(57)【要約】本開示は、改善されたゲノム編集組成物、およびＴＧＦβＲ２遺伝子を編集するための方法を提供する。本開示は、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の少なくとも１つの症状の予防、治療、または緩和のためのゲノム編集された細胞をさらに提供する。【選択図】図１１
2019535240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト形質転換成長因子ベータ受容体２（ＴＧＦβＲ２）遺伝子内の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含む、ポリペプチド。
【請求項２】
前記ＨＥバリアントが、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）バリアントである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、前記ＨＥバリアントの生物学的に活性な断片を含む、請求項１または請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸を欠いている、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、４個のＮ末端アミノ酸を欠いている、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、８個のＮ末端アミノ酸を欠いている、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸を欠いている、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、Ｃ末端アミノ酸を欠いている、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記生物学的に活性な断片が、対応する野生型ＨＥと比較して、２個のＣ末端アミノ酸を欠いている、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ＨＥバリアントが、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ＨＥバリアントが、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ＨＥバリアントが、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ＨＥバリアントが、配列番号：１〜５に記載のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片の１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるＤＮＡ認識インターフェースにおいて１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ＨＥバリアントが、配列番号：１〜５に記載のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片の１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるＤＮＡ認識インターフェースにおいて少なくとも５、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ＨＥバリアントが、ＴＧＦβＲ２標的部位を切断し、配列番号：１〜５またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか１つの位置：２６、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７５、７６、７８、８０、１１６、１３８、１４３、１５９、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８８、１９０、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０３、２０７、２２３、２２５、２２７、２３２、２４０、および２６４からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置において少なくとも５、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ＨＥバリアントが、ＴＧＦβＲ２標的部位を切断し、配列番号：１〜５またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか１つの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｍ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｑ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｋ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｎ、Ｓ４０Ｇ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｖ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｒ、Ｎ７５Ｇ、Ａ７６Ｓ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｄ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０ＲもしくはＳ１９０Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｔ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｒ、Ｆ２３２Ｎ、Ｔ２４０Ｒ、およびＥ２６４Ｋのうちの少なくとも５、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ＨＥバリアントが、ＴＧＦβＲ２標的部位を切断し、配列番号：１〜５またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか１つの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｍ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｑ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｋ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｎ、Ｓ４０Ｇ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｖ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｒ、Ｎ７５Ｇ、Ａ７６Ｓ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｄ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｒ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｔ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｒ、Ｆ２３２Ｎ、およびＴ２４０Ｒのうちの少なくとも５、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＨＥバリアントが、ＴＧＦβＲ２標的部位を切断し、配列番号：１〜５またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか１つの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｍ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｑ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｋ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｎ、Ｓ４０Ｇ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｖ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｒ、Ｎ７５Ｇ、Ａ７６Ｓ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｄ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｒ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｔ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｒ、Ｆ２３２Ｎ、Ｔ２４０Ｒ、およびＥ２６４Ｋのうちの少なくとも５、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ＨＥバリアントが、配列番号：６もしくは７に記載されるアミノ酸配列、またはそれらの生物学的に活性な断片と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記ＨＥバリアントが、配列番号：６に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ＨＥバリアントが、配列番号：７に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、配列番号：１１に記載されるポリヌクレオチド配列に結合する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる群から選択される、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが、約９．５のＴＡＬＥ繰り返し単位〜約１５．５のＴＡＬＥ繰り返し単位を含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが、前記ＴＧＦβＲ２遺伝子内のポリヌクレオチド配列に結合する、請求項２４または請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号：１２に記載されるポリヌクレオチド配列に結合する、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、配列番号：１３に記載されるポリヌクレオチド配列に結合し、それを切断する、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインが、２、３、４、５、６、７、または８つの亜鉛フィンガーモチーフを含む、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
ペプチドリンカーおよびエンドプロセシング酵素またはそれらの生物学的に活性な断片をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
ウイルス自己切断型２Ａペプチドおよびエンドプロセシング酵素またはそれらの生物学的に活性な断片をさらに含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記エンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片が、５´−３´エクソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、３´−５´エクソヌクレアーゼ、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、請求項３０または請求項３１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記エンドプロセシング酵素が、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、配列番号：８もしくは配列番号：９に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、配列番号：８に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記ポリペプチドが、配列番号：９に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む、請求項３４に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが、配列番号：１１または１３に記載されるポリヌクレオチド配列で前記ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子を切断する、請求項１〜３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ｍＲＮＡ。
【請求項４０】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ｃＤＮＡ。
【請求項４１】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４２】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、細胞。
【請求項４３】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、細胞。
【請求項４４】
請求項４１に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項４５】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチドによって導入された１つ以上のゲノム修飾を含む、細胞。
【請求項４６】
前記細胞が、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４７】
前記ポリヌクレオチドが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む、請求項４６に記載の細胞。
【請求項４８】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、短ＥＦ１αプロモーター、長ＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される、請求項４７に記載の細胞。
【請求項４９】
前記ポリヌクレオチドが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、それらの間に散在し、および／またはそれらに隣接する１つ以上の自己切断型ウイルスペプチドをさらにコードする、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５０】
前記自己切断型ウイルスペプチドが、２Ａペプチドである、請求項４９に記載の細胞。
【請求項５１】
前記ポリヌクレオチドが、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５２】
前記免疫抑制シグナルダンパーが、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５３】
前記免疫抑制シグナルダンパーが、キヌレニナーゼ活性を含む、請求項５２に記載の細胞。
【請求項５４】
前記免疫抑制シグナルダンパーが、
（ａ）免疫抑制因子に結合し、任意に抗体もしくはその抗原結合断片である細胞外ドメイン、
（ｂ）免疫抑制因子および膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、または
（ｃ）免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを前記細胞に伝達不可能である修飾細胞内ドメインと、を含む、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５５】
前記免疫抑制シグナルダンパーの前記細胞外ドメインおよび／または膜貫通ドメインが、前記ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインおよび／または膜貫通ドメインである、請求項５４に記載の細胞。
【請求項５６】
前記免疫力エンハンサーが、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５７】
前記免疫賦活因子が、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項５６に記載の細胞。
【請求項５８】
前記フリップ受容体が、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインと、ＴＧＦβＲ２膜貫通ドメインと、前記ＴＧＦβＲ２膜貫通ドメインの前記Ｃ末端終端にフレーム内で融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む、請求項５６に記載の細胞。
【請求項５９】
前記フリップ受容体が、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインと、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインと、前記ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインの前記Ｃ末端終端にフレーム内で融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む、請求項５６に記載の細胞。
【請求項６０】
前記フリップ受容体が、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインと、前記ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインの前記Ｃ末端終端にフレーム内で融合されたＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインと、同じく単離された細胞内ドメインと、を含む、請求項５６に記載の細胞。
【請求項６１】
前記遺伝子操作された抗原受容体が、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、またはゼータカイン（ｚｅｔａｋｉｎｅ）からなる群から選択される、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６２】
前記遺伝子操作された受容体が、前記ＴＧＦβＲ２遺伝子に一体化されない、請求項６１に記載の細胞。
【請求項６３】
免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードする前記ポリヌクレオチドが、前記ＴＧＦβＲ２遺伝子に一体化される、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６４】
免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードする前記ポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートが、請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチドによって導入されたＤＮＡ２本鎖の破断部位で前記ＴＧＦβＲ２遺伝子に一体化される、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６５】
前記細胞が、造血細胞である、請求項４２〜６４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６６】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項４２〜６５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６７】
前記細胞が、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ８＋細胞である、請求項４２〜６６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６８】
前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項４２〜６７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６９】
前記細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、請求項４２〜６８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７０】
前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項４２〜６８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７１】
前記細胞の源が、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、請求項４２〜７０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７２】
前記細胞が、１つ以上の修飾されたＴＧＦβＲ２対立遺伝子を含む、請求項４２〜７１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７３】
前記１つ以上の修飾されたＴＧＦβＲ２対立遺伝子が、機能不全であるか、または実質的に低減されたＴＧＦβＲ２機能および／もしくは細胞内シグナル伝達を有する、請求項７２に記載の細胞。
【請求項７４】
前記細胞が、前記１つ以上の修飾されたＴＧＦβＲ２対立遺伝子内に導入された免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルダンパーをコードする核酸を含み、かつ前記細胞が、前記１つ以上の修飾ＴＧＦβＲ２対立遺伝子内に導入されていない遺伝子操作された抗原受容体をさらに含む、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７５】
請求項４２〜７４のいずれか一項に記載の１つ以上の細胞を含む、複数の細胞。
【請求項７６】
請求項４２〜７４のいずれか一項に記載の１つ以上の細胞を含む、組成物。
【請求項７７】
請求項４２〜７４のいずれか一項に記載の１つ以上の細胞と、生理学的に許容可能な担体と、を含む、組成物。
【請求項７８】
細胞内のヒトＴＧＦβＲ２遺伝子を編集する方法であって、前記細胞内に請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位で２本鎖の破断を作成する、方法。
【請求項７９】
細胞内のヒトＴＧＦβＲ２遺伝子を編集する方法であって、前記細胞内に請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位で２本鎖の破断を作成し、前記破断が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される、方法。
【請求項８０】
細胞内のヒトＴＧＦβＲ２遺伝子を編集する方法であって、前記細胞内に請求項１〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびドナー修復テンプレートを導入することを含み、前記ポリペプチドの発現が、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位で２本鎖の破断を作成し、前記ドナー修復テンプレートが、前記２本鎖の破断（ＤＳＢ）の前記部位で相同組換え修復（ＨＤＲ）によって前記ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内に組み込まれる、方法。
【請求項８１】
前記細胞が、造血細胞である、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項７８〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記細胞が、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ８＋細胞である、請求項７８〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項７８〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項７８〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記細胞の源が、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、請求項７８〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡである、請求項７８〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
５´−３´エクソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが、前記細胞内に導入されている、請求項７８〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドが、前記細胞内に導入されている、請求項７８〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記ドナー修復テンプレートが、ＴＧＦβＲ２遺伝子、または前記野生型ＴＧＦβＲ２遺伝子と比較して、１つ以上の変異を含むその部分をコードする、請求項８０〜９０のいずれか一項に記載の方法．
【請求項９２】
前記ドナー修復テンプレートが、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードする、請求項８０〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記ドナー修復テンプレートが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、短ＥＦ１αプロモーター、長ＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記ドナー修復テンプレートが、前記免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、それらの間に散在し、および／またはそれらに隣接する１つ以上の自己切断型ウイルスペプチドをさらにコードする、請求項９２〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記自己切断型ウイルスペプチドが、２Ａペプチドである、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記ドナー修復テンプレートが、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項９２〜９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記免疫抑制シグナルダンパーが、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む、請求項９２〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記免疫抑制シグナルダンパーが、キヌレニナーゼ活性を含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記免疫抑制シグナルダンパーが、
（ａ）免疫抑制因子に結合し、任意に抗体もしくはその抗原結合断片である細胞外ドメイン、
（ｂ）免疫抑制因子および膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、または
（ｃ）免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを前記細胞に伝達不可能である修飾細胞内ドメインと、を含む、請求項９２〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記免疫抑制シグナルダンパーの前記細胞外ドメインおよび／または膜貫通ドメインが、前記ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインおよび／または膜貫通ドメインである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記免疫力エンハンサーが、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される、請求項９２〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記免疫賦活因子が、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記フリップ受容体が、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインと、ＴＧＦβＲ２膜貫通ドメインと、前記ＴＧＦβＲ２膜貫通ドメインの前記Ｃ末端終端にフレーム内で融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
前記フリップ受容体が、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインと、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインと、前記ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインの前記Ｃ末端終端にフレーム内で融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記フリップ受容体が、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインと、前記ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインの前記Ｃ末端終端にフレーム内で融合されたＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインと、同じく単離された細胞内ドメインと、を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０７】
前記遺伝子操作された抗原受容体が、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、またはゼータカインからなる群から選択される、請求項９２〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ドナー修復テンプレートが、前記ＤＳＢのヒトＴＧＦβＲ２遺伝子配列５´に対して相同な５´相同アームと、前記ＤＳＢのヒトＴＧＦβＲ２遺伝子配列３´に対して相同な３´相同アームと、を含む、請求項８０〜１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記５´および３´相同アームの長さが、約１００ｂｐ〜約２５００ｂｐから独立して選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記５´および３´相同アームの長さが、約６００ｂｐ〜約１５００ｂｐから独立して選択される、請求項１０８または請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記５´相同アームが約１５００ｂｐであり、前記３´相同アームが約１０００ｂｐである、請求項１０８〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記５´相同アームが約６００ｂｐであり、前記３´相同アームが約６００ｂｐである、請求項１０８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
ウイルスベクターが、前記細胞内に前記ドナー修復テンプレートを導入するために使用される、請求項８０〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ２由来の１つ以上のＩＴＲを有する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する、請求項１１４または請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６血清型を有する、請求項１１４〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記レトロウイルスが、レンチウイルスである、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１９】
前記レンチウイルスが、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）である、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
有効量の請求項７６または請求項７７に記載の組成物を対象に投与することを含む、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、またはそれらに関連する状態の少なくとも１つの症状を治療、予防、または緩和する、方法。
【請求項１２１】
有効量の請求項７６または請求項７７に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、固形癌を治療する方法。
【請求項１２２】
前記固形癌が、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、脳癌、肉腫、頭頸部癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌を含む、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
有効量の請求項７６または請求項７７に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、血液学的悪性腫瘍を治療する方法。
【請求項１２４】
前記血液学的悪性腫瘍が、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である、請求項１２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２０１６年１０月２８日出願の米国出願第６２／４１４，２６０号、および２０１６年１０月１７日出願の米国仮出願第６２／４０９，１６３号の利益を主張するものであり、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する陳述
本出願に関連する配列表は、ハードコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むこのテキストファイルの名前は、ＢＬＢＤ＿０７８＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。本テキストファイルは７９ＫＢであり、２０１７年１０月１７日に作成され、本明細書の出願と同時に、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
背景
【０００３】
本開示は、改善されたゲノム編集組成物に関する。より具体的には、本開示は、ヒト形質転換成長因子ベータ受容体２（ＴＧＦβＲ２）遺伝子を編集するための、ヌクレアーゼバリアント、組成物、およびそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
癌の世界的な負担は、１９７５年〜２０００年の間に２倍となった。癌は、世界中の疾病率および死亡率の２番目に高い要因であり、２０１２年において新たな症例はおよそ１４１０万件、癌関連死は８２０万件となっている。最も一般的な癌は、乳癌、肺および気管支癌、前立腺癌、結腸および直腸癌、膀胱癌、皮膚の黒色腫、非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、腎臓および腎盂癌、子宮内膜癌、白血病、ならびに膵臓癌である。新たな癌症例件数は、今後２０年以内で２２００万件に上昇すると予想される。
【０００５】
免疫系は、ヒト癌の検出および撲滅において主要な役割を有する。形質転換された細胞の大部分は、免疫センチネルによって迅速に検出され、クローン的に発現されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した抗原特異的Ｔ細胞の活性化を通して破壊される。したがって、癌は、免疫学的障害、すなわち、この疾患を恒久的に抑制および排除するために必要な抗腫瘍応答を開始する免疫系の機能障害とみなすことができる。癌をより有効に撲滅するために、過去数十年間にわたって開発されたある特定の免疫療法介入は、Ｔ細胞免疫性を強化することに特に注力してきた。これらの治療は、疾患寛解の孤発例をもたらしてきたのみであり、実質的な全体的奏功は達成していない。ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１などのＴ細胞活性化を阻害する分子を標的とするモノクローナル抗体を使用するより最近の療法は、より実質的な抗腫瘍効果を示してきたが、これらの治療はまた、全身免疫活性化に起因する実質的な毒性にも関連する。
【０００６】
より最近では、Ｔ細胞の単離、修飾、増大、および再注入に基づく養子細胞免疫療法戦略が探索されており、早期段階の臨床試験で試験されている。Ｔ細胞はしばしば、それらの選択的認識および強力なエフェクター機構に起因して、癌免疫療法のための一般的に好まれるエフェクター細胞となっている。これらの治療は、まちまちな奏効率を示してきたが、少数の患者は、恒久的な寛解を経験しており、Ｔ細胞ベースの免疫療法の未だ実現されていない可能性を強調している。
【０００７】
細胞溶解性Ｔ細胞による腫瘍細胞関連抗原の成功裏の認識は、標的とする腫瘍の溶解を惹起し、任意の有効な癌免疫療法手法を実証する。腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）は、腫瘍関連抗原に特異的に指向されたＴＣＲを発現するが、実質的な数のＴＩＬは、少数のヒト癌のみに限定される。遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、多くの癌および他の免疫障害に対するＴ細胞ベースの免疫療法の適用性を増加させる可能性がある。
【０００８】
その上、最新技術による遺伝子操作されたＴ細胞は依然として、癌細胞、炎症性細胞、間質細胞、およびサイトカインからなる複雑な免疫抑制腫瘍微小環境によって調節される。これらの構成要素のうち、癌細胞、炎症性細胞、および抑制性サイトカインがＴ細胞表現型および機能に不利に影響する。集合的に、腫瘍微小環境は、Ｔ細胞が疲弊したＴ細胞へと最終的に分化するよう駆り立てる。
【０００９】
Ｔ細胞疲弊は、阻害性受容体の増加した発現または阻害性受容体による増加したシグナル伝達、低減されたエフェクターサイトカイン産生、および持続して癌を排除する能力の減少によって特徴付けられる慢性的環境における、Ｔ細胞機能不全の状態である。疲弊したＴ細胞はまた、階層的様式で機能喪失を示し、すなわち、減少したＩＬ−２産生およびエクスビボでの殺傷能力が疲弊の早期段階で喪失され、ＴＮＦ−α産生が中期段階で喪失され、ＩＦＮ−γおよびＧｚｍＢ産生が疲弊の後期段階で喪失される。腫瘍微小環境におけるほとんどのＴ細胞は、疲弊したＴ細胞へと分化し、癌を排除する能力を喪失し、最終的には取り除かれる。
【００１０】
ＴＧＦβは、腫瘍微小環境において免疫抑制シグナル伝達分子として関連している多面性サイトカインである。ＴＧＦβは、ＴＧＦβＲ１およびＴＧＦβＲ２セリン／スレオニンキナーゼ受容体複合体に結合し、下流転写因子Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３の受容体媒介性リン酸化をもたらす。多くの腫瘍は、ＴＧＦβＲ２受容体および／または下流Ｓｍａｄシグナル伝達タンパク質中の変異を獲得することによって、ＴＧＦβの細胞静止性および抗増殖性効果から逃れる。ＴＧＦβは、ＩＦＮγ分泌を含む、インビトロのＴ細胞のエフェクターおよび細胞溶解性活性に関与する重要な分子を抑制する。
【００１１】
現在まで、中和Ａｂｓまたはキナーゼ阻害剤を使用するＴＧＦβシグナル伝達の阻害に指向された臨床試験は、残念な結果をもたらしており、著しい療法的利益は報告されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示は、概して、ヒト形質転換成長因子ベータ受容体２（ＴＧＦβＲ２）遺伝子内の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびｍｅｇａＴＡＬを含む組成物、ならびにその使用方法に部分的に関する。
【００１３】
種々の実施形態において、本開示は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位を切断するホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントを含むポリペプチドを部分的に企図する。
【００１４】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）バリアントである。
【００１５】
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、ＨＥバリアントの生物学的に活性な断片を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸を欠いている。
【００１７】
追加の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、４個のＮ末端アミノ酸を欠いている。
【００１８】
ある特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、８個のＮ末端アミノ酸を欠いている。
【００１９】
特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸を欠いている。
【００２０】
特定の実施形態において、ここで、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、Ｃ末端アミノ酸を欠いている。
【００２１】
いくつかの実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ＨＥと比較して、２個のＣ末端アミノ酸を欠いている。
【００２２】
さらなる実施形態において、ＨＥバリアントは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである。
【００２３】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥのバリアントである。
【００２４】
さらなる実施形態において、ＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントである。
【００２５】
追加の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号：１〜５に記載のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片の１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるＤＮＡ認識インターフェースにおいて１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００２６】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号：１〜５に記載のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片の１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるＤＮＡ認識インターフェースにおいて少なくとも５、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む。
【００２７】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＴＧＦβＲ２標的部位を切断し、配列番号：１〜５またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか１つの位置：２６、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７５、７６、７８、８０、１１６、１３８、１４３、１５９、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８８、１９０、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０３、２０７、２２３、２２５、２２７、２３２、２４０、および２６４からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置において少なくとも５、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む。
【００２８】
ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＴＧＦβＲ２標的部位を切断し、配列番号：１〜５またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか１つの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｍ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｑ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｋ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｎ、Ｓ４０Ｇ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｖ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｒ、Ｎ７５Ｇ、Ａ７６Ｓ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｄ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０ＲもしくはＳ１９０Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｔ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｒ、Ｆ２３２Ｎ、Ｔ２４０Ｒ、およびＥ２６４Ｋのうちの少なくとも５、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、ＴＧＦβＲ２標的部位を切断し、配列番号：１〜５またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか１つの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｍ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｑ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｋ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｎ、Ｓ４０Ｇ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｖ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｒ、Ｎ７５Ｇ、Ａ７６Ｓ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｄ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｒ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｔ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｒ、Ｆ２３２Ｎ、およびＴ２４０Ｒのうちの少なくとも５、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【００３０】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＴＧＦβＲ２標的部位を切断し、配列番号：１〜５またはそれらの生物学的に活性な断片のいずれか１つの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｍ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｑ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｋ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｎ、Ｓ４０Ｇ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｖ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｒ、Ｎ７５Ｇ、Ａ７６Ｓ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｄ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｒ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｔ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｒ、Ｆ２３２Ｎ、Ｔ２４０Ｒ、およびＥ２６４Ｋのうちの少なくとも５、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【００３１】
追加の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号：６もしくは７に記載されるアミノ酸配列、またはそれらの生物学的に活性な断片と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、またはさらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００３２】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号：６に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
【００３３】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、配列番号：７に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
【００３４】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号：１１に記載されるポリヌクレオチド配列に結合する。
【００３５】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインをさらに含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる群から選択される。
【００３７】
ある特定の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、約９．５のＴＡＬＥ繰り返し単位〜約１５．５のＴＡＬＥ繰り返し単位を含む。
【００３８】
追加の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＧＦβＲ２遺伝子内のポリヌクレオチド配列に結合する。
【００３９】
特定の実施形態において、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号：１２に記載されるポリヌクレオチド配列に結合する。
【００４０】
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号：１３に記載されるポリヌクレオチド配列に結合し、それを切断する。
【００４１】
ある特定の実施形態において、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインは、２、３、４、５、６、７、または８つの亜鉛フィンガーモチーフを含む。
【００４２】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、ペプチドリンカーおよびエンドプロセシング酵素またはそれらの生物学的に活性な断片をさらに含む。
【００４３】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、ウイルス自己切断型２Ａペプチドおよびエンドプロセシング酵素またはそれらの生物学的に活性な断片をさらに含む。
【００４４】
追加の実施形態において、エンドプロセシング酵素またはその生物学的に活性な断片は、５´−３´エクソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、３´−５´エクソヌクレアーゼ、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。
【００４５】
特定の実施形態において、エンドプロセシング酵素は、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片を含む。
【００４６】
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号：８〜９のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
【００４７】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号：８に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
【００４８】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号：９に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
【００４９】
さらなる実施形態において、ポリペプチドは、配列番号：１１または１３に記載されるポリヌクレオチド配列でヒトＴＧＦβＲ２遺伝子を切断する。
【００５０】
種々の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを部分的に企図する。
【００５１】
特定の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを部分的に企図する。
【００５２】
特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、配列番号：２０に記載される配列を含む。
【００５３】
種々の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするｃＤＮＡを部分的に企図する。
【００５４】
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを部分的に企図する。
【００５５】
種々の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドを含む細胞を部分的に企図する。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞を部分的に企図する。
【００５７】
種々の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるベクターを含む細胞を部分的に企図する。
【００５８】
追加の実施形態において、本開示は、本明細書で企図されるポリペプチドによって導入された１つ以上のゲノム修飾を含む細胞を部分的に企図する。
【００５９】
特定の実施形態において、本細胞は、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００６０】
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む。
【００６１】
特定の実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、短ＥＦ１αプロモーター、長ＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、それらの間に散在し、および／またはそれらに隣接する１つ以上の自己切断型ウイルスペプチドをさらにコードする。
【００６３】
いくつかの実施形態において、自己切断型ウイルスペプチドは、２Ａペプチドである。
【００６４】
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、キヌレニナーゼ活性を含む。
【００６７】
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合し、任意に抗体もしくはその抗原結合断片である細胞外ドメイン、免疫抑制因子および膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、または免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを細胞に伝達不可能である修飾細胞内ドメインと、を含む。
【００６８】
ある特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーの細胞外ドメインおよび／または膜貫通ドメインは、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインおよび／または膜貫通ドメインである。
【００６９】
いくつかの実施形態において、免疫力エンハンサーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される。
【００７０】
特定の実施形態において、免疫賦活因子は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される。
【００７１】
追加の実施形態において、フリップ受容体は、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインと、ＴＧＦβＲ２膜貫通ドメインと、ＴＧＦβＲ２膜貫通ドメインのＣ末端終端にフレーム内で融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む。
【００７２】
ある特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインと、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインと、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインのＣ末端終端にフレーム内で融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む。
【００７３】
特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインと、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインのＣ末端終端にフレーム内で融合されたＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインと、同じく単離された細胞内ドメインと、を含む。
【００７４】
追加の実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、またはゼータカイン（ｚｅｔａｋｉｎｅ）からなる群から選択される。
【００７５】
特定の実施形態において、遺伝子操作された受容体は、ＴＧＦβＲ２遺伝子に一体化されない。
【００７６】
ある特定の実施形態において、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドは、ＴＧＦβＲ２遺伝子に一体化される。
【００７７】
さらなる実施形態において、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートは、本明細書で企図されるポリペプチドによって導入されたＤＮＡ２本鎖の破断部位でＴＧＦβＲ２遺伝子に一体化される。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本細胞は、造血細胞である。
【００７９】
追加の実施形態において、本細胞は、Ｔ細胞である。
【００８０】
特定の実施形態において、本細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ８＋細胞である。
【００８１】
特定の実施形態において、本細胞は、免疫エフェクター細胞である。
【００８２】
さらなる実施形態において、本細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である。
【００８３】
ある特定の実施形態において、本細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。
【００８４】
特定の実施形態において、本細胞の源は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。
【００８５】
特定の実施形態において、本開示は、本明細書で企図される１つ以上の細胞を含む複数の細胞を部分的に企図する。
【００８６】
種々の実施形態において、本開示は、本明細書で企図される１つ以上の細胞を含む組成物を部分的に企図する。
【００８７】
ある特定の実施形態において、本開示は、本明細書で企図される１つ以上の細胞と、生理学的に許容可能な担体と、を含む組成物を部分的に企図する。
【００８８】
種々の実施形態において、本開示は、細胞内に本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、ここで、ポリペプチドの発現が、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位で２本鎖の破断を作成する、細胞内のヒトＴＧＦβＲ２遺伝子を編集する方法を部分的に企図する。
【００８９】
いくつかの実施形態において、本開示は、細胞内に本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することを含み、ここで、ポリペプチドの発現が、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位で２本鎖の破断を作成し、破断が、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって修復される、細胞内のヒトＴＧＦβＲ２遺伝子を編集する方法を部分的に企図する。
【００９０】
種々の実施形態において、本開示は、細胞内に本明細書で企図されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびドナー修復テンプレートを導入することを含み、ここで、ポリペプチドの発現が、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位で２本鎖の破断を作成し、ドナー修復テンプレートが、２本鎖の破断（ＤＳＢ）の部位で相同組換え修復（ＨＤＲ）によってヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内に組み込まれる、細胞内のヒトＴＧＦβＲ２遺伝子を編集する方法を部分的に企図する。
【００９１】
さらなる実施形態において、本細胞は、造血細胞である。
【００９２】
特定の実施形態において、本細胞は、Ｔ細胞である。
【００９３】
特定の実施形態において、本細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、および／またはＣＤ８＋細胞である。
【００９４】
ある特定の実施形態において、本細胞は、免疫エフェクター細胞である。
【００９５】
いくつかの実施形態において、本細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である。
【００９６】
特定の実施形態において、本細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。
【００９７】
ある特定の実施形態において、本細胞の源は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。
【００９８】
特定の実施形態において、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。
【００９９】
追加の実施形態において、５´−３´エクソヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドは、本細胞内に導入されている。
【０１００】
いくつかの実施形態において、Ｔｒｅｘ２またはその生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドが、本細胞内に導入されている。
【０１０１】
さらなる実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＴＧＦβＲ２遺伝子、または野生型ＴＧＦβＲ２遺伝子と比較して、１つ以上の変異を含むその部分をコードする。
【０１０２】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体のうちの１つ以上をコードする。
【０１０３】
追加の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結されたＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターをさらに含む。
【０１０４】
さらなる実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、短ＥＦ１αプロモーター、長ＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーター、および骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される。
【０１０５】
ある特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体に作動可能に連結され、それらの間に散在し、および／またはそれらに隣接する１つ以上の自己切断型ウイルスペプチドをさらにコードする。
【０１０６】
追加の実施形態において、自己切断型ウイルスペプチドは、２Ａペプチドである。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ドナー修復テンプレートは、異種ポリアデニル化シグナルをさらに含む。
【０１０８】
ある特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に対抗する酵素機能を含む。
【０１０９】
さらなる実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、キヌレニナーゼ活性を含む。
【０１１０】
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合し、任意に抗体もしくはその抗原結合断片である細胞外ドメイン、免疫抑制因子および膜貫通ドメインに結合する細胞外ドメイン、または免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを細胞に伝達不可能である修飾細胞内ドメインと、を含む。
【０１１１】
追加の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーの細胞外ドメインおよび／または膜貫通ドメインは、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインおよび／または膜貫通ドメインである。
【０１１２】
ある特定の実施形態において、免疫力エンハンサーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫賦活因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される。
【０１１３】
さらなる実施形態において、疫賦活因子は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される。
【０１１４】
特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインと、ＴＧＦβＲ２膜貫通ドメインと、ＴＧＦβＲ２膜貫通ドメインのＣ末端終端にフレーム内で融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む。
【０１１５】
追加の実施形態において、フリップ受容体は、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインと、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインと、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインのＣ末端終端にフレーム内で融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインと、を含む。
【０１１６】
さらなる実施形態において、フリップ受容体は、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインと、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインのＣ末端終端にフレーム内で融合されたＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７から単離された膜貫通ドメインと、同じく単離された細胞内ドメインと、を含む。
【０１１７】
追加の実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、Ｄａｒｉｃ、またはゼータカイン（ｚｅｔａｋｉｎｅ）からなる群から選択される。
【０１１８】
追加の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＳＢのヒトＴＧＦβＲ２遺伝子配列５´に対して相同な５´相同アームと、ＤＳＢのヒトＴＧＦβＲ２遺伝子配列３´に対して相同な３´相同アームと、を含む。
【０１１９】
特定の実施形態において、５´および３´相同アームの長さは独立して、約１００ｂｐ〜約２５００ｂｐから選択される。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、５´および３´相同アームの長さは独立して、約６００ｂｐ〜約１５００ｂｐから選択される。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、５´相同アームは約１５００ｂｐであり、３´相同アームは約１０００ｂｐである。
【０１２２】
ある特定の実施形態において、５´相同アームは約６００ｂｐであり、３´相同アームは約６００ｂｐである。
【０１２３】
特定の実施形態において、ウイルスベクターは、本細胞内にドナー修復テンプレートを導入するために使用される。
【０１２４】
追加の実施形態において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである。
【０１２５】
さらなる実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来の１つ以上のＩＴＲを有する。
【０１２６】
ある特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する。
【０１２７】
追加の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２またはＡＡＶ６血清型を有する。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。
【０１２９】
特定の実施形態において、レンチウイルスは、インテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ）である。
【０１３０】
種々の実施形態において、本開示は、有効量の本明細書で企図される組成物を対象に投与することを含む、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、またはそれらに関連する状態の少なくとも１つの症状を治療、予防、または緩和する方法を部分的に企図する。
【０１３１】
種々の実施形態において、本開示は、有効量の本明細書で企図される組成物を対象に投与することを含む、固形癌を治療する方法を部分的に企図する。
【０１３２】
さらなる実施形態において、固形癌は、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、脳癌、肉腫、頭頸部癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌を含む。
【０１３３】
種々の実施形態において、本開示は、有効量の本明細書で企図される組成物を対象に投与することを含む、血液学的悪性腫瘍を治療する方法を部分的に企図する。
【０１３４】
追加の実施形態において、血液学的悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】ＴＧＦβＲ２遺伝子およびエクソン６におけるＨＥ標的部位を示す（配列番号：６０および６１）。
【図２】３回の選別（ＣＴＤドメインに関しては、３回の並行スクリーニングのうち１回のみ成功したが、ＮＴＤドメインに関しては４回成功した）を通して、キメラ型「ハーフ部位」に対するＮＴＤおよびＣＴＤを遺伝子操作することによって、ＴＧＦβＲ２  ＨＥを再プログラミングし、その後、再プログラミングされたドメインの融合および完全なＴＧＦβＲ２標的部位に対するスクリーニングを行って、完全に再プログラミングされたＨＥを単離した方法を示す。
【図３】染色体レポーターアッセイにおけるＴＧＦβＲ２  ＨＥバリアントの活性、ならびにより厳密な条件下で変異誘発およびスクリーニングを通してより活性なバリアントを達成するためのＴＧＦβＲ２．Ｂ３の後の精製において増加した活性を示す。
【図４】ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８  ＨＥバリアントの酵母表面の親和性力価測定を示す。
【図５】野生型Ｉ−ＯｎｕＩタンパク質（配列番号：６２）に対する精製前および精製後のＴＧＦβＲ２  ＨＥバリアント（配列番号：６３および６４）の整列を示し、同一ではない位置を強調する。
【図６】ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬを生成するためにＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８  ＨＥバリアントに融合されたＴＡＬ  ＲＶＤの結合部位（配列番号：６５および６６）を示す。
【図７】Ｔｒｅｘ２の有無にかかわらず、Ｔ細胞内へのＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬの共送達が、標的遺伝子座での約６５％の編集を示すことを示す。
【図８】ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬ処理が、ｒＴＧＦβ−１リガンド刺激を介してＳｍａｄ２／３のリン酸化を実質的に低減することを示す。
【図９】ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬで処理された未形質導入（Ａ）Ｔ細胞または抗ＧＤ２ＣＡＲ発現（Ｂ）Ｔ細胞の編集効率を示す。未形質導入および抗ＧＤ２ＣＡＲの形質導入細胞の編集率は類似しており、それぞれ８９％および８９．６％である。
【図１０】ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬ処理が、未形質導入および抗ＧＤ２ＣＡＲ発現ヒトＴ細胞の両方において、ｒＴＧＦβ−１リガンド刺激を介してＳｍａｄ２／３のリン酸化を実質的に低減させることを示す。（Ａ）フローサイトメトリーによるｐＳＭＡＤ２／３の染色。未染色細胞を染色の負の対照として使用した。（Ｂ）ｐＳＭＡＤ２／３シグナルの平均蛍光強度。
【図１１】ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬで電気穿孔しｒＴＧＦβ−１の存在下でＧＤ２発現標的細胞と共に共培養した抗ＧＤ２ＣＡＲ  Ｔ細胞が、ｒＴＧＦβ−１に曝露した対照処理した細胞内でＩＦＮγ（Ａ）およびＩＬ−２（Ｂ）分泌の抑制解除をもたらすことを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１３６】
配列識別子の簡単な説明
配列番号：１は、野生型Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）のアミノ酸配列である。
【０１３７】
配列番号：２は、野生型Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨのアミノ酸配列である。
【０１３８】
配列番号：３は、野生型Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥの生物学的に活性な断片のアミノ酸配列である。
【０１３９】
配列番号：４は、野生型Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥの生物学的に活性な断片のアミノ酸配列である。
【０１４０】
配列番号：５は、野生型Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥの生物学的に活性な断片のアミノ酸配列である。
【０１４１】
配列番号：６は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するように再プログラミングされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
【０１４２】
配列番号：７は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するように再プログラミングされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントのアミノ酸配列である。
【０１４３】
配列番号：８は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
【０１４４】
配列番号：９は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
【０１４５】
配列番号：１０は、マウスＴｒｅｘ２に融合されたヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するｍｅｇａＴＡＬのアミノ酸配列である。
【０１４６】
配列番号：１１は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６におけるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアント標的部位である。
【０１４７】
配列番号：１２は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６におけるＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン標的部位である。
【０１４８】
配列番号：１３は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６におけるｍｅｇａＴＡＬ標的部位である。
【０１４９】
配列番号：１４は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６におけるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントＮ末端ドメイン標的部位である。
【０１５０】
配列番号：１５は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６におけるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントＮ末端ドメイン標的部位である。
【０１５１】
配列番号：１６は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６におけるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントＮ末端ドメイン標的部位である。
【０１５２】
配列番号：１７は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６におけるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントＮ末端ドメイン標的部位である。
【０１５３】
配列番号：１８は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６におけるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントＣ末端ドメイン標的部位である。
【０１５４】
配列番号：１９は、ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８表面ディスプレイプラスミドのポリヌクレオチド配列である。
【０１５５】
配列番号：２０は、ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡ配列である。
【０１５６】
配列番号：２１は、マウスＴｒｅｘ２をコードするｍＲＮＡ配列である。
【０１５７】
配列番号：２２は、マウスＴｒｅｘ２をコードするアミノ酸配列である。
【０１５８】
配列番号：２３〜３３は、種々のリンカーのアミノ酸配列を記載する。
【０１５９】
配列番号：３４〜５８は、プロテアーゼ切断部位および自己切断型ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を記載する。
【０１６０】
前述の配列において、Ｘは、存在する場合、任意のアミノ酸またはアミノ酸の不在を指す。
［発明を実施するための形態］
【０１６１】
Ａ概観
本開示は、概して、改善されたゲノム編集組成物およびその使用方法に部分的に関する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、種々の実施形態において企図されるゲノム編集組成物は、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、もしくはそれらに関連する状態を予防もしくは治療するために、またはそれらの少なくとも１つの症状を緩和するために使用され得る。既存の養子細胞療法を悩ませるある制限または問題は、腫瘍微小環境によって媒介された疲弊に起因する免疫エフェクター細胞の低応答性である。疲弊したＴ細胞は、ナイーブ、エフェクター、またはメモリーＴ細胞と著しく異なる固有の分子シグネチャを有する。それらは、減少したサイトカイン発現およびエフェクター機能を有するＴ細胞として定義される。ＴＧＦβシグナル伝達は、腫瘍微小環境におけるＴ細胞疲弊と関連しており、ＴＧＦβＲ１／ＴＧＦβＲ２を通る増加したＴＧＦβシグナル伝達は、減少したＴ細胞増殖およびＩＦＮ−γの低減した産生に関連する。
【０１６２】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、ＴＧＦβＲ２発現および／またはＴＧＦβを介するシグナル伝達を排除、減少、または減衰させることによって疲弊に対してより耐性を有するように作製される。
【０１６３】
種々の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヒト形質転換成長因子ベータ受容体２（ＴＧＦβＲ２）遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するように設計されたヌクレアーゼバリアントを含む。特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントを使用して、標的ポリヌクレオチド配列における２本鎖の破断を導入することができ、これは、ポリヌクレオチドテンプレート、例えば、ドナー修復テンプレートの不在下で非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって、またはドナー修復テンプレートの存在下で相同組換え修復（ＨＤＲ）、すなわち相同組換えによって修復され得る。ある特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントはまた、ニッカーゼとして設計され得、これは、ドナー修復テンプレートの存在下で細胞の塩基除去修復（ＢＥＲ）機構または相同組換えを使用して修復され得る、１本鎖ＤＮＡの破断を生成する。ＮＨＥＪは、遺伝子機能を撹乱する小さな挿入および欠失の形成を頻繁にもたらす、エラーの起こりやすいプロセスである。相同組換えは、修復用のテンプレートとして相同ＤＮＡを必要とし、これを活用して、標的部位に隣接する領域に対して相同性を有する配列が両側に隣接する、標的部位における所望の配列を含有するドナーＤＮＡの導入によって指定される限りなく多様な修飾を作成することができる。
【０１６４】
１つの好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子を標的とするホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬを含む。
【０１６５】
１つの好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬおよびエンドプロセシング酵素、例えば、Ｔｒｅｘ２を含む。
【０１６６】
種々の実施形態において、ゲノム編集された細胞が企図される。ゲノム編集された細胞は、編集されたＴＧＦβＲ２遺伝子を含み、ここで、編集戦略は、ＴＧＦβＲ２の細胞外リガンド結合ドメインを発現させるが、それが免疫抑制細胞内シグナルを伝達する能力を撹乱することによって、ＴＧＦβＲ２発現を減少もしくは排除するように、および／または優性阻害として機能するようにＴＧＦβＲ２を取り入れるように設計される。
【０１６７】
種々の実施形態において、ＤＮＡ破断は、Ｔ細胞、例えば、免疫エフェクター細胞内のＴＧＦβＲ２遺伝子の標的部位において生成され、切断されたゲノム配列の終端のＮＨＥＪは、細胞にＴＧＦβＲ２発現をほとんどまたは全くもたらさず、好ましくは、機能的ＴＧＦβＲ２発現および／またはシグナル伝達を欠いているかまたは実質的に欠いている、例えば、Ｔ細胞疲弊を増加させる能力を欠いているＴ細胞をもたらし得る。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、機能的ＴＧＦβＲ２発現を欠いているＴ細胞は、免疫抑制およびＴ細胞疲弊に対してより耐性を有し、したがって、より持続性があり、かつ療法的に有効である。
【０１６８】
種々の他の実施形態において、切断されたＴＧＦβＲ２ゲノム配列の修復用のドナーテンプレートが提供される。ＴＧＦβＲ２遺伝子は、ＤＮＡ破断部位での相同組換えによってテンプレートの配列で修復される。特定の実施形態において、修復テンプレートは、機能的ＴＧＦβＲ２発現を撹乱、および好ましくは実質的に減少または排除するポリヌクレオチド配列を含む。
【０１６９】
特定の実施形態において、ＴＧＦβＲ２遺伝子は、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインのリガンドに対して増加した親和性を有するＴＧＦβＲ２細胞外ドメインをコードするテンプレートで修復される。
【０１７０】
特定の実施形態において、ＴＧＦβＲ２遺伝子は、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドで修復される。
【０１７１】
特定の実施形態において、ＴＧＦβＲ２遺伝子は、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドで修復され、内因性ＴＧＦβＲ２プロモーターを採用して、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体の発現を転写的に制御するようにＴＧＦβＲ２遺伝子内に導入される。
【０１７２】
好ましい実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子を編集するために使用される。
【０１７３】
したがって、本明細書で企図される方法および組成物は、既存の養子細胞療法と比較して飛躍的改善を表す。
【０１７４】
特定の実施形態の実践は、特にそれとは反対の指定がない限り、当業者の技能の範囲内にある、化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を用いることになり、これらの多くが例示説明の目的で下記に記載される。かかる技法は、文献で完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの定期刊行物における論文を参照されたい。
【０１７５】
Ｂ．定義
別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等のいずれの方法および材料も、特定の実施形態の実践または試験において使用され得るが、組成物、方法、および材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本開示の目的において、次の用語が下記で定義される。
【０１７６】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ、または１つ以上）を指すように本明細書で使用される。例として、「（ａｎ）要素」は、１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
【０１７７】
二者択一（例えば、「または」）の使用は、その二者択一対象の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味するように理解されるべきである。
【０１７８】
「および／または」という用語は、その二者択一対象の一方、または両方のいずれかを意味するように理解されるべきである。
【０１７９】
本明細書で使用されるとき、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して最大１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％異なる、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
【０１８０】
一実施形態において、範囲、例えば、１〜５、約５〜１、または約１〜約５は、その範囲によって包含される各数値を指す。例えば、１つの非限定的かつ単に例示的な実施形態において、範囲「１〜５」は、１、２、３、４、５、または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０、または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０という表現と同等である。
【０１８１】
本明細書で使用されるとき、「実質的に」という用語は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上である数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「実質的に同じ」は、参照の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さとおよそ同じである効果、例えば、生理学的効果を生み出す、数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。
【０１８２】
本明細書全体を通して、文脈上他の解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、述べられるステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の包含を暗示するが、任意の他のステップもしくは要素、またはステップもしくは要素の群の排除を暗示しないことが理解されよう。「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、何であれ「〜からなる」という語句に続くものを含み、かつそれらに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる」という語句は、列挙される要素が必要とされるか、または必須であること、かつ他の要素が何ら存在してはならないことを示す。「〜から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、その語句の後に列挙される任意の要素を含み、かつ、その列挙される要素に関して本開示で指定される活性または作用に干渉しないか、または寄与しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「〜から本質的になる」という語句は、列挙される要素が必要とされるか、または必須であること、ただし、列挙される要素の活性または作用に実質的に影響を及ぼす他の要素が何ら存在しないことを示す。
【０１８３】
本明細書全体を通して、「一実施形態」、「ある実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「ある特定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」、またはそれらの組み合わせへの言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通した種々の箇所での前述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、それらの特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において任意の好適な様式で組み合わされ得る。一実施形態におけるある特徴の肯定的列挙が、特定の実施形態におけるその特徴の除外の根拠として機能することも理解される。
【０１８４】
「エクスビボ」という用語は、概して、好ましくは自然条件を最小限に改変した生物の外側の人口的環境において、生体組織内もしくは生体組織上で行われる実験または測定などの、生物の外側で起こる活性を指す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物から採取され、実験室装置において、通常は滅菌条件下で、典型的には、数時間または最大約２４時間であるが、状況に応じて最大４８もしくは７２時間を含む期間、培養または調節された、生体細胞または組織を伴う。ある特定の実施形態において、かかる組織または細胞は、収集および凍結され、後にエクスビボ処理のために解凍され得る。生体細胞または組織を使用した数日よりも長く持続する組織培養実験または手順は、典型的には、「インビトロ」とみなされるが、ある特定の実施形態において、この用語は、エクスビボと互換的に使用され得る。
【０１８５】
「インビボ」という用語は、概して、生物の内側で起こる活性を指す。一実施形態において、細胞ゲノムは、遺伝子操作、編集、または修飾されたインビボである。
【０１８６】
「強化する」または「促進する」または「増加する」または「増大させる」または「増強する」は、概して、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞が、ビヒクルまたは対照物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より高い応答（すなわち、生理的応答）を産生するか、引き出すか、または引き起こす能力を指す。測定可能な応答には、当該技術分野における理解から明らかであり、かつ本明細書に記載されるものの中でもとりわけ、触媒活性、結合親和性、結合部位特異性、結合部位選択性、持続性、細胞溶解活性の増加、および／または炎症促進性サイトカインの増加が含まれ得る。「増加した」または「強化された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照物によって産生される応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上の倍率（例えば、５００、１０００倍）（それらの間の、かつ１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）である増加を含み得る。
【０１８７】
「減少させる」または「低下させる」または「減らす」または「低減する」または「弱める」または「破壊する」または「阻害する」または「減衰する」は、概して、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞が、ビヒクルまたは対照物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より低い応答（すなわち、生理的応答）を産生するか、引き出すか、または引き起こす能力を指す。測定可能な応答には、目標ではない結合親和性、目標ではない切断特異性、Ｔ細胞疲弊などの減少が含まれ得る。「減少した」または「低減された」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照物によって産生される応答（参照応答）の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上の倍率（例えば、５００、１０００倍）（それらの間の、かつ１を超える全ての整数および小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）である減少を含み得る。
【０１８８】
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化なし」、または「実質的な変化なし」、または「実質的な減少なし」は、概して、本明細書で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞が、ビヒクルまたは対照物のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、実質的に類似しているか、または同等の生理的応答（すなわち、下流効果）を産生するか、引き出すか、または引き起こす能力を指す。同等の応答は、参照応答と著しく異なるか、または測定可能な異なり（ｍｅａｓｕｒａｂｌｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ）がないものである。
【０１８９】
本明細書で使用されるとき、「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合した」または「特異的結合」または「特異的に標的とする」という用語は、バックグラウンド結合よりもより高い結合親和性での１つの分子の、別の分子への結合、例えば、ＤＮＡへのポリペプチド結合のＤＮＡ結合ドメインを説明する。結合ドメインは、それが、例えば、約１０５Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的部位に結合するか、またはそれと会合する場合、標的部位に「特異的に結合する」。ある特定の実施形態において、結合ドメインは、約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１以上のＫａで標的部位に結合する。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１以上のＫａを有する結合ドメインを指す。
【０１９０】
あるいは、親和性は、Ｍの単位での特定の結合相互作用（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ以下）の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義され得る。特定の実施形態において企図されるＤＮＡ標的部位に対する１つ以上のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼバリアントの親和性は、従来の技法、例えば、酵母細胞表面ディスプレイを使用して、または結合会合もしくは標識リガンドを使用する置換アッセイによって容易に決定され得る。
【０１９１】
一実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合よりも約２倍高いか、バックグラウンド結合よりも約５倍高いか、バックグラウンド結合よりも約１０倍高いか、バックグラウンド結合よりも約２０倍高いか、バックグラウンド結合よりも約５０倍高いか、バックグラウンド結合よりも約１００倍高いか、またはバックグラウンド結合よりも約１０００倍以上高い。
【０１９２】
「に選択的に結合する」または「に選択的に結合された」または「に選択的に結合すること」または「を選択的に標的とする」、およびは、複数の目標ではない分子の存在下での１つの分子の標的分子への好ましい結合（目標結合）を説明する。特定の実施形態において、ＨＥまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＨＥまたはｍｅｇａＴＡＬが目標ではないＤＮＡ標的結合部位に結合するよりも約５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、または１０００倍多い頻度で目標ＤＮＡ結合部位に選択的に結合する。
【０１９３】
「目標」は、標的部位配列を指す。
【０１９４】
「目標ではない」は、標的部位配列と類似しているが、同一ではない配列を指す。
【０１９５】
「標的部位」または「標的配列」は、結合および／または切断に十分な条件が存在することを条件として結合分子が結合および／または切断する核酸の部分を規定する、染色体核酸配列または染色体外核酸配列である。ポリヌクレオチド配列、または標的部位もしくは標的配列の１本鎖のみを参照する配列番号に言及するとき、ヌクレアーゼバリアントによって結合および／または切断された標的部位または標的配列は、２本鎖であり、参照配列およびその補体を含むことが理解されるであろう。好ましい実施形態において、標的部位は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内の配列である。
【０１９６】
「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによるドナー捕捉を含むがこれらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間での遺伝子情報の交換プロセスを指す。本開示の目的に関して、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）機構を介した細胞における２本鎖の破断の修復中に起こる、かかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「ドナー」分子をテンプレートとして使用して、「標的」分子（すなわち、２本鎖の破断を経験したもの）を修復し、それがドナーから標的への遺伝子情報の移入につながることから「非交差遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に知られている。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、かかる移入は、破損した標的とドナーとの間で形成するヘテロ２本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーを使用して、標的の一部となる遺伝子情報を再合成する「合成依存的単鎖アニーリング」、および／または関連するプロセスを伴い得る。かかる特殊なＨＲはしばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチド内に組み込まれるような標的分子の配列の改変をもたらす。
【０１９７】
「ＮＨＥＪ」または「非相同末端結合」は、ドナー修復テンプレートまたは相同配列の不在下での２本鎖の破断の回復を指す。ＮＨＥＪは、破断の部位に挿入および欠失をもたらし得る。ＮＨＥＪは、いくつかの下位経路によって媒介され、これらの各々は、固有の変異結果を有する。典型的なＮＨＥＪ経路（ｃＮＨＥＪ）は、ＫＵ／ＤＮＡ−ＰＫｃｓ／Ｌｉｇ４／ＸＲＣＣ４複合体を必要とし、最小プロセシングと共に終端バックにライゲーションし、しばしば破断の精密な修復をもたらす。代替的なＮＨＥＪ経路（ａｌｔＮＨＥＪ）も、ｄｓＤＮＡ破断の回復において活性であるが、これらの経路は、著しくより変異原性であり、しばしば、挿入および欠失によって特徴付けられる破断の精密ではない修復をもたらす。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、例えば、エクソヌクレアーゼ、例えば、Ｔｒｅｘ２などのエンドプロセシング酵素によるｄｓＤＮＡ破断の修飾により、精密ではない修復の可能性が増加され得ることが企図される。
【０１９８】
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合性骨格の破断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素加水分解または化学加水分解を含むがこれらに限定されない、多様な方法によって惹起され得る。１本鎖切断および２本鎖切断の両方が可能である。２本鎖切断は、２つの固有の１本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑終端または段違い終端のいずれかの産生をもたらし得る。ある特定の実施形態において、本明細書で企図されるポリペプチドおよびヌクレアーゼバリアント、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬなどは、標的２本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。エンドヌクレアーゼ切断認識部位は、いずれかのＤＮＡ鎖上にあり得る。
【０１９９】
「外因性」分子は、細胞内に通常は存在しないが、１つ以上の遺伝学的、生化学的、または他の方法によって細胞内に導入される分子である。代表的な外因性分子には、小有機分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記の分子の任意の修飾された誘導体、または上記の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体が含まれるが、これらに限定されない。外因性分子を細胞内に導入するための方法は当業者には知られており、脂質媒介移入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含む、リポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、粒子ボンバードメント、バイオポリマーナノ粒子、リン酸カルシウム共沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移入、およびウイルスベクター媒介移入が含まれるが、これらに限定されない。
【０２００】
「内因性」分子は、特定の環境条件下の特定の発生段階で特定の細胞内に通常存在するものである。追加の内因性分子には、タンパク質が含まれ得る。
【０２０１】
「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、ならびに調節配列がコード配列および／または転写配列に隣接するか否かにかかわらず遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を指す。遺伝子は、プロモーター配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界要素、ターミネーター、ポリアデニル化配列、転写後応答要素、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、複製起源、マトリックス結合部位、ならびに遺伝子座制御領域を含むが、これらに限定されない。
【０２０２】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含有される情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡ、または任意の他の種類のＲＮＡ）、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物にはまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されたタンパク質も含まれる。
【０２０３】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子操作された」または「遺伝子修飾された」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態での外部遺伝物質の、細胞内の総遺伝物質への染色体付加または染色体外付加を指す。遺伝子修飾は、細胞のゲノム内の特定の部位に対して標的とされても標的とされなくてもよい。一実施形態において、遺伝子修飾は、部位特異的である。一実施形態において、遺伝子修飾は、部位特異的ではない。
【０２０４】
本明細書で使用されるとき、「ゲノム編集」という用語は、遺伝子または遺伝子産物の発現を回復、補正、撹乱、および／または修飾する、細胞のゲノム内の標的部位での遺伝子物質の置換、欠失、および／または導入を指す。特定の実施形態において企図されるゲノム編集は、細胞のゲノム内の標的部位でまた標的部位に近接してＤＮＡ損傷を生成するために、任意に、ドナー修復テンプレートの存在下で細胞内に１つ以上のヌクレアーゼバリアントを導入することを含む。
【０２０５】
本明細書で使用されるとき、「遺伝子療法」という用語は、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を回復、補正、もしくは修飾するか、または療法的なポリペプチドを発現させる目的のための細胞内の総遺伝子物質中への余分な遺伝子物質の導入を指す。特定の実施形態において、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を回復、補正、撹乱、もしくは修飾するか、または療法的なポリペプチドを発現させる目的のためのゲノム編集による細胞のゲノム内への遺伝子物質の導入が、考慮される遺伝子療法である。
【０２０６】
「免疫障害」は、免疫系からの応答を喚起する疾患を指す。特定の実施形態において、「免疫障害」という用語は、癌、移植片対宿主疾患、自己免疫疾患、または免疫不全を指す。一実施形態において、免疫障害は、感染性疾患を包含する。
【０２０７】
本明細書で使用されるとき、「癌」という用語は、概して、異常な細胞が制限なく分裂し、近隣組織に浸潤し得る、疾患または病態の分類を指す。
【０２０８】
本明細書で使用されるとき、「悪性」という用語は、腫瘍細胞の群が無制限の成長（すなわち、正常な限度を超えた分裂）、浸潤（すなわち、隣接組織への侵入およびその破壊）、および転移（すなわち、リンパまたは血液を介した体内の他の場所への広がり）のうちの１つ以上を示す癌を指す。
【０２０９】
本明細書で使用されるとき、「転移する」という用語は、身体の１つの部分から別の部分への癌の広がりを指す。広がった細胞によって形成される腫瘍は、「転移性腫瘍」または「転移」と呼ばれる。転移性腫瘍は、原発（一次）腫瘍と同様である細胞を含有する。
【０２１０】
本明細書で使用されるとき、「良性」または「非悪性」という用語は、より大きく成長し得るが、身体の他の部分には広がらない腫瘍を指す。良性腫瘍は、自己制限的であり、典型的には、浸潤または転移しない。
【０２１１】
「癌細胞」または「腫瘍細胞」は、癌性成長または組織の個々の細胞を指す。腫瘍は、概して、良性、前悪性、または悪性であり得る細胞の異常な成長によって形成される腫脹または病変を指す。ほとんどの癌が腫瘍を形成するが、一部、例えば、白血病は、必ずしも腫瘍を形成しない。腫瘍を形成する癌に関して、癌（細胞）および腫瘍（細胞）という用語は、互換的に使用される。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定され得る「腫瘍負荷」である。
【０２１２】
「移植片対宿主疾患」または「ＧＶＨＤ」は、細胞、組織、または固形臓器の移植後に起こり得る合併症を指す。ＧＶＨＤは、移植したドナー細胞が移植受容者の身体を攻撃する幹細胞移植後または骨髄移植後に起こり得る。ヒトにおける急性ＧＶＨＤは、移植後約６０日以内に起こり、細胞溶解性リンパ球の作用によって皮膚、肝臓、および内臓に損傷をもたらす。慢性的なＧＶＨＤは後に起こり、主に皮膚に影響を及ぼす全身性自己免疫疾患であり、Ｂ細胞のポリクローナル活性化、ならびにＩｇおよび自己抗体の過剰産生をもたらす。固形臓器移植片対宿主疾患患（ＳＯＴ−ＧＶＨＤ）は、２つの形態で起こる。より一般的な種類のものは、抗体による媒介であり、ここで、血液型がＯであるドナーからの抗体が、血液型がＡ、Ｂ、またはＡＢである受容者における受容者の赤血球細胞を攻撃し、軽度かつ一過性の溶血性貧血をもたらす。ＳＯＴ−ＧＶＨＤの第２の形態は、高い死亡率に関連する細胞型であり、ここで、ドナー由来のＴ細胞が、ほとんどの場合、皮膚、肝臓、胃腸管、および骨髄において免疫学的に異種の宿主組織に対する免疫学的攻撃を生み出し、これらの臓器において合併症をもたらす。
【０２１３】
「移植片対白血病」または「ＧＶＬ」は、ドナーの移植組織、例えば、骨髄または末梢血液に存在する免疫細胞による人の白血病細胞に対する免疫応答を指す。
【０２１４】
「自己免疫疾患」は、身体がその自己の組織の一部の構成要素に対する免疫原性（すなわち、免疫系）応答を生み出す疾患を指す。換言すると、免疫系は、体内の一部の組織または系を「自己」として認識するその能力を喪失し、それをあたかも異物であるかのように標的とし攻撃する。自己免疫疾患の例示的な例には、関節炎、炎症性腸疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、狼瘡、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、溶血性貧血、抗免疫（ａｎｔｉ−ｉｍｍｕｎｅ）甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬などが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１５】
「免疫不全」は、疾患によってまたは化学物質の投与によって免疫系が損なわれた患者の状態を意味する。この病態では、系は、異物に対して防御するのに必要とされる血球の数および種類が欠損するようになる。免疫不全病態または疾患は当該技術分野において知られており、例えば、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全疾患）、選択的ＩｇＡ欠損症、分類不能型免疫不全症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、慢性肉芽腫性疾患、高ＩｇＭ症候群、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、および糖尿病が含まれる。
【０２１６】
「感染性疾患」は、人から人へと、または生物から生物へと伝染し得、微生物またはウイルス因子によって引き起こされる疾患（例えば、感冒）を指す。感染性疾患は当該技術分野において知られており、例えば、肝炎、性行為感染症（例えば、クラミジア感染症、淋病）、結核症、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ジフテリア、肝炎Ｂ、肝炎Ｃ、コレラ、およびインフルエンザが含まれる。
【０２１７】
本明細書で使用されるとき、「個体」および「対象」という用語はしばしば互換的に使用され、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、遺伝子療法ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞、および本明細書の他の箇所で企図される方法を用いて治療され得る免疫障害の症状を呈する任意の動物を指す。好適な対象（例えば、患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜、および飼育動物またはペット（ネコまたはイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、および好ましくは、ヒト対象が含まれる。典型的な対象には、免疫障害を有するか、それを有すると診断されているか、またはそれを有する危険性があるヒト患者が含まれる。
【０２１８】
本明細書で使用されるとき、「患者」という用語は、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、遺伝子療法ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞、および本明細書の他の箇所で企図される方法を用いて治療され得る免疫障害と診断されている対象を指す。
【０２１９】
本明細書で使用されるとき、「治療」または「治療すること」は、疾患または病理学的状態の症状または病理に対するいずれの有益または望ましい効果も含み、治療されている疾患または病態、例えば、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全のうちの１つ以上の測定可能マーカーにおける最小限の低減さえも含み得る。治療は、任意に、疾患または病態の進行を遅延させることを伴い得る。「治療」は必ずしも、疾患もしくは病態、またはその関連する症状の完全な撲滅または治癒を指すものではない。
【０２２０】
本明細書で使用されるとき、「予防する」、および「予防」、「予防される」、「予防すること」などといった類似の語は、疾患または病態、例えば、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全の発生または再発の可能性を予防、阻害、または低減するための手法を示す。それはまた、疾患もしくは病態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは病態の症状の発生もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用されるとき、「予防」および類似の語は、疾患または病態の発症または再発前に疾患または病態の強度、影響、症状、および／または負荷を低減することも含む。
【０２２１】
本明細書で使用されるとき、「〜の少なくとも１つの症状を改善すること」という語句は、対象が治療されている疾患または病態、例えば、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全のうちの１つ以上の症状を減少させることを指す。特定の実施形態において、治療されている疾患または病態は癌であり、ここで、緩和される１つ以上の症状には、衰弱、疲労、息切れ、打撲および出血の起こりやすさ、頻繁な感染、腫脹したリンパ節、膨張したまたは痛みのある腹部（肥大した腹部臓器に起因）、骨または関節痛、骨折、意図しない体重減少、食欲不振、寝汗、持続する微熱、ならびに減少した排尿（腎機能不全に起因）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２２２】
本明細書で使用されるとき、「量」という用語は、臨床結果を含む有益または所望の予防結果または療法結果を達成するのに十分なヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の「有効な量」または「有効量」を指す。
【０２２３】
「予防上有効量」は、所望の予防結果を達成するのに十分なヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の量を指す。必須ではないが典型的には、疾患の前またはその早期に予防的用量が対象において使用されるため、予防上有効量は、治療上有効量よりも少ない。
【０２２４】
ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の「治療上有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を引き出す能力などの要因に応じて異なり得る。治療上有効量はまた、治療上有益な効果が、任意の毒性効果または有害効果を上回るものでもある。「治療上有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療」するのに有効である量を含む。療法量が示されるとき、特定の実施形態において企図される組成物の投与されるべき正確な量は、医師によって、規格に鑑みて、かつ患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および病態における個体差を考慮して決定され得る。
【０２２５】
Ｃヌクレアーゼバリアント
本明細書の特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントは、ＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位を編集するゲノムに好適であり、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインと、１つ以上のＤＮＡ切断ドメイン（例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼおよび／またはエクソヌクレアーゼドメイン）と、任意に、本明細書で企図される１つ以上のリンカーとを含む。「再プログラミングされたヌクレアーゼ」、「遺伝子操作されたヌクレアーゼ」、または「ヌクレアーゼバリアント」という用語は互換的に使用され、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインと１つ以上のＤＮＡ切断ドメインとを含むヌクレアーゼを指し、ここで、ヌクレアーゼは、ＴＧＦβＲ２遺伝子内の２本鎖ＤＮＡ標的配列に結合し、それを切断するように親ヌクレアーゼまたは自然発生するヌクレアーゼから設計および／または修飾されている。
【０２２６】
特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、ＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６において、好ましくはＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６における配列番号：１１で、およびより好ましくはＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６における配列番号：１１内の配列「ＡＴＣＣ」で標的配列に結合し、それを切断する。
【０２２７】
ヌクレアーゼバリアントは、自然発生するヌクレアーゼからか、または前のヌクレアーゼバリアントから設計および／または修飾され得る。特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントは、１つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、５´−３´エクソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、３´−５´エクソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。
【０２２８】
ＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的配列に結合し、それを切断するヌクレアーゼバリアントの例示的な例には、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）バリアントおよびｍｅｇａＴＡＬが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２９】
１．ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）バリアント
種々の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼは、ＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位に２本鎖の破断（ＤＳＢ）を導入するように再プログラミングされる。特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、ＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６において、好ましくはＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６における配列番号：１１で、およびより好ましくはＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６における配列番号：１１内の配列「ＡＴＣＣ」で２本鎖の破断を導入する。
【０２３０】
「ホーミングエンドヌクレアーゼ」および「メガヌクレアーゼ」は互換的に使用され、１２〜４５個の塩基対切断部位を認識し、一般的に配列および構造モチーフに基づいて５つのファミリー、すなわちＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックス、およびＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫに分類される、自然発生するホーミングエンドヌクレアーゼを指す。
【０２３１】
「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」または「参照メガヌクレアーゼ」は、自然界で見出される野生型ホーミングエンドヌクレアーゼまたはホーミングエンドヌクレアーゼを指す。一実施形態において、「参照ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、修飾されて、基礎活性を増加させる野生型ホーミングエンドヌクレアーゼを指す。
【０２３２】
「遺伝子操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「再プログラミングされたホーミングエンドヌクレアーゼ」、「ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント」、「遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ」、「再プログラミングされたメガヌクレアーゼ」、または「メガヌクレアーゼバリアント」は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含むホーミングエンドヌクレアーゼを指し、ここで、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＴＧＦβＲ２遺伝子内のＤＮＡ標的配列に結合し、それを切断するように親ホーミングエンドヌクレアーゼまたは自然発生するホーミングエンドヌクレアーゼから設計および／または修飾されている。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、自然発生するホーミングエンドヌクレアーゼまたは別のホーミングエンドヌクレアーゼバリアントから設計および／または修飾され得る。特定の実施形態において企図されるホーミングエンドヌクレアーゼバリアントは、１つ以上の追加の機能的ドメイン、例えば、５´−３´エクソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、３´−５´エクソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。
【０２３３】
ホーミングエンドヌクレアーゼ（ＨＥ）バリアントは、自然界に存在せず、組換えＤＮＡ技術によってまたはランダム変異誘発によって得ることができる。ＨＥバリアントは、自然発生するＨＥまたはＨＥバリアントにおいて、１つ以上のアミノ酸改変を行う、例えば、１つ以上のアミノ酸を変異、置換、付加、または欠失させることによって得ることができる。特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＤＮＡ認識インターフェースに対する１つ以上のアミノ酸改変を含む。
【０２３４】
特定の実施形態において企図されるＨＥバリアントは、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能的ドメイン、例えば、５´−３´エクソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、３´−５´エクソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインをさらに含み得る。特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、５´−３´エクソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、３´−５´エクソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素と共にＴ細胞内に導入される。ＨＥバリアントおよび３´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、あるいはウイルス自己切断型ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。
【０２３５】
「ＤＮＡ認識インターフェース」は、核酸標的塩基と相互作用するＨＥアミノ酸残基、ならびに隣接している残基を指す。各ＨＥに関して、ＤＮＡ認識インターフェースは、側鎖−側鎖間および側鎖−ＤＮＡ接触点間の広範囲のネットワークを含み、これらのほとんどは、特定の核酸標的配列を認識するために必然的に固有である。したがって、特定の核酸配列に対応するＤＮＡ認識インターフェースのアミノ酸配列は、著しく異なり、任意の天然またはＨＥバリアントの特徴である。非限定的な例として、特定の実施形態において企図されるＨＥバリアントは、天然ＨＥ（または以前に生成されたＨＥバリアント）のＤＮＡ認識インターフェースに局在する１つ以上のアミノ酸残基が変化に富む、ＨＥバリアントのライブラリを構築することによってもたらされ得る。ライブラリは、切断アッセイを使用して、各々予測されるＴＧＦβＲ２標的部位に対する標的切断活性に関してスクリーニングされ得る（例えば、Ｊａｒｊｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（２０）：６８７１−６８８０を参照されたい）。
【０２３６】
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）は、最も詳細に研究されているホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーであり、主に古細菌においてならびに緑藻類および真菌類のオルガネラＤＮＡにおいてコードされ、最も高い全体的なＤＮＡ認識特異性を示す。ＬＨＥは、タンパク質鎖１つあたり１つまたは２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ触媒モチーフを含み、それぞれホモ二量体または単鎖単量体として機能する。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質の構造的研究により、αββαββα折り畳みによって特徴付けられる、高度に保存されたコア構造が特定され（Ｓｔｏｄｄａｒｄ  ２００５）、このうちＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフは、この折り畳みの第１のヘリックスに属する。ＬＨＥによる高度に効率的および特異的な切断は、新規の高度に特異的なエンドヌクレアーゼを得るためのタンパク質足場を表す。しかしながら、非天然または非標準的な標的部位に結合し、それを切断するようにＬＨＥを遺伝子操作することは、適切なＬＨＥ足場の選択、標的遺伝子座の検査、推定標的部位の選択、ならびに標的部位における塩基対位置のうちの最大３分の２でのそのＤＮＡ接触点および切断特異性を改変するためのＬＨＥの大規模な改変を必要とする。
【０２３７】
一実施形態において、再プログラミングされたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントが設計され得るＬＨＥには、Ｉ−ＣｒｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３８】
再プログラミングされたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントが設計され得るＬＨＥの例示的な例には、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３９】
一実施形態において、再プログラミングされたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＣｐａＭＩバリアント、Ｉ−ＨｊｅＭＩバリアント、Ｉ−ＯｎｕＩバリアント、Ｉ−ＰａｎＭＩバリアント、およびＩ−ＳｍａＭＩバリアントからなる群から選択される。
【０２４０】
一実施形態において、再プログラミングされたＬＨＥまたはＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントである。例えば、配列番号：６〜７を参照されたい。
【０２４１】
一実施形態において、ＴＧＦβＲ２遺伝子を標的とする再プログラミングされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥまたはＩ−ＯｎｕＩバリアントは、天然Ｉ−ＯｎｕＩまたはその生物学的に活性な断片（配列番号：１〜５）から生成された。好ましい実施形態において、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子を標的とする再プログラミングされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥまたはＩ−ＯｎｕＩバリアントは、既存のＩ−ＯｎｕＩバリアントから生成された。一実施形態において、再プログラミングされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、配列番号：１１に記載されるヒトＴＧＦβＲ２遺伝子標的部位に対して生成された。
【０２４２】
特定の実施形態において、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子に結合し、それを切断する再プログラミングされたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥまたはＩ−ＯｎｕＩバリアントは、ＤＮＡ認識インターフェースにおいて１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩ（Ｔａｅｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１  Ａｕｇ  ９；１０８（３２）：１３０７７−１３０８２）、または配列番号：６もしくは７に記載のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および／またはそれらのさらなるバリアントのＤＮＡ認識インターフェースとの少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。
【０２４３】
一実施形態において、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩ（Ｔａｅｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１  Ａｕｇ  ９；１０８（３２）：１３０７７−１３０８２）、または配列番号：６もしくは７に記載のＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および／またはそれらのさらなるバリアントのＤＮＡ認識インターフェースとの少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を含む。
【０２４４】
特定の実施形態において、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号：１〜７のいずれか１つに記載のＩ−ＯｎｕＩ、それらの生物学的に活性な断片、および／またはそれらのさらなるバリアントのＤＮＡ認識インターフェースにおいて１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
【０２４５】
特定の実施形態において、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号１〜５）、または配列番号：６もしくは７に記載のＩ−ＯｎｕＩバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および／またはそれらのさらなるバリアントのＤＮＡ認識インターフェース、特に、位置２４〜５０、６８〜８２、１８０〜２０３、および２２３〜２４０に位置するサブドメインにおいて１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
【０２４６】
特定の実施形態において、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号：１〜５）、または配列番号：６もしくは７に記載のＩ−ＯｎｕＩバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および／またはそれらのさらなるバリアントの、１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるＤＮＡ認識インターフェースにおいて１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
【０２４７】
特定の実施形態において、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号：１〜５）、または配列番号：６もしくは７に記載のＩ−ＯｎｕＩバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および／またはそれらのさらなるバリアントのＤＮＡ認識インターフェース、特に、位置２４〜５０、６８〜８２、１８０〜２０３、および２２３〜２４０に位置するサブドメインにおいて５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０個以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
【０２４８】
特定の実施形態において、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号：１〜５）、または配列番号：６もしくは７に記載のＩ−ＯｎｕＩバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および／またはそれらのさらなるバリアントの、１９、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５９、６８、７０、７２、７５、７６、７７、７８、８０、８２、１６８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３２、２３４、２３６、２３８、および２４０からなる群から選択されるアミノ酸位置にあるＤＮＡ認識インターフェースにおいて５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０個以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
【０２４９】
一実施形態において、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ配列全体のどこにでも位置する追加の位置に１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。置換および／または修飾され得る残基は、核酸標的に接触するか、または核酸骨格もしくはヌクレオチド塩基と、直接もしくは水分子を介して相互作用するアミノ酸が含まれるが、これに限定されない。１つの非限定的な例において、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子に結合し、それを切断する本明細書で企図されるＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号：１〜５）、または配列番号：６もしくは７に記載のＩ−ＯｎｕＩバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および／またはそれらのさらなるバリアントの、位置：２６、３２、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４２、４４、４６、４８、６８、７０、７５、７６、７８、８０、１１６、１３８、１４３、１５９、１６８、１７８、１８０、１８２、１８４、１８８、１９０、１９２、１９３、１９５、１９７、１９９、２０３、２０７、２２３、２２５、２２７、２３２、２４０、および２６４からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置に１つ以上の置換および／または修飾、好ましくは少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、好ましくは少なくとも２０、より好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３０、さらにより好ましくは少なくとも３５、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上のアミノ酸置換を含む。
【０２５０】
ある特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＴＧＦβＲ２エクソン６標的部位を切断し、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号：１〜５）、または配列番号：６もしくは７に記載のＩ−ＯｎｕＩバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および／またはそれらのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｍ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｑ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｋ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｎ、Ｓ４０Ｇ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｖ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｒ、Ｎ７５Ｇ、Ａ７６Ｓ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｄ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０ＲまたはＳ１９０Ｇ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｔ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｒ、Ｆ２３２Ｎ、Ｔ２４０Ｒ、およびＥ２６４Ｋのうちの少なくとも５、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０２５１】
いくつかの実施形態において、ＨＥバリアントは、ＴＧＦβＲ２標的部位を切断し、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号：１〜５）、または配列番号：６もしくは７に記載のＩ−ＯｎｕＩバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および／またはそれらのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｍ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｑ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｋ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｎ、Ｓ４０Ｇ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｖ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｒ、Ｎ７５Ｇ、Ａ７６Ｓ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｄ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｒ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｔ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｒ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｒ、Ｆ２３２Ｎ、およびＴ２４０Ｒのうちの少なくとも５、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０２５２】
特定の実施形態において、ＨＥバリアントは、ＴＧＦβＲ２標的部位を切断し、Ｉ−ＯｎｕＩ（配列番号：１〜５）、または配列番号：６もしくは７に記載のＩ−ＯｎｕＩバリアント、それらの生物学的に活性な断片、および／またはそれらのさらなるバリアントの以下のアミノ酸置換：Ｌ２６Ｍ、Ｎ３２Ｒ、Ｋ３４Ｑ、Ｓ３５Ｒ、Ｓ３６Ｋ、Ｖ３７Ａ、Ｇ３８Ｎ、Ｓ４０Ｇ、Ｅ４２Ｓ、Ｇ４４Ｖ、Ｑ４６Ｅ、Ｔ４８Ｇ、Ｖ６８Ｋ、Ａ７０Ｒ、Ｎ７５Ｇ、Ａ７６Ｓ、Ｓ７８Ｒ、Ｋ８０Ｓ、Ｖ１１６Ｌ、Ｌ１３８Ｍ、Ｔ１４３Ｎ、Ｓ１５９Ｐ、Ｆ１６８Ｌ、Ｅ１７８Ｄ、Ｃ１８０Ｓ、Ｆ１８２Ｇ、Ｎ１８４Ｄ、Ｓ１８８Ｒ、Ｓ１９０Ｒ、Ｌ１９２Ｔ、Ｇ１９３Ｔ、Ｑ１９５Ｇ、Ｑ１９７Ｇ、Ｖ１９９Ｒ、Ｔ２０３Ｓ、Ｋ２０７Ｒ、Ｙ２２３Ｈ、Ｋ２２５Ｙ、Ｋ２２７Ｒ、Ｆ２３２Ｎ、Ｔ２４０Ｒ、およびＥ２６４Ｋのうちの少なくとも５、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、またはさらにより好ましくは少なくとも４０個以上を含む。
【０２５３】
特定の実施形態において、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子に結合し、それを切断するＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号：６もしくは７に記載されるアミノ酸配列、またはそれらの生物学的に活性な断片と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、もしくはさらにより好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２５４】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号：６もしくは７に記載されるアミノ酸配列、またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
【０２５５】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号：６に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
【０２５６】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号：７に記載されるアミノ酸配列またはそれらの生物学的に活性な断片を含む。
【０２５７】
２．ＭＥＧＡＴＡＬ
種々の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントを含むｍｅｇａＴＡＬは、ＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位に２本鎖の破断（ＤＳＢ）を導入するように再プログラミングされる。特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６において、好ましくはＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６における配列番号：１１で、およびより好ましくはＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６における配列番号：１１内の配列「ＡＴＣＣ」でＤＳＢを導入する。
【０２５８】
「ｍｅｇａＴＡＬ」は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、ＴＧＦβＲ２遺伝子内のＤＮＡ標的配列に結合し、それを切断するホーミングエンドヌクレアーゼバリアントとを含むポリペプチドを指し、任意に、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能的ドメイン、例えば、５´−３´エキソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エキソヌクレアーゼ、３´−５´エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素のエンドプロセシング酵素ドメインを含む。
【０２５９】
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、５´−３´エクソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、３´−５´エクソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼ、またはテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈するエンドプロセシング酵素と共に、細胞内に導入され得る。ｍｅｇａＴＡＬおよび３´プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別個のｍＲＮＡにおいて別個に、または一緒に、例えば、融合タンパク質として、あるいはウイルス自己切断型ペプチドもしくはＩＲＥＳ要素によって分離されたポリシストロニック構築物において導入され得る。
【０２６０】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」は、植物の転写物を操作するために植物の転写活性化因子を模倣する、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥまたはＴＡＬ−エフェクター）のＤＮＡ結合部分である（例えば、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１を参照されたい）。特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、デノボで、または自然発生するＴＡＬＥ、例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｇａｒｄｎｅｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｐｅｒｆｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｌｆａｌｆａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のＡｖｒＢｓ３から、ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来のｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７から遺伝子操作される。ＤＮＡ結合ドメインを誘導および設計するためのＴＡＬＥタンパク質の例示的な例は、米国特許第９，０１７，９６７号、および同特許で引用される参考文献に開示されており、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６１】
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの、その対応する標的ＤＮＡ配列への結合に関与する１つ以上の繰り返し単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。単一の「繰り返し単位」（「繰り返し」とも称される）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長である。各ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン繰り返し単位は、典型的には、繰り返しの位置１２および／または１３に、繰り返し可変Ｄｉ−残基（Ｒｅｐｅａｔ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｉ−Ｒｅｓｉｄｕｅ）（ＲＶＤ）を構成する１つまたは２つのＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ認識のための天然（標準的）コードは、位置１２および１３のＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＧがＴに結合するように、決定されている。ある特定の実施形態において、非標準的（非典型）ＲＶＤが企図される。
【０２６２】
特定の実施形態において企図される特定のｍｅｇａＴＡＬにおいて使用するのに好適な非標準的ＲＶＤの例示的な例には、グアニン（Ｇ）の認識のためのＨＨ、ＫＨ、ＮＨ、ＮＫ、ＮＱ、ＲＨ、ＲＮ、ＳＳ、ＮＮ、ＳＮ、ＫＮ；アデニン（Ａ）の認識のためのＮＩ、ＫＩ、ＲＩ、ＨＩ、ＳＩ；チミン（Ｔ）の認識のためのＮＧ、ＨＧ、ＫＧ、ＲＧ；シトシン（Ｃ）の認識のためのＲＤ、ＳＤ、ＨＤ、ＮＤ、ＫＤ、ＹＧ；ＡまたはＧの認識のためのＮＶ、ＨＮ；およびＡまたはＴまたはＧまたはＣの認識のためのＨ＊、ＨＡ、ＫＡ、Ｎ＊、ＮＡ、ＮＣ、ＮＳ、ＲＡ、Ｓ＊［（＊）は、位置１３にアミノ酸が不在であることを意味する］が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において企図される特定のｍｅｇａＴＡＬにおいて使用するのに好適なＲＶＤの追加の例示的な例には、米国特許第８，６１４，０９２号に開示されるものがさらに含まれ、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２６３】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３〜３０個の繰り返し単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン繰り返し単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、５〜１５個の繰り返し単位、より好ましくは７〜１５個の繰り返し単位、より好ましくは９〜１５個の繰り返し単位、およびより好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の繰り返し単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０２６４】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３〜３０個の繰り返し単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、１組のＴＡＬＥ繰り返し単位のＣ末端に位置する２０個のアミノ酸を含む追加の単一の切断短縮型ＴＡＬＥ繰り返し単位、すなわち、追加のＣ末端ハーフＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン繰り返し単位（本明細書の他の箇所で開示される（下記を参照）Ｃキャップのアミノ酸−２０〜−１）とを含む。したがって、特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、３．５〜３０．５個の繰り返し単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。ある特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、３．５、４．５、５．５、６．５、７．５、８．５、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３．５、２４．５、２５．５、２６．５、２７．５、２８．５、２９．５、または３０．５のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン繰り返し単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、５．５〜１５．５個の繰り返し単位、より好ましくは７．５〜１５．５個の繰り返し単位、より好ましくは９．５〜１５．５個の繰り返し単位、およびより好ましくは９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、または１５．５個の繰り返し単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０２６５】
特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドと、１つ以上のＴＡＬＥ繰り返しドメイン／単位と、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドと、およびホーミングエンドヌクレアーゼバリアントとを含むＴＡＬエフェクター構成を含む。いくつかの実施形態において、ＮＴＤ、ＴＡＬＥ繰り返し、および／またはＣＴＤドメインは、同じ種由来である。他の実施形態において、ＮＴＤ、ＴＡＬＥ繰り返し、および／またはＣＴＤドメインのうちの１つ以上は、異なる種由来である。
【０２６６】
本明細書で使用されるとき、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドという用語は、自然発生するＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端部分または断片に隣接する配列を指す。ＮＴＤ配列は、存在する場合、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン繰り返し単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも１２０個〜少なくとも１４０個以上のアミノ酸を含む（０は、最もＮ末端側の繰り返し単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または少なくとも１４０個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約＋１〜＋１２２から少なくとも約＋１〜＋１３７のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、最もＮ末端側の繰り返し単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸＋１〜＋１２１のＮＴＤポリペプチドを含む（０は、最もＮ末端側の繰り返し単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端側に少なくとも約１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７個のアミノ酸を含む。
【０２６７】
本明細書で使用されるとき、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドという用語は、自然発生するＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端部分または断片に隣接する配列を指す。ＣＴＤ配列は、存在する場合、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン繰り返し単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであってよい。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全繰り返しに対してＣ末端側に少なくとも２０〜少なくとも８５個以上のアミノ酸を含む（最初の２０個のアミノ酸は、最後のＣ末端完全繰り返し単位に対してＣ末端側のハーフ繰り返し単位である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全繰り返しに対してＣ末端側に少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または少なくとも８５個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約−２０〜−１のＣＴＤポリペプチドを含む（−２０は、最後のＣ末端完全繰り返し単位に対してＣ末端側のハーフ繰り返し単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全繰り返しに対してＣ末端側に少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約−２０〜−１のＣＴＤポリペプチドを含む（−２０は、最後のＣ末端完全繰り返し単位に対してＣ末端側のハーフ繰り返し単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全繰り返しに対してＣ末端側に少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸を含む。
【０２６８】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、標的配列に結合するように遺伝子操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む融合ポリペプチドと、標的配列に結合し、それを切断するように再プログラミングされたホーミングエンドヌクレアーゼと、任意に、本明細書の他の箇所で企図される１つ以上のリンカーポリペプチドと任意に互いに結合するＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドとを含む。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、任意に、ＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドとを含むｍｅｇａＴＡＬが、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントにさらに融合されるリンカーポリペプチドに融合されることが企図される。したがって、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントのＤＮＡ結合ドメインが結合した標的配列から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチド以内離れているＤＮＡ標的配列に結合する。このようにして、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ゲノム編集の特異性および効率を増加させる。
【０２６９】
一実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントと、再プログラミングされたホーミングエンドヌクレアーゼの結合部位の約４、５、または６ヌクレオチド以内、好ましくは、５または６ヌクレオチド上流であるヌクレオチド配列に結合するＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとを含む。
【０２７０】
一実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントと、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントが結合および切断するヌクレオチド配列（配列番号：１１）の６ヌクレオチド上流である（すなわち、ＴＡＬＥ結合部位とＨＥ結合部位との間に５個のヌクレオチドが存在する）、配列番号：１２に記載されるヌクレオチド配列に結合するＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとを含む。好ましい実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬ標的配列は、配列番号：１３である。
【０２７１】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合繰り返し単位と、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、Ｉ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、およびそれらのバリアント、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、およびそれらのバリアント、より好ましくはＩ−ＯｎｕＩおよびそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥから設計または再プログラミングされたＬＨＥバリアントとを含む。
【０２７２】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ＮＴＤと、１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合繰り返し単位と、ＣＴＤと、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、Ｉ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、およびそれらのバリアント、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、およびそれらのバリアント、より好ましくはＩ−ＯｎｕＩおよびそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥバリアントとを含む。
【０２７３】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、ＮＴＤと、約９．５〜約１５．５のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合繰り返し単位と、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、Ｉ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、およびそれらのバリアント、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、ＳｍａＭＩ、およびそれらのバリアント、より好ましくはＩ−ＯｎｕＩおよびそのバリアントからなる群から選択されるＬＨＥバリアントとを含む。
【０２７４】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、約１２２個のアミノ酸〜１３７個のアミノ酸のＮＴＤと、約９．５、約１０．５、約１１．５、約１２．５、約１３．５、約１４．５、または約１５．５個の結合繰り返し単位と、約２０個のアミノ酸〜約８５個のアミノ酸のＣＴＤと、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントとを含む。特定の実施形態において、ＮＴＤ、ＤＮＡ結合ドメイン、およびＣＴＤのいずれか１つ、２つ、または全ては、任意の好適な組み合わせで同じ種または異なる種から設計され得る。
【０２７５】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬは、配列番号：８または９に記載されるアミノ酸配列を含む。
【０２７６】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍｅｇａＴＡＬ−Ｔｒｅｘ２融合タンパク質は、配列番号：１０に記載されるアミノ酸配列を含む。
【０２７７】
ある特定の実施形態において、ｍｅｇａＴＡＬは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに結合し、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥバリアントは、配列番号：１３に記載されるヌクレオチド配列に結合し、それを切断する。
【０２７８】
３．エンドプロセッシング酵素
特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ヌクレアーゼバリアントおよびエンドプロセシング酵素の１つ以上のコピーを使用して細胞ゲノムを編集することを含む。特定の実施形態において、単一のポリヌクレオチドは、リンカー、自己切断型ペプチド配列、例えば、２Ａ配列によって、またはＩＲＥＳ配列によって分離されたホーミングエンドヌクレアーゼバリアントおよびエンドプロセシング酵素をコードする。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、ヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドと、エンドプロセシング酵素をコードする別個のポリヌクレオチドとを含む。特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、自己切断型ペプチドによって分離されたエンドプロセシング酵素のタンデムコピーに加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントエンドプロセシング酵素の単一のポリペプチド融合をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０２７９】
「エンドプロセシング酵素」という用語は、ポリヌクレオチド鎖の曝露された終端を修飾する酵素を指す。ポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの２本鎖ハイブリッド、ならびに合成ＤＮＡ（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴ以外の塩基を含有する）であり得る。エンドプロセシング酵素は、１つ以上のヌクレオチドを付加すること、１つ以上のヌクレオチドを除去すること、リン酸基を除去するかもしくは修飾すること、および／またはヒドロキシル基を除去するかもしくは修飾することによって、曝露されたポリヌクレオチド鎖終端を修飾し得る。エンドプロセシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部位の終端、または他の化学的もしくは機械的手段、例えば、せん断（例えば、微細ゲージの針を通すこと、加熱すること、超音波処理すること、小型ビーズ振とう、および噴霧することによる）、電離化放射、紫外線照射、酸素ラジカル、化学的加水分解、および化学療法剤によって生成された終端で修飾し得る。
【０２８０】
特定の実施形態において、特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、およびＤＮＡエンドプロセシング酵素を使用して細胞ゲノムを編集することを含む。
【０２８１】
「ＤＮＡエンドプロセシング酵素」という用語は、ＤＮＡの曝露された終端を修飾する酵素を指す。ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、平滑終端または段違い終端（５´または３´の突出を有する終端）を修飾し得る。ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、単鎖または２本鎖ＤＮＡを修飾し得る。ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、エンドヌクレアーゼ切断部位の終端、または他の化学的もしくは機械的手段、例えば、せん断（例えば、微細ゲージの針を通すこと、加熱すること、超音波処理すること、小型ビーズ振とう、および噴霧することによる）、電離化放射、紫外線照射、酸素ラジカル、化学的加水分解、および化学療法剤によって生成された終端で修飾し得る。ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、１つ以上のヌクレオチドを付加すること、１つ以上のヌクレオチドを除去すること、リン酸基を除去するかもしくは修飾すること、および／またはヒドロキシル基を除去するかもしくは修飾することによって、曝露されたＤＮＡ終端を修飾し得る。
【０２８２】
本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なＤＮＡエンドプロセシング酵素の例示的な例には、５´−３´エクソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、３´−５´エクソヌクレアーゼ、５´フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ホスファターゼ、ヒドロラーゼ、およびテンプレート非依存性ＤＮＡポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０２８３】
本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なＤＮＡエンドプロセシング酵素の追加の例示的な例には、Ｔｒｅｘ２、Ｔｒｅｘ１、膜貫通ドメイン無しのＴｒｅｘ１、Ａｐｏｌｌｏ、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＤＮＡ２、Ｅｘｏ１、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＩＩＩ、Ｆｅｎ１、Ｆａｎ１、ＭｒｅＩＩ、Ｒａｄ２、Ｒａｄ９、ＴｄＴ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）、ＰＮＫＰ、ＲｅｃＥ、ＲｅｃＪ、ＲｅｃＱ、ラムダエクソヌクレアーゼ、Ｓｏｘ、ワクシニアＤＮＡポリメラーゼ、エクソヌクレアーゼＩ、エクソヌクレアーゼＩＩＩ、エクソヌクレアーゼＶＩＩ、ＮＤＫ１、ＮＤＫ５、ＮＤＫ７、ＮＤＫ８、ＷＲＮ、Ｔ７−エクソヌクレアーゼ遺伝子６、トリ骨髄芽球症ウイルス組み込みタンパク質（ＩＮ）、Ｂｌｏｏｍ、南極ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、ＡｐｅＩ、マングビーンヌクレアーゼ、Ｈｅｘ１、ＴＴＲＡＰ（ＴＤＰ２）、Ｓｇｓ１、Ｓａｅ２、ＣＵＰ、Ｐｏｌ  ｍｕ、Ｐｏｌラムダ、ＭＵＳ８１、ＥＭＥ１、ＥＭＥ２、ＳＬＸ１、ＳＬＸ４、およびＵＬ−１２が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８４】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集組成物および細胞ゲノムを編集するための方法は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、およびエクソヌクレアーゼを含むポリペプチドを含む。「エクソヌクレアーゼ」という用語は、３´または５´終端のいずれかでホスホジエステル結合を破断する加水分解反応を介してポリヌクレオチド鎖の終端でホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。
【０２８５】
本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なエクソヌクレアーゼの例示的な例には、ｈＥｘｏＩ、酵母ＥｘｏＩ、大腸菌ＥｘｏＩ、ｈＴＲＥＸ２、マウスＴＲＥＸ２、ラットＴＲＥＸ２、ｈＴＲＥＸ１、マウスＴＲＥＸ１、ラットＴＲＥＸ１、およびＲａｔ  ＴＲＥＸ１が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８６】
特定の実施形態において、ＤＮＡエンドプロセシング酵素は、３´〜５´エクソヌクレアーゼ、好ましくはＴｒｅｘ１またはＴｒｅｘ２、より好ましくはＴｒｅｘ２、およびさらにより好ましくはヒトまたはマウスＴｒｅｘ２である。
【０２８７】
Ｄ標的部位
特定の実施形態において企図されるヌクレアーゼバリアントは、任意の好適な標的配列に結合するように設計され得、かつ自然発生するヌクレアーゼと比較して、新規の結合特異性を有し得る。特定の実施形態において、標的部位は、プロモーター、エンハンサー、抑制要素などを含むがこれらに限定されない遺伝子の調節領域である。特定の実施形態において、標的部位は、遺伝子のコード領域またはスプライス部位である。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、遺伝子の発現を下方調節または減少するように設計される。特定の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよびドナー修復テンプレートは、所望の標的配列を修復または欠失するように設計され得る。
【０２８８】
種々の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントは、形質転換成長因子ベータ受容体２（ＴＧＦβ２）遺伝子内の標的配列に結合し、それを切断する。ＴＧＦβ２は、ＴＧＦ−ベータ受容体タイプＩＩＢ、ＴＧＦ−ベータタイプＩＩ受容体、ＴＧＦベータ−ＲＩＩ、ＴＧＦＲ−２、ＴＧＦＲ２、形質転換成長因子ベータ受容体ＩＩ、形質転換成長因子、ベータ受容体ＩＩ（７０／８０ｋＤａ）、ＡＡＴ３、ＦＡＡ３、ＨＮＰＣＣ６、ＭＦＳ２、ＲＩＩＣ、およびＴＡＡＤ２とも称される。ＴＧＦβは、ＴＧＦβＲ１およびＴＧＦβＲ２セリン／スレオニンキナーゼ受容体複合体に結合し、下流転写因子Ｓｍａｄ２およびＳｍａｄ３の受容体媒介性リン酸化をもたらす。ＴＧＦβＲ２シグナル伝達は、ＩＦＮγおよび他の細胞溶解性分子の低減した分泌を含む、インビトロのＴ細胞のエフェクターおよび細胞溶解性活性に関与する重要な分子を抑制することによって、ＴＧＦβの細胞静止性および抗増殖性効果を生成する。
【０２８９】
特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位に２本鎖の破断（ＤＳＢ）を導入する。特定の実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、ＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６において、好ましくはＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６における配列番号：１１で、およびより好ましくはＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６における配列番号：１１内の配列「ＡＴＣＣ」でＤＳＢを導入する。
【０２９０】
好ましい実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬは、２本鎖ＤＮＡを切断し、かつ配列番号：１１または１３に記載されるポリヌクレオチド配列内にＤＳＢを導入する。
【０２９１】
好ましい実施形態において、ＴＧＦβＲ２遺伝子は、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子である。
【０２９２】
Ｅ．ドナー修復テンプレート
ヌクレアーゼバリアントは、標的配列にＤＳＢを導入するために使用され得、ＤＳＢは、１つ以上のドナー修復テンプレートの存在下で相同組換え修復（ＨＤＲ）機構を通して修復され得る。
【０２９３】
種々の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【０２９４】
種々の実施形態において、異なる免疫抑制経路を標的とする免疫力エンハンサーおよび／または免疫抑制シグナルダンパーを独立してコードする複数のドナー修復テンプレートの存在下で、細胞に遺伝子操作されたヌクレアーゼを提供することによって、療法的有効性および持続性の増加を有するゲノム編集されたＴ細胞をもたらすことが企図される。例えば、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ３、ＩＬ−１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、およびＴＧＦβＲ２経路の組み合わせを標的とする免疫力エンハンサーまたは免疫抑制シグナルは、特定の実施形態において好ましい場合がある。
【０２９５】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ゲノムに配列を挿入するために使用される。特定の好ましい実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ゲノム内の配列を修復または修飾するために使用される。
【０２９６】
種々の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、例えば、レンチウイルス、ＩＤＬＶなど、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、またはドナー修復テンプレートを含むワクシニアウイルスベクターで細胞を形質導入することによって、造血細胞、例えば、Ｔ細胞内に導入される。
【０２９７】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＳＢ部位に隣接する１つ以上の相同アームを含む。
【０２９８】
本明細書で使用されるとき、「相同アーム」という用語は、標的部位でヌクレアーゼによって導入されたＤＮＡ破断に隣接するＤＮＡ配列と同一、またはほぼ同一であるドナー修復テンプレート内の核酸配列を指す。一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＮＡ破断部位のＤＮＡ配列５´と同一、またはほぼ同一である核酸配列を含む５´相同アームを含む。一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＤＮＡ破断部位のＤＮＡ配列３´と同一、またはほぼ同一である核酸配列を含む３´相同アームを含む。好ましい実施形態において、ドナー修復テンプレートは、５´相同アームおよび３´相同アームを含む。ドナー修復テンプレートは、ＤＳＢ部位の直近のゲノム配列に対する相同性、またはＤＳＢ部位からの任意の数の塩基対内のゲノム配列に対する相同性を含み得る。一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、相同配列の任意の介在する長さを含む、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２５ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約５０００ｂｐ、約１００００ｂｐ以上のゲノム配列に対して相同な核酸配列を含む。
【０２９９】
特定の実施形態において企図される相同アームの好適な長さの例示的な例は、独立して選択され得、相同アームの全ての介在する長さを含む、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約２６００ｂｐ、約２７００ｂｐ、約２８００ｂｐ、約２９００ｂｐ、または約３０００ｂｐ以上の相同アームが含まれるが、これらに限定されない。
【０３００】
好適な相同アーム長さの追加の例示的な例には、相同アームの全ての介在する長さを含む、約１００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約３００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約４００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約３０００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約２５００ｂｐ、約５００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約７５０ｂｐ〜約１５００ｂｐ、または約１０００ｂｐ〜約１５００ｂｐが含まれるが、これらに限定されない。
【０３０１】
特定の実施形態において、５´および３´相同アームの長さは、独立して、約５００ｂｐ〜約１５００ｂｐから選択される。一実施形態において、５´相同アームは約１５００ｂｐであり、３´相同アームは約１０００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約２００ｂｐ〜約６００ｂｐであり、３´相同アームは約２００ｂｐ〜約６００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約２００ｂｐであり、３´相同アームは約２００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約３００ｂｐであり、３´相同アームは約３００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約４００ｂｐであり、３´相同アームは約４００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約５００ｂｐであり、３´相同アームは約５００ｂｐである。一実施形態において、５´相同アームは約６００ｂｐであり、３´相同アームは約６００ｂｐである。
【０３０２】
ドナー修復テンプレートは、本明細書の他の箇所に企図される、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、および自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの１つ以上のポリヌクレオチドをさらに含み得る。
【０３０３】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＴＧＦβＲ２遺伝子を含むポリヌクレオチドまたはその部分を含み、かつ変異体ＴＧＦβＲ２遺伝子産物が発現されるように、ゲノムＴＧＦβＲ２配列に１つ以上の変異を導入するように設計される。一実施形態において、変異体ＴＧＦβＲ２は、リガンド結合の減少および／または細胞内シグナル伝達の低減を有する。
【０３０４】
種々の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、５´相同アームと、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターと、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドと、３´相同アームとを含む。
【０３０５】
種々の実施形態において、標的部位は、５´相同アームと、自己切断型ウイルスペプチド、例えば、Ｔ２Ａ、免疫力エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または遺伝子操作された抗原受容体、任意に、ポリ（Ａ）シグナルもしくは自己切断型ペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドと、３´相同アームとを含むドナー修復テンプレートで修飾され、ここで、１つ以上のポリヌクレオチドの発現は、内因性ＴＧＦβＲ２プロモーターによって支配される。
【０３０６】
１．免疫力エンハンサー
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、免疫力エンハンサーをコードするドナー修復テンプレートの存在下でＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢを導入することによって免疫抑制因子に対してより強力および／または耐性を有するように作製される。本明細書で使用されるとき、「免疫力エンハンサー」という用語は、Ｔ細胞の活性化および／または機能を刺激および／または増強する非天然分子、免疫賦活因子、ならびにＴ細胞または他の免疫細胞内に腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルを免疫刺激シグナルに変換する非天然ポリペプチドを指す。
【０３０７】
特定の実施形態において、免疫力エンハンサーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）分子；サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、および／またはサイトカイン受容体を含むがこれらに限定されない免疫賦活因子；ならびにフリップ受容体からなる群から選択される。
【０３０８】
いくつかの実施形態において、免疫力エンハンサー、免疫賦活因子、またはフリップ受容体は、タンパク質不安定化ドメインを含む融合ポリペプチドである。
【０３０９】
ａ．二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）分子
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）分子をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、ＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢを導入することによってより強力になるように作製される。ＢｉＴＥ分子は、本明細書の他の箇所で企図される、標的抗原、リンカー、またはスペーサーに結合する第１の結合ドメインと、免疫エフェクター細胞上の刺激または共刺激分子に結合する第２の結合ドメインとを含む二分分子である。第１および第２の結合ドメインは、独立して、リガンド、受容体、抗体またはその抗原結合断片、レクチン、および炭水化物から選択され得る。
【０３１０】
特定の実施形態において、第１および第２の結合ドメインは、抗原結合ドメインである。
【０３１１】
特定の実施形態において、第１および第２の結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態において、第１および第２の結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
【０３１２】
特定の実施形態において第１の結合ドメインによって認識および結合され得る標的抗原の例示的な例には、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１３】
標的抗原の他の例示的な実施形態は、ＭＨＣ−ペプチド複合体を含み、任意に、ここで、ペプチドは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＭＡＧＥ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、ルイス−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１から処理される。
【０３１４】
特定の実施形態において第２の結合ドメインによって認識および結合される免疫エフェクター細胞上の刺激または共刺激分子の例示的な例には、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ２７８が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１５】
特定の実施形態において、ＤＳＢは、遺伝子操作されたヌクレアーゼによってＴＧＦβＲ２遺伝子において誘導され、ＢｉＴＥを含むドナー修復テンプレートは細胞内に導入され、相同組換えによってＴＧＦβＲ２遺伝子内に挿入される。
【０３１６】
ｂ．免疫賦活因子
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、ゲノム編集された細胞または腫瘍微小環境における細胞のいずれかにおいて免疫賦活因子を増加させることによってより強力になるように作製される。免疫賦活因子は、免疫エフェクター細胞における免疫応答を増強する特定のサイトカイン、ケモカイン、サイトキシン、およびサイトカイン受容体を指す。一実施形態において、Ｔ細胞は、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒素、またはサイトカイン受容体をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、ＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。
【０３１７】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＩＬ−２、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＴＮＦ−αからなる群から選択されるサイトカインをコードする。
【０３１８】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、およびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるケモカインをコードする。
【０３１９】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、パーフォリン、グランザイムＡ、およびグランザイムＢからなる群から選択される細胞毒素をコードする。
【０３２０】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、およびＩＬ−２１受容体からなる群から選択されるサイトカイン受容体をコードする。
【０３２１】
ｃ．フリップ受容体
さらなる実施形態において、ドナー修復テンプレートは、フリップ受容体またはその部分をコードする。本明細書で使用されるとき、「フリップ受容体」という用語は、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルをＴ細胞内の免疫刺激シグナルに変換する非天然ポリペプチドを指す。特定の実施形態において、ＴＧＦβＲ２フリップ受容体は、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインまたはそれらのバリアントと、膜貫通ドメインと、Ｔ細胞に免疫刺激シグナルを伝達する細胞内ドメインとを含むポリペプチドを指す。特定の実施形態において、ＴＧＦβＲ２フリップ受容体は、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインまたはそれらのバリアントと、ＴＧＦβＲ２膜貫通ドメインと、Ｔ細胞に免疫刺激シグナルを伝達する細胞内ドメインとを含むポリペプチドを指す。特定の実施形態において、ＴＧＦβＲ２フリップ受容体は、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインまたはそれらのバリアントと、膜貫通ドメインと、Ｔ細胞に免疫刺激シグナルを伝達するタンパク質からの細胞内ドメインとを含むポリペプチドを指す。ある特定の実施形態において、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインバリアントは、ＴＧＦβ−１に対する増加した結合親和性を有する。
【０３２２】
一実施形態において、膜貫通は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、ＰＤ−１、およびＴＧＦβＲ２から単離される。
【０３２３】
一実施形態において、膜貫通は、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ３ポリペプチドから単離される。
【０３２４】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＴＧＦβＲ２フリップ受容体を含み、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または主要シグナル伝達ドメインとを含む。膜貫通および細胞内ドメインは、同じタンパク質または異なるタンパク質から単離され得る。
【０３２５】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＴＧＦβＲ２フリップ受容体を含み、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、ＴＧＦβＲ２膜貫通ドメインのＣ末端終端にフレーム内で融合されたＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζからの細胞内ドメインとを含む。
【０３２６】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＴＧＦβＲ２フリップ受容体を含み、ＴＧＦβＲ２細胞外ドメインまたはリガンド結合ドメインと、ＴＧＦβＲ２膜貫通ドメインと、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または主要シグナル伝達ドメインとを含む。
【０３２７】
２．免疫抑制シグナルダンパー
既存の養子細胞療法を悩ませるある制限または問題は、腫瘍微小環境によって媒介された疲弊に起因する免疫エフェクター細胞の低応答性である。疲弊したＴ細胞は、ナイーブ、エフェクター、またはメモリーＴ細胞と著しく異なる固有の分子シグネチャを有する。それらは、減少したサイトカイン発現およびエフェクター機能を有するＴ細胞として定義される。
【０３２８】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、免疫抑制因子によるシグナル伝達を減少または減衰することによって疲弊に対してより耐性を有するように作製される。一実施形態において、Ｔ細胞は、免疫抑制シグナルダンパーをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、ＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。
【０３２９】
本明細書で使用されるとき、「免疫抑制シグナルダンパー」という用語は、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルのＴ細胞への伝達を減少させる非天然ポリペプチドを指す。一実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する抗体またはその抗原結合断片である。好ましい実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、ダンパーが、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、任意に、膜貫通ドメインと、任意に、修飾細胞内ドメイン（例えば、細胞内シグナル伝達ドメイン）とを含むため、特定の免疫抑制因子またはシグナル伝達経路への抑制、減衰、または優性阻害効果を引き出すポリペプチドを指す。
【０３３０】
特定の実施形態において、細胞外ドメインは、および免疫抑制因子を認識および結合する細胞外結合ドメインである。
【０３３１】
特定の実施形態において、修飾細胞内ドメインは、免疫抑制シグナルを減少または阻害するように変異される。好適な変異戦略には、アミノ酸置換、付加、または欠失が含まれるが、これらに限定されない。好適な変異には、さらに、シグナル伝達ドメインを除去するための細胞内ドメイン切断短縮、シグナル伝達モチーフ活性にとって重要な残基を除去するための変異細胞内ドメイン、および受容体循環を遮断するための変異細胞内ドメインが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、細胞内ドメインは、存在するとき、免疫抑制シグナルを伝達しないか、または実質的に低減されたシグナル伝達を有する。
【０３３２】
したがって、いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、腫瘍微小環境から１つ以上の免疫抑制因子のためのシンクの役割を果たし、Ｔ細胞において対応する免疫抑制シグナル伝達経路を阻害する。
【０３３３】
１つの免疫抑制シグナルは、トリプトファン異化によって媒介される。癌細胞においてインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）によるトリプトファン異化は、腫瘍微小環境におけるＴ細胞への免疫抑制効果を有することが示されているキヌレニンの産生をもたらす。例えば、Ｐｌａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２（２１）：５４３５−４０を参照されたい。
【０３３４】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、キヌレニナーゼ活性を有する酵素を含む。
【０３３５】
特定の実施形態において使用するのに好適なキヌレニナーゼ活性を有する酵素の例示的な例には、Ｌ−キヌレニンヒドロラーゼが含まれるが、これに限定されない。
【０３３６】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、免疫抑制因子によって媒介される免疫抑制シグナル伝達を減少または遮断する免疫抑制シグナルダンパーをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【０３３７】
特定の実施形態において企図される免疫抑制シグナルダンパーによって標的とされる免疫抑制因子の例示的な例には、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、マクロファージコロニー刺激因子１（Ｍ−ＣＳＦ１）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＳｉＳｏ細胞リガンド上で発現される受容体結合癌抗原（ＲＣＡＳ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ４７、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３３８】
種々の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０３３９】
種々の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインを含む。
【０３４０】
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとを含む。
【０３４１】
別の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを伝達しないかまたは免疫抑制シグナルを伝達する実質的に低減された能力を有する修飾細胞内ドメインとを含む。
【０３４２】
本明細書で使用されるとき、「細胞外ドメイン」という用語は、抗原結合ドメインを指す。一実施形態において、細胞外ドメインは、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルをＴ細胞に伝達する免疫抑制受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。特定の実施形態において、細胞外ドメインは、免疫受容体阻害性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）および／または免疫受容体チロシンスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む受容体の細胞外リガンド結合ドメインを指す。
【０３４３】
免疫抑制シグナルダンパーの特定の実施形態において使用するのに好適な細胞外ドメインの例示的な例には、抗体もしくはその抗原結合断片、または以下のポリペプチド：プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、バンドＴリンパ球減弱因子（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよび免疫受容体チロシン依存性阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、形質転換成長因子β受容体２（ＴＧＦβＲ２）、マクロファージコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）、インターロイキン４受容体（ＩＬ４Ｒ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体１（ＣＸＣＲ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体２（ＣＸＣＲ２）、インターロイキン１０受容体サブユニットアルファ（ＩＬ１０Ｒ）、インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ１３Ｒα２）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬＲ１）、ＳｉＳｏ細胞上で発現される受容体結合癌抗原（ＲＣＡＳ１Ｒ）、ならびにＦａｓ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）から単離された細胞外リガンド結合ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
【０３４４】
一実施形態において、細胞外ドメインは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、およびＴＧＦβＲ２からなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【０３４５】
多くの膜貫通ドメインは、特定の実施形態において使用され得る。特定の実施形態において企図される免疫抑制シグナルダンパーの特定の実施形態において使用するのに好適な膜貫通ドメインの例示的な例には、以下のタンパク質：Ｔ細胞受容体、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖の膜貫通ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
【０３４６】
特定の実施形態において、本明細書で企図される養子細胞療法は、ＴＧＦβＲ２を通る腫瘍微小環境からの免疫抑制ＴＧＦβシグナルの伝達を阻害または遮断する免疫抑制シグナルダンパーを含む。一実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、ＴＧＦβＲ２細胞外リガンド結合を含む細胞外ドメインと、ＴＧＦβＲ２膜貫通ドメインと、切断短縮された、機能不全ＴＧＦβＲ２細胞内ドメインとを含む。別の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、ＴＧＦβＲ２細胞外リガンド結合を含む細胞外ドメイン、ＴＧＦβＲ２膜貫通ドメインを含み、細胞内ドメインを欠いている。
【０３４７】
３．遺伝子操作された抗原受容体
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作された抗原受容体を含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、遺伝子操作された抗原受容体をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。
【０３４８】
特定の実施形態において、遺伝子操作された抗原受容体は、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体である。
【０３４９】
ａ．遺伝子操作されたＴＣＲ
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作されたＴＣＲを含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、遺伝子操作されたＴＣＲをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、遺伝子操作されたＴＣＲは、単一のＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢで挿入される。別の実施形態、遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖は、１つのＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢに挿入され、遺伝子操作されたＴＣＲのベータ鎖は、他のＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢに挿入される。
【０３５０】
一実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作されたＴ細胞は、ＴＧＦβＲ２遺伝子で挿入されていない遺伝子操作されたＴＣＲを含み、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファおよび／もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体のうちの１つ以上が、１つ以上のＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢに挿入される。
【０３５１】
自然発生するＴ細胞受容体は、２つのサブユニットであるアルファ鎖およびベータ鎖サブユニットを含み、これらの各々は、各Ｔ細胞のゲノムにおいて組換え事象によって産生される固有のタンパク質である。ＴＣＲのライブラリは、特定の標的抗原に対するそれらの選択性に関してスクリーニングされ得る。このように、標的抗原に対して高い結合活性および反応性を有する天然ＴＣＲが選択され、クローン化され、その後、養子免疫療法のために使用されるＴ細胞の集団内に導入され得る。
【０３５２】
一実施形態において、Ｔ細胞は、１つ以上のＴＧＦβＲ２遺伝子において、ＤＳＢでＴＣＲのサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復テンプレートに導入することによって修飾され、ここで、ＴＣＲサブユニットは、標的抗原を発現する腫瘍細胞に対してＴ細胞への特異性を付与するＴＣＲを形成する能力を有する。特定の実施形態において、サブユニットは、サブユニットがＴＣＲを形成する能力を保持し、トランスフェクトされたＴ細胞が標的細胞に誘導される能力を付与し、免疫学的に関連するサイトカインシグナル伝達に関与する限り、自然発生するサブユニットと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、または修飾を有する。遺伝子操作されたＴＣＲはまた、好ましくは、高い活性を有する関連のある腫瘍関連ペプチドを表示する標的細胞に結合し、および任意に、インビボで関連ペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺傷を媒介する。
【０３５３】
遺伝子操作されたＴＣＲをコードする核酸は、好ましくは、Ｔ細胞の（自然発生する）染色体においてそれらの天然の状況から単離され、本明細書の他の箇所で記載される、好適なベクター内に組み込まれ得る。それらを含む核酸およびベクターの両方が、細胞に、好ましくは、特定の実施形態において、Ｔ細胞内に移入され得る。次いで、修飾Ｔ細胞は、形質導入された核酸（複数可）によってコードされるＴＣＲのうちの１つ以上の鎖を発現することができる。好ましい実施形態において、遺伝子操作されたＴＣＲは、特定のＴＣＲを正常に発現しないＴ細胞内に導入されるため、外因性ＴＣＲである。遺伝子操作されたＴＣＲの本質的態様は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または類似の免疫学的構成要素によって提示される腫瘍抗原に対して高い結合力を有することである。遺伝子操作されたＴＣＲとは対照的に、ＣＡＲは、ＭＨＣの独立した様式で標的抗原に結合するように遺伝子操作される。
【０３５４】
ＴＣＲは、結合した追加のポリペプチドが、機能的Ｔ細胞受容体およびＭＨＣ依存性抗原認識を形成するアルファ鎖またはベータ鎖の能力に干渉しない限り、ＴＣＲの本発明のアルファ鎖またはベータ鎖のアミノ末端またはカルボキシル末端部分に結合する追加のポリペプチドで発現され得る。
【０３５５】
特定の実施形態において企図される遺伝子操作されたＴＣＲによって認識される抗原には、血液癌および固形腫瘍の両方における抗原を含む、癌抗原が含まれるが、これに限定されない。例示的な抗原には、アルファ葉酸受容体、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１が含まれるが、これらに限定されない。
【０３５６】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたは第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、１つの修飾および／または機能不全ＴＧＦβＲ２遺伝子に一体化された遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖および／またはベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。
【０３５７】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたは第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、１つの修飾および／または機能不全ＴＧＦβＲ２遺伝子に一体化された遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖およびベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。
【０３５８】
特定の実施形態において、ドナー修復テンプレートは、５´〜３´の、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドと、第２の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、１つの修飾および／または機能不全ＴＧＦβＲ２遺伝子に一体化された遺伝子操作されたＴＣＲのベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。このような場合には、他のＴＧＦβＲ２遺伝子は、機能的であり得るか、またはＤＳＢによって機能を減少させるかもしく機能不全を与えられ、ＮＨＥＪによって修復され得る。一実施形態において、他のＴＧＦβＲ２遺伝子は、本明細書で企図される遺伝子操作されたヌクレアーゼによって修飾され、機能を減少させるかまたは機能不全を与えられる。
【０３５９】
ある特定の実施形態において、両方のＴＧＦβＲ２遺伝子が修飾され、機能を減少するかまたは機能不全であり、第１の修飾ＴＧＦβＲ２遺伝子は、第１の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、遺伝子操作されたＴＣＲのアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む核酸を含み、第２の修飾ＴＧＦβＲ２遺伝子は、第２の自己切断型ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと遺伝子操作されたＴＣＲのベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。
【０３６０】
ｂ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
特定の実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、ＣＡＲは、単一のＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢで挿入される。
【０３６１】
一実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作されたＴ細胞、ＴＧＦβＲ２遺伝子で挿入されていないＣＡＲ、ならびに免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファおよび／もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体のうちの１つ以上が、１つ以上のＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢに挿入される。
【０３６２】
種々の実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性を再指向するＣＡＲを発現する。ＣＡＲは、特異的抗腫瘍細胞性免疫活性を呈するキメラタンパク質を生成するために、Ｔ細胞受容体を活性化する細胞内ドメインを有する標的抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体系特異性を組み合わせる分子である。本明細書で使用されるとき、「キメラ」という用語は、異なるタンパク質の部分または異なる起源からのＤＮＡからなっていることを説明する。
【０３６３】
種々の実施形態において、ＣＡＲは、特異的標的抗原（結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも称される）に結合する細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。ＣＡＲの主な特性は、免疫エフェクター細胞特異性を再指向するそれらの能力であり、それによって、主要組織適合性（ＭＨＣ）の独立した様式で、標的抗原を発現する細胞の細胞死を媒介し得る、分子の増殖、サイトカイン産生、食作用、または産生を引き起こし、モノクローナル抗体、可溶性リガンド、または細胞特異的共受容体の細胞特異的標的能力を利用する。
【０３６４】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、標的ポリペプチド、例えば、腫瘍細胞上で発現される標的抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含む。本明細書で使用されるとき、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は、互換的に使用され、キメラ受容体、例えば、目的となる標的抗原に特異的に結合する能力を有するＣＡＲまたはＤａｒｉｃを提供する。結合ドメインは、生物学的分子（例えば、細胞表面受容体または腫瘍タンパク質、脂質、多糖、または他の細胞表面標的分子もしくはその構成要素）に特異的に認識および結合する能力を有する、任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドを含み得る。結合ドメインは、目的となる生物学的分子に対する、任意に自然発生する、合成、半合成、または組換え技術によって産生された結合パートナーを含む。
【０３６５】
特定の実施形態において、細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０３６６】
「抗体」は、ペプチド、脂質、多糖、または抗原決定基を含有する核酸、例えば、免疫細胞によって認識されるものなどの、標的抗原のエピトープを特異的に認識し、それに結合する少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである結合剤を指す。抗体には、抗原結合断片、例えば、ラクダＩｇ（ラクダ科抗体またはそのＶＨＨ断片）、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、Ｎａｎｏｂｏｄｙ）またはその他の抗体断片が含まれる。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ共役抗体（二重特異性抗体など）、およびそれらの抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。
【０３６７】
１つの好ましい実施形態において、結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【０３６８】
別の好ましい実施形態において、結合ドメインは、ラクダ科抗体である。
【０３６９】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
【０３７０】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外結合ドメイン、例えば、抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、ここで、抗原は、クラスＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体またはクラスＩＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体などのＭＨＣ−ペプチド複合体である。
【０３７１】
ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、種々のドメイン間のリンカー残基を含む。「可変領域連結配列」は、重鎖可変領域を軽鎖可変領域に接続し、得られるポリペプチドが、同じ軽鎖および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対して特異的結合親和性を保持するように、２つのサブ結合ドメインの相互作用に適合性のあるスペーサー機能を提供するアミノ酸配列である。特定の実施形態において、ＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ以上のリンカーを含む。特定の実施形態において、リンカーの長さは、約１〜約２５個のアミノ酸、約５〜約２０個のアミノ酸、もしくは約１０〜約２０個のアミノ酸、またはアミノ酸の任意の介在する長さである。いくつかの実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上のアミノ酸長である。
【０３７２】
特定の実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインの後ろに、１つ以上の「スペーサードメイン」が続き、これは、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離して適切な細胞／細胞接触、抗原結合、および活性化を可能にする領域を指す（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２−４１９）。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ある特定の実施形態において、スペーサードメインは、１つ以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３を含むが、これらに限定されない、免疫グロブリンの部分である。スペーサードメインは、自然発生する免疫グロブリンヒンジ領域または改変した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
【０３７３】
一実施形態において、スペーサードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３を含む。
【０３７４】
一実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインは、エフェクター細胞表面から離して抗原結合ドメインを位置決めて、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、および活性化を可能にする役割を果たす、１つ以上の「ヒンジドメイン」に連結される。ＣＡＲは、概して、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間に１つ以上のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、自然発生する免疫グロブリンヒンジ領域または改変した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
【０３７５】
本明細書に記載されるＣＡＲにおいて使用するのに好適な例示的なヒンジドメインは、ＣＤ８α、およびＣＤ４などの１型膜タンパク質の細胞外領域に由来するヒンジ領域を含み、これは、これらの分子からの野生型ヒンジ領域であり得るか、または改変され得る。別の実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。
【０３７６】
一実施形態において、ヒンジは、ＰＤ−１ヒンジまたはＣＤ１５２ヒンジである。
【０３７７】
「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合部分および細胞内シグナル伝達ドメインを融合し、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の形質膜に固定するＣＡＲの部分である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。
【０３７８】
例示的なＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖の少なくとも膜貫通領域（複数可）に由来し得る（すなわち、それらを含み得る。
【０３７９】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインを含む。別の実施形態において、本明細書で企図されるＣＡＲは、ＣＤ８αに由来するＴＭドメインと、好ましくは、ＴＭドメインおよびＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインに連結する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長の短オリゴまたはポリペプチドリンカーとを含む。グリシン−セリンリンカーは、特定の好適なリンカーを提供する。
【０３８０】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、標的抗原への有効なＣＡＲ結合のメッセージを、免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、ＣＡＲ結合標的細胞への細胞傷害性因子の放出、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合で引き出される他の細胞応答を含む、活性化、サイトカイン産生、増殖、および細胞傷害性活性を引き出すことに関与するＣＡＲの部分を指す。
【０３８１】
「エフェクター機能」という用語は、本細胞の特殊な機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解性活性もしくは補助、またはサイトカインの分泌を含む活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊な機能を行うように細胞を指向するタンパク質の部分を指す。通常は、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を用いることができるが、多くの場合、ドメイン全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断短縮部分を使用する範囲内で、かかる切断短縮部分がエフェクター機能シグナルを伝達する限り、それをドメイン全体の代わりに使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意の切断短縮部分を含むことを意味する。
【０３８２】
ＴＣＲ単独によって生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化に不十分であること、および二次または共刺激シグナルも必要であることが知られている。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの固有のクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン：ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）によって抗原依存性一次活性化を惹起する主要シグナル伝達ドメイン、および抗原非依存性様式で作用して、二次または共刺激シグナルを提供する共刺激シグナル伝達ドメインによって媒介されると言うことができる。好ましい実施形態において、ＣＡＲは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」と「主要シグナル伝達ドメイン」とを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０３８３】
主要シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体の一次活性化を刺激性に、または阻害性に調節する。刺激様式に作用する主要シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン依存性活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして既知のシグナル伝達モチーフを含有し得る。
【０３８４】
特定の実施形態において企図されるＣＡＲにおいて使用するのに好適な主要シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの例示的な例には、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。特に好ましい実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインと１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。細胞内主要シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに膜貫通ドメインのカルボキシル末端と連結され得る。
【０３８５】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および増大を強化するための１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用されるとき、「共刺激シグナル伝達ドメイン」、または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。
【０３８６】
特定の実施形態において企図されるＣＡＲにおいて使用するのに好適なかかる共刺激分子の例示的な例には、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０が含まれる。一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインとを含む。
【０３８７】
種々の実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインと、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１５４、およびＰＤ−１からなる群から選択されるポリペプチドから単離された膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択されるポリペプチドから単離された１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されたシグナル伝達ドメインとを含む。
【０３８８】
ｃ．Ｄａｒｉｃ受容体
特定の実施形態において、遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上のＤａｒｉｃ受容体を含む。本明細書で使用されるとき、「Ｄａｒｉｃ受容体」という用語は、多鎖遺伝子操作された抗原受容体を指す。一実施形態において、Ｔ細胞は、Ｄａｒｉｃの１つ以上の構成要素をコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、Ｄａｒｉｃまたはその１つ以上の構成要素は、単一のＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢで挿入される。
【０３８９】
一実施形態において、遺伝子操作されたＴ細胞は、ＴＧＦβＲ２遺伝子、ならびに免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファおよび／もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のうちの１つ以上で挿入されないＤａｒｉｃを含むか、またはＤａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素は、１つ以上のＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢに挿入される。
【０３９０】
Ｄａｒｉｃ構成および構成要素の例示的な例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０１７２１４号および米国特許公開第２０１５／０２６６９７３号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３９１】
一実施形態において、ドナー修復テンプレートは、以下のＤａｒｉｃ構成要素：第１の多量体化ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、ならびに１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または主要シグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達ポリペプチドと、結合ドメイン、第２の多量体化ドメイン、および任意に、第２の膜貫通ドメインを含む結合ポリペプチドとを含む。機能的Ｄａｒｉｃは、シグナル伝達ポリペプチドおよび結合ポリペプチドの多量体化ドメインに関連し、かつそれらの間に配置される架橋因子を有する細胞表面上にＤａｒｉｃ受容体複合体の形成を促進する架橋因子を含む。
【０３９２】
特定の実施形態において、第１および第２の多量体化ドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログ、クーママイシンまたはその誘導体、ジベレリンまたはその誘導体、アブシジン酸（ＡＢＡ）またはその誘導体、メトトレキサートまたはその誘導体、シクロスポリンＡまたはその誘導体、ＦＫＣｓＡまたはその誘導体、ＦＫＢＰ（ＳＬＦ）のためのトリメトプリム（Ｔｍｐ）−合成リガンドまたはその誘導体、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される架橋因子と関連する。
【０３９３】
ラパマイシン類似体（ラパログ）の例示的な例には、米国特許第６，６４９，５９５号に開示されているものが含まれ、そのラパログ構造は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態において、架橋因子は、ラパマイシンと比較して、実質的に低減された免疫抑制効果を有するラパログである。「実質的に低減された免疫抑制効果」は、臨床的にソフトバンクまたはヒト免疫抑制活性の適切なインビトロ（例えば、Ｔ細胞増殖の阻害）もしくはインビボでのサロゲートで測定される、等モル量のラパマイシンに観察されるかまたは期待される免疫抑制効果を少なくとも０．１未満〜０．００５倍有するラパログを指す。一実施形態において、「実質的に低減された免疫抑制効果」は、同じアッセイにおいてラパマイシンに関して観察されるＥＣ５０値よりも少なくとも１０〜２５０倍大きいかかるインビトロアッセイにおいてＥＣ５０値を有するラパログを指す。
【０３９４】
ラパログの他の例示的な例には、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダフォロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、およびゾタロリムスが含まれるが、これらに限定されない。
【０３９５】
ある特定の実施形態において、多量体化ドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログである架橋因子と関連があるであろう。例えば、第１および第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰおよびＦＲＢから選択される対である。ＦＲＢドメインは、ＦＫＢＰタンパク質およびラパマイシンまたはそのラパログと共に三部分複合体を形成することができるポリペプチド領域（タンパク質「ドメイン」）である。ＦＲＢドメインは、ヒトおよび他の種からのｍＴＯＲタンパク質（文献においてＦＲＡＰ、ＲＡＰＴ１、またはＲＡＦＴとも称される）、Ｔｏｒ１およびＴｏｒ２を含む酵母タンパク質、ならびにカンジダＦＲＡＰホモログを含む、多くの自然発生するタンパク質中に存在する。ヌクレオチド配列、クローニング、およびこれらのタンパク質の他の態様に関する情報は、既に当該技術分野において知られている。例えば、ヒトｍＴＯＲにおけるタンパク質配列受託番号は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ３４０７５．１である（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６９：７５６，１９９４）。
【０３９６】
本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なＦＲＢドメインは、概して、少なくとも約８５〜約１００個のアミノ酸残基を含有する。ある特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質において使用するためのＦＲＢアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ３４０７５．１のアミノ酸配列に基づいて、９３アミノ酸配列Ｉｌｅ−２０２１〜Ｌｙｓ−２１１３およびＴ２０９８Ｌの変異を含むであろう。特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃにおいて使用するためのＦＲＢドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合したＦＫＢＰタンパク質の複合体に結合することができるであろう。ある特定の実施形態において、ＦＲＢドメインのペプチド配列は、（ａ）相同タンパク質のヒトｍＴＯＲの少なくとも示された９３アミノ酸領域または対応する領域に及ぶ自然発生するペプチド配列、（ｂ）自然発生するペプチドの、最大約１０個のアミノ酸、または約１〜約５個のアミノ酸もしくは約１〜約３個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態において、わずか１個のアミノ酸が、欠失、挿入、または置換されている自然発生するＦＲＢのバリアント、あるいは（ｃ）自然発生するＦＲＢドメインをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子によって、または遺伝子コードの縮重がなかったら、自然発生するＦＲＢドメインをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができ得るＤＮＡ配列によってコードされるペプチドを含む。
【０３９７】
ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）は、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、およびラパマイシンなどのマクロライドの細胞質受容体であり、種線にわたって高度に保存される。ＦＫＢＰは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合し、ＦＲＢを含有するタンパク質または融合タンパク質を用いて三部分複合体をさらに形成することができるタンパク質またはタンパク質ドメインである。ＦＫＢＰドメインはまた、「ラパマイシン結合ドメイン」とも称され得る。ヌクレオチド配列、クローニング、および種々のＦＫＢＰ種の他の態様に関連する情報は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｓｔａｅｎｄａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：６７１，１９９０（ｈｕｍａｎ  ＦＫＢＰ１２）、Ｋａｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１４：３６１，１９９６を参照されたい）。他の哺乳動物種、酵母、および他の生物における相同ＦＫＢＰタンパク質もまた、当該技術分野において知られており、本明細書に開示される融合タンパク質において使用され得る。特定の実施形態において企図されるＦＫＢＰドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合し、ＦＲＢを含有するタンパク質を用いて三部分複合体に関与することができるであろう（かかる結合を検出するために、任意の手段によって、直接または間接的に決定され得るように）。
【０３９８】
特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃにおいて使用するのに好適なＦＫＢＰドメインの例示的な例には、好ましくはヒトＦＫＢＰ１２タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ５８４７６．１）から単離された自然発生するＦＫＢＰペプチド配列、あるいはそこから、別のヒトＦＫＢＰから、マウスもしくは他の哺乳動物ＦＫＢＰから、またはいくつかの他の動物、酵母、もしくは真菌ＦＫＢＰから単離されたペプチド配列；自然発生するペプチドの、最大約１０個のアミノ酸、または約１〜約５個のアミノ酸もしくは約１〜約３個のアミノ酸、またはいくつかの実施形態において、わずか１個のアミノ酸が、欠失、挿入、もしくは置換されている自然発生するＦＫＢＰ配列のバリアント；あるいは自然発生するＦＫＢＰをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子によって、または遺伝子コードの縮重がなかったら、自然発生するＦＫＢＰをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができ得るＤＮＡ配列によってコードされるペプチド配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０３９９】
特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃにおいて使用するのに好適な多量体化ドメイン対の他の例示的な例には、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびシクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、またはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはそれらのバリアントが含まれるが、これらから含まれることに限定されない。
【０４００】
さらに他の実施形態において、抗架橋因子は、シグナル伝達ポリペプチドおよび結合ポリペプチドと架橋因子との会合を遮断する。例えば、シクロスポリンまたはＦＫ５０６は、ラパマイシンを滴定するための抗架橋因子として使用され、したがって、１つの多量体化ドメインのみが結合するため、シグナル伝達を停止し得る。ある特定の実施形態において、抗架橋因子（例えば、シクロスポリン、ＦＫ５０６）は、免疫抑制剤である。例えば、免疫抑制抗架橋因子は、特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃ構成要素の機能を遮断または最小限に抑え、同時に、臨床設定において望ましくないかまたは病理学的炎症応答を阻害または遮断するために使用され得る。
【０４０１】
一実施形態において、第１の多量体化ドメインはＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌを含み、第２の多量体化ドメインはＦＫＢＰ１２を含み、架橋因子はラパログＡＰ２１９６７である。
【０４０２】
別の実施形態において、第１の多量体化ドメインはＦＲＢを含み、第２の多量体化ドメインはＦＫＢＰ１２を含み、架橋因子はラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
【０４０３】
特定の実施形態において、シグナル伝達ポリペプチド、第１の膜貫通ドメイン、および結合ポリペプチドは、第２の膜貫通ドメインまたはＧＰＩアンカーを含む。第１および第２の膜貫通ドメインの例示的な例は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ−１からなる群から独立して選択されるポリペプチドから単離される。
【０４０４】
一実施形態において、シグナル伝達ポリペプチドは、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または主要シグナル伝達ドメインを含む。
【０４０５】
特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃシグナル伝達構成要素において使用するのに好適な主要シグナル伝達ドメインの例示的な例には、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが含まれる。特定の好ましい実施形態において、Ｄａｒｉｃシグナル伝達構成要素は、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインと、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。細胞内主要シグナル伝達ドメインおよび共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の順序でタンデムに膜貫通ドメインのカルボキシル末端と連結され得る。
【０４０６】
特定の実施形態において企図されるＤａｒｉｃシグナル伝達構成要素において使用するのに好適なかかる共刺激分子の例示的な例には、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０が含まれる。一実施形態において、Ｄａｒｉｃシグナル伝達構成要素は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインとを含む。
【０４０７】
特定の実施形態において、Ｄａｒｉｃ結合構成要素は、結合ドメインを含む。一実施形態において、結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片である。
【０４０８】
抗体またはその抗原結合断片は、ペプチド、脂質、多糖、または抗原決定基を含有する核酸、例えば、免疫細胞によって認識されるものなどの標的抗原のエピトープを特異的に認識し、それに結合する少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含む。抗体には、抗原結合断片、例えば、ラクダＩｇ（ラクダ科抗体またはそのＶＨＨ断片）、Ｉｇ  ＮＡＲ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ビス−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、Ｎａｎｏｂｏｄｙ）またはその他の抗体断片が含まれる。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ共役抗体（二重特異性抗体など）、およびそれらの抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７も参照されたい。
【０４０９】
１つの好ましい実施形態において、結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【０４１０】
別の好ましい実施形態において、結合ドメインは、ラクダ科抗体である。
【０４１１】
特定の実施形態において、Ｄａｒｉｃ結合構成要素は、アルファ葉酸受容体、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）を含むＥＧＦＲファミリー、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭ、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ２、ＧＤ３、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、カッパ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
【０４１２】
一実施形態において、Ｄａｒｉｃ結合構成要素は、細胞外ドメイン、例えば、クラスＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体またはクラスＩＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体などのＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０４１３】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＤａｒｉｃ構成要素は、２つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ドメイン、領域、またはモチーフを接続するリンカーまたはスペーサーを含む。ある特定の実施形態において、リンカーは、約２〜約３５個のアミノ酸、または約４〜約２０個のアミノ酸、または約８〜約１５個のアミノ酸、または約１５〜約２５個のアミノ酸を含む。他の実施形態において、スペーサーは、抗体ＣＨ２ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメインなどの特定の構造を有し得る。一実施形態において、スペーサーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。
【０４１４】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるＤａｒｉｃ構成要素は、ドメインを位置決めて、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、および活性化を可能にする役割を果たす、１つ以上の「ヒンジドメイン」を含む。Ｄａｒｉｃは、結合ドメインと、多量体化ドメインおよび／もしくは膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間、または多量体化ドメインと膜貫通ドメインとの間に１つ以上のヒンジドメインを含み得る。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組換え源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、自然発生する免疫グロブリンヒンジ領域または改変した免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８αヒンジまたはＣＤ４ヒンジである。
【０４１５】
一実施形態において、Ｄａｒｉｃは、シグナル伝達ポリペプチドを含み、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメインと、ＣＤ８膜貫通ドメインと、４−１ＢＢ共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインとを含み、結合ポリペプチドは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖと、ＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインと、ＣＤ４膜貫通ドメインとを含み、架橋因子は、ラパログＡＰ２１９６７である。
【０４１６】
一実施形態において、Ｄａｒｉｃは、シグナル伝達ポリペプチドを含み、ＦＲＢの第１の多量体化ドメインと、ＣＤ８膜貫通ドメインと、４−１ＢＢ共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインとを含み、結合ポリペプチドは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖと、ＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインと、ＣＤ４膜貫通ドメインとを含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
【０４１７】
ｄ．ゼータカイン
特定の実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上のキメラサイトカイン受容体を含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードするドナー修復テンプレートの存在下で、１つ以上のＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢを導入することによって遺伝子操作される。特定の実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、単一のＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢで挿入される。
【０４１８】
一実施形態において、本明細書で企図される遺伝子操作されたＴ細胞、ＴＧＦβＲ２遺伝子で挿入されていないキメラサイトカイン受容体、ならびに免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファおよび／もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体のうちの１つ以上が、１つ以上のＴＧＦβＲ２遺伝子においてＤＳＢに挿入される。
【０４１９】
種々の実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性を再指向するキメラサイトカイン受容体を発現する。ゼータカインは、細胞外ドメインを細胞表面に連結することができる支援領域に連結された可溶性受容体リガンドを含む細胞外ドメインと、膜貫通領域と、細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ膜貫通免疫受容体である。ゼータカインは、Ｔリンパ球の表面上で発現されるとき、可溶性受容体リガンドが特異的である受容体を発現するような細胞に、Ｔ細胞活性を指向する。ゼータカインキメラ免疫受容体は、様々な癌の治療への適用と共に、特に、ヒト悪性腫瘍によって利用される自己分泌／傍分泌サイトカイン系を介してＴ細胞の抗原特異性を再指向する。
【０４２０】
特定の実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、免疫抑制サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアント、リンカー、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０４２１】
特定の実施形態において、サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアントは、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）からなる群から選択される。
【０４２２】
ある特定の実施形態において、リンカーは、ＣＨ２ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメインなどを含む。一実施形態において、リンカーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。一実施形態において、リンカーは、ＣＤ８αまたはＣＤ４ヒンジドメインを含む。
【０４２３】
特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＡＭＮ、およびＰＤ−１のアルファまたはベータ鎖からなる群から選択される。
【０４２４】
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、主要シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激ドメインを含有するＩＴＡＭからなる群から選択される。
【０４２５】
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択される。
【０４２６】
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０からなる群から選択される。
【０４２７】
一実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ主要シグナル伝達ドメインとを含む。
【０４２８】
Ｆ．ポリペプチド
ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、および融合ポリペプチドを含むがこれらに限定されない種々のポリペプチドが本明細書で企図される。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、配列番号：１〜１０に記載されるアミノ酸配列を含む。「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、別段の規定がない限り、従来の意味に従って、すなわち、アミノ酸の配列として互換的に使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」は、融合ポリペプチドおよび他のバリアントを含む。ポリペプチドは、多様な周知の組換えおよび／または合成技法のうちのいずれかを使用して調製され得る。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、完全長タンパク質配列、完全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含み得、ポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに自然発生するかまたは自然発生しない両方の、当該技術分野において既知の他の修飾を含み得る。
【０４２９】
本明細書で使用されるとき、「単離されたタンパク質」、「単離されたペプチド」、または「単離されたポリペプチド」などは、ペプチドまたはポリペプチド分子の、細胞環境からの、および細胞の他の構成要素との会合からのインビトロ合成、単離、および／または精製を指し、すなわち、それは、インビボ物質と強く会合していない。
【０４３０】
特定の実施形態において企図されるポリペプチドの例示的な例には、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセシングヌクレアーゼ、融合ポリペプチド、およびそれらのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
【０４３１】
ポリペプチドは、「ポリペプチドバリアント」を含む。ポリペプチドバリアントは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、付加、および／または挿入において自然発生するポリペプチドとは異なり得る。かかるバリアントは、自然発生し得るか、または例えば、上述のポリペプチド配列の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって合成的に生成され得る。例えば、特定の実施形態において、ポリペプチド内に１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入を導入することによって、ヒトＴＧＦβＲ２遺伝子内の標的部位に結合し、それを切断するホーミングエンドヌクレアーゼ、ｍｅｇａＴＡＬなどの生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。特定の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書で企図される参照配列のいずれかに対して少なくとも約６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含み、典型的には、ここで、バリアントは、参照配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
【０４３２】
ポリペプチドバリアントは、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」を含む。生物学的に活性なポリペプチド断片の例示的な例には、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなどが含まれる。本明細書で使用されるとき、「生物学的に活性な断片」または「最小の生物学的に活性な断片」は、少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％の自然発生するポリペプチド活性を保持するポリペプチド断片を指す。好ましい実施形態において、生物学的活性は、標的配列に対する結合親和性および／または切断活性である。ある特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約１７００のアミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。ある特定の実施形態において、断片が、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００以上のアミノ酸長であることが理解されるであろう。特定の実施形態において、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの生物学的に活性な断片を含む。特定の実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、「Ｘ」として示される１つ以上のアミノ酸を含み得る。「Ｘ」は、アミノ酸配列番号に存在する場合、任意のアミノ酸を指す。１つ以上の「Ｘ」残基は、特に本明細書で企図される配列番号に記載されるアミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端に存在し得る。「Ｘ」アミノ酸が存在しない場合、配列番号に記載される残りのアミノ酸配列は、生物学的に活性な断片とみなされる。
【０４３３】
特定の実施形態において、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、例えば、配列番号：３〜７、またはｍｅｇａＴＡＬ（配列番号：８〜９）の生物学的に活性な断片を含む。生物学的に活性な断片は、Ｎ末端切断短縮および／またはＣ末端切断短縮を含み得る。特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの１、２、３、４、５、６、７、または８個のＮ末端アミノ酸の欠失、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの４個のＮ末端アミノ酸の欠失を欠いているかまたは含む。特定の実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの１、２、３、４、または５個のＣ末端アミノ酸の欠失、より好ましくは、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの２個のＣ末端アミノ酸の欠失を欠いているかまたは含む。特に好ましい実施形態において、生物学的に活性な断片は、対応する野生型ホーミングエンドヌクレアーゼ配列と比較して、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの４個のＮ末端アミノ酸および２個のＣ末端アミノ酸の欠失を欠いているかまたは含む。
【０４３４】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の、以下のＮ末端アミノ酸：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの欠失、および／または１、２、３、４、もしくは５個の、以下のＣ末端アミノ酸：Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｖの欠失を含む。
【０４３５】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の、以下のＮ末端アミノ酸：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの欠失もしくは置換、および／または１、２、３、４、もしくは５個の、以下のＣ末端アミノ酸：Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｆ、Ｖの欠失もしくは置換を含む。
【０４３６】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の、以下のＮ末端アミノ酸：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの欠失、および／または１もしくは２個の、以下のＣ末端アミノ酸：Ｆ、Ｖの欠失を含む。
【０４３７】
特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、もしくは８個の、以下のＮ末端アミノ酸：Ｍ、Ａ、Ｙ、Ｍ、Ｓ、Ｒ、Ｒ、Ｅの欠失もしくは置換、および／または１もしくは２個の、以下のＣ末端アミノ酸：Ｆ、Ｖの欠失もしくは置換を含む。
【０４３８】
上述のように、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断短縮、および挿入を含む種々の方法で改変され得る。かかる操作のための方法は、概して、当該技術分野において知られている。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡにおける変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列改変のための方法が当該技術分野において良く知られている。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８−４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）、およびそこに引用される参考文献を参照されたい。目的となるタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換に対するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルにおいて見出され得る。
【０４３９】
ある特定の実施形態において、バリアントは、１つ以上の保存的置換を含有するであろう。「保存的置換」は、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換され、そのためペプチド化学分野の当業者によってポリペプチドの二次構造およびハイドロパシー特性が実質的に変化しないことが予期されるような置換である。修飾は、特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造において行われ得、ポリペプチドは、少なくとも約を有するポリペプチドを含み、依然として望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を得る。同等の、またはさらに改善された、バリアントポリペプチドを作成するためポリペプチドのアミノ酸配列を改変することが所望されるとき、当業者は、例えば、表１に従って、例えば、コードするＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変化させ得る。
【表１】
2019535240.tif 000003
【０４４０】
どのアミノ酸残基が、生物学的活性を廃止することなく、置換、挿入、または欠失され得るかを決定するためのガイダンスは、ＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃベクター、またはベクターＮＴＩソフトウェアなどの当該技術分野において周知のコンピュータプログラムを使用して見出され得る。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントのアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電されたアミノ酸または非荷電のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリーのうちの１つの置換を伴う。自然発生するアミノ酸は、概して、４つのファミリー：酸性（アスパルテート、グルタメート）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）アミノ酸に分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換が当業者に知られており、概して、得られる分子の生物学的活性を改変することなく行われ得る。当業者は、概して、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換が、生物学的活性を実質的に改変しないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照されたい）。
【０４４１】
一実施形態において、２つ以上のポリペプチドの発現が所望される場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書の他の箇所で開示されるＩＲＥＳ配列によって分離され得る。
【０４４２】
特定の実施形態において企図されるポリペプチドには、融合ポリペプチドが含まれる。特定の実施形態において、融合ポリペプチドおよび融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。
【０４４３】
別の実施形態において、２つ以上のポリペプチドは、本明細書の他の箇所で開示される１つ以上の自己切断型ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として発現され得る。
【０４４４】
一実施形態において、本明細書で企図される融合タンパク質は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインと、１つ以上のヌクレアーゼと、１つ以上のリンカーおよび／または自己切断型ポリペプチドと含む。
【０４４５】
一実施形態において、本明細書で企図される融合タンパク質は、ヌクレアーゼバリアントと、リンカーまたは自己切断型ペプチドと、５´−３´エクソヌクレアーゼ、５´−３´アルカリ性エクソヌクレアーゼ、および３´−５´エクソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）を含むが、これらに限定されないエンドプロセシング酵素とを含む。
【０４４６】
融合ポリペプチドは、シグナルペプチド、細胞透過性ペプチドドメイン（ＣＰＰ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなど、エピトープタグ（例えば、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＩＳ６、ＭＹＣ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、およびＨＡ）、ポリペプチドリンカー、およびポリペプチド切断シグナルを含むが、これらに限定されない１つ以上のポリペプチドドメインまたはセグメントを含み得る。融合ポリペプチドは、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端、またはＮ末端からＣ末端に連結することも可能であるが、それらは、典型的には、Ｃ末端からＮ末端に連結される。特定の実施形態において、融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順番であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望の活性が保存されている限り、保守的に修飾されたバリアント、多型バリアント、対立遺伝子、変異体、部分配列、および種間ホモログも含み得る。融合ポリペプチドは、化学的な合成方法によって、もしくは２つの部分間の化学結合によって産生され得るか、または、概して、他の標準の技法を使用して調製され得る。融合ポリペプチドを含むライゲーションされたＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所で開示されるように、好適な転写または翻訳制御要素に作動可能に連結されている。
【０４４７】
融合ポリペプチドは、任意に、１つ以上のポリペプチドまたはポリペプチド内のドメインを連結させるために使用され得るリンカーを含む。ペプチドリンカー配列は、ポリペプチドドメインがそれらの所望の機能を発揮することができるように、各ポリペプチドがその適切な二次および三次構造に折り畳むのを確実にするのに十分な距離によって、任意の２つ以上のポリペプチド構成要素を分離するために用いられ得る。かかるペプチドリンカー配列は、当該技術分野において標準的な技法を使用して融合ポリペプチドに組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、以下の要因：（１）可撓性延長配座を採用する能力、（２）第１および第２のポリペプチド上の機能的エピトープと相互作用し得る二次構造を採用できない能力、ならびに（３）ポリペプチド機能的エピトープと反応し得る疎水性または荷電残基の欠如、に基づいて選択され得る。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＳｅｒ残基を含有する。ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の近い中性アミノ酸もまた、リンカー配列において使用され得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ４０：３９−４６，１９８５、Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：８２５８−８２６２，１９８６、米国特許第４，９３５，２３３号、および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されているものを含む。リンカー配列は、特定の融合ポリペプチドセグメントが、機能的ドメインを分離し、立体干渉を防ぐために使用され得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を含有するとき、必要とされない。好ましいリンカーは、典型的には、組換え融合タンパク質の一部として合成される可撓性アミノ酸部分配列である。リンカーポリペプチドは、１〜２００アミノ酸長、１〜１００アミノ酸長、または１〜５０アミノ酸長であり得、その間の全ての整数値を含む。
【０４４８】
代表的なリンカーには、以下のアミノ酸配列：グリセリンポリマー（Ｇ）ｎ、グリセリン−セリンポリマー（Ｇ１〜５Ｓ１〜５）ｎ（式中、ｎは、少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）、グリセリン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、ＧＧＧ（配列番号：２３）、ＤＧＧＧＳ（配列番号：２４）、ＴＧＥＫＰ（配列番号：２５）（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ５５２５−５５３０（１９９７）を参照されたい）、ＧＧＲＲ（配列番号：２６）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９５（上記参照））、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１、２、３、４、または５）（配列番号：２７）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９３，１１５６−１１６０（１９９６．）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号：２８）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号：２９）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号：３０）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号：３１）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号：３２）、ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号：３３）が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、可撓性リンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデリングすることができるコンピュータプログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ  ９０：２２５６−２２６０（１９９３）、ＰＮＡＳ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４）を使用して、またはファージディスプレイ方法によって理性的に設計され得る。
【０４４９】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドドメインの各々の間または内在性オープンリーディングフレームとドナー修復テンプレートによってコードされるポリペプチドとの間にポリペプチド切断シグナルをさらに含み得る。その上、ポリペプチド切断部位は、任意のリンカーペプチド配列に入れることができる。代表的なポリペプチド切断シグナルには、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、希な制限酵素認識部位、自己切断型リボザイム認識部位）、および自己切断型ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が含まれる（ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，２００４Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６−２６を参照されたい）。
【０４５０】
好適なプロテアーゼ切断部位および自己切断型ペプチドが当業者に知られている（例えば、Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９−７２２、Ｓｃｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９−５９４を参照されたい）。代表的なプロテアーゼ切断部位には、ポチウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチウイルスプロテアーゼ）、ポチウイルスＨＣプロテアーゼ、ポチウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルス（ｂｙｏｖｉｒｕｓ）ＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２−エンコードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロスフェリカルウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、第Ｘａ因子、およびエンテロキナーゼの切断部位が含まれるが、これらに限定されない。その高い切断厳密性に起因して、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ切断部位は、一実施形態において、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号：３４）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号：３５）、およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号：３６）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断は、ＱとＧまたはＱとＳとの間に起こる）が好ましい。
【０４５１】
ある特定の実施形態において、自己切断型ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様部位、配列またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。特定の実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポチウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。
【０４５２】
一実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）（Ｆ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）（Ｅ２Ａ）ペプチド、ゾーシーアシグナウイルス（ＴａＶ）（Ｔ２Ａ）ペプチド、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ−１）（Ｐ２Ａ）ペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。
【０４５３】
２Ａ部位の例示的な例を表２に提供する。
【表２−１】
2019535240.tif 000004
【表２−２】
2019535240.tif 000005
【０４５４】
Ｇ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、本明細書で企図される１つ以上のホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセシング酵素、および融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、１本鎖もしくは２本鎖、および組換え、合成、または単離のいずれかであり得る。ポリヌクレオチドには、プレ−メッセンジャーＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、合成ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、または少なくとも１５０００以上のヌクレオチド長、ならびに全ての中間の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド、もしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの多量体型、またはヌクレオチドのいずれかの型の修飾型を指す。この文脈において、「中間の長さ」は、６、７、８、９などの、１０１、１０２、１０３などの、１５１、１５２、１５３などの、２０１、２０２、２０３などの引用された値の間の任意の長さを意味することが容易に理解されよう。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、参照配列に対して少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【０４５５】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コドン最適化され得る。本明細書で使用されるとき、「コドン最適化される」という用語は、ポリペプチドの発現、安定性、および／または活性を増加させるためにポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいてコドンを置換することを指す。コドン最適化に影響を及ぼす要因には、（ｉ）２つ以上の生物もしくは遺伝子もしくは合成的に構築されたバイアステーブル間のコドンバイアスの変形、（ｉｉ）生物、遺伝子、もしくは遺伝子の組におけるコドンバイアスの角度の変動、（ｉｉｉ）文脈を含むコドンの系統的変形、（ｉｖ）それらのデコードｔＲＮＡに応じたコドンの変形、（ｖ）三つ組の全体もしくは１つの位置のいずれかにおけるＧＣ％に従ったコドンの変形、（ｖｉ）参照配列、例えば、自然発生する配列に対する類似性の程度の変動、（ｖｉｉ）コドン周波数遮断の変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されるｍＲＮＡの構造特性、（ｉｘ）コドン置換セットの設計が基になる際のＤＮＡ配列の機能に関する予備知識、（ｘ）各アミノ酸に関するコドンセットの系統的変形、および／または（ｘｉ）偽の翻訳惹起部位の単離除去のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
【０４５６】
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」という用語は、リン酸化糖とのＮ−グリコシド連結における複素環窒素塩基を指す。ヌクレオチドは、天然塩基、および幅広く多様な当該技術分野において認識された修飾塩基を含むと理解される。かかる塩基は、概して、ヌクレオチド糖部分の１´位に位置する。ヌクレオチドは、概して、塩基、糖、およびリン酸基を含む。リボ核酸（ＲＮＡ）において、糖はリボースであり、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）において、糖はデオキシリボース、すなわち、リボースに存在するヒドロキシル基を欠いている糖である。代表的な天然窒素塩基には、プリン、アデノシン（Ａ）およびグアニジン（Ｇ）、ならびにピリミジン、シチジン（Ｃ）、およびチミジン（Ｔ）（または、ＲＮＡの文脈で、ウラシル（Ｕ））が含まれる。デオキシリボースのＣ−１原子は、ピリミジンのＮ−１またはプリンのＮ−９に結合する。ヌクレオチドは、通常、モノ、ジ、またはトリホスフェートである。ヌクレオチドは、糖、ホスフェート、および／または塩基部分で修飾されていなくても、修飾されていてもよい（互換的に、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、および非標準ヌクレオチドとも称され、例えば、ＷＯ９２／０７０６５およびＷＯ９３／１５１８７を参照されたい）。修飾された核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３−２１９６）によって要約されている。
【０４５７】
ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルとも認識され得、エステル化は、糖のＣ−５に結合したヒドロキシル基上で起こる。本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド」という用語は、糖とのＮ−グリコシド連結における複素環窒素塩基を指す。ヌクレオシドは、当該技術分野において、天然塩基を含み、かつ周知の修飾塩基を含むとも認識される。かかる塩基は、概して、ヌクレオシド糖部分の１´位に位置する。ヌクレオシドは、概して、塩基および糖基を含む。ヌクレオシドは、糖および／または塩基部分で修飾されていなくても、修飾されていてもよい（互換的に、ヌクレオシド類似体、ヌクレオシド誘導体、修飾ヌクレオシド、非天然ヌクレオシド、または非標準ヌクレオシドとも称される）。上記にも述べられているように、修飾核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３−２１９６）によって要約されている。
【０４５８】
ポリヌクレオチドの例示的な例には、配列番号：１〜１０をコードするポリヌクレオチド、および配列番号：１１〜２０に記載されるポリヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０４５９】
種々の例示的な実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドには、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセシング酵素、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および発現ベクター、ウイルスベクター、および本明細書で企図されるポリヌクレオチドを含む移入プラスミドが含まれるが、これらに限定されない。
【０４６０】
本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などの用語は、以下に定義される厳密な条件下で、参照配列とハイブリダイズする参照ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチドと実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」という用語には、１つ以上のヌクレオチドが、付加もしくは欠失されるか、または修飾されるか、または異なるヌクレオチドで置き換えられるポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、変異、付加、欠失、および置換を含む、ある特定の改変が、参照ポリヌクレオチドに対して行われ得、それによって、改変されたポリヌクレオチドが、参照ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することが当該技術分野において十分に理解される。
【０４６１】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、厳密な条件下で、標的核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。「厳密な条件」下でハイブリダイズすることは、互いに少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列がハイブリダイズされたままである、ハイブリダイゼーションプロトコルを説明する。概して、厳密な条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特異的な配列に対して熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）である。概して、標的配列が過剰に存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有されている。
【０４６２】
本明細書で使用されるとき、「配列同一性」または、例えば、「〜に対して５０％の配列同一性」を含む記述は、配列が比較ウィンドウ上のヌクレオチドベースまたはアミノ酸ベースで同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウ上の２つの最適に整列させた配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列中に生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を得、その一致した位置の数を比較ウィンドウ（すなわち、ウィンドウサイズ）中の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じることによって計算し、配列同一性のパーセンテージを得ることができる。典型的には、ポリペプチドバリアントが、参照ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する場合に、本明細書に記載される参照配列のうちのいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。
【０４６３】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも１２個、しばしば、１５〜１８個、多くの場合、少なくとも２５個のモノマー単位である。２つのポリヌクレオチドは、各々、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似性がある配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部のみ）、および（２）２つのポリヌクレオチド間で多様性がある配列を含み得るため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には、配列類似性の局所領域を特定および比較するために、「比較ウィンドウ」上の２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって行われる。「比較ウィンドウ」は、２つの配列を最適に整列させた後に、配列が同数の連続した位置の参照配列と比較される少なくとも６個の連続した位置、通常、約５０〜約１００個、より一般的には約１００〜約１５０個の概念セグメントを指す。比較ウィンドウは、２つの配列の最適な整列のために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な整列は、アルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ実装によって、または検査、および選択された種々の方法のいずれかによって生成された最良の整列（すなわち、比較ウィンドウ上で最も高いパーセンテージの相同性をもたらすこと）によって行われ得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示されているようなプログラムのＢＬＡＳＴファミリーも参照することができる。配列分析の詳細な議論は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，１９９４−１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ１５のユニット１９．３に見出すことができる。
【０４６４】
本明細書で使用されるとき、「単離ポリヌクレオチド」は、自然発生する状態でそれに隣接する配列から精製されているポリヌクレオチド、例えば、通常、断片に隣接する配列から除去されているＤＮＡ断片を指す。特定の実施形態において、「単離ポリヌクレオチド」は、自然には存在せず、人間の手によって作製された、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、または他のポリヌクレオチドを指す。
【０４６５】
種々の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、およびエンドプロセシング酵素を含むがこれらに限定されない、本明細書で企図されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、キャップ、１つ以上のヌクレオチド、およびポリ（Ａ）尾部を含む。
【０４６６】
本明細書で使用されるとき、「５´キャップ」または「５´キャップ構造」または「５´キャップ部分」という用語は、ｍＲＮＡの５´終端で組み込まれている化学的修飾を指す。５´キャップは、核外搬出、ｍＲＮＡ安定性、および翻訳に関与する。
【０４６７】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子の末端グアノシンキャップ残基と５´末端転写センスヌクレオチドとの間に５´−ｐｐｐ−５´−トリホスフェート連結を含む５´キャップを含む。次いで、この５´−グアニレートキャップは、Ｎ７−メチル−グアニレート残基を生成するためにメチル化され得る。
【０４６８】
本明細書で企図されるｍＲＮＡポリヌクレオチドの特定の実施形態において使用するのに好適な５´キャップの例示的な例には、未メチル化５´キャップ類似体、例えば、Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ；メチル化５´キャップ類似体、例えば、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、およびｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ；ジメチル化５´キャップ類似体、例えば、ｍ２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、およびｍ２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ；トリメチル化５´キャップ類似体、例えば、ｍ２，２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ２，２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、およびｍ２，２，７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ；ジメチル化対称５´キャップ類似体、例えば、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐｍ７（５´）Ｇ、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐｍ７（５´）Ｃ、およびｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐｍ７（５´）Ａ；ならびに抗逆５´キャップ類似体、例えば、抗逆方向キャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップ、指定３´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、２´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、２´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、２´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、ｍ７２´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ７２´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、ｍ７２´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、３´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、３´Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、ｍ７３´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇ、ｍ７３´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｃ、ｍ７３´ｄ（５´）ｐｐｐ（５´）Ａ、およびそれらのテトラホスフェート誘導体）（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３）を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【０４６９】
特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、トリホスフェート架橋を介して、第１の転写ヌクレオチドの５´−終端に連結されて、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｎ（式中、Ｎは、任意のヌクレオシドである）をもたらす７−メチルグアニレート（「ｍ７Ｇ」）である５´キャップを含む。
【０４７０】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、５´キャップを含み、ここで、キャップは、Ｃａｐ０構造（Ｃａｐ０構造は、塩基１および２に結合したリボースの２´−Ｏ−メチル残基を欠いている）、Ｃａｐ１構造（Ｃａｐ１構造は、塩基２で２´−Ｏ−メチル残基を有する）、またはＣａｐ２構造（Ｃａｐ２構造は、塩基２および３の両方に結合した２´−Ｏ−メチル残基を有する）である。
【０４７１】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、ｍ７Ｇ（５´）ｐｐｐ（５´）Ｇキャップを含む。
【０４７２】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含む。
【０４７３】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍＲＮＡは、１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
【０４７４】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、シュードウリジン、ピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎ）−４−ワンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、５−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、およびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンからなる群から選択される１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
【０４７５】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、シュードウリジン、ピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎ）−４−ワンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−シュードウリジン、２−チオ−シュードウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−シュードウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−シュードウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−シュードウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、および４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジンからなる群から選択される１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
【０４７６】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、５−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−シュードイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−シュードイソシチジン、および４−メトキシ−１−メチル−シュードイソシチジンからなる群から選択される１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
【０４７７】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、および２−メトキシ−アデニンからなる群から選択される１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
【０４７８】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、およびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンからなる群から選択される１つ以上の修飾されたヌクレオシドを含む。
【０４７９】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上のシュードウリジン、１つ以上の５−メチル−シトシン、および／または１つ以上の５−メチル−シチジンを含む。
【０４８０】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上のシュードウリジンを含む。
【０４８１】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上の５−メチル−シチジンを含む。
【０４８２】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上の５−メチル−シトシンを含む。
【０４８３】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡをエクソヌクレアーゼ分解から保護し、ｍＲＮＡを安定化させ、翻訳を促進するのを補助するためのポリ（Ａ）尾部を含む。ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、３´ポリ（Ａ）尾部構造を含む。
【０４８４】
特定の実施形態において、ポリ（Ａ）尾部の長さは、少なくとも約１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、もしくは少なくとも約５００以上のアデニンヌクレオチド、または任意の介在する数のアデニンヌクレオチドである。特定の実施形態において、ポリ（Ａ）尾部の長さは、少なくとも約１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、または２７５以上のアデニンヌクレオチドである。
【０４８５】
特定の実施形態において、ポリ（Ａ）尾部の長さは、約１０〜約５００アデニンヌクレオチド、約５０〜約５００アデニンヌクレオチド、約１００〜約５００アデニンヌクレオチド、約１５０〜約５００アデニンヌクレオチド、約２００〜約５００アデニンヌクレオチド、約２５０〜約５００アデニンヌクレオチド、約３００〜約５００アデニンヌクレオチド、約５０〜約４５０アデニンヌクレオチド、約５０〜約４００アデニンヌクレオチド、約５０〜約３５０アデニンヌクレオチド、約１００〜約５００アデニンヌクレオチド、約１００〜約４５０アデニンヌクレオチド、約１００〜約４００アデニンヌクレオチド、約１００〜約３５０アデニンヌクレオチド、約１００〜約３００アデニンヌクレオチド、約１５０〜約５００アデニンヌクレオチド、約１５０〜約４５０アデニンヌクレオチド、約１５０〜約４００アデニンヌクレオチド、約１５０〜約３５０アデニンヌクレオチド、約１５０〜約３００アデニンヌクレオチド、約１５０〜約２５０アデニンヌクレオチド、約１５０〜約２００アデニンヌクレオチド、約２００〜約５００アデニンヌクレオチド、約２００〜約４５０アデニンヌクレオチド、約２００〜約４００アデニンヌクレオチド、約２００〜約３５０アデニンヌクレオチド、約２００〜約３００アデニンヌクレオチド、約２５０〜約５００アデニンヌクレオチド、約２５０〜約４５０アデニンヌクレオチド、約２５０〜約４００アデニンヌクレオチド、約２５０〜約３５０アデニンヌクレオチド、もしくは約２５０〜約３００アデニンヌクレオチドまたは任意の介在する範囲のアデニンヌクレオチドである。
【０４８６】
ポリヌクレオチドの方向を説明する用語には、５´（通常は、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの終端）および３´（通常は、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの終端）が含まれる。ポリヌクレオチド配列は、５´から３´の方向または３´から５´の方向で注記され得る。ＤＮＡおよびｍＲＮＡに関して、５´から３´の鎖は、「センス」、「プラス」、または「コード」鎖と呼ばれ、これは、その配列が、［ＤＮＡのチミン（Ｔ）の代わりに、ＲＮＡのウラシル（Ｕ）を除いて］プレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一であるからである。ＤＮＡおよびｍＲＮＡに関して、ＲＮＡポリメラーゼによって転写される鎖である相補的な３´から５´の鎖は、「テンプレート」、「アンチセンス」、「マイナス」、または「非コード」鎖と呼ばれる。本明細書で使用されるとき、「逆方向」という用語は、３´から５´の方向で書かれた５´から３´の配列または５´から３´の方向で書かれた３´から５´の配列を指す。
【０４８７】
「相補的」および「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連するポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５´Ａ  Ｇ  Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｔ  Ｇ  ３´の相補的鎖は、３´Ｔ  Ｃ  Ａ  Ｇ  Ｔ  Ａ  Ｃ  ５´である。後者の配列は、左に５´終端および右に３´終端を有する逆補体、５´Ｃ  Ａ  Ｔ  Ｇ  Ａ  Ｃ  Ｔ  ３´として書かれることが多い。その逆補体に等しい配列は、回文配列と言われる。相補性は、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対合則に従って一致している、「部分的」であり得る。または、核酸の間に「完璧な」または「完全な」相補性が存在し得る。
【０４８８】
本明細書で使用されるとき、「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、ＲＮＡを発現し、その後ポリペプチドを発現することができるベクター内の遺伝子配列を指す。一実施形態において、核酸カセットは、目的となる遺伝子（複数可）、例えば、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含有する。別の実施形態において、核酸カセットは、１つ以上の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリ（Ａ）配列、および目的となる遺伝子（複数可）、例えば、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含有する。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、必要であればタンパク質またはポリペプチドに翻訳され、形質転換された細胞における活性のために必要とされる適切な翻訳後修飾を受け、かつ、適切な細胞内区画への標的化または細胞外区画への分泌によって生物学的活性のために適した区画に転位置され得るような位置および配列でベクター内に方向付けられる。好ましくは、カセットは、ベクターへの即座の挿入に適合されたその３´および５´終端を有し、例えば、それは、各終端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態において、核酸カセットは、遺伝的障害を治療、予防、または改善するために使用される療法遺伝子の配列を含有する。カセットは除去され、単一ユニットとしてプラスミドまたはウイルスベクターに挿入され得る。
【０４８９】
ポリヌクレオチドは、目的となるポリヌクレオチド（複数可）を含む。本明細書で使用されるとき、「目的となるポリヌクレオチド」という用語は、本明細書で企図されるように、ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または阻害性ポリヌクレオチドの転写のためのテンプレートとして機能するポリペプチドを指す。
【０４９０】
さらに、本明細書で企図されるように、遺伝子コードの縮重の結果として、ポリペプチドをコードし得る多くのヌクレオチド配列またはそのバリアントの断片があることが、当業者によって理解されるであろう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、いかなるネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対しても最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用における相違に起因して異なるポリヌクレオチド、例えば、ヒトおよび／または霊長類コドン選択に最適化されるポリヌクレオチドは、特定の実施形態で具体的に企図される。一実施形態において、特定の対立遺伝子配列を含むポリヌクレオチドが提供される。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの１つ以上の変異の結果として改変される内因性ポリヌクレオチド配列である。
【０４９１】
ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、ドナー修復テンプレートを含む。
【０４９２】
ある特定の実施形態において、目的となるポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、または別の阻害性ＲＮＡを含むがこれらに限定されない阻害性ポリヌクレオチドを含む。
【０４９３】
一実施形態において、阻害性ＲＮＡを含むドナー修復テンプレートは、本明細書の他の箇所に記載されるように、例えば、強力な構造的なｐｏｌ  ＩＩＩ、例えば、ヒトもしくはマウスＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトおよびマウスＨ１  ＲＮＡプロモーター、またはヒトｔＲＮＡ−ｖａｌプロモーター、または強力な構造的なｐｏｌ  ＩＩプロモーターなどの１つ以上の調節配列を含む。
【０４９４】
コード配列それ自体の長さにかかわらず、特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所で開示されるか、または当該技術分野において知られているように、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終止コドン、転写終結シグナル、翻訳後応答要素、および自己切断型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わされ得、それにより、それらの全体的な長さが、著しく異なり得る。したがって、ほとんどのいかなる長さのポリヌクレオチド断片も用いられ得、合計の長さは、好ましくは調製の容易さおよび意図される組換えＤＮＡプロトコルの使用によって制限されることが特定の実施形態において企図される。
【０４９５】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野において既知の入手可能な多様な十分に確立された技法のいずれかを使用して、調製、操作、発現、および／または送達され得る。所望のポリペプチドを発現するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、適切なベクターに挿入され得る。所望のポリペプチドはまた、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを細胞内に送達することによっても発現され得る。
【０４９６】
ベクターの例示的な例には、プラスミド、自律的に複製する配列、および置き換え可能な要素、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃが含まれるが、これらに限定されない。
【０４９７】
ベクターの追加の例示的な例には、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、および動物ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【０４９８】
ベクターとして有用なウイルスの例示的な例には、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が含まれるが、これらに限定されない。
【０４９９】
発現ベクターの例示的な例には、哺乳動物細胞における発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）、哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子移入および発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドのコード配列は、哺乳動物細胞におけるポリペプチドの発現のためのかかる発現ベクターにライゲーションされ得る。
【０５００】
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクター、または染色体外で維持されるベクターである。本明細書で使用されるとき、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡに一体化することなしに、および宿主細胞の分裂により徐々に喪失されることなく複製することができるベクターを指し、該ベクターは染色体外またはエピソームで複製することも意味する。
【０５０１】
発現ベクター中に存在する「発現制御配列」、「制御要素」、または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するために宿主細胞タンパク質と相互作用する、複製のベクター起点のそれらの非翻訳領域、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（Ｓｈｉｎｅ  Ｄａｌｇａｒｎｏ配列またはＫｏｚａｋ配列）イントロン、転写後調節要素、ポリアデニル化配列、５´および３´非翻訳領域である。かかる要素は、それらの強度および特異性が異なり得る。利用されるベクター系および宿主に応じて、遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む、任意の数の好適な転写および翻訳要素を使用され得る。
【０５０２】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現ベクターおよびウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されないベクターを含む。ベクターは、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの１つ以上の外因性、内因性、または異種制御配列を含み得る。「内因性制御配列」は、ゲノムにおいて所与の遺伝子と自然に連結するものである。「外因性制御配列」は、その遺伝子の転写が連結されたエンハンサー／プロモーターによって指向されるように、遺伝子操作の手段（すなわち、分子生物学的技法）によって遺伝子と並立に配置されるものである。「異種制御配列」は、遺伝子操作されている細胞とは異なる種からの外因性配列である。「合成」制御配列は、もう１つの内因性および／もしくは外因性配列、ならびに／またはインビトロもしくはシリコン内で特定の療法のための最適なプロモーターおよび／もしくはエンハンサー活性を提供することが決定された配列の要素を含み得る。
【０５０３】
本明細書で使用されるとき、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを惹起および転写する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞において作動されるプロモーターは、転写が惹起される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴが豊富な領域を含み、および／または転写の開始から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、式中、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得る。
【０５０４】
「エンハンサー」という用語は、強化された転写を提供することができる配列を含有し、いくつかの場合において、別の制御配列に対するその方向とは独立して機能し得るＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサー要素と協同的または相加的に機能し得る。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。
【０５０５】
「作動可能に連結した」という用語は、記載されている構成要素が、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある並置を指す。一実施形態において、この用語は、核酸発現制御配列（プロモーター、および／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列、例えば、目的となるポリヌクレオチドとの間の機能的連結を指し、ここで、発現制御配列によって、第２の配列に対応する核酸の転写が指向される。
【０５０６】
本明細書で使用されるとき、「構成的発現制御配列」という用語は、作動可能に連結した配列の転写を継続的または連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列は、幅広い多様な細胞および組織型における発現を可能にする「遍在」プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーであり得るか、または制限された多様な細胞および組織型それぞれにおける発現を可能にする、「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系列特異的」、もしくは「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、もしくはプロモーター／エンハンサーであり得る。
【０５０７】
特定の実施形態において使用するのに好適な例示的な遍在発現制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最早期プロモーター、ウイルスシリアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、早期または後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルスからのＨ５、Ｐ７．５、およびＰ１１プロモーター、短伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ−短）プロモーター、長伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ−長）プロモーター、早期成長応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳惹起因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ  ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５，１４７７−１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域の欠失した、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８−５５（１９９５））が含まれるが、これらに限定されない。
【０５０８】
特定の実施形態において、所望のポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、細胞系列特異的、または組織特異的な発現を達成するために（例えば、ポリペプチドをコードする特定の核酸を細胞型、細胞系列、もしくは組織のサブセットにおいてのみ、または特定の発生段階に発現させるために）細胞、細胞型、細胞系列、または組織特異的発現制御配列を使用することが望ましい場合がある。
【０５０９】
本明細書で使用されるとき、「条件発現」は、誘導性発現、抑圧可能な発現、特定の生理学的、生物学的、または疾患の状態を有する細胞または組織における発現などが含まれるが、これらに限定されない任意の種類の条件発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的発現を除外することを意図しない。ある特定の実施形態は、例えば、細胞、組織、生物体などを、ポリヌクレオチドの発現を引き起こす処理もしくは条件、または目的となるポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドの発現の増大もしくは減少を引き起こす処理もしくは条件に供することによって発現が制御される、目的となるポリヌクレオチドの条件発現を提供する。
【０５１０】
誘導性プロモーター／系の例示的な例には、ステロイド誘導性プロモーター、例えば、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなど（対応するホルモンで処理することによって誘導される）、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（種々の重金属で処理することによって誘導される）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導される）、「遺伝子スイッチ」ミフェプリストン調節可能系（Ｓｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、クメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存性調節系などが含まれるが、これらに限定されない。
【０５１１】
条件発現はまた、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによっても達成され得る。ある特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための少なくとも１つの（典型的には、２つの）部位（複数可）を含む。本明細書で使用されるとき、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、野生型タンパク質であり得る、１つ以上の組換え部位（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個以上）を伴う組換え反応に関与する切除的または一体化的なタンパク質、酵素、補因子もしくは関連するタンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：６９９−７０７（１９９３）を参照されたい）、またはそれらの変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはその断片を含有する融合タンパク質）、断片、およびバリアントを含む。特定の実施形態において使用するのに好適なリコンビナーゼの例示的な例には、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが含まれるが、これらに限定されない。
【０５１２】
ポリヌクレオチドは、幅広い多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための１つ以上の組換え部位を含み得る。部位特異的リコンビナーゼの標的部位が、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの一体化のために必要とされる任意の部位（複数可）に加えたものであることが理解されるべきである。本明細書で使用されるとき、「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識し、結合する特定の核酸配列を指す。
【０５１３】
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼのための１つの組換え部位は、８塩基対コア配列と隣接した２つの１３塩基対の逆方向繰り返し（リコンビナーゼ結合部位としての機能を果たす）を含む３４塩基対の配列であるｌｏｘＰである（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：５２１〜５２７（１９９４）の図１を参照されたい）。他の代表的なｌｏｘＰ部位には、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｂｅｔｈｋｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９９７）、ｌｏｘ５１７１（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｌｏｘ２２７２（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、およびｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）が含まれるが、これらに限定されない。
【０５１４】
ＦＬＰリコンビナーゼのために好適な認識部位には、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、Ｆ４、Ｆ５（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）が含まれるが、これらに限定されない。
【０５１５】
認識配列の他の例は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列であり、これらは、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えば、ｐｈｉ−ｃ３１によって認識される。φＣ３１ＳＳＲは、ヘテロタイプの部位ａｔｔＢ（長さ３４ｂｐ）とａｔｔＰ（長さ３９ｂｐ）との間のみの組換えを媒介する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ａｔｔＢおよびａｔｔＰは、それぞれ、細菌ゲノムおよびファージゲノムに対するファージインテグラーゼの結合部位に対して名づけられ、両方とも、φＣ３１ホモ二量体が結合する可能性がある不完全な逆方向繰り返しを含有する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。産物の部位であるａｔｔＬおよびａｔｔＲは、さらなるφＣ３１媒介性組換えに対して有効に不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、それによって反応が不可逆的になる。挿入を触媒するために、ゲノムのａｔｔＰ部位へのａｔｔＢを有するＤＮＡの挿入が、ゲノムのａｔｔＢ部位へのａｔｔＰ部位の挿入よりも容易であることが見出されている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。したがって、典型的な戦略では、相同組換えによってａｔｔＰを有する「ドッキング部位」を定義された遺伝子座に位置付け、次いで、それを挿入のために、ａｔｔＢを有する入ってくる配列とパートナーにする。
【０５１６】
一実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドは、一対のリコンビナーゼ認識部位に隣接したドナー修復テンプレートポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、修復テンプレートポリヌクレオチドは、ＬｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、またはａｔｔ部位に隣接する。
【０５１７】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドは、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の目的となるポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、自己切断型ポリペプチドをコードする１つ以上のＩＲＥＳ配列またはポリヌクレオチド配列によって分離され得る。
【０５１８】
本明細書で使用されるとき、「内部リボソーム侵入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ＡＴＧなどの惹起コドンへのシストロン（タンパク質をコードする領域）の直接内部リボソーム侵入を促進し、それによって、キャップに依存しない遺伝子の翻訳をもたらす要素を指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５（１２）：４７７−８３）およびＪａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ１（１０）：９８５−１０００を参照されたい。概して当業者によって用いられるＩＲＥＳの例は、米国特許第６，６９２，７３６号に記載されるものを含む。当該技術分野において既知の「ＩＲＥＳ」のさらなる例には、ピコルナウイルスから得られるＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）およびウイルスまたは細胞ｍＲＮＡ源から得られるＩＲＥＳ、例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８−６１９０）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦＩＩ）、翻訳惹起因子ｅＩＦ４Ｇおよび酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎから市販されている脳心筋炎（ｅｎｃｅｐｈｅｌｏｍｙｃａｒｄｉｔｉｓ）ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６６（３）：１６０２−９）、ならびにＶＥＧＦ  ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ１８（１１）：６１７８−９０）が含まれるが、これらに限定されない。ＩＲＥＳはまた、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、およびＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ種のウイルスゲノム、ならびにＨＣＶ、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）において報告されている。
【０５１９】
一実施形態において、本明細書で企図されるポリヌクレオチドで使用されるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳである。
【０５２０】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列を有し、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用されるとき、「Ｋｏｚａｋ配列」という用語は、リボソームの小さなサブユニットに対するｍＲＮＡの初期結合を大幅に促進し、翻訳を増加させる、短ヌクレオチド配列を指す。コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号：５９）であり、式中、Ｒは、プリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３−９２，ａｎｄ  Ｋｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（２０）：８１２５−４８）。
【０５２１】
異種核酸転写物の効率的な終止およびポリアデニル化を指向する要素は、異種遺伝子の発現を増加させる。転写終止シグナルは、概して、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用されるとき、「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって発生期のＲＮＡ転写物の終止およびポリアデニル化の両方を指向するＤＮＡ配列を示す。ポリアデニル化配列は、ポリＡ尾部からコード配列の３´終端の付加によってｍＲＮＡの安定性を促進し、したがって、翻訳効率の増加に寄与し得る。切断およびポリアデニル化は、ＲＮＡにおいてポリ（Ａ）配列によって指向される。哺乳動物ｐｒｅ−ｍＲＮＡのコアポリ（Ａ）配列は、切断−ポリアデニル化部位に隣接する２つの認識要素を有する。典型的には、ほとんどのインバリアントなＡＡＵＡＡＡ六量体は、ＵまたはＧＵ残基が豊富なより可変性である要素の２０〜５０ヌクレオチド上流にある。発生期の転写物の切断は、これらの２つの要素間で起こり、５´切断産物への最大２５０アデノシンの付加に連結する。特定の実施形態において、コアポリ（Ａ）配列は、理想的なポリＡ配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）である。特定の実施形態において、ポリ（Ａ）配列は、ＳＶ４０ポリＡ配列、ウシ成長ホルモンポリＡ配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリＡ配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術分野において既知の別の好適な異種もしくは内因性ポリＡ配列を含む。
【０５２２】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含む細胞は、直接毒性および／または制御されていない増殖の危険性を低減させるために、誘導性自殺遺伝子を含む、自殺遺伝子を利用する。特定の実施形態において、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドまたは細胞を含む宿主に対して免疫原性ではない。使用され得る自殺遺伝子のある特定の例は、カスパーゼ−９またはカスパーゼ−８またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ−９は、二量化の特定の化学誘導物質（ＣＩＤ）を使用して活性化され得る。
【０５２３】
ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、インビボで負の選択の影響を受けやすい本明細書で企図される遺伝子修飾細胞を引き起こす遺伝子セグメントを含む。「負の選択」は、個体のインビボでの状態の変化の結果として排除され得る注入された細胞を指す。負の選択可能な表現型は、投与された薬剤、例えば、化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入から生じ得る。負の選択遺伝子は当該技術分野において知られており、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ）遺伝子；細胞ヒポキサンチンホスフリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、および細菌シトシンデアミナーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０５２４】
いくつかの実施形態において、遺伝子修飾細胞は、インビトロで負の選択可能表現型の細胞の選択を可能にする正のマーカーをさらに含むポリヌクレオチドを含む。正の選択可能マーカーは、宿主細胞内に導入されたとき、その遺伝子を運搬する細胞の正の選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。この型の遺伝子は当技術分野において知られており、ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与する、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５からのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【０５２５】
一実施形態において、正の選択可能マーカーおよび負の選択可能要素は、負の選択可能要素の喪失がまた必ず、正の選択可能マーカーの喪失を伴うように連結される。特定の実施形態において、正のおよび負の選択可能マーカーは、一方の喪失が、義務的に、他方の喪失をもたらすように融合される。発現産物として、上述の所望の正の選択特徴および負の選択特徴の両方を付与するポリペプチドをもたらす融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、インビトロでの正の選択のためのハイグロマイシンＢ耐性、およびインビボでの負の選択のためのガンシクロビル感受性を付与するポリペプチドもたらす。優性正の選択可能マーカーを負の選択可能マーカーと融合することに由来する二機能性選択可能融合遺伝子の使用に関して記載する、Ｓ．Ｄ．ＬｕｐｔｏｎによるＰＣＴ  ＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１の刊行物も参照されたい。
【０５２６】
好ましい正の選択可能マーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来し、好ましい負の選択可能マーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ、ＶＺＶ  ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来する。特定の実施形態において企図される代表的な二機能性選択可能融合遺伝子には、正の選択可能マーカーが、ｈｐｈまたはｎｅｏに由来し、負の選択可能マーカーが、シトシンデアミナーゼ、またはＴＫ遺伝子もしくは選択可能マーカーに由来する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【０５２７】
特定の実施形態において、１つ以上のヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、エンドプロセシング酵素、または融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、非ウイルス方法およびウイルス方法の両方によって、造血細胞、例えば、Ｔ細胞内に導入され得る。特定の実施形態において、ヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートの送達は、同じ方法によってもしくは異なる方法によって、および／または同じベクターもしくは異なるベクターによって提供され得る。
【０５２８】
「ベクター」という用語は、別の核酸分子を移入または輸送することができる核酸分子を指すように本明細書で使用される。移入された核酸は、概して、ベクター核酸分子に連結され、例えば、それに挿入される。ベクターは、細胞中に自律複製を指向する配列を含み得るか、または宿主細胞ＤＮＡへの一体化を可能にするのに十分な配列を含み得る。特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、本明細書で企図される１つ以上のポリヌクレオチドをＴ細胞に送達するために使用される。
【０５２９】
非ウイルスベクターの例示的な例には、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、および細菌人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。
【０５３０】
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドの非ウイルス送達の例示的な方法には、電気穿孔、ソノポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ウイロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ナノ粒子、ポリカチオン、または脂質：核酸共役体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介移入、遺伝子銃、および熱ショックが含まれるが、これらに限定されない。
【０５３１】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態において使用するのに好適なポリヌクレオチド送達系の例示的な例には、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃによって提供されるものが含まれるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂質が文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０−１８７、およびＢａｌａｚｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１−１２を参照されたい。抗体標的のバクテリア由来の非生存のナノ細胞系送達もまた、特定の実施形態において企図される。
【０５３２】
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、以下に記載されるように、個別の患者への投与によって、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所適用によって、インビボで送達され得る。あるいは、ベクターは、個別の患者から外植された細胞（例えば、動員された末梢血液、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）などの細胞にエクスビボで、または万能ドナー造血幹細胞に送達され得、続いて、患者に細胞を再移植することができる。
【０５３３】
一実施形態において、ヌクレアーゼバリアントおよび／またはドナー修復テンプレートを含むウイルスベクターは、インビボで細胞の形質導入のために生物に直接投与される。あるいは、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用、および電気穿孔が含まれるが、これらに限定されない、血液または組織細胞との最終接触に分子を導入するために通常使用される任意の経路による。かかる核酸を投与する好適な方法は、利用可能でかつ当業者に良く知られており、１つを超える経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、別の経路よりもより即時的かつより有効な反応を提供し得る場合が多い。
【０５３４】
本明細書で企図される特定の実施形態において使用するのに好適なウイルスベクター系の例示的な例には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【０５３５】
種々の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートは、１つ以上のポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）で細胞を形質導入することによって、造血細胞、例えば、Ｔ細胞内に導入される。
【０５３６】
ＡＡＶは、小さな（約２６ｎｍ）複製欠損、主に、エピソーム非エンベロープで覆われたウイルスである。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込み得る。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、典型的には、最低限、導入遺伝子およびその調節配列、ならびに５´および３´ＡＡＶ逆方向末端繰り返し（ＩＴＲ）からなる。ＩＴＲ配列は、長さが約１４５ｂｐである。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０から単離される、ＩＴＲおよびカプシド配列を含む。
【０５３７】
いくつかの実施形態において、キメラｒＡＡＶが使用され、ＩＴＲ配列は、１つのＡＡＶ血清型から単離され、カプシド配列は、異なるＡＡＶ血清型から単離される。例えば、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列およびＡＡＶ６に由来するカプシド配列を有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と称される。特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２からのＩＴＲ、およびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のいずれか１つからのカプシドタンパク質を含み得る。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列およびＡＡＶ６に由来するカプシド配列を含む。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２に由来するＩＴＲ配列およびＡＡＶ２に由来するカプシド配列を含む。
【０５３８】
いくつかの実施形態において、遺伝子操作方法および選択方法を、ＡＡＶカプシドに適用して、それが目的となる細胞を形質移入させる可能性を高める。
【０５３９】
ｒＡＡＶベクターの構築、産生、およびその精製は、例えば、米国特許第９，１６９，４９４号、同第９，１６９，４９２号、同第９，０１２，２２４号、同第８，８８９，６４１号、同第８，８０９，０５８号、および同第８，７８４，７９９号に開示されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５４０】
種々の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートは、１つ以上のポリヌクレオチドを含むレトロウイルス、例えば、レンチウイルスで細胞を形質導入することによって、造血細胞内に導入される。
【０５４１】
本明細書で使用されるとき、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖２本鎖ＤＮＡコピーに逆転写し、その後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有一体化するＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態において使用するのに好適な例示的なレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、ならびにレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【０５４２】
本明細書で使用されるとき、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または族）を指す。例示的なレンチウイルスには、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）、ビスナ−マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス、ヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＨＩＶを基にしたベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用配列要素）が好ましい。
【０５４３】
種々の実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、本明細書の他の箇所で議論されるように、１つ以上のＬＴＲ、および以下のアクセサリー要素：ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、プシー（Ψ）パッケージングシグナル、搬出要素、ポリ（Ａ）配列のうちの１つ以上または全てを含み、任意に、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ、絶縁体要素、選択可能なマーカー、および細胞自殺遺伝子を含み得る。
【０５４４】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるレンチウイルスベクターは、一体化または非一体化または一体化欠損レンチウイルスであり得る。本明細書で使用されるとき、「一体化欠損レンチウイルス」または「ＩＤＬＶ」という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに一体化する能力を欠いているインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。一体化−インコンピテントウイルスベクターは、特許出願第ＷＯ２００６／０１０８３４号に記載されており、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５４５】
インテグラーゼ活性を低減させるために好適なＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子における例示的な変異には、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ、およびＫ２６４Ｈが含まれるが、これらに限定されない。
【０５４６】
一実施形態において、ＨＩＶ−１インテグラーゼ欠損ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、Ｄ１１６Ａ、Ｅ１５２Ｇ、もしくはＥ１５２Ａ変異；Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、およびＥ１５２Ｇ変異；またはＤ６４Ｖ、Ｄ１１６Ａ、およびＥ１５２Ａ変異を含む。
【０５４７】
一実施形態において、ＨＩＶ−１インテグラーゼ欠損ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ変異を含む。
【０５４８】
「長い末端繰り返し（ＬＴＲ）」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの終端に位置する塩基対のドメインを指し、それらの天然の配列の状況では、直接繰り返しであり、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域を含有する。
【０５４９】
本明細書で使用されるとき、「ＦＬＡＰ要素」または「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、配列が、レトロウイルス、例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の中央ポリプリン区域および中央終止配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。好適なＦＬＡＰ要素は、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載されている。別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴおよび／またはＣＴＳ要素内で１つ以上の変異を有するＦＬＡＰ要素を含有する。さらに別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴまたはＣＴＳ要素のいずれかを含む。さらに別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴまたはＣＴＳ要素を含まない。
【０５５０】
本明細書で使用されるとき、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスカプシドまたは粒子へのウイルスＲＮＡの挿入に必要とされるレトロウイルスゲノム内に位置するプシー［Ψ］配列を指し、例えば、Ｃｌｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照されたい。
【０５５１】
「搬出要素」という用語は、核から細胞の細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を調節するシス作用性転写後調節要素を指す。ＲＮＡ搬出要素の例には、ヒト免疫不全ウィルスウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３、およびＣｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ  ５８：４２３を参照されたい）、およびＢ型肝炎ウイルス転写後調節要素（ＨＰＲＥ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０５５２】
特定の実施形態において、ウイルスベクターにおける異種配列の発現は、転写後調節要素、効率的なポリアデニル化部位、および任意に、転写終止シグナルをベクターに組み込むことによって増加される。多様な転写後調節要素は、タンパク質での異種核酸の発現、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルスに存在する転写後調節要素（ＨＰＲＥ）（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）、および同様のもの（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）を増加し得る。
【０５５３】
レンチウイルスベクターは、好ましくは、ＬＴＲの修飾の結果としていくつかの安全性の強化を含有する。「自己不活性化」（ＳＩＮ）ベクターは、例えば、１回目のウイルス複製を上回ってウイルスが転写されることを防ぐために、Ｕ３領域として既知の右側の（３´）ＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域が修飾された（例えば、欠失または置換によって）複製欠損性ベクターを指す。追加の安全性の強化は、ウイルス粒子の産生時にウイルスゲノムの転写を駆り立てるために、５´ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置き換えることによって提供される。使用され得る異種プロモーターの例には、例えば、ウイルスサルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、早期または後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最早期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが含まれ得る。
【０５５４】
本明細書で使用されるとき、「シュードタイプ」または「シュードタイピング」という用語は、ウイルスエンベロープタンパク質が、好ましい特性を有する別のウイルスのウイルスエンベロープタンパク質で置換されたウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧ−タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質を用いてシュードタイピングされ得、これにより、ＨＩＶがより広い範囲の細胞に感染することが可能になるが、これは、ＨＩＶエンベロープタンパク質（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）が、通常、ウイルスの標的をＣＤ４＋提示細胞とするためである。
【０５５５】
ある特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、既知の方法に従って産生される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。
【０５５６】
本明細書で企図されるあるある特定の実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列のほとんどまたは全てが、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかしながら、レトロウイルスおよび／もしくはレンチウイルス配列の多くの異なる源を使用することができるか、またはある特定のレンチウイルス配列の組み合わせられた多数の置換および改変が、移入ベクターの本明細書に記載される機能を行う能力を損なうことなく適応され得ることが理解されるべきである。さらに、多様なレンチウイルスベクターが当該技術分野で知られており、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６ａ、１９９６ｂ、および１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）、Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号、および同第５，９９４，１３６号を参照されたく、これらの多くは、本明細書で企図されるウイルスベクターまたは移入プラスミドを産生するために適合され得る。
【０５５７】
種々の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートは、１つ以上のポリヌクレオチドを含むアデノウイルスで細胞を形質導入することによって、造血細胞内に導入される。
【０５５８】
アデノウイルスを基にしたベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高力価かつ高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて大量に産生され得る。ほとんどのアデノウイルスベクターが、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置き換えるように遺伝子操作され、その後、複製欠損ベクターは、欠失した遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において増殖される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉に見出されるものなどの非分裂の分化細胞を含む複数の種類の組織をインビボで形質導入し得る。従来のＡｄベクターは、高い運搬能力を有する。
【０５５９】
複製欠損である現行のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、Ａｄ５  ＤＮＡ断片によってヒト胎児腎臓細胞から形質転換されて、Ｅ１タンパク質を構造的に発現する２９３と呼ばれる固有のヘルパー細胞株を利用し得る（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムには不必要であるため（Ｊｏｎｅｓ＆Ｓｈｅｎｋ，１９７８）、現行のアデノウイルスベクターは、２９３細胞を利用して、Ｅ１、Ｄ３、または両方のいずれかの領域に外来ＤＮＡを運搬する（Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１）。アデノウイルスベクターは、真核性遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ＆Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２、Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９２）において使用されている。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与した研究には、気管点滴（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、末梢静脈内注入（Ｈｅｒｚ＆Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）、および脳内への定位接種（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）が含まれる。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射での抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法を伴った（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。
【０５６０】
種々の実施形態において、ヌクレアーゼバリアントをコードする１つ以上のポリヌクレオチドおよび／またはドナー修復テンプレートは、１つ以上のポリヌクレオチドを含む単純ヘルペスウイルス、例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２で細胞を形質導入することによって、造血細胞内に導入される。
【０５６１】
成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂである直鎖２本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを含むエンベロープで覆われた二十面体カプシドからなる。一実施形態において、ＨＳＶを基にしたウイルスベクターは、１つ以上の必須または非必須ＨＳＶ遺伝子において欠損している。一実施形態において、ＨＳＶを基にしたウイルスベクターは、複製欠損である。ほとんどの複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を防ぐために１つ以上の最早期、早期、または後期ＨＳＶ遺伝子を除去するための欠失を含有する。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される最早期遺伝子において欠損であり得る。ＨＳＶベクターの利点は、長期間のＤＮＡ発現をもたらし得る潜伏期に入る能力、および最大２５ｋｂの外因性ＤＮＡを収容し得るその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。ＨＳＶを基にしたベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、同第５，８４６，７８２号、および同第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許出願第ＷＯ９１／０２７８８号、同第ＷＯ９６／０４３９４号、同第ＷＯ９８／１５６３７号、および同第ＷＯ９９／０６５８３号において記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５６２】
Ｈ．ゲノム編集された細胞
特定の実施形態において企図される方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、ＴＧＦβＲ２遺伝子において１つ以上の遺伝子編集を含み、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、免疫不全、またはそれらに関連する状態の少なくとも１つの症状の予防、治療、または緩和のための改善された細胞を基にした療法を提供する。任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書で企図される組成物および方法は、部分的に、療法的な細胞を免疫抑制シグナルおよび疲弊に対してより耐性を有するようにすることによって、養子細胞療法の有効性を増加させると考えられる。
【０５６３】
特定の実施形態において企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、自己移植／自源（「自己（ｓｅｌｆ）」）または非自己移植（「非自己」、例えば、同種、同系、または異種）であり得る。本明細書で使用されるとき、「自己移植」は、同じ対象からの細胞を指す。本明細書で使用されるとき、「同種」は、相対的に遺伝的に細胞とは異なる同じ種の細胞を指す。本明細書で使用されるとき、「同系」は、相対的に遺伝的に細胞と同一である異なる対象の細胞を指す。本明細書で使用されるとき、「異種」は、相対的に細胞に対して異なる種の細胞を指す。好ましい実施形態において、細胞は、哺乳動物対象から得られる。より好ましい実施形態において、細胞は、霊長類対象、任意に、非ヒト霊長類から得られる。最も好ましい実施形態において、細胞は、ヒト対象から得られる。
【０５６４】
「単離された細胞」は、インビボ組織または臓器から得られたもので、細胞外マトリックスを実質的に含まない、自然発生しない細胞、例えば、自然には存在しない細胞、修飾細胞、遺伝子操作された細胞などを指す。
【０５６５】
本明細書で使用されるとき、「細胞の集団」という用語は、本明細書の他の箇所に記載される同種または異種細胞型の任意の数および／または組み合わせから構成され得る複数の細胞を指す。例えば、Ｔ細胞の形質導入のために、細胞の集団は、末梢血液から単離され得るか、または得ることができる。細胞の集団は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％の編集される標的細胞型を含み得る。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、当該技術分野において既知の方法を使用して、異種細胞の集団から単離または精製され得る。
【０５６６】
ゲノムが本明細書で企図される組成物および方法を使用して編集され得る細胞型の例示的な例には、細胞株、初代細胞、幹細胞、前駆細胞、および分化細胞、ならびにそれらの混合細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０５６７】
好ましい実施形態において、ゲノム編集組成物および方法は、造血細胞、より好ましくは免疫細胞、およびさらにより好ましくはＴ細胞を編集するために使用される。
【０５６８】
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当該技術分野で認識されており、胸腺細胞、免疫エフェクター細胞、調節Ｔ細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことを意図する。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。一実施形態において、Ｔ細胞は、免疫エフェクター細胞である。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＮＫＴ細胞である。特定の実施形態において使用するのに好適なＴ細胞の他の例示的な集団には、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞が含まれる。
【０５６９】
種々の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、本明細書で企図される組成物および方法によって編集されたＴＧＦβＲ２遺伝子を含む免疫エフェクター細胞を含む。「免疫エフェクター細胞」は、１つ以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞殺傷活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞である。特定の実施形態において企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、特に、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞）である。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。
【０５７０】
「強力なＴ細胞」および「幼若Ｔ細胞」は、特定の実施形態において互換的に使用され、Ｔ細胞が増殖と同時に分化の減少が可能であるＴ細胞表現型を指す。特定の実施形態において、幼若Ｔ細胞は、「ナイーブＴ細胞」の表現型を有する。特定の実施形態において、幼若Ｔ細胞は、以下の生物学的マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８のうちの１つ以上、または全てを含む。一実施形態において、幼若Ｔ細胞は、以下の生物学的マーカー：ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８のうちの１つ以上、または全てを含む。一実施形態において、幼若Ｔ細胞は、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、およびＬＡＧ３の発現を欠いている。
【０５７１】
Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺問題、感染部位由来組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含むがこれらに限定されない多くの源から得ることができる。
【０５７２】
特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む細胞の集団は、編集されたＴＧＦβＲ２遺伝子を含み、ここで、編集は、ＮＨＥＪによって修復されたＤＳＢである。特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞は、編集されたＴＧＦβＲ２遺伝子を含み、ここで、編集は、ＮＨＥＪによって修復されたＤＳＢである。特定の実施形態において、編集は、ＴＧＦβＲ２遺伝子のコード配列における、好ましくはＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６において、より好ましくはＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６における配列番号：１１（または、配列番号：１３）での約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上のヌクレオチドの挿入または欠失（ＩＮＤＥＬ）である。
【０５７３】
特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む細胞の集団は、ＨＤＲによって修復されたＤＳＢで組み込まれたドナー修復テンプレートを含む編集されたＴＧＦβＲ２遺伝子を含む。
【０５７４】
特定の実施形態において、免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む細胞の集団は、ＴＧＦβＲ２遺伝子またはその部分を含むドナー修復テンプレートを含む編集されたＴＧＦβＲ２遺伝子を含み、ゲノムＴＧＦβＲ２配列において１つ以上の変異を導入して、ＴＧＦβＲ２発現またはシグナル伝達を修飾し、好ましくはＴＧＦβＲ２発現および／またはシグナル伝達を減少させるかまたは排除するように設計される。
【０５７５】
種々の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ＴＧＦβＲ２遺伝子における編集を含み、ＴＧＦβＲ２フリップ受容体、二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー（ＢｉＴＥ）分子をコードするポリヌクレオチド；サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＴＮＦ−α）、ケモカイン（例えば、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、およびＲＡＮＴＥＳ）、細胞毒素（例えば、パーフォリン、グランザイムＡ、およびグランザイムＢ）、サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、およびＩＬ−２１受容体）、または遺伝子操作された抗原受容体（例えば、遺伝子操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｄａｒｉｃ受容体もしくはその構成要素、またはキメラサイトカイン受容体）をさらに含む。一実施形態において、ポリヌクレオチドおよびヌクレアーゼバリアントを含むドナー修復テンプレートは、細胞内に導入され、ポリヌクレオチドは、ＨＤＲ修復によってＴＧＦβＲ２遺伝子におけるＤＳＢ部位で細胞のゲノム内に組み込まれる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、ポリヌクレオチドを含むベクターで細胞を形質導入することによって、ＴＧＦβＲ２遺伝子以外の部位でも細胞内に導入され得る。
【０５７６】
Ｉ．組成物および製剤
特定の実施形態において企図される組成物は、本明細書で企図されるような、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを含むベクタ−、ならびにゲノム編集組成物およびゲノム編集された細胞組成物を含み得る。特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、細胞または細胞の集団においてヒト形質転換成長因子ベータ受容体２（ＴＧＦβＲ２）遺伝子内の標的部位を編集するのに有用である。好ましい実施形態において、ゲノム編集組成物は、造血細胞、例えば、Ｔ細胞または免疫エフェクター細胞内のＴＧＦβＲ２遺伝子を編集するために使用される。
【０５７７】
種々の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、ヌクレアーゼバリアント、および任意に、エンドプロセシング酵素、例えば、３´−５´エクソヌクレアーゼ（Ｔｒｅｘ２）を含む。ヌクレアーゼバリアントは、開示されるポリヌクレオチド送達方法（上記参照）、例えば、電気穿孔、脂質ナノ粒子などを介して細胞内に導入されるｍＲＮＡの形態であり得る。一実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、および任意に、３´−５´エクソヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む組成物は、開示されるポリヌクレオチド送達方法（上記参照）を介して細胞において導入される。本組成物は、エラープローンＮＨＥＪによってゲノム編集された細胞またはゲノム編集された細胞の集団を生成するために使用され得る。
【０５７８】
種々の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、ドナー修復テンプレートを含む。本組成物は、ヌクレアーゼバリアント、および任意に、エンドプロセシング酵素を発現させるかまたは発現させるであろう細胞に送達され得る。一実施形態において、本組成物は、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、および任意に、３´−５´エクソヌクレアーゼを発現させるかまたは発現させるであろう細胞に送達され得る。ドナー修復テンプレートの存在下での遺伝子編集酵素の発現は、ＨＤＲによってゲノム編集された細胞またはゲノム編集された細胞の集団を生成するために使用され得る。
【０５７９】
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ヌクレアーゼバリアント、および任意に、ドナー修復テンプレートを含む。特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ヌクレアーゼバリアント、エンドプロセシング酵素、および任意に、ドナー修復テンプレートを含む。ヌクレアーゼバリアントおよび／またはエンドプロセシング酵素は、開示されるポリヌクレオチド送達方法（上記参照）を介して細胞内に導入されるｍＲＮＡの形態であり得る。
【０５８０】
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、および任意に、ドナー修復テンプレートを含む。特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、細胞の集団、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはｍｅｇａＴＡＬ、３´−５´エクソヌクレアーゼ、および任意に、ドナー修復テンプレートを含む。ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、ｍｅｇａＴＡＬ、および／または３´−５´エクソヌクレアーゼは、開示されるポリヌクレオチド送達方法（上記参照）を介して細胞内に導入されるｍＲＮＡの形態であり得る。
【０５８１】
特定の実施形態において、細胞の集団は、遺伝子修飾された免疫エフェクター細胞を含む。
【０５８２】
組成物には、薬学的組成物が含まれるが、これらに限定されない。「薬学的組成物」は、単独でまたは療法の１つ以上の他のモダリティと組み合わせて、細胞または動物への投与のために、薬学的に許容可能なまたは生理学的に許容可能な溶液中に製剤化される組成物を指す。所望される場合、本組成物が、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法薬プロドラッグ、薬物、抗体、または他の種々の薬学的に活性な薬剤などの他の薬剤と組み合わせて投与され得ることも理解されよう。本組成物に含めてよい他の構成成分に対する限定は実質的に存在しないが、但し、追加の薬剤が、本組成物に悪影響を及ぼさないことを条件とする。
【０５８３】
「薬学的に許容可能な」という語句は、適切な医学的判断の範囲内において、妥当な利益／危険性比に釣り合った、過度の毒性、炎症、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症などを伴うことなく、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に好適である化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すように本明細書で用いられる。
【０５８４】
「薬学的に許容可能な担体」は、療法細胞と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。薬学的担体の例示的な例は、細胞培養培地、水、ならびに石油、動物、植物、または合成起源の油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などを含む油などの滅菌液体であり得る。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注入可能溶液用の液体担体として用いられ得る。特定の実施形態において好適な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが含まれる。任意の従来の培地または薬剤が活性な成分と適合しないということを除いて、療法的組成物においてその使用が企図される。補足的活性成分も、本組成物中に組み込まれ得る。
【０５８５】
一実施形態において、薬学的に許容可能な担体を含む組成物は、対象への投与に好適である。特定の実施形態において、担体を含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内または動脈内）、腹腔内、または筋肉内投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体を含む組成物は、脳室内、脊髄内、または髄腔内投与に好適である。薬学的に許容可能な担体には、減菌水溶液、細胞培養培地、または分散液が含まれる。薬学的に活性な物質のためのかかる培地および薬剤の使用は、当該技術分野において良く知られている。任意の従来の培地または薬剤が形質導入された細胞と適合しないということを除いて、薬学的組成物においてその使用が企図される。
【０５８６】
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、遺伝子修飾されたＴ細胞および薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書で企図される細胞を基にした組成物を含む組成物は、所望の治療ゴールを有効にするために、腸内もしくは非経口投与方法によって別個に、または他の好適な化合物と組み合わせて投与され得る。
【０５８７】
薬学的に許容可能な担体は、治療されるヒト対象への投与にそれを好適にするために、十分に高純度のものおよび十分に低毒のものであるべきである。それはさらに、本組成物の安定性を維持または増加させるべきである。薬学的に許容可能な担体は、液体または固形であり得、本組成物の他の構成要素と組み合わされたときに所望の嵩、粘度などを提供するために、念頭に計画された投与の様式を以って選択される。例えば、薬学的に許容可能な担体は、結合薬剤（例えば、α化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、リン酸水素カルシウムなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属、水素化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）であり得るが、これらに限定されない。本明細書で企図される組成物のための他の好適な薬学的に許容可能な担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘着性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０５８８】
かかる担体溶液は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る。本明細書で使用されるとき、「緩衝剤」という用語は、化学的構成物質がｐＨの著しい変化を伴うことなく、酸または塩基を中和する溶液または液体を指す。本明細書で企図される緩衝剤の例には、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、リンガー溶液、水中の５％デキストロース（Ｄ５Ｗ）、通常の生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０５８９】
薬学的に許容可能な担体は、約７の組成物のｐＨを維持するのに十分な量で存在し得る。あるいは、本組成物は、約６．８〜約７．４、例えば、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、および７．４の範囲のｐＨを有する。さらに別の実施形態において、本組成物は、約７．４のｐＨを有する。
【０５９０】
本明細書で企図される組成物は、非毒性の薬学的に許容可能な培地を含み得る。本組成物は、懸濁液であり得る。本明細書で使用されるとき、「懸濁」という用語は、細胞が固形支持体に結合しない非粘着性状態を指す。例えば、懸濁液として維持される細胞は、攪拌または扇動され得、培養皿などの支持体に粘着しない。
【０５９１】
特定の実施形態において、本明細書で企図される組成物は、懸濁液中で製剤化され、ここで、ゲノム編集されたＴ細胞が静脈注射用（ＩＶ）袋などの中で、許容可能な液体培地または溶液、例えば、生理食塩水または血清不含培地中に分散される。許容可能な希釈剤には、水、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、リンガー溶液、等張性塩化ナトリウム（生理食塩水）溶液、血清不含細胞培養培地、および極低温保存に好適な培地、例えば、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）培地が含まれるが、これらに限定されない。
【０５９２】
ある特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体は、ヒトまたは動物起源の天然タンパク質を実質的に含まず、ゲノム編集されたＴ細胞の集団を含む組成物を保存するのに好適である。療法的組成物は、ヒト患者に投与されることが意図され、したがって、ウシ血清アルブミン、ウマ血清、および胎児ウシ血清などの細胞培養構成要素を実質的に含まない。
【０５９３】
いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な細胞培養培地中で製剤化される。かかる組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容可能な細胞培養培地は、血清不含培地である。
【０５９４】
血清不含培地は、単純化組成物およびより良好な規定組成物、低度の汚染物質、感染剤の潜在源の排除、およびより低費用を含む、血清含有培地を上回るいくらかの利点を有する。種々の実施形態において、血清不含培地は、動物質を含まず、任意に、タンパク質を含み得ない。任意に、培地は、生物薬学的に許容可能な組換えタンパク質を含有し得る。「動物質を含まない」培地は、構成要素が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地中の天然動物タンパク質に置き換わり、栄養素は、合成、植物、または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質を含まない」培地は、タンパク質を実質的に含まないと定義される。
【０５９５】
特定の組成物において使用される血清不含培地の例示的な例には、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＸ−ＶＩＶＯ１０が含まれるが、これらに限定されない。
【０５９６】
好ましい実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ中で製剤化される。
【０５９７】
種々の実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞を含む組成物は、凍結保存培地中で製剤化される。例えば、凍結保存薬剤を有する凍結保存培地は、解凍後に高い細胞生存率の結果を維持するために使用され得る。特定の組成物において使用される凍結保存培地の例示的な例には、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ２が含まれるが、これらに限定されない。
【０５９８】
一実施形態において、本組成物は、５０：５０でＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ対ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０を含む溶液中で製剤化される。
【０５９９】
特定の実施形態において、本組成物は、マイコプラズマ、内毒素、および微生物汚染を実質的に含まない。内毒素に対する「実質的に含まない」は、生物製剤に関してＦＤＡによって承認されている内毒素よりも細胞の１用量当たりの内毒素が少なく、これは、総内毒素が１日当たり５ＥＵ／体重ｋｇであり、平均７０ｋｇの人は３５０ＥＵ／総用量の細胞であることを意味する。特定の実施形態において、本明細書で企図されるレトロウイルスベクターで形質導入された造血性幹細胞または前駆細胞を含む組成物は、約０．５ＥＵ／ｍＬ〜約５．０ＥＵ／ｍＬ、または約０．５ＥＵ／ｍＬ、１．０ＥＵ／ｍＬ、１．５ＥＵ／ｍＬ、２．０ＥＵ／ｍＬ、２．５ＥＵ／ｍＬ、３．０ＥＵ／ｍＬ、３．５ＥＵ／ｍＬ、４．０ＥＵ／ｍＬ、４．５ＥＵ／ｍＬ、または５．０ＥＵ／ｍＬを含有する。
【０６００】
ある特定の実施形態において、１つ以上の再プログラミングされたヌクレアーゼをコードする１つ以上のｍＲＮＡ、および任意に、エンドプロセシング酵素を含むがこれらに限定されないポリヌクレオチドの送達に好適な組成物および製剤が企図される。
【０６０１】
エクスビボ送達のための代表的な製剤には、リン酸カルシウム、電気穿孔、熱ショック、および種々のリポソーム製剤（すなわち、脂質媒介性トランスフェクション）などの当該技術分野において既知の種々のトランスフェクション薬剤の使用も含まれ得る。下記でより詳細に記載のリポソームは、水性流体の画分を封入する脂質二重層である。ＤＮＡは、カチオン性リポソームの外表面に（その荷電に基づいて）自発的に会合し、これらのリポソームは、細胞膜と相互作用する。
【０６０２】
特定の実施形態において、薬学的に許容可能な担体溶液の製剤は、例えば、腸内および非経口、例えば、血管内、静脈内、動脈内、骨内、脳室内、脳内、頭蓋内、脊髄内、髄腔内、および髄内投与および製剤を含む、多様な治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するのに好適な投薬および治療レジメンの開発であるとして当業者に良く知られている。本明細書で企図される特定の実施形態が薬学的分野で良く知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ  ａｎｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ．２２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｏｙｄ  Ｖ．Ａｌｌｅｎ  Ｊｒ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ；２０１２に記載されているものなどの他の製剤を含み得ることが当業者によって理解され得、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６０３】
Ｊ．ゲノム編集された細胞療法
本明細書で企図される組成物および方法によって製造されたゲノム編集された細胞は、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の少なくとも１つの症状の予防、治療、または緩和において使用するための改善された製剤を提供する。本明細書で使用されるとき、「製剤」という用語は、本明細書で企図される組成物および方法を使用して産生された遺伝子修飾された細胞を指す。特定の実施形態において、製剤は、遺伝子的に編集された免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む。さらに、特定の実施形態において企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、Ｔ細胞疲弊に対して耐性を有し、かつ腫瘍微小環境において増加した耐久性および持続性を示し、持続的な療法をもたらし得るため、より安全かつより有効である養子細胞療法を提供する。
【０６０４】
特定の実施形態において、編集されたＴＧＦβＲ２遺伝子を含む有効量のゲノム編集された免疫エフェクター細胞またはＴ細胞は、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の少なくとも１つの症状を予防、治療、または緩和するために対象に投与される。
【０６０５】
特定の実施形態において、ＴＧＦβＲ２で編集された細胞は、ＴＧＦβＲ２を実質的に発現しないか、またはその発現を欠いており、したがって、機能的ＴＧＦβＲ２発現を欠いているか、または実質的に欠いており、例えば、Ｔ細胞疲弊を増加させ、炎症促進性サイトカインの発現を阻害する能力を欠いている。特定の実施形態において、ＴＧＦβＲ２を欠いているゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルに対してより耐性を有しており、増加した持続性およびＴ細胞疲弊に対する耐性を示す。
【０６０６】
特定の実施形態において、癌の少なくとも１つの症状を予防、治療、または緩和する方法は、編集されたＴＧＦβＲ２遺伝子および遺伝子操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、もしくはＤａｒｉｃ、または他の療法的な導入遺伝子を含む有効量のゲノム編集された免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を対象に投与して、細胞を腫瘍または癌に再指向させることを含む。遺伝子修飾された細胞は、ＴＧＦβＲ２遺伝子を編集することに基づいて腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルに対してより耐性を有して、ＴＧＦβＲ２発現を減少または排除するため、より耐久性および持続性がある製剤である。
【０６０７】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、固形腫瘍または癌の治療において使用される。
【０６０８】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、副腎癌、副腎皮質癌腫、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管癌腫、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管癌腫（ＤＣＩＳ）子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維性組織肉腫、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、神経膠腫、膠芽腫、頭頸部癌、血管芽細胞腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼内黒色腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌腫、髄芽細胞腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、黒色腫、メルケル細胞癌腫、正中管細胞癌腫、口腔癌、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、乏突起神経膠腫、口腔癌（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、膵島細胞腫瘍、乳頭癌腫、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌腫、腎盂および尿管癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、脂腺癌腫、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮細胞癌腫、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌、汗腺癌腫、滑膜腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管の癌、外陰癌、ならびにウィルムス腫瘍が含まれるが、これらに限定されない、固形腫瘍または癌の治療において使用される。
【０６０９】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脳癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌が含まれるが、これらに限定されない固形腫瘍または癌の治療において使用される。
【０６１０】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、膵臓、膀胱、および肺が含まれるが、これらに限定されない種々の癌の治療において使用される。
【０６１１】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、液体癌または血液癌の治療において使用される。
【０６１２】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫が含まれるが、これらに限定されないＢ細胞悪性腫瘍の治療において使用される。
【０６１３】
特定の実施形態において、本明細書で企図されるゲノム編集された細胞は、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫：急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病、有毛細胞性白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）および真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉腫、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞性白血病、非分泌性骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、ならびに髄外性形質細胞腫が含まれるが、これらに限定されない、液体癌の治療において使用される。
【０６１４】
本明細書で企図されるゲノム編集方法において使用するのに好ましい細胞には、自己移植／自源（「自己」）細胞、好ましくは造血細胞、より好ましくはＴ細胞、およびより好ましくは免疫エフェクター細胞またはＴｒｅｇ細胞が含まれる。
【０６１５】
特定の実施形態において、治療上有効量の本明細書で企図されるゲノム編集された細胞またはそれを含む組成物を、単独でまたは１つ以上の療法剤と組み合わせてそれを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。ある特定の実施形態において、本細胞は、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の進展の危険性のある患者の治療において使用される。したがって、特定の実施形態は、治療上有効量の本明細書で企図されるゲノム編集された細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の少なくとも１つの症状の治療または予防または緩和を含む。
【０６１６】
一実施形態において、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全を治療する方法は、それを必要とする対象において、有効量、例えば、治療上有効量の本明細書で企図されるゲノム編集された細胞を含む組成物を投与することを含む。適切な投与量が臨床試験によって決定され得るが、投与の量および頻度は、患者の病態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの要因によって決定されるであろう。
【０６１７】
１つの例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集された細胞の有効量は、細胞の全ての介在する用量を含む、少なくとも２ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも３ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも４ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも５ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも６ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも７ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも８ｘ１０６細胞／ｋｇ、少なくとも９ｘ１０６細胞／ｋｇ、または少なくとも１０ｘ１０６細胞／ｋｇ以上の細胞／ｋｇである。
【０６１８】
別の例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集された細胞の有効量は、細胞の全ての介在する用量を含む、約２ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４ｘ１０６細胞／ｋｇ、約５ｘ１０６細胞／ｋｇ、約６ｘ１０６細胞／ｋｇ、約７ｘ１０６細胞／ｋｇ、約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、約９ｘ１０６細胞／ｋｇ、または約１０ｘ１０６細胞／ｋｇ以上の細胞／ｋｇである。
【０６１９】
別の例示的な実施形態において、対象に提供されるゲノム編集された細胞の有効量は、細胞の全ての介在する用量を含む、約２ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約１０ｘ１０６細胞／ｋｇ、約３ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約１０ｘ１０６細胞／ｋｇ、約４ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約１０ｘ１０６細胞／ｋｇ、約５ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約１０ｘ１０６細胞／ｋｇ、２ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約６ｘ１０６細胞／ｋｇ、２ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約７ｘ１０６細胞／ｋｇ、２ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、３ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約６ｘ１０６細胞／ｋｇ、３ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約７ｘ１０６細胞／ｋｇ、３ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、４ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約６ｘ１０６細胞／ｋｇ、４ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約７ｘ１０６細胞／ｋｇ、４ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、５ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約６ｘ１０６細胞／ｋｇ、５ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約７ｘ１０６細胞／ｋｇ、５ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約８ｘ１０６細胞／ｋｇ、または６ｘ１０６細胞／ｋｇ〜約８ｘ１０６細胞／ｋｇである。
【０６２０】
当業者は、特定の実施形態において企図される組成物の複数回投与が所望の療法に影響を及ぼすために必要とされ得ることを認識するであろう。例えば、組成物は、１週間、２週間、３週間、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、１年間、２年間、５年間、１０年間以上の間にわたって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回以上投与され得る。
【０６２１】
ある特定の実施形態において、対象に活性化されたＴ細胞を投与し、その後、再採血し（またはアフェレーシスを行い）、その血液からＴ細胞を活性化し、これらの活性化し、増大させたＴ細胞を患者に再注入することが望ましい場合がある。このプロセスは、数週間ごとに複数回実行され得る。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化され得る。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、または４００ｃｃ以上の採血から活性化される。理論に拘束されるものではないが、この複数の採血／複数の再注入プロトコルを使用することは、ある特定のＴ細胞の集団を選択するように機能し得る。
【０６２２】
特定の実施形態において企図される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、埋め込み、または移植によるものを含む、任意の都合のよい様式で実行され得る。好ましい実施形態において、組成物は、非経口に投与される。本明細書で使用されるとき、「非経口投与」および「非経口に投与される」という語句は、腸内および局所投与以外の投与形式、通常は注射によるものを指し、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内への注射および注入が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、本明細書で企図される組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位に直接注射することによって対象に投与される。
【０６２３】
一実施形態において、癌と診断された対象を治療する方法は、対象から免疫エフェクター細胞を除去することと、該免疫エフェクター細胞のゲノムを編集することと、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞の集団を産生することと、同じ対象にゲノム編集された免疫エフェクター細胞の集団を投与することと、を含む。好ましい実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
【０６２４】
特定の実施形態において企図される細胞組成物を投与するための方法には、エクスビボでゲノム編集された免疫エフェクター細胞の再導入、または対象に導入されると、成熟免疫エフェクター細胞に分化する、免疫エフェクター細胞のゲノム編集された前駆体の再導入をもたらすのに有効である任意の方法が含まれる。１つの方法は、エクスビボにおいて末梢血Ｔ細胞をゲノム編集することと、形質導入された細胞を対象に戻すこととを含む。
【０６２５】
本明細書で引用される刊行物、特許出願、および発行特許は全て、個別の刊行物、特許出願、または発行された特許の各々が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。
【０６２６】
前述の実施形態は、明瞭な理解のために図解および実施例により少し詳細に記載されているが、本明細書で企図される教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、それらに対してある特定の変化および修正を行うことができることが当業者には容易に明らかになるであろう。以下の実施例は、単に例示として提供され、限定としては提供されない。基本的に類似した結果をもたらすために変化または修正され得る多様な重大でないパラメータは当業者には容易に認識されよう。
【実施例】
【０６２７】
実施例１
ヒト形質転換成長因子ベータ受容体２（ＴＧＦβＲ２）遺伝子を撹乱するための再プログラミングＩ−ＯＮＵＩ
ＤＮＡ認識インターフェースにおいて可変アミノ酸残基を含有するモジュラーライブラリを構築することによって、Ｉ−ＯｎｕＩを、ＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６を標的とするように再プログラミングした（図１）。バリアントを構築するために、オリゴヌクレオチドを使用して縮重コドンをＩ−ＯｎｕＩ  ＤＮＡ結合ドメイン内に組み込んだ。縮重コドンをコードするオリゴヌクレオチドをＰＣＲテンプレートとして使用して、酵母菌株Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるギャップ組換えによってバリアントライブラリを生成した。各バリアントライブラリは、Ｎ−またはＣ末端Ｉ−ＯｎｕＩ  ＤＮＡ認識ドメインのいずれかにおよび、約１０７〜１０８の固有の形質転換体を含有した。図２に示すように、得られた表面ディスプレイライブラリを、対応するドメインの「ハーフ部位」（配列番号：１４〜１８）を含む標的部位に対する切断活性に関してフローサイトメトリーによってスクリーニングした。
【０６２８】
Ｎ−およびＣ末端ドメインで再プログラミングされたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥを示す酵母を精製し、プラスミドＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ反応を行って、再プログラミングされたドメインを増幅し、これは、後に、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに融合および形質転換されて、再プログラミングされたドメインの組み合わせのライブラリを作成した。ＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６に存在する完全な標的部位（配列番号：１１）を認識する完全に再プログラミングされたＩ−ＯｎｕＩバリアントをこのライブラリから特定し、精製した。
【０６２９】
実施例２
ＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６を標的とする再プログラミングされたＭＥＤ  Ｉ−ＯＮＵＩホーミングエンドヌクレアーゼ
染色体に一体化された蛍光レポーター系を使用して、ＴＧＦβＲ２遺伝子のエクソン６を標的とする再プログラミングされたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥの活性を測定した（Ｃｅｒｔｏ  ｅｔ．ａｌ．，２０１１）。ＴＧＦβＲ２標的配列（配列番号：１１）に結合し、それを切断する完全に再プログラミングされたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥを、哺乳動物発現プラスミドにクローン化し、次いで、蛍光ｉＲＦＰタンパク質をコードするフレーム外遺伝子の上流にＴＧＦβＲ２標的配列を含有したＨＥＫ２９３Ｔ線維芽細胞細胞株に個別にトランスフェクトした。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介するＤＮＡ修復後のＨＥによって埋め込まれた標的部位および挿入欠失の蓄積の切断は、「インフレーム」の後方に蛍光レポーター遺伝子を配置する３つの修復された遺伝子座のうちのおよそ１つをもたらす。したがって、染色体に埋め込まれた標的配列におけるエンドヌクレアーゼ活性の読み出しに、ｉＲＦＰ蛍光性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のパーセンテージを使用する。ＴＧＦβＲ２標的配列に結合し、それを切断する完全に再プログラミングされたＩ−ＯｎｕＩ  ＨＥは、細胞染色体コンテクスト（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｃｏｎｔｅｘｔ）において、中程度のｉＲＦＰ発現の効率を示した。図３（上のグラフ）。
【０６３０】
次に、ＴＧＦβＲ２．Ｂ３ＨＥバリアント（例えば、配列番号：６）上でランダム変異誘発を行うことによって、二次Ｉ−ＯｎｕＩバリアントライブラリを生成した。改善された触媒効率でバリアントを単離するために、より厳密な切断条件下でディスプレイに基づく流動選別を行った。このプロセスは、染色体蛍光レポーター遺伝子アッセイにおいてｉＲＦＰ発現細胞の生成率がおよそ４倍高かったＩ−ＯｎｕＩバリアントＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８（配列番号：７）を特定した。図３（下のグラフ）。
【０６３１】
ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８は、親バリアントに対して２つのアミノ酸変異を有し、そのうちの１つがＤＮＡ認識インターフェース内に位置する。ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８は、エクソン６標的部位に対してサブナノモル親和性を有する。図４。図５は、代表的なＩ−ＯｎｕＩバリアントの相対整列、ならびにＤＮＡ認識インターフェースを含む残基の位置情報を示す。
【０６３２】
実施例３
ＴＧＦβＲ２エクソン６を標的とするＭＥＧＡＴＡＬの特徴付け
メガヌクレアーゼドメインのＮ末端に、１１塩基対ＴＡＬアレイ標的部位（配列番号：１２）に対応する、５−メチルシトシン寛容１０．５単位ＴＡＬアレイを付加することによって、ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬ（配列番号：９）として、ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ＨＥバリアントをフォーマット化した（Ｂｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３に記載）。図６。ｍｅｇａＴＡＬ標的部位配列は、配列番号：１３に記載される。リンカー配列（配列番号：１０）を介するＴｒｅｘ２へのＣ末端融合としても、ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬをフォーマット化した。
【０６３３】
ｍｅｇａＴＡＬの編集効率を、４８〜７２時間、サイトカインで補足された培地において抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体を用いて刺激前初代ヒトＴ細胞によって評価し、次いで、インビトロで転写し（ＩＶＴ）、キャップし、かつポリアデニル化した、ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡを用いてこの細胞を電気穿孔した。さらに、３´〜５´エクソヌクレアーゼＴｒｅｘ２をコードするＩＶＴ−ｍＲＮＡを付加して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路によって破断プロセスを強化した（Ｃｅｒｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２を参照されたい）。電気穿孔後、細胞を７〜１０日間、サイトカインで補足された培地において培養し、その間、ゲノムＤＮＡ単離のために分割量を取り出し、その後、ＴＧＦβＲ２エクソン６標的部位にわたって、ＰＣＲ増幅した。
【０６３４】
Ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｄｅｌｓ  ｂｙ  ＤＥｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＴＩＤＥ、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４を参照されたい）を使用して挿入欠失の頻度を測定した。Ｔｒｅｘ２の存在下でのＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬの編集効率は、およそ６５％であった。図７。標的部位で観察された優位な挿入欠失型は、−１ｂｐであったが、−２、−３、または−４ｂｐ挿入欠失も観察された。図７。この分析により、ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬが、ｍｅｇａＴＡＬで処理したヒトＴ細胞のかなりの部分において、ＴＧＦβＲ２標的部位を撹乱したことが確認された。
【０６３５】
実施例４
ＴＧＦβＲ２ＭＥＧＡＴＡＬは、ＴＧＦβ−１で誘導されたシグナル伝達を撹乱する。
ＴＧＦβＲ２に結合するＴＧＦβ−１は、ＳＭＡＤ２およびＳＭＡＤ３のリン酸化を含む下流シグナル伝達カスケードを誘導する。初代ヒトＴ細胞を、実施例３に記載されるように、ＣＤ３およびＣＤ２８で活性化した。活性化された初代ヒトＴ細胞を、インビトロで転写した、ＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬをコードするｍＲＮＡで電気穿孔した。トランスフェクトしたＴ細胞をさらに７〜１０日間増大させ、ＴＧＦβＲ２標的部位にわたってＴＩＤＥを使用して編集効率を測定した。
【０６３６】
１０日目に、ｍｅｇａＴＡＬで処理したＴ細胞および対照ドナーＴ細胞の両方を組換えＴＧＦβ−１で刺激し、フローサイトメトリーを使用して、ＳＭＡＤ２／３リン酸化を検査することによって、ＴＧＦβＲ２シグナル伝達能力を分析した。対照細胞は、ｒＴＧＦβ−１刺激後にリン酸化ＳＭＡＤ２／３の増加を示した。対照的に、ｍｅｇａＴＡＬを標的とするＴＧＦβＲ２で処理したＴ細胞は、ｒＴＧＦβ−１刺激後に最小のｐＳＭＡＤ２／３シグナルを呈し、これは、ＴＧＦβＲ２遺伝子の撹乱が細胞内シグナル伝達事象を実質的に低減し、そうでない場合、この事象がＴＧＦβＲ２シグナル伝達の下流で起こるであろうことを提示する。図８。
【０６３７】
実施例５
ＴＧＦβＲ２ＭＥＧＡＴＡＬは、抗ＧＤ２ＣＡＲ  Ｔ細胞においてＴＧＦβ−１で誘導されたシグナル伝達を撹乱する。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＣＤ３およびＣＤ２８で活性化した。活性化の２４時間後、細胞を偽形質導入するか、または抗ＧＤ２ＣＡＲをコードするレンチウイルスで形質導入した。活性化の７２時間後、偽形質導入された細胞および抗ＧＤ２ＣＡＲで形質導入された細胞を各々、３つの条件：非電気穿孔、偽電気穿孔、またはＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬをコードするインビトロで転写したｍＲＮＡを用いた電気穿孔に分けた。Ｔ細胞をさらに７日間増大させ、ＴＧＦβＲ２標的部位にわたってＴＩＤＥを使用して編集効率を測定した。図９。
【０６３８】
ヒトＰＢＭＣをＣＤ３およびＣＤ２８で活性化した。活性化の２４時間後、細胞を偽形質導入するか、または抗ＧＤ２ＣＡＲをコードするレンチウイルスで形質導入した。活性化の７２時間後、偽形質導入された細胞および抗ＧＤ２ＣＡＲで形質導入された細胞を各々、２つの条件：偽電気穿孔、またはＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬをコードするインビトロで転写したｍＲＮＡを用いた電気穿孔に分けた。Ｔ細胞をさらに７日間増大させた。１０日目に、ｍｅｇａＴＡＬで処理したＴ細胞および対照Ｔ細胞の両方を組換えＴＧＦβ−１で刺激し、フローサイトメトリーを使用して、ＳＭＡＤ２／３リン酸化を検査することによって、ＴＧＦβＲ２シグナル伝達能力を分析した。ｍｅｇａＴＡＬで処理したＴ細胞を標的とするＴＧＦβＲ２とは対照的に、対照細胞は、ｒＴＧＦβ−１刺激後にリン酸化ＳＭＡＤ２／３の増加を示した。図１０。
【０６３９】
ヒトＰＢＭＣをＣＤ３およびＣＤ２８で活性化した。活性化の２４時間後、細胞を偽形質導入するか、または抗ＧＤ２ＣＡＲをコードするレンチウイルスで形質導入した。活性化の７２時間後、偽形質導入された細胞および抗ＧＤ２ＣＡＲで形質導入された細胞を各々、抗体刺激の７２時間後、１００ｘ１０６の形質導入された３つの条件：非電気穿孔、偽電気穿孔、またはＴＧＦβＲ２．Ｂ３．Ｆ８ｍｅｇａＴＡＬをコードするインビトロで転写したｍＲＮＡを用いた電気穿孔に分けた。Ｔ細胞をさらに７日間増大させた。１０日目に、組換えＴＧＦβ−１の存在下または不在下で、ｍｅｇａＴＡＬで処理したＴ細胞および対照Ｔ細胞を、癌細胞を発現するＧＤ２と培養した。ＩＦＮγおよびＩＬ−２分泌を２４時間後に測定した。ｍｅｇａＴＡＬで処理したＴ細胞を標的とするＴＧＦβＲ２は、ＴＧＦβ−１の存在下で、対照の処理された細胞と比較して、サイトカイン分泌の劇的な増加を示した。図１１。
【０６４０】
全般に、以下の特許請求の範囲において、使用された用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定させるものと解釈されるべきではないが、そのような特許請求の範囲が権利を与える等価物の完全な範囲と共に全ての可能な実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。
【図１】
2019535240.tif 000006
【図２】
2019535240.tif 000007
【図３】
2019535240.tif 000008
【図４】
2019535240.tif 000009
【図５】
2019535240.tif 000010
【図６】
2019535240.tif 000011
【図７】
2019535240.tif 000012
【図８】
2019535240.tif 000013
【図９】
2019535240.tif 000014
【図１０】
2019535240.tif 000015
【図１１】
2019535240.tif 000016
【配列表】
2019535240000001.app
【国際調査報告】
2019535240.tif 000017
2019535240.tif 000018