(57)【要約】ＮＫ細胞の数および／または細胞傷害性が増大した低受胎女性において、反復自然流産または体外受精後の反復着床不全を処置する方法に使用するための、有効成分として脂肪酸またはそのエステルの組合せを含む経口組成物。本発明の経口組成物を特定の量で特定の期間投与する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
総末梢血細胞中に１２％以上の末梢血ＮＫ細胞を有し、および／または生殖障害を伴なわず少なくとも１人の子供を出産した生殖可能年令の健康な女性の対照集団の平均細胞傷害性よりその女性対象の末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性が少なくとも１０％高い女性対象において、再発性自然流産または反復着床不全を処置する方法に使用するための、有効成分として脂肪酸またはそのエステルの組合せを含む経口組成物であって、組成物が１５〜７０日間経口投与され、１日当たり投与される脂肪酸またはそのエステルの総量が脂肪酸として計算して０，０３ｇ／体重ｋｇから１ｇ／体重ｋｇまでである、経口組成物。
【請求項２】
１日当たり投与される脂肪酸またはそのエステルの総量が、脂肪酸として計算して０，１０ｇ／体重ｋｇから０，７０ｇ／体重ｋｇまでである、請求項１に記載の経口組成物。
【請求項３】
１日当たり投与される脂肪酸またはそのエステルの総量が、脂肪酸として計算して０，２０ｇ／体重ｋｇから０，５０ｇ／体重ｋｇまでである、請求項２に記載の経口組成物。
【請求項４】
組成物が３０〜６０日間投与される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の経口組成物。
【請求項５】
組成物が４０〜５０日間投与される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の経口組成物。
【請求項６】
脂肪酸が、長鎖、中鎖、短鎖脂肪酸、およびその混合物からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の経口組成物。
【請求項７】
長鎖脂肪酸が、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、アラキジン酸、オレイン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸、サピエン酸、リノール酸、ａ−リノレン酸、γ−リノレン酸、およびその混合物からなる群から選択される、請求項６に記載の経口組成物。
【請求項８】
中鎖脂肪酸が、ラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸、およびその混合物からなる群から選択される、請求項６に記載の経口組成物。
【請求項９】
組成物が、少なくとも１種類の飽和、少なくとも１種類の一価不飽和、および少なくとも１種類の多価不飽和長鎖脂肪酸、またはそのエステルを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の経口組成物。
【請求項１０】
脂肪酸として計算して組成物中の有効成分の少なくとも５０重量％が長鎖脂肪酸またはそのエステルである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の経口組成物。
【請求項１１】
脂肪酸として計算して組成物中の有効成分の少なくとも６５重量％が長鎖脂肪酸またはそのエステルである、請求項１０に記載の経口組成物。
【請求項１２】
脂肪酸として計算して組成物中の有効成分の少なくとも９７重量％が長鎖脂肪酸またはそのエステルである、請求項１１に記載の経口組成物。
【請求項１３】
脂肪酸エステルが、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質、およびその混合物からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の経口組成物。
【請求項１４】
脂肪酸エステルが、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、およびその混合物からなる群から選択される、請求項１３に記載の経口組成物。
【請求項１５】
組成物がさらに１種類以上のビタミン、金属イオン、アミノ酸、またはその混合物を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の経口組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＫ細胞の数および／または細胞傷害性が増大した低受胎(sub-fertile)女性対象において反復自然流産(repeated spontaneous abortion)（ＲＳＡ）または体外受精(in vitro fertilization)（ＩＶＦ）後の反復着床不全(repeated implantation failure)（ＲＩＦ）を処置する方法に使用するための経口組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー(Natural Killer)（ＮＫ）細胞は特定グループの大顆粒リンパ球(large granular lymphocyte)（ＬＧＬ）であり、それらは先天性免疫応答において主要な役割を果たすが、適応免疫応答に対する影響および免疫調節においても重要である(Herberman RB. Role of human natural killer cell responses in health and disease. Clin Diagn Lab Immunol 1994;1:125-33)。それらは主に脾臓にみられるリンパ系組織の１〜２％を形成する。末梢血において、ＮＫ細胞は全リンパ球の５〜１５％、およびＬＧＬの７０〜９５％を占める(Stites DP, Terr AI, Parslow TG. Basic and clinical immunology. 8th edition, Appleton and Lange, Norwalk, Conn, 1994)。
【０００３】
ＮＫ細胞はそれらの表面に一連のマーカーを発現し、それらのうち最も特徴的なものは分子ＣＤ１６およびＣＤ５６である(Caligiuri M. Human natural killer cells. Blood. 2008;112:461-9)。ＣＤ１６とＣＤ５６の相対発現に基づいて、ＮＫ細胞を異なる亜集団に小分類できる。２つの主要なサブセットは、ＣＤ５６ｄｉｍ  ＣＤ１６ｂｒｉｇｈｔ（ＣＤ５６の低発現、ＣＤ１６の高発現）、およびＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ＣＤ１６ｄｉｍ／−（ＣＤ５６の高発現、ＣＤ１６の低発現または発現なし）である。すべての末梢血ＮＫ細胞の少なくとも９０％を占めるＣＤ５６ｄｉｍ  ＣＤ１６ｂｒｉｇｈｔ細胞は細胞傷害機能をもつ。活性化されると、それらはそれらの顆粒からパーフォリン(perforin)およびグランザイム類を放出し、一方でそれらは炎症に際して内皮細胞および先天性免疫細胞により放出されるケモカイン類に応答して炎症部位へ移動する(Moretta A, Marcenaro E, Parolini S, Ferlazzo G, Moretta L. NK cells at the interface between innate and adaptive immunity. Cell Death Differ 2008;15:226-33)。ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ＣＤ１６ｄｉｍ／−細胞は二次リンパ系組織におけるＮＫ細胞の大部分を構成し、それらは活性化される前は弱い細胞傷害性であるにすぎないが、サイトカイン類の作用を受けるとそれらは直ちに大量のＩＮＦ−γを産生し、免疫調節特性をもつ可能性がある(Poli A, Michel T, Theresine M, Andres E, Hentges F, Zimmer J, CD56bright natural killer (NK) cells: an important NK cells subset. Immunology 2009 Apr;126(4):458-65)。これらの細胞は、おそらく局所分化した後に、子宮内膜白血球（ＣＤ５６  ｅＧＬ：子宮内膜顆粒球）の主要細胞集団を構成する(Hiby SE1, King A, Sharkey AM, Loke YW, Human uterine NK cells have a similar repertoire of killer inhibitory and activatory receptors to those found in blood, as demonstrated by RT-PCR and sequencing, Mol Immunol. 1997 Apr;34(5):419-30)。
【０００４】
ＮＫ−様細胞（ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ＣＤ１６ｄｉｍ／−）は、妊娠１期から第１三半期を通して主要な脱落膜細胞(decidual cell)集団である。それらの増殖および分化は、エストロゲンおよびプロゲステロンが子宮内膜を予定妊娠のために準備する月経周期の分泌期と同調しているという証拠がある。血液または他の組織からのＮＫ細胞の流入、あるいは子宮内膜間質細胞からＮＫ細胞へのリプログラミングおよび分化の結果として、この時期に子宮間質白血球が著しく増加する（５％から２５％に）(Gellersen B, Brosens IA, Brosens JJ. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Semin Reprod Med 2007; 25:445-53.; Santoni A, Carlino C, Gismondi A. Uterine NK cells development, migration and function. Reprod Biomed Online 2008; 16:202-10)。妊娠が起きると、ＮＫ−様細胞が急速に増加し、絨毛外栄養芽層(extravillous trophoblast)付近にある脱落膜全体に広く分布する(King A. Uterine leukocytes and decidualization. Hum Reprod Update 2000; 6:28-36)。それらの存在量が増加し、侵入する栄養芽層と直接接触するため、それらは正常な妊娠の樹立に重要であると考えられている。胚盤胞(blastocyst)移植および脱落膜形成(decidualization)と同時に、子宮ＮＫ細胞が活性化され、それらがＩＦＮ−γ、パーフォリン、および血管形成因子を含めた他の分子を産生し、こうしてそれらはそれらの細胞傷害活性により栄養芽層の侵入を制御でき、かつ血管不安定化および脱落膜動脈のリモデリングをも開始して胎児胎盤ユニット(feto-placental unit)への血液供給を増加させるという証拠がある(Ashkar AA, Di Santo JP, Croy BA. Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. J Exp Med 2000;192:259-70)。さらに、脱落膜ＮＫ細胞は母体免疫応答のサイトカイン仲介免疫調節に関与して、Ｔｈ２型サイトカインおよび成長因子を産生する可能性があり、その結果、胎盤増強および局所的な免疫抑制および免疫修飾が生じる(Clark D, Arck PC, Jallili R, et al. Psycho-Neuro-Cytokine/Endocrine pathways in immunoregulation during pregnancy. Am J Reprod Immunol 1996;35:330-7; Chaouat G, Tranchot Diallo J, Volumenie JL, et al. Immune suppression and Th1/Th2 balance in pregnancy revisited: A (very) personal tribute to Tom Wegmann. Am J Reprod Immunol 1997;37:427-34)。
【０００５】
脱落膜ＮＫ細胞は、胎児が母体により異物と認識されて“拒絶”されるいわゆる同種免疫流産(alloimmune abortion)の症例に関与する主な細胞集団であると思われる(Labarrere CA. Allogeneic recognition and rejection reactions in the placenta. Am J Reprod Immunol 1989;21:94-9; Stern JJ, Coulam CB: Current status of immunologic recurrent pregnancy loss. Curr Opin Obstet Gynecol 1993;5:252-9)。それらはＴｈ１型サイトカインの影響下で刺激されてＣＤ１６を発現する典型的ＮＫ細胞（ＣＤ５６ｄｉｍ  ＣＤ１６ｂｒｉｇｈｔ）になり、それが直接的に細胞溶解性物質の放出により、または間接的に炎症性サイトカインの産生により、栄養芽層に損傷を与える可能性がある(King A, Wheeler R, Carter NP, et al. The response of human decidual leukocytes to IL-2. Cell Immunol 1992;141:409-42)。
【０００６】
流産しやすい女性は子宮における一般的なＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋タイプのＮＫ細胞の数が増加しており(Vassiliadou N, Bulmer JN: Immunohistochemical evidence for increased numbers of 'classic' CD57+ natural killer cells in the endometrium of women suffering spontaneous early pregnancy loss. Hum Reprod 1996;11:1569-74; Kwak JY, Beer AE, Kim SH, et al. Immunopathology of the implantation site utilizing monoclonal antibodies to natural killer cells in women with recurrent pregnancy losses. Am J Reprod Immunol 1999;41:91-8)、血液ＮＫサブセットおよびＮＫ細胞活性も増大しており、これらはすべて染色体正常胎児の流産と関連づけられている(Coulam CB, Goodman C, Roussev RG, et al. Systemic CD56+ cells can predict pregnancy outcome. Am J Reprod Immunol 1995;33:40-6; Aoki K, Kajiura S, Matsumoto Y, et al. Preconceptual natural killer cell activity as a predictor of miscarriage. Lancet 1995;345:1340-2)ことが臨床試験により立証された。
【０００７】
上記のデータから、末梢血ＮＫ細胞（ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ＣＤ１６ｄｉｍ／−）の数および／または細胞傷害性の増大が、同種免疫流産の診断のために、また免疫療法のための女性を選択するマーカーとして実際に用いられている(Coulam CB, Goodman C, Roussev RG, et al. Systemic CD56+ cells can predict pregnancy outcome. Am J Reprod Immunol 1995;33:40-6; Aoki K, Kajiura S, Matsumoto Y, et al. Preconceptual natural killer cell activity as a predictor of miscarriage. Lancet 1995;345:1340-2)。
【０００８】
伝統的には、有害なＮＫ細胞活性化を低減して流産および／またはＲＩＦを阻止するための主な療法は、父性または第３パーティーのリンパ球を用いるその女性の能動免疫化(Gafter U, Sredni B, Segal J, Kalechman Y. Suppressed cell-mediated immunity and monocyte and natural killer cell activity following allogeneic immunization of women with spontaneous recurrent abortion. J Clin Immunol 1997;17:408-19)、および静脈内免疫グロブリンＧ投与（ＩＶＩｇ）の形での受動免疫化(Ruiz JE, Kwak JY, Baum L, et al. Intravenous immunoglobulin inhibits natural killer cell activity in vivo in women with spontaneous recurrent abortion. Am J Reprod Immunol 1996;35:370-5)であった。幾つか知られている静脈内免疫グロブリンの副作用または有害事象は下記のものである：無菌性髄膜炎、腎不全、血塞栓症、溶血反応、アナフィラキシー反応、肺疾患、腸炎、皮膚障害および感染性疾患(Stiehm, 2013)。ＮＫ細胞の機能性細胞傷害を抑制するためにこの数年に提唱された別の処置は、精製したダイズ油、精製した卵リン脂質、無水グリセロールおよび注射用水を含む脂肪エマルジョン（例：Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標））の静脈内投与であり、それは通常は栄養障害または非経口栄養補給を必要とする他の障害を伴なう患者においてエネルギーおよび必須脂肪酸の供給源として用いられている(Natural killer cell functional activity suppression by intravenous immunoglobulin, Intralipid and soluble human leukocyte antigen-G. Am J Reprod Immunol 2007;57:262-9, Meng L, Lin J, Chen L, Wang Z, Liu M, Liu Y, Chen X, Zhu L)。Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）による処置は末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性を低減するが、それは末梢血ＮＫ細胞の数は減少させない。さらに、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の静脈内注入は、幾つかの重篤な副作用、たとえば膀胱痛、血尿または混濁尿、悪寒、排尿困難、排尿時灼熱感または排尿痛、発熱、頻回尿意、下背部痛または側腹部痛、咽喉痛、および嘔吐を引き起こす可能性がある。最近の研究により、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の静脈内注入は肝腫脹、黄疸、胆汁うっ滞、脾腫大、血小板減少症、白血病および脂肪過負荷症候群を引き起こす可能性があることが示された（臨床試験において＜１％）(FDA,2007)。
【０００９】
末梢血ＮＫ細胞の数および細胞傷害性の増大は共に再発性自然流産を引き起こす可能性がある(Am J Reprod Immunol. 2007 Nov;58(5):447-59. Decline in number of elevated blood CD3(+) CD56(+) NKT cells in response to intravenous immunoglobulin treatment correlates with successful pregnancy, van den Heuvel MJ1, Peralta CG, Hatta K, Han VK, Clark DA; An Increased NK-cell percentage 5 days after the pregnancy termination could be a marker of immune aetiology of miscarriage, as the probability of an aborter with NK >12% to have an immune-mediated abortion is almost 90%. Am J Reprod Immunol. 2008 Apr;59(4):306-15. doi: 10.1111/j.1600-0897.2007.00547.x. Epub 2008 Feb 21)。
【００１０】
流産時の末梢血ＮＫ細胞の測定は有用であり、ＮＫ細胞数の増加がもつ有意の役割によるものであることが示された(Paparistidis N1, Papadopoulou C, Chioti A, Papaioannou D, Tsekoura C, Keramitsoglou T, Kontopoulou-Antonopoulou V, Agapitos E, Balafoutas C, Varla-Leftherioti M)。
【００１１】
末梢血ＮＫ細胞の数および活性の低減は生児出産率の重要な改善をもたらし、それがきわめて高いレベルで上昇することが多数の研究により示された；Am J Reprod Immunol. 2006 Mar;55(3):232-9; High levels of peripheral blood NK cells in women suffering from recurrent spontaneous abortion are reverted from high-dose intravenous immunoglobulins (Perricone R1, Di Muzio G, Perricone C, Giacomelli R, De Nardo D, Fontana L, De Carolis C. Am J Reprod Immunol. 2010 Mar 1;63(3):263-5. doi: 10.1111/j.1600-0897.2009.00790.x. Epub 2010 Jan 8; CD3-CD56+CD16+ natural killer cells and improvement of pregnancy outcome in IVF/ICSI failure after additional IVIG-treatment.Heilmann L1, Schorsch M, Hahn T.; Am J Reprod Immunol. 2007 Apr;57(4):262-9; Natural killer cell functional activity suppression by intravenous immunoglobulin, intralipid and soluble human leukocyte antigen-G.. Roussev RG1, Ng SC, Coulam CB.(Am J Reprod Immunol. 2007 Nov;58(5):447-59; Decline in number of elevated blood CD3(+) CD56(+) NKT cells in response to intravenous immunoglobulin treatment correlates with successful pregnancy. Van den Heuvel MJ1, Peralta CG, Hatta K, Han VK, Clark DA)。
【００１２】
前記の処置は多数の難点および欠点をもつ。たとえば、それらは患者の繰返し入院および医師による永続的な監視を必要とする。さらに、患者は入院しているので、院内感染を受ける可能性がある。その上、これらの方法は介入処置のリスクおよび影響を伴なう（生命を危うくするもの、たとえばヒト由来製剤に由来する敗血症、脂肪エマルジョン注入による過剰凝固を含む）。さらに、これらの処置は重篤な副作用を伴なう。
【００１３】
本発明はこれらの問題に対処し、先行技術に比較して多数の利点をもたらす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Herberman RB. Role of human natural killer cell responses in health and disease. Clin Diagn Lab Immunol 1994;1:125-33
【非特許文献２】Stites DP, Terr AI, Parslow TG. Basic and clinical immunology. 8th edition, Appleton and Lange, Norwalk, Conn, 1994
【非特許文献３】Caligiuri M. Human natural killer cells. Blood. 2008;112:461-9
【非特許文献４】Moretta A, Marcenaro E, Parolini S, Ferlazzo G, Moretta L. NK cells at the interface between innate and adaptive immunity. Cell Death Differ 2008;15:226-33
【非特許文献５】Poli A, Michel T, Theresine M, Andres E, Hentges F, Zimmer J, CD56bright natural killer (NK) cells: an important NK cells subset. Immunology 2009 Apr;126(4):458-65
【非特許文献６】Hiby SE1, King A, Sharkey AM, Loke YW, Human uterine NK cells have a similar repertoire of killer inhibitory and activatory receptors to those found in blood, as demonstrated by RT-PCR and sequencing, Mol Immunol. 1997 Apr;34(5):419-30
【非特許文献７】Gellersen B, Brosens IA, Brosens JJ. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Semin Reprod Med 2007; 25:445-53.
【非特許文献８】Santoni A, Carlino C, Gismondi A. Uterine NK cells development, migration and function. Reprod Biomed Online 2008; 16:202-10
【非特許文献９】King A. Uterine leukocytes and decidualization. Hum Reprod Update 2000; 6:28-36
【非特許文献１０】Ashkar AA, Di Santo JP, Croy BA. Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. J Exp Med 2000;192:259-7
【非特許文献１１】Clark D, Arck PC, Jallili R, et al. Psycho-Neuro-Cytokine/Endocrine pathways in immunoregulation during pregnancy. Am J Reprod Immunol 1996;35:330-7
【非特許文献１２】Chaouat G, Tranchot Diallo J, Volumenie JL, et al. Immune suppression and Th1/Th2 balance in pregnancy revisited: A (very) personal tribute to Tom Wegmann. Am J Reprod Immunol 1997;37:427-34
【非特許文献１３】Labarrere CA. Allogeneic recognition and rejection reactions in the placenta. Am J Reprod Immunol 1989;21:94-9
【非特許文献１４】Stern JJ, Coulam CB: Current status of immunologic recurrent pregnancy loss. Curr Opin Obstet Gynecol 1993;5:252-9
【非特許文献１５】King A, Wheeler R, Carter NP, et al. The response of human decidual leukocytes to IL-2. Cell Immunol 1992;141:409-42
【非特許文献１６】Vassiliadou N, Bulmer JN: Immunohistochemical evidence for increased numbers of 'classic' CD57+ natural killer cells in the endometrium of women suffering spontaneous early pregnancy loss. Hum Reprod 1996;11:1569-74
【非特許文献１７】Kwak JY, Beer AE, Kim SH, et al. Immunopathology of the implantation site utilizing monoclonal antibodies to natural killer cells in women with recurrent pregnancy losses. Am J Reprod Immunol 1999;41:91-8
【非特許文献１８】Coulam CB, Goodman C, Roussev RG, et al. Systemic CD56+ cells can predict pregnancy outcome. Am J Reprod Immunol 1995;33:40-6
【非特許文献１９】Aoki K, Kajiura S, Matsumoto Y, et al. Preconceptual natural killer cell activity as a predictor of miscarriage. Lancet 1995;345:1340-2
【非特許文献２０】Gafter U, Sredni B, Segal J, Kalechman Y. Suppressed cell-mediated immunity and monocyte and natural killer cell activity following allogeneic immunization of women with spontaneous recurrent abortion. J Clin Immunol 1997;17:408-19
【非特許文献２１】Ruiz JE, Kwak JY, Baum L, et al. Intravenous immunoglobulin inhibits natural killer cell activity in vivo in women with spontaneous recurrent abortion. Am J Reprod Immunol 1996;35:370-5
【非特許文献２２】Natural killer cell functional activity suppression by intravenous immunoglobulin, Intralipid and soluble human leukocyte antigen-G. Am J Reprod Immunol 2007;57:262-9; Meng L, Lin J, Chen L, Wang Z, Liu M, Liu Y, Chen X, Zhu L
【非特許文献２３】Am J Reprod Immunol. 2007 Nov;58(5):447-59. Decline in number of elevated blood CD3(+) CD56(+) NKT cells in response to intravenous immunoglobulin treatment correlates with successful pregnancy, van den Heuvel MJ1, Peralta CG, Hatta K, Han VK, Clark DA
【非特許文献２４】An Increased NK-cell percentage 5 days after the pregnancy termination could be a marker of immune aetiology of miscarriage, as the probability of an aborter with NK >12% to have an immune-mediated abortion is almost 90%. Am J Reprod Immunol. 2008 Apr;59(4):306-15. doi: 10.1111/j.1600-0897.2007.00547.x. Epub 2008 Feb 21
【非特許文献２５】Am J Reprod Immunol. 2006 Mar;55(3):232-9; High levels of peripheral blood NK cells in women suffering from recurrent spontaneous abortion are reverted from high-dose intravenous immunoglobulins (Perricone R1, Di Muzio G, Perricone C, Giacomelli R, De Nardo D, Fontana L, De Carolis C.
【非特許文献２６】Am J Reprod Immunol. 2010 Mar 1;63(3):263-5. doi: 10.1111/j.1600-0897.2009.00790.x. Epub 2010 Jan 8; CD3-CD56+CD16+ natural killer cells and improvement of pregnancy outcome in IVF/ICSI failure after additional IVIG-treatment.Heilmann L1, Schorsch M, Hahn T.
【非特許文献２７】Am J Reprod Immunol. 2007 Apr;57(4):262-9; Natural killer cell functional activity suppression by intravenous immunoglobulin, intralipid and soluble human leukocyte antigen-G.. Roussev RG1, Ng SC, Coulam CB.
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、再発性自然流産(recurrent spontaneous abortion)（ＲＳＡ）または体外受精（ＩＶＦ）状況における反復着床不全（ＲＩＦ）を経験し、末梢血ＮＫ細胞の数および／または細胞傷害性が増大している女性が使用するための、脂肪酸またはそのエステルの組合せを含む経口組成物を提供する。
【００１６】
本発明の組成物は、有効成分として脂肪酸またはそのエステルの組合せを含み、それらは一定量で一定期間にわたって投与される。
したがって、本発明は、関連の問題に直面しているかなり多数のコホートのカップルにおいて免疫仲介性の低受胎(sub-fertility)を阻止することを目的とする；それは、彼らから子供を出産する機会を奪うという家族状況とは別に、著しい社会的および経済的影響をもつ可能性もある。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
脂肪酸またはそのエステルの混合物を含む経口組成物は、一定量で一定期間にわたって投与すると、再発性自然流産（ＲＳＡ）または反復着床不全（ＲＩＦ）を経験し、末梢血ＮＫ細胞数が増加し、および／または末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性が増大している女性において末梢血ＮＫ細胞の数および細胞傷害性を低減することが、今回予想外に見出された。
【００１８】
よって、本発明は、総末梢血細胞中に１２％以上の末梢血ＮＫ細胞を有し、および／または生殖障害を伴なわず少なくとも１人の子供を出産した生殖可能年令の健康な女性の対照集団の平均細胞傷害性よりその女性対象の末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性が少なくとも１０％高い女性対象において、再発性自然流産または反復着床不全を処置する方法に使用するための、有効成分として脂肪酸またはそのエステルの組合せを含む経口組成物であって、組成物が１５〜７０日間経口投与され、１日当たり投与される脂肪酸またはそのエステルの総量が脂肪酸として計算して０，０３ｇ／体重ｋｇから１ｇ／体重ｋｇまでである、経口組成物を提供する。
【００１９】
本発明は、総末梢血細胞中に１２％以上の末梢血ＮＫ細胞を有し、および／または生殖障害を伴なわず少なくとも１人の子供を出産した生殖可能年令の健康な女性の対照集団の平均細胞傷害性よりその女性対象の末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性が少なくとも１０％高い女性対象において、再発性自然流産または反復着床不全を処置する方法であって、有効成分として脂肪酸またはそのエステルの組合せを含む経口組成物を投与することを含み、その組成物を１５〜７０日間経口投与し、１日当たり投与される脂肪酸またはそのエステルの総量は脂肪酸として計算して０，０３ｇ／体重ｋｇから１ｇ／体重ｋｇまでである方法をも提供する。
【００２０】
ＮＫ細胞の細胞傷害性を評価するために、幾つかの方法を適用できる。５１Ｃｒ放出は細胞傷害性を判定するための伝統的方法であるが、別法を使用でき、かつ幾つかの他の方法が開発段階にある。放射性同位体の使用が望ましくないかまたは許容されない検査室では、あるいは５１Ｃｒ標識を容易には取り込まない腫瘍ターゲット細胞を使用する場合には、酵素および比色用または蛍光性の色素を利用する試験系を使用できる。現在、ＮＫ細胞活性を測定するための最も一般的な方法はフローサイトメトリーであり、それは試薬の使用に関して改変できる方法であるにもかかわらず同じ結果が得られる(Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Kimberly l.Kane et al, Clinical and diagnostic laboratory immunology, may 1996, p. 295-300; Evaluation of a Flow Cytometry-Based Assay for Natural Killer Cell Activity in Clinical Settings, R. Valiathan et al. 2011 The Authors. Scandinavian Journal of Immunology)。
【００２１】
ＮＫ細胞に対する多くの免疫学的および内分泌的な影響の可能性のためＮＫ細胞傷害性が普通は個体内で一貫性がない場合があることを当業者は認識している。したがって、健康な個体を反復試験した際のＮＫ活性の微小な変化を予想できる。異なる対照集団は異なる平均ＮＫ細胞傷害値を生じる可能性がある。統計的に適正な結果を得るためには、対照試料は多い方が良い。それでもなお、本発明は、流産またはＩＶＦ不成功などの生殖障害を伴なわず少なくとも１人の子供を出産した生殖可能年令の健康な女性の対照集団の平均細胞傷害性より末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性が少なくとも１０％高い女性対象に適用される。
【００２２】
本発明によれば、用語“再発性自然流産（ＲＳＡ）”は、２回以上の妊娠２０週目より前の自然な妊娠喪失(spontaneous losses of pregnancy)と定義される。
本発明によれば、用語“反復着床不全（ＲＩＦ）”は、体外受精（ＩＶＦ）または卵細胞質内精子注入(intracytoplasmic sperm injection)（ＩＣＳＩ）または凍結胚置換サイクル(frozen embryo replacement cycle)を２サイクル繰り返した後に移植体が存在しないことと定義される。
【００２３】
本発明によれば、末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性の増大は、流産またはＩＶＦ不成功などの生殖障害を伴なわず少なくとも１人の子供を出産した生殖可能年令の健康な女性の対照集団の平均細胞傷害性より少なくとも１０％高いいずれかの殺傷活性と定義される。
【００２４】
用語“再発性自然流産または反復着床不全の処置”は、処置されていなかったとしたら受けていたであろうリスクと比較して処置した対象の流産のリスクの低減、および妊娠転帰の改善を意味する。
【００２５】
本発明によれば、用語“脂肪酸”は、飽和鎖または不飽和鎖をもち、一般に４個から２８個までの炭素原子を含む、脂肪族モノカルボン酸を意味する。
本発明によれば、用語“長鎖脂肪酸”は、１３個以上の炭素原子の脂肪族鎖をもつ脂肪酸を意味する。
【００２６】
本発明によれば、用語“中鎖脂肪酸”は、６〜１２個の炭素原子の脂肪族鎖をもつ脂肪酸を意味する。
本発明によれば、用語“短鎖脂肪酸”は、６個未満の炭素原子の脂肪族鎖をもつ脂肪酸を意味する。
【００２７】
本発明の組成物は、脂肪酸またはそのエステルの組合せを含む。脂肪酸には短鎖、中鎖または長鎖の、飽和または不飽和脂肪酸が含まれる。好ましくは、本発明の組成物は長鎖脂肪酸、または長鎖および中鎖の脂肪酸を含む。
【００２８】
飽和長鎖脂肪酸の例には、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、およびアラキジン酸が含まれる。
一価不飽和長鎖脂肪酸の例には、オレイン酸、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、パルミトレイン酸、ミリストレイン酸およびサピエン酸(sapienic acid)が含まれる。
【００２９】
多価不飽和長鎖脂肪酸の例には、リノール酸、ａ−リノレン酸およびγ−リノレン酸が含まれる。
中鎖脂肪酸の例には、ラウリン酸、カプリン酸およびカプリル酸が含まれる。
【００３０】
短鎖脂肪酸の例には、ブタン酸、２−メチルプロパン酸、ペンタン酸および３−メチルブタン酸が含まれる。
本発明の組成物の脂肪酸エステルは、脂肪酸と、脂肪族アルコール、たとえばＣ１−Ｃ６アルコールとのエステル、グリセリド、すなわちモノグリセリド、ジグリセリド、またはトリグリセリド、リン脂質、たとえばホスファチジン酸またはホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、サッカロ脂質(saccharolipid)、ろう、およびその混合物である。好ましくは、脂肪酸エステルはグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質またはサッカロ脂質、およびその混合物である。より好ましくは、脂肪酸エステルはグリセリドである。
【００３１】
本発明によれば、用語“脂肪酸として計算して”は、組成物が脂肪酸エステルを含む場合、投与すべき経口組成物の量を決定するためにはそれらの量を対応する脂肪酸の量に換算しなければならないことを意味する。
【００３２】
好ましくは、本発明の組成物は少なくとも１種類の飽和、少なくとも１種類の一価不飽和および少なくとも１種類の多価不飽和長鎖脂肪酸またはそのエステルを含む。
好ましくは、脂肪酸として計算して本発明の組成物中の有効成分の少なくとも５０重量％は長鎖脂肪酸またはそのエステルである。より好ましくは、脂肪酸として計算して本発明の組成物中の有効成分の少なくとも６５重量％は長鎖脂肪酸またはそのエステルである。よりさらに好ましくは、脂肪酸として計算して本発明の組成物中の有効成分の少なくとも９７重量％は長鎖脂肪酸またはそのエステルである。
【００３３】
本発明の組成物の脂肪酸は、ＮＫ細胞が関与する免疫および炎症反応に対する種々の影響をもつ細胞内および細胞間メディエーターとして作用する。脂肪酸は、下記を含めた幾つかのメカニズムにより免疫系の調節に関与する：（ｉ）膜の流動性；（ｉｉ）脂質過酸化物の産生；（ｉｉｉ）エイコサノイドの合成；および（ｉｖ）遺伝子調節に対する影響。脂肪酸の免疫修飾は、これらの要因の個々の作用によるだけでなく総合作用にもよっても起きるという可能性がある。
【００３４】
本発明の組成物は、追加の有効成分、たとえばビタミン、金属イオンまたはアミノ酸を含むことができる。これらの有効成分が存在する場合、それらの総量は好ましくは有効成分の総量の６％未満である。ビタミンの例には、ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ６、Ｄ、ミオイノシトール、イノシトールおよび葉酸が含まれる。金属イオンには、たとえばセレン、マグネシウム、銅、亜鉛またはマンガンを含めることができる。アミノ酸には天然アミノ酸、たとえばＬ−アルギニンまたはＬ−グルタミンを含めることができる。ビタミン、金属イオンまたはアミノ酸はＮＫ細胞の数および／または細胞傷害性の低減に直接に寄与するのではないが、身体バリヤー、細胞性免疫および抗体産生を支持することによって身体の免疫防御に寄与する。それでもなお、ステロイドホルモン  １，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３｛１，２５−（ＯＨ）２−Ｄ３）は免疫抑制作用をもつという考えがある。
【００３５】
本発明の組成物におけるビタミンの存在は、ＮＫ細胞が存在する自然環境に対する免疫調節およびホメオスタシスの効果を示す。その目的は、好ましい環境を作り出して生殖プロセス全体の改善に寄与することであり、免疫系を均衡のとれた状態に維持することによって母体応答を調節する作用をもつ。しかし、ビタミンのレベル上昇は免疫系をブーストしてＮＫ細胞の作用を増大させる可能性がある。このため、本発明の組成物中にビタミンが存在する場合、それらの総量は好ましくは有効成分の総量の４％未満である。
【００３６】
本発明の組成物は、経口投与に適したいかなる形態をもつこともできる。そのような形態は当業者に周知であり、それらには液体剤形、たとえば経口液剤、経口懸濁液剤もしくは経口乳剤、経口ゲル剤、または固体剤形、たとえば錠剤、カプセル剤、またはサッシェ（個包装）が含まれる。本発明の組成物は、栄養サプリメントとして投与することができる。
【００３７】
本発明の組成物は、有効成分のほかに、当技術分野で周知である１種類以上の医薬的に許容できる賦形剤、たとえば結合剤、希釈剤、崩壊剤、懸濁化剤、滑沢剤、溶剤、乳化剤、増粘剤、緩衝剤、保存剤、甘味剤、着色剤、矯味矯臭剤などを含むことができる。
【００３８】
組成物は当業者に周知の方法により製造できる。
本発明の組成物は、１５〜７０日間投与される。好ましくは、組成物は３０〜６０日間投与される。より好ましくは、組成物は４０〜５０日間投与される。
【００３９】
本発明の組成物は、１日１回、または１日１回より多く、たとえば１日２回、投与することができる。それでもなお、本発明によれば１日当たり投与される脂肪酸またはそのエステルの総量は脂肪酸として計算して０，０３ｇ／体重ｋｇから１ｇ／体重ｋｇまでである。好ましくは、１日当たり投与される脂肪酸またはそのエステルの総量は脂肪酸として計算して０，１０ｇ／体重ｋｇから０，７０ｇ／体重ｋｇまでである。より好ましくは、１日当たり投与される脂肪酸またはそのエステルの総量は脂肪酸として計算して０，２０ｇ／体重ｋｇから０，５０ｇ／体重ｋｇまでである。
【００４０】
本発明の組成物は、免疫系を全般的に抑制するのではなく、特に末梢血ＮＫ細胞の数および細胞傷害性を低減する。
本発明によれば、ＮＫ細胞の細胞傷害性および総末梢血細胞中のＮＫ細胞のパーセントは共に、処置を停止した後１２〜１４週間、低いレベルに留まり、増加した末梢血ＮＫ細胞数および／または亢進した末梢血ＮＫ細胞活性を伴なう低受胎女性において長期間にわたってＲＳＡまたはＲＩＦの防御および阻止が達成される。これは、処置の停止から６〜９週間後に効果が無くなるＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の静脈内投与を上回る大きな改善である(Acacio B, Ng SC, Coulam CB., Am J Reprod Immunol. 2008 Sep;60(3):258-63. doi: 10.1111/j.1600-0897.2008.00621.x. Duration of intralipid's suppressive effect on NK cell's functional activity Roussev RG)。さらに、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）による処置は末梢血ＮＫ細胞の細胞傷害性を低減するが、末梢血ＮＫ細胞の数を低減することは知られていない。これに対し、本発明は末梢血ＮＫ細胞の数および細胞傷害性を共に低減する。さらに、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）の静脈内注入は幾つかの重篤な副作用、たとえば膀胱痛、血尿または混濁尿、悪寒、排尿困難、排尿時灼熱感または排尿痛、発熱、頻回尿意、下背部痛または側腹部痛、咽喉痛、および嘔吐を引き起こす可能性があるのに対し、本発明はこれらの副作用を示さない。
【００４１】
静脈内または皮下（リンパ球免疫化）注入を適用する先行技術の処置と対照的に、本発明によれば組成物は経口投与され、それの成分は消化管通過中に消化され、普通の食物摂取および吸収のプロセスに従う。こうして、ＲＳＡまたはＲＩＦの処置は先行技術の処置と比較してより容易かつより安全になる。さらに、本発明によれば入院または医師による永続的な監視の必要がなく、院内感染への曝露から女性を保護する。さらに、本発明は介入処置のリスクおよび副作用を伴なわない。さらに、本発明によれば末梢血ＮＫ細胞の数および細胞傷害性の低減は処置を停止した後、先行技術の処置と比較してより長く持続し、長期間の保護が達成される。
【実施例】
【００４２】
実施例１〜４は末梢血ＮＫ細胞数およびそれらの活性（細胞傷害性）の低減における本発明の組成物の効果を示す。ＲＳＡまたはＲＩＦを経験し、かつ末梢血ＮＫ細胞数が増加し、末梢血ＮＫ細胞活性が増大している生殖可能年令（２５〜４６歳）の健康な女性に、組成物を投与した。すべての女性からの血液試料を症例に応じて処置開始前ゼロ日目、４５日目および７０日目に検査した。全員が処置停止の１２週間後に、ルーティン検査を受けた。
【００４３】
総リンパ系細胞中のＮＫ細胞パーセントおよびＮＫ細胞活性についての末梢血試料の測定を、先に記載された手法を用いるフローサイトメトリーにより実施した(Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Kimberly l.Kane et al, Clinical and diagnostic laboratory immunology, may 1996, p. 295-300; Evaluation of a Flow Cytometry-Based Assay for Natural Killer Cell Activity in Clinical Settings, R. Valiathan et al. 2011 The Authors. Scandinavian Journal of Immunology)。この方法により、ＰＢＬ中に存在する天然の細胞傷害性細胞によって死滅するターゲット細胞のパーセントが得られる。エフェクターとターゲット細胞、および生細菌と死細胞を識別するために２種類の蛍光色素を用いる。１つは緑色蛍光色素３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＯ）であり、それはターゲット集団として用いたヒト赤白血病腫瘍細胞株Ｋ５６２の原形質膜を標識するために用いられる。第２の色素ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は膜不透過性の赤色蛍光色素であり、アッセイに際してターゲット細胞膜がＮＫ−様細胞により破壊された時点で付加される。エフェクターによる影響を受けなかった無傷のターゲット細胞は単一陽性であり（緑色蛍光のみを示した）、一方、エフェクターにより死滅して破壊された膜をもつターゲットは二重陽性である（緑色および赤色の蛍光を示した）。エフェクターおよびターゲット細胞を試験管に添加して、種々のエフェクター対ターゲット（Ｅ：Ｔ）比、１：５０、１：２５および１：１２，５を作成した。以下の実施例にはＥ：Ｔ比５０：１での結果を示す(Natural killer cell functional activity suppression by intravenous immunoglobulin, intralipid and soluble human leukocyte antigen-G. Roussev RG1, Ng SC, Coulam CB. Am J Reprod Immunol. 2007 Apr;57(4):262-9.)。
【００４４】
対照試料は、流産またはＩＶＦ不成功などの生殖障害を伴なわず少なくとも１人の子供を出産した生殖可能年令の健康な女性であった。健康な対照集団に基づけば、平均ＮＫ細胞傷害性は５０：１の比で１９％であった。
【００４５】
０日目から７０日目までのＮＫ細胞の細胞傷害性および数の変化を前記のアッセイ法により測定することができた。本発明の組成物の投与中、ベースライン平均ＮＫ細胞の活性パーセントおよび数は４５日後に有意に低減し、次いで７０日後にはそれのベースラインレベル付近まで下降した。経口組成物の投与後の反復測定により、ＮＫ細胞の数および細胞傷害性の両方について有意の低減が示された。
【００４６】
以下の実施例では下記の略号を用いる：
ＬＣＦＡ  −  長鎖脂肪酸
ＳＦＡ  −  飽和脂肪酸
ＭＵＦＡ  −  一価不飽和脂肪酸
ＰＵＦＡ  −  多価不飽和脂肪酸
ＭＣＦＡ  −  中鎖脂肪酸
実施例１
１５人の女性のグループを１日１回、表１ａに示す有効成分を含む経口液剤の形態の経口組成物１で処置した。組成物の脂肪酸はグリセリドの形であった。投与した組成物の量は、１日当たり投与した脂肪酸の総量が０，２５ｇ／体重ｋｇとなる量であった。処置開始の前および４５日後に血液試料を採集し、検査した。
【００４７】
【表１ａ】
2019534334.tif 000002
【００４８】
末梢血ＮＫ細胞の数および活性の結果を表１ｂに示す。
【００４９】
【表１ｂ】
2019534334.tif 000003
【００５０】
総末梢血細胞中の末梢血ＮＫ細胞の平均パーセントは、処置前の０日目には２０，２５、処置開始後４５日目には１３，５９であった。この差は統計的に有意であった（ｐ値＜０，０００１）。
【００５１】
５０：１の比での末梢血ＮＫ細胞の平均活性は、処置前の０日目には４６，２６、処置開始後４５日目には１８，５４であった。この差は統計的に有意であった（ｐ値＜０，０００１）。
【００５２】
前記グループのうち５人の女性には合計７０日間、処置を継続した。それらを７０日目に末梢血ＮＫ細胞の数および活性について検査した。結果を表１ｃに示す。
【００５３】
【表１ｃ】
2019534334.tif 000004
【００５４】
総末梢血細胞中の末梢血ＮＫ細胞の平均パーセントは、処置前の０日目には１８，４２、処置開始後７０日目には１１，４５であった。この差は統計的に有意であった（ｐ値＜０，０００１）。
【００５５】
５０：１の比での末梢血ＮＫ細胞の平均活性は、処置前の０日目には４６，５４、処置開始後４５日目には１３，６０であった。この差は統計的に有意であった（ｐ値＜０，０００１）。
【００５６】
この組成物で処置したすべての女性が現在妊娠している。
実施例２
６人の女性のグループを、１日１回、経口組成物２を投与した後に、ＮＫ細胞の数および活性について０日目および７０日目に検査した。組成物は表２ａに示す有効成分を含む経口液剤の形態であった。組成物の脂肪酸はグリセリドの形であった。投与した組成物の量は、１日当たり投与した脂肪酸の総量が０，２５ｇ／体重ｋｇとなる量であった。
【００５７】
【表２ａ】
2019534334.tif 000005
【００５８】
末梢血ＮＫ細胞の数および活性の結果を表２ｂに示す。
【００５９】
【表２ｂ】
2019534334.tif 000006
【００６０】
総末梢血細胞中の末梢血ＮＫ細胞の平均パーセントは、処置前の０日目には１８，４５、処置開始後７０日目には１２，８０であった。この差は統計的に有意であった（ｐ値０，０００１）。
【００６１】
５０：１の比での末梢血ＮＫ細胞の平均活性は、処置前の０日目には４３，３２、処置開始後７０日目には１９であった。この差は統計的に有意であった（ｐ値０，０００１）。
【００６２】
実施例３
このグループでは、経口組成物３を１日１回投与する前および４５日後に６人の患者の血液試料を採集し、検査した。組成物は表３ａに示す有効成分を含む経口液剤の形態であった。組成物の脂肪酸はグリセリドの形であった。投与した組成物の量は、１日当たり投与した脂肪酸の総量が０，２５ｇ／体重ｋｇとなる量であった。
【００６３】
【表３ａ】
2019534334.tif 000007
【００６４】
末梢血ＮＫ細胞の数および活性の結果を表３ｂに示す。
【００６５】
【表３ｂ】
2019534334.tif 000008
【００６６】
総末梢血細胞中の末梢血ＮＫ細胞の平均パーセントは、処置前の０日目には１７，８４、処置開始後４５日目には１２，４０であった。この差は統計的に有意であった（ｐ値＜０，００１）。
【００６７】
５０：１の比での末梢血ＮＫ細胞の平均活性は、処置前の０日目には３６、処置開始後４５日目には１６，６であった。この差は統計的に有意であった（ｐ値０，００１）。
この組成物で処置した６人の女性のうち３人が出産し、２人が妊娠している。
【００６８】
実施例４
このグループでは、経口組成物４を１日１回投与する前および４５日後に８人の患者の血液試料を採集し、検査した。組成物は表４ａに示す有効成分を含む経口液剤の形態であった。組成物の脂肪酸はグリセリドの形であった。投与した組成物の量は、１日当たり投与した脂肪酸の総量が０，２５ｇ／体重ｋｇとなる量であった。
【００６９】
【表４ａ】
2019534334.tif 000009
【００７０】
末梢血ＮＫ細胞の数の結果を表４ｂに示す。
【００７１】
【表４ｂ】
2019534334.tif 000010
【００７２】
総末梢血細胞中の末梢血ＮＫ細胞の平均パーセントは、処置前の０日目には１８，９７、処置開始後４５日目には１４，５５であった。この差は統計的に有意であった（ｐ値＜０，０１７）。
【００７３】
この組成物で処置した８人の女性のうち５人が健康な子供を出産し、２人が２５週後の現在妊娠中であり、１人は流産した。
【国際調査報告】
2019534334.tif 000011
2019534334.tif 000012
2019534334.tif 000013
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