(57)【要約】  可撓性チューブを備える細胞培養容器と、支持台と、チューブの両側部分を液密様式で保持し、もって、チューブの内部のそれぞれの部分を流体が通過できないようになっている、対向するホルダの対とを備え、ホルダの対間でチューブ内に調節可能な密閉容積をもたらすために、対の間隔を調節することができる、細胞培養装置が開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
可撓性チューブ（１０）を備える細胞培養容器と、支持台（２２）と、前記チューブ（１０）の両側部分を保持するとともに、前記チューブ（１０）の中央部分を液密様式で保持し、もって、前記中央部分から前記チューブ（１０）の内部のそれぞれの部分に流体が入り込むのを妨げられるようになっている、対向するホルダ（３０，３０’）の対とを備え、前記ホルダ（３０，３０’）の対間で前記中央部分のチューブ（１０）内に調節可能な密閉容積をもたらすために、前記対の間隔を調節することができる、細胞培養装置（５）。
【請求項２】
前記培養容器が、前記容器が前記台（２２）に取り付けられたときに前記ホルダ（３０，３０’）の対間に位置する複数の流体ポート（１２）を含む、請求項１に記載の細胞培養装置（５）。
【請求項３】
前記可撓性チューブ（１０）が、前記ホルダ（３０，３０’）にて少なくとも一度折り曲げられるか、または丸められる、請求項１または２に記載の細胞培養装置（５）。
【請求項４】
前記装置（５）が、フィードバック機構を用いて制御される、請求項１、２または３に記載の細胞培養装置（５）。
【請求項５】
ポリマー材料製のチューブ（１０）から形成された細胞培養容器であって、前記チューブ（１０）が、最初に平らに横たえられ、次いで前記チューブ（１０）の少なくとも一端部で折り曲げられるか、または丸められ、前記チューブ（１０）のうち開かれるか、または広げられる部分にアクセスポート（１２）を有する、細胞培養容器。
【請求項６】
細胞培養物の可変容積をもたらすための方法であって、
平らに横たえられたチューブ（１０）の形で最初に細胞培養容器を準備するステップと、
前記チューブ（１０）の機械的圧縮によって、任意で、前記チューブ（１０）の折曲げによって、前記チューブ（１０）の中央部分を前記中央部分の両側にて密閉するステップと、
細胞培養用の液体を前記中央部分に導入し、前記密閉によって前記チューブ（１０）の両端部に前記液体が実質的に無いようにするステップと、
前記圧縮／折曲げの位置を互いに反対の方向に動かして、前記中央部分のサイズを大きくすることにより細胞培養容積を大きくするステップと
を含む方法。
【請求項７】
可撓性チューブ（１０）を備える細胞培養容器と、前記チューブ（１０）の両側部分を保持するための対向するホルダ（３０，３０’）の対とを備える細胞培養装置（５）であって、前記ホルダ（３０，３０’）の対間で前記チューブ（１０）内に調節可能な密閉容積をもたらすために、前記対の間隔を調節することができ、前記対の少なくとも一方が、前記チューブ（１０）の中央部分から前記チューブ（１０）の内部のそれぞれの部分に流体が入り込むのが妨げられるように、液密様式でそれぞれの部分を保持しており、前記保持が、前記チューブ（１０）を少なくとも９０度だけ折り曲げることを含む、細胞培養装置（５）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可変容積式の体外細胞培養のための、特に、前記培養を最適化するための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来の細胞培養は、増加する細胞の量に合わせて空間を保つために、ますます大きな容積の容器内で細胞を増殖することを伴う。この段階的な手法は常に、典型的に僅か数ミリメートルの小瓶内の小さな標本から、細胞袋またはタンク内の大きな容積（例えば、５００〜２０００Ｌ）へと、対象となる細胞を最初に増殖する形を取る。細胞増殖段階中に、細胞は、細胞株を蘇生させるために最初にフラスコまたはスピナボトル内に接種される。後に細胞は、移植され、ロッカ上の細胞袋または攪拌タンク内で増殖される。増殖過程では段階的に、細胞は、より大型の次のフラスコ／スピナボトル／細胞袋／タンクに移植され、増殖が続けられる。大型の容器を小さな細胞集団と共に使用する際には、高価な細胞培養液の要求量が、細胞の生成による見返りと釣り合わない；細胞が殆どまたは全く存在しないデッドスペースが生じることがある、という問題がある。
【０００３】
可変容積式の細胞培養容器は、上述した問題の一部に対処するものであり、国際公開第２０１５／００９１５３号にて提案されており、米国特許出願公開第２０１３／０１５７３５３号明細書にて同様の開示がなされている。これらの文献には、台上に横たえられる細胞培養袋が示されている。ローラが、袋の幅全体を押し潰すように台に押し付けられる。袋に対するローラの動きにより、袋は、より大きな容積を得ることができる。しかし、発明者等は、これら既知の可変容積式の細胞培養袋が、さらなる問題、すなわち、最初の小容積培養中に大型容器を保持および管理すること；最初の小容積培養中に容器の未使用領域が細胞培養物に接触するのを防止すること；容器の入口ポートおよび出口ポートを妨害せずに容積を大きくすること；容積を制御して大きくすることにより、細胞増殖段階を通じて細胞容器容積を最適化すること、という問題を有することに気付いた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１５／００９１５３号
【発明の概要】
【０００５】
本発明の目的は、上で特定した既知の細胞培養袋に関する上述した問題に対処する実施形態を含む細胞培養装置を提供することである。
【０００６】
本発明の第１の態様によれば、可撓性チューブを備える細胞培養容器と、支持台と、チューブの両側部分を液密様式で保持し、もって、チューブの内部のそれぞれの部分を流体が通過できないようになっている、対向するホルダの対とを備え、ホルダの対間でチューブ内に調節可能な密閉容積をもたらすために、前記対の間隔を調節することができる、細胞培養装置が提供される。その第１の態様において、ホルダの対は、チューブの各端部にて確実な固定をもたらし、同時に調節容積を可能にする。
【０００７】
培養容器は、容器が台に取り付けられたときにホルダの対間に位置する複数の流体ポートを含むことが好ましい。これにより、ホルダは、より大きな容積が要求されるときに互いに遠ざけられるので、その動きは、ポートおよびそれらそれぞれの流体連通を妨害しない。
【０００８】
可撓性チューブは、ホルダにて少なくとも一度折り曲げられるか、または丸められることが好ましい。これにより、ホルダにて液密シールをもたらすのに必要とされる圧縮力が抑制される。これは、チューブ材料が、ホルダにて圧縮されるだけではなく、折り曲げられるためである。
【０００９】
装置は、正確な位置調節と、それによるホルダ間の容積の一層良好な制御とをもたらすために、フィードバック機構を用いて制御されることが好ましい。
【００１０】
第２の態様によれば、本発明は、ポリマー材料製のチューブから形成された細胞培養容器であって、チューブが、最初に平らに横たえられ、次いでチューブの少なくとも一端部で折り曲げられるか、または丸められ、チューブのうち開かれるか、または広げられる部分にアクセスポートを有する、細胞培養容器を備える。チューブの両端部は、側部アクセスポートの各側で折り曲げられるか、または丸められることが好ましい。これにより、チューブは、流体で満たされたときに、チューブ内の利用可能な細胞培養容積を大きくするために、開かれるか、または広げられることができる。
【００１１】
本発明のまた別の態様によれば、細胞培養物の可変容積をもたらすための方法であって、平らに横たえられたチューブの形で最初に細胞培養容器を準備するステップと、チューブの機械的圧縮によって、任意で、チューブの折曲げによって、チューブの中央部分を前記中央部分の両側にて密閉するステップと、細胞培養用の液体を中央部分に導入し、前記密閉によってチューブの両端部に前記液体が実質的に無いようにするステップと、前記圧縮／折曲げの位置を互いに反対の方向に動かして、中央部分のサイズを大きくすることにより細胞培養容積を大きくするステップとを含む方法が提供される。
【００１２】
本発明の他の態様が想起される。よって、請求項中の特徴の記載は、その特徴をその請求項中の他の全ての特徴との組合せに限定することを意図しておらず、むしろ、状況が許す場合には、本発明の他の態様をもたらすために、そのような特徴は、他の請求項に見られるか、または説明中に見られる他の特徴と組み合わされてもよい。合わせて、本発明のそれら他の態様のより多くの利点および利益が、特に以下の詳細な説明に照らせば、当業者にとって容易に明らかになるであろう。
【００１３】
本発明は、添付の図面を参照して、より詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】細胞培養装置の一実施形態の絵図を示す。
【図２】図１とは異なる構成の装置を有する第１の実施形態を示す。
【図３】第１の実施形態の特徴の断面図を示す。
【図４】第１の実施形態の特徴の部分図を示す。
【図５】第１の実施形態の特徴の部分図を示す。
【図６】第１の実施形態の特徴の部分図を示す。
【図７】第１の実施形態のための制御回路の模式図を示す。
【図８】細胞培養装置の第２の実施形態を示す。
【図９】細胞培養装置の第２の実施形態を示す。
【図１０】細胞培養装置の第２の実施形態を示す。
【図１１】細胞培養装置の第２の実施形態を示す。
【図１２】細胞培養装置の第２の実施形態を示す。
【図１３】細胞培養装置の第２の実施形態を示す。
【図１４】細胞培養装置の第２の実施形態を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
図１は、支持台２２に平らに横たえられて揺動式支持トレイ２０に支持される細胞培養袋または容器を含む、この場合には細胞培養チューブ１０を含む、可変容積式の細胞培養装置５を示している。チューブ１０は、両側が結合されて二層閉鎖式の拡張可能な細胞培養チューブを形成する細長い継目なしチューブとしてポリマーから形成される。チューブ１０はさらに、チューブの内部に対する流体およびガスの出入りを可能にし、よってポートの周りに細胞培養容器を提供する、アクセスポート１２を含む。
【００１６】
チューブ１０の両端部のそれぞれが、ホルダ移動機構４０によって移動可能な対向するチューブホルダ３０および３０’の内部に保持され折り曲げられる。これにより、ホルダ間の間隔を調節できるので、細胞培養容器の容積も調節できることになる。細胞培養を始めるために要求される最小容積が、図１に示されている。
【００１７】
さらに図２を参照すると、ホルダ３０および３０’間に存在する、チューブ１０のより多くの部分に、細胞培養のためのより大きな容積をもたらすために、ホルダ３０および３０’が互いに遠ざけられて示されている。より大きな容積を可能にするために、ホルダ３０および３０’は、チューブが等しい量で両側から開かれるように、後述するように同時に動かされる。このことは、緩慢な連続的な動きとして、または、この実施形態のようにステップモータ４２を用いた段階的な動きとして行うことができる。ホルダは、ホルダ間の距離に基づいて、所望の細胞培養容積が得られるまで互いに遠ざけられることができる。ホルダは、矢印Ｘの方向の直線的な並進を可能にするガイド、例えば管状ガイドレール４４によって、所定位置に保持され、概して細胞培養過程の完了後には、並進が、すなわち図１に示したような最初の小さな容積が要求される位置に戻るのとは反対の方向となる。並進は、この実施形態では、中央位置に固定されるとともに、固定された軸方向ピニオンを回転させるステップモータ４２によって生じる。固定された軸方向ピニオンは、ピニオンの上歯および下歯とそれぞれ噛み合う歯付ラックの対の並進運動を生じさせる。ピニオンの回転により、２つのラックの互いに逆向きの運動が生じる。
【００１８】
図３は、ホルダ３０の断面図を示しており、ホルダ３０’は、示したホルダ３０の鏡像となる。ホルダ３０は、遊嵌したヒンジピン３４によって可動式の上顎部３６に連結された、固定された下顎部３２を含む。使用中、顎部３２および３６は、例えば引張ばねなどによって共に駆り立てられ、下顎部３２に取り付けられた電動式アクチュエータ３７によって、チューブ１０を載せるために強制的に互いに遠ざけられることができ、アクチュエータは、２つの顎部間の隙間を大きくするために上顎部３６を押す解放ピン３３を含む。顎部３２および３６はさらに、互いに近接されるものの接触されない相補歯３１を含み、それらの間に迂回経路３５を形成することにより、歯の密閉作用を大きくするために９０度を超えてチューブを効果的に折り曲げる。端部停止ロッド１６および端部分１４の折り曲げられたひだ状部分１８が、顎部間に形成された空洞３８内で所定位置に保持され、かつ、端部分１４のさらなるクランプ部分１１が、経路３５内で歯３１間に保持されるように、チューブ１０の端部分１４が、顎部３２／３６間に嵌められる。使用中、チューブ１０をクランプ部分１１で液密に保つのに十分なクランプ力が歯３１によって作用するが、チューブは依然として、ホルダ３０／３０’が矢印Ｘの方向に移動されるときに迂回経路３５を通過することができる。歯３１は、エラストマでオーバーモールドされて、チューブ上に密閉グリップをもたらすが、必要なときに顎部に対してチューブ１０を摺動させることができる。
【００１９】
図４は、ホルダ駆動機構４０をより詳細に示している。特に、取付板２６によってトレイ２０に固定して取り付けられた、上述したステップモータ４２およびその駆動ピニオン４１をこの図に見ることができる。ピニオンの歯は、それぞれのホルダ３０／３０’の下顎部３２の一方にそれぞれ固定されたそれぞれのラック４６の歯と協働する。上述したように、ピニオンの回転により、各ラック、結果として各ホルダが、同時に等しい量で互いに遠ざけられるか、または近づけられる。
【００２０】
図５は、トレイ２０に固定されたガイドレール４４と、レール４４を取り囲むガイドブッシュ４５とを含むトレイ２０の背面を示しており、ガイドブッシュは、それぞれのホルダ３０／３０’の各下顎部３２に取り付けられ、ホルダ３０／３０’が駆動機構４０によって駆動されるときにガイドレール４４に沿って移動される。
【００２１】
図６は、液体供給ポート１２ａ、取込みポート１２ｂ、標本収集ポート１２ｃ、およびガス供給ポート１２ｄを含む中央ポートの配置をより詳細に示している。
【００２２】
図７は、上述したハードウェア用の制御回路６０の模式図を示し、２つのホルダの位置を検知する位置センサ４８、例えば、レール４４に取り付けられた部品を有する直線エンコーダを含む。この例では、細胞標本ポート１２ｃから取得された標本から求められる細胞密度に適するように変更できる所定の細胞培養手順に従って、位置センサ４８から情報を取得してホルダ３０／３０’間の寸法を決定し、ホルダの位置を調節するために命令信号を駆動機構４０に送る制御ユニット５０も含まれる。センサからのフィードバックを制御ユニットによって検出して、駆動機構を所望の位置で停止させることができる。
【００２３】
上述した実施形態は、ホルダ３０／３０’が、チューブを所定位置に保持し、細胞培養中で必要とされるまでチューブの未使用領域を確保して空けておくために保管すること；２つのホルダが、同時に互いに遠ざけられて、細胞増殖中を通じて袋容積を制御し、よって、最適な細胞培養容積をもたらしながらチューブの両端部を確実に保持すること；チューブポートが比較的固定された位置に留まっている間に各側でチューブを対称的に分離する解くこと；装置を完全に自動化することができる、という利点を有する。チューブ１０の未使用部分１４を異なるように、折り曲げる代わりに、例えば、丸めて保管できることが理解されるであろう。
【００２４】
図８から図１４は、第１の実施形態よりも簡単であるが、細胞培養容積を調節するために手動調節を要求する、本発明の第２の実施形態１０５の図を示している。図８は、使用中に細胞培養液体を収容する中央領域１００と、チューブ部分１１０における引張に応じた、ローラ１３０および１３０’の対によって作用する密閉圧縮力によって、中央領域から液密に密閉される側部領域１１４とを含む、最初に平らに横たえられた細胞培養チューブ１００を示している。ローラは、それらの密閉効果をさらに高めるように、９０度を超えてチューブを効果的に折り曲げる。チューブ１００の端部分１１６は、停止端部１１８にて保持される。停止端部１１８および対向するローラ１３０／１３０’は、調節可能な枢動点１５０を有するハサミフレームによって対として連結される。枢動点１５０の調節により、ローラ１３０／１３０’が互いに遠ざけられ、関連する停止端部１１８がローラ１３０／１３０’に近づけられることで、２つのローラ１３０／１３０’間の寸法が大きくなり、中央部分１１０にて細胞培養容積が大きくなる。
【００２５】
図９および図１０は、図８に示した装置をさらに詳細に示している。図９では、中央に配置されたポート１２ａ、１２ｂ、１２ｃおよび１２ｄが、上述したポートに対応して示されている。図１０は、調節機構をさらに詳細に示しており、調節機構は、この場合、裏板１６０にある簡単な長穴１５２と、フレーム１４０を所望の位置に保持するために長穴内の任意の位置で締め付けられるボルトおよび蝶ナット１５４とを備える。
【００２６】
図１１および図１２は、ローラ１３０／１３０’間の最短距離を有する最初の位置にある装置１０５を示している。図１３および図１４は、機構がローラ間の最長距離を可能にすることにより、細胞培養のためにチューブ内の追加容積を可能にする、最終位置にある装置１０５を示している。所定のテーブルに従って、または、前記標本ポート１２ｃによって測定された細胞密度の増加に応じて手動で、手動調節を行うことができる。
【００２７】
本発明は、上述した実施形態によって限定されるものと考えられるべきではなく、当業者であれば容易に理解できるとおり、添付の請求項の範囲内で変更が可能である。例えば、他のチューブホルダ、例えば対向するピンチローラを用いることができ、または、上述した顎部以外の弾性的に駆り立てられる特徴を使用することができる。ステップモータ４２は、異なる種類の電気モータ、または非電動式アクチュエータ、例えば空気アクチュエータに置き換えることができる。また、第１の実施形態を手動で駆動することができ、第２の実施形態を自動化することができる。示した実施形態の重要な一特徴は、液密密閉が、チューブ材料の折曲げ、すなわち、チューブ材料の９０度以上の曲げによってもたらされ、密閉効果に寄与することである。
【符号の説明】
【００２８】
５  細胞培養装置
１０  細胞培養チューブ
１１  クランプ部分
１２  アクセスポート
１２ａ  液体供給ポート
１２ｂ  取込みポート
１２ｃ  標本収集ポート、細胞標本ポート
１２ｄ  ガス供給ポート
１４  端部分
１６  端部停止ロッド
１８  ひだ状部分
２０  移動式支持トレイ
２２  支持台
２６  取付板
３０  チューブホルダ
３０’  ホルダ
３１  相補歯
３２  下顎部
３３  解放ピン
３４  ヒンジピン
３５  迂回経路
３６  上顎部
３７  電動式アクチュエータ
３８  空洞
４０  ホルダ移動機構、ホルダ駆動機構
４１  駆動ピニオン
４２  ステップモータ
４４  ガイドレール
４５  ガイドブッシュ
４６  ラック
４８  位置センサ
５０  制御ユニット
６０  制御回路
１００  中央領域、細胞培養チューブ
１０５  装置
１１０  中央部分
１１４  側部領域
１１６  端部分
１１８  停止端部
１３０  ローラ
１３０’  ローラ
１４０  フレーム
１５０  枢動点
１５２  長穴
１５４  ボルトおよび蝶ナット
１６０  裏板
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
2019522978.tif 000017
2019522978.tif 000018
2019522978.tif 000019
2019522978.tif 000020
2019522978.tif 000021
2019522978.tif 000022