(57)【要約】本発明は特に、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症の治療方法を提供するものであり、当該方法は、治療を必要とする対象に対し、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするｍＲＮＡを有効量で含む組成物を、ＯＴＣ欠損症の少なくとも１つの症状または特徴が、強度、重篤度または頻度において低下する、またはその発症が遅延するような投与間隔で投与することを含む。一部の実施形態では、当該ｍＲＮＡはリポソーム内に封入され、当該リポソームは、１種以上のカチオン性脂質、１種以上の非カチオン性脂質、１種以上のコレステロール系脂質、および１種以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症の治療方法であって、治療を必要とする対象に対し、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするｍＲＮＡを有効量で含む組成物を、前記ＯＴＣ欠損症の少なくとも１つの症状または特徴が、強度、重篤度または頻度において低下する、またはその発症が遅延するような投与間隔で投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、コドン最適化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号３、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０に対し少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号３、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号７を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号１ではない、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ｍＲＮＡは、配列番号１１の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ｍＲＮＡは、配列番号１２または配列番号１３の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ｍＲＮＡは、リポソーム内に封入される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記リポソームは、１種以上のカチオン性脂質、１種以上の非カチオン性脂質、１種以上のコレステロール系脂質、および１種以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１種以上のカチオン性脂質は、Ｃ１２−２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＯＦ−０２、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるカチオン性脂質を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１種以上の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１種以上のコレステロール系脂質は、コレステロールおよび／またはＰＥＧ化コレステロールである、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記リポソームが、約１００ｎｍ未満の大きさを有する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｍＲＮＡは、体重１ｋｇ当たり、約０．０１〜５．０ｍｇの範囲の有効量で投与される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｍＲＮＡは、体重１ｋｇ当たり、約０．０１〜３．０ｍｇの範囲の有効量で投与される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｍＲＮＡは、体重１ｋｇ当たり、約０．０１〜１．０ｍｇの範囲の有効量で投与される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ｍＲＮＡは、体重１ｋｇ当たり、約０．０１〜０．５ｍｇの範囲の有効量で投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物は、静脈内投与される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物は週に１回投与される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物は月に２回投与される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物は１４日に１回投与される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物は月に１回投与される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物の投与は、対照レベルと比較して、前記対象血清中のＯＴＣタンパク質の発現レベルまたは活性レベルの増加を生じさせる、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記対照レベルは、治療前の前記対象におけるベースライン血清ＯＴＣタンパク質の発現レベルまたは活性レベルである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記対照レベルは、治療を行わないＯＴＣ患者における血清ＯＴＣタンパク質の平均の発現レベルまたは活性レベルを示す参照値である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記組成物の投与は、対照オロチン酸値と比較して、前記対象における尿オロチン酸値の低下を生じさせる、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記対照オロチン酸値は、治療前の前記対象におけるベースライン尿オロチン酸値である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記対照オロチン酸値は、治療を行わないＯＴＣ患者における平均尿オロチン酸値を示す参照値である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物の投与は、対照シトルリン値と比較して、前記対象血清中のシトルリン値の増加を生じさせる、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記対照シトルリン値は、治療前の前記対象におけるベースライン血清シトルリン値である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記対照シトルリン値は、治療を行わないＯＴＣ患者における平均血清シトルリン値を示す参照値である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｍＲＮＡは、１個以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記１個以上の修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン、Ｎ−１−メチル−シュードウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および／または２−チオシチジンを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｍＲＮＡは修飾されない、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を治療する方法であって、前記方法は、治療の必要のある患者に対し、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするｍＲＮＡを含む組成物を投与することを含み、前記ｍＲＮＡは、配列番号７に対し少なくとも８０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、方法。
【請求項３７】
オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を治療するための医薬組成物であって、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするｍＲＮＡを含み、前記ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号３、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０に対し少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、医薬組成物。
【請求項３８】
前記ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号３、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０を含む、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号７を含む、請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
前記ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号１ではない、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記ｍＲＮＡは、配列番号１１の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列をさらに含む、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記ｍＲＮＡは、配列番号１２または配列番号１３の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列をさらに含む、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、リポソーム内に封入される、請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記リポソームは、１種以上のカチオン性脂質、１種以上の非カチオン性脂質、１種以上のコレステロール系脂質、および１種以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記リポソームは、約１００ｎｍ未満の大きさを有する、請求項４３または請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を治療するための医薬組成物であって、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡは、配列番号７に対し少なくとも８０％同一であるポリヌクレオチド配列を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年６月１３日に出願された米国仮出願第６２／３４９，３３１号、および２０１７年５月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／５０９，５６８号に対する優先権を主張するものであり、当該開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本明細書は、配列表（「ＳＬ＿ＭＲＴ−１２４３ＵＳ」という名称のテキスト（．ｔｘｔ）ファイルとして２０１７年６月１３日に電子的に提出されたもの）を参照する。当該テキストファイルは、２０１７年６月１３日に作成されたものであり、サイズは２２，１４１バイトである。配列表の全内容が、参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ：Ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ  ｔｒａｎｓｃａｒｂａｍｙｌａｓｅ）欠損症は、ＯＴＣ遺伝子中の突然変異に特徴付けられるＸ染色体連鎖型遺伝性疾患である。ＯＴＣ遺伝子中の突然変異は、（肝臓および小腸において）カルバミルリン酸およびオルニチンからのシトルリン合成に触媒作用を及ぼすＯＴＣ酵素の能力を消滅または低下させる。結果として、過剰な窒素がアンモニアの形態で血中に蓄積され、これが神経系へと移動し、ＯＴＣ欠損症に関連した症状が生じる。ＯＴＣ活性を完全に無効化する突然変異は、重度な新生児発症型を生じさせ、一方でＯＴＣ活性の低下をもたらす突然変異は、遅発型の表現型を生じさせる。
【０００４】
ＯＴＣ欠損症は最も普遍的なタイプの尿素サイクル異常症であり、この疾患の発症率は、およそ５６，０００〜７７，０００人の生児出生当たり１人である。重度の新生児発症型の男児は誕生時は正常であるが、数日後に哺乳力の低下、低血圧症および無気力状態を発生させ、急速に傾眠および昏睡へと進行する。発作および過呼吸が存在する場合もある。治療しなかった場合、高い死のリスクを伴う重度な脳障害が発生する。中度型の患者は、年齢を問わずに存在し得る。幼児期であれば、母乳から全乳へと切り替えたときに引き起こされ得る。小児および成人であれば、環境ストレッサー（すなわち絶食、高タンパク質食、妊娠および産後期間、併発性疾患、外科手術）が、悪心、嘔吐、頭痛、奇異な行動、せん妄および闘争性を伴う高アンモニア血症性脳障害の症状の発現を誘発させ得る。これらの症状の発現は、抗アンモニア血症性の昏睡も生じさせ得る。高アンモニア血症性昏睡の神経系合併症には、発育遅延および（場合により）重度の認識機能障害が含まれる。女性キャリアの多くは無症状性であるが、疾患アレルのＸ染色体の不活化の程度が好ましくない場合、男性と同程度にまで影響を受ける可能性がある。凝固障害は、代謝性の代償不全の間に頻出する所見であり、急性肝不全へと発展する場合もある。
【０００５】
現在のところＯＴＣ欠損症に対する治療法は存在せず、長期的な療法には、一生涯のタンパク質摂取制限と窒素捕捉剤療法（フェニル酢酸ナトリウムもしくはフェニル酪酸ナトリウムおよび／または安息香酸ナトリウムを用いる）が含まれる。重度の新生児発症型ＯＴＣ欠損症の患者（通常、６か月齢までに行われる）、または頻繁に高アンモニア血症の症状を発現する患者では肝臓移植も検討される場合がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は特に、ｍＲＮＡ療法に基づいたオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症の治療のための方法および組成物の改善を提供する。本発明は、ヒトＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡをリポソーム内に封入して投与したところ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの高効率で持続的なタンパク質産生が生じ、そしてたとえば臨床的に関連する疾患マーカーである尿中のオロチン酸値の低下に成功したという実験結果を包含する。
【０００７】
１つの態様では、本発明は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症の治療方法を提供するものであり、当該方法は、治療を必要とする対象に対し、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするｍＲＮＡを有効量で含む組成物を、ＯＴＣ欠損症の少なくとも１つの症状または特徴が、強度、重篤度または頻度において低下する、またはその発生が遅延するような投与間隔で投与することを含む。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、コドン最適化される。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号３、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０に対し少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号３を含む。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号６を含む。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号７を含む。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号８を含む。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号９を含む。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号１０を含む。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号１ではない。
【０００８】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１１の５’非翻訳領域（ＵＴＲ：ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）配列をさらに含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１２または配列番号１３の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列をさらに含む。
【０００９】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡはリポソーム内に封入される。一部の実施形態では、リポソームは、１種以上のカチオン性脂質、１種以上の非カチオン性脂質、１種以上のコレステロール系脂質、および１種以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。一部の実施形態では、当該１種以上のカチオン性脂質は、Ｃ１２−２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＯＦ−０２、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ、ＨＧＴ４００３、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されるカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、当該１種以上の非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施形態では、当該１種以上のコレステロール系脂質は、コレステロールおよび／またはＰＥＧ化コレステロールである。
【００１０】
一部の実施形態では、リポソームは、約１００ｎｍ未満の大きさを有する。
【００１１】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、体重１ｋｇ当たり、約０．０１〜５．０ｍｇの範囲の有効量で投与される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、体重１ｋｇ当たり、約０．０１〜３．０ｍｇの範囲の有効量で投与される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、体重１ｋｇ当たり、約０．０１〜１．０ｍｇの範囲の有効量で投与される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、体重１ｋｇ当たり、約０．０１〜０．５ｍｇの範囲の有効量で投与される。
【００１２】
一部の実施形態では、組成物は、静脈内投与される。一部の実施形態では、組成物は、週に１回投与される。一部の実施形態では、組成物は、月に２回投与される。一部の実施形態では、組成物は、１４日に１回投与される。一部の実施形態では、組成物は、月に１回投与される。
【００１３】
一部の実施形態では、当該組成物の投与は、対照レベルと比較して、対象血清中のＯＴＣタンパク質の発現レベルまたは活性レベルの増加を生じさせる。一部の実施形態では、対照レベルは、治療前の対象におけるベースライン血清ＯＴＣタンパク質の発現レベルまたは活性レベルである。一部の実施形態では、対照レベルは、治療を行わないＯＴＣ患者における血清ＯＴＣタンパク質の平均の発現レベルまたは活性レベルを示す参照値である。一部の実施形態では、当該組成物の投与は、対照オロチン酸値と比較して、対象における尿オロチン酸値の低下を生じさせる。一部の実施形態では、対照オロチン酸値は、治療前の対象におけるベースライン尿オロチン酸値である。一部の実施形態では、対照オロチン酸値は、治療を行わないＯＴＣ患者における平均尿オロチン酸値を示す参照値である。一部の実施形態では、当該組成物の投与は、対照シトルリン値と比較して、当該対象血清中のシトルリン値の増加を生じさせる。一部の実施形態では、対照シトルリン値は、治療前の対象におけるベースライン血清シトルリン値である。一部の実施形態では、対照シトルリン値は、治療を行わないＯＴＣ患者における平均血清シトルリン値を示す参照値である。
【００１４】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１個以上の修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、当該１個以上の修飾ヌクレオチドは、シュードウリジン、Ｎ−１−メチル−シュードウリジン、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および／または２−チオシチジンを含む。
【００１５】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、修飾されない。
【００１６】
１つの態様において、本発明は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症を治療するための医薬組成物を提供するものであり、当該医薬組成物は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするｍＲＮＡを含み、当該ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号３、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０に対し少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号３を含む。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号６を含む。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号７を含む。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号８を含む。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号９を含む。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号１０を含む。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号１ではない。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１１の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列をさらに含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、配列番号１２または配列番号１３の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列をさらに含む。
【００１８】
一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、リポソーム内に封入される。一部の実施形態では、リポソームは、１種以上のカチオン性脂質、１種以上の非カチオン性脂質、１種以上のコレステロール系脂質、および１種以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。一部の実施形態では、リポソームは、約１００ｎｍ未満の大きさを有する。
【００１９】
本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の詳細な説明、図面および請求の範囲において明らかである。しかしながら、それら詳細な説明、図面、および請求の範囲は本発明の実施形態を示すが、例示のみを目的として与えられるものであり、限定ではないことを理解すべきである。本発明の範囲内の様々な変更及び修正が、当分野の当業者には明白となるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
図面は、解説のみを目的とするものであり、限定ではない。
【００２１】
【図１】図１は、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の０．５ｍｇ／ｋｇ単回投与後、２週間にわたるウェスタンブロットによるヒトＯＴＣタンパク質の免疫組織化学的検出の例を示す。
【００２２】
【図２Ａ】図２Ａは、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の単回０．５ｍｇ／ｋｇ投与後、２週間にわたる、マウスにおけるシトルリン産生の例を示す。
【００２３】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の単回０．５ｍｇ／ｋｇ投与後、２週間にわたる、マウスにおける、野生型活性の割合としてのｈＯＴＣタンパク質活性の例を示す。
【００２４】
【図３】図３Ａは、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の単回０．５ｍｇ／ｋｇ投与後、ウェスタンブロットによるヒトＯＴＣタンパク質の免疫組織化学的検出の例を示す。
【００２５】
図３Ｂは、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の単回０．５ｍｇ／ｋｇ投与後、ウェスタンブロットによるヒトＯＴＣタンパク質の免疫組織化学的検出の例を示す。使用された脂質ナノ粒子は、図３Ａで使用されたものとは異なった。
【００２６】
【図４】図４は、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の単回０．５ｍｇ／ｋｇ投与後２４時間のマウスにおけるシトルリン産生の例を示す。ナンセンス突然変異型ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子（ＳＴＯＰ）で治療されたマウスにおいて、ｈＯＴＣ活性は観察されなかった。
【００２７】
【図５】図５は、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の単回０．５ｍｇ／ｋｇ投与後のマウスの尿中オロチン酸値の例を示す。
【００２８】
【図６Ａ】図６Ａは、Ｓｐｆａｓｈマウスにおける、アンモニアチャレンジを含む投与および検査のスキームの例を示す。
【００２９】
【図６Ｂ】図６Ｂは、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を用いた治療後のＳｐｆａｓｈマウスにおける、ＮＨ４Ｃｌを用いたアンモニアチャレンジ後の血漿アンモニア値の例を示す。
【００３０】
【図７】図７は、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を用いた治療後のＳｐｆａｓｈマウスの肝臓におけるシトルリン産生の例であり、野生型活性の割合として示される。
【００３１】
【図８】図８は、８週間にわたるｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を用いた治療後のＳｐｆａｓｈマウスの肝臓におけるシトルリン産生により測定されるｈＯＴＣ活性の例であり、野生型活性の割合として示される。
【００３２】
【図９Ａ】図９Ａは、１カ月にわたる毎週のｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を用いた治療後のＳｐｆａｓｈマウスにおけるシトルリン産生により測定されるｈＯＴＣ活性の例である。
【００３３】
【図９Ｂ】図９Ｂは、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の毎週投与（１．０ｍｇ／ｋｇ）後のウェスタンブロットによるヒトＯＴＣタンパク質の免疫組織化学的検出の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
本発明をより容易に理解するために、いくつかの用語を最初に以下に定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書全体を通して述べられている。本発明の背景を説明し、その実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物及び他の参考資料は、参照によって本明細書に援用される。
【００３５】
アルキル：本明細書において使用される場合、「アルキル」とは、１〜１５個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状の飽和炭化水素基のラジカルを指す（Ｃ１−１５アルキル）。一部の実施形態では、アルキル基は、１〜３個の炭素原子を有する（Ｃ１−３アルキル）。Ｃ１−３アルキル基の例としては、メチル（Ｃ１）、エチル（（Ｃ２））、ｎ−プロピル（Ｃ３）、およびイソプロピル（Ｃ３）が挙げられる。一部の実施形態では、アルキル基は、８〜１２個の炭素原子を有する（Ｃ８−１２アルキル）。Ｃ８−１２アルキル基の例としては、限定されないが、ｎ−オクチル（Ｃ８）、ｎ−ノニル（Ｃ９）、ｎ−デシル（Ｃ１０）、ｎ−ウンデシル（Ｃ１１）、ｎ−ドデシル（Ｃ１２）などが挙げられる。接頭辞の”ｎ−”（直鎖状）とは、非分枝状アルキル基を指す。たとえば、ｎ−Ｃ８アルキルとは、−（ＣＨ２）７ＣＨ３を指し、ｎ−Ｃ１０アルキルとは、−（ＣＨ２）９ＣＨ３を指すなどである。
【００３６】
アミノ酸：本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、その最も広い意味で、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物及び／または物質を指す。一部の実施形態では、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。一部の実施形態ではアミノ酸は合成アミノ酸であり、一部の実施形態ではアミノ酸はＤ−アミノ酸であり、一部の実施形態ではアミノ酸はＬ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドに通常見られる２０個の標準Ｌ−アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準アミノ酸」は、合成して調製されるか天然源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味する。本明細書で使用される場合、「合成アミノ酸」は、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、及び／または置換を含むがこれらに限定されない、化学修飾されたアミノ酸を包含する。ペプチドにカルボキシ末端アミノ酸及び／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基によって修飾され、及び／またはその活性に悪影響を及ぼすことなくペプチドの循環半減期を変更することができる他の化学基との置換によって修飾され得る。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与する場合がある。アミノ酸は、１つ以上の化学成分（例えば、メチル基、アセテート基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）との会合といった、一修飾または翻訳後の修飾を含み得る。用語「アミノ酸」は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸及び／またはペプチドのアミノ酸残基を指す場合がある。この用語が遊離アミノ酸かまたはペプチドの残基を指すか否かについては、用語が使用される文脈から明らかになるであろう。
【００３７】
動物：本明細書で使用される場合、用語「動物」は、動物界の任意のメンバーを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階でのヒトを意味する。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階での非ヒト動物を意味する。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、ゲッ齒類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物には、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／または蠕虫類が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組換え動物、及び／またはクローンであり得る。
【００３８】
およそまたは約：本明細書で使用する場合、関心のある１つ以上の値に適用される「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、記載された基準値に類似する値を指す。特定の実施形態では、「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」または「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、特段の記載がない限り、または文脈から明らかでない限り（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、いずれかの方向（より大きいまたは小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ未満の値の範囲を指す。
【００３９】
生物学的に活性である：本明細書で使用される場合、「生物学的に活性である」という句は、生物学的系において、特に生物において活性を有する任意の作用物質の特性を指す。例えば、生物に投与されたときに、その生物に対して生物学的効果を有する薬剤は、生物学的に活性であると考えられる。
【００４０】
送達：本明細書で使用される場合、用語「送達」は局所送達及び全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、そのコードされたタンパク質が発現され、そしてその標的組織内で保持される状況（「局所分布」または「局所送達」とも称される）、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、そのコードされたタンパク質が発現され、そして患者の循環系（例えば、血清）内に分泌され、そして全身に分布され、他の組織によって取り込まれる状況（「全身分布」または「全身送達」とも称される）を包含する。
【００４１】
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、ｍＲＮＡをポリペプチドへと翻訳すること、複数のポリペプチドをインタクトなタンパク質（例えば、酵素）へと構築すること、及び／またはポリペプチドもしくは完全に構築されたタンパク質（例えば、酵素）の翻訳後修飾をすることを指す。この用途において、用語「発現」及び「産生」ならびに文法的等価物は互換的に使用される。
【００４２】
機能性：本明細書で用いられる場合、「機能性」生体分子は、それが特徴付けられる特性及び／または活性を呈する形態での生体分子である。
【００４３】
半減期：本明細書で使用される場合、用語「半減期」は、核酸またはタンパク質の濃度または活性などの量が、ある期間の開始時に測定された値の半分まで下がるのに要する時間である。
【００４４】
改善、増加または低減：本明細書で使用される場合、「改善」、「増加」、もしくは「低減」という用語、または文法的等価物は、本明細書に記載される治療の開始前の同一個体での測定値、または本明細書に記載される治療を受けていない対照被験体（または複数の対照被験体）での測定値などのベースライン測定値に対する相対的な値を示唆するものである。「対照被験体」とは、治療を受けている対象と同じ疾患形態を患っており、治療を受けている対象とほぼ同じ年齢の対象のことである。
【００４５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、多細胞生物体内ではなく、例えば、試験管または反応容器中、細胞培養液中などの人工的な環境で生じる事象を意味する。
【００４６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、ヒト及び非ヒト動物などの多細胞生物体内で生じる事象を意味する。細胞型系の文脈において、該用語は、生細胞内で生じる事象を意味するのに（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ系の対語として）使用され得る。
【００４７】
単離された：本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、（１）最初に生成された際に（自然界において及び／または実験的な環境においてにかかわらず）会合した成分の少なくとも一部から分離された、ならびに／または（２）人の手によって生成、調製、及び／もしくは製造された、物質及び／または要素を意味する。単離された物質及び／または要素は、それらが最初に会合した他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離され得る。一部の実施形態では、単離された作用物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の構成成分を実質的に含まない場合に「純粋」である。本明細書で使用される場合、単離された物質及び／または要素のパーセント純度の計算は、賦形剤（例えば、緩衝剤、溶媒、水など）を含むべきではない。
【００４８】
局所分布または局所送達：本明細書において使用される場合、「局所分布」、「局所送達」またはその文法的に均等な用語は、組織特異的な送達または分布を指す。典型的には、局所分布または局所送達は、細胞内で翻訳および発現される、または分泌が限定的で、患者の循環系へ入ることを回避する、ｍＲＮＡにコードされるタンパク質（たとえば酵素）を必要とする。
【００４９】
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾及び未修飾の両方のＲＮＡを包含する。ｍＲＮＡは、１つ以上のコード領域及び非コード領域を含み得る。ｍＲＮＡは、天然の供給源から精製されてもよく、組換え発現系を使用して作製されてもよく、および任意で精製されてもよく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されてもよく、化学的に合成されてもよい。必要に応じて、例えば、化学的に合成された分子の場合、ｍＲＮＡは、化学修飾された塩基または糖類、骨格修飾などを有する類似体といった、ヌクレオシド類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、別段に示されない限り、５’から３’の方向に提示される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５プロピニル−シチジン、Ｃ−５プロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、及び２−チオシチジン）；化学修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；介在塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ  ｂａｓｅ）；修飾された糖類（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）；及び／もしくは修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエート及び５’−Ｎ−ホスホルアミダイト結合）であるか、またはそれらを含む。
【００５０】
核酸：本明細書で用いられる場合、用語「核酸」は、最も広い意味において、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る任意の化合物及び／または物質を意味する。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る化合物及び／または物質である。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を意味する。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を意味する。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ、ならびに一本鎖ＤＮＡ及び／または二本鎖ＤＮＡ及び／またはｃＤＮＡを包含する。
【００５１】
患者：本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、提供される組成物が、例えば、実験、診断、予防、美容、及び／または治療目的のために投与され得る任意の生物体を意味する。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及び／またはヒトなどの哺乳類）が含まれる。一部の実施形態では、患者はヒトである。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。
【００５２】
医薬的に許容される：本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、合理的な利益／リスクの比率に相応で、ヒト及び動物の組織に接触させて使用することに適した物質を指す。
【００５３】
薬学的に許容される塩：薬学的に許容される塩は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１−１９において薬学的に許容される塩について詳述している。本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、好適な無機酸及び有機酸ならびに無機塩基及び有機塩基に由来するものを含む。薬学的に許容される非毒性の酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、及び過塩素酸などの無機酸を用いて、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸などの有機酸を用いて、あるいはイオン交換などの当該技術分野において使用される他の方法を用いて形成されたアミノ基の塩がある。他の薬学的に許容される塩として、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。適切な塩基に由来する塩として、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、及びＮ＋（Ｃ１−４アルキル）４塩が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが含まれる。さらなる薬学的に許容される塩には、適宜、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルホン酸塩、及びアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成される非毒性アンモニウムカチオン、４級アンモニウムカチオン、及びアミンカチオンが含まれる。さらなる薬学的に許容される塩には、適切な求電子物質（例えば、ハロゲン化アルキル）を使用して４級化アルキル化アミノ塩を形成する、アミンの４級化から形成される塩が含まれる。
【００５４】
全身分布または全身送達：本明細書で使用される場合、用語「全身分布」、「全身送達」、または文法的等価物は、全身もしくは生物体全体に影響を及ぼす送達または分布のメカニズムまたはアプローチを意味する。典型的には、全身分布または全身送達は、身体の循環系、例えば、血流を介して成し遂げられる。「局所分布または局所送達」の定義と比較される。
【００５５】
対象：本明細書で使用する「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を意味する。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は患者である場合があり、これは、疾患の診断または治療のために医療機関に来院するヒトを意味する。用語「対象」は、本明細書において「個体」または「患者」と交換可能に使用される。対象は、疾患または障害に罹患している可能性があるか、またはそれに感受性を有するが、疾患または障害の症状を表していてもいなくてもよい。
【００５６】
実質的：本明細書で使用される場合、用語「実質的」は、関心対象の特徴または特性の全てもしくはほぼ全ての範囲または程度を示す、定性的な状態を意味する。生物学分野の当業者であれば、生物学的及び化学的な現象が、完了すること及び／もしくは完了の域に到達すること、または絶対的な結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしても稀であることを理解するであろう。したがって、用語「実質的」は、本明細書において、多くの生物学的及び化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捉えるのに用いられる。
【００５７】
標的組織：本明細書で使用される場合、用語「標的組織」は、治療される疾患の影響を受ける任意の組織を意味する。一部の実施形態では、標的組織には、疾患関連病態、症状、または特徴を現す組織が含まれる。
【００５８】
治療有効量：本明細書で使用される場合、治療剤の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、及び／もしくは症状に罹患しているか、または感受性を有する対象に投与される場合、その疾患、障害、及び／または症状の徴候を治療する、診断する、予防する、及び／またはその開始を遅延するのに十分な量を意味する。当業者は、治療有効量が少なくとも１つの単位用量を含む投与レジメンによって投与されるのが典型的であることを理解するであろう。
【００５９】
治療：本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「治療」または「治療している」は、ある特定の疾患、障害、及び／または症状の１つ以上の徴候または特徴を、部分的にまたは完全に軽減する、寛解させる、緩和する、抑制する、予防する、その開始を遅延する、その重篤度を低減する、及び／またはその発症率を低減するために使用する任意の方法を意味する。疾患の症状を提示していない対象、及び／または疾患の初期の症状のみを提示している対象に対して、該疾患に関連する病態を発症させる危険性を減らすために、治療が行われる場合もある。
（発明を実施するための形態）
【００６０】
本発明はとりわけ、ｍＲＮＡ療法に基づいたオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症の治療のための方法および組成物を提供する。特に本発明は、治療を必要とする対象に対し、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）をコードするｍＲＮＡを有効量で含む組成物を、ＯＴＣ欠損症の少なくとも１つの症状または特徴が、強度、重篤度または頻度において低下する、またはその発生が遅延するような投与間隔で投与することによりＯＴＣ欠損症を治療する方法を提供する。本発明はさらに、治療を必要とする対象に対し、酸ＯＴＣをコードするｍＲＮＡを含む組成物の治療有効量を投与し、当該対象の高アンモニア血症を治療することを含む、ＯＴＣ欠損症を治療する方法を提供する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは１個以上のリポソーム内に封入される。本明細書において使用される場合、「リポソーム」という用語は、任意の層状、多重層状、または固形のナノ粒子小胞を指す。典型的には、本明細書において使用されるリポソームは、１種以上の脂質を混合することにより、または１種以上の脂質とポリマーを混合することにより形成され得る。ゆえに本明細書において使用される「リポソーム」という用語は、脂質系ナノ粒子およびポリマー系ナノ粒子の両方を包含する。一部の実施形態では、本発明に適したリポソームは、カチオン性または非カチオン性の脂質、コレステロール系脂質、およびＰＥＧ修飾脂質を含む。
【００６１】
オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症
本発明を使用して、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症に罹患する、またはＯＴＣ欠損症に罹りやすい対象を治療してもよい。ＯＴＣ欠損症は、酵素のオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）に対する遺伝子中の突然変異に特徴付けられるＸ染色体連鎖型遺伝性疾患である。ＯＴＣ酵素は、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ、ミトコンドリア型としても知られている。ＯＴＣはまた、以下としても知られている：ＭＧＣ１２９９６７、ＭＧＣ１２９９６８、ＯＣＴＤ、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ前駆体、オルニチントランスカルバミラーゼ、およびＯＴＣ＿ＨＵＭＡＮ。３００個を超えるＯＴＣ欠損症を引き起こす突然変異がＯＴＣ遺伝子中に特定されている。おそらくＯＴＣ遺伝子中の突然変異の多くが、産生されたタンパク質の構造に影響を与え、その活性を低下させる。
【００６２】
本明細書に記載される組成物および方法を使用して、ＯＴＣ欠損症の少なくとも１つの症状または特徴を治療してもよい。特に、本明細書に記載される組成物および方法を使用して、高アンモニア血症を治療してもよい。
【００６３】
ＯＴＣ遺伝子中の突然変異は、（肝臓および小腸において）カルバミルリン酸およびオルニチンからのシトルリン合成に触媒作用を及ぼすＯＴＣ酵素の能力を消滅または低下させる。結果として、過剰な窒素がアンモニアの形態で血中に蓄積され、これが神経系へと移動し、ＯＴＣ欠損症に関連した症状が生じる。アンモニアの蓄積は、脳の損傷および死へと繋がり得る。ＯＴＣ活性を完全に無効化する突然変異は、重度な新生児発症型を生じさせ、一方でＯＴＣ活性の低下をもたらす突然変異は、遅発型の表現型を生じさせる。
【００６４】
オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）
一部の実施形態では、本発明は、ＯＴＣ欠損症の治療を目的とした、ＯＴＣをコードするｍＲＮＡを対象に送達するための方法および組成物を提供する。適切なＯＴＣ  ｍＲＮＡは、天然型ＯＴＣタンパク質の活性の代わりに機能することができ、および／またはＯＴＣ欠損症と関連した１つ以上の症状の強度、重篤度、および／または頻度を低下させることができるＯＴＣタンパク質のいずれか全長、断片、または一部をコードする。
【００６５】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は、ヒトＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列である。天然型ヒトＯＴＣタンパク質のｍＲＮＡをコードする配列、およびその対応するアミノ酸配列を表１に示す：
【表１】
2019522047.tif 000003
【００６６】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は、野生型のヒトＯＴＣ  ｍＲＮＡの配列である（配列番号１）。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、コドン最適化されたｈＯＴＣ配列であってもよい。一部の実施形態では、適切なコドン最適化ｍＲＮＡは、配列番号５として表１に示されるＯＴＣアミノ酸配列、または配列番号５に対し少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列をコードしてもよい。適切なコドン最適化ｍＲＮＡ配列の例を以下に記載する。
【００６７】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号３において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。
AUGCUGUUCAACCUUCGGAUCUUGCUGAACAACGCUGCGUUCCGGAAUGGUCACAACUUCAUGGUCCGGAACUUCAGAUGCGGCCAGCCGCUCCAGAACAAGGUGCAGCUCAAGGGGAGGGACCUCCUCACCCUGAAAAACUUCACCGGAGAAGAGAUCAAGUACAUGCUGUGGCUGUCAGCCGACCUCAAAUUCCGGAUCAAGCAGAAGGGCGAAUACCUUCCUUUGCUGCAGGGAAAGUCCCUGGGGAUGAUCUUCGAGAAGCGCAGCACUCGCACUAGACUGUCAACUGAAACCGGCUUCGCGCUGCUGGGAGGACACCCCUGCUUCCUGACCACCCAAGAUAUCCAUCUGGGUGUGAACGAAUCCCUCACCGACACAGCGCGGGUGCUGUCGUCCAUGGCAGACGCGGUCCUCGCCCGCGUGUACAAGCAGUCUGAUCUGGACACUCUGGCCAAGGAAGCCUCCAUUCCUAUCAUUAAUGGAUUGUCCGACCUCUACCAUCCCAUCCAGAUUCUGGCCGAUUAUCUGACUCUGCAAGAACAUUACAGCUCCCUGAAGGGGCUUACCCUUUCGUGGAUCGGCGACGGCAACAACAUUCUGCACAGCAUUAUGAUGAGCGCUGCCAAGUUUGGAAUGCACCUCCAAGCAGCGACCCCGAAGGGAUACGAGCCAGACGCCUCCGUGACGAAGCUGGCUGAGCAGUACGCCAAGGAGAACGGCACUAAGCUGCUGCUCACCAACGACCCUCUCGAAGCCGCCCACGGUGGCAACGUGCUGAUCACCGAUACCUGGAUCUCCAUGGGACAGGAGGAGGAAAAGAAGAAGCGCCUGCAAGCAUUUCAGGGGUACCAGGUGACUAUGAAAACCGCCAAGGUCGCCGCCUCGGACUGGACCUUCUUGCACUGUCUGCCCAGAAAGCCCGAAGAGGUGGACGACGAGGUGUUCUACAGCCCGCGGUCGCUGGUCUUUCCGGAGGCCGAAAACAGGAAGUGGACUAUCAUGGCCGUGAUGGUGUCCCUGCUGACCGAUUACUCCCCGCAGCUGCAGAAACCAAAGUUCUGA（配列番号３）
【００６８】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号６において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。
AUGCUUUUCAACCUGAGAAUUCUGCUGAACAACGCAGCCUUCCGCAACGGACACAACUUCAUGGUCCGGAACUUCAGAUGCGGACAACCGCUGCAGAACAAGGUCCAGCUCAAGGGUCGGGACCUGUUGACUCUUAAGAAUUUCACCGGAGAAGAAAUCAAGUACAUGCUGUGGCUGUCCGCCGACCUGAAGUUUCGCAUCAAGCAGAAGGGGGAGUACCUCCCCCUGCUGCAAGGAAAGUCCCUGGGAAUGAUUUUCGAGAAGCGCUCCACCCGCACUAGACUUUCCACCGAAACCGGCUUCGCUCUGCUGGGCGGACAUCCUUGCUUUCUGACGACUCAGGACAUCCACCUCGGAGUGAACGAAUCCCUCACCGAUACCGCCAGGGUGCUGAGCAGCAUGGCCGACGCUGUGCUGGCUCGGGUGUACAAGCAGUCCGACCUCGACACCCUGGCCAAGGAAGCCUCGAUCCCUAUCAUCAAUGGCCUGUCAGACCUGUACCACCCAAUCCAGAUUCUGGCCGACUACCUGACUCUCCAAGAGCACUACAGCAGCCUCAAGGGGCUCACAUUGUCCUGGAUCGGCGACGGCAACAACAUCCUUCACUCCAUUAUGAUGUCGGCCGCCAAAUUCGGGAUGCAUCUGCAGGCAGCCACCCCUAAGGGAUACGAGCCCGAUGCCUCCGUGACCAAGCUCGCCGAACAGUAUGCGAAGGAGAACGGCACCAAGCUCCUGCUCACUAACGAUCCGUUGGAAGCUGCCCACGGCGGAAACGUGCUGAUUACCGACACCUGGAUCAGCAUGGGGCAGGAAGAAGAGAAGAAGAAGCGGCUGCAGGCGUUUCAGGGUUACCAAGUCACCAUGAAAACUGCCAAAGUCGCGGCAUCCGACUGGACUUUCCUGCACUGUCUGCCGAGGAAACCAGAGGAAGUGGAUGACGAAGUGUUCUACUCACCCCGGUCGCUGGUGUUCCCGGAAGCGGAGAACCGGAAGUGGACCAUCAUGGCCGUGAUGGUGUCGCUGCUCACCGAUUACUCUCCGCAACUGCAGAAGCCCAAGUUCUGA（配列番号６）
【００６９】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号７において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。
AUGCUGUUUAACCUGAGAAUUCUGCUGAACAACGCCGCGUUCAGGAACGGCCACAAUUUCAUGGUCCGCAACUUUAGAUGCGGACAGCCUCUCCAAAACAAGGUCCAGCUCAAGGGGCGGGACUUGCUGACCCUUAAGAACUUUACCGGCGAAGAGAUCAAGUACAUGCUGUGGUUGUCAGCGGACCUGAAGUUCCGCAUCAAGCAGAAAGGGGAGUAUCUGCCGCUGCUCCAAGGAAAGUCGCUCGGCAUGAUCUUCGAGAAGCGCUCGACCAGAACCCGGCUGUCCACUGAAACUGGUUUCGCCCUUCUGGGUGGACACCCUUGUUUCCUGACAACCCAGGACAUCCAUCUGGGCGUGAACGAAAGCCUCACUGACACCGCCAGGGUGCUGAGCUCCAUGGCCGACGCUGUCCUUGCCCGGGUGUACAAGCAGUCCGAUCUGGACACUCUGGCCAAGGAAGCGUCCAUCCCGAUCAUUAACGGACUGUCCGACCUGUACCACCCGAUCCAGAUUCUGGCCGACUACCUGACCUUGCAAGAGCACUACAGCUCACUGAAGGGCUUGACCCUGAGCUGGAUCGGCGACGGAAACAACAUUCUGCAUUCGAUCAUGAUGUCCGCGGCCAAGUUCGGAAUGCAUCUGCAGGCCGCAACUCCCAAGGGAUACGAACCUGAUGCGUCCGUGACUAAGCUGGCCGAGCAGUACGCAAAGGAAAACGGCACCAAGCUGCUGCUGACCAACGACCCGCUCGAAGCUGCCCACGGAGGGAACGUGCUCAUUACCGACACUUGGAUCUCCAUGGGGCAGGAAGAAGAGAAGAAGAAGCGGCUCCAGGCAUUCCAGGGUUACCAGGUCACCAUGAAAACGGCCAAAGUGGCCGCUUCGGAUUGGACUUUCCUCCACUGCCUUCCCCGCAAACCUGAGGAAGUGGAUGAUGAAGUGUUCUACUCCCCACGCUCCCUCGUGUUCCCCGAGGCCGAGAAUCGGAAGUGGACCAUUAUGGCCGUGAUGGUGUCACUGCUGACCGACUACAGCCCCCAACUGCAAAAGCCGAAGUUCUGA（配列番号７）
【００７０】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号８において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。
AUGCUGUUCAACCUCCGGAUCCUCCUCAACAACGCCGCGUUCCGCAACGGCCACAACUUCAUGGUCCGGAAUUUCCGAUGCGGACAGCCACUGCAGAACAAGGUCCAGCUGAAGGGCCGGGACUUGCUGACUCUCAAGAACUUUACCGGGGAAGAAAUCAAGUACAUGCUGUGGCUUUCCGCCGACCUGAAGUUCAGAAUCAAGCAGAAGGGCGAAUAUCUCCCCCUGCUGCAAGGAAAGAGCCUGGGCAUGAUUUUCGAGAAGAGAUCGACACGCACCCGGCUGUCCACCGAGACUGGGUUUGCCCUGCUGGGAGGACACCCGUGUUUCCUGACCACCCAAGAUAUCCAUCUCGGAGUGAACGAAUCCCUUACUGACACUGCCCGCGUGUUGUCCUCCAUGGCUGAUGCAGUGCUCGCUCGGGUGUACAAGCAGAGCGACCUGGACACUCUGGCGAAGGAAGCCUCAAUUCCUAUCAUUAACGGGCUGUCGGACCUGUACCACCCGAUCCAGAUUCUGGCCGACUACCUGACCCUGCAAGAACACUACUCAAGCCUGAAGGGUCUUACCCUGUCCUGGAUCGGCGACGGCAACAACAUCCUGCACUCCAUCAUGAUGUCGGCCGCGAAGUUCGGAAUGCACCUCCAAGCAGCGACUCCGAAGGGUUACGAGCCAGAUGCCUCCGUGACCAAGCUGGCGGAGCAGUACGCUAAGGAAAACGGAACCAAGCUGCUGCUCACUAACGACCCGUUGGAAGCCGCCCAUGGUGGAAAUGUGCUGAUCACGGAUACCUGGAUCAGCAUGGGCCAGGAGGAAGAGAAGAAGAAAAGGCUCCAGGCCUUCCAAGGGUACCAGGUCACCAUGAAAACCGCCAAAGUCGCCGCAUCCGAUUGGACCUUCCUCCACUGCCUGCCUCGGAAGCCUGAAGAGGUCGACGACGAAGUGUUCUACUCUCCCCGCUCCCUUGUGUUCCCCGAGGCCGAGAACAGGAAGUGGACCAUUAUGGCCGUGAUGGUGUCGCUCCUGACCGACUACAGCCCGCAGCUGCAGAAGCCCAAGUUCUGA（配列番号８）
【００７１】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号９において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。
AUGCUGUUCAAUCUUCGGAUCCUGCUGAACAACGCCGCCUUUCGGAACGGGCACAACUUCAUGGUCCGCAACUUCCGCUGUGGACAGCCGCUGCAGAACAAGGUCCAGCUUAAGGGCCGGGAUCUCCUGACCCUGAAGAACUUUACCGGAGAAGAAAUCAAGUACAUGCUCUGGCUGAGCGCCGACCUCAAGUUCCGGAUUAAGCAGAAGGGGGAGUACCUCCCGCUGCUUCAAGGAAAGUCCCUGGGGAUGAUCUUCGAGAAGCGGAGCACUAGGACCAGGCUGUCGACCGAAACGGGCUUUGCACUGCUGGGUGGACACCCAUGCUUCCUGACCACCCAAGAUAUUCAUCUCGGCGUGAACGAAUCCUUGACUGACACUGCGCGCGUCCUCUCAUCGAUGGCUGAUGCCGUGUUGGCUAGAGUGUACAAGCAGUCAGACCUGGACACUCUGGCUAAGGAAGCCUCCAUUCCGAUCAUCAACGGCCUGUCCGACCUGUACCACCCGAUUCAGAUUCUGGCCGACUACCUGACCCUGCAAGAGCACUAUUCGAGCCUUAAAGGGUUGACCCUGUCCUGGAUCGGCGACGGAAACAAUAUCUUGCACUCCAUUAUGAUGUCCGCCGCCAAGUUCGGCAUGCAUCUCCAAGCCGCGACUCCUAAGGGUUACGAGCCCGACGCAUCCGUGACAAAACUGGCCGAGCAGUACGCGAAGGAAAACGGUACCAAGCUCCUGCUGACCAAUGAUCCUCUCGAGGCUGCGCACGGAGGAAACGUGCUCAUCACCGACACCUGGAUCAGCAUGGGACAGGAAGAGGAAAAGAAAAAGCGCCUGCAGGCAUUCCAGGGCUACCAAGUCACUAUGAAAACCGCCAAAGUGGCCGCCUCGGAUUGGACCUUCCUUCACUGCCUGCCAAGAAAGCCUGAGGAAGUGGACGACGAAGUGUUCUACUCCCCCCGCUCUCUCGUGUUCCCCGAGGCCGAGAACCGGAAGUGGACCAUCAUGGCCGUGAUGGUGUCACUGCUCACUGACUACAGCCCGCAGCUGCAGAAGCCCAAGUUCUAA（配列番号９）
【００７２】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、配列番号１０において示されるようなコドン最適化された配列であってもよい。
AUGCUGUUCAACCUCCGGAUUCUGCUGAACAACGCCGCUUUCCGCAACGGCCACAAUUUCAUGGUCCGGAACUUCAGAUGCGGCCAGCCGUUGCAGAACAAGGUCCAGCUUAAGGGACGCGAUCUGCUGACCCUGAAGAACUUCACCGGAGAGGAAAUCAAGUAUAUGCUGUGGCUCUCGGCCGACCUGAAGUUCAGGAUCAAGCAGAAGGGGGAGUACCUCCCGCUGUUGCAAGGAAAGUCCCUGGGCAUGAUUUUCGAGAAGCGCUCAACUCGCACCAGGCUCUCCACCGAAACUGGUUUUGCCCUUCUGGGCGGUCAUCCUUGCUUUCUGACGACCCAGGACAUUCACCUCGGAGUGAAUGAGAGCCUGACCGACACUGCCAGAGUGCUGUCCUCCAUGGCGGAUGCAGUGUUGGCGCGGGUGUACAAGCAGUCAGACCUGGACACCCUGGCGAAGGAAGCGUCAAUCCCCAUCAUUAACGGACUGAGCGACCUGUACCACCCGAUCCAGAUCCUCGCCGACUACCUGACUCUCCAAGAACACUACUCGUCCCUGAAAGGGCUGACCUUGAGCUGGAUCGGCGACGGCAACAACAUCCUGCAUUCCAUCAUGAUGAGCGCCGCCAAGUUCGGAAUGCACCUUCAAGCCGCAACACCGAAGGGCUACGAGCCGGAUGCCUCGGUGACCAAGCUGGCCGAGCAGUACGCCAAGGAAAACGGGACCAAGCUGCUGCUCACUAACGACCCUCUGGAAGCUGCUCACGGGGGAAACGUGCUGAUCACCGACACCUGGAUUUCCAUGGGACAGGAAGAAGAGAAAAAGAAGCGGCUUCAGGCGUUCCAGGGUUACCAAGUCACCAUGAAAACCGCCAAAGUGGCAGCCAGCGACUGGACUUUCCUGCAUUGUCUCCCUCGGAAGCCUGAGGAAGUGGAUGACGAAGUGUUUUACUCUCCCCGCUCCCUGGUGUUCCCCGAGGCCGAGAACCGGAAGUGGACUAUCAUGGCCGUGAUGGUGUCCCUCCUGACCGAUUACUCCCCACAACUGCAGAAGCCCAAGUUCUGA（配列番号１０）
【００７３】
追加のｍＲＮＡ配列の例を、たとえば配列番号４、配列番号１４、および配列番号１５など、以下の実施例の項に記載する。それらすべて、コドン最適化ＯＴＣをコードするｍＲＮＡのフレームを構成する５’および３’の非翻訳領域を含む。
【００７４】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は、ヒトＯＴＣタンパク質のホモログまたは類似体のｍＲＮＡ配列であってもよい。たとえばヒトＯＴＣタンパク質のホモログまたは類似体は、実質的にＯＴＣタンパク質の活性を保持しながら、野生型または天然型のヒトＯＴＣタンパク質と比較して１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含む修飾ヒトＯＴＣタンパク質であってもよい。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、配列番号５に対し少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、ヒトＯＴＣタンパク質と実質的に同一であるタンパク質をコードする。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、配列番号５に対し少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、ヒトＯＴＣタンパク質の断片または一部をコードする。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、ヒトＯＴＣタンパク質の断片または一部をコードし、この場合において当該タンパク質の断片または一部は、野生型タンパク質と類似したＯＴＣ活性をいまだ維持している。一部の実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１４または配列番号１５に対し少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるヌクレオチド配列を有する。
【００７５】
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、別のタンパク質に融合した（たとえばＮ末端またはＣ末端融合）ＯＴＣタンパク質の全長、断片、または一部を含む融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質の全長、断片、または一部をコードするｍＲＮＡに融合したタンパク質は、シグナル配列または細胞標的化配列をコードする。
【００７６】
送達ビヒクル
本発明によると、本明細書に記載されるＯＴＣタンパク質（たとえば、ＯＴＣタンパク質の全長、断片、または一部）をコードするｍＲＮＡは、裸のＲＮＡ（パッケージされていない）として送達されてもよく、または送達ビヒクルを介して送達されてもよい。本明細書で使用される場合、「送達ビヒクル」、「移入ビヒクル」、「ナノ粒子」という用語、または文法的均等物は、互換的に使用される。
【００７７】
一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、単一の送達ビヒクルを介して送達されてもよい。一部の実施形態では、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡは、各々異なる組成の１つ以上の送達ビヒクルを介して送達されてもよい。様々な実施形態によると、好適な送達ビヒクルとして、以下に限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、脂質ナノ粒子、及びリポソームなどのポリマー系担体、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然及び合成由来のエキソソーム、天然層状体、合成層状体、及び半合成層状体、ナノ粒子、カルシウムリン−ケイ酸塩ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、微結晶微粒子、半導体ナノ粒子、ポリ（Ｄ−アルギニン）、ゾルゲル、ナノデンドリマー、デンプンベース送達系、ミセル、エマルジョン、ニオソーム、多ドメインブロックポリマー（ビニルポリマー、ポリプロピルアクリル酸ポリマー、動的多抱合体）、乾燥粉末製剤、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、ならびに他の指向性タグが挙げられる。
【００７８】
リポソーム送達ビヒクル
一部の実施形態では、好適な送達ビヒクルは、リポソーム送達ビヒクルであり、例えば、脂質ナノ粒子である。本明細書で使用される場合、リポソーム送達ビヒクル、例えば、脂質ナノ粒子は、通常、１つ以上の二分子層の膜によって外部媒体から隔離された内部水空間を有する微細小胞として特徴付けられる。リポソームの二分子膜は、典型的には、空間的に離れた親水性ドメインと疎水性ドメインとを含む合成起源または天然起源の脂質などの両親媒性分子によって形成されている（Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：３０７−３２１，１９９８）。リポソームの二分子膜は、両親媒性ポリマー及び界面活性剤（例えば、ポリメロソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｏｓｏｍｅ）、ニオソームなど）によっても形成され得る。本発明の背景において、リポソーム送達ビヒクルは多くの場合、所望のｍＲＮＡを標的の細胞または組織に輸送する役割を果たす。
【００７９】
カチオン性脂質
一部の実施形態では、リポソームは、１つ以上のカチオン性脂質を含み得る。本明細書で使用される場合、語句「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有する多数の脂質種のいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質は文献に記載されており、その多くは市販されている。本発明の組成物及び方法に使用するのに特に好適なカチオン性脂質は、国際特許公開第ＷＯ２０１０／０５３５７２号（具体的には、段落［００２２５］に記載されているＣＩ  ２−２００）及び同第ＷＯ２０１２／１７０９３０号に記載されているものを含み、その両方の文献は、参照により本明細書に援用される。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、例えば、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−ｌ−イル）テトラコサ−１５，１８−ジエン−１−アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−４，１５，１８−トリエン−ｌ−アミン（ＨＧＴ５００１）、及び（１５Ｚ，１８Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−６−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラコサ−５，１５，１８−トリエン−１−アミン（ＨＧＴ５００２）など、２０１２年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたイオン化可能なカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子を用いている。
【００８０】
一部の実施形態では、提供されるリポソームは、２０１２年１０月２６日に出願されたＷＯ２０１３／０６３４６８において、および２０１４年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６１／９５３，５１６号において記載されるカチオン性脂質を含む。それら両方とも本明細書に参照により組み込まれる。
【００８１】
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、以下の式Ｉ−ｃ１−ａの化合物：
【化１】
2019522047.tif 000004
またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、
各Ｒ２は独立して水素またはＣ１−３アルキルであり；
各ｑは独立して２〜６であり；
各Ｒ’は独立して水素またはＣ１−３アルキルであり；
各ＲＬは独立してＣ８−１２アルキルである。
【００８２】
一部の実施形態では、各Ｒ２は独立して水素、メチル、またはエチルである。一部の実施形態では、各Ｒ２は独立して水素またはメチルである。一部の実施形態では、各Ｒ２は水素である。
【００８３】
一部の実施形態では、各ｑは独立して３〜６である。一部の実施形態では、各ｑは独立して３〜５である。一部の実施形態では、各ｑは４である。
【００８４】
一部の実施形態では、各Ｒ’は独立して水素、メチル、またはエチルである。一部の実施形態では、各Ｒ’は独立して水素またはメチルである。一部の実施形態では、各Ｒ’は独立して水素である。
【００８５】
一部の実施形態では、各ＲＬは独立してＣ８−１２アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してｎ−Ｃ８−１２アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してＣ９−１１アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してｎ−Ｃ９−１１アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してＣ１０アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してｎ−Ｃ１０アルキルである。
【００８６】
一部の実施形態では、各Ｒ２は独立して水素またはメチルであり、各ｑは独立して３〜５であり、各Ｒ’は独立して水素またはメチルであり、各ＲＬは独立してＣ８−１２アルキルである。
【００８７】
一部の実施形態では、各Ｒ２は水素であり、各ｑは独立して３〜５であり、各Ｒ’は水素であり、各ＲＬは独立してＣ８−１２アルキルである。
【００８８】
一部の実施形態では、各Ｒ２は水素であり、各ｑは４であり、各Ｒ’は水素であり、各ＲＬは独立してＣ８−１２アルキルである。
【００８９】
一部の実施形態では、カチオン性脂質は、以下の式Ｉ−ｇの化合物：
【化２】
2019522047.tif 000005
またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、各ＲＬは独立してＣ８−１２アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してｎ−Ｃ８−１２アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してＣ９−１１アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してｎ−Ｃ９−１１アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬは独立してＣ１０アルキルである。一部の実施形態では、各ＲＬはｎ−Ｃ１０アルキルである。
【００９０】
特定の実施形態では、提供されるリポソームは、カチオン性脂質ｃＫＫ−Ｅ１２または（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）を含む。ｃＫＫ−Ｅ１２の構造を以下に示す：
【化３】
2019522047.tif 000006
【００９１】
カチオン性脂質のさらなる例として、式Ｉのカチオン性脂質と、
【化４】
2019522047.tif 000007
その薬学的に許容される塩とが挙げられ、
式中、
Ｒは
【化５】
2019522047.tif 000008
（「ＯＦ−００」）であるか、
Ｒは
【化６】
2019522047.tif 000009
（「ＯＦ−０１」）であるか、
Ｒは
【化７】
2019522047.tif 000010
（「ＯＦ−０２」）であるか、または
Ｒは
【化８】
2019522047.tif 000011
（「ＯＦ−０３」）である
（例えば、Ｆｅｎｔｏｎ，Ｏｗｅｎ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．”Ｂｉｏｉｎｓｐｉｒｅｄ  Ａｌｋｅｎｙｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｌｃｏｈｏｌ  Ｉｏｎｉｚａｂｌｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ｍＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．”  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１６）を参照のこと）。
【００９２】
一部の実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質はＮ−［ｌ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、すなわち「ＤＯＴＭＡ」であってもよい（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号）。ＤＯＴＭＡは、単独で製剤化され得るか、あるいは中性脂肪、ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミンすなわち「ＤＯＰＥ」、または他のカチオン性脂質もしくは非カチオン性脂質と混合して、リポソーム移入ビヒクルまたは脂質ナノ粒子にすることができ、こうしたポソームは、核酸の標的細胞内への送達を強化するために使用することができる。他の好適なカチオン性脂質として、例えば、５−カルボキシスペルミルグリジンジオクタデシルアミド（ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）すなわち「ＤＯＧＳ」、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｌ−プロパンアミニウムすなわち「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）；米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、ｌ，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパンすなわち「ＤＯＤＡＰ」、ｌ，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンすなわち「ＤＯＴＡＰ」が挙げられる。
【００９３】
さらなる例示的なカチオン性脂質として、ｌ，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＳＤＭＡ」、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＯＤＭＡ」、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＬｉｎＤＭＡ」、ｌ，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパンすなわち「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリドすなわち「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミドすなわち「ＤＤＡＢ」、Ｎ−（ｌ，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドすなわち「ＤＭＲＩＥ」、３−ジメチルアミノ−２−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシブタン−４−オキシ）−ｌ−（シス，シス−９，１２−オクタデカジエノキシ）プロパンすなわち「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２−（５’−（コレスト−５−エン−３−ベータ−オキシ）−３’−オキサペントキシ）−３−ジメチル−ｌ−（シス，シス−９’，ｌ−２’−オクタデカジエノキシ）プロパンすなわち「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ジオレイルオキシベンジルアミンすなわち「ＤＭＯＢＡ」、１，２−Ｎ，Ｎ’−ジオレイルカルミバル−３−ジメチルアミノプロパンすなわち「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３−ジリノレオイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピルアミンすなわち「ＤＬｉｎＤＡＰ」、ｌ，２−Ｎ，Ｎ’−ジリノレイルカルミバル−３−ジメチルアミノプロパンすなわち「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、ｌ，２−ジリノレオイルカルミバル−３−ジメチルアミノプロパンすなわち「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［ｌ，３］−ジオキソランすなわち「ＤＬｉｎ−  −ＤＭＡ」、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［ｌ，３］−ジオキソランすなわち「ＤＬｉｎ−Ｋ−ＸＴＣ２−ＤＭＡ」、及び２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，ｌ  ２−ジエン−１−イル）−ｌ，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ））（国際公開第ＷＯ２０１０／０４２８７７号；Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２−１７６（２０１０）を参照のこと）、またはこれらの混合物が挙げられる。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：２７６−２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３−１００７（２００５）；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／１２１３４８Ａ１号）。一部の実施形態では、カチオン性脂質のうちの１つ以上は、イミダゾール部分、ジアルキルアミノ部分、またはグアニジウム部分のうちの少なくとも１つを含む。
【００９４】
一部の実施形態では、１つ以上のカチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル  ４−（ジメチルアミノ）ブタノエート）、ＡＬＮＹ−１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン））、ＮＣ９８−５（４，７，１３−トリス（３−オキソ−３−（ウンデシルアミノ）プロピル）−Ｎ１，Ｎ１６−ジウンデシル−４，７，１０，１３−テトラアザへキサデカン−１，１６−ジアミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＨＧＴ４００３（国際公開第ＷＯ２０１２／１７０８８９号、その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、ＩＣＥ（国際公開第ＷＯ２０１１／０６８８１０号、その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、ＨＧＴ５０００（米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号、その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）またはＨＧＴ５００１（シスまたはトランス）（仮特許出願第６１／６１７，４６８号）、国際公開第ＷＯ２０１０／０５３５７２号に開示されるリピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）などのアミノアルコールリピドイド、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ”Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６−２８７）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２−１７６）、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”ＰＮＡＳ  ２０１０，１０７，１８６４−１８６９）から選択され得る。
【００９５】
一部の実施形態では、リポソーム中のカチオン性脂質の割合は、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、または７０％超であり得る。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、リポソームの約３０〜５０重量％（例えば、約３０〜４５重量％、約３０〜４０重量％、約３５〜５０重量％、約３５〜４５重量％、または約３５〜４０重量％）を構成する。一部の実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２）は、モル比でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％を構成する。
【００９６】
非カチオン性／ヘルパー脂質
一部の実施形態では、提供されたリポソームは、１つ以上の非カチオン性（「ヘルパー」）脂質を含む。本明細書で使用される場合、語句「非カチオン性脂質」は、任意の中性脂質、双性イオン脂質、またはアニオン性脂質を意味する。本明細書で使用される場合、語句「アニオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたＨで正味の負電荷を保有する多数の脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質として、以下に限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、ｌ−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が挙げられる。
【００９７】
一部の実施形態では、こうした非カチオン性脂質は、単独で使用され得るが、好ましくは他の賦形剤、例えば、カチオン性脂質と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、リポソームに存在する総脂質の約５％〜約９０％、または約１０％〜約７０％のモル割合を含み得る。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、中性脂質、すなわち、組成物が製剤化及び／または投与される条件下で正味の電荷を保有しない脂質である。一部の実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質の割合は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であり得る。
【００９８】
コレステロール系脂質
一部の実施形態では、提供されるリポソームは、１つ以上のコレステロール系脂質を含む。例として、好適なコレステロール系カチオン性脂質として、例えば、ＤＣ−Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−エチルカルボキサミドコレステロール）、ｌ，４−ビス（３−Ｎ−オレイルアミノ−プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３，１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、またはＩＣＥが挙げられる。一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、リポソームに存在する総脂質の約２％〜約３０％、または約５％〜約２０％のモル割合を含み得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質の割合は、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、または４０％超であり得る。
【００９９】
ＰＥＧ化脂質
一部の実施形態では、提供されるリポソームは１つ以上のＰＥＧ化脂質を含む。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質と、Ｎ−オクタノイル−スフィンゴシン−ｌ−［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）−２０００］（Ｃ８  ＰＥＧ−２０００セラミド）を含めた誘導体化されたセラミド（ＰＥＧ−ＣＥＲ）などの誘導体化脂質とを、カチオン性脂質のうちの１つ以上と共に、一部の実施形態ではリポソームを含む他の脂質と共に、組み合わせて使用することも、本発明により企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質は、長さがＣ６−Ｃ２０のアルキル鎖を有する脂質に共有結合された長さ最大５ｋＤａのポリエチレングリコール鎖を含むが、これに限定されない。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ−２Ｋである。こうした成分の付加は、複合体の凝集を阻止することができ、また循環寿命を増加させ、脂質−核酸組成物の標的細胞への送達を増加させるための手段を提供することができる（Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５−２３７）。あるいは、これらの成分はｉｎ  ｖｉｖｏで製剤の外へと速やかに交換されるように選択され得る（米国特許第５，８８５，６１３号を参照のこと）。
【０１００】
一部の実施形態では、特定の有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧセラミドである。本発明のＰＥＧ修飾リン脂質及び誘導体化された脂質は、リポソームに存在する総脂質の約０％〜約１５％、約０．５％〜約１５％、約１％〜約１５％、約４％〜約１０％、または約２％のモル割合を含み得る。
【０１０１】
様々な実施形態によると、脂質ナノ粒子を含む、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び／またはＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびにこれらの脂質の相互の相対モル割合の選択は、選択される脂質の特徴、目的の標的細胞の性質、送達されるｍＲＮＡの特徴に基づいて行われる。さらなる考慮すべき事項には、例えば、選択される脂質のアルキル鎖の飽和度、ならびに大きさ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性、及び毒性が含まれる。したがって、モル割合はそれらに応じて調節され得る。
【０１０２】
ポリマー
一部の実施形態では、好適な送達ビヒクルは、担体としてポリマーを使用して、単独でまたは本明細書に記載される様々な脂質を含む他の担体と組み合わせて製剤化される。したがって、一部の実施形態では、本明細書で使用されるリポソーム送達ビヒクルは、ナノ粒子を含むポリマーも包含する。好適なポリマーとして、例えば、ポリアクリレート類、ポリアルキシアノアクリレート類、ポリラクチド、ポリラクチド−ポリグリコリドコポリマー類、ポリカプロラクトン類、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン類、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬ、及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が挙げられ得る。ＰＥＩを含む場合、ＰＥＩは１０〜４０ｋＤａの範囲の分子量を持つ分枝状ＰＥＩ、例えば、２５ｋＤａの分枝状ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ  ＃４０８７２７）であり得る。
【０１０３】
本発明に好適なリポソームは、本明細書に記載のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール脂質、ＰＥＧ化脂質、及び／またはポリマーのいずれかのうちの１つ以上を様々な割合で含み得る。非限定的な例として、好適なリポソーム製剤は、ｃＫＫ−Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２−２００、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋ；またはＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋから選択されるある組み合わせを含み得る。
【０１０４】
種々の実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＩＣＥ、及び／またはＨＧＴ４００３）は、モル割合でリポソームの約３０〜６０％（例えば、約３０〜５５％、約３０〜５０％、約３０〜４５％、約３０〜４０％、約３５〜５０％、約３５〜４５％、または約３５〜４０％）を構成する。一部の実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ−Ｅ１２、Ｃ１２−２００、ＩＣＥ、及び／またはＨＧＴ４００３）の割合は、モル割合でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、または約６０％以上である。
【０１０５】
一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比は、それぞれ約３０〜６０：２５〜３５：２０〜３０：１〜１５であり得る。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比は、それぞれおよそ４０：３０：２０：１０である。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比は、それぞれおよそ４０：３０：２５：５である。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比は、それぞれおよそ４０：３２：２５：３である。一部の実施形態では、カチオン性脂質：非カチオン性脂質：コレステロール系脂質：ＰＥＧ化脂質の比は、およそ５０：２５：２０：５である。
【０１０６】
ｍＲＮＡの合成
本発明に従うｍＲＮＡは、公知の様々な方法のいずれかに従い合成することができる。たとえば本発明に従うｍＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を介して合成することができる。簡潔に述べると、ＩＶＴは多くの場合、プロモーターを含む直線状または環状のＤＮＡ鋳型、一群のリボヌクレオチド三リン酸、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含み得る緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅＩ、ピロホスファターゼ、ならびに／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて行われる。厳密な条件は具体的なアプリケーションに従い変化するであろう。
【０１０７】
一部の実施形態では、本発明に従うｍＲＮＡの調製のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡ鋳型が転写される。適切なＤＮＡ鋳型は多くの場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用のたとえばＴ３、Ｔ７、またはＳＰ６プロモーターなどのプロモーターを有し、その後ろに所望のｍＲＮＡに対する所望のヌクレオチド配列と終結シグナルを有する。
【０１０８】
修飾ｍＲＮＡ
一部の実施形態では、本発明に従うｍＲＮＡは、未修飾ｍＲＮＡまたは修飾ｍＲＮＡとして合成することができる。多くの場合、ｍＲＮＡは、安定性を強化するために修飾される。ｍＲＮＡの修飾は、たとえばＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含み得る。したがって、本発明に従う修飾ｍＲＮＡは、たとえば骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含み得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、限定されないが、プリン類（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン類（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））をはじめとする天然ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から合成されてもよく、ならびにたとえば１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニル−アデニン、Ｎ６−メチル−アデニン、Ｎ６−イソペンテニル−アデニン、２−チオ−シトシン、３−メチル−シトシン、４−アセチル−シトシン、５−メチル−シトシン、２，６−ジアミノプリン、１−メチル−グアニン、２−メチル−グアニン、２，２−ジメチル−グアニン、７−メチル−グアニン、イノシン、１−メチル−イノシン、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）（５−ウラシル）、ジヒドロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウラシル、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、５−メチル−２−チオ−ウラシル、５−メチル−ウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、５−メチルアミノメチル−ウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオ−ウラシル、５’−メトキシカルボニルメチル−ウラシル、５−メトキシ−ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、１−メチルシュードウラシル、キューオシン、ベータ−Ｄ−マンノシル−キューオシン、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、ならびにホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７−デアザグアノシン、５−メチルシトシンおよびイノシンなどのプリン類ならびにピリミジン類の修飾ヌクレオチド類似体または誘導体として合成されてもよい。こうした類似体の調製は、米国特許第４，３７３，０７１号、同第４，４０１，７９６号、同第４，４１５，７３２号、同第４，４５８，０６６号、同第４，５００，７０７号、同第４，６６８，７７７号、同第４，９７３，６７９号、同第５，０４７，５２４号、同第５，１３２，４１８号、同第５，１５３，３１９号、同第５，２６２，５３０号、及び同第５，７００，６４２号から当業者に既知であり、これらの文献の開示はその全体が参照によって援用される。
【０１０９】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（たとえばＯＴＣをコードするｍＲＮＡ）は、ＲＮＡ骨格修飾を含んでもよい。典型的には、骨格修飾は、ＲＮＡに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸塩が化学的に修飾される修飾である。例示的な骨格修飾として、典型的には、以下に限定されないが、メチルホスホネート、メチルホスホルアミデート、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５’−Ｏ−（１−チオフォスフェート））、ボラノリン酸塩、正荷電グアニジウム基などからなる群由来の修飾が挙げられ、これは、ホスホジエステル結合を他のアニオン基、カチオン基、または中性基で置き換えることに基づくことを意味する。
【０１１０】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（たとえばＯＴＣをコードするｍＲＮＡ）は、糖修飾を含んでもよい。典型的な糖修飾は、ｍＲＮＡが有するヌクレオチドの糖の化学修飾であり、糖修飾として、以下に限定されないが、２’−デオキシ−２’−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド（２’−フルオロ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−フルオロ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−デオキシ−２’−デアミン−オリゴリボヌクレオチド（２’−アミノ−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アミノ−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｏ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−メチルシチジン５’−三リン酸、２’−メチルウリジン５’−三リン酸）、２’−Ｃ−アルキルオリゴリボヌクレオチド、及びこれらの異性体（２’−アラシチジン５’−三リン酸、２’−アラウリジン５’−三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’−アジド−２’−デオキシシチジン５’−三リン酸、２’−アジド−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸）からなる群から選択される糖修飾が挙げられる。
【０１１１】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（たとえば、ＯＴＣをコードするｍＲＮＡ）は、ヌクレオチドの塩基の修飾（塩基修飾）を含んでもよい。塩基修飾を含む修飾されたヌクレオチドは、塩基修飾ヌクレオチドとも称される。こうした塩基修飾ヌクレオチドの例として、以下に限定されないが、２−アミノ−６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、２−アミノアデノシン５’−三リン酸、２−チオシチジン５’−三リン酸、２−チオウリジン５’−三リン酸、４−チオウリジン５’−三リン酸、５−アミノアリルシチジン５’−三リン酸、５−アミノアリルウリジン５’−三リン酸、５−ブロモシチジン５’−三リン酸、５−ブロモウリジン５’−三リン酸、５−ヨードシチジン５’−三リン酸、５−ヨードウリジン５’−三リン酸、５−メチルシチジン５’−三リン酸、５−メチルウリジン５’−三リン酸、６−アザシチジン５’−三リン酸、６−アザウリジン５’−三リン酸、６−クロロプリンリボシド５’−三リン酸、７−デアザアデノシン５’−三リン酸、７−デアザグアノシン５’−三リン酸、８−アザアデノシン５’−三リン酸、８−アジドアデノシン５’−三リン酸、ベンゾイミダゾールリボシド５’−三リン酸、Ｎ１−メチルアデノシン５’−三リン酸、Ｎ１−メチルグアノシン５’−三リン酸、Ｎ６−メチルアデノシン５’−三リン酸、Ｏ６−メチルグアノシン５’−三リン酸、プソイドウリジン５’−三リン酸、ピューロマイシン５’−三リン酸、またはキサントシン５’−三リン酸が挙げられる。
【０１１２】
ｍＲＮＡ合成には、Ｎ末端（５’）末端上への「キャップ」の付加、およびＣ末端（３’）上への「テール」の付加が含まれるのが典型的である。キャップの存在は、大半の真核生物細胞に見られるヌクレアーゼへの耐性を付与するのに重要である。「テール」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するのに役立つものである。
【０１１３】
したがって一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（たとえば、ＯＴＣをコードするｍＲＮＡ）は、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には次のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの１つを除去して２つの末端リン酸を残し、次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加されて５’５’５三リン酸結合を生成し、次いで、グアニンの７−窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ（たとえば、ＯＴＣをコードするｍＲＮＡ）は、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端のポリＡテールは多くの場合、約１０〜３００個のアデノシンヌクレオチド（例えば、約１０〜２００個のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１５０個のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１００個のアデノシンヌクレオチド、約２０〜７０個のアデノシンヌクレオチド、または約２０〜６０個のアデノシンヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは３’ポリ（Ｃ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端の好適なポリＣテールは多くの場合、約１０〜２００個のシトシンヌクレオチド（例えば、約１０〜１５０個のシトシンヌクレオチド、約１０〜１００個のシトシンヌクレオチド、約２０〜７０個のシトシンヌクレオチド、約２０〜６０個のシトシンヌクレオチド、または約１０〜４０個のシトシンヌクレオチド）を含む。ポリＣテールは、ポリＡテールに付加され得るか、またはポリＡテールを置換し得る。
【０１１５】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’および／または３’の非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域には、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす１つ以上の要素、例えば、鉄応答要素が含まれる。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００のヌクレオチドであり得る。
【０１１６】
一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞中のｍＲＮＡの位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの１つ以上の結合部位のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００ヌクレオチドであるか、またはそれ以上の長さであり得る。
【０１１７】
キャップ構造
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には次のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの１つを除去して２つの末端リン酸を残し、次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加されて５’５’５三リン酸結合を生成し、次いで、グアニンの７−窒素がメチルトランスフェラーゼによりメチル化される。キャップ構造の例としては、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
天然に存在するキャップ構造は７−メチルグアノシンを含み、これは、三リン酸架橋を介して第一の転写ヌクレオチドの５’末端に連結され、その結果、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシドである）のジヌクレオチドキャップをもたらす。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、キャップは酵素を用いて付加される。キャップは、核に付加され、酵素グアニリルトランスフェラーゼによる触媒作用を受ける。ＲＮＡの５’末端へのキャップの付加は、転写の開始直後に生じる。末端ヌクレオシドは、グアノシンであるのが典型的であり、全ての他のヌクレオチドとは逆の方向になっており、すなわち、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＧｐＮｐＮｐである。
【０１１９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により生成されたｍＲＮＡに対する普遍的なキャップは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇであり、これをｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写においてジヌクレオチドキャップとして使用し、その５’末端にキャップ構造を有するＲＮＡが取得される。キャップ化されたｍＲＮＡの一般的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成方法では、転写の開始因子として、形態がｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（「ｍ７ＧｐｐｐＧ」）である予め形成されたジヌクレオチドが用いられている。
【０１２０】
従来より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳実験に使用される合成ジヌクレオチドキャップの通常の形態は、アンチリバースキャップ類似体（「ＡＲＣＡ」）または修飾されたＡＲＣＡであり、これは、２’ＯＨ基または３’ＯＨ基が−ＯＣＨ３で置換される、修飾されたキャップ類似体であるのが一般的である。
【０１２１】
さらなるキャップ類似体として、ｍ７ＧｐｐｐＧ、ｍ７ＧｐｐｐＡ、ｍ７ＧｐｐｐＣ；非メチル化キャップ類似体（例えば、ＧｐｐｐＧ）；ジメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，７ＧｐｐｐＧ）、トリメチル化キャップ類似体（例えば、ｍ２，２，７ＧｐｐｐＧ）、ジメチル化対称キャップ類似体（例えば、ｍ７Ｇｐｐｐｍ７Ｇ）、またはアンチリバースキャップ類似体（例えば、ＡＲＣＡ；ｍ７、２’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７２’ｄＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ＯｍｅＧｐｐｐＧ、ｍ７，３’ｄＧｐｐｐＧ、及びそれらの四リン酸誘導体）からなる群から選択される化学構造が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｖｅｌ  ‘ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ’  ｃａｐ  ａｎａｌｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３）を参照のこと）。
【０１２２】
一部の実施形態では、好適なキャップは７−メチルグアニル酸（「ｍ７Ｇ」）であり、これは、三リン酸架橋を介して第一の転写ヌクレオチドの５’末端に連結され、その結果、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（Ｎは任意のヌクレオシドである）をもたらすものである。本発明の実施形態に利用されるｍ７Ｇキャップの好適な実施形態は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである。
【０１２３】
一部の実施形態では、キャップはキャップ０構造である。キャップ０構造は、塩基１及び塩基２に結合したリボースの２’−Ｏ−メチル残基を欠く。一部の実施形態では、キャップはキャップ１構造である。キャップ１構造は、塩基２に２’−Ｏ−メチル残基を有する。一部の実施形態では、キャップはキャップ２構造である。キャップ２構造は、塩基２及び塩基３の両方に結合した２’−Ｏ−メチル残基を有する。
【０１２４】
様々なｍ７Ｇキャップ類似体が当該技術分野において既知であり、その多くは市販されている。これらには、上述のｍ７ＧｐｐｐＧ、ならびにＡＲＣＡ  ３’−ＯＣＨ３及び２’−ＯＣＨ３キャップ類似体が含まれる（Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３））。本発明の実施形態において使用するためのさらなるキャップ類似体として、Ｎ７−ベンジル化ジヌクレオシド四リン酸類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１０：１４７９−１４８７（２００４）に記載）、ホスホロチオエートキャップ類似体（Ｇｒｕｄｚｉｅｎ−Ｎｏｇａｌｓｋａ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，１３：１７４５−１７５５（２００７）に記載）、ならびに米国特許第８，０９３，３６７号及び同第８，３０４，５２９号（参照により本明細書に援用される）に記載されるキャップ類似体（ビオチン化キャップ類似体を含む）が挙げられる。
【０１２５】
テール構造
多くの場合、「テール」の存在はエキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護するという役割を果たす。ポリＡテールは、天然のメッセンジャーセンスＲＮＡおよび合成センスＲＮＡを安定させると考えられている。したがって、ある実施形態では、長いポリＡテールをｍＲＮＡ分子に付加することにより、そのＲＮＡをさらに安定化することができる。ポリＡテールは、当該技術分野において認識されている様々な技術を使用して付加することができる。例えば、長いポリＡテールは、ポリＡポリメラーゼを使用して合成ＲＮＡまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡに付加することができる（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２−１２５６）。転写ベクターが、長いポリＡテールをコードすることもできる。加えて、ポリＡテールは、ＰＣＲ産物から直接転写することによって付加することができる。ポリＡは、ＲＮＡリガーゼを用いてセンスＲＮＡの３’末端にライゲーションすることもできる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９９１  ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照のこと）。
【０１２６】
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テール構造を含む。典型的には、ポリＡテールの長さは少なくとも約１０、５０、１００、２００、３００、４００、少なくとも５００ヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの３’末端のポリＡテールは多くの場合、約１０〜３００個のアデノシンヌクレオチド（例えば、約１０〜２００個のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１５０個のアデノシンヌクレオチド、約１０〜１００個のアデノシンヌクレオチド、約２０〜７０個のアデノシンヌクレオチド、または約２０〜６０個のアデノシンヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは３’ポリ（Ｃ）テール構造を含む。ｍＲＮＡの３’末端の好適なポリＣテールは多くの場合、約１０〜２００個のシトシンヌクレオチド（例えば、約１０〜１５０個のシトシンヌクレオチド、約１０〜１００個のシトシンヌクレオチド、約２０〜７０個のシトシンヌクレオチド、約２０〜６０個のシトシンヌクレオチド、または約１０〜４０個のシトシンヌクレオチド）を含む。ポリＣテールは、ポリＡテールに付加され得るか、またはポリＡテールを置換し得る。
【０１２７】
一部の実施形態では、ポリＡテールまたはポリＣテールの長さを調節して、本発明の修飾センスｍＲＮＡ分子の安定性を制御し、それにともなってタンパク質の転写を制御する。例えば、ポリＡテールの長さはセンスｍＲＮＡ分子の半減期に影響を及ぼし得るため、ポリＡテールの長さを調節して、ヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの耐性のレベルを改変し、それによって、標的細胞におけるポリヌクレオチドの発現及び／またはポリペプチドの産生の時間経過を制御してもよい。
【０１２８】
５’および３’の非翻訳領域
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、５’および／または３’の非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域には、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす１つ以上の要素、例えば、鉄応答要素が含まれる。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００のヌクレオチドであり得る。
【０１２９】
一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞中のｍＲＮＡの位置の安定性に影響を及ぼすタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの１つ以上の結合部位のうちの１つ以上を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さ約５０〜５００ヌクレオチドであるか、またはそれ以上の長さであり得る。
【０１３０】
例示的な３’および／または５’のＵＴＲ配列は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を強化するために、安定なｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路酵素）から誘導されてもよい。例えば、５’ＵＴＲ配列は、ヌクレアーゼ耐性を改善するため、及び／またはポリヌクレオチドの半減期を改善するために、ＣＭＶ最初期１（ＩＥ１）遺伝子またはその断片の部分配列を含み得る。ポリヌクレオチドをさらに安定化させるために、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端または非翻訳領域にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）またはその断片をコードする配列を含めることも想定される。一般に、これらの修飾は、ポリヌクレオチドの安定性及び／または薬物動態特性（例えば、半減期）を、それらの未修飾の対応物に比べて改善するものであり、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏヌクレアーゼ消化に対するポリヌクレオチド耐性を改善するように行われる修飾を含む。
【０１３１】
リポソームの形成
本発明の組成物で使用するためのリポソーム移入ビヒクルは、当該技術分野において現在既知である様々な技術により調製することができる。提供される組成物で使用するためのリポソームは、当該技術分野において現在既知である様々な技術により調製することができる。例えば、多重層ベシクル（ＭＬＶ）は、適切な溶媒に脂質を溶解することにより、選択された脂質を好適な容器または器の内壁に堆積させ、次いで、溶媒を蒸発させて器の内側に薄膜を残すか、または噴霧乾燥させることなどによる、従来技術に従って調製され得る。続いて、水相を渦動運動させながら器に添加し、その結果として、ＭＬＶを形成することができる。次に、単層ベシクル（ＵＬＶ）を、多重層ベシクルのホモジナイゼーション、超音波処理、または押出により形成することができる。加えて、単層ベシクルを、界面活性剤除去技術により形成することができる。
【０１３２】
ある実施形態では、提供される組成物はリポソームを含み、この場合においてｍＲＮＡはリポソームの両表面上で会合し、および同リポソーム内に封入される。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソームは、静電相互作用によりｍＲＮＡと会合し得る。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソームは、静電相互作用によりｍＲＮＡと会合し得る。
【０１３３】
一部の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、リポソームに封入されたｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、１種以上のｍＲＮＡ種が、同一のリポソームに封入され得る。一部の実施形態では、１種以上のｍＲＮＡ種が、異なるリポソームに封入され得る。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは１つ以上のリポソームに封入される。当該リポソームは、その脂質組成、脂質成分のモル比、大きさ、電荷（ゼータ電位）、標的化リガンド、及び／またはそれらの組み合わせにおいて異なる。一部の実施形態では、１つ以上のリポソームは、カチオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、及び／またはこれらの組み合わせの異なる組成物を有し得る。一部の実施形態では、１つ以上のリポソームは、リポソームを作製するために使用されるカチオン性脂質、中性脂質、コレステロール、及びＰＥＧ修飾脂質の異なるモル割合を有し得る。
【０１３４】
所望のｍＲＮＡをリポソーム内に組み込むプロセスは、「装填」と称されることが多い。例示的な方法が、Ｌａｓｉｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，３１２：２５５−２５８，１９９２に記載されており、この文献は参照によって本明細書に援用される。リポソーム組み込み核酸は、リポソームの内部空間、つまりリポソームの二分子膜内に完全にまたは部分的に位置するか、またはリポソーム膜の外表面と会合し得る。核酸のリポソーム内への組み込みは本明細書において「封入」とも称され、そこで、核酸がリポソームの内部空間内に完全に包含される。ｍＲＮＡを、たとえばリポソームなどの移入ビヒクル内に組み込む目的はしばしば、核酸を分解する酵素もしくは化学物質、および／または核酸の急速排出をもたらす系もしくは受容体を含み得る環境から核酸を保護することである。したがって、一部の実施形態では、好適な送達ビヒクルは、その中に含まれるｍＲＮＡの安定性を強化することができ、および／または標的細胞もしくは標的組織へのｍＲＮＡの送達を促進する。
【０１３５】
リポソームの大きさ
本発明による好適なリポソームは、様々な大きさに作製することができる。一部の実施形態では、提供されるリポソームは、従来から知られているｍＲＮＡ封入リポソームよりも小さく作製され得る。一部の実施形態では、リポソームの大きさが減少すると、ｍＲＮＡの送達効率が高くなる。適切なリポソームの大きさは、標的細胞または標的組織の部位を考慮し、また作製されるリポソームの用途をある程度考慮して選択することができる。
【０１３６】
一部の実施形態では、適切な大きさのリポソームを選択して、ｍＲＮＡによりコードされる抗体の全身分布を促進する。一部の実施形態では、特定の細胞または組織へのｍＲＮＡのトランスフェクションを限定することが望ましい場合がある。例えば、肝細胞を標的とするには、リポソームは、その寸法が肝臓の肝類洞を覆う内皮層の開窓よりも小さくなるように寸法決定されてもよく、こうした場合、リポソームは、その内皮開窓を容易に貫通して、標的肝細胞に達することができようになる。
【０１３７】
あるいはまたは加えて、リポソームは、リポソームの寸法が特定の細胞もしくは組織内への分布を制限するか、または意図的に分布しないようにするのに十分な直径であるように寸法決定されてもよい。例えば、リポソームは、その寸法が肝類洞を覆う内皮層の開窓より大きくなるように寸法決定されてもよく、それによって、リポソームの肝細胞への分布を制限する。
【０１３８】
一部の実施形態では、リポソームの大きさは、リポソーム粒子の最大直径の長さによって決定される。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約２５０ｎｍ以下（例えば、約２２５ｎｍ、２００ｎｍ、１７５ｎｍ、１５０ｎｍ、１２５ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、または５０ｎｍ以下）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１０〜２５０ｎｍの範囲（例えば、約１０〜２２５ｎｍ、１０〜２００ｎｍ、１０〜１７５ｎｍ、１０〜１５０ｎｍ、１０〜１２５ｎｍ、１０〜１００ｎｍ、１０〜７５ｎｍ、または１０〜５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１００〜２５０ｎｍの範囲（例えば、約１００〜２２５ｎｍ、１００〜２００ｎｍ、１００〜１７５ｎｍ、１００〜１５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。一部の実施形態では、好適なリポソームは、約１０〜１００ｎｍの範囲（例えば、約１０〜９０ｎｍ、１０〜８０ｎｍ、１０〜７０ｎｍ、１０〜６０ｎｍ、または１０〜５０ｎｍの範囲）の大きさを有する。ある特定の実施形態では、好適なリポソームは、約１００ｎｍ未満の大きさを有する。
【０１３９】
リポソーム集団の寸法決定に対して、当該技術分野において既知の様々な別の方法を利用することができる。こうした寸法決定方法の１つは、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、この文献は参照によって本明細書に援用される。バス超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかによるリポソーム懸濁液の超音波処理によって、直径が約０．０５マイクロメートル未満の小さいＵＬＶまでサイズ漸減する。ホモジナイゼーションは別の方法であり、大きいリポソームをより小さいものに断片化するのに剪断エネルギーを利用する。典型的なホモジナイゼーション手順において、ＭＬＶは、選択されたリポソームの大きさ、典型的には約０．１〜０．５マイクロメートルの大きさが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーを用いて再循環される。リポソームの大きさは、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１−１５０（１９８１）（参照によって本明細書に援用される）に記載された準電気光散乱（ＱＥＬＳ）によって算出され得る。平均リポソーム直径を、形成されたリポソームを超音波処理することによって減少させることができる。断続的な超音波処理サイクルをＱＥＬＳ評価と交互に行って、効率的なリポソーム合成を導くことができる。
【０１４０】
医薬組成物
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍＲＮＡの発現を促進するために、リポソームなどの送達ビヒクルは、１つ以上の追加の核酸、担体、標的化リガンドもしくは安定化試薬と組み合わせて製剤化されてもよく、または好適な賦形剤と混合されている薬理組成物中で製剤化されてもよい。薬物の製剤化及び投与の技術は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，”Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，ｌａｔｅｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎで知ることができる。
【０１４１】
提供されるリポソーム封入ｍＲＮＡ、またはリポソーム結合ｍＲＮＡ、及びそれを含む組成物は、対象の臨床状態、投与の部位及び投与方法、投与スケジュール、対象の年齢、性別、体重、ならびに当該技術分野の臨床医に関連する他の要因を考慮して、現在の医療行為に従い投与及び投薬され得る。本明細書における目的に適う「有効量」は、実験臨床研究、薬理学、臨床、及び医療分野の当業者に既知のこうした適切な考慮すべき事項により決定され得る。一部の実施形態では、投与される量は、症状や、当業者によって疾患の進行、退行、または改善の適切な基準として選択される他の指標を、少なくともいくらか安定化、改善、または排除するのに有効である。例えば、好適な量及び投薬レジメンは、少なくとも一過性タンパク質（例えば、酵素）の産生をもたらすものである。
【０１４２】
好適な投与経路として、例えば、経口投与、直腸投与、膣投与、経粘膜投与、気管内投与もしくは吸入投与を含めた経肺投与、または経腸投与；皮内注射、経皮（局所）注射、筋肉内注射、皮下注射、髄内注射を含めた非経口送達、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、もしくは鼻腔内が挙げられる。特定の実施形態では、筋肉内投与は、骨格筋、平滑筋、及び心筋からなる群から選択される筋肉に行う。一部の実施形態では、投与の結果、ｍＲＮＡが筋細胞に送達される。一部の実施形態では、投与の結果、ｍＲＮＡが肝細胞（すなわち肝臓細胞）に送達される。特定の実施形態では、筋肉内投与の結果、ｍＲＮＡが筋細胞に送達される。
【０１４３】
あるいはまたは加えて、本発明のリポソーム封入ｍＲＮＡ及び組成物は、全身的にではなく局所的に、例えば、好ましくは徐放性製剤中で、医薬組成物を標的組織内へ直接注射することによって投与され得る。局所送達は、標的とされる組織により様々な形で用いることができる。例えば、本発明の組成物を含むエアロゾルを吸引する場合があり（鼻送達、気管送達、または気管支送達として）；本発明の組成物を、例えば、損傷、疾患出現、または痛みの部位内に注射する場合があり；組成物を、経口、気管、または食道用途にトローチ剤で提供する場合があり；胃もしくは腸への投与用に液体、錠剤またはカプセル形態で供給する場合があり；直腸もしくは膣用途に坐剤形態で供給する場合があり；またはクリーム、液滴、さらには注射を使用することにより眼に送達する場合もある。治療用の分子またはリガンドと複合体を形成した提供される組成物を含む製剤は、例えば、組成物を移植部位から周囲細胞に拡散させることができるポリマーまたは他の構造もしくは物質と合わせて、外科的に投与することもできる。あるいは、これらは、ポリマーまたは支持体を使用することなく外科的に適用され得る。
【０１４４】
本発明の提供される方法は、本明細書に記載される治療剤（例えば、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡ）の治療有効量の単回投与ならびに複数回投与を企図する。治療剤は、対象の状態（たとえばＯＴＣ欠損症）の性質、重篤度、及び程度によって規則的な間隔で投与されてもよい。一部の実施形態では、本発明の治療剤（例えば、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡ）の治療有効量を、規則的な間隔で（例えば、年に１回、６か月に１回、５か月に１回、３か月に１回、隔月（２か月に１回）、毎月（毎月１回）、隔週（２週間に１回）、月２回、３０日に１回、２８日に１回、１４日に１回、１０日に１回、７日に１回、毎週、週２回、毎日、または連続して）、周期的に髄腔内に投与してもよい。
【０１４５】
一部の実施形態では、提供されるリポソーム及び／または組成物は、その中に含まれるｍＲＮＡの徐放に適するように製剤化される。こうした徐放性組成物は、投薬間隔を延長させて対象に適宜投与することができる。例えば、一実施形態では、本発明の組成物は、１日２回、毎日、または１日おきに対象に投与される。好適な実施形態では、本発明の組成物は、週２回、週１回、７日に１回、１０日に１回、１４日に１回、２８日に１回、３０日に１回、２週間に１回、３週間に１回もしくはより好ましくは４週間に１回、１か月に１回、１か月に２回、６週間に１回、８週間に１回、隔月に１回、３か月に１回、４か月に１回、６か月に１回、８か月に１回、９か月に１回、または毎年対象に投与される。長期間にわたるｍＲＮＡの送達または放出のいずれかを行うために、デポ投与（例えば、筋肉内、皮下、硝子体内）用に製剤化される組成物及びリポソームも企図される。好ましくは、採用される徐放手段は、安定性を強化するためにｍＲＮＡに施される修飾と組み合わされる。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、主として、本発明の医薬組成物に含まれる治療剤の総量に基づいて決定される。一般に、治療有効量は、対象に対して意義のある利益を得る（例えば、ＯＴＣ欠損症を治療、調節、治癒、防止、及び／または改善する）のに十分な量である。例えば、治療有効量は、所望の治療作用及び／または予防作用を得るのに十分な量であり得る。通常、その必要のある対象に投与される治療剤（例えば、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡ）の量は、当該対象の特徴に依存するであろう。このような特徴には、対象の状態、疾患重篤度、全般的健康、年齢、性別および体重が含まれる。当業者は、これらおよび他の関連因子に応じて適切な用量を容易に決定することができるであろう。さらに、最適な投薬量範囲を同定するために、客観的および主観的アッセイの両方を任意に用いることができる。
【０１４７】
治療上有効な量は、複数の単位用量を含み得る投薬レジメンで一般的に投与される。任意の特定の治療用タンパク質について、治療上有効な量（および／または有効な投与レジメン内の適切な単位投与量）は、例えば、投与経路に応じて、他の医薬品と組み合わせて変化し得る。また、任意の特定の患者に固有の治療有効量（及び／または単位用量）は、治療される障害及び障害の重篤度；採用される特定の医薬作用剤の活性；採用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事；投与時間、投与経路、及び／または採用される特定のタンパク質の排出または代謝速度；治療期間；ならびに医療分野において周知の類似要因を含む様々な要因に依存し得る。
【０１４８】
一部の実施形態では、治療有効投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）、例えば、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜４００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜３００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜９０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜８０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜７０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜６０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜４０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜３０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲である。
【０１４９】
一部の実施形態では、治療有効投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約６０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約７０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約８０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約９０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５００ｍｇ／ｋｇ（体重）超である。特定の実施形態では、治療有効投与量は１．０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、１．０ｍｇ／ｋｇの治療有効投与量は筋肉内または静脈内に投与される。
【０１５０】
また、本明細書に開示されるリポソームのうちの１つ以上を含む凍結乾燥された医薬組成物と、例えば、２０１２年６月８日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／４１６６３に開示されるような、かかる組成物を使用するための関連方法も、本明細書において企図される。当該出願の教示内容はその全体で参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本発明による凍結乾燥された医薬組成物は、投与前に戻されるか、またはｉｎ  ｖｉｖｏで戻され得る。例えば、凍結乾燥された医薬組成物は、適切な剤形（例えば、ディスク、ロッド、または膜などの皮内剤形）に製剤化され、剤形が個体の体液によってｉｎ  ｖｉｖｏで経時的に再水和されるように投与され得る。
【０１５１】
提供されるリポソーム及び組成物は、任意の所望の組織に投与され得る。一部の実施形態では、提供されるリポソームまたは組成物によって送達されるＯＴＣ  ｍＲＮＡは、リポソーム及び／または組成物が投与された組織で発現される。一部の実施形態では、送達されるｍＲＮＡは、リポソーム及び／または組成物が投与された組織とは異なる組織で発現される。送達されるｍＲＮＡが送達及び／または発現され得る組織の例としては、限定されないが、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、及び／または脳脊髄液が挙げられる。
【０１５２】
一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象由来の生体試料におけるＯＴＣ  ｍＲＮＡの発現レベルが、治療前のベースライン発現レベルと比較して増加する。通例、ベースラインレベルは、治療直前に測定される。生体試料としては、例えば、全血、血清、血漿、尿、及び組織試料（例えば、筋肉、肝臓、皮膚線維芽細胞）が含まれる。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、ＯＴＣ  ｍＲＮＡの発現レベルが、治療直前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、ＯＴＣ  ｍＲＮＡの発現レベルが、治療をしていない対象のＯＴＣ  ｍＲＮＡの発現レベルと比較して増加する
【０１５３】
本発明によると、提供される組成物の治療有効量は、定期的に投与された場合、治療前のベースラインのＯＴＣタンパク質の発現レベルまたは活性レベルと比較して、対象におけるＯＴＣタンパク質の発現レベルまたは活性レベルの増加をもたらす。典型的には、ＯＴＣタンパク質の発現レベルまたは活性レベルは、たとえば血液、血漿もしくは血清、尿、または固形組織抽出物などの対象から取得された生体試料において測定される。ベースラインレベルは、治療直前に測定される。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、生体試料（たとえば血漿／血清または尿）中のＯＴＣタンパク質の発現レベルまたは活性レベルは、治療前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、生体試料（たとえば血漿／血清または尿）中のＯＴＣタンパク質の発現レベルまたは活性レベルは、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、または少なくとも１５日間の治療前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで増加する。
【０１５４】
様々な実施形態によると、送達されるｍＲＮＡの発現の時期を、特定の医学的要求に合うように調整することができる。一部の実施形態では、送達されるｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、提供されるリポソーム及び／または組成物の投与の１時間、２時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週、２週、または１カ月後に検出可能である。
【０１５５】
一部の実施形態では、提供される組成物の治療有効量は、定期的に投与された場合、治療前のベースラインシトルリン産生と比較して、対象におけるシトルリン産生の増加をもたらす。典型的には、治療前または治療後のシトルリン値は、たとえば血液、血漿もしくは血清、尿、または固形組織抽出物などの対象から取得された生体試料において測定され得る。一部の実施形態では、本発明に従う治療により、ベースラインシトルリン値と比較して、生体試料（たとえば血漿、血清または尿）中のシトルリン値がそれぞれ少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、または３倍まで増加する。
【０１５６】
本発明によると、提供される組成物の治療有効量は、定期的に投与された場合、ＯＴＣ欠損症の少なくとも１つの症状または特徴の、強度、重篤度または頻度における低下をもたらすか、または発症の遅延をもたらす。一部の実施形態では、提供される組成物の治療有効量は、定期的に投与された場合、治療前のベースラインのオロチン酸値と比較して、対象におけるオロチン酸値の低下をもたらす。一部の実施形態では、提供される組成物の治療有効量は、定期的に投与された場合、治療前のベースラインのアンモニア値と比較して、対象におけるアンモニア値の低下をもたらす。一部の実施形態では、提供される組成物の治療有効量は、定期的に投与された場合、治療前のベースラインのグルタミン値と比較して、対象におけるグルタミン値の低下をもたらす。
【０１５７】
典型的には、治療前または治療後のオロチン酸値、アンモニア値、またはグルタミン値は、たとえば血液、血漿、血清、尿、または固形組織抽出物などの対象から取得された生体試料において測定され得る。ベースラインのオロチン酸値、アンモニア値、またはグルタミン値は、治療直前に測定される。一部の実施形態では、本発明に従う治療により、それぞれベースラインのオロチン酸値、アンモニア値、またはグルタミン値と比較して、対象から取得された生体試料（たとえば血液、血清または尿）においてオロチン酸値、アンモニア値、またはグルタミン値が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％まで低下する。一部の実施形態では、提供される組成物の治療有効量は、定期的に投与された場合、約５００μｍｏｌ／Ｌ、４００μｍｏｌ／Ｌ、３００μｍｏｌ／Ｌ、２００μｍｏｌ／Ｌ、１５０μｍｏｌ／Ｌ、または１００μｍｏｌ／Ｌ未満にまで血漿アンモニア値が低下する。一部の実施形態では、提供される組成物の治療有効量は、定期的に投与された場合、約８００μｍｏｌ／Ｌ、７００μｍｏｌ／Ｌ、または６００μｍｏｌ／Ｌ未満にまで血漿グルタミン値が低下する。一部の実施形態では、提供される組成物の治療有効量は、定期的に投与された場合、約２０μｍｏｌ／ｍｍｏｌのクレアチニン、１５μｍｏｌ／ｍｍｏｌのクレアチニン、または１０μｍｏｌ／ｍｍｏｌのクレアチニン未満にまで尿オロチン酸値が低下する。
【０１５８】
一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象の肝臓におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療前のベースライン発現レベルと比較して増加する。通例、ベースラインレベルは、治療直前に測定される。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、肝臓におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療直前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、肝臓におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療をしていない対象の肝臓におけるＯＴＣタンパク質のレベルと比較して増加する。
【０１５９】
一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象の肝臓細胞（たとえば肝細胞）におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療前のベースラインのレベルと比較して増加する。通例、ベースラインレベルは、治療直前に測定される。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、肝臓細胞におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療直前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、肝臓細胞におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療をしていない対象の肝臓細胞におけるＯＴＣタンパク質のレベルと比較して増加する。
【０１６０】
一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象の血漿または血清におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療前のベースラインのレベルと比較して増加する。通例、ベースラインレベルは、治療直前に測定される。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、血漿または血清におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療直前のベースラインのレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、血漿または血清におけるＯＴＣタンパク質のレベルが、治療をしていない対象の血漿または血清におけるＯＴＣタンパク質のレベルと比較して増加する。
【０１６１】
一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、対象由来の生体試料におけるＯＴＣ酵素活性が、治療前のベースラインのレベルと比較して増加する。通例、ベースラインレベルは、治療直前に測定される。生体試料としては、例えば、全血、血清、血漿、尿、及び組織試料（例えば、肝臓）が含まれる。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、ＯＴＣ酵素活性が、治療直前のベースラインのレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで増加する。一部の実施形態では、提供される組成物を投与することにより、ＯＴＣ酵素活性が、治療をしていない対象のＯＴＣ酵素活性と比較して増加する。
【０１６２】
様々な実施形態によると、送達されるｍＲＮＡの発現の時期を、特定の医学的要求に合うように調整することができる。一部の実施形態では、送達されるｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現は、提供されるリポソーム及び／または組成物の投与の１時間、２時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間及び／または９６時間後に検出可能である。一部の実施形態では、送達されるｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現は、投与の１週間、２週間、及び／または１か月後に検出可能である。
【実施例】
【０１６３】
本発明の特定の化合物、組成物、及び方法について、特定の実施形態に従って具体的に説明してきたが、以下の実施例は、本発明の化合物を単に説明するという役割を果たすものであり、それを制限することを意図するものではない。
実施例１．  ＯＴＣ  ｍＲＮＡの送達および発現のためのリポソーム製剤の例
本実施例は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＯＴＣ  ｍＲＮＡの効果的な送達および発現のためのリポソーム製剤の例を提供する。
【０１６４】
脂質材料
本明細書に記載される製剤は、ＯＴＣタンパク質をコードするｍＲＮＡを封入するよう設計された、１種以上のカチオン性脂質、ヘルパー脂質（たとえば非カチオン性脂質および／またはコレステロール系脂質）、およびＰＥＧ化脂質を活用する、様々な比率の多成分脂質混合物を含む。カチオン性脂質としては、（限定ではないが）ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ”Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６−２８７）、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ｌｉｐｉｄｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２−１７６）、Ｃ１２−２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”ＰＮＡＳ  ２０１０，１０７，１８６４−１８６９）、ｃＫＫ−Ｅ１２（３，６−ビス（４−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン−２，５−ジオン）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＩＣＥ、ＯＦ−０２、ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、グアニジニウム系などが挙げられる。ヘルパー脂質としては（限定ではないが）、ＤＳＰＣ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホチジルコリン）ＤＰＰＥ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、コレステロールなどが挙げられる。ＰＥＧ化脂質は、Ｃ６−Ｃ２０の長さのアルキル鎖を有する脂質に共有結合された、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖が挙げられる（限定ではない）。
【０１６５】
コドン最適化されたヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）メッセンジャーＲＮＡは、当該遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ鋳型からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により合成された。その後、５’キャップ構造（Ｃａｐ１）（Ｆｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，Ｇ．Ｇ．“Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｃａｐ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２００５，８６，１２３９−１２４９）と、およそ２５０ヌクレオチドの長さの３’ポリ（Ａ）テールの付加が行われ、ゲル電気泳動により測定された。各ｍＲＮＡ産物中に存在する５’および３’の非翻訳領域はそれぞれＸおよびＹと表されており、述べられるように定義される（以下を参照）。
コドン最適化されたヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ｍＲＮＡの例
コンストラクト設計：
Ｘ−配列番号３−Ｙ
Ｘ−配列番号７−Ｙ
５’および３’のＵＴＲ配列
Ｘ（５’ＵＴＲ配列）＝
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG（配列番号１１）
Ｙ（３’ＵＴＲ配列）＝
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU（配列番号１２）
または
GGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU（配列番号１３）
【０１６６】
コドン最適化されたヒトＯＴＣ  ｍＲＮＡ配列の例としては、詳細な説明の項に記載される配列番号３または配列番号７が挙げられる。
【０１６７】
コドン最適化されたヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）メッセンジャーＲＮＡ配列の全長の例を以下に示す：
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGCUGUUCAACCUUCGGAUCUUGCUGAACAACGCUGCGUUCCGGAAUGGUCACAACUUCAUGGUCCGGAACUUCAGAUGCGGCCAGCCGCUCCAGAACAAGGUGCAGCUCAAGGGGAGGGACCUCCUCACCCUGAAAAACUUCACCGGAGAAGAGAUCAAGUACAUGCUGUGGCUGUCAGCCGACCUCAAAUUCCGGAUCAAGCAGAAGGGCGAAUACCUUCCUUUGCUGCAGGGAAAGUCCCUGGGGAUGAUCUUCGAGAAGCGCAGCACUCGCACUAGACUGUCAACUGAAACCGGCUUCGCGCUGCUGGGAGGACACCCCUGCUUCCUGACCACCCAAGAUAUCCAUCUGGGUGUGAACGAAUCCCUCACCGACACAGCGCGGGUGCUGUCGUCCAUGGCAGACGCGGUCCUCGCCCGCGUGUACAAGCAGUCUGAUCUGGACACUCUGGCCAAGGAAGCCUCCAUUCCUAUCAUUAAUGGAUUGUCCGACCUCUACCAUCCCAUCCAGAUUCUGGCCGAUUAUCUGACUCUGCAAGAACAUUACAGCUCCCUGAAGGGGCUUACCCUUUCGUGGAUCGGCGACGGCAACAACAUUCUGCACAGCAUUAUGAUGAGCGCUGCCAAGUUUGGAAUGCACCUCCAAGCAGCGACCCCGAAGGGAUACGAGCCAGACGCCUCCGUGACGAAGCUGGCUGAGCAGUACGCCAAGGAGAACGGCACUAAGCUGCUGCUCACCAACGACCCUCUCGAAGCCGCCCACGGUGGCAACGUGCUGAUCACCGAUACCUGGAUCUCCAUGGGACAGGAGGAGGAAAAGAAGAAGCGCCUGCAAGCAUUUCAGGGGUACCAGGUGACUAUGAAAACCGCCAAGGUCGCCGCCUCGGACUGGACCUUCUUGCACUGUCUGCCCAGAAAGCCCGAAGAGGUGGACGACGAGGUGUUCUACAGCCCGCGGUCGCUGGUCUUUCCGGAGGCCGAAAACAGGAAGUGGACUAUCAUGGCCGUGAUGGUGUCCCUGCUGACCGAUUACUCCCCGCAGCUGCAGAAACCAAAGUUCUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU （配列番号１４）。
【０１６８】
別の例において、コドン最適化されたヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）メッセンジャーＲＮＡ配列の全長を以下に示す：
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGCUGUUCAACCUUCGGAUCUUGCUGAACAACGCUGCGUUCCGGAAUGGUCACAACUUCAUGGUCCGGAACUUCAGAUGCGGCCAGCCGCUCCAGAACAAGGUGCAGCUCAAGGGGAGGGACCUCCUCACCCUGAAAAACUUCACCGGAGAAGAGAUCAAGUACAUGCUGUGGCUGUCAGCCGACCUCAAAUUCCGGAUCAAGCAGAAGGGCGAAUACCUUCCUUUGCUGCAGGGAAAGUCCCUGGGGAUGAUCUUCGAGAAGCGCAGCACUCGCACUAGACUGUCAACUGAAACCGGCUUCGCGCUGCUGGGAGGACACCCCUGCUUCCUGACCACCCAAGAUAUCCAUCUGGGUGUGAACGAAUCCCUCACCGACACAGCGCGGGUGCUGUCGUCCAUGGCAGACGCGGUCCUCGCCCGCGUGUACAAGCAGUCUGAUCUGGACACUCUGGCCAAGGAAGCCUCCAUUCCUAUCAUUAAUGGAUUGUCCGACCUCUACCAUCCCAUCCAGAUUCUGGCCGAUUAUCUGACUCUGCAAGAACAUUACAGCUCCCUGAAGGGGCUUACCCUUUCGUGGAUCGGCGACGGCAACAACAUUCUGCACAGCAUUAUGAUGAGCGCUGCCAAGUUUGGAAUGCACCUCCAAGCAGCGACCCCGAAGGGAUACGAGCCAGACGCCUCCGUGACGAAGCUGGCUGAGCAGUACGCCAAGGAGAACGGCACUAAGCUGCUGCUCACCAACGACCCUCUCGAAGCCGCCCACGGUGGCAACGUGCUGAUCACCGAUACCUGGAUCUCCAUGGGACAGGAGGAGGAAAAGAAGAAGCGCCUGCAAGCAUUUCAGGGGUACCAGGUGACUAUGAAAACCGCCAAGGUCGCCGCCUCGGACUGGACCUUCUUGCACUGUCUGCCCAGAAAGCCCGAAGAGGUGGACGACGAGGUGUUCUACAGCCCGCGGUCGCUGGUCUUUCCGGAGGCCGAAAACAGGAAGUGGACUAUCAUGGCCGUGAUGGUGUCCCUGCUGACCGAUUACUCCCCGCAGCUGCAGAAACCAAAGUUCUGAGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAGCU（配列番号１５）。
別の例において、コドン最適化されたヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）メッセンジャーＲＮＡ配列の全長を以下に示す：
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGAUGCUGUUUAACCUGAGAAUUCUGCUGAACAACGCCGCGUUCAGGAACGGCCACAAUUUCAUGGUCCGCAACUUUAGAUGCGGACAGCCUCUCCAAAACAAGGUCCAGCUCAAGGGGCGGGACUUGCUGACCCUUAAGAACUUUACCGGCGAAGAGAUCAAGUACAUGCUGUGGUUGUCAGCGGACCUGAAGUUCCGCAUCAAGCAGAAAGGGGAGUAUCUGCCGCUGCUCCAAGGAAAGUCGCUCGGCAUGAUCUUCGAGAAGCGCUCGACCAGAACCCGGCUGUCCACUGAAACUGGUUUCGCCCUUCUGGGUGGACACCCUUGUUUCCUGACAACCCAGGACAUCCAUCUGGGCGUGAACGAAAGCCUCACUGACACCGCCAGGGUGCUGAGCUCCAUGGCCGACGCUGUCCUUGCCCGGGUGUACAAGCAGUCCGAUCUGGACACUCUGGCCAAGGAAGCGUCCAUCCCGAUCAUUAACGGACUGUCCGACCUGUACCACCCGAUCCAGAUUCUGGCCGACUACCUGACCUUGCAAGAGCACUACAGCUCACUGAAGGGCUUGACCCUGAGCUGGAUCGGCGACGGAAACAACAUUCUGCAUUCGAUCAUGAUGUCCGCGGCCAAGUUCGGAAUGCAUCUGCAGGCCGCAACUCCCAAGGGAUACGAACCUGAUGCGUCCGUGACUAAGCUGGCCGAGCAGUACGCAAAGGAAAACGGCACCAAGCUGCUGCUGACCAACGACCCGCUCGAAGCUGCCCACGGAGGGAACGUGCUCAUUACCGACACUUGGAUCUCCAUGGGGCAGGAAGAAGAGAAGAAGAAGCGGCUCCAGGCAUUCCAGGGUUACCAGGUCACCAUGAAAACGGCCAAAGUGGCCGCUUCGGAUUGGACUUUCCUCCACUGCCUUCCCCGCAAACCUGAGGAAGUGGAUGAUGAAGUGUUCUACUCCCCACGCUCCCUCGUGUUCCCCGAGGCCGAGAAUCGGAAGUGGACCAUUAUGGCCGUGAUGGUGUCACUGCUGACCGACUACAGCCCCCAACUGCAAAAGCCGAAGUUCUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU（配列番号４）
【０１６９】
製剤プロトコールの例
Ａ．  ｃＫＫ−Ｅ１２
ｃＫＫ−Ｅ１２の５０ｍｇ／ｍＬ  エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈した。別個に、ＯＴＣ  ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ  クエン酸／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製した。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得た。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析ろ過し、濃縮して２〜８℃で保存した。ＯＴＣ封入化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定した。
【０１７０】
Ｂ．  Ｃ１２−２００
ｃ１２−２００の５０ｍｇ／ｍＬ  エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＯＴＣ  ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ  クエン酸／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析ろ過し、濃縮して２〜８℃で保存する。ＯＴＣ封入化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。
【０１７１】
Ｃ．  ＨＧＴ４００３
ＨＧＴ４００３の５０ｍｇ／ｍＬ  エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＯＴＣ  ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ  クエン酸／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析ろ過し、濃縮して２〜８℃で保存する。ＯＴＣ封入化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。
Ｄ．  ＩＣＥ
ＩＣＥの５０ｍｇ／ｍＬ  エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＯＴＣ  ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ  クエン酸／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析ろ過し、濃縮して２〜８℃で保存する。ＯＴＣ封入化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。
【０１７２】
Ｅ．  ＨＧＴ５００１
ＨＧＴ５００１の５０ｍｇ／ｍＬ  エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＯＴＣ  ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ  クエン酸／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析ろ過し、濃縮して２〜８℃で保存する。ＯＴＣ封入化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。
【０１７３】
Ｆ．  ＨＧＴ５０００
ＨＧＴ５０００の５０ｍｇ／ｍＬ  エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＯＴＣ  ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ  クエン酸／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析ろ過し、濃縮して２〜８℃で保存する。ＯＴＣ封入化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。
【０１７４】
Ｇ．  ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡ
ＤＬｉｎＫＣ２ＤＭＡの５０ｍｇ／ｍＬ  エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＯＴＣ  ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ  クエン酸／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析ろ過し、濃縮して２〜８℃で保存する。ＯＴＣ封入化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。
Ｈ．  ＤＯＤＡＰ
【０１７５】
ＤＯＤＡＰの５０ｍｇ／ｍＬ  エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＯＴＣ  ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ  クエン酸／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析ろ過し、濃縮して２〜８℃で保存する。ＯＴＣ封入化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。
【０１７６】
Ｉ．  ＤＯＤＭＡ
ＤＯＤＭＡの５０ｍｇ／ｍＬ  エタノール溶液の分注物、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ−ＰＥＧ２Ｋを混合し、エタノールで最終量３ｍＬまで希釈する。別個に、ＯＴＣ  ｍＲＮＡの緩衝水溶液（１０ｍＭ  クエン酸／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５）を、１ｍｇ／ｍＬのストックから調製する。脂質溶液をｍＲＮＡ水溶液中に素早く注入し、振とうして、２０％エタノールの最終懸濁液を得る。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析ろ過し、濃縮して２〜８℃で保存する。ＯＴＣ封入化ｍＲＮＡの最終濃度、Ｚａｖｅ、Ｄｖ（５０）およびＤｖ（９０）を決定する。
【０１７７】
実施例２．  ＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持リポソームナノ粒子の静脈内投与
本実施例は、ＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持リポソームナノ粒子の投与方法の例および様々な標的組織における、ｉｎ  ｖｉｖｏのＯＴＣ  ｍＲＮＡ分析法の例を解説する。
【０１７８】
全ての実験が、ｓｐｆａｓｈマウスを使用して行われた。０．５ｍｇ／ｋｇ投与量の単回尾静脈ボーラス注入により、ヒトＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持ｃＫＫ−Ｅ１２系脂質ナノ粒子を用いてマウスを治療した。２４時間、７２時間、８日、１１日、および１５日でマウスを安楽死させ、生理食塩水でかん流した。
【０１７９】
たとえば肝臓などの各マウスの組織を採取し、別々の部分に分けて、１０％の中性緩衝ホルマリンまたは急速凍結のいずれかで保存し、そして分析を行うまで−８０℃で保存した。
【０１８０】
マウス肝臓ホモジネートにおけるＯＴＣタンパク質のウェスタンブロット検出
サンプルは、ＨＥＰＥＳ溶解緩衝液を使用してホモジネートされ、凍結／溶解を２回行い、確実にすべての細胞を溶解させた。残渣を沈殿させ、ホモジネートを、ＢＣＡアッセイにより総タンパク質定量に関して分析した。ＮｕＰａｇｅ還元剤およびローディング色素とともに１０ｎｇの総タンパク質を５分間、９５℃でインキュベートし、次いで８〜１６％のトリス／グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でタンパク質分離を行った。タンパク質をＰＶＤＦ膜上へ移し、ＰＢＳＴ中、２％のｉ−Ｂｌｏｃｋ溶液でブロッキングし、その後、特許品の抗ＯＴＣ抗体（２２Ａ０３）とともにインキュベートした。ゲルを洗浄し、ＨＲＰ結合二次抗体とともにインキュベートし、再度洗浄して、Ｋｏｎｉｋａ  Ｍｉｎｏｌｔａ  ＳＲＸ−１０１ａフィルムプロセッサー上でＥＣＬ−Ｐｒｉｍｅ基質を使用して発色させた。
【０１８１】
マウス肝臓ホモジネートにおけるＯＴＣタンパク質のＥＬＩＳＡ定量
サンプルは、ＨＥＰＥＳ溶解緩衝液を使用してホモジネートされ、凍結／溶解を２回行い、確実にすべての細胞を溶解させた。残渣を沈殿させ、アッセイ用の上清を集めた。特許品の抗ＯＴＣ抗体（２５Ｄ１１）を、５０ｍＭの重炭酸ナトリウム溶液、ｐＨ９．６中、１μｇ／ｍＬで１時間、Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｂプレート上にコーティングした。このプレートをＤＰＢＳおよびＴｗｅｅｎ−２０洗浄緩衝液を使用して洗浄し、その後、Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓカゼインブロッキング緩衝液とともに１時間、ブロッキングした。このプレートを再度洗浄し、その後、二重実験でサンプルと標準物を添加し、さらに１時間インキュベートした。このプレートを洗浄し、その後ＨＲＰ結合検出Ａｂ（２１Ｃ０２）を１：５５００希釈でプレートに加え、１時間インキュベートした。最終洗浄を行った後、ＳｕｒｍｏｄｉｃｓＴＭＢ基質を使用してプレートを発色させ、１ＮのＨＣｌを用いて発色停止させ、分光光度計で４５０ｎｍマイナス６５０ｎｍで読み取った。
【０１８２】
マウス肝臓ホモジネートを使用したシトルリン活性のアッセイ
マウスの肝臓ホモジネートは上述の通りに調製した。１ｘＤＰＢＳ中でホモジネートを所望の濃度まで希釈して、その後、９６ウェルプレート中の超純水に添加した。所定量のシトルリン標準物を加え、較正用物質として役立てた。リン酸カルバモイル、オルニチンおよびトリエタノールアミンを含むリアクションミックスを各ウェルに加え、３０分間、３７℃で反応を進行させた。リン酸と硫酸の混合物を使用して反応を停止させ、各ウェルにジアセチルモノオキシムを加えた。３０分間、８５℃でプレートをインキュベートし、簡単に冷却し、分光光度計で４９０ｎｍで読み取った。
【０１８３】
マウス尿中のオロチン酸定量
動物の尿サンプルからのオロチン酸の定量は、イオン交換カラムを使用した超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）で行われた。簡潔に記載すると、尿サンプルを、ＲＮａｓｅフリー水を使用して２倍に希釈し、一部をＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  １００ｘカラムにローディングした。アセトニトリルと２５ｍＭ酢酸アンモニウムを含む移動相によりオロチン酸が分離され、２８０ｎｍの吸光度に基づいた検出でオロチン酸が定量された。
【０１８４】
マウス血漿中のアンモニア定量
全血の分注物をリチウムヘパリン血漿管に集め、血漿へと処理した。新鮮な血漿サンプルを、ＩＤＥＸＸ  Ｃａｔａｌｙｓｔ  Ｄｘアナライザーを使用して分析した。
【０１８５】
結果
治療マウスの肝臓におけるＯＴＣタンパク質の検出は、免疫組織化学法（たとえばウェスタンブロット）を使用して行われた。図１に示されるように、２４時間、７２時間、８日、１１日および１５日に外因性ヒトＯＴＣタンパク質が検出された。
【０１８６】
さらに、カスタムのｅｘ  ｖｉｖｏ活性アッセイを使用したシトルリン産生値の測定により示されるように、ｍＲＮＡ由来ｈＯＴＣタンパク質は酵素的にも活性であることが示された。ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡを担持した脂質ナノ粒子によりマウスにおいて産生されたｈＯＴＣタンパク質は、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の０．５ｍｇ／ｋｇ単回投与後２週間にわたり活性であった（図２Ａ）。図２Ｂに示されるように、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子の０．５ｍｇ／ｋｇ単回投与により、最小治療標的範囲である正常活性の１０〜１５％を上回るｈＯＴＣタンパク質活性が生じた。さらに投与後２週で示された活性は、バックグラウンドレベルのおよそ３倍のシトルリン値をもたらした。
【０１８７】
複数のｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子製剤を使用した場合、ｓｐｆａｓｈマウスにおいてもｍＲＮＡ由来ｈＯＴＣタンパク質が産生された（図３Ａおよび図３Ｂ）。２つの別個の製剤が上述の方法を使用して作製された。それぞれ異なる量の脂質とともにＣＯ−ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡが封入されている。Ｎ：Ｐ  ４製剤は、Ｎ：Ｐ  ２製剤の２倍の総脂質を使用した。また、ナンセンス突然変異型ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡが組み込まれた類似の対照製剤（ＳＴＯＰ  Ｎ：Ｐ  ２およびＳＴＯＰ  Ｎ：Ｐ  ４）は、ｓｐｆａｓｈに投与された際、検出可能なｈＯＴＣタンパク質をまったく産生しなかった。それとは別に、本実験における別の対照治療として生理食塩水を使用した。単離した肝臓をホモジナイズし、上述のようにｈＯＴＣタンパク質の産生と活性を決定した。図３Ａおよび図３Ｂは、各群の代表的なマウス肝臓の免疫ブロット分析を示す。ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡを含む製剤の両方とも、ヒトＯＴＣタンパク質の陽性検出が観察された。ナンセンスｍＲＮＡを基にした対照群または生理食塩水治療した（未治療の）マウスのいずれに対してもｈＯＴＣタンパク質は観察されなかった。
【０１８８】
図４は、各群で観察されたｈＯＴＣ活性を示す。ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰで治療された群の両方で実質的なｈＯＴＣ活性が観察された一方、ナンセンス突然変異型ｍＲＮＡ対照群においては、生理食塩水治療（未治療）マウスと比較し、活性の上昇は測定されなかった。この活性は、ＬＮＰ送達されたｈＯＴＣ  ｍＲＮＡに由来する活性タンパク質の産生が成功したことに起因し得る。図４は、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡは、シトルリンを産生することができる活性ｈＯＴＣタンパク質を産生した一方で、検出可能なｈＯＴＣタンパク質を産生しない対照製剤は、バックグラウンドレベルを超えるシトルリン産生活性を全く示さなかったことを示す。
【０１８９】
さらに、治療マウスの尿中オロチン酸値の正常化により、本疾患モデルにおける有効性が示された。具体的には、すべての製剤（および生理食塩水対照の「未治療」）の投与の２４時間後に尿サンプルを取得し、オロチン酸を定量測定した。ｓｐｆａｓｈマウスにおけるｍＲＮＡ由来ｈＯＴＣタンパク質の活性は、ＯＴＣ欠損症の公知のバイオマーカーであるオロチン酸をモニタリングすることにより決定された（図５）。ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子で治療されたマウスにおいて、尿中オロチン酸値の明白な低下が観察された一方、ナンセンス突然変異型ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡを含む対照製剤がマウスに投与された場合には、オロチン酸の有意な低下は観察されなかった。
【０１９０】
別の実験において、２つの投与量レベル（０．５０ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ）で、２つの異なるｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤（Ｎ／Ｐ＝２、Ｎ／Ｐ＝４）を用いて、ｓｐｆａｓｈを治療した。被験物質は単回静脈内投薬として投与された。図６Ａに示されるように、（投与後）２４時間後、マウスにアンモニアチャレンジが行われた。チャレンジは、塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）のボーラス注入が腹腔内投与された。これは、ＯＴＣ欠損症に罹患する患者が経験するであろう、高アンモニア血症の発現を表現するために行われた。ＮＨ４Ｃｌチャレンジの４０分後、血漿アンモニア値がモニタリングされた。
【０１９１】
図６Ｂは、治療マウスの血漿アンモニア値と、未治療ｓｐｆａｓｈマウスならびに野生型マウスの両方の血漿アンモニア値を比較している。野生型（未治療）アンモニア値に対して標準化した場合、ｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ  ＬＮＰ製剤のすべての投与量で、高アンモニア血症発現の完全な阻止が達成された。未治療ｓｐｆａｓｈマウスは、同一条件下で血漿アンモニア値の著しい上昇を示した。この結果が、これらマウスの肝臓における活性ｈＯＴＣタンパク質の存在に起因することを確認するために、肝臓を採取し、ＯＴＣ活性を分析した（図７）。全ての投与量で、野生型活性レベルと比較し、正常活性の３５〜１０３％の範囲の活性レベルがもたらされた。
【０１９２】
実施例３．  ＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持リポソームナノ粒子の複数回投与
本実施例は、延長期間にわたるＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持リポソームナノ粒子の投与方法の例、および様々な標的組織における、ｉｎ  ｖｉｖｏのＯＴＣ  ｍＲＮＡ分析法の例を解説する。
【０１９３】
本実験は、ｓｐｆａｓｈマウスを使用して行われた。複数回投与の形式であることを除き、実施例２に記載されるようにマウスを治療した。具体的には、０．６０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与されるｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持ＬＮＰを、毎週８回投与することを含む、複数回投与実験をｓｐｆａｓｈマウスにおいて行った。マウスのコホートを各週で安楽死させ、肝臓をｈＯＴＣ活性に関して分析し、野生型のＯＴＣ活性レベルと比較した。被験物質は耐容性良好であり、肝臓酵素はすべての投与量に対し正常範囲内で維持された。図８は、これら治療マウスにおいて産生されたヒトＯＴＣ活性を、野生型レベルの割合として示す。野生型レベルの少なくともおよそ３６％のレベルが、投薬した８週間すべてで維持された。
【０１９４】
１．０ｍｇ／ｋｇの投与量のｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持ＬＮＰが毎週４回動物に投与されたことを除き、追加の複数回投与実験が実施例２に記載されるように行われた。図９Ａは、１．０ｍｇ／ｋｇの投与量でｈＯＴＣ  ｍＲＮＡ担持ＬＮＰを毎週投与されたｓｐｆａｓｈマウスにおける、これら治療マウスで産生されたヒトＯＴＣの活性を、野生型レベルの割合として示す。複数回投与の治療計画により、３週間にわたり、ＯＴＣ欠損症マウスにおいて治療効果のあるレベルの活性ｈＯＴＣタンパク質が産生された。図９Ｂに示されるように、外因性ヒトＯＴＣタンパク質は、１日目、８日目、１５日目、２２日目に検出された。
【０１９５】
均等
当業者は、日常的な実験手法を越えない手法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等を認識するか、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることは意図されず、むしろ以下の特許請求の範囲に記述されるとおりである。
【図１】
2019522047.tif 000012
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
2019522047.tif 000018
【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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