(57)【要約】  本発明は、緑内障に関し、特に眼圧上昇の緑内障症状から救うためのＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子の使用に関する。また、本発明は、アンジオポエチン１及びアンジオポエチン２の条件付きノックアウトマウスにおいて、発現された眼圧上昇の緑内障症状から救うためのＶＥ−ＰＴＰの条件付きノックアウトに関する。また、本発明は、ＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子の使用に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの野生型ＶＥ−ＰＴＰ対立遺伝子をＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子に置換することを含む、ＶＥ−ＰＴＰが低減しているマウスを製造する方法。
【請求項２】
前記マウスは、さらにヘテロ接合Ｔｉｅ２マウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
高い眼圧の形質発現を低減するための、Ｔｉｅ２ヘテロ接合マウスに導入されるＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子の使用。
【請求項４】
ＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子。
【請求項５】
アンジオポエチン１、アンジオポエチン２及びＶＥ−ＰＴＰの条件付きトリプルノックアウトがなされたマウスを含むマウスモデル。
【請求項６】
ＶＥ−ＰＴＰの条件付き完全ノックアウトがなされたマウスを含むマウスモデル。
【請求項７】
Ａｎｇ１／２の条件付きノックアウトマウスにおいて、野生型ＶＥ−ＰＴＰ対立遺伝子の両方をＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子に置換することを含む、条件付きトリプルノックアウトマウスを製造する方法。
【請求項８】
野生型ＶＥ−ＰＴＰ対立遺伝子の両方をＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子に置換することを含む、ＶＥ−ＰＴＰの条件付きノックアウトマウスを製造する方法。
【請求項９】
Ａｎｇ１／２の条件付きノックアウトマウスにおける高い眼圧を低減するためのＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子の使用。
【請求項１０】
高い眼圧を形質発現するマウスにおける高い眼圧を低減するためのＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子の使用。
【請求項１１】
高い眼圧の形質発現を除去するためのＡｎｇ１／２条件付きノックアウトマウスにおけるＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、緑内障に関し、特に眼圧上昇の緑内障症状から救うためのＶＥ−ＰＴＰ阻害の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中で約６０００万人の患者が緑内障に罹患しており、緑内障は治療しないと世界中で８００万人いる両側盲を引き起こす重篤な疾患である。現在の治療は、疾患の進行を遅延するのみである。失明を引き起こす最も重要なリスク因子は、眼圧の上昇である。
【０００３】
シュレム管は、眼の周囲の細胞鎖により形成された特殊な管である。マウスモデルが米国特許出願第１４／７９０８８４号（公開番号ＵＳ２０１６／００００８７１Ａ１）に記載されており、また、アンジオポエチン１／アンジオポエチン２（Ａｎｇｐｔ１／Ａｎｇｐｔ２）のダブルノックアウトマウス及びＴｉｅ２ノックアウトマウスが眼圧の上昇による牛眼症を発症することが記載されている。Ａｎｇｐｔ１／Ａｎｇｐｔ２のダブルノックアウトマウス及びＴｉｅ２ノックアウトマウスの両方は、シュレム管を欠損している。アンジオポエチンシグナリングは、シュレム管の形成に量依存的な効果を示す。Ｔｉｅ２シグナリング（活性）は、シュレム管の形成に量依存的な効果を示す。Ｔｉｅ２活性はシュレム管における管形成を促進し、Ｔｉｅ２を活性化する因子は血管内皮−ホスホチロシンホスファターゼ（ＶＥ−ＰＴＰ）阻害剤を含む。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の一実施形態において、少なくとも１つの野生型ＶＥ−ＰＴＰ対立遺伝子をＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子に置換することを含む、ＶＥ−ＰＴＰが低減しているマウスを製造する方法がある。
【０００５】
本発明の更なる実施形態において、ヘテロ接合Ｔｉｅ２マウスにおける少なくとも１つの野生型ＶＥ−ＰＴＰ対立遺伝子をＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子に置換することを含む、ＶＥ−ＰＴＰが低減しているマウスを製造する方法がある。
【０００６】
Ｔｉｅ２ヘテロ接合マウスに導入されるＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子の使用は、高い眼圧の形質発現を低減する。
【０００７】
本発明の一実施形態は、ＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子である。
【０００８】
本発明の一実施形態において、アンジオポエチン１、アンジオポエチン２及びＶＥ−ＰＴＰの条件付きトリプルノックアウトがなされたマウスを含むマウスモデルがある。
【０００９】
本発明の更なる実施形態において、ＶＥ−ＰＴＰの条件付き完全ノックアウトがなされたマウスを含むマウスモデルがある。
【００１０】
本発明の一実施形態において、Ａｎｇ１／２の条件付きノックアウトマウスにおいて両方の野生型ＶＥ−ＰＴＰ対立遺伝子をＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子に置換することを含む、条件付きトリプルノックアウトマウスを製造する方法がある。
【００１１】
本発明の一実施形態において、両方の野生型ＶＥ−ＰＴＰ対立遺伝子をＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子に置換することを含む、ＶＥ−ＰＴＰの条件付きノックアウトマウスを製造する方法がある。
【００１２】
本発明の一実施形態において、Ａｎｇ１／２の条件付きノックアウトマウスにおいて高い眼圧を低減するためのＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子の使用がある。
【００１３】
本発明の一実施形態において、高い眼圧を形質発現するマウスにおいて高い眼圧を低減するためのＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子の使用がある。
【００１４】
本発明の一実施形態において、高い眼圧の形質発現を除去するためのＡｎｇ１／Ａｎｇ２条件付きノックアウトマウスにおけるＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子の使用がある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、コントロールマウス及びＶＥ−ＰＴＰヘテロ接合マウスにおけるＴｉｅ２のリン酸化のレベルを比較するゲルである。
【図２】図２は、コントロールマウス及びＶＥ−ＰＴＰヘテロ接合マウスにおけるＴｉｅ２のリン酸化レベルを比較するグラフである。
【図３】図３は、コントロールマウス、ＶＥ−ＰＴＰヘテロ接合マウス、Ｔｉｅ２ヘテロ接合マウス及びＴｉｅ２ヘテロ接合／ＶＥ−ＰＴＰヘテロ接合マウスにおける眼圧の大きさの比較である。
【図４】図４（ａ）は、コントロールマウス、Ａｎｇ１／２条件付きノックアウトマウス及びＡｎｇ１／２／ＶＥ−ＰＴＰ条件付きノックアウト（３ＫＯ）マウスにおける眼の形質的外観及びシュレム管の組織学的断片の形質的外観の比較である。図４（ｂ）は、コントロールマウス、ＶＥ−ＰＴＰ条件付きノックアウトマウス、Ａｎｇ１／２条件付きノックアウトマウス及びＡｎｇ１／２／ＶＥ−ＰＴＰ条件付きノックアウト（３ＫＯ）マウスにおける眼圧の大きさの比較である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
用いられるコンストラクト、プライマー及びコンポーネントは、米国特許出願第１４／７９０８８４号（公開番号ＵＳ２０１６／０００８７１Ａ１）に記載されたマウスに用いられたものと同一である。この参照から、Ａ１Ａ２ＦｌｏｘＷＢΔＥ１６．５（ｃＫＯ又は条件付きノックアウト）マウスが両側牛眼症を発症すること、及びアンジオポエチン１及びアンジオポエチン２の条件付きノックアウトマウス（Ａｎｇ１／２条件付きノックアウトマウス）においてシュレム管が欠損し、眼圧（ＩＯＰ）が増大することは、周知である。
【００１７】
管形成において、Ａｎｇｐｔ／Ｔｉｅ２シグナリングに量依存的役割がある。Ａｎｇｐｔ１／２のダブルノックアウトは、完全にシュレム管を欠損する一方で、Ａｎｇｐｔ１ノックアウトマウスは多少の管組織が残った低形質の表現型のみを有する。Ａｎｇｐｔ２ノックアウトのみでは影響が無く、これは、Ａｎｇｐｔ１が主要なリガンドである一方で、Ａｎｇｐｔ２が補償を提供できることを提示する。（ダブルノックアウトほど上昇しないが）Ａｎｇｐｔ１ノックアウトマウスでは眼圧が上昇し、Ａｎｇｐｔ２ノックアウトでは正常であるため、眼圧（ＩＯＰ）の大きさはこれらの組織学的結果を確認する。Ｔｉｅ２活性（すなわちＡｎｇｐｔ／Ｔｉｅ２シグナリングのレベル）は、管形成における量依存的影響を及ぼす。
【００１８】
本発明の一実施形態は、ＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子である。本発明の一実施形態は、コントロールマウス又はＴｉｅ２ヘテロ接合マウスにＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子を導入することにより作製する方法及び作製されたマウスである。本発明の一実施形態は、ヘテロ接合ＶＥ−ＰＴＰマウスである。本発明の更なる実施形態において、ヘテロ接合ＶＥ−ＰＴＰ／ヘテロ接合Ｔｉｅ２マウスがある。
【００１９】
図１及び２に示すように、ＶＥ−ＰＴＰヘテロ接合マウスは、コントロールの同腹仔と比較してＴｉｅ２のリン酸化が増大した。
【００２０】
図１は、コントロールマウスとヘテロ接合ＶＥ−ＰＴＰＬａｃＺ／ＷＴマウスとの比較であり、ＶＥ−ＰＴＰＬａｃＺ／ＷＴマウスはコントロールよりもＶＥ−ＰＴＰが少なく、ＶＥ−ＰＴＰＬａｃＺ／ＷＴマウスではｐＴｉｅ２及びＴｉｅ２のレベルがより高いことを示している。
【００２１】
図２は、コントロールにおけるＴｉｅ２のリン酸化がＶＥ−ＰＴＰＬａｃＺ／ＷＴマウスにおけるＴｉｅ２のリン酸化の半分未満であることを示す。
【００２２】
ＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子（ＶＥ−ＰＴＰヘテロ接合性）の導入は、上記Ｔｉｅ２ヘテロ接合マウスの発育上の形質を救出し、増大したＩＯＰの発生を防止できる。図３は、ヘテロ接合ＶＥ−ＰＴＰマウス、又はＴｉｅ２／ＶＥ−ＰＴＰの組合せのヘテロ接合マウスでは、コントロールで見られた正常レベルに近づき、Ｔｉｅ２ノックアウトマウスよりも顕著に低いことを示す。
【００２３】
ＶＥ−ＰＴＰヘテロ接合マウスは、この実施形態において、チャールズ・リバー社から得られたＷＴ−ＬａｃＺマウスに由来し、ＶＥ−ＰＴＰＬａｃＺ／ＷＴマウスを作製するためにＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子が導入されたマウスである。
【００２４】
これは、緑内障表現型からの救出がＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子のＴｉｅ２ヘテロ接合マウスへの導入により起こることを証明する。
【００２５】
ＶＥ−ＰＴＰのノックアウト、又はＴｉｅ２が関連する状況下ではＴｉｅ２ヘテロ接合マウスは、増大したＩＯＰの表現型からマウスを救出する（すなわち、低減されたＶＥ−ＰＴＰによって、ＩＯＰが正常であり、従ってマウスが増大したＩＯＰの緑内障症状を有さない）。
【００２６】
図４（ａ）は、コントロールマウス、Ａｎｇ１／２条件付きノックアウトマウス及びＡｎｇ１／２／ＶＥ−ＰＴＰ条件付きノックアウト（３ＫＯ）マウスにおける眼の形質的外観及びシュレム管の組織学的断片の形質的外観の比較である。
【００２７】
図４（ｂ）は、コントロールマウス、条件付きＶＥ−ＰＴＰノックアウトマウス、Ａｎｇ１／２条件付きノックアウトマウス及びＡｎｇ１／２／ＶＥ−ＰＴＰ条件付きノックアウト（３ＫＯ）マウスにおける眼圧の大きさの比較である。
【００２８】
Ａｎｇｐｔ１／２条件付きダブルノックアウトマウスは、シュレム管を完全に欠損し、コントロールマウスと比較して突き出た眼を有する。Ａｎｇｐｔ１／２条件付きノックアウトマウスでは眼圧が上昇する一方で、コントロール及びＶＥ−ＰＴＰ条件付きノックアウトマウスでは正常であるため、眼圧（ＩＯＰ）の大きさは、これらの表現型及び組織学的結果を確認する。
【００２９】
図４（ａ）及び（ｂ）に示されるように、ＶＥ−ＰＴＰ条件付きノックアウトをさらになされたＡｎｇ１／２条件付きノックアウトマウスは、眼、シュレム管の組織学的外観及び眼圧の大きさが正常の表現型に近づく。
【００３０】
マウスにおいてＡｎｇ１／Ａｎｇ２及びＶＥ−ＰＴＰが全て条件付きノックアウトされた場合、Ａｎｇ１及びＡｎｇ２のみノックアウトされ、ＶＥ−ＰＴＰが存在している「緑内障」マウスと比較して、正常なＩＯＰの救出がある。
【００３１】
本発明の一実施形態は、ＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子をＡｎｇ１／２条件付きノックアウトマウスに導入することによる作製方法及び作製されたマウスである。本発明の他の実施形態は、ホモ接合ＶＥ−ＰＴＰ条件付きノックアウトマウスである。
【００３２】
図４（ｂ）に示すように、３ＫＯマウス、ＶＥ−ＰＴＰ条件付きノックアウトマウス及びコントロールマウスは、ＩＯＰが上昇しているＡｎｇ１／２条件付きノックアウトマウスと比較して類似のＩＯＰを有する。
【００３３】
ＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子（ＶＥ−ＰＴＰホモ接合性）の導入は、上記Ａｎｇ１／２条件付きノックアウトマウスの発育上の形質を救出でき、ＩＯＰの上昇の発生を防止できる。
【００３４】
これは、緑内障表現型からの救出がＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子のＡｎｇ１／２条件付きノックアウトマウスへの導入により起こることを証明する。
【００３５】
ＶＥ−ＰＴＰのノックアウト、又はＴｉｅ２抑制条件下ではＡｎｇ１／２条件付きマウスは、増大したＩＯＰの表現型からマウスを救出する（すなわち、ＶＥ−ＰＴＰの除去によりＩＯＰが正常となり、従ってマウスは増大したＩＯＰの緑内障症状を有さない）。
【図１】
2019514430.tif 000003
【図２】
2019514430.tif 000004
【図３】
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2019514430.tif 000006
【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年5月2日(2018.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
用いられるコンストラクト、プライマー及びコンポーネントは、米国特許出願第１４／７９０８８４号（公開番号ＵＳ２０１６／０００８７１Ａ１）に記載されたマウスに用いられたものと同一である。この参照から、Ａ１Ａ２ＦｌｏｘＷＢΔＥ１６．５（ｃＫＯ又は条件付きノックアウト）マウスが両側牛眼症を発症すること、及びアンジオポエチン１及びアンジオポエチン２の条件付きノックアウトマウス（Ａｎｇ１／２条件付きノックアウトマウス）においてシュレム管が欠損し、眼圧（ＩＯＰ）が増大することは、周知である。この参照は、ドキシサイクリン誘導性の全体Ａｎｇｐｔ１；Ａｎｇｐｔ２ダブルノックアウトマウスを作製するために、全体Ａｎｇｐｔ１ノックアウト系で、ＲＯＳＡ−ｒｔＴＡ：Ｔｅｔ−Ｏｎ−Ｃｒｅに交差された新規のＡｎｇｐｔ２Ｆｌｏｘマウスを生成した。全体Ｃｒｅリコンビナーゼ発現を、Ａ１Ａ２Ｆｌｏｘ．ｓｕｐ．ＷＢ．ＤＥＬＴＡ．Ｅ１６．５  ｐｕｐｓを生成するために胎生１６．５日（Ｅ１６．５）に、妊娠した雌親にドキシサイクリンを処理することにより誘導した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウスゲノムにおいて、単一の野生型ＶＥ−ＰＴＰ対立遺伝子をＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子に置換し、少なくとも１つの野生型Ｔｉｅ２対立遺伝子をＴｉｅ２欠損対立遺伝子に置換することを含む、ＶＥ−ＰＴＰ及びＴｉｅ２の発現が低減しているマウスを製造する方法。
【請求項２】
前記単一のＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子は、既に１つのＴｉｅ２欠損対立遺伝子をもつマウスゲノムに導入されて、ヘテロ接合ＶＥ−ＰＴＰ欠損及びヘテロ接合Ｔｉｅ２欠損マウスを生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｔｉｅ２ヘテロ接合欠損マウスの眼圧と比較して増大された眼圧の形質発現を低減するための、Ｔｉｅ２ヘテロ接合欠損マウスゲノムに導入される単一のＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子の使用。
【請求項４】
ＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子、ＶＥ−ＰＴＰ野生型対立遺伝子、Ｔｉｅ２野生型対立遺伝子及びＴｉｅ２欠損対立遺伝子をゲノムに含み、正常な眼圧を有するマウス。
【請求項５】
ＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子、ＶＥ−ＰＴＰ野生型対立遺伝子、２つのアンジオポエチン１欠損対立遺伝子、及び２つのアンジオポエチン２欠損対立遺伝子をゲノムに含むマウス。
【請求項６】
前記アンジオポエチン１及び／又はアンジオポエチン２欠損対立遺伝子は、条件付き欠損対立遺伝子であり、前記条件付き欠損対立遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現することにより誘導される、請求項５に記載のマウス。
【請求項７】
前記Ｃｒｅリコンビナーゼの発現は、妊娠１６．５日に誘導される、請求項６に記載のマウス。
【請求項８】
正常な眼圧を有する請求項６又は７に記載のマウス。
【請求項９】
前記ＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子は、ＶＥ−ＰＴＰＬａｃＺ欠損対立遺伝子である、請求項４〜８のいずれか１項に記載のマウス。
【請求項１０】
前記ＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼの全体の発現により誘導される条件付き欠損対立遺伝子である、請求項４に記載のマウス。
【請求項１１】
２つの条件付きＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子をゲノムに含み、前記条件付き欠損対立遺伝子はＣｒｅリコンビナーゼの全体の発現により誘導されるマウス。
【請求項１２】
請求項４〜１１のいずれか１項に記載のマウスの眼圧を測定することを含む眼圧の変化を評価する方法。
【請求項１３】
アンジオポエチン１／アンジオポエチン２のダブルヘテロ接合欠損マウスの眼圧と比較して増大された眼圧の形質発現を低減するための、アンジオポエチン１／アンジオポエチン２ダブルヘテロ接合欠損マウスに導入させる単一のＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子の使用。
【請求項１４】
前記ＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼの全体の発現により誘導される条件付き欠損対立遺伝子である、請求項３及び１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記ＶＥ−ＰＴＰ欠損対立遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼの全体の発現により誘導される条件付き欠損対立遺伝子である、請求項１及び２のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
2019514430.tif 000008
2019514430.tif 000009