(57)【要約】  本発明は、妊娠した対象からなどの試料中の非天然核酸の量を評価するための、非天然核酸が胎児特異的である、方法および組成物に関する。本明細書で提供される方法および組成物は、妊娠した対象における胎児状態などの状態のリスクを決定するために、使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠した対象からの試料中の胎児特異的核酸の量を評価する方法であって、試料が胎児特異的核酸および対象核酸を含み、方法が：
複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的のそれぞれについて、試料またはその一部に対して、少なくとも２つのプライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイを実施すること、ここで各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも２つのプライマー対の１つは、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対のもう１つは、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、および、
ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイからの結果を得るかまたは提供して、試料中の胎児特異的核酸の量を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
結果がレポートで提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
方法がさらに、試料中の胎児特異的核酸の量を、結果に基づいて決定することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
結果が、試料中の胎児特異的核酸の量を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
妊娠した対象からの試料中の胎児特異的核酸の量を評価する方法であって、試料が胎児特異的核酸および対象核酸を含み、方法が：
複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的のそれぞれについて、試料またはその一部に対して実施した、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイからの結果を得ること、ここで少なくとも２つのプライマー対を用い、各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、少なくとも２つのプライマー対の１つは、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対のもう１つは、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、および、
胎児特異的核酸の量を、結果に基づいて評価すること、
を含む、前記方法。
【請求項６】
試料中の胎児特異的核酸の量が、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの結果に基づく、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
結果がレポートから得られる、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも２つのプライマー対のもう１つのプライマー対もまた、プライマーにおいてＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の１つのアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
量が、全核酸に対する胎児特異的核酸の比率またはパーセンテージである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
結果が、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの情報提供的結果である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
量が、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの情報提供的結果に基づいている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
方法がさらに、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの情報提供的結果を選択することを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
選択された情報提供的結果が平均化されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイが、胎児特異的核酸および／または対象核酸の遺伝子型（または親の遺伝子型）に基づいて選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
方法がさらに、胎児特異的核酸および／または対象核酸の遺伝子型（または親の遺伝子型）を得ることを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
方法がさらに、複数のＳＮＶ標的を得ることを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
方法がさらに、複数のＳＮＶ標的のそれぞれについて少なくとも２つのプライマー対を得ることを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
複数のＳＮＶ標的が、少なくとも１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３または９６のＳＮＶ標的である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
複数のＳＮＶ標的が、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１または９０未満のＳＮＶ標的である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
複数のＳＮＶ標的が、７５未満のＳＮＶ標的である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
複数のＳＮＶ標的が情報提供的標的であり、複数のＳＮＶの情報提供的標的が、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２のＳＮＶの情報提供的標的である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
複数のＳＮＶの情報提供的標的が、３４、３３、３２、３１または３０未満のＳＮＶの情報提供的標的である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
複数のＳＮＶの情報提供的標的が、２５未満のＳＮＶの情報提供的標的である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
試料中の胎児特異的核酸の量が１０％未満である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
試料中の胎児特異的核酸の量が５％未満である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
親の遺伝子型が知られていないかまたは得られていない場合、方法がさらに：
親の遺伝子型の予測に基づいて、結果を評価すること、
を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
評価が、期待値最大化アルゴリズムを用いて実施される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
胎児特異的核酸が、胎児特異的無細胞ＤＮＡである、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
量を使用して、胎児へのリスクを決定する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
胎児へのリスクが、本明細書で提供されるいずれか１つの状態のリスクである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
複数のＰＣＲ定量アッセイが、リアルタイムＰＣＲアッセイまたはデジタルＰＣＲアッセイである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
方法がさらに、対象に対する処置を、胎児特異的核酸の量に基づき選択することを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
方法がさらに、胎児特異的核酸の量に基づき対象を処置することを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
方法がさらに、胎児特異的核酸の量に基づき、対象への処置に関する情報を提供することを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
方法がさらに、対象における胎児特異的核酸の量を、経時的にモニタリングすることまたはモニタリングを示唆することを含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
方法がさらに、対象における胎児特異的核酸の量を、その後の時点で評価することを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
方法がさらに、対象に投与する処置の効果を、胎児特異的核酸の量に基づき評価することを含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
処置が、本明細書で提供されるいずれか１つの処置である、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
試料が、少なくとも妊娠１０週齢の対象からのものである、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
１０％未満の胎児特異的核酸の量が、胎児苦痛を示す、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
試料またはその一部を提供するまたは取得することをさらに含む、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
核酸を試料から抽出することをさらに含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ＳＮＶ標的に対するプライマーを使用する増幅前ステップをさらに含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
試料が、血液、血漿または血清を含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
組成物またはキットであって、
少なくとも６つのＳＮＶの情報提供的標的のそれぞれについてプライマー対を含み、ここで各プライマー対は、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅する、
前記組成物またはキット。
【請求項４６】
少なくとも６つのＳＮＶの情報提供的標的のそれぞれについて別のプライマー対をさらに含む、請求項４５に記載の組成物またはキットであって、別のプライマー対がＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、前記組成物またはキット。
【請求項４７】
少なくとも６つのＳＮＶの情報提供的標的が、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２のＳＮＶの情報提供的標的である、請求項４５または４６に記載の組成物またはキット。
【請求項４８】
少なくとも６つのＳＮＶの情報提供的標的が、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６または２５未満のＳＮＶの情報提供的標的である、請求項４７に記載の組成物またはキット。
【請求項４９】
少なくとも６つのＳＮＶの情報提供的標的のそれぞれについて、別のプライマー対もまた、プライマーにおいてＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の１つのアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、請求項４５〜４８のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項５０】
組成物またはキットであって、
少なくとも１８のＳＮＶ標的のそれぞれについてプライマー対を含み、ここで各プライマー対は、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の別のアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅する、
前記組成物またはキット。
【請求項５１】
少なくとも１８のＳＮＶ標的のそれぞれについて別のプライマー対をさらに含み、ここで別のプライマー対が、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、請求項５０に記載の組成物またはキット。
【請求項５２】
少なくとも１８のＳＮＶ標的が、少なくとも２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７１、７５、８０、８５、９０または９５のＳＮＶ標的である、請求項５０または５１に記載の組成物またはキット。
【請求項５３】
少なくとも１８のＳＮＶ標的が、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１または９０未満のＳＮＶ標的である、請求項５２に記載の組成物またはキット。
【請求項５４】
少なくとも１８のＳＮＶ標的が７５未満のＳＮＶ標的である、請求項５３に記載の組成物またはキット。
【請求項５５】
少なくとも１８のＳＮＶ標的のそれぞれについて、別のプライマー対もまた、プライマーにおいてＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを、しかしＳＮＶ標的の１つのアレルに対しては３’二重ミスマッチを含み、かつＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、請求項５０〜５４のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項５６】
緩衝剤をさらに含む、請求項４５〜５５のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項５７】
ポリメラーゼをさらに含む、請求項４５〜５６のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項５８】
プローブをさらに含む、請求項４５〜５７のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項５９】
プローブが蛍光プローブである、請求項５８に記載の組成物またはキット。
【請求項６０】
使用説明書をさらに含む、請求項４５〜５９のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項６１】
使用説明書が、試料中の非天然核酸の量を決定するまたは評価するための説明書である、請求項６０に記載の組成物またはキット。
【請求項６２】
請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法で使用するための、請求項４５〜６１のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項６３】
本明細書で提供される方法のいずれか１つで使用するための、請求項４５〜６１のいずれか一項に記載の組成物またはキット。
【請求項６４】
方法であって、
請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法に基づいて胎児特異的核酸の量を得ること、および
対象または胎児におけるリスクを、量に基づいて評価すること、
を含む、前記方法。
【請求項６５】
処置または処置もしくは無処置に関する情報が、評価されたリスクに基づいて対象について選択されるかまたは対象に提供される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
方法がさらに、対象における胎児特異的核酸の量を経時的にモニタリングすること、またはモニタリングを示唆することを含む、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
対象が、妊娠期間１０週以降の間の１以上の時点でモニタリングされる、請求項６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、35 U.S.C. § 119(e)の元で、２０１６年４月２９日に出願された米国仮出願第62/330,044号の出願日の利益を主張し、この仮出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の分野
本発明は、対象からの試料中の非天然核酸の量を評価するための、方法および組成物に関する。本明細書で提供される方法および組成物は、胎児に関連するリスクを決定するために使用することができる。本発明はさらに、非天然無細胞デオキシリボ核酸（胎児特異的無細胞ＤＮＡなどの非天然無細胞ＤＮＡ）の量を評価するための、多重／最適化ミスマッチ増幅（ＭＯＭＡ）を使用した、方法および組成物に関する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は少なくとも部分的に、多重／最適化ミスマッチ増幅を用いて対象からの試料中の低頻度の非天然核酸を定量することができるという、驚くべき発見に基づく。多重／最適化ミスマッチ増幅は、特定配列の増幅のために３’末端から２番目のミスマッチを、しかし代替配列に対しては２重ミスマッチを含み得るプライマーの設計を包含する。かかるプライマーでの増幅は、核酸異種集団において、非天然核酸の量が例えば１％未満、または０．５％である場合でさえ、試料中の非天然核酸の量の定量的決定を可能にする。
【０００４】
本明細書に提供されるのは、かかる最適化された増幅に関連する方法、組成物およびキットである。本方法、組成物またはキットはそれぞれ、実施例および図面にあるもののいずれか１つを含む、本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つであることができる。
【０００５】
一側面において、妊娠した対象からの試料中の胎児特異的核酸の量を評価する方法、ここで試料は胎児特異的核酸を含む。一態様において、方法は、複数のの一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的のそれぞれについて、試料またはその一部について、少なくとも２つのプライマー対を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイを実施することを含み、ここで各プライマー対は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで少なくとも２つのプライマー対のうちの１つは、ＳＮＶ標的の１つのアレルに対して、プライマーにおいて３’末端から２番目のミスマッチを含むが、ＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’二重ミスマッチを含み、ＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対のもう１つはＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、および、増幅に基づくＰＣＲ定量アッセイなどの定量アッセイから結果を得るかまたは提供して、試料中の胎児特異的核酸の量を決定することを含む。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、結果はレポートで提供される。
【０００６】
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、結果に基づいて試料中の胎児特異的核酸の量を決定することをさらに含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、結果は、試料中の胎児特異的核酸の量を含む。
一側面において、妊娠した対象からの試料中の胎児特異的核酸の量を評価する方法、ここで試料は胎児特異的核酸および対象核酸を含む、が提供される。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、複数の一塩基バリアント（ＳＮＶ）標的のそれぞれについて、試料またはその一部に対して実施されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの増幅に基づく定量アッセイから結果を得ることを含み、増幅には少なくとも２つのプライマー対を用い、ここで各プライマー対はフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含み、ここで少なくとも２つのプライマー対の１つは、ＳＮＶ標的の１つのアレルに対してプライマーにおいて３’末端から２番目のミスマッチを含むが、ＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’二重ミスマッチを含み、ＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅し、少なくとも２つのプライマー対のもう１つがＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、および、結果に基づいて胎児特異的核酸の量を評価することを含む。
【０００７】
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料中の胎児特異的核酸の量は、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの結果に基づく。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、結果はレポートから得られる。
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも２つのプライマー対の別のプライマー対もまた、プライマーにおいてＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを含むが、ＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’二重ミスマッチを含み、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する。
【０００８】
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、量は、全核酸に対する胎児特異的核酸の比率またはパーセンテージである。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、結果は、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの情報提供的結果である。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、量は、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの情報提供的結果に基づく。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの情報提供的結果を選択することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、選択された情報提供的結果は、平均化される。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、ＰＣＲ定量アッセイなどの増幅に基づく定量アッセイの情報提供的結果は、胎児特異的核酸および／または対象核酸の遺伝子型（または親の遺伝子型）に基づいて選択される。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、胎児特異的核酸および／または対象核酸の遺伝子型（または親の遺伝子型）を得ることを含む。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、複数のＳＮＶ標的を得ることを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、複数のＳＮＶの標的のそれぞれについて少なくとも２つのプライマー対を得ることをさらに含む。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、複数のＳＮＶ標的は、少なくとも１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２または７５のＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、複数のＳＮＶ標的は、９０未満のＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、複数のＳＮＶ標的は、７５未満のＳＮＶ標的である。
【０００９】
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、複数のＳＮＶ標的は情報提供的標的であり、複数のＳＮＶの情報提供的標的は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のＳＮＶの情報提供的標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、複数のＳＮＶの情報提供的標的は、３０未満のＳＮＶの情報提供的標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、複数のＳＮＶの情報提供的標的は、２５未満のＳＮＶの情報提供的標的である。
【００１０】
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料の胎児特異的核酸の量は１０％未満である。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料の胎児特異的核酸の量は５％未満である。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、親の遺伝子型は、知られていないかまたは得られていない。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、親の遺伝子型の予測に基づいて結果を評価することをさらに含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、予測は、期待値最大化アルゴリズムを用いて実施される。
【００１１】
提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、胎児特異的核酸は、胎児特異的無細胞ＤＮＡである。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、量は、胎児に対するリスクを決定するために使用される。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、胎児に対するリスクは、本明細書で提供されるいずれか１つの状態のリスクである。
【００１２】
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、複数のＰＣＲ定量アッセイは、リアルタイムＰＣＲアッセイまたはデジタルＰＣＲアッセイである。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象への処置を、胎児特異的核酸の量に基づいて選択することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象を、胎児特異的核酸の量に基づいて処置することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、胎児特異的核酸の量に基づき、対象の処置についての情報を対象に提供することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象における胎児特異的核酸の量を経時的にモニタリングすること、またはモニタリングを示唆すること、を含む。
【００１３】
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象における胎児特異的核酸の量を、その後の時点で評価することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、対象に投与される処置の効果を、胎児特異的核酸の量に基づいて評価することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、処置は、本明細書で提供される処置のいずれか１つである。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料は、少なくとも妊娠１０週齢の対象からのものである。本発明で提供される方法のいずれか１つの一態様において、胎児特異的核酸の１０％未満の量は、妊娠１０週齢以降などにおける、胎児苦痛を示すものである。
【００１４】
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、試料またはその一部を提供することまたは得ることを含む。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、核酸を試料から抽出することを含む。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、ＳＮＶ標的のためのプライマーを使用する増幅前ステップをさらに含む。プライマーは、非天然核酸の量を決定するためのものと同一であっても異なっていてもよい。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、試料は、血液、血漿または血清を含む。
【００１５】
一側面において、少なくとも６つのＳＮＶの情報提供的標的のそれぞれについてプライマー対を含む組成物またはキットであって、ここで、各プライマー対は、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを含むが、ＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’二重ミスマッチを含み、ＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅するものが提供される。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットは、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する、少なくとも６つのＳＮＶの情報提供的標的のそれぞれについての別のプライマー対をさらに含む。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも６つのＳＮＶの情報提供的標的は、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２のＳＮＶの情報提供的標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも６つのＳＮＶの情報提供的標的は、３５未満のＳＮＶの情報提供的標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも６つのＳＮＶの情報提供的標的は、３０未満のＳＮＶの情報提供的標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも６つのＳＮＶの情報提供的標的は、２５未満のＳＮＶの情報提供的標的である。
【００１６】
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも６つのＳＮＶの情報提供的標的のそれぞれについての別のプライマー対もまた、プライマーにおいてＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチも含むが、ＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’二重ミスマッチを含み、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する。
【００１７】
一側面において、少なくとも１８のＳＮＶ標的のそれぞれについてのプライマー対を含む組成物またはキットであって、ここで各プライマー対は、プライマーにおいてＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを含むが、ＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’二重ミスマッチを含み、ＳＮＶ標的の１つのアレルを特異的に増幅するものが提供される。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットは、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する少なくとも１８のＳＮＶ標的のそれぞれについての別のプライマー対をさらに含む。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも１８のＳＮＶ標的は、少なくとも２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７１、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、または９６のＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも１８のＳＮＶ標的は、１００未満のＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも１８のＳＮＶ標的は、９５未満のＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも１８のＳＮＶ標的は、９０未満のＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも１８のＳＮＶ標的は、８５未満のＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも１８のＳＮＶ標的は、８０未満のＳＮＶ標的である。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも１８のＳＮＶ標的は、７５未満のＳＮＶ標的である。
【００１８】
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、少なくとも１８のＳＮＶ標的のそれぞれについての別のプライマー対もまた、プライマーにおいてＳＮＶ標的の別のアレルに対して３’末端から２番目のミスマッチを含むが、ＳＮＶ標的の１つのアレルに対して３’二重ミスマッチを含み、ＳＮＶ標的の別のアレルを特異的に増幅する。
本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットは緩衝剤をさらに含む。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットはポリメラーゼをさらに含む。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットはプローブをさらに含む。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、プローブは蛍光プローブである。
【００１９】
本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットは、使用説明書をさらに含む。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、使用説明書は、試料中の非天然核酸の量を決定または評価するための説明書である。本明細書で提供される組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、組成物またはキットは、本明細書で提供される方法のいずれか１つにおいて使用される。
【００２０】
一側面において、本明細書で提供される方法のいずれか１つに基づいて胎児特異的核酸の量を得ること、および量に基づいて対象または胎児におけるリスクを評価することを含む方法が提供される。
提供される方法のいずれか１つの一態様において、評価されたリスクに基づいて、処置または処置または無処置についての情報が対象に選択または提供される。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、経時的に対象における胎児特異的核酸の量をモニタリングすることまたはモニタリングすることを示唆することをさらに含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、対象は、妊娠１０週以降の間の１以上の時点でモニタリングされる。
【００２１】
一側面において、本明細書で提供される１つ以上の結果を含有するレポートが提供される。提供されるレポートのいずれか１つの一態様において、レポートは電子形式である。提供されるレポートのいずれか１つの一態様において、レポートはハードコピーである。提供されるレポートのいずれか１つの一態様において、レポートは口頭で与えられる。
提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、ミスマッチプライマー（単数または複数）はフォワードプライマー（単数または複数）である。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの一態様において、それぞれのＳＮＶ標的についてのプライマー対のリバースプライマーは同じである。
【００２２】
提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法は、本明細書で提供される方法のいずれか１つなどの、その後の時点などで、対象から別の試料を得ること、および試料について試験を実施することをさらに含む。
一態様において、本明細書で提供される方法の態様のいずれか１つは、提供される組成物、キットまたはレポートのいずれか１つの態様であることができる。一態様において、本明細書で提供される組成物、キットまたはレポートの態様のいずれか１つは、本明細書で提供される方法のいずれか１つの態様であることができる。
添付の図面は、一定の縮尺で描くことを意図していない。これらの図は例示的なものに過ぎず、開示を可能にするためには必要とされない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＭＯＭＡプライマーの例示的で非限定的な図を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイにおいて、ＳＮＶ Ａを含有する配列の伸長が起こることが予想され、これによりＳＮＶ Ａの検出が行われ、これは続いて定量され得る。しかしＳＮＶ Ｂの伸長は、二重ミスマッチのために起こることは予想されない。
【図２】図２は、例示的な増幅トレースを提供する。
【図３】図３は、期待値最大化を用いた、未知の場合の非天然遺伝子型の予測を示す。
【図４】図４は、期待値最大化を用いた、未知の場合の非天然遺伝子型の予測を示す。
【００２４】
【図５】図５は、１０４個のＭＯＭＡ標的の平均バックグラウンドノイズを提供する。
【図６】図６は、ＭＯＭＡを使用する方法のバックグラウンドノイズのさらなる例を提供する。
【図７】図７は、本明細書で記載された方法を使用して算出された胎児フラクションおよび胎児妊娠年齢を示す散布図である。
【図８】図８は、いくつかの態様が動作することができるコンピュータシステムの例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本開示の側面は、試料中の非天然核酸の高感度の検出および／または定量化のための方法に関する。非天然核酸、例えば非天然ＤＮＡは、妊娠した対象の胎児からのものを含む様々な状況において個体に存在し得る。本開示は、対象から得た試料中の、非天然無細胞ＤＮＡ濃度などの非天然核酸を検出、分析、および／または定量するための技術を提供する。
本明細書で使用する場合、「非天然核酸」は、別の供給源に由来するか、または対象において見出される核酸の突然変異型である（特定の配列に関して）、核酸を指す。したがって「天然核酸」は、別の供給源からではなく、対象において見出される核酸の突然変異型ではない（野生型（ＷＴ）配列などの特定の配列に関して）核酸である。いくつかの態様において、非天然核酸は、非天然無細胞ＤＮＡである。「無細胞ＤＮＡ」（またはｃｆ−ＤＮＡ）は、細胞の外、例えば対象の血液、血漿、血清、尿などに存在するＤＮＡである。いかなる特定の理論またはメカニズムにも束縛されることを望まないが、ｃｆ−ＤＮＡは、例えば細胞のアポトーシスを介して、細胞から放出されると考えられている。非天然核酸の例は、妊娠した対象における、胎児からの核酸である。本明細書で使用する場合、本明細書で提供される組成物および方法は、非天然供給源からの無細胞ＤＮＡ、例えば、胎児特異的ＤＮＡまたは胎児特異的無細胞ＤＮＡ（例えば、胎児特異的ｃｆ−ＤＮＡ）の量を決定するために、使用することができる。
【００２６】
本明細書において提供されるのは、配列同一性の違いを有する核酸を測定するために使用することができる、方法および組成物である。いくつかの態様において、配列同一性の違いは、一塩基バリアント（ＳＮＶ）である；しかしながら、ＳＮＶが本明細書で指される場合はいつでも、天然核酸と非天然核酸の間の配列同一性のいかなる違いも、適用可能であることが意図される。したがって、本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つは、配列同一性に違いがある場合に、天然核酸ｖｓ非天然核酸に適用することができる。本明細書で使用する場合、「一塩基バリアント」は、単一ヌクレオチド（single nucleotide）において配列可変性がその中に存在する、核酸配列を指す。いくつかの態様において、ＳＮＶは両アレル（両アレル）ＳＮＶであり、ＳＮＶについて１つのメジャーなアレルおよび１つのマイナーなアレルが存在することを意味する。いくつかの態様において、ＳＮＶは、集団内などに２つより多くのアレルを有し得る。一般に「マイナーなアレル」は、遺伝子座について、集団などにおいて頻度が少ないアレルを指し、一方「メジャーなアレル」は、集団などにおいてより頻度が高いアレルを指す。ＳＮＶはまた、胎児状態の既知の指標であり得る。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、かかる変異は、本明細書で提供される状態のいずれか１つに関連する変異である。本明細書で提供される方法および組成物は、核酸の混合物内のメジャーおよびマイナーなアレルの核酸を、いくつかの態様において低レベルで存在する場合であっても、定量することができる。変異の例としては、高リスクの遺伝子欠損、胎児死亡などを含む、本明細書で提供される胎児状態のいずれかに関連する変異が挙げられる。
【００２７】
ＳＮＶなどの、配列同一性に可変性が存在する核酸配列は、一般に「標的」と呼ばれる。本明細書で使用する場合、「ＳＮＶ標的」は、個体の集団などにおける、または対象において起こり得て疾患または状態に関連し得る突然変異の結果として生じる、単一ヌクレオチドなどにおいて配列可変性が存在するところの核酸配列を指す。ＳＮＶ標的は１つより多くのアレルを有し、好ましい態様において、ＳＮＶ標的は両アレルである。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ＳＮＶ標的は、ＳＮＰ標的である。これらの態様のいくつかにおいて、ＳＮＰ標的は両アレルである。非天然核酸は、極めて低いレベルであっても、ＰＣＲアッセイなどの増幅に基づく定量アッセイをＳＮＶ標的に特異的なプライマーを用いて実施することにより、定量可能であることが発見されている。いくつかの態様において、非天然核酸の量は、定量的ＰＣＲアッセイなどの増幅に基づく定量アッセイを、複数のＳＮＶ標的についてのプライマーを用いて試みることにより、決定される。
【００２８】
「複数のＳＮＶ標的」は、各標的に対して少なくとも２つのアレルが存在する、１より多くのＳＮＶ標的を指す。好ましくは、いくつかの態様において、各ＳＮＶ標的は両アレルであると予想され、ＳＮＶ標的の各アレルに特異的なプライマー対を使用して、各アレルの核酸を特異的に増幅し、ここで増幅は、特異的アレルの核酸が試料中に存在する場合に起こる。本明細書で使用する場合、１つのアレルは標的配列の突然変異型であってよく、別のアレルは配列の非突然変異型である。
【００２９】
本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つにおいて、複数のＳＮＶ標的は、少なくとも６つの情報提供的なＳＮＶ標的を含む。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的ＰＣＲなどの増幅に基づく定量的アッセイは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２の情報提供的標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量アッセイは、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、または２３未満の情報提供的標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは、６〜１０、６〜１５、６〜２０、６〜２５または６〜３０の情報提供的標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは、７〜１０、７〜１５、７〜２０、７〜２５または７〜３０の情報提供的標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは、８〜１０、８〜１５、８〜２０、８〜２５、または８〜３０の情報提供的標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５または１０〜３０の情報提供的標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは、１５〜２０、１５〜２５または１５〜３０の情報提供的標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは、１７〜２０、１７〜２５または１７〜３０の情報提供的標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは、２０〜２５または２０〜３０の情報提供的標的についてのプライマー対を用いて実施される。
【００３０】
本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つの態様において、ＳＮＶ標的についてのプライマー対は、ＳＮＶ標的が情報提供的であるという知識に基づいて、遺伝子型の知識を用いるなどして予め選択され得る。しかしながら、本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つの別の態様において、パーセンテージが情報提供的である可能性について、ＳＮＶ標的についてのプライマー対が選択される。かかる態様において、より多くの数のＳＮＶ標的についてのプライマー対が、パーセンテージが情報提供的である確率に基づいて使用される。したがって、本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、情報提供的な結果は、少なくとも１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３または９６の標的についてのプライマー対を用いて得られる。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは、９９、９６、９３、９０、８７、８４、８１、７８、７５、７２、または６９未満の標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは、１８〜３０、１８〜４５、１８〜６０、１８〜７５、１８〜８０、１８〜８５、１８〜９０、１８〜９５または１８〜１００の標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは、２１〜３０、２１〜４５、２１〜６０、２１〜７５、２１〜８０、２１〜８５、２１〜９０、２１〜９５または２１〜１００の標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは、２４〜３０、２４〜４５、２４〜６０、２４〜７５、２４〜８０、２４〜８５、２４〜９０、２４〜９５または２４〜１００の標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは、３０〜４５、３０〜６０、３０〜７５、３０〜８０、３０〜８５、３０〜９０、３０〜９５または３０〜１００の標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは、４０〜４５、４０〜６０、４０〜７５、４０〜８０、４０〜８５、４０〜９０、４０〜９５または４０〜１００の標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは、４５〜６０、４５〜７５、４５〜８０、４５〜８５、４５〜９０、４５〜９５または４５〜１００の標的についてのプライマー対を用いて実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的アッセイは、５０〜６０、５０〜７５、５０〜８０、５０〜８５、５０〜９０、５０〜９５または５０〜１００の標的についてのプライマー対を用いて実施される。
【００３１】
本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、定量的ＰＣＲなどの増幅に基づく定量アッセイは、プライマー対を用いて、少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、または９５個の標的に対して、実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、アッセイは、プライマー対を用いて、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００、９９、９８、または９７個未満の標的に対して、実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、十分に情報提供的な結果が、プライマー対を用いて、４０〜１０５、４５〜１０５、５０〜１０５、５５〜１０５、６０〜１０５、６５〜１０５、７０〜１０５、７５〜１０５、８０〜１０５、８５〜１０５、９０〜１０５、９０〜１０４、９０〜１０３、９０〜１０２、９０〜１０１、９０〜１００、９０〜９９、９１〜９９、９２〜９９、９３〜９９、９４〜９９、９５〜９９、または９０〜９５個の間の標的に対して、実施される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、十分に情報提供的な結果が、プライマー対を用いて、４０〜９９、４５〜９９、５０〜９９、５５〜９９、６０〜９９、６５〜９９、７０〜９９、７５〜９９、８０〜９９、８５〜９９、９０〜９９、９５〜９９、９０〜９８、９０〜９７または９０〜９６個の間の標的に対して、実施される。提供される方法または組成物のいずれか１つについて、方法または組成物は、前述の数の標的または情報提供的標的のいずれか１つに向けられ得る。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「情報提供的なＳＮＶ標的」とは、本明細書で提供されるプライマーによる増幅が生じ、その結果が情報提供的であるものである。本明細書で提供される「情報提供的な結果」とは、試料中の非天然核酸または天然核酸のレベルを定量するために使用することができる結果である。いくつかの態様において、情報提供的な結果は、天然核酸が特定のＳＮＶ標的についてヘテロ接合性である場合の結果および、「コールなし」または誤ったコール結果を除外する。胎児健康の文脈において、情報提供的な非天然核酸はヘテロ接合性であり得ることもまた認識されるべきである。情報提供的な結果からアレルのパーセントを、標準曲線を使用し、提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において算出することができる。提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、非天然核酸および／または天然核酸の量は、それぞれ、非天然核酸および／または天然核酸の情報提供的な結果にわたる平均値を表す。
【００３３】
非天然核酸の量またはレベル（例えば、比率またはパーセンテージ）は、天然および／または非天然核酸のメジャーおよびマイナーなアレルの量ならびに遺伝子型を用いて、決定することができる。結果は、父親の遺伝子型の知識なしで評価することもできる。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、天然核酸の遺伝子型は既知であるが父親および／または非天然核酸の遺伝子型は知られていない場合、方法は、可能性のある非天然の遺伝子型を予測すること、または父親の遺伝子型をシーケンシングによって決定すること、のステップを含む。かかる方法のさらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報番号WO2016/176662に見出され得、かかる方法は参照によって本明細書中に取り込まれる。本明細書に提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、アレルは、対象の天然核酸および／または父親の以前の遺伝子型決定に基づき、決定することができる。遺伝子型決定のための方法は、当技術分野において知られている。かかる方法には、次世代、ハイブリダイゼーション、マイクロアレイなどのシーケンシング、他の分離技術またはＰＣＲアッセイを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つは、かかる遺伝子型を得るステップを含むことができる。
【００３４】
本明細書で使用する「得ること」とは、それによってそれぞれの情報または材料を獲得できる任意の方法を指す。したがってそれぞれの情報は、天然の遺伝子型を決定することなどの、実験方法によって獲得することができる。いくつかの態様において、それぞれの材料を、様々な実験的または実験室的方法で作成し、設計することができる。それぞれの情報または材料は、レポートまたは資料などにおいて情報を与えられまたは提供されることによっても、獲得することができる。材料は、いくつかの態様において、商業的手段によって（すなわち、購入によって）与えられるかまたは提供されてもよい。
【００３５】
レポートは、口頭、書面（またはハードコピー）または電子形式において、例えば視覚化または表示することができる形式であってよい。いくつかの態様において、本明細書で提供される各アッセイについての「生の」結果がレポートで提供され、このレポートから、試料中の非天然核酸の量を決定するためのさらなるステップを実施することができる。これらのさらなるステップは、以下のうちのいずれか１つ以上を含むことができる：情報提供的な結果を選択すること、天然および／または非天然の遺伝子型（または父親の遺伝子型）を得ること、天然および非天然核酸に関する情報提供的な結果についてのアレルパーセントを算出すること、アレルパーセントを平均化すること、など。他の態様において、レポートは、試料中の非天然核酸の量を提供する。その量から、いくつかの態様において臨床医は、対象に対する処置の必要性または非天然核酸の量を経時的にモニターする必要性を、評価することができる。したがって、本明細書で提供される方法のいずれか１つにおいて、方法は、対象中の非核酸の量を１つよりも多い時点で評価することを含むことができる。かかる評価は、本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つを用いて実施することができる。
【００３６】
いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つは、対象由来の１つ以上の試料中の全無細胞ＤＮＡなどの核酸の全量を決定または取得するステップを含み得る。したがって、本明細書で提供されるレポートのいずれか１つ以上もまた、全無細胞ＤＮＡなどの全核酸の１つ以上の量を含み得、レポートにある天然核酸および／または非天然核酸の量の組合せを臨床医が使用して対象の処置の必要性または対象のモニタリングの必要性を評価し得る。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの好ましい態様において、核酸の全量は、本明細書で提供されるＭＯＭＡアッセイによって決定され、ＭＯＭＡアッセイによって決定されるような天然のおよび非天然の核酸カウントの尺度であり、好ましくは、情報提供的標的からのものである。いくつかの態様において、核酸の全量は、本明細書で提供されるＭＯＭＡアッセイまたは当業者に公知の他のアッセイであるが、本明細書で提供されるＭＯＭＡアッセイではない任意の方法によって決定される。
【００３７】
本明細書で提供される定量アッセイは、多重／最適化ミスマッチ増幅（ＭＯＭＡ）を利用する。かかるアッセイで使用するためのプライマーを得ることができ、本明細書で提供される方法のいずれか１つは、ＰＣＲアッセイなどの増幅に基づく定量アッセイを実施するための１つ以上のプライマー対を得るステップを含むことができる。一般にプライマーは、核酸の量を定量する際にそれらの使用を容易にする、ユニークな特性を有する。例えば、プライマー対のフォワードプライマーは、３’ヌクレオチド（例えば、末端から２番目の３’ヌクレオチド）でミスマッチであり得る。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、このミスマッチは３’ヌクレオチドにおいてであるが、ＳＮＶ位置に隣接している。提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ＳＮＶ位置に対するプライマーのミスマッチ位置は、図１に示される通りである。一般に、かかるフォワードプライマーは３’ミスマッチを有していても、ＰＣＲ反応などにおいて増幅生成物（適切なリバースプライマーと併せて）を生成し、こうしてそれぞれのＳＮＶを有する核酸の増幅およびその結果としての検出を可能にする。特定のＳＮＶが存在せず、ＳＮＶ標的の別のアレルに対して二重ミスマッチがある場合、増幅産物は一般に産生されない。好ましくは、本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、各ＳＮＶ標的について、各アレルの特異的増幅が、他のアレルの増幅なしで起こり得るプライマー対が得られる。「特異的増幅」とは、別の核酸の実質的な増幅なしの、またはバックグラウンドもしくはノイズを超える別の核酸配列の増幅なしの、標的の特異的アレルの増幅をいう。いくつかの態様において、特異的な増幅は、特異的なアレルの増幅のみをもたらす。
【００３８】
本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、両アレルである各ＳＮＶ標的について、２つのプライマー対があり、それぞれが２個のアレルのうちの１つに特異的であり、したがって、それが増幅するアレルに関しては１つのミスマッチを有し、増幅しないアレルに関して二重ミスマッチを有する（再びこれらのアレルの核酸が存在する場合に限る）。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、ミスマッチプライマーはフォワードプライマーである。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、各ＳＮＶ標的についての２つのプライマー対のリバースプライマーは、同一である。
これらの概念は、本明細書で提供される組成物および方法のいずれか１つでのプライマー対の設計において使用することができる。フォワードおよびリバースプライマーは、鋳型の特定の遺伝子座の断片を増幅するために、反対の鎖（例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖）に結合するように設計されることが理解されるべきである。プライマー対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、任意の適切なサイズの核酸断片を増幅するように設計され得て、例えば本開示によるＳＮＶ標的のアレルの存在を検出する。本明細書で提供される方法のいずれか１つは、本明細書に記載の１つ以上のプライマー対を得るための１つ以上のステップを含むことができる。
【００３９】
本明細書に記載のプライマー対は、ＰＣＲアッセイなどの多重増幅に基づく定量アッセイに使用され得ることが理解されるべきである。したがって、本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、プライマー対は、ＰＣＲ反応などの増幅反応において他のプライマー対と適合するように設計される。例えばプライマー対は、ＰＣＲ反応などの増幅反応における他のプライマー対の少なくとも２個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個等と適合するように設計されてもよい。本明細書で使用する場合、ＰＣＲ反応などの増幅反応におけるプライマー対は、それらの標的を同じ反応において増幅することができる場合に、「適合的」である。いくつかの態様においてプライマー対が適合的であるのは、ＰＣＲ反応などの同じ増幅反応に多重化されている場合に、それらの標的ＤＮＡの増幅が、１％以下、２％以下、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下、４５％以下、５０％以下、または６０％以下阻害されている場合である。プライマー対は多くの理由で適合的でない可能性があり、その理由としては、限定はされないが、プライマー二量体の形成、および他のプライマー対と干渉し得る、鋳型上の標的外部位への結合を含む。したがって、本開示のプライマー対は、他のプライマー対との二量体の形成を妨げるか、または標的外結合部位の数を制限するように、設計され得る。多重ＰＣＲアッセイにおいて使用するためのプライマーを設計するための例示的な方法は、当技術分野で知られており、さもなくば本明細書に別途記載される。
【００４０】
いくつかの態様において、本明細書に記載のプライマー対は、非天然核酸の量を定量するためにＰＣＲアッセイなどの多重増幅に基づくアッセイにおいて使用される。したがって、本明細書に提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、プライマー対は、潜在的に非二倍体であるゲノム領域を検出するように設計されたプライマー対を除いて、二倍体であるゲノム領域を検出するように設計される。本明細書で提供される方法または組成物のいずれか１つのいくつかの態様において、本開示に従って使用されるプライマー対は、反復マスク領域、既知コピー数可変領域、または非二倍体であり得る他のゲノム領域を検出しない。
本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、増幅に基づく定量アッセイは、それによって核酸が増幅されて、核酸の量を決定することができるような、任意の定量アッセイである。かかるアッセイには、核酸を本明細書に記載のＭＯＭＡプライマーで増幅して定量するものが含まれる。かかるアッセイには、単純な増幅および検出、ハイブリダイゼーション技術、電気泳動などの分離技術、次世代シーケンシングなどが含まれる。
本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、定量アッセイは定量的ＰＣＲアッセイである。定量的ＰＣＲには、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、TAQMAN（商標）などが含まれる。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ＰＣＲは「リアルタイムＰＣＲ」である。かかるＰＣＲは、増幅プロセスがまだ進行している間に反応動態を液相でモニタリングすることができる、ＰＣＲ反応を指す。従来のＰＣＲとは対照的に、リアルタイムＰＣＲは、増幅反応においてリアルタイムで同時に検出または定量する能力を提供する。特定の色素からの蛍光強度の増加に基づき、標的の濃度を、増幅がそのプラトーに達する前であっても決定することができる。
【００４１】
複数プローブの使用は、単一プローブリアルタイムＰＣＲの能力を拡大することができる。多重リアルタイムＰＣＲは、各アッセイが固有の蛍光色素で標識された特異的プローブを有し得、各アッセイについて異なる観察色をもたらす、複数のプローブに基づくアッセイを使用する。リアルタイムＰＣＲ装置は、異なる色素から生成される蛍光を区別することができる。異なるプローブは、それぞれ固有の発光スペクトルを有する異なる色素で標識することができる。スペクトル信号は、離散光学系で収集され、一連のフィルタセットを通過し、検出器のアレイによって収集される。色素間のスペクトルの重なりの補正は、純粋な色素スペクトルを用いて行列代数により実験データをデコンボリューションすることにより、実施することができる。
プローブは、本開示の方法、特に定量化ステップを含む方法のために有用であり得る。本明細書で提供される方法のいずれか１つは、ＰＣＲアッセイの実施におけるプローブの使用を含むことができ、一方で本明細書で提供されるキットの組成物のいずれか１つは、１つ以上のプローブを含むことができる。重要なことに、本明細書に提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、ＰＣＲ定量アッセイの１つ以上または全てにおけるプローブは、ミスマッチプライマーと同じ鎖上にあり、反対鎖上ではない。このようにプローブをＰＣＲ反応に組み込む際に、さらなるアレル特異的識別が提供できることが見出されている。
【００４２】
一例として、TAQMAN（商標）プローブは、５’末端にＦＡＭ（商標）またはＶＩＣ（登録商標）色素標識を有し、３’末端にマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）を有する、加水分解プローブである。TAQMAN（商標）プローブの原理は、一般に、相補的なプローブ結合領域へのハイブリダイゼーション中に二重標識TAQMAN（商標）プローブを切断するための、TAQMAN（商標）ポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、およびフルオロフォアに基づく検出に依存する。TAQMAN（商標）プローブは、定量的ＰＣＲ反応の指数関数的段階の間に、定量的測定における検出の特異性を高めることができる。
ＰＣＲシステムは一般に、蛍光色素またはレポーターの検出および定量に依存し、そのシグナルは反応におけるＰＣＲ産物の量に正比例して増加する。例えば、最も簡単で最も経済的な形式においては、そのレポーターは、二本鎖ＤＮＡ特異的色素SYBR（登録商標）Green（Molecular Probes）であることができる。SYBR Greenは、二本鎖ＤＮＡのマイナーグルーブに結合する色素である。SYBR Green色素が二本鎖ＤＮＡに結合すると、蛍光強度が増加する。より多くの二本鎖アンプリコンが産生されると、SYBR Green色素シグナルが増加する。
【００４３】
本明細書で提供される方法のいずれか１つにおいて、ＰＣＲはデジタルＰＣＲであってもよい。デジタルＰＣＲは、希釈された増幅産物を複数の個別試験部位に分割して、ほとんどの個別試験部位が、ゼロまたは１つの増幅産物を含むようにすることを含む。次いで増幅産物を分析して、試料中の選択された関心対象のゲノム領域の頻度の表示を提供する。個別試験部位ごとに１つの増幅産物を分析すると、各個別試験部位について２値の「イエスまたはノー」の結果が得られ、選択された関心のあるゲノム領域が定量化され、選択された関心のあるゲノム領域の相互の頻度が決定される。ある側面において、これに加えて、または代替として、複数の分析を、所定の領域からのゲノム領域に対応する増幅産物を使用して行うことができる。２つ以上の所定の領域の分析結果を用いて、増幅産物の数の相対的な頻度を定量し、決定することができる。２つ以上の所定の領域を使用して試料中の頻度を決定することにより、単一の検出アッセイによっては容易には明らかにされない、増幅効率の変動などを介したバイアスの可能性が低減される。デジタルＰＣＲを使用してＤＮＡを定量する方法は、当技術分野で知られており、例えば米国特許公開番号US20140242582に記載されている。
【００４４】
本明細書で提供されるＰＣＲ条件は、本明細書に記載の方法のいずれか１つに従って機能するように、改変または最適化できることが、理解されるべきである。典型的には、ＰＣＲ条件は、使用する酵素、標的鋳型、および／またはプライマーに基づく。いくつかの態様において、ＰＣＲ反応の１つ以上の成分が改変または最適化される。最適化され得るＰＣＲ反応の成分の非限定的な例としては、鋳型ＤＮＡ、プライマー（例えば、フォワードプライマーおよびリバースプライマー）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、ポリメラーゼ、マグネシウム濃度、緩衝液、プローブ（例えば、リアルタイムＰＣＲを実施する場合）、緩衝液、および反応容積を含む。
【００４５】
前述の態様のいずれにおいても、任意のＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡヌクレオチドのＤＮＡ鎖への重合を触媒する酵素）を利用することができ、これには熱安定性ポリメラーゼを含む。適切なポリメラーゼ酵素は当業者に知られており、以下を含む：大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウクラスのポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、REDTaq（商標）ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシークエナーゼ。例示的なポリメラーゼとしては、限定はされないが、以下を含む：Bacillus stearothermophilus ｐｏｌ Ｉ、Thermus aquaticus（Ｔａｑ）ｐｏｌ Ｉ、Pyrccoccus furiosus（Ｐｆｕ）、Pyrococcus woesei（Ｐｗｏ）、Thermus flavus（Ｔｆｌ）、Thermus thermophilus（Ｔｔｈ）、Thermus litoris(Ｔｌｉ）およびThermotoga maritime（Ｔｍａ）。これらの酵素、これらの酵素の改変型、および酵素の組み合わせは、Roche、Invitrogen、Qiagen、StratageneおよびApplied Biosystemsを含む販売元から市販されている。代表的な酵素としては、以下を含む：PHUSION（登録商標）（New England Biolabs, Ipswich, MA）、Hot MasterTaq（登録商標）（Eppendorf）、PHUSION（登録商標）Mpx（Finnzymes）、PyroStart（登録商標）（Fermentas）、KOD（EMD Biosciences）、Z-Taq（TAKARA）、およびCS3AC/LA（KlenTaq, University City, MO）。
【００４６】
塩および緩衝液としては、当業者によく知られているものが挙げられ、これには、それぞれＭｇＣｌ２およびＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびＫＣｌを含むものが含まれる。典型的には、１．５〜２．０ｎＭのマグネシウムがＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに最適であるが、しかし最適なマグネシウム濃度は、鋳型、緩衝液、ＤＮＡおよびｄＮＴＰに依存し得、これはそれぞれがマグネシウムをキレート化する可能性があるからである。マグネシウム［Ｍｇ２＋］の濃度が低すぎると、ＰＣＲ産物が形成されない場合がある。マグネシウム［Ｍｇ２＋］の濃度が高すぎると、望ましくないＰＣＲ産物が見られる場合がある。いくつかの態様において、マグネシウム濃度は、０．１ｍＭまたは０．５ｍＭ増分で約５ｍＭまでのマグネシウム濃度を補充することにより、最適化することができる。
【００４７】
本開示に従って使用される緩衝液は、添加剤、例えば界面活性剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など、ならびに当業者によく知られた他のものを含んでもよい。ヌクレオチドは一般に、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、例えばデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）などであり、これらは、標的核酸の増幅についての反応適切量に添加される。いくつかの態様において、１つ以上のｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）の濃度は、約１０μＭ〜約５００μＭであり、これはＰＣＲ反応で生成されるＰＣＲ産物の長さおよび数に依存し得る。
【００４８】
いくつかの態様において、本開示に従って使用されるプライマーは、改変される。プライマーは、それらの意図された標的（例えば、特定のＳＮＶ）のみに、高い特異性で結合し、さらなるヌクレオチド配列の差異に対して高い識別を示すように設計されてよい。プライマーは、特定の算出融解温度（Ｔｍ）、例えば、４６℃〜６４℃の範囲の融解温度を有するように、改変することができる。所望の融解温度を有するプライマーを設計するために、プライマーの長さを変えることができ、および／またはプライマーのＧＣ含量を変えることができる。典型的には、ＧＣ含量および／またはプライマーの長さを増加させることにより、プライマーのＴｍが増加する。逆に、ＧＣ含量および／またはプライマーの長さを減少させると、プライマーのＴｍが典型的に低下する。特定のＳＮＶ（または配列非同一性の他の形態）を別のものよりも高感度で検出するために、標的に対して意図的にミスマッチ（単数または複数）を組み込むことにより、プライマーを改変できることが理解されるべきである。したがってプライマーは、それらが結合するように設計された特定の配列（例えば、特定のＳＮＶ）に関して、１つ以上のミスマッチを組み込むことにより、改変され得る。
【００４９】
いくつかの態様において、ＰＣＲ反応において使用されるプライマーの濃度は、改変または最適化されてよい。いくつかの態様において、ＰＣＲ反応におけるプライマー（例えば、フォワードまたはリバースプライマー）の濃度は、例えば、約０．０５μＭ〜約１μＭであり得る。特定の態様において、各プライマーの濃度は、約１ｎＭ〜約１μＭである。本開示に従ったプライマーは、ＰＣＲ反応において同一または異なる濃度で使用され得ることが理解されるべきである。例えば、プライマー対のフォワードプライマーを０．５μＭの濃度で使用し、プライマー対のリバースプライマーを０．１μＭで使用することができる。プライマーの濃度は、限定はされないが、プライマー長、ＧＣ含量、純度、標的ＤＮＡとのミスマッチ、またはプライマー二量体を形成する可能性を含む因子に基づき得る。
いくつかの態様において、ＰＣＲ反応の熱プロファイルは、改変または最適化される。ＰＣＲ熱プロファイル改変の非限定的な例には、変性温度および持続時間、アニーリング温度および持続時間および伸長時間が含まれる。
【００５０】
ＰＣＲ反応溶液の温度は、所定のサイクル数の間、変性状態、アニーリング状態、および伸長状態の間で順次循環させることができる。実際の時間および温度は、酵素、プライマーおよび標的に依存性であり得る。任意の所与の反応について、変性状態は、ある態様において約７０℃〜約１００℃の範囲であり得る。さらに、アニーリング温度および時間は、標的核酸内の特定の座位に結合するプライマーの特異性および効率に影響を及ぼし得、特定のＰＣＲ反応にとって重要であり得る。任意の所与の反応について、アニーリング状態は、ある態様において約２０℃〜約７５℃の範囲であり得る。いくつかの態様において、アニーリング状態は、約４６℃〜６４℃であり得る。ある態様において、アニーリング状態は、室温（例えば、約２０℃〜約２５℃）で行うことができる。
【００５１】
伸長温度および時間もまた、アレル産物の収量に影響し得る。所与の酵素に対して、伸長状態は、ある態様において約６０℃〜約７５℃の範囲であることができる。
ＰＣＲアッセイからのアレルの量の定量化は、本明細書で提供されるように、または当業者に明らかな他のようにして、実施することができる。一例として、増幅トレースを、一貫性および堅牢な定量化のために分析する。内部標準を使用して、Cycle閾値を入力核酸（例えば、ＤＮＡ）の量に翻訳することができる。アレルの量は、性能（performant）アッセイの平均として算出することができ、遺伝子型について調整することができる。広範囲の効果的な増幅は、低濃度核酸でさえ成功した検出を示す。
本明細書で提供される方法および組成物は、試料中の、胎児特異的核酸のような非天然核酸などの低レベルの核酸を検出するために使用できることが見出されている。いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つを試料に用いて、全ｃｆ−ＤＮＡ（例えば、天然および非天然）などの全核酸に対して試料中で少なくとも約１０％である非天然核酸を検出することができる。いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つを試料に用いて、試料中の少なくとも７％である非天然核酸を検出することができる。いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つを試料に用いて、試料中の少なくとも約５％である非天然核酸を検出することができる。いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つを試料に用いて、試料中の少なくとも約２．５％である非天然核酸を検出することができる。いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つを試料に用いて、試料中の少なくとも約１％である非天然核酸を検出することができる。いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つを試料に用いて、試料中の少なくとも約０．５％である非天然核酸を検出することができる。いくつかの態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つを試料に用いて、試料中の少なくとも約０．２５％である非天然核酸を検出することができる。
【００５２】
非天然核酸の量を、低レベルにおいても決定する能力により、本明細書で提供される方法および組成物は、胎児へのリスクなどの対象におけるリスクを評価するために使用することができる。本明細書で提供される「リスク」とは、対象における任意の望ましくない状態の存在または不在または進行、または、胎児または妊娠した対象など、胎児に有害な状態の存在または不在または進行の可能性の増加を指す。状態は、本明細書で提供される状態のいずれか１つであり得る。
いくつかの態様において、胎児は、徐脈(bradycardia)、双胎間輸血症候群(TTTS)、腹壁破裂、先天性肺気道形成異常(CPAMS)、胎児水腫、または胎児不整脈を有するかまたはこれを有するリスクがある。いくつかの態様において、胎児は、苦痛を有していたか、これを有するリスクがある。いくつかの態様において、妊娠した対象は、リスクがある。いくつかの態様において、妊娠した対象は、例えば、絨毛羊膜炎または早期分娩を含む状態のリスクがある。本明細書で提供される例から、ｃｆｆ−ＤＮＡのパーセントまたは比率などの胎児特異的ｃｆ−ＤＮＡ（ｃｆｆ−ＤＮＡ）のレベルが、ベースラインと比較して減少し得ることが実証されており、それによって、減少が胎児の有害な状態を示す。したがって、妊娠した対象から得られたｃｆ−ＤＮＡ試料からの胎児特異的ｃｆ−ＤＮＡの量は、胎児の健康をモニタリングする感度があり非侵襲的な方法を提供し得、必要な場合、医療介入または早産を可能にする。本明細書で提供される「増加したリスク」とは、対象における任意の望ましくない状態の存在または進行、または、かかる状態の存在または進行の可能性の増加を指す。本明細書で提供される「リスクの減少」とは、対象における任意の望ましくない状態または進行の不在、または、かかる状態の存在または進行の可能性の低下（または不在または非進行の可能性の増加）を指す。いくつかの態様において、核酸は、ｃｆ−ＤＮＡを含み、これは、妊娠した対象のＤＮＡおよび胎児のＤＮＡを含み、ここで、妊娠した対象または前ＤＮＡに対する胎児ＤＮＡの量の減少は、胎児におけるリスクを示す、および／または、胎児における有害な状態の存在または進行を示す。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「量」とは、核酸の測定のための任意の定量値を指し、絶対量または相対量で与えることができる。さらに、量は、総量、頻度、比率、パーセンテージなどであることができる。本明細書で使用する「レベル」という用語は、「量」の代わりに使用することができるが、同じ種類の値を指すことを意図する。次いで、妊娠した対象からの試料中の、胎児特異的ｃｆ−ＤＮＡのパーセントまたは比率などの、胎児特異的核酸の決定された量は、胎児に関連するリスクを決定するために使用できる。これらの量は、閾値（ベースラインレベルなど）に対して比較することができ、および／または、かかる値の変化を経時的にモニタリングすることができる。例えば、閾値（例えば、ベースライン）からの差における変化を、非侵襲性臨床上指標として使用できる。この比率は、臨床状態における変化の測定を可能にし、および／または、正常な値またはベースラインレベルの算出を可能とする。好ましい態様において、量の形態が何であれ、量は、閾値レベルと比較され得る。
【００５４】
決定された量における閾値（例えばベースライン）を超える増加または減少、あるいは、経時的な増加または減少における変化は、胎児におけるリスクの増加または減少を示し得る。本明細書で使用する場合、「閾値（threshold）」は、状態の有無またはリスクの有無を示す、任意の所定のレベルを指す。閾値は、様々な形態をとることができる。これは、中央値または平均値などの単一カットオフ値であることができる。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、閾値は、例におけるような、本明細書で提供される中央値または平均値、あるいは、他に当該分野で既知のもののいずれかである。これは、１つの定義群のリスクが別の定義群のリスクの２倍の場合などの、比較群に基づいて設定することができる。これは範囲であることができ、例えば、試験される集団を複数の群に等しく（または不等に）分割するか（低リスク群、中リスク群および高リスク群など）、またはクォードラント（quadrant）に分割して、最も低い象限はリスクが最も低い対象で、最も高い象限はリスクが最も高い対象である、などである。閾値は、選択された特定の集団に依存し得る。例えば、明らかに健康な集団は、異なる「正常」範囲を有するであろう。別の例として、閾値は、状態またはリスクの存在前または処置経過後のベースライン値から、決定することができる。別の例として、閾値は、以前の時点でとられた値である。かかる値は、試験されているリスクまたは状態と相関していない状態などの、対象における正常状態または他の状態を示すことができる。したがって、選択された所定の値は、対象が属するカテゴリーを考慮に入れてよい。適切な範囲およびカテゴリーは、当業者の通常の実験を用いて選択することができる。いくつかの態様において、閾値は、試験される対象のベースライン値であることができる。本明細書で提供される方法のいずれか１つの態様において、比較は、１以上のベースライン価またはその変化に関連していることが好ましい。かかるベースライン値は、胎児が健康な状態であるときの、胎児における状態の開始前の、または、有害な時点に進行する状態の前の、全ｃｆ−ＤＮＡまたは非胎児特異的ｃｆ−ＤＮＡに対するパーセントまたはその比率などの、胎児特異的核酸の量を示す。
【００５５】
本明細書で使用する場合、かかる対象の「ベースラインレベル」は、対象（例えば、妊娠中の女性または胎児）が、健康であったか健康であると考えられていた、本明細書で提供される状態を有していなかったか同状態を有すると考えられていなかった、または、本明細書で提供される状態を有していたか同状態を有すると考えられていたが、状態が処置または介入を必要としない段階にあったかあると考えられていた時間以前に、またはその時間にその後の試料に採取された対象由来の試料から特異的ｃｆ−ＤＮＡなどの胎児特異的核酸の量（全ｃｆ−ＤＮＡまたは非特異的ｃｆ−ＤＮＡに対する胎児特異的ｃｆ−ＤＮＡのパーセントまたは比率など）を含み得る。本明細書で提供される方法のいずれか１つにおいて、ベースラインに対する変化の減少は、胎児の健康の指標となり得る。本明細書で提供される方法のいずれか１つにおいて、２つ以上の時点でのベースラインとの差の変化は、胎児の健康の指標となり得る。したがって、本明細書で提供される方法のいずれか１つにおいて、胎児特異的ｃｆ−ＤＮＡの量は、１つ以上の時点で決定され、１つ以上のベースライン値に対する増加または減少が決定される。本明細書で提供される方法のいずれか１つにおいて、胎児特異的核酸の量は２つ以上の時点で決定され、１つ以上のベースライン値に対する差の変化が決定される。本明細書で提供される方法のいずれかにおいて、方法は、胎児特異的核酸の定量を補助するために、内部標準で既知の量でスパイクするステップをさらに含み得る。
【００５６】
提供される方法のいずれか１つはさらに、任意に本明細書で提供される方法の結果またはその結果の比較に基づいて、対象に別の試験を実施することを含む。かかる別の試験は、胎児などへのリスクの有無を決定するのに有用であることが当業者に知られている、任意の別の試験であることができる。かかる検査は、超音波バイオメトリックパラメータ、胎児心拍数、動脈圧、羊水レベル、腸管拡張、水症の発生、介入後の水症の解消および胎児喪失を含む胎児の健康の他の臨床的尺度を決定するものを含む。いくつかの態様において、ｐＨ、ＰａＯ２、ＰａＣＯ２、および／または血液の乳酸塩レベルは、胎児および／または妊娠した対象において評価される。いくつかの態様において、別の試験は、１以上のさらなる時点において、本明細書で提供される方法を用いて、別の試験を実施することができる。提供される方法および／または追加の試験（単数または複数）は、妊娠中の多数の時点のいずれかにおいて実施することができ、例えば、時点は、妊娠中、胎児介入時の疾患などの状態の進行中、および介入後の状態の解消時を含み得る。胎児特異的ｃ−ＤＮＡのパーセントまたは比率などの胎児特異的核酸の量はまた、妊娠の間の任意の他の時間において決定してもよく、短期間または長期間の調査に利用してもよい。決定は、胎児の状態を評価するために現在使用されている他の検査の代わりに、またはそれに加えて実施され得る。非侵襲的方法など、胎児の早期リスクを検出する能力は、早期介入およびより良好な患者結果をもたらすことができる。
【００５７】
何十年の研究にもかかわらず、胎児健康の非侵襲性解剖学的評価は、困難なままである。胎児喪失の増加したリスクを有する出産前異常を有する妊娠における評価の方法の必要性が存在する。進行した兆候の苦痛の発生の前に、胎児妥協を決定するための方法の利用可能性は、適切な介入または初期出産のための時間の幅を提供するだろう。超音波または生物物理学的プロファイルなどの方法による間接的および遅延した測定は、臨床医に、出産後の胎児水腫などの問題を警告する。この時点で、かなり多くの損傷が発生しており、胎児回復は、可能であっても、かなりの社会的資源を必要とする。本明細書で提供される方法などの、初期段階の胎児の病気を測定し、発生する前に胎児に水症または死亡の発生についてのリスクがある時期を予測する方法は有利であり得る。提供される方法および関連する組成物は、妊娠結果を改善し、新生児死亡率を減少させることができる。高リスクの妊娠において必要性は特に急性であるが、提供される方法は、全ての妊娠において、早期分娩などのためのスクリーニングテストとして使用できる。
【００５８】
個体は、妊娠などにおいて、非天然ＤＮＡ供給源を保有している。胎児および胎盤絨毛性組織由来の断片化した無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆ−ＤＮＡ）は、５週以降から検出可能なレベルで母体血漿中で循環し得る。胎児健康における急性変化は、特にベースラインレベルに関連するレベルなどの、母体血漿中に検出可能な変更されたレベルの循環ｃｆｆ−ＤＮＡを生じ得ることが見い出されている。詳細には、ベースラインレベルと比較した場合の、変更されたレベルの循環胎児無細胞ＤＮＡは、子宮胎児死亡、自発的中絶、および水腫に関連している。したがって、循環ｃｆｆ−ＤＮＡのレベルの変化は、早期分娩、胎児水腫および胎児喪失ならびに本明細書で提供される他の状態の発生を含む、胎児予後の実行可能な初期指標であり得、より初期の臨床介入および改善された予後を最終的に導き得る。本明細書で提供される方法のいずれか１つを使用して、本明細書で提供されるいずれか１つの状態のリスクを評価することができる。
【００５９】
一般的に、ｃｆ−ＤＮＡなどの胎児特異的核酸の、ベースラインなどの閾値に対する量（例えば、本明細書で提供される胎児特異的ｃｆ−ＤＮＡのパーセントまたは比率）および／または量の変化は、胎児苦痛および関連する状態に相関し得る。例えば、低酸素／虚血に続発する胎児代謝の減少は、母体ｃｆｆ−ＤＮＡレベルの減少を導き、胎児妥協の伝統的な処置の出現に先行することが予測される。胎児特異的循環ｃｆ−ＤＮＡの変更されたレベルは、本明細書で提供されるような望ましくない状態の発生に関連することが実証されている。したがって、母体血清中の胎児特異的ｃｆ−ＤＮＡのフラクション（またはパーセントまたは比率）の定量を実施して、正常な発育をモニタリングし、早期分娩を減少させ、胎児水腫、子宮内死亡または他の有害な状態の発生前の適宜胎児介入または計画された早期分娩を可能にすることができる。したがって、適切な介入または早期分娩のための時間ウィンドウを提供し、子供の健康および予後を改善する際の重要な利点を提供する。
【００６０】
したがって、本明細書で提供される方法は、様々な胎児状態を同定および／またはモニタリングするために使用され得る。本明細書で使用する場合、「胎児状態」または「胎児の状態」は、経時的に変化し得る任意の健康状態または健康の評価を指す。かかる状態は、胎児異数性の存在または不在、胎児の性別または胎児のＲｈ血液型を含み得る。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、方法は、胎児異数性の存在または不在、胎児の性別または胎児のＲｈ血液型を決定するためのものではない。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、胎児の状態は、胎児苦痛（または胎児妥協）の存在または不在またはレベルである。
本明細書で提供されるアプローチは、母体試料中の胎児起源の無細胞ＤＮＡなどの核酸の検出および定量を含む。母体血液中のｃｃｆ−ＤＮＡの割合（またはパーセントまたは比率）は、胎児の健康の関数として変化し、胎児の健康を評価するためのベースライン値などの閾値と比較され得ることが見出されている。胎児は、例えば、解剖学的、代謝、または胎児水腫、損傷した新生児、未熟児または自発的に終結した妊娠をもたらし得る母体環境の問題から苦痛を受ける間、細胞傷害を受け得る。胎児の状態は、胃腸炎、胎児性心臓不整脈、先天性肺腺腫様奇形、半葉全前脳胞症、胎児左心症候群、先天性欠損（神経、心臓およびその他）、低代謝率、胎児死亡および双子−双子輸血症候群を含む。提供される技術は、絨毛羊膜炎、早産、胎児心臓不整脈（胎児水腫および子宮衰弱のリスク増加に関連する）、（通常、全身紅はん性（ＳＬＥ）などの母体のコラーゲン血管疾患にほとんど由来する様々な原因から生じ得る）胎児徐脈、大型先天性肺腺腫様奇形（ＣＰＡＭ）などのさらに他の状態において胎児妥協を検出するために、より広い適用性を有することができる。
【００６１】
したがって、本明細書で提供される方法および組成物は、胎児の状態を評価するために様々な状況で使用することができる。例えば、先天性心疾患などの先天性異常と診断された胎児において、胎児の健康が評価され得る。別の例として、胎児性胃症および胎児徐脈症候群を有する妊婦において、胎児の健康が評価され得る。高リスクまたは低リスクの妊娠では、方法および組成物は、胎児喪失を防止するための早期介入または出産について胎児妥協の認識を可能にすることができる。したがって、方法および組成物は、女性の妊娠を計画する上で助けとなり、医学的介入、適切な出産の時期などを可能にする。かかる方法および組成物は、早期分娩および胎児死亡のさらなる理解を可能にし、許容できないほど高いままである未熟児および新生児死亡率を減少させることを可能にする。したがって、提供される方法または組成物のいずれか１つは、上記の状況などの本明細書で提供される状態のいずれか１つまたは上記の対象について使用するためのものであり得る。
【００６２】
提供される方法は、胎児が本明細書で提供される状態のいずれか１つを有するか有すると疑われる（またはそのリスクがある）任意の妊娠をモニタリングするために使用することができる。例えば、全核酸または非胎児特異的核酸などに対して、ｃｆ−ＤＮＡなどの胎児特異的核酸のパーセンテージ、フラクション、または比率などのレベルまたは量は、本明細書中で提供される方法のいずれか１つを使用することによって決定され得る。リスクを評価する記載された方法は、任意の適切な様式で実施され得る。例えば、方法は、以下に記載されるように、例および添付の図面に関連して、実施することができる。ｃｆｆ−ＤＮＡの変化を使用して、臨床上の変数、ならびに、水症、介入後の水症の解消、および胎児喪失を含む胎児状態の現在の非侵襲的方法と相関させることができる。提供される方法のいずれか１つは、母体重量および／または在胎齢に基づいて結果を修正するステップを含み得ることも理解されるべきである。したがって、本明細書で提供される方法は、妊娠中のいくつかの時点にわたる胎児の健康を同定および／またはモニタリングするために使用することができる。かかるモニタリングは、胎児の介入後にも生じ得る。
【００６３】
したがって、提供される方法は、子宮内成長制限および母性血管疾患を含む低リスク妊娠ならびに高リスク妊娠をモニタリングするために使用することができる。「高リスク妊娠」は、臨床医がかかる合併症（単数または複数）に関連する１つ以上の合併症または状態のリスクがあると考える任意の妊娠を指すことを意味する。例えば、母親、赤ん坊、またはその両方に影響を及ぼす可能性のある合併症がある場合、妊娠は高リスクと考えられ得る。妊娠が高リスクであると示され得るさらなる例は、健康上の問題が存在する妊娠（例えば、糖尿病、がん、高血圧、腎臓疾患（例えば、慢性腎盂腎炎、慢性腎盂腎炎および腎不全）、てんかん）を含む。母親がアルコールまたは違法薬物を使用、または喫煙する場合、母親が１７歳未満または３５歳超である場合、母親が複数の妊娠歴がある場合、母親が以前の流産の病歴がある場合、または、胎児がダウン症候群、および／または心臓、肺または腎臓の問題などの遺伝的状態を有することが見出されている場合、妊娠もまた高リスクと考えられ得る。高リスク妊娠は、以前に妊娠に問題（例えば、早産、子癇前症または発作（子癇））があった人または現に妊娠に問題（例えば、早産、子癇前症または発作（子癇））を有する人、感染（例えば、ＨＩＶ、Ｃ型肝炎、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、水痘、風疹、トキソプラズマ症、または梅毒）を有する人、所定の薬物（例えば、リチウム、フェニトイン（Dilantinなど）、バルプロ酸（Depakene）、またはカルバマゼピン（Tegretolなど））を服用している人も含む。妊娠中の女性が所定の健康上の問題（例えば、心臓弁の問題、高血圧、鎌状赤血球症、喘息、狼瘡、または関節リウマチ）を有する妊娠も、高リスクと考えられ得る。高リスク妊娠の他の臨床指標は、当業者に知られている。
【００６４】
態様において、本明細書で提供される方法のいずれか１つは、いずれか１以上の所定の量または閾値もしくはベースラインに対する量の変化について、閾値またはベースライン値との比較などの、本明細書で記載されるいずれか１つ以上の比較に基づいて、妊娠した対象に治療（または処置）を提供するステップまたは治療（または処置）に関する情報を提供するステップを含み得る。さらに他の態様において、方法のいずれか１つを使用して治療（または処置）の有効性を評価することができ、ここで、改善された値は治療の必要性をより少なく示し得るが、値の悪化は療法、異なる療法または増加した量の療法の必要性を示し得る。胎児特異的核酸の量（例えば、パーセンテージまたは比率）は、臨床介入と共に変化し得ることが予測される。本明細書で提供される方法のいずれか１つは、１つ以上の時点での１つ以上の比較の結果に基づいて治療の必要性または用量を評価するステップを含み得る。いくつかの態様において、治療および介入は、子宮介入（例えば、外科的処置、薬物の投与など）または早期分娩を含む。いくつかの態様において、情報は、情報を含む書面を含む。書面は、書面による情報を電子形式で含み得る。いくつかの態様において、情報は、コンピュータ可読指示書として提供され得る。いくつかの態様において、情報は口頭で提供され得る。本明細書で提供される方法のいずれか１つにおいて、方法は、対象への治療の投与、対象への治療の情報の提供または対象への治療の示唆を記録することをさらに含み得る。治療は、本明細書で提供される療法または処置のいずれか１つであり得るか、または当業者に知られている。代替的に、量に基づいて変化なしまたは治療なしまたは処置なしを決定および示唆してもよく、本明細書で提供される方法のいずれか１つは、かかる情報を対象に提供するステップを含み得る。
【００６５】
本発明の側面は、１以上のベースライン値に対して妊娠した対象のサンプル中の胎児特異的核酸の量を比較すること、および任意には、処置することまたは処置に関する情報を提供することに関連する。臨床医が本明細書で提供される値（単数または複数）を含むレポートを有することは特に有用であり得る。したがって、一側面において、かかるレポートが提供される。いくつかの態様において、レポートは、全核酸（全無細胞ＤＮＡなど）または非胎児特異的核酸を用いるかまたは用いないで、胎児特異的核酸の量について複数の値を提供する。いくつかの態様において、臨床医は、対象の処置の必要性、または対象を経時的にモニタリングする必要性を量から評価することができる。
本明細書で提供されるアプローチは、喪失または水症の発生のリスクのある胎児の介入および計画的な分娩を適宜補助することができ、および、早期分娩のリスクを最小化するための支持療法のためのモニタリングを補助することもできる。最終的な利益は、胎児喪失の減少および胎児死亡率の減少であり得る。したがって、本明細書で提供される方法のいずれか１つは、妊娠中の女性の子宮内死が生じる前に、胎児の介入または出産を実施または推奨するステップをさらに含み得る。いくつかの態様において、推奨は、妊娠中の女性への胎児介入および／または出産オプションなどの示唆された処置に関する情報を提供することを含む。本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、妊娠した対象からの試料中の胎児特異的核酸の量を使用して、１以上のベースライン値に対する、胎児特異的核酸のパーセントまたは比率などの、胎児特異的核酸の量の差または差の変化を相関させる（または比較する）ことにより、胎児に対する治療の（例えば、正または負の）効果を評価することができる。適切な治療は、相関または比較に基づいて選択することができ、および／または、妊娠した対象に投与される治療の量は、増加または減少され得る。代替的には、変化または治療は、相関または比較に基づいて決定されなくてもよい。治療の選択およびかかる治療に関与する投薬は、当業者の技能の範囲内である。
【００６６】
本明細書で提供される方法のいずれか１つは、例えば妊娠した女性などの対象から得られた試料から、例えば無細胞ＤＮＡなどの核酸を抽出することを含み得る。かかる抽出は、当技術分野で知られている任意の方法または本明細書に提供される他の方法を用いて行うことができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology、最新版またはQIAamp循環核酸キットまたは他の適切な市販キットを参照）。無細胞ＤＮＡを血液から単離するための例示的な方法は、記載されている。ＥＤＴＡまたはＤＴＡなどの抗凝固剤を含有する血液を、対象から採取する。ｃｆ−ＤＮＡを含む血漿を、血液中に存在する細胞から分離する（例えば、遠心分離または濾過によって）。所望の二次分離を行って、任意の残存する細胞を血漿から除去することができる（例えば、第２の遠心分離または濾過ステップ）。その後ｃｆ−ＤＮＡを、当分野で知られている任意の方法、例えばQiagenにより製造されたものなどの市販のキットを用いて、抽出することができる。ｃｆ−ＤＮＡを抽出するための他の例示的な方法も、当技術分野で知られている（例えば、Cell-Free Plasma DNA as a Predictor of Outcome in Severe Sepsis and Septic Shock. Clin. Chem. 2008, v. 54, p. 1000-1007；Prediction of MYCN Amplification in Neuroblastoma Using Serum DNA and Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction. JCO 2005, v. 23, p.5205-5210；Circulating Nucleic Acids in Blood of Healthy Male and Female Donors. Clin. Chem. 2005, v. 51, p.1317-1319；Use of Magnetic Beads for Plasma Cell-free DNA Extraction: Toward Automation of Plasma DNA Analysis for Molecular Diagnostics. Clin. Chem. 2003, v. 49, p. 1953-1955；Chiu RWK, Poon LLM, Lau TK, Leung TN, Wong EMC, Lo YMD. Effects of blood-processing protocols on fetal and total DNA quantification in maternal plasma. Clin Chem 2001;47:1607-1613；およびSwinkels et al. Effects of Blood-Processing Protocols on Cell-free DNA Quantification in Plasma. Clinical Chemistry, 2003, vol. 49, no. 3, 525-526を参照）。
【００６７】
本明細書で使用する場合、対象からの試料は、生物学的試料であり得る。かかる生物学的試料の例には、全血、血漿、血清、尿などが含まれる。いくつかの態様において、さらなる核酸、例えば標準の、試料への添加が行われ得る。
本明細書で提供される方法のいずれか１つのいくつかの態様において、増幅前ステップが実施される。例示的なかかる増幅方法は以下の通りであり、かかる方法は、本明細書で提供される方法のいずれか１つに含めることができる。約１５ｎｇの無細胞血漿ＤＮＡを、約１００個の標的とＱ５ ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲで増幅する；ここでプールされたプライマーは合計で６μＭであった。試料を、約３５サイクルに供する。反応は合計で２５μｌである。増幅後、試料は、AMPUREビーズクリーンアップ、ビーズ精製、または簡単にExoSAP-IT（商標）itもしくはZymoを含む、いくつかのアプローチを用いて洗浄することができる。
【００６８】
本開示はまた、本明細書で提供される方法のいずれか１つにおいて使用するための複数のＳＮＶ標的を決定する方法、またはプライマーの組成物のいずれか１つを誘導できる方法を提供する。複数のＳＮＶ標的を決定する方法は、いくつかの態様において、ａ）複数の高度にヘテロ接合性のＳＮＶを個体の集団において同定すること、ｂ）各ＳＮＶにわたる１以上のプライマーを設計すること、ｃ）十分に特異的なプライマーを選択すること、ｄ）プライマーの多重化能力を、共通の融解温度および／または共通の溶液中において評価すること、およびｅ）プライマーまたはそのサブセットで均一に増幅された配列を同定すること、を含む。
本明細書で使用する場合、「高度にヘテロ接合性のＳＮＶ」とは、集団において十分に高いパーセンテージのマイナーなアレルを有するものである。いくつかの態様において、マイナーなアレルは、集団において少なくとも２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％または３５％またはそれ以上である。これらの態様のいずれか１つにおいて、マイナーなアレルは、集団において５０％、４９％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、または４０％未満である。かかるＳＮＶは、天然核酸と非天然核酸との間で異なる標的を提供する可能性を増加させる。
【００６９】
プライマーは、一般に７０ｂｐのウィンドウにまたがるように設計され得るが、他のウィンドウ、例えば６５ｂｐｓと７５ｂｐｓの間または６０ｂｐｓと８０ｂｐｓの間なども、選択することができる。また一般に、ＳＮＶはこのウィンドウの中央付近にあることが望まれ得る。例えば、７０ｂｐのウィンドウの場合、ＳＮＶは塩基１０〜６０または２０〜５０の間、例えば塩基３０〜４０の間であった。本明細書で提供されるプライマーは、ＳＮＶに隣接するように設計され得る。
本明細書で使用する場合、「十分に特異的なプライマー」とは、意図されたアレルの増幅の、意図されていないアレルの増幅に対する識別を実証したものであった。したがってＰＣＲでは、２つの増幅の間にサイクルギャップが必要であり得る。一態様において、サイクルギャップは、少なくとも５、６、７または８サイクルのギャップであり得る。
【００７０】
さらに、配列は融解温度に基づいて選択され、一般に４５〜５５℃の間の融解温度を有する配列が「中程度範囲の配列」として選択され得る。他の温度範囲が所望されてもよく、当業者によって決定することができる。「中程度範囲の配列」とは一般に、温度内の多重増幅形式で増幅され得るものである。いくつかの態様において、ＧＣ％含量は３０〜７０％、例えば３３〜６６％であった。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一態様において、方法はさらに、困難領域に関連する配列を除外することを含むことができる。「困難領域」とは、標的配列に関する予測を確実に行うことが困難な、または多重増幅に適さないと考えられる、容量または特徴を有する任意の領域である。かかる領域は、症候性領域、低複雑性領域、高ＧＣ含量の領域、または連続タンデム反復を有する領域を含む。他のかかる特徴は、当業者に決定されるか、または他の方法で当業者に知られている。
【００７１】
本開示はまた、試料中の非天然核酸の量を評価するために有用であり得る、組成物またはキットを提供する。いくつかの態様において、組成物またはキットは、複数のプライマー対を含む。組成物またはキットのプライマー対のそれぞれは、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含むことができ、ここで、本明細書に提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、プライマーの１つには３’ミスマッチがある（例えば、末端から２番目の３’ヌクレオチドにおいて）。本明細書に提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、このミスマッチは３’ヌクレオチドにおいて、ＳＮＶ位置に隣接しており、ここで特定のＳＮＶが存在しない場合、ＳＮＶ標的の別のアレルに対して二重ミスマッチがある。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、プライマー対のミスマッチプライマーは、フォワードプライマーである。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、ＳＮＶ標的の各アレルのリバースプライマーは、同一である。
【００７２】
方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、情報提供的標的などのＳＮＶ標的のそれぞれについて少なくとも２つのプライマー対がある。本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つは、ＳＮＶ標的の数のいずれか１つにしたがって、本明細書で提供される情報提供的標的を含むＳＮＶ標的のそれぞれについて少なくとも２つのプライマー対を含み得る。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つにおいて、複数のＳＮＶ標的は、少なくとも６つの情報提供的なＳＮＶ標的である。提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２の情報提供的標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４または２３未満の情報提供的標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、６〜１０、６〜１５、６〜２０、６〜２５または６〜３０の情報提供的標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、７〜１０、７〜１５、７〜２０、７〜２５または７〜３０の情報提供的標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、８〜１０、８〜１５、８〜２０、８〜２５または８〜３０の情報提供的標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５または１０〜３０の情報提供的標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、１５〜２０、１５〜２５または１５〜３０の情報提供的標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は１７〜２０、１７〜２５または１７〜３０の情報提供的標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、２０〜２５または２０〜３０の情報提供的標的である。
【００７３】
本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つの態様において、複数のＳＮＶ標的は、少なくとも１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９３または９６の標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、１００、９９、９７、９６、９３、９０、８７、８４、８１、７８、７５、７２または６９未満の標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、１８〜３０、１８〜４５、１８〜６０、１８〜７５、１８〜８０、１８〜８５、１８〜９０、１８〜９５または１８〜１００の標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、２１〜３０、２１〜４５、２１〜６０、２１〜７５、２１〜８０、２１〜８５、２１〜９０、２１〜９５または２１〜１００の標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、２４〜３０、２４〜４５、２４〜６０、２４〜７５、２４〜８０、２４〜８５、２４〜９０、２４〜９５または２４〜１００の標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、３０〜４５、３０〜６０、３０〜７５、３０〜８０、３０〜８５、３０〜９０、３０〜９５または３０〜１００の標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、４０〜４５、４０〜６０、４０〜７５、４０〜８０、４０〜８５、４０〜９０、４０〜９５または４０〜１００の標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、４５〜６０、４５〜７５、４５〜８０、４５〜８５、４５〜９０、４５〜９５または４５〜１００の標的である。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、複数のＳＮＶ標的は、５０〜６０、５０〜７５、５０〜８０、５０〜８５、５０〜９０、５０〜９５または５０〜１００の標的である。
【００７４】
本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４または９５の標的について、少なくとも２つのプライマー対などのプライマー対が存在する。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、１０５、１０４、１０３、１０２、１０１、１００、９９、９８または９７未満の標的について、少なくとも２つのプライマー対などのプライマー対が存在する。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、４０〜１０５、４５〜１０５、５０〜１０５、５５〜１０５、６０〜１０５、６５〜１０５、７０〜１０５、７５〜１０５、８０〜１０５、８５〜１０５、９０〜１０５、９０〜１０４、９０〜１０３、９０〜１０２、９０〜１０１、９０〜１００、９０〜９９、９１〜９９、９２〜９９、９３、９９、９４〜９９、９５〜９９、または９０〜９５の標的について、少なくとも２つのプライマー対などのプライマー対が存在する。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、４０〜９９、４５〜９９、５０〜９９、５５〜９９、６０〜９９、６５〜９９、７０〜９９、７５〜９９、８０〜９９、８５〜９９、９０〜９９、９０〜９９、９０〜９８、９０〜９７、または９０〜９６の標的について、少なくとも２つのプライマー対などのプライマー対が存在する。本明細書で提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、９０〜１０５、９０〜１０４、９０〜１０３、９０〜１０２、９０〜１０１、９０〜１００、９０〜９９、９１〜９９、９２〜９９、９３、９９、９４〜９９、９５〜９９、９０〜９５の標的について、少なくとも２つのプライマー対などのプライマー対が存在する。提供される方法または組成物またはキットのいずれか１つについて、方法または組成物またはキットは、前述の数の標的または情報提供的標的のいずれか１つに向けられ得る。したがって、方法または組成物またはキットのいずれか１つは、前記の数の標的または情報提供的標的のいずれか１つについての少なくとも２つのプライマー対に向けられ得る。
【００７５】
本明細書で提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つのいくつかの態様において、プライマー対は、定量ＰＣＲアッセイなどの増幅に基づく定量アッセイでの使用に適合するように設計される。例えば、プライマー対は、プライマー二量体を防止し、および／またはオフターゲット結合部位の数を制限するように設計される。提供される方法、組成物またはキットのいずれか１つの複数のプライマー対は、本明細書に記載の方法のいずれか１つに従って最適化または設計され得ることが、理解されるべきである。
いくつかの態様において、提供される組成物またはキットのいずれか１つは、緩衝液をさらに含む。いくつかの態様において、緩衝液は、界面活性剤、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他のＰＣＲ反応添加剤などの添加剤を含む。いくつかの態様において、提供される組成物またはキットのいずれか１つが、例えばポリメラーゼをさらに含む場合、組成物またはキットは、以下を含んでよい：大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウクラスのポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、バクテリオファージ２９、REDTaq（商標）ゲノムＤＮＡポリメラーゼ、またはシークエナーゼ。いくつかの態様において、提供される組成物またはキットのいずれか１つはさらに、１つ以上のｄＮＴＰ（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）を含む。いくつかの態様において、提供される組成物またはキットのいずれか１つはさらに、プローブ（例えば、TAQMAN（商標）プローブ）を含む。
【００７６】
本明細書で使用される「キット」とは、典型的には、例えば、前述のように、１つ以上の本発明の組成物、および／または本発明に関連する他の組成物を含む、パッケージまたはアセンブリを定義する。本明細書で提供されるキットのいずれか１つはさらに、少なくとも１つの反応チューブ、ウェル、チャンバーなどを含んでよい。本明細書に記載のプライマー、プライマーシステム（複数の標的のためのプライマーのセットなど）またはプライマー組成物のいずれか１つは、キットの形態で提供され得るか、またはキット内に含まれ得る。
キットの各組成物は、液体形態（例えば、溶液）、固体形態（例えば、乾燥粉末）などで提供され得る。キットはいくつかの場合において、任意の形態における使用説明書を含んでよく、これは本発明の組成物と関連して提供され、使用説明書が本発明の組成物と関連していることを当業者が認識するような様式のものである。使用説明書は、本明細書で提供される方法のいずれか１つを実施するための使用説明書を含み得る。使用説明書は、組成物および／またはキットに付随する他の組成物の、使用、改変、混合、希釈、保存、投与、組み立て、保管、包装および／または調製のための使用説明書を含み得る。使用説明書は、かかる使用説明書を含むのに好適な媒体として当業者により認識され得る任意の形態で提供されてよく、例えば、任意の様式での書面または発表、口頭、聴覚的（例えば、電話による）、デジタル、光学的、視覚的（例えば、ビデオテープ、ＤＶＤなど）、または電子通信（インターネットまたはウェブベースの通信を含む）を含む。
【００７７】
本発明の様々な側面は、単独で、組み合わせて、または前述の態様で具体的に論じられていない様々な構成で使用されてもよく、したがって、それらの用途においては、前述の説明または図面に示された構成要素の詳細および配置に限定されない。例えば、一態様に記載された側面は、他の態様に記載された側面と任意の様式で組み合わせてもよい。
また、本発明の態様は、その一例が提供されている、１つ以上の方法として実装されてもよい。方法の一部として実行される行為は、任意の適切な手段で順序付けられる。したがって、図示されていない順序で行為が実施される態様が構成されてもよく、これは、例示的な態様において連続的な行為として示されている場合でも、いくつかの行為を同時に実行することを含んでよい。
特許請求の範囲における順序を示す用語、例えば「第１」、「第２」、「第３」などの、クレーム要素を修飾するための使用は、それ自体、任意の優先順位、序列、または１つのクレーム要素の他の要素に対する順序、または方法の行為が実施される時間的順序を示さない。かかる用語は、特定の名称を有する１つのクレーム要素を、同じ名称を有する別の要素（但し、順序を示す用語の使用は除く）から区別するための、ラベルとしてのみ使用される。
【００７８】
本明細書で使用される語法および専門用語は、説明目的のものであり、限定的であると見なされるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」、「有する」、「含有する（containing）」、「伴う（involving）」、およびそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目および追加の項目を包含することを意味する。
本発明のいくつかの態様を詳細に説明したので、当業者には様々な改変および改良が容易に思い浮かぶであろう。かかる改変および改良は、本発明の精神および範囲内にあることが意図される。したがって、前述の説明は単なる例示に過ぎず、限定を意図するものではない。以下の説明は、本明細書で提供される方法の例を提供する。
【実施例】
【００７９】
例１−遺伝子型情報を用いるＭＯＭＡアッセイ
ＳＮＶ標的選択
開示による多重化のための標的の同定は、現在記載されているように、以下のステップの１つ以上を含み得る。第１に、既知の困難領域を除いて、いくつかの民族対照集団（Hardy-Weinberg ｐ＞０．２５）で高度にヘテロ接合性のＳＮＰをスクリーニングする。困難領域は、患者および染色体の動原体およびテロメアを含む低い複雑性の領域で異常である可能性のある症候性領域を含み得る。次いで、所望の長さの標的フラグメントをin silicoで設計し得る。具体的には、例えば、それぞれのＳＮＰの７０ｂｐウィンドウにわたる２つの２０〜２６ｂｐプライマーを設計する。次いで、ＢＬＡＳＴを使用して全ての候補プライマーをＧＣＲｈ３７に照会し得る。十分に特異的であることが見出されるプライマーは保持し得、オフターゲットヒット、特にフラグメントの３’末端でモニタリングし得る。オフターゲット候補のヒットを、サイズ選択を生き延びるペアワイズフラグメント生成について分析し得る。次いで、選択されたプライマーをin silico多重化評価に供し得る。プライマーの計算された融解温度およびグアニン−シトシンパーセンテージ（ＧＣ％）を使用して、中程度の範囲の配列をフィルタリングし得る。反復遺伝子アルゴリズムおよび模擬アニーリングを使用して、４００の標的に適合する候補プライマーを選択し、最終的に８００のプライマーを選択し得る。８００のプライマーを生成し、共通の溶解温度で共通の溶液で多重能力を物理的に試験し得る。具体的には、マルチプレックス画面および中程度の読み取り深度ウィンドウにおいて偶数倍の増幅に基づいてプライマーをフィルタリングし得る。最高性能の多重化ＳＮＰを使用してＭＯＭＡについて４８のアッセイを設計し得る。それぞれのＳＮＰは、４つのミスマッチの選択肢でＷＴ／ＭＵＴで設計されたプローブ、すなわち、アッセイ当たり８つのプローブを有し得る。新しく入れ子になったプライマーを、７０ｂｐの豊富なフラグメント内に設計し得る。最終的に、増幅効率を評価するために、既知のヘテロ接合性個体を用いてプライマーを実験的に増幅し得る（TAQMAN（商標）を使用して、３回で８プローブ×４８アッセイ）。
【００８０】
各アッセイの推測的遺伝子型決定の情報性（informativeness）
それぞれのアッセイされたＳＮＰでの既知の母親および父親遺伝子型を使用して、情報提供的なアッセイのサブセットを選択し得る。父親の遺伝子型がわからない場合、それは推論することができる。遺伝子型は、シーケンシング、ＳＮＰマイクロアレイ、または既知の試料に対するＭＯＭＡアッセイの適用によっても学習することができる。
【００８１】
多重アッセイ性能の後処理分析
患者特異的ＭＯＭＡプローブバイアスを実験コホートにわたって推定し得る。反復的な選択を洗練して最終的な胎児特異的パーセント・コールを行い得る。
【００８２】
再構成実験
アッセイの感度と精度を、既知の混合比で再構成された血漿試料を使用して評価した。
【００８３】
例２−母親の遺伝子型情報を有するが父親の遺伝子型情報を有さないＭＯＭＡアッセイ
標的は、一般に、非情報提供的なものと情報提供的なもののいずれかとして同定する。胎児では、赤ん坊が母親に関連しているとき、すべての標的が半情報提供的である。代理妊娠では、標的は半情報提供的標的および完全情報提供的標的である。関連する妊娠の文脈に続き、すべての標的は非情報提供的なものまたは半情報提供的なものいずれかである。半情報提供的は、５％の外因性（foreign）を示す標的が１０％の全体的な割合を示すようなヘテロ接合性の振る舞いを示す。非情報提供的標的は、バックグラウンドノイズレベルでほぼ０％を示す。情報提供的標的が共通の分布を共有しているという前提に基づいて、それぞれの標的の最も可能性の高い割り当てを推測するために、期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムを使用できる。「ベータ」分布などの分布を使用して、０と１との間の連続確率分布を与えることができる。すべての標的がバックグラウンドノイズ分布または胎児特異的比率のいずれかであると仮定すると、ＥＭアルゴリズムは未知の標的分類を満たす。
【００８４】
例えば、それぞれがコールされた胎児特異的パーセンテージを有する、１０の標的のセットを検討されたい。最初の推測は、２５番目未満のパーセンタイルをコールする任意の標的はバックグラウンドノイズであり、その他は半情報提供的である。その場の最初の推測でＥＭが始まり得る。次に、最大化ステップを実施する。ベータ分布モデルなどの分布モデルをそれぞれの点群にフィッティングし、データ点の対数尤度関数の２次元モデルへの合計を最小にする。ベータ分布を２つの形状パラメータによって定義する。合計で、４つの形状パラメータを収集する（１つの標的情報提供的な群につき２つ）。非天然％の最大尤度の推定は、半情報提供的群のベータモデルの平均の２倍に等しい。次の予測ステップでは、すべての標的が評価されて、それぞれが所属する可能性が高い群を見つける。標的は、どちらのモデルがより高い可能性を有するかに基づいて、非情報提供的または半情報提供的な群に再割り当てする。任意の標的が群を変更した場合、最大化ステップを繰り返し、再び予想ステップが続く。収束すると、ＥＭは完了し、すべての標的および最終モデルパラメータの最大尤度の情報提供的な分類をレポートする。
【００８５】
遺伝子型を推測する例を図３および４に提供する。ここで、ＥＭを使用して父の遺伝子型が知られていない胎児特異的な算出を決定した。方法は、非情報提供的な部位と半情報提供的な部位とを区別することができた。次いでこれらを２倍して胎児のフラクションを決定する。
さらに、本明細書で提供される方法は、胎児フラクションと胎児健康とを相関させる結果を提供することが見い出された。例えば、本明細書で提供される方法を使用して、低胎児フラクションが胎児死亡対象と相関していた。１０週の胎児妊娠年齢の後に、１〜１０％の胎児フラクションが発達病理を示したことも見出した。図７は、異なる試料の胎児フラクションを示す散布図を提供する。母親試料を、示された妊娠の週（１２〜３９週）に採取して、胎児フラクションを算出して、本明細書で記載される方法を使用して、父親の遺伝子型を推定した。次いで、パーセント胎児フラクションを、超音波結果と比較して、胎児妊娠１０週齢以降の１０％以下の胎児フラクションが、発達性病理を示すことを見出した。
【００８６】
例３−ＭＯＭＡ ｃｆ−ＤＮＡアッセイ
ＭＯＭＡ ｃｆ−ＤＮＡアッセイの原理と手順
この例示的アッセイは、移植レシピエントの血液試料中に存在する非天然ｃｆ−ＤＮＡのパーセンテージを決定するために設計される。この態様において、母親の血液試料をＥＤＴＡチューブに収集し、遠心分離して血漿とバフィーコートを分離する。血漿およびバフィーコートを２つの別個の１５ｍＬコニカルチューブに等分し、凍結させることができる。血漿試料は定量的遺伝子型決定（ｑＧＴ）に使用することができ、バフィーコートは母親試料の基本的遺伝子型決定（ｂＧＴ）に使用することができる。
プロセスの第１ステップは、血漿試料から無細胞ＤＮＡ（ｑＧＴに使用される）を、バフィーコート、全血、または組織試料からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）（ｂＧＴに使用される）を、抽出することであり得る。ｃｆＤＮＡの全量は、ｑＰＣＲによって決定し、標的濃度に対して標準化することができる。このプロセスはｃｆＤＮＡ定量として知られている。ＵＶ分光光度法を使用してｇＤＮＡを定量し、標準化することができる。１５ｎｇのＤＮＡは、一般に正確で有効な結果を提供する。
【００８７】
標準化された患者のＤＮＡは、例えばそれぞれがＭＯＭＡ標的部位の１つを含む領域を増幅する９６のプライマー対を含有する高度に多重化されたライブラリーＰＣＲ増幅への入力として使用することができる。得られたライブラリーは、ＭＯＭＡ標的プライマーおよびプローブ部位を有するＰＣＲアンプリコンからなるため、ｂＧＴまたはｑＧＴアッセイのいずれかのための入力として使用することができる。このステップは、高度に特異的なｑＰＣＲ増幅の前にそれぞれの標的のコピー数を増加させることによって、アッセイ全体の感度を向上させることができる。対照とキャリブレーター／スタンダードは、多重ライブラリーを使用して対象の試料とともに増幅することができる。ライブラリー増幅の後、下流の増幅への干渉を防ぐために、過剰のプライマーおよび組み込まれていないデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を除去するために酵素的クリーンアップを行うことができる。
平行したワークフローで、マスターミックスを調製し、３８４ウェルＰＣＲプレートに移すことができる。次いで、増幅された試料、対照、およびキャリブレーター／スタンダードを、ライブラリー希釈緩衝剤で所定の体積および濃度に希釈することができる。希釈された試料および対照は、６ウェルのリザーバープレートに等分し、アコースティック液体ハンドラー（acoustic liquid handler）を使用して３８４ウェルＰＣＲプレートに移すことができる。次いで、プレートを密封し、リアルタイムＰＣＲ増幅および検出システムに移すことができる。
【００８８】
ＭＯＭＡは、情報提供的であり得る両アレルＳＮＰなどのＳＮＶを標的とすることにより、基本的および定量的遺伝子型決定分析の両方を実施することができる。基本的遺伝子型決定は、レシピエントおよびドナーに、それぞれの標的（例えば、ホモ接合性ＲＥＦ、ヘテロ接合性ＲＥＦおよびＶＡＲ、およびホモ接合性ＶＡＲ）における３つの可能な遺伝子型を標識することができる。この情報は、標準曲線と共に定量的遺伝子型決定に使用して、それぞれの標的のアレル比率を定量することができ、これはマイナー種の割合として知られている。すべての情報提供的および品質管理されたアレル比率の中央値を使用して、胎児特異的ｃｆＤＮＡの％を決定することができる。
【００８９】
例４−コンピュータで実施される態様の例
いくつかの態様において、上述の診断技術は、１つ以上のソフトウェアファシリティを実行する１つ以上の計算機器を介して実施され、経時的に対象の試料を分析し、試料中の核酸（無細胞ＤＮＡなど）を測定し、１つ以上の試料に基づく診断結果を生み出すことができる。図８は、いくつかの態様が動作することができるコンピュータシステムの例を示しているが、態様は図８に示すタイプのシステムでの動作に限定されないことを理解されたい。
【００９０】
図８のコンピュータシステムは、対象８０２から試料８０６を得ることができる対象８０２および臨床医８０４を含む。上記から理解されるように、試料８０６は、対象８０２のための任意の適切な生物学的材料の試料（対象８０２の核酸（無細胞ＤＮＡなど）の存在を測定するために使用され得、血液試料を含む）であり得る。試料８０６は分析装置８０８に提供することができ、これは、当業者が前述のことから理解するように、試料８０６を分析して、核酸（無細胞ＤＮＡなど）の全量および試料８０６および／または対象８０２の非天然核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量を決定する（推定を含む）。図示を容易にするために、分析装置８０８は単一の装置として示されているが、分析装置８０８は、任意の適切な形態をとることができ、いくつかの態様において、複数の装置として実施することができることを理解されたい。試料８０６および／または対象８０２における核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量を決定するために、分析装置８０８は、上記の任意の技術を実施することができ、特定の分析を実施することに限定されない。分析装置８０８は、他のハードウェアを動作させ、他のハードウェアによって実施されるタスクの結果を受け取るようにプロセッサ（単数または複数）を駆動して、分析の全体的な結果（試料８０６および／または対象８０２の核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量であってもよい）を決定するソフトウェアに実施された分析ファシリティを実行する１つ以上のプロセッサを含むことができる。分析ファシリティは、１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体（装置８０８のメモリーなど）に保存され得る。他の態様において、試料を分析するための本明細書に記載の技術は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などの１つ以上の専用コンピュータ構成要素、またはソフトウェア実施の代わりになり得る他の適切な形態のコンピュータ構成要素で部分的または全体的に実行され得る。
【００９１】
いくつかの態様において、臨床医８０４は、試料８０６を分析装置８０８に直接提供することができ、対象８０２から試料８０６を得ることに加えて装置８０８を作動させることができ、他の態様において、装置８０８は臨床医８０４および対象８０２から地理的に離れていてもよく、試料８０６は出荷され得、または分析装置８０８に場所へ転送され得る。いくつかの態様において、試料８０６は、試料８０６が得られた日付および／または時間に関する試料８０６および／または対象８０２、または試料８０６を記載または同定する他の情報の識別子（例えば、任意の適切なインターフェースを介した入力）とともに分析装置８０８に提供される。
【００９２】
分析装置８０８は、いくつかの態様において、試料８０６に対して実行された分析の結果を、データベースまたは他の適切なデータストアとして実施され得るデータストア８１０Ａを含み得る計算機器８１０に提供するように構成され得る。いくつかの態様において、計算機器８１０は、クラウドサービスプロバイダなどの分散計算プラットフォームの１つ以上の物理的および／または仮想的な機械を含む１つ以上のサーバとして実施され得る。他の態様において、装置８１０は、デスクトップまたはラップトップパーソナルコンピュータ、スマート携帯電話、タブレットコンピュータ、専用ハードウェア装置、または他の計算機器として実施することができる。
いくつかの態様において、分析装置８０８は、その分析の結果を、インターネットを含む１つ以上の有線および／または無線、ローカルおよび／またはワイドエリアコンピュータ通信ネットワークを介して装置８１０に通信することができる。分析の結果は、任意の適切なプロトコルを使用して通信されてもよく、試料８０６および／または対象８０２の識別子、または試料８０６が得られた日付および／または時間など、試料８０６を記載または同定する情報とともに通信され得る。
【００９３】
計算機器８１０は、本明細書に記載の診断技術を実行するためのプロセッサ（単数または複数）を駆動し得るソフトウェアに実施された診断ファシリティを実行するための１つ以上のプロセッサを含むことができる。診断ファシリティは、装置８１０のメモリなどの１つ以上のコンピュータ可読記憶媒体に保存することができる。他の態様において、試料を分析するための本明細書に記載された技術は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などの１つ以上の専用コンピュータ構成要素、またはソフトウェア実施の代わりになり得る他の任意の適切な形態のコンピュータ構成要素で部分的または全体的に実施することができる。
【００９４】
診断ファシリティは、分析の結果および試料８０６を記載または同定する情報を受け取り、その情報をデータストア８１０Ａに保存することができる。情報は、対象８０２の以前の試料に関する情報が診断ファシリティによって以前に受信され、保存されている場合など、対象８０２の他の情報に関連して、データストア８１０Ａに保存されてもよい。複数の試料に関する情報は、対象８０２の識別子などの共通の識別子を使用して関連付けることができる。いくつかの場合において、データストア８１０Ａは、複数の異なる対象について情報を含むことができる。
【００９５】
診断ファシリティはまた、対象８０２の診断を決定するために、ユーザ入力によって特定された特定の対象８０２に対する１つ以上の試料８０６の分析の結果を分析するように動作されてもよい。診断は、対象８０２が特定の状態を有している、有し得る、または将来的に発症し得るというリスクの結論であってもよい。診断ファシリティは、特定の試料８０６について決定された核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量を１つ以上の閾値と比較すること、または試料８０６について経時的に決定された核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量の経時的な変化を１つ以上の閾値と比較することを含む、上記の様々な例のいずれかを使用して診断を決定することができる。例えば、診断ファシリティは、１つ以上の試料８０６に対する核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量を閾値と比較することによって、ある状態の対象８０２に対するリスクを決定することができる。閾値との比較に基づいて、診断ファシリティは、ある状態の対象８０２に対するリスクを示す出力を生成することができる。
【００９６】
前述から理解されるように、いくつかの態様において、核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量を比較することができる異なる閾値で診断ファシリティを構成することができる。異なる閾値は、例えば、異なる人口統計学的群（年齢、性別、人種、経済的クラス、病歴における特定の処置／状態／他の有無、または他の人口統計学的分類）、異なる状態、および／または他のパラメータまたはパラメータの組み合わせに対応する。かかる態様において、診断ファシリティは、計算機器８１０のメモリに保存された異なる閾値を用いて、核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量と比較される閾値を選択するように構成することができる。したがって、選択は、人口統計学的群に基づいて閾値が異なる態様における対象８０２の人口統計学的情報に基づき、これらの場合、対象８０２の人口統計学的情報は、診断ファシリティに提供されるか、または対象８０２の識別子を使用する診断ファシリティによって（別の計算機器、またはデータストア８１０Ａと同じかまたは異なるデータストア、または任意の他の適切な供給源から）回収される。選択は、追加的または代替的に、リスクが決定されるべき条件に基づいてもよく、診断ファシリティは、リスク受信を入力として条件を決定する前に、リスクの決定の基礎となる閾値を選択する条件を使用することができる。診断ファシリティは、複数の閾値がサポートされる態様において、任意の特定の方法で閾値を選択することに限定されないことを理解されたい。
【００９７】
いくつかの態様において、診断ファシリティは、リスクの診断および／または対象８０２の診断のための基礎を含むユーザインターフェースをユーザに提示するために出力するように構成されてもよい。診断の基礎は、例えば、対象８０２について１つ以上の試料８０６に検出された核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量を含み得る。いくつかの態様において、ユーザインターフェースは、上述の結果、値、量、グラフなどの任意の例を含み得る。それらは経時的な結果、値、量などを含み得る。例えば、いくつかの態様において、ユーザインターフェースは、本明細書で提供される図のいずれか１つに示されるものと同様のグラフを組み込むことができる。かかる場合、グラフには、グラフに表示されたデータの分析から生成され得る異なる診断に、グラフの異なる領域がどのように対応しているかをユーザに示すために注釈を付けることができる。例えば、グラフ化データと比較して分析を決定し得る閾値をグラフ（単数または複数）に課すことができる。
【００９８】
グラフ、特に線および／または影を有するグラフを含むユーザインターフェースは、核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量に基づいて対象８０２のリスクを決定するための、他のユーザインターフェースを介して提供され得るものよりも、より直感的で迅速なレビューインターフェースをユーザに提供し得る。しかしながら、態様は、任意の特定のユーザインターフェースで実施されることに限定されないことを理解されたい。
いくつかの態様において、診断ファシリティは、対象８０２および／または臨床医８０４または別の臨床医であり得る臨床医によって操作され得る１つ以上の他の計算機器８１４（装置８１４Ａ、８１４Ｂを含む）に診断またはユーザインターフェースをアウトプットし得る。診断ファシリティは、ネットワーク（単数または複数）８１２を介して診断および／またはユーザインターフェースをデバイス８１４に送信することができる。
【００９９】
本明細書で説明される原理に従って動作する技術は、任意の適切な方法で実施されてもよい。上記の議論には、核酸（無細胞ＤＮＡなど）の量の分析に基づく状態のリスクを決定する様々なプロセスのステップおよび動作を示す一連のフローチャートが含まれている。上述の処理ブロックおよび決定ブロックは、これらの様々なプロセスを実行するアルゴリズムに含まれ得るステップおよび動作を表す。これらのプロセスから導出されたアルゴリズムは、１つ以上の単一または多目的プロセッサの動作に統合され、その動作を指示するソフトウェアとして実施されてもよく、デジタル信号処理（ＤＳＰ）回路または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などの機能的に等価な回路として実施されてもよく、あるいは他の適切な方法で実施することができる。態様は、任意の特定の回路または任意の特定のプログラミング言語またはプログラミング言語のタイプの任意の特定の構文または動作に限定されないことを理解されたい。むしろ、当業者であれば、上記の説明を使用して回路を製作するか、または本明細書で説明したタイプの技術を実行する特定の装置の処理を実行するコンピュータソフトウェアアルゴリズムを実施することができる。本明細書で別段の指示がない限り、上述のステップおよび／または動作の特定のシーケンスは、本明細書に記載された原理の実施および態様において実施され、変更され得るアルゴリズムの単なる例示であることも理解されたい。
【０１００】
したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載の技術は、アプリケーションソフトウェア、システムソフトウェア、ファームウェア、ミドルウェア、埋め込みコード、または任意の他の適切なタイプのコンピュータコードを含む、ソフトウェアとして実施されるコンピュータ実行可能命令で実行することができる。かかるコンピュータ実行可能命令は、任意の多数の適切なプログラミング言語および／またはプログラミングツールまたはスクリプトツールを使用して記述することができ、フレームワークまたは仮想機械上で実行される実行可能な機械言語コードまたは中間コードとしてコンパイルすることもできる。
【０１０１】
本明細書で説明される技術がコンピュータ実行可能命令として実行されるとき、これらのコンピュータ実行可能命令は、これらの技術に従って動作するアルゴリズムの実行を完了する１つ以上の動作をそれぞれ提供する多数の機能的ファシリティを含む任意の適切な方法で実施され得る。「機能的ファシリティ」は、例えば、１つ以上のコンピュータと統合され、実行されると、１つ以上のコンピュータに特定の動作上の役割を実施させるコンピュータシステムの構造的な構成要素である。機能的ファシリティは、ソフトウェア要素の一部または全部であってもよい。例えば、機能的ファシリティは、プロセスの機能として、または個別プロセスとして、または任意の他の適切な処理のユニットとして実施されてもよい。本明細書に記載された技術が複数の機能ファシリティとして実施される場合、それぞれの機能ファシリティはそれ自身の方法で実施されてもよく、すべて同じ方法で実施する必要はない。さらに、これらの機能的ファシリティは、必要に応じて並列および／または直列に実行することができ、それらが実行しているコンピュータ（単数または複数）上の共有メモリを使用して、メッセージパッシングプロトコルまたは他の適切な方法を使用して、互いに情報を渡し得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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