまた、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡの、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）送達系を介した送達も特徴とする。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、ｍＲＮＡの標的細胞への安全で有効な送達の理想的な土台である。ＬＮＰは、細胞取り込み、細胞内輸送及びエンドソーム放出またはエンドソーム脱出を伴う機構によって核酸を送達する、固有の能力を有する。本発明は、インビボ投与されるときに改善された特性を有する、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡと組み合わせた新規のイオン性脂質系ＬＮＰを特徴とする。理論に拘束されることなく、この新規のイオン性脂質系ＬＮＰ製剤は、例えば、細胞取り込み、細胞内輸送及び／またはエンドソーム放出もしくはエンドソーム脱出等の改善された特性を有すると考えられる。例えば第１の投与において、全身経路（例えば、静脈内（ＩＶ）投与）で投与されるＬＮＰは、例えばさらなる投与においてその後注射されるＬＮＰのクリアランスを加速化し得る。この現象は、急速な血中クリアランス（ＡＢＣ）として知られ、特に治療的関連で欠乏酵素（例えば、ＧＬＡ）を補充する際の主要な課題である。これは、ｍＲＮＡ治療薬の反復投与がほとんどの事例において、対象（例えば、ファブリー病を患う対象）の標的組織内で必要な酵素レベルを維持するのに必須であるためである。反復投与の課題は、複数のレベルで対処することができる。ｍＲＮＡ操作及び／またはＬＮＰによる効率的な送達は、第１の用量投与後に発現されるタンパク質（例えば、ＧＬＡ）の増加したレベル及びまたはその持続時間の増大をもたらし得、これが今度は、第１の用量とその後の投薬との間の時間を延長し得る。ＡＢＣ現象は、少なくとも部分的には、本来一過性であり、ＡＢＣの根底をなす免疫応答は、全身投与から十分な時間がたつと解消することが知られている。したがって、一態様において本発明のｍＲＮＡ治療薬の全身送達後にタンパク質発現及び／または活性の持続期間を増加させることで、ＡＢＣ減少に対抗する。その上、ＬＮＰを操作して、免疫検知及び／または認識を回避することができ、故に、後続の投与または反復投薬時のＡＢＣをさらに回避することができる。本発明の例となる態様は、低減されたＡＢＣを有するように操作された新規のＬＮＰを特徴とする。
【０１８２】
１．α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）
α−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）は、ホモ二量体グリコシド加水分解酵素である４８，７６７Ｄａのポリペプチドである。それは、糖脂質及び糖タンパク質からの末端アルファ−ガラクトシル部分を加水分解する。ＧＬＡは、ヒトにおけるＧＬＡ遺伝子によってコードされる。
【０１８３】
ＧＬＡ遺伝子の変異は、α−ガラクトシダーゼＡの合成、プロセシング、及び安定性に影響を及ぼし得、まれなリソソーム蓄積障害であるファブリー病及びスフィンゴリピドーシスを引き起こし得る。ファブリー病は、アルファ−Ｄ−ガラクトシル糖脂質部分を異化することの不具合からもたらされ、糖脂質が多くの組織において蓄積するというスフィンゴ糖脂質異化の先天性異常を伴う。ファブリー病を有する患者では、血漿中のグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）及び関連するスフィンゴ糖脂質、ならびに細胞リソソームが全身にわたって全身的かつ進行的に蓄積する。例えば、ファブリー病の患者のある研究では、罹患した患者において平均Ｇｂ３血漿中濃度が１１．４±０．８ｎｍｏｌ／ｍＬであることが見出された。Ｓｃｈｉｆｆｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｏ’Ｂｒａｄｙ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ３６  ｉｎ  Ｆａｂｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｆｒｏｍ  ５  Ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ＦＯＳ（Ｏｘｆｏｒｄ：Ｏｘｆｏｒｄ  ＰｈａｒｍａＧｅｎｅｓｉｓ；２００６）。ファブリー病を有する男性は、体幹下部にわたって特徴的な皮膚病変（角化血管腫）を有する。眼内蓄積、熱性発作、四肢の灼熱痛が生じ得る。腎不全、ならびに高血圧による心臓もしくは脳の合併症または他の血管疾患は死につながり得る。角膜混濁等の特徴を伴う軽減されたファブリー病の形態が、ヘテロ接合型である女性において存在し得る。
【０１８４】
野生型ＧＬＡ標準ｍＲＮＡ配列のコード配列（ＣＤＳ）は、ＮＣＢＩ参照配列データベース（ＲｅｆＳｅｑ）にて受託番号ＮＭ＿０００１６９．２（「Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓガラクトシダーゼアルファ（ＧＬＡ）、ｍＲＮＡ」）の下に記載される。野生型ＧＬＡ標準タンパク質配列は、ＲｅｆＳｅｑデータベースにて受託番号ＮＰ＿０００１６０（「アルファ−ガラクトシダーゼＡ前駆体［Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ］」）の下に記載される。ＧＬＡタンパク質は、４２９アミノ酸長である。ＲｅｆＳｅｑ配列における参照タンパク質配列をコードする具体的な核酸配列は、それぞれのＲｅｆＳｅｑデータベースエントリにおいて示されるコード配列（ＣＤＳ）であることに留意する。
【０１８５】
ある特定の態様では、本発明は、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））を含むポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドは、野生型ＧＬＡタンパク質である。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドは、野生型ＧＬＡ配列と比べて置換、ならびに挿入及び／または付加、欠失及び／または共有結合修飾を含む、バリアント、ペプチドまたはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、配列タグまたはアミノ酸が、例えば、局在化のために、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端で）付加され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドのカルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域に位置するアミノ酸残基が任意選択で欠失されて、断片をもたらし得る。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、本発明のヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、１つ、２つ、３つまたは３つよりも多くの置換を含み得る、ＧＬＡ配列の置換バリアントをコードする。いくつかの実施形態では、置換バリアントは、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含み得る。他の実施形態では、バリアントは、挿入バリアントである。他の実施形態では、バリアントは、欠失バリアントである。
【０１８７】
当業者に認識されるように、ＧＬＡタンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、バリアント、及び同種タンパク質（オルソログ）もまた、本発明のＧＬＡポリペプチドの範囲内にあると見なされる。本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの非限定的な例が、ヒト野生型ＧＬＡのアミノ酸配列を示す、図１に示される。
【０１８８】
２．ポリヌクレオチド及びオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
本発明は、ファブリー病の治療（すなわち、予防的及び／または治療的治療）において使用するためのｍＲＮＡを特徴とする。本発明における使用のために特徴が示されるｍＲＮＡは、対象に投与され、インビボでヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）タンパク質（複数可）をコードする。したがって、本発明は、ヒトα−ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、そのアイソフォーム、その機能的断片、及びＧＬＡを含む融合タンパク質をコードする連結したヌクレオシドのオープンリーディングフレームを含む、ポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡに関する。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレームは、配列最適化される。特定の実施形態では、本発明は、ヒトＧＬＡのポリペプチド配列、または配列最適化ポリヌクレオチドとの高い配列同一性を有する配列をコードするヌクレオチドを含む、配列最適化ポリヌクレオチドを提供する。
【０１８９】
ある特定の態様では、本発明は、１つ以上のＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を提供する。いくつかの実施形態では、本発明のコードされるＧＬＡポリペプチドは、下記から選択することができる。
（ｉ）完全長ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型ＧＬＡと同じまたは本質的に同じ長さを有する）、
（ｉｉ）野生型ＧＬＡの機能的断片（例えば、野生型ＧＬＡよりも短いが、依然としてＧＬＡ酵素活性を保持する、切詰め（例えば、カルボキシ末端、アミノ末端、または内部領域の欠失）配列）、
（ｉｉｉ）そのバリアント（例えば、１つ以上のアミノ酸が置き換えられた完全長または切詰めタンパク質、例えば、野生型ＧＬＡのＧＬＡ活性の全てまたはほとんどを保持するバリアント）、または
（ｉｖ）（ｉ）完全長ＧＬＡタンパク質、機能的断片またはそのバリアント、及び（ｉｉ）異種タンパク質を含む融合タンパク質。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、コードされるＧＬＡポリペプチドは、哺乳類ＧＬＡポリペプチド、例えば、ヒトＧＬＡポリペプチド、その機能的断片またはバリアントである。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、細胞に導入されたとき、それらの細胞におけるＧＬＡタンパク質発現レベル及び／または検出可能なＧＬＡ酵素活性レベルを、本発明のポリヌクレオチドの投与前の細胞におけるＧＬＡタンパク質発現レベル及び／または検出可能なＧＬＡ酵素活性レベルと比較して、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加させる。ＧＬＡタンパク質発現レベル及び／またはＧＬＡ酵素活性は、当該技術分野で既知の方法に従って測定することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、インビトロで細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、インビボで細胞に導入される。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ヒトＧＬＡ、例えば、野生型ヒトＧＬＡ（配列番号１、図１を参照されたい）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、コドン最適化核酸配列を含み、このコドン最適化核酸配列のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、野生型ＧＬＡ配列から得られる。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒトＧＬＡの完全長配列（すなわち、イニシエーターメチオニンを含む）を有するＧＬＡをコードするヌクレオチド配列を含む。成熟ヒトＧＬＡにおいて、イニシエーターメチオニンを除去して、翻訳産物の２〜４２９のアミノ酸残基を含む  「成熟ＧＬＡ」を得ることができる。代替的に、シグナルペプチドを除去して、翻訳産物のアミノ酸残基３２〜４２９を得ることができる。ヒトＧＬＡの完全配列（アミノ酸１〜４２９）を対象とする本開示の教示はまた、イニシエーターメチオニンを欠いたヒトＧＬＡの成熟型（アミノ酸１〜４２９）及びシグナルペプチドを欠いたヒトＧＬＡ（アミノ酸３２〜４２９）にも適用可能である。故に、いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ヒトＧＬＡの成熟配列（すなわち、イニシエーターメチオニンを欠いた）を有するＧＬＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、シグナルペプチドを欠いたＧＬＡをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＧＬＡの完全長もしくは成熟配列を有するＧＬＡをコードする、またはシグナルペプチドを欠いたＧＬＡをコードするヌクレオチド配列を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化される。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、変異体ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＬＡ配列の少なくとも１つの点突然変異を含み、かつＧＬＡ酵素活性を保持するＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。いくつかの実施形態では、変異体ＧＬＡポリペプチドは、対応する野生型ＧＬＡ（すなわち、同じ野生型ＧＬＡであるが、変異（複数可）を有しない）のＧＬＡ活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％である、ＧＬＡ活性を有する。いくつかの実施形態では、変異体ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化される。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡ酵素活性を改変しない変異を有するＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。かかる変異体ＧＬＡポリペプチドは、機能的に中立と称され得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、１つ以上の機能的に中立な点の突然変異を含む変異体ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、変異体ＧＬＡポリペプチドは、対応する野生型ＧＬＡよりも高いＧＬＡ酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、変異体ＧＬＡポリペプチドは、対応する野生型ＧＬＡ（すなわち、同じ野生型ＧＬＡであるが、変異（複数可）を有しない）の活性よりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％高い、ＧＬＡ活性を有する。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、１つ以上の断片が野生型ＧＬＡポリペプチドのポリペプチド部分配列に対応し、ＧＬＡ酵素活性を保持する、機能的ＧＬＡ断片をコードする、ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＬＡ断片は、対応する完全長ＧＬＡのＧＬＡ活性の少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％である、ＧＬＡ活性を有する。いくつかの実施形態では、機能的ＧＬＡ断片をコードするＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化される。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、対応する完全長ＧＬＡよりも高いＧＬＡ酵素活性を有するＧＬＡ断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。故に、いくつかの実施形態ＧＬＡ断片は、対応する完全長ＧＬＡのＧＬＡ活性よりも少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％高い、ＧＬＡ活性を有する。
【０２００】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、野生型ＧＬＡよりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％短いＧＬＡ断片をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、このヌクレオチド配列は、配列番号３〜２７、７９〜８０、及び１４１〜１５９からなる群から選択される配列との少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。表２を参照されたい。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、このヌクレオチド配列は、配列番号３〜２７、７９〜８０、及び１４１〜１５９からなる群から選択される配列との７０％〜１００％、７５％〜１００％、８０％〜１００％、８１％〜１００％、８２％〜１００％、８３％〜１００％、８４％〜１００％、８５％〜１００％、８６％〜１００％、８７％〜１００％、８８％〜１００％、８９％〜１００％、９０％〜１００％、９１％〜１００％、９２％〜１００％、９３％〜１００％、９４％〜１００％、９５％〜１００％、７０％〜７５％、７０％〜８０％、７０％〜８５％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７５％〜８０％、７５％〜８５％、７５％〜９０％、７５％〜９５％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、８５％〜９５％、または９０％〜９５％の配列同一性を有する。表２を参照されたい。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするＯＲＦを含み、このポリヌクレオチドは、配列番号１１９〜１２０、１２２〜１４０、及び１６０からなる群から選択される配列との７０％〜１００％、７５％〜１００％、８０％〜１００％、８５％〜１００％、７０％〜９５％、８０％〜９５％、７０％〜８５％、７５％〜９０％、８０％〜９５％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または９５％〜１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。表５を参照されたい。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、このヌクレオチド配列は、配列番号２（例えば、図２を参照されたい）の配列と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、このヌクレオチド配列は、配列番号２（例えば、図２を参照されたい）の配列と７０％〜１００％、７５％〜１００％、８０％〜１００％、８１％〜１００％、８２％〜１００％、８３％〜１００％、８４％〜１００％、８５％〜１００％、８６％〜１００％、８７％〜１００％、８８％〜１００％、８９％〜１００％、９０％〜１００％、９１％〜１００％、９２％〜１００％、９３％〜１００％、９４％〜１００％、９５％〜１００％、７０％〜７５％、７０％〜８０％、７０％〜８５％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７５％〜８０％、７５％〜８５％、７５％〜９０％、７５％〜９５％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、８５％〜９５％、または９０％〜９５％同一である。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、約９００〜約１００，０００（例えば、９００〜１，０００、９００〜１，１００、９００〜１，２００、９００〜１，３００、９００〜１，４００、９００〜１，５００、１，０００〜１，１００、１，０００〜１，１００、１，０００〜１，２００、１，０００〜１，３００、１，０００〜１，４００、１，０００〜１，５００、１，１９４〜１，４００、１，１９４〜１，６００、１，１９４〜１，８００、１，１９４〜２，０００、１，１９４〜３，０００、１，１９４〜５，０００、１，１９４〜７，０００、１，１９４〜１０，０００、１，１９４〜２５，０００、１，１９４〜５０，０００、１，１９４〜７０，０００、１，１９４〜１００，０００、１，２８７〜１，４００、１，２８７〜１，６００、１，２８７〜１，８００、１，２８７〜２，０００、１，２８７〜３，０００、１，２８７〜５，０００、１，２８７〜７，０００、１，２８７〜１０，０００、１，２８７〜２５，０００、１，２８７〜５０，０００、１，２８７〜７０，０００、または１，２８７〜１００，０００）ヌクレオチドを含む。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、このヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）の長さは、少なくとも５００ヌクレオチド長（例えば、少なくとも約５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，０５０、１，１００、１，１５０、１，１９４、１，２００、１，２５０、１，２８７、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、１，９５９、２，０００、２，１００、２，２００、２，３００、２，４００、２，５００、２，６００、２，７００、２，８００、２，９００、３，０００、３，１００、３，２００、３，３００、３，４００、３，５００、３，６００、３，７００、３，８００、３，９００、４，０００、４，１００、４，２００、４，３００、４，４００、４，５００、４，６００、４，７００、４，８００、４，９００、５，０００、５，１００、５，２００、５，３００、５，４００、５，５００、５，６００、５，７００、５，８００、５，９００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００以上、または最大１００，０００ヌクレオチド）である。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、非コーディング、例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位である少なくとも１つの核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、５’−ＵＴＲ（例えば、配列番号３３〜５０、７７、及び１１５〜１１７の配列から選択される）及び３’ＵＴＲ（例えば、配列番号５１〜７５、８１〜８２、８８、１０３、１０６〜１１３、１１８、及び１６１〜１７０の配列から選択される）をさらに含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号１１９〜１２０、１２２〜１４０、及び１６０からなる群から選択される配列を含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、５’末端キャップ（例えば、キャップ０、キャップ１、ＡＲＣＡ、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’−フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、２−アジドグアノシン、キャップ２、キャップ４、５’メチルＧキャップ、またはそれらの類似体）と、ポリＡ尾部領域（例えば、約１００ヌクレオチド長）とを含む。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列番号８１、８２、１０３、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む３’ＵＴＲを含む。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、１本鎖または２本鎖であるＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）であるか、またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として機能する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つのＧＬＡポリペプチドをコードし、インビトロ、インビボ、インサイチュまたはエクスビボで翻訳されて、コードされたＧＬＡポリペプチドをもたらすことができる、ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、このポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲ−１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜２３２のうちのいずれか、例えば、化合物１８、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３〜３４２のうちのいずれか、例えば、化合物２３６、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９〜４２８のうちのいずれか、例えば、化合物４２８、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を、例えば約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
【０２１２】
３．シグナル配列
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）はまた、コードされるポリペプチドが治療的に関連性のある部位へ輸送されるのを容易にする追加の特徴をコードする、ヌクレオチド配列も含み得る。タンパク質輸送を補助する１つのかかる特徴は、シグナル配列、または標的化配列である。これらのシグナル配列によってコードされるペプチドは、標的化ペプチド、輸送ペプチド、及びシグナルペプチドを含めて、多様な名称で知られている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、本明細書に記載のＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含む。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」は、それぞれ、任意選択でコード領域またはポリペプチドの５’（またはＮ末端）にそれぞれ組み込まれる、約９〜２００ヌクレオチド（３〜７０アミノ酸）長である、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。これらの配列を追加することで、コードされたポリペプチドが、１つ以上の標的化経路を通して小胞体またはミトコンドリア等の所望の部位へと輸送されるようになる。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質が所望の部位に輸送された後、例えばシグナルペプチダーゼによって、タンパク質から切断される。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、天然シグナルペプチドをコードする５’核酸配列をさらに含む。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、天然シグナルペプチドをコードする核酸配列を欠いている。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、このヌクレオチド配列は、異種シグナルペプチドをコードする５’核酸配列をさらに含む。
【０２１６】
４．融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、目的のポリペプチドをコードする１つを超える核酸配列（例えば、ＯＲＦ）を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントをコードする単一のＯＲＦを含む。しかしながら、いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、１つを超えるＯＲＦ、例えば、ＧＬＡポリペプチド（第１の目的のポリペプチド）、その機能的断片、またはバリアントをコードする第１のＯＲＦと、第２の目的のポリペプチドを発現する第２のＯＲＦとを含み得る。いくつかの実施形態では、２つ以上の目的のポリペプチドが遺伝子融合され得る、すなわち、２つ以上のポリペプチドが同じＯＲＦによってコードされ得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上の目的のポリペプチド間のリンカー（例えば、Ｇ４Ｓペプチドリンカーまたは当該技術分野で既知の別のリンカー）をコードする核酸配列を含み得る。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多くのＯＲＦを含み得、各々が目的のポリペプチドを発現する。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチドをコードする第１の核酸配列（例えば、第１のＯＲＦ）と、第２の目的のポリペプチドをコードする第２の核酸配列（例えば、第２のＯＲＦ）とを含み得る。
【０２１９】
５．ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の配列最適化
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化される。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、配列最適化される、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、別の目的のポリペプチド、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、ｍｉＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、リンカーをコードするヌクレオチド配列、またはそれらの任意の組み合わせ）を含む。配列最適化の一態様
【０２２０】
配列最適化ヌクレオチド配列、例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするコドン最適化ｍＲＮＡ配列は、参照配列（例えば、野生型ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）に対して少なくとも１つの同義ヌクレオ塩基置換を含む配列である。
【０２２１】
配列最適化ヌクレオチド配列は、配列が参照配列とは部分的にまたは完全に異なり得る。例えば、ＴＣＴコドンによって一様にコードされるポリセリンをコードする参照配列を、そのヌクレオ塩基１００％を置換させることによって（各コドンにつき、１位のＴをＡで置き換え、２位のＣをＧで置き換え、３位のＴをＣで置き換える）配列最適化して、ＡＧＣコドンによって一様にコードされようポリセリンをコードする配列を得ることができる。参照ポリセリン核酸配列と配列最適化ポリセリン核酸配列との間の対合的グローバルアラインメントから得られる配列同一性のパーセンテージは、０％であろう。しかしながら、両配列からのタンパク質産物は、１００％同一であろう。
【０２２２】
いくつかの配列最適化（ときにコドン最適化とも称される）方法が、当該技術分野で知られており（及び下記でより詳細に考察され）、１つ以上の所望の結果を達成するのに有用であり得る。これらの結果には、例えば、適切な折り畳みが確実となるような、ある特定の組織標的及び／または宿主生物におけるコドン頻度の一致；ｍＲＮＡ安定性を増加させるもしくは二次構造を低減するようなＧ／Ｃ含量の偏り；遺伝子構築もしくは発現を損ない得る縦列型反復コドンもしくは塩基の連なりの最小化；転写及び翻訳制御領域のカスタマイズ；タンパク質輸送配列の挿入もしくは除去；コードされるタンパク質における翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）の除去／付加；タンパク質ドメインの付加、除去もしくはシャフリング；制限部位の挿入もしくは欠失；リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位の修飾；タンパク質の種々のドメインが適切に折り畳まれるようにする翻訳率の調整；及び／またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造の低減もしくは排除が含まれ得る。配列最適化ツール、アルゴリズム及びサービスは、当該技術分野で知られており、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ  ＣＡ）からのサービス及び／または専有の方法が挙げられる。
【０２２３】
各アミノ酸についてのコドン選択肢が表１に提供される。
【表１−１】
2019516719.tif 000029
【表１−２】
2019516719.tif 000030
【０２２４】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＧＬＡポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）を含み、この配列最適化ヌクレオチド配列によってコードされたＧＬＡポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントは、（例えば、配列最適化されていない参照ヌクレオチド配列によってコードされたＧＬＡポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントと比較して）改善された特性、例えば、インビボ投与後の発現効率に関連する改善された特性を有する。かかる特性には、核酸安定性（例えば、ｍＲＮＡ安定性）の改善、標的組織における翻訳有効性の増加、切り詰められた発現タンパク質の数の低減、発現タンパク質の折り畳みの改善またはその誤った折り畳みの防止、発現産物の毒性の低減、発現産物によって引き起こされる細胞死の低減、タンパク質凝集の増加及び／または減少が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、配列最適化ヌクレオチド配列は、ヒト対象における発現のためにコドン最適化され、当該技術分野における問題のうちの１つ以上を回避する構造的及び／または化学的特徴、例えば、構造的及び機能的統合性を保持しながらの核酸ベースの治療薬の製剤化及び送達の最適化；発現の閾値の克服；発現率の改善；半減期及び／またはタンパク質濃度；タンパク質局在化の最適化；ならびに免疫応答及び／または分解経路等の有害な生体応答の回避に有用である特徴を有する。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、下記を含む方法に従って配列最適化される、ヌクレオチド配列（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、別の目的のポリペプチド、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、マイクロＲＮＡ結合部位をコードするヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）、リンカーをコードする核酸配列、またはそれらの任意の組み合わせ）を含む。
（ｉ）参照ヌクレオチド配列（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）における少なくとも１つのコドンを、ウリジン含量を増加または減少させるように代替のコドンで置換して、ウリジン修飾配列を生成すること、
（ｉｉ）同義コドン組において参照ヌクレオチド配列（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）における少なくとも１つのコドンを、より高いコドン頻度を有する代替のコドンで置換すること、
（ｉｉｉ）参照ヌクレオチド配列（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）における少なくとも１つのコドンを、Ｇ／Ｃ含量を増加させるように代替のコドンで置換すること、あるいは
（ｉｖ）それらの組み合わせ。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦ）は、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも１つの改善された特性を有する。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、配列最適化方法は、多パラメータにより、本明細書に開示される１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれよりも多くの方法及び／または当該技術分野で既知の他の最適化方法を含む。
【０２２９】
本発明のいくつかの実施形態で有益と見され得る特徴は、該ポリヌクレオチドの領域によって、またはその領域内でコードされ得、かかる領域は、ＧＬＡポリペプチドをコードする領域の上流（５’）、その下流（３’）、または領域内にあり得る。これらの領域は、タンパク質コード領域またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列最適化の前及び／または後にポリヌクレオチドに組み込むことができる。かかる特徴の例としては、非翻訳領域（ＵＴＲ）、マイクロＲＮＡ配列、Ｋｏｚａｋ配列、オリゴ（ｄＴ）配列、ポリＡ尾部、及び検出可能なタグが挙げられるが、これらに限定されず、Ｘｂａｌ認識を有し得る複数のクローンニング部位を含み得る。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及び／またはｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、同じまたは異なる配列であり得る、２つ以上の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、同じまたは異なる配列であり得る、２つ以上のｍｉＲＮＡを含む。５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及び／またはｍｉＲＮＡ結合部位の任意の部分（どの部分もなしを含めて）が配列最適化され得、独立して、配列最適化の前及び／または後に１つ以上の異なる構造または化学修飾を含むことができる。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、最適化後、ポリヌクレオチドは、再構成され、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体等であるがこれらに限定されないベクターに形質転換される。例えば、最適化ポリヌクレオチドは、再構成され、化学的に適格なＥ．ｃｏｌｉ、酵母、ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、トウモロコシ、ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ等に形質転換され得、ここで高コピーのプラスミド様または染色体構造が本明細書に記載の方法によって生じる。
【０２３２】
６．ＧＬＡポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、このＯＲＦは、配列最適化されたものである。
【０２３３】
ヒトＧＬＡをコードする例となる配列最適化ヌクレオチド配列は、配列番号３〜２７として記載される（それぞれＧＬＡ−ＣＯ０１、ＧＬＡ−ＣＯ０２、ＧＬＡ−ＣＯ０３、ＧＬＡ−ＣＯ０４、ＧＬＡ−ＣＯ０５、ＧＬＡ−ＣＯ０６、ＧＬＡ−ＣＯ０７、ＧＬＡ−ＣＯ０８、ＧＬＡ−ＣＯ０９、ＧＬＡ−ＣＯ１０、ＧＬＡ−ＣＯ１１、ＧＬＡ−ＣＯ１２、ＧＬＡ−ＣＯ１３、ＧＬＡ−ＣＯ１４、ＧＬＡ−ＣＯ１５、ＧＬＡ−ＣＯ１６、ＧＬＡ−ＣＯ１７、ＧＬＡ−ＣＯ１８、ＧＬＡ−ＣＯ１９、ＧＬＡ−ＣＯ２０、ＧＬＡ−ＣＯ２１、ＧＬＡ−ＣＯ２２、ＧＬＡ−ＣＯ２３、ＧＬＡ−ＣＯ２４、及びＧＬＡ−ＣＯ２５。ヒトＧＬＡをコードするさらなる例となる配列最適化ヌクレオチド配列が表２に示される。いくつかの実施形態では、配列番号３〜２７として記載されるまたは表２に示される配列最適化ＧＬＡ配列、その断片、及びバリアントを使用して、本明細書に開示される方法を実施する。いくつかの実施形態では、表２における配列最適化ＧＬＡ配列、その断片及びバリアントは、図１〜２に開示される野生型配列と組み合わされるか、またはその代替となる。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’から３’末端へと、下記を含む。
（ｉ）本明細書に提供される５’キャップ、例えば、ＣＡＰ１、
（ｉｉ）本明細書に提供される配列、例えば、配列番号３３等の５’ＵＴＲ、
（ｉｉｉ）ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、配列番号３〜２７、７９〜８０、及び１４１〜１５９として記載される、または表２に示されるＧＬＡをコードする配列最適化核酸配列、
（ｉｖ）少なくとも１つの停止コドン；
（ｖ）本明細書に提供される配列、例えば、配列番号８１、８２、または１０３等の３’ＵＴＲ、ならびに
（ｖｉ）上記で提供されるポリＡ尾部。
【表２−１】
2019516719.tif 000031
【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
2019516719.tif 000034
【表２−５】
2019516719.tif 000035
【表２−６】
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【表２−７】
2019516719.tif 000037
【表２−８】
2019516719.tif 000038
【表２−９】
2019516719.tif 000039
【表２−１０】
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【表２−１１】
2019516719.tif 000041
【表２−１２】
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【表２−１３】
2019516719.tif 000043
【表２−１４】
2019516719.tif 000044
【表２−１５】
2019516719.tif 000045
【表２−１６】
2019516719.tif 000046
【表２−１７】
2019516719.tif 000047
【表２−１８】
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【表２−１９】
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【表２−２０】
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【表２−２１】
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【表２−２２】
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【表２−２３】
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【表２−２４】
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【表２−２５】
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【表２−２６】
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【表２−２７】
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【表２−２８】
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【表２−２９】
2019516719.tif 000059
【表２−３０】
2019516719.tif 000060
【表２−３１】
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【表２−３２】
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【表２−３３】
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【表２−３４】
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【表２−３５】
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【表２−３６】
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【０２３５】
本明細書に開示される配列最適化ヌクレオチド配列は、対応する野生型ヌクレオチド酸配列、及び他の既知の配列最適化ヌクレオチド配列とは明確に異なり、例えば、これらの配列最適化核酸は、固有の組成特性を有する。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＧＬＡポリペプチド、その機能的断片、またはバリアントをコードする）におけるウラシルまたはチミンヌクレオ塩基のパーセンテージは、参照の野生型ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミンヌクレオ塩基のパーセンテージに対して変更される（例えば、低減される）。かかる配列は、ウラシル修飾またはチミン修飾配列と称される。ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミン含量のパーセンテージは、ある配列におけるウラシルまたはチミンの数をヌクレオチドの総数で除し、１００を乗じることによって決定することができる。いくつかの実施形態では、配列最適化ヌクレオチド配列は、参照の野生型配列におけるウラシルまたはチミン含量よりも低いウラシルまたはチミン含量を有する。いくつかの実施形態では、本発明の配列最適化ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミン含量は、参照の野生型配列におけるウラシルまたはチミン含量を超え、かつ依然として有益な効果、例えば、参照の野生型配列と比較した場合に増加した発現及び／または低減されたＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答を維持する。
【０２３７】
野生型ＧＬＡのウラシルまたはチミン含量は約２６％である。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列のウラシルまたはチミン含量は、２６％未満である。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列のウラシルまたはチミン含量は、２５％未満、２４％未満、２３％未満、２２％未満、２１％未満、２０％未満、１９％未満、１８％未満、１７％未満、１６％未満、１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、または１１％未満である。いくつかの実施形態では、ウラシルまたはチミン含量は、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、または１２％以上である。本明細書に開示される配列のウラシルまたはチミン含量、すなわち、その総ウラシルまたはチミン含量は、本明細書で％ＵＴＬまたは％ＴＴＬと略称される。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、１２％〜２６％、１３％〜２６％、１３％〜２５％、１４％〜２５％、１４％〜２４％、１５％〜２４％、１５％〜２３％、１６％〜２３％、１６％〜２２％、１６％〜２１％、１６％〜２０％、１６％〜１９％、１６％〜１８％、または１６％〜１７％である。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、１５％〜１９％、１６％〜１９％、または１６％〜１８％である。
【０２４０】
特定の実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列のウラシルまたはチミン含量（％ＵＴＬまたは％ＴＴＬ）は、約１６％〜約１８％である。
【０２４１】
本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列はまた、対応する野生型核酸配列（％ＵＷＴまたは％ＴＷＴ）におけるウラシルもしくはチミン含量と比べたそのウラシルもしくはチミン含量に従って、または野生型タンパク質配列（％ＵＴＭまたは％ＴＴＭ）をコードする核酸の理論上最小ウラシルもしくはチミン含量と比べたそのウラシルもしくはチミン含量に従って、説明することもできる。
【０２４２】
「野生型核酸配列におけるウラシルまたはチミン含量と比べたウラシルまたはチミン含量」という語句は、配列最適化核酸におけるウラシルまたはチミンの数を対応する野生型核酸配列におけるウラシルまたはチミンの総数で除し、１００を乗じることによって決定される、パラメータを指す。このパラメータは、本明細書で％ＵＷＴまたは％ＴＷＴと略称される。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、５０％を上回る、５５％を上回る、６０％を上回る、６５％を上回る、７０％を上回る、７５％を上回る、８０％を上回る、８５％を上回る、９０％を上回る、または９５％を上回る。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、５０％〜８０％、５１％〜７９％、５２％〜７８％、５３％〜７７％、５４％〜７６％、５５％〜７５％、５６％〜７４％、５７％〜７３％、５８％〜７２％、５９％〜７１％、６０％〜７０％、６１％〜７０％、または６２％〜７０％である。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、６０％〜７２％、６０．２％〜７１．８％、６０．４％〜７１．６％、６０．６％〜７１．４％、６０．８％〜７１．２％、６１％〜７１％、６１．２％〜７０．８％、６１．４％〜７０．６％、６１．６％〜７０．４％、６１．８％〜７０．２％、または６２％〜７０％である。
【０２４６】
特定の実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾またはチミン修飾配列の％ＵＷＴまたは％ＴＷＴは、約６２％〜約７０％、例えば、６２．７３％〜６９．７０％である。
【０２４７】
ウラシルまたはチミン理論上最小量と比べたウラシル含量またはチミン含量とは、配列最適化ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミンの数を、仮想的配列におけるコドン全てが可能な限り低いウラシルまたはチミン含量を有する同義コドンで置き換えられた、仮想的ヌクレオチド配列におけるウラシルまたはチミンの総数で除し、１００を乗じることによって決定される、パラメータを指す。このパラメータは、本明細書で％ＵＴＭまたは％ＴＴＭと略称される。
【０２４８】
ＤＮＡの場合、チミンがウラシルの代わりに存在することが認識されるため、Ｕが現れる位置をＴで置換することになる。故に、例えば、ＲＮＡに関する％ＵＴＭ、％ＵＷＴ、または％ＵＴＬに関連する全ての開示は、ＤＮＡに関する％ＴＴＭ、％ＴＷＴ、または％ＴＴＬに同等に適用可能である。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列の％ＵＴＭは、３００％を下回る、２９５％を下回る、２９０％を下回る、２８５％を下回る、２８０％を下回る、２７５％を下回る、２７０％を下回る、２６５％を下回る、２６０％を下回る、２５５％を下回る、２５０％を下回る、２４５％を下回る、２４０％を下回る、２３５％を下回る、２３０％を下回る、２２５％を下回る、２２０％を下回る、２１５％を下回る、２００％を下回る、１９５％を下回る、１９０％を下回る、１８５％を下回る、１８０％を下回る、１７５％を下回る、１７０％を下回る、１６５％を下回る、１６０％を下回る、１５５％を下回る、１５４％を下回る、１５３％を下回る、１５２％を下回る、１５１％を下回る、１５０％を下回る、１４９％を下回る、１４８％を下回る、１４７％を下回る、１４６％を下回る、１４５％を下回る、１４４％を下回る、１４３％を下回る、１４２％を下回る、１４１％を下回る、１４０％を下回る、１３９％を下回る、１３８％を下回る、１３７％を下回る、１３６％を下回る、１３５％を下回る、１３４％を下回る、１３３％を下回る、１３２％を下回る、１３１％を下回る、１３０％を下回る、１２９％を下回る、１２８％を下回る、１２７％を下回る、１２６％を下回る、１２５％を下回る、１２４％を下回る、１２３％を下回る、１２２％を下回る、１２１％を下回る、または１２０％を下回る。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列％ＵＴＭは、１００％を上回る、１０１％を上回る、１０２％を上回る、１０３％を上回る、１０４％を上回る、１０５％を上回る、１０６％を上回る、１０７％を上回る、１０８％を上回る、１０９％を上回る、１１０％を上回る、１１１％を上回る、１１２％を上回る、１１３％を上回る、１１４％を上回る、１１５％を上回る、１１６％を上回る、１１７％を上回る、１１８％を上回る、１１９％を上回る、１２０％を上回る、１２１％を上回る、１２２％を上回る、１２３％を上回る、１２４％を上回る、１２５％を上回る、または１２６％を上回る、１２７％を上回る、１２８％を上回る、１２９％を上回る、または１３０％を上回る、１３５％を上回る、１３０％を上回る、１３１％を上回る、１３２％を上回る、１３３％を上回る、１３４％を上回る、１３５％を上回る、１３６％を上回る、１３７％を上回る、１３８％を上回る、１３９％を上回る、または１４０％を上回る、１４１％を上回る、１４２％を上回る、１４３％を上回る、１４４％を上回る、１４５％を上回る、１４６％を上回る、１４７％を上回る、１４８％を上回る、１４９％を上回る、または１５０％を上回る。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列の％ＵＴＭは、１３１％〜１３２％、１３０％〜１３３％、１２９％〜１３４％、１２８％〜１３５％、１２７％〜１３６％、１２６％〜１３７％、１２５％〜１３８％、１２４％〜１３９％、１２３％〜１４０％、１２２％〜１４１％、１２１％〜１４２％、１２０％〜１４３％、１１９％〜１４４％、１１８％〜１４５％、または１１７％〜１４６％である。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列の％ＵＴＭは、約１２３％〜約１３８％、例えば、１２３％〜１３８％である。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、対応する野生型核酸配列に対して、低減された数の連続ウラシルを有する。例えば、２つの連続ロイシンは、４つのウラシルクラスタを含む、配列ＣＵＵＵＵＧによってコードされ得る。かかる部分配列は、例えばＣＵＧＣＵＣで置換することができ、これによりウラシルクラスタを除去する。
【０２５４】
フェニルアラニンは、ＵＵＣまたはＵＵＵによってコードされ得る。故に、ＵＵＵによってコードされるフェニルアラニンがＵＵＣにより置き換えられたとしても、同義コドンは依然としてウラシル対（ＵＵ）を含む。したがって、ある配列におけるフェニルアラニンの数は、コードされるポリペプチドにおけるフェニルアラニンの数を変化させることなしには除去され得ないウラシル対（ＵＵ）の最小数を確立する。例えば、ポリペプチド、例えば、野生型ＧＬＡが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個のフェニルアラニンを有する場合、ポリペプチド、例えば、野生型ＧＬＡをコードするウラシル修飾配列が含むことができるウラシル対（ＵＵ）の絶対最小数は、それぞれ１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１７個である。
【０２５５】
野生型ＧＬＡは、５個のウラシル対（ＵＵ）、及び１２個のウラシル三つ組（ＵＵＵ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列に対して、低減された数のウラシル三つ組（ＵＵＵ）を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１個のウラシル三つ組（ＵＵＵ）を含むか、それを全く含まない。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列におけるウラシル対（ＵＵ）に対して、低減された数のウラシル対（ＵＵ）を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列における可能な限り最小数のウラシル対（ＵＵ）、例えば、野生型ＧＬＡの場合は１１個のウラシル対に対応する、ウラシル対（ＵＵ）を有する。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、野生型核酸配列におけるウラシル対（ＵＵ）の数よりも少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個少ないウラシル対（ＵＵ）を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、１１〜２７個のウラシル対（ＵＵ）を有する。
【０２５８】
「野生型核酸配列におけるウラシル対（ＵＵ）と比べたウラシル対（ＵＵ）」という語句は、配列最適化ヌクレオチド配列におけるウラシル対（ＵＵ）の数を対応する野生型ヌクレオチド配列におけるウラシル対（ＵＵ）の総数で除し、１００を乗じることによって決定される、パラメータを指す。このパラメータは、本明細書で％ＵＵｗｔと略称される。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、または２５％未満の％ＵＵｗｔを有する。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、％ＵＵｗｔ１６％〜５８％を有する。特定の実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、％ＵＵｗｔ２１％〜５３％を有する。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列におけるヌクレオ塩基（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％は、修飾されたヌクレオ塩基である。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列におけるウラシルの少なくとも９５％は、５−メトキシウラシルである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを含むウラシル修飾配列は、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲ−１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、ウラシル修飾配列を含むポリヌクレオチドは、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜２３２のうちのいずれか、例えば、化合物１８、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３〜３４２のうちのいずれか、例えば、化合物２３６、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９〜４２８のうちのいずれか、例えば、化合物４２８、またはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を、例えば約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、％ＧＴＭＸと略称される、「ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最大グアニン含量に対する、ＧＬＡをコードする配列最適化ＯＲＦのグアニン含量」は、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。いくつかの実施形態では、％ＧＴＭＸは、約７０％〜約８５％、約７０％〜約８０％、約７１％〜約８０％、または約７２％〜約８０％である。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、％ＣＴＭＸと略称される、「ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の理論上最大シトシン含量に対するＯＲＦのシトシン含量」は、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。いくつかの実施形態では、％ＣＴＭＸは、約６０％〜約８０％、約６５％〜約８０％、約７０％〜約８０％、または約７０％〜約７６％である。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、％Ｇ／ＣＴＭＸと略称される、「ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列における理論上最大グアニン及びシトシン（Ｇ／Ｃ）含量に対するＯＲＦのＧ／Ｃ含量（Ｇ／Ｃ）」は、少なくとも約７３％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。いくつかの実施形態では、％Ｇ／ＣＴＭＸは、約８０％〜約１００％、約８５％〜約９９％、約９０％〜約９７％、または約９１％〜約９５％である。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、％Ｇ／ＣＷＴと略称される、「対応する野生型ＯＲＦにおけるＧ／Ｃ含量と比べたＯＲＦにおけるＧ／Ｃ含量」は、少なくとも１０２％、少なくとも１０３％、少なくとも１０４％、少なくとも１０５％、少なくとも１０６％、少なくとも１０７％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１１５％、少なくとも約１２０％、または少なくとも約１２５％である。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、ＯＲＦにおける３番目のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含量は、対応する野生型ＯＲＦにおける３番目のコドン位置における平均Ｇ／Ｃ含量よりも少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、または少なくとも４０％高い。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、このＯＲＦは、配列最適化されたものであり、％ＵＴＬ、％ＵＷＴ、％ＵＴＭ、％ＧＴＬ、％ＧＷＴ、％ＧＴＭＸ、％ＣＴＬ、％ＣＷＴ、％ＣＴＭＸ、％Ｇ／ＣＴＬ、％Ｇ／ＣＷＴ、または％Ｇ／ＣＴＭＸの各々は、単独でまたはそれらの組み合わせで、（ｉ）パラメータの最大値（ＭＡＸ）プラス標準偏差（ＳＴＤ  ＤＥＶ）約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０に対応する最大値と、（ｉｉ）パラメータの最小値（ＭＩＮ）マイナス標準偏差（ＳＴＤ  ＤＥＶ）０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０に対応する最小値との間の範囲である。
【０２６８】
７．配列最適化のための方法
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ（例えば、ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはバリアント）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、配列最適化される。配列最適化ヌクレオチド配列（ヌクレオチド配列は、本明細書で「核酸」とも称される）は、参照配列（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードする野生型配列）に対して、少なくとも１つのコドン修飾を含む。故に、配列最適化核酸において、少なくとも１つのコドンが、参照配列（例えば、野生型配列）における対応するコドンとは異なる。
【０２６９】
一般に、配列最適化核酸は、少なくとも、参照配列におけるコドンを同義コドン（すなわち、同じアミノ酸をコードするコドン）で置換することを含む工程によって生成される。かかる置換は、例えば、コドン置換マップ（すなわち、コドン最適化配列における各アミノ酸をコードするコドンを提供する表）を適用することによって、または規則（例えば、グリシンが中性アミノ酸の隣にある場合、グリシンは、ある特定のコドンによってコードされるが、それが極性アミノ酸の隣にある場合、それは別のコドンによってコードされる）を適用することによって、達成される。コドン置換（すなわち、「コドン最適化」）に加えて、本明細書に開示される配列最適化方法は、有害なモチーフの除去（不安定化モチーフの置換）等、厳密にはコドン最適化を対象としない追加の最適化工程を含む。これらの配列最適化核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含む組成物及び製剤が、機能的に活性なＧＬＡのインビボ発現を促進するために、必要のある対象に投与され得る。
【０２７０】
細胞培養物中での大分子の組換え発現は、多数の制限（例えば、不十分なタンパク質発現レベル、切詰め発現産物をもたらす停滞した翻訳、タンパク質の誤った折り畳み等）を伴う困難なタスクであり得る。これらの制限は、機能的に活性なＧＬＡをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）またはそれを含む組成物もしくは製剤を、ファブリー病を患う患者に投与して、ファブリー病を治療するＧＬＡポリペプチドの合成及び送達が内因性で起こるようにすることによって、低減または回避することができる。
【０２７１】
インビトロ発現系（例えば、細胞培養）からインビボ発現への変更は、治療剤をコードする核酸配列の再設計を必要とする。コードされるアミノ酸配列を必ずしも改変することなく異なるコドンを選択することによって、天然に生じる遺伝子配列を再設計することにより、しばしばタンパク質発現レベルの劇的な増加がもたらされ得る（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２２，  ３４６−５３）。コドン・アダプテーション指標（ｃｏｄｏｎ  ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ、ＣＡＩ）、ｍＲＮＡ二次構造、シス−調節配列、ＧＣ含量等の可変要素及びその他多くの同様の可変要素が、タンパク質発現レベルといくらか相関することが示されている（Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，”Ｊｏｕｒｎａｌ／ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ７，  ２８５）。しかしながら、遺伝子コードの縮重に起因して、全てが同じ治療剤をコードし得る、多数の異なる核酸配列が存在する。各アミノ酸は、最大６つの同義コドンによってコードされるため、これらのコドン間での選択は、遺伝子発現に影響を及ぼす。さらに、コドン使用頻度（すなわち、異なる生物がポリペプチド配列の発現のためにコドンを使用する頻度）は、生物間で異なる（例えば、ヒトまたはヒト化治療抗体の組換え生産は、ハムスター細胞培養物中で行われることが多い）。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、コドンマップを適用することによって配列最適化され得る。当業者であれば、下記で開示されるコドンマップのＴ塩基がＤＮＡにおいて存在する一方で、対応するＲＮＡにおいてはＴ塩基はＵ塩基で置き換えられることを理解する。例えば、ＤＮＡ形態での本明細書に開示される配列最適化核酸、例えば、ベクターまたはインビトロ翻訳（ＩＶＴ）テンプレートは、対応する転写ｍＲＮＡにおいてはそのＴ塩基がＵ塩基として転写される。この点で、配列最適化ＤＮＡ配列（Ｔを含む）及びそれらの対応するＲＮＡ配列（Ｕを含む）の両方が、本発明の配列最適化核酸と見なされる。当業者であれば、１つ以上の塩基を非天然塩基で置き換えることによって同等のコドンマップが生成され得ることも理解する。故に、例えば、ＴＴＣコドン（ＤＮＡマップ）は、ＵＵＣコドン（ＲＮＡマップ）に対応し、これが今度は、ΨΨＣコドン（Ｕがシュードウリジンで置き換えられたＲＮＡマップ）に対応し得る。
【０２７３】
一実施形態では、ＧＬＡをコードする参照配列は、ある特定のアミノ酸をコードする全てのコドンを、コドンマップで提供される代替のコドンのうちの１つのみで置き換えることによって最適化され得る。例えば、最適化配列における全てのバリンは、ＧＴＧまたはＧＴＣまたはＧＴＴによってコードされる。
【０２７４】
本発明の配列最適化ポリヌクレオチドは、１つ以上のコドン最適化方法、またはそれらの組み合わせを用いることによって生成され得る。核酸配列を配列最適化するのに用いられ得る配列最適化方法が、本明細書で詳述される。この方法の列挙は、包括的でも限定的でもない。
【０２７５】
例えば、参照核酸配列の一部の領域に対する高Ｇ／Ｃ含量配列最適化または他の領域に対するウリジン含量配列最適化、ならびに配列全体にわたる二次構造を最小化するためまたは有害なモチーフを排除するための標的化されたヌクレオチド変異等の、下記で考察される配列最適化方法の一つひとつに関して記載される設計の原則及び規則は、多くの異なる方式で組み合わされ得ることが理解される。
【０２７６】
配列最適化方法の潜在的な組み合わせの選定は、例えば、合成ポリヌクレオチドを生産するために使用される特定の化学反応に依存し得る。かかる選定はまた、配列最適化核酸によってコードされるタンパク質、例えば、全配列、機能的断片、またはＧＬＡを含む融合タンパク質等にも依存し得る。いくつかの実施形態では、かかる選定は、配列最適化核酸（例えば、治療的合成ｍＲＮＡ）によって標的とされる特定の組織または細胞に依存し得る。
【０２７７】
配列最適化方法、または最適化方法の適用及び分析から導出された設計規則を組み合わせる機構は、単純な場合も、複雑な場合もある。例えば、組み合わせは下記であり得る。
（ｉ）逐次的：各配列最適化方法または設計規則の各組が、全体的配列のうちの異なる部分配列に適用される、例えば、コドン１〜３０位においてウリジンを低減し、次いでその配列の残りの部分について高頻度コドンを選択する、
（ｉｉ）階層的：いくつかの配列最適化方法または設計規則の組が、階層的、確定的様式で組み合わされる。例えば、最もＧＣリッチなコドンを使用して、それらのコドンのうち最も頻繁なものを選定することによって連結（共通である）を破断する。
（ｉｉｉ）多因子的／多パラメータ的：機械学習または他のモデリング手法を用いて、複数の重複する及びことによると矛盾する要件を最もよく満たす単一の配列を設計する。このアプローチは、いくつかの数学的手法、例えば、遺伝子アルゴリズムを適用するコンピュータの使用を必要とする。
【０２７８】
最終的には、これらのアプローチの一つひとつが特定の規則の組をもたらし得、これは多くの場合、単一のコドン表、すなわち、標的タンパク質（すなわち、ＧＬＡ）における各アミノ酸に対して選別され、特定の規則または規則の組が各アミノ酸位に対する特定のコドンの選択方法を示す、コドン一覧に要約され得る。
【０２７９】
ａ．ウリジン含量最適化
核酸配列における局所的に高濃度のウリジンの存在は、とりわけ、修飾されたウリジン類似体が合成ｍＲＮＡの生産において使用される場合、例えば、緩徐なまたは未成熟で終結した翻訳等、翻訳に有害な影響を有し得る。さらに、高ウリジン含量はまた、ＴＬＲ活性化に起因して合成ｍＲＮＡのインビボ半減期を低減し得る。
【０２８０】
したがって、核酸配列は、少なくとも１つのウリジン含量最適化工程を含む方法を用いて配列最適化され得る。かかる工程は、例えば、参照核酸における少なくとも１つのコドンを代替のコドンで置換して、ウリジン修飾配列を生成することを含み、このウリジン修飾配列は、以下の特性のうちの少なくとも１つを有する。
（ｉ）全体的なウリジン含量の増加または減少
（ｉｉ）局所的なウリジン含量の増加または減少（すなわち、ウリジン含量の変化は、特定の部分配列に限定される）、
（ｉｉｉ）全体的なウリジン含量を変化させることのないウリジン分布の変化、
（ｉｖ）ウリジンクラスタリングの変化（例えば、クラスターの数、クラスターの箇所、またはクラスター間の距離）、あるいは
（ｖ）それらの組み合わせ。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、配列最適化プロセスは、全体的なウリジン含量を最適化すること、すなわち、配列最適化核酸におけるウリジンヌクレオ塩基のパーセンテージを、参照核酸配列におけるウリジンヌクレオ塩基のパーセンテージに対して最適化することを含む。例えば、参照配列においてヌクレオ塩基の３０％がウリジンであり得、配列最適化核酸においてヌクレオ塩基の１０％がウリジンであり得る。
【０２８２】
他の実施形態では、配列最適化プロセスは、参照核酸配列の特定の領域における局所的ウリジン含量を低減する、すなわち、配列最適化核酸の部分配列におけるウリジンヌクレオ塩基のパーセンテージを、参照核酸配列の対応する部分配列におけるウリジンヌクレオ塩基のパーセンテージに対して低減することを含む。例えば、参照核酸配列が、局所的ウリジン含量３０％である５’末端領域（例えば、３０コドン）を有し得、配列最適化核酸においては同じ領域におけるウリジン含量が１０％に低減され得る。
【０２８３】
具体的な実施形態では、コドンが、参照核酸配列において、例えば、タンパク質翻訳に有害な影響を有し得るウリジンクラスターの数、サイズ、箇所、または分布を低減または変更するために置き換えられ得る。原則として、参照核酸配列のウリジン含量を低減することが望ましいが、ある特定の実施形態では、参照核酸配列のいくつかの部分配列のウリジン含量、特に局所的ウリジン含量は、増加され得る。
【０２８４】
翻訳に対する悪影響を回避するためのウリジン含量の低減は、他の設計目的を達成するために本明細書に開示される他の最適化方法と組み合わせて行うことができる。例えば、ほとんどのアミノ酸に対して最もまれなコドンの使用は、少数の例外を除いて、Ｕ含量を低減するため、ウリジン含量最適化を傾斜設計と組み合わせることができる。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列と比較したときにより低いＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）応答を誘発するように設計される。いくつかのＴＬＲは、核酸を認識してそれに応答する。ウイルスの頻繁な構成要素である、２本鎖（ｄｓ）ＲＮＡが、ＴＬＲ３を活性化することが示されている。Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ，  ４１３：７３２−７３８及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，  １０：１３６６−１３７３を参照されたい。１本鎖（ｓｓ）ＲＮＡはＴＬＲ７を活性化する。Ｄｉｅｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３  ：１５２９−１５３１を参照されたい。ＲＮＡオリゴヌクレオチド、例えば、ホスホロチオアートヌクレオチド間連結を有するＲＮＡは、ヒトＴＬＲ８のリガンドである。Ｈｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０３：１５２６−１５２９を参照されたい。細菌及びウイルスＤＮＡに特徴的な、非メチル化ＣｐＧモチーフを含有するＤＮＡは、ＴＬＲ９を活性化する。Ｈｅｍｍｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ，  ４０８：７４０−７４５を参照されたい。
【０２８６】
本明細書で使用されるとき、「ＴＬＲ応答」という用語は、ＴＬＲ７受容体による１本鎖ＲＮＡの認識として定義され、いくつかの実施形態では、この受容体による１本鎖ＲＮＡの認識によって引き起こされるＲＮＡの分解及び／または生理的応答を包含する。ＲＮＡのＴＬＲ７への結合の決定及び定量方法は、当該技術分野で知られている。同様に、ＲＮＡがＴＬＲ７媒介性生理学的応答（例えば、サイトカイン分泌）を誘発したかどうかの決定方法は、当該技術分野で周知のことである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ応答は、ＴＬＲ７の代わりにＴＬＲ３、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９によって媒介され得る。
【０２８７】
ＴＬＲ７媒介性応答の抑制は、ヌクレオシド修飾を介して達成することができる。ＲＮＡは、自然界で１００を超える様々なヌクレオシド修飾を経る（ｍｏｄｓ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕにて利用可能なＲＮＡ修飾データベースを参照されたい）。例えば、ヒトｒＲＮＡは、細菌ｒＲＮＡよりも１０倍多いシュードウリジン（Ψ）及び２５倍多い２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシドを有する。細菌ｍＲＮＡはヌクレオシド修飾を含まない一方で、哺乳類ｍＲＮＡは、Ｎ７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）に加えて、５−メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、イノシン及び多くの２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシド等の修飾されたヌクレオシドを有する。
【０２８８】
ＲＮＡを定義する２つの特徴である、ウラシル及びリボースは両方ともＴＬＲ７刺激に必要かつ十分であり、短い１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）は、近接したいくつかのウリジンを含有する限り、配列依存的様態でＴＬＲ７アゴニストとして作用する。Ｄｉｅｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：３２５６−３２６７を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、本明細書に開示される最適化方法のうちの１つ以上は、ＴＬＲ７媒介性応答を低減または抑制するために、ウリジン含量（局所的に及び／または局所的に）を低減すること、及び／またはウリジンクラスタリングを低減もしくは調節することを含む。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列によって引き起こされるＴＬＲ応答（例えば、ＴＬＲ７によって媒介される応答）は、参照核酸配列によって引き起こされるＴＬＲ応答よりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％低い。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、参照核酸配列によって引き起こされるＴＬＲ応答は、ウリジン修飾配列によって引き起こされるＴＬＲ応答よりも少なくとも約１倍、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、または少なくとも約１０倍高い。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列のウリジン含量（全体的ウリジン含量平均）（絶対または相対）は、参照核酸配列のウリジン含量（絶対または相対）よりも高い。したがって、いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％多くのウリジンを含む。
【０２９２】
他の実施形態では、ウリジン修飾配列のウリジン含量（平均全体的なウリジン含量）（絶対または相対）は、参照核酸配列のウリジン含量（絶対または相対）よりも低い。したがって、いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列よりも少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％低いウリジンを含む。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列のウリジン含量（平均全体的なウリジン含量）（絶対または相対）は、ウリジン修飾配列における総ヌクレオ塩基の５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満である。いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列のウリジン含量は、約１０％〜約２０％である。いくつかの特定の実施形態では、ウリジン修飾配列のウリジン含量は、約１２％〜約１６％である。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、参照核酸配列のウリジン含量は、スライディング・ウィンドウを使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、スライディング・ウィンドウの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオ塩基である。いくつかの実施形態では、スライディング・ウィンドウは、４０ヌクレオ塩基長を上回る。いくつかの実施形態では、スライディング・ウィンドウは、２０ヌクレオ塩基長である。スライディング・ウィンドウで測定されるウリジン含量に基づいて、参照核酸配列及び配列最適化核酸の全長にわたるウリジン含量を表すヒストグラムを生成することが可能である。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、ヒストグラムにおけるある特定のパーセンテージ値を上回るまたは下回るピークを低減または排除するように修飾され得る。いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、スライディング・ウィンドウ表示における６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、または３０％ウリジンを上回るピークを排除するように修飾され得る。別の実施形態では、参照核酸配列は、２０ヌクレオ塩基スライディング・ウィンドウを使用して測定した場合に、配列最適化核酸において３０％ウリジンを上回るピークが何もないように、修飾され得る。いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、２０ヌクレオ塩基スライディング・ウィンドウを使用して測定した場合に、ある特定の閾値を上回るまたは下回るピークが、配列最適化核酸配列において既定の数よりも多いまたはそれよりも少ないことのないように、修飾され得る。例えば、いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、配列最適化核酸において１０％、１５％、２０％、２５％または３０％ウリジンを上回るピークが何もないように、またはピークが１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個を超えないように、修飾され得る。別の実施形態では、配列最適化核酸は、ウリジン含量３０％以上のピーク０個の〜ピーク２個を含む。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、連続ウリジンの出現例を低減するように配列最適化され得る。例えば、２つの連続ロイシンが、４つのウリジンクラスターを含む、配列ＣＵＵＵＵＧによってコードされ得る。かかる部分配列は、ＣＵＧＣＵＣで置換され得、これはウリジンクラスターを効果的に除去する。したがって、参照核酸配列は、ウリジン対（ＵＵ）、ウリジン三つ組（ＵＵＵ）またはウリジン四つ組（ＵＵＵＵ）を低減または排除することによって配列最適化され得る。Ｕの高次の組み合わせは、低次の組み合わせの組み合わせとは見なされない。故に、例えば、ＵＵＵＵは、２つの連続Ｕ対ではなく四つ組と厳密に見なされ、またはＵＵＵＵＵＵは、３つの連続Ｕ対、または２つの連続Ｕ三つ組ではなく六つ組と見なされる。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、全てのウリジン対（ＵＵ）及び／またはウリジン三つ組（ＵＵＵ）及び／またはウリジン四つ組（ＵＵＵＵ）が、参照核酸配列から除去され得る。他の実施形態では、ウリジン対（ＵＵ）及び／またはウリジン三つ組（ＵＵＵ）及び／またはウリジン四つ組（ＵＵＵＵ）は、配列最適化核酸において、ある特定の閾値未満、例えば、出現例１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以下に低減され得る。特定の実施形態では、配列最適化核酸は、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個未満のウリジン対を含む。別の特定の実施形態では、配列最適化核酸は、ウリジン対及び／または三つ組を含まない。
【０２９８】
フェニルアラニンコドン、すなわち、ＵＵＣまたはＵＵＵは、ウリジン対または三つ組を含み、したがって、ウリジン含量を低減する配列最適化は、多くてもフェニルアラニンＵ三つ組をフェニルアラニンＵ対に低減するのみである。いくつかの実施形態では、ウリジン対（ＵＵ）及び／またはウリジン三つ組（ＵＵＵ）出現例は、非フェニルアラニンＵ対または三つ組のみを指す。したがって、いくつかの実施形態では、非フェニルアラニンウリジン対（ＵＵ）及び／またはウリジン三つ組（ＵＵＵ）は、配列最適化核酸において、ある特定の閾値未満、例えば、出現例１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個以下に低減され得る。特定の実施形態では、配列最適化核酸は、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個未満の非フェニルアラニンウリジン対及び／または三つ組を含む。別の特定の実施形態では、配列最適化核酸は、非フェニルアラニンウリジン対及び／または三つ組を含まない。
【０２９９】
いくつかの実施形態では、配列最適化核酸におけるウリジンの組み合わせ（例えば、対、三つ組、四つ組）の低減は、参照核酸配列に存在するウリジンの組み合わせに対するパーセンテージ低減として表され得る。
【０３００】
いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在するウリジン対の総数の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％を含有し得る。いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在するウリジン三つ組の総数の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％を含有し得る。いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在するウリジン四つ組の総数の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％を含有し得る。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在する非フェニルアラニンウリジン対の総数の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％を含有し得る。いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、参照核酸配列に存在する非フェニルアラニンウリジン三つ組の総数の約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または６５％を含有し得る。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、配列最適化配列におけるウリジン含量は、その配列における理論上最小ウリジン含量に対して表され得る。「理論上最小ウリジン含量」という用語は、核酸配列における全てのコドンが、最も低いウリジン含量を有する同義コドンで置き換えられた後の、その配列の長さのパーセンテージとしてのその配列のウリジン含量として定義される。いくつかの実施形態では、配列最適化核酸のウリジン含量は、参照配列（例えば、野生型配列）の理論上最小ウリジン含量と同一である。いくつかの態様では、配列最適化核酸のウリジン含量は、参照配列（例えば、野生型配列）の理論上最小ウリジン含量の約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１１５％、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、約１４０％、約１４５％、約１５０％、約１５５％、約１６０％、約１６５％、約１７０％、約１７５％、約１８０％、約１８５％、約１９０％、約１９５％または約２００％である。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、配列最適化核酸のウリジン含量は、参照配列（例えば、野生型配列）の理論上最小ウリジン含量と同一である。
【０３０４】
参照核酸配列（例えば、野生型配列）は、ウリジンクラスターを含み得、これは、それらの数、サイズ、箇所、分布またはそれらの組み合わせに起因して、翻訳に悪影響を有する。本明細書で使用されるとき、「ウリジンクラスター」という用語は、ある特定の閾値を上回るウリジン含量（通常はパーセンテージとして説明される）を含有する、参照核酸配列または配列最適化核酸配列における部分配列を指す。故に、ある特定の実施形態では、ｉｆ部分配列は、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％または６５％を超えるウリジン含量を含み、かかる部分配列はウリジンクラスターと見なされる。
【０３０５】
ウリジンクラスターの悪影響は、例えば、ＴＬＲ７応答の誘発であり得る。故に、本明細書に開示される核酸配列最適化方法のいくつかの実施態様では、クラスターの数、クラスターのサイズ、クラスターの箇所（例えば、核酸配列の５’及び／または３’末端に近い）、クラスター間の核酸配列、またはウリジンクラスターの分布（例えば、核酸配列にわたるクラスターのある特定のパターン、発現産物における二次構造要素に対するクラスターの分布、またはｍＲＮＡの二次構造要素に対するクラスターの分布）を低減することが望ましい。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、少なくとも１つのウリジンクラスターを含み、該ウリジンクラスターは、該部分配列における総ウリジンヌクレオ塩基のパーセンテージが既定の閾値を上回る、参照核酸配列の部分配列である。いくつかの実施形態では、部分配列の長さは、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、または少なくとも約１００ヌクレオ塩基である。いくつかの実施形態では、部分配列は、１００ヌクレオ塩基よりも長い。いくつかの実施形態では、閾値は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％ウリジン含量である。いくつかの実施形態では、閾値は、２５％を上回る。
【０３０７】
例えば、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｓ及びＲを含むアミノ酸配列は、核酸配列ＧＣＵ、ＧＡＵ、ＧＧＵ、ＡＧＵ、ＣＧＵによってコードされ得る。かかる配列は、いずれのウリジン対、三つ組、または四つ組も含まないが、ヌクレオ塩基の３分の１がウリジンである。かかるウリジンクラスターは、代替のコドンを使用することによって、例えば、ウリジンを含まない、ＧＣＣ、ＧＡＣ、ＧＧＣ、ＡＧＣ、及びＣＧＣを使用することによって、除去され得る。
【０３０８】
他の実施形態では、参照核酸配列は、少なくとも１つのウリジンクラスターを含み、該ウリジンクラスターは、スライディング・ウィンドウを使用して測定したときに該部分配列のウリジンヌクレオ塩基のパーセンテージが既定の閾値を上回る、参照核酸配列の部分配列である。いくつかの実施形態では、スライディング・ウィンドウの長さは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオ塩基である。いくつかの実施形態では、スライディング・ウィンドウは、４０ヌクレオ塩基長を上回る。いくつかの実施形態では、閾値は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％または２５％ウリジン含量である。いくつかの実施形態では、閾値は、２５％を上回る。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、参照核酸配列は、少なくとも２つのウリジンクラスターを含む。いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列よりも少ないウリジンリッチクラスターを含む。いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列よりも多くのウリジンリッチクラスターを含む。いくつかの実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列における対応するウリジンリッチクラスターよりも長さが短いウリジンリッチクラスターを含有する。他の実施形態では、ウリジン修飾配列は、参照核酸配列における対応するウリジンリッチクラスターよりも長さが長いウリジンリッチクラスターを含有する。Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２３：１６５−１７５、Ｋｏｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：１５４−１５７、またはＳａｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｜  ＡＯＰ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  １９  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１４ｍ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｄ４２７８を参照されたく、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０３１０】
ｂ．グアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量
参照核酸配列は、参照核酸配列のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対または相対）を変化させることを含む方法を用いて配列最適化され得る。かかる最適化は、参照核酸配列の全体的なＧ／Ｃ含量（絶対または相対）を変化させる（例えば、増加させるまたは減少させる）こと、参照核酸配列におけるＧ／Ｃ含量の局所的な変更を導入すること（例えば、参照核酸配列における選択される領域または部分配列のＧ／Ｃを増加または減少させる）、参照核酸配列におけるＧ／Ｃクラスターの頻度、サイズ、及び分布を変化させること、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量（絶対または相対）と比べたＧ／Ｃ含量（絶対または相対）の全体的な増加を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）の全体的な増加は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量（絶対または相対）と比べて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％である。
【０３１２】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量と比べたＧ／Ｃ含量（絶対または相対）の全体的な減少を含む。いくつかの実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）の全体的な減少は、参照核酸配列のＧ／Ｃ含量（絶対または相対）と比べて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％である。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列における対応する部分配列のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対または相対）と比べた、部分配列（すなわち、Ｇ／Ｃ修飾部分配列）におけるグＧ／Ｃ含量（絶対または相対）の局所的増加である。いくつかの実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）の局所的増加は、参照核酸配列における対応する部分配列のＧ／Ｃ含量（絶対または相対）と比べて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％の幅である。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列における対応する部分配列のグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対または相対）と比べた、部分配列（すなわち、Ｇ／Ｃ修飾部分配列）におけるＧ／Ｃ含量（絶対または相対）の局所的減少である。いくつかの実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）の局所的減少は、参照核酸配列における対応する部分配列のＧ／Ｃ含量（絶対または相対）と比べて少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％の幅である。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ヌクレオ塩基長である部分配列において増加または減少される。
【０３１６】
いくつかの実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）は、少なくとも約１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、または１０００ヌクレオ塩基長である部分配列において増加または減少される。
【０３１７】
いくつかの実施形態では、Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）は、少なくとも約１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００、または１００００ヌクレオ塩基長である部分配列において増加または減少される。
【０３１８】
本明細書に記載のＧ及びＣ含量（絶対または相対）の増加または減少は、低Ｇ／Ｃ含量を有する同義コドンを、より高いＧ／Ｃ含量を有する同義コドンと置き換えること、またはその逆によって、実施され得る。例えば、Ｌは、６つの同義コドンを有し、これらのうちの２つが２つのＧ／Ｃ（ＣＵＣ、ＣＵＧ）を有し、３つが単一のＧ／Ｃ（ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＡ）を有し、１つがＧ／Ｃ（ＵＵＡ）を有しない。したがって、参照核酸がある特定の位置にＣＵＣコドンを有したとして、その位置のＧ／Ｃ含量は、ＣＵＣを、単一のＧ／Ｃを有するコドンのうちのいずれかまたはＧ／Ｃを有しないコドンで置き換えることによって低減され得る。
【０３１９】
米国公開第ＵＳ２０１４０２２８５５８号、同第ＵＳ２００５００３２７３０  Ａ１号、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ８３：３７−４６を参照されたく、これらの全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３２０】
ｃ．コドン頻度−コドン使用頻度バイアス
当該技術分野で既知の多数のコドン最適化方法は、参照核酸配列におけるコドンの、より高い頻度を有するコドンでの置換に基づく。故に、いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＧＬＡをコードする核酸配列は、非コドン最適化配列における使用頻度に対する、配列最適化核酸における他の同義コドンと比べた１つ以上のコドンの使用頻度の変更を含む方法を用いて、配列最適化され得る。
【０３２１】
本明細書で使用されるとき、「コドン頻度」という用語は、コドン使用頻度バイアス、すなわち、コードＤＮＡ／ＲＮＡにおける同義コドンの出現頻度の差異を指す。一般に、コドン選好は、翻訳最適化のための変異バイアスと自然選択との間の均衡を反映することが認識される。最適なコドンは、より早い翻訳速度及び高確度を達成する一助となる。これらの要因の結果として、より高度に発現される遺伝子において翻訳選択がより強力となることが予想される。バイオインフォマティクス及び計算生物学の分野において、コドン使用頻度バイアスを解析するための多くの統計手法が提案され、使用されている。例えば、Ｃｏｍｅｒｏｎ  ＆  Ａｇｕａｄｅ（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４７：２６８−７４を参照されたい。「最適なコドンの頻度」（Ｆｏｐ）（Ｉｋｅｍｕｒａ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５１（３）：３８９−４０９）、相対コドン適合（ＲＣＡ）（Ｆｏｘ  ＆  Ｅｒｉｌ（２０１０）ＤＮＡ  Ｒｅｓ．１７（３）：１８５−９６）または「コドン適合インデックス」（ＣＡＩ）（Ｓｈａｒｐ  ＆  Ｌｉ（１９８７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（３）：１２８１−９５）等の方法が、遺伝子発現レベルを予測するために用いられる一方で、「コドン有効数」（Ｎｃ）及び情報理論におけるシャノンエントロピー等の方法が、コドン使用頻度均一性を測定するために用いられる。対応分析及び主成分分析等の多変量統計手法が、遺伝子間のコドン使用頻度のばらつきを分析するために広く用いられる（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  ＤＮＡ  Ｒｅｓ．１５（６）：３５７−６５、Ｓａｎｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ  Ｂｉｏｌ．２００８；８（２）：１８７−９２）。
【０３２２】
本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードする核酸配列（例えば、ｍＲＮＡであり得る、例えば、野生型核酸配列、変異体核酸配列、キメラ核酸配列等）は、参照核酸配列における少なくとも１つのコドンを、同義コドン組においてより高いまたはより低いコドン頻度を有する代替のコドンで置換することを含む方法を用いて、コドン最適化され得、結果として得られる配列最適化核酸は、参照核酸配列に対して、少なくとも１つの最適化された特性を有する。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡをコードする参照核酸配列におけるコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、代替のコドンで置換され、各々代替のコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡをコードする参照核酸配列における少なくとも１つのコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する代替のコドンで置換され、参照核酸配列における少なくとも１つのコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替のコドンで置換される。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡをコードする参照核酸配列におけるコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％が、代替のコドンで置換され、各々代替のコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、より高いコドン頻度を有する少なくとも１つの代替のコドンは、コドン組において最も高いコドン頻度同義を有する。他の実施形態では、より高いコドン頻度を有する全ての代替のコドンが、同義コドン組において最も高いコドン頻度を有する。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、より低いコドン頻度を有する少なくとも１つの代替のコドンは、コドン組において最も低いコドン頻度同義を有する。いくつかの実施形態では、より高いコドン頻度を有する全ての代替のコドンが、同義コドン組において最も高いコドン頻度を有する。
【０３２８】
いくつかの具体的な実施形態では、少なくとも１つの代替のコドンは、同義コドン組において２番目に高い、３番目に高い、４番目に高い、５番目に高い、または６番目に高い頻度を有する。いくつかの具体的な実施形態では、少なくとも１つの代替のコドンは、同義コドン組において２番目に低い、３番目に低い、４番目に低い、５番目に低い、または６番目に低い頻度を有する。
【０３２９】
コドン頻度に基づく最適化は、ＧＬＡポリペプチドをコードする参照核酸配列に、上述のように全体的に、または局所的に適用され得る。いくつかの実施形態では、局所的に適用される場合、参照核酸配列の領域は、コドン頻度に基づいて、ある特定の部分配列における全てのまたはある特定のパーセンテージのコドンを、それらのそれぞれの同義コドン組においてより高いまたはより低い頻度を有するコドンで置換することで、修飾され得る。故に、いくつかの実施形態では、参照核酸配列の部分配列におけるコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％が、代替のコドンで置換され、各々代替のコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列における少なくとも１つのコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する代替のコドンで置換され、参照核酸配列の部分配列における少なくとも１つのコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも低いコドン頻度を有する代替のコドンで置換される。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列におけるコドンの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％が、代替のコドンで置換され、各々代替のコドンは、同義コドン組において置換されるコドンのコドン頻度よりも高いコドン頻度を有する。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列において置換され、より高いコドン頻度を有する少なくとも１つの代替のコドンは、同義コドン組において最も高いコドン頻度を有する。他の実施形態では、参照核酸配列の部分配列において置換され、より低いコドン頻度を有する全ての代替のコドンが、同義コドン組において最も低いコドン頻度を有する。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする参照核酸配列の部分配列において置換され、より低いコドン頻度を有する少なくとも１つの代替のコドンは、同義コドン組において最も低いコドン頻度を有する。いくつかの実施形態では、参照核酸配列の部分配列において置換され、より高いコドン頻度を有する全ての代替のコドンが、同義コドン組において最も高いコドン頻度を有する。
【０３３４】
具体的な実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、特定の箇所で、例えば、配列最適化核酸の５’末端もしくは３’末端で、またはこれらの領域から既定の距離（例えば、配列最適化核酸の５’末端または３’末端から少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００コドン）以内で、参照核酸配列の対応する部分配列における全体的コドン頻度よりも高いまたは低い全体的コドン頻度を有する、部分配列を含み得る。
【０３３５】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする配列最適化核酸は、参照核酸配列の対応する部分配列における全体的コドン頻度よりも高いまたは低い全体的コドン頻度を有する、１つを超える部分配列を含み得る。当業者であれば、全体的により高いまたはより低い全体的コドン頻度を有する部分配列が、全体的コドン頻度がより高いかそれともより低いか、部分配列の長さ、部分配列間の長さ、部分配列の箇所等に応じて、無数のパターンで組織化され得ることを理解する。米国特許第ＵＳ５０８２７６７号、同第ＵＳ８１２６６５３号、同第ＵＳ７５６１９７３号、同第ＵＳ８４０１７９８号、米国公開第ＵＳ２００８００４６１９２号、同第ＵＳ２００８００７６１６１号、国際公開第ＷＯ２００００１８７７８号、Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ４（９）：ｅ７００２、Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ８３：３７−４６、Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＢＭＣ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：１３４を参照されたく、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０３３６】
ｄ．不安定化モチーフ置換
配列最適化に影響し得る様々なモチーフが存在し、それは、例えば以下の非排他的部類に分類される。
（ｉ）モチーフに基づく一次配列：ヌクレオチドの単純な配置によって定義されるモチーフ。
（ｉｉ）構造モチーフ：ある特定の二次構造を形成する傾向にあるヌクレオチドの配置によってコードされるモチーフ。
（ｉｉｉ）局所モチーフ：１つの隣接する部分配列中にコードされるモチーフ。
（ｉｖ）分布モチーフ：２つ以上の分解された部分配列中にコードされるモチーフ。
（ｖ）有利なモチーフ：ヌクレオチドの構造または機能を改善するモチーフ。
（ｖｉ）不利なモチーフ：ヌクレオチドの構造または機能への有害な影響を有するモチーフ。
【０３３７】
不利なモチーフの部類に適合する多くのモチーフが存在する。いくつかの例として、例えば、相対的に短くなる傾向がある制限酵素モチーフ、Ｘｂａ１の制限部位モチーフ等の完全系列（ＴＣＴＡＧＡ）、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）、ＥｃｏＲＩＩ（ＣＣＷＧＧ、式中、ＩＵＰＡＣアンビギュイディーコードにつき、Ｗは、ＡまたはＴを意味する、）、またはＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）；Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＧｎｎｎｎＷｎＣＲｎＣＴＣｎＣｎｎＷｎＤ、式中、ｎは、任意のヌクレオチドを意味し、Ｒは、ＡまたはＧ意味し、Ｗは、ＡまたはＴを意味し、Ｄは、ＡまたはＧまたはＴを意味するがＣではない）中等、より長くなる傾向があり、正確な配列ではなくコンセンサスに基づく酵素部位；ＧＧＧＧ反復（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５１（６３２４）：３３１−２）等の構造モチーフ；またはＣＵＧ−トリプレット反復（Ｑｕｅｒｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１２４：１７０３−１７１４）等の他のモチーフが挙げられる。
【０３３８】
したがって、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードする核酸配列は、参照核酸配列において、少なくとも１つの不安定化モチーフを置換することと、かかる不利なモチーフを除去することまたはそれを有利なモチーフと置き換えることとを含む方法を使用して配列最適化され得る。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、最適化プロセスは、参照核配列において、有利及び／または不利なモチーフを同定することを含み、かかるモチーフは、例えば、最適化プロセスの前またはその間に参照核酸配列において、安定性の損失を引き起こし得る特定の部分配列である。例えば、最適化の間の特定の塩基の置換は、制限酵素によって認識される部分配列（モチーフ）を生成し得る。したがって、最適化プロセスの間、不利なモチーフの出現は、配列最適化配列を不利であることが既知のモチーフのライブラリと比較することによって監視され得る。次いで、不利なモチーフの同定は、事後フィルターとして、すなわち、参照核酸配列中に潜在的に導入され得るある特定の修飾が実際に実施されるべきかどうかを判定するために使用され得る。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、不利なモチーフの同定は、本明細書に開示される配列最適化方法の用途の前に使用され得、すなわち、ＧＬＡポリペプチドをコードする参照核酸配列中のモチーフの同定及び代替の核酸配列でのそれらの置き換えは、事前プロセスステップとして、例えば、ウリジン低減の前に使用され得る。
他の実施形態では、不利なモチーフの同定及びそれらの除去は、本明細書に開示される配列最適化方法のうちの２つ以上を含む多パラメータ核酸最適化方法において統合された追加の配列最適化技術として使用される。この仕方で使用される場合、最適化プロセスの間に同定される不利なモチーフは、例えば、元々の設計原理（複数可）（例えば、低いＵ、高い頻度等）と可能な限り綿密に維持するために、最も低い可能な数のヌクレオ塩基を置換することによって除去され得る。例えば、米国公開第ＵＳ２０１４／０２２８５５８号、第ＵＳ２００５／００３２７３０号、または第ＵＳ２０１４／０２２８５５８号を参照されたく、それらは、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０３４１】
ｅ．限られたコドンセット最適化
いくつかの特定の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする参照核酸配列における配列最適化は、限られたコドンセット、例えば、自然数より少ないコドンが２０個の天然アミノ酸、２０個の天然アミノ酸のサブセット、または例えば非天然アミノ酸を含むアミノ酸の拡大されたセットをコードするために使用されるコドンセットを使用して行われ得る。
【０３４２】
遺伝コードは、全ての生物の中で非常に類似し、開始及び停止コドンに加えて、タンパク質翻訳に含まれる２０個の標準アミノ酸をコードする６４個の進入を有する単純な表に発現され得る。遺伝コードは、退化、すなわち、一般に、１つ以上のコドンが各アミノ酸を特定する。例えば、アミノ酸ロイシンは、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、またはＣＵＧコドンによって特定されるが、アミノ酸セリンは、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＵＣＣ、ＵＣＵ、ＡＧＵ、またはＡＧＣコドンによって特定される（第１、第２、または第３の位置における差異）。自然遺伝コードは、天然発生型アミノ酸をコードする６２個のコドンを含む。したがって、本明細書に開示される方法のいくつかの実施形態では、２０個のアミノ酸をコードするために６２個未満のコドンを含む最適化コドンセット（遺伝コード）は、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、または２０個のコドンを含み得る。
【０３４３】
いくつかの実施形態では、限られたコドンセットは、２０個未満のコドンを含む。例えば、タンパク質が２０種類未満のアミノ酸を含む場合、かかるタンパク質は、２０個未満のコドンを有するコドンセットによってコードされ得る。したがって、いくつかの実施形態では、最適化コドンセットは、参照核酸配列によってコードされるタンパク質中に存在するアミノ酸の異なる種類と同程度の多くのコドンを含む。いくつかの実施形態では、最適化コドンセットは、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、またはさらに１個のコドンを含む。
【０３４４】
いくつかの実施形態では、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、及びＶａｌ、すなわち１つ以上のコドンによって天然にコードされるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸は、同義のコドンの天然発生数未満のコドンでコードされる。例えば、いくつかの実施形態では、Ａｌａは、３、２、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｃｙｓは、１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ａｓｐは、１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｇｌｕは、１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｐｈｅは、１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｇｌｙは、３個のコドン、２個のコドン、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｈｉｓは、１個のコドンによって配列最適化核酸中にコードされ得；Ｉｌｅは、２個のコドンまたは１個のコドンによって配列最適化核酸中にコードされ得；Ｌｙｓは、１個のコドンによって配列最適化核酸中にコードされ得；Ｌｅｕは、５個のコドン、４個のコドン、３個のコドン、２個のコドン、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ａｓｎは、１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｐｒｏは、３個のコドン、２個のコドン、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｇｌｎは、１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ａｒｇは、５個のコドン、４個のコドン、３個のコドン、２個のコドン、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ；Ｓｅｒは、５個のコドン、４個のコドン、３個のコドン、２個のコドン、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｔｈｒは、３個のコドン、２個のコドン、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ得；Ｖａｌは、３個のコドン、２個のコドン、または１個のコドンによって配列最適化核酸中でコードされ；Ｔｙｒは、１個のコドンによって配列最適化核酸中にコードされ得る。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、及びＶａｌ、すなわち、１つ以上のコドンによって天然にコードされるアミノ酸からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸は、限られたコドンセット中の単一コドンによってコードされる。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、ＤＮＡ及び２０個のコドンからなる限られたコドンセットであり、各コドンは２０個のアミノ酸のうちの１個をコードする。いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、ＤＮＡであり、限られたコドンセットは、ＧＣＴ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、及びＧＣＧからなる群から選択される少なくとも１つのコドン；ＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、及びＡＧＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＡＡＴまたはＡＣＣから選択される少なくともコドン；ＧＡＴまたはＧＡＣから選択される少なくともコドン；ＴＧＴまたはＴＧＣから選択される少なくともコドン；ＣＡＡまたはＣＡＧから選択される少なくともコドン；ＧＡＡまたはＧＡＧから選択される少なくともコドン；ＧＧＴ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、及びＧＧＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＣＡＴまたはＣＡＣから選択される少なくともコドン；ＡＴＴ、ＡＴＣ、及びＡＴＡからなる群から選択される少なくともコドン；ＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、及びＣＴＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＡＡＡまたはＡＡＧから選択される少なくともコドン；ＡＴＧコドン；ＴＴＴまたはＴＴＣから選択される少なくともコドン；ＣＣＴ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、及びＣＣＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＴＣＴ、ＴＣＣ、ＴＣＡ、ＴＣＧ、ＡＧＴ、及びＡＧＣからなる群から選択される少なくともコドン；ＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、及びＡＣＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＴＧＧコドン；ＴＡＴまたはＴＡＣから選択される少なくともコドン；ならびに、ＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ、及びＧＴＧからなる群から選択される少なくともコドンを含む。
【０３４７】
他の実施形態では、配列最適化核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）であり、限られたコドンセットは、２０個のコドンからなり、各コドンは、２０個のアミノ酸のうちの１個をコードする。いくつかの実施形態では、配列最適化核酸は、ＲＮＡであり、限られたコドンセットは、ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、及びＧＣＧからなる群から選択される少なくとも１つのコドン；ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、及びＡＧＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＡＡＵまたはＡＣＣから選択される少なくともコドン；ＧＡＵまたはＧＡＣから選択される少なくともコドン；ＵＧＵまたはＵＧＣから選択される少なくともコドン；ＣＡＡまたはＣＡＧから選択される少なくともコドン；ＧＡＡまたはＧＡＧから選択され少なくともコドン；ＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、及びＧＧＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＣＡＵまたはＣＡＣから選択される少なくともコドン；ＡＵＵ、ＡＵＣ、及びＡＵＡからなる群から選択される少なくともコドン；ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、及びＣＵＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＡＡＡまたはＡＡＧから選択される少なくともコドン；ＡＵＧコドン；ＵＵＵまたはＵＵＣから選択される少なくともコドン；ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、及びＣＣＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＡＧＵ、及びＡＧＣからなる群から選択される少なくともコドン；ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、及びＡＣＧからなる群から選択される少なくともコドン；ＵＧＧコドン；ＵＡＵまたはＵＡＣから選択される少なくともコドン；ならびに、ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、及びＧＵＧからなる群から選択される少なくともコドンを含む。
【０３４８】
いくつかの特定の実施形態では、限られたコドンセットは、ある特定の組織または細胞への投与後に、配列最適化核酸（例えば、合成ｍＲＮＡ）のインビボ発現へ最適化されている。
【０３４９】
いくつかの実施形態では、最適化コドンセット（例えば、２０個のアミノ酸をコードする２０個のコドンセット）は、以下の特性のうちの少なくとも１つに従う。
（ｉ）最適化コドンセットは、元々のもしくは天然コドンセットより高い平均Ｇ／Ｃ含量を有する；または、
（ｉｉ）最適化コドンセットは、元々のもしくは天然コドンセットより低い平均Ｕ含量を有する；または、
（ｉｉｉ）最適化コドンセットは、最も高い頻度を有するコドンからなる；または、
（ｉｖ）最適化コドンセットは、最も低い頻度を有するコドンからなる；または、
（ｖ）それらの組み合わせ。
【０３５０】
いくつかの特定の実施形態では、最適化コドンセット中の少なくとも１つのコドンは、同義のコドンセット中で２番目に高い、３番目に高い、４番目に高い、５番目に高い、または６番目に高い頻度を有する。いくつかの特定の実施形態では、最適化コドン中の少なくとも１つのコドンは、同義のコドンセット中で２番目に低い、３番目に低い、４番目に低い、５番目に低い、または６番目に低い頻度を有する。
【０３５１】
本明細書で使用される場合、「天然コドンセット」という用語は、参照核酸配列をコードするために源生物によって天然に使用されるコドンセットを指す。本明細書で使用される場合、「元々のコドンセット」という用語は、配列最適化の開始前に参照核酸配列をコードするために使用されるコドンセット、または配列最適化が反復的もしくは再帰的に適用される場合に、新しい最適化反復の開始での参照核酸配列の最適化バリアントをコードするために使用されるコドンセットを指す。
【０３５２】
いくつかの実施形態では、コドンセット中のコドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、最も高い頻度を有するものである。他の実施形態では、コドンセット中のコドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、最も低い頻度を有するものである。
【０３５３】
いくつかの実施形態では、コドンセット中のコドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、最も高いウリジン含量を有するものである。いくつかの実施形態では、コドンセット中のコドンの５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％が、最も低いウリジン含量を有するものである。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、コドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）は、元々のコドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対またはｒｅｌａｔｉｖｅ）よりも、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％高い。いくつかの実施形態では、コドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対または相対）は、元々のコドンセットの平均Ｇ／Ｃ含量（絶対またはｒｅｌａｔｉｖｅ）よりも、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低い。
【０３５５】
いくつかの実施形態では、コドンセットのウラシル含量（絶対または相対）は、元々のコドンセットの平均ウラシル含量（絶対または相対）よりも、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％高い。いくつかの実施形態では、コドンセットのウラシル含量（絶対または相対）は、元々のコドンセットの平均ウラシル含量（絶対または相対）よりも、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％低い。
【０３５６】
米国出願公開第２０１１／００８２０５５号、及び国際公開第ＷＯ２０００／０１８７７８号もまた参照されたく、その両方は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０３５７】
８．配列最適化核酸の特徴付け
本発明のいくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化核酸を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、少なくとも１つの核酸配列特性（例えば、ヌクレアーゼに曝露される場合の安定性）または発現特性が、非配列最適化核酸に関して改善されているかどうかを判定するために試験され得る。
【０３５８】
本明細書で使用される場合、「発現特性」は、インビボ（例えば、投与を必要とする対象への投与後の、合成ｍＲＮＡの翻訳有効性）またはインビトロ（例えば、インビトロモデル系内で試験される合成ｍＲＮＡの翻訳有効性）のいずれかで核酸配列の特性を指す。発現特性は、これらに限定されないが、投与後にＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡによって生成されるプロテインの量、及び生成される可溶性またはそうでなければ機能的タンパク質の量を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される配列最適化核酸は、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードする配列最適化核酸配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）によってコードされるタンパク質を発現する細胞の生存能力に従って評価され得る。
【０３５９】
特定の実施形態では、非最適化参照核酸配列に関するコドン置換を含む本明細書に開示される複数の配列最適化核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、対象の特性、例えば、インビトロモデル系、またはインビボでの標的組織もしくは細胞における発現特性を測定するために機能的に特徴付けられ得る。
【０３６０】
ａ．核酸配列固有特性の最適化
本発明のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの所望の特性は、核酸配列の固有特性である。例えば、ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、インビボまたはインビトロでの安定性のために配列最適化され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、特定の標的組織または細胞中の発現のために配列最適化され得る。いくつかの実施形態では、核酸配列は、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼによるその分解を防ぐことによってその血漿半減期を増加させるために配列最適化される。
【０３６１】
他の実施形態では、核酸配列は、その抵抗を増加させるために配列最適化され、溶液中で加水分解し、例えば、配列最適化核酸または配列最適化核酸を含む医薬組成物が、最小限の分解を伴う水性条件下で保管され得る時間を長くする。
【０３６２】
他の実施形態では、配列最適化核酸は、その抵抗を増加させるために最適化され得、乾燥保管条件で加水分解し、例えば、配列最適化核酸が、最小限の分解を伴う水性条件下で保管され得る時間を長くする。
【０３６３】
ｂ．タンパク質発現のための核酸配列最適化
本発明のいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド所望の特性は、本明細書に開示される配列最適化配列によってコードされるＧＬＡポリペプチドの発現のレベルである。タンパク質発現レベルは、１つ以上の発現系を使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、発現は、細胞培養系、例えば、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞中で測定され得る。いくつかの実施形態では、発現は、生細胞の抽出物、例えば、ウサギ網状赤血球ライセートから調製されたインビトロ発現系、または精製された個々の構成成分の集合体によって調製されたインビトロ発現系を使用して測定され得る。他の実施形態では、タンパク質発現は、インビボ系、例えば、マウス、ウサギ、サル等において測定される。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、溶液形態でのタンパク質発現が望ましくあり得る。したがって、いくつかの実施形態では、参照配列は、可溶性形態で発現されたタンパク質の最適化レベルを有する配列最適化核酸配列を産出するために、配列最適化され得る。タンパク質発現のレベル、ならびに可溶性、集合体のレベル、及び不完全生成物の存在（すなわち、タンパク質分解、加水分解、または欠陥のある翻訳に起因する断片）等の他の特性は、当該技術分野で知られている方法、例えば、電気泳動法（例えば、ネイティブまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ）またはクロマトグラフィー法（例えば、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー等）に従って測定され得る。
【０３６５】
ｃ．標的組織または標的細胞生存能力
いくつかの実施形態では、核酸配列によってコードされる異種治療用タンパク質の発現は、標的組織及び細胞において有害な影響を有し得、タンパク質産出を低減するか、または発現された生成物の質を低減するか（例えば、タンパク質断片の存在または封入体中の発現されたタンパク質の沈殿に起因する）、または毒性を引き起こす。
【０３６６】
したがって、本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸配列の配列最適化、例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードする核酸配列は、配列最適化核酸によってコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存能力を増加させるために使用され得る。
【０３６７】
異種タンパク質発現はまた、自己または異種の核酸配列でトランスフェクションされた細胞に対して有害であり得る。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸配列の配列最適化は、配列最適化核酸配列によってコードされるタンパク質を発現する標的細胞の生存能力を増加させるために使用され得る。細胞または組織生存能力、毒性、及び他の生理的反応における変化は、当該技術分野で知られている方法に従って測定され得る。
【０３６８】
ｄ．免疫及び／または炎症性反応の低減
いくつかの場合では、ＧＬＡポリペプチドまたはその機能的断片をコードする配列最適化核酸の投与は、免疫応答を引き起こし得、それは、（ｉ）治療剤（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡ）、または（ｉｉ）かかる治療剤の発現生成物（例えば、ｍＲＮＡによってコードされるＧＬＡポリペプチド）、または（ｉｖ）それらの組み合わせによって引き起こされ得る。したがって、本開示のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）の配列最適化減少免疫は、ＧＬＡポリペプチドをコードする核酸の投与によって、またはかかる核酸によってコードされるＧＬＡの発現生成物によって引き起こされる、免疫もしくは炎症性反応を減少させるために使用され得る。
【０３６９】
いくつかの態様では、炎症性反応は、当該技術分野で知られている方法、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して、１つ以上の炎症性サイトカインの増加されたレベルを検出することによって測定され得る。「炎症性サイトカイン」という用語は、炎症性反応が高められたサイトカインを指す。炎症性サイトカインの例としては、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、ＧＲＯαとしても知られているＣＸＣＬ１（ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１；インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ−誘発性タンパク質１０（ＩＰ−１０）、または顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が挙げられる。用語、炎症性サイトカインはまた、当該技術分野で知られている炎症性反応に関連する他のサイトカイン、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１３（Ｉｌ−１３）、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）等を含む。
【０３７０】
９．ＧＬＡポリペプチドをコードする修飾されたヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含むウラシル修飾配列を含み、ｍＲＮＡは、化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。
【０３７１】
本発明のある特定の態様では、５−メトキシウラシル塩基がリボ―ス糖に連結されている場合、それはポリヌクレオチド中にあるため、結果として得られる修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、５−メトキシウリジンと称される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％が５−メトキシウラシルである。一実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、少なくとも９５％が５−メトキシウラシルである。別の実施形態では、ポリヌクレオチド中のウラシルは、１００％が５−メトキシウラシルである。
【０３７２】
ポリヌクレオチドのウラシルが、少なくとも９５％が５−メトキシウラシルである実施形態では、全体のウラシル含量は、ｍＲＮＡが、免疫応答にほとんど誘発しない間に好適なタンパク質発現レベルを提供するように調節され得る。いくつかの実施形態では、ＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦ中の理論上最小ウラシル含量（％ＵＴＭ）の約１１０％〜約１５０％、約１１５％〜約１５０％、約１２０％〜約１５０％、約１１０％〜約１４５％、約１１５％〜約１４５％、約１２０％〜約１４５％、約１１０％〜約１４０％、約１１５％〜約１４０％、または約１２０％〜約１４０％である。他の実施形態では、ＯＲＦのウラシル含量は、約１２０％〜約１４３％または１２３％〜１３８％の％ＵＴＭである。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦのウラシル含量は、約１２０％、約１２５％、約１３０％、約１３５％、または約１４０％の％ＵＴＭである。この文脈では、「ウラシル」という用語は、５−メトキシウラシル及び／または天然発生型ウラシルを指す。
【０３７３】
いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおけるウラシル含量は、ＯＲＦにおける総ヌクレオ塩基含量の約５０％、約４０％、約３０％、または約２０％未満である。いくつかの実施形態では、ＯＲＦにおけるウラシル含量は、ＯＲＦにおける総ヌクレオ塩基含量の約１２％〜約２６％である。他の実施形態では、ＯＲＦにおけるウラシル含量は、ＯＲＦにおける総ヌクレオ塩基含量の約１６％〜約１８％である。一実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおけるウラシル含量は、オープンリーディングフレーム中の総ヌクレオ塩基含量の約２６％未満である。この文脈では、「ウラシル」という用語は、５−メトキシウラシル及び／または天然発生型ウラシルを指す。
【０３７４】
さらなる実施形態では、５−メトキシウラシル及び調節されたウラシル含量を有するＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、増加されたシトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、またはグアニン／シトシン（Ｇ／Ｃ）含量（絶対または相対）を有する。いくつかの実施形態では、ＯＲＦのＣ、Ｇ、またはＧ／Ｃ含量（絶対または相対）の全体の増加は、野生型ＯＲＦのＧ／Ｃ含量（絶対または相対）に対して少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％である。いくつかの実施形態では、ＯＲＦにおけるＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量は、ＧＬＡポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列の理論上最大Ｇ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量（％ＧＴＭＸ、％ＣＴＭＸ、または％Ｇ／ＣＴＭＸ）の約１００％未満、約９５％未満、約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、または約７５％未満である。他の実施形態では、ＯＲＦにおけるＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量は、それぞれ、％ＧＴＭＸ、％ＣＴＭＸ、または％Ｇ／ＣＴＭＸの約７２％〜約８０％、約７０％〜約７６％、または約９１％〜約９５％である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＧ及び／またはＣ含量（絶対または相対）の増加は、低いＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量を有する同義のコドンをより高いＧ、Ｃ、またはＧ／Ｃ含量を有する同義のコドンと置き換えることによって行われ得る。他の実施形態では、Ｇ及び／またはＣ含量（絶対または相対）の増加は、Ｕで終わるコドンをＧまたはＣで終わる同義のコドンと置き換えることによって行われる。
【０３７５】
さらなる実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、５−メトキシウラシルを含み、ＧＬＡポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列よりも低いウラシル対（ＵＵ）及び／またはウラシル三つ組（ＵＵＵ）及び／またはウラシル四つ組（ＵＵＵＵ）を含む調節されたウラシル含量を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、ウラシル対及び／またはウラシル三つ組及び／またはウラシル四つ組を含まない。いくつかの実施形態では、ウラシル対及び／またはウラシル三つ組及び／またはウラシル四つ組は、ある特定の閾値未満、例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおける１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、または５１以下の発生を低減される。特定の実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３９、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１未満の非フェニルアラニンウラシル対及び／または三つ組を含む。別の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、非フェニルアラニンウラシル対及び／または三つ組を含まない。
【０３７６】
さらなる実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、５−メトキシウラシルを含み、ＧＬＡポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列より少ないウラシルリッチクラスターを含む調節されたウラシル含量を有する。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦは、ＧＬＡポリペプチドをコードする対応する野生型ヌクレオチド配列中の対応するウラシルリッチクラスターよりも短い長さのウラシルリッチクラスターを含む。
【０３７７】
さらなる実施形態では、代替のより低い頻度のコドンが用いられる。５−メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦにおけるコドンの、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％は、代替のコドンで置換され、各代替のコドンは、同義のコドンセット中の置換コドンのコドン頻度より低いコドン頻度を有する。ＯＲＦはまた、上述される通り、調節されたウラシル含量を有する。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおける少なくとも１つのコドンは、同義のコドンセット中の置換コドンのコドン頻度より低いコドン頻度を有する代替のコドンで置換される。
【０３７８】
いくつかの実施形態では、調節されたウラシル含量、５−メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦは、対応する野生型ｍＲＮＡからのＧＬＡの発現レベルより高い哺乳類細胞に投与されるとき、ＧＬＡの発現レベルを示す。他の実施形態では、哺乳類細胞に投与された際のＧＬＡの発現レベルは、少なくとも９５％の５−メトキシウラシルを含み、かつ理論上最小の約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、または約２００％のウラシル含量を有する対応するｍＲＮＡに対して増加される。なおも他の実施形態では、哺乳類細胞に投与された際のＧＬＡの発現レベルは、対応するｍＲＮＡに対して増加され、ウラシルの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％は、１−メチルシュードウラシルまたはシュードウラシルである。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、マウス細胞、ラット細胞、またはウサギ細胞である。他の実施形態では、哺乳類細胞は、サル細胞またはヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＢＪ線維芽細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。いくつかの実施形態では、ＧＬＡは、ｍＲＮＡが哺乳類細胞にインビボで投与される際に発現される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、マウス、ウサギ、サル、またはヒトに投与される。一実施形態では、マウスは、ヌルマウスである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約０．１５ｍｇ／ｋｇの量でマウスに投与される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内または筋肉内に投与される。他の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドは、ｍＲＮＡが、哺乳類細胞にインビトロで投与される際に発現される。いくつかの実施形態では、発現は、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１５００倍、または少なくとも約３０００倍増加される。他の実施形態では、発現は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％増加される。
【０３７９】
いくつかの実施形態では、調製されたウラシル含量、５−メトキシウラシルを含むｍＲＮＡのＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦは、増加された安定性を示す。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、同じ条件下で対応する野生型ｍＲＮＡの安定性に対して、細胞中で増加された安定性を示す。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ヌクレアーゼへの抵抗を含む増加された安定性、熱安定性、及び／または二次構造の増加された安定化を示す。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによって示される増加された安定性は、ｍＲＮＡの半減期（例えば、血漿、細胞、または組織試料中）を決定すること及び／または経時的なｍＲＮＡ（例えば、インビトロまたはインビボ）によるタンパク質発現の曲線（ＡＵＣ）下の領域を決定することによって測定される。ｍＲＮＡは、半減期及び／またはＡＵＳが、同じ条件下で対応する野生型ｍＲＮＡの半減期及び／またはＡＵＣを超える場合、増加された安定性を有するとして同定される。
【０３８０】
いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡが、同じ条件下で対応する野生型ｍＲＮＡによって誘発される免疫応答に対して、検出可能により低い免疫応答（例えば、自然または獲得）を誘発する。他の実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、同じ条件下で５−メトキシウラシルは含まないが、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡによって誘発される免疫応答に対して、または同じ条件下で調節されたウラシル含量を含まないが、ＧＬＡポリペプチドをコードし、かつ５−メトキシウラシルを含むｍＲＮＡによって誘発される免疫応答に対して、検出可能により低い免疫応答（例えば、自然または獲得）を誘発する。自然免疫応答は、炎症誘発性サイトカイン、細胞内ＰＲＲ（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５等）の活性化、細胞死、及び／またはタンパク質翻訳の停止もしくは低減の増加された発現によって現れ得る。いくつかの実施形態では、自然免疫応答の低減は、１型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−δ、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−τ、ＩＦＮ−ω、及びＩＦＮ−ζ）の発現もしくは活性レベル、またはｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８）等のインターフェロン調節遺伝子の発現、及び／または細胞への本発明のｍＲＮＡの１つ以上の投与後の減少された細胞子によって測定され得る。
【０３８１】
いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡに対する反応における哺乳類細胞による１型インターフェロンの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡ、５−メトキシウラシルを含まないがＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、または調節されたウラシル含量を有さないがＧＬＡポリペプチドをコードし、かつ５−メトキシウラシルを含むｍＲＮＡに対して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％、または９９．９％超が低減される。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、ＩＦＮ−βである。いくつかの実施形態では、本開示のｍＲＮＡの哺乳類細胞への投与によって引き起こされる細胞死頻度は、対応する野生型ｍＲＮＡ、５−メトキシウラシルを含まないがＧＬＡポリペプチドコードするｍＲＮＡ、または調節されたウラシル含量を有さないがＧＬＡポリペプチドをコードし、かつ５−メトキシウラシルを含むｍＲＮＡと共に観察される細胞死頻度よりも、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９５％超少ない。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、ＢＪ線維芽細胞である。他の実施形態では、哺乳類細胞は、脾細胞である。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、マウスまたはラットのものである。他の実施形態では、哺乳類細胞は、ヒトのものである。一実施形態では、本開示のｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが誘発される哺乳類細胞の自然免疫応答を実質的には誘発しない。
【０３８２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡであり、ｍＲＮＡ中のウラシルは、少なくとも約９５％の５−メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦにおける理論上最小ウラシル含量の約１２０％〜約１４０％であり、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦにおけるウラシル含量は、ＯＲＦにおける総ヌクレオ塩基含量の約２６％未満である。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦは、対応する野生型ＯＲＦと比較して、ＯＲＦのＧ／Ｃ含量（絶対または相対）を少なくとも約４０％増加させるためにさらに修飾される。なおも他の実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦは、２０個未満の非フェニルアラニンウラシル対及び／または三つ組を含む。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡのＯＲＦにおける少なくとも１つのコドンは、同義のコドンセット中の置換コドンのコドン頻度より低いコドン頻度を有する代替のコドンでさらに置換される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ中のウラシルが少なくとも約９５％の５−メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量が対応する野生型ＯＲＦにおける理論上最小ウラシル含量の約１２０％〜約１４０％であるＯＲＦを含むｍＲＮＡによってコードされるＧＬＡポリペプチドの発現は、対応する野生型ｍＲＮＡからのＧＬＡポリペプチドの発現と比較して、少なくとも約１０倍増加される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、オープンＯＲＦを含み、ｍＲＮＡ中のウラシルは、少なくとも約９５％の５−メトキシウラシルであり、ＯＲＦのウラシル含量は、対応する野生型ＯＲＦにおける理論上最小ウラシル含量の約１２０％〜約１４０％であり、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが誘発される哺乳類細胞の免疫応答を実質的には誘発しない。
【０３８３】
１０．ポリヌクレオチドを修飾するための方法
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む修飾されたポリヌクレオチドを含む（例えば、ポリヌクレオチド、例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ）。修飾されたポリヌクレオチドは、化学修飾及び／または構造修飾され得る。本発明のポリヌクレオチドは、化学修飾及び／または構造修飾されている場合、ポリヌクレオチドは、「修飾されたポリヌクレオチド」と称され得る。
【０３８４】
本開示は、修飾されたヌクレオシド、及びＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）のヌクレオチドを提供する。「ヌクレオシド」は、糖分子（例えば、ペントースまたはリボース）、または有機塩基と組み合わされたそれらの誘導体（例えば、プリンまたはピリミジン）、またはそれらの誘導体（本明細書で「ヌクレオ塩基」とも称される）を含む化合物を指す。「ヌクレオチド」は、リン酸基を含むヌクレオシドを指す。修飾されたヌクレオチドは、例えば、化学的、酵素的、または組換え的等の任意の有用な方法によって合成され、１つ以上の修飾されたまたは非天然ヌクレオシドを含む。ポリヌクレオチドは、領域または結合されたヌクレオシドの領域を含み得る。かかる領域は、可変骨格結合を有し得る。結合は、標準的なホスホジエステルであり得、その場合においてポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの領域を含む。
【０３８５】
本明細書に開示される修飾されたポリヌクレオチドは、様々な異なる修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾されたポリヌクレオチドは、１つ、２つ、またはそれ以上（任意に異なる）のヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含む。いくつかの実施形態では、細胞に導入された、修飾されたポリヌクレオチドは、修飾されていないポリヌクレオチドと比較して、１つ以上の望ましい特性、例えば、改善されたタンパク質発現、低減された免疫原性、または細胞中の低減された分解を示し得る。
【０３８６】
ａ．構造修飾
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、構造的に修飾されている。本明細書で使用されるように、「構造」修飾は、ヌクレオチド自体への著しい化学修飾なしでポリヌクレオチド中で２つ以上の結合されたヌクレオシドが、挿入、欠失、重複、転化、またはランダム化されるものである。化学結合が必然的に破壊及び改質されて、構造修飾に影響を与えるため、構造修飾は化学的性質であり、それ故に化学修飾である。しかしながら、構造修飾は、ヌクレオチドの異なる配列をもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」に化学修飾され得る。同じポリヌクレオチドは、「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造的に修飾され得る。ここで、ジヌクレオチド「ＣＣ」は挿入され、ポリヌクレオチドへの構造修飾をもたらす。
【０３８７】
ｂ．化学修飾
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、化学修飾されている。ポリヌクレオチドの参照において本明細書で使用されるように、「化学修飾」または、適切な場合、「化学修飾された」という用語は、１つ以上のそれらの位置、パターン、パーセント、または集団において、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）、またはシチジン（Ｃ）リボ−もしくはデオキシリボヌクレオシドに関する修飾を指す。一般に、本明細書において、これらの用語は、天然発生型５’−末端ｍＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すことは意図しない。
【０３８８】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、同じヌクレオシドの種類の全てもしくはいずれかの均一な化学修飾、または同じヌクレオシドの種類の全てもしくはいずれかの同じ開始修飾の単なる下方滴定によって生成された修飾の集団、または全てのウリジンが、ウリジン類似体、例えば、プソイドウリジンまたは５−メトキシウリジンによって置き換えられるような、同じヌクレオシドの種類であるがランダムな組み込みを伴う全ての任意の化学修飾の測定されたパーセント。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体を通して同じヌクレオシドの種類のうちの２、３、または４つの均一な化学修飾を有し得る（同じ方法で修飾される全てのウリジン及び全てのサイトカイン等）。
【０３８９】
修飾されたヌクレオシド塩基対は、標準的なアデノシン−チミン、アデノシン−ウラシル、またはグアノシン−シトシン塩基対を包含するだけでなく、非標準的もしくは修飾された塩基を含むヌクレオチド及び／または修飾されたヌクレオチドの間で形成された塩基対も包含し、水素結合供与対及び水素受容体の配置が、非標準的な塩基及び標準的な塩基の間、または２つの補完的な非標準的な塩基構造の間で水素結合を可能にする。かかる非標準的な塩基対の一実施例は、修飾されたヌクレオチドのイノシン及びアデニン、シトシン、またはウラシルの間の塩基対である。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせは、本開示のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。
【０３９０】
当業者は、特に明記がある場合を除いて、本出願に記載のポリヌクレオチド配列が大法的なＤＮＡ配列中に「Ｔ」を列挙するが、配列はＲＮＡを表し、「Ｔ」は「Ｕ」に置換され得ることを理解するであろう。
【０３９１】
本開示の組成物、方法、合成プロセスにおいて有用なポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）修飾としては、以下のヌクレオチドに限定されないが、ヌクレオシド、及びヌクレオ塩基：２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−イソペンテニルアデノシン；Ｎ６−メチルアデノシン；Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；１，２’−Ｏ−ｄｉメチルアデノシン；１−メチルアデノシン；２’−Ｏ−メチルアデノシン；２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート）；２−メチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバニルカルバモイルアデノシン；２’−Ｏ−メチルアデノシン；２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート）；イソペンテニルアデノシン；Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン；Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン；Ｎ６，２’−Ｏ−ジメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６，２’−Ｏ−トリメチルアデノシン；Ｎ６，Ｎ６−ｄｉメチルアデノシン；Ｎ６−ヒドロキシノルバニルアデノシン；Ｎ６−ヒドロキシノルバニルカルバモイルアデノシン；Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン；２−メチルアデノシン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン；７−デアザ−アデノシン；Ｎ１−メチル−アデノシン；Ｎ６、Ｎ６（ジメチル）アデニン；Ｎ６−シス−ヒドロキシ−イソペンテニル−アデノシン；α−チオ−アデノシン；２（アミノ）アデニン；２（アミノプロピル）アデニン；２（メチルチオ）Ｎ６（イソペンテニル）アデニン；２−（アルキル）アデニン；２−（アミノアルキル）アデニン；２−（アミノプロピル）アデニン；２−（ハロ）アデニン；２−（ハロ）アデニン；２−（プロピル）アデニン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＡＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＡＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アミノアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アジドアデノシンＴＰ；６（アルキル）アデニン；６（メチル）アデニン；６−（アルキル）アデニン；６−（メチル）アデニン；７（デアザ）アデニン；８（アルケニル）アデニン；８（アルキニル）アデニン；８（アミノ）アデニン；８（チオアルキル）アデニン；８−（アルケニル）アデニン；８−（アルキル）アデニン；８−（アルキニル）アデニン；８−（アミノ）アデニン；８−（ハロ）アデニン；８−（ヒドロキシル）アデニン；８−（チオアルキル）アデニン；８−（チオｌ）アデニン；８−アジド−アデノシン；アザアデニン；デアザアデニン；Ｎ６（メチル）アデニン；Ｎ６−（イソペンチル）アデニン；７−デアザ−８−アザ−アデノシン；７−メチルアデニン；１−デアザアデノシンＴＰ；２’フルオロ−Ｎ６−Ｂｚ−デオキシアデノシンＴＰ；２’−ＯＭｅ−２−アミノ−ＡＴＰ；２’Ｏ−メチル−Ｎ６−Ｂｚ−デオキシアデノシンＴＰ；２’−ａ−エチニルアデノシンＴＰ；２−アミノアデニン；２−アミノアデノシンＴＰ；２−アミノ−ＡＴ���；２’−ａ−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；２−アジドアデノシンＴＰ；２’−ｂ−エチニルアデノシンＴＰ；２−ブロモアデノシンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；２−クロロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトアデノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシアデノシンＴＰ；２−フルオロアデノシンＴＰ；２−ヨードアデノシンＴＰ；２−メルカプトアデノシンＴＰ；２−メトキシ−アデニン；２−メチルチオ−アデニン；２−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−ブロモアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−クロロアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−フルオロアデノシンＴＰ；３−デアザ−３−ヨードアデノシンＴＰ；３−デアザアデノシンＴＰ；４’−アジドアデノシンＴＰ；４’−炭素環式アデノシンＴＰ；４’−エチニルアデノシンＴＰ；５’−ホモ−アデノシンＴＰ；８−アザ−ＡＴＰ；８−ブロモ−アデノシンＴＰ；８−トリフルオロメチルアデノシンＴＰ；９−デアザアデノシンＴＰ；２−アミノプリン；７−デアザ−２，６−ジアミノプリン；７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン；７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン；２，６−ジアミノプリン；７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン；２−チオシチジン；３−メチルシチジン；５−ホルミルシチジン；５−ヒドロキシメチルシチジン；５−メチルシチジン；Ｎ４−アセチルシチジン；２’−Ｏ−メチルシチジン；２’−Ｏ−メチルシチジン；５，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン；ライシジン；Ｎ４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチルシチジン；Ｎ４−メチルシチジン；Ｎ４，Ｎ４−Ｄｉメチル−２’−ＯＭｅ−シチジンＴＰ；４−メチルシチジン；５−アザ−シチジン；シュード−イソ−シチジン；ピロロ−シチジン；α−チオ−シチジン；２−（チオ）シトシン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＣＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＣＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アミノシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アジドシチジンＴＰ；３（デアザ）５（アザ）シトシン；３（メチル）シトシン；３−（アルキル）シトシン；３−（デアザ）５（アザ）シトシン；３−（メチル）シチジン；４，２’−Ｏ−ジメチルシチジン；５（ハロ）シトシン；５（メチル）シトシン；５（プロピニル）シトシン；５（トリフルオロメチル）シトシン；５−（アルキル）シトシン；５−（アルキニル）シトシン；５−（ハロ）シトシン；５−（プロピニル）シトシン；５−（トリフルオロメチル）シトシン；５−ブロモ−シチジン；５−ヨード−シチジ��；５−プロピニルシトシン；６−（アゾ）シトシン；６−アザ−シチジン；アザシトシン；デアザシトシン；Ｎ４（アセチル）シトシン；１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン；１−メチル−シュードイソシチジン；２−メトキシ−５−メチル−シチジン；２−メトキシ−シチジン；２−チオ−５−メチル−シチジン；４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン；４−メトキシ−シュードイソシチジン；４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン；４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン；４−チオ−シュードイソシチジン；５−アザ−ゼブラリン；５−メチル−ゼブラリン；ピロロ−シュードイソシチジン；ゼブラリン；（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）シチジンＴＰ；２，２’−アンヒドロ−シチジンＴＰハイドロクロライド；２’フルオロ−Ｎ４−Ｂｚ−シチジンＴＰ；２’フルオロ−Ｎ４−アセチル−シチジンＴＰ；２’−Ｏ−メチル−Ｎ４−アセチル−シチジンＴＰ；２’Ｏ−メチル−Ｎ４−Ｂｚ−シチジンＴＰ；２’−ａ−エチニルシチジンＴＰ；２’−ａ−トリフルオロメチルシチジンＴＰ；２’−ｂ−エチニルシチジンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトシチジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシシチジンＴＰ；２’−Ｏ−メチル−５−（１−プロピニル）シチジンＴＰ；３’−エチニルシチジンＴＰ；４’−アジドシチジンＴＰ；４’−炭素環式シチジンＴＰ；４’−エチニルシチジンＴＰ；５−（１−プロピニル）アラ−シチジンＴＰ；５−（２−クロロ−フェニル）−２−チオシチジンＴＰ；５−（４−アミノ−フェニル）−２−チオシチジンＴＰ；５−アミノアリール−ＣＴＰ；５−シアノシチジンＴＰ；５−エチニルアラ−シチジンＴＰ；５−エチニルシチジンＴＰ；５’−ホモ−シチジンＴＰ；５−メトキシシチジンＴＰ；５−トリフルオロメチル−シチジンＴＰ；Ｎ４−アミノ−シチジンＴＰ；Ｎ４−ベンゾイル−シチジンＴＰ；シュードイソシチジン；７−メチルグアノシン；Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン；Ｎ２−メチルグアノシン；ワイオシン；１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン；１−メチルグアノシン；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート）；２’−Ｏ−メチルグアノシン；２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート）；７−アミノメチル−７−デアザグアノシン；７−シアノ−７−デアザグアノシン；アルカエオシン；メチルワイオシン；Ｎ２，７−ジメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン；Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン；Ｎ２，７，２’−Ｏ−トリメチ��グアノシン；６−チオ−グアノシン；７−デアザ−グアノシン；８−オキソ−グアノシン；Ｎ１−メチル−グアノシン；α−チオ−グアノシン；２（プロピル）グアニン；２−（アルキル）グアニン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＧＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＧＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アミノグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アジドグアノシンＴＰ；６（メチル）グアニン；６−（アルキル）グアニン；６−（メチル）グアニン；６−メチル−グアノシン；７（アルキル）グアニン；７（デアザ）グアニン；７（メチル）グアニン；７−（アルキル）グアニン；７−（デアザ）グアニン；７−（メチル）グアニン；８（アルキル）グアニン；８（アルキニル）グアニン；８（ハロ）グアニン；８（チオアルキル）グアニン；８−（アルケニル）グアニン；８−（アルキル）グアニン；８−（アルキニル）グアニン；８−（アミノ）グアニン；８−（ハロ）グアニン；８−（ヒドロキシル）グアニン；８−（チオアルキル）グアニン；８−（チオール）グアニン；アザグアニン；デアザグアニン；Ｎ（メチル）グアニン；Ｎ−（メチル）グアニン；１−メチル−６−チオ−グアノシン；６−メトキシ−グアノシン；６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン；６−チオ−７−デアザ−グアノシン；６−チオ−７−メチル−グアノシン；７−デアザ−８−アザ−グアノシン；７−メチル−８−オキソ−グアノシン；Ｎ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシン；Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン；１−Ｍｅ−ＧＴＰ；２’フルオロ−Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ；２’Ｏ−メチル−Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ；２’−ａ−エチニルグアノシンＴＰ；２’−ａ−トリフルオロメチルグアノシンＴＰ；２’−ｂ−エチニルグアノシンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオログアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロログアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオログアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−
メルカプトグアノシンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシグアノシンＴＰ；４’−アジドグアノシンＴＰ；４’−炭素環式グアノシンＴＰ；４’−エチニルグアノシンＴＰ；５’−ホモ−グアノシンＴＰ；８−ブロモ−グアノシンＴＰ；９−デアザグアノシンＴＰ；Ｎ２−イソブチル−グアノシンＴＰ；１−メチルイノシン；イノシン；１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン；２’−Ｏ−メチルイノシン；７−メチルイノシン；２’−Ｏ−メチルイノシン；エポキシキューオシン；ガラクトシル−キューオシン；マンノシルキューオシン；キューオシン；アリアミノ−チミジン；アザチミジン；デアザチミジン；デオキシ−チミジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２−チオウリジン；３−メチルウリジン；５−カルボキシメチルウリジン；５−ヒドロキシウリジン；５−メチルウリジン；５−タウリノメチル−２−チオウリジン；５−タウリノメチルウリジン；ジヒドロウリジン；シュードウリジン；（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン；１−メチル−３−（３−アミノ−５−カルボキシプロピル）シュードウリジン；１−メチルシュードウリジン；１−エチル−シュードウリジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；２’−Ｏ−メチルウリジン；２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン；３，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；３−メチル−シュード−ウリジンＴＰ；４−チオウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン；５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル；５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン；５，６−ジヒドロ−ウリジン；５−アミノメチル−２−チオウリジン；５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−カルバモイルメチルウリジン；５−カルボキシヒドロキシメチルウリジン；５−カルボキシヒドロキシメチルウリジンメチルエステル；５−カルボキシメチルアミノメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン；５−カルバモイルメチルウリジンＴＰ；５−メトキシカルボニルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン；５−メトキシカルボニルメチルウリジン；５−メチルウリジン，）、５−メトキシウリジン；５−メチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン；５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン；５−メチルアミノメチルウリジン；５−メチルジヒドロウリジン；５−オキシ酢酸−ウリジンＴＰ；５−オキシ酢酸−メチルエステル−ウリジンＴＰ；Ｎ１−メチル−シュード−ウラシル；Ｎ１−エチル−シュード−ウラシル；ウリジン５−オキシ酢酸；ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）−ウリジンＴＰ；５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）−２−チオウリジンＴＰ；５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジンＴＰ；５−（イソ−ペンテニルアミノメチル）ウリジンＴＰ；５−プロピニルウラシル；α−チオ−ウリジン；１（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチルエニル）−２（チオ）−シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル）−２，４−（ジチオ）シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル）−４（チオ）シュードウラシル；１（アミノアルキルアミノカルボニルエチルエニル）−シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチルエニル）−２（チオ）−シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチルエニル）−２，４−（ジチオ）シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチルエニル）−４（チオ）シュードウラシル；１（アミノカルボニルエチルエニル）−シュードウラシル；１置換２（チオ）−シュードウラシル；１置換２，４−（ジチオ）シュードウラシル；１置換４（チオ）シュードウラシル；１置換シュードウラシル；１−（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチルエニル）−２−（チオ）−シュードウラシル；１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュード−ＵＴＰ；１−メチル−シュード−ＵＴＰ；１−エチル−シュード−ＵＴＰ；２（チオ）シュードウラシル；２’デオキシウリジン；２’フルオロウリジン；２−（チオ）ウラシル；２，４−（ジチオ）シュードウラシル；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ−グアノシン；２’−アミノ−２’−デオキシ−ＵＴＰ；２’−アジド−２’−デオキシ−ＵＴＰ；２’−アジド−デオキシウリジンＴＰ；２’−Ｏ−メチルシュードウリジン；２’デオキシウリジン；２’フルオロウリジン；２’−デオキシ−２’−ａ−アミノウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−アジドウリジンＴＰ；２−メチルシュードウリジン；３（３アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル；４（チオ）シュードウラシル；４−（チオ）シュードウラシル；４−（チオ）ウラシル；４−チオウラシル；５（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル；５（２−アミノプロピル）ウラシル；５（アミノアルキル）ウラシル；５（ジメチルアミノアルキル）ウラシル；５（グアニジニウムアルキル）ウラシル；５（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル；５（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル；５（メチル）２（チオ）ウラシル；５（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル；５（メチル）４（チオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル；５（メチルアミノメチル）−４（チオ）ウラシル；５（プロピニル）ウラシル；５（トリフルオロメチル）ウラシル；５−（２−アミノプロピル）ウラシル；５−（アルキル）−２−（チオ）シュードウラシル；５−（アルキル）−２，４（ジチオ）シュードウラシル；５−（アルキル）−４（チオ）シュードウラシル；５−（アルキル）シュードウラシル；５−（アルキル）ウラシル；５−（アルキニル）ウラシル；５−（アリールアミノ）ウラシル；５−（シアノアルキル）ウラシル；５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル；５−（ジメチルアミノアルキル）ウラシル；５−（グアニジニウムアルキル）ウラシル；���−（ハロ）ウラシル；５−（ｌ，３−ジアゾール−ｌ−アルキル）ウラシル；５−（メトキシ）ウラシル；５−（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル；５−（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル；５−（メチル）２（チオ）ウラシル；５−（メチル）２，４（ジチオ）ウラシル；５−（メチル）４（チオ）ウラシル；５−（メチル）−２−（チオ）シュードウラシル；５−（メチル）−２，４（ジチオ）シュードウラシル；５−（メチル）−４（チオ）シュードウラシル；５−（メチル）シュードウラシル；５−（メチルアミノメチル）−２（チオ）ウラシル；５−（メチルアミノメチル）−２，４（ジチオ）ウラシル；５−（メチルアミノメチル）−４−（チオ）ウラシル；５−（プロピニル）ウラシル；５−（トリフルオロメチル）ウラシル；５−アミノアリール−ウリジン；５−ブロモ−ウリジン；５−ヨード−ウリジン；５−ウラシル；６（アゾ）ウラシル；６−（アゾ）ウラシル；６−アザ−ウリジン；アリアミノ−ウラシル；アザウラシル；デアザウラシル；Ｎ３（メチル）ウラシル；シュード−ＵＴＰ−１−２−エタン酸；シュードウラシル；４−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−カルボキシメチル−シュードウリジン；１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン；１−プロピニル−ウリジン；１−タウリノメチル−１−メチル−ウリジン；１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン；１−タウリノメチル−シュードウリジン；２−メトキシ−４−チオ−シュードウリジン；２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン；２−チオ−１−メチル−シュードウリジン；２−チオ−５−アザ−ウリジン；２−チオ−ジヒドロシュードウリジン；２−チオ−ジヒドロウリジン；２−チオ−シュードウリジン；４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン；４−メトキシ−シュードウリジン；４−チオ−１−メチル−シュードウリジン；４−チオ−シュードウリジン；５−アザ−ウリジン；ジヒドロシュードウリジン；（±）１−（２−ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（２Ｒ）−１−（２−ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（２Ｓ）−１−（２−ヒドロキシプロピル）シュードウリジンＴＰ；（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）アラ−ウリジンＴＰ；（Ｅ）−５−（２−ブロモ−ビニル）ウリジンＴＰ；（Ｚ）−５−（２−ブロモ−ビニル）アラ−ウリジンＴＰ；（Ｚ）−５−（２−ブロモ−ビニル）ウリジンＴＰ；１−（２，２，２−トリフルオロエチル）−シュード−ＵＴＰ；１−（２，２，３，３，３−ペンタフルオロプロピル）シュードウリジンＴＰ；１−（２，２−ジエトキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１−（２，４，６−トリメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（２，４，６−トリメチル−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１−（２，４，６−トリメチル−フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−（２−アミノ−２−カルボキシエチル）シュード−ＵＴＰ；１−（２−アミノ−エチル）シュード−ＵＴＰ；１−（２−ヒドロキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１−（２−メトキシエチル）シュードウリジンＴＰ；１−（３，４−ビス−トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（３，４−ジメトキシベンジル）シュ��ドウリジンＴＰ；１−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュード−ＵＴＰ；１−（３−アミノ−プロピル）シュード−ＵＴＰ；１−（３−シクロプロピル−プロップ−２−イニル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−アミノ−４−カルボキシブチル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アミノ−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アミノ−ブチル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アミノ−フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−アジドベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−ブロモベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−クロロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−フルオロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−ヨードベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メタンスルホニルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メトキシ−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−メトキシ−フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−メチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−メチル−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−ニトロベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−ニトロ−ベンジル）シュード−ＵＴＰ；１（４−ニトロ−フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−（４−チオメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−トリフルオロメトキシベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（４−トリフルオロメチルベンジル）シュードウリジンＴＰ；１−（５−アミノ−ペンチル）シュード−ＵＴＰ；１−（６−アミノ−ヘキシル）シュード−ＵＴＰ；１，６−ジメチル−シュード−ＵＴＰ；１−［３−（２−｛２−［２−（２−アミノエトキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−エトキシ）−プロピオニル］シュードウリジンＴＰ；１−｛３−［２−（２−アミノエトキシ）−エトキシ］−プロピオニル｝シュードウリジンＴＰ；１−アセチルシュードウリジンＴＰ；１−アルキル−６−（１−プロピニル）−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−（２−プロピニル）−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−アリール−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−エチニル−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−ホモアリール−シュード−ＵＴＰ；１−アルキル−６−ビニル−シュード−ＵＴＰ；１−アリールシュードウリジンＴＰ；１−アミノメチル−シュード−ＵＴＰ；１−ベンゾイルシュードウリジンＴＰ；１−ベンジルオキシメチルシュード
ウリジンＴＰ；１−ベンジル−シュード−ＵＴＰ；１−ビオチニル−ＰＥＧ２−シュードウリジンＴＰ；１−ビオチニルシュードウリジンＴＰ；１−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−シアノメチルシュードウリジンＴＰ；１−シクロブチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロブチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロへプチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロへプチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロヘキシルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロヘキシル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロオクチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロオクチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロペンチルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロペンチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロプロピルメチル−シュード−ＵＴＰ；１−シクロプロピル−シュード−ＵＴＰ；１−エチル−シュード−ＵＴＰ；１−ヘキシル−シュード−ＵＴＰ；１−ホモアリールシュードウリジンＴＰ；１−ヒドロキシメチルシュードウリジンＴＰ；１−イソ−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−Ｍｅ−２−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−Ｍｅ−４−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−Ｍｅ−α−チオ−シュード−ＵＴＰ；１−メタンスルホニルメチルシュードウリジンＴＰ；１−メトキシメチルシュードウリジンＴＰ；１−メチル−６−（２，２，２−トリフルオロエチル）シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−（４−モルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−（４−チオモルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−（置換フェニル）シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−アミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−アジド−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ブロモ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−クロロ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−シアノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ジメチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−エトキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−エチルカルボキシレート−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−エチル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−フルオロ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ホルミル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ヒドロキシアミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ヒドロキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ヨード−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−イソ−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−メトキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−メチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−フェニル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−ｔｅｒｔ−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−トリフルオロメトキシ−シュード−ＵＴＰ；１−メチル−６−トリフルオロメチル−シュード−ＵＴＰ；１−モルホリノメチルシュードウリジンＴＰ；１−ペンチル−シュード−ＵＴＰ；１−フェニル−シュード−ＵＴＰ；１−ピバロイルシュードウリジンＴＰ；１−プロパルギルシュードウリジンＴＰ；１−プロピル−シュード−ＵＴＰ；１−プロピニル−シュードウリジン；１−ｐ−トリル−シュード−ＵＴＰ；１−ｔｅｒｔ−ブチル−シュード−ＵＴＰ；１−チオメトキシメチルシュードウリジンＴＰ；１���チオモルホリノメチルシュードウリジンＴＰ；１−トリフルオロアセチルシュードウリジンＴＰ；１−トリフルオロメチル−シュード−ＵＴＰ；１−ビニルシュードウリジンＴＰ；２，２’−アンヒドロ−ウリジンＴＰ；２’−ブロモ−デオキシウリジンＴＰ；２’−Ｆ−５−メチル−２’−デオキシ−ＵＴＰ；２’−ＯＭｅ−５−Ｍｅ−ＵＴＰ；２’−ＯＭｅ−シュード−ＵＴＰ；２’−ａ−エチニルウリジンＴＰ；２’−ａ−トリフルオロメチルウリジンＴＰ；２’−ｂ−エチニルウリジンＴＰ；２’−ｂ−トリフルオロメチルウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’，２’−ジフルオロウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−メルカプトウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ａ−チオメトキシウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アミノウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−アジドウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ブロモウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−クロロウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−フルオロウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−ヨードウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−メルカプトウリジンＴＰ；２’−デオキシ−２’−ｂ−チオメトキシウリジンＴＰ；２−メトキシ−４−チオ−ウリジン；２−メトキシウリジン；２’−Ｏ−メチル−５−（１−プロピニル）ウリジンＴＰ；３−アルキル−シュード−ＵＴＰ；４’−アジドウリジンＴＰ；４’−炭素環式ウリジンＴＰ；４’−エチニルウリジンＴＰ；５−（１−プロピニル）アラ−ウリジンＴＰ；５−（２−フラニル）ウリジンＴＰ；５−シアノウリジンＴＰ；５−ジメチルアミノウリジンＴＰ；５’−ホモ−ウリジンＴＰ；５−ヨード−２’−フルオロ−デオキシウリジンＴＰ；５−フェニルエチニルウリジンＴＰ；５−トリデューテロメチル−６−デューテロウリジンＴＰ；５−トリフルオロメチル−ウリジンＴＰ；５−ビニルアラウリジンＴＰ；６−（２，２，２−トリフルオロエチル）−シュード−ＵＴＰ；６−（４−モルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；６−（４−チオモルホリノ）−シュード−ＵＴＰ；６−（置換−フェニル）−シュード−ＵＴＰ；６−アミノ−シュード−ＵＴＰ；６−アジド−シュード−ＵＴＰ；６−ブロモ−シュード−ＵＴＰ；６−ブチル−シュード−ＵＴＰ；６−クロロ−シュード−ＵＴＰ；６−シアノ−シュード−ＵＴＰ；６−ジメチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；６−エトキシ−シュード−ＵＴＰ；６−エチルカルボキシレート−シュード−ＵＴＰ；６−エチル−シュード−ＵＴＰ；６−フルオロ−シュード−ＵＴＰ；６−ホルミル−シュード−ＵＴＰ；６−ヒドロキシアミノ−シュード−ＵＴＰ；６−ヒドロキシ−シュード−ＵＴＰ；６−ヨード−シュード−ＵＴＰ；６−イソ−プロピル−シュード−ＵＴＰ；６−メトキシ−シュード−ＵＴＰ；６−メチルアミノ−シュード−ＵＴＰ；６−メチル−シュード−ＵＴＰ；６−フェニル−シュード−ＵＴＰ；６−フェニル−シュード−ＵＴＰ；６−プロピル−シュード−ＵＴＰ；６−ｔｅｒｔ−ブチル−シュード−ＵＴＰ；６−トリフルオロメトキシ−シュード−ＵＴＰ；６−トリフルオロメチル−シュード−ＵＴＰ；α−チオ−シュード−ＵＴＰ；シュードウリジン１−（４−メチルベンゼンスルホン��）ＴＰ；シュードウリジン１−（４−メチル安息香酸）ＴＰ；シュードウリジンＴＰ１−［３−（２−エトキシ）］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ  １−［３−｛２−（２−［２−（２−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ  １−［３−｛２−（２−［２−｛２（２−エトキシ）−エトキシ｝−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ  １−［３−｛２−（２−［２−エトキシ］−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ  １−［３−｛２−（２−エトキシ）−エトキシ｝］プロピオン酸；シュードウリジンＴＰ  １−メチルホスホン酸；シュードウリジンＴＰ  １−メチルホスホン酸ジエチルエステル；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−３−プロピオン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−４−ブタン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−５−ペンタン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−６−ヘキサン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−７−ヘプタン酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−メチル−ｐ−安息香酸；シュード−ＵＴＰ−Ｎ１−ｐ−安息香酸；ワイブトシン；ヒドロキシワイブトシン；イソワイオシン；ペルオキシワイブトシン；非修飾ヒドロキシワイブトシン；４−ジメチルワイオシン；２，６−（ジアミノ）プリン；１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１イル：１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノチアジン−ｌ−イル；１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１イル；１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン；２（アミノ）プリン；２，４，５−（トリメチル）フェニル；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ−シチジン；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ−アデニン；２’メチル、２’アミノ、２’アジド、２’フルロ−ウリジン；２’−アミノ−２’−デオキシリボース；２−アミノ−６−クロロ−プリン；２−アザ−イノシニル；２’−アジド−２’−デオキシリボース；２’フルオロ−２’−デオキシリボース；２’−フルオロ−修飾塩基；２’−Ｏ−メチル−リボース；２−オキソ−７−アミノピリドピリミジン−３イル；２−オキソ−ピリドピリミジン−３イル；２−ピリジノン；３ニトロピロール；３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリル；３−（メチル）イソカルボスチリル；４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンズイミダゾール；４−（メチル）ベンズイミダゾール；４−（メチル）インドリル；４，６−（ジメチル）インドリル；５ニトロインドール；５置換ピリミジン；５−（メチル）イソカルボスチリル；５−ニトロインドール；６−（アザ）ピリミジン；６−（アゾ）チミン；６−（メチル）−７−（アザ）インドリル；６−クロロ−プリン；６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノチアジン−ｌイル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１イル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−ｌ��３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノチアジン−ｌイル；７−（アミノアルキルヒドロキシ）−ｌ，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−ｌイル；７−（アザ）インドリル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジンｌイル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノチアジン−ｌイル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１イル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１イル；７−（グアニジニウムアルキル−ヒドロキシ）−ｌ，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノチアジン−ｌイル；７−（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）−ｌ，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−ｌイル；７−（プロピニル）イソカルボスチリル；７−（プロピニル）イソカルボスチリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル；７−デアザ−イノシニル；７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１イル；７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１イル；９−（メチル）−イミジゾピリジニル；アミノインドリル；アントラックエニル；ビス−オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３イル；ビス−オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３イル；ジフルオロトリル；ヒポキサンチン；イミジゾピリジニル；イノシニル；イソカルボスチリル；イソグアニシン；Ｎ２−置換プリン；Ｎ６−メチル−２−アミノ−プリン；Ｎ６−置換プリン；Ｎ−アルキル化誘導体；ナフタレニル；ニトロベンズイミダゾール；ニトロイミダゾイル；ニトロインダゾイル；ニトロピラゾイル；ヌブラリン；Ｏ６−置換プリン；Ｏ−アルキル化誘導体；オルト−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３イル；オルト−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３イル；オキソホルマイシンＴＰ；パラ−（アミノアルキルヒドロキシ）−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３イル；パラ−置換−６−フェニル−ピロロ−ピリミジン−２−オン−３イル；ペンタセニル；フェナントレニル；フェニル；プロ
ピニル−７−（アザ）インドリル；ピレニル；ピリドピリミジン−３イル；ピリドピリミジン−３イル、２−オキソ−７−アミノ−ピリドピリミジン−３イル；ピロロ−ピリミジン−２−オン−３イル；ピロロピリミジニル；ピロロピリジニル；スチルベンジル；置換１，２，４−トリアゾール；テトラセニル；ツベルシジン；キサンチン；キサントシン−５’−ＴＰ；２−チオ−ゼブラリン；５−アザ−２−チオ−ゼブラリン；７−デアザ−２−アミノ−プリン；ピリジン−４−オンリボヌクレオシド；２−アミノ−リボシド−ＴＰ；ホルマイシンＡ  ＴＰ；ホルマイシンＢ  ＴＰ；ピロロジンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−アデノシンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−シチジンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−ウリジンＴＰ；２’−ＯＨ−アラ−グアノシンＴＰ；５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジンＴＰ；及びＮ６−（１９−アミノ−ペンタオキサノナデシル）アデノシンＴＰが挙げられる。
【０３９２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾されたヌクレオ塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の組み合わせを含む。
【０３９３】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン（ψ）、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メチルウリジン、５−メトキシウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、１−エチル−シュードウリジン（ｅ１ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、α−チオ−グアノシン、α−チオ−アデノシン、５−シアノウリジン、４’−チオウリジン７−デアザ−アデニン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、及び２，６−ジアミノプリン、（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７−デアザ−グアノシン、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、２，８−ジメチルアデノシン、２−ゲラニルチオウリジン、２−リシジン、２−セレノウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）−５，６−ジヒドロウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）シュードウリジン、３−メチルシュードウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−２’−Ｏ−メチルウリジンメチルエステル、５−アミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−アミノメチル−２−セレノウリジン、５−アミノメチルウリジン、５−カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５−カルバモイルメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−セレノウリジン、５−シアノメチルウリジン、５−ヒドロキシシチジン、５−メチルアミノメチル−２−ゲラニルチオウリジン、７−アミノカルボキシプロピル−デメチルワイオシン、７−アミノカルボキシプロピルワイオシン、７−アミノカルボキシプロピルワイオシンメチルエステル、８−メチルアデノシン、Ｎ４，Ｎ４−ジメチルシチジン、Ｎ６−ホルミルアデノシン、Ｎ６−ヒドロキシメチルアデノシン、アグマチジン、環式Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、グルタミル−キューオシン、メチル化非修飾ヒドロキシワイブトシン、Ｎ４，Ｎ４，２’−Ｏ−トリメチルシチジン、ゲラニル化５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、ゲラニル化５−カルボキシメチルアミノメチル��２−チオウリジン、Ｑ塩基、ｐｒｅＱ０塩基、ｐｒｅＱ１塩基、ならびにそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオシドは、シュードウリジン、１−メチル−シュードウリジン、１−エチル−シュードウリジン、５−メチルシトシン、５−メトキシウリジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、前述の修飾されたヌクレオ塩基のうちの少なくとも２つ（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の組み合わせを含む。
【０３９４】
（ｉ）塩基修飾
ある特定の実施形態では、化学修飾は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）中のヌクレオ塩基における。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）中の修飾されたヌクレオ塩基は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）、１−エチル−シュードウリジン（ｅ１ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、シュードウリジン（ψ）、α−チオ−グアノシン、及びα−チオ−アデノシンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、前述の修飾されたヌクレオ塩基の少なくとも２つ（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の組み合わせを含む。
【０３９５】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、シュードウリジン（ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）を含む。いくつか実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、１−エチル−シュードウリジン（ｅ１ψ）を含む。いくつか実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ１ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、１−エチル−シュードウリジン（ｅ１ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、２−チオウリジン（ｓ２Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、２−チオウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、２’−Ｏ−メチルウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
【０３９６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾に均一に修飾されている（例えば、完全に修飾された、配列全体を通して修飾された）。例えば、ポリヌクレオチドは、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）で均一に修飾され得、ｍＲＮＡ配列中の全てのシトシン残基が、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）で置き換えられることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、上記に記載のもののうちのいずれか等の修飾された残基での置き換えによって、配列中に存在する任意の種類のヌクレオシド残基に均一に修飾され得る。
【０３９７】
いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム中で化学修飾されたヌクレオシドは、ウリジン、アデニン、シトシン、グアニン、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０３９８】
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたシトシンである。修飾されたシトシンを有するヌクレオ塩基及びヌクレオシドの例として、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジンが挙げられる。
【０３９９】
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたウリジンである。修飾されたウリジンを有する例としてのヌクレオ塩基及びヌクレオシドは、５−シアノウリジンまたは４’−チオウリジンを含む。
【０４００】
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたアデニンである。修飾されたアデニンを有する例としてのヌクレオ塩基及びヌクレオシドは、７−デアザ−アデニン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデニン（ｍ６Ａ）、及び２，６−Ｄｉアミノプリンを含む。
【０４０１】
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたグアニンである。修飾されたグアニンを有する例としてのヌクレオ塩基及びヌクレオシドは、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７−デアザ−グアノシン、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（ｐｒｅＱ１）、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシンを含む。
【０４０２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）中のヌクレオ塩基修飾ヌクレオチドは、５−メトキシウリジンである。
【０４０３】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、修飾されたヌクレオ塩基の少なくとも２つ（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の組み合わせを含む。
【０４０４】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチド）中の少なくとも９５％の種類のヌクレオ塩基（例えば、ウラシル）は、修飾されたヌクレオ塩基である。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡをコードするｍＲＮＡポリヌクレオチド）中の少なくとも９５％のウラシルは、５−メトキシウラシルである。
【０４０５】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、５−メトキシウリジン（５ｍｏ５Ｕ）及び５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）を含む。
【０４０６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡポリヌクレオチド等のＲＮＡポリヌクレオチド）は、特定の修飾に均一に修飾されている（例えば、完全に修飾された、配列全体を通して修飾された）。例えば、ポリヌクレオチドは、５−メトキシウリジンで均一に修飾され得、実質的には、ｍＲＮＡ配列中の全てウリジンの残基が５−メトキシウリジンで置き換えられることを意味する。同様に、ポリヌクレオチドは、上記に記載のもののうちのいずれか等の修飾された残基での置き換えによって、配列中に存在する任意の種類のヌクレオシド残基に均一に修飾され得る。
【０４０７】
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたシトシンである。
【０４０８】
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたウラシルである。修飾されたウラシルを有する例としてのヌクレオ塩基及びヌクレオシドは、５−メトキシウラシルを含む。
【０４０９】
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたアデニンである。
【０４１０】
いくつかの実施形態では、修飾されたヌクレオ塩基は、修飾されたグアニンである。
【０４１１】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のヌクレオ塩基、糖、骨格、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％化学修飾されている。
【０４１２】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のウリジンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％化学修飾されている。
【０４１３】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のアデノシンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％化学修飾されている。
【０４１４】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のシチジンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％化学修飾されている。
【０４１５】
いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム中のグアノシンヌクレオシドは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％化学修飾されている。
【０４１６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ヌクレオシド間で任意の有用なリンカーを含み得る。本開示の組成物において有用である、骨格修飾を含むかかるリンカーとしては、以下に限定されないが、３’−アルキレンホスホネート、３’−アミノホスホルアミデート、骨格を含むアルケン、アミノアルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル、ボラノホスフェート、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、キラルホスホネート、キラルホスホロチオエート、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレン（メチルイミノ）、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、モルホリノ結合、−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−、ヘテロ原子ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオシド、ホスフィネート、ホスホルアミデート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオエートヌクレオシド管結合、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、ＰＮＡ、シロキサン骨格、スルファメート骨格、スルフィドスルホキシド及びスルホン骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにチオノホスホルアミデートが挙げられる。
【０４１７】
（ｉｉ）糖修飾
ポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるようなＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に組み込まれ得る、修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチド（例えば、ビルディングブロック分子）は、リボ核酸の糖上で修飾され得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、数多くの異なる置換で修飾または置き換えられ得る。２’−位置における例となる置換としては、これらに限定されないが、Ｈ、ハロ、任意選択で置換されるＣ１−６アルキル；任意選択で置換されるＣ１−６アルコキシ；任意選択で置換されるＣ６−１０アリールオキシ；任意選択で置換されるＣ３−８シクロアルキル；任意選択で置換されるＣ３−８シクロアルコキシ；任意選択で置換されるＣ６−１０アリールオキシ；任意選択で置換されるＣ６−１０アリール−Ｃ１−６アルコキシ、任意選択で置換されるＣ１−１２（ヘテロシクリル）オキシ；糖（例えば、リボース、ペントース、または本明細書に記載されるいずれかのもの）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ、式中、Ｒは、Ｈまたは任意選択で置換されるアルキル、ｎは、０〜２０（例えば、０〜４、０〜８、０〜１０、０〜１６、１〜４、１〜８、１〜１０、１〜１６、１〜２０、２〜４、２〜８、２〜１０、２〜１６、２〜２０、４〜８、４〜１０、４〜１６、及び４〜２０）の整数であり；２’−ヒドロキシルが、Ｃ１−６アルキレンまたはＣ１−６ヘテロアルキレンによって連結されている「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）は、４’−同じリボース糖の炭素に架橋し、例となるブリッジは、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノブリッジを含み；本明細書に定義されるアミノアルキル；本明細書に定義されるアミノアルコキシ；本明細書に定義されるアミノ；及び本明細書に定義されるアミノ酸が挙げられる。
【０４１８】
一般に、ＲＮＡは、糖基リボースを含み、それは、酸素を有する５員環である。例となる、非限定的に修飾されたヌクレオチドは、リボース中で酸素の置き換え（例えば、Ｓ、Ｓｅ、またはメチレンまたはエチレン等のアルキレン）；二重結合の追加（例えば、シクロペンタニルまたはシクロヘキセニルでリボースを置き換える）；リボースの環縮小（例えば、シクロブタンまたはオキセタンの４員環を形成する）；リボースの環拡大（例えば、アンヒドロヘキシトール、アルトリトール、マンニトール、シクロヘキサニル、シクロヘキセニル、及びホスホルアミデート骨格も有するモルホリノ等への追加の炭素またはヘテロ原子を有する６または７員環）；多環式形態（例えば、トリシクロ；及びグルコール核酸（ＧＮＡ）等の「ロック解除された」形態（例えば、Ｒ−ＧＮＡまたはＳ−ＧＮＡ、リボースは、ホスホジエステル結合に結合されるグリコール単位によって置き換えられる）、トレオース核酸（リボースがα−Ｌ−トレオフラノシル−（３’→２’）で置き換えられる、ＴＮＡ）、及びペプチド核酸（２−アミノ−エチル−グリシン結合がリボース及びホスホジエステル骨格を置き換える、ＰＮＡ）を含む。糖基はまた、リボース中の対応する炭素の炭素よりも立体化学的配置を保有する１つ以上の炭素を含み得る。したがって、ポリヌクレオチド分子は、例えば、糖としてアラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。かかる糖修飾は、国際特許公開第ＷＯ２０１３／０５２５２３号及び第ＷＯ２０１４／０９３９２４号に教示され、その各々の内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０４１９】
（ｉｉｉ）修飾の組み合わせ
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または機能的断片またはそのバリアントを含むポリヌクレオチド）は、糖、ヌクレオ塩基、及び／またはヌクレオシド間結合への修飾の組み合わせを含み得る。これらの組み合わせは、本明細書に記載される任意の１つ以上の修飾を含み得る。
【０４２０】
修飾されたヌクレオチドの組み合わせは、本発明のポリヌクレオチドを形成するために使用され得る。特に記述がない限り、修飾されたヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの天然ヌクレオチドに完全に置換され得る。非限定的な例として、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に記載される修飾されたヌクレオシドで置換され得る。別の非限定的な例では、天然ヌクレオチドウリジンは、本明細書に開示される少なくとも１つの修飾されたヌクレオシドで部分的に置換または置き換えられ得る（例えば、約０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９．９％）。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせは、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得、及びかかる修飾は、国際特許公報ＷＯ２０１３／０５２５２３及びＷＯ２０１４／０９３９２４、ならびに米国公開第ＵＳ２０１３／０１１５２７２号及び第ＵＳ２０１５／０３０７５４２号に教示され、その各々の内容は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０４２１】
１１．非翻訳領域（ＵＴＲ）
非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳されていない開始コドン（５’ＵＴＲ）の前及び停止コドン（３’ＵＴＲ）の後のポリヌクレオチドの核酸部分である。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、ＵＴＲ（例えば、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの組み合わせ）をさらに含む。
【０４２２】
ＵＴＲは、ポリヌクレオチド中のコード領域に対して相同または異種であり得る。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦに対して相同である。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、ＧＬＡポリペプチドをコードするＯＲＦに対して異種である。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上の５’ＵＴＲまたはその機能的断片を含み、それらの各々が、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上の３’ＵＴＲまたはその機能的断片を含み、それらの各々が、同じまたは異なるヌクレオチド配列を有する。
【０４２３】
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、配列最適化されている。
【０４２４】
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲもしくはその機能的断片、３’ＵＴＲもしくはその機能的断片、またはそれらの任意の組み合わせは、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、１−メチルシュードウリジンまたは５−メトキシウラシルを含む。
【０４２５】
ＵＴＲは、調節的役割を提供する特徴、例えば、増加または減少された安定性、局在化、及び／または翻訳効率性を有し得る。ＵＴＲを含むポリヌクレオチドは、細胞、組織、または有機体に投与され得、１つ以上の調節的特徴は、日常の方法を使用して測定され得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲ機能的断片は、それぞれ、完全長５’または３’ＵＴＲの１つ以上の調節特徴を有する。
【０４２６】
天然５’ＵＴＲは、翻訳開始における役割を果たす特徴を生む。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始することによるプロセスに含まれることで一般に知られているＫｏｚａｋ配列のようなシグネチャーを含む。Ｋｏｚａｋ配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）のプリン（アデニンまたはグアニン）の３つの塩基上流であり、別の「Ｇ」が後に続く。５’ＵＴＲはまた、伸長因子結合中に含まれる二次的構造を形成することで知られている。
【０４２７】
特定の標的臓器の豊富に発現された遺伝子において典型的に見出される特徴を操作することによって、１つはポリヌクレオチドの安定性及びタンパク質生成を増大させ得る。例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、α−フェトタンパク質、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子等の肝臓−発現ｍＲＮＡの５’ＵＴＲの導入は、肝細胞株または肝臓におけるポリヌクレオチドの発現を増大させ得る。同様に、組織中の発現を改善するための他の組織−特定のｍＲＮＡの５’ＵＴＲの使用は、筋肉（例えば、ＭｙｏＤ、ミオシン、ミオグロビン、ミオゲニン、ヘルクリン）、内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ−１、ＣＤ３６）、骨髄系細胞（例えば、Ｃ／ＥＢＰ、ＡＭＬ１、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ１１ｂ、ＭＳＲ、Ｆｒ−１、ｉ−ＮＯＳ）、白血球（例えば、ＣＤ４５、ＣＤ１８）、脂肪組織（例えば、ＣＤ３６、ＧＬＵＴ４、ＡＣＲＰ３０、アディポネクチン）、及び肺上皮細胞（例えば、ＳＰ−Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）に可能である。
【０４２８】
いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、タンパク質が共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する転写のファミリーから選択される。例えば、コードされるポリペプチドは、タンパク質（すなわち、少なくとも１つの機能、構造、特徴、局在化、起源、または発現パターンを共有する）のファミリーに属し得、それは、特定の細胞、組織、または発達中のある時点で発現される。任意の遺伝子またはｍＲＮＡのＵＴＲは、タンパク質の同じまたは異なるファミリーの任意の他のＵＴＲと交換され、新しいポリヌクレオチドを作製し得る。
【０４２９】
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、異種であり得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、３’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、５’ＵＴＲとは異なる種に由来し得る。
【０４３０】
共有される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０２１５２２号（公開第ＷＯ／２０１４／１６４２５３、その全体において参照により本明細書に組み込まれる）は、ＯＲＦに対する隣接領域として本発明のポリヌクレオチドにおいて利用され得る例となるＵＴＲの一覧を提供する。
【０４３１】
本出願の例となるＵＴＲとしては、これらに限定されないが、α−またはβ−グロビン（例えば、ツメガエル、マウス、ラビット、またはヒトグロビン）等のグロビン；強度のＫｏｚａｋ翻訳開始シグナル；ＣＹＢＡ（例えば、ヒトチトクロムｂ−２４５  αポリペプチド）；アルブミン（例えば、ヒトアルブミン７）；ＨＳＤ１７Ｂ４（ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ）；ウイルス（例えば、タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、デングウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１））、肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス）、シンドビスウイルス、またはＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス）；ヒートショックタンパク質（例えば、ｈｓｐ７０）；翻訳開始因子（例えば、ｅｌＦ４Ｇ）；グルコース輸送体（例えば、ｈＧＬＵＴ１（ヒトグルコース輸送体１））；アクチン（例えば、ヒトαまたはβアクチン）；ＧＡＰＤＨ；チューブリン；ヒストン；クエン酸回路酵素；トポイソメラーゼ（例えば、５’ＴＯＰモチーフを欠乏するＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ（オリゴピリミジントラクト））；リボソームタンパク質大３２（Ｌ３２）；リボソームタンパク質（例えば、例えばｒｐｓ９等のヒトまたはマウスリボソームタンパク質）；ＡＴＰシンターゼ（例えば、ミトコンドリアＨ＋−ＡＴＰシンターゼのＡＴＰ５Ａ１またはβサブユニット）；成長ホルモンｅ（例えば、ウシ（ｂＧＨ）またはヒト（ｈＧＨ））；伸長因子（例えば、伸長因子１  α１（ＥＥＦ１Ａ１））；マンガンスーパオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）；筋細胞エンハンサー因子２Ａ（ＭＥＦ２Ａ）；β−Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ、クレアチンキナーゼ、ミオグロビン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）；コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、α２（Ｃｏｌ１Ａ２）、Ｉ型コラーゲン、α１（Ｃｏｌ１Ａ１）、ＶＩ型コラーゲン、α２（Ｃｏｌ６Ａ２）、ＶＩ型コラーゲン、α１（Ｃｏｌ６Ａ１））；リボホリン（例えば、リボホリンＩ（ＲＰＮＩ））；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（例えば、ＬＲＰ１）；カルジオトロフィン様サイトカイン因子（例えば、Ｎｎｔ１）；カルレティキュリン（Ｃａｌｒ）；プロコラーゲン−リジン、２−オキソグルタレート５−ジオキシゲナーゼ１（Ｐｌｏｄ１）；及びヌクレオビンディン（例えば、Ｎｕｃｂ１）の核酸配列に由来する１つ以上の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲが挙げられる。
【０４３２】
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、β−グロビン５’  ＵＴＲ；強度のＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ；チトクロムｂ−２４５  αポリペプチド（ＣＹＢＡ）５’ＵＴＲ；ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ（ＨＳＤ１７Ｂ４）５’ＵＴＲ；タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）５’ＵＴＲ；ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＴＥＥＶ）５’ＵＴＲ；非構造タンパク質をコードする風疹ウイルス（ＲＶ）ＲＮＡの５’近位オープンリーディングフレーム；デングウイルス（ＤＥＮ）５’ＵＴＲ；ヒートショックタンパク質７０（Ｈｓｐ７０）５’ＵＴＲ；ｅＩＦ４Ｇ  ５’ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１  ５’ＵＴＲ；それらの機能的断片、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０４３３】
いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、β−グロブリン３’ＵＴＲ；ＣＹＢＡ  ３’ＵＴＲ；アルブミン３’  ＵＴＲ；成長ホルモン（ＧＨ）３’ＵＴＲ；ＶＥＥＶ３’ＵＴＲ；Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）３’ＵＴＲ；α−グロビン３’ＵＴＲ；ＤＥＮ  ３’ＵＴＲ；ＰＡＶオオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ−ＰＡＶ）３’ＵＴＲ；伸長因子１  α１（ＥＥＦ１Ａ１）３’ＵＴＲ；マンガンスーパオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤ）３’ＵＴＲ；βサブユニットミトコンドリアＨ（＋）−ＡＴＰシンターゼ（β−ｍＲＮＡ）３’  ＵＴＲ；ＧＬＵＴ１  ３’ＵＴＲ；ＭＥＦ２Ａ  ３’ＵＴＲ；β−Ｆ１−ＡＴＰａｓｅ  ３’ＵＴＲ；それらの機能的断片、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０４３４】
任意の遺伝子またはｍＲＮＡに由来する野生型ＵＴＲは、発明のポリヌクレオチドに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、野生型または天然ＵＴＲに対して変化され得、例えば、ＯＲＦに対してＵＴＲの方向付けまたは位置を変更することによって、またはヌクレオチドの追加、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオドの交換または輸送を含むことによってバリアントＵＴＲを生成する。いくつかの実施形態では、５’または３’ＵＴＲのバリアントは、例えば、野生型ＵＴＲの変異体、またはバリアントが利用され得、１つ以上のヌクレオチドは、ＵＴＲの末端に追加されるか、またはそこから除去される。
【０４３５】
さらに、１つ以上の合成ＵＴＲは、１つ以上の非合成ＵＴＲと組み合わせて使用され得る。例えば、Ｍａｎｄａｌ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  ８（３）：５６８−８２、及びｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／Ｄｅｒｒｉｃｋ＿Ｒｏｓｓｉ／で利用可能な配列を参照されたい。各々の内容は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。ＵＴＲまたはその部分は、それらが選択されたものからの転写においてと同じ方向付けで配置され得るか、または方向付けもしくは位置において変化され得る。それ故に、５’及び／または３’ＵＴＲは、転化、短縮、延長され得るか、または１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲと組み合わされ得る。
【０４３６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、複数のＵＴＲ、例えば、二重、三重、または四重５’ＵＴＲもしくは３’ＵＴＲを含む。例えば、二重ＵＴＲは、連続してまたは実質的に連続してのいずれかで同じＵＴＲの２つのコピーを含む。例えば、二重β−グロブリン３’ＵＴＲが使用され得る（ＵＳ２０１０／０１２９８７７を参照されたく、その内容は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４３７】
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるＵＴＲのうちのいずれかから選択される５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲを含む。
【０４３８】
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、
５’ＵＴＲ−００１（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号３３）；
５’ＵＴＲ−００２（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＧＡＵＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号３４）；
５’ＵＴＲ−００３（上流ＵＴＲ）（配列番号３５を参照されたい）；
５’ＵＴＲ−００４（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＧＧＣＡＵＵＣＣＧＧＵＡＣＵＧＵＵＧＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号３６）；
５’ＵＴＲ−００５（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＧＡＵＣＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号３７）；
５’ＵＴＲ−００６（上流ＵＴＲ）
（ＧＧＡＡＵＡＡＡＡＧＵＣＵＣＡＡＣＡＣＡＡＣＡＵＡＵＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＡＡＵＣＵＣＡＡＧＣＡＡＵＣＡＡＧＣＡＵＵＣＵＡＣＵＵＣＵＡＵＵＧＣＡＧＣＡＡＵＵＵＡＡＡＵＣＡＵＵＵＣＵＵＵＵＡＡＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＵＵＵＵＣＵＧＡＡＡＡＵＵＵＵＣＡＣＣＡＵＵＵＡＣＧＡＡＣＧＡＵＡＧＣＡＡＣ）（配列番号３８）；
５’ＵＴＲ−００７（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＵＵＧＧＣＡＵＵＣＣＧＧＵＡＣＵＧＵＵＧＧＵＡＡＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号３９）；
５’ＵＴＲ−００８（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＵＵＡＡＣＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４０）；
５’ＵＴＲ−００９（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＵＡＧＡＣＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４１）；
５’ＵＴＲ−０１０、上流（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＵＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４２）；
５’ＵＴＲ−０１１（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４３）；
５’ＵＴＲ−０１２（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＵＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４４）；
５’ＵＴＲ−０１３（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４５）；
５’ＵＴＲ−０１４（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＵＡＧＡＧＡＧＵＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＡＡＧＵＡＧＡＡＵＵＡＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４６）；
５’ＵＴＲ−１５（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＵＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４７）；
５’ＵＴＲ−０１６（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＵＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４８）；
５’ＵＴＲ−０１７（上流ＵＴＲ）（ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＵＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号４９）；または
５’ＵＴＲ−０１８（上流ＵＴＲ）
（ＵＣＡＡＧＣＵＵＵＵＧＧＡＣＣＣＵＣＧＵＡＣＡＧＡＡＧＣＵＡＡＵＡＣＧＡＣＵＣＡＣＵＡＵＡＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ）（配列番号５０）を含む。
【０４３９】
いくつかの実施形態では、３’  ＵＴＲは、
１４２−３ｐ  ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２−３ｐを含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５１）；
１４２−３ｐ  ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２−３ｐを含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５２）；
１４２−３ｐ  ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２−３ｐを含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５３）；
１４２−３ｐ  ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２−３ｐを含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５４）；
１４２−３ｐ  ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２−３ｐを含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５５）；
１４２−３ｐ  ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２−３ｐを含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５６）；
１４２−３ｐ  ３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２−３ｐを含むＵＴＲ）
（ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ）（配列番号５７）；
３’ＵＴＲ−００１（クレアチンキナーゼＵＴＲ）（配列番号５８を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−００２（ミオグロビンＵＴＲ）（配列番号５９を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−００３（α−アクチンＵＴＲ）（配列番号６０を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−００４（アルブミンＵＴＲ）（配列番号６１を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−００５（α−グロブリンＵＴＲ）（配列番号６２を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−００６（Ｇ−ＣＳＦ  ＵＴＲ）（配列番号６３を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−００７（Ｃｏｌ１ａ２；コラーゲン、Ｉ型、α２ＵＴＲ）（配列番号６４を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−００８（Ｃｏｌ６ａ２；コラーゲン、ＶＩ型、α２ＵＴＲ）（配列番号６５を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−００９（ＲＰＮ１；リボホリン  Ｉ  ＵＴＲ）（配列番号６６を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−０１０（ＬＲＰ１；低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１ＵＴＲ）（配列番号６７を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−０１１（Ｎｎｔ１；カルジオトロフィン様サイトカイン因子１ＵＴＲ）（配列番号６８を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−０１２（Ｃｏｌ６ａ１；コラーゲン、ＶＩ型、α１ＵＴＲ）（配列番号６９を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−０１３（Ｃａｌｒ；カルレティキュリンＵＴＲ）（配列番号７０を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−０１４（Ｃｏｌ１ａ１；コラーゲン、Ｉ型、α１ＵＴＲ（配列番号７１を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−０１５（Ｐｌｏｄ１；プロコラーゲン−リジン、２−オキソグルタレート５−オキシゲナーゼ１ＵＴＲ）（配列番号７２を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−０１６（Ｎｕｃｂ１；クレオビンディン１ＵＴＲ）（配列番号７３を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−０１７（α−グロビン）（配列番号７４を参照されたい）；
３’ＵＴＲ−０１８（配列番号７５を参照されたい）；
３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２＋ｍｉＲ１２６バリアント１）
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号８１）；
３’ＵＴＲ（ｍｉＲ  １４２−３ｐ及びｍｉＲ  １２６−３ｐ結合部位バリアント２）
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号８２）；または
３’ＵＴＲ（ｍｉＲ１４２結合部位）
ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＵＡＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＵＣＣＡＵＡＡＡＧＵＡＧＧＡＡＡＣＡＣＵＡＣＡＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡＧＵＧＧＧＣＧＧＣ（配列番号１６１）を含む。
【０４４０】
ある特定の実施形態では、本発明の５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ配列は、配列番号３３〜５０、７７、及び１１５〜１１７のうちのいずれか含む５’ＵＴＲ配列及び／または配列番号５１〜７５、８１〜８２、８８、１０３、１０６〜１１３、１１８、及び１６１−１７０のうちのいずれか、ならびにそれらの任意の組み合わせを含む３’ＵＴＲ配列からなる群から選択される配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０４４１】
本発明のポリヌクレオチドは、特徴の組み合わせを含み得る。例えば、ＯＲＦは、強度なＫｏｚａｋ翻訳開始シグナルを含む５’ＵＴＲ及び／またはポリ−Ａテールのテンプレート追加のためのオリゴ（ｄＴ）配列を含む３’ＵＴＲが隣接し得る。５’ＵＴＲは、同じ及び／または異なるＵＴＲの第１のポリヌクレオチド断片及び第２のポリヌクレオチド断片を含む（例えば、ＵＳ２０１０／０２９３６２５を参照されたく、その全体において参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４４２】
他の非ＵＴＲ配列は、本発明のポリヌクレオチド内で領域またはサブ領域として使用され得る。例えば、イントロンまたはイントロン配列の部分は、本発明のポリヌクレオチドへ組み込まれ得る。イントロン配列の組み込みは、タンパク質生成ならびにポリヌクレオチド発現レベルを増加させ得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＵＴＲの代わりまたはそれに加えて、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む（例えば、Ｙａｋｕｂｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１０  ３９４（１）：１８９−１９３を参照されたく、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ配列の代わりにＩＲＥＳを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＯＲＦ及びウイルスカプシド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、非合成３’ＵＴＲと組み合わせた５’ＵＴＲを含む。
【０４４３】
いくつかの実施形態では、ＵＴＲはまた、少なくとも１つの翻訳エンハンサーポリヌクレオチド、翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）エンハンサー要素、または翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ）エンハンサー要素を含む（集合的には、ポリヌクレオチドから生成されるポリペプチドまたはタンパク質の量を増加させる核酸配列を指す、「ＴＥＥ」）。非限定的な例として、ＴＥＥは、ＵＳ２００９／０２２６４７０に記載されているものを含み得、その全体において参照により本明細書に組み込まれ、他のものは当該技術分野で既知である。非限定的な例として、ＴＥＥは、転写プロモーター及び開始コドンの間に位置され得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ＴＥＥを含む。
【０４４４】
一態様では、ＴＥＥは、これらに限定されないが、キャップ依存またはキャップ独立翻訳等の核酸の翻訳活性を促進し得るＵＴＲ中の保存要素である。
【０４４５】
一非限定的な例では、ＴＥＥは、Ｇｔｘホームドメインタンパク質の５’−リーダーにおいてＴＥＥ配列を含む。Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２００４  １０１：９５９０−９５９４を参照されたく、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０４４６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＥＥうちの１つまたは複数のコピーを含む。翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中のＴＥＥは、１つ以上の配列セグメントにおいて組織化され得る。配列セグメントは、本明細書に提供されるＴＥＥのうちの１つ以上を含み得、各ＴＥＥは、１つ以上のコピー中に存在する。複数の配列セグメントが、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中に存在する間、それらは、相同または異種であり得る。したがって、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド中の複数の配列セグメントは、同一もしくは異なる種類の本明細書に提供されるＴＥＥ、同一もしくは異なる数のＴＥＥの各々のコピー、及び／または各配列セグメント内の同一もしくは異なる組織のＴＥＥを含み得る。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、翻訳エンハンサーポリヌクレオチド配列を含む。ＴＥＥ配列の非限定的な例は、米国公開２０１４／０２００２６１に記載されており、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０４４７】
１２．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位
本発明のポリヌクレオチドは、調節エレメント、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）結合部位、転写因子結合部位、構造化ｍＲＮＡ配列及び／またはモチーフ、外因性核酸結合分子のシュード−受容体として作用するように操作された人工結合部位、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、かかる調節エレメントを含むポリヌクレオチドは、「センサー配列」を含むとしても称される。センサー配列の非限定的な例は、米国公開２０１４／０２００２６１に記載されており、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０４４８】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）をさらに含む。ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の封入または組み込みは、組織特異的及び／または天然に生じるｍｉＲＮＡの細胞型特異的発現に基づいて、本発明のポリヌクレオチド、及び今度は、それからコードされるポリペプチドの調節を提供する。
【０４４９】
本発明は、また、医薬組成物及び上述されるポリヌクレオチドのいずれかを含む製剤を提供する。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
【０４５０】
いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、ポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化された核酸配列を含むポリヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、ポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化された核酸配列に対する著しい配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。
【０４５１】
ｍｉＲＮＡ、例えば、天然に生じるｍｉＲＮＡは、安定性を低減することか、またはポリヌクレオチドの翻訳を阻害することのいずれかによって、ポリヌクレオチドに結合し、遺伝子発現を下方制御する、１９〜２５ヌクレオチド長非コーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち、成熟ｍｉＲＮＡの位置２〜８の領域における配列を含む。ｍｉＲＮＡシードは、成熟ｍｉＲＮＡの位置２〜８または２〜７を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、７つのヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含み得て、対応するｍｉＲＮＡ結合部位においてシード補完部位は、ｍｉＲＮＡ位置１に対置されるアデノシン（Ａ）に隣接する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡシードは、６つのヌクレオチド（例えば、成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含み得て、対応するｍｉＲＮＡ結合部位においてシード補完部位は、ｍｉＲＮＡ位置１に対置されるアデノシン（Ａ）に隣接する。例えば、Ｇｒｉｍｓｏｎ  Ａ，Ｆａｒｈ  ＫＫ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ，Ｌｉｍ  ＬＰ，Ｂａｒｔｅｌ  ＤＰ；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２００７  Ｊｕｌ  ６；２７（１）：９１−１０５を参照されたい。標的細胞または組織のｍｉＲＮＡプロファイリングは、細胞または組織におけるｍｉＲＮＡの存在または非存在を決定するために行われ得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、１つ以上のマイクロＲＮＡ結合部位、マイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ補完配列、またはマイクロＲＮＡシード補完配列を含む。かかる配列は、その各々の内容が、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国公開ＵＳ２００５／０２６１２１８及び米国公開ＵＳ２００５／００５９００５で教示されるもの等の任意の既知のマイクロＲＮＡに対応、例えば、相補性を有し得る。
【０４５２】
マイクロＲＮＡは、それ自体の上で折り返して、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（前駆体−ｍｉＲＮＡ）としばしば称される低分子ヘアピン型構造を形成するＲＮＡ転写物の領域に酵素的に由来する。ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、典型的に、その３’末端で２−ヌクレオチドオーバーハングを有し、３’ヒドロキシル基及び５’リン酸基を有する。この前駆体−ｍＲＮＡは、核でプロセシングされ、その後細胞質に輸送され、これはＤＩＣＥＲ（ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ  酵素）によってさらにプロセシングされて、おおよそ２２ヌクレオチドの成熟マイクロＲＮＡを形成する。成熟マイクロＲＮＡは、次いで、リボ核粒子に組み込まれて、遺伝子サイレンシングを媒介するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体、ＲＩＳＣを形成する。成熟ｍｉＲＮＡの当該技術分野で認識されている述語は、典型的には、成熟ｍｉＲＮＡが由来するｐｒｅ−ｍｉＲＮＡのアームを指し、「５ｐ」はマイクロＲＮＡがｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヘアピンの５プライムアームからであり、「３ｐ」はマイクロＲＮＡがｐｒｅ−ｍｉＲＮＡヘアピンの３プライム末端からであることを意味する。本明細書において数字によって指されるｍｉＲは、同じｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（例えば、３ｐまたは５ｐマイクロＲＮＡのいずれか）の逆のアームに起源を持つ２つの成熟マイクロＲＮＡのいずれかを称し得る。本明細書において言及される全てのｍｉＲは、３ｐまたは５ｐの指名によって特に特定されない限り、３ｐアーム／配列及び５ｐアーム／配列の両方を含むことを意図する。
【０４５３】
本明細書で使用されるとき、用語「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）結合部位」は、ｍｉＲＮＡに相互作用、会合、または結合するためにｍｉＲＮＡの全てまたは一領域に十分な相補性を有する、ポリヌクレオチド内、例えば、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ中を含む、ＤＮＡ内またはＲＮＡ転写物内の配列を指す。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするＯＲＦを含み、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）をさらに含む。例となる実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）を含む。
【０４５４】
ｍｉＲＮＡに十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ介在性調節、例えば、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ介在性翻訳抑制または分解を容易にするのに十分な相補性の程度を指す。本発明の例となる態様では、ｍｉＲＮＡに十分な相補性を有するｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドのｍｉＲＮＡ介在性分解、例えば、ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ誘導されたＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）介在性切断を容易にするのに十分な相補性の程度を指す。ｍｉＲＮＡ結合部位は、例えば、１９〜２５ヌクレオチド長ｍｉＲＮＡ配列、１９〜２３ヌクレオチド長ｍｉＲＮＡ配列、または２２ヌクレオチド長ｍｉＲＮＡ配列に相補性を有し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡの一部分にのみ、例えば、天然に生じるｍｉＲＮＡ配列の完全長の１、２、３、もしくは４ヌクレオチド未満の一部分に、または天然に生じるｍｉＲＮＡ配列より短い１、２、３、もしくは４ヌクレオチド未満の一部分に相補性であり得る。完全（ｆｕｌｌ）または完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）な相補性（例えば、天然に生じるｍｉＲＮＡの長さの全体または著しい部分にわたる完全（ｆｕｌｌ）な相補性または完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）な相補性）が、所望の調節がｍＲＮＡ分解である場合、好ましい。
【０４５５】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡシード配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と相補性（例えば、部分的または完全な相補性）を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ配列と完全な相補性を有するが、１、２、または３ヌクレオチド置換、末端付加、及び／またはトランスケーションとは有さない。
【０４５６】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡと同じ長さである。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、または両方における対応するｍｉＲＮＡより短い、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヌクレオチド（複数可）である。依然として他の実施形態では、マイクロＲＮＡ結合部位は、５’末端、３’末端、または両方における対応マイクロＲＮＡより短い２ヌクレオチドである。対応するｍｉＲＮＡより短いｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ結合部位のうちの１つ以上を組み込むｍＲＮＡを分解することまたはｍＲＮＡの翻訳を予防することが依然として可能である。
【０４５７】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、Ｄｉｃｅｒを含有する活性ＲＩＳＣの部分である対応する成熟ｍｉＲＮＡに結合する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位のＲＩＳＣ中の対応するｍｉＲＮＡへの結合は、ｍｉＲＮＡ結合部位を含有するｍＲＮＡを分解するか、またはｍＲＮＡが翻訳されることを予防する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体が、ｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドを切断するように、ｍｉＲＮＡに十分な相補性を有する。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体がｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドにおいて不安定性を誘発するように、不完全な相補性を有する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡを含むＲＩＳＣ複合体がｍｉＲＮＡ結合部位を含むポリヌクレオチドの転写を抑制するように、不完全な相補性を有する。
【０４５８】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡとの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のミスマッチ（複数可）を有する。
【０４５９】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、対応するｍｉＲＮＡの少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の、それぞれ、近接ヌクレオチドに相補的な、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、または少なくとも約２１の近接ヌクレオチドを有する。
【０４６０】
１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を本発明のポリヌクレオチド内に操作することによって、当該のｍｉＲＮＡが利用可能である場合、ポリヌクレオチドは分解または低減された翻訳に対して標的化され得る。これは、ポリヌクレオチドの送達の際にオフターゲット効果を低減し得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドが組織または細胞に送達されることが意図されないがこの組織または細胞中に行きつく場合、組織または細胞中の豊富なｍｉＲＮＡは、１つまたは複数のｍｉＲＮＡの結合部位がポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ内に操作される場合、目的の遺伝子の発現を阻害し得る。故に、いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の本開示のｍＲＮＡへの組み込みは、核酸分子の送達の際のオフターゲット効果の危険を低減し、及び／またはｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現の組織特異型調節を可能にし得る。なおも他の実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の本開示のｍＲＮＡへの組み込みが、インビボでの核酸送達の際に免疫応答を調節し得る。さらなる実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位の本開示のｍＲＮＡへの組み込みが、本明細書に記載の脂質含有化合物及び組成物の急速な血中クリアランス（ＡＢＣ）を調節し得る。
【０４６１】
反対に、ｍｉＲＮＡ結合部位は、特異型組織におけるタンパク質発現を増加するために、天然に生じるポリヌクレオチド配列から除去され得る。例えば、特異型ｍｉＲＮＡの結合部位は、ｍｉＲＮＡを含有する組織または細胞におけるタンパク質発現を向上するためにポリヌクレオチドから除去され得る。
【０４６２】
複数の組織における発現の調節は、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、１つ以上の明確に異なるｍｉＲＮＡ結合部位の導入または除去を通して達成され得る。ｍｉＲＮＡ結合部位を除去または挿入するかどうかの決定は、発達及び／または疾患における組織及び／または細胞中のｍｉＲＮＡ発現パターン及び／またはそれらのプロファイリングに基づいて行われ得る。ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、ならびにそれらの発現パターン及び生物学における役割の同定は、報告されてきた（例えば、Ｂｏｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１０  １１：９４３−９４９；Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０１２  ２６：４０４−４１３（２０１１  Ｄｅｃ  ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；Ｂａｒｔｅｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９  １３６：２１５−２３３；Ｌａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７  １２９：１４０１−１４１４；Ｇｅｎｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２  ８０：３９３−４０３、及びその中の全ての参考文献、その各々がそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４６３】
ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ結合部位は、その各々がそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、米国公開第２０１４／０２００２６１号、第２００５／０２６１２１８号、及び第２００５／００５９００５号で記載される非限定的な例を含む任意の既知の配列に対応し得る。
【０４６４】
ｍｉＲＮＡがｍＲＮＡ、及びそれによりタンパク質発現を調節することが既知である組織の例には、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−１ｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）、及び肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が含まれるが、これらに限定されない。
【０４６５】
具体的には、ｍｉＲＮＡは、免疫細胞（造血細胞とも呼ばれる）、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞及びマクロファージ）、マクロファージ、単球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、顆粒球、ナチュラルキラー細胞等中で異なって発現することが既知である。免疫細胞特異型ｍｉＲＮＡは、免疫原性、自己免疫、感染に対する免疫応答、炎症、ならびに遺伝子療法及び組織／臓器移植後の不要な免疫応答に関与する。免疫細胞特異型ｍｉＲＮＡは、また、造血細胞（免疫細胞）の発達、増殖、分化、及びアポトーシスの多くの態様を調節する。例えば、ｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１４６は、免疫細胞中に排他的に発現し、骨髄樹状細胞中で特に豊富である。ポリヌクレオチドに対する免疫応答は、ｍｉＲ−１４２結合部位をポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲに添加することによって遮断され得て、組織及び細胞においてより多くの安定した遺伝子導入を可能にすることが示されてきた。ｍｉＲ−１４２は、抗原提示細胞中で外因性ポリヌクレオチドを効率的に分解し、形質導入細胞の細胞毒性除去を抑制する（例えば、Ａｎｎｏｎｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００９，１１４，５１５２−５１６１；Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  ｍｅｄ．２００６，１２（５），５８５−５９１；Ｂｒｏｗｎ  ＢＤ，ｅｔ  ａｌ．，ｂｌｏｏｄ，２００７，１１０（１３）：４１４４−４１５２、その各々がそれらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）。
【０４６６】
抗原媒介性免疫応答は、生物に侵入する時に抗原提示細胞によってプロセシングされ、抗原提示細胞の表面上に提示される、外来性抗原によって引き起こされる免疫応答を指し得る。Ｔ細胞は、提示される抗原を認識し、抗原を発現する細胞の細胞毒性除去を誘発し得る。
【０４６７】
ｍｉＲ−１４２結合部位を本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲに導入することは、ｍｉＲ−１４２媒介性分解を介して抗原提示細胞中の遺伝子発現を選択的に抑制し得て、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）中の抗原提示を制限し、それによりポリヌクレオチドの送達後に抗原媒介性免疫応答を予防する。ポリヌクレオチドは、次いで、細胞毒性除去を引き起こすことなしで標的組織または細胞中で安定的に発現する。
【０４６８】
一実施形態では、免疫細胞、特に、抗原提示細胞中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡの結合部位は、ｍｉＲＮＡ媒介性ＲＮＡ分解を介して抗原提示細胞中のポリヌクレオチドの発現を抑制するために、本発明のポリヌクレオチド内に操作され得て、抗原媒介性免疫応答を抑止する。ポリヌクレオチドの発現は、免疫細胞特異型ｍｉＲＮＡが発現しない非免疫細胞中で維持される。例えば、いくつかの実施形態では、肝臓特異型タンパク質に対する免疫原性応答を予防するために、任意のｍｉＲ−１２２結合部位は、除去され得て、ｍｉＲ−１４２（及び／またはｍｉｒＲ−１４６）結合部位は、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ内に操作され得る。
【０４６９】
ＡＰＣ及びマクロファージ中に選択的な分解及び抑圧をさらに駆動するために、本発明のポリヌクレオチドは、単独でまたはｍｉＲ−１４２及び／またはｍｉＲ−１４６結合部位との組み合わせのいずれかで、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ中にさらなる陰性の調節エレメントを含み得る。非限定的な例としては、さらなる陰性の調節エレメントは、Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ｄｅｃａｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔ（ＣＤＥ）である。
【０４７０】
免疫細胞特異型ｍｉＲＮＡには、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｈｓａ−７ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｃ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｅ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｉ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１１８４、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−１−−３ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−２−−５ｐ、ｈｓａ−ｌｅｔ−７ｆ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７９、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１４７ａ、ｍｉＲ−１４７ｂ、ｍｉＲ−１４８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−３ｐ、ｍｉＲ−１５０−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ｂ、ｍｉＲ−１５５−３ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１６−１−３ｐ、ｍｉＲ−１６−２−３ｐ、ｍｉＲ−１６−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−３ｐ、ｍｉＲ−１８２−５ｐ、ｍｉＲ−１９７−３ｐ、ｍｉＲ−１９７−５ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２２３−３ｐ、ｍｉＲ−２２３−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−１−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ−３ｐ，ｍｉＲ−２７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２８−３ｐ、ｍｉＲ−２８−５ｐ、ｍｉＲ−２９０９、ｍｉＲ−２９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２９ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３３１−５ｐ、ｍｉＲ−３３９−３ｐ、ｍｉＲ−３３９−５ｐ、ｍｉＲ−３４５−３ｐ、ｍｉＲ−３４５−５ｐ、ｍｉＲ−３４６、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、ｍｉＲ−３７２、ｍｉＲ−３７７−３ｐ、ｍｉＲ−３７７−５ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、ｍｉＲ−５４２、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｊ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５７４−３ｐ、ｍｉＲ−５９８、ｍｉＲ−７１８、ｍｉＲ−９３５、ｍｉＲ−９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。さらに、新規のｍｉＲＮＡは、マイクロアレイハイブリダイゼーション及びミクロトーム分析を介して免疫細胞中で識別され得る（例えば、Ｊｉｍａ  ＤＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，２０１０，１１６：ｅ１１８−ｅ１２７；Ｖａｚ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１０，１１，２８８、その各々の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０４７１】
肝臓中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１０７、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１２２−５ｐ、ｍｉＲ−１２２８−３ｐ、ｍｉＲ−１２２８−５ｐ、ｍｉＲ−１２４９、ｍｉＲ−１２９−５ｐ、ｍｉＲ−１３０３、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１５２、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−５５７、ｍｉＲ−５８１、ｍｉＲ−９３９−３ｐ、及びｍｉＲ−９３９−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の肝臓特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、肝臓でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。肝臓特異型ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらに本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組み合わせで、操作され得る。
【０４７２】
肺中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１２７−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１３４、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２４−１−５ｐ、ｍｉＲ−２４−２−５ｐ、ｍｉＲ−２４−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３２−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−３ｐ、ｍｉＲ−３３７−５ｐ、ｍｉＲ−３８１−３ｐ、及びｍｉＲ−３８１−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の肺特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、肺でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。肺特異型ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらに本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組み合わせで、操作され得る。
【０４７３】
心臓中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１８６−３ｐ、ｍｉＲ−１８６−５ｐ、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−４９９ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７４４−３ｐ、ｍｉＲ−７４４−５ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の心臓特異型マイクロＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、心臓でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。心臓特異型ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらに本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組み合わせで、操作され得る。
【０４７４】
神経系中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１２４−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−１−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１２５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２７１−３ｐ、ｍｉＲ−１２７１−５ｐ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３２−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１３５ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１３７、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−３ｐ、ｍｉＲ−１４９−５ｐ、ｍｉＲ−１５３、ｍｉＲ−１８１ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−１８１ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−１８３−３ｐ、ｍｉＲ−１８３−５ｐ、ｍｉＲ−１９０ａ、ｍｉＲ−１９０ｂ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ，ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３２９、ｍｉＲ−３４２−３ｐ、ｍｉＲ−３６６５、ｍｉＲ−３６６６、ｍｉＲ−３８０−３ｐ、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−３８３、ｍｉＲ−４１０、ｍｉＲ−４２５−３ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−４５４−３ｐ、ｍｉＲ−４５４−５ｐ、ｍｉＲ−４８３、ｍｉＲ−５１０、ｍｉＲ−５１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−５７１、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−７−５ｐ、ｍｉＲ−８０２、ｍｉＲ−９２２、ｍｉＲ−９−３ｐ、及びｍｉＲ−９−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。神経系中で濃縮されるｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１３２−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１５１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１２−３ｐ、ｍｉＲ−２１２−５ｐ、ｍｉＲ−３２０ｂ、ｍｉＲ−３２０ｅ、ｍｉＲ−３２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−５ｐ、ｍｉＲ−３２５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−９２２が含まれるが、これらに限定されない、ニューロン中で特異的に発現するもの、ならびにｍｉＲ−１２５０、ｍｉＲ−２１９−１−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−２−３ｐ、ｍｉＲ−２１９−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０６５−３ｐ、ｍｉＲ−３０６５−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｅ−５ｐ、ｍｉＲ−３２−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−５ｐ、及びｍｉＲ−６５７が含まれるが、これらに限定されない、グリア細胞中で特異的に発現するものをさらに含む。任意のＣＮＳ特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、神経系でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。神経系特異型ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらに本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組み合わせで、操作され得る。
【０４７５】
膵臓中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１０５−３ｐ、ｍｉＲ−１０５−５ｐ、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１９５−３ｐ、ｍｉＲ−１９５−５ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２１４−５ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−７−１−３ｐ、ｍｉＲ−７−２−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−３ｐ、ｍｉＲ−４９３−５ｐ、及びｍｉＲ−９４４が含まれるが、これらに限定されない。任意の膵臓特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、膵臓でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。膵臓特異型ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらに本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組み合わせで、操作され得る。
【０４７６】
腎臓中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−１２２−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１９２−３ｐ、ｍｉＲ−１９２−５ｐ、ｍｉＲ−１９４−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２０４−３ｐ、ｍｉＲ−２０４−５ｐ、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２１６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−１−３ｐ、ｍｉＲ−３０ｃ−２−３ｐ、ｍｉＲ３０ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３２４−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−３ｐ、ｍｉＲ−３３５−５ｐ、ｍｉＲ−３６３−３ｐ、ｍｉＲ−３６３−５ｐ、及びｍｉＲ−５６２が含まれるが、これらに限定されない。任意の腎臓特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、腎臓でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。腎臓特異型ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらに本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組み合わせで、操作され得る。
【０４７７】
筋肉中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ−７ｇ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２８６、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８８−３ｐ、ｍｉＲ−１８８−５ｐ、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２５−３ｐ、及びｍｉＲ−２５−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。任意の筋肉特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、筋肉でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。筋肉特異型ｍｉＲＮＡ結合部位は、単独でまたはさらに本発明のポリヌクレオチド中の免疫細胞（例えば、ＡＰＣ）ｍｉＲＮＡ結合部位との組み合わせで、操作され得る。
【０４７８】
ｍｉＲＮＡは、また、例えば、内皮細胞、上皮細胞、及び脂肪細胞だが、これらに限定されない、異なる種類の細胞中で異なって発現する。
【０４７９】
内皮細胞中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１００−３ｐ、ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｍｉＲ−１０１−３ｐ、ｍｉＲ−１０１−５ｐ、ｍｉＲ−１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−１２３６−３ｐ、ｍｉＲ−１２３６−５ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１７−５ｐ、ｍｉＲ−１７−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−１−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−２−５ｐ、ｍｉＲ−１９ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２０ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２１７、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−２１−３ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２１−３ｐ、ｍｉＲ−２２１−５ｐ、ｍｉＲ−２２２−３ｐ、ｍｉＲ−２２２−５ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２９６−５ｐ、ｍｉＲ−３６１−３ｐ、ｍｉＲ−３６１−５ｐ、ｍｉＲ−４２１、ｍｉＲ−４２４−３ｐ、ｍｉＲ−４２４−５ｐ、ｍｉＲ−５１３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−１−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−２−５ｐ、ｍｉＲ−９２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−９２ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９２ｂ−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。多くの新規のｍｉＲＮＡは、ディープシークエンシング分析から内皮細胞中で発見される（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＶｏｅｌｌｅｎｋｌｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，２０１２，１８，４７２−４８４）。任意の内皮細胞特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、内皮細胞でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。
【０４８０】
上皮細胞中で発現することが既知であるｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ−７ｂ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−２００ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ａ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３３８−３ｐ、ｍｉＲ−４２９、ｍｉＲ−４５１ａ、ｍｉＲ−４５１ｂ、ｍｉＲ−４９４、ｍｉＲ−８０２及びｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３４ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−４４９ａ、ｍｉＲ−４４９ｂ−３ｐ、呼吸器線毛上皮細胞中に特異なｍｉＲ−４４９ｂ−５ｐ、ｌｅｔ−７ファミリー、ｍｉＲ−１３３ａ、ｍｉＲ−１３３ｂ、肺上皮細胞中に特異なｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−３８２−３ｐ、腎臓上皮細胞中に特異なｍｉＲ−３８２−５ｐ、ならびに角膜上皮細胞中に特異なｍｉＲ−７６２が含まれるが、これらに限定されない。任意の上皮細胞特異型ｍｉＲＮＡからのｍｉＲＮＡ結合部位は、上皮細胞でのポリヌクレオチドの発現を調節するために、本発明のポリヌクレオチドに導入され得るか、または本発明のポリヌクレオチドから除去され得る。
【０４８１】
加えて、ｍｉＲＮＡの大群は、胚性幹細胞中で濃縮され、幹細胞自己再生ならびに様々な細胞、例えば神経細胞、心臓、造血細胞、肌細胞、骨原性細胞、及び筋肉細胞の発達及び／または分化を制御する（例えば、Ｋｕｐｐｕｓａｍｙ  ＫＴ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２０１３，１３（５），７５７−７６４；Ｖｉｄｉｇａｌ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｖｅｎｔｕｒａ  Ａ，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．２０１２，２２（５−６），４２８−４３６；Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０−６２１；Ｙｏｏ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ．２０１２，２１（１１），２０４９−２０５７、その各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。胚性幹細胞において豊富なｍｉＲＮＡには、ｌｅｔ−７ａ−２−３ｐ、ｌｅｔ−ａ−３ｐ、ｌｅｔ−７ａ−５ｐ、ｌｅｔ７ｄ−３ｐ、ｌｅｔ−７ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−２−３ｐ、ｍｉＲ−１０３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１０６ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１２４６、ｍｉＲ−１２７５、ｍｉＲ−１３８−１−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−２−３ｐ、ｍｉＲ−１３８−５ｐ、ｍｉＲ−１５４−３ｐ、ｍｉＲ−１５４−５ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−２９０、ｍｉＲ−３０１ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０１ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｃ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−３ｐ、ｍｉＲ−３０２ｄ−５ｐ、ｍｉＲ−３０２ｅ、ｍｉＲ−３６７−３ｐ、ｍｉＲ−３６７−５ｐ、ｍｉＲ−３６９−３ｐ、ｍｉＲ−３６９−５ｐ、ｍｉＲ−３７０、ｍｉＲ−３７１、ｍｉＲ−３７３、ｍｉＲ−３８０−５ｐ、ｍｉＲ−４２３−３ｐ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−４８６−５ｐ、ｍｉＲ−５２０ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｅ、ｍｉＲ−５４８ｆ、ｍｉＲ−５４８ｇ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｇ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｉ、ｍｉＲ−５４８ｋ、ｍｉＲ−５４８ｌ、ｍｉＲ−５４８ｍ、ｍｉＲ−５４８ｎ、ｍｉＲ−５４８ｏ−３ｐ、ｍｉＲ−５４８ｏ−５ｐ、ｍｉＲ−５４８ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−６６４ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−７６６−３ｐ、ｍｉＲ−７６６−５ｐ、ｍｉＲ−８８５−３ｐ、ｍｉＲ−８８５−５ｐ，ｍｉＲ−９３−３ｐ、ｍｉＲ−９３−５ｐ、ｍｉＲ−９４１、ｍｉＲ−９６−３ｐ、ｍｉＲ−９６−５ｐ、ｍｉＲ−９９ｂ−３ｐ、及びｍｉＲ−９９ｂ−５ｐが含まれるが、これらに限定されない。多くの予期される新規のｍｉＲＮＡは、ヒト胚性幹細胞におけるディープシークエンシングによって発見される（例えば、Ｍｏｒｉｎ  ＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００８，１８，６１０−６２１；Ｇｏｆｆ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００９，４：ｅ７１９２；Ｂａｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，２００８，２６，２４９６−２５０５、その各々の内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０４８２】
一実施形態では、胚性幹細胞特異型ｍｉＲＮＡの結合部位は、胚性幹細胞の発達及び／または分化を調節するために、変性状態（例えば変性疾患）で幹細胞の老化を阻害するために、または、疾患状態で幹細胞の老化及びアポトーシスを刺激するために、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに含まれ得るか、または本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲから除去され得る。
【０４８３】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、造血系の免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、ならびにＴＬＲ７／ＴＬＲ８を発現することが既知である及び／またはサイトカイン、例えば内皮細胞及び血小板を分泌することができる細胞における発現及び存在量に基づいて選択される。いくつかの実施形態では、故に、ｍｉＲＮＡ組は、本発明のポリヌクレオチド中の対応するｍｉＲ部位組み込み（例えば、ｍＲＮＡ）が、特異型細胞型中のｍＲＮＡの不安定化及び／またはこれらのｍＲＮＡからの翻訳の抑圧をもたらし得るように、部分的にこれらの細胞の免疫原性の原因となり得るｍｉＲを含む。非限定的な代表例としては、造血細胞のうち多くに特異な、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、及びｍｉＲ−２２３、Ｂ細胞に発現する、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ−１６、及びｍｉＲ−２２３、前駆体造血細胞に発現する、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１６、ならびに形質細胞様樹状細胞、血小板、及び内皮細胞に発現するｍｉＲ−１２６が挙げられる。ｍｉＲの組織発現のさらなる考察に関しては、例えば、Ｔｅｒｕｅｌ−Ｍｏｎｔｏｙａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９：ｅ１０２２５９；Ｌａｎｄｇｒａｆ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ  １２９：１４０１−１４１４；Ｂｉｓｓｅｌｓ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＲＮＡ  １５：２３７５−２３８４を参照されたい。３’ＵＴＲ及び／または５’ＵＴＲにおける任意の１つのｍｉＲ部位組み込みは、複数の目的の細胞型において、かかる効果を媒介し得る（例えば、ｍｉＲ−１４２は、Ｂ細胞及び樹状細胞の両方において豊富である）。
【０４８４】
いくつかの実施形態では、複数のｍｉＲを有する同じ細胞型を標的にし、両方が豊富である（例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ１４２−５ｐの両方が、造血幹細胞において豊富である）場合、３ｐ及び５ｐアームの各々への結合部位を組み込むことは有益であり得る。故に、ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、（ｉ）（多くの造血細胞中で発現する）ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、及びｍｉＲ−２２３からなる群、または（ｉｉ）（Ｂ細胞中で発現する）ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１６、及びｍｉＲ−２２３からなる群、もしくは（前駆体造血細胞中で発現する）ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１６からなる群からの、２つ以上の（例えば、２、３、４つ以上の）ｍｉＲ結合部位を含有する。
【０４８５】
いくつかの実施形態では、複数の目的の細胞型が同時に標的にされるように、様々なｍｉＲを組み合わせることが、また、有益であり得る（例えば、造血系及び内皮細胞のうちの多くの細胞を標的にするｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１２６）。故に、例えば、ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、（ｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、造血系細胞（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、またはｍｉＲ−２２３）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、形質細胞様樹状細胞、血小板、もしくは内皮細胞（例えば、ｍｉＲ−１２６）を標的とするか、または（ｉｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、Ｂ細胞（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ−１６、またはｍｉＲ−２２３）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、形質細胞様樹状細胞、血小板、もしくは内皮細胞（例えば、ｍｉＲ−１２６）を標的とするか、または（ｉｉｉ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、前駆体造血細胞（例えば、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−２６ａ、またはｍｉＲ−１６）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、形質細胞様樹状細胞、血小板、または内皮細胞（例えば、ｍｉＲ−１２６）を標的とするか、または（ｉｖ）ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、造血系細胞（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、またはｍｉＲ−２２３）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、Ｂ細胞（例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ１５０、ｍｉＲ−１６、またはｍｉＲ−２２３）を標的とし、ｍｉＲのうちの少なくとも１つは、形質細胞様樹状細胞、血小板、または内皮細胞（ｍｉＲ−１２６）を標的とするか、またはｍｉＲ結合部位の前述の４つの分類（すなわち、造血系細胞を標的とするもの、Ｂ細胞を標的とするもの、前駆体造血細胞を標的とするもの、及び／または形質細胞様樹状細胞／血小板／内皮細胞を標的とするもの）の任意の他の可能な組み合わせである２つ以上の（例えば、２、３、４つ以上の）ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
【０４８６】
一実施形態では、免疫応答を調節するために、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、（例えば、末梢性リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞中で）炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する従来の免疫細胞または任意の細胞中に発現する１つ以上のｍｉＲに結合する１つ以上のｍｉＲＮＡ結合配列を含み得る。ＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、（例えば、末梢性リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞中で）炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する従来の免疫細胞または任意の細胞中に発現する１つ以上のｍｉＲのｍＲＮＡへの組み込みが、免疫細胞活性化（例えば、活性化されたＢ細胞の頻度によって計測されるＢ細胞活性化）及び／またはサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、及び／またはＴＮＦαの産生）を低減または阻害することが今や発見された。さらに、ＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、（例えば、末梢性リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞中で）炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する従来の免疫細胞または任意の細胞中に発現する１つ以上のｍｉＲのｍＲＮＡへの組み込みが、ｍＲＮＡによってコードされる目的のタンパク質に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答を低減または阻害することが今や発見された。
【０４８７】
別の実施形態では、脂質含有化合物または組成物中に送達されるポリヌクレオチドの加速血中クリアランスを調節するために、本発明のポリヌクレオチドは、ＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、（例えば、末梢性リンパ器官及び／または脾細胞及び／または内皮細胞の免疫細胞中で）炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する従来の免疫細胞または任意の細胞中で発現する１つ以上のｍｉＲＮＡに結合する１つ以上のｍｉＲ結合配列を含み得る。１つ以上のｍｉＲ結合部位のｍＲＮＡへの組み込みは、ｍＲＮＡの送達に使用するための脂質含有化合物または組成物の急速な血中クリアランス（ＡＢＣ）を低減または阻害することが今や発見された。さらに、１つ以上のｍｉＲ結合部位のｍＲＮＡへの組み込みは、抗ＰＥＧ抗ＩｇＭの血清レベルを低減する（例えば、Ｂ細胞によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を認識するＩｇＭの急性産生を低減もしくは阻害する）及び／またはｍＲＮＡを含む脂質含有化合物または組成物の投与の後に形質細胞様樹状細胞の増殖及び／または活性化を低減もしくは阻害することが今や発見された。
【０４８８】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲ配列は、免疫細胞で発現する任意の既知のマイクロＲＮＡに対応し得て、これは米国公開ＵＳ２００５／０２６１２１８及び米国公開ＵＳ２００５／００５９００５で教示され、その内容が、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれるものを含むが、それらに限定されない。免疫細胞で発現するｍｉＲの非限定的な例としては、脾臓細胞、骨髄細胞、樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び／またはマクロファージで発現するものが挙げられる。例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、及びｍｉＲ−２７は、骨髄細胞中で発現し、ｍｉＲ−１５５は、樹状細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞中で発現し、ｍｉＲ−１４６は、ＴＬＲ刺激の際、マクロファージ中でアップレギュレートされ、ｍｉＲ−１２６は、形質細胞様樹状細胞中で発現する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ（複数可）は、免疫細胞中で豊富にまたは優先的に発現する。例えば、ｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐ及び／またはｍｉＲ−１４２−５ｐ）、ｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐ及び／またはｍｉＲ−１２６−５ｐ）、ｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３ｐ及び／またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、及びｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐ及び／またはｍｉＲ１５５−５ｐ）は、免疫細胞中で豊富に発現する。これらのマイクロＲＮＡ配列は、当該技術分野で知られており、故に、当業者は、ワトソン−クリック相補性に基づいて、これらのマイクロＲＮＡが結合する結合配列または標的配列を容易に設計し得る。
【０４８９】
したがって、様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、及びｍｉＲ−２７からなる群から選択されるｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位を含む。別の実施形態では、ｍＲＮＡは、免疫細胞中に発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含む。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中に発現するマイクロＲＮＡのための１〜４、１、２、３、または４のｍｉＲ結合部位を含む。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３つのｍｉＲ結合部位を含む。これらのｍｉＲ結合部位は、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるマイクロＲＮＡのためであり得る。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中に発現する同じｍｉＲ結合部位の２つ以上の（例えば、２、３、４つの）コピー、例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７からなるｍｉＲの群から選択されるｍｉＲ結合部位の２つ以上のコピーを含む。
【０４９０】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、同じｍｉＲ結合部位の３つのコピーを含む。ある特定の実施形態では、同じｍｉＲ結合部位の３つのコピーの使用は、単一のｍｉＲ結合部位の使用と比較して有益な特性を示し得る。３つのｍｉＲ結合部位を含有する３’ＵＴＲのための配列の非限定的な例は、配列番号１０６（３つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位）及び配列番号１０８（３つのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位）に示される。
【０４９１】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中に発現する少なくとも２つの異なるｍｉＲ結合部位の２つ以上の（例えば、２、３、４つの）コピーを含む。２つ以上の異なるｍｉＲ結合部位を含有する３’ＵＴＲの配列の非限定的な例は、配列番号８１（１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位）、配列番号８２（１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位）、配列番号１０３（１つのｍｉＲ１２６−３ｐ結合部位）、配列番号１０９（２つのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位）、及び配列番号１１２（２つのｍｉＲ−１５５−５ｐ結合部位及び１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位）に示される。
【０４９２】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中に発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、ｍｉＲ結合部位のうち１つは、ｍｉＲ−１４２−３ｐのためである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐまたはｍｉＲ−１５５−５ｐ）、ｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１４２−３ｐ及びｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐ）のための結合部位を含む。
【０４９３】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中に発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、ｍｉＲ結合部位のうち１つは、ｍｉＲ−１２６−３ｐのためである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１２６−３ｐ及びｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐまたはｍｉＲ−１５５−５ｐ）、ｍｉＲ−１２６−３ｐ及びｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３ｐまたはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１２６−３ｐ及びｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｍｉＲ−１４２−５ｐ）のための結合部位を含む。
【０４９４】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中に発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ−１４２−５ｐのためである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４２−５ｐ及びｍｉＲ−１５５（ｍｉＲ−１５５−３ｐまたはｍｉＲ−１５５−５ｐ）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ及びｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１４２−５ｐ及びｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐ）のための結合部位を含む。
【０４９５】
さらに別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、免疫細胞中に発現するマイクロＲＮＡのための少なくとも２つのｍｉＲ結合部位を含み、ｍｉＲ結合部位のうちの１つは、ｍｉＲ−１５５−５ｐのためである。様々な実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１５５−５ｐ及びｍｉＲ−１４２（ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｍｉＲ−１４２−５ｐ）、ｍｉＲ−１５５−５ｐ及びｍｉＲ−１４６（ｍｉＲ−１４６−３またはｍｉＲ−１４６−５ｐ）、またはｍｉＲ−１５５−５ｐ及びｍｉＲ−１２６（ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐ）のための結合部位を含む。
【０４９６】
ｍｉＲＮＡは、また、血管新生（例えば、ｍｉＲ−１３２）（Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６）等の複合生物学的プロセスを調節し得る。本発明のポリヌクレオチドにおいて、かかるプロセスに関与するｍｉＲＮＡ結合部位は、生物学的に関連性のある細胞型または関連性のある生物学的プロセスにポリヌクレオチドの発現を適合させるために除去または導入され得る。この文脈において、本発明のポリヌクレオチドは、栄養要求性ポリヌクレオチドとして定義される。
【０４９７】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含み、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ結合部位配列のうちの任意の１つ以上のうちの１つ以上のコピーを含む表３または表４から選択される１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、それらの任意の組み合わせを含む表３または表４から選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０以上の同じまたは異なるｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。
【０４９８】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２に結合するか、またはｍｉＲ−１４２に相補性がある。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１４２は、配列番号２８を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２−３ｐまたはｍｉＲ−１４２−５ｐに結合する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位は、配列番号３０を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位は、配列番号３２を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号３０または配列番号３２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
【０４９９】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６に結合するか、またはｍｉＲ−１２６に相補性がある。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２６は、配列番号８３を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６−３ｐまたはｍｉＲ−１２６−５ｐに結合する。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位は、配列番号８５を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１２６−５ｐ結合部位は、配列番号８７を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、配列番号８５または配列番号８７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一のヌクレオチド配列を含む。
【０５００】
一実施形態では、３’ＵＴＲは、２つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み、第１のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１４２に結合し、第２のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２６に結合する。具体的な実施形態では、ｍｉＲ−１４２及びｍｉＲ−１２６に結合する３’ＵＴＲは、配列番号８１または８２の配列を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。
【表３−１】
2019516719.tif 000067
【表３−２】
2019516719.tif 000068
【０５０１】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ポリヌクレオチドの任意の位置（例えば、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲ）で本発明のポリヌクレオチドに挿入される。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ポリヌクレオチド中の挿入部位は、対応するｍｉＲＮＡの非存在下で、ポリヌクレオチド中のｍｉＲＮＡ結合部位の挿入が機能的ポリペプチドの翻訳に干渉しない限り、ポリヌクレオチド中のどこでもよく、ｍｉＲＮＡの存在下で、ポリヌクレオチド中のｍｉＲＮＡ結合部位の挿入及び対応するｍｉＲＮＡへのｍｉＲＮＡ結合部位の結合は、ポリヌクレオチドを分解し得るか、またはポリヌクレオチドの翻訳を予防し得る。
【０５０２】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ＯＲＦを含む本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの停止コドンから下流にある少なくとも約３０ヌクレオチド中に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの停止コドンから下流にある少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、または少なくとも約１００ヌクレオチド中に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中のＯＲＦの停止コドンから下流にある約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド〜約９０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド〜約８０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド〜約６０ヌクレオチド、約４５ヌクレオチド〜約６５ヌクレオチド中に挿入される。
【０５０３】
いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ内のコード領域の停止コドン直後に３’ＵＴＲ内に挿入される。いくつかの実施形態では、構築物中に停止コドンの複数のコピーが存在する場合、ｍｉＲＮＡ結合部位は、最終停止コドン直後に挿入される。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、停止コドンのさらに下流で挿入され、その場合、停止コドンとｍｉＲ結合部位（複数可）との間に３’ＵＴＲ塩基が存在する。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲ中のｍｉＲに対する可能な挿入部位の３つの非限定的な例は、配列番号５１、５２、及び１１３に示され、これは、それぞれ、３’ＵＴＲ内の３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つ内に挿入されるｍｉＲ−１４２−３ｐ部位を有する３’ＵＴＲ配列を示す。
【０５０４】
いくつかの実施形態では、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位は、１つ以上の可能な挿入部位で５’ＵＴＲ内に位置付けられ得る。例えば、５’ＵＴＲ中のｍｉＲに対する可能な挿入部位の３つの非限定的な例は、配列番号１１５、１１６、及び１１７に示され、これは、それぞれ、５’ＵＴＲ内の３つの異なる可能な挿入部位のうちの１つ内に挿入されるｍｉＲ−１４２−３ｐ部位を有する５’ＵＴＲ配列を示す。
【０５０５】
一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、停止コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、停止コドン後の３’ＵＴＲの１〜１００ヌクレオチド内に位置する。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、停止コドンを含み、免疫細胞中で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、停止コドン後の３’ＵＴＲの３０〜５０ヌクレオチド内に位置する。別の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、停止コドンを含み、免疫細胞中で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、停止コドン後の３’ＵＴＲの少なくとも５０ヌクレオチド内に位置する。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、停止コドンを含み、免疫細胞中で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、停止コドン直後の３’ＵＴＲ内、または停止コドン後の３’ＵＴＲの１５〜２０ヌクレオチド内、または停止コドン後の３’ＵＴＲの７０〜８０ヌクレオチド内に位置する。他の実施形態では、３’ＵＴＲは、１つを超えるｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２〜４つのｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、各ｍｉＲＮＡ結合部位の間に（例えば、１０〜１００、２０〜７０、または３０〜５０ヌクレオチド長の）スペーサー領域が存在し得る。別の実施形態では、３’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の末端とポリＡ尾部ヌクレオチドとの間にスペーサー領域を含む。例えば、１０〜１００、２０〜７０、または３０〜５０ヌクレオチド長のスペーサー領域は、ｍｉＲＮＡ結合部位（複数可）の末端とポリＡ尾部の初めとの間に位置し得る。
【０５０６】
一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドン（の上流）前の５’ＵＴＲの１〜１００のヌクレオチド内に位置する。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞中で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドン（の上流）前の５’ＵＴＲの１０〜５０のヌクレオチド内に位置する。一実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞中で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドン（の上流）前の５’ＵＴＲの少なくとも２５のヌクレオチド内に位置する。他の実施形態では、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレームは、開始コドンを含み、免疫細胞中で発現するｍｉＲのための少なくとも１つのマイクロＲＮＡ結合部位は、開始コドン直前の５’ＵＴＲ内、または開始コドン前の５’ＵＴＲの１５〜２０のヌクレオチド内、または開始コドン前の５’ＵＴＲの７０〜８０のヌクレオチド内に位置する。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、１つを超えるｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、２〜４つのｍｉＲＮＡ結合部位）を含み、各ｍｉＲＮＡ結合部位の間に（例えば、１０〜１００、２０〜７０、または３０〜５０ヌクレオチド長の）スペーサー領域が存在し得る。
【０５０７】
一実施形態では、３’ＵＴＲは、１つを超える停止コドンを含み、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、停止コドンの下流に位置付けられる。例えば、３’ＵＴＲは、１、２、または３つの停止コドンを含み得る。使用され得る三重停止コドンの非限定的な例としては、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧ、ＵＧＡＵＡＧＵＡＡ、ＵＡＡＵＧＡＵＡＧ、ＵＧＡＵＡＡＵＡＡ、ＵＧＡＵＡＧＵＡＧ、ＵＡＡＵＧＡＵＧＡ、ＵＡＡＵＡＧＵＡＧ、ＵＧＡＵＧＡＵＧＡ、ＵＡＡＵＡＡＵＡＡ、及びＵＡＧＵＡＧＵＡＧが挙げられる。３’ＵＴＲ内で、例えば、１、２、３、または４つのｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位は、停止コドン（複数可）に直接隣接して、または最終停止コドンの下流にある任意の数のヌクレオチドで位置付けられ得る。３’ＵＴＲが複数のｍｉＲＮＡ結合部位を含む場合、これらの結合部位は、構築物中で互いに直接隣接して（すなわち、順に）位置づけられ得て、または、代替的に、スペーサーヌクレオチドは、各結合部位の間に位置付けられ得る。
【０５０８】
一実施形態では、３’ＵＴＲは、第３の停止コドンの下流に位置する単一のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を有する３つの停止コドンを含む。最終停止コドンの下流にある異なる位置に位置する３つの停止コドン及び単一のｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位を有する３’ＵＴＲの配列の非限定的な例は、以下の表４に示される。
【０５０９】
表４は、本出願の発明における有用なｍｉＲ配列、ｍｉＲ結合部位、及びＵＴＲの非限定的な例を含む。
【表４−１】
2019516719.tif 000069
【表４−２】
2019516719.tif 000070
【表４−３】
2019516719.tif 000071
【表４−４】
2019516719.tif 000072
【表４−５】
2019516719.tif 000073
【表４−６】
2019516719.tif 000074
停止コドン＝太字
ｍｉＲ１４２−３ｐ結合部位＝下線
ｍｉＲ１２６−３ｐ結合部位＝太字下線
ｍｉＲ１５５−５ｐ結合部位＝陰影付き
ｍｉＲ１４２−５ｐ結合部位＝陰影付き及び太字下線
【０５１０】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、目的のポリペプチドをコードするコドン最適化オープンリーディングフレーム、免疫細胞中に発現するｍｉＲのための少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む３’ＵＴＲ、及び連結したヌクレオシドの３’尾部領域を含む。様々な実施形態では、３’ＵＴＲは、免疫細胞中に発現する、好ましくは免疫細胞中に豊富または優先的に発現する、ｍｉＲのための１〜４つ、少なくとも２つ、１つ、２つ、３つ、または４つのｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
【０５１１】
一実施形態では、免疫細胞中に発現する少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号３０に示される配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ−１４２−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含むｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号８８に示される配列を含む。
【０５１２】
一実施形態では、免疫細胞中に発現する少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２６マイクロＲＮＡ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ−１２６結合部位は、ｍｉＲ−１２６−３ｐ結合部位である。一実施形態では、ｍｉＲ−１２６−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位は、配列番号８５に示される配列を含む。一実施形態では、ｍｉＲ−１２６−３ｐマイクロＲＮＡ結合部位を含む本発明のｍＲＮＡの３’ＵＴＲは、配列番号１０３に示される配列を含む。
【０５１３】
本開示のマイクロＲＮＡ結合部位（複数可）が結合し得るｍｉＲのための非限定的な例となる配列としては、以下、ｍｉＲ−１４２−３ｐ（配列番号２９）、ｍｉＲ−１４２−５ｐ（配列番号３１）、ｍｉＲ−１４６−３ｐ（配列番号８９）、ｍｉＲ−１４６−５ｐ（配列番号９０）、ｍｉＲ−１５５−３ｐ（配列番号９１）、ｍｉＲ−１５５−５ｐ（配列番号９２）、ｍｉＲ−１２６−３ｐ（配列番号８４）、ｍｉＲ−１２６−５ｐ（配列番号８６）、ｍｉＲ−１６−３ｐ（配列番号９３）、ｍｉＲ−１６−５ｐ（配列番号９４）、ｍｉＲ−２１−３ｐ（配列番号９５）、ｍｉＲ−２１−５ｐ（配列番号９６）、ｍｉＲ−２２３−３ｐ（配列番号９７）、ｍｉＲ−２２３−５ｐ（配列番号９８）、ｍｉＲ−２４−３ｐ（配列番号９９）、ｍｉＲ−２４−５ｐ（配列番号１００）、ｍｉＲ−２７−３ｐ（配列番号１０１）、及びｍｉＲ−２７−５ｐ（配列番号１０２）が挙げられる。免疫細胞中に発現する（例えば、免疫細胞中に豊富にまたは優先的に発現する）他の好適なｍｉＲ配列は、当該技術分野、例えば、マンチェスター大学のマイクロＲＮＡデータベース、ｍｉＲＢａｓｅで既知であり、利用可能である。前述のｍｉＲのうちいずれかを結合する部位が、ｍｉＲに対するワトソン−クリック相補性、ｍｉＲに対する典型的には１００％の相補性に基づいて、設計され得て、本明細書に記載される本開示のｍＲＮＡ構築物内に挿入され得る。
【０５１４】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、及びｍＲＮＡ、例えば、それらの３’ＵＴＲ）は、例えば、ＰＥＧに対してＢ細胞によりＩｇＭｓの産生を例えば低減または阻害することによって、及び／またはｐＤＣの増殖及び／または活性化を低減または阻害することによって、それにより加速血中クリアランスを低減または阻害する少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得て、コードされる目的のタンパク質の組織発現を調節するための少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。
【０５１５】
ｍｉＲＮＡ結合部位の間の距離は相当に変化し得て、２つのｍｉＲＮＡ結合部位の異なる配置を有するいくつかの異なる構築物が試験されてきて、全て機能的である。ある特定の実施形態では、ヌクレオチドスペーサーは、それぞれへのＲＩＳＣの結合を可能にするのに十分な長さの２つのｍｉＲＮＡ結合部位の間に位置付けられる。一実施形態では、２つのｍｉＲＮＡ結合部位は、互いから約４０塩基離れて位置付けられ、３’ＵＴＲの全長は、約１００〜１１０塩基である。
【０５１６】
ｍｉＲＮＡ遺伝子調節は、取り囲む配列の種類、配列の種類（例えば、異種、同種、外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）、外因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）、または人工）、取り囲む配列中の調節エレメント、及び／または取り囲む配列中の構造的エレメント等の、しかしそれに限定されない、ｍｉＲＮＡを取り囲む配列によって影響され得る。ｍｉＲＮＡは、５’ＵＴＲ及び／または３’ＵＴＲによって影響され得る。非限定的な例としては、非ヒト３’ＵＴＲは、同じ配列の種類のヒト３’ＵＴＲと比較して、目的のポリペプチドの発現に対するｍｉＲＮＡ配列の調節効果を増加し得る。
【０５１７】
一実施形態では、５’ＵＴＲの他の調節エレメント及び／または構造的エレメントが、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子調節に影響し得る。調節エレメント及び／または構造的エレメントの一実施例は、タンパク質翻訳を開始する翻訳伸長因子の結合に必要な５’ＵＴＲ中の構造化ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）である。５’−ＵＴＲ中のこの二次構造化エレメントに結合するＥＩＦ４Ａ２は、ｍｉＲＮＡ媒介性遺伝子発現に必要である（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍｅｉｊｅｒ  ＨＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４０，８２−８５）。本発明のポリヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ媒介性遺伝子調節を増大させるために、この構造化５’ＵＴＲをさらに含み得る。
【０５１８】
少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位が、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作され得る。この文脈では、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０以上のｍｉＲＮＡ結合部位が、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作され得る。例えば、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、２、または１つのｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチドの３’ＵＴＲに操作され得る。一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、同じであり得るか、または異なるｍｉＲＮＡ部位であり得る。本発明のポリヌクレオチドに組み込まれる異なるｍｉＲＮＡ結合部位の組み合わせとしては、異なるｍｉＲＮＡ部位のいずれかのうちの１つを超えるコピーが組み込まれる組み合わせが挙げられ得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡ結合部位は、体内の同じまたは異なる組織を標的にし得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドの３’−ＵＴＲ中の組織特異型、細胞型特異型、または疾患特異型ｍｉＲＮＡ結合部位の導入を介して、特異型細胞型（例えば、骨髄細胞、内皮細胞等）中の発現の程度が低減され得る。
【０５１９】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、本発明のポリヌクレオチド中の３’ＵＴＲの５’末端近く、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端のほぼ中間、及び／または３’ＵＴＲの３’末端の近くで操作され得る。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端近く、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端のほぼ中間で操作され得る。別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの３’末端近く、３’ＵＴＲの５’末端と３’末端のほぼ中間で操作され得る。さらに別の非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、３’ＵＴＲの５’末端の近くで、及び３’ＵＴＲの３’末端近くで操作され得る。
【０５２０】
別の実施形態では、３’ＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡシード配列、及び／またはシード配列に隣接するｍｉＲＮＡ配列に相補性であり得る。
【０５２１】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチド中に少なくとも１つのセンサー配列を組み込むこと及び投与のためにポリヌクレオチドを製剤化することによって、制御され得る。非限定的な例として、本発明のポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むこと及び本明細書に記載の脂質のうちのいずれかを含むイオン性脂質を含む脂質ナノ粒子におけるポリヌクレオチドを製剤化することによって、組織または細胞に対して標的化され得る。
【０５２２】
本発明のポリヌクレオチドは、異なる組織、細胞型、または生物学的条件中のｍｉＲＮＡの発現パターンに基づいて、特異型の組織、細胞型、または生物学的条件における、より標的化された発現のために操作され得る。組織特異型ｍｉＲＮＡ結合部位の導入を介して、本発明のポリヌクレオチドは、組織もしくは細胞中の、または生物学的条件の文脈における最適なタンパク質発現のために設計され得る。
【０５２３】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、既知のｍｉＲＮＡシード配列と１００％の同一性を有するか、またはｍｉＲＮＡシード配列と１００％未満の同一性を有するかのいずれかのｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むために設計され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、既知のｍｉＲＮＡシード配列と少なくとも：６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するｍｉＲＮＡ結合部位を組み込むために設計され得る。ｍｉＲＮＡシード配列は、ｍｉＲＮＡ結合親和性を減少するために部分的に変異され、そのようにしてポリヌクレオチドの低減された発現低下をもたらし得る。本質的に、ｍｉＲＮＡ結合部位とｍｉＲＮＡシードとの間のマッチまたはミスマッチの程度が、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力をより細かく調整するためにレオスタットとして作用し得る。加えて、ｍｉＲＮＡ結合部位の非シード領域中の変異は、また、タンパク質発現を調節するｍｉＲＮＡの能力に影響し得る。
【０５２４】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列は、ステムループのループに組み込まれ得る。
【０５２５】
別の実施形態では、ｍｉＲＮＡシード配列は、ステムループのループに組み込まれ得て、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ステムループの５’または３’ステムに組み込まれ得る。
【０５２６】
一実施形態では、翻訳エンハンサー要素（ＴＥＥ）は、ステムループのステムの５’末端上に組み込まれ得て、ｍｉＲＮＡシードは、ステムループのステムに組み込まれ得る。別の実施形態では、ＴＥＥは、ステムループのステムの５’末端上に組み込まれ得て、ｍｉＲＮＡシードは、ステムループのステムに組み込まれ得て、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ステムループ後のステムまたは配列の３’末端に組み込まれ得る。ｍｉＲＮＡシード及びｍｉＲＮＡ結合部位は、同じ及び／または異なるｍｉＲＮＡ配列用であり得る。
【０５２７】
一実施形態では、ｍｉＲＮＡ配列及び／またはＴＥＥ配列の組み込みは、翻訳を増加及び／または減少し得るステムループ領域の形態を変化させる。（例えば、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｅｄｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｐｕｍｉｌｉｏ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＲＮＡ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｗｉｔｃｈ  ｉｎ  ｐ２７−３’ＵＴＲ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｍｉＲ−２２１  ａｎｄ  ｍｉＲ−２２  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ．”Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０を参照されたい。）
【０５２８】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’−ＵＴＲは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含み得る。ｍｉＲＮＡ配列は、シードなしの１９または２２のヌクレオチド配列及び／またはｍｉＲＮＡ配列であり得るが、それらに限定されない。
【０５２９】
一実施形態では、５’ＵＴＲ中のｍｉＲＮＡ配列は、本明細書に記載の本発明のポリヌクレオチドを安定するために使用され得る。
【０５３０】
別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの５’ＵＴＲ中のｍｉＲＮＡ配列は、開始コドン等だが、それらに限定されない、翻訳開始の部位の到達性を減少するために使用され得る。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１０  １１（５）：ｅ１５０５７を参照されたく、これは、開始コドン（−４〜＋３７で、ＡＵＧコドンのＡが＋１）の周りでアンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド及びエキソン接合部複合体（ＥＪＣ）を、第１の開始コドン（ＡＵＧ）への到達性を減少するために使用した。Ｍａｔｓｕｄａは、開始コドンの周囲の配列をＬＮＡまたはＥＪＣで変更することが、ポリヌクレオチドの効率、長さ、及び構造的安定性に影響したことを示した。本発明のポリヌクレオチドは、Ｍａｔｓｕｄａらによって記載されたＬＮＡまたはＥＪＣ配列の代わりに、翻訳開始部位への到達性を減少するために、翻訳開始の部位の近くでｍｉＲＮＡ配列を含み得る。翻訳開始の部位は、ｍｉＲＮＡ配列の前、後、または内部であり得る。非限定的な例としては、翻訳開始の部位は、シード配列または結合部位等のｍｉＲＮＡ配列内に位置し得る。
【０５３１】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、抗原提示細胞による抗原の提示を弱めるために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。ｍｉＲＮＡは、完全なｍｉＲＮＡ配列、ｍｉＲＮＡシード配列、シードなしのｍｉＲＮＡ配列、またはそれらの組み合わせであり得る。非限定的な例としては、本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、造血系に特異的であり得る。別の非限定的な例としては、抗原の提示を弱めるために本発明のポリヌクレオチドに組み込まれるｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１４２−３ｐである。
【０５３２】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、目的の組織または細胞中でコードされるポリペプチドの発現を弱めるために、少なくとも１つのｍｉＲＮＡを含み得る。非限定的な例としては、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−３ｐシード配列、シードなしのｍｉＲ−１４２−３ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４２−５ｐシード配列、シードなしのｍｉＲ−１４２−５ｐ結合部位、ｍｉＲ−１４６結合部位、ｍｉＲ−１４６シード配列、及び／またはシード配列なしのｍｉＲ−１４６結合部位を含み得る。
【０５３３】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、治療的送達によって引き起こされる不要な免疫原性の反応を抑止するため、免疫細胞中でｍＲＮＡ治療薬を選択的に分解するために、３’ＵＴＲ中に少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。非限定的な例としては、ｍｉＲＮＡ結合部位は、抗原提示細胞において、本発明のポリヌクレオチドをより不安定にし得る。これらのｍｉＲＮＡの非限定的な例としては、ｍｉｒ−１４２−５ｐ、ｍｉｒ−１４２−３ｐ、ｍｉｒ−１４６ａ−５ｐ、及びｍｉｒ−１４６−３ｐが挙げられる。
【０５３４】
一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ結合タンパク質と相互作用し得るポリヌクレオチドの領域において少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列を含む。
【０５３５】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、（ｉ）ＧＬＡポリペプチド（例えば、野生型配列、その機能的断片、またはそれらのバリアント）をコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）及び（ｉｉ）ｍｉＲＮＡ結合部位（例えば、ｍｉＲ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位）を含む。
【０５３６】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列及び本明細書に開示されるｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位及び／またはｍｉＲ−１２６に結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするウラシル修飾配列及び本明細書に開示されるｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、またはｍｉＲ−２６ａに結合するｍｉＲＮＡ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ１２６−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、またはｍｉＲ−１５５に結合する。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするウラシル修飾配列及び少なくとも２つの異なるマイクロＲＮＡ結合部位を含み、マイクロＲＮＡは、造血系の免疫細胞またはＴＬＲ７及び／またはＴＬＲ８を発現し、炎症誘発性サイトカイン及び／またはケモカインを分泌する細胞中で発現し、ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾されたヌクレオ塩基を含む。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列は、少なくとも１つの化学修飾されたヌクレオ塩基、例えば、５−メトキシウラシルを含む。いくつかの実施形態では、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列におけるヌクレオ塩基の一種（例えば、ウラシル）の少なくとも９５％は、修飾されたヌクレオ塩基である。いくつかの実施形態では、ＧＬＡポリペプチドをコードするウラシル修飾配列におけるウラシルの少なくとも９５％は、５−メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜２３２のうちのいずれか、例えば、化合物１８、式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、もしくは（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３〜３４２のうちのいずれか、例えば、化合物２３６、または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９〜４２８のうちのいずれか、例えば、化合物４２８、またはそれらの任意の組み合わせを含む、送達剤と共に製剤化される。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を、例えば約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
【０５３７】
１３．３’ＵＴＲ
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、本発明のＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、３’ＵＴＲをさらに含む。
【０５３８】
３’−ＵＴＲは、翻訳終了コドンのすぐ後に続き、転写後に遺伝子発現に影響する調節領域をしばしば含む、ｍＲＮＡの部分である。３’−ＵＴＲ内の調節領域は、ｍＲＮＡのポリアデニル化、翻訳効率、局在化、及び安定性に影響し得る。一実施形態では、本発明に有用な３’−ＵＴＲは、調節タンパク質またはマイクロＲＮＡのための結合部位を含む。
【０５３９】
ある特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに有用な３’ＵＴＲは、配列番号５１〜７５、８１〜８２、８８、１０３、１０６〜１１３、１１８、及び１６１〜１７０、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、配列番号８１、８２、１０３、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸配列を含む。
【０５４０】
ある特定の実施形態では、本発明に有用な３’ＵＴＲ配列は、配列番号５１〜７５、８１〜８２、８８、１０３、１０６〜１１３、１１８、及び１６１〜１７０、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
【０５４１】
１４．５’キャップを有する領域
本発明は、また、５’キャップ及び本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。
【０５４２】
天然のｍＲＮＡの５’キャップ構造は、核外輸送に関与し、ｍＲＮＡ安定性を増大し、ＣＢＰのポリ（Ａ）結合タンパク質との会合を介して、細胞中のｍＲＮＡ安定性及び翻訳適格性の原因になるｍＲＮＡキャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）に結合し、成熟サイクリックｍＲＮＡ種を形成する。キャップは、ｍＲＮＡのスプライシングの間に、さらに５’近位イントロンの除去を支援する。
【０５４３】
外因性ｍＲＮＡ分子は、５’末端キャッピングされ得て、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端転写センスヌクレオチドとの間で５’−ｐｐｐ−５’−トリホスフェート結合を生成する。この５’グアニル酸キャップは、その後メチル化されてＮ７−メチル−グアニル酸残基を生成し得る。ｍＲＮＡの５’末端の末端及び／または末端前転写ヌクレオチドのリボース糖は、任意選択で、また、２’−Ｏ−メチル化され得る。グアニル酸キャップ構造の加水分解及び切断による５’キャップ除去は、分解のためにｍＲＮＡ分子等の核酸分子を標的とし得る。
【０５４４】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ部分を組み込む。
【０５４５】
例となる実施形態では、本発明のポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡ、または特に、ポリヌクレオチド（またはｍＲＮＡ）の５’ＵＴＲは、キャップ構造を含むか、またはキャッピングされる。
【０５４６】
例となる実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの部分またはセグメント、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム、３’ＵＴＲ、及びポリＡ尾部は、作動可能に連結されている。
【０５４７】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、キャップ除去を予防し、故にｍＲＮＡ半減期を増加する非加水分解性キャップ構造を含む。キャップ構造加水分解が５’−ｐｐｐ−５’ホスホロジエステル結合の切断を必要とするため、修飾されたヌクレオチドは、キャッピング反応の間に使用され得る。例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）からのワクシニアキャッピング酵素は、製造者の指示に従ってα−チオ−グアノシンヌクレオチドと共に使用され、５’−ｐｐｐ−５’キャップ中でホスホロチオアート結合を作製し得る。α−メチル−ホスホネート及びセレノ−リン酸ヌクレオチド等の追加の修飾されたグアノシンヌクレオチドが、使用され得る。
【０５４８】
追加の修飾には、５’末端のリボース糖の２’−Ｏ−メチル化及び／または糖環の２’ヒドロキシル基上の（前述の）ポリヌクレオチドの５’末端前ヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。複数の明確に異なる５’キャップ構造は、ｍＲＮＡ分子として機能するポリヌクレオチド等の核酸分子の５’キャップを生成するために使用され得る。本明細書で、また、合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構造的もしくは機能的キャップ類似体と称されるキャップ類似体は、キャップ機能を保持する一方で、それらの化学構造において天然の（すなわち、外因性、野生型、または生理的）５’キャップと異なる。キャップ類似体は、化学的（すなわち、非酵素的）または酵素的に合成され、及び／または本発明のポリヌクレオチドに連結され得る。
【０５４９】
例えば、アンチリバースキャップアナログ（ＡＲＣＡ）キャップは、５’−５’−トリホスフェート基によって連結される２つのグアニンを含み得て、１つのグアニンは、Ｎ７メチル基ならびに３’−Ｏ−メチル基（すなわち、Ｎ７，３’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−トリホスフェート−５’−グアノシン（ｍ７Ｇ−３’ｍｐｐｐ−Ｇ；同じく３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇとも呼ばれ得る）を含む。他の、非修飾グアニンの３’Ｏ原子は、キャッピングされたポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドに連結するようになる。Ｎ７−及び３’−Ｏ−メチル化グアニンは、キャッピングされたポリヌクレオチドの末端部分を提供する。
【０５５０】
別の例となるキャップは、ＡＲＣＡと同様だが、グアノシン上の２’−Ｏ−メチル基を有するｍＣＡＰである（すなわち、Ｎ７，２’−Ｏ−ジメチル−グアノシン−５’−トリホスフェート−５’−グアノシン、ｍ７Ｇｍ−ｐｐｐ−Ｇ）。
【０５５１】
いくつかの実施形態では、キャップは、ジヌクレオチドキャップ類似体である。非限定的な例としては、ジヌクレオチドキャップ類似体は、異なるホスフェート位置で、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第ＵＳ８，５１９，１１０号に記載の、ジヌクレオチドキャップ類似体等の、ボラノホスフェート基またはホホロセレノ酸基で修飾され得る。
【０５５２】
別の実施形態では、キャップは、キャップ類似体は、当該技術分野で知られており及び／または本明細書に記載のキャップ類似体のＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジククレオチド形態である。キャップ類似体のＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）置換ジククレオチド形態の非限定的な例としては、Ｎ７−（４−クロロフェノキシエチル）−Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ及びＮ７−（４−クロロフェノキシエチル）−ｍ３’−ＯＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体が挙げられる（例えば、その内容が参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＫｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１３  ２１：４５７０−４５７４に記載の様々なキャップ類似体及びキャップ類似体を合成する方法を参照されたい）。別の実施形態では、本発明のキャップ類似体は、４−クロロ／ブロモフェノキシエチル類似体である。
【０５５３】
キャップ類似体がインビトロ転写反応においてポリヌクレオチドまたはそれらの領域の同時キャッピングを可能にする一方で、転写物の最大２０％は、キャッピングされないままを維持し得る。これ、ならびに外因性細胞転写機構によって生成される核酸の外因性５’キャップ構造からのキャップ類似体の構造的差異は、低減された翻訳適格性及び低減された細胞安定性をもたらし得る。
【０５５４】
本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、また、製造（ＩＶＴまたは化学合成のいずれか）後、より真正な５’キャップ構造を生成するために、酵素を使用してキャッピングされ得る。本明細書で使用されるとき、「より真正な」という語句は、外因性または野生型特徴を、構造的にまたは機能的にのいずれかで、綿密に写すかまたは模倣する特徴を指す。すなわち、「より真正な」特徴は、例えば、従来技術の合成の特徴もしくは類似体等と比較して、外因性、野生型、天然、もしくは生理的細胞機能及び／または構造をより良く表すか、または１つ以上の点において、対応する外因性、野生型、天然、もしくは生理的特徴よりも性能が優れている。本発明のより真正な５’キャップ構造の非限定的な例は、とりわけ、当該技術分野で知られている合成５’キャップ構造（または野生型、天然、もしくは生理的５’キャップ構造）と比較して、キャップ結合タンパク質の結合、増加した半減期、５’エンドヌクレアーゼに対する低減された感受性、及び／または低減された５’キャップ除去を増大するものである。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素及び組み換え２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ酵素は、ポリヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に標準５’−５’−トリホスフェート結合を作製し得て、キャップグアニンは、Ｎ７メチル化を含み、ｍＲＮＡの５’末端ヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルを含む。かかる構造は、キャップ１構造と称される。このキャップは、例えば、当該技術分野で知られている他の５’キャップ類似体構造と比較して、より高い翻訳適格性及び細胞安定性ならびに細胞炎症誘発性サイトカインの低減された活性化をもたらす。キャップ構造には、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ，ｐＮ２ｐ（キャップ０）、７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮｐ（キャップ１）、及び７ｍＧ（５’）−ｐｐｐ（５’）ＮｌｍｐＮ２ｍｐ（キャップ２）が含まれるが、これらに限定されない。
【０５５５】
非限定的な例としては、製造後にキメラポリヌクレオチドをキャッピングすることは、ほぼ１００％のキメラポリヌクレオチドはキャッピングされ得るため、より効率的であり得る。これは、インビトロ転写反応の経過においてキャップ類似体がキメラポリヌクレオチドに連結される場合の約８０％と対照的である。
【０５５６】
本発明に従って、５’末端キャップは、外因性キャップまたはキャップ類似体を含み得る。本発明に従って、５’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン類似体には、イノシン、Ｎ１−メチル−グアノシン、２’フルオロ−グアノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソ−グアノシン、２−アミノ−グアノシン、ＬＮＡ−グアノシン、及び２−アジド−グアノシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０５５７】
１５．ポリＡ尾部
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、ポリＡ尾部をさらに含む。さらなる実施形態では、ポリＡ尾部上の末端基が、安定化のために組み込まれ得る。他の実施形態では、ポリＡ尾部は、脱３’ヒドロキシル尾部を含む。
【０５５８】
ＲＮＡプロセシングの間、アデニンヌクレオチド（ポリＡ尾部）の長鎖が、安定性を増加するために、ｍＲＮＡ分子等のポリヌクレオチドに添加され得る。転写直後で、転写物の３’末端が切断され、３’ヒドロキシルを取り除き得る。次いで、ポリＡポリメラーゼは、アデニンヌクレオチド鎖をＲＮＡに添加する。ポリアデニル化と呼ばれるプロセスは、例えば、約８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０残基長を含む、約８０〜約２５０残基長であり得るポリＡ尾部を添加する。
【０５５９】
ポリＡ尾部は、また、構築物が核から輸送された後に添加され得る。
【０５６０】
本発明に従って、ポリＡ尾部上の末端基が、安定化のために組み込まれ得る。本発明のポリヌクレオチドは、脱３’ヒドロキシル尾部を含み得る。これらは、また、Ｊｕｎｊｉｅ  Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５，１５０１−１５０７，Ａｕｇｕｓｔ  ２３，２００５、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）によって教示される構造的部分または２’−Ｏメチル修飾を含み得る。
【０５６１】
本発明のポリヌクレオチドは、ヒストンｍＲＮＡを含む代替のポリＡ尾部構造を有する転写物をコードするように設計され得る。Ｎｏｒｂｕｒｙに従って、「末端ユリジン化は、また、ヒト複製依存的ヒストンｍＲＮＡに関して検出されてきた。これらのｍＲＮＡのターンオーバーは、染色体ＤＮＡ複製の完了または抑制後の潜在的に毒性のあるヒストン蓄積を予防するために重要であると考えられる。これらのｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）尾部のそれらの欠乏によって区別され、その機能は、代わりに、安定的なステムループ構造及びその同族ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）によって仮定され、後者は、ポリアデニル化されたｍＲＮＡ上のＰＡＢＰのものと同じ機能を実行する」（Ｎｏｒｂｕｒｙ，“Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ：ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔａｉｌ  ｗａｇｇｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｏｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；ＡＯＰ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  ２９  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１３；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍ３６４５）その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５６２】
固有のポリＡ尾部長は、本発明のポリヌクレオチドに、ある特定の利点を提供する。一般に、ポリＡ尾部の長さは、存在する場合、３０ヌクレオチド長より長い。別の実施形態では、ポリＡ尾部は、３５ヌクレオチド長（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチドまたはそれより大きい）より長い。
【０５６３】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはそれらの領域は、約３０〜約３，０００（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜７５０、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜２，０００、３０〜２，５００、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜７５０、５０〜１，０００、５０〜１，５００、５０〜２，０００、５０〜２，５００、５０〜３，０００、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜２，０００、１００〜２，５００、１００〜３，０００、５００〜７５０、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜２，５００、５００〜３，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜２，５００、１，０００〜３，０００、１，５００〜２，０００、１，５００〜２，５００、１，５００〜３，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜２，５００、及び２，５００〜３，０００）ヌクレオチドを含む。
【０５６４】
いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、全体のポリヌクレオチドの長さまたはポリヌクレオチドの特定の領域の長さと比べて設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴もしくは領域の長さに基づくか、または、ポリヌクレオチドから発現する最終産物の長さに基づき得る。
【０５６５】
この文脈において、ポリＡ尾部は、ポリヌクレオチドまたはそれらの特徴より長さにおいて１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００％長くあり得る。ポリＡ尾部は、また、それが属するポリヌクレオチドの部分として設計され得る。この文脈において、ポリＡ尾部は、構築物の全長、構築物領域、またはポリＡ尾部を引いた構築物の全長の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０％以上であり得る。さらに、ポリＡ結合タンパク質のためのポリヌクレオチドの操作された結合部位及び抱合は、発現を増大させ得る。
【０５６６】
加えて、複数の明確に異なるポリヌクレオチドは、ポリＡ尾部の３’末端で、修飾されたヌクレオチドを使用して、３’末端によってＰＡＢＰ（ポリＡ結合タンパク質）を介して共に連結され得る。トランスフェクション試験は、関連性のある細胞株中で行われ得て、タンパク質産生は、トランスフェクションの１２時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後、及び７日後で、ＥＬＩＳＡによって評価され得る。
【０５６７】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ポリＡ−Ｇカルテット領域を含むように設計される。Ｇ−カルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方でＧ−リッチ配列によって形成され得る４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。この実施形態では、Ｇ−カルテットは、ポリＡ尾部の末端で組み込まれる。結果として得られるポリヌクレオチドは、様々な時点で、安定性、タンパク質産生、及び半減期を含む他のパラメータを評価される。ポリＡ−Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチドのポリＡ尾部のみを使用して見出されるものの少なくとも７５％と同等のｍＲＮＡからのタンパク質産生をもたらすことが発見されてきた。
【０５６８】
１６．開始コドン領域
本発明は、また、開始コドン領域と本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、開始コドン領域に類似の領域または開始コドン領域のような機能を有し得る。
【０５６９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの翻訳は、開始コドンＡＵＧではないコドン上で開始し得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧ等であるが、それに限定されない、代替の開始コドン上で開始し得る（Ｔｏｕｒｉｏｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ９５（２００３）１６９−１７８  ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１を参照されたく、その内容の各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０５７０】
非限定的な例としては、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドンＡＣＧ上で開始する。別の非限定的な例としては、ポリヌクレオチド翻訳は、代替の開始コドンＣＴＧまたはＣＵＧ上で開始する。さらに別の非限定的な例としては、ポリヌクレオチドの翻訳は、代替の開始コドンＧＴＧまたはＧＵＧ上で開始する。
【０５７１】
開始コドンまたは代替の開始コドン等であるが、それらに限定されない、翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの翻訳効率、長さ、及び／または構造に影響することが知られている。（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１を参照されたく、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスキングすることは、ポリヌクレオチドの翻訳開始の位置、翻訳効率、長さ、及び／または構造を改変するために使用され得る。
【０５７２】
いくつかの実施形態では、マスキング剤が、コドンをマスキングまたは隠して、マスキングされた開始コドンまたは代替の開始コドンでの翻訳開始の可能性を低減するために、開始コドンまたは代替の開始コドンの近くで使用され得る。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）ポリヌクレオチド及びエキソン接合部複合体（ＥＪＣ）が挙げられる（例えば、Ｍａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ  ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｍａｓｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ＬＮＡ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ＥＪＣｓ（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１）を参照されたく、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）。
【０５７３】
別の実施形態では、マスキング剤は、翻訳が代替の開始コドン上で開始する可能性を増加するために、ポリヌクレオチドの開始コドンをマスキングするために使用され得る。いくつかの実施形態では、マスキング剤が、マスキングされた開始コドンまたは代替の開始コドンの下流にある開始コドンまたは代替の開始コドン上での翻訳が開始する可能性を増加するために、第１の開始コドンまたは代替の開始コドンをマスキングするために使用され得る。
【０５７４】
いくつかの実施形態では、開始コドンまたは代替の開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な補体内に位置し得る。ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な補体は、マスキング剤と同様のポリヌクレオチドの翻訳、長さ、及び／または構造の制御の一助となり得る。非限定的な例としては、開始コドンまたは代替の開始コドンは、ｍｉＲＮＡ結合部位の完全な補体の中間に位置し得る。開始コドンまたは代替の開始コドンは、第１のヌクレオチド、第２のヌクレオチド、第３のヌクレオチド、第４のヌクレオチド、第５のヌクレオチド、第６のヌクレオチド、第７のヌクレオチド、第８のヌクレオチド、第９のヌクレオチド、第１０のヌクレオチド、第１１のヌクレオチド、第１２のヌクレオチド、第１３のヌクレオチド、第１４のヌクレオチド、第１５のヌクレオチド、第１６のヌクレオチド、第１７のヌクレオチド、第１８のヌクレオチド、第１９のヌクレオチド、第２０のヌクレオチド、または第２１のヌクレオチド後に位置し得る。
【０５７５】
別の実施形態では、ポリヌクレオチドの開始コドンは、ポリヌクレオチドの翻訳を開始コドンではないコドン上で開始させるために、ポリヌクレオチド配列から除去され得る。ポリヌクレオチドの翻訳は、除去された開始コドンの後のコドン上、または下流開始コドンもしくは代替の開始コドン上で開始し得る。非限定的な例では、開始コドンＡＴＧまたはＡＵＧは、下流開始コドンまたは代替の開始コドン上で翻訳を開始させるために、ポリヌクレオチド配列の第１の３ヌクレオチドとして除去される。開始コドンが除去されたポリヌクレオチド配列は、翻訳の開始、ポリヌクレオチドの長さ、及び／またはポリヌクレオチドの構造を制御するために、または制御しようとして、下流開始コドン及び／または代替の開始コドンのための少なくとも１つのマスキング剤をさらに含み得る。
【０５７６】
１７．停止コドン領域
本発明は、また、停止コドン領域及び本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の両方を含むポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）前に少なくとも２つの停止コドンを含み得る。停止コドンは、ＤＮＡの場合、ＴＧＡ、ＴＡＡ、及びＴＡＧから、またはＲＮＡの場合、ＵＧＡ、ＵＡＡ、及びＵＡＧから選択され得る。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの場合、停止コドンＴＧＡ、またはＲＮＡの場合、停止コドンＵＧＡ、及び１つの追加の停止コドンを含む。さらなる実施形態では、追加の停止コドンは、ＴＡＡまたはＵＡＡであり得る。別の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、３つの連続停止コドン、４つの停止コドン、またはそれ以上を含む。
【０５７７】
１８．挿入及び置換
本発明は、また、挿入及び／または置換をさらに含む本開示のポリヌクレオチドを含む。
【０５７８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、同じ塩基のヌクレオシドの少なくとも１つの領域及び／または紐の挿入によって置き換えられ得る。ヌクレオチドの領域及び／または紐には、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８ヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されず、ヌクレオチドは天然及び／または非天然であり得る。非限定的な例としては、ヌクレオチドの群は、５−８アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドのいずれかの紐、及び／またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０５７９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの５’ＵＴＲは、アデニン、シトシン、チミン、本明細書に開示される他のヌクレオチドのいずれか、及び／またはそれらの組み合わせ等であるが、それらに限定されない、２つの異なる塩基のヌクレオチドの少なくとも２つの領域及び／または紐の挿入によって置き換えられ得る。例えば、５’ＵＴＲは、５−８アデニン塩基の挿入の後に５−８シトシン塩基の挿入によって置き換えられ得る。別の例では、５’ＵＴＲは、５−８シトシン塩基の挿入の後に５−８アデニン塩基の挿入によって置き換えられ得る。
【０５８０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得る転写開始部位の下流にある少なくとも１つの置換及び／または挿入を含み得る。非限定的な例としては、少なくとも１つの置換及び／または挿入が、（例えば、＋１〜＋６であるが、これに限定されない）転写開始部位のすぐ下流にある領域で少なくとも１つの核酸を置換することにより、転写開始部位の下流で発生し得る。転写開始部位のすぐ下流にあるヌクレオチドの領域に対する改変は、開始速度に影響し、明らかなヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）反応一定値を増加し、転写複合体硬化開始転写からの短い転写物の解離を増加し得る（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｒｉｅｂａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：５１４４−５１４９）。少なくとも１つのヌクレオシドの修飾、置換、及び／または挿入は、配列のサイレント変異を引き起こし得るか、またはアミノ酸配列で変異を引き起こし得る。
【０５８１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位の下流にある少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、または少なくとも１３グアニン塩基の置換を含み得る。
【０５８２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、転写開始部位のすぐ下流にある領域で少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６グアニン塩基の置換を含み得る。非限定的な例としては、領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４アデニン塩基によって置換され得る。別の非限定的な例では、領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４シトシン塩基によって置換され得る。別の非限定的な例では、領域中のヌクレオチドがＧＧＧＡＧＡである場合、グアニン塩基は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、または少なくとも４チミン、及び／または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかによって置換され得る。
【０５８３】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、開始コドンの上流にある少なくとも１つの置換及び／または挿入を含み得る。明瞭さの目的のため、当業者は、開始コドンがタンパク質コード領域の第１のコドンである一方で、転写開始位置が転写が開始する位置であることを理解するであろう。ポリヌクレオチドには、ヌクレオチド塩基の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、または少なくとも８置換及び／または挿入が含まれ得るが、これらに限定されない。ヌクレオチド塩基は、開始コドンの上流にある１つ、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの位置で挿入及び置換され得る。挿入された及び／または置換されたヌクレオチドは、同じ塩基（例えば、全てＡまたは全てＣまたは全てＴまたは全てＧ）、２つの異なる塩基（例えば、Ａ及びＣ、Ａ及びＴ、またはＣ及びＴ）、３つの異なる塩基（例えば、Ａ、Ｃ、及びＴ、またはＡ、Ｃ、及びＴ）、または少なくとも４つの異なる塩基であり得る。
【０５８４】
非限定的な例としては、ポリヌクレオチド中のコード領域の上流にあるグアニン塩基は、アデニン、シトシン、チミン、または本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかで置換され得る。別の非限定的な例では、ポリヌクレオチド中のグアニン塩基の置換は、転写開始部位の下流及び開始コドンの前にある領域中に１つのグアニン塩基を残すために設計され得る（Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１１）４７２（７３４４）：４９９−５０３を参照されたく、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。非限定的な例としては、少なくとも５ヌクレオチドは、転写開始部位の下流であるが開始コドンの上流にある１つの位置で挿入され得て、少なくとも５ヌクレオチドは、同じ塩基の種類であり得る。
【０５８５】
１９．ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含むポリヌクレオチド
ある特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、５’から３’末端へと、下記を含む。
（ｉ）上記で提供される５’キャップ；
（ｉｉ）上記で提供される配列等の５’ＵＴＲ；
（ｉｉｉ）ＧＬＡポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、例えば、本明細書に開示されるＧＬＡをコードする配列最適化核酸配列；
（ｉｖ）少なくとも１つの停止コドン；
（ｖ）上記で提供される配列等の３’ＵＴＲ；
（ｖｉ）上記で提供されるポリＡ尾部。
【０５８６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲＮＡ−１４２に結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。
【０５８７】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、野生型ＧＬＡのタンパク質配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一のポリペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０５８８】
いくつかの実施形態では、本開示のポリヌクレオチド、例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドは、（１）上記に提供される５’キャップ、例えば、ＣＡＰ１と、（２）配列番号１１９、１２０、１２２〜１４０、及び１６０からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、（３）上記に提供されるポリＡ尾部、例えば、およそ１００残基のポリＡ尾部を含み、
【０５８９】
配列番号１１９は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号７９のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０５９０】
配列番号１２０は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号８０のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０５９１】
配列番号１２２は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４１のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０５９２】
配列番号１２３は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４２のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０５９３】
配列番号１２４は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４３のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０５９４】
配列番号１２５は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４４のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０５９５】
配列番号１２６は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４５のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０５９６】
配列番号１２７は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４６のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０５９７】
配列番号１２８は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４７のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０５９８】
配列番号１２９は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４８のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０５９９】
配列番号１３０は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１４９のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０６００】
配列番号１３１は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５０のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０６０１】
配列番号１３２は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５１のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０６０２】
配列番号１３３は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５２のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０６０３】
配列番号１３４は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５３のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０６０４】
配列番号１３５は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５４のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０６０５】
配列番号１３６は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５５のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０６０６】
配列番号１３７は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５６のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０６０７】
配列番号１３８は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５７のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０６０８】
配列番号１３９は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５８のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０６０９】
配列番号１４０は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号１５９のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号８１の３’ＵＴＲを含み、
【０６１０】
配列番号１６０は、５’から３’末端へと：配列番号３３の５’ＵＴＲ、配列番号７９のＧＬＡポリペプチドＯＲＦ、及び配列番号１０３の３’ＵＴＲを含む。
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【表５−８】
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【表５−９】
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【０６１１】
２０．ポリヌクレオチドの作製方法
本開示は、また、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）またはそれらの補体を作製する方法を提供する。
【０６１２】
いくつかの態様では、本明細書に開示され、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、インビトロ転写を使用して構築され得る。他の態様では、本明細書に開示され、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、オリゴヌクレオチドシンセサイザーを使用する化学合成によって構築され得る。
【０６１３】
他の態様では、本明細書に開示され、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、宿主細胞を使用することによって作製される。ある特定の態様では、本明細書に開示され、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＩＶＴ、化学合成、宿主細胞発現、または当該技術分野で知られている任意の他の方法の１つ以上の組み合わせによって作製される。
【０６１４】
天然に生じるヌクレオシド、非天然に生じるヌクレオシド、またはそれらの組み合わせは、候補ヌクレオチド配列中に存在する天然に生じるヌクレオシドを完全にまたは部分的に置き換え得て、ＧＬＡポリペプチドをコードする配列最適化ヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）に組み込まれ得る。結果として得られるポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡは、その後、タンパク質を産生及び／または治療的転帰を産生する能力を試験され得る。
【０６１５】
ａ．インビトロ転写／酵素合成
本明細書に開示される本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、インビトロ転写（ＩＶＴ）システムを使用して転写され得る。システムは、典型的には、転写緩衝、ヌクレオチドトリホスフェート（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤、及びポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、天然の及び非天然の（修飾された）ＮＴＰを含む本明細書に記載のものから選択され得るが、これらに限定されない。ポリメラーゼは、本明細書に記載のポリヌクレオチドを組み込み得るポリメラーゼ等であるが、これらに限定されない、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、及び変異体ポリメラーゼから選択され得るが、これらに限定されない。米国公開第ＵＳ２０１３０２５９９２３号を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６１６】
任意の数のＲＮＡポリメラーゼまたはバリアントが、本発明のポリヌクレオチドの合成において使用され得る。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼ配列のアミノ酸を挿入または欠失することによって修飾され得る。非限定的な例としては、ＲＮＡポリメラーゼは、非修飾ＲＮＡポリメラーゼと比較して２’修飾ヌクレオチドトリホスフェートを組み込む増加された能力を示すように修飾され得る（それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ２００８０７８１８０及び米国特許８，１０１，３８５を参照されたい）。
【０６１７】
バリアントは、ＲＮＡポリメラーゼを進化すること、ＲＮＡポリメラーゼアミノ酸及び／または核酸配列を最適化することによって、及び／または当該技術分野で知られている他の方法を使用することによって得られ得る。非限定的な例としては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのバリアントは、Ｅｓｖｅｌｔら（それらの全体において参照により本明細書に組み込まれるＮａｔｕｒｅ  ４７２：４９９−５０３（２０１１））によって提示される連続した定向進化系を使用して進化され得て、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのクローンは、トレオニンで置換された９３位のリジン（Ｋ９３Ｔ）、Ｉ４Ｍ、Ａ７Ｔ、Ｅ６３Ｖ、Ｖ６４Ｄ、Ａ６５Ｅ、Ｄ６６Ｙ、Ｔ７６Ｎ、Ｃ１２５Ｒ、Ｓ１２８Ｒ、Ａ１３６Ｔ、Ｎ１６５Ｓ、Ｇ１７５Ｒ、Ｈ１７６Ｌ、Ｙ１７８Ｈ、Ｆ１８２Ｌ、Ｌ１９６Ｆ、Ｇ１９８Ｖ、Ｄ２０８Ｙ、Ｅ２２２Ｋ、Ｓ２２８Ａ、Ｑ２３９Ｒ、Ｔ２４３Ｎ、Ｇ２５９Ｄ、Ｍ２６７Ｉ、Ｇ２８０Ｃ、Ｈ３００Ｒ、Ｄ３５１Ａ、Ａ３５４Ｓ、Ｅ３５６Ｄ、Ｌ３６０Ｐ、Ａ３８３Ｖ、Ｙ３８５Ｃ、Ｄ３８８Ｙ、Ｓ３９７Ｒ、Ｍ４０１Ｔ、Ｎ４１０Ｓ、Ｋ４５０Ｒ、Ｐ４５１Ｔ、Ｇ４５２Ｖ、Ｅ４８４Ａ、Ｈ５２３Ｌ、Ｈ５２４Ｎ、Ｇ５４２Ｖ、Ｅ５６５Ｋ、Ｋ５７７Ｅ、Ｋ５７７Ｍ、Ｎ６０１Ｓ、Ｓ６８４Ｙ、Ｌ６９９Ｉ、Ｋ７１３Ｅ、Ｎ７４８Ｄ、Ｑ７５４Ｒ、Ｅ７７５Ｋ、Ａ８２７Ｖ、Ｄ８５１Ｎ、またはＬ８６４Ｆ等であるが、それらに限定されない、少なくとも１つの変異をコードし得る。別の非限定的な例としては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのバリアントは、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる米国公開第２０１００１２００２４号及び第２００７０１１７１１２号で記載されるように、少なくとも変異をコードし得る。ＲＮＡポリメラーゼのバリアントには、また、置換バリアント、保存的アミノ酸置換、挿入バリアント、及び／または欠失バリアントが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０６１８】
一態様では、ポリヌクレオチドは、野生型またはバリアントＲＮＡポリメラーゼによって認識されるように設計され得る。それによって、ポリヌクレオチドは、野生型または親キメラポリヌクレオチドからの配列改変の部位または領域を含有するように修飾され得る。
【０６１９】
ポリヌクレオチドまたは核酸合成反応は、ポリメラーゼを利用する酵素方法によって行われ得る。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドまたは核酸鎖中のヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の作製を触媒する。現在知られているＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸配列の比較及び結晶構造の分析に基づいて、異なるファミリーに分割され得る。Ｅ．ｃｏｌｉのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにＴ７  ＲＮＡ及びＤＮＡポリメラーゼを含む、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）またはＡポリメラーゼファミリーは、これらのファミリーのうち最もよく研究されたもの１つである。別の大きなファミリーは、全て真核複製ＤＮＡポリメラーゼならびにファージＴ４及びＲＢ６９からのポリメラーゼを含む、ＤＮＡポリメラーゼα（ｐｏｌ  α）またはＢポリメラーゼファミリーである。これらは同様の触媒機構を用いるが、ポリメラーゼのこれらのファミリーは、基質の特異性、基質類似体組み込み効率、プライマー伸長の度合い及び速度、ＤＮＡ合成のモード、エキソヌクレアーゼ活性、ならびに阻害剤に対する感受性が異なる。
【０６２０】
ＤＮＡポリメラーゼは、また、反応温度、ｐＨ、ならびにテンプレート及びプライマー濃度等の必要とする最適反応条件に基づいて選択される。ときに、１つを超えるＤＮＡポリメラーゼの組み合わせは、所望のＤＮＡ断片サイズ及び合成効率を達成するために用いられる。例えば、Ｃｈｅｎｇらは、クローン化挿入及びヒトゲノムＤＮＡからの長い標的を効果的に増幅するために、ｐＨを増加し、グリセロール及びジメチルスルホキシドを添加し、変性時間を減少し、伸長時間を増加し、及び３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を保有する二次耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ９１：５６９５−５６９９（１９９４）、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）。バクテリオファージＴ３、Ｔ７、及びＳＰ６からのＲＮＡポリメラーゼが、生化学及び生物物理学研究のためのＲＮＡを調製するために広く使用されてきた。ＲＮＡポリメラーゼ、キャッピング酵素、及びポリＡポリメラーゼは、同時係属中の国際公開第ＷＯ２０１４０２８４２９号で開示され、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０６２１】
一態様では、本発明のポリヌクレオチドの合成に使用され得るＲＮＡポリメラーゼは、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼである。（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｔ１１９３を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼは、Ｚｈｕらによって、海洋性シアノファージＳｙｎ５から、近年特徴付けられ、彼らは、また、プロモーター配列を識別した（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３を参照されたく、その内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる）。Ｚｈｕらは、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較して温度及び塩分のより広い範囲にわたってＲＮＡ合成を触媒したことを見出した。加えて、プロモーターにおける開始ヌクレオチドの要件として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼと比較して、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼに対してよりストリンジェントでないことが見出されており、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ合成に有望となっている。
【０６２２】
一態様では、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載のポリヌクレオチドの合成に使用され得る。非限定的な例としては、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼは、正確な３’末端を必要とするポリヌクレオチドの合成に使用され得る。
【０６２３】
一態様では、Ｓｙｎ５プロモーターは、ポリヌクレオチドの合成に使用され得る。非限定的な例としては、Ｓｙｎ５プロモーターは、Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３）によって説明される５’−ＡＴＴＧＧＧＣＡＣＣＣＧＴＡＡＧＧＧ−３’（配列番号７６）であり得る。
【０６２４】
一態様では、Ｓｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼは、本明細書に記載の及び／または当該技術分野で既知の少なくとも１つの化学修飾を含むポリヌクレオチドの合成に使用され得る（例えば、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３に記載のシュード−ＵＴＰ及び５Ｍｅ−ＣＴＰの組み込みを参照されたい）。
【０６２５】
一態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、Ｚｈｕら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３）によって記載される変更及び改善された精製手順を使用して精製されてきたＳｙｎ５  ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成され得る。
【０６２６】
遺伝子操作における様々なツールは、テンプレートとして作用する標的遺伝子の酵素増幅に基づく。目的の個体の遺伝子または具体的な領域の配列の研究及び他の研究の必要のために、ポリヌクレオチドまたは核酸の小さな試料からの標的遺伝子の複数のコピーを生成することが必要である。かかる方法が、本発明のポリヌクレオチドの製造において適用され得る。
【０６２７】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写介在性増幅（ＴＭＡ）とも呼ばれる核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び／またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が、本発明のポリヌクレオチドの１つ以上の領域の製造で利用され得る。
【０６２８】
リガーゼによりポリヌクレオチドまたは核酸を構成することが、また、広く使用される。
【０６２９】
ｂ．化学合成
標準的な方法は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）等の目的の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成するように適用され得る。例えば、特定の単離されたポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む単一ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーは、合成され得る。他の態様では、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドは、合成され得、次いでライゲーションされ得る。いくつかの態様では、個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的な集合体のために５’または３’突出を含む。
【０６３０】
本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、当該技術分野で既知の化学合成方法及び潜在的なヌクレオ塩基置換を使用して化学合成され得る。例えば、国際公開第ＷＯ２０１４０９３９２４号、第ＷＯ２０１３０５２５２３号；第ＷＯ２０１３０３９８５７号、第ＷＯ２０１２１３５８０５号、第ＷＯ２０１３１５１６７１号；米国公開第ＵＳ２０１３０１１５２７２号；または米国特許第ＵＳ８９９９３８０号もしくは第ＵＳ８７１０２００号を参照されたく、それらの全ては、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０６３１】
ｃ．ＧＬＡをコードするポリヌクレオチドの精製
本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製には、ポリヌクレオチドの浄化、品質保証、及び品質管理が含まれ得るが、これらに限定されない。浄化は、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリ−Ｔビーズ、ＬＮＡ（商標）オリゴ−Ｔ捕捉プローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ．，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）等の当該技術分野で知られている方法、または、これらに限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び疏水的相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）等のＨＰＬＣに基づく精製方法によって行われ得るが、これらに限定されない。
【０６３２】
「精製されたポリヌクレオチド」等のポリヌクレオチドに関して使用されるときの「精製された」という用語は、少なくとも１つの汚染物質から分離されたものを指す。本明細書で使用されるとき、「汚染物質」は、別のものを不適当、不純、または劣等にする任意の物質である。したがって、精製されたポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、天然に見出されるものとは異なる形態もしくは環境、またはそれが治療もしくは精製方法を受ける前に存在したものとは異なる形態もしくは環境で存在する。
【０６３３】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）の精製は、不要な免疫応答を低減または除去し得る不純物を除去し、例えば、サイトカイン活性を低減する。
【０６３４】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して、投与の前に精製される。
【０６３５】
いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））を使用して精製される本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）は、異なる精製方法によって精製される本開示の同じポリヌクレオチドと共に得られる発現レベルと比較して、コードされたＧＬＡタンパク質の増加された発現を呈する。
【０６３６】
いくつかの実施形態では、カラムクロマトグラフィー（例えば、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）、または（ＬＣＭＳ））精製されたポリヌクレオチドは、当該技術分野で知られている点突然変異のうちの１つ以上を含むＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０６３７】
いくつかの実施形態では、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドの使用は、それらの細胞中に導入されたときに、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドが細胞中に導入される前、または非ＲＰ−ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドが細胞中に導入された後の、細胞中のＧＬＡタンパク質の発現レベルに対して、細胞中でＧＬＡタンパク質発現レベルを、例えば、１０〜１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％増加させる。
【０６３８】
いくつかの実施形態では、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドの使用は、それらの細胞中に導入されたときに、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドが細胞中に導入される前、または非ＲＰ−ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドが細胞中に導入された後の、細胞中のＧＬＡタンパク質の機能的発現レベルに対して、細胞中で機能的ＧＬＡタンパク質発現レベルを、例えば、１０〜１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％増加させる。
【０６３９】
いくつかの実施形態では、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドの使用は、それらの細胞中に導入されたときに、ＲＰ−ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドが細胞中に導入される前、または非ＲＰ−ＨＰＬＣ精製されたポリヌクレオチドが細胞中に導入された後の、細胞中の機能的ＧＬＡの活性レベルに対して、細胞中で検出可能なＧＬＡ活性を、例えば、１０〜１００％、すなわち、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％増加させる。
【０６４０】
いくつかの実施形態では、精製されたポリヌクレオチドは、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約８５％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９６％純粋、少なくとも約９７％純粋、少なくとも約９８％純粋、少なくとも約９９％純粋、または約１００％純粋である。
【０６４１】
品質保証及び／または品質管理のチェックは、ゲル電気泳動法、ＵＶ吸光度、または分析的ＨＰＬＣ等の方法を使用して行われ得るが、これらに限定されない。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、逆転写酵素ＰＣＲを含むが、これに限定されない方法によって配列され得る。
【０６４２】
ｄ．ＧＬＡをコードする発現されたポリヌクレオチドの定量化
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）、それらの発現生成物、ならびに分解生成物及び代謝産物は、当該技術分野で知られている方法に従って定量化され得る。
【０６４３】
いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、エクソソーム中または１つ以上の体液に由来する場合に定量化され得る。本明細書で使用されるとき、「体液」は、末梢血液、血清、血漿、腹水、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、痰、唾液、骨髄、関節液、眼房水、羊水、耳垢、母乳、気管支肺胞洗浄液、精液、前立腺液、カウパー液または尿道球腺液、汗、排泄物、毛髪、涙、嚢胞液、肋膜及び腹膜液、心膜液、リンパ、糜粥、乳糜、胆汁、間質液、経血、膿、皮脂、嘔吐物、腟分泌物、粘膜分泌物、水様便、膵液、副鼻腔の洗浄液、気管支肺吸引液、胚盤胞液、ならびに臍帯血を含む。代替的に、エクソソームは、肺、心臓、膵臓、胃、腸、膀胱、腎臓、卵巣、精巣、皮膚、結腸、乳房、前立腺、脳、食道、肝臓、及び胎盤からなる群から選択される器官から回収され得る。
【０６４４】
エクソソーム定量化方法では、２ｍＬ以下の試料は、対象、及びサイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離法、分画遠心分離法、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、親和性精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組み合わせによって単離されるエクソソームから得られる。分析では、ポリヌクレオチドのレベルまたは濃度は、投与された構築物の発現レベル、存在、不在、不完全、または変更であり得る。そのレベルが１つ以上の臨床表現型またはヒト疾患バイオマーカーについてのアッセイと相関があることが有利である。
【０６４５】
アッセイは、構築物の特定のプローブ、サイトメトリー、ｑＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＰＣＲ、フローサイトメトリー、電気泳動法、質量分析、またはそれらの組み合わせを使用して行われ得るが、一方でエクソソームは、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）方法等の免疫組織化学的方法を使用して単離され得る。エクソソームはまた、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分離法、分画遠心分離法、ナノ膜限外濾過、免疫吸着捕捉、親和性精製、マイクロ流体分離、またはそれらの組み合わせによって単離され得る。
【０６４６】
これらの方法は、研究者らに、即時に、残っているまたは送達されるポリヌクレオチドのレベルを監視する能力を提供する。これは、本発明のポリヌクレオチドが、構造または化学修飾に起因する外因性形態とは異なるため、可能である。
【０６４７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、これに限定されないが、紫外可視分光法（ＵＶ／Ｖｉｓ）等の方法を使用して定量化され得る。ＵＶ／Ｖｉｓ分光計の非限定的な例は、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（登録商標）分光計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。定量化されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが、適切なサイズであり得るかどうかを決定し、ポリヌクレオチドの分解が生じていないことを確認するために分析され得る。ポリヌクレオチドの分解は、これらに限定されないが、アガロースゲル電気泳動法、これらに限定されないが、強アニオン交換ＨＰＬＣ、弱アニオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、及び疏水的相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ−ＨＰＬＣ）等のＨＰＬＣに基づく精製方法、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣＭＳ）、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）、ならびキャピラリーゲル電気泳動法（ＣＧＥ）等の方法によって確認され得る。
【０６４８】
２１．医薬組成物及び製剤
本発明は、上記に記載されるポリヌクレオチドのうちのいずれかを含む医薬組成物及び製剤を提供する。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。
【０６４９】
いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、ＧＬＡポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化核酸配列を含むポリヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、ＧＬＡポリペプチドをコードする本明細書に開示される配列最適化核酸配列に対する著しい配列同一性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ結合部位、例えば、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１４２、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−１４６、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７、及びｍｉＲ−２６ａに結合するｍｉＲＮＡ結合部位をさらに含む。
【０６５０】
医薬組成物または製剤は、任意選択で、１つ以上の追加の活性物質、例えば、治療的及び／または予防的活性物質を含み得る。本発明の医薬組成物または製剤は、無菌及び／または発熱物質を含まないものであり得る。医薬品の製剤及び／または製造における一般的考察は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体において参照により本明細書に組み込まれる）に見出され得る。いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という語句は、一般に、本明細書に記載される通りに送達されるポリヌクレオチドを指す。
【０６５１】
本明細書に記載される製剤及び医薬組成物は、薬理学の分野で知られているまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、かかる調製方法は、活性成分を賦形剤及び／または１つ以上の他の補助的な成分と会合させ、次いで、必要な場合及び／または望ましい場合、生成物を所望の単回用量単位または複数回用量単位へ、分割、成形、及び／または包装する工程を含む。
【０６５２】
本開示に従う医薬組成物または製剤は、単回単位用量として、及び／または複数の単回単位用量として、調製、包装、及び／または大量に販売され得る。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、活性成分の所定の量を含む医薬組成物の離散的な量を指す。活性成分の量は、一般に、対象に投与される活性成分の用量及び／または例えば、かかる用量の２分の１または３分の１等のかかる用量の好都合な割合に等しい。
【０６５３】
本開示に従う医薬組成物中の活性成分、医薬として許容され得る賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、同一性、サイズ、及び／または治療されている対象の状態に応じて変化し得、組成物が投与される経路にさらに応じて変化し得る。
【０６５４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物及び製剤は、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有し得る。非限定的な例として、組成物または製剤は、本発明の１、２、３、４、または５つのポリヌクレオチドを含有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物または製剤は、１つを超える種類のポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物または製剤は、直鎖及び環状形態でポリヌクレオチドを含み得る。別の実施形態では、組成物または製剤は、環状ポリヌクレオチド及びインビトロ転写（ＩＶＴ）ポリヌクレオチドを含み得る。さらに別の実施形態では、組成物または製剤は、ＩＶＴポリヌクレオチド、キメラポリヌクレオチド、及び環状ポリヌクレオチドを含み得る。
【０６５５】
本明細書に提供される医薬組成物及び製剤の説明は、ヒトへの投与に好適な医薬組成物及び製剤を主に対象とするが、かかる組成物は、一般に任意の他の動物へ、例えば、非ヒト動物へ、例えば非ヒト哺乳動物への投与に好適であることが当業者によって理解されるであろう。
【０６５６】
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を含む医薬製剤を提供する。本明細書に記載のポリヌクレオチドは、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化され、（１）安定性を増加させる；（２）細胞トランスフェクションを増加させる；（３）持続または遅延放出（例えば、ポリヌクレオチドのデポ製剤から）を可能にする；（４）生体分布（例えば、ポリヌクレオチドを特定の組織または細胞型に対して標的化する）を変化させる；（５）インビボでコードされるタンパク質の翻訳を増加させる；及び／または（６）インビボでコードされるタンパク質の放出プロファイルを変化させる。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、例えば、式（Ｉ）を有する化合物、例えば、化合物１〜２３２のうちのいずれか、例えば、化合物１８；式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）を有する化合物、例えば、化合物２３３〜３４２のうちのいずれか、例えば、化合物２３６；または式（ＶＩＩＩ）を有する化合物、例えば、化合物４１９〜４２８のうちのいずれか、例えば、化合物４２８、もしくはそれらの任意の組み合わせを含む送達剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物１８、ＤＳＰＣ、コレステロール、及び化合物４２８を、例えば約５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
【０６５７】
本明細書で使用されるとき、医薬として許容され得る賦形剤には、所望の特定の剤形に適するような、任意及び全ての溶媒、分散媒、または他の液体ビヒクル、分散剤もしくは懸濁助剤、希釈剤、造粒剤及び／または分散剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤もしくは乳化剤、防腐剤、結合剤、潤滑剤もしくは油、着色剤、甘味剤もしくは香味剤、安定剤、抗酸化剤、抗微生物薬もしくは抗真菌薬、オスモル濃度調整剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、キレート剤、凍結防止剤、及び／または充填剤が含まれるが、これらに限定されない。医薬組成物を製剤化するための様々な賦形剤及び組成物を調製するため技術は、当該技術分野で知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏを参照されたい（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６；その全体において参照により本明細書に組み込まれる）。
【０６５８】
例となる希釈剤には、炭酸カルシウムもしくは炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール等、及び／またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６５９】
例となる造粒剤及び／または分散剤には、スターチ、予備糊化スターチ、もしくは微結晶スターチ、アルギン酸、グアーガム、寒天、ポリ（ビニル−ピロリドン）、（ポビドン）、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、架橋ナトリウムカルボキシメチルセルロース（クロスカルメロース）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（ＶＥＥＧＵＭ（登録商標））、ラウリル硫酸ナトリウム等、及び／またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６６０】
例となる界面活性剤及び／または乳化剤には、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガント、コンドラックス、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、蝋、及びレシチン）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０］、ソルビタンモノパルミテート［ＳＰＡＮ（登録商標）４０］、グリセリルモノオレエート、ポリオキシエチレンエステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ（登録商標））、ポリオキシエチレンエステル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ＢＲＩＪ（登録商標）３０］）、ＰＬＵＯＲＩＮＣ（登録商標）Ｆ  ６８、ＰＯＬＯＸＡＭＥＲ（登録商標）１８８等、及び／またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６６１】
例となる結合剤には、スターチ、ゼラチン、糖（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）、アミノ酸（例えば、グリシン）、天然及び合成ゴム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム）、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６６２】
酸化は、ｍＲＮＡ、特に液体ｍＲＮＡ製剤の潜在的な分解経路である。酸化を防ぐために、抗酸化剤が製剤に添加され得る。例となる抗酸化剤には、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アコルビル、ベンジルアルコール、ブチルヒドロキシアニソール、ｍ−クレゾール、メチオニン、ジブチルヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、ピロ亜硫酸ナトリウムもしくはピロ亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム等、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６６３】
例となるキレート剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、エデト酸三ナトリウム等、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６６４】
例となる抗微生物薬または抗真菌薬には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウムまたは安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウムまたはソルビン酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸等、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６６５】
例となる防腐剤には、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β−カロチン、クエン酸、アスコルビン酸、ブチルヒドロキシアニソール、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）等、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６６６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド溶液のｐＨは、ｐＨ５〜ｐＨ８で維持され、安定性を改善する。ｐＨを制御するための例となる緩衝剤は、リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、ヒスチジン（またはヒスチジン−ＨＣｌ）、リンゴ酸ナトリウム、炭酸ナトリウム等、及び／またはそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０６６７】
例となる潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、滑石、麦芽、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸マグネシウム等、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６６８】
本明細書に記載の医薬組成物または製剤は、凍結防止剤を含み、凍結の間にポリヌクレオチドを安定化し得る。例となる凍結防止剤には、スクロース、トレハロース、ラクトース、グリセロール、デキストロース等、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０６６９】
本明細書に記載の医薬組成物または製剤は、凍結乾燥されたポリヌクレオチド製剤中に充填剤を含み、「医薬的に優れた」を固形物を産出し、長期間（例えば、３６カ月）の保管の間、凍結乾燥されたポリヌクレオチドを安定化させ得る。本発明の例となる充填剤には、トレハロース、マンニトール、グリシン、ラクトース、ラフィノース、及びそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０６７０】
いくつかの実施形態では、医薬組成物または製剤は、送達剤をさらに含む。本開示の送達剤は、限定することなく、リポソーム、脂質ナノ粒子、脂質様物質、ポリマー、リポプレックス、マイクロベシクル、エクソソーム、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドでトランスフェクションされた細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣体、ナノチューブ、コンジュゲート、及びそれらの組み合わせを含み得る。
【０６７１】
２２．送達剤
ａ．脂質化合物
本開示は、有利な特性を有する医薬組成物を提供する。本明細書に記載の脂質組成物は、治療剤及び／または予防剤、例えば、ｍＲＮＡの、哺乳類細胞または器官への送達のために、脂質ナノ粒子組成物として有利に使用され得る。例えば、本明細書に記載の脂質は、免疫原性をほとんどまたは全く有しない。例えば、本明細書に開示される脂質化合物は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）と比較してより低い免疫原性を有する。例えば、本明細書に開示される脂質及び治療剤または予防剤、例えば、ｍＲＮＡを含む製剤は、参照脂質（例えば、ＭＣ３、ＫＣ２、またはＤＬｉｎＤＭＡ）及び同じ治療剤または予防剤を含む対応する製剤と比較して、増加した治療インデックスを有する。
【０６７２】
ある特定の実施形態では、本出願は、
（ａ）ＧＬＡポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、
（ｂ）送達剤と、を含む、医薬組成物を提供する。
【０６７３】
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（Ｉ）を有する脂質化合物であって、
【化２７】
2019516719.tif 000084
式中、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
脂質化合物、またはその塩もしくは立体異性体を含む。
【０６７４】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、炭素環、複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれ、式中、アルキル及びアルケニル基は、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。
【０６７５】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、または−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、（ｉ）Ｑは、ｎが１、２、３、４もしくは５である場合の−Ｎ（Ｒ）２ではないか、または（ｉｉ）Ｑは、ｎが１もしくは２である場合の５、６、もしくは７員ヘテロシクロアルキルではない、化合物が含まれる。
【０６７６】
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、ならびに、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１−３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
【０６７７】
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびに、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１−３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
【０６７８】
なおも他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員の複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｑが５員〜１４員の複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ（ｎは１または２である）であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（ｎは１である）であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、Ｑは、５員〜１４員のヘテロアリールまたは８員〜１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
【０６７９】
なおも他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員の複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｑが５員〜１４員の複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ（ｎは１または２である）であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（ｎは１である）であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、Ｑは、５員〜１４員のヘテロアリールまたは８員〜１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかであり、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
【０６８０】
依然として別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（ＯＲ）Ｃ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）ＯＲ、及び−Ｃ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２から選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｒ８は、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
Ｒ９は、Ｈ、ＣＮ、ＮＯ２、Ｃ１−６アルキル、−ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ）２、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６炭素環及び複素環からなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
【０６８１】
依然として別の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、−ＣＱ（Ｒ）２、及び非置換Ｃ１−６アルキルからなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＣＲＮ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
【０６８２】
なおも他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ２−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、式中、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ１−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
【０６８３】
なおも他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ２−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、式中、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ１−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
【０６８４】
依然として他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５−３０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ１−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
【０６８５】
依然として他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物の別のサブセットには、
Ｒ１は、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ１−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、
Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、１、２、３、４、及び５から選択され、
各Ｒ５は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ６は独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル、Ｃ２−３アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１８アルキル、Ｃ２−１８アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ１−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｘは独立して、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩからなる群から選択され、
ｍは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、及び１３から選択される、
化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれる。
【０６８６】
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＡ）の化合物、
【化２８】
2019516719.tif 000085
またはその塩もしくは立体異性体が含まれ、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される。
【０６８７】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＡ）の化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれ、
式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、ｍは、５、６、７、８、及び９から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２でり、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される。
【０６８８】
ある特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩ）の化合物、
【化２９】
2019516719.tif 000086
またはその塩もしくは立体異性体が含まれ、式中、ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｍ１は、結合またはＭ’であり、Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｒ８、−ＮＨＣ（＝ＮＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＮＨＣ（＝ＣＨＲ９）Ｎ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ヘテロアリール、またはヘテロシクロアルキルであり、Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ−Ｓ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される。
【０６８９】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物のサブセットには、式（ＩＩ）の化合物、またはその塩もしくは立体異性体が含まれ、式中、
ｌは、１、２、３、４、及び５から選択され、
Ｍ１は、結合またはＭ’であり、
Ｒ４は、非置換Ｃ１−３アルキル、または−（ＣＨ２）ｎＱであり、式中、ｎは、２、３、または４であり、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２であり、
Ｍ及びＭ’は独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｈ、Ｃ１−１４アルキル、及びＣ２−１４アルケニルからなる群から選択される。
【０６９０】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩａ）のもの、
【化３０】
2019516719.tif 000087
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述される通りである。
【０６９１】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｂ）のもの、
【化３１】
2019516719.tif 000088
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述される通りである。
【０６９２】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｃ）のもの、
【化３２】
2019516719.tif 000089
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述される通りである。
【０６９３】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｅ）のもの、
【化３３】
2019516719.tif 000090
またはその塩であり、式中、Ｒ４は、上述される通りである。
【０６９４】
いくつかの実施形態では、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、または（ＩＩｅ）の化合物は、−（ＣＨ２）ｎＱ及び−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択されるＲ４を含み、式中、Ｑ、Ｒ及びｎは、上記で定義される通りである。
【０６９５】
いくつかの実施形態では、Ｑは、−ＯＲ、−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、及び複素環からなる群から選択され、式中、Ｒは、上記で定義される通りである。いくつかの態様では、ｎは、１または２である。いくつかの実施形態では、Ｑは、ＯＨ、−ＮＨＣ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、または−ＮＨＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２である。
【０６９６】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩｄ）のもの、
【化３４】
2019516719.tif 000091
またはその塩であり、式中、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ５−１４アルキル及びＣ５−１４アルケニルからなる群から選択され、ｎは、２、３、及び４から選択され、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ５、Ｒ６及びｍは、上記で定義される通りである。
【０６９７】
式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、Ｒ３は、Ｃ５−Ｃ９アルキルである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、ｍは、５、７、または９である。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、各Ｒ５は、Ｈである。式（ＩＩｄ）の化合物のいくつかの態様では、各Ｒ６は、Ｈである。
【０６９８】
別の態様では、本出願は、（１）式（Ｉ）を有する化合物と、（２）任意選択でヘルパー脂質（例えばリン脂質）と、（３）任意選択で構造脂質（例えばステロール）と、（４）任意選択で脂質コンジュゲート（例えばＰＥＧ−脂質）とを含む、脂質組成物（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ））を提供する。例となる実施形態では、脂質組成物（例えば、ＬＮＰ）は、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、その中にカプセル封入されたポリヌクレオチドをさらに含む。
【０６９９】
本明細書で使用されるとき、「アルキル」または「アルキル基」という用語は、１個以上の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれよりも多くの炭素原子）を含む、直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。
【０７００】
「Ｃ１−１４アルキル」という表記は、１〜１４個の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の飽和炭化水素を意味する。アルキル基は、任意選択で置換され得る。
【０７０１】
本明細書で使用されるとき、「アルケニル」または「アルケニル基」という用語は、２個以上の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれよりも多くの炭素原子）及び少なくとも１つの二重結合を含む、直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。
【０７０２】
「Ｃ２−１４アルケニル」という表記は、２〜１４個の炭素原子及び少なくとも１つの二重結合を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素を意味する。アルケニル基は、１、２、３、４つ、またはそれよりも多くの二重結合を含み得る。例えば、Ｃ１８アルケニルは、１つ以上の二重結合を含み得る。２つの二重結合を含むＣ１８アルケニル基は、リノレイル基であり得る。アルケニル基は、任意選択で置換され得る。
【０７０３】
本明細書で使用されるとき、「炭素環」または「炭素環式基」という用語は、炭素原子の１つ以上の環を含む単環または多環系を意味する。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５員環であり得る。
【０７０４】
「Ｃ３−６炭素環」という表記は、３〜６個の炭素原子を含む炭素環を意味する。炭素環は、１つ以上の二重結合を含み得、芳香族であり得る（例えば、アリール基）。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニル、ナフチル、及び１，２−ジヒドロナフチル基が挙げられる。炭素環は、任意選択で置換され得る。
【０７０５】
本明細書で使用されるとき、「複素環」または「複素環式基」という用語は、少なくとも１つの環が少なくとも１個のヘテロ原子を含む、１つ以上の環を含む単環または多環系を意味する。ヘテロ原子は、例えば、窒素、酸素、または硫黄原子であり得る。環は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２員環であり得る。複素環は、１つ以上の二重結合を含み得、芳香族であり得る（例えば、ヘテロアリール基）。複素環の例としては、イミダゾリル、イミダゾリジニル、オキサゾリル、オキサゾリジニル、チアゾリル、チアゾリジニル、ピラゾリジニル、ピラゾリル、イソキサゾリジニル、イソキサゾリル、イソチアゾリジニル、イソチアゾリル、モルホリニル、ピロリル、ピロリジニル、フリル、テトラヒドロフリル、チオフェニル、ピリジニル、ピペリジニル、キノリル、及びイソキノリル基が挙げられる。複素環は、任意選択で置換され得る。
【０７０６】
本明細書で使用されるとき、「生分解性基」は、対象における脂質のより迅速な代謝を促進し得る基である。生分解性基は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基であり得るが、これらに限定されない。
【０７０７】
本明細書で使用されるとき、「アリール基」は、１つ以上の芳香族環を含む炭素環式基である。アリール基の例としては、フェニル基及びナフチル基が挙げられる。
【０７０８】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロアリール基」は、１つ以上の芳香族環を含む複素環式基である。ヘテロアリール基の例としては、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、及びチアゾリルが挙げられる。アリール基及びヘテロアリール基は両方とも、任意選択で置換され得る。例えば、Ｍ及びＭ’は、任意選択で置換されるフェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる非限定的な群から選択され得る。本明細書の式において、Ｍ及びＭ’は独立して、上記の生分解性基の一覧から選択され得る。
【０７０９】
アルキル、アルケニル、及びシクリル（例えば、カルボシクリル及びヘテロシクリル）基は、別途明記されない限り、任意選択で置換され得る。任意選択的な置換基は、ハロゲン原子（例えば、塩化物、臭化物、フッ化物、またはヨウ化物基）、カルボン酸（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、アルコール（例えば、ヒドロキシル、−ＯＨ）、エステル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＯＲまたは−ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アルデヒド（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｈ）、カルボニル（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、代替的にＣ＝Ｏで表される）、アシルハロゲン化物（例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｘ（式中、Ｘは、臭化物、フッ化物、塩化物、及びヨウ化物から選択されるハロゲン化物である））、炭酸塩（例えば、−ＯＣ（Ｏ）ＯＲ）、アルコキシ（例えば、−ＯＲ）、アセタール（例えば、−Ｃ（ＯＲ）２Ｒ”“（式中、各ＯＲは、同じまたは異なり得るアルコキシ基であり、Ｒ”“は、アルキルまたはアルケニル基））、リン酸塩（例えば、Ｐ（Ｏ）４３−）、チオール（例えば、−ＳＨ）、スルホキシド（例えば、−Ｓ（Ｏ）Ｒ）、スルフィン酸（例えば、−Ｓ（Ｏ）ＯＨ）、スルホン酸（例えば、−Ｓ（Ｏ）２ＯＨ）、チアール（ｔｈｉａｌ）（例えば、−Ｃ（Ｓ）Ｈ）、硫酸イオン（例えば、Ｓ（Ｏ）４２−）、スルホニル（例えば、−Ｓ（Ｏ）２−）、アミド（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、または−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）、アジド（例えば、−Ｎ３）、ニトロ（例えば、−ＮＯ２）、シアノ（例えば、−ＣＮ）、イソシアノ（例えば、−ＮＣ）、アシルオキシ（例えば、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ）、アミノ（例えば、−ＮＲ２、−ＮＲＨ、または−ＮＨ２）、カルバモイル（例えば、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲＨ、または−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ２）、スルホンアミド（例えば、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲＨ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ２、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ、または−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｈ）、アルキル基、アルケニル基、及びシクリル（例えば、カルボシクリルまたはヘテロシクリル）基からなるが、これらに限定されない群から選択され得る。
【０７１０】
前述のうちのいずれにおいても、Ｒは、本明細書で定義されるアルキルまたはアルケニル基である。いくつかの実施形態では、置換基自体が、例えば、本明細書で定義される１、２、３、４、５、または６つの置換基でさらに置換され得る。例えば、Ｃ１−６アルキル基は、本明細書に記載される１、２、３、４、５、または６つの置換基でさらに置換され得る。
【０７１１】
式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、及び（ＩＩｅ）のうちのいずれか１つの化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
【０７１２】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＰから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員の芳香族または非芳香族複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、及び−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択される。
【０７１３】
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、ならびに、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１−３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員のヘテロシクロアルキルから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択される。
【０７１４】
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員の複素環、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択され、Ｑが５員〜１４員の複素環であり、かつ（ｉ）Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＱ（ｎは１または２である）であるか、または（ｉｉ）Ｒ４が−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ（ｎは１である）であるか、または（ｉｉｉ）Ｒ４が−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２であるとき、Ｑは、５員〜１４員のヘテロアリールまたは８員〜１４員のヘテロシクロアルキルのいずれかである。
【０７１５】
別の実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、Ｃ３−６炭素環、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員のヘテロアリール、−ＯＲ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＸ２Ｈ、−ＣＸＨ２、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲから選択され、各ｎは独立して、１、２、３、４、及び５から選択される。
【０７１６】
別の実施形態では、Ｒ４は、非置換Ｃ１−４アルキル、例えば、非置換メチルである。
【０７１７】
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物を提供し、式中、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、式中、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、及び５から選択される。
【０７１８】
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物を提供し、式中、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱ、−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲ、−ＣＨＱＲ、及び−ＣＱ（Ｒ）２からなる群から選択され、式中、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、１、２、３、４、及び５から選択される。
【０７１９】
ある特定の実施形態では、本開示は、式（Ｉ）を有する化合物を提供し、式中、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ２−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成し、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱまたは−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲであり、式中、Ｑは、−Ｎ（Ｒ）２であり、ｎは、３、４、及び５から選択される。
【０７２０】
ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ２−１４アルキル、Ｃ２−１４アルケニル、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択されるか、またはＲ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環もしくは炭素環を形成する。
【０７２１】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５−２０アルキル及びＣ５−２０アルケニルからなる群から選択される。
【０７２２】
他の実施形態では、Ｒ１は、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ”Ｍ’Ｒ’からなる群から選択される。
【０７２３】
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、−Ｒ＊ＹＲ”及び−ＹＲ”から選択される。いくつかの実施形態では、Ｙは、シクロプロピル基である。いくつかの実施形態では、Ｒ＊は、Ｃ８アルキルまたはＣ８アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３−１２アルキルである。例えば、Ｒ”は、Ｃ３アルキルであり得る。例えば、Ｒ”は、Ｃ４−８アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、またはＣ８アルキル）であり得る。
【０７２４】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５−２０アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ８アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ９アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１８アルキルである。
【０７２５】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｃ５−２０アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１８アルケニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、リノレイルである。
【０７２６】
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、分岐鎖（例えば、デカン−２−イル、ウンデカン−３−イル、ドデカン−４−イル、トリデカン−５−イル、テトラデカン−６−イル、２−メチルウンデカン−３−イル、２−メチルデカン−２−イル、３−メチルウンデカン−３−イル、４−メチルドデカン−４−イル、またはヘプタデカ−９−イル）である。ある特定の実施形態では、Ｒ１は、
【化３５】
2019516719.tif 000092
である。
【０７２７】
ある特定の実施形態では、Ｒ１は、非置換Ｃ５−２０アルキルまたはＣ５−２０アルケニルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、置換Ｃ５−２０アルキルまたはＣ５−２０アルケニル（例えば、Ｃ３−６炭素環で置換された、例えば、１−シクロプロピルノニル）である。
【０７２８】
他の実施形態では、Ｒ１は、−Ｒ”Ｍ’Ｒ’である。
【０７２９】
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、−Ｒ＊ＹＲ”及び−ＹＲ”から選択される。いくつかの実施形態では、Ｙは、Ｃ３−８シクロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙは、Ｃ６−１０アリールである。いくつかの実施形態では、Ｙは、シクロプロピル基である。いくつかの実施形態では、Ｙは、シクロヘキシル基である。ある特定の実施形態では、Ｒ＊は、Ｃ１アルキルである。
【０７３０】
いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｙに隣接したＲ”は、Ｃ１アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙに隣接したＲ”は、Ｃ４−９アルキル（例えば、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８またはＣ９アルキル）である。
【０７３１】
いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ４アルキル及びＣ４アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ５アルキル及びＣ５アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ６アルキル及びＣ６アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ７アルキル及びＣ７アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ’は、Ｃ９アルキル及びＣ９アルケニルから選択される。
【０７３２】
他の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ１１アルキル及びＣ１１アルケニルから選択される。他の実施形態では、Ｒ’は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１３アルキル、Ｃ１３アルケニル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１５アルキル、Ｃ１５アルケニル、Ｃ１６アルキル、Ｃ１６アルケニル、Ｃ１７アルキル、Ｃ１７アルケニル、Ｃ１８アルキル、及びＣ１８アルケニルから選択される。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、分岐鎖（例えば、デカン−２−イル、ウンデカン−３−イル、ドデカン−４−イル、トリデカン−５−イル、テトラデカン−６−イル、２−メチルウンデカン−３−イル、２−メチルデカン−２−イル、３−メチルウンデカン−３−イル、４−メチルドデカン−４−イルまたはヘプタデカ−９−イル）である。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、
【化３６】
2019516719.tif 000093
である。
【０７３３】
ある特定の実施形態では、Ｒ’は、非置換Ｃ１−１８アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ’は、置換Ｃ１−１８アルキル（例えば、Ｃ３−６炭素環で置換されるＣ１−１５アルキル、例えば、１−シクロプロピルノニル）である。
【０７３４】
いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３−１４アルキル及びＣ３−１４アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、またはＣ８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ”は、Ｃ９アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１３アルキル、またはＣ１４アルキルである。
【０７３５】
いくつかの実施形態では、Ｍ’は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、Ｍ’は、−ＯＣ（Ｏ）−である。
【０７３６】
他の実施形態では、Ｍ’は、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍ’は、フェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる群から選択され得る。
【０７３７】
いくつかの実施形態では、Ｍは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり、いくつかの実施形態では、Ｍは、−ＯＣ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、Ｍは、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−である。いくつかの実施形態では、Ｍは、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−である。
【０７３８】
他の実施形態では、Ｍは、アリール基またはヘテロアリール基である。例えば、Ｍは、フェニル、オキサゾール、及びチアゾールからなる群から選択され得る。
【０７３９】
いくつかの実施形態では、Ｍは、Ｍ’と同じである。他の実施形態では、Ｍは、Ｍ’とは異なる。
【０７４０】
いくつかの実施形態では、各Ｒ５は、Ｈである。ある特定のかかる実施形態では、各Ｒ６もまた、Ｈである。
【０７４１】
いくつかの実施形態では、Ｒ７は、Ｈである。他の実施形態では、Ｒ７は、Ｃ１−３アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、またはｉ−プロピル）である。
【０７４２】
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は独立して、Ｃ５−１４アルキルまたはＣ５−１４アルケニルである。
【０７４３】
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ８アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ２アルキルである。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、Ｃ７アルキルである。
【０７４４】
他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、異なる。ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｃ８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、Ｃ１−７（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、またはＣ７アルキル）またはＣ９アルキルである。
【０７４５】
いくつかの実施形態では、Ｒ７及びＲ３は、Ｈである。
【０７４６】
ある特定の実施形態では、Ｒ２は、Ｈである。
【０７４７】
いくつかの実施形態では、ｍは、５、７、または９である。
【０７４８】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱ及び−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。
【０７４９】
いくつかの実施形態では、Ｑは、−ＯＲ、−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｃ（Ｒ）Ｎ（Ｒ）２Ｃ（Ｏ）ＯＲ、炭素環、及び複素環からなる群から選択される。
【０７５０】
ある特定の実施形態では、Ｑは、−ＯＨである。
【０７５１】
ある特定の実施形態では、Ｑは、置換または非置換５員〜１０員のヘテロアリール、例えば、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン、プリン、２−アミノ−１，９−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−オン−９−イル（またはグアニン−９−イル）、アデニン−９−イル、シトシン−１−イル、またはウラシル−１−イルである。ある特定の実施形態では、Ｑは、例えば、オキソ（＝Ｏ）、ＯＨ、アミノ、及びＣ１−３アルキルから選択される１つ以上の置換基で置換される、置換された５員〜１４員のヘテロシクロアルキルである。例えば、Ｑは、４−メチルピペラジニル、４−（４−メトキシベンジル）ピペラジニル、またはイソインドリン−２−イル−１，３−ジオンである。
【０７５２】
ある特定の実施形態では、Ｑは、非置換または置換Ｃ６−１０アリール（フェニル等）またはＣ３−６シクロアルキルである。
【０７５３】
いくつかの実施形態では、ｎは、１である。他の実施形態では、ｎは、２である。さらなる実施形態では、ｎは、３である。ある特定の他の実施形態では、ｎは、４である。例えば、Ｒ４は、−（ＣＨ２）２ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、−（ＣＨ２）３ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、−（ＣＨ２）４ＯＨであり得る。例えば、Ｒ４は、ベンジルであり得る。例えば、Ｒ４は、４−メトキシベンジルであり得る。
【０７５４】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６炭素環である。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ３−６シクロアルキルである。例えば、Ｒ４は、例えば、ＯＨ、ハロ、Ｃ１−６アルキル等で任意選択で置換される、シクロヘキシルであり得る。例えば、Ｒ４は、２−ヒドロキシシクロヘキシルであり得る。
【０７５５】
いくつかの実施形態では、Ｒは、Ｈである。
【０７５６】
いくつかの実施形態では、Ｒは、非置換Ｃ１−３アルキルまたは非置換Ｃ２−３アルケニルである。例えば、Ｒ４は、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＣＨ３であり得る。
【０７５７】
いくつかの実施形態では、Ｒは、置換Ｃ１−３アルキル、例えば、ＣＨ２ＯＨである。例えば、Ｒ４は、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＯＨであり得る。
【０７５８】
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＰから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する５員〜１４員の芳香族または非芳香族複素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、芳香族であれ非芳香族であれ、任意選択で置換されるＣ３−２０炭素環（例えば、Ｃ３−１８炭素環、Ｃ３−１５炭素環、Ｃ３−１２炭素環、またはＣ３−１０炭素環）を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、Ｃ３−６炭素環を形成する。他の実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘキシルまたはフェニル基等のＣ６炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、複素環またはＣ３−６炭素環は、１つ以上のアルキル基で（例えば、同じ環原子においてまたは隣接したもしくは隣接していない環原子において）置換される。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＣ５アルキル置換を持つシクロヘキシルまたはフェニル基を形成し得る。ある特定の実施形態では、Ｒ２及びＲ３によって形成される複素環またはＣ３−６炭素環は、炭素環基で置換される。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘキシルで置換されるシクロヘキシルまたはフェニル基を形成し得る。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、シクロヘプチル、シクロペンタデカニル、またはナフチル基等のＣ７−１５炭素環を形成する。
【０７５９】
いくつかの実施形態では、Ｒ４は、−（ＣＨ２）ｎＱ及び−（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択される。いくつかの実施形態では、Ｑは、−ＯＲ、−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、−Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、及び複素環からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｑは、イミダゾール、ピリミジン、及びプリンからなる群から選択される。
【０７６０】
いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、複素環または炭素環を形成する。いくつかの実施形態では、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、フェニル基等のＣ３−６炭素環を形成する。ある特定の実施形態では、複素環またはＣ３−６炭素環は、１つ以上のアルキル基で（例えば、同じ環原子においてまたは隣接したもしくは隣接していない環原子において）置換される。例えば、Ｒ２及びＲ３は、それらが結合している原子と一緒になって、１つ以上のＣ５アルキル置換を持つフェニル基を形成し得る。
【０７６１】
いくつかの実施形態では、本開示の医薬組成物、式（Ｉ）の化合物は、下記からなる群から選択される。
【化３７−１】
2019516719.tif 000094
【化３７−２】
2019516719.tif 000095
【化３７−３】
2019516719.tif 000096
【化３７−４】
2019516719.tif 000097
【化３７−５】
2019516719.tif 000098
【化３７−６】
2019516719.tif 000099
【化３７−７】
2019516719.tif 000100
【化３７−８】
2019516719.tif 000101
【化３７−９】
2019516719.tif 000102
【化３７−１０】
2019516719.tif 000103
【化３７−１１】
2019516719.tif 000104
【化３７−１２】
2019516719.tif 000105
【化３７−１３】
2019516719.tif 000106
【化３７−１４】
2019516719.tif 000107
【化３７−１５】
2019516719.tif 000108
【化３７−１６】
2019516719.tif 000109
【化３７−１７】
2019516719.tif 000110
【化３７−１８】
2019516719.tif 000111
【化３７−１９】
2019516719.tif 000112
【化３７−２０】
2019516719.tif 000113
【化３７−２１】
2019516719.tif 000114
【化３７−２２】
2019516719.tif 000115
【化３７−２３】
2019516719.tif 000116
【化３７−２４】
2019516719.tif 000117
【化３７−２５】
2019516719.tif 000118
【化３７−２６】
2019516719.tif 000119
【化３７−２７】
2019516719.tif 000120
【化３７−２８】
2019516719.tif 000121
【化３７−２９】
2019516719.tif 000122
【化３７−３０】
2019516719.tif 000123
【化３７−３１】
2019516719.tif 000124
【化３７−３２】
2019516719.tif 000125
及びそれらの塩もしくは立体異性体。
【０７６２】
他の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、化合物１〜化合物１４７からなる群、またはその塩もしくは立体異性体から選択される。
【０７６３】
いくつかの実施形態では、中心ピペラジン部分を含むイオン性脂質が提供される。
【０７６４】
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（ＩＩＩ）を有する脂質化合物
【化３８】
2019516719.tif 000126
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
環Ａは、
【化３９】
2019516719.tif 000127
であり、
ｔは、１または２であり、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３は独立して、結合、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
【化４０】
2019516719.tif 000128
であるとき、
ｉ）Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、−ＣＨ２−ではない、及び／または
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’である。
【０７６５】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＩＩａ１）〜（ＩＩＩａ６）のうちのいずれかのものである。
【化４１−１】
2019516719.tif 000129
【化４１−２】
2019516719.tif 000130
【０７６６】
式（ＩＩＩ）、または（ＩＩＩａ１）〜（ＩＩＩａ６）のうちのいずれかの化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
【０７６７】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化４２】
2019516719.tif 000131
である。
【０７６８】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化４３】
2019516719.tif 000132
である。
【０７６９】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化４４】
2019516719.tif 000133
である。
【０７７０】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化４５】
2019516719.tif 000134
である。
【０７７１】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化４６】
2019516719.tif 000135
である。
【０７７２】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
【化４７】
2019516719.tif 000136
であり、この環は、Ｎ原子がＸ２と接続されている。
【０７７３】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
【０７７４】
いくつかの実施形態では、Ｚは、不在である。
【０７７５】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも一方は、Ｎである。
【０７７６】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、Ｎである。
【０７７７】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、ＣＨである。
【０７７８】
いくつかの実施形態では、Ａ１は、Ｎであり、Ａ２は、ＣＨである。
【０７７９】
いくつかの実施形態では、Ａ１は、ＣＨであり、Ａ２は、Ｎである。
【０７８０】
いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、−ＣＨ２−ではない。例えば、ある特定の実施形態では、Ｘ１は、−ＣＨ２−ではない。いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ３のうちの少なくとも１つは、−Ｃ（Ｏ）−である。
【０７８１】
いくつかの実施形態では、Ｘ２は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−である。
【０７８２】
いくつかの実施形態では、Ｘ３は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−である。他の実施形態では、Ｘ３は、−ＣＨ２−である。
【０７８３】
いくつかの実施形態では、Ｘ３は、結合または−（ＣＨ２）２−である。
【０７８４】
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じである。
【０７８５】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの多くても１つが、−Ｒ”ＭＲ’である。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３のうちの少なくとも１つが、−Ｒ”ＭＲ’であり得、及び／またはＲ４及びＲ５のうちの少なくとも１つが、−Ｒ”ＭＲ’であり得る。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＭは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、各Ｍは、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭは、−ＯＣ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、各Ｍは、−ＯＣ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＭは、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、各Ｍは、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ３アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ３アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ５アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ５アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ６アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ６アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ”は、Ｃ７アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ”は、Ｃ７アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ５アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ５アルキルである。他の実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ１アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ１アルキルである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲ’は、Ｃ２アルキルである。ある特定の実施形態では、各Ｒ’は、Ｃ２アルキルである。
【０７８６】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ１２アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の各々は、Ｃ１２アルキルである。
【０７８７】
ある特定の実施形態では、化合物は、下記からなる群から選択される。
【化４８−１】
2019516719.tif 000137
【化４８−２】
2019516719.tif 000138
【化４８−３】
2019516719.tif 000139
【化４８−４】
2019516719.tif 000140
【化４８−５】
2019516719.tif 000141
【化４８−６】
2019516719.tif 000142
【化４８−７】
2019516719.tif 000143
【化４８−８】
2019516719.tif 000144
【化４８−９】
2019516719.tif 000145
【化４８−１０】
2019516719.tif 000146
【化４８−１１】
2019516719.tif 000147
【化４８−１２】
2019516719.tif 000148
【０７８８】
いくつかの実施形態では、送達剤は、化合物２３６を含む。別の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、化合物４２８である。
【０７８９】
いくつかの実施形態では、送達剤は、式（ＩＶ）を有する化合物
【化４９】
2019516719.tif 000149
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ１及びＡ２は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は独立して、Ｃ６−２０アルキル及びＣ６−２０アルケニルからなる群から選択され、
環Ａが
【化５０】
2019516719.tif 000150
であるとき、
ｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は同じであり、ここでＲ１は、Ｃ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、もしくはＣ１８アルケニルではない、
ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６−２０アルケニルから選択される、
ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも別の１つとは異なる数の炭素原子を有する、
ｉｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルキルから選択される、または
ｖ）Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルケニルから選択される。
【０７９０】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＶａ）のものである。
【化５１】
2019516719.tif 000151
【０７９１】
式（ＩＶ）または（ＩＶａ）の化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
【０７９２】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
【０７９３】
いくつかの実施形態では、Ｚは、不在である。
【０７９４】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２のうちの少なくとも一方は、Ｎである。
【０７９５】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、Ｎである。
【０７９６】
いくつかの実施形態では、Ａ１及びＡ２の各々は、ＣＨである。
【０７９７】
いくつかの実施形態では、Ａ１は、Ｎであり、Ａ２は、ＣＨである。
【０７９８】
いくつかの実施形態では、Ａ１は、ＣＨであり、Ａ２は、Ｎである。
【０７９９】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じであり、かつＣ１２アルキル、Ｃ１８アルキル、またはＣ１８アルケニルではない。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じであり、かつＣ９アルキルまたはＣ１４アルキルである。
【０８００】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの１つのみが、Ｃ６−２０アルケニルから選択される。ある特定のかかる実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じ数の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、Ｒ４は、Ｃ５−２０アルケニルから選択される。例えば、Ｒ４は、Ｃ１２アルケニルまたはＣ１８アルケニルであり得る。
【０８０１】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも別の１つとは異なる数の炭素原子を有する。
【０８０２】
ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルケニルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルキルから選択される。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６−２０アルキルから選択され、Ｒ４及びＲ５は、Ｃ６−２０アルケニルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じ数の炭素原子を有し、及び／またはＲ４及びＲ５は、同じ数の炭素原子を有する。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２、１４、または１８個の炭素原子を有し得る。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、Ｃ１８アルケニル（例えば、リノレイル）である。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、またはＲ４及びＲ５は、６、８、９、１２、または１４個の炭素原子を含むアルキル基である。
【０８０３】
いくつかの実施形態では、Ｒ１は、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。他の実施形態では、Ｒ３は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。さらなる実施形態では、Ｒ４は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ５とは異なる数の炭素原子を有する。
【０８０４】
いくつかの実施形態では、化合物は、下記からなる群から選択される。
【化５２−１】
2019516719.tif 000152
【化５２−２】
2019516719.tif 000153
【化５２−３】
2019516719.tif 000154
【０８０５】
他の実施形態では、送達剤は、式（Ｖ）を有する化合物
【化５３】
2019516719.tif 000155
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ３は、ＣＨまたはＮであり、
Ａ４は、ＣＨ２またはＮＨであり、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも１つは、ＮまたはＮＨであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基から選択され、
Ｘ１及びＸ２は独立して、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から選択される。
【０８０６】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（Ｖａ）のものである。
【化５４】
2019516719.tif 000156
【０８０７】
式（Ｖ）または（Ｖａ）の化合物は、該当する場合、以下の特徴のうちの１つ以上を含む。
【０８０８】
いくつかの実施形態では、Ｚは、ＣＨ２である。
【０８０９】
いくつかの実施形態では、Ｚは、不在である。
【０８１０】
いくつかの実施形態では、Ａ３及びＡ４のうちの少なくとも一方は、ＮまたはＮＨである。
【０８１１】
いくつかの実施形態では、Ａ３は、Ｎであり、Ａ４は、ＮＨである。
【０８１２】
いくつかの実施形態では、Ａ３は、Ｎであり、Ａ４は、ＣＨ２である。
【０８１３】
いくつかの実施形態では、Ａ３は、ＣＨであり、Ａ４は、ＮＨである。
【０８１４】
いくつかの実施形態では、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも一方は、−ＣＨ２−ではない。例えば、ある特定の実施形態では、Ｘ１は、−ＣＨ２−ではない。いくつかの実施形態では、Ｘ１及びＸ２のうちの少なくとも一方は、−Ｃ（Ｏ）−である。
【０８１５】
いくつかの実施形態では、Ｘ２は、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、または−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−である。
【０８１６】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は独立して、Ｃ５−２０アルキル及びＣ５−２０アルケニルからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、またはＣ１４アルキルである。他の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、Ｃ１８アルケニルである。例えば、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、リノレイルであり得る。
【０８１７】
いくつかの実施形態では、化合物は、下記からなる群から選択される。
【化５５】
2019516719.tif 000157
【０８１８】
他の実施形態では、送達剤は、式（ＶＩ）を有する化合物、
【化５６】
2019516719.tif 000158
またはその塩もしくは立体異性体を含み、式中、
Ａ６及びＡ７は各々独立して、ＣＨまたはＮから選択され、Ａ６及びＡ７のうちの少なくとも１つは、Ｎであり、
Ｚは、ＣＨ２または不在であり、ＺがＣＨ２であるとき、破線（１）及び（２）は各々単結合を表し、Ｚが不在であるとき、破線（１）及び（２）は両方とも不在であり、
Ｘ４及びＸ５は独立して、−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）２−、−ＣＨＲ−、−ＣＨＹ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＣＨ２−、−ＯＣ（Ｏ）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｃ（Ｓ）−、及び−ＣＨ（ＳＨ）−からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、独立して、Ｃ５−２０アルキル、Ｃ５−２０アルケニル、−Ｒ”ＭＲ’、−Ｒ＊ＹＲ”、−ＹＲ”、及び−Ｒ＊ＯＲ”からなる群から選択され、
各Ｍは独立して、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−ＣＨ（ＯＨ）−、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、アリール基、及びヘテロアリール基からなる群から選択され、
各Ｙは独立して、Ｃ３−６炭素環であり、
各Ｒ＊は独立して、Ｃ１−１２アルキル及びＣ２−１２アルケニルからなる群から選択され、
各Ｒは独立して、Ｃ１−３アルキル及びＣ３−６炭素環からなる群から選択され、
各Ｒ’は独立して、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、及びＨからなる群から選択され、
各Ｒ”は独立して、Ｃ３−１２アルキル及びＣ３−１２アルケニルからなる群から選択される。
【０８１９】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２，Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は各々、独立して、Ｃ６−２０アルキル及びＣ６−２０アルケニルからなる群から選択される。
【０８２０】
いくつかの実施形態では、Ｒ１及びＲ２は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じである。いくつかの実施形態では、Ｒ４及びＲ５は、同じである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同じである。
【０８２１】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、Ｃ９−１２アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の各々は独立して、Ｃ９、Ｃ１２またはＣ１４アルキルである。ある特定の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５の各々は、Ｃ９アルキルである。
【０８２２】
いくつかの実施形態では、Ａ６は、Ｎであり、Ａ７は、Ｎである。いくつかの実施形態では、Ａ６は、ＣＨであり、Ａ７は、Ｎである。
【０８２３】
いくつかの実施形態では、Ｘ４は、−ＣＨ２−であり、Ｘ５は、−Ｃ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、Ｘ４及びＸ５は、−Ｃ（Ｏ）−である。
【０８２４】
いくつかの実施形態では、Ａ６がＮであり、かつＡ７がＮであるとき、Ｘ４及びＸ５のうちの少なくとも一方は、−ＣＨ２−ではなく、例えば、Ｘ４及びＸ５のうちの少なくとも一方は、−Ｃ（Ｏ）−である。いくつかの実施形態では、Ａ６がＮであり、かつＡ７がＮであるとき、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’である。
【０８２５】
いくつかの実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５のうちの少なくとも１つは、−Ｒ”ＭＲ’ではない。
【０８２６】
いくつかの実施形態では、化合物は、下記である。
【化５７】
2019516719.tif 000159
【０８２７】
他の実施形態では、送達剤は、下記式を有する化合物を含む。
【化５８】
2019516719.tif 000160
（化合物３４２）
【０８２８】
本明細書に開示される脂質化合物のアミン部分は、ある特定の条件下でプロトン化され得る。例えば、式（Ｉ）による脂質の中心アミン部分は、アミノ部分のｐＫａを下回るｐＨで典型的にプロトン化され（すなわち、正荷電性）、そのｐＫａを上回るｐＨでは実質的に非荷電性である。かかる脂質は、イオン性アミノ脂質と称され得る。
【０８２９】
具体的な一実施形態では、イオン性アミノ脂質は、化合物１８である。別の実施形態では、イオン性アミノ脂質は、化合物２３６である。
【０８３０】
いくつかの実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で約１ｍｏｌ％〜９９ｍｏｌ％の範囲である。
【０８３１】
一実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９ｍｏｌ％である。
【０８３２】
一実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で約３０ｍｏｌ％〜約７０ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、及び約４５ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％の範囲である。
【０８３３】
具体的な一実施形態では、イオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物の量は、脂質組成物中で約５０ｍｏｌ％である。
【０８３４】
本明細書に開示されるイオン性アミノ脂質、例えば、式（Ｉ）の化合物に加えて、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、リン脂質、構造脂質、ＰＥＧ−脂質、及びそれらの任意の組み合わせ等の追加の構成成分を含み得る。
【０８３５】
ｂ．脂質組成物中の追加の構成成分
（ｉ）リン脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上のリン脂質、例えば、１つ以上の飽和もしくは（ポリ）不飽和リン脂質またはそれらの組み合わせを含み得る。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び１つ以上の脂肪酸部分を含む。
【０８３６】
リン脂質部分は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２−リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる非限定的な群から選択され得る。
【０８３７】
脂肪酸部分は、例えば、ラウリル酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アルファ−リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群から選択され得る。
【０８３８】
特定のリン脂質は、膜への融合を促進し得る。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜または細胞内膜）の１つ以上の負荷電性リン脂質と相互作用することができる。リン脂質の膜への融合は、脂質含有組成物（例えば、ＬＮＰ）の１つ以上の要素（例えば、治療剤）が膜を通過して、例えば、１つ以上の要素の標的組織への送達を許容するようにし得る。
【０８３９】
分岐、酸化、環化、及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含めた、非天然リン脂質種もまた企図される。例えば、リン脂質は、１つ以上のアルキン（例えば、１つ以上の二重結合が三重結合で置き換えられているアルケニル基）で官能化されるか、またはそれに架橋結合され得る。適切な反応条件下で、アルキン基は、アジドに曝露されると銅触媒による環付加を経ることができる。かかる反応は、膜透過もしくは膜認識を促進するようにナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化する際に、またはナノ粒子組成物を、標的化もしくは画像化部分（例えば、色素）等の有用な構成成分にコンジュゲートする際に有用であり得る。
【０８４０】
リン脂質には、ホスファチジルコリン等のグリセロリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジグリセロール、及びホスファチジン酸が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質はまた、スフィンゴミエリン等のホスホスフィンゴ脂質も含む。
【０８４１】
リン脂質の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
【化５９−１】
2019516719.tif 000161
【化５９−２】
2019516719.tif 000162
【０８４２】
ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、ＤＳＰＣの類似体またはバリアントである。ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、式（ＩＸ）の化合物：
【化６０】
2019516719.tif 000163
（ＩＸ）、
またはその塩であり、式中、
各Ｒ１は独立して、任意選択で置換されるアルキルであるか、または任意選択で、２つのＲ１が、介在する原子と一緒に連結して、任意選択で置換される単環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換される単環式ヘテロシクリルを形成するか、または任意選択で、３つのＲ１が、介在する原子と一緒に連結して、任意選択で置換される二環式カルボシクリルもしくは任意選択で置換二環式ヘテロシクリルを形成し、
ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、
【化６１】
2019516719.tif 000164
のものであり、
Ｌ２の各出現例は独立して、結合または任意選択で置換されるＣ１−６アルキレンであり、該任意選択で置換されるＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位は任意選択で、−Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、または−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−で置き換えられ、
Ｒ２の各出現例は独立して、任意選択で置換されるＣ１−３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１−３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１−３０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−で置き換えられ、
ＲＮの各出現例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり、
ｐは、１または２であるが、
但し、該化合物は、下記式、
【化６２】
2019516719.tif 000165
のものではないことを条件とし、Ｒ２の各出現例は独立して、非置換アルキル、非置換アルケニル、または非置換アルキニルである。
【０８４３】
リン脂質頭部修飾
ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、修飾されたリン脂質頭部（例えば、修飾されたコリン基）を含む。ある特定の実施形態では、修飾された頭部を有するリン脂質は、修飾された第四級アミンを有するＤＳＰＣ、またはその類似体である。例えば、式（ＩＸ）の実施形態では、Ｒ１のうちの少なくとも１つは、メチルではない。ある特定の実施形態では、Ｒ１のうちの少なくとも１つは、水素でもメチルでもない。ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
【化６３】
2019516719.tif 000166
またはその塩であり、式中、
各ｔは独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｕは独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
各ｖは独立して、１、２、または３である。
【０８４４】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
【化６４】
2019516719.tif 000167
またはその塩である。
【０８４５】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下のうちの１つ、
【化６５−１】
2019516719.tif 000168
【化６５−２】
2019516719.tif 000169
【化６５−３】
2019516719.tif 000170
またはその塩である。
【０８４６】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ−ａ）のもの、
【化６６】
2019516719.tif 000171
またはその塩である。
【０８４７】
ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、修飾されたコアを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の修飾されたコアを有するリン脂質は、修飾されたコア構造を有するＤＳＰＣ、またはその類似体である。例えば、式（ＩＸ−ａ）のある特定の実施形態では、基Ａは、以下の式のものではない。
【化６７】
2019516719.tif 000172
【０８４８】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ａ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
【化６８】
2019516719.tif 000173
またはその塩である。
【０８４９】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下のうちの１つ、
【化６９】
2019516719.tif 000174
またはその塩である。
【０８５０】
ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を含む。ある特定の実施形態では、本発明において有用なリン脂質は、グリセリド部分の代わりに環状部分を有するＤＳＰＣ、またはその類似体である。ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ−ｂ）のもの、
【化７０】
2019516719.tif 000175
またはその塩である。
【０８５１】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｂ）の化合物は、式（ＩＸ−ｂ−１）のもの、
【化７１】
2019516719.tif 000176
またはその塩であり、式中、
ｗは、０、１、２、または３である。
【０８５２】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｂ）の化合物は、式（ＩＸ−ｂ−２）のもの、
【化７２】
2019516719.tif 000177
またはその塩である。
【０８５３】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｂ）の化合物は、式（ＩＸ−ｂ−３）のもの、
【化７３】
2019516719.tif 000178
またはその塩である。
【０８５４】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｂ）の化合物は、式（ＩＸ−ｂ−４）のもの、
【化７４】
2019516719.tif 000179
またはその塩である。
【０８５５】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｂ）の化合物は、以下のうちの１つ、
【化７５】
2019516719.tif 000180
またはその塩である。
【０８５６】
リン脂質尾部修飾
ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、修飾された尾部を含む。ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、修飾された尾部を有するＤＳＰＣ、またはその類似体である。本明細書に記載されるとき、「修飾された尾部」は、より短いまたはより長い脂肪族鎖を有する尾部、分岐が導入された脂肪族鎖、置換基が導入された脂肪族鎖、１つ以上のメチレンが環状もしくはヘテロ原子基で置き換えられた脂肪族鎖、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。例えば、ある特定の実施形態では、（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ−ａ）のもの、またはその塩であり、式中、Ｒ２の少なくとも１つの出現例は、Ｒ２の各出現例は、任意選択で置換されるＣ１−３０アルキルであり、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−で置き換えられている。
【０８５７】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、式（ＩＸ−ｃ）のもの、
【化７６】
2019516719.tif 000181
またはその塩であり、式中、
各ｘは独立して、整数０〜３０（端点を含む）であり、
各出現例は、Ｇは独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を代表する。
【０８５８】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、式（ＩＸ−ｃ−１）のもの、
【化７７】
2019516719.tif 000182
またはその塩であり、式中、
ｖの各出現例は独立して、１、２、または３である。
【０８５９】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、式（ＩＸ−ｃ−２）のもの、
【化７８】
2019516719.tif 000183
またはその塩である。
【０８６０】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、以下の式のもの、
【化７９】
2019516719.tif 000184
またはその塩である。
【０８６１】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、以下、
【化８０】
2019516719.tif 000185
またはその塩である。
【０８６２】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、式（ＩＸ−ｃ−３）のもの、
【化８１】
2019516719.tif 000186
またはその塩である。
【０８６３】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、以下の式のもの、
【化８２】
2019516719.tif 000187
またはその塩である。
【０８６４】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ−ｃ）の化合物は、以下、
【化８３】
2019516719.tif 000188
またはその塩である。
【０８６５】
ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、第四級アミンをホスホリル基に連結するアルキル鎖がエチレンではない（例えば、ｎは２ではない）、修飾されたホスホコリン部分を含む。したがって、ある特定の実施形態では、本発明において有用なまたは有用な可能性のあるリン脂質は、式（ＩＸ）の化合物であり、式中、ｎは、１、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。例えば、ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
【化８４】
2019516719.tif 000189
またはその塩である。
【０８６６】
ある特定の実施形態では、式（ＩＸ）の化合物は、以下のうちの１つ、
【化８５−１】
2019516719.tif 000190
【化８５−２】
2019516719.tif 000191
またはその塩である。
【０８６７】
（ｉｉ）代替的な脂質
ある特定の実施形態では、代替的な脂質が、本発明のリン脂質の代わりに使用される。かかる代替的な脂質の非限定的な例としては、以下が挙げられる。
【化８６−１】
2019516719.tif 000192
【化８６−２】
2019516719.tif 000193
【０８６８】
（ｉｉｉ）構造脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上の構造脂質を含み得る。本明細書で使用されるとき、「構造脂質」という用語は、ステロール、そしてまたステロール部分を含有する脂質を指す。
【０８６９】
脂質ナノ粒子への構造脂質の組み込みは、粒子中の他の脂質の凝集を軽減する一助となり得る。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、アルファ−トコフェロール、ホパノイド、フィトステロール、ステロイド、及びそれらの混合物を含むがこれらに限定されない群から選択され得る。いくつかの実施形態では、構造脂質は、ステロールである。本明細書で定義されるとき、「ステロール」は、ステロイドアルコールからなるステロイドの下位群である。ある特定の実施形態では、構造脂質は、ステロイドである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールである。ある特定の実施形態では、構造脂質は、コレステロールの類似体である。ある特定の実施形態では、構造脂質は、アルファ−トコフェロールである。構造脂質の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。
【化８７−１】
2019516719.tif 000194
【化８７−２】
2019516719.tif 000195
【０８７０】
一実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物における構造脂質（例えば、コレステロール等のステロール）の量は、約２０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％〜約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％〜約４５ｍｏｌ％の範囲である。
【０８７１】
一実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物における構造脂質（例えば、コレステロール等のステロール）の量は、約２５ｍｏｌ％〜約３０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％、または約３５ｍｏｌ％〜約４０ｍｏｌ％の範囲である。
【０８７２】
一実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物における構造脂質（例えば、コレステロール等のステロール）の量は、約２４ｍｏｌ％、約２９ｍｏｌ％、約３４ｍｏｌ％、または約３９ｍｏｌ％である。
【０８７３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物における構造脂質（例えば、コレステロール等のステロール）の量は、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０ｍｏｌ％である。
【０８７４】
（ｉｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質を含み得る。
【０８７５】
本明細書で使用されるとき、「ＰＥＧ−脂質」という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾脂質を指す。ＰＥＧ−脂質の非限定的な例としては、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ−セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン及びＰＥＧ修飾１，２−ジアシルオキシプロパン−３−アミンが挙げられる。かかる脂質は、ＰＥＧ化脂質とも称される。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。
【０８７６】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−脂質には、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロールメトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［アミノ（ポリエチレングリコール）］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ）、ＰＥＧ−ジパルメトレイル、ＰＥＧ−ジオレイル、ＰＥＧ−ジステアリル、ＰＥＧ−ジアシルグリカミド（ＰＥＧ−ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＰＰＥ）、またはＰＥＧ−ｌ，２−ジミリスチルオキソプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｌｐｒｏｐｙｌ）−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０８７７】
一実施形態では、ＰＥＧ−脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
【０８７８】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−脂質の脂質部分には、約Ｃ１４〜約Ｃ２２、好ましくは約Ｃ１４〜約Ｃ１６の長さを有するものが含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ部分、例えばｍＰＥＧ−ＮＨ２は、約１０００、２０００、５０００、１０，０００、１５，０００または２０，０００ダルトンのサイズを有する。一実施形態では、ＰＥＧ−脂質は、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。
【０８７９】
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、非拡散性ＰＥＧであるＰＥＧ脂質を含み得る。非拡散性ＰＥＧの非限定的な例としては、ＰＥＧ−ＤＳＧ及びＰＥＧ−ＤＳＰＥが挙げられる。
【０８８０】
ＰＥＧ−脂質は、当該技術分野で知られており、米国特許第８１５８６０１号及び国際公開第ＷＯ  ２０１５／１３０５８４  Ａ２号に記載されるもの等があり、同文献は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０８８１】
一般に、本明細書に記載の種々の式の他の脂質構成成分（例えば、ＰＥＧ脂質）のうちのいくつかは、２０１６年１２月１０日に出願された、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ」と題される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０００１２９号に記載されるように合成されてもよく、同文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０８８２】
脂質ナノ粒子組成物の脂質構成成分は、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質等の、ポリエチレングリコールを含む１つ以上の分子を含んでもよい。かかる種は代替的に、ＰＥＧ化脂質と称され得る。ＰＥＧ脂質は、ポリエチレングリコールで修飾された脂質である。ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物を含む非限定的な群から選択され得る。例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＬＰＥ、ＰＥＧ−ＤＭＰＥ、ＰＥＧ−ＤＰＰＣ、またはＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質であり得る。
【０８８３】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ  ＤＭＧの修飾形態である。ＰＥＧ−ＤＭＧは、以下の構造を有する。
【化８８】
2019516719.tif 000196
【０８８４】
一実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、国際公開第ＷＯ２０１２０９９７５５号に記載されるＰＥＧ化脂質であり得、同文献の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のこれらの例となるＰＥＧ脂質のうちのいずれも、ＰＥＧ鎖上にヒドロキシル基を含むように修飾され得る。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ＯＨ脂質である。本明細書で一般に定義されるとき、「ＰＥＧ−ＯＨ脂質」（本明細書で「ヒドロキシ−ＰＥＧ化脂質」とも称される）は、脂質上に１つ以上のヒドロキシル（−ＯＨ）基を有するＰＥＧ化脂質である。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ−ＯＨ脂質は、ＰＥＧ鎖上に１つ以上のヒドロキシル基を含む。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ−ＯＨまたはヒドロキシ−ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ鎖の末端に−ＯＨ基を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を代表する。
【０８８５】
ある特定の実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩ）の化合物である。本明細書に提供されるは、式（ＶＩＩ）の化合物、
【化８９】
2019516719.tif 000197
またはその塩であり、式中、
Ｒ３は、−ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択で置換されるアルキル、または酸素保護基であり、
ｒは、１〜１００（端点を含む）の整数であり、
Ｌ１は、任意選択で置換されるＣ１−１０アルキレンであり、該任意選択で置換されるＣ１−１０アルキレンの少なくとも１つのメチレンは独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、−Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、または−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−で置き換えられ、
Ｄは、クリックケミストリーによって得られた部分または生理的条件下で切断可能な部分であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり、
Ａは、
【化９０】
2019516719.tif 000198
のものであり、
Ｌ２の各出現例は独立して、結合または任意選択で置換されるＣ１−６アルキレンであり、該任意選択で置換されるＣ１−６アルキレンの１つのメチレン単位は任意選択で、−Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、または−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−で置き換えられ、
Ｒ２の各出現例は独立して、任意選択で置換されるＣ１−３０アルキル、任意選択で置換されるＣ１−３０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１−３０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ２の１つ以上のメチレン単位は独立して、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−で置き換えられ、
ＲＮの各出現例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基であり、
環Ｂは、任意選択で置換されるカルボシクリル、任意選択で置換されるヘテロシクリル、任意選択で置換されるアリール、または任意選択で置換されるヘテロアリールであり、
ｐは、１または２である。
【０８８６】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、ＰＥＧ−ＯＨ脂質（すなわち、Ｒ３は、−ＯＲＯであり、ＲＯは、水素である）である。ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ−ＯＨ）のもの、
【化９１】
2019516719.tif 000199
またはその塩である。
【０８８７】
ある特定の実施形態では、Ｄは、クリックケミストリーによって得られる部分（例えば、トリアゾール）である。ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ−ａ−１）もしくは（ＶＩＩ−ａ−２）のもの、
【化９２】
2019516719.tif 000200
またはその塩である。
【０８８８】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
【化９３】
2019516719.tif 000201
またはその塩であり、式中、
ｓは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。
【０８８９】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
【化９４】
2019516719.tif 000202
またはその塩である。
【０８９０】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
【化９５−１】
2019516719.tif 000203
【化９５−２】
2019516719.tif 000204
またはその塩である。
【０８９１】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
【化９６】
2019516719.tif 000205
またはその塩である。
【０８９２】
ある特定の実施形態では、Ｄは、生理的条件下で切断可能な部分である（例えば、エステル、アミド、炭酸塩、カルバメート、尿素）。ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ−ｂ−１）もしくは（ＶＩＩ−ｂ−２）のもの、
【化９７】
2019516719.tif 000206
またはその塩である。
【０８９３】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩ−ｂ−１−ＯＨ）もしくは（ＶＩＩ−ｂ−２−ＯＨ）のもの、
【化９８】
2019516719.tif 000207
またはその塩である。
【０８９４】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
【化９９】
2019516719.tif 000208
またはその塩である。
【０８９５】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
【化１００】
2019516719.tif 000209
またはその塩である。
【０８９６】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
【化１０１】
2019516719.tif 000210
またはその塩である。
【０８９７】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
【化１０２】
2019516719.tif 000211
またはその塩である。
【０８９８】
ある特定の実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ化脂肪酸である。ある特定の実施形態では、本発明において有用なＰＥＧ脂質は、式（ＶＩＩＩ）の化合物である。本明細書に提供されるのは、式（ＶＩＩＩ）の化合物、
【化１０３】
2019516719.tif 000212
またはその塩であり、式中、
Ｒ３は、−ＯＲＯであり、
ＲＯは、水素、任意選択で置換されるアルキルまたは酸素保護基であり、
ｒは、１〜１００（端点を含む）の整数であり、
Ｒ５は、任意選択で置換されるＣ１０−４０アルキル、任意選択で置換されるＣ１０−４０アルケニル、または任意選択で置換されるＣ１０−４０アルキニルであり、任意選択で、Ｒ５１つ以上のメチレン基は、任意選択で置換されるカルボシクリレン、任意選択で置換されるヘテロシクリレン、任意選択で置換されるアリーレン、任意選択で置換されるヘテロアリーレン、−Ｎ（ＲＮ）−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）−、−Ｃ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）−、−ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＯＳ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｏ−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、−ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）−、または−Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ−で置き換えられ、
ＲＮの各出現例は独立して、水素、任意選択で置換されるアルキル、または窒素保護基である。
【０８９９】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、式（ＶＩＩＩ−ＯＨ）のもの、
【化１０４】
2019516719.tif 000213
またはその塩である。いくつかの実施形態では、ｒは、４５である。
【０９００】
ある特定の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、以下の式のうちの１つのもの、
【化１０５−１】
2019516719.tif 000214
【化１０５−２】
2019516719.tif 000215
またはその塩である。いくつかの実施形態では、ｒは、４５である。
【０９０１】
なおも他の実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、下記、
【化１０６】
2019516719.tif 000216
またはその塩である。
【０９０２】
一実施形態では、式（ＶＩＩＩ）の化合物は、下記である。
【化１０７】
2019516719.tif 000217
【０９０３】
一実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物中のＰＥＧ−脂質の量は、約０．１ｍｏｌ％〜約５ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約５ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約５ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％〜約５ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約５ｍｏｌ％ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％〜約４ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約４ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約４ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％〜約４ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約４ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％、約２ｍｏｌ％〜約３ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約１．５ｍｏｌ％〜約２ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％〜約１．５ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％〜約１．５ｍｏｌ％、または約１ｍｏｌ％〜約１．５ｍｏｌ％の範囲である。
【０９０４】
一実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物中のＰＥＧ−脂質の量は、約２ｍｏｌ％である。
【０９０５】
一実施形態では、本明細書に開示される脂質組成物中のＰＥＧ−脂質の量は、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５ｍｏｌ％である。
【０９０６】
いくつかの態様では、本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、ＰＥＧ−脂質を含まない。
【０９０７】
（ｖ）他のイオン性アミノ脂質
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）による脂質に加えて、１つ以上のイオン性アミノ脂質を含み得る。
【０９０８】
イオン性脂質は、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１，Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタンアミン（ＫＬ１０）、Ｎ１−［２−（ジドデシルアミノ）エチル］−Ｎ１，Ｎ４，Ｎ４−トリドデシル−１，４−ピペラジンジエタンアミン（ＫＬ２２）、１４，２５−ジトリデシル−１５，１８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（ＫＬ２５）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノアート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、（１３Ｚ，１６５Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニドコサ−１３−１６−ジエン−１−アミン（Ｌ６０８）、２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ）、（２Ｒ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ））、及び（２Ｓ）−２−（｛８−［（３β）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ））からなる非限定的な群から選択され得る。これらに加えて、イオン性アミノ脂質はまた、環状アミン基を含む脂質でもあり得る。
【０９０９】
イオン性脂質はまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ  ２０１７／０７５５３１  Ａ１号に開示される化合物でもあり得る。例えば、イオン性アミノ脂質には、下記が含まれるが、これらに限定されない。
【化１０８−１】
2019516719.tif 000218
【化１０８−２】
2019516719.tif 000219
及びそれらの任意の組み合わせ。
【０９１０】
イオン性脂質はまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ  ２０１５／１９９９５２  Ａ１号に開示される化合物でもあり得る。例えば、イオン性アミノ脂質には、下記が含まれるが、これらに限定されない。
【化１０９−１】
2019516719.tif 000220
【化１０９−２】
2019516719.tif 000221
【化１０９−３】
2019516719.tif 000222
及びそれらの任意の組み合わせ。
【０９１１】
イオン性脂質には、下記がさらに含まれ得るが、これらに限定されない。
【化１１０】
2019516719.tif 000223
及びそれらの任意の組み合わせ。
【０９１２】
（ｖｉ）他の脂質組成物構成成分
本明細書に開示される医薬組成物の脂質組成物は、上述のものに加えて１つ以上の構成成分を含み得る。例えば、脂質組成物は、１つ以上の透過促進分子、炭水化物、ポリマー、表面改質剤（例えば、界面活性剤）、または他の構成成分を含み得る。例えば、透過促進分子は、米国特許出願公開第２００５／０２２２０６４号に記載される分子であり得る。炭水化物は、単糖（例えば、グルコース）及び多糖類（例えば、グリコーゲンならびにその誘導体及び類似体）を含み得る。
【０９１３】
本明細書に開示される医薬組成物（例えば、脂質ナノ粒子形態の医薬組成物）をカプセル封入または部分的にカプセル封入するために、ポリマーを含める及び／または使用することができる。ポリマーは、生分解性及び／または生体適合性であり得る。ポリマーは、ポリアミン、ポリエーテル、ポリアミド、ポリエステル、ポリカルバメート、ポリ尿素、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリアセチレン、ポリエチレン、ポリエチレンイミン、ポリイソシアネート、ポリアクリレート、ポリエタクリレート、ポリアクリロニトリル、及びポリアリレートから選択され得るが、これらに限定されない。
【０９１４】
脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比の範囲は、約１０：１〜約６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。
【０９１５】
いくつかの実施形態では、脂質組成物とポリヌクレオチドとの間の比は、約１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２１：１、２２：１、２３：１、２４：１、２５：１、２６：１、２７：１、２８：１、２９：１、３０：１、３１：１、３２：１、３３：１、３４：１、３５：１、３６：１、３７：１、３８：１、３９：１、４０：１、４１：１、４２：１、４３：１、４４：１、４５：１、４６：１、４７：１、４８：１、４９：１、５０：１、５１：１、５２：１、５３：１、５４：１、５５：１、５６：１、５７：１、５８：１、５９：１または６０：１（ｗｔ／ｗｔ）であり得る。いくつかの実施形態では、脂質組成物対、治療剤をコードするポリヌクレオチドのｗｔ／ｗｔ比は、約２０：１または約１５：１である。
【０９１６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、１つを超えるポリペプチドを含有し得る。例えば、本明細書に開示される医薬組成物は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）を含有し得る。
【０９１７】
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）を、脂質：ポリヌクレオチド重量比５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１もしくは７０：１で、またはこれらの比の範囲もしくはそのいずれか、例えば、限定されないが、５：１〜約１０：１、約５：１〜約１５：１、約５：１〜約２０：１、約５：１〜約２５：１、約５：１〜約３０：１、約５：１〜約３５：１、約５：１〜約４０：１、約５：１〜約４５：１、約５：１〜約５０：１、約５：１〜約５５：１、約５：１〜約６０：１、約５：１〜約７０：１、約１０：１〜約１５：１、約１０：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１０：１〜約３０：１、約１０：１〜約３５：１、約１０：１〜約４０：１、約１０：１〜約４５：１、約１０：１〜約５０：１、約１０：１〜約５５：１、約１０：１〜約６０：１、約１０：１〜約７０：１、約１５：１〜約２０：１、約１５：１〜約２５：１、約１５：１〜約３０：１、約１５：１〜約３５：１、約１５：１〜約４０：１、約１５：１〜約４５：１、約１５：１〜約５０：１、約１５：１〜約５５：１、約１５：１〜約６０：１もしくは約１５：１〜約７０：１で含み得る。
【０９１８】
一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子は、ポリヌクレオチドを、およそ０．１ｍｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ、例えば、限定されないが、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．１ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．３ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、１．７ｍｇ／ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍｌ、１．９ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌまたは２．０ｍｇ／ｍｌ超の濃度で含み得る。
【０９１９】
（ｖｉｉ）ナノ粒子組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化される。したがって、本開示はまた、（ｉ）本明細書に記載される式（Ｉ）または（ＩＩＩ）の化合物等の送達剤を含む脂質組成物と、（ｉｉ）ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む、ナノ粒子組成物も提供する。かかるナノ粒子組成物において、本明細書に開示される脂質組成物は、ＧＬＡポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをカプセル封入することができる。
【０９２０】
ナノ粒子組成物は、典型的に、およそ数マイクロメートル以下のサイズにされ、脂質二重層を含み得る。ナノ粒子組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム（例えば、脂質小胞）、及びリポプレックスを包含する。例えば、ナノ粒子組成物は、直径５００ｎｍ以下の脂質二重層を有するリポソームであり得る。
【０９２１】
ナノ粒子組成物は、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム、及びリポプレックスを含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、１つ以上の脂質二重層を含む小胞である。ある特定の実施形態では、ナノ粒子組成物は、水性区画によって分離された２つ以上の同心二重層を含む。脂質二重層は、官能化及び／または互いに架橋結合され得る。脂質二重層は、１つ以上のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含み得る。
【０９２２】
いくつかの実施形態では、本開示のナノ粒子組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）による少なくとも１つの化合物を含む。例えば、ナノ粒子組成物は、化合物１〜１４７のうちの１つ以上、または化合物１〜３４２のうちの１つ以上を含み得る。ナノ粒子組成物はまた、多様な他の構成成分も含み得る。例えば、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、または（ＶＩ）による脂質に加えて１つ以上の他の脂質、例えば、（ｉ）少なくとも１つのリン脂質、（ｉｉ）少なくとも１つの構造脂質、（ｉｉｉ）少なくとも１つのＰＥＧ−脂質、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせを含んでもよい。構造脂質の包含は、例えば、式ＩＩＩによる脂質が本発明の脂質ナノ粒子組成物中で使用される場合等、任意選択的であり得る。
【０９２３】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物、（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）及びリン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）を含む。
【０９２４】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）。を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）及びリン脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＳＰＣ）を含む。
【０９２５】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）からなるまたはそれから本質的になる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（Ｉ）の化合物（例えば、化合物１８、２５、２６または４８）及びリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）からなるまたはそれから本質的になる脂質組成物を含む。
【０９２６】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）からなるまたはそれから本質的になる脂質組成物を含む。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、式（ＩＩＩ）の化合物（例えば、化合物２３６）及びリン脂質（例えば、ＤＳＰＣ）からなるまたはそれから本質的になる脂質組成物を含む。
【０９２７】
一実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン性脂質、構造脂質、リン脂質、及びｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、ステロール及び構造脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約２０〜６０％のイオン性脂質：約５〜２５％の構造脂質：約２５〜５５％のステロール；及び約０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質のモル比を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５０％のイオン性脂質、約１．５％のＰＥＧ修飾脂質、約３８．５％のコレステロール、及び約１０％の構造脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、約５５％のイオン性脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質、約３２．５％のコレステロール、及び約１０％の構造脂質のモル比を含む。いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、イオン性アミノ脂質であり、構造脂質は、中性脂質であり、ステロールは、コレステロールである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、イオン性脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ脂質のモル比が５０：３８．５：１０：１．５である。いくつかの実施形態では、イオン性脂質は、化合物１８または化合物２３６であり、ＰＥＧ脂質は、化合物４２８である。
【０９２８】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物１８：コレステロール：リン脂質：化合物４２８のモル比が５０：３８．５：１０：１．５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物１８：コレステロール：ＤＳＰＣ：化合物４２８のモル比が５０：３８．５：１０：１．５である。
【０９２９】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物２３６：コレステロール：リン脂質：化合物４２８のモル比が５０：３８．５：１０：１．５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、化合物２３６：コレステロール：ＤＳＰＣ：化合物４２８のモル比が５０：３８．５：１０：１．５である。
【０９３０】
いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、０．４未満の多分散値を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、中性ｐＨで正味中性電荷を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、５０〜１５０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、８０〜１００ｎｍの平均直径を有する。
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꺁觧놨ꯨ花臣蒯鯥ꮁ꣨覼臣貂苣骀苣ꞁ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†觧놨ꯨ花臣蒯鯥ꮁ臣蒁臣膀胣膽胣貀뷯躽胣膀迥뎁胣钽뷯薽胣覭臣ꂆꧨ꾁胣鶁苣ꢁ臣趏꿥꺁賦몤臣芁苣讁胣뺁臣꾁雦袄臣袂苣ꖈ胩躘駧ꞁ臣蒁駩誂胣醼臣뺁臣꾁볯ꒁ苣誂苣骤臣銂蓦뎑臣鞾苣芀뻧꺁볯ꒁ믤誸臣ꆃ菣邃菣鎖臣貀뷯銽胣銂郥肂胣릉꣨讫뇦꺁꿧늛臣龁臣겪飦꾁胣鶁苣ꢁ臣趏꿥꺁賦몤臣芁苣讁胣뺁臣꾁雦袄臣袂苣ꖈ胩躘駧ꞁ臣蒁駩誂胣꒾臣ꆃ菣邃菣꺁臣ꆁ臣醼臣膀볯ꒁ苣誂苣骤臣膀臣龁臣ꢅ臣貁触躸臣龔裦ꦉ臣龁臣鞃菣뮂苣ꮁ臣蒁臣颭鳥馁苣膀臣貂臣誁臣ꚁ铧蒁苣貂苣膀臣讂臣꾁臣貂臣ꊖ胩Ꞁ臣芁苣뒠郥ꮁ胣肺臣閁苣讂臣讦臣閁苣讂胣겜駧躘臣膀뻧꺁臣ꆁ臣뎎꿥ꮁ볯ꒁ臣ꆃ菣邃菣貁触躸臣龔裦ꦉ臣龁臣鞃菣뮂苣ꮁ臣蒁臣颭鳥馁苣膀臣貂臣誁臣ꚁ铧蒁苣貂苣膀臣讂臣꾁臣貂臣ꊖ胩Ꞁ臣芁苣膀껥붖뷥讅苣ꮐ苣芀鳦몙飦꾁胣꒾臣邈鏥꺁臣ꆁ臣醼臣袂苣节ꓥ辁胣뺁臣꾁藥ꚁ臣肉룤꺁铧邈觧뺁臣꾁菣궃苣릂臣誁臣ꚁ귥ꢜ臣讂胣鶁苣ꮁ臣蒁臣ꢔ臣覂苣讂胣芁苣蒁臣鶁苣ꢁ雩ꎀ胦貁臣讂胣龮雦ꊽ藦銂郥肂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†臣龁胣貀苣ꮐ苣趀臣蒁臣ꢔꫨ貁꿧늛苣뚈駩鮁臣膀뿨ꂊ臣膦듧뺁臣꾁럥讨臣薌郥銂꣨릮臣讂臣膀臣貂苣薿ꛨꢁ臣鞁臣蒁臣ꢁ臣节闧辄臣貂臣蒁胣貀苣ꮐ苣趀臣蒁臣ꢔꫨ貁鳦躘듧뢛臣뾽铧閁苣讂臣趁胣貀臣覂臣讂胣ꢁ臣蚁铧麪苣鶁苣薕臣薌郥閁苣膀雩몤臣貂苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 蒯鯥貁룤袁苣貂苣뒠郥膀ꯧ릂臣ꮐ臣貂苣芀臣覂臣膀裥钀賦骮臣貂苣讁胣뺁臣꾁雦袄苣鞁臣꾁뷥궥胨꺁郧ꎧ臣袂苣ꖈ胩躘駧ꞁ臣蒁駩誂胣蒯鯥ꢁ臣ꚁꇨ閁苣讂胥꾁胣螖蓨誸胣鶁臣ꞁ臣蒁臣馁苣躘ꋧꪁ賦몤臣ꪁ臣邙苣膀鳦몙飦꺁闧ꪁ苣龮雦ꊽ藦ꮁ臣蒁臣낿臣覂苣讂꿧늛蛥꺁믤辄臣랅뷤蒚臣蒯鯥뺁臣꾁菩蚈꿧늛苣膀臣꺁꿧늛臣许駩꺁跥趽臣醼볯蚈臣醼臣ꞁ菦骮臣鞾苣鎁臣銂郧ꎧ臣貂臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†臣覂臣膀藥財諦鎡臣蒯鯥薆臣늩뷥馁苣겜駧躘臣릉껥꺁껥붖뷥讅臣膀ꯨ花ꃩ꺁臣ꆁ臣뮻蓦꺁볯ꒁ믤誸臣覂飦몤髧ꮁ駩隤臣貂뻥讂臣ꢁ苣蚐꟨閁苣龁臣芀臣讁苣龮雦ꊽ藦꾁胣鎽ꗦ薀臣ꊗ鿧ꞁ臣讂臣閁苣讂臣膂胣鶁苣覂臣膀駩隤臣ꒁ臣ꚁ鳦躘듧뢛臣躘ꓧ蒚臣風볨閁苣ꚁ臣ꪁ臣ꢁ臣ꚁ苣꒙ꓥ閁苣鞾苣芀鳦몙飦꺁뗧邈觧꺁믤辄臣릉껥꺁껥붖뷥讅볯设臣낁胣뮻蓦꺁ꃦ뢅臣龁臣鶁苣ꮁ苣ꎁ臣뎂菣覃臣貂苣뾂菣醃苣ꪳ胣뮻蓦꺁铧ꎔ雦閳胣뮻蓦꺁뷤ꢔ雦閳귧覼臣膀藥財諦鎡臣颭鳥ꮁ雩ꎀ臣讂臣Ꚑ臣ꮁ臣讁苣覂臣膀뷤覂臣꺁郧놔臣膀믤辄臣醼臣ꖻ룤꺁ꯨ花ꃩ讁苣꒙ꓥ閁苣鞾苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꢅ臣꺁볥ꢔ臣貂苣몇藥膀뻤袁臣膀迥莀雦꺌胣誈ꇨꦉ胣螃菣뾂菣벃苣膀菣벃苣馃菣릂苣뎃菣ꪃ胣誏臣겜飦내鯦ꮁ볥ꢔ臣貂苣肊ꇨ꾁胣閼铧ꮁ臣蒁臣躘ꓧ蒚臣낿臣覂苣ꚁ臣ꪁ臣ꢁ臣ꚁ苣膀迥ꞅ臣袂苣겜飦내鯦ꮁ뗧뾁뻨뺁苣讂胣閼铧閁苣讂蟥뢅臣겜飦내鯦ꢁ臣鮟鯧馁苣風뿨貁臣ꎁ臣뒠郥膀鳦躘듧뢛臣風뿨貁蓥袅臣貂苣蚁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯钼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†꿧誏臣ꢡꛨ몇臣꾁胣邙껥蒚臣芁苣鎁臣銂蓦뎛臣ꪁ臣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣龮雦设胣㲑䐯噉ਾ䐼噉邀볯钼볯钼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤醼볯궂菣ꦃ菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃郥邈戼㹲 ꆼ볯袃菣鮃苣閃苣벃菣貵럨㲯牢ਾ†苣ꆃ菣鶃菣貃苣것苣膃菣꺁볯ꒁ臣颠鿥뺁臣꾁菩蚈臣膀菣ꪃ菣릂菣Ꞃ菣袃臣隌귥蒚胦ꪳ苣뾽铧鞁臣邵郥閁苣鞾苣讁胣뺁臣꾁菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣閁苣鞾苣芀臣꺁雦閳臣鎾臣ꚁ胣견볯꺁ꃩ龟臣龁臣醼볯邼胥ꖻ룤꺁菣꾂菣ꪂ菣覃臣膀볯馀菣躃菣릂菣Ꞃ菣袃迥뎁鳦꾫볯馀뷯薽뷯꾼볯뺁臣꾁菣궃菣꾂볯ꢼ臣隌귥袐裦閁苣鞾苣芀ꃩ龟臣颼볯讀臣貃苣것苣膃菣袂苣节闩蒁ꃥ袐胣鶁苣꾁菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣꺁臣膂臣銼臣꺁軩ꢁ臣ꚁ郥邈臣貂뻥讂胣ં䐼噉邀볯钼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†곧醼臣颠鿥뺁臣꾁菩蚈臣膀苣뎃菣袃菣ꊻ蛥袼볯뚼볯覼苣뾽铧鞁臣膀鷩趽뷧蒚臣꺿ꏩ閁苣龁ꃩ龟臣龁臣ꢃ裥ꢁ臣ꚁ郥邈臣貂苣뒠郥膀볯馀鳦꾫臣鶁臣貾臣궂菣莃菣뎃苣ꢁ臣閼胢ꊃ菣鮃苣閃苣벃菣꺁ꓥ鮏臣鶁臣貾臣骶臣鞾苣芀菣躃菣릂菣Ꞃ菣袃뿤랭鿥꾁胣鎽ꧨ肊ꇨ蚈蟩ꞁ韦ꖟ臣节臣꺁臣ꆁ臣蒁臣貂臣讁苣뢁諦閁苣鞾苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 궂菣ꦃ菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃곧銼臣颠鿥뺁臣꾁菩蚈臣膀賥ꚭ郥邈臣龁臣ꦼ볯뒼돦꺁臣骁苣讁苣뾽铧鞁臣袐裦閁苣鞾苣芀볯뚼볯閳臣膀뿤뺣臣貂臣궂菣莃菣ꢁ藥ꮁ菣ꦃ苣麃菣銂裥ꢔ臣讂볯꺼볯鶃菣ꆃ菣벃苣銂郥뾁뻥讂胣ꎻ鯦蒚臣꾁胣肜ꓥ颼볯讀臣貃苣것苣膃菣꺁苣ꎃ菣鞃臣膀賥ꚭ郥邈臣貂뻥膀볯뚼볯颠鿥뺁臣꾁菩蚈臣ꎀ뗧閁苣鞾苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꦃ苣늂菣랂菣뎃雦閳臣ꒁ臣ꚁ胣꒼볯ꆼ†볯钼菣겂菣벂臣꺁菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣膀뛧蒁臣꒼볯ꆼ裥ꎧ藩ꂴ臣꺁蟥蚐臣膀胩階苣릮飦ꮁ鯥뾁臣讂臣骁臣芁苣鎁臣ꮁ闧辄臣貂臣蒁胣ં䐼噉邀볯钼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†藥鎽髧ꪁ苣ꆃ菣鶃菣貃苣것苣膃菣꾁胣ꪃ菣뢅裢隳ꫩ베臣鲽ꏨ閁苣ꚁ臣ꪁ臣薿ꛨ貁臣讂胣颠鿥뺁臣꾁菩蚈臣蚁臣꺁볯ꒁ臣鶃菣骃菣膃菣銂苣벃菣馁苣뒠郥膀臣讁苣颠鿥뺁臣꾁菩蚈臣膀菣릂菣Ꞃ菣袃裢隳ꫩ베苣ꮐ臣鞾苣芀㰊䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꆬ臣ꞁ胣ꦃ苣늂菣랂菣뎃臣膀믤辄臣ꊗ鿧꺁苣ꪃ菣꾂賥ꚭ胣ꪂ菣袃苣ꪃ菣꾂賥ꚭ胣붂菣ꪃ菣꾂胣뺁臣꾁뷥궥胨ꮁ韦ꖟ臣隻臣龔뷤놅뷥趏뿥隌귥銂뷤ꢔ臣ꚁꇨ辂苣鞾苣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 ꊼ볯袐裦貵럨㲯牢ਾ†苣ꆃ菣鶃菣貃苣것苣膃菣꾁胣肸胩꺁苣낂菣뎃菣꺁雩讧苣뾽铧鞁臣鲽ꏨ閁苣鞾苣芀臣讁苣뮂苣ꆃ菣袃臣膀믤许苣ꮐ苣芀戼㹲袼뷯覼귦뢸臣鎼胢꾼볯銂郥肂苣ꎃ菣鞃迥뎁뿤랭볯馀苣낂菣뎃菣袼苣낂菣뎃菣醼볯㲉牢ਾ볯芽볯鶃菣骃菣膃菣꺁苣벃菣颠鿥銂郥뾁뻥膀귦뢸臣鎼胢꾼볯銂郥肂볯馀菣ꪃ菣릂菣Ꞃ菣袃藩뮂苣ꆃ菣袃볯뮂苣ꆃ菣袃볯覼戼㹲袼뷯覼苣ꮃ苣뮂菣뎃苣ꮐ苣讁胣뺁臣꾁볯馀볯ꢼ苣ꮐ臣ꪁ臣궂菣ꦃ菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣鎼胢ꮜꯧ꺁볯馀菣躃菣릂菣Ꞃ菣袃苣낂菣뎃菣袼뻤袁臣膀냥ꢃ볯袼苣낂菣뎃菣鎼볯ઉ䐼噉邀볯钼볯醼胣㲑䐯噉ਾ†郥邈볯隌귥뺁臣꾁볯뚼볯覼뻥膀苣낂菣뎃菣鎼볯뮂苣ꆃ菣袃볯覼臣膀苣ꮃ苣뮂菣뎃胣ꆬ臣ꞁ胣钃菣鮃苣閃苣뾂菣벂臣ꚇ郧閁苣膀볯馀菣躃菣릂菣Ꞃ菣袃苣鲽ꏨ鞁뻥讂胣ં䐼噉邀볯钼볯銼胣㲑䐯噉ਾ†곦蒁臣膀苣낂菣뎃菣銼볯뮂苣ꆃ菣袃볯覼臣늼볯ꆼ菣겂菣벂苣뾽铧鞁臣뮂苣ꆃ菣袃볯ꮁ菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣閁苣鞾苣芀곦蒁臣膀菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣閁苣龁菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣膀菣궃菣릂菣ꆂ苣벃苣ꞁ닧붣迥뎁蟥蚐臣貂胣뢂菣릂菣Ꞃ菣袃苣螈雦馁苣芀곦蒁臣膀蟥蚐臣貂臣뮂苣ꆃ菣袃볯鲀苣낂菣뎃菣鎼臣讧꿧ꦉ臣膀닧붣臣貂胣뮂苣ꆃ菣袃볯꾁胣閼胢ꮜꯧꮁ菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣閁苣讂胣궂菣ꦃ菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣閁苣ꪁ苣뺲ꏨꖷ꣧貁ꇨ辂苣鞾苣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 궂菣ꦃ菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣膀菣ꪃ菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂ꃥ袐胣ꦃ苣늂菣랂菣뎃臣龁臣邵郥閁苣龁苣낂菣뎃菣꾁胣閼胢떼볯늼볯뮂苣ꆃ菣袃볯覼胣ꪂ菣鞃菣ꪃ菣螃苣뎃苣閃菣벃菣膀臣龁臣꾼볯ꚼ볯뮂苣ꆃ菣袃볯覼迥뎁볯馀볯뒼볯讼볯辽뷯馽볯袼苣낂菣뎃菣鎼볯ꢁ臣ꚁꇨ閁苣鞾苣芀㰊䥄㹖胣醼볯钼볯醀⼼䥄㹖 蒐럥讨臣躏軧꾁胣馼볯鲀볯閼볯ꢁ郥讨뫥ꞁ臣誂뻥讂胣ં䐼噉邀볯钼볯閼胣㲑䐯噉ਾ†껥붖뻤銼볯莽볯꺼볯ꎔ铧꺁臣膂臣낼볯늼戼㹲 莽볯꺼볯꺁ꏨꒉ臣낼볯늼触蚠臣膀볯膽뷯膽†볯覽뷯鎽뷯鎽뷯薽뷯鎽볯랼뷯芽뷯銽뷯貼볯ꆼ볯꺁볯趀臣ꮼ볯낼볯₡ꢼ볯ꚼ볯袼闥馨볯ꢼ뷯钽볯钽뷯銽뷯ₔ늼뷯膽뷯馽볯覽뷯銂뷤ꢔ臣ꚁꇨ辂苣鞾苣芀臣꺁苣릂菣ꂃ臣膀볯趀臣ꮼ볯낼볯₡늼뷯膽뷯馽볯覽뷯醼볯躼볯캕貽胣閃苣꾃菣覃菣ꦃ苣麃菣袼볯邼볎볯覼볯躼볯閼볎뷯膀菣邃菣릂菣ꦃ苣麃菣袼볯邼볎볯覼볯躼볯閼볎뷯膀菣뎃菣것菣袃뷯꒼볯ꆼ裢醼볯邼뷯螽胣誏臣銼볯躼볯캐貽臣貸蟩閁苣龁뷯ꢼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢볯銂郥肂胣낼볯늼迥鲿鷦뚻臣膀볯閼蓢ꞁ볯蚈雩膀迥뎁볯颼蓢ꞁ볯邼꟧鎖臣銼볯떂苣꾂菣膀곦蒁臣閼볯莄臣醼볯銧雩膀곦蒁臣鞼볯莄臣钼볯銧雩膀곦蒁臣鞼볯莄臣閼裥鎖胣ꆬ臣ꞁ볯莄臣芵뫤뺁臣ꞁ臣誂뻥讂胣ં䐼噉邀볯钼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†鳦몙飦꺁菣邃菣릂菣ꦃ苣麃菣꾁胣趽볯꺼볯ꮁ臣蒁臣鶃菣銈볯㲡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銼볯㲐猯扵꺁菣ꪃ裢뒼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰醼볯邼⼼畳㹢苣蒵臣벾臣鞾苣芀苣誂闩蒁臣龁臣袂苣궟臣鶃菣袼볯覼菣ꦃ苣袃苣覜臣讂믤꺁菣邃菣릂菣ꦃ苣麃菣꾁胣鶃菣貃苣것苣膃菣趽볯꺼볯궸臣鶃菣袼볯覼菣벃菣꺁闩閁苣뾪꿧馁苣龁苣ꮁ뷤ꢔ臣貂뻥讂胣ં䐼噉邀볯钼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†迥鲿臣膀볯躽뷯覽뷯銽뷯螽뷯躽臣낼볯늼볯겼볯꺼볯袼闥馨볯낼볯늼†볯覽뷯銽뷯₏ꮼ뷯钽볯ꎼ뷯銽뷯鎽뷯膽뷯貼볯ꆼ볯銂ꏨꂀ胨꺁賦몤볯肜ꓥ閼볎뷯覼胩誂臣뾽铧鞁臣蒵賥閁苣鞾苣芀苣誂ꓥ趁臣趏뿥꾁胣袂苣Ꞥ臣ꪁ껥辇苣覜臣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