(57)【要約】  本発明は、マイクロ流体チャネルネットワークを備えるマイクロ流体細胞培養システムを使用して、上皮細胞を培養および／またはモニタリングする方法に関するものである。本方法では、上皮細胞が、間葉系由来の細胞によってマイクロ流体細胞培養システム中で覆われる。細胞は、管状構造体またはチューブ様構造体、すなわち、二重構造チューブを形成することができる。本方法によって、これらに限定されないが、ハイスループットスクリーニングならびに健常および疾患における上皮の解析を含めて、広範囲の様々な用途に適する改良型の上皮モデルが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体チャネルネットワークを備えるマイクロ流体細胞培養システムを使用して、上皮細胞を培養および／またはモニタリングする方法であって、
ａ）前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に間葉系細胞を導入するステップであって、前記間葉系細胞を前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に
ａ１）水性培地を使用して導入し、または
ａ２）ゲル前駆体を使用して導入し、前記ゲル前駆体は、前記マイクロ流体チャネルネットワーク中でゲル化することが可能となり、それによって、前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占めるステップ、
ｂ）ステップａ１）の場合において、好ましくはステップａ２）の場合において、好ましくは、前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分が間葉系細胞で被覆されるまで、前記間葉系細胞が増殖および／または分化することを可能とするステップ、
ｃ）前記間葉系細胞を含む前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に上皮細胞を導入するステップ、ならびに
ｄ）好ましくは、前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分が上皮細胞で被覆されるまで、および／または前記間葉系細胞の少なくとも一部分が上皮細胞で被覆されるまで、前記上皮細胞が増殖および／または分化することを可能とするステップ
を含む方法。
【請求項２】
ゲル前駆体が前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に導入され、前記ゲル前駆体は前記マイクロ流体チャネルネットワーク中でゲル化することが可能となり、それによって、前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占める、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲルを、好ましくは、毛細管圧力障壁の使用によって、ＵＶパターン化によって、またはゲル化後に針を引っ込ませることによって、またはゲル化後に除去される犠牲層を有することによって、パターン化する、請求項１または２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）において導入される前記間葉系細胞は、前記ゲル前駆体中に分散／懸濁されている、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法
【請求項５】
ステップａ）において、水性培地を使用して、好ましくはゲルに沿って、前記間葉系細胞を前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に導入する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）において、間葉系細胞の少なくとも群／層／シートが前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に形成されるまで、前記間葉系細胞を増殖および／または分化させる、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップｂ）において、間葉系細胞の少なくとも管状構造体が前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に形成されるまで、前記間葉系細胞を増殖および／または分化させる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
導入する際、前記間葉系細胞および／または前記上皮細胞は解離している、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｄ）において、上皮細胞の少なくとも群／層／シートが前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に形成されるまで、前記上皮細胞を増殖および／または分化させる、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｄ）において、上皮細胞の少なくとも管状構造体が前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に形成されるまで、前記上皮細胞を増殖および／または分化させる、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップａ）において前記間葉系細胞をゲル中において導入する場合、ステップｄ）において、上皮細胞の少なくとも群／層／シートが、前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占める前記ゲルの少なくとも一部分を被覆するまで、前記上皮細胞を増殖および／または分化させる、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記管状構造体の内腔を通して増殖培地の流れが適用され、前記流れは一方向性であっても二方向性であってもよい、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
因子Ｗｎｔ、ノギン、ｅｇｆ／ｆｇｆ、および／またはｒｅｓｐｏｎｄｉｎのうちの少なくとも１つを含む増殖培地の存在下で細胞を培養する、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法
【請求項１４】
前記間葉系細胞の少なくとも一部分はマイクロ流体チャネルネットワークの壁と前記上皮細胞との間に配置される、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップｄ）において、前記上皮細胞は、前記間葉系細胞によって形成される管状構造体の内側に管状構造体を形成する、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップｄ）において、前記上皮細胞は、頂端側および基底側を備える細胞の層を形成することが可能となり、前記基底側は前記間葉系細胞に面している、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記間葉系細胞の少なくとも一部分は前記上皮細胞の少なくとも一部分と直接接触し、かつ／または、間葉系細胞シートと上皮細胞シートとの間の距離は、基底板の厚さ以下である、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記間葉系細胞は、筋線維芽細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞および間質細胞から選択され、好ましくは、前記間葉系細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記上皮細胞は、単層上皮細胞、単層扁平上皮細胞、重層上皮細胞、または円柱上皮細胞から選択され、好ましくは、前記上皮細胞は哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記間葉系細胞および／または前記上皮細胞は初代細胞である、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法は、前記上皮細胞を含む前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に存在する水性培地を除去することによって前記上皮細胞を空気にさらすステップをさらに含む、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記マイクロ流体細胞培養システムは培養チャンバを備え、ここに、ステップａ）における前記間葉系細胞およびステップｃ）における前記上皮細胞を導入する、請求項１から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記マイクロ流体チャネルネットワークは、好ましくは前記間葉系細胞および前記上皮細胞を含む前記培養チャンバへの行き来であるが、前記細胞に流体流路を提供するように構成されている第１の部分および／または前記細胞からの流体流路を提供するように構成されている第２の部分の存在によって特徴付けられる、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ゲルが存在する場合、前記ゲルを、前記マイクロ流体チャネルネットワーク内に、または前記マイクロ流体チャネルネットワークに隣接しているチャネル内に供給し、かつ前記ゲルは前記マイクロ流体チャネルネットワークと直接接触している、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ゲルに隣接して、前記ゲルと接触しているさらなる中空マイクロ流体チャネルが存在するが、前記チャネルは、前記上皮細胞を含む前記マイクロ流体チャネルと直接接触していない、請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ステップａ）において様々な種類の間葉系細胞を導入し、および／または、ステップｃ）において様々な種類の上皮細胞を同一のマイクロ流体チャネル中に導入する、請求項１から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ゲルは、基底膜抽出物、細胞外マトリックス成分、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、Ｄ−リジン、エンタクチン、ヘパランスルフィドプロテオグリカンまたはそれらの組み合わせである、請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記マイクロ流体細胞培養システムによって、前記マイクロ流体チャネルネットワーク中の前記細胞におよび／もしくは前記ゲルにならびに／またはさらなるマイクロ流体チャネルネットワークに、連続した光路をもたらす、請求項１から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法は、前記マイクロ流体培養システムにおける、前記細胞、ゲル、および／またはマイクロ流体チャネルネットワークの複数の画像を撮るステップをさらに含む、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ステップａ）〜ｄ）のいずれかと同時にまたはその後に、前記細胞を試験化合物と接触させる、請求項１から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１から３０のいずれか１項に記載の前記方法により得られるマイクロ流体細胞培養システム中の前記細胞の使用であって、上皮障壁を越えての輸送の評価、毒性研究、マイクロバイオームとの共培養、食品の吸収の研究、炎症の研究、炎症性腸疾患、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、喘息、がんなどの疾患モデルの提供のため、健常および疾患条件での上皮機能に関する機構研究のための使用。
【請求項３２】
細胞の内側群および細胞の外側群を含むマイクロ流体チャネルネットワークを有するマイクロ流体細胞培養システムを含む組成物またはシステムであって、細胞の前記内側群は細胞の前記外側群によって少なくとも部分的に被覆され、かつ、前記内側群の前記細胞は上皮細胞であり、前記外側群の前記細胞は、間葉系細胞であり、好ましくは、細胞の前記内側群および細胞の前記外側群は相互作用しているか、または直接接触している、
組成物またはシステム。
【請求項３３】
マイクロ流体チャネルネットワークを備えるマイクロ流体細胞培養システムを使用して、上皮細胞を培養および／またはモニタリングする方法であって、
ａ）上皮細胞および間葉系細胞の混合物を前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に導入するステップであって、水性培地を使用して細胞の前記混合物を前記マイクロ流体チャネルネットワーク中に導入するステップ、
ｂ）好ましくは、前記マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分が前記細胞で被覆されるまで、前記間葉系細胞および前記上皮細胞が増殖および／または分化することを可能とするステップ、
を含む方法。
【請求項３４】
好ましくは、間葉系細胞および上皮細胞が管状構造体を形成する、前記間葉系細胞および上皮細胞を含むマイクロ流体チャネルネットワークを備えるマイクロ流体細胞培養システム。
【請求項３５】
先行請求項のいずれか１項に記載の、上皮細胞を培養および／またはモニタリングする方法によって入手可能な、間葉系細胞および上皮細胞を含むマイクロ流体チャネルネットワークを備えるマイクロ流体細胞培養システム。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
上皮とは、内部の身体表面および外部の身体表面のライニングを形成する特殊化したかつ極性を持つ組織である。上皮を形成する細胞は密集し、かつ１つまたは複数の層を形成することができる。上皮は、１つの細胞厚（単層上皮）または２つ以上の細胞厚（重層上皮）とすることができる。単層および重層両方の様々な種類の上皮が、扁平上皮、立方上皮、円柱上皮、および移行上皮を含めて、形状と機能に基づいて認められている。
【０００２】
通常、基底膜と称する結合組織の薄いシートによって、上皮は、下部にある組織から分離されている。基底膜によって、上皮に対する構造的支持がもたらされ、かつ上皮は隣接する構造体に連通している。基底膜は、上皮が成長し、かつ障害後に再生することができる足場として機能する。上皮組織は神経支配を受けているが無血管であり、上皮は、下部にある組織の血管から物質が拡散することによって養い育てられる必要がある。基底膜は、どの物質が上皮に入り込むことができるかを決定する選択的な透過膜として機能する。
【０００３】
発生中の上皮の分化は順序の決まった一連の形態形成の事象と密接に関連している。いくつかの実験的研究によって、この発生過程は上皮−間葉系の相互作用に左右されることが強調されてきた。
【０００４】
ｉｎ  ｖｉｖｏで観察される組織化および制限的挙動を再現し、かつ、たとえば、新薬候補、化学薬品および食品の非侵襲性、迅速な、経済的、および再現可能な試験ならびに／またはスクリーニングのためにその使用を可能とする、上皮障壁組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルの開発に大きな関心がある。しかし、細胞が２次元プラスチック基材上でｅｘ  ｖｉｖｏで培養される場合、重要なシグナルが失われる。多くの場合、得られる組織は、それらのｉｎ  ｖｉｖｏ同等の組織の形態的特徴を示さず、特殊化した分化した多数の細胞種は存在しない。
【０００５】
こういった限界に対する取り組みによって、細胞を細胞外マトリックスに包埋して増殖させる３Ｄ細胞培養モデルの開発がもたらされた。このようなアプローチによって、分化した機能の発現が促進され、組織形成が改善される（Ｐａｍｐａｌｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ８：８３９−８４）。
【０００６】
具体的には、オルガノイド培養の分野で偉大な最近の進歩が遂げられた。オルガノイドとは、ヒトの体内でも利用可能である最も特殊化した細胞で典型的には構成されている３次元の器官原基である。実際には、胚発生過程の組織の培養と分化がｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境で模倣され、その結果、幹細胞は種々の分化細胞に分化する。このようなオルガノイドの既知の例としては、小腸オルガノイドである（Ｓｈｏｉｃｈｉ  Ｄａｔｅ  ａｎｄ  Ｔｏｓｈｉｒｏ  Ｓａｔｏ，Ｍｉｎｉ−Ｇｕｔ  Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ：Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｎｉｃｈｅ，Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．，２０１５，Ｖｏｌ．３１：２６９−２８９）。Ｗｎｔ経路のアゴニスト（たとえば、Ｗｎｔ３ａ、Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ、ＣＨＩＲ９９０２１）、ＢＭＰ／ＴＧＦ経路インヒビター（たとえばＮｏｇｇｉｎ）、ＥＧＦなどの増殖因子とシグナル伝達分子とのカクテル、および基底膜抽出物（マトリゲルまたは類似のもの）の環境によって、初代腸陰窩の培養、その幹細胞ニッチの維持、ならびにたとえば、杯細胞、腸細胞および腸内分泌細胞に向かう細胞の分化の可能性、が保証される。このことによって、陰窩および絨毛形成を含めて、腸の二次形態的態様を有する３次元構造体がもたらされる。類似の３次元培養が、ヒトの初代食道、胃、結腸、肝臓および膵臓の培養のために確立されてきた。
【０００７】
さらに最近、人工多能性幹細胞から脳オルガノイドを成長させることについて著しい進歩が記録されている。連続振とう下での懸濁スフェロイドの長期培養によって、前脳および後脳の特徴などの特殊化したセクションを有するいわゆるミニ脳（ｍｉｎｉｂｒａｉｎ）がもたらされる。さらに最近では、トランスウエルシステム上の人工多能性幹細胞で開始する、複雑な培養プロトコルを使用して、腎臓の糸球体の培養においてブレークスルーが実現されたが、この培養によって、ヒト腎臓の糸球体に存在する高度に特殊化した細胞がやはりもたらされる。
【０００８】
かかるオルガノイド技法の欠点は、ミニ臓器にわたって構造的制御を欠いていることである。特に、回転楕円形状のために独立した頂端−基底のアクセスを欠いている。オルガノイドプロトコルを適用してトランスウエル膜上に平らな極性組織を創製することが試みられてきたが、その結果、頂端−基底のアクセスは可能であるが、おそらく、細胞外マトリックスの状況がオルガノイドの成長のために重要であり、これを組み込んでも、漏れの無い障壁が得られないので、進捗度合いはこれまで非常に限られている。
【０００９】
トランスウエルセットアップにおいて、半透過性膜上で、様々なソース由来の上皮細胞を単独で、または支持細胞（フィーダー層または線維芽細胞などの間葉系細胞）との組み合わせで培養することによって、静的ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルが開発されてきた。残念なことに、これらのモデルは、低い経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）、通常では不透過性のマーカー分子の高透過性、トランスポーターの低い発現および機能（たとえば、Ｐ−糖タンパク質流出ポンプ）、および短期の生存率を示す。このようなことが、モデルとしてその価値を制限することにもなる。
【００１０】
フィーダー層は、一般的に、多くの種類の胚幹細胞および成人幹細胞の培養について支持体として使用されている。たとえば、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）は、胚幹細胞（ＥＳＣ）の培養を支持するのに頻繁に使用されている。間質間葉系幹細胞との共培養により、別の幹細胞種、造血幹細胞（ＨＳＣ）を維持することができ、こういった維持を増強することができる。
典型的には、フィーダー細胞とは、有糸分裂不能であり、かつ標的細胞型の所望の表現型の維持において重要である必要不可欠な増殖因子およびサイトカインを分泌する代替ニッチ細胞として機能している、細胞のシートからなる。フィーダー細胞は、培養培地に増殖因子を放出することによって、また所望の細胞−ＥＣＭ相互作用を高める細胞外マトリックス支持体を供給することによっても、他の細胞の増殖を支えている。幹細胞のその微小環境との相互作用によって、幹細胞の自己再生のメカニズムと分化能が調節されている。しかし、記載の通り、トランスウエルセットアップでは、残念なことに、これらのモデルは、低い経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）、通常では不透過性のマーカー分子の高透過性、トランスポーターの低い発現および機能（たとえば、Ｐ−糖タンパク質流出ポンプ）、および短期の生存率を示し、このようなことが、フィーダー層との組み合わせにおいても、モデルとしてその価値を制限している。
【００１１】
さらに、現行の方法および手段では、上皮組織を横切る吸収、輸送および／または分泌の解析などの、ハイスループット研究を行うことができない。たとえば、組織試料がトランスウエルプレートの膜に十分付着しないことになるので、既知のトランスウエルプレートは、上皮組織の試料を横切る吸収、輸送および／または分泌を測定するのには適していない。
【００１２】
したがって、細胞の増殖および分化がｉｎ  ｖｉｖｏでの状況を模倣している、ヒト上皮を培養するより明確なかつ予測的なモデルを開発する必要がある。この点で、改良型ｉｎ  ｖｉｔｒｏ上皮モデルのための製品、組成物、方法およびその使用が非常に望ましいが、まだ容易には入手できない。具体的には、独立した基底−頂端のアクセスを備えるそういったｉｎ  ｖｉｔｒｏ上皮障壁モデルを提供することを可能とし、かつ、たとえば、ｉｎ−ｖｉｖｏの均等な組織においても存在する最も特殊化した細胞を提供することができる、信頼性の高い、効率的かつ再現性のある方法が当技術分野で明らかに必要である。こういったモデルは、たとえば、ハイスループットスクリーニング、薬物吸収、輸送および毒性研究、疾患モデリング、たとえば微生物培養との相互作用、ならびに／または栄養摂取を研究するためのモデルにおいて、使用することができる。したがって、本発明の根底にある技術的問題は、上記ニーズのいずれかを満たすかかる製品、組成物、方法および使用を提供することと理解することができる。技術的問題は、特許請求の範囲においておよび本明細書で以下に特徴付けられる実施形態によって解決される。
【００１３】
説明
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】チューブ状上皮（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｕｂｅ）を培養するためのデバイスの例の図（原寸に比例しない）：下面図である。
【図２】チューブ状上皮を培養するためのデバイスの例の図（原寸に比例しない）：表示ウィンドウの拡大図である。
【図３】チューブ状上皮を培養するためのデバイスの例の図（原寸に比例しない）：図２の鉛直断面図である。
【図４．５】チューブ状上皮を培養するための方法におけるステップ：間葉系細胞を含むＥＣＭゲル前駆体を、図２／３のゲルレーン内に挿入し、毛細管圧力障壁上に固定し、ゲル化させる。ＥＣＭは、たとえば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（増殖因子を低減させているかまたはさせていないかのどちらか）、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、またはそれらの組み合わせならびに合成ＥＣＭとすることができる。
【図６．７】図４／５に記載のステップに続いて、チューブ状上皮を培養するための方法におけるステップの図である。この場合、上皮細胞を第１のかん流チャネル中に導入する（および場合により増殖培地を第２のかん流チャネル中に導入する）。
【図８．９】図６／７に記載のステップに続いてチューブ状上皮を培養するための方法におけるステップの図である。この場合、上皮細胞がゲルの表面に沈降するように図３のデバイスを垂直に配置する。上皮細胞が接着する際に流れを誘導する（図示せず）。
【図１０．１１】図８／９に記載のステップに続いてチューブ状上皮を培養するための方法におけるステップの図である。この場合、上皮細胞は、増殖しかつ細管を形成するためにチャネル壁およびゲル表面を覆うことが可能となる。
【図１２．１３】図１０／１１に記載のステップに続いてチューブ状上皮を培養するための方法におけるステップの図である。この場合、間葉系細胞は、上皮細胞と相互作用することが可能となり、かつ、上皮は分化することが可能となる；分化によって、規則的な形態的なパターンを、ここでは陰窩構造体をもたらすことができる。
【図１４．１５】チューブ状上皮を培養するための方法におけるステップの図である：ＥＣＭゲル前駆体を、図２／３のゲルレーン内に挿入し、毛細管圧力障壁上に固定し、ゲル化させる。
【図１６．１７】図１４／１５に記載のステップに続いてチューブ状上皮を培養するための方法におけるステップの図である。この場合、間葉系細胞を第１のかん流チャネル中に導入する（および場合により増殖培地を第２のかん流チャネル中に導入する）。
【図１８．１９】図１６／１７に記載のステップに続いてチューブ状上皮を培養するための方法におけるステップの図である。この場合、間葉系細胞がゲル表面に沈降するように図３のデバイスを垂直に配置する。間葉系細胞が接着する際に流れを誘導することができる（図示せず）。
【図２０．２１】図１８／１９に記載のステップに続いてチューブ状上皮を培養するための方法におけるステップの図である。この場合、間葉系細胞は、増殖しかつチャネル壁およびゲルの表面を覆うことが可能となる。
【図２２】図２０／２１に記載のステップに続いてチューブ状上皮を培養するための方法におけるステップの図である。この場合、上皮細胞を第１のかん流チャネル中に導入する（および場合により異なる培地を使用する）。
【図２３】図２２に記載のステップに続いてチューブ状上皮を培養するための方法におけるステップの図である。この場合、上皮細胞が、ゲル表面に沈降した間葉系細胞上に沈降するように図３のデバイスを垂直に配置する。間葉系細胞が接着する際に流れを誘導することができる（図示せず）。
【図２４】図２３に記載のステップに続いてチューブ状上皮を培養するための方法におけるステップの図である。この場合、上皮細胞は増殖し、かつタイトジャンクションを有する細管を形成するためにチャネル壁およびゲル表面を覆うことが可能となる。
【図２５．２６】図２４に記載のステップに続いてチューブ状上皮を培養するための方法におけるステップの図である。この場合、間葉系細胞および上皮細胞は相互作用することが可能となり、かつ、上皮は分化することが可能となる；分化によって、規則的な形態的なパターンを、ここでは陰窩構造体およびドームをもたらすことができる。
【図２７】１つのゲルレーンおよび１つのかん流レーンを有する、図１に対する代替実施形態の図である。
【図２８】単一の入口から充填されている（場合により別々の入口であってもよい）２つのゲルレーンを有する、図１に対する代替実施形態の図である。
【図２９】１．図１に示した、４００ミクロン幅のレーンを備える３レーンＯｒｇａｎｏＰｌａｔｅ（登録商標）（ＭＩＭＥＴＡＳ）における間葉系細胞および上皮細胞の連続播種後の位相差画像の図である。
【図３０】４００ミクロン幅のレーンを備える２レーンＯｒｇａｎｏＰｌａｔｅ（登録商標）（ＭＩＭＥＴＡＳ）における間葉系／上皮細胞の播種後の共焦点顕微鏡の結果の図であり、管状構造体が示されている
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
本開示の一部には、著作権保護の対象となる資料が含まれている（たとえば、これらに限定されないが、図、デバイスの写真または著作権保護が任意の法域で利用できるもしくは利用できる場合がある本提出物のその他の任意の態様。）。著作権者は、それが米国特許庁の特許ファイルまたは記録に存在する場合、誰でも特許文書または特許開示の複写をすることに対して異議がないが、ただし、そうでない場合には、何であろうとも著作権についての全ての権利を留保する。
【００１６】
本発明の方法、組成物、使用、およびその他の態様に関する様々な用語が、本明細書および特許請求の範囲の全体を通して使用されている。このような用語には、特記されない限り、本発明が属する技術分野のその通常の意味が与えられる。その他の具体的に定義される用語は、本明細書に提供される定義と一致するように解釈される。本明細書に記載のものと類似したまたは均等なあらゆる方法および材料を、本発明の試験を実施する際に使用することができるが、好ましい材料および方法は本明細書に記載されている。
【００１７】
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」について、これらの単数形の用語は、内容により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の指示対象も含む。したがって、たとえば、「１個の細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及には、２個以上の細胞の組み合わせ等が含まれる。
「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」について、これらの用語は、量、時間的な期間等などの測定可能な数値に言及する場合に、具体的な数値からの±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、さらにより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味し、なぜなら、このような変動は開示される方法を実施するのに適切であるからである。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」について、この用語は、包括的およびオープンエンドであり、かつ排他的ではないと解釈される。具体的には、この用語および変化形は、特定の特徴、ステップ、または構成成分が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ、または構成成分の存在を除外すると解釈されるべきではない。
「例示的な（ｅｘｅｍｐｌａｒｙ）」について、この用語は、「一例、一事例、または一例示としての役割を果たす」ことを意味し、本明細書に開示されたその他の構成を除外すると解釈されるべきではない。
【００１８】
詳細な説明
本明細書に記載の任意の方法、使用または組成物は、本明細書に記載の他の任意の方法、使用または組成物に対して実施することができることが企図される。本発明の方法、使用および／または組成物に関する文脈において論議する実施形態は、本明細書に記載の他の任意の方法、使用または組成物に対して用いることができる。したがって、一方法、使用または組成物に関連する一実施形態は、同様に本発明のその他の方法、使用および組成物に適用することができる。
【００１９】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、本明細書に記載のマイクロ流体細胞培養の方法によって、本発明の根底にある技術的問題を解決することができることを見いだした。
【００２０】
マイクロ流体細胞培養は、ますます重要な技術である。この技術は、薬物スクリーニング、組織培養、毒性スクリーニング、および生物学的研究に適用されている。マイクロ流体細胞培養の主な利点は、それが、従来の細胞培養に対してかん流の流れ、強化された共培養および安定した勾配などの態様を追加することができるとともに、より高品質なデータ、試薬消費量の削減、および低コストを提供することができる、ということである。
【００２１】
マイクロ流体システム、デバイス、方法および製造に関連する多くの態様については、ＷＯ２００８／０７９３２０、ＷＯ２０１３／１５１６１６、ＷＯ２０１０／０８６１７９、ＷＯ２０１２／１２０１０１などの特許文献を含めて、または、たとえば、Ｍｉｍｅｔａｓ（Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）（たとえばＯｒｇａｎｏＰｌａｔｅ；ｗｗｗ．ｍｉｍｅｔａｓ．ｃｏｍ）から市販されているように、先行技術において論議されている。これらの出願および文献からここに提示される任意の特許請求への特定の制限を読み取るべきではないが、これらの文献は、特定の実施形態に関連した有用な背景材料を提供する。
【００２２】
高品質の試料の調製は、多くの臨床、研究および他の用途にとって重要である。細胞の培養、特徴付けおよび可視化は、創薬、疾患の診断および解析ならびに様々な他の治療的および実験的研究の分野においてますます価値あるものとなってきた。マイクロ流体細胞培養技術を使用すれば、そのｉｎ  ｖｉｖｏ特徴を密接に表しているｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を得ることができることが非常に重要である。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料は、広範囲の分子や細胞の用途に潜在的に役に立つことができる。
【００２３】
本発明の根底にある技術的問題は、それらのｉｎ  ｖｉｖｏ特徴をより密接に表すｉｎ  ｖｉｔｒｏ上皮細胞培養物を提供することができる細胞培養方法およびシステムの分野に存在する。これには、極性（トランスポーターおよびチャネルタンパク質（たとえば、ＯＡＴ２／３、ＭＡＴＥ１／２、ＮＫＣＣ１）などの頂端タンパク質および基底タンパク質の発現、構造関連タンパク質（たとえば刷子縁のビリン（ｖｉｌｌｉｎ）、アクチン）の発現および機能、膜受容体（たとえば、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ）、接着結合、焦点接着、細胞の形態および細胞層の形成（形状および外観、寸法、微絨毛、繊毛、コンフルエント）および機能（障壁機能、細胞表面受容体の発現、取込みおよび分泌）、が含まれ得る。
【００２４】
最も重要であるが、これらのモデルは、好ましいことに、特定の場所で特殊化した細胞への細胞の分化を示すが、いっぽう、好ましいことに、その他の特定の場所では幹細胞ニッチを維持している。小腸においてそのような特殊化した細胞の例には、腸細胞、杯細胞、パネート細胞、腎臓において足細胞、様々な特殊化立方上皮、網膜において網膜色素上皮、杆体、錐体、双極細胞、神経節細胞、肺においてタイプＩ扁平上皮肺胞細胞、タイプＩＩ巨大肺胞細胞、が含まれる。特定の場所での細胞の分化によって、異なる機能と挙動を備える特殊化した細胞がもたらされるだけではなく、多くの場合、組織の形状も変化し、その結果、組織がその特徴的な形態を得ることになる。例としては、小腸における陰窩−絨毛構造体およびムチン産生であり、肺における肺胞であり、腎臓における糸球体、遠位尿細管と近位尿細管およびヘンレのループであり、網膜における色素層ならびに桿体および錐体の層である。本発明者らは、トランスウエル細胞培養および表面接着型細胞培養での平たいパンケーキ状の（ｆｌａｔ  ｐａｎｃａｋｅ−ｌｉｋｅ）細胞層、または、ｉｎ  ｖｉｖｏの状況でのまたはマイクロ流体システムでの組織の管状構造体などの、一次形態に対して区別するために、これらの特徴的な形状を二次形態と呼ぶ。
【００２５】
そのｉｎ  ｖｉｖｏカウンターパートにより良好に相応しているｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料を提供することが重要である。
【００２６】
当技術分野では、マイクロ流体細胞培養システム、マイクロチャンバまたはマイクロ流体を使用するいくつかの方法が提案されてきた。他のほとんどのシステムは、標準的な培養プレートを使用し、かつ、そのｉｎ  ｖｉｖｏ特徴をより密接に表す上皮細胞を培養することを試みて、様々な障壁インサートを使用する（たとえば、トランスウエル透過性支持体）。しかし、現在の入手可能なシステムでは、ｉｎ  ｖｉｖｏ特徴に酷似するｉｎ  ｖｉｔｒｏ上皮細胞試料を提供することについて、および使いやすさ、ハイスループット、または自動化アプリケーションに必要ないくつかの態様についてどちらも、まだ基準を満たしていない。
【００２７】
本発明の発明者らは、驚くべきことに、当技術分野における問題は、マイクロ流体チャネルネットワークを備えるマイクロ流体細胞培養システムを使用して、上皮細胞を培養および／またはモニタリングする方法を提供することによって解決できることを見いだした。
【００２８】
本発明の方法によって、二次形態を表示することが可能な、マイクロ流体デバイス中でのチューブ形成が可能となり、かつ、特殊化した、極性を持つ、分化した細胞が提供される。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏ組織形成に類似していると思われるパターンに従い得る。これは、手短にいえば、堅牢な構造体を使用している当技術分野でのそういった方法、たとえば、トランスウエルシステムとは対照的に、上皮細胞を間葉系細胞でライニングすることによって、および、好ましい一実施形態では、二次形態をさらに順応させるゲル、たとえば、細胞外マトリックスゲルの使用によって、達成される。
【００２９】
したがって、本発明の第１の態様によれば、マイクロ流体チャネルネットワークを備えるマイクロ流体細胞培養システムを使用して、上皮細胞を培養および／またはモニタリングする方法であって、
ａ）マイクロ流体チャネルネットワーク中に間葉系細胞を導入するステップであって、間葉系細胞をマイクロ流体チャネルネットワーク中に
ａ１）水性培地を使用して導入し、または
ａ２）ゲル前駆体を使用して導入し、ゲル前駆体はマイクロ流体チャネルネットワーク中でゲル化することが可能となり、それによって、マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占めるステップ、
ｂ）ステップａ１）の場合において、好ましくはステップａ２）の場合において、好ましくは、マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分が間葉系細胞で被覆されるまで、間葉系細胞が増殖および／または分化することを可能とするステップ、
ｃ）間葉系細胞を含むマイクロ流体チャネルネットワーク中に上皮細胞を導入するステップ、ならびに
ｄ）好ましくは、マイクロ流体チャネルネットワークの表面（壁）の少なくとも一部分が上皮細胞で被覆されるまで、および／または間葉系細胞の少なくとも一部分が上皮細胞で被覆されるまで、上皮細胞が増殖および／または分化することを可能とするステップ
を含む方法が、提供される。
【００３０】
あるいは、マイクロ流体チャネルネットワークを備えるマイクロ流体細胞培養システムを使用して、上皮細胞を培養および／またはモニタリングする方法であって、
Ａ１．１）ゲル前駆体を、好ましくは細胞外マトリックスゲル前駆体を、マイクロ流体チャネルネットワーク中に、たとえば、マイクロ流体チャネルネットワークの一部分中に、たとえば、中空の体積部中に、導入するステップ、
Ａ１．２）ゲルが固化またはゲル化することを可能とするステップ、
Ａ１．３）ＥＣＭゲルによって被覆されていない、マイクロ流体チャネルネットワークの別の技術中に間葉系細胞を導入するステップ、あるいは
Ａ２）細胞をゲル前駆体と混合するステップ、およびゲル前駆体がマイクロ流体チャネルネットワーク中でゲル化することが可能となり、それによって、マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占めるステップ、
Ｂ）ステップａ１）の場合において、好ましくはステップａ２）の場合において、好ましくは、マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分が間葉系細胞で被覆されるまで、間葉系細胞が増殖および／または分化することを可能とするステップ、
Ｃ）間葉系細胞を含むマイクロ流体チャネルネットワーク中に上皮細胞を導入するステップ、ならびに
Ｄ）好ましくは、マイクロ流体チャネルネットワークの表面の少なくとも一部分が上皮細胞で被覆されるまで、および／または間葉系細胞の少なくとも一部分が上皮細胞で被覆されるまで、上皮細胞が増殖および／または分化することを可能とするステップ
を含む方法が、提供される。
【００３１】
本明細書および特許請求の範囲において、上に記載の第１の方法が参照されるのに対して（たとえばステップａ）〜ｄ）を使用して、いっぽう、当業者であれば、本明細書に記載の任意の方法、使用、または組成物を、代替表現で提示される方法（たとえばステップＡ）〜Ｄ）を使用して）に対して同様に実行し得ることを理解している。
【００３２】
本発明の方法では、マイクロ流体チャネルネットワーク中で、間葉系由来の細胞が培養されて、層またはシートを形成する細胞の最初の群を形成する。間葉系細胞が、マイクロ流体ネットワークおよび／またはゲルの表面の少なくとも一部分を被覆した後、上皮細胞を、マイクロ流体チャネルネットワーク中に、好ましくは間葉系細胞の層またはシート内に、導入する（すなわち、マイクロ流体チャネルの（人工的な）壁から離れて）。上皮細胞（および間葉系細胞）を、好ましくは、少なくともコンフルエントに達するまで、増殖および／または分化させる。
【００３３】
本発明の方法を使用して、間葉系細胞の層と直接接触している、場合によっては、この２つの細胞種によって分泌され、かつ当技術分野において記載の方法と比べてｉｎ  ｖｉｖｏ状況により類似している、中間基底板の等価物と直接接触している上皮細胞の層が提供される。たとえば、間葉系細胞および／または基底板は、トランスウエルシステムで使用されている膜などの、人工的な、非天然の任意の膜が存在しなくてもまたは外部からの導入された膜が存在しなくても、上皮細胞と直接接触することが可能である。同時に、本発明の方法を使用して、上皮細胞は、マイクロ流体細胞培養システムのマイクロ流体チャネルネットワークの人工的な（たとえばプラスチックまたはガラス）壁（表面）と低減された接触を有することとなる。
【００３４】
くわえて、たとえば、少なくとも１０μｍの人工多孔膜の堅牢な構造体が提供されるトランスウエルシステムを使用する、当技術分野のそういった方法とは対照的に、細胞外マトリックスゲルの使用によって細胞の二次形態がさらに順応する。
【００３５】
理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、細胞の増殖および分化は、上皮細胞と間葉系細胞との間の双方向コミュニケーションに左右されていると推測し、ならびに、特に、トランスウエルシステムに適用されているかかる堅牢な構造体がないため、および／または、用いられている培養デバイスの堅牢な壁と上皮細胞が接触することを防止するまたは低減させることにより、および／または、中空マイクロ流体チャネルにおいて（すなわちマイクロ流体チャネルネットワークにおいて）、細胞の増殖および分化がｉｎ  ｖｉｖｏ状況により類似することを可能とする（微小）環境を創製することにより、本発明の方法によってこのコミュニケーションは改善されている、と推測する。
【００３６】
特定の理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、間葉系細胞の存在は、上皮に対して有益であると仮定する。シグナル伝達分子、たとえばモルフォゲンの交換は、かかる分子、たとえばモルフォゲンの組み合わせのパターンを特にもたらす。特定の場所でのモルフォゲンの特定の組み合わせによって、幹細胞ニッチの維持をもたらすことができ、いっぽう、別の特定の場所でのモルフォゲンの別の組み合わせによって、特定のサブタイプへの分化をもたらす。モルフォゲンとは、形態形成のプロセスにおいて組織発達のパターン、および組織内の様々な特殊化した細胞種の位置を支配する物質として一般的に理解されている。より詳細には、モルフォゲンとは、細胞に直接作用し、その結果、その局所濃度に応じて特定の細胞応答を生じるシグナル伝達分子とすることができる。
【００３７】
特定の理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、シグナル伝達分子の、具体的にはモルフォゲンであるが、その特定の組み合わせは多少とも規則的間隔で発生する、と仮定する。規則的であるとは、正確な規則性ではないが明瞭なパターンであるシマウマの縞、またはパンターの（ｐａｎｔｅｒ’ｓ）毛皮上のパッチなどの規則性であると生物学的な文脈においてここでは解釈するものとする。
【００３８】
このようなパターン形成に重要であるモルフォゲンには、これらに限定されないが、Ｗｎｔファミリーメンバー、ヘッジホッグファミリーメンバー、ノギン、骨形成タンパク質、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）およびＤｉｃｋｋｏｐｆ（ＤＫＫ）タンパク質が含まれる。
【００３９】
細胞外マトリックスまたは基底板は、ある特定の形態形成因子を結合することができ、その結果、局所的濃度が生じ、いっぽう、その他の因子は拡散することを可能とするので、かかる規則的なパターンの形成において重要な要素である。
【００４０】
本発明の文脈において、マイクロ流体ネットワークとは、２つの側壁（面）、底面の基材、およびチャネルネットワークを閉じている上面の基材によって定義される中空の体積部である。マイクロ流体チャネルネットワークと接触している場合、両方の側壁、上面の基材および底面の基材を壁と呼ぶことができる。チャネルネットワークは、外部世界からネットワークを充填するのに使用される入口、典型的には上面の基材中の穴にさらに連通されている。さらに、第１の流体（通常は液体）でネットワークを充填する際に、ネットワークに存在する流体（通常は空気）の排出を行うベントが存在することが必要である。チャネルネットワークは、１つのマイクロ流体チャネルまたは相互に連通されている複数のマイクロ流体チャネルを含み得る。マイクロ流体チャネルネットワークをさらなる入口または出口に連通することもできる。
【００４１】
本方法の第１のステップでは、間葉系細胞をマイクロ流体細胞培養システムのマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入する。
【００４２】
本発明において使用することができる間葉系細胞は、任意の種類の間葉系由来の細胞とすることができる。間葉系細胞または少なくとも１つもしくは複数の間葉系細胞には、線維芽細胞、筋線維芽細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、ならびに骨髄、前立腺、心臓、肺、腸、腎臓、血管や腱といった身体の様々な領域からの骨芽細胞および間質細胞、が含まれる。好ましくは、間葉系細胞は、線維芽細胞または筋線維芽細胞である。間葉系細胞は、増殖状態または有糸分裂不能であってもよい。間葉系細胞は、分化した間葉系細胞であっても、間葉系前駆細胞であってもよい。間葉系前駆細胞とは、間葉系由来の多能性細胞、たとえば、間葉系由来の種々の系統に分化させることができる細胞を意味する。誤解を避けるために、間葉系細胞とは、本発明者らは間葉系由来の細胞であるとする。
【００４３】
間葉系細胞は、新生児の細胞であっても、成人の細胞であってもよい。好ましくは、間葉系細胞は、哺乳動物細胞、より好ましくはヒト間葉系細胞である。間葉系細胞は新鮮単離された細胞であっても複数継代細胞であってもよい。間葉系細胞は、初代細胞であっても（不死化）細胞株であってもよい。間葉系細胞は、健常組織から単離しても、腫瘍を含めて、疾患組織から単離してもよい。間葉系細胞は２種類以上の間葉系細胞を含んでもよい。間葉系細胞はまた、人工多能性幹細胞技法などの幹細胞技法によって得ることができる。間葉系細胞はまた、間葉移行（ＥＭＴ）上皮の誘導によって、上皮に由来することもできる。
【００４４】
好ましい一実施形態では、間葉系細胞は、筋線維芽細胞、線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞および間質細胞から選択され、好ましくは、ここで、間葉系細胞は哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である。
【００４５】
細胞は、任意の適切な手段によって、マイクロ流体チャネルネットワーク中に導入することができる。たとえば、細胞は、水性培地、典型的には細胞培養培地を使用して導入することができる。細胞培養培地よって、細胞の成長および／または増殖に必須の全ての栄養素およびその他の化合物を送達することができなければならないが、これらには、好ましくは、細胞の成長および／または増殖に有害であるおそれのある化合物を含めてはならない。
【００４６】
細胞を、前記培地中に分散させ、培地がマイクロ流体チャネルネットワーク中に入り込むことを可能とすることによって、マイクロ流体チャネル中に導入することができる。典型的には、ピペットを使用して入口の培地中に細胞を分注することができ、その結果、マイクロ流体チャネルネットワークが毛管力によって充填されることを可能とする。あるいは、培地中の細胞を、能動的ポンプによってマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入することができる。細胞をマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入したら、細胞が沈降し、かつ分化および／または増殖を開始することを可能とする必要があることは、当業者であれば理解されるであろう。細胞の沈降が複数の表面のうちの１つの上への沈降であってもよい。好ましくは、使用する水性培地は、間葉系細胞の増殖および／または分化に適した培地である。かかる培地の組成物は、当技術分野で広く知られており、所望であれば、追加の（増殖）因子で補った適切な任意の増殖培地を使用することができる。細胞が沈降し、場合により（存在する場合）ゲル、たとえば細胞外マトリックスゲルおよび／またはマイクロ流体チャネルネットワークの壁に付着した後に、間葉系細胞に栄養素や酸素を供給する適切な増殖培地が提供され、その結果、間葉系細胞が増殖および／または分化することが可能となる。増殖培地は流れにおいて供給されてもされなくてもよい。流れの場合、増殖培地はまた、細胞によって産生された老廃物を除去または希釈することができる。
【００４７】
あるいは、間葉系細胞を、ゲル前駆体を使用してマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入することができる。細胞を、前記ゲル前駆体中に分散／懸濁させ、ゲル前駆体がマイクロ流体チャネルネットワーク中に入り込むことを可能とすることによって、およびたとえば毛細管圧力障壁などのパターン化技法の助けによりネットワークの選択された領域を充填することを可能とすることによって、マイクロ流体チャネルネットワーク中に導入することができる。続いて、ゲル前駆体は、マイクロ流体チャネルのある特定の領域でゲル化（固体化）し、それによって、マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占めることが可能となる。用語、マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占める、に関して、ゲルが、マイクロ流体チャネルネットワーク全体を通して存在することは必要としないが、好ましくは、特定の領域またはネットワークを占め、その結果、選択されたその他の領域が、たとえばかん流の流れによるさらなるゲルまたは増殖培地の導入に対して、引き続きアクセス可能であること、を当業者であれば理解されるであろう。また、ゲルによって、マイクロ流体チャネルネットワークによる増殖培地の通過が遮断されるべきではないことも理解されるであろう。
【００４８】
上記のようにゲル前駆体を、チャネルに供給することができる。ゲルを供給した後、さらなる流体の導入に先立ち、ゲル化が引き起こされる。適切な（前駆体）ゲルは、当技術分野でよく知られている。一例として、ゲル前駆体は、ヒドロゲルとすることができ、典型的には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）ゲルである。ＥＣＭは、たとえば、コラーゲン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、および／またはＭａｔｒｉｇｅｌもしくは合成ゲルなどの基底膜抽出物を含み得る。ゲル前駆体を、一例として、ピペットで入口に導入することができる（典型的には、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｏｍｂｉｔｉｐｓ  ａｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ、ドイツ、カタログ番号００３０  ０８９．４０５）と組み合わせた、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍｕｌｔｉｐｅｔｔｅ（登録商標）Ｍ４（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ、ドイツ、カタログ番号４９８２  ０００．０１２）などの繰返しピペット。
【００４９】
したがって、ゲルは、基底膜抽出物、ヒト組織もしくは動物組織または細胞培養物由来の細胞外マトリックス、動物組織由来の細胞外マトリックス、合成細胞外マトリックス、ヒドロゲル、コラーゲン、軟寒天、卵白およびＭａｔｒｉｇｅｌなどの市販製品を含み得る。
【００５０】
基底膜は、基底板を含めて、ｉｎ  ｖｉｖｏでは上皮細胞の下部にある薄い細胞外マトリックスであり、タンパク質およびプロテオグリカンなどの細胞外マトリックスで構成されている。上皮細胞層が、多層でも単層でも、障壁として外界から外因性物質の侵襲を防いでいるが、基底膜自体も物理的障壁として機能している。したがって、上皮組織を含めた上皮細胞は基底膜と連携して、固相障壁を形成するとともに内部の生命活動を保護している。
【００５１】
基底膜は、コラーゲンＩＶ、ラミニン、エンタクチン、ヘパランスルフィドプロテオグリカン（ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆｉｄｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）および他の多数の微量成分（Ｑｕａｒａｎｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６，６７４−６８１，１９９４）で構成されている。これらの成分単独ならびにインタクトな基底膜は生物学的に活性であり、細胞接着、遊走、および多くの場合において増殖および分化を促進する。基底膜に基づいたゲルの一例は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＵＳ４８２９０００）と称する。この材料は、上皮細胞の基層としてｉｎ  ｖｉｔｒｏで生物学的に非常に活性である。
【００５２】
本発明の方法に使用するための適切な多くの様々なゲルが市販されており、これには、これらに限定されないが、Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｒｇｆ、ＢＭＥ１、ＢＭＥ１ｒｇｆ、ＢＭＥ２、ＢＭＥ２ｒｇｆ、ＢＭＥ３（全てＭａｔｒｉｇｅｌの変種）コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＩとＩＶの混合物、またはコラーゲンＩとＩＶ、およびコラーゲンＩＩとＩＩＩの混合物）、ピュラマトリックス、ヒドロゲル、Ｃｅｌｌ−Ｔａｋ（商標）、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニン、オステオポンチン、ポリ−リジン（ＰＤＬ、ＰＬＬ）、ＰＤＬ／ＬＭおよびＰＬＯ／ＬＭ、ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）またはビトロネクチンが含まれる。好ましい一実施態様では、マトリックス成分は、市販のＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ１４８３１、米国）として得られる。
【００５３】
ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘは、基底膜に富む腫瘍であるＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（「ＥＨＳ」）マウス腫瘍から抽出される。主要なマトリックス成分はラミニン、コラーゲンＩＶ、エンタクチン、およびヘパリン硫酸プロテオグリカン（「ＨＳＰＧ」）である。マトリックスはまた、増殖因子、マトリックスメタロプロテイナーゼ（コレゲナーゼ（ｃｏｌｌｅｇｅｎａｓｅ））、およびその他のプロテアーゼ（プラスミノーゲンアクチベーター）、ならびにいくつかのまだ未同定の細胞外マトリックス成分も含有する。室温において、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘはゲル化して再構成された基底膜を形成する。
【００５４】
好ましくは、ゲル（前駆体）は、基底膜抽出物、細胞外マトリックス成分、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、Ｄ−リジン、エンタクチン、ヘパランスルフィドプロテオグリカンまたはそれらの組み合わせである。／ｐｃｔ
【００５５】
ゲル前駆体は、毛管力によって、潜在的には重力に助けられて、マイクロ流体ネットワークへの入口へと放出され、かつそこへと輸送される。ゲルは、ここでも一例であるが、たとえば相ガイドによって停止し得るが、これは本質的に、マイクロ流体チャネルネットワークの全幅に広がる毛細管圧力障壁でありかつゲル化を生じる。ゲルが形成した後、ゲル中の間葉系細胞に栄養素および酸素を供給する適切な増殖培地が供給され、その結果、間葉系細胞が増殖および／または分化することが可能となる。増殖培地は流れにおいて供給されてもされなくてもよい。流れの場合、増殖培地はまた、細胞によって産生された老廃物を除去または希釈することができる。
【００５６】
ゲル前駆体、たとえばＥＣＭゲルプリカーサのパターン化は、フォトリソグラフィックパターン化および毛細管圧力技法でのパターン化を含めた、様々な方法で行うことができる。毛細管障壁の機能およびパターン化は、たとえばＷＯ２０１４０３８９４３の出願人らによって先に記載されている。毛細管圧力障壁は壁またはゲル前駆体が充填されている空洞として理解すべきものではないが、表面張力によってゲル前駆体が広がらないことを確実とする要素で構成されている。この概念はメニスカスのピン止めと呼ばれる。したがって、マイクロ流体チャネル中に（ＥＣＭ）ゲル前駆体からなる流体メニスカスを安定して閉じ込めることが達成されることになる。
【００５７】
提供される毛細管圧力障壁は、たとえば、底面の基材から突き出ている材料の縁、または底面の基材へと突き入っている溝からなり得るであろう。縁の側壁の、縁の上部に対する角度は、可能な限り大きいことが好ましい。良好な障壁を提供するために、この角度は７０°超、典型的には９０°周辺である必要がある。隆起の側壁と底面の基材の上面との間の角度についても同様である。
【００５８】
毛細管圧力障壁を創製する代替の方法によって、周囲の材料よりかなり疎水性である材料ライン（ｌｉｎｅ）を底面の基材上に適用することができる。後者は、毛管力／表面張力に起因する拡大の防止として機能する。結果として、液体が、毛細管圧力障壁を越えて流れることを防止し、マイクロ流体チャネルネットワーク中に安定して閉じ込められたメニスカスの形成を可能としている。したがって特定の実施形態では、使用される毛細管圧力障壁は、特に、縁、溝、穴、もしくは材料の疎水性ラインまたはそれらの組み合わせから選択される。別の実施形態では、毛細管圧力障壁を、ゲルにより占められることになる領域を覆っている、選択された間隔にあるピラーによって創製することができる。
【００５９】
（ＥＣＭ）ゲル前駆体を選択的にパターン化する代替の方法には、ゲル前駆体を挿入する際に、マイクロ流体チャネルネットワーク中に存在し、かつゲルがゲル化する際に取り外される、犠牲層または取り外しの可能な構造体を使用することが含まれる。
【００６０】
あるいは、感光性架橋剤がゲル中に存在する場合もあり、その結果、たとえば、ＵＶ光に曝露すると、ゲルがゲル化する。光源をマスキングすると、ゲル前駆体を選択的にゲル化することができ、ゲルが無いはずであるそういった領域から非凝固ゲル前駆体を除去することが可能である。
【００６１】
間葉系細胞をマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入した後、水性培地、好ましくは増殖培地を使用して、またはゲル（前駆体）を使用することによっていずれかで、間葉系細胞はマイクロ流体チャネルネットワーク中で増殖および／または分化することが可能となる。間葉系細胞の増殖は、マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分が間葉系細胞で被覆されるまでの間、継続される。細胞をマイクロ流体チャネル中で培養すると、それらは管状構造体を典型的には形成し、これを、管状構造体の内腔を通る流れを用いてかん流することができる（すなわち、チャネルの壁とは反対側に向いている、細胞の側）。
【００６２】
換言すれば、間葉系細胞をマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入したら、間葉系細胞がマイクロ流体チャネルネットワーク中に細胞のシート、層、群を形成することを可能とするために、細胞を、成長、分化、増殖および分裂させることができる。
【００６３】
マイクロ流体チャネルネットワーク中にゲルが存在しない実施形態では、細胞はチャネルの（堅牢な）壁に少なくとも部分的に付着している細胞の群の、シート、層を形成することができる。
【００６４】
一部の実施形態では、および以下に詳述するものでは、マイクロ流体チャネルネットワークの一部分がゲルを含むが、この場合、ゲル前駆体は間葉系細胞とともに提供されておらず、かつ、たとえば、間葉系細胞は水性培地を使用してチャネル中に導入される。かかる実施形態では、間葉系細胞は、マイクロ流体チャネルネットワーク中に存在するゲル上に、ならびにゲルによって形成されていないチャネルの（堅牢な）壁の上に、細胞の群またはシートまたは層を形成することができる（たとえば、マイクロ流体チャネルネットワークのプラスチックまたはガラス壁、壁を作製している材料の種類に応じて）。
【００６５】
ゲル前駆体を使用して間葉系細胞をチャネル中に導入する実施形態では、細胞を、ゲル中で成長、分裂、増殖および／または分化させることができ、かつ／または、マイクロ流体チャネルネットワーク中へとゲルの外側に成長させることができる。
【００６６】
マイクロ流体チャネルネットワークの被覆に関連して、これは、ゲルのみにおける間葉系細胞の存在、チャネルのみにおける間葉系細胞の存在、ならびにゲルおよびチャネル両方における間葉系細胞の存在を包含する。好ましい一実施形態では、マイクロ流体チャネルの領域の全部を被覆する間葉系細胞は、導入された細胞であった（したがって管状構造体を形成することができる）。これを１００パーセントのコンフルエントということができる。コンフルエントは、マイクロ流体デバイス内に接着している細胞の数の評価として一般的に使用される用語であり、細胞によって被覆されている表面の比率を指す。たとえば、５０パーセントのコンフルエントとは、表面のほぼ半分が被覆されていることを意味する。層がコンフルエントであるといわれる場合、ゲルの表面の約１００パーセントが細胞によって被覆され、細胞が単層として増殖する余地がこれ以上全く残されていない。
【００６７】
マイクロ流体チャネルネットワークの１００パーセントのコンフルエントまたは被覆は（細胞を導入する、またはモニタリングする領域において）必要とはされず、より低いパーセントの被覆率、一例ではあるが、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０パーセントが、本発明で使用するのに適している可能性がある。たとえば、間葉系細胞はゲルのみに存在してもよい。この後者の場合、間葉系細胞はチャネルの壁上で必ずしも増殖しないが、そこで増殖させることが好ましく、細胞のクラスターとして（ＥＣＭ）ゲルの内部で増殖させることが好ましい。
【００６８】
当業者であれば理解されるように、間葉系細胞を、ゲル前駆体の手段によってマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入する実施形態では、本発明の方法の次のステップでの上皮細胞の導入前に、間葉系細胞が増殖および／または分化することを可能とする必要はない。間葉系細胞を含むゲルのゲル化後にチャネル中に上皮細胞を導入し、間葉系細胞および上皮細胞が一緒に増殖および／または分化させることを可能とすることもできる。
【００６９】
しかし、好ましくは、間葉系細胞は増殖および分化することが可能となり、その後に、上皮細胞を培養システムに導入する。期間の長さは、導入された間葉系細胞の種類、導入方法、導入された細胞の数、細胞を増殖および／または分化させるのに使用する増殖培地の組成、温度等といった、様々な因子に左右される。たとえば、期間は少なくとも２０分、少なくとも１時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも１、２、３または４日であってもよい。典型的には、この期間は、１４日以内である。当業者であれば、本発明での使用に適したそういった培養条件を確立するのに何の問題もないであろう。
【００７０】
次に、上皮細胞を、間葉系細胞が存在しているマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入する。
【００７１】
本発明において使用することができる上皮細胞は、上皮特徴を備える、またはその特徴を有する細胞に分化させることができる、任意の種類の細胞とすることができる。典型的には、上皮細胞は、外胚葉由来または内胚葉由来である。上皮細胞という場合、本発明者らはまた、本発明の対象としての上皮細胞に分化させる能力を備える前駆細胞および幹細胞を、意図する。
【００７２】
上皮細胞または１つまたは複数の上皮細胞は、中皮または内皮などの、単層扁平上皮などの単層上皮であってもよい。あるいは、上皮細胞は、表皮細胞または円柱上皮細胞などの、重層上皮であってもよい。かかる細胞には、腎臓、結腸、小腸、肺、網膜の上皮細胞が含まれ得る。上皮細胞は、分化した上皮細胞であっても上皮前駆細胞であってもよい。上皮前駆細胞とは、上皮の潜在性を有する多能性細胞、たとえば、上皮細胞に分化させることができる細胞を意味する。
【００７３】
上皮細胞は、新生児の細胞であっても成人の細胞であってもよい。好ましくは、上皮細胞は、哺乳動物細胞、より好ましくはヒト上皮細胞である。上皮細胞は新鮮単離された細胞であっても複数継代細胞であってもよい。上皮細胞は、初代細胞であっても（不死化）細胞株であってもよい。上皮細胞は、健常組織から単離しても、疾患組織から単離してもよい。上皮細胞は２種類以上の上皮細胞を含んでもよい。一部の実施形態では、２種類以上の上皮細胞を様々な比で混合し、間葉系細胞上で増殖させる。
【００７４】
好ましくは、上皮細胞は、単層上皮細胞、単層扁平上皮細胞、重層上皮細胞、または円柱上皮細胞から選択され、好ましくは、ここで、上皮細胞は哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である。
【００７５】
好ましい一実施形態では、本発明の方法において使用する上皮細胞は、たとえば、ＵＳ２０１２／０１９６３１２に記載のように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養のオルガノイドから得られる。オルガノイド中の細胞を、マイクロ流体チャネルネットワーク中に導入する前に、処理して、たとえば、単層細胞または細胞の凝集塊を提供することができる（たとえば、２〜５０個の細胞、好ましくは２０個以下、１０個の細胞）。
【００７６】
一部の実施形態では、上皮細胞および間葉系細胞は同一の起源を有する、すなわち、同一種類の動物由来または同一動物由来である。好ましくは、上皮細胞および間葉系細胞は、同一の身体部分由来である。
【００７７】
一部の実施形態では、上皮細胞および間葉系細胞は異なる起源由来である、すなわち、異なる種類の動物由来、または同一種類の動物もしくは同一動物の異なる身体部分由来である。一部の実施形態では、上皮細胞は疾患組織由来であり、間葉系細胞が健常な組織由来である。一部の実施形態では、間葉系細胞は疾患組織由来であり、上皮細胞が健常な組織由来である。一部の実施形態では、細胞は腫瘍から得られる。
【００７８】
ステップａ）において様々な種類の間葉系細胞を導入し、および／または、ここで、ステップｃ）において様々な種類の上皮細胞を同一のマイクロ流体チャネル中に導入すること、も提供される。これによって、たとえば、様々な種類の上皮細胞間の相互作用を研究することが可能となり、健常な組織を形成する上皮細胞と疾患組織を形成する上皮細胞との間のより複雑な上皮システムに関する研究が可能となる。
【００７９】
上皮細胞を、適切な任意の手段によって、マイクロ流体チャネルネットワーク中に導入することができる。好ましくは、水性培地を使用して細胞を導入することができる。細胞を、前記培地中に分散させ、かつ、間葉系細胞を含むマイクロ流体チャネルネットワーク中に培地が入り込むことを可能とすることによって、マイクロ流体チャネル中に導入することができる。細胞をマイクロ流体チャネル中に導入したら、細胞が沈降し、かつ増殖を開始する必要があることは、当業者であれば理解されるであろう。好ましくは、使用する水性培地は、上皮細胞の増殖に、好ましくは上皮細胞と間葉系細胞との増殖に適した培地である。かかる培地の組成物は、当技術分野で広く知られており、所望であれば、追加の（増殖）因子で補った適切な任意の増殖培地を使用することができる。上皮細胞が沈降し付着した後、細胞に栄養素および酸素を供給する適切な増殖培地が供給され、その結果、上皮細胞（および間葉系細胞）が増殖および／または分化することが可能となる。増殖培地は流れにおいて供給されてもされなくてもよい。流れの場合、増殖培地はまた、細胞によって産生された老廃物を除去または希釈することができる。
【００８０】
上皮細胞を、間葉系細胞を含むマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入した後、細胞はマイクロ流体チャネルネットワーク中で増殖および／または分化させることが可能となる。細胞をマイクロ流体チャネル中で培養すると、それらは典型的には、管状構造体を形成し、これを、管状構造体の内腔を通る流れを用いてかん流することができる（すなわち、チャネルの壁とは反対側に向いている、細胞層の側）。
【００８１】
管状構造体とは、ＥＣＭゲルによって被覆されていない、かん流のフローチャネルのチャネルの表面の大部分、ならびに、上皮細胞懸濁液が導入されているかん流のフローチャネルに面しているＥＣＭゲル自体の表面、を細胞が覆っていることを意味する。管状構造体は、典型的には、ある入口から別の入口へとチャネルの全長に沿って形を成す。入口によって、さらに、細管の内部または内腔へのアクセスが可能となる。培地の流れの場合、流れは、上皮細管の内腔側に適用される。典型的には、これは、上皮の頂端側と一致する。
【００８２】
導入された間葉系細胞によって形成された、および導入された間葉系細胞を含む、生物材料の少なくとも一部分が、導入された上皮細胞によって形成された、および導入された上皮細胞を含む、生物材料で被覆されるまでの間、上皮細胞の増殖は継続される。換言すれば、間葉系細胞および上皮細胞の培養過程で形成される任意の基底板または基底板様構造体を含めて、間葉系細胞と密接に接触している上皮細胞の層の形成が可能である間、間葉系細胞および上皮細胞を培養する。たとえば、期間は少なくとも２０分、少なくとも１時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも１、２、３または４日であってもよい。典型的には、この期間は、少なくとも６時間、少なくとも２２時間、少なくとも１、２、３または４日である。通常、この期間は１４日以内である。
【００８３】
間葉系細胞の被覆に関連して、好ましい一実施形態では、上皮細胞は、間葉系細胞によって被覆されている領域の全部を被覆する。しかし、マイクロ流体チャネルネットワーク中で間葉系細胞の１００パーセントの被覆率（細胞が導入されている、またはモニタリングされている領域において）は必要とはされず、より低いパーセントの被覆率、一例ではあるが、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０パーセントが、本発明で使用するのに適している可能性がある。しかし、本発明では、上皮細胞の少なくとも一部分は、間葉系細胞の少なくとも一部分、ならびに／または、細胞の培養過程で形成される任意の基底板および／もしくは基底板様構造体、と密接に接触している必要がある。
【００８４】
一例として、マイクロ流体チャネル中に存在するゲルの表面上のみで、および／または本明細書で詳述のように、間葉系細胞がゲル前駆体の手段によってチャネル中に導入された、そういった実施形態でのゲルの中でおよびゲルの表面上のみで、間葉系細胞は存在してもよい。ゲルの表面上またはこれに近接している間葉系細胞を有する領域の少なくとも一部分が上皮細胞で被覆されている場合、上皮細胞は間葉系細胞の少なくとも一部分を被覆していると理解されたい。
【００８５】
下に詳述するが、非常に好ましい一実施形態では、間葉系細胞はマイクロ流体チャネルネットワーク中に管状構造体を形成し、その管状構造体内で、上皮細胞は増殖することが可能となり、それによって、好ましい一実施形態では、間葉系細胞の前記管状構造体内に管状構造体を形成し、この場合、間葉系細胞は上皮細胞によって少なくとも部分的に被覆されている。かかる一実施形態では、ここでも、間葉系細胞、ならびに／または、細胞の培養過程で形成される任意の基底板および／もしくは基底板様構造体は、上皮細胞と密接に接触している。
【００８６】
たとえば、従来技術のいくつかの方法と比較した場合、本発明を使用すると、上皮細胞および／または間葉系細胞はｉｎ  ｖｉｖｏで見られる上皮および／または間葉系細胞により酷似していることがわかった。こういったことは、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況に典型的である特定の遺伝子発現による細胞として、ｉｎ  ｖｉｖｏ形態により酷似している形態として、上皮障壁の機能の改善として、頂端膜と基底膜の存在および機能として、または絨毛、陰窩、繊毛組織、粘膜層の存在としても、および／または上皮細胞のシートまたは層において異なって分化した細胞の存在として現れ得る。上皮細胞層は、培地中におよび培地からの様々な種類の材料を分泌および／または吸収しているであろう。最も重要なことだが、細胞は、起始組織の種々の系統に分化しているであろう。
【００８７】
本発明の方法の範囲内で、ゲル前駆体をマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入し、ゲル前駆体がマイクロ流体チャネルネットワーク中でゲル化することが可能となり、それによって、マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占めることもできる。一部の実施形態では、上記のようにゲル前駆体は間葉系細胞を含んでもよいが、しかし、間葉系細胞を含まないマイクロ流体チャネルネットワーク中にゲルを導入することも企図されている。
【００８８】
一例として、ゲル前駆体をチャネル中に導入し、かつゲル化させ、その後、間葉系細胞を、たとえば水性培地の手段によってマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入してもよい。
【００８９】
これらの実施形態では、マイクロ流体チャネルネットワークの壁はゲルによって部分的に形成されている。ここでも、導入されるゲル前駆体は間葉系細胞を含んでも含まなくてもよい。
【００９０】
間葉系細胞が存在しないゲルを導入する場合、水性培地、好ましくは、栄養素および酸素を供給する増殖培地を使用して、間葉系細胞をチャネル中に導入してもよい。この培地によって、細胞をチャネル中に導入し、その結果、ゲルに対して細胞が沈着し、かつ間葉系細胞が、たとえばゲル上で細胞のシート、群または層を形成することが可能となる。
【００９１】
先に記載の通り、細胞をマイクロ流体チャネル中で培養すると、それらは典型的には、必ずしも必要としないが、管状構造体を形成し、これを、管状構造体の内腔を通る流れを用いてかん流することができる（すなわち、細胞の、チャネルの壁とは反対側）。したがって、一部の実施形態では、ゲルをチャネルに最初に供給し、その結果、ゲル化後、間葉系細胞を培地、たとえば、培養培地の手段によってチャネル中に導入し、これによって、細胞がゲルと接触しかつゲル上に細胞の層を形成することが可能となる（たとえば、シート、または管状構造体もしくは道管）。次に、上皮細胞をチャネルに培地、たとえば、培養培地の手段によって導入し、これによって、上皮細胞が間葉系細胞と接触しかつ間葉系細胞上に細胞の層を形成することが可能となり（たとえば、シート、または管状構造体もしくは道管）、それによって、頂端側および基底側を創製することができる。
【００９２】
管状構造体は、間葉系由来の細胞は上皮の場合のようにタイトな層を形成するとは想定されていないので、言葉通りの意味である。上皮はタイトジャンクションを形成すると知られているいっぽう、タイトジャンクションが無い疎なネットワークを形成する刷子縁および絨毛、間葉系由来の細胞、線維芽細胞および筋線維芽細胞をともなう敷石形状を有する。上皮は、Ｅ−カドヘリンおよびビリンなどの上皮細胞マーカーを発現し、いっぽう、間葉系細胞は、α−ＳＭＡおよびビメンチンなどの間葉系細胞マーカーを発現する。
【００９３】
間葉系細胞を導入するのにゲル前駆体が使用されている実施形態および間葉系細胞を導入するのにゲル前駆体が使用されていない実施形態の両方において、複数のゲルを、互いに隣接してパターン化することができるかもしれない。ゲル前駆体を注入し、毛細管圧力障壁により前駆体の前進を停止させ、そしてネットワーク（チャネル）の様々な部分において前駆体のゲル化を順次にまたは並行して引き起こすことによって、複数のゲルをパターン化することができる。第１のゲル前駆体への第１の細胞種の懸濁によって、続いて、第２のゲル前駆体への第２の細胞種の懸濁によって、いわゆる重層した共培養が得られ、ここでは、両細胞種が互いに隣接して培養される。ゲルは好ましくは、１つまたは複数のチャネル壁と接触している／これらに対して沈着している。
【００９４】
ゲルとは、実質的に希薄架橋システムと定義され、これは、ゲル化すると依然としてその場所にとどまるが、ゲルを通して間質流が可能となる。ゲルは多くの場合、流体によってその体積部全体が膨張する非流体のコロイド状ネットワークまたはポリマーネットワークである。ヒドロゲル、またはアクアゲルは、膨潤剤が水であるゲルである。本発明の方法の文脈内において、ゲル材料は、好ましくは水に不溶性であるが２次元または３次元の支持構造体を有するように水を含んでいる水含有ゲルとすることができる。本発明において、使用するゲルは、前記ゲル内でおよびこれを越えて、物質の拡散を可能とする。
【００９５】
本発明において使用されるゲルは、層が上記の特性を有しかつゲル上での細胞の層の形成が可能である限り、特に限定されない。一般的に使用されるゲルには、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、フィブリノーゲンを含む生物起源由来のゲル、Ｍａｔｒｉｇｅｌおよび／またはアガロース、ならびに、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ペプチド、ＰＬＬＡ（ポリ−Ｌ−乳酸）、ＰＬＧＡ（ポリ（乳酸-グリコール酸共重合体）などのいくつかの足場をベースとした合成ゲルが含まれる。
【００９６】
いくつかの技法を使用してゲルをパターン化することができる、すなわち、これらに限定されないが、光硬化性ゲルのリソグラフィーパターン化、たとえばピラー、疎水性パッチまたは相ガイドを使用するパターン化に基づいた毛管力、および選択的沈着を含めて、ゲルを用いてマイクロ流体チャネルの一部分を充填することができる。
【００９７】
好ましくは、ゲルを、好ましくは毛細管圧力障壁の使用によって、ＵＶパターン化によって、またはゲル化後に針を引っ込ませることによって、またはゲル化後に除去される犠牲層を有することによって、パターン化する。
【００９８】
上に詳述のように、ステップａ）において導入される間葉系細胞が、ゲル前駆体中に分散／懸濁されていてもよく、好ましくは、ゲル（たとえば間葉系細胞が分散していないゲル）が存在する場合、ゲルに沿って、水性培地を使用してマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入することができる。
【００９９】
本発明の方法の好ましい一実施形態では、ステップｂ）において、間葉系細胞の少なくとも群／層／シートがマイクロ流体チャネルネットワーク中および／またはゲル中に形成されるまで、間葉系細胞を増殖させる。本発明の方法で培養した間葉系細胞は、細胞のシートまたは層を形成することができる。かかるシートまたは層は、単層であってもよいが、また、２以上の層からなってもよく、シートに沿って様々な厚さを示すことができる。シートまたは層は、任意のサイズとすることができる。
【０１００】
好ましくは、ステップｂ）において、間葉系細胞の少なくとも管状構造体がマイクロ流体チャネルネットワーク中に形成されるまで、間葉系細胞を増殖させる。本発明の文脈内において、間葉系細胞の管状構造体とは、マイクロ流体チャネルネットワークの入口から出口へと増殖している細胞によって形成されている構造体であり、それによって、チャネルの表面および／またはゲルの表面の大部分を覆っている。構造体は完全に「円い」チューブである必要はなく、たとえば、マイクロ流体チャネルネットワークおよび／またはゲルの壁の形態によって決定されるような任意の形態を実際には有していてもよいことを、当業者であれば理解している。しかし、管状構造体は、必ずしもチャネルの形態に従う必要はないが、一例として、円形形態チューブまたはよりく形である形態のチューブを含めて、規則的形態の標準型の任意のタイプを適合させることができる。
【０１０１】
間葉系細胞は、本発明の文脈内において定義の管状構造体を形成することが、好ましいが、このことによって、上皮細胞が前記管状構造体内に導入され、管状の様式で、間葉系細胞を被覆することを可能とするからである。かかる「二重構造チューブ」（ｔｕｂｅ−ｉｎ−ａ−ｔｕｂｅ）または二重のチューブ組織は、本明細書で開示のものなどの、表現型の特徴に関連して、ｉｎ  ｖｉｖｏ組織に酷似していることがわかった。
【０１０２】
間葉系細胞に関して、同様に、好ましくは、ステップｄ）において、上皮細胞の少なくとも群／層／シートがマイクロ流体チャネルネットワーク中に形成されるまで、上皮細胞を増殖させる。存在する場合、間葉系細胞で被覆されていない任意のゲルを含めて、マイクロ流体チャネルネットワークの一部分を、たとえば壁または表面を、上皮細胞は被覆することができるが、また間葉系細胞の一部分も上皮細胞に被覆されることになることを、当業者であれば理解している。本発明の方法で培養した上皮細胞は細胞のシートまたは層を形成することができるが、このシートまたは層は、使用した上皮細胞の種類に応じて、単層であるか、または様々な層で形成されている（たとえば、重層上皮組織の細胞が使用されている場合生じる可能性がある）かいずれかである。層は、シートに沿って様々な厚さを示してよい。シートまたは層は任意のサイズとすることができる。
【０１０３】
好ましくは、ステップｄ）において、上皮細胞の少なくとも管状構造体がマイクロ流体チャネルネットワーク中に形成されるまで、上皮細胞を増殖させる。本発明の文脈内において、上皮細胞の管状構造体とは、マイクロ流体チャネルネットワークの入口から出口へと増殖している細胞によって形成されている構造体であり、それによって、間葉系細胞によって被覆されているかまたは被覆されていないかのいずれかであるチャネルの表面および／またはゲルの表面の大部分を覆っている。構造体は完全に「円形の」チューブである必要はなく、たとえば、マイクロ流体チャネルネットワークおよび／またはゲルの壁の形態によって、および／または間葉系細胞）の形態によって、決定されるような任意の形態を実際には有していてもよいことを、当業者であれば理解している。しかし、管状構造体は、必ずしもチャネルの形態または間葉系細胞のシートの形態に従う必要はないが、一例として、円形形態チューブまたはよりく形である形態のチューブを含めて、規則的形態の標準型の任意のタイプを適合させることができる。
【０１０４】
ステップａ）において、間葉系細胞をゲル中において導入する場合（すなわち、ゲル前駆体を使用して導入する）、本方法のステップｄ）において、上皮細胞の少なくとも群／層／シートがマイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分を占めるゲルの少なくとも一部分を被覆するまで、上皮細胞を増殖させることが好ましい。
【０１０５】
しかし、好ましくは、間葉系細胞および上皮細胞の両方が本発明の文脈内の管状構造体を形成し、その結果、上皮細胞層はタイトジャンクションの形成によって、および間葉系細胞の層は細胞の疎なネットワークによって、特徴付けられる。したがって、ステップｄ）において、上皮細胞は、間葉系細胞によって形成される管状構造体の内側に管状構造体を形成する、本発明の方法が提供される。また、本実施形態では、間葉系細胞は、上皮細胞によって少なくとも部分的に被覆され、別の言い方をすれば、上皮細胞は、少なくとも部分的に間葉系細胞によって覆われている。間葉系細胞と上皮細胞との密接な接触に起因して、たとえば、分泌因子またはシグナル伝達分子による、たとえばｗｎｔファミリー、ヘッジホッグファミリー（ソニックヘッジホッグ、インディアンヘッジホッグ）、ノギン、ＢＭＰ、ｒｓｐｏｎｄｉｎ、ｎｏｔｃｈ−ファミリー等のメンバーによる、細胞間のコミュニケーションが、たとえば、トランスウエルシステムを用いる方法または他のタイプの支持体、フィルターまたは膜を含む方法と比較して、最適化されている、と推測される。
【０１０６】
この状況下で、中空マイクロ流体チャネル（すなわち、マイクロ流体チャネルネットワーク中）試料中の増殖培地は流れていなくても流れていても好ましい場合もあるが、ここで、前記流れは、一方向性であるかまたは二方向性である。具体的には、管状構造体が間葉系細胞でもしくは上皮細胞のいずれかで得られる場合、または両方であることが好ましいが、管状構造体の内腔を通して増殖培地の流れを適用することが好ましいであろう。
【０１０７】
一例として、たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況において液体の流れを上皮細胞に適用する場合も、かかる流れを適用することによって、上皮細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況で似ている表現型を取ることをさらに誘発する可能性がある。
【０１０８】
別の例としては、流れを使用して、物質、たとえば、上皮の機能または反応へのその影響について試験予定の薬物を培地中に導入しまたはその中の物質を除去することができる。
【０１０９】
本発明の方法において使用する増殖培地は、その組成について特に限定されるものではないことを当業者であれば理解している。たとえば、使用する細胞の状況に応じて、Ｗｎｔ、ノギン、ｅｇｆ／ｆｇｆ、ｎｏｔｃｈリガンドおよび／またはＲｓｐｏｎｄｉｎおよび本明細書に記載のもの等といった、ある特定の因子（シグナル伝達分子、増殖因子、シグナル伝達経路のインヒビターおよび／またはアクチベーター）で、増殖培地を補うことが望ましいであろう。これらの因子は、上皮の幹細胞ニッチを維持するのに有益であることが知られており、このニッチは、さらに、ペディグリー（ｐｅｄｉｇｒｅｅ）細胞を目的となっている上皮のサブ系統へと増殖および分化させるのに重要ある。たとえば、小腸オルガノイドの場合、マトリゲルに懸濁させた細胞にそれらの因子を添加することによって、幹細胞、腸細胞、杯細胞、ｐａｎｅｔｈ細胞、腸管内分泌細胞からなるインタクトな陰窩−絨毛構造体が得られることを見いだした。
【０１１０】
より多くの因子のうちの１つを、間葉系細胞を培養する段階で、および／または間葉系細胞と上皮細胞の両方を培養する段階で供給してもよい。
【０１１１】
１つまたは複数の因子は、細胞の培養全体を通してまたは限られた期間（たとえば、１〜２４時間、４８時間、７２時間、１、２、３、４、５、６、７日以上の間）のみ存在してもよい。
【０１１２】
より多くの因子のうちの１つを、上皮細胞の頂端側からの細胞にもしくは上皮細胞の基底側からの細胞に、または両側からの細胞に提示してもよい。
【０１１３】
１つまたは複数の因子は、本明細書に記載のシグナル伝達経路のうちの１つまたは複数のインヒビターまたはアクチベーターとすることができる（たとえば、ヘッジホッグシグナル伝達経路、Ｗｎｔシグナル伝達経路、ＢＭＰシグナル伝達経路）。最初に細胞をある特定のシグナル伝達経路のインヒビターで処理し、続いて同一経路のアクチベーターで処理すること、または順番を逆にすることも企図されている。細胞をアクチベーターで頂端側で処理し、かつ同一の経路のインヒビターで基底側で処理すること、または順番を逆にすることも企図されている。１つまたは複数の因子を同時に使用してもよい。
【０１１４】
１つまたは複数の因子の濃度勾配を、たとえば、頂端側から基底側に、または入口から出口に中空チャネルに沿って適用することも企図されている。勾配は、線形であっても非線形であってもよい。因子の濃度は、培養の段階に応じて変化してもよい。因子は、増殖培地を使用して、またはゲルを介して供給することができ、たとえば、培養前にゲル中に分散させても、または培養中にゲルに供給してもよい。
【０１１５】
因子に関連して、より多くのシグナル伝達経路のうち１、２、３つを標的として、１、２、３または４以上の任意の組み合わせを使用することができる。
【０１１６】
好ましい因子であるが、標的とされる非限定的シグナル伝達経路、それらのインヒビターおよびアクチベーター（たとえば因子）には、
・  骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のアクチベーターおよびインヒビターが含まれる。ＢＭＰは第一義的な形態形成シグナルの群を構成し、身体全体を通して組織形成を指揮している。
【０１１７】
適切なＢＭＰシグナル伝達インヒビターの例には、これらに限定されないが、ＢＭＰ受容体へのＢＭＰ（骨形成タンパク質）の結合によって媒介されるＢＭＰシグナル伝達の阻害に関与する分子が含まれるが、これには、Ｎｏｇｇｉｎ（Ｎｏｇｇｉｎは、ＮＯＧとしても知られている、神経組織、筋肉、および骨を含めて、多くの身体組織の発達に関与しているタンパク質である；たとえば、１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度で）、ｃｈｏｒｄｉｎ、およびフォリスタチンなどのインヒビターがある。このような特性を有する小分子ＢＭＰインヒビターのその他の例には、転写因子ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、またはＳＭＡＤ８を活性化することができるＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６またはＢＭＰ７を阻害する化合物、たとえば、ドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）（Ｐ．Ｂ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１６：１１  ６０；ＲＢ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：  ３３−４１；Ｊ．Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（ｗｗｗ．ｐｌｏｚｏｎｅ．ｏｒｇ），３（８）：ｅ２９０４）が含まれる。くわえて、ＢＭＰＩ型受容体キナーゼのインヒビターの例には、ＬＤＮ−１９３１８９（すなわち、４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノロン；Ｙｕ  ＰＢ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ，１４：１３６３−９，２００８）が含まれる。ＬＤＮ−１９３１８９は、たとえば、Ｓｔｅｍｇｅｎｔから市販されている。
【０１１８】
適切なＢＭＰシグナル伝達アクチベーターの例には、なかでもとりわけ、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７などの、（トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦＢ）スーパーファミリーに属するＢＭＰが含まれる（たとえば、０．１ｎｇ／ｍｌ〜２５０ｎｇ／ｍｌ培地の間の濃度で。
【０１１９】
・  Ｗｎｔシグナル伝達のアクチベーターおよびインヒビター。Ｗｎｔシグナル伝達経路は、細胞表面受容体を介して細胞内にシグナルを通過させるタンパク質からできている一群のシグナル伝達経路である。標準的なＷｎｔ経路、非標準的な平面細胞極性経路、および非標準的なＷｎｔ／カルシウム経路と、３つのＷｎｔシグナル伝達経路が特徴付けられている。３つの経路は全て、Ｗｎｔタンパク質リガンドのＦｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体への結合によって活性化され、Ｆｒｉｚｚｌｅｄファミリー受容体は、細胞内のｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄタンパク質に生物学的シグナルを送る。Ｗｎｔは、長さが３５０〜４００個のアミノ酸である、分泌型脂質修飾シグナル伝達糖タンパク質の多様なファミリーを含む。これらのタンパク質上に生じる脂質修飾のタイプは、２３〜２４個のシステイン残基の保存されたパターンにおけるシステインのパルミトイル化である。
【０１２０】
適切なＷｎｔアクチベーターの例には、これらに限定されないが、ＢＭＬ−２８４；２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジルアミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジンまたはＤＫＫ１インヒビター；（１−（４−（ナフタレン−２−イル）ピリミジン−２−イル）ピペリジン−４−イル）メタナミン、およびＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−１を含めたＲ−ｓｐｏｎｄｉｎファミリーのタンパク質（たとえば、０．０１〜５マイクログラム／ｍｌ培地の濃度で）、ならびに、Ｗｎｔ３ａ等を含めたウイングレス型（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ−Ｔｙｐｅ）ＭＭＴＶ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｓｉｔｅ  Ｆａｍｉｌｙのタンパク質（たとえば、少なくとも５０、１００、５００、１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で、たとえば、５０〜１０００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で）、が含まれる。
【０１２１】
Ｗｎｔシグナル伝達インヒビターの例には、ＸＡＶ−９３９、ＰＯＲＣＮインヒビターＷｎｔ−Ｃ５９（Ｃ５９）、ＬＧＫ−９７４、ＩＣＧ−００１、ＩＷＰ−２、ＩＷＰ−Ｌ６および他多数が含まれる。
【０１２２】
・  ＧＳＫｂｅｔａインヒビターおよび／またはアクチベーターも適切である。グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）は、グリコーゲンシンターゼのリン酸化および不活性化剤として当初同定された、プロリン指向性セリン−スレオニンキナーゼである。２つのアイソフォーム、アルファ（ＧＳＫ３Ａ）およびベータは、高度のアミノ酸相同性を示す。ＧＳＫ３Ｂは、エネルギー代謝、神経細胞発達および体パターン形成に関与している。
【０１２３】
ＧＳＫｂｅｔａインヒビターの非限定的例には、ＣＨＩＲ−９９０２１（ＣＴ９９０２１）、ＳＢ２１６７６３、ＣＨＩＲ−９８０１４、Ｔｉｄｅｇｌｕｓｉｂ、ａｃｅｔｏｘｉｍｅ、およびＡＺＤ２８５８、ＬｉＣｌ（たとえば、０．１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で）が含まれる。ＣＨＩＲ  ９９０２１またはＣＨＩＲ  ９８０１４は、たとえば、培地中少なくとも約１μＭ〜約２０μＭの濃度で使用することができる。
【０１２４】
・  別の例は上皮成長因子すなわちＥＧＦであり、これは、その受容体ＥＧＦＲに結合することによって細胞の成長、増殖、および分化を刺激する増殖因子である。ヒトＥＧＦは、５３個のアミノ酸残基を有する６０４５−Ｄａタンパク質である。ＥＧＦは、たとえば、５〜２００ｎｇ／ｎｌ、好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌ、たとえば５０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用することができる。
【０１２５】
・  Ｎｏｔｃｈ経路のアクチベーターおよびインヒビター。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、ほとんどの多細胞生物に存在する高度に保存された細胞シグナル伝達系である。哺乳動物は、ＮＯＴＣＨ１、ＮＯＴＣＨ２、ＮＯＴＣＨ３、およびＮＯＴＣＨ４と呼ばれる４種の異なるノッチ受容体を有する。ノッチ受容体は、一回通過膜貫通受容体タンパク質である。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、神経新生中に増殖性シグナル伝達を促進し、その活性はＮｕｍｂによって阻害されて神経分化を促進する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、胚および成人期の間に複数の細胞分化プロセスを制御する遺伝子調節機構を含む細胞−細胞間コミュニケーションに重要である。Ｎｏｔｃｈ経路モジュレーターの例には、ＤＡＰＴなどのガンマ−分泌酵素インヒビター（たとえば、０．１〜５０マイクロＭの濃度で）、および／またはＦＬＩ−０６、ＬＹ４１１５７５、Ｄｉｂｅｎｚａｚｅｐｉｎｅ、Ｓｅｍａｇａｃｅｓｔａｔ、Ｌ６５８等が含まれる。
【０１２６】
・  線維芽細胞増殖因子、すなわちＦＧＦの別の例、これは増殖因子のファミリーであり、血管新生、創傷治癒、胚発生や様々な内分泌シグナル伝達経路に関与するメンバーをともなう。ＦＧＦはヘパリン結合タンパク質であり、細胞表面結合ヘパラン硫酸プロテオグリカンとの相互作用が、ＦＧＦシグナル伝達に必須であることが示されてきた。ＦＧＦは、広い種々の細胞および組織の増殖および分化の過程におけるキープレーヤーである。
【０１２７】
・  かかる因子のさらなる例は、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）であり、これは、３つの異なるアイソフォーム（ＴＧＦ−β１〜３）および他の多くのシグナル伝達タンパク質を含むＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する多機能性サイトカインである。
【０１２８】
・  エンドセリン−１
・  ＰＤＧＦ−ＢおよびＰＤＧＦＡ、血小板由来成長因子サブユニットＢおよびサブユニットＡ。このファミリーのメンバーは、間葉系由来の細胞の分裂促進因子であり、８個のシステインのモチーフによって特徴付けられる。
【０１２９】
・  ヘッジホッグタンパク質を含めて、ヘッジホッグシグナル伝達のアクチベーターおよびインヒビター。ヘッジホッグシグナル伝達経路は、適切な発達に必要な細胞に情報を伝達するシグナル伝達経路である。哺乳動物は、３つのヘッジホッグ相同体、ＤＨＨ、ＩＨＨ、およびＳＨＨを有し、これらのうち、Ｓｏｎｉｃ（ＳＨＨ）が最もよく研究されている。本発明での使用に適したタンパク質因子には、Ｓｈｈ、ＩｈｈおよびＨｈが含まれる、たとえば、０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１ｍｇ／ｍｌ、またはこれ未満の濃度で）。インヒビターには、ＬＤＥ  ２２５、ｓａｒｉｄｅｇｉｂ、ＢＭＳ  ８３３９２３、ＬＥＱ  ５０６、ＰＦ−０４４４９９１３およびＴＡＫ−４４１が含まれる。
【０１３０】
当業者にとってこういった因子は既知であり、当業者であれば、本発明の文脈内においてこれらをどのように使用するか知っている。
【０１３１】
最近、間葉系由来のフィーダー層の使用によって（この場合、有糸分裂不能の３Ｔ３線維芽細胞）、マトリゲルを使用せずに、フラットなトランスウエル基材上でオルガノイドの成長が可能であることが示された（Ｘ．Ｗａｎｇ，Ｙ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｌ．Ｈ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｔ．Ｚｈａｎｇ， Ｂ．Ｅ．Ｈｏｗｉｔｔ，Ｍ．Ａ．Ｆａｒｒｏｗ，Ｆ．Ｋｅｒｎ，Ｇ．Ｎｉｎｇ，Ｙ．Ｈｏｎｇ，Ｃ．Ｃ．Ｋｈｏｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５２２（２０１５），ｐｐ．１７３−１７８）。本明細書でも、小腸の本質的なサブタイプにおいて分化することが可能であると思えた。しかし、トランスウエルの堅牢な基材では、二次形態の自由な生成が可能ではなかったが、本発明者らは、トランスウエルは堅牢な基材でありならびに流れの状態がないので、分化が制限されていると、明記する。
【０１３２】
本発明の方法によれば、好ましい一実施形態では、ゲルに対して、たとえば、細胞外マトリックスゲルに対して間葉系フィーダー層の存在下で上皮細胞を培養することができ、したがって、明瞭な頂端／基底方向性を有してかつかん流を行うことができる状態で管状構造体を成長させることにくわえて、二次形態を形成するのに十分なフレキシビリティが提供される。ゲルと接触しているこういった細胞の場合、（堅牢な）壁またはフィルター（たとえば不織布フィルター）は完全に存在しない。
【０１３３】
上に詳述の通り、上皮シートまたは管状構造体は間葉系細胞によって覆われることが好ましく、この場合、間葉系細胞は、マイクロ流体チャネルネットワークの壁と上皮細胞との間に配置される。換言すると、間葉系細胞の少なくとも一部分はマイクロ流体チャネルネットワークの壁と上皮細胞との間に配置されることも、提供される。
【０１３４】
ステップｄ）において、上皮細胞は、頂端側および基底側を備える細胞の層を形成することが可能となり、基底側は間葉系細胞に面していることも提供される。頂端−基底極性化にとって重要なのは、ＥＣＭ／基底板の存在である。また、かん流の流れを使用することによって、良い具合に分極した細管が得られる。
【０１３５】
極性を持つ細胞の頂端膜は、内腔の内側に面する原形質膜の表面である。極性を持つ細胞の基底膜は、その基底表面および側部表面を形成する原形質膜の表面である。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、これは間質に向かって、そして内腔とは反対側に面する。本発明において、基底側方膜は、間葉系細胞および／またはゲル、たとえば、細胞外マトリックスゲルに面している、またはこれらと密接に接触している膜である。上皮細胞はお互いにタイトジャンクションを形成し、密接に引き締まった膜が得られる。各原形質膜のドメインは、基底方向または頂端方向のいずれかにおいて膜を越えてある特定の化合物の輸送を可能とする特定のトランスポーターを含めて、異なるタンパク質組成を有する。
【０１３６】
上述のように、間葉系細胞の少なくとも一部分は、上皮細胞の少なくとも一部分と密接に（または直接）接触している。本発明の文脈において、このことによって、上皮細胞および間葉系細胞は、本発明に従った培養中に、直接にまたは細胞間に形成される基底板の存在によりいずれかで、互いに連通していること、を指摘することができる。典型的には、間葉系細胞シートと上皮細胞シートとの間の距離は、基底板の厚さ以下である（たとえば、好ましくは１００マイクロメートル未満、より好ましくは１０マイクロメートルの範囲内）。基底板とは、上皮細胞と、本発明の文脈内の、間葉系細胞との間の構造的および機能的なインターフェイスであり、上皮細胞の増殖および制御機構において重要であることを、当業者であれば理解している。基底板の厚さは、たとえば、上皮のタイプまたは位置、および身体の状態に応じて、変動することができ、たとえば３０〜３００ｎｍ、たとえば１００ｎｍ（たとえば、Ｄｏｃｋｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ．Ｒｅｐｒ．Ｕｐｄａｔｅ（１９９８）４（５）：４８６−４９５を参照されたい）の値を持つ厚さ、当技術分野で使用する膜およびフィルターよりも小さい値を持つ厚さを有することができる。
【０１３７】
本方法は、上皮細胞を含むマイクロ流体チャネルネットワーク中に存在する水性培地を除去することによって上皮細胞を空気にさらすステップをさらに含むことも提供される。間葉系細胞および上皮細胞が増殖可能となった後、好ましくは、管状構造体を形成した後、空気にさらすことができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下で、たとえば、また肺、皮膚または腸内で、空気にさらされることにもなる上皮細胞を使用する場合、この実施形態は特に好ましい。
【０１３８】
空気に限定せず、その他のガスに、流体に、薬物および化合物に、食品成分にさらすことを含み得る広範囲の条件に上皮細胞をさらしてもよいことを当業者であれば理解している。さらには、細胞を、たとえば、胃腸管または膣上皮の内腔内の細菌に細胞をさらすことも企図されている。
【０１３９】
また、マイクロ流体細胞培養システムは培養チャンバを備え、ここに、ステップａ）における間葉系細胞およびステップｃ）における上皮細胞を導入する。したがって、かかるチャンバはマイクロ流体チャネルネットワークを形成する）。
【０１４０】
好ましい一実施形態では、細胞を導入するマイクロ流体チャネルネットワークは、好ましくは間葉系細胞および上皮細胞を含む培養チャンバへの行き来であるが、細胞に流体流路を提供するように構成されている第１の部分、および／または前記細胞からの流体流路を提供するように構成されている第２の部分の存在によって特徴付けられる。これによって、チャネルを通しておよびチャネルに存在する、たとえば培養チャンバに存在する細胞に沿って、増殖培地の流れが可能となる。
【０１４１】
ゲルに関連して、ゲルが存在する場合、ゲルを、マイクロ流体チャネルネットワーク内に、またはマイクロ流体チャネルネットワークに隣接しているチャネル内に供給することができるが、この場合、前記ゲルは前記マイクロ流体チャネルネットワークと直接接触している。両方の場合において、したがって、ゲルは、細胞を導入するマイクロ流体チャネルネットワークの壁の一部分を被覆または形成する。
【０１４２】
ゲルと接触しているさらなるマイクロ流体チャネルネットワークが、ゲルと隣接して存在する場合もあるが、この場合、前記チャネルは、上皮細胞を含むマイクロ流体チャネルと直接接触していない。たとえば、細胞が導入されることになるチャネルに隣接しているチャネルにゲルが存在する場合、ひいては、ゲルはこのチャネルの壁の一部分を形成する。ゲルのもう一方側では、さらなるチャネルが存在することができ、これを使用して、たとえば、栄養素または化合物をゲルに付与することができ、またはこれを使用して細胞によって分泌された物質を採取することができる。
【０１４３】
あるいは、ゲルは、かん流チャネルの両側に存在することができる。この実施形態は、最大限のゲル表面が細管に向かって露出されるという利点を有する。ゲルは、いくつかの入口または１つの共通の入口から導入することができる。特に相ガイドなどの毛細管圧力障壁を扱う場合、メニスカスのピン止めの際にゲル前駆体のメニスカスが、かん流チャネルへと伸び、その結果、断面に円弧状のメニスカスが存在する。このことは、形成予定の細管に関してより球状の断面を達成するのに有利であり得る。
【０１４４】
本発明の方法において、マイクロ流体細胞培養システムによって、マイクロ流体チャネルネットワーク中の細胞におよび／もしくはゲルにならびに／またはさらなるマイクロ流体チャネルネットワークに、連続した光路をもたらすことも、提供される。これによって、中空チャネル／マイクロ流体チャネルネットワーク中で培養された細胞の、連続した測定、モニタリングまたは観察が可能となるであろう。本発明の方法での培養の間または培養細胞の使用の際のいずれかで、マイクロ流体培養システムにおける、細胞、ゲル、および／またはマイクロ流体チャネルネットワークの複数の画像を撮ることも、本方法には含まれ得る。
【０１４５】
ステップａ）〜ｄ）のいずれかと同時にまたはその後に、細胞を試験化合物と接触させることも提供される。試験化合物は、任意の種類の化合物、たとえば、薬物、食品中または血液中に見いだされる材料とすることができる。さらには、試験化合物は、真核細胞（たとえば、血液細胞を含む）にかかわる細菌、ウイルスであることも、企図されている。上皮機能に対するかかる化合物の影響を、かかる化合物が無い場合の条件と比較することによって決定することができる。
【０１４６】
当業者であれば理解するように、本発明の方法によりマイクロ流体システム中に得られる細胞は、広範な様々な状況で使用することができる。たとえば、上皮障壁を越えての輸送の評価、毒性研究、マイクロバイオームとの共培養、食品の吸収の研究、炎症の研究、炎症性腸疾患、嚢胞性線維症、ＣＯＰＤ、喘息、がんなどの疾患モデルの提供のため、健常および疾患条件での上皮機能に関する機構研究のため等である。当業者であれば、かかる実験的状況の文脈内で、本発明に従って培養した細胞を使用する方法を理解している。本発明に従ったマイクロ流体システムを使用すると、信頼性の高いハイスループット試験が可能となる。
【０１４７】
細胞の内側群および細胞の外側群を含むマイクロ流体チャネルネットワークを有するマイクロ流体細胞培養システムを含む組成物またはシステムも提供され、この場合、細胞の内側群は細胞の前記外側群によって少なくとも部分的に被覆され、かつ、内側群の細胞は上皮細胞であり、外側群の細胞は、間葉系細胞であり、好ましくは、細胞の内側群および細胞の外側群は相互作用しているか、または直接接触している。換言すれば、お互いに密接に接触しかつ本明細書に記載の通り、その中に間葉系細胞の層および上皮細胞の層を含むマイクロ流体細胞培養デバイスも提供される。好ましくは、本明細書で定義の通り、間葉系細胞および上皮細胞は管状構造体の形態である。
【０１４８】
また、マイクロ流体チャネルネットワークを備えるマイクロ流体細胞培養システムを使用して、上皮細胞を培養および／またはモニタリングする方法であって、
ａ）上皮細胞および間葉系細胞の混合物をマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入するステップであって、水性培地を使用して細胞の混合物をマイクロ流体チャネルネットワーク中に導入するステップ、
ｂ）好ましくは、マイクロ流体チャネルネットワークの少なくとも一部分が細胞で被覆されるまで、間葉系細胞および上皮細胞が増殖することを可能とするステップ、
を含む方法が提供される。
【０１４９】
最終的には、間葉系細胞および上皮細胞を含むマイクロ流体細胞培養システムが提供され、好ましくは、この場合、間葉系細胞および上皮細胞が管状構造体を形成しており、あるいは、本発明の、上皮細胞を培養および／またはモニタリングする方法によって入手可能な、間葉系細胞および上皮細胞を含むマイクロ流体細胞培養システムが提供される。
【０１５０】
間葉系細胞および上皮細胞を含むかかるマイクロ流体細胞培養システムによって、重要な利点が提供されることを当業者であれば理解するであろう。かかるシステムを使用すれば、たとえば、適切な細胞をすでに備えている、すぐに使用できるシステム（たとえば試験のため）を、あるいは、限られたさらなる培養と操作を必要とするだけのシステムを、消費者に提供することができる。本システムによって、本発明の方法で培養した細胞を使用すると得られる実験データの再現性および質が改善される。したがって、マイクロ流体細胞培養システムは、本明細書に記載の通り、任意の発達段階にあってよいとする間葉系細胞および上皮細胞を含み得ることが理解されよう。
【０１５１】
本方法に関連して種々の実施形態および優先権に関連して、本方法に適用が可能である限り、本明細書および特許請求の範囲全体を通してここに記載されている種々の実施形態および優先権について参照することができることを、当業者であれば理解している。
ここで、本発明について全体的に説明してきたが、例示によって提供されかつ本発明を限定すること意図しない、以下の実施例を参照することにより本発明はさらに容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０１５２】
［実施例１］
材料および方法
ヘッジホッグ、ＷｎｔおよびＢＭＰシグナルは、腸管の発達パターン化に際してならびに陰窩−絨毛軸を確立するのに必要とすることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、腸上皮細胞は相互作用し、下部にある間葉からのシグナルに依拠している。腸の間葉系細胞は、上皮−間葉系相互作用に動的に寄与し、上皮の増殖および分化の両方を調節している。
【０１５３】
腸管のマイクロ流体モデルにおける陰窩−絨毛軸を確立するために、本発明者らは、記載の通りにヒト腸組織試料から確立された腸のオルガノイド培養物を使用した（Ｓａｔｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ）。マウス、イヌ、ネコ等由来のオルガノイドも使用することができる。
【０１５４】
オルガノイドをＥＣＭ（たとえば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ、好ましくはマトリゲル、ＢＭＥ（Ｃｕｌｔｒｅｘ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ，ＢＭＥ２）１０〜５０マイクロに包埋し、４８または２４ウエルプレートに播種し、血清低減（ａｄｖａｎｃｅｄ）ダルベッコ改変イーグル培地／Ｆ１２で構成される基礎培地２５０〜７５０マイクロリットルで重層した。培地は、ペニシリン／ストレプトマイシン、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍｍｏｌ／Ｌ、１×Ｎ２、１×Ｂ２７（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、マウスＥＧＦ  ５０ｎｇ／ｍｌ、Ｎ−アセチルシステイン（シグマ）１ｍｍｏｌ／Ｌ、マウスノギン１００ｎｇ／ｍｌ、ヒトＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ−１  １μｇ／ｍｌ、ガストリン１ｍＭ、ニコチンアミド１０ｍＭ、ＳＢ２０２１９０  １０μΜ、Ａ８３−０１  ５００ｎＭ、５０％のＷｎｔ３ａ調整培地または組換えＷｎｔ３ａタンパク質（Ｒ＆Ｄ）２００（３００、４００、５００以上）ｎｇ／ｍｌ、で補った。培地全体を２〜３日ごとに交換し、オルガノイドを１：２（または１：３、１：４、１：５）で毎週継代した。
腸管の発達をモデル化するのに、本発明者らは好ましくは、腸管由来の（たとえば、マウス胚線維芽細胞、マウス線維芽細胞、ヒト線維芽細胞、腸の線維芽細胞、平滑筋細胞、腸の筋線維芽細胞、好ましくはヒトの）間葉系細胞を使用し、ゲル（たとえば、コラーゲンＩ、ＩＶ、Ｈｙｓｔｅｍ  ｃ、マトリゲルであってよい）の２レーンまたは３レーンに、ＥＣＭ中１Ｅ６または５Ｅ６または１０Ｅ６または１５Ｅ６または２０Ｅ６細胞／ｍｌの密度で播種し、あるいは、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、１×ＮＥＡＡ、１×Ｇｌｕｔａｍａｘで補ったＤＭＥＭ（またはＥＭＥＭまたはＲＰＭＩ培地）中の１０または１５％ＦＣＳで構成される培地とＥＣＭとの組み合わせ中に播種した。ＥＣＭと培地との間の比率は、たとえば、９：１または８：１または７：１または６：１または５：１または３：１または２：１または１：１とすることができる。
【０１５５】
別の実験では、たとえば腸管由来の（腸の線維芽細胞、腸の筋線維芽細胞、好ましくは、ヒトの）間葉系細胞を、ＥＣＭに対して導入する。間葉系細胞のインキュベーションの約０〜７２時間以上の後、上皮腸オルガノイド細胞を、間葉系細胞に隣接したチャネル中に導入する。
【０１５６】
下部にある間葉のパターン化は、上皮細胞のパターン化および陰窩形成にとって重要である可能性がある。腸管の発達中に、間葉系細胞は、腸管上皮における陰窩形成のためのキュー（ｃｕｅ）を提供することになるペリクリプトの（ｐｅｒｉｃｒｙｐｔａｌ）領域に濃縮される。陰窩形成を助ける間葉系濃縮細胞により産生される主な因子の１つが、Ｗｎｔタンパク質である。
【０１５７】
腸の間葉系細胞を動員して、ＴＧＦβ、エンドセリン１、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦＡおよびヘッジホッグタンパク質（Ｓｈｈ、Ｉｈｈ、Ｈｈ）などの走化性シグナルを提供することによって、濃縮された細胞のクラスターを形成することができることがわかった。腸間葉系は、多数の様々な種類のＷｎｔタンパク質を産生する。
本方法の一実験では、これらキューの組み合わせのうちの１つを染みこませてあるゲル含有樹脂（たとえば、Ａｆｆｉ−ｇｅｌビーズ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ、１５３−７３０２）に間葉系細胞を播種することができ、ｈｒＳＨＨ（たとえばＰＢＳ中０．１〜１ｍｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；１８４５−ＳＨ）に含浸し、これに、ゲル中の間葉系細胞を播種して、細胞濃縮を誘導した。次に、腸オルガノイド細胞（単層細胞またはＴｒｙｐＬＥを５’ｍｉｎ間使用することによって調製した細胞の２〜５の細胞クラスター）をＥＣＭの、またはＥＣＭに対する次のチャネル中に導入した。細胞を１Ｅ６または５Ｅ６または１０Ｅ６または１５Ｅ６または２０Ｅ６細胞／ｍｌの密度で播種することができる。
【０１５８】
中央レーンにＥＣＭの一タイプを備えるマイクロ流体培養デバイスの３レーンデザインにおいて、ビーズ上にキューを濃縮した状態で（アガロースビーズには、化学誘引物質／シグナル伝達分子を染みこませてある）ゲル中に、間葉系細胞を導入することができる。次に、上皮細胞を、隣接チャネルのうちの１つに導入する。
【０１５９】
分極上皮細胞は、細胞−細胞接触に依拠し、妨害されるとアポトーシスを遂げる。したがって、上皮細胞の解離の間および後にＲｏｃｋキナーゼインヒビターを提供して、その生存率を高めることが重要であろう。好ましくはＹ２７６３２  Ｒｏｃｋインヒビター１０μΜを使用することができる。
【０１６０】
上皮細胞を、最初に、たとえば、１または２または３または４日間頂端におよび基底に基礎培地中に維持する。次いで、腸上皮細胞チャネル中の培地はＷｎｔ３ａを枯渇させ、いっぽう、遠位チャネル培地においては、追加のｗｎｔ３ａタンパク質で補った。Ｗｎｔタンパク質は、チューブの一方の側で陰窩様構造体を維持するシグナルを提供し、かつ、他方のチャネルにおけるＷｎｔの濃度低下によって上皮障壁の分化が支えられることになるので、腸幹細胞由来の上皮構造体を培養する場合、このことは特に有利であるかもしれない。
【０１６１】
デバイスにおいて、細胞微小環境および腸についてｉｎ  ｖｉｖｏで見られた、たとえばＷｎｔシグナルに関するシグナル伝達の勾配を再現することは、機能的な腸組織の組み立てに有利であることがわかった。たとえば、少なくとも１００ｎｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度でのＷｎｔ３ａ組換えタンパク質が、このシグナルの勾配を創製するために使用するのに好ましい。その処理の効果を増幅するためには、同一の勾配を、たとえば、５０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度でのＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ（たとえばＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １）タンパク質とともに創製する必要がある。Ｗｎｔ３ａ調整培地およびＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １調整培地を使用して、かかる勾配を創製することもできる。Ｒ−ｓｐｏｎｄｉｎ調整培地のための濃度は、好ましくは１０％以上とすることができる。Ｗｎｔ３ａ調整培地のための濃度は、好ましくは５０％以上、好ましくは３０％以上とすることができる。
【０１６２】
ＧＳＫβインヒビター小分子ＣＨＩＲは、標準的なＷｎｔ経路を活性化する。ＣＨＩＲ分子によって、たとえば３μΜ以上の濃度で使用される場合、デバイス内の腸上皮の初期増殖期の間、Ｗｎｔ３ａタンパク質またはＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ１タンパク質の使用を代替できるかもしれない。ＣＨＩＲ小分子は、タンパク質とは対照的に培養において急速に拡散することができるので、この分子はＷｎｔシグナル伝達の勾配の創製にとって望ましくないであろう。たとえば、１ｍＭから３０ｍＭまでの濃度で、別のＧＳＫβインヒビターＬｉＣｌを、ＣＨＩＲの代わりに使用することができる。
【０１６３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでは、Ｂｍｐシグナル分子（たとえば、ＢＭＰ４）は、下部にある間葉によって産生かつ放出される。ＢＭＰシグナル伝達によって、腸幹細胞に対して分化シグナルがもたらされる。したがって、ＢＭＰインヒビター（たとえばＮｏｇｇｉｎ）の勾配を再現して、幹細胞コンパートメントの活発な増殖（ＢＭＰによって阻害される）を支え、かつ、ｉｎ  ｖｉｖｏで見いだされるカウンターパートに類似している腸管の分離および分化を可能とすることは、有利であろう。
【０１６４】
Ｎｏｇｇｉｎ含有培地を、デバイスの一方の側で提供することができ、たとえば、陰窩の「底部」で供給することができるであろう。上皮細胞がコンフルエントに達した後（または前）に、このシグナルの勾配を、たとえば、創製してもよい。Ｎｏｇｇｉｎを枯渇させた培地を、操作するとされたチューブの頂端側に提供してもよい。頂端側でのムチンの産生など、そういった分化状態の特異的な発現が望まれる場合、本方法は、腸のライニングの成熟にとって特に有益であるかもしれない。
【０１６５】
ＥＧＦはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで腸幹細胞および前駆細胞を維持するのに重要であろう。くわえて、頂端に補うと（たとえば母乳とともに）、これは、新生児において発生中の腸のアポトーシスおよび壊死から保護することができる。したがって、たとえば、１０ｎｇ／ｍｌ以上および１００ｎｇ／ｍｌ以下、好ましくは５０ｎｇ／ｍｌの濃度でのＥＧＦの補充を培養期間を通して維持して、上皮細胞の増殖を支え、かつこれらの細胞のアポトーシスを阻害することができる。
【０１６６】
Ｎｏｔｃｈ経路の活性は、腸上皮の増殖状態にとって重要であり、たとえばガンマ−分泌酵素インヒビターで阻害された場合、たとえば杯細胞への腸組織の最終分化をもたらすことができる。したがって、Ｎｏｔｃｈ経路インヒビターの短期パルスを与えて、ムチンの産生のために杯細胞の成熟を増強することは、有益であろう。デバイス内で上皮細胞による初期増殖が行われた後に、ガンマ−分泌酵素インヒビター（たとえば、ＤＡＰＴ１０μΜ）を使用することは、好ましいであろう。
【０１６７】
たとえば上皮細胞の播種３日後、または細胞の上皮層がコンフルエントに達した後、ガンマ−分泌酵素インヒビターを頂端側培地に添加して、杯細胞の増殖停止および成熟を誘導することができる。培地はガンマ−分泌酵素インヒビターを枯渇させて、好ましくは、たとえば、ガンマ−分泌酵素インヒビターの存在下での連続培養の５日以内（たとえば、１２ｈまたは２４または４８ｈ等）、幹細胞ニッチ（陰窩）の損失を防ぐことができる。この処理によって成熟杯細胞での粘液層の産生を改善することができる、いっぽう、基底側（陰窩により近い）からＮｏｔｃｈインヒビターでの短期処理および強力なＷｎｔアゴニスト処理によって、幹細胞ニッチが保存されるようになることを確実とし得る。
重要な経路をアゴニストおよびインヒビターで処理する期間に続いて２つの細胞種をこうして続いて播種することによって、成熟した管状の腸ミニ臓器の首尾よい発達が確実となる。
【０１６８】
［実施例２］
間葉系細胞および上皮細胞の連続的播種
本実験については、図１に示す通り、４００ミクロン幅のレーンを備える３レーンＯｒｇａｎｏＰｌａｔｅ（登録商標）（ＭＩＭＥＴＡＳ）を使用した。ＥＣＭゲルに播種した（下を参照）、腸の筋線維芽細胞を、５０００個の細胞／実験の濃度で、ゲルレーン（１０３）に注入した。その後、ＥＭＥＭ培地中のＣａＣＯ−２細胞を（下記のように）、２０，０００細胞／実験の濃度でかん流レーン（１０２）に注入した。次に、Ｃａｃｏ−２細胞を７日間培養した（筋線維芽細胞の存在下で）。第３のマイクロ流体チャネル（１０６）にはｓｍＧＭ培地（平滑筋増殖培地；Ｌｏｎｚａ）が存在した。第７日目、位相差画像を撮り、その結果を図２９Ａおよび図２９Ｂに示す。
【０１６９】
これらの図からわかるように、Ｃａｃｏ−２細胞は、筋線維芽細胞を含有するゲルレーン中に入り込み、筋線維芽細胞と相互作用し、上部に層を形成していた。くわえて、実験が示すところによれば、Ｃａｃｏ−２細胞および筋線維芽細胞が相互作用している二次形態および組織化が形成されている。矢印は、たとえば、結腸または小腸中に見いだされる陰窩または絨毛の形態に類似して見え、かつｉｎ  ｖｉｖｏでの状況に酷似している、そういった構造体を指す。
【０１７０】
ＥＭＥＭ培地：
ＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ、Ｃａｔ．Ｎｏ．３０−２００３）
Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ  １％（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ４３３３）
ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（１００×）１％（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１１１４０−０５０）
ＦＢＳ  ＨＩ  １０％（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１６１４０−０７１）。
ＥＣＭゲル：
コラーゲンＩ  ５ｍｇ／ｍＬ（ＡＭＳｂｉｏ  Ｃｕｌｔｒｅｘ３ＤコラーゲンＩラット尾、５ｍｇ／ｍＬ、＃３４４７−０２０−０１）
ｉ．  １Ｍ  ＨＥＰＥＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １５６３０−１２２）
ｉｉ．  ３７ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ  Ｓ５７６１−５００Ｇ））
ＳｍＧＭ−２  平滑筋増殖培地−２
ＳｍＧＭ−２  完全培地：
−  ＳｍＢＭ基礎培地（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ−３１５６）
−  ＳｍＧＭ（商標）−２  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（商標）サプルメントおよび増殖因子（ｈＥＧＦ、インシュリン、ＦＧＦ−Ｂ、ＦＢＳおよびゲンタマイシン／アムホテリシンＢ）
【０１７１】
［実施例３］
間葉系細胞チューブ／上皮細胞チューブ
本実験については、４００ミクロン幅のレーンを備える２レーンＯｒｇａｎｏＰｌａｔｅ（登録商標）（ＭＩＭＥＴＡＳ）を使用した。
細胞を、内皮細胞増殖培地ＭＶ２（Ｐｒｏｍｏｃｅｌ、Ｃａｔ：Ｃ−２２０２２）中のｖｖＨＵＶＥＣ−ＲＦＰ内皮細胞（Ａｎｇｉｏｃｒｉｎｅ、細胞通路４）と、周皮細胞培地（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ）中の脳血管周皮細胞（Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ、細胞通路４）との４：１混合物、５０００細胞／μＬの総出発濃度で、培養し、いっぽう、２レーンＯｒｇａｎｏＰｌａｔｅ（登録商標）をかん流ロッカーに配置した（傾斜角７°、ロッキングサイクル８ｍｉｎ）。
【０１７２】
培養３日後、細胞をＡｃｔｉｎ−Ｇｒｅｅｎを使用して染色した。形成されたチューブの画像を、共焦点顕微鏡（ライカ、ＴＣＳ  ＳＰ５  ＳＴＥＤ）を使用して作製した。３Ｄプロジェクションを、３ＤビューアＦｉｊｉプラグイン（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，Ｊ．；Ａｒｇａｎｄａ−Ｃａｒｒｅｒａｓ，Ｉ．  ＆  Ｆｒｉｓｅ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ.（２０１２）、“Ｆｉｊｉ：ａｎ  ｏｐｅｎ−ｓｏｕｒｃｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ−ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ９（７）：６７６−６８２，ＰＭＩＤ  ２２７４３７７２．）を使用して作製した。結果を図３１に示す。図からわかるように、間葉系細胞および内皮細胞は、内皮細胞および周皮細胞の両方を含むチューブを形成することができる。
【０１７３】
本発明について全て記載したが、当業者であれば、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、また過度の実験を行うことなく、同等のパラメータ、濃度、および条件の広い範囲内で、本発明を実施することができるということを、理解するであろう。本発明を、それらの特定の実施形態と関連して説明してきたが、さらなる改変が可能であることが理解されるであろう。本願が、本発明の属する技術分野における公知慣行の範囲内に入ってくるものとして、また添付の特許請求の範囲内の通りである前述した本質的特徴に適用できるものとして、本開示から逸脱するものを含めて、本発明の原理に全体的に従う発明のあらゆる変形形態、使用または適合を包含するものである。
【０１７４】
本明細書に引用された全ての参考文献、雑誌の記事および抄録、公開されたまたは相応する特許出願、特許、あるいは他の任意の参考文献を含めて、引用することにより本明細書の一部をなすものとするが、これには、引用文献に提示された全てのデータ、表、図、およびテキストが含まれる。さらに、本明細書に引用される参考文献の中に引用された参考文献の全体の内容も、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。既知の方法のステップ、従来方法のステップ、既知の方法、または従来方法を参照するということは、本発明の任意の態様、説明、または実施形態が、関連技術において開示、教示、または示唆されているということをいかようにも承認するものではない。
【０１７５】
特定の実施形態についての上記説明は、本発明の全体的性質を十分に明らかにするものであるため、当技術分野の技術範囲内の知識（本明細書に引用された参考文献の内容を含む）を適用すれば、他者が、過度の実験を行うことなく、また本発明の全体的概念から逸脱することなく、このような特定の実施形態を様々な用途のために容易に改変および／または適合することができるであろう。したがって、このような適合および改変は、本明細書に提示された教示および指針に基づいて、開示された実施形態の均等物の意味および範囲の中であることが意図される。ここで表現法および専門用語は、説明の目的のためであって限定目的のためではないこと、その結果、本明細書の専門用語または表現法は、本明細書で提示された教示および指針に照らして、当技術分野において通常の技能を有する者の知識と組み合わせて、当業者によって解釈されるべきであることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際調査報告】
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