(57)【要約】  本発明は、標的分子画像化及び/又は標的薬物送達のための多価化合物であって、2つの構成成分又は標的指向性分子が、それぞれ、細胞上の1つ以上のバイオマーカーと相互作用する、多価化合物を提供する。本発明はさらに、標的指向性分子を組み合わせるための多官能性キレーターを提供する。本発明はまた、スペーサー分子の長さを決定するためのインビトロハイスループットスクリーニングアッセイを提供する。本発明はまた、標的分子画像化及び/又は標的薬物送達において使用するための、化合物/プローブ、キット及び方法に関する。【選択図】図１
2019522625.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的対象の分子画像化のための化合物であって、
少なくとも1つの第1の標的指向性分子、及び
検出可能な標識
を含む、化合物。
【請求項２】
少なくとも1つの第2の標的指向性分子をさらに含む、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
キレーターをさらに含む、請求項2に記載の化合物。
【請求項４】
第1の分子が、生物学的対象のバイオマーカーに結合する、請求項2に記載の化合物。
【請求項５】
第2の標的指向性分子が、生物学的対象のバイオマーカーに結合する、請求項4に記載の化合物。
【請求項６】
少なくとも1つの第1の標的指向性分子及び少なくとも1つの第2の標的指向性分子が、生物学的対象における異なるバイオマーカーに結合する、請求項5に記載の化合物。
【請求項７】
第1の標的指向性分子が、タンパク質、抗体、ペプチド、小分子、ナノ粒子、多糖、又はポリヌクレオチドである、請求項1に記載の化合物。
【請求項８】
第2の標的指向性分子が、タンパク質、抗体、ペプチド、小分子、ナノ粒子、多糖、又はポリヌクレオチドである、請求項2に記載の化合物。
【請求項９】
検出可能な標識が、110In、111In、177Lu、52Fe、62Cu、64Cu、32P、11C、13N、15O、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、18F、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154〜158Gd、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、及び他のガンマ、ベータ又はポジトロン放射体である、請求項1に記載の化合物。
【請求項１０】
少なくとも第1の標的指向性分子及び少なくとも1つの第2の標的指向性分子のバイオマーカーが、独立に、uPAR、CD13、又はαvβ3である、請求項6に記載の化合物。
【請求項１１】
uPARの標的指向性分子が、AE105又はAE105mutである、請求項10に記載の化合物。
【請求項１２】
CD13の標的指向性分子が、シクロ(cNGRc)である、請求項10に記載の化合物。
【請求項１３】
αvβ3の標的指向性分子が、シクロ(RGDyK)又はシクロ(RADyK)である、請求項10に記載の化合物。
【請求項１４】
治療有効量の活性剤を、活性剤を必要とする対象に送達するための薬物送達化合物であって、
少なくとも1つの第1の標的指向性分子、及び
活性剤
を含む、化合物。
【請求項１５】
少なくとも1つの第2の標的指向性分子をさらに含む、請求項14に記載の化合物。
【請求項１６】
キレーターをさらに含む、請求項15に記載の化合物。
【請求項１７】
第1の分子が、生物学的対象のバイオマーカーに結合する、請求項15に記載の化合物。
【請求項１８】
第2の分子が、生物学的対象のバイオマーカーに結合する、請求項17に記載の化合物。
【請求項１９】
少なくとも1つの第1の標的指向性分子及び少なくとも1つの第2の標的指向性分子が、生物学的対象における異なるバイオマーカーに結合する、請求項18に記載の化合物。
【請求項２０】
第1の標的指向性分子が、タンパク質、抗体、ペプチド、小分子、ナノ粒子、多糖、又はポリヌクレオチドである、請求項14に記載の化合物。
【請求項２１】
第2の標的指向性分子が、タンパク質、抗体、ペプチド、小分子、ナノ粒子、多糖、又はポリヌクレオチドである、請求項15に記載の化合物。
【請求項２２】
活性剤が、タンパク質、ペプチド、小分子、ナノ粒子、又は放射性医薬品である、請求項14に記載の化合物。
【請求項２３】
放射性医薬品が、67Cu、177Lu、90Y、131I、212Bi、211At、225Ac、188Re、又は111Inである、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
小分子が、ドキソルビシン、パクリタキセル、又はフルオロウラシルである、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも第1の標的指向性分子及び少なくとも1つの第2の標的指向性分子のバイオマーカーが、独立に、uPAR、CD13、又はαvβ3である、請求項19に記載の化合物。
【請求項２６】
uPARの標的指向性分子が、AE105又はAE105mutである、請求項25に記載の化合物。
【請求項２７】
CD13の標的指向性分子が、シクロ(cNGRc)である、請求項25に記載の化合物。
【請求項２８】
αvβ3の標的指向性分子が、シクロ(RGDyK)又はシクロ(RADyK)である、請求項25に記載の化合物。
【請求項２９】
(a)アミド結合接続を作製するためのカルボン酸基又は活性なエステル基、
(b)アジド基、及び
(c)キレートコア
を含む、多官能性キレーター。
【請求項３０】
1,4,7-トリアザシクロネノナン(TACN)ベースのキレーターを含む、請求項29に記載の多官能性キレーター。
【請求項３１】
N3-NOtB2又はN3-DOtB3を含む、請求項29に記載の多官能性キレーター。
【請求項３２】
【化１】
2019522625.tif 000015
である、請求項29に記載の多官能性キレーター。
【請求項３３】
【化２】
2019522625.tif 000016
である、請求項29に記載の多官能性キレーター。
【請求項３４】
1つの標的指向性分子を結合する、請求項29に記載の多官能性キレーター。
【請求項３５】
同じ標的指向性分子の2つを結合する、請求項29に記載の多官能性キレーター。
【請求項３６】
2つの異なる標的指向性分子を結合する、請求項29に記載の多官能性キレーター。
【請求項３７】
1つの標的指向性分子及び1つの色素分子を結合する、請求項29に記載の多官能性キレーター。
【請求項３８】
標的医用画像化のためのキットであって、
(a)少なくとも1つの第1の標的指向性分子、少なくとも1つの第2の標的指向性分子、及び検出可能な標識を含む多価化合物、並びに
(b)キットを使用するための使用説明書
を含む、キット。
【請求項３９】
多価化合物が、キレーターをさらに含む、請求項38に記載のキット。
【請求項４０】
検出可能な標識が、64Cu、68Ga、18F、89Zr、111In、又は99mTcである、請求項38に記載のキット。
【請求項４１】
標的薬物送達のためのキットであって、
(a)少なくとも1つの第1の標的指向性分子、少なくとも1つの第2の標的指向性分子、及び活性剤を含む多価化合物、並びに
(b)キットを使用するための使用説明書
を含む、キット。
【請求項４２】
多価化合物が、キレーターをさらに含む、請求項41に記載のキット。
【請求項４３】
活性剤が、タンパク質、ペプチド、小分子、ナノ粒子又は放射性医薬品である、請求項41に記載のキット。
【請求項４４】
第1の標的指向性分子及び第2の標的指向性分子が、生物学的対象における異なるバイオマーカーに結合する、請求項41に記載のキット。
【請求項４５】
第1の標的指向性分子及び第2の標的指向性分子のバイオマーカーが、独立に、uPAR、CD13、又はαvβ3である、請求項44に記載のキット。
【請求項４６】
uPARの標的指向性分子が、AE105又はAE105mutである、請求項45に記載の化合物。
【請求項４７】
αvβ3の標的指向性分子が、シクロ(RGDyK)又はシクロ(RADyK)である、請求項45に記載の化合物。
【請求項４８】
(a)第1の官能化された標的指向性分子であって、標的指向性分子と第1の官能化された標的指向性分子の官能基との間に様々な長さのスペーサーを含む、第1の官能化された標的指向性分子、
(b)第2の官能化された標的指向性分子であって、標的指向性分子と第2の官能化された標的指向性分子の官能基との間に一定の長さのスペーサーを含む、第2の官能化された標的指向性分子、
(c)第1の官能化された標的指向性分子の官能基に結合する放射標識化官能基、並びに
(d)第1及び第2の官能化された標的指向性分子の標的指向性分子によって標的とされたバイオマーカーを発現する細胞
を含む、ハイスループットスクリーニングプラットフォーム。
【請求項４９】
第1の官能化された標的指向性分子の官能基が、感光性官能基であり、第2の官能化された標的指向性分子の官能基が、反応性官能基であり、感光性官能基が光子エネルギーによって活性化された後、反応性官能基が感光性官能基に結合することができる、請求項48に記載のハイスループットスクリーニングプラットフォーム。
【請求項５０】
第2の官能化された標的指向性分子の官能基が、感光性官能基であり、第1の官能化された標的指向性分子の官能基が、反応性官能基であり、感光性官能基が光子エネルギーによって活性化された後、反応性官能基が感光性官能基に結合することができる、請求項48に記載のハイスループットスクリーニングプラットフォーム。
【請求項５１】
感光性官能基が、光OIDBOであり、反応性官能基が、アジドである、請求項49〜50のいずれかに記載のハイスループットスクリーニングプラットフォーム。
【請求項５２】
放射標識化官能基が、放射標識化アジドである、請求項51に記載のハイスループットスクリーニングプラットフォーム。
【請求項５３】
第1の官能化された標的指向性分子が、光ODIBO-PEGn-RGDペプチドであり、PEGが、モノマーであり、nが、2、4、6、8、10、12、14、16、18、及び20から選択される、請求項51に記載のハイスループットスクリーニングプラットフォーム。
【請求項５４】
第1の官能化された標的指向性分子が、光N3-PEGn-AE105であり、PEGが、モノマーであり、nが、2、4、6、8、10、12、14、16、18、及び20から選択される、請求項51に記載のハイスループットスクリーニングプラットフォーム。
【請求項５５】
放射標識化官能基が、N3-(64Cu)NOTAである、請求項51に記載のハイスループットスクリーニングプラットフォーム。
【請求項５６】
光子エネルギーが、UV線である、請求項49〜50のいずれかに記載のハイスループットスクリーニングプラットフォーム。
【請求項５７】
スペーサーが、ポリマーを含む、請求項48に記載のハイスループットスクリーニングプラットフォーム。
【請求項５８】
スペーサーが、PEGモノマーを含む、請求項57に記載のハイスループットスクリーニングプラットフォーム。
【請求項５９】
(a)第1の官能化された標的指向性分子であって、標的指向性分子と第1の官能化された標的指向性分子の官能基との間に様々な長さのスペーサーを含む第1の官能化された標的指向性分子を、第2の官能化された標的指向性分子であって、標的指向性分子と第2の官能化された標的指向性分子の官能基との間に一定の長さのスペーサーを含む第2の官能化された標的指向性分子と混合して、混合された標的指向性分子の原液を作製するステップと、
(b)混合された標的指向性分子の原液を、第1及び第2の官能化された標的指向性分子の標的指向性分子によって標的とされたバイオマーカーを発現する細胞と共にインキュベートするステップと、
(c)結合していない第1及び第2の官能化された標的指向性分子を除去するステップと、
(d)細胞を、第1の官能化された標的指向性分子の官能基に結合する放射標識化官能基と共にインキュベートするステップと、
(e)結合していない放射標識化官能基を除去するステップと、
(f)細胞の放射活性レベルを測定するステップと
を含む、ハイスループットスクリーニング方法。
【請求項６０】
第1の官能化された標的指向性分子の官能基が、感光性官能基であり、第2の官能化された標的指向性分子の官能基が、反応性官能基であり、感光性官能基が光子エネルギーによって活性化された後、反応性官能基が感光性官能基に結合することができる、請求項59に記載のハイスループットスクリーニング方法。
【請求項６１】
感光性官能基が、光OIDBOであり、反応性官能基が、アジドである、請求項59に記載のハイスループットスクリーニング方法。
【請求項６２】
放射標識化官能基が、放射標識化アジドである、請求項61に記載のハイスループットスクリーニング方法。
【請求項６３】
第1の官能化された標的指向性分子が、光ODIBO-PEGn-RGDペプチドであり、PEGが、モノマーであり、nが、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項59に記載のハイスループットスクリーニング方法。
【請求項６４】
第1の官能化された標的指向性分子が、光N3-PEGn-AE105であり、PEGが、モノマーであり、nが、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項59に記載のハイスループットスクリーニング方法。
【請求項６５】
放射標識化官能基が、N3-(64Cu)NOTAである、請求項59に記載のハイスループットスクリーニング方法。
【請求項６６】
光子エネルギーが、UV線である、請求項60に記載のハイスループットスクリーニング方法。
【請求項６７】
そのような処置を必要とする対象、例えば疾患若しくは障害を有するか、疾患若しくは障害を有するリスクがあるか、又は疾患若しくは障害についてスクリーニング/検査を受ける対象の、目的の細胞、組織、又は構造を画像化する方法であって、対象に、請求項1〜28のいずれかに記載の1つ以上の化合物を投与するステップを含む、方法。
【請求項６８】
そのような処置を必要とする対象、例えば疾患若しくは障害を有するか、疾患若しくは障害を有するリスクがあるか、又は疾患若しくは障害についてスクリーニング/検査を受ける対象の、目的の細胞、組織、又は構造を画像化する方法における、請求項1〜28のいずれかに記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2016年5月2日出願の米国仮出願第62/330,622号、2016年6月7日出願の米国仮出願第62/346,783号、及び2016年8月10日出願の米国仮出願第62/373,036号の優先権を主張し、それらのそれぞれの内容及びすべては、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
補助金情報
本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって付与された補助金番号EB017317号及びEB020737号の下で政府の支援を受けた。政府は、本発明においてある一定の権利を有する。
【０００３】
1.導入
本発明は、多価分子画像化方法及び/又は標的薬物送達方法に関し、異なるバイオマーカーを標的とする多価分子は、画像化標識及び/又は薬物を有している。したがって、多価分子は、同じであっても、異なっていてもよい少なくとも2つのバイオマーカーに結合することができ、その結果、感受性が増大し、特異性が増大し、結合親和性が増大し、Bmaxが増大し、血中保持時間がより長くなり、信号対雑音比が改善され、薬物動態性能が改善される。特に、多価分子は、初期段階で、且つ/又はバイオマーカーの量が相対的に少量である場合に、がん又は他の疾患/障害を画像化することができる。本発明はまた、色素分子へのリガンドのカップリングを含む、多価分子並びに他の二量体分子を調製するのに有用なキレーターに関する。本発明のキレーターは、追加の化学的プラットフォームを使用せずに分子をカップリングする、改善された能力を提供する。本発明はさらに、多価分子におけるスペーサーを最適化するためのインビトロハイスループットスクリーニングプラットフォームに関する。
【背景技術】
【０００４】
2.発明の背景
一価の画像化プローブの臨床的実用性は、しばしば、受容体密度、結合親和性、及びインビボ薬物動態を含めた様々な因子によって制限される。複数の相互作用によって結合活性を改善する多価の戦略は、画像化及び治療に有望な手法である。例えば、2つの異なる受容体に対する2つの連結したリガンドの同時の結合を特色とするヘテロ二価性は、単一受容体標的戦略を上回るいくつかの利点を有することにより、有望な標的化戦略として浮上している。第1に、ヘテロ二価性は、低親和性の一価リガンド(Kdは、およそμM)を、高い結合活性を有するリガンド(Kdは、およそnM)に容易に変換することができる。第2に、ヘテロ二価性は、モノマー(又はホモ二量体)には利用不可能な新しい作用機序を示し、第2の結合部位は、密度が低く、特異性が低く、又はさらには非特異的な受容体であってよい(例えば、モノマータンパク質上の疎水性パッチ)。したがって、2つのリガンドが適切な連結で接続された場合には、特異的取込みが増強されることがかなり期待される。第3に、ヘテロ二量体は、サイズ及び親油性が変化することにより、特にクリアランス特性及び排出速度がそれらの一価の対応物にとって最適でない場合に改善された薬物動態性能を有することができる。しかし今までのプローブは、腫瘍の不均一性及び複雑な腫瘍微小環境により、初期段階のがんを同定する能力が制限されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、当技術分野では、感受性が増大し、特異性が増大し、結合親和性が増大し、Bmaxが増大し、薬物動態が改善され(例えば、血中保持時間がより長くなる、並びにクリアランス特性及び排出速度が、一価リガンドにとって最適でない場合)、信号対雑音比が改善された、分子画像化及び/又は放射免疫治療の方法、並びに分子画像化及び放射免疫治療に使用される多量体を作成する改善された方法が必要である。
【０００６】
そのような手法の例は、本明細書で開示される分子画像化及び治療のための多価である。スペーサーの長さは、多量体における二価性の結合活性に劇的に影響を及ぼすことが広く認識されている。多価化合物を作製する従来の戦略は、リガンド間で様々な長さのスペーサーを有する類似体を調製した後、対応するインビトロ及び/又はインビボ試験を実施して、最も適切な長さのスペーサーを見出すことを含む。しかしこの戦略は、冗長で高価な合成作業を伴う。ある場合には、適切なスペーサーの長さは、コンピューターモデル化研究から予測され得るが、この戦略は、2つの標的受容体が互いに相互作用した状況に限定され、その予測は不正確な場合がある。したがって、多価化合物のリガンド間に適切な間隔を有する多価化合物を作成する改善された方法が、依然必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
3.発明の概要
本発明は、標的分子画像化及び/又は治療のための化合物、キット、及び方法に関する。その最も広範な態様では、本発明は、目的の細胞、組織、又は構造上のバイオマーカーと相互作用する2つの構成成分又は分子に関する。本発明は、細胞(例えば、腫瘍細胞)上の少なくとも2つのバイオマーカーを標的とすることによって、画像化標識及び/又は活性剤の感受性及び/又は特異性が増大し、分子の薬物動態特性も改善されるという発見に少なくとも部分的に基づく。本発明はまた、標的分子画像化及び/又は標的薬物送達の方法に関する。
【０００８】
本発明は、分子画像化のための化合物、組成物、方法、及びキットを提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、分子画像化多価化合物は、少なくとも1つのバイオマーカーと結合し且つ/又は相互作用する少なくとも1つの第1の標的指向性分子、少なくとも1つの他のバイオマーカーと結合し且つ/又は相互作用する少なくとも1つの第2の標的指向性分子、及び検出可能な標識を含む。ある特定の実施形態では、化合物は、2つ以上の検出可能な標識を有することができる。
【０００９】
ある特定の非限定的な実施形態では、分子画像化マルチモーダル及び/又は多価化合物は、少なくとも1つのバイオマーカーと結合し且つ/又は相互作用する少なくとも1つの標的指向性分子、少なくとも1つの第1の検出可能な標識、及び少なくとも1つの第2の検出可能な標識を含む。
【００１０】
ある特定の非限定的な実施形態では、検出可能な標識は、画像化標識である。ある特定の非限定的な実施形態では、画像化標識は、64Cu、68Ga、18F、89Zr、111In、Al18F又は99mTcからなる群から選択される同位体であり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、検出可能な標識は、色素分子である。ある特定の非限定的な実施形態では、色素分子は、シアニン、FluoProbes、又はDyLight Fluor色素であり得るが、それらに限定されない。
【００１１】
本発明は、薬物送達を標的とするための化合物、組成物、方法、及びキットを提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、標的薬物送達のための多価化合物は、少なくとも1つのバイオマーカーと結合且つ/又は相互作用する少なくとも1つの第1の標的指向性分子、少なくとも1つの他のバイオマーカーと結合且つ/又は相互作用する少なくとも1つの第2の標的指向性分子、及び少なくとも1つの活性剤を含む。
【００１２】
ある特定の非限定的な実施形態では、活性剤は、タンパク質、ペプチド、小分子、ナノ粒子、医薬品、又は放射性医薬品であり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、放射性医薬品は、67Cu、177Lu、90Y、131I、212Bi、211At、225Ac、188Re、又は111Inを含むことができる。医薬品(場合により放射性同位体を組み込むことができる)の非限定的な例として、抗がん剤、抗感染剤、抗増殖剤、免疫応答を増大又は低減する薬剤を含めた、免疫応答をモジュレートする薬剤、抗血栓剤等が挙げられる。ある特定の非限定的な実施形態では、小分子は、ドキソルビシン、パクリタキセル又はフルオロウラシルであり得るが、それらに限定されない。
【００１３】
ある特定の非限定的な実施形態では、多価化合物の第1の標的指向性分子及び/又は第2の標的指向性分子は、目的の生物学的対象の少なくとも1つのバイオマーカーに結合する。ある特定の非限定的な実施形態では、第1の標的指向性分子及び/又は第2の標的指向性分子は、それぞれ個々に、タンパク質、抗体、ペプチド、小分子、ナノ粒子、多糖、又はポリヌクレオチドであり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、第1の標的指向性分子及び/又は第2の標的指向性分子は、内部移行することができても、内部移行することができなくてもよい。
【００１４】
ある特定の非限定的な実施形態では、第1及び第2の標的指向性分子は、目的の生物学的対象の同じ又は異なるバイオマーカーを標的とする。ある特定の非限定的な実施形態では、第1及び第2の標的指向性分子が、2つの異なるバイオマーカーに結合する場合、バイオマーカーは、同じ生物学的対象上に発現される。ある特定の非限定的な実施形態では、目的の生物学的対象は、細胞であり得るが、それに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、目的の生物学的対象は、目的の細胞、組織、又は構造、例えば腫瘍又はがん細胞であり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーは、細胞表面上又は内部に発現され得る。ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーは、細胞表面タンパク質であり得るが、それに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーは、インテグリンであり得るが、それに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーは、CD13及び/又はインテグリンαvβ3であり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーは、uPAR及び/又はインテグリンαvβ3であり得るが、それらに限定されない。
【００１５】
ある特定の非限定的な実施形態では、標的指向性分子は、CD13標的指向性分子であり得るが、それに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、CD13標的指向性分子は、Asn-Gly-Arg(NGR)モチーフを含有するペプチドであり得るが、それに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、CD13標的指向性分子は、シクロ(cNGRc)、シクロ(cPNGRc)、シクロ(NGRyK)、直鎖cNGRc、又は直鎖cPNGRcなどのペプチドであり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、標的指向性分子は、インテグリンαvβ3標的指向性分子であり得るが、それに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、インテグリンαvβ3標的指向性分子は、曝露されたアルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)トリペプチドモチーフを有するタンパク質であり得るが、それに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、インテグリンαvβ3標的指向性分子は、シクロ(RGDyK)又はシクロ(RADyK)などのペプチドであり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、標的指向性分子は、uPAR標的指向性分子であり得るが、それに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、uPAR標的指向性分子は、uPA、ATF(ウロキナーゼのアミノ末端断片)、AE105、又はAE105mutであり得るが、それらに限定されない。
【００１６】
ある特定の非限定的な実施形態では、少なくとも1つの第1の標的指向性分子及び少なくとも1つの第2の標的指向性分子は、スペーサー(例えば、ポリマー)によって結合することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、少なくとも1つの第1の標的指向性分子及び少なくとも1つの第2の標的指向性分子は、キレーターによって結合することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、少なくとも1つの第1の標的指向性分子及び少なくとも1つの第2の標的指向性分子は、スペーサー(例えば、ポリマー)によってキレーターに結合する。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、多官能性キレーターを含む。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、アミド結合接続のためのカルボン酸又は活性なエステル基、クリックケミストリーに適したアジド基、及びキレートコアを組み合わせる。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、1,4,7-トリアザシクロネノナン(triazacyclonenonane)(TACN)ベースのキレーターを含む。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、NOTA、DOTA、L-NETA、N3-NOtB2又はN3-DOtB3を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、モノマーのための1つの標的指向性分子(例えば、第1又は第2の標的指向性分子のいずれか)に結合することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、ホモ二量体の同じ標的指向性分子の2つ(例えば、第1の標的指向性分子の2つ又は第2の標的指向性分子の2つのいずれか)に結合することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、ヘテロ二量体の2つの異なる標的指向性分子(例えば、第1及び第2の標的指向性分子)に結合することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、マルチモダリティのための1つの標的指向性分子(例えば、第1又は第2の標的指向性分子のいずれか)及び1つの色素分子に結合することができる。
【００１７】
ある特定の非限定的な実施形態では、本開示の化合物は、そのような処置を必要とする対象、例えば疾患若しくは障害を有するか、疾患若しくは障害を有するリスクがあるか、又は疾患若しくは障害についてスクリーニング/検査を受ける対象の、目的の細胞、組織、又は構造を画像化する方法において使用することができ、対象は、本発明による化合物を投与される。
【００１８】
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、多価化合物の標的指向性分子間のスペーサーの長さを最適化するためのインビトロハイスループットスクリーニングプラットフォームを提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、方法は、スペーサーの長さを最適化するために、クリックケミストリー及び放射化学を組み合わせる。ある特定の非限定的な実施形態では、細胞は、多価化合物をその場で形成することによって、スクリーニングプラットフォームとして使用することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、多価化合物の標的指向性分子は、反応基及び感光性(すなわち、光誘発可能な)基で別個に官能化され得る。ある特定の非限定的な実施形態では、インビトロハイスループットスクリーニングプラットフォームは、細胞を第1の官能化された標的指向性分子及び第2の官能化された標的指向性分子に曝露することを含み、官能化された標的指向性分子の少なくとも1つは、異なる長さのスペーサーに結合することができ、官能化された標的指向性分子の少なくとも1つの他の組は、一定の長さを有するスペーサーに結合する。ある特定の非限定的な実施形態では、標的指向性分子は、第1の官能化された標的指向性分子のスペーサーを、第2の官能化された標的指向性分子のスペーサーに結合させることができる官能基で官能化される。ある特定の非限定的な実施形態では、官能基の少なくとも1つを、光子エネルギーによって活性化して、他の官能化基に結合させることができる。ある特定の非限定的な実施形態では、放射性金属で標識された反応基を付加して、そのスペーサーによって別の官能化された標的指向性分子に結合していない官能化された標的指向性分子の少なくとも1つの集団に結合させることができる。ある特定の非限定的な実施形態では、結合した放射性金属(例えば、68Ga、64Cu、Al18F、177Lu、111In、及び89Zr)で標識された反応基の量を測定して、どのスペーサーの長さが、2つの官能化された標的指向性分子集団間の大部分の結合をもたらしたかを決定する。
【００１９】
本発明はまた、標的医用画像化及び/又は標的薬物送達のためのキットを提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、キットは、少なくとも1つの第1の標的指向性分子、少なくとも1つの第2の標的指向性分子、並びに少なくとも1つの検出可能な標識及び/又は活性剤を含む少なくとも1つの多価化合物を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、キットは、1つの標的指向性分子、及び少なくとも1つの検出可能な標識又は活性剤を含む少なくとも1つの化合物を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、キットは、少なくとも1つの第1の標的指向性分子及び少なくとも1つの第2の標的指向性分子を結合することができるキレーターを含む。ある特定の非限定的な実施形態では、キットは、少なくとも1つの第1の標的指向性分子及び少なくとも1つの第2の標的指向性分子を互いに結合させるか、又はキレーターと結合させるためのスペーサー(例えば、ポリマー)を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、多官能性キレーターを含む。ある特定の非限定的な実施形態では、キットは、キットを使用するための使用説明書を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
4.図面の簡単な説明
【図１】本発明の多価化合物の非限定的な模式図である。
【図２】本発明の多価化合物を作成するための非限定的な模式図である。
【図３】本発明のハイスループットスクリーニングプラットフォームの非限定的な模式図である。
【図４−１】AE105-NOTA-RGDの構造を示す図である。
【図４−２】AE105-NOTA-RGDの構造を示す図である。
【図５】プローブの放射標識化の代表的なHPLCの結果を示す図である。
【図６】AE105-NODAGA及びRGD-NODAGAの構造を示す図である。
【図７】血清中でプローブを1日インキュベートした後、著しい64Cu-解離がなかったことを示す、放射性HPLCの結果を示す図である。
【図８】AE105-PEG4-DOTA-PEG4-RGDの構造を示す図である。
【図９】AE105-NOTA-NHCO-Cy3(A)及び遮断(B)を使用するU87MG細胞染色を示す図である。
【図１０】AE105-NOTA-RGD、AE105-NODAGA及びRGD-NODAGAの細胞取込みアッセイを示す図である。
【図１１】64CUで標識されたAE105-NOTA-RGD化合物の注射1時間後及び4時間後の、ヒトU87MG腫瘍細胞を有するマウスのPET画像化を示す図である。
【図１２】注射1時間後及び4時間後の、64Cuで標識されたヘテロ二量体とモノマーのPET画像の比較を示す図である。
【図１３】64Cuで標識されたAE105-NOTA-RGD化合物のエクスビボ体内分布、及び腫瘍対非腫瘍の取込み比(ration)を示す図である。
【図１４】CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyKヘテロ二量体、(68Ga)NOTA(CNGRC)、又は(68Ga)NOTA(RGDyK)の注射後のヒトbxpc3腫瘍細胞及び4T1腫瘍細胞を有しているマウスのPET画像化を示す図である。
【図１５Ａ】同所異種移植マウスモデルにおけるPET画像化を示す図である。図15Aは、CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyKヘテロ二量体の注射後のPET画像を提供する。
【図１５Ｂ】同所異種移植マウスモデルにおけるPET画像化を示す図である。図15Bは、RGDモノマーの注射後のPET画像を提供する。
【図１５Ｃ】同所異種移植マウスモデルにおけるPET画像化を示す図である。図15Cは、NGRモノマーの注射後のPET画像を提供する。
【図１６Ａ】遺伝子組換えマウス(GEM)モデルにおけるPET画像化を示す図である。図16Aは、CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyKヘテロ二量体の注射後のPET画像を提供する。
【図１６Ｂ】遺伝子組換えマウス(GEM)モデルにおけるPET画像化を示す図である。図16Bは、18F-FDGの注射後のPET画像を提供する。
【図１６Ｃ】遺伝子組換えマウス(GEM)モデルにおけるPET画像化を示す図である。図16Cは、RGDモノマーの注射後のPET画像を提供する。
【図１６Ｄ】遺伝子組換えマウス(GEM)モデルにおけるPET画像化を示す図である。図16Dは、NGRモノマーの注射後のPET画像を提供する。
【図１７】本発明によるインビトロスクリーニングプラットフォームの基盤となる理論的根拠の概略図である。
【図１８Ａ】RGD官能化のHPLCモニタリングを示す図である。図18Aは、RGDのHPLCを示す。
【図１８Ｂ】RGD官能化のHPLCモニタリングを示す図である。図18Bは、光ODIBO-PEG4-NHSのHPLCを示す。
【図１８Ｃ】RGD官能化のHPLCモニタリングを示す図である。図18Cは、実施例13の反応混合物の30分後のHPLCを示す。
【図１８Ｄ】RGD官能化のHPLCモニタリングを示す図である。図18Dは、PBSを添加し、一晩インキュベーションした後の実施例13の反応混合物のHPLCを示す。
【図１９】開発されたプラットフォームによる、選択されたスペーサーのインビトロスクリーニングを示す図である。(*、P<0.05;**、P<0.01)。
【図２０Ａ】細胞取込み及び流出研究を示す図である。図20Aは、実施例13による様々なスペーサーを有するヘテロ二量体に関する細胞取込み研究の結果を提供する。
【図２０Ｂ】細胞取込み及び流出研究を示す図である。図20Bは、実施例13による様々なスペーサーを有するヘテロ二量体に関する細胞流出研究の結果を提供する。
【図２１】インビトロスクリーニングのために選択されたものと同じ長さのスペーサーを有するGa68で標識されたヘテロ二量体を使用する、u87MG腫瘍のPET画像化を示す図である。
【図２２】PET画像に基づくROI定量化を示す図である。(*、P<0.05;**、P<0.01;***、P<0.001)。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
5.発明を実施するための形態
本発明は、標的分子画像化及び/又は治療のための化合物、キット、及び方法に関し、標的指向性分子は、生物学的対象上の対応するバイオマーカーと相互作用する。ある特定の非限定的な実施形態では、生物学的対象は、目的の正常な又は疾患状態の又は変性した細胞、組織、又は他の構造である。ある特定の非限定的な実施形態では、生物学的対象は、腫瘍又はがん細胞である。本発明はさらに、標的分子画像化及び/又は治療のための化合物/組成物/分子/キレーター及びキットに関する。本発明はまた、多価標的分子画像化化合物及び/又は治療化合物に適したスペーサーの長さを同定するインビトロハイスループットスクリーニング方法に関する。
【００２２】
ある特定の非限定的な実施形態では、開示される標的分子画像化方法及び/又は標的薬物送達方法によって、急速に除去される検出可能な標識及び/又は活性剤を長時間保持することができ、したがってその結果、細胞取込みが著しく増大する。ある特定の非限定的な実施形態では、開示される方法は、感受性の増大及び/又は特異性の増大を提供する。例えば、開示される方法は、低親和性の一価標的指向性分子(およそμM)を、高い結合活性を有する一価標的指向性分子(およそnM)に変換することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、開示される標的分子画像化方法及び/又は標的薬物送達方法は、様々な二重/多重バイオマーカーの組合せ及び標的(例えば、腫瘍又はがん)に広範に適用することができる。
【００２３】
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、目的の細胞(例えば、腫瘍又はがん細胞)により密接に結合し、それによって非特異的結合を低減し、偽陽性結果を低減することができる、標的分子画像化化合物及び/又は標的薬物送達化合物を提供する。より密接に結合する標的分子画像化化合物及び/又は標的薬物送達化合物は、目的の生物学的対象から解離する化合物の量を、より少なくすることができる。ある特定の非限定的な実施形態では、より密接に結合する化合物は、細胞取込み(update)を増大し、且つ/又は非標的細胞による取込みを低減する。例としてそれらに限定されるものではないが、腫瘍細胞の場合、高い結合活性が達成されると、2つの標的バイオマーカーを同時に過剰発現する腫瘍に対する結合親和性を著しく増強することができるが、2つの標的バイオマーカーの一方のみを発現する(又はいずれも発現しない)非腫瘍組織に対する結合親和性は増大せず、したがって、腫瘍/非腫瘍比は、著しく増大する。ある特定の非限定的な実施形態では、本発明の方法は、全結合部位の増大により標的指向性分子の局所濃度を増大することによって、及び改善された薬物動態(クリアランス特性及び排出速度など)により標的指向性分子の循環時間を増大することによって、標的指向性リガンド/分子が組み込まれた放射性/薬物分子が、目的の部位に蓄積し、それによって取込みを増大することができるので、臨床解釈にとってより高い潜在可能性を提供する。例えば、標的受容体の密度は、相補的な細胞表面受容体の適切な組合せを標的とすることによって、増大することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、多量体は、サイズ及び親油性の変化に起因して、改善された薬物動態性能を有することもできる。
【００２４】
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、標的指向性分子を、同じ標的指向性分子の少なくとも1つ、少なくとも1つの異なる標的指向性分子、及び/又は色素分子と組み合わせるためのキレーターを提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、少なくとも2つの標的指向性分子をカップリングすることができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、固相ペプチド合成に関与することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、標的モノマー、ホモ二量体、ヘテロ二量体、及びマルチモダリティを、診断用トレーサー及び/又は放射線治療剤として開発する過程を簡素化することができる。
【００２５】
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、多量体の標的指向性分子間のスペーサーの長さを最適化するための、インビトロハイスループットスクリーニングプラットフォームを提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、インビトロハイスループットスクリーニングプラットフォームは、試験ごとにnM範囲の標的指向性分子を利用することができる高感度アッセイである。
【００２６】
ある特定の非限定的な実施形態では、方法は、スペーサーの長さを最適化するために、クリックケミストリー及び放射化学を組み合わせる。ある特定の非限定的な実施形態では、細胞は、多量体(例えば、ヘテロ二量体)をその場(すなわち、インビトロ)で形成することによって、スクリーニングプラットフォームとして使用することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、多量体の標的指向性分子は、反応基(例えば、クリック可能な基)及び感光性基(例えば、クリック可能な基)を用いて別個に官能化することができる。
【００２７】
「バイオマーカー」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患又は障害の初期段階での検出を含めた個体における疾患又は障害の検出を可能にする、マーカー(例えば、それらに限定されるものではないが、タンパク質(モノマーの及び多量体のタンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質等を含む)、炭水化物、脂質、核酸及びそれらの組合せを含む)を指す。疾患又は障害には、それらに限定されるものではないが、がん性(cancersl)自己免疫性状態、変性状態、血管障害、神経障害、及び伝染病を含めた増殖障害が含まれるが、それらに限定されず、ヒト及び非ヒト動物における数々の疾患及び障害と関連するバイオマーカーは、当技術分野で公知である。ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーの存在又は非存在は、画像化によって決定される。ある特定の非限定的な実施形態では、対象の生物学的試料におけるバイオマーカーの存在又は非存在は、基準対照と比較される。
【００２８】
「活性剤」という用語は、対象に投与されると生理効果を有することができる薬剤を指す。ある特定の非限定的な実施形態では、「活性剤」という用語は、タンパク質、ペプチド、小分子、又は放射性医薬品を指す。ある特定の非限定的な実施形態では、活性剤は、化学治療剤である。ある特定の非限定的な実施形態では、活性剤は、免疫治療剤である。
【００２９】
「治療有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患を処置し、予防し、又は管理するのに十分な活性剤の量を指す。さらに、本開示の第2の標的指向性プローブに関する治療有効量は、疾患症状の重症度の低減、疾患症状がない期間の頻度及び長さの増大、又は疾患の苦痛に起因する機能障害若しくは身体障害の予防を含み得る、疾患の処置又は管理において治療上の利益をもたらす、活性剤単独の量、又は他の治療との組合せにおける活性剤の量を意味することができる。この用語は、治療全体を改善し、望ましくない効果を低減若しくは回避し、又は別の治療剤との相乗作用の治療有効性を増強する量を包含することができる。
【００３０】
「生物学的対象」という用語は、本明細書で使用される場合、それらに限定されるものではないが、タンパク質、ウイルス、細胞、組織、臓器又は生物を指す。ある特定の非限定的な実施形態では、生物学的対象は、正常な又は疾患状態の又は変性した又は感染した細胞、組織、又は臓器であり得る。ある特定の非限定的な実施形態では、細胞は、腫瘍又はがん細胞であり得る。
【００３１】
「官能化」という用語は、本明細書で使用される場合、別の官能基(例えば、アジド)と反応することができる新しい官能基を導入するための、既存の分子セグメントの修飾を指す。
【００３２】
本明細書に開示される範囲、例えば「約X〜約Yの間」は、別段特定されない限り、約X及び約Y、並びにX及びYの範囲限界値を含む。
【００３３】
本発明の詳細な説明を、それらに限定することなく明確に説明するために、以下のサブセクションに分ける。
(i)標的分子画像化化合物及び/又は薬物送達化合物並びにその使用方法、
(ii)標的分子画像化化合物及び/又は薬物送達化合物を作成するためのキレーター及び方法、
(iii)多量体の標的指向性分子間のスペーサーの長さを最適化するためのハイスループットスクリーニングプラットフォーム、
(iv)バイオマーカー、並びに
(v)キット。
【００３４】
5.1.標的分子画像化化合物及び/又は薬物送達化合物並びにその使用方法
本発明は、標的分子画像化化合物及び/又は標的薬物送達化合物を提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、少なくとも1つのバイオマーカー(例えば、細胞上の)とそれぞれ相互作用する2つの構成成分又は標的指向性分子を提供する。
【００３５】
5.1.1.標的指向性分子
本発明は、少なくとも1つの第1の標的指向性分子を有する標的分子画像化化合物及び/又は標的薬物送達化合物を提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、少なくとも1つの第1の標的指向性分子及び少なくとも1つの第2の標的指向性分子を有する標的分子画像化化合物及び/又は標的薬物送達化合物を提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、標的分子画像化化合物及び/又は標的薬物送達化合物は、同じ又は異なるバイオマーカーを対象とした少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、又は少なくとも5つの異なる標的指向性分子を有することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、標的分子画像化化合物及び/又は標的薬物送達化合物は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又はそれよりも多い標的指向性分子を有することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、標的分子画像化化合物及び/又は標的薬物送達化合物は、各標的指向性分子の2つ以上を有することができる。
【００３６】
ある特定の非限定的な実施形態では、標的指向性分子は、バイオマーカーに結合する、抗体、タンパク質、ペプチド、小分子、ナノ粒子、多糖、又はポリヌクレオチドであり得る。ある特定の非限定的な実施形態では、標的指向性分子は、活性剤である。ある特定の非限定的な実施形態では、標的指向性分子は、内部移行することができても、内部移行することができなくてもよい。
【００３７】
ある特定の非限定的な実施形態では、標的指向性分子は、タンパク質であり得る。ある特定の非限定的な実施形態では、第1の標的指向性プローブは、抗体である。「抗体」という用語には、本明細書で使用される場合、抗体、抗体誘導体、それらから誘導された有機化合物、モノクローナル抗体、抗体断片、修飾抗体、単鎖抗体並びにそれらの断片及びミニ抗体、二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、又はそれらの二量体、オリゴマー若しくは多量体が含まれるが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、修飾抗体には、合成抗体、キメラ抗体若しくはヒト化抗体、又はそれらの混合物、又は定常領域が部分的若しくは完全に欠失している抗体断片、例えば、Fv、Fab、Fab'又はF(ab)'2等が含まれる。ある特定の非限定的な実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００３８】
ある特定の非限定的な実施形態では、標的指向性分子は、商業的に利用可能である。ある特定の非限定的な実施形態では、標的指向性分子は、当業者によって理解される任意の技術によって、特異的バイオマーカーに対して作成され得る。
【００３９】
ある特定の非限定的な実施形態では、標的分子画像化化合物は、1つ又は2つの検出可能な標識を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、検出可能な標識は、画像化標識、及び/又は治療プローブである。
【００４０】
ある特定の非限定的な実施形態では、画像化標識は、110In、111In、177Lu、52Fe、62Cu、64Cu、32P、11C、13N、15O、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、18F、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154〜158Gd、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb、83Sr、及び他のガンマ、ベータ又はポジトロン放射体であり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、治療プローブは、治療的放射性同位体、例えば、67Cu、177Lu、90Y、131I、212Bi、211At又は225Acであるが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、治療プローブは、抗がん薬、例えばドキソルビシン、パクリタキセル、フルオロウラシル等である。
【００４１】
ある特定の非限定的な実施形態では、標的薬物送達化合物は、1つ又は2つの活性剤を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、活性剤は、タンパク質、ペプチド、小分子、ペプチド核酸(PNA)、又は放射性医薬品であり得るが、それらに限定されない。
【００４２】
ある特定の非限定的な実施形態では、検出可能な標識は、色素分子である。ある特定の非限定的な実施形態では、化合物は、2つ以上の色素分子を有することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、色素分子は、1つのタイプの標的指向性分子(1つのタイプの1つ以上)に結合する。ある特定の非限定的な実施形態では、色素分子は、少なくとも2つのタイプの標的指向性分子(それぞれの少なくとも1つ)に結合する。ある特定の非限定的な実施形態では、色素分子は、シアニン色素(Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy7、Cy5.5、Cy7.5)、GFP、カルセイン、FITC、FluorX、Alexa色素、ローダミン色素、5-FAM、オレゴングリーン、テキサスレッドであり得るが、それらに限定されない。
【００４３】
ある特定の非限定的な実施形態では、活性剤は、トラスツズマブ、T-DM1、ラパチニブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ  ゲフィチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、KD-019エルロチニブ、シスプラチン、カルボプラチン、ゲムシタビン、ペメトレキセド、イリノテカン、5-フルオロウラシル(fluoruracil)、パクリタキセル、ドセタキセル、又はカペシタビンであり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、放射性医薬品は、111In-イブリツモマブチウキセタン、90Y-イブリツモマブチウキセタン、131I-トシツモマブ、131I-ラベツズマブ、131I-リツキシマブ、212Pb-トラスツズマブ、131I-トラスツズマブ、111In-トラスツズマブ、188Re-トラスツズマブであり得る。
【００４４】
以下の表1は、特異的バイオマーカーに結合する標的指向性分子(すなわち、第1の標的指向性分子及び/又は第2の標的指向性分子)の非限定的な例を提供する。
【００４５】
【表１】
2019522625.tif 000003
【００４６】
ある特定の非限定的な実施形態では、標的分子画像化化合物及び/又は標的薬物送達化合物は、少なくとも1つの第1の標的指向性分子、少なくとも1つの第2の標的指向性分子、並びに検出可能な標識及び/又は活性剤を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、標的分子画像化化合物及び/又は標的薬物送達化合物は、第1の標的指向性分子、第2の標的指向性分子、並びに検出可能な標識及び/又は活性剤を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、標的分子画像化化合物は、第1の標的指向性分子、第2の標的指向性分子、検出可能な標識、及び場合により活性剤を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、第1の標的指向性分子及び第2の標的指向性分子は、タンパク質であり得る。ある特定の非限定的な実施形態では、検出可能な標識は、画像化標識であり得る。ある特定の非限定的な実施形態では、画像化標識は、64Cu、68Ga、又は18Fであり得る。ある特定の非限定的な実施形態では、第1の標的指向性分子は、uPAR標的指向性分子であり得るが、それに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、uPAR標的指向性分子は、uPA、ATF(ウロキナーゼのアミノ末端断片)、AE105、又はAE105mutであり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、第1の標的指向性分子は、CD13標的指向性分子であり得るが、それに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、CD13標的指向性分子は、Asn-Gly-Arg(NGR)モチーフを含有するペプチドであり得るが、それに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、CD13標的指向性分子は、シクロ(cNGRc)、シクロ(cPNGRc)、シクロ(NRGyK)、直鎖cNGRc、又は直鎖cPNGRcなどのペプチドであり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、第2の標的指向性分子は、インテグリンαvβ3標的指向性分子であり得るが、それに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、インテグリンαvβ3標的指向性分子は、曝露されたアルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)トリペプチド配列又はアルギニン-アラニン-アスパラギン酸(RAD)配列を有するタンパク質であり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、インテグリンαvβ3標的指向性分子は、シクロ(cyclco)(RGDyK)(RGD)又はシクロ(RADyK)(RAD)などのペプチドであり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーは、CD13及び/又はインテグリンαvβ3であり得るが、それらに限定されない(例えば、図1を参照されたい)。ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーは、uPAR及び/又はインテグリンαvβ3であり得るが、それらに限定されない。
【００４７】
ある特定の実施形態では、本発明は、そのような処置を必要とする対象、例えば疾患若しくは障害を有するか、疾患若しくは障害を有するリスクがあるか、又は疾患若しくは障害についてスクリーニング/検査を受ける対象の、目的の細胞、組織、又は構造を画像化するための前述の化合物の使用を提供する。そのような方法によれば、対象は、有効量の少なくとも1つの第1の標的指向性分子及び検出可能な標識を投与される。関係する実施形態では、前記対象は、前述の通り、第2の標的指向性分子、及びキレーター化合物をさらに投与され得る。前記方法は、例えば、対象における腫瘍、感染症、変性状態等を診断するために使用され得る。ある特定の実施形態では、前記方法は、疾患の拡大、例えば、臓器又は構造(例えば、骨)における腫瘍転移又は浸潤の存在又は非存在を決定するために使用され得る。
【００４８】
5.1.2.活性剤の送達
ある特定の非限定的な実施形態では、対象は、治療有効量の本発明の標的薬物送達化合物が提供される。ある特定の実施形態では、本発明は、それらに限定されるものではないが、がん、うっ血性心不全、糖尿病、喘息、肺気腫、梗塞、虚血、動脈硬化症、毒性、精神疾患、うつ病又は不整脈などの疾患を処置する方法を提供する。当業者は、活性剤の標的を疾患状態の細胞に絞るのに適したバイオマーカーを選択することができる。
【００４９】
したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、対象の疾患若しくは障害、又は対象の、目的の細胞、組織若しくは構造を処置するための前述の化合物の使用であって、対象に、有効量の少なくとも1つの第1の標的指向性分子及び検出可能な標識を投与することを含む、使用を提供する。関係する実施形態では、前記対象は、前述の通り、第2の標的指向性分子及びキレーター化合物をさらに投与され得る。
【００５０】
ある特定の非限定的な実施形態では、対象には、任意のヒト又は非ヒト動物が含まれる。ある特定の非限定的な実施形態では、対象は、小児患者である。ある特定の非限定的な実施形態では、対象は、成人患者である。ある特定の非限定的な実施形態では、非ヒト動物には、すべての脊椎動物、例えば哺乳動物及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、げっ歯類、ウサギ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等が含まれるが、それらに限定されない。
【００５１】
ある特定の非限定的な実施形態では、標的分子画像化化合物は、それらに限定されるものではないが、注射(例えば、静脈内、皮下、腹腔内)、注入、吸入、経口、局所、非経口、経皮的、直腸内によって、又は埋込み型リザーバーを介して投与され得る。
【００５２】
5.1.3.分子画像化
ある特定の非限定的な実施形態では、対象は、標的分子画像化化合物を投与された後に画像化される。ある特定の非限定的な実施形態では、画像化は、陽電子放出断層撮影(PET)、単一光子放射型コンピュータ断層撮影法(SPECT)、平面ガンマカメラ、X線CT、平面X線、磁気共鳴画像法(MRI)、光学撮像装置、又は他の画像診断技術によって実施され得る。
【００５３】
ある特定の非限定的な実施形態では、対象には、任意のヒト又は非ヒト動物が含まれる。ある特定の非限定的な実施形態では、対象は、小児患者である。ある特定の非限定的な実施形態では、対象は、成人患者である。ある特定の非限定的な実施形態では、非ヒト動物には、すべての脊椎動物、例えば哺乳動物及び非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、げっ歯類、ウサギ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等が含まれるが、それらに限定されない。
【００５４】
標的分子画像化化合物は、標的薬物送達化合物について開示される経路と同じ経路によって投与され得る。
【００５５】
5.2 標的分子画像化化合物及び/又は薬物送達化合物を作成するためのキレーター及び方法
本発明は、標的分子画像化化合物及び/又は標的薬物送達化合物を提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、少なくとも1つのバイオマーカー(例えば、細胞上の)とそれぞれ相互作用する2つの構成成分又は標的指向性分子を提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、標的分子画像化化合物及び/又は標的薬物送達化合物の様々な部分に結合させるために使用することができる。例えば、キレーターは、様々な標的指向性分子を一緒に結合させることができる(例として図2を参照されたい)。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、検出可能な標識、色素分子、及び/又は活性剤を、少なくとも1つの標的指向性分子に結合させることもできる。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、検出可能な標識、色素分子、及び/又は活性剤を、少なくとも2つの標的指向性分子に結合させることもできる。
【００５６】
ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、1つの標的指向性分子に結合することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、2つの標的指向性分子に結合することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、同じ標的指向性分子の2つ以上に結合することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、2つ以上のタイプの標的指向性分子に結合することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、2つのタイプの標的指向性分子に結合することができる。
【００５７】
ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、モノマーのための1つの標的指向性分子(例えば、第1又は第2の標的指向性分子のいずれか)に結合することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、ホモ二量体のための同じ標的指向性分子の2つ(例えば、第1の標的指向性分子の2つ又は第2の標的指向性分子の2つのいずれか)に結合することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、ヘテロ二量体のための2つの異なる標的指向性分子(例えば、第1及び第2の標的指向性分子)に結合することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、マルチモダリティのための1つの標的指向性分子(例えば、第1又は第2の標的指向性分子のいずれか)及び1つの色素分子に結合することができる。
【００５８】
ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、スペーサーによって標的指向性分子の1つ以上に結合することができる。ある特定の非限定的な例では、スペーサーは、ポリマー又は生体分子であり得る。ある特定の非限定的な実施形態では、ポリマーは、合成又は天然であり得る。ある特定の非限定的な例では、ポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)であり得る。例えば、ポリマーは、約5〜40Daの間、約40Da、約100Daまで、約200Daまで、約300Daまで、約400Daまで、約1,000Daまで、約10,000Daまで、約25,000Daまで、約30,000Daまで、約35,000Daまで、若しくは約40,000Daまで、又はさらなる例では、約40Da〜約100,000Da、約40Da〜約5,000Da、約40Da〜約10,000Da、約40Da〜約25,000Da、約1,000Da〜約25,000Da、約200Da〜約100,000Da、約10,000Da〜約100,000Da、約25,000〜約100,000Da、若しくは約25,000Da〜約50,000Daの分子量を有することができる。さらなる例では、ポリマーは、ポリアクリル酸;ヒドロキシエチルデンプン(HES);ポリラクチド-co-グリコリド;ポリ-D,L-p-ジオキサノンポリ乳酸-エチレングリコールブロックコポリマー(PLA-DX-PEG);ポリ(オルト)エステル;ポリ-グルタメート;ポリアスパルテート;α-β-不飽和モノマー、例えば(メタ)アクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、無水マレイン酸、フマル酸、イタコン酸又は無水物等のポリマー;ビニルエーテル、ビニルエステル、ビニルアミンアミド、オレフィン、ジアリルジアルキルアンモニウムハロゲン化物、好ましくはビニルエーテルを含むコモノマー;ポリ(ジエチレングリコールアジペート(diethylenglycoladipat));ポリエチレンイミン;ポリグリコリド;ポリ尿素;ポリリモネン(又はポリリモ);ポリ(2-メチル-1,3-プロピレンアジペート);グラフトポリマー;他のポリマーとのグラフト(ブロック)ポリマーであり得る。ある特定の非限定的な実施形態では、ポリマーは、直鎖、分岐、又は樹状(dendrimic)である。
【００５９】
ある特定の非限定的な実施形態では、ポリマーは、PEGである。ある特定の非限定的な実施形態では、PEGスペーサーは、約44Da〜20kDaの分子量を有することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、PEGスペーサーは、非PEG部分及び/又は非PEGモノマーを含み得る。
【００６０】
ある特定の非限定的な実施形態では、スペーサーは、約2〜約30個のモノマーを含み得る。ある特定の非限定的な実施形態では、スペーサーは、約2〜約20個、約2〜約10個、約4〜約10個、約4〜約9個、約4〜約8個、約4〜約7個、約4〜約6個、又は約4〜約5個のモノマーを含み得る。ある特定の非限定的な実施形態では、スペーサーは、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、少なくとも55個、少なくとも26個、少なくとも27個、少なくとも28個、少なくとも29個、又は少なくとも30個のモノマーを含み得る。ある特定の非限定的な実施形態では、スペーサーは、約2個、約3個、約4個、約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19個、約20個、約21個、約22個、約23個、約24個、約25個、約26個、約27個、約28個、約29個、又は約30個のモノマーを含み得る。
【００６１】
ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、一般式Iを有する多官能性(mutlifunctional)キレーターを含み、
【化１】
2019522625.tif 000004
式中、キレートコア基は、NOTA、NETA、CB-TE2A、CB-TE1A1P、TETA、Pycu2A、DiAmSar、DOTA、DTPA、PCTA、DFO等から選択される。
【００６２】
【化２】
2019522625.tif 000005
【００６３】
ある特定の実施形態では、キレートコアは、ある特定の金属イオンに配位し、安定なキレートを形成することができる基である。キレートコアは、放射性金属を錯化するために非常に重要な基である。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、放射性同位体、例えば64Cu、68Ga、Al18F等と配位することができるキレートコアに加えて、アミド結合接続のためのカルボン酸又は活性なエステル基、及びアジド-アルキンベースのクリックケミストリーに適したアジド基を組み合わせる。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、1,4,7-トリアザシクロネノナン(TACN)ベースのキレーターを含む。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン(シクレン(cyclen))ベースのキレーターを含む。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、1,4,8,11-テトラアザビシクロ[6.6.2]ヘキサデカンベースのキレーターを含む。ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、NOTA、DOTA、L-NETA、N3-NOtB2又はN3-DOtB3を含む。実施例1及び2は、本発明による試料合成スキームを提供する。
【００６４】
【化３】
2019522625.tif 000006
【００６５】
開示されるキレーターは、金属キレートコアに加えて、それぞれ、補助アミド形成によって第1の標的指向性分子に結合し、クリックケミストリーによって第2の標的指向性分子(又は検出可能な標識、又は活性剤)に結合するための、カルボン酸基及びアジド基の2つのバイオ直交型（bioorthogonal）官能基を含有することができる。官能基を1つだけ含有する他の分子キレーターと比較して、新しく開発されたこれらの二官能性キレーター(BFC)には、いくつかの利点があることが実証された。第1に、キレーター及びスペーサーの両方として働くBFCの使用により、合成戦略がより簡潔になり得、したがって、大規模な保護及び/又は脱保護及び/又は多官能性スペーサーの調製が不要になる。第2に、反応(SPPS及びクリック反応)は、ほぼ定量的な収率で容易に完了し得るので、条件の最適化が不要になり、それによって調製しやすさが促進される。SPPS及びクリック反応を最大限利用することによって、1つのクロマトグラフィー精製ステップだけを使用して、純粋な画像化プローブを得ることが可能になる。最後に、このことは、本明細書で例示されるものに限定されないが、目的とする任意のリガンド、色素及び他の官能性部分を含有する多価及びマルチモーダル画像化プローブを調製するために適用することができる、普遍的で確固たるプラットフォームである。
【００６６】
ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、PPh3などの一般に使用される還元剤を使用してアジドをアミド基に還元することによって、固相ペプチド合成(SPPS)に使用するのに適するように修飾され得る。SPPSは、カルボン酸とアミノ基の反応を形成するアミドに基づく。アジドの還元によって、その後のアミノ酸コンジュゲーションのためのアミノ基が提供される。したがって、キレーターは、アミノ基と共にSPPSシステムに対して適合性がある。ある特定の非限定的な実施形態では、アジド基からアミド基に樹脂上で還元した後、自動ペプチド合成を使用して、合成過程を簡素化することができる。自動ペプチド合成は、SPPSと同じ原理で作用し、それによって時間と労力が節約され得る。
【００６７】
ある特定の非限定的な実施形態では、キレーターは、アジド基及びカルボン酸又はエステル基の両方を有する活性なペンダントアームを、求核置換反応によってキレートコアにコンジュゲートすることによって、合成することができる。
【００６８】
ある特定の非限定的な実施形態では、検出可能な標識は、キレーターを放射性核種と共にインキュベートすることによって結合させることができる。ある特定の非限定的な実施形態では、第2の検出可能な標識は、クリックケミストリー、エステル化反応、アミド化反応、又は別のコンジュゲート反応を介してキレーターを色素と反応させることによって結合させることができる。
【００６９】
ある特定の非限定的な実施形態では、活性剤は、クリックケミストリー、エステル化反応、アミド化反応、又は別のコンジュゲート反応を介してキレーターを活性剤と反応させることによって付加することができる。
【００７０】
5.2.多量体の標的指向性分子間のスペーサーの長さを最適化するためのハイスループットスクリーニングプラットフォーム
ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、画像化化合物及び/又は標的薬物送達化合物の標的指向性分子間のスペーサーの長さを最適化するためのインビトロハイスループットスクリーニングプラットフォームを提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、インビトロハイスループットスクリーニングプラットフォームは、試験ごとにnM範囲の標的指向性分子だけを利用する高感度アッセイである。より少ない標的指向性分子を使用することによって、スクリーニングアッセイの費用を抑えることができる。ある特定の非限定的な実施形態では、本発明は、1つ〜2つのステップだけを伴う反応を提供する。図3は、本発明のインビトロハイスループットスクリーニングアッセイの非限定的な例である。
【００７１】
ある特定の非限定的な実施形態では、方法は、スペーサーの長さを最適化するために、クリックケミストリー及び放射化学を組み合わせる。ある特定の非限定的な実施形態では、細胞は、標的分子画像化化合物及び/又は標的薬物送達化合物をその場で形成することによって、スクリーニングプラットフォームとして使用することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、標的分子画像化化合物及び/又は標的薬物送達化合物の標的指向性分子は、光子発生源によって活性化されたら感光性(photoliable)官能基に結合する、非活性化感光性官能基(すなわち、光誘発可能な官能基)又は反応性官能基で別個に官能化され得る。
【００７２】
ある特定の非限定的な実施形態では、ハイスループットスクリーニングプラットフォームは、細胞を第1の官能化された標的指向性分子及び第2の官能化された標的指向性分子に曝露することを含み、第1の官能化された標的指向性分子及び/又は第2の官能化された標的指向性分子のいずれかは、標的指向性分子と反応性官能基の間に異なる長さのスペーサーを含む。ある特定の非限定的な実施形態では、第1の官能化された標的指向性分子又は第2の官能化された標的指向性分子のいずれかは、標的指向性分子と反応性官能基の間に一定の長さのスペーサーを含む。
【００７３】
ある特定の非限定的な実施形態では、細胞は、2つの標的指向性分子を、それらのそれぞれのスペーサーによって連結可能にする非活性化感光性官能基を活性化するために、光子エネルギーに曝露される。ある特定の非限定的な実施形態では、アッセイは、結合していない活性化感光性官能基に結合することができる過剰の放射性金属で標識されたキレーターを用いてクエンチすることができる。ある特定の非限定的な実施形態では、結合した放射性金属で標識されたキレーターの量は、測定することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、測定された放射活性の低下は、スペーサーの長さが適切であるか、又は最適化されていることを示す。
【００７４】
ある特定の非限定的な実施形態では、第1の官能化された標的指向性分子は、感光性官能基を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、感光性官能基は、光OIDBO又は光テトラゾールであり得るが、そられに限定されない。
【００７５】
ある特定の非限定的な実施形態では、第2の官能化された標的指向性分子は、感光性官能基が光子エネルギーに曝露されたら感光性官能基だけに結合する、反応性官能基を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、第2の官能化された標的指向性分子の反応性官能基は、アジド又はアルケンであり得るが、それらに限定されない。
【００７６】
5.2.1.多価化合物の調製
ある特定の非限定的な実施形態では、第1の官能化された標的指向性分子は、様々なモノマー長のスペーサー(例えば、PEG)を含む、非活性化感光性官能基-(モノマー)n-標的指向性分子(図3においてp-ODIBOと例示される)である。ある特定の非限定的な実施形態では、スペーサーは、約2〜約30個のモノマー(先に論じた通り)を含み得る。例えば、nは、2個、4個、6個、8個、10個、12個、14個、16個、18個、20個、又は30個のモノマーに等価であり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、非活性化感光性官能基-(モノマー)n-標的指向性分子は、Boc-(モノマー)n-NHSを、目的の標的指向性分子に付加し、その後Boc脱保護することによって、NH2-(モノマー)n-標的指向性分子を最初に形成することによって調製され得る。例えば、Boc-(モノマー)n-NHSを、適切な緩衝液(例えば、リン酸緩衝食塩水(PBS))中で標的指向性分子と組み合わせ、その後トリフルオロ酢酸(TFA)(例えば、95%)で脱保護することができる。次に、調製されたNH2-(モノマー)n-標的指向性分子を、非活性化感光性官能基-NHSと混合して、非活性化感光性官能基-(モノマー)n-標的指向性分子を生成することができる。
【００７７】
ある特定の非限定的な実施形態では、第2の官能化された標的指向性分子は、ある一定のモノマー長を有するスペーサーを含む、反応性官能基-スペーサー-標的指向性分子(図3においてN3と例示される)である。ある特定の非限定的な実施形態では、スペーサーは、約2〜約30個のモノマー(先に論じた通り)を含み得る。例えば、スペーサーは、4個又は8個のモノマーであり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、官能化された反応性標的指向性分子は、標的指向性分子及び反応性官能基-スペーサー-NHSを、適切な緩衝液(例えば、PBS)中で混合することによって調製され得る。
【００７８】
ある特定の非限定的な実施形態では、官能化された反応性標的指向性分子は、官能化された感光性標的指向性分子とは異なる長さのスペーサーを含む。非限定的な一例として、官能化された反応性標的指向性分子の方が調製しやすい場合があるので、官能化された感光性標的指向性分子の代わりに官能化された反応性標的指向性分子を使用してスペーサーの長さを試験することが、より好都合となり得る。
【００７９】
例として、官能化された感光性標的指向性分子は、光ODIBO-PEGn-RGDペプチド(例えば、n=2、4、6、8、10、12、14、16、18、20)であり得るが、それらに限定されない。また、例として、官能化された反応性標的指向性分子は、N3-PEGn-AE105及び/又はN3-PEGn-NGRペプチドであり得るが、それらに限定されない。
【００８０】
5.2.2.インビトロハイスループットアッセイ
ある特定の非限定的な実施形態では、反応性官能基-スペーサー-標的指向性分子は、非活性化感光性官能基-(モノマー)n-標的指向性分子と特定のモノマー長を有するスペーサーの一組と混合され得る。例えば、そのような実施形態では、各スペーサーの長さの組合せの1つの混合物が存在してもよい。ある特定の非限定的な実施形態では、非活性化感光性官能基-スペーサー-標的指向性分子は、反応性官能基-(モノマー)n-標的指向性分子と特定のモノマー長を有するスペーサーの一組と混合され得る。ある特定の非限定的な実施形態では、官能化された反応性標的指向性分子及び非活性化官能化された感光性標的指向性分子を、約1:1モル比で混合して、混合された標的指向性分子の原液を調製することができる。この比は、2つの標的受容体の密度に応じて調整され得る。ある特定の非限定的な実施形態では、各反応混合物は、それぞれ1つの特定のスペーサーの長さを有する官能化された標的指向性分子を含む。
【００８１】
ある特定の非限定的な実施形態では、混合された標的指向性分子の原液の1つを、目的のバイオマーカーを含む細胞に添加することができる。大過剰の標的指向性分子が存在することが望ましい。ある特定の非限定的な実施形態では、標的指向性分子が標的バイオマーカーに結合した後、結合していない標的指向性分子は、(例えば、適切な緩衝液を使用して)洗い流される。
【００８２】
ある特定の非限定的な実施形態では、細胞は、例えば、約1分〜1時間の間(両端を含む)、すなわち、官能化された標的指向性分子上の非活性化感光性官能基を、活性化感光性官能基に変換するのに有効な時間、(それらに限定されるものではないが、レーザー及び/又は他の光源を含む)光子エネルギーに曝露される。
【００８３】
ある特定の非限定的な実施形態では、活性化感光性官能基に結合する放射標識された反応性官能基が、細胞に添加される。ある特定の非限定的な実施形態では、細胞は、放射標識された反応性官能基を添加する2〜4時間前にインキュベートされる。ある特定の実施形態では、放射標識された官能基は、N3-放射性元素-キレーター(例えば、N3-(64Cu)NOTA)であってよく、非限定的な実施形態では、光照射の2〜4時間後に添加して、2つの異なる標的指向性分子間のクリック反応に十分な時間を設けることができる。このN3-放射性元素-キレーターを添加する目的は、2つの異なる標的指向性分子間のクリック反応の程度を測定するために、未反応の感光性官能基の量を検出することである。ある特定の非限定的な実施形態では、放射標識された反応性官能基は、バイオマーカーには結合するが、官能化された標的指向性分子の反応基には結合しなかった「過剰」の活性化感光性基に結合する。
【００８４】
ある特定の非限定的な実施形態では、細胞は、当業者に公知の方法によって放射活性レベルを検出する前に、過剰の放射標識された反応基を除去するために、適切な緩衝液で洗浄される。ある特定の非限定的な実施形態では、最少「過剰」の放射標識された反応基を含有する、最少放射線計数を有する官能化された標的指向性分子の組合せは、対応するスペーサーが、適切な又は最適な長さのものであることを示す。
【００８５】
例として、限定されるものではないが、反応性官能基-スペーサー-標的指向性分子(例えば、N3-PEG4-AE105)を、1つ以上(例えば、約10)の非活性化感光性官能基-(モノマー)n-標的指向性分子(例えば、光ODIBO-PEGn-RGDペプチド、n=2、4、6、8、10、12、14、16、18、20)と1:1モル比で混合して、1つ以上(例えば、約10)の混合された標的指向性分子の原液を調製することができる。混合された標的指向性分子の原液のそれぞれは、細胞を予め播種した細胞培養ウェルを分離するために添加することができ、細胞は、(例えば、結合平衡が達成されるまで)混合された標的指向性分子と共にインキュベートされ得る。ある特定の実施形態では、細胞は、24、48、96、384、又は1536ウェルプレートに予め播種される。細胞は、混合された標的指向性分子と共にインキュベートされた後、結合していない標的指向性分子を除去するために、適切な緩衝液(例えば、PBS)で洗浄され得る。次に、細胞を光子エネルギー(例えば、UVランプ(365nm))に曝露して、感光性官能基(例えば、アジド-活性「ODIBO」を作成するための)を活性化し、その後、反応基と、細胞上のバイオマーカーに結合した活性化感光性基(例えば、N3-PEGn-AE105及びODIBO-PEGn-RGD)との間の連結を誘発することができる。2つの標的指向性分子を結合させるためのインキュベーション後(例えば、2〜4時間)、放射標識化反応基(例えば、N3-(64Cu)NOTA)を細胞に添加することができ、それによって、官能化された標的指向性分子の反応基に結合していない活性化感光性基に結合する。結合していない放射標識化反応基は、洗い流すことができ、細胞プレートは、プレートリーダー(例えば、ハイスループットMicroBeta2プレートカウンター)で読み取るために処理して、放射標識化反応基を測定することができる。
【００８６】
5.2.3.細胞株
ある特定の実施形態では、この方法は、それらに限定されるものではないが、当技術分野で公知の初代細胞培養、組織外植片、又は形質転換細胞培養を含めた様々な細胞培養を使用して適用され得る。このような細胞培養の非限定的な例として、以下が挙げられる。初代-hBM SC、初代-h皮膚FB、初代ウシCC、初代ラットBMSC、初代-h CC、MC3T3-E1、初代-hUVEC、初代ウサギCC、NIH 3T3、初代CC、初代ラット肝臓Hep、初代-h皮膚ケラチノサイト、MG63、HEP-G2、L929、初代BM SC、初代ウサギBM SC、初代ブタCC、初代-h骨OB、MCF-7、初代ラット心臓CM、初代-h包皮FB、初代-h脂肪SC、初代-hFB、初代-h脂肪SC、初代FB、初代ラット大動脈SMC、初代骨、初代イヌCC、3T3(非特異的)、C2C12、MDA-MB-231、SaOS-2、初代マウスBM SC、初代ラットCC、初代-h中胚葉Mes Pre C、初代ラット脳神経細胞性、PC12、初代がん性、初代-h皮膚EC、初代ラットBM OB、初代マウス胚SC、MCF-10A、初代-h骨OB様、初代ヤギBMSC、初代-h大動脈SMC、MDCK(メイディン-ダービーイヌ腎臓)、初代-hi D線維輪C、初代ラット骨OB、初代-h脂肪前脂肪細胞、初代SC、初代ラット骨格筋筋芽細胞、初代心臓CM、初代ウシ大動脈EC、初代イヌBM SC、初代ヒツジBM SC、初代ヒツジCC、初代ブタBMSC、初代ウシBMSC、初代-h膀胱SMC、初代ブタ大動脈EC、初代-h角膜Epi C、初代-h大動脈EC、初代-h角膜FB、初代ブタ大動脈SMC、初代マウス肝臓Hep、A549、初代骨OB、初代-h膀胱Uro、初代-h UV SMC、Swiss 3T3、初代肝臓Hep、初代-h靱帯(Lig)FB、初代-h冠動脈SMC、初代OB様、初代-h歯Mes Pre C、HT1080、初代ラット心臓FB、初代ブタHV間質(Intersticial)C、C3A、初代-h乳がん性、初代-h包皮ケラチノサイト、初代-h口腔粘膜ケラチノサイト、初代マウス卵巣卵母細胞、初代-h Vase SMC、3T3-L1、初代-h肺FB、初代ニワトリ神経節神経細胞性、初代-h U CStC、初代ウシ大動脈SMC、初代マウス胚FB、初代-h気管支EpiC、CHO-K1、初代-h肝臓Hep、初代-hSaphVEC、初代-h歯PDL、初代ラット皮膚FB、初代ブタ肝臓Hep、PC-3、初代SMC、初代-hMVEC、初代マウスFB、初代-h鼻軟骨細胞、初代-h角膜ケラチノサイト、初代-h卵巣がん性、初代-h U CBSC、初代ラット心臓EC、初代Vasc、初代マウス皮膚FB、初代-h腱TC、初代ラット脳アストロサイト、初代ラット神経SC、Ha CaT、初代-h歯肉FB、初代神経性、初代ウシ骨OB、初代ラット脂肪SC、初代マウス骨OB、初代-h歯PC、初代-h血液単核、初代ラット海馬神経細胞性、D3、HeLa、HEK293、C17.2、初代-h皮膚メラニン細胞、初代-h血液EC様、HOSTE85、初代-h UC SC様、初代-h角膜SC、初代ラット大動脈EC、初代-h Saph VSMC、初代-h UCBEC、初代マウス心臓CM、D10RL UVA、初代-h冠動脈EC、初代-h大動脈Myo FB、HT-29、初代-h腱FB、RAW 264、初代ラット歯髄SC、3T3-J2、H1、初代ブタ歯、初代ラット坐骨シュワン、初代ウサギ骨OB様、初代ヒツジ大動脈EC、初代ウサギ角膜Epi C、初代-h卵巣Epi C、初代ウサギ耳軟骨細胞、SH-SY5Y、初代-h歯FB、初代-h口腔粘膜FB、初代ウサギFB、C6、初代ラット精巣セルトリ(Stertoli)、初代ウシ動脈EC、初代ブタHVEC、初代ウシ髄核細胞、初代ラット神経節神経細胞性、初代イヌ膀胱SMC、初代Vasc SMC、129/SV、初代ブタ耳軟骨細胞、ED27、初代ウサギ骨B、初代-h脳神経膠芽細胞、初代ラット脂肪前脂肪細胞、初代-h軟骨滑膜、初代ラット膵臓インスリン、初代-hEC、初代ヒツジ大動脈SMC、初代-h子宮内膜EpiC、U251、初代-h子宮内膜StC、初代ブタ膀胱SMC、初代-h HV間質(Iintersticial)C、初代ブタ食道SMC、初代-h NP神経細胞性、初代��サギ大動脈SMC、初代-h NSC、初代ウサギ角膜FB、初代-h ralがん性、初代ウサギ靱帯FB、初代-h SC、初代ラットBMOB様、初代-h骨格筋筋芽細胞、COS-7、C-28/12、HK-2、初代-h子宮がん性、初代ラット心室CM、初代-h Vase EC、初代ヒツジ頸動脈SMC、HCT-116、ROS 17/2.8、初代-h声帯FB、UMR-106、初代マウス大動脈SMC、H9、R1、初代ラット胎仔神経細胞性、初代ニワトリ耳EpiC、Huh7、初代ラットVasc SMC、初代-h NP SC、ES-D3、IMR-90、初代ラット膀胱SMC、293T、初代-h包皮血管EC、初代-h胎盤EC、初代-h肺EpiC、初代-h前立腺EpiC、U-87MG、初代イヌ頸動脈SMC、初代ウサギ角膜StC、初代イヌID線維輪、初代ニワトリ胚軟骨細胞、初代EC、HFF、Vero、HFL-1、初代-h脂肪FB、初代ウシFB、初代-h UTSMC、初代ラット心室FB、AH 927、初代ヒツジVasc FB、DU-145、ST2、B16.F10、初代-h鼻EpiC、初代ID線維輪C、初代-h歯髄SC、3H10T1/2、初代心臓弁、初代-h骨肺胞、初代ウサギ腱FB、初代マウス腎臓インスリン、HEPM、初代ヒヒ大動脈SMC、HTK、初代マウスMDSC、初代ラット食道EpiC、初代マウス神経SC、初代-h胎児OB様、初代マウス骨格筋SC、hFOB 1.19、初代神経シュワン、初代-h神経節神経細胞性、Caco-2、初代-h腎臓(Kidney)腎臓(Renal)、初代-h胸部EpiC、初代-h肝臓SC、初代ブタ膀胱Uro、初代-h肺EC、初代-h胸部FB、初代ヒツジ頸静脈EC、初代ブタ食道EpiC、初代-hリンパEC、初代ニワトリCC、初代-hリンパT細胞、初代-h結腸腺癌、初代-h乳房EC、初代ブタ声帯FB、初代-h乳房EpiC、初代ウサギ脂肪SC、初代-h角膜EC、H9c2、初代-h UT StC、初代ネコ心臓CM、初代マウス膵臓EpiC、HS-5、初代ヒツジ骨格筋胎児筋芽細胞、初代ウシID、初代マウスBM OCpre、初代ウシ膝メニスカスC、Hep-3B、初代ウシ靱帯FB、HL-1、HuS-E/2、RWPE1、初代ウシ網膜EpiC、初代-hVascMyoFB、IEC-6、初代マウス胎仔Hep、HS68、OVCAR-3、初代イヌ膝メニスカスC、初代ウサギ中胚葉Mes PreC、初代イヌ靱帯FB、初代ラット肺胞、初代イヌ皮膚ケラチノサイト、CRL-11372、初代イヌVase SMC、HMEC-1、初代胚SC、T-47D1、初代(Pimary)-ヤギCC、初代-h UVSC様、初代モルモット耳EpiC、初代靱帯、初代モルモット皮膚FB、初代マウス皮質神経細胞性、初代-h脂肪脂肪細胞、初代マウス肝臓SC、初代-h脂肪FB様、CAL72、J774、P19、初代-h羊水、初代ウサギ角膜EC、初代-h羊水FSC、初代ラットBMFB様、ARPE-19、初代ラット腎臓糸球体間質性、K-562、初代ラット鼻神経鞘、初代-h膀胱StC、初代ニワトリ胚前心外膜(Proepicardium)、ATDC5、初代ヒツジFB、Kasumi-1、初代骨格筋、初代-h骨Mes PreC、HMT-3522、初代-h骨膜性、A431、初代-h脳EC、初代-h UTFB、KLE、143b OST、BALB/3T3、初代-h Vasc FB、LLC-PKI、初代-h Vasc周皮細胞、BHK21-C13、初代乳房EpiC、M.DUNNI、C4-2B、ZR-75、HEC-1B、初代-h歯肉ケラチノサイト、U178、初代-h HNがん性、初代マウス乳房EpiC、初代-hケラチノサイト、初代マウス坐骨Nシュワン、OVCA429、初代-h腎臓EpiC、初代ブタ食道FB、MBA-15、初代ブタ下顎骨FB様、初代-h肝臓がん性、初代ウサギ膀胱Uro、GD25betalA、初代ウサギID線維輪C、HSC-T6、初代ウサギNP神経細胞性、DOV13、HEY、初代-h乳房FB、HTB-94、BZR-T33、初代ニワトリ角膜FB、MiaPaCa2、初代ラット粘膜神経鞘、初代-h卵巣FB、初代ラット唾液腺腺房、初代-h卵巣卵母細胞、初代ラット精巣胚、初代-h膵臓がん性、初代ニワトリ胚StC、初代-h膵臓星状細胞、初代ヒツジ頸動脈FB、ML0-Y4、初代ニワトリ網膜SC様、初代-h前立腺がん性、初代ニワトリTen TC、初代-h Saph V Myo FB、初代滑膜細胞、MTLn3、初代Vasc EC、初代-h骨格筋Pre、RT4-D6P2T、C2、SCA-9、HOC-7、T31、初代-h UC EpiC、TR146、HCS-2/8、EA.hy926、初代ラット胚(Ebryo)、SW480、初代ヒツジ胎仔CC、初代イヌ膵臓インスリン、KS-IMM、BPH-1、初代ラット膵臓SC、M2139、RIN-5F、初代-h胆嚢がん性、E14/TG2a、M4E、HES3、G8、初代-h結膜FB、初代イヌSaphVEC、LN CaP、初代イヌSaph V SMC、M4T、初代-h胎児CC、BR-5、初代ブタUT Uro、初代海馬神経細胞性、PE-0041、初代イヌ皮膚FB、初代ウサギ骨格筋筋芽細胞、初代ウシ歯髄(Denta ipulp)、CGR8、初代イヌ歯PDL、初代ラット胎仔Hep、初代イヌ腱FB、初代ラット乳房性、初代-h膝C、初代ラットSMC、BRC6、初代ヒツジ動脈FB、初代イヌVasc EC、初代ウシ乳房肺胞、pZIP、293細胞株、BMC9、初代-h肺がん性、SKOV-3、IOSE、TEC3、MCF-12A、初代ウサギ膀胱EpiC、Gli36デルタEGFR、初代ウサギ結膜EpiC、初代-h肺神経細胞性、初代ウサギ子宮内膜EpiC、1205Lu、初代ウサギMDSC、3T3-A31、初代ウサギ腱細胞、MDA-MB-435、初代-hがん性、初代ウシEC、初代ラット角膜FB、初代EpiC、初代ラット胎仔心臓、初代-h髄膜くも膜性、COS-1、初代目、初代ラット肝臓Oval C、GLUTag-INS、初代ラット口腔粘膜ケラチノサイト、GM3348、CRFK、21NT、初代ラット精巣EC、初代-h鼻FB、初代-h硬膜SC、初代-h鼻OB、初代イヌNP神経細胞性、初代-h鼻分泌、初代ヒツジ肺FB、AC-1M59、BHPrE1、MIN6、初代UT、MKN28、RAT-2、MLO-A5、RT112、CRL-2266、S91、GM5387、SK-ChA-1、初代ウマCC、SPL201、初代ウマ腱FB、初代-h胎児Mes PreC、D283、初代ブタ甲状腺EpiC、H1299、Par-C10、AE-6、初代ウサギ血液血小板、初代ヤギ頸動脈EC、初代ウサギ骨OC、初代ヤギ頸動脈FB、初代ウシ角膜FB様、初代-h膵臓SC、初代ウサギCT周皮細胞、初代ヤギ頸動脈SMC、初代ウサギ食道SMC、初代-h耳下腺腺房、初代ヒヒ血液EC、A498、初代-h気管支SMC、初代-h胎盤SC、初代ウサギ括約筋SMC、初代ウシ網膜SC、7F2、MM-Sv/HP、A10、初代-h前立腺StC、初代水牛胚SC様、初代-h唾液腺がん性、CHO-4、初代-h唾液腺幹細胞(Salivary Salisphere)、初代ラット皮質神経細胞性、H13、初代ラット胚神経細胞性、初代モルモット膵臓EpiC、初代ラット胎仔OB、H144、CNE-2、MPC-11、21PT、初代ウシ滑膜、初代ラット肝臓EC、初代ウシ胎仔CC、BEAS-2B、H2122、LM2-4、Detroit 551、C18-4、FLC4、Ishikawa、初代ラット皮膚ケラチノサイト、H35、初代ラット腱、初代-h SMC、HTR8、初代-h滑液CC、E8.5、H460M、HL-60、MUM-2B、CRL-1213、MUM-2C、CRL-12424、W20-17、Lovo、初代イヌ血液EC、初代ヒツジ鼻CC、HAK-2、初代ヒツジ皮膚FB、初代-h精巣セルトリ、初代-h甲状腺がん性、初代気管、初代-h気管、LRM55、初代-h UASC様、初代結腸FB、初代-hUASMC、r-CHO、HAT-7、RN22、HC-11、初代-h目硝子体性、AEC2、S2-020、HCC1937、CRL-2020、AG1522、SCC-71、N18-RE-105、SK-N-AS、初代-h子宮SMC、SLMT-1、IMR-32、STO、NB4、Swan 71、初代-h肺胞骨膜(Perosteum)、初代イヌ口腔粘膜EpiC、初代-h羊膜EP、初代-h胎児シュワン、初代イヌ骨OB、初代ブタUTSMC、184A1、Panc 1、NCTC 2544、46C、初代ウシ角膜EC、B6-RPE07、初代ハムスターEC、cBAL111、初代ハムスター網膜神経細胞性、HEPA-1Clc7、NEB1、CCE、NHPrE1、初代ウサギ結膜FB、410、Hepa RG、初代ケラチノサイト、PMC42-LA、初代イヌ軟骨滑膜、21MT、NOR-P1、初代ウサギ子宮内膜StC、初代リンパ節リンパ球、DLD-1、初代リンパ節T細胞、初代ウサギ涙腺腺房、AB2.1、初代ウサギ肺細胞、初代サル胚、ES-2、初代サル腎臓FB様、初代ウサギ陰茎SMC、初代マウス脂肪StC、初代ウサギ皮膚FB、NR6、初代血液SC、初代マウスBMマクロファージ、786-0、AT2、初代ラット副腎クロム親和��、AT3、CCF-STTGI、初代マウス頭蓋冠骨、初代ラット膀胱Uro、HCT-8/E11、CE3、初代マウス脳神経細胞性、CFK2、初代マウス乳がん性、L6、初代マウス軟骨細胞、HeyA8、初代マウス結腸EpiC、初代ラット皮質アストロサイト、初代イヌCFB、初代水牛卵巣EpiC、初代イヌ角膜軟骨細胞、初代ラット胚CM、初代マウス胚神経細胞性、A2780、C5.18、初代イヌMV EpiC、初代マウス食道SC、初代ラット胎仔腎臓、HEK001、A357、EFO-27、初代ニワトリ骨OB、初代マウス胎仔肺、初代ラット心臓SC様、初代マウス胚、初代ラット腎臓、EN Stem-A(商標)、初代ラット涙腺腺房、U-251MG、初代イヌ筋線維芽細胞、A4-4、初代ラット肝臓SC様、初代ウシ脳EC、初代ラット肺FB、初代マウス腎臓(Kidney)腎臓(Renal)、BEL-7402、NT2、HIAE-101、初代-h BM単核、初代ラット卵巣、初代マウスリンパFB様、初代ラット膵臓島、初代イヌ食道EpiC、初代ラット腎臓EpiC、初代マウスMast、初代ニワトリ胚盤葉、NTera2/c1.D1、G-415、Null、初代ラット小腸、初代マウス卵丘C、初代ラット歯SC様、HEL-299、初代ラット腱細胞、KB、b-End-2、初代マウス膵臓インスリン、初代ラットVase EC、
初代マウス唾液腺幹細胞、初代-h十二指腸EpiC、初代-h骨胎児OB、初代呼吸器EpiC、初代マウス骨格筋筋芽細胞、初代ヒツジ羊水、OC2、初代ニワトリ心臓CM、Daudi、初代ヒツジ動脈MyoFB、初代マウス皮膚ケラチノサイト、初代ヒツジ骨OB様、初代マウス小腸、初代ニワトリ心臓ECM、初代マウス脾臓T細胞、LNZ308、初代マウス歯象牙芽細胞、初代ヒツジID線維輪、初代マウス精巣SC、初代ヒツジ頸静脈SMC、初代マウス精巣精子、初代ヒツジ肺SC、初代マウスUT Uro、初代ヒツジSaph VEC、初代マウス子宮EpiC、初代ヒツジ皮膚EC、OCT-1、初代ヒツジVasc EC、HELF、初代ヒツジVasc SMC、CAC2、HL-7720、OPC1、初代歯PDL、初代イヌ心臓SC、初代UCB単核、初代ブタ頸動脈EC、初代-h子宮内膜症CystStC、初代ブタ頸動脈SMC、初代結腸がん性、初代ブタ冠状動脈SMC、QCE-6、初代ブタ膀胱FB、R221A、OSCORT、LS180、B35、RIF-1、Calu-1、RL-65、Calu-3、初代ウシ副腎ChrC、B5/EGFP、RT-112、初代ブタEC、RW.4、初代ブタESC、S2-013、OVCAR-5、S5Y5、初代-h骨OC様、SA87、INT-407、SAV-I、初代ブタ胎仔Hep、SCC-68、P69、HNPSV-1、CaSki、SK-CO15、初代ブタIliac EC、SK-N-DZ、Hep2、SKOV31p.1、初代ブタ下顎骨エナメル芽細胞、SNB 19、初代ウシ関節滑液、初代-h胎児FB、初代ブタ下顎骨象牙芽細胞、SW1353、初代ブタNP神経細胞性、SW948、初代ブタ口腔粘膜EpiC、CRL-2102、初代ブタ膵臓島、T4-2、初代ブタ肺SMC、TE-85、初代ブタ唾液腺腺房、THP-1、初代ブタ滑膜SC、BME-UV1、KG-1、D4T、HUES-9、初代マウス海馬神経細胞性、ECV304、NRK、初代マウス腎臓糸球体間質性、D407、10T1/2細胞株、及び初代-h包皮メラニン細胞。
【００８７】
5.3.バイオマーカー
ある特定の非限定的な実施形態では、第1の標的指向性分子及び第2の標的指向性分子は、目的の生物学的対象の少なくとも1つのバイオマーカーを標的とする。ある特定の非限定的な実施形態では、第1及び第2の標的指向性分子は、目的の生物学的対象の同じ又は異なるバイオマーカーを標的とすることができる。ある特定の非限定的な実施形態では、第1及び第2の標的指向性分子が2つの異なるバイオマーカーを標的としている場合、バイオマーカーは、同じ細胞上に発現する。
【００８８】
ある特定の非限定的な実施形態では、1つのバイオマーカーを標的とする標的指向性分子が1つだけ存在する。
【００８９】
ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーは、細胞表面上又は内部に発現され得る。ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーは、細胞表面タンパク質、受容体、受容体サブユニット、組織特異的抗原、ウイルスから誘導されたタンパク質、ウイルスによってコードされたエンベロープタンパク質、細菌から誘導されたタンパク質、細胞表面タンパク質等であり得る。ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーは、インテグリンである。
【００９０】
ある特定の非限定的な実施形態では、生物学的対象は、タンパク質、ウイルス、細胞、組織、臓器又は生物である。ある特定の非限定的な実施形態では、細胞は、腫瘍、がん、又は疾患状態の細胞であり得るが、それらに限定されない。ある特定の非限定的な実施形態では、第1及び第2の標的指向性分子は、それらに限定されるものではないが、膵臓がん、乳がん、結腸直腸がん、NSCLC、肺がん、骨がん、皮膚がん、頭部若しくは頸部がん、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん(stomach cancer)、胃がん(gastric cancer)、結腸がん、乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓がん、尿管がん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、慢性白血病、急性白血病、リンパ球性リンパ腫、CNS新生物、脊髄軸がん、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌及び下垂体腺腫腫瘍、又は腫瘍転移などの細胞(腫瘍又はがんを含む)に結合する。ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーのレベルは、他の方法によって検出可能となるはずのレベルよりも低い。ある特定の非限定的な実施形態では、本発明の方法は、疾患(例えば、がん)の初期段階を検出することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、本発明の方法は、低レベルのバイオマーカーの存在を検出することができる。
【００９１】
ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーは、上皮増殖因子受容体(EGFR)、インテグリンα1β1、インテグリンα2β1、インテグリンα3β1、インテグリンα4β1、インテグリンα5β1、インテグリンα6β1、インテグリンαvβ3、uPAR、ガストリン放出ペプチド(GRP)、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5、葉酸受容体、CCR5、CXCR4、プレクチン-1、VEGF、CA19-9、PD-I1、Her2/neu、5-アルファレダクターゼ、α-フェトプロテイン、AM-1、APC、APRIL、BAGE、β-カテニン、Bc12、bcr-abl(b3a2)、CA 125、CASP-8/FLICE、カテプシン、CD13、CD19、CD20、CD21、CD23、CD22、CD38、CD33、CD35、CD40、CD44、CD45、CD46、CD5、CD52、CD55、CD59(791Tgp72)、CDC27、CDK4、CEA、c-myc、COX-2、サイトケラチン、DCC、DcR3、E6/E7、EGFR、EMBP、Ena78、エストロゲン受容体(ER)、FGF8b及びFGF8a、FLK 1/KDR、G250、GAGE-ファミリー、ガストリン17、ガストリン放出ホルモン(ボンベシン)、GD2/GD3/GM2、GnRH、GnTV、gp100/Pme117、gp-100-in4、gp15、gp75/TRP-1、hCG、ヘパラナーゼ、Her3、HMTV、Hsp70、hTERT(テロメラーゼ)、IGFR1、IL 13R、iNOS、Ki 67、KIAA0205、K-ras、H-ras、N-ras、KSA(CO17-1A)、LDLR-FUT、MAGEファミリー(MAGE1、MAGE3等)、マンマグロビン、MAP17、メラン-A/MART-1、メソテリン、MIC A/B、MT-MMP's、例えばMMP2、MMP3、MMP7、MMP9、Mox1、ムチン、例えばMUC-1、MUC-2、MUC-3、及びMUC-4、MUM-1、NY-ESO-1、オステオネクチン、p15、P170/MDR1、p53、p97/メラノトランスフェリン(melanotransferrin)、PAI-1、PDGF、プラスミノーゲン(uPA)、PRAME、プロバシン、プロゲニポイエチン、プロゲステロン受容体(PR)、PSA、PSM、RAGE-1、Rb、RCAS1、SART-1、SSX遺伝子ファミリー、STAT3、STn(ムチン関連)、TAG-72、TGF-α、TGF-β、チモシンβ-15、IFN-γ、TPA、TPI、TRP-2、チロシナーゼ、VEGF、ZAG、p16INK4、Myo D1、グルタチオン、又はS-トランスフェラーゼであり得る。ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーは、上皮増殖因子受容体(EGFR)、インテグリンαvβ3、uPAR、ガストリン放出ペプチド(GRP)、SSTR2、CCR5、インテグリンα4β1、VEGF、CA19-9、CD13、CD40、又はPD-L1であり得る。ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーは、uPAR及び/又はインテグリンαvβ3である。ある特定の非限定的な実施形態では、バイオマーカーは、CD13及び/又はインテグリンαvβ3である。
【００９２】
インテグリンは、細胞-細胞相互作用及び細胞-マトリックス相互作用を媒介し、遊走、増殖、血管新生、腫瘍浸潤、及び転移に寄与する細胞接着分子である。インテグリンανβ3は、曝露されたアルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)トリペプチド配列を有する細胞外マトリックスタンパク質の受容体として働く。重要なことに、インテグリンανβ3は、通常、大部分の成人上皮(epithelia)細胞において非常に低い(又は検出不可能な)レベルで発現するが、様々な腫瘍細胞において高度に上方制御される。近年の発現分析によって、高度なανβ3発現を有する患者が、ανβ3発現が少ない患者よりも著しく短い生存期間を示したことが実証された。腫瘍増殖、浸潤、及び転移中のその発現の制限は、急速に増殖する腫瘍及び転移性腫瘍の診断及び処置のための興味深い分子標的を示し、したがって、ανβ3は、本発明のバイオマーカーの1つの例である。
【００９３】
膜貫通プロテアーゼであるアミノペプチダーゼN(APN)/CD13は、別の重要なバイオマーカーである。CD13は、インテグリンανβ3と同様、やはり腫瘍の新生血管において上方制御されるが、正常な血管においてはほとんど発現せず、CD13の高度な発現は、黒色腫、前立腺、肺及び卵巣のがん、並びに膵臓がんを含めたいくつかのヒト固形腫瘍において観測された。NGR配列を含有するペプチドは、CD13との結合において高い効率/選択性を示している。したがって、CD13は、本発明による別のバイオマーカーの例を提供する。
【００９４】
臨床試験及び実験研究の両方によって、uPA/uPARの過剰発現が、悪性腫瘍における予後不良と強力に相関することが明らかになったので、uPARは、がん画像化のための別の重要なバイオマーカーである。さらに、uPARは、様々な悪性腫瘍において過剰発現されるが(普通、細胞1つ当たり数千の受容体を発現する)、正常な組織及び隣接する組織においては存在しないか、又はごくわずかに発現される。したがって、uPARは、本発明の別のバイオマーカーの例である。
【００９５】
ある特定の非限定的な実施形態では、インテグリンανβ3及びCD13(例えば、CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyKヘテロ二量体)を対象とする本発明の多価化合物は、がんの初期段階を検出するために使用することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、インテグリンανβ3及びCD13を対象とする本発明の多価化合物は、低レベルのインテグリンανβ3及び/又はCD13を検出するために使用することができる。
【００９６】
5.4.キット
本発明はさらに、本発明を実施するために使用することができるキットを提供する。例えば、それらに限定されるものではないが、本発明のキットは、少なくとも1つの画像化化合物及び/又は薬物送達化合物を含むことができる。ある特定の非限定的な実施形態では、本発明のキットは、場合により、分子画像化及び/又は標的薬物送達のためのキットの使用方法に関する使用説明書を含むことができる。ある特定の非限定的な実施形態では、キットは、シリンジ及び/又はカテーテル及び/又はイントロデューサーシースなどの投与デバイスをさらに含むことができる。
【００９７】
ある特定の非限定的な実施形態では、画像化化合物及び/又は薬物送達化合物は、検出可能な標識及び/又は活性剤と共に、モノマーを含む。ある特定の非限定的な実施形態では、画像化化合物及び/又は薬物送達化合物は、検出可能な標識及び/又は活性剤と共に、ホモ二量体を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、画像化化合物及び/又は薬物送達化合物は、検出可能な標識及び/又は活性剤と共に、ヘテロ二量体を含む。ある特定の非限定的な実施形態では、画像化化合物及び/又は薬物送達化合物は、色素分子と、検出可能な標識及び/又は活性剤と共に、標的指向性分子を含む。
【００９８】
本発明はさらに、画像化化合物及び/又は薬物送達化合物を製造するためのキットを提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、本発明のキットは、画像化化合物及び/又は薬物送達化合物に組み立てるための、第1の標的指向性分子(乾燥形態又は液体形態)及び/又は第2の標的指向性分子(乾燥形態又は液体形態)及び/又はキレーターを含有する。分子が乾燥形態で提供される場合、キットは、溶液又は組成物を作製するのに適した緩衝液又は溶媒を含有することができる。
【００９９】
本発明はさらに、画像化化合物及び/又は薬物送達化合物のスペーサーの最適な長さを決定するためのキットを提供する。ある特定の非限定的な実施形態では、本発明のキットは、ハイスループットスクリーニングプラットフォームのための、第1の標的指向性分子(乾燥形態又は液体形態)及び/又は第2の標的指向性分子(乾燥形態又は液体形態)及び/又は異なる長さのスペーサー及び/又は放射性金属で標識されたキレーターを含有する。ある特定の非限定的な実施形態では、キットは、ハイスループットアッセイを作製、実施するのに適した緩衝液又は溶媒を含有することができる。
【０１００】
以下の実施例は、本開示をより完全に例示するために提供されるが、本開示の範囲を制限するとみなされるべきではない。実施例に記載される方法及び材料は、本明細書において、本発明の詳細な説明に参照によって組み込まれる。
【実施例】
【０１０１】
6.実施例
[実施例1]
本発明の金属キレーターの合成
1,4,7-トリアザシクロネノナン(TACN)ベースのキレーター(N3-NOtB2)を、スキーム1に示される通り調製した。
【０１０２】
スキーム1:N3-NOtB2の合成
【０１０３】
【化４】
2019522625.tif 000007
【０１０４】
4-アミノ-2-ヒドロキシブタノエート(2)
MeCOCl(15mL)を、無水メタノール(100mL)に0℃で滴下添加した。得られた混合物を室温で1時間撹拌した。次に、出発材料(1)(10g、84mmol)を添加し、混合物を室温で2時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をエーテル(50mL)で処理して、濾過した後に、(2)(12.67g、88.5%)を白色固体として得た。TLC及びNMRによって、さらなる精製は必要ないことが示唆された。1H NMR (400 MHz, D2O) δ4.53 - 4.44 (m, 1H, -CH(COOH)-), 3.82 (s, 3H, -CH3), 3.27 - 3.11 (m, 2H, -CH2N3), 2.31 - 2.19 (m, 1H, -CH2CH2N3), 2.13 - 1.98 (m, 1H, -CH2CH2N3). 13C NMR (101 MHz, D2O) δ 175.16, 68.50, 52.89, 36.66, 30.42. ESI-MS: 実測値, m/z (M+H)+ =133.92, 計算値, (M+H)+=134.08.
【０１０５】
メチル4-アジド-2-ヒドロキシブタノエート(3)
イミダゾール-1-スルホニルアジド塩酸塩(2.5g、12mmol)を、MeOH(30mL)中、(2)(1.7g、5mmol)、K2CO3(3.2g、23mmol)、及びCuSO4.5H2O(30mg、100μmol)のスラリーに添加し、混合物を一晩撹拌した。混合物を濃縮し、H2O(100mL)で希釈し、濃HClで酸性にし、EtOAc(50×3mL)で抽出した。合わせた有機層を乾燥させ(MgSO4)、濾過し、濃縮して、粗製(3)(1.22g、76.6%)を無色液体として得た。粗製物を、さらなる精製なしに次のステップで使用した。NMRスペクトルのために、少量の粗製物をシリカゲルクロマトグラフィー(DCM/MeOH、10:1)によって精製して、純粋な(3)を無色液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.31 (dd, J = 7.6, 4.0 Hz, 1H, -CH(COOH)-), 3.83 (s, 3H, -CH3), 3.59 - 3.43 (m, 2H, -CH2N3), 2.93 (brs, 1H, -OH), 2.15 - 2.04 (m, 1H, -CH2CH2N3), 1.99 - 1.86 (m, 1H, -CH2CH2N3).13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 175.06, 67.60, 52.81, 47.18, 33.16.
【０１０６】
メチル4-アジド-2-(トシルオキシ)ブタノエート(4)
TsCl(2.7g、14mmol)を、(3)(1.5g、9.4mmol)及びTEA(3g、30mmol)のDCM(50mL)溶液に添加し、混合物を一晩室温で撹拌した。次に、混合物を水(30×2mL)で洗浄し、MgSO4で脱水し、濾過した。濾液の濃縮及びフラッシュクロマトグラフィー(EtOAc/ヘキサン、1:4)によって、(4)(2.37g、70.8%)を白色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.84 (d, J = 8.3 Hz, 2H, Ar-H), 7.38 (d, J = 8.1 Hz, 2H, Ar-H), 4.97 (dd, J = 7.6, 5.0 Hz, 1H, -CH(COOH)-), 3.72 - 3.68 (m, 3H, -CH3), 3.47 - 3.39 (m, 1H, -CH2CH2N3), 3.37 - 3.27 (m, -CH2CH2N3), 2.47 (s, 3H, Ar-CH3), 2.13 - 1.98 (m, 2H, -CH2N3). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 168.68, 145.46, 132.89, 129.88, 128.08, 74.36, 52.77, 46.36, 31.53, 21.69.
【０１０７】
ジ-tert-ブチル2,2'-(7-(4-アジド-1-メトキシ-1-オキソブタン-2-イル)-1,4,7-トリアゾナン-1,4-ジイル)ジアセテート(5)
MeCN(20mL)中、NO2A(tBu)(0.8g、2.24mmol)及びCs2CO3(1.1g、3.36mmol)のスラリーに、(4)(0.95g、2.67mmol)を添加し、混合物を50℃で1日加熱した。室温に冷却した後、混合物を濾過し、濃縮した。残留物を、シリカゲルクロマトグラフィー(DCM/MeOH、10:1)によって精製して、(5)(0.73g、65.2%)を黄色がかった液体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.73 - 3.60 (m, 3H, -OCH3), 3.58 - 3.44 (m, 2H, -CH2N3), 3.39 (s, 1H-NCH-), 3.28 (s, 4H, 2*-CH2CO-), 3.02 - 2.58 (m, 12H, 6*-NCH2-), 2.01 - 1.79 (m, 2H, -CH2CH2N3), 1.43 (s, 18H, 6*-CH3). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173.51, 171.54, 80.70, 63.83, 59.40, 56.11, 55.77, 53.31, 51.23, 48.52, 29.52, 28.21. ESI-MS: 実測値, m/z (M+H)+ =499.266, 計算値, (M+H)+=499.32. ESI-HRMS: 実測値, m/z (M+H)+ = 499.3239, 計算値, (M+H)+= 499.3239.
【０１０８】
4-アジド-2-(4,7-ビス(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1,4,7-トリアゾナン-1-イル)ブタン酸(N3-NOtB2、6)
(5)(100mg、0.2mmol)のピリジン(2mL)溶液に、LiI(134mg、1mmol)を添加し、混合物を室温で4時間撹拌した。混合物をDCM(20mL)で処理し、飽和クエン酸(10×2mL)及び水(20mL)で洗浄した。有機層をMgSO4で脱水し、濾過し、濃縮して、粗製(6)を得た。シリカゲルクロマトグラフィー(DCM/MeOH、20:3)で精製した後、純粋な(6)(50mg、51.5%)を白色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.72 (d, J = 7.1 Hz, 1H, -NCH(COOH)-), 3.70 - 3.41 (m, 6H, 2*-CH2CO- & - CH2N3), 3.43 - 2.75 (m, 12H, 6*-NCH2-), 2.36 - 2.21 (m, 1H, -CH2CH2N3), 1.91 (dd, J = 12.9, 5.2 Hz, 1H, -CH2CH2N3), 1.46 (s, 18H, 6*-CH3). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 172.17 (-COOH), 169.51 (2*-CO2C(CH3)3), 82.28 (-CO2C(CH3)3), 63.12 (-NCH(COOH)-), 56.35 (2*-NCH2CO2C(CH3)3), 50.79 (-N-CH2-), 49.80 (-N-CH2-), 49.16 (-N-CH2-), 49.04 (-CH2N3), 28.62 (-CH2CH2N3), 28.12 (6*-CH3). ESI-MS: 実測値, m/z (M+H)+ = 485.45, 計算値, (M+H)+= 485.31. ESI-HRMS: 実測値, m/z (M+H)+ = 485.3064, 計算値, (M+H)+ = 485.3082.
【０１０９】
N3-NOtB2を、全収率15%で合成した。
【０１１０】
[実施例2]
本発明の金属キレーターの合成
TACNベースのキレーター(N3-DOtB3)を、スキーム2に示される通り調製した。
【０１１１】
スキーム2.N3-DOtB3の合成。試薬:a)4、CsCO3、MeCN、b)LiI、ピリジン
【０１１２】
【化５】
2019522625.tif 000008
【０１１３】
トリ-tert-ブチル2,2',2''-(10-(4-アジド-1-メトキシ-1-オキソブタン-2-イル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7-トリイル)トリアセテート(S2)
MeCN(1mL)中、(S1)(DO3A(tBu))(51.4mg、0.1mmol)及びCs2CO3(49mg、0.15mmol)のスラリーに、(4)(38mg、0.12mmol)を添加し、混合物を50℃で1日振とうした。室温に冷却した後、混合物を濾過し、濃縮した。反応をLC-MSによってモニタリングした。シリカゲルクロマトグラフィー(DCM/MeOH、10:1)で精製した後、純粋な(S2)(30mg、38.4%)を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ3.70 - 3.18 (m, 10H, -CHCO- & -NCH2CO- & -OCH3), 3.04 - 2.07 (m, 16H -NCH2-), 1.97 - 1.81 (m, 2H, -CH2N), 1.71 - 1.63 (m, 2H, -CH2CH2N3), 1.48 - 1.45 (m, 27H, 9*-CH3). ESI-MS: 実測値, m/z (M+H)+ = 656.455, 計算値, (M+H)+= 656.435. ESI-HRMS: 実測値, m/z (M+H)+ = 656.4322, 計算値, (M+H)+= 656.4347.
【０１１４】
4-アジド-2-(4,7,10-トリス(2-(tert-ブトキシ)-2-オキソエチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル)ブタン酸(S3)
S2(10mg、0.015mmol)のピリジン(0.5mL)溶液に、LiI(10mg、0.075mmol)を添加し、混合物を室温で2時間振とうした。混合物をDCMで処理し、飽和クエン酸及び水で洗浄した。有機層をMgSO4で脱水し、濾過し、濃縮して、粗製(S3)を得た。シリカゲルクロマトグラフィー(DCM/MeOH、10:1)を適用して、純粋なS3(3mg、31.2%)を得た。1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 3.87 - 3.74 (m, 2H, -CH2CO-), 3.63 - 3.53 (m, 1H, -NCH(COOH)-), 3.46 - 3.33 (m, 4H, -CH2CO-), 3.08 - 1.98 (m, 18H, -NCH2- & -CH2N), 1.67- 1.56 (m, 2H, -CH2CH2N3), 1.51 - 1.46 (m, 27H, 9*-CH3). ESI-MS: 実測値, m/z (M+H)+ = 642.439, 計算値, (M+H)+= 642.419. ESI-HRMS: 実測値, m/z (M-H)- = 640.4046, 計算値, (M-H)-= 640.4034.
【０１１５】
N3-DOtB3を、全収率12%で合成した。
【０１１６】
[実施例3]
本発明のAE105-二量体の合成
TACNベースのキレーターを、実施例1に提示される通り調製した。次に、TACNベースのキレーターを、固相合成(SPS)によってAE105ペプチドに結合させた。特に、N3-NOtB2を、SPSによってペプチドAE105のN末端に高収率で結合させた。
【０１１７】
ペプチドを、標準SPSプロトコールを使用し、ペプチド合成機によって樹脂(樹脂-AE105*、樹脂-AE105-PEG8-NH2)上で調製した。化合物6(実施例1から)(3当量)を、DMF中、HATU(5当量)及びDIEA(10当量)と室温で2時間混合することによって、樹脂にカップリングさせた。次に、TFA/H2O/TIS/フェノール(90:5:2.5:2.5)及びHPLC精製を使用して樹脂支持体から切断した後、部分-A-NOTA-N3(7)を得た。
【０１１８】
ヘテロ二量体化合物、ホモ二量体化合物、及び二重モダリティ化合物を得るために、スキーム3に概説される通り、モノマー(AE105-NOTA-N3)を、Rinkアミド樹脂から切断し、次に歪み促進型アルキン-アジド環化付加(SPAAC)によって、BCN-官能化RGDyk(又はAE105又はシアニン(cynaine)色素Cy3若しくはCy5)に高い収率でコンジュゲートさせた。
【０１１９】
スキーム3:A)AE105-RGDヘテロ二量体、B)AE105ホモ二量体、C)AE105-クリック-Cy5、D)AE105-非クリック-Cy3の調製。BCNはシクロオクチンであり、これは、Cu(I)を触媒として使用せずに、高い反応率でアジドと直接反応し、トリアゾール基を形成することができる。
【０１２０】
【化６】
2019522625.tif 000009
【０１２１】
モノマー(AE105-NOTA-N3)を、1.0当量のBCNに結合したペプチド又は色素と共に37℃で一晩インキュベートした後、金属を伴わないクリック反応させ、>95%の収率を達成した。得られた化合物は、直接使用することができた。0%アセトニトリル100%水から出発して100%アセトニトリルまでの勾配溶出を介するHPLC精製によって、合成したプローブの純度をさらに増大することができた。
【０１２２】
調製した前述のプローブを、それぞれ37℃、70℃、及び90℃において64Cu、68Ga、及びAl18Fで標識することに成功した。一般に、64Cu及び68Ga標識について、1nmolのプローブ及び1mCiの放射活性を使用すると、ほぼ100%の標識化収率を達成することができた。図5は、放射標識化の放射性HPLCの結果の代表例を提供している。
【０１２３】
前述のすべての化合物を、穏やかな条件下で、1.0mCi/nmolの比活性により64Cuで標識することができた。得られた放射性トレーサーは、37℃で24時間インキュベートした後、ヒト血清中で高い安定性を示した(<2%の64Cuが解離した)。
【０１２４】
得られたヘテロ二量体(AE105-NOTA-RGD、図6)及びモノマー(AE105-NODAGA及びRGD-NODAGA、図6)を、NH4OAc緩衝液(pH約6.8)中70℃において64Cuで放射標識し、それらの血清中の安定性を評価した。得られた放射性トレーサーは、37℃で24時間インキュベートした後も未変化のままであり、高い血清中の安定性を示した。図7は、血清中で1日インキュベートした後、プローブから著しい64Cuの解離がなかったことを実証する放射性HPLCの結果を提供している。良好な血清中の安定性によって、プローブは、インビボの血流中での循環中、未変化のままでいられることが実証される。より高い分子量及びより大きいサイズでも、血中でのプローブの保持が増大する。
【０１２５】
化合物の放射標識化:すべての化合物を、Cu-64標識化のために、0.1MのNH4OAC緩衝液(pH=6.8)中で実施した。簡潔には、64CuCl2(通常、0.1NのHCl中)を、最初に0.1MのNH4OAC緩衝液(pH=6.8)に緩衝させ、次に、調製したNOTA-バイオコンジュゲートを添加した。得られた混合物を10秒間ボルテックスし、サーモミキサー中、37℃で0.5時間インキュベートした後、64Cu取込み収率を、放射性HPLCによって決定した。
【０１２６】
図8は、N3-DOtB3-AE105-PEG4-DOTA-PEG4-RGDを用いて作成した二量体を図示している。
【０１２７】
細胞染色研究:細胞を、実験の24時間前に、8ウェルチャンバースライドに播種した(1ウェル当たり100,000個の細胞)。実験前に、細胞をPBSで2回洗浄し、培養培地を添加した。次に、インビトロでの非特異的取込みを決定するために、遮断剤(10μgのAE105)を、冷却遮断としてウェルの半分に添加し、1時間インキュベートした。次に、AE105-NOTA-NHCO-Cy3(1ウェル当たり10pmol)を、各ウェルに添加し、さらに2時間インキュベートした。次に、培地を除去し、細胞をPBSで2回洗浄した。1%パラホルムアルデヒドを使用して細胞を固定した後、核をDAPIによって染色した。スライドを封止し、蛍光顕微鏡(40倍、油)の下で観測した。
【０１２８】
図9に示される通り、染色及び遮断を、U87MGヒト膠芽腫細胞株上で観測し、それによって、uPAR受容体に対するペプチドAE105の強力な親和性が確認され、AE105-NOTA-NHCO-Cy3が、光学的プローブとしても使用することができることが示された。
【０１２９】
[実施例4]
細胞取込み及び結合研究
細胞取込み及び染色研究を、U87MGヒトがん細胞において測定した。特に、AE105-RGDヘテロ二量体(図4)と、モノマーAE105-NODAGA及びRGD-NODAGA(図6)を比較した。
【０１３０】
細胞取込みアッセイ:U87MGヒトがん細胞を、American Type Culture Collection(バージニア州、マナサス)から購入した。すべての細胞処理を、層流フード内で無菌状態で実施した。U87MG細胞を、10% FBS、ペニシリン(100単位/mL)、ストレプトマイシン(100μg/mL)、L-グルタミン(300μg/mL)及びピルビン酸ナトリウム(100mg/mL)、グルコース(4.5g/L)を補充したダルベッコ改変イーグル培地中で培養し、37℃、5%CO2で維持した。
【０１３１】
細胞を、実験の24時間前に12ウェルプレートに播種した(1ウェル当たり200,000個の細胞)。実験前に、細胞を1mLのHBSSで2回洗浄し、1mLの培地(0.1%BSA及び1mMのMn2+を含むDMEM)を、各ウェルに添加した。次に、細胞を、64Cuで標識されたコンジュゲート(1ウェル当たり10pmolの64Cu-GYK12、64Cu-RGD又は64Cu-AE105)と共にインキュベートした。各時点(1時間、2時間及び4時間)で、放射性培地を吸引した。細胞をHBSS(pH7.2)で2回洗浄し、0.5%SDSに溶解させた。各画分における放射活性を、ガンマカウンターで測定した。各細胞溶菌液試料のタンパク質含量を決定した。細胞と関連する測定された放射活性を、1ウェル当たり同量の細胞タンパク質に正規化した。細胞取込みを、減衰補正後、添加用量の百分率として表した。
【０１３２】
ヘテロ二量体は、モノマーAE105-NODAGA及びRGD-NODAGAと比較して、すべての調査時点において細胞取込みに対する著しい改善を示した(p<0.1)(図10)。
【０１３３】
細胞飽和結合アッセイ:細胞を、実験の24時間前に24ウェルプレートに播種した(1ウェル当たり100,000個の細胞)。実験前に、細胞を1mLのHBSSで2回洗浄し、0.5mLの結合培地(0.1%BSA及び1mMのMn2+を含むHBSS)を、各ウェルに添加した。次に、インビトロでの非特異的結合を決定するために、遮断剤(10μgのAE105及び/又は10μgのRGD)を、冷却遮断としてウェルの半分に添加した後、64Cu-AE105-RGD、64Cu-RGD及び64Cu-AE105を、濃度を増大して(1〜100nM)添加した。試料を氷(4℃)上で2時間インキュベートした。インキュベーション後、放射性培地を除去した。細胞ペレットを、氷冷結合緩衝液(1mL)で2回すすぎ、0.5%SDS溶液に溶解させた。各画分の放射活性を、ガンマカウンターで測定した。各細胞溶菌液試料のタンパク質含量を決定した(BCAタンパク質アッセイキット、Pierce)。細胞と関連する測定された放射活性を、存在する細胞タンパク質の量に正規化した(fmol/mg)。
【０１３４】
結果は、64Cu-GYK12が、2つの64Cu-モノマーの値:64Cu-AE105(Bmax269±43fmol/mg、Kd65±49nM)、及び64Cu-RGD(Bmax260±44fmol/mg、Kd91±36nM)と比較して、著しく増強されたBmax(488±73fmol/mg)及び結合親和性(9.9±4.2nM)を呈したことを示した。
【０１３５】
統計的分析:すべての実験を、3通り実施した。実験の異なる群間の比較を、二元ANOVA試験(GraphPad Prism 6)を使用して行った。3つ以上のデータセットを比較する場合、二元ANOVA分析をBonferroni事後検定と共に適用した。P値<0.05を、統計的に有意であるとみなした。
【０１３６】
[実施例5]
AE105-RGDヘテロ二量体を使用するPET画像化
インビボPET/CT画像化を、U87MG腫瘍異種移植片を有するNCrヌードマウスにおいて実施した。
【０１３７】
ヌードマウスに、U87MG細胞(150μLのPBS中500万個の細胞)を、右肩の側腹部皮下に注射した。AE105-RGDヘテロ二量体(図4)、AE105-NODAGA、又はRGD-NODAGAのいずれかを、尾静脈注射によって血流に注射した。遮断研究を、ヘテロ二量体研究のためにAE105及びRGDを100回同時注射することによって実施した。小動物PET/CTを、トレーサーの注射1時間後及び4時間後に実施した。臓器取込みを、ROIの分析によって決定した。AE105-RGD二量体について、エクスビボ体内分布も実施した。マウスの臓器を取り出し、ガンマ-カウンター(Gama-counter)を使用して計数した。
【０１３８】
すべての異種移植腫瘍を、注射1時間後及び4時間後の両方で可視化した(図11)。臓器取込みを、PET画像化定量化から決定した。結果は、64Cu-ヘテロ二量体(1時間目3.13±0.49%ID/g、4時間目3.27±0.25%ID/g)を注射したマウスでは、2つのモノマーPETプローブ:64Cu-AE105(1時間目1.45±0.15%ID/g、4時間目1.55±0.31%ID/g)及び64Cu-RGD(1時間目1.50±0.42%ID/g、4時間目1.73±0.51%ID/g)を注射したマウスの値と比較して、より高い腫瘍取込み値(p<0.01)が観測されたことを示した。64Cu-ヘテロ二量体の筋肉に対する腫瘍の比は、4時間目で7.6±1.9であり、これは、64Cu-AE105の値(4.2±1.1)よりも著しく高い。64Cu-ヘテロ二量体の肝臓に対する腫瘍の比は、4時間目で1.5±0.4であり、これは、やはり64Cu-AE105の値(0.43±0.1)よりも著しく高い。腸取込み値の高さは、αvβ3インテグリン及びuPARが、若いマウスの腸においても高度に発現されるという事実に寄与し得る。標識されていないシクロ(RGDyK)及びAE105(マウス1匹ごとに100μg)を同時に注射することによって実施した遮断研究では(図12)、64Cu-ヘテロ二量体の腫瘍取込みは、1.01±0.18%ID/gに低下し(4時間、p<0.01)、それによって、U87MG異種移植片においてαvβ3インテグリン及びuPARを標的とするヘテロ二量体の特異性がさらに確認された。エクスビボ体内分布も、AE105-RGDについて実施して、PET画像化定量化データの妥当性を検証した。結果を図13に示す。
【０１３９】
統計的分析:すべての実験を、3通り実施した。実験の異なる群間の比較を、二元ANOVA試験(GraphPad Prism 6)を使用して行った。3つ以上のデータセットを比較する場合、二元ANOVA分析をBonferroni事後検定と共に適用した。P値<0.05を、統計的に有意であるとみなした。
【０１４０】
[実施例6]
二重標的化のためのヘテロ二量体の合成
この実施例は、二重標的化のためのヘテロ二量体を合成する代替方法を提供する。この方法は、様々なペプチドが組み合わさったヘテロ二量体を調製するために改変され得る。
【０１４１】
第1のペプチド(ペプチドA)を、標準SPSプロトコールを使用し、ペプチド合成機によって樹脂(樹脂-ペプチドA-PEGn-NH2)上で調製することができる。N3-NOtB2を、樹脂及びペプチドにカップリングさせることができる。得られるペプチドA-PEGn-NOTA-N3を、TFA及びHPLC精製を使用して、樹脂支持体から切断することができる。ヘテロ二量体は、スキーム4に示される通り、ペプチドB(例えば、ペプチドB-PEG4-BCN)とさらに組み合わせることによって調製することができる。
【０１４２】
スキーム4:2つのペプチドのヘテロ二量体の合成
【０１４３】
【化７】
2019522625.tif 000010
【０１４４】
スキーム4に示される通り、ペプチドA及びBは、いくつかの適切なペプチドから選択することができる。例えば、それらのペプチドは、インテグリン及びCD13を標的とするように選択することができる。したがって、ペプチドAは、AE105及びAE105mutから選択することができ、ペプチドBは、シクロ(RGDyK)及びシクロ(RADyK)から選択することができる。さらに、PEGスペーサーは、様々な長さ、例えばn=0〜n=12であり得る。例えば、AE105及びシクロ(RGDyK)のヘテロ二量体は、前述の実施例4に記載されるもの(すなわち、GYK4、GYK8、GYK12、及びGYK16)と同じである。しかし、この実施例によって、ヘテロ二量体が、代替標的指向性分子、例えばAE105mut及びシクロ(RADyK)を用いて調製できることがさらに実証される。
【０１４５】
調製したヘテロ二量体を、それぞれインビトロ及び/又はインビボ評価のために放射標識することができる。細胞取込み及び/又は流出アッセイは、以下の実施例13においてより詳細に説明される通り、細胞取込み及び保持のための最も高い潜在可能性を有する1つ以上のヘテロ二量体を同定するために使用することができる。さらに、細胞飽和結合アッセイを実施例4に記載される通り実施して、ヘテロ二量体のBmax及び結合親和性をモノマーと比較して評価することができる。
【０１４６】
[実施例7]
インテグリン-CD13二重標的指向性化合物の合成
インテグリン-CD13二重標的指向性化合物を、スキーム4に示される通り調製した。
【０１４７】
スキーム4:インテグリン-CD13二重標的指向性化合物の合成
【０１４８】
【化８】
2019522625.tif 000011
【０１４９】
二官能性キレーター(BFC)であるN3-NOtB2を使用し、CD13及びανβ3をそれぞれ標的とするペプチドリガンドc(CNGRC)及びc(RGDyK)を、金属を伴わないクリック反応及びアミド形成反応によって共有結合により連結した。図1は、N3-NOtB2-c(CNGRC)-PEG4-NOTA-PEG4-RGDを用いて作成した二量体を図示している。
【０１５０】
Fmoc-PEG4-OH及びTACNベースのキレーターを、固相合成(SPS)によってシクロ(CNGRC)ペプチドに逐次結合させた。特に、N3-NOtB2を、SPSによってペプチドシクロ(CNGRC)-PEG4-NH2のN末端に高収率で結合させた。
【０１５１】
樹脂上のペプチド(樹脂-CNGRC)を、標準SPSプロトコールを使用し、ペプチド合成機によって調製し、次に、システインの側鎖を脱保護し、次に、トリフルオロ酢酸タリウム(III)で処置することによって環化した。Fmoc-PEG4-OH及びN3-NOtB2を、DMF中HATU(5当量)及びDIEA(10当量)と室温で2時間混合することによって、樹脂に逐次結合させた。次に、c(CNRGC)-PEG4-NOTA-N3を、TFA/H2O/TIS/フェノール(90:5:2.5:2.5)及びHPLC精製を使用して樹脂支持体から切断した後に得、次にN3とBCN部分の間の歪み促進型アルキン-アジド環化付加(SPAAC)によって、シクロ(RGDyK)-PEG4-BCN(pH約8.5のPBS緩衝液中で、BCN-PEG4-NHSをシクロ(RGDyK)と混合することによって調製した)と連結させた。
【０１５２】
金属を伴わないクリック反応後にトリアゾールを形成させ、精製したヘテロ二量体(NGR-NOTA-RGD)を、それぞれ37℃、70℃、及び90℃において64Cu、68Ga、及びAl18Fで標識することに成功した。標識化の結果を、放射性HPLCによってモニタリングした。標識化の収率は、64Cu及び68Gaについては90%を超え、Al18Fについてはほぼ50%であった。
【０１５３】
[実施例8]
インテグリン-CD13二重標的指向性化合物の合成
インテグリン-CD13二重標的指向性化合物を、スキーム5に示される通り調製した。アミド形成(ペプチド由来のアミノ基とBFC由来のカルボン酸基との間の反応)において使用されるカップリング剤は、容易に除去することができるので、固相合成(スキーム4)は、合成の態様からより好都合である。しかし、溶液相合成(スキーム5)では、より少量のペプチド及びBFCが消費された。したがって、溶液相合成は、利用可能なペプチド及び/又はBFCの量が制限される小規模の調製に適している場合がある。
【０１５４】
スキーム5:インテグリン-CD13二重標的指向性化合物の合成
【０１５５】
【化９】
2019522625.tif 000012
【０１５６】
二官能性キレーター(BFC)を使用し、N3-NOtB2を、アミド形成反応によって、完全に保護されたc(RGDyK)にコンジュゲートし、次に、保護基を強酸性条件下で除去した。得られたペプチドを、金属を伴わないクリック反応によってBCN-c(CNGRC)に連結させた。
【０１５７】
図1は、N3-NOtB2-c(CNGRC)-PEG4-NOTA-PEG4-RGDを用いて作成した二量体を図示している。保護された直鎖RGDyKを、固相合成(SPS)によって調製し、次にDCM中2%TFAを使用して樹脂から切断した。保護されたRGDyKの環化を、ジフェニルホスホリルアジド(DPPA)で処理することによって実施した。リシン上のivDdeを脱保護した後、Fmoc-PEG4-OHを、リシンの側鎖上の第一級アミンに結合させ、次に、Fmocを、DMF中20%ピペリジンを使用して脱保護した。HPLC精製後に得られた、保護されたシクロ(RGDyK)-PEG4-NH2を、EDCI及びDMAPを使用してN3-NOtB2とコンジュゲートした。精製したシクロ(RGDyK)-PEG4-NOTA-N3を、N3とBCN部分の間の歪み促進型アルキン-アジド環化付加(SPAAC)によって、シクロ(CNGRC)-PEG4-BCN(pH約8.5のPBS緩衝液中で、BCN-PEG4-NHSをシクロ(CNGRC)と混合することによって調製した)と連結させた。
【０１５８】
金属を伴わないクリック反応後にトリアゾールを形成させ、精製したヘテロ二量体(NGR-NOTA-RGD)を、それぞれ37℃、70℃、及び90℃において64Cu、68Ga、及びAl18Fで標識することに成功した。標識化の結果を、放射性HPLCによってモニタリングした。標識化の収率は、64Cu及び68Gaについては90%を超え、Al18Fについてはほぼ50%であった。
【０１５９】
[実施例9]
皮下異種移植マウスモデルにおけるc(cNGRc)-c(RGDyK)ヘテロ二量体を使用するPET画像化
インビボPET/CT画像化を、bxpc3(ヒト膵臓腺癌細胞株)及び4T1(インテグリンανβ3及びCD13を過剰発現するマウス乳がん細胞株)腫瘍異種移植片を有するNCrヌードマウスにおいて実施した。
【０１６０】
マウスに、bxpc3細胞(150μLのPBS中100万個の細胞)を、右肩の側腹部皮下に、4T1細胞(150μLのPBS中100万個の細胞)を、左肩の側腹部皮下に注射した。CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyKヘテロ二量体、(68Ga)NOTA(CNGRC)、又は(68Ga)NOTA(RGDyK)のいずれかを、尾静脈注射によって血流に注射した。遮断研究を、ヘテロ二量体研究のためにシクロ(CNGRC)及びシクロ(RGDyK)を100回同時注射することによって実施した。小動物PET/CTを、トレーサーの注射1時間後に実施した(図14)。ヘテロ二量体CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyKは、インビボ性能の増強の改善を示した(例えば、血中保持時間がより長く、腫瘍/非腫瘍比がより良好であった)。
【０１６１】
[実施例10]
同所異種移植マウスモデルにおけるc(cNGRc)-c(RGDyK)ヘテロ二量体を使用するPET画像化
インビボPET/CT画像化を、Balb/cマウスにおいて実施した。1×106個のルシフェラーゼ-トランスフェクトKPCPがん細胞をBalb/cマウスの膵臓に同所(orthotropic)移植した1週間後、マウスをPET画像化のために使用した。CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyKヘテロ二量体、(68Ga)NOTA(CNGRC)、又は(68Ga)NOTA(RGDyK)のいずれかを、尾静脈注射によって血流に注射した。遮断研究を、ヘテロ二量体研究のためにCNGRC及びRGDyKを100回同時注射することによって実施した。小動物PET/CTを、トレーサーの注射1時間後に実施した(図15A〜15C)。ヘテロ二量体CNGR-(68Ga)NOTA-RGDyKは、インビボ性能の改善を示した(例えば、血中保持時間がより長く、腫瘍/非腫瘍比がより良好であった)(図15A)。筋肉、血液、肝臓、脾臓、腎臓、膵臓、及び同所腫瘍へのRGD-NGRヘテロ二量体の取込み率は、それぞれ0.1%ID/g、0.1%ID/g、1.8%ID/g、1.1%ID/g、2.2%ID/g、0.36%ID/g、及び1.4%ID/gであった。
【０１６２】
[実施例11]
自発的遺伝子導入マウスモデルにおけるc(cNGRc)-c(RGDyK)ヘテロ二量体を使用するPET画像化
インビボPET/CT画像化を、遺伝子組換えKCH(Pdx1-Cre、K-RasG12D/+、HMGB1-/-)マウスモデルにおいて実施した。高移動度群ボックス1(HMGB1)は、老廃タンパク質及び損傷を受けた細胞小器官の劣化の主な経路である自己貪食の非常に重要な調節物質であり、膵臓に限定されるHMGB1の条件的な遺伝子破壊は、自己貪食を抑制し、増殖を促進し、普通は静止状態の経路を活性化し、マウスをK-RasG12D/+駆動性膵臓発癌に対して極端に敏感にする。低悪性度PanIN1から高悪性度PanIN3へのPanINの進行は、早くも生後7日で(通常は3〜9ヶ月)KCH(Pdx1-Cre、K-RasG12D/+、HMGB1-/-)に観測することができた。PET画像化は、普通、約6週齢のKCHマウスで実施した。
【０１６３】
CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyKヘテロ二量体、(68Ga)NOTA(CNGRC)、又は(68Ga)NOTA(RGDyK)のいずれかを、尾静脈注射によって血流に注射した。遮断研究を、ヘテロ二量体研究のためにCNGRC及びRGDyKを100回同時注射することによって実施した。小動物PET/CTを、トレーサーの注射1時間後に実施した(図16A〜16D)。ヘテロ二量体CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyKは、インビボ性能の改善を示した(例えば、血中保持時間がより長く、腫瘍/非腫瘍比がより良好であった)(図16A)。筋肉、血液、肝臓、脾臓、腎臓、及び悪性膵臓へのRGD-NGRヘテロ二量体の取込み率は、それぞれ0.38%ID/g、0.23%ID/g、4.7%ID/g、3.1%ID/g、5.0%ID/g、及び5.9%ID/gであった。
【０１６４】
さらに、ヘテロ二量体CNGRC-(68Ga)NOTA-RGDyKは、自発的遺伝子導入マウスモデルにおいて任意の特異的腫瘍取込みを示さなかった、臨床的に広く使用されている18F-FDG(図16B)と比較して、特異的腫瘍取込み及び良好な腫瘍/非腫瘍比を示した(図16A)。
【０１６５】
[実施例12]
インビトロハイスループットスクリーニングプラットフォーム
概念実証研究では、RGD及びAE105の間の異なる長さのPEGスペーサー(PEG4、8、12及び16)をスクリーニングするためのプラットフォームを、ανβw及びuPARを標的とするヘテロ二量体について開発した。結果は、PEG12が最良のスペーサーであることを示したので、これについてインビボPET画像化によって妥当性を検証した。
【０１６６】
前述の最適化のための化学物質の調製を、図3に概説する(RGD及びAE105は、それぞれバイオマーカーανβ3及びuPARを標的とするペプチドである)。
1)様々なPEGの長さ(n=2、4、6、8、10、12、14、16、18、20)のスペーサーを含有する、10種のNH2-PEGn-RGDペプチドを、PBS緩衝液(pH=8.2)中で対応するBoc-PEGn-NHSをRGDに添加し、その後95%TFAでBoc脱保護することによって調製することができる。次に、調製されたNH2-PEGn-RGDを、PBS緩衝液(pH=8.2)中で光ODIBO-NHSと混合して、光OIDBO-PEGn-RGD(図3ではp-ODIBOと省略される)を生成する。
2)N3-PEG4-AE105は、PBS緩衝液(pH=8.2)中でAE105をN3-PEG4-NHSと混合することによって調製することができる。
【０１６７】
インビトロ最適化手順
1)N3-PEG4-AE105を、10種の光ODIBO-PEGn-RGDペプチド(n=2、4、6、8、10、12、14、16、18、20)の1つと1:1モル比で混合して、10種の混合された標的指向性分子の原液を調製する。
2)10種の混合された標的指向性分子の原液の1つを、細胞を予め播種した96ウェルプレート中のウェルに添加する(10種の混合された標的指向性分子溶液のために合計10個のウェルが必要である)。
3)標的指向性分子が標的受容体に結合した後、結合していない標的指向性分子を、PBS緩衝液を使用して洗い流す。
4)UVランプ(365nm)を適用して、アジド-不活性光ODIBOを脱保護し、アジド-活性「ODIBO」を作成し、その後、N3-PEG4-AE105とODIBO-PEGn-RGD(共に細胞上のバイオマーカーに結合する)の間の連結を誘発する。
5)さらに2〜4時間インキュベートした後、N3-(64Cu)NOTAを添加して、「過剰」のODIBO-PEGn-RGD(がん細胞に結合するが、N3-PEG4-AE105とは反応しない)と反応させる。
6)過剰のN3-(64Cu)NOTAを、PBS緩衝液を使用して洗い流し、N3-(64Cu)NOTAは、「過剰」のODIBO-PEGn-RGDに連結した後に始めて、細胞上に保持され得る。
7)次に、96ウェルプレートをハイスループットMicroBeta2プレートカウンターに搭載して、細胞上の「過剰」のODIBO-PEGn-RGDに連結したN3-(64Cu)NOTAを測定する。
【０１６８】
最少「過剰」のODIBOを含有する、最少放射線計数を有するウェルでは、最大量の連結生成物(AE105-PEG4-N3とODIBO-PEGn-RGDの間)を得られるはずであり、したがって、対応するスペーサーは、適切な長さのものである。
【０１６９】
[実施例13]
ヘテロ二量体スペーサーの最適化のためのハイスループットスクリーニングプラットフォーム
速やかなヘテロ二量体スペーサーの最適化のために、ハイスループット細胞ベースの普遍的なプラットフォームを開発して、高い結合活性効果を有するヘテロ二量体を作成した。ヘテロ二量体ライブラリーの合成及び評価を反復する必要がある従来の手法の反復は、開発されたプラットフォームを使用することによって回避される。プラットフォームによって、様々なスペーサーを有するヘテロ二量体をスクリーニングして、インビトロ及び/又はインビボ評価において最高の性能を有するヘテロ二量体を同定することができる。
【０１７０】
方法論
ヘテロ二量体をその場で形成するために、目的の2つのリガンド、RGD(インテグリンαvβ3を標的とする)及びAE105(ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)を標的とする)を、それぞれ光ODIBO基及びN3基で官能化した。本明細書では、光ODIBO基は、金属を伴わない光誘発型のクリックケミストリー部分であり、これは、ODIBOに脱保護され、UV365nmを照射すると歪み促進型アルキン-アジド環化付加(SPAAC)によってアジドと反応することができる。ハイスループットスクリーニング能を提供し、研究群におけるその適用を容易にするために、化学的ツールの調製を設計して、複雑な精製を回避した(スキーム6を参照されたい)。特に、光ODIBO-PEG4-RGDを、DMSOに溶解させたRGDを6当量のDIEA及び3当量のODIBO-PEG4-NHSで処理することによって調製した。ペグ化が完了した後、1×PBSを反応混合物に添加し、したがって、過剰の光ODIBO-PEG4-NHSを、非細胞反応性の光ODIBO-PEG4-COOHに加水分解することができた。異なるスペーサーを有する4種のN3官能化AE105類似体を、類似の方法で、AE105をN3-PEGn-NHS(類似体ごとに選択された4種のPEGスペーサーの1つ)と共にインキュベートし、その後過剰のNHSを1×PBSで加水分解することによって、並行して合成した。さらなる精製なしに、得られた光ODIBO-PEG4-RGD及び4種のN3-PEGPn-AE105溶液を、その後のヘテロ二量体スペーサーの最適化実験に直接適用することができた。
【０１７１】
スキーム6.化学的ツールの調製
【０１７２】
【化１０】
2019522625.tif 000013
【０１７３】
スペーサーの最適化を、図17に示される通り実施した。光ODIBO-PEG4-RGD及び既に調製したN3-PEGn-AE105の1つを混合し、次に、u87MG細胞(インテグリンαvβ3受容体及びuPARの両方を過剰発現したヒト脳がん細胞株)を予め播種した96ウェルプレートに添加した。それらの細胞を、4%パラホルムアルデヒドで予め固定して、内部移行を最小限に抑えた。RGD及びAE105を、それぞれインテグリンαvβ3及びuPARに十分に結合させるために2時間インキュベートした後、過剰の(結合していない)リガンドを、PBS緩衝液を使用して洗い流した。次に、プレートをUVランプ(365nm)で2分間照射して、アジド-不活性光ODIBOをアジド-活性「ODIBO」に脱保護して、N3-PEGn-AE105とODIBO-PEG4-RGDの間の金属を伴わないクリック反応を誘発した。金属を伴わないクリック反応を完了させるために、さらに2時間インキュベートした後、「過剰」のODIBO-PEG4-RGD(細胞に結合するが、N3-PEGn-AE105とクリックしなかった)とクリックさせるために、(64Cu)NOTA-N3を、放射捕捉剤として添加した。結合していない(64Cu)NOTA-N3を除去後直ちに、ODIBO-PEGn-RGDにクリックした(64Cu)NOTA-N3を、MicroBeta2プレートカウンターで測定した。UV照射なしの1群を、バックグラウンド対照として使用して、(64Cu)NOTA-N3の非特異的結合から生じる計数を得た。非特異的結合に起因するバックグラウンド計数を減算した後、最少放射活性計数を有するウェルは、最少量の(64Cu)NOTA-クリック-PEG4-RGDを含有しており、したがって、その場で作成された最大量のヘテロ二量体(AE105-PEGn-クリック-PEG4-RGD)は、対応するスペーサーの長さ(PEGn+4)を示し、高い結合活性を達成するために最も適している。
【０１７４】
従来の戦略と比較して、このプラットフォームによって、様々なスペーサーを有するヘテロ二量体からなるヘテロ二量体ライブラリーの過剰な合成及び評価が回避された。さらに、ベータカウンターの高い感受性に起因して、リガンドは、試験ごとにナノモル尺度で消費され、したがって、高価な出発材料にかかる費用が著しく低減された。ハイスループットスクリーニングの利便性、感受性及び可能性の利点を考慮すると、この普遍的で速やかなスペーサーの最適化プラットフォームは、研究及び/又は臨床適用のためのヘテロ二量体医薬品の開発を、大幅に容易にすることができる。
【０１７５】
結果及び議論
まず、細胞表面上の1つのインテグリンαvβ3受容体と1つのuPARの間の距離を推定して、スクリーニングに適した長さのスペーサーを選択し、2つの受容体間の可能な距離が、5nm以下になり得ることを見出した。単結合の長さが約1.5Å(0.15nm)であるとすると、12の単結合からなるPEG4単位の長さは、結合角度を考慮すると約1.2nmになるはずである。したがって、1nm〜5nmの長さをカバーするために、PEG4、PEG8、PEG12、及びPEG16からなる4種のスペーサーを、スクリーニング目的で選択した(表2を参照されたい)。
【０１７６】
【表２】
2019522625.tif 000014
【０１７７】
次に、RGD-PEG4-光ODIBO及びAE105-PEGn-N3(n=0、4、8、及び12)を、スキーム6に示される通り調製した。3当量のR-PEG-NHSエステルを使用したので、ペプチドリガンドの変換収率は、HPLCによってモニタリングされる通り、30分以内に95%超に達した。図18は、RGD-PEG4-光ODIBOへのRGDの変換の例を示しており、ここで、RGD、RGD-PEG4-光ODIBO、光ODIBO-PEG4-COOH、及び光ODIBO-PEG4-NHSは、それぞれ13分、19分、20分、及び21分において溶出された。図18では、HPLC条件は以下の通りであった。0〜2分、100%H2O;2〜12分、100%H2Oから80%H2O及び20%ACNに変更;12〜22分、80%H2O及び20%ACNから10%H2O及び90%ACNに変更;22〜26分、10%H2O及び90%ACN;26〜27分、10%H2O及び90%ACNから100%H2Oに変更;27〜35分、100%H2Oで流速1.5ml/分。HPLCスペクトルから得られた定量的結果に基づいて、反応混合物を室温で0.5時間撹拌した後、RGD変換収率は、95%を超えており、5%未満の光ODIBO-PEG4-NHSが、光ODIBO-PEG4-COOHに加水分解された。
【０１７８】
1×PBSを添加した後、反応混合物を一晩静置すると、光ODIBO-PEG4-NHSの加水分解が最大限になり、RGD-PEG4-光ODIBO並びに光ODIBO-PEG4-COOHだけが反応混合物に残った。AE105-PEGn-N3(n=0、4、8、及び12)を調製した場合にも、類似の観測が得られた。光ODIBO-PEG4-COOHもN3-PEGn-COOHも、標的指向性リガンドが欠如していることに起因して細胞に結合できなかったので、結合していないRGD-PEG4-光ODIBO又はAE105-PEGn-N3と一緒に洗い流された。したがって、得られた5種の反応混合物を、さらなる精製なしに細胞ベースのスクリーニングに直接適用することができる。
【０１７９】
その後、RGD-PEG4-光ODIBOを、AE105-PEG0-N3又はAE105-PEG4-N3又はAE105-PEG8-N3又はAE105-PEG12-N3のいずれかと並行して混合して、RGD-PEG4-光ODIBO及びAE105-PEGn-N3(n=0、4、8、12)の1つの両方をそれぞれ含有する4種の原液群を得た。図17に示される通り、4種の原液群を、設計された細胞ベースのスクリーニングアッセイにおいて、4%パラホルムアルデヒドで予め固定したu87MG細胞を使用して適用した。4つの実験群に加えて、細胞をRGD-PEG4-光ODIBO及びNH2-PEG0-AE105で処理して負の対照群を調製した。したがって、ODIBOとNH2の間には連結が存在しないので、この負の対照群ではヘテロ二量体を作成することができなかった。さらに、UV照射を適用しなかったバックグラウンド対照群が存在し、したがって、検出された(64Cu)NOTA-N3の量は、細胞上のその非特異的結合によって引き起こされたものであった。バックグラウンド対照群において記録された非特異的結合を減算した後、RGD-PEG4-ODIBOとの連結によって引き起こされた、異なる群における(64Cu)NOTA-N3の特異的結合を比較した。図19に示される通り、N3-PEG4-AE105及びN3-PEG8-AE105で処理した群は、より少量の(64Cu)NOTA-N3の特異的結合を呈し、RGD-PEG8-AE105及びRGD-PEG12-AE105が、u87MG細胞上に形成された2つの最も豊富なヘテロ二量体であったことを示唆した。したがって、2つの対応するスペーサー(登録番号2及び3)は、試験した4種のスペーサーの中で最も強力であった。
【０１８０】
最後に、前述のスクリーニングアッセイから得られた結果について、インビトロ及びインビボの両方で妥当性を検証した。様々なPEGスペーサー(それぞれPEG4、PEG8、PEG12及びPEG16)を有する4種のRGD-AE105ヘテロ二量体を、前述の実施例に記載される通り調製した。次に、調製されたヘテロ二量体を、インビトロ評価及びインビボ評価のために、それぞれCu-64又はGa-68のいずれかで放射標識した。図20Aに示される細胞取込み結果に基づくと、PEG16を含有するヘテロ二量体は、細胞取込みの最高値を呈し、その後にPEG12、PEG8、及びPEG4を含有していたヘテロ二量体が続き、4時間目の取込み値は、それぞれ0.46%、0.38%、0.24%及び0.16%であった。細胞流出研究では(図20B)、PEG8及びPEG12を含有するヘテロ二量体が、細胞保持の最高値を示し、その後にPEG4及びPEG16を含有するヘテロ二量体が続き、2時間目の保持値は、それぞれ44%、43%、35%及び26%であった。試験した4種のヘテロ二量体における細胞取込み及び流出の両方の結果を考慮すると、PEG12を含有するヘテロ二量体によって、このインビトロ評価における最高の潜在可能性が実証され、これは、設計された細胞ベースのスクリーニングアッセイから得られた結果と一致していた。
【０１８１】
さらなるインビボ検証を、u87MG異種移植片を有するマウスから得られたPET画像化結果を比較することによって実施した。図21に示される通り、腫瘍を、試験した4種のヘテロ二量体PETトレーサーすべてを使用して可視化することができ、一方でPEG12を含有していたヘテロ二量体は、最も高い腫瘍対バックグラウンドのコントラストを呈し、その後にPEG8、PEG16、及びPEG4を含有するヘテロ二量体が続いた。その後、定量的腫瘍取込み値を、関心領域(ROI)分析によって明らかにした(図22)。PEG12を含有するヘテロ二量体の腫瘍取込み値は2.8%であり、一方でPEG8、PEG16、及びPEG4を含有するヘテロ二量体の腫瘍取込み値は、それぞれ2.4%、2.1%及び1.7%であり、これによって、設計された細胞ベースのスクリーニングアッセイから得られた結果が再確認された。まとめると、インビトロ評価及びインビボ評価の両方から得られた結果によって、速やかなスペーサーの最適化プラットフォームの精度及び信頼性の妥当性の検証に成功した。選択されたAE105-PEG12-RGDを、ヌードマウスのu87MG異種移植片のPET画像化によって、2種の対応するモノマーAE105及びRGDとさらに比較した。ヘテロ二量体を投与したマウスにおいて優れた画像化結果が得られ、結合活性効果に起因して、2つのモノマー対応物よりも良好なインビボ性能があることが示された。
【０１８２】
したがって、様々な二重バイオマーカーの組合せ及び異なる疾患に広範に適用できる高結合活性のヘテロ二量体の開発に関与するスペーサーの最適化過程を簡素化するために、金属を伴わない光誘発型のクリック反応を使用し、普遍的なインビトロスクリーニングプラットフォームを確立することができる。開発されたスクリーニングプラットフォームは、インテグリンαvβ3-uPAR二重標的ヘテロ二量体リガンドのスペーサーの最適化における適用に成功した。このプラットフォームの精度及び信頼性を、インビトロ評価及びインビボ評価の両方によってさらに妥当性について検証し、ここで、試験したすべてのスペーサーを含有するヘテロ二量体を調製し、個々に評価した。ハイスループットスクリーニングの実証された可能性に加えて(図17に示される通り)、この普遍的なプラットフォームは、様々な生物医学的分野において、特に標的受容体が少量で発現される場合、且つ/又は高親和性(及び/又は特異性)の一価リガンドが利用不可能である場合に、二重受容体標的化戦略の適用を著しく促進し、且つ/又は増強することができる。
【０１８３】
[実施例14]
スペーサーの長さの探索
様々なPEG長(n=2、4、6、8、10、12、14、16)のスペーサーを含有する8種のNH2-PEGn-RGDペプチドを、PBS緩衝液(pH=8.2)中で対応するBoc-PEGn-NHSをRGDに添加し、その後Boc脱保護することによって調製する。次に、既に報告されている手順を使用して調製した光ODIBO-NHSを、PBS緩衝液(pH=8.2)中、調製されたNH2-PEGn-RGDと混合して、光OIDBO-PEGn-RGDを生成する。N3-PEG4-セツキシマブを、既に報告されている手順を使用して調製する。N3-PEG4-セツキシマブ及び8種の光ODIBO-PEGn-RGDペプチド(n=2、4、6、8、10、12、14、16)を、インビトロスクリーニングのために使用する(標的指向性プローブの内部移行を最小限にするために4℃で行う)。図11に示される通り、1)8種の混合リガンド原液を、N3-PEG4-セツキシマブを8種の光OIDBO-PEGn-RGDペプチドの1つと混合することによって調製し、2)U87MG細胞を、96ウェルプレート中で培養し、3)前述の8種の混合リガンド原液の1つを、U87MGを予め播種した各ウェル(合計8つのウェル)に添加し、2)リガンドが標的受容体に結合した後、過剰の(結合していない)標的指向性リガンドを、PBS緩衝液を使用して洗い流し(完全に除去するために5回反復する)、3)UVランプ(365nm)を適用して、アジド-不活性光ODIBOを脱保護し、アジド-活性「ODIBO」を作成し、その後、N3-PEG4-セツキシマブとODIBO-PEGn-RGDの間の連結を誘発し、4)さらに2時間インキュベートした後、64Cuで標識されたN3-NOTAを添加して、「過剰」のODIBO-PEGn-RGD(細胞に結合するが、N3-PEG4-セツキシマブにクリックしない)とクリックさせ、5)過剰のN3-(64Cu)NOTAを除去し、「過剰」のODIBO-PEGn-RGDにクリックされたN3-(64Cu)NOTAを、MicroBeta2プレートカウンターで測定する。UV照射なしの1群を、負の対照として使用して、N3-(64Cu)NOTAの非特異的結合からの計数を得る。非特異的結合を減算した後、8種のODIBO-PEGn-RGD(n=2、4、6、8、10、12、14、16)から得られたN3-(64Cu)NOTAの特異的結合を比較する。最少特異的結合を有するウェルは、最大量のクリック生成物(セツキシマブ-PEG4-N3とODIBO-PEGn-RGDの間)を含有し、したがって、対応するスペーサーは、最も強力である。
【０１８４】
最も強力なPEGスペーサーを含有するODIBO-PEGn-RGDを、Tz-NOTA-N3とクリックさせ、次に64Cuで放射標識し、得られたTz-(64Cu)NOTA-PEGn-RGDを、U87MG細胞によるインビトロ結合活性研究のために使用する。得られるヘテロ二量体におけるRGDとセツキシマブの間の距離は、結合活性効果を達成するには短すぎるので(予備的な研究で証明された、図5B)、Tz-(64Cu)NOTA-RGD(PEGスペーサーなし)を、負の対照として使用する。簡潔には、Tz-(64Cu)NOTA-PEGn-RGD/TCO-PEG4-セツキシマブ連結生成物(セツキシマブ-PEG4-(64Cu)NOTA-PEGn-RGD)を、U87MG細胞による細胞取込み/流出、結合親和性及びBmax測定のために使用する。前述の連結生成物により、高い結合活性効果が確認された後、次にインビボ評価を実施する。U87MG異種移植片を有するマウスに、100μgのTCOPEG4-セツキシマブを予め注射し、24時間後に約250〜350μCiのTz-(64Cu)NOTA-PEGn-RGD(又は負の対照群ではTz-(64Cu)NOTA-RGD)を注射する。次に、複数の時点(注射後4時間、18時間、及び/又は28時間)で、1時間の動的PET走査を実施する。セツキシマブは、肝臓によって排出されるので、中間時点及び後期時点における腫瘍及び肝臓での反応速度を評価することができる。中間/後期時点(4時間、18時間、28時間)において、連結しなかったTz-(64Cu)NOTAPEGn-RGDの大部分が洗い流されていた場合、腫瘍の洗い流しが相対的に緩慢であり、肝臓での排出の方が急速であるという観測によって(Tz-(64Cu)NOTA-RGDの観測と比較)、腫瘍細胞との結合の方がかなり強力であることを示すことができ、したがってインビボ連結生成物(セツキシマブ-PEG2-(64Cu)NOTA-PEGn-RGD)の結合活性効果が達成される。
【０１８５】
様々な参考文献が本文書に引用されているが、それらは、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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