(57)【要約】本開示は、コドン最適化第ＶＩＩＩ因子配列、コドン最適化第ＶＩＩＩ因子配列を含むベクター及び宿主細胞、コドン最適化第ＶＩＩＩ因子配列によってコードされるポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドの作製方法を提供する。本開示は、血友病のような出血障害の治療方法であって、コドン最適化第ＶＩＩＩ因子核酸配列またはその核酸配列によってコードされるポリペプチドを対象に投与することを含む方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、
（ａ）前記第１の核酸配列の、
（ｉ）配列番号３の５８〜２２７７位と２３２０〜１７９１位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、
（ｉｉ）配列番号４の５８〜２２７７位と２３２０〜１７９１位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、
（ｉｉｉ）配列番号５の５８〜１７９１位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、もしくは
（ｉｖ）配列番号６の５８〜１７９１位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、
（ｂ）前記第２のヌクレオチド配列の、
（ｉ）配列番号３の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、
（ｉｉ）配列番号４の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、
（ｉｉｉ）配列番号５の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、もしくは
（ｉｖ）配列番号６の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、または
（ｃ）（ａ）と（ｂ）がいずれかに組み合わせてあり、
前記Ｎ末端部分と前記Ｃ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する前記単離核酸分子。
【請求項２】
ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列の核酸配列の、
（ｉ）配列番号１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、
（ｉｉ）配列番号２の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、
（ｉｉｉ）配列番号７０の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、
（ｉｖ）配列番号７１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、
（ｖ）配列番号３の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、
（ｖｉ）配列番号４の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、
（ｖｉｉ）配列番号５の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、
（ｖｉｉｉ）配列番号６の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％であるか、または
（ｉｘ）（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）がいずれかに組み合わせてある前記単離核酸分子。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列が、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含み、シグナルペプチドをコードする前記核酸配列の、
（ｉ）配列番号１の１〜５７位のヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号２の１〜５７位のヌクレオチド、
（ｉｉｉ）配列番号３の１〜５７位のヌクレオチド、
（ｉｖ）配列番号４の１〜５７位のヌクレオチド、
（ｖ）配列番号５の１〜５７位のヌクレオチド、
（ｖｉ）配列番号６の１〜５７位のヌクレオチド、
（ｖｉｉ）配列番号７０の１〜５７位のヌクレオチド、
（ｖｉｉｉ）配列番号７１の１〜５７位のヌクレオチドまたは
（ｉｘ）配列番号６８の１〜５７位のヌクレオチド
に対する配列同一性が、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である、請求項１または２に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
（ａ）前記核酸分子またはその一部のヒトコドン適応指標が、配列番号１６よりも上昇していること、
（ｂ）前記ヌクレオチド配列またはその一部の最適コドン頻度が、配列番号１６よりも上昇していること、
（ｃ）前記ヌクレオチド配列またはその一部が、配列番号１６におけるＧ／Ｃヌクレオチドの割合よりも高い割合で、Ｇ／Ｃヌクレオチドを含むこと、
（ｄ）前記ヌクレオチド配列またはその一部の相対的な同義コドン使用頻度が、配列番号１６よりも上昇していること、
（ｅ）前記ヌクレオチド配列またはその一部のコドンの有効数が、配列番号１６よりも減少していること、
（ｆ）前記ヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列（配列番号２１及び２２）を含むこと、
（ｇ）前記ヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ない不安定化エレメント（配列番号２３及び２４）を含むこと、
（ｈ）これらをいずれかに組み合わせたもの、
からなる群から選択した１つ以上の特性を前記核酸分子が含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
異種のアミノ酸配列をコードする異種のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
前記異種のアミノ酸配列が、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、ＸＴＥＮ、トランスフェリン、アルブミンまたはＰＡＳ配列である、請求項５に記載の単離核酸分子。
【請求項７】
前記異種のアミノ酸配列が、前記ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端に連結しているか、または前記ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列における２つのアミノ酸の間に、表３から選択した１つ以上の挿入部位において挿入されている、請求項５または６に記載の単離核酸分子。
【請求項８】
前記ＦＶＩＩＩポリペプチドが、完全長ＦＶＩＩＩまたはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離核酸分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１０】
レンチウイルスベクターである、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項９もしくは１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１１に記載の宿主細胞によって産生されるポリペプチド。
【請求項１３】
ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの作製方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドが産生される条件下で、請求項１１に記載の宿主細胞を培養することと、ＦＶＩＩＩ活性を有する前記ポリペプチドを回収することとを含む前記方法。
【請求項１４】
ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの、対象における発現の増加方法であって、前記増加が必要な対象に、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離核酸分子または請求項９または１０に記載のベクターを投与することを含み、配列番号１６を含む参照核酸分子または前記参照核酸分子を含むベクターよりも、前記ポリペプチドの発現を増加させる前記方法。
【請求項１５】
出血疾患の治療方法であって、その治療を必要とする対象に、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項９もしくは１０に記載のベクター、または請求項１２に記載のポリペプチドを投与することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出した配列表の参照
ＡＳＣＩＩテキストファイルで電子的に提出した配列表（名称：２１５９＿４６９ＰＣ０２＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：２０４，１３８バイト、作成日：２０１７年１月３１日）の内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固経路は部分的に、血小板の表面で、第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）と第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）との酵素複合体（Ｘａｓｅ複合体）が形成されることを伴う。ＦＩＸａは、その補因子のＦＶＩＩＩａがない状態では、触媒活性が比較的弱いセリンプロテアーゼである。Ｘａｓｅ複合体は、第Ｘ因子（ＦＸ）を切断して第Ｘａ因子（ＦＸａ）にし、そして、このＦＸａが第Ｖａ因子（ＦＶａ）と相互作用して、プロトロンビンを切断し、トロンビンを生成する。血友病Ａは、ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）遺伝子の変異及び／または欠失により、ＦＶＩＩＩ活性が欠損することを原因とする出血障害である（Ｐｅｙｖａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。いくつかのケースでは、患者は、抗ＦＶＩＩＩ抗体のようなＦＶＩＩＩインヒビターの存在により、ＦＶＩＩＩレベルが低下している。
【０００３】
血友病Ａは、自然発生性出血と過度の出血によって特徴付けられている。筋肉内出血と関節内出血の反復（幼児期に開始する場合が多い）により、時間の経過とともに、血友病性関節症と不可逆性の関節損傷に至る。この損傷は進行性であり、この損傷により、関節の運動性が著しく制限されたり、筋肉が萎縮したり、慢性疼痛を起こしたりすることがある（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｍｅｒｃｈａｎ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２９：８７−９６（２００３）、参照により、その全体が本明細書に援用される）。
【０００４】
この疾患は、ＦＶＩＩＩ活性を正常レベルの１〜５％まで回復させて、自然出血を防止することを目標とする補充療法によって治療できる（例えば、Ｍａｎｎｕｃｃｉ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１７７３−９（２００１）（参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい）。オンデマンドで出血エピソードを治療するか、または予防的処置によって、出血エピソードの発生を防ぐ目的で利用できるものには、血漿由来のＦＶＩＩＩ製品と、組み換えＦＶＩＩＩ製品がある。これらの製品の半減期（１０〜１２時間）に基づき（Ｗｈｉｔｅ  Ｇ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：６６０−７（１９９７）、Ｍｏｒｆｉｎｉ，Ｍ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ９（ｓｕｐｐｌ  １）：９４−９９；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ１００（２００３））、治療レジメンでは、頻回、一般には、予防目的では週に２〜３回、オンデマンド治療では１日に１〜３回の静脈内投与が必要となる（Ｍａｎｃｏ−Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５７：５３５−５４４（２００７））（これらの各文献は、参照により、その全体が本明細書に援用される）。このような頻回投与は、不便であり、費用がかかる。
【０００５】
低コストの組み換えＦＶＩＩＩタンパク質を患者に供給するにあたって、主な障害は、商業生産コストの高さである。ＦＶＩＩＩタンパク質は、異種の発現系では十分に発現せず、その発現は、同様のサイズのタンパク質の２分の１〜３分の１である。（Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．；４：２５９−７２（１９９３）。ＦＶＩＩＩの発現の低さは部分的には、ＦＶＩＩＩコード配列に、ＦＶＩＩＩの発現を阻害するシス作動性エレメント（転写サイレンサーエレメント（Ｈｏｅｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８５：２４４７−２４５４（１９９５））、マトリックス付着様配列（ＭＡＲ）（Ｆａｌｌｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：４２６４−４２７２（１９９６））及び転写伸長阻害エレメント（Ｋｏｅｂｅｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．；６：４６９−４７９（１９９５））など）が存在することに起因する。
【０００６】
ＦＶＩＩＩの発現生態への我々の理解を深めることによって、さらに強力なＦＶＩＩＩバリアントの開発に至った。例えば、生化学的な調査により、ＦＶＩＩＩ  ＢドメインがＦＶＩＩＩ補因子活性に必須ではないことが示された。Ｂドメインの欠失により、完全長野生型ＦＶＩＩＩよりも、ｍＲＮＡレベルが１７倍上昇し、タンパク質の分泌が３０％増大した（Ｔｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８３：５９３９−４２（１９８６））。これにより、現在、臨床で広く用いられているＢドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩタンパク質濃縮物の開発に至った。しかしながら、最近の研究では、完全長ｈＦＶＩＩＩとＢＤＤ  ｈＦＶＩＩＩは、ＥＲ内腔でミスフォールディングし、その結果、マウス幹細胞の折り畳み不全タンパク質応答（ＵＰＲ）とアポトーシスが活性化されることが示されている。
したがって、当該技術分野では、異種の系で効率的に発現するＦＶＩＩＩ配列に対するニーズが存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｍｅｒｃｈａｎ，Ｅ．Ｃ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２９：８７−９６（２００３）
【非特許文献２】Ｍａｎｎｕｃｃｉ，Ｐ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：１７７３−９（２００１）
【非特許文献３】Ｗｈｉｔｅ  Ｇ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：６６０−７（１９９７）
【非特許文献４】Ｍｏｒｆｉｎｉ，Ｍ．，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ９（ｓｕｐｐｌ  １）：９４−９９；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ１００（２００３）
【非特許文献５】Ｍａｎｃｏ−Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５７：５３５−５４４（２００７）
【非特許文献６】Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．；４：２５９−７２（１９９３）
【非特許文献７】Ｈｏｅｂｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８５：２４４７−２４５４（１９９５）
【非特許文献８】Ｆａｌｌｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：４２６４−４２７２（１９９６）
【非特許文献９】Ｋｏｅｂｅｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．；６：４６９−４７９（１９９５）
【非特許文献１０】Ｔｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８３：５９３９−４２（１９８６）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
開示するのは、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化核酸分子である。一態様では、本開示は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号３の５８〜２２７７位と２３２０〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号４の５８〜２２７７位と２３２０〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する単離核酸分子を提供する。
【０００９】
本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号５の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号６の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位に対する第２の核酸配列の配列同一性が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する単離核酸分子も提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号２の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。一実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号７０の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号７１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号３の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号４の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号５の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号６の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本開示は、対象における、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現の増加方法であって、この発現の増加が必要な対象に、本明細書に開示されている単離核酸分子またはベクターを投与することを含み、配列番号１６を含む参照核酸分子またはこの参照核酸分子を含むベクターよりも、そのポリペプチドの発現を増加させる方法を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本開示は、出血障害の治療方法であって、その治療が必要な対象に、本明細書に開示されている核酸分子、ベクターまたはポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。
【００１７】
実施形態
実施形態１．第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）ポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号３の５８〜２２７７位と２３２０〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号４の５８〜２２７７位と２３２０〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する単離核酸分子。
【００１８】
実施形態２．その第１のヌクレオチド配列が、配列番号３の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは配列番号４の５８〜１７９１位のヌクレオチドを含む、実施形態１に記載の単離核酸分子。
【００１９】
実施形態３．配列番号３の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドまたは配列番号４の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位に対する第２のヌクレオチド配列の配列同一性が少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である、実施形態１または実施形態２に記載の単離核酸分子。
【００２０】
実施形態４．その第２のヌクレオチド配列が、配列番号３の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位または配列番号４の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む、実施形態１または実施形態２に記載の単離核酸分子。
【００２１】
実施形態５．ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号５の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号６の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位に対する第２の核酸配列の配列同一性が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する単離核酸分子。
【００２２】
実施形態６．その第２の核酸配列が、配列番号５の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位または配列番号６の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む、実施形態５に記載の単離核酸分子。
【００２３】
実施形態７．配列番号５の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは配列番号６の５８〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である、実施形態５または実施形態６に記載の単離核酸分子。
【００２４】
実施形態８．その第１の核酸配列が、配列番号５の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは配列番号６の５８〜１７９１位のヌクレオチドを含む、実施形態５または実施形態６に記載の単離核酸分子。
【００２５】
実施形態９．ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子。
【００２６】
実施形態１０．そのヌクレオチド配列が、配列番号１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む、実施形態９に記載の単離核酸分子。
【００２７】
実施形態１１．ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号２の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子。
【００２８】
実施形態１２．そのヌクレオチド配列が、配列番号２の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む、実施形態１０に記載の単離核酸分子。
【００２９】
実施形態１３．ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号７０の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子。
【００３０】
実施形態１４．そのヌクレオチド配列が、配列番号７０の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む、実施形態１３に記載の単離核酸分子。
【００３１】
実施形態１５．ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号７１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子。
【００３２】
実施形態１６．そのヌクレオチド配列が、配列番号７１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む、実施形態１５に記載の単離核酸分子。
【００３３】
実施形態１７．ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号３の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子。
【００３４】
実施形態１８．そのヌクレオチド配列が、配列番号３の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む、実施形態１７に記載の単離核酸分子。
【００３５】
実施形態１９．ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号４の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子。
【００３６】
実施形態２０．そのヌクレオチド配列が、配列番号４の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む、実施形態１９に記載の単離核酸分子。
【００３７】
実施形態２１．ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号５の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子。
【００３８】
実施形態２２．そのヌクレオチド配列が、配列番号５の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む、実施形態２１に記載の単離核酸分子。
【００３９】
実施形態２３．ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号６の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子。
【００４０】
実施形態２４．そのヌクレオチド配列が、配列番号６の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む、実施形態２３に記載の単離核酸分子。
【００４１】
実施形態２５．そのヌクレオチド配列が、シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、実施形態１〜実施形態２４のいずれか１つに記載の単離核酸分子。
【００４２】
実施形態２６．そのシグナルペプチドが、ＦＶＩＩＩシグナルペプチドである、実施形態２５に記載の単離核酸分子。
【００４３】
実施形態２７．シグナルペプチドをコードする核酸配列のコドンが最適化されている、実施形態２５または実施形態２６に記載の単離核酸分子。
【００４４】
実施形態２８．シグナルペプチドをコードする核酸配列の、（ｉ）配列番号１の１〜５７位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２の１〜５７位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号３の１〜５７位のヌクレオチド、（ｉｖ）配列番号４の１〜５７位のヌクレオチド、（ｖ）配列番号５の１〜５７位のヌクレオチド、（ｖｉ）配列番号６の１〜５７位のヌクレオチド、（ｖｉｉ）配列番号７０の１〜５７位のヌクレオチド、（ｖｉｉｉ）配列番号７１の１〜５７位のヌクレオチドまたは（ｉｘ）配列番号６８の１〜５７位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である、実施形態２５〜実施形態２７のいずれか１つに記載の単離核酸分子。
【００４５】
実施形態２９．
（ａ）核酸分子またはその一部のヒトコドン適応指標が、配列番号１６よりも上昇していることと、
（ｂ）ヌクレオチド配列またはその一部の最適コドン頻度が、配列番号１６よりも上昇していることと、
（ｃ）ヌクレオチド配列またはその一部が、配列番号１６におけるＧ／Ｃヌクレオチドの割合よりも高い割合で、Ｇ／Ｃヌクレオチドを含むことと、
（ｄ）ヌクレオチド配列またはその一部の相対的な同義コドン使用頻度が、配列番号１６よりも上昇していることと、
（ｅ）ヌクレオチド配列またはその一部のコドンの有効数が、配列番号１６よりも減少していることと、
（ｆ）ヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列（配列番号２１及び２２）を含むことと、
（ｇ）ヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ない不安定化エレメント（配列番号２３及び２４）を含むことと、
（ｈ）これらをいずれかに組み合わせたもの、
からなる群から選択した１つ以上の特性をその核酸分子が含む、実施形態１〜実施形態２８のいずれか１つに記載の単離核酸分子。
【００４６】
実施形態３０．異種のヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態１〜実施形態２９のいずれか１つに記載の単離核酸分子。
【００４７】
実施形態３１．その異種のヌクレオチド配列が、半減期延長因子である異種のアミノ酸配列をコードする、実施形態３０に記載の単離核酸分子。
【００４８】
実施形態３２．その異種のアミノ酸配列が、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、トランスフェリン、アルブミンまたはＰＡＳ配列である、実施形態３０または実施形態３１に記載の単離核酸分子。
【００４９】
実施形態３３．その異種のアミノ酸配列が、Ｆｃ領域である、実施形態３０または実施形態３１に記載の単離核酸分子。
【００５０】
実施形態３４．その異種のアミノ酸配列が、上記のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端に連結されているか、または上記のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列における２つのアミノ酸の間に挿入されている、実施形態３０〜実施形態３３のいずれか１つに記載の単離核酸分子。
【００５１】
実施形態３５．その異種のアミノ酸配列が、表３から選択した１つ以上の挿入部位の２つのアミノ酸の間に挿入されている、実施形態３４に記載の単離核酸分子。
【００５２】
実施形態３６．ＦＶＩＩＩを含む単量体−二量体ハイブリッド分子をコードする、実施形態３０〜実施形態３５のいずれか１つに記載の単離核酸分子。
【００５３】
実施形態３７．そのＦＶＩＩＩポリペプチドが、完全長ＦＶＩＩＩまたはＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩである、実施形態１〜実施形態３６のいずれか１つに記載の単離核酸分子。
【００５４】
実施形態３８．少なくとも１つの転写制御配列に機能可能に連結されている、実施形態１〜実施形態３７のいずれか１つに記載の単離核酸分子。
【００５５】
実施形態３９．実施形態１〜実施形態３８のいずれか１つに記載の核酸分子を含むベクター。
【００５６】
実施形態４０．ウイルスベクターである、実施形態３９に記載のベクター。
【００５７】
実施形態４１．実施形態１〜実施形態３２のいずれか１つに記載の核酸分子、または実施形態３９もしくは実施形態４０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【００５８】
実施形態４２．ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０細胞及びＣＡＰ細胞からなる群から選択されている、実施形態４１に記載の宿主細胞。
【００５９】
実施形態４３．実施形態１〜実施形態３７のいずれか１つに記載の核酸分子、もしくは実施形態３９もしくは４０に記載のベクターによってコードされるか、または実施形態４１もしくは実施形態４２に記載の宿主細胞によって産生されるポリペプチド。
【００６０】
実施形態４４．ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの作製方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドが産生される条件下で、実施形態４１または実施形態４２に記載の宿主細胞を培養することと、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドを回収することを含む方法。
【００６１】
実施形態４５．配列番号１６を含む参照ヌクレオチド配列を含む宿主細胞を同じ条件下で培養した場合よりも、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現を増加させる、実施形態４４に記載の方法。
【００６２】
実施形態４６．対象における、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現の増加方法であって、その発現の増加が必要な対象に、実施形態１〜実施形態３８のいずれか１つに記載の単離核酸分子、または実施形態３９もしくは実施形態４０に記載のベクターを投与することを含み、配列番号１６を含む参照核酸分子またはこの参照核酸分子を含むベクターよりも、そのポリペプチドの発現を増加させる方法。
【００６３】
実施形態４７．ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現の増加方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドがその核酸分子によって発現される条件下で、実施形態４１または実施形態４２に記載の宿主細胞を培養することを含み、配列番号１６を含む参照核酸配列を含む宿主細胞を同じ条件下で培養した場合よりも、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現を増加させる方法。
【００６４】
実施形態４８．ＦＶＩＩＩポリペプチドの発現を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍または少なくとも約１００倍増加させる、実施形態４４〜実施形態４７のいずれか１つに記載の方法。
【００６５】
実施形態４９．ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの収量の改善方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドがその核酸分子によって産生される条件下で、実施形態４１または実施形態４２に記載の宿主細胞を培養することを含み、配列番号１６を含む参照核酸配列を含む宿主細胞を同じ条件下で培養した場合よりも、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの収量を増加させる方法。
【００６６】
実施形態５０．出血障害の治療方法であって、その治療が必要な対象に、実施形態１〜実施形態３８のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態３９もしくは実施形態４０に記載のベクター、または実施形態４３に記載のポリペプチドを投与することを含む方法。
【００６７】
実施形態５１．その出血障害が、ＦＶＩＩＩの欠損によって特徴付けられる、実施形態５０に記載の方法。
【００６８】
実施形態５２．その出血障害が血友病である、実施形態５０に記載の方法。
【００６９】
実施形態５３．その出血障害が血友病Ａである、実施形態５０に記載の方法。
【００７０】
実施形態５４．配列番号１６を含む参照核酸分子、その参照核酸分子を含むベクターまたはその参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与した対象よりも、投与から２４時間後の血漿中ＦＶＩＩＩ活性を向上させる、実施形態５０〜実施形態５３のいずれか１つに記載の方法。
【００７１】
実施形態５５．血漿中ＦＶＩＩＩ活性を少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍または少なくとも約１００倍向上させる、実施形態５４に記載の方法。
【００７２】
実施形態５６．レンチウイルスベクターである、実施形態３９または４０に記載のベクター。
【００７３】
実施形態５７．組織特異的プロモーター、組織特異的エンハンサー、または組織特異的プロモーターと組織特異的エンハンサーの両方をさらに含む、実施形態３９、実施形態４０及び実施形態５６のいずれか１つに記載のベクター。
【００７４】
実施形態５８．その組織特異的プロモーター及び／または組織特異的エンハンサーが、肝細胞において導入遺伝子の発現を選択的に増強する、実施形態５７に記載のベクター。
【００７５】
実施形態５９．その組織特異的プロモーターが、マウスチレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、内因性ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター（Ｆ８）、ヒトα１−アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター及びマウスアルブミンプロモーターからなる群から選択したプロモーター配列を含む、実施形態５７または実施形態５８に記載のベクター。
【００７６】
実施形態６０．その組織特異的プロモーターがｍＴＴＲプロモーターを含む、実施形態５７〜実施形態５９のいずれか１つに記載のベクター。
【００７７】
実施形態６１．出血障害の治療方法であって、その治療が必要な対象に、実施形態５６〜実施形態６０のいずれかの１つに記載のベクターを投与することを含む方法。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１Ａ】Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（配列番号１７）をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を示している。ｃｏＦＶＩＩＩ−３のヌクレオチド配列（配列番号１）を示している。
【図１Ｂ】Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（配列番号１７）をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を示している。ｃｏＦＶＩＩＩ−４のヌクレオチド配列（配列番号２）を示している。
【図１Ｃ】Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（配列番号１７）をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を示している。ｃｏＦＶＩＩＩ−５のヌクレオチド配列（配列番号７０）を示している。
【図１Ｄ】Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（配列番号１７）をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を示している。ｃｏＦＶＩＩＩ−６のヌクレオチド配列（配列番号７１）を示している。
【図１Ｅ】Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（配列番号１７）をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を示している。ｃｏＦＶＩＩＩ−５２のヌクレオチド配列（配列番号３）を示している。
【図１Ｆ】Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（配列番号１７）をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を示している。ｃｏＦＶＩＩＩ−６２のヌクレオチド配列（配列番号４）を示している。
【図１Ｇ】Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（配列番号１７）をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を示している。ｃｏＦＶＩＩＩ−２５のヌクレオチド配列（配列番号５）を示している。
【図１Ｈ】Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子（配列番号１７）をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を示している。ｃｏＦＶＩＩＩ−２６のヌクレオチド配列（配列番号６）を示している。
【図１Ｉ】Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）のヌクレオチド配列（配列番号１６）を示している。
【図１Ｊ】Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）のアミノ酸配列（配列番号１７）を示している。
【図２−１】図２Ａ〜Ｊは、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列におけるコドン使用頻度バイアスの調節を示している。図２Ａは、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、例えば非最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードする野生型ヌクレオチド配列（コドン最適化前）における相対的なコドン頻度を示している。非最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの配列のヒトコドン適応指標（ＣＡＩ）は、７４％である。図２Ｂは、ヒトＣＡＩが８８％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−１の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｃは、ヒトＣＡＩが９１％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−３の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｄは、ヒトＣＡＩが９７％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−４の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｅは、ヒトＣＡＩが８３％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−５の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｆは、ヒトＣＡＩが８３％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−６の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｇは、ヒトＣＡＩが９１％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−５２の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｈは、ヒトＣＡＩが９１％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−６２の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｉは、ヒトＣＡＩが８８％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−２５の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｊは、ヒトＣＡＩが８８％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−２６の配列における相対的なコドン頻度を示している。
【図２−２】図２Ａ〜Ｊは、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列におけるコドン使用頻度バイアスの調節を示している。図２Ａは、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、例えば非最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードする野生型ヌクレオチド配列（コドン最適化前）における相対的なコドン頻度を示している。非最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの配列のヒトコドン適応指標（ＣＡＩ）は、７４％である。図２Ｂは、ヒトＣＡＩが８８％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−１の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｃは、ヒトＣＡＩが９１％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−３の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｄは、ヒトＣＡＩが９７％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−４の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｅは、ヒトＣＡＩが８３％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−５の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｆは、ヒトＣＡＩが８３％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−６の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｇは、ヒトＣＡＩが９１％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−５２の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｈは、ヒトＣＡＩが９１％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−６２の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｉは、ヒトＣＡＩが８８％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−２５の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｊは、ヒトＣＡＩが８８％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−２６の配列における相対的なコドン頻度を示している。
【図２−３】図２Ａ〜Ｊは、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列におけるコドン使用頻度バイアスの調節を示している。図２Ａは、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、例えば非最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードする野生型ヌクレオチド配列（コドン最適化前）における相対的なコドン頻度を示している。非最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの配列のヒトコドン適応指標（ＣＡＩ）は、７４％である。図２Ｂは、ヒトＣＡＩが８８％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−１の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｃは、ヒトＣＡＩが９１％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−３の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｄは、ヒトＣＡＩが９７％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−４の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｅは、ヒトＣＡＩが８３％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−５の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｆは、ヒトＣＡＩが８３％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−６の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｇは、ヒトＣＡＩが９１％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−５２の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｈは、ヒトＣＡＩが９１％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−６２の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｉは、ヒトＣＡＩが８８％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−２５の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｊは、ヒトＣＡＩが８８％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−２６の配列における相対的なコドン頻度を示している。
【図２−４】図２Ａ〜Ｊは、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列におけるコドン使用頻度バイアスの調節を示している。図２Ａは、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、例えば非最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードする野生型ヌクレオチド配列（コドン最適化前）における相対的なコドン頻度を示している。非最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの配列のヒトコドン適応指標（ＣＡＩ）は、７４％である。図２Ｂは、ヒトＣＡＩが８８％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−１の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｃは、ヒトＣＡＩが９１％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−３の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｄは、ヒトＣＡＩが９７％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−４の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｅは、ヒトＣＡＩが８３％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−５の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｆは、ヒトＣＡＩが８３％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−６の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｇは、ヒトＣＡＩが９１％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−５２の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｈは、ヒトＣＡＩが９１％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−６２の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｉは、ヒトＣＡＩが８８％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−２５の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｊは、ヒトＣＡＩが８８％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−２６の配列における相対的なコドン頻度を示している。
【図２−５】図２Ａ〜Ｊは、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列におけるコドン使用頻度バイアスの調節を示している。図２Ａは、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、例えば非最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードする野生型ヌクレオチド配列（コドン最適化前）における相対的なコドン頻度を示している。非最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩの配列のヒトコドン適応指標（ＣＡＩ）は、７４％である。図２Ｂは、ヒトＣＡＩが８８％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−１の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｃは、ヒトＣＡＩが９１％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−３の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｄは、ヒトＣＡＩが９７％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−４の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｅは、ヒトＣＡＩが８３％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−５の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｆは、ヒトＣＡＩが８３％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−６の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｇは、ヒトＣＡＩが９１％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−５２の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｈは、ヒトＣＡＩが９１％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−６２の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｉは、ヒトＣＡＩが８８％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−２５の配列における相対的なコドン頻度を示している。図２Ｊは、ヒトＣＡＩが８８％である、バリアントｃｏＦＶＩＩＩ−２６の配列における相対的なコドン頻度を示している。
【図３】ｐｃＤＮＡ３骨格において、ＥＴ（増強トランスチレチン）プロモーター（ｃｏＦＶＩＩＩ−１翻訳開始部位の上流にあるとともに、合成エンハンサーと、ｍＴＩＲエンハンサーと、ｍＴＩＲプロモーターを含む）の制御下で、ｃｏＦＶＩＩＩ−１を含むＦＶＩＩＩ−３０３のプラスミドマップを示している。
【図４】ＦＶＩＩＩ−３０３（ｃｏＦＶＩＩＩ−１、円）を５μｇまたはＦＶＩＩＩ−３１１（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、四角）を５μｇ水圧注射後のＨｅｍＡマウスにおける血漿中ＦＶＩＩＩ活性のグラフ表示を示している。血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、注射の２４時間後、４８時間後及び７２時間後に、ＦＶＩＩＩ特異的発色アッセイによって割り出した。７２時間時点の相対的な活性レベルをＦＶＩＩＩ−３１１の発現レベルで補正したものが示されている。
【図５】レンチウイルスプラスミドにおいて、ＥＴプロモーター（ｃｏＦＶＩＩＩ−５２翻訳開始部位の上流にあるとともに、合成エンハンサーと、ｍＴＴＲエンハンサーと、ｍＴＴＲプロモーターを含む）の制御下で、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２を含むｐＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２のプラスミドマップを示している。
【図６Ａ】各種ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチドを水圧注射後のＨｅｍＡマウスにおける血漿中ＦＶＩＩＩ活性のグラフ表示を示している。血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、注射の２４時間後、４８時間後及び７２時間後に、ＦＶＩＩＩ特異的発色アッセイによって割り出した。ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−１を５μｇ（黒丸）、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−３を５μｇ（三角）、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−４を５μｇ（逆三角）、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５を５μｇ（ひし形）またはＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６を５μｇ（白丸）水圧注射後のＨｅｍＡマウスにおける血漿中ＦＶＩＩＩ活性を示している。示されているように、各プラスミドにおいて、７２時間時点の相対的な活性レベルは、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−１の発現レベルで補正したものが示されている。
【図６Ｂ】各種ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチドを水圧注射後のＨｅｍＡマウスにおける血漿中ＦＶＩＩＩ活性のグラフ表示を示している。血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、注射の２４時間後、４８時間後及び７２時間後に、ＦＶＩＩＩ特異的発色アッセイによって割り出した。ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−１を５μｇ（円）、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−２５を５μｇ（三角）またはＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−２６を５μｇ（逆三角）水圧注射後のＨｅｍＡマウスにおける血漿中ＦＶＩＩＩ活性を示している。示されているように、各プラスミドにおいて、７２時間時点の相対的な活性レベルは、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−１の発現レベルで補正したものが示されている。
【図６Ｃ】各種ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチドを水圧注射後のＨｅｍＡマウスにおける血漿中ＦＶＩＩＩ活性のグラフ表示を示している。血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、注射の２４時間後、４８時間後及び７２時間後に、ＦＶＩＩＩ特異的発色アッセイによって割り出した。ＬＶ−２１１６を２０μｇ（非コドン最適化（ＷＴ）ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列、白丸）、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−１を２０μｇ（三角）、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２を２０μｇ（四角）またはＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６２を２０μｇ（黒丸）水圧注射後のＨｅｍＡマウスにおける血漿中ＦＶＩＩＩ活性を示している。示されているように、各プラスミドにおいて、７２時間時点の相対的な活性レベルは、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−１及び／またはＬＶ−２１１６の発現レベルで補正したものが示されている。
【図７】ｃｏＦＶＩＩＩ−１、ｃｏＦＶＩＩＩ−５、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２、ｃｏＦＶＩＩＩ−６またはｃｏＦＶＩＩＩ−６２を含むレンチウイルスベクターを１Ｅ８ＴＵ／マウスで注射してから２４日後のＨｅｍＡマウスにおける血漿中ＦＶＩＩＩ活性を、コントロールのＬＶ−２１１６（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）と比較したとともに、ＦＶＩＩＩ特異的発色アッセイによって測定したものを示している。エラーバーは、標準偏差を示している。
【図８Ａ】ＸＴＥＮに融合したＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードする各種のコドン最適化ヌクレオチド配列を示している。ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮのヌクレオチド配列（配列番号１９）であって、１４４個のアミノ酸を有するＸＴＥＮ（「ＸＴＥＮ１４４」、配列番号１８、下線部分）をコードするヌクレオチド配列が、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２のヌクレオチド配列に挿入されているヌクレオチド配列を示している。
【図８Ｂ】ＸＴＥＮに融合したＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードする各種のコドン最適化ヌクレオチド配列を示している。ｃｏＦＶＩＩＩ−１−ＸＴＥＮのヌクレオチド配列（配列番号２０）であって、１４４個のアミノ酸を有するＸＴＥＮ（「ＸＴＥＮ１４４」、配列番号１８、下線部分）をコードするヌクレオチド配列が、ｃｏＦＶＩＩＩ−１のヌクレオチド配列に挿入されているヌクレオチド配列を示している。
【図８Ｃ】ＸＴＥＮに融合したＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードする各種のコドン最適化ヌクレオチド配列を示している。ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮのヌクレオチド配列（配列番号７２）であって、１４４個のアミノ酸を有するＸＴＥＮ（「ＸＴＥＮ１４４」、配列番号１８、下線部分）をコードするヌクレオチド配列が、ｃｏＦＶＩＩＩ−６のヌクレオチド配列（例えば、成熟ＦＶＩＩＩ配列に対応する７４５位のアミノ酸残基）に挿入されているヌクレオチド配列を示している。
【図９】レンチウイルスベクターにおいて、ＥＴプロモーターの制御下で、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮを含むｐＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮのプラスミドマップを示している。本明細書に記載されているような、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする残りの各コドン最適化核酸分子を含むレンチウイルスベクターは、ｐＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮと同じようにして構築し、その際には、同じＸＴＥＮ配列を挿入して、ＦＶＩＩＩのＢドメインを置き換えた。
【図１０Ａ】ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードする各種のコドン最適化ヌクレオチド配列を含むプラスミドＤＮＡを注射後のＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩ活性を示している。ＦＶＩＩＩ−３１１を５μｇ（非コドン最適化型、ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列、四角）、ＦＶＩＩＩ−３０３を５μｇ（ｃｏＦＶＩＩＩ−１、小さい円）またはＦＶＩＩＩ−３０６を５μｇ（ｃｏＦＶＩＩＩ−１−ＸＴＥＮ１４４、大きい円）を水圧注射後のＨｅｍＡマウスにおける血漿中ＦＶＩＩＩ活性のグラフ表示を示している。それぞれのプラスミドにおいて、７２時間時点の相対的な活性は、ＦＶＩＩＩ−３１１で補正したものが示されている。
【図１０Ｂ】ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩをコードする各種のコドン最適化ヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクターを注射後のＨｅｍＡマウスにおけるＦＶＩＩＩ活性を示している。ｃｏＦＶＩＩＩ−５２またはｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮを含むレンチウイルスベクターを１Ｅ８ＴＵ／マウスで注射してから２１日後のＨｅｍＡマウスにおける血漿中ＦＶＩＩＩ活性を、コントロールのＬＶ−２１１６（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）と比較したとともに、ＦＶＩＩＩ特異的発色アッセイによって測定したものを示している。エラーバーは、標準偏差を示している。
【図１１−１】図１１Ａは、完全長成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を示している。図１１Ｂは、完全長ヒトフォンビルブランド因子のアミノ酸配列（配列番号４４）を示している。図１１Ｃは、４２個のアミノ酸を有するＸＴＥＮポリペプチド（ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４、配列番号４６）のアミノ酸配列を示している。図１１Ｄは、４２個のアミノ酸を有するＸＴＥＮポリペプチド（ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４、配列番号４７）のヌクレオチド配列を示している。１４４個のアミノ酸を有する各種ＸＴＥＮポリペプチドのアミノ酸配列は、図１１Ｅ（配列番号４８）、図１１Ｇ（配列番号５０）、図１１Ｉ（配列番号５２）、図１１Ｋ（配列番号５４）、図１１Ｍ（配列番号５６）、図１１Ｏ（配列番号５８）、図１１Ｑ（配列番号６０）、図１１Ｓ（配列番号６２）、図１１Ｕ（配列番号６４）及び図１１Ｗ（配列番号６６）に示されており、それらの対応するヌクレオチド配列はそれぞれ、図１１Ｆ（配列番号４９）、図１１Ｈ（配列番号５１）、図１１Ｊ（配列番号５３）、図１１Ｌ（配列番号５５）、図１１Ｎ（配列番号５７）、図１１Ｐ（配列番号５９）、図１１Ｒ（配列番号６１）、図１１Ｔ（配列番号６３）、図１１Ｖ（配列番号６５）及び図１１Ｘ（配列番号６７）に示されている。図１１Ｙは、ＥＴプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号６９）を示している。図Ｚは、ｃｏＦＶＩＩＩ−１のヌクレオチド配列（配列番号６８）を示している（国際公開第２０１４／１２７２１５号、配列番号１を参照されたい）。
【図１１−２】図１１Ａは、完全長成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を示している。図１１Ｂは、完全長ヒトフォンビルブランド因子のアミノ酸配列（配列番号４４）を示している。図１１Ｃは、４２個のアミノ酸を有するＸＴＥＮポリペプチド（ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４、配列番号４６）のアミノ酸配列を示している。図１１Ｄは、４２個のアミノ酸を有するＸＴＥＮポリペプチド（ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４、配列番号４７）のヌクレオチド配列を示している。１４４個のアミノ酸を有する各種ＸＴＥＮポリペプチドのアミノ酸配列は、図１１Ｅ（配列番号４８）、図１１Ｇ（配列番号５０）、図１１Ｉ（配列番号５２）、図１１Ｋ（配列番号５４）、図１１Ｍ（配列番号５６）、図１１Ｏ（配列番号５８）、図１１Ｑ（配列番号６０）、図１１Ｓ（配列番号６２）、図１１Ｕ（配列番号６４）及び図１１Ｗ（配列番号６６）に示されており、それらの対応するヌクレオチド配列はそれぞれ、図１１Ｆ（配列番号４９）、図１１Ｈ（配列番号５１）、図１１Ｊ（配列番号５３）、図１１Ｌ（配列番号５５）、図１１Ｎ（配列番号５７）、図１１Ｐ（配列番号５９）、図１１Ｒ（配列番号６１）、図１１Ｔ（配列番号６３）、図１１Ｖ（配列番号６５）及び図１１Ｘ（配列番号６７）に示されている。図１１Ｙは、ＥＴプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号６９）を示している。図Ｚは、ｃｏＦＶＩＩＩ−１のヌクレオチド配列（配列番号６８）を示している（国際公開第２０１４／１２７２１５号、配列番号１を参照されたい）。
【図１１−３】図１１Ａは、完全長成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を示している。図１１Ｂは、完全長ヒトフォンビルブランド因子のアミノ酸配列（配列番号４４）を示している。図１１Ｃは、４２個のアミノ酸を有するＸＴＥＮポリペプチド（ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４、配列番号４６）のアミノ酸配列を示している。図１１Ｄは、４２個のアミノ酸を有するＸＴＥＮポリペプチド（ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４、配列番号４７）のヌクレオチド配列を示している。１４４個のアミノ酸を有する各種ＸＴＥＮポリペプチドのアミノ酸配列は、図１１Ｅ（配列番号４８）、図１１Ｇ（配列番号５０）、図１１Ｉ（配列番号５２）、図１１Ｋ（配列番号５４）、図１１Ｍ（配列番号５６）、図１１Ｏ（配列番号５８）、図１１Ｑ（配列番号６０）、図１１Ｓ（配列番号６２）、図１１Ｕ（配列番号６４）及び図１１Ｗ（配列番号６６）に示されており、それらの対応するヌクレオチド配列はそれぞれ、図１１Ｆ（配列番号４９）、図１１Ｈ（配列番号５１）、図１１Ｊ（配列番号５３）、図１１Ｌ（配列番号５５）、図１１Ｎ（配列番号５７）、図１１Ｐ（配列番号５９）、図１１Ｒ（配列番号６１）、図１１Ｔ（配列番号６３）、図１１Ｖ（配列番号６５）及び図１１Ｘ（配列番号６７）に示されている。図１１Ｙは、ＥＴプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号６９）を示している。図Ｚは、ｃｏＦＶＩＩＩ−１のヌクレオチド配列（配列番号６８）を示している（国際公開第２０１４／１２７２１５号、配列番号１を参照されたい）。
【図１１−４】図１１Ａは、完全長成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を示している。図１１Ｂは、完全長ヒトフォンビルブランド因子のアミノ酸配列（配列番号４４）を示している。図１１Ｃは、４２個のアミノ酸を有するＸＴＥＮポリペプチド（ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４、配列番号４６）のアミノ酸配列を示している。図１１Ｄは、４２個のアミノ酸を有するＸＴＥＮポリペプチド（ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４、配列番号４７）のヌクレオチド配列を示している。１４４個のアミノ酸を有する各種ＸＴＥＮポリペプチドのアミノ酸配列は、図１１Ｅ（配列番号４８）、図１１Ｇ（配列番号５０）、図１１Ｉ（配列番号５２）、図１１Ｋ（配列番号５４）、図１１Ｍ（配列番号５６）、図１１Ｏ（配列番号５８）、図１１Ｑ（配列番号６０）、図１１Ｓ（配列番号６２）、図１１Ｕ（配列番号６４）及び図１１Ｗ（配列番号６６）に示されており、それらの対応するヌクレオチド配列はそれぞれ、図１１Ｆ（配列番号４９）、図１１Ｈ（配列番号５１）、図１１Ｊ（配列番号５３）、図１１Ｌ（配列番号５５）、図１１Ｎ（配列番号５７）、図１１Ｐ（配列番号５９）、図１１Ｒ（配列番号６１）、図１１Ｔ（配列番号６３）、図１１Ｖ（配列番号６５）及び図１１Ｘ（配列番号６７）に示されている。図１１Ｙは、ＥＴプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号６９）を示している。図Ｚは、ｃｏＦＶＩＩＩ−１のヌクレオチド配列（配列番号６８）を示している（国際公開第２０１４／１２７２１５号、配列番号１を参照されたい）。
【図１１−５】図１１Ａは、完全長成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を示している。図１１Ｂは、完全長ヒトフォンビルブランド因子のアミノ酸配列（配列番号４４）を示している。図１１Ｃは、４２個のアミノ酸を有するＸＴＥＮポリペプチド（ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４、配列番号４６）のアミノ酸配列を示している。図１１Ｄは、４２個のアミノ酸を有するＸＴＥＮポリペプチド（ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４、配列番号４７）のヌクレオチド配列を示している。１４４個のアミノ酸を有する各種ＸＴＥＮポリペプチドのアミノ酸配列は、図１１Ｅ（配列番号４８）、図１１Ｇ（配列番号５０）、図１１Ｉ（配列番号５２）、図１１Ｋ（配列番号５４）、図１１Ｍ（配列番号５６）、図１１Ｏ（配列番号５８）、図１１Ｑ（配列番号６０）、図１１Ｓ（配列番号６２）、図１１Ｕ（配列番号６４）及び図１１Ｗ（配列番号６６）に示されており、それらの対応するヌクレオチド配列はそれぞれ、図１１Ｆ（配列番号４９）、図１１Ｈ（配列番号５１）、図１１Ｊ（配列番号５３）、図１１Ｌ（配列番号５５）、図１１Ｎ（配列番号５７）、図１１Ｐ（配列番号５９）、図１１Ｒ（配列番号６１）、図１１Ｔ（配列番号６３）、図１１Ｖ（配列番号６５）及び図１１Ｘ（配列番号６７）に示されている。図１１Ｙは、ＥＴプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号６９）を示している。図Ｚは、ｃｏＦＶＩＩＩ−１のヌクレオチド配列（配列番号６８）を示している（国際公開第２０１４／１２７２１５号、配列番号１を参照されたい）。
【図１１−６】図１１Ａは、完全長成熟ヒト第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸配列を示している。図１１Ｂは、完全長ヒトフォンビルブランド因子のアミノ酸配列（配列番号４４）を示している。図１１Ｃは、４２個のアミノ酸を有するＸＴＥＮポリペプチド（ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４、配列番号４６）のアミノ酸配列を示している。図１１Ｄは、４２個のアミノ酸を有するＸＴＥＮポリペプチド（ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４、配列番号４７）のヌクレオチド配列を示している。１４４個のアミノ酸を有する各種ＸＴＥＮポリペプチドのアミノ酸配列は、図１１Ｅ（配列番号４８）、図１１Ｇ（配列番号５０）、図１１Ｉ（配列番号５２）、図１１Ｋ（配列番号５４）、図１１Ｍ（配列番号５６）、図１１Ｏ（配列番号５８）、図１１Ｑ（配列番号６０）、図１１Ｓ（配列番号６２）、図１１Ｕ（配列番号６４）及び図１１Ｗ（配列番号６６）に示されており、それらの対応するヌクレオチド配列はそれぞれ、図１１Ｆ（配列番号４９）、図１１Ｈ（配列番号５１）、図１１Ｊ（配列番号５３）、図１１Ｌ（配列番号５５）、図１１Ｎ（配列番号５７）、図１１Ｐ（配列番号５９）、図１１Ｒ（配列番号６１）、図１１Ｔ（配列番号６３）、図１１Ｖ（配列番号６５）及び図１１Ｘ（配列番号６７）に示されている。図１１Ｙは、ＥＴプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号６９）を示している。図Ｚは、ｃｏＦＶＩＩＩ−１のヌクレオチド配列（配列番号６８）を示している（国際公開第２０１４／１２７２１５号、配列番号１を参照されたい）。
【図１２−１】図１２Ａは、約１．５Ｅ１０ＴＵ／ｋｇのＬＶ−ｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（円）、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６（四角）またはＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６ＸＴＥＮ（三角）をＩＶ投与後の１４日齢のＨｅｍＡマウスにおける血漿中ＦＶＩＩＩ活性（ＩＵ／ｍＬ）のグラフ表示である。図１２Ｂは、ｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、ｃｏＦＶＩＩＩ−１、ｃｏＦＶＩＩＩ−３、ｃｏＦＶＩＩＩ−４、ｃｏＦＶＩＩＩ−５、ｃｏＦＶＩＩＩ−６、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５またはｃｏＦＶＩＩＩ−２６を発現するレンチウイルスベクターを約１．５Ｅ１０ＴＵ／ｋｇ、ＩＶ投与した１４日齢のＨｅｍＡマウスの、処置から１５０日後のベクターコピー数（ＶＣＮ）のグラフ表示である。図１２Ｃは、ｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、ｃｏＦＶＩＩＩ−１、ｃｏＦＶＩＩＩ−３、ｃｏＦＶＩＩＩ−４、ｃｏＦＶＩＩＩ−５、ｃｏＦＶＩＩＩ−６、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５またはｃｏＦＶＩＩＩ−２６を発現するレンチウイルスベクターを約１．５Ｅ１０ＴＵ／ｋｇ、ＩＶ投与した１４日齢のＨｅｍＡマウスの、処置から２１日後の血漿中ＦＶＩＩＩ活性（ＩＵ／ｍＬ）のグラフ表示である。
【図１２−２】図１２Ａは、約１．５Ｅ１０ＴＵ／ｋｇのＬＶ−ｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ（円）、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６（四角）またはＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６ＸＴＥＮ（三角）をＩＶ投与後の１４日齢のＨｅｍＡマウスにおける血漿中ＦＶＩＩＩ活性（ＩＵ／ｍＬ）のグラフ表示である。図１２Ｂは、ｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、ｃｏＦＶＩＩＩ−１、ｃｏＦＶＩＩＩ−３、ｃｏＦＶＩＩＩ−４、ｃｏＦＶＩＩＩ−５、ｃｏＦＶＩＩＩ−６、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５またはｃｏＦＶＩＩＩ−２６を発現するレンチウイルスベクターを約１．５Ｅ１０ＴＵ／ｋｇ、ＩＶ投与した１４日齢のＨｅｍＡマウスの、処置から１５０日後のベクターコピー数（ＶＣＮ）のグラフ表示である。図１２Ｃは、ｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、ｃｏＦＶＩＩＩ−１、ｃｏＦＶＩＩＩ−３、ｃｏＦＶＩＩＩ−４、ｃｏＦＶＩＩＩ−５、ｃｏＦＶＩＩＩ−６、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５またはｃｏＦＶＩＩＩ−２６を発現するレンチウイルスベクターを約１．５Ｅ１０ＴＵ／ｋｇ、ＩＶ投与した１４日齢のＨｅｍＡマウスの、処置から２１日後の血漿中ＦＶＩＩＩ活性（ＩＵ／ｍＬ）のグラフ表示である。
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、ｃｏＦＶＩＩＩ−５バリアントを発現するレンチウイルスで処置した５匹のＨｅｍＡマウスにおける血漿中ＦＶＩＩＩ活性レベル（図１３Ａ）と抗ＦＶＩＩＩ抗体レベル（図１３Ｂ）を示しているグラフ表示である。１４日齢のＨｅｍＡ同腹マウスに、ｃｏＦＶＩＩＩ−５バリアントを発現するレンチウイルスをおよそ１．５Ｅ１０ＴＵ／ｋｇ、静脈内注射によって投与した。各マウスに、番号を割り当てた（すなわち、１、２、３、４及び５、図１３Ａ及び１３Ｂ）。
【図１４】ＬＶ−ＦＶＩＩＩの発現レベル（レンチウイルスによる処置から２１日後の血漿中ＦＶＩＩＩ活性によって示したもの）と、抗ＦＶＩＩＩ抗体の存在との相関関係のグラフ表示である。各データポイントは、１匹のＨｅｍＡマウスに対応している。各マウスには、本明細書に開示されているｃｏＦＶＩＩＩバリアントのうちの１つを発現するレンチウイルスを１．５Ｅ１０ＴＵ／ｋｇの用量で静脈内注射によって投与した。横線は、平均血漿中ＦＶＩＩＩ活性を示している。
【図１５】レンチウイルスによる処置から１５０日後の細胞１つ当たりのベクターコピー数（ＶＣＮ）と、抗ＦＶＩＩＩ抗体の存在との相関関係のグラフ表示である。各データポイントは、１匹のＨｅｍＡマウスに対応している。各マウスには、本明細書に開示されているｃｏＦＶＩＩＩバリアントのうちの１つを発現するレンチウイルスを１．５Ｅ１０ＴＵ／ｋｇの用量で静脈内注射によって投与した。横線は、平均ＶＣＮを示している。
【図１６】図１６Ａ及び１６Ｂは、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２バリアントを発現するレンチウイルスで処置した２匹のＨｅｍＡマウス（ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−Ａ及びｃｏＦＶＩＩＩ−５２−Ｂ）における血漿中ＦＶＩＩＩ活性レベル（図１６Ａ）と抗ＦＶＩＩＩ抗体レベル（図１６Ｂ）を示しているグラフ表示である。１４日齢のＨｅｍＡ同腹マウスに、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２バリアントを発現するレンチウイルスをおよそ１．５Ｅ１０ＴＵ／ｋｇ、静脈内注射によって投与した。図１６Ｃ及び１６Ｄは、図１６Ａ及び１６ＢのｃｏＦＶＩＩＩ−５２−Ａマウス（図１６Ｃ）とｃｏＦＶＩＩＩ−５２−Ｂマウス（図１６Ｄ）から採取した肝組織におけるＦＶＩＩＩの発現（濃染色）に関するＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション染色結果を示している画像である。
【図１７】野生型Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ（ｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、三角）、バリアントのｃｏＦＶＩＩＩ−５２ＸＴＥＮ（円）またはｃｏＦＶＩＩＩ−６ＸＴＥＮ（逆三角）を発現するレンチウイルスで処置したＨｅｍＡ新生マウスにおけるＦＶＩＩＩの長期的な発現を示しているグラフ表示である。ＨｅｍＡ新生マウスには、静脈内注射によって、ｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２ＸＴＥＮまたはｃｏＦＶＩＩＩ−６ＸＴＥＮを発現するレンチウイルスをおよそ１．５Ａ１０ＴＵ／ｋｇ投与した。血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、およそ１６週間にわたって測定した。
【図１８】ＸＴＥＮに融合した第ＶＩＩＩ因子をコードするヌクレオチドを含むレンチウイルスベクター（配列番号７２、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮ）を１．３×１０９形質導入単位／ｋｇで投与後のＨｅｍＡ新生イヌ（Ｓ３またはＫ４）における循環血液中ＦＶＩＩＩレベルのグラフ表示である。実線で連結されている四角は、ａＰＴＴ−Ｓ３試料を表しており、破線で連結されている三角は、ａＰＴＴ−Ｋ４試料を表している。ｙ軸は、正常なヒトＦＶＩＩＩ活性を１００％とした場合の正常値に対する割合（％）として、血漿中ＦＶＩＩＩ活性を示している。ｘ軸は、レンチウイルスによる処置からの経過日数を示しており、レンチウイルスによる処置を行った日が０日目になっている。
【図１９−１】図１９Ａ〜１９Ｃは、ナイーブＨｅｍＡイヌ（図１９Ａ）と、レンチウイルスによる処置から２週間後のＳ３のイヌ（図１９Ｂ）と、レンチウイルスによる処置から２週間後のＫ４のイヌ（図１９Ｃ）において、回転トロンボエラストグラフィー（ＲＯＴＥＭ）アッセイによってモニタリングした場合の全血止血のグラフ表示である。図１９Ａ〜１９Ｃのそれぞれにおいて、凝固時間（ＣＴ）は秒で示されており、血餅形成時間（ＣＦＴ）は秒で示されており、アルファ角（α）は度（°）で示されており、ＣＴの５分後の振幅（Ａ５）は、ミリメートル（ｍｍ）で示されており、ＣＴの２０分後の振幅（Ａ２０）は、ミリメートル（ｍｍ）で示されており、最大血餅硬度（ＭＣＦ）は、ミリメートル（ｍｍ）で示されている。図１９Ｄは、図１９Ａ〜１９Ｃに示されているＣＴ、ＣＦＴ、α、Ａ５、Ａ２及びＭＣＦの各パラメーターの正常範囲をまとめた表である。
【図１９−２】図１９Ａ〜１９Ｃは、ナイーブＨｅｍＡイヌ（図１９Ａ）と、レンチウイルスによる処置から２週間後のＳ３のイヌ（図１９Ｂ）と、レンチウイルスによる処置から２週間後のＫ４のイヌ（図１９Ｃ）において、回転トロンボエラストグラフィー（ＲＯＴＥＭ）アッセイによってモニタリングした場合の全血止血のグラフ表示である。図１９Ａ〜１９Ｃのそれぞれにおいて、凝固時間（ＣＴ）は秒で示されており、血餅形成時間（ＣＦＴ）は秒で示されており、アルファ角（α）は度（°）で示されており、ＣＴの５分後の振幅（Ａ５）は、ミリメートル（ｍｍ）で示されており、ＣＴの２０分後の振幅（Ａ２０）は、ミリメートル（ｍｍ）で示されており、最大血餅硬度（ＭＣＦ）は、ミリメートル（ｍｍ）で示されている。図１９Ｄは、図１９Ａ〜１９Ｃに示されているＣＴ、ＣＦＴ、α、Ａ５、Ａ２及びＭＣＦの各パラメーターの正常範囲をまとめた表である。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
本開示は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を説明するものである。本開示は、第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化核酸分子、最適化核酸分子を含むベクター及び宿主細胞、最適化核酸分子によってコードされるポリペプチド、ならびにこのようなポリペプチドの作製方法に対するものである。本開示は、血友病のような出血障害の治療方法であって、その対象に、最適化第ＶＩＩＩ因子核酸配列、その最適化核酸配列を含むベクター、またはその最適化核酸配列によってコードされるポリペプチドを投与することを含む方法にも対するものである。本開示は、宿主細胞における発現が増加し、組み換え第ＶＩＩＩ因子の作製方法において、第ＶＩＩＩ因子タンパク質の収量を改善させ、遺伝子療法で使用したときに、より優れた治療有効性が得られる可能性のある最適化第ＶＩＩＩ因子配列を提供することによって、当該技術分野の重要なニーズを満たすものである。特定の実施形態では、本開示は、配列番号１〜１４、７０及び７１から選択したヌクレオチド配列に対して配列相同性を有するヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を説明するものである。
【００８０】
本開示の例示的なコンストラクトは、添付の図面と配列表に示されている。本明細書と特許請求の範囲が明確に理解されるように、以下の定義を下に示す。
【００８１】
Ｉ．定義
「ａ」または「ａｎ」という用語の付されたものは、そのものが１つ以上であることを指すことに留意されたい。例えば、「ａ」の付されたヌクレオチド配列は、１つ以上のヌクレオチド配列を表すことが分かる。すなわち、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では同義的に使用できる。
【００８２】
「約」という用語は、本明細書では、およそ、おおまかには、前後またはその領域を意味するものとして使用する。「約」という用語を数値範囲と併せて使用する場合、その用語は、示されている数値の前後まで、その境界を広げることによって、その範囲を修正する。概して、「約」という用語は、本明細書では、示されている値のプラスマイナス（上下）１０パーセントの幅で、数値を修正する目的で使用する。
【００８３】
「単離」という用語は、本開示の目的においては、生物学的物質（細胞、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、又はその断片、バリアント若しくは誘導体）の元の環境（その物質が天然において存在する環境）から取り出した生物学的物質を指す。例えば、天然の状態で、植物または動物に存在するポリヌクレオチドは単離されていないが、天然においてそのポリヌクレオチドが存在する隣接の核酸から分離した同じポリヌクレオチドは、「単離されている」ものとみなす。特定の精製レベルが求められるわけではない。いずれかの好適な技法によって、分離、分画または部分的もしくは実質的に精製した天然のポリペプチドまたは組み換えポリペプチドと同様に、宿主細胞で発現させた組み換え作製ポリペプチドとタンパク質は、本開示の目的において、単離されているものとみなす。
【００８４】
「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、同義的に用いられており、一本鎖形態または二重らせんのいずれかである、リン酸エステルポリマー形態のリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンもしくはシチジン、「ＲＮＡ分子」）、もしくはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジンもしくはデオキシシチジン、「ＤＮＡ分子」）、またはそれらのいずれかのホスホエステルアナログ（ホスホロチオエート及びチオエステルなど）を指す。ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ及びＲＮＡ−ＲＮＡの二重らせんも可能である。核酸分子、特にはＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子という用語は、その分子の一次構造と二次構造のみを指し、その分子をいずれかの特定の三次形態に限定するものではない。したがって、この用語には、とりわけ、直鎖状または環状ＤＮＡ分子（例えば制限断片）、プラスミド、超らせんＤＮＡ及び染色体に見られる二本鎖ＤＮＡが含まれる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造について論じる際には、本明細書では、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿って、５’から３’末端方向のみに配列を示す通常の慣例に従って、配列を説明することができる。「組み換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的な操作を加えたＤＮＡ分子である。ＤＮＡとしては、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ及び半合成ＤＮＡが挙げられるが、これらに限らない。本開示の「核酸組成物」は、本明細書に記載されているような核酸を１つ以上含む。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸に翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチド部分である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）は典型的には、アミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部とみなすことができる。ただし、いずれのフランキング配列（例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなど）も、コード領域の一部ではない。コード領域の境界は典型的には、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする、５’末端の開始コドンと、得られるポリペプチドのカルボキシル末端をコードする、３’末端の翻訳終止コドンとによって定められる。２つ以上のコード領域が、１つのポリヌクレオチドコンストラクト、例えば１つのベクター、または別々のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば別々の（異なる）ベクターに存在できる。すなわち、１つのベクターは、１つのコード領域のみを含むことも、または２つ以上のコード領域を含むこともできることになる。
【００８６】
哺乳動物細胞によって分泌される特定のタンパク質は、成長しているタンパク質鎖が粗面小胞体を経て輸送され始めると、成熟タンパク質から切断される分泌シグナルペプチドと関連付けられている。シグナルペプチドは概して、ポリペプチドのＮ末端に融合しており、完全なポリペプチド、すなわち「完全長」ポリペプチドから切断されて、そのポリペプチドの分泌形態、すなわち「成熟」形態を作ることは、当業者に知られている。特定の実施形態では、ネイティブシグナルペプチド、またはポリペプチドの分泌を誘導する能力を保持している、その配列の機能的誘導体が、そのポリペプチドと機能可能に関連付けられている。あるいは、異種の哺乳動物シグナルペプチド、例えば、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）もしくはマウスβ−グルクロニダーゼシグナルペプチド、またはそれらの機能的誘導体を用いることができる。
【００８７】
「下流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の３’側にあるヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、下流ヌクレオチド配列は、転写開始点に続く配列に関するものである。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写開始部位の下流にある。
【００８８】
「上流」という用語は、参照ヌクレオチド配列の５’側のヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、上流ヌクレオチド配列は、コード領域または転写開始点の５’側にある配列に関するものである。例えば、大半のプロモーターは、転写開始部位の上流にある。
【００８９】
本明細書で使用する場合、「遺伝子調節領域」または「調節領域」という用語は、コード領域の上流（５’非コード配列）、コード領域内、またはコード領域の下流（３’非コード配列）にあるヌクレオチド配列であって、関連付けられたコード領域の転写、ＲＮＡプロセシング、安定性または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節領域としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造を挙げることができる。コード領域が、真核細胞での発現用として意図されている場合、ポリアデニル化シグナルと転写終結配列は通常、コード配列の３’側に位置することになる。
【００９０】
遺伝子産物、例えばポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つ以上のコード領域と機能可能に関連付けられたプロモーター及び／またはその他の発現（例えば、転写もしくは翻訳）制御エレメントを含むことができる。機能可能な関連付けにおいては、調節領域（複数可）の影響または制御下で、遺伝子産物、例えばポリペプチドの発現が行われるような形で、遺伝子産物のコード領域が、１つ以上の調節領域と関連付けられている。例えば、プロモーター機能が誘導されると、コード領域によってコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡが転写される場合、また、プロモーターとコード領域との連携の性質によって、プロモーターが遺伝子産物の発現を誘導する能力が干渉されないか、またはＤＮＡ鋳型が転写される能力が干渉されない場合、コード領域とプロモーターは、「機能可能に関連付けられている」。プロモーター以外のその他の発現制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写終結シグナルをコード領域と機能可能に関連付けて、遺伝子産物の発現を誘導することもできる。
【００９１】
「転写制御配列」とは、宿主細胞においてコード配列を発現させるＤＮＡ調節配列（プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）を指す。様々な転写制御領域が当業者に知られている。この領域としては、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域などが挙げられるが、これらに限らず、このような転写制御領域は、サイトメガロウイルス由来（イントロンＡと連動する前初期プロモーター）、シミアンウイルス４０由来（初期プロモーター）及びレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスなど）由来のプロモーターセグメント及びエンハンサーセグメントなどであるが、これらに限らない。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子（アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビンなど）に由来するものと、真核細胞において遺伝子の発現を制御できるその他の配列が挙げられる。さらなる好適な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサーと、リンフォカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。
【００９２】
同様に、様々な翻訳制御エレメントが当業者に知られている。このエレメントとしては、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン、翻訳終止コドン、及びピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、内部リボソーム侵入部位、すなわちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列ともいう）が挙げられるが、これらに限らない。
【００９３】
「発現」という用語は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチドから遺伝子産物、例えばＲＮＡまたはポリペプチドを産生するプロセスを指す。発現としては、ポリヌクレオチドをメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはその他のいずれかのＲＮＡ産物に転写することと、ｍＲＮＡをポリペプチドに翻訳することが挙げられるが、これらに限らない。発現により、「遺伝子産物」が産生される。本明細書で使用する場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写産物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであることができる。本明細書に記載されている遺伝子産物としてはさらに、転写後修飾、例えばポリアデニル化もしくはスプライシングが行われた核酸、または翻訳後修飾、例えばメチル化、糖鎖付加、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、もしくはタンパク質切断が行われたポリペプチドが挙げられる。「収量」という用語は、本明細書で使用する場合、遺伝子の発現によって産生されるポリペプチドの量を指す。
【００９４】
「ベクター」とは、核酸を宿主細胞にクローニング及び／または移入するためのいずれかのビヒクルを指す。ベクターは、別の核酸セグメントを結合して、結合したセグメントを複製させるようにできるレプリコンであることができる。「レプリコン」とは、インビボで自己複製ユニットとして機能する、すなわち、自己制御下で複製できるいずれかの遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を指す。「ベクター」という用語には、インビトロ、エキソビボまたはインビボで核酸を細胞に導入するためのウイルスビヒクルと非ウイルスビヒクルの両方が含まれる。当該技術分野では、例えば、プラスミド、改変真核生物ウイルスまたは改変細菌ウイルスを含め、多くのベクターが知られているとともに、使われている。好適なベクターへのポリヌクレオチドの挿入は、相補的な付着末端を有する選択したベクターに、適切なポリヌクレオチド断片をライゲーションすることによって行うことができる。
【００９５】
ベクターを操作して、そのベクターが導入された細胞の選択または同定を行える選択可能なマーカーまたはレポーターをコードするようにできる。選択可能なマーカーまたはレポーターの発現により、ベクターに含まれる他のコード領域を導入及び発現する宿主細胞の同定及び／または選択が可能になる。当該技術分野において知られているとともに、使用されている選択可能なマーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する耐性を付与する遺伝子と、表現型マーカーとして用いられる遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。当該技術分野において知られているとともに、使用されているレポーターの例としては、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などが挙げられる。選択可能なマーカーは、レポーターであるとみなすこともできる。
【００９６】
「選択可能なマーカー」という用語は、そのマーカー遺伝子の作用、すなわち、抗生物質耐性、除草剤耐性に基づき選択できる同定因子、通常は抗生物質耐性または薬品耐性遺伝子、発色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどを指し、その作用を用いて、目的の核酸の継承を追跡したり、及び／または目的の核酸を受け継いだ細胞もしくは生物を同定したりできる。当該技術分野において知られているとともに、使用されている選択可能なマーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどに対する耐性を付与する遺伝子と、表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。
【００９７】
「レポーター遺伝子」という用語は、そのレポーター遺伝子の作用に基づき同定できる同定因子をコードする核酸を指し、その作用を用いて、目的の核酸の継承を追跡したり、目的の核酸を受け継いだ細胞もしくは生物を同定したり、及び／または遺伝子発現の誘導もしくは転写を測定したりする。当該技術分野において知られているとともに、使用されているレポーター遺伝子の例としては、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などが挙げられる。選択可能なマーカー遺伝子は、レポーター遺伝子とみなすこともできる。
【００９８】
「プロモーター」及び「プロモーター配列」は、同義的に使用されており、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指す。概して、コード配列は、プロモーター配列の３’側にある。プロモーターは、その全体が、ネイティブ遺伝子に由来することも、天然において見られる異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されていることも、さらには、合成ＤＮＡセグメントを含むこともできる。異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞種においてか、異なる発生期においてか、または異なる環境条件もしくは生理的条件に応答するかして、遺伝子の発現を誘導できることは当業者であれば分かる。大半の細胞種において、大半の時点に、遺伝子を発現させるプロモーターは一般的に、「構成的プロモーター」という。特有の細胞種において遺伝子を発現させるプロモーターは一般的に、「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」という。特有の発生期または細胞分化期に遺伝子を発現させるプロモーターは一般的に、「発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」という。プロモーターを誘導する作用剤、生体分子、化学物質、リガンド、光などに細胞が曝露または処置されると誘導されて、遺伝子を発現させるプロモーターは一般的に、「誘導性プロモーター」または「調節性プロモーター」という。大半の場合、調節配列の正確な境界は、完全には定められていないので、長さの異なるＤＮＡ断片が、同じプロモーター活性を有する場合があることがさらに認識されている。
【００９９】
プロモーター配列は典型的には、その３’末端で転写開始部位と結合し、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルで、転写の開始に必要な最小限の数の塩基またはエレメントを含むように、上流（５’方向）に延びている。プロモーター配列内には、転写開始部位（利便的なことに、例えば、ヌクレアーゼＳ１でマッピングすることによって定められる）と、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られることになる。
【０１００】
「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」という用語は、同義的に使用されており、二本鎖ＤＮＡ内の特有のヌクレオチド配列内に結合して切断する酵素を指す。
【０１０１】
「プラスミド」という用語は、その細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多いとともに、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外エレメントを指す。このようなエレメントは、いずれかの供給源に由来する自己複製配列、ゲノム組み込み型配列、ファージもしくはヌクレオチド配列、直鎖状、環状もしくは超らせんの一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡであることができ、そのエレメントにおいては、多くのヌクレオチド配列を結合または組み換えて、適切な３’非翻訳配列とともに、選択した遺伝子産物のためのプロモーター断片とＤＮＡ配列を細胞に導入できる独自の構築体になっている。
【０１０２】
使用できる真核生物ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルスベクター、バキュロウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これに限らない。非ウイルスベクターとしては、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（サイトフェクチン）、ＤＮＡ−タンパク質複合体及びバイオポリマーが挙げられる。
【０１０３】
「クローニングベクター」とは、プラスミド、ファージまたはコスミドなど、順次複製される、ある単位長の核酸であるとともに、複製起点を含む「レプリコン」であって、そのレプリコンに別の核酸セグメントを結合して、結合したセグメントを複製させるようにできる「レプリコン」を指す。特定のクローニングベクターは、一方の細胞種、例えば細菌細胞で複製できるとともに、別の細胞種、例えば真核細胞で発現できる。クローニングベクターは典型的には、そのベクター及び／または目的の核酸配列の挿入用の１つ以上のマルチクローニング部位を含む細胞の選択に使用できる配列を１つ以上含む。
【０１０４】
「発現ベクター」とは、宿主細胞に挿入後に、挿入核酸配列の発現を可能にするように設計したビヒクルを指す。挿入核酸配列は、上記のような調節領域と機能可能に関連付けた状態で配置する。
【０１０５】
ベクターは、当該技術分野において周知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用またはＤＮＡベクタートランスポーターによって、宿主細胞に導入する。
【０１０６】
「培養する」、「培養すること」及び「培養」とは、本明細書で使用する場合、細胞の成長もしくは分裂を可能にするか、または細胞を生きた状態に保つインビトロ条件下で、細胞をインキュベートすることを意味する。「培養細胞」とは、本明細書で使用する場合、インビトロで増殖されている細胞を意味する。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」と複数の「ポリペプチド」を含むように意図されており、単量体（アミノ酸）がアミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直鎖状に結合されたもので構成された分子を指す。「ポリペプチド」と言う用語は、２つ以上のアミノ酸のいずれかの１本の鎖または複数の鎖を指し、特定の長さの生成物は指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２つ以上のアミノ酸の１本の鎖または複数の鎖を指す目的で使用するいずれかの他の用語が、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、上記の用語のいずれかの代わりに、または上記の用語のいずれかと同義的に使用できる。「ポリペプチド」という用語は、ポリペプチドの発現後修飾（糖鎖付加、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断または非天然型アミノ酸による修飾が挙げられるが、これらに限らない）の産物も指すように意図されている。ポリペプチドは、天然の生物源に由来することも、組み換え技術によって作製することもできるが、必ずしも、特定の核酸配列から翻訳されたものである必要はない。ポリペプチドは、化学合成によるものを含むいずれかの方法で生成できる。
【０１０８】
「アミノ酸」という用語には、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）及びバリン（ＶａｌまたはＶ）が含まれる。従来のアミノ酸以外のアミノ酸も、本開示の範囲内であり、そのようなアミノ酸としては、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、及びＥｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．２０２：３０１−３３６（１９９１）に記載されているようなその他のアミノ酸残基類似体が挙げられる。このような非天然型アミノ酸残基を生成するには、Ｎｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２（１９８９）及びＥｌｌｍａｎらの上記の文献の手順を用いることができる。簡潔には、これらの手順は、非天然型アミノ酸残基を有するサプレッサーｔＲＮＡを化学的に活性化してから、ＲＮＡのインビトロ転写と翻訳を行うことが伴う。従来のアミノ酸以外のアミノ酸の導入は、当該技術分野で知られているペプチド化学を用いて行うこともできる。本明細書で使用する場合、「極性アミノ酸」という用語には、実効電荷が０であるが、その側鎖のそれぞれ異なる部分における部分電荷が０ではないアミノ酸（例えば、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｃ）が含まれる。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用と静電相互作用に関与することができる。本明細書で使用する場合、「荷電アミノ酸」という用語には、その側鎖の実効電荷が０以外であることのできるアミノ酸（例えば、Ｒ、Ｋ、Ｈ、Ｅ、Ｄ）が含まれる。これらのアミノ酸は、疎水性相互作用と静電相互作用に関与することができる。
【０１０９】
本開示には、ポリペプチドの断片またはバリアントと、これらをいずれかに組み合わせたものも含まれる。本開示のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子に言及する場合、「断片」または「バリアント」という用語には、参照ポリペプチドの特性（例えば、ＦｃＲｎ結合ドメインまたはＦｃバリアントに対するＦｃＲｎの結合親和性、ＦＶＩＩＩバリアントの凝固活性、またはＶＷＦ断片のＦＶＩＩＩ結合活性）の少なくともいくつかを保持しているいずれのポリペプチドも含まれる。ポリペプチドの断片には、本明細書の別の箇所で論じられている特異的抗体断片に加えて、タンパク質分解断片と、欠失断片が含まれるが、天然の完全長ポリペプチド（または成熟ポリペプチド）は含まれない。本開示のポリペプチド結合ドメインまたは結合分子のバリアントには、上記の断片と、アミノ酸の置換、欠失または挿入によりアミノ酸配列が改変されたポリペプチドも含まれる。バリアントは、天然のものであることも、非天然のものであることもできる。非天然のバリアントは、当該技術分野において知られている変異誘発技法を用いて作製できる。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加を含むことができる。
【０１１０】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、ポリペプチド内のアミノ酸が、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸に置き換えられている場合には、その置換は、保存的とみなす。別の実施形態では、アミノ酸鎖は、側鎖ファミリーメンバーの順序及び／または組成の異なる構造的に類似の鎖と保存的に置き換えることができる。
【０１１１】
当該技術分野において知られているような「同一性％」という用語は、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を、それらの配列の比較によって割り出したものである。当該技術分野においては、「同一性」とは、場合によっては、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列間の配列類縁性の程度を、その配列群間の適合性によって割り出したものも意味する。「同一性」は、既知の方法（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）及びＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されているものが挙げられるが、これらに限らない）によって容易に算出できる。同一性を割り出すための好ましい方法は、調べる配列間の適合性が最大になるように設計されている。同一性を割り出すための方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムで体系化されている。配列アラインメントと同一性％の算出は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイートのＭｅｇａｌｉｇｎというプログラム（ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）、ＧＣＧスイートのプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ９．０、ウィスコンシン州マディソンのＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））及びＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１５  ＵＳＡ）のような配列解析ソフトウェアを用いて行うことができる。本願の脈略内では、別段の定めのない限り、配列解析ソフトウェアを解析に用いる場合、解析結果は、参照するプログラムの「デフォルト値」に基づくものとなることが分かるであろう。本明細書で使用する場合、「デフォルト値」とは、初期化したときに、ソフトウェアに最初に搭載されている値またはパラメーターのいずれかのセットを意味することになる。本開示の最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列と参照配列との同一性％を割り出す目的においては、参照配列内のヌクレオチドのうち、本開示の最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列内のヌクレオチドに対応するヌクレオチドのみを用いて、同一性％を算出する。例えば、Ｂドメインを含む完全長ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列と、本開示の最適化Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列を比較するときには、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｃ１及びＣ２ドメインを含むアラインメント部分を用いて、同一性％を算出することになる。完全長ＦＶＩＩＩ配列のうち、Ｂドメインをコードする部分のヌクレオチド（アラインメントにおいて大きな「ギャップ」となる）は、非適合とはみなさない。加えて、本開示の最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列またはその特定部分（例えば、配列番号３の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド）と参照配列との同一性％を割り出す際には、同一性％は、適合ヌクレオチドの数を、最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ配列の完全配列または本明細書に示されているようなその特定部分内のヌクレオチドの総数で除することによって算出することになる。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、「本開示の最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列内のヌクレオチドに対応するヌクレオチド」は、参照ＦＶＩＩＩ配列に対する同一性が最大になるように、本開示の最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列をアラインメントすることによって特定する。参照ＦＶＩＩＩ配列内の等価なアミノ酸を特定するのに用いる数は、本開示の最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列内の対応するアミノ酸を特定するのに用いる数に基づくものである。
【０１１３】
「融合」または「キメラ」タンパク質は、天然においては本質的に第１のアミノ酸配列とは連結されない第２のアミノ酸配列に連結された第１のアミノ酸配列を含む。通常は別々のタンパク質に存在するアミノ酸配列を融合ポリペプチドで合わせることができ、または通常は同じタンパク質に存在するアミノ酸配列を融合ポリペプチドで、新たな配列で配置できる（例えば、本開示の第ＶＩＩＩ因子ドメインとＩｇ  Ｆｃドメインとの融合）。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域を所望の関係でコードするポリヌクレオチドを作製もしくは翻訳することによって作製する。キメラタンパク質は、共有結合、非ペプチド結合または非共有結合によって第１のアミノ酸配列と会合した第２のアミノ酸配列をさらに含むことができる。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、「挿入部位」という用語は、ＦＶＩＩＩポリペプチド、またはその断片、バリアントもしくは誘導体における位置のうち、異種の部分を挿入できる位置のすぐ上流の位置を指す。「挿入部位」は、数字で定められており、その数字は、成熟ネイティブＦＶＩＩＩ（配列番号１５、図１１Ａ）内のアミノ酸のうち、挿入位置のすぐＮ末端側である挿入部位に対応するアミノ酸の数値である。例えば、「ａ３は、配列番号１５の１６５６位のアミノ酸に対応する挿入部位に、異種の部分を含む」という言い回しは、その異種の部分が、配列番号１５の１６５６位のアミノ酸と１６５７位のアミノ酸に対応する２つのアミノ酸の間に位置することを示す。
【０１１５】
「アミノ酸のすぐ下流」という言い回しは、本明細書で使用する場合、そのアミノ酸の末端カルボキシル基のすぐ隣の位置を指す。同様に、「アミノ酸のすぐ上流」という言い回しは、そのアミノ酸の末端アミン基のすぐ隣の位置を指す。
【０１１６】
「挿入された」、「挿入されている」、「〜に挿入された」という用語、または文法的に関連する用語は、本明細書で使用する場合、組み換えＦＶＩＩＩポリペプチド内の異種の部分の位置を、ネイティブ成熟ヒトＦＶＩＩＩにおける類似の位置と比較したものを指す。本明細書で使用する場合、これらの用語は、ネイティブ成熟ヒトＦＶＩＩＩに対する組み換えＦＶＩＩＩポリペプチドの特徴を指し、組み換えＦＶＩＩＩポリペプチドを作製したいずれかの方法またはプロセスを示したり、暗示したり、または推測したりするものではない。
【０１１７】
本明細書で使用する場合、「半減期」という用語は、インビボにおける特定のポリペプチドの生物学的半減期を指す。半減期は、対象に投与した量の半分を、その動物の循環血液及び／またはその他の組織から除去するのに必要な時間によって表すことができる。所定のポリペプチドのクリアランス曲線を時間の関数として構築すると、その曲線は通常、急速なα相と、それよりも長いβ相を有する二相性の曲線となる。α相は典型的には、投与したＦｃポリペプチドが血管内と血管外で平衡状態となっていることを表し、部分的には、ポリペプチドのサイズによって決まる。β相は典型的には、血管内におけるポリペプチドの異化を表す。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩと、ＦＶＩＩＩを含むキメラタンパク質は、単相のものであるので、α相を有さず、１つのβ相のみを有する。したがって、特定の実施形態では、半減期という用語は、本明細書で使用する場合、β相におけるポリペプチドの半減期を指す。
【０１１８】
「連結された」という用語は、本明細書で使用する場合、第２のアミノ酸配列に共有もしくは非共有結合された第１のアミノ酸配列または第２のヌクレオチド配列に共有もしくは非共有結合された第１のヌクレオチド配列を指す。第１のアミノ酸配列は第２のアミノ酸配列に、または第１のヌクレオチド配列は第２のヌクレオチド配列に、直接結合または並置されていることができ、あるいは、介在配列が、第１の配列を第２の配列に共有結合させることもできる。「連結された」という用語は、Ｃ末端またはＮ末端で、第１のアミノ酸配列が第２のアミノ酸配列に融合されていることを意味するのみならず、第１のアミノ酸配列（または第２のアミノ酸配列）全体が、第２のアミノ酸配列（または第１のアミノ酸配列）内のいずれかの２つのアミノ酸に挿入されていることも含まれる。一実施形態では、第１のアミノ酸配列は、ペプチド結合またはリンカーによって、第２のアミノ酸配列に連結できる。第１のヌクレオチド配列は、ホスホジエステル結合またはリンカーによって、第２のヌクレオチド配列に連結できる。リンカーは、ペプチドもしくはポリペプチド（ポリペプチド鎖の場合）、もしくはヌクレオチドもしくはヌクレオチド鎖（ヌクレオチド鎖の場合）、またはいずれかの化学的部分（ポリペプチド鎖とポリヌクレオチド鎖の両方の場合）であることができる。「連結された」という用語は、ハイフォン（−）によっても示されている。
【０１１９】
本明細書で使用する場合、「〜と会合した」という用語は、第１のアミノ酸鎖と第２のアミノ酸鎖との間に形成された共有結合または非共有結合を指す。一実施形態では、「〜と会合した」という用語は、共有結合、非ペプチド結合または非共有結合を意味する。この会合は、コロン、すなわち（：）によって示すことができる。別の実施形態では、この会合は、ペプチド結合以外の共有結合を意味する。例えば、アミノ酸のシステインは、第２のシステイン残基のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成できるチオール基を含む。大半の天然のＩｇＧ分子では、ＣＨ１領域とＣＬ領域は、ジスルフィド結合によって会合しており、２本の重鎖は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムを用いた場合、２３９位と２４２位（ＥＵの番号付けシステムでは２２６位または２２９位の位置）に対応する位置で、２つのジスルフィド結合によって会合している。共有結合の例としては、ペプチド結合、金属結合、水素結合、ジスルフィド結合、σ結合、π結合、δ結合、グリコシド結合、アゴスチック結合、曲がった結合、双極子結合、π逆供与結合、二重結合、三重結合、四重結合、五重結合、六重結合、共役、超共役、芳香族性、ハプト数または反結合が挙げられるが、これらに限らない。非共有結合の非限定的な例としては、イオン結合（例えば、カチオン−π結合もしくは塩結合）、金属結合、水素結合（例えば、二水素結合、二水素錯体、低障壁水素結合もしくは対称的水素結合）、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、機械結合、ハロゲン結合、金−金相互作用、インターカレーション、スタッキング、エントロピー力、または化学極性が挙げられる。
【０１２０】
本明細書で使用されている「単量体−二量体ハイブリッド」という用語は、ジスルフィド結合によって互いに会合している第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含むキメラタンパク質であって、その第１の鎖が、凝固因子、例えば第ＶＩＩＩ因子と、第１のＦｃ領域とを含み、第２の鎖が、凝固因子のない状態で、第２のＦｃ領域から本質的になるか、または第２のＦｃ領域からなるキメラタンパク質を指す。したがって、単量体−二量体ハイブリッドコンストラクトは、１つの凝固因子のみを有する単量体部分と、２つのＦｃ領域を有する二量体部分とを含むハイブリッドである。
【０１２１】
止血とは、本明細書で使用する場合、出血もしくは大量出血を止めるかもしくは遅くするか、または血管もしくは身体部分を通る血流を止めるかもしくは遅くすることを意味する。
【０１２２】
止血障害とは、本明細書で使用する場合、遺伝的に継承または獲得した状態であって、フィブリン血餅を形成する能力の低下またはその能力がないことが原因で、自然に、または外傷によるかのいずれかで大量出血する傾向によって特徴付けられる状態を意味する。このような障害の例としては、血友病が挙げられる。主要な３つの型は、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子の欠損）と、血友病Ｂ（第ＩＸ因子の欠損、すなわち「クリスマス病」）と、血友病Ｃ（第ＸＩ因子の欠損、軽度な出血傾向）である。その他の止血障害としては、例えば、フォンビルブランド病、第ＸＩ因子の欠損（ＰＴＡの欠損）、第ＸＩＩ因子の欠損、フィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の欠損または構造的異常、ベルナールスーリエ症候群（ＧＰＩｂの欠陥または欠損）が挙げられる。ｖＷＦレセプターであるＧＰＩｂに欠陥があると、一次血餅形成（一次止血）が行われなくなり、出血傾向が高くなり、グランツマン及びネーゲリの血小板無力症（グランツマン血小板無力症）に至ることがある。肝不全（急性型及び慢性型）では、肝臓による凝固因子の産生が不十分で、出血リスクが向上し得る。
【０１２３】
本開示の単離核酸分子、単離ポリペプチド、またはその単離核酸分子を含むベクターは、予防的に用いることができる。本明細書で使用する場合、「予防的治療」という用語は、出血エピソードの前に、分子を投与することを指す。一実施形態では、一般的な止血剤を必要とする対象は、手術を受けているか、または手術を受けようとしている者である。本開示のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはベクターは、手術の前または後に、予防として投与できる。本開示のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはベクターは、急性出血エピソードを制御する目的で、手術の最中または後に投与できる。手術としては、肝移植、肝切除、歯科的処置または幹細胞移植を挙げることができるが、これらに限らない。
【０１２４】
本開示の単離核酸分子、単離ポリペプチドまたはベクターは、オンデマンド治療にも用いられる。「オンデマンド治療」という用語は、出血エピソードの症状に応じて、または出血の原因となり得る活動の前に、単離核酸分子、単離ポリペプチドまたはベクターを投与することを指す。一態様では、オンデマンド治療は、損傷後のように、出血が開始したら、または手術前のように、出血が予測されるときに、対象に行うことができる。別の態様では、オンデマンド治療は、コンタクトスポーツのように、出血リスクを向上させる活動のまえに行うことができる。
【０１２５】
本明細書で使用する場合、「急性出血」という用語は、根本的な原因にかかわらず、出血エピソードを指す。例えば、対象は、外傷、尿毒症、遺伝性出血障害（例えば第ＶＩＩ因子の欠損）、血小板障害、または凝固因子に対する抗体の発生による耐性を有する者であることができる。
【０１２６】
治療する、治療、治療することとは、本明細書で使用する場合、例えば、疾患もしくは状態の重症度の低下、疾患経過期間の短縮、疾患もしくは状態と関連する１つ以上の症状の改善、疾患もしくは状態を有する対象への有益な作用の提供（必ずしも、疾患もしくは状態を治癒させる必要はない）、または疾患もしくは状態と関連する１つ以上の症状の予防を指す。一実施形態では、「治療すること」または「治療」という用語は、本開示の単離核酸分子、単離ポリペプチドまたはベクターを投与することによって、対象において、ＦＶＩＩＩトラフレベルを少なくとも約１ＩＵ／ｄＬ、２ＩＵ／ｄＬ、３ＩＵ／ｄＬ、４ＩＵ／ｄＬ、５ＩＵ／ｄＬ、６ＩＵ／ｄＬ、７ＩＵ／ｄＬ、８ＩＵ／ｄＬ、９ＩＵ／ｄＬ、１０ＩＵ／ｄＬ、１１ＩＵ／ｄＬ、１２ＩＵ／ｄＬ、１３ＩＵ／ｄＬ、１４ＩＵ／ｄＬ、１５ＩＵ／ｄＬ、１６ＩＵ／ｄＬ、１７ＩＵ／ｄＬ、１８ＩＵ／ｄＬ、１９ＩＵ／ｄＬまたは２０ＩＵ／ｄＬに保つことを意味する。別の実施形態では、治療することまたは治療とは、ＦＶＩＩＩトラフレベルを約１〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約２〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約３〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約４〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約５〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約６〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約７〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約８〜約２０ＩＵ／ｄＬ、約９〜約２０ＩＵ／ｄＬまたは約１０〜約２０ＩＵ／ｄＬに保つことを意味する。疾患もしくは状態の治療、または疾患もしくは状態を治療することには、対象において、ＦＶＩＩＩ活性を、血友病ではない対象におけるＦＶＩＩＩ活性の少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％または２０％に相当するレベルに保つことを含めることもできる。治療に必要な最低トラフレベルは、１つ以上の既知の方法によって測定でき、それぞれの人に合わせて調節できる（上昇または低下させることができる）。
【０１２７】
「投与すること」とは、本明細書で使用する場合、製薬学的に許容可能な経路を介して、本開示の第ＶＩＩＩ因子をコードする製薬学的に許容可能な核酸分子、第ＶＩＩＩ因子ポリペプチド、または第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸分子を含むベクターを対象に与えることを意味する。投与経路は、静脈内、例えば、静脈内注射及び静脈内注入であることができる。追加の投与経路としては、例えば、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、経鼻投与及び経肺投与が挙げられる。本開示の核酸分子、ポリペプチド及びベクターは、少なくとも１つの賦形剤を含む医薬組成物の一部として投与できる。
【０１２８】
本明細書で使用する場合、「必要とする対象」という言い回しには、例えば、止血を改善する目的で、本開示の核酸分子、ポリペプチドまたはベクターを投与すると、恩恵を受けると見られる対象（哺乳動物の対象など）が含まれる。一実施形態では、対象としては、血友病の個体が挙げられるが、これらに限らない。別の実施形態では、対象としては、ＦＶＩＩＩインヒビターが発生しているために、バイパス療法が必要な個体が挙げられるが、これらに限らない。対象は、成人であることも、未成年（例えば１２歳未満）であることもできる。
【０１２９】
本明細書で使用する場合、「凝固因子」という用語は、天然のものであるか、または組み換え作製した分子またはそのアナログであって、対象において出血エピソードを予防するか、またはその期間を短縮する分子またはそのアナログを指す。換言すると、この因子は、凝固促進活性を有する分子、すなわち、フィブリノゲンをメッシュ状の不溶性フィブリンに変換して、血液を凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｅ）または凝固（ｃｌｏｔ）させることを担う分子を意味する。「活性化可能な凝固因子」は、活性形態に変換できる不活性形態（例えば、そのチモーゲン形態）にある凝固因子である。
【０１３０】
凝固活性とは、本明細書で使用する場合、フィブリン血餅を形成させ、及び／または大量出血もしくは出血エピソードの重症度、期間もしくは頻度を低減する生化学反応カスケードに関与する能力を意味する。
【０１３１】
本明細書で使用する場合、「異種」または「外因性」という用語は、通常、所定の状況、例えば細胞またはポリペプチドでは見られないような分子を指す。例えば、外因性または異種の分子は、細胞に導入でき、例えばトランスフェクションもしくはその他の形態の遺伝子組み換えによって、その細胞を操作した後のみに存在するか、または異種のアミノ酸配列は、天然においてはその配列が見られないタンパク質に存在できる。
【０１３２】
本明細書で使用する場合、「異種のヌクレオチド配列」という用語は、天然においては所定のポリヌクレオチド配列で見られないヌクレオチド配列を指す。一実施形態では、異種のヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩの半減期を延長できるポリペプチドをコードする。別の実施形態では、異種のヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩの流体力学的半径を増大させるポリペプチドをコードする。別の実施形態では、異種のヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩの生物学的活性または機能（例えば、その凝固促進活性）に有意な影響を及ぼすことなく、ＦＶＩＩＩの１つ以上の薬物動態特性を改善するポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩは、異種のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに、リンカーによって連結または接合されている。異種のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド部分の非限定的な例としては、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、アルブミンもしくはその断片、アルブミン結合部分、トランスフェリン、米国特許出願公開第２０１００２９２１３０号のＰＡＳポリペプチド、ＨＡＰ配列、トランスフェリンもしくはその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、アルブミン結合低分子、ＸＴＥＮ配列、ＦｃＲｎ結合部分（例えば、完全Ｆｃ領域もしくはそのうちのＦｃＲｎに結合する部分）、一本鎖Ｆｃ領域（例えば、ＵＳ２００８／０２６０７３８、ＷＯ２００８／０１２５４３もしくはＷＯ２００８／１４３９５４５に記載されているようなＳｃＦｃ領域）、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択した２種類のアミノ酸の６〜４０個のアミノ酸のペプチド及び短いポリペプチドであって、二次構造の程度がとりわけ、５０％未満から５０％超まで様々であるペプチド及び短いポリペプチド、またはこれらの２つ以上を組み合わせたものが挙げられる。いくつかの実施形態では、異種のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、ポリペプチド以外の部分に連結されている。ポリペプチド以外の部分の非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン結合低分子、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、これらの誘導体またはこれらをいずれかに組み合わせたものが挙げられる。
【０１３３】
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域」という用語は、ネイティブＩｇのＦｃ領域に対応するポリペプチド部分、すなわち、２つの重鎖のそれぞれのＦｃドメインの二量体会合によって形成されるような部分として定義する。ネイティブＦｃ領域は、もう一方のＦｃ領域とホモ二量体を形成する。これに対して、「遺伝子工学によって融合したＦｃ領域」または「一本鎖Ｆｃ領域」（ｓｃＦｃ領域）という用語は、本明細書で使用する場合、１本のポリペプチド鎖において、遺伝子工学によって連結された（すなわち、１つの連続する遺伝子配列でコードされた）Ｆｃドメインで構成された合成二量体Ｆｃ領域を指す。
【０１３４】
一実施形態では、「Ｆｃ領域」とは、１つのＩｇ重鎖の部分のうち、ヒンジ領域において、パパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の第１の残基を１１４位としたときのＩｇＧの２１６位の残基）のすぐ上流から始まり、その抗体のＣ末端で終わる部分を指す。したがって、完全Ｆｃドメインは少なくとも、ヒンジドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインを含む。
【０１３５】
Ｉｇ定常領域のＦｃ領域は、Ｉｇアイソタイプに応じて、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインと、ＣＨ４ドメインと、ヒンジ領域を含むことができる。ＩｇのＦｃ領域を含むキメラタンパク質は、安定性の向上、血清中半減期の延長（Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５を参照されたい）、Ｆｃレセプター（胎児性Ｆｃレセプターなど）（ＦｃＲｎ）への結合（米国特許第６，０８６，８７５号、同第６，４８５，７２６号、同第６，０３０，６１３、ＷＯ０３／０７７８３４、ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１、これらの特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される）を含め、いくつかの望ましい特性をキメラタンパク質に付与する。
【０１３６】
「参照ヌクレオチド配列」とは、本明細書において、本開示のヌクレオチド配列に対する比較配列として用いる場合、ＦＶＩＩＩ配列に対応する部分が最適化されていない以外は、本開示のヌクレオチド配列と本質的に同一のポリヌクレオチド配列である。例えば、配列番号１のコドン最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩと、一本鎖Ｆｃ領域をコードする異種のヌクレオチド配列であって、配列番号１にその３’末端で連結された異種のヌクレオチド配列とからなる核酸分子に対する参照ヌクレオチド配列は、配列番号１６（図１Ｉ）の元の（すなわち「親」）ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩと、一本鎖Ｆｃ領域をコードする同じ異種のヌクレオチド配列であって、配列番号１６にその３’末端で連結された同じ異種のヌクレオチド配列とからなる核酸分子である。
【０１３７】
「コドン適応指標」とは、本明細書で使用する場合、コドン使用頻度バイアスの尺度を指す。コドン適応指標（ＣＡＩ）は、所定のタンパク質コード遺伝子配列の参照遺伝子セットに対する偏差を測定するものである（Ｓｈａｒｐ  ＰＭ  ａｎｄ  Ｌｉ  ＷＨ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（３）：１２８１−９５（１９８７））。ＣＡＩは、下記のように、遺伝子配列の長さ（コドンで測定）にわたって、各コドンに関連付けられた重みの幾何平均を割り出すことによって算出する。
【数１】
2019506166.tif 000002
【０１３８】
下記のように、各アミノ酸に関して、ＣＡＩにおけるその各コドンの重みは、そのアミノ酸のコドンの観察頻度（ｆｉ）と同義コドンの頻度（ｆｊ）との比として演算する。
【０１３９】
式２：
【数２】
2019506166.tif 000003
【０１４０】
本明細書で使用する場合、「最適化された」という用語は、ヌクレオチド配列に関しては、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列であって、そのポリヌクレオチド配列の特性が増強されるように変異させたポリヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態では、最適化は、転写レベルを高めたり、翻訳レベルを高めたり、定常状態のｍＲＮＡレベルを高めたり、調節タンパク質（基本転写因子など）の結合を増大もしくは低減したり、スプライシングを増大もしくは低減したり、またはポリヌクレオチド配列によって産生されるポリペプチドの収量を増加させたりするために行う。ポリヌクレオチド配列を最適化するために、ポリヌクレオチド配列に加えることのできる変更の例としては、コドンの最適化、Ｇ／Ｃ含有率の最適化、反復配列の除去、ＡＴリッチエレメントの除去、クリプティックスプライス部位の除去、転写または翻訳を抑制するシス作動性エレメントの除去、ポリＴ配列またはポリＡ配列の付加または除去、転写を増強する転写開始部位周囲配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列など）の付加、ステムループ構造を形成し得る配列の除去、不安定化配列の除去、及びこれらを２つ以上組み合わせたものが挙げられる。
【０１４１】
ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化核酸分子に対するものである。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、完全長ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。別の実施形態では、その核酸分子は、Ｂドメイン欠失（ＢＤＤ）ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードし、ＦＶＩＩＩのＢドメインの全体または一部が欠失している。特定的な一実施形態では、その核酸分子は、配列番号１７（図１Ｊ）またはその断片に対する配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。一実施形態では、その核酸分子は、配列番号１７またはその断片のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、シグナルペプチドまたはその断片を含むＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。別の実施形態では、その核酸分子は、シグナルペプチドが欠損しているＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、配列番号１７の１〜１９位のアミノ酸を含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号３の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号４の５８〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する単離核酸分子を提供する。特定的な一実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号３の５８〜１７９１位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。別の実施形態では、第１の核酸配列は、配列番号４の５８〜１７９１位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。別の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号３の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは配列番号４の５８〜１７９１位のヌクレオチドを含む。
【０１４４】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号３の１〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号４の１〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する単離核酸分子を提供する。一実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号３の１〜１７９１位のヌクレオチドまたは配列番号４の１〜１７９１位のヌクレオチドを含む。別の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号３の１７９２〜４３７４位または配列番号４の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。特定的な一実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号３の１７９２〜４３７４位または配列番号４の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号３の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位または配列番号４の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号３の１７９２〜４３７４位または配列番号４の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。特定的な一実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、配列番号３の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位または配列番号４の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号３の１７９２〜４３７４位または配列番号４の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）を含む。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号５の１７９２〜４３７４位または（ｉｉ）配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドに対する第２の核酸配列の配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する単離核酸分子を提供する。特定の実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号５の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。別の実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。特定的な一実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号５の１７９２〜４３７４位または配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、上に列挙した第２の核酸配列に連結された第１の核酸配列は、配列番号５の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは配列番号６の５８〜１７９１位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。別の実施形態では、上に列挙した第２の核酸配列に連結された第１の核酸配列は、配列番号５の１〜１７９１位のヌクレオチドまたは配列番号６の１〜１７９１位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。
【０１４６】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号５の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号５の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）または（ｉｉ）配列番号６の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する第２の核酸配列の配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する単離核酸分子を提供する。特定の実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号５の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号５の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。別の実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号６の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。特定的な一実施形態では、第２の核酸配列は、配列番号５の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位または配列番号６の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号５の１７９２〜４３７４位または配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）を含む。いくつかの実施形態では、上に列挙した第２の核酸配列に連結された第１の核酸配列は、配列番号５の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは配列番号６の５８〜１７９１位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。別の実施形態では、上に列挙した第２の核酸配列に連結された第１の核酸配列は、配列番号５の１〜１７９１位のヌクレオチドまたは配列番号６の１〜１７９１位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号１の５８〜１７９１位ヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２の５８〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号７０の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号７１の５８〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号１の５８〜１７９１位のヌクレオチド、配列番号２の５８〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号７０の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号７１の５８〜１７９１位のヌクレオチドを含む。
【０１４８】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号１の１〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２の１〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号７０の１〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号７１の１〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する単離核酸分子を提供する。一実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、配列番号１の１〜１７９１位のヌクレオチド、配列番号２の１〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号７０の１〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号７１の１〜１７９１位のヌクレオチドを含む。別の実施形態では、第１のヌクレオチド配列に連結された第２のヌクレオチド配列は、配列番号１の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、配列番号２の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号７０の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号７１の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。特定的な一実施形態では、第１のヌクレオチド配列に連結された第２のヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号７０の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号７１の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドを含む。別の実施形態では、第１のヌクレオチド配列に連結された第２のヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号７０の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号７１の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。一実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号１の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号７０の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号７１の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０１４９】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号１の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号７０の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号７１の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドに対する第２の核酸配列の配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する単離核酸分子を提供する。特定的な一実施形態では、第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号１の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号７０の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号７１の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号１の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号７０の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号７１の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号１の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、配列番号２の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、配列番号７０の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドまたは配列番号７１の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する第２の核酸配列の配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有する単離核酸分子を提供する。一実施形態では、第２の核酸配列は、（ｉ）配列番号１の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号７０の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号７１の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号１の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、配列番号２の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、配列番号７０の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドまたは配列番号７１の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号１の５８〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号１の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列を含む。別の実施形態では、その核酸配列は、配列番号１に対する配列同一性が少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号１の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）、または配列番号１の５８〜４３７４位のヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号１の１〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号１の１〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）、または配列番号１の１〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号２の５８〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号２の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列を含む。別の実施形態では、その核酸配列は、配列番号２に対する配列同一性が少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号２の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号２の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）、または配列番号２の５８〜４３７４位のヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号２の１〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号２の１〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）、または配列番号２の１〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号７０の５８〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号７０の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号７０の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列を含む。別の実施形態では、その核酸配列は、配列番号７０に対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号７０の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号７０の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）、または配列番号７０の５８〜４３７４位のヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号７０の１〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号７０の１〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）、または配列番号７０の１〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号７１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列を含む。別の実施形態では、その核酸配列は、配列番号７１に対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号７１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）、または配列番号１の５８〜４３７４位のヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号７１の１〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号７１の１〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）、または配列番号７１の１〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号３の５８〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号３の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号３の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列を含む。特定の実施形態では、その核酸配列は、配列番号３に対する配列同一性が少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号３の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号３の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）、または配列番号３の５８〜４３７４位のヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号３の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号３の１〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）、または配列番号３の１〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号４の５８〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号４の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号４の８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列を含む。別の実施形態では、その核酸配列は、配列番号４に対する配列同一性が少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号４の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号４の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）、または配列番号４の５８〜４３７４位のヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号４の１〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号４の１〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）、または配列番号４の１〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号５の５８〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号５の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号５の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列を含む。特定の実施形態では、その核酸配列は、配列番号５に対する配列同一性が少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号５の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号５の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドから除去したもの）、または配列番号５の５８〜４３７４位のヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号５の１〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号５の１〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）、または配列番号５の１〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号６の５８〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号６の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号６の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列を含む。特定の実施形態では、その核酸配列は、配列番号６に対する配列同一性が少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号６の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号６の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）、または配列番号６の５８〜４３７４位のヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、配列番号６の１〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号６の１〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除去したもの）、または配列番号６の１〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含む。特定の実施形態では、そのシグナルペプチドは、ＦＶＩＩＩシグナルペプチドである。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、コドンが最適化されている。特定的な一実施形態では、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、（ｉ）配列番号１の１〜５７位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号２の１〜５７位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号３の１〜５７位のヌクレオチド、（ｉｖ）配列番号４の１〜５７位のヌクレオチド、（ｖ）配列番号５の１〜５７位のヌクレオチド、（ｖｉ）配列番号６の１〜５７位のヌクレオチド、（ｖｉｉ）配列番号７０の１〜５７位のヌクレオチド、（ｖｉｉｉ）配列番号７１の１〜５７位のヌクレオチドまたは（ｉｘ）配列番号６８の１〜５７位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％である。
【０１５９】
配列番号１〜６、７０及び７１は、出発または「親」もしくは「野生型」ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列である配列番号１６の最適化型である。配列番号１６は、Ｂドメイン欠失ヒトＦＶＩＩＩをコードする。配列番号１〜６、７０及び７１は、ある特定のＢドメイン欠失型のＦＶＩＩＩ（配列番号１６）に由来するが、本開示は、その他の型のＦＶＩＩＩをコードする核酸の最適化型に対するものでもあることを理解されたい。例えば、その他の型のＦＶＩＩＩとしては、完全長ＦＶＩＩＩ、その他のＢドメイン欠失型のＦＶＩＩＩ（下記の型）またはＦＶＩＩＩ活性を保持しているその他のＦＶＩＩＩ断片を挙げることができる。
【０１６０】
「ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチド」とは、本明細書で使用する場合、別段の定めのない限り、凝固の際のその正常な役割における機能性ＦＶＩＩＩポリペプチドを意味する。ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドという用語には、凝固経路における完全長野生型第ＶＩＩＩ因子の機能を保持しているその機能性断片、バリアント、アナログまたは誘導体が含まれる。「ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチド」は、ＦＶＩＩＩタンパク質、ＦＶＩＩＩポリペプチドまたはＦＶＩＩＩと同義的に用いられている。ＦＶＩＩＩの機能の例としては、凝固を活性化させる能力、第ＩＸ因子の補因子として作用する能力、またはＣａ２＋とリン脂質の存在下で、第ＩＸ因子とのテナーゼ複合体を形成させてから、第Ｘ因子を活性化形態Ｘａに変換する能力が挙げられるが、これらに限らない。一実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、２本のポリペプチド鎖を含み、その第１の鎖は、ＦＶＩＩＩ重鎖を有し、第２の鎖は、ＦＶＩＩＩ軽鎖を有する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドは、一本鎖ＦＶＩＩＩである。一本鎖ＦＶＩＩＩは、成熟ＦＶＩＩＩ配列に対応する１６４５位及び／または１６４８位のアミノ酸残基に、１つ以上の変異または置換を含むことができる。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４５７８４（参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。ＦＶＩＩＩタンパク質は、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質、ブタＦＶＩＩＩタンパク質、イヌＦＶＩＩＩタンパク質、ラットＦＶＩＩＩタンパク質またはマウスＦＶＩＩＩタンパク質であることができる。加えて、ヒトのＦＶＩＩＩとその他の種のＦＶＩＩＩとの比較により、機能するために必要な可能性の高い保存残基が同定されている（Ｃａｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７９：３１７−２２（１９９８）、ＵＳ６，２５１，６３２）。
【０１６１】
ＦＶＩＩＩの「Ｂドメイン」は、本明細書で使用する場合、当該技術分野において知られているＢドメインであって、内部アミノ酸配列同一性とトロンビンによるタンパク質切断部位によって定められるＢドメイン、例えば、完全長ヒトＦＶＩＩＩのＳｅｒ７４１〜Ａｒｇ１６４８の残基と同じである。その他のヒトＦＶＩＩＩドメインは、Ａ１がＡｌａ１〜Ａｒｇ３７２のアミノ酸残基、Ａ２が、Ｓｅｒ３７３〜Ａｒｇ７４０のアミノ酸残基、Ａ３がＳｅｒ１６９０〜Ｉｌｅ２０３２のアミノ酸残基、Ｃ１がＡｒｇ２０３３〜Ａｓｎ２１７２のアミノ酸残基、Ｃ２が、Ｓｅｒ２１７３〜Ｔｙｒ２３３２のアミノ酸残基によって定められている。Ａ３−Ｃ１−Ｃ２の配列には、Ｓｅｒ１６９０〜Ｔｙｒ２３３２の残基が含まれる。残りの配列（Ｇｌｕ１６４９〜Ａｒｇ１６８９の残基）は通常、ＦＶＩＩＩ軽鎖活性化ペプチドと称されている。ブタＦＶＩＩＩ、マウスＦＶＩＩＩ及びイヌＦＶＩＩＩについても、Ｂドメインを含むすべてのドメインの境界線の位置が、当該技術分野において知られている。ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩの例は、ＲＥＦＡＣＴＯ（登録商標）という組み換えＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ（Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）である。
【０１６２】
「Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ」は、米国特許第６，３１６，２２６号、同第６，３４６，５１３号、同第７，０４１，６３５号、同第５，７８９，２０３号、同第６，０６０，４４７号、同第５，５９５，８８６号、同第６，２２８，６２０号、同第５，９７２，８８５号、同第６，０４８，７２０号、同第５，５４３，５０２号、同第５，６１０，２７８号、同第５，１７１，８４４号、同第５，１１２，９５０号、同第４，８６８，１１２号及び同第６，４５８，５６３（それぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されている完全欠失または部分欠失を有することができる。いくつかの実施形態では、本開示のＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ配列は、米国特許第６，３１６，２２６号の４列目、４行目〜５列目、２８行目と、実施例１〜５（さらにＵＳ６，３４６，５１３）に開示されている欠失のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態では、本開示のＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、米国特許第５，７８９，２０３号の２列目、２６〜５１行目と、実施例５〜８（さらに、ＵＳ６，０６０，４４７、ＵＳ５，５９５，８８６及びＵＳ６，２２８，６２０）に開示されている欠失を有する。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、米国特許第５，９７２，８８５号の１列目、２５行目〜２列目、４０行目、米国特許第６，０４８，７２０号の６列目、１〜２２行目と、実施例１、米国特許第５，５４３，５０２号の２列目、１７〜４６行目、米国特許第５，１７１，８４４号の４列目、２２行目〜５列目、３６行目、米国特許第５，１１２，９５０号の２列目、５５〜６８行目と、図２と、実施例１、米国特許第４，８６８，１１２号の２列目、２行目〜１９列目、２１行目と、表２、米国特許第７，０４１，６３５号の２列目、１行目〜３列目、１９行目と、３列目、４０行目〜４列目、６７行目と、７列目、４３行目〜８列目、２６行目と、１１列目、５行目〜１３列目、３９行目、または米国特許第６，４５８，５６３号の４列目、２５〜５３行目に記載されている欠失を有する。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩでは、Ｂドメインの大半が欠失しているが、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、ＷＯ９１／０９１２２（参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されているように、一次翻訳産物をインビボでタンパク質分解処理して、２本のポリペプチド鎖にするのに不可欠であるＢドメインアミノ末端配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、７４７〜１６３８位のアミノ酸を欠失した状態で、すなわち、実質的にＢドメインが完全に欠失した状態で構築されている。Ｈｏｅｂｅｎ  Ｒ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１３）：７３１８−７３２３（１９９０）（参照により、その全体が本明細書に援用される）。Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩは、ＦＶＩＩＩの７７１〜１６６６位のアミノ酸または８６８〜１５６２位のアミノ酸も欠失していることができる。Ｍｅｕｌｉｅｎ  Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．２（４）：３０１−６（１９８８）（参照により、その全体が本明細書に援用される）。本開示の一部である追加のＢドメイン欠失としては、例えば、９８２〜１５６２位��しくは７６０〜１６３９位（Ｔｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８６）８３，５９３９−５９４２））、７９７〜１５６２位（Ｅａｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６）２５：８３４３−８３４７））、７４１〜１６４６位（Ｋａｕｆｍａｎ（国際公開第８７／０４１８７号））、７４７〜１５６０位（Ｓａｒｖｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ（１９８７）６：５５３−５６４））、７４１〜１６４８位（Ｐａｓｅｋ（国際公開第８８／００８３１号））、８１６〜１５９８位または７４１〜１６８９位（Ｌａｇｎｅｒ（Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．（１９８８）Ｎｏ８２：１６−２５，ＥＰ２９５５９７））（これらの各文献は、参照により、その全体が本明細書に援用される）のアミノ酸の欠失が挙げられる。上記の各欠失は、いずれのＦＶＩＩＩ配列においても行うこともできる。
【０１６３】
Ｂドメイン欠失を含め、多くの機能性ＦＶＩＩＩ分子が、いずれもＢａｘｔｅｒに譲渡されたＵＳ６，３１６，２２６及びＵＳ６，３４６，５１３、Ｉｎ２Ｇｅｎに譲渡されたＵＳ７，０４１，６３５、Ｃｈｉｒｏｎに譲渡されたＵＳ５，７８９，２０３、ＵＳ６，０６０，４４７、ＵＳ５，５９５，８８６及びＵＳ６，２２８，６２０、Ｂｉｏｖｉｔｒｕｍに譲渡されたＵＳ５，９７２，８８５及びＵＳ６，０４８，７２０、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋに譲渡されたＵＳ５，５４３，５０２及びＵＳ５，６１０，２７８、Ｉｍｍｕｎｏ  Ａｇに譲渡されたＵＳ５，１７１，８４４、Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｓ．Ａ．に譲渡されたＵＳ５，１１２，９５０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに譲渡されたＵＳ４，８６８，１１２（これらの各特許は、参照により、その全体が本明細書に援用される）という特許に開示されている。
【０１６４】
コドン最適化
一実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、その核酸配列のコドンが最適化されている単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするとともに、コドンの最適化を行う開始核酸配列は、配列番号１６である。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする配列は、ヒトでの発現用に、コドンが最適化されている。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする配列は、マウスでの発現用に、コドンが最適化されている。配列番号１〜６、７０及び７１は、配列番号１６のコドン最適化型であって、ヒトでの発現用に最適化されたものである。
【０１６５】
「コドン最適化」という用語は、各種宿主のトランスフォーメーション用の核酸分子の遺伝子またはコード領域に関する場合、そのＤＮＡによってコードされるポリペプチドを改変せずに、宿主生物の典型的なコドン使用頻度を反映するように、核酸分子の遺伝子またはコード領域のコドンを改変することを指す。このような最適化としては、少なくとも１つ、２つ以上または有意な数のコドンを、宿主生物の遺伝子での使用頻度がより高い１つ以上のコドンに置き換えることが挙げられる。
【０１６６】
いずれかのポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列における偏差によって、その遺伝子のコード配列の変動が可能になる。各コドンは、３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを構成するヌクレオチドは、４つの特定の塩基に制限されているので、考え得るヌクレオチドの組み合わせは６４個あり、そのうちの６１個が、アミノ酸をコードする（残りの３つのコドンは、翻訳を停止するシグナルをコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝暗号」が表１に示されている。結果として、多くのアミノ酸に、２つ以上のコドンが対応している。例えば、アミノ酸のアラニンとプロリンは、４つのトリプレットによって、セリンとアルギニンは、６つのトリプレットによってコードされるが、トリプトファンとメチオニンは、１つのトリプレットのみによってコードされる。この縮退によって、ＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変することなく、ＤＮＡの塩基組成を広範に変化させることが可能になる。
【表１−１】
2019506166.tif 000004
【表１−２】
2019506166.tif 000005
【０１６７】
多くの生物では、成長しているペプチド鎖において特定のアミノ酸の挿入をコードする特定のコドンの使用で、バイアスが見られる。生物間におけるコドン優先度またはコドンバイアス（コドン使用頻度の差）は、遺伝暗号の縮退により可能になり、多くの生物間において十分に立証されている。コドンバイアスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関する場合が多く、ひいては、とりわけ、翻訳されるコドンの特性と、特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用性に左右されると考えられている。細胞において、選択されるｔＲＮＡの優勢は概して、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンが反映されたものである。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づき、所定の生物において最適な遺伝子発現が行われるように適合させることができる。
【０１６８】
多種多様な動物種、植物種及び微生物種に利用可能な多数の遺伝子配列を踏まえて、相対的なコドン使用頻度が算出されている。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２０１２年６月１８日に閲覧）に掲載されている「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」から入手可能である。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。
【０１６９】
所定のポリペプチド配列をコードするように、最適化頻度のコドンをランダムに割り当てる作業は、各アミノ酸のコドン頻度を算出してから、それらのコドンをポリペプチド配列にランダムに割り当てることによって、手動で行うことができる。加えて、様々なアルゴリズムとコンピューターソフトウェアプログラムを用いて、最適な配列を算出することができる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、（ａ）その核酸分子もしくはその一部のヒトコドン適応指標が、配列番号１６よりも上昇していること、（ｂ）そのヌクレオチド配列もしくはその一部の最適コドン頻度が、配列番号１６よりも上昇していること、（ｃ）そのヌクレオチド配列もしくはその一部が、配列番号１６におけるＧ／Ｃヌクレオチドの割合よりも高い割合で、Ｇ／Ｃヌクレオチドを含むこと、（ｄ）そのヌクレオチド配列もしくはその一部の相対的な同義コドン使用頻度が、配列番号１６よりも上昇していること、（ｅ）そのヌクレオチド配列もしくはその一部のコドンの有効数が、配列番号１６よりも減少していること、（ｆ）そのヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列（配列番号２１及び２２）を含むこと、（ｇ）そのヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ない不安定化エレメント（配列番号２３及び２４）を含むこと、（ｉ）そのヌクレオチド配列が、ポリＴ配列を含まないこと、（ｊ）そのヌクレオチド配列が、ポリＡ配列を含まないこと、または（ｋ）これらをいずれかに組み合わせたもののうちの１つ以上の特性を含む。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子は、（ａ）〜（ｊ）のうちの少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個または１０個の特徴を含む。
【０１７１】
コドン適応指標
一実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、そのヒトコドン適応指標が、配列番号１６よりも上昇している単離核酸分子を提供する。例えば、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が、少なくとも約０．７５（７５％）、少なくとも約０．７６（７６％）、少なくとも約０．７７（７７％）、少なくとも約０．７８（７８％）、少なくとも約０．７９（７９％）、少なくとも約０．８０（８０％）、少なくとも約０．８１（８１％）、少なくとも約０．８２（８２％）、少なくとも約０．８３（８３％）、少なくとも約０．８４（８４％）、少なくとも約０．８５（８５％）、少なくとも約０．８６（８６％）、少なくとも約０．８７（８７％）、少なくとも約０．８８（８８％）、少なくとも約０．８９（８９％）、少なくとも約０．９０（９０％）、少なくとも約０．９１（９１％）、少なくとも約０．９２（９２％）、少なくとも約０．９３（９３％）、少なくとも約０．９４（９４％）、少なくとも約０．９５（９５％）、少なくとも約０．９６（９６％）、少なくとも約０．９７（９７％）、少なくとも約０．９８（９８％）または少なくとも約０．９９（９９％）であることができる。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が少なくとも約０．８８（８８％）である。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が少なくとも約０．９１（９１％）である。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が少なくとも約０．９１（９７％）である。
【０１７２】
特定的な一実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号３の５８〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号３の１〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号４の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号４の１〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列のヒトコドン適応指標が、配列番号１６よりも上昇している単離核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が少なくとも約０．７５（７５％）、少なくとも約０．７６（７６％）、少なくとも約０．７７（７７％）、少なくとも約０．７８（７８％）、少なくとも約０．７９（７９％）、少なくとも約０．８０（８０％）、少なくとも約０．８１（８１％）、少なくとも約０．８２（８２％）、少なくとも約０．８３（８３％）、少なくとも約０．８４（８４％）、少なくとも約０．８５（８５％）、少なくとも約０．８６（８６％）、少なくとも約０．８７（８７％）、少なくとも約０．８８（８８％）、少なくとも約０．８９（８９％）、少なくとも約０．９０（９０％）または少なくとも約０．９１（９１％）である。特には、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が少なくとも約０．８８（８８％）である。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が少なくとも約０．９１（９１％）である。
【０１７３】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号５の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号６の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する第２の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列のヒトコドン適応指標が、配列番号１６よりも上昇している単離核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が少なくとも約０．７５（７５％）、少なくとも約０．７６（７６％）、少なくとも約０．７７（７７％）、少なくとも約０．７８（７８％）、少なくとも約０．７９（７９％）、少なくとも約０．８０（８０％）、少なくとも約０．８１（８１％）、少なくとも約０．８２（８２％）、少なくとも約０．８３（８３％）、少なくとも約０．８４（８４％）、少なくとも約０．８５（８５％）、少なくとも約０．８６（８６％）、少なくとも約０．８７（８７％）または少なくとも約０．８８（８８％）である。特には、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が少なくとも約０．８３（８３％）である。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が少なくとも約０．８８（８８％）である。
【０１７４】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、７０または７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインまたはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列のヒトコドン適応指標が、配列番号１６よりも上昇している単離核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が少なくとも約０．７５（７５％）、少なくとも約０．７６（７６％）、少なくとも約０．７７（７７％）、少なくとも約０．７８（７８％）、少なくとも約０．７９（７９％）、少なくとも約０．８０（８０％）、少なくとも約０．８１（８１％）、少なくとも約０．８２（８２％）、少なくとも約０．８３（８３％）、少なくとも約０．８４（８４％）、少なくとも約０．８５（８５％）、少なくとも約０．８６（８６％）、少なくとも約０．８７（８７％）または少なくとも約０．８８（８８％）である。特には、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が少なくとも約０．７５（７５％）である。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が少なくとも約０．８３（８３％）である。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が少なくとも約０．８８（８８％）である。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が少なくとも約０．９１（９１％）である。別の実施形態では、そのヌクレオチド配列は、ヒトコドン適応指標が少なくとも約０．９７（９７％）である。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、本開示の単離核酸分子は、最適コドン頻度（ＦＯＰ）が配列番号１６よりも上昇している。特定の実施形態では、本開示の単離核酸分子のＦＯＰは、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６４、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約７９、少なくとも約８０、少なくとも約８５または少なくとも約９０である。
【０１７６】
別の実施形態では、本開示の単離核酸分子は、相対的な同義コドン使用頻度（ＲＣＳＵ）が配列番号１６よりも上昇している。いくつかの実施形態では、本開示の単離核酸分子のＲＣＳＵは、１．５超である。別の実施形態では、本開示の単離核酸分子のＲＣＳＵは、２．０超である。特定の実施形態では、本開示の単離核酸分子のＲＣＳＵは、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、少なくとも約２．０、少なくとも約２．１、少なくとも約２．２、少なくとも約２．３、少なくとも約２．４、少なくとも約２．５、少なくとも約２．６または少なくとも約２．７である。
【０１７７】
さらに別の実施形態では、本開示の単離核酸分子は、コドンの有効数が配列番号１６よりも減少している。いくつかの実施形態では、本開示の単離核酸分子は、コドンの有効数が、約５０個未満、約４５個未満、約４０個未満、約３５個未満、約３０個未満または約２５個未満である。特定的な一実施形態では、その単離核酸分子は、コドンの有効数が約４０、約３５、約３０、約２５または約２０である。
【０１７８】
Ｇ／Ｃ含有率の最適化
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６におけるＧ／Ｃヌクレオチドの割合よりも高い割合でＧ／Ｃヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｇ／Ｃ含有率が少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％、少なくとも約５８％、少なくとも約５９％または少なくとも約６０％である。
【０１７９】
特定的な一実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号３の５８〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号３の１〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号４の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号４の１〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６におけるＧ／Ｃヌクレオチドの割合よりも高い割合でＧ／Ｃヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｇ／Ｃ含有率が少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％または少なくとも約５８％である。特定的な一実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｇ／Ｃ含有率が少なくとも約５８％である。
【０１８０】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号５の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号５の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号５の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）または（ｉｖ）配列番号６の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位（すなわち、配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する第２の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６におけるＧ／Ｃヌクレオチドの割合よりも高い割合でＧ／Ｃヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｇ／Ｃ含有率が少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％または少なくとも約５７％である。特定的な一実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｇ／Ｃ含有率が少なくとも約５２％である。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｇ／Ｃ含有率が少なくとも約５５％である。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｇ／Ｃ含有率が少なくとも約５７％である。
【０１８１】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の（ｉ）５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、７０または７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６におけるＧ／Ｃヌクレオチドの割合よりも高い割合でＧ／Ｃヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｇ／Ｃ含有率が少なくとも約４５％である。特定的な一実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｇ／Ｃ含有率が少なくとも約５２％である。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｇ／Ｃ含有率が少なくとも約５５％である。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｇ／Ｃ含有率が少なくとも約５７％である。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｇ／Ｃ含有率が少なくとも約５８％である。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、Ｇ／Ｃ含有率が少なくとも約６０％である。
【０１８２】
「Ｇ／Ｃ含有率」（すなわち、グアニン−シトシン含有率）または「Ｇ／Ｃヌクレオチドの割合」とは、ＤＮＡ分子中の含窒素塩基（グアニンまたはシトシンのいずれかである）の割合を指す。Ｇ／Ｃ含有率は、下記の式を用いて算出できる。
【数３】
2019506166.tif 000006
【０１８３】
ヒト遺伝子は、Ｇ／Ｃ含有率が大きく異なっており、Ｇ／Ｃ含有率が２０％ほどの低さである遺伝子もあれば、Ｇ／Ｃ含有率が９５％ほどの高さである遺伝子もある。概して、Ｇ／Ｃリッチな遺伝子ほど、多く発現される。実際、遺伝子のＧ／Ｃ含有率が向上すると、主に、転写の増大と、ｍＲＮＡレベルの安定状態の向上により、遺伝子の発現を増加させることができることが示されている。Ｋｕｄｌａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．，４（６）：ｅ１８０（２００６）を参照されたい。
【０１８４】
マトリックス付着領域様配列
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を最大でも６個、最大でも５個、最大でも４個、最大でも３個または最大でも２個しか含まない。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を最大で１個しか含まない。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含まない。
【０１８５】
特定的な一実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号３の５８〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号３の１〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号４の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号４の１〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を最大でも６個、最大でも５個、最大でも４個、最大でも３個または最大でも２個しか含まない。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を最大で１個しか含まない。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含まない。
【０１８６】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号５の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号５の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号５の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）または（ｉｖ）配列番号６の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位（すなわち、配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する第２の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を最大でも６個、最大でも５個、最大でも４個、最大でも３個または最大でも２個しか含まない。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を最大で１個しか含まない。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含まない。
【０１８７】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０もしくは７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０もしくは７１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、７０もしくは７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ないＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を最大でも６個、最大でも５個、最大でも４個、最大でも３個または最大でも２個しか含まない。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を最大で１個しか含まない。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＭＡＲＳ／ＡＲＳ配列を含まない。
【０１８８】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ自己複製配列（ＡＲＳ）及び核マトリックス付着領域（ＭＡＲ）と配列類似性を持つ、ヒトＦＶＩＩＩヌクレオチド配列におけるＡＴリッチエレメントが同定されている。（Ｆａｌｌｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：４２６４−４２７２（１９９６）。これらのエレメントの１つは、インビトロで核因子と結合して、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子の発現を抑制することが示されている。上記の文献を参照されたい。これらの配列は、ヒトＦＶＩＩＩ遺伝子の転写抑制に寄与する可能性があるという仮説が立てられている。したがって、一実施形態では、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子では、すべてのＭＡＲ／ＡＲＳ配列が無効にされている。親ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１６）には、４つのＭＡＲ／ＡＲＳ  ＡＴＡＴＴＴ配列（配列番号２１）と、３つのＭＡＲ／ＡＲＳ  ＡＡＡＴＡＴ配列（配列番号２２）が存在する。最適化ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１〜６）では、これらの部位をすべて変異させて、ＭＡＲ／ＡＲＳ配列を破壊した。これらの各エレメントの位置と、最適化配列における対応するヌクレオチドの配列は、下記の表２に示されている。
【表２−１】
2019506166.tif 000007
【表２−２】
2019506166.tif 000008
【表２−３】
2019506166.tif 000009
【０１８９】
不安定化配列
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ない不安定化エレメントを含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも９個、最大でも８個、最大でも７個、最大でも６個または最大でも５個の不安定化エレメントしか含まない。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも４個、最大でも３個、最大でも２個または最大でも１個の不安定化エレメントしか含まない。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、不安定化エレメントを含まない。
【０１９０】
特定的な一実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号３の５８〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号３の１〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号４の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号４の１〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ない不安定化エレメントを含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも９個、最大でも８個、最大でも７個、最大でも６個または最大でも５個の不安定化エレメントしか含まない。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも４個、最大でも３個、最大でも２個または最大でも１個の不安定化エレメントしか含まない。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、不安定化エレメントを含まない。
【０１９１】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号５の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号５の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号５の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）または（ｉｖ）配列番号６の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位（すなわち、配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する第２の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ない不安定化エレメントを含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも９個、最大でも８個、最大でも７個、最大でも６個または最大でも５個の不安定化エレメントしか含まない。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも４個、最大でも３個、最大でも２個または最大でも１個の不安定化エレメントしか含まない。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、不安定化エレメントを含まない。
【０１９２】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、７０もしくは７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ない不安定化エレメントを含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも９個、最大でも８個、最大でも７個、最大でも６個または最大でも５個の不安定化エレメントしか含まない。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも４個、最大でも３個、最大でも２個または最大でも１個の不安定化エレメントしか含まない。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、不安定化エレメントを含まない。
【０１９３】
親ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１６）には、６個のＡＴＴＴＡ配列（配列番号２３）と、４個のＴＡＡＡＴ配列（配列番号２４）という１０個の不安定化エレメントが存在する。一実施形態では、最適化ＦＶＩＩＩ配列番号１〜６、７０及び７１において、これらの部位の配列を変異させて、不安定化エレメントを破壊した。これらの各エレメントの位置と、最適化配列における対応するヌクレオチドの配列は、表２に示されている。
【０１９４】
潜在的プロモーター結合部位
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする、本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ない潜在的プロモーター結合部位を含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも９個、最大でも８個、最大でも７個、最大でも６個または最大でも５個の潜在的プロモーター結合部位しか含まない。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも４個、最大でも３個、最大でも２個または最大でも１個の潜在的プロモーター結合部位しか含まない。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、潜在的プロモーター結合部位を含まない。
【０１９５】
特定的な一実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号３の５８〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号３の１〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号４の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号４の１〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ない潜在的プロモーター結合部位を含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも９個、最大でも８個、最大でも７個、最大でも６個または最大でも５個の潜在的プロモーター結合部位しか含まない。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも４個、最大でも３個、最大でも２個または最大でも１個の潜在的プロモーター結合部位しか含まない。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、潜在的プロモーター結合部位を含まない。
【０１９６】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号５の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号５の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号５の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）または（ｉｖ）配列番号６の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する第２の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ない潜在的プロモーター結合部位を含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも９個、最大でも８個、最大でも７個、最大でも６個または最大でも５個の潜在的プロモーター結合部位しか含まない。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも４個、最大でも３個、最大でも２個または最大でも１個の潜在的プロモーター結合部位しか含まない。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、潜在的プロモーター結合部位を含まない。
【０１９７】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、７０もしくは７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、配列番号１６よりも少ない潜在的プロモーター結合部位を含む単離核酸分子を提供する。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも９個、最大でも８個、最大でも７個、最大でも６個または最大でも５個の潜在的プロモーター結合部位しか含まない。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、最大でも４個、最大でも３個、最大でも２個または最大でも１個の潜在的プロモーター結合部位しか含まない。さらに別の実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするこのヌクレオチド配列は、潜在的プロモーター結合部位を含まない。
【０１９８】
ＴＡＴＡボックスは、真核生物のプロモーター領域で見られることの多い調節配列である。この配列は、基本転写因子であるＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）の結合部位としての機能を果たす。ＴＡＴＡボックスは通常、ＴＡＴＡＡという配列（配列番号２８）または近いバリアントを含む。しかしながら、コード配列内のＴＡＴＡボックスは、完全長タンパク質の翻訳を阻害することがある。野生型ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１６）には、５個のＴＡＴＡＡ配列（配列番号２８）と、５個のＴＴＡＴＡ配列（配列番号２９）という１０個の潜在的プロモーター結合配列が存在する。いくつかの実施形態では、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個または少なくとも４個のプロモーター結合部位が無効にされている。いくつかの実施形態では、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において、少なくとも５個のプロモーター結合部位が無効にされている。別の実施形態では、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において、少なくとも６個、少なくとも７個または少なくとも８個のプロモーター結合部位が無効にされている。一実施形態では、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において、少なくとも９個のプロモーター結合部位が無効にされている。特定的な一実施形態では、本開示のＦＶＩＩＩ遺伝子において、すべてのプロモーター結合部位が無効にされている。それぞれの潜在的プロモーター結合部位の位置と、最適化配列における対応するヌクレオチドの配列は、表２に示されている。
【０１９９】
その他の負のシス作動性調節エレメント
野生型ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列（配列番号１６）では、上記のＭＡＲ／ＡＲＳ配列、不安定化エレメント及び潜在的プロモーター部位に加えて、さらなる潜在的阻害配列をいくつか同定できる。非最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列では、ポリＡ部位（ＡＡＡＡＡＡＡ、配列番号２６）、ポリＴ部位（ＴＴＴＴＴＴ、配列番号２５）及びスプライス部位（ＧＧＴＧＡＴ、配列番号２７）とともに、２つのＡＵリッチ配列エレメント（ＡＲＥ）（ＡＴＴＴＴＡＴＴ（配列番号３０）及びＡＴＴＴＴＴＡＡ（配列番号３１））を同定できる。これらのエレメントのうちの１つ以上を最適化ＦＶＩＩＩ配列から除去できる。これらの各部位の位置と、最適化配列における対応するヌクレオチドの配列は、表２に示されている。
【０２００】
特定の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号３の５８〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号３の１〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号４の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号４の１〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列が、１つ以上の負のシス作動性調節エレメント、例えば、スプライス部位、ポリＴ配列、ポリＡ配列、ＡＲＥ配列またはこれらをいずれかに組み合わせたものを含まない単離核酸分子を提供する。
【０２０１】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号５の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号５の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号５の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）または（ｉｖ）配列番号６の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位（すなわち、配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する第２の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列が、１つ以上の負のシス作動性調節エレメント、例えば、スプライス部位、ポリＴ配列、ポリＡ配列、ＡＲＥ配列またはこれらをいずれかに組み合わせたものを含まない単離核酸分子を提供する。
【０２０２】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、７０もしくは７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、１つ以上の負のシス作動性調節エレメント、例えば、スプライス部位、ポリＴ配列、ポリＡ配列、ＡＲＥ配列またはこれらをいずれかに組み合わせたものを含まない単離核酸分子を提供する。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号３の５８〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号３の１〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号４の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号４の１〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列が、スプライス部位ＧＧＴＧＡＴ（配列番号２７）を含まない単離核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号３の５８〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号３の１〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号４の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号４の１〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列が、ポリＴ配列（配列番号２５）を含まない単離核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号３の５８〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号３の１〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号４の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号４の１〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列が、ポリＡ配列（配列番号２６）を含まない単離核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号３の５８〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号３の１〜１７９１位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号４の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号４の１〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有し、そのヌクレオチド配列が、ＡＲＥエレメント（配列番号３０または配列番号３１）を含まない単離核酸分子を提供する。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、７０もしくは７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、スプライス部位ＧＧＴＧＡＴ（配列番号２７）を含まない単離核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、７０もしくは７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、ポリＴ配列（配列番号２５）を含まない単離核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、７０もしくは７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、ポリＡ配列（配列番号２６）を含まない単離核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、（ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７０及び７１から選択したアミノ酸配列の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチド（すなわち、配列番号１、２、３、４、５、６、７０もしくは７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドから、ＢドメインもしくはＢドメイン断片をコードするヌクレオチドを除外したもの）に対する配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、ＡＲＥエレメント（配列番号３０または配列番号３１）を含まない単離核酸分子を提供する。
【０２０５】
別の実施形態では、本開示の最適化ＦＶＩＩＩ配列は、抗ウイルスモチーフ、ステムループ構造及び反復配列のうちの１つ以上を含まない。
【０２０６】
さらに別の実施形態では、転写開始部位周辺のヌクレオチドは、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列（
【化１】
2019506166.tif 000010
（配列番号３２）、下線部分のヌクレオチドは、開始コドンである）に変更されている。別の実施形態では、クローニングプロセスを促進するために、制限部位を付加または除去することができる。
【０２０７】
異種のヌクレオチド配列
いくつかの実施形態では、本開示の単離核酸分子は、異種のヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、本開示の単離核酸分子は、少なくとも１つの異種のヌクレオチド配列をさらに含む。この異種のヌクレオチド配列は、本開示の最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列と、５’末端、３’末端で連結することも、最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列の中間に挿入することもできる。したがって、いくつかの実施形態では、この異種のヌクレオチド配列によってコードされる異種のアミノ酸配列は、本開示のヌクレオチド配列によってコードされるＦＶＩＩＩアミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端に連結されるか、ＦＶＩＩＩアミノ酸配列内の２つのアミノ酸の間に挿入される。いくつかの実施形態では、この異種のアミノ酸配列は、表３から選択した１つ以上の挿入部位の２つのアミノ酸の間に挿入できる。いくつかの実施形態では、この異種のアミノ酸配列は、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩポリペプチド内に、国際公開第２０１３／１２３４５７Ａ１号、同第２０１５／１０６０５２Ａ１号または米国特許出願公開第２０１５／０１５８９２９Ａ１号（これらは、参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されているいずれかの部位で挿入できる。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、この異種のヌクレオチド配列によってコードされる異種のアミノ酸配列は、Ｂドメインまたはその断片内に挿入される。いくつかの実施形態では、この異種のアミノ酸配列は、ＦＶＩＩＩ内に、成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号１５）の７４５位のアミノ酸に対応するアミノ酸のすぐ下流で挿入される。特定的な一実施形態では、本開示のＦＶＩＩＩは、成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号１５）の７４６〜１６４６位に対応するアミノ酸の欠失を含むとともに、異種のヌクレオチド配列によってコードされる異種のアミノ酸配列が、成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号１５）の７４５位に対応するアミノ酸のすぐ下流に挿入される。
【表３−１】
2019506166.tif 000011
【表３−２】
2019506166.tif 000012
注：挿入部位は、成熟ヒトＦＶＩＩＩ（配列番号１５）のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸の位置を示している。
【０２０９】
別の実施形態では、本開示の単離核酸分子はさらに、異種のヌクレオチド配列を２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個含む。いくつかの実施形態では、異種のヌクレオチド配列はすべて同じである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異種のヌクレオチド配列は、他の異種のヌクレオチド配列と異なる。いくつかの実施形態では、本開示は、異種のヌクレオチド配列を２個、３個、４個、５個または７個超、タンデムに含むことができる。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、異種のヌクレオチド配列は、アミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、異種のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、ＦＶＩＩＩ分子の半減期を延長できる異種の部分（「半減期延長因子」）である。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、異種の部分は、本開示のタンパク質に組み込まれると、インビボ半減期の延長と関連する非構造化の特徴または構造化の特徴のいずれかを有するペプチドまたはポリペプチドである。非限定的な例としては、アルブミン、アルブミン断片、免疫グロブリンのＦｃ断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、ＨＡＰ配列、ＸＴＥＮ配列、トランスフェリンもしくはその断片、ＰＡＳポリペプチド、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、アルブミン結合部分、またはこれらのポリペプチドのいずれかの断片、誘導体、バリアントもしくは組み合わせたものが挙げられる。特定的な一実施形態では、異種のアミノ酸配列は、免疫グロブリン定常領域もしくはその一部、トランスフェリン、アルブミン、またはＰＡＳ配列である。いくつかの態様では、異種の部分は、フォンビルブランド因子またはその断片を含む。その他の関連する態様では、異種の部分は、ポリペプチド以外の部分（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらのエレメントのいずれかの誘導体、バリアントもしくは組み合わせたものなど）に対する付着部位（例えば、システインアミノ酸）を含むことができる。いくつかの態様では、異種の部分は、ポリペプチド以外の部分（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリシアル酸、またはこれらのエレメントのいずれかの誘導体、バリアントもしくは組み合わせなど）に対する付着部位として機能するシステインアミノ酸を含む。
【０２１２】
具体的な一実施形態では、第１の異種のヌクレオチド配列は、当該技術分野において知られている半減期延長分子である第１の異種の部分をコードし、第２の異種のヌクレオチド配列は、同様に、当該技術分野において知られている半減期延長分子であることができる第２の異種の部分をコードする。特定の実施形態では、第１の異種の部分（例えば第１のＦｃ部分）と第２の異種の部分（例えば第２のＦｃ部分）は、互いに会合して、二量体を形成する。一実施形態では、第２の異種の部分は、第２のＦｃ部分であり、この第２のＦｃ部分は、第１の異種の部分、例えば第１のＦｃ部分と連結または会合している。例えば、第２の異種の部分（例えば第２のＦｃ部分）は、リンカーによって、第１の異種の部分（例えば第１のＦｃ部分）に連結することも、共有結合または非共有結合によって、第１の異種の部分と会合することもできる。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、異種の部分は、少なくとも約１０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、少なくとも約８００個、少なくとも約９００個、少なくとも約１０００個、少なくとも約１１００個、少なくとも約１２００個、少なくとも約１３００個、少なくとも約１４００個、少なくとも約１５００個、少なくとも約１６００個、少なくとも約１７００個、少なくとも約１８００個、少なくとも約１９００個、少なくとも約２０００個、少なくとも約２５００個、少なくとも約３０００個または少なくとも約４０００個のアミノ酸を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなるポリペプチドである。別の実施形態では、異種の部分は、約１００〜約２００個のアミノ酸、約２００〜約３００個のアミノ酸、約３００〜約４００個のアミノ酸、約４００〜約５００個のアミノ酸、約５００〜約６００個のアミノ酸、約６００〜約７００個のアミノ酸、約７００〜約８００個のアミノ酸、約８００〜約９００個のアミノ酸または約９００〜約１０００個のアミノ酸を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなるポリペプチドである。
【０２１４】
特定の実施形態では、異種の部分は、ＦＶＩＩＩタンパク質の生物学的活性または機能に有意な影響を及ぼさずに、ＦＶＩＩＩタンパク質の１つ以上の薬物動態特性を改善する。
【０２１５】
特定の実施形態では、異種の部分は、本開示のＦＶＩＩＩタンパク質のインビボ及び／またはインビトロ半減期を延長する。別の実施形態では、異種の部分は、本開示のＦＶＩＩＩタンパク質またはその断片（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質のタンパク質切断後の、異種の部分を含む断片）の可視化または局在化を促す。本開示のＦＶＩＩＩタンパク質またはその断片の可視化及び／または位置は、インビボ、インビトロ、エキソビボまたはこれらを組み合わせたものであることができる。
【０２１６】
別の実施形態では、異種の部分は、本開示のＦＶＩＩＩタンパク質またはその断片（例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質のタンパク質切断後の、異種の部分を含む断片）の安定性を向上させる。本明細書で使用する場合、「安定性」という用語は、環境条件（例えば、高温または低温）に応じて、ＦＶＩＩＩタンパク質の１つ以上の物理的特性が保持されていることの尺度のうち、当該技術分野において認識されている尺度を指す。特定の態様では、この物理的特性は、ＦＶＩＩＩタンパク質の共有構造の維持（例えば、タンパク質切断、不要な酸化または脱アミド化が行われてないこと）であることができる。別の態様では、この物理的特性は、ＦＶＩＩＩタンパク質が適切に折り畳まれた状態で存在すること（例えば、可溶性または不溶性の凝集体または沈殿物が存在しないこと）であることもできる。一態様では、ＦＶＩＩＩタンパク質の安定性は、ＦＶＩＩＩタンパク質の生物物理的特性、例えば、熱安定性、ｐＨアンフォールディングプロファイル、糖鎖付加の安定な除去、溶解性、生化学的機能（例えば、タンパク質、レセプターもしくはリガンドに結合する能力）など、及び／またはこれらを組み合わせたものをアッセイすることによって測定する。別の態様では、生化学的機能は、相互作用の結合親和性によって示される。一態様では、タンパク質の安定性の尺度は、熱安定性、すなわち、熱変化に対する耐性である。安定性は、当該技術分野において知られている方法（ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）、ＤＬＳ（動的光散乱）など）を用いて測定できる。熱安定性を測定する方法としては、示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、円偏光二色性（ＣＤ）及び熱変化アッセイが挙げられるが、これらに限らない。
【０２１７】
特定の態様では、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩタンパク質は、少なくとも１つの半減期延長因子、すなわち、異種の部分であって、その異種の部分が欠乏している対応するＦＶＩＩＩタンパク質のインビボ半減期よりも、ＦＶＩＩＩタンパク質のインビボ半減期を延長させる異種の部分を含む。ＦＶＩＩＩタンパク質のインビボ半減期は、当業者に知られているいずれかの方法、例えば、活性アッセイ（発色アッセイまたは一段階凝固ａＰＴＴアッセイ）、ＥＬＩＳＡ、ＲＯＴＥＭ（商標）などによって割り出すことができる。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、１つ以上の半減期延長因子が存在すると、そのような１つ以上の半減期延長因子が欠損している対応するタンパク質の半減期よりも、ＦＶＩＩＩタンパク質の半減期が長くなる。半減期延長因子を含むＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、そのような半減期延長因子が欠損している対応するＦＶＩＩＩタンパク質のインビボ半減期よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍または少なくとも約１２倍長い。
【０２１９】
一実施形態では、半減期延長因子を含むＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、そのような半減期延長因子が欠損している対応するタンパク質のインビボ半減期よりも、約１．５倍〜約２０倍、約１．５倍〜約１５倍または約１．５倍〜約１０倍長い。別の実施形態では、半減期延長因子を含むＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、そのような半減期延長因子が欠損している対応するタンパク質のインビボ半減期と比べて、約２倍〜約１０倍、約２倍〜約９倍、約２倍〜約８倍、約２倍〜約７倍、約２倍〜約６倍、約２倍〜約５倍、約２倍〜約４倍、約２倍〜約３倍、約２．５倍〜約１０倍、約２．５倍〜約９倍、約２．５倍〜約８倍、約２．５倍〜約７倍、約２．５倍〜約６倍、約２．５倍〜約５倍、約２．５倍〜約４倍、約２．５倍〜約３倍、約３倍〜約１０倍、約３倍〜約９倍、約３倍〜約８倍、約３倍〜約７倍、約３倍〜約６倍、約３倍〜約５倍、約３倍〜約４倍、約４倍〜約６倍、約５倍〜約７倍または約６倍〜約８倍長くなる。
【０２２０】
別の実施形態では、半減期延長因子を含むＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２７時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約２９時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３１時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３３時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３５時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約７２時間、少なくとも約８４時間、少なくとも約９６時間または少なくとも約１０８時間である。
【０２２１】
さらに別の実施形態では、半減期延長因子を含むＦＶＩＩＩタンパク質の半減期は、約１５時間〜約２週間、約１６時間〜約１週間、約１７時間〜約１週間、約１８時間〜約１週間、約１９時間〜約１週間、約２０時間〜約１週間、約２１時間〜約１週間、約２２時間〜約１週間、約２３時間〜約１週間、約２４時間〜約１週間、約３６時間〜約１週間、約４８時間〜約１週間、約６０時間〜約１週間、約２４時間〜約６日、約２４時間〜約５日、約２４時間〜約４日、約２４時間〜約３日または約２４時間〜約２日である。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、半減期延長因子を含むＦＶＩＩＩタンパク質の、対象１人当たりの平均半減期は、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間（１日）、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間（２日）、約５４時間、約６０時間、約７２時間（３日）、約８４時間、約９６時間（４日）、約１０８時間、約１２０時間（５日）、約６日、約７日（１週間）、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日または約１４日である。
【０２２３】
１つ以上の半減期延長因子は、ＦＶＩＩＩのＣ末端またはＮ末端に融合することも、ＦＶＩＩＩ内に挿入することもできる。
【０２２４】
１．免疫グロブリン定常領域またはその一部
別の態様では、異種の部分は、１つ以上の免疫グロブリン定常領域またはその一部（例えばＦｃ領域）を含む。一実施形態では、本開示の単離核酸分子は、免疫グロブリン定常領域またはその一部をコードする異種の核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、Ｆｃ領域である。
【０２２５】
免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ（定常重鎖）ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２など）であるドメインで構成されている。アイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）に応じて、定常領域は、３つまたは４つのＣＨドメインで構成されることもある。いくつかのアイソタイプ（例えばＩｇＧ）の定常領域は、ヒンジ領域も含む。Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。
【０２２６】
本開示のＦＶＩＩＩタンパク質を作製するための免疫グロブリン定常領域またはその一部は、多種多様な供給源から得ることができる。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ヒト免疫グロブリンに由来する。しかしながら、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、別の哺乳動物種（例えば、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）またはヒト以外の霊長類動物（例えば、チンパンジー、マカク）の種を含む）の免疫グロブリンに由来し得ることが分かる。さらに、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含むいずれかの免疫グロブリンクラスと、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むいずれかの免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。一実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１を用いる。
【０２２７】
公的に入手可能な寄託物の形態で、様々な免疫グロブリン定常領域遺伝子配列（例えば、ヒト定常領域遺伝子配列）が利用可能である。定常領域ドメイン配列は、特定のエフェクター機能を有するように（もしくは、特定のエフェクター機能が欠損するように）、または免疫原性を低下させる特定の改変を有するように選択することができる。抗体と、抗体をコードする遺伝子の多くの配列が公開されており、これらの配列から、当該技術分野で認識されている技法を用いて、好適なＩｇ定常領域配列（例えば、ヒンジ配列、ＣＨ２配列及び／もしくはＣＨ３配列、またはその一部）を導き出すことができる。そして、上記の方法のいずれかを用いて得た遺伝物質を改変または合成して、本開示のポリペプチドを得ることができる。さらに、本開示の範囲には、定常領域ＤＮＡ配列のアレル、バリアント及び変異が含まれることは明らかであろう。
【０２２８】
免疫グロブリン定常領域またはその一部の配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応と、目的のドメインを増幅する目的で選択されるプライマーとを用いてクローニングすることができる。抗体の免疫グロブリン定常領域またはその一部の配列をクローニングするには、ｍＲＮＡをハイブリドーマ細胞、脾臓細胞またはリンパ細胞から単離して、ＤＮＡに逆転写して、抗体遺伝子をＰＣＲによって増幅できる。ＰＣＲ増幅法は、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号と、例えば、“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．１９８９．Ｇｅｎｅ  ７７：５１、Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２７０）に詳細に説明されている。ＰＣＲは、公表されている、重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列とアミノ酸配列に基づき、コンセンサス定常領域プライマーによって、またはより特異性の高いプライマーによって開始できる。ＰＣＲを用いて、抗体の軽鎖と重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離することもできる。この場合には、ライブラリーは、コンセンサスプライマーまたはさらに大きい相同プローブ（マウス定常領域プローブなど）によってスクリーニングできる。抗体遺伝子の増幅に適するプライマーセットは、当該技術分野において数多く知られている（例えば、精製抗体のＮ末端配列（Ｂｅｎｈａｒ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ．１９９４．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：１５０９）、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（Ｒｕｂｅｒｔｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７３：３３）、抗体リーダー配列（Ｌａｒｒｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６０：１２５０）に基づく５’プライマー）。抗体配列のクローニングはさらに、１９９５年１月２５日に提出された、Ｎｅｗｍａｎらの米国特許第５，６５８，５７０号（参照により、本明細書に援用される）に説明されている。
【０２２９】
本発明で使用する免疫グロブリン定常領域は、すべてのドメインとヒンジ領域、またはその一部を含むことができる。一実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインと、ヒンジ領域、すなわち、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む。
【０２３０】
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域」という用語は、ネイティブＩｇのＦｃ領域に対応するポリペプチド部分、すなわち、２つの重鎖のそれぞれのＦｃドメインの二量体会合によって形成されるような部分として定義する。ネイティブＦｃ領域は、もう一方のＦｃ領域とホモ二量体を形成する。これに対して、「遺伝子工学によって融合したＦｃ領域」または「一本鎖Ｆｃ領域」（ｓｃＦｃ領域）という用語は、本明細書で使用する場合、１本のポリペプチド鎖において、遺伝子工学によって連結された（すなわち、１つの連続する遺伝子配列でコードされた）Ｆｃドメインで構成された合成二量体Ｆｃ領域を指す。国際公開第２０１２／００６６３５号（参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
【０２３１】
一実施形態では、「Ｆｃ領域」とは、１つのＩｇ重鎖の部分のうち、ヒンジ領域において、パパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の第１の残基を１１４位としたときのＩｇＧの２１６位の残基）のすぐ上流から始まり、その抗体のＣ末端で終わる部分を指す。したがって、完全Ｆｃ領域は少なくとも、ヒンジドメインと、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインを含む。
【０２３２】
免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ＦｃＲｎ結合パートナーであることができる。ＦｃＲｎは、成人上皮組織において活性を有し、腸の内腔、肺気道、鼻腔内表面、膣表面、大腸表面及び直腸表面で発現する（米国特許第６，４８５，７２６号）。ＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎに結合する免疫グロブリン部分である。
【０２３３】
ＦｃＲｎレセプターは、ヒトを含むいくつかの哺乳動物種から単離されている。ヒトＦｃＲｎ、サルＦｃＲｎ、ラットＦｃＲｎ及びマウスＦｃＲｎの配列は、既知である（Ｓｔｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３７７）。ＦｃＲｎレセプターは、比較的低いｐＨにおいてＩｇＧに結合し（ただし、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥのような他の免疫グロブリンクラスには結合しない）、ＩｇＧを経細胞的に、内腔から漿膜への方向に能動的に輸送し、そして、間質液で見られる相対的に高いｐＨにおいて、ＩｇＧを放出する。ＦｃＲｎレセプターは、成人上皮組織（米国特許第６，４８５，７２６号、同第６，０３０，６１３号、同第６，０８６，８７５号、ＷＯ０３／０７７８３４、ＵＳ２００３−０２３５５３６Ａ１）（肺及び腸上皮（Ｉｓｒａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９２：６９）、近位尿細管上皮（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８２：Ｆ３５８）を含む）と、鼻上皮と、膣表面と、胆道系表面で発現する。
【０２３４】
本開示において有用なＦｃＲｎ結合パートナーには、全ＩｇＧ、ＩｇＧのＦｃ断片、及び完全なＦｃＲｎレセプター結合領域を含むその他の断片を含め、ＦｃＲｎレセプターが特異的に結合できる分子が含まれる。ＩｇＧのＦｃ部分のうち、ＦｃＲｎレセプターに結合する領域は、Ｘ線結晶構造解析に基づき説明されている（Ｂｕｒｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３７９）。ＦｃとＦｃＲｎとの主な接触区域は、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの連結部の近くである。Ｆｃ−ＦｃＲｎ接触部はすべて、１つのＩｇ重鎖内に存在する。ＦｃＲｎ結合パートナーとしては、全ＩｇＧと、ＩｇＧのＦｃ断片と、完全なＦｃＲｎ結合領域を含むその他のＩｇＧ断片が挙げられる。主な接触部位には、ＣＨ２ドメインの２４８位、２５０〜２５７位、２７２位、２８５位、２８８位、２９０〜２９１位、３０８〜３１１位及び３１４位のアミノ酸残基と、ＣＨ３ドメインの３８５〜３８７位、４２８位及び４３３〜４３６位のアミノ酸残基が含まれる。免疫グロブリン、または免疫グロブリンの断片もしくは領域のアミノ酸の番号に言及している場合には、いずれも、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．に基づいている。
【０２３５】
ＦｃＲｎに結合したＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーは、ＦｃＲｎによって、上皮バリアを越えて効率的に運ぶことができるので、所望の治療的分子を全身投与するための非侵襲的手段が得られる。加えて、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを含む融合タンパク質は、ＦｃＲｎを発現している細胞に貪食される。しかし、これらの融合タンパク質は、分解の対象にはならずに、リサイクルされて、再度血液循環に入るので、これらのタンパク質のインビボ半減期は長くなる。特定の実施形態では、免疫グロブリン定常領域部分は、典型的にはジスルフィド結合とその他の非特異的相互作用を介して、別のＦｃ領域または別のＦｃＲｎ結合パートナーと会合して、二量体以上の多量体を形成するＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーである。
【０２３６】
２つのＦｃＲｎレセプターが１つのＦｃ分子と結合することができる。結晶学的データから、各ＦｃＲｎ分子が、Ｆｃホモ二量体の１つのポリペプチドと結合することが示唆されている。一実施形態では、ＦｃＲｎ結合パートナー、例えばＩｇＧのＦｃ断片を生物活性分子に連結することで、その生物活性分子の経口送達、口腔内送達、舌下送達、直腸送達、膣内送達、経鼻投与を行うエアゾール剤としての送達、経肺経路による送達または眼局所経路による送達を行う手段が得られる。別の実施形態では、ＦＶＩＩＩタンパク質は、侵襲的に投与、例えば、皮下投与、静脈内投与できる。
【０２３７】
ＦｃＲｎ結合パートナー領域は、ＦｃＲｎレセプターが特異的に結合し、その結果、Ｆｃ領域をＦｃＲｎレセプターによって能動輸送できる分子またはその一部である。特異的な結合とは、生理的条件下で比較的安定である複合体を形成する２つの分子を指す。通常、親和性が高く、容量が中度から高度な非特異的な結合と区別される形で、特異的な結合は、高い親和性と、低度から中度の容量によって特徴付けられる。典型的には、親和性定数ＫＡが、１０６Ｍ−１超または１０８Ｍ−１超であるときに、結合は特異的であるとみなす。必要な場合、結合条件を変えることによって、特異的な結合に実質的な影響を及ぼすことなく、非特異的な結合を低減できる。適切な結合条件（分子の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合させる時間、ブロッキング剤（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度など）は、当業者であれば、常法を用いて最適化できる。
【０２３８】
特定の実施形態では、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩタンパク質は、トランケート型Ｆｃ領域であって、トランケート型にもかかわらず、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合特性をＦｃ領域に付与するのに十分であるトランケート型Ｆｃ領域を１つ以上含む。例えば、ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域部分（すなわち、ＦｃＲｎ結合部分）は、ＥＵの番号付けで、ＩｇＧ１の２８２〜４３８位周辺のアミノ酸を含む（主要な接触部位は、ＣＨ２ドメインの２４８位、２５０〜２５７位、２７２位、２８５位、２８８位、２９０〜２９１位、３０８〜３１１位及び３１４位のアミノ酸と、ＣＨ３ドメインの３８５〜３８７位、４２８位及び４３３〜４３６位のアミノ酸残基である）。すなわち、本開示のＦｃ領域は、ＦｃＲｎ結合部分を含むか、またはＦｃＲｎ結合部分からなることができる。ＦｃＲｎ結合部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含め、いずれかのアイソタイプの重鎖に由来することができる。一実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１の抗体のＦｃＲｎ結合部分が用いられている。別の実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ４の抗体のＦｃＲｎ結合部分が用いられている。
【０２３９】
Ｆｃ領域は、多種多様な供給源から得ることができる。一実施形態では、本開示のポリペプチドのＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリンに由来している。しかしながら、Ｆｃ部分は、別の哺乳動物種（例えば、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット）またはヒト以外の霊長類動物（例えば、チンパンジー、マカク）の種を含む）の免疫グロブリンに由来し得ることが分かる。さらに、Ｆｃドメインまたはその一部のポリペプチドは、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含むいずれかの免疫グロブリンクラスと、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むいずれかの免疫グロブリンアイソタイプに由来し得る。別の実施形態では、ヒトアイソタイプＩｇＧ１を用いる。
【０２４０】
特定の実施形態では、Ｆｃバリアントによって、前記野生型Ｆｃドメインを含むＦｃ部分によって付与される少なくとも１つのエフェクター機能が変化する（例えば、Ｆｃ領域がＦｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩもしくはＦｃγＲＩＩＩ）もしくは補体タンパク質（例えばＣ１ｑ）に結合したり、または抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）、食作用もしくは補体依存性細胞障害性（ＣＤＣＣ）を誘発したりする能力が改善または低下する）。別の実施形態では、Ｆｃバリアントは、操作されたシステイン残基をもたらす。
【０２４１】
本開示のＦｃ領域は、当該技術分野において認識されているＦｃバリアントのうち、エフェクター機能及び／またはＦｃＲもしくはＦｃＲｎの結合を変化させる（例えば、増強または低減させる）ことが知られているＦｃバリアントを用いることができる。具体的には、本開示のＦｃ領域は例えば、国際公開第８８／０７０８９Ａ１号、同第９６／１４３３９Ａ１号、同第９８／０５７８７Ａ１号、同第９８／２３２８９Ａ１号、同第９９／５１６４２Ａ１号、同第９９／５８５７２Ａ１号、同第００／０９５６０Ａ２号、同第００／３２７６７Ａ１号、同第００／４２０７２Ａ２号、同第０２／４４２１５Ａ２号、同第０２／０６０９１９Ａ２号、同第０３／０７４５６９Ａ２号、同第０４／０１６７５０Ａ２号、同第０４／０２９２０７Ａ２号、同第０４／０３５７５２Ａ２号、同第０４／０６３３５１Ａ２号、同第０４／０７４４５５Ａ２号、同第０４／０９９２４９Ａ２号、同第０５／０４０２１７Ａ２号、同第０４／０４４８５９号、同第０５／０７０９６３Ａ１号、同第０５／０７７９８１Ａ２号、同第０５／０９２９２５Ａ２号、同第０５／１２３７８０Ａ２号、同第０６／０１９４４７Ａ１号、同第０６／０４７３５０Ａ２号及び同第０６／０８５９６７Ａ２号、米国特許出願公開第ＵＳ２００７／０２３１３２９号、同第２００７／０２３１３２９号、同第２００７／０２３７７６５号、同第２００７／０２３７７６６号、同第２００７／０２３７７６７号、同第２００７／０２４３１８８号、同第２００７０２４８６０３号、同第２００７０２８６８５９号、同第２００８００５７０５６号、または米国特許第５，６４８，２６０号、同第５，７３９，２７７号、同第５，８３４，２５０号、同第５，８６９，０４６号、同第６，０９６，８７１号、同第６，１２１，０２２号、同第６，１９４，５５１号、同第６，２４２，１９５号、同第６，２７７，３７５号、同第６，５２８，６２４号、同第６，５３８，１２４号、同第６，７３７，０５６号、同第６，８２１，５０５号、同第６，９９８，２５３号、同第７，０８３，７８４号、同第７，４０４，９５６号及び同第７，３１７，０９１号（それぞれ、参照により、本明細書に援用される）に開示されているアミノ酸位置のうちの１つ以上に、変更（例えば置換）を含むことができる。一実施形態では、この具体的な変更（例えば、当該技術分野において開示されている１つ以上のアミノ酸の具体的な置換）は、開示されているアミノ酸位置のうちの１つ以上において施すことができる。別の実施形態では、開示されているアミノ酸位置のうちの１つ以上において、異なる変更（例えば、当該技術分野において開示されている１つ以上のアミノ酸位置において、異なる置換）を施すことができる。
【０２４２】
十分に認識されている手順（部位特異的変異誘発など）に従って、ＩｇＧのＦｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーを改変して、改変型ＩｇＧもしくはＦｃ断片、またはその一部のうち、ＦｃＲｎが結合することになる一部を得ることができる。このような改変としては、ＦｃＲｎ接触部位から離れた場所の改変と、ＦｃＲｎへの結合を保持させるか、またはさらにはＦｃＲｎへの結合を増強する、接触部位内の改変が挙げられる。例えば、Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｋ２４８Ａ、Ｄ２４９Ａ、Ｍ２５２Ａ、Ｔ２５６Ａ、Ｅ２５８Ａ、Ｔ２６０Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ａ、Ｈ２６８Ａ、Ｅ２６９Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｅ２７２Ａ、Ｌ２７４Ａ、Ｎ２７６Ａ、Ｙ２７８Ａ、Ｄ２８０Ａ、Ｖ２８２Ａ、Ｅ２８３Ａ、Ｈ２８５Ａ、Ｎ２８６Ａ、Ｔ２８９Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｒ２９２Ａ、Ｅ２９３Ａ、Ｅ２９４Ａ、Ｑ２９５Ａ、Ｙ２９６Ｆ、Ｎ２９７Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｆ、Ｒ３０１Ａ、Ｖ３０３Ａ、Ｖ３０５Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｌ３０９Ａ、Ｑ３１１Ａ、Ｄ３１２Ａ、Ｎ３１５Ａ、Ｋ３１７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｓ３２４Ａ、Ｋ３２６Ａ、Ａ３２７Ｑ、Ｐ３２９Ａ、Ａ３３０Ｑ、Ｐ３３１Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｔ３３５Ａ、Ｓ３３７Ａ、Ｋ３３８Ａ、Ｋ３４０Ａ、Ｑ３４２Ａ、Ｒ３４４Ａ、Ｅ３４５Ａ、Ｑ３４７Ａ、Ｒ３５５Ａ、Ｅ３５６Ａ、Ｍ３５８Ａ、Ｔ３５９Ａ、Ｋ３６０Ａ、Ｎ３６１Ａ、Ｑ３６２Ａ、Ｙ３７３Ａ、Ｓ３７５Ａ、Ｄ３７６Ａ、Ａ３７８Ｑ、Ｅ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｓ３８３Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｑ３８６Ａ、Ｅ３８８Ａ、Ｎ３８９Ａ、Ｎ３９０Ａ、Ｙ３９１Ｆ、Ｋ３９２Ａ、Ｌ３９８Ａ、Ｓ４００Ａ、Ｄ４０１Ａ、Ｄ４１３Ａ、Ｋ４１４Ａ、Ｒ４１６Ａ、Ｑ４１８Ａ、Ｑ４１９Ａ、Ｎ４２１Ａ、Ｖ４２２Ａ、Ｓ４２４Ａ、Ｅ４３０Ａ、Ｎ４３４Ａ、Ｔ４３７Ａ、Ｑ４３８Ａ、Ｋ４３９Ａ、Ｓ４４０Ａ、Ｓ４４４Ａ及びＫ４４７Ａ（例えば、Ｐ２３８Ａは、２３８位の野生型プロリンのアラニンへの置換を表す）のように、ＦｃＲｎに対するＦｃ結合親和性を有意に喪失することなく、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（Ｆｃγ１）における１つのアミノ酸残基を置換できる。一例としては、具体的な実施形態では、Ｎ２９７Ａの変異を組み込んで、高度に保存されたＮ糖鎖付加部位を除去している。アラニンに加えて、上で定めた位置の野生型アミノ酸を他のアミノ酸で置換できる。変異を個々にＦｃに組み込んで、ネイティブＦｃと異なるＦｃ領域を１００個超もたらすことができる。加えて、これらの個々の変異を２つ、３つまたは４つ以上を組み合わせたものを一緒に組み込んで、１００個以上のＦｃ領域をもたらすことができる。
【０２４３】
上記のうちの特定の変異により、Ｆｃ領域またはＦｃＲｎ結合パートナーに、新たな機能を付与できる。例えば、一実施形態では、Ｎ２９７Ａを組み込んで、高度に保存されたＮ糖鎖付加部位を除去している。この変異の作用は、免疫原性を低減することによって、Ｆｃ領域の循環血液中半減期を延長することと、ＦｃＲｎに対する親和性を損なうことなく、Ｆｃ領域がＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ及びＦｃγＲＩＩＩＡに結合できないようにすることである（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６０：８４７、Ｆｒｉｅｎｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：１６３２、Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１）。上記の変異に起因する新たな機能のさらなる例として、いくつかのケースでは、ＦｃＲｎに対する親和性を野生型の親和性よりも向上させることができる。この親和性の向上は、「会合」速度の上昇、「解離」速度の低下、または「会合」速度の上昇と「解離」速度の低下の両方の反映であり得る。ＦｃＲｎに対する親和性を向上させると考えられる変異の例としては、Ｔ２５６Ａ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ及びＮ４３４Ａが挙げられるが、これらに限らない（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１）。
【０２４４】
加えて、少なくとも３つのヒトＦｃγレセプターは、下流のヒンジ領域、概して２３４〜２３７位のアミノ酸内の、ＩｇＧ上の結合部位を認識すると見られる。したがって、新たな機能と、免疫原性の潜在的な低減の別の例は、例えば、ヒトＩｇＧ１の２３３〜２３６位のアミノ酸「ＥＬＬＧ」（配列番号４５）を、ＩｇＧ２の対応する配列「ＰＶＡ」（アミノ酸が１つ欠失している）で置換することによるなど、この領域の変異に起因し得る。このような変異を導入すると、様々なエフェクター機能を媒介するＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩが、ＩｇＧ１に結合しなくなることが示されている。Ｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｇｈｅｔｉｅ  １９９５，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：７７及びＡｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：２６１３。
【０２４５】
別の実施形態では、免疫グロブリン定常領域またはその一部は、ヒンジ領域またはその一部に、第２の免疫グロブリン定常領域またはその一部と１つ以上のジスルフィド結合を形成するアミノ酸配列を含む。この第２の免疫グロブリン定常領域またはその一部は、第２のポリペプチドに連結して、ＦＶＩＩＩタンパク質と第２のポリペプチドを一体にするようにできる。いくつかの実施形態では、この第２のポリペプチドは、エンハンサー部分である。本明細書で使用する場合、「エンハンサー部分」という用語は、ＦＶＩＩＩの凝固促進活性を増強できる分子、その断片またはポリペプチドの構成要素を指す。このエンハンサー部分は、補因子（可溶性組織因子（ｓＴＦ）など）または凝固促進ペプチドであることができる。したがって、ＦＶＩＩＩの活性化の際に、このエンハンサー部分は、ＦＶＩＩＩ活性を増強する目的で利用可能である。
【０２４６】
特定の実施形態では、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩタンパク質は、免疫グロブリン定常領域またはその一部（例えばＦｃバリアント）に対するアミノ酸置換であって、Ｉｇ定常領域の抗原依存性エフェクター機能、特には、タンパク質の循環血液中半減期を変化させるアミノ酸置換を含む。
【０２４７】
２．ｓｃＦｃ領域
別の態様では、異種の部分は、ｓｃＦｃ（一本鎖Ｆｃ）領域を含む。一実施形態では、本開示の単離核酸分子は、ＳｃＦｃ領域をコードする異種の核酸配列をさらに含む。このｓｃＦｃ領域は、同じ直鎖状ポリペプチド鎖内に、フォールディング（例えば分子内または分子間フォールディング）して、Ｆｃペプチドリンカーによって連結されている１つの機能性ｓｃＦｃ領域を形成できる少なくとも２つの免疫グロブリン定常領域またはその一部（例えば、Ｆｃ部分もしくはＦｃドメイン（例えば、２個、３個、４個、５個、６個もしくは７個以上のＦｃ部分もしくはドメイン））を含む。例えば、一実施形態では、半減期を改善したり、免疫エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞障害性（ＡＤＣＣ）、食作用もしくは補体依存性細胞障害性（ＣＤＣＣ））を誘発したり、及び／または製造性を改善したりする目的で、本開示のポリペプチドは、そのＳｃＦｃ領域を介して、少なくとも１つのＦｃレセプター（例えば、ＦｃＲｎ、ＦｃγＲレセプター（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）または補体タンパク質（例えばＣ１ｑ））に結合できる。
【０２４８】
３．ＣＴＰ
別の態様では、異種の部分は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、またはその断片、バリアントもしくは誘導体を１つ含む。組み換えタンパク質に挿入された１つ以上のＣＴＰペプチドは、そのタンパク質のインビボ半減期を延長することが知られている。例えば、米国特許第５，７１２，１２２号（参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
【０２４９】
例示的なＣＴＰペプチドとしては、ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬ（配列番号３３）またはＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号３４）が挙げられる。例えば、米国特許出願公開第２００９／００８７４１１Ａ１号（参照により、援用される）を参照されたい。
【０２５０】
４．ＸＴＥＮ配列
いくつかの実施形態では、異種の部分は、１つ以上のＸＴＥＮ配列、その断片、バリアントまたは誘導体を含む。本明細書で使用する場合、「ＸＴＥＮ配列」とは、非天然かつ実質的に非反復の配列であって、低分子親水性アミノ酸で主に構成されている配列を有する伸展長ポリペプチドを指し、この配列は、生理的条件下では、二次構造もしくは三次構造を取る程度が低いか、または二次構造もしくは三次構造を取らない。異種の部分として、ＸＴＥＮは、半減期延長部分としての機能を果たすことができる。加えて、ＸＴＥＮは、所望の特性（薬物動態パラメーターと溶解性特性の増強が挙げられるが、これらに限らない）をもたらすことができる。
【０２５１】
ＸＴＥＮ配列を含む異種の部分を本開示のタンパク質に導入すると、そのタンパク質に、コンフォメーション柔軟性、水溶解性の向上、高度なプロテアーゼ耐性、低免疫原性、哺乳動物レセプターへの低結合性、または流体力学的（もしくはストークス）半径の増大という有益な特性のうちの１つ以上を付与できる。
【０２５２】
特定の態様では、ＸＴＥＮ配列は、インビボ半減期の延長または曲線下面積（ＡＵＣ）の増大など、薬物動態特性を向上させることができ、その結果、本開示のタンパク質は、インビボに留まり、ＸＴＥＮという異種の部分を有さないこと以外は同じであるタンパク質よりも長期間にわたって、凝固促進活性を有する。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、本開示で有用なＸＴＥＮ配列は、約２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、６００個、６５０個、７００個、７５０個、８００個、８５０個、９００個、９５０個、１０００個、１２００個、１４００個、１６００個、１８００個または２０００個超のアミノ酸残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。特定の実施形態では、ＸＴＥＮは、約２０〜約３０００個超のアミノ酸残基、３０〜約２５００個超の残基、４０〜約２０００個の残基、５０〜約１５００超の残基、６０〜約１０００個の残基、７０〜約９００個の残基、８０〜約８００個の残基、９０〜約７００個の残基、１００〜約６００個の残基、１１０〜約５００個の残基または１２０〜約４００個の残基を有するペプチドまたはポリペプチドである。特定的な一実施形態では、ＸＴＥＮは、４２個超のアミノ酸の長さ、かつ１４４個未満のアミノ酸の長さであるアミノ酸配列を含む。
【０２５４】
本開示のＸＴＥＮ配列は、５〜１４個（例えば９〜１４個）のアミノ酸残基の１つ以上の配列モチーフ、またはその配列モチーフと少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、そのモチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）からなる群から選択した４〜６種類のアミノ酸（例えば５種類のアミノ酸）を含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなる。ＵＳ２０１０−０２３９５５４Ａ１を参照されたい。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮは、配列の約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％が、表４から選択した１つのモチーフファミリーから選択した非重複配列の複数ユニットからなる（その結果、ファミリー配列が得られる）非重複配列モチーフを含む。本明細書で使用する場合、「ファミリー」とは、ＸＴＥＮが、表４の１つのモチーフカテゴリー、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣまたはＢＤのＸＴＥＮのみから選択したモチーフを有することと、ＸＴＥＮにおけるアミノ酸のうち、ファミリーモチーフに由来しないいずれかの他のアミノ酸は、必要な特性を得られるように、例えば、コードヌクレオチドによって制限部位を導入できるように、切断配列を導入できるように、またはＦＶＩＩＩへの連結を向上させるように選択されていることを意味する。ＸＴＥＮファミリーのいくつかの実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、ＡＤモチーフファミリー、ＡＥモチーフファミリー、ＡＦモチーフファミリー、ＡＧモチーフファミリー、ＡＭモチーフファミリー、ＡＱモチーフファミリー、ＢＣファミリーまたはＢＤファミリーの非重複配列モチーフを複数ユニット含み、得られたＸＴＥＮは、上記の範囲の相同性を示す。別の実施形態では、ＸＴＥＮは、表２Ａのモチーフファミリーのうちの２つ以上からのモチーフ配列を複数ユニット含む。これらの配列は、下にさらに詳しく説明されている、そのモチーフのアミノ酸組成物によって付与される実効電荷、親水性、二次構造の欠乏または反復性の欠乏のような特性を含む所望の物理的／化学的特徴を得られるように選択できる。この段落で説明されている上記の実施形態では、本明細書に記載されている方法を用いて、ＸＴＥＮに導入するモチーフを選択及びアセンブルして、約３６〜約３０００個のアミノ酸残基のＸＴＥＮを得ることができる。
【表４−１】
2019506166.tif 000013
【表４−２】
2019506166.tif 000014
＊様々な並べ替えで併せて用いると、「ファミリー配列」が得られる個々のモチーフ配列を示している。
【０２５６】
本開示のキメラタンパク質において、異種の部分として使用できるＸＴＥＮ配列の例は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４Ａ１号、同第２０１０／０３２３９５６Ａ１号、同第２０１１／００４６０６０Ａ１号、同第２０１１／００４６０６１Ａ１号、同第２０１１／００７７１９９Ａ１号もしくは同第２０１１／０１７２１４６Ａ１号、または国際公開第２０１００９１１２２Ａ１号、同第２０１０１４４５０２Ａ２号、同第２０１０１４４５０８Ａ１号、同第２０１１０２８２２８Ａ１号、同第２０１１０２８２２９Ａ１もしくは同第２０１１０２８３４４Ａ２号（それぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されている。
【０２５７】
ＦＶＩＩＩに挿入または連結するために、ＸＴＥＮの長さは様々であることができる。一実施形態では、ＸＴＥＮ配列（複数可）の長さは、融合タンパク質において実現したい特性または機能に基づいて選択する。意図する特性または機能に応じて、ＸＴＥＮは、長さが短いかもしくは中程度の配列、または担体としての役割を果たすことができるさらに長い配列であることができる。特定の実施形態では、ＸＴＥＮは、約６〜約９９個のアミノ酸残基という短いセグメント、約１００〜約３９９個のアミノ酸残基という中程度の長さ、約４００〜約１０００個、かつ最大で約３０００個のアミノ酸残基というさらに長い長さを含む。したがって、ＦＶＩＩＩに挿入または連結するＸＴＥＮは、長さが、約６個、約１２個、約３６個、約４０個、約４２個、約７２個、約９６個、約１４４個、約２８８個、約４００個、約５００個、約５７６個、約６００個、約７００個、約８００個、約８６４個、約９００個、約１０００個、約１５００個、約２０００個、約２５００または最大で約３０００個のアミノ酸残基の長さであることができる。別の実施形態では、ＸＴＥＮ配列は、約６〜約５０個、約５０〜約１００個、約１００〜１５０個、約１５０〜２５０個、約２５０〜４００個、約４００〜約５００個、約５００〜約９００個、約９００〜１５００個、約１５００〜２０００個または約２０００〜約３０００個のアミノ酸残基の長さである。ＦＶＩＩＩに挿入または連結するＸＴＥＮの正確な長さは、ＦＶＩＩＩの活性に有意な影響を及ぼさなければ、様々であることができる。一実施形態では、本発明で用いるＸＴＥＮの１つ以上は、４２個のアミノ酸、７２個のアミノ酸、１４４個のアミノ酸、２８８個のアミノ酸、５７６個のアミノ酸または８６４個のアミノ酸の長さであり、ＸＴＥＮファミリー配列、すなわち、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＱ、ＢＣまたはＢＤのうちの１つ以上から選択できる。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、本開示で用いるＸＴＥＮ配列は、ＡＥ４２、ＡＧ４２、ＡＥ４８、ＡＭ４８、ＡＥ７２、ＡＧ７２、ＡＥ１０８、ＡＧ１０８、ＡＥ１４４、ＡＦ１４４、ＡＧ１４４、ＡＥ１８０、ＡＧ１８０、ＡＥ２１６、ＡＧ２１６、ＡＥ２５２、ＡＧ２５２、ＡＥ２８８、ＡＧ２８８、ＡＥ３２４、ＡＧ３２４、ＡＥ３６０、ＡＧ３６０、ＡＥ３９６、ＡＧ３９６、ＡＥ４３２、ＡＧ４３２、ＡＥ４６８、ＡＧ４６８、ＡＥ５０４、ＡＧ５０４、ＡＦ５０４、ＡＥ５４０、ＡＧ５４０、ＡＦ５４０、ＡＤ５７６、ＡＥ５７６、ＡＦ５７６、ＡＧ５７６、ＡＥ６１２、ＡＧ６１２、ＡＥ６２４、ＡＥ６４８、ＡＧ６４８、ＡＧ６８４、ＡＥ７２０、ＡＧ７２０、ＡＥ７５６、ＡＧ７５６、ＡＥ７９２、ＡＧ７９２、ＡＥ８２８、ＡＧ８２８、ＡＤ８３６、ＡＥ８６４、ＡＦ８６４、ＡＧ８６４、ＡＭ８７５、ＡＥ９１２、ＡＭ９２３、ＡＭ１３１８、ＢＣ８６４、ＢＤ８６４、ＡＥ９４８、ＡＥ１０４４、ＡＥ１１４０、ＡＥ１２３６、ＡＥ１３３２、ＡＥ１４２８、ＡＥ１５２４、ＡＥ１６２０、ＡＥ１７１６、ＡＥ１８１２、ＡＥ１９０８、ＡＥ２００４Ａ、ＡＧ９４８、ＡＧ１０４４、ＡＧ１１４０、ＡＧ１２３６、ＡＧ１３３２、ＡＧ１４２８、ＡＧ１５２４、ＡＧ１６２０、ＡＧ１７１６、ＡＧ１８１２、ＡＧ１９０８、ＡＧ２００４及びこれらをいずれかに組み合わせたものからなる群から選択した配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。ＵＳ２０１０−０２３９５５４Ａ１を参照されたい。特定的な一実施形態では、ＸＴＥＮは、ＡＥ４２、ＡＥ７２、ＡＥ１４４、ＡＥ２８８、ＡＥ５７６、ＡＥ８６４、ＡＧ４２、ＡＧ７２、ＡＧ１４４、ＡＧ２８８、ＡＧ５７６、ＡＧ８６４またはこれらをいずれかに組み合わせたものを含む。
【０２５９】
本開示のキメラタンパク質において、異種の部分として使用できる例示的なＸＴＥＮ配列としては、ＸＴＥＮ  ＡＥ４２−４（配列番号４７（１１Ｄ）によってコードされる配列番号４６（図１１Ｃ））、ＸＴＥＮ  １４４−２Ａ（配列番号４９（図１１Ｆ）によってコードされる配列番号４８（図１１Ｅ））、ＸＴＥＮ  Ａ１４４−３Ｂ（配列番号５１（図１１Ｈ）によってコードされる配列番号５０（図１１Ｇ））、ＸＴＥＮ  ＡＥ１４４−４Ａ（配列番号５３（図１１Ｊ）によってコードされる配列番号５２（図１１Ｉ））、ＸＴＥＮ  ＡＥ１４４−５Ａ（配列番号５５（１１Ｌ）によってコードされる配列番号５４（図１１Ｋ））、ＸＴＥＮ  ＡＥ１４４−６Ｂ（配列番号５７（１１Ｎ）によってコードされる配列番号５６（図１１Ｍ））、ＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−１（配列番号５９（１１Ｐ）によってコードされる配列番号５８（図１１Ｏ））、ＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−Ａ（配列番号６１（図１１Ｒ）によってコードされる配列番号６０（図１１Ｑ））、ＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−Ｂ（配列番号６３（図１１Ｔ）によってコードされる配列番号６２（図１１Ｓ））、ＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−Ｃ（配列番号６５（図１１Ｖ）によってコードされる配列番号６４（図１１Ｕ））及びＸＴＥＮ  ＡＧ１４４−Ｆ（配列番号６７（図１１Ｘ）によってコードされる配列番号６６（図１１Ｗ））が挙げられる。特定的な一実施形態では、ＸＴＥＮは、配列番号１８によってコードされる。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、ＸＴＥＮのアミノ酸の１００％未満が、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）及びプロリン（Ｐ）から選択されているか、または配列の１００％未満が、表２Ａの配列モチーフまたは本発明で提供するＸＴＥＮ配列からなっている。このような実施形態では、ＸＴＥＮの残りのアミノ酸残基は、その他の１４個の天然Ｌ−アミノ酸のうちのいずれかから選択されているが、ＸＴＥＮ配列が、親水性アミノ酸を少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または少なくとも約９９％含むように、親水性アミノ酸から優先的に選択できる。本開示の共役コンストラクトで用いるＸＴＥＮにおける疎水性アミノ酸の含有率は、５％未満、２％未満または１％未満であることができる。ＸＴＥＮの構築の際に、あまり好ましくない疎水性残基としては、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、バリン及びメチオニンが挙げられる。加えて、ＸＴＥＮ配列は、メチオニン（例えば、酸化を回避する目的）またはアスパラギン及びグルタミン（脱アミド化を回避する目的）というアミノ酸を５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満または０％含むことができる。
【０２６１】
１つ以上のＸＴＥＮ配列は、本開示のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列のＣ末端またはＮ末端に挿入することも、本開示のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列内の２つのアミノ酸の間に挿入することもできる。例えば、ＸＴＥＮは、表３から選択した１つ以上の挿入部位で、２つのアミノ酸の間に挿入できる。ＦＶＩＩＩ内の部位のうち、ＸＴＥＮの挿入部位として許容できる例は、例えば、国際公開第２０１３／１２３４５７Ａ１号または米国特許出願公開第２０１５／０１５８９２９Ａ１号（これらは、参照により、その全体が本明細書に援用される）に見ることができる。
【０２６２】
５．アルブミン、またはその断片、誘導体もしくはバリアント
いくつかの実施形態では、異種の部分は、アルブミンまたはその機能性断片を含む。完全長形態では６０９個のアミノ酸のタンパク質であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡまたはＨＡ）は、血清の浸透圧のかなりの部分を担っており、内因性リガンドと外因性リガンドの担体としても機能する。本明細書で使用する場合、「アルブミン」という用語には、完全長アルブミン、またはその機能性断片、バリアント、誘導体もしくはアナログが含まれる。アルブミン、またはその断片もしくはバリアントの例は、米国特許出願公開第２００８／０１９４４８１Ａ１号、同第２００８／０００４２０６Ａ１号、同第２００８／０１６１２４３Ａ１号、同第２００８／０２６１８７７Ａ１号もしくは同第２００８／０１５３７５１Ａ１号、または国際公開第２００８／０３３４１３Ａ２号、同第２００９／０５８３２２Ａ１号もしくは同第２００７／０２１４９４Ａ２号（参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されている。
【０２６３】
一実施形態では、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩタンパク質は、免疫グロブリン定常領域またはその一部（例えばＦｃ領域）、ＰＡＳ配列、ＨＥＳ及びＰＥＧからなる群から選択した第２の異種の部分にさらに連結されたアルブミン、その断片またはバリアントを含む。
【０２６４】
６．アルブミン結合部分
特定の実施形態では、異種の部分は、アルブミン結合ペプチド、細菌アルブミン結合ドメイン、アルブミン結合抗体断片またはこれらをいずれかに組み合わせたものを含むアルブミン結合部分を含む。
【０２６５】
例えば、アルブミン結合タンパク質は、細菌アルブミン結合タンパク質、ドメイン抗体を含む抗体または抗体断片であることができる（米国特許第６，６９６，２４５号を参照されたい）。アルブミン結合タンパク質は例えば、細菌アルブミン結合ドメイン（連鎖球菌プロテインＧの細菌アルブミン結合ドメインなど）であることができる（Ｋｏｎｉｇ，Ｔ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２１８，７３−８３）。共役パートナーとして使用できるアルブミン結合ペプチドの他の例は例えば、米国特許出願公開第２００３／００６９３９５号またはＤｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３５０３５−３５０４３）に記載されているように、Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓというコンセンサス配列を有するアルブミン結合ペプチドであり、このＸａａ１は、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＴｒｐであり、Ｘａａ２は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＬｙｓであり、Ｘａａ３は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒであり、Ｘａａ４は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ＳｅｒまたはＴｈｒである。
【０２６６】
Ｋｒａｕｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３７８：１９０−１９４（１９９６）及びＬｉｎｈｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１１：２０６−２１３（２００２）によって開示されているように、連鎖球菌プロテインＧのドメイン３は、細菌アルブミン結合ドメインの一例である。アルブミン結合ペプチドの例としては、コア配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号３５）を有する一連のペプチドが挙げられる。例えば、Ｄｅｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）を参照されたい。アルブミン結合抗体断片の例は、Ｍｕｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．９：３１９−３２６（２００７）、Ｒｏｏｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６：３０３−３１７（２００７）及びＨｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ  Ｓｃｉ．，２１：２８３−２８８（２００８）（参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されている。このようなアルブミン結合部分の例は、Ｔｒｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２０：２２８６−２２９２（２００９）によって開示されているような２−（３−マレイミドプロパンアミド）−６−（４−（４−ヨードフェニル）ブタンアミド）ヘキサノエート（「Ａｌｂｕ」タグ）である。
【０２６７】
脂肪酸、特に、長鎖脂肪酸（ＬＣＦＡ）及び長鎖脂肪酸様アルブミン結合化合物を用いて、本開示のＦＶＩＩＩタンパク質のインビボ半減期を延長できる。ＬＣＦＡ様アルブミン結合化合物の例は、１６−（１−（３−（９−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イルオキシ）カルボニルオキシ）−メチル）−７−スルホ−９Ｈ−フルオレン−２−イルアミノ）−３−オキソプロピル）−２，５−ジオキソピロリジン−３−イルチオ）ヘキサデカン酸である（例えば、ＷＯ２０１０／１４０１４８を参照されたい）。
【０２６８】
７．ＰＡＳ配列
別の実施形態では、異種の部分は、ＰＡＳ配列である。ＰＡＳ配列とは、本明細書で使用する場合、アラニン残基とセリン残基を主に含むか、またはアラニン残基と、セリン残基と、プロリン残基を主に含むアミノ酸配列であって、生理的条件下でランダムコイル構造を形成するアミノ酸配列を意味する。したがって、ＰＡＳ配列は、アラニン、セリン及びプロリンを含むか、これらから本質的になるか、またはこれらからなるビルディングブロック、アミノ酸ポリマーまたは配列カセットであって、本開示のキメラタンパク質における異種の部分の一部として使用できるビルディングブロック、アミノ酸ポリマーまたは配列カセットである。ただし、ＰＡＳ配列における微量成分として、アラニン、セリン及びプロリン以外の残基が付加されていても、アミノ酸ポリマーがランダムコイル構造を形成できることは当業者であれば分かる。「微量成分」という用語は、本明細書で使用する場合、ＰＡＳ配列に、アラニン、セリン及びプロリン以外のアミノ酸を特定の程度まで、例えば、最大で約１２％、すなわち、ＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のうちの約１２個、最大で約１０％、すなわち、ＰＡＳ配列の１００個のアミノ酸のうちの約１０個、最大で約９％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約９個、最大で約８％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約８個、約６％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約６個、約５％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約５個、約４％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約４個、約３％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約３個、約２％、すなわち、１００個のアミノ酸のうちの約２個、約１％、すなわち、１００個のアミノ酸うちの約１個付加できることを意味する。アラニン、セリン及びプロリンとは異なるアミノ酸は、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌからなる群から選択できる。
【０２６９】
生理的条件下では、ＰＡＳ配列伸長体は、ランダムコイル構造を形成することによって、ＦＶＩＩＩタンパク質に対して、インビボ及び／またはインビトロ安定性の向上を媒介できる。ランダムコイルドメインは、単独では安定な構造または機能を持たないので、ＦＶＩＩＩタンパク質によって媒介される生物学的活性は、本質的に保持される。別の実施形態では、ランダムコイルドメインを形成するＰＡＳ配列は、特に、血漿中でのタンパク質分解、免疫原性、等電点／静電挙動、細胞表面レセプターへの結合またはインターナリゼーションに関して、生物学的に不活性であるが、生分解性を有し、それにより、ＰＥＧなどの合成ポリマーを上回る明らかな利点をもたらす。
【０２７０】
ランダムコイル構造を形成するＰＡＳ配列の非限定的な例は、ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号３６）、ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号３７）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号３８）、ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号３９）、ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号４０）、ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号４１）及びＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号４２）またはこれらをいずれかに組み合わせたものからなる群から選択したアミノ酸配列を含む。ＰＡＳ配列のさらなる例は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２９２１３０Ａ１号及び国際公開第２００８／１５５１３４Ａ１号から知られている。
【０２７１】
８．ＨＡＰ配列
特定の実施形態では、異種の部分は、グリシンリッチホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ）である。ＨＡＰ配列は、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、１２０個のアミノ酸、１４０個のアミノ酸、１６０個のアミノ酸、１８０個のアミノ酸、２００個のアミノ酸、２５０個のアミノ酸、３００個のアミノ酸、３５０個のアミノ酸、４００個のアミノ酸、４５０個のアミノ酸または５００個のアミノ酸の長さであるグリシン反復配列を含むことができる。一実施形態では、ＨＡＰ配列は、そのＨＡＰ配列に融合または連結された部分の半減期を延長できる。ＨＡＰ配列の非限定的な例としては、（Ｇｌｙ）ｎ、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎまたはＳ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０である）が挙げられるが、これらに限らない。一実施形態では、ｎは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０である。別の実施形態では、ｎは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００である。
【０２７２】
９．トランスフェリンまたはその断片
特定の実施形態では、異種の部分は、トランスフェリンまたはその断片である。いずれかのトランスフェリンを用いて、本開示のＦＶＩＩＩタンパク質を作製できる。一例としては、野生型ヒトＴＦ（ＴＦ）は、およそ７５ＫＤａの６７９個のアミノ酸タンパク質（糖鎖付加は考慮していない）であり、２つの主要ドメインと、Ｎ（約３３０個のアミノ酸）と、Ｃ（約３４０個のアミノ酸）を有する（これは、遺伝子重複に起因すると見られる）。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ０３９８４５、ＸＭ０３９８４７及びＳ９５９３６（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）（これらはすべて、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。トランスフェリンは、２つのドメインと、Ｎドメインと、Ｃドメインを含む。Ｎドメインは、Ｎ１ドメインとＮ２ドメインという２つのサブドメインを含み、Ｃドメインは、Ｃ１ドメインとＣ２ドメインというという２つのサブドメインを含む。
【０２７３】
一実施形態では、トランスフェリンという異種の部分としては、トランスフェリンスプライスバリアントが挙げられる。一例では、トランスフェリンスプライスバリアントは、ヒトトランスフェリンのスプライスバリアント、例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＡＡ６１１４０であることができる。別の実施形態では、本開示のキメラタンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリン配列の１つ以上のドメイン、例えば、Ｎドメイン、Ｃドメイン、Ｎ１ドメイン、Ｎ２ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメインまたはこれらをいずれかに組み合わせたものを含む。
【０２７４】
１０．クリアランスレセプター
特定の実施形態では、異種の部分は、クリアランスレセプター、その断片、バリアントまたは誘導体である。ＬＲＰ１は、様々なタンパク質（第Ｘ因子など）のレセプター媒介性クリアランスに関与する６００ＫＤａの膜内在性タンパク質である。例えば、Ｎａｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９１：５５５−５６０（１９９８）を参照されたい。
【０２７５】
１１．フォンビルブランド因子またはその断片
特定の実施形態では、異種の部分は、フォンビルブランド因子（ＶＷＦ）またはその１つ以上の断片である。
【０２７６】
ＶＷＦ（Ｆ８ＶＷＦとして知られている）は、血漿に存在するとともに、内皮（バイベルパラーデ小体内）、巨核球（血小板のα顆粒）及び内皮下結合組織で構成的に産生される巨大な多量体糖タンパク質である。基本的なＶＷＦ単量体は、２８１３個のアミノ酸のタンパク質である。各単量体は、Ｄ’及びＤ３ドメイン（一体になって、第ＶＩＩＩ因子に結合する）、Ａ１ドメイン（血小板ＧＰＩｂレセプター、ヘパリン及び／またはおそらくはコラーゲンに結合する）、Ａ３ドメイン（コラーゲンに結合する）、Ｃ１ドメイン（このドメインが活性化すると、ＲＧＤドメインが血小板インテグリンαＩＩｂβ３に結合する）、そのタンパク質のＣ末端にある「システインノット」ドメイン（ＶＷＦは、このドメインを血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦβ）及びβ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（βＨＣＧ）と共有する）という、特有の機能を有する多くの特有のドメインを含む。
【０２７７】
ヒトＶＷＦの２８１３個の単量体アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋでアクセッション番号ＮＰ０００５４３．２として報告されている。ヒトＶＷＦをコードするヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋでアクセッション番号ＮＭ００５５２．３として報告されている。配列番号４４（図１１Ｂ）は、配列番号４３によってコードされるアミノ酸配列である。Ｄ’ドメインは、配列番号４４の７６４〜８６６位のアミノ酸を含む。Ｄ３ドメインは、配列番号４４の８６７〜１２４０位のアミノ酸を含む。
【０２７８】
血漿では、ＦＶＩＩＩの９５〜９８％は、完全長ＶＷＦとの強固な非共有複合体で循環する。インビボでＦＶＩＩＩＩの適切な血漿中レベルを保つには、この複合体の形成が重要である。Ｌｅｎｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．９２（１１）：３９８３−９６（１９９８）、Ｌｅｎｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．５（７）：１３５３−６０（２００７）。重鎖の３７２位及び７４０位と、軽鎖の１６８９位におけるタンパク質分解により、ＦＶＩＩＩが活性化するときには、ＦＶＩＩＩに結合していたＶＷＦが、活性化ＦＶＩＩＩから外れる。
【０２７９】
特定の実施形態では、異種の部分は、完全長フォンビルブランド因子である。別の実施形態では、異種の部分は、フォンビルブランド因子断片である。本明細書で使用する場合、本明細書で使用している「１つのＶＷＦ断片」または「複数のＶＷＦ断片」という用語は、ＦＶＩＩＩと相互作用するとともに、完全長ＶＷＦによってＦＶＩＩＩに通常もたらされる特性（例えば、ＦＶＩＩＩａの尚早な活性化の防止、尚早なタンパク質分解の防止、尚早なクリアランスをもたらすことのある、リン脂質膜との会合の防止、ネイキッドＦＶＩＩＩとは結合できるが、ＶＷＦの結合したＦＶＩＩＩには結合できないＦＶＩＩＩクリアランスレセプターへの結合の防止、及び／またはＦＶＩＩＩの重鎖と軽鎖の相互作用の安定化）を少なくとも１つ以上保持するいずれかのＶＷＦ断片を意味する。具体的な実施形態では、異種の部分は、ＶＷＦのＤ’ドメインとＤ３ドメインを含む（ＶＷＦ）断片である。Ｄ’ドメインとＤ３ドメインを含むＶＷＦ断片は、Ａ１ドメイン、Ａ２ドメイン、Ａ３ドメイン、Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン、Ｄ４ドメイン、Ｂ１ドメイン、Ｂ２ドメイン、Ｂ３ドメイン、Ｃ１ドメイン、Ｃ２ドメイン、ＣＫドメイン、これらの１つ以上の断片、及びこれらをいずれかに組み合わせたものからなる群から選択したＶＷＦドメインをさらに含むことができる。ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドであって、ＶＷＦ断片に融合したポリペプチドのさらなる例は、２０１２年７月３日に提出された米国特許仮出願第６１／６６７，９０１号と、米国特許出願公開第２０１５／００２３９５９Ａ１号（いずれも、参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されている。
【０２８０】
１２．リンカー部分
特定の実施形態では、異種の部分は、ペプチドリンカーである。
【０２８１】
本明細書で使用する場合、「ペプチドリンカー」または「リンカー部分」という用語は、ポリペプチド鎖の直鎖状アミノ酸配列で２つのドメインを連結するペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）を指す。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーをコードする異種のヌクレオチド配列は、本開示の最適化ＦＶＩＩＩポリヌクレオチド配列と、例えば、上記の異種の部分のうちの１つ（アルブミンなど）をコードする異種のヌクレオチド配列との間に挿入できる。ペプチドリンカーは、キメラポリペプチド分子に柔軟性をもたらすことができる。リンカーは、典型的には切断されないが、リンカーの切断が望ましいことがある。一実施形態では、これらのリンカーは、プロセシング中に除去されない。
【０２８３】
本開示のキメラタンパク質に存在できるタイプのリンカーは、プロテアーゼで切断可能なリンカーであって、切断部位（すなわち、プロテアーゼ切断部位基質、例えば、第ＸＩａ因子、第Ｘａ因子またはトロンビン切断部位）を含むとともに、その切断部位のＮ末端もしくはＣ末端のいずれか、または両側に、追加のリンカーを含むことができるリンカーである。これらの切断可能なリンカーは、本開示のコンストラクトに導入すると、異種の切断部位を有するキメラ分子が得られる。
【０２８４】
一実施形態では、本開示の核酸分子によってコードされるＦＶＩＩＩポリペプチドは、１本のポリペプチド鎖で構成されるＦｃ領域を形成するように、ｃｓｃＦｃリンカーを介して連結されている２つ以上のＦｃドメインまたはＦｃ部分を含む。ｃｓｃＦｃリンカーは、少なくとも１つの細胞内プロセシング部位、すなわち、細胞内酵素によって切断される部位に隣接している。少なくとも１つの細胞内プロセシング部位で、ポリペプチドが切断されると、少なくとも２本のポリペプチド鎖を含むポリペプチドが得られる。
【０２８５】
本開示のコンストラクトにおいて、その他のペプチドリンカーを任意に応じて用いて、例えば、ＦＶＩＩＩタンパク質をＦｃ領域に連結できる。本開示との関連で使用できるいくつかの例示的なリンカーとしては、例えば、下にさらに詳細に説明されているＧｌｙＳｅｒアミノ酸を含むポリペプチドが挙げられる。
【０２８６】
一実施形態では、ペプチドリンカーは、合成、すなわち、非天然のものである。一実施形態では、ペプチドリンカーは、アミノ酸からなる第１の直鎖状配列を、天然の状態においては連結されないか、または天然では遺伝的に融合されないアミノ酸からなる第２の直鎖状配列に連結または遺伝的に融合するアミノ酸配列を含むペプチド（またはポリペプチド）（天然のものであることも、天然のものでないこともできる）を含む。例えば、一実施形態では、ペプチドリンカーは、天然のポリペプチドの改変型である（例えば、付加、置換または欠失のような変異を含む）非天然のポリペプチドを含むことができる。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、非天然型アミノ酸を含むことができる。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、天然では見られない直鎖状配列で存在させた天然のアミノ酸を含むことができる。さらに別の実施形態では、ペプチドリンカーは、天然のポリペプチド配列を含むことができる。
【０２８７】
例えば、特定の実施形態では、ペプチドリンカーを用いて、同じＦｃ部分を融合することによって、ホモ二量体のｓｃＦｃ領域を形成できる。別の実施形態では、ペプチドリンカーを用いて、異なるＦｃ部分（例えば、野生型Ｆｃ部分と、Ｆｃ部分バリアント）を融合することによって、ヘテロ二量体のｓｃＦｃ領域を形成できる。
【０２８８】
別の実施形態では、ペプチドリンカーは、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーを含むか、またはｇｌｙ−ｓｅｒリンカーからなる。一実施形態では、ｓｃＦｃまたはｃｓｃＦｃリンカーは、免疫グロブリンヒンジとｇｌｙ−ｓｅｒリンカーの少なくとも一部を含む。本明細書で使用する場合、「ｇｌｙ−ｓｅｒリンカー」という用語は、グリシン残基とセリン残基からなるペプチドを指す。特定の実施形態では、前記ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカーの２つの別の配列の間に挿入できる。別の実施形態では、ｇｌｙ−ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカーの別の配列の一端または両端に結合する。さらに別の実施形態では、２つ以上のｇｌｙ−ｓｅｒリンカーは、ペプチドリンカーに直列に導入する。一実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子に由来する）ヒンジ領域上流の少なくとも一部と、（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子に由来する）ヒンジ領域中央の少なくとも一部と、一連のｇｌｙ／ｓｅｒアミノ酸残基を含む。
【０２８９】
本開示のペプチドリンカーは、少なくとも１つのアミノ酸の長さであり、様々な長さのものであることができる。一実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１〜約５０個のアミノ酸の長さである。この関連で使用する場合、「約」という用語は、＋／−２個のアミノ酸残基を示す。リンカーの長さは、正の整数でなければならないので、約１〜約５０個のアミノ酸の長さ分の長さは、１〜３個から４８〜５２個までのアミノ酸の長さ分の長さである。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１０〜約２０個のアミノ酸の長さである。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１５〜約５０個のアミノ酸の長さである。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約２０〜約４５個のアミノ酸の長さである。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１５〜約３５個または約２０〜約３０個のアミノ酸の長さである。別の実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、５００個、１０００個または２０００個のアミノ酸の長さである。一実施形態では、本開示のペプチドリンカーは、２０個または３０個のアミノ酸の長さである。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個または少なくとも１００個のアミノ酸を含むことができる。別の実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個または少なくとも１，０００個のアミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個、１０００個、１１００個、１２００個、１３００個、１４００個、１５００個、１６００個、１７００個、１８００個、１９００個または２０００個のアミノ酸を含むことができる。ペプチドリンカーは、１〜５個のアミノ酸、１〜１０個のアミノ酸、１〜２０個のアミノ酸、１０〜５０個のアミノ酸、５０〜１００個のアミノ酸、１００〜２００個のアミノ酸、２００〜３００個のアミノ酸、３００〜４００個のアミノ酸、４００〜５００個のアミノ酸、５００〜６００個のアミノ酸、６００〜７００個のアミノ酸、７００〜８００個のアミノ酸、８００〜９００個のアミノ酸または９００〜１０００個のアミノ酸を含むことができる。
【０２９１】
ペプチドリンカーは、当該技術分野において知られている技法を用いて、ポリペプチド配列に導入できる。改変は、ＤＮＡ配列解析によって確認できる。プラスミドＤＮＡを用いて、産生させるポリペプチドを安定な産生するように、宿主細胞をトランスフォーメーションできる。
【０２９２】
単量体−二量体ハイブリッド
いくつかの実施形態では、異種のヌクレオチド配列をさらに含む、本開示の単離核酸分子は、ＦＶＩＩＩを含む単量体−二量体ハイブリッド分子をコードする。
【０２９３】
本明細書で使用する「単量体−二量体ハイブリッド」という用語は、ジスルフィド結合によって互いに会合している第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖を含むキメラタンパク質を指し、この第１の鎖は、第ＶＩＩＩ因子と第１のＦｃ領域を含み、第２の鎖は、ＦＶＩＩＩのない第２のＦｃ領域を含むか、その領域から本質的になるか、またはその領域からなる。したがって、単量体−二量体ハイブリッドコンストラクトは、１つの凝固因子のみを有する単量体部分と、２つのＦｃ領域を有する二量体部分とを含むハイブリッドである。
【０２９４】
発現制御エレメント
いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子またはベクターは、少なくとも１つの発現制御配列をさらに含む。発現制御配列とは、本明細書で使用する場合、プロモーター配列、またはプロモーターとエンハンサーを組み合わせたもののようないずれかの調節ヌクレオチド配列であって、その配列が機能可能に連結しているコード核酸の効率的な転写と翻訳を促す配列である。例えば、本開示の単離核酸分子は、少なくとも１つの転写制御配列に機能可能に連結できる。遺伝子発現制御配列は、例えば、構成的または誘導性プロモーターなどの哺乳動物プロモーターまたはウイルスプロモーターであることができる。哺乳動物構成的プロモーターとしては、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルベートキナーゼ、βアクチンプロモーターという遺伝子のプロモーター、及びその他の構成的プロモーターが挙げられるが、これらに限らない。真核細胞において構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（例えばＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）及びその他のレトロウイルスのプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。その他の構成的プロモーターは、当業者に知られている。本開示の遺伝子発現配列として有用なプロモーターとしては、誘導性プロモーターも挙げられる。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下で発現する。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下で誘導されて、転写と翻訳を促す。その他の誘導性プロモーターは、当業者に知られている。
【０２９５】
一実施形態では、本開示は、組織特異的プロモーター及び／またはエンハンサーの制御下で、導入遺伝子を発現させることを含む。別の実施形態では、プロモーターまたはその他の発現制御配列は、肝細胞における導入遺伝子の発現を選択的に増強する。肝特異的プロモーターの例としては、マウスチレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、内因性ヒト第ＶＩＩＩ因子プロモーター（Ｆ８）、ヒトα１−アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター及びマウスアルブミンプロモーターが挙げられるが、これらに限らない。特定的な実施形態では、プロモーターは、ｍＴＴＲプロモーターを含む。ｍＴＴＲプロモーターは、Ｒ．Ｈ．Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：４６９７に記載されている。Ｆ８プロモーターは、Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１８２８−１１８３８に記載されている。
【０２９６】
１つ以上のエンハンサーを用いて、発現レベルをさらに高めて、治療効果を得ることができる。１つ以上のエンハンサーは、単独で供給することも、１つ以上のプロモーターエレメントとともに供給することもできる。典型的には、発現制御配列は、複数のエンハンサーエレメントと組織特異的プロモーターを含む。一実施形態では、エンハンサーは、１コピー以上のα１−ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーを含む（Ｒｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０７６５−２０７７３、Ｒｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：３９５−４０４、Ｒｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３４：５７７−５８４、Ｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ８：Ｓ２３−Ｓ３０）。別の実施形態では、エンハンサーは、ＥＢＰ、ＤＢＰ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６などの肝特異的転写因子結合部位に由来し、Ｅｎｈ１は、ＨＮＦ１、（センス）−ＨＮＦ３、（センス）−ＨＮＦ４、（アンチセンス）−ＨＮＦ１、（アンチセンス）−ＨＮＦ６、（センス）−ＥＢＰ、（アンチセンス）−ＨＮＦ４（アンチセンス）を含む。
【０２９７】
特定的な例では、本開示に有用なプロモーターは、配列番号６９（すなわち、ＥＴプロモーター、図１１Ｙ）を含み、この配列は、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＹ６６１２６５としても知られている。Ｖｉｇｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１（５）：７６３（２００５）も参照されたい。その他の好適なベクターと遺伝子調節エレメントの例は、ＷＯ０２／０９２１３４、ＥＰ１３９５２９３、または米国特許第６，８０８，９０５号、同第７，７４５，１７９号もしくは同第７，１７９，９０３号（参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されている。
【０２９８】
概して、発現制御配列は、必要に応じて、転写の開始に関与する５’非転写配列と、翻訳の開始に関与する５’非翻訳配列（ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列など）を含むことになる。特に、このような５’非転写配列は、機能可能に接合したコード核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むことになる。遺伝子発現配列は任意に応じて、所望の場合、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列を含む。
【０２９９】
ベクター系
本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードする１つ以上のコドン最適化核酸分子を含むベクターと、そのベクターを含む宿主細胞と、そのベクターを用いて出血障害を治療する方法に対するものである。本開示は、対象における発現が増加する最適化ＦＶＩＩＩ配列であって、遺伝子療法で用いると、治療効果を高める可能性のある最適化ＦＶＩＩＩ配列を含むベクターを提供することによって、当該技術分野における重要なニーズを満たす。
【０３００】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を含むベクターであって、（ｉ）配列番号３の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号４の５８〜１７９１位のヌクレオチドに対する第１の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有するベクターを提供する。別の実施形態では、その核酸分子は、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＮ末端部分をコードする第１の核酸配列と、ＦＶＩＩＩポリペプチドのＣ末端部分をコードする第２の核酸配列とを含むヌクレオチド配列であって、（ｉ）配列番号５の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉ）配列番号６の１７９２〜４３７４位のヌクレオチド、（ｉｉｉ）配列番号５の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｖ）配列番号６の１７９２〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する第２の核酸配列の配列同一性が少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％であり、そのＮ末端部分とＣ末端部分が一体になって、ＦＶＩＩＩポリペプチド活性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０３０１】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を含むベクターであって、（ｉ）配列番号１の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、プロモーター、標的配列またはこれらの両方に機能可能に連結されているベクターを提供する。別の実施形態では、その核酸配列は、（ｉ）配列番号１の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を含むベクターであって、（ｉ）配列番号２の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号２の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、プロモーター、標的配列またはこれらの両方に機能可能に連結されているベクターを提供する。別の実施形態では、その核酸配列は、（ｉ）配列番号２の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号２の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０３０３】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を含むベクターであって、（ｉ）配列番号７０の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号７０の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、プロモーター、標的配列またはこれらの両方に機能可能に連結されているベクターを提供する。別の実施形態では、その核酸配列は、（ｉ）配列番号７０の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号７０の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を含むベクターであって、（ｉ）配列番号７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号７１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、プロモーター、標的配列またはこれらの両方に機能可能に連結されているベクターを提供する。別の実施形態では、その核酸配列は、（ｉ）配列番号７１の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号７１の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を含むベクターであって、（ｉ）配列番号３の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号３の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、プロモーター、標的配列またはこれらの両方に機能可能に連結されているベクターを提供する。別の実施形態では、その核酸配列は、（ｉ）配列番号３の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号３の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を含むベクターであって、（ｉ）配列番号４の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号４の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、プロモーター、標的配列またはこれらの両方に機能可能に連結されているベクターを提供する。別の実施形態では、その核酸配列は、（ｉ）配列番号４の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号４の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を含むベクターであって、（ｉ）配列番号５の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号５の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、プロモーター、標的配列またはこれらの両方に機能可能に連結されているベクターを提供する。別の実施形態では、その核酸配列は、（ｉ）配列番号５の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号５の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を含むベクターであって、（ｉ）配列番号６の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号６の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドに対する配列同一性が少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％である核酸配列をそのヌクレオチド配列が含み、そのヌクレオチド配列が、プロモーター、標的配列またはこれらの両方に機能可能に連結されているベクターを提供する。別の実施形態では、その核酸配列は、（ｉ）配列番号６の５８〜４３７４位のヌクレオチドまたは（ｉｉ）配列番号６の５８〜２２７７位と２３２０〜４３７４位のヌクレオチドを含む。
【０３０９】
本開示に適するベクターとしては、発現ベクター、ウイルスベクター及びプラスミドベクターが挙げられる。一実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。
【０３１０】
本明細書で使用する場合、発現ベクターとは、挿入されているコード配列の転写と翻訳に必要なエレメント、またはＲＮＡウイルスベクターの場合には、適切な宿主細胞に導入したときに、複製と翻訳に必要なエレメントを含むいずれかの核酸コンストラクトを指す。発現ベクターとしては、プラスミド、ファージミド、ウイルス及びこれらの誘導体を挙げることができる。
【０３１１】
本開示の発現ベクターは、本明細書に記載されているＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする最適化ポリヌクレオチドを含むことになる。一実施形態では、このＢＤＤ  ＦＶＩＩＩタンパク質の最適化コード配列は、発現制御配列に機能可能に連結されている。本明細書で使用する場合、構成要素の核酸配列のそれぞれが、その機能を保持できるような形で、２つの核酸配列が共有結合しているときに、２つの核酸配列は、機能可能に連結されている。遺伝子発現制御配列の影響下または制御下で、コード配列の発現、転写及び／または翻訳が行われるような形で、コード配列と遺伝子発現制御配列が共有結合しているときに、コード配列と遺伝子発現制御配列は、機能可能に連結しているという。５’遺伝子発現配列内のプロモーターの誘導によって、コード配列が転写される場合と、２つのＤＮＡ配列間の連結の性質により、（１）フレームシフト変異が導入されたり、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を誘導する能力が妨げられたり、または（３）対応するＲＮＡ転写物をタンパク質に翻訳する能力が妨げられたりしない場合に、２つのＤＮＡ配列は、機能可能に連結しているという。したがって、遺伝子発現配列が、コード核酸配列の転写をもたらして、得られた転写産物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるようにできる場合、その遺伝子発現配列は、そのコード核酸配列に機能可能に連結されていることになる。
【０３１２】
ウイルスベクターとしては、レトロウイルス（モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス及びラウス肉腫ウイルスなど）、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０型ウイルス、ポリオーマウイルス、エプスタインバーウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ならびにＲＮＡウイルス（レトロウイルスなど）というウイルスの核酸配列が挙げられるが、これらに限らない。当該技術分野において周知のその他のベクターを容易に採用できる。特定のウイルスベクターは、非必須遺伝子が、目的の遺伝子に置き換えられている非細胞変性真核ウイルスに基づいている。非細胞変性ウイルスとしては、ウイルスのゲノムＲＮＡがＤＮＡに逆転写された後に、プロウイルスが宿主細胞ＤＮＡに組み込まれることが生活環に含まれるレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法の試験用に認可されている。最も有用なのは、複製欠損性（すなわち、所望のタンパク質の合成を誘導できるが、感染性粒子を産生できない）レトロウイルスである。遺伝子改変したこのようなレトロウイルス発現ベクターには、インビボで遺伝子を高効率にトランスダクションするための一般的な有用性がある。複製欠損性レトロウイルスを作製するための標準的なプロトコール（外因性遺伝物質をプラスミドに導入し、パッケージング細胞株にプラスミドをトランスフェクションし、パッケージング細胞株によって組み換えレトロウイルスを産生させ、組織培養培地からウイルス粒子を回収し、標的細胞にウイルス粒子を感染させる工程を含む）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９０）及びＭｕｒｒｙ，Ｅ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．（１９９１）に示されている。
【０３１３】
一実施形態では、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、操作して複製欠損性にできるとともに、広範なタイプ及び種の細胞に感染できる。アデノ随伴ウイルスはさらに、熱安定性、脂質溶媒安定性、造血細胞を含む多様な系列の細胞における高いトランスダクション頻度、重感染阻害の欠如（これにより、複数回のトランスダクションが可能になる）などの利点を有する。報告によると、アデノ随伴ウイルスは、ヒト細胞ＤＮＡに、部位特異的な形で組み込まれることによって、レトロウイルス感染の特徴である挿入変異誘発の可能性と挿入遺伝子の発現のばらつきを最小限にできる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、組織培養において、選択圧の非存在下で、１００回を超える継代で追跡されており、アデノ随伴ウイルスゲノムの組み込みが比較的安定なイベントであることが示唆されている。アデノ随伴ウイルスは、染色体外でも機能することができる。
【０３１４】
別の実施形態では、ウイルスベクターは、本明細書に開示されているように、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むように操作したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を得るための一般的な方法は、開示されている。例えば、ＵＳＰ８，７３４，８０９と、２０１３／０１９５８０１と、これらで引用されている参照文献を参照されたい。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と、目的の導入遺伝子（例えば、最適化ＦＶＩＩＩポリヌクレオチド配列）を含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶの作製方法には、ＡＡＶキャプシドタンパク質またはその断片をコードする核酸配列と、機能性ｒｅｐ遺伝子と、ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と目的の導入遺伝子とで構成されたｒＡＡＶベクターと、組み換えＡＡＶベクターをＡＡＶキャプシドタンパク質にパッケージング可能にするのに十分なヘルパー機能とを含む所望の宿主細胞を培養することが伴う。これらの手順と、関連する手順を行うための材料と方法は例えば、ＵＳＰ８，７３４，８０９、２０１３／０１９５８０１、ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１５６９２、ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３３６９２、ＰＣＴ／ＵＳ２００２／０３３６３０、ＷＯ２００７／１４８９７１、ＷＯ００／２０５６１、ＷＯ０３／０４２３６１及びＷＯ２００７／０４６７０に開示されている。
【０３１５】
ほぼいずれの抗原型にも由来する異なるＡＡＶベクター配列のうちの１つ以上を本開示に従って用いることができる。特定のＡＡＶベクター配列の選択は、目的のトロピズム、所要ベクター収量などのような既知のパラメーターによって導き出すことになる。概して、ＡＡＶ抗原型は、アミノ酸レベルと核酸レベルの相同性がかなりの程度であるゲノム配列を有し、関連する一連の遺伝機能をもたらし、関連するビリオンを産生し、同様の形式で複製とアセンブルを行う。各種のＡＡＶ抗原型のゲノム配列と、ゲノム類似性の概要については、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８９７９０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０１９０１、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０４３３０３、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６、Ｃｈｌｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７，Ｊ．Ｖｉｒ．７１：６８２３−３３）、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３，Ｊ．Ｖｉｒ．４５：５５５−６４）、Ｃｈｌｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９，Ｊ．Ｖｉｒ．７３：１３０９−１３１９）、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８，Ｊ．Ｖｉｒ．７２：３０９−３１９）及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｊ．Ｖｉｒ．７４：８６３５−４７）を参照されたい。ＡＡＶ抗原型１、２、３、４及び５は、本開示の関連で使用するためのＡＡＶヌクレオチド配列の例示的な供給源である。特定の開示用途には、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ９、または例えばキャプシドシャッフリング法と、ＡＡＶキャプシドライブラリー、もしくは新たに設計、開発もしくは進化したＩＴＲライブラリーによって得られる新開発のＡＡＶ様粒子も適している。Ｄａｌｋａｒａ，Ｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５（１８９）：１８９ｒａ７６、Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ，ＭＡ  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（２０１４）５（７）：４５５を参照されたい。
【０３１６】
しかしながら、特定の実施形態では、本明細書に開示されているＦＶＩＩＩタンパク質を発現させるためには、肝臓と関連組織に対するトロピズムが有意なＡＡＶベクターが対象となる。非限定的な例としては、ＡＡＶ抗原型１、２、６及び８が挙げられる。例えば、Ｔｏｒｒｅｓ−Ｔｏｒｒａｎｔｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）２２：９０１と、その文献で引用されている参照文献を参照されたい。
【０３１７】
別の実施形態では、ベクターは、レンチウイルスに由来する。特定の実施形態では、ベクターは、非分裂細胞に感染できる組み換えレンチウイルスのベクターである。
【０３１８】
レンチウイルスゲノムとプロウイルスＤＮＡは典型的には、レトロウイルスで見られる３つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）を有し、これらの遺伝子は、２つの長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列に挟まれている。ｇａｇ遺伝子は、内部構造（マトリックス、キャプシド及びヌクレオキャプシド）タンパク質をコードし、ｐｏｌ遺伝子は、ＲＮＡ依存型ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）と、プロテアーゼと、インテグラーゼをコードし、ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。５’ＬＴＲと３’ＬＴＲは、ビリオンＲＮＡの転写とポリアデニル化を促す働きをする。このＬＴＲは、ウイルス複製に必要なすべての他のシス作動性配列を含む。レンチウイルスは、（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及び／またはＳＩＶにおける）ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆ及びｖｐｘを含むさらなる遺伝子を有する。
【０３１９】
５’ＬＴＲに隣接するのは、ゲノムを逆転写する際に必要な配列（ｔＲＮＡプライマー結合部位）と、ウイルスＲＮＡを効率的にキャプシドに包んで粒子にする際に必要な配列（Ｐｓｉ部位）である。キャプシドに包む際（またはレトロウイルスＲＮＡをパッケージングして感染性ビリオンにする際）に必要な配列が、ウイルスゲノムから欠損している場合には、シス欠損により、ゲノムＲＮＡのキャプシド包囲が阻止される。
【０３２０】
しかしながら、得られる変異体は、依然として、すべてのビリオンタンパク質の合成を誘導できる。本開示は、非分裂細胞に感染できる組み換えレンチウイルスの作製方法であって、好適な宿主細胞に、パッケージング機能、すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖと、ｒｅｖ及びｔａｔを有する２つ以上のベクターをトランスフェクションすることを含む方法を提供する。下記に開示するように、特定の用途では、機能性ｔａｔ遺伝子が欠損しているベクターが望ましい。したがって、例えば、第１のベクターは、ウイルスｇａｇとウイルスｐｏｌをコードする核酸を備えることができ、もう一方のベクターは、パッケージング細胞を産生するように、ウイルスｅｎｖをコードする核酸を備えることができる。異種の遺伝子を備えるベクター（本明細書では、トランスファーベクターと定める）をそのパッケージング細胞に導入すると、目的の外来遺伝子を有する感染性ウイルス粒子を放出するプロデューサー細胞が得られる。
【０３２１】
ベクターと外来遺伝子の上記の構成に従って、第２のベクターは、ウイルスエンベロープ（ｅｎｖ）遺伝子をコードする核酸を備えることができる。ｅｎｖ遺伝子は、レトロウイルスを含め、ほぼすべての好適なウイルスに由来することができる。いくつかの実施形態では、ｅｎｖタンパク質は、ヒトとその他の種の細胞のトランスダクションを可能にするアンフォトロピックエンベロープタンパク質である。
【０３２２】
レトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子の例としては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶまたはＭＭＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶまたはＨＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶまたはＭＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶまたはＧＡＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられるが、これらに限らない。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）プロテインＧ（ＶＳＶ  Ｇ）、肝炎ウイルスのｅｎｖ遺伝子、インフルエンザのｅｎｖ遺伝子のような他のｅｎｖ遺伝子も使用できる。
【０３２３】
ウイルスｅｎｖ核酸配列を備えるベクターは、本明細書の別の箇所に記載されている調節配列と機能可能に関連付けられている。
【０３２４】
特定の実施形態では、ベクターとしては、ベクターが非分裂細胞をトランスダクションする能力を損なわずに、ＨＩＶ病原性遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆを欠失させたレンチウイルスベクターが挙げられる。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、ベクターとしては、３’ＬＴＲのＵ３領域の欠失を含むレンチウイルスベクターが挙げられる。Ｕ３領域の欠失は、完全な欠失であることも、部分的な欠失であることもできる。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＦＶＩＩＩヌクレオチド配列を含む本開示のレンチウイルスベクターは、（ａ）ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、またはｇａｇ遺伝子とｐｏｌ遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列と、（ｂ）異種のｅｎｖ遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列とともに、細胞にトランスフェクションでき、このレンチウイルスベクターは、機能性ｔａｔ遺伝子が欠損している。別の実施形態では、細胞には、ｒｅｖ遺伝子を含む第４のヌクレオチド配列をさらにトランスフェクションする。特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ及びｎｅｆ、またはこれらを組み合わせたものから選択した機能性遺伝子が欠損している。
【０３２７】
特定の実施形態では、レンチウイルスベクターは、ｇａｇタンパク質、Ｒｅｖ応答エレメント、セントラルポリプリントラック（ｃＰＰＴ）またはこれらをいずれかに組み合わせたものをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。
【０３２８】
レンチウイルスベクターの例は、ＷＯ９９３１２５１、ＷＯ９７１２６２２、ＷＯ９８１７８１５、ＷＯ９８１７８１６及びＷＯ９８１８９３４（参照により、その全体が本明細書に援用される）に開示されている。
【０３２９】
その他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当該技術分野において詳細に説明されており、当業者には周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９を参照されたい。この数年で、プラスミドベクターが、インビボで遺伝子を細胞に送達するのに特に有用であることが分かった。プラスミドベクターは、宿主ゲノム内で複製したり、宿主ゲノムに組み込んだりできないからである。しかしながら、宿主細胞と適合するプロモーターを有するこれらのプラスミドは、プラスミド内で機能可能にコードされる遺伝子からペプチドを発現できる。広く用いられているプラスミドのうち、市販業者から入手可能ないくつかのプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、各種ｐｃＤＮＡプラスミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ、各種ｐＣＭＶプラスミド、ｐＳＶ４０及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。具体的なプラスミドのさらなる例としては、いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から得られるｐｃＤＮＡ３．１（カタログ番号Ｖ７９０２０）、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ（カタログ番号Ｖ８７０２０）、ｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ（カタログ番号Ｖ８６３２０）及びｐＢｕｄＣＥ４．１（カタログ番号Ｖ５３２２０）が挙げられる。その他のプラスミドは、当業者に周知である。加えて、プラスミドは、ＤＮＡの特定の断片を除去及び／または付加するように、標準的な分子生物学的技法を用いて、カスタム設計することができる。
【０３３０】
組織特異的発現
特定の実施形態では、例えば、最適化ＦＶＩＩＩ導入遺伝子に機能可能に連結されている１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列をベクター内に含めるのが有用となる。したがって、本開示は、最適化ＦＶＩＩＩヌクレオチド配列に機能可能に連結されているか、または別段の形で、ベクター内に挿入されている少なくとも１つのｍｉＲＮＡ配列標的も提供する。ベクターに含まれるｍｉＲＮＡ標的配列が２コピー以上であると、そのベクター系の有効性を高めることができる。異なるｍｉＲＮＡ標的配列も含まれる。例えば、２つ以上の導入遺伝子を発現するベクターは、２つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列（同じであることも、異なることもできる）の制御下で、それらの導入遺伝子を有することができる。ｍｉＲＮＡ標的配列は、タンデムに存在することができるが、その他の並べ方も含まれる。ｍｉＲＮＡ標的配列を含む導入遺伝子発現カセットは、ベクター内にアンチセンス方向で挿入できる。アンチセンス方向は、ウイルス粒子の産生において、その発現を回避しなければ、プロデューサー細胞に対して毒性を示すことのある遺伝子産物の発現を回避するのに有用である場合がある。別の実施形態では、ベクターは、同じまたは異なるｍｉＲＮＡ標的配列を１コピー、２コピー、３コピー、４コピー、５コピー、６コピー、７コピーまたは８コピー含む。しかしながら、特定の別の実施形態では、ベクターは、いずれのｍｉＲＮＡ標的配列も含まないことになる。ｍｉＲＮＡ標的配列を含めるか否か（及び何個のｍｉＲＮＡ標的配列を含めるか）の選択は、意図する組織標的、所要発現レベルなどの既知のパラメーターによって導き出すことになる。
【０３３１】
一実施形態では、標的配列は、骨髄系コミット前駆細胞において、発現を最も有効にブロックするとともに、より初期のＨＳＰＣにおいて、発現を少なくとも部分的にブロックすることが報告されているｍｉＲ−２２３標的である。ｍｉＲ−２２３標的は、顆粒球、単球、マクロファージ、骨髄樹状細胞を含め、分化した骨髄系細胞における発現をブロックできる。ｍｉＲ−２２３標的は、リンパ球系統または赤血球系統における導入遺伝子の活発な発現に依存する遺伝子療法用途に適することもできる。ｍｉＲ−２２３標的は、ヒトＨＳＣにおける発現も非常に有効にブロックできる。
【０３３２】
別の実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１４２標的（ｔｃｃａｔａａａｇｔ  ａｇｇａａａｃａｃｔ  ａｃａ（配列番号４３））である。一実施形態では、ベクターは、ｍｉＲ−１４２標的配列を４コピー含む。特定の実施形態では、造血特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−１４２（１４２Ｔ）など）の相補配列をベクター、例えばレンチウイルスベクター（ＬＶ）の３’非翻訳領域に導入して、導入遺伝子のコードする転写物に対して、ｍｉＲＮＡ媒介性ダウンレギュレーションを起こすようにする。この方法によって、非造血細胞における導入遺伝子の発現を保持したまま、造血系統抗原提示細胞（ＡＰＣ）において、導入遺伝子の発現を阻止することができる（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００６）。この方策によって、導入遺伝子の発現に対してストリンジェントな転写後制御が行われるようにできるので、導入遺伝子の安定な送達と長期的な発現が可能になる。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１４２による制御により、トランスダクションした細胞の免疫媒介性クリアランスが阻止されたり、及び／または抗原特異的調節Ｔ細胞（Ｔ  ｒｅｇ）が誘導されて、導入遺伝子のコードする抗原に対する強固な免疫寛容が媒介されたりする。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、標的配列は、ｍｉＲ１８１標的である。Ｃｈｅｎ  Ｃ−Ｚ  ａｎｄ  Ｌｏｄｉｓｈ  Ｈ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００５）１７（２）：１５５−１６５には、ｍｉＲ−１８１（マウス骨髄内のＢ細胞で特異的に発現するｍｉＲＮＡ）が開示されている（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｌｏｄｉｓｈ，２００５）。いくつかのヒトｍｉＲＮＡが、白血病に関連することも開示されている。
【０３３４】
標的配列は、そのｍｉＲＮＡに完全または部分的に相補的であることができる。「完全に相補的な」という用語は、標的配列が、その配列を認識するｍｉＲＮＡの配列に対して１００％相補的な核酸配列を有することを意味する。「部分的に相補的な」という用語は、標的配列が、その配列を認識するｍｉＲＮＡの配列に対して一部分のみ相補的であることによって、部分的に相補的な配列が依然として、ｍｉＲＮＡによって認識されることを意味する。換言すると、本開示の関連において、部分的に相補的な標的配列は、対応するｍｉＲＮＡを認識するのに有効であるとともに、そのｍｉＲＮＡを発現する細胞における導入遺伝子の発現を阻止または抑制するのに有効である。ｍｉＲＮＡ標的配列の例は、ＷＯ２００７／０００６６８、ＷＯ２００４／０９４６４２、ＷＯ２０１０／０５５４１３またはＷＯ２０１０／１２５４７１（参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されている。
【０３３５】
宿主細胞
本開示は、本開示の核酸分子またはベクターを含む宿主細胞も提供する。本明細書で使用する場合、「トランスフォーメーション」という用語は、広い意味で、レシピエント宿主細胞へのＤＮＡの導入のうち、遺伝型を変化させ、その結果、レシピエント細胞を変化させる導入を指す目的で用いるものとする。
【０３３６】
「宿主細胞」とは、組み換えＤＮＡ技法を用いて構築したとともに、少なくとも１つの異種の遺伝子をコードするベクターでトランスフォーメーションした細胞を指す。本開示の宿主細胞は、好ましくは、哺乳動物起源のものであり、最も好ましくは、ヒトまたはマウス起源のものである。当業者には、目的に最も適する具体的な宿主細胞株を選択的に割り出す能力がある。例示的な宿主細胞株としては、ＣＨＯ、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を有するＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３−Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−１Ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、ＮＳ０、ＣＡＰ、ＢＨＫ２１及びＨＥＫ２９３（ヒト腎臓）が挙げられるが、これらに限らない。特定的な一実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＮＳ０細胞及びＣＡＰ細胞からなる群から選択されている。宿主細胞株は典型的には、商業サービスのＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたは公の文献から入手可能である。
【０３３７】
宿主細胞への、本開示の単離核酸分子またはベクターの導入は、当業者に周知の様々な技法によって行うことができる。これらの技法としては、トランスフェクション（電気泳動及びエレクトロポレーションを含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープ化ＤＮＡとの細胞融合、マイクロインジェクション、ならびにインタクトウイルスへの感染が挙げられるが、これらに限らない。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．“Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．１９８８）を参照されたい。最も好ましくは、宿主へのプラスミドの導入は、エレクトロポレーションによるものである。トランスフォーメーションした細胞を、軽鎖と重鎖の産生に適する条件下で培養して、重鎖タンパク質及び／または軽鎖タンパク質の合成についてアッセイする。例示的なアッセイ技法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化セルソーター解析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。
【０３３８】
本開示の単離核酸分子またはベクターを含む宿主細胞は、適切な培養培地で培養する。本明細書で使用する場合、「適切な培養培地」という用語は、細胞の成長に必要な栄養素を含む培地を意味する。細胞の成長に必要な栄養素としては、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル及び成長因子を挙げることができる。任意に応じて、培地は、１つ以上の選択因子を含むことができる。任意に応じて、培地は、仔ウシ血清またはウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むことができる。一実施形態では、培地は、ＩｇＧを実質的に含まない。培養培地では概して、例えば、薬物選択、またはＤＮＡコンストラクト上の選択可能なマーカーもしくはＤＮＡコンストラクトとコトランスフェクションした選択可能なマーカーによって相補される必須栄養素の欠損によって、ＤＮＡコンストラクトを含む細胞を選択する。培養哺乳動物細胞は概して、市販の血清含有培地または無血清培地（例えば、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）で増殖させる。一実施形態では、培地は、ＣＤｏｐｔｉＣＨＯ（カリフォルニア州カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。別の実施形態では、培地は、ＣＤ１７（カリフォルニア州カールスバッドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。使用する具体的な細胞株に適する培地の選択は、当業者のレベルの範囲内である。
【０３３９】
ポリペプチドの調製
本開示は、本開示の核酸分子によってコードされるポリペプチドも提供する。別の実施形態では、本開示のポリペプチドは、本開示の単離核酸分子を含むベクターによってコードされる。さらに別の実施形態では、本開示のポリペプチドは、本開示の単離核酸分子を含む宿主細胞によって産生させる。
【０３４０】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの作製方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドが産生される条件下で、本開示の宿主細胞を培養することと、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドを回収することを含む方法も提供する。いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現は、同じ条件下で培養するが、配列番号１６（親ＦＶＩＩＩ遺伝子配列）を含む参照ヌクレオチド配列を含む宿主細胞よりも増加する。
【０３４１】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチド発現の増加方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドが核酸分子によって発現される条件下で、本開示の宿主細胞を培養することを含み、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現が、同じ条件下で培養するとともに、配列番号１６を含む参照核酸分子を含む宿主細胞よりも増加する方法を提供する。
【０３４２】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの収量の改善方法であって、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドが核酸分子によって産生される条件下で、宿主細胞を培養することを含み、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの収量が、同じ条件下で培養するとともに、配列番号１６を含む参照核酸配列を含む宿主細胞よりも増加する方法を提供する。
【０３４３】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの収量の改善方法であって、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を培養することを含み、そのヌクレオチド配列の３’部分のコドン適応指標が、そのヌクレオチド配列の５’部分よりも上昇し、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの収量が、同じ条件下で培養するとともに、配列番号１６を含む参照核酸配列を含む宿主細胞よりも増加する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列の５’部分のコドン適応指標は、配列番号１６のコドン最適化指標と比べて、上昇するか、低下するかまたは不変である。
【０３４４】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの収量の改善方法であって、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を培養することを含み、そのヌクレオチド配列の５’部分のコドン適応指標が、そのヌクレオチド配列の３’部分よりも上昇し、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの収量が、同じ条件下で培養するとともに、配列番号１６を含む参照核酸配列を含む宿主細胞よりも増加する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列の３’部分のコドン適応指標は、配列番号１６のコドン最適化指標と比べて、上昇するか、低下するかまたは不変である。
【０３４５】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの収量の改善方法であって、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を培養することを含み、そのポリペプチドのＣ末端部分をコードするヌクレオチド部分のコドン適応指標が、そのポリペプチドのＮ末端部分をコードするヌクレオチド部分よりも上昇し、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの収量が、同じ条件下で培養するとともに、配列番号１６を含む参照核酸配列を含む宿主細胞よりも増加する方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドのＮ末端部分をコードするヌクレオチド部分のコドン適応指標は、配列番号１６のコドン最適化指標と比べて、上昇するか、低下するかまたは不変である。
【０３４６】
別の実施形態では、本開示は、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの収量の改善方法であって、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む宿主細胞を培養することを含み、そのポリペプチドのＮ末端部分をコードするヌクレオチド部分のコドン適応指標が、そのポリペプチドのＣ末端部分をコードするヌクレオチド部分よりも上昇し、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの収量が、同じ条件下で培養するとともに、配列番号１６を含む参照核酸配列を含む宿主細胞よりも増加する方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのポリペプチドのＣ末端部分をコードするヌクレオチド部分のコドン適応指標は、配列番号１６のコドン最適化指標と比べて、上昇するか、低下するかまたは不変である。
【０３４７】
ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの収量を増加させる特定の実施形態では、そのヌクレオチド配列の５’部分は、適切にアラインメントすると、大体、配列番号１の１〜１７９１位のヌクレオチド、配列番号１の５８〜１７９１位のヌクレオチド、またはそれらの断片と一致する。別の実施形態では、本開示のヌクレオチドの５’部分によってコードされるポリペプチドは、適切にアラインメントすると、大体、配列番号１７の１〜４９７位のアミノ酸、配列番号１７の２０〜４９７位のアミノ酸またはそれらの断片と一致する。特定の実施形態では、そのポリペプチドのＮ末端部分をコードするヌクレオチド配列部分は、大体、適切にアラインメントすると、配列番号１の１〜１７９１位のヌクレオチド、配列番号１の５８〜１７９１位のヌクレオチドまたはそれらの断片と一致する。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド配列の３’部分は、適切にアラインメントすると、大体、配列番号１の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドまたはその断片と一致する。別の実施形態では、本開示のヌクレオチドの３’部分によってコードされるポリペプチドは、適切にアラインメントすると、大体、配列番号１７の４９８〜１４５８位のアミノ酸またはその断片と一致する。特定の実施形態では、本開示のポリペプチドのＣ末端部分をコードするヌクレオチド配列部分は、適切にアラインメントすると、大体、配列番号１の１７９２〜４３７４位のヌクレオチドまたはその断片と一致する。
【０３４８】
いくつかの実施形態では、ＦＶＩＩＩポリペプチドの発現は、同じ条件下で培養するとともに、配列番号１６を含む参照核酸配列を含む宿主細胞よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍または少なくとも約２００倍向上する。
【０３４９】
本開示の最適化核酸分子からＦＶＩＩＩタンパク質を組み換え産生させるには、様々な方法が利用可能である。所望の配列のポリヌクレオチドは、デノボ固相ＤＮＡ合成または事前に調製したポリヌクレオチドのＰＣＲ変異誘発によって作製できる。オリゴヌクレオチド媒介性変異誘発は、ヌクレオチド配列に置換、挿入、欠失または改変（例えば改変コドン）を行う方法の１つである。．例えば、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡテンプレートにハイブリダイズすることによって、出発ＤＮＡを改変する。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、オリゴヌクレオチドプライマーが組み込まれているテンプレートの第２の相補鎖全体を合成する。一実施形態では、遺伝子組み換え、例えばプライマーベースのＰＣＲ変異誘発は、本明細書に定められているように、本開示のポリヌクレオチドを作製するための改変を組み込むのに十分である。
【０３５０】
組み換えタンパク質の作製のためには、ＦＶＩＩＩタンパク質をコードする本開示の最適化ポリヌクレオチド配列を適切な発現ビヒクル、すなわち、挿入されるコード配列の転写と翻訳に必要なエレメントを含むベクター、またはＲＮＡウイルスベクターの場合には、複製と翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入する。
【０３５１】
本開示のポリヌクレオチド配列は、ベクターに、適切なリーディングフレーム内で挿入する。続いて、本開示のポリペプチドを発現することになる好適な標的細胞に、発現ベクターをトランスフェクションする。当該技術分野において知られているトランスフェクション技法としては、リン酸カルシウム沈殿（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９７８，Ｃｅｌｌ１４：７２５）及びエレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８２，ＥＭＢＯ，Ｊ．１：８４１）が挙げられるが、これらに限らない。様々な宿主発現ベクター系を用いて、本明細書に記載されているＦＶＩＩＩタンパク質を真核細胞において発現させることができる。一実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞を含む動物細胞である（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＨＥＬＡ細胞）。本開示のポリヌクレオチド配列は、ＦＶＩＩＩタンパク質を分泌可能にするシグナル配列もコードできる。当業者であれば、ＦＶＩＩＩタンパク質が翻訳される際、シグナル配列が細胞によって切断されて、成熟タンパク質が形成されることは分かる。様々なシグナル配列（例えば、ネイティブ第ＶＩＩ因子シグナル配列、ネイティブ第ＩＸ因子シグナル配列及びマウスＩｇＫ軽鎖シグナル配列）が当該技術分野において知られている。あるいは、シグナル配列が含まれない場合には、ＦＶＩＩＩタンパク質は、細胞を溶解することによって回収できる。
【０３５２】
本開示のＦＶＩＩＩタンパク質は、トランスジェニック動物（齧歯動物、ヤギ、ヒツジ、ブタまたはウシなど）で合成できる。「トランスジェニック動物」という用語は、そのゲノムに外来遺伝子が組み込まれた、ヒト以外の動物を指す。この遺伝子は、生殖系組織に存在するので、親から子孫に伝わる。外因性遺伝子は、単一細胞胚に導入する（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４４３８）。トランスジェニック動物の作製方法は、免疫グロブリン分子を産生するトランスジェニック動物を含め、当該技術分野において知られている（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：６３７６、ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８３，Ｃｅｌｌ  ３４：３３５、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８３，Ｎａｔｕｒｅ３０６：３３２、Ｒｉｔｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：５１７、Ｂａｌｄａｓｓａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５９：８３１、Ｒｏｂｌ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ５９：１０７、Ｍａｌａｓｓａｇｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００３，Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ１０（３）：２６７）。
【０３５３】
発現ベクターは、組み換え作製したタンパク質を容易に精製または同定できるようにするタグをコードできる。例としては、ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８３  ＥＭＢＯ  Ｊ．２：１７９１）（本明細書に記載のＦＶＩＩＩタンパク質のコード配列をそのベクターに、ｌａｃＺコード領域とインフレームでライゲーションして、ハイブリッドタンパク質が産生されるようにできる）が挙げられるが、これに限らず、ｐＧＥＸベクターを用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグとともに、タンパク質を発現できる。これらのタンパク質は通常、可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させてから、遊離グルタチオンの存在下で溶出することによって、細胞から容易に精製できる。これらのベクターは、精製後にタグを除去しやすいように、切断部位（例えばＰｒｅＣｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ニュージャージー州ピーパックのＰｈａｒｍａｃｉａ））を含む。
【０３５４】
本開示の目的においては、数多くの発現ベクター系を用いることができる。これらの発現ベクターは典型的には、宿主生物において、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの一体部分のいずれかとして複製可能である。発現ベクターは、発現制御配列を含むことができ、その配列としては、プロモーター（例えば、天然において関連付けらているプロモーターまたは異種のプロモーター）、エンハンサー、シグナル配列、スプライスシグナル、エンハンサーエレメント及び転写終結配列が挙げられるが、これらに限らない。好ましくは、発現制御配列は、真核宿主細胞をトランスフォーメーションまたはトランスフェクションできるベクターにおける真核生物プロモーター系である。発現ベクターでは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶもしくはＭＯＭＬＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、またはＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントも用いることができる。その他のベクターでは、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニックな系の使用を伴う。
【０３５５】
一般的に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列でトランスフォーメーションされた細胞を検出できるように、選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性またはネオマイシン耐性）を含む（例えば、Ｉｔａｋｕｒａらの米国特許第４，７０４，３６２号を参照されたい）。所望のＤＮＡが染色体に組み込まれた細胞は、トランスフェクションされた宿主細胞を選択可能にする１つ以上のマーカーを導入することによって選択できる。このマーカーは、栄養要求性宿主に原栄養性を付与したり、殺生物剤（例えば抗生物質）耐性または重金属（銅など）耐性を付与したりできる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結することも、コトランスフォーメーションによって、同じ細胞に導入することもできる。
【０３５６】
最適化ＦＶＩＩＩ配列を発現させるための有用なベクターの例は、ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号）である。このベクターは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーと、マウスβグロビン主要プロモーターと、ＳＶ４０複製起点と、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列と、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエキソン１及びエキソン２と、ジヒドロフォレートレダクターゼ遺伝子と、リーダー配列を含む。このベクターは、可変及び定常領域遺伝子に導入し、細胞にトランスフェクションしてから、Ｇ４１８含有培地で選択し、メトトレキセート増幅をすると、非常に高い抗体発現レベルが得られることが分かっている。ベクター系は、米国特許第５，７３６，１３７号及び同第５，６５８，５７０号（それぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される）にも教示されている。この系は、高い発現レベル（例えば、＞３０ｐｇ／細胞／日）をもたらす。その他の例示的なベクター系は、例えば米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
【０３５７】
別の実施形態では、本開示のポリペプチドは、ポリシストロニックなコンストラクトを用いて発現させることができる。これらの発現系では、複数の目的遺伝子産物（多量体結合タンパク質の複数のポリペプチドなど）を１つのポリシストロニックなコンストラクトから作製できる。これらの系は、有益なことに、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を用いて、真核宿主細胞において、比較的高いレベルのポリペプチドをもたらす。適合性のあるＩＲＥＳ配列は、米国特許第６，１９３，９８０号（この特許も本明細書に援用される）に開示されている。
【０３５８】
より一般的には、ポリペプチドをコードするベクターまたはＤＮＡ配列を調製したら、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入できる。すなわち、宿主細胞をトランスフォーメーションできる。宿主細胞へのプラスミドの導入は、上で論じたように、当業者に周知の様々な技法によって行うことができる。トランスフォーメーションした細胞を、ＦＶＩＩＩポリペプチドの産生に適する条件下で増殖させて、ＦＶＩＩＩポリペプチドの合成についてアッセイする。例示的なアッセイ技法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化セルソーター解析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが挙げられる。
【０３５９】
組み換え宿主からポリペプチドを単離するプロセスの説明においては、「細胞」及び「細胞培養液」という用語は、明らかに別段の定めのない限り、ポリペプチド源を示す目的で同義的に使用する。換言すると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、スピンダウンした全細胞、または培地と懸濁細胞の両方を含む細胞培養液のいずれかからの回収を意味することができる。
【０３６０】
本開示の単離核酸は、ヒト細胞において発現するように最適化されているので、タンパク質発現で用いる宿主細胞株は、好ましくは哺乳動物起源の株、最も好ましくは、ヒトまたはマウス起源の株である。例示的な宿主細胞株は、上記されている。ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの作製方法の一実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの作製方法の別の実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【０３６１】
本開示のポリペプチドをコードする遺伝子は、哺乳動物以外の細胞（細菌細胞、酵母細胞または植物細胞など）でも発現できる。この関連においては、哺乳動物以外の様々な単細胞微生物（細菌など）もトランスフォーメーションでき、すなわち、これらの微生物を培養または発酵で増殖させることができることは分かるであろう。トランスフォーメーションを行える細菌としては、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの株など）、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓなど）、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのメンバーが挙げられる。さらに、細菌で発現させると、ポリペプチドは典型的には、封入体の一部になることが分かるであろう。そのポリペプチドは、単離、精製してから、機能性分子にアセンブルする必要がある。
【０３６２】
あるいは、本開示の最適化ヌクレオチド配列は、トランスジェニック動物のゲノムに導入してから、トランスジェニック動物のミルクで発現させるための導入遺伝子に組み込むことができる（例えば、ＤｅｂｏｅｒらのＵＳ５，７４１，９５７、ＲｏｓｅｎのＵＳ５，３０４，４８９及びＭｅａｄｅらのＵＳ５，８４９，９９２を参照されたい）。好適な導入遺伝子は、カゼインまたはβラクトグロブリンなどの乳腺特異的遺伝子のプロモーター及びエンハンサーと機能可能に連結したポリペプチドコード配列を含む。
【０３６３】
インビトロ産生により、所望のポリペプチドを大量に得るためのスケールアップが可能になる。組織培養条件下で哺乳動物細胞を培養する技法は、当該技術分野において知られており、この技法としては、例えば、エアリフト反応器もしくは連続撹拌反応器での均質懸濁培養、または例えば、中空繊維内、マイクロカプセル内、アガロースマイクロビーズ上もしくはセラミックカートリッジ上に固定または捕捉した細胞の培養が挙げられる。必要及び／または所望の場合、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの選択的生合成後、または本明細書に記載されているＨＩＣクロマトグラフィー工程の前もしくは後に、慣例的なクロマトグラフィー方法、例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥセスロースクロマトグラフィーまたは（免疫）アフィニティークロマトグラフィーによって、ポリペプチドの溶液を精製できる。アフィニティータグ配列（例えばＨｉｓ（６）タグ）を任意に応じて、ポリペプチド配列に結合させたり、含めたりして、下流精製を促すことができる。
【０３６４】
ＦＶＩＩＩタンパク質は、発現したら、当該技術分野の標準的な手順（硫安分画、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動などを含む）に従って精製できる（概して、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，（１９８２）を参照されたい）。医薬用途には、均質性が少なくとも約９０〜９５％の実質的に純粋なタンパク質が好ましく、９８〜９９％以上の均質性が最も好ましい。
【０３６５】
医薬組成物
本開示の単離核酸分子、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドであって、その核酸分子によってコードされるポリペプチド、ベクターまたは宿主細胞を含む組成物は、製薬学的に許容可能な好適な担体を含むことができる。例えば、この組成物は、活性化合物を処理して、作用部位への送達用に設計された調製物にするのを容易にする賦形剤及び／または補助剤を含むことができる。
【０３６６】
この医薬組成物は、ボーラス注射による非経口投与（すなわち、静脈内投与、皮下投与または筋肉内投与）用に調合できる。注射用製剤は、例えば、投与単位形態でアンプル内に、または複数回用量容器内に保存剤を加えた状態で供給できる。この組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤または乳剤のような形態を取ることができ、製剤化剤（懸濁化剤、安定化剤及び／または分散化剤など）を含む。あるいは、活性成分は、好適なビヒクル、例えばパイロジェンフリー水で構成される粉末形態であることができる。
【０３６７】
非経口投与用の好適な製剤としては、水溶性形態、例えば水溶性塩である、活性化合物の水性液剤も挙げられる。加えて、適切な油性注射用懸濁剤としての活性化合物懸濁剤を投与できる。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪酸、例えば、ゴマ油または合成脂肪酸エステル、例えばエチルオレエートまたはトリグリセリドが挙げられる。水性注射用懸濁剤は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及びデキストランを含め、懸濁剤の粘度を向上させる物質を含むことができる。任意に応じて、その懸濁剤は、安定剤も含むことができる。リポソームを用いて、細胞または間質腔への送達用に、本開示の分子を封入することもできる。例示的な製薬学的に許容可能な担体は、生理学的に適合可能な溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤、抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）、または塩化ナトリウムを含む。別の実施形態では、本開示の組成物は、製薬学的に許容可能な物質（湿潤剤など）、または活性成分の貯蔵寿命もしくは有効性を向上させる少量の補助物質（湿潤剤、乳化剤、保存剤もしくは緩衝剤など）を含む。
【０３６８】
本開示の組成物は、例えば、液体（例えば、注射用溶液及び注入用溶液）、分散液、懸濁液、半固体及び固体の剤形を含め、様々な形態であることができる。好ましい形態は、投与方法と治療用途に左右される。
【０３６９】
本開示の組成物は、液剤、マイクロエマルジョン剤、分散剤、リポソームまたは高い薬物濃度に適するその他の規則構造体として調合できる。滅菌注射用液剤は、必要に応じて、上で列挙した成分を１つ以上組み合わせたものとともに、活性成分を所要量で適切な溶媒に組み込んでから、ろ過滅菌することによって調製できる。概して、分散剤は、塩基性分散媒と、上で列挙したその他の成分のうちの必要な成分とを含む滅菌ビヒクルに活性成分を組み込むことによって調製する。滅菌注射用液剤を調製するための滅菌散剤の場合には、好ましい調製方法は、事前に滅菌ろ過した溶液から、活性成分と、いずれかの所望の追加成分との粉末をもたらす真空乾燥と凍結乾燥である。溶剤の適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを使用することによって、分散剤の場合には、所要粒径を保持することによって、また、界面活性剤を使用することによって保持できる。注射用組成物の吸収時間の延長は、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアレート塩及びゼラチンをその組成物に含めることによって実現できる。
【０３７０】
活性成分は、放出制御製剤または放出制御器具で調合できる。このような製剤と器具の例としては、インプラント、軽皮パッチ及びマイクロカプセル化送達システムが挙げられる。生分解性生体適合性ポリマー、例えば、エチレンビニルアセテート、ポリアンハイドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸を用いることができる。このような製剤と器具の調製方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０３７１】
注射用デポー製剤は、生分解性ポリマー（ポリラクチド−ポリグリコリドなど）内の薬物のマイクロカプセル化マトリックスを形成することによって作製できる。薬物とポリマーとの比率と、使用するポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御できる。その他の例示的な生分解性ポリマーは、ポリオルトエステルとポリアンハイドライドである。注射用デポー製剤は、薬物をリポソームまたはマイクロエマルジョン中に捕捉することによっても調製できる。
【０３７２】
本開示の組成物には、補足的な活性化合物を組み込むことができる。一実施形態では、本開示のキメラタンパク質は、別の凝固因子、またはそのバリアント、断片、アナログもしくは誘導体とともに調合する。例えば、その凝固因子としては、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビン、フィブリノゲン、フォンビルブランド因子、またはこれらのいずれかの組み換え可溶性組織因子（ｒｓＴＦ）または活性化形態が挙げられるが、これらに限らない。止血剤の凝固因子としては、抗線溶薬、例えば、ε−アミノカプロン酸、トラネキサム酸も挙げることができる。
【０３７３】
投与レジメンを調節して、最適な所望の応答をもたらすことができる。例えば、単回ボーラス投与を行うことも、経時的に、数回の分割投与を行うことも、治療状況の緊急性によって示されるのに応じて、用量を比例的に減少または増加させることもできる。投与のしやすさと、用量の均一化のために、非経口組成物を投与単位形態で調合するのが有益である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１９８０）を参照されたい。
【０３７４】
液体剤形は、活性化合物に加えて、水、エチルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステルのような不活性成分を含むことができる。
【０３７５】
好適な製剤用担体の非限定的な例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにも記載されている。賦形剤のいくつかの例としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ナトリウムステアレート、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。本開示の組成物は、ｐＨ緩衝試薬と、湿潤剤または乳化剤を含むことができる。
【０３７６】
経口投与用には、医薬組成物は、従来の手段によって調製した錠剤またはカプセル剤の形態を取ることができる。本開示の組成物は、液剤、例えば、シロップ剤または懸濁剤として調製することもできる。この液体は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ剤、セルロース誘導体または水素添加食用脂）、乳化剤（レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）及び保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を含むことができる。この調製剤は、矯味矯臭剤、着色剤及び甘味剤も含むことができる。あるいは、本開示の組成物は、水またはその他の好適なビヒクルで構成するための乾燥生成物として供給できる。
【０３７７】
口腔内投与用では、本開示の組成物は、従来のプロトコールに従って、錠剤またはロゼンジ剤の形態を取ることができる。
【０３７８】
吸入による投与用では、本開示に従って使用する化合物は、利便的には、賦形剤を含むかもしくは含まない霧状化エアゾール剤の形態、または任意に応じて、噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素もしくはその他の好適な気体とともに、圧縮パックもしくはネブライザーから出るエアゾールスプレーの形態で送達する。加圧エアゾール剤の場合には、投与単位は、バルブを搭載して、定量した量を送達することによって定めることができる。吸入器または注入器で用いるための、例えばゼラチンのカプセル剤及びカートリッジは、本開示の化合物と、好適な粉末基剤（ラクトースまたはデンプン）との混合粉末を含めて調合できる。
【０３７９】
本開示の医薬組成物は、直腸投与用に、例えば、従来の坐剤基剤（ココアバターまたはその他のグリセリド）を含む坐剤または保持型浣腸剤として調合することもできる。
【０３８０】
一実施形態では、医薬組成物は、第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチド、第ＶＩＩＩ因子活性を有するポリペプチドをコードする最適化核酸分子、この核酸分子を含むベクター、またはこのベクターを含む宿主細胞と、製薬学的に許容可能な担体とを含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、局所投与、眼内投与、非経口投与、髄腔内投与、硬膜下投与及び経口投与からなる群から選択した経路によって投与する。非経口投与は、静脈内投与または皮下投与であることができる。
【０３８１】
別の実施形態では、本開示の組成物を用いて、出血疾患または出血状態の治療が必要な対象において、出血疾患または出血状態を治療する。出血疾患または出血状態は、出血凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉への大量出血、口腔大量出血、外傷、頭部の外傷、胃腸出血、頭蓋内大量出血、腹腔内大量出血、胸腔内大量出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内の出血、腹膜後隙内の出血、腸腰筋鞘内の出血及びこれらをいずれかに組み合わせたものからなる群から選択されている。さらに別の実施形態では、対象は、手術を受ける予定である。さらに別の実施形態では、この治療は、予防またはオンデマンドのものである。
【０３８２】
治療方法
本開示は、出血障害の治療方法であって、出血障害の治療が必要な対象に、本開示の核酸分子、ベクターまたはポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、出血障害は、ＦＶＩＩＩの欠損によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、出血障害は、血友病である。いくつかの実施形態では、出血障害は、血友病Ａである。出血障害の治療方法のいくつかの実施形態では、投与から２４時間後の血漿中ＦＶＩＩＩ活性が、配列番号１６を含む参照核酸分子、その参照核酸分子を含むベクター、またはその参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与した対象よりも向上する。
【０３８３】
いくつかの実施形態では、血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、配列番号１６を含む参照核酸分子、その参照核酸分子を含むウイルスベクター、またはその参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与した対象よりも、投与から約６時間後、約１２時間後、約１８時間後、約２４時間後、約３６時間後、約４８時間後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約８日後、約９日後、約１０日後、約１１日後、約１２日後、約１３日後、約１４日後、約１５日後、約１６日後、約１７日後、約１８日後、約１９日後、約２０日後、約２１日後、約２２日後、約２３日後、約２４日後、約２５日後、約２６日後、約２７日後または約２８日後に向上する。特定の実施形態では、血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、配列番号１６を含む参照核酸分子、その参照核酸分子を含むウイルスベクター、またはその参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与した対象よりも、投与から約２４時間後に向上する。別の実施形態では、血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、配列番号１６を含む参照核酸分子、その参照核酸分子を含むウイルスベクター、またはその参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与した対象よりも、投与から約２１日後に向上する。
【０３８４】
いくつかの実施形態では、投与後の血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、配列番号１６を含む参照核酸分子、その参照核酸分子を含むウイルスベクター、またはその参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与した対象よりも、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約３５０倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約４５０倍または少なくとも約５００倍向上する。いくつかの実施形態では、投与後の血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、生理学的に正常な循環血液中ＦＶＩＩＩレベルよりも、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、少なくとも約１０００％、少なくとも約１５００％、少なくとも約２０００％、少なくとも約２５００％、少なくとも約３０００％、少なくとも約３５００％、少なくとも約４０００％、少なくとも約４５００％、少なくとも約５０００％、少なくとも約５５００％、少なくとも約６０００％、少なくとも約７０００％、少なくとも約８０００％、少なくとも約９０００％、少なくとも約１０，０００％向上する。一実施形態では、投与後の血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、生理学的に正常な循環血液中ＦＶＩＩＩレベルよりも、少なくとも約３０００〜約５０００％向上する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むプラスミドの投与から２４時間後に、または本明細書に記載されている、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むレンチウイルスベクターもしくはＡＡＶベクターの投与から２１日後に、血漿中ＦＶＩＩＩ活性が、配列番号１６を含む参照核酸分子、その参照核酸分子を含むベクター、またはその参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与した対象よりも少なくとも約６倍向上する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むプラスミドの投与から２４時間後に、または本明細書に記載されている、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むレンチウイルスベクターもしくはＡＡＶベクターの投与から２１日後に、血漿中ＦＶＩＩＩ活性が、配列番号１６を含む参照核酸分子、その参照核酸分子を含むベクター、またはその参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与した対象よりも少なくとも約１０倍向上する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むプラスミドの投与から２４時間後に、または本明細書に記載されている、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むレンチウイルスベクターもしくはＡＡＶベクターの投与から２１日後に、血漿中ＦＶＩＩＩ活性が、配列番号１６を含む参照核酸分子、その参照核酸分子を含むベクター、またはその参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与した対象よりも少なくとも約２３倍向上する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むプラスミドの投与から２４時間後に、または本明細書に記載されている、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むレンチウイルスベクターもしくはＡＡＶベクターの投与から２１日後に、血漿中ＦＶＩＩＩ活性が、配列番号１６を含む参照核酸分子、その参照核酸分子を含むベクター、またはその参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与した対象よりも少なくとも約１８倍向上する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むプラスミドの投与から２４時間後に、または本明細書に記載されている、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むレンチウイルスベクターもしくはＡＡＶベクターの投与から２１日後に、血漿中ＦＶＩＩＩ活性が、配列番号１６を含む参照核酸分子、その参照核酸分子を含むベクター、またはその参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与した対象よりも少なくとも約３０倍向上する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むプラスミドの投与から２４時間後に、または本明細書に記載されている、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むレンチウイルスベクターもしくはＡＡＶベクターの投与から２１日後に、血漿中ＦＶＩＩＩ活性が、配列番号１６を含む参照核酸分子、その参照核酸分子を含むベクター、またはその参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与した対象よりも少なくとも約５０倍向上する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むプラスミドの投与から２４時間後に、または本明細書に記載されている、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むレンチウイルスベクターもしくはＡＡＶベクターの投与から２１日後に、血漿中ＦＶＩＩＩ活性が、配列番号１６を含む参照核酸分子、その参照核酸分子を含むベクター、またはその参照核酸分子によってコードされるポリペプチドを投与した対象よりも少なくとも約１００倍向上する。
【０３８５】
本開示は、対象の止血障害の治療、改善または予防方法であって、本開示の単離核酸分子、またはＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドであって、本開示の核酸分子によってコードされるポリペプチドを治療有効量投与することを含む方法にも関する。本開示の単離核酸分子またはコードされるポリペプチドによる治療、改善及び予防は、バイパス療法であることができる。バイパス療法を受ける対象は、凝固因子、例えばＦＶＩＩＩに対するインヒビターをすでに発現していることも、凝固因子インヒビターを発現する傾向があることもできる。
【０３８６】
本開示の核酸分子、ベクターまたはポリペプチドは、フィブリン血餅の形成を促すことによって、止血障害を治療または予防する。ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドであって、本開示の核酸分子によってコードされるポリペプチドは、凝固カスケードのメンバーを活性化できる。この凝固因子は、外因経路、内因経路またはこれらの両方に関与できる。
【０３８７】
本開示の核酸分子、ベクターまたはポリペプチドを用いて、ＦＶＩＩＩで治療可能であることが知られている止血障害を治療できる。本開示の方法を用いて治療できる止血障害としては、血友病Ａ、血友病Ｂ、フォンビルブランド病、第ＸＩ因子欠損（ＰＴＡ欠損）、第ＸＩＩ因子欠損、フィブリノゲン、プロトロンビン、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第Ｘ因子または第ＸＩＩＩ因子の欠損または構造的異常、関節血症、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉への大量出血、口腔大量出血、外傷、頭部の外傷、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内の出血、腹膜後隙内の出血及び腸腰筋鞘内の出血が挙げられるが、これらに限らない。対象に投与するための組成物としては、ＦＶＩＩＩ凝固因子をコードする本開示の最適化ヌクレオチド配列を含む核酸分子（遺伝子療法用途用）と、ＦＶＩＩＩポリペプチド分子が挙げられる。
【０３８８】
いくつかの実施形態では、止血障害は、遺伝性障害である。一実施形態では、対象は、血友病Ａである。別の実施形態では、止血障害は、ＦＶＩＩＩの欠損によるものである。別の実施形態では、止血障害は、異常なＦＶＩＩＩ凝固因子によるものであることができる。
【０３８９】
別の実施形態では、止血障害は、後天性障害であることができる。この後天性障害は、裏に潜む二次的な疾患または状態によるものであることができる。この無関連の状態は、一例としては、がん、自己免疫疾患または妊娠であることができるが、これらに限らない。後天性障害は、加齢、または裏に潜む二次的な障害を治療するための投薬（例えば、がんへの化学療法）によるものであることができる。
【０３９０】
本開示は、止血障害ではないか、または止血障害の発症の原因となる二次的な疾患もしくは状態である対象の治療方法に関するものでもある。したがって、本開示は、一般的な止血剤を必要とする対象の治療方法であって、本開示の単離核酸分子、ベクターまたはＦＶＩＩＩポリペプチドを治療有効量投与することを含む方法に関するものである。例えば、一実施形態では、一般的な止血剤を必要とする対象は、手術を受けているか、または手術を受けようとしている者である。本開示の単離核酸分子、ベクターまたはＦＶＩＩＩポリペプチドは、手術の前または後に、予防として投与できる。本開示の単離核酸分子、ベクターまたはＦＶＩＩＩポリペプチドは、手術の最中または後に投与して、急性出血エピソードを制御できる。手術としては、肝移植、肝切除または幹細胞移植を挙げることができるが、これらに限らない。
【０３９１】
別の実施形態では、本開示の単離核酸分子、ベクターまたはＦＶＩＩＩポリペプチドを用いて、急性出血エピソードを有する対象であって、止血障害ではない対象を治療できる。急性出血エピソードは、無制御な出血を引き起こす重大な外傷、例えば、手術、自動車事故、創傷、裂傷、銃創またはいずれかの他の外傷イベントに起因することができる。
【０３９２】
単離核酸分子、ベクターまたはＦＶＩＩＩタンパク質を用いて、止血障害の対象を予防的に治療できる。単離核酸分子、ベクターまたはＦＶＩＩＩタンパク質を用いて、止血障害の対象の急性出血エピソードを治療できる。
【０３９３】
別の実施形態では、本開示の単離核酸分子またはベクターを投与することによって、ＦＶＩＩＩタンパク質を発現させる際には、対象において免疫応答を誘導しない。いくつかの実施形態では、この免疫応答は、ＦＶＩＩＩに対する抗体の発現を含む。いくつかの実施形態では、この免疫応答は、サイトカインの分泌を含む。いくつかの実施形態では、この免疫応答は、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞とＴ細胞の両方の活性化を含む。いくつかの実施形態では、この免疫応答は、抑制性免疫応答であり、対象におけるこの免疫応答は、免疫応答を発現していない対象におけるＦＶＩＩＩ活性よりも、ＦＶＩＩＩタンパク質の活性を低下させる。特定の実施形態では、本開示の単離核酸分子またはベクターを投与することによって、ＦＶＩＩＩタンパク質を発現させると、ＦＶＩＩＩタンパク質または本開示の単離核酸分子もしくはベクターから発現するＦＶＩＩＩタンパク質に対する抑制性免疫応答が阻止される。
【０３９４】
いくつかの実施形態では、止血を促す少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて、本開示の単離核酸分子、ベクターまたはＦＶＩＩＩタンパク質組成物を投与する。前記その他の薬剤は、凝固活性が示されている治療において、止血を促す。止血剤としては、一例として、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロトロンビンもしくはフィブリノゲン、またはこれらのいずれかの活性化形態を挙げることができるが、これらに限らない。この凝固因子または止血剤としては、抗線溶薬、例えば、ε−アミノカプロン酸、トラネキサム酸も挙げることができる。
【０３９５】
本開示の一実施形態では、本開示の組成物（例えば、単離核酸分子、ベクターまたはＦＶＩＩＩポリペプチド）は、対象に投与したときに、ＦＶＩＩＩが活性化可能な形態で存在する組成物である。このような活性化可能な分子は、対象に投与後、インビボにおいて、凝固部位で活性化できる。
【０３９６】
本開示の単離核酸分子、ベクターまたはＦＶＩＩＩポリペプチドは、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、または粘膜表面を介した投与、例えば、経口投与、舌下投与、口腔内投与、舌下投与、経鼻投与、直腸投与、膣内投与もしくは経肺経路を介した投与を行うことができる。本開示のＦＶＩＩＩタンパク質は、そのキメラタンパク質を所望の部位に徐放できるようにするバイオポリマー固体支持体に埋め込んだり、連結したりすることができる。
【０３９７】
経口投与用には、本開示の医薬組成物は、従来の手段によって調製した錠剤またはカプセル剤の形態を取ることができる。本開示の組成物は、液剤、例えば、シロップ剤または懸濁剤として調製することもできる。この液剤は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ剤、セルロース誘導体または水素添加食用脂）、乳化剤（レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）及び保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、またはソルビン酸）を含むことができる。この調製剤は、矯味矯臭剤、着色剤及び甘味剤も含むことができる。あるいは、本開示の組成物は、水またはその他の好適なビヒクルで構成するための乾燥生成物として供給できる。
【０３９８】
口腔内及び舌下投与用では、本開示の組成物は、従来のプロトコールに従って、錠剤、ロゼンジ剤または速溶性フィルムの形態を取ることができる。
【０３９９】
吸入による投与用では、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドであって、本開示に従って使用するためのポリペプチドは、利便的なことに、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、二酸化炭素またはその他の好適な気体とともに、圧縮パックまたはネブライザーから出るエアゾールスプレー（例えばＰＢＳ中）の形態で送達する。加圧エアゾール剤の場合には、投与単位は、バルブを搭載して、定量した量を送達することによって定めることができる。吸入器または注入器で用いるための、例えばゼラチンのカプセル剤及びカートリッジは、本開示の化合物と好適な粉末基剤（ラクトースまたはデンプン）との混合粉末を含めて調合できる。
【０４００】
一実施形態では、本開示の単離核酸分子、ベクターまたはＦＶＩＩＩポリペプチドの投与経路は、非経口経路である。本明細書で使用する場合、非経口という用語には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与または膣内投与が含まれる。静脈内形態の非経口投与が好ましい。これらのすべての投与形態は明らかに、本開示の範囲内と想定されているが、投与形態は、注射用液剤、特に静脈内注射、動脈内注射または点滴用の液剤となる。通常、好適な注射用医薬組成物は、緩衝剤（例えば、酢酸緩衝剤、リン酸緩衝剤またはクエン酸緩衝剤）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、任意に応じて安定化剤（例えばヒトアルブミン）などを含むことができる。しかしながら、本発明の教示と適合する他の方法では、本開示の単離核酸分子、ベクターまたはＦＶＩＩＩポリペプチドは、有害な細胞集団の部位に直接送達することによって、その治療剤への疾患組織の曝露を増大できる。
【０４０１】
非経口投与用調製剤としては、滅菌水性液剤、非水性液剤、懸濁剤及び乳剤が挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）及び注射用有機エステル（エチルオレエートなど）である。水性担体としては、水、アルコール溶液／水溶液、乳剤または懸濁液（生理食塩水及び緩衝化媒体を含む）が挙げられる。本開示では、製薬学的に許容可能な担体としては、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝剤、または０．８％生理食塩水が挙げられるが、これらに限らない。その他の一般的な非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲルまたは固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養補給液、電解質補液（リンゲルデキストロースベースのものなど）などが挙げられる。保存剤及びその他の添加剤（例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤及び不活性ガスなど）も存在することができる。
【０４０２】
さらに詳細には、注射用に適する医薬組成物としては、滅菌水溶液剤（水溶性の場合）または分散液剤と、滅菌注射用液剤または分散液剤の用時調製用の滅菌粉末が挙げられる。このようなケースでは、医薬組成物は、無菌でなければならず、容易に注射可能な程度の流体でなければならない。医薬組成物は、製造条件及び保管条件下で安定でなければならず、微生物（細菌及び真菌など）の汚染作用から保護するのが好ましい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにこれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることによって、分散剤の場合には、所要の粒径を保つことによって、また、界面活性剤を用いることによって保つことができる。
【０４０３】
微生物作用の阻止は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって行うことができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール（マンニトール、ソルビトールなど）または塩化ナトリウムを組成物に含めるのが好ましい、注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる作用剤、例えば、アルミニウムモノステアレート及びゼラチンをその組成物に含めることによって実現できる。
【０４０４】
いずれのケースでも、滅菌注射用液剤は、必要に応じて、本明細書に列挙されている成分の１つまたはそれらの成分を組み合わせたものとともに、活性化合物（例えば、ポリペプチド単独、またはその他の活性剤と組み合わせたもの）を所要量で、適切な溶媒に組み込んでから、ろ過滅菌を行うことによって調製できる。概して、分散剤は、塩基性分散媒と、上に列挙されているその他の成分のうちの必要な成分とを含む滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製する。滅菌注射用液剤を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は、活性成分と、いずれかの所望の追加成分との溶液を事前に滅菌ろ過したものから、活性成分と、いずれかの所望の追加成分との粉末をもたらす真空乾燥と凍結乾燥である。注射用の調製剤は、当該技術分野において知られている方法に従って、処理して、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジまたはバイアルなどの容器に詰め、無菌条件下で密封する。さらに、その調製剤は、キットの形態で包装して販売することができる。このような製造品には、凝固障害を罹患しているかまたは凝固障害に対する素因を有する対象を治療するのに有用である関連組成物を示しているラベルまたは添付文書があるのが好ましい。
【０４０５】
本開示の医薬組成物は、直腸投与用に、例えば従来の坐剤基剤（ココアバターまたはその他のグリセリド）を含む坐剤または保持型浣腸剤として調合することもできる。
【０４０６】
状態を治療する際の、本開示の組成物の有効な用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び処置が予防的なものであるか治療的なものであるかを含む多くの異なる要因によって変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含むヒト以外の哺乳動物も治療できる。当業者に知られている常法を用いて、処置用量を漸増・漸減して、安全性と効能を最適化できる。
【０４０７】
本明細書に記載されているような、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むプラスミド、またはそのコドン最適化遺伝子によってコードされるポリペプチドの投与用量は、体重１ｋｇ当たり１０００μｇ〜体重１ｋｇ当たり０．１ｎｇの範囲であることができる。一実施形態では、この用量の範囲は、１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇである。本明細書に記載されているような、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むレンチウイルスベクターの投与用量は、１０３〜１０１５ＴＵ／ｋｇの範囲であることができる。本明細書に記載されているような、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）活性を有するポリペプチドをコードするコドン最適化遺伝子を含むＡＡＶベクターの投与用量は、１０５〜１０１８ＶＧ／ｋｇの範囲であることができる。
【０４０８】
本開示の単離核酸分子、プラスミド、ベクターまたはＦＶＩＩＩポリペプチドは、単回用量または多回数用量として投与でき、多回数用量は、連続して、または特定の時間間隔を置いて投与できる。インビトロアッセイを用いて、最適な用量範囲及び／または投与スケジュールを割り出すことができる。凝固因子活性を測定するインビトロアッセイは、当該技術分野において知られている。加えて、有効な用量は、動物モデル、例えば血友病のイヌから得た用量反応曲線から推定できる（Ｍｏｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９（８）：２６７０）。
【０４０９】
上記範囲の間にある用量も、本開示の範囲内であるように意図されている。対象には、上記のような用量を毎日、１日置き、週に１回または実証的な解析によって定めたいずれかの他のスケジュールに従って投与できる。例示的な治療には、長期間、例えば少なくとも６カ月にわたって、多回数用量で投与することを伴う。いくつかの方法では、２つ以上のポリペプチドを同時に投与でき、その場合、各ポリペプチドの投与用量は、示した範囲内に収まる。
【０４１０】
本開示の単離核酸分子、ベクターまたはＦＶＩＩＩポリペプチドは、多くの状況で投与できる。単回投与間の間隔は、１日、１週間、１カ月または１年であることができる。間隔は、患者における改変ポリペプチドまたは抗原の血中レベルを測定することによって示されるのに従って、不規則であることもできる。あるいは、ポリペプチドは、徐放製剤として投与でき、その場合、頻度の低い投与が必要となる。用量と頻度は、患者におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドの半減期によって変化する。
【０４１１】
投与用量と投与頻度は、処置が予防的なものであるか、治療的なものであるかによって変化し得る。予防的用途では、まだ病態にない患者に、本開示の単離核酸分子、ベクターもしくはＦＶＩＩＩポリペプチドを含む組成物、またはそのカクテルを投与して、患者の耐性を高めるか、または疾患の作用を最小限にする。このような量は、「予防上有効な用量」であると定義する。比較的低い用量を比較的低頻度な間隔で、長期間にわたって投与する。一部の患者では、一生にわたって治療を継続する。
【０４１２】
本開示の単離核酸分子、ベクターまたはＦＶＩＩＩポリペプチドは、任意に応じて、処置（例えば、予防的処置または治療的処置）の必要な障害または状態の処置に有効である他の薬剤と組み合わせて投与できる。
【０４１３】
本明細書で使用する場合、補助療法と併せて、または補助療法と組み合わせて、本開示の単離核酸分子、ベクターまたはＦＶＩＩＩポリペプチドを投与することは、その療法と開示されているポリペプチドを順次に、同時に、同域に、併用で、共存でまたは同時期に投与または適用することを意味する。治療の全体的な有効性を高めるように、併用療法レジメンの各種成分の投与または適用のタイミングを決定することになることは当業者には分かるであろう。当業者（例えば医師）は、過度の実験なしに、所定の補助療法と、本明細書の教示に基づき、有効な併用療法レジメンを容易に識別できるであろう。
【０４１４】
さらに、（例えば、併用療法レジメンを提供する目的で、）１つの薬剤または複数の薬剤と併せて、または組み合わせて、本開示の単離核酸分子、ベクターまたはＦＶＩＩＩポリペプチドを使用できることは明らかであろう。本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと組み合わせることのできる例示的な薬剤としては、治療する特定の疾患に対する最新の標準ケアとなる薬剤が挙げられる。このような薬剤は、本質的に化学的または生物学的なものであることができる。「生物学的」または「生物学的薬剤」という用語は、生物及び／またはその産物から作られるいずれかの製薬学的活性剤であって、治療剤として用いるように意図されている製薬学的活性剤を指す。
【０４１５】
本開示のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと組み合わせて用いる薬剤の量は、対象によって変化し得るか、または当該技術分野において知られている事象に従って投与できる。例えば、Ｂｒｕｃｅ  Ａ  Ｃｈａｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，ｉｎ  ＧＯＯＤＭＡＮ  ＆  ＧＩＬＭＡＮ’Ｓ  ＴＨＥ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＢＡＳＩＳ  ＯＦ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ  １２３３−１２８７（（Ｊｏｅｌ  Ｇ．Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，９ｔｈｅｄ．１９９６）を参照されたい。別の実施形態では、このような薬剤は、標準ケアと整合する量で投与する。
【０４１６】
すでに考察したように、本開示のポリヌクレオチドとポリペプチドは、凝固障害のインビボ治療用として製薬学的に有効な量で投与できる。この関連においては、本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、投与を容易にするとともに、活性剤の安定性を促すように調合できることは明らかであろう。好ましくは、本開示による医薬組成物は、製薬学的に許容可能な無毒の滅菌担体（生理食塩水など）、無毒の緩衝剤、保存剤などを含む。当然ながら、本開示の医薬組成物は、製薬学的に有効な量のポリペプチドを供給するように、単回用量または多回数用量で投与できる。
【０４１７】
凝固系の機能の評価には、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）検査、発色アッセイ、ＲＯＴＥＭ（登録商標）アッセイ、プロトロンビン時間（ＰＴ）検査（ＩＮＲを割り出すのにも使用する）、フィブリノゲン検査（クラウス方法による場合が多い）、血小板数、血小板機能検査（ＰＦＡ−１００による場合が多い）、ＴＣＴ、出血時間、ミキシングテスト（患者の血漿を正常な血漿と混合した場合に、異常が補正されるか）、凝固因子アッセイ、抗リン脂質抗体、Ｄ−二量体、遺伝子検査（例えば、第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ、プロトロンビン変異Ｇ２０２１０Ａ）、希釈ラッセル蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）、多面的な血小板機能検査、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧまたはＳｏｎｏｃｌｏｔ）、トロンボエラストメトリー（ＴＥＭ（登録商標）、例えばＲＯＴＥＭ（登録商標））、またはオイグロブリン溶解時間（ＥＬＴ）といった多くの検査が利用可能である。
【０４１８】
ａＰＴＴ検査は、「内因性」凝固経路（接触活性化経路ともいう）と共通凝固経路の両方の効力を測定する能力指標である。この検査は、市販の組み換え凝固因子、例えばＦＶＩＩＩまたはＦＩＸの凝固活性を測定する目的で、広く用いられている。この検査は、外因性経路を測定するプロトロンビン時間（ＰＴ）と併せて用いられている。
【０４１９】
ＲＯＴＥＭ（登録商標）解析は、止血の全体的な動態に関する情報、すなわち、凝固時間、血餅形成、凝固安定性及び溶解を提供するものである。トロンボエラストメトリーにおける様々なパラメーターは、血漿凝固系の活性、血小板機能、線維素溶解またはこれらの相互作用に影響を及ぼす多くの要因に左右される。このアッセイによって、二次止血の包括的概観を得ることができる。
【０４２０】
遺伝子療法
本開示は、対象において、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現を増大させる方法であって、この増大を必要とする対象に、本開示の単離核酸分子を投与することを含み、そのポリペプチドの発現が、配列番号１６を含む参照核酸分子よりも増大する方法を提供する。本開示は、対象において、ＦＶＩＩＩ活性を有するポリペプチドの発現を増大させる方法であって、この増大を必要とする対象に、本開示のベクターを投与することを含み、そのポリペプチドの発現が、参照核酸分子を含むベクターよりも増大する方法も提供する。
【０４２１】
血友病Ａの考え得る治療法として、体細胞遺伝子療法が探求されている。遺伝子療法は、血友病に対する特に魅力的な治療法である。ベクターを１回投与後、ＦＶＩＩＩを継続的に内因性産生させることを通じて、血友病を治癒させる可能性があるからである。血友病Ａは、遺伝子置換アプローチにかなり適している。その臨床症状が全面的に、血漿においてわずかな量（２００ｎｇ／ｍｌ）で循環する１つの遺伝子産物（ＦＶＩＩＩ）の欠損に起因するからである。
【０４２２】
本開示のＦＶＩＩＩタンパク質は、哺乳動物、例えばヒトの患者において、インビボで産生させることができる。出血凝固障害、関節血症、筋肉出血、口腔出血、大量出血、筋肉への大量出血、口腔大量出血、外傷、頭部の外傷、胃腸出血、頭蓋内出血、腹腔内出血、胸腔内大量出血、骨折、中枢神経系出血、咽頭後隙内の出血、腹膜後隙内の出血及び腸腰筋鞘内の出血からなる群から選択した出血疾患または出血障害の治療に対する遺伝子療法アプローチを用いることは、治療上、有益と見られる。一実施形態では、出血疾患または出血障害は、血友病である。別の実施形態では、出血疾患または出血障害は、血友病Ａである。上記のアプローチには、好適な発現制御配列に機能可能に連結された最適化ＦＶＩＩＩコード核酸の投与を伴う。特定の実施形態では、これらの配列は、ウイルスベクターに組み込まれている。このような遺伝子療法のための好適なウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、エプスタインバーウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられる。このウイルスベクターは、複製能欠失型ウイルスベクターであることができる。別の実施形態では、アデノウイルスベクターは、そのＥ１遺伝子またはＥ３遺伝子が欠失している。別の実施形態では、当業者に知られている非ウイルスベクターに、配列が組み込まれている。
【０４２３】
本明細書に記載されている様々な態様、実施形態及び選択肢はいずれも、あらゆる変形形態で組み合わせることができる。
【０４２４】
本明細書で言及されている文献、特許及び特許出願はいずれも、個々の文献、特許または特許出願が、参照により援用されることが具体的かつ個々に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用される。
【０４２５】
本開示について概ね説明してきたが、本明細書に示されている実施例を参照することによって、さらに深く理解できる。これらの実施例は、例示するためのものに過ぎず、限定するようには意図されていない。
【実施例】
【０４２６】
実施例１．コドン最適化の方策
コドン使用頻度バイアスを制御することによって、ｃｏＦＶＩＩＩ−３（配列番号１、図１Ａ）、ｃｏＦＶＩＩＩ−４（配列番号２、図１Ｂ）、ｃｏＦＶＩＩＩ−５（配列番号７０、図１Ｃ）、ｃｏＦＶＩＩＩ−６（配列番号７１、図１Ｄ）、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２（配列番号３、図１Ｅ）、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２（配列番号４、図１Ｆ）、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５（配列番号５、図１Ｇ）及びｃｏＦＶＩＩＩ−２６（配列番号６、図１Ｈ）を含む８つのコドン最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩバリアントを作製した。すでに説明されているように、オンラインツールのＥｕｇｅｎｅを用いて、コドン最適化を促し（Ｇａｓｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，“ＥｕＧｅｎｅ：ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２８：２６８３−８４（２０１２）を参照されたい）、コドン適応指標（ＣＡＩ）及び相対的な同義コドン使用頻度（ＲＳＣＵ）のようないくつかのコドン使用頻度パラメーターをモニタリングした（表５）。いずれのバリアントも、ＣＡＩ≧８３％及びＲＳＣＵ≧１．６３に調整したが、最適化前のＢドメイン欠失親ＦＶＩＩＩ配列は、ＣＡＩが７４％、ＲＳＣＵが１．１２である（表５）。
【表５】
2019506166.tif 000015
【０４２７】
ＣＡＩの全体的な向上に加えて、これらの８つのバリアントは、図２に示されているように、コード領域にわたるＣＡＩの分布を非最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ配列（図２Ａ）と比較したものに基づき、３つのクラスに設計した。第１のクラスは、コード領域全体にわたり、高いＣＡＩが均一に分布しているＢＤＤ  ＦＶＩＩＩバリアントを含む（図２Ｃ〜２Ｆを参照されたい）。第１のクラスには、ｃｏＦＶＩＩＩ−３（図２Ｃ）と、ｃｏＦＶＩＩＩ−４（図２Ｄ）と、ｃｏＦＶＩＩＩ−５（図２Ｅ）と、ｃｏＦＶＩＩＩ−６（図２Ｆ）と、以前に説明されたｃｏＦＶＩＩＩ−１（国際公開第２０１４／１２７２１５号（配列番号１）を参照されたい）（図２Ｂ）が含まれる。第２のクラスは、コード配列のＮ末端側半分のＣＡＩの方が低く、コード配列のＣ末端側半分のＣＡＩの方が高いＢＤＤ−ＦＶＩＩＩバリアントを含む（図２Ｇ及び２Ｈを参照されたい）。第２のクラスには、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２（図２Ｇ）とｃｏＦＶＩＩＩ−６２（図２Ｈ）が含まれる。第３のクラスは、コード配列のＮ末端側半分のＣＡＩの方が高く、コード配列のＣ末端側半分のＣＡＩの方が低いＢＤＤ  ＦＶＩＩＩバリアントを含む（図２Ｉ及び２Ｊを参照されたい）。第３のクラスには、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５（図２Ｉ）とｃｏＦＶＩＩＩ−２６（図２Ｊ）が含まれる。
【０４２８】
いずれかの理論に拘束される訳ではないが、ＣＡＩが高いほど、タンパク質への翻訳が速くなるとともに、これらの３つのクラスでは、最初から最後まで、異なるタンパク質合成速度を示すのではないかと推測した。例えば、ＣＡＩの低い方の領域の翻訳は、ＣＡＩの高い方の領域の翻訳よりもゆっくり進むと見られる。その場合、例えば、まず、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２またはｃｏＦＶＩＩＩ−６２のＮ末端側半分（ＣＡＩが低い）の翻訳がゆっくり進み、その後、ＣＡＩが高いＣ末端側半分の翻訳が、より速く進むと見られる。翻訳の際、タンパク質合成の全体を遅くすることなく、タンパク質のフォールディングと翻訳後修飾を行うには、これが好ましいことがある。ｃｏＦＶＩＩＩ−２５バリアントとｃｏＦＶＩＩＩ−２６バリアント（Ｎ末端側半分の方がＣＡＩが高く、Ｃ末端側半分の方がＣＡＩが低い）では、逆の作用が見られると推測した。
【０４２９】
ｍＲＮＡの安定性を確保するために、すべてのＦＶＩＩＩコドン最適化バリアントを調整して、クリプティックスプライス部位、未成熟ポリＡ部位、ＲＮＡ不安定モチーフ（ＡＲＥ）及び反復配列を含む多くの部位を取り除いたとともに、ＧＣ含有率を調整した（表２を参照されたい）。
【０４３０】
実施例２．ｐｃＤＮＡ３プラスミドからのｃｏＦＶＩＩＩバリアントのクローニングと発現
各種のＦＶＩＩＩバリアントを含む発現プラスミドをインビボ発現用に設計した。非最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ（図１Ｉ、配列番号１６）とｃｏＦＶＩＩＩ−１（図１１Ｚ、配列番号６８）のポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３骨格（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＣＭＶプロモーターをＥＴプロモーターに置き換えたもの）にクローニングした（図３を参照されたい）。得られたプラスミドのＦＶＩＩＩ−３１１（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ）は、非最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩの発現を、ＦＶＩＩＩ−３０３（ｃｏＦＶＩＩＩ−１）は、ｃｏＦＶＩＩＩ−１の発現を駆動するものである。
【０４３１】
ＨｅｍＡマウスにおいて、ＦＶＩＩＩ−３０３またはＦＶＩＩＩ−３１１をマウス１匹当たり５μｇのＤＮＡ、水圧注射することによって、ＦＶＩＩＩ−３１１とＦＶＩＩＩ−３０３のインビボ発現を評価した。注射から２４時間、４８時間及び７２時間後に、血漿試料を採取し、ＦＶＩＩＩ特異的発色アッセイによって、ＦＶＩＩＩ活性を割り出した。
【０４３２】
図４に示されているように、ＦＶＩＩＩ−３１１で処置したマウスの血漿中ＦＶＩＩＩ活性（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ、四角）は、注射から７２時間後において７４±４３ｍＵ／ｍＬであったのに対して、ＦＶＩＩＩ−３０３で処置したマウスの血漿中ＦＶＩＩＩ活性（ｃｏＦＶＩＩＩ−１、円）は、注射から７２時間後において４５２±１７０ｍＵ／ｍＬであった（図４）。このことから、ｃｏＦＶＩＩＩ−１の発現が、非最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩと比べて、およそ６倍増大したことが示されている。
【０４３３】
実施例３．レンチウイルスベクター系を用いた、ｃｏＦＶＩＩＩバリアントのクローニングと発現
コドン最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩバリアントの発現レベルをさらに評価するために、ＥＴプロモーターの制御下で、コード配列をレンチウイルスプラスミドにクローニングした（Ａｍｅｎｄｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ  ｄｕａｌ−ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｌ．２３：１０８−１６（２００５）、国際公開第２０００／０６６７５９Ａ１号を参照されたい）。ｐＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２のプラスミドマップは、図５に示されており、非最適化ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ（ＬＶ−２１１６）、ｃｏＦＶＩＩＩ−１（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−１）、ｃｏＦＶＩＩＩ−３（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−３）、ｃｏＦＶＩＩＩ−４（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−４）、ｃｏＦＶＩＩＩ−５（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５）、ｃｏＦＶＩＩＩ−６（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６）、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６２）、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−２５）及びｃｏＦＶＩＩＩ−２６（ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−２６）を含むプラスミドは、ＮｈｅＩ部位とＳａｌＩ部位を用いて、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２断片を、示されている各コード配列で置き換えた以外は、同様にして構築した（表６）。
【表６−１】
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【表６−２】
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【０４３４】
レンチウイルスコドン最適化ＦＶＩＩＩバリアントは、ＨｅｍＡマウスにおいて、マウス１匹当たり５μｇのＤＮＡ（図６Ａ、６Ｂ）またはマウス１匹当たり２０μｇのＤＮＡ（図６Ｃ）の用量で水圧注射することによって評価した。図６に示されているように、ｃｏＦＶＩＩＩ−３（図６Ａ、三角）、ｃｏＦＶＩＩＩ−４（図６Ａ、逆三角）、ｃｏＦＶＩＩＩ−５（図６Ａ、ダイヤモンド）、ｃｏＦＶＩＩＩ−６（図６Ａ、白丸）、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５（図６Ｂ、三角）、ｃｏＦＶＩＩＩ−２６（図６Ｂ、逆三角）、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２（図６Ｃ、四角）及びｃｏＦＶＩＩＩ−６２（図６Ｃ、黒丸）はそれぞれ、ＦＶＩＩＩ活性が、ｃｏＦＶＩＩＩ−１（図６Ａ：円、図６Ｂ：円、図６Ｃ：三角）よりも高かった。詳細には、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５とｃｏＦＶＩＩＩ−２６は、注射から７２時間後の発現レベルが同程度で、ｃｏＦＶＩＩＩ−１の活性よりも約３倍高い活性に達し（図６Ｂ）、これは、換算すると、非最適化親ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩと比べて２４倍高いＦＶＩＩＩ活性となる（図４を参照されたい）。ｃｏＦＶＩＩＩ−５２（四角）とｃｏＦＶＩＩＩ−６２（黒丸）はいずれも、注射から７２時間後の発現がさらに高く、ｃｏＦＶＩＩＩ−１（三角）よりも、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２は６倍、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２は４倍高く、非最適化親ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ（白丸）よりも、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２は５０倍、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２や３０倍高かった（図６Ｃ）。これらのデータから、ＦＶＩＩＩを発現させる際には、コード配列のＮ末端側半分のＣＡＩの方が低いことと、コード配列のＣ末端側半分のＣＡＩの方が高いことを組み合わせると、ＣＡＩの分布がこれと反対である場合よりも有益と見られることが示されている。
【０４３５】
実施例４：ＨｅｍＡマウスにおけるコドン最適化ＦＶＩＩＩバリアントの、レンチウイルスによる長期的な発現
水圧注射から７２時間後に、ＨｅｍＡマウスにおいて、ＦＶＩＩＩの高い発現を駆動することが分かったバリアントにおいて、レンチウイルスベクターの媒介による遺伝子移入による長期的なＦＶＩＩＩ発現について評価した。レンチウイルスベクターを２９３Ｔ細胞において、一過性トランスフェクションによって作製し、超遠心分離によって、約５Ｅ９ＴＵ／ｍｌまで濃縮した。続いて、そのレンチウイルスベクターを１２〜１４日齢のＨｅｍＡマウスに、後眼窩注射によって、１Ｅ８ＴＵ／マウスの用量で投与した。ＬＶ−２１１６（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ、図７）を注射したマウスでは、レンチウイルスの注射から２１日目に、平均血漿中ＦＶＩＩＩ活性は、約０．０４ＩＵ／ｍｌであった。ｃｏＦＶＩＩＩ−１、ｃｏＦＶＩＩＩ−５、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２、ｃｏＦＶＩＩＩ−６及びｃｏＦＶＩＩＩ−６２ではそれぞれ、注射から２１日目の循環血液中ＦＶＩＩＩレベルが、コントロールのＬＶ−２１１６（非最適化Ｂドメイン欠失ＦＶＩＩＩ）よりも高くなった。詳細には、注射から２１日目に、ｃｏＦＶＩＩＩ−１とｃｏＦＶＩＩＩ−５の注射では、血漿中ＦＶＩＩＩ活性レベルは、約１．８ＩＵ／ｍＬとなり、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２では、血漿中ＦＶＩＩＩ活性レベルは、約４．９ＩＵ／ｍＬとなり、ｃｏＦＶＩＩＩ−６では、血漿中ＦＶＩＩＩ活性レベルは、約４．６ＩＵ／ｍＬとなり、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２では、血漿中ＦＶＩＩＩ活性レベルは、約２．５ＩＵ／ｍＬとなった（図７）。ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６を注射したマウスで観察された血漿中ＦＶＩＩＩレベルは４．６ＩＵ／ｍｌ、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２を注射したマウスでは、４．９ＩＵ／ｍｌであり、これらは、コントロールのＬＶ−２１１６（非最適化ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）を注射したマウスで観察された血漿中レベルよりも１００倍超高い。
【０４３６】
実施例５．ｃｏＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ融合コンストラクト
ＸＴＥＮが、定常状態のＦＶＩＩＩ発現を向上させる能力について試験した。まず、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２及びｃｏＦＶＩＩＩ−１の１１９３位のヌクレオチドに（または、コードされるポリペプチドの最初の７６４個のアミノ酸の後に）、１４４個のアミノ酸のＸＴＥＮのコード配列（「ＸＴＥＮ１４４」、配列番号１８）を挿入して、それぞれ、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮ（図８Ａ、配列番号１９）とｃｏＦＶＩＩＩ−１−ＸＴＥＮ（図８Ｂ、配列番号２０）を作製した。続いて、上記のように、ＥＴプロモーターの制御下で、ｃｏＦＶＩＩＩ−１−ＸＴＥＮ配列をｐｃＤＮＡ３骨格（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、ＦＶＩＩＩ−３０６発現プラスミドを作製し、上記のように、ＥＴプロモーターの制御下で、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮ配列をレンチウイルスプラスミドにクローニングして、ｐＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮを作製した（図９）。ＦＶＩＩＩ−３０６（ｃｏＦＶＩＩＩ−１−ＸＴＥＮ）をＨｅｍＡマウスに、マウス１匹当たり５μｇのＤＮＡで、水圧注射によって投与した。ｃｏＦＶＩＩＩ−１へのＸＴＥＮ１４４の融合（ＦＶＩＩＩ−３０６、図１０Ａ、大円）により、ＦＶＩＩＩの発現は、ＨｅｍＡマウスにおいて、注射から７２時間の時点で、ＦＶＩＩＩ−３０３（ｃｏＦＶＩＩＩ−１、図１０Ａ、小円）と比べて約５倍、ＦＶＩＩＩ−３１１（ＢＤＤ  ＦＶＩＩＩ、図１０Ａ、四角）と比べて約３３倍高くなった。ＸＴＥＮの挿入がＦＶＩＩＩの発現に及ぼす作用は、ＨｅｍＡマウスにおいて、レンチウイルスベクターを用いても評価した（図１０Ｂ）。ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−ＸＴＥＮを１２〜１４日齢のＨｅｍＡマウスに、マウス１匹当たり１Ｅ８ＴＵで、後眼窩注射によって投与した。ｃｏＦＶＩＩＩ−５２へのＸＴＥＮ１４４の挿入により（図１０Ｂ）、ＦＶＩＩＩの発現は、ＨｅｍＡマウスにおいて、注射から２１日目の時点で、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ５２と比べて約４倍、ＬＶ−２１１６（ＢＤＤ−ＦＶＩＩＩ）と比べて４５０倍高くなった。
【０４３７】
ｃｏＦＶＩＩＩ−３、ｃｏ−ＦＶＩＩＩ−４、ｃｏＦＶＩＩＩ−５、ｃｏＦＶＩＩＩ−６、ｃｏＦＶＩＩＩ−６２、ｃｏＦＶＩＩＩ−２５及びｃｏＦＶＩＩＩ−２６をそれぞれＸＴＥＮ１４４に融合したとともに、ＥＴプロモーターに融合したものを含むレンチウイルスベクターを、上記のように作製することになる。このベクターにおいて、ＦＶＩＩＩタンパク質の発現について試験する。
【０４３８】
実施例６．ｃｏＦＶＩＩＩコンストラクトの発現
図９に示されているように、標準的な分子クローニング技法によって、コドン最適化ＦＶＩＩＩバリアントをレンチウイルスプラスミドにクローニングした。続いて、一過性トランスフェクションを通じて、レンチウイルスベクターをＨＥＫ２９３細胞で作製し、超遠心分離によって単離した。
【０４３９】
ＦＶＩＩＩレンチウイルスベクターを１４日齢のＨｅｍＡ仔マウスに、静脈内注射によって、１．５Ｅ１０ＴＵ／ｋｇのＬＶ−ＦＶＩＩＩバリアントという用量で投与した。ＬＶ−ＦＶＩＩＩによる処置から２１日目に、血漿中ＦＶＩＩＩ活性を測定し、ＬＶ−ＦＶＩＩＩによる処置からから１５０日目に、ＬＶ−ＦＶＩＩＩで処置したマウスから採取した検死肝臓試料において、細胞１個当たりのベクターコピー数（ＶＣＮ）を測定した。投与したＬＶ−ＦＶＩＩＩバリアントにかかわらず、ＶＣＮ値は、すべてのマウスにおいて同程度であったが（図１２Ｂ）、ｃｏＦＶＩＩＩバリアントで処置したマウスにおけるＦＶＩＩＩ活性レベルは、ｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩで処置したマウスよりも３０〜１００倍高かった（図１２Ａ及び１２Ｃ、表７）。これらのデータから、ＦＶＩＩＩコドンの最適化が、レンチウイルスベクターによる設定において、ＦＶＩＩＩの発現を向上させることが示されている。
【表７】
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【０４４０】
実施例７．レンチウイルスによる処置後のＨｅｍＡマウスにおける、ＦＶＩＩＩ導入遺伝子発現媒介性の免疫応答
実施例６でＬＶ−ＦＶＩＩＩによって処置したマウスにおいて、ＦＶＩＩＩの長期的な発現と抗ＦＶＩＩＩ抗体の形成について評価した。ＦＶＩＩＩの発現は、血漿中ＦＶＩＩＩ活性によって示されるように、同じ処置群内のマウス間で異なっていた（図１３Ａ）。例えば、ｃｏＦＶＩＩＩ−５バリアントを発現するレンチウイルスベクターで処置した３匹のマウス（１、２及び３という番号が付されている）では、およそ１６週間にわたって、ＦＶＩＩＩの一貫した発現が見られたが、同じレンチウイルスベクターで処置した３匹の同腹マウス（４、５及び６という番号が付されている）では、処置から約１０週間後までに、血漿中ＦＶＩＩＩ活性レベルが急落した（図１３Ａ）。マウス１、２及び３で一貫した血漿中ＦＶＩＩＩ活性が観察されたことは、抗ＦＶＩＩＩ抗体のレベルが検出不能であったか、または非常に低かったことと相関していた（図１３Ｂ、マウス１、２及び３）。これに対して、血漿中ＦＶＩＩＩ活性が急落したマウスでは、抗ＦＶＩＩＩ抗体のレベルも向上した（図１３Ｂ、マウス４、５及び６）。これらのデータから、マウスのサブセットの１つでは、ＦＶＩＩＩ導入遺伝子の発現により、抗ＦＶＩＩＩ抗体の形成が誘導され、その結果生じた抗ＦＶＩＩＩ抗体が、遺伝子組み換えＦＶＩＩＩタンパク質を循環血液から消失させることが示唆されている。
【０４４１】
ＦＶＩＩＩの発現と抗ＦＶＩＩＩ抗体の形成との関係を評価した。実施例６でＬＶ−ＦＶＩＩＩによって処置したマウスを、抗ＦＶＩＩＩ抗体陰性マウスと、抗ＦＶＩＩＩ抗体陽性マウスという２つの群に分けた。図１４に示されているように、生理的なレベルにおける遺伝子組み換えＦＶＩＩＩの発現によっては、遺伝子組み換えＦＶＩＩＩに対する免疫応答が誘導されない（図１４、円）。しかしながら、超生理的なレベルにおけるＦＶＩＩＩの発現によっては、抗ＦＶＩＩＩ抗体の形成が誘導され、ＦＶＩＩＩ発現レベルが高いほど、抗ＦＶＩＩＩ抗体が誘導される可能性が高くなるようである。これらのデータから、ＦＶＩＩＩ遺伝子治療を行う患者において、生理的なレベルにおけるＦＶＩＩＩの発現を保つことが有益であり得ることが示唆されている。
【０４４２】
ＦＶＩＩＩの発現によって誘導される免疫応答によって、肝細胞を発現する導入遺伝子が消失するか確かめるために、抗ＦＶＩＩＩ抗体陽性マウスと抗ＦＶＩＩＩ抗体陰性マウスから得た検死体肝臓試料において、ベクターコピー数（図１５）とＦＶＩＩＩ  ＲＮＡ転写レベル（図１６）を評価した。図１５に示されているように、ベクターコピー数の分布は、抗ＦＶＩＩＩ抗体陽性マウスと抗ＦＶＩＩＩ抗体陰性マウスにおいて同じであったことから、抗ＦＶＩＩＩ抗体の発現にかかわらず、ＬＶ−ＦＶＩＩＩが組み込まれた細胞が維持されたことが示された。このことから、ＬＶ−ＦＶＩＩＩ媒介性のＦＶＩＩＩ導入遺伝子の発現によっては、ＦＶＩＩＩ発現肝細胞に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答が誘導されないことが示唆されている。これらの結果を更に確認するために、ＦＶＩＩＩ  ＲＮＡの転写をＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーションによって評価した（図１６Ｃ及び１６Ｄ）。肝臓摘出時、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−Ｂマウスは、循環血液中ＦＶＩＩＩが検出不能であったとともに、抗ＦＶＩＩＩ抗体のレベルが高かった（図１６Ａ及び１６Ｂ）。しかしながら、ｃｏＦＶＩＩＩ−５２−Ｂマウスから得た肝組織におけるＲＮＡ転写シグナルとＦＶＩＩＩ−ＲＮＡ陽性細胞の数は、ＦＶＩＩＩ−５２−Ａマウス（検死時の循環血液中ＦＶＩＩＩが約４ＩＵ／ｍｌであった）と同程度であった。したがって、実験用のＨｅｍＡマウスでは、ＦＶＩＩＩの発現によっては、ＣＴＬ応答は誘導されなかった。
【０４４３】
実施例８．ＬＶ−ＦＶＩＩＩで処置したＨｅｍＡ新生マウスにおけるＦＶＩＩＩの長期的な発現
肝臓を標的にすることを通じて、小児のＨｅｍＡ患者の治療にレンチウイルス系を使用することの有効性を評価するために、２日齢のＨｅｍＡマウスに、側頭静脈注射によって、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−５２ＸＴＥＮ、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ６−ＸＴＥＮ、またはｗｔＢＤＤ−ＦＶＩＩＩを発現するレンチウイルスベクターを約１．５Ｅ１０ＴＵ／ｋｇ投与した。バリアントとコントロールの両方において、ＦＶＩＩＩの一貫した長期的な発現が観察されたことから、処置したマウスの分裂肝細胞において、組み込みＦＶＩＩＩ発現カスケードが維持されたことが示された（図１７）。これらのデータから、ＬＶ−ＦＶＩＩＩを用いて、小児のＨｅｍＡ患者と成人のＨｅｍＡ患者の両方を治療できる可能性のあることが示唆されている。
【０４４４】
実施例９．ＨｅｍＡ新生イヌにおけるＬＶ−ＦＶＩＩＩの評価
マウスよりも大きい動物モデルにおいてＬＶ−ＦＶＩＩＩの有効性をさらに評価するために、１週齢のＨｅｍＡ新生イヌ２匹（Ｓ３及びＫ４とした）に、静脈内注射によって、ＬＶ−ｃｏＦＶＩＩＩ−６−ＸＴＥＮを１．３×１０９ＴＵ／ｋｇ投与した。この用量は、前述のＨｅｍＡマウスモデルで用いた用量の１０分の１であった。レンチウイルスベクターの投与後、血漿中ＦＶＩＩＩ活性を一段階凝固アッセイ（ａＰＴＴ）によってモニタリングし（図１８）、全血止血を回転トロンボエラストグラフィ（ＲＯＴＥＭ）アッセイによってモニタリングした（図１９Ａ〜１９Ｄ）。ＬＶ−ＦＶＩＩＩによる処置の前には、Ｓ３のＦＶＩＩＩレベルは、正常レベルの０．７％であった（図１８）。レンチウイルスベクターによる処置後には、Ｓ３のＦＶＩＩＩレベルは、７日目には、正常レベルの７９％、１４日目には、正常レベルの１０３％まで上昇した（図１８）。Ｋ４では、投与前のＦＶＩＩＩレベルは、正常レベルの１．４％であった（図１８）。レンチウイルスベクターによる処置後には、ＦＶＩＩＩレベルは、６日目には、正常レベルの２２％、１４日目には、正常レベルの２５％まで上昇した（図１８）。
【０４４５】
ＦＶＩＩＩレベルに相関して、両方のイヌにおいて、処置から２週間後に、正規化ＲＯＴＥＭを観察した（図１９Ａ〜１９Ｃ）ところ、ＬＶ−ＦＶＩＩＩによって媒介される治療効果が示された。ＨｅｍＡイヌにおいて、ＬＶ−ＦＶＩＩＩによって、治療効果のあるＦＶＩＩＩ発現レベルが得られたことから、血友病Ａの治療にＬＶ−ＦＶＩＩＩを使用できる可能性が確認されている。
【０４４６】
実施例１０．ＨｅｍＡ新生マウスにおけるＬＶ−ＦＶＩＩＩの評価
遺伝子置換のためのレンチウイルスベクター（ＬＶ）によるエキソビボ遺伝子療法によって、複数の適応症に関して、処置した患者のうち、腫瘍形成のエビデンスが見られなかった患者における複数年のフォローアップによって、臨床効果が示されている。ＬＶ−ＦＩＸの全身送達は、ＦＩＸの持続的な発現を媒介するとともに、血友病動物モデルにおいて十分に耐えられるものである。高いパッケージング能、遺伝子組み込みを介した、導入遺伝子の長期的な発現を維持する能力、ヒト集団における既存の抗ＬＶ抗体（ａｂｓ）の欠損、臨床前及び臨床現場において示された有望なインビボプロファイルにより、ＬＶは、インビボ遺伝子送達用、特に、ｃＤＮＡサイズの大きい候補遺伝子（ＦＶＩＩＩなど）用の有望なビヒクルとなっている。
【０４４７】
血友病Ａ（ＨｅｍＡ）の治療にＬＶ−ＦＶＩＩＩを使用できる可能性を評価するために、マイクロＲＮＡ−１４２標的配列を複数コピー含むＬＶ系に、肝細胞特異的プロモーターの制御下に置いたコドン最適化ヒトＦＶＩＩＩ（ｈＦＶＩＩＩ）バリアントを構築して、抗原提示細胞におけるＦＶＩＩＩの発現を最小限にし、抗ＦＶＩＩＩ抗体を誘導する可能性を低下させた。２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションによって、ＬＶ−ｈＦＶＩＩＩベクターを作製してから、超遠心分離によって１０００倍に濃縮し、ＨｅｍＡマウスモデルにおいて評価した。ＬＶ−ｈＦＶＩＩＩの静脈内投与後、ＦＶＩＩＩ活性及び抗原アッセイによって、循環血液中ｈＦＶＩＩＩレベルをモニタリングし、定量ＰＣＲを介して、ＬＶ  ＤＮＡコピーを測定するとともに、インサイチューハイブリダイゼーションを介して、導入遺伝子ＲＮＡを測定することによって、肝臓におけるＬＶ形質導入効率を評価し、全抗ｈＦＶＩＩＩ抗体ＥＬＩＳＡによって、抗ｈＦＶＩＩＩ抗体を測定した。
【０４４８】
新生期に処置したＨｅｍＡマウスでは、すべてのＬＶ−ｈＦＶＩＩＩバリアントにおいて、ＦＶＩＩＩの持続的な発現が観察された。用量１ｋｇ当たり１．５Ｅ１０形質導入単位において、コドン最適化ｈＦＶＩＩＩをコードするＬＶ（ＬＶ−ｃｏｈＦＶＩＩＩ）によって、循環血液中ＦＶＩＩＩは、野生型ｈＦＶＩＩＩをコードするＬＶよりも、３０〜１００倍高くなったが（図１２Ｃ）、肝細胞におけるベクターコピー数と、ＦＶＩＩＩ  ＲＮＡ陽性細胞の割合は、すべての試験群において同程度であった（図１２Ｂ）。コドン最適化と、ＸＴＥＮ（ペイロードの流体力学的サイズを増大させることによって、循環血液中半減期を改善すると推定される非構造化親水性ポリペプチド）とを組み合わせたところ（ＬＶ−ｃｏｈＦＶＩＩＩ−ＸＴＥＮ）、血漿において、３０〜５０ＩＵ／ｍＬのＦＶＩＩＩ活性が得られ、この値は、正常な循環血液中ＦＶＩＩＩレベルの３，０００〜５，０００％である（図１２Ａ、図１７）。さらに、ｈＦＶＩＩＩが超生理的なレベルのマウスのみで、抗ｈＦＶＩＩＩ  ａｂｓが検出されたが（図１４）、抗ｈＦＶＩＩＩ抗体陽性マウスにおいて、ＬＶ形質導入細胞に対する細胞傷害性Ｔリンパ球応答は、観察されなかった（図１５及び１６Ａ〜１６Ｄ）。我々の結果は、血友病Ａのインビボ遺伝子療法用ＬＶ−ＦＶＩＩＩのさらなる開発を後押しするものである。
【０４４９】
具体的な実施形態の上記説明は、本開示の一般的な性質を十分に明らかにするものであるので、他者は、当該技術分野の技術の範囲内の知見を適用することによって、過度の実験なしに、本開示の一般的概念から逸脱せずに、このような具体的な実施形態を容易に修正したり、及び／または様々な用途に適合させたりできる。したがって、このような適合形態と修正形態は、本明細書に示されている教示及び手引きに基づく、本開示の実施形態の均等物の意義及び範囲内であるように意図されている。本明細書における言い回しまたは専門用語は、説明するためのものであって、限定するためのものではなく、当業者は、本開示の教示及び手引きに鑑みれば、本明細書の専門用語または言い回しを解釈するはずであることを理解されたい。
【０４５０】
本開示のその他の実施形態は、本明細書と、本明細書に開示されている本開示の実践を考察すれば、当業者に明らかとなる。本明細書と実施例は、単なる例示的なものとみなすように意図されており、本開示の真の範囲及び趣旨は、下記の請求項によって示されている。
【０４５１】
本明細書に引用されているすべての特許及び文献は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
【０４５２】
本願は、２０１６年２月１日に提出された米国特許仮出願第６２／２８９，６９６号と、２０１６年１０月１８日に提出された同第６２／４０９，７３９号（参照により、その全体が本明細書に援用される）に基づく優先権の利益を主張するものである。
【図１Ａ】
2019506166.tif 000019
【図１Ｂ】
2019506166.tif 000020
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２−１】
2019506166.tif 000029
【図２−２】
2019506166.tif 000030
【図２−３】
2019506166.tif 000031
【図２−４】
2019506166.tif 000032
【図２−５】
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【図３】
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【図４】
2019506166.tif 000035
【図５】
2019506166.tif 000036
【図６Ａ】
2019506166.tif 000037
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
2019506166.tif 000040
【図８Ａ】
2019506166.tif 000041
【図８Ｂ】
2019506166.tif 000042
【図８Ｃ】
2019506166.tif 000043
【図９】
2019506166.tif 000044
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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