(57)【要約】本出願は、アルギネートマトリックスの周辺においてマルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋された当該アルギネートマトリックスを含む半浸透性ヒドロゲル組成物を、その関連する方法及び使用と併せて提供する。
2019512522.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギネートマトリックスの周辺においてマルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋された前記アルギネートマトリックスを含む半浸透性ヒドロゲル組成物。
【請求項２】
前記マルチアームの水溶性ポリマーが、前記アルギネートマトリックスの前記周辺に浸透している、請求項１に記載の半浸透性ヒドロゲル組成物。
【請求項３】
前記アルギネートマトリックスの前記周辺が、前記マルチアームの水溶性ポリマーに連結され、かつ共有結合的に架橋されている、請求項１または２に記載の半浸透性ヒドロゲル組成物。
【請求項４】
マルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋されている、アルギネートの１つ以上の表面層をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の半浸透性ヒドロゲル組成物。
【請求項５】
生体適合性表面層をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の半浸透性ヒドロゲル組成物。
【請求項６】
前記生体適合性表面層が、前記半浸透性ヒドロゲル組成物に共有結合的に結合している、請求項５に記載の半浸透性ヒドロゲル組成物。
【請求項７】
１ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中４０℃で少なくとも３０日間安定である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項８】
１ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中４０℃で３０日間保存されたとき、その形状を維持している、請求項７に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項９】
前記組成物は、前記組成物が１ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中４０℃での保存に供されるとき（０日目）に決定される第１タンジェントデルタ値、及び前記組成物が１ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中４０℃で３０日間保存された後に決定される第２タンジェントデルタ値によって特徴付けられ；前記第１タンジェントデルタ値及び前記第２タンジェントデルタ値が、同じであるか、または約０．０５以下だけ異なっている、請求項７または８に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１０】
前記ヒドロゲルが、１ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中４０℃で３０日間の保存の後に、その半浸透性を維持する、請求項７〜９のいずれか一項に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１１】
約１００ｋＤａ以下の分子量を有する分子種に浸透性であり、より大きい分子種に不浸透性である、先行請求項のいずれか一項に記載の半浸透性ヒドロゲル組成物。
【請求項１２】
前記アルギネートマトリックスが、二価または多価カチオンを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の半浸透性ヒドロゲル組成物。
【請求項１３】
前記アルギネートマトリックスが、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｍｇ２＋、及びこれらの組み合わせなる群から選択される二価のカチオンを含む、請求項１２に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１４】
前記マルチアームの水溶性ポリマーが、３〜１０個のアームを有するマルチアームのポリエチレングリコールである、先行請求項のいずれか一項に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１５】
前記マルチアームの水溶性ポリマーが、約１，０００〜約１００，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項１４に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１６】
前記アルギネートマトリックスが、約１０，０００〜約３００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の重量平均分子量を有する、請求項１４に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１７】
前記共有結合的な架橋結合が、ポリマーアームの末端において第１官能基を含む前記マルチアームの水溶性ポリマーと、前記アルギネートマトリックスにおける第２官能基との反応によって形成される共有結合を含み、前記第１及び第２官能基が、穏やかな反応条件下で互いに選択的に化学的に反応性である、先行請求項のいずれか一項に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１８】
前記アルギネートマトリックスが、約３モル％〜約５０モル％の前記第２官能基を含む、請求項１７に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項１９】
前記第２官能基が、アジド及びテトラジンから選択され；前記第１官能基が、ジベンジルシクロオクチンアミン及びノルボレンから選択され；前記共有結合的な架橋結合が、前記第１及び第２官能基間の付加環化反応によって形成されている、請求項１７に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２０】
１〜２０個の表面層を含む、請求項４に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２１】
１〜１０個の表面層を含む、請求項４に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２２】
前記アルギネートマトリックス内に、薬理活性物質をさらに含む、先行請求項のいずれか一項以上に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２３】
前記アルギネートマトリックス内に生細胞をさらに含む、先行請求項のいずれか一項以上に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２４】
前記生細胞が、自家細胞、同種異系細胞または異種細胞から選択される、請求項２３に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２５】
前記生細胞が、誘導多能性幹細胞由来の細胞、誘導多能性幹細胞由来の膵臓前駆細胞、血小板、Ｔ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞、心筋芽細胞、遺伝子組み換えＡＰＲＥ−１９細胞、膵臓細胞または真皮細胞である、請求項２３に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２６】
前記生細胞が、ホルモン、サイトカイン、または成長因子分泌細胞である、請求項２３に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２７】
前記薬理活性物質が、タンパク質、ポリヌクレオチド、及び小分子からなる群から選択される、請求項２２に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２８】
ビーズ、カプセル、シート、膜、糸、ファイバ、フィラメント、粒子、スポンジ、メッシュ、フォーム、足場及び前記のいずれかの複合体からなる群から選択される形態である、先行請求項のいずれか一項に記載のヒドロゲル組成物。
【請求項２９】
アルギネートマトリックスの周辺においてマルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋された前記アルギネートマトリックスを含むヒドロゲル組成物を調製する方法であって：
（ｉ）約３モル％〜約５０モル％の第２官能基を有するアルギネートマトリックス（「ＡＬＧ−Ｂ」）を、第１官能基をポリマーアームの１つ以上の末端に含むマルチアームの水溶性ポリマー（「ＰＯＬＹ−Ａ」）と共に含む水性混合物を、約０℃〜６０℃の範囲の温度で反応させることを含み、前記第１及び第２官能基は、共有結合的連結Ｃを形成する穏やかな反応条件下で選択的に化学的に反応性であることにより、周辺において、前記マルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋された半浸透性アルギネートマトリックス、第１生成物を含むヒドロゲル組成物を付与する、前記方法。
【請求項３０】
前記反応ステップが、５分〜２時間の期間にわたって実施される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記水性混合物が、約０．５〜２５重量％の前記アルギネートマトリックスを含む、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記水性混合物中の前記マルチアームの水溶性ポリマーの濃度が、約０．１重量％〜約５０重量％の範囲である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｉ）からの前記第１生成物を前記水性混合物から分離して、単離された生成物を付与することをさらに含む、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記単離された生成物を等張液で洗浄することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＡＬＧ−Ｂが、二価または多価カチオンを含む、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記二価または多価カチオンが、Ｃａ２＋である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ＡＬＧ−Ｂが、約１０，０００〜約３００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の重量平均分子量を有する、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記マルチアームの水溶性ポリマーが、１，０００〜約５０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記マルチアームの水溶性ポリマーが、第１官能基によってそれぞれが終端している３〜１０個の線状ポリエチレングリコールアームを有するポリエチレングリコールである、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１官能基がジベンジルシクロオクチンアミンであり、前記第２官能基がアジドである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１官能基がノルボレンであり、前記第２官能基がチオールまたはテトラジンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１官能基対前記第２官能基のモル比が１を超えることにより、前記アルギネートマトリックスの前記共有結合的に架橋された周辺において未反応の第１官能基を含む前記第１生成物を付与する、請求項２９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１官能基対前記第２官能基のモル比Ａ：Ｂが、約１．１〜５の範囲内である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
約０℃〜６０℃の範囲の温度で、水性混合物中、前記第１生成物をＡＬＧ−Ｂと反応させることにより、前記ヒドロゲル表面に共有結合的に架橋されたアルギネートの第２層を含む第２生成物を形成することをさらに含む、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＰＯＬＹ−ＡまたはＡＬＧ−Ｂを、前記第２生成物に、または架橋された表面層を有する逐次ヒドロゲル生成物に逐次添加することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ステップ（ｉ）からの前記ＡＬＧ−Ｂが、マイクロカプセル、ビーズ、シート、ファイバ、膜、微粒子、スポンジ、メッシュ、縫合糸、フォーム、複合体、足場または前記の複合体の形態である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４７】
ステップ（ｉ）からの前記ＡＬＧ−Ｂが、その中にカプセル化されている薬理活性物質を含む、請求項２９〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記薬理活性物質が、タンパク質、ポリヌクレオチド、及び小分子からなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ｉ）からの前記ＡＬＧ−Ｂが、前記ヒドロゲル内に生細胞を含む、請求項２９〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記生細胞が、自家細胞、同種異系細胞または異種細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記生細胞が、誘導多能性幹由来の細胞、誘導多能性幹由来の膵臓前駆細胞、血小板、Ｔ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞、心筋芽細胞、遺伝子組み換えＡＰＲＥ−１９細胞、膵臓細胞または真皮細胞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記生細胞が、ホルモン、サイトカイン、膵臓、遺伝子組み換えＡＲＰＥ−１９、または成長因子分泌細胞である、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、「アルギネートヒドロゲル組成物」のタイトルで２０１６年３月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／３１２，９９８号の利益を主張する。上記出願の全内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、とりわけ、アルギネート系ヒドロゲル組成物、これらの関連する形態、方法及び使用に概して関する。
【背景技術】
【０００３】
アルギネートは、典型的にはワカメから得られ、また、（１，４）−結合したβ−Ｄ−マンヌロネート（Ｍ）及びα−Ｌ−グルロネート（Ｇ）残基のブロックを含有する天然に存在する線状アニオン性ポリマーのファミリーである。その生体適合性、比較的低いコスト、及び天然存在度に少なくとも部分的に起因して、アルギネートは、とりわけ、創傷治癒、生物活性剤の送達、及び細胞移植を含めた多くの生物医学的応用において使用されてきた。
【０００４】
アルギネートの構造は、連続Ｇ残基のブロック、連続Ｍ残基のブロック、ならびに交互しているＧ及びＭ残基のブロックを含む。例えばＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓから生合成的に調製される細菌性アルギネートもまた利用可能である。生物医学的応用において使用されるアルギネートは、典型的には、ヒドロゲル、例えば、イオンで架橋されたヒドロゲルの形態である。かかるゲルを調製するために、アルギネートの水溶液が、典型的には、イオン架橋剤、例えばＣａ２＋などの二価のカチオンと合わされる。ゲル形成は、二価のカチオンの存在下で会合して接合体を形成するＧ−ブロック間の相互作用によって駆動される（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００７，８：２０９８−２１０３）。ＭＧブロックも関与する（Ｄｏｎａｔｉ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００５，６：１０３１−１０４０）。
イオンで架橋されたアルギネートゲルの１つの欠点は、生理条件下での制限された安定性である。イオンで架橋されたゲルは、一価のカチオン及び他のカチオンとの交換反応によって生理条件下で溶解する傾向がある。ゆえに、イオンで架橋されたアルギネートヒドロゲル及び他の修飾されたアルギネートヒドロゲルに関連する不安定性ならびに他の欠点を有することなく、生物医学的応用における使用に好適なアルギネート組成物を提供することがかなり有利である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００７，８：２０９８−２１０３
【非特許文献２】Ｄｏｎａｔｉ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００５，６：１０３１−１０４０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１態様において、アルギネートマトリックスの周辺においてマルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋された当該アルギネートマトリックスを含む半浸透性ヒドロゲル組成物を本明細書において提供する。
【０００７】
１つ以上の実施形態において、マルチアームの水溶性ポリマーは、アルギネートマトリックスの周辺に浸透している。
【０００８】
いくつかの実施形態において、アルギネートマトリックスの周辺は、マルチアームの水溶性ポリマーと連動していて、かつ共有結合的に架橋されている。
【０００９】
いくつかの追加の実施形態において、ヒドロゲル組成物は、マルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋されている、アルギネートの１つ以上の相互浸透（例えば、最大で約１００ミクロン、最大で約１０ミクロン、最大で約１ミクロン）表面層をさらに含む。
【００１０】
いくつかのさらなる実施形態において、ヒドロゲル組成物は、生体適合性表面層をさらに含む。
【００１１】
上記に関連するいくつかの実施形態において、生体適合性表面層は、半浸透性ヒドロゲル組成物に共有結合的に結合している。
【００１２】
いくつかの追加の実施形態において、ヒドロゲル組成物は、１ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中４０℃で少なくとも３０日間安定である。
【００１３】
いくつかのさらなる実施形態において、ヒドロゲル組成物は、１ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中４０℃で３０日間安定であるとき、その形状を維持する。
【００１４】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、上記組成物は、当該組成物が１ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中４０℃での保存に供されるとき（０日目）に決定される第１タンジェントデルタ値、及び当該組成物が１ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中４０℃で３０日間保存された後に決定される第２タンジェントデルタ値によって特徴付けられ；第１タンジェントデルタ値及び第２タンジェントデルタ値が、同じであるか、または約０．０５以下だけ異なっている。
【００１５】
さらにいくつかの実施形態において、ヒドロゲルは、１ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中４０℃で３０日間の保存の後に、その半浸透性を維持する。
【００１６】
いくつかの追加の実施形態において、上記組成物は、約１００ｋＤａ以下の分子量を有する分子種に浸透性であり、より大きい分子種に不浸透性である。
【００１７】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、アルギネートマトリックスは、二価または多価カチオンを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、上記に関連して、アルギネートマトリックスは、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｍｇ２＋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される二価のカチオンを含む。
【００１９】
１つ以上の実施形態において、マルチアームの水溶性ポリマーは、３〜１０個のアーム（例えば、３、４、５、６、７、８、９、及び１０から選択される）を有するマルチアームのポリエチレングリコールである。
【００２０】
いくつかの追加の実施形態において、マルチアームの水溶性ポリマーは、約１，０００〜約１００，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する。
【００２１】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、アルギネートマトリックスは、約１０，０００〜約３００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の重量平均分子量を有する。
【００２２】
さらにいくつかの追加の実施形態において、共有結合的な架橋結合は、（例えば、末端において、またはペンダント基として）ポリマーアームにおいて含まれる第１官能基を含む、マルチアームの水溶性ポリマーと、アルギネートマトリックスにおける第２官能基との反応によって形成される共有結合を含み、第１及び第２官能基が、穏やかな反応条件下で互いに選択的に化学的に反応性である。
【００２３】
上記に関連するいくつかの実施形態において、アルギネートマトリックスは、約３モル％〜約５０モル％の第２官能基を含む。
【００２４】
第１及び第２官能基の１つ以上の特定の実施形態において、第２官能基は、アジド及びテトラジンから選択され；第１官能基は、ジベンジルシクロオクチンアミン及びノルボレンから選択され；共有結合的な架橋結合が、第１及び第２官能基間の付加環化反応によって形成されている。
【００２５】
第１及び第２官能基の１つ以上のさらなる実施形態において、第２官能基は、ジベンジルシクロオクチンアミン及びノルボレンから選択され；第１官能基は、アジド及びテトラジンから選択され；共有結合的な架橋結合が、第１及び第２官能基間の付加環化反応によって形成されている。
【００２６】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、ヒドロゲル組成物は、１〜２０個の表面層を含む。さらにいくつかの実施形態において、ヒドロゲル組成物は、１〜１０個の表面層を含む。
【００２７】
ヒドロゲル組成物のさらにいくつかの追加の実施形態において、アルギネートマトリックスは、薬理活性物質を含む。
【００２８】
ヒドロゲル組成物のいくつかの代替の実施形態において、アルギネートマトリックスは、生細胞を含む。いくつかの特定の実施形態において、生細胞は、自家細胞、同種異系細胞または異種細胞から選択される。
【００２９】
アルギネートマトリックス内に含まれる生細胞のさらにいくつかのさらなる実施形態において、生細胞は、誘導多能性幹細胞由来の細胞、誘導多能性幹細胞由来の膵臓前駆細胞、血小板、Ｔ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞、心筋芽細胞、遺伝子組み換えＡＰＲＥ−１９細胞、膵臓細胞または真皮細胞である。
【００３０】
さらに追加の実施形態において、生細胞は、ホルモン、サイトカイン、または成長因子分泌細胞である。
【００３１】
薬理活性物質を含むアルギネートマトリックスを含むヒドロゲル組成物に関するいくつかの実施形態において、薬理活性物質は、タンパク質、ポリヌクレオチド、及び小分子からなる群から選択される。
【００３２】
さらに、１つ以上の追加の実施形態において、ヒドロゲル組成物は、ビーズ、カプセル、シート、膜、糸、ファイバ、フィラメント、粒子、スポンジ、メッシュ、フォーム、足場または上記のいずれかの複合体の形態である。
【００３３】
さらに別の態様において、アルギネートマトリックスの周辺においてマルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋された当該アルギネートマトリックスを含むヒドロゲル組成物を調製する方法を提供する。上記方法は、（ｉ）約３モル％〜約５０モル％の第２官能基を有するアルギネートマトリックス（「ＡＬＧ−Ｂ」）を、ポリマーアームの１つ以上において第１官能基を含む、マルチアームの水溶性ポリマー（「ＰＯＬＹ−Ａ」）と共に含む水性混合物を、約０℃〜６０℃の範囲の温度で反応させることを含み、第１及び第２官能基は、共有結合的連結Ｃを形成する穏やかな反応条件下で選択的に化学的に反応性であることにより、その周辺において、マルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋された半浸透性アルギネートマトリックス、第１生成物を含むヒドロゲル組成物を付与する。
【００３４】
上記方法に関連するいくつかの実施形態において、反応ステップは、５分〜２時間の期間にわたって実施される。
【００３５】
上記方法に関連するいくつかのさらなる実施形態において、水性混合物は、約０．５〜２５重量％のアルギネートマトリックスを含む。
【００３６】
上記方法のさらにいくつかの追加の実施形態において、水性混合物中のマルチアームの水溶性ポリマーの濃度は、約０．１重量％〜約５０重量％の範囲である。
【００３７】
さらに１つ以上のさらなる実施形態において、上記方法は、ステップ（ｉ）からの第１生成物を水性混合物から分離して、単離された生成物を付与することをさらに含む。
【００３８】
いくつかの追加の実施形態において、上記方法は、単離された生成物を等張液で洗浄することをさらに含む。
【００３９】
いくつかの特定の実施形態において、ＡＬＧ−Ｂは、二価または多価カチオンを含む。１つ以上の関係する実施形態において、二価または多価カチオンは、Ｃａ２＋である。
【００４０】
さらにいくつかのさらなる実施形態において、ＡＬＧ−Ｂは、約１０，０００〜約３００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の重量平均分子量を有する。
【００４１】
上記方法のいくつかの追加の実施形態において、マルチアームの水溶性ポリマーは、１，０００〜約５０，０００ダルトンの範囲の重量平均分子量を有する。
【００４２】
上記方法のさらにいくつかのさらなる実施形態において、マルチアームの水溶性ポリマーは、第１官能基によってそれぞれが終端している３〜１０個の線状ポリエチレングリコールアームを有するポリエチレングリコールである。１つ以上の関係する実施形態において、第１官能基は、ジベンジルシクロオクチンアミンであり、第２官能基はアジドである。さらに１つ以上の追加の実施形態において、第１官能基は、ノルボレンであり、第２官能基はチオールまたはテトラジンである。
【００４３】
上記方法のいくつかの実施形態において、第１官能基対第２官能基のモル比が１を超えることにより、アルギネートマトリックスの共有結合的に架橋された周辺において未反応の第１官能基を含む第１生成物を付与する。
【００４４】
いくつかの特定の実施形態において、第１官能基対第２官能基のモル比Ａ：Ｂは、約１．１〜５の範囲内である。
【００４５】
いくつかの実施形態において、上記方法は、約０℃〜６０℃の範囲の温度で、水性混合物中、第１生成物をＡＬＧ−Ｂと反応させることにより、ヒドロゲル表面に共有結合的に架橋されたアルギネートの第２層を含む第２生成物を形成することをさらに含む。
【００４６】
上記に関連するいくつかのさらなる実施形態において、上記方法は、ＰＯＬＹ−ＡまたはＡＬＧ−Ｂを、第２生成物に、または架橋された表面層を有する逐次ヒドロゲル生成物に逐次添加することをさらに含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ステップ（ｉ）からのＡＬＧ−Ｂは、その中にカプセル化されている薬理活性物質を含む。ある特定の実施形態において、薬理活性物質は、タンパク質、ポリヌクレオチド、及び小分子からなる群から選択される。
【００４８】
いくつかの他の実施形態において、ステップ（ｉ）からのＡＬＧ−Ｂは、ヒドロゲル内に生細胞を含む。いくつかの特定の実施形態において、生細胞は、自家細胞、同種異系細胞または異種細胞である。いくつかの追加の実施形態において、生細胞は、誘導多能性幹由来の細胞、誘導多能性幹由来の膵臓前駆細胞、血小板、Ｔ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞、心筋芽細胞、遺伝子組み換えＡＰＲＥ−１９細胞、膵臓細胞または真皮細胞である。
【００４９】
いくつかの特定の実施形態において、生細胞は、ホルモン、サイトカイン、膵臓、遺伝子組み換えＡＲＰＥ−１９、または成長因子分泌細胞である。
【００５０】
組成物、方法、使用などの追加の実施形態は、以下の詳細な説明、図、実施例、及び特許請求の範囲から明らかであろう。以上及び以下の詳細な説明から認識され得るように、本明細書に記載されているありとあらゆる特徴、及びかかる特徴の２つ以上のありとあらゆる組み合わせは、かかる組み合わせに含まれる特徴が互いに矛盾しないことを条件として、本開示の範囲内に含まれる。また、任意の特徴または特徴の組み合わせが、本発明の任意の実施形態から具体的に排除されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】さらなる架橋された表面層を任意選択的に含む、その周辺において共有結合的に架橋された半浸透性ヒドロゲル組成物を調製するための一般的な概略図を提供する。
【図２】その周辺において、マルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋されたアルギネートマトリックスを調製するための例示的な反応スキームを提供する。
【図３Ａ】図３Ａ及び図３Ｂは、実施例６に記載されているように、水溶性ポリマーの１〜７つの共有結合的に架橋された相互浸透層を有する例示的なアルギネートビーズの半浸透性の性質を示す。図３Ａは、共焦点顕微鏡法によって求められる、１ｍＭ  ＰＢＳ中４０℃で９０日間インキュベートしたときの、１０ｋＤデキストラン−ＦＩＴＣに対して共有結合的に架橋された１、３、５、及び７つの層（複数可）を有する例示的な周辺及び表面修飾アルギネートビーズの浸透性を示す。図３Ｂは、同じ条件下でのＩｇＧ  ＦＩＴＣに対するビーズの不浸透性を示す。
【図３Ｂ】同上。
【図４】実施例７に記載されているように特定された条件下でインキュベートした後の異なるアルギネートビーズについての貯蔵弾性率（Ｅ’）（Ｐａ）対角周波数（ｒａｄ／ｓ）を示す。
【図５】実施例７に記載されているように特定された条件下でインキュベートした後の異なるアルギネートビーズ（表面においてイオンで架橋されたもの及び共有結合的に架橋されたもの）についてのタンジェントデルタ値（Ｅ”／Ｅ’）対角周波数（ｒａｄ／ｓ）を示す。
【図６】その周辺において、マルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋されたイオンで架橋されたアルギネートマトリックス（すなわち、ヒドロゲルの最内部、コア）（「Ｘ」で示される）を含む例示的な半浸透性ヒドロゲルビーズの概略表示である。ビーズ（または他の好適なヒドロゲル形態）は、マルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋されている、アルギネートの１〜２０個のさらなる共有結合的に架橋された表面層（「Ｘ」によって示される周辺に隣接する二番目に外側の層（複数可））をさらに含んでいてよく、最外の生体適合性表面層（「Ｂ」によって示される層）を任意選択的に含有していてよい。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、ＡＡがアルギン酸／アルギネートを示し、ｎが約１〜１０の範囲内であり、いくつかの実施形態においては３である当アルギネートに、線維症耐性を導入するための例示的な部位を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
以下、本発明をより完全にここで説明する。しかし、この発明は、多くの種々の形態で具現化され得、本明細書に記載されている実施形態に限定されると何ら解釈されるべきではなく；むしろ、これらの実施形態は、この開示が詳細かつ完全であるように、また、当業者に本発明の範囲を完全に伝達するように提供されている。
【００５３】
上記であろうと下記であろうと本明細書に列挙されている全ての公開公報、特許及び特許出願は、別途示されない限り、これらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれる公開公報、特許、または特許出願、及び本開示の両方において同じ用語が定義されている場合には、本開示における定義が、支配的な定義を表している。化合物、化学などの特定のタイプの定義について言及されている公開公報、特許、及び特許出願について、かかる化合物、化学などに関係する部分が、参照により本明細書に組み込まれる文献のこれらの部分である。
【００５４】
定義
本発明を説明しかつ特許請求する際、以下の用語を以下に記載されている定義に従って使用する。別途具体的に記述しない限り、本明細書における用語の定義は、有機合成、ならびにポリマー及び薬学の分野において使用されている標準定義である。
【００５５】
単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」及び「ｔｈｅ（その）」は、文脈が別途明確に示していない限り、複数の指示対象を含む。ゆえに、例えば、１つの「水溶性ポリマー」への言及は、単一の水溶性ポリマー、ならびに２つ以上の同じまたは異なる水溶性ポリマーを含む。
【００５６】
特に、所与の量を参照しての「約」という用語は、プラスまたはマイナス５パーセントの偏差を包含することが意図される。
【００５７】
「アルギネート誘導体」または「誘導体化されたアルギネート」または「化学的に修飾されたアルギネート」という用語は、例えば、１つ以上の化学反応体との化学反応によってある程度誘導体化されたアルギネートを指す。
【００５８】
「アルギネートマトリックス」は、二価または多価カチオンによって静電的に架橋されているアルギネートを含むヒドロゲルを指す。アルギネートマトリックスは、それぞれが任意の所望のサイズの、任意の所望の形態、例えば、ビーズ、カプセル、シート、膜、糸、ファイバ、フィラメント、粒子、スポンジ、メッシュ、フォーム、足場及び上記のいずれかの複合体の形態であり得る。（例えば、マイクロビーズまたはナノビーズ）。
【００５９】
「生体適合性表面層」は、本明細書において使用されているとき、生体適合性コーティングを含むヒドロゲル組成物の表面における層を指す。生体適合性コーティングは、好ましくは、ヒドロゲル組成物に共有結合的に結合している。
【００６０】
「コア」は、本明細書において定義されている「周辺」ではないアルギネートマトリックスの部分を指す。
【００６１】
「デンドリマー」は、結合が、中央の中心またはコアから、規則的な分岐パターンによって、また、分岐点をそれぞれ与える繰り返し単位によって放射状に現れる、高度に分岐した、球状のサイズ単分散ポリマーである。デンドリマーは、中央のコア、内部の樹枝状構造（分岐）、及び官能性表面基を有する外側表面を有することを一般に特徴とする。デンドリマーは、これらを他のタイプのポリマーと比べてユニークにするある特定の樹枝状状態の特性を示す。
【００６２】
組成物の「有効量」または「薬学的有効量」または「治療有効量」という用語は、非毒性であるが、所望の応答を与えるのに十分な組成物量を指す。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び全身状態、処置される状態の重篤度、組成物の種、投与形態などに応じて、対象によって変動する。任意の個々の場合における適切な「有効」量は、当業者によって決定されてよい。
【００６３】
「ゲル化」により、材料をゲル化状態にすることが意図される。
【００６４】
「ヒドロゲル」という用語は、水が連続相である含水三次元親水性ポリマーネットワークまたはゲルを指す。
【００６５】
「超分岐」ポリマーは、結合が、（規則的な分岐パターンを有するデンドリマーとは対照的に）非規則的な分岐パターンを有する中央のコアから放射状に現れる、高度に分岐したポリマーである。
【００６６】
「分子質量」または分子量は、ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマーの文脈において、本明細書において使用されているとき、別途示されない限り、数平均分子量を指す。分子量値の非存在下では、ポリマーは、分子量を測定するための粘度測定法である、その固有またはインヘレント粘度によって特徴付けられてもよい。
【００６７】
水溶性ポリマーの幾何形状または全体構造を参照しての「マルチアームの」は、中央のコアから放射している２つ以上の線状ポリマー鎖または「アーム」を有するポリマーを指す。ゆえに、マルチアームのポリマーは、その構成及びコア構造に応じて、２つのポリマーアーム、３つのポリマーアーム、４つのポリマーアーム、５つのポリマーアーム、６つのポリマーアーム、７つのポリマーアーム、８つのポリマーアームまたはそれより多くを持っていてよい。マルチアームのポリマーは、樹枝状ポリマーまたはデンドリマー、ならびに密に分岐した木様の構造を有する超分岐ポリマーを排除する。
【００６８】
「任意選択的な」または「任意選択的に」は、続いて記載されている状況が生じても生じなくてもよく、その結果、当該記載が、当該状況が生じる場合及び生じない場合を含むことになることを意味する。
【００６９】
アルギネートマトリックスの「周辺」は、当該マトリックスの外側表面を含み、かつ当該表面から最大で約１００ミクロンまでマトリックス内に延在している、マトリックス内の領域を指す。特定の態様において、アルギネートマトリックスの「周辺」は、当該マトリックスの外側表面を含み、かつ該表面から最大で約１０ミクロンまでマトリックス内に延在している、または該表面から最大で約１ミクロンまでマトリックス内に延在している。ゆえに、ある特定の実施形態において、アルギネートマトリックスの周辺における、アルギネートマトリックスとマルチアームの水溶性ポリマーとの間の架橋結合は、マトリックス全体にわたって延在しておらず、例えば、アルギネートマトリックスの中央まで延在していない。
【００７０】
「反応性」という用語は、有機合成の従来の条件下で容易にまたは実用的な速度で反応する官能基（例えば、ポリマーに存在する）を指す。これは、反応しないか、または反応するために強い触媒もしくは非実用的な反応条件を必要とするかのいずれかである基（すなわち、「非反応性」または「不活性」基）とは対照的である。
【００７１】
本明細書において提供されている、その周辺において架橋されているアルギネートマトリックスを含むヒドロゲル組成物を参照しての「半浸透性」は、ある特定の材料には浸透性であるが他にはそうではない生体適合性組成物を指す。実例的なヒドロゲルは、例えば、カプセル化された細胞を、当該細胞に材料及び酸素を通過させかつ当該細胞から代謝材料を通過させながら保持するのに有効である。
【００７２】
ある一定の特徴または実体を参照しての「実質的に」という用語は、該特徴または実体を参照して有意な程度までまたはほとんど完全である（すなわち８５％以上の程度まで）ことを意味する。
【００７３】
値の範囲が提供されている場合、該範囲の上限と下限との間に介在する各値、及び記述されている該範囲内の任意の他の記述されているまたは介在する値が、本開示内に包含されることが意図される。例えば、３モル％〜１０モル％の範囲が記載されているとき、３モル％、４モル％、５モル％、６モル％、７モル％、８モル％、９モル％、及び１０モル％、ならびに３モル％以上の値の範囲かつ１０モル％以下の値の範囲も明白に開示されていることが意図される。
【００７４】
有機化合物への言及は、適用できる場合、本明細書において開示されている化合物の、ジアステレオマー及びエナンチオマーなどの異性体、塩、溶媒和物、ならびに多形体を含めたその許容可能な形態、特定の結晶形態、ならびに、ラセミ混合物及び純粋な異性体のいずれの化合物も含むことが意図される。
【００７５】
さらなる定義は、後に続くセクションにおいても見られ得る。
【００７６】
概説
本出願は、本明細書においてより詳細に記載されている、とりわけ、多くの特に驚くべきかつ有益な特徴を有する半浸透性ヒドロゲル組成物の本発明者らの発見に少なくとも部分的に基づいている。ヒドロゲル組成物は、アルギネートマトリックスの周辺においてマルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋された当該アルギネートマトリックスを含む。１つ以上の実施形態において、マルチアームの水溶性ポリマーがアルギネートマトリックスの周辺に浸透していることにより、アルギネートマトリックスの周辺がマルチアームの水溶性ポリマーと連動しており、かつ共有結合的に架橋されている、組成物を提供する。これにより、ヒドロゲルを安定化させることにより、当組成物にいくつかの特有かつ驚くべき特徴を付与する。
【００７７】
この点に付け加えて、当ヒドロゲル組成物の特性決定に基づいて、当組成物は、他の公知の外見的には安定化されているアルギネートとは対照的に、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境をモデル化する高ストレス条件下に置かれたときに、長期間にわたって、その形状及びゲル完全性を維持し（すなわち、良好な機械的安定性を有する）、また、その半浸透性及び他のレオロジー特性も保持することが認識された。より詳細には、共有結合的に架橋された周辺、及び任意選択的にさらなる表面層を有する例示的なアルギネートヒドロゲル配合物が、４０℃で１ｍＭ  ＰＢＳ中に保存されたとき、最長で少なくとも９０日間、その形状（例えば、ビーズ形状）及び完全性を維持した。このことは特に驚くべきことであった。なぜなら、アルギネートヒドロゲルが、特に高温でＰＢＳ中に保存されたときに膨潤すること、及びＰＢＳに含有されるイオン（例えばホスフェートイオン）が、アルギネートヒドロゲル中のカチオンに取って代わり、最終的に、ヒドロゲルマトリックスの破壊及び崩壊を結果として生じることが周知されていたからである。これらの当該例示的なアルギネートヒドロゲル配合物はまた、長期間、すなわち、少なくとも３０日間、また、実際には最長で３ヶ月間、シミュレーションしたｉｎ  ｖｉｖｏ条件下においてもその半浸透性を維持した。ゆえに、本発明者らは、優れた安定性（構造的かつ機能的弾性）を有するアルギネートヒドロゲル組成物を発見した。以上によると、当アルギネートヒドロゲル組成物は、治療薬での使用に、特に、他の使用の中でも、生存細胞を送達するのに有利に適している。
【００７８】
さらなる共有結合的に架橋された表面層を含まない、共有結合的に架橋された周辺を有するヒドロゲルビーズにおいて、ならびに共有結合的に架橋された表面層を有するものについて、アルギネートヒドロゲル組成物の安定性が達成された。これにより、共有結合的に架橋された周辺（例えば、アルギネートマトリックスの周辺は、マルチアームの水溶性ポリマーと連動しており、かつ共有結合的に架橋されている）及び共有結合的に架橋された複数の表面層の両方の効能が実証される。
【００７９】
いずれの特定の理論によっても拘束されないが、当ヒドロゲルの著しい安定性（例えば、シミュレーションしたｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で保持される構造的完全性及び半浸透性）は、アルギネートマトリックスの表面より下の程度まで相互浸透しているマルチアームの水溶性ポリマーと、アルギネートマトリックスとの間の共有結合を含むとされている、アルギネートマトリックスの共有結合架橋されている周辺から少なくとも部分的に生ずるとされている。この物理化学的特徴は、動的機械分析データ、及び、特に、材料のエネルギー散逸の尺度を付与するタンジェントデルタから推論される。当ヒドロゲルでは、タンジェントデルタが、秩序及び制限された柔軟性を示している他の「安定化された」アルギネートヒドロゲル、例えばアルギネート−ポリ−Ｌ−オルニチン−アルギネート（ＡＰＡとも称される）よりも有意に低い（すなわち、数倍低い）。さらに、機械的安定性データ及び共有結合的架橋の性質から、当ヒドロゲルが、単に表面コーティングを保有するだけでなく、むしろ、アルギネートマトリックスの外表面の下のアルギネートマトリックスの周辺において共有結合的な架橋結合を含有していることがさらに推論される。これにより、ヒドロゲルが高ストレス条件下に置かれたときでも、構造的安定性及び機能的安定性（例えば、半浸透性）の達成を結果としてもたらすとされている。
【００８０】
最終的に、ヒドロゲルが、開始剤もしくは促進剤または他の有害な添加剤を必要とすることなく、穏やかな反応条件下で形成される。ヒドロゲル組成物、その成分、関係する方法、使用などの特徴をここでより詳細に以下に議論する。
【００８１】
半浸透性ヒドロゲル組成物
アルギネート／アルギン酸
ヒドロゲル組成物は、アルギネートマトリックスを含む。アルギネート（アルギン酸）は、例えば、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｈｙｐｅｒｂｏｒｅａ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｄｉｇｉｔａｔａ、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｎｏｄｏｓｕｍ、及びＭａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｙｒｉｆｅｒａ、ならびにＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓを含めた、藻及び細菌の両方の源を含めた任意の好適な源から得られてよく；アルギネートは、褐藻類から最も一般的に調達される。細菌源から得られるアルギネートは、部分的にアセチル化されている。本明細書において提供されているヒドロゲル組成物の調製の際の使用に好適なアルギネートとして、例えば、Ｔｏｎｎｅｓｅｎ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．，２００２；２８：６２１−６３０に記載されているものが挙げられる。アルギネートは、（１，４）−結合したβ−Ｄ−マンヌロネート（Ｍ）及びα−Ｌ−グルロネート（Ｇ）残基のブロックを含み；本明細書における使用のためのアルギネートは、いずれの好適なＭ／Ｇブロック比を有していてもよい。例えば、Ｇ−ブロック含有率は、約１０％から最大で約８０％までの範囲であってよく、または約１０％〜約６０％、約１５％〜約５０％、約２０％〜約８０％、約２０％〜約６０％、もしくは約２０％〜約５５％の範囲であってよい。いくつかの実施形態において、Ｇ−ブロック含有率は、約３０％〜約９５％の範囲内であり、または、いくつかの好ましい実施形態において、約４０％〜約７０％の範囲内である。Ｍ及びＧ単位の含有率は、典型的には、製造者によって提供されており、１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって求めることもできる。アルギネートは、典型的には、約５，０００〜約５００，０００ｇ／ｍｏｌ、約７，０００〜約４００，０００ｇ／ｍｏｌ、または約１０，０００〜約３００，０００ｇ／ｍｏｌの範囲の平均分子量（重量平均）を有する。いくつかの実施形態において、好ましい分子量範囲は、約１０，０００ダルトン〜約３００，０００ダルトンである。アルギネートマトリックスを調製するのに使用されるアルギネートは、共有結合的に架橋された表面層を与えるのに使用されるアルギネートと同じであっても異なっていてもよい。
【００８２】
アルギネート（またはｐＨに応じてアルギン酸）は、マルチアームの水溶性ポリマーにおける補足的官能基と反応性である官能基を導入するように官能化される。当ヒドロゲルを調製するために任意の数の反応性官能基の組み合わせが使用されてもよく；好ましい反応対は、安定な共有結合的連結部、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏで、またはシミュレーションしたｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で迅速に加水分解されないものを結果として生じさせるものである。例えば、アルギネートは、反応性官能基、例えば、アミノ、活性化カルボキシ基など、例えば炭酸Ｎ−スクシンイミジル、ヒドラジド、プロピオン酸スクシンイミジル、ブタン酸スクシンイミジル、コハク酸スクシンイミジル、ベンゾトリアゾールカーボネート、グリシジルエーテル、オキシカルボミルイミダゾール、ｐ−ニトロフェニルカーボネート、マレイミド、オルトピリジルジスルフィド、アクリロール、ビニルスルホン、チオール基、アルデヒドなどを導入するために直接または連結部位を介してのいずれかで官能化されてよい。１つ以上の実施形態において、アルギネートの誘導体化は、二官能性リンカーとの反応によって実施される。アルギネートの官能化は、典型的には、アルギネートカルボキシル基との反応によって実施される。用いられる特定の反応対及び化学は、限定的であるとされるべきではなく、当業者に公知である。例として、活性エステル、例えばスクシンイミジルエステルは、アミノ基と反応してアミドを形成し；ベンゾトリアゾールカーボネートは、アミノ基と反応してカルバメートを形成し；マレイミド、ビニルスルホン、ハロアセチル、ピリジルジスルフィド、チオスルホネート、及びチオールは、チオール基と反応し；アルデヒドは、還元アミノ化条件下で第１級アミノ基と反応して第２級アミンなどを形成する。
【００８３】
本明細書において定義されている、共有結合的な架橋結合を周辺において有する当ヒドロゲルを提供するのに使用され得る反応性官能基には、クリックケミストリーまたはＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションに関連するものも含まれる。好適なクリックケミストリー反応として、付加環化、例えば１，２−二極性付加環化及びヘテロディールスアルダー付加環化；ひずんだ複素環式求電子剤、例えばアジリジン、エポキシド、環状サルフェート、エピスルホニウムなどの求核開環；尿素、チオ尿素、ヒドロゾン、オキシムエーテル、アミド及び芳香族複素環を形成するための非アルドールカルボニル化学；ならびに炭素−炭素多重結合への付加、例えば、エポキシ化、アジリジン化、ジヒドロキシル化、ハロゲン化スルフェニル付加、ニトロシル付加、及びマイケル付加が挙げられる。クリックケミストリー反応対、すなわち、穏やかな条件下で選択的に反応性であり、比較的迅速であり、位置特異的であり、容易に除去される副生成物を形成し、かつ、高い生成物収率を結果としてもたらすものが、アルギネートマトリックスが生細胞を含有するこれらの実施形態において特に好ましい。共有結合的カップリングのための実例的な好ましい選択的官能基対として、アジド−ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン）（トリアゾール連結部を結果として生じさせる）、チオール−ノルボレン（マイケル付加）、及びテトラジン−ノルボレン（ピラゾ連結部）が挙げられる。１つ以上の実施形態において、アルギネートとマルチアームの水溶性ポリマーとの間の共有結合的付着は、１，２，３−トリアゾールを形成するための、アジドと末端アルキンとの間の付加環化反応である。いくつかの追加の実施形態において、アルギネートとマルチアームの水溶性ポリマーとの間の共有結合的付着は、ディールスアルダー反応である。さらにいくつかのさらなる実施形態において、アルギネートとマルチアームの水溶性ポリマーとの間の共有結合的付着は、マイケル付加を介して起こる。用いられ得る実例的な反応対は、例えば、ＭｃＫａｙ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１（９），２０１４年９月１８日，１０７５−１１０１；Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊ．Ｌａｈａｎｎ，Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００９（これらにおいて提供されている参照文献を含む）に記載されている。上記の選択的官能基対は互換可能であり、すなわち、誘導体化されたアルギネートまたはマルチアームの水溶性ポリマーに含まれていてよい。
【００８４】
アルギネートの官能化は、直接であってよく、すなわち、カルボキシル基が、マルチアームの水溶性ポリマーとの反応に好適な官能基に直接変換されてよく、またはリンカーを介していてよい。典型的には、アルギネートは、約２〜約２０原子、約２原子〜約１５原子、または約２〜１０原子の長さを有する二官能性リンカーとの反応によって誘導体化され、ここで、リンカーの一方の末端が、マルチアームの水溶性ポリマーとの選択的反応に好適な官能基であり、他方の末端が、アルギネートカルボキシル基との選択的反応に好適である。例えば、実施例（例えば、実施例１を参照されたい）に記載されている１つの例示的なリンカーは、３−アジド−アミノプロパンであり、ここで、アミノ基が、アルギネートのＣ−６カルボキシル基と選択的に反応してアミドを形成する一方で、アジド官能基は、好適に官能化されたマルチアームの水溶性ポリマーへの共有結合的付着に使用される。原子鎖長を考えるとき、全距離に寄与する原子が考えられる。例えば、構造：ＮＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ；を有する３−アジド−アミノプロパンリンカーは、置換基がリンカーの長さに有意に寄与すると考えられないため、鎖長は７原子である。典型的な二官能性リンカーは、線状であり、脂肪族鎖、例えば、二価の飽和脂肪族ラジカル、例えばアルキレン（−ＣＨ２ＣＨ２）ｎ：ここで、ｎは、典型的には、１から最大で約１０までの範囲内である；を含み、末端の反応性官能基に接続している。代替的には、任意の好適なリンカーが用いられてよく；両末端において官能化された小さな線状オリゴマー性エチレングリコールが、リンカー、〜（ＰＥＧ〜）ｎ：ここでｎは、約１〜７の範囲である（例えば、１、２、３、４、５、６、または７である）；として使用されてよい。いくつかの実施形態において、好ましい二官能性リンカーが、一方の末端にアミノ基を有する（すなわち、アルギネートカルボキシルとの反応に好適である）一方で、他方の末端は、マルチアームの水溶性ポリマーとの選択的な共有結合的反応に好適な官能基を有する。
【００８５】
アルギネートは、典型的には、平均で２モル％〜約８０モル％の間、または約３モル％〜約６０モル％、もしくは約３モル％〜約５０モル％のアルギネートカルボキシル基が二官能性リンカーのカルボキシル選択性官能基との反応によって誘導体化されるように誘導体化される。アルギネートの誘導体化の程度は、アルギネートの出発物質の選択、用いられるカップリング反応の性質、反応条件、例えば、反応体のモル比、相対濃度、及び反応時間などによって制御され得る。反応時間が短いと、アルギネートの誘導体化の程度が結果として低くなる。実例として、実施例１には、実例的な二官能性リンカー、３−アジド−アミノプロパンとの反応によるアルギネートの修飾が記載されており、２０％の置換、１５％の置換、１０％の置換、及び５％の置換を有し、置換度が二官能性リンカーの当量数を調整することによって調整されているアルギネートが付与される。二官能性リンカーによる実例的なアルギネートの置換度は、以下のモル百分率：２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％，３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％など；から、付与されている整数のありとあらゆる組み合わせから得られる範囲、例えば、２〜１５％、１５〜２０％、２０〜２５％、２５〜３０％、３０〜３５％、３５〜４０％、４０〜４５％、４５〜５０％などと併せて選択される。
【００８６】
アルギネートの置換／修飾度は、多くの好適な方法、例えば、ＮＭＲ、ＵＶ、またはＩＲ分析、または元素分析のいずれかによって求められ得る。ポリマー、例えばアルギネートのパーセント置換を算出するための好ましい方法は、１Ｈ  ＮＭＲである。
【００８７】
アルギネートは、移植線維症に抵抗する／移植線維症を軽減する、かつ／もしくは皮下炎症を低減するヒドロゲルを提供するのに有効である、または、より一般的には、最小限の免疫反応を示す、さらなる官能基を含むように任意選択的にさらに修飾されてよい。修飾は、アルギネートのヒドロキシルまたはカルボキシル基において実施され得る。いくつかの好ましい実施形態において、移植線維症に抵抗するまたはこれを軽減するのに有効な部位を導入する修飾は、例えば、アルギネートのカルボキシル基との反応に好適な官能基、例えばアミノ基を一方の末端に有する二官能性分子の導入によって、アルギネートのカルボキシル官能基において起こる。好ましい部位は、トリアゾール基または誘導体化されたトリアゾリル基、例えば、６員のアリールまたはヘテロアルキル環を含む部位によって置換されたトリアゾール基を含むものである。例として、２〜３例を挙げると、トリアゾール−チオモルホリンジオキシド、トリアゾール−テトラヒドロフラン、またはトリアゾール−アニリンが挙げられる。トリアゾールまたは誘導体化されたトリアゾリル基は、親水性または疎水性のいずれかのリンカーを介してアルギネートに接続されていてよい。実例的なリンカーは、例えば、アルキレン（すなわち、線状アルキル鎖）、シクロアルキルアルキレン、アラルキレン、または２つの反応性末端に相互接続するオリゴマー性ＰＥＧを有するものであるが、任意の好適な非反応性連結基が使用されてもよい。かかる部位を導入するための１つの代表的な方法は、所望のトリアゾリル基を形成するための、アジドとアルキンとの間のヒュスゲン付加環化を介する。マクロファージによる認識を最小にするもしくは低減する、かつ／または線維堆積を最小にするもしくは低減するトリアゾリルまたは同様に修飾されたアルギネートを形成するための代表的な部位及び化学合成方法は、例えば、補足の材料を含めた、Ｖｅｇａｓ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１６年１月２５日にオンラインで公表されている）に記載されている。例えば、図１及び図２ｅを参照されたい。代表的な官能基として、Ｎ−（４−（４−（（（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２イル）オキシ）メチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）ベンジルカルボキサミド；Ｎ−（２−（２−（２−（（４−（（１，１−ジオキシドチオモルホリノ）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）メトキシ）エトキシ）エチル）カルボキサミド；及び図７Ａ〜Ｃに示されている、Ｎ−（２−（２−（２−（（４−（４−アミノフェニル）１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）メトキシ）エトキシ）エチル）カルボキサミド：ＡＡは、アルギン酸／アルギネートを示し、ｎは１〜１０の範囲であり、いくつかの実施形態において３である；が挙げられる。アルギネートは、共有結合的架橋に好適な官能基を導入するのに使用されるアルギネート化学修飾の位置及びタイプ、ならびにかかる架橋性官能基の置換度に応じて、任意の好適な程度まで修飾され得る。
【００８８】
上記の特徴（修飾度、二官能性リンカー、分子量など）の任意の組み合わせを有するかかる官能化されたアルギネートは、本明細書において提供されている組成物、キット、方法及び用途での使用に好適である。
【００８９】
アルギネートは、二価または多価カチオンへの暴露によって静電的に架橋されているアルギネートマトリックスとされる。イオン架橋結合を含有するアルギネートマトリックスの形成は、二官能性リンカーによる化学修飾の前または後のいずれかに実施され得る。概して、アルギネートマトリックスの形成は、アルギネート水溶液を、イオン架橋剤、例えば二価または多価カチオンと合わせて、ヒドロゲルを形成することに実施される。アルギネート水溶液のイオン架橋の条件は、当該分野において周知されている。イオン架橋を促進するのに好適なカチオンとして、例えば、典型的には、塩の形態でアルギネート水溶液に付加される、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｍｇ２＋、及びこれらの混合物が挙げられる。例示的なアニオンとして、ハライド、サルフェート、及びカーボネートが挙げられる。１つの特に有用なイオン架橋剤は、塩化カルシウムである。１つ以上の特定の実施形態において、カチオンは、二価のカチオンである。いくつかの好ましい実施形態において、二価のカチオンは、Ｃａ２＋であり、または、Ｃａ２＋と、別の二価のカチオン、例えばＢａ２＋との組み合わせであり、ここで、カルシウムが、モル過剰の二次カチオンである。例示的な二価のカチオンの組み合わせとして、例えば、４９：１、または４５：５、４０：１０、及び３０：２０から選択されるモル比のＣａ２＋：Ｂａ２＋が挙げられる。二価のカチオンの組み合わせが使用される１つ以上の実施形態において、当該組み合わせは、４９：１のモル比でのＣａ２＋：Ｂａ２＋の組み合わせである。実例として、実施例３には、二官能性リンカーによる修飾によるもの及びかかる修飾によらないものの両方の、イオンで架橋されたアルギネートビーズの調製が記載されている。
【００９０】
マルチアームの水溶性ポリマー
当ヒドロゲルの形成の際の使用のためのマルチアームの水溶性ポリマーは、中央のコアから放射している２つ以上の線状ポリマー鎖または「アーム」を有する。ゆえに、マルチアームポリマーは、その構成及びコア構造に応じて、単一の分岐点から放射している２つの線状ポリマーアームによる２つのポリマーアーム（典型的には、分岐ポリマーと称される）、３つのポリマーアーム、４つのポリマーアーム、５つのポリマーアーム、６つのポリマーアーム、７つのポリマーアーム、８つのポリマーアーム、９つのアームもしくは１０個のアーム、またはこれより多くを有していてよい。いくつかの実施形態において、マルチアームの水溶性ポリマーは、３〜１０個のポリマーアームを有する。いくつかの実施形態において、マルチアームの水溶性ポリマーは、３〜８つのアームを有する。いくつかの実施形態において、マルチアームの水溶性ポリマーは、４つのアームを有する。いくつかの代替の実施形態において、マルチアームの水溶性ポリマーは、６つのアームを有する。いくつかのさらなる実施形態において、マルチアームの水溶性ポリマーは、８つのアームを有する。上記のように、マルチアームのポリマーは、樹枝状ポリマーでも超分岐ポリマーでもない。いくつかの実施形態において、共有結合的連結部自体に含まれるマルチアームのポリマーのアームは、分岐していない（すなわち、線状である）。例えば、共有結合的な架橋連結部に含まれる、アルギネート上の所与の官能基のいくつかの好ましい実施形態において、マルチアームのポリマーの所与のアームに対して１−１の連結部が存在する。
【００９１】
代表的な水溶性ポリマーとして、ポリエチレングリコール、ポリ（オルニチン）、ポリ（Ｌ−リシン、ポリ（乳酸、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、ポリポリ（オレフィンアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリルアミド）、ポリ（ヒドロキシアルキルメタクリレート）、ポリ（サッカライド）、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリ（Ｎ−アクリロイルモルホリン）、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、または、これらのコポリマーもしくはターポリマー（（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）及びＬ−リシンメタクリルアミドのコポリマーを含む）が挙げられる。いくつかの実施形態において、マルチアームの水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールポリマーである。
【００９２】
マルチアームポリマー、例えばマルチアームＰＥＧ及び他のポリマーは、例えば、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧＷｏｒｋｓ（Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ，ＮＣ），ＪｅｎＫｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡ（Ｐｌａｎｏ，ＴＸ）、Ｌａｙｓａｎ  Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．（Ａｒａｂ，Ａｌａｂａｍａ）、及びＮＯＦ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）などの供給元から市販されている。
【００９３】
マルチアームポリマーの中央のコア分子は、ポリマーの付着に利用可能な少なくとも３つのヒドロキシル、チオール、またはアミノ基を持つ、例えば、ポリオール、ポリチオール、ポリカルボン酸、またはポリアミンの残基であってよい。マルチアームの水溶性ポリマー、例えばＰＥＧの実例的なコア分子として、例えば、リシン、エリスリトール、ペンタエリスリトール、トリメチロールプロパン、グリセロール、グリセロールダイマー（３，３’−オキシジプロパン−１，２−ジオール）、グリセロールオリゴマー、ソルビトール、ヘキサグリセロールなどが挙げられる。マルチアームＰＥＧポリマーは、線状ポリエチレングリコールアームを概して有しており、該アームは、中央のコア分子から放射しており、また、誘導体化されたアルギネート上に存在する官能基と共有結合的に反応性である官能基によって官能化されたポリマーアームのうちの１つ以上を有している。アルギネートとの反応のための官能基（複数可）は、ポリマーアームの末端にあってよく、またはペンダントであってよい（すなわち、ポリマーアーム上に位置されるが、その末端には位置されない）。１つ以上の実施形態において、マルチアームのポリマーは、そのポリマーアームの各々におけるアルギネートとの反応のための単一の官能基を、例えば、末端において、もしくはペンダント官能基として有しており、または、そのポリマーアームの各々におけるアルギネートとの反応のための、平均で１より少ない官能基を有している（すなわち、あらゆるポリマーアームが、アルギネートとの反応のための官能基を有しているわけではない）。実例的なマルチアームのＰＥＧとして、ペンタエリスリトールコアを有し、かつ、誘導体化されたアジド上の官能基と選択的に反応性である基によって端部またはその他が官能化されている４−アームＰＥＧが挙げられる。例えば、当ヒドロゲル組成物の調製の際の使用に好適な、（ここで参照により組み込まれる）Ｎ−ヒドロキシスクシニジル、パラ−ニトロフェニルカーボネート、アミン、チオール、及びマレイミドによって端部が官能化された４−アームＰＥＧを含む、ＮＯＦのマルチアームＰＥＧポリマーＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）シリーズの構造を参照されたい。同様に、ヒドロキシル、アクリレート、アクリルアミド、アミン、チオール、スクシンイミジルカルボキシメチルエステル、スクシンイミジルグルタレートエステル、スクシンイミジルスクシネートエステル、グルタルアミドスクシンイミジルエステル及びスクシンアミドスクシンイミジルエステルを含めた種々のＮ−ヒドロキシスクシンイミド、エポキシド、パラ−ニトロフェニルカーボネート、カルボキシメチル（カルボキシ）、グルタル酸、コハク酸、グルタルアミド酸、スクシンアミド酸、アジド、及びアルキンから選択される末端反応性基を有するものを含めた、様々な官能基及び介在リンカーによって端部が官能化された４−アームＰＥＧが、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧｗｏｒｋｓから入手可能である。かかるマルチアームポリマーは、当ヒドロゲル組成物を形成するのに直接使用されてよく、または、さらにカスタマイズされて、すなわち、化学的に修飾されて、所望の官能基（複数可）を付与してよい。１つ以上���実施形態において、マルチアームの水溶性ポリマーは、ＤＢＣＯ、アジド、シクロオクチン、電子不足アルキン、テトラジン、アルケン、及びチオールから選択される反応性基を含む。
【００９４】
別の代表的なマルチアームＰＥＧは、ヘキサグリセリンコアを有する８−アームＰＥＧである。例えば、ＮＯＦの、８−アームのＨＧＥＯシリーズのポリマー、またはＣｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧｗｏｒｋｓから入手可能である８−アームＰＥＧを参照されたい。上記のように、マルチアームの水溶性ポリマー、例えばマルチアームのＰＥＧは、公知の合成変換方法を使用して化学的に修飾されて、誘導体化されたアルギネートとの反応に好適な所望の末端反応性基を有するマルチアームの水溶性ポリマーを付与することができる。
【００９５】
マルチアームの水溶性ポリマーは、典型的には、約５００〜約６０，０００ダルトンの範囲の分子量を有する。実例的な分子量範囲は、約１，０００〜約４０，０００ダルトン、約１，０００〜約３０，０００ダルトン、約１，０００〜約２０，０００ダルトン、及び約１，０００〜約１０，０００ダルトンである。マルチアームポリマーの例示的な分子量として、例えば、１ｋＤ、５ｋＤ、１０ｋＤ、２０ｋＤ、３０ｋＤ、４０ｋＤ、５０ｋＤ、及び６０ｋＤが挙げられる。
【００９６】
生物活性剤及び治療用細胞
本明細書において提供されているヒドロゲルは、薬理活性物質または生細胞を任意選択的に含んでいてよい。薬理活性剤として、小分子（約１０００未満の分子量を有する）、タンパク質、ポリヌクレオチドなどが挙げられる。
【００９７】
本明細書において提供されている組成物に含まれていてよい薬理活性剤として、例えば、抗菌剤、抗生物質、鎮痛剤、抗生物質、抗増殖／抗有糸分裂剤、酵素、抗増殖／抗有糸分裂アルキル化剤、抗増殖／抗有糸分裂代謝拮抗剤；白金配位錯体、ホルモン、抗凝血剤、線維素溶解剤、抗遊走剤；分泌抑制剤、抗炎症剤、非ステロイド剤、金化合物、免疫抑制剤、細胞分裂または形態形成成長因子タンパク質、ペプチドまたは模倣剤；成長因子受容体アゴニストまたはアンタゴニスト、一酸化窒素ドナー；アンチセンスオリゴヌクレオチド、転写因子、シグナル伝達カスケードメディエーター、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００９８】
本明細書において提供されているヒドロゲルは、生細胞を含んでいてもよい。かかる生細胞は、自己、同種異系、または異種であってよい。例示的な生細胞として、例えば、幹細胞、多能性細胞、機能的に分化した細胞、組み換え細胞、またはこれらの組み合わせが挙げられる。幹細胞の例として、限定されないが、胚性幹細胞、例えばヒト胚性幹幹細胞、造血幹細胞、血管幹細胞、神経幹細胞、間葉幹細胞、心臓幹細胞、脂肪幹細胞、筋肉幹細胞、歯の幹細胞、骨幹細胞、軟骨幹細胞、骨膜幹細胞、乳房幹細胞、子宮幹細胞、内皮幹細胞、皮膚幹細胞、胎盤幹細胞、臍帯血幹細胞、卵黄嚢幹細胞、及び羊水幹細胞が挙げられる。
【００９９】
例示的な機能的に分化した細胞として、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、脂肪細胞、上皮細胞、角化細胞、網膜細胞、歯の細胞、腎細胞、膵島細胞、肝細胞、神経細胞、免疫細胞、筋肉細胞、及び血液細胞が挙げられる。
【０１００】
いくつかの実施形態において、生細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）由来の細胞、ｉＰＳ由来の膵臓前駆細胞、血小板、Ｔ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞、心筋芽細胞、及び真皮細胞から選択される。いくつかの他の実施形態において、生細胞は、ホルモン、サイトカイン、膵臓、遺伝子操作されたＡＲＰＥ−１９、または成長因子分泌細胞である。
【０１０１】
幹細胞の組織源として、例えば、成体（例えば、造血、血管、神経、間葉、心臓、脂肪、筋肉、歯、骨、軟骨、骨膜、乳房、子宮、皮膚）；周産期（例えば、胎盤、臍帯血）；胎児（例えば、羊水、卵黄嚢、神経、皮膚）；及び胚が挙げられる。機能的に分化した細胞は、成体ヒトドナー（自己もしくは同種異系）から、または動物源（異種）から得られてよい。源細胞として、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、脂肪細胞、上皮細胞、角化細胞、網膜細胞、歯の細胞、腎細胞、膵島細胞、肝細胞、神経細胞、免疫細胞、筋肉細胞、及び血液細胞を挙げることができる。
【０１０２】
さらなる生物活性剤として、限定されないが、細胞分裂、細胞分泌、細胞遊走、細胞接着、サイトカイン、ケモカイン（もしくは他の炎症活性物質）産生及び／もしくは放出、血管形成、ならびに／またはフリーラジカル形成及び／もしくは放出、ならびに／または凝固カスケードを含めたプロセスの１つまたは組み合わせを阻害するものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本明細書において提供されている組成物は、線維症の発症を増加させる細胞及び／または非細胞プロセスの薬理的改変を生じさせるのに有効でもあり得る。ゆえに、生物活性剤として、さらに、限定されないが、細胞分裂、細胞分泌、細胞遊走、細胞接着、サイトカイン、ケモカイン（もしくは他の炎症活性物質）産生及び／もしくは放出、血管形成、ならびに／またはフリーラジカル形成及び／もしくは放出を含めたプロセスの１つまたは組み合わせを阻害するものが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる生物活性剤は、本明細書において提供されている組成物が止血剤及び／または接着防止剤であり得るような瘢痕形成プロセスに含まれる他のプロセスを増大させまたはこれに影響し得、その結果、薬物の添加により、線維症の増大もしくは減少がもたらされ得、かつ／あるいは、薬物機構に応じて組織の増強及び／または外科的接着の増大もしくは低減が結果として生じ得る。
【０１０４】
生物活性剤または生細胞は、典型的には、本明細書において提供されているヒドロゲル組成物内に取り込まれる。代替的には、生物活性剤は、ヒドロゲル、例えば、誘導体化されたアルギネートまたはマルチアームの水溶性ポリマーを調製するのに使用される成分に、放出可能に、共有結合的に付着されてよい。ヒドロゲル組成物は、例えば、約０．００１〜約５０重量％のカプセル化された薬理活性物質、または用量当たり約１０６〜約１０１１の細胞を含んでいてよい。
【０１０５】
ヒドロゲル組成物及び作製方法
ヒドロゲル組成物は、以下のように概して調製されるが、記載されている方法は、当開示に基づいて、本明細書において提供されている組成物、材料、及びヒドロゲルに達するように当業者によって好適に変更されてよいことが認識される。当ヒドロゲル組成物は、典型的には、その周辺において、マルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋されたアルギネートマトリックスを形成するのに有効な条件下で、上記のような誘導体化されたアルギネートマトリックスをマルチアームの水溶性ポリマーと反応させることによって形成される。アルギネートマトリックスは、１から数層の共有結合的に付着された水溶性ポリマーを含むように逐次修飾されてよく、ここで、ポリマー層は、典型的には、官能化されたアルギネートと水溶性のマルチアームのポリマーとの間で交互に存在する。代替的には、アルギネートマトリックスの周辺でのマルチアームの水溶性ポリマーへの共有結合的な架橋結合の形成の後に、さらなる連動層が、任意の好適な水溶性ポリマーとの反応によって共有結合的に付着されてよい。アルギネートマトリックスの共有結合的に付着された周辺を形成するのに利用される反応基対は、任意選択的なさらなる共有結合的に連結された表面層を形成するのに使用される反応基対（複数可）と同じであっても異なっていてもよい。アルギネートマトリックスは、上記のようなヒドロゲル組成物の投与の際に免疫反応を軽減するのに有効な１つ以上の部位を任意選択的に含んでいてもよく、ここで、かかる修飾は、共有結合的に反応性の架橋可能基の導入の前または後のいずれであってもよい。代替的には、いくつかの実施形態において、共有結合的な架橋結合、例えば、ジベンジルシクロオクタントリアゾール環系、もしくはトリアゾール基を含むもの、または修飾トリアゾールは、ヒトまたは動物対象への当ヒドロゲル組成物の投与の際の免疫介在反応を低減／最小化するのに有効であり得る。
【０１０６】
図１は、アルギネートマトリックスの周辺において、マルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋された当該アルギネートマトリックスを含む、例えばビーズの形態のヒドロゲル組成物を調製するための例示的なアプローチの概略図を付与する。イオン反応性官能基（例えば、カルボキシル）及び選択的に共有結合的に反応性である共有結合的反応性官能基Ｂの両方を含むアルギネートポリマーは、イオン架橋剤（例えば、カルシウムイオンまたは他の多価カチオン）の存在下で静電的に架橋されて、イオン架橋結合を含むアルギネートマトリックスを形成している。アルギネートマトリックスの共有結合的反応性官能基Ｂは、マルチアームの水溶性ポリマーの１つ以上のポリマーアームの末端において含まれる官能基Ｄと選択的に反応して、水平線によって示されている、アルギネートマトリックスの周辺における共有結合的な架橋結合を形成する。共有結合的な架橋結合は、イオンで架橋されたアルギネートマトリックスの外側表面で形成され、表面からある距離で（例えば、約１００ミクロン、または約１０ミクロンもしくは約１ミクロン）マトリックス内に延在する。複数層が形成されている実施形態では、ヒドロゲル形態の周辺において、過剰の共有結合的な反応性基Ｄが、次いで、共有結合的な反応性基Ｂを含む官能化されたアルギネートと反応して、周辺などを含むマルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋されている、アルギネートのさらなる表面層を有するヒドロゲルを形成する。
【０１０７】
概して、反応体の相対量、アルギネートの修飾度、マルチアームの水溶性ポリマーの選択、ポリマーアームの数、補足の反応性基の選択、反応条件などは、アルギネートマトリックスの周辺において最適な共有結合的架橋を付与するように調整される。上記のように、誘導体化されたアルギネートマトリックスへの共有結合的付着のためにマルチアームの水溶性ポリマーを賢明に選択することによって、特に有利な安定性または本明細書に記載の他の特徴の１つ以上を含むヒドロゲル組成物が提供される。
【０１０８】
（誘導体化されたアルギネートとマルチアームの水溶性ポリマーとの反応により）周辺の共有結合的な架橋結合を形成するのに利用される共有結合的カップリング反応は、典型的には、反応基及び得られる連結部の性質に応じて、当業者に公知の従来の反応条件を使用して実施される。得られるヒドロゲルは、得られる共有結合的連結が、マルチアームの水溶性ポリマーの第１官能基と、誘導体化されたアルギネートの第２官能基との生成物である共有結合的な架橋結合を含む。共有結合的な架橋結合の正確な性質は、用いられる特定の反応対に依る。１つ以上の実施形態において、好ましい反応対とは、特にアルギネートマトリックスが生細胞または他の感応性材料を含む場合に、穏やかかつ制御可能な反応条件（例えば、クリックケミストリー条件）下で反応するものである。
【０１０９】
概して、共有結合的な架橋結合は、例えば、水、アルコール、アセトニトリル、テトラヒドロフランなどを含めた多くの好適な溶媒のいずれかにおいて形成され得るが、典型的には、任意選択的には１つ以上の有機共溶媒の存在下で、水性媒体中で実施される。概して、上記のような誘導体化されたアルギネートマトリックスを含む水性混合物は、誘導体化されたアルギネートマトリックス内に含まれる官能基（すなわち、第２官能基）と反応性である官能基（すなわち、第１官能基）を含むマルチアームの水溶性ポリマーと反応する。典型的には、共有結合的カップリング反応は、約０℃〜６０℃、約０℃〜５０°、約２℃〜５０℃、もしくは約３℃〜４０℃の範囲の温度で、または約０℃〜１０℃、もしくは約２０℃〜３０℃の温度範囲内で、または約２５℃で行われる。１つ以上の代替の実施形態において、反応は、室温で実施される。いくつかの実施形態において、反応は、約２５℃〜約３７℃（すなわち、約室温〜体温）の範囲の温度で行われる。１つ以上の実施形態において、反応は、室温未満、例えば、約０℃〜１０℃で実施される。いくつかの実施形態において、反応は、４℃で実施される。アルギネートマトリックスが、カプセル化された生細胞を含む実施形態では、いくつかの場合において、室温未満の温度で反応を実施することが好ましい場合がある。
【０１１０】
１つ以上の実施形態において、共有結合的架橋反応は、触媒またはラジカル開始剤の存在を必要とせず、かつ非毒性の副生成物を形成する条件下で実施される。１つ以上の好ましい実施形態において、第１及び第２官能基は選択的に反応性である。水性媒体中で行われる反応では、概して、ｐＨが、約６〜約８、または約６．５〜約７．５の範囲である。いくつかの好ましい実施形態において、反応混合物のｐＨは、約７．０〜７．５の範囲である。水性反応媒体は、１つ以上の緩衝剤を任意選択的に含んでいてよい。概して、共有結合的架橋反応は、用いられる反応条件、アルギネートマトリックスの修飾度、マルチアームの水溶性ポリマー内に含有されている官能基の数、反応体の相対モル比などに応じて、１分〜約１５時間の範囲の期間にわたって実施される。より典型的には、共有結合的架橋反応は、約５分〜約２．５時間、約４分〜約２時間、約１５分〜１．５時間、または約３０分〜１時間の期間にわたって実施される。官能化されたアルギネートの実例的な濃度は、反応混合物中約０．５重量％〜約２５重量％であり；さらなる例示的な濃度範囲は、反応混合物中の官能化されたアルギネートが約２重量％〜約２０重量％；または約５重量％〜約１８重量％である。反応混合物中のマルチアームの水溶性ポリマーの実例的な量は、約０．１重量％〜約５０重量％、または約１重量％〜約４０重量％である。共有結合的に架橋された連動している表面層の所望の数、及び所望の架橋度に応じて、第１官能基対第２官能基のモル比は、約１．０〜約５の範囲であってよく；さらなる表面層を形成するための共有結合的付着が望ましいときには、典型的には、より高い比が用いられる。
【０１１１】
得られる周辺架橋されたヒドロゲル組成物における架橋度は、膨潤度によって推定され得る。例示的なヒドロゲル組成物は、例えば、約５０重量％未満の比較的低い膨潤度を示す。ある特定の例示的な組成物は、約４０重量％未満だけ、またはさらには約３０重量％未満だけ膨潤する。典型的には、膨潤度は、ヒドロゲル組成物を任意の好適な形態（例えば、ビーズ、カプセル、糸、ファイバ、フィラメントなど）で、１ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中にある特定の期間、例えば、１時間にわたって置き、所与の期間にわたって質量増加を測定することによって測定される。
【０１１２】
上記のように、任意の好適な反応対（すなわち、第１及び第２官能基）は、当ヒドロゲル組成物を提供するのに用いられてよく、ここで、共有結合的な架橋結合は、反応対の生成物である。代表的な共有結合的架橋反応として、付加環化、例えば１，２−二極性付加環化及びヘテロディールスアルダー付加環化；ひずんだ複素環式求電子剤、例えばアジリジン、エポキシド、環状サルフェート、エピスルホニウムなどの求核開環；尿素、チオ尿素、ヒドロゾン、オキシムエーテル、アミド及び芳香族複素環を形成するための非アルドールカルボニル化学；ならびに炭素−炭素多重結合への付加、例えば、エポキシ化、アジリジン化、ジヒドロキシル化、ハロゲン化スルフェニル付加、ニトロシル付加、及びマイケル付加が挙げられる。穏やかな条件下で選択的に反応性であり、比較的迅速であり、位置特異的であり、容易に除去される副生成物を形成し、高い生成物収率を結果としてもたらす反応対が、いくつかの実施形態において、特に、アルギネートマトリックスが生細胞または比較的不安定な生体分子を含有するこれらの実施形態において好ましい。例えば、Ｈｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２００８，Ｏｃｔ．２５（１０）：２２１６−２２３０、及びこれに記載されている例示的な反応対を参照されたい。共有結合的カップリングのための実例的な選択的官能基対として、アジド−ＤＢＣＯ（ジベンゾシクロオクチン）（トリアゾール連結部を結果として生じさせる）、チオール−ノルボレン（マイケル付加）、及びテトラジン−ノルボレン（ピラゾ連結部）が挙げられる。１つ以上の実施形態において、アルギネートとマルチアームの水溶性ポリマーとの間の共有結合的付着は、１，２，３−トリアゾールを形成するための、アジドと末端アルキンとの間の付加環化反応である。いくつかの他の実施形態において、アルギネートとマルチアームの水溶性ポリマーとの間の共有結合的付着は、ディールスアルダー反応である。さらにいくつかのさらなる実施形態において、アルギネートとマルチアームの水溶性ポリマーとの間の共有結合的付着は、マイケル付加を介して起こる。例えば、誘導体化されたアルギネートと、アジド−ＤＢＣＯ反応対を含むマルチアームの水溶性ポリマーとの間の反応は、５％水溶液中で約１分〜約５分間実施されてよく；誘導体化されたアルギネートと、アジド−シクロオクチン反応対を含むマルチアームの水溶性ポリマーとの間の反応は、室温で約１〜２時間実施されてよく；誘導体化されたアルギネートと、アジド−電子不足アルキン反応対を含むマルチアームの水溶性ポリマーとの間の反応は、例えば、水中、室温で約１２〜１５時間実施されてよく；誘導体化されたアルギネートと、逆［４＋２］付加環化を実施するのに好適なテトラジン−アルケン反応対を含むマルチアームの水溶性ポリマーとの間の反応は、例えば、約３０分〜１時間実施されてよいが、ＵＶ光の存在下での、誘導体化されたアルギネートと、チオール−アルケン反応対を含むマルチアームの水溶性ポリマーとの間の反応が、約３０分〜１時間で行われてよい。
【０１１３】
アルギネートまたはマルチアームの水溶性ポリマーのいずれかの官能化を付与するのに有用な官能化されたアルキンとして、例えば、アルキレン−ＰＥＧ５−酸、Ｒ−３−アミノ−５−ヘキシン酸塩酸塩、Ｓ−３−アミノ−５−ヘキシン酸塩酸塩、Ｒ−３−（Ｂｏｃ−アミノ）−５−ヘキシン酸、Ｓ−３−（Ｂｏｃ−アミノ）−５−ヘキシン酸、Ｎ−Ｂｏｃ−４−ペンチン−１−アミン、Ｂｏｃ−プロパルギル−Ｇｌｙ−ＯＨ、３−エチニルアニリン、４−エチニルアニリン、４−ペンチニル−１−アミン、プロパルギルアミン塩酸塩、プロパルギルクロロホルメート、プロパルギル−ＮＨＳエステル、Ｎ−Ｚ−４−ペンチン−１−アミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）が挙げられ、ここで、アルギネートまたはマルチアームの水溶性ポリマーのいずれかへのアルキン官能基の導入には、アルキン以外の官能基が使用される。ＤＢＯＣ試薬として、例えば、ＤＢＣＯ−Ｃ６エステル、ＤＢＣＯ−ＮＨＳエステル、ＤＶＣＯ−ＰＥＧ−４−ＮＨＳエステル、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−５−ＮＨＳエステル、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−４アミン、ＤＢＣＯ−アミン、及びアルギネートまたはマルチアームポリマーのいずれかへの導入に好適な基によって官能化された同様の試薬が挙げられる。前述のＤＢＣＯ試薬は、Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ，ＡＺ）から入手可能であり；その構造は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における詳細な説明から明らかとなるように、これらのアルキン（ａｌｋｙｅｎｅ）は、実例的であるが何ら限定的ではないことが意図される。実例的なアジドとして、限定されないが、４−アセトアミドベンゼンスルホニルアジド、１−アジドアダマンタン、２−アジド−４−オクタデカン−１，３−ジオール、５−アジドペンタン酸、３−アジド−１−プロパンアミン、及び３−アジド−１−プロパノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が挙げられる。アジド部位の導入に使用されてもよい短いＰＥＧリンカーを有するアジドとして、Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−アジドエチル）ヘプタエチレングリコール、Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−アジドエチル）ノナエチレングリコール、Ｏ−（２−アミノエチル）−Ｏ’−（２−アジドエチル）ペンタメチレングリコールなど（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が挙げられる。
【０１１４】
周辺の共有結合的な架橋結合の形成の後に、共有結合的に架橋された連動している表面層の逐次添加が、所望の数の共有結合的に架橋された表面層を有するヒドロゲル組成物が形成されるまで行われる。理論によって拘束されないが、得られるヒドロゲルは、複数層の逐次添加によって調製されるとき、延在する連動している架橋−結合した表面を有することができ、ここで、マルチアームのポリエチレングリコールは、近位層に浸透している。概して、ヒドロゲルは、上記のようにマルチアームの水溶性ポリマーに共有結合的に架橋されている、アルギネートの１〜２０個のさらなる逐次分子表面層、または約１〜１０個のさらなる逐次分子表面層を任意選択的に含む。
【０１１５】
実施例４には、周辺の共有結合的な架橋結合を有するアルギネートマトリックスを含む例示的なヒドロゲル組成物の調製が記載されている。当該反応はまた、図２として模式的に付与されている。周辺の共有結合的な架橋結合を付与するのに利用される共有結合的反応対は、アジド−ＤＢＣＯである。アルギン酸は、例えば、アルギン酸のカルボキシル基と、アジド−官能化されたリンカー、例えば３−アジド−アミノプロパンとの反応によって、反応性アジド基を含むようにまず誘導体化される。アジド−官能化されたアルギネートは、静電的に架橋されて、アルギネートマトリックスを付与し；アジド−官能化されたアルギネートマトリックスが、次いで、穏やかな反応条件下で、例えば、脱イオン水中で、４−アームポリエチレングリコール−ＤＢＣＯ（ジベンジルシクロオクチン）「４−アームＰＥＧ−ＤＢＣＯ」と反応して、周辺の共有結合的なトリアゾール含有架橋結合を有するアルギネートビーズを付与する。共有結合的架橋度は、アルギネートの官能化度、マルチアームポリマー中のポリマーアームの数、及び反応官能基の比（例えば、アジド対ＤＢＣＯ）の調整によって変更され得る。さらなる表面層は、所望の数の共有結合的に架橋された表面層が形成されるまで、アジド−官能化されたアルギネート、続いてのマルチアームの水溶性ポリマーとのさらなる逐次反応によって、共有結合的に付着されてよい。
【０１１６】
ヒドロゲル組成物は、生体適合性表面層を、その最外表面において任意選択的にさらに含んでいてよく、ここで、生体適合性表面層は、アルギネートまたはマルチアームの水溶性ポリマー以外である。生体適合性表面層は、ヒドロゲル組成物に好ましくは共有結合的に付着されているが、必ずしもそうではない。生体適合性ポリマーがヒドロゲル組成物に共有結合的に付着されている場合、生体適合性ポリマーは、ヒドロゲル組成物の外層への、すなわち、いくつかの実施形態においてはアルギネート層への、または他の実施形態においてはマルチアームの水溶性ポリマー層への付着に好適な官能基を含む。例えば、生体適合性ポリマーは、ヒドロゲル組成物の外側表面に存在するアジド基との反応のためにＤＢＣＯ−官能化されてよい。代替の生体適合性ポリマーは、ヒドロゲル組成物の外層におけるＤＢＣＯ基との反応のためにアジド−官能化されてよい。ヒドロゲルの外側表面への共有結合的付着に好適な基の選択は、当業者に明らかである。かかるカップリングに好適な例示的な反応基対は、本明細書に記載されている。
【０１１７】
生体適合性表面層を形成するのに好適な実例的な生体適合性ポリマーは、存在する場合、例えば、ポリエチレングリコール、ホスホコリン含有ポリマー及びコポリマー（Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２２（５），（１９９０），３５５−３６０；Ｘｕ，Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，３１（２０１０）８８３９−８８４６；Ｙｕ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１１（２０１２）４６８−４７６；Ｓｈｉｉｎｏ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６，２１４，９５７号）、ポリ（ビニルアルコール）、カルボキシメチルセルロース、キトサン、ヒドロキシアパタイト、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、及びヒアルロン酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、生体適合性表面層は、ペンダントホスホコリン基を含むように官能化された生体適合性ホモポリマーまたはコポリマーを含む。いくつかの好ましい実施形態において、生体適合性表面層を付与するように使用される生体適合性ポリマーは、ヒドロゲル組成物の最外表面への共有結合的付着に好適な官能基を含む。官能基（複数可）は、生体適合性ポリマーに直接付着していてよく、介在する短いリンカー、例えば短いＰＥＧ鎖、カルボキシメチル基、アミノ酸もしくはオリゴペプチドリンカー、または任意の他の好適な連結基を介して導入されてよい。かかる連結基は、典型的には、約２〜約２０原子、約２原子〜約１５原子、または約２〜１０原子を含有する。実施例８には、４つのモノマー繰り返し単位を有する短いＰＥＧリンカーの使用が記載されている。実例的な官能基は、本明細書において先に記載されており、ヒドロゲル組成物の最外表面内に含有される官能基との反応に選択的である。実例的な反応対は、クリックケミストリー反応対である。ホスホコリン及びリシン基、ならびに生体適合性表面コーティングをアルギネートヒドロゲルにこれに対する共有結合的付着によって付与するのに好適なクリックケミストリー官能基を含む例示的なポリマー（ＰＣ−Ｌｙｓ−ＭＡ−ＤＢＣＯ）の合成は、実施例８に記載されている。
【０１１８】
より特定的には、実施例８には、ホスホコリン及びＬ−リシン官能基を含む実例的な生体適合性メタクリルアミドポリマーの合成が記載されている。好ましい生体適合性ポリマーは、以下のモノマー単位を含み、
【化１】
2019512522.tif 000003
式中、ポリマー中のリシン部位の約５モル％〜約１００モル％（例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００モル％）が、クリックケミストリー官能基、例えばＤＢＣＯ、または、リシン（ｌｙｉｎｅ）のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかに、上記のように、直接または短いリンカーを介してのいずれかで共有結合的に付着された、任意の他のクリックケミストリー−関連官能基を有する。実例的なリンカーは、約３〜５つのエチレンオキシド繰り返し単位、またはカルボキシ官能基を有するジカルボン酸を、各末端及び介在する短いアルキレン鎖〜（ＣＨ２）ｎ〜：ここで、ｎは約３〜６の範囲である；において有する短いＰＥＧ−マーを含む。ＰＣ−ＬＹ−ＭＡ−ＣＬＩＣＫポリマーは、約１０ｋＤ〜約１ミリオンｋＤの範囲である、好ましくは約２５ｋＤ〜約５００ｋＤの範囲である重量平均分子量を概して有する。
【０１１９】
クリック−反応性官能基を含有するように修飾されている生体適合性ポリマーを、実例的なモノマー、メタクリルアミドホスホコリン及びＮ−メタクリルアミドＬ−リシンを水系において水溶性アゾ開始剤と共に高温で重合させることによって調製した。得られるポリマーの水系への溶解度は、ホスホコリン対リシン含有モノマーのモル比を調整することによって適合され得る。リシン含有モノマーのモル百分率が増加するにつれ、得られるコポリマーの溶解度が減少する。例えば実施例８及び９に記載されているホスホコリン−リシンコポリマーの好ましいモル百分率は、水溶性ポリマーを付与する、例えば、本明細書において提供されているヒドロゲル組成物のための生体適合性表面層を付与するために、約１モル％〜約３０％の範囲内であり、好ましくは約５モル％〜約２０モル％の範囲内である。
【０１２０】
ヒドロゲル組成物の特徴
当ヒドロゲルは、ストレス条件下（例えば、４０℃及び１ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）での長期間にわたる顕著な安定性を含めたいくつかの望ましい特徴を有する。１つ以上の実施形態において、当組成物は、その形状及びゲル完全性を維持する（すなわち、良好な機械的安定性を有する）だけでなく、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境をモデル化する高ストレス条件下に置かれたときに、長期間にわたって半浸透性及び他のレオロジー特性を保持する。より詳細には、本明細書に記載されているアルギネートヒドロゲル組成物は１ｍＭ  ＰＢＳ中４０℃で保存したとき、最長で少なくとも３０日間、例えば、最長で少なくとも４５日間、または最長で少なくとも６０日間、また、さらには最長で少なくとも９０日間にわたって安定であり、また、形状かつその及び完全性を維持する。例えば、当ヒドロゲル組成物の浸透性及び機械的安定性の特徴を記載している実施例６及び７を参照されたい。１つ以上の実施形態において、当ヒドロゲルは、長期間、すなわち、少なくとも３０日間、最長で少なくとも４５日間、最長で少なくとも６０日間、また、実際に最長で３ヶ月間（少なくとも９０日間）にわたって、シミュレーションされたｉｎ  ｖｉｖｏ条件下でその半浸透性をさらに維持し−当該ヒドロゲルを驚くべきことに構造的かつ機能的に弾力性にする。上記によると、当材料は、治療薬での使用に、特に、他の用途の中でも、生存細胞を送達するのに有利に適している。
【０１２１】
実施例６に記載されている浸透性研究は、１ｍＭ  ＰＢＳ中４０℃での９０日安定性研究の過程全体にわたっての例示的な表面架橋アルギネートヒドロゲル組成物の半浸透性の性質を実証している。より詳細には、（共有結合的に架橋された１〜７つの表面層を有する）ヒドロゲル組成物は、ビーズ内の強い蛍光の観察によって示されるように）約１０ｋＤａサイズ（ＦＩＴＣ−デキストラン１０Ｋ）の低分子量の蛍光標識デキストランに浸透性であったが、より高分子量の種、例えば、７０ｋＤａ、１５０ｋＤａ及び２５０ｋＤａのＦＩＴＣ−デキストランは、ビーズ内で検出される蛍光の非存在によって示されるように、排除された。同様に、（共有結合的に架橋された１〜７つの表面層を有する）ビーズは、抗体ＩｇＧ（およそ１５０ｋＤａの分子量）に不浸透性であった。これにより、１ｍＭ  ＰＢＳ中、体温でのヒドロゲル組成物の安定性、及び半浸透性の性質の耐久性が示される。とりわけ、半浸透性は、シミュレーションされたｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で長期間、すなわち、少なくとも３ヶ月安定であり、ビーズの半浸透性の性質が、その周辺において単一の共有結合的に架橋された表面層を有するビーズについて、ならびに、共有結合的に架橋された複数の表面層を有するものについて観察された。
【０１２２】
ヒドロゲル組成物に浸透することが可能である分子種の実際の分子量カットオフは、ヒドロゲル組成物の詳細に応じて変動し得、所望の用途または適用に適合され得る。例えば、組成物は、１つ以上の実施形態において、約１００ｋＤａ以下、約７５ｋＤａ以下、約５０ｋＤａ以下、約２５ｋＤａ以下、約２０ｋＤａ以下、または約１０ｋＤａ以下の分子量を有する分子種に浸透性であってよく、対応して、上記の各々よりもそれぞれ大きい分子種に不浸透性であり得る。
【０１２３】
種々のストレス条件下でインキュベーション後の異なるタイプのアルギネートヒドロゲルビーズの圧縮強度が実施例７に記載されている。先行技術の安定化されたビーズであるアルギネート−ポリ−Ｌ−オルニチンアルギネート（ＡＰＡ）ビーズは、水中、室温で高い凝集強度を示すが（組成物「ＩＴＬ−Ａ」と表記される）、例えば、１ｍＭ  ＰＢＳ中、４０℃でのインキュベーションに対してインキュベーション条件のストリンジェンシーを増大させると、凝集強度の顕著な損失が、特に１Ｎを超える軸力値で観察される（「ＩＴＬ−Ｂ」）。対照的に、本明細書に記載されている周辺において共有結合的に架橋されたヒドロゲルの例示であるＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤビーズ（単一層及び７層の両方）は、インキュベーション条件のストリンジェンシーの増大の際に強度の有意な損失を本質的に示さない。興味深いことに、単一層材料は、７層材料と同程度まで、ストレス条件下でその強度を維持するようである。７層材料は、１ｍＭ  ＰＢＳ中４０℃で長期間の間その凝集強度をさらに維持し、これらの例示的なアルギネート材料の有利な性質をさらに実証した。
【０１２４】
材料の弾性応答（該材料が機械エネルギーを貯蔵する能力）を測定する貯蔵弾性率を、図４に示される実例的なアルギネートについて求めた。図４に示されているように、イオンで架橋されたＡＰＡビーズは、両方の一連のインキュベーション条件下で、共有結合的に架橋されたＡｌｇ−Ａｚ−ＰＥＧＤビーズ（アルギネートマトリックスの周辺における、共有結合的に架橋された１層）よりもかなり高い貯蔵弾性率を示す。単一層及び７層のＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤビーズの貯蔵弾性率は、インキュベーション時間に拘わらず、１ｍＭ  ＰＢＳ／４０℃のストリンジェンシー条件下で本質的に同じであった。
【０１２５】
Ｅ”が貯蔵弾性率でありＥ’が損失弾性率であるタンジェントデルタ（Ｅ”Ｅ’）を、図５に示されるように、実例的なアルギネートについて求めた。タンジェントデルタは、材料のエネルギー散逸の尺度を付与する。図５に示されるように、タンジェントデルタは、Ａｌｇ−Ａｚ−ＰＥＧＤビーズと比較して、イオンで架橋されたＡＰＡビーズで顕著により高い。ＡＰＡ材料のより高いタンジェントデルタは、これらの材料がより有効にエネルギーを散逸するにつれて、該材料の不安定性を示している。このことは、Ａｌｇ−Ａｚ−ＰＥＧＤビーズと比較したとき、ＡＰＡ材料の分子運動のオーダーがより高いことに起因し得る。対照的に、Ａｌｇ−Ａｚ−ＰＥＧＤビーズは、測定した角周波数の範囲にわたってＡＰＡ材料よりもかなり低いタンジェントデルタを示し、これは、これらの実例的な材料が限定されたエネルギー散逸を示すことを示唆している。このことから、これらの例示的な材料が、より少ない分子運動で、より高度に構造化された、ゆえに、安定なポリマー骨格を有することが推測され得る。単一層及び７層のＡｌｇ−Ａｚ−ＰＥＧＤビーズについてのタンジェントデルタ値は、図６における３つの底部プロットにおいて分かるように、かなり類似している。
【０１２６】
１つ以上の実施形態において、ヒドロゲル組成物は、約０．１０より低い、すなわち、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３未満、例えば、約０．０４または約０．０３のタンジェントデルタを有する。いくつかの実施形態において、ヒドロゲル組成物は、当該組成物が１ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中４０℃での保存に供されるとき（０日目）に決定される第１タンジェントデルタ値、及び当該組成物が１ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中４０℃で３０日間保存された後に決定される第２タンジェントデルタ値によって特徴付けられ、第１タンジェントデルタ値及び第２タンジェントデルタ値が、同じであるか、または約０．０５以下だけ異なっている。さらにいくつかの追加の実施形態において、第１タンジェントデルタ値及び第２タンジェントデルタ値は、上記の条件下で評価したとき、約０．０４以下だけ、約０．０３以下だけ、または約０．０１以下だけ異なる。
【０１２７】
当ヒドロゲルは、多数の形態のうちのいずれかをとってよい。実例的なヒドロゲル形態として、例えば、ビーズ、カプセル、シート、膜、糸、ファイバ、フィラメント、粒子、スポンジ、メッシュ、フォーム、足場及び上記のいずれかの複合体が挙げられる。
【０１２８】
ヒドロゲル組成物は、生物医学的応用における、例えば、細胞の免疫隔離、薬物送達、コーティングなどのための使用に好適である。組成物は、任意の好適な目的、例えば、胚発生、組織構築（例えば、足場として）、創傷治癒（例えば、創傷充填材として）、血管形成及び腫瘍形成に使用されてもよく、また、マクロまたはマイクロデバイスに含まれていてよい。組成物は、細胞の移植、例えば糖尿病を有する対象を処置するための膵臓細胞（例えば、膵島細胞）の移植のためのデバイスとして特に有用である。細胞の免疫隔離のために、細胞を、ドナーから、ドナー由来の細胞の培養物から、または確立された細胞培養系から直接得ることができる。いくつかの実施形態において、細胞をドナーから直接得て、洗浄し、ヒドロゲル組成物内に組み込む。当該細胞は、ヒドロゲル組成物内への組み込みの前に、組織培養の当業者に公知の任意の好適な培養技術を使用して培養する（例えば、分化及び／または増殖する）ことができる。好ましい実施形態において、上記細胞は、自己移植である−−すなわち、該細胞が移植されるべき個体に由来しているが、代替の実施形態において、同種異系であっても異種であってもよい。例えば、膵臓の島細胞は、ヒドロゲル組成物内に組み込まれて移植されて、適切なインスリン分泌によるグルコース調節を達成し、糖尿病を処置することができる。他の内分泌組織からの細胞が移植されてもよい。当ヒドロゲルは、多数の細胞の効率的な移入、及び新しい組織または組織等価物を作り出す目的での移植生着の促進のために、遺伝子組み換え細胞を含めた複数の細胞タイプを例えば三次元足場内に付与するのに使用され得る。ヒドロゲル組成物はまた、新しい組織または組織等価物が宿主免疫系を排除することにより成長しながら、細胞移植物の免疫保護のために使用することもできる。当ヒドロゲル配合物は、ある特定の実施形態において、対象への移植の際、免疫反応を生じさせないか、または最小の免疫反応を生じさせるかのいずれかであってよい。１つ以上の実施形態において、当ヒドロゲル組成物は、移植の際、以下の１つ以上を結果としてもたらす：最小限の線維症、すなわち、最小限の線維堆積、最小限または低減された栄養単離、及びドナーの組織壊死。
【０１２９】
ヒドロゲル組成物は、体液因子と組み合わされて、細胞移植及び生着を促進することができる。例えば、ヒドロゲル組成物は、血管新生因子、抗生物質、抗炎症薬、成長因子、分化を誘発する化合物、及び細胞培養の当業者に公知の他の因子と組み合わされ得る。
【０１３０】
当ヒドロゲルは、異なる組織構造を得るために多くの異なる細胞タイプの送達に使用され得る。１つ以上の実施形態において、所望のタイプの細胞を含有するヒドロゲル組成物は、細胞を移植することが望ましい部位内に直接注入され得る。ヒドロゲルは、特定の適用に適合するように成形されかつ身体の１つ以上の異なる領域に移植されてもよい。
【０１３１】
ヒドロゲル組成物は、例えば、生物活性剤を、局部的に、筋肉内に、関節内に、皮下に、目の領域に、骨内欠陥、軟骨内欠陥を処置するために皮内に、組織内空隙に、及び体内の内腔に局所送達するように薬物送達ビヒクルとして使用されてもよい。
【０１３２】
当ヒドロゲル組成物を、ある特定の実施形態と併せてここで説明する。かかる実施形態は、範囲が限定的であることは意図されていない。それどころか、本出願は、特許請求の範囲内に含まれる全ての代替物、変更物、及び等価物をカバーする。ゆえに、以下は、ある特定の実施形態の説明の目的のためである。
【実施例】
【０１３３】
以下の実施例は、当業者に、本明細書において提供されている組成物、ヒドロゲル、及び方法がどのように作製及び評価されるかの完全な開示及び記載を付与するために記載されており、純粋に例示的であることが意図される。ゆえに、実施例は、本発明者らが自身の発明とみなしている範囲を限定することは何ら意図されていない。反応条件、例えば、成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、ならびに生成物の特徴を最適化するのに用いられてよい他の反応パラメータ及び条件、例えば安定性、純度、機械的特性、収率などの多数の変形例及び組み合わせが存在する。これらは、同様に本開示の範囲内であるとされる。
【０１３４】
材料
藻類由来のアルギン酸、２００ｋＤ
４−アームポリエチレングリコールカルボン酸、５及び１０ｋＤ（ペンタエリスリトールコア）
ＤＢＣＯ−アミン（ジベンジルシクロオクチンアミン）、
【化２】
2019512522.tif 000004
ＥＤＣＩ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（さらなる異名にはＥＤＣが含まれる）
ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸
ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩ水：脱イオン水
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート
【０１３５】
実施例１
３−アジド−アミノプロパンによるアルギン酸の修飾
アルギン酸のカルボキシル基を、異なる量の３−アジド−アミノプロパンによってランダムに修飾して、異なるアジド置換度を有するアルギン酸を得た。アルギン酸アジドポリマーを透析によって精製した。５％、１０％、１５％及び２０％のモル当量のアジドを有する、化学的に修飾されたアルギン酸アジドを以下のように調製した。
【０１３６】
１Ａ．０．２当量の３−アジド−アミノプロパンによるアルギン酸の修飾（２０％の置換）
アルギン酸（１ｇ、５．０５ｍＭ）をＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）（０．１Ｍ）及びＮａＣｌ（０．３Ｍ）緩衝剤にｐＨ６．５で溶解して、０．５％濃度のアルギン酸を有する溶液を得た。３−アジド−１−プロパミン（０．２当量、１０１．０６ｍｇ）、ＥＤＣ．ＨＣｌ（１当量、９６７．５ｍｇ）及びＮＨＳ（０．４当量、２３２．３４ｍｇ）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を、次いで、１５０ｍｍから０ｍｍまで減少する塩勾配を使用して脱イオン水に対して透析した。透析後、生成物を凍結乾燥し、４〜８℃で保存した。
【０１３７】
１Ｂ．０．１５当量の３−アジド−アミノプロパンによるアルギン酸の修飾（１５％の置換）
アルギン酸（１ｇ、５．０５ｍＭ）をＭＥＳ（０．１Ｍ）及びＮａＣｌ（０．３Ｍ）緩衝剤にｐＨ６．５で溶解して、０．５％濃度のアルギン酸を有する溶液を得た。３−アジド−１−プロパミン（０．１５当量、７５．７９ｍｇ）、ＥＤＣ．ＨＣｌ（０．７５当量、７２５．６２ｍｇ）及びＮＨＳ（０．３当量、１７４．２６ｍｇ）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を、次いで、１５０ｍｍから０ｍｍまで減少する塩勾配を使用して脱イオン水に対して透析した。透析後、生成物を凍結乾燥し、４〜８℃で保存した。
【０１３８】
１Ｃ．０．１０当量の３−アジド−アミノプロパンによるアルギン酸の修飾（１０％の置換）
アルギン酸（１ｇ、５．０５ｍＭ）をＭＥＳ（０．１Ｍ）及びＮａＣｌ（０．３Ｍ）緩衝剤にｐＨ６．５で溶解して、０．５％濃度のアルギン酸を有する溶液を得た。３−アジド−１−プロパミン（０．１当量、５０．５３ｍｇ）、ＥＤＣ．ＨＣｌ（０．５当量、４８３．７５ｍｇ）及びＮＨＳ（０．２当量、１１６．１７ｍｇ）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を、次いで、１５０ｍｍから０ｍｍまで減少する塩勾配を使用して脱イオン水に対して透析した。透析後、生成物を凍結乾燥し、４〜８℃で保存した。
【０１３９】
１Ｄ．０．０５当量の３−アジド−アミノプロパンによるアルギン酸の修飾（５％の置換）
アルギン酸（１ｇ、５．０５ｍＭ）をＭＥＳ（０．１Ｍ）及びＮａＣｌ（０．３Ｍ）緩衝剤にｐＨ６．５で溶解して、０．５％濃度のアルギン酸を有する溶液を得た。３−アジド−１−プロパミン（０．０５当量、２５．２６ｍｇ）、ＥＤＣ．ＨＣｌ（０．２５当量、２４１．８７ｍｇ）及びＮＨＳ（０．１当量、５８．０９ｍｇ）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を、次いで、１５０ｍｍから０ｍｍまで減少する塩勾配を使用して脱イオン水に対して透析した。透析後、生成物を凍結乾燥し、４〜８℃で保存した。
【０１４０】
実施例２
４−アームＰＥＧ−ＤＢＣＯの合成
その４つの末端の各々にカルボン酸基を有する４−アームＰＥＧ、「４−アームＰＥＧ−ＣＯＯＨ」、１０ｋＤ（１グラム）を、４０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解した。ＥＤＣ．ＨＣｌ（５当量、７６６．８ｍｇ）、ＮＨＳ（２当量、１８４．１４ｍｇ）及びトリエチルアミン（５当量、５５７μｌ）を４−アームＰＥＧ−ＣＯＯＨ／ＤＣＭ溶液に撹拌しながら添加した。ジベンジルシクロオクチンアミン（１．０５当量、２３２．１２ｍｇ）を次いで添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌させた。ジクロロメタンを蒸発によって除去し、ＤＢＣＯ官能化された生成物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ｇ−１５カラム及び溶出液としてのエタノールを使用してカラムクロマトグラフィによって精製し、４−アームＰＥＧ−ＤＢＣＯを得た。
【０１４１】
実施例３
アルギン酸−アジドビーズの調製
アルギン酸アジドポリマーの水溶液を（１．５重量％、１．５ｇ／１００ｍＬ、２０％アジド−修飾、実施例１に記載されている）を、２５ゲージ針を装着したシリンジを有する自動ポンプを使用してＣａＣｌ２の０．１Ｍ溶液に滴加した。得られたビーズを収集し、水で洗浄した。
【０１４２】
対照：アルギン酸の５ｍｌの水溶液（１．５重量％）を、撹拌しながら１２０ｍＬ／分の速度で自動ポンプを使用してＣａＣｌ２浴（０．１Ｍ）に２５ゲージ針を通して滴加した。得られたビーズを上記浴において１０分間残存させた。ＣａＣｌ２溶液を次いでデカントし、ビーズを５０ｍｌの水で３回洗浄した。
【０１４３】
安定性の特性決定：アルギン酸アジドビーズは、ＰＢＳ緩衝剤中で不安定であった。ビーズの小さなサンプルをＰＢＳ中４０℃で２４時間保存した。２４時間経過後、ビーズはその形状を失い、最終的に破壊した。個々のビーズはいずれも２４時間において見られなかった。
【０１４４】
同様の結果が、アルギネートビーズ（対照、非アジド修飾）について観察された。
【０１４５】
ＰＢＳ中４０℃におけるビーズの挙動は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの挙動を示している；すなわち、従来のイオンで架橋されたアルギネートビーズは、その構造的不安定性及び生理条件下での破壊に起因して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの活性剤、細胞などの送達に不適切である。
【０１４６】
実施例４
４−アームＰＥＧ−ＤＢＣＯによるアルギン酸−アジドビーズの共有結合的な表面修飾
【化３】
2019512522.tif 000005
実施例３からのイオンで架橋されたアルギネートアジドビーズの洗浄液のデカントの後、実施例２で記載されているように調製した４−アームＰＥＧ−ＤＢＣＯの水溶液（２０ｍＬのＤＩ水中２００ｍｇ）をビーズに添加し、混合物を３０分間撹拌した。４−アームＰＥＧ−ＤＢＣＯ溶液を次いでデカントし、８，９−ジヒドロ−２Ｈ−ジベンゾ［ｂ，ｆ］［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｄ］アゾシン基を介してアルギネートに付着した４−アームポリエチレングリコールの単一の共有結合的に架橋された相互浸透表面層を有するビーズ（「ＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤ」）を、３×５０ｍｌの水によって洗浄した。ビーズを、次いで、形状保持、浸透性、及び粘弾性を含めたさらなる特性決定のために、緩衝剤中または水中のいずれかに保存した。反応の簡素化した模式的な表示を上記及び図２に示す。
【０１４７】
ビーズを１ｍＭ  ＰＢＳ溶液中４０℃でインキュベートした。定期的に、ビーズをサイズ、形状、浸透性、及び機械的特性について分析した。
【０１４８】
４０℃でＰＢＳ中のインキュベーション後の目視検査に基づくと、共有結合的に表面修飾ビーズは、驚くべきことに、２４時間以上にわたってビーズ形状を保持しゲル完全性を維持した。ゆえに、２４時間の時間枠にわたる保存条件下（ＰＢＳ／４０℃）で破壊した、共有結合的架橋を有さないアルギネートビーズ及びアルギネート−アジド修飾ビーズの両方とは対照的に、例示的な共有結合的表面修飾アルギネートビーズは、同じ条件下で優れた堅牢さを示した。さらに、共有結合的表面修飾ビーズ（例えば、以下に記載される、共有結合的に連結された１〜７つの相互浸透表面層を有する）は、１ｍＭ  ＰＢＳ中４０℃で保存したときに最長で少なくとも９０日間そのビーズ形状及び完全性を維持した。ビーズの構造的完全性の維持を実証している図３Ａ〜３Ｂを参照されたい。ビーズをさらなる特性決定のために脱イオン水中２〜８℃で保存した。
【０１４９】
実施例５
複数の共有結合的に架橋されたポリマー表面層を有するアルギン酸−アジドビーズの調製
４−アームポリエチレングリコールの単一の共有結合的に架橋された相互浸透表面層を有する、実施例４からの表面修飾ビーズ（「ＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤ」）を、所望の層数に応じて、実施例４に記載されているさらなる表面層を逐次添加し、相応に反応官能基のモル比を調整することによってさらに修飾した。共有結合的に架橋された３、５、及び７つの表面層を有するビーズを以下のように調製した。
【０１５０】
実施例４に記載されている単一の共有結合的に架橋された相互浸透ビーズを、２０％アジド−修飾アルギン酸の２０ｍＬの０．１５重量％溶液に添加し、３０分間反応させた。アルギン酸溶液を次いでデカントし、ビーズを３×５０ｍＬの水で洗浄した。ビーズを、実施例２に記載されているように調製した４−アームＰＥＧ−ＤＢＣＯの水溶液（２０ｍＬのＤＩ水中２００ｍｇ）に添加し、混合物を３０分間撹拌した。４−アームＰＥＧ−ＤＢＣＯ溶液を次いでデカントし、ビーズを３×５０ｍＬの水で洗浄した。３層状ビーズを、次いで、さらなるコーティングに使用し、または形状保持、浸透性、及び粘弾性を含めたさらなる特性決定のために、緩衝剤中もしくは水中のいずれかで保存した。
【０１５１】
上記のシーケンスを繰り返して、５及び７層状ビーズを形成した。
【０１５２】
共有結合的に架橋された３つの相互浸透表面層を有するアルギネートビーズをＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤ／ＡｌｇＡｚ／ＰＥＧＤと表記した。ここで、第１層を、アジド−官能化されたアルギネートと４−アームＰＥＧ  ＤＢＣＯとの反応によって形成し、第２層を、ＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤの表面における過剰のＤＢＣＯ基と、実施例１に記載されているアジド−修飾アルギネートとの反応によってＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤ／ＡｌｇＡｚ（共有結合的に架橋された２つの表面層を有する）を形成することによって形成し、ここで、ＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤ／ＡｌｇＡｚの過剰のアジド反応性基を、次いで、４−アームＰＥＧ  ＤＢＣＯと反応させて、本明細書においてＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤ−３とも称される、３層ヒドロゲルビーズＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤ／ＡｌｇＡｚ／ＰＥＧＤを形成する。本明細書において、共有結合的に架橋された５つの相互浸透表面層を有するアルギネートビーズをＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤ（ＡｌｇＡｚ／ＰＥＧＤ）２またはＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤ−５と称し、共有結合的に架橋された７つの相互浸透表面層を有するアルギネートビーズを、ＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤ（ＡｌｇＡｚ／ＰＥＧＤ）３またはＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤ−７などと称する。
【０１５３】
実施例６
浸透性研究
浸透性研究を、実施例４及び５からの、共有結合的に表面架橋された修飾されたビーズ（共有結合的に架橋された１、３、５、及び７つの表面層（複数可）を有する）を使用して行った。浸透性研究において使用した蛍光分子量マーカーは、デキストラン−ＦＩＴＣ１０ｋＤ、７０ｋＤ、１５０ｋＤ、及び２５０ｋＤ、ウシ血清アルブミンＦＩＴＣ（ＢＳＡ  ＦＩＴＣ）、ならびに免疫グロブリンＧ−ＦＩＴＣ（ＩｇＧ  ＦＩＴＣ）であった。分子量マーカーを、０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で生理食塩水に溶解した。ビーズを、９６ウエルプレートにおいて２００μＬのＦＩＴＣ溶液によって４０℃／１ｍＭ  ＰＢＳで最大９０日間インキュベートした。ビーズ内へのプローブの拡散を各時点（１８日間、６７日間、９０日間）において共焦点顕微鏡法によってモニタリングした。
【０１５４】
浸透性研究により、例示的な表面架橋アルギネートビーズの半浸透性の性質を、９０日の安定性研究の過程を通して１ｍＭ  ＰＢＳ中４０℃で実証する。より詳細には、ビーズ（共有結合的に架橋された１〜７つの表面層を有する）は、ビーズ内の強い蛍光の観察によって示されるように）、低分子量の蛍光標識デキストラン（ＦＩＴＣ−デキストラン１０Ｋ）に浸透性であるが、より高い分子量の種、例えば、ＦＩＴＣ−デキストラン７０ｋＤ、１５０ｋＤ及び２５０ｋＤは、ビーズ（共有結合的に架橋された１〜７つの表面層を有する）内で検出される蛍光の非存在によって示されるように不浸透性であった。同様に、ビーズ（共有結合的に架橋された１〜７つの表面層を有する）は、抗体ＩｇＧ（およそ１５０ｋＤａの分子量）に不浸透性であった。これは、記載されている例示的なビーズについて、１ｍＭ  ＰＢＳ中、体温におけるその半浸透性の性質を示している。さらに、ビーズは、シミュレーションされたｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で長期間、すなわち、３ヶ月間、その半浸透性を維持した。ビーズの半浸透性の性質を、単一の共有結合的に架橋された表面層を有するビーズについて、ならびに、共有結合的に架橋された複数の表面層を有するものについて観察した。ゆえに、少なくとも上記に基づいて、これらの例示的な材料は、治療薬での使用に、特に、他の用途の中でも、生存細胞の治療生成物を付与するのに有利に適している。
【０１５５】
実施例７
機械的安定性
ビーズの機械的特性を、平行板形状（板直径８ｍｍ及びギャップ２ｍｍ）を使用して２１℃でＲＳＡ−Ｇ２固体分析装置（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して分析した。０．０５ｎの法線軸方向の力を適用し、ビーズの直径を、分析装置の軸方向の位置の読み取り値によって求めた。ビーズを、５％の動的ひずみ及び１〜１００ｒａｄｓ／ｓの周波数掃引を適用することによって圧縮モードで分析した。
【０１５６】
種々のストレス条件下でのインキュベーション後の異なるアルギネートビーズの圧縮強度を求めた。以下の材料を評価した：
【表１−１】
2019512522.tif 000006
【表１−２】
2019512522.tif 000007
【０１５７】
実施例３に記載されているイオンで架橋されたアルギネートビーズを、その不安定性に起因して、比較において使用しなかった。
【０１５８】
ＡＰＡビーズは、水中、室温で高い凝集強度を示すが（ＩＴＬ−Ａ）、インキュベーション条件のストリンジェンシーを、例えば、１ｍＭ  ＰＢＳ中、４０℃でのインキュベーションまで増大させると、凝集強度の顕著な損失が、特に１Ｎを超える軸力値で観察された（「ＩＴＬ−Ｂ」）。対照的に、ＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤビーズ（単一層及び７層の両方）は、インキュベーション条件のストリンジェンシーの増大の際に強度の有意な損失を本質的に示さなかった。興味深いことに、単一層材料は、７層材料と同程度まで、ストレス条件下でその強度を維持するようである。７層材料は、１ｍＭ  ＰＢＳ中４０℃で長期間の間その凝集強度をさらに維持し、これらの例示的なアルギネート材料の優れた性質をさらに実証した。
【０１５９】
材料の弾性応答（該材料が機械エネルギーを貯蔵する能力）を測定する貯蔵弾性率を、図４に示されるように、表１に記載されている実例的なアルギネートについて求めた。図４に示されるように、イオンで架橋されたＡＰＡビーズは、両方の一連のインキュベーション条件下で、共有結合的に表面架橋されているＡｌｇ−Ａｚ−ＰＥＧＤビーズよりもかなり高い貯蔵弾性率を示した。単一層及び７層のＡｌｇＡｚ−ＰＥＧＤビーズの貯蔵弾性率は、インキュベーション時間に拘わらず、１ｍＭ  ＰＢＳ／４０℃のストリンジェンシー条件下で本質的に同じであった。
【０１６０】
Ｅ”が貯蔵弾性率でありＥ’が損失弾性率であるタンジェントデルタ（Ｅ”Ｅ’）を、図５に示されるように、表１に記載されている実例的なアルギネートについて求めた。タンジェントデルタは、材料のエネルギー散逸の尺度を付与する。図５に示されるように、タンジェントデルタは、Ａｌｇ−Ａｚ−ＰＥＧＤビーズと比較して、イオンで架橋されたＡＰＡビーズで顕著により高い。ＡＰＡ材料のより高いタンジェントデルタは、これらの材料がより有効にエネルギーを散逸するにつれて、該材料の不安定性を示している。このことは、Ａｌｇ−Ａｚ−ＰＥＧＤビーズと比較したとき、ＡＰＡ材料の分子運動のオーダーがより高いことに起因し得る。対照的に、Ａｌｇ−Ａｚ−ＰＥＧＤビーズは、測定した角周波数の範囲にわたってＡＰＡ−材料よりもかなり低いタンジェントデルタを示し、これは、これらの実例的な材料が限定されたエネルギー散逸を示すことを示唆している。このことから、これらの材料が、より少ない分子運動で、より高度に構造化された、ゆえに、安定なポリマー骨格を有することが推測され得る。単一層及び７層のＡｌｇ−Ａｚ−ＰＥＧＤビーズについてのタンジェントデルタ値は、図６における３つの底部プロットにおいて分かるように、かなり類似している。
【０１６１】
表２は、表１に記載されている材料についての振動試験から得られた、線形領域における動的機械分析データの概要を付与する。
【表２】
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【０１６２】
表２における値は、上記の点をさらに示している。評価したアルギネート材料の中でも、ＡＰＡ材料、ＩＴＬ−Ａは、そのＥ’及びタンジェントデルタ値によって明らかなように、最も低く順序づけられ、最も延性である。対照的に、Ａｌｇ−Ａｚ−ＰＥＧＤ材料は、最も良好に順序づけられ、最も延性でない。
【０１６３】
共有結合的表面架橋アルギネートは、驚くべき機械的安定性を示し、すなわち、シミュレーションしたｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で（１ｍＭ  ＰＢＳ／３７℃）長期間（少なくとも９０日間）にわたって構造的完全性及び半浸透性を維持しており、該アルギネートを治療的用途及び他の用途に理想的に適合させた。
【０１６４】
実施例８
ホスホコリン及びリシンを含む生体適合性ポリマーの合成
実例的なホスホコリン及びリシンコポリマーを以下に記載のように設計及び合成した。
【化４】
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スキーム１：クリック反応性部位を持つ水溶性のＰＣ−リシンのメタクリルアミドコポリマーの合成。
【化５】
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スキーム２：例示的なクリック反応性部位を持ち、短いＰＥＧリンカーを有する水溶性ＰＣ−リシンのメタクリルアミドコポリマーの合成
【化６】
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【０１６５】
８Ａ．ホスホコリン（ＰＣ）及びリシン（１０モル％リシン）のメタクリルアミドコポリマー「ＰＣ−Ｌｙｓ−ＭＡコポリマー」）の合成
５０ｍｌの二口丸底フラスコに、２−メタクリルオキシホスホコリン（１．１８ｇ、４ｍｍｏｌ）及びＮ−メタクリロイルＬ−リシン（８５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、ならびに撹拌棒を入れた。窒素ガスをニードルによって１０分間パージした後、脱イオン水（１０ｍｌ）を付加し；得られた混合物を、透明な溶液が形成されるまで撹拌した。窒素ガスを、反応全体を通して連続してパージした。反応混合物に、水溶性アゾ開始剤、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（Ｖ−５０）を添加した。当該開始剤を、上記の添加後２〜３分以内に溶解させた。フラスコを６０℃に加熱し、窒素雰囲気下で１６時間、制御された温度条件下で維持した。得られた粘性溶液を室温まで冷却させた。粘性溶液をイソプロパノール（２００ｍｌ）中に注いだ。ポリマーを白色塊として沈殿させた。溶媒をデカントし、乾燥して、真空下で溶媒を除去した。ポリマーを水（３０ｍｌ）に溶解させ、粘性溶液をイソプロパノール中に滴下により注いだ。ポリマーを収集し、真空下で乾燥し、その後、水にさらに３回溶解させ、その後、イソプロパノールにおいて沈殿させた。ポリマーを真空下で乾燥させて、白色粉末を得た（１．２ｇ）。生成物の分子量（ＧＰＣ分析）は約３００ｋＤであった。
【０１６６】
８Ｂ：ホスホコリン及びリシン（１６．６モル％リシン）のメタクリルアミドコポリマーの合成
５０ｍｌの二口丸底フラスコに、２−メタクリルオキシホスホコリン（１．１８１ｇ、４ｍｍｏｌ）及びＮ−メタクリロイルＬ−リシン（１７０ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）、ならびに撹拌棒を入れた。フラスコを窒素ガスで１０分間パージした後、脱イオン水（１０ｍｌ）を付加しし；得られた混合物を、透明な溶液が形成されるまで撹拌した。窒素ガスを、反応を通して連続してパージした。水溶性アゾ開始剤、２，２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩（Ｖ−５０）を反応混合物に添加した。当該開始剤を、上記の添加後２〜３分以内に溶解させた。フラスコを６０℃に加熱し、窒素雰囲気下で１６時間、この温度にて制御された条件下で維持した。得られる粘性溶液を室温まで冷却させた。粘性溶液をイソプロパノール（２００ｍｌ）中に注いだ。ポリマーを白色塊として沈殿させた。溶媒をデカントし、乾燥して、真空下で溶媒を除去した。ポリマーを水（３０ｍｌ）に溶解させ、粘性溶液をイソプロパノール中に滴下により注いだ。ポリマーを収集し、真空下で乾燥し、その後、水にさらに３回溶解させ、その後、イソプロパノールにおいて沈殿させた。ポリマーを収集し、真空下で乾燥した。再び、当該ポリマーを水に溶解させ、イソプロパノールにおいて沈殿させた。３回再沈殿した後、最後にポリマーを真空下で乾燥させて、白色粉末を得た（１．３ｇ）。
【０１６７】
８Ｃ．：ＰＣ−Ｌｙｓ−ＭＡコポリマーへのＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステルのカップリング：
実施例８Ｂに記載されている、ホスホコリン及びリシン（１６．６モル％リシン）のメタクリルアミドコポリマー（３００ｍｇ）を５ｍｌの水に溶解し、ｐＨをＮａＨＣＯ３粉末（約１０ｍｇ）の添加によって７．４に調整した。これにＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル（５０ｍｇ、０．０９４ｍｍｏｌ））を添加し、その後、室温で３時間撹拌した。ｐＨを、ＮａＨＣＯ３粉末（５ｍｇ）を１５分以内に添加することによって７．３で維持し、ｐＨを時折モニタリングした。３時間後、反応混合物を（５Ｋモル重量カットオフ膜を使用して）透析した。溶液を凍結乾燥した。ポリマーを白色のフレーク状材料として得た。
【０１６８】
８Ｄ．コポリマーへのＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステルのカップリング：
ホスホコリン及びリシンのメタクリルアミドコポリマー、ＰＣ−Ｌｙｓ−ＭＡ（１６．６モル％リシン；３００ｍｇ）を５ｍｌの水に溶解し、ｐＨをＮａＨＣＯ３粉末（約１０ｍｇ）の添加によって７．４に調整した。上記溶液にＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル（５０ｍｇ）を添加し、その後、室温で３時間撹拌した。ｐＨを、ＮａＨＣＯ３粉末（５ｍｇ）を１５分以内に添加することによって７．３で維持し、その後、ｐＨを時折モニタリングした。３時間後、反応混合物を透析した（５Ｋモル重量カットオフ膜）。溶液を凍結乾燥した。ポリマーを白色粉末として得た。
【０１６９】
８Ｅ：ＤＢＣＯ−カップリングした、ホスホコリン−リシンのメタクリルアミドポリマー（ＤＢＣＯ−ＰＣ−Ｌｙｓ−ＭＡ）のゲル形成試験
実施例８Ｃまたは８Ｄに記載されているＤＢＣＯ−ＰＣ−Ｌｙｓ−ＭＡポリマーの溶液（２％）を、室温で水中にコポリマーを溶解することによって調製した。４−アームＰＥＧアジドの溶液（１０％）を、室温で水中に４−アームＰＥＧアジド（モル中量５Ｋ）を溶解することによって調製した。きれいなガラスバイアルにＤＢＣＯ−ＰＣ−Ｌｙｓ−ＭＡポリマー（１００マイクロリットル）を入れ、その後、ＰＥＧアジド溶液（１００マイクロリットル）を添加した。混合物を僅かに旋回させた。すぐに、透明なゲルが得られた。この結果は、ＤＢＣＯ−ＰＣ−Ｌｙｓ−ＭＡポリマーが活性であり、かつ、例えば、本明細書に記載されているように、アジド基を含有するアルギン酸ビーズを表面にコーティングするのに好適であり、これにより、生体適合性クリック反応性ポリマーによる最終コーティングが得られることを示唆している。
【図１】
2019512522.tif 000012
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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