(57)【要約】  新規抗ＥＭＲ２抗体及び抗体薬物複合体と、がんの治療用としてのこのような抗ＥＭＲ２抗体及び抗体薬物複合体の使用方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＭＲ２を発現する腫瘍始原細胞と結合する単離抗体。
【請求項２】
配列番号１を含むヒトＥＭＲ２と結合する単離抗体。
【請求項３】
ＥＭＲ２と結合する単離抗体であって、
配列番号２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）と配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）；又は
配列番号２５のＶＬと配列番号２７のＶＨ；又は
配列番号２９のＶＬと配列番号３１のＶＨ；又は
配列番号３３のＶＬと配列番号３５のＶＨ；又は
配列番号３７のＶＬと配列番号３９のＶＨ；又は
配列番号４１のＶＬと配列番号４３のＶＨ；又は
配列番号４５のＶＬと配列番号４７のＶＨ；又は
配列番号４９のＶＬと配列番号５１のＶＨ；又は
配列番号５３のＶＬと配列番号５５のＶＨ；又は
配列番号５７のＶＬと配列番号５９のＶＨ；又は
配列番号６１のＶＬと配列番号６３のＶＨ；又は
配列番号６５のＶＬと配列番号６７のＶＨ；又は
配列番号６９のＶＬと配列番号７１のＶＨ；又は
配列番号７３のＶＬと配列番号７５のＶＨ；又は
配列番号７７のＶＬと配列番号７９のＶＨ；又は
配列番号２１のＶＬと配列番号８１のＶＨ；又は
配列番号８３のＶＬと配列番号７５のＶＨ
を含む抗体と結合を競合する前記単離抗体。
【請求項４】
内在化抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項５】
キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体、又はその免疫反応性断片である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項６】
ｈＥＭＲ２アイソフォームａのａａ２６１〜４７８のストークドメイン内のエピトープと結合する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項７】
ＣＤ９７と免疫特異的に結合しない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項８】
配列番号１０１の軽鎖可変領域（ＶＬ）と配列番号１０３の重鎖可変領域（ＶＨ）；又は配列番号１０５のＶＬと配列番号１０７のＶＨを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項９】
配列番号１１０の軽鎖と配列番号１１１の重鎖；又は配列番号１１０の軽鎖と配列番号１１３の重鎖；又は配列番号１１４の軽鎖と配列番号１１５の重鎖；又は配列番号１１４の軽鎖と配列番号１１７の重鎖を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１０】
部位特異的抗体を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１１】
ペイロードとコンジュゲートされている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体の全部又は一部をコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸又は請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
式：Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎのＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩であって、前記式中、
ａ）Ａｂは抗ＥＭＲ２抗体を含み；
ｂ）Ｌは任意選択的なリンカーを含み；
ｃ）Ｄは薬物を含み；
ｄ）ｎは約１〜約２０の整数である
ＡＤＣ又はその薬学的に許容される塩。
【請求項１７】
前記抗ＥＭＲ２抗体が、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又はその免疫反応性断片を含む、請求項１６に記載のＡＤＣ。
【請求項１８】
Ａｂが、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗ＥＭＲ２抗体である、請求項１６に記載のＡＤＣ。
【請求項１９】
ｎが、約２〜約８の整数を含む、請求項１６に記載のＡＤＣ。
【請求項２０】
Ｄが、アウリスタチン、メイタンシノイド、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、カリケアマイシン及びアマニチンから構成される群から選択される化合物を含む、請求項１６に記載のＡＤＣ。
【請求項２１】
請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のＡＤＣを含有する医薬組成物。
【請求項２２】
がんの治療を必要とする対象に請求項１２又は２１に記載の医薬組成物を投与することを含む、がんの治療方法。
【請求項２３】
がんが、造血器悪性腫瘍を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
造血器悪性腫瘍が、白血病又はリンパ腫を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
造血器悪性腫瘍が、急性骨髄性白血病を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
造血器悪性腫瘍が、非ホジキンリンパ腫を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
非ホジキンリンパ腫が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
がんが、固形腫瘍を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
がんが、副腎がん、肝臓がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、胃がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、食道がん、大腸がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん（小細胞がん及び非小細胞がん）、甲状腺がん及び神経膠芽腫から構成される群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
がんが、肺腺癌を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
がんが、扁平上皮細胞癌を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
対象に少なくとも１種の別の治療薬部分を投与することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
腫瘍細胞集団における腫瘍始原細胞の低減方法であって、腫瘍始原細胞と腫瘍始原細胞以外の腫瘍細胞とを含む腫瘍細胞集団を、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のＡＤＣと接触させることにより、腫瘍始原細胞の頻度を低減する、方法。
【請求項３４】
接触が、インビボで実施される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
接触が、インビトロで実施される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
細胞毒素を細胞に送達する方法であって、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載のＡＤＣと前記細胞を接触させることを含む前記方法。
【請求項３７】
対象におけるがんの検出、診断又はモニター方法であって、（ａ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗体と腫瘍細胞を接触させる工程と、（ｂ）前記腫瘍細胞上の前記抗体を検出する工程とを含む、方法。
【請求項３８】
接触がインビトロで実施される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
接触がインビボで実施される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１６に記載のＡＤＣの製造方法であって、抗ＥＭＲ２抗体（Ａｂ）を薬物（Ｄ）とコンジュゲートさせる工程を含む、方法。
【請求項４１】
抗体が、部位特異的抗体を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）請求項２１に記載の医薬組成物を収容した１個以上の容器；及び
（ｂ）前記１個以上の容器に添付されており、前記組成物が、がんをもつ対象の治療用であることを指示したラベル又は添付文書
を含むキット。
【請求項４３】
（ａ）請求項２１に記載の医薬組成物を収容した１個以上の容器；及び
（ｂ）前記１個以上の容器に添付されており、がんをもつ対象用の投与レジメンを指示したラベル又は添付文書
を含む、キット。
【請求項４４】
がんが、ＡＭＬである、請求項４２又は４３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、一般には、新規抗ＥＭＲ２抗体又はその免疫反応性断片と、がん及びその再発又は転移の治療、診断又は予防のための、前記抗体又は断片を含有する組成物（抗体薬物複合体を含む）とに関する。本発明の選択された実施形態は、造腫瘍性細胞頻度の低減を含めて、がんの治療における前記抗ＥＭＲ２抗体又は抗体薬物複合体の使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞と前駆細胞の分化・増殖は、器官形成、細胞修復及び細胞置換の間に組織成長を維持するために協調し合う正常な継続プロセスである。この機構は、生体の必要に基づいて適切なシグナルのみが発生されるように厳密に制御される。細胞増殖・分化は、通常では損傷細胞若しくは瀕死細胞の置換又は増殖に必要とされる場合のみに行われる。しかし、種々のシグナル分子の過少若しくは過剰、変化した微小環境の存在、遺伝子突然変異又はその組み合わせを含む多数の因子により、これらのプロセスに混乱を来す場合がある。正常な細胞増殖及び／又は分化の混乱は、がん等の増殖性疾患を含む種々の疾患を招きかねない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
従来のがん治療法には、化学療法、放射線療法及び免疫療法がある。これらの治療法は無効なことが多く、外科的切除も実行可能な代案とならない場合がある。現在の標準治療の限界は、患者がファーストライン治療を受けた後に再発する場合に、特に明白である。このような場合には、侵攻性で不治のことが多い、不応性の腫瘍を頻繁に生じる。多くの腫瘍の全生存率は、ここ何年もほぼ横ばいであるが、少なくともその一因は既存の治療法ではぶり返し、腫瘍再発及び転移を防ぐことができない点にある。したがって、標的特異性が高くかつ強力な増殖性疾患治療法を開発することが、依然として大いに必要とされている。本発明はこの必要性に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
広義の態様において、本発明は、ヒトＥＭＲ２決定基と特異的に結合する単離抗体及び対応する抗体と薬物若しくは診断薬との複合体（ＡＤＣ）、又はその組成物を提供する。所定の実施形態において、ＥＭＲ２決定基は、腫瘍細胞上に発現するＥＭＲ２タンパク質であり、他の実施形態において、ＥＭＲ２決定基は腫瘍始原細胞上に発現する。他の実施形態において、本発明の抗体は、ＥＭＲ２タンパク質と結合し、ヒトＥＭＲ２タンパク質上のエピトープと結合する抗体と、結合について競合する。
【０００５】
所定の実施形態において、本発明は、ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣを含み、前記抗体又はＡＤＣ結合ドメインは、ヒトＥＭＲ２（配列番号１）と特異的に結合し、（１）配列番号２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）；又は（２）配列番号２５のＶＬ及び配列番号２７のＶＨ；又は（３）配列番号２９のＶＬ及び配列番号３１のＶＨ；又は（４）配列番号３３のＶＬ及び配列番号３５のＶＨ；又は（５）配列番号３７のＶＬ及び配列番号３９のＶＨ；又は（６）配列番号４１のＶＬ及び配列番号４３のＶＨ；又は（７）配列番号４５のＶＬ及び配列番号４７のＶＨ；又は（８）配列番号４９のＶＬ及び配列番号５１のＶＨ；又は（９）配列番号５３のＶＬ及び配列番号５５のＶＨ；又は（１０）配列番号５７のＶＬ及び配列番号５９のＶＨ；又は（１１）配列番号６１のＶＬ及び配列番号６３のＶＨ；又は（１２）配列番号６５のＶＬ及び配列番号６７のＶＨ；又は（１３）配列番号６９のＶＬ及び配列番号７１のＶＨ；又は（１４）配列番号７３のＶＬ及び配列番号７５のＶＨ；又は（１５）配列番号７７のＶＬ及び配列番号７９のＶＨ；又は（１６）配列番号２１のＶＬ及び配列番号８１のＶＨ又は（１７）配列番号８３のＶＬ及び配列番号７５のＶＨを含む抗体を含むか、あるいはこのような抗体と結合について競合する。
【０００６】
別の態様において、本発明は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むＥＭＲ２と結合する抗体を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、配列番号４１、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６９、配列番号７３、配列番号７７又は配列番号８３に記載の軽鎖可変領域の３つのＣＤＲをもち、前記重鎖可変領域は配列番号２３、配列番号２７、配列番号３１、配列番号３５、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４７、配列番号５１、配列番号５５、配列番号５９、配列番号６３、配列番号６７、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７９又は配列番号８１に記載の重鎖可変領域の３つのＣＤＲをもつ。
【０００７】
他の態様において、本発明は、（１）配列番号１０１を含むＶＬ及び配列番号１０３を含むＶＨ又は（２）配列番号１０５を含むＶＬ及び配列番号１０７を含むＶＨを有するヒト化抗体を含む。所定の実施形態において、ヒト化抗体は、部位特異的抗体を含むであろう。選択された実施形態において、前記部位特異的ヒト化抗体は、（１）配列番号１０１を含むＶＬ及び配列番号１０３を含むＶＨ又は（２）配列番号１０５を含むＶＬ及び配列番号１０７を含むＶＨを含むであろう。
【０００８】
他の選択された実施形態において、本発明は、（配列番号１１０及び１１１を含む）ｈＳＣ９３．２５３、（配列番号１１０及び１１３を含む）ｈＳＣ９３．２５３ｓｓ１、（配列番号１１４及び１１５を含む）ｈＳＣ９３．２５６、（配列番号１１４及び１１７を含む）ｈＳＣ９３．２５６ｓｓ１から構成される群から選択されるヒト化抗体を含むであろう。
【０００９】
本発明のある種の態様において、前記抗体は、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体又はその免疫反応性断片を含む。本発明の他の態様において、好ましくは上記配列の全部又は一部を含む前記抗体は、内在化抗体である。更に他の実施形態において、前記抗体は、部位特異的抗体を含むであろう。他の選択された実施形態において、本発明は、上記抗体のいずれかを組込んだ抗体薬物複合体を含む。
【００１０】
所定の態様において、本発明は、本発明の抗ＥＭＲ２抗体又はその断片をコードする核酸を含む。他の実施形態において、本発明は、上記核酸の１種以上を含むベクター又は前記ベクターを含む宿主細胞を含む。
【００１１】
上記に示唆したように、本発明は、更に本願に開示するような抗体をペイロードとコンジュゲートさせた抗ＥＭＲ２抗体薬物複合体を提供する。所定の態様において、本発明は、ｈＥＭＲ２と免疫優先的に会合又は結合するＡＤＣを含む。本発明の適合可能な抗ＥＭＲ２抗体薬物複合体（ＡＤＣ）は、一般に式：Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ又はその薬学的に許容される塩を含み、前記式中、
ａ）Ａｂは抗ＥＭＲ２抗体を含み；
ｂ）Ｌは任意選択的なリンカーを含み；
ｃ）Ｄは薬物を含み；
ｄ）ｎは約１〜約２０の整数である。
【００１２】
１態様において、本発明のＡＤＣは、上記に記載したもの等の抗ＥＭＲ２抗体又はその免疫反応性断片を含む。他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、放射性同位体、カリケアマイシン、ピロロベンゾジアゼピン、ベンゾジアゼピン誘導体、アウリスタチン、デュオカルマイシン、メイタンシノイド又は本願に記載する別の治療薬部分から選択される細胞毒性化合物を含む。
【００１３】
更に、本願に開示するような抗ＥＭＲ２ＡＤＣを含有する医薬組成物も、提供する。
【００１４】
本発明の別の態様は、治療を必要とする対象に本願に記載するもの等の医薬組成物を投与することを含むがんの治療方法である。所定の態様において、前記がんは、例えば急性骨髄性白血病やびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫等の造血器悪性腫瘍を含む。他の態様において、前記対象は、固形腫瘍に罹患しているであろう。このような実施形態に関して、前記がんは、副腎がん、肝臓がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、胃がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、食道がん、大腸がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん（小細胞がん及び非小細胞がん）、甲状腺がん及び神経膠芽腫から構成される群から選択されることが好ましい。所定の実施形態において、前記対象は、肺腺癌又は扁平上皮細胞癌に罹患しているであろう。更に、選択された実施形態において、上記がんの治療方法は、本発明の抗ＥＭＲ２ＡＤＣ以外に少なくとも１種の別の治療薬部分を、前記対象に投与することを含む。
【００１５】
更に別の実施形態において、本発明は、腫瘍細胞集団における腫瘍始原細胞（ｔｕｍｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）の低減方法を含み、前記方法は、腫瘍始原細胞集団を本願に記載するようなＡＤＣ又は抗体と（例えばインビトロ又はインビボで）接触させることにより、腫瘍始原細胞の頻度を低減することを含む。
【００１６】
１態様において、本発明は、細胞毒素を細胞に送達とする方法として、前記細胞を上記ＡＤＣのいずれかと接触させることを含む方法を含む。
【００１７】
別の態様において、本発明は、対象におけるがん（例えば肺がんや造血器悪性腫瘍）の検出、診断又はモニター方法を含み、前記方法は、腫瘍細胞をＥＭＲ２検出剤と（例えばインビトロ又はインビボで）接触させる段階と、腫瘍細胞と会合したＥＭＲ２検出剤を検出する段階を含む。選択された実施形態において、前記検出剤は、抗ＥＭＲ２抗体又はＥＭＲ２遺伝子型決定基と会合する核酸プローブを含む。関連する実施形態において、前記診断方法は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を含むであろう。当業者に自明の通り、このような検出剤は、任意にエフェクター、マーカー又はレポーターで標識又は修飾してもよく、多数の標準技術（例えばＭＲＩ、ＣＡＴスキャン、ＰＥＴスキャン等）のいずれか１種を使用して検出することができる。
【００１８】
同様に、本発明は、がん等のＥＭＲ２関連疾患の診断、モニター又は治療に有用なキット又は装置及び関連する方法も提供する。このために、本発明は、ＥＭＲ２関連疾患の検出、診断又は治療に有用な製品として、ＥＭＲ２ＡＤＣを収容した容器と、ＥＭＲ２関連疾患を治療、モニター若しくは診断するため又は前記疾患に適した投与レジメンを提供するための前記ＥＭＲ２ＡＤＣの使用説明書を含む製品を提供することが好ましい。選択された実施形態において、前記装置及び関連方法は、少なくとも１個の循環腫瘍細胞を接触させる段階を含むであろう。他の実施形態において、本願に開示するキットは、前記キット又は装置がＥＭＲ２に関連するがんの診断、モニター若しくは治療用であること又は前記がんに適した投与レジメンを指示した説明書、ラベル、添付文書、注意書き等を含むであろう。
【００１９】
以上の記載は概要であるため、必然的に詳細を簡略化、一般化及び省略しており、したがって、当業者に自明の通り、以上の概要は説明に過ぎず、限定的なものでは全くない。本願に記載する方法、組成物及び／又は装置及び／又は他の保護対象の他の態様、特徴及び利点も本願に記載する教示から容易に理解されよう。以上の概要は、以下の詳細な説明の欄に具体的に記載する、選択した概念を略式で紹介することを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｅは、夫々、ＥＭＲ２のアイソフォームａのアノテーション付きアミノ酸配列（図１Ａ）とその模式図（図１Ｂ）、ＥＭＲ２ドメインの一覧（図１Ｃ）、及び推定されたＥＭＲ２アイソフォーム（図１Ｄ）と観測されたＥＭＲ２アイソフォーム（図１Ｅ）の表を示す。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｅは、夫々、ＥＭＲ２のアイソフォームａのアノテーション付きアミノ酸配列（図１Ａ）とその模式図（図１Ｂ）、ＥＭＲ２ドメインの一覧（図１Ｃ）、及び推定されたＥＭＲ２アイソフォーム（図１Ｄ）と観測されたＥＭＲ２アイソフォーム（図１Ｅ）の表を示す。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｅは、夫々、ＥＭＲ２のアイソフォームａのアノテーション付きアミノ酸配列（図１Ａ）とその模式図（図１Ｂ）、ＥＭＲ２ドメインの一覧（図１Ｃ）、及び推定されたＥＭＲ２アイソフォーム（図１Ｄ）と観測されたＥＭＲ２アイソフォーム（図１Ｅ）の表を示す。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｅは、夫々、ＥＭＲ２のアイソフォームａのアノテーション付きアミノ酸配列（図１Ａ）とその模式図（図１Ｂ）、ＥＭＲ２ドメインの一覧（図１Ｃ）、及び推定されたＥＭＲ２アイソフォーム（図１Ｄ）と観測されたＥＭＲ２アイソフォーム（図１Ｅ）の表を示す。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｅは、夫々、ＥＭＲ２のアイソフォームａのアノテーション付きアミノ酸配列（図１Ａ）とその模式図（図１Ｂ）、ＥＭＲ２ドメインの一覧（図１Ｃ）、及び推定されたＥＭＲ２アイソフォーム（図１Ｄ）と観測されたＥＭＲ２アイソフォーム（図１Ｅ）の表を示す。
【図２】患者由来異種移植片（ＰＤＸ）がん幹細胞（ＣＳＣ）及び非造腫瘍性（ＮＴＧ）細胞と正常組織に由来するＲＮＡの完全なトランスクリプトーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）シーケンシングを使用して測定したＥＭＲ２の発現レベルを示す。
【図３】正常組織と種々のＰＤＸ腫瘍から単離したＲＮＡ試料においてｑＲＴ−ＰＣＲにより測定したＥＭＲ２転写産物の相対発現レベルを示す。
【図４】正常組織と種々のＰＤＸ細胞株においてマイクロアレイハイブリダイゼーションにより測定したＥＭＲ２転写産物発現の正規化強度値を示す。
【図５】公共入手可能なデータセットであるＴｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）からの正常組織と原発腫瘍におけるＥＭＲ２転写産物の発現を示す。
【図６】ＴＣＧＡデータセットからの原発性肺腺癌腫瘍におけるＥＭＲ２転写産物の発現の高低に基づくカプランマイヤー生存曲線を示し、閾値指数値はＲＰＫＭ値の相加平均を使用して決定している。
【図７−１】代表的な抗ＥＭＲ２抗体の染色、アイソタイプ、細胞殺傷及びカニクイザル交差反応特性を表形態で示す。
【図７−２】代表的な抗ＥＭＲ２抗体の染色、アイソタイプ、細胞殺傷及びカニクイザル交差反応特性を表形態で示す。
【図７−３】代表的な抗ＥＭＲ２抗体の染色、アイソタイプ、細胞殺傷及びカニクイザル交差反応特性を表形態で示す。
【図８Ａ−１】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ａ−２】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｂ−１】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｂ−２】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｃ−１】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｃ−２】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｃ−３】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｃ−４】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｃ−５】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｅ】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｆ】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｇ−１】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｇ−２】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｇ−３】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｇ−４】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｈ−１】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｈ−２】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｈ−３】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｈ−４】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｉ−１】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｉ−２】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｉ−３】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図８Ｉ−４】図８Ａ〜８Ｅは、マウス抗ＥＭＲ２抗体のアノテーション付きアミノ酸及び核酸配列を示し、図８Ａ及び８Ｂは、代表的なマウス抗ＥＭＲ２抗体の軽鎖（図８Ａ）及び重鎖（図８Ｂ）可変領域の連続アミノ酸配列（配列番号２１〜８３の奇数番号）を示し、図８Ｃは、上記軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示し、図８Ｄ及び８Ｅは、夫々、抗ＥＭＲ２抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインのアミノ酸配列と核酸配列を示し、図８Ｆは、全長重鎖及び軽鎖コンストラクトのアミノ酸配列を示し、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７マウス抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを示す。
【図９】ビンＣに含まれることが判明した代表的な抗ＥＭＲ２抗体は、ＥＭＲ２のストークドメインを認識することを実証する。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｃは、種々のＡＭＬ患者試料即ちＰＤＸ細胞株（図１０Ａ）、種々の肺がんＰＤＸ細胞株（図１０Ｂ）、並びに正常な造血細胞及びＡＭＬ細胞（図１０Ｃ）を使用して、正常細胞及び腫瘍細胞の表面のＥＭＲ２タンパク質発現をフローサイトメトリーにより測定した結果を示し、本発明の代表的な抗体（黒線）を、アイソタイプ−対照染色集団（グレー塗りつぶし部分）と比較する。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｃは、種々のＡＭＬ患者試料即ちＰＤＸ細胞株（図１０Ａ）、種々の肺がんＰＤＸ細胞株（図１０Ｂ）、並びに正常な造血細胞及びＡＭＬ細胞（図１０Ｃ）を使用して正常細胞及び腫瘍細胞の表面のＥＭＲ２タンパク質発現をフローサイトメトリーにより測定した結果を示し、本発明の代表的な抗体（黒線）を、アイソタイプ−対照染色集団（グレー塗りつぶし部分）と比較する。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｃは、種々のＡＭＬ患者試料即ちＰＤＸ細胞株（図１０Ａ）、種々の肺がんＰＤＸ細胞株（図１０Ｂ）、並びに正常な造血細胞及びＡＭＬ細胞（図１０Ｃ）を使用して正常細胞及び腫瘍細胞の表面のＥＭＲ２タンパク質発現をフローサイトメトリーにより測定した結果を示し、本発明の代表的な抗体（黒線）を、アイソタイプ−対照染色集団（グレー塗りつぶし部分）と比較する。
【図１１Ａ】図１１Ａ及び１１Ｂは、本発明のＥＭＲ２ＡＤＣが、ＥＭＲ＋細胞（図１１Ａ）への細胞毒性薬の送達及び内在化にインビトロで有効に関与するが、ＥＭＲ２−対照細胞（図１１Ｂ）へは作用しないことを実証する。
【図１１Ｂ】図１１Ａ及び１１Ｂは、本発明のＥＭＲ２ＡＤＣが、ＥＭＲ＋細胞（図１１Ａ）への細胞毒性薬の送達と内在化にインビトロで有効に関与するが、ＥＭＲ２−対照細胞（図１１Ｂ）へは作用しないことを実証する。
【図１２】代表的なＥＭＲ２ＡＤＣが、本願の教示に従って肺ＰＤＸ腫瘍の成長を抑制できることを立証する。
【図１３】図１３Ａ及び１３ＢはＦＡＣＳにより分離したＥＭＲ２＋細胞（図１３Ａ）を使用することにより、ＥＭＲ２決定基が、所定のＡＭＬ  ＰＤＸ細胞株で腫瘍始原細胞と会合し、免疫不全マウスに移植した場合に不均一な腫瘍を再現する（図１３Ｂ）ことを立証する。
【図１４Ａ】図１４Ａ及び１４Ｂは、本発明の代表的なヒト化部位特異的ＡＤＣが、ＡＭＬ  ＰＤＸ腫瘍細胞株の白血病負荷をインビボで低減できることを示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａ及び１４Ｂは、本発明の代表的なヒト化部位特異的ＡＤＣが、ＡＭＬ  ＰＤＸ腫瘍細胞株の白血病負荷をインビボで低減できることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、多数の異なる形態で実施することができる。本願には、本発明の原理を例証する具体的な実施形態を開示するが、本発明を限定するものではない。本願で使用する項目の見出しはいずれも構成上の目的に過ぎず、記載する保護対象を制限するものと解釈すべきではない。本開示の目的のために、全ての配列識別アクセッション番号は、特に指定しない限り、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＲｅｆＳｅｑ）データベース及び／又はＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（Ｒ）アーカイブ配列データベースから引用している。
【００２２】
ＥＭＲ２表現型決定基は、新生物を含む種々の増殖性疾患に臨床的に関連しており、ＥＭＲ２タンパク質及びその変異体又はアイソフォームは、関連疾患の治療で利用可能な有用な腫瘍マーカーとなることが、驚くべきことに見出された。この点で、本発明は、改変型抗ＥＭＲ２抗体標的薬及び細胞毒性ペイロードを含む抗体薬物複合体を提供する。以下により詳細に記載し、後記実施例に報告するように、本願に開示する抗ＥＭＲ２ＡＤＣは、造腫瘍性細胞を除去するために特に有効であるため、所定の増殖性疾患又はその進行若しくは再発の治療と予防のために有用である。更に、本願に開示するＡＤＣ組成物は、ＤＡＲ＝２の百分率を比較的高くできると共に、予想外の安定性を示すことができるため、同一の成分を含有する従来のＡＤＣ組成物に比較して治療指数を改善することができる。
【００２３】
更に、細胞表面ＥＭＲ２タンパク質等のＥＭＲ２マーカー又は決定基は、がん幹細胞（腫瘍永続化細胞とも言う）と治療的に関連付けられて、がん幹細胞を消滅又は鎮静化させるために有効に利用され得ることが判明した。がん幹細胞は、多くの従来の治療法に対して一般に耐性であることが知られているので、本願に開示するような抗ＥＭＲ２複合体を使用することによりこのような細胞を選択的に低減又は消滅できることは、意外である。即ち、従来の及びより最近の標的治療法は、これらの種々の治療法を受けても腫瘍成長を永続化させることが可能な耐性がん幹細胞の存在及び／又は出現により、有効性を制限されることが多い。更に、がん幹細胞に会合している決定基は、発現度が低いか若しくは一貫していないこと、造腫瘍性細胞に会合し続けることができなかいこと、又は細胞表面に提示されないことに起因して、治療標的として不良であることが多い。従来技術の教示とは全く対照的に、本願に開示するＡＤＣと方法は、この固有の耐性を有効に解決し、具体的にこのようながん幹細胞の分化を排除、低減、鎮静化又は促進することにより、潜在的な腫瘍成長を維持するか又は再誘発するがん幹細胞の能力を打ち消す。
【００２４】
したがって、本願に開示するもの等のＥＭＲ２複合体は、選択された増殖性（例えば腫瘍性）疾患又はその進行若しくは再発の治療及び／又は予防に有利に使用できるという点で、特に注目に値する。当然のことながら、以下の説明では、特に、特定のドメイン、領域又はエピトープの観点や、がん幹細胞又は神経内分泌性腫瘍及び本願に開示する抗体薬物複合体とそれらの相互作用に照らして、本発明の好ましい実施形態を詳細に説明するが、当業者に自明の通り、本発明の範囲は、このような代表的な実施形態に制限されない。逆に、本発明の最も広義の実施形態と特許請求の範囲は、特定の作用メカニズム又は特異的に標的とする腫瘍、細胞若しくは分子成分に関係なく、本願に開示するものを含めた抗ＥＭＲ２抗体及び複合体、並びに腫瘍性又は細胞増殖性疾患を含む種々のＥＭＲ２関連又は介在疾患の治療及び／又は予防におけるその使用を、広義かつ明白に対象とする。
【００２５】
Ｉ．ＥＭＲ２生理機構
ＥＧＦ様モジュール受容体２（ＥＭＲ２、別称ＥＧＦ様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様２、ＣＤ３１２及び接着Ｇタンパク質共役受容体Ｅ２ないしＡＤＧＲＥ２）は、接着型クラス（ＡＤＧＲ、ａＧＰＣＲ又はクラスＢ）のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。全ＧＰＣＲに典型的な特徴として、ＥＭＲ２は、７回膜貫通ドメイン（７ＴＭ）を含み、原形質膜内に局在し、Ｎ末端が細胞外スペースに暴露され、Ｃ末端が細胞内を向いている（Ｍｏｎｋ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＭＩＤ：２５９５６４３２）。ＧＰＣＲは、種々のファミリーに分類され、そのうちでＡＤＧＲは２番目に大きいファミリーであり、ヒトに３３のメンバーを含む（Ｈａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＭＩＤ：２５７１３２８８）。ＡＤＧＲの特徴は、Ｎ’末端が多くの場合にかなり長いことと、高度に保存された長いＧＰＣＲ自己タンパク質分解誘導配列（ＧＡＩＮ）の内側に膜近傍ＧＰＣＲタンパク質分解切断部位（ＧＰＳ）が位置するという点である。ＥＭＲ２及び他のファミリーメンバーについては、ＧＰＳで自己タンパク質分解により切断され、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の大半を含むＮ末端サブユニット（αサブユニットとも言う）と、７ＴＭと細胞質ドメインと非常に小部分のＥＣＤを含むＣ末端サブユニット（βサブユニット）とが、小胞体（ｅＲ）で生じることが分かっている（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＭＩＤ：２２３１０６６２）。タンパク質分解切断後、２つの断片は非共有的に結合し続け、表面に一緒に発現する。ＡＤＧＲファミリーメンバーは更に９種類のサブファミリーに分類され、ＥＭＲ２はＥＭＲ１（ＡＤＧＲＥ１）、ＥＭＲ３（ＡＤＧＲＥ３）、ＥＭＲ４（ＡＤＧＲＥ４）及びＣＤ９７（ＡＤＧＲＥ５）と共にクラスＩＩ（クラスＥ又はＥＧＦ−ＴＭ７とも言う）サブファミリーに属する。このサブファミリーの全メンバーは、そのＮ’末端ＥＣＤの内側に２〜６個の上皮成長因子様ドメイン（ＥＧＦ）を含むという点が共通している。
【００２６】
ＥＭＲ２をコードする遺伝子は、ＣＤ９７との高い相同性により最初に記載され、ヒト染色体１９ｐ１３．１に位置することが確認された（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＭＩＤ：１０９０３８４４）。ヒトＥＭＲ２（ｈＥＭＲ２）遺伝子は２１個のエクソンから成り、約５０ｋｂｐの長さである。ヒトＥＭＲ２遺伝子が転写されると、少なくとも６個のｍＲＮＡ転写産物を生じることが分かっており、そのうち、６．５ｋｂｐの標準型アイソフォーム（ＮＭ＿０１３４４７）は、図１Ｂに模式的に示すアイソフォームａと呼ばれる８２３ａａタンパク質の全長タンパク質（ＮＰ＿０３８４７５、配列番号１、図１Ａ）に翻訳される。なお、図１Ａ中、リーダー配列は太字、細胞外ドメインは下線、ＧＰＳドメインの切断部位は四角で示される。ｈＥＭＲ２アイソフォームａの種々のドメインをそのアミノ酸残基により定義し、図１Ｃに示す。ヒトＥＭＲ２タンパク質のオーソログとしては、限定されないが、チンパンジー（ＸＰ＿５１２４４６）、アカゲザル（ＮＰ＿００１０３３７５１）及びイヌ（ＮＰ＿００１０３３７５６）が挙げられるが、特筆すべき点として、マウスオーソログは存在しない（Ｋｗａｋｋｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＭＩＤ：１７０６８１１１）。
【００２７】
翻訳される１又は２個のエクソンをスキップするＥＭＲ２の少なくとも６個の他の短いアイソフォームがパブリックドメインで記載されており、このうちには７６５ａａタンパク質（ＮＰ＿００１２５７９８１）等に翻訳される６ｋｂｐ転写産物（ＮＭ＿００１２７１０５２）が含まれる。これらのアイソフォームと（図１Ｄ及び１Ｅに記載するような）他のアイソフォームとのエビデンスは、後記実施例に記載するように作成された次世代シーケンシング（ＮＧＳ）データセットから得られた。スプライス変異体の大半は、１個以上の翻訳されるエクソンをスキップする短い転写産物と会合しているため、ＥＧＦドメインの１〜３個までを欠失するか又はストーク領域が短縮した、タンパク質アイソフォームとなる。これらの短いアイソフォームの生物学的帰結は現時点では不明であるが、種々の転写産物が異なるリガンド結合（特異性及び／又は親和性）、下流シグナル伝達、局在及び内在化を示すと推測することができる。これらの変異体は異なるＥＣＤを示すので、本発明によると、選択されたアイソフォームに特異的であるか又は全ての潜在的なアイソフォームと結合するｈＥＭＲ２抗体を、作製又は選択できると考えられる。後記実施例１０により詳細に記載するように、正常及び腫瘍試料に関連付けられる種々のＥＭＲ２抗体染色パターンは、これらの短いアイソフォームの存在により説明することができる。
【００２８】
ＥＭＲ２の正常組織発現は、骨髄におけるそれらの前駆体を含めた好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞の亜集団を含む骨髄細胞に限られると考えられている（Ｋｗａｋｋｅｎｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＭＩＤ：１１９９４５１１及びＣｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＭＩＤ：１７１７４２７４）。ＥＭＲ２の表面発現は、特に全身性炎症反応症候群患者を含む炎症組織において好中球とマクロファージの活性化及び成熟中にアップレギュレートされることが分かっている。また、乳がん（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＭＩＤ：２１１７４０６３）、大腸がんの小さいサブセット（Ａｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＭＩＤ：１２７６１６２２）及び神経膠腫（Ｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＭＩＤ：２５２００８３１）にも関係があるとされている。興味深いことに、多数のヒト腫瘍では多くのＡＤＧＲが高頻度で突然変異していることが分かっている（Ｏ’Ｈａｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＭＩＤ：２４５０８９１４）が、これらの突然変異の大半では、直接の生物学的帰結があるか否か、ＡＤＧＲのシグナル伝達又は局在に変化があるか否かについて不明である。
【００２９】
ＥＭＲ２の唯一知られているリガンドは、コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカンであり（Ｓｔａｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＭＩＤ：１２８２９６０４）、細胞接着／移動中の潜在的役割が予想される。これは、抗ＥＭＲ２Ａｂが好中球の接着とケモカインＣＸＣＬ１２  依存的移動をインビトロで誘導できるという報告（Ｙｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＭＩＤ：１７９２８３６０）に一致している。αサブユニットと結合するリガンドは、７ＴＭサブユニットとＧタンパク質の活性化により細胞内シグナルを伝達できると一般に考えられている。また、ＥＭＲ２及び他のＡＧＲＥでは、リガンド結合によりαサブユニットが受容体複合体から外れ、ＧＰＣＲのβサブユニット部分が活性化するのではないかとも推測されている。近縁のファミリーメンバーであるＣＤ９７については、リガンド結合によりＣＤ９７表面発現のダウンレギュレーションを生じることが分かっている（Ｋａｒｐｕｓ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＭＩＤ：２３４４７６８８）が、これがα／β複合体の内在化及び／又はαサブユニットのシェディングに起因するか否かについては不明である。更に最近になって、ＥＭＲ２はα／βヘテロダイマーとして発現されるだけでなく、各サブユニットが原形質膜に局在し、独立してシグナル伝達するらしいことが分かっており、各サブユニットが異なるリガンドと結合する可能性を開いている（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＭＩＤ：２２３１０６６２）。更に、ＡＤＧＲは無差別であるため、異なるＡＤＧＲ遺伝子産物に由来するαサブユニット及びβサブユニットの結合が可能になるのではないかと推測されている。
【００３０】
当然のことながら、ＥＭＲ２の発現と生物学的機能に関する従来の報告には、高度に保存されたＥＧＦドメイン領域と結合してＥＭＲ２及びＣＤ９７の両者と反応する抗体試薬の使用により混乱しているものもあると思われる。
【００３１】
ＩＩ．がん幹細胞
現行モデルによると、腫瘍は、非造腫瘍性細胞と造腫瘍性細胞を含む。非造腫瘍性細胞は、自己再生能をもたず、過剰な細胞数を免疫不全マウスに移植しても再現可能に腫瘍を形成することができない。造腫瘍性細胞は本願では「腫瘍始原細胞」（ＴＩＣ）とも呼び、通常では腫瘍の細胞集団の０．０１〜１０％を構成し、腫瘍形成能がある。造血器悪性腫瘍では、特に急性骨髄性悪性腫瘍（ＡＭＬ）のようにＴＩＣが１：１０４〜１：１０７と非常に少ない場合と、例えばＢ細胞系統のリンパ腫のように非常に多い場合がある。造腫瘍性細胞は腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）（がん幹細胞（ＣＳＣ）とも言う）と腫瘍前駆細胞（ＴＰｒｏｇｓ）の両方を含む。
【００３２】
ＣＳＣは、正常組織で細胞ヒエラルキーを維持する正常幹細胞と同様に、多系統分化能を維持しながら無限に自己複製することができる。この点で、ＣＳＣは造腫瘍性子孫と非造腫瘍性子孫の双方を生じることができ、単離と単離後の少数のＣＳＣの免疫不全マウスへの移植との連続により実証されるように、親腫瘍の不均一な細胞組成を完全に再現することができる。これらの「種子細胞」を取り除かない限り、腫瘍は転移又は再発する可能性が非常に高く、疾患の再発と最終的な進行に繋がることが分かっている。
【００３３】
Ｔｐｒｏｇは、ＣＳＣと同様に一次移植で腫瘍成長を促進することができる。一方、ＣＳＣと異なり、ＴＰｒｏｇは高度に精製された少数のＴＰｒｏｇの免疫不全マウスへの連続移植により実証されるように、通常では有限数しか細胞分裂できないため、親腫瘍の細胞不均一性を再現することができず、その後の移植で腫瘍形成を再開するには効率が低い。ＴＰｒｏｇは、更に、初期ＴＰｒｏｇと後期ＴＰｒｏｇに分類することができ、表現型（例えば細胞表面マーカー）及び腫瘍細胞構成を再現するそれらの能力の違いによって区別することができる。どちらもＣＳＣと同程度まで腫瘍を再現することはできないが、初期ＴＰｒｏｇのほうが後期ＴＰｒｏｇよりも親腫瘍の特性を再現する能力が高い。以上の違いにも拘わらず、ＴＰｒｏｇ集団にはごく稀ではあるが、ＣＳＣの通常の属性である自己再生能を獲得し、それ自体ＣＳＣになることができるものがあることが分かっている。
【００３４】
ＣＳＣは、（ｉ）ＴＰｒｏｇ（初期及び後期ＴＰｒｏｇ）と、（ｉｉ）最終分化腫瘍細胞や腫瘍浸潤細胞（例えばＣＳＣに由来し、通常では腫瘍のバルクを構成し得る線維芽細胞／間質細胞、内皮細胞及び造血細胞）等の非造腫瘍性細胞よりも造腫瘍性が高く、比較的静止状態にあることが多い。従来の治療法及びレジメンの大半は、腫瘍を縮小させ、迅速に増殖中の細胞を攻撃するように設計されているので、ＣＳＣは増殖速度の速いＴＰｒｏｇと非造腫瘍性細胞等の他のバルク腫瘍細胞集団よりも従来の治療法及びレジメンに対する耐性が強い。ＣＳＣを従来の治療法に対して比較的化学耐性にしていると思われる他の特性は、多剤耐性トランスポーターの発現増加、ＤＮＡ修復メカニズムの強化及び抗アポトーシス遺伝子発現である。標準化学療法は、持続的な腫瘍成長と再発を実際に促進するＣＳＣを有効に標的としないため、上記のようなＣＳＣの特性は、ステージの進行した新生物患者で標準治療レジメンにより持続的応答が得られない一因となっている。
【００３５】
本願に記載するようにＥＭＲ２発現は、種々の造腫瘍性細胞亜集団との間でこれらの細胞が治療に感受性となるような関係にあることが、意外にも発見された。本発明は、造腫瘍性細胞を標的とするのに特に有用であり、造腫瘍性細胞を沈静化、増感、中和、頻度低減、阻止、排除、妨害、減少、抑止、抑制、防除、低減、減弱、調節、縮小、リプログラム、除去、殺傷又は他の方法で阻害（総称して「阻害」）することにより、増殖性疾患（例えばがん）の治療、管理及び／又は予防を容易にするために使用することができる抗ＥＭＲ２抗体を、提供する。有利なことに、本発明の抗ＥＭＲ２抗体は、ＥＭＲ２決定基の形態（例えば表現型であるか又は遺伝子型であるか）に関係なく、対象に投与すると、好ましくは造腫瘍性細胞の頻度又は造腫瘍性が低減するように選択できる。造腫瘍性細胞頻度の低減は、（ｉ）造腫瘍性細胞の阻害若しくは消滅；（ｉｉ）造腫瘍性細胞の増殖、拡大若しくは再発の抑制；（ｉｉｉ）造腫瘍性細胞の発生、成長、維持若しくは増殖の妨害；又は（ｉｖ）他の方法での造腫瘍性細胞の生存、再生及び／若しくは転移の妨害の、結果として得られる。実施形態によっては、造腫瘍性細胞の阻害は、１種以上の生理的経路の変化の結果として得られる。造腫瘍性細胞の阻害若しくは除去、（例えば分化誘導又はニッチ破壊による）これらの細胞のポテンシャルの改変、又は造腫瘍性細胞が腫瘍環境若しくは他の細胞に影響を与えられないようにする他の方法のいずれによるかに関係なく、経路の変化は腫瘍形成、腫瘍維持及び／又は転移と再発を阻害することにより、ＥＭＲ２関連疾患のより有効な治療を可能にする。更に当然のことながら、本願に開示する抗体のこれらの同一の特性により、これらの抗体は標準治療レジメンに耐性又は不応であることが分かっている再発性腫瘍の治療に特に有用である。
【００３６】
造腫瘍性細胞の頻度の低減を評価するために使用することができる方法としては、限定されないが、好ましくはインビトロ又はインビボ限界希釈法によるサイトメトリー又は免疫組織化学的解析法が挙げられる（Ｄｙｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．２００８，ＰＭＩＤ：ＰＭＣ２４１３４０２及びＨｏｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２００９，ＰＭＩＤ：１９６６４９９１）。
【００３７】
インビトロ限界希釈法は、コロニー形成と増殖するコロニーの計数及び特性決定とを助長する固体培地で、分画腫瘍細胞又は未分画腫瘍細胞（例えば夫々治療後と治療前の腫瘍に由来する）を培養することにより実施することができる。あるいは、ウェルに液体培地を加えたプレートで腫瘍細胞を段階希釈し、接種後の任意時点、好ましくは接種から１０日以上経過後に、各ウェルをコロニー形成について陽性又は陰性と判定することができる。
【００３８】
インビボ限界希釈法は、未治療対照又は選択された治療薬に暴露した腫瘍に由来する腫瘍細胞を、段階希釈で免疫不全マウスに移植した後、各マウスを腫瘍形成について陽性又は陰性と判定することにより実施される。判定は、移植した腫瘍細胞を検出可能になった後の任意時点で行うことができるが、移植から６０日以上経過後に行うことが好ましい。造腫瘍性細胞の頻度を測定するための限界希釈実験結果の解析は、ポアソン分布統計を使用する方法又は腫瘍をインビボで生成できるか否か等の所定の明確なイベントの頻度を評価する方法により、行うことが好ましい（Ｆａｚｅｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，ＰＭＩＤ：７０４０５４８）。
【００３９】
造腫瘍性細胞頻度を測定するために、フローサイトメトリーと免疫組織化学法を使用してもよい。このどちらの技術も、造腫瘍性細胞で集積することが分かっている当分野で公知の細胞表面タンパク質又はマーカーと結合する１種以上の抗体又は試薬を、利用する（ＷＯ２０１２／０３１２８０参照）。当分野で公知の通り、造腫瘍性細胞を含む種々の細胞集団について、特性決定、単離、精製、集積又は選別を行うために、フローサイトメトリー（例えば蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ））を使用することもできる。フローサイトメトリーは、毎秒数千個までの粒子の物理的特性及び／又は化学的特性を測定することが可能な電子検出装置に、細胞の混合集団を懸濁させた流体流を通すことにより、造腫瘍性細胞濃度を測定する。免疫組織化学法は、造腫瘍性細胞マーカーと結合する標識抗体又は試薬で組織試料を染色することにより、造腫瘍性細胞を（例えば組織切片中で）ｉｎ  ｓｉｔｕで可視化できるので、更に情報が得られる。
【００４０】
したがって、本発明の抗体は、例えばフローサイトメトリー、磁気活性化細胞選別法（ＭＡＣＳ）、レーザーによる切片切断又はＦＡＣＳ等の方法により、造腫瘍性細胞の集団又は亜集団を同定、特性決定、モニター、単離、切片切断又は集積させるために有用であると思われる。ＦＡＣＳは、特異的細胞表面マーカーにより９９．５％超の純度で細胞亜集団を単離するために使用される、確実な方法である。ＣＳＣを含む造腫瘍性細胞の特性決定と操作に適合可能な他の技術は、例えば米国特許出願第１２／６８６，３５９号、１２／６６９，１３６号及び１２／７５７，６４９号に記載されている。
【００４１】
ＣＳＣ集団と関連付けられており、ＣＳＣを単離又は特性決定するために使用されているマーカーとしては、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ３、ＡＢＣＢ５、ＡＢＣＧ２、ＡＤＡＭ９、ＡＤＣＹ９、ＡＤＯＲＡ２Ａ、ＡＬＤＨ、ＡＦＰ、ＡＸＩＮ１、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＬ９、Ｂｍｉ−１、ＢＭＰ−４、Ｃ２０ｏｒｆ５２、Ｃ４．４Ａ、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＡＶ１、ＣＡＶ２、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１６６、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２９、ＣＤ３、ＣＤ３１、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７４、ＣＤ９、ＣＤ９０、ＣＤ９６、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＬＳＲ１、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＣＰＤ、ＣＲＩＭ１、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸＣＲ４、ＤＡＦ、デコリン、ｅａｓｙｈ１、ｅａｓｙｈ２、ＥＤＧ３、ＥＧＦＲ、ＥＮＰＰ１、ＥＰＣＡＭ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＦＬＪ１００５２、ＦＬＶＣＲ、ＦＺＤ１、ＦＺＤ１０、ＦＺＤ２、ＦＺＤ３、ＦＺＤ４、ＦＺＤ６、ＦＺＤ７、ＦＺＤ８、ＦＺＤ９、ＧＤ２、ＧＪＡ１、ＧＬＩ１、ＧＬＩ２、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲ５４、ＧＰＲＣ５Ｂ、ＨＡＶＣＲ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＪＡＭ３、Ｌｇｒ５、Ｌｇｒ６、ＬＲＰ３、ＬＹ６Ｅ、ＭＣＰ、ｍｆ２、ｍｌｌｔ３、ＭＰＺＬ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＭＹＣ、Ｎ３３、ＮＡＮＯＧ、ＮＢ８４、ＮＥＳ、ＮＩＤ２、ＮＭＡ、ＮＰＣ１、ＯＳＭ、ＯＣＴ４、ＯＰＮ３、ＰＣＤＨ７、ＰＣＤＨＡ１０、ＰＣＤＨＢ２、ＰＰＡＰ２Ｃ、ＰＴＰＮ３、ＰＴＳ、ＲＡＲＲＥＳ１、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＬＣ１９Ａ２、ＳＬＣ１Ａ１、ＳＬＣ３９Ａ１、ＳＬＣ４Ａ１１、ＳＬＣ６Ａ１４、ＳＬＣ７Ａ８、ＳＭＡＲＣＡ３、ＳＭＡＲＣＤ３、ＳＭＡＲＣＥ１、ＳＭＡＲＣＡ５、ＳＯＸ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＥＡＰ、ＴＣＦ４、ＴＥＭ８、ＴＧＦＢＲ３、ＴＭＥＰＡＩ、ＴＭＰＲＳＳ４、ＴＦＲＣ、ＴＲＫＡ、ＷＮＴ１０Ｂ、ＷＮＴ１６、ＷＮＴ２、ＷＮＴ２Ｂ、ＷＮＴ３、ＷＮＴ５Ａ、ＹＹ１及びＣＴＮＮＢ１が挙げられる。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，ＰＭＩＤ：２０１８５３２９、米国特許第７，６３２，６７８号並びに米国特許出願第２００７／０２９２４１４号、２００８／０１７５８７０号、２０１０／０２７５２８０号、２０１０／０１６２４１６号及び２０１１／００２０２２１号参照。
【００４２】
同様に、所定の腫瘍タイプのＣＳＣと関連付けられている細胞表面表現型の非限定的な例としては、ＣＤ４４ｈｉＣＤ２４ｌｏｗ、ＡＬＤＨ＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−、ＣＤ４４＋ＣＤ２４−、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＤ６６ｃ−、ＣＤ１３３＋ＣＤ３４＋ＣＤ１０−ＣＤ１９−、ＣＤ１３８−ＣＤ３４−ＣＤ１９＋、ＣＤ１３３＋ＲＣ２＋、ＣＤ４４＋α２β１ｈｉＣＤ１３３＋、ＣＤ４４＋ＣＤ２４＋ＥＳＡ＋、ＣＤ２７１＋、ＡＢＣＢ５＋及び当分野で公知の他のＣＳＣ表面表現型が挙げられる。例えば、Ｓｃｈｕｌｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，前出、Ｖｉｓｖａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＭＩＤ：１８７８４６５８及び米国特許出願第２００８／０１３８３１３号参照。本発明に特に関係があるのは、固形腫瘍におけるＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋表現型と白血病におけるＣＤ３４＋ＣＤ３８とを含むＣＳＣ調製物である。
【００４３】
マーカー又はマーカー表現型に適用する場合の「陽性」、「低」及び「陰性」の発現レベルは、以下のように定義される。本願では、陰性発現（即ち「−」）の細胞とは、他の蛍光発光チャネルで他の着目タンパク質を標識する完全抗体染色カクテルの存在下において蛍光チャネルでアイソタイプ対照抗体にて観測される発現の９５パーセンタイル以下を発現する細胞として、定義される。当業者に自明の通り、陰性イベントを定義するためのこの手順は、「フルオレッセンスマイナスワン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ）」ないし「ＦＭＯ」染色法と呼ばれる。上記ＦＭＯ染色法を使用して、アイソタイプ対照抗体で観測される発現の９５パーセンタイル超を発現する細胞を、本願では「陽性」（即ち「＋」）と定義する。本願の定義によると、種々の細胞集団が、広義に「陽性」と定義される。抗原の平均発現観測値が上記のようにアイソタイプ対照抗体でＦＭＯ染色法を使用した測定値の９５パーセンタイル超であるならば、細胞は陽性であると定義される。ＦＭＯ染色法により測定した場合に、平均発現観測値が９５パーセンタイル超であり、９５パーセンタイルの１標準偏差以内であるならば、この陽性細胞を低発現（即ち「ｌｏ」）細胞と呼ぶことができる。あるいは、ＦＭＯ染色法により測定した場合に平均発現観測値が９５パーセンタイル超であり、９５パーセンタイルの１標準偏差超であるならば、この陽性細胞を高発現（即ち「ｈｉ」）細胞と呼ぶことができる。他の実施形態では、陰性と陽性のＦＭＯ染色間の境界点として９９パーセンタイルを使用することが好ましく、実施形態によっては、パーセンタイルを９９％超とすることができる。
【００４４】
ＴＩＣ及び／又はＴＰＣ細胞又は細胞集団を、その後の解析に備えて、特性決定、単離、精製又は集積させるために、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−マーカー表現型として上記に例示したものを、標準フローサイトメトリー解析及び細胞選別技術と共に使用することができる。
【００４５】
したがって、本発明の抗体が造腫瘍性細胞の頻度を低減する能力は、上記技術及びマーカーを使用して判定することができる。場合により、抗ＥＭＲ２抗体は、造腫瘍性細胞の頻度を１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、更には３５％低減することができる。他の実施形態において、造腫瘍性細胞の頻度の低減は、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％又は６５％程度とすることができる。所定の実施形態において、本願に開示する化合物は、造腫瘍性細胞の頻度を７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、更には９５％低減することができる。当然のことながら、造腫瘍性細胞の頻度の低減に伴い、新生物の造腫瘍性、持続性、再発及び侵略性も低減すると思われる。
【００４６】
ＩＩＩ．抗体
Ａ．抗体構造
抗体とその変異体及び誘導体については、公認の命名法と番号付けシステムを含めて例えばＡｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６ｔｈ  Ｅｄ．），Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；又はＭｕｒｐｈｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（８ｔｈ  Ｅｄ．），Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅに詳細に記載されている。
【００４７】
「抗体」又は「無傷の（ｉｎｔａｃｔ）抗体」とは、重鎖（Ｈ）２本及び軽鎖（Ｌ）２本のポリペプチド鎖を共有的なジスルフィド結合と非共有的な相互作用により相互に結合した、Ｙ字形四量体タンパク質を意味する。各軽鎖は、１個の可変領域（ＶＬ）と１個の定常領域（ＣＬ）とから構成される。各重鎖は、１個の可変領域（ＶＨ）と、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体の場合にはＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と呼ばれる３個のドメインからなる定常領域とを含む（ＩｇＭとＩｇＥには第４のドメインＣＨ４がある）。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤクラスでは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとは可変長（種々のＩｇＧサブクラスで約１０〜約６０アミノ酸）のプロリン及びシステインリッチなセグメントであるフレキシブルなヒンジ領域により分離されている。軽鎖及び重鎖の可変領域は、約１２アミノ酸以上の「Ｊ」領域により定常領域と連結されており、重鎖には更に約１０アミノ酸の「Ｄ」領域がある。各抗体クラスは、更に対合したシステイン残基により形成される鎖間及び鎖内ジスルフィド結合を含む。
【００４８】
本願で使用する「抗体」なる用語は、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化及び霊長類化抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト抗体（組換え生産されたヒト抗体を含む）、組換え生産された抗体、イントラボディ、多重特異性抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、ムテインとその変異体とを含む合成抗体、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）断片、１本鎖断片（例えばＳｃＦｖ及びＳｃＦｖＦｃ）等のその免疫特異的抗体断片、並びにＦｃ融合体及び他の変形を含むその誘導体を包含し、更に、決定基との優先的な会合又は結合を示すものであれば、他のあらゆる免疫反応性分子を包含する。更に、文脈からそうでないことが明白である場合をのぞき、この用語は、全クラス（即ちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）及び全サブクラス（即ちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）の抗体を包含する。種々のクラスの抗体に対応する重鎖定常領域は、通常では夫々対応する小文字のギリシャ文字α、δ、ε、γ及びμにより表される。全ての脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖は、定常領域のアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ぶ２種類の明白に異なる型の一方に割り当てることができる。
【００４９】
抗体の可変領域は、抗体間でアミノ酸組成が著しく相違し、主に抗原認識及び結合に関与する。各軽鎖／重鎖対の可変領域は、無傷のＩｇＧ抗体が２個の結合部位をもつような抗体結合部位を形成する（即ち２価である）。ＶＨ及びＶＬ領域は、超可変領域又はより一般には相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３個の超可変性の領域と、その間及び両端に配置されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる４個の低可変性領域とを含む。ＶＨ領域とＶＬ領域との非共有的な会合は、抗体の２個の抗原結合部位の一方を含むＦｖ断片（「可変性断片」）を形成する。
【００５０】
本願で使用する各領域、フレームワーク領域及びＣＤＲへのアミノ酸の割り当ては特に指定しない限り、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（５ｔｈ Ｅｄ．），ＵＳ  Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ＰＭＩＤ：２６８７６９８；ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ＰＭＩＤ：８８７６６５０；Ｄｕｂｅｌ，Ｅｄ．（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗｉｌｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ又はＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／ＭＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）に記載されているスキームの１種に従うことができる。当分野で周知の通り、可変領域残基番号付けは、一般には、Ｃｈｏｔｈｉａ又はＫａｂａｔの記載に準じる。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｃｏｎｔａｃｔとも言う）及びＡｂＭにより定義されるＣＤＲを含むアミノ酸残基を、Ａｂｙｓｉｓウェブサイトデータベース（後出）から入手し、下表１に記載する。なお、ＭａｃＣａｌｌｕｍはＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムを使用している。
【００５１】
【表１】
2019506136.tif 000002
【００５２】
抗体配列中の可変領域及びＣＤＲは、（例えばＫａｂａｔ番号付けシステム等の上記のような）当分野で開発されている一般規則に準じて同定することもできるし、配列を公知可変領域のデータベースと整列させることにより同定することもできる。これらの領域の同定方法は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００１及びＤｉｎａｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２０００に記載されている。抗体配列の代表的なデータベースは、（英国、ロンドンに所在のユニバーシティ・カレッジ・ロンドン、生化学・分子生物学部のＡ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎにより管理されている）「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイトｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓと、Ｒｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３３（データベース版）：Ｄ６７１−Ｄ６７４（２００５）に記載されているようなＶＢＡＳＥ２ウェブサイトｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇに記載されており、これらのウェブサイトから閲覧することができる。
【００５３】
Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）からの配列データをＰＤＢからの構造データと統合したＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して、配列を解析することが好ましい。ＭａｒｔｉｎグループのＤｒ．Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．Ｒ．の著書Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０４１３５４７，ウェブサイトｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓでも閲覧可能）のＰｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓの章参照。Ａｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトは、更に、本願の教示に従って使用することができるＣＤＲを同定するために開発された一般規則も含む。本願に添付する図８Ｇ〜８Ｉは、ＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７抗体の代表的な重鎖及び軽鎖可変領域のアノテーションに記載のこのような解析の結果を示す。特に指定しない限り、本願に記載する全ＣＤＲは、Ａｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトに照らし、Ｋａｂａｔらに準じて決定する。
【００５４】
Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６３（１）：７８−８５は、配列決定された最初のヒトＩｇＧ１であると報告されている骨髄腫タンパク質Ｅｕのアミノ酸配列を記載し、Ｅｕインデックスについて最初に記載しているが、本発明で記載する重鎖定常領域アミノ酸位置の番号付けは、このＥｕインデックスに従う。ＥｄｅｌｍａｎのＥｕインデックスは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１（前出）にも記載されている。したがって、重鎖に関して「Ｋａｂａｔに記載のＥｕインデックス」又は「ＫａｂａｔのＥｕインデックス」又は「Ｅｕインデックス」又は「Ｅｕ番号付け」なる用語は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１（前出）に記載されているようなＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１  Ｅｕ抗体に基づく残基番号付けシステムを意味する。軽鎖定常領域アミノ酸配列に使用する番号付けシステムも、同様に、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（前出）に記載されている。本発明に適合可能な代表的なκ（配列番号５）及びλ（配列番号８）軽鎖定常領域アミノ酸配列を、以下に示す。
【００５５】
【化１】
2019506136.tif 000003
【００５６】
【化２】
2019506136.tif 000004
【００５７】
同様に、本発明に適合可能な代表的なＩｇＧ１重鎖定常領域アミノ酸配列を、以下に示す。
【００５８】
【化３】
2019506136.tif 000005
【００５９】
当業者に自明の通り、野生型（例えば配列番号２、５又は８参照）であるか又は不対システインを提供するように本願に開示するように改変されている（例えば配列番号３、４、６、７、９又は１０参照）かに拘わらず、このような重鎖及び軽鎖定常領域配列を標準分子生物学技術により本願に開示する重鎖及び軽鎖可変領域と機能的に会合させると、本発明のＥＭＲ２抗体薬物複合体に組込むことができる全長抗体が得られる。本発明の選択された抗体（ｈＳＣ９３．２５３、ｈＳＣ９３．２５３ｓｓ１、ｈＳＣ９３．２５６及びｈＳＣ９３．２５６ｓｓ１）を含む全長重鎖及び軽鎖の配列を添付の図８Ｅに記載する。
【００６０】
免疫グロブリン分子には、鎖間ジスルフィド結合と鎖内ジスルフィド結合との２種類のジスルフィド架橋又は結合が存在する。当分野で周知の通り、鎖間ジスルフィド結合の位置及び個数は、免疫グロブリンのクラス及び種により異なる。本発明は、特定の抗体クラス又はサブクラスに制限されないが、説明の目的で、本開示の随所でＩｇＧ１免疫グロブリンを使用する。野生型ＩｇＧ１分子には、１２個の鎖内ジスルフィド結合（各重鎖に４個と各軽鎖に２個）と４個の鎖間ジスルフィド結合とが存在する。鎖内ジスルフィド結合は、一般に、いくらか保護されており、鎖間結合よりも比較的還元されにくい。逆に、鎖間ジスルフィド結合は、免疫グロブリンの表面に位置し、溶媒と接触し易く、通常では比較的還元され易い。重鎖間に２個、及び各重鎖と夫々の軽鎖との間に１個ずつの、鎖間ジスルフィド結合が存在する。鎖間ジスルフィド結合が鎖会合に必須でないことは分かっている。ＩｇＧ１ヒンジ領域は、鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを重鎖に含み、Ｆａｂ移動を容易にするフレキシビリティと共に構造支持をもたらす。重鎖／重鎖ＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合は、残基Ｃ２２６及びＣ２２９（Ｅｕ番号付け）に位置し、ＩｇＧ１の軽鎖と重鎖との間のＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合（重鎖／軽鎖）は、κ又はλ軽鎖のＣ２１４と重鎖の上部ヒンジ領域のＣ２２０との間に形成される。
【００６１】
Ｂ．抗体の作製及び生産
本発明の抗体は、当分野で公知の種々の方法を使用して生産することができる。
【００６２】
１．宿主動物におけるポリクローナル抗体の作製
種々の宿主細胞におけるポリクローナル抗体の生産は、当分野で周知である（例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｅｄｓ．）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ；及びＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＮＹ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ参照）。ポリクローナル抗体を作製するためには、免疫不全動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒト以外の霊長類等）を、抗原タンパク質又は抗原タンパク質を含む細胞若しくは調製物で免疫する。所定の時間後、動物から採血するか又は屠殺することにより、ポリクローナル抗体を含む血清を得る。動物から得られた形態で血清を使用してもよいし、抗体を部分的又は完全に精製し、免疫グロブリン画分又は単離抗体調製物としてもよい。
【００６３】
これについて、本発明の抗体は、免疫不全動物に免疫反応を誘発する任意のＥＭＲ２決定基から作製することができる。本願で使用する「決定基」又は「標的」とは、特定の細胞、細胞集団又は組織に識別可能に会合しているか又は特異的に存在する、何らかの検出可能な形質、性質、マーカー又は因子を意味する。決定基又は標的は、実際に形態的、機能的又は生化学的のいずれの決定基又は標的であってもよく、表現型決定基又は表現型標的が好ましい。好ましい実施形態において、決定基は、所定の条件下で特定の細胞種又は細胞により（例えば細胞周期の特定時点の間に又は特定のニッチで細胞中により）異常に発現（過剰又は過少発現）させられるタンパク質である。本発明の目的では、決定基は、異常ながん細胞で異常に発現することが好ましく、ＥＭＲ２タンパク質又はそのスプライス変異体、アイソフォーム、ホモログ若しくはファミリーメンバー、又はその特定のドメイン、領域若しくはエピトープのいずれかを含むことができる。「抗原」、「免疫原性決定基」、「抗原決定基」又は「免疫原」とは、免疫不全動物に導入すると免疫反応を刺激することができ、免疫反応により生産される抗体により認識される、任意のＥＭＲ２タンパク質又はその任意の断片、領域若しくはドメインを意味する。本願におけるＥＭＲ２決定基の有無は、細胞、細胞亜集団又は組織（例えば腫瘍、造腫瘍性細胞又はＣＳＣ）を同定するために、使用することができる。
【００６４】
ＥＭＲ２決定基に特異的な抗体を作製するためには、任意の形態の抗原、又は前記抗原を含む細胞若しくは調製物を使用することができる。本願に記載する「抗原」なる用語は、広義に使用され、選択された標的の任意の免疫原性断片又は決定基を含むことができ、単一のエピトープ、複数のエピトープ、単一若しくは複数のドメイン、又は完全な細胞外ドメイン（ＥＣＤ）若しくはタンパク質が挙げられる。抗原は、単離された全長タンパク質でもよいし、細胞表面タンパク質（例えばその表面に抗原の少なくとも一部を発現する細胞を免疫する）でもよいし、可溶性タンパク質（例えばタンパク質のＥＣＤ部分のみを免疫する）や、タンパク質コンストラクト（例えばＦｃ−抗原）でもよい。抗原は、遺伝子改変細胞で生産されてもよい。上記抗原は、いずれも単独で使用してもよいし、当分野で公知の１種以上の免疫原性強化用アジュバントと共に使用してもよい。前記抗原をコードするＤＮＡは、ゲノムでもゲノム以外（例えばｃＤＮＡ）でもよく、免疫原性反応を誘発するために十分なＥＣＤの少なくとも一部をコードすることができる。抗原を発現させる細胞を形質転換させるためにはどのようなベクターを利用してもよく、限定されないが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、プラスミド、及びカチオン性脂質等の非ウイルスベクターが挙げられる。
【００６５】
２．モノクローナル抗体
選択された実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体の使用を想定する。当分野で公知の通り、「モノクローナル抗体」ないし「ｍＡｂ」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、即ち集団を構成する個々の抗体は、少量存在する可能性のある突然変異（例えば天然に生じる突然変異）を除いて、同一である。
【００６６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えばＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ））又はその何らかの組み合わせを含む当分野で公知の多様な技術を使用して作製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、Ａｎ，Ｚｈｉｇｉａｎｇ（ｅｄ．）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１ｓｔ  ｅｄ．２００９；Ｓｈｉｒｅ  ｅｔ．ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＋  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ  ＬＬＣ，１ｓｔ  ｅｄ．２０１０；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）に詳述されているように、ハイブリドーマと生化学技術及び遺伝子工学技術とを使用して生産することができる。決定基と特異的に結合する複数のモノクローナル抗体の生産後、例えば決定基に対するその親和性や内在化率に基づく種々のスクリーニング法により、特に有効な抗体を選択することができる。本願に記載するように、生産された抗体を「ソース」抗体として使用し、例えば標的に対する親和性を改善するため、細胞培養におけるその生産を改善するため、インビボ免疫原性を低減するため、多重特異性コンストラクトを作製するため等の目的で、更に改変することができる。モノクローナル抗体生産及びスクリーニングに関するより詳細な説明は、後記実施例に記載する。
【００６７】
３．ヒト抗体
別の実施形態において、抗体は、完全ヒト抗体を含むことができる。「ヒト抗体」なる用語は、ヒトにより生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列をもつ抗体及び／又は以下に記載するヒト抗体作製技術のいずれかを使用して作製された抗体を意味する。
【００６８】
ヒト抗体は、当分野で公知の種々の技術を使用して生産することができる。１例はファージディスプレイ法であり、（好ましくはヒト）抗体のライブラリーをファージで合成し、ライブラリーを着目抗原又はその抗体結合部分でスクリーニングし、前記抗原と結合するファージを単離することにより、免疫反応性断片を得ることができる。このようなライブラリーの作製及びスクリーニング方法は、当分野で周知であり、ファージディスプレイライブラリーの作製用キットは、市販されている（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，カタログ番号２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（ＴＭ）ファージディスプレイキット，カタログ番号２４０６１２）。他の方法及び試薬も、抗体ディスプレイライブラリーの作製とスクリーニングに使用することができる（例えば米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；及びＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２（１９９１）参照）。
【００６９】
１実施形態では、上記のように作製した組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより、組換えヒト抗体を単離することができる。１実施形態において、前記ライブラリーは、Ｂ細胞から単離したｍＲＮＡから作製したヒトＶＬ及びＶＨ  ｃＤＮＡを使用して作製されたｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーである。
【００７０】
（天然型又は合成型の）ナイーブライブラリーにより生産された抗体は、親和性を中程度（Ｋａが約１０６〜１０７Ｍ−１）とすることができるが、当分野で記載されているように二次ライブラリーから作製及び再選択することによりインビトロで親和性成熟を模倣することもできる。例えば、（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５（１９８９）に報告されている）エラープローンポリメラーゼを使用することにより突然変異をランダムにインビトロで導入することができる。更に、例えば選択された個々のＦｖクローンで、着目ＣＤＲに相当するランダム配列をもつプライマーによるＰＣＲを使用して、１個以上のＣＤＲをランダムに突然変異させ、より親和性の高いクローンについてスクリーニングすることにより、親和性成熟を行うこともできる。ＷＯ９６０７７５４は、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲに突然変異誘発を誘導して軽鎖遺伝子のライブラリーを作製する方法を記載している。別の有効なアプローチは、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７７９−７８３（１９９２）に記載されているように、ファージディスプレイ法により選択されたＶＨ又はＶＬドメインを非免疫ドナーから得られた天然に存在するＶドメイン変異体のレパートリーと組換え、数ラウンドのチェーンリシャフリングでより高い親和性についてスクリーニングする方法である。この技術により、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が約１０−９Ｍ以下の抗体及び抗体断片の生産が可能になる。
【００７１】
他の実施形態では、その表面に結合対を発現する真核細胞（例えば酵母）を含むライブラリーを使用して同様の手順を利用することができる。例えば、米国特許第７，７００，３０２号及び米国特許出願第１２／４０４，０５９号参照。１実施形態では、ヒト抗体を発現するファージライブラリーからヒト抗体を選択する（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０９−３１４（１９９６）：Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６１５７−６１６２（１９９８））。他の実施形態では、酵母等の真核細胞で作製されたコンビナトリアル抗体ライブラリーからヒト結合対を単離することができる。例えば米国特許第７，７００，３０２号参照。このような技術は、多数の候補モジュレーターのスクリーニングが可能であり、（例えばアフィニティー成熟又は組換えシャフリングにより）比較的簡単に候補配列が得られるという利点がある。
【００７２】
ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物（例えば内在性免疫グロブリン遺伝子を部分的又は完全に不活性化させ、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入したマウス）に導入することによりヒト抗体を作製することもできる。攻撃投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）後、遺伝子再構成、アセンブリ及び抗体レパートリーを含むあらゆる点で、ヒトに見られるものとよく似たヒト抗体生産が認められる。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号、５，５４５，８０６号、５，５６９，８２５号、５，６２５，１２６号、５，６３３，４２５号、５，６６１，０１６号、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）技術については米国特許第６，０７５，１８１号及び６，１５０，５８４号；更にＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。あるいは、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化によりヒト抗体を作製することもできる（このようなＢリンパ球は腫瘍性疾患に罹患している個体から採取してもよいし、インビトロで免疫したものでもよい）。例えばＣｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７（ｌ）：８６−９５（１９９１）；及び米国特許第５，７５０，３７３号参照。
【００７３】
ソースに関係なく、当分野で公知の分子工学技術を使用してヒト抗体配列を作製し、本願に記載するような発現システムと宿主細胞に導入できることが理解されよう。このような組換え生産された非天然型ヒト抗体（及び対応する組成物）は、本開示の教示に完全に適合可能であり、明白に本発明の範囲に含まれるものとみなす。所定の選択態様において、本発明のＥＭＲ２ＡＤＣは、細胞結合剤として作用する組換え生産されたヒト抗体を含むであろう。
【００７４】
４．誘導抗体
上記のようにソース抗体を作製、選択及び単離したら、医薬特性を改善した抗ＥＭＲ２抗体とするように更に改変することができる。所望の治療特性をもつ誘導抗体とするように、公知分子工学技術を使用してソース抗体を改良又は改変することが好ましい。
【００７５】
４．１．キメラ抗体及びヒト化抗体
本発明の選択された実施形態は、ＥＭＲ２と免疫特異的に結合し、「ソース」抗体とみなすことができるマウスモノクローナル抗体を含む。選択された実施形態において、本発明の抗体は、ソース抗体の定常領域及び／又はエピトープ結合性アミノ酸配列を任意に改変することによりこのような「ソース」抗体から誘導することができる。所定の実施形態において、ソース抗体の選択されたアミノ酸が欠失、突然変異、置換、組込み又は組み合わせにより改変される場合に、抗体はソース抗体から「誘導」される。別の実施形態において、「誘導」抗体とは、ソース抗体の断片（例えば１個以上のＣＤＲ若しくはドメイン又は全長重鎖及び軽鎖可変領域）をアクセプター抗体配列と合体又は一体化して抗体誘導体（例えばキメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体又はヒト化抗体）としたものである。例えば、決定基に対する親和性を改善するため、抗体安定性を改善するため、細胞培養における生産と収率を改善するため、インビボ免疫原性を低減するため、毒性を低減するため、活性部分のコンジュゲートを容易にするため、又は多重特異性抗体を作製するために、抗体産生細胞に由来する遺伝子材料と以下に記載するような標準分子生物学技術とを使用して、これらの「誘導」抗体を作製することがでる。このような抗体は、化学的手段又は翻訳後修飾による成熟分子の修飾（例えばグリコシル化パターン又はペグ化）により、ソース抗体から誘導することもできる。
【００７６】
１実施形態において、本発明の抗体は、共有結合した少なくとも２個の異なる種又はクラスの抗体に由来するタンパク質セグメントから誘導されるキメラ抗体を含む。「キメラ」抗体なる用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の生物種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であり、ポリペプチド鎖の残余が別の生物種に由来するか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同であるコンストラクトと、このような抗体の断片を意味する（米国特許第４，８１６，５６７号）。実施形態によっては、本発明のキメラ抗体は、選択されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域の全部又は大部分をヒト軽鎖及び重鎖定常領域に機能的に連結したものとすることができる。他の選択された実施形態では、本願に開示するマウス抗体から抗ＥＭＲ２抗体を「誘導」することができ、全長重鎖及び軽鎖可変領域よりも短い領域を含む。
【００７７】
他の実施形態において、本発明のキメラ抗体は、（Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＭｃＣａｌｌｕｍ法等を使用して定義されるような）ＣＤＲが特定の生物種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属しかつ抗体の残余が主に別の生物種に由来するか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体に由来する、「ＣＤＲグラフト」抗体である。ヒトで使用するには、１個以上の選択された齧歯類ＣＤＲ（例えばマウスＣＤＲ）をヒトアクセプター抗体にグラフトし、ヒト抗体の天然型ＣＤＲの１個以上に置換えることができる。これらのコンストラクトは、一般に抗体に対する対象の望ましくない免疫反応を抑制しながら、最大限のヒト抗体機能（例えば補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ））が得られるという利点がある。１実施形態において、ＣＤＲグラフト抗体は、マウスから得られた１個以上のＣＤＲをヒトフレームワーク配列に組込んだものとなる。
【００７８】
ＣＤＲグラフト抗体と似たものに「ヒト化」抗体がある。本願で使用する「ヒト化」抗体とは、１種以上の非ヒト抗体（ドナーないしソース抗体）に由来する１個以上のアミノ酸配列（例えばＣＤＲ配列）をヒト抗体（アクセプター抗体）に組み込んだものである。所定の実施形態では、「復帰突然変異」をヒト化抗体に導入することができ、レシピエントヒト抗体の可変領域の１個以上のＦＲの残基を非ヒト生物種ドナー抗体に由来する対応する残基で置換える。このような復帰突然変異は、グラフトしたＣＤＲの適切な三次元構造を維持するのに役立ち、親和性と抗体安定性とを改善することができる。種々のドナー種に由来する抗体を使用することができ、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ又はヒト以外の霊長類が挙げられる。更に、ヒト化抗体は、例えば抗体性能を更に改良するように、レシピエント抗体又はドナー抗体に存在しない新規残基を含むことができる。ソース抗体に由来するマウス成分とアクセプター抗体に由来するヒト成分とを含む本発明に適合官能なＣＤＲグラフト抗体及びヒト化抗体を、後記実施例に記載するように作製することができる。
【００７９】
本発明に従ってヒト化コンストラクトを提供するために、アクセプター抗体としてどのヒト配列を使用すべきかを決定するには、当分野で公知の種々の技術を使用することができる。適合可能なヒト生殖細胞系列配列の編纂データと、アクセプター配列としての適応性を決定する方法は、例えばＤｕｂｅｌ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ（Ｅｄｓ．）（２０１４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ＧｍｂＨ；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６：２３７−２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：４６２８−４６３８に開示されている。（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫにより編纂された）ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリーを提供するＶ−ＢＡＳＥディレクトリー（ＶＢＡＳＥ２−Ｒｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３３；６７１−６７４，２００５）も、適合可能なアクセプター配列を同定するために使用することができる。更に、例えば米国特許第６，３００，０６４号に記載されているコンセンサスヒトフレームワーク配列も、適合可能なアクセプター配列であることが判明すると思われ、本願の教示に従って使用することができる。一般に、マウスソースフレームワーク配列との相同度、及びソース抗体とアクセプター抗体のＣＤＲ標準型構造との解析に基づいて、ヒトフレームワークアクセプター配列を選択する。その後、当分野で公知の技術を使用して、誘導抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の誘導配列を合成することができる。
【００８０】
例えば、ＣＤＲグラフト抗体及びヒト化抗体と関連方法とは、米国特許第６，１８０，３７０号及び５，６９３，７６２号に記載されている。更に詳細については、例えばＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，（ＰＭＩＤ：３７１３８３１）と、米国特許第６，９８２，３２１号及び７，０８７，４０９号参照。
【００８１】
ヒトアクセプター可変領域に対するＣＤＲグラフト抗体又はヒト化抗体可変領域の配列一致度又は相同度は、本願に記載するように決定することができ、こうして測定した場合に、配列一致度は、少なくとも６０％又は６５％であると好ましく、配列一致度は少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％であるとより好ましく、配列一致度は少なくとも９３％、９５％、９８％又は９９％であると更に好ましい。一致しない残基位置は、保存的アミノ酸置換による相違であることが好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が化学的性質（例えば電荷又は疎水性）の類似する側鎖（Ｒ基）をもつ別のアミノ酸残基で置換されている場合である。一般に、保存的アミノ酸置換では、タンパク質の機能的性質は実質的に変わらない。２個以上のアミノ酸配列が保存的置換により相互に相違する場合、置換の保存性を補正するように配列一致度又は類似度百分率を上方に調整することができる。
【００８２】
当然のことながら、添付の図８Ａ及び８Ｂに示すようなアノテーション付きＣＤＲ及びフレームワーク配列は、私設Ａｂｙｓｉｓデータベースを使用し、Ｋａｂａｔらに準じて定義される。しかし、本願に記載し、図８Ｇ〜８Ｉに示すように、当業者は、Ｋａｂａｔらと同様に、Ｃｈｏｔｈｉａら、ＡＢＭ又はＭａｃＣａｌｌｕｍらにより記載されている定義に準じて容易にＣＤＲを定義することができよう。したがって、上記システムのいずれかに準じて決定された１個以上のＣＤＲを含む抗ＥＭＲ２ヒト化抗体もまた、明白に本発明の範囲に含まれるものとみなす。
【００８３】
４．２．部位特異的抗体
（以下に詳述するような）細胞毒素又は他の抗がん剤とのコンジュゲーションを助長するように、本発明の抗体を改変することができる。抗体薬物複合体（ＡＤＣ）製剤は、抗体上の細胞毒素の位置と薬物対抗体比（ＤＡＲ）に関して均一なＡＤＣ分子集団を含むようにすると有利である。本開示に基づき、当業者は、本願に記載するような部位特異的改変型コンストラクトを容易に作製することができよう。本願で使用する「部位特異的抗体」又は「部位特異的コンストラクト」とは、少なくとも１個の遊離システインを提供するように重鎖又は軽鎖における少なくとも１個のアミノ酸を欠失、改変若しくは（好ましくは別のアミノ酸で）置換させた抗体又はその免疫反応性断片を意味する。同様に、「部位特異的複合体」とは、部位特異的抗体と不対ないし遊離システインにコンジュゲートさせた少なくとも１種の細胞毒素又は他の化合物（例えばレポーター分子）を含むＡＤＣを意味するものとみなす。所定の実施形態において、不対システイン残基は、不対鎖内システイン残基を含むであろう。他の実施形態において、遊離システイン残基は、不対鎖間システイン残基を含むであろう。更に他の実施形態では、抗体のアミノ酸配列（例えばＣＨ３ドメイン）に遊離システインを組込んでもよい。いずれにせよ、部位特異的抗体は、種々のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤ）とすることができ、これらのクラスのうちで前記抗体は、種々のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）とすることができる。ＩｇＧコンストラクトの場合、抗体の軽鎖は、各々Ｃ２１４を組込んだκ又はλアイソタイプを含むことができ、選択された実施形態では、ＩｇＧ１重鎖におけるＣ２２０残基の欠失により不対にすることができる。
【００８４】
したがって、本願で使用する「遊離システイン」又は「不対システイン」なる用語は、文脈からそうでないと判断される場合を除いて同義に使用することができ、天然に存在するものであるか又は分子工学技術を使用して選択された残基位置に特異的に組込まれたもの、即ち生理的条件下で天然に存在する（即ち「天然型」）ジスルフィド結合に含まれないものであるかに拘わらず、抗体の任意のシステイン（又はチオール含有）成分（例えばシステイン残基）を意味する。所定の選択された実施形態において、遊離システインは、生理的条件下で天然に存在するジスルフィド架橋を切断するように、天然に存在するシステインの天然型鎖間又は鎖内ジスルフィド架橋パートナーを置換、除去又は他の方法で改変し、部位特異的コンジュゲーションに適した不対システインにしたものとすることができる。他の好ましい実施形態において、遊離ないし不対システインは、抗体重鎖又は軽鎖アミノ酸配列内の所定の部位に選択的に配置されたシステイン残基を含むであろう。当然のことながら、コンジュゲーション前に、遊離ないし不対システインはシステムの酸化状態に応じてチオール（還元型システイン）として存在していてもよいし、キャップ修飾型システイン（酸化型）として存在していてもよいし、同一又は異なる分子上の別のシステイン又はチオール基との非天然型分子内又は分子間ジスルフィド結合の一部（酸化型）として存在していてもよい。以下に詳述するように、適切に改変された抗体コンストラクトの穏和な還元により、部位特異的コンジュゲーションに利用可能なチオールが得られる。したがって、特に好ましい実施形態では、（天然に存在するか又は組込まれたかに拘わらず）遊離ないし不対システインを選択的に還元した後にコンジュゲートさせ、均一なＤＡＲ組成を得る。
【００８５】
当然のことながら、本願に開示する改変型複合体製剤により示される有利な性質の少なくとも一因は、コンジュゲーションを特異的に行うことができ、作製された複合体をコンジュゲーション位置と組成の絶対ＤＡＲ値に関して大幅に限定できるという点にあると推定される。大半の従来のＡＤＣ製剤と異なり、本発明は、ランダムなコンジュゲーション部位とＤＡＲ種の比較的無制御な生成とを得るために、抗体の部分的又は完全な還元のみに依存せずに済む。逆に、所定の態様において、本発明は、天然に存在する（即ち「天然型」）鎖間若しくは鎖内ジスルフィド架橋の１個以上を切断するように又は任意の位置にシステイン残基を導入するように標的抗体を改変することにより、１個以上の所定の不対（即ち遊離）システイン部位を提供することが好ましい。このために、当然のことながら、選択された実施形態では、標準分子工学技術を使用してシステイン残基を抗体（又はその免疫反応性断片）の重鎖若しくは軽鎖の任意の位置に組込むこと又は付加することができる。他の好ましい実施形態では、天然型ジスルフィド結合を切断すると共に、（その後に遊離システインとなる）非天然型システインを導入すると、後でコンジュゲーション部位として使用することができる。
【００８６】
所定の実施形態において、改変型抗体は、鎖内又は鎖間システイン残基の少なくとも１カ所のアミノ酸欠失又は置換を含む。本願で使用する「鎖間システイン残基」とは、抗体の軽鎖と重鎖との間又は抗体の２本の重鎖間の天然型ジスルフィド結合に関与するシステイン残基を意味し、「鎖内システイン残基」とは、同一の重鎖又は軽鎖で別のシステインと天然に対合しているシステイン残基である。１実施形態において、欠失又は置換される鎖間システイン残基は、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の形成に関与している。別の実施形態において、欠失又は置換されるシステイン残基は、２本の重鎖間のジスルフィド結合に関与している。典型的な実施形態では、軽鎖が重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと対合し、一方の重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインが相補的な重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインと対合しているという抗体の相補的構造により、軽鎖又は重鎖のどちらかで１個のシステインが突然変異又は欠失すると、改変型抗体には２個の不対システイン残基が得られる。
【００８７】
実施形態によっては、鎖間システイン残基を欠失させる。他の実施形態では、鎖間システインを別のアミノ酸（例えば天然アミノ酸）で置換する。例えば、アミノ酸置換の結果として、鎖間システインを中性残基（例えばセリン、トレオニン又はグリシン）又は親水性残基（例えばメチオニン、アラニン、バリン、ロイシン又はイソロイシン）で置換えることができる。選択された実施形態では、鎖間システインをセリンで置換える。
【００８８】
本発明により想定される実施形態によっては、欠失又は置換されるシステイン残基は、軽鎖（κ又はλ）に存在するので、重鎖に遊離システインが残る。他の実施形態において、欠失又は置換されるシステイン残基は、重鎖に存在するので、軽鎖定常領域に遊離システインが残る。当然のことながら、無傷の抗体の軽鎖又は重鎖のどちらかで１個のシステインが欠失又は置換すると、アセンブリ後に２個の不対システイン残基をもつ部位特異的抗体となる。
【００８９】
１実施形態では、ＩｇＧ軽鎖（κ又はλ）の２１４位のシステイン（Ｃ２１４）を欠失又は置換させる。別の実施形態では、ＩｇＧ重鎖の２２０位のシステイン（Ｃ２２０）を欠失又は置換させる。他の実施形態では、重鎖の２２６位又は２２９位のシステインを欠失又は置換させる。１実施形態では、重鎖のＣ２２０をセリン（Ｃ２２０Ｓ）で置換し、軽鎖に所望の遊離システインを提供する。別の実施形態では、軽鎖のＣ２１４をセリン（Ｃ２１４Ｓ）で置換し、重鎖に所望の遊離システインを提供する。このような部位特異的コンストラクトについては、後記実施例に詳述する。適合可能な部位特異的コンストラクトの一覧を下表２に示すが、表中、番号付けは一般にＫａｂａｔに記載されているようなＥｕインデックスに準じ、ＷＴは改変されていない「野生型」即ち天然型定常領域配列を表し、デルタ（Δ）はアミノ酸残基の欠失を表す（例えばＣ２１４Δは２１４位のシステイン残基が欠失していることを示す）。
【００９０】
【表２】
2019506136.tif 000006
【００９１】
本発明の部位特異的コンストラクトに適合可能な代表的な改変型軽鎖及び重鎖定常領域を以下に記載するが、配列番号３及び４は夫々２２０Ｓ  ＩｇＧ１及びＣ２２０ΔＩｇＧ１重鎖定常領域を含み、配列番号６及び７は夫々Ｃ２１４Δ及びＣ２１４Ｓκ軽鎖定常領域を含み、配列番号９及び１０は夫々代表的なＣ２１４Δ及びＣ２１４Ｓλ軽鎖定常領域を含む。いずれの場合も、改変又は欠失させたアミノ酸の部位を（両側の残基と共に）下線で示す。
【００９２】
【化４】
2019506136.tif 000007
【００９３】
【化５】
2019506136.tif 000008
【００９４】
【化６】
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【００９５】
【化７】
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【００９６】
【化８】
2019506136.tif 000011
【００９７】
【化９】
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【００９８】
上記のように、重鎖及び軽鎖変異体を本願に開示する重鎖及び軽鎖可変領域（又はヒト化若しくはＣＤＲグラフトコンストラクト等のその誘導体）と各々機能的に会合させ、本願に開示するような部位特異的抗ＥＭＲ２抗体とすることができる。このような改変型抗体は本願に開示するＡＤＣで使用するのに特に適合可能である。
【００９９】
（天然型ジスルフィド結合の切断とは対照的に）遊離システインを得るために１個以上のシステイン残基を導入又は付加する場合、抗体又は抗体断片上の適合可能な位置は、当業者が容易に見出すことができる。したがって、選択された実施形態では、所望のＤＡＲ、抗体コンストラクト、選択されたペイロード及び抗体標的に応じてＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン若しくはＣＨ３ドメイン又はその任意の組み合わせにシステインを導入することができる。他の好ましい実施形態では、κ又はλＣＬドメイン、特に好ましい実施形態ではＣＬドメインのＣ末端領域にシステインを導入することができる。いずれの場合も、分子安定性、コンジュゲーション効率を助長するため、又は結合後にペイロードの保護環境を提供するために、システイン挿入部位に近接する他のアミノ酸残基を改変、除去又は置換させることができる。特定の実施形態において、置換される残基は、抗体の任意の接近可能な部位に存在する。このような表面残基をシステインで置換することにより、抗体上の容易に接近可能な部位に反応性チオール基が配置され、本願に詳述するようの選択的に還元することができる。特定の実施形態において、置換される残基は、抗体の接近可能な部位に存在する。これらの残基をシステインで置換することにより、抗体の接近可能な部位に反応性チオール基が配置され、抗体を選択的にコンジュゲートさせるために使用することができる。所定の実施形態では、軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）、重鎖のＡ１１８（Ｅｕ番号付け）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（Ｅｕ番号付け）の各残基のいずれか１種以上をシステインで置換することができる。その他の置換位置と適合可能な部位特異的抗体の作製方法は、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されており、その開示内容全体を本願に援用する。
【０１００】
本願に開示するように薬物を付加する部位と化学量論比を規定した抗体薬物複合体を作製するためのストラテジーは、主に抗体の保存された定常領域の改変によるため、全抗ＥＭＲ２抗体に広く応用できる。抗体の各クラス及びサブクラスのアミノ酸配列と天然型ジスルフィド架橋については十分な資料があるため、当業者は、必要以上の実験を行わずに種々の抗体の改変型コンストラクトを容易に作製することができ、したがって、このようなコンストラクトは、明白に本発明の範囲に含まれるものとみなす。このような例として、特に、本開示に記載するような重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列の全部又は一部を含む部位特異的コンストラクトが挙げられる。
【０１０１】
４．３．定常領域修飾及びグリコシル化改変
本発明の選択された実施形態は、更に、定常領域（即ちＦｃ領域）の置換又は修飾を含むことができ、限定されないが、アミノ酸残基置換、突然変異及び／又は修飾が挙げられ、その結果として、限定されないが、薬物動態の改変、血清半減期の延長、結合親和性の増加、免疫原性の低減、生産増加、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）とのＦｃリガンド結合の改変、ＡＤＣＣ又はＣＤＣの増加又は低減、グリコシル化及び／又はジスルフィド結合改変、並びに結合特異性の改変等の特徴をもつ化合物が得られる。
【０１０２】
例えばＦｃドメインとＦｃ受容体（例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＢ、ＦｃγＲＩＩＩ並びにＦｃＲｎ）との相互作用に関与するアミノ酸残基の置換により、Ｆｃエフェクター機能が改善された化合物を作製することができ、細胞毒性の増加及び／又は血清半減期の延長等の薬物動態の改変をもたらすことができる（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）参照）。
【０１０３】
選択された実施形態では、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との相互作用に関与するアミノ酸残基を改変（例えば置換、欠失又は付加）することにより、インビボ半減期の長い抗体を作製することができる（例えば国際公開番号ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ０４／０２９２０７；米国特許第６，７３７，０５６号及び米国特許出願第２００３／０１９０３１１号参照）。この実施形態に関して、Ｆｃ変異体は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける半減期を５日超、１０日超、１５日超、好ましくは２０日超、２５日超、３０日超、３５日超、４０日超、４５日超、２カ月超、３カ月超、４カ月超又は５カ月超にすることができる。半減期の延長の結果、血清力価が上昇し、したがって、抗体の投与頻度が低減し、及び／又は投与する抗体の濃度が低減する。ヒトＦｃＲｎ高親和性結合性ポリペプチドのヒトＦｃＲｎとのインビボ結合と血清中半減期は、例えばトランスジェニックマウスでアッセイすることができ、ヒトＦｃＲｎを発現するヒト細胞株にトランスフェクトしたり、変異体Ｆｃ領域をもつポリペプチドを霊長類に投与してアッセイすることもできる。ＷＯ２０００／４２０７２はＦｃＲｎとの結合を改善又は減弱した抗体変異体について記載している。例えばＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）も参照。
【０１０４】
他の実施形態では、Ｆｃ改変により、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性を増加又は低下させることができる。当分野で公知の通り、ＣＤＣとは、補体の存在下における標的細胞の溶解を意味し、ＡＤＣＣとは、分泌型Ｉｇが所定の細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー細胞、好中球及びマクロファージ）に存在するＦｃＲと結合することにより、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原をもつ標的細胞と特異的に結合した後、標的細胞を細胞毒素で殺傷することができるような形態の細胞傷害作用を意味する。本発明に即して説明すると、抗体変異体のＦｃＲ結合親和性を「改変」して、親即ち未改変型抗体又は天然型配列ＦｃＲを含む抗体に比較して結合性を増加又は低下させる。結合性の低下を示すこのような変異体は、検出可能な結合性を殆ど又は全くもたないようにすることができ、例えば当分野で周知の技術により測定した場合に、ＦｃＲとの結合性を天然型配列に比較して例えば０〜２０％にすることができる。他の実施形態において、変異体は、天然型免疫グロブリンＦｃドメインに比較して結合性の増加を示すであろう。当然のことながら、これらの型のＦｃ変異体は、本願に開示する抗体の有効な抗腫瘍性を強化するために、有利に使用することができる。更に他の実施形態において、このような改変は、結合親和性の増加、免疫原性の低減、生産増加、（例えばコンジュゲーション部位の）グリコシル化及び／又はジスルフィド結合の改変、結合特異性の改変、貪食作用の亢進及び／又は細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体；ＢＣＲ）のダウンレギュレーション等をもたらす。
【０１０５】
更に他の実施形態は、１種以上の改変型グリコフォームを含み、例えば（例えばＦｃドメインで）タンパク質と共有結合した改変型グリコシル化パターン又は改変型糖鎖組成を含む部位特異的抗体が挙げられる。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０参照。改変型グリコフォームは、種々の目的に有用であると思われ、限定されないが、エフェクター機能の増減、標的に対する抗体の親和性の増加又は抗体の生産の助長が挙げられる。エフェクター機能の低下が所望される所定の実施形態では、非グリコシル化形態を発現するように分子を操作することができる。１個以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を除去することによりこの部位をグリコシル化しないようにする置換は、周知である（例えば米国特許第５，７１４，３５０号及び６，３５０，８６１号参照）。逆に、１個以上の他のグリコシル化部位の操作により、エフェクター機能の強化又は結合性の改善をＦｃ含有分子に付与することもできる。
【０１０６】
他の実施形態としては、フコシル残基の量を減らした低フコシル化抗体やバイセクティングＧｌｃＮＡｃ構造を増やした抗体等の改変型グリコシル化組成をもつＦｃ変異体が挙げられる。このような改変型グリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ機能を増加することが実証されている。改変型グリコフォームは、当業者に公知の任意の方法により作製することができ、例えば改変型若しくは変異体発現系統を使用する方法、１種以上の酵素（例えばＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））の共発現、種々の生物若しくは種々の生物に由来する細胞株でＦｃ領域を含む分子を発現させる方法又はＦｃ領域を含む分子を発現させた後に糖鎖を改変する方法が挙げられる（例えばＷＯ２０１２／１１７００２参照）。
【０１０７】
４．４．断片
本発明を実施するためにどのような形態の抗体（例えばキメラ、ヒト化等）を選択するかに関係なく、当然のことながら、本願の教示に従って抗体の免疫反応性断片を単独で又は抗体薬物複合体の一部として使用することができる。「抗体断片」は、無傷の抗体の少なくとも一部を含む。本願で使用する抗体分子の「断片」なる用語は、抗体の抗原結合性断片を意味し、「抗原結合性断片」なる用語は、選択された抗原若しくはその免疫原性決定基と免疫特異的に結合若しくは反応するか又はこの断片の元の無傷の抗体と特異的抗原結合を競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を意味する。
【０１０８】
代表的な免疫反応性断片としては、軽鎖可変領域断片（ＶＬ）、重鎖可変領域断片（ＶＨ）、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、シングルドメイン抗体断片、ダイアボディ、線状抗体、１本鎖抗体分子及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。更に、活性部位特異的断片は、抗原／基質又は受容体と相互作用して（若干効率が劣るかもしれないが）無傷の抗体と同様にそれらを修飾する能力を維持する抗体の一部を含む。本願に記載するような遊離システインを１個以上含むように、このような抗体断片を更に操作することができる。
【０１０９】
特に好ましい実施形態において、ＥＭＲ２結合性ドメインは、ｓｃＦｖコンストラクトを含むであろう。本願で使用する「１本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）」とは、抗体から誘導される１本鎖ポリペプチドであって、抗原との結合能を維持するものを意味する。ｓｃＦｖの１例としては、組換えＤＮＡ技術により形成され、スペーサー配列を介して免疫グロブリン重鎖及び軽鎖断片のＦｖ領域を連結した抗体ポリペプチドが挙げられる。ｓｃＦｖの種々の作製方法が知られており、米国特許第４，６９４，７７８号に記載されている方法が挙げられる。
【０１１０】
他の実施形態において、抗体断片は、Ｆｃ領域を含む断片であって、Ｆｃ領域が無傷の抗体に存在する場合に通常付随する生物学的機能（例えばＦｃＲｎ結合性、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合性等）の少なくとも１種を維持するものである。１実施形態において、抗体断片は、無傷の抗体と実質的に同様のインビボ半減期をもつ１価抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に付与することが可能な少なくとも１個の遊離システインを含むＦｃ配列と連結した抗原結合性アームを含むことができる。
【０１１１】
当業者に自明の通り、断片は分子工学的手法により得ることもできるし、無傷即ち完全な抗体又は抗体鎖の化学処理又は酵素処理（例えばパパインやペプシン）や、組換え手段により得ることもできる。抗体断片のより詳細な説明については、例えばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９９）参照。
【０１１２】
選択された実施形態において、本発明の抗体断片は、種々の構造で使用することができるＳｃＦｖコンストラクトを含むであろう。例えば、このような抗ＥＭＲ２ＳｃＦｖコンストラクトは、腫瘍を治療するために養子免疫遺伝子療法で使用することができる。所定の実施形態では、ＥＭＲ２と免疫選択的に反応するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製するために本発明の抗体（例えばＳｃＦｖ断片）を使用することができる。本開示によると、抗ＥＭＲ２ＣＡＲは、本発明の抗ＥＭＲ２抗体又はその免疫反応性断片（例えばＳｃＦｖ断片）と、膜貫通ドメインと、少なくとも１個の細胞内ドメインとを含む融合タンパク質である。所定の実施形態では、ＥＭＲ２を発現する腫瘍細胞を特異的に標的とするように対象の免疫系を刺激するために、がんに罹患している対象に抗ＥＭＲ２ＣＡＲを発現するように遺伝子改変されたＴ細胞、ナチュラルキラー細胞又は樹状細胞を導入することができる。実施形態によっては、本発明のＣＡＲは、一次細胞質シグナル配列、即ちＴ細胞受容体複合体を介して抗原依存性一次活性化を開始するための配列を供与する細胞内ドメイン（例えばＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来する細胞内ドメイン）を含むであろう。他の実施形態において、本発明のＣＡＲは、二次又は共刺激シグナルを供与する細胞内ドメイン（例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、４−１ＢＢ及びグルココルチコイド誘発性腫瘍壊死因子受容体に由来する細胞内ドメイン）を含むであろう（米国特許第ＵＳ／２０１４／０２４２７０１号参照）。
【０１１３】
４．５．多価コンストラクト
他の実施形態において、本発明の抗体及び複合体は、１価でもよいし、多価（例えば２価、３価等）でもよい。本願で使用する「価数」なる用語は、抗体と会合している潜在的標的結合部位の数を意味する。各標的結合部位は、１個の標的分子又は標的分子上の特定の位置若しくは遺伝子座と特異的に結合する。抗体が１価であるとき、分子の各結合部位は、単一の抗原位置即ちエピトープと特異的に結合するであろう。抗体が２個以上の標的結合部位を含む（多価）とき、各標的結合部位は、同一又は異なる分子と特異的に結合することができる（例えば異なるリガンド又は異なる抗原又は同一抗原上の異なるエピトープないし位置と結合することができる）。例えば、米国特許出願第２００９／０１３０１０５号参照。
【０１１４】
１実施形態において、抗体は、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９に記載されているように、２本の分子鎖の特異性が異なる二重特異性抗体である。他の実施形態としては、更に特異性をもつ抗体（例えば三重特異性抗体）が挙げられる。他のより高度な適合可能な多重特異性コンストラクトとその作製方法は、米国特許出願第２００９／０１５５２５５号、ＷＯ９４／０４６９０、Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０、及びＷＯ９６／２７０１１に記載されている。
【０１１５】
多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープと免疫特異的に結合することができ、あるいは標的分子と異種エピトープ（例えば異種ポリペプチドや固相支持体材料）の両方に免疫特異的に結合することができる。選択された実施形態は、２種の抗原のみと結合する（即ち二重特異性抗体）が、更に特異性をもつ抗体（例えば三重特異性抗体）も本発明に含まれる。二重特異性抗体には、架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体も含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の一方をアビジンで標識し、他方をビオチンで標識することができる。このような抗体は、例えば望ましくない細胞を免疫系細胞の標的とするため（米国特許第４，６７６，９８０号）や、ＨＩＶ感染の治療に使用するため（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３及びＥＰ０３０８９）に提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の従来の架橋法を使用して作製することができる。適切な架橋剤は、当分野で周知であり、多数の架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１１６】
５．抗体の組換え生産
抗体とその断片とは、抗体産生細胞から得られる遺伝子材料と組換え技術とを使用して、生産又は修飾することができる。（例えば、Ｄｕｂｅｌ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ（Ｅｄｓ．）（２０１４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ＧｍｂＨ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｅｄｓ．）（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄ．），ＮＹ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．；及び米国特許第７，７０９，６１１号参照）。
【０１１７】
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞中に、細胞溶解液中に、又は部分精製形態で若しくは実質的に純粋な形態で、存在することができる。アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動法及び当分野で周知の他の方法を含む標準技術により、他の細胞成分又は他の汚染物質（例えば他の細胞核酸又はタンパク質）から分離されているときに、核酸は、「単離されている」か又は実質的に純粋にされている。本発明の核酸は、例えばＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ及びその人工変異体（例えばペプチド核酸）とすることができ、１本鎖でも２本鎖でもＲＮＡでもよく、ＲＮＡはイントロンを含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。選択された実施形態において、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
【０１１８】
本発明の核酸は、標準分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマ（例えば後記実施例に記載するように作製されたハイブリドーマ）により発現される抗体では、標準ＰＣＲ増幅法又はｃＤＮＡクローニング技術により、抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡを得ることができる。（例えばファージディスプレイ技術を使用して）免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られた抗体では、抗体をコードする核酸分子を、ライブラリーから回収することができる。
【０１１９】
例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するように、ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片を、標準組換えＤＮＡ技術により更に操作することができる。これらの操作では、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片を、抗体定常領域やフレキシブルリンカー等の別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片と機能的に連結する。これに関して使用する「機能的に連結」なる用語は、２個のＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列が、インフレームに維持されるように２個のＤＮＡ断片を連結することを意味する。
【０１２０】
ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＩｇＧ１の場合にはＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子と機能的に連結することにより、ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡを全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当分野で公知であり（例えばＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）（前出）参照）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅法により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域とすることができるが、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域が最も好ましい。代表的なＩｇＧ１定常領域を、配列番号２に記載する。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子では、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子と機能的に連結することができる。
【０１２１】
ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子と機能的に連結することにより、ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡを、全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当分野で公知であり（例えばＫａｂａｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）（前出）参照）、これらの領域を含むＤＮＡ断片は、標準ＰＣＲ増幅法により得ることができる。軽鎖定常領域は、κ定常領域でもλ定常領域でもよいが、κ定常領域が最も好ましい。代表的な適合可能なκ軽鎖定常領域を配列番号５に記載し、代表的な適合可能なλ軽鎖定常領域を配列番号８に記載する。
【０１２２】
いずれの場合も、ＶＨ又はＶＬドメインを夫々の定常領域（ＣＨ又はＣＬ）と機能的に連結することができ、前記定常領域は、部位特異的定常領域であり、部位特異的抗体が得られる。選択された実施形態において、得られた部位特異的抗体は、重鎖に２個の不対システインを含み、他の実施形態において、部位特異的抗体は、ＣＬドメインに２個の不対システインを含むであろう。
【０１２３】
本発明のポリペプチドに対して、「配列一致」、「配列類似性」又は「配列相同性」を示す所定のポリペプチド（例えば抗原又は抗体）も、本願に含まれる。例えば、誘導ヒト化抗体ＶＨ又はＶＬドメインは、ソース（例えばマウス）又はアクセプター（例えばヒト）ＶＨ又はＶＬドメインに対して配列類似性を示すことができる。「相同」ポリペプチドは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列一致度を示すことができる。他の実施形態において、「相同」ポリペプチドは、９３％、９５％又は９８％の配列一致度を示すことができる。本願で使用する２つのアミノ酸配列間の相同度百分率は、これらの２つの配列間の一致度百分率と等価である。２つの配列間の一致度百分率は、これらの２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップ数と各ギャップの長さを考慮してこれらの配列に共有される同一位置の数の関数である（即ち相同度％＝同一位置数／合計位置数×１００）。配列の比較と２つの配列間の一致度百分率の決定は、非限定的な後記実施例に記載するように数学的アルゴリズムを使用して実施することができる。
【０１２４】
２つのアミノ酸配列間の一致度百分率は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓとＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））を使用し、ＰＡＭ１２０荷重残基行列表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用して決定することができる。更に、２つのアミノ酸配列間の一致度百分率はＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）のＧＡＰプログラムに組込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２行列又はＰＡＭ２５０行列とギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６又は４と長さ荷重１、２、３、４、５又は６を使用して決定することもできる。
【０１２５】
上記の追加又は代用として、例えば関連配列を同定するために公共データベースで検索を行うための「クエリー配列」として本発明のタンパク質配列を更に使用することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３を使用して実施し、本発明の抗体分子に相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されているようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合には、夫々のプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。
【０１２６】
一致しない残基位置は、保存的アミノ酸置換による相違でもよいし、非保存的アミノ酸置換による相違でもよい。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が化学的性質（例えば電荷又は疎水性）の類似する側鎖をもつ別のアミノ酸残基で置換されている場合である。一般に、保存的アミノ酸置換ではタンパク質の機能的性質は実質的に変わらない。２個以上のアミノ酸配列が保存的置換により相互に相違する場合、置換の保存性を補正するように配列一致度又は類似度百分率を上方に調整することができる。非保存的アミノ酸による置換が存在する場合、複数の実施形態において、配列一致を示すポリペプチドは本発明のポリペプチド（例えば抗体）の所望の機能又は活性を維持するであろう。
【０１２７】
本発明の別の核酸に対して「配列一致」、「配列類似性」又は「配列相同性」を示す核酸もまた、本願に含まれる。「相同配列」とは、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列一致度を示す核酸分子の配列を意味する。他の実施形態において、核酸の「相同配列」は、参照核酸に対して９３％、９５％又は９８％の配列一致度を示すことができる。
【０１２８】
本発明は、真核細胞分泌経路のプロモーター（例えばＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；及び米国特許第５，１２２，４６４号参照）と他の転写調節因子及びプロセシング制御因子と機能的に連結することができる上記のような核酸を含むベクターも提供する。本発明は、これらのベクター及び宿主発現システムを組込んだ宿主細胞も提供する。
【０１２９】
本願で使用する「宿主発現システム」なる用語は、本発明の核酸又はポリペプチド及び抗体を作製するために改変することができる任意種類の細胞システムを包含する。このような宿主発現システムとしては、限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ若しくはプラスミドＤＮＡで形質転換若しくはトランスフェクトされた微生物（例えば大腸菌又は枯草菌）；組換え酵母発現ベクターをトランスフェクトされた酵母（例えばサッカロミセス属）；又は哺乳動物細胞若しくはウイルスのゲノムに由来するプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター）を含む組換え発現コンストラクトを組込んだ哺乳動物細胞（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）が挙げられる。宿主細胞に２種の発現ベクター（例えば重鎖に由来するポリペプチドをコードする第１のベクターと軽鎖に由来するポリペプチドをコードする第２のベクター）をコトランスフェクトしてもよい。
【０１３０】
哺乳動物細胞の形質転換方法は、当分野で周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、４，９１２，０４０号、４，７４０，４６１号及び４，９５９，４５５号参照。種々の特性をもつ抗原結合性分子（例えばＧｎＴＩＩＩ活性をもつ改変型グリコフォーム又はタンパク質）を生産できるように宿主細胞を改変することもできる。
【０１３１】
組換えタンパク質を長期間にわたって高収率で生産するには、安定した発現が好ましい。したがって、当分野で公知の標準技術を使用して、選択された抗体を安定して発現する細胞株を作製することができ、本発明の一部を構成する。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現調節因子（例えばプロモーター又はエンハンサー配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位等）と選択マーカーの制御下のＤＮＡとで宿主細胞を形質転換することができる。当分野で周知の選択システムのいずれを使用してもよく、選択された条件下で発現を強化するための効率的なアプローチとなるグルタミンシンテターゼ遺伝子発現システム（ＧＳシステム）が挙げられる。ＧＳシステムは、ＥＰ０  ２１６  ８４６、ＥＰ０  ２５６  ０５５、ＥＰ０  ３２３  ９９７、ＥＰ０  ３３８  ８４１並びに米国特許第５，５９１，６３９号及び５，８７９，９３６号に全体又は一部を記載されている。安定な細胞株の作製用の別の適合可能な発現システムは、Ｆｒｅｅｄｏｍ（ＴＭ）ＣＨＯ−Ｓキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
【０１３２】
組換え発現又は本願に開示する他のいずれかの技術により本発明の抗体が生産されたら、当分野で公知の方法により、精製又は単離すること、即ち、同定し、その天然環境から分離及び／又は回収し、抗体又は関連するＡＤＣを診断又は治療に使用するのを妨げるような汚染物質から分離することが、できる。単離抗体としては、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕ抗体が挙げられる。
【０１３３】
例えばイオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィー、透析、透析濾過並びにアフィニティークロマトグラフィー、特にプロテインＡ又はプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー等の当分野で公知の種々の技術を使用して、これらの単離調製物を精製することができる。適合可能な方法については後記実施例により詳細に記載する。
【０１３４】
６．生産後選択
どのようにして得られたかに関係なく、抗体産生細胞（例えばハイブリドーマ、酵母コロニー等）を選択し、クローニングし、例えば確実な増殖、高度な抗体産生能及び着目抗原に対する高い親和性等の望ましい抗体特性を含む望ましい特性について、更にスクリーニングすることができる。ハイブリドーマを、細胞培養によって、インビトロ又は同系免疫不全動物でインビボにて拡大することができる。ハイブリドーマ及び／又はコロニーの選択、クローニング及び拡大方法は、当分野の通常の知識をもつ者に周知である。所望の抗体が同定されたら、当分野で公知の一般的な分子生物学及び生化学技術を使用して、関連する遺伝子材料を単離、操作及び発現させることができる。
【０１３５】
（天然型又は合成型の）ナイーブライブラリーにより生産された抗体は、親和性を中程度（Ｋａが約１０６〜１０７Ｍ−１）とすることができる。親和性を増加させるためには、（例えばエラープローンポリメラーゼを使用することによりランダム突然変異をインビトロで導入することにより）抗体ライブラリーを作製し、（例えばファージ又は酵母ディスプレイ法を使用することにより）二次ライブラリーから抗原に対する親和性の高い抗体を再選択することにより、インビトロで親和性成熟を模倣することができる。ＷＯ９６０７７５４は、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲに突然変異誘発を誘導して軽鎖遺伝子のライブラリーを作製する方法を記載している。
【０１３６】
抗体を選択するためには種々の技術を使用することができ、限定されないが、ファージ又は酵母ディスプレイ法が挙げられ、ヒトコンビナトリアル抗体又はｓｃＦｖ断片のライブラリーをファージ又は酵母で作製し、ライブラリーを着目抗原又はその抗体結合部分でスクリーニングし、前記抗原と結合するファージ又は酵母を単離することにより、抗体又は免疫反応性断片を得ることができる（Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ＰＭＩＤ：９６３０８９１；Ｓｈｅｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＰＭＩＤ：９６００９３４；Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＰＭＩＤ：９１８１５７８；Ｐｅｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＭＩＤ：１８３３６２０６）。ファージ又は酵母ディスプレイライブラリーの作製用キットは、市販されている。他の方法及び試薬もまた、抗体ディスプレイライブラリーの作製とスクリーニングに使用することができる（米国特許第５，２２３，４０９号、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；及びＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＰＭＩＤ：１８９６４４５参照）。このような技術は多数の候補抗体のスクリーニングを可能にし、（例えば組換えシャフリングにより）比較的簡単に配列を操作できるという利点がある。
【０１３７】
ＩＶ．抗体の特性決定
所定の実施形態では、抗体産生細胞（例えばハイブリドーマや酵母コロニー）を選択し、クローニングし、例えば確実な増殖、高度な抗体産生能及び以下に詳述するように望ましい部位特異的抗体特性を含む有利な性質について更にスクリーニングすることができる。他の場合には、動物に接種するのに適した特定の抗原（例えば特定のＥＭＲ２アイソフォーム）又は標的抗原の免疫反応性断片を選択することにより抗体の特性を付与することができる。更に他の実施形態では、親和性や薬物動態等の免疫化学的特性を強化又は改良するように、選択された抗体を上記のように改変することができる。
【０１３８】
Ａ．中和抗体
選択された実施形態において、本発明の抗体は、「アンタゴニスト」ないし「中和」抗体とすることができ、即ち抗体は決定基と会合し、直接又は決定基がリガンドや受容体等の結合パートナーと会合しないようにすることにより前記決定基の活性を阻止又は阻害し、分子の相互作用によって生じるような生体応答が起こらないようにする。例えば標的分子活性又はインビトロ競合的結合アッセイにより測定した場合に、過剰の抗体が決定基と結合する結合パートナーの量を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％以上減らすときに、中和ないしアンタゴニスト抗体は、決定基とそのリガンド又は基質との結合を実質的に阻害するであろう。当然のことながら、活性の変化は当分野で公知の技術を使用して直接測定してもよいし、活性の変化が下流に与える影響（例えば腫瘍形成又は細胞生存）により測定してもよい。
【０１３９】
Ｂ．内在化抗体
所定の実施形態において、抗体は、抗体が決定基と結合し、造腫瘍性細胞を含む選択された標的細胞に（医薬活性部分をコンジュゲートさせた場合にはそれと共に）内在化されるように、内在化抗体を含むことができる。内在化される抗体分子の数は、抗原を発現する細胞、特に抗原を発現する造腫瘍性細胞を殺傷するために十分な数とすることができる。抗体、又は場合によっては抗体薬物複合体の力価に応じて、１個の抗体分子が細胞に取り込まれるだけで抗体が結合する標的細胞を殺傷するのに十分な場合がある。本発明については、発現されるＥＭＲ２タンパク質の実質的な部分が造腫瘍性細胞表面と会合し続けるため、本願に開示する抗体又はＡＤＣの局在と内在化が可能になることが分かっている。選択された実施形態では、内在化後に細胞を殺傷する１種以上の薬物とこのような抗体を会合又はコンジュゲートさせる。実施形態によっては、本発明のＡＤＣは内在化部位特異的ＡＤＣを含むであろう。
【０１４０】
本願で使用する「内在化する」抗体とは、会合した決定基との結合後に（細胞毒素をコンジュゲートさせた場合にはそれと共に）標的細胞に取り込まれる抗体である。内在化されるこのようなＡＤＣの数は決定基を発現する細胞、特に決定基を発現するがん幹細胞を殺傷するために十分であることが好ましい。細胞毒素又は全体としてのＡＤＣの力価に応じて、場合によっては、少数の抗体分子が細胞に取り込まれるだけで抗体が結合する標的細胞を殺傷するために十分である。例えば、ＰＢＤやカリケアマイシン等の所定の薬物は非常に強力であるため、抗体にコンジュゲートさせたトキシンの少数の分子が内在化すれば標的細胞を殺傷するのに十分である。抗体が哺乳動物細胞と結合後に内在化するか否かは、後記実施例に記載するものを含めて当分野で公知の種々のアッセイ（例えばＭａｂ−ＺａｐやＦａｂ−Ｚａｐ等のサポニンアッセイ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により判定することができる。抗体が細胞に内在化するか否かを検出する方法も米国特許第７，６１９，０６８号に記載されている。
【０１４１】
Ｃ．細胞除去抗体
他の実施形態において、本発明の抗体は細胞除去抗体である。「細胞除去」抗体なる用語は、好ましくは、細胞表面又はその近傍の抗原と結合し、（例えばＣＤＣ、ＡＤＣＣ又は細胞毒性薬の導入により）細胞の死滅を誘導、促進又は誘起する抗体を意味する。実施形態によっては、選択された細胞除去抗体を細胞毒素にコンジュゲートさせる。
【０１４２】
細胞除去抗体は、所定の細胞集団でＥＭＲ２を発現する細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％を殺傷できることが好ましい。実施形態によっては、細胞集団は、がん幹細胞を含めて集積、切片切断、精製又は単離後の造腫瘍性細胞を含むことができる。他の実施形態において、細胞集団は、がん幹細胞を含む全腫瘍試料又は不均一な腫瘍抽出物を含むことができる。標準生化学技術を使用し、本願の教示に従って造腫瘍性細胞の除去をモニター及び定量化することができる。
【０１４３】
Ｄ．結合親和性
本願では、特定の決定基（例えばＥＭＲ２）に対する結合親和性の高い抗体を開示する。「ＫＤ」なる用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数又は見掛けの親和性を意味する。本発明の抗体は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が≦１０−７Ｍであるときにその標的抗原と免疫特異的に結合することができる。前記抗体は、ＫＤが≦５×１０−９Ｍのときに高い親和性で抗原と特異的に結合し、ＫＤが≦５×１０−１０ Ｍのときに非常に高い親和性で結合する。本発明の１実施形態において、前記抗体は、ＫＤが≦１０−９Ｍであり、解離速度が約１×１０−４／ｓｅｃである。本発明の１実施形態において、解離速度は、＜１×１０−５／ｓｅｃである。本発明の他の実施形態において、前記抗体は、ＫＤが約１０−７Ｍ〜１０−１０Ｍで決定基と結合し、更に別の実施形態では、ＫＤ≦２×１０−１０Ｍで結合するであろう。本発明の更に他の選択された実施形態は、ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満又は５×１０−１５Ｍ未満の抗体を含む。
【０１４４】
所定の実施形態において、決定基（例えばＥＭＲ２）と免疫特異的に結合する本発明の抗体は、会合速度定数即ちｋｏｎ（又はｋａ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ←抗体−Ａｇ）を少なくとも１０５Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも２×１０５Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも５×１０５Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも１０６Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも５×１０６Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも１０７Ｍ−ｌｓ−ｌ、少なくとも５×１０７Ｍ−ｌｓ−ｌ、又は少なくとも１０８Ｍ−ｌｓ−ｌとすることができる。
【０１４５】
別の実施形態において、決定基（例えばＥＭＲ２）と免疫特異的に結合する本発明の抗体は、解離速度定数即ちｋｏｆｆ（又はｋｄ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋｏｆｆ←抗体−Ａｇ）を１０−ｌｓ−ｌ未満、５×１０−ｌｓ−ｌ未満、１０−２ｓ−ｌ未満、５×１０−２ｓ−ｌ未満、１０−３ｓ−ｌ未満、５×１０−３ｓ−ｌ未満、１０−４ｓ−ｌ未満、５×１０４ｓ−ｌ未満、１０−５ｓ−ｌ未満、５×１０−５ｓ−ｌ未満、１０−６ｓ−ｌ未満、５×１０−６ｓ−ｌ未満、１０−７ｓ−ｌ未満、５×１０−７ｓ−ｌ未満、１０−８ｓ−ｌ未満、５×１０−８ｓ−ｌ未満、１０−９ｓ−ｌ未満、５×１０−９ｓ−ｌ未満又は１０−１０ｓ−ｌ未満とすることができる。
【０１４６】
結合親和性は、当分野で公知の種々の技術、例えば表面プラズモン共鳴法、バイオレイヤー干渉法、二面偏波式干渉法、静的光散乱法、動的光散乱法、等温滴定型カロリメトリー、ＥＬＩＳＡ、分析用超遠心法及びフローサイトメトリーを使用して測定することができる。
【０１４７】
Ｅ．ビニング及びエピトープマッピング
本願に開示する抗体は、それらが会合する不連続エピトープにより特徴付けることができる。「エピトープ」とは、抗体又は免疫反応性断片が特異的に結合する決定基の部分である。免疫特異的結合は、上記のように結合親和性に基づいてあるいは（例えば競合アッセイで）タンパク質及び／又は高分子の複雑な混合物中で、抗体によるその標的抗原の優先的認識により確認及び確定することができる。「線状エピトープ」は、抗体の免疫特異的結合を可能にする抗原中の連続アミノ酸により形成される。線状エピトープと優先的に結合する能力は、通常では抗原が変性しても維持される。逆に、「構造的エピトープ」は、通常では抗原のアミノ酸配列中に不連続なアミノ酸を含むが、抗原の二次、三次又は四次構造から見ると、単一抗体と同時に結合するために十分に近接している。構造的エピトープをもつ抗原が変性すると、抗体は通常では抗原を認識しなくなる。（連続又は不連続な）エピトープは通常では少なくとも３個、より一般的には少なくとも５個又は８〜１０個又は１２〜２０個のアミノ酸をユニークな空間配置で含む。
【０１４８】
本発明の抗体をそれらが属する「ビン」により特徴付けることも可能である。「ビニング」とは、免疫原性決定基と同時に結合できない抗体対を同定するために競合的抗体結合アッセイを使用し、結合を「競合」する抗体を同定することを意味する。競合抗体は、被験抗体又は免疫学的機能的断片が参照抗体と共通抗原の特異的結合を防止又は阻害するアッセイにより決定することができる。一般的に、このようなアッセイでは、固体表面又は細胞に固定した精製抗原（例えばＥＭＲ２又はそのドメイン若しくは断片）と、未標識被験抗体と、標識参照抗体を使用する。競合的阻害は固体表面又は細胞に固定した標識の量を被験抗体の存在下で測定することにより測定される。競合的結合の測定方法に関するその他の詳細については後記実施例に記載する。一般に、競合抗体が過剰に存在する場合には、参照抗体と共通抗原の特異的結合を少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害するであろう。場合により、結合は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。逆に、参照抗体を固定している場合には、後から添加される被験抗体（即ちＥＭＲ２抗体）の結合を好ましくは少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害するであろう。場合により、被験抗体の結合は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。
【０１４９】
一般に、ビニング又は競合的結合は、当分野で公知の種々の技術を使用して測定することができ、例えばウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、プレシピチン反応、ゲル拡散プレシピチン反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ及びプロテインＡイムノアッセイ等のイムノアッセイが挙げられる。このようなイムノアッセイは当分野で常法であり、周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。更に、クロスブロッキングアッセイを使用してもよい（例えば、ＷＯ２００３／４８７３１；及びＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ参照）。
【０１５０】
競合的阻害（及び「ビン」）を測定するために使用される他の技術としては、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（ＴＭ）２０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴法；例えばＦｏｒｔｅＢｉｏ（Ｒ）Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用したバイオレイヤー干渉法；又は例えばＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）若しくは多重ＬＵＭＩＮＥＸ（ＴＭ）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用したフローサイトメトリービーズアレイが挙げられる。
【０１５１】
Ｌｕｍｉｎｅｘは、ビーズ式イムノアッセイプラットフォームであり、大規模な多重抗体ペアリングが可能である。このアッセイは、標的抗原に対する抗体対の同時結合パターンを比較する。対の一方の抗体（キャプチャーｍＡｂ）をＬｕｍｉｎｅｘビーズに固定し、各キャプチャーｍＡｂを別の色のビーズに固定する。他方の抗体（ディテクターｍＡｂ）を蛍光シグナル（例えばフィコエリスリン（ＰＥ））に固定する。このアッセイは、抗体と抗原との同時結合（ペアリング）を解析し、類似のペアリングプロファイルをもつ抗体同士をグループ化する。ディテクターｍＡｂとキャプチャーｍＡｂとのプロファイルが似ているならば、これらの２つの抗体は同一又は近縁のエピトープと結合すると判断される。１実施形態では、ピアソンの相関係数を使用してペアリングプロファイルを測定し、被験抗体パネル上の特定の抗体と最も密接に相関する抗体を同定することができる。実施形態によっては、抗体対のピアソンの相関係数が少なくとも０．９であるならば、被験／ディテクターｍＡｂは参照／キャプチャーｍＡｂと同一ビンに含まれると判定されよう。他の実施形態において、ピアソンの相関係数は少なくとも０．８、０．８５、０．８７又は０．８９である。他の実施形態において、ピアソンの相関係数は少なくとも０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９又は１である。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイから得られたデータの他の解析方法は米国特許第８，５６８，９９２号に記載されている。Ｌｕｍｉｎｅｘは１００種類（以上）の異なるタイプのビーズを同時に解析できるので、ほぼ無制限に抗原及び／又は抗体表面に対応でき、バイオセンサーアッセイよりも抗体エピトーププロファイリングのスループットと分解能が改善される（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＭＩＤ：２１２２３９７０）。
【０１５２】
同様に、表面プラズモン共鳴法を含むビニング技術も、本発明に適合可能である。本願で使用する「表面プラズモン共鳴法」とは、バイオセンサーマトリックスの内側のタンパク質濃度変化の検出により、リアルタイム特異的相互作用の解析を可能にする光学現象を意味する。ＢＩＡｃｏｒｅ（ＴＭ）２０００システム等の市販機器を使用して、選択された抗体が、所定の抗原との結合を相互に競合するか否かを容易に判定することができる。
【０１５３】
他の実施形態において、被験抗体が参照抗体と結合を「競合」するか否かを判定するために使用することができる技術の１例は、「バイオレイヤー干渉法」であり、バイオセンサーチップに固定化したタンパク質層と内部参照層との２つの表面から反射される白色光の干渉パターンを解析する光学解析技術である。バイオセンサーチップに固定した分子の数が変化すると、干渉パターンがシフトし、リアルタイムで測定することができる。このようなバイオレイヤー干渉法アッセイは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（Ｒ）Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ装置を使用して以下のように実施することができる。参照抗体（Ａｂ１）を抗マウスキャプチャーチップに捕捉させた後、高濃度の非結合性抗体を使用してチップをブロックし、ベースラインを取得する。次に、単量体組換え標的タンパク質を特異抗体（Ａｂ１）に捕捉させ、対照として同一抗体（Ａｂ１）を加えたウェル又は別の被験抗体（Ａｂ２）を加えたウェルにチップを浸す。結合レベルを対照Ａｂ１と比較してそれ以上結合しないと判断されるならば、Ａｂ１とＡｂ２は「競合」抗体であると判断する。Ａｂ２で余分な結合が観測されるならば、Ａｂ１とＡｂ２は相互に競合しないと判断する。ユニークなビンに相当する９６ウェルプレートの抗体１列全体を使用してユニークな抗体の大規模なライブラリーをスクリーニングするようにこのプロセスを拡張することができる。実施形態によっては、参照抗体が被験抗体と共通抗原の特異的結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する場合に、被験抗体は参照抗体と競合する。他の実施形態において、結合は少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。
【０１５４】
１群の競合抗体を含むビンが決定されたら、更に特性決定を行い、この群の抗体が結合する抗原上の特異的ドメインないしエピトープを決定することができる。Ｃｏｃｈｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＰＭＩＤ：１５０９９７６３に記載されているプロトコールの変法を使用してドメインレベルエピトープマッピングを実施することができる。ファインエピトープマッピングは、抗体が結合する決定基のエピトープを含む抗原上の特定のアミノ酸を決定する方法である。
【０１５５】
所定の実施形態では、ファージ又は酵母ディスプレイ法を使用してファインエピトープマッピングを実施することができる。他の適合可能なエピトープマッピング技術としては、アラニンスキャニング突然変異体、ペプチドブロット法（Ｒｅｉｎｅｋｅ，２００４，ＰＭＩＤ：１４９７０５１３）又はペプチド切断解析法が挙げられる。更に、タンパク質分解酵素（例えばトリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、キモトリプシン等）等の酵素；スクシンイミジルエステルとその誘導体、第１級アミン含有化合物、ヒドラジン及びカルボヒドラジン、遊離アミノ酸等の化学物質等を使用してエピトープ切り出し、エピトープ抽出及び抗原の化学的修飾等の方法を利用することができる（Ｔｏｍｅｒ，２０００，ＰＭＩＤ：１０７５２６１０）。別の実施形態では、修飾を利用したプロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）（別称：抗原構造に基づく抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：ＡＳＡＰ））を使用し、化学物質又は酵素で修飾した抗原表面と各抗体の結合プロファイルの類似性に従って同一抗原に対する多数のモノクローナル抗体を分類することができる（米国特許出願第２００４／０１０１９２０号）。
【０１５６】
抗原上の所望のエピトープが決定されたら、例えば本願に記載する技術を使用して選択されたエピトープを含むペプチドで免疫することにより、このエピトープに対する他の抗体を作製することが可能である。
【０１５７】
Ｖ．抗体複合体
実施形態によっては、本発明の抗体を医薬活性部分又は診断薬部分とコンジュゲートさせ、「抗体薬物複合体（ＡＤＣ）」ないし「抗体複合体」を形成することができる。「複合体」なる用語は広義に使用され、会合方法に関係なく、任意の医薬活性部分又は診断薬部分と本発明の抗体との共有的又は非共有的会合を意味する。所定の実施形態において、会合は、抗体のリジン又はシステイン残基を介して行われる。実施形態によっては、１個以上の部位特異的遊離システインを介して医薬活性部分又は診断薬部分を抗体とコンジュゲートさせることができる。本願に開示するＡＤＣは、治療及び診断目的で使用することができる。
【０１５８】
本発明のＡＤＣは、細胞毒素又は他のペイロードを標的位置（例えば造腫瘍性細胞及び／又はＥＭＲ２を発現する細胞）に送達するために使用することができる。本願に記載する「薬物」又は「ウォーヘッド」なる用語は同義に使用することができ、生物学的に活性又は検出可能な分子又は薬物を意味し、以下に記載するような抗がん剤や細胞毒素が挙げられる。「ペイロード」は、任意選択的なリンカー化合物と共に「薬物」又は「ウォーヘッド」を含むことができる。複合体上のウォーヘッドは、ペプチド、タンパク質又はインビボで代謝されて活性な薬物となるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、低分子、結合剤、ミメティック剤、合成薬物、無機分子、有機分子及び放射性同位体を含むことができる。好ましい１実施形態において、本願に開示するＡＤＣは、ウォーヘッド（例えば本願に開示するようなＰＢＤＳ１〜５）を放出及び活性化させる前に、固定されたペイロードを比較的非反応性で非毒性状態の標的部位に導くであろう。ウォーヘッドのこの標的放出は（例えば抗体上の１個以上のシステインを介する）ペイロードの安定的なコンジュゲーションと、過剰にコンジュゲーションされた毒性のＡＤＣ種を最小限にするＡＤＣ製剤の比較的均一な組成により行われることが好ましい。腫瘍部位に送達されるとウォーヘッドを多量に放出するように設計された薬物リンカーと相俟って、本発明の複合体は望ましくない非特異的な毒性を実質的に減らすことができる。これは、非標的細胞及び組織の暴露を最小限にしながら腫瘍部位に比較的高濃度の活性細胞毒素が得られるため、高い治療指数が得られるという利点がある。
【０１５９】
当然のことながら、本発明のある種の実施形態は、治療薬部分（例えば細胞毒素）を組込んだペイロードを含むが、診断薬や生体適合性修飾剤を組込んだペイロードも本願に開示する複合体により実現される標的放出で利用することができる。したがって、文脈からそうでないと判断される場合を除き、代表的な治療薬ペイロードに関する全開示は、本願に記載するような診断薬又は生体適合性修飾剤を含むペイロードにも適用される。選択されたペイロードは、抗体と共有的又は非共有的に連結することができ、コンジュゲーションを行うために使用される方法に少なくともある程度依存して、種々の化学量論的モル比を示すことができる。
【０１６０】
本発明の複合体は、一般に式：Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎにより表すことができ、又はその薬学的に許容される塩であり、前記式中、
ａ）Ａｂは抗ＥＭＲ２抗体を含み；
ｂ）Ｌは任意選択的なリンカーを含み；
ｃ）Ｄは薬物を含み；
ｄ）ｎは約１〜約２０の整数である。
【０１６１】
当業者に自明の通り、上記式の複合体は、多数の異なるリンカー及び薬物を使用して作製することができ、コンジュゲーション法は、成分の選択に応じて異なるであろう。したがって、本願に開示する抗体の反応性残基（例えばシステイン又はリジン）と会合するあらゆる薬物又は薬物リンカー化合物が、本願の教示に適合可能である。同様に、選択された薬物と抗体のコンジュゲーション（部位特異的コンジュゲーションを含む）を可能にするあらゆる反応条件が本発明の範囲に含まれる。ただし、本発明のある種の好ましい実施形態は、本願に記載するような穏和な還元剤と安定化剤とを併用することによる薬物又は薬物リンカーと遊離システインの選択的コンジュゲーションを含む。このような反応条件ではより均一な製剤が得られ、非特異的なコンジュゲーションと汚染物質が少なく、それに伴って毒性も低下する傾向がある。
【０１６２】
Ａ．ウォーヘッド
１．治療薬
本発明の抗体は、治療薬部分又は抗がん剤等の薬物である医薬活性部分とコンジュゲーション、連結、融合又は他の方法で会合させることができ、抗がん剤としては、限定されないが、細胞毒性薬（細胞毒素）、細胞増殖抑制剤、抗血管新生薬、腫瘍減量剤、化学療法剤、放射線療法剤、標的抗がん剤、生体応答調節剤、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移薬及び免疫療法剤が挙げられる。
【０１６３】
代表的な抗がん剤又は細胞毒素（そのホモログ及び誘導体を含む）としては、１−デヒドロテストステロン、アントラマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、カリケアマイシン（ｎ−アセチルカリケアマイシンを含む）、コルヒチン、シクロホスファミド、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン（旧名称アクチノマイシン）、ジヒドロキシアントラセン、ジオン、デュオカルマイシン、エメチン、エピルビシン、臭化エチジウム、エトポシド、グルココルチコイド、グラミシジンＤ、リドカイン、ＤＭ−１やＤＭ−４（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）等のメイタンシノイド、ベンゾジアゼピン誘導体（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、プロカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、テニポシド、テトラカイン及び上記のいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸若しくは誘導体が挙げられる。
【０１６４】
その他の適合可能な細胞毒素としては、ドラスタチン及びアウリスタチン（例えばモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ））、アマニチン（例えばα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン又はε−アマニチン（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｐｈａｒｍａ））、ＤＮＡの副溝に結合する薬剤（例えばデュオカルマイシン誘導体（Ｓｙｎｔａｒｇａ））、アルキル化剤（例えば修飾又は二量体型ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトールストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ，シスプラチン））、スプライシング阻害剤（例えばメアヤマイシンアナログ又は誘導体（例えば米国特許第７，８２５，２６７号に記載されているようなＦＲ９０１４６４））、微小管結合剤（例えばエポチロンアナログ、チューブリシン及びパクリタキセル）、ＤＮＡ傷害剤（例えばカリケアマイシンやエスペラマイシン）、代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン及び５−フルオロウラシルダカルバジン）、有糸分裂阻害剤（例えばビンブラスチンやビンクリスチン）、及びアントラサイクリン（例えばダウノルビシン（旧名称ダウノマイシン）やドキソルビシン）並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸若しくは誘導体が挙げられる。
【０１６５】
選択された実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞を動員して造腫瘍性細胞を標的にするように本発明の抗体を抗ＣＤ３結合分子と会合させることができる（ＢｉＴＥ技術；例えばＦｕｈｒｍａｎｎ  ｅｔ．ａｌ．（２０１０）Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＡＡＣＲ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．５６２５参照）。
【０１６６】
他の実施形態において、本発明のＡＤＣは適切なリンカーを使用して治療用放射性同位体をコンジュゲートさせた細胞毒素を含むことができる。このような実施形態に適合可能であると思われる代表的な放射性同位体としては、限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、硫黄（３５Ｓ）、ラジウム（２２３Ｒ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ、７６Ｂｒ、２１１Ａｔ及び２２５Ａｃが挙げられる。診断薬及び治療薬として他の放射性核種も利用可能であり、特に６０〜４，０００ｋｅＶのエネルギー範囲のものが挙げられる。
【０１６７】
他の選択された実施形態では、本発明のＡＤＣを細胞毒性ベンゾジアゼピン誘導体ウォーヘッドとコンジュゲートさせる。本願に開示する抗体にコンジュゲートさせることができる適合可能なベンゾジアゼピン誘導体（及び任意選択的なリンカー）は例えば米国特許第８，４２６，４０２号や、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１２／１２８８６８及びＷＯ２０１４／０３１５６６に記載されている。ＰＢＤと同様に、適合可能なベンゾジアゼピン誘導体はＤＮＡの副溝に結合して核酸合成を阻害すると考えられている。このような化合物は強力な抗腫瘍性をもつと報告されているため、本発明のＡＤＣで使用するのに特に適している。
【０１６８】
実施形態によっては、本発明のＡＤＣは、ＰＢＤ及びその薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸若しくは誘導体をウォーヘッドとして含むことができる。ＰＢＤは、副溝でＤＮＡと共有結合して核酸合成を阻害することにより抗腫瘍活性を発揮するアルキル化剤である。ＰＢＤは、骨髄機能低下を最小限にしながら強力な抗腫瘍性を示すことが分かっている。本発明に適合可能なＰＢＤは、数種のリンカー（例えば遊離スルフヒドリル基をもつマレイミド部分を含むペプチドリンカー）を使用して抗体と連結することができ、所定の実施形態では、二量体形態（即ちＰＢＤダイマー）である。本願に開示する抗体にコンジュゲートさせることができる適合可能なＰＢＤ（及び任意選択的なリンカー）は、例えば米国特許第６，３６２，３３１号、７，０４９，３１１号、７，１８９，７１０号、７，４２９，６５８号、７，４０７，９５１号、７，７４１，３１９号、７，５５７，０９９号、８，０３４，８０８号、８，１６３，７３６号、米国特許出願第２０１１／０２５６１５７号、並びにＰＣＴ出願ＷＯ２０１１／１３０６１３、ＷＯ２０１１／１２８６５０、ＷＯ２０１１／１３０６１６、ＷＯ２０１４／０５７０７３及びＷＯ２０１４／０５７０７４に記載されている。本発明に適合可能なＰＢＤ化合物の例について、以下に更に詳述する。
【０１６９】
本発明に関して、ＰＢＤは、骨髄機能低下を最小限にしながら強力な抗腫瘍性を示すことが分かっている。本発明に適合可能なＰＢＤは、数種のリンカーのいずれか１種（例えば遊離スルフヒドリル基をもつマレイミド部分を含むペプチドリンカー）を使用してＥＭＲ２標的薬と連結することができ、所定の実施形態では、二量体形態（即ちＰＢＤダイマー）である。ＰＢＤは、以下の一般構造である。
【０１７０】
【化１０】
2019506136.tif 000013
【０１７１】
上記化合物は、芳香Ａ環及びピロロＣ環における置換基の数、種類及び位置と、Ｃ環の飽和度が異なる。Ｂ環には、ＤＮＡのアルキル化に関与する求電子性中心であるＮ１０−Ｃ１１位にイミン（Ｎ＝Ｃ）、カルビノールアミン（ＮＨ−ＣＨ（ＯＨ））、又はカルビノールアミンメチルエーテル（ＮＨ−ＣＨ（ＯＭｅ））が存在する。公知の全天然物は、キラルＣ１１ａ位にＳ配置を有するため、Ｃ環からＡ環に向かって見たときに右ねじ形となる。こうしてＢ形ＤＮＡの副溝とのイソヘリシティに適した三次元形となり、結合部位にぴったりとはめ込まれる（Ｋｏｈｎ，Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ＩＩＩ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３−１１（１９７５）；Ｈｕｒｌｅｙ  ａｎｄ  Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９，２３０−２３７（１９８６））。副溝に付加物を形成できるため、ＤＮＡプロセシングを妨害し、細胞毒性薬として作用することができる。上記に示唆したように、力価を高くするために、本願に記載するような抗ＥＭＲ２抗体とコンジュゲートさせることができる二量体でＰＢＤを使用することが多い。
【０１７２】
特に好ましい実施形態において、本願に開示するモジュレーターとコンジュゲートさせることができる適合可能なＰＢＤは、米国特許出願第２０１１／０２５６１５７号に記載されている。本開示では、ＰＢＤダイマー、即ち２個のＰＢＤ部分を含むものが好ましいと思われる。したがって、本発明の好ましい複合体は式（ＡＢ）又は（ＡＣ）を有するものである。
【０１７３】
【化１１】
2019506136.tif 000014
上記式中、
点線はＣ１とＣ２又はＣ２とＣ３の間に任意選択的な二重結合を表し；
Ｒ２は独立してＨ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから選択され、任意に更にハロ又はジハロから選択され；
ＲＤは独立してＲ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ及びハロから選択され；
Ｒ６及びＲ９は独立してＨ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから選択され；
Ｒ７は独立してＨ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから選択され；
Ｒ１０は本願に記載するようなＥＭＲ２抗体又はその断片若しくは誘導体と連結されたリンカーであり；
Ｑは独立してＯ、Ｓ及びＮＨから選択され；
Ｒ１１はＨ又はＲであり、又はＱがＯである場合にはＳＯ３Ｍ（式中、Ｍは金属カチオンである）であり；
ＸはＯ，Ｓ又はＮ（Ｈ）から選択され、選択された実施形態では、Ｏを含み；
Ｒ”は分子鎖に１個以上のヘテロ原子（例えばＯ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ）及び／又は任意に置換された芳香環（例えばベンゼン又はピリジン）が挿入されていてもよいＣ３−１２アルキレン基であり；
Ｒ及びＲ’は各々独立して任意に置換されたＣ１−１２アルキル基、Ｃ３−２０ヘテロシクリル基及びＣ５−２０アリール基から選択され、任意にＮＲＲ’基に関して、Ｒ及びＲ’はそれらが結合している窒素原子と一緒になって任意に置換された４員、５員、６員又は７員複素環を形成し；
（存在する場合に）Ｒ２”、Ｒ６”、Ｒ７”、Ｒ９”、Ｘ”、Ｑ”及びＲ１１”は夫々Ｒ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｘ、Ｑ及びＲ１１と同義であり、ＲＣはキャッピング基である。
【０１７４】
上記構造を含む選択された実施形態について以下に更に詳細に説明する。
【０１７５】
二重結合
１実施形態では、Ｃ１とＣ２及びＣ２とＣ３の間に二重結合が存在しない。
【０１７６】
１実施形態において、点線は下記のようにＣ２とＣ３の間に任意選択的な二重結合を表す。
【０１７７】
【化１２】
2019506136.tif 000015
【０１７８】
１実施形態では、Ｒ２がＣ５−２０アリール又はＣ１−１２アルキルであるときに、Ｃ２とＣ３との間に二重結合が存在する。好ましい１実施形態において、Ｒ２はメチル基を含む。
【０１７９】
１実施形態において、点線は下記のようにＣ１とＣ２との間に任意選択的な二重結合を表す。
【０１８０】
【化１３】
2019506136.tif 000016
【０１８１】
１実施形態では、Ｒ２がＣ５−２０アリール又はＣ１−１２アルキルであるときに、Ｃ１とＣ２との間に二重結合が存在する。好ましい１実施形態において、Ｒ２はメチル基を含む。
【０１８２】
Ｒ２
１実施形態において、Ｒ２は独立してＨ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから選択され、任意に更にハロ又はジハロから選択される。
【０１８３】
１実施形態において、Ｒ２は独立してＨ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから選択される。
【０１８４】
１実施形態において、Ｒ２は独立してＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、Ｒ、＝ＣＨ−ＲＤ及び＝Ｃ（ＲＤ）２から選択される。
【０１８５】
１実施形態において、Ｒ２は独立してＨである。
【０１８６】
１実施形態において、Ｒ２は独立してＲであり、ＲはＣＨ３を含む。
【０１８７】
１実施形態において、Ｒ２は独立して＝Ｏである。
【０１８８】
１実施形態において、Ｒ２は独立して＝ＣＨである。
【０１８９】
１実施形態において、Ｒ２は独立して＝ＣＨ−ＲＤである。ＰＢＤ化合物内において、＝ＣＨ−ＲＤ基は下記構造のいずれかをもつ。
【０１９０】
【化１４】
2019506136.tif 000017
【０１９１】
１実施形態において、前記構造は構造（Ｉ）である。
【０１９２】
１実施形態において、Ｒ２は独立して＝Ｃ（ＲＤ）２である。
【０１９３】
１実施形態において、Ｒ２は独立して＝ＣＦ２である。
【０１９４】
１実施形態において、Ｒ２は独立してＲである。
【０１９５】
１実施形態において、Ｒ２は独立して任意に置換されたＣ５−２０アリールである。
【０１９６】
１実施形態において、Ｒ２は独立して任意に置換されたＣ１−１２アルキルである。
【０１９７】
１実施形態において、Ｒ２は独立して任意に置換されたＣ５−２０アリールである。
【０１９８】
１実施形態において、Ｒ２は独立して任意に置換されたＣ５−７アリールである。
【０１９９】
１実施形態において、Ｒ２は独立して任意に置換されたＣ８−１０アリールである。
【０２００】
１実施形態において、Ｒ２は独立して任意に置換されたフェニルである。
【０２０１】
１実施形態において、Ｒ２は独立して任意に置換されたナフチルである。
【０２０２】
１実施形態において、Ｒ２は独立して任意に置換されたピリジルである。
【０２０３】
１実施形態において、Ｒ２は独立して任意に置換されたキノリニル又はイソキノリニルである。
【０２０４】
１実施形態において、Ｒ２は１〜３個の置換基をもち、１〜２個がより好ましく、置換基は１個が最も好ましい。置換基はどの位置でもよい。
【０２０５】
Ｒ２がＣ５−７アリール基である場合には、化合物の残余との結合に隣接しない環原子に１個の置換基が存在していることが好ましく、即ち化合物の残余との結合に対してβ又はγ位に存在していることが好ましい。したがって、Ｃ５−７アリール基がフェニルである場合には、置換基はメタ位又はパラ位に存在していることが好ましく、パラ位がより好ましい。
【０２０６】
１実施形態において、Ｒ２は以下から選択される。
【０２０７】
【化１５】
2019506136.tif 000018
式中、星印は結合点を表す。
【０２０８】
Ｒ２がＣ８−１０アリール基（例えばキノリニル又はイソキノリニル）である場合には、キノリン又はイソキノリン環の任意の位置に任意数の置換基をもつことができる。実施形態によっては、１、２又は３個の置換基をもち、これらは近位及び遠位の環のどちらでもよいし、（置換基が２個以上の場合は）両方でもよい。
【０２０９】
Ｒ２が任意に置換されている１実施形態において、置換基は以下の置換基のセクションに示す置換基から選択される。
【０２１０】
Ｒが任意に置換されている場合、置換基はハロ、ヒドロキシル、エーテル、ホルミル、アシル、カルボキシ、エステル、アシルオキシ、アミノ、アミド、アシルアミド、アミノカルボニルオキシ、ウレイド、ニトロ、シアノ及びチオエーテルから選択されることが好ましい。
【０２１１】
Ｒ又はＲ２が任意に置換されている１実施形態において、置換基はＲ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、ハロ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ及びＣＯＮＲＲ’から構成される群から選択される。
【０２１２】
Ｒ２がＣ１−１２アルキル基であるとき、任意選択的な置換基は更にＣ３−２０ヘテロシクリル基とＣ５−２０アリール基を含むことができる。
【０２１３】
Ｒ２がＣ３−２０ヘテロシクリル基であるとき、任意選択的な置換基は更にＣ１−１２アルキル基とＣ５−２０アリール基を含むことができる。
【０２１４】
Ｒ２がＣ５−２０アリール基であるとき、任意選択的な置換基は更にＣ３−２０ヘテロシクリル基とＣ１−１２アルキル基を含むことができる。
【０２１５】
当然のことながら、「アルキル」なる用語はサブクラスであるアルケニル及びアルキニルとシクロアルキルを包含する。したがって、Ｒ２が任意に置換されたＣ１−１２アルキル基である場合には、当然のことながら、アルキル基は任意に複合体システムの一部を構成することができる１個以上の炭素−炭素二重結合又は三重結合を含む。１実施形態において、任意に置換されたＣ１−１２アルキル基は少なくとも１個の炭素−炭素二重結合又は三重結合を含み、この結合はＣ１とＣ２との間又はＣ２とＣ３との間に存在する二重結合とコンジュゲートしている。１実施形態において、Ｃ１−１２アルキル基は飽和のＣ１−１２アルキル、Ｃ２−１２アルケニル、Ｃ２−１２アルキニル及びＣ３−１２シクロアルキルから選択される基である。
【０２１６】
Ｒ２上の置換基がハロである場合には、Ｆ又はＣｌであることが好ましく、Ｃｌがより好ましい。
【０２１７】
Ｒ２上の置換基がエーテルである場合には、実施形態によってはアルコキシ基、例えばＣ１−７アルコキシ基（例えばメトキシ、エトキシ）とすることができ、あるいは実施形態によってはＣ５−７アリールオキシ基（例えばフェノキシ、ピリジルオキシ、フラニルオキシ）とすることができる。
【０２１８】
Ｒ２上の置換基がＣ１−７アルキル基である場合には、Ｃ１−４アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル）であることが好ましい。
【０２１９】
Ｒ２上の置換基がＣ３−７ヘテロシクリル基である場合には、実施形態によってはＣ６窒素含有ヘテロシクリル基（例えばモルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニル）とすることができる。これらの基は窒素原子を介してＰＢＤ部分の残余と結合することができる。これらの基は更に例えばＣ１−４アルキル基で置換されていてもよい。
【０２２０】
Ｒ２上の置換基がビスオキシ−Ｃ１−３アルキレンである場合には、ビスオキシメチレン又はビスオキシエチレンであることが好ましい。
【０２２１】
Ｒ２の特に好ましい置換基としては、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、シアノ、ビスオキシメチレン、メチルピペラジニル、モルホリノ及びメチルチエニルが挙げられる。
【０２２２】
置換基をもつ特に好ましいＲ２基としては、限定されないが、４−メトキシフェニル、３−メトキシフェニル、４−エトキシフェニル、３−エトキシフェニル、４−フルオロフェニル、４−クロロフェニル、３，４−ビスオキシメチレンフェニル、４−メチルチエニル、４−シアノフェニル、４−フェノキシフェニル、キノリン−３−イル及びキノリン−６−イル、イソキノリン−３−イル及びイソキノリン−６−イル、２−チエニル、２−フラニル、メトキシナフチル並びにナフチルが挙げられる。
【０２２３】
１実施形態において、Ｒ２はハロ又はジハロである。１実施形態において、Ｒ２は−Ｆ又は−Ｆ２であり、置換基は夫々下記（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）である。
【０２２４】
【化１６】
2019506136.tif 000019
ＲＤ
１実施形態において、ＲＤは独立してＲ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ及びハロから選択される。
【０２２５】
１実施形態において、ＲＤは独立してＲである。
【０２２６】
１実施形態において、ＲＤは独立してハロである。
【０２２７】
Ｒ６
１実施形態において、Ｒ６は独立してＨ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ−及びハロから選択される。
【０２２８】
１実施形態において、Ｒ６は独立してＨ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＯ２及びハロから選択される。
【０２２９】
１実施形態において、Ｒ６は独立してＨ及びハロから選択される。
【０２３０】
１実施形態において、Ｒ６は独立してＨである。
【０２３１】
１実施形態において、Ｒ６とＲ７は一緒になって−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−基を形成し、式中、ｐは１又は２である。
【０２３２】
Ｒ７
Ｒ７は独立してＨ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから選択される。
【０２３３】
１実施形態において、Ｒ７は独立してＯＲである。
【０２３４】
１実施形態において、Ｒ７は独立してＯＲ７Ａであり、Ｒ７Ａは独立して任意に置換されたＣ１−６アルキルである。
【０２３５】
１実施形態において、Ｒ７Ａは独立して任意に置換された飽和のＣ１−６アルキルである。
【０２３６】
１実施形態において、Ｒ７Ａは独立して任意に置換されたＣ２−４アルケニルである。
【０２３７】
１実施形態において、Ｒ７Ａは独立してＭｅである。
【０２３８】
１実施形態において、Ｒ７Ａは独立してＣＨ２Ｐｈである。
【０２３９】
１実施形態において、Ｒ７Ａは独立してアリルである。
【０２４０】
１実施形態において、前記化合物は二量体であり、各単量体のＲ７基が一緒になり、各単量体を連結する式Ｘ−Ｒ”−Ｘの二量体架橋を形成する。
【０２４１】
Ｒ９
１実施形態において、Ｒ９は独立してＨ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ−及びハロから選択される。
【０２４２】
１実施形態において、Ｒ９は独立してＨである。
【０２４３】
１実施形態において、Ｒ９は独立してＲ又はＯＲである。
【０２４４】
Ｒ１０
本願に記載するもの等の適合可能なリンカーはＲ１０位（即ちＮ１０）の共有結合を介してＥＭＲ２抗体をＰＢＤ薬物部分と結合することが好ましい。
【０２４５】
Ｑ
所定の実施形態において、Ｑは独立してＯ，Ｓ及びＮＨから選択される。
【０２４６】
１実施形態において、Ｑは独立してＯである。
【０２４７】
１実施形態において、Ｑは独立してＳである。
【０２４８】
１実施形態において、Ｑは独立してＮＨである。
【０２４９】
Ｒ１１
選択された実施形態において、Ｒ１１はＨ又はＲであり、あるいはＱがＯの場合には、ＳＯ３Ｍでもよく、式中、Ｍは金属カチオンである。前記カチオンはＮａ＋とすることができる。
【０２５０】
所定の実施形態において、Ｒ１１はＨである。
【０２５１】
所定の実施形態において、Ｒ１１はＲである。
【０２５２】
ＱがＯである所定の実施形態において、Ｒ１１はＳＯ３Ｍであり、式中、Ｍは金属カチオンである。前記カチオンはＮａ＋とすることができる。
【０２５３】
ＱがＯである所定の実施形態において、Ｒ１１はＨである。
【０２５４】
ＱがＯである所定の実施形態において、Ｒ１１はＲである。
【０２５５】
Ｘ
１実施形態において、ＸはＯ、Ｓ又はＮ（Ｈ）から選択される。
【０２５６】
ＸはＯであることが好ましい。
【０２５７】
Ｒ”
Ｒ”は分子鎖に１個以上のヘテロ原子（例えばＯ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ）及び／又は任意に置換された芳香環（例えばベンゼン又はピリジン）が挿入されていてもよいＣ３−１２アルキレン基である。
【０２５８】
１実施形態において、Ｒ”は分子鎖に１個以上のヘテロ原子及び／又は芳香環（例えばベンゼン又はピリジン）が挿入されていてもよいＣ３−１２アルキレン基である。
【０２５９】
１実施形態において、前記アルキレン基には任意にＯ、Ｓ及びＮＭｅから選択される１個以上のヘテロ原子並びに／又は任意に置換された芳香環が挿入されている。
【０２６０】
１実施形態において、前記芳香環は芳香族化合物の２個の芳香環原子から２個の水素原子を除去することにより得られる環原子数５〜２０の２価部分であるＣ５−２０アリーレン基である。
【０２６１】
１実施形態において、Ｒ”は分子鎖に１個以上のヘテロ原子（例えばＯ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ）及び／又は任意にＮＨ２で置換された芳香環（例えばベンゼン又はピリジン）が挿入されていてもよいＣ３−１２アルキレン基である。
【０２６２】
１実施形態において、Ｒ”はＣ３−１２アルキレン基である。
【０２６３】
１実施形態において、Ｒ”はＣ３、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９及びＣ１１アルキレン基から選択される。
【０２６４】
１実施形態において、Ｒ”はＣ３、Ｃ５及びＣ７アルキレン基から選択される。
【０２６５】
１実施形態において、Ｒ”はＣ３及びＣ５アルキレン基から選択される。
【０２６６】
１実施形態において、Ｒ”はＣ３アルキレン基である。
【０２６７】
１実施形態において、Ｒ”はＣ５アルキレン基である。
【０２６８】
上記アルキレン基には任意に１個以上のヘテロ原子及び／又は任意に置換された芳香環（例えばベンゼン又はピリジン）が挿入されていてもよい。
【０２６９】
上記アルキレン基には任意に１個以上のヘテロ原子及び／又は芳香環（例えばベンゼン又はピリジン）が挿入されていてもよい。
【０２７０】
上記アルキレン基は非置換の直鎖脂肪族アルキレン基とすることができる。
【０２７１】
Ｒ及びＲ’
１実施形態において、Ｒは独立して任意に置換されたＣ１−１２アルキル基、Ｃ３−２０ヘテロシクリル基及びＣ５−２０アリール基から選択される。
【０２７２】
１実施形態において、Ｒは独立して任意に置換されたＣ１−１２アルキル基である。
【０２７３】
１実施形態において、Ｒは独立して任意に置換されたＣ３−２０ヘテロシクリル基である。
【０２７４】
１実施形態において、Ｒは独立して任意に置換されたＣ５−２０アリール基である。
【０２７５】
Ｒ２について好ましいアルキル基及びアリール基と置換基の種類及び個数に関する種々の実施形態を上記に記載した。Ｒ２がＲである場合に好ましいと述べたものは必要に応じてＲ６、Ｒ７、Ｒ８又はＲ９がＲである場合の他の全Ｒ基にも当てはまる。
【０２７６】
Ｒに好ましいものはＲ’にも当てはまる。
【０２７７】
本発明の実施形態によっては、置換基−ＮＲＲ’をもつ化合物が提供される。１実施形態において、Ｒ及びＲ’はそれらが結合している窒素原子と一緒になって任意に置換された４員、５員、６員又は７員複素環を形成する。複素環は更にヘテロ原子（例えばＮ、Ｏ又はＳ）を含むことができる。
【０２７８】
１実施形態において、前記複素環はそれ自体Ｒ基で置換されている。更にＮヘテロ原子が存在する場合、置換基はＮヘテロ原子上に存在することができる。
【０２７９】
上記ＰＢＤ以外に、所定の二量体ＰＢＤは特に活性であることが分かっており、本発明で使用することができる。このために、本発明の抗体薬物複合体（即ち本願に開示するようなＡＤＣ１〜６）はＰＢＤ１〜５として以下に示すＰＢＤ化合物を含むことができる。なお、以下のＰＢＤ１〜５は本願に詳細に記載するもの等のリンカーの分離後に放出される細胞毒性ウォーヘッドを含む。薬物−リンカー化合物の成分としてのＰＢＤ１〜５の各々の合成については、ＷＯ２０１４／１３０８７９に詳細に記載されており、このような合成に関して本願に援用する。ＷＯ２０１４／１３０８７９を参照すると、本発明のＡＤＣの選択されたウォーヘッドを含むことができる細胞毒性化合物を本願に記載するように容易に作製及び利用することができる。そこで、リンカーから分離後に本願に開示するＡＤＣから放出することができる選択されたＰＢＤ化合物を以下に示す。
【０２８０】
【化１７】
2019506136.tif 000020
2019506136.tif 000021
【０２８１】
当然のことながら、上記二量体ＰＢＤウォーヘッドは、各々標的細胞による内在化とリンカーの切断後に放出されることが好ましい。以下に詳述するように、所定のリンカーは、リンカーを全く残さずに活性なＰＢＤウォーヘッドの放出を可能にする自己犠牲（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｏｎ）部分を組込むことができる開裂性リンカーを含むであろう。放出されると、ＰＢＤウォーヘッドは標的細胞のＤＮＡと結合し、架橋するであろう。このような結合は、そのＤＮＡ螺旋を歪ませずに標的がん細胞の分裂を阻止すると報告されており、薬物耐性の出現というよくある現象を潜在的に避けることができる。他の好ましい実施形態では、自己犠牲部分を含まない開裂性リンカーを介してウォーヘッドをＥＭＲ２標的部分と結合することができる。
【０２８２】
このような化合物が腫瘍部位に送達及び放出されると、本開示に従って増殖性疾患を治療又は管理するのに臨床的に有効であること思われる。化合物については、当然のことながら、本願に開示するＰＢＤは各々各Ｃ環に２個のｓｐ２中心をもつため、各Ｃ環にｓｐ２中心を１個しかもたない化合物よりもＤＮＡの副溝に強く結合させることができる（したがって、毒性を高めることができる）。したがって、本願に記載するようなＥＭＲ２ＡＤＣで使用する場合、本願に開示するＰＢＤは増殖性疾患の治療に特に有効であると思われる。
【０２８３】
本発明に適合可能な代表的なＰＢＤ化合物を上記に示したが、本願の教示に従って抗ＥＭＲ２複合体に首尾よく組込むことができる他のＰＢＤを制限するものではない。逆に、本願に記載し、後記実施例に示すような抗体とコンジュゲートさせることができるものであればどのようなＰＢＤでも本願に開示する複合体に適合可能であり、明白に本発明の範囲に含まれる。
【０２８４】
上記薬剤以外に、本発明の抗体を生体応答調節剤とコンジュゲートさせてもよい。所定の実施形態において、生体応答調節剤はインターロイキン２、インターフェロン又は種々のタイプのコロニー刺激因子（例えばＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ）を含むであろう。
【０２８５】
より一般的に述べると、会合させる薬物部分は、所望の生物活性をもつポリペプチドとすることができる。このようなタンパク質としては、例えば毒素（例えばアブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（又は別の細胞毒性ＲＮａｓｅ）、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素）；アポトーシス剤（例えば腫瘍壊死因子（例えばＴＮＦ−α又はＴＮＦ−β）、インターフェロンα、インターフェロンβ、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ＡＩＭ  Ｉ（ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩＭ  ＩＩ（ＷＯ９７／３４９１１）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＭＩＤ：７８２６９４７）及びＶＥＧＩ（ＷＯ９９／２３１０５））、抗血栓薬、抗血管新生薬（例えばアンギオスタチン又はエンドスタチン）、リンホカイン（例えばインターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ））又は成長因子（例えば成長ホルモン（ＧＨ））が挙げられる。
【０２８６】
２．診断薬又は検出薬
他の実施形態では、本発明の抗体又はその断片若しくは誘導体を、例えば生体分子（例えばペプチド又はヌクレオチド）、低分子、フルオロフォア又は放射性同位体等の診断薬若しくは検出可能な薬剤、マーカー又はレポーターとコンジュゲートさせる。標識抗体は、過剰増殖性疾患の発症若しくは進行をモニターするため、臨床試験手順の一部として本願に開示する抗体を利用する特定の治療法の効力を測定するため（即ちセラノスティクス）、及び将来の治療コースを決定するためなどに、有用であると思われる。このようなマーカー又はレポーターは、選択された抗体の精製、抗体解析（例えばエピトープ結合又は抗体ビニング）、造腫瘍性細胞の分離若しくは単離、又は前臨床処置若しくは毒性試験でも有用であると思われる。
【０２８７】
このような診断、解析及び／又は検出は、検出可能な物質と抗体を結合させることにより実施することができ、このような物質としては限定されないが、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼを含む種々の酵素；限定されないが、ストレプトアビジン／ビオチンやアビジン／ビオチン等の補欠分子族；限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリスリン等の蛍光物質；限定されないが、ルミノール等の発光物質；限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリン等の生物発光物質；限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、８９Ｚｒ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ及び１１７錫等の放射性物質；種々のポジトロン放出断層撮影法を使用したポジトロン放出金属、非放射性常磁性金属イオン、並びに特定の放射性同位体に放射性標識又はコンジュゲートされる分子が挙げられる。このような実施形態において、適切な検出方法は、当分野で周知であり、多数の業者から容易に入手可能である。
【０２８８】
他の実施形態では、免疫組織化学法、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴法、フローサイトメトリー、競合ＥＬＩＳＡ法、ＦＡＣＳ等の精製又は診断又は解析手順を容易にするために、前記抗体又はその断片を、ペプチドやフルオロフォア等のマーカー配列又は化合物と融合又はコンジュゲートさせることができる。実施形態によっては、前記マーカーは、多くの市販品があるヒスチジンタグを含み、特にｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）により提供されるものが挙げられる。精製に有用な他のペプチドタグとしては、限定されないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）と、「フラグ」タグ（米国特許第４，７０３，００４号）が挙げられる。
【０２８９】
３．生体適合性修飾剤
選択された実施形態では、抗体特性を所望通りに調整、改変、改善又は調節するために使用することができる生体適合性修飾剤と、本発明の抗体とをコンジュゲートさせることができる。例えば、市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）や同様の生体適合性ポリマー等の比較的高分子量のポリマー分子を結合することにより、インビボ半減期の長い抗体又は融合コンストラクトを作製することができる。当業者に自明の通り、ＰＥＧは、特定の性質を抗体に付与する（例えば半減期を適応させる）ように選択することができる多数の異なる分子量と分子構造で得られる。ＰＥＧを抗体又は抗体断片若しくは誘導体と結合するには多官能性リンカーの有無を問わず、前記抗体又は抗体断片のＮ末端又はＣ末端とＰＥＧとをコンジュゲートさせることもできるし、リジン残基に存在するε−アミノ基を介してさせることもできる。生物活性の低下が最小限になるような直鎖又は分岐鎖ポリマー誘導体化を使用することができる。ＰＥＧ分子と抗体分子との最適なコンジュゲーションを確保するように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析法により、コンジュゲーションの程度を綿密にモニターすることができる。例えばサイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィーにより、未反応のＰＥＧを抗体−ＰＥＧ複合体から分離することができる。同様に、抗体又は抗体断片のインビボ安定性を高めるため又はインビボ半減期を延ばすために、本願に開示する抗体をアルブミンとコンジュゲートさせることができる。このような技術は、当分野で周知であり、例えばＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００、ＷＯ０１／７７１３７及びＥＰ０  ４１３，６２２を参照されたい。他の生体適合性複合体も当業者に自明であり、本願の教示に従って容易に同定することができる。
【０２９０】
Ｂ．リンカー化合物
上記のように、本発明に適合官能なペイロードは、１個以上のウォーヘッドと、任意にウォーヘッドを抗体標的剤と会合させるリンカーとを含む。本発明の抗体を適切なウォーヘッドとコンジュゲートさせるためには、多数のリンカー化合物を使用することができる。リンカーは、抗体上の反応性残基（好ましくはシステイン又はリジン）と選択された薬物合物とに共有結合しさえすればよい。したがって、選択された抗体残基と反応して本発明の（部位特異的又は他の）比較的安定な複合体を得るために使用できるものであればあらゆるリンカーが本願の教示に適合可能である。
【０２９１】
適合可能なリンカーは、求核性の還元型システイン及びリジンと結合できると有利である。還元型システイン及びリジンを含むコンジュゲーション反応としては、限定されないが、チオール−マレイミド反応、チオール−ハロゲノ（ハロゲン化アシル）反応、チオール−エン反応、チオール−イン反応、チオール−ビニルスルホン反応、チオール−ビスルホン反応、チオール−チオスルホネート反応、チオール−ピリジルジスルフィド反応及びチオール−パラフルオロ反応が挙げられる。本願に詳述するように、チオール−マレイミドバイオコンジュゲーションは、反応速度が速く、コンジュゲーション条件が穏和であるため、最も広く使用されているアプローチの１つである。このアプローチの１つの問題は、レトロマイケル反応の可能性があり、マレイミドと連結したペイロードが減少したり、抗体から血漿中の他のタンパク質（例えばヒト血清アルブミン）に移動する可能性があるという点である。しかし、実施形態によっては、後記実施例に記載するように、選択的還元と部位特異的抗体とを使用すると、複合体を安定化させ、この望ましくない移動を減らすことができる。チオール−ハロゲン化アシル反応では、レトロマイケル反応が生じないのでより安定なバイオコンジュゲートが得られる。しかし、チオール−ハロゲン化物反応は、一般に、マレイミドによるコンジュゲーションに比較して反応速度が遅いため、効率的ではなく、望ましくない薬物対抗体比となる。チオール−ピリジルジスルフィド反応も、よく知られているバイオコンジュゲーション経路である。ピリジルジスルフィドは、遊離チオールと迅速に交換して混合ジスルフィドを生じ、ピリジン−２−チオンが放出される。混合ジスルフィドは、細胞内還元環境で開裂し、ペイロードが放出される。バイオコンジュゲーションで更に注目されている他のアプローチは、チオール−ビニルスルホン反応とチオール−ビスルホン反応であり、各々本願の教示に適合可能であり、明白に本発明の範囲に含まれる。
【０２９２】
選択された実施形態において、適合可能なリンカーは、細胞外環境でＡＤＣに安定性を付与し、ＡＤＣ分子の凝集を防ぎ、ＡＤＣを単量体状態で水性媒体に溶けやすい状態に保つであろう。細胞内に輸送又は送達されるまで、ＡＤＣは安定し、無傷のままでいること、即ち抗体が薬物部分と連結された状態に保たれることが好ましい。標的細胞の外側では安定しているが、細胞の内側ではある程度有効な速度で開裂又は分解されるように、リンカーを設計することができる。したがって、有効なリンカーは、（ｉ）抗体の特異的結合性を維持し；（ｉｉ）複合体又は薬物部分の細胞内送達を可能にし；（ｉｉｉ）複合体がその標的部位に送達又は輸送されるまで安定で無傷のままに維持され、即ち開裂又は分解されずに維持され；（ｉｖ）薬物部分の細胞傷害効果、細胞殺傷効果又は細胞増殖抑制効果（場合により何らかのバイスタンダー効果を含む）を維持するであろう。ＡＤＣの安定性は、ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ、質量分析法、ＨＰＬＣ、及び分離／分析技術であるＬＣ／ＭＳやＬＣ／ＭＳ／ＭＳ等の標準分析技術により測定することができる。上記のように、抗体と薬物部と分を共有結合させるには、リンカーに２個の反応性官能基をもたせること、即ち反応の面で２価にすることが必要である。ＭＭＡＥと抗体等との２個以上の官能性部分又は生物活性部分を結合するのに有用な２価リンカー試薬は公知であり、本願の教示に適合可能な複合体を得るための方法も記載されている。
【０２９３】
本発明に適合可能なリンカーは、開裂性リンカーと非開裂性リンカーとに大別することができる。開裂性リンカーとしては、酸易変性リンカー（例えばオキシムやヒドラゾン）、プロテアーゼ開裂性リンカー及びジスルフィドリンカーが挙げられ、標的細胞に内在化され、細胞の内側のエンドソーム−リソソーム経路で開裂される。細胞毒素の放出及び活性化は、ヒドラゾンやオキシム等の酸易変性化学結合の開裂を助長するエンドソーム／リソソーム酸性区画に依存している。リソソーム特異的プロテアーゼ開裂部位がリンカーに組込まれるならば、細胞毒素はそれらの細胞内標的の近傍に放出されるであろう。あるいは、混合ジスルフィドを含むリンカーは、細胞毒性ペイロードを血流中の酸素濃度の高い環境では開裂せずに細胞内の還元的環境で選択的に開裂して細胞内に放出するアプローチを提供する。一方、アミドと連結したポリエチレングリコール又はアルキルスペーサーを含む適合可能な非開裂性リンカーは、標的細胞の内側でＡＤＣのリソソーム分解中に毒性のペイロードを放出する。ある意味では、リンカーの選択は、複合体で使用される特定の薬物、特定の適応症及び抗体標的に依存するであろう。
【０２９４】
したがって、本発明の所定の実施形態は、細胞内環境（例えばリソソーム又はエンドソーム又はカベオラの内側）に存在する開裂剤により開裂可能なリンカーを含む。リンカーは、例えば、限定されないが、リソソーム又はエンドソームプロテアーゼ等の細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素により開裂されるペプチドリンカーとすることができる。実施形態によっては、ペプチドリンカーは、少なくとも２アミノ酸長又は少なくとも３アミノ酸長である。開裂剤としては、カテプシンＢ及びＤ並びにプラスミンが挙げられ、各々ジペプチド薬物誘導体を加水分解し、標的細胞の内側に活性薬物を放出することが知られている。チオール依存性プロテアーゼであるカテプシンＢは、がん組織で高度に発現されることが分かっているので、カテプシンＢにより開裂可能な代表的なペプチドリンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｅｕを含むペプチドである。このようなリンカーの他の例は、例えば米国特許第６，２１４，３４５号に記載されている。特定の実施形態において、細胞内プロテアーゼにより開裂可能なペプチドリンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー、Ｖａｌ−Ａｌａリンカー又はＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。治療薬の細胞内タンパク質分解放出を使用する１つの利点は、治療薬が結合している間は通常では効果が抑えられ、複合体の血清中での安定性が比較的高いという点である。
【０２９５】
他の実施形態において、開裂性リンカーは、ｐＨ感受性である。通常では、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解可能となるであろう。例えば、リソソームで加水分解可能な酸易変性リンカー（例えばヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニット酸アミド、オルトエステル、アセタール、ケタール等）を使用することができる（例えば米国特許第５，１２２，３６８号、５，８２４，８０５号、５，６２２，９２９号参照）。このようなリンカーは、血液中の条件等の中性ｐＨ条件下で比較的安定しているが、リソソームのｐＨに近似するｐＨ５．５又は５．０未満では不安定（例えば開裂可能）である。
【０２９６】
更に他の実施形態において、リンカーは、還元条件下で開裂可能である（例えばジスルフィドリンカー）。種々のジスルフィドリンカーが当分野で公知であり、例えばＳＡＴＡ（チオ酢酸Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル）、ＳＰＤＰ（３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル）、ＳＰＤＢ（３−（２−ピリジルジチオ）酪酸Ｎ−スクシンイミジル）及びＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン）を使用して形成することができるものが挙げられる。更に他の特定の実施形態において、リンカーは、マロン酸エステルリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）、又は３’−Ｎ−アミドアナログ（Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
【０２９７】
本発明の所定の態様において、選択されたリンカーは、下式の化合物を含むであろう。
【０２９８】
【化１８】
2019506136.tif 000022
式中、星印は薬物との結合点を表し、ＣＢＡ（即ち細胞結合剤）は抗ＥＭＲ２抗体を含み、Ｌ１はリンカー単位、任意に開裂性リンカー単位を含み、ＡはＬ１を抗体上の反応性残基と連結する連結基（任意にスペーサーを含む）であり、Ｌ２は好ましくは共有結合であり、Ｕは存在してもしなくてもよく、腫瘍部位でウォーヘッドからリンカーのクリーンな分離を助長する自己犠牲単位の全部又は一部を含むことができる。
【０２９９】
（米国特許出願第２０１１／０２５６１５７号に記載されているもの等の）ある種の実施形態において、適合可能なリンカーは以下の化合物を含むことができる。
【０３００】
【化１９】
2019506136.tif 000023
式中、星印は薬物との結合点を表し、ＣＢＡ（即ち細胞結合剤）は抗ＥＭＲ２抗体を含み、Ｌ１はリンカー、任意に開裂性リンカーを含み、ＡはＬ１を抗体上の反応性残基と連結する連結基（任意にスペーサーを含む）であり、Ｌ２は共有結合であるか又は−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって自己犠牲部分を形成する。
【０３０１】
当然のことながら、Ｌ１とＬ２とが存在する場合、その種類は非常に多様なものとすることができる。これらの基は、複合体が送達される部位の条件により決定され得るその開裂特性に基づいて選択することができる。酵素の作用により開裂されるリンカーが好ましいが、ｐＨ変化（例えば酸又は塩基易変性）、温度又は放射線（例えば光易変性）により開裂可能なリンカーも使用してもよい。還元又は酸化条件下で開裂可能なリンカーも本発明で利用できる。
【０３０２】
所定の実施形態において、Ｌ１は、アミノ酸の連続配列を含む。前記アミノ酸配列は、薬物を放出できるように、酵素による切断の標的基質とすることができる。
【０３０３】
１実施形態において、Ｌ１は、酵素の作用により開裂可能である。１実施形態において、前記酵素はエステラーゼ又はペプチダーゼである。
【０３０４】
別の実施形態において、Ｌ１は、カテプシン易変性リンカーである。
【０３０５】
１実施形態において、Ｌ１は、ジペプチドを含む。ジペプチドは、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−として表すことができ、式中、−ＮＨ−及び−ＣＯ−は、夫々アミノ酸基Ｘ１及びＸ２のＮ末端とＣ末端とを表す。ジペプチドにおけるアミノ酸は、天然アミノ酸の任意の組み合わせとすることができる。リンカーがカテプシン易変性リンカーであるとき、ジペプチドは、カテプシンによる開裂の作用部位とすることができる。
【０３０６】
更に、カルボキシル又はアミノ側鎖官能基をもつアミノ酸基（例えば夫々Ｇｌｕ及びＬｙｓ）の場合、ＣＯ及びＮＨは、この側鎖官能基を表すことができる。
【０３０７】
１実施形態において、ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における−Ｘ１−Ｘ２−基は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−及び−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−から選択され、ここでＣｉｔはシトルリンである。
【０３０８】
ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における−Ｘ１−Ｘ２−基は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−及び−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−から選択されることが好ましい。
【０３０９】
ジペプチド−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における−Ｘ１−Ｘ２−基は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−又は−Ｖａｌ−Ａｌａ−又はＶａｌ−Ｃｉが最も好ましい。所定の選択された実施形態において、前記ジペプチドは−Ｖａｌ−Ａｌａ−を含む。
【０３１０】
１実施形態において、Ｌ２は共有結合として存在する。
【０３１１】
１実施形態において、Ｌ２は存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒になって自己犠牲リンカー（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ  ｌｉｎｋｅｒ）を形成する。
【０３１２】
１実施形態において、Ｌ２は、ウォーヘッドを放出できるようにする酵素活性の基質である。
【０３１３】
Ｌ１が酵素の作用により開裂可能でありかつＬ２が存在する１実施形態において、前記酵素はＬ１とＬ２との間の結合を切断する。
【０３１４】
Ｌ１とＬ２とが存在する場合には、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合により、相互に連結することができる。
【０３１５】
Ｌ２と連結するＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端でもよいし、アミノ酸側鎖、例えばリジンアミノ酸側鎖のアミノ基に由来するものでもよい。
【０３１６】
Ｌ２と連結するＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端でもよいし、アミノ酸側鎖、例えばグルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基に由来するものでもよい。
【０３１７】
Ｌ２と連結するＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えばセリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基に由来するものとすることができる。
【０３１８】
「アミノ酸側鎖」なる用語は、（ｉ）アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン等の天然アミノ酸；（ｉｉ）オルニチンやシトルリン等の微量アミノ酸；（ｉｉｉ）非天然アミノ酸、β−アミノ酸、合成アナログ及び天然アミノ酸の誘導体；並びに（ｉｖ）その全エナンチオマー、ジアステレオマー、どちらかの異性体がリッチな形態、同位体標識形態（例えば２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）、保護形態及びラセミ混合物に存在するこのような基を包含する。
【０３１９】
１実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−とＬ２は、一緒になって以下の基を形成する。
【０３２０】
【化２０】
2019506136.tif 000024
式中、星印は薬物又は細胞毒性薬の位置との結合点を表し、波線はリンカーＬ１との結合点を表し、Ｙは−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、ｎは０〜３である。フェニレン環は任意に１、２又は３個の置換基で置換されている。１実施形態において、フェニレン基は任意にハロ、ＮＯ２、アルキル又はヒドロキシアルキルで置換されている。
【０３２１】
１実施形態において、ＹはＮＨである。
【０３２２】
１実施形態において、ｎは０又は１である。ｎは０が好ましい。
【０３２３】
ＹがＮＨであり、ｎが０である場合には、自己犠牲リンカーをｐ−アミノベンジルカルボニルリンカー（ＰＡＢＣ）と言うことができる。
【０３２４】
他の実施形態において、リンカーは自己犠牲リンカーを含むことができ、ジペプチドは一緒になって−ＮＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−基を形成する。他の選択された実施形態において、リンカーは、下記−ＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−基を含むことができる。
【０３２５】
【化２１】
2019506136.tif 000025
式中、星印は選択された細胞毒性部分との結合点を表し、波線は抗体とコンジュゲーションさせることができるリンカーの残余部分（例えばスペーサー−抗体結合セグメント）との結合点を表す。ジペプチドが酵素により切断され、遠位部位が活性化されると、自己犠牲リンカーは保護された化合物（即ち細胞毒素）をクリーンに放出することが可能になり、下記経路を辿る。
【０３２６】
【化２２】
2019506136.tif 000026
式中、星印は選択された細胞毒性部分との結合点を表し、Ｌ＊は切断後のペプチド単位を含むリンカーの残余部分の活性化形態である。ウォーヘッドのクリーンな放出により所望の毒性活性を維持することが確保される。
【０３２７】
１実施形態において、Ａは、共有結合である。したがって、Ｌ１と抗体とは、直接連結されている。例えば、Ｌ１が連続アミノ酸配列を含む場合には、配列のＮ末端は抗体残基と直接連結することができる。
【０３２８】
別の実施形態において、Ａはスペーサー基である。したがって、Ｌ１と抗体とは、間接的に連結されている。
【０３２９】
所定の実施形態において、Ｌ１とＡとは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合により連結することができる。
【０３３０】
以下に詳述するように、本発明の薬物リンカーは、遊離システインを含むシステイン上の反応性チオール求核基と連結することが好ましい。このためには、ＤＴＴやＴＣＥＰ等の種々の還元剤又は本願に記載するような穏和な還元剤で処理することによりリンカー試薬とコンジュゲートできるように抗体のシステインを反応性にすることができる。他の実施形態では、本発明の薬物リンカーをリジンと連結することが好ましい。
【０３３１】
リンカーは、抗体上の求核性官能基と反応できるように、求電子性官能基を含むことが好ましい。抗体上の求核基としては、限定されないが、（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基（例えばリジン）、（ｉｉｉ）側鎖チオール基（例えばシステイン）、及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている場合には糖ヒドロキシル基又はアミノ基が挙げられる。アミン、チオール及びヒドロキシル基は求核性であり、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基である（ｉ）マレイミド基、（ｉｉ）活性化ジスルフィド、（ｉｉｉ）ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）エステル、ハロギ酸エステル及び酸ハロゲン化物等の活性エステル、（ｉｖ）ハロアセトアミド等のハロゲン化アルキル及びベンジル、並びに（ｖ）アルデヒド、ケトン及びカルボキシル基等と共有結合を形成するように反応することができる。
【０３３２】
本発明に適合可能な代表的な官能基を以下に示す。
【０３３３】
【化２３】
2019506136.tif 000027
実施形態によっては、システイン（部位特異的抗体の遊離システインを含む）と薬物−リンカー部分との連結は、チオール残基とリンカーに存在する末端マレイミド基とを介する。このような実施形態において、抗体と薬物−リンカーとの連結は、下記のようにすることができる。
【０３３４】
【化２４】
2019506136.tif 000028
式中、星印は薬物−リンカーの残余部分との結合点を表し、波線は抗体の残余部分との結合点を示す。この実施形態において、Ｓ原子は部位特異的遊離システインに由来することが好ましい。
【０３３５】
他の適合可能なリンカーでは、結合部分は、所望の複合体を得るため抗体上の活性化残基と反応させることができる末端ブロモ又はヨードアセトアミドを含むことができる。いずれにせよ、当業者は本開示に鑑み、本願に開示する各薬物−リンカー化合物を適合可能な抗ＥＭＲ２抗体（部位特異的抗体を含む）と容易にコンジュゲートさせることができる。
【０３３６】
本開示によると、本発明は、適合可能な抗体薬物複合体の作製方法として、抗ＥＭＲ２抗体を以下から構成される群から選択される薬物−リンカー化合物とコンジュゲートさせることを含む方法を提供する。
【０３３７】
【化２５】
2019506136.tif 000029
2019506136.tif 000030
【０３３８】
本願の目的では、ＤＬは「薬物−リンカー」の略号として使用し、上記のような薬物リンカー１〜６（即ちＤＬ１、ＤＬ２、ＤＬ３、ＤＬ４、ＤＬ５及びＤＬ６）を含む。なお、ＤＬ１とＤＬ６は同一のウォーヘッドと同一のジペプチドサブユニットを含むが、連結基であるスペーサーが相違する。したがって、リンカーが切断されると、ＤＬ１とＤＬ６はいずれもＰＢＤ１を放出する。
【０３３９】
当然のことながら、リンカーにより付加される末端マレイミド部分（ＤＬ１〜ＤＬ４及びＤＬ６）又はヨードアセトアミド部分（ＤＬ５）は、当分野で公知の技術を使用して選択されたＥＭＲ２抗体上の遊離スルフヒドリル基とコンジュゲートすることができる。上記化合物の合成経路は特に上記ＤＬ化合物の合成に関して本願に援用するＷＯ２０１４／１３０８７９に記載されており、このようなＰＢＤとリンカーとの組み合わせをコンジュゲートさせる特定の方法については後記実施例に記載する。
【０３４０】
したがって、選択された態様において、本発明は、実質的に下記ＡＤＣ１〜６に記載するＥＭＲ２イムノコンジュゲートを提供するように本願に開示するＤＬ部分にコンジュゲートさせたＥＭＲ２抗体に関する。したがって、所定の態様において、本発明は以下から構成される群から選択される抗体薬物複合体に関する。
【０３４１】
【化２６】
2019506136.tif 000031
2019506136.tif 000032
2019506136.tif 000033
式中、Ａｂは、抗ＥＭＲ２抗体又はその免疫反応性断片を含む。
【０３４２】
所定の態様において、本発明のＥＭＲ２  ＰＢＤ  ＡＤＣは、後記実施例に記載するような抗ＥＭＲ２抗体又はその免疫反応性断片を含むであろう。特定の態様において、ＡＤＣ３は、ｈＳＣ９３．２５３ｓｓ１（例えばｈＳＣ９３．２５３ｓｓ１  ＰＢＤ３）を含むであろう。他の態様において、本発明のＥＭＲ２  ＰＢＤ  ＡＤＣは、ｈＳＣ９３．２５６ｓｓ１（例えばｈＳＣ９３．２５６ｓｓ１  ＰＢＤ３）を含むであろう。
【０３４３】
Ｃ．コンジュゲーション
当然のことながら、薬物部分及び／又はリンカーを選択された抗体に結合させるために、多数の周知の反応を使用することができる。例えば、所望の部分をコンジュゲートさせるために、システインのスルフヒドリル基を利用する種々の反応を利用することができる。実施形態によっては、以下に詳述するように１個以上の遊離システインを含む抗体のコンジュゲーションを含むであろう。他の実施形態では、選択された抗体に存在するリジン残基の溶媒に暴露されるアミノ基と薬物のコンジュゲーションにより本発明のＡＤＣを作製することができる。更に他の実施形態は、Ｎ末端トレオニン残基とセリン残基とを活性化させ、その後、本願に開示するペイロードを抗体と結合するために使用することができる。抗体に結合させる薬物の数を最適化し、比較的高い治療指数を提供するように、選択されたコンジュゲーション法を適応させることが好ましい。
【０３４４】
治療用化合物をシステイン残基にコンジュゲートさせるための種々の方法が当分野で公知であり、当業者に容易に理解されよう。塩基性条件下でシステイン残基を脱プロトン化してチオラート求核剤とすると、マレイミドやヨードアセトアミド等のソフトな求電子剤と反応させることができる。一般に、このようなコンジュゲーションに用いる試薬は、システインチオールと直接反応して複合体タンパク質を形成するか又はリンカー−薬物と反応してリンカー−薬物中間体を形成することができる。リンカーの場合、有機化学反応、条件及び試薬を利用する数種の経路が当業者の公知であり、（１）本発明のタンパク質のシステイン基をリンカー試薬と反応させ、共有結合によりタンパク質−リンカー中間体を形成した後、活性型化合物と反応させる方法や、（２）化合物の求核基をリンカー試薬と反応させ、共有結合により薬物−リンカー中間体を形成した後、本発明のタンパク質のシステイン基と反応させる方法が挙げられる。以上の説明から、当業者に自明の通り、本発明では、２官能性（即ち２価）リンカーが有用である。例えば、２官能性リンカーは、システイン残基との共有結合に使用されるチオール修飾基と、化合物との共有又は非共有結合に使用される少なくとも１個の結合部分（例えば第２のチオール修飾部分）とを含むことができる。
【０３４５】
コンジュゲーションの前に、抗体をジチオトレイトール（ＤＴＴ）やトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）等の還元剤で処理することによりリンカー試薬とコンジュゲーションできるように反応性にすることができる。他の実施形態では、限定されないが、２−イミノチオラン（トラウト試薬）、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はＳＡＴ（ＰＥＧ）４等の試薬とリジンとの反応により別の求核基を抗体に導入し、アミンをチオールに変換することができる。
【０３４６】
このようなコンジュゲーションに関して、システインチオール又はリジンアミノ基は求核性であり、リンカー試薬又は化合物−リンカー中間体若しくは薬物上の、以下を含む求電子基と共有結合を形成するように反応することができる：（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸エステル及び酸ハロゲン化物等の活性エステル類；（ｉｉ）ハロアセトアミド等のハロゲン化アルキル及びベンジル；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基；並びに（ｉｖ）ピリジルジスルフィド等のスルフィド交換を経たジスルフィド。化合物又はリンカー上の求核基としては、限定されないが、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子基と共有結合を形成するように反応することが可能なアミン基、チオール基、ヒドロキシル基、ヒドラジド基、オキシム基、ヒドラジン基、チオセミカルバゾン基、ヒドラジンカルボキシレート基及びアリールヒドラジド基が挙げられる。
【０３４７】
コンジュゲーション試薬としては、一般にマレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、塩化スルホニル、２、６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル及びホスホロアミダイトが挙げられるが、他の官能基も使用できる。所定の実施形態において、方法としては、例えば、マレイミド、ヨードアセトアミド又はハロアセチル／ハロゲン化アルキル、アジリジン、アクリロイル誘導体を使用してシステインのチオールと反応させ、化合物に対して反応性のチオエーテルを生成する方法が挙げられる。遊離チオールと活性化ピリジルジスルフィドとのジスルフィド交換（例えば５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）の使用）も、複合体を生成するのに有用である。マレイミドを使用することが好ましい。
【０３４８】
上記のように、本願に記載するようなコンジュゲーションを実施するために、反応性残基としてリジンを使用してもよい。求核性リジン残基は、一般に、アミン反応性スクシンイミジルエステルにより標的される。最適数の脱プロトン化リジン残基を得るためには、水溶液のｐＨを１０．５前後であるリジンアンモニウム基のｐＫａよりも低くする必要があるため、反応の典型的なｐＨは約８〜９である。カップリング反応に一般に使用される試薬は、リジンアシル化メカニズムにより求核性リジンと反応するＮＨＳエステルである。同様の反応を生じる他の適合可能な試薬は、イソシアネートとイソチオシアネートを含み、同様にＡＤＣを提供するために本願の教示に従って使用することができる。リジンが活性化されたら、ウォーヘッドを抗体と共有結合させるために、上記連結基の多くを使用することができる。
【０３４９】
化合物をトレオニン又はセリン残基（好ましくはＮ末端残基）とコンジュゲートさせる方法も当分野で公知である。例えば、セリン又はトレオニンの１，２−アミノアルコールからカルボニル前駆体を誘導する方法が記載されており、過ヨウ素酸酸化により選択的かつ迅速にアルデヒド形態に変換することができる。本発明のタンパク質と結合させようとする化合物中のシステインの１，２−アミノチオールとアルデヒドとを反応させると、安定なチアゾリジン産物が形成される。この方法は、タンパク質のＮ末端セリン又はトレオニン残基を標識するのに特に有用である。
【０３５０】
実施形態によっては、１個、２個、３個、４個又はそれ以上の遊離システイン残基を導入する（例えば１個以上の非天然型遊離システインアミノ酸残基を含む抗体を作製する）ことにより、選択された抗体（又はその断片）に反応性チオール基を導入することができる。このような部位特異的抗体又は改変型抗体は、高い安定性及び実質的な均一性を示す複合体製剤を実現するが、少なくともその一因は、改変型遊離システイン部位の作製及び／又は本願に記載する新規コンジュゲーション手法にある。（本発明に完全に適合する手法ではあるが）鎖内又は鎖間抗体ジスルフィド結合の各々を完全又は部分的に還元してコンジュゲーション部位を作る従来のコンジュゲーション手法と異なり、本発明は、所定の作製後の遊離システイン部位を更に選択的に還元し、薬物−リンカーをこれに結合する。
【０３５１】
この点では、当然のことながら、作製した部位と選択的還元によりコンジュゲーション特異性が促進されるため、所望の位置における部位特異的コンジュゲーションの百分率を高くすることができる。特筆すべき点として、これらのコンジュゲーション部位のうちで軽鎖定常領域の末端領域に存在するもの等は他の遊離システインと交差反応する傾向があるため、通常では有効にコンジュゲートさせにくい。しかし、分子操作と得られた遊離システインの選択的還元により、効率的なコンジュゲーション率が得られ、望ましくないＤＡＲ値の高い汚染物質と非特異的毒性が著しく低減する。より一般的に述べると、改変型コンストラクトと選択的還元とを含む本願に開示する新規コンジュゲーション法により、薬物動態及び／又は薬力学作用を改善し、潜在的に治療指数を改善したＡＤＣ製剤が得られる。
【０３５２】
所定の実施形態において、部位特異的コンストラクトは、遊離システインをもち、還元されると、上記に開示したもの等のリンカー部分の求電子基と共有結合を形成するように反応することができる、求核性のチオール基を生じる。上記のように、本発明の抗体は、還元性不対鎖間システイン若しくは鎖内システイン又は導入された非天然型システイン、即ちこのような求核基を生じるシステインを、含むことができる。したがって、所定の実施形態では、還元型遊離システインの遊離スルフヒドリル基と本願に開示する薬物−リンカーの末端マレイミド又はハロアセトアミド基との反応により、所望のコンジュゲーションが得られるであろう。このような場合には、抗体の遊離システインをジチオトレイトール（ＤＴＴ）やトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）等の還元剤で処理することにより、リンカー試薬とコンジュゲーションできるように反応性にすることができる。したがって、各遊離システインは、理論的には、反応性チオール求核剤をもつであろう。このような試薬は、特に本発明に適合可能であるが、当然のことながら、部位特異的抗体のコンジュゲーションは、当業者に一般に公知の種々の反応、条件及び試薬を使用して行うことができる。
【０３５３】
更に、部位特異的コンジュゲーションを強化し、望ましくない潜在的に毒性の汚染物質を減らすように、改変型抗体の遊離システインを選択的に還元できることが判明した。より具体的には、アルギニン等の「安定化剤」はタンパク質の分子内及び分子間の相互作用を調節することが分かっており、本願に記載するように遊離システインを選択的に還元し、部位特異的コンジュゲーションを容易にするために、（好ましくは比較的穏和な）選択された還元剤と共に使用することができる。本願で使用する「選択的還元」又は「選択的に還元する」なる用語は、同義に使用することができ、改変型抗体に存在する天然型ジスルフィド結合を実質的に切断せずに遊離システインを還元することを意味する。選択された実施形態において、この選択的還元は、所定の還元剤又は所定の還元剤濃度を使用することにより、実施することができる。他の実施形態において、改変型コンストラクトの選択的還元は、安定化剤と還元剤（穏和な還元剤を含む）との併用を含むであろう。当然のことながら、「選択的コンジュゲーション」なる用語は、本願に記載するような細胞毒素の存在下で選択的に還元された、改変型抗体のコンジュゲーションを意味する。この点で、このような安定化剤（例えばアルギニン）を選択された還元剤と併用すると、重鎖及び軽鎖抗体鎖へのコンジュゲーションの程度と製剤のＤＡＲ分布により測定した場合に部位特異的コンジュゲーションの効率を著しく改善することができる。適合可能な抗体コンストラクトと選択的コンジュゲーション技術及び試薬とは、特にこのような手法とコンストラクトに関して本願に援用するＷＯ２０１５／０３１６９８に詳細に開示されている。
【０３５４】
特定の理論に拘泥する意図はないが、このような安定化剤は、静電的微小環境を調節し、及び／又は所望のコンジュゲーション部位のコンフォメーション変化を調節するように作用することができるため、（無傷の天然型ジスルフィド結合を実質的に還元しない）比較的穏和な還元剤で、所望の遊離システイン部位へのコンジュゲーションを助長することができる。このような安定化剤（例えば所定のアミノ酸）は、（水素結合と静電相互作用を介して）塩架橋を形成することが知られており、好ましいコンフォメーション変化を生じること及び／又は好ましくないタンパク質−タンパク質相互作用を減らすことができる安定化効果を付与するように、タンパク質−タンパク質相互作用を調節することができる。更に、このような安定化剤は、還元後に望ましくない分子内（及び分子間）システイン−システイン結合の形成を抑えるように作用することができるので、（好ましくはリンカーを介して）改変型部位特異的システインを薬物と結合させる所望のコンジュゲーション反応を助長する。選択的還元条件では、無傷の天然型ジスルフィド結合の有意還元が得られないので、その後のコンジュゲーション反応は、当然のことながら遊離システイン上の比較的少数の反応性チオール（例えば好ましくは抗体１個当たり遊離チオール２個）に対して行われる。上記に示唆したように、このような技術を使用すると、本開示に従って作製された複合体製剤中の非特異的コンジュゲーションレベルと対応する望ましくないＤＡＲ種を、著しく減らすことができる。
【０３５５】
選択された実施形態において、本発明に適合可能な安定化剤は、一般に少なくとも１個の部分が塩基性ｐＫａである化合物を含むであろう。所定の実施形態において、前記部分は第１級アミンを含み、他の実施形態において、前記アミン部分は第２級アミンを含むであろう。更に他の実施形態において、前記アミン部分は第３級アミン又はグアニジニウム基を含むであろう。他の選択された実施形態において、前記アミン部分はアミノ酸を含み、他の適合可能な実施形態において前記アミン部分はアミノ酸側鎖を含むであろう。更に他の実施形態において、前記アミン部分はタンパク質を構成するアミノ酸を含むであろう。更に他の実施形態において、前記アミン部分はタンパク質を構成しないアミノ酸を含むであろう。実施形態によっては、適合可能な安定化剤は、アルギニン、リジン、プロリン及びシステインを含むことができる。所定の好ましい実施形態において、安定化剤はアルギニンを含むであろう。更に、適合可能な安定化剤としては、グアニジンと塩基性ｐＫａの窒素含有複素環が挙げられる。
【０３５６】
所定の実施形態において、適合可能な安定化剤は、少なくとも１個のアミン部分のｐＫａが約７．５超である化合物を含み、他の実施形態において、前記アミン部分はｐＫａが約８．０超であり、更に他の実施形態において、前記アミン部分はｐＫａが約８．５超であり、更に他の実施形態において、安定化剤はｐＫａが約９．０超のアミン部分を含むであろう。他の実施形態は前記アミン部分のｐＫａが約９．５超である安定化剤を含み、所定の他の実施形態は少なくとも１個のアミン部分のｐＫａが約１０．０超である安定化剤を含むであろう。更に他の実施形態において、安定化剤は前記アミン部分のｐＫａが約１０．５超である化合物を含み、他の実施形態において、安定化剤はアミン部分のｐＫａが約１１．０超である化合物を含み、更に他の実施形態において、安定化剤はｐＫａが約１１．５超であるアミン部分を含むであろう。更に他の実施形態において、安定化剤はアミン部分のｐＫａが約１２．０超である化合物を含み、更に他の実施形態において、安定化剤はｐＫａが約１２．５超のアミン部分を含むであろう。当業者に自明の通り、該当するｐＫａ値は、標準技術を使用して容易に計算又は決定することができ、選択された化合物を安定化剤として使用する利用可能性を判定するために使用することができる。
【０３５７】
本願に開示する安定化剤は、所定の還元剤と併用するときに、コンジュゲーションを部位特異的遊離システインに標的化するのに、特に有効であることが明らかである。本発明の目的では、適合可能な還元剤としては、改変型抗体の天然型ジスルフィド結合をさほど切断せずにコンジュゲーションに適した還元型の部位特異的遊離システインを生成する、あらゆる化合物が挙げられる。好ましくは、選択された安定化剤と還元剤の併用により提供されるこのような条件下で、活性化された薬物リンカーは、所望の部位特異的遊離システイン部位との結合に主に制限される。比較的穏和な還元剤又は穏和な条件を提供するために、比較的低濃度で使用される還元剤が特に好ましい。本願で使用する「穏和な還元剤」又は「穏和な還元条件」なる用語は、改変型抗体に存在する天然型ジスルフィド結合を実質的に切断せずに遊離システイン部位にチオールを提供する任意の還元剤又は（任意に安定化剤の存在下で）還元剤によりもたらされる任意の状態を意味するものとみなす。即ち、（好ましくは安定化剤と併用される）穏和な還元剤又は条件はタンパク質の天然型ジスルフィド結合をさほど切断せずに遊離システインを有効に還元する（チオールを生じる）ことができる。選択的コンジュゲーションに適した環境を確立する多数のスルフヒドリル化合物により、所望の還元条件を提供することができる。実施形態によっては、穏和な還元剤は、遊離チオールが１個以上の化合物を含むことができ、実施形態によっては、穏和な還元剤は、遊離チオールが１個だけの化合物を含むであろう。本発明の選択的還元技術に適合可能な還元剤の非限定的な例としては、グルタチオン、ｎ−アセチルシステイン、システイン、２−アミノエタン−１−チオール及び２−ヒドロキシエタン−１−チオールが挙げられる。
【０３５８】
当然のことながら、上記の選択的還元法は、遊離システインとの標的コンジュゲーションに特に有効である。これについて、部位特異的抗体における所望の標的部位とのコンジュゲーションの程度（本願では「コンジュゲーション効率」と言う）は、種々の当分野で公認の技術により測定することができる。薬物と抗体との部位特異的コンジュゲーションの効率は、他の全コンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーション部位（例えば各軽鎖のｃ末端の遊離システイン）のコンジュゲーション百分率を評価することにより、測定することができる。所定の実施形態において、本願の方法は、遊離システインを含む抗体と薬物とを効率的にコンジュゲートさせることができる。実施形態によっては、コンジュゲーション効率は、他の全コンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーションの百分率により測定した場合に、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上である。
【０３５９】
更に当然のことながら、コンジュゲーションが可能な改変型抗体は、抗体が生産又は保存されるにつれてスルフヒドリル基がブロックないしキャップ修飾される遊離システイン残基を含むことができる。このようなキャップとしては、低分子、タンパク質、ペプチド、イオン及びスルフヒドリル基と相互作用して複合体形成を防止又は阻害する他の物質が挙げられる。場合により、コンジュゲーション前の改変型抗体は、同一又は異なる抗体上の他の遊離システインと結合する遊離システインを含むことができる。本願に記載するように、このような交差反応性は、作製工程中に種々の汚染物質を生じる可能性がある。実施形態によっては、改変型抗体は、コンジュゲーション反応前にキャップを外す必要があると思われる。特定の実施形態において、本願の抗体は、キャップを外され、コンジュゲーションが可能な遊離スルフヒドリル基を提示する。特定の実施形態では、天然に存在するジスルフィド結合を撹乱又は再配置せずにキャップを外す反応に、本願の抗体を供する。当然のことながら、大半の場合に、キャップを外す反応は、正常な還元反応（還元又は選択的還元）中に生じるであろう。
【０３６０】
Ｄ．ＤＡＲ分布及び精製
選択された実施形態において、本発明に適合可能なコンジュゲーション及び精製法は、ＤＡＲ分布の狭い比較的均一なＡＤＣ製剤を作製できると有利である。この点で、本願に開示するコンストラクト（例えば部位特異的コンストラクト）及び／又は選択的コンジュゲーションは、薬物と改変型抗体の化学量論的比と毒素の位置とに関して、試料内のＡＤＣ種の均一性を実現する。上記に簡単に述べたように、「薬物対抗体比」又は「ＤＡＲ」なる用語は、薬物と抗体のモル比を意味する。所定の実施形態において、複合体製剤は、そのＤＡＲ分布に関して実質的に均一とすることができ、即ち、ＡＤＣ製剤内には、ＤＡＲが特定の値（例えばＤＡＲが２又は４）である主要な部位特異的ＡＤＣ種が存在し、付加部位（即ち遊離システイン上）についても均一である。本発明の他の所定の実施形態では、部位特異的抗体の使用及び／又は選択的な還元とコンジュゲーションにより、所望の均一性を達成することが可能である。他の実施形態では、部位特異的コンストラクトと選択的還元の併用により、所望の均一性を達成することができる。更に他の実施形態では、所望の均一性を得るように分析又は分取用クロマトグラフィー技術を使用して、適合可能な製剤を精製することができる。これらの実施形態の各々で、当分野で公知の種々の技術を使用して、ＡＤＣ試料の均一性を分析することができ、限定されないが、質量分析法、ＨＰＬＣ（例えばサイズ排除ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ等）又はキャピラリー電気泳動法が挙げられる。
【０３６１】
ＡＤＣ製剤の精製については、当然のことながら、所望の純度を得るように標準医薬製造方法を使用することができる。逆相（ＲＰ）及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）等の液体クロマトグラフィー法は、薬物負荷値により混合物中の化合物を分離することができる。場合により、イオン交換（ＩＥＣ）又は混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を使用して、特定の薬物負荷をもつ種を単離してもよい。
【０３６２】
本願に開示するＡＤＣとその製剤は、抗体の構造と少なくとも部分的にコンジュゲーションを実施するために、使用される方法に応じて種々の化学量論的モル比で薬物部分と抗体部分を含むことができる。所定の実施形態において、ＡＤＣ１個当たりの薬物負荷は、ウォーヘッド１〜２０個とすることができる（即ちｎは１〜２０である）。他の選択された実施形態は、薬物負荷がウォーヘッド１〜１５個であるＡＤＣを含むことができる。更に他の実施形態において、ＡＤＣは、ウォーヘッド１〜１２個、より好ましくはウォーヘッド１〜１０個を含むことができる。実施形態によっては、ＡＤＣはウォーヘッド１〜８個を含むであろう。
【０３６３】
理論的薬物負荷は比較的高いかもしれないが、遊離システイン交差反応やウォーヘッド疎水性等の実際的な制約により、このようなＤＡＲを含む均一な製剤の作製は、凝集物や他の汚染物質によって制限される傾向がある。即ち、薬物負荷が高いほど（例えば＞８又は１０）ペイロードに応じて所定の抗体薬物複合体の凝集、不溶性、毒性又は細胞透過性低下を生じる可能性がある。このような問題に鑑み、本発明により提供される薬物負荷は、複合体１個当たり薬物１〜８個とすることが好ましく、即ち各抗体に薬物１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又は８個を共有結合させる（例えばＩｇＧ１の場合であり、他の抗体の負荷量はジスルフィド結合数に応じて変動し得る）。本発明の組成物のＤＡＲは、約２、４又は６とすることが好ましく、実施形態によっては、ＤＡＲは約２となるであろう。
【０３６４】
本発明により比較的高レベルの均一性が実現されるが、本願に開示する組成物は、実際には種々の薬物化合物（ＩｇＧ１の場合には１〜８種と考えられる）からなる複合体の混合物を含む。したがって、本願に開示するＡＤＣ組成物は、成分抗体の大半が１個以上の薬物部分と共有結合しており、（改変型コンストラクトと選択的還元により相対的なコンジュゲーション特異性が提供されるが）薬物部分が種々のチオール基により抗体と結合している可能性のある複合体の混合物を含む。即ち、コンジュゲーション後に、本発明のＡＤＣ組成物は、（主に遊離システイン交差反応により生じる所定の反応汚染物と共に）種々の濃度で種々の薬物負荷（例えばＩｇＧ１抗体１個に対して薬物１〜８個）の複合体の混合物を含むであろう。しかし、選択的還元と生産後精製とを使用すると、（例えば薬物負荷が２の）単一の所望の主要なＡＤＣ種を主に含み、（例えば薬物負荷が１、４、６等の）他のＡＤＣ種の割合が比較的低いという点にまで複合体組成物を向上させることができる。平均ＤＡＲ値は組成物全体（即ち全ＡＤＣ種の合計）の薬物負荷の加重平均に相当する。利用する定量化方法に付随する不確実さと、非主要ＡＤＣ種を商業的環境で完全に除去するのが困難であることから、許容ＤＡＲ値即ち仕様は、平均、範囲又は分布として表されることが多い（即ち平均ＤＡＲ２±０．５）。医薬環境では、平均ＤＡＲ測定値がこの範囲（即ち１．５〜２．５）の組成物を使用することが好ましい。
【０３６５】
したがって、実施形態によっては、本発明は、平均ＤＡＲが各々±０．５の誤差内で１、２、３、４、５、６、７又は８である組成物を含むであろう。他の実施形態において、本発明は、平均ＤＡＲが２、４、６又は８±０．５となろう。最後に、選択された実施形態において、本発明は、平均ＤＡＲが２±０．５又は４±０．５となろう。当然のことながら、実施形態によっては範囲又は偏差は０．４未満でもよい。したがって、他の実施形態において、組成物は、平均ＤＡＲが各々±０．３の誤差内で１、２、３、４、５、６、７又は８、平均ＤＡＲが２、４、６又は８±０．３、更に好ましくは平均ＤＡＲが２又は４±０．３、更には平均ＤＡＲが２±０．３となろう。他の実施形態において、ＩｇＧ１複合体組成物は、平均ＤＡＲが各々±０．４の誤差内で１、２、３、４、５、６、７又は８であり、非主要ＡＤＣ種の割合が比較的低い（即ち３０％未満）組成物を含むことが好ましい。他の実施形態において、ＡＤＣ組成物は、平均ＤＡＲが各々±０．４の誤差内で２、４、６又は８であり、非主要ＡＤＣ種の割合が比較的低くなるであろう（＜３０％）。実施形態によっては、ＡＤＣ組成物は、平均ＤＡＲが２±０．４であり、非主要ＡＤＣ種の割合が比較的低くなるであろう（＜３０％）。更に他の実施形態において、組成物中に存在する他の全ＤＡＲ種に対して測定した場合に、主要ＡＤＣ種（例えばＤＡＲが２又はＤＡＲが４）は、５０％超の濃度、５５％超の濃度、６０％超の濃度、６５％超の濃度、７０％超の濃度、７５％超の濃度、８０％超の濃度、８５％超の濃度、９０％超の濃度、９３％超の濃度、９５％超の濃度、更には９７％超の濃度で存在するであろう。
【０３６６】
後記実施例に詳述するように、コンジュゲーション反応からのＡＤＣ製剤における抗体当たりの薬物の分布は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法、逆相ＨＰＬ、ＨＩＣ、質量分析法、ＥＬＩＳＡ及び電気泳動法等の従来の手段により特性決定することができる。抗体当たりの薬物で表したＡＤＣの定量的分布も測定できる。ＥＬＩＳＡにより、特定のＡＤＣ製剤中の抗体当たりの薬物の平均値を求めることができる。一方、抗体当たりの薬物値の分布は、抗体−抗原結合とＥＬＩＳＡの検出限界により識別できない。また、抗体薬物複合体の検出用のＥＬＩＳＡアッセイでは、薬物部分が抗体のどの部分と結合するか（例えば重鎖又は軽鎖断片であるか特定のアミノ酸残基であるか）は判定されない。
【０３６７】
ＩＶ．診断とスクリーニング
Ａ．診断
本発明は、増殖性疾患のインビトロ及びインビボ検出、診断又はモニター方法と、造腫瘍性細胞を含む腫瘍細胞を同定するために患者からの細胞をスクリーニングする方法とを提供する。このような方法としては、治療対象となるがんをもつ個体を同定する方法又はがんの進行をモニターする方法が挙げられ、ＥＭＲ２決定基を特異的に認識してこれと会合することが可能な検出剤（例えば抗体又は核酸プローブ）と患者又は患者から得られた試料とを（インビボ又はインビトロで）接触させる段階、及び試料中の検出剤の会合の有無又は程度を検出する段階を含む。選択された実施形態において、前記検出剤は、本願に記載するような検出可能なラベル又はレポーター分子と会合させた抗体を含むであろう。所定の他の実施形態では、ＥＭＲ２抗体を投与し、二次標識抗体（例えば抗マウス抗体）を使用して検出するであろう。更に他の実施形態（例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション即ちＩＳＨ）では、ゲノムＥＭＲ２決定基と反応する核酸プローブを、増殖性疾患の検出、診断又はモニターに使用するであろう。
【０３６８】
より一般的に述べると、ＥＭＲ２決定基の存在及び／又は濃度は、タンパク質又は核酸分析用として当業者に利用可能な多数の技術のいずれかを使用して測定することができ、例えば直接物理的測定（例えば質量分析法）、結合アッセイ（例えばイムノアッセイ、凝集アッセイ及び免疫クロマトグラフィーアッセイ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ｑＰＣＲ）技術、分岐型オリゴヌクレオチド技術、ノーザンブロット技術、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術が挙げられる。この方法は、更に化学反応（例えば吸光度の変化、蛍光の変化、化学発光又は電気化学発光の発生、反射率、屈折率又は光散乱の変化、表面からの検出可能なラベルの蓄積又は放出、酸化又は還元又は酸化還元種、電流又は電位、磁場の変化等）に起因するシグナルを測定する工程を含むことができる。適切な検出技術は、（例えば蛍光、時間分割蛍光、エバネッセント波蛍光、アップコンバーティング蛍光体、マルチフォトン蛍光等の測定による）その光ルミネセンス（ｐｈｏｔｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）、化学発光、電気化学発光、光散乱、吸光度、放射能、磁場、（例えば吸光度若しくは蛍光の変化を生じるか又は化学発光を発生させる酵素反応により酵素活性を測定することにより）酵素活性による標識の測定により標識結合試薬の寄与を測定することにより，結合イベントを検出することができる。あるいは、標識を使用する必要のない検出技術をしてもよく、例えば検体の質量測定（例えば弾性表面波測定）、屈折率（例えば表面プラズモン共鳴法による測定）、又は固有発光に基づく技術が挙げられる。
【０３６９】
実施形態によっては、試料中で検出剤と特定の細胞又は細胞成分とが会合すると、この試料は、造腫瘍性細胞を含む可能性があると判断し、がんをもつ個体を本願に記載するような抗体又はＡＤＣで有効に治療できると判断する。
【０３７０】
所定の好ましい実施形態において、アッセイは、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ若しくはその変形（例えば蛍光、発色、標準ＡＢＣ、標準ＬＳＡＢ等）、免疫細胞化学法若しくはその変形（例えば直接、間接、蛍光、発色等）又はｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）若しくはその変形（例えば発色ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）又は蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＤＮＡ−ＦＩＳＨ又はＲＮＡ−ＦＩＳＨ））を含むことができる。
【０３７１】
この点で、本発明の所定の態様は、免疫組織化学法（ＩＨＣ）に標識ＥＭＲ２を使用することを含む。より特定的には、種々の増殖性疾患の診断を助け、ＥＭＲ２抗体療法を含む治療に対する潜在的応答をモニターするための診断ツールとして、ＥＭＲ２  ＩＨＣを使用することができる。所定の実施形態では、ＥＭＲ２を１個以上のレポーター分子とコンジュゲーションさせるであろう。他の実施形態では、ＥＭＲ２抗体を標識せず、１個以上のレポーター分子と会合させた別の物質（例えば抗マウス抗体）で検出するであろう。本願に記載し、後記実施例に示すように、化学的に固定（限定されないが、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム、二塩酸カリウム、酢酸、アルコール、亜鉛塩、塩化水銀、四酸化クロム及びピクリン酸）及び包埋（限定されないが、メタクリル酸グリコール、パラフィン及び樹脂）又は凍結保存した組織で、適合可能な診断アッセイを実施することができる。このようなアッセイは、治療決定を導き、投与レジメンとタイミングを決定するために使用することができる。
【０３７２】
本発明の他の特に適合可能な態様は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用してＥＭＲ２決定基を検出又はモニターする。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術即ちＩＳＨは、当業者に周知である。要約すると、細胞を固定し、固定した細胞に特定のヌクレオチド配列を含む検出可能なプローブを添加する。細胞が相補的なヌクレオチド配列を含んでいるならば、検出可能なプローブは、それらとハイブリダイズするであろう。本願に記載する配列情報を使用し、遺伝子型ＥＭＲ２決定基を発現する細胞を同定するように、プローブを設計することができる。プローブは、このような決定基に対応するヌクレオチド配列とハイブリダイズすることが好ましい。完全には相補的でないハイブリダイゼーションによるバックグラウンドを最小限にするように、ハイブリダイゼーション条件を定期的に最適化することができるが、プローブは、選択されたＥＭＲ２決定基と完全に相補的であることが好ましい。選択された実施形態では、標準蛍光法により容易に検出可能なプローブに結合した蛍光色素で、前記プローブを標識する。
【０３７３】
適合可能なインビボセラノスティクス又は診断アッセイは、当業者に理解されるように、磁気共鳴画像法、コンピューター断層撮影法（例えばＣＡＴスキャン）、ポジトロン断層撮影法（例えばＰＥＴスキャン）、Ｘ線撮影、超音波等の当分野で公知の画像又はモニター技術を含むことができる。
【０３７４】
所定の実施形態では、患者試料（例えば血漿又は血液）中の特定の決定基（例えばＥＭＲ２タンパク質）の濃度を検出及び定量するために本発明の抗体を使用することができ、このような濃度を使用して当該決定基に関連する増殖性疾患を検出、診断又はモニターすることができる。例えば、血液及び骨髄試料をフローサイトメトリーで使用してＥＭＲ２発現（又は別の共発現されるマーカー）を検出及び測定し、疾患の進行及び／又は治療に対する応答をモニターする。関連する実施形態では、循環腫瘍細胞をインビボ又はインビトロで検出、モニター及び／又は定量するために、本発明の抗体を使用することができる（ＷＯ２０１２／０１２８８０１）。更に他の実施形態において、前記循環腫瘍細胞は、造腫瘍性細胞を含むことができる。
【０３７５】
本発明の所定の実施形態では、ベースラインを設定するために、治療又はレジメン前に本願に開示する抗体を使用して、対象又は対象に由来する試料中の造腫瘍性細胞を評価又は特性決定することができる。他の例では、治療後の対象に由来する試料から、造腫瘍性細胞を評価することができる。
【０３７６】
別の実施形態において、本発明は、がん進行及び／又は病因のインビボ分析方法を提供する。別の実施形態において、がん進行及び／又は病因のインビボ分析は、腫瘍進行程度を判定することを含む。別の実施形態において、分析は、腫瘍の同定を含む。別の実施形態において、腫瘍進行の分析は、原発腫瘍で実施される。別の実施形態において、分析は、当業者に公知のがんのタイプに応じて経時的に実施される。別の実施形態では、原発腫瘍の転移性細胞に由来する二次性腫瘍の分析を、更にインビボで実施する。別の実施形態では、二次性腫瘍のサイズと形状を分析する。実施形態によっては、更にエクスビボ分析を実施する。
【０３７７】
別の実施形態において、本発明は、がん進行及び／又は病因のインビボ分析方法を提供し、細胞転移を判定する方法又は循環腫瘍細胞の濃度を検出及び定量する方法を含む。更に別の実施形態において、細胞転移の分析は、原発腫瘍から連続していない部位における細胞の進行性増殖の判定を含む。実施形態によっては、血管、リンパ、体腔内又はその組み合わせを通って分散する腫瘍細胞をモニターするように、手順を実施することができる。別の実施形態では、細胞移動、播種、血管外脱出、増殖又はその組み合わせについて細胞転移分析を実施する。
【０３７８】
所定の例では、ベースラインを設定するために、治療前に本願に開示する抗体を使用して対象又は対象に由来する試料中の造腫瘍性細胞を評価又は特性決定することができる。他の例では、治療後の対象から試料を得る。場合により、対象が治療を開始又は終了してから少なくとも約１日後、２日後、４日後、６日後、７日後、８日後、１０日後、１２日後、１４日後、１５日後、１６日後、１８日後、２０日後、３０日後、６０日後、９０日後、６カ月後、９カ月後、１２カ月後、又は１２カ月よりも後に、対象から試料を採取する。所定の例では、所定の回数の治療後（例えば２回、５回、１０回、２０回、３０回以上治療後）に造腫瘍性細胞を評価又は特性決定する。他の例では、１種以上の治療を受けてから１週間後、２週間後、１カ月後、２カ月後、１年後、２年後、３年後、４年以上後に造腫瘍性細胞を評価又は特性決定する。
【０３７９】
Ｂ．スクリーニング
所定の実施形態では、決定基と相互作用することにより腫瘍細胞の機能又は活性を変化させる化合物又は物質（例えば抗体又はＡＤＣ）を同定するために、本発明の抗体を使用して試料をスクリーニングすることができる。１実施形態では、腫瘍細胞を抗体又はＡＤＣと接触させ、限定されないが、診断目的等の目的で所定の標的（例えばＥＭＲ２）を発現する細胞を同定するため、治療効力を判定するためにこのような細胞をモニターするため、又は標的を発現するこのような細胞を細胞集団に集積させるために、前記抗体又はＡＤＣを使用してこのような細胞について腫瘍をスクリーニングすることができる。
【０３８０】
更に別の実施形態において、方法は、腫瘍細胞を試験物質又は化合物と直接又は間接的に接触させる段階と、試験物質又は化合物が決定基と会合した腫瘍細胞の活性又は機能を調節するか否か、例えば細胞形態若しくは生存性の変化、マーカーの発現、分化若しくは脱分化、細胞呼吸、ミトコンドリア活性、膜完全性、成熟、増殖、生存性、アポトーシス又は細胞死を判定する段階を含む。直接相互作用の１例は、物理的相互作用であり、間接相互作用としては、例えば参照エンティティ（例えば細胞又は細胞培養液）に作用する中間分子に対する組成物の作用が挙げられる。
【０３８１】
スクリーニング法としては、高スループットスクリーニングが挙げられ、例えば培養皿、試験管、フラスコ、ローラーボトル若しくはプレート上の任意に所定の位置に配置又は載置された細胞アレイ（例えばマイクロアレイ）を含むことができる。高スループットロボット又は手動操作法により、化学的相互作用をプローブし、多数の遺伝子の発現レベルを短時間で測定することができる。例えばフルオロフォア又はマイクロアレイ（Ｍｏｃｅｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ，２００７，ＰＭＩＤ：１７２６５７１３）と、非常に高速度で情報を処理する自動解析（例えばＰｉｎｈａｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＰＭＩＤ：１５０３２６６０参照）により、分子シグナルを利用する技術が開発されている。スクリーニングすることができるライブラリーとしては、例えば、低分子ライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、完全ヒト型抗体酵母ディスプレイライブラリー（Ａｄｉｍａｂ）、ｓｉＲＮＡライブラリー及びアデノウイルストランスフェクションベクターが挙げられる。
【０３８２】
ＶＩＩ．医薬製剤及び治療用途
Ａ．製剤及び投与経路
本発明の抗体又はＡＤＣは、当分野で公知の技術を使用して種々の方法で製剤化することができる。実施形態によっては、本発明の治療用組成物を単独で又は最小限の他の成分と共に投与することができ、任意に適切な薬学的に許容される担体を含有するように製剤化することもできる。本願で使用する「薬学的に許容される担体」とは、製薬用として業者から入手可能な、当分野で周知の賦形剤、基剤、佐剤及び希釈剤を含む（例えばＧｅｎｎａｒｏ（２００３）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ  Ｐｌｕｓ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ．参照）。
【０３８３】
適切な薬学的に許容される担体は、比較的不活性な物質であって、抗体若しくはＡＤＣを投与し易くすることができるもの又は作用部位に送達するように薬学的に最適化された製剤に活性化合物を加工し易くすることができるものを含む。
【０３８４】
このような薬学的に許容される担体としては、製剤の形状、コンシステンシー、粘度、ｐＨ、張性、安定性、浸透圧、薬物動態、タンパク質凝集又は溶解度を変えることができる物質が挙げられ、緩衝剤、湿潤剤、乳化剤、希釈剤、カプセル封入剤及び皮膚浸透促進剤が挙げられる。担体の所定の非限定的な例としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、アルギニン、スクロース、水、グリセロール、エタノール、ソルビトール、デキストラン、カルボキシメチルセルロースナトリウム及びその組み合わせが挙げられる。全身投与用抗体は、腸管内、腸管外又は局所投与用に製剤化することができる。実際には、活性成分の全身投与を達成するために全３種の製剤を同時に使用することができる。腸管外及び非腸管外薬物送達用の賦形剤と製剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）２０ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇに記載されている。
【０３８５】
適切な腸管内投与用製剤としては、ハード若しくはソフトゼラチンカプセル剤、丸剤、コーティング錠を含む錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤又は吸入剤及びその制御放出形態が挙げられる。
【０３８６】
（例えば注射による）腸管外投与に適した製剤としては、活性成分を溶解、懸濁又は他の方法で（例えばリポソーム又は他の微粒子内に）配置した水性又は非水性の等張パイロジェンフリー滅菌液剤（例えば溶液剤、懸濁剤）が挙げられる。このような液剤は、更に、酸化防止剤、緩衝剤、防腐剤、安定化剤、懸濁化剤、増粘剤及び製剤を対象レシピエントの血液（又は他の該当する体液）と等張にする溶質等の他の薬学的に許容される担体を含有していてもよい。賦形剤の例としては、例えば水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油等が挙げられる。このような製剤に使用される適切な薬学的に許容される等張担体としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液又は乳酸リンゲル注射液が挙げられる。
【０３８７】
特に好ましい実施形態では、本発明の製剤化組成物を凍結乾燥して抗体又はＡＤＣの粉末形態とした後、投与前に再構成してもよい。注射溶液の調製用の滅菌粉末は、本願に開示する抗体又はＡＤＣを含む溶液を凍結乾燥し、任意に同時に可溶化された生体適合性成分と共に活性成分を含む粉末とすることにより、製造することができる。一般に、分散液剤又は溶液剤は、塩基性分散媒又は溶媒（例えば希釈剤）と任意に他の生体適合性成分とを含有する滅菌基剤に活性化合物を加えることにより、製造される。適合可能な希釈剤は、薬学的に許容され（人体に投与するのに安全で非毒性であり）、凍結乾燥後に再構成される製剤等の液体製剤の調製に有用なものである。代表的な希釈剤としては、滅菌水、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液又はブドウ糖液が挙げられる。代替実施形態において、希釈剤としては、塩及び／又は緩衝剤の水溶液が挙げられる。
【０３８８】
所定の好ましい実施形態では、前記抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣを薬学的に許容される糖類と共に凍結乾燥させる。「薬学的に許容される糖類」とは、着目タンパク質と組み合わせたときに、保存後のタンパク質の化学的及び／又は物理的不安定性を有意に防止又は抑制する分子である。製剤を凍結乾燥後に再構成する場合、本願で使用する薬学的に許容される糖類を「溶解保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）」と言う場合もある。代表的な糖類とそれらの対応する糖アルコール類としては、グルタミン酸ナトリウムやヒスチジン等のアミノ酸；ベタイン等のメチルアミン；硫酸マグネシウム等の離液性塩；３価以上の高分子量糖アルコール類（例えばグリセリン、デキストラン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトール）、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（Ｒ）等のポリオール；並びにその組み合わせが挙げられる。その他の代表的な溶解保護剤としては、グリセリン及びゼラチンと、糖類としてメリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース及びスタキオースが挙げられる。還元糖類の例としては、グルコース、マルトース、ラクトース、マルチュロース、イソマルチュロース及びラクチュロースが挙げられる。非還元糖類の例としては、糖アルコール類及び他の直鎖状多価アルコール類から選択されるポリヒドロキシ化合物の非還元グリコシドが挙げられる。好ましい糖アルコール類はモノグリコシドであり、特にラクトース、マルトース、ラクチュロース及びマルチュロース等の二糖類の還元により得られる化合物である。グリコシド側基はグルコシド型でもガラクトシド型でもよい。糖アルコール類のその他の例はグルシトール、マルチトール、ラクチトール及びイソマルチュロースである。薬学的に許容される好ましい糖類は、非還元糖類であるトレハロース又はスクロースである。薬学的に許容される糖類は、保存中（例えば再構成及び保存後）にその物理的及び化学的安定性及び完全性を本質的に維持することを意味する「保護的量」で（例えば凍結乾燥前に）製剤に添加される。
【０３８９】
当業者に自明の通り、適合可能な溶解保護剤を液体又は凍結乾燥製剤に約１ｍＭ〜約１０００ｍＭ、約２５ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１２５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約２００ｍＭ又は約１６５ｍＭ〜約１８５ｍＭの濃度で添加することができる。所定の実施形態では、約１０ｍＭ、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１６５ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１８５ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約４００ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約８００ｍＭ、約９００ｍＭ又は約１０００ｍＭの濃度となるように前記溶解保護剤を添加することができる。所定の好ましい実施形態において、前記溶解保護剤は、薬学的に許容される糖類を含むことができる。特に好ましい態様において、前記薬学的に許容される糖類は、トレハロース又はスクロースを含むであろう。
【０３９０】
他の選択された実施形態において、本発明の液体又は凍結乾燥製剤は、アミノ酸又はその薬学的に許容される塩等の安定化剤又は緩衝剤として作用するための所定の化合物を含むことができる。このような化合物は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約５ｍＭ〜約７５ｍＭ、約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３０ｍＭ又は約１５ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度で添加することができる。所定の実施形態では、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ又は約１００ｍＭの濃度となるように、前記緩衝剤を添加することができる。他の選択された実施形態では、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ又は約１００ｍＭの濃度となるように、前記緩衝剤を添加することができる。所定の好ましい実施形態において、前記緩衝剤は、ヒスチジン塩酸塩を含むであろう。
【０３９１】
更に他の選択された実施形態において、本発明の液体又は凍結乾燥製剤は、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０又はポリソルベート８０等の非イオン性界面活性剤を、安定化剤として含むことができる。このような化合物は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約０．６ｍｇ／ｍｌ又は約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で添加することができる。所定の実施形態では、約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ又は約１．０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように前記界面活性剤を添加することができる。他の選択された実施形態では、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ又は約２．０ｍｇ／ｍｌの濃度となるように前記界面活性剤を添加することができる。所定の好ましい実施形態において、前記界面活性剤は、ポリソルベート２０又はポリソルベート４０を含むであろう。
【０３９２】
凍結乾燥粉末から再構成されるか又は元々溶液であるかに関係なく、本願に開示する抗体又はＡＤＣの適合可能な腸管外投与（例えば静脈内注射）用製剤は、約１０μｇ／ｍＬ〜約１００ｍｇ／ｍＬのＡＤＣ又は抗体濃度とすることができる。所定の選択された実施形態において、抗体又はＡＤＣ濃度は、２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、３００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ、７００μｇ／ｍＬ、８００μｇ／ｍＬ、９００μｇ／ｍＬ又は１ｍｇ／ｍＬとなるであろう。他の実施形態において、ＡＤＣ濃度は、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ又は１００ｍｇ／ｍＬとなるであろう。
【０３９３】
所定の好ましい態様において、本発明の組成物は、ｐＨ６．０で１０ｍｇ／ｍｌのＥＭＲ２ＡＤＣと、２０ｍＭのヒスチジン塩酸塩と、０．１７５Ｍのスクロースと、０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０とを含有する液体製剤を含むであろう。１態様において、本発明の組成物は、ｐＨ６．０で１０ｍｇ／ｍｌのＥＭＲ２ＡＤＣと、２０ｍＭのヒスチジン塩酸塩と、０．１７５Ｍのスクロースと、０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０とを含有する。別の態様において、本発明の組成物は、ｐＨ６．０で１０ｍｇ／ｍｌのＥＭＲ２ＡＤＣと、２０ｍＭのヒスチジン塩酸塩と、０．１７５Ｍのスクロースと、０．４ｍｇ／ｍＬのポリソルベート２０とを含有する。本願に記載するように、このような液体製剤を凍結乾燥して粉末組成物とし、使用前に薬学的に適合可能な（例えば水性の）担体で再構成してもよい。溶液状の場合、このような組成物は−７０℃で保存し、遮光することが好ましい。凍結乾燥する場合には、ＥＭＲ２ＡＤＣ粉末製剤を２〜８℃で保存し、遮光することが好ましい。上記溶液剤又は散剤は、適切な保存条件を指示したラベルを付けた滅菌ガラスバイアル（例えばＵＳＰ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  １０ｍｌ）に各々収容することが好ましく、（元々の溶液又は再構成した溶液中）１０ｍｇ／ｍＬのＥＭＲ２ＡＤＣを規定体積（例えば３又は５ｍＬ）ずつ安定して提供するように構成することができる。
【０３９４】
凍結乾燥粉末から再構成するか否かに拘わらず、（例えば上記のような）液体ＥＭＲ２ＡＤＣ製剤を、投与前に（好ましくは水性担体で）更に希釈してもよい。例えば、０．９％塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰ又は等価物（準用）を入れた輸液バッグに上記液体製剤を加えて、所望の投与用量レベルとなるように更に希釈することができる。所定の態様では、完全に希釈したＥＭＲ２ＡＤＣ溶液をＩＶ装置で静脈内輸液により投与する。投与されるＥＭＲ２ＡＤＣ薬物溶液は、（静脈内（ＩＶ）輸液又は注射のいずれかに拘わらず）無色透明であり、目に見える粒子を含まないことが好ましい。
【０３９５】
本発明の化合物及び組成物は、投与を必要とする対象に種々の経路で投与することができ、限定されないが、経口、静脈内、関節内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、心臓内、心室内、気管内、口腔、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮及び髄腔内又は移植若しくは吸入による他の経路が挙げられる。本組成物は、固体、半固体、液体又は気体形状の製剤に製剤化することができ、限定されないが、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、溶液剤、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤及びエアゾールが挙げられる。適切な製剤と投与経路は、所期用途及び治療レジメンに従って選択することができる。
【０３９６】
Ｂ．投与量及び投与レジメン
特定の投与レジメン、即ち用量、タイミング及び頻度は、特定の個体と、薬物動態（例えば半減期、クリアランス速度等）等の実験結果により、異なるであろう。投与頻度の決定は、治療する病態の状態と重篤度、被治療対象の年齢と一般健康状態等を考慮して、主治医等の当業者が実施することができる。選択された組成物の効力と投与レジメンとの評価に基づいて、治療経過に伴って投与頻度を調節することができる。このような評価は、特定の疾患、障害又は病態のマーカーに基づいて行うことができる。個体ががんをもつ実施形態において、これらのマーカーとしては、触診若しくは目視観察による腫瘍サイズの直接測定；Ｘ線若しくは他の画像技術による腫瘍サイズの間接測定；腫瘍試料の直接腫瘍生検と顕微鏡検査により評価した場合の改善；間接腫瘍マーカー（例えば前立腺がんのＰＳＡ）若しくは本願に記載する方法に従って同定された抗原の測定；増殖性若しくは造腫瘍性細胞数の減少、このような腫瘍性細胞の減少の維持；腫瘍性細胞の増殖の低減；又は転移の発生の遅延が挙げられる。
【０３９７】
本発明のＥＭＲ２抗体又はＡＤＣは、種々の範囲で投与することができる。これらの範囲としては、１回に約５μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、１回に約５０μｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重、１回に約１００μｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。他の範囲としては、１回に約１００μｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重及び１回に約０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。所定の実施形態において、投与量は少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０３９８】
選択された実施形態では、前記ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣを、１回に体重１ｋｇ当たり約１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ又は１００μｇの割合で（好ましくは静脈内に）投与する。他の実施形態は、抗体又はＡＤＣを１回に体重１ｋｇ当たり約２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇ、９００μｇ、１０００μｇ、１１００μｇ、１２００μｇ、１３００μｇ、１４００μｇ、１５００μｇ、１６００μｇ、１７００μｇ、１８００μｇ、１９００μｇ、２０００μｇの割合で投与することを含むことができる。他の実施形態では、本願に開示する複合体を２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの割合で投与するであろう。更に他の実施形態では、前記複合体を１回に体重１ｋｇ当たり１２ｍｇ、１４ｍｇ、１６ｍｇ、１８ｍｇ又は２０ｍｇの割合で投与することができる。更に他の実施形態では、前記複合体を１回に体重１ｋｇ当たり２５ｍｇ、３０ｍｇ、３５ｍｇ、４０ｍｇ、４５ｍｇ、５０ｍｇ、５５ｍｇ、６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ又は１００ｍｇの割合で投与することができる。本願の教示に鑑み、当業者は前臨床動物試験、臨床結果並びに標準医学及び生化学技術及び測定に基づいて種々のＥＭＲ２抗体又はＡＤＣに適した投与量を容易に決定することができよう。
【０３９９】
米国特許第７，７４４，８７７号に開示されているような体表面積（ＢＳＡ）計算に基づいて、他の投与レジメンを予測することもできる。周知の通り、ＢＳＡは、患者の身長と体重を使用して計算され、対象の体の表面積により表されるその体格の尺度となる。所定の実施形態では、前記複合体を１ｍｇ／ｍ２〜８００ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２の投与量、及び１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２又は４５０ｍｇ／ｍ２の投与量で投与することができる。同じく当然のことながら、当分野で公知の技術と実験技術を使用して、適切な投与量を決定してもよい。
【０４００】
抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣは、特定のスケジュールで投与することができる。一般に、有効用量のＥＭＲ２複合体を、対象に１回以上投与する。より特定的には、有効用量のＡＤＣを対象に１カ月に１回、１カ月に２回以上、又は１カ月に１回未満投与する。所定の実施形態では、有効用量のＥＭＲ２抗体又はＡＤＣを少なくとも１カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間又は数年間にわたって複数回投与することができる。更に他の実施形態では、本願に開示する抗体又はＡＤＣの投与間隔を、数日（２日、３日、４日、５日、６日又は７日）、数週間（１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間又は８週間）又は数カ月（１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月又は８カ月）又は１年又は数年とすることができる。
【０４０１】
実施形態によっては、複合体抗体を使用する治療クールは、選択された薬物製剤を数週間又は数カ月間にわたって複数回投与することを含むであろう。より具体的には、本発明の抗体又はＡＤＣを１日１回、２日に１回、４日に１回、１週間に１回、１０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、１カ月に１回、６週間に１回、２カ月に１回、１０週間に１回又は３カ月に１回投与することができる。これについては、当然のことながら、患者応答と臨床プラクティスに基づいて投与量を変更したり、間隔を調整してもよい。本発明は更に不連続投与や、１日用量を数回に分けて投与することも想定する。本発明の組成物と抗がん剤を１日おき又は１週間おきに交互に投与してもよいし、抗体治療を１クール行った後に抗がん剤療法を１回以上行ってもよい。いずれにせよ、当業者に自明の通り、化学療法剤の適切な用量は、化学療法剤を単独投与又は他の化学療法剤と併用投与する臨床療法で既に利用されている用量と大体同程度となるであろう。
【０４０２】
別の実施形態では、疾患の最初の発現後の腫瘍再発の可能性を低減又は消失させるための維持療法で、本発明のＥＭＲ２抗体又はＡＤＣを使用してもよい。疾患は治療されており、初期腫瘤が除去、縮小又は他の方法で改善されているため、患者が無症候又は寛解状態にあることが好ましい。標準診断法によると疾患の徴候が殆ど又は全くなくても、このような時点で薬学的に有効な量の本願に開示する抗体を対象に１回以上投与することができる。
【０４０３】
別の好ましい実施形態では、腫瘍減量処置後の腫瘍転移の可能性を予防又は低減するために、本発明のモジュレーターを予防的に又はアジュバント療法として使用することができる。本開示で使用する「腫瘍減量処置」とは、腫瘍質量を減らすか又は腫瘍負荷若しくは腫瘍増殖を改善する任意の処置、技術又は方法を意味する。代表的な腫瘍減量処置としては、限定されないが、外科処置、放射線治療（即ち放射線照射）、化学療法、免疫療法又はアブレーションが挙げられる。本開示に鑑みて当業者に容易に決定される適切な時点で、臨床、診断又はセラノスティクス処理による推奨に応じて腫瘍転移を減らすために、本願に開示するＡＤＣを投与することができる。
【０４０４】
本発明の更に他の実施形態は、無症候であるが、がんを発症する危険のある対象に本願に開示する抗体又はＡＤＣを投与することを含む。即ち、本発明の抗体又はＡＤＣを真に予防の意味で使用し、検査又は試験を受けて１種以上の危険因子（例えばゲノム徴候、家族歴、インビボ又はインビトロ試験結果等）が認められたが新生物を発生していない患者に、投与することができる。
【０４０５】
本願に開示する治療用組成物を１回以上投与したことのある個体で、投与量とレジメンを経験的に決定してもよい。例えば、本願に記載するように製造された治療用組成物の投与量を、漸増しながら個体に投与してもよい。選択された実施形態では、夫々経験的に判断されるか又は観測される副作用と毒性に基づいて、投与量を徐々に増加又は減少又は減弱させることができる。選択された組成物の効力を評価するためには、従来記載されているように特定の疾患、障害又は病態のマーカーを追跡することができる。がんの場合、これらのマーカーとしては、触診若しくは目視観察による腫瘍サイズの直接測定；Ｘ線若しくは他の画像技術による腫瘍サイズの間接測定；腫瘍試料の直接腫瘍生検と顕微鏡検査により評価した場合の改善；間接腫瘍マーカー（例えば前立腺がんのＰＳＡ）若しくは本願に記載する方法に従って同定された造腫瘍性抗原の測定；疼痛若しくは麻痺の低減；発語、視覚、呼吸若しくは腫瘍に関連する他の身体障害の改善；食欲増加；又は公認試験若しくは生存延長により測定した場合のクオリティオブライフの向上が挙げられる。当業者に自明の通り、投与量は、個体、腫瘍性病態の種類、腫瘍性病態のステージ、腫瘍性病態が個体の他の場所に転移し始めているか否か、並びに過去及び現在併用している治療により変動するであろう。
【０４０６】
Ｃ．併用療法
上記に示唆したように、望ましくない腫瘍性細胞増殖の抑制若しくは阻害、がんの発生の抑制、がんの再発の抑制若しくは予防、又はがんの広がり若しくは転移の抑制若しくは予防には、併用療法が特に有用であると思われる。このような場合に、本発明の抗体又はＡＤＣは、腫瘤を持続及び永続化させるＣＳＣを除去することにより、増感剤又は化学増感剤として機能することができ、現行標準の腫瘍減量剤又は抗がん剤をより有効に使用できるようにする。即ち、本願に開示する抗体又はＡＤＣは、所定の実施形態において、投与される別の治療薬の作用方式を強化する増強効果（例えば相加又は相乗効果）を提供する。本発明に関して、「併用療法」とは広義に解釈すべきであり、単に抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと１種以上の抗がん剤の投与を意味し、このような抗がん剤としては、限定されないが、細胞毒性薬、細胞増殖抑制剤、抗血管新生薬、腫瘍減量剤、化学療法剤、放射線療法及び放射線療法剤、標的抗がん剤（モノクローナル抗体と低分子薬の両者を含む）、ＢＲＭ、治療用抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法、抗転移薬、並びに特異的アプローチと非特異的アプローチを含めた免疫療法剤が挙げられる。
【０４０７】
併用結果は、各治療（例えば抗体と抗がん剤）を別々に行う場合に認められる効果の相加効果である必要はない。少なくとも相加効果が一般に望ましいが、単独療法の効果を上回る何らかの抗腫瘍効果の増加があると有利である。更に、本発明は併用治療が相乗効果を示す必要はない。しかし、当業者に自明の通り、好ましい実施形態を含む所定の選択された組み合わせでは、相乗効果を認めることができる。
【０４０８】
したがって、所定の態様において、前記併用療法には相乗治療効果があり、あるいは（ｉ）抗ＥＭＲ２抗体若しくはＡＤＣの単独使用、又は（ｉｉ）治療薬部分の単独使用、又は（ｉｉｉ）抗ＥＭＲ２抗体若しくはＡＤＣの非添加下での治療薬部分と別の治療薬部分の併用に比較してがんの治療における測定可能な治療効果を改善する。本願で使用する「相乗治療効果」とは、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと１種以上の治療薬部分の併用が前記抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと前記１種以上の治療薬部分の併用の相加効果よりも大きな治療効果をもつことを意味する。
【０４０９】
本願に開示する併用の望ましい転帰は、対照又はベースライン測定と比較することにより定量化される。本願で使用する「改善する」、「増加する」又は「低減する」等の相対語は、本願に記載する治療の開始前の同一個体における測定や、本願に記載する抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣの不在下でかつ標準治療等の他の治療薬部分の存在下で対照個体（又は複数の対照個体）における測定等の対照に対する相対値を表す。代表的な対照個体は、被治療個体と同一形態のがんに罹患しており、（被治療個体と対照個体における疾患のステージを比較可能にするように）被治療個体とほぼ同年齢の個体である。
【０４１０】
治療に対する応答の変化又は改善は、一般に統計的に有意である。本願で使用する「有意性」又は「有意」なる用語は、２以上のエンティティ間に非ランダムな関連がある確率の統計分析に関する。関係が「有意」であるか否か又は「有意性」をもつか否かを判定するためには、「ｐ値」を計算することができる。ユーザー定義のカットオフ点よりも下回るｐ値を有意とみなす。０．１以下、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満又は０．００１未満のｐ値を有意とみなすことができる。
【０４１１】
相乗治療効果は、単一治療薬部分若しくは抗ＥＭＲ２抗体若しくはＡＤＣにより誘発される治療効果又は所定の組み合わせの前記抗ＥＭＲ２抗体若しくはＡＤＣ若しくは前記単一治療薬部分により誘発される治療効果の和の少なくとも約２倍、又は少なくとも約５倍、又は少なくとも約１０倍、又は少なくとも約２０倍、又は少なくとも約５０倍、又は少なくとも約１００倍の効果とすることができる。相乗治療効果は、単一治療薬部分若しくは抗ＥＭＲ２抗体若しくはＡＤＣにより誘発される治療効果又は所定の組み合わせの前記抗ＥＭＲ２抗体若しくはＡＤＣ若しくは前記単一治療薬部分により誘発される治療効果の和に比較して、少なくとも１０％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも５０％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも１００％、又はそれ以上の治療効果の増加として確認することもできる。相乗効果は、治療薬を併用した場合に投与を減らすことができる効果でもある。
【０４１２】
併用療法の実施にあたっては、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと治療薬部分とを、単一組成物として又は２個以上の別個の組成物として、同一若しくは異なる投与経路を使用して、対象に同時に投与することができる。あるいは、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣの投与前又は投与後に、例えば数分間から数週間の間隔を空けて治療薬部分を投与してもよい。１実施形態では、治療薬部分と抗体又はＡＤＣとの両方を、約５分〜約２週間以内に投与する。更に他の実施形態では、抗体と治療薬部分との投与間隔を数日（２日、３日、４日、５日、６日又は７日）、数週間（１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間又は８週間）又は数カ月（１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月又は８カ月）とすることができる。
【０４１３】
併用療法は、病態が治療、軽減又は治癒するまで種々のスケジュールで投与することができ、例えば１日１回、１日２回、１日３回、２日に１回、３日に１回、１週間に１回、２週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回、又は連続して投与することができる。抗体と治療薬部分とを１日おき又は１週間おきに交互に投与してもよいし、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣ投与を１クール行った後に別の治療薬部分を１回以上投与してもよい。１実施形態では、短い投与サイクルで抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣを１種以上の治療薬部分と併用投与する。他の実施形態では、長い投与サイクルで併用投与する。併用療法は、任意の経路で投与することができる。
【０４１４】
選択された実施形態では、本発明の化合物及び組成物を、ＰＤ−１阻害薬やＰＤ−Ｌ１阻害薬等のチェックポイント阻害薬と併用してもよい。ＰＤ−１は、そのリガンドであるＰＤ−Ｌ１と共働して、抗腫瘍Ｔリンパ球応答の負のレギュレーターとなる。１実施形態において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、抗ＰＤ−１抗体（例えばペムブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ）と、任意に１種以上の他の治療薬部分との投与を、含むことができる。別の実施形態において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えばアベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ）と、任意に１種以上の他の治療薬部分との投与を含むことができる。更に別の実施形態において、併用療法は、チェックポイント阻害薬及び／又は標的ＢＲＡＦ併用療法（例えばベムラフェニブ又はダブラフェニブ）後に進行し続ける患者に、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣを抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−Ｌ１と併用投与することができる。
【０４１５】
実施形態によっては、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣを種々のファーストラインがん治療と併用することができる。したがって、選択された実施形態において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、イホスファミド、マイトマイシンＣ、ビンデシン、ビンブラスチン、エトポシド、イリノテカン、ゲムシタビン、タキサン、ビノレルビン、メトトレキサート及びペメトレキセド等の細胞毒性薬と、任意に１種以上の他の治療薬部分との使用を含む。所定の腫瘍性疾患（例えばＡＭＬや多発性骨髄腫等の造血器疾患）では、本願に開示するＡＤＣをシタラビン（ＡｒａＣ）＋アントラサイクリン（アクラルビシン、アムサクリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン等）又はミトキサントロン、フルダラビン；ヒドロキシ尿素、クロファラビン、クロレタジン等の細胞毒性薬と併用することができる。他の実施形態では、本発明のＡＤＣをＧ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦプライミング、アザシチジンやデシタビン等の脱メチル化剤、ＦＬＴ３−選択的チロシンキナーゼ阻害薬（例えばミドスタウリン、レスタウルチニブ及びスニチニブ）、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）及び三酸化ヒ素と併用投与することができる（最後の２種の併用は急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）に特に有効であると思われる）。
【０４１６】
別の実施形態において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、白金系薬物（例えばカルボプラチン又はシスプラチン）と、任意に１種以上の他の治療薬部分（例えばビノレルビン；ゲムシタビン；例えばドセタキセルやパクリタキセル等のタキサン；イリノテカン；又はペメトレキセド）との使用を含む。
【０４１７】
所定の実施形態では、例えばＢＲ−ＥＲＰＲ、ＢＲ−ＥＲ又はＢＲ−ＰＲがんの治療において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと「ホルモン療法」と呼ばれる１種以上の治療薬部分との使用を含む。本願で使用する「ホルモン療法」とは、例えばタモキシフェン；性腺刺激ホルモン若しくは黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ若しくはＬＨＲＨ）；エベロリムス及びエキセメスタン；トレミフェン；又はアロマターゼ阻害薬（例えばアナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン又はフルベストラント）を意味する。
【０４１８】
別の実施形態では、例えばＢＲ−ＨＥＲ２の治療において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、トラスツズマブ又はアドトラスツズマブエムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ）と、任意に１種以上の他の治療薬部分と（例えばペルツズマブ及び／又はドセタキセル）の使用を含む。
【０４１９】
実施形態によっては、例えば転移性乳がんの治療において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、タキサン（例えばドセタキセル又はパクリタキセル）と、任意に別の治療薬部分、例えばアントラサイクリン（例えばドキソルビシン又はエピルビシン）及び／又はエリブリンとの使用を含む。
【０４２０】
別の実施形態では、例えば転移性又は再発性乳がん又はＢＲＣＡ−突然変異体乳がんの治療において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、メゲストロールと、任意に別の治療薬部分との使用を含む。
【０４２１】
他の実施形態では、例えばＢＲ−ＴＮＢＣの治療において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害薬（例えばＢＭＮ−６７３、オラパリブ、ルカパリブ及びベリパリブ）と、任意に別の治療薬部分との使用を含む。
【０４２２】
別の実施形態において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、ＰＡＲＰ阻害薬と、任意に１種以上の他の治療薬部分との使用を含む。
【０４２３】
別の実施形態では、例えば乳がんの治療において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、シクロホスファミドと、任意に別の治療薬部分（例えばドキソルビシン、タキサン、エピルビシン、５−ＦＵ及び／又はメトトレキサート）との使用を含む。
【０４２４】
別の実施形態において、ＥＧＦＲ陽性ＮＳＣＬＣの治療用の併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、アファチニブと、任意に１種以上の他の治療薬部分（例えばエルロチニブ及び／又はベバシズマブ）との使用を含む。
【０４２５】
別の実施形態において、ＥＧＦＲ陽性ＮＳＣＬＣの治療用の併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、エルロチニブと、任意に１種以上の他の治療薬部分（例えばベバシズマブ）との使用を含む。
【０４２６】
別の実施形態において、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣの治療用の併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、セリチニブ（Ｚｙｋａｄｉａ）と、任意に１種以上の他の治療薬部分との使用を含む。
【０４２７】
別の実施形態において、ＡＬＫ陽性ＮＳＣＬＣの治療用の併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、クリゾチニブ（Ｘａｌｃｏｒｉ）と、任意に１種以上の他の治療薬部分との使用を含む。
【０４２８】
別の実施形態において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、ベバシズマブと、任意に１種以上の他の治療薬部分（例えばゲムシタビン又は例えばドセタキセルやパクリタキセル等のタキサン；及び／又は白金アナログ）との使用を含む。
【０４２９】
別の実施形態において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、ベバシズマブと、任意にシクロホスファミドとの使用を含む。
【０４３０】
特定の実施形態において、白金製剤耐性腫瘍の治療用の併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、ドキソルビシン及び／又はエトポシド及び／又はゲムシタビン及び／又はビノレルビン及び／又はイホスファミド及び／又はロイコボリン＋５−フルオロウラシル及び／又はベバシズマブ及び／又はタモキシフェンと、任意に１種以上の他の治療薬部分との使用を含む。
【０４３１】
選択された実施形態では、潜在的に治療経過をより有効にし、炎症、悪心及び過敏症等の副作用を減らすために、本願に開示する抗体及びＡＤＣを所定のステロイド剤と併用することができる。本発明のＡＤＣと併用することができる代表的なステロイド剤としては、限定されないが、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン及びプレドニゾロンが挙げられる。特に好ましい態様において、前記ステロイド剤は、デキサメタゾンを含むであろう。
【０４３２】
実施形態によっては、前記抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣを、種々のファーストラインメラノーマ治療と併用してもよい。１実施形態において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、ダカルバジンと、任意に１種以上の他の治療薬部分との使用を含む。他の実施形態において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、テモゾロミドと、任意に１種以上の他の治療薬部分との使用を含む。別の実施形態において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、白金系治療薬部分（例えばカルボプラチンやシスプラチン）と、任意に１種以上の他の治療薬部分との使用を含む。実施形態によっては、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、ビンカアルカロイド治療薬部分（例えばビンブラスチン、ビノレルビン、ビンクリスチン又はビンデシン）と、任意に１種以上の他の治療薬部分との使用を含む。１実施形態において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、インターロイキン２と、任意に１種以上の他の治療薬部分との使用を含む。別の実施形態において、併用療法は、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、インターフェロンαと、任意に１種以上の他の治療薬部分との使用を含む。
【０４３３】
他の実施形態では、前記抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣをアジュバントメラノーマ治療及び／又は外科処置（例えば腫瘍切除）と併用してもよい。１実施形態において、併用療法は抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、インターフェロンαと、任意に１種以上の他の治療薬部分の使用を含む。
【０４３４】
本発明は、更に、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと放射線療法との併用を提供する。本願で使用する「放射線療法」なる用語は、腫瘍細胞の内側で局所的にＤＮＡ損傷を誘導するための任意メカニズムを意味し、γ線、Ｘ線、紫外線、マイクロ波、電子放出等が挙げられる。腫瘍細胞への放射性同位体の特異的送達を使用した併用療法も想定され、併用又は本願に開示する抗ＥＭＲ２抗体の複合体として使用することができる。一般的には、放射線療法をパルスで約１〜約２週間行う。任意に、放射線療法を単回行ってもよいし、複数回逐次行ってもよい。
【０４３５】
他の実施形態では、抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣを、下記化学療法剤の１種以上と併用してもよい。
【０４３６】
Ｄ．抗がん剤
本願で使用する「抗がん剤」なる用語は、「治療薬部分」の１つのサブセットであり、それ自体「医薬活性部分」と呼ぶ薬剤のサブセットである。より特定的には、「抗がん剤」とはがん等の細胞増殖性疾患を治療するために使用することができる任意の薬剤（又はその薬学的に許容される塩）を意味し、限定されないが、細胞毒性薬、細胞増殖抑制剤、抗血管新生薬、腫瘍減量剤、化学療法剤、放射線療法剤、標的抗がん剤、生体応答調節剤、治療用抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移薬剤及び免疫療法剤が挙げられる。なお、抗がん剤の上記分類は相互に排他的ではなく、選択された薬剤は、１種類以上の分類に該当することができる。例えば、適合可能な抗がん剤を細胞毒性薬と化学療法剤として分類することができる。したがって、上記用語は、各々本開示に照らして医学分野でのその使用に従って解釈すべきである。
【０４３７】
好ましい実施形態において、抗がん剤としては、がん細胞又はがん細胞になる可能性若しくは造腫瘍性子孫（例えば造腫瘍性細胞）を生じる可能性のある細胞を抑制若しくは除去するか又は抑制若しくは除去するように設計された、あらゆる化学物質（例えば化学療法剤）が挙げられる。この点で、選択された化学物質（細胞周期依存性物質）は、細胞増殖又は分裂に必要な細胞内プロセスを対象としていることが多いので、一般に迅速に増殖・分裂するがん細胞に対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは微小管を脱重合させ、迅速に分割している腫瘍細胞が有糸分裂に進まないようにする。あるいは、選択された化学物質は、その生活環のあらゆる点で、細胞生存を妨害する細胞周期非依存性物質であり、特異的治療薬（例えばＡＤＣ）で有効であると思われる。例えば、所定のピロロベンゾジアゼピンは、細胞内ＤＮＡの副溝と結合し、核に送達されると転写を阻害する。併用療法又はＡＤＣ成分の選択については、当然のことながら、当業者は本開示に照らして適合可能な細胞周期依存性物質と細胞周期非依存性物質を容易に識別できよう。
【０４３８】
いずれにせよ、上記に示唆したように、当然のことながら、本願に開示する抗ＥＭＲ２抗体及びＡＤＣに加えて、選択された抗がん剤を相互に併用投与してもよい（例えばＣＨＯＰ療法）。更に、同じく当然のことながら、選択された実施形態において、このような抗がん剤は、複合体を含むことができ、投与前に抗体と会合させることができる。所定の実施形態では、本願に開示する抗がん剤を抗ＥＭＲ２抗体と連結し、本願に開示するようなＡＤＣとする。
【０４３９】
本願で使用する「細胞毒性薬」（又は細胞毒素）なる用語は、一般に、細胞に対して毒性の物質を意味し、細胞機能を低下若しくは阻害し、及び／又は腫瘍細胞の破壊を生じるものである。所定の実施形態において、この物質は、生体に由来する天然分子又はそのアナログ（天然原料から精製されたもの又は合成により作製されたもの）である。細胞毒性薬の例としては、限定されないが、低分子毒素又は酵素活性毒素として夫々、細菌（例えばカリケアマイシン、ジフテリア毒素、シュードモナス内毒素及び外毒素、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ）、真菌（例えばα−サルシン、レストリクトシン）、植物（例えばアブリン、リシン、モデクシン、ビスクミン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポニン、ゲロニン、モモリジン、トリコサンチン、オオムギ毒素、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質［ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ］、ツルレイシ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、シャボンソウ（ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ミトゲリン（ｍｉｔｅｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン及びトリコテセン類）又は動物（例えば細胞外膵臓ＲＮａｓｅ等の細胞毒性ＲＮａｓｅ類；ＤＮａｓｅ  Ｉ、その断片及び／又は変異体を含む）に由来するものが挙げられる。所定の放射性同位体、メイタンシノイド、アウリスタチン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、アマニチン及びピロロベンゾジアゼピンを含むその他の適合可能な細胞毒性薬についても、本願に記載する。
【０４４０】
より一般的に述べると、本発明の抗体と併用（又はコンジュゲーション）させることができる細胞毒性薬又は抗がん剤の例としては、限定されないが、アルキル化剤、アルキルスルホン酸エステル、アナストロゾール、アマニチン、アジリジン、エチレンイミン及びメチルメラミン、アセトゲニン、カンプトテシン、ＢＥＺ−２３５、ボルテゾミブ、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ−１０６５、セリチニブ、クリゾチニブ、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、エルロチニブ、パンクラチスタチン、サルコジクチイン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジインジネミシン、ビスホスホネート、エスペラマイシン、色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カンホスファミド、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルチノフィリン、クロモマイシン、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、エキセメスタン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲティチニブ、イダルビシン、ラパチニブ、レトロゾール、ロナファルニブ、マルセロマイシン、酢酸メゲストロール、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、パゾパニブ、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ラパマイシン、ロドルビシン、ソラフェニブ、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、タモキシフェンクエン酸塩、テモゾロミド、テパジナ、チピファルニブ、ツベルシジン、ウベニメクス、バンデタニブ、ボロゾール、ＸＬ−１４７、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、葉酸アナログ、プリンアナログ、アンドロゲン、抗副腎剤、フォリン酸等の葉酸補充薬、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトレキセート、デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）、デメコルシン、ジアジクオン、エフロルニチン、エリプチニウム酢酸塩、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシ尿素、レンチナン、ロニダミン、メイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、多糖複合体、ラゾキサン；リゾキシン；ＳＦ−１１２６、シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（Ｔ−２トキシン、ベルカリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；カルバミン酸エチル（ウレタン）；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ、ビンブラスチン；白金；エトポシド；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；イリノテカン、トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；ＸＬ５１８、細胞増殖を抑制するＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦ−Ａの阻害薬並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸若しくは誘導体が挙げられる。更に、腫瘍に及ぼすホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン薬（例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体抗体、副腎におけるエストロゲン生産を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害薬並びに抗アンドロゲン薬）；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ発現阻害薬やＨＥＲ２発現阻害薬等のリボザイム；ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（Ｒ）ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（Ｒ）トポイソメラーゼ１阻害薬；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（Ｒ）ｒｍＲＨ；ビノレルビン及びエスペラマイシン並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸若しくは誘導体もこの定義に含まれる。
【０４４１】
適合可能な細胞毒性薬又は抗がん剤は、更に、商用又は臨床利用可能な化合物を含むことができ、例えばエルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（Ｒ），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（Ｒ），Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ  Ｎｏ．５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（Ｒ），Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ  Ｎｏ．３９１２１０−１０−９，Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（ｃｉｓ−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ  Ｎｏ．１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ  Ｎｏ．４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（Ｒ），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（Ｒ），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタアザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド，ＣＡＳ  Ｎｏ．８５６２２−９３−１，ＴＥＭＯＤＡＲ（Ｒ），ＴＥＭＯＤＡＬ（Ｒ），Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブト−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタナミン、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（Ｒ）、ＩＳＴＵＢＡＬ（Ｒ）、ＶＡＬＯＤＥＸ（Ｒ））及びドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（Ｒ））が挙げられる。その他の商用又は臨床利用可能な抗がん剤としては、イブルチニブ（ＩＭＢＲＵＶＩＣＡ（Ｒ），ＡｂｂＶｉｅ）、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（Ｒ），Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（Ｒ），Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（Ｒ），ＳＵ１１２４８，Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（Ｒ），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、イマチニブメシル酸塩（ＧＬＥＥＶＥＣ（Ｒ），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋ阻害薬，Ｅｘｅｌｉｘｉｓ，ＷＯ２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋ阻害薬，ＡＺＤ６２４４，Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ，Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害薬，Ｓｅｍａｆｏｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害薬，Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害薬，Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（Ｒ），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ロイコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス，ＲＡＰＡＭＵＮＥ（Ｒ），Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（Ｒ），ＧＳＫ５７２０１６，Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、ロナファルニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（ＴＭ），ＳＣＨ  ６６３３６，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（Ｒ），ＢＡＹ４３−９００６，Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）、ゲティチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（Ｒ），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（Ｒ），ＣＰＴ−１１，Ｐｆｉｚｅｒ）、チピファルニブ（ＺＡＲＮＥＳＴＲＡ（ＴＭ），Ｊｏｈｎｓｏ���  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（ＴＭ）（クレモフォールフリー）、アルブミン結合型のパクリタキセルのナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ，ＺＤ６４７４，ＺＡＣＴＩＭＡ（Ｒ），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ  ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（Ｒ），Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンホスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（Ｒ），Ｔｅｌｉｋ）、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（Ｒ），ＮＥＯＳＡＲ（Ｒ））；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（Ｒ））；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（Ｒ），Ｒｏｃｈｅ）、タモキシフェン（タモキシフェンクエン酸塩であるＮＯＬＶＡＤＥＸ（Ｒ）を含む）、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（Ｒ）（トレミフェンクエン酸塩）、ＭＥＧＡＳＥ（Ｒ）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（Ｒ）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、ホルメスタン、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（Ｒ）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（Ｒ）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（Ｒ）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）が挙げられる。
【０４４２】
「薬学的に許容される塩」又は「塩」なる用語は、分子又は高分子の有機又は無機塩を意味する。アミノ基と共に酸付加塩を形成することができる。代表的な塩としては、限定されないが、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩及びパモ酸塩（即ち１，１’−メチレンビス（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸塩））が挙げられる。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオン又は他の対イオン等の別の分子を包摂していてもよい。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化させる任意の有機又は無機部分とすることができる。更に、薬学的に許容される塩は、その構造中に荷電原子を２個以上有していてもよい。薬学的に許容される塩に複数の荷電原子が含まれる場合、この塩は、複数の対イオンを有することができる。したがって、薬学的に許容される塩は１個以上の荷電原子及び／又は１個以上の対イオンを有することができる。
【０４４３】
同様に、「薬学的に許容される溶媒和物」又は「溶媒和物」とは、１個以上の溶媒分子と分子又は高分子の会合を意味する。薬学的に許容される溶媒和物を形成する溶媒の例としては、限定されないが、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸及びエタノールアミンが挙げられる。
【０４４４】
他の実施形態では、現在臨床試験中又は市販されている多数の抗体（又は免疫療法剤）のいずれか１種と、本発明の抗体又はＡＤＣとを、併用することができる。本願に開示する抗体は、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デツモマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、デュルバルマブ、デュシジツマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、ラムブロリズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブ、オビヌツズマブ、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オラパリブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペムブロリズマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピディリズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、セルメチニブ、シブロツズマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモマブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８、ＭＥＤＩ０６８０、ＭＤＸ−１１０５及びその組み合わせから構成される群から選択される抗体と併用することができる。
【０４４５】
他の実施形態は、がん療法に公認されている抗体の使用を含み、限定されないが、リツキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、イピリムマブ及びブレンツキシマブベドチンが挙げられる。当業者は、本願の教示に適合可能な他の抗がん剤も容易に認識できよう。
【０４４６】
Ｅ．放射線療法
本発明は、更に、抗体又はＡＤＣと放射線療法（即ち腫瘍細胞の内側で局所的にＤＮＡ損傷を誘導するための任意メカニズム、例えばγ線、Ｘ線、紫外線、マイクロ波、電子放出等）との併用も、提供する。腫瘍細胞への放射性同位体の特異的送達を使用した併用療法も想定され、本願に開示する抗体又はＡＤＣを、標的抗がん剤又は他の標的手段と併用することができる。一般的には、放射線療法をパルスで約１〜約２週間行う。頭頸部がんをもつ対象に放射線療法を約６〜７週間行ってもよい。任意に、放射線療法を単回行ってもよいし、複数回逐次行ってもよい。
【０４４７】
ＶＩＩ．適応症
本発明は、腫瘍性、炎症性、血管新生性及び免疫性疾患、並びに病原体に起因する疾患を含む、種々の疾患の診断、セラノスティクス、治療及び／又は予防用としての、本発明の抗体及びＡＤＣの使用を提供する。所定の実施形態において、治療する疾患は、固形腫瘍を含む腫瘍性病態を含む。他の実施形態において、治療する疾患は、造血器悪性腫瘍を含む。所定の実施形態では、腫瘍又はＥＭＲ２決定基を発現する造腫瘍性細胞を治療するために、本発明の抗体又はＡＤＣを使用する。被治療「対象」又は「患者」は、ヒトであることが好ましいが、本願で使用するこの用語は、明白にあらゆる哺乳動物種を含むものとみなす。
【０４４８】
当然のことながら、本発明の化合物及び組成物は、種々の疾患ステージ及び治療サイクルにおける種々の時点で、対象を治療するために使用することができる。したがって、所定の実施形態では、本発明の抗体及びＡＤＣをフロントライン療法として使用し、過去にがん性病態の治療を受けたことのない対象に投与する。他の実施形態では、セカンド及びサードラインの患者（即ち過去に同一病態の治療を夫々１回又は２回受けたことのある対象）を治療するために本発明の抗体及びＡＤＣを使用する。更に他の実施形態は、本願に開示するＥＭＲ２ＡＤＣ又は他の治療薬で同一又は関連病態の治療を３回以上受けたことのあるフォースライン以降の患者（例えば胃がん又は大腸がん患者）の治療を含む。他の実施形態では、過去に（本発明の抗体若しくはＡＤＣ又は他の抗がん剤で）治療したことがあり、再発しているか又は先行治療に対して不応であると判断される対象を治療するために、本発明の化合物及び組成物を使用する。選択された実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、再発性腫瘍をもつ対象を治療するために使用することができる。
【０４４９】
所定の実施形態では、本発明の化合物及び組成物を、フロントラインないし導入療法として単剤使用又は併用し、過去にがん性病態の治療を受けたことのない対象に投与する。他の実施形態では、地固め療法又は維持療法中に本発明の化合物及び組成物を単剤使用又は併用する。他の実施形態では、過去に（本発明の抗体若しくはＡＤＣ又は他の抗がん剤で）治療したことがあり、再発しているか又は先行治療に対して不応であると判断される対象を治療するために、本発明の化合物及び組成物を使用する。選択された実施形態において、本発明の化合物及び組成物は、再発性腫瘍をもつ対象を治療するために使用することができる。他の実施形態では、骨髄、臍帯血又は動員末梢血を幹細胞源とする自家又は同種造血幹細胞移植に備えて、コンディショニングレジメンの一部として、本発明の化合物及び組成物を使用する。
【０４５０】
造血器悪性腫瘍については、更に当然のことながら、本発明の化合物及び方法は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ、そのサブタイプについては、ＦＡＢ命名法（Ｍ０〜Ｍ７）、ＷＨＯ分類、分子マーカー／突然変異、核型、形態及び他の特性に基づいて種々のものが分かっている）、Ｂ細胞系急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）及び大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＬ）を含む種々の白血病と、ホジキンリンパ腫（古典的ホジキンリンパ腫及び結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、低悪性度／ＮＨＬ濾胞性細胞リンパ腫（ＦＣＣ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、粘膜関連リンパ組織型（ＭＡＬＴ）リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）及びバーキットリンパ腫（ＢＬ）を含む非ホジキンリンパ腫；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み核細胞型ＮＨＬ、巨大腫瘤性病変を呈するＮＨＬ、ワルデンストレームマクログロブリン血症、リンパ形質細胞性リンパ腫（ＬＰＬ）、エイズ関連リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節腫脹、びまん性小型切れ込み核細胞型、大細胞免疫芽球性リンパ芽球腫、小型非切れ込み核細胞型、バーキット及び非バーキット、濾胞性大細胞優位型；濾胞性中細胞優位型；並びに濾胞性中細胞／大細胞混合型リンパ腫を含むＢ細胞リンパ腫の治療に特に有効であると思われる。Ｇａｉｄｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ”，ＩＮ  ＣＡＮＣＥＲ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＆  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ＯＦ  ＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．２：２１３１−２１４５（ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，５．ｓｕｐ．ｔｈ  ｅｄ．１９９７）参照。当業者に自明の通り、これらのリンパ腫は、分類システムの変更により別の名称になることが多く、別の名称に分類されたリンパ腫の患者も、本発明の併用治療レジメンを利用することができる。
【０４５１】
他の好ましい実施形態において、前記増殖性疾患は、固形腫瘍を含み、限定されないが、副腎がん、肝臓がん、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、胃がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、食道がん、大腸がん、前立腺がん、膵臓がん、肺がん（小細胞肺がん及び非小細胞肺がん）、甲状腺がん、癌腫、肉腫、神経膠芽腫及び種々の頭頸部腫瘍が挙げられる。所定の選択された態様では、後記実施例に示すように、本願に開示するＡＤＣは、肺腺がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（例えば扁平上皮細胞非小細胞肺がん又は扁平上皮細胞小細胞肺がん）を含む肺がんの治療に特に有効である。１実施形態において、前記肺がんは、白金系製剤（例えばカルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）及び／又はタキサン（例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル又はカバジタキセル）に不応、再発性又は耐性である。別の実施形態において、被治療対象は、大細胞神経内分泌がん（ＬＣＮＥＣ）に罹患している。
【０４５２】
上記のように、本願に開示する抗体及びＡＤＣは、小細胞肺がん及び非小細胞肺がん（例えば扁平上皮細胞非小細胞肺がん又は扁平上皮細胞小細胞肺がん）のサブタイプを含む肺がんの治療に、特に有効である。他の実施形態において、本願に開示する組成物は、肺腺がんを治療するために使用することができる。選択された実施形態では、限られたステージの疾患又は広範なステージの疾患を示す患者に、前記抗体及びＡＤＣを投与することができる。他の実施形態では、不応患者（即ち導入療法クール中又はその完了直後に疾患を再発する患者）；感受性患者（即ち一次療法から２〜３カ月以上後に再発する患者）；あるいは白金系製剤（例えばカルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）及び／又はタキサン（例えばドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル又はカバジタキセル）に対して耐性を示す患者に、本願に開示する複合体抗体を投与する。所定の好ましい実施形態では、フロントラインの患者に、本発明のＥＭＲ２ＡＤＣを投与することができる。他の実施形態では、セカンドラインの患者に、本発明のＥＭＲ２ＡＤＣを投与することができる。更に他の実施形態では、サードラインの患者に、本発明のＥＭＲ２ＡＤＣを投与することができる。
【０４５３】
特に好ましい実施形態では、小細胞肺がんを治療するために、本願に開示するＡＤＣを使用することができる。このような実施形態については、限られたステージの疾患を示す患者に、複合体モジュレーターを投与することができる。他の実施形態では、広範なステージの疾患を示す患者に、本願に開示するＡＤＣを投与する。他の実施形態では、不応患者（即ち導入療法クール中又はその完了直後に疾患を再発する患者）又は再発性小細胞肺がん患者に、本願に開示するＡＤＣを投与する。更に他の実施形態は、本願に開示するＡＤＣを感受性患者（即ち一次療法から２〜３カ月以上後に再発する患者）に投与することを含む。いずれの場合も、当然のことながら、選択される投与レジメンと臨床診断に応じて適合可能なＡＤＣを、他の抗がん剤と併用することができる。
【０４５４】
より一般的に述べると、本発明による治療の対象となる腫瘍性病態は、良性でも悪性でもよく、固形腫瘍でも造血器悪性腫瘍でもよく、限定されないが、副腎腫瘍、エイズに付随するがん、胞巣状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、自律神経節腫瘍、膀胱がん（扁平上皮細胞がん及び移行上皮がん）、胞胚腔病変、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤様骨嚢腫、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳及び脊椎のがん、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈小体腫瘍、子宮頸がん、軟骨肉腫、脊索腫、色素嫌性腎細胞がん、淡明細胞がん、結腸がん、大腸がん、皮膚良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、上皮細胞病変、ユーイング腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨性線維形成不全症、線維性骨異形成症、胆嚢がん及び胆管がん、胃がん、胃腸がん、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、腺病変、頭頸部がん、視床下部病変、腸がん、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎芽腫、乳頭状腎細胞がん）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫性腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫性腫瘍、肝臓がん（肝芽腫、肝細胞がん）、リンパ腫、リンパ腫（ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫）、肺がん（小細胞がん、腺がん、扁平上皮細胞がん、大細胞がん等）、マクロファージ病変、髄芽腫、メラノーマ、髄膜腫、多発性内分泌腫瘍症、多発性骨髄腫（形質細胞腫、限局性骨髄腫及び髄外性骨髄腫を含む）、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患（骨髄線維症、真性多血症及び本態性血小板減少症を含む）、神経芽細胞腫、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、副甲状腺腫瘍、小児がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、前立腺がん、後部ブドウ膜メラノーマ、希少造血器疾患、転移性腎臓がん、横紋筋腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟組織肉腫、扁平上皮細胞がん、胃がん、間質性疾患、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺がん、胸腺腫、転移性甲状腺がん、及び子宮がん（子宮頸がん、子宮内膜がん及び平滑筋腫を含む）から構成される群から選択することができる。
【０４５５】
ＩＸ．製品
本発明は、１個以上の容器ないしレセプタクルを含む医薬パック及びキットを包含し、各容器に１回分以上の用量の本発明の抗体又はＡＤＣを収容することができる。このようなキット又はパックは、実際に診断又は治療用とすることができる。所定の実施形態において、前記パック又はキットは、例えば１種以上の他の薬剤の存在下又は不在下で、本発明の抗体又はＡＤＣと、任意に１種以上の抗がん剤を含有する単位用量即ち規定量の組成物を収容している。所定の他の実施形態において、前記パック又はキットは、レポーター分子を結合したか又は結合しない検出可能な量の抗ＥＭＲ２抗体又はＡＤＣと、任意にがん細胞の検出、定量及び／又は視覚化用の１種以上の他の薬剤とを収容している。
【０４５６】
いずれにせよ、本発明のキットは、一般に、適切な容器ないしレセプタクルに収容された本発明の抗体又はＡＤＣと、同一又は異なる容器に収容された薬学的に許容される製剤と、任意に１種以上の抗がん剤とを含むであろう。前記キットは、更に、診断又は併用療法用の他の薬学的に許容される製剤又は装置も含むことができる。診断装置又は計器の例としては、増殖性疾患に関連する細胞又はマーカーを検出、モニター、定量又はプロファイリングするために使用できるものが挙げられる（このようなマーカーの詳細な一覧については上記参照）。実施形態によっては、循環腫瘍細胞をインビボ又はインビトロで検出、モニター及び／又は定量するために、前記装置を使用することができる（例えば、ＷＯ２０１２／０１２８８０１参照）。更に、他の実施形態において、前記循環腫瘍細胞は造腫瘍性細胞を含むことができる。本発明のキットは、更に、本発明の抗体又はＡＤＣを抗がん剤又は診断薬と組み合わせるのに、適した試薬を含むことができる（例えば米国特許第７，４２２，７３９号参照）。
【０４５７】
キットのコンポーネントを１種以上の溶液として提供する場合に、前記溶液は、非水性でもよいが、一般には水溶液が好ましく、滅菌水溶液が特に好ましい。キットに含まれる製剤は、乾燥粉末又は適切な液体を添加して再構成することができる凍結乾燥形態で提供することもできる。再構成に使用される液体は、別の容器に収容することができる。このような液体は、薬学的に許容される滅菌緩衝液又は他の希釈剤（例えば静菌性注射用水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液又はブドウ糖液）を含むことができる。キットが他の治療薬又は薬剤と共に本発明の抗体又はＡＤＣを含む場合には、等モルとなるように配合するか又は一方の成分が他方よりも多くなるように前記溶液をプレミックスすることができる。あるいは、本発明の抗体又はＡＤＣと任意に添加する抗がん剤又は他の薬剤（例えばステロイド剤）とを、患者に投与するまで別個の容器に別々にしておくこともできる。
【０４５８】
所定の好ましい実施形態において、本発明の組成物を含む上記キットは、キット内容物をがんの治療、予防及び／又は診断に使用できることを記したラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は注意書きを含むであろう。他の好ましい実施形態において、前記キットは、がんに罹患している対象を治療するために、キット内容物を所定の投与量又は投与レジメンに従って投与できることを記したラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は注意書きを含むことができる。特に好ましい態様において、前記ラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は注意書きは、キット内容物を造血器悪性腫瘍（例えばＡＭＬ）の治療、予防及び／又は診断に使用できることを記しており、あるいはその治療に適した投与量又は投与レジメンを記している。他の特に好ましい態様において、前記ラベル、マーカー、添付文書、バーコード及び／又は注意書きはキット内容物を肺がん（例えば腺がん）の治療、予防及び／又は診断に使用できることを記しており、あるいはその治療に適した投与レジメンを記している。
【０４５９】
適切な容器ないしレセプタクルとしては、例えばボトル、バイアル、シリンジ、輸液バッグ（静注バッグ）等が挙げられる。容器は、ガラスや医薬用に適合可能なプラスチック等の種々の材料から形成することができる。所定の実施形態において、レセプタクルは、滅菌開封口を含むことができる。例えば、容器は、皮下注射針で穴を開けることができるストッパー付きの静注溶液バッグ又はバイアルとすることができる。
【０４６０】
実施形態によっては、前記キットは、前記抗体と任意に含まれる成分とを患者に投与する手段を含むことができ、例えば、製剤を対象に注射若しくは導入又は患部に塗布することができる、１個以上の針若しくは（プレフィルド又は空の）シリンジ、点眼器、ピペット又は他の同様の装置が挙げられる。本発明のキットは、更に、一般にはバイアル等と他のコンポーネントとを市販用に密封するための手段を含み、例えば所望のバイアルと他の装置とをブロー成形プラスチック容器に挿入して保持する。
【０４６１】
Ｘ．その他
本願に特に定義しない限り、本発明に関して使用する科学技術用語は、当分野の通常の知識をもつ者に広く理解されている意味とする。更に、文脈からそうでないことが明白である場合を除き、単数形の用語は複数も含み、複数形の用語は単数も含む。更に、本明細書及び特許請求の範囲に記載する範囲は両端と両端間の全点を含む。したがって、２．０〜３．０の範囲は２．０と、３．０と、２．０から３．０の間の全点を含む。
【０４６２】
一般に、本願に記載する細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学並びに化学の技術は、当分野で周知の広く使用されている技術である。このような技術に関して、本願で使用する命名法も当分野で広く使用されている。特に記載しない限り、本発明の方法及び技術は、一般に本明細書の随所に引用する種々の参考資料に記載されているような当分野で周知の従来方法に従って実施される。
【０４６３】
ＸＩ．参考資料
特定の資料に関して、「本願に援用する」という表記を使用するか否かに拘わらず、本願に引用する全特許、特許出願及び刊行物と電子版資料（例えば、例えばＧｅｎＢａｎｋとＲｅｆＳｅｑに登録されているヌクレオチド配列、例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＢＤに登録されているアミノ酸配列、及びＧｅｎＢａｎｋとＲｅｆＳｅｑに登録されているアノテーション付きコーディング領域からの翻訳を含む）の開示内容全体を、本願に援用する。以上の詳細な説明と以下の実施例は、単に理解し易くすることを目的としている。これらの記載により不必要に制限されるものと解釈すべきではない。本発明は、明記・記載する厳密な内容に限定されない。当業者に自明の変形も特許請求の範囲に記載する発明に含まれる。本願で使用する各項目の見出しは、構成上の目的に過ぎず、記載する保護対象を制限するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【０４６４】
以上、本発明の全般について説明したが、以下の実施例を参照することにより、更によく理解されよう。なお、以下の実施例は、例証の目的であり、本発明を制限するものではない。これらの実施例は、以下の実験が実施された全ての実験であるという意味ではない。特に指定しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又は大気圧付近である。
【０４６５】
配列表一覧
表３は本願に含まれるアミノ酸及び核酸配列の一覧である。
【０４６６】
【表３】
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【０４６７】
腫瘍細胞株一覧
ＰＤＸ腫瘍細胞タイプは、略号の後に特定の腫瘍細胞株を表す番号を付けて表示される。試験した試料の継代数は、試料記号に付けたｐ０−ｐ＃により示され、ｐ０は、患者腫瘍から直接得られた未継代試料を表し、ｐ＃は、試験前に腫瘍をマウスで継代した回数を表す。本願では、下表４に示す腫瘍タイブ及びサブタイプの略号を使用する。
【０４６８】
【表４】
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【０４６９】
［実施例１］完全なトランスクリプトームシーケンシングを使用したＥＭＲ２発現の同定
がん患者に存在する場合のような固形腫瘍の細胞不均一性を特性決定し、臨床的に適切な標的を同定するために、当分野で公知の技術を使用して大規模なＰＤＸ腫瘍バンクを作製し、維持した。種々の悪性固形腫瘍に罹患したがん患者から得られた初代腫瘍細胞の複数継代により、多数の別個の腫瘍細胞株を含むＰＤＸ腫瘍バンクを免疫不全マウスで拡大させた。継代数の少ないＰＤＸ腫瘍は、その天然環境における腫瘍を代表するものであり、腫瘍成長と現行治療法に対する耐性をもたらす根本的なメカニズムを洞察するのに臨床的に適切である。
【０４７０】
腫瘍細胞は、非造腫瘍性細胞（ＮＴＧ）と腫瘍始原細胞（ＴＩＣ）の２種類の細胞亜集団に大別することができる。ＴＩＣは、免疫不全マウスに移植したときに腫瘍を形成することができる。がん幹細胞（ＣＳＣ）は、多系統分化能を維持しながら無限に自己複製することができるＴＩＣのサブセットである。ＮＴＧは、インビボで増殖できる場合もあるが、移植したときに元の腫瘍の不均一性を再現する腫瘍を形成しないであろう。
【０４７１】
完全なトランスクリプトーム解析を実施するために、ＰＤＸ腫瘍が８００〜２，０００ｍｍ３に達した後、又はＡＭＬの場合には白血病が骨髄に定着した後（ヒト由来の骨髄細胞密度が＜５％）にマウスから切除した。当分野で公知の酵素消化技術を使用して、切除後のＰＤＸ腫瘍を、シングルセル浮遊液に解離させた（例えば、米国特許出願第２００７／０２９２４１４号参照）。解離後のバルク腫瘍細胞を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と共にインキュベートして死細胞を検出し、抗マウスＣＤ４５及びＨ−２Ｋｄ抗体によりマウス細胞を同定し、抗ヒトＥＰＣＡＭ抗体によりヒト細胞を同定した。更に、腫瘍細胞を、蛍光標識抗ヒトＣＤ４６及び／又はＣＤ３２４抗体と共にインキュベートし、ＣＤ４６ｈｉＣＤ３２４＋ＣＳＣ又はＣＤ４６ｌｏ／−ＣＤ３２４−ＮＴＧ細胞を同定した後、ＦＡＣＳＡｒｉａセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して選別した（米国特許出願第２０１３／０２６０３８５号、２０１３／００６１３４０号及び２０１３／００６１３４２号参照）。ＡＭＬについては、多くの場合にはＰＤＸ株から大腿骨と脛骨を採取し、骨髄を抽出した。シングルセル浮遊液を、低張塩化アンモニウム／カリウム（ＡＣＫ）溶液で処理して赤血球を減少させ、ＣＤ４５、ＣＤ３３、ＣＤ３４及びＣＤ３８に対する抗ヒト抗体で染色し、ヒト細胞を検出した。場合により、患者から直接得られた末梢血又は骨髄試料を、マウスで予め増殖させずに使用した。
【０４７２】
２−メルカプトエタノール１％を添加したＲＬＴｐｌｕｓ  ＲＮＡ溶解緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）に細胞を溶解させ、溶解液を−８０℃で凍結させた後、溶解液を解凍し、ＲＮｅａｓｙ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡ抽出することにより、腫瘍細胞からＲＮＡを抽出した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び／又はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＲＮＡを定量した。正常組織ＲＮＡは、種々の業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、ＢｉｏＣｈａｉｎ及びＣｌｏｎｔｅｃｈ）から購入した。得られた全ＲＮＡ調製物を、遺伝子シーケンシング及び遺伝子発現解析により評価した。より具体的には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００又は２５００次世代シーケンシングシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）を使用して、所定の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び肺腫瘍試料を解析した。
【０４７３】
これについては、本実施例１で上述したように、単離したＮＴＧ又はＣＳＣ腫瘍亜集団から抽出した全ＲＮＡ５ｎｇを使用して作製したｃＤＮＡで、Ｉｌｌｕｍｉｎａによる完全なトランスクリプトーム解析を実施した。ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）を使用して、ライブラリーを作製した。得られたｃＤＮＡライブラリーを断片化し、バーコード化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームからのシーケンシングデータは、遺伝子のエクソン領域にマッピングされたＦＰＫＭ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ：１００万リード当たり１キロベース当たりの断片数）値を使用した断片発現値として名目的に表されるので、塩基配列による遺伝子発現解析を正規化し、ＦＰＫＭ転写産物として計数することができる。図２に示すように、ＡＭＬ及びＬＵ  ＣＳＣ腫瘍細胞亜集団（黒棒）におけるＥＭＲ２  ｍＲＮＡ発現は、一般に正常細胞（グレー棒）及びＮＴＧ細胞集団（白棒）のどちらの発現レベルよりも高かった。
【０４７４】
ＡＭＬ及び肺腫瘍ＣＳＣ集団の両者でＥＭＲ２  ｍＲＮＡ発現の増加が確認されたことから、ＥＭＲ２は、潜在的な診断及び免疫療法標的として更に評価する価値があると判断される。更に、ＣＳＣにおけるＥＭＲ２の発現は、ＡＭＬ及びＬＵ  ＰＤＸ腫瘍におけるＮＴＧに比較して増加していることから、ＥＭＲ２はこれらの腫瘍タイプにおける造腫瘍性細胞の良好なマーカーであると判断される。
【０４７５】
［実施例２］ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した腫瘍におけるＥＭＲ２  ｍＲＮＡの発現解析
図１Ｄ及び１Ｅに示し、上述したように、ヒトＥＭＲ２遺伝子は、６．５ｋｂｐの２１エクソン長標準型全長アイソフォーム（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０１３４４７）と、従来記載されているもの（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿００１２７１０５２、ＮＭ＿１５２９１６、ＮＭ＿１５２９１６＿１７、ＮＭ＿１５２９１８）；図１Ｄも参照）と本願で初めて記載されたもの（図１Ｅ参照）とを含めた種々の長さの数個の短いアイソフォームを含む、複数の転写産物を潜在的にコードする。ＥＭＲ２タンパク質（「ｈＥＭＲ２」）の長いアイソフォームは、３２８アミノ酸の７回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体タンパク質（ＮＰ＿０３８４７５）である。従来記載されているアイソフォームの大半は、１個以上のエクソンをスキップしてＥＧＦ様ドメインの１〜３個を欠失した短いＥＣＤとするか又はストーク領域を短縮することにより、作製されている。２種を除く全アイソフォームは、無傷の７ＴＭドメインとＧＰＳ配列とをもつことから、膜結合と翻訳後自己消化切断とが、無傷のままであると予想される。エクソン１６又はエクソン１６とエクソン１７とが欠失する２種のアイソフォームでは、７ＴＭと潜在的にＧＰＳの内側とに欠失が生じるが、これらのアイソフォームが、ＥＭＲ２タンパク質アイソフォームの局在とトラフィキングとに影響を与えるか否か及びその方法については、不明である。更に、従来記載されている種々のエクソン欠失は、種々に組み合わせて存在することも考えられるので、アイソフォームの潜在数は更に増えることも考慮すべきである。従来記載されている全アイソフォームは、ＥＭＲ２のＥＣＤに直接影響を与えるので、これらのアイソフォームのどれが発現されても、本願に記載する抗体の標的となる所定のエピトープに影響を与えることができる。（例えばＥＧＦ様ドメイン１及び２を標的とすることにより）全ての潜在的なアイソフォームと結合するＡｂを作製すること、あるいは（例えばＥＧＦ様ドメイン３〜５又はストーク領域を標的とすることにより）アイソフォームの１種又はサブセットとより限定的に結合するＡｂを作製することが、考えられる。短いアイソフォームには、主に正常細胞に存在するものもある（図１Ｅ参照）ので、ＡＭＬ及び他の腫瘍細胞を特異的に標的とし、正常細胞とは殆ど又は全く結合しないようにする可能性が開ける。
【０４７６】
腫瘍細胞におけるＥＭＲ２  ＲＮＡ発現を確認するために、産業用標準プロトコールに従って、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＢｉｏＭａｒｋ（ＴＭ）ＨＤ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、種々のＰＤＸ細胞株又は一次患者試料で、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。実施例１に記載したように、バルクＰＤＸ腫瘍細胞又は選別後のＣＳＣ亜集団とＮＴＧ亜集団とから、ＲＮＡを抽出した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、製造業者の指示に従って使用して、ＲＮＡ１．０ｎｇをｃＤＮＡに変換した。次に、ＥＭＲ２プローブ特異的Ｔａｑｍａｎアッセイを使用して予め増幅したｃＤＮＡ材料を、その後のｑＲＴ−ＰＣＲ実験に使用した。
【０４７７】
正常組織におけるＥＭＲ２発現をＡＭＬ、ＬＵ−Ａｄ及びＬＵ−ＳＣＣ  ＰＤＸ腫瘍細胞株における発現と比較した（図３；各丸印は個々の組織又はＰＤＸ細胞株の平均相対発現を表し、短い横線は幾何平均を表す）。「正常」は膀胱、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、脳、乳房、前立腺、胸腺、副腎、結腸、後根神経節、内皮細胞（動脈、静脈、血管平滑筋）、食道、心臓、腎臓、肝臓、肺、膵臓、骨格筋、皮膚（全細胞及び単離細胞としての繊維芽細胞及び角化細胞）、小腸、脾臓、胃、気管及び精巣の各正常組織の試料を表す。発現が最高の２種の正常組織は脾臓とＰＢＭＣである。図３から明らかなように、平均すると、ＥＭＲ２発現は正常組織に比較してＡＭＬとＬＵ−Ａｄ及びＬＵ−ＳＣＣのサブセットのほうが高かったが、幾何平均は全体としてＬＵ腫瘍検体のほうが低かった。このデータは、ＡＭＬと選択されたＬＵ  ＰＤＸでは正常組織に比較してＥＭＲ２の発現が増加するという先の結果を裏付けるものである。
【０４７８】
［実施例３］マイクロアレイを使用した腫瘍におけるＥＭＲ２  ｍＲＮＡの発現の測定
種々の腫瘍ＰＤＸ株におけるＥＭＲ２の発現レベルを測定するためのマイクロアレイ実験を、以下のように実施し、データを解析した。ＡＭＬ、ＬＹＭ、ＭＭ、ＬＵ−Ａｄ、ＬＵ−ＳＣＣ及びＢＬ  ＰＤＸ腫瘍から、実質的に実施例１に記載したように、全腫瘍全ＲＮＡ１〜２μｇを抽出した。ヒトゲノムにおける２７，９５８種の遺伝子と７，４１９種のｌｎｃＲＮＡに対して設計された５０，５９９個の生物学的プローブとを含むＡｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  ＧＥ  Ｈｕｍａｎ  ８ｘ６０  ｖ２マイクロアレイプラットフォームを使用して、試料を分析した。標準産業用プラクティスを使用して、強度値を正規化及び変換し、各試料の遺伝子発現を定量化した。各試料におけるＥＭＲ２発現の正規化強度を図４にプロットし、各腫瘍タイプで得られた幾何平均を横線で示す。正常組織は乳房、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、ＰＢＭＣ、皮膚、脾臓及び胃を含む。
【０４７９】
図４を精査すると、ＡＭＬ、ＬＹＭ、ＭＭ及びＢＬ腫瘍細胞株と、ＬＵ−Ａｄ及びＬＵ−ＳＣＣの少なくとも一部の腫瘍試料では正常組織に比較してＥＭＲ２発現がアップレギュレートされることが明らかである。上記腫瘍タイプでＥＭＲ２発現の増加が認められたことから、先の実施例の結果が裏付けられる。特に、全３種のプラットフォームで分析したＡＭＬ腫瘍試料はＥＭＲ２発現の実質的な増加を示す。より一般的に言うと、これらのデータはＥＭＲ２がＡＭＬ、ＬＹＭ、ＭＭ、ＬＵ−Ａｄ、ＬＵ−ＳＣＣ及びＢＬを含む多数の腫瘍サブタイプで発現され、これらの適応症における抗体療法の開発の良好な標的となり得ることを実証するものである。
【０４８０】
［実施例４］Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓを使用した腫瘍におけるＥＭＲ２発現解析
Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）と呼ばれる原発腫瘍と正常試料の大規模な公共入手可能なデータセットを使用して、種々の腫瘍におけるｈＥＭＲ２  ｍＲＮＡの過剰発現を確認した。ＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑ＿ＲＮＡＳｅｑＶ２プラットフォームからのｈＥＭＲ２発現データをＴＣＧＡ  Ｄａｔａ  Ｐｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｔｃｇａ−ｄａｔａ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｃｇａ／ｔｃｇａＤｏｗｎｌｏａｄ．ｊｓｐ）からダウンロードし、パーシングし、各遺伝子の個々のエクソンからのリード数を総計し、マッピングされた１００万リード当たりエクソン１キロベース当たりの片側リード数（ＲＰＫＭ）を求めた。図５から明らかなように、ＥＭＲ２発現は、正常組織に比較してＡＭＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞（ＤＬＢＣ）及びＬＵ−Ａｄ一次患者試料で増加している。これらのデータから、更に、種々の腫瘍タイプで高レベルのＥＭＲ２  ｍＲＮＡを検出できることが確認され、抗ＥＭＲ２抗体とＡＤＣとは、これらの腫瘍に有用な治療手段となり得ると判断される。
【０４８１】
図６は、患者生存率データを入手できたＬＵ−Ａｄ  ＴＣＧＡ腫瘍のサブセットのカプランマイヤー腫瘍曲線を示す。ＬＵ−Ａｄ腫瘍におけるＥＭＲ２  ｍＲＮＡの高レベル発現、即ち閾値指数値を上回る発現又はＥＭＲ２  ｍＲＮＡの低レベル発現、即ち閾値指数値を下回る発現に基づいて、患者を階層化した。閾値指数値はＲＰＫＭ値の７５パーセンタイル点として計算し、２．７４であった。
【０４８２】
プロットの下に記載した「各時点の直前までの生存数」は、各患者を最初に診断した日（０日）から２０００日後毎にデータセットに残っている生存患者数を示す。２本の生存率曲線は、ログランク（マンテル・コックス）検定によると有意差（ｐ＝０．００６６）があり、ゲーハン・ブレスロウ・ウィルコクソン検定によるとｐ＝０．００８８である。これらのデータから明らかなように、ＥＭＲ２の高レベル発現を示すＬＵ−Ａｄ腫瘍患者は、ＥＭＲ２の低レベル発現を示すＬＵ−Ａｄ腫瘍患者に比較して生存時間が著しく短い。このことから、ＥＭＲ２療法は、ＬＵ−Ａｄを治療するのに抗有用であり、ＥＭＲ２発現は、治療決定の基礎となる予後バイオマーカーとして有用であると考えられる。
【０４８３】
［実施例５］組換えＥＭＲ２タンパク質のクローニング及び発現と細胞表面ＥＭＲ２タンパク質を過剰発現する細胞株の作製
全長ヒトＥＭＲ２（ｈＥＭＲ２）ＤＮＡコンストラクト
全長ｈＥＲＭ２タンパク質を過剰発現する細胞株を作製するために、成熟ｈＥＲＭ２タンパク質をコードするオープンリーディングを含むレンチウイルスベクターを以下のように作製した。先ず、標準分子クローニング技術を使用し、ＩｇＫシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を導入した後、ｐＣＤＨ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＥＦ１−ｃｏｐＧＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のマルチクローニングサイトの上流にアスパラギン酸／リジンエピトープタグを挿入し、ベクターｐＬＭＥＧＰＡを作製した。このデュアルプロモーターコンストラクトはｃｏｐＧＦＰ  Ｔ２Ａ  Ｐｕｒｏレポーターと選択マーカーの発現を誘導する下流のＥＦ１プロモーターから独立してアスパラギン酸／リジンタグ付き細胞表面タンパク質の発現を誘導するためにＣＭＶプロモーターを利用する。ｐＬＭＥＧＰＡにおけるＴ２Ａ配列は、ペプチド結合縮合のリボソームスキップを促進し、その結果、Ｔ２Ａペプチドの上流にコードされるレポーターｃｏｐＧＦＰの高レベル発現と、ピューロマイシンの存在下で選択を可能にするＴ２Ａペプチドの下流にコードされるＰｕｒｏ選択マーカータンパク質の共発現という、２種の独立したタンパク質が発現される。
【０４８４】
ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１３４４７を基準として使用して成熟ｈＥＭＲ２タンパク質（残基Ｑ２４〜Ｎ８２３）をコードする合成ＤＮＡ断片を、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に作製委託した。合成遺伝子を哺乳動物細胞株で発現できるようにコドン最適化させ、ＩｇＫシグナルペプチド−アスパラギン酸／リジンエピトープタグの下流でｐＬＭＥＧＰＡにインフレームでサブクローニングできるように制限エンドヌクレアーゼ部位を両端に付加した。こうして、成熟ｈＥＭＲ２タンパク質のＮ末端にアスパラギン酸／リジンタグを付けた融合タンパク質をコードするｐＬＭＥＧＰＡ−ｈＥＭＲ２−ＮＦｌａｇレンチウイルスベクターを得た。
【０４８５】
ｈＥＭＲ２細胞外ドメイン融合タンパク質
ｈＥＲＭ２タンパク質の細胞外ドメインの部分を含む融合タンパク質を作製するために、成熟ポリペプチドの始点からＧＰＳドメインの始点まで（例えばＱ２４〜Ｑ４７８）のｈＥＲＭ２タンパク質のＮ末端細胞外領域又は前記タンパク質のＥＣＤストーク領域をコードする小さい領域（例えばＤ２９１〜Ｑ４７８）をコードする合成ＤＮＡ断片を、ＧｅｎｅＡｒｔに作製委託した。これらのＤＮＡ分子の配列を、哺乳動物細胞で発現できるようにコドン最適化させた。ｈＥＭＲ２  ＥＣＤを含む融合又はタグ付きタンパク質を発現するコンストラクト又はその断片のその後の全操作に、これらのＤＮＡ断片を使用した。特に、標準分子技術を使用し、ｈＥＲＭ２ポリペプチド残基Ｑ２４〜Ｑ４７８をコードするＤＮＡを、９×ヒスチジンタグ（ｈＥＲＭ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓ）又はヒトＩｇＧ２  Ｆｃタンパク質（ｈＥＲＭ２−ＥＣＤ−Ｆｃ）をコードするＤＮＡとインフレームで融合したコンストラクトを作製した。同様に、標準分子技術を使用し、ｈＥＲＭ２ポリペプチド残基Ｄ２９１〜Ｑ４７８をコードするＤＮＡを、９×ヒスチジンタグ（ｈＥＲＭ２−ＥＣＤｓｔａｌｋ−Ｈｉｓ）又はヒトＩｇＧ２  Ｆｃタンパク質（ｈＥＲＭ２−ＥＣＤｓｔａｌｋ−Ｆｃ）をコードするＤＮＡとインフレームで融合したコンストラクトを作製した。
【０４８６】
ｈＥＭＲ２タンパク質のＥＣＤに対する免疫反応性抗体を作製するために使用することができる免疫原を作製するために、標準分子技術を使用して、上記キメラ融合遺伝子を、免疫グロブリンκ（ＩｇＫ）シグナルペプチド配列の下流でＣＭＶ誘導型発現ベクターにインフレームでサブクローニングした。ＣＭＶ誘導型発現ベクターは、ＨＥＫ２９３Ｔ及び／又はＣＨＯ−Ｓ細胞で高レベルの一過的発現を可能にする。ポリエチレンイミンポリマーをトランスフェクト試薬として使用し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の浮遊培養液若しくは接着培養液又はＣＨＯ−Ｓ細胞の浮遊培養液に、ｈＥＭＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓ、ｈＥＭＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ、ｈＥＲＭ２−ＥＣＤｓｔａｌｋ−Ｈｉｓ又はｈＥＲＭ２−ＥＣＤｓｔａｌｋ−Ｆｃの１種から選択される発現コンストラクトをトランスフェクトした。トランスフェクションの３〜５日後に、タグに応じてＮｉｃｋｅｌ−ＥＤＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）又はＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＴＭ）プロテインＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムを使用して、清澄化細胞上清からｈＥＭＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓ、ｈＥＭＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ、ｈＥＲＭ２−ＥＣＤｓｔａｌｋ−Ｈｉｓ、又はｈＥＲＭ２−ＥＣＤｓｔａｌｋ−Ｆｃタンパク質を精製した。
【０４８７】
全長カニクイザルＥＭＲ２（ｃＥＭＲ２）ＤＮＡコンストラクト
カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＥＭＲ２タンパク質（ｃＥＭＲ２）に関して本発明で必要な全分子及び細胞材料を作製するために、ｈＥＭＲ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＮＣＢＩのカニクイザル全ゲノムショットガンコンティグ配列データベースと比較してＢＬＡＳＴ解析し、ヒト遺伝子とカニクイザル遺伝子の間でエクソン／イントロン境界が保存されていることを確認し、ｃＥＭＲ２をコードする推定カニクイザルオープンリーディングフレームをアセンブルすることにより、先ずｃＥＭＲ２オープンリーディングフレーム配列を推定した。結果を解析した処、ｈＥＭＲ２タンパク質とｃＥＭＲ２タンパク質とは、８９．３％一致していた。
【０４８８】
上記のように得られたヌクレオチド配列を基準として使用し、成熟ｃＥＭＲ２タンパク質（残基Ｑ２４〜Ｎ８１６）をコードする合成ＤＮＡ断片を、ＧｅｎｅＡｒｔに作製委託した。合成遺伝子を、哺乳動物細胞株で発現できるようにコドン最適化させ、ＩｇＫシグナルペプチド−アスパラギン酸／リジンエピトープタグの下流でｐＬＭＥＧＰＡにインフレームでサブクローニングできるように制限エンドヌクレアーゼ部位を両端に付加した。こうして、成熟ｃＥＭＲ２タンパク質のＮ末端にアスパラギン酸／リジンタグを付けた融合タンパク質をコードするｐＬＭＥＧＰＡ−ｃＥＭＲ２−ＮＦｌａｇレンチウイルスベクターを得た。
【０４８９】
カニクイザルＥＭＲ２（ｃＥＭＲ２）細胞外ドメイン融合タンパク質
ｃＥＭＲ２タンパク質の細胞外ドメインに関して本発明で必要な全分子及び細胞材料を作製するために、上記ｐＬＭＥＧＰＡベクターの内側に含まれるｃＥＭＲ２オープンリーディングフレームをＰＣＲ反応の鋳型として使用し、成熟ポリペプチドの始点からＧＰＳドメインの始点まで（例えばＤ２５〜Ｑ４７１）のｃＥＲＭ２タンパク質のＮ末端細胞外領域又は前記タンパク質のＥＣＤストーク領域をコードする小さい領域（例えばＤ２８８〜Ｑ４７１）をコードする合成ＤＮＡ断片を増幅した。ＩｇＫシグナルペプチド配列の下流でかつ９×ヒスチジンタグ又はヒトＩｇＧ２  Ｆｃ  ｃＤＮＡの上流でＣＭＶ誘導型発現ベクターにインフレームでサブクローニングできるように、所望の残基をコードするＤＮＡの両端に適切な制限部位を付加した。同様のヒト融合タンパク質について上述したように、組換えｃＥＭＲ２−ＥＣＤ−Ｈｉｓ又はｃＥＭＲ２−ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質を作製した。
【０４９０】
ヒト及びカニクイザルＣＤ９７（ｈＣＤ９７及びｃＣＤ９７コンストラクト）
本願に開示する抗体をスクリーニングするために、実質的に上記のようにヒト及びカニクイザルＣＤ９７コンストラクトを作製した。より具体的には、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０７８４８１を基準として使用して、ヒトＣＤ９７コンストラクトを設計した。全長成熟ヒトＣＤ９７タンパク質（残基Ｑ２１〜Ｉ８４５）をコードする合成ＤＮＡ断片をＧｅｎｅＡｒｔに作製委託し、ｈＥＭＲ２について上述したと同様にＩｇＫシグナルペプチド−アスパラギン酸／リジンエピトープタグの下流でｐＬＭＥＧＰＡベクターにサブクローニングし、ｐＬＭＥＧＰＡ−ｈＣＤ９７−ＮＦｌａｇを得た。ヒトＣＤ９７−ＥＣＤ−Ｈｉｓ及びｈＣＤ９７−ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするコンストラクトを作製するために、ＩｇＫシグナルペプチド配列の下流でかつ９×ヒスチジンタグ又はヒトＩｇＧ２  Ｆｃ  ｃＤＮＡの上流でＣＭＶ誘導型発現ベクターに、インフレームでサブクローニングできるように適切な制限部位を両端に付加した残基Ｑ２１〜Ｒ５５２をコードするＤＮＡ断片を、ＰＣＲにより増幅した。得られたＣＭＶ−ｈＣＤ９７−ＥＣＤ−Ｈｉｓ及びＣＭＶ−ｈＣＤ９７−ＥＣＤ−Ｆｃの２つのＤＮＡコンストラクトを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ及び／又はＣＨＯ−Ｓ細胞にトランスフェクトし、同様のｈＥＭＲ２融合タンパク質について上述したようにｈＣＤ９７−ＥＣＤ−Ｈｉｓ又はｈＣＤ９７−ＥＣＤ融合タンパク質を作製した。
【０４９１】
ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００５５８８２４３を基準として使用して、カニクイザルＣＤ９７  ＥＣＤ（残基Ｑ２３〜Ｒ５５４）をコードする合成ＣＤ９７  ＤＮＡ断片を設計し、ＧｅｎｅＡｒｔに作製委託し、ＩｇＫシグナルペプチド配列の下流でかつ９×ヒスチジンタグの上流でＣＭＶ誘導型発現ベクターにインフレームで直接サブクローニングした。同様のｈＣＤ９７融合タンパク質について上述したように、組換えｃＣＤ９７−Ｈｉｓタンパク質を作製した。
【０４９２】
細胞株作製
ｐＬＭＥＧＰＡ−ｈＥＭＲ２−Ｎｆｌａｇ、ｐＬＭＥＧＰＡ−ｃＥＭＲ２−ＮＦｌａｇ又はｐＬＭＥＧＰＡ−ｈＣＤ９７−ＮＦｌａｇの３種類のレンチウイルスベクターを使用し、当業者に周知の標準レンチウイルス形質導入技術を使用してｈＥＭＲ２、ｃＥＭＲ２又はｈＣＤ９７タンパク質を過剰発現する安定なＨＥＫ２９３Ｔ系細胞株を作製した。ピューロマイシンを使用して形質導入された細胞を選択した後、発現度の高いＨＥＫ２９３Ｔサブクローン（例えばＧＦＰとＦＬＡＧエピトープについて強く陽性であった細胞）を蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）に供した。
【０４９３】
［実施例６］抗ＥＭＲ２抗体の作製
抗ＥＭＲ２マウス抗体を作製するために、Ｂａｌｂ／ｃ系マウス１匹、ＦＶＢ系１匹及びＣＤ−１系１匹にｈＥＭＲ２−Ｈｉｓタンパク質１０μｇ、ｃＥＭＲ２−Ｈｉｓストークタンパク質１０μｇ又はｈＥＭＲ２若しくはｃＥＭＲ２を過剰発現する２９３Ｔ細胞を、適切なアジュバントと共に接種した。初期接種後、マウスにｈＥＭＲ２−Ｈｉｓタンパク質１０μｇを適切なアジュバントと共に週２回ずつ４週間注射し、最終接種は、ｈＥＭＲ２−Ｈｉｓタンパク質１０μｇ、ｃＥＭＲ２−Ｈｉｓストークタンパク質１０μｇ又はｈＥＭＲ２若しくはｃＥＭＲ２を過剰発現する２９３Ｔ細胞を適切なアジュバントと共に使用して行った。
【０４９４】
マウスを屠殺し、所属リンパ節（膝窩、鼡径及び内側腸骨）を切除し、抗体産生細胞の原料として使用した。モデルＢＴＸ  Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用してエレクトロセルフュージョンによりＢ細胞（４３０×１０６個）のシングルセル懸濁液を非分泌性Ｓｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５８１）と１：１の比で融合させた。アザセリン、１５％胎児クローンＩ血清、１０％ＢＭ条件培地、１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵペニシリン−ストレプトマイシン及び５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを添加したＤＭＥＭ培地から構成されるハイブリドーマ選択培地に細胞を再浮遊させ、Ｔ２２５フラスコ４本で１本当たり１００ｍＬの選択培地にて培養した。５％ＣＯ２と９５％空気を含む加湿３７℃インキュベーターにフラスコを入れ、６日間保温した。
【０４９５】
融合から６日後に、ハイブリドーマライブラリー細胞をフラスコから採取し、ライブラリーを液体窒素に保存した。凍結したバイアルを解凍してＴ７５フラスコに空け、翌日、（ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｉセルソーターを使用して）Ｆａｌｃｏｎ  ３８４ウェルプレート１５枚で（上記のような）添加物入りハイブリドーマ選択培地９０μＬに、ハイブリドーマ細胞をウェル当たり細胞１個の割合で播種した。
【０４９６】
ハイブリドーマを１０日間培養し、フローサイトメトリーを以下のように実施することにより、ｈＥＭＲ２に特異的な抗体について上清をスクリーニングした。ｈＥＭＲ２を安定的に形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ウェル当たり１×１０５個の割合でハイブリドーマ上清２５μＬと共に３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで洗浄後、ＤｙｅＬｉｇｈｔ  ６４９で標識したヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ断片特異的二次抗体をＰＢＳ／２％ＦＣＳで３００倍に希釈し、この希釈液を１試料当たり２５μＬ加えて１５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄し、ＤＡＰＩを添加したＰＢＳ／２％ＦＣＳに再浮遊させ、蛍光量がアイソタイプ対照抗体で染色した細胞を上回るかどうかをフローサイトメトリーにより解析した。残りの未使用のハイブリドーマライブラリー細胞を、将来のライブラリー試験とスクリーニングに備えて液体窒素で凍結させた。
【０４９７】
免疫操作の結果、ｈＥＭＲ２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞と免疫特異的に反応するが、ナイーブＨＥＫ２９３Ｔ細胞とは反応しない、相当数のマウス抗体が得られた。
【０４９８】
［実施例７］抗ＥＭＲ２抗体の特性決定
種々の方法を使用し、実施例６で作製した抗ＥＭＲ２マウス抗体を、アイソタイプ、エピトープビニング、更にカニクイザル及びヒトＥＭＲ２とヒトＣＤ９７を発現する細胞を染色又は殺傷する能力について、特性決定した。図７は多数の代表的なマウス抗ｈＥＭＲ２抗体の特性をまとめた表である。「ＮＤ」はアイソタイプが決定されなかったことを表し、「ｍｉｘ」は２種類以上のアイソタイプが検出されたことを表す。
【０４９９】
Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘマウス免疫グロブリンアイソタイピングキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を製造業者のプロトコールに従って使用し、多数の代表的な抗体のアイソタイプを決定した。ＥＭＲ２特異的抗体の結果を、図７の最終列に示す。
【０５００】
多重競合イムノアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）を使用して、抗体をビンにグループ化した。１０μｇ／ｍＬの濃度の各抗ＥＭＲ２抗体（キャプチャーｍＡｂ）１００μｌを、抗マウスκ抗体に結合させておいた磁気ビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）と共に１時間インキュベートした（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＭＩＤ：２１２２３９７０）。キャプチャーｍＡｂ／結合ビーズ複合体を、ＰＢＳＴＡ緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、プールした。残留している緩衝液洗浄液を除去した後、ビーズをｈＥＭＲ２−Ｈｉｓタンパク質２μｇ／ｍＬと共に１時間インキュベートし、洗浄後、ＰＢＳＴＡに再懸濁した。各ウェルに抗ＥＭＲ２抗体（ディテクターｍＡｂ）を含むように、プールしたビーズ混合物を９６ウェルプレートに分配し、１時間振盪培養した。洗浄工程後、ＰＥで修飾した抗マウスκ抗体（上記で使用したものと同じ）を５μｇ／ｍｌの濃度でウェルに加え、１時間インキュベートした。ビーズを再び洗浄し、ＰＢＳＴＡに再懸濁した。Ｌｕｍｉｎｅｘ  ＭＡＧＰＩＸ計器を使用して平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を測定した。抗体対のピアソンの相関係数から計算した距離行列のデンドログラムとして、抗体ペアリングを視覚化した。抗体対のＭＦＩ値のデンドログラムと解析に基づいて、ビニングを決定した。図７から明らかなように、スクリーニングした抗ＥＭＲ２抗体は、ｈＥＭＲ２タンパク質上で少なくとも３つのユニークなビン（Ａ〜Ｃ）にグループ化できる。
【０５０１】
代表的な抗体を、更に、フローサイトメトリーにより試験し、細胞表面に発現させたｈＥＭＲ２、ｃＥＭＲ２及びＣＤ９７と結合する能力について調べた。このために、（実施例５に準じて作製した）ｈＥＭＲ２、ｃＥＭＲ２及びｈＣＤ９７を過剰発現する改変型ＨＥＫ２９３Ｔ細胞とナイーブ対照細胞とを、指定の抗体と共に３０分間インキュベートし、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターを製造業者の指示に従って使用して、フローサイトメトリーによりｈＥＭＲ２発現について解析した。抗原発現は、アイソタイプ対照抗体で染色した同一細胞と比較して、抗ＥＭＲ２抗体で染色した改変型細胞の表面で観測された幾何平均蛍光強度の差（ΔＭＦＩ）として定量化される。改変型細胞と非改変型細胞とにおける幾何平均蛍光強度の差（ΔＭＦＩ）も観測した。平均蛍光強度として表したアッセイの結果を、図７のＦＣの欄に示す。これらのデータを精査すると、本願に開示する抗体のうちの数種は、細胞表面のｈＥＭＲ２及びｃＥＭＲ２と結合することが明らかである。更に、これらの同一抗体のうちには、明白にｈＣＤ９７と結合するものもあるが、ＳＣ９３．２５４やＳＣ９３．２６６のように結合しないものもあり、ＥＭＲ２抗原に対する特異性を強化できると判断される。
【０５０２】
生きた腫瘍細胞への細胞毒性薬の送達を促すために、本発明の抗ＥＭＲ２抗体が内在化できたか否かを判定するために、代表的な抗ＥＭＲ２抗体とサポニンに結合させた二次抗マウス抗体ＦＡＢ断片とを使用し、インビトロ細胞殺傷アッセイを実施した。サポニンは、リボソームを失活させることによりタンパク質合成を阻害し、その結果として細胞の死滅をもたらす植物由来毒素である。サポニンは、リボソームに接近する細胞の内側のみで細胞毒性であり、独立して内在化することができない。したがって、これらのアッセイで、サポニンによる細胞毒性が検出されるならば、結合した抗ＥＭＲ２マウス抗体が標的細胞に結合及び内在化するときに、抗マウスＦＡＢ−サポニンコンストラクトは内在化が可能であると判断される。
【０５０３】
（実施例５に準じて作製した）ｈＥＭＲ２、ｃＥＭＲ２及びｈＣＤ９７を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞と、ナイーブ対照細胞のシングルセル浮遊液とを、ＢＤ組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にウェル当たり細胞５００個の割合で播種した。１日後に、培養液に一定濃度の２ｎＭ抗マウスＩｇＧ  ＦＡＢ−サポニンコンストラクト（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に、図７に記載する精製抗ＥＭＲ２抗体を、種々の濃度で加えた。９６時間インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、製造業者の指示に従って使用して、生存細胞を計数した。二次ＦＡＢ−サポニン複合体のみと共にインキュベートした細胞を含む培養液を使用した生の発光カウント数を１００％基準値とし、他の全カウント数を基準値に対する百分率として計算した。結果を生存細胞の百分率として示す。
【０５０４】
これらのデータから明らかなように、２５０ｐＭの濃度の抗ＥＭＲ２抗体−サポニン複合体のサブセットは、ｈＥＭＲ２、ｃＥＭＲ２及び／又はＣＤ９７を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を種々の効力で有効に殺傷した（図７）が、同一条件下でナイーブ２９３Ｔ対照は除去されなかった。興味深いことに、試験した抗体のうちの数種（例えばＳＣ９３．２３９、ＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５５）は、ｈＥＭＲ２とｃＥＭＲ２とを発現する細胞を除去することができたが、ｈＣＤ９７を発現する細胞を除去することはできなかった。本願に記載するように、このような特性をもつ抗体は、細胞毒性の低減を示すため、特に有益な治療指数が得られると思われる。
【０５０５】
［実施例８］ＥＭＲ２抗体のシーケンシング
実施例６で作製した抗ＥＭＲ２マウス抗体を、以下のようにシーケンシングした。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用し、選択されたハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを精製した。１試料当たり細胞１０４〜１０５個を使用した。単離したＲＮＡ試料を、使用時まで−８０℃で保存した。
【０５０６】
全長マウスＶＨレパートリーを標的とするように設計された８６個のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む２種の５’プライマーミックスを、全マウスＩｇアイソタイプに特異的な３’マウスＣγプライマーと併用して、各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を増幅した。同様に、κ軽鎖を増幅及び配列決定するために、Ｖκマウスファミリーの各々を増幅するように設計された６４個の５’Ｖκリーダー配列を含む２種のプライマーミックスを、マウスκ定常領域に特異的な単一のリバースプライマーと併用した。ＱｉａｇｅｎワンステップＲＴ−ＰＣＲキットを使用して、全ＲＮＡ１００ｎｇからＶＨ及びＶＬ転写産物を以下のように増幅した。ＲＴ−ＰＣＲ反応を、Ｖκ軽鎖に２回とＶＨ重鎖に２回ずつ各ハイブリドーマに合計４回行った。ＰＣＲ反応混合物は、ＲＮＡ１．５μＬ、１００μＭ重鎖又はκ軽鎖プライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで特注合成したもの）０．４μＬ、５×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液５μＬ、ｄＮＴＰ１μＬ、及び逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼを含む酵素ミックス０．６μＬとした。サーマルサイクラープログラムは、５０℃で６０分、９５℃で１５分のＲＴ工程の後、（９４．５℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で１分）を３５サイクル行った。その後、７２℃で１０分間最終インキュベーションを行った。
【０５０７】
可変領域の増幅について上述したと同一の特異的可変領域プライマーを使用し、抽出したＰＣＲ産物を配列決定した。ＰＣＲ産物を、外部のＰＣＲ精製及びシーケンシングサービス用シーケンシング業者（ＭＣＬＡＢ）に送った。ＩＭＧＴ配列解析ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｍｅｄｉｃａｌ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ａｎａｌｙｓｉｓ．ｈｔｍｌ）を使用してヌクレオチド配列を解析し、配列相同度が最高の生殖細胞系列Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子メンバーを同定した。私設抗体配列データベースを使用してＶＨ及びＶＬ遺伝子をマウス生殖細胞系列データベースと整列させることにより、ＩｇＶ領域及びＪ領域の公知生殖細胞系列ＤＮＡ配列と得られた配列を比較した。
【０５０８】
図８Ａは、抗ＥＭＲ２抗体に由来する多数の新規マウス軽鎖可変領域の連続アミノ酸配列を示し、図８Ｂは、同一の抗ＥＭＲ２抗体に由来する新規マウス重鎖可変領域の連続アミノ酸配列を示す。マウス軽鎖及び重鎖可変領域アミノ酸配列を配列番号２１〜８３の奇数番号に示す。
【０５０９】
より詳細には、図８Ａ及び８Ｂは、多数のマウス抗ＥＭＲ２抗体、即ち配列番号２１のＶＬと配列番号２３のＶＨをもつＳＣ９３．１５；配列番号２５のＶＬと配列番号２７のＶＨをもつＳＣ９３．３４；配列番号２９のＶＬと配列番号３１のＶＨをもつＳＣ９３．５１；配列番号３３のＶＬと配列番号３５のＶＨをもつＳＣ９３．１６０；配列番号３７のＶＬと配列番号３９のＶＨをもつＳＣ９３．２１６；配列番号４１のＶＬと配列番号４３のＶＨをもつＳＣ９３．２１９；配列番号４５のＶＬと配列番号４７のＶＨをもつＳＣ９３．２２１；配列番号４９のＶＬと配列番号５１のＶＨをもつＳＣ９３．２３４；配列番号５３のＶＬと配列番号５５のＶＨをもつＳＣ９３．２３９；配列番号５７のＶＬと配列番号５９のＶＨをもつＳＣ９３．２４３；配列番号６１のＶＬと配列番号６３のＶＨをもつＳＣ９３．２５２；配列番号６５のＶＬと配列番号６７のＶＨをもつＳＣ９３．２５３；配列番号６９のＶＬと配列番号７１のＶＨをもつＳＣ９３．２５５；配列番号７３のＶＬと配列番号７５のＶＨをもつＳＣ９３．２５６及び配列番号７７のＶＬと配列番号７９のＶＨをもつＳＣ９３．２６７のアノテーション付き配列を示す。更に、図８Ａ及び８Ｂは、配列番号２１のＶＬ（ＳＣ９３．１５のＶＬと同一）と配列番号８１のＶＨをもつＳＣ９３．１５．１、及び配列番号８３のＶＬと配列番号７５のＶＨ（ＳＣ９３．２５６のＶＬと同一）をもつＳＣ９３．２６６のアノテーション付き配列を示す。これらのデータを下表５にまとめる。
【０５１０】
【表５】
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【０５１１】
Ｋａｂａｔ法に準じて定義されるフレームワーク領域（即ちＦＲ１〜ＦＲ４）と相補性決定領域（即ち図８ＡのＣＤＲＬ１〜ＣＤＲＬ３又は図８ＢのＣＤＲＨ１〜ＣＤＲＨ３）とを同定するように、ＶＬ及びＶＨアミノ酸配列にアノテーションを付与する。Ａｂｙｓｉｓデータベースの私設バージョンを使用して可変領域配列を解析し、ＣＤＲとＦＲとの区画を決定した。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法に準じて定義するが、当業者に自明の通り、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＭｃＣａｌｌｕｍ法又は他の任意の公認の命名システムに準じて、ＣＤＲとＦＲの区画を定義することもできる。図８Ｃは、図８Ａ及び８Ｂに記載したアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２０〜８２の偶数番号）を示す。
【０５１２】
図８Ａ及び８Ｂに示すように、特定の各マウス抗体の重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列の配列番号は、一般に、連続奇数番号である。即ち、モノクローナル抗ＥＭＲ２抗体ＳＣ９３．１５は、軽鎖及び重鎖可変領域に夫々アミノ酸配列番号２１及び２３を含み、ＳＣ９３．３４は配列番号２５及び２７を含み、ＳＣ９３．５１は配列番号２９及び３１を含み、以下同様である。図８Ａ及び８Ｂに記載する番号付けスキームの例外は、ＳＣ９３．１５．１（配列番号２１及び８１）とＳＣ９３．２６６（配列番号８３及び７５）であり、各々可変領域（夫々ＶＬ及びＶＨ）が他の配列決定された抗体と同一である。いずれにせよ、マウス抗体アミノ酸配列をコードする対応する核酸配列を図８Ｃに示し、その配列番号は、対応するアミノ酸配列番号の直前の番号とする。即ち、例えば、ＳＣ９３．１５抗体のＶＬ及びＶＨの核酸配列の配列番号は夫々配列番号２０及び２２である。
【０５１３】
図８Ａ〜８Ｃのアノテーション付き配列に加え、図８Ｇ〜８Ｉは、Ｋａｂａｔ法、Ｃｈｏｔｈｉａ法、ＡＢＭ法及びＣｏｎｔａｃｔ法を使用して決定したＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲの区画を示す。図８Ｇ〜８Ｉに示すＣＤＲの区画は、上述したようにＡｂｙｓｉｓデータベースの私設バージョンを使用して決定した。以下の実施例に示すように、本願に開示するマウスＣＤＲをヒトフレームワーク配列にグラフトすると、本発明のＣＤＲグラフト又はヒト化抗ＥＭＲ２抗体を得られることが、当業者に理解されよう。更に、本開示に鑑み、本願の教示に従って作製・配列決定した任意の抗ＥＭＲ２抗体のＣＤＲを容易に決定し、得られたＣＤＲ配列を使用して、本発明のＣＤＲグラフト又はヒト化抗ＥＭＲ２抗体を得ることができる。特に、図８Ａ及び８Ｂに記載するような重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗体が得られる。
【０５１４】
［実施例９］ビンＣの抗ＥＭＲ２抗体はＥＭＲ２のストーク領域を認識する
上記実施例の抗ＥＭＲ２抗体について更に検討し、観測したビンに関連する抗体エピトープの位置を調べた。
【０５１５】
より具体的には、ＥＬＩＳＡアッセイを実施し、選択された抗体がどの位置でＥＭＲ２タンパク質と結合しているかをマッピングした。要約すると、９６ウェルプレート（ＶＷＲ，６１０７４４）を炭酸ナトリウム緩衝液中１μｇ／ｍＬのｈＥＭＲ２（Ｑ２４〜Ｑ４７８）−ＥＣＤ−Ｈｉｓ又はｈＥＭＲ２（Ｑ２４〜Ｑ４７８）−ＥＣＤ−Ｆｃタンパク質で４℃に一晩コーティングした。プレートを洗浄し、２％ＦＣＳ−ＰＢＳで３７℃にて１時間ブロックし、すぐに使用するか又は４℃で保存した。未希釈ハイブリドーマ上清をプレート上で室温にて１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０，０００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧで室温にて１時間プロービングした。基質溶液と共にインキュベーション後にプレートのＯＤ４５０値を読み取った。
【０５１６】
アッセイの結果を図９に示し、図中、各データ点は異なる抗体を表し、シグナルレベルは結合の指標である。図９から明らかなように、ビンＣに含まれると判定された抗体は、ＥＭＲ２タンパク質のストーク領域（即ち残基２６１〜４７８）と会合することが判明した。
【０５１７】
［実施例１０］フローサイトメトリーを使用した腫瘍上のＥＭＲ２発現の検出
フローサイトメトリーを使用し、本発明の抗ＥＭＲ２抗体が一次及びＰＤＸ  ＡＭＬ腫瘍試料とＬＵ  ＰＤＸ腫瘍細胞株の表面におけるヒトＥＭＲ２タンパク質の存在を特異的に検出する能力について評価した。更に、ＬＵ  ＣＳＣの表面におけるＥＭＲ２の発現も調べた。
【０５１８】
マウスから大腿骨と脛骨とを摘出することによりＡＭＬ  ＰＤＸ試料を採取した。結合している筋組織を除去した後、骨を集め、乳鉢・乳棒を使用して粉砕し、骨髄を骨の残余から分離した。細胞浮遊液を回収し、低張塩化アンモニウム／カリウム溶液（ＡＣＫ）に暴露して赤血球を溶解させた。氷上で５分間インキュベーション後、２％ウシ胎児血清を添加したＰＢＳ緩衝液（ＦＳＭ）を加えることにより赤血球溶解を停止し、遠心により細胞を回収し、ナイロンメッシュを使用して組織破片を濾過した。一次ヒトＡＭＬ試料を得、Ｆｉｃｏｌｌで分離した単核細胞として冷凍保存し、解凍し、ＦＳＭで１回洗浄し、分析に使用した。シングルセル浮遊液を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と共にインキュベートして死細胞を検出し、抗ヒトＣＤ４５及びＣＤ３３によりヒト白血病細胞を同定した。得られたシングルセル浮遊液は、ＮＴＧ細胞とＣＳＣの両方を含む腫瘍細胞と非腫瘍細胞とのバルク試料を構成した。バルクＡＭＬ白血病集団をＮＴＧ亜集団とＣＳＣ亜集団とに分けるために、ＰＤＸ腫瘍細胞を抗ヒトＣＤ３４及びＣＤ３８又は候補ＡＭＬ  ＣＳＣマーカーと共に更にインキュベートした。
【０５１９】
ＬＵ  ＰＤＸ腫瘍を採取し、当分野で公知の酵素組織消化技術を使用して解離させ、ＰＤＸ腫瘍細胞のシングルセル浮遊液を得た（例えば、米国特許出願第２００７／０２９２４１４号参照）。ＰＤＸ腫瘍シングルセル浮遊液を、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）と共にインキュベートして死細胞を検出し、抗マウスＣＤ４５及びＨ−２Ｋｄ抗体によりマウス細胞を同定し、抗ヒトＥＰＣＡＭ抗体によりヒト癌腫細胞を同定した。得られたシングルセル浮遊液は、ＮＴＧ細胞とＣＳＣとの両方を含む腫瘍細胞のバルク試料を構成した。バルクＬＵ  ＰＤＸ腫瘍細胞集団をＮＴＧ亜集団とＣＳＣ亜集団とに分けるために、ＰＤＸ腫瘍細胞を抗ヒトＣＤ４６及び／又はＣＤ３２４及びＥＳＡ抗体と共にインキュベートした（米国特許出願第２０１３／０２６０３８５号、２０１３／００６１３４０号及び２０１３／００６１３４２号参照）。
【０５２０】
いずれの場合も、ＣＤ９７を発現する細胞を殺傷する能力を殆ど示さない抗ＥＭＲ２抗体であるＳＣ９３．２６７を使用し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターを用いてフローサイトメトリーによりバルク又は選別後の腫瘍細胞をｈＥＭＲ２発現について分析した。
【０５２１】
図１０Ａから明らかなように、ＳＣ９３．２６７抗体は、試験したＡＭＬ試料（黒線）の各々でＩｇＧアイソタイプ対照抗体（グレー塗りつぶし部分）に比較して高レベルのｈＥＭＲ２の表面発現を検出した。患者の血液又は骨髄から新たに単離した多数の個々の一次ＡＭＬ試料と、樹立ヒトＡＭＬ  ＰＤＸ株に由来する白血病細胞とで、ＥＭＲ２特異的染色が認められる。これらのデータによると、ＥＭＲ２はこの疾患の多数のサブタイプを含む広範囲のＡＭＬ細胞で発現される。このような結果から更に、本発明の抗ＥＭＲ２抗体は、ＡＭＬの診断と治療に有用であり得ると判断される。
【０５２２】
図１０Ｂから明らかなように、抗ｈＥＭＲ２抗体ＳＣ９３．２６７は、選別後のＮＴＧ細胞又はアイソタイプ対照と比較して、ＣＳＣ  ＬＵ細胞の表面で高レベルのｈＥＭＲ２の発現を検出した。より詳細には、ＰＤＸ腫瘍試料ＬＵ１２３、ＬＵ２０５、ＬＵ３００（ＬＵ−Ａｄ）及びＬＵ１２０（ＬＵ−ＳＣＣ）は、ＩｇＧアイソタイプ対照抗体（グレー塗りつぶし部分）に比較し、ＬＵ及びＢＲ  ＰＤＸ腫瘍細胞のＣＳＣ亜集団（黒実線）とＮＴＧ亜集団（破線）とで、ｈＥＭＲ２発現の増加を示した。これは、ＥＭＲ２が、多数のＬＵ腫瘍サブタイプ（ＬＵ−Ａｄ及びＬＵ−ＳＣＣ）のＣＳＣで発現されることを実証するものである。注目すべき点として、ＭＡ及び／又はＱＰＣＲデータに基づくＲＮＡ測定でＥＭＲ２発現を示さなかったＬＵ５８及びＬＵ１３４の２種類のＬＵ  ＰＤＸ株は、ＥＭＲ２抗体による染色を示さず、ＭＲ２抗体の特異性が更に実証された。
【０５２３】
いずれの場合も、アイソタイプ対照抗体で染色した同一腫瘍と比較した抗ＥＭＲ２抗体で染色した腫瘍細胞の表面で観測された幾何平均蛍光強度の差（ΔＭＦＩ）として、発現を定量化することができる。分析した腫瘍細胞株の各々のΔＭＦＩをまとめた表を、図１０Ａ及び１０Ｂの挿入図として示す。総合すると、このデータは、ＥＭＲ２がＬＵ及びＡＭＬ腫瘍細胞で発現されることを示唆しており、このような腫瘍は、本願に開示する抗ＥＭＲ２抗体又は前記抗体を含む抗体薬物複合体による治療に感受性であると判断される。
【０５２４】
図１０Ａ及び１０Ｂに示す結合に加え、図１０Ｃから明らかなように、異なるエピトープビンに由来する選択された抗ｈＥＭＲ２抗体は、正常血液及び骨髄細胞、ＡＭＬ  ＰＤＸ株から単離した細胞、並びに造血器悪性腫瘍に由来する種々の細胞株の染色において相違する。これについては、健康なボランティアドナーからの血液を凝固しないようにＥＤＴＡ又はヘパリンで処理し、抗ｈＥＭＲ２抗体であるＳＣ９３．２３９（ビンＡ）とＳＣ９３．２６２（ビンＣ）で直接染色し、インキュベートし、洗浄し、抗マウスＩｇＧフルオロクロム標識抗体を使用して検出し、ＤＡＰＩで共染色して死細胞を除去した。次にＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の指示に従って使用して、フローサイトメトリーにより血液細胞を分析した。分画後の試料以外に、種々の血液成分をその前方／側方散乱性のみに基づいて電子ゲーティングした。このために、冷凍保存された正常骨髄を業者（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）から購入し、解凍し、洗浄し、ＥＭＲ２特異的抗体で染色し、抗ヒトＣＤ３４及びＣＤ３８抗体とＤＡＰＩで共染色した。生きたＣＤ３４＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞でゲーティング後に、ｈＥＭＲ２の発現を解析した。
【０５２５】
これらの試料と方法とを利用し、図１０Ｃは、血液顆粒球（Ｇｒａｎ）、単球（Ｍｏ）及びリンパ球（ＬＹＭ）で、ＳＣ９３．２３９及びＳＣ９３．２６２抗体により検出されたｈＥＭＲ２発現のヒストグラムを示す。太実線はＥＭＲ２発現を示し、グレー斜線ヒストグラムは適切なアイソタイプ対照のシグナルを示す。予想通り、どちらのクローンもヒトリンパ球を染色せず、強度は異なるが、どちらも単球を染色した。一方、顆粒球のサブセットを染色したのはクローンＳＣ９３．２３９のみであり、クローンＳＣ９３．２６２は顆粒球での存在量が少ないエピトープを認識すると判断される（例えば顆粒球はＳＣ９３．２６２により認識されないＥＭＲ２のアイソフォームを発現する）。同様に、骨髄以外のヒト正常細胞を分析した場合には、ＳＣ９３．２３９を使用したほうが強い染色が得られた。
【０５２６】
更に、ヒストグラムに示すように、クローンＳＣ９３．２３９は、ＣＤ３４＋骨髄細胞に存在するエピトープを認識するが、クローンＳＣ９３．２６２は、ＣＤ３４＋細胞を全く染色しない。ＡＭＬ  ＰＤＸ株に由来する白血病細胞を分析したところ、ｈＥＭＲ２特異的クローン間にも染色パターンの相違が認められた。即ち、クローンＳＣ９３．２３９は、ＡＭＬ３１ｐ２を染色したがＡＭＬ２３ｐ２を染色せず、クローンＳＣ９３．２６２は、ＡＭＬ２３ｐ２と反応したがＡＭＬ３１ｐ２とは反応しなかった。図１０Ｃは、更に、ＲＮＡ測定ではいずれもＥＭＲ２発現に陽性であるＫＧ１（ＡＭＬ）及びＤＥＬ（組織球増殖症）の２種類の造血細胞株でＥＭＲ２の表面発現が相違することを示す。どちらのクローンもＤＥＬ細胞を染色するが、ＫＧ１で陽性染色を示すのはクローンＳＣ９３．２３９のみである。ＥＭＲ２陰性でかつＣＤ９７陽性の細胞株であるＪＶＭ２（マントル細胞リンパ腫）は、どちらの抗体でも認識されず、ＥＭＲ２に対するそれらの特異性が更に実証される。
【０５２７】
要するに、これらのデータは、種々のエピトープ特異的抗ｈＥＭＲ２を作製したところ、正常及び悪性腫瘍細胞として異なる結合プロファイルをもつ造血器試料と特異的に結合するために使用できることを実証している。より具体的には、本発明の抗体は、主に造腫瘍性細胞により発現されるエピトープと反応するように作製及び／又は選択することができるので、有益な治療指数が得られると予想されよう。
【０５２８】
［実施例１１］キメラ及びヒト化抗ＥＭＲ２抗体の作製
当分野で公知の技術を使用して、以下のようにキメラ抗ＥＭＲ２抗体を作製した。全ＲＮＡをハイブリドーマから抽出し、ＰＣＲ増幅した。マウス抗体ＳＣ９３．２５３及びＳＣ９３．２５６のＶＨ及びＶＬ鎖のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントに関するデータを、対象核酸配列の解析から得た（核酸配列については図８Ｃ参照）。制限部位として、ＶＨ断片にはＡｇｅＩとＸｈｏＩを使用し、ＶＬ断片にはＸｍａＩとＤｒａＩＩＩを使用して、抗体のＶＨ及びＶＬ鎖のフレームワーク配列に特異的なプライマーセットを設計した。ＰＣＲ産物をＱｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した後、ＶＨ断片は制限酵素ＡｇｅＩ及びＸｈｏＩで消化し、ＶＬ断片はＸｍａＩ及びＤｒａＩＩＩで消化した。ＶＨとＶＬとの消化後のＰＣＲ産物を精製し、夫々、ＩｇＨ又はＩｇκ発現ベクターにライゲーションした。ライゲーション反応は、Ｔ４−ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）２００Ｕ、消化・精製後の遺伝子特異的ＰＣＲ産物７．５μＬ及び直鎖化ベクターＤＮＡ２５ｎｇで総容量１０μＬとして実施した。コンピテント大腸菌ＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を４２℃にてのヒートショック下にライゲーション産物３μＬで形質転換し、アンピシリンプレートに１００μｇ／ｍＬの濃度で播種した。増幅したライゲーション産物の精製と消化後、ＨｕＩｇＧ１を含むｐＥＥ６．４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ制限部位にＶＨ断片をクローニングし、Ｈｕ−κ軽鎖定常領域を含むｐＥＥ１２．４発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ制限部位にＶＬ断片をクローニングした。
【０５２９】
トランスフェクション試薬としてＰＥＩを使用して、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１及びｐＥＥ１２．４Ｈｕ−κ発現ベクターをＣＨＯ−Ｓ細胞にコトランスフェクションすることにより、全長マウス重鎖及び軽鎖可変領域とヒト定常領域とを含むキメラ抗体を発現させた。トランスフェクションから３〜６日後に上清を回収した。８００×ｇで１０分間遠心して、組換えキメラ抗体を含む培養上清から細胞破片を除去し、４℃で保存した。組換えキメラ抗体をプロテインＡビーズで精製した。
【０５３０】
私設コンピューター支援ＣＤＲグラフト法（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ，ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）と標準分子工学技術とを使用して、以下のようにマウス抗ＥＭＲ２抗体のＣＤＲグラフト化又はヒト化も行った。ヒト生殖細胞系列抗体配列のフレームワーク配列及びＣＤＲ標準型構造と、対応するマウス抗体のフレームワーク配列及びＣＤＲの最高相同度とに基づいて、可変領域のヒトフレームワーク領域を設計した。解析のために、Ｋａｂａｔらの番号付けに準じてＣＤＲドメインの各々へのアミノ酸の割り当てを行った。これについて、図５Ｈ〜５Ｊは、マウス抗体ＳＣ９３．２５３及びＳＣ９３．２５６に種々の解析スキームを使用して得られた重鎖及び軽鎖ＣＤＲを示す。マウスＫａｂａｔ  ＣＤＲと選択されたヒトフレームワークとを含む可変領域を設計した後、合成遺伝子セグメントから作製した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。次にヒト化抗体をクローニングし、キメラ抗体について上述した分子手法を使用して発現させた。（以下に詳述する所定の部位特異的コンストラクトを含む）代表的なヒト化ＥＭＲ２抗体コンストラクトの詳細を下表６に記載する。
【０５３１】
これについては、表６から明らかなように、最終的なヒト化抗体の安定性と均一性を強化するためにヒト化工程中にアミノ酸置換Ｔ５７Ｎを利用してＳＣ９３．２５３のＣＤＲの予想グリコシル化部位を除去したことに留意すべきである。この置換は最終的なｈＳＣ９３．２５３抗体に含まれる。
【０５３２】
【表６】
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【０５３３】
各々対応するマウス抗体（例えばＳＣ９３．２５３はＳＣ９３．２５６に由来する）のＶＬ及びＶＨ配列に由来するヒト化抗体ｈＳＣ９３．２５３（配列番号１０１及び１０３）及びｈＳＣ９３．２５６（配列番号１０５及び１０７）のＶＬ及びＶＨアミノ酸配列を、図８Ｄに示す。ＶＬ及びＶＨの対応する核酸配列を図８Ｅに記載する（配列番号１００〜１０６の偶数番号）。ヒト化コンストラクトの配列の一覧を、下表７に示す。
【０５３４】
【表７】
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【０５３５】
本実施例に記載した代表的なヒト化抗体は、臨床的に適合可能な抗体を本願に開示するように作製及び誘導できることを実証するものである。本発明の所定の態様では、このような抗体をＥＭＲ２ＡＤＣに組込み、有利な治療指数を示す組成物を提供することができる。
【０５３６】
［実施例１２］部位特異的抗ＥＭＲ２抗体の作製
上記表６及び７に記載したように、本願の教示に従って代表的な部位特異的抗体を作製した。これらの部位特異的コンストラクトは、クローン名に接尾辞「ｓｓ１」を付けた名称で呼称し、ｈＳＣ９３．２５３及びｈＳＣ９３．２５６可変領域を含む。
【０５３７】
表７に記載したコンストラクトについて説明すると、ｈＳＣ９３．２５３及びｈＳＣ９３．２５３ｓｓ１は、同一の可変領域アミノ酸配列（即ち配列番号１０１のＶＬと配列番号１０３のＶＨ）を含む。同様に、モノクローナル抗体ｈＳＣ９３．２５６及びｈＳＣ９３．２５６ｓｓ１は、各々配列番号１０５に記載したＶＬアミノ酸配列と配列番号１０７に記載したＶＨアミノ酸配列とを含む。（野生型ＩｇＧ１及び部位特異的の両方の）コンストラクトの各々の全長軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を図８Ｆに示し、重鎖Ｃ２２０Ｓ突然変異点と対応する天然型システイン結合パートナーを各々下線で示す。より具体的には、図８Ｆは代表的な抗体であるｈＳＣ９３．２５３（配列番号１１０及び１１１）、ｈＳＣ９３．２５３ｓｓ１（配列番号１１０及び１１３）、ｈＳＣ９３．２５６（配列番号１１４及び１１５）及びｈＳＣ９３．２５６ｓｓ１（配列番号１１４及び１１７）の全長重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を示す。
【０５３８】
部位特異的コンストラクトを以下のように作製した。
【０５３９】
天然型軽鎖（ＬＣ）定常領域及び重鎖（ＨＣ）定常領域を含み、天然ではＬＣのシステイン２１４（Ｃ２１４）と鎖間ジスルフィド結合を形成するＨＣの上部ヒンジ領域のシステイン２２０（Ｃ２２０）をセリン（Ｃ２２０Ｓ）で置換した改変型ヒトＩｇＧ１／κ抗ＥＭＲ２部位特異的抗体を作製した。アセンプリすると、ＨＣとＬＣとは、治療薬とのコンジュゲーションに適した２個の遊離システインを（軽鎖の２１４位に）含む抗体を形成する。特に指定しない限り、定常領域残基の全番号付けは、Ｋａｂａｔらに記載されているような番号付けスキームに準じる。
【０５４０】
より具体的には、ヒト化抗ＥＭＲ２抗体ｈＳＣ９３．２５３  ＨＣ（配列番号１１１）又はｈＳＣ９３．２５６  ＨＣ（配列番号１１５）の一方をコードする発現ベクターを、ＰＣＲ増幅及び部位特異的突然変異誘発用の鋳型として使用した。Ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ（Ｒ）システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、製造業者の指示に従って使用して、部位特異的突然変異誘発を実施した。
【０５４１】
ｈＳＣ９３．２５３のＣ２２０Ｓ突然変異体ＨＣ（配列番号１１３）をコードするベクターを、ｈＳＣ９３．２５３のκＬＣ（配列番号１１０）と共にＣＨＯ−Ｓ細胞にコトランスフェクトし、哺乳動物一過性発現システムを使用して発現させた。同様に、ＣＨＯ−Ｓ細胞を使用してｈＳＣ９３．２５６のＣ２２０Ｓ突然変異体ＨＣ（配列番号１１７）をコードするベクターをｈＳＣ９３．２５６のκＬＣ（配列番号１１４）と共にコトランスフェクトし、発現させた。
【０５４２】
Ｃ２２０Ｓ突然変異体を含む改変型抗ＥＭＲ２部位特異的抗体を、ｈＳＣ９３．２５３ｓｓ１及びｈＳＣ９３．２５６ｓｓ１と命名した。部位特異的抗体であるｈＳＣ９３．２５３ｓｓ１（配列番号１１０及び１１３）及びｈＳＣ９３．２５６ｓｓ１（配列番号１１４及び１１７）の全長ＬＣ及びＨＣのアミノ酸配列を、図８Ｆに示す。改変型抗ＥＭＲ２抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特性決定し、正しい突然変異体が作製されていることを確認した。ＤＴＴ（ジチオトレイトール）等の還元剤の存在下と不在下にＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製プレキャスト１０％Ｔｒｉｓ−グリシンミニゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。電気泳動後、ゲルをコロイド状クマシー溶液で染色した。還元条件下では、遊離ＬＣと遊離ＨＣに対応する２本のバンドが認められた。このパターンは、還元条件におけるＩｇＧ分子に典型的である。非還元条件下では、バンドターンは、天然型ＩｇＧ分子と異なり、ＨＣとＬＣの間にジスルフィド結合が不在であることを示した。ＨＣ−ＨＣ二量体に対応する９８ｋＤ付近のバンドが認められた。更に、遊離ＬＣに対応する微弱なバンドと、ＬＣ−ＬＣ二量体に対応する４８ｋＤ付近の顕著なバンドも認められた。若干量のＬＣ−ＬＣ種の形成は各ＬＣのＣ末端の遊離システインに起因すると予想される。
【０５４３】
本願に記載するように、部位特異的ＥＭＲ２抗体を作製できると、より均一な組成物を製造することが可能になり、標準的な従来技術のＡＤＣ組成物に比較して治療指数を改善することが可能になる。
【０５４４】
［実施例１３］抗ＥＭＲ２抗体のコンジュゲーション
末端マレイミド部分と遊離スルフヒドリル基とを介してマウス可変領域をもつ種々のキメラ抗体と（ｈＳＣ９３．２５３及びｈＳＣ９３．２５６の部位特異的コンストラクトを含む）ヒト化抗ＥＭＲ２抗体とをピロロベンゾジアゼピン（例えばＰＢＤ１及びＰＢＤ３）にコンジュゲートさせ、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）を作製し、ＳＣ９３．２３９  ＰＢＤ１、ＳＣ９３．２５３  ＰＢＤ１、ＳＣ９３．２５６  ＰＢＤ１、ＳＣ９３．２６７  ＰＢＤ１、ｈＳＣ９３．２５３ｓｓ１  ＰＢＤ１、ｈＳＣ９３．２５３ｓｓ１  ＰＢＤ３、ｈＳＣ９３．２５６ｓｓ１  ＰＢＤ１及びｈＳＣ９３．２５６ｓｓ１  ＰＢＤ３と命名した。以下の実施例では、これらの複合体を適切な複合体対照及び非複合体対照と共に使用する。
【０５４５】
天然型抗ＥＭＲ２ＡＤＣを以下のように作製した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）＋５ｍＭ  ＥＤＴＡ中、抗体１モル当たり所定モル数のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を室温で９０分間添加することにより、抗ＥＭＲ２抗体のシステイン結合を部分還元した。得られた部分還元調製物を、次にマレイミドリンカーを介して室温で最低３０分間かけてＰＢＤ１（ＰＢＤ１の構造は本明細書中で上記に示した）にコンジュゲートさせた。次に水で調製した１０ｍＭストック溶液を使用して、リンカー−薬物に比較して過剰のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を加えることにより、反応をクエンチした。２０分間の最低クエンチ時間後に、０．５Ｍ酢酸を添加してｐＨを６．０に調整した。３０ｋＤａメンブレンを使用してＡＤＣの調製物を透析濾過により透析濾過緩衝液に緩衝液交換した。透析濾過した抗ＥＭＲ２ＡＤＣにスクロースとポリソルベート２０を目標最終濃度まで加えて製剤化した。得られた抗ＥＭＲ２ＡＤＣを（ＵＶの測定により）タンパク質濃度、凝集（ＳＥＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により薬物対抗体比（ＤＡＲ）、及び活性（インビトロ細胞毒性）について分析した。
【０５４６】
改変型部分還元法を使用して、代表的な部位特異的ヒト化抗ＥＭＲ２ＡＤＣをコンジュゲートさせた。望ましい生成物は、各ＬＣ定常領域上の不対システイン（ｓｓ１コンストラクトのＣ２１４）に最大限にコンジュゲートされたＡＤＣであって、薬物対抗体比（ＤＡＲ）が２よりも大きい（ＤＡＲ＞２）ＡＤＣを最小限にしながら、ＤＡＲが２（ＤＡＲ＝２）のＡＤＣを最大限にするものである。コンジュゲーションの特異性を更に改善するために、リンカー−薬物とのコンジュゲーション前に安定化剤（例えばＬ−アルギニン）と穏和な還元剤（例えばグルタチオン）を利用する方法を使用して、抗体を選択的に還元した後、透析濾過・製剤化工程を行った。
【０５４７】
１Ｍ  Ｌ−アルギニン／５ｍＭ  ＥＤＴＡと規定濃度の還元型グルタチオン（ＧＳＨ）とを含有する緩衝液（ｐＨ８．０）で、各部位特異的抗体の調製物を室温にて最低２時間かけて選択的に還元した。次に３０ｋＤａメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ）を使用して、全調製物を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／３．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．０緩衝液に緩衝液交換し、還元性の緩衝液を除去した。得られた選択的還元型調製物を、次に、マレイミドリンカーを介して室温で最低３０分間かけてＰＢＤ１又はＰＢＤ３（ＰＢＤの構造は上記に示した）にコンジュゲートさせた。次に、水で調製した１０ｍＭストック溶液を使用して、リンカー−薬物に比較して過剰のＮＡＣを加えることにより、反応をクエンチした。２０分間の最低クエンチ時間後に、０．５Ｍ酢酸を添加してｐＨを６．０に調整した。得られたＡＤＣの部位特異的調製物を、３０ｋＤａメンブレンで透析濾過により透析濾過緩衝液に緩衝液交換した。透析濾過した抗ＥＭＲ２ＡＤＣに、次に、スクロースとポリソルベート２０を目標最終濃度まで加えて、製剤化した。得られた部位特異的抗ＥＭＲ２ＡＤＣを、（ＵＶの測定により）タンパク質濃度、凝集（ＳＥＣ）、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により薬物対抗体比（ＤＡＲ）、及び活性（インビトロ細胞毒性）について分析した。
【０５４８】
得られた複合体を、使用時まで保存した。
【０５４９】
［実施例１４］抗ＥＭＲ２ＡＤＣはインビトロ殺傷を助長する
生きた腫瘍細胞への細胞毒性薬の送達を助長するために本発明の抗ＥＭＲ２ＡＤＣが内在化できたか否かを判定するために、代表的な抗ＥＭＲ２ＡＤＣである（上記実施例に記載したように作製した）ｈＳＣ９３．２５３ｓｓ１  ＰＢＤ１、ｈＳＣ９３．２５３ｓｓ１  ＰＢＤ３、ｈＳＣ９３．２５６ｓｓ１  ＰＢＤ１及びｈＳＣ９３．２５６ｓｓ１  ＰＢＤ３を使用して、インビトロ細胞殺傷アッセイを実施した。この場合には、ＡＤＣ６を投与するためにＤＬ６を使用してＰＢＤ１を送達し、ＡＤＣ３を投与するためにＤＬ３を使用してＰＢＤ３を送達する。
【０５５０】
ｈＥＭＲ２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はナイーブＨＥＫ２９３Ｔ細胞のシングルセル浮遊液を、ＢＤ組織培養プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にウェル当たり細胞５００個の割合で播種した。１日後に、ＰＢＤ１又はＰＢＤ３とコンジュゲートさせた種々の濃度の精製ＡＤＣ又はヒトＩｇＧ１対照抗体を培養液に加えた。細胞を、３７℃／５％ＣＯ２下に９６時間インキュベートした。インキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造業者の指示に従って使用して、生存細胞を計数した。非処理細胞を含む培養液を使用した生の発光カウント数を１００％基準値とし、他の全カウント数を基準値に対する百分率として計算した。
【０５５１】
図１１Ａ（ＥＭＲ２＋細胞）及び１１Ｂ（ＥＭＲ２−細胞）から明らかなように、ＥＭＲ２決定基を発現する細胞は、複合体ヒトＩｇＧ１対照抗体に比較してヒト化部位特異的抗ＥＭＲ２ＡＤＣ（例えばｈＳＣ９３．２５３ｓｓ１  ＰＢＤ３及びｈＳＣ９３．２５６ｓｓ１  ＰＢＤ３）に著しく感受性であった。更に、ＥＭＲ２ＡＤＣは、ＥＭＲ２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に比較してＥＭＲ２を過剰発現しないナイーブＨＥＫ２９３Ｔ細胞には殆ど影響がなく、ＥＭＲ２抗原に対するＡＤＣの特異性が実証された（図１１Ｂ）。
【０５５２】
上記の結果は、抗ＥＭＲ２ＡＤＣがＥＭＲ２を発現する細胞への細胞毒性ペイロードの内在化と送達を特異的に助長できることを実証するものである。
【０５５３】
［実施例１５］ＥＭＲ２抗体薬物複合体は固形腫瘍成長をインビボで抑制する
上記結果に基づき、本発明の複合体ＥＭＲ２モジュレーターがＥＭＲ２を発現するヒト腫瘍の成長をインビボで減少・抑制することを実証しようとした。これについては、選択された本発明の抗体（ＳＣ９３．２５３、ＳＣ９３．２５６及びＳＣ９３．２６７）をＰＢＤ細胞毒性薬（ＰＢＤ１，ＤＬ６）と共有的に会合させ、得られたＡＤＣを試験し、免疫不全マウスにおいてヒトＰＤＸ腫瘍成長を抑制できることを実証した。
【０５５４】
このために、当分野で公知の技術を使用して、患者由来異種移植片（ＰＤＸ）肺腫瘍（ＬＵ１８７）を、雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤレシピエントマウスの脇腹の皮下で成長させた。腫瘍体積とマウス体重を、週２回モニターした。腫瘍体積が１５０〜２５０ｍｍ３に達したら、マウスを治療群にランダムに割り当て、（各々実質的に実施例１３に記載したように作製した）ＳＣ９３  ＡＤＣ（１．６ｍｇ／ｋｇ）又は抗ハプテン対照ＩｇＧ２ａ  ＰＢＤ１を腹腔内注射により単回注射した。投与後、腫瘍が８００ｍｍ３を超えるまで又はマウスに病状が現れるまで腫瘍体積とマウス体重をモニターした。全試験で、治療群のマウスは、腫瘍をもつ免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスで通常認められるものを上回る健康上の悪影響を示さなかった。
【０５５５】
図１２は、ＥＭＲ２発現を示すＬＵ１８７腫瘍をもつマウスにおいて、腫瘍成長に及ぼす本願に開示するＡＤＣの影響を示す。より詳細には、図１２は、基剤（図示せず）又は対照ＡＤＣ  ＩｇＧ２ａ  ＰＢＤ１と直接比較した場合に、抗ＥＭＲ２ＡＤＣの投与の結果として腫瘍抑制を生じたことを示す。
【０５５６】
代表的な複合体抗体が腫瘍体積をインビボで抑制できるという驚くべき結果は、ＥＭＲ２が増殖性疾患の治療の治療標的として有用であることを更に裏付けるものである。
【０５５７】
［実施例１６］抗ＥＭＲ２抗体を使用したＣＳＣのターゲティング
上記のように、腫瘍細胞は、非造腫瘍性細胞（ＮＴＧ）と腫瘍始原細胞ないし造腫瘍性細胞（ＴＩＣ）との２種類の細胞亜集団に大別することができる。造腫瘍性細胞は、免疫不全マウスに移植したときに腫瘍を形成することができるが、非造腫瘍性細胞はできない。がん幹細胞（ＣＳＣ）は、造腫瘍性細胞のサブセットであり、多系統分化能を維持しながら無限に自己複製することができる。腫瘍におけるＥＭＲ２発現を造腫瘍性の増加に相関できるか否かを判定するために、所定のＡＭＬ腫瘍細胞を分離し、以下のように分析した。
【０５５８】
より詳細には、ビオチンで標識した抗ヒトＣＤ３４及び抗ＥＭＲ２抗体（ＳＣ９３．２６７）で一次ヒトＡＭＬ試料を染色した。一次染色を実施した後、試料を洗浄し、ＡＰＣで標識したストレプトアビジンで再度染色し、ＳＣ９３．２６７＋細胞を検出した。次にＦＡＣＳＡｒｉａ（ＴＭ）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してこの試料をＣＤ３４−ＳＣ９３．２６７＋、ＣＤ３４−ＳＣ９３．２６７ｈｉｇｈ及びＤ３４＋ＳＣ９３．２６７＋の亜集団に分けた。各コホート５匹の雌性ＮＳＧ免疫不全マウスを２７５ｒａｄ全身照射によりコンディショニングし、上記３群の亜集団の細胞各１５，０００個を静脈内注射した。移植から１０週間後にマウスを安楽死させ、骨髄、末梢血及び脾臓を採取し、フローサイトメトリーにより白血病負荷を測定した。
【０５５９】
図１３Ａは、本願に開示するＥＭＲ２抗体ＳＣ９３．２６７を使用した細胞集団のゲーティング条件と分離とを示し、図１３Ｂは、造腫瘍性細胞亜集団を免疫不全マウスに注入すると、親腫瘍を再現できることを実証する。これについて、図１３Ａ及び１３Ｂは、この試料中の造腫瘍性細胞がＣＤ３４＋ＥＭＲ２＋細胞集団（図１３Ｂの黒三角）に属することを示す。したがって、本願に記載するＥＭＲ２特異的ＡＤＣのように、ＣＤ３４＋ＥＭＲ２＋細胞の集団を標的とする薬剤は、腫瘍関連細胞の造腫瘍性亜集団をターゲティングするために使用することができる。このようなターゲティングの結果として、有意な腫瘍退縮と腫瘍再発又はぶり返しの予防が得られると思われる。更に、患者の骨髄又は血液試料内のＣＤ３４＋ＥＭＲ２＋細胞を（例えばフローサイトメトリー又は共免疫組織化学法により）検出すると、診断又は予後目的に使用できよう。
【０５６０】
［実施例１７］ヒト化ＥＭＲ２抗体薬物複合体はＡＭＬ  ＰＤＸ腫瘍における白血病負荷をインビボで低減する
上記実施例でＥＭＲ２ＡＤＣにより目覚ましい結果が得られたことと、造血器悪性腫瘍に（例えば造腫瘍性細胞として）ＥＭＲ２＋造腫瘍性細胞が存在することが実証されたことに鑑み、本願に開示する化合物が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）等の種々の造血器悪性腫瘍を治療できることを実証するために、更に実験を行った。
【０５６１】
より具体的には、ＥＭＲ２を発現するＡＭＬ  ＰＤＸ株（例えばＡＭＬ１６及びＡＭＬ２３）を播種性白血病モデルで使用し、本願に開示するＡＤＣが免疫不全マウスにおける腫瘍負荷を有効に低減できるか否かを調べた。これについては、Ｍｕｌｔｉｒａｄ  ２５０Ｘ線照射装置（Ｆａｘｉｔｒｏｎ）を使用して、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／共通γ鎖ノックアウトマウス（ＮＳＧ）に、２７５の亜致死線量で全身照射した。照射後４８時間以内に、マウスにＡＭＬ細胞のシングルセル浮遊液を静脈内輸液した。腫瘍生着を確認するために、ランダムに選択したマウス３匹を所定の時点で安楽死させ、白血病負荷の評価のために骨髄、末梢血及び脾臓を採取した。このために、組織から細胞のシングルセル浮遊液を調製し、低張液で赤血球を溶解させ、ＣＤ４５及びＣＤ３３を認識するヒト特異的フルオロクロム標識抗体で細胞を染色した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＴＭ）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して染色した試料を解析し、各組織におけるヒト白血病細胞負荷の相対数を求めた。
【０５６２】
生着の確認後、マウスを体重によりランダムに分け、抗ＥＭＲ２ＡＤＣ又は夫々の対照を腹腔内注射した。ＡＭＬ１６の場合には、マウスに０．１ｍｇ／ｋｇのｈＳＣ９３．２５３ｓｓ１  ＰＢＤ１（例えばＡＤＣ６）、ｈＳＣ９３．２５６ｓｓ１  ＰＢＤ１、対照ＨｕＩｇＧ１．ｓｓ１  ＰＢＤ１又は基剤対照を１回注射した（図１４Ａ）。ＡＭＬ２３の場合には、マウスに０．２ｍｇ／ｋｇのＳＣ９３．２３９  ＰＢＤ１、ＳＣ９３．２５３  ＰＢＤ１、ＳＣ９３．２５６  ＰＢＤ１、ＳＣ９３．２６７  ＰＢＤ１、対照マウスＩｇＧ２ａ  ＰＢＤ１又は基剤対照を１回注射した（図１４Ｂ）。投与後のマウスの健康状態を定期的にモニターし、マウスに病状が現れた時点又は予め設定した時点で全マウスを安楽死させ、各マウスの骨髄、脾臓及び血液中の白血病負荷を上記のようにフローサイトメトリーにより解析した。図１４Ａ及び１４Ｂは、抗ＥＭＲ２ＡＤＣ投与後に白血病負荷がインビボで低減したことを示し、ＥＭＲ２がＡＭＬの治療の治療標的として有用であることを更に裏付けるものである。
【０５６３】
抗ＥＭＲ２ＡＤＣがＥＭＲ２を発現する腫瘍細胞（造腫瘍性細胞を含む）を特異的に殺傷することができ、長期間にわたって腫瘍成長をインビボで劇的に抑制できるという結果は、抗ＥＭＲ２ＡＤＣががん、特にＡＭＬの治療処置に有用であることを更に裏付けるものである。
【０５６４】
更に当業者に自明の通り、本発明の趣旨又は中心的属性を逸脱しない限り、他の特定の形態で本発明を実施してもよい。以上の本発明の説明はその代表的な実施形態のみを開示するものであり、当然のことながら他の変形も本発明の範囲内に含まれるとみなす。したがって、本発明は本願に詳細に記載した特定の実施形態に限定されない。より正確に言うならば、本発明の範囲と内容を表すものとして以下の特許請求の範囲を参照すべきである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ｂ−１】
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【図８Ｂ−２】
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【図８Ｃ−１】
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【図８Ｃ−２】
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【図８Ｃ−３】
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【図８Ｃ−４】
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【図８Ｃ−５】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ−１】
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【図８Ｇ−２】
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【図８Ｇ−３】
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【図８Ｇ−４】
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【図８Ｈ−１】
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【図８Ｈ−２】
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【図８Ｈ−３】
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【図８Ｈ−４】
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【図８Ｉ−１】
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【図８Ｉ−２】
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【図８Ｉ−３】
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【図８Ｉ−４】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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