(57)【要約】  本発明は、ヘテロ二量体であり、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＴＩＭ−３と結合し、かつ単独で、ならびに化学療法及び他の癌治療法と組み合わせて癌の治療に有用であり得る抗体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）及びヒトＴＩＭ−３（配列番号２）に結合する抗体であって、
ａ）配列番号３、配列番号１９、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ）と、
ｂ）配列番号４及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖（ＬＣ）と、
ｃ）配列番号７、配列番号２３、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む第２のＨＣと、
ｄ）配列番号１０及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む第２のＬＣ
とを含み、
前記第１のＬＣが前記第１のＨＣと鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第２のＬＣが前記第２のＨＣと鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第１のＨＣが前記第２のＨＣと２つの鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第１のＨＣ及び前記第２のＨＣがヒトＩｇＧ１アイソタイプである、抗体。
【請求項２】
ａ）前記第１のＨＣが、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
ｂ）前記第２のＨＣが、配列番号２４及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
２つの軽鎖（ＬＣ）及び２つの重鎖（ＨＣ）を含む、ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）及びヒトＴＩＭ−３（配列番号２）に結合する抗体であって、
ａ）第１のＬＣが配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
ｂ）第１のＨＣが配列番号１１のアミノ酸配列を有し、
ｃ）第２のＬＣが、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のアミノ酸配列を有し、
ｄ）第２のＨＣが、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列を有する、抗体。
【請求項４】
前記第２のＬＣが配列番号１６のアミノ酸配列を有し、前記第２のＨＣが配列番号１３のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記第２のＬＣが配列番号１７のアミノ酸配列を有し、前記第２のＨＣが配列番号１４のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
前記第２のＬＣが配列番号１８のアミノ酸配列を有し、前記第２のＨＣが配列番号１５のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号１１、配列番号１５、配列番号１２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が請求項６に記載の抗体を発現することができる、哺乳動物細胞。
【請求項８】
第１のＤＮＡ分子及び第２のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記第１のＤＮＡ分子が配列番号１１及び配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記第２のＤＮＡ分子が配列番号１５及び配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記細胞が請求項６に記載の抗体を発現することができる、哺乳動物細胞。
【請求項９】
抗体を生成するためのプロセスであって、前記抗体が発現されるような条件下で請求項７または８に記載の哺乳動物細胞を培養することと、前記発現された抗体を回収することとを含む、プロセス。
【請求項１０】
配列番号１１、配列番号１５、配列番号１２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を抗体が発現されるような条件下で培養することと、
前記発現された抗体を回収すること
とによって産生される、抗体。
【請求項１１】
第１のＤＮＡ分子及び第２のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記第１のＤＮＡ分子が配列番号１１及び配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記第２のＤＮＡ分子が配列番号１５及び配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、細胞を抗体が発現されるような条件下で培養することと、
前記発現された抗体を回収すること
とによって産生される、抗体。
【請求項１２】
請求項１〜６または１０〜１１のいずれか１項に記載の抗体と、許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
癌を治療する方法であって、請求項１〜６または１０〜１１のいずれか１項に記載の抗体の有効量を、それを必要としている患者に投与することを含む、方法。
【請求項１４】
前記癌が、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、肝癌、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、食道癌、軟部組織肉腫、胆管癌、または肝細胞癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記肺癌が非小細胞肺癌、小細胞肺癌、または中皮腫である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
シスプラチン、カルボプラチン、ダカルバジン、リポソーム化ドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド及びドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、パクリタキセル、注射用懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イクサベピロン、カペシタビン、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びイリノテカン）、ゲムシタビン、トポテカン、リポソーム化イリノテカン、ペメトレキセド、ならびにセツキシマブからなる群より選択される１種以上の標準的な治療剤を同時に、別々に、または逐次的に投与することをさらに含む、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
治療における使用のための請求項１〜６または１０〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１８】
癌の治療における使用のための請求項１〜６または１０〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１９】
前記癌が、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、肝癌、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、食道癌、軟部組織肉腫、胆管癌、または肝細胞癌である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
前記肺癌が非小細胞肺癌、小細胞肺癌、または中皮腫である、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
癌の治療において、シスプラチン、カルボプラチン、ダカルバジン、リポソーム化ドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド及びドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、パクリタキセル、注射用懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イクサベピロン、カペシタビン、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びイリノテカン）、ゲムシタビン、トポテカン、リポソーム化イリノテカン、ペメトレキセド、ならびにセツキシマブからなる群より選択される１種以上の標準的な治療剤と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて使用するための請求項１〜６または１０〜１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項２２】
請求項１〜６または１０〜１１のいずれか１項に記載の抗体の有効量を含む、癌の治療における使用のための薬学的組成物。
【請求項２３】
前記癌が、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、肝癌、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、食道癌、軟部組織肉腫、胆管癌、または肝細胞癌である、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記肺癌が非小細胞肺癌、小細胞肺癌、または中皮腫である、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
シスプラチン、カルボプラチン、ダカルバジン、リポソーム化ドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド及びドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、パクリタキセル、注射用懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イクサベピロン、カペシタビン、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びイリノテカン）、ゲムシタビン、トポテカン、リポソーム化イリノテカン、ペメトレキセド、ならびにセツキシマブからなる群より選択される１種以上の標準的な治療剤と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて投与される、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に関する。より具体的には、本発明は、ヒトプログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）ならびにＴ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質−３（ＴＩＭ−３）に結合し、かつ単独で、ならびに化学療法及び他の癌療法と組み合わせて、固形及び血液系腫瘍を治療するのに有用であり得る、二重特異性抗体に関する。
【０００２】
腫瘍細胞は、免疫系による検出及び除去を、複数のメカニズムを通じて逃れる。免疫チェックポイント経路は、自己寛容の維持及びＴ細胞活性化の制御で使用されるが、癌細胞は、経路を使用して、抗腫瘍応答を抑制し、癌細胞の破壊を防止することができる。
【０００３】
ＰＤ−Ｌ１／ヒトプログラム細胞死１（ＰＤ−１）経路は、１つのそのような免疫チェックポイントである。ヒトＰＤ−１は、Ｔ細胞上で見られ、ＰＤ−Ｌ１は様々な腫瘍型によって異常に発現され、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合は、Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生を阻害する。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１阻害性軸は、抗腫瘍免疫応答の文脈において腫瘍進展を形作る自然選択過程の一部として、腫瘍によって抑えられている。
【０００４】
ＴＩＭ−３は、消耗したＴ細胞の機能抑制に重要な役割を果たしていると特定されたチェックポイントの受容体である。腫瘍抗原を認識するＴ細胞は、患者及びマウスモデルから単離することができるが、そのような細胞は、細胞傷害性機能、エフェクターサイトカイン産生、及び増殖における障害を特徴とする消耗した表現型を示すことがある。これらのＴ細胞は、高レベルのチェックポイント制御因子ＴＩＭ−３を発現することができる。
【０００５】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の治療標的が、臨床的に検証されているが、ＰＤ−Ｌ１陰性かつＰＤ−Ｌ２−高陽性の腫瘍において、９〜４５％で変動する癌患者における客観的応答があり、多くの患者は耐久性のある応答を達成しなかった。２つ以上のチェックポイント受容体の複合遮断は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１遮断抗体による単独療法に抵抗性であり得る癌患者において、客観的応答の頻度を増加させ、効力を発揮し得る。
【０００６】
２つの抗体、すなわちＴ細胞と相互作用することができる抗マウスＴＩＭ−３抗体及びマウス腫瘍細胞と別個に相互作用することができる抗マウスＰＤ−Ｌ１抗体による、ＣＴ２６担腫瘍マウスから採取した腫瘍浸潤リンパ球のインビトロ治療は、いずれかの経路を単独で標的とするよりも、マウス腫瘍増殖のより効果的な制御をもたらした（Ｓａｋｕｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．ＪＥＭ  ２０１０，２０７：２１８７及びＷＯ２０１５／０４８３１２）。
【０００７】
ＰＤ−Ｌ１及びＴＩＭ−３をアンタゴナイズする経口の小分子が報告されている（Ｓａｓｉｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＡＣＲ；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１６；７６（１４  Ｓｕｐｐｌ）：Ａｂｓｔｒａｃｔ  ４８６１）。この小分子化合物は、同系マウス腫瘍モデルにおいて効力を実証すると報告されている。
【０００８】
ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＴＩＭ−３の両方に結合して阻害することができ、抗体の標的特異性及び薬物動態をも有する化合物を提供する必要性が依然として存在する。特に、ヘテロ二量体の二重特異性抗体が２つの異なる重鎖及び２つの異なる軽鎖を単一のＩｇＧ様抗体に対形成させ得る、ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＴＩＭ−３の両方に結合するヘテロ二量体の二重特異性抗体を提供する必要性が依然として存在する。さらに、低い免疫原性、安定したインビボの薬物動態、及び適切な安定性のような目的のためのモデリング、質量分析、及び安定性分析によって測定されるとき、二重特異性抗体が天然の抗体構造に類似している必要性が存在する。さらに、以下の特徴：ＰＤ−Ｌ１発現腫瘍細胞とＴＩＭ−３発現Ｔ細胞に同時に結合して架橋すること、ＰＤ−１及びＴＩＭ−３チェックポイント阻害因子経路を抑制すること、腫瘍モデルで測定されるときに抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び抗ＴＩＭ−３抗体の組み合わせよりもより良好な抗腫瘍活性を示すこと、ならびに抗体の免疫エフェクター機能を欠くことの１つ以上を有する、抗ヒトＰＤ−Ｌ１及び抗ヒトＴＩＭ−３二重特異性抗体を提供する必要性が依然として存在する。
【０００９】
したがって、本発明は、ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）及びヒトＴＩＭ−３（配列番号２）に結合する抗体であって、
ａ）配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）を含む第１の重鎖（ＨＣ）と、
ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む第１の軽鎖（ＬＣ）と、
ｃ）配列番号５、配列番号６、または配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含む第２のＨＣと、
ｄ）配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む第２のＬＣ
とを含み、
第１のＬＣが第１のＨＣと鎖間ジスルフィド結合を形成し、第２のＬＣが第２のＨＣと鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のＨＣが第２のＨＣと２つの鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のＨＣ及び第２のＨＣがヒトＩｇＧ１アイソタイプである、抗体を提供する。
【００１０】
本発明はさらに、第２のＨＣが配列番号５のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含み、第２のＬＣが配列番号８のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む抗体を提供する。本発明はさらに、第２のＨＣが配列番号６のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含み、第２のＬＣが配列番号９のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む抗体を提供する。本発明はさらに、第２のＨＣが配列番号７のアミノ酸配列を有するＨＣＶＲを含み、第２のＬＣが配列番号１０のアミノ酸配列を有するＬＣＶＲを含む抗体を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、抗体であって、
ａ）第１のＨＣが、配列番号１９及び配列番号２２のアミノ酸配列を含み、
ｂ）第２のＨＣが、配列番号２３及び配列番号２６のアミノ酸配列を含み、
ｃ）第１のＬＣが、配列番号２７のアミノ酸配列を含み、
ｄ）第２のＬＣが、配列番号２８のアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【００１２】
本発明は、ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）及びヒトＴＩＭ−３（配列番号２）に結合する抗体であって：
ａ）配列番号３、配列番号１９、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１のＨＣと、
ｂ）配列番号４及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む第１のＬＣと、
ｃ）配列番号５、配列番号２３、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む第２のＨＣと、
ｄ）配列番号８及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む第２のＬＣ
とを含み、
第１のＬＣが第１のＨＣと鎖間ジスルフィド結合を形成し、第２のＬＣが第２のＨＣと鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のＨＣが第２のＨＣと２つの鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のＨＣ及び第２のＨＣがヒトＩｇＧ１アイソタイプである、抗体を提供する。
【００１３】
本発明は、ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）及びヒトＴＩＭ−３（配列番号２）に結合する抗体であって：
ａ）配列番号３、配列番号１９、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１のＨＣと、
ｂ）配列番号４及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む第１のＬＣと、
ｃ）配列番号６、配列番号２３、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む第２のＨＣと、
ｄ）配列番号９及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む第２のＬＣ
とを含み、
第１のＬＣが第１のＨＣと鎖間ジスルフィド結合を形成し、第２のＬＣが第２のＨＣと鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のＨＣが第２のＨＣと２つの鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のＨＣ及び第２のＨＣがヒトＩｇＧ１アイソタイプである、抗体を提供する。
【００１４】
本発明は、ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）及びヒトＴＩＭ−３（配列番号２）に結合する抗体であって：
ａ）配列番号３、配列番号１９、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１のＨＣと、
ｂ）配列番号４及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む第１のＬＣと、
ｃ）配列番号７、配列番号２３、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む第２のＨＣと、
ｄ）配列番号１０及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む第２のＬＣ
とを含み、
第１のＬＣが第１のＨＣと鎖間ジスルフィド結合を形成し、第２のＬＣが第２のＨＣと鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のＨＣが第２のＨＣと２つの鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のＨＣ及び第２のＨＣがヒトＩｇＧ１アイソタイプである、抗体を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）及びヒトＴＩＭ−３（配列番号２）に結合する抗体であって：
ａ）第１のＨＣが、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
ｂ）第２のＨＣが、配列番号２４及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む、抗体を提供する。
【００１６】
配列番号１９〜２８に関して、表１は、配列が抗体上で相関する場所を示す。配列番号３〜１０に関して、表２は、配列が抗体上で相関する場所を示す。
【００１７】
本発明は、２つの軽鎖（ＬＣ）及び２つの重鎖（ＨＣ）を含むヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）及びヒトＴＩＭ−３（配列番号２）に結合する抗体であって、
ａ）第１のＬＣが配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
ｂ）第１のＨＣが配列番号１１のアミノ酸配列を有し、
ｃ）第２のＬＣが、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のアミノ酸配列を有し、
ｄ）第２のＨＣが、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列を有する、抗体を提供する。
【００１８】
本発明は、２つの軽鎖（ＬＣ）及び２つの重鎖（ＨＣ）を含む抗体であって、
ａ）第１のＬＣが配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
ｂ）第１のＨＣが配列番号１１のアミノ酸配列を有し、
ｃ）第２のＬＣが、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のアミノ酸配列を有し、
ｄ）第２のＨＣが、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列を有する、抗体を提供する。
【００１９】
本発明は、２つの軽鎖（ＬＣ）及び２つの重鎖（ＨＣ）を含むヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）及びヒトＴＩＭ−３（配列番号２）に結合する抗体であって、
ａ）第１のＬＣが、配列番号１２のアミノ酸配列を有し、第１のＨＣが配列番号１１のアミノ酸配列を有し、
ｂ）第２のＬＣ及び第２のＨＣが、それぞれ、配列番号１６及び配列番号１３、配列番号１７及び配列番号１４、または配列番号１８及び配列番号１５のアミノ酸配列を有する抗体を提供する。
【００２０】
本発明はさらに、第２のＬＣが配列番号１６のアミノ酸配列を有し、第２のＨＣが配列番号１３のアミノ酸配列を有する抗体を提供する。本発明はさらに、第２のＬＣが配列番号１７のアミノ酸配列を有し、第２のＨＣが配列番号１４のアミノ酸配列を有する抗体を提供する。本発明はさらに、第２のＬＣが配列番号１８のアミノ酸配列を有し、第２のＨＣが配列番号１５のアミノ酸配列を有する抗体を提供する。
【００２１】
本発明は、ＬＣ及びＨＣを含むヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）に結合する半抗体であって、ＬＣが配列番号１２のアミノ酸配列を有し、ＨＣが配列番号１１のアミノ酸配列を有する半抗体を提供する。
【００２２】
本発明は、ＬＣ及びＨＣを含むヒトＴＩＭ−３（配列番号２）に結合する半抗体であって、ＬＣ及びＨＣが、それぞれ、配列番号１６及び配列番号１３、配列番号１７及び配列番号１４、または配列番号１８及び配列番号１５のアミノ酸配列を有する半抗体を提供する。
【表１】
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【００２３】
本発明は、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供し、細胞は、本発明の抗体を発現することができる。
【００２４】
本発明は、第１のＤＮＡ分子及び第２のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供し、第１のＤＮＡ分子が配列番号１１及び配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、第２のＤＮＡ分子が配列番号１５及び配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、細胞は本発明の抗体を発現することができる。
【００２５】
本発明は、第１のＤＮＡ分子、第２のＤＮＡ分子、第３のＤＮＡ分子、及び第４のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供し、第１のＤＮＡ分子が配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、第２のＤＮＡ分子が配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、第３のＤＮＡ分子が配列番号１５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、第４のＤＮＡ分子が配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、細胞は本発明の抗体を発現することができる。
【００２６】
本発明は、本発明の抗体を生成するためのプロセスであって、抗体が発現されるような条件下で本発明の哺乳動物細胞を培養することと、発現された抗体を回収することとを含むプロセスを提供する。
【００２７】
本発明は、本発明のプロセスにより産生される抗体を提供する。
【００２８】
本発明は、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を抗体が発現されるような条件下で培養することと、発現された抗体を回収することとによって産生される抗体を提供する。
【００２９】
本発明は、第１のＤＮＡ分子及び第２のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、第１のＤＮＡ分子が配列番号１１及び配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、第２のＤＮＡ分子が配列番号１５及び配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む細胞を抗体が発現されるような条件下で培養することと、発現された抗体を回収することとによって産生される抗体を提供する。
【００３０】
本発明は、本発明の抗体、及び許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。
【００３１】
本発明は、有効量の本発明の抗体をそれを必要としている患者に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。本発明はさらに、有効量の本発明の抗体をそれを必要としている患者に投与することを含む、癌を治療する方法を提供し、癌は、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、肝癌、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、食道癌、軟部組織肉腫、胆管癌、または肝細胞癌である。
【００３２】
本発明は、癌を治療する方法を提供し、癌は黒色腫である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は肺癌である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、肺癌は非小細胞肺癌、小細胞肺癌、または中皮腫である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は頭頸部癌である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は肝癌である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は結腸直腸癌である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は膵癌である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は胃癌である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は腎癌である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は膀胱癌である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は前立腺癌である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は乳癌である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は卵巣癌である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は子宮内膜癌である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は食道癌である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は軟部組織肉腫である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は胆管癌である。本発明はさらに、癌を治療する方法を提供し、癌は肝細胞癌である。
【００３３】
本発明はさらに、シスプラチン、カルボプラチン、ダカルバジン、リポソーム化ドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド及びドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、パクリタキセル、注射用懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イクサベピロン、カペシタビン、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びイリノテカン）、ゲムシタビン、トポテカン、リポソーム化イリノテカン、ペメトレキセド、ならびにセツキシマブからなる群より選択される１種以上の標準的な治療剤と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて、有効量の本発明の抗体を投与することを含む方法を提供する。
【００３４】
本発明はさらに、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、リリルマブ、アテゾリズマブ、エパカドスタット、及びデュルバルマブからなる群より選択される１種以上の抗腫瘍剤と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて、有効量の本発明の抗体を投与することを含む方法を提供する。
【００３５】
本発明はさらに、電離放射線と同時の、別々の、または逐次的な組み合わせを含む有効量の本発明の抗体を投与することを含む方法を提供する。
【００３６】
本発明は、療法で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明はさらに、癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供し、癌は、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、肝癌、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、食道癌、軟部組織肉腫、胆管癌、または肝細胞癌である。
【００３７】
本発明は、黒色腫の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、肺癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明はさらに、本発明の抗体を提供し、肺癌は非小細胞肺癌、小細胞肺癌、または中皮腫である。本発明は、頭頸部癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、肝癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、結腸直腸癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、膵癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、胃癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、腎癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、膀胱癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、前立腺癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、乳癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、卵巣癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、子宮内膜癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、食道癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、軟部組織肉腫の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、胆管癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。本発明は、肝細胞癌の治療で使用するための本発明の抗体を提供する。
【００３８】
本発明は、癌の治療において、シスプラチン、カルボプラチン、ダカルバジン、リポソーム化ドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド及びドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、パクリタキセル、注射用懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イクサベピロン、カペシタビン、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びイリノテカン）、ゲムシタビン、トポテカン、リポソーム化イリノテカン、ペメトレキセド、ならびにセツキシマブからなる群より選択される１種以上の標準的な治療剤と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて使用するための本発明の抗体を提供する。
【００３９】
本発明はさらに、癌の治療において、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、リリルマブ、アテゾリズマブ、エパカドスタット、及びデュルバルマブからなる群より選択される１種以上の抗腫瘍剤と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて使用するための本発明の抗体を提供する。
【００４０】
本発明は、癌の治療において、電離放射線と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて使用するための本発明の抗体を提供する。
【００４１】
本発明は、有効量の本発明の抗体を含む癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明はさらに、有効量の本発明の抗体を含む癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供し、癌は、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、肝癌、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、食道癌、軟部組織肉腫、胆管癌、または肝細胞癌である。本発明はさらに、有効量の本発明の抗体を含む癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供し、肺癌は非小細胞肺癌、小細胞肺癌、または中皮腫である。
【００４２】
本発明は、有効量の本発明の抗体を含む黒色腫の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む肺癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む頭頸部癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む肝癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む結腸直腸癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む膵癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む胃癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む腎癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む膀胱癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む前立腺癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む乳癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む卵巣癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む子宮内膜癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む食道癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む軟部組織肉腫の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む胆管癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。本発明は、有効量の本発明の抗体を含む肝細胞癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供する。
【００４３】
本発明はさらに、癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供し、シスプラチン、カルボプラチン、ダカルバジン、リポソーム化ドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド及びドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、パクリタキセル、注射用懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イクサベピロン、カペシタビン、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びイリノテカン）、ゲムシタビン、トポテカン、リポソーム化イリノテカン、ペメトレキセド、ならびにセツキシマブからなる群より選択される１種以上の標準的な治療剤と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて、前記薬学的組成物が投与される。
【００４４】
本発明はさらに、癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供し、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、リリルマブ、アテゾリズマブ、エパカドスタット、及びデュルバルマブからなる群より選択される１種以上の抗腫瘍剤と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて、前記薬学的組成物が投与される。
【００４５】
本発明はさらに、癌の治療において使用するための薬学的組成物を提供し、前記薬学的組成物は、電離放射線と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて投与される。
【００４６】
本発明は、癌の治療のための医薬の製造のための本発明の抗体の使用を提供する。本発明はさらに、癌の治療のための医薬の製造のための本発明の抗体の使用を提供し、癌は、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、肝癌、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、食道癌、軟部組織肉腫、胆管癌、または肝細胞癌である。本発明はさらに、癌の治療のための医薬の製造のための本発明の抗体の使用を提供し、肺癌は非小細胞肺癌、小細胞肺癌、または中皮腫である。
【００４７】
本発明はさらに、癌の治療のための医薬の製造のための本発明の抗体の使用を提供し、前記医薬は、シスプラチン、カルボプラチン、ダカルバジン、リポソーム化ドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド及びドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、パクリタキセル、注射用懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イクサベピロン、カペシタビン、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びイリノテカン）、ゲムシタビン、トポテカン、リポソーム化イリノテカン、ペメトレキセド、ならびにセツキシマブからなる群より選択される１種以上の標準的な治療剤と同時に、別々に、または逐次的に投与されるものである。
【００４８】
本発明はさらに、癌の治療のための医薬の製造のための本発明の抗体の使用を提供し、前記医薬は、ニボルマブ、イピリムマブ、ピジリズマブ、ペムブロリズマブ、トレメリムマブ、ウレルマブ、リリルマブ、アテゾリズマブ、エパカドスタット、及びデュルバルマブからなる群より選択される１種以上の抗腫瘍剤と同時に、別々に、または逐次的に投与されるものである。
【００４９】
本発明はさらに、癌の治療のための医薬の製造のための本発明の抗体の使用を提供し、前記医薬は、電離放射線と同時に、別々に、または逐次的に投与されるものである。
【００５０】
本発明の抗体は、改変された非天然型のポリペプチド複合体である。本発明のＤＮＡ分子は、本発明の抗体中のポリペプチドのうちの１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、非天然型のＤＮＡ分子である。
【００５１】
本発明の抗体は、ＩｇＧ型抗体であり、鎖内及び鎖間ジスルフィド結合を介して架橋される「重」鎖と「軽」鎖とを有する。各重鎖は、Ｎ末端ＨＣＶＲ及び重鎖定常領域（「ＨＣＣＲ」）からなる。各軽鎖は、ＬＣＶＲ及び軽鎖定常領域（「ＬＣＣＲ」）からなる。軽鎖はそれぞれ重鎖とジスルフィド結合を形成し、２つの重鎖は互いに２つのジスルフィド結合を形成する。
【００５２】
重鎖の定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ１はＨＣＶＲの後にあり、ＣＨ１及びＨＣＶＲはＦａｂの重鎖部分を形成する。ＣＨ２はヒンジ領域の後、ＣＨ３の前にある。ＣＨ３はＣＨ２の後にあり、重鎖のカルボキシ末端にある。
【００５３】
軽鎖の定常領域は、１つのドメインＣＬを含む。ＣＬはＬＣＶＲの後にあり、ＣＬ及びＬＣＶＲはＦａｂの軽鎖部分を形成する。
【００５４】
本発明の抗体は、抗体を形成する２つの異なる重鎖及び２つの異なる軽鎖のために、抗体の各アームがその同種抗原に対する選択的一価結合を示すという点でヘテロ二量体である。本発明において、抗体の一方のアームはヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）に結合し、他方のアームはヒトＴＩＭ−３（配列番号２）に結合する。これらの二重特異性抗体の適切な組み立てを確実にするために、ＣＨ１及びＣＨ３領域内の重鎖の配列に、ならびに軽鎖定常領域内の軽鎖の配列に変異を組み入れる。ＣＨ１及びＬＣの変異は、必要な軽鎖と重鎖の対の自然な対形成に有利に働き、軽鎖の誤った対形成を不利にするためになされる。ＣＨ３変異は、２つの異なる重鎖のヘテロ二量体対形成に有利に働き、ホモ二量体の形成を不利にする。抗体の抗ＰＤ−Ｌ１部分のＣＨ３領域における変異は、好ましくは、配列番号１１の絶対位置によってナンバリングされた３５６位、３７２位、３９８位、及び４００位（ＥＵナンバリングを使用する場合は、３５０位、３６６位、３９２位、及び３９４位）を含む。抗体の抗ＴＩＭ−３部分のＣＨ３領域における変異は、好ましくは、配列番号１５の絶対位置によってナンバリングされた３５０位、３５１位、３５６位、４０５位、及び４０７位（ＥＵナンバリングを使用する場合は、３５０位、３５１位、４０５位、及び４０７位）を含む。抗体の抗ＰＤ−Ｌ１部分のＣＨ１領域の変異は、好ましくは、配列番号１１の絶対位置によってナンバリングされた１８９位（ＥＵナンバリングを使用する場合は１８３位）を含む。抗体の抗ＴＩＭ−３部分のＣＨ１領域における変異は、好ましくは、配列番号１５の絶対位置によってナンバリングされた１２８位、１４７位、１７５位、及び１８３位（ＥＵナンバリングを使用する場合は、１２８位、１４７位、１７５位、及び１８３位）を含む。
【００５５】
抗体の抗ＰＤ−Ｌ１部分のＣＬ領域における変異は、好ましくは、配列番号１１の絶対位置によってナンバリングされた１７９位及び１８１位（ＥＵナンバリングを使用する場合は、１７６位及び１７８位）を含む。抗体の抗ＴＩＭ−３部分のＣＬ領域における変異は、好ましくは、配列番号１５の絶対位置によってナンバリングされた１３１位、１３３位、１７６位、及び１７８位（ＥＵナンバリングを使用する場合は、１３１位、１３３位、１７６位、及び１７８位）を含む。
【００５６】
本発明の特定の抗体において、重鎖ヘテロ二量体対形成変異は、天然抗体に匹敵する８０℃を超えるＣＨ３の熱安定性をもたらす（表１及びＶｏｎ  Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【００５７】
ある特定の生物系において発現したとき、Ｆｃ配列を有する抗体は、Ｆｃ領域内でグリコシル化される。典型的には、グリコシル化は、抗体のＦｃ領域内の高度に保存されたＮ−グリコシル化部位で生じる。Ｎ−グリカンは、典型的には、アスパラギンに付着する。抗体は、他の位置においても同様にグリコシル化され得る。
【００５８】
任意に、ある特定の本発明の抗体は、ヒトＩｇＧ１由来であるＦｃ部分を含む。ＩｇＧ１は、Ｆｃ−γ受容体ファミリー（ＦｃγＲ）及びＣ１ｑのタンパク質に結合することが周知である。これらの受容体との相互作用は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発し得る。したがって、免疫エフェクター機能を除去するために、抗体Ａ、Ｂ、及びＣを含む本発明の特定の抗体について、あるアミノ酸置換がＩｇＧ１  Ｆｃに導入される。抗体の抗ＰＤ−Ｌ１部分のＣＨ２領域における変異は、配列番号１１の絶対位置によってナンバリングされた２４０位、２４１位、及び２７１位（ＥＵナンバリングを使用する場合は、２３４位、２３５位、及び２６５位）を含み得る。抗体の抗ＴＩＭ−３部分のＣＨ２領域における変異は、配列番号１５の絶対位置によってナンバリングされた２３４位、２３５位、及び２６５位（ＥＵナンバリングを使用する場合は、２３４位、２３５位、及び２６５位）を含み得る。
【００５９】
ＨＣＶＲ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＨＣＶＲをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト及び他の哺乳動物の重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において既知である。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、例えば、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。
【００６０】
ＬＣＶＲ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＬＣＶＲをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子に変換され得る。ヒト及び他の哺乳動物の軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において既知である。これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって取得され得る。軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域であり得る。好ましくは、本発明の抗体に関して、抗体の抗ＰＤ−Ｌ１部分の軽鎖定常領域はλ軽鎖であり、抗体の抗ＴＩＭ−３部分の軽鎖定常領域はκ軽鎖である。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドは、その配列が発現制御配列に作動可能に連結された後に、宿主細胞内で発現する。発現ベクターは、典型的には、エピソーム、または宿主染色体ＤＮＡの一体化した部分のいずれかとして、宿主生物中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、及びジヒドロ葉酸レダクターゼを含む。
【００６２】
本発明の抗体は、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＨＥＫ２９３、またはＣＯＳ細胞などの哺乳動物細胞内で容易に産生され得る。宿主細胞は、当該技術分野において周知の技術を使用して培養される。
【００６３】
対象となるポリヌクレオチド配列（例えば、抗体のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び発現制御配列）を含むベクターは、細胞宿主の型に応じて変動する周知の方法によって、宿主細胞に導入され得る。
【００６４】
タンパク質精製の様々な方法が用いられ得、そのような方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８２：８３−８９（１９９０）、及びＳｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ＮＹ（１９９４）に記載される。
【００６５】
本発明の別の実施形態において、抗体またはそれをコードする核酸が、単離形態で提供される。本明細書で使用されるとき、「単離された」という用語は、細胞環境において見られる任意の他の高分子種を含まない、または実質的に含まない、タンパク質、ペプチド、または核酸を指す。本明細書で使用されるとき、「実質的に含まない」は、対象となるタンパク質、ペプチド、または核酸が、８０％超（モル基準で）、好ましくは９０％超、及びより好ましくは９５％超で存在する高分子種を含むことを意味する。
【００６６】
本発明の抗体またはそれを含む薬学的組成物は、非経口経路（例えば、皮下及び静脈内）によって投与されてもよい。本発明の抗体単独で、単回または複数回投与で、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と共に患者に投与されてもよい。本発明の薬学的組成物は、当該技術分野において周知の方法によって調製され得（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  ｅｄ．（２０１２），Ａ．Ｌｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ）、本明細書に開示される抗体、及び１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤を含む。
【００６７】
「治療すること」（または「治療する」もしくは「治療」という用語は、既存の症状、疾患、状態、または疾病の進行または重症度を遅らせること、妨げること、阻止すること、軽減すること、停止すること、低減すること、または回復させることを指す。
【００６８】
ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）、ヒトＴＩＭ−３（配列番号２）、または両方に対する抗体の親和性に関連して本明細書で使用されるとき、「結合する」は、特に指示がない限り、本質的に本明細書に記載されるように、３７℃で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサーを使用することを含む、当該技術分野において既知の一般的な方法によって決定されるときに、約１×１０−６Ｍ未満、好ましくは約１×１０−９Ｍ未満のＫＤを意味することを意図する。
【００６９】
「有効量」は、研究者、医師、または他の臨床医によって探究されている組織、体系、動物、哺乳動物、またはヒトの生物学的もしくは医学的応答、またはそれに対する所望の治療効果を誘発する、本発明の抗体または本発明の抗体を含む薬学的組成物の量を意味する。有効量の抗体は、個人の病状、年齢、性別、及び体重、ならびに個人における所望の応答を誘発する抗体の能力などの要因に応じて変動し得る。有効量はまた、抗体の任意の毒作用または有害作用よりも治療的に有益な効果が上回る量である。
【実施例】
【００７０】
本発明は、以下の非限定的な実施例によってさらに例示される。
【００７１】
実施例１：抗体発現及び精製
重鎖及び軽鎖の可変領域のポリペプチド、抗体Ａ、抗体Ｂ、及び抗体Ｃの完全重鎖及び軽鎖アミノ酸配列、ならびにそれをコードするヌクレオチド配列を、下で「アミノ酸及びヌクレオチド配列」と題されている節において列挙する。加えて、抗体Ａ、Ｂ、及びＣの軽鎖、重鎖、軽鎖可変領域、及び重鎖可変領域に対する配列番号を、表２に示す。
【００７２】
抗体Ａ、抗体Ｂ、及び抗体Ｃを含むがこれらに限定されない本発明の抗体は、本質的に下記のように作製及び精製することができる。ＣＨＯのような適切な宿主細胞は、クワッドベクター、デュアルベクター、または２０ＨＣ抗ＴＩＭ−３：１０ＨＣ抗ＰＤ−Ｌ１：２４ＬＣ抗ＴＩＭ−３：４６ＬＣ抗ＰＤ−Ｌ１の比での４つの単一ベクターを用いて抗体を分泌するための発現系で一過性にまたは安定にトランスフェクトすることができる。配列番号２９〜配列番号３２は、抗体Ｃの軽鎖及び重鎖のＤＮＡ配列であり、ＰＤ−Ｌ１抗体軽鎖は、ＴＩＭ−３軽鎖と比較して発現レベルを増加させる内部イントロンを有する。抗体が分泌された既知組成培地は、多くの一般的に使用される技術のうちのいずれかを使用して精製されてもよい。例えば、培地は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）のような適合緩衝液で平衡化された、ＭａｂＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、またはＦａｂフラグメントのためのＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に簡便に適用され得る。カラムは、非特異的結合成分を除去するために洗浄され得る。結合した抗体は、例えば、ｐＨ勾配（２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７から１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．０、またはリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４から１００ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ３．０など）によって溶出され得る。抗体画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどによって検出され得、次いで、プールされ得る。可溶性凝集体及び多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、マルチモーダル、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む一般的な技術によって効果的に除去され得る。抗体は、一般的な技術を使用して濃縮及び／または滅菌濾過され得る。生成物は、−７０℃ですぐに冷凍されてもよく、または凍結乾燥されてもよい。
【表２】
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【００７３】
アッセイ
抗体のインビトロ結合
ヘテロ二重特異性抗体を用いて、抗体の一方のアーム（１つの軽鎖及び１つの重鎖）は、抗原に一価結合し、抗体の第２のアーム（１つの軽鎖及び１つの重鎖）は、第２の抗原に一価結合する。本発明の抗体が、抗原に二価結合する親抗体と比較したときに匹敵する、各抗原への結合を維持する能力は、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによって評価することができる。
【００７４】
対応する抗原ＴＩＭ−３及びＰＤ−Ｌ１に対する抗体Ｃ及びその親抗体の結合動態及び親和性を、３７℃でＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００バイオセンサー装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析した。ヒトＦａｂは、固定化レベル７０００〜９０００ＲＵでアミンカップリングを用いてＣＭ５センサーチップ上に固定化した。抗体サンプルをＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液で希釈し、３０μＬ／分の流速で注入した。次いで、一連の濃度のヒトＴＩＭ−３単一アーム抗原（ＴＩＭ−３−ＳＡＧ）及びＦｃ標識化ＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ）を１８０秒間注入し、１２００秒の解離時間が後に続いた。センサーグラムは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェア３．０を使用して評価し、会合（Ｋａ）及び解離（Ｋｄ）速度定数の計算は、１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルフィットに基づく。動態定数Ｋｄ／Ｋａの比から、平衡解離定数（ＫＤ）または結合親和定数を計算した。
【００７５】
抗体ＡのＦａｂについてのＰＤ−Ｌ１に結合する一価抗原は６．５×１０−１０Ｍであり、親の抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＦａｂによるＰＤ−Ｌ１の二価結合に匹敵した。抗体Ｂ及びＣのＦａｂの一価のＰＤ−Ｌ１結合もまた、親の抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＦａｂに匹敵した。
【００７６】
抗体ＡのＦａｂのＴＩＭ−３に結合する一価抗原は２．５３×１０−９Ｍであり、親の抗ＴＩＭ−３抗体の二価結合親和性よりも約３３倍低かった。抗体ＢのＦａｂはＴＩＭ−３に対して１．９１×１０−１０ＭのＫｄを有し、抗体ＣのＦａｂはＴＩＭ−３に対して１．１１×１０−１０ＭのＫｄを有した。抗体Ｂの一価のＦａｂ結合は、親の抗ＴＩＭ−３抗体の二価の結合親和性よりも３倍低い親和性であったが、抗体Ｃの一価のＦａｂ結合は親の二価の結合親和性に匹敵した。
【００７７】
熱安定性
ヘテロ二量体二重特異性抗体では、２つの異なる重鎖の対形成、及びそれぞれの重鎖と同種の軽鎖との選択的対形成が必要である。本発明の抗体が天然抗体に匹敵する安定性を維持する能力は、ＤＳＣ分析によって試験することができる。
【００７８】
試験はＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−キャピラリーＤＳＣ（Ｓｅｒｉａｌ＃１１．０５０８３．ＣＡＰ）を用いてＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで実施した。全てのサンプルは、２５℃〜１００℃の温度範囲内で６０℃／時間の走査速度で走査した。溶液を各走査の間に毛管中で約６０ｐｓｉで加圧した。各タンパク質について、緩衝液／緩衝液走査を緩衝液／タンパク質走査から差し引き、サーモグラムをタンパク質濃度について標準化した。ベースライン補正を実施し、各熱変性（Ｔｍ）の中点を最大ピークから得た。
【００７９】
本質的にこのアッセイに記載されるように実施した試験において、抗体ＣのＤＳＣ分析は、親抗体（抗ＰＤ−Ｌ１抗体：Ｔｍ１  ６７℃、Ｔｍ２、７５℃、Ｔｍ３  ８２℃、抗ＴＩＭ−３抗体：Ｔｍ１  ６４℃、Ｔｍ２  ８５℃）と同等のアンフォールディング温度において熱安定性（Ｔｍ１  ６７℃、Ｔｍ２  ７６℃、Ｔｍ３  ８３℃）を示した。
【００８０】
ＥＬＩＳＡで測定したときのＰＤ−Ｌ１及びＴＩＭ−３への同時結合
本発明の抗体がＰＤ−Ｌ１及びＴＩＭ−３に同時に結合する能力は、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで測定することができる。ＴＩＭ−３−Ｆｃタンパク質をプレート上にコーティングして、本発明の抗体のＴＩＭ−３への結合を試験することができるが、プレート結合抗体が可溶性ビオチン化ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃにも結合する場合にのみシグナルが生じる。
【００８１】
結合アッセイのために、９６ウェル（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ）プレートを４℃において一晩、５０μｌ／ウェルの１μｇ／ｍｌのヒトＴＩＭ−３−Ｆｃでコーティングした。次いで、プレートを０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、３％ＢＳＡを含む２５０μｌ／ウェルのＰＢＳで室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を除去し、２００ｎＭで開始する５０μｌの滴定抗体をプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌの１００ｎｇ／ｍｌヒトＰＤ−Ｌ１ビオチンを添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌの１：５０００希釈したＳｔｒｅｐ  ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  １０６−０３０−０８４）を添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌ／ウェルの１：１ＴＭＢ基質溶液Ａ及びＢ（ＫＰＬ）を用いて室温で１０分間発色させた。１００μｌ／ウェルの０．１Ｎ−Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させ、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーで読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてデータをグラフ化した。
【００８２】
本質的にこのアッセイに記載されるように実施した試験において、抗体Ｃは、抗体Ｃの濃度と共に増加するシグナルを生成し、抗体Ｃがこれらの条件下で同時にヒトＰＤ−Ｌ１及びＴＩＭ−３に結合することを実証する。対照のＴＩＭ−３抗体単独では、バックグラウンドシグナルのみを生成した。
【００８３】
抗体Ｃは、細胞表面上のＰＤ−Ｌ１及びＴＩＭ−３標的に同時に結合する
本発明の抗体が細胞表面上のＴＩＭ−３及びＰＤ−Ｌ１タンパク質を同時に結合する能力は、ＴＩＭ−３：ＰＤ−Ｌ１ヘテロタイプ受容体結合（ＨＲＡ）を測定するための生細胞レポーターアッセイ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）において試験することができる。ＨＲＡアッセイは、酵素フラグメントの相補性に基づいており、個々に触媒的に不活性であり、互いにほとんど親和性を示さない２つの組換えβ−ガラクトシダーゼフラグメントを使用する。互いに結合するタンパク質に融合パートナーとして付加されるとき、２つのフラグメントを近接させて機能的β−ガラクトシダーゼ酵素を再構成することができる。酵素活性は、化学発光基質の切断中に生成される光によってモニターされる。
【００８４】
アッセイのために、ＴＩＭ−３（１〜２２３）−ＰＫ及びＰＤ−Ｌ１（１〜２５９）−ＥＡ（ＰＫ＝ＰｒｏＬｉｎｋ  β−ガラクトシダーゼ断片、ＥＡ＝酵素アクセプター断片）をコードするコンストラクトを用いてＵ２ＯＳ細胞を連続的にトランスフェクトした。異所膜タンパク質発現を許容する能力によってＵ２ＯＳ細胞を選択したが、ＴＩＭ−３、ＰＤ−Ｌ１コンストラクトは、細胞内ドメインの大部分、ならびに受容体インターナリゼーション及びシグナル誘発クラスタリングのような潜在的な複雑化を排除するように設計された。
【００８５】
安定なＵ２ＯＳ  ＴＩＭ−３（１〜２２３）−ＰＫ  ＰＤ−Ｌ１（１〜２５９）−ＥＡプールからの細胞を、３８４ウェルプレート（５０００細胞／ウェル）上に四重で播種した。抗体Ｃ、ならびに対応する親の抗ＴＩＭ−３及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体の希釈系列を細胞に添加し、３７℃／５％ＣＯ２で一晩（１６時間）インキュベートした。次いで、溶解緩衝液及び酵素基質を含む検出試薬を細胞に添加し、プレートをＥｎｖｉｓｉｏｎ照度計で読み取った。
【００８６】
本質的にこのアッセイに記載されるように実施した試験において、抗体Ｃは、約２ｎＭのＥＣ５０でシグナルの滴定可能な増加をもたらすが、対応するＴＩＭ−３及びＰＤ−Ｌ１に対する単一特異性モノクローナル抗体は完全に不活性である。これらのデータは、抗体Ｃが、これらの条件下で細胞表面上のＴＩＭ−３及びＰＤ−Ｌ１の両方に同時に結合し得ることを示す。
【００８７】
抗体Ｃは、ＴＩＭ−３発現細胞をＰＤ−Ｌ１発現細胞と架橋する
ＴＩＭ−３発現細胞とＰＤ−Ｌ１発現細胞を架橋する本発明の抗体の能力は、トランスフェクションした、ＰＤ−Ｌ１を発現するＣＨＯ発現とＴＩＭ−３を発現するＤＯ１１細胞を用いるフローサイトメトリー分析によって決定することができる。簡潔に述べると、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１とＤＯ１１−ＴＩＭ−３の過剰発現細胞は、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル）（ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ）またはＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ（ＣＴＤＲ／Ｔｈｅｒｍｏ）によって別々に標識することができる。ＤＯ１１−ＴＩＭ−３とＣＨＯ−ＰＤＬ１の細胞を、抗体Ｃのような試験抗体と３０分間別々にインキュベートする（氷上でＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０９％アジ化ナトリウム中において）。結合していない抗体は、洗浄（２００μｌＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０９％アジ化ナトリウムで２回）によって除去することができる。ＣＨＯ−ＰＤＬ１細胞をＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０９％アジ化ナトリウム中の４５μｇ／ｍｌの親ＰＤ−Ｌ１抗体またはｈＩｇＧ１対照と氷上で２時間インキュベートする。ＤＯ１１−ＴＩＭ−３細胞をＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．０９％アジ化ナトリウム中の４５μｇ／ｍｌの親ＴＩＭ−３抗体またはｈｕＩｇＧ４−ＰＡＡと氷上で２時間インキュベートする。ＤＯ１１−ＴＩＭ−３／抗体Ｃ細胞をＣＨＯ−ＰＤＬ１＋親ＰＤ−Ｌ１抗体またはｈＩｇＧ１と２２．５μｇ／ｍｌの最終濃度で混合する。ＣＨＯ−ＰＤＬ１／抗体Ｃ細胞を、ＤＯ１１−ＴＩＭ−３＋ＴＩＭ−３抗体の親抗体またはｈｕＩｇＧ４−ＰＡＡと２２．５μｇ／ｍｌの最終濃度で混合する。４℃で約７２時間のインキュベーション後、細胞をＣＦＳＥとＣＴＤＲに適したチャネルで（ＨＴＳサンプラー付）Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０上で測定する。ＦＬＯＷＪＯ（登録商標）ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて、二重陽性事象（ＣＦＳＥ＋／ＣＴＤＲ＋）をゲートし、（二重のウェルについて）全事象の割合を計算し、報告することができる。フィットと統計は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍで非線形回帰（可変勾配、４パラメータ）を用いて生成する。
【００８８】
本質的に上記のように実施された実験において、フローサイトメトリーにより二重陽性事象として検出されるように、抗体Ｃは細胞架橋を媒介する。抗体ＣのＤＯ１１−ＴＩＭ−３またはＣＨＯ−ＰＤＬ１細胞への結合（後続の未結合の除去を伴う）、次いで、それぞれのＣＨＯ−ＰＤＬ１またはＤＯ１１−ＴＩＭ−３細胞との混合は、バックグラウンドと比較して二重陽性事象の用量依存性の増加を引き起こす（緩衝液のみと比較して最大４倍増加）。この二重陽性事象の増加は、競合ＰＤ−Ｌ１及び／またはＴＩＭ−３のｍＡｂの高濃度での過剰な添加によって阻止されたが、対応する非特異性ＩｇＧ対照によっては阻止されず、標的抗原発現に対する特異性及び依存性を示している。
【００８９】
インビトロ機能活性
１．ｈＴＩＭ−３  ＤＯ１１細胞に基づくアッセイ
ＴＩＭ−３阻害によるＴ細胞の抑制を緩和する本発明の抗体の能力は、ＤＯ１１インビトロアッセイにおいて測定することができる。
【００９０】
ｈＴＩＭ−３  ＤＯ１１細胞ベースのアッセイのために５０μｌのＤＯ１１細胞またはｈＴＩＭ−３過剰発現ＤＯ１１細胞を２×１０４細胞／ウェルで、及び５０μｌのＡ２０細胞を２×１０４細胞／ウェルで、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、＃１１８７５−０８５）を用いて、９６ウェルＵ底組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｃｅｌｌｓｔａｒ、＃６５１１８０）に播種した。５０μｌのＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ，＃Ｏ１６４１）を０．２μＭの最終濃度（培地中に希釈）で添加した。５０Ｌμｌの系列希釈抗体を添加した（培地中に希釈）。いくつかのウェルに培地を添加して総量を２００μｌ／ウェルにした。１８〜２２時間後に上清を回収し、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、＃ＳＭ２０００）を用いてｍＩＬ−２を測定した。
【００９１】
本質的にこのアッセイに記載されるように実施した試験において、抗体Ｃは、増加するｍＩＬ−２レベルによって測定したとき、４．３６６ｎＭのＥＣ５０でＯＶＡ抗原特異的Ｔ細胞活性化を増強したが、ヒトＩｇＧ対照は増強しなかった。
【００９２】
２．混合白血球応答（ＭＬＲ）アッセイ
ＰＤ−Ｌ１シグナルを遮断する本発明の抗体の能力は、インビトロＭＬＲアッセイにおいてＴ細胞活性化の間にサイトカインの放出を測定することによって評価することができる。ＩＦＮ−γのような特定のサイトカインのレベルは、Ｔ細胞活性化が本発明の抗体での処理によって促進される場合に増加すると予測される。
【００９３】
ＭＬＲアッセイのために、単球をヒト単球単離キットＩＩ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，＃１３０−０９１−１５３）を用いてヒトＰＢＭＣ（Ａｌｌｃｅｌｌｓ，＃ＰＢ００１）から単離し、６２．５ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４と共に７日間培養して樹立細胞を分化させる。ＣＤ４  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，ｃａｔ＃１３０−０９１−１５５）を用いてＰＢＭＣ（Ａｌｌｃｅｌｌｓからの種々のドナー）から単離した、１００μｌの１×１０５のＣＤ４  Ｔ細胞と、１×１０４の単球由来のヒト樹状細胞を、１００μｌの抗体と共に９６ウェルＵ底プレート中に播種した。細胞を加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートし、３日後に上清を回収した。ヒトＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡを、Ｒ＆Ｄ  ＥＬＩＳＡキット（＃ＳＩＦ５０）を用いて上清について実施した。
【００９４】
本質的にこのアッセイに記載されるように実施した試験において、４ｎＭの抗体ＣがＩＦＮ−γレベルを約３倍増加させたる一方で、８ｎＭの抗体ＣはＩＦＮ−γレベルを約５倍増加させた。これらの結果は、このアッセイにおいて抗体Ｃが同種異系Ｔ細胞応答を増強する能力を実証している。
【００９５】
インビボ機能試験
１．ＨＣＣ８２７ヒトＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおける抗体Ｃ
Ｔ細胞の同種異系抗原への応答を増強することによってモデルにおいて確立された腫瘍を遅らせるか、または破壊する能力を評価するためのＨＣＣ８２７ヒトＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおいて、本発明の抗体の効力が試験され得る。
【００９６】
試験のために、０日目に、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＮＳＧマウス（７週齢、メス、８匹のマウスの群）に、ＨＢＳＳ中の１０×１０６個のＨＣＣ８２７細胞（全量０．２ｍｌ）を腹部の皮下に移植した。全血から単離したバルクヒトＴ細胞（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ）を、Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いて１０日間増殖させ、凍結保存した。Ｔ細胞を解凍し、洗浄し、計数し、３６日目にＨＣＣ８２７担腫瘍マウスの静脈内に注入した（マウスあたり０．２ｍｌのＰＢＳ中２．５×１０６個のＴ細胞）。３６日目から、３週間週１回で（ｄ３６、ｄ４３、ｄ５０に投与）、ヒトＩｇＧ（２０ｍｇ／ｋｇ）、抗体Ｂの親の抗ＴＩＭ−３抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）または抗体Ｃの親の抗ＴＩＭ−３抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせた抗体Ｃの親の抗ＰＤ−Ｌ１抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗体Ｂ（２０ｍｇ／ｋｇ）、または抗体Ｃ（２０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内投与で処理した。毛繕い及び歩行を含む動物の健康及び挙動を、１週間に少なくとも２回モニターした。体重及び腫瘍容積を、１週間に２回測定した。腫瘍容積は、ＩＭ−Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔと題するＳＯＰに記載されているように、電子キャリパーを用いて細胞移植後４日目に開始して、週に２回測定した。腫瘍容積は、式：
【数１】
2019522624.tif 000004
を用いて計算した。
【００９７】
本質的にこのアッセイに記載されるように実施した試験において、処理対未処理
【数２】
2019522624.tif 000005
の腫瘍サイズを比較するとき、抗体Ｃの親の抗ＰＤ−Ｌ１抗体と抗体Ｃの親の抗ＴＩＭ−３抗体の組み合わせは、５０日目において６２．５％腫瘍増殖を遅らせた。抗体Ｂの親の抗ＰＤ−Ｌ１抗体と抗体Ｂの親の抗ＴＩＭ−３抗体の組み合わせは、
【数３】
2019522624.tif 000006
で腫瘍増殖を遅らせた。５０日目に、抗体Ｃ処理により、Ｔ細胞を注入した３５日目と比較して腫瘍サイズの８．３％退縮をもたらした。したがって、ＨＣＣ８２７モデルにおけるＴＩＭ−３抗体とＰＤ−Ｌ１抗体の組み合わせは、腫瘍増殖を遅らせたが、抗体Ｃは腫瘍サイズの退縮をもたらした。
【００９８】
２．Ｌ５５担腫瘍ヒト化ＨＳＣＴＦＬ−ＮＯＧ−Ｆマウス（ＮＳＣＬＣモデル）における抗体Ｃ
Ｔ細胞の同種異系抗原への応答を増強することによってモデルにおいて確立された腫瘍を遅らせるか、または破壊する能力を評価するためのＬ５５ヒトＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおいて、本発明の抗体の効力が試験され得る。
【００９９】
Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓのメスＮＯＧマウスに、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を移植した。マウス末梢血におけるｈｕＣＤ４５＋細胞及びマウスＣＤ４５＋細胞（ｍＣＤ４５）の存在は、移植後１６週間にフローサイトメトリーによって確認された。試験のために、０日目に、ＨＳＣＴＦＬ−ＮＯＧ−Ｆマウスに、Ｌ５５フラグメントを腹部の皮下に移植した。Ｌ５５細胞を、１０％ウシ胎仔血清＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム及びＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養し、Ｌ５５腫瘍をＮＳＧマウス上で増殖させてこの試験のためのフラグメントを生成した。動物を約１８０ｍｍ３の平均腫瘍体積でランダム化して群に分けた。２６日目に処理を開始し、３３日目及び４０日目における全ての抗体の週１回投与（Ｑ７ＤＸ３）が後に続いた。抗体Ｃの親の抗ＰＤ−Ｌ１抗体と抗体Ｃの親の抗ＴＩＭ−３抗体の組み合わせについては、各抗体を１０ｍｇ／ｋｇで投与した。二重特異性抗体については、抗体Ｃを２０ｍｇ／ｋｇで投与した。毛繕い及び歩行を含む動物の健康及び挙動を、１週間に少なくとも２回モニターした。体重及び腫瘍容積を、１週間に２回測定した。腫瘍容積は、ＩＭ−Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔと題するＳＯＰに記載されているように、電子キャリパーを用いて細胞移植後４日目に開始して、週に２回測定した。腫瘍容積は、式：
【数４】
2019522624.tif 000007
を用いて計算した。
【０１００】
本質的にこのアッセイに記載されるように実施した試験において、処理対対照（腫瘍容積について
【数５】
2019522624.tif 000008
）の腫瘍サイズを比較するとき、抗体Ｃの親の抗ＰＤ−Ｌ１抗体と抗体Ｃの親の抗ＴＩＭ−３抗体の組み合わせは、４０日目において５０％のＴ／Ｃ％を有した。４０日目において、抗体Ｃの処理は、２つの親抗体の組み合わせと比べて腫瘍増殖を遅らせ、処理対対照（腫瘍容積について
【数６】
2019522624.tif 000009
）の腫瘍サイズを比較するとき、７％のＴ／Ｃ％を有した。
【０１０１】
３．Ｌ５５ヒトＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおける抗体Ｃとペメトレキセドの併用療法
Ｔ細胞の同種異系抗原への応答を増強することによってモデルにおいて確立された腫瘍を遅らせるか、または破壊する能力を評価するためのＬ５５ヒトＮＳＣＬＣ異種移植モデルにおいて、ペメトレキセドと組み合わせた本発明の抗体の効力が試験され得る。
【０１０２】
Ｌ５５細胞を、１０％ウシ胎仔血清＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム及びＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養するであろう。試験のために、０日目に、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのＮＳＧマウス（７週齢、メス、８匹のマウスの群）に、（５０／５０）マトリゲル：ＨＢＳＳ中の５×１０６個のＬ５５細胞（全量０．２ｍｌ）を腹部の皮下に移植した。バルクヒトＰＢＭＣをアフェレーシス（ＢｉｏＳｐｅｃ）から単離し、腫瘍が約２５０ｍｍ３に達する３３日目にＬ５５担腫瘍マウスの静脈内に注入した（マウスあたり０．２ｍｌのＰＢＳ中の１１×１０６ＰＢＭＣ細胞）。３４日目から、ヒトＩｇＧ（２０ｍｇ／ｋｇ）、抗体Ｃ（２０ｍｇ／ｋｇ）、またはペメトレキセド（５０ｍｇ／ｋｇ）と組み合わせて、腹腔内注射によりマウスを処理した。ペメトレキセドは毎週５日間、その間に２日間の休止を伴って実施した。抗体は４週間、週に４回（ｄ３４、ｄ４１、ｄ４８、ｄ５５で投与）実施した。４７日目に、第２バッチの５ＭのＰＢＭＣ（第１注入と同じロット）をＬ５５担腫瘍マウスに注射した。毛繕い及び歩行を含む動物の健康及び挙動を、１週間に少なくとも２回モニターした。体重及び腫瘍容積を、１週間に２回測定した。腫瘍容積は、ＩＭ−Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔと題するＳＯＰに記載されているように、電子キャリパーを用いて細胞移植後４日目に開始して、週に２回測定した。腫瘍容積は、式：
【数７】
2019522624.tif 000010
を用いて計算した。
【０１０３】
本質的にこのアッセイに記載されるように実施した試験において、抗体Ｃ自体またはｈｕＩｇＧとペメトレキセドの組み合わせは、このモデルにおいてＢｌｉｓｓ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ法によって定義される「無効果」をもたらした。抗体Ｃとペメトレキセドの組み合わせは、試験終了時に
【数８】
2019522624.tif 000011
で腫瘍増殖を遅らせた。
【０１０４】
プレート結合抗体ＣによるヒトＰＢＭＣにおけるインビトロサイトカイン放出試験
本発明の抗体がサイトカイン放出症候群を誘発する可能性は、新鮮な末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いたプレート結合アッセイにおいてサイトカイン放出を測定することによって評価することができる。抗体による治療によって誘発されるサイトカイン放出症候群は、ほとんどの患者にとって望ましくない反応であり、二重特異性抗体による治療はリスクを高める可能性がある。
【０１０５】
６人の健康な被験者由来の新しく単離したＰＢＭＣを、０．１μｇ〜１０μｇの広い滴定範囲にわたって、プレート結合の抗体Ｃまたは対照抗体とともに２４時間インキュベートした。陽性対照は、抗ヒトＣＤ３ε抗体、ＯＫＴ３、及びＣＤ２８特異的スーパーアゴニスト治療用抗体ＴＧＮ１４１２の相同体であった。両方の抗体は、臨床においてサイトカインストームを引き起こすと知られている。陰性対照は、エフェクターヌルｈＩｇＧ１（ＩｇＧ１−ＥＮ）アイソタイプ抗体であった。ウェルあたり合計２×１０５個の細胞（２００μＬ）を三重で抗体被覆プレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを４００ｇで５分間遠心分離し、細胞培養上清を回収し、サイトカイン測定前に−８０℃で保存した。ｃｕｓｔｏｍ  ５−ｐｌｅｘ  ａｓｓａｙ  ＭＳＤ  ｋｉｔ（Ｃａｔ＃  Ｋ１５１Ａ０Ｈ−２；Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いて製造者の指示に従って培養上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及びＴＮＦ−αを含む５種類のサイトカインを測定した。
【０１０６】
本質的にこのアッセイに記載されるように実施した試験において、広範囲の濃度にわたる抗体ＣとのヒトＰＢＭＣのインキュベーションは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、及びＴＮＦ−αについて有意なレベルのサイトカイン放出をもたらさなかった。対照的に、抗ＣＤ３ε及びＴＧＮ１４１２陽性対照抗体とのＰＢＭＣのインキュベーションは、大部分のドナーにおいて分析された５つのサイトカインの全てについて強力なサイトカイン産生をもたらした。
【０１０７】
ヒト全血における可溶性抗体Ｃを用いたインビトロサイトカイン放出試験
本発明の抗体がサイトカイン放出症候群を誘発する可能性はまた、ヒト全血における本発明の可溶性抗体によるサイトカイン放出を測定することによって評価することができる。
【０１０８】
１０人の健康なドナーから採取した新鮮なヒト全血サンプルを１００μｇ／ｍＬの可溶性抗体Ｃまたは対照抗体と共に２４時間インキュベートした。陽性対照は、抗ヒトＣＤ３ε抗体、ＯＫＴ３、及び相同体抗ヒトＣＤ５２（Ｃａｍｐａｔｈ）を含んだ。ＯＫＴ３及びＣａｍｐａｔｈは、臨床において「サイトカインストーム」を引き起こすと知られている。陰性対照は、臨床においてサイトカイン放出症候群に関与しない治療用抗体インフリキシマブ及び、エフェクターヌル（ＥＮ）ｈＩｇＧ１（ＩｇＧ１−ＥＮ）アイソタイプ抗体であった。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、及びＴＮＦ−αを含むサイトカインの広範囲のパネルは、ヒト血漿上清中のＭｅｓｏｓｃａｌｅプラットフォームに基づくカスタムマルチプレックスアッセイ（Ｃａｔ＃Ｋ１５０４９Ｄ−１，Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を用いて分析した。
【０１０９】
本質的にこのアッセイに記載されるように実施した試験において、ＣａｍｐａｔｈまたはＯＫＴ３は、全てのドナーにおいて、ＣＲＳ（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、及びＩＬ−１０）に関連するサイトカインを含む、分析したサイトカインのいくつかの強力なサイトカイン放出をもたらした。対照的に、抗体Ｃまたはインフリキシマブとのインキュベーションは、１０人の健康なドナーにおいて有意なサイトカイン放出をまったく誘発しなかった。１００μｇ／ｍｌまでの濃度で２４時間までヒト全血とインキュベートしたとき、抗体Ｃは強力なサイトカイン放出をもたらさなかった。
【０１１０】
インビトロ免疫原性アッセイ
本発明の抗体は、抗体の各半分が異なる標的に結合するヘテロ二量体であるように改変される。ヘテロ二量体抗体の非天然構成により、免疫原性は評価されなければならない潜在的リスクである。
【０１１１】
ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）ＤＣ：Ｔ細胞アッセイを用いて、抗体Ｃの臨床的免疫原性の相対的可能性を決定した。単球由来樹状細胞を、５０人の健常ドナーのコホートのＰＢＭＣから調製し、抗体Ｃを負荷し、Ｔ細胞エピトープを自家精製ＣＤ４＋Ｔ細胞に提示するために成熟表現型に誘導した。Ｔ細胞増殖（［３Ｈ］−チミジン取り込み）及びＩＬ−２サイトカイン分泌（ＥＬＩＳｐｏｔ）を用いて、Ｔ細胞応答を測定した。
【０１１２】
（インフリキシマブ、アダリムマブ、及びベバシズマブのような）既知の生物製剤の群によるＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）時間経過Ｔ細胞アッセイは、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイにおけるドナーＴ細胞応答の頻度と臨床で観察される免疫原性のレベル（抗タンパク質治療用抗体応答）との明らかな相関を示している。アレムツズマブのような免疫原性抗体のＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイでは高頻度のドナー応答が観察されたが、オマリズマブ及びトラスツズマブのような非免疫原性抗体については比較的低頻度のドナー応答が観察された。一般に、ＥｐｉＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイにおいて１０％以下の陽性応答を誘発するタンパク質治療薬は、臨床における免疫原性の低いリスクと関連する。
【０１１３】
本質的にこのアッセイに記載されるように実施した試験において、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の頻度及び大きさの分析は、抗体Ｃがドナーコホートの６〜８％において控えめな陽性応答を誘発し、したがって臨床免疫原性のリスクが低いことを示した。
【０１１４】
抗体Ｃ免疫エフェクター機能のインビトロ解析
ヒトＰＤ−Ｌ１及びヒトＴＩＭ−３に対する二重特異性抗体による癌の潜在的治療法として、抗体によってもたらされる免疫エフェクター機能は望ましくない。抗体Ｃは、免疫エフェクター機能を欠くように改変されている。免疫エフェクター機能の非存在を確認するために、抗体Ｃを、ヒトＦｃγ受容体及びＣ１ｑの結合のための標準的な固相結合アッセイで試験し、そして抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）応答の誘発について、標準的な細胞ベースのインビトロアッセイで試験した。
【０１１５】
固相ヒトＦｃγ受容体結合アッセイのために、このアッセイで使用する組換えのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ））タンパク質は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、及びＦｃγＲＩＩＩａ（Ｖ）である。受容体タンパク質はＰＢＳ中に希釈し、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅプレート（ＭＳＤ  ｃａｔ＃  Ｌ１５ＸＡ−３）上にコーティングした（５０ｎｇ／ウェル）。４℃で一晩インキュベートした後、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、１５０μＬ／ウェルのＰＢＳＴ中の５％ＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ（ＭＳＤ  ｃａｔ＃  Ｒ９３ＢＡ−１）で、１〜２時間室温でブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ＭＳＤブロッカーＡ中に希釈した試験抗体または対照抗体（表３）の３０μＬを各ウェルに添加し、２時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、３０μＬの二次抗体（ＭＳＤ  Ｃａｔ＃Ｄ２０ＴＦ−６）を各ウェルに添加し、攪拌しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、１５０μＬの１×Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＭＳＤ  ｃａｔ＃Ｒ９２ＴＣ−１）を各ウェルに添加した。次いで、Ｓｅｃｔｏｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ２４００上でプレートを読みとった。
【０１１６】
Ｃ１ｑ結合ＥＬＩＳＡアッセイのために、９６ウェルポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃａｔ．３８５５）を、ＰＢＳ中２００〜０．０３０５μｇ／ｍＬの範囲の濃度の試験抗体ならびに対照（リツキシマブ−ＩｇＧ１エフェクターヌル及び別のヒトＩｇＧ１エフェクターヌル抗体）でコーティングした。４℃で一晩インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで室温で２時間、３００μｌのカゼイン緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｃａｔ＃３７５２８）でブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、カゼインブロッキング緩衝液で希釈した０．５μｇ／ウェルのＣ１ｑ（Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃａｔ＃  Ａ４００）を添加した。室温で２時間後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、５０μＬの二次抗体（１：２００，Ａｂｄ  Ｓｅｒｏｔｅｃ  Ｉｎｃ＃２２２１−５００４Ｐ）を各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、１００μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ：ＫＰＬ  ｃａｔ＃  ５０−６５−０１／０２）、ＨＲＰの基質を各ウェルに添加し、プレートを室温で２０分間インキュベートした。反応を停止させ（  ＫＰＬ  ｃａｔ＃  ５０−８５−０６）、吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎＭで測定した。
【０１１７】
ＡＤＣＣアッセイのために、ＰＤ−Ｌ１及びＴＩＭ−３陽性標的細胞ならびにＣＤ２０陽性Ｗｉｌ２Ｓ細胞を、５０μＬのＡＤＣＣアッセイ緩衝液（ＲＰＭＩ  １６４０中０．５％ＢＳＡ）中１００００細胞／ウェルの密度で９６穴平底プレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，＃６００−５６８０）に播種した。細胞を３０分間インキュベートし（特に明記しない限り、細胞を用いた全てのインキュベーションは３７℃、５％ＣＯ２で実施した）、ＡＤＣＣアッセイ緩衝液で希釈した滴定試験抗体の２５μＬ／ウェルの添加が後に続いた。試験抗体との３０分間のインキュベーション後、２５μＬのエフェクター細胞（ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを有するＦｃγＲＩＩＩａ陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞）を１５：１（エフェクター：標的）の比率で添加し、５〜６時間インキュベートした。活性化されたエフェクター細胞のルシフェラーゼ活性を、１００μＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｇ７９４０）による１０分間の室温インキュベーション後に測定した。マイクロタイタープレートリーダーを用いて発光を定量し、４パラメータモデルを用いてデータを分析して、各抗体のＥＣ５０値を決定した。
【０１１８】
ＡＤＣＰアッセイのために、ＰＤ−Ｌ１及びＴＩＭ−３陽性標的細胞ならびにＣＤ２０陽性Ｗｉｌ２Ｓ細胞を、５０μＬのＡＤＣＰアッセイ緩衝液（ＲＰＭＩ  １６４０中０．５％ＢＳＡ）中１００００細胞／ウェルの密度で９６穴平底プレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，＃６００−５６８０）に播種した。細胞を３０分間インキュベートし（特に明記しない限り、細胞を用いた全てのインキュベーションは３７℃、５％ＣＯ２で実施した）、ＡＤＣＰアッセイ緩衝液で希釈した滴定試験抗体の２５μＬ／ウェルの添加が後に続いた。試験抗体との３０分間のインキュベーション後、２５μＬのエフェクター細胞（ＮＦＡＴ−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを有するＦｃγＲＩＩａ陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞；Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ９８８５）を６：１（エフェクター：標的）の比率で添加し、５〜６時間インキュベートした。活性化されたエフェクター細胞のルシフェラーゼ活性を、１００μＬのＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃Ｇ７９４０）による１０分間の室温インキュベーション後に測定した。マイクロタイタープレートリーダーを用いて発光を定量し、４パラメータモデルを用いてデータを分析して、各抗体のＥＣ５０値を決定した。
【０１１９】
ＣＤＣアッセイのために、接着標的細胞を１００μＬ／ウェルの細胞増殖培地中２５０００細胞／ウェルで９６ウェル白色平底プレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，＃６００−５６８０）に播種した。一晩のインキュベーション（特に明記しない限り、細胞を用いた全てのインキュベーションは３７℃、５％ＣＯ２で実施した）後、培地を除去し、５０μＬのＣＤＣアッセイ緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０培地、０．１％ＢＳＡを含む１０％ＦＢＳ、及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳ）を添加した。アッセイの日に５０μＬのＣＤＣアッセイ緩衝液中５０，０００細胞／ウェルの密度で懸濁細胞を播種した。試験抗体及び対照抗体をプレートに二重で加え、３０分間インキュベートした。次いで、インキュベーション後、５ｍＬのアッセイ緩衝液（１：５）で希釈した５０μＬのヒト補体（Ｓ１７６４；Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに１時間加えた。インキュベーション後、１６μＬ／ウェルのＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＤＡＬ１１００）を各ウェルに添加した。プレートを２２時間インキュベートした後、インキュベーターから取り出し、室温で５分間平衡させた。Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏ２（励起：５６０ｎｍ、発光：５９０ｎｍ）で蛍光を読み取り、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００によって引き起こされる完全な細胞溶解と比較して、ＣＤＣ細胞溶解を表した。
【０１２０】
本質的にこのアッセイに記載されるように実施した試験において、抗体Ｃは、試験したヒトＦｃγ受容体のいずれか、またはＣ１ｑとの特異的な結合を全く示さなかった。さらに、抗体Ｃに関連するＴＩＭ−３及びＰＤ−Ｌ１陽性細胞株を用いた細胞ベースのＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、またはＣＤＣアッセイにおいて検出可能な応答はなかった。これらの結果は、実施されたアッセイの検出限界内で抗体Ｃが検出可能な免疫エフェクター機能を欠いていることを示している。
【０１２１】
サルにおける薬物動態
本発明の抗体は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて血清薬物動態（ＰＫ）分析を用いてサルにおける安定性について試験することができる。
【０１２２】
抗体Ｃの血清ＰＫを分析するために、血清サンプルを、３つの異なる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）フォーマットで分析した。全免疫グロブリン（ＩｇＧ）ＥＬＩＳＡを用いて、ＴＩＭ−３またはＰＤ−Ｌ１に対する結合能力にかかわらず、全ＩｇＧ骨格の存在を定量した。抗体Ｃの標準曲線範囲は１２５〜８０００ｎｇ／ｍＬで、定量上限（ＵＬＯＱ）は３０００ｎｇ／ｍＬ、定量下限（ＬＬＯＱ）は３００ｎｇ／ｍＬであった。さらに、血清中の活性薬物の存在を定量するために、ＴＩＭ−３抗原捕捉ＥＬＩＳＡ及びＰＤ−Ｌ１抗原捕捉ＥＬＩＳＡを用いた。ＴＩＭ−３抗原捕捉ＥＬＩＳＡの場合、抗体Ｃのアッセイ範囲は１２５〜８０００ｎｇ／ｍＬであり、ＵＬＯＱは３０００ｎｇ／ｍＬでＬＬＯＱは３００ｎｇ／ｍＬであった。ＰＤ−Ｌ１抗原捕捉ＥＬＩＳＡの場合、抗体Ｃの標準曲線範囲は１２５〜８０００ｎｇ／ｍＬで、定量上限（ＵＬＯＱ）は３０００ｎｇ／ｍＬ、定量下限（ＬＬＯＱ）は３００ｎｇ／ｍＬであった。
【０１２３】
本質的にこのアッセイに記載されるように実施した試験において、ＴＩＭ−３及びＰＤ−Ｌ１に対する全ＩｇＧ及び機能的抗原捕捉ＥＬＩＳＡアッセイは、すべての用量レベルで定量的に類似しており、抗体Ｃにおける安定性及びインビボでの経時的な機能的結合能力の保持を示す。
【０１２４】
アミノ酸及びヌクレオチド配列
配列番号１  （ヒトＰＤ−Ｌ１）
ＭＲＩＦＡＶＦＩＦＭＴＹＷＨＬＬＮＡＦＴＶＴＶＰＫＤＬＹＶＶＥＹＧＳＮＭＴＩＥＣＫＦＰＶＥＫＱＬＤＬＡＡＬＩＶＹＷＥＭＥＤＫＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫＶＱＨＳＳＹＲＱＲＡＲＬＬＫＤＱＬＳＬＧＮＡＡＬＱＩＴＤＶＫＬＱＤＡＧＶＹＲＣＭＩＳＹＧＧＡＤＹＫＲＩＴＶＫＶＮＡＰＹＮＫＩＮＱＲＩＬＶＶＤＰＶＴＳＥＨＥＬＴＣＱＡＥＧＹＰＫＡＥＶＩＷＴＳＳＤＨＱＶＬＳＧＫＴＴＴＴＮＳＫＲＥＥＫＬＦＮＶＴＳＴＬＲＩＮＴＴＴＮＥＩＦＹＣＴＦＲＲＬＤＰＥＥＮＨＴＡＥＬＶＩＰＥＬＰＬＡＨＰＰＮＥＲＴＨＬＶＩＬＧＡＩＬＬＣＬＧＶＡＬＴＦＩＦＲＬＲＫＧＲＭＭＤＶＫＫＣＧＩＱＤＴＮＳＫＫＱＳＤＴＨＬＥＥＴ
【０１２５】
配列番号２  （ヒトＴＩＭ−３）
ＭＦＳＨＬＰＦＤＣＶＬＬＬＬＬＬＬＬＴＲＳＳＥＶＥＹＲＡＥＶＧＱＮＡＹＬＰＣＦＹＴＰＡＡＰＧＮＬＶＰＶＣＷＧＫＧＡＣＰＶＦＥＣＧＮＶＶＬＲＴＤＥＲＤＶＮＹＷＴＳＲＹＷＬＮＧＤＦＲＫＧＤＶＳＬＴＩＥＮＶＴＬＡＤＳＧＩＹＣＣＲＩＱＩＰＧＩＭＮＤＥＫＦＮＬＫＬＶＩＫ
【０１２６】
配列番号３  （抗体Ａ、抗体Ｂ、及び抗体ＣにおけるＰＤ−Ｌ１抗体のＨＣＶＲ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＰＤＹＳＰＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【０１２７】
配列番号４  （抗体Ａ、抗体Ｂ、及び抗体ＣにおけるＰＤ−Ｌ１抗体のＬＣＶＲ）
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＧＮＳＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＳＬＳＧＳＶＦＧＧＧＩＫＬＴＶＬＧ
【０１２８】
配列番号５  （抗体ＡにおけるＴＩＭ−３抗体のＨＣＶＲ）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＡＲＴＡＦＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１２９】
配列番号６  （抗体ＢにおけるＴＩＭ−３抗体のＨＣＶＲ）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＦＳＳＦＹＦＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＮＧＲＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＹＮＴＧＦＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１３０】
配列番号７  （抗体ＣにおけるＴＩＭ−３抗体のＨＣＶＲ）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＮＧＫＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＹＮＴＧＦＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１３１】
配列番号８  （抗体ＡにおけるＴＩＭ−３抗体のＬＣＶＲ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＥＡＩＹＧＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＰＩＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＹＧＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
【０１３２】
配列番号９  （抗体ＢにおけるＴＩＭ−３抗体のＬＣＶＲ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＥＡＩＹＧＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＰＩＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＹＧＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
【０１３３】
配列番号１０  （抗体ＣにおけるＴＩＭ−３抗体のＬＣＶＲ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＧＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＹＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＡＳＳＩＶＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＳＳＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
【０１３４】
配列番号１１  （抗体Ａ、抗体Ｂ、及び抗体ＣにおけるＰＤ−Ｌ１抗体のＨＣ）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＰＤＹＳＰＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＫＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＬＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１３５】
配列番号１２  （抗体Ａ、抗体Ｂ、及び抗体ＣにおけるＰＤ−Ｌ１抗体のＬＣ）
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＡＳＧＴＰＧＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＳＮＴＶＮＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＧＮＳＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＳＬＳＧＳＶＦＧＧＧＩＫＬＴＶＬＧＱＰＫＡＡＰＳＶＴＬＦＰＰＳＳＥＥＬＱＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＥＳＥＬＳＬＴＰＥＱＷＫＳＨＲＳＹＳＣＱＶＴＨＥＧＳＴＶＥＫＴＶＡＰＡＥＣＳ
【０１３６】
配列番号１３  （抗体ＡにおけるＴＩＭ−３抗体のＨＣ）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＡＲＴＡＦＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＥＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＴＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＥＳＳＧＬＹＳＬＷＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１３７】
配列番号１４  （抗体ＢにおけるＴＩＭ−３抗体のＨＣ）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＦＳＳＦＹＦＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＮＧＲＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＹＮＴＧＦＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＥＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＴＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＥＳＳＧＬＹＳＬＷＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１３８】
配列番号１５  （抗体ＣにおけるＴＩＭ−３抗体のＨＣ）
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＮＧＫＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＹＮＴＧＦＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＥＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＴＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＥＳＳＧＬＹＳＬＷＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０１３９】
配列番号１６  （抗体ＡにおけるＴＩＭ−３抗体のＬＣ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＧＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＹＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＳＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＲＶＧＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＲＳＡＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０１４０】
配列番号１７  （抗体ＢにおけるＴＩＭ−３抗体のＬＣ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＥＡＩＹＧＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＰＩＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＹＧＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＲＶＧＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＲＳＡＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０１４１】
配列番号１８  （抗体ＣにおけるＴＩＭ−３抗体のＬＣ）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＧＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＹＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＡＳＳＩＶＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＳＳＦＰＰＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＲＶＧＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＲＳＡＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０１４２】
配列番号１９  （ＰＤ−Ｌ１抗体ＨＣのＣＨ１ドメインからの領域）
ＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＫＳ
【０１４３】
配列番号２０  （ＰＤ−Ｌ１抗体ＨＣのＣＨ２ドメインからの領域）
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳ
【０１４４】
配列番号２１  （ＰＤ−Ｌ１抗体ＨＣのＣＨ２ドメインからの領域）
ＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫ      
【０１４５】
配列番号２２  （ＰＤ−Ｌ１抗体ＨＣのＣＨ３ドメインからの領域）
ＲＥＰＱＶＹＶＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＬＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦ
【０１４６】
配列番号２３  （ＴＩＭ−３抗体ＨＣのＣＨ１ドメインからの領域）
ＥＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＴＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＥＳＳＧＬＹＳＬＷＳＶＶＴＶＰＳ
【０１４７】
配列番号２４（ＴＩＭ−３抗体ＨＣのＣＨ２ドメインからの領域）
ＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＳ
【０１４８】
配列番号２５（ＴＩＭ−３抗体ＨＣのＣＨ２ドメインからの領域）
ＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫ
【０１４９】
配列番号２６  （ＴＩＭ−３抗体ＨＣのＣＨ３ドメインからの領域）
ＶＹＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬ
【０１５０】
配列番号２７  （ＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖定常領域からの領域）
ＡＮＫＡＴＬＶＣＬＩＳＤＦＹＰＧＡＶＴＶＡＷＫＡＤＳＳＰＶＫＡＧＶＥＴＴＴＰＳＫＱＳＮＮＫＹＡＡＥＳＥ
【０１５１】
配列番号２８  （ＴＩＭ−３抗体の軽鎖定常領域からの領域）
ＲＶＧＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＲＳＡＬＴＬ
【０１５２】
配列番号２９  抗体ＣのＰＤ−Ｌ１  ＬＣのＤＮＡ配列
ＣＡＧＴＣＣＧＴＣＣ  ＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣ  ＡＣＣＴＴＣＣＧＣＴ  ＡＧＣＧＧＴＡＣＣＣ  ＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧ
ＡＧＴＧＡＣＡＡＴＣ  ＴＣＡＴＧＣＴＣＣＧ  ＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣ  ＴＡＡＣＡＴＴＧＧＣ  ＴＣＴＡＡＣＡＣＴＧ
ＴＣＡＡＴＴＧＧＴＡ  ＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧ  ＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧ  ＣＡＣＣＡＡＡＧＣＴ  ＧＣＴＧＡＴＣＴＡＴ
ＧＧＡＡＡＣＴＣＡＡ  ＡＴＡＧＧＣＣＴＡＧ  ＣＧＧＧＧＴＧＣＣＡ  ＧＡＣＣＧＧＴＴＴＡ  ＧＣＧＧＡＴＣＴＡＡ
ＡＡＧＴＧＧＧＡＣＴ  ＴＣＡＧＣＴＴＣＣＣ  ＴＧＧＣＡＡＴＴＴＣ  ＴＧＧＡＣＴＧＣＡＧ  ＡＧＴＧＡＧＧＡＣＧ
ＡＡＧＣＴＧＡＴＴＡ  ＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧ  ＴＣＣＴＡＣＧＡＴＡ  ＧＴＴＣＡＣＴＧＡＧ  ＣＧＧＴＴＣＣＧＴＧ
ＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧ  ＧＧＡＴＣＡＡＧＣＴ  ＧＡＣＡＧＴＣＣＴＧ  ＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡ  ＡＧＧＴＧＡＧＴＴＣ
ＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣ  ＡＴＣＴＧＧＧＡＴＡ  ＡＧＣＡＴＧＣＴＧＴ  ＴＴＴＣＴＧＴＣＴＧ  ＴＣＣＣＴＡＡＣＡＴ
ＧＣＣＣＴＧＴＧＡＴ  ＴＡＴＣＣＧＣＡＡＡ  ＣＡＡＣＡＣＡＣＣＣ  ＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡ  ＣＴＴＴＧＴＴＡＣＴ
ＴＡＡＡＣＡＣＣＡＴ  ＣＣＴＧＴＴＴＧＣＴ  ＴＣＴＴＴＣＣＴＣＡ  ＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴ  ＴＣＣＧＴＧＡＣＴＣ
ＴＧＴＴＴＣＣＣＣＣ  ＴＴＣＣＡＧＣＧＡＧ  ＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧ  ＣＣＡＡＴＡＡＧＧＣ  ＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧ
ＴＧＣＣＴＧＡＴＴＡ  ＧＣＧＡＣＴＴＣＴＡ  ＴＣＣＴＧＧＡＧＣＴ  ＧＴＧＡＣＡＧＴＣＧ  ＣＡＴＧＧＡＡＧＧＣ
ＣＧＡＴＴＣＴＡＧＴ  ＣＣＡＧＴＧＡＡＡＧ  ＣＡＧＧＧＧＴＣＧＡ  ＧＡＣＣＡＣＡＡＣＴ  ＣＣＣＴＣＣＡＡＧＣ
ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＡ  ＣＡＡＧＴＡＣＧＣＡ  ＧＣＣＧＡＧＴＣＴＧ  ＡＡＣＴＧＡＧＴＣＴ  ＧＡＣＣＣＣＡＧＡＡ
ＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴ  ＣＣＣＡＣＡＧＧＡＧ  ＴＴＡＴＴＣＡＴＧＣ  ＣＡＧＧＴＧＡＣＣＣ  ＡＴＧＡＧＧＧＣＴＣ
ＣＡＣＡＧＴＧＧＡＧ  ＡＡＧＡＣＣＧＴＧＧ  ＣＣＣＣＴＧＣＴＧＡ  ＧＴＧＴＡＧＣ
【０１５３】
配列番号３０  抗体ＣのＴＩＭ−３  ＬＣのＤＮＡ配列
ＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡ  ＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣ  ＣＣＣＴＴＣＣＡＧＣ  ＣＴＧＴＣＴＧＣＣＴ  ＣＣＧＴＧＧＧＣＧＡ
ＣＧＧＡＧＴＧＡＣＣ  ＡＴＣＡＣＡＴＧＣＣ  ＡＧＧＣＴＡＧＣＣＡ  ＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣ  ＡＡＣＴＡＴＣＴＧＡ
ＡＴＴＧＧＴＡＣＣＡ  ＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴ  ＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣ  ＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴ  ＧＡＴＣＴＡＴＴＡＣ
ＧＣＴＴＣＴＴＣＣＡ  ＴＣＧＴＧＴＣＴＧＧ  ＡＧＴＧＣＣＡＴＣＣ  ＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧ  ＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣ
ＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣ  ＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡ  ＣＡＡＴＣＡＧＣＴＣ  ＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴ  ＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧ
ＣＣＡＣＡＴＡＣＴＡ  ＴＴＧＣＣＡＧＣＡＧ  ＧＣＴＴＣＣＴＣＴＴ  ＴＣＣＣＣＣＣＴＡＣ  ＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧ
ＧＧＣＡＣＡＡＡＧＣ  ＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡ  ＧＡＧＡＡＣＣＧＴＧ  ＧＣＣＧＣＴＣＣＡＴ  ＣＣＧＴＧＴＴＣＡＴ
ＣＴＴＴＣＣＡＣＣＣ  ＡＧＣＧＡＣＧＡＧＣ  ＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣ  ＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴ  ＡＧＧＧＴＧＧＧＣＴ
ＧＴＣＴＧＣＴＧＡＡ  ＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣ  ＣＣＣＣＧＧＧＡＧＧ  ＣＣＡＡＧＧＴＧＣＡ  ＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧ
ＧＡＴＡＡＣＧＣＴＣ  ＴＧＣＡＧＡＧＣＧＧ  ＣＡＡＴＴＣＴＣＡＧ  ＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡ  ＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡ
ＣＡＧＣＡＡＧＧＡＴ  ＴＣＴＡＣＡＴＡＴＴ  ＣＣＣＴＧＡＧＡＡＧ  ＣＧＣＣＣＴＧＡＣＡ  ＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧ
ＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡ  ＧＡＡＧＣＡＣＡＡＧ  ＧＴＧＴＡＴＧＣＴＴ  ＧＣＧＡＧＧＴＧＡＣ  ＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣ
ＣＴＧＴＣＣＡＧＣＣ  ＣＡＧＴＧＡＣＡＡＡ  ＧＴＣＴＴＴＣＡＡＴ  ＣＧＣＧＧＣＧＡＧＴ  ＧＴ
【０１５４】
配列番号３１  抗体ＣのＰＤ−Ｌ１  ＨＣのＤＮＡ配列
ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣ  ＴＧＧＴＧＣＡＧＡＧ  ＣＧＧＡＧＣＣＧＡＡ  ＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣ  ＣＣＧＧＴＡＧＣＡＧ
ＣＧＴＣＡＡＡＧＴＧ  ＴＣＡＴＧＴＡＡＡＧ  ＣＣＴＣＡＧＧＧＧＧ  ＡＡＣＡＴＴＣＴＣＣ  ＡＧＣＴＡＣＧＣＣＡ
ＴＣＴＣＣＴＧＧＧＴ  ＧＡＧＡＣＡＧＧＣＴ  ＣＣＡＧＧＡＣＡＧＧ  ＧＡＣＴＧＧＡＧＴＧ  ＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡ
ＡＴＣＡＴＣＣＣＴＡ  ＴＣＴＴＣＧＧＣＡＣ  ＣＧＣＣＡＡＣＴＡＣ  ＧＣＴＣＡＧＡＡＧＴ  ＴＴＣＡＧＧＧＣＣＧ
ＣＧＴＧＡＣＣＡＴＣ  ＡＣＡＧＣＣＧＡＣＡ  ＡＧＡＧＣＡＣＣＴＣ  ＴＡＣＡＧＣＴＴＡＴ  ＡＴＧＧＡＧＣＴＧＴ
ＣＴＴＣＣＣＴＧＡＧ  ＡＡＧＣＧＡＧＧＡＴ  ＡＣＡＧＣＣＧＴＧＴ  ＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣ  ＴＣＧＣＴＣＣＣＣＣ
ＧＡＣＴＡＣＡＧＣＣ  ＣＴＴＡＣＴＡＴＴＡ  ＣＴＡＴＧＧＣＡＴＧ  ＧＡＣＧＴＧＴＧＧＧ  ＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣ
ＣＡＣＡＧＴＧＡＣＣ  ＧＴＧＡＧＣＴＣＴＧ  ＣＴＡＧＣＡＣＡＡＡ  ＧＧＧＣＣＣＡＴＣＣ  ＧＴＧＴＴＣＣＣＡＣ
ＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣ  ＣＡＧＣＡＡＧＴＣＣ  ＡＣＣＡＧＣＧＧＡＧ  ＧＡＡＣＡＧＣＣＧＣ  ＴＣＴＧＧＧＣＴＧＴ
ＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧ  ＡＣＴＡＴＴＴＣＣＣ  ＡＧＡＧＣＣＡＧＴＧ  ＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴ  ＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧ
ＣＧＣＣＣＴＧＡＣＣ  ＴＣＴＧＧＡＧＴＧＣ  ＡＣＡＣＡＴＴＴＣＣ  ＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧ  ＣＡＧＴＣＴＴＣＣＧ
ＧＣＣＴＧＴＡＣＴＣ  ＴＣＴＧＡＡＧＴＣＣ  ＧＴＧＧＴＧＡＣＣＧ  ＴＧＣＣＴＡＧＣＴＣ  ＴＴＣＣＣＴＧＧＧＣ
ＡＣＣＣＡＧＡＣＡＴ  ＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡ  ＣＧＴＧＡＡＴＣＡＣ  ＡＡＧＣＣＴＴＣＣＡ  ＡＴＡＣＡＡＡＧＧＴ
ＧＧＡＣＡＡＧＡＧＧ  ＧＴＧＧＡＧＣＣＡＡ  ＡＧＡＧＣＴＧＴＧＡ  ＴＡＡＧＡＣＣＣＡＴ  ＡＣＡＴＧＣＣＣＣＣ
ＣＴＴＧＴＣＣＴＧＣ  ＴＣＣＡＧＡＧＧＣＴ  ＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣ  ＣＡＡＧＣＧＴＧＴＴ  ＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡ
ＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡ  ＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴ  ＧＡＴＧＡＴＣＴＣＴ  ＡＧＧＡＣＣＣＣＴＧ  ＡＧＧＴＧＡＣＡＴＧ
ＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧ  ＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣ  ＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣ  ＡＧＡＧＧＴＧＡＡＧ  ＴＴＴＡＡＣＴＧＧＴ
ＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧ  ＣＧＴＧＧＡＧＧＴＧ  ＣＡＴＡＡＴＧＣＴＡ  ＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣ  ＴＡＧＧＧＡＧＧＡＧ
ＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡ  ＧＣＡＣＣＴＡＴＣＧ  ＧＧＴＧＧＴＧＴＣＴ  ＧＴＧＣＴＧＡＣＡＧ  ＴＧＣＴＧＣＡＴＣＡ
ＧＧＡＴＴＧＧＣＴＧ  ＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧ  ＡＧＴＡＴＡＡＧＴＧ  ＣＡＡＧＧＴＧＴＣＴ  ＡＡＴＡＡＧＧＣＣＣ
ＴＧＣＣＣＧＣＴＣＣ  ＴＡＴＣＧＡＧＡＡＧ  ＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡ  ＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧ  ＣＣＡＧＣＣＴＡＧＧ
ＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧ  ＴＧＴＡＣＧＴＧＣＴ  ＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣ  ＣＧＧＧＡＣＧＡＧＣ  ＴＧＡＣＡＡＡＧＡＡ
ＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴ  ＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣ  ＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧ  ＣＴＴＣＴＡＴＣＣＡ  ＴＣＴＧＡＴＡＴＣＧ
ＣＴＧＴＧＧＡＧＴＧ  ＧＧＡＧＴＣＣＡＡＴ  ＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧ  ＡＧＡＡＣＡＡＴＴＡ  ＣＣＴＧＡＣＣＴＧＧ
ＣＣＣＣＣＴＧＴＧＣ  ＴＧＧＡＣＡＧＣＧＡ  ＴＧＧＣＴＣＴＴＴＣ  ＴＴＴＣＴＧＴＡＴＴ  ＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣ
ＡＧＴＧＧＡＴＡＡＧ  ＡＧＣＣＧＧＴＧＧＣ  ＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡ  ＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣ  ＴＧＴＴＣＴＧＴＧＡ
ＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣ  ＡＣＴＧＣＡＣＡＡＴ  ＣＡＴＴＡＣＡＣＣＣ  ＡＧＡＡＡＴＣＣＣＴ  ＧＴＣＡＣＴＧＡＧＣ
ＣＣＣＧＧＣＡＡＧ
【０１５５】
配列番号３２  抗体ＣのＴＩＭ−３  ＨＣのＤＮＡ配列
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣ  ＴＧＣＴＧＧＡＧＴＣ  ＴＧＧＧＧＧＧＧＧＴ  ＣＴＧＧＴＧＣＡＧＣ  ＣＣＧＧＧＧＧＴＡＧ
ＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧ  ＴＣＴＴＧＴＧＣＣＧ  ＣＣＴＣＴＧＧＧＴＴ  ＴＡＣＴＴＴＴＴＣＣ  ＡＧＣＴＡＣＴＡＴＡ
ＴＧＡＧＣＴＧＧＧＴ  ＧＡＧＡＣＡＧＧＣＴ  ＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧ  ＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧ  ＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣ
ＡＴＣＡＧＣＧＧＣＡ  ＡＣＧＧＣＡＡＡＴＣ  ＴＡＣＣＴＡＣＴＡＴ  ＧＣＴＧＡＣＴＣＣＧ  ＴＧＡＡＧＧＧＣＡＧ
ＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣ  ＡＧＣＣＧＣＧＡＴＡ  ＡＣＴＣＴＡＡＧＡＡ  ＴＡＣＡＣＴＧＴＡＣ  ＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡ
ＡＣＡＧＣＣＴＧＣＧ  ＣＧＣＴＧＡＧＧＡＣ  ＡＣＣＧＣＣＧＴＧＴ  ＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣ  ＣＡＧＡＴＡＴＴＡＴ
ＡＡＣＡＣＡＧＧＣＴ  ＴＣＧＡＴＣＴＧＴＧ  ＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣ  ＡＣＣＣＴＧＧＴＧＡ  ＣＡＧＴＧＴＣＴＴＣ
ＣＧＣＴＡＧＣＡＣＣ  ＡＡＧＧＧＣＣＣＡＡ  ＧＣＧＴＧＴＴＴＣＣ  ＡＧＡＧＧＣＴＣＣＡ  ＡＧＣＴＣＴＡＡＧＴ
ＣＣＡＣＣＡＧＣＧＧ  ＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣ  ＧＣＴＣＴＧＧＧＣＴ  ＧＴＣＴＧＧＴＧＡＣ  ＣＧＡＣＴＡＣＴＴＣ
ＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧ  ＴＧＡＣＡＧＴＧＴＣ  ＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣ  ＧＧＣＧＣＴＣＴＧＡ  ＣＣＴＣＴＧＧＣＧＴ
ＧＣＡＣＡＣＡＴＴＴ  ＣＣＡＧＣＣＧＴＧＣ  ＴＧＧＡＧＴＣＣＡＧ  ＣＧＧＣＣＴＧＴＡＣ  ＴＣＣＣＴＧＴＧＧＴ
ＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣ  ＣＧＴＧＣＣＣＡＧＣ  ＴＣＴＴＣＣＣＴＧＧ  ＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣ  ＡＴＡＴＡＴＣＴＧＣ
ＡＡＣＧＴＧＡＡＴＣ  ＡＣＡＡＧＣＣＡＴＣ  ＣＡＡＴＡＣＡＡＡＧ  ＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡ  ＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣ
ＣＡＡＧＡＧＣＴＧＴ  ＧＡＴＡＡＧＡＣＣＣ  ＡＴＡＣＡＴＧＣＣＣ  ＣＣＣＴＴＧＴＣＣＴ  ＧＣＴＣＣＡＧＡＧＧ
ＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧ  ＡＣＣＡＴＣＣＧＴＧ  ＴＴＣＣＴＧＴＴＴＣ  ＣＡＣＣＣＡＡＧＣＣ  ＴＡＡＧＧＡＣＡＣＣ
ＣＴＧＡＴＧＡＴＣＡ  ＧＣＡＧＧＡＣＣＣＣ  ＡＧＡＧＧＴＧＡＣＡ  ＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧ  ＴＧＴＣＣＧＴＧＴＣ
ＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣ  ＣＣＴＧＡＧＧＴＧＡ  ＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧ  ＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴ  ＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧ
ＴＧＣＡＴＡＡＴＧＣ  ＴＡＡＧＡＣＡＡＡＧ  ＣＣＣＡＧＧＧＡＧＧ  ＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡ  ＣＡＧＣＡＣＣＴＡＴ
ＣＧＧＧＴＧＧＴＧＴ  ＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣ  ＡＧＴＧＣＴＧＣＡＴ  ＣＡＧＧＡＴＴＧＧＣ  ＴＧＡＡＣＧＧＣＡＡ
ＧＧＡＧＴＡＴＡＡＧ  ＴＧＣＡＡＧＧＴＧＴ  ＣＴＡＡＴＡＡＧＧＣ  ＴＣＴＧＣＣＣＧＣＣ  ＣＣＴＡＴＣＧＡＧＡ
ＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣ  ＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧ  ＧＧＣＣＡＧＣＣＴＡ  ＧＡＧＡＧＣＣＡＣＡ  ＧＧＴＧＴＡＣＧＴＧ
ＴＡＴＣＣＴＣＣＡＡ  ＧＣＣＧＣＧＡＣＧＡ  ＧＣＴＧＡＣＣＡＡＧ  ＡＡＣＣＡＧＧＴＧＴ  ＣＴＣＴＧＡＣＡＴＧ
ＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧ  ＧＧＣＴＴＴＴＡＣＣ  ＣＴＴＣＴＧＡＴＡＴ  ＣＧＣＴＧＴＧＧＡＧ  ＴＧＧＧＡＧＴＣＣＡ
ＡＴＧＧＣＣＡＧＣＣ  ＡＧＡＧＡＡＣＡＡＴ  ＴＡＴＡＡＧＡＣＣＡ  ＣＡＣＣＣＣＣＴＧＴ  ＧＣＴＧＧＡＣＴＣＴ
ＧＡＴＧＧＣＴＣＣＴ  ＴＣＧＣＣＣＴＧＧＴ  ＧＴＣＣＡＡＧＣＴＧ  ＡＣＣＧＴＧＧＡＴＡ  ＡＧＡＧＣＡＧＧＴＧ
ＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣ  ＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴ  ＣＣＴＧＴＴＣＴＧＴ  ＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧ  ＧＣＡＣＴＧＣＡＣＡ
ＡＣＣＡＴＴＡＣＡＣ  ＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣ  ＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡ  ＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡ  Ａ
【配列表】
2019522624000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月18日(2018.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）及びヒトＴＩＭ−３（配列番号２）に結合する抗体であって、
ａ）配列番号３、配列番号１９、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含む第１の重鎖（ＨＣ）と、
ｂ）配列番号４及び配列番号２７のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖（ＬＣ）と、
ｃ）配列番号７、配列番号２３、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む第２のＨＣと、
ｄ）配列番号１０及び配列番号２８のアミノ酸配列を含む第２のＬＣ
とを含み、
前記第１のＬＣが前記第１のＨＣと鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第２のＬＣが前記第２のＨＣと鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第１のＨＣが前記第２のＨＣと２つの鎖間ジスルフィド結合を形成し、前記第１のＨＣ及び前記第２のＨＣがヒトＩｇＧ１アイソタイプである、抗体。
【請求項２】
ａ）前記第１のＨＣが、配列番号２０及び配列番号２１のアミノ酸配列を含み、
ｂ）前記第２のＨＣが、配列番号２４及び配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
２つの軽鎖（ＬＣ）及び２つの重鎖（ＨＣ）を含む、ヒトＰＤ−Ｌ１（配列番号１）及びヒトＴＩＭ−３（配列番号２）に結合する抗体であって、
ａ）第１のＬＣが配列番号１２のアミノ酸配列を有し、
ｂ）第１のＨＣが配列番号１１のアミノ酸配列を有し、
ｃ）第２のＬＣが、配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８のアミノ酸配列を有し、
ｄ）第２のＨＣが、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５のアミノ酸配列を有する、抗体。
【請求項４】
前記第２のＬＣが配列番号１６のアミノ酸配列を有し、前記第２のＨＣが配列番号１３のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記第２のＬＣが配列番号１７のアミノ酸配列を有し、前記第２のＨＣが配列番号１４のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の抗体。
【請求項６】
前記第２のＬＣが配列番号１８のアミノ酸配列を有し、前記第２のＨＣが配列番号１５のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号１１、配列番号１５、配列番号１２、及び配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞が請求項６に記載の抗体を発現することができる、哺乳動物細胞。
【請求項８】
第１のＤＮＡ分子及び第２のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記第１のＤＮＡ分子が配列番号１１及び配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記第２のＤＮＡ分子が配列番号１５及び配列番号１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記細胞が請求項６に記載の抗体を発現することができる、哺乳動物細胞。
【請求項９】
抗体を生成するためのプロセスであって、前記抗体が発現されるような条件下で請求項７または８に記載の哺乳動物細胞を培養することと、前記発現された抗体を回収することとを含む、プロセス。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体と、許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体の有効量を含む、癌の治療における使用のための薬学的組成物。
【請求項１２】
前記癌が、黒色腫、肺癌、頭頸部癌、肝癌、結腸直腸癌、膵癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮内膜癌、食道癌、軟部組織肉腫、胆管癌、または肝細胞癌である、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記肺癌が非小細胞肺癌、小細胞肺癌、または中皮腫である、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
シスプラチン、カルボプラチン、ダカルバジン、リポソーム化ドキソルビシン、ドセタキセル、シクロホスファミド及びドキソルビシン、ナベルビン、エリブリン、パクリタキセル、注射用懸濁液のためのパクリタキセルタンパク質結合粒子、イクサベピロン、カペシタビン、ＦＯＬＦＯＸ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びオキサリプラチン）、ＦＯＬＦＩＲＩ（ロイコボリン、フルオロウラシル、及びイリノテカン）、ゲムシタビン、トポテカン、リポソーム化イリノテカン、ペメトレキセド、ならびにセツキシマブからなる群より選択される１種以上の標準的な治療剤と同時に、別々に、または逐次的に組み合わせて投与される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。                                         
【国際調査報告】
2019522624.tif 000012
2019522624.tif 000013
2019522624.tif 000014