(57)【要約】  本発明は、ｅｘ  ｖｉｖｏでの樹状細胞療法においてカチオン性脂質を含むあるクラスの脂質を用いることを包含する。カチオン性脂質は、抗原の取り込み、プロセシング、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ提示経路を介した、それぞれ樹状細胞によるＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞に対するプロセシングされた抗原の提示をそれぞれ亢進する。樹状細胞によってカチオン性脂質を介して抗原が取り込まれると、腫瘍において免疫抑制性調節性Ｔ細胞の集団が大幅に減少し、腫瘍を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞が大幅に増加する。調節性Ｔ細胞がなくなり、腫瘍特異的細胞傷害性細胞が増加すると、腫瘍の有効な除去に資することになる。
2019500021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された樹状細胞の集団と、
少なくとも１つのカチオン性脂質と、
少なくとも１つのペプチド抗原と、を含む、ワクチンを製造するための組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つのペプチド抗原は、自己会合複合体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの抗原は、疎水性が高められたアミノ酸を有する、修飾されたタンパク質、リポタンパク質、リポペプチド、ペプチドまたはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも１つの抗原は、癌または腫瘍関連抗原を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの抗原は、患者における遺伝子のタンパク質産物を含み、前記遺伝子は、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、変異を有する遺伝子、腫瘍細胞に特有の再構成を有する遺伝子、再活性化胚遺伝子産物、癌胎児性抗原、組織特異的分化遺伝子、成長因子受容体、および細胞表面タンパク質遺伝子からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１つの抗原は、微生物抗原を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記微生物抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、および微生物抗原の天然単離物、断片、およびその誘導体からなる群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
複数の抗原を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも１つの抗原は、非免疫原性のペプチドまたは免疫原性が乏しいペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのカチオン性脂質は、リンカーによって前記少なくとも１つの抗原と構造的に結合している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記リンカーは、セリン−セリンのジペプチドリンカーである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記カチオン性脂質は、前記抗原をカプセル封入する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記カチオン性脂質は、リポソームを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記カチオン性脂質および前記抗原は、エマルジョンである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのカチオン性脂質は、Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＤＤＡ、およびＤＯＴＭＡからなる群から選択される、請求項１〜１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記カチオン性脂質は精製されている、請求項１〜１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記カチオン性脂質はエナンチオマーである、請求項１〜１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記カチオン性脂質はナノ粒子を形成する、請求項１〜１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ナノ粒子は直径が約１０，０００ｎｍ未満である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
樹状細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで活性化する方法であって、
単離された樹状細胞を得る工程と、
単離された樹状細胞を、有効量の少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つの抗原とを含む組成物で処理する工程と、
を含み、
前記単離された樹状細胞を処理するによって、前記単離された樹状細胞が活性化される、方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのカチオン性脂質は、Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＤＤＡ、およびＤＯＴＭＡからなる群から選択され、
前記少なくとも１つの抗原は癌抗原である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記樹状細胞を、少なくとも成長因子または少なくともサイトカインまたはそれらの組み合わせで処理する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離された樹状細胞はヒトである、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのサイトカインはＧＭＣＳＦである、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
癌ワクチンの製造に使用するために樹状細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで活性化する方法であって、
単離された樹状細胞を得る工程と、
前記単離された樹状細胞を、
有効量の少なくとも１つのカチオン性脂質と、
少なくとも１つの癌抗原と、
少なくとも成長因子または少なくともサイトカインまたはそれらの組み合わせと、
を含む組成物で処理する工程と、
を含み、
前記樹状細胞を処理することによって、前記樹状細胞が活性化される、方法。
【請求項２６】
前記樹状細胞は、ヒト樹状細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１つのサイトカインはＧＭＣＳＦである、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
癌樹状細胞ワクチンを製造するための方法であって、
単離された樹状細胞を得る工程と、
前記単離された樹状細胞を、
有効量の少なくとも１つのカチオン性脂質と、
少なくとも１つの癌抗原と、
少なくとも成長因子または少なくともサイトカインまたはそれらの組み合わせと、
を含む組成物で処理する工程と、
を含み、
前記樹状細胞を処理することによって、前記樹状細胞が活性化される、方法。
【請求項２９】
前記樹状細胞を成長因子およびＧＭ−ＣＳＦで処理することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
癌患者において治療免疫応答を高めるための方法であって、
単離された樹状細胞を得る工程と、
前記単離された樹状細胞を、
有効量の少なくとも１つのカチオン性脂質と、
少なくとも１つの癌抗原と、
少なくとも成長因子または少なくともサイトカインまたはそれらの組み合わせと、
を含む組成物で処理する工程と、
を含み、
前記樹状細胞を処理することによって、前記樹状細胞が活性化される、方法。
【請求項３１】
癌患者を治療するための方法であって、
単離された樹状細胞を得る工程と、
前記単離された樹状細胞を、
有効量の少なくとも１つのカチオン性脂質と、
少なくとも１つの癌抗原と、
少なくとも成長因子または少なくともサイトカインまたはそれらの組み合わせと、
を含む組成物で活性化する工程と、
それによって活性化された樹状細胞を作製する工程と、
適切な数の活性化された樹状細胞を前記患者に投与する工程と、
を含み、
前記適切な数の活性化された樹状細胞を投与することによって、前記癌の前記患者が治療される、方法。
【請求項３２】
前記組成物中の前記少なくとも１つの抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルを周期的に確認する工程と、
前記樹状細胞を前記患者に投与した後に続いて、前記患者におけるＴｒｅｇ細胞のレベルを確認する工程と、
をさらに含み、
抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルが高く、Ｔｒｅｇ細胞のレベルが低いことが、前記患者に対し、前記癌を効果的に治療していることを示す、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記カチオン性脂質は、Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＤＤＡ、およびＤＯＴＭＡからなる群から選択される、請求項２８、３０、３１または３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
腫瘍微小環境を変化させるための、腫瘍抗原と組み合わせた、カチオン性脂質の使用。
【請求項３５】
前記腫瘍微小環境を変えることとは、免疫抑制性調節性Ｔ細胞の集団を減少させることである、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記腫瘍内の免疫抑制性調節性Ｔ細胞の集団が減少し、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞または両方の集団が増加する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
効果的な免疫療法に対して重要な３つの機能である、ｉ）前記抗原の、ＭＨＣクラスＩによるＣＤ８＋Ｔ細胞と、ＭＨＣクラスＩＩによるＣＤ４＋Ｔ細胞と、に対する提示、ｉｉ）Ｔ細胞の増殖とＴ細胞の活性化を促進する前記サイトカインおよびケモカインの誘導、ｉｉｉ）腫瘍に浸潤するＴ細胞の誘導、ｉｖ）前記腫瘍微小環境内における前記免疫抑制性細胞集団の低減、の各々を行うための、カチオン性脂質系ワクチンの使用。
【請求項３８】
前記免疫抑制性細胞集団は前記Ｔｒｅｇ集団である、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原特異的Ｔ細胞応答を亢進させるための、タンパク質およびペプチド系樹状細胞ワクチンにおけるカチオン性脂質の使用。
【請求項４０】
前記カチオン性脂質は、Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＤＤＡ、およびＤＯＴＭＡからなる群から選択される、請求項３４〜３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記カチオン性脂質は、少なくとも１つの癌ペプチド抗原との組み合わせである、請求項３４〜３９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
【０００２】
本国際出願は、２０１５年１１月１３日に出願された米国特許仮出願第６２／２５４，７９４号および２０１６年１０月５日に出願された米国特許仮出願第６２／４０４，５０４号の優先権の利益を主張するものであり、その内容全体を本明細書に援用する。
【０００３】
本発明は、癌における樹状細胞療法に関する。１０年以上にわたって、ｅｘ  ｖｉｖｏで自家培養された造血前駆細胞または単球由来樹状細胞（ＤＣ）の養子移入が癌ワクチンとして試験されている。これらの研究は、樹状細胞ワクチンが安全であり、腫瘍抗原に特異的で体内を循環するＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘導できることを示唆している。客観的な臨床応答が観察された患者もいた。臨床応答が成立するには時間を要するものの、非常に長期間にわたって寛解が続く可能性があることが確立されている。前臨床抗腫瘍研究では、動物から単離し、ｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍抗原を負荷した上で細胞療法として投与されたＤＣが、予防効果と治療効果の両方を誘導することが示されている。
【０００４】
ＤＣの抗原提示特性の研究によって、近年、効果的な癌免疫療法の開発において有望であることが示され、近時における複数の臨床試験で有望な結果が得られている。転移性前立腺癌をｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔで治療したところ、第ＩＩＩ相治験で生存期間の中央値が約４ヶ月間長くなった。ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標））は、患者から採取し、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）とＧＭ−ＣＳＦの融合タンパク質を用いて培養した、濃縮血液から得られた樹状細胞をベースにした細胞の製品である。樹状細胞は、それから静脈への注入（静注）によって患者に戻す。このプロセスをさらに２回、２週間おきに繰り返し、患者に３用量の細胞が投与されるようにする。ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔは、転移性前立腺癌の治療用で米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の認可を受けたことで、次世代の細胞免疫療法製品の臨床開発および規制への道を切り開いた。腫瘍抗原ペプチドを負荷した活性化ＤＣのワクチンを受けた転移性黒色腫患者に、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示した患者がいた。このように有望視されていたにもかかわらず、臨床応答は思ったほどではなく、昔からの客観的な抗腫瘍応答率もかろうじて１５％を超えるくらいであった。
【背景技術】
【０００５】
樹状細胞療法は、癌をはじめとする様々な衰弱性疾患を治療するための有望な手法である。この手法によって、患者に合わせてカスタマイズされ、パーソナライズされた治療法の開発が可能になる。たとえば、特定の癌に対する特異的なタンパク質抗原を使用するのではなく、治療のために患者の腫瘍から抗原を得て患者自身の樹状細胞に負荷することができる。ｅｘ  ｖｉｖｏで樹状細胞療法を用いる手法は、治療後２年目の患者において持続的な免疫応答を示した承認済製品で、有意な前途を示すことがわかっている。しかしながら、治療結果は最良には至らず、これらの治療法を改善するための手法がいくつか研究されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
重要な問題のひとつに、ＤＣを負荷するための腫瘍抗原の選択がある。候補となる抗原には、特異的な（変異）抗原と、非特異的な非変異自己抗原が含まれる。広く適用可能な治療法を生み出すには、ネガティブセレクションによって高親和性のクローンの集団が除去されるとしても、非変異自己抗原が最も好ましい。変異抗原を使用すると、この欠点を回避することができるだろう。ＲＮＡシークエンシング技術が開発されたことは、全範囲の原発腫瘍由来の変異抗原および転移腫瘍由来の変異抗原を決定する一助となっており、これによって治療を特定の患者に合わせることができるようになっている。
【０００７】
ペプチドまたはタンパク質抗原、および腫瘍由来の自己抗原では、ＤＣワクチンの適用を成功させる上で制約となる重要な要因は、利用できる抗原の量であることが非常に多い。克服すべき技術的な障壁のひとつは、樹状細胞に対してこれらの抗原を効果的に提示し、ＭＨＣクラスＩ（ＣＤ８＋Ｔ細胞）およびＭＨＣクラスＩＩ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）による一層効果的な提示を可能にすることである。これも依然として最良には至らない、得られるＴ細胞応答の効力と安定性に直接的に影響する。
【０００８】
ＤＣは、抗原を交差提示することもできる。交差提示とは、外来性の可溶性タンパク質またはペプチドが抗原提示細胞に取り込まれる経路のことであり、タンパク質が分解されＭＨＣクラスＩＩとともに提示される経路に入るのではなく、ペプチドまたはタンパク質がＭＨＣクラスＩのプロセシング経路に入る経路をいう。これは、細胞質内の経路またはエンドソーム内の経路の２つの方法で起こり得る。どちらの経路でも、タンパク質はまず、エンドソーム／ファゴソームに取り込まれる。細胞質内の経路では、部分的に分解されたエンドソームのタンパク質の一部が最終的に細胞質に入る。そのメカニズムはほとんど理解されていないが、エンドソームのタンパク質がプロテアソームでプロセシングされ、これによって生じるペプチドがＴＡＰによって輸送されて、ＭＨＣクラスＩと結合するための小胞体または他のエンドソームのいずれかに入る。あるいは、タンパク質がエンドソームで分解されて、ペプチドがエンドソームに存在するＭＨＣクラスＩに結合することもある。この後者の経路は、プロテアソーム非依存的で、エンドソームのプロテアーゼによる正しいペプチドの偶然の産生に依るため、非効率である。タンパク質分解活性が限られている初期エンドソームへのタンパク質の侵入は交差提示に有利であるのに対し、タンパク質分解活性のレベルが高い後期エンドソームは、交差提示を阻害する場合がある。
【０００９】
上記の考察から、エンドソーム経路、特に初期エンドソーム経路に入るタンパク質がＭＨＣクラスＩ上で交差提示され得ることは明らかである。また、交差提示の程度は、初期エンドソームに取り込まれるタンパク質／ペプチドの量、およびその後に細胞質に運ばれる抗原断片の量に依存することになる。ＤＣスカベンジャー受容体に結合する可溶性タンパク質は、交差提示することができる。古典的な例は、マンノース受容体に結合するオボアルブミンである。しかしながら、タンパク質／ペプチドにすでに導入されている標的受容体への手法は様々であって、全てがＤＣスカベンジャー受容体に結合するわけではない。これらの経路には、Ｆｃ受容体、ＣＤ２０５などの様々なＣ型レクチン受容体、ＣＤ２０７、ＣＬＥＣ９ａ、インテグリンまたは糖脂質を標的とすることが含まれる。これらの手法には、いくつかの欠点がある。抗原を特定の受容体結合タンパク質、通常はモノクローナル抗体に結合する必要があり、非常に面倒な手法になる。タンパク質の取り込み量は、起こり得る受容体の細胞内への取り込みの量に限定され、いったん取り込まれると、限定的ではあるが細胞質へ放出される。ＤＣ受容体の中には後期エンドソームを標的とするものがあり、そのため結果的に、交差提示が非効率的になってしまう。最後に、ヒトＤＣサブセット上での交差提示型ＤＣ受容体の分布は、ほとんど理解されておらず、このことは、そのような技術の設計を困難にしている上、マウスでの研究をヒトにうまく置き換えられない理由の説明となり得る。もう少し特異性の低い別の手法として、可溶性抗原をナノ粒子に付着させて微粒子の形に変換する手法がある。この手法は、十分な抗原を運ぶのが困難であること、ＤＣが成熟しリンパ節に運ばれるにつれて貪食能力を失うという事実に悩まされている。
【００１０】
本出願によって、ペプチド系ＤＣワクチン、および抗原が腫瘍に由来する自家ＤＣワクチンの開発において、樹状細胞による抗原の取り込みが抗原量に大きく依存することを証明する。この樹状細胞による取り込みを促進し、重要な抗原の交差提示を促進するために、カチオン性脂質を安全に使用することができる。
【００１１】
したがって、本出願は、ＤＮＡ／ＲＮＡによらない樹状細胞ワクチンの開発に焦点を当て、ＤＣに対する毒性を限定的なものにしながら、ＤＣによる抗原の取り込みとプロセシングを向上させるようなワクチンの開発を容易にする手段を示す。
【００１２】
免疫療法を成功させる上でのさらに別の重大な障害が、抗腫瘍細胞溶解性Ｔ細胞応答を妨げる様々な免疫抑制機構を進める主役である、腫瘍の抑制的微小環境である。この作用は、「免疫回避」または「免疫寛容化」と呼ばれてきた。末期の腫瘍に存在する阻害効果を避けるために、最小限の残存病変と高い再発リスクを有し、アジュバントを投与された患者で臨床試験が行われた［Ｓｅａｒｓ  ＡＫ，  Ｐｅｒｅｚ  ＳＡ，  Ｃｌｉｆｔｏｎ  ＧＴ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＥ３７：  ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ−ｅｌｉｃｉｔｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎｅ    ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２０１１；  １１（１１）：  １５４３−１５５０］。この臨床的な設定におけるワクチン接種を支える合理的な点は、腫瘍負荷が最小限の患者に、確実な抗腫瘍応答をすることができる十分な能力のある免疫系を依然として持たせることにある。さらに、初期の癌またはアジュバント投与におけるワクチン接種には、Ｔ細胞が不活性化され得る免疫抑制性腫瘍環境内でのＴ細胞の蓄積を最小限に抑えるという利点がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明のある例示的な態様を以下に示す。これらの態様は、本発明がとりうる形態の簡単な概要を読者に提供するためだけに提示され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。実際、本発明は、以下に明示的に記載されていない多種多様な態様を包含することができる。
【００１４】
本明細書に記載の一実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏでの樹状細胞活性化のための組成物が提供される。この組成物は、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つの抗原とを有する１つ以上の脂質を含む。この組成物は、他の脂質ならびに、樹状細胞の生存率および増殖を亢進させるための成長因子を含んでもよい。
【００１５】
ｅｘ  ｖｉｖｏでのＤＣ活性化のための組成物は、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つの抗原とを有する１つ以上の脂質を含み、抗原は、腫瘍または癌において見られるタンパク質またはポリペプチドである。あるカチオン性脂質は、受容体に依存しない形で樹状細胞に速やかに結合する能力において独特であり、速やかに初期エンドソームに取り込まれる。重要なことに、一旦初期エンドソームに入ると、カチオン性脂質は、クラスＩのプロセシング経路に入るためのエンドソームの不安定化と内容物の細胞質への放出を助長する。これによって、標的となる受容体の取り込みで生じるであろうよりもかなり多くのエンドソーム内容物を細胞質に放出できるようになる。また、適切なカチオン性脂質は、Ｔ細胞を活性化および増殖させ、Ｔ細胞のリンパ節への移動を引き起こす、あるサイトカインおよびケモカインの産生を誘導する免疫学的危険信号（Ｄａｎｇｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ）を提供することもできる。また、適切なカチオン性脂質は、好ましくは腫瘍抗原との併用時に、腫瘍微小環境内のＴｒｅｇ細胞の集団を減少させることができる。
【００１６】
別の実施形態では、対象が哺乳動物である、ｅｘ  ｖｉｖｏで対象の樹状細胞を処理する方法が提供される。この方法は、有効量の少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つの抗原とを含む１つ以上の脂質で樹状細胞を処理する工程を含む。また、この組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の維持と増殖を助長するためのＧＭ−ＣＳＦおよびサイトカインなどの成長因子も含む。少なくとも１つの抗原は癌抗原である。
【００１７】
癌ＤＣワクチンの製造方法が提供される。この方法は、有効量の少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つの抗原とを含む１つ以上の脂質で樹状細胞を処理する工程を含む。また、この組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の維持と増殖を助長するためのＧＭ−ＣＳＦおよびサイトカインなどの成長因子も含む。
【００１８】
腫瘍微小環境内のＴｒｅｇ集団の大幅な減少を誘導しながら、高レベルの腫瘍浸潤Ｔ細胞を誘導することができる癌ＤＣワクチンの製造方法が提供される。この方法は、有効量の少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つの抗原とを含む１つ以上の脂質で樹状細胞を活性化する工程を含む。また、この方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の維持と増殖を助長するためのＧＭ−ＣＳＦおよびサイトカインなどの成長因子でＤＣをさらに活性化することを含む。カチオン性脂質を腫瘍抗原と組み合わせてｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＣの活性化に使用し、その後、癌を有する対象にＤＣを注入すると、ＤＣは、腫瘍微少環境内の腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔの量を増加させることにより、腫瘍微小環境を変化させるとともに、Ｔｒｅｇ集団を大幅に減少させることができる。その結果、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＴｒｅｇの比が大幅に小さくなる。
【００１９】
有効量の少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つの抗原とを含む１つ以上の脂質で前処理されたＤＣを患者に投与する工程を含み、抗原が癌抗原である、ＤＣワクチンで対象を免疫する方法が提供される。この方法は、対象を２回以上免疫することを含む。この方法は、免疫後の対象における癌特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルおよびＴｒｅｇ細胞のレベルを確認することを含む。
【００２０】
さらに別の実施形態では、哺乳動物において予防用または治療用の免疫応答を高める方法が提供される。この方法は、場合によってはＧＭ−ＣＳＦおよびサイトカインなどの成長因子とともに有効量の少なくとも１つのカチオン性脂質と抗原とを含む１つ以上の脂質で樹状細胞を活性化する工程と、活性化した樹状細胞を哺乳動物に投与する工程とを含む。様々な実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【００２１】
本発明の一実施形態は、ｅｘ  ｖｉｖｏで樹状細胞と組み合わせて投与される場合、腫瘍由来抗原ならびにタンパク質抗原およびペプチド抗原の取り込みおよび提示を促進するためのカチオン性脂質の使用に関する。この実施の、樹状細胞に対する毒性は限定的であって、樹状細胞の生存率と成長を維持し、その増殖を促進することが意図されている増殖因子およびサイトカインの存在下で使用することができる。
【００２２】
カチオン性リポソームは、遺伝子治療で使用するためのＲＮＡおよびＤＮＡのトランスフェクションおよび送達ならびに、ＤＮＡ系樹状細胞ワクチンにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで広く使用されている。最近、カチオン性脂質は、ＭＡＰキナーゼの活性化を通じて強い免疫応答を刺激することができる強力なアジュバントであることも報告されている。
【００２３】
カチオン性脂質は、受容体に依存しない形で樹状細胞に速やかに結合する能力において独特であり、速やかに初期エンドソームに取り込まれる。重要なことに、一旦初期エンドソームに入ると、カチオン性脂質は、クラスＩのプロセシング経路に入るためのエンドソームの不安定化と内容物の細胞質への放出を助長するようである。これにより、エンドソーム含有量のより多くが、標的受容体取り込みで生じるよりも、細胞質に放出されることが可能になる。これによって、標的になる受容体の取り込みで生じるであろうよりもかなり多くのエンドソーム内容物を細胞質に放出できるようになる。
【００２４】
本発明の一実施形態では、本開示は、カチオン性脂質が、樹状細胞の成熟を誘導するのにアジュバントを使用するといった現行の手法よりも数桁多くのタンパク質がＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ経路に入るのを助長することができることを示す。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、ｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍に対するＤＣワクチンを調製するために必要な、カチオン性脂質と特定の腫瘍抗原とを含む組成物を提供する。
【００２６】
一実施形態では、腫瘍に対するＤＣワクチンを調製するために必要な組成物は、非核酸抗原、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、リポタンパク質またはリポペプチドを含む。
【００２７】
一実施形態では、抗原は腫瘍抗原または変異腫瘍抗原である。抗原は、患者の遺伝子のタンパク質産物であり、遺伝子は、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、変異を有する遺伝子、腫瘍細胞に特有の再構成を有する遺伝子、再活性化胚遺伝子産物、癌胎児性抗原、組織特異的分化遺伝子、成長因子受容体、および細胞表面タンパク質遺伝子からなる群から選択される。
【００２８】
一実施形態では、抗原は、微生物抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原または微生物抗原の天然単離物、断片およびその誘導体である。
【００２９】
一実施形態では、抗原はウイルス抗原である。
【００３０】
一実施形態では、ＤＣワクチンを製造するための、ＤＣを刺激または活性化する組成物は、複数のペプチド抗原を含む。
【００３１】
一実施形態では、ＤＣワクチンを製造するための、ＤＣを刺激または活性化する組成物は、自己会合複合体であるペプチド抗原を含む。
【００３２】
一実施形態では、カチオン性脂質と抗原とは、化学結合によって構造的に結合していない。
【００３３】
一実施形態では、カチオン性脂質と抗原とは、化学結合によって結合している。
【００３４】
一実施形態では、カチオン性脂質と抗原とはリンカーによって結合している。
【００３５】
一実施形態では、カチオン性脂質は抗原をカプセル封入する。
【００３６】
一実施形態では、カチオン性脂質はリポソームを形成する。
【００３７】
一実施形態では、カチオン性脂質および抗原はエマルジョンを形成する。
【００３８】
一実施形態では、カチオン性脂質はタンパク質またはペプチド抗原の取り込みを促進する。
【００３９】
一実施形態では、ＤＣワクチンの開発過程においてＤＣを取り込んで刺激するための、組成物のペプチドまたはタンパク質抗原をさらに修飾して、抗原の疎水性を低下させる。抗原の疎水性は、たとえば、カチオン性脂質の疎水性アシル鎖における抗原の溶解性を改善するために、脂質鎖または疎水性アミノ酸に結合させることによって、分子の抗原特性を維持しながら高めることができる。
【００４０】
修飾された抗原は、アミノ酸配列の疎水性が高められた、修飾されたリポタンパク質、リポペプチド、タンパク質またはペプチド、それらの組み合わせであってもよい。
【００４１】
修飾された抗原は、脂質と抗原との間にリンカーを結合させることができ、たとえば、セリン−セリンのジペプチドリンカーを介してＮ末端αまたはε−パルミトイルリジンを抗原に結合することができる。
【００４２】
一実施形態では、カチオン性脂質は、Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＤＤＡ、およびＤＯＴＭＡを含む。カチオン性脂質は無毒であり、抗原の内在化とＤＣ成熟を促進することができる。より具体的には、カチオン性脂質は、樹状細胞による抗原の内在化のみならず、そのプロセシング、細胞質への侵入、その後のｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＨＣクラスＩおよびＩＩ経路による提示の亢進を促進することができる。これによって、抗原特異的免疫応答が改善される。
【００４３】
別の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰである。
【００４４】
さらに別の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡである。
【００４５】
別の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＥＰＣである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は精製されている。
【００４７】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質はエナンチオマーである。
【００４８】
いくつかの実施形態では、エナンチオマーは精製されている。
【００４９】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質とタンパク質抗原とを含む組成物は、ＤＣ癌ワクチンの製造におけるＤＣ取り込みのための粒子状組成物を形成する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質とタンパク質抗原とを含む組成物は、ＤＣ癌ワクチンの製造におけるＤＣ取り込みのためのナノ粒子組成物を形成する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、直径が約１０，０００ｎｍ未満である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、本発明は、単離された樹状細胞を、有効量の少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つの癌抗原とを含む１つ以上の脂質でｅｘ  ｖｉｖｏにて処理することを含む、癌樹状細胞ワクチンを製造する方法を提供する。抗原。
【００５３】
よって、本開示は、単離された樹状細胞を得て、（ａ）有効量の少なくとも１つのカチオン性脂質と、（ｂ）少なくとも１つの癌抗原と、（ｃ）少なくとも成長因子または少なくともサイトカインまたはそれらの組み合わせと、を含む組成物で、単離された樹状細胞を活性化することによって、活性化された樹状細胞を作製し、適切な数の活性化された樹状細胞を患者に投与することを含み、適切な数の活性化された樹状細胞を投与することによって、癌患者を治療する、癌患者を治療するための方法を提供する。
【００５４】
また、本開示は、組成物中の少なくとも１つの抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルを周期的に確認することを含む、上記の方法による癌患者の治療の成功を評価する方法であって、評価工程は、組成物中の少なくとも１つの抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルを周期的に確認し、樹状細胞を患者に投与した後に患者におけるＴｒｅｇ細胞のレベルを確認することを含み、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルが高く、Ｔｒｅｇ細胞のレベルが低いことが、患者に対して癌を効果的に治療していることを示す、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】蛍光オボアルブミンを取り込んでいる細胞によって放射される幾何平均蛍光強度。２元ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意性を評価したところ、＊値は処理間で有意に異なっていた。
【図２】ＤＣによって取り込まれ、プロセシングされたＤＱ−ＯＶＡの量を表す、ゲートされたＣＤ１１ｃ陽性細胞の緑色蛍光の平均蛍光強度。
【図３】表記の濃度でのＤＯＴＡＰの存在下におけるＤＣおよびＴＣ１細胞によるＤＱ−ＯＶＡの取り込みを示す平均蛍光強度。
【図４】マウスＤＣによるＤＱ−ＯＶＡの取り込みおよびプロセシングを示す緑色対赤色蛍光のフローサイトメトリー分析。
【図５】ＤＯＴＡＰまたはＭＰＬの存在下におけるマウスＤＣによるＤＱ−ＯＶＡの取り込みおよびプロセシングを示す緑色対赤色蛍光。
【図６】ＤＱ−ＯＶＡの取り込みとプロセシングを示す、レーザー走査共焦点顕微鏡法およびフローサイトメトリー。
【図７】相対吸光度（５７０ｎｍ）の測定値（任意の単位）を示すベータガラクトシダーゼアッセイ。２元ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意性を評価したところ、＊値は処理間で有意に異なっていた。
【図８】ＤＯＴＡＰを含むまたは含まない場合で、ＯＶＡ刺激ＢＤＭＣの存在下でのＯＴ１細胞による３Ｈ−チミジン取り込みの平均ＣＰＭ。
【図９】ＤＯ１１．１０脾細胞およびＯＶＡｐ３２３−３３９による３Ｈ−チミジン取り込みの平均ＣＰＭ。
【図１０】ＯＶＡのみまたはＯＶＡとＤＯＴＡＰを注射したマウスの流入領域リンパ節からのＴ細胞のＣＦＳＥ希釈プロフィールのフローサイトメトリー分析。
【図１１】ＯＶＡおよび３種類のカチオン性脂質で「パルス」したＢＭＤＣの存在下でのＯＴ１  Ｔ細胞増殖。培養の最後の１８時間における３Ｈ−チミジン取り込みの平均ＣＰＭ。
【図１２】カチオン性脂質（ＲＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ）または中性脂質（ＤＯＰＣ）と混合したパルミトイル化−ＫＳＳＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドまたは等張性スクロース（２８０ｍＭ）でパルスしたＢＭＤＣでワクチン接種したマウスからのＴ細胞のＩＦＮ−  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。
【図１３】カチオン性脂質（ＲＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ）または中性脂質（ＤＯＰＣ）と混合した腫瘍関連ペプチド（ａ）、ＨＰＶ関連抗原および（ｂ）ムチン１または等張性スクロース（２８０ｍＭ）でパルスしたＢＭＤＣでワクチン接種したマウスからのＴ細胞のＩＦＮ−  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。
【図１４】Ａ：ＥＬＩＳｐｏｔによる、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞誘導に対する、ＨＰＶ１６−Ｅ７、Ｒ−ＤＯＴＡＰ／ＨＰＶ１６−Ｅ７、Ｓ−ＤＯＴＡＰ／ＨＰＶ１６−Ｅ７およびＡｌｕｍ／ＭＰＬ／ＨＰＶ１６−Ｅ７ワクチン接種による作用。Ｂ．確立されたＨＰＶ１６陽性ＴＣ−１腫瘍の退縮に対する、Ｒ−ＤＯＴＡＰ、Ｒ−ＤＯＴＡＰ／ＨＰＶ１６−Ｅ７、Ｓ−ＤＯＴＡＰ／ＨＰＶ１６−Ｅ７ワクチン接種の作用。
【図１５】フローサイトメトリーを用いて分析した、ＲＦ９特異的デキストラマーによる腫瘍浸潤ＨＰＶ１６特異的ＣＤ８＋Ｔの定量。データは、各群４〜５匹のマウスの平均＋ＳＥＭを表す。
【図１６】腫瘍のあるマウスを様々なワクチンで治療した後の腫瘍内の調節性Ｔ細胞の定量。データは、各群４〜５匹のマウスの平均＋ＳＥＭを表す。＊他のすべての群（Ｒ−ＤＯＴＡＰのみを除く）と比較した、統計的に有意なＲ−ＤＯＴＡＰ＋抗原。Ｐ＜０．０１。
【図１７】ＣＤ４５＋細胞中のＨＰＶ１６  Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＴ調節性細胞（Ｔｒｅｇ）の比である。データは、各群４〜５匹のマウスの平均＋ＳＥＭを表す。
【図１８】確立されたＴＣ−１腫瘍の退縮に対するワクチン接種の作用。＊他のすべての群と比較した、統計的に有意なＲ−ＤＯＴＡＰ＋抗原腫瘍退縮。Ｐ＜０．０１。
【図１９】ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴによる、ＣＤ８＋Ｔ細胞誘導の定量。データは、各群４〜５匹のマウスの平均＋ＳＥＭを表す。＊他のすべての群と比較した、統計的に有意なＲ−ＤＯＴＡＰ＋抗原。Ｐ＜０．０１。ダネットの多重比較試験。
【図２０】Ｒ−ＤＯＴＡＰカチオン性脂質系ワクチン接種後の流入領域リンパ節におけるＴリンパ球および全リンパ球の定量。
【図２１】ワクチン接種に応答するＭＣＰ−１およびＩＰ−１０レベルの定量。図は、ワクチン接種後１２時間、２４時間および４８時間目のＭＣＰ−１およびＩＰ−１０のレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
カチオン性脂質は、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に対する毒性が報告されていることから、遺伝子トランスフェクション剤として想定される医薬品にはほとんど使用されていない。一方、樹状細胞を含む細胞にＤＮＡおよびＲＮＡを複合化して送達するためのトランスフェクション剤としてカチオン性脂質を使用することには成功している。また、この手法は、ＤＣワクチンにおいてＲＮＡ／ＤＮＡ剤を抗原として用いる場合にこれらを送達するのに使用されている。そのような場合には、正電荷が中和され、毒性が最小限に抑えられる。
【００５７】
本明細書に記載の方法によって、タンパク質およびペプチド系樹状細胞療法を改善することが可能である。ｅｘ  ｖｉｖｏで処理する場合、Ｒ−ＤＯＡＴＰ、Ｓ−ＤＯＴＡＰ、ＤＯＥＰＣ、ＤＤＡ、ＤＯＴＭＡを含むクラスのカチオン性脂質は、毒性を限定的にする条件下で樹状細胞に投与することができ、樹状細胞による抗原の内在化のみならず、そのプロセシング、サイトゾルへの侵入、その後のｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＨＣクラスＩおよびＩＩ経路による提示を促進することができる。これによって、抗原特異的免疫応答が改善される。この効果は他の脂質に共通ではなく、むしろカチオン性脂質に特有のものであった。
【００５８】
また、この効果は、最近報告された免疫アジュバントとしてのカチオン性脂質の効果とは無関係である。なぜなら、強い（Ｒ−ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ）カチオン性脂質アジュバントと弱い（Ｓ−ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡ）カチオン性脂質アジュバントの両方ならびに、ｉｎ  ｖｉｖｏで免疫アジュバントとしての作用がないことが示されている中性脂質で同様の効果がもたらされたためである。また、Ｓ−ＤＯＴＡＰとＤＤＡのいずれも、過去に報告された研究ではｉｎ  ｖｉｖｏで効果的な抗原特異的免疫応答を誘導しなかったが、現在ではｅｘ  ｖｉｖｏで抗原プロセシングと抗原の提示を促進することが示されている。抗原の取り込み、プロセシングおよび提示を容易にすることにおけるこの効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏの条件設定する際、樹状細胞とカチオン性脂質を近接させることによって容易になることもあるが、ｉｎ  ｖｉｖｏでは必ずしも起こらない。この重要な発見によって、一層効果的なｅｘ  ｖｉｖｏでの樹状細胞療法の開発におけるカチオン性脂質の新たな用途につながっている。今日まで、カチオン性脂質のこの能力は知られていなかったため、ｅｘ  ｖｉｖｏでの樹状細胞療法でカチオン性脂質を用いてタンパク質およびペプチドの取り込みと提示を促進することは報告されていない。
【００５９】
以下、本発明の様々な実施形態を記載する。本明細書に記載の一実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏの樹状細胞治療組成物が提供される。この組成物は、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つの抗原とを有する１つ以上の脂質を含む。この組成物は、他の脂質ならびに、樹状細胞の生存率および増殖を亢進させるための成長因子を含んでもよい。
【００６０】
対象が哺乳動物である場合には、ｅｘ  ｖｉｖｏで対象の樹状細胞を治療する方法が提供される。この方法は、有効量の少なくとも１つのカチオン性脂質および抗原を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の維持と成長を容易にするために場合によってはＧＭ−ＣＳＦおよびサイトカインなどの成長因子と一緒に含む１つ以上の脂質で樹状細胞を処理する工程を含む。
【００６１】
哺乳類において予防用または治療用の免疫応答を増強する方法が提供される。この方法は、有効量の少なくとも１つのカチオン性脂質および抗原を、場合によってはＧＭ−ＣＳＦおよびサイトカインなどの成長因子と一緒に含む１つ以上の脂質で樹状細胞を処理する工程と、成熟した樹状細胞を対象に投与する工程と、を含む。様々な実施形態において、組成物は、少なくとも１つのカチオン性脂質および少なくとも１つの抗原を有する１つ以上の脂質を含む。
【００６２】
この発見によって、極めて限られた量で抗原を提示できる自己の腫瘍由来の抗原をベースにした樹状細胞ワクチンの開発と、タンパク質では極めて低用量の抗原の投与を可能にするためのペプチド系の樹状細胞ワクチンにおいて、大きな利点を提供し得る。樹状細胞ワクチンの手法は重要な将来性を示しているが、しっかりしたＴ細胞応答が欠けていることから、実施可能な癌療法としてのその有効性と用途は限られてしまっている。本開示は、カチオン性脂質の使用を限定的な毒性で使用して、自己の腫瘍由来の抗原またはタンパク質およびペプチド系抗原を利用するこのような樹状細胞ワクチンの効力を増強し得ることを証明する。
【００６３】
以下、本発明の様々な実施形態を次のとおり記載する。本明細書に記載の一実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏでの樹状細胞治療組成物が提供される。この組成物は、少なくとも１つのカチオン性脂質と少なくとも１つの抗原とを有する１つ以上の脂質を含む。この組成物は、他の脂質ならびに、樹状細胞の生存率および増殖を向上させるための成長因子を含んでもよい。
【００６４】
本発明は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩの文脈にて、樹状細胞への抗原提示ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞への提示を安全に促進するワクチン剤としてカチオン性脂質を使用できることを示す。カチオン性脂質は、高レベルの腫瘍に浸潤するＴ細胞の誘導を促進する一方、腫瘍微小環境内のＴｒｅｇ集団の有意な減少も誘導するのに有効である。これらの効果は、腫瘍細胞の非常に効果的な死滅につがるＴｒｅｇ対ＣＤ８＋Ｔ細胞比を低減することによって、腫瘍微小環境を大幅に変化させる。Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１５；１２５（９）：３４０１−３４１２の最近のレビューにおいて、Ｍｅｌｉｅｆらは、次のように述べている。「最適には至らないワクチン設計と免疫抑制性の癌微小環境は、癌の撲滅に至らない根本的な原因である。薬剤や物理的な治療は、免疫抑制性の癌微小環境を和らげることができ、化学療法、放射線、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、Ｔ細胞チェックポイントの阻害剤、選択されたＴＮＦ受容体ファミリーメンバーのアゴニスト、望ましくないサイトカインの阻害剤が含まれる。そのような免疫調節と組み合わせた治療用ワクチン接種の特異性は、将来の癌療法の開発に向けて魅力的な手段を提供する。
抗原
【００６５】
一実施形態では、カチオン性脂質は、患者自身の腫瘍由来の抗原などの自己抗原とともに投与される。別の実施形態では、カチオン性脂質は、合成ペプチド、組換えタンパク質またはＤＮＡなどの非自己抗原と組み合わせて投与される。それぞれの場合において、目的は、抗原に特異的な免疫応答を惹起することであり、その抗原とともに樹状細胞がカチオン性脂質と一緒に処理される。ｅｘ  ｖｉｖｏで処理された樹状細胞の注入時に生じるｉｎ  ｖｉｖｏでの応答は、特定の細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞またはＢ細胞の産生を含むことがあり、これらの抗原に関連する特定の疾患の予防または当該疾患に対する治療応答につながる。抗原は、どのような腫瘍関連抗原または微生物抗原であってもよく、当業者に知られた他のどのような抗原であってもよい。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「腫瘍関連抗原」は、腫瘍または癌細胞に関連し、ＭＨＣ分子の文脈において抗原提示細胞の表面で発現されると免疫応答（体液性および／または細胞性）を引き起こすことが可能な分子または化合物（たとえば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）である。腫瘍関連抗原には、自己抗原ならびに、癌に特異的に関連しないかもしれないが、それにもかかわらず動物に投与した場合に腫瘍または癌細胞の免疫応答を増強および／または低下させる他の抗原が含まれる。より具体的な実施形態を本明細書で提供する。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「微生物抗原」は、微生物の抗原であり、感染性ウイルス、感染性細菌、感染性寄生虫および感染性真菌を含むがこれらに限定されるものではない。微生物抗原は、無傷の微生物、天然の単離物、断片またはそれらの誘導体、天然に存在する微生物抗原と同一または類似の合成化合物であり、好ましくは（天然に存在する微生物抗原が得られた起源である）対応する微生物に特異的な免疫応答を誘導する。好ましい実施形態では、化合物は、天然に存在する微生物の抗原と同様の免疫応答（体液性および／または細胞性）を誘導するのであれば、天然に存在する微生物の抗原と同等である。天然に存在する微生物の抗原と同等である化合物または抗原は、たとえば、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡ、および／またはＤＮＡなど、などの当業者に周知である。天然に存在する微生物の抗原と類似である化合物の別の非限定的な例は、多糖抗原のペプチド模倣物である。
【００６８】
「抗原」という用語は、本明細書に記載されているものなどの既知の抗原または野生型抗原のペプチドまたはタンパク質類似体を包含することをさらに意図する。類似体は、野生型抗原よりも可溶性または安定性が高く、抗原を免疫学的に一層活性化する変異または修飾も含み得る。抗原は、脂質または糖部分の付加、ペプチドまたはタンパク質アミノ酸配列の変異、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の変異または当業者に知られた他の何らかの修飾など、どのような方法でも修飾することができる。抗原は、当業者に知られた標準的な方法を用いて修飾することができる。
【００６９】
同じく本発明の組成物および方法において有用なのが、所望の抗原のアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を有するペプチドまたはタンパク質であり、この場合、その相同性を有する抗原がそれぞれの腫瘍、微生物または感染細胞に対する免疫応答を誘導する。
【００７０】
一実施形態では、カチオン性脂質複合体の抗原は、腫瘍を予防または治療するためのワクチンを製造するための、腫瘍または癌に関連する抗原、すなわち腫瘍関連抗原を含む。このように、一実施形態では、本発明の腫瘍ワクチンまたは癌ワクチンは、少なくとも１つの腫瘍関連抗原の少なくとも１つのエピトープをさらに含む。別の好ましい実施形態では、本発明の腫瘍ワクチンまたは癌ワクチンは、１つ以上の腫瘍関連抗原由来の複数のエピトープをさらに含む。本発明のカチオン性脂質複合体および方法において使用される腫瘍関連抗原は、本質的に免疫原性または非免疫原性、あるいはわずかに免疫原性であり得る。本明細書に証明されるように、腫瘍関連自己抗原ですら、治療効果を得るべく本ワクチンに有利に使用することができる。これは、本組成物がこのような抗原に対する免疫寛容を破壊することができるためである。例示的な抗原としては、合成抗原、組換え抗原、外来抗原または相同性を有する抗原があげられるが、これらに限定されるものではなく、抗原の材料としては、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡ、ＤＮＡがあげられるが、これらに限定されるものではない。このような治療法の例として、乳癌、頭頸部癌、黒色腫、子宮頸癌、肺癌、前立腺癌、腸癌、あるいは免疫療法に感受性である従来技術において知られた他の癌の治療または予防があげられるが、これらに限定されるものではない。そのようなｅｘ  ｖｉｖｏでの治療法では、カプセル封入せずに抗原をカチオン性脂質と組み合わせることも可能である。
【００７１】
本発明で使用するのに適した腫瘍関連抗原としては、単一の腫瘍型の指標となり得る、いくつかのタイプの腫瘍で共有される、および／または腫瘍細胞において排他的に発現されるか正常な細胞と比較して過剰に発現される、天然に存在する分子と修飾された分子の両方があげられる。タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ペプチド、リポペプチドに加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質、ムチンの発現の腫瘍特異的なパターンも示されている。癌ワクチンに使用される例示的な腫瘍関連抗原としては、腫瘍遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、腫瘍細胞に特有の変異または再構成を有する他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化胚遺伝子産物、癌胎児性抗原、組織特異的（ただし腫瘍特異的ではない）分化抗原、成長因子受容体、細胞表面の炭水化物残基、外来性ウイルスタンパク質、多数の他の自己タンパク質があげられる。
【００７２】
腫瘍関連抗原の特定の実施形態としては、たとえば、Ｒａｓ  ｐ２１癌原遺伝子、腫瘍抑制因子ｐ５３、ＨＥＲ−２／ｎｅｕおよびＢＣＲ−ａｂｌ癌遺伝子のタンパク質産物などの変異抗原または改変抗原、ならびにＣＤＫ４、ＭＵＭ１、カスパーゼ８、ベータカテニン；ガレクチン４、ガレクチン９、炭酸脱水酵素、アルドラーゼＡ、ＰＲＡＭＥ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｒｂＢ−２およびＫＳＡなどの過剰発現抗原；アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）などの癌胎児性抗原；癌胚性抗原（ＣＥＡ）などの自己抗原およびＭａｒｔ１  ／  ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、チロシナーゼ、ＴＲＰ１およびＴＲＰ２などのメラノサイト分化抗原；ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＭＡ、ＰＳＭ−Ｐ１およびＰＳＭ−Ｐ２などの前立腺関連抗原；ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＧＡＧＥ１、ＧＡＧＥ２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、さらにはＮＹ−ＥＳＯ１、ＳＳＸ２およびＳＣＰ１といった他の癌精巣抗原などの再活性化胚遺伝子産物；  Ｍｕｃ−１およびＭｕｃ−２などのムチン；ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３などのガングリオシド、Ｌｅｗｉｓ（ｙ）およびｇｌｏｂｏ−Ｈなどの中性糖脂質および糖タンパク質；Ｔｎ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ−Ｆｒｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原（ＴＦ）およびｓＴｎなどの糖タンパク質があげられる。また、本明細書における腫瘍関連抗原としては、全細胞および腫瘍細胞溶解物ならびにその免疫原性部分、さらにはＢ細胞リンパ腫に対して用いられるＢリンパ球のモノクローナル増殖で発現される免疫グロブリンイディオタイプがあげられる。
【００７３】
腫瘍関連抗原およびそのそれぞれの腫瘍細胞標的としては、たとえば、悪性癌に対する抗原として、サイトケラチン、特にサイトケラチン８、１８、１９があげられる。上皮膜抗原（ＥＭＡ）、ヒト胚抗原（ＨＥＡ−１２５）、ヒト乳脂肪球、ＭＢｒ１、ＭＢｒ８、Ｂｅｒ−ＥＰ４，１７−１Ａ、Ｃ２６、Ｔ１６も既知の癌腫抗原である。デスミンおよび筋肉特異的アクチンは、筋原性の肉腫の抗原である。胎盤アルカリ性ホスファターゼ、β−ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、α−フェトプロテインは、栄養膜および胚細胞腫瘍の抗原である。前立腺特異的抗原は、前立腺癌の抗原、結腸腺癌の癌胎児性抗原である。ＨＭＢ−４５は、黒色腫の抗原である。子宮頸癌では、有用な抗原がヒトパピローマウイルスによってコードされている可能性がある。クロマグラニン−Ａおよびシナプトフィジンは、神経内分泌腫瘍および神経外胚葉性腫瘍の抗原である。特に興味深いのは、壊死領域を有する固形腫瘍塊を形成する攻撃的な腫瘍である。そのような壊死細胞の溶解は、抗原提示細胞のための抗原の豊富な供給源であり、したがって、本治療法には、従来の化学療法および／または放射線療法と組み合わせて有利な用途を見いだすことができる。
【００７４】
腫瘍関連抗原は、従来技術において周知の方法で調製することができる。たとえば、これらの抗原は、（たとえばＣｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４：１０５５（１９９４）に記載されているように）癌細胞の粗抽出物を調製する、抗原を部分的に精製する、組換え技術による、あるいは既知の抗原のｄｅ  ｎｏｖｏ合成によるなどの方法で、癌細胞から調製することができる。また、抗原は、対象における発現および免疫される対象の免疫系への提示に適した形態の抗原ペプチドをコードする核酸の形態であってもよい。さらに、抗原は完全抗原であってもよいし、少なくとも１つのエピトープを含む完全抗原の断片であってもよい。
【００７５】
ある種の癌の素因となることが知られている病原体由来の抗原も、本発明の癌ワクチンに有利に含むことができる。全世界での癌発生率の１６％近くが感染性病原体に起因すると推定でき、いくつかの一般的な悪性疾患は、特定のウイルス遺伝子産物が発現することで特徴付けられる。よって、癌の発生に関与する病原体由来の１つ以上の抗原を含むことで、宿主の免疫応答を拡大し、癌ワクチンの予防効果または治療効果を増す一助となり得る。本明細書で提供する癌ワクチンで使用される特に興味深い病原体として、Ｂ型肝炎ウイルス（肝細胞癌）、Ｃ型肝炎ウイルス（肝腫）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）（バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌、免疫抑制個体におけるＰＴＬＤ）、ＨＴＬＶＬ（成人Ｔ細胞白血病）、発がん性ヒトパピローマウイルス１６、１８、３３、４５型（成人子宮頸癌）、ヘリコバクターピロリ菌（Ｂ細胞胃リンパ腫）があげられる。哺乳動物、特にヒトにおいて抗原として働くことができる他の医学的に関連する微生物は、Ｃ．Ｇ．Ａ  Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ  １９８３などの文献に記載されており、その内容全体を本明細書に援用する。
【００７６】
別の実施形態では、抗原は、病原体に由来する抗原または病原体に関連する抗原、すなわち微生物抗原を含む。このように、一実施形態では、本発明の病原体ワクチンは、少なくとも１つの微生物抗原の少なくとも１つのエピトープをさらに含む。本ワクチンの標的になり得る病原体としては、ウイルス、細菌、寄生虫および真菌があげられるが、これらに限定されるものではない。別の実施形態では、本発明の病原体ワクチンは、１つ以上の微生物抗原由来の複数のエピトープをさらに含む。
【００７７】
カチオン性脂質複合体および方法において有用な微生物抗原は、固有の免疫原性を有してもよく、または非免疫原性であってもよく、あるいはわずかに免疫原性であってもよい。例示的な抗原としては、合成抗原、組換え抗原、外来抗原または相同性を有する抗原があげられるが、これらに限定されるものではなく、抗原の材料としては、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、リポタンパク質、リポペプチド、脂質、糖脂質、炭水化物、ＲＮＡ、ＤＮＡがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
例示的なウイルス病原体としては、哺乳動物、特にヒトに感染するウイルスがあげられるが、これらに限定されるものではない。ウイルスの例としては、レトロウイルス科（たとえば、ＨＩＶ−１などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶまたはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる；ならびにＨＩＶ−ＬＰなどの他の分離株など）、ピコルナウイルス科（たとえば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルスなど）、カリシウイルス科（たとえば、胃腸炎を引き起こす菌株など）、トガウイルス科（たとえば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルスなど）、フラビウイルス科（たとえば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルスなど）、コロナウイルス科（たとえば、コロナウイルスなど）、ラブドウイルス科（たとえば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルスなど）、フィロウイルス科（たとえば、エボラウイルスなど）、パラミクソウイルス科（たとえば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルスなど）、オルソミクソウイルス科（たとえば、インフルエンザウイルスなど）、ブンガウイルス科（たとえば、ハンタンウイルス、ブンガウイルス、プラボウイルス、ナイロウイルスなど）、アレナウイルス科（出血熱ウイルス）、レオウイルス科（たとえば、レオウイルス、アルボウイルス、ロタウイルスなど）、ビルナウイルス科、ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）、パルボウイルス科（パルボウイルス）、パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス科（大半のアデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ）（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）、イリドウイルス科（たとえば、アフリカ豚コレラウイルスなど）、未分類のウイルス（たとえば、海綿状脳症の病原因子、デルタ肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトであると考えられている）、非Ａ非Ｂ型肝炎の因子（クラス１＝内因的に伝染、クラス２＝非経口的に伝染（すなわち、Ｃ型肝炎）、ノーウォークウイルスおよび関連ウイルス、アストロウイルス）があげられるが、これらに限定されるものではない。
【００７９】
また、脊椎動物では、グラム陰性菌およびグラム陽性菌を本組成物および方法の標的とすることができる。このようなグラム陽性菌としては、パスツレラ種、ブドウ球菌種、ストレプトコッカス種があげられるが、これらに限定されるものではない。グラム陰性菌としては、大腸菌、シュードモナス種、サルモネラ種があげられるが、これらに限定されるものではない。感染性細菌の具体例として、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｂｏｒｅｌｌａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐｓ（たとえば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅなど）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ビリダンス群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ａｎａｅｒｏｂｉｃ  ｓｐｓ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、病原性Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｓ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｒｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００８０】
本組成物中の微生物抗原の供給源として有用でありうる細菌病原体のポリペプチドとしては、鉄調節外膜タンパク質（「ＩＲＯＭＰ」）、外膜タンパク質（「ＯＭＰ」）、フルネグリシスを引き起こすＡｅｒｏｍｏｎｉｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａのＡタンパク質、細菌性腎疾患（「ＢＫＤ」）を引き起こすＲｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍのｐ５７タンパク質、主要表面関連抗原（「ｍｓａ」）、表面発現細胞毒（「ｍｐｒ」）、表面発現溶血素（「ｉｓｈ」）、Ｙｅｒｓｉｎｉｏｓｉｓの鞭毛抗原、細胞外タンパク質（「ＥＣＰ」）、鉄調節外膜タンパク質（「ＩＲＯＭＰ」）、パスツレラ症の構造タンパク質、ＯＭＰおよびＶｉｂｒｏｓｉｓ  ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍおよびＶ．ｏｒｄａｌｉｉの鞭毛タンパク質、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌｏｓｉｓ  ｉｃｔａｌｕｒｉおよびＥ．ｔａｒｄａの鞭毛タンパク質、ＯＭＰタンパク質、ａｒｏＡ、ｐｕｒＡ、Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓの表面抗原、Ｃｙｔｏｐｈａｇａ  ｃｏｌｕｍｎａｒｉの構造タンパク質および調節タンパク質、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａの構造タンパク質および調節タンパク質があげられるが、これらに限定されるものではない。このような抗原は、組換えまたは従来技術において知られた他の手段によって単離または調製することができる。
【００８１】
病原体の例としては、哺乳動物、特にヒトに感染する真菌がさらにあげられるが、これらに限定されるものではない。真菌の例としては、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓｉ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓがあげられるが、これらに限定されるものではない。感染性寄生虫の例としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘなどのマラリア原虫があげられる。他の感染性生物（すなわち原生生物）として、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉがあげられる。寄生虫病原体のポリペプチドには、Ｉｃｈｔｈｙｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓの表面抗原があげられるが、これに限定されるものではない。
【００８２】
哺乳動物、特にヒトにおいて抗原として作用する、医学的に関連のある他の微生物については、文献に広く記載されている。たとえば、Ｃ．Ｇ．Ａ  Ｔｈｏｍａｓ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ，Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ  １９８３（その内容全体を本明細書に援用する）を参照のこと。感染性ヒト疾患およびヒト病原体の治療に加えて、本発明の組成物および方法は、非ヒト哺乳動物の感染を治療するにも有用である。非ヒト哺乳動物を治療するための多くのワクチンが、Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｋ．  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，３ｒｄ  ｅｄ．  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍｓ，Ｉｎｃ．，１９９５に開示されており、ＷＯ０２／０６９３６９号も併せて参照のこと（その開示内容を明示的に本明細書に援用する）。
【００８３】
例示的な非ヒト病原体としては、マウス乳房腫瘍ウイルス（「ＭＭＴＶ」）、ラウス肉腫ウイルス（「ＲＳＶ」）、トリ白血病ウイルス（「ＡＬＶ」）、トリ骨髄芽球症ウイルス（「ＡＭＶ」）、マウス白血病ウイルス（「ＭＬＶ」）、ネコ白血病ウイルス（「ＦｅＬＶ」）、マウス肉腫ウイルス（「ＭＳＶ」）、テナガザル白血病ウイルス（「ＧＡＬＶ」）、脾臓壊死ウイルス（「ＳＮＶ」）、細網内皮症ウイルス（「ＲＳＶ」）、サル肉腫ウイルス（「ＳＳＶ」）、マソン・ファイザーサルウイルス（「ＭＰＭＶ」）、サルレトロウイルス１型（「ＳＲＶ−１」）、さらにはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、Ｖｉｓｎａウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（「ＦＩＶ」）などのレンチウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス（「ＥＩＡＶ」）、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サルＴ細胞白血病ウイルス（「ＳＴＬＶ」）、ウシ白血病ウイルス（「ＢＬＶ」）などのＴ細胞白血病ウイルス、ヒト泡沫ウイルス（「ＨＦＶ」）、サル泡沫ウイルス（「ＳＦＶ」）、ウシ泡沫ウイルス（「ＢＦＶ」）などの泡沫ウイルスがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
いくつかの実施形態では、感染性病原体に関して本明細書で使用する場合、「治療」、「治療する」、「治療している」は、病原体による感染に対する対象の耐性を高めるか、対象が病原体に感染することになる尤度を下げる予防的治療および／または対象が感染した後に、たとえば感染を低減または排除するか、感染が悪化するのを防ぐなど、感染と戦うための治療をいう。
【００８５】
微生物抗原は、従来技術において周知の方法で調製することができる。たとえば、これらの抗原は、粗抽出物を調製する、抗原を部分的に精製する、組換え技術による、あるいは既知の抗原のｄｅ  ｎｏｖｏ合成によって、ウイルスおよび細菌細胞から直接調製することができる。また、抗原は、対象における発現および免疫される対象の免疫系への提示に適した形態の抗原ペプチドをコードする核酸の形態であってもよい。さらに、抗原は完全抗原であってもよいし、少なくとも１つのエピトープを含む完全抗原の断片であってもよい。
脂質
【００８６】
カチオン性脂質ベシクルへの抗原の取り込みを改善し、また免疫系の細胞への送達を改善するために、抗原を修飾してその疎水性または抗原表面の負電荷を高めてもよい。たとえば、分子の抗原特性を維持しながらカチオン性脂質の疎水性アシル鎖における抗原の溶解性を改善するために、脂質鎖または疎水性アミノ酸に結合させることで抗原の疎水性を高めてもよい。修飾された抗原は、アミノ酸配列の疎水性が高められた、修飾されたリポタンパク質、リポペプチド、タンパク質またはペプチド、それらの組み合わせとすることができる。修飾された抗原は、脂質と抗原との間に結合されたリンカーを有するものであってもよく、たとえば、Ｎ末端αまたはε−パルミトイルリジンをセリン−セリンのジペプチドリンカーを介して抗原に結合させてもよい。以下でより詳細に考察するように、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７−リポペプチド複合体は、ＤＯＴＡＰ／Ｅ７調製物と比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能的な抗原特異的ＣＤ８  Ｔリンパ球応答が増強していた。さらに、抗原がカチオン性脂質の複合体に封入されている調製物のバッファーを変えることによって、あるいは、たとえばアニオン性アミノ酸などのアニオン性部分を抗原に共有結合させることによって、負電荷が高まるように抗原を操作してもよい。
【００８７】
本明細書に記載した実施例１に示されるように、Ｅ７抗原の免疫原性は、抗原を共有結合で修飾することによって増大した。得られる抗原アミノ酸配列が、もともと抗原を得た親タンパク質には見られないようなものになるアミノ酸配列を抗原に共有結合させることが可能であった。修飾された抗原のほうがネイティブな抗原よりもＭＨＣクラスＩ結合親和性が優れていることを示すために、研究を行った。この研究で証明されたような優れた結合親和性のために、ＨＰＶ陽性ＴＣ−１腫瘍に対するｉｎ  ｖｉｖｏでの優れた抗腫瘍免疫応答が生じることとなった。本発明は、以下の実施例に照らしてさらに理解されるであろう。
【００８８】
本明細書に記載のいくつかの実施形態において、カチオン性脂質は、ナノ粒子アセンブリーの形態であってもよい。本明細書で使用する場合、「ナノ粒子」という用語は、測定されるサイズがナノメートル台である粒子をいう。たとえば、「ナノ粒子」とは、サイズが約１０，０００ナノメートル未満の構造を有する粒子をいうことができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子はリポソームである。
【００８９】
本明細書で使用する場合、「カチオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで正味の正電荷を保持するか、プロトン化可能な基を有し、ｐＫａより低いｐＨで正に荷電される多数の脂質種のすべてをいう。本開示による好適なカチオン性脂質としては、３−β［４Ｎ−（１Ｎ，８Ｎ−ジグアニジノスペルミジン）−カルバモイル］コレステロール（ＢＧＳＣ）、３−β［Ｎ，Ｎ−ジグアニジノエチル−アミノエタン）−カルバモイルコレステロール（ＢＧＴＣ）、Ｎ，Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３  テトラメチルテトラミルスペルミン（セルフェクチン）、Ｎ−ｔ−ブチル−Ｎ’−テトラデシル−３−テトラデシルアミノプロピオンアミジン（ＣＬＯＮｆｅｃｔｉｎ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン−カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロセテート）（ＤＯＳＰＡ）、１，３−ジオレイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）−プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）、４−（２，３−ビス−パルミトイルオキシ−プロピル）−１−メチル−１Ｈ−イミダゾール（ＤＰＩＭ）Ν，Ν，Ν’，Ν’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジオレオイルオキシ−１，４−ブタン−ジアンモニウムヨージド）（Ｔｆｘ−５０）、Ｎ−１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ν，Ν，Ν−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）または他のＮ−（Ｎ，Ｎ−１−ジアルコオキシ）−アルキル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−三置換アンモニウム界面活性剤、１，２ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノール−ｓｎ−グリセロール（ＤＯＢＴ）またはコレステリル（４’トリメチルアンモニア）ブタノエート（ＣｈＯＴＢ）（ここで、トリメチル−アンモニウム基は、ブタノールスペーサーアームを介して二本鎖（ＤＯＴＢの場合）またはコレステリル基（ＣｈＯＴＢの場合）に接続されている）、ＤＯＲＩ（ＤＬ−１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム）またはＤＯＲＩＥ（ＤＬ−１，２−Ｏ−ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキシエチルアンモニウム）（ＤＯＲＩＥ）またはそれらの類似体（ＷＯ９３／０３７０９に開示されているものなど）、１，２−ジオレオイル−３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）、コレステリルヘミスクシネートエステル（ＣｈＯＳＣ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミルスペルミン（ＤＰＰＥＳ）などのリポポリアミン、コレステリル−３β−カルボキシル−アミド−エチレントリメチルアンモニウムヨージド、１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−ＤＬ−２−プロピル−コレステリルカルボキシレートヨージド、コレステリル−３−Ｏ−カルボキシアミドエチレンアミン、コレステリル−３−β−オキシスクシンアミド−エチレントリメチルアンモニウムヨージド、１−ジメチルアミノ−３−トリメチルアンモニオ−ＤＬ−２−��ロピル−コレステリル−３−β−オキシスクシネートヨージド、２−（２−トリメチルアンモニオ）−エチルメチルアミノエチル−コレステリル−３−β−オキシスクシネートヨージド、３−β−Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイルコレステロール（ＤＣ−ｃｈｏｌ）、３−β−Ｎ−（ポリエチレンイミン）−カルバモイルコレステロール、Ο，Ο’−ジミリスチル−Ｎ−リシルアスパルテート（ＤＭＫＥ）、Ο，Ο’−ジミリスチル−Ｎ−リシル−グルタメート（ＤＭＫＤ）、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、１，２−じらウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＬＥＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＰＥＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＳＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ジオレオイルジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−パルミトイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）があげられるが、これらに限定されるものではない。さらに、記載されたカチオン性脂質のいずれの構造的変異体および誘導体も、企図される。
【００９０】
ある実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。他の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＡＰである。さらに他の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＴＭＡである。他の実施形態では、カチオン性脂質はＤＯＥＰＣである。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質が精製される。
【００９１】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、カチオン性脂質のエナンチオマーである。「エナンチオマー」という用語は、その対になる立体異性体、たとえばＲエナンチオマーおよびＳエナンチオマーのように、互いに重ね合わせることのできない鏡像であるカチオン性脂質の立体異性体をいう。様々な例において、エナンチオマーはＲ−ＤＯＴＡＰまたはＳ−ＤＯＴＡＰである。一例では、エナンチオマーはＲ−ＤＯＴＡＰである。別の例では、エナンチオマーはＳ−ＤＯＴＡＰである。いくつかの実施形態では、そのエナンチオマーは精製される。様々な例において、エナンチオマーはＲ−ＤＯＴＭＡまたはＳ−ＤＯＴＭＡである。一例では、エナンチオマーはＲ−ＤＯＴＭＡである。別の例では、エナンチオマーはＳ−ＤＯＴＭＡである。いくつかの実施形態では、そのエナンチオマーは精製される。様々な例において、エナンチオマーは、Ｒ−ＤＯＰＥＣまたはＳ−ＤＯＰＥＣである。一例では、エナンチオマーはＲ−ＤＯＰＥＣである。別の例では、エナンチオマーはＳ−ＤＯＰＥＣである。いくつかの実施形態では、そのエナンチオマーは精製される。
【００９２】
例示の目的で、実施例はいずれも、十分に研究され、二重蛍光標識と一緒に利用可能なモデルタンパク質であるオボアルブミンを用いて実施されることに注意されたい。モデルタンパク質を用いることで、カチオン性脂質がどのようにして抗原の取り込みプロセシングと提示を亢進するかを示す優れた例が提供される。また、クラスＩおよびクラスＩＩ拘束性ＯＶＡペプチドに特異的なＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を利用可能であることから、両方の経路を介した詳細な研究と抗原提示の確認が可能になる。
【実施例】
【００９３】
実施例で報告されたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究はいずれも、代表的な抗原としてモデルタンパク質であるオボアルブミンを用いて実施した。抗原提示細胞による抗原の取り込みとプロセシングに対するカチオン性脂質の作用を評価するために、フローサイトメーターを用いて容易に追跡できる蛍光ＯＶＡコンジュゲート（ＤＱ−ＯＶＡコンジュゲート、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７  ＯＶＡコンジュゲート）を使用した。さらに、抗原としてオボアルブミンタンパク質を使用することで、オボアルブミン特異的ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞受容体を有するオボアルブミン特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞およびＴＣＲトランスジェニックマウス（ＯＴ−１およびＤＯ１１．１０）を用いるＭＨＣ  ＩおよびＭＨＣ  ＩＩによる抗原提示の確認が容易になった。この研究で示された結果は、一般にあらゆるタンパク質およびペプチド抗原に適用可能である。
＜実施例１：樹状細胞による抗原取り込みに対するカチオン性脂質の作用＞
【００９４】
タンパク質抗原の取り込みに対するカチオン性脂質の作用を決定するために、マウス骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７−ＯＶＡコンジュゲートでパルスし、フローサイトメトリーを用いてＢＭＤＣによるオボアルブミン取り込みを定量した。簡単に説明すると、２０μｇ／ｍｌのオボアルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲート；ライフテクノロジーズ、カタログ番号０３４７８４）と５０μＭのカチオン性脂質（ＲＤＯＴＡＰ）または２８０ｍＭのスクロース希釈剤を含む無血清ＲＰＭＩ  １６４０細胞培養培地において、２×１０６個／ｍｌのＢＭＤＣを３７℃で１０〜６０分間インキュベートした。細胞をパルス後に洗浄して細胞に結合していないオボアルブミンを除去し、フローサイトメーターでの分析用に１％ホルムアルデヒドで固定した。ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターを用いてオボアルブミンの取り込みを定量した。図１に示すように、カチオン性脂質は、測定したすべての時点でＢＭＤＣによるタンパク質の取り込みを有意に増加した。さらに、タンパク質の取り込みはカチオン性ナノ粒子の存在下で非常に急速に起こったことから、カチオン性脂質が、樹状細胞ワクチンの調製時に抗原パルスの時間を大幅に短縮する上で有益であることを示唆している。
＜実施例２：樹状細胞および上皮細胞による抗原プロセシングに対するカチオン性脂質の作用＞
【００９５】
樹状細胞によるｅｘ  ｖｉｖｏでの抗原の取り込みとプロセシングに対するカチオン性脂質の作用を決定するために、ＤＱ−ＯＶＡと呼ばれる蛍光オボアルブミンタンパク質を使用した。ＤＱ−ＯＶＡは、インタクトな状態では蛍光性ではないが、タンパク質が分解されると赤色と緑色の両方の蛍光を発する。ＢＭＤＣを、ＤＱ−ＯＶＡのみまたは濃度の異なるカチオン性脂質ＤＯＴＡＰと混合したＤＱ−ＯＶＡと一緒に、３７℃または４℃で１時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、固定し、樹状細胞のマーカーであるＣＤ１１ｃに対する蛍光抗体で染色した。次に、赤色および緑色蛍光チャネルの両方で、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターで細胞を分析した。
【００９６】
図２の結果は、培地のみで蛍光ＤＱ−ＯＶＡと一緒にインキュベートしたＢＭＤＣが３７℃で蛍光を増大させ、取り込みとプロセッシングがなされたことを示している。これは、ＤＣによる、ＯＶＡのよく知られたマンノース受容体が介在する取り込みを表す。ＤＯＴＡＰは、ＤＣによる抗原の取り込みとプロセシングを亢進する。フローサイトメトリーで測定したＢＭＤＣへのＤＱ−ＯＶＡの蛍光取り込みのグラフ表示。プロットは、ＤＣによって取り込まれ、プロセシングされたＤＱ−ＯＶＡの量を表す、ゲートされたＣＤ１１ｃ陽性細胞の緑色蛍光の平均蛍光強度を示す。
【００９７】
この取り込みとプロセシングは４℃で阻害され、このタイプの取り込みにはアクティブな細胞骨格の再構成が必要であることが確認された。ＤＯＴＡＰの純粋なＲ−エナンチオマー（Ｒ−ＤＯＴＡＰ）の存在下でＤＱ−ＯＶＡと一緒にインキュベートされたＢＭＤＣでは蛍光の倍増が認められ、カチオン性脂質であるＲ−ＤＯＴＡＰがＤＣでのタンパク質の取り込みとプロセシングを大幅に亢進することが示された。４℃でになってもなお有意な取り込みが認められ、アクティブな細胞代謝がなくてもＲ−ＤＯＴＡＰがタンパク質の取り込みを助長し得ることが示された。Ｒ−ＤＯＴＡＰによる作用は濃度依存的であり、５０μＭで最大の作用が認められた。Ｒ−ＤＯＴＡＰによるタンパク質取り込みの亢進が細胞依存であるか否かを決定するために、マウス上皮細胞株をＢＭＤＣと同一条件下でＤＱ−ＯＶＡと一緒にインキュベートした。図３の結果は、このＯＶＡの取り込みとプロセシングがＤＣでのみ観察され、ＴＣ１上皮細胞では観察されないことを示している。これらのデータから、ＤＯＴＡＰが、ｅｘ  ｖｉｖｏで完全タンパク質の樹状細胞への取り込みとプロセシングを大幅に亢進できることがわかる。さらに、この亢進が樹状細胞に対して選択的であり、他の非抗原提示細胞型に対して選択的ではないこともわかる。
＜実施例３：抗原のプロセシングおよびエンドソーム侵入に対する、カチオン性脂質と既知のアジュバントによる作用の比較＞
【００９８】
脂質アジュバントがＲ−ＤＯＴＡＰと同じ作用に介在し得るか否かを決定するために、図１で説明したように、培地のみまたはＲ−ＤＯＴＡＰを用いて、ＢＭＤＣをＤＱ−ＯＶＡと一緒にインキュベートした。また、強力な脂質アジュバントであるリポ多糖（ＬＰＳ）を用いる同一の条件下で、ＢＭＤＣをインキュベートした。２５μＭのＤＯＴＡＰナノ粒子、１０μｇ／ｍｌのＬＰＳまたは培地のみの存在下、３７℃または４℃／アジドのいずれかで、蛍光ＤＱ−ＯＶＡの存在下でマウス骨髄ＤＣを１時間インキュベートし、フローサイトメトリーで分析した。図１に示すように、ＤＱ−ＯＶＡは、Ｒ−ＤＯＴＡＰの非存在下でＤＣによってアクティブに取り込まれ、プロセシングされたが、Ｒ−ＤＯＴＡＰの存在下では、赤色蛍光が強く増したことから明らかなように、取り込みが大幅に亢進された。対照的に、図４に示すように、このような増大はＬＰＳでの処理では観察されなかった。モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）は、毒性が低いＬＰＳの誘導体であり、現在、いくつかのワクチンでＦＤＡの承認済みのアジュバントである。図５におけるＬＰＳでの結果と同様に、ＭＰＬはＢＭＤＣにおけるタンパク質の取り込みを亢進する能力を示さなかった。
＜実施例４：ヒト単球細胞株における抗原プロセシングに対するカチオン性脂質の作用＞
【００９９】
ヒトの細胞に対するカチオン性脂質の作用を決定するために、ヒト単球細胞株であるＴＨＰ−１を用いてｅｘ  ｖｉｖｏでのＤＱ−ＯＶＡの取り込みを評価した。ＴＨＰ−１は、ヒト血液由来の単球細胞の代表であり、ｅｘ  ｖｉｖｏでのＤＣ療法の手法で患者からＤＣを作製するのに用いられるものと同じ細胞である。Ｒ−ＤＯＴＡＰ（２５μｇ／ｍｌ）の存在下（Ａ、Ｂ）または非存在下（Ｃ、Ｄ）で、３７℃にて１時間、ＤＱ−ＯＶＡ（１０μｇ／ｍｌ）と一緒にＴＨＰ−１細胞をインキュベートした。レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて同じ細胞を画像化し、フローサイトメトリーで緑色対赤色蛍光を測定することによって定量した。図６の結果は、Ｒ−ＤＯＴＡＰがＴＨＰ−１細胞におけるＤＱ−ＯＶＡの取り込みを劇的に増したことを示している。マウスＢＭＤＣとは異なり、Ｒ−ＤＯＴＡＰが存在しない場合、ＤＱ−ＯＶＡの取り込みは観察されなかった。これは、血液由来の単球は樹状細胞の前駆体であるが、タンパク質の取り込みに必要な受容体をまだ持たないためであると考えられる。この結果は、重要である。なぜなら、Ｒ−ＤＯＴＡＰが、通常であれば受容体による取り込みが不可能な細胞で取り込みとプロセシングを亢進できることを示しているからである。もうひとつ、図６Ａおよび図Ｂから顕著に観察できるのが、エンドサイトーシスのベシクルにおけるプロセシングされたＯＶＡの蓄積である。エンドサイトーシスのベシクルのタンパク質は、ＣＤ４  Ｔ細胞を刺激するためにＭＨＣクラスＩＩ分子に効率的に取り込まれるか、ＭＨＣクラスＩからＣＤ８  Ｔ細胞への提示のための交差提示経路を行き来することは良く知られている。したがって、カチオン性脂質は、ＭＨＣクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子の両方への抗原の提示を最大限に最適化する形でタンパク質の取り込みを助長し、ＣＤ８およびＣＤ４  Ｔ細胞のそれぞれを最大限刺激する。
＜実施例５：ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞に対する抗原のプロセシングと交差提示に対するＤＯＴＡＰおよびＤＯＴＭＡの作用＞
【０１００】
カチオン性脂質が抗原の取り込みを助長することが、ＭＨＣクラスＩ（交差提示）での抗原提示の亢進に実際につながることを検証するために、カチオン性脂質の存在下で交差提示を評価するための２つの異なる方法を利用した。第１の方法では、Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞株（Ｂ３Ｚ細胞）を用いた。この細胞株は、β−ガラクトシダーゼ酵素を誘導することによって、ＭＨＣ  Ｉを介してＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを交差提示する抗原提示細胞に応答することができ、これはβ−ｇａｌアッセイを用いて定量化することが可能である。５０μＭのＲＤＯＴＡＰと混合したオボアルブミンペプチドを有するＢＭＤＣ（ＯＶＡ２４１−２７０；ＳＭＬＶＬＬＰＤＥＶＳＧＬＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳ）または等張性スクロース（２８０ｍＭ）（Ｓｕｃ）のみ。ペプチドでパルスしたＢＭＤＣを洗浄し、ＭＨＣＩ（Ｈ２Ｋｂ）を介して抗原提示細胞によって提示されるＳＩＩＮＥＫＬエピトープを認識できる抗原特異的Ｔ細胞ハイブリドーマ細胞株（Ｂ３Ｚ細胞）と３７℃で一晩共培養した。Ｂ３Ｚ細胞は、β−ガラクトシダーゼ酵素を産生することによってＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープに応答し、これを樹状細胞によるペプチド交差提示の指標に比色β−ガラクトシダーゼアッセイを用いて定量した。データは、試験ウェル（任意の単位）における相対吸光度（５７０ｎｍ）を表す。２元ＡＮＯＶＡを用いて統計的有意性を評価し、＊値は処理ごとに有意に異なっていた（図７に示す）。
【０１０１】
図７に示すように、カチオン性ナノ粒子によるペプチドパルスは、効率的なパルスに必要なペプチドの濃度を有意に減少させることが観察された。カチオン性脂質を利用するこの方法は、特に、利用できるペプチド抗原の量またはペプチドの濃度がゆえに樹状細胞の交差提示が制限される条件下（たとえば、エピトープが限られる自己腫瘍ワクチンの場合など）でのペプチドローディングで重要な利点を提供する。
【０１０２】
２つ目の方法では、すべてのＴ細胞がＯＶＡの内部ペプチドに特異的であるＴＣＲトランスジェニックマウス（ＯＴ−１）由来のＴ細胞を使用した。これらのＴ細胞は、ＯＶＡを処理し、ＭＨＣクラスＩ分子にＯＶＡペプチドを提示したＤＣで提示された場合にのみ増殖する。
【０１０３】
したがって、これは、交差提示に対する厳密なアッセイとなる。ＢＭＤＣを、２種類のカチオン性脂質であるＤＯＴＡＰまたはＤＯＴＭＡのいずれかの存在下または非存在下で、異なる濃度のＯＶＡ完全タンパク質と一緒に３７℃で１時間インキュベートした。その後、ＤＣを洗浄し、固定し、ＯＶＡペプチド特異的Ｔ細胞に添加した。図８の結果は、ＤＯＴＡＰまたはＤＯＴＭＡの存在下でＯＶＡと一緒にインキュベートしたＤＣが、カチオン性脂質なしでＯＶＡと一緒にインキュベートしたＤＣよりもはるかに強くＣＤ８＋Ｔ細胞に抗原を交差提示したことを示している。この応答は、ＯＶＡ濃度に関して用量依存的であり、ＤＣを４℃でＯＶＡと一緒にインキュベートした場合にも明らかであった。
【０１０４】
これらの結果は、カチオン性脂質によって抗原の取り込みが亢進されることで、ＣＤ８  Ｔ細胞の効果的な活性化の絶対的前提条件である、効率的な抗原のプロセシングとＭＨＣクラスＩ経路へのペプチドの取り込みに実際につながることを示している。
＜実施例６：ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞に対する抗原のプロセシングと交差提示に対するＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰの作用＞
【０１０５】
カチオン性脂質が実際にＣＤ４  Ｔ細胞への抗原提示を増すか否かを確認するために、ＭＨＣクラスＩＩ分子に提示されるＯＶＡペプチドに特異的なＴ細胞を有するＤＯ１１．１０トランスジェニックマウス由来の細胞を使用した。図９の結果は、クラスＩＩ提示にも図８のクラスＩ提示で観察されたものと同じ傾向が観察されたことを示している。カチオン性脂質の存在下でＯＶＡが取り込まれることで、ＣＤ４  Ｔ細胞に対する抗原提示が亢進された。
【０１０６】
これらの結果は、カチオン性脂質によって抗原の取り込みが亢進されることで、ＣＤ４  Ｔ細胞の効果的な活性化の絶対的前提条件である、効率的な抗原のプロセシングとＭＨＣクラスＩＩ経路へのペプチドの取り込みに実際につながることを示している。
＜実施例７：ｉｎ  ｖｉｖｏでの実際のワクチン設定における抗原提示に対するＤＯＴＡＰによる作用＞
【０１０７】
実際のワクチン設定におけるＤＯＴＡＰの作用をモデル化するために、Ｔ細胞受容体養子移入系を使用した。この系では、図８および図９で説明したのと同じＴＣＲトランスジェニックマウス由来のＴ細胞を用いているが、これらの細胞がワクチン接種後にｉｎ  ｖｉｖｏでどのように応答するかを分析する。最初に、ＯＴ−１（ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋）またはＤＯ１１．１０（ＯＶＡ特異的ＣＤ４＋）Ｔ細胞を追跡用の蛍光色素ＣＦＳＥで標識した。２４時間後、マウスに、ＯＶＡのみまたはＤＯＴＡＰの存在下のＯＶＡを注射した。これらのＴ細胞が、免疫化後に流入領域リンパ節でＤＣによって提示される抗原を認識すれば、Ｔ細胞は増殖し、全ての娘細胞でＣＦＳＥ色素が希釈される。次に、ＤＯＴＡＰを用いる場合と用いない場合でマウスにＯＶＡを注射した。３日後、ワクチン接種部位の流入領域リンパ節を取り出し、Ｔ細胞を抗ＣＤ８抗体および抗ＣＤ４抗体で染色し、ＣＦＳＥのレベルをフローサイトメトリーで可視化した。図１０の結果は、完全ＯＶＡまたはＤＯＴＡＰと混合した完全ＯＶＡのいずれかをさらに注射（免疫化）した場合のＣＦＳＥ標識ＯＴ１（ＣＤ８  Ｔ細胞）またはＤＯ１１．１０（ＣＤ４  Ｔ細胞）を示している。マウスにＯＶＡ＋ＤＯＴＡＰをワクチン接種した場合のみ、Ｔ細胞の有意な分裂が生じた。これらの結果は、ＤＯＴＡＰの抗原送達特性が、ワクチン接種後の流入領域リンパ節におけるＴ細胞応答の増大につながることを示している。
＜実施例８：ＭＨＣクラスＩ拘束性Ｔ細胞に対する抗原のプロセシングと交差提示に対する様々な脂質の作用＞
【０１０８】
抗原の取り込みと交差提示に対する他のカチオン性脂質および中性脂質の作用を確認するために、完全ＯＶＡタンパク質と様々な濃度のＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＣ、ＤＯＥＰＣまたはＤＤＡの存在下、ＢＭＤＣを３７℃または４℃で３０分間インキュベートした。その後、ＤＣを洗浄し、マイクロタイタープレートでＯＴ１脾細胞（クラスＩ拘束性ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬに特異的なＴＣＲトランスジェニックＴ細胞）に添加し、３７℃で３日間培養した。プロットは、培養の最後の１８時間における３Ｈチミジン取り込みの平均ＣＰＭを示している。対照培養には、ＯＴ１脾細胞とＳＩＩＮＦＥＫＬだけを含有し、これは抗原プロセシングの必要性を回避する。
【０１０９】
図１１の結果は、カチオン性脂質であるＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＥＰＣ、ＤＤＡがいずれも、ＢＭＤＣによるＯＶＡの取り込みと交差提示の亢進を助長することを示している。また、カチオン性脂質Ｓ−ＤＯＴＡＰも取り込みと提示を助長した。中性脂質ＤＯＰＣも、取り込みと提示を助長した。これらの結果は、ひとつのクラスとしてのカチオン性脂質が、抗原の効果的な取り込みと樹状細胞によるタンパク質抗原の送達を介在するのに有効であることを示している。
＜実施例９：カチオン性脂質は、樹状細胞ワクチンの有効性を改善する＞
【０１１０】
カチオン性脂質がｉｎ  ｖｉｖｏで樹状細胞系ワクチンの有効性を改善するという概念の証拠として示すために、樹状細胞ワクチンによるＣＴＬ誘導に対するカチオン性脂質の作用を評価した。ペプチド単独（パルミトイル化−ＫＳＳＳＩＩＮＦＥＫＬ）またはカチオン性（５０μＭＲ−ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ）ナノ粒子または中性脂質ナノ粒子（ＤＯＰＣ）と混合したペプチドでパルスしたＢＭＤＣまたは等張性スクロースのみで、Ｂ６マウスを免疫した。０日目と７日目に、ペプチドでパルスしたＢＭＤＣを用いてＣ５７ＢＬ６／Ｊマウスの群（ｎ＝５）を皮下免疫し、１４日目にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて抗原特異的ＩＦＮ−γ応答を測定することで、ワクチン応答を評価した。データは、代表的な研究における各マウスのスポット形成細胞を表す。
【０１１１】
図１２に示すように、ペプチドを負荷したカチオン性ナノ粒子で樹状細胞をパルスすると、ワクチンによって誘導される抗原特異的Ｔ細胞応答が有意に増加するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイで見られるカチオン性ナノ粒子の有益な作用が樹状細胞系ワクチンの有効性に影響し得るということが直接的に示される。以下の研究では、ＣＴＬ誘導におけるカチオン性ナノ粒子の有効性を、ＨＰＶ関連腫瘍およびムチン１関連腫瘍に由来する腫瘍関連抗原を用いて検討した。予想通り、腫瘍関連抗原を負荷したカチオン性ナノ粒子は、ワクチン接種したマウスにマウントされた抗原特異的Ｔ細胞免疫応答を改善した（図１３）。この実験では、５０μＭのカチオン性脂質（ＲＤＯＴＡＰ）と混合した腫瘍関連抗原（ＨＰＶ腫瘍関連（ａ）またはムチン１関連（ｂ））を含有するペプチド混合物または等張性スクロース（２８０ｎＭ）で、マウスＢＭＤＣを１０分間パルスした。０日目および７日目に、ペプチドでパルスしたＢＭＤＣまたはパルスなしのＢＭＤＣでＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス（ｎ＝５）の群を皮下免疫し、１４日目にＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いて抗原特異的ＩＦＮ−γ応答を測定することで、ワクチン応答を評価した。データは、代表的な研究における各マウスのスポット形成細胞を表す。ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＣでは、いくらか亢進が認められたのに対し、ＤＯＥＰＣとＤＤＡでは、抗原提示が大幅に亢進された。注：ＤＤＡは、ＯＶＡで希釈すると沈殿を形成した。カチオン性脂質ではいずれも亢進がみとめられるが、全体の大きさは実験によって変わる。また、中性脂質であるＤＯＰＣも、この実験ではいくらか亢進が認められた。
【０１１２】
これらの結果は、ひとつのクラスとしてのカチオン性脂質が、抗原の効果的な取り込みと樹状細胞によるタンパク質抗原の送達を介在するのに有効であることを示している。さらに、抗原を負荷したカチオン性脂質でパルスした樹状細胞は、樹状細胞ワクチンの有効性を大幅に改善することができる。
＜実施例１０：腫瘍微小環境内のＴ細胞および調節性Ｔ細胞の集団に対するＲ−ＤＯＴＡＰの作用＞
【０１１３】
Ｒ−ＤＯＴＡＰおよびＳ−ＤＯＴＡＰによって、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導した。
【０１１４】
Ｃ５７ＢＬマウスに、様々な調製物をワクチン接種した。
群１：ＫＦ１８  ＨＰＶペプチド（ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）
群２：ＫＦ１８  ＨＰＶペプチド＋Ｒ−ＤＯＴＡＰリポソーム
群３：ＫＦ１８  ＨＰＶペプチド＋Ｓ−ＤＯＴＡＰリポソーム
群４：ＫＦ１８ペプチド＋ＭＰＬ／Ａｌｕｍアジュバント
【０１１５】
１群あたり５匹のマウスに、様々な調製物を注射した。０日目および７日目に、マウスにワクチン接種し、１４日目に屠殺した。脾細胞を取り出し、ＥＬＩＳＰＯＴ研究を行った。ペプチドＲＡＨＹＮＩＶＴＦ（ＲＦ９）で脾細胞を刺激し、Ｃ５７マウスによって認識されるＨＰＶ１６  ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープペプチドをＣ５７マウスによって認識した。この研究は、Ｒ−ＤＯＴＡＰが強いＨＰＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導するのに有効であることを示している。しかしながら、抗原の取り込み、内在化、プロセシングならびに、樹状細胞の成熟を促進する同一の能力を示したＳ−ＤＯＴＡＰは、ペプチドだけのときに見られたほどはＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増大につながらなかった（図１４Ａ）。ＭＰＬは、Ｒ−ＤＯＴＡＰとＳ−ＤＯＴＡＰのどちらと比較しても抗原の取り込みを促進する上で有効ではなかったため、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答がＲ−ＤＯＴＡＰよりも有意に低くなると想定されていた。この作用の別の例が、カチオン性脂質であるＤＤＡでも観察される。図１４Ｂは、ＤＤＡが抗原の取り込みと提示を助長する能力を示している。しかしながら、強い抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導するために、ＤＤＡを強力なアジュバントと組み合わせて使用することが報告されている（Ｂｒａｎｄｔ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ，ＥＳＡＴ−６  Ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２０００  Ｆｅｂ；６８（２）：７９１−７９５）。
【０１１６】
Ｒ−ＤＯＴＡＰによる抗原取り込みの亢進と提示ならびに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの優れたＣＤ８＋Ｔ細胞誘導が観察されることから、腫瘍抗原を用いるＲ−ＤＯＴＡＰおよびＧＭ−ＣＳＦを基にした免疫療法を使用して直接比較（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ）の研究を実施し、この２種のワクチンが腫瘍微小環境へのＴ細胞の浸潤や、免疫抑制性腫瘍微小環境をダウンレギュレートする能力に及ぼす影響を研究した。
【０１１７】
Ｃ５７マウスを、１群あたり８匹として、Ｒ−ＤＯＴＡＰ＋ＨＰＶ１６  Ｅ７ペプチドＫＦ１８（ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＨＰＶ１６  Ｅ７ペプチドＫＦ１８、Ｒ−ＤＯＴＡＰ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＰＶ１６  Ｅ７ペプチドＫＦ１８、未処理群の各群にわけた。１日目に、１×１０５個のＴＣ−１腫瘍細胞をマウスの脇腹に注射した。腫瘍移植後１２日目と１９日目に様々な調製物を投与した。１９日目に、１群あたり４〜５匹のマウスを屠殺し、複数の評価を行って腫瘍微小環境の免疫学を評価した。
【０１１８】
ＲＦ９特異的デキストラマー染色とフローサイトメトリーを使用して、腫瘍微小環境に浸潤したＨＰＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を定量した。この研究では、マウスエピトープＲＦ９に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の数を定量した。これらのＣＤ８＋Ｔ細胞を、腫瘍中に存在する全ての免疫細胞（ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８）の割合として測定した。腫瘍に浸潤する抗原特異的Ｔ細胞を、フローサイトメトリーによってＲＦ９特異的デキストラマーを用いて測定した。図１５は、研究の結果を示し、他のすべての群と比較して、Ｒ−ＤＯＴＡＰ／ＨＰＶと比べてＨＰＶ特異的Ｔ細胞の統計的に有意な増加を示している。データは、各群の４〜５匹のマウスの平均＋ＳＥＭを表す。
【０１１９】
１９日目に、免疫抑制性腫瘍微小環境、特に調節性Ｔ細胞の集団を研究するためにフローサイトメトリーを使用した。１４日目と１９日目に、Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋）細胞が腫瘍に浸潤した。結果を図１６に示す。この研究は、腫瘍内のＴｒｅｇ集団の約４０％という統計的に有意な減少がワクチン接種後１週間以内にＲ−ＤＯＴＡＰ＋抗原のみで観察されることを示している（Ｐ＜０．０１）。この群では統計的有意性が達成されなかったが、Ｒ−ＤＯＴＡＰ群以外の群では、いずれもＴｒｅｇの集団を減らす能力が示されなかった。
【０１２０】
どの免疫療法でも臨床的な有効性に非常に重要なのは、腫瘍微小環境でＣＤ８＋Ｔ細胞を標的とする腫瘍に対する免疫抑制細胞の比である。ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する免疫抑制細胞の比率が低いほど、抗腫瘍効果に向けて予後の改善が促進される。この研究は、ＧＭ−ＣＳＦ＋抗原の場合や抗原だけの場合に比が約１であるのと比較して、Ｒ−ＤＯＴＡＰ＋抗原では、Ｔｒｅｇ／ＣＤ８＋Ｔ細胞比が劇的に低下して０．１３未満となることを示している。腫瘍抗原のない群では比が約３２であった（図１７に示す）。カチオン性脂質は、ＴｒｅｇｓよりもエフェクターＴ細胞の正しい表現型の優先的な拡大を促進するようである。これは、攻撃者が免疫抑制性Ｔｒｅｇｓ「擁護者」よりもＣＤ８＋Ｔ細胞に有利な「力のシフト」を生むため免疫療法が非常に効果的になる、腫瘍微小環境の大幅な改変につながる。
【０１２１】
同じ研究で、確立されたＴＣ−１腫瘍に対する様々な調製物の影響を評価した。図１８は、Ｒ−ＤＯＴＡＰ＋抗原で処理した動物（Ｔｒｅｇ／ＣＤ８＋比＜０．１３）ではいずれも、２６日目までに腫瘍が完全に消失したことを示している。腫瘍体積は、キャリパーを用いて測定した。ナイーブマウス群は、未処理のままで腫瘍のあるマウスである。ワクチンで使用したＨＰＶ１６  Ｅ７ペプチドは、ＫＦ１８である。ＧＭ−ＣＳＦ＋抗原および抗原のみ（Ｔｒｅｇ／ＣＤ８＋比は約１．０）ではどちらも、腫瘍の退縮が誘導されなかったが、腫瘍の成長が阻害され、２６日目に腫瘍体積が約２００ｍｍ３となった。Ｒ−ＤＯＴＡＰまたはＧＭ−ＣＳＦで抗原なしで処理した動物または未処理の動物からなる３つ目の群（Ｔｒｅｇ／ＣＤ８＋比＞３０）では、腫瘍体積が３００〜７００ｍｍ３であった。
【０１２２】
この研究では、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ研究を行い、生成する腫瘍特異的Ｔ細胞の「質」を定量化して理解した。この研究では２６日目に動物を屠殺し、脾細胞を使用した。結果を図１９に示す。この研究は、細胞をＨＰＶ１６  ＣＤ８＋マウスエピトープＲＦ９で刺激すると、Ｒ−ＤＯＴＡＰ＋抗原調製物のほうがＧＭ−ＣＳＦ＋抗原よりもＩＦＮ−γの生成量が約４〜５倍多かったことを示している。これは、図１１において、腫瘍微小環境に浸潤しているＣＤ８＋  細胞の量がＧＭ−ＣＳＦでの結果の２倍未満であるという事実がゆえ、カチオン性脂質がＧＭ−ＣＳＦよりも「高品質」のＴ細胞を生成することができることを示唆している。Ｔ細胞のプライミングが優れているのかという理由については、別の研究で評価された。
＜実施例１１：リンパ節へのＴ細胞およびＢ細胞の浸潤に対するＲ−ＤＯＴＡＰワクチン接種の評価＞
【０１２３】
１２ｍＭのＲ−ＤＯＴＡＰまたは対照としてのスクロースを、それぞれマウスの右足と左足の肉趾に注射し、流入領域リンパ節へのＴ細胞と全リンパ球の流入をフローサイトメトリーで定量した。この実験では、ワクチン接種の１５時間後に膝窩のリンパ節を取り出して、分析した。図１７は、Ｒ−ＤＯＴＡＰがリンパ節へのＴ細胞の有意な浸潤を誘導したことを示している。第２の実験では、５時間、１６時間、３日目、４日目の時点で分析を行い、リンパ節へのリンパ球の浸潤が４日間にわたって増加することがわかった（図２０）。１つの研究でマウス５匹を使用した。
実施例１２：リンパ節へのリンパ球浸潤に対するケモカインの役割の評価
【０１２４】
現在の実験の主目的は、５匹のマウスを用いて実施例７に記載の研究を行い、養子移入されたＣＦＳＥ標識細胞のホーミングを可視化することであった。この研究には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにて百日咳毒素で処理してケモカイン受容体を不活化した細胞集団が含まれていた。百日咳毒素と未処理の細胞とをフローサイトメトリーで区別することができるように、これらの細胞を２通りの濃度のＣＦＳＥで標識した。リンパ球は、リンパ節に帰るように誘導されるべきである。しかしながら、ＤＯＴＡＰで亢進されるホーミングがケモカインによるものである場合、ＤＬＮに百日咳毒素集団は存在しないはずであるか、大幅に低減されたレベルで存在するだけのはずである。
【０１２５】
脾臓細胞を１匹のＢ６マウスから調製し、半分に分けた。細胞のうち半分を１００ｎｇ／ｍｌの百日咳毒素で３７℃にて１時間処理し、洗浄した。次に、２つの細胞集団をフローサイトメトリーで区別することができるように、これらの細胞集団を２通りの濃度のＣＦＳＥで標識し、一緒に混合した。混合物（細胞１０７個）を５匹のＢ６マウスの尾静脈に静脈注射した。次にマウスを麻酔し、スクロース（右足肉趾）とＲ−ＤＯＴＡＰ（左足肉趾、５０μｌ、６００ナノモル）のいずれかを肉趾に注射した。
【０１２６】
１６時間後、マウスを屠殺し、膝窩のＬＮと脾臓を採取した。各マウスの左右の節から回収した総細胞数をカウントした。移動したＣＦＳＥ標識リンパ球も、Ｒ−ＤＯＴＡＰワクチン接種時にリンパ節に浸潤した。しかしながら、これは百日咳で処理した細胞では起こらなかったことから、リンパ節へのリンパ球の流入をカチオン性脂質が誘導し、この現象にはおそらくケモカインが介在していることを示している。
【０１２７】
過去の研究（Ｙａｎら）では、カチオン性脂質がケモカインＣＣＬ２、３、４を誘導することが示唆された。しかしながら、これらのケモカインは、リンパ節のホーミングに関与していない。したがって、この研究は、Ｒ−ＤＯＴＡＰなどのカチオン性脂質も、ＣＣＬ２１またはＣＸＣＬ１２などの他のリンパ節ホーミングケモカインを誘導することを示唆している。
＜実施例１３：リンパ節内でのサイトカインおよびケモカインの誘導＞
【０１２８】
アジュバントの重要な副作用の１つは、サイトカインを誘導し、循環する血液にそのようなサイトカインを増やしてしまうことである。サイトカインが血中に存在すると、重大な炎症反応が起こることが多く、結果的に、これは発熱、悪心、嘔吐、頭痛、さらには極端な症例になると毒によるショックや死にすらつながる毒性が生じる。様々なアジュバントの投与にサイトカインストームが関連していることも多い。
【０１２９】
したがって、この研究では、カチオン性脂質ワクチンを皮下投与した後に全身におけるサイトカインの存在の評価に焦点を当てた。ヒトＨＰＶ抗原を認識することができるヒトＨＬＡ−Ａ２マウスに、高用量および低用量のＲ−ＤＯＴＡＰ＋抗原を投与した。
群１：
高用量Ｒ−ＤＯＴＡＰ（３．４ｍｇ／ｍＬ）とスクロース溶液の１：１混合物１００μＬをマウスにワクチン接種
群２：
サイトカイン誘導の陽性対照として５０μｇのＬＰＳをワクチン接種
群３：
高用量のＲ−ＤＯＴＡＰ＋ＨＰＶ抗原（ＲＤＯＴＡＰが３．４ｍｇ／ｍＬとＨＰＶＭｉｘが０．１４ｍｇ／ｍＬの１：１混合物）１００μＬをマウスにワクチン接種
群４：
低用量のＲ−ＤＯＴＡＰ＋ＨＰＶ抗原（ＲＤＯＴＡＰが３．４ｍｇ／ｍＬとＨＰＶＭｉｘが０．１４ｍｇ／ｍＬの１：１混合物）１００μＬをマウスにワクチン接種
【０１３０】
１回のワクチン接種の後、全てのマウスから以下のように採血した。
１．採血前（ワクチン接種前）
２．１２時間
３．２４時間
４．４８時間
【０１３１】
約２００μＬの血液を上記の時点で各マウスから採取した。
【０１３２】
サイトカイン分析は、製造業者の指示に従って、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイで行った。
【０１３３】
陽性対照として、十分に研究されたトール様受容体（ＴＬＲ）アゴニストリポ多糖（ＬＰＳ）をマウスにワクチン接種した。
【０１３４】
研究結果：Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｍｏｕｓｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ２０−ｐｌｅｘパネル（サイトカインについては以下に列挙する）を使用して、マウスの血清を分析した。Ｌｕｍｉｎｅｘソフトウェアを使用して、同じプレートで実行したサイトカイン標準と比較することで、サイトカインの強度レベルを定量した。陽性対照群（ＬＰＳ）は、ワクチン接種時のＩＬ−１２、ＩＰ−１０、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＭＩＧの全身レベルが増加することを示していた。図２１に示すように、研究したサイトカインとケモカインのいずれの全身誘導も、高用量と低用量のＰＤＳ０１０１でワクチン接種前のベースラインを超えて誘導されることはなかった。
【０１３５】
マウスサイトカイン２０−ｐｌｅｘパネル：
ＦＧＦ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、ＩＬ−１２（Ｐ４０／Ｐ７０）、ＩＬ−１７、ＭＩＰ−１ａ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＩＬ−５、ＶＥＧＦ、ＩＬ−１ａ、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦａ、ＩＬ−２、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＫＣ、ＩＬ−４。
【０１３６】
試験したすべてのサイトカインで見られる結果に典型的なＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）およびＩＰ−１０についての研究結果を図２０に示す。この研究は、カチオン性脂質の場合、サイトカインおよびケモカイン誘導が主にリンパ節に限定されるようであることを示している。典型的なＴＬＲアゴニストであるＬＰＳの場合、サイトカイン誘導はリンパ節に限定されず、ワクチン接種から１２時間以内にサイトカインレベルの全身スパイクが観察される。血液循環にサイトカインが存在しないと、カチオン性脂質が、腫瘍微小環境を変化させるための免疫療法の独特で安全な手段を提供することを示唆している。
等価物
【０１３７】
当業者であれば、慣用的な実験にすぎないものを用いて、本明細書に記載した本発明の具体的な実施形態に対する多くの等価物を認識するか、確認することができるであろう。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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